(57)【要約】  注射可能薬剤充填マイクロスフェアが、ポリエステルの不飽和官能化多価アルコールエステから、不飽和官能化エステルを疎水性有機溶媒に溶解させ、薬剤および／または生物学的活性剤を水に溶解させ、２溶液を混合して油中水型エマルジョンを形成させ、安定化剤の水性溶液を形成し、油中水型エマルジョンおよび安定化剤溶液を混合して、水中油中水型エマルジョンを形成させ、そして有機溶媒を蒸発させることを含む、方法により得られる。
2008504258.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ)ポリエステルの不飽和官能化多価アルコールエステルを疎水性有機溶媒に溶解させ、
(ｂ)薬剤および／または他の生物学的活性剤を水に溶解させ、
(ｃ)段階(ａ)および段階(ｂ)で形成させた溶媒を混合してエマルジョンを形成させ、ここで、段階(ａ)において形成させた溶液が連続相を構成し、そして段階(ｂ)において形成させた溶液が分散相を構成し、
(ｄ)安定化剤を水に溶解させ、
(ｅ)段階(ｄ)で形成させた溶液と段階(ｃ)で形成させたエマルジョンを混合して、水中油中水型(water-in-oil-in-water)エマルジョンを形成させ、ここで、段階(ｄ)の溶液が連続相を構成し、そして段階(ｃ)で形成させたエマルジョンが分散相を構成し、
(ｆ)有機溶媒を、段階(ｄ)で形成させた水中油中水型エマルジョンから蒸発させて、該薬剤および／または他の生物学的活性剤をその中に封入したポリエステルの不飽和官能化多価アルコールエステルから硬化したマイクロスフェアを形成させ、
(ｇ)薬剤／生物学的活性剤充填硬化マイクロスフェアを回収する
段階を含む、薬剤／生物学的活性剤充填注射可能マイクロスフェアの形成法。
【請求項２】
ポリエステルの不飽和官能化多価アルコールエステルを、ε−カプロラクトンモノマーまたはε−カプロラクトンモノマーとラクチドモノマーもしくはグリコリドモノマーのブレンドを、３個から６個のヒドロキシル基を含む多価アルコール存在下で重合化させて、ポリエステルの多価アルコールエステルを形成させ(ここで、アシル基は遊離ヒドロキシルをその末端に有する)、そして無水マレイン酸と反応させて該遊離ヒドロキシルのいくつかまたは各々を１−カルボキシル−２−カルボキシエテニル基を含む部分に変換させることにより得る、請求項１記載の方法。
【請求項３】
二重結合官能化ポリエステルの多価アルコールエステルを、ε−カプロラクトンモノマーを、グリセロール存在下で重合化させて、ポリエステルの多価アルコールエステルを形成させ(ここで、アシル基は遊離ヒドロキシルをその末端に有する)、そして無水マレイン酸と反応させて該遊離ヒドロキシルのいくつかまたは各々を１−カルボキシル−２−カルボキシエテニル基を含む部分に変換させることにより得る、請求項２記載の方法。
【請求項４】
二重結合官能化ポリエステルの多価アルコールエステルが１,０００から５０,０００の範囲の数平均分子量、Ｍｎを有する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
段階(ａ)の溶媒がポリエステルの不飽和官能化多価アルコールエステルを室温で溶解し、３０−４５℃の範囲の沸点を有するものである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
溶媒がジクロロメタンである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
安定化剤が安定化に有効な濃度で水に可溶性であり、段階(ａ)の溶媒に不溶性であり、水での洗浄により除去でき、そして日光および人工光に安定である、請求項４記載の方法。
【請求項８】
安定化剤が１０,０００から３０,０００の範囲の数平均分子量を有するポリビニルアルコールであり、８５−９０％加水分解され、そして段階(ｄ)で形成させた溶液に０.５％から５％ｗ／ｖの範囲で存在する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
段階(ｃ)で混合する段階(ｂ)で形成させた溶液対段階(ａ)で形成させた溶液の体積比が３：１から１０：１の範囲である、請求項４記載の方法。
【請求項１０】
光開始剤が段階(ａ)で形成させた溶液に存在し、段階(ｅ)で形成させた混合物中を照射して光架橋を得て、分散相粒子上にヒドロゲル表面を提供する、請求項４記載の方法。
【請求項１１】
(ａ)ポリエステルの不飽和官能化多価アルコールエステルを疎水性有機溶媒に溶解させ、
(ｂ)薬剤および／または他の生物学的活性剤を水に溶解させ、
(ｃ)段階(ａ)および段階(ｂ)で形成させた溶媒を混合してエマルジョンを形成させ、ここで、段階(ａ)で形成させた溶液が連続層を構成し、そして段階(ｂ)で形成させた溶液が分散相を構成し、
(ｄ)安定化剤を水に溶解し、
(ｅ)段階(ｄ)で形成させた溶液と段階(ｃ)で形成させたエマルジョンを混合して水中油中水型エマルジョンを形成させ、ここで、段階(ｄ)の溶液が連続層を構成し、そして段階(ｃ)で形成させたエマルジョンが分散相を構成し、
(ｆ)有機溶媒を水中油中水型エマルジョンから蒸発させて、該マイクロスフェアを形成するポリエステルの多価アルコールエステルの不飽和官能性に共有結合的に結合した薬剤／生物学的活性剤を有する、硬化したマイクロスフェアを形成させ、
(ｇ)薬剤／生物学的活性剤充填硬化マイクロスフェアを回収する
段階を含む、薬剤／生物学的活性剤充填注射可能マイクロスフェアの形成法。
【請求項１２】
マイクロスフェア注射後の持続放出のための、マイクロスフェアの１から１０重量％の薬剤または他の生物学的活性剤が充填された、硬化したポリエステルの不飽和官能化多価アルコールエステルの形の、１０から６０μｍの平均横断面を有する注射可能マイクロスフェア。
【請求項１３】
ポリエステルの不飽和官能化多価アルコールエステルを、ε−カプロラクトンモノマーをグリセロール存在下で重合化させてポリエステルの多価アルコールエステルを形成させ(ここで、アシル基は遊離ヒドロキシルをその末端に有する)、そして無水マレイン酸と反応させて該遊離ヒドロキシルのいくつかまたは各々を１−カルボキシル−２−カルボキシエテニル基を含む部分に変換させることにより得る、請求項１２記載の注射可能マイクロスフェア。
【請求項１４】
マイクロスフェアがヒドロゲルに変換されている、請求項１３記載の注射可能マイクロスフェア。
【請求項１５】
薬剤／生物学的活性剤がマイクロスフェア中に封入されている、請求項１２記載の注射可能マイクロスフェア。
【請求項１６】
薬剤／生物学的活性剤が該マイクロスフェアを形成するポリエステルの多価アルコールエステルの不飽和官能性に共有結合している、請求項１２記載の注射可能マイクロスフェア。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００４年６月２８日出願の米国仮出願６０／５８２,８２３の利益を主張し、その全体を引用により本明細書に包含する。
【０００２】
本発明は、一部、米商務省により提供されたNational Textile Center受託番号00-27-07400の米国政府支援のもとに成された。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本発明は、薬剤／生物学的活性剤充填注射可能ヒドロゲルマイクロスフェアおよび、身体への薬剤／生物学的活性剤の制御放出に有用であるそれにより形成された薬剤／生物学的活性剤充填マイクロスフェアに関する。
【背景技術】
【０００４】
封入されたまたは共有結合された薬剤を有するマイクロスフェアは、外科的インプラントの代替としての注射可能懸濁液の供給を可能にし、一回の注射で複数薬剤の投与を可能にする。これらのマイクロスフェアは、治療的濃度に到達させるための初期バースト、続く代謝的損失を補うことにより治療濃度を維持するための薬剤の０次放出を提供する。故に、マイクロスフェアは治療濃度の持続放出を提供する。
【０００５】
Ｄ,Ｌ−ラクチド／グリコリドからの生物分解性ポリエステルのマイクロスフェアおよびε−カプロラクトンからの生物分解性ポリエステルのマイクロスフェアは、薬剤および巨大分子の身体への制御された放出のために注目されている。しかしながら、これらのポリエステルは相対的に疎水性であり、より親水性の表面が、循環系における有効寿命を延ばすために、および炎症性応答の発生を減少させるために、注射可能マイクロスフェアに対して望まれる。親水性特性は、ポリエステルマイクロスフェアの親水性ポリマーでの表面修飾により達成されている。故に、より親水性の表面を有するポリエステルマイクロスフェアは、親水性ポリマーの化学結合または物理的吸着の確実性を損なわなずには得られない。
【発明の開示】
【０００６】
本発明により、表面親水性を有する生物分解性注射可能ポリエステルマイクロスフェアが、不飽和官能化、例えば、二重結合官能化、ポリエステルの多価アルコールエステル、例えば、米国特許６,５９２,８９５およびLang, M., et al., Journal of Polymer Science:Park A:Polymer Chemistry, Vol. 40, 1127-1141 (2002)(両文献の全体を、引用により本明細書に包含する)に記載のものから、マイクロスフェアを形成することにより、親水性ポリマーでの表面修飾なしに製造できることが発見された。
【０００７】
ここに、一つの態様において(第一の態様と記す)、本発明は、二重エマルジョン技術を利用し、
(ａ)ポリエステルの不飽和官能化、例えば、二重結合官能化、多価アルコールエステルを疎水性有機溶媒に溶解させ、
(ｂ)薬剤および／または他の生物学的活性剤を水に溶解させ、
(ｃ)段階(ａ)および段階(ｂ)で形成させた溶媒を混合して第一エマルジョンを形成させ、ここで、段階(ａ)において形成させた溶液が連続相を構成し、そして段階(ｂ)において形成させた溶液が分散相を構成し、
(ｄ)安定化剤を水に溶解させ、
(ｅ)段階(ｄ)で形成させた溶液と段階(ｃ)で形成させたエマルジョンを混合して、水中油中水型(water-in-oil-in-water)エマルジョンを形成させ、ここで、段階(ｄ)の溶液が連続相を構成し、そして段階(ｃ)で形成させたエマルジョンが分散相を構成し、
(ｆ)有機溶媒を、段階(ｄ)で形成させた水中油中水型エマルジョンから蒸発させて、該薬剤および／または他の生物学的活性剤をその中に封入したポリエステルの不飽和官能化多価アルコールエステルから硬化したマイクロスフェアを形成させ、
(ｇ)その中に薬剤／生物学的活性剤が充填された硬化マイクロスフェアを回収する
段階を含む、薬剤／生物学的活性剤充填生物分解性注射可能マイクロスフェアの形成に関する。
【０００８】
他の例では(第二の態様と記す)、薬剤および／または他の生物学的活性剤が反応して不飽和官能性と共有結合を形成でき、そして段階(ｆ)で形成された硬化したマイクロスフェアおよび段階(ｇ)における回収は、該不飽和官能性で反応させてマイクロスフェアに共有結合させる。
【０００９】
好ましくは、第一および第二の態様のための該不飽和官能化、例えば、該二重結合官能化、多価アルコールエステルは、ε−カプロラクトンモノマーまたはε−カプロラクトンとラクチドモノマーまたはグリコリドモノマーのブレンドを、３個から６個のヒドロキシル基を含む多価アルコール存在下で重合化させて、多価アルコールエステルを形成させ(ここで、アシル基は遊離ヒドロキシルをその末端に有する)(ＰＧＣＬ)、そして無水マレイン酸と反応させて該遊離ヒドロキシルのいくつかまたは各々を２−カルボキシエテニル基、特に１−カルボキシル−２−カルボキシエテニル基を含む部分に変換させて、(ＰＧＣＬＭ)と呼ぶ(ＰＧＣＬ)のマレイン酸エステルを形成させることにより得る。
【００１０】
ポリエステルの多価アルコールエステルは、通常３種の異なる官能性末端基、すなわち未反応−ＯＨ、−ＣＯＯＨおよび＞Ｃ＝Ｃ＜を有し、多側鎖(arm)、例えば３側鎖化合物である。
【００１１】
第一の態様中の段階(ｆ)における溶媒蒸発は、ポリマー沈殿によるマイクロスフェアの硬化をもたらす。
【００１２】
ここに、他の態様において(本発明の第三の態様と記す)、本発明は、マイクロスフェア注射後の数ヶ月の期間にわたる持続放出のための、例えば、マイクロスフェアの１から１０重量％の薬剤または他の生物学的活性剤、例えば、タンパク質が充填された、硬化した不飽和官能化、例えば、二重結合官能化、多側鎖ポリエステルの多価アルコールエステルの形の、１５から６０μmの平均横断面を有する、生物分解性注射可能マイクロスフェアに関する。不飽和官能性は、遅延放出のための生物学的活性剤との共有結合を可能にし、そして、一方はマイクロスフェアからそして他方はヒドロゲルからである２種の異なる放出形態を可能にする利点を有するマイクロスフェア表面上のハイドロゲルを形成する機会を提供する。好ましい例では、該マイクロスフェアは、ε−カプロラクトンモノマーをグリセロール存在下で重合化させて多価アルコールエステルを形成させ(ここで、アシル基は遊離ヒドロキシルをその末端に有する)、そして無水マレイン酸と反応させて該遊離ヒドロキシルのいくつかまたは各々をカルボキシエテニル基、特に１−カルボキシル−２−カルボキシエテニル末端基を含む部分に変換させることにより得た、硬化した二重結合官能化ポリエステルの多価アルコールエステルの形である；すなわち、該マイクロスフェアは、−ＯＨ、−ＣＯＯＮおよび＞Ｃ＝Ｃ＜官能基を有する末端官能化３側鎖ポリ(ε−カプロラクトン)マレイン酸である二重結合官能化ポリエステルの多価アルコールエステルの形である。
【００１３】
別法として、マイクロスフェアの表面は、例えば、表面二重結合での架橋によりヒドロゲルに変換されている。充填は、例えば、薬剤または他の生物学的活性剤、例えば、任意の水溶性ペプチドまたはタンパク質、または水溶性ビタミン(全ビタミンＢ群、ビオチン、葉酸およびアスコルビン酸を含む)の、マイクロスフェア内および／またはマイクロスフェア表面のヒドロゲル内への封入によりおよび／または該マイクロスフェアの官能基(複数もある)への共有結合(すなわち、末端−ＯＨ、−ＣＯＯＮおよび＞Ｃ＝Ｃ＜官能基を介した)により得ることができる。マイクロスフェアの官能基(複数もある)に共有結合させるための薬剤または他の生物学的活性剤は、例えば、炭素−炭素二重結合(エン)および炭素−炭素三重結合(イン)の両方を含む化合物であるエンイン(抗癌性染料(dye))を含む。ここのマイクロスフェアは、親水性表面を有し、そして良好なかつより持続した治療剤の送達のために疎水性表面のマイクロスフェアよりも循環系において長い寿命を有する。
【００１４】
本明細書で使用する用語“生物分解性”は、正常に機能しているヒトおよび生存生物(例えば細菌)の体において、トリプシン、リパーゼおよびライソーム(lysome)のような種々の酵素によりおよび／または水性環境で分解できることを意味する。
【００１５】
ここに記載の分子量よび多分散性はポリスチレン標準を使用したゲル浸透クロマトグラフィーにより決定する。より特に、製造したポリマーの分子量(ＭｎおよびＭｗ)は、溶離剤としてテトラヒドロフラン(ＴＨＦ)(１.０ml／分)を、Water 510 HPLCポンプ、Water U6Kインジェクター、連続した３種のPSS SDVカラム(直線状および１０４および１００オングストローム)、およびMilton ROM示差屈折計を使用したゲル浸透クロマトグラフィー(ＧＰＣ)で、サンプル濃度はＴＨＦ  １mlあたり５−１０mgで、カラムは狭い分子量分布を有するポリスチレン標準で較正して、決定する。
【００１６】
図面の簡単な説明
図１は、ＰＧＣＬおよびＰＧＣＬＭの化学構造ならびにＮＰＧＣＬＭの代表的構造を示す；
図２Ａは、作業実施例において形成したＰＧＣＬＭ６５マイクロスフェアのサイズ分布を示す；
図２Ｂは、作業実施例において形成したＰＧＣＬＭ８１マイクロスフェアのサイズ分布を示す；
図２Ｃは、作業実施例において形成したＰＧＣＬＭ６１マイクロスフェアのサイズ分布を示す；
図３Ａは、作業実施例で得たＰＧＣＬＭ４１、ＰＧＣＬＭ６１、ＰＧＣＬＭ８１およびＰＧＣＬＭ８５についてのＯＶＡの累積的放出を示す；
図３Ｂは、作業実施例で得たＰＧＣＬＭ６１、ＰＧＣＬ６１および架橋ＰＧＣＬＭ６１(ＮＰＧＣＬＭ６１と呼ぶ)についてのＯＶＡの累積的放出を示す。
【００１７】
詳細な記載
ここで、我々は第一の態様の方法に話題を変える。
段階(ａ)のためのポリエステルの不飽和官能化多価アルコールエステルは、米国特許６,５９２,８９５およびLang, M., et al., Journal of Polymer Science:Part A:Polymer Chemistry, Vol. 40, 1127-1141 (2002)に記載され、それらの中に示される通りに合成できるポリエステルの二重結合官能化多価アルコールエステルを含む。
【００１８】
非常に好ましいポリエステルの二重結合官能化多価アルコールエステルは、ε−カプロラクトンモノマーをグリセロール存在下で重合させて、アシル基の末端に遊離ヒドロキシルを有するエステル(ＰＧＣＬ)を得て、無水マレイン酸と反応させて該遊離ヒドロキシルのいくつかまたは各々を２−カルボキシエテニル基、特に１−カルボキシル−２−カルボキシエテニル基に変換させることにより得る。これらのポリエステルの二重結合官能化多価アルコールエステルおよびそれらの製造は、米国特許６,５９２,８９５に記載され、本明細書でＰＧＣＬＭと呼ぶ。得られる化合物は、例えば、１,０００から５０,０００の範囲の数平均分子量、Ｍｎを有する。
【００１９】
段階(ａ)のための溶媒は、ポリエステルの不飽和官能化多価アルコールエステルを室温で溶解し、例えば、３０−４５℃の範囲の沸点を有する(これは溶媒の容易な除去を可能にする)ものである。段階(ａ)のための好ましい溶媒はジクロロメタン(３８.９−４０℃のｂｐ)である。段階(ａ)のための他の適当な溶媒は、クロロホルム、酢酸エチル、およびＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミドを含む。
【００２０】
段階(ａ)について、本ポリエステルの二重結合官能化多価アルコールエステルを、疎水性有機溶媒に、例えば、０.５から１０％ｗ／ｖの範囲の量で溶解する。濃度の上昇は最終的に得られるマイクロスフェアの平均直径の増加、ならびに、後記の通りに充填される水溶性薬剤の充填効率(loading efficiency)の増加をもたらし、そして少なくとも６％ｗ／ｖまでの増加は充填レベルの増加をもたらす(薬剤％、マイクロスフェアのｗ／ｗ)。
【００２１】
次に、我々は、マイクロスフェアに、そこからの持続放出のために充填される薬剤および／または他の生物学的活性剤；すなわち、薬剤および／または他の生物学的活性剤に話題を変える。本薬剤または生物学的活性剤は、例えば、アミノキシルラジカルの担体または抗炎症剤(例えば、セロリムス(serolimos))または抗増殖剤(例えば、パクリタキセル)、または生物製剤、またはタンパク質、またはサイトカイン、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、または遺伝子、または炭水化物、ホルモン、または上記の通りであり得る。
【００２２】
段階(ｂ)について、水溶性薬剤および／または他の生物学的活性剤を、１−５００mg／mlの濃度で水に溶解する。
【００２３】
段階(ｃ)で混合する段階(ｂ)の溶液対段階(ａ)の溶液の体積比は、例えば、３：１から１０：１であり得て、例えば、段階(ｃ)における水対ジクロロメタンの体積比は９：１から１：１の範囲であり得る。混合は８００から１,０００rpmで５分から１時間、磁気撹拌子を使用して行うことができる。
【００２４】
段階(ｄ)のための安定化剤は、段階(ａ)の溶媒に不溶性であり、水での洗浄により除去でき、そして日光および人工光に安定であり、水相と有機相の間の界面張力を減少させ、段階(ｅ)における小滴の崩壊を段階(ｆ)で硬化したマイクロスフェアを得る前に限定する化合物である。
【００２５】
好ましい安定化剤は、１０,０００から３０,０００の数平均分子量を有するポリビニルアルコール(ＰＶＡ)であり、それは８５−９０％加水分解され、段階(ｄ)で形成させた溶液中に０.５から１０％、例えば、０.５から５％ｗ／ｖの範囲の量で存在する。０.５％ｗ／ｖ未満の量でのＰＶＡの使用は望ましくないマイクロスフェアの凝集と、続く大きな凝集物の形成をもたらす。
【００２６】
ＰＶＡの代替物はPluronic F68(７６８０から９５１０の分子量およびＣＡＳ登録番号９００３−１１−６を有する、構造式：
ＨＯ(Ｃ２Ｈ４Ｏ)ａ(Ｃ３Ｈ６Ｏ)ｂ(Ｃ２Ｈ４Ｏ)ａＨ
(式中、ａは８０であり、そしてｂは２７である)
を有するエチレンオキシド／プロピレンオキシドブロックコポリマー)、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)、および塩素酸ナトリウムを含む。
【００２７】
段階(ｅ)で混合する段階(ｄ)の溶液対段階(ｃ)のエマルジョンの体積比は、例えば、５：１から１：１の範囲であり得る。
【００２８】
段階(ｆ)の蒸発は、段階(ｅ)で形成させたエマルジョンを大気に曝し、エマルジョンを室温から４５℃に維持しながら撹拌することにより、容易に行える。蒸発により、エマルジョン滴の表面への安定化剤のより多い存在により、本マイクロスフェアは沈殿し、硬化する。
【００２９】
段階(ｇ)の回収は、マイクロスフェアを回収するための遠心、ＰＶＡまたは他の安定化剤を除去するためのマイクロスフェアの蒸留水での洗浄、および凍結乾燥により行うことができ、そして、その後使用まで貯蔵する。
【００３０】
我々は、次に、マイクロスフェアの表面がヒドロゲルに変換されている例に話題を変える。これは、段階(ａ)で形成させた溶液に、光開始剤を、例えば、二重結合官能化多価アルコールエステルの０.０５から０.５％ｗ／ｗで、例えば、２,２−ジメトキシ２−フェニルアセトフェノン(ＤＭＰＡ)を０.１％(ＰＧＣＬＭのｗ／ｗ)で包含させ、次いで、段階(ａ)および段階(ｂ)で形成させた溶媒を混合して段階(ｃ)のエマルジョンを形成させ、そして、段階(ｅ)で段階(ｄ)で形成させた溶液と段階(ｃ)で形成させたエマルジョンを混合し、段階(ｅ)を行う中で、二重結合官能性において、例えば、光架橋により架橋をもたらし、すなわち、放射エネルギーの適用により、例えば、長波長ＵＶ光(３６５nm、１６ワット)で、室温で穏やかに撹拌しながら一晩照射することにより、ビニル結合の破壊および架橋の形成をもたらすことにより、行う。その後、マイクロスフェア表面にヒドロゲルが形成されないときと同じ硬化マイクロスフェア形成および回収法を使用できる。
【００３１】
我々は、ここで第三の態様に話題を変える。後記の作業実施例における注射可能マイクロスフェアは、約２０μｍから約５５μｍの平均横断面を有し、そして薬剤または他の生物学的活性剤がマイクロスフェアの約１から約８重量％充填されていた。一つの別法として、ＰＧＣＬＭマイクロスフェアの表面を上記の通りヒドロゲルに変換する。全ての例で、マイクロスフェア表面の二重結合およびカルボキシル基が、薬剤または他の生物学的活性剤と共有結合できる。充填効率(実際に充填された薬剤(ｇ)／理論的充填(ｇ)×１００％)は、容易に約４５％まで(１例で４６％が得られた)得られ、充填レベル(実際に充填された薬剤(ｇ)／マイクロスフェア重量(ｇ)×１００％)は容易に約８％まで得られ、０.１Ｍリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)中３７°での累積的放出は、５０日間で約５０％まで得られる。
【００３２】
上記の通り、マイクロスフェア表面でヒドロゲルが形成されているものを含む第三の態様における注射可能マイクロスフェアは、生物分解性である。
【００３３】
“いくつかまたは各々”なる表現において、“いくつか”は１個以上であるが全てより少ないことを意味し、そして“各々”は全てを意味する。
【００３４】
本発明を下記作業実施例により説明する。
【実施例】
【００３５】
作業実施例
使用するポリマーは、米国特許６,５９２,８９５に記載のＰＧＣＬ−Ｍａ−３であり、米国特許６,５９２,８９５に記載の通り製造した。
【００３６】
ポリマーの製造法は下記の通りである：
簡単に言うと、ε−カプロラクトン(ＣＬ)を、コアとして働くグリセロール(２０：１のＣＬ対グリセロールのヒドロキシル基の供給モル比)、およびオクチル酸第一スズ触媒(ＣＬの０.１ｗｔ％)存在下でシラン処理(silinized)Pyrox加圧反応試験管(press reaction tube)中、開環重合化させることによりヒドロキシル官能化３側鎖ポリ(ε−カプロラクトン)(ＰＧＣＬ)を合成した。減圧し、乾燥アルゴンで数回再充填後、重合化試験管を真空で密封し、１３０℃の油浴に４８時間入れた。得られたポリマー(ＰＧＣＬ)をクロロホルムに溶解し、次いで過剰の石油エーテルに注いで生成物を沈殿させた。沈殿を蒸留水で４回洗浄し、Ｐ２Ｏ５で真空下、室温で一定重量が得られるまで乾燥させた。
【００３７】
二重結合官能化３側鎖ポリ(ε−カプロラクトン)マレイン酸(ＰＧＣＬＭ)、ＰＧＣＬおよび無水マレイン酸の５当量のヒドロキシル官能基を三首フラスコに乾燥Ｎ２環境下入れ、フラスコを１３０℃で１日加熱した。反応混合物を次いで室温に冷却し、クロロホルムに溶解した。このクロロホルム溶液を過剰の石油エーテルに注ぎ、ＰＧＣＬＭを沈殿させた。粉末の沈殿を、何らかの過剰の無水マレイン酸を除去するために５００mLの蒸留水中、４時間撹拌した。濾過後、沈殿を蒸留水で４回洗浄し、Ｐ２Ｏ５で真空下、室温で一定重量が得られるまで乾燥させた。
【００３８】
直鎖高分子量(ポリ(ε−カプロラクトン)、Ｍｎ＝５６.９kg／mol)はまた開始剤としてのグリセロールまたは何らかの他のアルコールなしで、オクチル酸第一スズの用量を０.０５ｗｔ％ＣＬに減少させる以外、同じ方法でも合成した。この高分子量ＰＣＬは、ＰＧＣＬおよびＰＧＣＬＭ特徴付け、マイクロスフェア製造およびタンパク質封入のコントロールとして使用した。
【００３９】
他の例では、架橋ＰＧＣＬＭ(ＮＰＧＣＬＭ)を、ＰＧＣＬＭ形成のために０.１％(ｗ／ｗ)ＤＭＰＡを反応混合物包含させ、ＰＧＣＬＭ形成後、次いで長波長ランプ(３６５nm、１６ワット)で照射して、二重結合部位で架橋させることにより製造した。
【００４０】
他の例では、Tarvainen, T., et al., J. Control. Release, 86 (2-3), 213-222 (2003)に記載の２,２'−ビス(２−オキサゾリム)結合ポリ(ε−カプロラクトン)(ＰＣＬ−Ｏ)を得た。
【００４１】
ＰＧＣＬ、ＰＧＣＬＭ、ＮＰＧＣＬＭ、ＰＣＬおよびＰＣＬ−Ｏの物理化学特性を下記表１に記載する：
【表１】
2008504258.tif 000003
ａ. ポリスチレン標準を用いるＧＰＣにより決定；
ｂ. 結晶度＝(ΔＨｍ, サンプル／ΔＨ°ｍ, １００％結晶)×１００％；
ｃ. ＣＬモノマー対グリセロールのヒドロキシルのモル比は２０／１；
ｄ. 供給モル比として５当量の無水マレイン酸を有するＰＧＣＬ。
【００４２】
図１はＰＧＣＬおよびＰＧＣＬＭの化学構造ならびにＮＰＧＣＬＭの代表的構造を示す。
【００４３】
薬剤充填なしのＰＧＣＬＭおよびＮＰＧＣＬＭマイクロスフェアを製造した。
薬剤充填なしのマイクロスフェアの製造のために、ＰＧＣＬ−Ｍａ−３をジクロロメタンに溶解した(４％、６％、８％ｗ／ｖ)。溶液を５０mL  水性１％(ｗ／ｖ)ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)(分子量１２,０００−２３,０００および８７−８９％加水分解)中に混合することにより乳化させ、３０分、９００rpmで撹拌した。得られる溶液を室温(２２℃)で磁気撹拌子により一晩撹拌し、ジクロロメタンを蒸発させた。サンプルを２２℃で遠心(８００rpmで６時間)により蒸発させ、蒸留水で少なくとも４回洗浄してＰＶＡを除去した。サンプルを、真空下、−４５℃でVirtis Freeze Drier中、３日間凍結乾燥させ、マイクロスフェア生成物を得て、それを真空でデシケーター中に貯蔵した。
【００４４】
架橋表面網状(ヒドロゲル)構造を有するマイクロスフェアの製造のために、ＰＧＣＬＭの０.１％(ｗ／ｗ)レベルのＤＭＰＡをＰＧＣＬＭ溶液に添加し、それを次に乳化させて、水中油中水型エマルジョンを形成させた。エマルジョンを次いで長波長ＵＶランプ(３６５nm、１６ワット)で室温で照射して、表面架橋をもたらし、一晩、室温で穏やかに撹拌してジクロロメタンを蒸発させた。得られるマイクロスフェアの回収法は、上段落と同様であった。
【００４５】
図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃは、各々得られたＰＧＣＬＭ６５マイクロスフェア、ＰＧＣＬＭ８１マイクロスフェアおよびＰＧＣＬＭ６１マイクロスフェアのサイズ分布を示す。
【００４６】
薬剤充填のために、ＯＶＡと記すオブアルブミンタンパク質(アルブミン、鶏卵、グレードＶ)を、充填すべき薬剤の代表として選択した。それは抗体細胞−介在免免疫反応の誘発における抗原として、ならびに経口ワクチン送達のために使用されている。
【００４７】
ＯＶＡを充填されたＰＧＣＬＭおよびＮＰＧＣＬＭマイクロスフェアは、水中油中水型(ｗ／ｏ／ｗ)エマルジョン技術により製造した。
【００４８】
ＯＶＡ充填ＰＧＣＬＭマイクロスフェアについて、充填は下記の通り行った：
１mL  ＯＶＡ水性溶液(４０、８０または１７０mg  ＯＶＡ含有)を１０mLのＰＧＣＬＭ溶液(ジクロロメタン中４％、６％、８％ｗ／ｖ)に、激しく撹拌(磁気撹拌子で、９００rpmで１５分)しながら分散させて、油中水型エマルジョンを形成させ、ここで、水性ＯＶＡ溶液がＰＧＣＬＭ溶液連続相中の分散相であった。得られるｗ／ｏエマルジョンを５０mL  水性１％ＰＶＡ(Ｍｎ＝１２,０００−２３,００９および８７−８９％加水分解)溶液(ｗ／ｖ)に、磁気撹拌子で、３０分、９００rpmで混合しながら乳化させ、ｗ／ｏ／ｗエマルジョンを形成させた。得られるｗ／ｏ／ｗエマルジョンを、穏やかに一晩、室温(２２℃)で磁気撹拌子(EYELA Magnetic Stirrer RC-2)で撹拌して有機溶媒を蒸発させ、水性連続相中に不溶性のＯＶＡが充填された硬化したマイクロスフェアを残した。マイクロスフェアを、２２℃での遠心(International Centrifuge, Clinical Model, International Equipment Co,, Needham Hts, Mass 02194 USA)により集め、蒸留水で少なくとも４回洗浄して、ＰＶＡ乳化剤を除去した。サンプルを次いで３日間、真空下、４５℃でVirtis Freeze Drier(Gardiner, NY)中凍結乾燥させて、マイクロスフェアを得て、それを特徴付けおよび使用前に真空でデシケーター中、４０℃で貯蔵した。
【００４９】
他の例では、０.１％(ＰＧＣＬＭのｗ／ｗ)のＤＭＰＡをＰＧＣＬＭの溶液に添加し、その後それを使用してＯＶＡの水性溶液とｗ／ｏエマルジョンを形成させ、その上で該ｗ／ｏエマルジョンをＰＶＡ水性溶液と混合してｗ／ｏ／ｗエマルジョンを形成させ、それを長波長ＵＶランプ(３６５nm、１６ワット)の使用により、室温で一晩穏やかに撹拌しながら照射する以外、上記と同じであった。その後、上記で使用ものと同じ方法を使用してマイクロスフェアを回収した。結果は、ＯＶＡを充填された架橋表面網状構造マイクロスフェア(ＮＰＧＣＬＭと呼ぶ)となった。
ＯＶＡ充填されたＰＧＣＬＭおよびＮＰＧＣＬＭマイクロスフェアの特徴を下記表２に示す。
【表２】
2008504258.tif 000004
ａ. 溶媒としてのジクロロメタン(ＤＣＭ)、ＰＧＣＬ  Ｍｎ＝１５.４kDa；ＰＧＣＬＭ  Ｍｎ＝１３.３kDa；ＮＰＧＣＬＭＭｎ＝１３.３kDa；
ｂ. 溶媒としての水；
ｃ. ＯＶＡ充填(％)＝実際に充填されたＯＶＡ(ｇ)／マイクロスフェア重量(ｇ)×１００％
ｄ. 充填効率＝実際に充填されたＯＶＡ(ｇ)／供給ＯＶＡ(ｇ)×１００％。
【００５０】
上記表２および後記において、ＰＧＣＬＭ４１は４％ｗ／ｖ  ＰＧＣＬＭポリマーおよび１％ｗ／ｖ  ＰＶＡを使用して製造したマイクロスフェアを意味し、ＰＧＣＬＭ６１は６％ｗ／ｖ  ＰＧＣＬＭポリマーおよび１％ｗ／ｖ  ＰＶＡを使用して製造したＰＧＣＬＭマイクロスフェアを意味し、ＰＧＣＬＭ８１は８％ｗ／ｖ  ＰＧＣＬＭポリマーおよび１％ｗ／ｖ  ＰＶＡを使用して製造したＰＧＣＬＭマイクロスフェアを意味する。ＰＧＣＬ６１は、６％ｗ／ｖ  ＰＧＣＬおよび１％ｗ／ｖ  ＰＶＡを使用して製造したＰＧＣＬマイクロスフェアを意味する。ＮＰＧＣＬＭ６１は６％ｗ／ｖ  ＰＧＣＬＭポリマーおよび１％ｗ／ｖ  ＰＶＡを使用して製造したＮＰＧＣＬＭマイクロスフェアを意味する。
【００５１】
平均直径は、下記方法に従い決定した。乾燥させたマイクロスフェア粉末サンプルを最初にＨＰＬＣグレートの水(５−１０％用量)に懸濁させ、次いで短く超音波処理して均質懸濁液を得た。サイズ測定は、レーザー光分散法により行った(Brinkman Particle Size Analyzer 2010, Brinkman Instruments, Inc,, Westbury, NY)。
【００５２】
表２は、平均直径がＤＣＭ／Ｈ２Ｏ溶媒中のＰＧＣＬＭ濃度に依存することを示す。ＤＣＭの固定された用量で、一定ＰＶＡ濃度(１％ｗ／ｖ)でのＰＧＣＬＭ濃度の４％から８％ｗ／ｖの増加は、マイクロスフェアサイズの減少をもたらした。架橋ＮＰＧＣＬＭは、非架橋ＰＧＣＬＭよりも小さな平均直径を有した。
【００５３】
表２の充填効率は、ポリマー濃度と薬剤充填の間に相関関係が存在することを示す。ＰＧＣＬＭおよびＮＰＧＣＬＭマイクロスフェアに関するＯＶＡ充填効率は４１％から４５％(ｗ／ｗ)の範囲であった。対応する充填レベルは、４.１から７.６％(ｗ／ｗ)の範囲であった。表２は、一定ＯＶＡおよびＰＶＡ濃度での、ポリマー濃度の増加は、充填効率のわずかな上昇をもたらし、そして、光架橋された例において充填効率は平均直径が小さいとの事実にも係わらず改善されることを示す。
【００５４】
オブアルブミン(ＯＶＡ)濃度の、一定マイクロスフェア製剤(固定されたポリマー濃度およびそのＰＶＡ安定化剤に対する比率)でのＯＶＡ充填効率に対する影響を、下記表３に示す。
【表３】
2008504258.tif 000005
ａ. 溶媒としてのジクロロメタン、ＰＧＣＬＭ  Ｍｎ＝１３.３kDa；
ｂ. 溶媒としての水；
ｃ. ＯＶＡ充填(％)＝実際に充填されたＯＶＡ(ｇ)／マイクロスフェア重量(ｇ)×１００％
ｄ. 充填効率＝実際に充填されたＯＶＡ(ｇ)／供給ＯＶＡ(ｇ)×１００％。
【００５５】
上記表３において、ＰＧＣＬＭ６１は６％ｗ／ｖ  ＰＧＣＬＭポリマーおよび１％ｗ／ｖ  ＰＶＡを使用して製造したマイクロスフェアを意味する。データは、水性相中のＯＶＡ濃度の上昇(１０から４０から８５mg)は、マイクロスフェア平均直径に有意な変化なしで、ＯＶＡ充填効率の４３％から２８％への低下をもたらすことを示す。
【００５６】
６％および８％ＰＧＣＬＭ濃度から形成されたマイクロスフェアにおけるＯＶＡ充填効率に対するＰＶＡ濃度(０.５％ｗ／ｖから５％ｗ／ｖの範囲)の影響を、下記表４に示す。
【表４】
2008504258.tif 000006
ａ. 溶媒としてのジクロロメタン、ＰＧＣＬＭ  Ｍｎ＝１３.３kDa；
ｂ. 溶媒としての水；
ｃ. ＯＶＡ充填(％)＝実際に充填されたＯＶＡ(ｇ)／マイクロスフェア重量(ｇ)×１００％
ｄ. 充填効率＝実際に充填されたＯＶＡ(ｇ)／供給ＯＶＡ(ｇ)×１００％。
【００５７】
表４のＰＧＣＬＭ６１およびＰＧＣＬＭ８１は、表２に記載の通りである。表４および後記に関して、ＰＧＣＬＭ６０５は６％(ｗ／ｖ)ＰＧＣＬＭポリマーおよび０.５％(ｗ／ｖ)ＰＶＡを使用して製造したマイクロスフェアを意味する；ＰＧＣＬＭ６５は６％(ｗ／ｖ)ＰＧＣＬＭポリマーおよび５％(ｗ／ｖ)ＰＶＡを使用して製造したマイクロスフェアを意味する；ＰＧＣＬＭ８０５は８％ＰＧＣＬＭ(ｗ／ｖ)および０.５％(ｗ／ｖ)ＰＶＡを使用して製造したマイクロスフェアを意味する；そしてＰＧＣＬＭ８５は８％(ｗ／ｖ)ＰＧＣＬＭおよび５％(ｗ／ｖ)ＰＶＡを使用して製造したマイクロスフェアを意味する。
【００５８】
上記表４において、データは、６％ＰＧＣＬＭおよび８％ＰＧＣＬＭの両方について、低いＰＶＡ安定化剤濃度(０.５％)は、低いＯＶＡ充填レベルおよび充填効率をもたらし、そして高いＰＶＡ安定化剤濃度(１％、５％)は高い充填レベルおよび充填効率をもたらし、そしてＰＶＡ濃度の減少はマイクロスフェアのサイズ低下をもたらすことを示す。
【００５９】
ＯＶＡ充填ＰＧＣＬＭマイクロスフェア表面の走査型電子顕微鏡(ＳＥＭ)は、ほとんど球形の、非凝集、平滑表面、無孔表面外観のマイクロスフェアを示す。
【００６０】
ｐＨ７.４のリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)に３７℃で暴露させたときのマイクロスフェアのＳＥＭ造影は、表面から内部に伸びる小孔が経時的に発達し、経時的に隣の孔と融合して大きな孔を形成することを示した。同じ試験において、ＮＰＧＣＬＭマイクロスフェアは、ＮＰＧＣＬＭ表面でのヒドロゲルの膨張性の性質に起因する、より相互連結し、そして不規則な孔の、より粗い表面を示した。
【００６１】
ＰＧＣＬＭマイクロスフェアの表面上の不飽和官能性結合(＞Ｃ＝Ｃ＜)を、後方散乱電子像(ＢＳＥ)およびＸ線元素分析スペクトルにより確認した。
【００６２】
ＰＢＳ中、３７℃でのＰＧＣＬＭマイクロスフェアからのＯＶＡの累積的放出を測定するインビトロ実験は、マイクロスフェア形成条件にかかわらず、ＯＶＡ放出が初期バースト放出、続くゆっくりで漸進的な放出により特徴付けられることを示した。結果は図３Ａに示す。図３Ａに示す通り、ＯＶＡ充填ＰＧＣＬＭマイクロスフェアに関して、１日目の初期バースト累積的放出％は、ＰＧＣＬＭ４１、ＰＧＣＬＭ６１、ＰＧＣＬＭ８１、およびＰＧＣＬＭ８５について、各々２３、２６、２７、および２８％であった。１０日間の最後に、ＯＶＡの対応する累積的放出％は、２８、３２、３２、および３５％であった。その期間後、ＯＶＡ放出は遅くなった。５０日間の最後に、ＰＧＣＬＭマイクロスフェアからのＯＶＡの放出は４５−４９％に達し、ＰＧＣＬＭ８５が最高のＯＶＡ放出％を有した。観察された放出プロファイルは、小さいサイズおよび低い充填効率を有するＰＧＣＬＭマイクロスフェアが、早いバースト放出および高い全体的累積的放出パーセントを示すことを指示する。
【００６３】
ＰＧＣＬ６１、ＰＧＣＬＭ６１およびＮＰＧＣＬＭ６１マイクロスフェアの累積的放出プロファイルを比較した。結果を図３Ｂに示す。ＰＧＣＬ６１マイクロスフェアは、ＰＧＣＬ６１のマレイン酸モノエステル鎖末端を欠く点でＰＧＣＬＭ６１と異なる；一方、ＰＧＣＬＭ６１とＮＰＧＣＬＭ６１は、互いに、ＮＰＧＣＬＭ６１マイクロスフェアが網状構造形成(すなわち、光架橋)されており、ＰＧＣＬＭ６１マイクロスフェアがされていない点で異なる。ＯＶＡの初期バーストは、ＰＧＣＬ６１、ＰＧＣＬＭ６１およびＮＰＧＣＬＭ６１マイクロスフェアについて各々２０、２６および１６％であった。非網状構造形成ＰＧＣＬＭ６１マイクロスフェアと比較して、ＮＰＧＣＬＭ６１マイクロスフェアにおいて、ＯＶＡバースト放出の４０％減少があった。故に、マイクロスフェア中の網状構造の存在は、初期バースト放出の強度を減少させた。５０日試験期間の最後に、ＰＧＣＬ６１、ＰＧＣＬＭ６１およびＮＰＧＣＬＭ６１マイクロスフェアの各々について、４３、４７および４０％の累積的ＯＶＡ放出が見られた。故に、ＯＶＡ放出の程度は、ＰＧＣＬＭ６１＞ＰＧＣＬ６１＞ＮＰＧＣＬＭ６１の順番であった。
【００６４】
ゲル電気泳動データは、製剤およびインビトロ放出試験に関係なく、ポリマーによるＯＶＡの断片化を示さなかった。放出されたＯＶＡは、新鮮なＯＶＡサンプルと同じ分子量を有することが示された。
【００６５】
ここに記載の実験において、ＰＶＡに関して０.５％ｗ／ｖより低い濃度は、マイクロスフェアの凝集および続く大きな凝集体の形成を防止できず、そして４％より低いＰＧＣＬＭで形成されたマイクロスフェアの形成は不完全であり、その中へのＯＶＡの封入は不完全であった。
【００６６】
ＰＧＣＬマイクロスフェアおよびＮＰＧＣＬＭマイクロスフェアと比較して、ＰＧＣＬＭマイクロスフェアからの速いＯＶＡ放出は、水和およびタンパク質放出レベルを制限するための架橋網状なしの、ＰＣＬ側鎖の末端−ＣＯＯＨ基が原因の、ＰＧＣＬＭの高い親水性に起因した。
【００６７】
マイクロスフェアからのＯＶＡの長期持続放出は、薬剤濃度における経時的な周期変化なく、薬剤の連続的送達を示すのに十分であり、故に、長期間にわたり、良好な薬理学的特性を提供する。
【００６８】
変形
本発明前記の開示はある種の操作可能かつ好ましい態様を記載するために提示している。本発明は、変形および修飾が当業者には明白であり、その全てが本発明の範囲内であるため、そのように限定することを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】ＰＧＣＬおよびＰＧＣＬＭの化学構造ならびにＮＰＧＣＬＭの代表的構造を示す。
【図２Ａ】作業実施例において形成したＰＧＣＬＭ６５マイクロスフェアのサイズ分布を示す。
【図２Ｂ】作業実施例において形成したＰＧＣＬＭ８１マイクロスフェアのサイズ分布を示す。
【図２Ｃ】作業実施例において形成したＰＧＣＬＭ６１マイクロスフェアのサイズ分布を示す。
【図３Ａ】作業実施例で得たＰＧＣＬＭ４１、ＰＧＣＬＭ６１、ＰＧＣＬＭ８１およびＰＧＣＬＭ８５についてのＯＶＡの累積的放出を示す。
【図３Ｂ】作業実施例で得たＰＧＣＬＭ６１、ＰＧＣＬ６１および架橋ＰＧＣＬＭ６１(ＮＰＧＣＬＭ６１と呼ぶ)についてのＯＶＡの累積的放出を示す。
【図１】
2008504258.tif 000007
【図２Ａ】
2008504258.tif 000008
【図２Ｂ】
2008504258.tif 000009
【図２Ｃ】
2008504258.tif 000010
【図３Ａ】
2008504258.tif 000011
【図３Ｂ】
2008504258.tif 000012
【国際調査報告】
2008504258.tif 000013