(57)【要約】  本発明は、ＩＦＮ産生を刺激することにより免疫応答を調節するオリゴヌクレオチド剤、および該剤を哺乳類の治療的処置に用いる方法を提供する。
2008523094.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類における免疫応答を刺激する方法であって、
前記哺乳類に、配列番号：１からの、好ましくは当該配列の５’末端からの、４以上、５以上、６以上、７以上、または８以上の連続したヌクレオチドの配列を含むか、該配列で構成されるか、または、本質的に該配列で構成されるオリゴヌクレオチド剤を投与する工程を含む方法。
【請求項２】
オリゴヌクレオチド剤は、配列番号：１、または配列番号：１の配列から１以下または２以下のヌクレオチドだけが異なる配列を含むか、該配列で構成されるか、または、本質的に該配列で構成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
オリゴヌクレオチド剤は、配列番号：１で構成されるか、本質的に該配列で構成されるか、または、該配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記配列は、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、および配列番号：６からなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドは、ｉＲＮＡ剤であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記剤は一本鎖ＲＮＡ剤であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
哺乳類において免疫応答の刺激を回避するためのオリゴヌクレオチド剤の製造方法であって、潜在薬剤プールから、配列番号：１、好ましくは当該配列の５’末端からの、４以上、５以上、６以上、７以上、または８以上の連続したヌクレオチドの配列を含む、または配列番号：１から１以下または２以下のヌクレオチドしか違わない配列を含む任意の剤を除去する工程を含む方法。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドはｉＲＮＡ剤であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記剤は一本鎖ＲＮＡ剤であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
配列番号：１からの、好ましくは当該配列の５’末端からの、４以上、５以上、６以上、７以上、または８以上の連続したヌクレオチドの配列を含むか、該配列で構成されるか、または、本質的に該配列で構成される、免疫応答を誘導する単離オリゴヌクレオチド剤。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチド剤は、配列番号：１、または配列番号：１の配列から１以下または２以下のヌクレオチドだけが異なる配列を含むか、該配列で構成されるか、または、本質的に該配列で構成されることを特徴とする請求項１０に記載の単離オリゴヌクレオチド剤。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチド剤は、配列番号：１で構成されるか、本質的に該配列で構成されるか、または、該配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の単離オリゴヌクレオチド剤。
【請求項１３】
前記配列は、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、および配列番号：６からなる群より選択されることを特徴とする請求項１０に記載の単離オリゴヌク
レオチド剤。
【請求項１４】
ｉＲＮＡ剤であることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド剤。
【請求項１５】
一本鎖ＲＮＡ剤であることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド剤。
【請求項１６】
少なくとも１つの２’−フルオロ修飾ヌクレオチドをさらに含み、該２’−フルオロ修飾ヌクレオチドは、配列番号：１からの４以上の連続したヌクレオチドを含む配列の一部ではない、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の単離オリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
哺乳類における免疫応答を誘導するオリゴヌクレオチド剤の製造方法であって、潜在薬剤プールに、配列番号：１の、４以上、５以上、６以上、７以上、または８以上の連続したヌクレオチドの配列を含む、または配列番号：１から１以下または２以下のヌクレオチドしか違わない配列を含む任意の剤を添加する工程を含む方法。
【請求項１８】
オリゴヌクレオチド剤は、ｉＲＮＡ剤であることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記剤は、一本鎖ＲＮＡ剤であることを特徴とする請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド剤。
【請求項２０】
哺乳類において遺伝子の発現の阻害と、免疫応答の誘導とを同時に行う方法であって、前記哺乳類に、配列番号：１からの、好ましくは当該配列の５’末端からの、４以上、５以上、６以上、７以上、または８以上の連続したヌクレオチドの配列、または、配列番号：１の配列から１以下または２以下のヌクレオチドだけが異なる配列を含むｉＲＮＡ剤を投与する工程を含む方法。
【請求項２１】
前記配列は、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、および配列番号：６からなる群より選択されることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ｉＲＮＡ剤の評価方法であって、
ａ．候補ｉＲＮＡ剤を提供することと、
ｂ．候補ｉＲＮＡ剤を検査して、配列番号：１、または、配列番号：１から１ヌクレオチドまたは２ヌクレオチドしか違わない配列を該候補ｉＲＮＡ剤が含むかどうかを判定することとを含む方法。
【請求項２３】
ｉＲＮＡ剤を修飾して、配列番号：１の配列、または配列番号：１から１ヌクレオチドまたは２ヌクレオチドしか違わない配列を除去することをさらに含む請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドと、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項２５】
ワクチンであることを特徴とする請求項２４に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
哺乳類における免疫応答の刺激を回避するためのオリゴヌクレオチド剤の製造方法であって、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号：１からの４以上、５以上、６以上、７以上、または８以上の連続したヌクレオチドの配列を含み、前記方法は、オリゴヌクレオチド
剤を、該オリゴヌクレオチド剤が少なくとも２つ、または少なくとも４つの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含むように提供することを含む方法。
【請求項２７】
２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも１つ、または少なくとも２つが、配列番号：１からの４以上連続したヌクレオチドの配列の一部であることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象における免疫応答を誘導することのできる配列特異的オリゴリボヌクレオチド剤を提供することによる、免疫治療および創薬の分野、ならびにＲＮＡｉ剤に対する配列特異的免疫応答の回避方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連出願）
本願は、参照によりその全体を本願に組み込む、２００４年１２月９日に提出された米国仮出願番号第６０／６３４，８４９号明細書に利益を請求する。
【０００３】
（背景）
二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる高度に保存された調節機構によって、遺伝子発現をブロックすることができる。すなわち、ＲＮＡＩＩＩＤｉｃｅｒ酵素は、ｄｓＲＮＡを、約２２ヌクレオチドの小さい干渉ＲＮＡ（短鎖干渉ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡとも呼ばれる）に処理する。ｓｉＲＮＡの一方の鎖（「アンチセンス鎖」）は、ＲＮＡによって誘導されるサイレンシング複合体ＲＩＳＣによってアンチセンス鎖の配列と少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の切断を誘導するガイド配列としてはたらく。アンチセンス鎖は、このプロセスにおいては切断されないか、いずれにせよ分解されず、アンチセンス鎖を含んだＲＩＳＣは引き続き、さらなるｍＲＮＡの切断に影響を及ぼすことができる。
【０００４】
転写後二本鎖ＲＮＡ依存性遺伝子サイレンシングのプロセスは、一般的にＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれている（非特許文献１〜３）。真核生物は、ウィルスなどの侵襲してくる外来遺伝子要素から自己のゲノムを守るためにＲＮＡｉを利用していると提案されてきた。ウィルス複製中の二本鎖ＲＮＡの形成は、望まれない遺伝子活性に対するシグナルとして細胞によって解釈される（非特許文献４、５）。ＤｉｃｅｒＲＮａｓｅＩＩＩは、二本鎖ＲＮＡを明確なサイズと構造を持った小さい二本鎖ＲＮＡ断片、すなわち短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に迅速に処理して、該短鎖干渉ＲＮＡが、侵襲遺伝子の一本鎖ｍＲＮＡの配列特異的分解を支援する（非特許文献６〜９）。このようなｓｉＲＮＡ二本鎖は、２〜３ヌクレオチドの３’突出端を有するとともに、５’リン酸および自由３’ヒドロキシ末端を含む（非特許文献１０）。合成ｓｉＲＮＡ二本鎖の細胞送達またはプラスミドもしくはウィルスベクターによるｓｉＲＮＡの導入は、現在では、導入された二本鎖ＲＮＡと配列が相同な細胞遺伝子の活性を妨害するために広く用いられている。
【０００５】
ｓｉＲＮＡがどのようにして哺乳類の系と相互作用しているかを理解することが、この遺伝子サイレンシング技術に磨きをかけ、遺伝子特異的治療剤を開発するために重要である（非特許文献１１）。長い二本鎖ＲＮＡの認識について、２つの異なる検出モード、すなわち、セリンスレオニンキナーゼＰＫＲ（非特許文献１２〜１４）およびＴＬＲ３（非特許文献１５）が知られている。ＰＫＲは細胞質内に局在しているが、ＴＬＲ３はエンドゾーム内に存在している（非特許文献１６）。ＴＬＲ３は、病原体特異的分子を検出するために進化してきたＴｏｌｌ様受容体ファミリーのメンバーである（非特許文献１７）。
【０００６】
ＰＫＲは、２つの二本鎖ＲＮＡ結合ドメインを有し、その一方は、二本鎖ＲＮＡに対する高い親和性を有し、他方は相当に低い親和性しか示さない。ＰＫＲによって媒介される反応の完全な活性化には、二本鎖ＲＮＡが両ドメインに同時に結合することが必要であり（これは、長い二本鎖ＲＮＡ、たとえば長さが５０〜８０ヌクレオチド対を超える二本鎖
ＲＮＡによって容易化されるようである）、また二量化を必要とするようである（非特許文献１８、１９）。５０ヌクレオチド対未満の二本鎖ＲＮＡを含む二本鎖ＲＮＡの濃度が高いと、または二本鎖ＲＮＡ結合部位に対する他のリガンド（たとえばＡｌｕ  ＲＮＡ）の濃度が高いと、ＰＫＲの活性化が阻害される。初期の研究から、ｓｉＲＮＡ二本鎖は、脊椎動物細胞における一般的な二本鎖ＲＮＡによって誘導される非特異的効果をバイパスするのに十分に短いことが証明されている。（非特許文献２０）。しかしながら、複数のより最近の文献では、インターフェロン経路、特にＰＫＲの活性化に関与する遺伝子を含む短い二本鎖ＲＮＡの導入によって、長い二本鎖ＲＮＡの効果と同等とまではいかないにせよ、数多くの遺伝子が様々に調節されることが示されている（非特許文献２１〜２９）。どの遺伝子がアップレギュレートまたはダウンレギュレートされるかは、少なくとも部分的にはｓｉＲＮＡ配列特異的と考えられ、この調節の基礎をなす機構（または機構群）はまだ解明されていない。
【０００７】
ウィルス感染を認識するために免疫系によって利用されるウィルス核酸の第２の特徴的性質はウィルスＤＮＡ中に見られるＣｐＧモチーフであり、ＣｐＧモチーフはＴＬＲ９を介して検出される（非特許文献３０〜３１）。ＣｐＧモチーフは、特定の隣接塩基を有したメチル化されていないＣＧジヌクレオチドである。脊椎動物においてはＣｐＧモチーフの頻度は抑制されており、これにより脊椎動物免疫系が、ＣｐＧモチーフなどに基づいて微生物ＤＮＡを検出できるようになっている（非特許文献３２〜３４）。ＴＬＲ３と同様に、ＴＬＲ９はエンドゾームに局在しており、ここで、ＴＬＲ９はＣｐＧモチーフに直接結合する（非特許文献３５）。
【０００８】
長い二本鎖ＲＮＡおよびＣｐＧ  ＤＮＡに加えて、２つの最近の文献により、ウィルス核酸が認識される第３の機構が示唆されている。これらの研究は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウィルスのｓｓＲＮＡがＴＬＲ７（マウスおよびヒト）およびＴＬＲ８（ヒトのみ）を介して検出されることを実証している（非特許文献３６、３７）。グアニンアナログは、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８に対する特異的リガンドとして初期に同定されていた（非特許文献３８、３９）。ＴＬＲ９（ＣｐＧＤＮＡに対する受容体）（非特許文献３５）と同様に、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８は、エンドゾーム膜に局在している。
【０００９】
ウィルス核酸の検出は、Ｉ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β）の生産につながる。ヒトにおけるＩ型ＩＦＮの主たる生産者は、プラズマサイトイド樹状細胞（インターフェロン産生細胞、ＩＰＣとも呼ばれる）である。プラズマサイトイド樹状細胞（ＰＤＣ）は、樹状細胞の高度に特化したサブセットであり、ウィルス感染に対する見張り（センチネル）として機能すると考えられ、ウィルス感染のあいだの大量のＩ型ＩＦＮに関与する（非特許文献４０）。ＰＤＣが、ウィルス感染を検出するための核酸系分子を優先的に使用するという証拠も増えてきている。ヒトおよびマウスＰＤＣのＴＬＲ発現は、ＴＬＲ７およびＴＬＲ９に限られている（非特許文献４１〜４３）。
【００１０】
非特許文献４４〜４６および３２は、細菌および合成のオリゴデオキシリボヌクレオチド中の特定の配列コンテクストにＣｐＧジヌクレオチドが存在すること（ＣｐＧ  ＤＮＡ）が、脊椎動物の生来の免疫応答、Ｔ細胞およびＢ細胞を活性化することが知られていることを教示している。
【００１１】
非特許文献４７〜５０は、ＣｐＧＤＮＡによる免疫細胞の活性化が、ＩＦＮ，ガンマ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−６を含む複数のサイトカインの分泌と、共刺激性表面分子の刺激発現を誘導していると教示している。
【００１２】
前掲の非特許文献３２および非特許文献５１〜５４は、ＣｐＧジヌクレオチドの存在および該ジヌクレオチドに隣接する配列が、ＤＮＡの免疫刺激活性を決定するのに重要な役
割を果たすこと、パリンドロームまたは非パリンドロームの６量体配列中のＣｐＧジヌクレオチド（Ｐ１．Ｐ２ＣＧＰ３Ｐ４）が免疫刺激に必要とされること、およびさらに、ＰｕＰｕＣＧＰｙＰｙおよびＰｕＴＣＧモチーフが、それぞれマウスおよびヒト免疫系を最適に活性化することを教示している。
【非特許文献１】タシュル、ティー（Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．）  Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ  ２，２３９〜４５（２００１）
【非特許文献２】ザモア、ピーディー（Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６，１２６５〜９（２００２）
【非特許文献３】ハノン、ジージェイ（Ｈａｎｎｏｎ，ＧＪ．）  Ｎａｔｕｒｅ  ４１８，２４４〜５１（２００２））
【非特許文献４】アールキスト、ピー（Ａｈｌｑｕｉｓｔ，Ｐ．）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６，１２７０〜３（２００２）
【非特許文献５】プラスターク、アールエイチ（Ｐｌａｓｔｅｒｋ，Ｒ．Ｈ．）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６，１２６３〜５（２００２）
【非特許文献６】エルバシャー、エスエム（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．）ら  Ｎａｔｕｒｅ  ４１１，４９４〜８（２００１）
【非特許文献７】エルバシャー、エスエム（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ＳＭ．）ら  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １５，１８８〜２００（２００１）
【非特許文献８】ハモンド、エスエム（Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｓ．Ｍ．）ら  Ｎａｔｕｒｅ  ４０４，２９３〜６（２０００）
【非特許文献９】ザモア、ピーディー（Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．）ら  Ｃｅｌｌ  １０１，２５〜３３（２０００）
【非特許文献１０】エルバシャー、エスエム（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．）ら  Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２０，６８７７〜８８（２００１）
【非特許文献１１】タシュル、ティー（Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．）ら  Ｍｏｌ  Ｉｎｔｅｒｖ  ２，１５８〜６７（２００２）
【非特許文献１２】ウィリアムズ、ビーアール（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｂ．Ｒ．）  Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔ  ８９，ＲＥ２（２００１）
【非特許文献１３】ミュルス、イーエフ（Ｍｅｕｒｓ，Ｅ．Ｆ．）ら  Ｖｉｒｏｌ  ６６，５８０５〜１４（１９９２）
【非特許文献１４】カッツェ、エムジー（Ｋａｔｚｅ，Ｍ．Ｇ．）ら  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１，５４９７〜５０５（１９９１）
【非特許文献１５】アレキソポーロー、エル（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ，Ｌ．）ら  Ｎａｔｕｒｅ  ４１３，７３２〜８（２００１）
【非特許文献１６】マツモト、エム（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｍ．）ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１，３１５４〜６２（２００３）
【非特許文献１７】タケダ、ケイ（Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．）ら  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１，３３５〜７６（２００３）
【非特許文献１８】マンヘ、エル（Ｍａｎｃｈｅ，Ｌ．）ら，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１２，５２３８〜４８（１９９２）
【非特許文献１９】ウィリアムズ、ビージー（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｂ．Ｇ．）  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８，６１１２〜２０（１９９９）
【非特許文献２０】ビトコ、ブイ（Ｂｉｔｋｏ，Ｖ．）ら  ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１，３４（２００１）
【非特許文献２１】ジャクソン、エイアール（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｌ．）およびリンスレー、ピーエス（Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．Ｓ．）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ，２０，５２１〜４（２００４）
【非特許文献２２】ジャクソン、エイアール（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｌ．）ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２１，６３５〜７（２００３）
【非特許文献２３】モス、イージー（Ｍｏｓｓ，Ｅ．Ｇ．）およびテイラー、ジェイエム（Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｍ．）  Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，５，７７１〜２（２００３）
【非特許文献２４】ブリッジ、エイジェイ（Ｂｒｉｄｇｅ，Ａ．Ｊ．）ら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，３４，２６３〜４（２００３）
【非特許文献２５】スレズ、シーエイ（Ｓｌｅｄｚ，Ｃ．Ａ．）ら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，５，８３４〜９（２００３）
【非特許文献２６】ヘイデル、ジェイディー（Ｈｅｉｄｅｌ，Ｊ．Ｄ．）ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２，１５７９〜８１（２００４）
【非特許文献２７】キム、ディーエイチ（Ｋｉｍ，Ｄ．Ｈ．）ら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２，３２１〜５（２００４）
【非特許文献２８】ツェン、エックス（Ｚｈｅｎｇ，Ｘ．）およびベビラッカ、ピーシー（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ，Ｐ．Ｃ．）、ＲＮＡ，１０，１９３４〜４５（２００４）
【非特許文献２９】ペバナード、エス（Ｐｅｂｅｒｎａｒｄ，Ｓ．）およびイッゴ、アール（Ｉｇｇｏ，Ｒ．）、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，７２，１０３〜１１（２００４）
【非特許文献３０】ランド、ジェイ（Ｌｕｎｄ，Ｊ．）ら  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９８，５１３〜５２０（２００３）
【非特許文献３１】クルグ、エイ（Ｋｒｕｇ，Ａ．）ら  Ｂｌｏｏｄ  １０３，１４３３〜７（２００４）
【非特許文献３２】クリーグ、エイエム（Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．）ら  Ｎａｔｕｒｅ  ３７４，５４６〜９（１９９５）
【非特許文献３３】バウア、エス（Ｂａｕｅｒ，Ｓ．）ら  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８，９２３７〜４２（２００１）
【非特許文献３４】ワグナー、エイチ（Ｗａｇｎｅｒ，Ｈ．）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５，６２〜９（２００２）
【非特許文献３５】ラッツ、イー（Ｌａｔｚ，Ｅ．）ら  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５，１９０〜８（２００４）
【非特許文献３６】ディーボルト、エスエス（Ｄｉｅｂｏｌｄ，Ｓ．Ｓ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３，１５２９〜３１（２００４）
【非特許文献３７】ハイル、エフ（Ｈｅｉｌ，Ｆ．）ら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３，１５２６〜９（２００４）
【非特許文献３８】リ、ジェイ（Ｌｅｅ，Ｊ．）ら  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００，６６４６〜５１（２００３）
【非特許文献３９】ハイル、エフ（Ｈｅｉｌ，Ｆ．）ら  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３３，２９８７〜９７（２００３）
【非特許文献４０】アセリン‐パトゥエル、シー（Ａｓｓｅｌｉｎ−Ｐａｔｕｒｅｌ，Ｃ．）ら  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２，１１４４〜５０（２００１）
【非特許文献４１】クルグ、エイ（Ｋｒｕｇ，Ａ．）ら  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１，３０２６〜３７（２００１）
【非特許文献４２】ホルヌング、ブイ（Ｈｏｒｎｕｎｇ，Ｖ．）ら  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６８，４５３１〜７（２００２）
【非特許文献４３】エドワーズ、エイディー（Ｅｄｗａｒｄｓ，Ａ．Ｄ．）ら  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３３，８２７〜３３（２００３）
【非特許文献４４】トクナガ（Ｔｏｋｕｎａｇａ）ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．７２：９５５〜９６２（１９８４）
【非特許文献４５】メシナ（Ｍｅｓｓｉｎａ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１７５９〜１７６４（１９９１）
【非特許文献４６】サトウ（Ｓａｔｏ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：３５２〜３５４（１９９６）
【非特許文献４７】ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７９：８６６〜８７３（１９８８）
【非特許文献４８】ハルパーン（Ｈａｌｐｅｒｎ）ら，Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６７：７２〜７８（１９９６）
【非特許文献４９】クリンマン（Ｋｌｉｎｍａｎ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：２８７９〜２８８３（１９９６）
【非特許文献５０】ツァオ（Ｚｈａｏ）ら，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．７：４９５〜５０２（１９９７）
【非特許文献５１】ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８；４０７２〜４０７６（１９９２）
【非特許文献５２】トクナガ（Ｔｏｋｕｎａｇａ）ら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：５５〜６６（１９９２）
【非特許文献５３】リャン（Ｌｉａｎｇ）ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：１１１９〜１１２９（１９９６）
【非特許文献５４】ハートマン（Ｈａｒｔｍａｎｎ）ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１６１７〜１６２４（２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上記の発見は、オリゴヌクレオチドが免疫刺激剤として有用であることを示すが、そのような用途に伴ういくつかの問題もいまだに存在している。たとえば、長いオリゴヌクレオチドは作製費用が高く、隣接配列の種特異性が任意の所与のオリゴヌクレオチドの有用性の幅を限定してしまう。したがって、より安価な免疫刺激剤、好ましくは種を超えて有効な免疫刺激剤が必要されるとともに、さらに別の配列特異的モチーフを同定することが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、少なくとも部分的には、一本鎖または二本鎖ＲＮＡ分子内の特定の配列モチーフが特にプラズマサイトイド樹状細胞（ＰＤＣ）などのＴＬＲ７を発現する細胞におけるＩＦＮ誘導を介した免疫応答の刺激に有効であるという発見に基づいている。この発見に基づいて、本発明は、哺乳類におけるＩＦＮ産生を刺激するために使用することのできる免疫刺激性オリゴヌクレオチド剤、ならびに、望まれる免疫応答を誘導するため、または望ましくない免疫応答の誘導を回避するために、一本鎖アンチセンス剤および二本鎖ｉＲＮＡ剤を選択的に設計する方法を提供する。
【００１５】
本発明は、免疫刺激剤として一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドを含む治療用組成物、ならびに、そのような組成物の免疫治療用途での使用方法も提供する。本発明は具体的には、限定はされないが、たとえば、成人および小児ならびに家畜に対する適用において、がん、自己免疫疾患、ぜんそく、呼吸器系アレルギー、食品アレルギー、および細菌、寄生虫、およびウィルス感染の治療などの免疫治療用途に用いられる免疫応答を高めるための方法および組成物を提供する。本発明は、そのような化合物の製造方法も提供する。さらに、本発明の化合物は、ＤＮＡワクチン、抗体およびアレルゲンと組み合わせるアジュバントとして、および他の免疫刺激剤、化学治療剤、ｉＲＮＡ剤および／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドと組み合わせるアジュバントとして有用である。
【００１６】
本発明のオリゴヌクレオチド剤は、ヌクレオチド配列
５’−ＧＵＣＣＵＵＣＡＡ−３’（配列番号：１）
を含むか、該配列で構成されるか、または本質的に該配列で構成される。
【００１７】
他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号：１由来の、好ましくは当該
配列の５’末端からの、４以上、５以上、６以上、７以上、または８以上の連続したヌクレオチドの配列、たとえば、５’−ＧＵＣＣ−３’（配列番号：２）、５’−ＧＵＣＣＵ−３’（配列番号：３）、５’−ＧＵＣＣＵＵ−３’（配列番号：４）、５’−ＧＵＣＣＵＵＣ−３’（配列番号：５）、または５’−ＧＵＣＣＵＵＣＡ−３’（配列番号：６）を含むか、該配列で構成されるか、または、本質的に該配列で構成される。
【００１８】
すなわち、１つの態様において、本発明は、哺乳類における免疫応答を刺激する方法であって、前記哺乳類に、配列番号：１由来の、好ましくは当該配列の５’末端からの、４以上、５以上、６以上、７以上、または８以上の連続したヌクレオチドの配列を含むか、該配列で構成されるか、または、本質的に該配列で構成されるオリゴヌクレオチド剤を投与する工程を含む方法を提供する。前記オリゴヌクレオチド剤は、配列番号：１、または配列番号：１の配列から１以下または２以下のヌクレオチドだけが異なる配列を含むか、該配列で構成されるか、または、本質的に該配列で構成されてもよい。前記配列は、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、および配列番号：６からなる群より選択されてもよい。オリゴヌクレオチドは、ｉＲＮＡ剤であってもよいし、または一本鎖ＲＮＡ剤であってもよい。
【００１９】
第２の態様において、本発明は、哺乳類において免疫応答の刺激を回避するためのオリゴヌクレオチド剤の製造方法であって、潜在薬剤プールから、配列番号：１由来の、好ましくは当該配列の５’末端から４以上、５以上、６以上、７以上、または８以上の連続したヌクレオチドの配列を含む、または配列番号：１から１以下または２以下のヌクレオチドしか違わない配列を含む任意の剤を除去する工程を含む方法を提供する。オリゴヌクレオチドは、ｉＲＮＡ剤であってもよいし、または一本鎖ＲＮＡ剤であってもよい。
【００２０】
第３の態様において、本発明は、配列番号：１由来の、好ましくは当該配列の５’末端からの、４以上、５以上、６以上、７以上、または８以上の連続したヌクレオチドの配列を含むか、該配列で構成されるか、または、本質的に該配列で構成される単離オリゴヌクレオチド剤を提供する。該オリゴヌクレオチド剤は、配列番号：１、または配列番号：１の配列から１以下または２以下のヌクレオチドだけが異なる配列を含むか、該配列で構成されるか、または、本質的に該配列で構成されてもよい。前記配列は、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、および配列番号：６からなる群より選択されてもよい。オリゴヌクレオチドは、ｉＲＮＡ剤であってもよいし、または一本鎖ＲＮＡ剤であってもよい。少なくとも１つの２’−フルオロ修飾ヌクレオチドをさらに含んでいてもよく、該２’−フルオロ修飾ヌクレオチドは、配列番号：１由来の４つ以上の連続したヌクレオチドを含む配列の一部ではない。オリゴヌクレオチド剤がｉＲＮＡ剤の場合には、表８の遺伝子のいずれかに対して特異的（たとえば、一方の鎖は少なくとも部分的に該遺伝子に相補的）なものであればよい。
【００２１】
第４の態様において、本発明は、哺乳類における免疫応答を誘導するオリゴヌクレオチド剤の製造方法であって、潜在薬剤プールに、配列番号：１の４以上、５以上、６以上、７以上、または８以上の連続したヌクレオチドを含む、または配列番号：１から１以下または２以下のヌクレオチドしか違わない配列を含む任意の剤を添加する工程を含む方法を提供する。オリゴヌクレオチドは、ｉＲＮＡ剤であってもよいし、または一本鎖ＲＮＡ剤であってもよい。
【００２２】
第５の態様において、本発明は、哺乳類において遺伝子の発現の阻害と、免疫応答の誘導とを同時に行う方法であって、前記哺乳類に、配列番号：１由来の、好ましくは当該配列の５’末端からの、４以上、５以上、６以上、７以上、または８以上の連続したヌクレオチドの配列、または、配列番号：１の配列から１以下または２以下のヌクレオチドだけが異なる配列を含むｉＲＮＡ剤を投与する工程を含む方法を提供する。前記配列は、配列
番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、および配列番号：６からなる群より選択されてよい。前記遺伝子は、表８の遺伝子のうちの任意のものであってよい。
【００２３】
第６の態様において、本発明は、ｉＲＮＡ剤の評価方法であって、
ａ．候補ｉＲＮＡ剤を提供することと、
ｂ．候補ｉＲＮＡ剤を検査して、配列番号：１、または、配列番号：１から１または２ヌクレオチドしか違わない配列を含むかどうかを判定することと
を含む方法を提供する。
【００２４】
前記方法は、ｉＲＮＡ剤を修飾して、配列番号：１の配列、または配列番号：１から１または２ヌクレオチドしか違わない配列を除去することをさらに含んでもよい。
第７の態様において、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドと、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。前記薬学的組成物はワクチンであってもよい。
【００２５】
第８の態様において、本発明は、哺乳類における免疫応答の刺激を回避するオリゴヌクレオチド剤の製造方法であって、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号：１由来の４以上、５以上、６以上、７以上、または８以上の連続したヌクレオチドの配列を含み、前記方法は、オリゴヌクレオチド剤を、該オリゴヌクレオチド剤が少なくとも２つ、または少なくとも４つの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含むように提供することを含む方法を提供する。２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも１つ、または少なくとも２つが、配列番号：１からの４以上連続したヌクレオチドの配列の一部であってよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明は少なくとも部分的には、一本鎖または二本鎖ＲＮＡ分子内の特定の配列モチーフが、とりわけＴＬＲ７を発現している細胞、たとえばプラズマサイトイド樹状細胞（ＰＤＣ）などにおいて、ＩＦＮ誘導を介した免疫応答を刺激するのに有効であるという発見に基づくものである。この発見に基づいて、本発明は、哺乳類においてＩＦＮ産生を刺激するために用いることのできる免疫刺激性オリゴヌクレオチド剤、ならびに一本鎖アンチセンス剤および二本鎖ｉＲＮＡ剤を選択的に設計して、所望の免疫応答を誘導するか、不要な免疫応答の誘導を回避するようにする方法も提供する。
【００２７】
具体的には、本発明は、免疫刺激剤として一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドを含む治療用組成物、ならびに、かかる組成物を免疫治療用途に用いる方法を提供する。本発明は具体的には、限定はされないが、成人および小児ならびに家畜への適用における、がん、自己免疫疾患、ぜんそく、呼吸アレルギー、食品アレルギー、および、細菌、寄生虫およびウィルス感染の治療などの免疫治療用途に用いられる免疫応答を強化するための方法および組成物を提供する。本発明はさらに、そのような化合物の製造方法をさらに提供する。さらに、本発明の化合物は、ＤＮＡワクチン、抗体、およびアレルゲンと組み合わせるアジュバントとして、および他の免疫刺激剤、化学療法剤、ｉＲＮＡ剤および／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドと組み合わせるアジュバントとしても有用である。
【００２８】
本発明は、ヌクレオチド配列
５’−ＧＵＣＣＵＵＣＡＡ−３’（配列番号：１）
を含むか、該配列で構成されるか、または、本質的に該配列で構成されるオリゴヌクレオチド剤を提供する。
【００２９】
他の実施形態において、オリゴヌクレオチド剤は、配列番号：１由来の、好ましくは当該配列の５’末端から、４以上、５以上、６以上、７以上または８以上の連続したヌクレオチドの配列、たとえば、５’−ＧＵＣＣ−３’（配列番号：２）、５’−ＧＵＣＣＵ−３’（配列番号：３）、５’−ＧＵＣＣＵＵ−３’（配列番号：４）、５’−ＧＵＣＣＵ
ＵＣ−３’（配列番号：５）、または５’−ＧＵＣＣＵＵＣＡ−３’（配列番号：６）を含むか、該配列で構成されるか、または、本質的に該配列で構成される。
【００３０】
本明細書において、オリゴヌクレオチド剤は、同剤において他のヌクレオチドを含まない場合には、配列番号：１で構成されると表現する。本明細書において、オリゴヌクレオチド剤は、１、２、３または４以下の他のヌクレオチドしか同剤に含まない場合には、本質的に配列番号：１で構成されると表現する。本明細書において、オリゴヌクレオチド剤は、同剤に他のヌクレオチドを含む場合には、配列番号：１を含むと表現する。好ましくは、このような剤は、同剤が二本鎖構造からならない場合には、２１以下の他のヌクレオチド、より好ましくは約１５〜約１０以下の他のヌクレオチドしか該剤に含まない。二本鎖構造を含むオリゴヌクレオチド剤、たとえばｉＲＮＡ剤は、配列番号：１を含む鎖の中に、２１、１５または１０以下の他のヌクレオチドを含み、好ましくは、配列番号：１を含まない方の鎖の中に、３０、２４または１９以下のヌクレオチドを含む。
【００３１】
本明細書において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、複数の連結されたヌクレオシド単位で形成されるポリヌクレオチドのことをいう。このようなオリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む既存の核酸供給源から得ることができるが、好ましくは合成法によって作成される。好ましい実施形態において、各ヌクレオシド単位は、複素環塩基と、ペントフラノシル、トレハロース、アラビノース、２’−デオキシ−２’−置換アラビノース、２’−Ｏ−置換アラビノースまたはヘキソース糖基とを含む。ヌクレオシド残基は、任意の様々な既知のヌクレオシド間結合によって互いに連結することができる。そのようなヌクレオシド間結合としては、限定はされないが、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、シロキサン、カーボネート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホラミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、およびスルフォンヌクレオシド間結合が挙げられる。「オリゴヌクレオチド」という用語は、１つ以上の立体特異的ヌクレオシド間結合（たとえば、（Ｒｐ）−または（Ｓｐ）−ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、またはホスホトリエステル結合）を有するポリヌクレオシドも包含する。
【００３２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号：１を含むか、配列番号：１で構成されるか、または、本質的に配列番号：１で構成されるのであれば、天然のヌクレオシド、修飾ヌクレオシドまたはその混合物を含んでいてもよい。本明細書において、「修飾ヌクレオシド」とは、修飾複素環塩基、修飾糖部分、またはその組み合わせを含むヌクレオシドのことである。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオシドは、本明細書に記載するように、非天然のピリミジンまたはプリンヌクレオシドである。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオシドは、２’−置換リボヌクレオシド、アラビノヌクレオシドまたは２’−デオキシ−２’−置換−アラビノシドである。
【００３３】
本明細書において、「２’−置換リボヌクレオシド」または「２’−置換アラビノシド」という用語には、ペントース部分の２’位のヒドロキシル基が置換されて、２’−置換または２’−Ｏ−置換リボヌクレオシドが生じた、リボヌクレオシドまたはアラビノヌクレオシドが含まれる。好ましくは、このような置換は１〜６個の飽和または不飽和炭素原子を含む低級アルキル基による置換、または６〜１０個の炭素原子を有したアリール基による置換であり、このようなアルキルまたはアリール基は、非置換のものであってもよいし、たとえばハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルボアルコキシ、またはアミノ基などによって置換されていてもよい。２’−Ｏ−置換リボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−置換−アラビノシドの例としては、限定はされないが、たとえば、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドま
たは２’−Ｏ−メチルアラビノシドおよび２’−Ｏ−メトキシエチルリボヌクレオシド、または２’−Ｏ−メトキシエチルアラビノシドが挙げられる。
【００３４】
「２’−置換リボヌクレオシド」または「２’−置換アラビノシド」という用語は、２’−ヒドロキシル基が１〜６個の飽和または不飽和炭素原子を含む低級アルキル基によって、あるいはアミノまたはハロ基によって置換されている、リボヌクレオシドまたはアラビノヌクレオシドも含む。このような２’−置換リボヌクレオシドまたは２’−置換アラビノシドの例としては、限定はされないが、たとえば、２’−アミノ、２’−フルオロ、２’−アリル、および２’−プロパルギルリボヌクレオシドまたはアラビノシドが挙げられる。
【００３５】
「オリゴヌクレオチド」という用語には、ハイブリッドおよびキメラオリゴヌクレオチドも含まれる。「キメラオリゴヌクレオチド」とは、２種以上のヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドのことである。キメラオリゴヌクレオチドの１つの好ましい実施形態は、ホスホロチオエート、ホスホジエステルまたはホスホロジチオエート領域と、アルキルホスホネートまたはアルキルホスホノチオエート結合などの非イオン結合とを含むキメラオリゴヌクレオチドである（たとえば、ペダーソン（Ｐｅｄｅｒｓｏｎ）らの米国特許第５，６３５，３７７号および同第５，３６６，８７８号明細書を参照のこと）。
【００３６】
「ハイブリッドオリゴヌクレオチド」は、２種以上のヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドである。このようなハイブリッドオリゴヌクレオチドの１つの好ましい実施形態は、リボヌクレオチドまたは２’−置換リボヌクレオチド領域と、デオキシリボヌクレオチド領域とを含む（たとえば、メテレフ（Ｍｅｔｅｌｅｖ）およびアグラバル（Ａｇｒａｗａｌ）の米国特許第５，６５２，３５５号、同第６，３４６，６１４号および同第６，１４３，８８１号を参照のこと）。
【００３７】
本明細書における「免疫刺激」剤、または「免疫応答を刺激する」剤とは、細胞内でｉｎ  ｖｉｔｒｏにて、または生物体内でｉｎ  ｖｉｖｏにて、生物病原体に対する天然の防御の一部であると一般的に理解されている反応、たとえば免疫系を刺激する剤のことをいう。このような反応としては、限定はされないが、たとえば、抗体またはサイトカイン、たとえばインターフェロン、たとえばインターフェロンα（ＩＦＮ−α）の産生が挙げられる。
【００３８】
別の実施形態において、本発明は、たとえば、上記の免疫調節性オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド剤と、該オリゴヌクレオチド剤の利用可能な５’末端以外の位置に連結された抗原とを含んでなる、免疫調節性オリゴヌクレオチド複合体およびオリゴヌクレオチド剤複合体を提供する。いくつかの実施形態において、非ヌクレオチドリンカーは、オリゴヌクレオチドに連結された抗原を含む。いくつかの他の実施形態において、抗原は、オリゴヌクレオチドの３’末端以外の位置に連結される。いくつかの実施形態において、抗原は、ワクチン効果を生じる。他のオリゴヌクレオチド剤複合体については以下にさらに説明する。
【００３９】
オリゴヌクレオチド剤が抗原と複合体化される場合には、抗原は好ましくは、病原体に関連する抗原、がんに関連する抗原、自己免疫疾患に関連する抗原、および、限定はされないがたとえば家畜の疾患または小児疾患などの他の疾患に関連する抗原からなる群より選択される。本明細書において、「と関連する」という用語は、その抗原が当該病原体、がん、自己免疫疾患、食品アレルギー、呼吸器系アレルギー、ぜんそく、または他の疾患が存在するときには存在するが、当該病原体、がん、自己免疫疾患、食品アレルギー、呼吸器系アレルギー、ぜんそく、または他の疾患が存在しないときには存在しないか、少ない量でしか存在しないことを意味する。
【００４０】
免疫調節性オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド剤は抗原に共有結合されているか、いずれにせよ抗原に機能的に結合されている。本明細書において「機能的に結合されている」という場合、オリゴヌクレオチド剤と抗原の両方の活性を維持するあらゆる結合をさす。このような機能的な結合の非限定的な例としては、同一のリポソームその他の同様の輸送ビヒクルまたは薬剤の一部であることが含まれる。オリゴヌクレオチド剤が抗原と共有結合している実施形態において、このような共有結合は、免疫調節性オリゴヌクレオチドの利用可能な５’末端以外のオリゴヌクレオチド剤上の任意の位置にあるのが好ましい。たとえば、抗原は、ヌクレオシド間結合に付加してもよいし、非ヌクレオチドリンカーに付加してもよい。あるいは、抗原自体が非ヌクレオチドリンカーであってもよい。
【００４１】
ある好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド剤はｉＲＮＡ剤、たとえばアンチセンス剤またはｓｉＲＮＡ剤である。その意味で、本明細書において用いるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド剤は、たとえばヒトなどの哺乳類の血清中において、または哺乳類、特にヒトの細胞の細胞質においてみられるようなある条件下で互いにハイブリダイズするなどの直接結合によってのみ本質的に生じる、２以上、好ましくは２つのオリゴヌクレオチド分子で構成される複合体をも意味する。以後、オリゴヌクレオチド剤であるためには、該複合体を形成する２以上の該オリゴヌクレオチド分子のうちの少なくとも１つが、配列番号：１を含むか、該配列で構成されるか、または、本質的に該配列で構成される。
【００４２】
本明細書中で用いるｉＲＮＡ剤とは、アンチセンス剤またはｓｉＲＮＡ剤などの、標的遺伝子の発現を特異的に妨害することのできる剤のことである。典型的には、ｉＲＮＡ剤は、標的遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの一部と相補的なオリゴヌクレオチド配列を含む。該ｉＲＮＡ剤は、任意のメカニズム、たとえば、ｍＲＮＡの翻訳をブロックしたり、たとえばＲＮＡ干渉のメカニズムを介してｍＲＮＡの分解を開始させたり、またはたとえばＤＮＡメチル化を介して遺伝子の転写をブロックすることによって、標的遺伝子の発現を妨害する。
【００４３】
ｉＲＮＡ剤の設計
本発明はさらに、アンチセンス剤またはｓｉＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤を、炎症反応を誘導するか、炎症反応の誘導を回避するように、設計／選択する方法も提供する。具体的には、本方法は、ＩＦＮ／炎症反応が望まれる場合には、配列番号：１、またはその断片をアンチセンス剤またはｓｉＲＮＡ剤などのオリゴヌクレオチド剤に含める工程を含み、あるいは炎症反応が望まれない場合には、上記配列を剤の中に含めない工程を含む。
【００４４】
したがって、本発明は、とりわけ、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２３ヌクレオチドの配列を含む、アンチセンス鎖と、任意選択でセンス鎖とを含むｉＲＮＡ剤を提供し、ＩＦＮ産生が望まれる場合には、アンチセンスおよび任意選択のセンス鎖の配列のうちの少なくとも一方は配列番号：１からなり、ＩＦＮ産生を避ける場合には、アンチセンス鎖と任意選択のセンス鎖のいずれも上記配列を含まない。
【００４５】
ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０または５０ヌクレオチド以上の長さを有するものとする。また、５０、４０または３０ヌクレオチド以下の長さのものとする。好ましい範囲は、長さが１５〜３０、１７〜２５、１９〜２３および１９〜２１ヌクレオチドである。
【００４６】
ｉＲＮＡ剤のセンス鎖がある場合には、該センス鎖は、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０または５０ヌクレオチド以上の長さを有するものとする。また、５０
、４０または３０ヌクレオチド以下の長さのものとする。好ましい範囲は、長さが１５〜３０、１７〜２５、１９〜２３および１９〜２１ヌクレオチドである。
【００４７】
ｉＲＮＡ剤に二本鎖部分がある場合、該二本鎖部分は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２９、４０または５０以上のヌクレオチド対の長さを有するものとする。その長さは５０、４０または３０ヌクレオチド対以下でなければならない。好ましい範囲は、１５〜３０、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド対の長さである。
【００４８】
本発明によるｉＲＮＡ剤を設計する際には、最初に、配列番号：１からの４以上、５以上、６以上、７以上、または８以上の連続ヌクレオチドと相補的（アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡアンチセンス鎖において用いるため）または同一（ｓｉＲＮＡセンス鎖において用いるため）である標的遺伝子のｍＲＮＡ配列中の領域を同定することが有益である。次いでｉＲＮＡ剤を、この領域に相補的または同一の配列と、標的遺伝子発現阻害活性を与えるようにいくつかの適切な追加のヌクレオチドとを含むように選ぶことができる。ここで配列番号：１は、ｉＲＮＡ剤内のたとえば３’または５’末端領域などのどこの場所に含まれていてもよく、または、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかのどこの場所に含まれていてもよい。
【００４９】
しかしながら、そのｍＲＮＡが配列番号：１と完全に相補的または同一の領域を含まない特定の遺伝子を阻害することが望まれる場合には、標的遺伝子ｍＲＮＡに対するミスマッチを含むｉＲＮＡ剤を用いてもよい。ミスマッチは、たとえばｓｉＲＮＡのいずれかの鎖の末端領域において最も許容されうるため、ミスマッチはこれらの末端領域に導入するのが最もよい。たとえば、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の最も３’末端側または最も５’末端側の４，５，６，７，８または９ヌクレオチド、またはアンチセンス鎖の最も３’末端側の４，５，６，７，８または９ヌクレオチドを配列番号：１から選んでもよく、この場合、１以下、２以下、または３以下のヌクレオチドが標的ｍＲＮＡに対してミスマッチを示し、残りのヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡに対して完全に一致するか相補的になるように選ばれる。しかしながら、アンチセンス鎖の（５’から３’に向けて数えて）２〜９位にあるヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡの認識にとって重要であると考えられている（ヘイリー、ビー（Ｈａｌｅｙ，Ｂ．），およびザモア、ピーディー（Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．），Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，１１，５９９〜６０６（２００４））。したがって、この領域（「シード領域」ともよばれることもある）では、標的ｍＲＮＡとの完全な相補配列が存在することが好ましい。
【００５０】
このような実施形態において、前記標的遺伝子は本質的に、上述のような完全に一致した、または部分的にミスマッチのあるｉＲＮＡ剤の設計を可能にする任意の遺伝子配列であってよい。この遺伝子は、たとえば、ヒト遺伝子など、哺乳類の遺伝子であってよい。たとえば、限定するものではないが、このような遺伝子は、オンコジーン、免疫応答に関与する遺伝子、代謝に関与する遺伝子、または成長因子、転写因子、もしくは受容体をコードする遺伝子であってよい。表７は、ヒトｍＲＮＡ配列データベースのＢＬＡＳＴ検索によって得られた、配列番号：１と同一または相補的な配列を含むことからこの様式で阻害可能な例示的な遺伝子転写物の名前を示した非限定的なリストを含む。あるいは、標的遺伝子は、動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトに対して病原性のある生物、たとえば細菌またはウィルスに由来するものであってもよい。
【００５１】
ｉＲＮＡ剤化学
本明細書で検討するｉＲＮＡ剤には、非修飾ＲＮＡとともに、たとえば効力を高めるために修飾されたＲＮＡや、ヌクレオシド代用物のポリマーも含まれる。非修飾ＲＮＡは、核酸の成分、すなわち、糖、塩基、およびリン酸部分が、天然に生じるものと、好ましく
はヒトの体において天然に生じるものと同じまたは実質的に同じ分子のことをいう。従来技術では、希少または特殊であるが天然に発生するＲＮＡを修飾ＲＮＡと呼んできた。たとえば、リンバッハ（Ｌｉｍｂａｃｈ）ら．，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２２：２１８３〜２１９６を参照のこと。修飾ＲＮＡと呼ばれることも多いこのような希少または特殊なＲＮＡ（明らかにこれらは典型的に転写後修飾の結果によるものである）は、本明細書中では非修飾ＲＮＡの用語の範囲内であるとする。本明細書中で用いる修飾ＲＮＡとは、核酸の成分、すなわち、糖、塩基、およびリン酸部分のうちの１つまたはそれ以上が、天然に生じるものとは異なる、好ましくはヒトの体内で生じるものとは異なる分子のことをいう。それらは、修飾「ＲＮＡ」と呼ばれるが、勿論、修飾のためにもはやＲＮＡではない分子をも含む。ヌクレオシド代用物は、リボホスフェート骨格が非リボホスフェート構築物に置き換わっている分子であり、該構築物は、ハイブリダイゼーションがリボホスフェート骨格、たとえば非荷電のリボホスフェート骨格類似物の場合に見られるものとほぼ同じとなるように、塩基を正しい空間的関係に存在できるようにする。上記のそれぞれの例について下記で検討する。
【００５２】
ヌクレアーゼ耐性の増強
ヌクレアーゼ耐性および／または標的ｍＲＮＡへの結合親和性を高めるために、オリゴヌクレオチド剤は、たとえば、２’修飾リボース単位および／またはホスホロチオエート結合を含んでいてもよく、たとえば２’ヒドロキシル基（ＯＨ）を、複数の異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で修飾または置換してもよい。
【００５３】
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、たとえば、Ｒ＝Ｈ，アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ；２’ヒドロキシが、たとえばメチレン架橋によって、同じリボース糖の４’炭素に複合化した「ロックト」核酸（ＬＮＡ）；Ｏ−ＡＭＩＮＥおよびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＡＭｌＮＥ、（たとえば、ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロサイクリルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）が挙げられる。注目すべきは、メトキシエチル基（ＭＯＥ）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＰＥＧ誘導体）のみを含むオリゴヌクレオチドは、堅牢なホスホロチオエート修飾によって修飾されたものに匹敵するヌクレアーゼ安定性を示す。
【００５４】
「デオキシ」修飾は、水素（すなわち、部分的に二本鎖のＲＮＡの突出部分に特に関係のあるデオキシリボース糖）；ハロ（たとえば、フルオロ）；アミノ（たとえば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロサイクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロサイクリルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）、シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；および任意選択でたとえばアミノ官能性に置換されていてもよいアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニルを含む。
【００５５】
好ましい置換基は、２’−メトキシエチル、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、および２’−フルオロである。
ヌクレアーゼ耐性を最大化するために、２’修飾を、１つまたはそれ以上のホスフェートリンカー修飾（たとえば、ホスホロチオエート）と組み合わせて用いてもよい。
【００５６】
オリゴヌクレオチド骨格内にフラノース糖を含めることによっても、エンドヌクレアーゼによる切断を低減することができる。オリゴヌクレオチド剤は、３’カチオン基を含めることによって、または３’末端のヌクレオシドを３’−３’結合で反転させることによって、さらに修飾することもできる。別の代替例において、３’末端を、アミノアルキル基、たとえば、３’Ｃ５−アミノアルキルｄＴでブロックすることもできる。他の３’複合体が、３’−５’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害することもできる。理論に束縛されるものではないが、ナプロキセンまたはイブプロフェンなどの３’複合体は、エキソヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドの３’末端に結合するのを立体的に阻害することにより、該エキソヌクレアーゼによる切断を阻害することができる。小さいアルキル鎖、アリール基、または複素環複合体または修飾糖（Ｄ−リボース、デオキシリボース、グルコースなど）も３’−５’エキソヌクレアーゼを阻害することができる。
【００５７】
同様に、５’複合体は、５’−３’エキソヌクレアーゼによる切断を阻害することができる。理論に束縛されるものではないが、ナプロキセンまたはイブプロフェンなどの５’複合体は、エキソヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドの５’末端に結合するのを立体的に阻害することにより、該エキソヌクレアーゼによる切断を阻害することができる。小さいアルキル鎖、アリール基、または複素環複合体または修飾糖（Ｄ−リボース、デオキシリボース、グルコースなど）も３’−５’エキソヌクレアーゼを阻害することができる。
【００５８】
テザードリガンド
オリゴヌクレオチド剤の特性は、その薬理学的特性も含めて、リガンド、たとえばテザードリガンド（繋留リガンド）などの導入によって影響を与えたり、調整したりすることができる。テザードリガンドを含むオリゴヌクレオチド剤は、本明細書においては複合体または生物複合体ともよぶこともある。
【００５９】
たとえばリガンドなどの幅広い実体をオリゴヌクレオチド剤に、たとえばリガンド複合化モノマーサブユニットの担体に繋留することができる。その例を、リガンド複合化モノマーサブユニットに関して下記に記載するが、これは好適な例にすぎず、実体をオリゴヌクレオチド剤の他の地点に連結することもできる。
【００６０】
好ましい部分は、担体に、好ましくは共有結合によって、直接または間接的に介在テザーを介して連結されたリガンドである。好ましい実施形態において、リガンドは、介在テザーを介して担体に付加されている。リガンドまたはテザードリガンドは、リガンド複合化モノマーが成長中の鎖に組み込まれる場合には、リガンド複合化モノマー上に存在していてもよい。一部の実施形態では、「前駆体」リガンド複合化モノマーサブユニットを成長中の鎖に組み込んだ後に、リガンドを「前駆体」リガンド複合化モノマーサブユニットに組み込むとよい。たとえば、アミノ末端テザー、たとえばＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ２を有するモノマーを、成長中のセンス鎖またはアンチセンス鎖に組み込むことができる。次の操作において、すなわち前駆体モノマーサブユニットを鎖に組み込んだ後に、続いて求電子基、たとえばペンタフルオロフェニルエステルまたはアルデヒド基を有するリガンドを、該リガンドの求電子基と前駆体リガンド複合化モノマーサブユニットテザーの求核基とを連結することによって、前駆体リガンド複合化モノマーに付加することができる。
【００６１】
好ましい実施形態において、リガンドはそれが組み込まれるオリゴヌクレオチド剤の分布、標的または寿命を変える。好ましい実施形態において、リガンドは、選択された標的、たとえば分子、細胞または細胞種、コンパートメント、たとえば細胞または器官のコンパートメント、組織、器官、または体の部位に対して、たとえば当該リガンドが存在しないものと比べて高い親和性を提供する。
【００６２】
好ましいリガンドは、輸送特性、ハイブリダイゼーション特性、および特異性を向上さ
せることができ、得られる天然または修飾オリゴリボヌクレオチド、または、本明細書に記載のモノマーの任意の組み合わせを含む高分子、および／または天然または修飾リボヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を向上させることもできる。
【００６３】
リガンドは一般的に、たとえば取り込みを高めるための治療用改質剤；たとえば分布をモニタするための診断用化合物またはレポーター基；架橋剤；ヌクレアーゼ耐性を付与する部分；および天然または通常のものとは異なる核酸塩基を含んでいてもよい。一般例としては、脂溶性分子、脂質、レクチン、ステロイド（たとえば、ウバオール、ヘシゲニン（ｈｅｃｉｇｅｎｉｎ）、ジオスゲニン）、テルペン（たとえば、トリテルペン、たとえばサルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導化リトコール酸）、ビタミン、炭水化物（たとえば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）、タンパク質、タンパク質結合物質、インテグリンを標的とする分子、ポリカチオン、ペプチド、ポリアミン、およびペプチド疑似物質が挙げられる。
【００６４】
リガンドは、天然に存在する分子または組換えもしくは合成分子、たとえば、合成ポリマー、たとえば合成ポリアミノ酸であってよい。ポリアミノ酸の例としては、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコライド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、疑似ペプチド−ポリアミン、ペプチド疑似物−ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン部分、たとえば、カチオン脂質、カチオンプロフィリン、ポリアミンの第４級塩、またはαヘリックスペプチドが挙げられる。
【００６５】
リガンドは、標的化基、たとえば、細胞または組織を標的とする物質、たとえば、チロトロピン、メラノトロピン、サーファクタントプロテインＡ、ムチン炭水化物、グリコシル化ポリアミノ酸、トランスフェリン、ビスホスフォネート、ポリグルタメート、ポリアルパルテート、またはＲＧＤペプチドもしくはＲＧＤペプチド疑似物を含んでいてもよい。
【００６６】
リガンドは、タンパク質、たとえば糖タンパク質、リポタンパク質、例えば低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、またはアルブミン、たとえばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはペプチド、たとえば、共リガンドに対する特異的親和性を有する分子、または抗体、たとえば、がん細胞、内皮細胞、もしくは骨細胞などの特定の細胞種に結合する抗体であってよい。リガンドは、ホルモンおよびホルモン受容体を含んでいてもよい。それらは、非ペプチド性のもの、たとえば補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、または多価フコースを含んでいてもよい。リガンドは、たとえば、リポ多糖、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化剤、またはＮＦ−κＢの活性化剤であってもよい。
【００６７】
リガンドは、物質、たとえば薬剤であって、たとえば細胞の細胞骨格を崩壊させることにより、たとえば、細胞の微小管、マイクロフィラメント、および／または中間径フィラメントを崩壊させることにより、細胞へのオリゴヌクレオチド剤の取り込みを高めることのできる薬剤であってもよい。この薬剤は、たとえば、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホライドＡ、インダノシン、また
はミオセルビンなどであってよい。
【００６８】
一実施形態において、リガンドは脂質または脂質系分子である。このような脂質または脂質系分子は、血清タンパク質、たとえば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合することが好ましい。ＨＳＡ結合リガンドは、標的組織、たとえば肝臓実質細胞を含む肝臓組織への複合体の分布を可能にする。ＨＳＡに結合しうる他の分子もリガンドとして用いることができる。たとえば、ネプロキシンまたはアスピリンを用いることができる。脂質または脂質系リガンドは、（ａ）複合体の分解に対する耐性を増大させる、（ｂ）標的細胞または標的膜への標的化または輸送を増大させる、および／または（ｃ）たとえばＨＳＡなどの血清タンパク質への結合を調節するために用いることができる。
【００６９】
脂質系リガンドは、標的組織への複合体の結合を調節、たとえば制御するために用いることができる。たとえば、ＨＳＡに比較的強く結合する脂質または脂質系リガンドは、腎臓を標的としにくく、したがって、体から除去されにくい。ＨＳＡに比較的弱く結合する脂質または脂質系リガンドは、複合体の標的を腎臓とするために用いることができる。
【００７０】
別の実施形態において、リガンドは、例えば増殖中の細胞などの標的細胞によって取り込まれる部分、例えばビタミンまたは栄養素である。これらは、悪性型または非悪性型のたとえばがん細胞などの望ましくない細胞増殖を特徴とする疾患を治療するために特に有用である。ビタミンの例としては、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫが挙げられる。他のビタミンの例としては、Ｂビタミン類、たとえば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサルまたはがん細胞によって取り込まれる他のビタミンまたは栄養素が挙げられる。
【００７１】
別の実施形態において、リガンドは細胞透過剤であり、好ましくはヘリックス細胞透過剤である。好ましくは、同剤は両親媒性である。剤としては、たとえば、ｔａｔまたはアンテナペディアなどのペプチドが挙げられる。剤がペプチドであれば、ペプチジル疑似物、インバートマー、非ペプチドまたは疑似ペプチド結合、およびＤ−アミノ酸の使用も含めて修飾することができる。ヘリックス剤は、好ましくは脂溶性相および疎油性相を有する好ましくはαヘリックス剤である。
【００７２】
好ましいリガンドは、本発明の剤に、細胞に結合する能力、好ましくは、問題の病状と最も関連する特定の種類の細胞に結合する能力を与える。たとえば、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）（ウー（Ｗｕ）およびウー（Ｗｕ）、１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４４２９〜４４３２）は、幹細胞に独特のものであり、分枝状ガラクトース末端糖タンパク質、たとえばアシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）と結合する。他の例では、葉酸受容体は多くのがん細胞において過剰発現される。このような糖タンパク質、合成糖複合体、または葉酸塩の受容体への結合は、オリゴサッカライド鎖の分枝の程度に強く依存する親和性で起こり、たとえば、トリアンテナ型構造は、バイアンテナ型またはモノアンテナ型鎖よりも大きな親和性で結合する（ベツィンガー（Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ）およびフィーテ（Ｆｉｅｔｅ）、１９８０，Ｃｅｌｌ，２２，６１１〜６２０；コノリー（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ）ら、１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７，９３９〜９４５）。リ（Ｌｅｅ）およびリ（Ｌｅｅ）、１９８７，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ
Ｊ．，４，３１７〜３２８では、この高い特異性を、ガラクトースに比べて高い受容体親和性を有するＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを炭水化物部分として使用することによって得ている。この「クラスタリング効果」は、マンノシル末端糖タンパク質または糖複合体の結合および取り込みについても記載されている（ポンパイポム（Ｐｏｎｐｉｐｏｍ）ら、１９８１，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２４，１３８８〜１３９５）。ガラクトース、ガラクトサミン、または葉酸塩に基づく複合体を用いて外来化合物を細胞膜を通して輸送することにより、たとえば、肝疾患、肝臓がん、または他のがんの治療に対するター
ゲッティド（標的を定めた）送達手法を提供することができる。生物複合体を用いることにより、治療に必要な治療用化合物の必要用量を低減することもできる。さらに、治療上の生物利用性、薬力学、および薬物動態パラメータを、本発明の核酸生物複合体を使用することによって調節することができる。このような生物複合体の非限定的な例が、バルギース（Ｖａｒｇｅｅｓｅ）らの米国特許出願番号第１０／２０１，３９４号（２００１年８月１３日出願）；およびマトゥーリック‐アダミック（Ｍａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ）らの米国特許出願番号第６０／３６２，０１６号（２００２年３月６日出願）に記載されている。
【００７３】
５’リン酸修飾
他の実施形態において、オリゴヌクレオチド剤は、５’リン酸化されているか、または５’末端にホスホリルアナログを含む。アンチセンス鎖の５’リン酸修飾には、ＲＩＳＣ媒介性遺伝子サイレンシングに適合するものが挙げられる。適切な修飾には、５’−モノホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および修飾または非修飾のヌクレオチドキャップ構造がある。他の適切な５’リン酸修飾は当業者に周知である。
【００７４】
製剤
本明細書において記載するオリゴヌクレオチド剤は、対象への投与、好ましくは、限定はされないが静脈内、筋肉内、腹腔内、直腸、皮内、皮下、または、経皮投与などの、たとえば非経口または経口投与などの全身投与用として、または、組織、たとえば肺や鼻腔（呼吸組織）などへのたとえば吸入または経鼻投与、肝臓、腎臓、脾臓、脳、脊髄、目、皮膚、腸、粘膜、胎盤、または当該オリゴヌクレオチド剤の効果に対する好適な標的である他の任意の組織または器官への標的を定めた送達用として、製剤することができる。
【００７５】
説明を容易にするために、本セクションにおける製剤、組成物、および方法は、主に非修飾オリゴヌクレオチド剤に関して説明する。しかしながら、これらの製剤、組成物、および方法は、他のオリゴヌクレオチド剤、たとえば修飾オリゴヌクレオチド剤を用いても実施することができ、そのような実施も本発明に含まれることは当然のことである。
【００７６】
製剤されたオリゴヌクレオチド剤組成物は、様々な形態をとりうる。いくつかの例において、組成物は少なくとも部分的に結晶、均一な結晶および／または無水物（たとえば、水分が８０，５０，３０，２０または１０％未満）である。別の例において、オリゴヌクレオチド剤は水性相にあり、たとえば、水を含む溶液状態であり、この形態が非経口投与には好ましい。
【００７７】
水性相または結晶組成物は、輸送ビヒクル、たとえばリポソーム（特に水性相に対して）または粒子（たとえば、結晶組成物に対して適切であるような微粒子）内に組み込んでもよい。一般に、オリゴヌクレオチド剤組成物は、対象とする投与方法に適合するような様式で調合される。
【００７８】
オリゴヌクレオチド剤製剤は、別の剤、たとえば別の治療剤または前記オリゴヌクレオチド剤を安定化させる剤、たとえば、オリゴヌクレオチド剤と複合体を形成するタンパク質と組み合わせて調合してもよい。さらに他の剤としては、キレート剤、たとえばＥＤＴＡ（たとえば、Ｍｇ２＋などの二価カチオンを除去するため）、塩、ヌクレアーゼ阻害剤（たとえば、ＲＮＡｓｉｎなどの広い特異性のヌクレアーゼ阻害剤）などが挙げられる。
【００７９】
一実施形態において、オリゴヌクレオチド剤製剤は、別のオリゴヌクレオチド剤、たとえば、標的遺伝子に関してＲＮＡｉを媒介することのできるｓｉＲＮＡ剤を含む。そのような用途では、本発明のオリゴヌクレオチド剤により、標的遺伝子は細胞内で崩壊するとともに、該細胞は刺激されてＩＦＮを産生する。このような同時治療は、がんおよびウィルス感染などの疾患の治療において重要である。
【００８０】
核酸分子の送達方法は、アクタール（Ａｋｈｔａｒ）ら、１９９２、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，２，１３９；「アンチセンスオリゴヌクレオチド治療のための送達戦略（Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」、アクタール（Ａｋｈｔａｒ）編、１９９５、マウレル（Ｍａｕｒｅｒ）ら、１９９９、Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．，１６，１２９〜１４０；ホフランド（Ｈｏｆｌａｎｄ）およびヒュアン（Ｈｕａｎｇ）、１９９９、Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１３７，１６５〜１９２；およびリ（Ｌｅｅ）ら，２０００、ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，７５２，１８４〜１９２に記載されており、これらのすべての文献は参照により本願に組み入れる。バイゲルマン（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ）ら、米国特許第６，３９５，７１３号、およびサリバン（Ｓｕｌｌｉｖａｎ）ら、国際公開公報第９４／０２５９５号パンフレットは、さらに、核酸分子のための一般的な送達方法を記載している。これらのプロトコールは、事実上あらゆる核酸分子の送達のために利用することができる。核酸分子は、限定はされないが、イオントフォレシスによるリポソームへのカプセル化、他のビヒクルたとえば生分解性ポリマー、ハイドロゲル、シクロデキストリン（たとえば、ゴンザレス（Ｇｏｎｚａｌｅｚ）ら、１９９９、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１０，１０６８〜１０７４；ワン（Ｗａｎｇ）ら、国際公開公報第０３／４７５１８号および同第０３／４６１８５号パンフレット）、ポリ（乳酸−グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）およびＰＬＣＡミクロスフェア（たとえば、米国特許第６，４４７，７９６号、および米国特許出願公開番号第２００２１３０４３０号を参照）、生分解性ナノカプセル、および生体接着性ミクロスフェアへの組み込みによって、またはタンパク様ベクター（オヘア（Ｏ’Ｈａｒｅ）およびノーマンド（Ｎｏｒｍａｎｄ）、国際公開公報第００／５３７２２号パンフレット）によってなど、当業者に周知の様々な方法によって投与することができる。あるいは、核酸／ビヒクルの組み合わせは、直接注射によって、または注入ポンプを用いることによって局所的に送達される。本発明の核酸分子の直接注射は、皮下、筋肉内、皮内にかかわらず、標準的な針とシリンジの方法を用いて、またはコンリー（Ｃｏｎｒｙ）ら、１９９９、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５，２３３０〜２３３７およびバリー（Ｂａｒｒｙ）ら、国際公開公報第９９／３１２６２号パンフレットに記載されるような無針技術によって行うことができる。
【００８１】
別の実施形態において、本発明の核酸分子は、ポリエチレンイミンおよびその誘導体、たとえば、ポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＧＡＬ）やポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−トリ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−トリＧＡＬ）誘導体とともに製剤化または複合体形成してもよい。一実施形態において、本発明の核酸分子は、参照によりその全体を本願に組み込む米国特許出願公開番号第２００３００７７８２９号に記載されているように製剤する。
【００８２】
一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド剤は、参照により図面も含めたその全体を本願に組み込む米国特許出願公開番号第２００１０００７６６６号に記載されるような膜破壊剤と複合化される。別の実施形態において、膜破壊剤およびオリゴヌクレオチド剤は、カチオン脂質またはヘルパー脂質分子、たとえば、参照により図面も含めたその全体を本願に組み込む米国特許第６，２３５，３１０号に記載されるような脂質とも複合
化される。
【００８３】
一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド剤は、図面を含めた全体を参照により本願に組み込む米国特許出願公報番号２００３０７７８２９号明細書および国際公開公報第００／０３６８３号および同第０２／０８７５４１号パンフレットに記載されるような送達系と複合化される。
【００８４】
一実施形態において、本発明の核酸分子は、肺送達、たとえば、吸入装置もしくはネブライザーによって投与されるエアロゾルまたはスプレー乾燥製剤の吸入などによって、肺送達を介して投与され、核酸分子を迅速に関連する肺組織に局所的に取り込ませる。微粉化核酸組成物の呼吸用乾燥粒子を含む固体粒状組成物は、乾燥または凍結乾燥した核酸組成物を粉砕して、その微粉化組成物を、たとえば４００メッシュスクリーンに通して、大きな凝集体を分割もしくは分離することによって調製することができる。本発明の核酸組成物を含む固体粒状組成物は、任意選択で、エアロゾルならびに他の治療用化合物の作成を容易にするためにはたらく分散剤を含んでいてもよい。適切な分散剤はラクトースであり、１対１の重量比などの任意の適切な比率で核酸化合物と混合することができる。
【００８５】
本発明の核酸組成物を含む液体粒子のエアロゾルは、ネブライザーを用いるなど任意の手段によって発生させることができる（たとえば、米国特許第４，５０１，７２９号を参照）。ネブライザーは市販の装置であり、有効成分の溶液または懸濁液を、典型的には空気または酸素などの圧縮ガスを狭いベンチュリを通して加速するか、あるいは超音波攪拌によって、治療用エアロゾルミストに変えるものである。ネブライザーにおいて用いるのに適した製剤は、液体担体中に、有効成分を、製剤の４０％（ｗ／ｗ）まで、好ましくは２０％（ｗ／ｗ）未満の量で含む。担体は典型的には水または希釈水性アルコール溶液であり、好ましくはたとえば塩化ナトリウムまたは他の適切な塩などを加えることにより体液と等張にしたものである。任意選択の添加物としては、製剤が無菌的に調製されない場合には保存剤、たとえば、メチルヒドロキシベンゾエート、抗酸化剤、着香剤、揮発油、緩衝剤、および乳化剤、ならびに他の調合界面活性剤が挙げられる。有効組成物と界面活性剤とを含む固体粒子のエアロゾルも同様に、任意の固体粒状エアロゾル発生器を用いて発生させることができる。固体粒状治療薬を対象に投与するためのエアロゾル発生器は、上述のように吸入可能な粒子を発生し、所定量の治療組成物を含む一定体積のエアロゾルをヒトへの投与に適した速度で発生させる。固体粒状エアロゾル発生器の説明的な例として、吸入器がある。吸入による投与に適した製剤は、吸入器によって送達可能な細かく砕いた粉末を含む。吸入器において、粉末、たとえば、本明細書において記載する治療を行うのに有効な一定量の粉末は、典型的にはゼラチンまたはプラスチックからなるカプセルまたはカートリッジに含まれ、該カプセルまたはカートリッジはｉｎ  ｓｉｔｕにおいて穿刺または開口され、吸入時に装置を通って吸引される空気によって、または手動ポンプによって、粉末が送達される。吸入器において用いられる粉末は、有効成分だけで構成されるか、有効成分と、適切な粉末希釈剤、たとえばラクトースと、任意選択の界面活性剤とからなる粉末混成物のいずれかである。有効成分は典型的には、製剤の０．１〜１００（ｗ／ｗ）である。第２の説明的なエアロゾル発生器は、定量吸入器からなる。定量吸入器は、典型的には液化推進剤中に有効成分の懸濁物または溶液製剤を含む加圧エアロゾルディスペンサである。使用中にはこれらの装置は、定体積を送達するようにしたバルブを介して製剤を放出し、有効成分を含んだ微細粒状スプレーを発生する。適切な推進剤としては、ある種のクロロフルオロカーボン化合物、たとえば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、およびその混合物が挙げられる。製剤は、さらに、１つ以上の共溶媒、たとえば、エタノール、乳化剤および他の製剤界面活性剤、たとえばオレイン酸または三オレイン酸ソルビタン、抗酸化剤および適切な着香剤を含んでいてもよい。肺送達のための他の方法は、たとえば、米国特許出願番号第２００４００３７７８０号、および米国特許第６，５９２，９０４号、同第６，５８２
，７２８号、同第６，５６５，８８５号に記載されている。
【００８６】
一実施形態において、本発明の核酸分子は、中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）に投与される。実験から、ニューロンによる核酸の有効なｉｎ  ｖｉｖｏでの取り込みが証明された。神経細胞への核酸の局所投与の例として、ソマー（Ｓｏｍｍｅｒ）ら、１９９８、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，８，７５は、ｃ−ｆｏｓに対する１５量体のホスホロチオエートアンチセンス核酸分子を、脳へのマイクロインジェクションによりラットに投与する研究について述べている。テトラメチルローダミン−イソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識されたアンチセンス分子は、注入後３０分の間に専らニューロンによって取り込まれた。広範な細胞質染色および核染色がこれらの細胞において見られた。神経細胞への核酸の全身投与の例としては、エパ（Ｅｐａ）ら、２０００、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，１０，４６９は、神経系に分化したＰＣ１２細胞においてｐ７５ニューロトロピン受容体を標的とするためにβ−シクロデキストリン−アダマンタン−オリゴヌクレオチド複合体を使用した、マウスでのｉｎ  ｖｉｖｏ研究について述べている。２週間にわたる腹腔内投与に続いて、ｐ７５ニューロトロピン受容体アンチセンスの顕著な取り込みが、後根神経節（ＤＲＧ）細胞において観察された。さらに、ｐ７５の際だった一貫したダウンレギュレーションが、ＤＲＧニューロンにおいて観察された。核酸の標的をニューロンに定めるためのさらなるアプローチが、ブローダス（Ｂｒｏａｄｄｕｓ）ら、１９９８、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．，８８（４），７３４；カーレ（Ｋａｒｌｅ）ら、１９９７、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍｏｃｏｌ．，３４０（２／３），１５３；バナイ（Ｂａｎｎａｉ）ら、１９９８、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７８４（１，２），３０４；ラジャクマー（Ｒａｊａｋｕｍａｒ）ら、１９９７、Ｓｙｎａｐｓｅ，２６（３），１９９；ウー‐ポン（Ｗｕ−ｐｏｎｇ）ら、１９９９、ＢｉｏＰｈａｒｍ，１２（１），３２；バナイ（Ｂａｎｎａｉ）ら、１９９８、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｐｒｏｔｏｃ，３（１），８３；シマトフ（Ｓｉｍａｎｔｏｖ）ら、１９９６、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，７４（１），３９に記載されている。したがって、本発明の核酸分子は、ＣＮＳおよび／またはＰＮＳにおいて細胞に送達され取り込まれやすい。
【００８７】
ＣＮＳへの本発明の核酸分子の送達は、様々な異なる戦略によって提供される。使用しうるＣＮＳ送達に対する伝統的なアプローチとしては、限定はされないが、髄腔内および脳室内投与、カテーテルおよびポンプの移植、障害または損傷の部位における直接注入または潅流、脳動脈系への注入、または血液−脳関門の化学的または浸透性開口によるものが挙げられる。他のアプローチとしては、たとえば複合体および生分解性ポリマーの使用を介した、様々な輸送システムおよび担体システムの使用が挙げられる。さらに、たとえばカプリット（Ｋａｐｌｉｔｔ）らの米国特許第６，１８０，６１３号およびデビッドソン（Ｄａｖｉｄｓｏｎ）の国際公開公報第０４／０１３２８０号パンフレットに記載されるような遺伝子治療アプローチを用いて、ＣＮＳにおいて核酸分子を発現させることができる。
【００８８】
一実施形態において、本発明の送達系は、たとえば、水性または非水性ゲル、クリーム、多重エマルジョン、ミクロエマルジョン、リポソーム、軟膏、水性および非水性溶液、ローション、エアロゾル、ハイドロカーボン基剤および粉末を含み、また賦形剤、たとえば、可溶化剤、透過促進剤（たとえば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコール、およびアミノ酸）、および親水性ポリマー（たとえば、ポリカルボフィルおよびポリビニルピロリドン）を含んでいてもよい。一実施形態において、薬学的に許容される担体はリポソームまたは経皮増強剤である。本発明において使用しうるリポソームの例は次の通り、すなわち（１）ＣｅｌｌＦｅｃｔｉｎ（Ｒ）、カチオン脂質Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラメチル−Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−−テトラパルミット−ｙ−スペルミンおよ
びジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の１：１．５（Ｍ／Ｍ）リポソーム製剤（ギブコ・ビーアールエル（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ））；（２）Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ  ＧＳＶ（Ｒ）、カチオン脂質およびＤＯＰＥの２：１（Ｍ／Ｍ）リポソーム製剤（グレン・リサーチ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ））；（３）ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート）（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ））；および（４）Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＴＭ）、ポリカチオン脂質ＤＯＳＰＡおよび中性脂質ＤＯＰＥの３：１（Ｍ／Ｍ）リポソーム製剤（ギブコ・ビーアールエル）。
【００８９】
一実施形態において、本発明の送達系は、パッチ剤、錠剤、坐剤、腟坐薬、ゲル剤、およびクリーム剤を含み、可溶化剤および増強剤などの賦形剤（たとえば、ポリエチレングリコール、胆汁酸塩およびアミノ酸）、および他のビヒクル（たとえば、ポリエチレングリコール、脂肪酸エステルおよび誘導体、および親水性ポリマー、たとえばヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびヒアルロン酸）を含有していてもよい。
【００９０】
一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド剤は、ポリエチレンイミン（たとえば、直鎖または分枝状ＰＥＩ）および／またはポリエチレンイミン誘導体、たとえばガラクトースＰＥＩ、コレステロールＰＥＩ，抗体誘導化ＰＥＩ、およびそれらのポリエチレングリコールＰＥＩ（ＰＥＧ−ＰＥＩ）誘導体などのグラフトＰＥＩとともに製剤または複合体形成される（たとえば、参照により本願に組み込む以下の文献、すなわちオグリス（Ｏｇｒｉｓ）ら，２００１，ＡＡＰＡ  ＰｈａｒｍＳｃｉ，３，１〜１１；ファーガソン（Ｆｕｒｇｅｓｏｎ）ら，２００３，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１４，８４０〜８４７；クナス（Ｋｕｎａｔｈ）ら，２００２，Ｐｈｒａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９，８１０〜８１７；チョイ（Ｃｈｏｉ）ら，２００１，Ｂｕｌｌ．Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，２２，４６〜５２；ベッティンガー（Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ）ら，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１０，５５８〜５６１；ピーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）ら，２００２，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１３，８４５〜８５４；エルバシャー（Ｅｒｂａｃｈｅｒ）ら，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔ，１，１〜１８；ゴドベイ（Ｇｏｄｂｅｙ）ら，１９９９．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９６，５１７７〜５１８１；ゴドベイ（Ｇｏｄｂｅｙ）ら，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，６０，１４９〜１６０；ディーボルド（Ｄｉｅｂｏｌｄ）ら，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４，１９０８７〜１９０９４；トマス（Ｔｈｏｍａｓ）およびクリバノフ（Ｋｌｉｂａｎｏｖ），２００２，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９９，１４６４０〜１４６４５；およびサガラ（Ｓａｇａｒａ），米国特許第６，５８６，５２４号を参照のこと）。
【００９１】
したがって、本発明は、記載の化合物の薬学的に許容される製剤をも含む。これらの製剤は、上記化合物の塩、たとえば酸付加塩、たとえば、塩酸、シュウ酸、酢酸およびベンゼンスルホン酸の塩を含む。
【００９２】
本発明は、ポリ（エチレングリコール）脂質を含む表面修飾リポソーム（ＰＥＧ修飾、または長期循環リポソームまたはステルスリポソーム）を含む組成物も特徴とする。これらの製剤は、標的組織における薬物の蓄積を増加させるための方法も提供する。この部類の薬物担体は、オプソニン化および単核性食細胞系（ＭＰＳまたはＲＥＳ）による排除に耐えることにより、より長い血液循環時間を可能にするとともに、カプセルに封入された薬物に対する組織の曝露を増強する（ラシック（Ｌａｓｉｃ）ら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９５，９５，２６０１〜２６２７；イシワタ（Ｉｓｈｉｗａｔａ）ら，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９５，４３，１００５〜１０１１）。このようなリポソームは、おそらくは血管新生が生じた標的組織における遊出と取り込みにより、腫瘍内に選択的に
蓄積することが示されている（ラシック（Ｌａｓｉｃ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５，２６７，１２７５〜１２７６；オク（Ｏｋｕ）ら，１９９５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２３８，８６〜９０）。長期間循環リポソームは、特にＭＰＳの組織内に蓄積することが知られている従来のカチオン性リポソームと比べて、ＤＮＡおよびＲＮＡの薬物動態および薬力学を増強する。（リウ（Ｌｉｕ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，４２，２４８６４〜２４８７０；チョイ（Ｃｈｏｉ）ら，国際公開公報第９６／１０３９１号パンフレット；アンセル（Ａｎｓｅｌｌ）ら，国際公開公報第９６／１０３９０号パンフレット；ホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）ら，国際公開公報第９６／１０３９２号パンフレット）。長期間循環リポソームは、代謝的に活発なＭＰＳ組織、たとえば肝臓や脾臓などにおける蓄積を回避できることから、カチオン性リポソームに比べて、薬物をヌクレアーゼ分解から大きく保護するようである。
【００９３】
ＩＦＮ産生を介した免疫応答の調節方法
本発明は、さらに、脊椎動物における免疫応答を調節するための方法を提供する。本方法は、脊椎動物に、本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを投与する工程を含む。
【００９４】
本明細書において、用語「脊椎動物」には、限定はされないが、魚類、鳥類、または哺乳類が含まれる。本明細書において、「哺乳類」には、限定はされないが、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、乳牛、ブタ、ウサギ、ヒト以外の霊長類、およびヒトが含まれる。
【００９５】
明細書において、「免疫応答を調節する」とは、Ｂ細胞誘導、Ｔ細胞誘導、サイトカイン誘導、ナチュラルキラー細胞誘導、特異的細胞表面マーカー発現、ケモカイン誘導および、たとえば樹状細胞、単球およびマクロファージなどの抗原提示細胞の活性化のうちの一つ以上の増大または活性化を引き起こすことを意味する。とりわけ、このような免疫応答には、ＰＤＣなどのＴＬＲ７タンパク質を発現する細胞におけるＩＦＮの産生を伴う。
【００９６】
本発明は、ＩＦＮ産生を誘導することによって改善可能な疾患を有した脊椎動物の治療方法も提供する。本発明の本実施形態による方法は、脊椎動物に本発明のオリゴヌクレオチド剤、たとえば、配列番号：１で構成されるか、本質的に該配列で構成されるか、または該配列を含む剤を投与することを含む。そのような用途において、本発明のオリゴヌクレオチド剤は、脊椎動物におけるＩＦＮ産生を刺激して、その状態を直接治療するか、他の治療を増強するために用いられる。ＩＦＮ産生の選択的活性化が望まれる場合には、よく認知された臨床設定が存在する。
【００９７】
別の実施形態において、本発明は、疾患または疾病を有する患者を治療的に処置する方法も提供し、該方法は、患者に、本発明による免疫調節性オリゴヌクレオチド、免疫調節性オリゴヌクレオチド複合体、オリゴヌクレオチド剤またはオリゴヌクレオチド剤複合体を投与することを含む。様々な実施形態において、治療される疾患または疾病は、がん、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、アレルギー、ぜんそく、または病原体によって引き起こされる疾病である。病原体としては、細菌、寄生虫、真菌、ウィルス、ウィロイド、およびプリオンが挙げられる。投与は本明細書中に別途記載してあるようにして実施する。
【００９８】
本明細書において、「アレルギー」という用語には、限定はされないが、食品アレルギーと呼吸器系アレルギーとが含まれる。「気道炎症」という用語には、限定はされないが、ぜんそくが含まれる。
【００９９】
本明細書において、「自己免疫疾患」という用語は、「自己」のタンパク質が免疫系によって攻撃を受ける疾患のことをいう。このような用語には、自己免疫ぜんそくが含まれ
る。
【０１００】
本発明のいずれの方法においても、免疫調節性オリゴヌクレオチド、免疫調節性オリゴヌクレオチド複合体、オリゴヌクレオチド剤またはオリゴヌクレオチド剤複合体は、疾病または状態を治療するために有用な、該オリゴヌクレオチド剤の免疫刺激効果を減退させることのない他の任意の剤と組み合わせて投与してもよい。たとえば、がんの治療において、免疫調節性オリゴヌクレオチド、免疫調節性オリゴヌクレオチド複合体、オリゴヌクレオチド剤またはオリゴヌクレオチド剤複合体は、化学治療化合物と組み合わせて投与してもよいものとする。
【０１０１】
細胞の増殖性疾患および／または分化不全の例としては、がん、たとえば、癌腫、肉腫、転移性疾患、または造血系新生物疾患、たとえば白血病などが挙げられる。転移性腫瘍は、限定はされないが、前立腺、結腸、肺、乳房および肝臓を起源とするものを含む多数の原発性腫瘍から発生しうる。本明細書において、「がん」「過剰増殖性」および「新生物の」という用語は、自律的に増殖する能力を有する細胞のことをいい、すなわち、急速に増殖する細胞増殖によって特徴づけられる異常な状況または状態のことをいう。これらの用語は、組織病理学上のタイプまたは侵襲性のステージに関係なく、あらゆるタイプのがん性増殖または発がんプロセス、転移性組織または悪性形質転換細胞、組織、または器官を含むことを意味する。増殖性疾患は、たとえば、脊髄、リンパ球、または赤血球系統、またはそれらの前駆細胞から発生する、造血系起源の増生／新生細胞を伴う疾患を含む造血系新生物疾患も含む。
【０１０２】
本発明の薬学的組成物は、様々な造血系疾患を治療するために用いることができる。造血系の疾患または疾病の例としては、限定はされないが、自己免疫疾患（たとえば、糖尿病、関節炎（リウマチ性関節炎、若年性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎を含む）、多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡、自己免疫甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹様皮膚炎を含む）、乾癬、シューグレン症候群、クローン病、アフター性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、ぜんそく、アレルギー性ぜんそく、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬物発疹、ハンセン病逆転反応、らい性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳髄膜炎、急性壊死性出血性脳障害、突発性両側性進行性感音難聴、喪失、再生不良性貧血、赤芽球貧血、突発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、突発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、および間質肺線維症）、移植片対宿主病、移植症例、およびアレルギーが挙げられる。
【０１０３】
別の実施形態において、本発明は、限定はされないが、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ），ＨΓＶ−ＡＩＤＳ、ポリオウィルス、および天然痘ウィルスを含むウィルス疾患を治療するための方法に関する。（＋）鎖ＲＮＡウィルスの例としては、限定はされないが、ピコルナウィルス、カリシウィルス、ノダウィルス、コロナウィルス、アルテリウィルス、フラビウィルス、およびトガウィルスが挙げられる。ピコルナウィルスの例としては、エンテロウィルス（ポリオウィルス１）、リノウィルス（ヒトリノウィルス１Ａ）、ヘパトウィルス（Ａ型肝炎ウィルス）、カルディオウィルス（脳心筋炎ウィルス）、アフト・ウィルス属（口蹄疫ウィルスＯ）、およびパレコウィルス（ヒトエコウィルス２２）が挙げられる。カリシウィルスの例としては、ベシクロウィルス（ブタ水疱性発疹ウィルス）、ラゴウィルス（ウサギ出血性疾患ウィルス）、「ノーウォーク様ウィルス」（ノーウォークウィルス）、「サッポロ様ウィルス」（サッポロウィルス）、および、「Ｅ型肝炎様ウィルス」（Ｅ型肝炎ウィルス）が挙げられる。ベータノダウィルス（ストライプジャック（ｓｔｒｉｐｅｄ  ｊａｃｋ）神経壊死ウィルス）が代表的なノダウィルスである。コロナウィルスには、コロナウィルス（鳥類伝染性気管支炎ウィルス
）およびトロウィルス（ベルネウィルス）が含まれる。アルテリウィルス（ウマ動脈炎ウィルス）は、代表的なアルテリウィルスである。トガウィルスには、アルファウィルス（シンドビスウィルス）と、ルビウィルス（ルベラウィルス）が含まれる。最後に、フラビウィルスは、フラビウィルス（黄熱ウィルス）とペストウィルス（ウシ下痢ウィルス）、およびヘパチウィルス（Ｃ型肝炎ウィルス）を含む。ある好ましい実施形態において、ウィルスはヘパチウィルス、Ｃ型肝炎ウィルスである。
【０１０４】
薬学的組成物
一実施形態において、本発明は、前セクションにおいて記載したようなオリゴヌクレオチド剤と、以下に示すような薬学的に許容される担体とを含有する薬学的組成物にも関する。該オリゴヌクレオチド剤を含む薬学的組成物は、ＩＦＮ産生によって改善可能な疾患の治療に有用である。本発明の本形態において、本発明のオリゴヌクレオチド剤は、後述のように調製される。本発明の薬学的組成物は、ＩＦＮ産生を誘導するのに十分な用量で投与される。薬学的組成物はｉＲＮＡ剤からなり、用量は、標的遺伝子の発現または活性を阻害するのに十分な量である。本発明のオリゴヌクレオチド剤を含有する組成物は、驚くほど低用量での投与が可能である。ＩＦＮ産生を誘導するには、また応用できる場合には、標的遺伝子の発現または活性を阻害または完全に抑制するためには、一日あたり体重１ｋｇにつき５ｍｇの最大用量のオリゴヌクレオチド剤で十分である。
【０１０５】
治療用途のための許容される担体または希釈剤は、製薬分野においてはよく知られており、たとえば、参照により本願に組み入れる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９８５）に記載されている。たとえば、防腐剤、安定剤、染料および着香料が提供されてもよい。これらには、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。さらに、抗酸化剤および懸濁化剤を用いてもよい。
【０１０６】
一般に、オリゴヌクレオチド剤の適切な用量は、１日につき受容者の体重１ｋｇあたり０．００１〜５００ミリグラムの範囲（たとえば、１ｋｇあたり約１μｇから１ｋｇあたり約５００ｍｇ、１ｋｇあたり約１００μｇから１ｋｇあたり約１００ｍｇ、１ｋｇあたり約１ｍｇから１ｋｇあたり約７５ｍｇ、１ｋｇあたり約１０μｇから１ｋｇあたり約５０ｍｇ、または１ｋｇあたり約１μｇから１ｋｇあたり約５０μｇ）である。薬学的組成物は、１日につき１回投与してもよいし、オリゴヌクレオチド剤は、１日のあいだに２回、３回、４回、５回、６回またはそれ以上の回数に分けて適当な間隔で投与してもよい。その場合、各分回用量に含まれるオリゴヌクレオチド剤は、１日の総用量を達成するために対応して少なくなるはずである。用量単位は、数日間の期間にわたってオリゴヌクレオチド剤を徐放させる従来の徐放製剤を例えば用いて、数日間にわたって送達するように構成することもできる。徐放製剤は、当該技術分野において周知である。この実施形態において、用量単位は、１日用量の相応の複数倍を含んでいる。
【０１０７】
当業者であれば、ある特定の要因が対象を有効に治療するのに必要な用量およびタイミングに影響を与えうること、該要因は例えば、限定はされないが、感染または疾病の重症度、以前の治療、対象の全体的な健康および／または年齢、および他の疾病の存在などであることを認識しているであろう。さらに、治療上有効な量の組成物による対象の治療は、１回の治療であっても、一連の複数回の治療であってもよい。本発明によって含意される個々のオリゴヌクレオチド剤についての有効用量およびｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の評価は、従来の方法論を用いて、または本明細書中に別途記載する適切な動物モデルを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ試験に基づいて行うことができる。
【０１０８】
本発明によって含意される薬学的組成物は、限定はされないが、経口または非経口経路
、例えば静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、眼内、直腸内、膣内および局所（例えば口腔内および舌下）投与を含む、当該技術分野において知られる任意の手段によって投与することができる。好ましい実施形態において、薬学的組成物は、静脈内または腹腔内注入または注射によって投与される。薬学的組成物は、実質内、髄腔内投与してもよいし、および／または定位注射によって投与してもよい。
【０１０９】
経口投与については、本発明において有用なオリゴヌクレオチド剤は、一般的に錠剤またはカプセル剤の形態で、粉末または顆粒として、または水性溶液または懸濁液として提供される。経口使用のためのカプセルは、有効成分が固体希釈剤と混合される硬ゼラチンカプセルと、有効成分が水または油、例えばピーナツ油、流動パラフィンまたはオリーブ油などと混合される軟ゼラチンカプセルとを含む。
【０１１０】
筋肉内、腹腔内、皮下、および静脈内使用に対しては、本発明の薬学的組成物は、一般的に、適当なｐＨおよび等張性に緩衝された無菌の水性溶液または懸濁液として提供される。適切な水性ビヒクルには、リンガー（Ｒｉｎｇｅｒ）溶液および等張塩化ナトリウムが含まれる。ある好ましい実施形態において、担体は専ら水性バッファのみからなる。本文中において「専ら〜のみ」とは、標的遺伝子またはウィルスを有する細胞中のオリゴヌクレオチド剤の取り込みに影響を与えるか、これを媒介する可能性のある補助剤またはカプセル化物質が全く存在しないことを意味する。このような物質としては、たとえば、ミセル構造、たとえば以下に示すようなリポソームまたはカプシドが挙げられる。オリゴヌクレオチド剤を細胞培養物内に導入するには、マイクロインジェクション、リポフェクション、ウィルス、ウィロイド、カプシド、カプソイド、または他の補助剤が必要であるが、驚くべきことに、これらの方法および物質はｉｎ  ｖｉｖｏにおけるオリゴヌクレオチド剤の取り込みには必要とされない。本発明のオリゴヌクレオチド剤は、オリゴヌクレオチド剤の細胞内への取り込みを媒介する補助剤の使用を必要としないという点で特に有用であるが、それはこれらの補助剤の多くが毒性であるか、有害な副作用を伴うためである。本発明による水性懸濁剤は、セルロース誘導体、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンおよびトラガカントガム、およびレシチンなどの湿潤剤を含んでいてもよい。水性懸濁液のための適切な防腐剤には、エチルおよびｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートが含まれる。
【０１１１】
本発明の核酸分子は、たとえば薬物の直腸投与のために、坐剤の形態で投与することもできる。これらの組成物は、薬物を、常温では固体であるが直腸温度においては液体となるため直腸内で溶けて薬物を放出する適当な非刺激性賦形剤と混合することによって、調製することができる。このような材料としては、ココアバターおよびポリエチレングリコールが含まれる。
【０１１２】
薬学的組成物は、オリゴヌクレオチド剤を体からの迅速な排除から保護するための、カプセル化製剤、たとえば、移植物およびミクロカプセル化送達系を含む、放出制御製剤を含んでいてもよい。生分解性、生体適合性ポリマー、たとえばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などを用いてもよい。このような製剤の調製方法は、当業者にとっては明白である。材料もアルツァ・コーポレーション（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびノバ・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド（Ｎｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）から市販されているものを入手することができる。リポソーム懸濁液（ウィルス抗原に対するモノクローナル抗体によって感染細胞を標的とするリポソームを含む）もまた、薬学的に許容される担体として使用できる。これらは、たとえば、参照により本願に組み入れる米国特許第４，５２２，８１１号；国際公開公報第９１／０６３０９号パンフレット；および欧州特許公報ＥＰ−Ａ−４３０７５号に記載されるような、当業者に周知の方法によって調製することができる。
【０１１３】
本発明による好ましい薬学的組成物は、ワクチンである。ワクチンは、本発明のオリゴヌクレオチド以外に抗原を含んでいなければならない。この抗原が、ワクチン接種した個体の防御／免疫反応を高める潜在性は、該抗原を本発明のオリゴヌクレオチドと組み合わせることによって、特に該オリゴヌクレオチドの免疫刺激活性により、強力に向上する。
【０１１４】
ワクチンは、種々の異なる抗原を含んでいてもよい。抗原の例としては、不活化されたウィルスまたは細菌、真菌、原虫などの死生物全体、あるいはがん細胞が挙げられる。抗原は、これらの生物／組織、タンパク質、またはそれらの最も単純な形のペプチドの、サブフラクションからなるものであってよい。抗原は、グリコシル化タンパク質またはペプチドの形態で免疫系によって認識されてもよいし、多糖または脂質であるか、多糖または脂質を含むものであってよい。たとえば、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）と複合化した、通常は８〜１１アミノ酸長の短いペプチドの形態の抗原を認識するので、短いペプチドを使用してもよい（ラメンシー（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ）ら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，４１，１７８〜２２８（１９９５））。Ｂ細胞は１５アミノ酸程度からのより長いペプチドを認識する（ハロウ（Ｈａｒｒｏｗ）ら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８））。Ｔ細胞エピトープとは対照的に、Ｂ細胞抗原の三次元構造も、抗体による認識にとって重要であるのかもしれない。持続的な抗原特異的免疫応答を得るために、必要な免疫系のすべての細胞を含む免疫カスケードをトリガーするためには、アジュバントが助けとなる。主としてアジュバントはいわゆる抗原提示細胞（ＡＰＣ）に作用するが、それらの作用様式において制限されていない。抗原提示細胞は通常は、最初に抗原と遭遇してから、免疫エフェクタに対してプロセシング済みまたは非修飾の抗原の提示を行う。中間種の細胞が関与してもよい。適切な特異性を有したエフェクタ細胞だけが、生産性免疫反応において活性化される。アジュバントもまた局所的に抗原および同時注射された他の因子を保持しうる。さらにアジュバントは他の免疫細胞に対する化学誘引物質として作用することもあるし、免疫系の刺激剤として局所的および／または全身的に作用する場合もある。
【０１１５】
本発明の組成物において用いる抗原はさほど重要でない。好ましくは、ウィルスまたは細菌病原体に由来する、または真菌または寄生虫に由来するタンパク質またはペプチドをこのような抗原（たとえば、誘導体化した抗原またはグリコシル化もしくは脂質化した抗原または多糖または脂質を含む）として用いる。抗原の別の好ましい供給源は、腫瘍抗原である。好ましい病原体は、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、Ａ型およびＢ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）、エプスタインバーウィルス（ＥＢＶ）、インフルエンザウィルス、ロタウィルス、スタフィロコッカス・アウレウス、クラミジア・ニューモニア、クラミジア・トラコマティス、ミコバクテリウム・ツベルクロシス、ストレプトコッカス・ニューモニア、バチルス・アントラシス、ビブリオ・コレラエ、プラスモディウム属生物種（プラズモディウム・ファルシパルム、プラズモディウム・ヴィバックスなど）、アスペルギルス属生物種またはカンジダ・アルビカンスより選択される。抗原は、がん細胞によって発現される分子（腫瘍抗原）であってもよい。誘導体化のプロセスは、病原体／がん細胞から特定のタンパク質を精製すること、病原体の不活化、ならびにそのようなタンパク質の化学的誘導体化または安定化を含みうる。同様に、腫瘍抗原（がんワクチン）または自己免疫抗原を本発明による薬学的組成物において用いてもよい。そのような組成物を用いて、腫瘍ワクチン接種または自己免疫疾患に対する治療を行うことができる。
【０１１６】
ペプチド抗原の場合、ペプチドミミトープ／アゴニスト／スーパーアゴニスト／アンタゴニストまたは免疫学的特性に影響を与えることなくある部位が変更されたペプチド、または非ペプチドミミトープ／アゴニスト／スーパーアゴニスト／アンタゴニスト（総説と
してスパルビア（Ｓｐａｒｂｉｅｒ）およびバルデン（Ｗａｌｄｅｎ），Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１１，２１４〜２１８（１９９９））の使用が本発明に含まれる。ペプチド抗原は、該ペプチド抗原のカルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかに、ポリカチオン性化合物または免疫刺激性化合物との相互作用を容易にする延長部を有していてもよい。自己免疫疾患の治療のためには、ペプチドアンタゴニストを適用してもよい。抗原提示と、抗原提示細胞への抗原の標的化を高める分子を含むように、抗原を誘導体化してもよい。
【０１１７】
オリゴヌクレオチド剤の毒性および治療効力は、例えばＬＤ５０（集団の５０％致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって判定することができる。毒性と治療効果との間の用量比が治療指標であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０で表すことができる。高い治療指標を示すオリゴヌクレオチド剤が好ましい。
【０１１８】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータを用いて、ヒトにおいて使用する用量の範囲を策定することができる。本発明の組成物の用量は、好ましくは、毒性が殆どまたは全く無いＥＤ５０を含む血中濃度の範囲にある。用量は、採用する剤形および利用する投与経路に応じてこの範囲内で変えることができる。本発明の方法において用いられる任意のオリゴヌクレオチド剤において、治療上有効な用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。用量を、細胞培養において決定されるＩＣ５０（すなわち、兆候の最大阻害の半分の阻害を達成する試験オリゴヌクレオチド剤の濃度）を含む、オリゴヌクレオチド剤またはＩＦＮの循環血漿中濃度を達成するように、または必要に応じてｉＲＮＡ剤の標的配列のポリペプチド生成物の循環血漿中濃度を達成するように（たとえば、ポリペプチド濃度の減少を達成）、動物モデルにおいて策定してもよい。このような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中の濃度は、たとえば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【０１１９】
上述のように個別または複数として投与することに加えて、本発明に関するオリゴヌクレオチド剤は、ウィルス感染および疾患を治療するのに有効な他の既知の剤と組み合わせて投与することもできる。いずれの場合も、投与を行う医師は、当該技術分野において周知であるかまたは本明細書に記載するような、標準的な有効性の尺度を用いて観察された結果に基づいて、オリゴヌクレオチド剤投与の量とタイミングを調整することができる。
【０１２０】
本発明の数々の実施形態について記載してきた。しかしながら、本発明の精神と範囲から逸脱しない限りにおいて様々な変更を行ってよいことが理解できるであろう。他の実施形態は特許請求の範囲に記載されている。
【実施例１】
【０１２１】
プラズマサイトイド樹状細胞の単離
ＰＢＭＣは、健康な個体の全血液からフィコール・ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）密度勾配遠心分離（ドイツ連邦共和国ベルリン所在のバイオクロム（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ））により得た。ＰＤＣは、ミルテニル・バイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）製のＢＤＣＡ−４樹状細胞単離キットを用いてＭＡＣＳによって単離した。すなわち、ＰＤＣを、コロイド状常磁性マイクロビーズを連結した抗ＢＤＣＡ−４抗体で標識し、磁気分離カラム（ＬＳカラム；ミルテニル・バイオテク）に１回通した。単離したＰＤＣ（ｌｉｎｅａｇｅ陰性、ＭＨＣ−ＩＩ陽性，およびＣＤ１２３陽性細胞）の純度は、７５％〜１００％であった。混入細胞は主としてＴ細胞であった。トリパンブルー排除法で判定した生存率は、９５％を超えていた。
【０１２２】
細胞培養
単離したＰＤＣを９６ウェル平底プレート中にて、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３（ドイツ連邦共和国ヴィースバーデン所在のＲ＆Ｄシステムズ）を添加した１５０μＬのＯＰＴＩＭＥＭ（Ｒ）（ドイツ連邦共和国カールスルーエ所在のインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ））中、５×１０４細胞の濃度で培養した。Ｃ末端黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）タグを有したヒトＴＬＲ９遺伝子を含む構築物で安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞は、ディ．ゴレンボック氏（Ｄ．Ｇｏｌｅｎｂｏｃｋ）（米国マサチューセッツ州ワーチェスター（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ））の好意により提供されたものである。ＨＥＫ２９３細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（米国メリーランド州ウォーカーズビル（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）所在のバイオウィッテイカー（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ））、１．５ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（すべてドイツ連邦共和国ミュンヘン所在のシグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）より入手）を添加したＲＰＭＩ１６４０培養培地（バイオクロム）中で培養した。ＥＢＶ陰性のバーキットリンパ腫細胞株ＢＬ４１は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（バイオクロム）、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍｇ／ｍＬ  ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１％の１ｍＭピルベート（すべてオーストリア国リンツ所在のＰＡＡより入手）を添加したＲＰＭＩ１６４０（ＰＡＡ）中で増殖させた。細胞は３７℃および５％ＣＯ２においてインキュベートした。
【０１２３】
Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏでの細胞の刺激、トランスフェクションおよびエレクトロポーレション
ＣｐＧ  ＯＤＮは、コリー・ファーマシューティカル・グループ（Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ）（米国マサチューセッツ州ウェルスレイ（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ））から供給されたものである（下線を付けた文字：該塩基の３’ホスホロチオエート結合；太字：ＣｐＧジヌクレオチド）：
【０１２４】
【化１】
2008523094.tif 000003
Ｒ８４８はインビボゲン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）（フランス国トゥールーズ所在）より購入した。Ｒ８４８およびＯＤＮ２２１６は、それぞれ最終濃度５００ｎｇ／ｍＬおよび３μｇ／ｍＬで添加した。ｓｉＲＮＡ配列（表１を参照）はダーマコン（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）（米国コロラド州ラファイエット所在）によって合成およびアニールされたものである。ｓｉＲＮＡをリポフェクタミン２０００（ドイツ連邦共和国カールスルーエ所在のインビトロジェン）を用いてトランスフェクトした。特に示さない限り、２００ｎｇの核酸を２５μＬのＯＰＴＩＭＥＭ（Ｒ）と混合した。別のチューブにおいて、０．５μＬのリポフェクタミンを２５μＬのＯＰＴＩＭＥＭに加え、室温で５分間インキュベートした。複合体形成のために、両溶液を混合し、室温でさらに２０分間インキュベートし、９６ウェルプレートにおいて細胞（１００μＬ）に加えた（最終容量１５０μＬ）。トランスフェクション溶液中の細胞はさらなる洗浄を行うことなく、３７℃でインキュベートした。
【０１２５】
エレクトロポーレションのために、２５０，０００ＰＤＣを、ｓｉＲＮＡ（２．５μｇ／ｍＬ）含有または非含有の４００μＬの「等浸透圧エレクトロポーレション−バッファ」（ドイツ連邦共和国ハンブルク所在のエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ））に再懸濁し、１００Ｖで５０μ秒間の１回のパルスを行った（Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ（Ｒ）、エッペンドルフ）。５分後、８００μＬの完全培地を加え、細胞を２４ウェルの平底ウ
ェルでさらに３６時間インキュベートした。
【０１２６】
マウス実験
ｉｎ  ｖｉｖｏ刺激については、１２９Ｐ２／ＯｌａＨｓｄマウスまたは１２９Ｓｖマウスを麻酔して、１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）複合体形成（３０μＬのＤＯＴＡＰ（ベーリンガー・マンハイム）を１７０μＬのＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）中の５μｇの核酸と混合した）を事前に行った、または行っていない、５μｇのＣｐＧ  ＯＤＮ１８２６またはｓｉＲＮＡ  ＴＬＲ９．２を含む２００μＬを後眼窩静脈に静脈注射した。対照のマウスにはＨＢＳ単独（対照）またはＨＢＳおよびＤＯＴＡＰ（ＤＯＴＡＰ）のいずれかを与えた。全血液試料は、注射から７時間、１８時間、または２４時間のいずれかにおいて、テールクリッピングによって得た。血清は３７℃で３０分間凝固させてから遠心分離することによって全血液より調製した。
【０１２７】
サイトカインの検出
ＩＦＮ−α全体は１４の異なる異性体からなるので、ＥＬＩＳＡによって測定されるＩＦＮ−αの量は、これらの異性体の検出に用いた抗体の特異性に依存し、従ってＥＬＩＳＡが異なれば同一でなくなる。この実験には、ベンダー・メドシステムズ（Ｂｅｎｄｅｒ
ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ（オーストリア国グラーツ（Ｇｒａｚ）所在）のＩＦＮ−αキット（検出範囲８〜５００ｐｇ／ｍＬ）を使用した。このＥＬＩＳＡは、ＩＦＮ−α異性体の殆どを検出するが、ＩＦＮ−ＢおよびＩＦＮ−Ｆは検出しない。ヒトＴＮＦ−αＥＬＩＳＡ（検出範囲８〜５００ｐｇ／ｍＬ）およびヒトＩＬ−６ＥＬＩＳＡ（検出範囲５〜３００ｐｇ／ｍＬ）は、ビーディー・ファルミンゲン（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（ドイツ連邦共和国ハイデルベルク所在））から得た。マウスＩＦＮ−αは、ピービーエル・バイオメディカル・ラボラトリーズ（ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国ピスカタウェイ所在））製のマウスＩＦＮ−αＥＬＩＳＡキットを用いて判定した。すべてのＥＬＩＳＡ手順は、製造業者の推奨に従って行った。
【０１２８】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーデータは、２つのレーザ（波長４８８ｎｍおよび６３５ｎｍで励起）を備えたビーディー・バイオサイエンシズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（ドイツ連邦共和国ハイデルベルク所在））のＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）で得た。概して、細胞は示した特定の抗体および適当なアイソタイプ対照を用いて、４℃で２０分間染色した。ヒトＰＤＣは、抗ＣＤ１２３ＰＥおよび抗ＭＨＣＩＩＰｅｒＣＰによるポジティブ染色、および抗ｌｉｎｅａｇｅＦＩＴＣによるネガティブ染色によって同定した。共刺激分子の発現は、抗ＣＤ８６ＡＰＣを用いて判定した（すべてビーディー・ファルミンゲン）。ＰＤＣの生き残りについては、刺激から３６時間後に細胞を回収し、吸引体積５０μＬあたりの生きている細胞の絶対数をフローサイトメトリーによって判定した。ＰＤＣの生存率は、ＴＯ−ＰＲＯ−３ヨウ素（米国オレゴン州ユージーン所在のモレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））に対してネガティブの染色、および形態学に基づくライブゲート（ｌｉｖｅ  ｇａｔｅ）によって判定した。マウスＭＤＣの表現型（ＣＤ１１ｃ＋＋，ＣＤ１１ｂ＋＋およびＢ２２０−）およびＰＤＣの表現型（ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１１ｂ−およびＢ２２０＋＋）の解析のために、新鮮な単離脾臓細胞を抗ＣＤ８６ＦＩＴＣ、抗ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０ＰＥ、抗ＣＤ１１ｂＰｅｒＣＰおよび抗ＣＤ１１ｃＡＰＣ（すべてビーディー・ファルミンゲン）で染色した。脾臓ＮＫ細胞およびＴ細胞の活性化は、抗ｐａｎ−ＮＫ  ＦＩＴＣ陽性細胞（ＮＫ細胞）および抗ＣＤ３ＡＰＣ陽性細胞（Ｔ細胞）上で抗ＣＤ６９ＰＥによって判定した（すべてビーディー・ファルミンゲン）。データは、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（商標）（ビーディー・バイオサイエンシズ）またはＦｌｏｗＪｏ（Ｒ）ソフトウェア（バージョン２．５．１；米国カリフォルニア州スタンフォード所在のツリー・スター（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ））を用いて解析した。
【０１２９】
ウェスタンブロット分析
細胞はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で１回洗浄し、計数し、ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）サンプルバッファ（１０６細胞／５０μＬ）中への再懸濁と１０秒間の超音波処理により溶菌した。この試料をＳＤＳポリアクリルアミドゲル（１０％）上で分離し、ニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ−ＥＣＬ（商標）、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））上に写し取った。写し取りに続いて、膜をポンソーレッド中で染色し、等量のタンパク質がロードされていたことを確認した。次に、膜をＴＢＳＴ（トリス１０ｍＭ，ｐＨ８．０，ＮａＣｌ  ３０ｍＭ，０．１％Ｔｗｅｅｎ）中で５分間洗浄し、ＴＢＳＴ−ＭＬＫ（５％乾燥スキムミルクを添加したＴＢＳＴ）中で３０分間インキュベートした。水で２回リンスした後、ＴＢＳＴ−ＭＬＫ中の特異抗体（１：１０００）を加え４℃で１時間または一晩処理した。水で２回リンスし、ＴＢＳＴによる５分間の洗浄を３回行った後、セイヨウワサビペルオキシダーゼと複合化された二次抗体（ＴＢＳ−ＭＬＫ中１：３０００）を加えて１．５時間処理し、水で３回リンスし、ＴＢＳＴ中で５分間の洗浄を３回行い、水で５回リンスした。バンドは、ＥＣＬフィルム（アマシャム）上で、供給業者の方法（アマシャム）に従った強化化学発光によって可視化した。以下のタンパク質に対する抗体：ホスホ（チロシン７０１）−ＳＴＡＴｌ（米国マサチューセッツ州ビバリー所在のニューイングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ−Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））およびホスホ（チロシン６８９）−ＳＴＡＴ２（米国マサチューセッツ州ウォルサム所在のアップステート（Ｕｐｓｔａｔｅ））を用いた。
【０１３０】
統計学的解析
データは、平均±ＳＥＭとして表す。差の統計学的有意性は、対応のある両側スチューデントｔ検定によって判定した。差は、ｐ＜０．０５である場合に統計学的に有意であるとみなした。統計学的解析は、ＳｔａｔＶｉｅｗ（Ｒ）４．５１ソフトウェア（米国カリフォルニア州カラバサス所在のアバカス・コンセプツ・インコーポレイテッド（Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  Ｉｎｃ．））を用いて行った。
【０１３１】
特異的ｓｉＲＮＡによって媒介されるＨＥＫ２９３細胞におけるＴＬＲ９発現の阻害
プラズマサイトイド樹状細胞（ＰＤＣ）は、ＣｐＧモチーフの重要なセンサとして同定されてきた。ｓｉＲＮＡを用いてＰＤＣにおけるＴＬＲ９を選択的に阻害することにより、ウィルスおよび種々のＣｐＧモチーフ含有オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）の認識におけるＴＬＲ９の関与について解析することが可能となる。本発明者らは、Ｃ末端黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）タグを有したヒトＴＬＲ９遺伝子を含む構築物で安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞株における、ｓｉＲＮＡ媒介性のＴＬＲ９のダウンレギュレーションを確立した。ヒトＴＬＲ９ｍＲＮＡを標的とする４つのｓｉＲＮＡ分子（ＴＬＲ９．１，ＴＬＲ９．２，ＴＬＲ９．３，ＴＬＲ９．４）を設計した（表１）。標準ＢＬＡＳＴ検索によって、これらのｓｉＲＮＡ標的配列が、他のヒト遺伝子といかなる相同性も有しないことを確認した。ヒトＴＬＲ２ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを陰性対照として用いて、ＴＬＲ９構築物のＣ末端ＹＦＰタグを標的とする以前に確立されたｓｉＲＮＡを阻害の陽性対照として用いた（表１を参照）。接着性のＨＥＫ２９３細胞を、９６ウェルプレート中でリポフェクタミンを用いて２００ｎｇのｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。２０時間、３０時間、および５４時間後、ＨＥＫ２９３細胞をハーベストし、フローサイトメトリーによってＹＦＰ蛍光強度を定量することによりＴＬＲ９の発現を評定した。分析した３つの時点のすべてにおいて、調べた４つのＴＬＲ９特異的ｓｉＲＮＡのうちの２つ（ＴＬＲ９．２およびＴＬＲ９．３）が、阻害の陽性対照として用いた抗ＹＦＰｓｉＲＮＡと同範囲の、強力なＴＬＲ９−ＹＦＰ融合タンパク質発現の阻害を示した（２０時間後のＴＬＲ９発現を図１Ａに示す；３０時間後：ＴＬＲ２．１：１５１±１０；ＴＬＲ９．１：７１±１０；ＴＬＲ９．２：４３±２；ＴＬＲ９．３：４８±２；ＴＬＲ９．４：１１９±５；ＧＦＰ：３７±３；５４時間後：ＴＬＲ２．１：１
６７±８，ＴＬＲ９．１：６５±４；ＴＬＲ９．２：３２±１；ＴＬＲ９．３：３４±２；ＴＬＲ９．４：１１０±７；ＧＦＰ：２４±１）。
【０１３２】
ＨＥＫ２９３細胞中の標的遺伝子のダウンレギュレーションが、標的特異的ではないＩ型ＩＦＮの誘導に関係している可能性を除外するために、ＨＥＫ２９３細胞の上清について、Ｉ型ＩＦＮ活性を分析した。ＢＬ４１細胞におけるＳＴＡＴｌおよびＳＴＡＴ２リン酸化の誘導を、Ｉ型ＩＦＮの高感度の尺度として用いた。４つの異なる抗ＴＬＲ９ｓｉＲＮＡであるＴＬＲ９．１、ＴＬＲ９．２、ＴＬＲ９．３、ＴＬＲ９．４でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の上清には、Ｉ型ＩＦＮ活性は全く検出されなかった（図１Ｂ）。予想どおり、リポフェクタミンと複合化した５００塩基対の長さの二本鎖ＲＮＡ（リポフェクタミンは含まない）は、陽性対照の組換えＩＦＮ−βを用いた場合と同様のＳＴＡＴｌおよびＳＴＡＴ２リン酸化活性を誘導した（図１Ｂ）。これらの結果は、２つの抗ＴＬＲ９ｓｉＲＮＡ、ＴＬＲ９．２およびＴＬＲ９．３が、ＨＥＫ２９３細胞におけるＴＬＲ９発現の特異的ダウンレギュレーションを可能にすること、およびこの細胞株において、ｓｉＲＮＡによるトランスフェクションが標的非特異的な効果としてＩ型ＩＦＮを誘導するのではないことを実証した。
【０１３３】
プラズマサイトイド樹状細胞におけるｓｉＲＮＡによるＩＦＮ−αの配列依存性の強力な誘導
次に、ＨＥＫ２９３細胞におけるＴＬＲ９発現を阻害した抗ＴＬＲ９ｓｉＲＮＡが、ＴＬＲ９リガンドによる刺激に対してＰＤＳを脱感作するかどうかを調べた。ＰＤＣは、ヒト免疫系におけるＩ型ＩＦＮの主な生産者であるので、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡをＰＤＣにおける選択的標的タンパク質阻害に用いると、ＰＤＣにおけるタンパク質阻害は、二本鎖ＲＮＡに媒介される標的非特異的なＩ型ＩＦＮ誘導によって複雑になると考えられる。この可能性を調べるために、ヒト末梢血からのＰＤＣを、いずれも細胞質送達のためにリポフェクタミンと複合化した二本鎖ＲＮＡのプロトタイプ刺激剤であるポリ（Ｉ：Ｃ）、または５００塩基対（ｂｐ）長の二本鎖ＲＮＡ分子のいずれかとともにインキュベートした。ＴＬＲ９リガンドであるＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮ２２１６（クルグ、エイ（（Ｋｒｕｇ，Ａ．）ら  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１，２１５４〜６３（２００１））およびＴＬＲ７リガンドであるＲ８４８を陽性対照とした。陽性対照のＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮ２２１６およびＲ８４８が、活発なＩＦＮ−α応答を示したのに対し、どちらの二本鎖ＲＮＡ分子もＰＤＣにおけるＩＦＮ−αの誘導能を欠いていることがわかった。これらの結果は、二本鎖ＲＮＡが、ＰＤＣにおける標的遺伝子の選択的ノックダウンに有用であることを示唆している。
【０１３４】
驚くべきことに、４つの抗ＴＬＲ９ｓｉＲＮＡの２００ｎｇでのトランスフェクションでは、ＰＤＣにおけるＩＦＮ−α産生の一貫性のあるパターンが誘導された（図２Ａ）。ＴＬＲ９．２およびＴＬＲ９．３は、ＴＬＲ９．１およびＴＬＲ９．４と比べて、ＰＤＣにおいて有意に多いＩＦＮ−α産生を誘導した（図２Ａ）。ＴＬＲ９．１およびＴＬＲ９．４によるインターフェロン誘導の程度の低さ（図２Ａを参照）にＲＮＡの分解が関与していることを除外するために、４つすべての配列の減少量を比較した。２５ｎｇ（１２．５ｎＭ）において、２つの配列ＴＬＲ９．２およびＴＬＲ９．３は、２００ｎｇ（１００ｎＭ）のＴＬＲ９．１より依然として高いレベルのＩＦＮ−αを誘導することから（図２Ｂ）、ＰＤＣにおけるＩＦＮ−αの誘導における４つの抗ＴＬＲ９ｓｉＲＮＡの活性の違いが確認された。ＴＬＲ９．１およびＴＬＲ９．２の異なるＩＦＮ−α誘導活性は、ｓｉＲＮＡがエレクトロポーレションによってＰＤＣのサイトゾルへ送達される際にも観察されたことから、リポフェクタミンとｓｉＲＮＡとの複合体形成はｓｉＲＮＡによるＩＦＮ−α誘導には必要なく、むしろｓｉＲＮＡ分子そのものが有効成分のようであることが示された。Ｂ細胞または骨髄樹状細胞においては、ｓｉＲＮＡによるＩＦＮ−α誘導は全く見られなかった（データ示さず）。
【０１３５】
注目すべきは、調べた４つの抗ＴＬＲ９ｓｉＲＮＡのうち、ＨＥＫ２９３細胞におけるＴＬＲ９発現をダウンレギュレートする最も高い活性を有する２つが、ＰＤＣにおけるＩＦＮ−αを誘導する最も強力な配列でもあったことである（図１Ａと図２Ａを比較）。ありそうもないことではあるが、標的非特異的な免疫刺激効果ではなく、標的特異的効果（ＴＬＲ９の阻害）が、ＰＤＣにおけるＩＦＮ−α誘導に関与しているのかもしれない。この可能性を排除するために、ＰＤＣにおいて発現されるｍＲＮＡ（ＴＬＲ９）、ＰＤＣにおいて発現されないｍＲＮＡ（ＴＬＲ２，ＴＬＲ３，ＴＬＲ４，表１を参照）を標的とするｓｉＲＮＡのパネルを比較した。これらのｓｉＲＮＡがＩＦＮ−αを誘導する効力には有意な違いが見られたが、ＩＦＮ−αの誘導効力と、ＰＤＣ中の標的ｍＲＮＡの有無との間に相関関係は見つからなかった（ＯＤＮ  ２２１６：ｘＡＤＤ  ＶＡＬＵＥ±ＳＥＭ；ＩＦＮ−α誘導の低い順に：ＴＬＲ４．１：４９１±５９；ＴＬＲ９．１：５００±８８；ＴＬＲ９．４：７６０±１３１；ＴＬＲ４．２：１２０８±２６７；ＴＬＲ３．２：１２１９±２０４；ＴＬＲ２．１：１５３５±２３５；ＴＬＲ３．１：２５０３±５５２；ＴＬＲ９．３：３５９２±２８３；ＴＬＲ９．２：４８４５±６２１：ｎ＝６）。調製品質の違いまたは混入物がｓｉＲＮＡのＩＦＮ−α誘導活性の違いに寄与する可能性は、種々の市販供給源のｓｉＲＮＡ配列を用いて同じ結果が得られたことから排除された（データ示さず）。これらのデータは、ｓｉＲＮＡによるＰＤＣにおけるＩＦＮ−αの誘導が配列依存性であり、標的ｍＲＮＡの有無とは関係がないことを示すものである。
【０１３６】
ＩＦＮ−α誘導性ＲＮＡ配列の同定
グアノシンおよびウリジンに富む一本鎖ＲＮＡがＰＤＣにおけるＩＦＮ−αを誘導することが報告されている。グアノシンおよびウリジンモノマーの混合物もまた、免疫刺激活性を示した。したがって、我々の研究におけるｓｉＲＮＡのグアノシンおよびウリジン含量の違いが、ｓｉＲＮＡのＰＤＣにおけるＩＦＮ−α誘導能力の差をもたらしているのではないかとの仮説をたてた。ｓｉＲＮＡは二本鎖であるので、１９量体のｓｉＲＮＡ中のグアノシンおよびウリジンの総含量は、常に１９である。調べたｓｉＲＮＡ内のウリジンの数は、９から１１の範囲であり、ウリジンの数とＩＦＮ−α誘導活性との間には何ら相関関係は無かった（表１を参照）。免疫活性ｓｉＲＮＡは、様々なグアノシンおよびウリジン含量の特異的一本鎖（センスまたはアンチセンス）を含みうる。しかしながら、グアノシンとウリジンの合計数は、活性ｓｉＲＮＡ（ＴＬＲ９．２およびＴＬＲ９．３）の一本鎖において、またより低い活性を有するｓｉＲＮＡ（ＴＬＲ９．１，ＴＬＲ９．４，ＴＬＲ２．１，ＴＬＲ４．１，ＴＬＲ４．２，ＴＬＲ３．１，ＴＬＲ３．２）の一本鎖においても、７〜１２の範囲であり、さらに、グアノシンに対するウリジンの比は、免疫学的活性とは関連がなかった（表１を参照）。したがって、単にグアノシンおよびウリジンの含量ではなく、特定の配列がＴＬＲ９．２およびＴＬＲ９．３の免疫学的活性に関与していると思われる。
【０１３７】
この免疫刺激配列を同定するために、ＴＬＲ９．２の２本の一本鎖（センスおよびアンチセンス）のＩＦＮ−α誘導活性を、二本鎖の活性と比較した。ＴＬＲ９．２のセンス鎖は、二本鎖と比べてＰＤＣにおいてＩＦＮ−αを同等の強さで誘導したが、ＴＬＲ９．２のアンチセンス鎖は、弱い活性しか示さなかった（図２Ｃ、左パネル）。ポリ（Ｕ）またはポリ（Ａ）一本鎖ＲＮＡおよびポリ（Ｕ：Ａ）二本鎖ＲＮＡによるＩＦＮ−α誘導は、ＴＬＲ９．２ｓｉＲＮＡのセンス鎖に比べて低く（ＲＮＡ９．２ｓ：４９６２±７９７；ポリ（Ｕ）：５７４±１６５；ポリ（Ａ）：２４４±１２０；ポリ（Ｕ：Ａ）：１１１±５３；ｎ＝７；ポリ（Ａ）については、図３Ｂの左から二番目のバーも参照のこと）、このことは、ＴＬＲ９．２のセンス鎖がＰＤＣによって認識される特異的免疫刺激モチーフを含んでいるという概念をさらに支持するものである。
【０１３８】
ｓｉＲＮＡは、センスおよびアンチセンス鎖のアニーリングによって生成されるので、
ＴＬＲ９．２ｓｉＲＮＡの免疫刺激活性は、ｓｉＲＮＡ調製物中の非結合のセンス鎖によるものであり、二本鎖によるものではないかもしれない。この可能性を排除するために、ＴＬＲ９．２のセンス鎖と二本鎖を一本鎖ＲＮＡｓｅに曝露した。予想どおり、センス鎖はＲＮＡｓｅ処理によって完全に分解され（図２Ｄ、左パネル）、免疫活性が失われた（図２Ｄ、右パネル）。これに対して、二本鎖は、ＲＮＡｓｅ処理による影響は受けず、ＩＦＮ−αの誘導活性は維持されていた（図２Ｄ）。ｓｉＲＮＡ調製物に混入した一本鎖ＲＮＡの寄与をさらに排除するために、二本鎖領域に完全なＴＬＲ９．２ｓｉＲＮＡの二本鎖が含まれたエネルギー的に安定なヘアピン（ミクロＲＮＡと同様）を形成する一本鎖ＲＮＡを設計した（表２）。このヘアピンは、ＴＬＲ９．２ｓｉＲＮＡ二本鎖と同様にＩＦＮ−αを誘導する活性をもつことが判った（図２Ｅ）。これらのデータは、ｓｉＲＮＡの免疫刺激活性が、ｓｉＲＮＡ調製物中の一本鎖混入物を除去することでは防げないこと、また免疫刺激がヘアピン型ＲＮＡの干渉（すなわちミクロＲＮＡ）にも関係することを実証するものである。
【０１３９】
ＴＬＲ９．２およびＴＬＲ９．３の配列は、１３塩基の重複を示している（表１を参照）。どちらのｓｉＲＮＡもＰＤＣにおけるＩＦＮ−αの強力な誘導剤であるので、ＩＦＮα誘導に関与する配列モチーフがこのＴＬＲ９．２とＴＬＲ９．３との重複領域に存在するとの仮説をたてた。このように、免疫刺激モチーフの局在化から、ＴＬＲ９．２のセンス鎖の３’末端にある１３塩基に着目した。この仮説は、ＦＩＴＣ分子を３’末端に連結し、５’末端には連結しない場合に、センス鎖の活性が低下したことから支持された（図３Ａ、５’Ｆを３’Ｆと比較のこと）。ポリ（Ａ）には免疫学的活性が欠如していることから（図３Ａ）、モチーフを絞り混むために、ＴＬＲ９．２のセンス鎖内の塩基をＡに置換することができた。ＴＬＲ９．２のセンス鎖の３’末端の１３塩基内に免疫刺激モチーフが局在することと矛盾することなく、３’末端の８塩基を置換すると（Ｒ８Ａ，Ｒは右を表す）、センス鎖の免疫学的活性が無効となり、５’末端の８塩基を置換しても（Ｌ８Ａ，Ｌは左を表す）センス鎖の免疫学的活性は無効とはならなかった（図３Ｂ）。５’末端からＡの数をさらに増加させることにより（Ｌ８ＡからＬ１２Ａ）、部位１１が３’末端のモチーフに必須であることが同定され、ＴＬＲ９．２センス鎖の３’末端の９塩基（５’ＧＵＣＣＵＵＣＡＡ３’，配列番号：１）がＴＬＲ９．２センス鎖の免疫刺激活性に関与していることが示唆される。この９量体配列における塩基の交換数を増加していくと、ＴＬＲ９．２センス鎖の免疫学的活性が徐々に低下し、９量体配列のうちの６塩基を交換した場合に活性は完全に損失した（図３Ｂ；Ｒ８Ａ）。ＩＦＮα誘導に必要なＲＮＡの最小の長さは１９塩基の範囲内にあることが判ったが、これは、前記９量体配列を含む１２量体および１６量体はいずれもはるかに低い活性しか示さなかったためである（図３Ｂ）。一方、１９量体ＲＮＡオリゴヌクレオチド中に９量体配列を２度配置することにより（ＤＲとよぶ）、１つの免疫刺激性９量体配列しか含まないＴＬＲ９．２のセンス鎖（ｎとよぶ、図３Ｂ）と比べて免疫学的活性はさらに増加する。
【０１４０】
ｓｉＲＮＡの免疫刺激活性およびサイレンシング活性についての検討
上記の研究によれば、ＴＬＲ９．２の免疫刺激活性はセンス鎖内に局在し、サイレンシング活性は二本鎖のアンチセンス鎖に局在する。ＴＬＲ９．２の一本鎖ＲＮＡ鎖の両方を適当に修飾して、サイレンシング活性から免疫刺激性を分離しても、またその逆を行うようにしてもよい。ｓｉＲＮＡの標的阻害に関する特性を変更するために、骨格の修飾であるロックト核酸（ＬＮＡ）が用いられてきた。本発明者らは、センス鎖およびアンチセンス鎖のＬＮＡ修飾を用いて、サイレンシングだけでなくｓｉＲＮＡの免疫学的活性をも調節できるかどうかに興味を持った。最初に、ＴＬＲ９．２のセンス鎖の免疫学的活性に対する５’および３’ＬＮＡの影響を調べた（表２を参照）。ＦＩＴＣ分子を５’または３’末端に連結した場合（図３Ａを参照）と矛盾することなく、５’末端ではなく３’末端におけるＬＮＡ修飾により、センス鎖がＩＦＮαを誘導する活性が強く阻害された（図４Ａ）。次に、異なるＬＮＡ修飾を有する（５’末端、３’末端、または５’および３’末
端のＬＮＡ）、またはＬＮＡ修飾を有しないセンスおよびアンチセンス鎖をアニーリングして、全部で１６の異なるＴＬＲ９．２ｓｉＲＮＡ誘導体を作成した。この一連のＴＬＲ９．２二本鎖がＰＤＣにおけるＩＦＮαを誘導する活性について評定した（図４Ｂ，黒色バー）。センス鎖単独の場合（図４Ａ）と同様に、センス鎖の３’末端または３’末端と５’末端の両方にＬＮＡ修飾を有する二本鎖は、ＩＦＮα誘導活性を強く阻害したが、センス鎖の５’末端におけるＬＮＡ修飾では、大きな活性変化は見られなかった（図４Ｂ）。アンチセンス鎖のＬＮＡ修飾は、非修飾センス鎖を含むｓｉＲＮＡの免疫刺激性に影響を与えることはなかった（図４Ｂ）。
【０１４１】
次に、ＴＬＲ９．２ｓｉＲＮＡのサイレンシング活性に対するＬＮＡ修飾の影響を調べた。ＩＦＮα誘導の場合と異なり、センス鎖のＬＮＡ修飾は、ＴＬＲ９．２ｓｉＲＮＡのサイレンシング活性にほとんど影響を及ぼさなかった（図４Ｂ、白抜きバー）。これに対し、アンチセンス鎖のＬＮＡ修飾は、ＴＬＲ９．２ｓｉＲＮＡのサイレンシング活性に強く影響を及ぼした。アンチセンス鎖の３’末端のＬＮＡ修飾は、アンチセンス鎖の５’末端のＬＮＡ修飾よりもサイレンシング活性に与える影響がより小さかった。サイレンシング活性は、３’および５’末端の両方をＬＮＡによって修飾した場合に、完全に失われた。これらのデータを合わせると、センスおよびアンチセンス鎖の異なる領域にＬＮＡ修飾を導入することによりｓｉＲＮＡの２つの機能的活性を分離することが可能であり、ｓｉＲＮＡの免疫刺激成分を最小限にしながらサイレンシング活性を維持することもできるし（たとえば：センス鎖の３’末端にＬＮＡ）；ｓｉＲＮＡのサイレンシング活性を無効にしながら免疫刺激活性を維持することもできる（すなわち、アンチセンス鎖の３’および５’末端にＬＮＡ）ことがわかる。
【０１４２】
免疫刺激性のｓｉＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏでマウスの全身性免疫反応を誘導する
ｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏでの全身作用を検討するために、最初にマウスの系においてｓｉＲＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫刺激活性について調べた。ヒトの系と同様に、ＴＬＲ９．２の二本鎖およびセンス鎖がＩＦＮαを誘導する一方、ＴＬＲ９．２のアンチセンス鎖ははるかに活性が低く、ポリ（Ａ）は活性を持たないことが判った（図５Ａ）。
【０１４３】
次に、ＴＬＲ９．２二本鎖、ＴＬＲ９．２センス鎖、およびＴＬＲ９．２アンチセンス鎖の免疫学的活性をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて評価した。この分析には、ヒトの系においてＴＬＲ９．２よりも活性の低かったｓｉＲＮＡとしてＴＬＲ２．１を含めた。１２９Ｓｖマウスへの静脈注射の７時間後に、マウス血清中のＩＦＮ−αの濃度を測定した（図５Ｂ）。さらに、脾臓における免疫細胞サブセットの活性化を、４３時間後にフローサイトメトリーによって評価した（図５Ｃ）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータと矛盾することなく、ＴＬＲ９．２二本鎖およびＴＬＲ９．２センス鎖は、ＩＦＮ−αの全身レベルを誘導し、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞および骨髄樹状細胞を活性化する最も高い活性を示した（図５Ｃ）。カチオン性リポソーム（ＤＯＴＡＰ）またはｓｉＲＮＡ単独のいずれかでは免疫学的活性は観察されなかった（図５Ｄ）。同時に上記の結果は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｓｉＲＮＡの投与が、血液および脾臓のいずれにおいても検出可能な全身性免疫反応を誘引すること、ならびにマウスにおける免疫学的活性がヒトの系におけるものと同じ配列依存性を示すことを実証するものである。
【０１４４】
ｓｉＲＮＡの免疫認識はＴＬＲ７を必要とする
マウスとヒトにおいてｓｉＲＮＡの配列依存性免疫認識が保存されていることから、関係する受容体を同定するためにノックアウトマウスを使用することができた。ＴＬＲ７およびＴＬＲ９は、ＰＤＣにおいて発現され（ＦＩＸ  ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ｛Ｋｒｕｇ，２００１＃５；Ｈｏｒｎｕｎｇ，２００２＃３７｝）、ＩＦＮ−α産生と関係することが知られているＴＬＲファミリーの唯一のメンバーである。これまでのところ、ＴＬＲ７を介して特異的に検出されるＲＮＡ配列モチーフは同定されていない。本発明者らは、ＴＬＲ
７がＴＬＲ９．２ｓｉＲＮＡに含まれる免疫刺激配列モチーフの認識に関与しているという仮説をたてた。実際に本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴＬＲ９．２二本鎖およびＴＬＲ９．２センス鎖による、また確立されたＴＬＲ７リガンド（ロキソリビン）によるＩＦＮ−α誘導が、ＴＬＲ７欠失マウス由来の骨髄細胞には存在しないことを発見した（図６Ａ）。対照的に、ＴＬＲ９リガンドであるＣｐＧ  ＯＤＮ１８２６によるＩＦＮ−α誘導は、ＴＬＲ７欠失マウス由来の骨髄細胞においては減少しなかった（図６Ａ）。
【０１４５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは検出不可能な、ｓｉＲＮＡの免疫認識のさらなるｉｎ  ｖｉｖｏメカニズムが存在するかもしれない。そのようなものとして、ＴＬＲ９．２ｓｉＲＮＡをＴＬＲ７欠失マウスおよび野生型の対照マウスに静脈注射した。野生型マウスとは対照的に、ＴＬＲ７欠失マウスは、７時間および２４時間後の血清中に検出可能なＩＦＮ−αは全くみられなかった（図６Ｂ）。さらに、ＴＬＲ７欠失マウスの脾臓細胞においては、ＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、骨髄樹状細胞およびＰＤＣの活性化は全く見られなかったが、野生型マウスにおいては４つすべての細胞サブセットに強い活性化が見られた（図６Ｃ）。これらのデータを合わせると、ＴＬＲ７がＴＬＲ９．２ｓｉＲＮＡの免疫認識のために必要とされていることがわかる。
【０１４６】
考察
ＲＮＡ干渉技術における最も顕著な進歩の一つとして、二本鎖ＲＮＡ分子の長さを２２塩基対まで減らすことにより、標的ｍＲＮＡの配列特異的ダウンレギュレーションを維持しながら、ＰＫＲによって媒介される非特異的Ｉ型ＩＦＮ誘導を回避できるということがある。この概念どおり、本発明者らは、ＩＦＮ応答を伴わないヒトＨＥＫ２９３細胞株におけるｓｉＲＮＡ媒介性の配列特異的なＴＬＲ９ダウンレギュレーションを実証することができた。しかしながら、この方法を初代プラズマサイトイド樹状細胞（ＰＤＣ）に適用しようとしたところ、以前に提案された長さ依存性の二本鎖ＲＮＡ認識が逆転しているようであり、５００塩基対長の二本鎖ＲＮＡ分子またはポリ（Ｉ：Ｃ）（長い二本鎖ＲＮＡの模倣物）によるＰＤＣのトランスフェクションでは、ＩＦＮ−αが誘導できず、調べたｓｉＲＮＡ配列のいくつかが活発なＩＦＮ−α反応を示すという驚くべき観察結果を得た。
【０１４７】
強力なＩＦＮ−α誘導活性を有した２つのｓｉＲＮＡの重複配列に基づいて、９塩基（５’ＧＵＣＣＵＵＣＡＡ３’，配列番号：１）で構成される免疫刺激性の一本鎖ＲＮＡ配列を同定することができた。免疫刺激性ｓｉＲＮＡの両鎖の異なる領域の化学的骨格修飾により、免疫刺激とＲＮＡサイレンシングを、２つの独立した機能的活性として分けることができた。ｓｉＲＮＡによるＩＦＮ−α誘導に関する同じタイプの配列特異性が、マウスにおいても見られた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの免疫刺激活性およびｉｎ  ｖｉｖｏの全身性免疫反応はＴＬＲ７欠失マウスにおいては無効になったことから、ｓｉＲＮＡの配列特異的免疫認識は、ＴＬＲ７によって媒介されることが実証された。
【０１４８】
本発明者らの結果は、ｓｉＲＮＡの免疫刺激活性が、不完全なアニーリング処理後のｓｉＲＮＡ調製物に残された一本鎖ＲＮＡ分子によって媒介されるのではないという証拠を与えるものである。すなわち、ｉ）ｓｉＲＮＡ調製物を一本鎖ＲＮＡｓｅで処理しても、ｓｉＲＮＡの免疫学的活性に影響はないが、対応する免疫刺激性一本鎖ＲＮＡの活性は損なわれた。ｉｉ）免疫刺激性ｓｉＲＮＡの完全な二本鎖を含む、エネルギー的に安定なヘアピンを自然に形成するように設計された一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド（ミクロＲＮＡの形態）は、免疫刺激性ｓｉＲＮＡと同等の活性を有していた。これらのデータから、ｓｉＲＮＡの認識に関与する認識メカニズムによって、ＲＮＡ二本鎖の内の一本鎖ＲＮＡモチーフの検出が可能になっていることが確認された。
【０１４９】
ｓｉＲＮＡおよびＴＬＲ９リガンド（ＣｐＧ  ＤＮＡ）の認識に関して、ｓｉＲＮＡと
微生物ＤＮＡのいずれも最初は二本鎖（ウィルスまたは細菌のＤＮＡゲノムは通常は二本鎖）であるにもかかわらず、免疫刺激配列モチーフの検出は一本鎖レベルにおいて行われるということは興味深い。これまで、ヘリカーゼ活性が認識プロセスの一部であるかどうかについての情報はなかった。ＲＮＡおよびＤＮＡのいずれに対しても、対応するタイプの免疫反応を誘起するために、適当な配列モチーフを含む合成一本鎖オリゴヌクレオチドを用いることができる。免疫刺激性ＲＮＡオリゴヌクレオチドの最短の長さは、約１９塩基であった。同様に、活性ＴＬＲ９リガンドになるためには、６量体ＣｐＧモチーフは、より長いオリゴヌクレオチドの一部でなければならない（ハートマン、ジー（Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｇ．）ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００，１６４：９４４〜５３）。ポリＡ  ＲＮＡは免疫学的活性を全く示さないので、９量体の刺激配列を含むＲＮＡオリゴヌクレオチドを、１９量体の長さにまで延長するためにポリＡの添加を利用することができた。１９量体ＲＮＡオリゴヌクレオチド中に２つの刺激性９量体配列を挿入することによって、免疫刺激活性がさらに増大した。同様に、ポリ（Ｃ）ＤＮＡ（ホスホロチオエート修飾を有するものも有しないものも）は免疫刺激活性を欠如していることから、ポリ（Ｃ）は、以前の研究においてオリゴデスオキシヌクレオチドを含んだＣｐＧモチーフの延長のために用いられていた（ハートマン、ジー（Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｇ．）ら  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００，１６４：９４４〜５３）。
【０１５０】
水疱性口内炎ウィルスやインフルエンザウィルスなどのある種の一本鎖ＲＮＡウィルスは、ＴＬＲ７を介して免疫細胞によって認識されることが報告されているが（ランド（Ｌｕｎｄ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００４，１０１：５５９８〜６０３；ハイル（Ｈｅｉｌ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００４，３０３：１５２６〜９；ディーボルト（Ｄｉｅｂｏｌｄ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００４，３０３：１５２６〜９）、ウィルスＲＮＡの認識に関与する特定の配列モチーフはこれまで同定されていない。その代わりに、ポリ（Ｕ）が活性であることが報告されており、ウィルスＲＮＡにおいてはＧＵが豊富な配列が免疫認識に関与し、さらにモノマーのＧおよびＵの混合物が免疫刺激性であることが提案されている。後者は、ＲＮＡ分解産物の関与している可能性を示すものである。本研究におけるＲＮＡ分子の免疫刺激活性がＧＵ含量によるものではないという証拠がいくつかある。最初に、当然のことながら、二本鎖ＲＮＡのＧおよびＵの総数は、二本鎖の長さと常に一致する（すなわち、１９量体二本鎖のＧＵ数は、常に１９である）。第２に、ｓｉＲＮＡの２つの一本鎖の一方または他方において、ＧまたはＵの数、またはＧ対Ｕの比が大きくなっても、ｓｉＲＮＡの免疫学的活性には関係しなかった。第３に、免疫刺激性一本鎖ＲＮＡにおけるＧの数を増加すると、免疫学活性は強化されるよりもむしろ減少した。そして、第４に、本研究において記載する免疫刺激性ＲＮＡ配列を含むＲＮＡオリゴヌクレオチドと比べて、ポリ（Ｕ）は弱かった。
【０１５１】
本発明者らの結果は、ＰＤＣによるｓｉＲＮＡの免疫認識が、配列依存性かつＧＵ含量非依存性であり、本研究において記載された配列がいくつかの異なる免疫刺激性ＲＮＡ配列モチーフの１つであるかもしれないことを明確に実証するものである。本研究の配列の最適化と、さらなる配列の同定は、最も強力な免疫刺激性ＲＮＡモチーフを同定するための幅広い配列スクリーニングの課題となるであろう。
【０１５２】
少なくとも本研究において記載するＲＮＡ配列については、ｓｉＲＮＡの認識はマウスとヒトとの間で保存されているようである。ＤＯＴＡＰに複合化した免疫刺激性ｓｉＲＮＡを静脈注射したところ、血清中のＩＦＮ−αならびにＴ細胞、ＰＤＣおよび骨髄樹状細胞の活性化を含む強い全身免疫反応が観察された。免疫活性化のレベルは、ＴＬＲ９リガンドであるＣｐＧの場合と同じ範囲にあった。ｓｉＲＮＡによる骨髄樹状細胞およびＴ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ活性化は、すでにヒトの系において実証されているように（クルグ、エイ（Ｋｒｕｇ，Ａ．）ら  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０，３４６８〜７７（２００３），ローテンファッサー、エス（Ｒｏｔｈｅｎｆｕｓｓｅｒ，Ｓ．）ら、Ｂｌｏｏｄ  １０
３，２１６２〜９（２００４），ローテンファッサー、エス（Ｒｏｔｈｅｎｆｕｓｓｅｒ，Ｓ．）ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１，３５２５〜３４（２００１））、ＩＦＮ−αによって媒介される二次的効果によるものであるかもしれない。結果として、カチオン性脂質と複合化したｓｉＲＮＡは、ＣｐＧと同様に、ウィルス（ディトマー、ユー（Ｄｉｔｔｍｅｒ，Ｕ．）＆オルブリッチ、エイ・アール（Ｏｌｂｒｉｃｈ，Ａ．Ｒ．）、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６，４７２〜７（２００３））および細菌感染（ワグナー、エイチ（Ｗａｇｎｅｒ，Ｈ．）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  ２２，１４７〜５２（２０００））および腫瘍（ヘッケルスミラー、ケイ（Ｈｅｃｋｅｌｓｍｉｌｌｅｒ，Ｋ．）ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２，３２３５〜４５（２００２）、ヘッケルスミラー、ケイ（Ｈｅｃｋｅｌｓｍｉｌｌｅｒ，Ｋ．）ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９，３８９２〜９（２００２）、ワイナー、ジー・ジェイ（Ｗｅｉｎｅｒ，Ｇ．Ｊ．）、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４７，１５７〜７０（２０００））に対して、強力な治療活性を示すかもしれない。Ｂ型肝炎のマウスモデルにおいてウィルスの複製と転写を阻害するためにｓｉＲＮＡがうまく用いられたことは興味深い（クライン、シー（Ｋｌｅｉｎ，Ｃ．）ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２５，９〜１８（２００３）、デビッドソン、ビー・エル（Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｂ．Ｌ．）、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４９，２３５７〜９（２００３））。ＩＦＮ−αはＢ型肝炎治療の中心となるものであるから、ＰＤＣに由来するＩＦＮ−αがｓｉＲＮＡの治療効果に寄与しているかもしれない。
【０１５３】
本研究において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方においてｓｉＲＮＡによって誘導される免疫反応は、完全にＴＬＲ７の存在に依存していた。しかしながら、ＨＥＫ２９３細胞などの多くの細胞株においてＴＬＲ７は発現されず、したがって、ＴＬＲ７を介したｓｉＲＮＡの免疫認識は期待されない。このことは、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の上清が、長い二本鎖ＲＮＡ分子によるトランスフェクションとは対照的に、ＳＴＡＴｌまたはＳＴＡＴ２リン酸化活性の欠如によって証明されるようにＩ型ＩＦＮ反応を示さないという我々のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの観察に矛盾しない。これらの結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＴＬＲ７欠損細胞株において、２１塩基対の短い二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が免疫刺激活性を欠き、標的遺伝子の配列特異的ダウンレギュレーションについては有用であるという概念と一致する。
【０１５４】
この概念に反する報告として、ｓｉＲＮＡの細胞株へのトランスフェクションが、ＰＫＲ依存性のＩ型ＩＦＮ媒介性のＳＴＡＴ経路の活性化をもたらし、ＩＦＮによって刺激される遺伝子のアップレギュレーションにつながることを示唆したものがある（スレズ、シー・エイ（Ｓｌｅｄｚ，Ｃ．Ａ．）ら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ５，８３４〜９（２００３））。さらに、ｓｉＲＮＡは、ＨＥＫ２９３細胞などの細胞株において発現されるＴＬＲ３を介してＩ型ＩＦＮ反応を誘導することが報告されている（カリコ、ケイ（Ｋａｒｉｋｏ，Ｋ．）ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２，６５４５〜９（２００４），カリコ、ケイ（Ｋａｒｉｋｏ，Ｋ．）ら、Ｃｅｌｌｓ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｏｒｇａｎｓ  １７７，１３２〜８（２００４））。しかしながら、本研究におけるＴＬＲ７欠損マウスでのｓｉＲＮＡの免疫刺激活性の完全な損失は、ＰＫＲおよびＴＬＲ３が、天然の免疫系によってｓｉＲＮＡを検出する主たるメカニズムを示すものではないという証拠を提供する。このことは、ｓｉＲＮＡの免疫学的活性がＴＲＩＦ欠損マウスでは影響されないという我々の最近の知見（データ示さず）によって支持される。ＴＲＩＦは、ＴＬＲ３シグナル伝達に必要なアダプタ分子である。ＴＲＩＦ欠損マウスにおけるｓｉＲＮＡの免疫学的活性の欠如は、ホーベ（Ｈｏｅｂｅ）および共同研究者（ホーベ、ケイ（Ｈｏｅｂｅ，Ｋ．）ら、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４，１２２３〜９（２００３））によって提案された、代替のＴＬＲ３およびＴＲＩＦ非依存性の長い二本鎖ＲＮＡ（ポリ［Ｉ：Ｃ］）認識の経路が、ｓｉＲＮＡの免疫認識に関与していないことも示す。
【０１５５】
ｓｉＲＮＡによって誘導されるＩ型ＩＦＮ産生による、タンパク質発現の標的非特異的ダウンレギュレーションは、ＲＮＡ干渉技術における大きな問題である。ｓｉＲＮＡのサイレンシング活性からＩ型ＩＦＮ誘導特性を分離する方法によって、ｓｉＲＮＡの用途は進化するであろう。本研究において、ｓｉＲＮＡ  ＴＬＲ９．２は、サイレンシング活性と免疫刺激活性とがｓｉＲＮＡの２つの無関係の機能的特性であることを実証するための優れたモデルであることが判った。ＩＦＮ−α誘導に関与するＲＮＡ配列がアンチセンス鎖上ではなくセンス鎖上に見つかったので、両機能的活性の解離が可能であった。ｓｉＲＮＡ  ＴＬＲ９．２のセンス鎖またはアンチセンス鎖上のある領域に選択された骨格修飾（ロックト核酸；ＬＮＡによるもの）を施すことにより、サイレンシング活性は維持されているが免疫刺激活性が無効になった、またはその逆の、ｓｉＲＮＡ  ＴＬＲ９．２誘導体を作成することができた。これにより、ｓｉＲＮＡの機能的特性は、免疫刺激および／または標的ｍＲＮＡのサイレンシングを好むように変更できることが実証された。明らかに、ｍＲＮＡサイレンシングに対するその効果に加えて、ある種のｓｉＲＮＡは、その潜在的免疫刺激特性ゆえに、とくに該ｓｉＲＮＡが抗感染または抗腫瘍治療薬としての使用に関する場合には、さらなる治療的可能性を有しうる。本研究において用いた刺激性配列は、ＰＤＣにおいて見られた最大刺激（刺激：ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮ２２１６）の約３０％のＩＦＮ−α誘導を起こした。この刺激性配列が最適であるとは思えないが、このＲＮＡ配列によるｉｎ  ｖｉｖｏでの結果は、免疫刺激性ｓｉＲＮＡ分子のさらなる開発に対する潜在性を浮き彫りにするものである。
【実施例２】
【０１５６】
免疫刺激を調節するための修飾オリゴヌクレオチドの合成
（ａ）ＲＮＡ，２’−Ｏ−メチル修飾、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾、およびチオエート修飾を施したオリゴヌクレオチド
ＲＮＡ分子は、３９４ＡＢＩ合成機で、製造業者によって記載された標準サイクルを用い、下記に記載するように数箇所の待ち工程に改変を加えて合成した。固体支持体は、多孔性ガラス（ＣＰＧ；５００Å、米国ペンシルベニア州アストン所在のプライム・シンセシス・インコーポレイテッド（Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．））とした。モノマーは、ピアス・ヌクレイック・アシド・テクノロジーズ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（米国ウィスコンシン州ミルウォーキー所在のピアス・ミルウォーキー・エルエルシー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ  ＬＬＣ））から入手した標準的な保護基を有するＲＮＡホスホルアミダイトまたは２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）ＲＮＡホスホルアミダイトであって、特に述べない限り、ＣＨ３ＣＮ中に０．１５Ｍの濃度で使用した。具体的には、ＲＮＡホスホルアミダイトは、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔブチルジメチルシリル−アデノシン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−イソブチリル−２’−Ｏ−ｔブチルジメチルシリル−グアノシン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−ｔブチルジメチルシリル−シチジン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔブチルジメチルシリル−ウリジン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−ベンゾイル−２’−Ｏ−メチル−アデノシン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−イソブチリル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチル−シチジン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト、および５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホルアミダイトであった。２’−デオキシ−
２’−フルオロ（２’−Ｆ）ホスホルアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−デオキシ−２’−フルオロ−シチジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホルアミダイトおよび５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシ−２’−フルオロ−ウリジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホルアミダイトは、プロメガ・コーポレイション（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．（米国ウィスコンシン州マディソン所在））より購入した。５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−フルオロ−アデノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホルアミダイトおよび５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−イソブチリル−２’−デオキシ−２’−フルオロ−グアノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホルアミダイトは、文献プロトコールに従って合成した（引用）。すべてのモノマーに対してカップリング時間は１０分間とした。他の試薬の詳細は以下の通りである；アクチベータ，５−エチルチオテトラゾール（０．２５Ｍ、米国ＶＩスターリング所在のグレン・リサーチ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ））；ＣａｐＡ，５％無水酢酸／ＴＨＦ／ピリジン（米国ＶＩスターリング所在のグレン・リサーチ）；ＣａｐＢ：１０％Ｎ−メチルイミダゾール／ＴＨＦ（米国ＶＩスターリング所在のグレン・リサーチ）；ＰＯ酸化には０．０２Ｍ  Ｉ２／ＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（米国ＶＩスターリング所在のグレン・リサーチ）を用いた。ＰＳ酸化には、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬（英国グラスゴー所在のクルアケム・リミテッド（Ｃｈｒｕａｃｈｅｍ  Ｌｔｄ））のアセトニトリル溶液（１％）を使用した。トリチル基は、合成機において、３％ＴＣＡ／ジクロロメタン（米国ＶＩスターリング所在のグレン・リサーチ）によって除去した。
【０１５７】
（ｂ）ＬＮＡ結合を有するオリゴヌクレオチドの合成
ＲＮＡ分子は、３９４ＡＢＩ合成機で、製造業者によって記載された標準サイクルを用い、下記に記載するように数箇所の待ち工程に改変を加えて合成した。固体支持体は、ｒＡ  ＣＰＧ（２マイクロモル、５２０Å、米国ペンシルベニア州アストン所在のプライム・シンセシス・インコーポレイテッド、バッチ番号ＣＰＧ６０Ｎ１１ＲＡＳＮ）、ｒＵ  ＣＰＧ（Ｇ３１１１０３がこれ、米国ペンシルベニア州アストン所在のプライム・シンセシス・インコーポレイテッド、バッチ番号も同様か）、ＬｏｃＡ（２マイクロモル、米国コロラド州ボルダー所在のプロリゴ・エルエルシー（Ｐｒｏｌｉｇｏ  ＬＬＣ）、４０．０マイクロモル／ｇ、バッチ番号２２５４０１）、またはＬｏｃＴ（２マイクロモル、米国コロラド州ボルダー所在のプロリゴ・エルエルシー、３９．０マイクロモル／ｇ、バッチ番号２２４５９７）とした。Ｌｏｃは、ＬＮＡ構築ブロックを表す。モノマーは、ＲＮＡホスホルアミダイト（ピアス・ヌクレイック・アシド・テクノロジーズ、ピアス・ミルウォーキー・エルエルシー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ  ＬＬＣ）、米国ウィスコンシン州ミルウォーキー所在）またはＬＮＡホスホルアミダイトＬｏｃＡＢｚ（米国コロラド州ボルダー所在のプロリゴ・エルエルシー、カタログ番号２２３９１７），５’ＤＭＴＣＥＬｏｃ５ｍｅＣＢｚ（米国コロラド州ボルダー所在のプロリゴ・エルエルシー、カタログ番号２２３８１６），５’ＤＭＴＣＥＬｏｃ５ｍｅＧｉＢｕ（米国コロラド州ボルダー所在のプロリゴ・エルエルシー、カタログ番号２２３８１７），５’ＤＭＴＣＥＬｏｃＴ（米国コロラド州ボルダー所在のプロリゴ・エルエルシー、カタログ番号２２８１８）とした。特に注記のない限り、すべて標準的な保護基を有し、ＣＨ３ＣＮ中０．１５Ｍの濃度で使用した。具体的には、ＲＮＡホスホルアミダイトは、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔブチルジメチルシリル−アデノシン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト（バッチ番号ＦＧ００８２）、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−イソブチリル−２’−Ｏ−ｔブチルジメチルシリル−グアノシン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト（バッチ番号ＦＥ００３１）、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−ｔブチルジメチルシリル−シチジン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−
Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト（バッチ番号ＦＦ００４６）、および５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔブチルジメチルシリル−ウリジン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト（バッチ番号ＦＦ００３６）とした。ＬＮＡホスホルアミダイトは、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−ベンゾイル−アデノシン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ＬＮＡホスホルアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−イソブチリル−グアノシン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ＬＮＡホスホルアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−５−メチル−シチジン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ＬＮＡホスホルアミダイト、および５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−チミジン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ＬＮＡホスホルアミダイトとした。
【０１５８】
すべてのモノマーに対してカップリング時間は１０分間とした。他の試薬の詳細は以下の通りである：アクチベータ、５−エチルチオテトラゾール（０．２５Ｍ、米国ＶＩスターリング所在のグレン・リサーチ）；ＣａｐＡ、５％無水酢酸／ＴＨＦ／ピリジン（米国ＶＩスターリング所在のグレン・リサーチ）；およびＣａｐＢ、１０％Ｎ−メチルイミダゾール／ＴＨＦ（米国ＶＩスターリング所在のグレン・リサーチ）；ＰＯ酸化には０．０２Ｍ  Ｉ２／ＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（米国ＶＩスターリング所在のグレン・リサーチ）を用いた。トリチル基は、合成機において、３％ＴＣＡ／ジクロロメタン（米国ＶＩスターリング所在のグレン・リサーチ）によって除去した。
【０１５９】
脱保護
合成の完了後、多孔性ガラス（ＣＰＧ）をネジ蓋付無菌微量遠心チューブに移した。オリゴヌクレオチドを切断し、同時に、塩基およびリン酸基を１．０ｍＬのエタノール性アンモニアの混合物（１：３）中、５５℃で５時間かけて脱保護した。遠心チューブを氷上で短時間冷却し、溶液を５ｍＬの遠心チューブに移した。固体支持体を、５０％ＣＨ３ＣＮ水溶液０．２５ｍＬを用いて３回洗浄し、洗浄液は元の溶液に加えた。遠心チューブを−８０℃で１５分間冷却し、溶液を凍結乾燥器中で乾燥させた。
【０１６０】
得られた白色の残渣は、２００μＬのトリエチルアミントリヒドロフルオリド中に再懸濁し、６５℃で１．５時間加熱して、２’位にあるＴＢＤＭＳ基を除去した。次にオリゴヌクレオチドを乾燥メタノール（４００μＬ）中で沈殿させた。液体を注意深く除去したところ、チューブの底にペレットが得られた。残ったメタノールを高速真空遠心機中で除去して、粗ＲＮＡを白色のふわふわした物質として得た。
【０１６１】
精製
試料を１ｍＬのＲＮａｓｅを含まない水に溶解し、２６０ｎｍで定量した。粗オリゴヌクレオチドは、変性ゲル電気泳動（２０％アクリルアミド、６Ｍ尿素）によって精製した。精製したオリゴヌクレオチドは、セファデックスＧ２５Ｍ（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ所在のアマシャム・バイオサイエンシズ・コーポレイション（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ））を用いて脱塩した。
【０１６２】
表３〜６は、合成された、記載のように修飾したオリゴヌクレオチドの配列を示したものである。
活性の測定
修飾オリゴヌクレオチドを、実施例１において上記したようにＰＤＣとともにインキュベートし、ＩＦＮ−α産生を測定した。表７は、末端チミジン以外はＴＬＲ９．２ｓと同じ塩基配列を有するが、１および２位、１、２、１８および１９位、１〜４および１６〜１９位、ならびに１６〜１９位に２’−フルオロまたは２’−Ｏ−メチル修飾を含むか、または完全にホスホロチオエートで置換された骨格を含むオリゴヌクレオチドについて得
られた結果を、それぞれ、ＴＬＲ９．２ｓについて測定されたＩＦＮ−α産生に対する％で表して示すものである。２’−フルオロ修飾は一般にこれらのオリゴヌクレオチドの免疫刺激性活性への影響は少ないのに対し、２’−Ｏ−メチル修飾はこの活性をほぼ完全に無効にすることが明らかである。２’−フルオロ修飾に関しては、５’−ＧＵＣＣＵＵＣＡＡ−３’（配列番号：１）モチーフから最も遠い５’末端のヌクレオチドのみを修飾すると、影響は最小限であるが、両端の４ヌクレオチドを修飾するとオリゴヌクレオチドの免疫刺激活性を著しく減退させた。ホスホロチオエートは、ＩＦＮ−α誘導活性を穏やかに減退させた。
【０１６３】
したがって、たとえばヌクレアーゼによる分解から保護するために、本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを修飾することが望ましいようであれば、２’−フルオロ修飾を導入することにより、また好ましくは２’−フルオロ修飾を配列番号：１のヌクレオチドが非修飾のままであるように導入することによって達成することができる。しかしながら、配列番号：１を含むオリゴヌクレオチド、またはヌクレオチド配列番号：１由来の４以上、５以上、６以上、７以上または８以上の連続したヌクレオチド、たとえば、５’−ＧＵＣＣ−３’（配列番号：２），５’−ＧＵＣＣＵ−３’（配列番号：３），５’−ＧＵＣＣＵＵ−３’（配列番号：４），５’−ＧＵＣＣＵＵＣ−３’（配列番号：５），または５’−ＧＵＣＣＵＵＣＡ−３’（配列番号：６）を含むオリゴヌクレオチドを作成し、免疫刺激活性は回避することが望ましい場合、２’−Ｏ−メチル修飾を導入することにより、また好ましくは、２’−Ｏ−メチル修飾を、配列番号：１のヌクレオチドが修飾されるように導入することにより、達成することができる。
【０１６４】
【表１】
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【０１６５】
【表２】
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【０１６６】
【表３】
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【０１６７】
【表４】
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【０１６８】
【表５】
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【０１６９】
【表６】
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表３〜６において、鎖は５’から３’の方向に示した。ｄＴは２’−デオキシチミジンを示し、前に小文字の「ｓ」が付いたものは５’−ホスホロチオエート基を表す。ロックト核酸は、後ろに「Ｌ」を付けて示した。前に小文字の「ｄ」が付いたものはデオキシ残
基を示す。前に「ｏ」が付いたものは２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを表す。前に「ｆ」が付いたものは２’−フルオロヌクレオチドを示す。「Ｔ」は５−メチル−ウリジンを表し、「ｍＣ５」は５−メチル−シチジンを表す。フルオロ修飾セットの配列のうち６つが「ｄＴ」突出部で終わっているのは、リボフルオロヌクレオシドを含む適切なＣＰＧがこの時点では入手できなかったからである。これらは、２７９３、２７９４、２７９５、２７９７、２７９８、および２７９９である。「Ｅｘｔｎ  ｃｏｅｆｆ．ｅ２６０＊１０−３」は、波長２６０ｎｍにおけるオリゴヌクレオチドのモル吸光係数を（１０００×ｌ／（ｍｏｌ×ｃｍ）で割ったものである。
【０１７０】
【表７】
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【０１７１】
【表８】
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【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】ＨＥＫ２９３細胞において、ｓｉＲＮＡを用いて、標的非特異的なＩ型ＩＦＮ媒介性のＳＴＡＴｌまたはＳＴＡＴ２リン酸化活性を誘導せずに、ＴＬＲ９発現を阻害することができることを示す図。  ＨＥＫ２９３細胞（５０．０００／ウェル）を、様々なＲＮＡ分子およびリポフェクタミンとともにインキュベートした。  Ａ：Ｃ末端ＹＦＰタグを有するヒトＴＬＲ９の構築物を発現するＨＥＫ２９３細胞を、ヒトＴＬＲ９ｍＲＮＡの種々の領域と相補的な４つのｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ＧＦＰｍＲＮＡおよびＴＬＲ２（図面中では、ｓｉＲＮＡ２．１と表す）ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションを陽性および陰性対照とした。２０時間目に、ＹＦＰタグ発現の平均蛍光強度をフローサイトメトリーによって解析した。結果を平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３）として示す。  Ｂ：ＨＥＫ２９３細胞を、単独でインキュベートしたもの（レーン１）、リポフェクタミンとともにインキュベートしたもの（レーン２）、５００塩基対長の二本鎖ＲＮＡとともにインキュベートしたもの（１０μｇ／ｍＬ、レーン３）、または５００塩基対長の二本鎖ＲＮＡと複合化したリポフェクタミンでトランスフェクトしたもの（レーン４）、ヒトＴＬＲ９ｍＲＮＡを標的とする４つの異なるｓｉＲＮＡと複合化したリポフェクタミンでトランスフェクトしたもの（ＴＬＲ９．１，ＴＬＲ９．２，ＴＬＲ９．３およびＴＬＲ９．４；レーン５〜８；ＴＬＲ９．１，ＴＬＲ９．２，ＴＬＲ９．３およびＴＬＲ９．４は、図面ではそれぞれｓｉＲＮＡ９．１，ｓｉＲＮＡ９．２，ｓｉＲＮＡ９．３、およびｓｉＲＮＡ９．４と表されている）。２４時間後、上清を回収し、ＢＬ４１細胞（１条件あたり細胞１×１０６個）に加えた。組換えＩＦＮ−β（１００Ｕ／ｍＬ）を加えたものを、陽性対照とした（レーン９）。３０分後、ＢＬ４１細胞を溶菌し、ＳＤＳ−ｐａｇｅにかけて、ＳＴＡＴｌおよびＳＴＡＴ２のリン酸化を調べた。上清は４連実験から回収した。３回のうちの１つの代表的な実験を示す。
【図２Ａ】ｓｉＲＮＡによるプラズマサイトイド樹状細胞におけるＩＦＮ−αの配列依存性誘導は、一本鎖レベルでのモチーフ認識に基づいていることを示す図。  ＰＤＣ（５０．０００／ウェル）を、リポフェクタミン（０．５μＬ）を用いて種々のＲＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。３６時間後、上清中のＩＦＮ−α産生を測定した。  Ａ：ＰＤＣを、２００ｎｇの４つの異なるｓｉＲＮＡ（ＴＬＲ９．１、ＴＬＲ９．２、ＴＬＲ９．３およびＴＬＲ９．４）でトランスフェクトした。ＴＬＲ９−リガンドであるＣｐＧ−Ａ（ＯＤＮ２２１６、灰色バー）を、ＩＦＮ−α誘導に関する陽性対照とした。結果は、１１名の個別ドナーからの平均ＩＦＮ−α産生±ＳＥＭで示されている（ＴＬＲ９．１対ＴＬＲ９．２に対してはｐ＜０．０００１、ＴＬＲ９．１対ＴＬＲ９．３に対してはｐ＜０．０００１、ＴＬＲ９．３対ＴＬＲ９．１に対してはｐ＜０．０００１、およびＴＬＲ９．３対ＴＬＲ９．４に対してはｐ＜０．００１）。
【図２Ｂ】ｓｉＲＮＡによるプラズマサイトイド樹状細胞におけるＩＦＮ−αの配列依存性誘導は、一本鎖レベルでのモチーフ認識に基づいていることを示す図。  ＰＤＣ（５０．０００／ウェル）を、リポフェクタミン（０．５μＬ）を用いて種々のＲＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。３６時間後、上清中のＩＦＮ−α産生を測定した。  Ｂ：ＴＬＲ９．１、ＴＬＲ９．２、ＴＬＲ９．３またはＴＬＲ９．４の量を減少させて（２００ｎｇ、１００ｎｇ、５０ｎｇ、２５ｎｇ）ＰＤＣをトランスフェクトした。結果は、３名の個別ドナーからの平均ＩＦＮ−α産生±ＳＥＭを示す。
【図２Ｃ】ｓｉＲＮＡによるプラズマサイトイド樹状細胞におけるＩＦＮ−αの配列依存性誘導は、一本鎖レベルでのモチーフ認識に基づいていることを示す図。  ＰＤＣ（５０．０００／ウェル）を、リポフェクタミン（０．５μＬ）を用いて種々のＲＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。３６時間後、上清中のＩＦＮ−α産生を測定した。  Ｃ：ＰＤＣを、ｓｉＲＮＡ９．２二本鎖または対応するセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれかによってトランスフェクトした。１０名の個別ドナーからの結果をまとめ、平均値±ＳＥＭで示した。
【図２Ｄ】ｓｉＲＮＡによるプラズマサイトイド樹状細胞におけるＩＦＮ−αの配列依存性誘導は、一本鎖レベルでのモチーフ認識に基づいていることを示す図。  ＰＤＣ（５０．０００／ウェル）を、リポフェクタミン（０．５μＬ）を用いて種々のＲＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。３６時間後、上清中のＩＦＮ−α産生を測定した。  Ｄ（左パネル）：ｓｉＲＮＡ９．２センス鎖のＦＩＴＣ修飾物、または対応するアニールしたｓｉＲＮＡ二本鎖を、２６６μｇ／ｍＬのＲＮＡｓｅの存在下、または非存在下でインキュベートした。３時間後、４μＬのこの調製物を、未処理の試料を対照として含めて３％アガロースゲルで解析した。  Ｄ（右パネル）：次に、ｓｉＲＮＡ精製カラムを介して試料を精製してＲＮａｓｅを除去し、３μＬのこの調製物をＰＤＣにトランスフェクトした。３６時間後、ＩＦＮ−α産生をＥＬＩＳＡによって評価した。２つの代表的な実験の一方からのデータを示す。
【図２Ｅ】ｓｉＲＮＡによるプラズマサイトイド樹状細胞におけるＩＦＮ−αの配列依存性誘導は、一本鎖レベルでのモチーフ認識に基づいていることを示す図。  ＰＤＣ（５０．０００／ウェル）を、リポフェクタミン（０．５μＬ）を用いて種々のＲＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。３６時間後、上清中のＩＦＮ−α産生を測定した。  Ｅ：ｓｉＲＮＡ二本鎖９．２を自己安定化する一本鎖ヘアピン型としたもの（表２を参照）を、ｓｉＲＮＡ９．２二本鎖と比較したもの。２つの独立した実験からのデータを平均±ＳＥＭで表している。
【図３】ＲＮＡ９．２センス鎖３’末端の９塩基の配列が、免疫刺激活性に関与していることを示す図。  ＰＤＣを種々のＲＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。３６時間後、上清中のＩＦＮ−α産生を測定した。  Ａ：ＴＬＲ９．２のセンス鎖（ＲＮＡ９．２ｓ、元の配列については「ｎ」で示す）およびＲＮＡ９．２ｓにフルオレセインタグを付加したもの（５’Ｆまたは３’Ｆ）でＰＤＣをトランスフェクトした。＊はｐ＜０．０５を示す。  Ｂ：ＴＬＲ９．２のセンス鎖、１９量体ポリＡオリゴヌクレオチド、５’末端から数えて塩基番号８〜１２がアデノシンに置換された一連のＲＮＡ９．２ｓ（Ｌ８Ａ〜Ｌ１２Ａ）、３’末端から数えて９塩基対（推定モチーフ）以内にある１つ、２つ、３つまたは６つの塩基が（推定９量体モチーフに混乱をきたすために）アデノシンまたはウリジンで置換された一連のＲＮＡ９．２ｓ誘導体、または２つのＲＮＡ９．２ｓ短縮物（いずれもＲＮＡ９．２ｓの３’末端の推定９量体モチーフを含む１６量体または１２量体）ならびに配列内に推定９量体モチーフを２回含む１９量体ＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＤＲ）でＰＤＣをトランスフェクトした。使用したすべての配列の詳細については表２に示す。４名の個別ドナーからの結果を平均値±ＳＥＭとして示す。
【図４】ｓｉＲＮＡＴＬＲ９．２のセンス鎖およびアンチセンス鎖のＬＮＡ修飾から、ｓｉＲＮＡのＩＦＮ−α誘導およびサイレンシングが２つの独立した活性であることが明らかになったことを示す図。  ＰＤＣを種々のＲＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。３６時間後、上清中のＩＦＮ−α産生を測定した。  Ａ：ＴＬＲ９．２のセンス鎖（ＲＮＡ９．２ｓ）とその５’末端および３’末端にＬＮＡ修飾を有する、または有しない誘導体（ｎ、５’ＬＮＡ、３’ＬＮＡ、５’３’ＬＮＡ）を比較したもの（表２を参照）。  Ｂ：ｓｉＲＮＡ９．２のセンスおよびアンチセンス鎖を様々にＬＮＡ修飾したものを二本鎖にアニールし、ＰＤＣにトランスフェクトした。３６時間後、上清中のＩＦＮ−α産生を測定した（黒色バー）。５名の個別ドナーからの結果を平均値±ＳＥＭで示す。さらに、Ｃ末端ＹＦＰタグを有するヒトＴＬＲ９の構築物を安定に発現しているＨＥＫ２９３細胞を、同じタイプのｓｉＲＮＡ９．２誘導体でトランスフェクトした。ＧＦＰ、ＴＬＲ２またはＴＬＲ４のｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖によるトランスフェクションを対照とした。トランスフェクションから２０時間後、ＹＦＰタグ発現の平均蛍光強度をフローサイトメトリーによって解析した（白抜きバー）。データは、ｓｉＲＮＡ２．１を１００％、非修飾ｓｉＲＮＡ９．２を０％としたときのＴＬＲ９発現の割合（％）で示している。結果は、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３）で示されている。
【図５Ａ】マウスｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｓｉＲＮＡによる全身免疫応答の配列依存性誘導を示す図。  Ａ：マウス骨髄培養物（１２９Ｓｖ）を、ｓｉＲＮＡ  ＴＬＲ９．２の二本鎖、センス鎖もしくはアンチセンス鎖または１９量体ポリ（Ａ）オリゴヌクレオチドをポリカチオン性ペプチドと複合化したもので刺激した。ＯＤＮ１８２６（６μｇ／ｍＬ）およびＲ８４８（１Ｈ−イミダゾ（４，５−ｃ）キノリン−１−エタノール（エトキシメチル）−α；０．５μｇ／ｍＬ）を陽性対照とした。３６時間後、上清を回収し、ＩＦＮ−α産生をＥＬＩＳＡによって評価した。データは、マウス３個体の骨髄培養物をプールしたものの３連実験の平均値±ＳＥＭとして示す。
【図５Ｂ】マウスｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｓｉＲＮＡによる全身免疫応答の配列依存性誘導を示す図。  Ｂ：５μｇのｓｉＲＮＡ  ＴＬＲ２．１、ＴＬＲ９．２、または一本鎖ＴＬＲ９．２ａ（センス鎖）またはＴＬＲ９．２ａｓ（アンチセンス鎖）をＤＯＴＡＰと複合体化し、静脈注射によって１２９Ｓｖマウス（１群につき３個体）に投与した。ＲＮＡを含まないＤＯＴＡＰを対照として含めた。７時間後、血清を回収し、ＩＦＮ−α産生をＥＬＩＳＡによって評価した。データは平均値±ＳＥＭとして示す。
【図５Ｃ】マウスｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｓｉＲＮＡによる全身免疫応答の配列依存性誘導を示す図。  Ｃ：注射から４１時間後、脾臓細胞を単離し、抗ＣＤ３、抗ＣＤ８、抗ＣＤ１１ｂおよび抗ＣＤ１１ｃ抗体を用いて、脾臓細胞中のＣＤ８＋Ｔ細胞およびＭＤＣを同定した。ＣＤ６９またはＣＤ８６発現を、適当なアイソタイプの対照抗体を用いて評定した。１群につき３個体のマウスからの結果を平均値±ＳＥＭとして示す。
【図５Ｄ】マウスｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｓｉＲＮＡによる全身免疫応答の配列依存性誘導を示す図。  Ｄ：ＤＯＴＡＰと複合化した、または複合体化していないｓｉＲＮＡ  ＴＬＲ９．２、ＣｐＧ  ＯＤＮ１８２６（いずれも５μｇ）またはＨＢＳを、静脈注射によって１２９Ｐ２／ＯｌａＨｓｄマウス（１群につき３個体）に投与した。１８時間後、血清を回収し、ＩＦＮ−α産生をＥＬＩＳＡによって評価した（左パネル）。さらに、注射から４１時間後に、脾臓ＭＤＣ上でのＣＤ８６発現を分析した（右パネル）。データは平均値±ＳＥＭとして示す。
【図６Ａ】ｓｉＲＮＡ認識にはＴＬＲ７が必要であることを示す図。  Ａ：野生型（黒色バー）またはＴＬＲ７−／−（白抜きバー）のＣ５７ＢＬ／６マウスからの骨髄培養物を、ｓｉＲＮＡ  ＴＬＲ９．２とともに、ＴＬＲ９．２のセンス鎖またはアンチセンス鎖とともに、またはポリカチオン性ペプチドと複合化した１９量体ポリ（Ａ）オリゴヌクレオチドとともにインキュベートした。ＣｐＧ  ＯＤＮ１８２６（ＴＬＲ９）およびロキソリビン（ＴＬＲ７）をそれぞれ６μｇ／ｍＬまたは０．５μｇ／ｍＬの濃度で使用した。刺激から３６時間後、上清を回収し、ＩＦＮ−α産生をＥＬＩＳＡによって評定した。データは、２個体のマウスからプールした骨髄培養物の３連実験の平均値±ＳＥＭとして示す。
【図６Ｂ】ｓｉＲＮＡ認識にはＴＬＲ７が必要であることを示す図。  Ｂ：５μｇのｓｉＲＮＡ  ＴＬＲ９．２をＤＯＴＡＰと複合体化し、野生型（黒色バー）またはＴＬＲ７−／−（白抜きバー）のＣ５７ＢＬ／６マウスのいずれかに静脈注射した。１群につき２匹のマウスを用いた。７および１８時間後、血清を回収し、ＩＦＮ−α産生をＥＬＩＳＡによって評定した。
【図６Ｃ】ｓｉＲＮＡ認識にはＴＬＲ７が必要であることを示す図。  Ｃ：注射から４１時間後、脾臓細胞を単離した。抗ＣＤ３および抗ＣＤ８抗体を用いることにより、脾臓細胞中のＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞を同定した。適当なアイソタイプの対照抗体を用いてＣＤ６９発現を評定した（灰色バー）。ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する１つの代表的なヒストグラムを示す。ＰＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋，ＣＤ１１ｂ−およびＢ２２０＋＋）および骨髄樹状細胞（ＭＤＣ：ＣＤ１１ｃ＋＋，ＣＤ１１ｂ＋＋およびＢ２２０−）上でのＣＤ６９またはＣＤ８６の発現を分析した。ＣＤ６９およびＣＤ８６の発現は平均値±ＳＥＭとして示されている。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【配列表】
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