(57)【要約】本発明は、分散媒質においてタンパク質の複合体を形成する方法に関する。同様に、本発明の複合体形成法によって産生された会合タンパク質も開示される。薬学的に有効な安定化タンパク質用量も同様に開示される。本発明はまた、分散媒質においてAHFタンパク質を会合させる方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、分散媒質においてタンパク質の複合体を形成する方法：
タンパク質を提供する段階；
その中の疎水性ドメインを露出するようにタンパク質のコンフォメーション状態を変更させる段階；
該露出した疎水性ドメインに安定剤を結合させる段階；および
タンパク質の少なくとも一部を安定剤と会合させるために、該変更を少なくとも部分的に逆転させる段階。
【請求項２】
変更させる段階が、化学的および物理的撹乱因子(perturbant)の少なくとも一つにタンパク質を接触させる段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
化学的撹乱因子が、有機溶媒、尿素、酸性pHを有する緩衝液、または塩酸グアンジニウムを含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
有機溶媒が、メタノール、エタノール、グリセロール、またはエチレングリコールを含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
変更させる段階が、約3％〜約80％のエタノール-水混合物にタンパク質を接触させる段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
タンパク質がリゾチームを含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
物理的撹乱因子が熱または圧力の変化を含む、請求項2記載の方法。
【請求項８】
安定剤がリポソームを含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
逆転させる段階が冷却を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
逆転させる段階が溶媒の除去を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
逆転させる段階が透析を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
変更させる段階がタンパク質をアンフォールディングする段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
逆転させる段階がタンパク質をリフォールディングする段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
会合が封入を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
請求項1記載の方法によって産生された会合タンパク質。
【請求項１６】
約1％未満から約90％より多いタンパク質が安定剤に会合している、薬学的に有効な安定化タンパク質用量。
【請求項１７】
分散系媒質をさらに含む、請求項16記載の産物。
【請求項１８】
安定剤がリポソームを含む、請求項16記載の産物。
【請求項１９】
約1％より多くのタンパク質が会合している、請求項16記載の産物。
【請求項２０】
約3％より多くのタンパク質が会合している、請求項16記載の産物。
【請求項２１】
約80％〜約90％のタンパク質が会合している、請求項16記載の産物。
【請求項２２】
会合が封入を含む、請求項16記載の産物。
【請求項２３】
会合が封入を含む、請求項19記載の産物。
【請求項２４】
会合が封入を含む、請求項20記載の産物。
【請求項２５】
会合が封入を含む、請求項21記載の産物。
【請求項２６】
以下を含む、分散媒質においてAHFタンパク質の複合体を形成する方法：
AHFタンパク質を提供する段階；
その中の疎水性ドメインを露出するように、該AHFタンパク質のコンフォメーション状態を変更させる段階；
該露出した疎水性ドメインに安定剤を結合させる段階；および
該タンパク質の少なくとも一部を該安定剤と会合させるために、該変更を少なくとも部分的に逆転させる段階。
【請求項２７】
変更させる段階が、化学的および物理的撹乱因子の少なくとも一つにタンパク質を接触させる段階を含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
化学的撹乱因子が、有機溶媒、尿素、酸性pHを有する緩衝液、または塩酸グアンジニウムを含む、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
有機溶媒が、メタノール、エタノール、グリセロール、またはエチレングリコールを含む、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
変更させる段階が、約3％〜約80％のエタノール-水混合物にタンパク質を接触させる段階を含む、請求項26記載の方法。
【請求項３１】
物理的撹乱因子が熱または圧力の変化を含む、請求項27記載の方法。
【請求項３２】
安定剤がリポソームを含む、請求項26記載の方法。
【請求項３３】
逆転させる段階が冷却を含む、請求項26記載の方法。
【請求項３４】
逆転させる段階が溶媒の除去を含む、請求項26記載の方法。
【請求項３５】
逆転させる段階が透析を含む、請求項26記載の方法。
【請求項３６】
変更させる段階がAHFタンパク質をアンフォールディングする段階を含む、請求項26記載の方法。
【請求項３７】
逆転させる段階がAHFタンパク質をリフォールディングする段階を含む、請求項26記載の方法。
【請求項３８】
リポソームの表面を親水性ポリマーでコーティングする段階をさらに含む、請求項26記載の方法。
【請求項３９】
親水性ポリマーがポリエチレングリコールを含む、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
変更がAHFタンパク質の疎水性ドメインを露出するように行われる、請求項26記載の方法。
【請求項４１】
約70％より多くのタンパク質が安定剤に会合している、請求項26記載の方法。
【請求項４２】
会合が、安定剤によるタンパク質の少なくとも一部の封入を含む、請求項26記載の方法。
【請求項４３】
タンパク質の少なくとも一部が約0.5％より多くのタンパク質分子を含む、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
タンパク質の少なくとも一部が約25％より多くのタンパク質分子を含む、請求項42記載の方法。
【請求項４５】
請求項26記載の方法によって産生された分散系会合AHFタンパク質。
【請求項４６】
約0.5％より多くのAHF分子が安定剤によって封入されている、薬学的に有効な安定化AHF用量。
【請求項４７】
約25％より多くのAHF分子が安定剤によって封入されている、請求項46記載の産物。
【請求項４８】
分散系媒質をさらに含む、請求項46記載の産物。
【請求項４９】
安定剤がリポソームを含む、請求項46記載の産物。
【請求項５０】
タンパク質の特異的領域とリポソームとの会合が、非会合タンパク質の治療反応を変更させる、請求項46記載の産物。
【請求項５１】
治療反応が免疫原性および抗原性である、請求項50記載の産物。
【請求項５２】
以下の段階を含む、分散媒質においてタンパク質の複合体を形成する方法：
タンパク質を提供する段階；
エタノールを約10〜50％の濃度で含む混合物にタンパク質を接触させることによって、その中の疎水性ドメインを露出するようにタンパク質のコンフォメーション状態を変更させる段階；
露出した疎水性ドメインに安定剤を結合させる段階；および
タンパク質の少なくとも一部を安定剤と会合させるために、該変更を少なくとも部分的に逆転させる段階。
【請求項５３】
混合物が約7.0〜約7.4のpH範囲を有する、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
接触させる段階が温度約40℃〜約74℃で行われる、請求項52記載の方法。
【請求項５５】
接触させる段階が、温度約70℃〜約74℃で行われる、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
接触させる段階が、温度約58℃〜約62℃で行われる、請求項54記載の方法。
【請求項５７】
接触させる段階が、温度約40℃で行われる、請求項54記載の方法。
【請求項５８】
タンパク質がリゾチームである、請求項52記載の方法。
【請求項５９】
タンパク質がインターフェロンγである、請求項52記載の方法。
【請求項６０】
タンパク質が第VIII因子である、請求項52記載の方法。
【請求項６１】
タンパク質がAHFである、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
安定剤がリポソームを含む、請求項52記載の方法。
【請求項６３】
逆転させる段階が溶媒の除去を含む、請求項52記載の方法。
【請求項６４】
逆転させる段階が透析を含む、請求項52記載の方法。
【請求項６５】
変更させる段階がタンパク質をアンフォールディングする段階を含む、請求項52記載の方法。
【請求項６６】
変更させる段階が、タンパク質の二次タンパク質構造または実質的二次タンパク質構造を安定化させる段階を含む、請求項52記載の方法。
【請求項６７】
変更させる段階が、タンパク質の二次-三次中間タンパク質構造を安定化させる段階を含む、請求項52記載の方法。
【請求項６８】
変更させる段階がタンパク質の未変性様タンパク質構造を安定化させる段階を含み、未変性様タンパク質構造が実質的な二次および三次構造を有する、請求項52記載の方法。
【請求項６９】
逆転させる段階がタンパク質をリフォールディングする段階を含む、請求項52記載の方法。
【請求項７０】
会合が封入を含む、請求項52記載の方法。
【請求項７１】
混合物がエタノール-水混合物である、請求項52記載の方法。
【請求項７２】
混合物がエタノール-リン酸緩衝生理食塩溶液混合物である、請求項52記載の方法。
【請求項７３】
エタノールが変性エタノールである、請求項52記載の方法。
【請求項７４】
エタノールが190％プルーフ等級エタノールまたは200％プルーフ等級エタノールである、請求項73記載の方法。
【請求項７５】
請求項52記載の方法によって産生された会合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、分散媒質においてタンパク質の複合体を形成する方法、分散媒質においてAHFタンパク質の複合体を形成する方法、分散媒質においてタンパク質の複合体を形成する方法によって産生された会合タンパク質、および薬学的に有効な安定化タンパク質用量に関する。
【０００２】
本発明は、2000年11月30日に提出された米国特許仮出願第60/250,283号の恩典を主張する、現在は放棄された2001年11月30日に提出された米国特許出願第10/000,226号、および2000年11月30日に提出された米国特許仮出願第60/250,137号の恩典を主張する、現在は放棄された2001年11月30日に提出された米国特許出願第09/997,936号の一部継続出願である。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
タンパク質工学における進歩により、薬学目的のためにタンパク質およびペプチドが大規模に産生されるようになった。しかし、多くのタンパク質に関して、二次、三次、および四次コンフォメーションのような高次構造の保存は、活性を保持するために必要である。そのような適したタンパク質およびペプチドに基づく薬剤の製剤は、解決されていない大きい問題である。タンパク質は物理化学的不安定性を被り、かつこれらの不安定性は、タンパク質薬剤の産生、製剤、および貯蔵における独自の難しさを提起する(Ahern et al., 「Pharmaceutical Biotechnology」, Borchardt, Ed., pp550, Plenum Press, New York(1992)(非特許文献1)；Balasubramanian et al., Pharmaceutical Research 17:343〜349(2000)(非特許文献2))。変性、凝集、および沈殿は、物理的不安定性の頻出する顕在化である。
【０００４】
タンパク質産物に関する他の薬学的懸念は、より短い半減期および薬物の長期使用後の免疫反応(Ahern et al., 「Pharmaceutical Biotechnology」, Borchardt, Ed., pp550, Plenum Press, New York(1992)(非特許文献3))である。安定性を改善するために、循環時間を延長するために、および免疫原性の問題を変更させるために、リポソームのような送達媒体が探索されている(Balasubramanian et al., Pharmaceutical Research 17:343〜349(2000)(非特許文献4))。リポソームをタンパク質に加えた場合、リポソームはタンパク質の凝集量を低減させるために役立つことから、タンパク質の安定性が改善されることは公知である。しかし、リポソームは典型的に、総タンパク質のごく小さい割合と複合体を形成するに過ぎない。したがって、そのような送達媒体の薬学的開発は、タンパク質との不良な会合のために妨害される。
【０００５】
このように、加工および貯蔵条件での不安定性が改善され；生物学的利用率を増加させることによって投与間隔が増加して、したがって費用および患者の不快感が低減され；取り扱いが容易で；かつ血管損傷部位への送達が改善された、適したタンパク質およびペプチドに基づく薬剤が必要である。本発明は、タンパク質と分散系に基づく送達媒体とのあいだの複合体を作出するための方法論を提供することによって、当技術分野におけるこれらおよび他の欠陥を克服することに向けられる。
【０００６】
【非特許文献１】Ahern et al., 「Pharmaceutical Biotechnology」, Borchardt, Ed., pp550, Plenum Press, New York(1992)
【非特許文献２】Balasubramanian et al., Pharmaceutical Research 17:343〜349(2000)
【非特許文献３】Ahern et al., 「Pharmaceutical Biotechnology」, Borchardt, Ed., pp550, Plenum Press, New York(1992)
【非特許文献４】Balasubramanian et al., Pharmaceutical Research 17:343〜349(2000)
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明の一つの局面は、分散媒質においてタンパク質の複合体を形成する方法に関する。この方法は、タンパク質を提供する段階、およびその中の疎水性ドメインを露出するようにタンパク質のコンフォメーション状態を変更させる段階を含む。安定剤は露出した疎水性ドメインに結合する。変更は、タンパク質の少なくとも一部が安定剤と会合するように、少なくとも部分的に逆転される。
【０００８】
本発明のもう一つの局面は、タンパク質を提供する段階、その中の疎水性ドメインを露出するようにタンパク質のコンフォメーション状態を変更させる段階、露出した疎水性ドメインに安定剤を結合させる段階、およびタンパク質の少なくとも一部を安定剤と会合させるように、変更を少なくとも部分的に逆転させる段階によって産生された会合タンパク質に関する。
【０００９】
本発明のさらなる局面は、約1％未満から約90％より多くのタンパク質が安定剤と会合している、薬学的に有効な安定化タンパク質用量に関する。
【００１０】
本発明のさらにもう一つの局面は、分散媒質においてAHFタンパク質を会合させる方法に関する。この方法は、AHFタンパク質を提供する段階、およびその中の疎水性ドメインを露出するようにAHFタンパク質のコンフォメーション状態を変更させる段階を含む。安定剤は、露出した疎水性ドメインに結合する。変更は、タンパク質の少なくとも一部が安定剤と会合するように少なくとも部分的に逆転される。
【００１１】
なお、本発明のもう一つの局面は、AHFタンパク質を提供する段階、およびその中の疎水性ドメインを露出ようにAHFタンパク質のコンフォメーション状態を変更させる段階によって産生された分散系会合AHFタンパク質に関する。安定剤は、露出した疎水性ドメインに結合する。変更は、タンパク質の少なくとも一部が安定剤と会合するように少なくとも部分的に逆転される。
【００１２】
本発明のさらにさらなる局面は、約0.5％より多い、好ましくは約3％より多い、およびより好ましくは約25％より多いAHFが安定剤と会合している、薬学的に有効な安定化AHF用量に関する。
【００１３】
本発明のもう一つの局面は、分散媒質においてタンパク質の複合体を形成する方法に関する。本発明の方法は、タンパク質を提供する段階、および濃度約10〜50％のタンパク質をエタノールを含む混合物に接触させることによって、その疎水性ドメインを露出するようにコンフォメーション状態を変更させる段階を含む。安定剤は、露出した疎水性ドメインに結合する。変更は、タンパク質の少なくとも一部が安定剤に会合するように少なくとも部分的に逆転される。
【００１４】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲を参照することによって明らかとなるであろう。
【００１５】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、誘発負荷にとって適した構造を形成するために、タンパク質のコンフォメーションを変化させるために(すなわち、タンパク質と、リポソームのような分散系との疎水性相互作用を操作するために)、濃度約10〜50％のエタノールのような溶媒の使用を利用する。これらの構造は、モルテングロビュールのような通常の中間構造とは明白に異なる。通常の中間構造は三次構造特色を欠損するが、実質的な二次構造特色をとる。対照的に、本発明において利用されるエタノール媒介構造は、実質的な三次および二次構造特色を有する。
【００１６】
本発明の一つの局面は、分散媒質においてタンパク質の複合体を形成する方法に関する。方法は、タンパク質を提供する段階、およびその中の疎水性ドメインを露出するようにタンパク質のコンフォメーション状態を変更させる段階を含む。安定剤は露出した疎水性ドメインに結合する。変更は、タンパク質の少なくとも一部を安定剤と会合させるために少なくとも部分的に逆転される。
【００１７】
本発明のもう一つの局面は、タンパク質を提供する段階、その中の疎水性ドメインを露出するようにタンパク質のコンフォメーション状態を変更させる段階、露出した疎水性ドメインに安定剤を結合させる段階、およびタンパク質の少なくとも一部を安定剤に会合させるために、変更を少なくとも部分的に逆転させる段階によって産生された会合タンパク質に関する。
【００１８】
本発明のさらなる局面は、約1％未満から約90％より多いタンパク質が安定剤に会合する、薬学的に有効な安定化タンパク質用量に関する。
【００１９】
本発明のもう一つの局面は、分散媒質においてタンパク質の複合体を形成する方法に関する。この方法は、タンパク質を提供する段階、およびタンパク質を濃度約10〜50％のエタノールを含む混合物に接触させることによって、その中の疎水性ドメインを露出するようにタンパク質のコンフォメーション状態を変更させる段階を含む。安定剤は、露出した疎水性ドメインに結合する。変更は、タンパク質の少なくとも一部が安定剤に会合するように少なくとも部分的に逆転される。
【００２０】
一般的に、本発明は、タンパク質と分散系との複合体を操作する方法およびそれによって調製された複合体形成タンパク質に関する。分散系は、疎水性の内部と親水性の外部とを有する任意の系であると見なされる。タンパク質のコンフォメーション状態の変更の際の望ましい段階で、安定剤または賦形剤を加える。例えば、これは、制御されたタンパク質アンフォールディング条件で、部分的にフォールディングされたタンパク質に加えられる。本発明の方法における部分的にフォールディングされたタンパク質の構造は、モルテングロビュールのような通常の中間構造とは異なる。通常の中間構造が三次構造特色を欠損するが実質的な二次構造を有するのに対し、本発明において利用される構造は、実質的な二次および三次構造をとる。例えば、40℃で20％エタノールの存在下でのタンパク質の近および遠UV CD(図5B)は、実質的な三次構造特色を示す。さらに、これらの溶液条件において、疎水性ドメインの露出は、熱ストレス単独の場合より高い(図2)。これは、疎水性基周辺の溶媒分子のクラスタ形成を促進するタンパク質とエタノールとの相互作用による可能性がある。そのような相互作用によって、遷移温度(TM)の低下が起こることが示されている(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Remmele et al., Biopharm. 2000, 36〜46)。より高いアルコール濃度では、ヘリックス構造が形成された(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Bhakuni, Archives of Biochemistry and Biophysics 357:274〜284(1998))。より低いアルコール濃度によって調製されたタンパク質は、表面に対する吸着を防止するために非経口投与剤形にとって好ましく、タンパク質の容易な取り扱いを提供する。その上、約50％未満のアルコール濃度によって調製されたタンパク質は、ヒトでの使用に関してより安全であり、構造がより未変性様であることから活性の増加した可能性を有する。
【００２１】
通常の中間体の膜との相互作用は記述されている(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Yoshimoto et al., Biotechnol. Prog. 15:480〜487(1999)；Banuelos et al., Journal of Biological Chemistry 270:29910〜29915(1995))。しかし、露出した疎水性ドメインによって封入を媒介するために本発明の経路外構造を用いることは記述されていない。
【００２２】
本発明に従って、タンパク質のコンフォメーション状態は疎水性ドメインを露出するように変更される。タンパク質の疎水性ドメインは、安定剤がタンパク質と会合する能力を増強するために露出される。会合には、封入が含まれる。アルコール、好ましくはエタノールの存在下でのアンフォールディングは、タンパク質のコンフォメーション状態を変更させるための好ましい方法である。そのような複合体形成は、タンパク質の会合効率を増加させるための努力において、疎水性相互作用および分散系におけるタンパク質の転移を増強するように操作される。活性は、二次、三次、四次コンフォメーション、および／またはその中間コンフォメーション構造のような、タンパク質の高次構造の保存によって保持される。このようにして、変性、凝集、および沈殿のような物理化学的不安定性の問題は、タンパク質薬剤の産生、製剤、および貯蔵の改善に至ることによって克服されうる。
【００２３】
本発明において、タンパク質構造のコンフォメーションの変化には、未変性様の二次構造(エタノールの存在下において)、二次タンパク質構造、中間または二次-三次ハイブリッドタンパク質構造変化、三次タンパク質構造変化、および／または四次タンパク質構造変化等が含まれてもよい。
【００２４】
実験的に、タンパク質の二次、三次、および／または四次構造(すなわち、二次-三次ハイブリッドタンパク質構造等のような中間タンパク質構造コンフォメーションが実験的に含まれる)は、アンフォールディングを含むコンフォメーション変更条件下においてモニターされる。例えば、疎水性ドメインの露出は、露出された疎水性ドメインに対する特異的蛍光プローブの結合によって確認される。このようにして、そのような実験を用いて、露出された疎水性ドメインを有するタンパク質の特異的コンフォメーション状態を同定する。望ましい疎水性ドメインが露出されると、安定剤が添加される。
【００２５】
一般的に、露出された疎水性ドメインを有する特異的コンフォメーション状態は、熱(すなわち、公知のタンパク質の至適温度を超える温度)、低温(すなわち、公知のタンパク質の至適温度より低い)、有機および無機溶媒、共溶媒混合物、および様々なpH条件下での共溶質にタンパク質を供することによって生成されてもよい。
【００２６】
好ましい態様において、本発明の方法は、タンパク質の温度が40℃〜74℃である条件下で行われる。
【００２７】
本発明に従って、薬物の安定性を改善すること、および循環時間を延長することによって、より短い半減期および薬物の長期使用後の免疫反応に典型的に関連する問題を克服する、タンパク質と分散系に基づく送達媒体との複合体を作出するための方法論が紹介される。具体的には、本発明は、タンパク質の不良な会合に一般的に帰因する、送達媒体としてリポソームを用いることに派生する薬学的に関連した問題を解決する。
【００２８】
本発明の方法論に従って、そのようなタンパク質を、その疎水性ドメインを露出して、タンパク質の少なくとも一部と安定剤とを会合させるように、タンパク質のコンフォメーションを変化させる条件に供した。本発明の製剤戦略は、エタノールのようなアルコールによって誘導されるコンフォメーションの変化、および／またはタンパク質の中間構造の特性を利用する。第一段階は、タンパク質の制御されたアンフォールディングのような、コンフォメーション状態の変更を用いて、「構造的」中間状態を形成することである。条件は、注意深く制御され、賦形剤との相互作用を可能にするドメインの露出を可能にする。
【００２９】
本発明は、タンパク質の選択によって制限されない。天然および非天然アミノ酸からなるバイオポリマー、ならびに多ドメインタンパク質が含まれるがそれらに限定されるわけではない任意のタンパク質が適用可能であろう。
【００３０】
同様に、本発明は、タンパク質濃度の選択によって制限されず、任意のタンパク質濃度が適用可能であろう。本発明の方法において用いるために適したタンパク質濃度には、濃度約14μM〜約47.5μMが含まれる。
【００３１】
特に、分散系における複合体形成のための溶媒の使用を調べるために、本発明の方法に適用可能なタンパク質の例としてリゾチームを用いた。
【００３２】
リゾチームは、以下の理由に関して代表的なタンパク質として選択された。リゾチームは、親水性のタンパク質であり、中性リポソームにおけるその自然発生的封入は限定的である。重要なことに、水性系におけるタンパク質の熱ストレスは中間構造を生成しないが、エタノール-水混合物ではそのような構造が観察される。
【００３３】
リゾチームは、AIDSの治療物質として研究中の溶菌タンパク質である(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Tavio et al., Eur. J. Cancer 34:1634〜1637(1998)；Lunardi-Iskandar et al., Nat. Med. 4:428〜434(1998)；Witzke et al., Eur. J. Med. Res. 2:155〜158(1997))。第一トリメスターにおける母親から胎児へのI型HIVの伝幡は、hcgβサブユニットおよびhcg bコア調製物に存在するリゾチームによって防止される(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Lunardi-Iskandar et al., Nat. Med. 4:428〜434(1998)；Lee-Huang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2678〜2681(1999))ことが示されている。最近、Lee-Huangら(その全内容物が、参照により本明細書に組み入れられるProc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2678〜2681(1999))は、ヒト乳汁および鶏卵卵白のような他の起源から得たリゾチームが同様に、HIV-1に対して活性を有することを示した。リゾチームの構造-安定性関係を調べるために、詳細な構造情報が利用可能である。
【００３４】
本発明の目的に関して、リポソームは、脂質から合成された疎水性内部と親水性外部とを有するマイクロカプセルであると定義される。本発明において用いるために適した安定剤にはそのようなリポソームが含まれる。他の適した分散系には、ミセル、界面活性剤等が含まれる。
【００３５】
リポソームの組成物は、未変性状態との会合を増強し、したがって変性を防止するように改変することができる。リポソームはまた、リフォールディングを認識可能に変更させることなく中間状態と相互作用して、それによって中間状態の安定化を通して有益な効果を発揮するか、または凝集のような他の物理的不安定性に至るコンフォメーションへの進行を阻害する可能性がある。または、リポソームは、シャペロンとして作用して、未変性構造により厳密に類似する状態へのタンパク質のリフォールディングを補助する可能性がある。最後に、リポソームは、安定化されて活性であるが、リポソームの非存在下で存在すると考えられるフォールディング中間体とは異なる独自の中間構造へのタンパク質のリフォールディングを誘導する可能性がある。
【００３６】
本発明は、約1％未満から90％より多いリゾチームタンパク質、好ましくは約1％より多い、より好ましくは約3％より多い、より好ましくは約3％から約90％、および最も好ましくは約80％〜約90％のタンパク質のリポソーム会合を可能にする。封入を含む％会合は、タンパク質の大きさに一部関連し、所定のタンパク質に関する特異的％会合は、異なる大きさのタンパク質に従って変化するであろうと理解される。
【００３７】
本発明は、その疎水性ドメインを露出するようにタンパク質の構造またはコンフォメーション状態を変化させるために適した任意の方法に適用可能であるが、アンフォールディングが好ましい。複合体形成の撹乱因子(perturbant)として溶媒を用いることが例として選択されているが、本発明はこの方法のみに限定されない。例えば、熱と併用して溶媒を用いることは、典型的にタンパク質のコンフォメーション状態の変化を促進するであろう。
【００３８】
アンフォールディングのように、その疎水性ドメインを露出するようにタンパク質のコンフォメーション状態を変化させることは、化学的および／または物理的撹乱因子の双方によって可能である。
【００３９】
一般的に、物理的撹乱因子には、熱の変化および／または圧の変化が含まれるがそれらに限定されるわけではない。例えば、熱の変化には、特異的温度範囲が含まれる。本発明の方法に関して、好ましい温度範囲は約25℃〜約95℃である。
【００４０】
化学的撹乱因子には、化学溶媒(すなわち有機または無機溶媒)、共溶媒混合物、共溶質等が含まれるがそれらに限定されるわけではない。化学溶媒には、非水性液体(例えば、エタノール)のような有機溶媒、無機溶媒等が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００４１】
共溶媒には、異なる比率での溶媒と水との混合物(例えば、エタノールと水の混合物)および緩衝液(すなわち、酸性または塩基性pHを有する緩衝液のような)が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００４２】
本発明に従って、本発明において用いられるエタノール溶媒には、変性エタノール、190プルーフ試薬等級エタノール、変性試薬等級、および／または200プルーフ試薬等級エタノールが含まれるがそれらに限定されるわけではない、任意の市販の等級のエタノールが含まれる。
【００４３】
その上、異なるエタノール-水混合物には、エタノール-水溶液、および／またはエタノール-リン酸緩衝生理食塩溶液(エタノール-PBS)が含まれるがそれらに限定されるわけではない。そのようなエタノール-水混合物におけるエタノール含有量は、約3％エタノール〜約80％エタノールの範囲で存在し、好ましい範囲は約20％エタノール〜約80％水、より好ましくは約20％エタノール〜約40％エタノールの範囲である。
【００４４】
本発明において用いるために適した緩衝溶液には、リン酸緩衝溶液、生理食塩液、トリス-HCl、水等が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００４５】
共溶質には、本発明のタンパク質と共に存在する溶液中の他の化学成分および／または分子が含まれ、これには有機化合物(例えば、尿素または通常の界面活性剤)、上記の有機／無機化合物に対応する無機化合物および／または塩(例えば、Na+のようなイオン、塩酸グアニジン等)が含まれるがそれらに限定されるわけではない。いくつかの有機溶媒がタンパク質と適合性であり、これには、メタノール、エタノール、グリセロール、エチレングリコール等のようなアルコールが含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００４６】
本発明に従って、異なるタイプの化学的および／または物理的撹乱因子に基づいて異なる実験条件を用いることは、実験において観察された異なるタンパク質コンフォメーション状態および／または特徴に有意に影響を及ぼすことが決定された。
【００４７】
特に、先に定義したような異なる化学的撹乱因子、安定剤、賦形剤、溶液等とのタンパク質複合体形成は、市販されている化学もしくは試薬等級溶媒(すなわち、エタノールまたは他の化学的溶液)、ならびに／または異なるpHもしくはpH範囲内、およびそこに示された異なるタンパク質濃度の異なる緩衝液を用いることによって得られる異なる実験条件下で起こることが決定された。
【００４８】
本発明の方法に関して、適したpHは、pH 7.4のような約6〜約8のような特異的値を有してもよい。本発明の方法はまた、約6〜約8の適したpH範囲内で行ってもよい。
【００４９】
リゾチームを、中間構造を生成するためにエタノール-水混合物において熱ストレスに供した。水中で、三次および二次構造変化に関して得られた融解曲線は重なり合う(Tm 74℃)(図1Aおよび図1B)。これらのデータは、水中で中間体が存在しないが、エタノール-水中でのリゾチームの熱ストレスによって、二次-三次ハイブリッドまたは中間構造が生成されたことを示している。そのような結論は、二次および三次構造によって測定したTmが重なり合わない融解プロフィールに基づいて引き出された(図1Aおよび図1B)。
【００５０】
タンパク質のアンフォールディングに及ぼすエタノールの効果を調べるために、エタノール-水混合物においてリゾチームの熱変性試験を行った。5％もの低いエタノールを加えると、二次構造の変化によって測定したTm(s)は2℃減少した(図1Aおよび図4A)。しかし、三次構造をモニターすることによって測定したTm(t)は、エタノール濃度が増加すると減少する(図1Bおよび図4B)。0％〜10％のような低いエタノール濃度では、二次および三次構造によって測定した融解プロフィールの中点は重なり合う；Tm(s)およびTm(t)は等しかったが、エタノール濃度が増加すると、Tm(s)とTm(t)との差は、増加した(図1A〜Bおよび図4A〜B)。例えば、20％エタノールの存在下では、Tm(s)は72.5℃であることが見いだされたのに対し、Tm(t)は68℃である(図1A〜Bおよび図4A〜B)。
【００５１】
さらに、70℃で20％エタノールの存在下において、リゾチームはその三次構造特徴の全てを失ったが、実質的な残留二次構造特色を有する。70℃では、リゾチームは中間状態の特性を示す(図4Aおよび図4B、異なる実験条件、すなわち異なる試薬等級のエタノール、既定のpH条件、および異なるリゾチーム材料バッチに基づいてそのような結果を説明するデータの結果を示す)。
【００５２】
約68℃〜約72.5℃の温度範囲において、タンパク質は中間状態の特性を示す。この中間構造は、複合体形成にとって適した疎水性ドメインを露出する。疎水性ドメインの露出は、エタノールを加えることによっても得ることができる。例えば、温度範囲30℃〜50℃において、エタノールは未変性様のCDプロフィールによって示されるようにタンパク質のコンフォメーションを変更させないが、疎水性ドメインの露出を促進する。観察されたエタノール誘導コンフォメーション変化または中間構造の生成は、溶媒とタンパク質との相互作用による可能性がある。Timasheff and Inoue(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Biochemistry 7:2501〜2513(1968))は、バイナリ(タンパク質-水系)に第三の成分を加えることが、タンパク質の未変性のおよび変更された構造を安定化する力に対して重要な効果を有することを示唆した。タンパク質がアンフォールディングすると、非極性残基は溶媒系と接触するようになる。このプロセスにおいて、添加剤として用いられる有機化合物は、これらの残基の周囲でクラスタを形成する傾向がある。このように、エタノールの存在下において、少数の疎水性残基の露出は熱力学的に好ましい可能性がある。
【００５３】
エタノールによって誘導された観察された経路外のアンフォールディングプロフィールは、タンパク質との相互作用による可能性がある(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Bhakuni, Archives of Biochemistry and Biophysics, 357:274〜284(1998))。アルコールとタンパク質との相互作用は広く調べられている。Timasheff and Inoue(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Biochemistry 7:2501〜2513(1968))は、バイナリ(タンパク質-水)系に第三の成分を加えることが、タンパク質の未変性のおよび変更された構造を安定化する力に対して重要な効果を有することを示唆した。タンパク質がアンフォールディングすると、非極性残基は溶媒系と接触するようになる。このプロセスにおいて、添加剤として用いる有機化合物は、これらの残基の周囲でクラスタを形成する傾向がある。このように、エタノールの存在下において、少数の疎水性残基の露出は熱力学的に許容され、これらの接触は親水性環境では好ましくない可能性がある。
【００５４】
さらに、溶媒に基づく賦形剤は、治療タンパク質の単離、出荷、貯蔵、および投与の際により容易な薬学的加工および取り扱い条件を提供する可能性がある。エタノールを別として、グリセロールのような他の溶媒は、リゾチームの安定性に対して適合性であることが示されている(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Rariy et al., Biotechnol. Bioeng. 62:704〜710(1999)；Rariy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:13520〜13523(1997)；Knubovets et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1262〜1267(1999))。さらに、プロピレングリコールのような他の薬学的に許容される溶媒は、皮下投与に関してそれらが十分に認容されることから、タンパク質薬剤を開発するために適した候補物質である可能性がある。これは、ほとんどのタンパク質が皮下投与されるためである。
【００５５】
抗血友病(「AHF」)タンパク質はまた、分散系における複合体形成のための溶媒の使用を調べるために本発明の方法に適用可能なタンパク質の例として用いられた。
【００５６】
バイオテクノロジーおよびタンパク質工学の最近の進歩は、AHFをコードする遺伝子のクローニング(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Toole et al., Nature 312:342〜7(1984)；Wood et al., Nature 312:330〜7(1984))と共に、組換え型ヒトAHF(「rhAHF」)の製造を実現可能とした。組換え型調製物は、血液媒介性のウイルスの伝幡という合併症を伴わない無限の供給源であることを約束する。しかし、市販のタンパク質薬剤は、治療活性の喪失を伴う上記の物理的不安定性の問題を被ることが報告されており、したがって新しい製剤戦略を必要とする。これには、その複合体構造および動力学的フォールディング特色の理解を必要とする。構造的に、AHFは、ドメインA1およびA2を含む重鎖、ならびにドメインA3、C1およびC2を含む軽鎖に分けることができる。重鎖および軽鎖は、第三の異なるBドメインによって空間を隔てて接続される(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Fay, Thromb. Haemost. 70:63〜7(1993)；Foster et al., Blood Rev 3:180〜91(1989))。しかし、この大規模多ドメインタンパク質のフォールディング挙動に関連する重要な特色は、当技術分野において不明であり、安定な製剤の開発に向けての有効なアプローチの肝要な一部となる可能性がある。
【００５７】
組換え型ヒト第VIII因子(AHF)は、古典的な血友病Aを有する患者の処置において用いられる多ドメインタンパク質である。その複雑な構造およびフォールディング特徴のために、現在の臨床製剤はいくつかの短所を有する：(1)製剤は物理的不安定性、タンパク質の変性を示し、活性の同時喪失に関連する凝集を促進する；(2)製剤は循環中での半減期が短く、薬物の頻回投与を必要とする；および(3)製剤は免疫反応を誘発し、より高用量の頻回投与を必要とする。これによって、費用がより高くなるのみならず、患者の不快感も大きくなる。
【００５８】
上記の問題を克服するために、本発明は、抗血友病タンパク質が、リポソームによる封入を含む複合体会合を通してリポソームのような分散系に会合する方法を提供する。
【００５９】
このように、本発明のもう一つの局面は、分散媒質においてAHFタンパク質を会合させるための方法に関する。この方法は、AHFタンパク質を提供する段階、その中の疎水性ドメインを露出するようにAHFタンパク質のコンフォメーション状態を変更させる段階を含む。安定剤は露出した疎水性ドメインに結合する。変更は、タンパク質の少なくとも一部が安定剤と会合させるように少なくとも部分的に逆転される。
【００６０】
本発明のさらなる局面は、約0.5％より多い、好ましくは約3％より多い、およびより好ましくは約25％より多いAHFが安定剤と会合している、薬学的に有効な安定化AHF用量に関する。
【００６１】
AHFは多ドメインタンパク質であることから、いくつかの中間体が可能であり、特異的中間体の会合は他の中間体に対して都合がよい可能性がある。これは、タンパク質のリフォールディングのようないくつかの局面に影響を及ぼす可能性があるタンパク質の特異的領域の会合による可能性が最も高く、C2ドメインの会合によってより低い免疫反応を提供する。効果を増強するため、およびより低い温度での露出を得るために撹乱因子、溶媒および熱の併用を用いることも同様に、疎水性ドメイン相互作用によるAHF複合体の安定化と共に、本発明によって提供される。
【００６２】
変性のプロセスは、分子レベルでのアンフォールディングのような、血友病Aの処置において用いられるタンパク質抗血友病因子(AHF／第VIII因子)のコンフォメーション状態の変更に関連することから、タンパク質がアンフォールディングする際のコンフォメーションの変化を分析して、プロセスにおける重要な段階で新規方法を適用した。本発明に従って、中間構造の存在および凝集におけるその役割を調べるために、特異的実験アプローチによって、コンフォメーションの変化、例えばrhAHFのフォールディング／アンフォールディング特性を詳細に理解するために生物物理学的試験を行った。
【００６３】
AHF製剤の賦形剤としてリポソームを用いることに関する関心は三つの部分からなる。(1)リポソームはこれまで、凝集に対してタンパク質を安定化させて、分子シャペロンとして作用して、タンパク質-フォールディング経路を変更させることが示されている(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Yoshimoto et al., Biotechnol. Prog. 15:480〜7(1999)；Balasubramanian et al., Pharm. Res. 17:344〜50(2000))。(2)表面修飾リポソームは、タンパク質剤の循環時間を変更させ、それらをバイオテクノロジー由来産物にとって魅力的な送達媒体とすることが示されている(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Kanaoka et al., Int. J. Pharm. 188:165〜72(1999)；Woodle, Chem Phys Lipids 64:249〜62(1993))。AHFは、インビボでPS含有リン脂質に強く結合することが報告されている(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Gilbert et al., J. Biol. Chem. 267:15861〜8(1992)；Gilbert et al., Biochemistry 32;9577〜9585(1993))。本発明において、タンパク質-フォールディング経路の変更を発生させるために、タンパク質とPS含有リポソームとの相互作用が調べられ、そのような変更が本発明の送達媒体の開発に利用された。(3)リポソームを用いて、脂質結合による免疫反応および抗原性を低減するために、C2のようなエピトープ領域を遮蔽した。
【００６４】
本発明に従って、リポソームを、物理的不安定性に対してAHFタンパク質を安定化させるための賦形剤として用いた。円偏光二色性(「CD」)および蛍光分光法を用いて、リポソームの存在下および非存在下におけるタンパク質の温度依存的フォールディング／アンフォールディングの特徴を調べた。疎水性ドメインに分配する蛍光プローブであるANS(1,8-アニリニナフタレンスルホネート)を用いて、AHF疎水性ドメインの露出を検出した。タンパク質のアンフォールディングは、ANS蛍光によって観察されたように疎水性ドメインの露出に関連した。10％エタノールの存在下で、疎水性ドメインの露出は、未変性状態により近い構造を伴って可能であった。平衡リフォールディング試験を通して、リポソームの存在下における熱変性タンパク質は、異なるフォールディング経路に従い、リポソームとAHFタンパク質との相互作用に帰因し得、おそらく複合体の形成がもたらされることが見いだされた。本観察の副産物は、第VIII因子の安定性を改善するのみならず、インビボでのその循環時間を延長するために、このタンパク質-リポソーム複合体を送達媒体として利用することができるという点である。
【００６５】
本発明において、安定性を提供するため、タンパク質の循環時間を改善するため、かつ免疫反応を低減するためにリポソーム含有AHF製剤が開発され、このように、現在の臨床製剤に関連した問題を克服している。
【００６６】
このように、本発明の重要な局面は、脂質-AHFタンパク質複合体に基づく送達媒体である。任意で、この脂質-タンパク質会合は、送達媒体に対してステルス特性を提供するために、ポリエチレングリコール(PEG)のような分子によってコーティングすることができる。
【００６７】
本発明は、約3％より多いタンパク質、好ましくは約25％(±約3％)より多いAHFタンパク質の封入を可能にする。本発明は、約0.5％より多い、好ましくは約3％より多い、より好ましくは約25％より多い、および最も好ましくは約75％より多いAHFタンパク質と安定剤との会合を可能にする。
【００６８】
実施例
本発明は、以下の特異的実施例によってさらにより詳細に説明されるであろう。これらの実施例は、説明するために提供されるのであって、本開示または以下の特許請求の範囲を制限することを意味しないことが理解される。
【００６９】
以下には、本発明の実施例において用いられる実験手順が含まれる。
【００７０】
実施例1-実験材料
ニワトリ卵白リゾチームをSigma(St. Louis, MO)から、結晶化して透析した凍結乾燥粉末(バッチ番号：57M7045)として購入した。分光学等級の溶媒をPharmaco, Inc.(Brookfield, CT)から購入して、さらに精製せずに用いた。疎水性ドメインのプローブであるANS(1-アニリノ-8-ナフタレンスルホネート)(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Purohit et al., Biochemistry 36:12355〜123633(1998)；Balasubramanian et al., Molec. Pharmacol. 53:926〜932(1998)；Aloj et al., Arch. Biochem. Biophys. 155:478〜479(1973))を、Molecular Probes Inc.(Eugene, OR)から購入した。以下の実施例のエタノール-水混合物を、米国薬局方に記述されているように、エタノールおよび水の適当量を混合することによって調製した。
【００７１】
実施例2-リポソームの調製およびタンパク質封入
10 μmol/ml DMPC(ジミリストイルホスファチジルコリン)をクロロホルムに溶解して、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を蒸発させて、丸底フラスコに薄膜を形成させた。タンパク質を封入するMLV(「多重膜小胞」)は、脂質の膜を、2 mg/mlリゾチームを含む20％エタノール-水混合物において、穏やかに撹拌しながら30℃、40℃、および70℃で分散させることによって形成した。窒素を用いて溶媒を除去して蒸留水に置換した。この技法を用いて、タンパク質をその未変性様構造または中間構造で封入した；しかし未変性状態の封入のために、脂質膜およびタンパク質を30℃の水に分散させた。
【００７２】
タンパク質の封入は、以下の溶液を用いて上記の技法に従って行った：
溶液A- 水800μl中にエタノール200μl=約20％エタノール
溶液B- 水700μl中にエタノール300μl=約30％エタノール
溶液C- 水500μl中にエタノール500μl=約50％エタノール
溶液D- 水400μl中にエタノール600μl=約60％エタノール
溶液E- 水300μl中にエタノール700μl=約70％エタノール
【００７３】
実施例3-円偏光二色性実験
d10カンフルスルホン酸によって較正したJASCO J715分光偏光計においてCDスペクトルを得た。Peltier 300 RTSユニットを用いて温度スキャンを得て、製造者によって提供されたソフトウェアを用いて融解プロフィールを作製した。スペクトルは、加熱速度60℃/時間および120℃/時間で得た；本明細書において示したデータは、60℃/時間についてのデータである。全ての試料に関して、10 mmキュベットを用いてデータを得た。二次構造分析に関して試料を260 nm〜200 nmの範囲でスキャンし、用いたタンパク質濃度は20 g/mlであった。近UV CD試験に関して、360 nm〜270 nmの範囲でスペクトルを得、用いたタンパク質濃度は0.66 mg/mlであった。タンパク質のCDスペクトルは、溶媒単独のスペクトルを差し引くことによって補正して、シグナルの質を改善するために、多重スキャンを得て平均した。
【００７４】
リフォールディング実験は、70％または30％(v/v)エタノール-水試料を水によって10倍希釈して、それぞれ7％または3％溶媒を生じることによって行った。路長をそれに従って増加させることによって、スペクトルを希釈の効果に関して正規化した。例えば、70％エタノール-水溶液に関して、用いた路長は1 mmであったが、7％溶液の場合は、希釈を補うためにキュベットの路長を10 mmに増加した。さらに、希釈効果の関与を以下のように分析した：(1)平均残基楕円率を計算して、タンパク質の濃度および用いた石英キュベットの路長に関して正規化した；(2)形状は希釈によって変化しないことから、スペクトルの形状も同様に分析した。
【００７５】
実施例4-蛍光試験
蛍光スペクトルを、SLM 8000C分光蛍光計(Urbana, IL)において得た。発光スペクトルは、励起および発光路においてスリット幅4 nmを用いて、400 nm〜550 nmの範囲で得た。励起モノクロメーターを380 nmに設定して、発光を482 nmでモニターした。内部フィルター効果の補正は、適当な技法によって行った(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Lakowicz, 「Principles of Fluorescence Spectroscopy」, Plenum Press, New York, (1986))。試料を水浴(Neslab RTE 110, NESLAB Instruments. Inc., Newington, NH)を用いて所望の温度で維持した。内部標準を用いることによってスペクトルを補正して、製造者によって提供されたソフトウェアを用いてさらに処理した。
【００７６】
実施例5-平衡フォールディング分析
平衡アンフォールディングデータを分析するために、二状態アンフォールディングモデルを適用した。それぞれのアンフォールディング曲線を、以下の関係を用いてアンフォールディング型(Fapp)の見かけの分画に対して正規化した：
Fapp=(Yobs-Ynat)/(Yunf-Ynat)
式中、Yobsは、所定の温度での楕円率(220 nmまたは290 nmでの)であり、YunfおよびYnatはそれぞれ、アンフォールディングした構造および未変性構造のスペクトル値である。YunfおよびYnatはそれぞれ、高温および低温でのスペクトルプラトー領域の直線回帰分析を行うことによって得られる。
【００７７】
実施例6-ANS結合試験
ANS(1-アニリノ-8-ナフタレンスルホネート)を2％エタノールを含み1 mg/mlで溶解して、少量を10 Mリゾチーム水溶液に加えて、最終プローブ濃度0.3 Mを得た。蛍光測定に及ぼすエタノールの一般的溶媒効果を補うために、プローブの初回蛍光強度を正規化した。
【００７８】
実施例7-生物活性アッセイ
先に記述したようにタンパク質の触媒活性を測定することによって、リゾチームの活性を決定した(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Rariy et al., Biotechnol. Bioeng. 62:704〜710(1986)；Rariy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:13520〜13523(1997))。リフォールディングしたタンパク質を、0.16 mg/mlのミクロコッカス・リソデイクティカス(M. lysodeikticus)の予め濾過した細胞懸濁液を含むアッセイ混合物に20倍希釈して、450 nmでの吸光度の変化をタンパク質の溶菌活性に関してモニターした。0％〜100％までのエタノール濃度に関して対照実験を行い、得られたデータは、エタノールの存在が活性の測定に関与しないことを示した。
【００７９】
実施例8-リポソーム結合タンパク質からの遊離のタンパク質の分離
リポソーム結合タンパク質を、デキストラン遠心分離勾配によって遊離のタンパク質から分離した。リポソーム結合タンパク質0.5 mlを、20％w/vデキストラン1 mlと混合して、10％w/vデキストラン3 mlをこの溶液の上に載せた。次に、水0.5 mlをこの溶液の上部に載せた。Beckman SW 50.1ローターを用いて、45 K RPMで勾配を35分間遠心分離した。
【００８０】
実施例9-リポソームタンパク質の分子位相学
バルク水性区画に曝露したタンパク質の表面を、アクリルアミド消光およびトリプシン消化を用いて調べた。タンパク質表面の衝突消光剤への到達度を決定するために、アクリルアミドによる蛍光の消光を行い、これはリポソームにおけるタンパク質の局在に関する情報を提供するであろう。
【００８１】
実施例10-熱変性試験
熱ストレスは、アンフォールディングしたタンパク質に対する変性剤として(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Morozova et al., Biophys. Chem., 41:185〜191(1991))、および中間構造の形成を調べるために非常にしばしば用いられる。リゾチームの水中でのアンフォールディングは、中間体を形成せずに二状態モデルに従うことから(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Ikeguchi et al., Biochemistry 25:6965〜6972(1986))、中間体構造を生成するために、エタノールを熱ストレスと併用して用いた。
【００８２】
実施例11-二次構造およびアンフォールディング
様々なエタノール-水混合物において異なる温度でリゾチームに関して遠UV CDスペクトルを得て、220 nmでの楕円率値を用いて融解曲線を作製した(図1A)。水において、リゾチームは、Tm 74℃で熱によるアンフォールディングを受ける。エタノール(5％〜60％v/v)を加えると、Tmは72.5℃に低減した。アンフォールディングの協調性に及ぼすエタノールの効果を決定するために、エタノールの存在下および非存在下でリゾチームに関して得られた融解曲線に関して重ね合わせ試験を適用した(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Luo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:11283〜11287(1999))。水において、アンフォールディング遷移曲線は、エタノール-水混合物において観察された場合と比較してより広く、水中でのリゾチームに関してより弱い協調的遷移を示唆した。40℃では、エタノールの存在下で、タンパク質はその未変性様の二次構造特色のいくつかを保持した。
【００８３】
実施例12-三次構造およびアンフォールディング
様々なエタノール-水混合物におけるリゾチームの融解を近UV CDスペクトルによって調べて、290 nmでの楕円率を温度の関数としてプロットすることによって融解曲線を作製した(図1B)。エタノール濃度が増加するとTmは減少した。水において、三次構造の変化に関して得られた融解曲線は、二次構造に関して観察された曲線と重なり合い、Tmは74℃付近である。この観察は、既に報告された結果と一致して(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Knubovets et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1262〜1267(1999))、中間体が水におけるリゾチームのアンフォールディングの際に形成されないことを示唆している。さらに、二次構造変化とは異なり、水中での三次構造のアンフォールディングは、エタノール-水混合物において観察された場合と同様に、より協調的であった。しかし、エタノール-水混合物においてリゾチームに関して測定された二次および三次構造のフォールディング特徴が重なり合わなかったことは興味深い(図1Aおよび図1B)。例えば、より低いエタノール濃度(20％v/v)では、近UV CDスペクトルの遷移の中点は、68.75℃付近で起こったが、対照的に、遠UV CDによって検出された遷移はより高く、約72.5℃であった。68.75℃〜72.5℃の温度範囲において、タンパク質は、それがその三次構造を失うが、二次構造は無傷のままであるコンフォメーションで存在した。この分子特性は、中間状態の特徴である。しかし、40℃ではタンパク質のコンフォメーションは、未変性状態と高度に比較可能である。二次および三次構造変化に関して得られた冷却曲線は可逆的であった。同様に、より高いエタノール濃度(60％v/v)でのリゾチームのアンフォールディングの近UV CDスペクトルは、タンパク質が60℃付近で融解することを示したのに対し、遠UV CDスペクトルによって決定したTmは72.5℃であった。このように、二次および三次構造に関する融解曲線の中点は重なり合わず、中間体構造の存在を示した。
【００８４】
実施例13-疎水性ドメインの露出に及ぼす熱変性の効果
タンパク質のアンフォールディングによってしばしば、疎水性ドメインの露出が起こり、1,8-アニリノナフタレンスルホネート(ANS)のような蛍光プローブの結合は、アンフォールディングタンパク質の表面特性を調べるために有効に用いられている(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Aloj et al., Arch. Biochem. Biophys. 155:478〜479(1973)；Balasubramanian et al., Mol. Pharmacol. 53:926〜932(1998)；Purohit et al., Biochemistry, 36:12355〜12363(1998))。リゾチーム-ANS複合体の蛍光強度を、温度の関数としてエタノール-水混合物においてモニターした(図2)。水において、蛍光強度は、温度範囲25℃〜50℃で不変であったが、10％および20％v/vエタノール-水混合物では、リゾチーム-ANS複合体に関して同じ温度範囲で強度の増加が観察された。データは、疎水性ドメインの露出が、おそらく疎水性アミノ酸周辺の溶媒分子のクラスタ形成により、水において観察した場合と比較してエタノール-水混合物ではより低温で起こることを示唆している。この温度範囲において、タンパク質のコンフォメーションは、未変性状態と比較可能であり、中間状態の形成を示さない。溶媒増強蛍光の寄与および未変性状態に対するプローブの結合が弱いことを補うために、プローブの初回蛍光強度を正規化して、温度依存的効果を絶対蛍光強度よりむしろ％変化として計算した。
【００８５】
実施例14-エタノール誘導コンフォメーション状態とリポソームとの相互作用
タンパク質をエタノール-水混合物において熱ストレスに供すると、タンパク質のアンフォールディングは、露出された疎水性ドメインを有する中間構造を生成する。この分子特徴は、リポソーム封入にとって適している。この仮説を調べるために、本発明者らは、20％エタノール-水混合物の存在下において、タンパク質が疎水性ドメインを露出するが通常の中間構造の如何なる特性も有さない40℃で、一方タンパク質が中間状態の特性を示す70℃で、タンパク質の封入を行った。溶媒を窒素流または透析によって除去した。溶媒の除去によって、平衡リフォールディング実験から推論されるように、タンパク質のリフォールディングが起こることを本明細書において言及することは適当である。未変性状態、すなわち40℃での水中のタンパク質(エタノールの非存在下)の封入を含むいくつかの対照実験も同様に行った(表1)。70℃での水中(エタノールの存在下および非存在下)でのタンパク質の封入を含むさらなる実験も同様に行った(表1)。遊離のタンパク質をデキストラン遠心分離勾配によってリポソーム結合タンパク質から分離して、タンパク質の％封入を、BCAタンパク質定量、UV吸収、および蛍光アッセイによって推定した。リポソームへの中間構造媒介封入は、タンパク質の未変性状態と比較してより高い封入効率を生じたことは、データから明らかである。
【００８６】
（表１）
2008504268.tif 000002
【００８７】
実施例15-リポソームタンパク質のさらなる分子位相学試験
本実施例はさらに、実施例8および他の上記の実施例において記述された実験技法によって調製された材料を用いることによって行われる、リポソームタンパク質試験のさらなる分子位相学試験を例示する。実施例8のように、本実施例は、二次および三次タンパク質構造変化を調べるために円偏光二色性(cd)実験の使用を記述する。
【００８８】
実施例16-円偏光二色性(CD)実験
以下の実験の節のそれぞれにおいて、d10-カンフルスルホン酸によって較正したJASCO J715分光偏光計において、CDスペクトルを得た。Peltier 300 RTSユニットを用いて温度のスキャンを得、製造者によって提供されるソフトウェアを用いてアンフォールディングプロフィールを作製した。
【００８９】
エタノール-水混合物においてリゾチームの二次および三次(図4Aおよび4B)構造の温度依存的変化を、220 nmおよび290 nmでの楕円率を温度の関数としてプロットすることによって比較する。温度25℃〜95℃の範囲で加熱速度60℃/時間で0.5℃間隔で融解プロフィールを収集した。各データポイントは、3回の実験の平均値である。アンフォールディングした状態にあるタンパク質分画Fappは、実験技法において先に記述したように計算する。
【００９０】
二次構造に関して、用いたキュベットの路長は10 mmであり、タンパク質の濃度は20 μg/mlであった。三次構造測定に関して、用いたキュベットの路長は10 mmであり、タンパク質濃度は0.66 mg/mlであった。20μg/ml。これらの実験において用いた三次構造に関して、10 mm石英キュベットを用いてデータを得た。試料を360〜270 nmの範囲でスキャンして、タンパク質濃度は典型的に〜660 μg/mlであった。エタノールの存在によって、タンパク質のアンフォールディング経路において中間構造の形成が起こり、対照的に水性環境はそのような如何なる中間構造も促進しなかった。例えば、20％(v/v)エタノール-PBS混合物(pH=7.4)において、二次および三次構造のTmは61.75℃および58℃であった。リン酸緩衝液では(pH=7.0)、Tmはそれぞれ、〜73℃および72.25℃であった。
【００９１】
実施例17-二次および三次構造変化(図4Aおよび図4B)二次構造およびアンフォールディング
遠UV CDスペクトルを、表記のエタノール-水またはエタノール-緩衝液混合物において(pH=7.0または7.4)異なる温度でリゾチームに関して得て、220 nmでの楕円率の値を用いてアンフォールディング曲線を作製した(図4(a))。スペクトルを60℃/時間の加熱速度で得た。全ての試料に関して10 mm石英キュベットを用いてデータを得た。試料を260〜200 nmの範囲でスキャンして、タンパク質濃度は典型的に〜20 μg/mlであった。
【００９２】
実施例18-三次構造およびアンフォールディング
近UV CDスペクトルを、表記のエタノール-水またはエタノール-緩衝液混合物(pH=7.0または7.4)において異なる温度でリゾチームに関して得て、290 nmでの楕円率の値を用いてアンフォールディング曲線を作製した(図4(b))。スペクトルは加熱速度60℃/時間で得た。
【００９３】
これらの実験において用いた全ての試料に関して、10 mm石英キュベットを用いてデータを得た。試料を360〜270 nmの範囲でスキャンして、タンパク質濃度は典型的に〜660μg/mlであった。エタノールの存在によって、タンパク質のアンフォールディング経路において中間構造が形成されたのに対し、水性環境はそのような如何なる中間構造も促進しなかった。
【００９４】
例えば、20％(v/v)エタノール-PBS混合物(pH=7.4)において、二次および三次構造のTmは61.75℃および58℃であった。リン酸緩衝液(pH=7.0)において、Tmはそれぞれ、〜73℃および72.25℃であった。二次および三次構造のTmにおける上記の差は、中間構造の存在を明らかに示している。
【００９５】
重要なことに、エタノールの等級(すなわち、試薬、溶媒、絶対、市販等級等)は、そのような中間構造が生成される実験条件に影響を及ぼすように思われる。したがって、特定の温度または温度範囲は、エタノールのような溶媒と共に、露出された疎水性ドメインを有する二次、中間および／または三次タンパク質構造を含むタンパク質のコンフォメーション構造を促進するために有用である。そのような中間構造は、封入効率を増加させるためにリポソームとの疎水性相互作用を作出するために有用である。
【００９６】
上記に照らして(すなわち、二次構造およびアンフォールディングに関して)、本発明において調べたリゾチームのようなタンパク質における二次および三次構造変化によって測定した融解プロフィールおよび遷移温度(Tm)は、実験条件に置いて異なるおよび／または変化に対して感受性であった。そのような実験条件には、pH、成分、緩衝液、溶媒等級、およびタンパク質濃度の変化が含まれる(図4Aおよび4B)。特に、実験条件のそのような変化に基づいて、Tmがリゾチームのバッチによって変化することも同様に観察された(すなわち、異なる三つのリゾチームバッチを異なる実験条件で試験した)。
【００９７】
特に、これらの実験は、異なるタイプの化学的および／または物理的撹乱因子に基づいて異なる実験条件を用いることが、実験的に観察された異なるタンパク質コンフォメーション状態および／または特徴に有意な影響を及ぼすことを決定した。特に、化学的撹乱因子、安定剤、賦形剤、溶液等とのタンパク質複合体形成は、異なるpHまたはpH範囲内の異なる緩衝液、市販の化学薬品または試薬等級溶媒、および本明細書において示した異なるタンパク質濃度を用いることによって得られる異なる実験条件で起こることが決定された。
【００９８】
全ての場合において、エタノール-水混合物における熱ストレスの関数としてのリゾチームのような試験タンパク質における二次構造の変化は、実質的な残留二次構造特徴を保持することが見いだされ、三次構造変化と比較してより協調的でないことが見いだされ、その代わりに二次および三次構造特徴を有するハイブリッド構造を特徴とする中間構造が生成された。例えば、70℃では、試験タンパク質はその三次構造特徴的変化の全てを失うが、二次タンパク質または実質的な残留二次タンパク質の構造、特徴、または特色が観察された。40℃では、試験タンパク質は二次および三次構造特色の双方を保持した。
【００９９】
既に示したように、そのようなタンパク質は、適当な反応条件でその異なる対応するタンパク質構造またはコンフォメーション状態において安定化される可能性がある。例えば、露出された疎水性ドメインを有する安定化された二次または実質的に二次タンパク質構造は、温度約70℃〜約74℃の範囲でpH約7.0〜約7.4の範囲で、20％エタノール-水混合物または20％エタノール-リン酸緩衝生理食塩溶液との接触によって、タンパク質の少なくとも一部を安定剤と会合させるために変更を少なくとも部分的に逆転させることが含まれてもよい、露出した疎水性ドメインと安定剤との結合によって、形成される可能性がある。さらに、そのようなタンパク質は、温度約58℃〜約62℃の範囲でpH約7.0〜約7.4の範囲で、20％エタノール-水混合物または20％エタノール-リン酸緩衝生理食塩溶液との接触によって、タンパク質の少なくとも一部を安定剤と会合させるために変更を少なくとも部分的に逆転させることが含まれてもよい、露出した疎水性ドメインと安定剤との結合によって、露出された疎水性ドメインを有するその二次-三次ハイブリッド中間タンパク質構造において安定化される可能性がある。
【０１００】
A、B、およびDヘリックスが含まれるヘリックス疎水性コア構造のエタノール媒介安定化は、残留二次構造が観察される原因である可能性がある(図3)。全体的に、70℃では、リゾチームは中間構造で存在し、20％エタノール-水混合物において中間構造状態の特性を示す。
【０１０１】
実施例19-様々なエタノール-水混合物におけるリゾチームの二次および三次構造の温度依存性
エタノール-水混合物におけるリゾチームの二次(図1A)および三次(図1B)構造の温度依存的変化を、220 nmおよび268 nmでの楕円率を温度の関数としてプロットすることによって比較する。融解プロフィールを加熱速度60℃/時間で0.5℃間隔で25℃から95℃の温度範囲で収集した。それぞれのデータポイントは、実験3回の平均値である。アンフォールディングした状態にあるタンパク質分画Fappを、実験技法において先に記述したように計算する。二次構造に関して、用いたキュベットの路長は10 mmであり、タンパク質の濃度は20 μg/mlであった。三次構造測定に関して、用いたキュベットの路長は10 mmであり、タンパク質の濃度は0.66 mg/mlであった。
【０１０２】
実施例20-ANS複合体形成により探索されたエタノール-水混合物におけるリゾチームの疎水性ドメインの露出
ANSを水に高濃度で溶解して、少量を10μMリゾチーム溶液に加えて、最終的なプローブ濃度を0.3μMとした。試料を380 nmで励起して、発光を482 nmでモニターした。結果を図2 に示す。各データポイントは、3回の実験の平均値である。
【０１０３】
実施例21-リゾチームの三次元構造のリボン図
四つの主要なヘリックスを含む疎水性コアを、図3においてA(5-15)、B(25-36)、C(88-101)、およびD(109-115)と記す。
【０１０４】
実施例22-二次および三次構造の変化
二次および三次(図4Aおよび図4B)構造の温度依存的変化を、220 nmおよび290 nmでの楕円率を温度の関数としてプロットすることによって比較する。融解プロフィールを加熱速度60℃/時間で0.5℃間隔で25℃から95℃の温度範囲で収集した。それぞれのデータポイントは、実験3回の平均値である。アンフォールディングした状態にあるタンパク質分画Fappを、実験技法において先に記述したように計算する。
【０１０５】
実施例23-実験材料
rhAHFタンパク質はBaxter Health Care(Deerfield, IL)によって提供され、さらに精製せずに用いた。疎水性プローブであるANS(1-アニリノ-8ナフタレンスルホネート)(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Aloj et al., Arch. Biochem. Biophysics 155:478〜479(1973)；Purohit et al., Biochemistry 36:12355〜63(1997)；Balasubramanian et al., Mol. Pharmacol 53:926〜32(1998))を、Molecular Probes Inc.(Eugene, OR)から購入した。脂質は、Avanti polar lipids(Alabaster, AL)から得てさらに精製せずに用いた。
【０１０６】
実施例24-リポソームの調製
通常の方法に従う技法において、クロロホルムに溶解した0.30 mg/ml DMPC、0.15 mg/ml bPS、および0.04 mg/ml DSPE-PEGを丸底フラスコに入れ、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去して、脂質をフラスコの壁に沿って薄膜として沈着させた。脂質の膜を、室温で穏やかに撹拌しながら0.5 mg/mlタンパク質を含む適当な緩衝液(0.4 M NaClおよび50 mMトリス)に分散させることによって、タンパク質を封入する多重膜小胞(MLV)を形成した。
【０１０７】
本発明の方法に従う技法において、クロロホルムに溶解した0.30 mg/ml DMPC、0.15 mg/ml bPS、および0.04 mg/ml DSPE-PEGを丸底フラスコに入れ、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去して、脂質をフラスコの壁に沿って薄膜として沈着させた。脂質の膜を、室温または37℃で穏やかに撹拌しながら0.5 mg/mlタンパク質を含む適当な緩衝液(0.4 M NaCl、50 Mmトリス、および〜10％v/vエタノール)に分散させることによって、タンパク質を封入する多重膜小胞(MLV)を形成した。95％エタノール50 mlを特定の緩衝液中のタンパク質溶液450 mlに加えることによって、タンパク質保存溶液を調製した。次に、エタノールを室温または37℃で液体窒素流を用いて除去した。本実施例から生成されたデータのグラフは、rhAHFの二次構造に及ぼすリポソームの効果を示す：rhAHFの遠UV CDスペクトルを、実施例14に示すようにDMPC(ジミリストイルホスファチジルコリン)、bPS(脳ホスファチジルセリン)、およびDSPE-PEG(ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン-ポリエチレングリコール-2000)からなるPEG化リポソームの存在下および非存在下で得た。
【０１０８】
本発明において、目標を達成するためにいくつかの調製技法を試みた。クロロホルムに溶解した0.3 mg/ml DMPC、0.15 mg/ml bPS、コレステロールを、丸底フラスコに入れ、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去して、脂質をフラスコの壁に沿って薄膜として沈着させた。このように形成されたMLVをポリカーボネートフィルター(0.22μm)を通して濾過して、200 nm未満のSUVを形成した。タンパク質を封入するリポソームは、タンパク質含有緩衝液およびエタノールにおいてリポソームを混合した後、37℃またはそれより高い温度で穏やかに撹拌することによって中間構造を生成することによって形成した。粒子の平均直径は160 nmであった。これらの粒子のPEG化は、DSPE-PEGを加えることによって行った。
【０１０９】
実施例25-円偏光二色性実験
CDスペクトルを、d10カンフルスルホン酸によって較正したJASCO-715分光偏光計において得た。試料を二次構造分析に関して205 nm〜255 nmの範囲でスキャンして、典型的に用いたタンパク質濃度は約20μg/ml〜22μg/mlであった。近UV CD試験に関して、10 mm石英キュベットを用いて320 nm〜255 nmの範囲でスペクトルを得、用いたタンパク質濃度は約0.5 mg/mlであった。タンパク質のCDスペクトルは、緩衝液のベースラインのスペクトルを差し引くことによって補正して、シグナルの質を改善するために、多重スキャンを得て平均した。リポソームを含む試料のCDスペクトルは、光の散乱の結果として歪められる可能性がある。光の散乱による関与を以下のように補正した：(1)350 nm〜400 nmの楕円率の値をモニターして、スキャンから差し引いたベースラインとして用いた；(2)多重スキャンを得て、シグナルの質を改善するために平均した。このようにして得られたスペクトルは、キュベットの路長、試料の希釈、路長に沿った試料の位置によって不変であり、スペクトルに及ぼす散乱の効果が最小限であることを示した。
【０１１０】
実施例26-蛍光試験
蛍光スペクトルをSLM 8000C分光蛍光計(Urbana, IL)において得た。発光スペクトルの強度を、励起および発光路上でのスリット幅4 nmを用いて300 nm〜400 nmの範囲でモニターした。励起モノクロメーターを280 nmに設定して、295 nmロングパスフィルターを用いて散乱の効果を最小限にした。タンパク質の融解は、温度範囲25℃〜90℃に及ぶ330 nmでの発光強度の減少をモニターすることによって追跡した。試料を、水浴(Neslab RTE 110)を用いて所望の温度で約3〜4分間平衡化した。
【０１１１】
実施例27-平衡フォールディング分析
二状態アンフォールディングモデルを用いて平衡アンフォールディングデータを分析した。いくつかの方法によって検出された遷移を比較するために、それぞれのアンフォールディング曲線を、以下の関係を用いてアンフォールディング型(Fapp)の見かけの分画に対して正規化した：
Fapp=(Yobs-Ynat)/(Yunf-Ynat)
式中、Yobsは、所定の温度でのモル楕円率(215 nmまたは295 nm)であり、YunfおよびYnatはそれぞれ、アンフォールディングした構造および未変性構造のスペクトル値である。YunfおよびYnatはそれぞれ、高温および低温でのスペクトルプラトー領域の平均値を得ることによって得られる。
【０１１２】
実施例28-ANS結合試験
ANS(1-アニリノ-8-ナフタレンスルホネート)を適当な緩衝液において高濃度で溶解して、少量を10 nM/ml rhAHF溶液に加えて、プローブの最終濃度50 nM/mlを得た。励起波長は380 nmであり、発光は482 nmでモニターした。内部フィルター効果の補正は、先に記述した適当な技法(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Lakowicz, 「Principles of Fluorescence Spectroscopy」, New York, Plenum Press(1986))によって行った。
【０１１３】
実施例29-rhAHFの生物活性アッセイ
rhAHF凝結活性を、微粉シリカまたはCaCl2を活性化剤として用いて、AHF欠損血漿を基質として用いる一段階活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)アッセイによって決定した。APTTアッセイはCOAG-A-MATE凝固アナライザー(Organon Teknika Corporation, Durham, NC)を用いて行った。簡単には、rhAHFをAHF欠損血漿に加えて、凝結時間をモニターした。次に、rhAHFの活性を、公知の活性の凍結乾燥参照濃縮物の様々な希釈液から決定した凝結時間を用いて構築した較正曲線から得た。
【０１１４】
実施例30-rhAHFの熱変性試験
物理的不安定性のプロセスは分子レベルでのタンパク質のアンフォールディングに関連することから、当面の目的は、rhAHFタンパク質のアンフォールディングを詳細に分析することであった。タンパク質剤の構造的安定性を理解するため、および薬学的に安定な製剤を開発するために、熱変性試験が一般的に用いられている(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Tsai et al., Pharm. Res. 10:649〜59(1993)；Balasubramanian et al., Pharm. Res. 17:344〜50(2000))。
【０１１５】
実施例31-二次構造の温度の効果
rhAHF二次構造の温度誘導変化を、遠UV CDスペクトル(255 nm〜205 nm、図6A)を得ることによって調べた。20℃では、215 nmでの広い負のバンドが、タンパク質が主にβ-シートコンフォメーションで存在することを示唆した。これは、相同性モデリングに基づいて提案された構造(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Pan et al., Nat. Struct. Biol. 2:740〜4(1995))と一致する。温度範囲20℃〜50℃で温度を増加させても、遠UV CDスペクトルには有意な変化を認めず、タンパク質の二次構造が変更されていないことを示した。50℃〜65℃の温度範囲では、215 nmでの楕円率は、温度の増加と共に増加して、このことはβ-シートコンフォメーションの増加を示唆している。65℃を超える温度では、スペクトル特徴に有意な変化を認めた。CDスペクトルは、約2 nm赤色にシフトして、205 nm〜210 nm範囲での正のバンドの出現は、分子間β-鎖によって最終的に安定化される凝集物の形成におそらく至る、逆平行β-鎖の形成を示唆した(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Hilbich et al., J. Mol. Biol. 218:149〜63(1991)；Hammarstrom et al., J. Biol Chem 274:32897〜903(1999))。このように、二次構造は、以下のコンフォメーション遷移を受けるように思われた：
平行-β-シート----β-シート含有量の増加----逆平行β-シート。
遠UVスペクトルデータを用いて、本明細書に記述の方法に従って、アンフォールディング型にある見かけの分画であるFappを計算した。
【０１１６】
実施例32-三次および二次構造に及ぼす温度の効果ならびに構造中間体の存在に関する証拠
近UV CDスペクトルは三次構造を示しているが、遠UV CDスペクトルが二次構造を示している。225 nm〜320 nmの波長範囲に及ぶ近UV CDスペクトルの温度依存性を調べた(図6B)。20℃では、約295 nmおよび約268 nmで二つの正のピークを認め、温度が増加すると、ピークの強度は減少した。
【０１１７】
近UV CDスペクトルを用いて三次構造のアンフォールディングの温度依存性を計算した。温度が増加すると、295 nmでの楕円率が減少し、したがってFappは、おおよそ50℃〜52℃の範囲で起こる主な遷移の中点と共に増加した(図6C)。遠UV CDスペクトルの温度依存性を、205 nm〜255 nmでの波長範囲でモニターし、遠UV CDによって検出された主な遷移は、かなり高く、おおよそ60℃〜62℃であった(図6C)。三次および二次構造変化が起こる温度のそのような差から、中間のアンフォールディング状態が存在することが確認された(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Ptitsyn et al., FEBS Lett. 262:20〜24(1990))。多段階遷移は、遠UV CDスペクトルに関して明白であったが、近UV CDスペクトルについては比較的明白ではなかった。
【０１１８】
第VIII因子は、いくつかのトリプトファン残基を有する多ドメインタンパク質であり、Trp蛍光の変化は、異なるドメインに及ぶタンパク質のおおまかな三次構造変化に関する情報を提供する可能性がある。rhAHFの蛍光発光スペクトルを、25℃〜90℃の温度範囲で得て、Trp蛍光の変化を検出した(図7)。データは多段階遷移を示して、それらは遠UV CDによって観察されたものと重なり合わなかった。蛍光強度の％変化および近UV CDによって、いくつかの分子種が同定された(SI1、SI2、SI3)。温度範囲20〜50℃では、構造はSI1であると同定され、C2ドメインに小さいコンフォメーション変化を伴い、それによって疎水性ドメインの露出が起こる未変性様の二次および三次構造特色を保持した。温度範囲50〜65℃では、種SI2が同定されて、これは凝集物を含む可能性がある。65℃より上でのコンフォメーション状態はSI3と名付けられ、これはより高温での分子間β鎖のスペクトル特徴を示す遠UV CD試験から明らかであるように、実質的な凝集を含む可能性がある。励起状態の温度依存的不活化および蛍光強度を評価するためにトリプトファンに関して対照実験を行ったところ、結果は、その温度範囲で、20〜50％の蛍光強度の喪失が、不活化によるものであって、実質的なコンフォメーションの変化を伴わない可能性があることを示している。これを近UV CD試験によってさらに確認した。
【０１１９】
実施例33-疎水性ドメインの露出の熱変性の効果
rhAHFがアンフォールディングプロセスの際に疎水性ドメインが露出された中間構造を形成するか否かを決定するために、タンパク質と、疎水性ドメインのプローブであるANS(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Aloj et al., Arch. Biochem. Biophysics 155:478〜479(1973)；Purohit et al., Biochemistry 36:12355〜63(1997)；Balasubramanian et al., Mol. Pharmacol. 53:926〜32(1998))との複合体形成をモニターした。ANSに結合したタンパク質の蛍光強度は、温度の増加と共に増加した(図8)。25℃〜45℃の温度範囲にわたって、ANS強度の増加はほぼ直線的であり、SI1の疎水性ドメインの露出が進行的に増加していることを示唆した。50℃〜60℃の温度範囲では、強度の実質的な増加(65℃で強度の約40％の増加)を認め、疎水性ドメインのより多くの露出および／または凝集体の形成を示唆して、SI2に関連する可能性がある。温度範囲85℃〜90℃でのタンパク質-ANS複合体の蛍光の激しい増加は、タンパク質凝集の指標であり、これは疎水性ドメインの露出を増加させるタンパク質のコンフォメーションの変化の結果として起こり、SI3の形成と一致した。
【０１２０】
実施例34-タンパク質のコンフォメーションの変化およびその含意
報告された凝集プロセスおよび活性の減少を促進する、タンパク質におけるコンフォメーション変化に洞察を得るために、タンパク質を様々な温度でインキュベートして、遠UV CDスペクトルの変化をモニターした(図9)。90℃で行ったインキュベーション試験に関して、分子間β-鎖の形成が観察され、アニーリングしたタンパク質は、未変性様の二次構造特色を回復せず、未変性構造特色の喪失は生物活性の喪失と一致した。露出された疎水性ドメインを有する部分的にフォールディングした構造中間体(SI3)は、凝集を促進して、凝集体はおそらく分子間β-鎖によって安定化され、それによってタンパク質の活性が失われると推測される。この推測は、上昇した温度でのANS蛍光の観察された増加を強く反映する。SI1の形成に対応する37℃および47℃でのインキュベーション試験に関して、CD特徴の有意な変化を認めなかったが、SI2の形成に対応する60℃では、215 nmでのバンドの強度の増加および小さい青色シフトが認められ、これはこれまでの観察と一致する。
【０１２１】
実施例35-リポソームrhAHFのコンフォメーション分析
AHFはインビボでPS含有リン脂質に強く結合することが報告されているが、PS含有リポソームとAHFとのあいだの相互作用の性質および複合体の分子特徴に関してあまり多くのことはわかっていない。この相互作用の特性を理解するために、予備スペクトル試験を行った。遠UV CDによって調べたリポソームの存在下での第VIII因子のコンフォメーションを、図10に示す。その未変性のコンフォメーションにおけるタンパク質のCDスペクトルを比較のために示す(図10)。未変性状態において、タンパク質は主にβシートコンフォメーションで存在する。リポソーム会合rhAHFのCDスペクトルは、215 nmで比較的強くない負のバンドおよび小さい赤色シフトを示し、このことは、未変性のタンパク質のコンフォメーションが変化したことを示している。
【０１２２】
タンパク質のTrp蛍光の変化も同様に、タンパク質のコンフォメーション状態を探索する手段として、リポソームの存在下で追跡した。リポソームの存在下では、リポソームの非存在下でのタンパク質試料と比較して蛍光強度の増加が観察された。さらに、Trp発光スペクトルは未変性のタンパク質と比較して青色にシフトしたが、観察されたシフトは非常に小さく、ほとんどがタンパク質の非極性領域とリポソーム膜との相互作用の結果である可能性が高かった。この相互作用は、蛍光体を含むドメインの外部環境からの遮蔽を提供する可能性があり、タンパク質の凝集を防止する可能性がある。
【０１２３】
実施例36-rhAHFの平衡リフォールディングに及ぼすリポソームの効果
タンパク質のアンフォールディングおよびリフォールディング経路に及ぼすリポソームの効果に関する洞察を得るため、および中間体の役割を理解するために、第VIII因子の平衡リフォールディング試験を、リポソームの存在下および非存在下で異なる温度で、制御された加熱および再冷却条件で行った。
【０１２４】
図11Aは、リポソームの非存在下でのタンパク質の二次構造の融解および再冷却を示す。温度が増加すると、スペクトル特徴に有意な変化を認めた。既に記述されたように、融解は二段階で起こるように思われる：約60℃〜約62℃のTmでの顕著な遷移および約70℃での非常に広い遷移。分子間β-鎖の形成は、温度≧65℃で顕著であり、遠UV CDスペクトルにおいて、215 nmの負のバンドの広幅化および200 nm〜210 nmの範囲での正のバンドの発生を伴う有意な赤色シフトを認めた。熱変性試料を再冷却しても、未変性様の二次構造の回復を認めず、215 nmでの広幅化バンドが持続した。リポソームの存在下では、図11Bにおいて認められるように、二次構造の融解は再度二段階で起こるように思われた。第一の遷移は未変性のタンパク質に関して観察されたものと類似であったが、第二の遷移はより広い温度範囲で起こった。これは、おそらく、リポソームがタンパク質と複合体を形成した結果である可能性がある。再冷却すると、リポソームの存在下で変性されたタンパク質は、その未変性様の二次構造特色のいくつかを回復するように思われた(図11B)。さらに、蛍光試験は、CDデータを確認し、リポソームの存在下で再冷却したタンパク質は、約48％から約50％の強度の有意な回復を示したのに対し、遊離のタンパク質は、蛍光強度の約20％から約30％の回復を示したに過ぎなかった。リポソームの存在下で再冷却したタンパク質は、遊離のタンパク質と比較してわずかにより活性があることが見いだされた。
【０１２５】
これらの実験において、リポソームに基づく製剤は、AHFとホスファチジルセリン(PS)頭部基含有リポソームとの複合体形成を作出することによって得られた。この複合体は、脂質集合体のシャペロン様の分子特徴を利用し、37℃および10〜20％エタノールを含むタンパク質の条件における、リポソームと特異的中間状態との疎水性相互作用を通して安定化された。複合体を形成した中間体はまた、タンパク質のその未変性状態へのリフォールディングに役立つ。リポソームとAHFタンパク質との会合によって安定性が増加し、凝集が防止された(表2)。
【０１２６】
（表２）通常のおよび本発明の技術を用いて会合した％AHFタンパク質
2008504268.tif 000003
【０１２７】
リポソームを負荷したタンパク質を、既に記述されたように急速沈降(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Gilbert et al., J. Biol. Chem. 266:815〜822(1990))によって遊離の第VIII因子から分離した。複合体を速度15,000 gで4℃で45分間回転させた。上清および再懸濁させた沈降物を蛍光分光法によって分析した。未結合のタンパク質を、デキストラン遠心分離勾配によってリポソーム結合タンパク質から分離した。試料をSW50.1 Beckmanローターを用いて185,000 gで30分間遠心分離した。封入効率を決定するために、試料を蛍光および活性アッセイによって分析した。
【０１２８】
本発明に従って調製された分子会合は、表3における活性データによって示されるように、通常に投与される製剤と比較可能な活性を示した。
【０１２９】
（表３）活性データ
2008504268.tif 000004
【０１３０】
AHFの生物学的利用率を増加させるために、リポソームにおける脂質成分の一つとして、PEG-ホスファチジルエタノールアミンを用いて、複合体／送達媒体をポリエチレングリコールによってコーティングした。これはまた、タンパク質-脂質複合体にステルス様の特性を提供することによって、免疫原性問題に取り組む。
【０１３１】
タンパク質の部分的アンフォールディングによって、疎水性ドメインの露出が増加して、凝集を促進することが報告されている(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Balasubramanian et al., Pharm. Res. 17:344〜350(2000))。したがって、アンフォールディングプロセスに関係する巧妙さおよび物理的不安定化に対するその寄与を理解するために、rhAHFの熱変性試験を行った。タンパク質の融解は多段階プロセスであり、アンフォールディングが進行する際の三次構造の進行的喪失を伴う二次構造において観察された小さい変化は、タンパク質の未変性のコンフォメーションが構造的中間状態に遷移することを示唆した。本明細書におけるデータは、少なくとも三つの「構造的中間」状態の存在を示唆して、そのような変化は、凝集を促進することによってタンパク質の不活化を引き起こしうる。さらに、平衡リフォールディング試験に基づく分析から、中間状態SI1の形成は可逆的であるが、アンフォールディング経路におけるSI2およびSI3の出現によって、タンパク質がその構造を非可逆的に喪失したことが示された。上記の観察は、第一の主要な遷移の後またはそれと一致して起こる中間状態形成によって、おそらくタンパク質構造の非可逆的な喪失が起こり(図12の略図に示すように)、それによってタンパク質の沈殿が起こることを示唆している。
【０１３２】
蛍光分光法によって決定したAHFタンパク質のコンフォメーションは、温度範囲50℃〜65℃において疎水性ドメインの十分な露出が起こることを示している。そのような露出は、凝集プロセスを加速させうる。同様に、CDデータは、分子間β鎖の形成が上昇した温度で起こることを示している。これらの観察から、凝集物がおそらく分子間β-鎖によって安定化され、そのような安定化は次に長期間にわたって沈殿を促進することができるであろうという仮説が導かれた。実際に、分子間β-鎖は、タンパク質における物理的不安定性を媒介することが報告されている(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Hilbich et al., J. Mol. Biol. 218:149〜163(1991)；Hammarstrom et al., J. Biol. Chem. 274:32897〜32903(1999))。
【０１３３】
タンパク質における物理的不安定性の問題に対処する非常に一般的なアプローチは、賦形剤を用いることであった(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Tsai et al., Pharm. Res. 10:649〜659(1993)；Carpenter et al., Pharm. Res. 14:969〜975(1997))。しかし、用いられる典型的な賦形剤は、経験的に選択され、製剤設計の基礎となる根本的理由は、タンパク質のアンフォールディングが二段階プロセスとなることを仮定する(すなわち、アンフォールディングプロセスにおける任意の選択された時間で、二種類の集団；フォールディングした分子とアンフォールディングした分子のみが存在する)。これは、リゾチームおよびチトクロームCのような低分子に関しては有効であるかも知れないが、そのような仮定は、rhAHFのような多ドメインタンパク質に関する問題の複雑な特性を単純化しすぎる。本発明の試験は明らかに、多段階アンフォールディングプロセスを示唆しており、これは深い意味を有しうる。そのような相互作用はおそらく、これらの構造を未変性の状態へと誘導する賦形剤の能力を増強しうることから、賦形剤の選択は、部分的にフォールディングした構造に対するその選択的相互作用に基づかなければならないことが見いだされている。
【０１３４】
リポソームは、これまで、中間構造と選択的に相互作用することによって、タンパク質を凝集に対して安定化することが示されている(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Balasubramanian et al., Pharm. Res. 17:344〜350(2000))。AHFはインビボでリン脂質を含むPSに強く結合することが示されていることから、PS含有リポソームを用いてタンパク質との相互作用の特徴を調べた。膜にPSが存在することは、AHF結合の媒介にとって必須であることが報告されている(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Gilbert et al., Biochemistry 32:9577〜9585(1993))。同様に、PS結合部位は、AHFの軽鎖の一部であるC2ドメインに局在するが、他の五つのドメインの空間的方向性に関してはあまりわかっていない(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Foster et al., Blood 75:1999〜2004(1990))。しかし、凝固V因子(fV)(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Gilbert et al., J. Biol. Chem. 265:815〜822(1990)；Kalafatis et al., Biochemistry 33:486〜493(1994)；Lecompte et al., J. Biol. Chem. 269:1905〜1910)(rhAHFの相同体)と、リン脂質との相互作用に関して提唱されているモデルに基づいて、C2ドメイン配列以外の領域も同様に膜の結合に関係している可能性があると提唱されている(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Saenko et al., J. Biol. Chem. 270:13826〜13833(1995))。この相互作用の正確な特性はわかっていないが、PS含有リポソームは、タンパク質と相互作用して、コンフォメーションの変化を誘導して、それによってタンパク質のC2ドメインの疎水性領域の二重層へのインターカレーションが起こると想像される。極性頭部基はおそらく疎水性領域と相互作用して、複合体にさらなる安定性を提供する。さらに、リポソームは、アンフォールディングタンパク質に疎水性の環境を提供して、それによって部分的にフォールディングした構造と選択的に相互作用して、分子間会合を防止すると推測される。最初のスペクトル特徴試験は、リポソームとタンパク質との相互作用が、これらの中間状態に関連した可逆性において反映されるように、中間状態の特性に依存するように思われることを示唆する。リポソームの存在下において、SI1の形成は完全に可逆的であり、SI2の出現によって、タンパク質構造の非可逆的喪失が起こった。しかし、SI3の形成後に未変性様特色の部分的回復を認めた。同様に、PS含有リポソームとの会合が、「非未変性」様コンフォメーションをとるようにタンパク質の未変性構造を誘導して、おそらくアンフォールディング／リフォールディングプロセスにおいて重要な役割を果たすと論理的に考えられる。重鎖および軽鎖におけるタンパク質サブユニットが、変性プロセスの際に特定の配列に融解すると仮定すると、C2へのリポソーム結合の事象において、サブユニットのこの連続的融解は変更される可能性がある。これは、リポソームの存在下でタンパク質が異なるアンフォールディング／リフォールディング経路をとるように思われることを示唆する蛍光および遠UV CD試験からの観察において反映される。これが真実であるならば、タンパク質に会合した脂質分子も同様に、タンパク質をその未変性状態に誘導することに関係する可能性がある。それにもかかわらず、複合体の特性とは無関係に、本試験は、この複合体タンパク質に関する製剤の問題に取り組むための見通しを与え、これを下記でさらに議論する。
【０１３５】
タンパク質のC2ドメインが血小板の表面に存在するリン脂質との高親和性相互作用に関係することが報告されている(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Foster et al., Blood 75:1999〜2004(1990))。さらに、C2ドメインに対する阻害剤がインビボでAHF活性の中和の主な原因であることが示されている(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Scandella et al., Throm. Res. 101:377〜385(2001))。本発明において産生されたリポソームrAHF分散液は、免疫反応および抗原性を低減させるためにタンパク質のエピトープ領域を遮蔽する。C2ドメインがリポソームにおいて遮蔽されているか否かを具体的に決定するために、C2ドメイン特異的抗体を用いるELISA(「酵素結合免疫吸着アッセイ」)を準備した。タンパク質結合リポソームを、炭酸緩衝液において4℃で終夜インキュベートすることによって、Nunc Maxicorpプレート上にコーティングした。抗体の結合(ODによって測定)は、リポソーム結合タンパク質に関して遊離のタンパク質の場合よりはるかに少ないことが見いだされ、エピトープ領域が抗体結合のために利用できないことを示している。ELISAの他に、衝突消光剤へのタンパク質上の蛍光体の到達度を決定するために、アクリルアミドによる蛍光の消光を行った。このデータは、リポソームにおけるタンパク質の位置に関する情報を提供するであろう。消光実験は、この技法によって産生された脂質rhAHFが、0.2 Mアクリルアミドの消光効率が、リポソーム結合タンパク質に関して遊離のタンパク質の場合より38％低いことを示すことを示した。結果は、タンパク質分子の一部が脂質結合の結果として遮蔽されるELISAアッセイを支持する。
【０１３６】
前記の観察は、rhAHF製剤において安定剤としてリポソームを用いる望ましい特色を説明している。タンパク質と脂質との複合体形成はさらに、酵素の不活化を防止することによって、インビボでタンパク質の安定性をさらに増強する可能性がある。さらに、表面修飾リポソームも同様に安全な送達媒体として用いることができる(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Woodle et al., Biochim. Biophys. Acta 1105:193〜200(1992))。これを達成するためのアプローチの一つは、ポリエチレングリコール(PEG)のような親水性ポリマーによって表面をコーティングすることであった(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Klibanov et al., FEBS Lett. 268:235〜237(1990))。PEG化リポソームはまた、RES系を回避することによってより長い間血液中で循環することが示されている(その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、Lasic et al., Biochim. Biophys. Acta 1070:187〜192(1991)；Papahadjopoulos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:11460〜4(1991))。(1)複合体形成を促進してタンパク質を安定化させるための手段として(図13)、および(2)インビボでrhAHFを送達して、それによってその循環時間を増加するための媒体として、PEG化リポソームを用いる実現可能性が調べられている。予備実験から、リポソームに会合したタンパク質の活性が遊離のタンパク質と比較可能であることが示されている。溶媒の存在下で加熱すると、AHFタンパク質のリポソーム会合にとって必要な所望のコンフォメーションの変化を促進するであろう。
【０１３７】
実施例37-インターフェロンγの複合体形成
誘発負荷にとって適した構造を生成するために、インターフェロンγ20μgを、10％エタノールを含むリン酸緩衝生理食塩液に溶解した。25℃および40℃でのエタノールの存在下および非存在下におけるインターフェロンγのCDスペクトルは、タンパク質のコンフォメーションがエタノールの存在下で有意に変更されないことを示した。タンパク質は、このエタノール濃度で実質的な二次および三次構造を保持し、このことは生成された構造がモルテングロビュールのような従来の中間体ではないことを示唆している。さらに、PBS生理食塩液におけるインターフェロンγの熱融解に基づくTmは、56.7℃であることが見いだされ、これはエタノールの存在下では43.8℃に減少して、疎水性基周辺でのエタノール分子のクラスタ形成をさらに示唆している。この分子構造は、タンパク質とリポソームとの疎水性相互作用を作出するために適している。10％エタノールの存在下で40℃で生成された構造を利用して、DMPC：PG混合物で構成されるリポソーム中に封入した。ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)約6.75 mgおよびジミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG)0.675 mgのクロロホルム溶液を蒸発させて、丸底フラスコの側面周囲に薄膜を形成させた。リン酸緩衝生理食塩液に溶解したインターフェロンγ25 μgを用いて、10％エタノールの存在下および非存在下で25℃および40℃で薄膜を水和した。乾燥窒素流を用いて試料中のエタノールを蒸発させて、リン酸緩衝生理食塩液に置換した。遊離のタンパク質をデキストラン密度勾配によってリポソーム会合タンパク質から分離した。リポソームに会合したタンパク質を決定するために、異なる勾配におけるタンパク質およびリポソーム試料を、BCAタンパク質アッセイキット、蛍光、または280 nmでの吸光度を測定することによって分析した。誘発負荷にとって適した構造(40℃で10％エタノールの存在下で)は、未変性状態と比較してより高いリポソーム会合(典型的に、6〜10％高い)を媒介した。
【０１３８】
実施例38-第VIII因子の複合体形成
誘発負荷にとって適した構造を生成するために、第VIII因子50μgを、10％および20％エタノールを含むTRIS緩衝液(300 mM NaCl、25 mM Tris、5 mM CaCl2・2H2O、pH=7.0)に溶解した。完全長またはB-ドメイン欠失第VIII因子をCOS-7またはCHO細胞において発現させ、クロマトグラフィーによって精製した。エタノールの存在下および非存在下で25℃および40℃での第VIII因子のCDスペクトルは、タンパク質のコンフォメーションがエタノールの存在下で有意に変更しないことを示した。タンパク質は、このエタノール濃度で実質的な二次および三次構造を保持し、生成された構造がモルテングロビュールのような従来の中間体ではないことを示唆した。さらに、第VIII因子の熱融解に基づくTmは60.1℃であることが見いだされ、これはエタノールの存在下で51.5℃に減少し、疎水性基周辺でのエタノール分子のクラスタ形成をさらに示唆している。この分子構造は、タンパク質とリポソームとの疎水性相互作用を作出するために適している。10％エタノールの存在下で40℃で生成された構造を利用して、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)：ホスファチジルセリン(PS)混合物で構成されるリポソーム中に封入した。DMPC約1.69 mgおよび脳PS 0.868 mgのクロロホルム溶液を蒸発させて、丸底フラスコの側面周囲に薄膜を形成させた。TRIS緩衝液を用いて膜を水和して、200ミクロンのポリカーボネートフィルターを用いて押し出した。タンパク質を、エタノールの存在下および非存在下で20℃および37℃でリポソームと会合させた。試料中のエタノールを、乾燥窒素流を用いて蒸発させて、リン酸緩衝生理食塩液に置換した。遊離のタンパク質をデキストラン密度勾配によってリポソーム会合タンパク質から分離した。異なる勾配分画におけるタンパク質をBCAタンパク質アッセイ、蛍光によって、または280 nmでの吸光度によって分析して、リポソームに会合した％タンパク質を決定した。誘発負荷、例えば40℃での10％エタノールの存在下にとって適した構造によって、タンパク質の57％(蛍光アッセイ、n=2)が得られた。未変性状態、例えば37℃で媒介されるタンパク質会合は、活性アッセイに基づいて45.2±16.8(n=16)であることが見いだされた。しかし、これらの実験条件下で媒介される相互作用は異なってもよく、会合効率に関して比較されなくてもよいことに言及することは適当である。リポソーム組成物はまた、タンパク質会合において重要な役割を有する。例えば、未変性状態のFVIIIは、静電気的相互作用によりPS含有リポソームと容易に相互作用する。エタノールの存在下で、疎水性相互作用は、静電気的相互作用に干渉する可能性があるリポソームとのタンパク質の会合を媒介する可能性がある。
【０１３９】
本発明は、好ましい態様を用いて記述してきたが、当業者に明らかであるように、変形および改変を用いてもよいと理解すべきである。そのような変形および改変は、本明細書に添付の特許請求の範囲の本文および範囲内に含まれるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１Ａ】220 nmおよび268 nmでの楕円率を温度の関数としてプロットすることによって、エタノール-水混合物におけるリゾチームの二次構造の温度依存的変化を示す。
【図１Ｂ】220 nmおよび268 nmでの楕円率を温度の関数としてプロットすることによって、エタノール-水混合物におけるリゾチームの三次構造の温度依存的変化を示す。
【図２】温度の関数としてのANS複合体形成の％変化のプロットである。
【図３】リゾチームの三次元構造のリボン図である。
【図４Ａ】波長220 nmおよび290 nmでの楕円率を温度の関数としてプロットすることによって、エタノール百分率の比率が約20％エタノール〜約40％エタノールまでの異なるエタノール-水混合物における、約1.40μM〜約47.5μMの範囲の異なるタンパク質濃度でのリゾチームの二次、二次-三次ハイブリッド、または中間、および三次構造の温度依存的変化を示す。
【図４Ｂ】波長220 nmおよび290 nmでの楕円率を温度の関数としてプロットすることによって、エタノール-水混合物におけるリゾチームの三次構造の温度依存的変化を示す。
【図５Ａ】20％エタノールの存在下および非存在下での水中における1.40μM〜47.5μMまでの異なるタンパク質濃度でのリゾチームの二次構造を示す。
【図５Ｂ】20％エタノールの存在下および非存在下での水中における1.40μM〜47.5μMまでの異なるタンパク質濃度でのリゾチームの三次構造を示す。
【図６Ａ】波長208 nm〜255 nmの範囲に対して20℃〜90℃で得た、適当な緩衝液中のrhAHFのモル楕円率の遠UV-CDスペクトルのグラフである。
【図６Ｂ】波長255 nm〜320 nmの範囲に対して20℃〜80℃で得た、適当な緩衝液中のrhAHFのモル楕円率の近UV CDスペクトルのグラフである。
【図６Ｃ】温度の関数としての、215 nmおよび295 nmでのrhAHFの楕円率のグラフである。
【図７】rhAHFの任意の単位(「a.u.」)で測定した蛍光強度の温度依存的変化のグラフである。
【図８】温度の関数としてのANS蛍光の％変化のグラフである。
【図９】温度の関数としてのrhAHFの楕円率のグラフである。
【図１０】rhAHFおよびリポソーム中のrhAHFのモル楕円率のグラフである。
【図１１Ａ】リポソームの非存在下において温度20℃〜90℃の範囲に対して行った、適当な緩衝液におけるrhAHFの制御された加熱および再冷却を示すグラフである。
【図１１Ｂ】リポソームの存在下において温度20℃〜90℃の範囲に対して行った、適当な緩衝液におけるrhAHFの制御された加熱および再冷却を示すグラフである。
【図１２】rhAHFのフォールディング特徴および物理的不安定性経路に対するその関連の略図である。
【図１３】本発明のrhAHF-リポソーム複合体に基づく送達媒体の略図である。
【図１４】rhAHFの二次構造に及ぼすリポソームの効果を示すグラフである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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