(57)【要約】  本発明は、悪性腫瘍および感染症を治療する方法、治療にまたは臨床試験への加入に適する患者を認定する方法、および医療適用において使用される抗体を産生する方法に関する。一般に、本方法は、ＮＫ細胞表面に存在する活性化レセプターを標的とし、かつ同時に悪性のまたは感染した標的細胞の表面に存在する分子と相互作用し、それによって抗体の治療効率を増強する抗体の使用を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液悪性腫瘍の治療における使用に適する抗体を産生する方法であって、ａ）ヒト活性化ＮＫ細胞レセプターに特異的に結合するヒト用抗体を用意する工程、およびｂ）前記抗体の、ヒトＦｃレセプターに特異的に結合する能力を評価する工程を含み、前記抗体が前記レセプターに特異的に結合することができるという決定は、前記抗体は前記悪性腫瘍の治療のための使用に適していることを示す、方法。
【請求項２】
前記ヒトＦｃレセプターがＦｃγレセプターであり、前記抗体がＩｇＧである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記Ｆｃγレセプターが、ＦＣＧＲ１Ａ、ＦＣＧＲ１Ｂ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ２ＢおよびＦＣＧＲ３から成る群より選ばれる、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記Ｆｃレセプターが細胞の表面に存在するかまたは細胞膜内に存在する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記血液悪性腫瘍が、濾胞性リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、マクロファージ腫瘍、急性単球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、慢性リンパ球性白血病、マスト細胞悪性腫瘍、骨髄化生、および慢性骨髄性白血病から成る群より選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ヒト用抗体がマウスモノクローナル抗体に由来する、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記活性化ＮＫ細胞レセプターがＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４またはＮＫｐ４６である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記活性化ＮＫ細胞レセプターがＮＫｐ３０であり、前記ヒト用抗体がＡＺ２０、Ａ７６およびＺ２５から成る群より選ばれるマウスモノクローナル抗体に由来する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記ＮＫ細胞活性化レセプターがＮＫｐ４４であり、前記ヒト用抗体がマウスモノクローナル抗体Ｚ２３１に由来する、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記ＮＫ細胞活性化レセプターがＮＫｐ４６であり、前記ヒト用抗体がマウスモノクローナル抗体ＢＡＢ２８１に由来する、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
請求項１の方法によって産生される抗体、および薬学的に許容されうる担体を含む、医薬品組成物。
【請求項１２】
ヒト活性化ＮＫ細胞レセプターに特異的に結合するヒト用抗体の、濾胞性リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、マクロファージ腫瘍、急性単球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、慢性リンパ球性白血病、マスト細胞悪性腫瘍、骨髄化生、および慢性骨髄性白血病から成る群より選ばれる血液悪性腫瘍を治療するための医薬を製造するための、使用。
【請求項１３】
前記ヒト活性化ＮＫ細胞レセプターがＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６から成る群より選ばれる、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
前記活性化ＮＫ細胞レセプターがＮＫｐ３０であり、前記ヒト用抗体が、ＡＺ２０、Ａ７６およびＺ２５から成る群より選ばれるマウスモノクローナル抗体に由来する、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
前記レセプターがＮＫｐ４４であり、前記ヒト用抗体がモノクローナル抗体Ｚ２３１に由来する、請求項１３記載の使用。
【請求項１６】
前記レセプターがＮＫｐ４６であり、前記ヒト用抗体がモノクローナル抗体ＢＡＢ２８１に由来する、請求項１３記載の使用。
【請求項１７】
前記抗体がＩｇＧである請求項１２記載の使用。
【請求項１８】
前記悪性腫瘍がＦｃγレセプターを発現する細胞を含む、請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
前記ＦｃγレセプターがＦＣＧＲ１Ａ、ＦＣＧＲ１Ｂ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ２ＢおよびＦＣＧＲ３から成る群より選ばれる、請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
前記ヒト用抗体が患者から採取した悪性細胞と相互作用する能力を、前記医薬の投与に先立って評価し、前記抗体が前記悪性細胞に特異的に結合するという決定が、前記抗体が前記患者の治療のための使用に適することを示す、請求項１２記載の使用。
【請求項２１】
患者から採取した悪性細胞表面上のＦｃレセプターの存在または不存在を評価し、前記悪性細胞表面上におけるＦｃレセプターの検出が、前記抗体が前記患者の治療のための使用に適することを示す、請求項１２記載の使用。
【請求項２２】
前記ＦｃレセプターがＦｃγレセプターである、請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
前記ヒト用抗体がヒトＦｃ領域を含む、請求項１２記載の使用。
【請求項２４】
前記ヒト用抗体がヒト化またはキメラ抗体である、請求項２３記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性腫瘍および感染症を治療する方法、治療にまたは臨床試験への加入に適する患者を識別する方法、および治療用途に用いるための抗体を産生する方法に関する。概して本方法は、ＮＫ細胞の表面に存在する活性化レセプターを標的とする抗体の使用を含み、その抗体は同時に、活性化されたＮＫ細胞を悪性のまたは感染した標的細胞へ導くために役立ち、それによりＮＫ細胞の有効性を高める。
【０００２】
〔背景技術〕
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、非特異的免疫に関係するリンパ球の分集団である。ＮＫ細胞は、腫瘍またはウイルス感染細胞などの望ましくない細胞を除去することができる効率的な免疫監視機構を提供する。ＮＫ細胞の特性および生物的性質には、ＣＤ１６、ＣＤ５６および／またはＣＤ５７を含む表面抗原の発現、細胞表面上のα／βまたはγ／δＴＣＲ複合体の欠如；“自己”ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現できない細胞に結合して特異的細胞溶解酵素の活性化により殺す能力、ＮＫ活性化レセプターに対するリガンドを発現する腫瘍細胞または他の病気の細胞を殺す能力、およびサイトカインと呼ばれる免疫応答を刺激するかまたは阻害するタンパク質分子を放出する能力が含まれる。
【０００３】
ＮＫ細胞活性は、活性化信号および抑制性信号の両方を含む複雑な機構により調節される。ＮＫ細胞により仲介される、ＨＬＡクラスＩ欠失標的細胞の認識および殺傷に重要な役割を果たす、いくつかの異なるＮＫ特異的レセプターが同定されている。ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６およびＮＫｐ４４と名付けられたこれらのレセプターは、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーである。特異的ｍＡｂによって誘導されるそれらのレセプターの架橋は、ＮＫ細胞の強い活性化を引き起こし、その結果細胞内Ｃａ++レベルの増加、細胞毒性の誘発およびリンホカインの放出がもたらされる。重要なことには、ｍＡｂを媒介とするＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６および／またはＮＫｐ４４の活性化は、多くの型の標的細胞に対するＮＫ細胞毒性の活性化という結果をもたらす。これらの発見が、自然細胞毒性におけるこれらのレセプターの中心的な役割についての証拠を提供する。
【０００４】
ＮＫ細胞は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ−特異的抑制性レセプターにより、負の調節を受ける（Kaerre et al.(1986) Nature 319:675-8; Ohlen et al,(1989); Science 246:666-8）。これらの特異的なレセプターは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子またはＨＬＡの多型性決定基に結合し、ナチュラルキラー（ＮＫ）による細胞溶解を阻害する。ヒトでは、キラーＩｇ様レセプター（ＫＩＲ）と名付けられたレセプターのファミリーのあるメンバーが、ＨＬＡクラスＩの対立遺伝子群を認識する。
【０００５】
ＦｃγレセプターなどのＦｃレセプターが、白血球の表面上に発現される。これらのレセプターは、免疫グロブリン（Ｉｇ）のＦｃ部分に結合する。例えばＦｃγレセプターは、ＩｇＧのＦｃ部分に結合する。この結合は、抗体による抗原の認識を、細胞ベースのエフェクター機構とリンクさせることにより、免疫機能への寄与を促進する。様々な免疫グロブリンのクラスが、様々なエフェクター機構を、免疫グロブリンＦｃ領域と免疫細胞上の特異的Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）との特異な相互作用を通じて始動する。活性化Ｆｃγレセプターには、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIＡ、ＦｃγＲIIＣおよびＦｃγＲIIIＡが含まれる。ＦｃγＲIIＢは、抑制性Ｆｃγレセプターと考えられる。例えば、Woof et al. (2004) Nat Rev Immunol. 4(2):89-99; Baumann et al. (2003) Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 51(6):399-406; および Pan et al.(2003) Chin Med J (Engl) 116(4):487-94)を参照のこと。
【０００６】
〔発明の開示〕
本発明は、血液悪性腫瘍およびウイルス感染症のような障害の治療に役立つ抗体を産生するための方法および組成物を提供する。本方法を用いて産生される抗体は、ＮＫ細胞の細胞毒性の活性化、およびＮＫ細胞の標的細胞との相互作用を促進し、それによって細胞が標的を殺す能力を高めることができる。抗体を血液悪性腫瘍などの悪性腫瘍およびウイルス感染症などの感染症を含む多くの障害のいずれの治療にも用いる方法もまた提供する。
【０００７】
従って、本発明は、悪性腫瘍または感染症の治療での使用に適する抗体を産生するための方法を提供し、その方法は、ａ）ヒト活性化ＮＫ細胞レセプターに特異的に結合するヒト用抗体を用意する工程、およびｂ）抗体がヒトＦｃレセプターに特異的に結合する能力を評価する工程を含み、抗体がレセプターに特異的に結合することができるという決定は、抗体が悪性腫瘍または感染症の治療に使用することに適することを示す。
【０００８】
実施態様の１つでは、ヒトＦｃレセプターはＦｃγレセプターであり、抗体はＩｇＧである。別の実施態様では、ＦｃγレセプターがＦＣＧＲ１Ａ、ＦＣＧＲ１Ｂ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ２Ｂ、およびＦＣＧＲ３から成る群より選ばれる。別の実施態様では、Ｆｃレセプターは細胞の表面に存在するか、または細胞膜内に存在する。別の実施態様では、悪性腫瘍は、濾胞性リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、マクロファージ腫瘍、急性単球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、慢性リンパ球性白血病、マスト細胞悪性腫瘍、骨髄化生、非ホジキンリンパ腫、および慢性骨髄性白血病から成る群より選ばれる。別の実施態様では、悪性腫瘍または感染症は、Ｂ細胞、マクロファージ、マスト細胞、骨髄細胞、単球、好中球、好塩基球、好酸球、ランゲルハンス細胞、血小板および胎盤内皮細胞から成る群より選ばれる細胞を含む。別の実施態様では、ヒト用抗体が、マウスモノクローナル抗体に由来する。別の実施態様では、活性化ＮＫ細胞レセプターは、ＮＫｐ３０（アクセッション番号 ＮＰ_６６７３４１）、ＮＫｐ４４（アクセッション番号 ＣＡＢ３９１６８）、またはＮＫｐ４６（アクセッション番号 ＮＰ_００４８２０）である。前述のアクセッション番号に対応するＧｅｎｂａｎｋファイルの開示は、参照により本明細書に組み入れられる。別の実施態様では、活性化ＮＫ細胞レセプターはＮＫｐ３０であり、またヒト用抗体は、ＡＺ２０、Ａ７６、およびＺ２５から成る群より選ばれるマウスモノクローナル抗体に由来する。別の実施態様では、活性化ＮＫ細胞レセプターはＮＫｐ４４であり、またヒト用抗体は、マウスモノクローナル抗体Ｚ２３１に由来する。別の実施態様では、活性化ＮＫ細胞レセプターはＮＫｐ４６であり、またヒト用抗体は、マウスモノクローナル抗体ＢＡＢ２８１に由来する。
【０００９】
別の局面では、本発明は、本明細書記載の任意の方法によって産生された抗体および薬学的に許容されうる担体を含む医薬品組成物を提供する。
【００１０】
別の局面では、本発明は、濾胞性リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、マクロファージ腫瘍、急性単球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、慢性リンパ球性白血病、マスト細胞悪性腫瘍、骨髄化生、非ホジキンリンパ腫および慢性骨髄性白血病から成る群より選ばれる悪性腫瘍に罹患している患者を治療する方法を提供し、その方法は、患者に、ヒト活性化ＮＫ細胞レセプターに特異的に結合するヒト用抗体および薬学的に許容されうる担体を含む医薬品組成物を投与する工程を含む。
【００１１】
別の関連する局面では、本発明は、Ｂ細胞、マクロファージ、マスト細胞、骨髄細胞、単球、好中球、好塩基球、好酸球、ランゲルハンス細胞、血小板および胎盤内皮細胞から成る群より選ばれる細胞の感染症または悪性腫瘍を有する患者を治療するための方法を提供し、この方法は、患者に、ヒト活性化ＮＫ細胞レセプターに特異的に結合するヒト用抗体および薬学的に許容されうる担体を含む医薬品組成物を投与する工程を含む。
【００１２】
これらの局面のどちらか１つの実施態様では、ヒト活性化ＮＫ細胞レセプターは、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６から成る群より選ばれる。別の実施態様では、活性化ＮＫ細胞レセプターは、ＮＫｐ３０であり、ヒト用抗体は、ＡＺ２０、Ａ７６およびＺ２５から成る群より選ばれるマウスモノクローナル抗体に由来する。別の実施態様では、レセプターはＮＫｐ４４であり、ヒト用抗体はモノクローナル抗体Ｚ２３１に由来する。別の実施態様では、レセプターはＮＫｐ４６であり、ヒト用抗体はモノクローナル抗体ＢＡＢ２８１に由来する。別の実施態様では、抗体はＩｇＧである。別の実施態様では、悪性腫瘍は、Ｆｃγレセプターを発現する細胞を含む。別の実施態様では、Ｆｃγレセプターは、ＦＣＧＲ１Ａ、ＦＣＧＲ１Ｂ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ２ＢおよびＦＣＧＲ３から成る群より選ばれる。
【００１３】
別の実施態様では、方法はさらに、組成物の投与に先立って、ヒト用抗体が患者から採取した悪性細胞と相互作用する能力を評価する工程を含む。その場合、抗体が悪性細胞に特異的に結合するという決定は、抗体が治療での使用に適することを示す。
【００１４】
別の実施態様では、方法は、患者から取り出した悪性細胞表面上のＦｃレセプターの有無を評価する工程をさらに含む。その場合悪性細胞表面上のＦｃレセプターを検出することは、前記抗体が治療への使用に適することを示す。実施態様の１つでは、ＦｃレセプターはＦｃγレセプターである。別の実施態様では、ＦｃγレセプターはＦＣＧＲ１Ａ、ＦＣＧＲ１Ｂ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ２ＢおよびＦＣＧＲ３から成る群より選ばれる。
【００１５】
別の実施態様では、ヒト用抗体は、ヒトＦｃ領域を含む。別の実施態様では、ヒト用抗体は、ヒト化抗体またはキメラ抗体である。
【００１６】
本発明の特定の目的は、したがって抗体であり、その抗体は、ＮＫ細胞上の１つ以上のヒト活性化レセプターに特異的に結合するヒト化抗体またはそうでなければヒト用抗体であり、またその抗体には、標的細胞の表面に存在するヒトＦｃレセプター、例えばＦｃγレセプターが、特異的に結合する。本抗体を含むキットもまた本発明に包含される。
【００１７】
本発明はまた、実質的に同じ抗原特異性および活性を有する（例えば、親の抗体と交差反応することができ、またヒトＦｃレセプターに結合するだけでなくＮＫ細胞を活性化することができる）と報告された、抗体の断片および誘導体を包含する。そのような断片には、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ'２断片、ＣＤＲおよびＳｃＦｖが含まれるが、それに限定されるわけではない。好ましいのは、ヒトＦｃレセプターによって認識可能となるように、ヒトＦｃ領域または他のモチーフを含むか、または含むように誘導体化された、断片である。
【００１８】
本発明はまた、上に開示した抗体あるいはその断片または誘導体、および薬学的に許容されうる担体または賦形剤を含む医薬品組成物に関する。
【００１９】
本発明はまた、ヒトＮＫ細胞を、抗体または上に定義した断片または誘導体と接触させる工程を含む、ヒトＮＫ細胞活性を、インビトロ、エクスビボまたはインビボで調節する方法を提供する。最も好ましい方法は、ヒトＮＫ細胞の細胞毒性活性を、最も好ましくはエクスビボまたはインビボで、例えば血液悪性腫瘍などの癌または感染症に罹患している患者中で、増加させることを目標とする。
【００２０】
発明の詳細な説明
序
本発明は、患者の血液悪性腫瘍などの悪性腫瘍およびウイルス感染症などの感染症などの障害の治療に適した抗体を産生するための、新規な方法を提供する。本明細書に記載される方法を用いて産生される抗体、抗体誘導体または抗体断片も、ならびに抗体を用いて患者を治療する方法もまた、含まれる。本明細書に記述される抗体は、特にＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６などのＮＫ細胞表面の１つ以上の活性化レセプターを標的とすることにより、インビボでヒトのＮＫ細胞を活性化することができる。
【００２１】
本抗体は、ＮＫ細胞を活性化するその能力に加えて、さらに活性化されたＮＫ細胞とその標的との間の相互作用を促進する高い能力を有しており、それによりある種の障害の治療のための抗体の治療有効性を増加させる。とりわけ、本抗体は、濾胞性リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、マクロファージ腫瘍、急性単球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、慢性リンパ球性白血病、マスト細胞悪性腫瘍、骨髄化生および慢性骨髄性白血病などの、一定の血液の悪性腫瘍、または、Ｂ細胞、マクロファージ、マスト細胞、骨髄細胞、単球、好中球、好塩基球、好酸球、ランゲルハンス細胞、血小板および胎盤内皮細胞の細胞型のいずれかを含む任意の感染症または悪性腫瘍の治療に特に役立つ。実施態様の１つでは、活性化されたＮＫ細胞は、Ｆｃレセプター、好ましくはＦｃγレセプターを発現する細胞を標的とする増加した能力を有する。
【００２２】
次の理論に束縛されるわけではないが、本抗体の特別の有効性は、少なくとも部分的には、標的細胞表面のＦｃレセプター、例えばＦｃγレセプターの、ＮＫ細胞活性化抗体と相互作用する能力自体によるものであると信じられている。このように、活性化されたＮＫ細胞が、抗体の２つの反応性部分、例えば抗原認識領域およびＦｃ領域を介してその標的細胞の極めて近くへ連れ込まれ、それによって治療の効率を高める、と信じられている。
【００２３】
一般に、本方法は、ＮＫ細胞の表面上の、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４またはＮＫｐ４６などの１以上の活性化レセプターに特異的な、ＮＫ細胞を活性化することができるモノクローナル抗体を用意する工程を含む。その後、例えばヒト化抗体、キメラ抗体あるいはヒト抗体を産生することにより、抗体をヒトにおける使用に適するようにする。これらのヒト用抗体を、次にそれらが標的細胞と、好ましくはＦｃγレセプターなどの１以上のヒトＦｃレセプターを発現する標的細胞と、相互作用する能力について評価する。次に特異的に標的細胞と相互作用するヒト用抗体を選択して、血液悪性腫瘍またはウイルス感染症、好ましくはＦｃγレセプターを発現している細胞を含む悪性腫瘍または感染症などの、一定の障害の治療方法において使用する。
【００２４】
定義
本明細書では、以下の用語は、もし他に指定しなければ、それらに特有の意味を持つものとする。
【００２５】
本明細書で「ＮＫ」細胞とは、非特異的免疫に関係するリンパ球の分集団を指す。ＮＫ細胞は、ＣＤ１６、ＣＤ５６および／またはＣＤ５７を含む特異的表面抗原の発現、細胞表面上のα／βまたはγ／δＴＣＲ複合体の欠如、 特異的細胞溶解酵素の活性化により、“自己”ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現できない細胞に結合して殺傷する能力、ＮＫ活性化レセプターに対するリガンドを発現する腫瘍細胞または他の異常細胞を殺す能力、およびサイトカインと呼ばれる免疫応答を刺激するかまたは阻害するタンパク質分子を放出する能力、などの特性および生物的性質により同定することができる。任意のこれらの特性と活性を用い、当技術分野において周知の方法を使用して、ＮＫ細胞を同定することができる。
【００２６】
本明細書で用いられる用語「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を指す。重鎖中の不変領域の型に依存して、抗体は５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの１つに割り当てられる。これらの内のいくつかはさらに、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、その他などのサブクラスまたはアイソタイプへ分類される。典型的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は四量体を含む。各四量体は、同一の２対のポリペプチド鎖から成り、各対は１本の「軽鎖」(約２５ kDa）および１本の「重鎖」(約５０〜７０ kDa）を有する。各鎖のＮ末端は、主として抗原認識の役割を担う約１００〜１１０個以上のアミノ酸の可変領域を規定する。用語、可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）とは、それぞれこれらの軽鎖および重鎖を指す。種々のクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖の不変領域は、それぞれ「α」、「δ」、「ε」、「γ」、および「μ」と呼ばれる。種々のクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および３次元配置は周知である。ＩｇＧおよび／またはＩｇＭは、本発明で使用する抗体の好適なクラスであって、ＩｇＧは特に好適である。その理由は、それが生理的な状況における最も一般的な抗体であり、また実験室設定において最も容易に作製され、そしてＦｃγレセプターが特異的にＩｇＧを認識するからである。好ましくは、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。特に好ましいのは、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体または他のヒト用抗体である。
【００２７】
用語「特異的に結合する」とは、競合的結合分析において、抗体が、例えばＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはＮＫｐ４６などの活性化ＮＫレセプターまたはヒトＦｃγレセプターなどの結合相手へ好ましく結合することができることを意味する。これは、単離したＮＫ細胞または適切な標的細胞の表面に存在するタンパク質の組換え型、その中のエピトープ、あるいは自然のタンパク質のいずれかを用いて評価される。特異的結合を測定するための競合結合分析および他の方法については、さらに下に述べるが、これらは当技術分野において周知である。
【００２８】
「ヒト用」抗体とは、ヒトにおいて、例えば本明細書に記述する治療方法に安全に用いることができる、任意の抗体、誘導体化された抗体、または抗体断片を指す。ヒト用抗体は、すべての型のヒト化抗体、キメラ抗体、または完全なヒト抗体、あるいは、自然の非ヒト抗体を用いる場合に誘発される免疫応答を回避するように、抗体の少なくとも一部分がヒトに由来するか、またはその他の修飾された任意の抗体を含む。
【００２９】
本明細書で「免疫原断片」とは、任意のポリペプチドのまたはペプチドの断片であって、（ｉ）前記断片に結合するおよび／または前記断片を含む任意の形の分子（膜結合型レセプターおよびそれ由来の突然変異体を含む）に結合する抗体の産生、（ii）任意のＭＨＣ分子および前記断片に由来するペプチドを含む２分子複合体に反応するＴ細胞を含む、Ｔ細胞応答の刺激、（iii） 哺乳動物の免疫グロブリンをコードする遺伝子を発現しているバクテリオファージまたはバクテリアなどのトランスフェクションされた媒体の結合、などの免疫応答を誘発することができる断片を意味する。あるいは、免疫原断片とはまた、上に定義した免疫応答を誘発することができる任意のコンストラクション、例えば共有結合によって担体タンパク質に結合したペプチド断片、アミノ酸配列中に前記ペプチド断片を含むキメラの組換えポリペプチドコンストラクトなどを指し、また特に、配列が前記断片をコードする部分を含むｃＤＮＡでトランスフェクションされた細胞を含む。
【００３０】
本発明の目的のために、「ヒト化」抗体とは、１つ以上のヒト免疫グロブリンの不変および可変フレームワーク領域を、動物免疫グロブリンの結合領域、例えばＣＤＲ、と融合させた抗体を指す。そのようなヒト化抗体は、結合領域が由来する非ヒト抗体の結合特異性を維持して、しかし非ヒト抗体に対する免疫反応を回避するように設計される。
【００３１】
「キメラ抗体」は、（ａ）不変領域あるいはその一部が変更、置換または交換されていて、その結果抗原結合部位（可変領域）が、異なるか変更された、クラスの、エフェクター機能の、および／または種の、不変領域に連結されている、あるいはキメラ抗体へ新しい特性を与える完全に異なる分子、例えば酵素、毒素、ホルモン、生長因子、薬剤などに連結されている；あるいは（ｂ）可変領域またはその一部が、異なるか変更された抗原特異性を有する可変領域と変更、置換、あるいは交換された、抗体分子である。本発明の好ましい実施態様では、キメラ抗体はそれにもかかわらず免疫グロブリンのＦｃ領域、好ましくはヒトＦｃ領域、を維持しており、そのために標的細胞表面上のヒトＦｃレセプターとの相互作用が可能になる。
【００３２】
本発明の文脈では、「活性な」または「活性化された」ＮＫ細胞とは、生物学的に活性なＮＫ細胞を、より詳細には標的細胞を溶解する能力を有するＮＫ細胞を指す。例えば、「活性な」ＮＫ細胞は、ＮＫ活性化レセプターのリガンドを発現し、「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現することが出来ない細胞（ＫＩＲ−不適合細胞）を、殺すことができる。リダイレクテッドキリングアッセイでの使用に適する標的細胞の例は、Ｐ８１５およびＫ５６２細胞であるが、しかし多くの細胞型のいずれも用いることができ、それは当技術分野において周知である（例えば、Sivori et al. (1997) J. Exp. Med. 186: 1129-1136; Vitale et al. (1998) J. Exp. Med. 187: 2065-2072; Pessino et al. (1998) J. Exp. Med. 188: 953-960; Neri et al. (2001) Clin. Diag. Lab. Immun. 8:1131-1135 を参照のこと）。「活性な」または「活性化された」細胞はまた、サイトカイン（例えばＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α）の産生または細胞内フリーカルシウムレベルの増加などの、ＮＫ活性に関係している当技術分野において公知の他の特性または活性などによって、同定することができる。
【００３３】
本明細書で用いられる、用語「活性化ＮＫレセプター」とは、ＮＫ細胞表面上の任意の分子であって、刺激された時に、ＮＫ活性に関係しているとして当技術分野において公知の任意の特性または活性、例えばサイトカイン（例えばＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α）産生、細胞内フリーカルシウムレベルの増加、あるいは例えば本明細書中の他の場所に記述されたリダイレクテッドキリングアッセイでの細胞を標的とする能力などの、測定可能な増加を引き起こす分子を指す。そのようなレセプターの例には、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ４６が含まれる。ＮＫ細胞が活性であるかどうかを判断する方法について、より詳細に下に記述する。
【００３４】
用語「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」とは、自然の状態で見出される場合には通常それと一緒に存在する成分が、実質的にまたは本質的に存在しない物質を指す。純度および均一性を、通常は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法または高速液体クロマトグラフィーのような分析化学技術を用いて、決定する。調製物中に存在する大部分を占める化学種のタンパク質は、実質的に精製されている。
【００３５】
本明細書に使用される用語「生体試料」は、体液（例えば血清、リンパ液、血液）、細胞試料、または組織試料（例えば骨髄）を含むが、それらに限られない。
【００３６】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書で、互いに交換可能に、アミノ酸残基のポリマーを指すために用いられる。これらの用語は、自然に存在するアミノ酸ポリマーおよび自然には存在しないアミノ酸ポリマーに適用されるだけでなく、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する自然に存在するアミノ酸の人工の化学的模倣物であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００３７】
「ラベル」または「検知可能部分」とは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段によって検知することのできる構成物である。例えば、有用なラベルには、32Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えばＥＬＩＳＡ中で一般に用いられるような）、ビオチン、ジゴキシゲニンまたは、例えばペプチドに放射性ラベルを組み込むことによって検知可能にできる、あるいはペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために用いられる、ハプテンおよびタンパク質が含まれる。
【００３８】
用語「組換え体」とは、例えば細胞、あるいは核酸、タンパク質またはベクターを参照して用いられたときは、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、非相同の核酸またはタンパク質の導入により、または自然の核酸またはタンパク質の変化により、修飾されたこと、または細胞がそのように修飾された細胞に由来することを示す。したがって、例えば組換え細胞は、細胞の自然の（組換えのない）形には見出されない遺伝子を発現するか、または本来なら異常に発現されるか、過小発現されるか、または全く発現されない自然の遺伝子を発現する。
【００３９】
活性化ＮＫ細胞レセプターに対して特異的なモノクローナル抗体の産生
本発明の抗体を、様々な公知技術のいずれによって産生してもよい。通常はそれらを、非ヒト動物、好ましくはマウスを、ＮＫ細胞の表面に存在する活性化レセプターを含む免疫原で免疫化することにより産生する。活性化レセプターは、全ＮＫ細胞または細胞膜、ＮＫｐ３０（例えばＰＣＴ ＷＯ ０１／３６６３０を参照のこと、参照によりその開示の全体が本明細書に組み入れられる）、ＮＫｐ４４（例えば、 Vitale et al. (1998) J. Exp. Med. 187:2065-2072,参照によりその開示の全体が本明細書に組み入れられる）、またはＮＫｐ４６（例えば、Sivori et al. (1997) J. Exp. Med. 186:1129-1136; Pessino et al. (1998) J. Exp. Med. 188:953-960;を参照のこと、参照によりその開示の全体が本明細書に組み入れられる）などのレセプターの全長配列、あるいはそれらの断片または誘導体、通常は免疫原断片、すなわちこれらのレセプターのいずれかを、またはその刺激がＮＫ細胞の活性化をもたらす他のレセプターのいずれかを発現している細胞の表面に露出したエピトープを含むポリペプチドの一部を含むことができる。そのような断片は、通常は成熟したポリペプチド配列の少なくとも連続７個のアミノ酸を、さらに好ましくはそれの少なくとも連続１０個のアミノ酸を含む。それらは、本質的にレセプターの細胞外領域に由来する。ＮＫ細胞の表面に存在するレセプターであって、刺激により、細胞毒性、細胞内フリーカルシウムレベルの増加、サイトカインの産生、または当技術分野において公知の他の方法により測定されるような細胞の活性化をもたらす任意のレセプターを、抗体の産生に用いることができることが理解されるであろう。好ましい実施態様では、抗体を産生するために用いられる活性化ＮＫ細胞レセプターは、ヒトのレセプターである。
【００４０】
実施態様の１つでは、免疫原は、脂質膜中の、通常は細胞表面の、野生型ヒトＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４またはＮＫｐ４６ポリペプチドを含む。特定の実施態様では、免疫原は、無処理のＮＫ細胞、特に無処理のヒトＮＫ細胞を、場合によっては処理または溶解されたものを含む。本発明の好ましい単離された抗体の例には、本発明の少なくとも１つの単離されたアミノ酸化合物に対する単離された抗体であって、標的細胞の存在下に１：１の比率で置かれたＮＫ細胞により誘発される自然細胞毒性の、少なくとも約４倍の、好ましくは少なくとも約５倍の、より好ましくは少なくとも約６倍の増加を引き起こすことができる抗体が含まれる。
【００４１】
本発明の最も好ましい単離された抗体は、本発明の少なくとも１つの単離されたアミノ酸化合物に対するものであり、いずれのＴまたはＢ細胞の表面分子にも結合せず、標的細胞の存在下で１：１の比率で置かれたＮＫ細胞により誘発される自然な細胞毒性の、少なくとも約４倍の、好ましくは少なくとも約５倍の、より好ましくは少なくとも約６倍の増加を引き起こすことができる。
【００４２】
抗体は、例えば、無処理の免疫グロブリンとして、または様々なペプチダーゼで消化することによって産生された、多くのよく特性決定された断片として存在することができる。したがって例えば、ペプシンが、抗体をヒンジ領域のジスルフィド結合の下で消化して、Ｆ（ａｂ)'2、即ちＦａｂ（それ自身は、ジスルフィド結合によってＶH−ＣH1に連結された軽鎖である）の二量体を産生する。Ｆ（ａｂ)'2を、ヒンジ領域のジスルフィド結合を破壊する穏和な条件下で還元することができ、それによってＦ（ａｂ)'2二量体を、Ｆａｂ’モノマーへ変換する。Ｆａｂ’モノマーは、本質的には、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（Fundamental Immunology (Paul ed., 3d ed. 1993)を参照のこと）。様々な抗体断片が、無処理の抗体の消化によって定義されている一方で、当業者は、化学的に、または組換えＤＮＡ法を用いることにより、そのような断片を新たに合成できることが理解されるであろう。したがって、本明細書で用いられる用語「抗体」はまた、完全な抗体の修飾により産生された抗体断片、または組換えＤＮＡ法を用いて新たに合成されたもの（例えば一本鎖Ｆｖ）、またはファージディスプレイライブラリーを用いて同定されたもの（例えば、McCafferty et al, Nature 348:552-554 (1990) 参照）を含む。好ましい実施態様では、断片は、ヒトＦｃレセプター（例えばＦｃγレセプター）による抗体の特異的な認識を可能にする、ヒトＦｃ領域または他の領域を、本来含むか、または修飾されて含むことになる。
【００４３】
モロクローナルまたはポリクローナル抗体の調製は当技術分野において周知であり、任意の当技術分野における公知技術を用いることができる（例えば、Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al, Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al, pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985)を参照のこと）。一本鎖抗体の産生用技術（米国特許第４,９４６,７７８号）を、所望のポリペプチド（例えばＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６のような活性化ＮＫ細胞レセプター）に対する抗体を産生するために応用することができる。さらに、遺伝子組換えマウスまたは他の哺乳動物などの他の生物体を、ヒト化抗体、キメラ抗体または同様に修飾された抗体を発現するために用いることができる。あるいはファージディスプレイ技術を用いて、選択された抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロマーＦａｂ断片（例えば、McCafferty et al, Nature 348:552-554 (1990); Marks et al, Biotechnology 10:779- 783 (1992)参照のこと）を同定することができる。実施態様の１つでは、方法は、ライブラリーまたはレパートリーから、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４またはＮＫｐ４６などの少なくとも１つの活性化ＮＫレセプターと交差反応する、モノクローナル抗体あるいはその断片または誘導体を選択する工程を含む。例えば、レパートリーは、任意の適当な構造体（例えばファージ、バクテリア、合成複合体など）によって任意で表示された、抗体またはその断片の任意の（組換え体）レパートリーであってよい。
【００４４】
非ヒト哺乳動物を抗原により免疫化する工程は、当技術分野において周知の任意の方法で行なえばよい（例えば、E. Harlow and D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)を参照のこと）。一般に、免疫原を、任意で完全フロイントアジュバントなどのアジュバントと共に、緩衝液中に懸濁するか溶解する。免疫原の量、緩衝液の型およびアジュバントの量を決定する方法は、当業者において周知であり、本発明でいかなる形でも制限されない。
【００４５】
同様に、抗体の産生を刺激するために十分な免疫化の場所および頻度もまた、当技術分野において周知である。典型的な免疫化プロトコールでは、非ヒト動物の腹腔内に抗原を、１日目に、および約１週間後に再び、注射する。これに続いて約２０日目に、抗原のリコール注射を、任意で不完全フロイントアジュバントのようなアジュバントと共に、行う。リコール注射を静脈内に行ない、連続する数日間繰り返してもよい。これに続いて、ブースター注射を４０日目に静脈内または腹腔内に、通常アジュバントなしで行う。このプロトコールの結果、約４０日後に抗原特異的抗体産生Ｂ細胞の生成がもたらされる。他のプロトコールを、その結果免疫化に用いる抗原に対する抗体を発現するＢ細胞の生成が起こる限り、利用することができる。
【００４６】
別の実施態様では、免疫化されていない非ヒト哺乳動物からのリンパ球を単離し、インビトロで成長させ、次に細胞培養中に免疫原に曝露する。その後リンパ球を集め、下に述べる融合工程を実施する。
【００４７】
本発明の目的のために好ましいモノクローナル抗体のための次の工程は、免疫化された非ヒト哺乳動物から、例えばリンパ球、脾細胞またはＢ細胞などの細胞を単離し、続いてそれらの脾細胞、またはＢ細胞、またはリンパ球を、不死化された細胞と融合させて、抗体を生産するハイブリドーマを形成することである。従って、本明細書に用いられる用語「免疫化された動物から抗体を調製する」には、免疫化された動物の血清から抗体を直接得る工程だけでなく、免疫化された動物からＢ細胞／脾細胞／リンパ球を得る工程、およびそれらの細胞を用いて抗体を発現するハイブリドーマを産生する工程が含まれる。例えば、非ヒト哺乳動物からの脾細胞の単離は、当技術分野において周知であり、例えば、麻酔した非ヒト哺乳動物から脾臓を取り出し、それを小片に寸断し、脾臓被膜から脾細胞を絞り出し、細胞ストレーナーのナイロンメッシュを通して、適切な緩衝液へ入れ、単一細胞懸濁液を生成する工程を含む。赤血球をすべて溶解する緩衝液中で、細胞を洗浄し、遠心し、再懸濁する。その溶液を再び遠心し、ペレット中に残っているリンパ球を最後に新鮮な緩衝液に再懸濁する。
【００４８】
単離されて単一細胞懸濁液として存在するとすぐに、抗体産生細胞は不死の細胞系統に融合される。ハイブリドーマの作成に役立つ他の多くの不死の細胞系統が当技術分野において公知であるが、これは通常はマウス骨髄腫細胞系統である。好ましいマウス骨髄腫系統には、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. U.S.A. から入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来する系統、American Type Culture Collection, Rockville, Maryland U.S.A.から入手可能な Ｘ６３ Ａｇ８６５３およびＳＰ−２細胞が含まれるが、それらに限られない。融合を、ポリエチレングリコールその他を用いて達成する。得られたハイブリドーマを、次に、融合しなかった親の骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含む選択培地中で増殖させる。例えば、もし親の骨髄腫細胞がヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル転移酵素（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠いていれば、ハイブリドーマ用の培地は通常、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む（ＨＡＴ培養液）ことになり、それらの物質がＨＧＰＲＴを欠く細胞の増殖を阻止する。
【００４９】
ハイブリドーマは、マクロファージの支持細胞層上で増殖させることができる。マクロファージは好ましくは、脾細胞を単離するために用いた非ヒト哺乳動物と同腹子のものであり、通常は、ハイブリドーマをプレートする数日前に不完全フロイントアジュバントなどで前もって処理しておく。融合法については、例えば、(Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice," pp. 59-103 (Academic Press, 1986)）の中で記述されており、その開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【００５０】
細胞は、コロニー形成および抗体産生のために十分な時間だけ選択培地中で成長させておく。これは通常７〜１４日である。その後ハイブリドーマのコロニーを、所望の基質、例えばＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４および／またはＮＫｐ４６などの活性化ＮＫ細胞レセプターを特異的に認識する抗体を産生するかについて分析する。分析は、ハイブリドーマが成長するウエルに適合できる任意の分析を用いることができるが、通常は比色ＥＬＩＳＡ型分析である。他の分析には、免疫沈降法および放射免疫測定法が挙げられる。所望の抗体産生に対して陽性のウエルを検査し、１以上の別個のコロニーが存在するかどうかを判断する。２以上のコロニーが存在する場合、細胞を再度クローニングして増殖させ、単一細胞のみが抗体を産生するコロニーを生成したことを確認する。通常は一つの明白なコロニーを有する陽性のウエルを再度クローニングして再検査し、１つのモノクローナル抗体だけが検出され、産生されていることを確認する。
【００５１】
本発明のモノクローナル抗体を産生していることが確認されたハイブリドーマを、次にＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０などの適切な培地中で大量に増殖させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、インビボで動物の腹水癌として増殖させることができる。
【００５２】
所望のモノクローナル抗体を産生するために十分な増殖の後、モノクローナル抗体を含む増殖培地（あるいは腹水）を細胞から分離し、そこに存在するモノクローナル抗体を精製する。精製は、通常はゲル電気泳動、透析、プロテインＡまたはプロテインＧセファロースを用いるクロマトグラフィー、またはアガロースまたはセファロースビーズなどの固体支持体に連結された抗−マウスＩｇによって、達成される（すべてが、例えば Antibody Purification Handbook, Amersham Biosciences, publication No. 18-1037-46, Edition AC,に記述されており、その開示は参照により本明細書に組み入れられる）。結合した抗体を、プロテインＡ／プロテインＧカラムから、通常は低ｐＨ緩衝液（ｐＨ３.０以下のグリシンまたは酢酸緩衝溶液）を用いることにより溶出し、直ちに抗体を含む分画を中和する。これらの分画を、貯め、透析し、必要に応じて濃縮する。
【００５３】
好ましい実施態様では、活性化ＮＫレセプター上に存在する決定基に結合する抗体をコードするＤＮＡを、ハイブリドーマから単離し、適切な発現ベクター中に置いて、適切な宿主中へトランスフェクションする。その宿主を次に、抗体、その変異体、その活性断片、または抗体の抗原認識部分を含むヒト化またはキメラ抗体の組換え体の産生のために用いる。好ましくは、この実施態様の中で用いられるＤＮＡは、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４またはＮＫｐ４６などの１つ以上のヒト活性化ＮＫレセプター上に存在する決定基を認識し、関連するレセプターを発現するＮＫ細胞の活性化を引き起こす抗体をコードする。また好ましくは、誘導体または断片は、ヒトまたはヒト様のＦｃ部分、例えばＦｃγレセプターなどのヒトＦｃレセプターにより特異的に認識される部分を包含する。
【００５４】
本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、従来の手続きを用いて（例えば、マウスの抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）、容易に単離し、配列決定することができる。一旦単離すれば、ＤＮＡを発現ベクター中に配置することができ、それを次にE. coli細胞、サルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞などの、本来は免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞へトランスフェクションして、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体を合成できるようにする。抗体をコードするＤＮＡのバクテリア中での組換え発現は、当技術分野において周知である（例えば、Skerra et al. (1993) Curr. Op. Immunol. 5:256; および Pluckthun (1992) Immunol. Revs. 130:151 参照）。
【００５５】
抗体はまた、例えば、Ward et al.(1989) Nature 341 :544.の中で開示されているように、免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリーの選択によって産生されることもできる。
【００５６】
特定の実施態様では、抗体は、モノクローナル抗体：ＡＺ２０、Ａ７６、Ｚ２５、Ｚ２３１またはＢＡＢ２８１のいずれかが結合するものと本質的に同じエピトープに結合する。そのような抗体を、本明細書では「ＡＺ２０様抗体」、「Ａ７６様抗体」などと呼ぶ。用語モノクローナル抗体ｘと「実質的に同じエピトープまたは決定基に結合する」とは、抗体がｘと「競合することができる」ことを意味する（ここでｘは、ＡＺ２０、Ａ７６などである）。問題のモノクローナル抗体と実質的に同じエピトープと結合する１つ以上の抗体の同定は、抗体の競合を評価することができる様々な免疫学的スクリーニング分析の任意の１つを用いて、容易に行うことができる。そのような分析は当技術分野においてすべて日常業務である（例えばＵ.Ｓ. Ｐａｔ. Ｎｏ. ５,６６０,８２７、１９９７年８月２６日発行、を参照のこと、それは参照により具体的に本明細書に組み入れられる）。抗体が結合するエピトープを実際に決定することは、問題のモノクローナル抗体が結合するものと同じまたは実質的に同じエピトープに結合する抗体を同定するためには、全く必要ではないことが理解されるであろう。ＡＺ２０産生ハイブリドーマは、番号Ｉ−２５７６の下にＣ.Ｎ.Ｃ.Ｍ.に２０００年１１月８日に寄託されている（C.N.C.M., Institut Pasteur, 25 rue du Dr. Roux, F- 75724 Paris Cedex 15, France）。Ｂａｂ２８１は、Sivori et al (1997) J. Exp. Med. 186:1129-1136 に記述され；Ｚ２３１は、Vitale et al. (1998) J. Exp. Med. 187:2065-2072 に記述され；Ｚ２５（およびＡＺ２０）は、Pende et al.(1999) J Exp Med. 190(10):1505-1516 に記述されている。
【００５７】
例えば、検査するテスト抗体が、種々の供給源の動物から得られる場合、または異なるＩｇアイソタイプである場合にさえも、対照（例えばＢＡＢ２８１）とテスト抗体を混ぜ（またはあらかじめ吸着させ）、エピトープを含むタンパク質（例えばＢＡＢ２８１の場合のＮＫｐ４６）を含む試料に適用する、単純な競合分析を採用することができる。ＥＬＩＳＡ、放射免疫検定法、ウェスタンブロッティングに基づいたプロトコール、およびＢＩＡＣＯＲＥ（例えば、実施例の項で記述されている）の使用が、そのような単純な競合研究における使用に適しており、当技術分野において周知である。
【００５８】
ある実施態様では、対照抗体（例えばＢＡＢ２８１）を、種々の量のテスト抗体（例えば１：１０または１：１００）と、抗原（例えばＮＫｐ４６エピトープ）を含む試料に適用する前の期間にあらかじめ混合しておくことになろう。他の実施態様では、対照および種々の量のテスト抗体を、抗原試料に曝露する間に単に混ぜることができる。結合した抗体とフリーの抗体を区別することができ（例えば分離または洗浄技術を用いて結合していない抗体を除去することにより）、かつ対照抗体とテスト抗体を区別することができるならば（例えば種−またはアイソタイプ−特異的な二次抗体を用いて、または対照抗体を検知可能なラベルで特異的にラベルすることにより、テスト抗体が、対照抗体の抗原への結合を減少させるかどうか判断することができ、それはテスト抗体が対照と実質的に同じエピトープを認識することを示す。完全に無関係の抗体が存在しない状態での（ラベルされた）対照抗体の結合は、高い対照値になるであろう。低い対照値は、ラベルされた対照抗体（例えばＢＡＢ２８１）を正確に同一の型のラベルされていない抗体（例えばＢＡＢ２８１）とインキュベーションすることによって得られるであろう。その場合競合が生じてラベルされた抗体の結合が減少することになる。テスト分析におけるテスト抗体存在下でのラベルされた抗体の反応性の著しい減少は、同一のエピトープを認識するテスト抗体、すなわちラベルされた対照抗体と「交差反応する」テスト抗体を示す。ラベルされた対照の各抗原への結合を、約１：１０〜約１：１００の間における任意の比率の対照対テスト抗体で、少なくとも５０％、またはより好ましくは７０％低下させる任意のテスト抗体は、実質的に対照と同じエピトープまたは決定因子に結合する抗体であると考えられる。好ましくはそのようなテスト抗体は、対照の抗原への結合を少なくとも９０％低下させる。
【００５９】
実施態様の１つでは、競合をフローサイトメトリーテストによって評価することができる。所定の活性化レセプターを所持する細胞を、まず特異的にレセプターに結合すると知られている対照抗体と（例えばＮＫｐ４６を発現するＮＫ細胞を、ＢＡＢ２８１抗体と）インキュベーションし、次に、例えば螢光色素またはビオチンでラベルされたテスト抗体とインキュベーションする。もし飽和量の対照抗体とプレインキュベーションした細胞について得られた結合が、対照とプレインキュベーションしなかった細胞によって得られた結合の８０％、好ましくは５０、４０％、またはそれ以下（蛍光の平均）である場合は、テスト抗体は対照と競合すると言う。あるいは、もし、ラベルされた（蛍光色素またはビオチンにより）対照抗体と、テストするべき抗体の飽和量とプレインキュベーションした細胞との間で得られた結合量が、テスト抗体とのプレインキュベーションなしの場合に得られた結合量の８０％、好ましくは５０％  ４０％、またはそれ以下である場合には、テスト抗体は対照と競合すると言う。
【００６０】
１つの好ましい例では、テスト抗体を、抗体結合の基質（例えばＮＫｐ４６タンパク質、またはそれのＢＡＢ２８１が結合すると知られているエピトープを含む部分）を固定化した表面へ、あらかじめ吸着させ飽和濃度で適用する、単純な競合分析を用いてもよい。表面は、ＢＩＡＣＯＲＥチップが好ましい。次に、対照抗体（例えばＢＡＢ２８１）を、基質を飽和させる濃度で表面と接触させて、対照抗体の基質表面への結合を測定する。対照抗体のこの結合量を、テスト抗体がない状態での、対照抗体の基質を含む表面への結合と比較する。テスト分析において、テスト抗体の存在下での対照抗体の基質を含む表面への結合の有意な減少は、同一のエピトープを認識するテスト抗体の存在、すなわち対照抗体と「交差反応する」テスト抗体の存在を示す。抗原を含む基質への対照抗体の結合を少なくとも３０％以上好ましくは４０％低下させる任意のテスト抗体は、対照抗体と実質的に同一のエピトープまたは決定因子に結合する抗体であると考えられる。好ましくは、そのようなテスト抗体は、対照抗体の基質への結合を少なくとも５０％低下させる。対照抗体とテスト抗体の順序を逆転させること、即ち対照抗体を先ず表面と結合させ、その後テスト抗体を表面と接触させることができることも了解される。好ましくは、先ず基質抗原に対するより高い親和性を有する抗体を、基質を含む表面へ結合させる。それは、第２の抗体（抗体が交差反応をしていると仮定して）に見られる結合量の減少量がより大きいと予測されるからである。そのような分析のさらなる例が、実施例および Saunal and Regenmortel, (1995) J. Immunol.Methods 183:33-41 に与えられており、その開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【００６１】
１つの実施態様においては、特にもし抗体が他の無関係なタンパク質と過度の交差反応性を示さないことが保証されるならば、ＮＫ細胞表面上の複数の活性化レセプター（例えばＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６の２以上の任意の組み合わせ、または１つ以上のこれらのレセプターおよび追加の活性化レセプターを含む任意の組み合せと相互作用することができる抗体を得てもよい。活性化ＮＫ細胞レセプターのエピトープ（例えばＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６のエピトープ）を認識するモノクローナル抗体は、高い割合のＮＫ細胞上に、例えば少なくとも約７０〜９０％、好ましくは約８０％のそのような細胞上に存在するエピトープと反応するであろう。しかしＣＤ３＋Ｔ細胞またはＣＤ２０＋Ｂ細胞とは有意に反応しないであろう。好ましい実施態様では、抗体は、また、単球、顆粒球、血小板および赤血球とは反応しない。
【００６２】
ＮＫ細胞を活性化する抗体の同定
ＮＫ細胞上の、好ましくはヒトＮＫ細胞上の１以上の活性化レセプターを特異的に認識する抗体を同定した場合は、まずそれが無処理のＮＫ細胞を、好ましくはヒトＮＫ細胞を活性化する能力についてテストする。その後そのような抗体を、それらが少なくとも部分的にはレセプターによって仲介される活性化信号伝達経路を刺激する、という意味で、「活性化」抗体と認める。具体的には、本明細書に使用される用語、ＮＫ細胞活性を「活性化する」とは、とりわけ、結合、発現に基づくまたは細胞の分析などの、その多数が利用可能で本発明の目的に適当でありまた当業者に周知である任意の適切な分析あるいはテストを用いて、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、４０％または５０％以上増加させる能力を意味する。本発明の好ましい抗体は、例えば：（ｉ）ＭＨＣクラスＩ陰性標的、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞または同種異系細胞に対する自然細胞毒性、（ii）抗体をコートされた標的細胞に対する細胞毒性、（iii）細胞質内Ｃａ2+濃度の増加、（iv）ＺＡＰ７０、Ｓｙｋ、ＬＡＴ、ＳＬＰ７６、Ｓｈｃ、Ｇｒｂ２、ホスホリパーゼＣ−γ酵素、ホスファチジル−イノシトール３−キナーゼなどの細胞質内のアダプター／エフェクター分子のチロシンリン酸化の誘導、（v）レセプターに関連する情報変換鎖、ＫＡＲＡＰ／ＤＡＰ１２またはＣＤ３ζまたはＦｃＲγのリン酸化、（ｖｉ）インターフェロンγ、腫瘍壊死因子、ＩＬ５、ＩＬｌ０、（ＭＩＰ−１αなどの）ケモカイン、ＴＧＦβなどのサイトカイン分泌、（vii）ＣＤ６９およびＰＥＮ５などのＮＫ細胞表面の分子それぞれの、アップまたはダウンレギュレーションなどによって評価される、ＮＫ細胞活性化の、統計的に有意な（ｐ＜０.０５）増加を引き起こすことができる。
【００６３】
ＮＫ細胞活性化を多くの方法のいずれかによって、例えば Sivori et at (1997) J. Exp. Med. 186:1129-1136 に記述されている細胞内フリーカルシウムの増加によって、検出することができる。ＮＫ細胞活性を、抗体がＮＫ細胞を刺激して、Ｐ８１５、Ｋ５６２細胞、または Sivori et al. (1997) J. Exp. Med. 186: 1129-1136; Vitale et al. (1998) J. Exp. Med. 187: 2065-2072; Pessino et al (1998) J. Exp. Med. 188: 953-960; Neri et al. (2001) Clin. Diag. Lab. Immun. 8:1131-1135); Pende et al. (1999) J. Exp. Med. 190: 1505-1516（各開示の全体は参照により本明細書に組み入れられる）の中で開示されている適切な腫瘍細胞などの標的細胞を、殺す能力を評価することなどの、細胞に基づく細胞毒性分析、例えばクロム放出を測定して評価することができる。好ましい実施態様では、抗体がＮＫ細胞毒性の少なくとも１０％の増加を、好ましくは少なくとも４０％または５０％のＮＫ細胞毒性の増加を、またはより好ましくは少なくとも７０％のＮＫ細胞毒性の増加を引き起こす。
【００６４】
サイトカイン放出分析を用いて、ＮＫ細胞活性を扱うことができる。その場合、ＮＫ細胞を抗体とインキュベーションしてＮＫ細胞のサイトカイン産生（例えばＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの産生）を刺激する。例示的なプロトコールにおいて、ＰＢＭＣからのＩＦＮ−γの産生を、細胞表面および細胞質内の染色およびフローサイトメトリーによる解析によって培養４日後に評価する。手短に言えば、ブレフェルジンＡ（Sigma Aldrich）を５μg/mlの最終濃度で、培養の最後の４時間に加える。その後、細胞を抗ＣＤ３および抗ＣＤ５６ ｍＡｂとインキュベーションした後、透過性を付与し（IntraPrep（商標)；Beckman Coulter）、ＰＥ−抗−ＩＦＮ−γまたはＰＥ−ＩｇＧ１（Pharmingen）で染色する。ポリクローンの活性化されたＮＫ細胞からのＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γ産生を、ＥＬＩＳＡ（GM-CSF: DuoSet Elisa, R&D Systems, Minneapolis, MN; IFN-γ: OptE1A set, Pharmingen）を用いて、上清中で測定する。
【００６５】
好ましい実施態様では、抗体がヒトＮＫ細胞を活性化する能力を評価し、その場合に抗体がヒトＮＫ細胞を少なくとも非ヒトＮＫ細胞と同じに活性化する能力は、その抗体が本発明での使用に適することを示す。
【００６６】
ヒトにおける使用に適する抗体の産生
ヒト活性化ＮＫ細胞レセプターに特異的に結合し、刺激することができるモノクローナル抗体が、一般に非ヒト動物で産生されたならば、その抗体を、ヒトでの治療用使用に適するように修飾する。例えば、当技術分野において周知の方法を用いて、それらをヒト化するか、キメラ化するか、あるいはヒト抗体のライブラリーから選ぶ。
【００６７】
１つの好ましい実施態様では、本発明の例えばＢＡＢ２８１様抗体などの抗体を生成するハイブリドーマＤＮＡを、発現ベクター中へ挿入する前に、例えばヒトの重鎖および軽鎖の不変領域のコード配列を、相同の非ヒト配列の代わりに置き換えることにより（例えば、 Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851）、または免疫グロブリンのコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列のすべてまたは一部を共有結合で連結することにより、修飾することができる。そのようにして、元の抗体の結合特異性を有する「キメラの」または「ハイブリッドの」抗体を調製する。通常は、そのような非免疫グロブリンポリペプチドを、本発明の抗体の不変領域に置換する。
【００６８】
特に好ましい１つの実施態様では、本発明の抗体をヒト化する。本発明の抗体の「ヒト化」型は、マウスまたは他の非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含む、特異的なキメラの免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、あるいはそれらの断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’)２、あるいは抗体の他の抗原結合部分配列など）である。大部分、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（受容側抗体）の相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、元の抗体（供与側抗体）のＣＤＲの残基によって、元の抗体の望ましい特異性、親和性、および能力を維持しながら置換されたものである。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト動物の残基によって置換されてもよい。さらにヒト化抗体は、受容側抗体にも輸入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見つからない残基を含むことができる。これらの修飾を、さらに抗体の性能を洗練し最適化するために行う。一般にヒト化抗体は、少なくとも１つの、通常は２つの可変領域（その可変領域内では、すべてのまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域が元の抗体のＣＤＲ領域に対応し、またすべてのあるいは実質的にすべてのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンの共通配列のＦＲ領域である）を実質的にすべて含む。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン不変領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分を、通常はヒト免疫グロブリンのそれを含むのが最もよい。さらに詳細には、Jones et al, Nature, 321, pp. 522 (1986); Reichmann et al, Nature, 332, pp. 323 (1988); および Presta, Curr. Op. Struct. Biol, 2, pp. 593 (1992) を参照のこと。
【００６９】
抗体をヒト化する方法は、当技術分野において周知である。一般に、本発明によるヒト化抗体は、元の抗体からヒト化抗体へ導入された１個以上のアミノ酸残基を有する。これらのマウスまたは他の非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「輸入」残基と呼ばれ、通常それらは「輸入」元の可変領域から採取される。ヒト化を、Winter および共同研究者 (Jones et al (1986) Nature 321:522; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323; Verhoeyen et al (1988) Science 239:1534 (1988))の方法に従って、実質的に行なうことができる。ある場合には、そのような「ヒト化」抗体は、ヒトの可変領域全体より相当小さな領域が、元の抗体の対応する配列により置換された、キメラ抗体（Cabilly et al., U.S.PAT 4,816,567）である。実際には、本発明によるヒト化抗体は、通常は、いくつかのＣＤＲ残基および恐らくいくつかのＦＲ残基が元の抗体の類似部位の残基によって置換された、ヒト抗体である。
【００７０】
ヒト化抗体の作製に用いられるヒトの軽鎖および重鎖双方の可変領域の選択が、抗原性を減少させるために極めて重要である。いわゆる「最良適合」法により、本発明の抗体の可変領域の配列を、公知のヒト可変領域配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。マウスの配列に最も近いヒトの配列を、次に、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れる（Sims et al (1993) J. Immunol., 151:2296; Chothia and Lesk (1987) J. MoI. Biol. 196:901）。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体の共通配列由来の特別なフレームワークを用いる。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に用いることができる（Carter et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 4285; Presta et al (1993) J. Immunol. 51:1993）。
【００７１】
１以上の活性化ＮＫ細胞レセプターへの、好ましくはヒトのレセプターへの高い親和性および他の好適な生物学的特性を保持したままで、抗体をヒト化することがさらに重要である。この目標を達成するために、好ましい方法によれば、親配列およびヒト化配列の３次元モデルを用いる、親配列および様々な概念的ヒト化生成物の分析過程によって、ヒト化抗体を調製する。３次元免疫グロブリンモデルは、一般に当業者が利用可能であり、なじみ深い。選択された候補免疫グロブリン配列の予想される３次元立体構造を図示し、表示するコンピュータープログラムを利用することができる。これらの表示を精査することにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性の高い役割の分析、即ち候補免疫グロブリンが抗原を結合する能力に影響を及ぼす残基の分析、が可能となる。このようにして、標的抗原への増加した親和性などの望ましい抗体特性を達成するために、共通配列および輸入配列からＦＲ残基を選択して組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は、直接的かつ最も実質的に抗原結合に影響を及ぼしている。
【００７２】
「ヒト化」モノクローナル抗体を作製する別の方法は、免疫化に使用するマウスとして、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標、Abgenix, Fremont, CA）を用いることである。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、自己の免疫グロブリン遺伝子を機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子と置き換えられたマウス宿主である。したがって、このマウスによって生成された、あるいはこのマウスのＢ細胞から作製されたハイブリドーマ中で生成された抗体は、既にヒト化されている。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅについては米国特許第６,１６２,９６３号に記述されており、その全体は参照により本明細書に組み入れられる。同様な方法を、ＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（商標、Medarex）を用いて達成することができる。
【００７３】
ヒト抗体を様々な他の技術により、例えば、ヒト抗体レパートリーを発現するために遺伝子操作された他の遺伝子組換え動物（Jakobovitz et al, Nature 362 (1993) 255）を免疫化のために用いることにより、またはファージディスプレイ法を用いて抗体レパートリーを選択することにより、生成してもよい。そのような技術を当業者は知っており、モノクローナル抗体から出発して、本出願中に開示されるようにして実施することができる。
【００７４】
本発明はまた、本発明の抗体の断片および誘導体を含む。「免疫反応性断片」は、無処理の抗体の一部、一般に抗原結合部位または可変領域、を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ'−ＳＨ、Ｆ（ａｂ')２、およびＦｖ断片；ダイアボディ；隣接するアミノ酸残基の連続する一つの配列から成る一次構造を有するポリペプチド（本明細書で「一本鎖抗体断片」または「一本鎖ポリペプチド」と呼ぶ）であって、（１）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（２）関連する重鎖部分のない軽鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む、１本の軽鎖可変領域のみまたはその断片、を含む一本鎖ポリペプチド、および（３）関連する軽鎖部分のない重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む、１本の重鎖可変領域のみまたはその断片を含む一本鎖ポリペプチド、を含むがそれらに限られない任意の抗体断片；および抗体断片から形成された多重特異的な抗体が挙げられるが、それらに限られない。例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ')2断片を、従来の技術により、単離した抗体のプロテアーゼ消化によって生成することができる。好ましい実施態様では、断片または誘導体はヒトもしくはヒト様Ｆｃ部分を含み、それはＦｃγレセプターなどのヒトのＦｃレセプターによって特異的に認識される区分を意味する。
【００７５】
また本発明の抗体を誘導体化して、重鎖および／または軽鎖の一部は元の抗体中の対応する配列と同一かまたは相同であり、一方で鎖の残りの部分が、別の種に由来するか、別の抗体のクラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一か相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）にすることができ、ならびにそれらが望みの生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片にもすることができる（Cabilly et al.,上記; Morrison et al.(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851）。
【００７６】
本発明の範囲内の他の誘導体には、機能化された抗体、即ちリシン、ジフテリア毒素、アブリンおよびPseudomonas菌体外毒素などの毒素に；蛍光性部分などの検知できる部分に；放射性同位体またはイメージング薬剤に；あるいはアガロースビーズなどの固体支持体に、共役されているかまたは共有結合している抗体が含まれる。抗体へのこれらの他の薬剤の共役あるいは共有結合のための方法は、当技術分野において周知である。
【００７７】
治療方法における使用のための抗体の選択
ＮＫ細胞上の活性化レセプターに、好ましくはヒトＮＫ細胞レセプターに特異的に結合し、それによりＮＫ細胞を活性化し、ヒトでの使用に適するように調整されたことがわかった抗体が得たらならば、次に通常はそれらが標的細胞と相互作用する能力について評価する。好ましい実施態様では、標的細胞は、Ｆｃレセプター、特にＦｃγレセプターを発現する。そのＦｃγレセプターには、ＦＣＧＲ３Ａ（ＣＤ１６、ＦＣＧＲ３、免疫グロブリンＧ ＦｃレセプターIII；ＩＧＦＲ３、ＩｇＧのＦｃ断片に対するレセプター、低親和性IIIａ、とも呼ばれる；例えばOMIM 146760を参照のこと）、ＦＣＧＲ２Ａ（ＣＤ３２、ＣＤｗ３２、ＩｇＧのＦｃ断片に対するレセプター、低親和性IIａ、ＦＣＧ２、免疫グロブリンＧ ＦｃレセプターII、とも呼ばれる；例えばOMIM 146790を参照のこと）；ＦＣＧＲ２Ｂ（ＣＤ３２、ＩｇＧのＦｃ断片に対するレセプター、低親和性IIｂ；ＦＣＧＲ２Ｂ、ＦＣγ−ＲIIＢ、とも呼ばれる；例えばOMIM 604590を参照のこと）、ＦＣＧ１ＲＡ（ＣＤ６４；ＩｇＧのＦｃ断片に対するレセプター；高親和性Ｉａ、ＩＧＦＲ１、とも呼ばれる；例えばOMIM 146760を参照のこと）；ＩｇＧのＦＣＧＲ１断片、高親和性Ｉｃ、免疫グロブリンＧ ＦｃレセプターＩＣ、ＩＧＦＲＣ；例えばOMIM 601503を参照のこと）；またはＦＣＧＲ１Ｂ（ＣＤ６４、ＩｇＧのＦｃ断片に対するレセプター、高親和性Ｉｂ；免疫グロブリンＧ ＦｃレセプターＩＢ；ＩＧＦＲＢとも呼ばれる；例えばOMIM 601502を参照のこと）；などがある。
【００７８】
抗体の標的細胞と相互作用する能力を、多くの周知の方法の任意のものを用いて評価することができる。一般に、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６などの活性化ＮＫ細胞レセプターへの抗体結合を検出するための、競合に基づく分析、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット、ＢＩＡＣＯＲＥに基づく分析およびフローサイトメトリー分析を含む上述の分析を、ヒト化された、キメラの、または他のヒト用活性化ＮＫ細胞抗体の標的細胞との相互作用を検出するために、等しく適用することができる。１つの実施態様では、結合を評価するために用いられる標的細胞は、Ｂ細胞、マクロファージ、マスト細胞、骨髄性細胞、単球、好中球、好塩基球、好酸球、ランゲルハンス細胞、血小板および胎盤内皮細胞から成る群より選択される感染細胞または悪性細胞である。１つの好ましい実施態様では、標的細胞はヒトの細胞である。
【００７９】
別の実施態様では、標的細胞は、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ２Ｂ、ＦＣＧ１ＲＡ、ＦＣＧＲ１またはＦＣＧＲ１ＢのようなＦｃγレセプターなどのＦｃレセプターを発現する細胞系統である。再び、抗体−あるいはそのＦｃ断片−と単離したＦｃレセプターの間の、あるいは無処理の細胞、溶解された細胞または細胞膜もしくは脂質製剤の内に存在するレセプターとの相互作用の測定に適する任意の分析を行なうことができる。好ましくは、分析において、ヒト細胞および／またはヒトＦｃレセプターを用いる。標的細胞への結合を検出するための任意の分析の実施態様の１つでは、抗体の単離したＦｃ断片を用いる。
【００８０】
ある実施態様では、抗体はさらに、Ｆｃレセプターとの相互作用を増強するために、例えば、Ｆｃレセプターとの相互作用が増強されることが知られているＦｃ領域内のある残基の変更によって、あるいは、Ｆｃレセプターへの結合を増強することができるＦｃ領域内の（またはＩｇ内の他の場所の）アミノ酸の変更を実験的に同定するための周知の方法を用いて、修飾される。例えば、Shields et al.(J. Biol. Chem. 276:6591-6604)を参照のこと。
【００８１】
本分析では、ヒト化またはヒト用抗体、あるいはＦｃを含むその断片の、標的細胞またはヒトＦｃレセプターへ結合する能力を、対照のタンパク質、例えば同じ標的に結合する非ヒト抗体あるいは非Ｉｇペプチドまたはタンパク質、の能力と比較することになる。任意の適当な分析を用いて、対照タンパク質に比較して２５％、５０％、１００％、２００％、１０００％、あるいはより高く増加した親和性で、標的細胞またはＦｃレセプターへ結合する抗体あるいは断片は、標的に「特異的に結合する」あるいは標的と「特異的に相互作用する」とよび、下に述べる治療方法での使用に好ましい。
【００８２】
好ましい実施態様の１つでは、したがって、本発明は、血液悪性腫瘍のような悪性腫瘍、あるいはウイルス感染症を含む感染症などの障害の治療における使用に適する抗体を生成する方法であって、次の工程を含む方法を提供する：ａ）ヒト活性化ＮＫ細胞レセプターに特異的に結合し、活性化するモノクローナル抗体を用意する工程；ｂ）抗体をヒト化する、またはヒトでの使用に適するように調整する工程；およびｃ）ヒト化またはヒト用抗体が、ヒトＦｃレセプターを発現している標的細胞、または単離したヒトＦｃレセプターと特異的に相互作用する能力を評価する工程であって、ヒト化されたまたはヒト用抗体が、ヒトＦｃレセプター発現標的細胞および／または単離したヒトＦｃレセプターに特異的に結合するという決定が、抗体が障害の治療への使用に適していることを示す工程。
【００８３】
同等な方法を用いて、動物の治療に、あるいは動物モデルでのテストに適する抗体を生成することができることは理解されよう。その場合、抗体は、当該動物のＮＫ細胞レセプターを特異的に認識し活性化することができ、かつ同じ動物のＦｃレセプターによって認識されることが保証される。同様に、抗体は、動物への投与に適するように修飾される。
【００８４】
ある実施態様では、抗体は適当な動物モデル中で、インビボで評価される。例えば、ヒトＮＫ細胞を含むマウスモデルにヒト用抗体を投与し、マウス中のヒトＮＫ細胞の活性を検討する（サイトカイン産生、細胞毒活性、その他の点から）。好ましい実施態様では、動物モデルは、ヒトＮＫ細胞およびヒトの腫瘍または感染細胞の両方を、好ましくはＦｃγレセプター陽性の腫瘍または感染細胞を含み、抗体が、ＮＫ細胞の活性化を刺激し、標的細胞と相互作用する能力、および／または標的細胞を、溶解し、殺し、数を減少させ、増殖を阻害し、または別の方法で阻害する能力が決定される。例えば実施例７を参照のこと。
【００８５】
抗体の投与および治療方法の候補の認定
本方法を用いて産生される抗体は、癌、充実性および非充実性腫瘍および血液悪性腫瘍などの一定の障害、ならびにウイルス感染症などの感染症の治療において特に有効である。好ましい実施態様では、本抗体は、腫瘍または他の悪性腫瘍、ウイルス感染症あるいは任意の他の望ましくない細胞を有する患者であって、その悪性細胞、感染細胞または望まれない細胞が、Ｆｃγレセプターのような１つ以上のＦｃレセプターを発現する患者を治療するのに役立つ。１つの実施態様では、細胞はＭＨＣクラスIを欠失している。
【００８６】
本発明はまた、本抗体を用いる治療に適する患者を認定するための方法、あるいは本発明の抗体の治療効果を評価することを目指す臨床試験への加入に適する個人を認定するための方法も提供する。特に、悪性腫瘍またはウイルス感染細胞がＦｃγレセプターなどのＦｃレセプターを発現する細胞を含む、血液悪性腫瘍などの悪性腫瘍またはウイルス感染細胞を有する個人が、そのような治療に、またはそのような臨床試験への加入に特によく適する。従って本発明は、悪性腫瘍または感染症を有する患者を治療する方法、あるいは臨床試験への加入に適する悪性腫瘍または感染症を有する患者を認定する方法であって、悪性腫瘍または感染症がＦｃレセプターを発現する細胞を含むかどうか判断する工程を含み、その場合悪性腫瘍または感染症がＦｃレセプターを発現する細胞を含んでいるという決定は、その個人が、本抗体の投与を含む治療または臨床試験への加入に適することを示す。好ましい実施態様では、ＦｃレセプーはＦｃγレセプターである。別の好ましい実施態様では、悪性腫瘍は、濾胞性リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、マクロファージ腫瘍、急性単球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、慢性リンパ球性白血病、マスト細胞悪性腫瘍、骨髄化生または慢性骨髄性白血病などの血液悪性腫瘍であり、あるいはより一般的には、悪性腫瘍または感染症は、次の細胞型：Ｂ細胞、マクロファージ、マスト細胞、骨髄性細胞、単球、好中球、好塩基球、好酸球、ランゲルハンス細胞、血小板および胎盤内皮細胞のいずれかを含む。
【００８７】
そのような方法においては、Ｆｃレセプター発現細胞の存在を、当業者に周知の多くの方法のうちのいずれかで検出することができる。例えば、生検を行なって腫瘍細胞あるいは感染細胞を単離することができ、また細胞表面上のＦｃレセプターの存在または欠如を、特異的に１以上のＦｃレセプターを認識する抗体を用いて検出することができる。そのような抗体は容易に入手でき、また細胞上の特異的なレセプターを検出する方法は当技術分野において周知である。任意のＦｃレセプターの検出はいずれも、患者が本抗体を用いる治療の候補であること、あるいは本方法を用いて産生された任意の特定の抗体の効能を評価する臨床試験への加入に適することを示す。
【００８８】
本発明はまた、例えば医薬品組成物のような組成物であって、任意の適当な媒体中に本抗体のいずれか(その断片または誘導体を含む）を、患者中のまたはＮＫ細胞を含む生体サンプル中のＮＫ細胞の細胞毒性を検知可能に増強するために、および細胞毒性ＮＫ細胞の、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞またはＦｃレセプター発現細胞を標的とする能力を増強するために、十分な量だけ含む組成物を提供する。組成物は一般に、薬学的に許容されうる担体をさらに含む。本発明の単離した抗体を、例えば治療方法において使用するための本抗体を含むキットとしても提供する。
【００８９】
これらの組成物中で用いることのできる薬学的に許容されうる担体には、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清蛋白質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝剤例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩類または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩類、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が含まれるが、それらに限られない。
【００９０】
本発明の組成物を、患者または生体サンプル中のＮＫ細胞の活性を増強する方法において、使用してもよい。患者と関連する使用のためには、患者への投与のために組成物を調製しなければならない。患者へ抗体および組成物を投与する本方法はまた、動物を治療するために、あるいはヒトの疾病の動物モデルにおいて本明細書に記載した方法または組成物のいずれかの効能をテストするために、もまた用いることができることは理解できよう。
【００９１】
本発明の組成物を、経口的に、非経口的に、吸入スプレーにより、局所的に、直腸に、鼻中に、口腔に、膣にあるいは植設された貯蔵器経由で、投与することができる。本明細書に使用される用語「非経口的」には、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、関節滑液内、胸骨内、髄膜内、肝臓内、病巣内および頭蓋内への注射または注入技術が含まれる。好ましくは、組成物を、経口的に、腹腔内にあるいは静脈内に投与する。
【００９２】
別の実施態様では、本発明の抗体を、悪性腫瘍と感染症を治療するための移植方法の一部として用いることができる。例えば、患者に、本発明の方法によって活性化された精製ＮＫ細胞を与える。これは特に、ＭＨＣが一致しするまたは一致しない造血細胞の移植（骨髄／末梢血幹細胞）に適用される。これらの活性化されたＮＫ細胞、例えば同種異系ＮＫ細胞を、例えば、移植される患者に、理想的には移植の遅くとも約２日後に、静脈内に注入することができる。実施態様の１つでは、充実性または液性腫瘍あるいはウイルス他の微生物感染症に罹患している患者の、その患者由来のＮＫ細胞を、本発明の方法および／または組成物によって精製して活性化し、次に患者の静脈内に再注入する。患者への注入の正確な量および頻度は、個々の病状に依存し、資格のある開業医によってケースバイケースで決定がなされるのが最善である可能性が最も高い。
【００９３】
本発明の組成物の滅菌注射剤形は、水性または油性の懸濁液である。これらの懸濁液を、公知技術によって、適当な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて調製することができる。滅菌注射製剤はまた、例えば１,３−ブタンジオールの溶液のような無毒で非経口的に許容されうる希釈液または溶媒中の滅菌注射溶液または懸濁液でよい。採用してもよい許容されうる媒体および溶媒には、水、リンゲル液、および等張食塩水がある。さらに滅菌不揮発性油が、従来から、溶媒または懸濁媒体として使用されている。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の穏和な不揮発性油を使用することができる。オレイン酸などの脂肪酸およびそのグリセリド誘導体は注射剤の調製に役立ち、オリーブ油またはヒマシ油、特にそれらのポリオキシエチル化物などの自然の薬学的に許容されうる油がそうである。これらの油溶液あるいは懸濁液はまた、乳剤および懸濁液を含む薬学的に許容されうる製剤の調製において一般に用いられる、カルボキシメチルセルロースまたは類似の分散剤などの、長鎖アルコール希釈剤あるいは分散剤を含んでもよい。Ｔｗｅｅｎ，Ｓｐａｎおよび他の乳化剤などの、他の一般に用いられている界面活性剤、あるいは薬学的に許容されうる固体、液体あるいは他の剤形の製造において一般に用いられる生物学的有用性促進剤を、調剤のために用いてもよい。
【００９４】
本発明の組成物を、カプセル、錠剤、水性懸濁液または溶液を非限定的に含む、経口での受容が可能な任意の剤形で、経口で投与することができる。経口用の錠剤の場合には、一般に用いられる担体にはラクトースとコーンスターチが含まれる。ステアリン酸マグネシウムなどの円滑剤も、通常加える。カプセル形式での経口投与には、有用な希釈剤に、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。水性懸濁液が経口使用に必要な場合は、活性成分を乳化剤および懸濁剤と組み合わせる。もし所望であれば、一定の甘味料、調味料あるいは着色剤を加えてもよい。
【００９５】
あるいは、本発明の組成物を直腸投与用の坐薬の形で投与してもよい。薬剤を、室温では固体であるが直腸温では液体であり、したがって直腸中で溶けて薬剤を放出する適当な非刺激性賦形剤と混合することにより、これらを調製することができる。そのような材料には、カカオバター、密蝋およびポリエチレングリコールが含まれる。
【００９６】
実施態様の１つでは、本発明の抗体をリポソーム（「免疫リポソーム」）に、単独でまたは患者または動物への標的指向性送達用の他の物質と共に、組み込むことができる。そのような他の物質には、遺伝子療法用の遺伝子の送達のための、またはＮＫ細胞において遺伝子を抑制するためのアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡの送達のための核酸、あるいは他の手段によってＮＫ細胞を活性化するための毒素または薬物、あるいはＮＫ細胞の活性化に、または腫瘍や感染細胞を標的とすることに役立つことができる、本明細書に記載される他の薬剤を挙げることができる。
【００９７】
特に治療の標的に、目、皮膚または下部腸管の疾病を含む、局所投与が容易にできる領域あるいは器官が含まれる場合は、本発明の組成物を局所投与することもできる。適当な局所製剤が、これらの各領域または器官用に容易に調製される。下部腸管への局所適用を、直腸の坐薬製剤（上記参照）あるいは適当な浣腸製剤により行うことができる。局所経皮パッチを用いることもできる。
【００９８】
局所適用のために、組成物を、１以上の担体中に懸濁または溶解した有効成分を含む適当な軟膏に調剤することができる。本発明の化合物の局所投与用担体には、鉱油、流動パラフィン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化蝋および水が含まれるが、それらに限られない。あるいは組成物を、１以上の薬学的に許容されうる担体中に懸濁または溶解した有効成分を含む適当なローションまたはクリームに調剤することができる。適当な担体には、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が含まれるが、それらに限られない。
【００９９】
眼科用の使用のために、組成物を、等張のｐＨ調節した滅菌食塩水中の微粒状懸濁液として調剤するか、あるいは好ましくは、塩化ベンジルアルコニウムなどの保存剤と共にまたは保存剤なしで、等張のｐＨ調節した滅菌食塩水中の溶液として調剤することができる。あるいは、眼科用の使用のために、組成物をワセリンのような軟膏中に調剤してもよい。
【０１００】
本発明の組成物を、鼻エアロゾルまたは吸入剤によって投与してもよい。そのような組成物は、製剤処方の技術分野における周知技術によって調製され、またベンジルアルコールまたは他の適当な保存剤、生物学的有用性を増強する吸収促進剤、フルオロカーボンおよび／または、他の従来の可溶化剤または分散剤を使用して、食塩水中の溶液として調製することもできる。
【０１０１】
Ｒｉｔｕｘａｎ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）あるいはＸｏｌａｉｒ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）などの、いくつかのモノクローナル抗体が、臨床症状において効果的であることが示されており、同様の投与方式（すなわち、剤形および／または用量および／または投与プロトコール）を、本発明の抗体について用いてもよい。投与のためのスケジュールおよび用量を、これらの生成物のための既知の方法に従って、例えばメーカーの指示書を用いて、決定することができる。例えばモノクローナル抗体を、１００mg（１０ml）あるいは５００mg（５０ml）のいずれかの使い捨てガラス瓶で１０mg/mlの濃度で供給することができる。生成物を、静脈内投与のために、９.０mg/mlの塩化ナトリウム、７.３５mg/mlのクエン酸ナトリウム二水和物、０.７mg/mlのポリソルベート８０、および注射用の滅菌水中に調剤する。ｐＨを６.５に調節する。交差反応する本発明のＫＩＲ抗体に適する例示的な用量範囲は、約１０mg/m2〜５００mg/m2であろう。しかし、これらのスケジュールは例示的であり、また最適なスケジュールおよび処方計画を、臨床試験で決定しなければならない抗体の親和性およびＮＫ細胞活性化抗体の耐性を考慮に入れて、調整できることが分かるであろう。２４時間、４８時間、７２時間、または１週間、あるいは１ヶ月間ＮＫ細胞を飽和させる、活性化ＮＫ細胞レセプターに対する抗体の注入量およびスケジュールを、抗体の親和性およびそれの薬物動力学的パラメーターを考えて、決定することになる。
【０１０２】
別の実施態様によれば、本発明の抗体組成物はさらに、抗体を投与する特定の治療目的のために通常利用される薬剤を含む、別の治療薬を含んでもよい。追加の治療薬は、治療中の特定の疾病または症状のための単独療法でその薬剤について通常用いられる量だけ、組成物中に通常は存在することになる。そのような治療薬には、癌治療で用いられる治療薬、感染症の治療に用いる治療薬、他の免疫療法で用いられる治療薬、サイトカイン（ＩＬ−２あるいはＩＬ−１５など）、他の抗体および他の抗体の断片が含まれるが、それらに限られない。
【０１０３】
例えば、多くの治療薬が癌の治療に利用できる。本発明の抗体組成物および方法は、特定の疾病、特に腫瘍、癌、悪性腫瘍の治療で、あるいは患者が示す他の疾病または障害の治療で一般に使用される任意の他の方法と併用することができる。特定の治療手段が、患者の状態にそれ自身で有害であるとは知られておらず、また活性化ＮＫレセプター抗体を基礎にした治療を有意に妨害することがない限り、それと本発明との組み合わせを考慮する。
【０１０４】
充実性腫瘍治療に関しては、本発明を、手術、放射線療法、化学療法、その他の古典的な手法と組み合わせて用いることができる。したがって本発明は、活性化ＮＫレセプターに対するヒト化抗体またはヒト用抗体を、手術または放射線治療と同時に、その前に、またはその後に用いる；あるいは、従来の化学療法剤、放射線療法剤または抗血管新生剤、あるいは標的指向性免疫毒素または凝固剤と共に、その前に、あるいはその後に患者に投与する、併用療法を提供する。
【０１０５】
１以上の薬剤を、本抗体を基礎にした治療と併用する場合、組み合わせた結果がそれぞれ別々に治療を行ったときに観察される結果の和である必要はない。一般には少なくとも加算的な効果が望ましいが、単一治療の１つよりも少しでも増加した癌治療効果であれば利益であろう。また、併用治療が相乗効果を示すことは、確かに可能であり有利であるが、そうである必要は特に無い。
【０１０６】
併用抗癌治療を実施するために、活性化ＮＫレセプター抗体組成物を別の抗癌剤と組み合わせて、患者内で組み合わされた抗癌作用が生ずるのに有効な方式で、患者に単に投与することになろう。したがって、薬剤を、腫瘍血管内にそれらが組み合わされて存在し、また腫瘍環境においてそれらが組み合わされて作用する結果となるのに有効な量および有効な期間の間、与えることになろう。この目標を達成するために、活性化ＮＫレセプター抗体に基づく治療薬および抗癌剤を、患者に同時に、単一の組成物中で、あるいは２つの別個の組成物として、異なる投与経路を用いて投与してもよい。
【０１０７】
あるいは、活性化ＮＫレセプター抗体に基づく治療が、例えば数分から数週および数か月までの範囲の間隔で、抗癌剤治療に先立つかあるいは後に続いてもよい。抗癌剤および活性化ＮＫ細胞レセプターに基づく薬剤が癌に対して有利な併用効果を有することが確証されることになろう。
【０１０８】
大部分の抗癌剤は、活性化ＮＫレセプターに基づく抗血管新生治療の前に与えられるであろう。しかし、活性化ＮＫレセプターに基づく免疫複合体を用いる場合は、様々な抗癌剤を、同時にあるいは後に投与してもよい。
【０１０９】
ある状況では、処置の時間間隔を著しく拡張することがさらに望ましい可能性があり、その場合は各投与の間に数日（例えば２、３、４、５、６または７日）、数週間（例えば１、２、３、４、５、６、７または８週）あるいは数か月（例えば１、２、３、４、５、６、７または８ヶ月）さえも経過する。これは、手術または化学療法などのある治療が、実質的に腫瘍を破壊することを意図し、また別の活性化ＮＫ細胞レセプター抗体組成物などによる治療が、微小癌組織の転移あるいは腫瘍再増殖を予防することを意図する状況において、有利であろう。
【０１１０】
さらに、活性化ＮＫ細胞レセプター抗体に基づく組成物または抗癌剤のいずれかを１つより多く投与することも考えられる。薬剤を隔日または隔週に交換して投与してもよく；または、活性化ＮＫ細胞レセプター抗体に基づく治療サイクルを行い、その後に抗癌剤治療のサイクルを続けてもよい。いずれにせよ、併用療法を用いて腫瘍の減退を達成するためには、投与の回数に関係なく、抗腫瘍効果を及ぼすために有効な組み合わせた量の両方の薬剤を送達しさえすればよい。
【０１１１】
手術については、本発明と組み合わせて任意の外科手術的介入を実施してもよい。放射線療法に関しては、ガンマ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波および電子放射などの、癌細胞内でＤＮＡ損傷を局所的に引き起こすための任意の機構が考えられる。放射性同位体の癌細胞へ向けた送達も考えられ、これを標的指向の抗体あるいは他の標的指向手段と関連して用いることができる。
【０１１２】
他の局面では、免疫調節化合物あるいは処方を本発明と組み合わせて実行することができる。好ましい例には、サイトカインによる治療が含まれる。様々なサイトカインを、そのような併用の手法において、使用することができる。サイトカインの例には、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＧＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＬＡＦ、ＴＣＧＦ、ＢＣＧＦ、ＴＲＦ、ＢＡＦ、ＢＤＧ、ＭＰ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＴＭＦ、ＰＤＧＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γが含まれる。特に好ましいのは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２またはＩＬ−１５などのＮＫ細胞の細胞毒活性を刺激するサイトカインである。患者の症状およびサイトカインの相対的な毒性などの臨床的適応と合致する標準的処方によってサイトカインを投与する。
【０１１３】
本発明の化合物あるいは処方と組み合わせて実施できる他の好ましい化合物あるいは処方の例には、ＮＫ細胞活性をモジュレートする組成物が挙げられる。例えば、ある好ましい実施態様では、本発明の抗体を、ＮＫ細胞抑制性レセプターに干渉することができる化合物、例えば、抗体、またはＰＣＴ公開番号 ＷＯ ０３／０１１８９５（その開示は参照により本明細書に組み入れられる）に記述された、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレセプターまたは炎症誘発性ＨＬＡ−Ｅ結合ペプチドの活性を抑制することができる小分子、あるいは、例えば（Yawata et al. (2002) Crit Rev Immunol. 22(5- 6):463-82; Middleton et al. (2002) Transpl Immunol. 10(2-3): 147-64; Vilches et al. (2002) Annu Rev Immunol.20:217-51; またはLong et al. 2001 Immunol Rev. 181:223-33、その各々の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）に記述されているＮＫ細胞活性化を阻害する任意のＫＩＲレセプター、などと共に投与することになる。
【０１１４】
ある実施態様では、本発明の活性化ＮＫ細胞レセプター抗体療法用組成物を、化学療法剤またはホルモン療法剤と組み合わせて投与してもよい。様々なホルモン療法剤および化学療法剤を、本明細書に開示された併用治療法で用いることができる。例示的なものとして考慮される化学療法剤には、アルキル化剤、代謝拮抗剤、細胞毒性抗生物質、ビンカアルカロイド、例えばアドリアマイシン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、カルミノマイシン、ダウノマイシン、ドキソルビシン、タモキシフェン、タキソール、タキソテル、ビンクリスチン, ビンブラスチン, ビノレルビン、エトポシド（ＶＰ−１６）、５フルオロウラシル（５ＦＵ）、シトシン アラビノシド、シクロホスファミド、チオテパ、メトトレキサート、カンプトセシン、アクチノマイシン−Ｄ、マイトマイシンＣ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、アミノプテリン、コンブレタスタチンおよびそれらの誘導体およびプロドラッグが含まれる。ホルモン剤には、例えばロイプロレリン、ゴセレリン、トリプトレリン、およびブセレリンのようなＬＨＲＨ作動薬；タモキシフェンおよびトレミフェンなどの抗エストロゲン；フルタミド、ニルタミド、シプロテロンおよびビカルタミドなどの抗アンドロゲン；アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾールおよびファドロゾールなどのアロマターゼ阻害剤；およびメドロキシ、クロルマジノンおよびメゲストロールなどのプロゲストゲン、が含まれる。
【０１１５】
当業者によって理解されるように、化学療法剤の適切な用量は、一般に臨床治療で既に用いられているものに近く、化学療法剤は単独であるいは他の化学療法剤と組み合わせて投与される。単なる例として、シスプラチンのような薬剤および他のＤＮＡアルキル化剤を用いることができる。シスプラチンは、癌を治療するために、臨床適用で３週ごとに５日間２０mg/m2を合計３コースの効果的な用量で、広く用いられてきた。シスプラチンは経口では吸収されず、したがって注射により、静脈内に、皮下に、腫瘍内にあるいは腹腔内に送達しなければならない。
【０１１６】
さらに有用な薬剤には、ＤＮＡ複製、有糸分裂、および染色体分離を妨害する化合物が含まれ、ポリヌクレオチド先駆物質の合成および忠実度を混乱させる薬剤を用いることもできる。併用療法用の多くの例示的な化学療法剤が、Ｕ.Ｓ. Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ.６,５２４,５８３の表Ｃに列挙されており、その薬剤および指示の開示は参照により具体的に本明細書に組み入れられる。列挙された薬剤の各々は例示的なものであり、それに限られない。当該技術分野の専門家には、"Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, chapter 33, 特に 624-652 ページが薦められる。治療する病状に応じて、用量を変更する可能性が高いであろう。治療を行う医師は、個々の患者のための適切な用量を決定することができるであろう。
【０１１７】
本抗体を、任意の他の１つ以上の抗血管新生治療と併用して用いることができる。そのような薬剤の例には、中和抗体アンチセンス戦略、ＲＮＡアプタマー、およびＶＥＧＦもしくはＶＥＧＦレセプターに対するリボザイム（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ.６,５２４,５８３、その開示は参照により本明細書に組み入れられる）が含まれる。ＷＯ ９８／１６５５１（参照により具体的に本明細書に組み入れられる）に記述されている、拮抗的特性を有するＶＥＧＦ変異体を使用することもできる。さらに併用療法に関連して有用な例示的な抗血管新生剤がＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ. ６,５２４,５８３の表Ｄに列挙されており、その薬剤および指示の開示は参照により具体的に本明細書に組み入れられる。
【０１１８】
活性化ＮＫ細胞抗体はまた、アポトーシスを引き起こす方法と併用すると有利である。例えば、アポトーシス即ちプログラム細胞死を阻害する、多数の癌遺伝子が同定されている。この範疇の例示的な癌遺伝子には、ｂｃｒ−ａｂｌ、ｂｃｌ−２（ｂｃｌ−１、サイクリンＤ１とは異なる；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ１４７４５，Ｘ０６４８７；  Ｕ.Ｓ. Ｐａｔ. Ｎｏｓ. ５,６５０,４９１；および５,５３９,０９４；各々は参照により本明細書に組み入れられる）、およびＢｃｌ−ｘ１、Ｍｃｌ−１、Ｂａｋ、Ａ１、Ａ２０を含むファミリーのメンバー、が含まれるが、しかしそれらに限られない。ｂｃｌ−２の過剰発現が、最初にＴ細胞リンパ腫中で発見された。ｂｃｌ−２は、アポトーシス経路中のタンパク質であるＢａｘへ結合して不活性化することにより、癌遺伝子として機能する。ｂｃｌ−２機能の阻害により、Ｂａｘの不活性化が阻止され、アポトーシス経路の進行が可能になる。例えば、アンチセンスヌクレオチド配列あるいは小分子化合物を用いるこの種の癌遺伝子の阻害を、アポトーシスを促進するために（Ｕ.Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５,６５０，４９１；５,５３９，０９４；および５,５８３,０３４；各々は参照により本明細書に組み入れられる）本発明において使用するよう企図する。
【０１１９】
本抗体を、それの標的指向部、例えば抗体もしくはリガンドを標的細胞（例えば標的腫瘍細胞）の比較的特異的なマーカーに導く部分と組み合わせて用いることができる。一般的に言えば、本発明のこれらの追加の態様で使用される、抗体あるいはリガンドが、好ましくは腫瘍部位中で優先的または特異的に発現されているアクセス可能な腫瘍抗原を認識することになる。標的指向性薬剤は、一般に腫瘍細胞の表面に発現された、表面でアクセス可能な、または表面に局在化された成分に結合することになる。抗体またはリガンドはまた、好ましくは高い親和性特性を示し；ならびに抗体、リガンド、またはそれらの結合体は、心臓、腎臓、脳、肝臓、骨髄、結腸、乳房、前立腺、甲状腺、胆嚢、肺、副腎、筋肉、神経繊維、膵臓、皮膚、あるいは他の人体の生命維持器官もしくは組織、より選択される１以上の組織などの、生命維持正常組織に対して、有意なインビボの副作用を及ぼさない。本明細書で用いられる用語「有意な副作用」とは、インビボで投与されたときに、化学療法中に通常遭遇するような、無視できるかまたは臨床的に処理できる副作用を生じるだけである、抗体、リガンドまたは抗体コンジュゲートを指す。
【０１２０】
腫瘍の治療においては、活性化ＮＫ細胞抗体を含む任意の治療を、補助化合物と組み合わせて行うことができる。補助化合物には、例として、セロトニン拮抗薬などの抗吐剤、およびフェノチアジン、置換ベンズアミド、抗ヒスタミン剤、ブチロフェノン、副腎皮質ステロイド、ベンゾジアゼピンおよびカンナビノイドのような治療薬；ゾレドロン酸およびパミドロン酸などのビスホスホン酸；およびエリスロポエチンおよびＧ−ＣＳＦ、例えばフィルグラスチム、 レノグラスチムおよびダルベポエチンなどの造血成長因子が含まれる。
【０１２１】
別の実施態様では、できるだけ多くのＮＫ細胞またはできるだけ多くの型のＮＫ細胞を活性化するように、および／またはできるだけ多くのＮＫ細胞標的細胞型を標的とするように、異なる特異性を有する本発明の２つ以上の抗体を、単一の組成物中で組み合わせることができる。本抗体またはその断片もしくは誘導体の組み合わせを含む組成物は、さらに広い用途を有することができるであろう、何故なら、単一の活性化抗体によって認識される活性化レセプターのうちの１つを欠く、またはレセプターの１つの内の特異的なエピトープを欠く、僅かな割合のヒト集団が存在する可能性が高いからである。
【０１２２】
本発明はまた、活性化の必要のある患者中のＮＫ細胞活性を活性化する方法を提供し、その方法は、本発明による組成物を前記患者へ投与する工程を含む。この方法は、より具体的には、増加したＮＫ細胞活性が有益であるか、ＮＫ細胞による溶解を受けやすい細胞を含むか、その細胞に影響するか、またはそれによって引き起こされるか、あるいは、癌、感染症または免疫障害などの、不十分なＮＫ細胞活性によって引き起こされるかまたは特徴づけられる、疾病を有する患者中のＮＫ細胞活性を増加させることを目標とする。より具体的には、本発明の方法を、膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、前立腺、膵臓、胃、頚部、甲状腺および皮膚（扁平上皮癌を含む）の癌を非限定的に含む癌腫；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、毛様細胞リンパ腫およびバーキットリンパ腫を含むリンパ系統の造血系腫瘍；急性および慢性骨髄性白血病、前骨髄球性白血病を含む骨髄性系統の造血系腫瘍；繊維肉腫および横紋筋肉腫を含む間充織起源の腫瘍；メラノーマ、精上皮腫、奇形癌、神経芽細胞腫および神経膠腫を含む他の腫瘍；星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫およびシュワン腫を含む中枢および末梢神経系の腫瘍；繊維肉腫、横紋筋肉腫および骨肉腫を含む間充織起源の腫瘍；およびメラノーマ、色素性乾皮症、角化性棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞癌および奇形癌を含む他の腫瘍、を含む、様々な癌および他の増殖性疾病の治療のために利用する。
【０１２３】
好ましい障害には、例えば、小細胞および脳様細胞型を含むＴ−前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）などのＴ細胞障害を非限定的に含むＴ細胞腫瘍およびＢ細胞腫瘍；好ましくはＴ細胞型の大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）；セザリー症候群（ＳＳ）；成人Ｔ細胞性白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）；ａ／ｄ Ｔ−ＮＨＬ 肝脾リンパ腫；末梢／後胸腺Ｔ細胞リンパ腫（多形性および免疫芽細胞性亜型）；血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫；血管中心性（鼻腔）Ｔ細胞リンパ腫；退形成性（Ｋｉ１＋）大細胞リンパ腫；腸管Ｔ細胞リンパ腫；およびＴ−リンパ芽球；リンパ腫／白血病（Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ）などのリンパ系造血系腫瘍を含むがそれに限られない、１以上のＦｃレセプター、好ましくはＦｃγレセプターを発現する細胞を含む血液悪性腫瘍が、含まれる。最も好ましいのは、濾胞性リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、マクロファージ腫瘍、急性単球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、慢性リンパ球性白血病、マスト細胞悪性腫瘍、骨髄化性および慢性骨髄性白血病、あるいは、Ｂ細胞、マクロファージ、マスト細胞、骨髄性細胞、単球、好中球、好塩基球、好酸球、ランゲルハンス細胞、血小板および胎盤内皮細胞を含む、任意の悪性腫瘍または増殖障害である。
【０１２４】
例えば、過形成、繊維症（特に肺線維症、しかし腎繊維症などの他の型の繊維症も）、血管形成、乾癬、アテローム性動脈硬化症および血管形成後の狭窄または再狭窄などの血管の平滑筋増殖などを含む、他の増殖障害もまた、本発明によって治療することができる。活性化ＮＫ細胞抗体に基づく治療を、ウイルス、バクテリア、原虫類、カビまたは真菌による感染によって引き起こされる任意の感染症を好ましくは含む感染症を、治療または予防するために、用いることができる。そのようなウイルス性伝染生物には、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純疱疹１型（ＨＳＶ−１）、単純疱疹２型（ＨＳＶ−２）、牛疫、ライノウイルス、エコウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、はしかウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルスおよびヒト免疫不全ウイルス１型または２型（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）、が含まれるが、しかしそれらに限られない。バクテリアは別の好ましい階層の伝染性生物体を構成し：Staphylococcus属；lo S.pyogenesを含むStreptococcus属；Enterococcal属；Bacillus anthracisおよびLactobacillusを含むBacillus属；Listeria属；Corynebacterium diphtheriae；G.vaginalisを含むGardnerella属；Nocardia属；Streptomyces属; Thermoactinomyces vulgaris; Treponema；Camplyobacter, Raeruginosaを含むPseudomonas属；Legionella属；N.gonorrhoeaeおよびN.meningitidesを含むNeisseria属；F.meningosepticumおよびF.odoraturnを含むFlavobacterium属; Brucella; B.pertussisおよびB.bronchisepticaを含むBordetella 属；E.coliを含むEscherichia属；Klebsiella属;Enterobacter属；S.marcescensおよびS.liquefaciensを含むSerratia属；Edwardsiella属；P.mirabilisおよびP.vulgarisを含むProteus属;Streptobacillus属;R.fickettsfiを含むRickettsiaceae；C.psittaci およびC.trachornatisを含むChlamydia；M.tuberculosis、M.intracellular、M.folluiturn、M.laprae、M.avium、M.bovis、M.africanum、M.kansasii、M.intracellulare、およびM.lepraernuriumを含むMycobacterium属；およびNocardiaを含むが、しかしそれらに限られない。原生動物には、leishmania属, kokzidioa属,およびtrypanosoma属が含まれるが、それらに限られない。寄生生物には、chlamydia および rickettsia が含まれるが、それらに制限されない。感染症の完全なリストを、Center for Disease Control (CDC)の National Center for Infectious Disease (NCID) のウエブサイト (インターネットサイト www.cdc.gov/ncidod/diseases/)で見出すことができる。そのリストは参照により本明細書に組み入れられる。さらに治療可能であるのは、Ｂ細胞、マクロファージ、マスト細胞、骨髄性細胞、単球、好中球、好塩基球、好酸球、ランゲルハンス細胞、血小板および胎盤内皮細胞を含む細胞型の感染症である。前記疾病はすべて本発明の抗体を用いる治療に対する候補である。
【０１２５】
実施例
本発明のさらなる局面および長所を、次の実験の部で開示する。それらは説明のためであって、本出願の範囲を制限するものではないと見なすべきである。
【０１２６】
〔実施例１〕
活性化ＮＫ細胞レセプターに特異的なｍＡｂの生成
新規なモノクローナル抗体を、例えば Moretta et al.(1990) J Exp Med.172(6): 1589-98 に記述されているように、活性化ポリクローナルまたはモロクローナルＮＫ細胞系統によって生後５週のＢａｌｂ Ｃマウスを免疫化することにより、生成する。種々の細胞融合の後、ｍＡｂをまず、１以上の、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ４６などの活性化ＮＫ細胞レセプターを特異的に認識する能力について選択する。陽性のモノクローナル抗体をさらに、ＥＢ６陽性またはＧＬ１８３陽性のＮＫクローンによるＣｗ４陽性またはＣｗ３陽性標的それぞれの溶解を再構成するそれらの能力について、あるいはＰ８１５標的細胞に対するリダイレクテッドキリングアッセイにおいて、選別する。適切なｍＡｂには、（ｉ）ＭＨＣクラスＩ陰性標的、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、同種異型細胞に対する自然細胞毒性、（ii）抗体でコートされた標的細胞に対する細胞毒性、（iii）細胞質内Ｃａ2+濃度の増加、（iv）ＺＡＰ７０、Ｓｙｋ、ＬＡＴ、ＳＬＰ７６、Ｓｈｃ、Ｇｒｂ２、ホスホリパーゼＣ−γ酵素、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ、などの細胞質内アダプター／エフェクター分子のチロシン燐酸化の誘導、（vi）レセプター関連情報変換鎖ＫＡＲＡＰＩＤＡＰ１２またはＣＤ３ζあるいはＦｃＲγの燐酸化、（vi）インターフェロンγ、腫瘍壊死因子、ＩＬ５、ＩＬ１０、ケモカイン（ＭＩＰ−１αなど）、ＴＧＦβなどの、サイトカイン分泌、（vii）ＣＤ６９およびＰＥＮ５などそれぞれのＮＫ細胞表面分子の上方または下方調節、によって評価される、統計的に有意な（ｐ＜０.０５）ＮＫ細胞活性化増加を引き起こすｍＡｂが含まれる。好ましいｍＡｂは、例えば、１：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比率での標的細胞溶解を、前記ｍＡｂが存在しない状態でのエフェクターＮＫ細胞によって行なわれる基礎的な標的細胞溶解と比較したとき、少なくとも約５倍の増加を誘導する。
【０１２７】
〔実施例２〕
末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の精製、およびポリクローナルまたはクローンＮＫ細胞集団の生成
末梢血リンパ球（ＰＢＬ）が、健常な提供者から、Ficoll-Hypaque勾配およびプラスチック付着細胞の除去によって導かれる。濃縮ＮＫ細胞を得るために、ＰＢＬを、抗ＣＤ３（ＪＴ３Ａ）、抗ＣＤ４（ＨＰ２.６）および抗−ＨＬＡ−ＤＲ（Ｄ１.１２）ｍＡｂ（４℃３０分）と、次いでヤギの抗マウス抗体でコートされたＤｙｎａｂｅａｄｓ（Dynal, Oslo, Norway）（４℃３０分）とインキュベーションし、免疫磁性除去（Pende et al. (1998) Eur. J. Immunol. 28:2384-2394; Sivori et al. (1997) J. Exp. Med. 186: 1129-1136; Vitale et al. (1998) J. Exp. Med. 187:2065- 2072）を行った。ＣＤ３−４−ＤＲ−細胞を、細胞溶解分析中で用いるか、または、ポリクローナルＮＫ細胞集団を、あるいは限界希釈法の後にＮＫ細胞クローン（Moretta (1985) Eur. J. Immunol. 151:148-155）を得るために、照射された支持細胞上で１００U/ml ｒｌＬ−２（Proleukin, Chiron Corp., Emeryville, USA）および１.５ng/mlのＰＨＡ（Gibco Ltd, Paisley, Scotland）存在下で培養する。
【０１２８】
〔実施例３〕
フローサイトフルオロメトリー分析
細胞を適切なｍＡｂで、続いてＰＥ−またはＦＩＴＣ−結合アイソタイプ特異的ヤギ抗マウス第２試薬（Southern Biotechnology Associated, Birmingham, Ala.）で染める。試料を、以前に報告された（例えば、 Moretta et al. (1990) J. Exp. Med. 171:695-714）ような１色または２色のサイトフルオロメトリー分析（FACScan Becton Dickinson & Co, Mountain View, Calif.）により分析する。
【０１２９】
〔実施例４〕
細胞系統および細胞溶解分析
用いるＦｃγレセプター陰性標的は： ＭＥＬ１５（ＭＥＬ１５３９２、ヒトメラノーマ）（Pende et al. (1998) Eur J. Immunol. 28:2384-2394）；Ｍ１４（ヒトメラノーマ；Pessino et al. (1998) J. Exp. Med. 188:953-960）；ＳＭＭＣ（ヒト肝臓癌；Sivori et al (1999) Eur J. Immunol. 29:1656-1666）；Ａ５４９（ヒト肺腺癌；ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１８５.１）；ＦＯ−１および１１７４ ｍｅｌ（ヒトメラノーマ）；ＡＵＭＡ（ヒトメラノーマ）である。７２１.２２１などの、Ｆｃγレセプター陽性のＥＢＶ形質転換細胞系統を用いる。ＥＢＶおよび正常な標的細胞を、ＰＢＬを１.５ng/mlのＰＨＡ（Gibco）で培養することにより、得る。
【０１３０】
細胞の細胞溶解活性を、以前に報告された４時間の51Ｃｒ−放出分析で、様々なｍＡｂ不在下または存在下でテストする（Moretta et al.(1990) J. Exp. Med. 172: 1589-1598; Sivori et al. (1999) Eur. J. Immunol. 29: 1656-1666）。様々なｍＡｂの濃度は、マスキング実験用には１０μg/mlおよびリダイレクテッドキリング実験用には０.５μg/mlである。適切なｍＡｂには、それらが存在しない場合に観察される細胞溶解活性を有意に増加させるｍＡｂが含まれる。そのような適切な有意な増加の例は、前記ｍＡｂの存在下で、エフェクター：標的比率が１：１で観察される細胞溶解活性の、これらのｍＡｂ不在下で観察される細胞溶解活性と比較したときの、少なくとも約５倍の増加を含む。
【０１３１】
〔実施例５〕
細胞内フリーカルシウム［Ｃａ++]i増加の測定 
［Ｃａ++]iの測定を、以前に報告されたように行なう（Poggi et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2445-2463）。Ｆｕｒａ−２ラベルされたＮＫ細胞を、４℃で３０秒間飽和量の適切な抗体、例えば抗ＮＫｐ４６抗体（ＢＡＢ２８１）、抗ＮＫｐ３０ｍＡｂ（ＡＺ２０）などと、あるいは培地のみと、インキュベーションする。レセプターの架橋結合を、キュベットに、２０μg/mlのアフィニティー精製されたヤギ抗マウス抗血清（ＧＡＭ）（ICN Biomedicals, Aurora, Ohio）を加えることにより、得ることができる。
【０１３２】
〔実施例６〕
抗体−基質相互作用のバイオコア分析
組換えタンパク質の生成および精製
組換えタンパク質を、標準的方法を用いてＰＣＲにより増幅された、ＮＫ細胞活性化レセプターの細胞外領域全体をコードするE.coli、ｃＤＮＡ中で産生する。核酸配列を、ｐＭＬ１発現ベクターのビオチン化シグナルをコードする配列を有するフレーム中へクローニングする（Saulquin et al, 2003）。
【０１３３】
タンパク質発現を、ＢＬ２１（ＤＥ３）バクテリア株（Invitrogen）中で行なう。トランスフェクションされたバクテリアを、アンピシリン（１００μg/ml）を補った培地中３７℃で、ＯＤ600＝０.６に育て、１mMＩＰＴＧで発現を誘導した。
【０１３４】
タンパク質を変性条件（８M尿素）下で封入体から回収する。組換えタンパク質のリフォールディングを、２０mMトリス、ｐＨ７.８、Ｌ−アルギニン（４００mM、Sigma）、およびβ−メルカプトエタノール（１mM）を含むＮａＣｌ １５０mM緩衝液中、室温で、尿素濃度を６段階の透析（それぞれ４、３、２、１、０.５、および０Ｍ尿素）により減少させることにより、行なう。還元型および酸化型グルタチオン（それぞれ５mMおよび０.５mM、Sigma）を０.５および０Ｍ尿素透析工程の間に加える。最後に、１０mMトリス、ｐＨ７.５、ＮａＣｌ１５０mM緩衝液に対してタンパク質を十分に透析する。可溶性のリフォールディングされたタンパク質を濃縮し、次にＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００サイズ排除カラム（Pharmacia ; AKTA system）で精製した。
【０１３５】
表面プラズモン共鳴測定をＢｉａｃｏｒｅ装置（Biacore）上で行なう。すべてのＢｉａｃｏｒｅ実験で、０.０５％の界面活性剤Ｐ２０を補ったＨＢＳ緩衝液が、実行緩衝液として用いられた。
【０１３６】
タンパク質の固定化
上述のようにして生成された組換え基質タンパク質を、センサーチップＣＭ５（Biacore）上のデキストラン層中のカルボキシル基に共有結合により固定する。センサーチップ表面を、ＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ'−(３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Biacore）で活性化する。結合緩衝液（１０mM酢酸、ｐＨ４.５）中のタンパク質を注入した。残存する活性化された基の非活性化を、１００mMエタノールアミンｐＨ８（Biacore）を用いて行なった。
【０１３７】
親和性測定
速度論的測定のために、固定した基質試料上に様々な濃度（１×１０-7〜４×１０-10M）の可溶性抗体を適用する。測定を、連続的な流量２０μl/mlで行なう。各サイクルについて、５μlの１０mM ＮａＯＨ、ｐＨ１１を注入して、センサーチップの表面を再生する。ＢＩＡｌｏｇｕｅ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ プログラム（BIAevaluation 3.1, Biacore）をデータ分析に用いる。溶解した検体（様々な濃度で４０μl）を、ＨＢＳ緩衝液中２０μl/分の流速で、例えば５００反射率単位（RU）、および１０００RUの基質を含むデキストラン層上に、注入する。
【０１３８】
〔実施例７〕
ヒト用抗体の、マウスモデルでのインビボにおけるテスト
Ｎｏｄ−ＳＣＩＤ／腫瘍を準備し、Ｎｏｄ−ＳＣＩＤ中において抗ＮＣＲ抗体でヒトＭＮＣを刺激する予備的研究を以下のように行なう：
【０１３９】
７２１.２２１系統などのＥＢＶ形質転換細胞系統を用いることができる。生後８〜１２週のＮｏｄ−ＳＣＩＤマウスを細胞系統の受容動物として用いる。従って他の細胞系統を選択し用いることもできる。
【０１４０】
各マウスは、左脇腹上部に、２〜５×ｌ０6個の細胞を０日目に皮下注射により投与される。腫瘍発達の外観および成長を毎週点検する。
【０１４１】
腫瘍の外観および発達は、細胞系統および移植した細胞数に依存する。例えば２×１０6細胞の移植後、７８６−ＯおよびＫａｃｉ−１は３〜４週を必要とし、一方でＧ４０１および４０２は２週を必要とする可能性がある。充実性腫瘍の体積が、＞３０mm3（式 Ａ２×Ｂ／２で計算され、ＡおよびＢはそれぞれ腫瘍の長さおよび幅を表わす）を超える体積に達すると、マウスは無作為化され、ＰＢＭＣを腹腔内（ＩＰ）に投与され、抗ＮＣＲ抗体処理を受ける。
【０１４２】
０日目に、マウスの腹腔内に５０×１０6 ＰＢＭＣ（etablissement francais du sangで健康な提供者から集めた  ）を注入し、次に抗ＮＣＲ抗体約２００μgを注入（腹腔内）して刺激する。ＩＬ２（１０００IU）を抗ＮＣＲ抗体と共に、そしてその後毎日５日間（５００IU）、投与する。もし所望であれば、Ｎｏｄ−ＳＣＩＤ／ヒト（ｈｕ）抗ＮＣＲ抗体処理マウスの腹膜腔中のヒトＮＫ細胞の発達を、任意の適当な方法（例えばフローサイトメトリーに基づいた方法）を用いて評価する。
【０１４３】
いくつかの群を構成する：
陰性対照群：この群のマウスは、腫瘍細胞系統のみを投与される。
ＰＢＭＣ群：マウスは、腹腔中に５０×１０6 のＰＢＭＣを注入される。
調査群：マウスは、５０×１０6ＰＢＭＣを投与された後、抗ＮＣＲ抗体およびＩＬ２で処理される。
各群について、腫瘍サイズおよび体積を毎週点検する。
【０１４４】
すべての本明細書に引用された出版物および特許出願は、個々の出版物あるいは特許出願が、それぞれ具体的に個々に参照により本明細書に組み入れられることが指示されたかの如く、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１４５】
明瞭な理解の目的のために、例証および実例により、上述の本発明についてかなり詳細に記述したが、添付する特許請求の範囲の精神または範囲から外れることなく一定の変更および修正を本発明に行なうことができることは、本発明の教示に照らして、当業者に容易に明らかであろう。
【国際調査報告】
2008502322.tif 000002
2008502322.tif 000003
2008502322.tif 000004