(57)【要約】エレクトロポレーションセル中で、電圧に対する電流の比率として本発明において定義されるような電気インピーダンスをモニターすることにより、生物組織中に存在する個々のおよび複数の生体細胞中で、制御された様式でエレクトロポレーションを実施する。インピーダンスは、生体細胞中でのエレクトロポレーションの開始を検出し、この情報は、電圧の強度および持続時間を制御するために使用され、エレクトロポレーションが細胞を破壊することなく行われたことを確実にする。本発明は概してエレクトロポレーションに適用可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の生体細胞を含む組織を横切って電圧を印加するための手段（a）と、
該生体細胞のエレクトロポレーションの程度の指標として、組織を横切る電圧に対する組織を通る電流の比率を連続して検出するための手段（b）と、
印加される電圧を電流対電圧比率の変化に従って調整して、制御された程度の該生体細胞全体にわたって平均化されたエレクトロポレーションを達成し、それによって組織中の生体細胞の制御され平均化された程度のエレクトロポレーションを達成するための手段（c）と
を備える、制御された様式でエレクトロポレーションを実施するためのデバイス。
【請求項２】
電圧を印加するための手段が2つの電極およびフロースルーチャネルを備え、該電極がチャネルを通る流れの方向に対して横断する方向で電圧を印加するように配置され、
連続して検出するための手段が、生体細胞のエレクトロポレーションの開始の指標として電流対電圧比率を検出することを提供し、かつ
調整するための手段が、制御された程度のエレクトロポレーションを達成するために電流対電圧比率に従って印加される電圧の持続時間を調整することを提供する、
請求項1記載のデバイス。
【請求項３】
チャネルを通して組織を連続的に通過させるための手段と、
電流対電圧比率を電極間の生体細胞の存在と相関させるための手段と
をさらに備える、請求項2記載のデバイス。
【請求項４】
生体細胞が組織中の生体細胞の平均化された程度のエレクトロポレーションに基づいて電極間にある間に、調整するための手段が電圧の大きさを調整することを提供する、請求項1、2または3のいずれか一項記載のデバイス。
【請求項５】
電気セルが電流に対する障壁を含み、電圧が該電気セルを横切って加えられる場合に該障壁が組織中の生体細胞をバイパスする電流を実質的に許容しない一方で生体細胞を通して通過する流路に電流の流れを制限するように、該障壁が配置される、溶解された化学物質とともに液体を含む電気セル中に組織中の生体細胞を固定するための手段（a）と、
電気セルを横切って電圧を加えるため、ならびに組織中の生体細胞のエレクトロポレーションの発生の指標として、電気セルを通して通過する電流の相対値および加えられた電圧の相対値をモニターするための手段（b）と
を備える、エレクトロポレーションの開始の検出およびその制御を可能にする様式の、エレクトロポレーションによる組織中の生体細胞への化学物質の注入のためのデバイス。
【請求項６】
障壁が電気セル中の第1の電極チャンバーおよび第2の電極チャンバーを分離し、生体細胞の群よりも幅が狭い開口部を含み、固定するための手段が、生体細胞の群が開口部を閉じるように、開口部の上に生体細胞の群を固定することを提供し、かつ
該第1の電極チャンバーが第1の導電性液体を含み、該第2の電極チャンバーが第2の導電性液体を含み、かつ化学物質が該第1の導電性液体および該第2の導電性液体の一方のみの中に溶解される、
請求項5記載のデバイス。
【請求項７】
第1の電極チャンバーが第1の導電性液体を含み、第2の電極チャンバーが第2の導電性液体を含み、かつ化学物質が該第1の導電性液体および該第2の導電性液体の両方の中に溶解される、請求項5記載のデバイス。
【請求項８】
固定するための手段が、開口部の一方の側に対して生体細胞の群に圧力を加えるために開口部を横切って差次的に圧力を加えることを提供する、請求項5、6または7記載のいずれか一項記載のデバイス。
【請求項９】
障壁に結合する物質から構成される、開口部を取り囲む領域上のコーティングをさらに備える、請求項5、6、7または8のいずれか一項記載のデバイス。
【請求項１０】
第1の電極チャンバーがそこを通る液体の連続的な流れを許容するように構築および配置され、デバイスが第1の電極チャンバーを通る第1の導電性液体の連続的な流れをもたらすための手段をさらに備える、請求項5、6、7または8のいずれか一項記載のデバイス。
【請求項１１】
第1の電極チャンバーおよび第2の電極チャンバーが各々のこのようなチャンバーを通して独立して液体の連続的な流れを許容するように構築および配置され、デバイスが第1の電極チャンバーを通る第1の導電性液体の連続的な流れ、および第2の電極チャンバーを通る第2の導電性液体の連続的な流れをもたらすための手段をさらに備える、請求項5記載のデバイス。
【請求項１２】
電気セルが透明であり、電圧を加える間生体細胞の群の変化を観察することを可能にする、請求項5、6、7、8、9、10または11のいずれか一項記載のデバイス。
【請求項１３】
組織の生体細胞の群を保持するための内部支持体、および実質的に電流不透過性である材料の内部障壁を備え、該障壁が、電気セル中の電流の流れを、内部支持体を横切りかつそれによって保持される生体細胞を通る流路に制限するように配置されている、電気セルと、
電気セルを横切る電圧を加えるための、ならびにそれによって保持される生体細胞中のエレクトロポレーションの発生および程度の指標として電流および電圧の相対値をモニターするための手段と
を備える、エレクトロポレーションによる、組織の生体細胞の群への化学物質の注入のためのデバイス。
【請求項１４】
障壁が、電気セルの内部を第1の電極チャンバーおよび第2の電極チャンバーに分離し、内部支持体が生体細胞よりも幅が狭い障壁中の開口部である、請求項13記載のデバイス。
【請求項１５】
開口部中の生体細胞の群を留めるために、開口部を横切って差次的に圧力を加えるための手段をさらに備える、請求項13または14記載のデバイス。
【請求項１６】
生きている哺乳動物の組織中の生体細胞の群を横切って電圧を印加するための手段（a）と、
生体細胞のエレクトロポレーションの程度の指標として、細胞を横切る電圧に対する細胞を通る電流の比率を連続的に検出するための手段（b）と、
組織中の細胞の群の制御された程度のエレクトロポレーションを達成するために、検出された大きさの電流対電圧比率の変化に従って、印加される電圧の決定された大きさを調整するための手段（c）と
を備える、デバイス。
【請求項１７】
連続的に検出するための手段が、生体細胞のエレクトロポレーションの開始の指標における電流対電圧比率を連続的に検出することを提供し、調整するための手段が、組織中の細胞の群の制御された程度のエレクトロポレーションを達成するために、連続的に検出される電流対電圧比率に従って、印加される電圧の持続時間を調整することを提供する、請求項16記載のデバイス。
【請求項１８】
電流対電圧比率が、生体細胞の群の細胞全体にわたって平均化されたエレクトロポレーションの程度の指標であり、生体細胞の群の制御され平均化された程度のエレクトロポレーションを達成する、請求項16記載のデバイス。
【請求項１９】
電圧を印加するための手段が、間に生体細胞の群を配置した2つの微小電極間に電圧を印加する、請求項16記載のデバイス。
【請求項２０】
生物組織を保持するため、および導電性媒体を横切って電圧を印加するための導電性媒体（a）と、
生物組織の細胞のエレクトロポレーションの程度の指標として、該媒体を横切る電圧に対する媒体を通る電流の比率を連続的に検出するための手段（b）と、
生物組織の細胞の制御された程度のエレクトロポレーションを達成するために、電流対電圧比率の大きさの変化に従って、印加される電圧の大きさを調整するための手段（c）と
を備える、デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、細胞膜を横切るエレクトロポレーションおよび物質移動の分野に関し、より具体的には、組織中の細胞のエレクトロポレーションに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
エレクトロポレーションは、生体細胞に化学種を導入するために使用される技術であり、細胞膜を横切る電位に細胞を曝露することによって実施される。そのメカニズムは十分に理解されてはいないが、エレクトロポレーションは、細胞膜脂質二重膜の破壊を含み、化学種が拡散により細胞に入ることを可能にする膜中での一過性または永続的な孔の形成をもたらすと考えられている。電位は、典型的にはパルスで印加され、孔の形成が可逆的であるかまたは不可逆的であるかに関わらず、細胞の型および発生段階に加えて、パルスの振幅、長さ、形状および反復速度などのパラメーターに依存する。細胞に化学種を導入する方法として、エレクトロポレーションは多数の利点を提供する：使用することが簡単である；細胞の全集団を同時に処理するために使用することができる；細胞に本質的に任意の高分子を導入するために使用することができる；広範な種々の初代細胞株または樹立された細胞株とともに使用することができ、特定の細胞株を用いて特に有効である；ならびに細胞型および起源に対して大きな改変または適合なしに、原核生物細胞と真核生物細胞の両方に対して使用することができる。エレクトロポレーションは現在、組織および器官の中の細胞と同様に、懸濁液および培養物の中の細胞に対して使用されている。
【０００３】
エレクトロポレーションは、高電圧の電場のパルスを放出する発生装置に接続された2つの電極間で、懸濁物の中または組織の中で、1つまたは複数の細胞を配置することによって、現在実施されている。膜の孔形成または透過（permealization）は、細胞の孔において起こり、これは電極に直接的に面している細胞膜上の部位であり、従って膜電位が最高である部位である。不運にも、エレクトロポレーションにおいて起こる透過の程度は細胞型とともに変化し、かつ同様に所定の集団中の細胞間で変化する。さらに、手順はその特性が集団中の個々の細胞間で変化する細胞の大きな集団間で実施されるので、エレクトロポレーション条件は、細胞集団の平均量を扱うために選択することができるのみである；現在実施されているような手順は、個々の細胞の特異的な特徴に適合させることはできない。特に関心が持たれることは、特定の条件下で、エレクトロポレーションが不可逆的な孔形成および細胞死を引き起こし得ることである。従って、例えば、電場は、細胞集団の1つの部分においてトランスフェクションの増加を生じ得るのに対して、別の部分において細胞死を引き起こす可能性がある。公知のエレクトロポレーションの方法に伴うさらなる問題は、エレクトロポレーションによるトランスフェクションの効率が時折低い可能性があることである。DNAの場合において、例えば、細胞の効率的な形質転換を達成するために、周囲の媒体中に大量のDNAが必要とされる。
【０００４】
上記に同定された問題の多くは、個々の細胞と組織の両方におけるエレクトロポレーションのプロセスがリアルタイムで制御できないという事実の結果である。細胞がエレクトロポレーションの状態に入るときをリアルタイムで確認するための手段は現在存在しない。結果として、エレクトロポレーションプロトコールの結果は、物質移動のプロセスの最終的な結果および細胞に対するその効果を通して決定することができるのみである。これらのことは、エレクトロポレーション下での物質移動が起こったずっと後で起こる。現在のエレクトロポレーションのこれらの欠陥およびその他の欠陥に本発明は取り組む。
【０００５】
細胞膜を横切る物質移動の研究および制御のための現在の技術もまた本発明に関連する。正常に機能している細胞と、疾患を有する細胞の両方における、天然での細胞膜を横切る物質移動の知見は、特定の疾患の研究において価値がある。加えて、細胞膜を横切る物質移動を改変および制御する能力は、現代のバイオテクノロジーおよび医学において研究開発および治療を実施する際の有用なツールである。細胞の機能、生理、または挙動を制御するための、DNAまたはタンパク質などの化学種の導入または除去は、細胞の正常なプロセスと異常なプロセスの両方に関する価値のある情報を提供する。
【０００６】
細胞膜を横切る物質移動をもたらし、かつこれを研究する最も一般的な方法は、エレクトロポレーションを伴って、または伴わずに、膜を横切って移動される化合物を含む溶液と接触して細胞を配置することである。このバルク移動法は、膜を横切る物質移動の正確な制御または測定を可能にしない。特異的部位における溶液の組成は未知であり、変動可能である。加えて、電場が存在する場合、局所的な電場の強度は、1つの点から別の点までで変化する。さらに、溶液に露出している細胞の表面は十分に定義されていない。細胞表面領域は、所定の集団中の細胞間で変化し、これは物質移動の量における細胞間での有意な違いをもたらす。これらの理由のために、バルク移動プロセスによって達成される質量移動の量は細胞間で均一ではなく、任意の特定の細胞について移動した実際の量を決定することはできない。
【０００７】
バルク移動技術の制限を克服するためにこれまでに行われた試みには、細胞膜を通るこれらの化合物の機械的注入（マイクロインジェクション）または微小電極を用いるエレクトロポレーションが含まれる。注入技術において、化学剤を送達するために膜を針で貫通し、化学薬剤の適用を注入点に近接する小さな領域に局在化する。これは、実施することが困難で、労働集約的で、かつ容易に再現可能ではない技術である、人の手を用いる細胞の操作を必要とする。微小電極を有するエレクトロポレーションは、これらの問題、ならびに個々の細胞におけるエレクトロポレーションの開始を検出するための任意の手段の欠如に苦しんでいる。本発明はこれらの問題に同様に取り組む。
【０００８】
上記のように、エレクトロポレーションは、通常は細胞膜を透過しない分子を細胞に導入するために、バイオテクノロジーおよび医学において使用される。これは、細胞膜を横切る電気パルスを印加することによって行われる。印加の振幅および時間の特定の範囲については、電気パルスは細胞膜を可逆的に透過できるのに対して、その範囲より下のパルスは膜に対して効果を有さず、その範囲よりも上は不可逆的な透過を誘導する。一般的に、エレクトロポレーションは試行錯誤の手順であり、エレクトロポレーションのための最適な電気パルスパラメーターは、細胞に対する手順の生物学的な結果を評価することによって選択される。米国特許第6,482,619号など本発明者らより初期の特許において、本発明者らは、エレクトロポレーションによる細胞の透過は、細胞膜の透過が細胞を通るイオンの流入の変化を引き起こすという仮定の下で、細胞を通して電流を測定することによって検出できることを示した。これは次に、リアルタイムでエレクトロポレーションのプロトコールを検出、制御、および最適化するために使用することができる。単一細胞微小電気機械チップを使用して、本発明者らは、この手順がいかにして単一の細胞とともに使用することができるかの例を提供した。正確に同じ概念が、コンフルエント細胞層を用いる実験を通して、および組織中の細胞を用いる実験を通して、多数の細胞においてエレクトロポレーションを制御するために適用することができ、このようなものは以下に例証される。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、組織中の生体細胞および細胞の群のエレクトロポレーションの開始および程度が、生体細胞または組織を含む導電性媒体の電気インピーダンス（この用語は、電圧に対する電流の比率を意味するために本明細書で使用される）の変化に相関する可能性があるという開示から一部生じている。細胞の膜が孔形成に起因して透過性になるときに、生体細胞の群を横切る電流対電圧比率の増加が起こる。同様に、液体が、フロースルー電気セル中の電極間の領域に生体細胞を引き出すとき、流れている導電体を通る電流対電圧比率の減少が起こる。従って、組織中の生体細胞のインピーダンスをモニターすることによって、平均して細胞の孔の形成が起こる時点、ならびに孔形成に起因する細胞膜透過性の相対的な程度を検出することができる。次いで、この情報は、平均して組織の細胞が実際にエレクトロポレーションを受けたことを確立するため、または電圧の大きさの選択を管理することによってエレクトロポレーションを制御するために使用することができる。本発明は、多数の細胞の同時エレクトロポレーションを提供する。なぜなら、本発明は、エレクトロポレーションの実際の発生の直接的な指標および多数に対して平均化したエレクトロポレーションの程度の指標を提供するからである。この開示は、同じ理由のために、生物組織（連続する膜を有する生体細胞の集団）のエレクトロポレーションにおいて同様に有用である。
【００１０】
このプロセスの利点は、特定の細胞集団において作製された透過性の発生および程度のより詳細な知見と一緒に、エレクトロポレーションの開始および程度に対する高いレベルの制御を含む。細胞に適用される場合、このプロセスは、平均して、組織の細胞が、確かに透過可能にされ、および化学種の導入によって確かに形質転換されること、ならびにこれはリアルタイムで観察および測定することができることを保証する。このプロセスはまた、他の細胞に対して不十分な効果を有しながら、ある細胞を破壊する電気的な環境において変動を回避することによってエレクトロポレーションの効率を増加する能力を提供する。
【００１１】
より特定のその態様のいくつかにおいて、本発明は、抽出した組織試料が配置可能であり、電流の流れを方向付ける障壁を含み、従って、電流が組織試料をバイパスすることを実質的に許容しない一方、組織試料を通して通過する流路を通してイオンが流れる、電気セルの使用を含む。これらの態様のいくつかにおいて、本発明は、電流に対して実質的に透過性ではない障壁によって分離されている2つの液体含有チャンバーを備えた装置の使用を含む。この障壁は、開口部に一旦入った組織試料が開口部に栓をするかまたは開口部を閉じるように、組織試料よりも小さな開口部を備える。エレクトロポレーションを達成するために、組織試料は、組織試料が組織への損傷を伴うことなく後で取り出すことができるように、好ましくは可逆的な様式で、機械的手段または化学的手段によって開口部の上に固定される。一旦、組織試料が開口部の上に固定されると、電圧が2つのチャンバー間に、開口部に存在する組織試料を横切って加えられる。従って、チャンバー間の電流の通り道は、開口部を通して、それゆえに、組織試料を通して通過する経路に制限される。電気セル中の電流-電圧の関係をモニターすることによって、エレクトロポレーションの開始を検出し、かつ孔の形成の程度を制御して、エレクトロポレーションが平均して起こっていることを保証することと、過度の孔形成および細胞死を平均して妨害していることの両方を行う。従って、ユーザーに、組織の細胞の平均を横切る条件および流れの、高度に正確な知見および制御が提供される。
【００１２】
別の一連の態様において、本発明は、組織の細胞への、または組織の細胞からの化学種の拡散的移動において有用である。これらの態様において、組織試料は、障壁によって2つのチャンバーに再度分離され、組織試料は、1つのチャンバーから他のチャンバーまでの組織試料の周囲の液体の通路が実質的に妨害されるような様式で、障壁中の開口部を横切って留められる。組織の細胞に導入される種の液体溶液は、チャンバーの一方または両方に配置される。溶液中の種の濃度は、組織の細胞中の濃度と異なり（細胞から種を導入するか、または除去するかを追求しているかに依存して、より高いかまたはより低いかのいずれかである）、または一方のチャンバーの濃度は他のチャンバーの濃度と異なる。
【００１３】
拡散的移動に本発明を適用する好ましい方法において、2つのチャンバー中の溶液は濃度が異なり、その結果、拡散的輸送のための駆動力が、チャンバーと組織の細胞の内部の間よりもむしろ2つのチャンバーそれ自体の間にある。開口部の寸法の正確な知見とともに、拡散が進行するにつれて、定期的または連続的な、2つのチャンバーの各々の中の濃度の知見および制御されたモニタリングは、ユーザーが、組織の平均的な細胞に入る種の速度および量を平均して正確に観察および制御することを可能にする。拡散時間は、チャンバーのいずれかまたは両方における濃度の段階的な変化を与えることによって制御することができ、それによって、差次的な濃度を与えるか、または除去する。特に関心対象の応用は、先行する段落において記載されたような制御されたエレクトロポレーションを用いる、化学種の拡散的移動のこの型の組み合わせである。
【００１４】
本発明の種々の態様の各々は、異なるサイズの組織試料を用いて使用されてもよい。上記の装置は、電流または拡散移動が、試料の細胞の周囲のバイパスを妨害しながら、試料の細胞のすべてを通して通過する流路に制限されるように、障壁を配列することによって、異なるサイズの組織試料を用いる使用のために適合することができる。
【００１５】
本発明の概念のさらなる応用は、流れている液体中に懸濁される生体細胞のエレクトロポレーションである。電極は、フローチャネル中の固定された位置に配置され、電極間を通る電流をモニターしながら、電圧が電極間に加えられる。電極間の領域に入る生体細胞は電圧を低下させ、インピーダンスはその領域中の1つ以上の細胞の存在の指標として、および任意でエレクトロポレーションを達成するために十分なより高い電圧の印加を開始するためのシグナルとしても働く。
【００１６】
先行技術と比較して、本発明が提供する利点の中には、組織試料を個々に処理する能力、および個々の組織試料の必要性に対して処理条件を適合させる能力がある。電圧が印加される態様において、インピーダンスのモニタリングは、孔の存在または非存在の認識をユーザーに与え、かつ孔形成の進行、および細胞死に導く可能性がある不可逆的孔形成が起こったか否かを示す。障壁および開口部装置の利点は、開口部を通して通過する電流の流路への電流のその制限による、電気エネルギーのその高度に効率的な使用である。なおさらなる利点は、装置および方法が自動化システムに統合される能力であり、それによって、各組織試料の状態が機器によってモニターされ、個々の組織試料は開口部に入れられ、次いで、モニターされる条件によって管理される時点で取り出される。
【００１７】
本発明の1つの局面は、リアルタイムで電気インピーダンスの変化を測定および／または観察しながら、かつ可能な限り多く、不可逆的な細胞損傷を回避するために電流を調整しながら、それによって組織の細胞を電気泳動する方法である。
【００１８】
本発明の特徴は、組織の細胞のエレクトロポレーションの間、電流の大きさが細胞のエレクトロポレーションの程度に依存するようになり、その結果、所定の範囲内で電流が調整されて、細胞損傷を最小限にする、所望の程度のエレクトロポレーションが得られることである。
【００１９】
本発明の別の特徴は、回路を通して電流を（リアルタイムで）測定することが、電極間で組織中の細胞が受けたエレクトロポレーションの全体のおよび平均の程度に依存して測定を与えることである。
【００２０】
本発明の別の局面は、組織の正確な電気抵抗が、プローブ電極を用いる相互時間電圧測定、およびエレクトロポレーション電極に結合された回路を用いる相互電流測定から計算されることである。
【００２１】
本発明の1つの局面は、制御された様式でエレクトロポレーションを実施するためのデバイスであり、このデバイスは：
複数の生体細胞を含む組織を横切って電圧を印加するための手段（a）と、
該生体細胞のエレクトロポレーションの程度の指標として、組織を横切る電圧に対する組織を通る電流の比率を連続して検出するための手段（b）と、
印加される電圧を電流対電圧比率の変化に従って調整して、制御された程度の該生体細胞全体にわたって平均化されたエレクトロポレーションを達成し、それによって組織中の生体細胞の制御され平均化された程度のエレクトロポレーションを達成するための手段（c）
を備える。
【００２２】
本発明の別の局面は、電圧を印加するための手段が2つの電極およびフロースルーチャネルを備え、該電極がチャネルを通る流れの方向に対して横断する方向で電圧を印加するように配置され、
連続して検出するための手段が、生体細胞のエレクトロポレーションの開始の指標として電流対電圧比率を検出することを提供し、かつ
調整するための手段が、制御された程度のエレクトロポレーションを達成するために電流対電圧比率に従って印加される電圧の持続時間を調整することを提供する、デバイスである。
【００２３】
本発明の別の局面は、エレクトロポレーションの開始の検出およびその制御を可能にする様式の、エレクトロポレーションによる組織中の生体細胞への化学物質の注入のためのデバイスであって、このデバイスは：
電気セルが電流に対する障壁を含み、該障壁が、電圧が該電気セルを横切って加えられる場合に障壁が組織中の生体細胞をバイパスする電流を実質的に許容しない一方で生体細胞を通して通過する流路に電流の流れを制限する、溶解された化学物質とともに液体を含む電気セル中に組織中の生体細胞を固定するための手段（a）と、
電気セルを横切って電圧を加えるため、ならびに組織中の生物組織のエレクトロポレーションの発生の指標として、電気セルを通して通過する電流の相対値および加えられた電圧の相対値をモニターするための手段（b）を備える。
【００２４】
本発明のなお別の局面は、電気セル内で障壁が第1の電極チャンバーおよび第2の電極チャンバーを分離し、生物組織の群より幅が狭い開口部を含み、ここで、固定するための手段が、生体細胞の群が開口部を閉じるように、開口部の上に生体細胞の群を固定することを提供し、かつ
該第1の電極チャンバーが第1の導電性液体を含み、該第2の電極チャンバーが第2の導電性液体を含み、かつ化学物質が該第1の導電性液体および該第2の導電性液体の一方のみの中に溶解される、デバイスである。
【００２５】
本発明のなお別の局面は、エレクトロポレーションによる、組織の生体細胞の群への化学物質の注入のためのデバイスであって、このデバイスは、
組織の生体細胞の群を保持するための内部支持体、および電流が実質的に不透過性である物質の内部障壁を備え、該障壁が、電気セル中の電流の流れを、内部支持体を横切りかつそれによって保持される生体細胞を通る流路に制限する、電気セルと、
電気セルを横切る電圧を加えるため、ならびにそれによって保持される生体細胞中のエレクトロポレーションの発生および程度の指標として電流および電圧の相対値をモニターするための手段と、
を備える。
【００２６】
本発明のなお別の局面は、
生きている哺乳動物の組織中の生体細胞の群を横切って電圧を印加するための手段（a）と、
生体細胞のエレクトロポレーションの程度の指標として、細胞を横切る電圧に対する細胞を通る電流の比率を連続的に検出するための手段（b）と、
組織中の細胞の群の制御された程度のエレクトロポレーションを達成するために、検出された大きさの電流対電圧比率の変化に従って、印加される電圧の大きさを調整するための手段（c）と
を備える、デバイスである。
【００２７】
本発明のなお別の局面は、
生物組織を保持するため、および導電性媒体を横切って電圧を印加するための導電性媒体（a）と、
生物組織の細胞のエレクトロポレーションの程度の指標として、該媒体を横切る電圧に対する媒体を通る電流の比率を連続的に検出するための手段（b）と、
生物組織の細胞の制御された程度のエレクトロポレーションを達成するために、電流対電圧比率の大きさの変化に従って、印加される電圧の大きさを調整するための手段（c）と
を備える、デバイスである。
【００２８】
本発明のこれらおよびさらなる特徴、利点ならびに目的は、以下に続く説明からより良好に理解される。
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明の方法、処理およびデバイスを説明する前に、本発明が特定の説明する態様に限定されず、それ自体が当然、変動する可能性があることが理解される。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される専門用語は、特定の態様を説明する目的のみのためであり、限定を意図するものではないこともまた理解される。
【００３０】
一定の範囲の値が提供される場合、各々の中間の値は、文脈が明確に反対のことを指示しない限り、その範囲の上限と下限の間の、下限の単位の10分の1までも同様に具体的に開示されることが理解される。任意の言及した値または言及した範囲における中間の値と、任意の他の言及した値またはその言及した範囲における中間の値の間のより狭い各々の範囲が、本発明に包含される。これらのより狭い範囲の上限および下限は、その範囲内に独立して含まれるかまたは除外され、各々の範囲は、いずれかの境界がより狭い範囲に含まれ、いずれもがそこに含まれず、または両方がそこに含まれる場合の各々の範囲もまた、言及した範囲内の具体的に除外された境界に従属して、本発明に包含される。言及された範囲が境界の一方または両方を含む場合、境界を含んだもののいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。
【００３１】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する当技術分野の当業者によって共通して理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似のまたは等価な任意の方法および材料が本発明の実施または試験において使用できるが、好ましい方法および材料が、本明細書において説明される。本明細書に言及されるすべての刊行物は、刊行物がそれに関連して引用される方法および／または材料を開示ならびに説明するために、参照により本明細書に組み入れられる。
【００３２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、文脈が明確に他を指示しない限り、複数形の指示対象が含まれることに注意しなければならない。従って、例えば、「（1つの）パルス（a pulse）」は、複数のそのようなパルスを含み、「試料」への言及は、1つまたは複数の試料および当業者に公知であるその等価物を含む。
【００３３】
本明細書で議論される刊行物は、単に、本発明の出願日より前のそれらの開示を提供するのみである。本明細書において、本発明が、先行技術の発明によってこのような公開に先行する権利がないことの認可として解釈されることはない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の公開日とは異なる可能性があり、これは、独立して確認される必要があり得る。
【００３４】
単一細胞層電極システム
エレクトロポレーションのプロトコールにおいて、細胞をa）基材上で増殖させ、b）トリプシン処理を通して基材から分離し、c）細胞が浮遊している細胞懸濁液に導入し、d）次いで、細胞懸濁液を、電極間のリアルタイム制御なしでエレクトロポレーションし、パルスは試行錯誤によって決定し、e）エレクトロポレーション後に細胞を細胞増殖基材上にまき、およびf）細胞を増殖させ、エレクトロポレーションが成功したか否かを生化学的マーカー通して決定する。これは6段階の手順である。細胞のエレクトロポレーションは、層の中の細胞の大きさと同様に、個々の細胞についてリアルタイムで検出することができる。この基本概念は、基材上で増殖させた一定の大きさの細胞において、リアルタイムでエレクトロポレーションを検出および制御するエレクトロポレーション手順のために、本発明で適用される。これは、細胞をトリプシン処理する必要を伴うことなく、直接的に、基材上の細胞の層のリアルタイム制御を用いてエレクトロポレーションを容易にし、基材上でのさらなる増殖のためにまくのではなく、懸濁液中でエレクトロポレーションを行う。
【００３５】
単一層の細胞の大きさのエレクトロポレーションのために使用される装置は図1に示される。この装置の基礎は、電子5-9によってモニターされる電極3および4の使用である。ここに記載される例は、市販の膜挿入物（Millicel-PCF, # PIHP03050 Millipore, USA）を使用してもよく、これは、0.4ミクロンの孔および10%の多孔性を有する。他の型の孔挿入物も同様に使用することができる。
【００３６】
細胞層中で増殖させた細胞についての典型的なエレクトロポレーションにおいて、細胞を、Millipore社の説明書によって記載されるような多孔性挿入物上で所望のコンフルエンスまで増殖させる。エレクトロポレーションプロトコールの間、細胞挿入物は、図1に示されるように、電極3と4の間に導入される。電解質を導入して、細胞層と電極3および4との間の良好な接触をもたらす。電気パルスは、2つのエレクトロポレーション電極3および4を通して接着細胞に適用され；これらの電極は電力増幅器18に接続されている。この電気回路を通して電流を測定することは、試料1における細胞1である全体のおよび平均のエレクトロポレーションの程度に依存する。一旦、試料1における細胞がエレクトロポレーションされると、細胞を通る電流の増加が存在するはずであり、電流の大きさは、接着細胞のエレクトロポレーションの程度に依存するようになる。この細胞を横切る電流は、アンプ19を用いて測定することができ、細胞膜のエレクトロポレーションのプロセスをモニターするために使用することができる。電流測定に加えて、5つの挿入されたプローブ電極5、6、7、8および9を使用して、エレクトロポレーション電極3および4を横切るイオン層の積み重ねによって誘導されるアーティファクトを伴うことなく、エレクトロポレーションプロセスの間に、試料1の細胞層を横切る電圧の低下を正解に測定する。ハイアンプ19に接続されたプローブ電極5-9は、エレクトロポレーション電極3および4界面において電圧の低下を取り消すように使用することができ、試料1の細胞層を横切る電圧に対する正確な読み取りを提供する。従って、試料1における細胞層の正確な電気抵抗は、プローブ電極5-9を用いる細胞層を横切る電圧測定から計算される。抵抗測定は、試料1の細胞層のエレクトロポレーションの程度を明らかにする。なぜなら、細胞膜抵抗は、膜エレクトロポレーションの程度に直接的に依存するからである。エレクトロポレーションをモニターすることに加えて、電流測定ならびに膜抵抗測定は、試料1における細胞に高度に制御されたエレクトロポレーションを達成するためにエレクトロポレーションパルスの微調整のためのフィードバックとして使用することができる。
【００３７】
組織エレクトロポレーション4電極システム
インビトロまたはインビボのいずれかで行われる組織エレクトロポレーションにおいて、エレクトロポレーションすることが所望されている組織は、図1の2つの電極3および4の間に導入され、電気パルスは、細胞がエレクトロポレーションされた状態になるように印加される。エレクトロポレーションの程度または型に関してリアルタイム情報は存在しない可能性がある。細胞エレクトロポレーションが個々の細胞、ならびに層の中の多数の細胞、ならびに組織中の細胞についてリアルタイムで検出することができるという基本的概念は、組織中でリアルタイムでエレクトロポレーションを検出するために使用することができる。
【００３８】
組織のための典型的なエレクトロポレーション手順において、試料1は、インビトロエレクトロポレーションのために、図1に示されるような2つの電極3および4の間に配置される。電解質が導入され、試料1と電極3および4の間に良好な接触をもたらす。次いで、電子パルス発生装置18に接続された2つのエレクトロポレーション電極3および4を通して、電気パルスが組織に印加される。この電気回路を通して電流を測定することは、電極の間の組織試料中の細胞が受ける全体および平均のエレクトロポレーションの程度に依存して行われてもよい。
【００３９】
一旦、細胞がエレクトロポレーションされると、細胞を通る電流の増加が存在するはずであり、電流の大きさは、接着細胞のエレクトロポレーションの程度に依存するようになる。この細胞を横切る電流は、電極5-9を用いて測定することができ、細胞膜のエレクトロポレーションのプロセスをモニターするために使用することができる。アンプ19に接続された2つのプローブ電極5-9は、エレクトロポレーション電極界面において電圧の低下を取り消すように使用することができ、組織を横切る電圧に対する正確な読み取りを提供する。
【００４０】
従って、組織の正確な電気抵抗は、プローブ電極5-9を用いる細胞層を横切る電圧測定および相互電流測定から計算される。抵抗測定は、組織試料1中の細胞のエレクトロポレーションの程度を明らかにする。なぜなら、細胞膜抵抗は、膜エレクトロポレーションの程度に直接的に依存するからである。エレクトロポレーションをモニターすることに加えて、電流測定ならびに膜抵抗測定は、試料1における組織中の細胞の高度に制御されたエレクトロポレーションを達成するためにエレクトロポレーションパルスの微調整のためのフィードバックとして使用することができる。
【００４１】
実施例
以下の実施例は、どのようにして本発明を完成しかつ使用するかの完全な開示および説明を当業者に提供するために示され、本発明らが本発明者らの発明と見なしているものの範囲を限定することは意図せず、また以下の実験が実施されたすべての実験または唯一の実験であることを表すことを意図しない。使用された数字（例えば、量、温度など）に関して正確さを保証するための努力がなされてきたが、ある程度の実験誤差および偏差が考慮されるべきである。他に示されない限り、部分は重量部分であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧またはその近傍である。
【００４２】
実施例1
材料
細胞
2つの細胞の型：マウス皮膚線維芽細胞（NIH 3T3細胞株）および初代骨格筋サテライト細胞を試験した。サテライト細胞は単離しかつ拡大した。これらの細胞を膜挿入物（Millicel-PCF, #PIHP03050 Millipore, USA）に配置し、所望のコンフルエンスが達成されるまで、6ウェルプレート中で、培養培地（DMEM、10%ウシ胎仔血清、1% L-グルタミン、抗生物質、Biological industries, Bet Haeemek, Israel）中で5日間インキュベートした。
【００４３】
組織
肝臓は、Spraque Dewleyラット（250〜350グラム）から入手し、切除から10分間以内に使用した。肝臓を、麻酔したラットから取り出し、外科用メスを用いて1mmから4mmの範囲の厚さにスライスした。次いで、余分な組織を切り取るために先の尖った円形チューブを試料に押しつけることによって、肝臓のディスクを得た。次いで、得られた試料は、測定のために、図1に示されるようなデバイスの中に配置することができる。陰性対照のために、肝臓を使用することができ、切除の前に4℃で冷蔵庫中に保持されるべきである。
【００４４】
電気的パラメーター研究
細胞
細胞の接着層を有する挿入物は、図1に示される構成に配置することができ、培地を収集することができ、細胞はPBS（リン酸緩衝化生理食塩水）で洗浄し、電極と、コンフルエント細胞層の両側の間の良好な接触を確実にするために、さらなるPBSを導入することができる。コンフルエンシー試験を実施することができ、その後、一連のエレクトロポレーションパルスを与え、電気的データを記録することができる。
【００４５】
組織
組織層は、測定電極間に配置することができる。次いで、電極と組織の間の良好な接触を確実にするために、PBSが加えられるべきである。
【００４６】
導入遺伝子発現
導入遺伝子の送達および発現の効率を評価するために、2種類のプラスミド：CMV-GFPおよびMSV-MyoDを使用してもよい。GFPレポーター遺伝子は、遺伝子送達の効率を評価するために、培養して線維芽細胞またはサテライト細胞に導入してもよい。MSV-MyoDは、筋原性変化を試験するために培養した線維芽細胞に導入してもよい。
【００４７】
挿入物を図1のシステムに配置してもよく、培地を収集してもよく、細胞をPBSで洗浄し、かつプラスミドDNA（1μg/ml）を含む1ml PBSを細胞層に導入する。6ml PBSをエレクトロポレーションシステムチャンバーに配置してもよい。その後、一連のエレクトロポレーションパルスを与えることができる。エレクトロポレーション後、PBSは廃棄し、新鮮な培地で置き換えることができる。次いで、細胞は3日間インキュベートすることができる（5% CO2インキュベーター、37℃）。
【００４８】
導入遺伝子発現遺伝子送達効率は、GFP遺伝子の発現の程度によって、蛍光顕微鏡を用いて、エレクトロポレーションの3日後に決定してもよい。処理された線維芽細胞またはサテライト細胞は、トリプシン処理し（トリプシンEDTA溶液、Biological industries, Bet Haeemek, Israel）、かつ室温にて、1800pmで10分間、遠心分離することができる。ペレットは、グルコース（2.5gr/L）を有する冷PBS中に懸濁し、ガラス顕微鏡スライド上で15分間、500rpmでサイトスピンすることができる。GFP発現は、緑色フィルター蛍光顕微鏡下で観察されてもよい。
【００４９】
MyoD処理線維芽細胞は、10% FCSを有する培地DMEM中で6時間インキュベートし、次いで、分化（低血清）培地（2% FCSを補充したDMEM培地）に3日間転換してもよい。
【００５０】
エレクトロポレーション電気測定の結果
典型的な3段階の電気パルスが、細胞層および組織試料におけるエレクトロポレーションのプロセスを研究するために使用されてもよい。これは3段階からなる。第1のパルスは、エレクトロポレーションを生じることができない低振幅パルスであり、エレクトロポレーションの前に細胞または組織の典型的な電気インピーダンスを探るために使用される。第2のパルスは、細胞の電気インピーダンスの変化が検出され、エレクトロポレーションの発生を決定するまで、増幅が変動した。エレクトロポレーションの発生は、細胞の電気インピーダンスの減少を生じる一方、エレクトロポレーションを生じない電気パルスは、細胞の電気インピーダンスに影響を与えない。荷電したプラスミドの細胞への挿入を容易にするために、電気泳動的な考慮からプラスミドが導入された電極と比較して、パルスの極性は陰性であることが選択されたことに注目するべきである。第3の電気パルスは第1と同じ振幅を有する。第3のパルスの間に測定されたインピーダンスは、エレクトロポレーションが可逆的であったか否かを決定するために使用されてもよい。種々の時間間隔によって分けられるいくつかの3つのパルス段階の効果が研究されてもよい。
【００５１】
上記の実施例は、全組織を表す電気モデルに、エレクトロポレーションの間の単一細胞の導電率の変化を取り込むことによって、電気インピーダンストモグラフィー（EIT）がエレクトロポレーションをモニターする潜在能力を実証する。しかし、身体の内部の組織中の細胞は、細胞外の導電性液体によって取り囲まれており、本発明者らはここで、組織のバルク特性がエレクトロポレーションによって測定可能に影響を受けることを示す。これは、本発明で、露出された電場の関数として、エクスビボでのラット肝臓組織の導電率の標準化された変化を定量することによって行われる。パルスの持続時間、パルスの回数、および屠殺からの時間などのパラメーターは、印加される電場の関数として研究される。結果は、組織の細胞が制御可能に電気的に浸透可能であること、および組織の導電率が実質的にかつ予測可能に増加することを示し、ならびに、電気インピーダンストモグラフィー（BIT）がエレクトロポレーションを受けた領域の画像を生成できることを示す。
【００５２】
実験方法
これらのエクスビボ実験は、インビボEGTおよびECTに典型的である電気パルスのセットに起因して、組織の標準化された導電率の変化を定量するために設計される。一般的に、ECTのための短いパルス長（100μs）を有するより高い電場、および遺伝子治療のためのより長いパルス（>1ms）を有するより低い電場を合わせた、6〜12回のパルスがIHzの周波数で印加される。標準化された導電率の変化は、動物間の組織特性の大きな変動に起因して、組織抵抗率の絶対値とは対照的に測定される。
【００５３】
実験設定
使用されるシステムは、長方形の組織スライスについての単純な単一周波数のバイオインピーダンス測定システムである。実験装置は図1に示される。各実験について、組織試料1を、電極3および4によって取り囲まれるガラス顕微鏡スライド2の上に配置した。この構成は、2つの別々のセットの電極からなる：1つはエレクトロポレーションパルスを投与するためであり（電極3および4）、他方のセット5、6、7、8、および9はバイオインピーダンス測定のためである。測定電極5-9を外すための1つのスイッチ10、およびシステムが互いに干渉することを防止するためにエレクトロポレーション電極を係合するための別のスイッチ11が存在する。
【００５４】
組織エレクトロポレーション
図1のエレクトロポレーションシステムは、組織の幅を横切る500V cm-1までの8つの方形波パルスを供給するように設計されている。2つの並行したステンレス鋼プレート電極は、電気パルスを印加するためにスライドの幅に沿って配置した。エレクトロポレーションパルスは、Jouan PS-15方形波エレクトロパルセーター（Jouan, St Herblain, France）を使用して生成した。所望の電場Eから、このデバイスのために印加される電圧Vに転換するために、所望の電場に電極間隔s（この場合、2.54cm）を掛け、損失を補うために110%掛け、かつ最後に2/3を掛ける（なぜなら、このシステムに付随したもともとの電極は1.5cm離れていた）。例えば、電圧は、250V/cmパルスを印加するために、372Vに設定される。オシロスコープは、電気パルスの送達を確証するためにシステムに付属した。
2008545415.tif 000002
【００５５】
組織導電率の変化の測定
エレクトロポレーションを受けている組織試料1のインピーダンス変化を定量するために、図1のシステムは、記録電極から注入電極を分けるバイオインピーダンス測定デバイスと類似して設計した。エポキシでスライドの一方の末端に接着した、中心から中心まで4.5mmの等間隔である5つの0.7mm幅四方のステンレス鋼ロッド5-9が存在する。正弦波電流は、試料1を通して第1の電極5から、および最後の電極9から注入される。その経路は、図1において太い実線12として描かれている。これらの外部電極5および9は、永続的なソース／シンク注入対として働き、間の3つの電極6、7、および8が測定のために使用される。
【００５６】
この3つの電極構成は、3つの異なる電極の組み合わせを通してそれらの実験的な測定を確証することを可能にする。第1の電極および最後の電極は、接触抵抗が不確実性を引き起こすので、測定のために使用されない。1つの注入対および1つの測定対（任意の所定の時間において）は、バイオインピーダンス測定システムにおいて共通であり、同じ電極を通して注入および測定を行う単一対システムを超えて結果を劇的に改善することが示された。
【００５７】
図1のシステムを通る電流は、最後の電極9と接地14の間に位置する2kΩ抵抗13を横切る電圧の低下を測定することによって決定した。定電流が使用され、低電圧とは対照的に、ソースおよびシンクの電極において接触インピーダンスを最小化する。この電流を生成するために、関数発生器（Tektronix FG502）は、Raytheon（864107-4）25V電源装置によって作動するデュアルopアンプ（JFET TLO82CP）電圧-電流変換装置17（VCC）への入力として使用される、正弦波参照波形を生じる。このシステムは、National Instruments DAQCard 700データ獲得カード15（2.5mV解像度）および、256MbのRAMを有し、800MHzプロセッサを有するCompaq Presario 1700 notebookコンピュータ16を用いて制御される。獲得ソフトウェアは、National Instruments Lab Windows CVI 5.0を使用して書かれ、12kHzでサンプリングされる電圧示差的測定の二乗平均平方根を連続的に記録するために設計された。
【００５８】
試料の調製
200gの雄性Wistarラットを麻酔し屠殺した。腹部の開腹後、肝臓を切除し、外科用メスを用いて、約2.5cmの長さ、1〜2cmの幅、および0.2〜0.4cmの厚さにスライスした。他に言及しない限り、実験は、動物の屠殺から90分間以内に実施し、使用するまで0.9% NaCl中で組織を保存した。試料のサイズ、屠殺からデータ獲得までの遅れ、およびすべての電圧パラメーターを、各試料について記録した。肝臓組織は、それが巨視的に等方性であり、したがって相対的に均質であり、これは組織に関して電極の方向を伴ういかなる問題も最小化することから選択した。同様にこの器官ではインビボ可逆的エレクトロポレーションの間に収縮が存在せず、この段階では、これらの収縮のために必要とされる修正を扱わないことが好ましかった。肝臓組織のみが実験のために使用されたが、他の組織試料はこのデバイスとともに容易に使用することができた。
【００５９】
任意の実験設定において、印加されたエレクトロポレーションの電圧対距離の比率は、電極と組織の間の接触インピーダンスと関連する電圧の低下のために、組織に露出した電場とは必ずしも相関しないこともまた注目されるべきである。電圧は、組織の全体の長さを横切って印加され、これは、電圧の低下の大部分を説明するはずであり、必要な場合、心電計ペーストが組織と電極の間に適用され、良好な電気的接触を保証した。したがってに、本発明者らは、この不一致は小さいと仮定し、これらの用語を交換可能に使用する。
【００６０】
実験の結果および考察
IQOFASパルスを用いた最初の実験
最初の実験は、0〜500V/cmで変化させた電場を用いるIHzの周波数における8回の100usパルスを使用して実施した；これらのパラメーターは、ECTに典型的である。組織の抵抗は、測定電極を横切る電位の低下および組織を通した電流（2kΩ抵抗を通して）を測定することによって、オームの法則を使用して計算する。これらの測定値は、エレクトロポレーションパルスの送達の前後に取られる。電気パルスは全体の組織を横切って印加され、等価な抵抗の変化は抵抗率の変化に対応する。図2に示されるように、結果は、シグナルドリフトから区別することが困難であり、3%未満の導電率の変化を示唆する。
【００６１】
結果の指標は表6.1において以下に示される。
表6.1：実験結果の指標
（表）
2008545415.tif 000003
【００６２】
標準化した導電率の変化に対するパルス長の効果
100マイクロ秒の100μsパルスを用いる最初の試行は、組織の周辺の導電性の変化のみを示した。従って、実験の2番目のセットは、導電率の変化に対するパルス長の効果を探索した。パルス長は、400V/cmの定電圧対距離の比率を維持しながら、IHzにおける8回の400V/cmの定電圧対距離の比率を使用して100マイクロ秒から10ミリ秒まで変化させた。この限界値は、オシロスコープを用いる観察下で、パルス形状が10msよりも長い時間では完全性を失い始めたので、選択した。図3は、パルス長に対する導電率の変化の強力な依存性、および10msにおける有意により大きな導電率の変化を示す。図4は、印加した電場の関数として、1Hzにおける100Ωにおける8回のパルスについての組織抵抗率の低下を示す。
【００６３】
10msパルスを用いる実験
いくつかの実験（試料あたり2〜5回）は、10ミリ秒のパルス長を用いるIHzの周波数における8回のパルスを使用して実施した。劇的な変化が観察され、これは、時間とともに減少するように見えた。最後のパルスと測定の間の時間は、0.5秒以内の精度でのみ正確であったので、結果は、5秒平均、最後のパルス後の10〜15秒として提示する。
【００６４】
実験は、200(2)、250(2)、300(5)、350(2)、400(4)、450(3)および500(3)V/cmにおいて実施し、ここで、括弧内の数字は、全体で32回の実験についてのその勾配における試行の数である。結果は、200V/cmについて3.2±0.8、250V/cmについて12.1±0.3、300V/cmについて14.212.5、35V/cmについて19.211.2、400V/cmについて22.711.4、450V/cmについて31.4+4.7；および500V/cmについて34.8±6.5の抵抗率の平均低下を示した。結果における標準偏差は相対的に小さかった。
【００６５】
組織のパーセンテージにわたるエレクトロポレーション
図5は、組織の全体の長さを横切って電気を印加するよりはむしろ、エレクトロポレーションされる組織の量を変化させる効果を示す。電極は、組織の幅の25%、50%、75%および100%に沿って配置した。各測定について2つの試料を、300V/cmおよび400V/cmについて、25%、50%および75%で取った。フレームi、iiおよびiiiを有する図6は、設定および電場を確実にする分析的表示を図示する。これらの結果の要約を図7に示す。
【００６６】
絶対抵抗率測定
この実験のセットを用いて、抵抗は、エレクトロポレーション電極それ自体を通して記録した。測定は、エレクトロポレーションパルスの1秒前および1秒後に、これらの電極を通してIVパルスを印加することによって行った。以前に言及したように、これは、一般的には、バイオインピーダンス研究においては所望されない。なぜなら、電流を注入する電極はまた、接触抵抗から誘導される不確実性のために、測定電極であるべきではないからである。この実験は以下のことを可能にした：（1）抵抗測定からの組織の絶対抵抗率値を見積もること（組織試料の本質的に長方形型の形状のため）；および（2）電極のスイッチングが必要でなかったため、測定は最後のパルスの送達後1s以内に記録可能であった。
【００６７】
エレクトロポレーション電極それ自体を使用して、最後のエレクトロポレーションパルスの1秒後に測定を行い、その後15〜20s後に、バイオインピーダンス電極によって一過性の効果を探索した。結果を表8に要約する。
【００６８】
一過性の効果
可逆的エレクトロポレーションは、上記に示すように一過性の現象である。抵抗の初期の低下は、パルスが可逆的である場合に、最終的に回復するべきである。図9は、勾配の関数としての導電率の変化の一過性の応答をプロットする。測定のために使用した電極はステンレス鋼であったので、分極は不可避であった。これを補償するために、エレクトロポレーションの前のドリフトの傾きを計算し、各測定についての全体の応答から差し引いた。電圧の勾配が増加するにつれて、もともとの導電率まで回復する組織の能力は減少し、残存する導電性の変化の増加を生じた。このことは、可逆的と不可逆的の両方のエレクトロポレーションの存在を示唆する。
【００６９】
実施例
数値的方法
単純化された直径7cmの肝臓の二次元等方性横断面を、シミュレーションのために使用する。分析した組織の表面は、ゼロフラックス境界条件を用いて電気的に単離されていると仮定して、肝臓が外科的手順の間に、一時的に絶縁半剛体電極アレイ固定具に配置される状況をシミュレートする。再構築アルゴリズムのためのデータを収集するために、32個の電極が、仮想のファントム、すなわち、エレクトロポレーション導電性マップの末梢の周囲に等間隔に配置される。
【００７０】
フロントトラッキング再構築アルゴリズムにおいて使用される実験結果
コンピュータ上の理由のため、およびモデルの実証のために、本発明者らは、本研究において10msパルスからのデータを使用した。具体的には、これらの実験を用いて、IHzの周波数で8回の1msパルスを、0、200、300、400および500Vcm”1の電場について送達した。エレクトロポレーションを誘導するために必要とされる閾値の勾配は実験データから取られ、200Vcm”1であることが示された。インピーダンスの変化は、エレクトロポレーションパルスの5秒、10秒後に、2.5kHz、0.3mA rmsの正弦波電流を用いて測定した。より初期の研究において、組織中の透過性は、パルスの送達後15秒間より長い時間の間持続する。3回の試行を、全体で15回の実験についての各勾配について実施した。これらの実験の結果は、本発明者らが5つの導電性のレベルを有する導電性マップを生成することを可能にし、これには、組織中のエレクトロポレーションの程度の4段階が含まれる。エレクトロポレーションモデルへの入力として使用される実験結果の要約は図10に含まれる。
【００７１】
実施例2
エレクトロポレーションモデル
エレクトロポレーションのシミュレーションは、有限要素法を使用して、電気パルスに起因する組織中の電位および勾配分布を評価する。エレクトロポレーションの間の組織の電気的特性の変化について説明するために、アルゴリズムは、ゼロソースタームを有するPoisson方程式：
2008545415.tif 000004
を反復して解く。  式中、σは電気的導電率であり、φは電気的電位である。組織の導電率は最初0.13Sm-1であることが仮定されており、これは、IkHzにおけるインサイチューでのイヌの肝臓についての結果と一致し、1つの試料から測定される。図10における実験結果によって規定されたように、電圧勾配が閾値の勾配を超えるすべての位置において、導電率は増加する。解が収束するまで、勾配は、アップデートされた導電率を用いて再計算される。収束のために、一旦、1つのエレメントの導電率が増加すると、これは少なくともデータ獲得の期間内に、より低い値まで戻らないと仮定した。この結果は、組織中でのエレクトロポレーションの4つの程度を含む、5つの導電率レベルを有する導電率マップを生成するために使用される。BITシミュレーションは、仮想のファントムとして導電率マップを使用して、エレクトロポレーションされた領域の画像を再構築する。
【００７２】
実施例3
エクスビボ再構築実施例
ベースライン実施例に加えて、3つのエレクトロポレーション電極の幾何学的構成を研究した。これは、ウサギ肝臓およびマウス骨格筋に対して実施したインビボエレクトロポレーション実験後にモデル化する。図11に示す第1の構成は、肝臓の中心にあり、8mmの内部距離で分けられている2つの電極を有し、1つの電極は800Vであり、他方は接地されている。第2の構成は印加した電圧が600Vであること以外は第1の構成と類似していた。第3の構成は、肝臓の中心に4個の電極の2つの列を有した。2つの列の間の中心から中心までの距離は4mmであり、各列における電極間の中心から中心までの間隔は2mmであった。上端の列の電圧は1200Vに設定され、下端の列は接地されていた。2つの例についての電極の直径は、それぞれ、1.1mm、0.3mm、および0.5mmであった。
【００７３】
実施例4
数値的結果
再構築モデル
再構築アルゴリズムは、96個の末梢エレメントおよびエレクトロポレーション領域を規定する20個のエレメントを有する116個のエレメントメッシュからなった。外部の領域は0.13S/mの導電率を維持したのに対して、内部領域は、0.2S/mの重み付け導電率値を使用した。このアルゴリズムは、最初に、エレクトロポレーション領域が、エレクトロポレーション電極間の中心にある6mm半径を有する円であることを仮定した。境界条件は、電極のソースおよびシンクを除いて、末梢セグメントについてゼロフラックスであった。BIT電極エレメント幅は1mmであり、ソース／シンク電流は+/-1rnAであった。
【００７４】
実施例5
再構築実施例
図11は、第1の構成についての電位分布を示し、関連する寸法および境界条件を表示する。図12a、12bおよび12cは、この構成のための本発明者らのシミュレーションにおける選択されたモデリング工程および画像化工程を示す。図12aは、勾配分布のために集中させた溶液を示す。閾値の勾配よりも上のエレメントについては、導電率は本発明者らの測定値まで増加した。図12bは、図12aからの情報を使用して生成した導電率マップを示す。次いで、この分布は、EIT画像化モジュールに通され、図12cは生成した画像を示す。
【００７５】
図13a、13bおよび13cは、それぞれ、第2の例についての勾配分布、導電率マップ、および生成した画像を示す。図14a、14bおよび14cは、それぞれ、第3の例についての勾配分布、導電率マップ、および生成した画像を示す。これらの3つの光構成について、定量的な識別力研究は実施されなかったが、画像の品質において知覚できる減少が、最大測定BIT電圧振幅の5.0%に近づくノイズレベルとして観察された。
【００７６】
実施例6
ベースライン実施例
図15aおよび15bは、図10において提示されたエクスビボ実験データからアップデートされた生物学的特性を使用する、ベースライン実験のための導電率マップおよび再構築画像を示す。本実施例は、10cmの画像ドメインを有する16個のBIT電極を使用する。組織の中心に配置された4個のエレクトロポレーション電極が存在し、上端の電極は1300Vに設定し、下端の電極は接地に設定した。本実施例において使用した末梢エレメントの数は64であった。
【００７７】
パラメーター研究
再構築アルゴリズムによって使用される変数、すなわち、1)エレクトロポレーション領域を規定するエレメントの数、2)内部領域の導電率、3)内部領域の最初の半径、4)ドメインサイズ、および5)HIT電極の数を、パラメトリックに研究した。最初の3つの実施例からのパラメーターは、ベースラインモデルからのエレクトロポレーション電極構成を使用して、対照として使用した。再構築アルゴリズムにおいて使用した対照モデルは、160個の末梢エレメントおよびエレクトロポレーション領域を規定する20個のエレメントを有する180個のエレメントからなった。内部領域は、0.2S/mの導電率を有し、エレクトロポレーション電極間の中心にある6mm半径を有する円として仮定した。互いから10mmである、正方形構成に配置された組織の中心に位置する4つのエレクトロポレーション電極が存在し、上端の電極は1300Vに設定し、下端の電極は接地に設定した。
【００７８】
図16a、16bおよび16cは、周囲の領域のサイズが、それぞれ、25cm、35cmおよび50cmの領域直径についての再構築された画像に対して有した効果を示す。図17a、17bおよび17cは、それぞれ、0.19S/m、0.20S/mおよび0.21S/mの内部導電率値についての再構築画像を示す。図18a、18bおよび18cは、それぞれ、16個、24個および32個の周辺のEIT電極を使用する再構築画像を示す。これらの3つの実施例のための末梢エレメントの数は、それぞれ、80個、120個および160個であったことに注目するべきである。図19a、19bおよび19cは、それぞれ、6mm、8mmおよび10mmの最初の内部領域半径を使用する再構築画像を示す。図20a、20bおよび20cは、エレクトロポレーション領域を規定するために、それぞれ、18個、20個および22個のエレメントを使用する再構築画像を示す。
【００７９】
考察
インビボエレクトロポレーションのために2つの主要な応用が存在する：抗腫瘍電気化学療法（ECT）および非ウイルス遺伝子治療の新規なアプローチとしての電気移動である。長いパルスを有するより低い電場強度は、一般的に、膜を透過することに加えて、細胞に高分子を電気泳動的に押し込むために使用される。これは、拡散を介して浸透した細胞に入る、ブレオマイシンなどの小さな薬物のためには必要ではない。例えば、ブタ骨格筋のためのプロトコールは、ECTのために100usパルスを用いる450V/cmであるが、遺伝子治療のためには、20msを用いる90V/cmのみである。
【００８０】
100μsパルスを用いる最初の試行は、3%未満の導電率の変化を示唆した。10msパルスを用いると、10msにおいて、導電率の有意により大きな変化が観察された。
【００８１】
電圧勾配が増加するにつれて、そのもともとの導電率まで回復する組織の能力は減少し、残りの導電率の変化を生じる。このことは、可逆的と不可逆的の両方のエレクトロポレーションの存在を示唆する。さらに、これらの結果はまた、EITモニタリングが、ECTよりも本質的により正確さを必要とする、遺伝子治療などのより長いパルスを必要とする応用のためにより適用可能であることを示す。導電率の変化は、本質的に永続的であり、かつ不可逆的なエレクトロポレーションのためにより意味があり、これらの結果はまた、EITが不可逆的なエレクトロポレーションを画像化するために適切であることを示す。
【００８２】
現実的な実験データを使用して得られた、図12〜15における結果は、EITがエレクトロポレーションによって影響を受けた領域の画像を作製することが可能であることを実証する。3つの例は、組織の中心に配置した。なぜなら、これは、この領域における導電率の摂動が表面電圧測定に最小限の影響を与えるために画像化が最も難しい位置だからである。以前の章における実施例は、ここで提示したものよりも、導電率の劇的な変化であるが、より小さな画像化領域、および32個とは対照的に、16個のみの末梢電極を使用したことに注目するべきである。再構築アルゴリズムは、第1の例および第3の例の優れた画像を生成したが、一般的な位置を再構築することのみが可能であり、第2の例の画像の形状は可能ではなかった。
【００８３】
第2の例は、再構築アルゴリズムが現在書かれているように画像化することは困難である。これは、その凸型形状および2つの局所的極大、すなわち、各電極が中心である、500V/cm閾値を有する2つの別々の領域が原因である。この問題は、アルゴリズムの将来の反復を用いて解決可能であるはずである。他の例は、中心的な導電率領域を有した。これは、1つの平均的な導電率値を用いて画像化することがはるかに容易である。
【００８４】
例2を適切に画像化するために、アルゴリズムは、複数の埋め込まれた導電率領域を取り込むように書くことができる。
【００８５】
実施例は、パルスを印加しながら、得られたインビトロ細胞実験の結果から、エレクトロポレーションした組織の導電率を導いてもよい。上記および図1〜20において提示された一過性のエクスビボ実験結果がその瞬間に外挿されるならば、パルスは除去され、結果は比較可能である。これは、バイオインピーダンス測定がパルスの印加の間に起こり得る場合に理想的であることを示す；しかし、比較的短い持続時間のパルスがこれを困難にする。
【００８６】
図15における結果は、ベースライン再構築実施例が、より劇的でなく、かつ複数レベルの導電率の摂動を伴って、なお再現可能であることを示す。ドメインサイズおよび画像化電極の数などの一般的なパラメーター、ならびにこの再構築アルゴリズムに特異的なパラメーター、例えば、エレクトロポレーション領域を規定するエレメントの数、内部領域の導電率、および内部領域の最初の半径を、アルゴリズムの能力に対する効果を決定するために変化させ、正確な画像を作製することができる。これらの変数の効果は、ベースラインモデルにおけるエレクトロポレーション電極の構成および上記に提示した実施例における幾何学的な構成を使用して探索した。図16〜20における結果は、画像化電極および画像化ドメインの数が、驚くべきことに、わずかにしか画像に影響を与えないことを示す。画像に最も影響を与えるパラメーターは、アルゴリズムそれ自体に固有である。これは、これらのパラメーターを選択する際には先制的な配慮がなされなければならないこと、将来の研究はこれらを最適化するためになされなければならないことを示す。物理的なシステムのパラメーターとは対照的に、画像再構築を支配するアルゴリズムパラメーターを有することの利点は、これがこれらのパラメーターを超えて完全な制御を提供すること、およびこれが外科的手順によって指示されないことである。
【００８７】
結論
要約すると、エレクトロポレーションを用いると、すべての他の分子医学的技術におけるように、リアルタイムでそのプロセスを活発にモニターまたは制御するため、すなわち、この手順の間に、細胞膜が、組織の所望の領域中で一過性に透過性になったことを決定するための方法は存在していない。しかし、上記の実施例は、インビボで分子薬物をモニターすることが、2つのかなり良好に理解されている技術、エレクトロポレーションおよびBITの合成を通して達成可能であることを実証する。
【００８８】
前述は本発明の技術を単に例証するのみである。当業者は、本明細書に明確に記載されておらずまたは示されていないが、本発明の原理を具体化しかつその技術思想および範囲の中に含まれる、種々の配置を工夫することが可能であることが認識される。さらに、本明細書に列挙されるすべての例および条件的な言葉は、基本的には本発明の原理、および本発明者らによって技術分野を促進することに寄与される概念を理解する際に読者の理解を補助することを意図し、そしてこれらは、このような具体的に列挙された例および条件への限定を伴わないと解釈される。さらに、本発明の原理、局面、および態様、ならびにその具体的な実施例を列挙する本明細書におけるすべての記述は、その構造的な等価物と、機能的な等価物の両方を包含することが意図される。加えて、このような等価物は、現在公知である等価物と、将来開発される等価物の両方、すなわち、構造に関わらず、同じ機能を実施する、開発された任意のエレメントを含むことが意図される。それゆえに、本発明の範囲は、本明細書に示されかつ記載される例示的な態様に限定されることは意図されない。むしろ、本発明の範囲および技術思想は添付の特許請求の範囲によって具体化される。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
本発明は、添付の図面をとともに読まれるときに、以下の詳細な説明が最良に理解される。一般的な実務に従って、種々の図面の特徴は、原寸通りではないことが強調される。反対に、種々の特徴の寸法は、明確さのために任意に拡大または縮小される。以下の図が図面に含まれる。
【図１】エレクトロポレーションシステムの概略図である。
【図２】印加した電場 対 抵抗の変化パーセントのグラフである。
【図３】パルス長 対 抵抗の変化パーセントのグラフである。
【図４】印加した電場 対 抵抗の変化パーセントのグラフである。
【図５】組織の長さに対する電極の長さ（Electrical length）の比率 対 全体の組織抵抗の変化パーセントのグラフである。
【図６】3つの画像、i、ii、およびiiiである。
【図７】電極に曝露された組織のパーセントのチャート 対 印加した電圧の比率のチャートである。
【図８】2つの電極システムのデータのチャートである。
【図９】時間 対 導電率の変化（charge）パーセントのグラフである。
【図１０】導電率 対 印加した電場のグラフである。
【図１１】電位分布の画像である。
【図１２】電場分布の3枚の画像である。
【図１３】電場分布の3枚の画像である。
【図１４】電場分布の3枚の画像である。
【図１５】電場分布の2枚の画像である。
【図１６】電場分布の3枚の画像である。
【図１７】電場分布の3枚の画像である。
【図１８】電場分布の3枚の画像である。
【図１９】電場分布の3枚の画像である。
【図２０】電場分布の3枚の画像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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