(57)【要約】  本発明は、以下の工程を包含する止血アッセイに関する：試験されるべき血液産物、トロンビン生成を誘導するためのトリガー分子、トロンビンによる切断に際して測定可能なトロンビン特異的なシグナルを生じるトロンビン特異的な基質、プラスミン生成を誘導するためのトリガー分子、プラスミンによる切断に際して測定可能なプラスミン特異的なシグナルを生じるプラスミン特異的な基質、リン脂質含有表面およびカルシウムイオンを含む反応混合物を提供する工程、ならびにトロンビン特異的なおよびプラスミン特異的なシグナルを測定することによってｔ＝０で開始する時間内に反応混合物中に生成されたトロンビンの量およびプラスミンの量を決定する工程。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を包含する止血アッセイ：試験されるべき血液産物、トロンビン生成を誘導するためのトリガー分子、トロンビンによる切断に際して測定可能なトロンビン特異的なシグナルを生じるトロンビン特異的な基質、プラスミン生成を誘導するためのトリガー分子、プラスミンによる切断に際して測定可能なプラスミン特異的なシグナルを生じるプラスミン特異的な基質、リン脂質含有表面およびカルシウムイオンを含む反応混合物を提供する工程、ならびにトロンビン特異的なおよびプラスミン特異的なシグナルを測定することによってｔ＝０で開始する時間内に反応混合物中に生成されたトロンビンの量およびプラスミンの量を決定する工程。
【請求項２】
試験されるべき血液産物が、血漿、ドレイン液、全血および多血小板血漿から選択される、請求項１記載のアッセイ。
【請求項３】
トロンビン生成を誘導するためのトリガー分子が、外因系のイニシエーター、特に組織因子（ＴＦ）、または内因系のイニシエーター、特にガラス、カオリン、酸である、請求項１または２記載のアッセイ。
【請求項４】
アッセイにおけるプラスミン生成を誘導するためのトリガー分子が、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼおよび組織プラスミノーゲンアクチベーターから選択され、そして好ましくは組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）である、請求項１〜３のいずれか１項記載のアッセイ。
【請求項５】
基質が、測定されるべき分子との接触に際して測定可能な基を遊離する化合物である、請求項１〜４のいずれか１項記載のアッセイ。
【請求項６】
基質が蛍光基質である、請求項１〜４のいずれか１項記載のアッセイ。
【請求項７】
基質が異なる励起および発光スペクトルを有する、請求項６記載のアッセイ。
【請求項８】
トロンビン特異的な基質が７−アミノ−４−メチルクマリンに結合される、請求項７記載のアッセイ。
【請求項９】
トロンビン特異的な基質がＢｚ−β−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ−ＡｃＯＨである、請求項８記載のアッセイ。
【請求項１０】
プラスミン特異的な基質がローダミン１１０に結合される、請求項７記載のアッセイ。
【請求項１１】
プラスミン特異的な基質が（ｂｉｓ−（ＣＢＺ−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アルギニンアミド））である、請求項１０記載のアッセイ。
【請求項１２】
リン脂質含有表面が、セファリン、細胞、特に内皮細胞、血小板、細菌、ウイルス、内皮細胞のマトリックスまたは微小血管から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項記載のアッセイ。
【請求項１３】
薬物、タンパク質、細胞または他の添加物を反応混合物に添加する工程を包含する、トロンビンおよびプラスミン両方の生成に対する薬物、タンパク質、細胞または他の添加物の効果の決定における使用のための、請求項１〜１２のいずれか１項記載のアッセイ。
【請求項１４】
以下の試薬の１つ以上を含む容器を含む、請求項１〜１２のいずれか１項記載のアッセイを実施するためのキット：トロンビン生成を誘導するためのトリガー分子、トロンビンによる切断に際して測定可能なトロンビン特異的なシグナルを生じるトロンビン特異的な基質、プラスミンによる切断に際して測定可能なプラスミン特異的なシグナルを生じるプラスミン特異的な基質、プラスミン生成を誘導するためのトリガー分子、リン脂質含有表面およびカルシウムイオン。
【請求項１５】
トロンビン生成を誘導するためのトリガー分子が、外因系のイニシエーター、特に組織因子（ＴＦ）、または内因系のイニシエーター、特にガラス、カオリン、酸である、請求項１４記載のキット。
【請求項１６】
アッセイにおけるプラスミン生成を誘導するためのトリガー分子が、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼおよび組織プラスミノーゲンアクチベーターから選択され、そして好ましくは組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）である、請求項１４記載のキット。
【請求項１７】
基質が、測定されるべき分子との接触に際して測定可能な基を遊離する化合物である、請求項１４〜１６のいずれか１項記載のキット。
【請求項１８】
基質が蛍光基質である、請求項１４、１５または１６記載のキット。
【請求項１９】
基質が異なる励起および発光スペクトルを有する、請求項１８記載のキット。
【請求項２０】
トロンビン特異的な基質が７−アミノ−４−メチルクマリンに結合される、請求項１９記載のキット。
【請求項２１】
トロンビン特異的な基質がＢｚ−β−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ−ＡｃＯＨである、請求項１９記載のキット。
【請求項２２】
プラスミン特異的な基質がローダミン１１０に結合される、請求項１９記載のキット。
【請求項２３】
プラスミン特異的な基質が（ｂｉｓ−（ＣＢＺ−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アルギニンアミド））である、請求項２２記載のキット。
【請求項２４】
以下の工程を包含する、２つ以上の反応が同時に分析されるアッセイ：表面、試験されるべきサンプル、測定されるべき反応を誘導するためのトリガー分子、反応の結果である測定可能なシグナルを生じる基質を含む反応混合物を提供する工程、およびｔ＝０で開始する時間内に反応混合物中に生成されたシグナルを決定する工程、ここで試験されるべき反応において処理される異なる基質のスペクトルは重複しない、アッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２つ以上の反応パラメーター、特にトロンビン生成およびプラスミン生成を同時に決定するためのアッセイに関する。本発明はさらに、アッセイを実施するためのキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
正常な生理的状態では、止血（血液の損失を防止するために血液が凝固する迅速性）は、フィードバック機構によって止血均衡に保たれている。止血均衡は、線維素溶解系としての凝血促進および抗凝血経路ならびに血管壁の両方に依存している。止血均衡が平衡でない場合、病理学的な凝固（血管封鎖）または放血（出血）が、正常な止血に取って代わり得る。
【０００３】
止血系の異常は、後天性または先天性であり得る。そのような場合、治療介入を至適化するために、患者を診断、モニターおよび管理することが臨床的に重要である。
【０００４】
大部分の凝血試験は、エンドポイントアッセイ（これは、比濁法によって血漿の凝固時間またはリアルタイム血餅溶解を検出する）を含む。日常的に実施されているとはいえ、現在利用可能な凝血アッセイは、増加する凝血をモニターするための道具としてこれらを潜在的に信頼できないものにしている固有の制限を有する。さらに、凝血試験の結果と術後出血または再発性血栓症の予防との間の良好な相関は常には存在しない。
【０００５】
大部分の制限は、これらがインビトロにおける血餅形成の時間を測定し、そして外因性試薬（例えば、抗凝血剤によって結合されたものを補充するための組織因子、カオリンおよびＣａ２＋イオン）の添加を必要とするエンドポイント試験であり、従って患者の血栓性ポテンシャル（凝固ポテンシャル）を必ずしも反映していないという事実に関する。
【０００６】
上記の試験と比較して、ＥＰ−４２０  ３３２は改善されたトロンビン生成アッセイを開示する。このアッセイにおいて、血漿の凝固についてだけでなく血餅形成後の全トロンビン生成についての情報も集められる。これらのアッセイは最初に色素生産性基質を用いて実施され、そして後に蛍光発生基質を用いて実施された。さらに、少血小板血漿および多血小板血漿を用いるいくつかのトロンビン生成アッセイが開示されている。
【０００７】
これらのアッセイにおいて再び、制限は増加する凝血性（血栓形成傾向）の測定である。血栓形成傾向は、過剰な凝固についての増加した傾向（しばしば繰り返された、そしてしばしば延長された期間にわたっての）が存在する状態の群を記載するために使用される用語である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
それゆえ、上記に示される欠点を有さず、より簡便な、そしてトロンビン生成依存的に線維素溶解を測定し得る新たなアッセイについての必要性が存在する。そのようなアッセイを提供することが、本発明の目的である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明に至った研究において、トロンビン生成ならびにプラスミン生成が早く（単一ウェル中で同時に）決定され得る新たなアッセイ（特に蛍光定量的アッセイ）が開発された。本発明の止血アッセイは、既存のアッセイと２つの点において異なる。本発明のアッセイは、単一ウェル中でのトロンビンおよびプラスミン両方の生成の同時検出を提供する。さらに、アッセイは、トロンビンまたはフィブリンの添加の代わりに、トロンビン生成依存性プラスミン生成を使用する。これは、線維素溶解での異常によって誘導される凝血における異常を測定することの可能性を導く。
【００１０】
従って本発明は、以下の工程を包含する止血アッセイに関する：試験されるべき血液産物、トロンビン生成を誘導するためのトリガー分子、トロンビンによる切断に際して測定可能なトロンビン特異的なシグナルを生じるトロンビン特異的な基質、プラスミン生成を誘導するためのトリガー分子、プラスミンによる切断に際して測定可能なプラスミン特異的なシグナルを生じるプラスミン特異的な基質、カルシウムイオンおよびリン脂質含有表面を含む反応混合物を提供する工程、ならびにトロンビン特異的なおよびプラスミン特異的なシグナルを測定することによってｔ＝０で開始する時間内に反応混合物中に生成されたトロンビンの量およびプラスミンの量を決定する工程。
【００１１】
本発明のアッセイは、単一容器中で適切に実施され得る。血液サンプルの大量試験のために、アッセイが実施される容器は適切にはマイクロタイタープレートのウェルである。そのようなマイクロタイタープレートは、当該分野において周知の機器において自動的に処理され得る。１つの実施態様において、試薬は血液サンプルが添加される前に容器中に適切に含まれ、そして例えば壁にコートされるか、または凍結乾燥形態で存在し得る。これは、キットにおいて特に有用である。しかし反対に、すなわち最初に血液産物、次いでその他の試薬をウェルに添加することもまた可能である。
【００１２】
種々の血液産物（例えば、血漿、全血、ドレイン液および多血小板血漿）におけるトロンビンおよびプラスミンの生成を決定するために本発明のアッセイは使用され得る。
【００１３】
リン脂質含有表面は、例えば、リン脂質小胞、セファリン、細胞、特に内皮細胞、血小板、細菌、ウイルス、内皮細胞のマトリックスもしくは微小血管または当業者に公知の他の表面からなる。
【００１４】
トロンビン生成を誘導するためのトリガー分子は、適切には組織因子（ＴＦ）である。ＴＦは、第ＶＩＩａ因子とともに複合体形成して、ＸをＸａに直接的に変換することによってか（外因系）、またはＩＸをＩＸａに変換し、これが今度はＶＩＩＩａとともに複合体形成して、ＸをＸａに変換することによってＸａを生成することにより間接的に、止血を媒介する。第Ｘａ因子は、一旦生成されると、その補因子、Ｖａとともに複合体形成して、プロトロンビン（ＩＩ）をトロンビン（ＩＩａ）に変換する。ＴＦは、それが外因系について体内で見出される同じトリガーであるので、好ましい。内因系についてのトリガーは、例えばガラス、カオリン、シリカまたは酸のような表面である。
【００１５】
プラスミンは、プラスミノーゲンアクチベーターによってプロ酵素、プラスミノーゲンの活性化により形成される。組織プラスミノーゲンアクチベーターは、多くの組織において見出される。組織プラスミノーゲンアクチベーターは内皮細胞および活性化血小板によって放出される。体内での天然の状態においてもトリガーであるので、本発明のアッセイにおいてプラスミン生成を誘導するためのトリガー分子は適切には組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）である。他のトリガーの例は、ウロキナーゼおよびストレプトキナーゼである。
【００１６】
本発明の止血アッセイは、好ましくは異なる蛍光励起および発光スペクトルを有する２つの蛍光基質（トロンビン用に１つおよびプラスミン用に１つ）を使用する。トロンビンによるトロンビン特異的な蛍光基質の切断の後、励起の後に発光波長において蛍光シグナルが決定され得る。プラスミン特異的な蛍光基質についても同じことが当てはまる。
【００１７】
好ましくは、互いに干渉しない２つの蛍光基質が選択される。実際には、これは異なる蛍光基質のスペクトルが重複しないことを意味する。従って、本発明のアッセイは、トロンビンおよびプラスミン両方の生成を同時に測定するように実施され得る。２組のフィルターを備えた蛍光光度計を使用することによって、単一のウェル中でリアルタイムに両方の産物が決定され得る。適切な基質の例は以下のとおりである：７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）に結合されたトロンビン特異的な基質（Ｂｚ−β−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ−ＡｃＯＨ）；およびローダミン１１０に結合されたプラスミン特異的な基質（ｂｉｓ−（ＣＢＺ−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アルギニンアミド））。
【００１８】
トロンビンおよびプラスミン両方の生成に対する薬物、タンパク質、細胞または他の添加物の効果、ならびにまたそれぞれプラスミン生成またはトロンビン生成に対する妨害されたトロンビンまたはプラスミン生成の効果を決定するために本発明のアッセイは使用され得る。そのような添加物の効果を測定するために、それらは反応混合物に添加され得る。これらの添加物はまた、アッセイが実施される容器中のウェル（例えば、９６ウェルプレートのウェル）にコートされ得る。内皮細胞が反応混合物の一部である場合、これらはウェル中で培養され得る。
【００１９】
さらに、異なる条件が反応を開始するために選択され得る。例えば、異なる濃度の試薬が使用され得る。
【００２０】
本発明の方法は、現在利用可能な試験と比較して以下の利点を有する。外因および内因凝固系についての情報が、１つのアッセイにおいて得られる。これまでは、ＡＰＴＴおよびＰＴ標準凝固アッセイを実施することによってのみこの情報は集められ得る。本発明はさらに、少血小板血漿中で実施される標準トロンビン生成アッセイを用いては可能でない凝血性亢進もまた決定する可能性を提供する。本発明のアッセイを用いて、血漿の脱線維素なしのトロンビン生成の直接分析が可能である。この前条件工程は、公知のヘンカー（Ｈｅｍｋｅｒ）のトロンビン生成アッセイにおいて初めに必要とされる。さらに、本発明のアッセイは、トロンビンおよびプラスミン両方の生成の直接かつオンラインの分析を提供し、これは結果の直接的な解釈を可能にする。さらに、線維素溶解および凝血に対する線維素溶解の効果について即時的な結果が得られる。線維素溶解を分析するために実施されなければならない前条件工程はない。真性グロブリン血餅溶解試験において、これらの工程は必須である。
【００２１】
上記の特異的なアッセイに加えて、本発明は２つ以上の反応が同時に分析されるより一般的なアッセイを提供する。主な要件は、試験されるべき反応において処理される異なる基質のスペクトルが重複しないことである。
【００２２】
そのような一般的な方法は、以下を包含する：表面、試験されるべきサンプル、測定されるべき反応を誘導するためのトリガー分子、反応の結果である測定可能なシグナルを生じる基質を含む反応混合物を提供する工程、およびｔ＝０で開始する時間内に反応混合物中で生じるシグナルを決定する工程。表面は、特にトロンビン生成についてはリン脂質表面であり、そしてプラスミン生成については内因的に形成されたフィブリンである。
【００２３】
本発明の特定の実施態様において、試験されるべき反応はトロンビン生成およびプラスミン生成である。凝血因子および／または細胞のいずれかの異なる対を用いて、他の対の反応もまた試験され得る。例はトロンビン生成および血小板特異的な酵素の放出である。基質は試験されるべき酵素に依存する。一般に、スペクトルが重複しない限り、システムは１つの実験において２つより多い分析すら受け入れ得る。
【００２４】
本発明はさらに、以下の試薬の１つ以上を含む容器を含む本発明のアッセイを実施するためのキットに関する：トロンビン生成を誘導するためのトリガー分子、トロンビンによる切断に際して測定可能なトロンビン特異的なシグナルを生じるトロンビン特異的な基質、プラスミンによる切断に際して測定可能なプラスミン特異的なシグナルを生じるプラスミン特異的な基質、プラスミン生成を誘導するためのトリガー分子、リン脂質表面、およびカルシウムイオン。容器中に存在しないこのリストのその他の試薬は、キットの一部であるか、または別々に添加され得るかのいずれかである。アッセイを実施するに際して全ての試薬を存在させることが重要である。全ての試薬および試験されるべき血液産物が反応混合物中に存在すると、反応は開始される。
【００２５】
種々の試薬の異なる実施態様が上記されている。
【００２６】
続く実施例において、異なる患者サンプルを使用して本発明のアッセイが試験された。アッセイ内およびアッセイ間両方の変動が確立された。
【実施例】
【００２７】
実施例
材料および方法
１．基質
試験するために使用した基質は、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）に結合されたトロンビン特異的な基質（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ、Ｂｚ−β−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ−ＡｃＯＨ、製品番号ＰＦ０８２−２１）、およびローダミン１１０に結合されたプラスミン特異的な基質（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ローダミン１１０、ｂｉｓ−（ＣＢＺ−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アルギニンアミド）、ジヒドロクロリド、製品番号Ｒ−６５０２）であった。
【００２８】
２．アッセイ条件
アッセイ条件は以下の通りであった：
８０μｌ  クエン酸塩添加血漿
２μｌ  セファリン（Ｒｏｃｈｅ製品番号５２４２９８（１ｍｌの蒸留水に溶解））
２μｌ  組換え組織因子（Ｉｎｎｏｖｉｎ、Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）（最終濃
度０．１ｐＭ）
１９μｌ  トリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ、５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  
ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）、以下を含む
−トロンビン特異的な蛍光発生基質（最終濃度８３３μＭ）
−プラスミン蛍光発生基質（最終濃度３３μＭ）
１７μｌ  ＴＢＳ、以下を含む
−組換えｔＰＡ（Ａｃｔｉｌｙｓｅ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  
Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）（最終濃度１５０ＩＵ／ｍｌ）
−ＣａＣｌ２（最終Ｃａ２＋濃度１６．７ｍＭ）
【００２９】
３．方法
サーモスタットを備えた蛍光光度計において、蛍光発生シグナルを決定した。トロンビン（線Ａ）については、励起波長は３５５ｎｍであり、そして発光波長は４６０ｎｍであった。プラスミン（線Ｂ）については、励起波長は４８５ｎｍであり、そして発光波長は５２０ｎｍであった。一次導関数を計算し、プロットした。代表的なプロットを図１に示す。
【００３０】
４．実験
実施例１において、種々の試薬の濃度を変動させて上記の実験を実施した。実施例２において、種々の患者の血漿を試験した。
【００３１】
実施例１
異なる試薬の効果
１．ヒルジン
異なるヒルジン濃度の存在下でトロンビンおよびプラスミンの生成を試験した。結果を図２および表１に示す。
【００３２】
【表１】
2008526219.tif 000003
【００３３】
図２において、パネルＡにトロンビン生成を示し、一方パネルＢはプラスミン生成を示す。異なるヒルジン濃度を使用した：０（線ａ）、２（線ｂ）、８（線ｃ）、１７（線ｄ）、３３（線ｅ）および８３（線ｆ）Ｕ／ｍｌ。
【００３４】
ヒルジンは、トロンビンの直接的なインヒビターである。おそらくトロンビンによって第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子および第ＸＩ因子のいずれもが活性化されないという事実に起因して、ヒルジン濃度の増加は、トロンビン生成の阻害および遅延の両方をさせる。パネルＢにおいて、トロンビン生成の阻害に起因して、フィブリン形成が遅延されるのでプラスミン生成は遅延されるのみである。
【００３５】
２．トリプシンインヒビター
トウモロコシトリプシンインヒビター（ＣＴＩ）（内因系のインヒビター）の添加もまた試験した。ＣＴＩはトロンビン生成およびプラスミン生成の両方に影響を及ぼさず、このことは反応が完全に組織因子依存性であることを示す（データは示さず）。
【００３６】
３．ｔ−ＰＡ
正常プール化血漿におけるｔＰＡ用量設定のために、以下のように、異なる組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）濃度を使用した：６００（線ａ）、２３０（線ｂ）、１５０（線ｃ）、１１０（線ｄ）、７５（線ｅ）および０（線ｆ）ＩＵ／ｍｌ。結果を図３および表２に示す。図３のパネルＡはトロンビン生成を表す。パネルＢはプラスミン生成を表す。
【００３７】
【表２】
2008526219.tif 000004
【００３８】
ｔ−ＰＡ濃度が高ければ高い程、より多くのプラスミン、および興味深いことにより多くのトロンビンが生成される。通常の条件下で、アッセイにおいて１５０ＩＵ／ｍｌのｔ−ＰＡ（ｄ）を使用する。この濃度の使用は、トロンビン活性化線溶阻害因子（ＴＡＦＩ）活性の検出を可能にする。ｔ−ＰＡ濃度がより高い場合、血餅溶解はより速くなり、そしてより低いＴＡＦＩ活性を観察し得る。
【００３９】
４．活性型プロテインＣ
活性型プロテインＣの添加の後のトロンビン（Ａ）およびプラスミン（Ｂ）の生成を試験するために、以下のように、異なるＡＰＣ濃度を使用した：１０．２５μｇ／ｍｌ（線ａ）、５．１（線ｂ）、４．１（線ｃ）、２．６（線ｄ）、１．７（線ｅ）、および０（線ｆ）μｇ／ｍｌ。結果を図４および表３に示す。
【００４０】
【表３】
2008526219.tif 000005
【００４１】
図４において、線（ｆ）はＡＰＣ添加なしの状態を表す。活性型プロテインＣは第Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ因子を不活化する。それで、ＡＰＣは抗凝血経路の一部である。予想通り、ＡＰＣの添加はもっぱらトロンビンポテンシャル（パネルＡ）に影響を及ぼし、そしてＴＡＦＩ活性に影響を及ぼす。なぜなら、活性化されるためにＴＡＦＩは比較的高濃度のトロンビンを必要とするからである。ＡＰＣなしの状態（線ｆ）において、ＴＡＦＩ活性に起因して線維素溶解は遅延される。
【００４２】
５．トロンボモジュリン
異なるトロンボモジュリン（ＴＭ）濃度の存在下で、トロンビンおよびプラスミンの生成を測定した。図５のパネルＡおよび表４にトロンビン生成を示し、一方パネルＢにプラスミン生成を示す。以下のように、異なる濃度のＴＭを使用した：０（線ａ）、０．０８５ｎＭ（線ｂ）、０．１７（線ｃ）、０．３４（線ｄ）、１０．２（線ｅ）、５１（線ｆ）および１０２ｎＭ（線ｇ）。
【００４３】
ＴＭは、トロンビン結合に基づく２つの活性を有する。第１に、ＴＭはプロテインＣを活性型プロテインＣ（ＡＰＣ）に活性化する。ＡＰＣは第Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ因子を不活化し、従ってトロンビン形成を阻害する（Ａ）。第２の活性は、トロンビン活性化線溶阻害因子（ＴＡＦＩ）の活性化である。ＴＡＦＩはフィブリンからカルボキシ末端アミノ酸を除去することによって線維素溶解を阻害し、そしてそれによりプラスミノーゲン結合部位を除去する。ＴＭが多ければ多い程、ＴＡＦＩの活性として予期されるプラスミン生成の開始により長い時間を要する（パネルＢ）。ＡＰＣの活性化より低いＴＭ濃度でＴＡＦＩの活性化が生じる。
【００４４】
【表４】
2008526219.tif 000006
【００４５】
６．カルボキシペプチダーゼインヒビター
トロンボモジュリン（ＴＭ）およびカルボキシペプチダーゼインヒビター（ＣＰＩ）（ＴＡＦＩのインヒビター）の存在下で、トロンビン生成およびプラスミン生成を測定した。線（ａ）は、いずれの添加もない通常の状態を表す。線（ｂ）は、０．６８ｎＭ  ＴＭの存在下での状態を表す。線（ｄ）は３３μｇ／ｍｌ  ＣＰＩを含む状態を、そして線（ｃ）はＴＭおよびＣＰＩを含む状態を表す。図６および表５は結果を示す。
【００４６】
再び、ＴＭはＴＡＦＩを活性化して、遅延されたプラスミン生成をもたらす。ＣＰＩの存在下で、プラスミン生成は直ちに開始する。ＣＰＩはまたＴＭの効果を無効にし、このことは確かにＴＭがＴＡＦＩを活性化することを示す。従って、通常の状態においてさえＴＡＦＩ活性が存在する。
【００４７】
【表５】
2008526219.tif 000007
【００４８】
７．プラスミン
異なるプラスミン濃度の存在下でトロンビンおよびプラスミンの生成を測定した。図７のパネルＡにトロンビン生成を示し、一方パネルＢにプラスミン生成を示す（表６もまた参照のこと）。以下の最終プラスミン濃度を使用した：０（線ａ）、１（線ｂ）、３（線ｃ）、６（線ｄ）、９（線ｅ）、１３（線ｆ）、１６（線ｇ）、１９（線ｈ）、２２（線ｉ）、および２５（線ｊ）μｇ／ｍｌ。
【００４９】
プラスミンがトロンビン生成に影響を及ぼすことを証明するために、反応混合物にプラスミンを直接添加した。予想どおり、プラスミンの添加は、プラスミン生成曲線に対する効果を直接的に有した。さらに、プラスミンがトロンビン生成のラグ時間を短縮しそして最大トロンビンピーク高さを増加させるので、プラスミンはトロンビン生成にも影響を及ぼす。
【００５０】
【表６】
2008526219.tif 000008
【００５１】
実施例２
種々の臨床状態の試験
１．線維素溶解患者
図８は、正常プール化血漿（線ｃ、ｆ）、α２抗プラスミン欠損を有する患者（線ｂ、ｅ）およびＰＡＩ−１過剰を有する患者（線ａ、ｄ）の血漿におけるトロンビン（線ａ〜ｃ）およびプラスミン（ｄ〜ｆ）の生成を示す（表７もまた参照のこと）。
【００５２】
【表７】
2008526219.tif 000009
【００５３】
この実施例において、α２−ＡＰを有する患者（線ｂ、ｅ）は非常に増加したプラスミンピーク高さならびに、これに起因して、トロンビン生成における減少したラグ時間、および増加したトロンビン生成さえ有することが観察された。プラスミノーゲン活性化因子インヒビター２型（ＰＡＩ−２）過剰を有する患者（線ａ、ｄ）は反対の効果を示す。プラスミン生成はほとんど存在せず、そしてトロンビン生成は遅延される。全トロンビン生成に対する効果は観察されない。
【００５４】
２．第ＶＩＩ因子欠損
第ＶＩＩａ因子補充の前（線ａ、ｃ）および後（線ｂ、ｄ）での第ＶＩＩ因子欠損を有する患者の血漿中のトロンビンおよびプラスミンの生成を測定した。図９の線ａは第ＶＩＩ（ａ）因子補充の前のトロンビン生成を、線ｃはプラスミン生成を表し、一方線ｂおよびｄはそれぞれ４０μｇ／ｋｇの第ＶＩＩａ因子補充の１０分後である。表８もまた参照のこと。
【００５５】
【表８】
2008526219.tif 000010
【００５６】
患者は＜１％の第ＶＩＩ因子活性を有し、そして遅延されたトロンビン生成曲線および遅延されたプラスミン生成曲線（線ａおよびｃ）を示す。第ＶＩＩａ因子の補充は、トロンビンおよびプラスミンの生成のラグ時間を減少させる（線ｂおよびｄ）。興味深いことに、全トロンビン生成（トロンビンポテンシャル）において効果は観察されず、このことはボウマループ（Ｂｏｕｍａ  ｌｏｏｐ）が妨害されないことを示す（これは、重篤な血友病Ａ（ＨＡ）を有する患者における場合である）。
【００５７】
トロンビン生成と同様に、活性化の後にプラスミン生成が同様に速やかに遅延される。これは、フィブリン形成の後にプラスミン生成が誘発されるという事実によって説明され得る。ＴＡＦＩ（線溶阻害因子）が、同様に活性化される。
【００５８】
３．血友病Ａ
本発明のアッセイにおいて、重篤な血友病Ａを有する患者の血漿を試験した。図１０および表９は結果を示す。
【００５９】
【表９】
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【００６０】
図１０において、線は正常プール化クエン酸塩添加血漿を使用して測定したトロンビン（ａ〜ｃ）およびプラスミン（ｄ〜ｆ）の生成を表す。線ｂおよびｅは第ＶＩＩＩ因子補充前の重篤な血友病Ａ患者の血漿を表し、一方線ｃおよびｆは第ＶＩＩＩ因子補充後のＨＡ患者の血漿を表す。
【００６１】
血友病Ａ患者においてトロンビン生成は明らかに減少され、そして第ＶＩＩＩ因子補充によって部分的に回復されることが理解され得る。次に、補充の前に患者においてプラスミン生成は増強され、そして第ＶＩＩＩ因子補充後に部分的に回復される。ＴＡＦＩ（線溶阻害因子）は活性化されず（低いトロンビンレベルに起因して）、従ってより多くのプラスミンが生成されると説明され得る。
【００６２】
４．プロトロンビン欠損
正常プール化血漿（ａおよびｃ）ならびにプロトロンビン欠損（５％）を有する患者の血漿（ｂおよびｄ）におけるトロンビン（図１１の線ａおよびｂ）ならびにプラスミン（線ｃおよびｄ）の生成を測定するために本発明のアッセイを使用した。表１０もまた参照のこと。
【００６３】
【表１０】
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【００６４】
患者は妨害されたトロンビン生成、および結果としてトロンビンによるＴＡＦＩ活性化の欠如によって部分的に説明され得る増加した線維素溶解活性を有する。ＴＡＦＩは、プラスミン生成を通常阻害する。
【００６５】
５．血栓形成傾向患者
正常プール化血漿（線ａおよびｆ）、ならびに種々の血栓形成傾向患者、すなわち第Ｖ因子ライデンについてヘテロ接合性の患者（線ｂおよびｇ）、プロトロンビン変異についてヘテロ接合性（線ｃおよびｈ）、プロテインＳ欠損を有する患者（線ｄおよびｉ）、およびプロテインＣ欠損を有する患者（線ｅおよびｊ）由来の血漿におけるトロンビン（線ａ〜ｅ）およびプラスミン（線ｆ〜ｊ）の生成を測定した。図１２および表１１に結果を示す。
【００６６】
【表１１】
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【００６７】
興味深いことに、全ての血栓形成傾向患者が減少したトロンビン生成ラグ時間、増加した全トロンビン生成（トロンビンポテンシャル）、および興味深いことに減少したプラスミン生成を有し、その結果増加した血餅溶解時間がもたらされる。より高いＴＡＦＩ活性化およびこれに起因する遅延されたプラスミン生成が、説明となり得る。少し後に、ＴＡＦＩの活性はなくなり、そして正常なプラスミン生成が生じる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
以下の図面に言及する。
【図１】図１は、本発明のアッセイから得られる代表的なプロットを示す。線（ａ）は、ｎＭ／分で表現されるトロンビン生成の一次導関数を表す（標準計算曲線を介しての）。線（ｂ）は、ＦＵ／分で表現されるプラスミン生成の一次導関数を表す。グラフから以下のデータが生じさせられ得る。  １：トロンビン生成ラグ時間  ２：トロンビンピークまでの時間  ３：最大トロンビン生成  ４：トロンビンポテンシャル  ５：凝血促進トロンビンポテンシャル  ６：抗凝血トロンビンポテンシャル  ７：プラスミン生成低下時間（血餅形成開始）  ８：プラスミン生成ピーク時間（可溶化血餅）  ９：血餅溶解時間  １０：プラスミン生成ピーク時間でのプラスミン生成レベル  １２：プラスミンポテンシャル加速期（血餅溶解範囲）  １３：プラスミンポテンシャル（１０分間にわたって測定）
【図２】図２は、正常プール化クエン酸塩添加血漿を使用する異なるヒルジン濃度の存在下でのトロンビン（Ａ）およびプラスミン（Ｂ）の生成を示す。
【図３】図３は、正常プール化クエン酸塩添加血漿を使用するトロンビン（Ａ）およびプラスミン（Ｂ）の生成に対するｔＰＡ用量設定の効果を示す。
【図４】図４は、正常プール化クエン酸塩添加血漿を使用する活性型プロテインＣの添加の後のトロンビン（Ａ）およびプラスミン（Ｂ）の生成を示す。
【図５】図５は、正常プール化クエン酸塩添加血漿を使用する異なるトロンボモジュリン（ＴＭ）濃度の存在下でのトロンビン（Ａ）およびプラスミン（Ｂ）の生成を示す。
【図６】図６は、正常プール化クエン酸塩添加血漿を使用するトロンボモジュリン（ＴＭ）およびカルボキシペプチダーゼインヒビター（ＣＰＩ）（ＴＡＦＩのインヒビター）の存在下でのトロンビン生成およびプラスミン生成を示す。
【図７】図７は、正常プール化クエン酸塩添加血漿を使用する異なるプラスミン濃度の存在下でのトロンビン（Ａ）およびプラスミン（Ｂ）の生成を示す。
【図８】図８は、α２抗プラスミン欠損を有する患者およびＰＡＩ−１過剰を有する患者の正常プール化クエン酸塩添加血漿におけるトロンビンおよびプラスミンの生成を示す。
【図９】図９は、第ＶＩＩａ因子補充の前および後での第ＶＩＩ因子欠損を有する患者の血漿におけるトロンビンおよびプラスミンの生成を示す。
【図１０】図１０において、線ａおよびｄは、正常プール化クエン酸塩添加血漿を使用して測定されたトロンビン（線ａ）およびプラスミン（線ｄ）の生成を表す。線ｂおよびｅは、第ＶＩＩＩ因子補充前の重篤な血友病Ａ患者の血漿を表し、一方線ｃおよびｆは第ＶＩＩＩ因子補充後のＨＡ患者の血漿を表す。
【図１１】図１１は、正常プール化血漿におけるトロンビン（線ａ）およびプラスミン（線ｃ）の生成、ならびにプロトロンビン欠損（５％）を有する患者の血漿におけるトロンビンおよびプラスミンの生成（それぞれ線ｂおよびｄ）を示す。
【図１２】図１２は、正常プール化血漿（線ａおよびｆ）、ならびに第Ｖ因子ライデンについてヘテロ接合性（線ｂおよびｇ）、プロトロンビン変異についてヘテロ接合性（線ｃおよびｈ）、プロテインＳ欠損（線ｄおよびｉ）、およびプロテインＣ欠損（線ｅおよびｊ）の患者由来の血漿におけるトロンビン（線ａ〜ｅ）およびプラスミン（線ｆ〜ｊ）の生成を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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