(57)【要約】  本発明は、Eph受容体に免疫特異的に結合する新規のFc変異体に関する。このFc変異体は、Eph受容体に免疫特異的に結合する結合領域と、エフェクター機能の増強をもたらしうる少なくとも１個の新規アミノ酸残基をさらに含むFc領域とを含む。さらに具体的には、本発明は、１以上のFcリガンド（例えば、FcγR、C1q）に対し、変更された結合親和性を有するFc変異体を提供する。さらに、本発明のFc変異体は、改変された抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）および／または補体依存性細胞傷害（CDC）活性を有する。本発明はさらに、特に治療を目的とする、Eph受容体に免疫特異的に結合する前記Fc変異体の適用のための方法およびプロトコルを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
IgG1 Fc領域を含む抗体であって、該Fc領域が、Kabatに記載されたEU指数によって番号付けされた少なくとも高エフェクター機能アミノ酸残基332Eを含み、ここで、少なくとも高エフェクター機能アミノ酸残基332Eを含む該抗体が、少なくとも高エフェクター機能アミノ酸残基332Eを含まない同じ抗体と比較して、１以上のFcγRに対し改変された結合親和性を有する、上記抗体。
【請求項２】
前記Fc領域が、Kabatに記載されたEU指数によって番号付けされた少なくとも高エフェクター機能アミノ酸残基239Dおよび330Lを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記高エフェクター機能アミノ酸残基が、234E、235R、235A、235W、235P、235V、235Y、236E、239D、265L、269S、269G、298I、298T、298F、327N、327G、327W、328S、328V、329H、329Q、330K、330V、330G、330Y、330T、330L、330I、330R、330C、332E、332H、332S、332W、332F、332D、および332Yからなる群より選択され、ここで、番号付けの方式は、Kabatに記載されたEU指数によるものである、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記１以上のFcγRに対し改変された結合親和性が、少なくとも高エフェクター機能アミノ酸残基332Eを含まない同じ抗体と比較して、増加している、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記FcγRがFcγRIIIAである、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
前記FcγRがFcγRIIBである、請求項４に記載の抗体。
【請求項７】
前記１以上のFcγRに対し改変された結合親和性が、少なくとも高エフェクター機能アミノ酸残基332Eを含まない同じ抗体と比較して、低減している、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
FcγRIIIAに対する結合の平衡解離定数（KD）が、少なくとも高エフェクター機能アミノ酸残基332Eを含まない同じ抗体と比較して、少なくとも２分の1に低減している、請求項５に記載の抗体。
【請求項９】
FcγRIIIAに対する結合の平衡解離定数（KD）が、少なくとも高エフェクター機能アミノ酸残基332Eを含まない同等の分子と比較して、少なくとも70分の1に低減している、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
前記FcγRIIIAに対し増加した親和性により、少なくとも高エフェクター機能アミノ酸残基332Eを含まない同等の分子と比較して、増強されたADCC活性をもたらす、請求項５に記載の抗体。
【請求項１１】
前記増強されたADCC活性が、少なくとも高エフェクター機能アミノ酸残基332Eを含まない同じ抗体と比較して、少なくとも２倍高い、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体が、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、CDR移植抗体、もしくはキメラ抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１３】
前記抗体が、EphA1、EphA2、EphA3a、EphA3b、EphA4、EphA5a、EphA5b、EphA6、EphA7、EphA8、EphB1、EphB2a、EphB2b、EphB3、EphB4およびEphB6からなる群より選択される、少なくとも１つのEph受容体に結合する、請求項12に記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体が、Eph受容体EphA2に結合する、請求項12に記載の抗体。
【請求項１５】
前記抗体が、Eph受容体EphA4に結合する、請求項12に記載の抗体。
【請求項１６】
前記抗体可変配列が、配列番号68および69を含む、請求項12に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体が、検出可能な剤、治療薬もしくは薬剤と結合している、請求項12に記載の抗体。
【請求項１８】
（a）抗体コード領域を単離し；（b）この単離した抗体コード領域の前記Fc領域に１以上の所望の置換を行うことを含む、請求項１に記載の抗体の作製方法。
【請求項１９】
１以上の高エフェクター機能アミノ酸残基を含む前記Fc領域をコードするベクターに、可変領域をサブクローニングすることを含む、請求項１に記載の抗体の作製方法。
【請求項２０】
薬学的に許容される賦形剤に、治療に有効な量の請求項１に記載の抗体を含む製剤。
【請求項２１】
必要とする患者に、請求項20に記載の製剤を投与することにより、癌を改善、治療もしくは予防する方法。
【請求項２２】
前記癌が、頭部、頸部、眼、口、咽喉、食道、胸部、骨、肺、結腸、直腸、結腸直腸、胃、脾、腎臓、骨格筋、皮下組織、転移性黒色腫、子宮内膜、前立腺、乳房、卵巣、精巣、皮膚、甲状腺、血液、リンパ節、腎臓、肝臓、膵臓、脳もしくは中枢神経系の癌である、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記投与が、経口、非経口、筋内、鼻内、膣内、直腸、舌、舌下、頬側、口腔内、静脈内、皮膚、皮下もしくは経皮投与である、請求項21に記載の方法。
【請求項２４】
他の治療法、例えば、化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、免疫療法もしくは放射線療法と組み合わせて、前記製剤を投与することをさらに含む、請求項21に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願についてのクロス・リファレンス
本出願は、以下の米国仮出願番号：60/601,634（2004年８月16日出願）および60/608,852（2004年９月13日出願）の35 U.S.C.§119(e)に従う利益を請求する。優先権出願は、すべての目的のために本明細書にその全文を参照として組み込む。
【０００２】
２．発明の分野
本発明は、少なくとも１つの抗体結合領域と、本発明の少なくとも１つの新規アミノ酸残基をさらに含むFc領域とを含む新規の抗体を提供する。本発明はまた、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合する可変領域、またはそのフラグメントと、少なくとも１つの高エフェクター機能アミノ酸残基をさらに含むFc領域とを含む新規の抗体に関する。本発明はさらに、そのFc領域に１以上の置換を含む、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合する抗体の新規の変異体に関する。本明細書では、これらの新規の抗体を総称的に「本発明のFc変異体」または「Fc変異体」と呼ぶ。一実施形態では、本発明のFc変異体は、増強されたエフェクター機能を有する。別の実施形態では、本発明のFc変異体は、１以上のFcリガンドに対し、改変された結合親和性を有する。別の実施形態では、本発明のFc変異体は、FcγRIIIAとの結合が増強され、かつ、抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）を仲介する能力が高められている。別の実施形態では、Fc変異体は、FcγRIIIAとの結合が低減され、ADCC（本明細書では「ADCC活性」と呼ぶ）を仲介する能力が低減されている。さらに別の実施形態では、Fc変異体は、C1qとの結合が増強され、補体依存性細胞傷害（CDC）を仲介する能力が高められている。別の実施形態では、C1qとの結合が低減され、CDCを仲介する能力が低減されている。特に、本発明は、１以上のEph受容体に結合することができるFc変異体に関する。加えて、本発明は、特に治療を目的とする、Fc変異体の適用または使用のための方法およびプロトコルを提供する。具体的には、本方法およびプロトコルは、単独で、あるいは、Eph受容体仲介（および／またはエフリン仲介）および／または関連の疾患および障害もしくは１以上のそれらの症状（限定するものではないが、癌、炎症性疾患および自己免疫疾患など）の治療および／または予防に有用な１以上の他の治療法の投与と組み合わせて、予防または治療に有効な量の１以上のFc変異体を投与することを含む。治療目的で用いるFc変異体は、１成分（例えば、治療薬剤または薬剤）と結合または融合させても、させなくてもよい。本発明の方法は、特に、様々な形態の癌の予防、管理、治療に有用である。本発明はまた、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合する抗体をスクリーニングする方法、ならびに、Fc領域を操作し、これにより、該Fc領域がADCCおよび／またはCDC活性を仲介する能力、および／または１以上のFcリガンドに対する結合親和性をモジュレートする方法も提供する。本発明はまた、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体融合物を作製する方法も提供する。さらに、本発明は、Eph受容体仲介（および／またはエフリン仲介）および／または関連の疾患および障害もしくは１以上のそれらの症状（限定するものではないが、癌、炎症性疾患および自己免疫疾患など）の予防、管理、治療もしくは改善に使用するための医薬製剤およびキットを提供する。
【背景技術】
【０００３】
３．発明の背景
３．１  癌
新生物、すなわち、腫瘍は、異常な非制御細胞増殖によって生じる新生物塊であり、良性および悪性の両方がある。良性腫瘍は一般に局在した状態を維持する。悪性腫瘍は総称的に癌と呼ばれる。「悪性」という用語は、一般に、腫瘍が隣接する身体構造に侵入して、これを破壊し、遠位の部位まで広がって死に至らしめることを意味する（詳しくは、RobbinsおよびAngenll, 1976, Basic Pathology, 第２版、W.B. Saunders Co., フィラデルフィア、pp. 68-122参照）。癌は身体の様々な部位に起こる可能性があり、その起源によって異なる挙動を呈する。癌細胞は、それが発生した身体の部分を破壊した後、身体の他の部分に広がり、そこで新たな増殖を開始し、さらなる破壊を引き起こす。
【０００４】
毎年120万以上のアメリカ人が癌を発症している。癌は、米国における第２位の死亡原因であり、もし現在の傾向が続けば、2010年までに癌が第１位の死亡原因になることが予想される。米国では男性の死亡原因となる主な癌は肺癌および前立腺癌である。また、米国人女性の死亡原因となる主な癌は肺癌および乳癌である。２人に１人の米国人男性が生涯のある時期に癌と診断されることになる。また、３人に１人の米国人女性が生涯のある時期に癌と診断されることになる。
【０００５】
信頼できる癌の治療法はまだみつかっていない。現在の治療方法、例えば、外科手術、化学療法および放射線療法は、往々にして無効であったり、あるいは深刻な副作用をもたらしたりする。
【０００６】
３．２  転移
癌の最も生命を脅かす形態は、腫瘍細胞の集団が身体の遠位および異質部位にコロニー化する能力を獲得するときに発生する。これらの転移細胞は、異なる組織への細胞コロニー化を通常抑制している制限をオーバーライドする（overriding）ことにより、生存する。例えば、典型的な乳房上皮細胞は、肺に移植しても一般に増殖または生存しないが、肺転移は、乳癌罹患および致死の主な原因である。近年の証拠から、身体への転移細胞の播種は、原発性腫瘍の臨床上の出現よりはるかに前に起こりうることが示唆されている。これらの微小転移細胞は、原発性腫瘍の検出および除去後何ヶ月または何年もの間潜伏したままの場合もある。従って、異質微小環境における転移細胞の増殖および生存を可能にする作用機構をよりよく理解することが、転移性癌を克服するために設計した治療法、ならびに、転移の早期発見および位置決定のための診断の改善に重要である。
【０００７】
３．３  癌細胞シグナル伝達
癌は異常シグナル伝達の疾患である。異常シグナル伝達は、細胞増殖および生存に関する足場依存性制約をオーバーライドする（Rhimら、Critical Reviews in Oncogenesis 8:305, 1997；Patarca, Critical Reviews in Oncogenesis 7:343, 1996；Malikら、Biochimica et Biophysica Acta 1287:73, 1996；Canceら、Breast Cancer Res Treat 35:105, 1995）。チロシンキナーゼ活性は、EMC足場により誘導され、実際に、チロシンキナーゼの発現または機能は通常、悪性細胞で増大する（Rhimら、Critical Reviews in Oncogenesis 8:305, 1997；Canceら、Breast Cancer Res Treat 35:105, 1995；Hunter, Cell 88:333, 1997）。チロシンキナーゼ活性が悪性細胞増殖に必要であるという証拠に基づき、新しい治療法では、チロシンキナーゼが標的とされている（Levitzkiら、Science 267:1782, 1995；Kondapakaら、Molecular & Cellular Endocrinology 117:53, 1996；Fryら、Current Opinion in BioTechnology 6: 662, 1995）。残念なことに、腫瘍細胞の特異的ターゲッティングに伴う障害により、これら薬剤の適用は往々にして制限される。特に、チロシンキナーゼ活性は、良性組織の機能および生存に必要であることが多い（Levitzkiら、Science 267:1782, 1995）。側副毒性を最小限にするため、腫瘍細胞に選択的に過剰発現するチロシンキナーゼを同定し、標的とすることが重要である。
【０００８】
３．４  受容体チロシンキナーゼのEphファミリー
受容体のEphファミリーは、受容体チロシンキナーゼ（RTK）の最大のファミリーである。Eph受容体、ならびにそれらの膜結合エフリンリガンドは、細胞接着、形状および移動性を調節する細胞間連絡の重要なメディエーターである。Eph RTKシグナル伝達事象は、特に神経系において胚発生の様々な面を制御する（詳しくは、Kullanderら、2002, Nat, Rev. Mol. Cell Biol. 3:473およびMamlingら、2002, Trends Biochem Sci 27:514-520参照）。EPHサブファミリーにおける受容体は、典型的に、単一キナーゼドメインと、Cysの豊富なドメインおよび２つのフィブロネクチンIII型反復配列を含む細胞外領域とを有する（図18参照）。エフリン受容体は、その細胞外ドメイン配列、およびエフリンＡおよびエフリンＢリガンドに結合するその親和性の類似性に基づいて、２つの群に分けられる。エフリン受容体の多くのメンバーは、癌の発生および進行の重要なマーカーおよび／または調節因子として同定されている（例えば、Thakerら、2004, Clin. Cancer Res. 10:5145; Fox BPら、2004, Biochem. Biophys. Res. Commun. 318:882；Nakadaら、2004, Cancer Res. 64:3179；Coffmanら、2003, Cancer Res. 63:7907；また、Dodeletら、2000, Oncogene 19:5614の総説も参照）。癌に関与することが知られるEph受容体のうち、EphA2およびEphA4の役割および発現パターンが最もよく特性決定されているものとして挙げられる。
【０００９】
EphA2は成体の上皮に発現するが、そこでは、EphA2は少量しか存在せず、細胞間接着の部位内で豊富である（Zantekら、1999, Cell, Growth & Diff 10:629；Lindbergら、1990, Mol & Cell Biol 10:6316）。この細胞下局在化は、EphA2が、細胞膜に固定したエフリンA1〜A5に結合するため、重要である（Eph Nomenclature Committee, 1997, Cell 90:403；Galeら、1997, Cell & Tissue Res 290:227）。リガンド結合の主要な結果は、EphA2自己リン酸化（Lindbergら、1990、前掲）である。しかし、他の受容体チロシンキナーゼとは違い、EphA2は、リガンド結合またはホスホチロシン含有物の非存在下で酵素活性を保持する（Zantekら、1999、前掲）。EphA2およびエフリンA1は、乳癌、前立腺癌、結腸癌、皮膚癌および食道癌など、非常に多種の腫瘍の形質転換細胞においてアップレギュレートされる（Ogawaら、2000, Oncogene 19:6043；Zelinskiら、2001, Cancer Res 61:2301；Walker-Danielsら、1999, Prostate 41:275；Eastyら、1995, Int J Cancer 60: 129；Nemotoら、1997, Pathobiology 65:195）。
【００１０】
EphA4は、脳、心臓、肺、筋肉、腎臓、胎盤、膵臓（Foxら、1995, Oncogene 10:897）およびメラノサイト（Eastyら、1997, Int, J. Cancer 71:1061）に発現する。EphA4は、エフリンA1、A2、A3、A4、A5、B2およびB3（Pasquale, 1997, Curr. Opin. in Cell Biology 9:608）、また、リガンドB61、AL1/RAGS, LERK4、Htk-L、およびElk-L3（Martoneら、1997, Brain Research 771:238）に結合する。リガンド結合により、チロシン残基でのEphA4自己リン酸化が起こる（Ellisら、1996, Oncogene 12:1727）。EphA4チロシンリン酸化は、Src相同性2/3（SH2/SH3）ドメインをもつタンパク質に対する結合領域、例えば、細胞質チロシンキナーゼp59fynを形成する（Ellisら、前掲；Chengら、Cytokine and Growth Factor Reviews 13:75, 2002）。アフリカツメガエル胚でのEphA4の活性化により、カドヘリン依存性細胞接着の喪失が起こる（Winningら、Differentiation 70:46, 2002；Chengら、前掲）が、これは、腫瘍血管新生におけるEph4の役割を示唆している。しかし、癌進行におけるEph4の役割は不明である。Eph4は、乳癌、食道癌、および膵臓癌においてアップレギュレートされるようである（Kuangら、Nucleic Acids Res. 26:1116, 1998；Mericら、Clinical Cancer Res. 8:361, 2002；Nemotoら、Pathobiology 65:195, 1997；Logsdonら、Cancer Res. 63:2649, 2003）が、黒色腫組織ではダウンレギュレートされる（Eastyら、前掲）。
【００１１】
EphB2およびEphB4受容体はまた特定の腫瘍組織でも過剰発現する。EphB4過剰発現は、主として高い悪性度２の浸潤性腺管乳癌に認められる（Berclazら、1996, Biochem Biophys Res Commun 226:869）のに対し、EphB2は、大部分の胃腫瘍に過剰発現する（Kiynokawaら、1994, Cancer Res 54:3645）。両受容体は、多くの腫瘍細胞系にも過剰発現する（Berclazら、前掲；Kiynokawaら、前掲；Bennettら、1995, PNAS USA 92:1866）。EphB2およびEphB4は、結腸癌組織においてもアップレギュレートされる（Liuら、2002, Cancer 94:934；Stephensonら、2001, BMC Mol Biol 2:15）。さらに、EphB2およびEphB4は、胚における脈管発生に関して、また恐らくは腫瘍においても重要である（Wangら、1998, Cell 93:741；Gerety, S.S.ら、1999 Mol Cell 4:403）。
【００１２】
３．５  癌治療法
抗転移薬開発の障害の一つは、これらの薬剤を設計および評価するのに用いられるアッセイシステムであった。最も一般的な癌治療法は、急速に増殖する細胞を標的とすることである。しかし、癌細胞は、必ずしもより迅速に増殖するわけではなく、正常細胞に対しては非許容状態で生存し、増殖する（LawrenceおよびSteeg, 1996, World J. Urol. 14:124-130）。正常および悪性細胞の挙動のこのような基本的相違により、治療ターゲッティングの機会がもたらされる。微小転移腫瘍が身体全体にすでに広がっているというパラダイムは、異質および三次元微小環境に関して潜在的化学療法薬を評価する必要性を強調するものである。多くの標準的癌治療薬アッセイでは、典型的な細胞培養条件下（すなわち、単層増殖）で、腫瘍細胞増殖または生存を測定する。しかし、二次元アッセイでの細胞挙動は、in vivoでの腫瘍細胞挙動について信頼性の高い予測を提供しないことが多い。
【００１３】
現在、癌治療法として、患者における腫瘍細胞を根絶するための外科手術、化学療法、ホルモン療法および／または放射線治療が挙げられる（例えば、Stockdale, 1998, “Principles of Cancer Patient Management”, in Scientific American:  Medicine, 第３巻、RubensteinおよびFederman編、第12章、第IV節参照）。これら手法のすべてが患者に対し有意な問題を呈する。例えば、外科手術は、患者の健康状態により禁忌である場合や、患者が許容できない場合がある。加えて、外科手術は、腫瘍組織を完全に除去しないこともある。放射線療法は、腫瘍組織が、正常組織より高い感度を示す場合にしか有効ではなく、放射線療法はまた、往々にして深刻な副作用を誘発しうる。ホルモン療法は、単一の薬剤として投与されることはほとんどなく、有効な場合もあるが、他の治療法によって大部分の癌細胞を除去した後、癌の再発を予防するか、遅らせるために用いられることが多い。
【００１４】
化学療法に関しては、癌の治療に利用できる様々な化学療法薬がある。癌化学療法薬の大部分が、DNA合成を阻害することにより作用するものである（例えば、Gilmanら、Goodman and Gilman’s: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Eighth Ed. (Pergamom Press, New York, 1990)参照）。化学療法薬はそれ自体では、本来非特異的である。加えて、ほとんどの化学療法薬に毒性があるため、化学療法薬は、重度の吐気、骨髄減少、免疫抑制など、深刻で、しかも多くの場合危険な副作用を引き起こす（例えば、Stockdale, 1998, “Principles Of Cancer Patient Management” in Scientific American Medicine, 第３巻、RubensteinおよびFederman編、第12章、第10章参照）。さらに、化学療法薬を組み合わせて投与しても、多くの腫瘍細胞は化学療法薬に対して耐性であるか、耐性を形成する。
【００１５】
近年、癌療法には、生物学的療法または免疫療法も含まれるといえる。生物学的療法／免疫療法は数に限りがあり、化学療法薬より特異的であるが、その多くがいまだに健康な細胞と癌細胞の両方をターゲッティングしている。さらに、このような療法は、発疹または膨潤、インフルエンザ様症状（例えば、熱、悪感および疲労、消化管の問題もしくはアレルギー反応）のような副作用をもたらす可能性がある。
【００１６】
従って、従来のものに代わる癌治療法、特に、癌細胞をより特異的にターゲッティングする治療法が強く求められている。腫瘍細胞のマーカーとしてのEph受容体ファミリーのメンバーを同定すれば、これらを治療薬の有力な標的にすることができる。従って、Eph受容体ファミリーの１以上のメンバーを異常に発現する腫瘍細胞を特異的にターゲッティングし、破壊する癌治療法は、癌の治療および予防の強力な手段となるであろう。
【００１７】
３．６  癌治療のための抗体
抗体は、特定の抗原に結合する免疫タンパク質である。ヒトやマウスを含むほとんどの哺乳動物において、抗体は、対合した重および軽ポリペプチド鎖から構築されている。各々の鎖は、２つの異なる領域から構成され、これらは可変（Fv）領域および定常（Fc）領域と呼ばれる。軽および重鎖Fv領域は、分子の抗原結合決定基を含み、標的抗原の結合を担当する。Fc領域は、抗体（例えば、IgG）のクラス（またはイソタイプ）を決定し、多数の天然タンパク質と結合して、重要な生化学事象を誘発する役割を果たす。
【００１８】
抗体のFc領域は多数のリガンド（Fc受容体および他のリガンドを含む）と相互作用して、エフェクター機能と呼ばれる一連の重要な機能的能力を賦与する。IgGクラスに対しFc受容体の重要なファミリーはFcガンマ受容体（FcγR）である。これらの受容体は、抗体と、免疫系の細胞アームとの連絡を仲介する（Raghavanら、1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220；Ravetchら、2001, Annu Rev Immunol 19:275-290）。ヒトにおいて、このタンパク質ファミリーは、FcγRI（CID64）（FcγRIA、FcγRIBおよびFcγRICイソ型など）；FcγRII（CD32）（FcγRIIA、FcγRIIBおよびFcγRIICイソ型など）；FcγRIII（CD16）（FcγRIIIAおよびFcγRIIIBイソ型など）を含む（Jefferisら、2002, Immunol Lett 82:57-65）。これらの受容体は、典型的に、Fcとの結合を仲介する細胞外ドメイン、膜貫通領域、ならびに、細胞内の特定のシグナル伝達事象を仲介しうる細胞内ドメインを有する。これらの様々なFcγRサブタイプは、様々な細胞型に発現する（詳しくは、Ravetchら、1991, Annu Rev Immunol 9:457-492）。例えば、ヒトの場合、FcγRIIIBは好中球にしか存在しないが、FcγRIIIAはマクロファージ、単球、ナチュラルキラー（NK）細胞、ならびにＴ細胞の亜集団に存在する。
【００１９】
Fc／FcγR複合体の形成は、結合抗原の部位にエフェクター細胞をリクルートし、その結果、典型的には、細胞内にシグナル伝達事象、ならびに、続いて起こる重要な免疫応答、例えば、炎症仲介物質の放出、Ｂ細胞活性化、エンドサイトーシス、食作用、および細胞傷害が起こる。細胞傷害および食作用エフェクター機能を仲介する能力は、抗体が標的細胞を破壊する強力な作用機構である。FcγRを発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞に結合した抗体を認識した後、標的細胞の溶解を引き起こす細胞性反応を抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）と呼ぶ（Raghavanら、1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220；Ghetieら、2000, Annu Rev Immunol 18:739-766；Ravetchら、2001, Annu Rev Immunol 19:275-290）。特に、ADCCを仲介する主要細胞、すなわちNK細胞はFcγRIIIAだけを発現するのに対し、単球は、FcγRI、FcγRIIおよびFcγRIIIを発現する（Ravetchら、1991、前掲）。
【００２０】
もう一つの重要なFcリガンドは、補体タンパク質C1qである。C1qに結合するFcが、補体依存性細胞傷害（CDC）と呼ばれるプロセスを仲介する（詳しくは、Wardら、1995, Ther Immunol 2:77-94）。C1qは、６つの抗体に結合することができるが、補体カスケードを活性化するには、２つのIgGに結合すれば十分である。C1qは、C1rおよびC1sセリンプロテアーゼと複合体を形成し、補体経路のC1複合体を形成する。
【００２１】
抗体のいくつかの重要な特徴（限定するものではないが、標的に対する特異性、免疫エフェクター機構を仲介する能力、ならびに血清における半減期が長いことなど）により、抗体および関連免疫グロブリン分子は効力の高い治療薬となる。多数のモノクローナル抗体が現在開発中であり、また、癌を含む様々な状態を治療するための治療薬として用いられている。このような治療薬の例として、以下のものが挙げられる：Vitaxin（登録商標）（MedImmune）、ヒト化インテグリンαvβ3抗体（例：PCT公開WO2003/075957）、Herceptin（登録商標）（Genentech）、乳癌を治療するのに認可されたヒト化抗Her2/neu抗体（例：米国特許第5,677,171号）、CNTO 95（Centocor）、ヒトインテグリンαv抗体（PCT公開WO02/12501）、Rituxan（登録商標）（IDEC/Genetech/Roche）、非ホジキンリンパ腫を治療するのに認可されたキメラ抗CD20抗体（例：米国特許第5,736,137号）およびErbitux（登録商標）（ImClone）、キメラ抗EGFR抗体（例：米国特許第4,943,533号）。
【００２２】
抗体が腫瘍細胞を破壊するのに考えられる作用機構は多数あり、例えば、必要な成長経路の遮断による抗増殖、アポトーシスを引き起こす細胞内シグナル伝達、受容体のダウンレギュレーションおよび／または代謝回転の増強、ADCC、CDC、ならびに適応免疫応答の促進（Craggら、1999, Curr Opin Immunol 11:541-547；Glennieら、2000, Immunol Today 21:403-410）が挙げられる。しかし、広範な用途にもかかわらず、抗体は臨床上の使用に未だ最適化されておらず、その多くの抗癌効力は最適に満たないものである。従って、抗体が標的癌細胞を破壊する能力を増強する必要がある。ADCCおよびCDCのような細胞傷害性エフェクター機能を仲介する能力の増強により、抗体の抗腫瘍効力を高める方法は特に有望である。抗体の抗癌活性に関するFcγR仲介のエフェクター機能の重要性は、マウスで証明されており（Clynesら、1998, Proc Natl Acad Sci USA 95:652-656；Clynesら、Nat Med 6:443-446）、また、細胞アッセイにおいて、Fcと特定のFcγR間の相互作用の親和性は標的細胞傷害性と相関している（Shieldsら、2001, J. Biol Chem 276:6604；Prestaら、2002, Biochem Soc Trans 30:487-490；Shieldsら、2002, J. Biol Chem 277:26733-26740）。これらのデータを総合すると、IgG1抗体のFc領域が特定のFcγRと結合する能力を操作することにより、エフェクター機能を増強し、その結果、患者における癌細胞のより有効な破壊を達成できることを示唆している。さらに、FcγRは、抗原提示細胞による抗原取込みおよびプロセシングを仲介することができるため、Fc／FcγR親和性を増強すれば、抗体治療薬が適応免疫応答を誘発する能力を高めることもできる。
【００２３】
エフェクター機能の増強により、抗体が標的細胞を破壊する能力を増強することができるが、抗体治療によっては、エフェクター機能を低減または排除するのが望ましい場合もある。これは、特に、標的細胞に薬剤（例えば、毒素や同位体）を送達し、そこで、Fc／FcγR仲介のエフェクター機能が有害なペイロード（payload）の近傍に健康な免疫細胞をもたらし、これによって、標的細胞と一緒に正常なリンパ様組織を欠失させるように設計された抗体の場合に言えることである（Hutchinsら、1995, PNAS USA 92:11980-11984；Whiteら、2001, Annu Rev Med 52:125-145）。このような場合、補体またはエフェクター細胞をあまりリクルートしないFc変異体の使用が極めて有利である（例えば、Wuら、2000, Cell Immunol 200:16-26；Shieldsら、2001, J. Biol Chem 276:6591-6604；米国特許第6,194,551号；米国特許第5,885,573号およびPCT公開番号WO04/029207を参照）。
【００２４】
すべてのFcγRは、IgGサブクラスのFcの同じ領域に結合するが、それぞれの親和性は違っている（例えば、FcγRIは高親和性を有するのに対し、FcγRIIおよびFcγRIIIは低親和性バインダーである）。これ以外のFcγR同士の相違は機械論的である。例えば、FcγRI、FcγRIIA／CおよびFcγRIIIAは、免疫複合体が誘発した活性化の正の調節因子であり、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を有することを特徴とするが、FcγRIIBは免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ITIM）を有するため、阻害性である。従って、活性化および阻害性受容体同士の均衡を考慮することは重要である。例えば、負の調節因子FcγRIIBとFcの結合は不変のまま、もしくは低減させて、正の調節因子（例えば、FcγRIIIA）とFcの結合を増大することにより、最適化エフェクター機能、例えば、ADCC仲介による腫瘍細胞の破壊の増強を達成することができる。考慮すべきもう一つの重要な点は、FcγRおよび／またはC1qとの結合を所望の様式でモジュレートするが、その際、それらの安定性、溶解度、構造的一体性、ならびに、それらが他の重要なFcリガンド（例えば、FcRnや、プロテインＡおよびＧ）と相互作用する能力を維持するように、Fc変異体を作製しなければならないことである。
【００２５】
Fcドメインに関して多くの突然変異誘発研究が実施されてきた（例えば、Duncanら、1988, Nature 332:563-564；Lundら、1995, Faseb J 9:115-119；Lundら、1996, J Immunol 157:4963-4969；Armourら、1999, Eur J Immunol 29:2613-2624；Shieldsら、2001, J Biol Chem 276:6591-6604；Jefferisら、2002, Immunol Lett 82:57-65；Prestaら、2002, Biochem Soc Trans 30:487-490；米国特許第5,624,821号、第5,885,573号およびPCT公開番号WO 00/42072、WO 99/58572およびWO 04/029207参照）。大部分の置換は、FcγRとのFc結合を低減または除去するが、中にはFcγR親和性を高めるものもある。しかし、開示された方法のほとんどは、FcγRIIIA結合およびADCC活性にわずかな改善しかもたらしていない。本発明は、１以上のEph受容体に免疫特異的に結合する抗体の改変Fcを初めて提供し、このFcは、FcγRIIIAとの結合を増大して、ADCCを有意に増強し、しかもFcγRIIB結合の増大を示さない。
【００２６】
参照文献の引用または記述は、これらが本発明の先行技術であるとの承認と解釈すべきではない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２７】
４．発明の概要
本発明は、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性のフラグメントと、本発明の少なくとも１つの新規アミノ酸残基（本明細書では「高エフェクター機能アミノ酸残基」とも呼ぶ）をさらに含むFc領域とを含む新規の抗体を提供する。この新規抗体は、本明細書において「本発明のFc変異体」または「Fc変異体」もしくは「改変抗体」と称する。Fc結合相互作用は、多様なエフェクター機能、ならびに、下流のシグナル伝達事象、限定するものではないが、抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）および補体依存性細胞傷害（CDC）に必須である。従って、本発明は、本発明の分子と同じアミノ酸配列を有するが、本発明の新規アミノ酸残基を含まない抗体（本明細書では「同等分子」と呼ぶ）、例えば、Fcドメインの対応位置に天然に存在するアミノ酸残基を含む非改変Fc領域を含んでなる抗体と比較して、少なくとも１以上のFcリガンド（例えば、FcγR、C1q）に対する改変された結合親和性を呈示するFc変異体を提供する。加えて、本発明は、１以上のEph受容体に免疫特異的に結合する可変領域、またはそのフラグメントと、少なくとも１つの高エフェクター機能アミノ酸残基を含む新規のFc変異体を提供する。
【００２８】
本発明は、さらに、１以上のEph受容体に免疫特異的に結合する抗体のFc変異体を提供し、該Fc変異体は、少なくとも１つのアミノ酸残基が置換されたFc領域を含んでいる。具体的に、上記Fc変異体は、当業者には周知の方法により作製することができると考えられる。手短に言えば、このような方法として、所望の特異性を有する可変領域（例えば、ファージ展示または発現ライブラリーから単離した、もしくはヒトまたは非ヒト抗体由来の可変領域）と、少なくとも１つの高エフェクター機能アミノ酸残基を含むFc領域を結合させるものがある。あるいは、当業者は、抗体のFc領域における少なくとも１つのアミノ酸残基を置換することによりFc変異体を作製することも可能である。
【００２９】
本発明はまた、同等分子（例えば、本来の非改変Fc領域を有する抗体）と比較して、１以上のFcリガンド（例えば、FcγR、C1q）に対する結合親和性が改変されたFc変異体を提供する。一実施形態では、同等分子（例えば、本来の非改変Fc領域を有する抗体）と比較して、活性化FcγR（例えば、FcγRIIIA）に対する結合親和性が高い、および／または阻害性FcγR（例えば、FcγRIIIB）に対する結合親和性が不変または低減したFc変異体を提供する。本発明はさらに、同等分子（例えば、本来の非改変Fc領域を有する抗体）と比較して、ADCC機能を増強したFc変異体を提供する。別の実施形態では、本発明のFc変異体について、同等分子（例えば、本来の非改変Fc領域を有する抗体）と比較して、前述したFcγR親和性の改変に加え、ADCCを仲介する能力（本明細書では「ADCC活性」と呼ぶ）が増強されている。さらに別の実施形態では、本発明のFc変異体は、１以上のEph受容体に免疫特異的に結合する抗体の変異体である。別の実施形態では、本発明のFc変異体は、その抗原結合特異性が有意に改変されていない。
【００３０】
本発明はまた、同等分子（例えば、本来の非改変Fc領域を有する抗体）と比較して、活性化FcγR（例えば、FcγRIIIA）に対する結合親和性が低減した、および／または阻害性FcγR（例えば、FcγRIIIB）に対する結合親和性が増大したFc変異体を提供する。本発明はさらに、同等分子（例えば、本来の非改変Fc領域を有する抗体）と比較して、ADCC活性が低減したFc変異体を提供する。別の実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子（例えば、本来の非改変Fc領域を有する抗体）と比較して、前記FcγR親和性の改変に加え、低減したADCC活性を呈示する。別の実施形態では、本発明のFc変異体は、１以上のEph受容体に免疫特異的に結合する抗体の変異体である。さらに別の実施形態では、本発明のFc変異体は、抗原結合特異性が有意に改変されいない。
【００３１】
本発明はさらに、同等分子（例えば、本来の非改変Fc領域を有する抗体）と比較して、補体タンパク質C1qに対する結合親和性が改変されたFc変異体を提供する。一実施形態では、上記Fc変異体は、C1qに対する結合親和性が増強され、かつ、CDCを仲介する能力（本明細書では「CDC活性」と呼ぶ）が増強されている。別の実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子（例えば、本来の非改変Fc領域を有する抗体）と比較して、C1qに対する結合親和性が低減し、かつCDC活性が低下している。さらに別の実施形態では、本発明のFc変異体は、１以上のEph受容体に免疫特異的に結合する抗体の変異体である。
【００３２】
具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、234E、235R、235A、235W、235P、235V、235Y、236E、239D、265L、269S、269G、298I、298T、298F、327N、327G、327W、328S、328V、329H、329Q、330K、330V、330G、330Y、330T、330L、330I、330R、330C、332E、332H、332S、332W、332F、332D、および332Yからなる群より選択される少なくとも１個の高エフェクター機能アミノ酸残基を含むFc領域を含んでなり、ここで、上記の番号付けの方式は、Kabatら（1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service；バージニア州スプリングフィールド）により記載されたEU指数に従う。
【００３３】
別の具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、239D、330K、330V、330G、330Y、330T、330L、330I、330R、330C、332E、332H、332S、332W、332F、332D、および332Yからなる群より選択される少なくとも１個の高エフェクター機能アミノ酸残基を含むFc領域を含んでなり、ここで、上記の番号付けの方式は、Kabatらにより記載されたEU指数に従う。
【００３４】
さらに別の具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、239D、330Lおよび332Eからなる群より選択される少なくとも１個の高エフェクター機能アミノ酸残基を含むFc領域を含んでなる。一実施形態では、本発明のFc変異体は、少なくとも１個の高エフェクター機能アミノ酸残基332Eを含むFc領域を含んでなる。具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、高エフェクター機能アミノ酸残基239D、330Lおよび332Eを含むFc領域を含んでなる。
【００３５】
一実施形態では、本発明のFc変異体は、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、239、242、246、250、251、257、259、260、261、265、269、273、274、275、277、281、282、284、287、291、298、300、302、304、306、308、310、314、316、318、319、321、323、327、328、329、330、332および336からなる群より選択される位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ここで、上記の番号付けの方式は、Kabatらにより記載されたEU指数に従う。
【００３６】
具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、L234E、L235R、L235A、L235W、L235P、L235V、L235Y、G236E、S239D、D265L、E269S、E269G、S298I、S298T、S298F、A327N、A327G、A327W、L328S、L328V、P329H、P329Q、A330K、A330V、A330G、A330Y、A330T、A330L、A330I、A330R、A330C、I332E、I332H、I332S、I332W、I332F、I332D、およびI332Yからなる群より選択される少なくとも１つの置換を含み、ここで、上記の番号付けの方式は、Kabatらにより記載されたEU指数に従う。一実施形態では、上記Fc変異体は、S239D、A330LおよびI332Eからなる群より選択される少なくとも１つの置換を含む。別の実施形態では、Fc変異体は、次の置換：S239D、A330LおよびI332Eのうち少なくとも１つを含む。さらに別の実施形態では、Fc変異体は、少なくともアミノ酸置換I332Eを含む。
【００３７】
本発明の目的は、１以上のFcリガンド（例えば、FcγR、C1q）と、高い結合親和性で結合するFc変異体を提供することである。一実施形態では、上記変異体は、同等分子（例えば、Fc改変前の抗体）と比較して、１以上のFcリガンド（例えば、FcγR、C1q）に対し少なくとも２倍高い親和性を有する。さらに別の実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子（例えば、Fc改変前の抗体）と比較して、Fcリガンド（例えば、FcγR、C1q）に対し２倍〜500倍高い親和性を有する。一具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、FcγRIIIAに対し高い親和性を有する。別の具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、FcγRIIBに対し高い親和性を有する。さらに別の具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、C1qに対し高い親和性を有する。
【００３８】
本発明の目的はまた、１以上のFcリガンド（例えば、FcγR、C1q）と、低い結合親和性で結合するFc変異体を提供することである。一実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子（例えば、Fc改変前の抗体）と比較して、１以上のFcリガンド（例えば、FcγR、C1q）に対し約２分の1〜約500分の1の低い親和性を有する。さらに別の実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子（例えば、Fc改変前の抗体）と比較して、１以上のFcリガンド（例えば、FcγR、C1q）に対し約２分の1〜約500分の1に低減した親和性を有する。一具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、FcγRIIBに対し、不変か、好ましくは低い親和性を有する。別の具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、FcγRIIIAに対し、低減した親和性を有する。さらに別の具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、C1qに対し、低減した親和性を有する。
【００３９】
さらに、本発明の目的は、増強したADCCおよび／またはCDC活性を有するFc変異体を提供することである。一実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子（例えば、Fc改変前の抗体）と比較して、少なくとも約２倍高いADCCおよび／またはCDC活性を有する。別の実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子と比較して、約２倍〜約100倍高いADCCおよび／またはCDC活性を有する。さらに別の実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子（例えば、Fc改変前の抗体）と比較して、少なくとも２倍高いADCCおよび／またはCDC活性を有する。別の実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子と比較して、２倍〜100倍高いADCCおよび／またはCDC活性を有する。
【００４０】
本発明の目的はまた、低減したADCCおよび／またはCDC活性を有するFc変異体を提供することである。一実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子（例えば、Fc改変前の抗体）と比較して、少なくとも約２分の1に低減したADCCおよび／またはCDC活性を有する。別の実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子と比較して、２分の１〜100分の１に低減したADCCおよび／またはCDC活性を有する。さらに別の実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子（例えば、Fc改変前の抗体）と比較して、少なくとも約２分の1に低減したADCCおよび／またはCDC活性を有する。別の実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子と比較して、２分の１〜100分の１に低減したADCCおよび／またはCDC活性を有する。
【００４１】
一具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、FcγRIIIAに対し高い親和性を、またFcγRIIBに対し、不変か、好ましくは低減した親和性を有し、かつ増強したADCC活性を有する。別の具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子と比較して、約２分の1〜約10分の１、または約５分の１〜約50分の１、もしくは約25分の１〜約250分の１、あるいは約100分の１〜約500分の１に低減した平衡解離定数（KD）を有する。さらに別の具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子と比較して、２分の１〜10分の１、または５分の１〜50分の１、もしくは25分の１〜250分の１、あるいは100分の１〜500分の１に低減した平衡解離定数（KD）を有する。別の具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子と比較して、低いFcγRIIIA/ FcγRIIB平衡解離定数（KD）の比と、増強したADCC活性を有する。
【００４２】
一実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子（例えば、Fc改変前の抗体）と比較して、FcγRIIIAに対し高い親和性、FcγRIIBに対し、不変か、好ましくは低い親和性、C1qに対し低い親和性、ならびに増強したADCC活性を有する。
【００４３】
別の実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子（例えば、Fc改変前の抗体）と比較して、FcγRIIIAに対し低い親和性、FcγRIIBに対し高い親和性、ならびに低減したADCC活性を有する。さらに別の具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子と比較して、高いFcγRIIIA/ FcγRIIB平衡解離定数（KD）の比と、低減したADCC活性を有する。
【００４４】
受容体のリガンドに対する結合特性は、当業者には周知の様々な方法により決定することができ、このような方法として、限定するものではないが、平衡方法（例：酵素結合イムノソルベント検定法（ELISA）または放射免疫測定法（RIA）、もしくは速度論（例：BIACORE（登録商標）分析）、ならびにその他の方法、例えば、間接結合アッセイ、競合阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー（例：ゲル濾過）がある。上記方法およびその他周知の方法では、１以上の被検成分に標識を用いてもよく、および／または限定するものではないが、色素源、蛍光、ルミネセンス、もしくは同位体標識などの様々な検出方法を使用してもよい。結合親和性および速度論についての詳細な説明は、抗体−免疫原相互作用を主題とするPaul, W.E.編、Fundamental Immunology, 第４版、Lippincott-Raven, フィラデルフィア（1999）を参照されたい。
【００４５】
本発明のFc変異体は、他のFc改変（例えば、他のアミノ酸置換、改変グリコシル化など）と組み合わせてもよく、このようなものとして限定するものではないが、Fcリガンド結合および／またはエフェクター機能を改変する変更が挙げられる。本発明は、本発明のFc変異体と、他のFc改変を組み合わせることにより、抗体またはFc融合物に付加的、相乗的、もしくは新しい特性を賦与することを包含する。好ましくは、他のFc改変により、それと組み合わせた本発明のFc変異体（例えば、少なくとも１個の高エフェクター機能アミノ酸を含むFc変異体）の表現型を増強する。例えば、Fc変異体（本発明のヒンジ改変を含む）と、野生型Fc領域を含む同等分子より親和性が高いFcγRIIIAに結合することが知られる突然変異体を組み合わせれば、FcγRIIIA親和性の大幅な増強が得られる。
【００４６】
本発明は、少なくとも１つのFc領域が本発明の少なくとも１つの高エフェクター機能アミノ酸を含む、Fc領域のホモ二量体またはヘテロ二量体を含有する分子を包含する。Fc領域を含むヘテロ二量体は、２本のFc鎖が異なる配列を有する分子を意味する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの高エフェクター機能アミノ酸および／またはその他のFc改変を含むFc領域を含んでなるヘテロ二量体分子において、各鎖は、他方の鎖とは異なる１以上の変更を有する。別の実施形態では、ヒンジ改変を含むFc領域を含んでなるヘテロ二量体分子において、１本の鎖は野生型Fc領域を含み、また他方の鎖は１以上の改変を含む。ヘテロ二量体Fc含有分子の作製方法は当業者には周知であり、本発明に含まれる。
【００４７】
一実施形態では、１以上のFcリガンド（例えば、FcγR、C1q）に対する結合親和性が変更され、かつ、ADCCおよび／またはCDC活性が改変された本発明のFc変異体は、１以上のEph受容体に免疫特異的に結合する。別の実施形態では、上記Fc変異体は、１以上のEph受容体のアンタゴニストである。１以上のEph受容体のアンタゴニストは、１以上のEph受容体の機能、活性および／または発現を阻止、阻害、低減もしくは中和するあらゆる分子である。アンタゴニストは、受容体のリガンドへの結合を妨害し、またその逆もしかりであり、リガンドにより活性化された細胞を無能力にするか、死なせることにより、および／または細胞受容体へのリガンドの結合後、受容体またはリガンド活性化（例えば、チロシンキナーゼ活性化）もしくはシグナル伝達を妨害することにより、作用すると考えられる。アンタゴニストは、受容体−リガンド相互作用を完全に阻止するか、あるいはこのような相互作用を実質的に低減することができる。従って、Eph受容体のアンタゴニストは、Eph受容体シグナル伝達を阻止することができる。
【００４８】
さらに別の実施形態では、本発明のFc変異体は、１以上のEph受容体のアゴニストである。Eph受容体のアゴニストは、Eph受容体の活性、活性化もしくは機能を増大することができるあらゆる分子である。アゴニストは、例えば、標的分子を活性化する、および／またはシグナル伝達を仲介することにより作用すると考えられる。好ましい実施形態では、上記Fc変異体は、前記のような１以上のEph受容体に免疫特異的に結合する抗体の変異体である。別のEph受容体特異的抗体は、PCT公開番号WO 04/014292、WO 03/094859ならびに米国特許出願番号10/863,729号に記載されている。尚、これら文献はすべて、参照としてその全文を本明細書に組み込むものとする。
【００４９】
一実施形態では、１以上のFcリガンド（例えば、FcγR、C1q）に対する結合親和性が変更され、かつADCCおよび／またはCDC活性が改変された本発明のFc変異体は、他の受容体チロシンキナーゼに比べ、１以上のEph受容体（例：EphA1、A2、A3a、A3b、A4、A5a、A5b、A6、A7、A8、B1、B2a、B2b、B3、B4およびB6）に優先的に結合する。一実施形態では、本発明のEph受容体は、限定するものではないが、「Eph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体」と題した第６．１節（後述）に記載されているもの、および図18に示すものを含む。別の実施形態では、本発明のFc変異体は、他のEph受容体より、EphA2に優先的に結合する。別の実施形態では、本発明のFc変異体はEphA2に結合しない。別の実施形態では、本発明のFc変異体は、他のEph受容体より、EphA4に優先的に結合する。さらに別の実施形態では、本発明のFc変異体はEphA4に結合しない。また別の実施形態では、本発明のFc変異体は、１以上のEph受容体と免疫反応する。別の実施形態では、本発明のFc変異体は、EphA4とEphA2の両方に結合する。さらに別の実施形態では、本発明のFc変異体は、EphA4とEphA2の両方に結合し、かつ、両者のアゴニストである。Fc変異体は、１以上のEph受容体に対し同じ免疫反応性を有してもよく、Fc変異体は、別の受容体より１つのEph受容体と強く免疫反応してもよい。具体的には、本発明のFc変異体は二重特異性抗体であることが考えられる。また、具体的には、本発明のFc変異体が、１以上のEph受容体が共有する共通エピトープに結合することも考えられる。
【００５０】
本発明はまた、１以上のFcリガンド（例えば、FcγR、C1q）に対する結合親和性が変更され、かつADCCおよび／またはCDC活性が改変された、１以上のEph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体であって、１成分（例えば、治療薬剤または薬剤）と結合または融合した上記Fc変異体も包含する。
【００５１】
本発明はさらに、１以上のFcリガンド（例えば、FcγR、C1q）に対する結合親和性が変更され、かつADCCおよび／またはCDC活性が改変された、１以上のEph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体の、Eph受容体仲介（および／またはエフリン仲介）および／または関連の疾患および障害もしくはそれらの１以上の症状（限定するものではないが、癌、炎症性疾患および自己免疫疾患など）の予防、管理、治療もしくは改善を目的とする、単独、またはその他の治療法と組み合わせた使用も包含する。本発明はまた、１以上のFcリガンド（例えば、FcγR、C1q）に対する結合親和性が変更され、かつADCCおよび／またはCDC活性が改変された、１以上のEph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体であって、１成分（例えば、治療薬剤または薬剤）と結合または融合した上記Fc変異体の、Eph受容体仲介および／または関連の疾患および障害もしくはそれらの１以上の症状（限定するものではないが、癌、炎症性疾患および自己免疫疾患など）の予防、管理、治療もしくは改善を目的とする、単独で、またはその他の治療法と組み合わせた使用も包含する。
【００５２】
本発明はさらに、１以上のFcリガンド（例えば、FcγR、C1q）に対する結合親和性が変更され、かつADCCおよび／またはCDC活性が改変された、１以上のEph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体の予防または治療効果を高める治療プロトコルも包含する。
【００５３】
本発明は、１以上のEph受容体に免疫特異的に結合する抗体の同定および／または作製方法を提供する。加えて、１以上のEph受容体に免疫特異的に結合し、１以上のEph受容体のアンタゴニストまたはアゴニストのいずれかである抗体のスクリーニングおよび同定方法、例えば、限定するものではないが、Eph受容体活性（例えば、細胞接着、血管新生、腫瘍細胞増殖および腫瘍進行）および／または血漿濃度をモニターするアッセイ方法を提供する。さらに、本発明は、このようなスクリーニング方法を用いて同定した抗体のADCCおよびCDC活性の両方またはいずれか、ならびにFcγRおよび／またはC1qに対する結合親和性を操作する方法も提供する。このような方法を用いて同定および操作した抗体は、Eph受容体仲介の疾患および障害もしくはそれらの１以上の症状（限定するものではないが、癌、炎症性および自己免疫疾患など）の予防、治療、管理もしくは改善のために、単独で、またはその他の治療法と組み合わせて用いることができる。
【００５４】
本発明は、Eph受容体仲介および／または関連の疾患および障害（限定するものではないが、癌、炎症性および自己免疫疾患など）の予防、治療、管理、改善、検出、モニタリングもしくは診断を目的として使用するための、１以上のFcリガンド（例えば、FcγR、C1q）に対する結合親和性が変更され、かつADCCおよび／またはCDC機能が改変された、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体であって、検出可能な薬剤、治療薬剤もしくは薬剤と結合または融合した１以上の上記Fc変異体を１以上の容器中に含むキットを提供する。
【００５５】
５．図面の簡単な説明
（後述の図面の簡単な説明を参照のこと。）
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
６．発明の詳細な説明
本発明は、高エフェクター機能と相関するIgG抗体のFc領域における特定のアミノ酸残基を提供する。さらに、本発明は、Fc受容体であるFcγRIIIAに対し高い結合親和性を呈示する抗体のFc領域における高エフェクター機能残基を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個の本発明の高エフェクター機能アミノ酸残基の導入であって、FcγRIIB受容体との結合の増大を伴わない、上記導入を包含する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個の本発明の高エフェクター機能アミノ酸残基を導入することにより、FcγRIIB受容体および／またはC1qとの結合を低下させることを包含する。さらに別の実施形態では、少なくとも１個の本発明の高エフェクター機能アミノ酸残基を導入することにより、FcγRIIIA およびFcγRIIB受容体両方との結合を増大させる。好ましくは、FcγRIIIA／FcγRIIB平衡解離定数（KD）の比を低下させる。さらに、少なくとも１個の本発明の高エフェクター機能アミノ酸残基の存在により、抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）活性が増強した抗体が得られる。従って、本発明は、本発明の分子と同じアミノ酸配列を有するが、本発明の新規アミノ酸残基を含まない抗体（または他のFcドメイン含有ポリペプチド）（本明細書では「同等分子」と呼ぶ）、例えば、Fcドメインの対応位置に天然に存在するアミノ酸残基を含む非改変Fc領域を含んでなる抗体と比較して、改変されたエフェクター機能（例えば、ADCC、CDCなど）、および／または少なくとも１つのFcリガンド（例えば、FcγRIIIA、FcγRIIB、C1qなど）に対し改変された結合親和性を呈示するFc変異体を提供する。特に、本発明は、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合する可変領域、またはそのフラグメントと、少なくとも１つの高エフェクター機能アミノ酸残基をさらに含むFc領域とを含んでなる新規のFc変異体を提供する。
【００５７】
本発明はさらに、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合する抗体のFc変異体を提供し、該Fc変異体は、少なくとも１つのアミノ酸残基が置換されたFc領域を含んでいる。本発明はまた、同等分子（例えば、本来の非改変Fc領域を有する抗体）と比較して、そのFcγRに対する結合親和性が改変されたFc変異体に関する。一実施形態では、上記Fc変異体は、活性化FcγR（例えば、FcγRIIIA）に対し高い結合親和性を有する。具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子と比較して低い平衡解離定数（KD）を有する。別の実施形態では、Fc変異体は、活性化FcγRに対し高い結合親和性を有し、かつ、阻害性FcγR（例えば、FcγRIIIB）に対し不変または低い結合親和性を有する。別の実施形態では、上記変異体は、同等分子と比較して、FcγRIIIA／FcγRIIB平衡解離定数（KD）の比が低いFc変異体である。さらに別の実施形態では、本発明のFc変異体は、前記FcγR親和性の変更に加え、同等分子（例えば、本来の非改変Fc領域を有する抗体）と比較して、高いADCC活性も呈示する。別の実施形態では、本発明のFc変異体は、少なくとも１つのEph受容体（例：EphA1、A2、A3a、A3b、A4、A5a、A5b、A6、A7、A8、B1、B2a、B2b、B3、B4およびB6）と免疫特異的に結合する抗体の変異体である。具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、少なくとも１つのEph受容体と結合し、しかも、少なくとも１つのEph受容体のアンタゴニストである。別の具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、少なくとも１つのEph受容体と結合し、しかも、少なくとも１つのEph受容体のアゴニストである。
【００５８】
本発明の抗体は、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合する可変領域、またはそのフラグメントと、本明細書に開示する１以上の高エフェクター機能残基を含むFcドメインを組み合わせることにより、「新たに」作製するか、もしくは、Fcドメインに１以上の高エフェクター機能および／または他の調節アミノ酸残基を導入して、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合するFcドメイン含有抗体を改変することにより、作製することができる。
【００５９】
本発明はまた、同等分子（例えば、本来の非改変Fc領域を有する抗体）と比較して、阻害性FcγRに対する結合親和性が高く、かつ活性化FcγR（例えば、FcγRIIIA）に対する結合親和性をが低い新規のFc変異体に関する。一実施形態では、上記Fc変異体は、同等分子（例えば、本来の非改変Fc領域を有する抗体）と比較して、低いADCC活性仲介能力も呈示しうる。別の実施形態では、本発明のFc変異体は、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合する抗体の変異体である。具体的実施形態では、阻害性FcγRに対する結合親和性が高く、かつ活性化FcγRに対する結合親和性が低い本発明のFc変異体は、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合し、しかも、少なくとも１つのEph受容体のアンタゴニストである。別の具体的実施形態では、阻害性FcγRに対する結合親和性が高く、かつ活性化FcγRに対する結合親和性が低い本発明のFc変異体は、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合し、しかも、少なくとも１つのEph受容体のアゴニストである。
【００６０】
加えて、本発明はさらに、同等分子（例えば、本来の非改変Fc領域を有する抗体）と比較して、C1qに対する結合親和性が改変されたFc変異体を提供する。具体的には、本発明のFc変異体は、C1qに対する高い結合親和性と、増大したCDC活性を呈示しうる。あるいは、本発明のFc変異体は、C1qに対する低い結合親和性と、低減したCDC活性を呈示しうる。さらに別の状況では、C1qに対する結合が改変された本発明のFc変異体は、同等分子と比較して不変のCDC活性を呈示する。具体的には、C1q結合およびCDC活性が改変されたFc変異体は、１以上のFcγRに対する結合および／またはADCC活性の改変を示すことができる。一実施形態では、本発明のFc変異体は、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合する抗体の変異体である。具体的実施形態では、C1qとの結合が改変された本発明のFc変異体は、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合し、しかも、少なくとも１つのEph受容体のアンタゴニストである。
【００６１】
別の具体的実施形態では、C1qとの結合が改変された本発明のFc変異体は、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合し、少なくとも１つのEph受容体のアンタゴニストである。
【００６２】
本発明のFc変異体は、腫瘍の転移を予防、治療もしくは管理する、またはEph受容体により仲介または影響される他の機能、例えば、限定するものではないが、細胞増殖、細胞接着、細胞遊走、肉芽組織発生、腫瘍成長、腫瘍細胞侵入および／または炎症などを阻害する上で有用となりうる。いずれの作用機構にも拘束される意図はないが、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合する本発明のFc変異体は、多様な機構により機能することができ、このようなものとして、限定するものではないが、Eph受容体を異常に発現する細胞をターゲッティングして破壊する、あるいは１以上のEph受容体活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する、などがある。また、少なくとも１つのEph受容体の機能活性を阻害または刺激することにより、Eph受容体仲介の病因を阻害するFc変異体も本発明に含まれる。EphA2およびEphA4は、PCT公開番号WO 04/014292、WO 03/094859および米国特許出願番号10/863,729に記載されている。尚、これら文献はすべて、参照としてその全文を本明細書に組み込むものとする。
【００６３】
別の実施形態では、本発明のFc変異体を用いて、細胞の過増殖に関連する疾患または障害、例えば、限定するものではないが、癌、喘息、慢性閉塞性肺病、腸、小腸、胃およびその他生命維持に必要な器官の炎症性疾患、再狭窄（平滑筋および内皮）、クローン病、乾癬、ならびにその他の非転移性疾患を治療、予防、および／または管理する。一実施形態では、過増殖細胞は上皮細胞である。別の実施形態では、過増殖細胞はEphA4を過剰発現する。別の実施形態では、細胞同士の接触の低下、細胞下局在の改変、もしくはEphA4リガンドに対するEphA4の量的増加のいずれかにより、リガンドと結合しないEphA4も存在する。さらに別の実施形態では、過増殖細胞はEphA2を過剰発現する。別の実施形態では、細胞同士の接触の低下、細胞下局在の変化、もしくはEphA2リガンドに対するEphA2の量的増加のいずれかにより、リガンドと結合しないEphA2も存在する。
【００６４】
本明細書で用いる用語「抗体」とは、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、一本鎖Fv（scFv）、ジスルフィド結合Fv（sdFv）、Fabフラグメント、F(ab’)フラグメント、および抗イディオタイプ（抗Id）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Id抗体）、ならびに前記いずれかのエピトープ結合フラグメントを意味する。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性のフラグメント、すなわち、抗原結合部位を含む分子を含み、これらのフラグメントを別の免疫グロブリンドメイン（限定するものではないが、Fc領域またはそのフラグメント）と融合してもよいし、しなくてもよい。本明細書に概説したように、用語「抗体」は、本明細書に記載するFc変異体、全長抗体、ならびに、免疫グロブリンの免疫学的に活性のフラグメントまたは本明細書に記載する他のタンパク質と融合した、本明細書に記載する少なくとも１個の新規アミノ酸残基を含む、Fc領域またはそのフラグメントを含んでなる変異体Fc-融合物を指す。このような変異体Fc融合物として、限定するものではないが、scFv-Fc融合物、可変領域（例えば、VLおよびVH）-Fc融合物、scFv-scFv-Fc融合物が挙げられる。免疫グロブリン分子は、いずれの型（例：IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY）、クラス（例：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2）もしくはサブクラスでもよい。
【００６５】
本明細書で用いる用語「Eph受容体」とは、既知のEph受容体チロシンキナーゼ（RTK）との所定程度の相同性により定義されるタンパク質を含むポリペプチドのファミリーを意味する。Eph受容体として、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：EphA1（エフリンＡ型受容体１としても知られ、エリトロポエチン生産肝癌増幅配列であり、GenBank受託番号：NP 005223.2により例示される）、EphA2（上皮細胞受容体プロテインチロシンキナーゼとしても知られ、GenBank受託番号：NP 004422.2により例示される）、EphA3（ヒト胎児キナーゼ１、eph様チロシンキナーゼ１、TYRO4プロテインチロシンキナーゼとしても知られ、GenBank受託番号：NP 005224.2およびNP 872585.1イソ型3aおよび3bによりそれぞれ例示される）、EphA4（エフリンＡ型受容体４、TYRO1プロテインチロシンキナーゼ、チロシン−プロテインキナーゼ受容体SEK、受容体プロテイン−チロシンキナーゼHEK8としても知られ、GenBank受託番号：NP 004429.1により例示される）、EphA5（Eph相同性キナーゼ-1、エフリンＡ型受容体５、受容体プロテイン−チロシンキナーゼHEK7、チロシン−プロテインキナーゼ受容体EHK-1としても知られ、GenBank受託番号：NP 004430.2およびNP 872272イソ型5aおよび5bによりそれぞれ例示される）、EphA6（GenBank受託番号：XP 114973.4により例示される）、EphA7（Eph相同性キナーゼ-3、エフリンＡ型受容体７、受容体プロテイン−チロシンキナーゼHEK11、チロシン−プロテインキナーゼ受容体EHK-3としても知られ、GenBank受託番号：NP 004431.1により例示される）、EphA8（チロシルプロテインキナーゼ、プロテイン−チロシンキナーゼ、ヒドロキシアリール−プロテインキナーゼ、エフリンＡ型受容体８前駆体、ephおよびelk関連チロシンキナーゼ、チロシン−プロテインキナーゼ受容体eekとしても知られ、GenBank受託番号：NP 0065387.1により例示される）、EphB1（ephチロシンキナーゼ２として知られ、GenBank受託番号：NP 004432.1により
例示される）、EphB2（ephチロシンキナーゼ３、elk関連チロシンキナーゼ、発生調節eph関連チロシンキナーゼとしても知られ、GenBank受託番号：NP 0059145.1およびNP 004432.2イソ型2aおよび2bによりそれぞれ例示される）、EphB3（ヒト胎児キナーゼ２、EPH様チロシンキナーゼ-2としても知られ、GenBank受託番号：NP 004434.2により例示される）、EphB4（ヘパトーマ膜貫通キナーゼとしても知られ、GenBank受託番号：NP 004435.3により例示される）、ならびにB6（GenBank受託番号：NP 004445.1により例示される）。本発明により考慮されるいくつかのEph受容体ポリペプチドのアラインメントを図18に示す。
【００６６】
本明細書で用いる用語「免疫特異的にEph受容体と結合する」、ならびに類似の用語は、少なくとも１つのEph受容体またはその断片と特異的に結合する、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質ならびに抗体またはそのフラグメントを意味する。少なくとも１つのEph受容体またはその断片と免疫特異的に結合する、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、もしくは抗体は、低い親和性で別のペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質と結合してもよく、その際、親和性は、例えば、免疫検定法、BIAcore、もしくは当分野で周知の他のアッセイにより決定する。少なくとも１つのEph受容体またはその断片と免疫特異的に結合する抗体またはそのフラグメントは、関連抗原と交差反応性であってもよい。好ましくは、少なくとも１つのEph受容体またはその断片と免疫特異的に結合する抗体またはそのフラグメントは、他の抗原より、少なくとも１つのEph受容体と優先的に結合する。しかし、本発明は、具体的に、「Eph受容体に免疫特異的に結合する抗体」の定義に、多重特異性を有する抗体（例えば、２以上の異なる抗原に対して特異性を有する抗体）（詳しくは、Caoら、2003, Adv Drug Deliv Rev 55:171；Hudsonら、2003, Nat med 1:129参照）も含む。例えば、二重特異性抗体は、互いに融合した２つの異なる結合特異性を含む。最も簡単なケースでは、二重特異性抗体は、単一標的抗原上の２つの隣接するエピトープに結合するが、このような抗体は他の抗原と交差反応しない（前述した通り）。あるいは、二重特異性抗体は２つの異なる抗原と結合することができる。このような抗体は、免疫特異的に２つの異なる分子に結合するが、他の無関係の分子には結合しない。別のクラスの多重特異性抗体は、１以上の特定の複合体に関して、多サブユニット複合体からなる共有サブユニットを認識することができる。加えて、Eph受容体に免疫特異的に結合する抗体は、関連Eph受容体またはRTKと交差反応するものでもよい。
【００６７】
Eph受容体またはその断片に免疫特異的に結合する抗体またはそのフラグメントは、例えば、免疫検定法、BIAcore、もしくは当業者には周知の他の方法により同定する。抗体またはそのフラグメントは、それが、どの交差反応性抗原より高い親和性でEph受容体またはその断片に結合するとき、免疫特異的に結合するといい、これは、放射免疫測定法（RIA）および酵素結合イムノソルベント検定法（ELISA）のような実験方法を用いて決定する。抗体特異性に関しては、例えば、Paulら、1989, Fundamental Immunology 第２版、Raven Press, ニューヨーク（332-336頁）を参照されたい。
【００６８】
特定の理論に拘束されるものではないが、本発明のアミノ酸置換は、タンパク質−タンパク質相互作用（例えば、受容体−リガンドと抗体−抗原相互作用）を調節する１以上の因子をモジュレートすることにより、FcγRおよび／または補体タンパク質C1qに対する抗体の親和性を改変する。このような因子として、限定するものではないが、タンパク質フォールディング（折り畳み）または三次元立体配置に作用する因子（例えば、水素結合、疎水的相互作用、イオン相互作用、ファン・デル・ワールス力および／またはジスルフィド結合）、ならびにアロステリック相互作用、溶解性および共有結合変更に作用する因子が挙げられる。
【００６９】
特定の理論に拘束されるものではないが、本発明のアミノ酸置換は、下流エフェクター機能に影響を与える１以上の因子（限定するものではないが、FcγRおよび／またはC1qに対する抗体の親和性、細胞傷害性エフェクターおよび／または補体カスケード機能を仲介する能力、タンパク質安定性、抗体半減期、ならびにエフェクター細胞および／または分子のリクルート）を改変することにより、抗体のADCCおよび／またはCDC活性をモジュレートする。
【００７０】
本明細書で用いるFc領域（本明細書では「Fc」および「Fcポリペプチド」とも呼ぶ）が、最初の定常領域免疫グロブリンドメインを除いた抗体の定常領域を含むポリペプチドを包含することは理解されよう。従って、Fcは、IgA、IgD、およびIgGの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメインと、IgEおよびIgMの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメインと、これらドメインに対する可変ヒンジN末端を指す。IgAとIgMの場合、FcはＪ鎖を含んでいてもよい。IgGの場合、Fcは免疫グロブリンドメインCガンマ2およびCガンマ3（Cγ2およびCγ3）と、Cガンマ１（Cγ1）およびCガンマ2（Cγ2）間のヒンジを含む。Fc領域の境界は変化しうるが、ヒトIgG重鎖Fc領域は通常、そのカルボキシル末端に残基C226またはP230を含むよう規定される。その際、番号付けは、KabatらによるEU指数（1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service；バージニア州スプリングフィールド）に従う。KabatらによるEU指数とは、Kabatら（前掲）により記載されたヒトIgG1 EU抗体の残基番号付けを意味する。Fcは、分離した上記領域、または抗体に関する上記領域、抗体フラグメント、もしくはFc融合タンパク質を指すこともある。多数のFc位置（限定するものではないが、Kabat 270、272、312、315、356および358など）で多型性が観察されているため、従来技術で示された配列には若干の相違が存在しうることに留意されたい。
【００７１】
本明細書に記載する相補性決定領域（CDR）残基の番号は、Kabatら（1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service ；バージニア州スプリングフィールド）によるものであることは理解されたい。具体的には、軽鎖可変ドメインにおける残基24-34（CDR1）、50-56（CDR2）および89-97（CDR3）と、重鎖可変ドメインにおける残基31-35（CDR1）、50-65（CDR2）および95-102（CDR3）である。CDRは、抗体によってかなり変動する（また、定義により、Kabat共通配列との相同性を示さない場合もある）ことに留意すべきである。フレームワーク残基の最大アラインメントは、Fv領域に用いるのに、番号付け方式に「スペーサー」残基の挿入を必要とすることが多い。本明細書に記載するCDRはKabatら（前掲）によるものであることは理解されよう。加えて、所与のKabat部位番号におけるいくつかの個々の残基の同一性は、種間または対立遺伝子ダイバージェンスのために抗体鎖によって変動することがある。
【００７２】
一実施形態では、本発明のFc変異体は、Fc領域の少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、その際、該抗体変異体は、同等分子（例えば、このような置換を含まない本来の抗体）と比較して、そのFcγRおよび／またはC1qに対する結合親和性が改変されている。
【００７３】
具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、234E、235R、235A、235W、235P、235V、235Y、236E、239D、265L、269S、269G、298I、298T、298F、327N、327G、327W、328S、328V、329H、329Q、330K、330V、330G、330Y、330T、330L、330I、330R、330C、332E、332H、332S、332W、332F、332D、および332Yからなる群より選択される少なくとも１個の高エフェクター機能アミノ酸残基を含むFc領域を含んでなり、ここで番号付け方式は、Kabatらにより記載されたEU指数によるものである。本発明の考えられる高エフェクター機能アミノ酸残基は、表１にも記載する。
【００７４】
別の実施形態では、本発明のFc変異体は、少なくとも２個、または少なくとも３個、または少なくとも４個、または少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも10個、または少なくとも20個、または少なくとも30個、または少なくとも40個、または少なくとも50個、または少なくとも60個、または少なくとも70個、または少なくとも80個、または少なくとも90個、または少なくとも100個、もしくは少なくとも200個の高エフェクター機能アミノ酸残基を含むFc領域を含んでなる。
【００７５】
別の具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、239D、330K、330V、330G、330Y、330T、330L、330I、330R、330C、332E、332H、332S、332W、332F、332D、および332Yからなる群より選択される少なくとも１個の高エフェクター機能アミノ酸残基を含むFc領域を含んでなり、ここで番号付け方式は、Kabatらにより記載されたEU指数によるものである。
【００７６】
さらに別の具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、239D、330Lおよび332Eからなる群より選択される少なくとも１個の高エフェクター機能アミノ酸残基を含むFc領域を含んでなる。一実施形態では、本発明のFc変異体は、少なくとも１個の高エフェクター機能アミノ酸残基332Eを含むFc領域を含んでなる。具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、高エフェクター機能アミノ酸残基239D、330Lおよび332Eを含むFc領域を含んでなる。
【００７７】
具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、Fc領域の206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、239、242、246、250、251、257、259、260、261、265、269、273、274、275、277、281、282、284、287、291、298、300、302、304、306、308、310、314、316、318、319、321、323、327、328、329、330、332および336からなる群より選択される位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、その際、Fc領域における残基の番号付けは、Kabatらにより記載されたEU指数によるものである。
【００７８】
別の具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、L234E、L235R、L235A、L235W、L235P、L235V、L235Y、G236E、S239D、D265L、E269S、E269G、S298I、S298T、S298F、A327N、A327G、A327W、L328S、L328V、P329H、P329Q、A330K、A330V、A330G、A330Y、A330T、A330L、A330I、A330R、A330C、I332E、I332H、I332S、I332W、I332F、I332D、およびI332Yからなる群より選択される少なくとも１つの置換を含み、ここで番号付け方式は、Kabatらにより記載されたEU指数によるものである。
【００７９】
別の実施形態では、上記Fc変異体は、Fc領域の少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも10、または少なくとも20、または少なくとも30、または少なくとも40、または少なくとも50、または少なくとも60、または少なくとも70、または少なくとも80、または少なくとも90、または少なくとも100、もしくは少なくとも200のアミノ酸置換を含む。
【表１】
2008510007.tif 000002
【００８０】
一実施形態では、本発明のFc変異体は、S239D、A330LおよびI332Eからなる群より選択される少なくとも１つの置換を含む。別の実施形態では、上記Fc変異体は、次の置換：S239D、A330LおよびI332Eの少なくとも１つを含む。さらに別の実施形態では、本発明のFc変異体は、少なくとも高エフェクター機能アミノ酸残基332Eを含む。
【００８１】
前記（表１参照）のような、目的とする抗体のFcにおける前記アミノ酸置換のために保存的アミノ酸置換を実施できることが特に意図される。「保存的アミノ酸置換」とは、機能的に同等のアミノ酸を置換するアミノ酸置換を意味する。保存的アミノ酸置換により、得られるペプチドのアミノ酸配列にサイレント改変が起こる。例えば、類似極性の１以上のアミノ酸は機能的同等物として働き、ペプチドのアミノ酸配列にサイレント改変をもたらす。電荷中性であり、より小さい残基で残基を置換する置換は、残基が異なる群に属するものであっても（例えば、より小さいイソロイシンによるフェニルアラニンの置換）「保存的置換」とみなすこともある。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で定義されている。保存的アミノ酸置換のいくつかのファミリーを表２に示す。
【表２】
2008510007.tif 000003
【００８２】
用語「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸類似体または変異体の使用も意味する。表現型がサイレントのアミノ酸置換を実施する方法に関する手引きはBowieら、”Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions”（1990, Science 247:1306-1310）に記載されている。
【００８３】
別の実施形態では、Fc変異体は、少なくとも高エフェクター機能アミノ酸332Dを含む。
【００８４】
当業者は、本発明のFc変異体が、改変されたFcγRおよび／またはC1q結合特性（結合特性の例として、限定するものではないが、結合特異性、平衡解離定数（KD）、解離および会合率（それぞれ、KoffおよびKon）、結合親和性および／または結合活性が挙げられる）を有すること、また、特定の改変が多かれ少かれ望ましいことを理解するであろう。当分野において、平衡解離定数（KD）が、Koff／Konとして定義されることは周知である。KDが低い結合分子（例えば、抗体）の方が、KDが高い結合分子（例えば、抗体）より好ましいことは一般に知られている。しかし、場合によっては、KonまたはKoffの値の方がKDの値より関連性が高いこともある。当業者は、どの速度論的パラメーターが所与の抗体の適用に最も重要であるかを決定することができる。例えば、ADCC活性を高めるためには、負の調節因子FcγRIIBとの Fc結合は不変のまま、もしくは低減させて、１以上の正の調節因子（例えば、FcγRIIIA）とのFc結合を増強する改変がより好ましいと言えよう。あるいは、ACDD活性を低下させるためには、１以上の正の調節因子に対する結合を低減し、および／またはFcγRIIBとの結合を増強する改変が好ましいであろう。従って、結合親和性の比（例えば、平衡解離定数（KD））は、Fc変異体のADCC活性が増大したか、低下したかを示すことができる。例えば、FcγRIIIA／FcγRIIB平衡解離定数（KD）の比の低下はADCC活性の改善と相関するのに対し、この比の増加はADCC活性の低下と相関する。加えて、C1qとの結合の増強は、CDC活性を高めるのに好ましく、また、C1qとの結合を低減する改変は、CDC活性を低下または排除するのに好ましい。
【００８５】
リガンドに対するFcドメインの結合親和性および特性は、Fc-FcγR相互作用、すなわちFc領域のFcγRとの特異的結合を決定するために当分野で周知の多様なin vitroアッセイ方法（生化学または免疫学的アッセイ）により決定することができ、このような方法として、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：平衡方法（例：酵素結合イムノソルベント検定法（ELISA；実施例３を参照）または放射免疫測定法（RIA））、または速度論（例：BIACORE（登録商標）分析）、ならびに間接結合アッセイ、競合的阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー（例：ゲル濾過）。上記方法およびその他周知の方法では、１以上の被検成分に標識を用いてもよく、および／または限定するものではないが、色素源、蛍光、ルミネセンス、もしくは同位体標識などの様々な検出方法を使用してもよい。結合親和性および速度論についての詳細な説明は、抗体−免疫原相互作用を主題とするPaul, W.E.編、Fundamental Immunology, 第４版、Lippincott-Raven, フィラデルフィア（1999）を参照されたい。
【００８６】
一実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子と比較して、高い親和性でFcγRIIIAに結合する。別の実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子と比較して、高い親和性でFcγRIIIAに結合すると共に、不変の結合親和性でFcγRIIBに結合する。さらに別の実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子と比較して、高い親和性でFcγRIIIAに結合すると共に、低い結合親和性でFcγRIIBに結合する。別の実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子と比較して、低下したFcγRIIIA／FcγRIIB平衡解離定数（KD）の比を有する。
【００８７】
好ましい実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子と比較して、増大した親和性でFcγRIIIAに結合すると共に、低下した結合親和性でFcγRIIBに結合し、しかもEph受容体に免疫特異的に結合する。
【００８８】
一実施形態では、上記Fc変異体は、増大した親和性でFcγRIIIAに結合する。別の実施形態では、上記Fc変異体は、同等分子と比較して、少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも５倍、または少なくとも７倍、または少なくとも10倍、または少なくとも20倍、または少なくとも30倍、または少なくとも40倍、または少なくとも50倍、または少なくとも60倍、または少なくとも70倍、または少なくとも80倍、または少なくとも90倍、または少なくとも100倍、または少なくとも200倍高い、FcγRIIIAに対する親和性を有する。さらに別の実施形態では、上記Fc変異体は、同等分子と比較して、少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約７倍、または少なくとも約10倍、または少なくとも約20倍、または少なくとも約30倍、または少なくとも約40倍、または少なくとも約50倍、または少なくとも約60倍、または少なくとも約70倍、または少なくとも約80倍、または少なくとも約90倍、または少なくとも約100倍、または少なくとも約200倍高い、FcγRIIIAに対する親和性を有する。
【００８９】
別の実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子と比較して、約２分の1〜約10分の1、または約５分の1〜約50分の1、または約25分の1〜約250分の1、または約100分の1〜約500分の1、または約250分の1〜約1,000分の1に低減した平衡解離定数（KD）を有する。さらに別の具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子と比較して、２分の1〜10分の1、または５分の1〜50分の1、または25分の1〜250分の1、または100分の1〜500分の1、または250分の1〜1,000分の1に低減した平衡解離定数（KD）を有する。具体的実施形態では、上記Fc変異体は、同等分子と比較して、少なくとも２分の1、または少なくとも３分の1、または少なくとも５分の1、または少なくとも７分の1、または少なくとも10分の1、または少なくとも20分の1、または少なくとも30分の1、または少なくとも40分の1、または少なくとも50分の1、または少なくとも60分の1、または少なくとも70分の1、または少なくとも80分の1、または少なくとも90分の1、または少なくとも100分の1、または少なくとも200分の1、または少なくとも400分の1、または600分の1に低減した、FcγRIIIAに対する平衡解離定数（KD）を有する。別の具体的実施形態では、上記Fc変異体は、同等分子と比較して、少なくとも約２分の1、または少なくとも約３分の1、または少なくとも約５分の1、または少なくとも約７分の1、または少なくとも約10分の1、または少なくとも約20分の1、または少なくとも約30分の1、または少なくとも約40分の1、または少なくとも約50分の1、または少なくとも約60分の1、または少なくとも約70分の1、または少なくとも約80分の1、または少なくとも約90分の1、または少なくとも約100分の1、または少なくとも約200分の1、または少なくとも約400分の1、または約600分の1に低減した、FcγRIIIAに対する平衡解離定数（KD）を有する。
【００９０】
一実施形態では、上記Fc変異体は、不変または低い親和性でFcγRIIBに結合する。別の実施形態では、上記Fc変異体は、同等分子と比較して、不変であるか、あるいは、少なくとも１分の1、または少なくとも３分の1、または少なくとも５分の1、または少なくとも10分の1、または少なくとも20分の1、もしくは少なくとも50分の1に低減した、FcγRIIBに対する親和性を有する。さらに別の実施形態では、上記Fc変異体は、同等分子と比較して、不変であるか、あるいは、少なくとも約１分の1、または少なくとも約３分の1、または少なくとも約５分の1、または少なくとも約10分の1、または少なくとも約20分の1、または少なくとも約50分の1に低減した、FcγRIIBに対する親和性を有する。
【００９１】
別の実施形態では、上記Fc変異体は、同等分子と比較して、不変であるか、あるいは、少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも５倍、または少なくとも７倍、または少なくとも10倍、または少なくとも20倍、または少なくとも30倍、または少なくとも40倍、または少なくとも50倍、または少なくとも60倍、または少なくとも70倍、または少なくとも80倍、または少なくとも90倍、または少なくとも100倍、もしくは少なくとも200倍増大した、FcγRIIBに対する平衡解離定数（KD）を有する。さらに別の具体的実施形態では、上記Fc変異体は、同等分子と比較して、不変であるか、あるいは、少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約７倍、または少なくとも約10倍、または少なくとも約20倍、または少なくとも約30倍、または少なくとも約40倍、または少なくとも約50倍、または少なくとも約60倍、または少なくとも約70倍、または少なくとも約80倍、または少なくとも約90倍、または少なくとも約100倍、もしくは少なくとも約200倍増大した、FcγRIIBに対する平衡解離定数（KD）を有する。
【００９２】
別の実施形態では、上記Fc変異体は、置換されたFcを含まない本来の抗体と比較して、低減した親和性でFcγRIIIAに結合し、増大した親和性でFcγRIIBに結合する。一実施形態では、上記Fc変異体は、置換されたFcを含まない本来の抗体と比較して、少なくとも１分の1、または少なくとも３分の1、または少なくとも５分の1、または少なくとも10分の1、または少なくとも20分の1、または少なくとも50分の1に低減した、FcγRIIIAに対する親和性を有する。別の実施形態では、上記Fc変異体は、置換されたFcを含まない本来の抗体と比較して、少なくとも約１分の1、または少なくとも約３分の1、または少なくとも約５分の1、または少なくとも約10分の1、または少なくとも約20分の1、または少なくとも約50分の1に低減した、FcγRIIIAに対する親和性を有する。さらに別の実施形態では、上記Fc変異体は、同等分子と比較して、、少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも５倍、または少なくとも７倍、または少なくとも10倍、または少なくとも20倍、または少なくとも50倍、または少なくとも100倍高い、FcγRIIBに対する親和性を有する。さらに別の実施形態では、上記Fc変異体は、同等分子と比較して、少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約７倍、または少なくとも約10倍、または少なくとも約20倍、または少なくとも約50倍、または少なくとも約100倍高い、FcγRIIBに対する親和性を有する。
【００９３】
さらに別の実施形態では、上記Fc変異体は、置換されたFcを含まない本来の抗体と比較して、少なくとも１倍、または少なくとも３倍、または少なくとも５倍、または少なくとも10倍、または少なくとも20倍、もしくは少なくとも50倍増大した、FcγRIIIAに対する平衡解離定数（KD）を有する。別の具体的実施形態では、上記Fc変異体は、置換されたFcを含まない本来の抗体と比較して、、少なくとも約１倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約10倍、または少なくとも約20倍、または少なくとも約50倍増大した、FcγRIIIAに対する平衡解離定数（KD）を有する。別の実施形態では、上記Fc変異体は、同等分子と比較して、少なくとも２分の1、または少なくとも３分の1、または少なくとも５分の1、または少なくとも７分の1、または少なくとも10分の1、または少なくとも20分の1、または少なくとも50分の1、または少なくとも100分の1に低減した、FcγRIIBに対する平衡解離定数（KD）を有する。さらに別の実施形態では、上記Fc変異体は、同等分子と比較して、少なくとも約２分の1、または少なくとも約３分の1、または少なくとも約５分の1、または少なくとも約７分の1、または少なくとも約10分の1、または少なくとも約20分の1、または少なくとも約50分の1、または約100分の1に低減した、FcγRIIBに対する平衡解離定数（KD）を有する。
【００９４】
「抗体依存性細胞性細胞傷害」または「ADCC」とは、特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（NK）細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するFc受容体（FcR）に結合した分泌Igが、これら細胞傷害性エフェクター細胞を抗原担持標的細胞に特異的に結合させた後、細胞毒で標的細胞を死滅させることができる細胞傷害の形態を意味する。標的細胞の表面に向かう特異的高親和性IgG抗体は、細胞傷害性細胞を「アーミングする（arm）」ことから、このような死滅には絶対に必要である。標的細胞の溶解は細胞外であり、直接の細胞同士の接触を必要とし、補体には関与しない。
【００９５】
任意の抗体がADCCにより標的細胞の溶解を仲介する能力をアッセイすることができる。ADCC活性を評価するためには、免疫エフェクター細胞と組み合わせた標的細胞に目的の抗体を添加し、これらを抗原抗体複合体により活性化させることにより、標的細胞の細胞溶解を起こすことができる。細胞溶解は、一般に、溶解した細胞からの標識（例えば、放射性基質、蛍光染料もしくは天然の細胞内タンパク質）の放出により検出することができる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞として、末梢血液単核細胞（PBMC）およびナチュラルキラー（NK）細胞が挙げられる。In vitro ADCCアッセイの具体例は、Wisecarverら、1985, 79:277；Bruggemannら、1987, J Exp Med 166:1351；Wilkinsonら、2001, J Immunol Methods 258:183；Patelら、1995 J Immunol Methods 184:29（これらの各々を参照として本明細書に組み込む）ならびに本明細書（実施例３を参照）に記載されている。前記に代わり、または加えて、目的の抗体のADCC活性をin vivoで、例えば、Clynesら、1998, PNAS USA 95:652（参照として本明細書に組み込む）に開示されているような動物モデルで評価することもできる。
【００９６】
一実施形態では、１以上のFcγRメディエーターエフェクター細胞機能を決定するin vitro機能アッセイ（実施例３参照）によっても本発明のFc変異体の特性決定を行なう。別の実施形態では、本発明の分子のin vivoモデル（本明細書に記載および開示したものなど）における結合特性およびエフェクター細胞機能は、in vitroアッセイのものと類似している。しかし、本発明は、in vitroアッセイで所望の表現型を示さないが、in vivoで所望の表現型を示す本発明の分子を排除するものではない。
【００９７】
本発明はさらに、ADCC機能を増強したFc変異体を提供する。一実施形態では、本発明のFc変異体は、増大したADCC活性を有する。一実施形態では、上記Fc変異体は、同等分子と比較して、少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも５倍、または少なくとも10倍、または少なくとも50倍、または少なくとも100倍高い、ADCC活性を有する。別の実施形態では、上記Fc変異体は、同等分子と比較して、少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約10倍、または少なくとも約50倍、または少なくとも約100倍高い、ADCC活性を有する。具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子と比較して、増大した親和性でFcγRIIIAに結合すると共に、低減した親和性でFcγRIIBに結合し、しかも、高められたADCC活性を有する。
【００９８】
別の実施形態では、本発明のFc変異体は、高いADCC活性を有し、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合する。別の実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子と比較して、高められたADCC活性を有すると共に、FcγRIIIA／FcγRIIB平衡解離定数（KD）の比が低減し、しかも、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合する。さらに別の実施形態では、本発明のFc変異体は、高められたADCC活性を有し、高い親和性で活性化FcγR（例えば、FcγRIIIA）に結合すると共に、不変または低い親和性で阻害性FcγR（例えば、FcγRIIB）と結合し、しかも、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合する。
【００９９】
本発明はまた、ADCC機能を低減したFc変異体を提供する。一実施形態では、本発明のFc変異体は、低減したADCC活性を有する。別の実施形態では、上記Fc変異体は、同等分子と比較して、少なくとも２分の1、または少なくとも３分の1、または少なくとも５分の1、または少なくとも10分の1、または少なくとも50分の1、または少なくとも100分の1の低いADCC活性を有する。別の実施形態では、上記Fc変異体は、同等分子と比較して、少なくとも約２分の1、または少なくとも約３分の1、または少なくとも約５分の1、または少なくとも約10分の1、または少なくとも約50分の1、または少なくとも約100分の1の低いADCC活性を有する。具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子と比較して、低減した親和性でFcγRIIIAと結合すると共に、増大した親和性でFcγRIIBと結合し、しかも、低減したADCC活性を有する。
【０１００】
一実施形態では、本発明のFc変異体は、低減したADCC活性を有し、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合する。別の実施形態では、本発明の抗体変異体は、低減したADCC活性を有し、低い親和性で活性化FcγR（例えば、FcγRIIIA）に結合すると共に、高い親和性で阻害性FcγR（例えば、FcγRIIB）と結合し、しかも、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合する。
【０１０１】
「補体依存性細胞傷害」および「CDC」は、補体の存在下での標的細胞の溶解を意味する。補体活性化経路は、補体系の第１成分（C1q）と、１分子、例えば、コグネイト抗原と複合体化した抗体との結合により開始する。補体活性化を評価するためには、Gazzano-Santoroら、1996, J. Immunol. Methods, 202:163に記載されたCDCアッセイを実施することができる。
【０１０２】
本発明はさらに、CDC機能を増強したFc変異体を提供する。一実施形態では、本発明のFc変異体は、高いCDC活性を有する。別の実施形態では、上記Fc変異体は、同等分子と比較して、少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも５倍、または少なくとも10倍、または少なくとも50倍、もしくは少なくとも100倍高いCDC活性を有する。別の実施形態では、上記Fc変異体は、同等分子と比較して、少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約10倍、または少なくとも約50倍、もしくは少なくとも約100倍高いCDC活性を有する。別の実施形態では、上記Fc変異体は、同等分子と比較して、少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも５倍、または少なくとも７倍、または少なくとも10倍、または少なくとも20倍、または少なくとも50倍、もしくは少なくとも100倍高い親和性でC1qに結合する。さらに別の実施形態では、上記Fc変異体は、同等分子と比較して、少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約７倍、または少なくとも約10倍、または少なくとも約20倍、または少なくとも約50倍、もしくは少なくとも約100倍高い親和性でC1qに結合する。具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、増大した親和性でC1qに結合し；高いCDC活性を有すると共に、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合する。
【０１０３】
本発明はさらに、CDC機能を低減したFc変異体を提供する。一実施形態では、本発明のFc変異体は、低減したCDC活性を有する。別の実施形態では、上記Fc変異体は、同等分子と比較して、少なくとも２分の1、または少なくとも３分の1、または少なくとも５分の1、または少なくとも10分の1、または少なくとも50分の1、または少なくとも100分の1の低いCDC活性を有する。別の実施形態では、上記Fc変異体は、同等分子と比較して、少なくとも約２分の1、または少なくとも約３分の1、または少なくとも約５分の1、または少なくとも約10分の1、または少なくとも約50分の1、または少なくとも約100分の1の低いCDC活性を有する。別の実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子と比較して、少なくとも１分の1、または少なくとも３分の1、または少なくとも５分の1、または少なくとも10分の1、または少なくとも20分の1、または少なくとも50分の1に低減した親和性でC1qに結合する。さらに別の実施形態では、本発明のFc変異体は、同等分子と比較して、少なくとも約１分の1、または少なくとも約３分の1、または少なくとも約５分の1、または少なくとも約10分の1、または少なくとも約20分の1、または少なくとも約50倍分の1に低減した親和性でC1qに結合する。具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、少なくとも１つのEph受容体に結合し、低減した親和性でC1qと結合すると共に、低減したCDC活性を有し、しかも、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合する。
【０１０４】
本発明のFc変異体に、特に、１以上の追加のアミノ酸残基置換、突然変異および／または変更を含有させることにより、限定するものではないが、以下に挙げる好ましい特性を備えた抗体を得ることも具体的に考えられる：長い血清半減期、高い結合親和性、低い免疫原性、高い生産性、改変されたFcリガンド結合、増強または低減されたADCCまたはCDC活性、改変されたグリコシル化および／またはジスルフィド結合、ならびに変更された結合特異性（例えば、以下参照）。本発明は、本発明のFc変異体と他のFc改変を組み合わせることにより、抗体またはFc融合物に付加的、相乗的、もしくは新規の特性をもたらすことを包含する。一実施形態では、別のFc改変により、これらと組み合わせたFc変異体の表現型を増強する。例えば、野生型Fc領域を含む同等分子より高い親和性でFcγRIIIAに結合することが知られる突然変異体と、本発明のFc 変異体を組み合わせれば、本発明の突然変異体との組合せにより、FcγRIIIA親和性が大幅に増大する。
【０１０５】
一実施形態では、本発明のFc変異体を、以下の文献に開示されているような別の周知のFc変異体と組み合わせることができる：Ghetieら、1997, Nat Biotech. 15:637-40；Duncanら、1988, Nature 332:563-564；Lundら、1991, J. Immunol 147:2657-2662；Lundら、1992, Mol Immunol 29:53-59；Alegreら、1994, Transplantation 57:1537-1543；Hutchinsら、1995, Proc Natl. Acad Sci U S A 92:11980-11984；Jefferisら、1995, Immunol Lett. 44:111-117；Lund ら、1995, Faseb J 9:115-119；Jefferisら、1996, Immunol Lett 54:101-104；Lundら、1996, J Immunol 157:4963-4969；Armourら、1999, Eur J Immunol 29:2613-2624；Idusogie ら、2000, J Immunol 164:4178-4184；Reddyら、2000, J Immunol 164:1925-1933；Xuら、2000, Cell Immunol 200:16-26；Idusogie ら、2001, J Immunol 166:2571-2575；Shieldsら、2001, J Biol Chem 276:6591-6604；Jefferisら、2002, Immunol Lett 82:57-65；Prestaら、2002, Biochem Soc Trans 30:487-490；米国特許第5,624,821号；第5,885,573号；第5,677,425号；第6,165,745号；第6,277,375号；第5,869,046号；第6,121,022号；第5,624,821号；第5,648,260号；第6,194,551号；第6,737,056号；第6,821,505号；第6,277,375号；米国特許出願番号10/370,749およびPCT 公開WO 94/2935；WO 99/58572；WO 00/42072；WO 02/060919、WO
04/029207（これらは各々、参照としてその全文を本明細書に組み込む）。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、本発明のFc変異体は、Fc領域を含む分子に共有結合した１以上の操作型糖形態、すなわち、炭水化物組成物を含む。操作型糖形態は、様々な目的、例えば、エフェクター機能を増強または低減する上で有用であると考えられる。操作型糖形態は、当業者には周知のあらゆる方法、例えば、遺伝子操作型または変異型発現株を使用する；１以上の酵素、例えば、DI N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII（GnRI11）との共発現を実施する；各種生物または各種生物由来の細胞系にFc領域含有分子を発現させる；もしくはFc領域含有分子を発現させた後、炭水化物を変更することにより、作製することができる。操作型糖形態の作製方法は、当業者には周知であり、限定するものではないが、以下の文献に記載のものが挙げられる：Umanaら、1999, Nat. Biotechnol 17:176-180；Daviesら、20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294；Shieldsら、2002, J Biol Chem 277:26733-26740；Shinkawaら、2003, J Biol Chem 278:3466-3473；米国特許第6,602,684号；米国特許出願番号10/277,370；米国特許出願番号10/113,929；PCT WO 00/61739A1；PCT WO 01/292246A1；PCT WO 02/311140A1；PCT WO 02/30954A1；Potillegent（商標）technology（Biowa, Inc.；ニュージャージー州プリンストン）；GlycoMAb（商標）glycosylation engineering technology （GLYCART biotechnology AG；スイス国ズーリッヒ）（これらは各々参照としてその全文を本明細書に組み込む）。例えば、WO 00061739；EA01229125；US 20030115614；Okazakiら、2004, JMB, 336: 1239-49を参照されたい（各々、参照としてその全文を本明細書に組み込む）。さらに別の方法は、「本発明の抗体」と題する以下の第６．２節に記載する。
【０１０７】
受容体チロシンキナーゼ（RTK）は、細胞外環境から細胞質にシグナルを伝達する膜貫通分子である。RTKのEphファミリーはRTKの最も大きなサブファミリーである。この群は、細胞外ドメインにおけるシステインが豊富な領域と、２つのフィブロネクチンIII型反復配列により識別される。Eph受容体は、細胞表面アンカー型タンパク質の第２ファミリー、エフリンにより活性化される。Ephチロシンキナーゼとエフリンリガンド両方のメンバーが受容体−リガンド相互作用後にシグナル伝達を仲介する（Brucknerら、1997, Science 275:1640；Hollandら、1996, Nature 383:722）。この二方向シグナル伝達は、細胞接着、細胞遊走および組織境界形成のような細胞相互作用に関与する過程に影響を与えることがわかっている（Boydら、2001 Sci STKE RE20；Schmucherら、2001, Cell 105:701-4；Kullanderら、2002 Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3:475）。さらに近年、Eph受容体は、癌の発現および進行に関連することがわかった。細胞表面分子としてEph受容体は、抗体特異的療法の場合、容易に接近できる標的細胞である。一実施形態では、本発明のFc変異体は少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合する抗体の変異体である。本発明のFc変異体が免疫特異的に結合するEph受容体として、限定するものではないが、EphA1、EphA2、EphA3a、EphA3b、EphA4、EphA5a、EphA5b、EphA6、EphA7、EphA8、EphB1、EphB2a、EphB2b、EphB3、EphB4およびEphB6が挙げられる。
【０１０８】
当業者は、本発明のEph受容体が、既知Eph受容体（例えば、前掲を参照）に対し実質的な程度の相同性を示す分子であって、このような分子が、そのアミノ酸配列に基づいてEph受容体ファミリー分子として分類されている、または分類できることは理解されよう。Clustal Wアルゴリズムを含むMegaALignプログラム（DNASTAR）を用いて、既知ヒトEph受容体の対方式の比較が実施されている（Thompsonら、1994 Nucleic Acids Res 22:4673-80）。これらの結果（図18）から、各タンパク質において、Eph受容体ファミリーメンバー間に高度の類似性を共有する多数の領域があることがわかる。当業者は、抗体が高い親和性で１つのファミリーだけに免疫特異的に結合するように、ファミリーメンバー間で上記抗体の交差反応性、またはさらに制限された特異性を可能にするような、Eph受容体の領域に対する抗体を作製できることが具体的に考えられる。タンパク質特異的であるか、または１以上のEph受容体と結合することができる抗体の作製に使用するための免疫原性ペプチド候補を同定するために、Jameson-Wolfアルゴリズムを用いたProteanプログラム（DNASTAR）により、各タンパク質の抗原性指数を調べることができる。Eph受容体ファミリーの全メンバーの中で最も高い抗原性指数を有する領域を同定することができ、１以上のファミリーメンバーの中で高度に保存された領域が、１以上のファミリーメンバーを認識する抗体を生産するための優れた候補となりうる。これに対し、保存度の低い領域を使用すれば、１つのEph受容体ファミリーメンバーに特異的な抗体を作製することができると考えられる。
【０１０９】
一実施形態で、本発明のFc変異体は、腫瘍細胞に存在するEph受容体に優先的に結合するが、非腫瘍細胞に存在するEph受容体には結合しない。別の実施形態では、本発明のFc変異体は、正常な組織、限定するものではないが、脳、肺、膵臓、肝臓、前立腺、心臓、卵巣、皮膚、腎臓、腸および胃を染色しない。抗体結合および特異的染色パターンは、限定するものではないが、免疫組織化学および蛍光細胞分析分離装置（FACS）など、当分野で周知の免疫学的標識方法により容易に決定することができる。具体的方法およびプロトコルは、特に、以下に挙げる文献に記載されている：PolakおよびVan Moorden（1997）Introduction to Immunocytochemistry, 第２版、Springer Verlag, N.Y.およびHaugland（2004）Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 第９版、Molecular Probes, Inc.（オレゴン州ユージーン）により刊行されたハンドブックおよびカタログ組合せ。
【０１１０】
別の実施形態では、EphA2および／またはEphA4に免疫特異的に結合する抗体の変異体、その誘導体、類似体およびエピトープ結合フラグメントであり、例えば、限定するものではないが、本明細書、ならびにPCT公開番号WO 04/014292、WO 03/094859および米国特許出願番号10/863,729（これらの各々は、参照としてその全文を本明細書に組み込む）に開示されているもの、ならびに、表４に記載した抗体のすべてが挙げられる。具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、12G3H11、および／または3F2および／または表４に記載した抗体のいずれかに由来する可変領域（例えば、１以上のCDR）の全部または一部を含むEphA2および／またはEphA4に免疫特異的に結合する抗体である。
【０１１１】
本発明はさらに、少なくとも１つのEph受容体に対し高い親和性を有する本発明のFc変異体の使用も含む。具体的実施形態では、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合する本発明のFc変異体は、その会合速度定数すなわちkon速度（Fc変異体(Ab)+抗原(Ag)kon←Ab−Ag）が、少なくとも105M-1s-1、少なくとも5×105M-1s-1、少なくとも106M-1s-1、少なくとも5×106M-1s-1、少なくとも107M-1s-1、少なくとも5×107M-1s-1、もしくは少なくとも108M-1s-1である。別の具体的実施形態では、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合する本発明のFc変異体は、その会合速度定数すなわちkon速度（Fc変異体(Ab)+抗原(Ag)kon←Ab−Ag）が、少なくとも約105M-1s-1、少なくとも約5×105M-1s-1、少なくとも約106M-1s-1、少なくとも約5×106M-1s-1、少なくとも約107M-1s-1、少なくとも約5×107M-1s-1、もしくは少なくとも約108M-1s-1である。別の実施形態では、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体は、そのkonが、少なくとも2×105M-1s-1、少なくとも5×105M-1s-1、少なくとも106M-1s-1、少なくとも5×106M-1s-1、少なくとも107M-1s-1、少なくとも5×107M-1s-1、もしくは少なくとも108M-1s-1である。さらに別の具体的実施形態では、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体は、そのkon速度が、少なくとも約2×105M-1s-1、少なくとも約5×105M-1s-1、少なくとも約106M-1s-1、少なくとも約5×106M-1s-1、少なくとも約107M-1s-1、少なくとも約5×107M-1s-1、もしくは少なくとも約108M-1s-1である。
【０１１２】
別の実施形態では、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合する本発明のFc変異体は、そのkoff速度（Fc変異体(Ab)+抗原(Ag)koff←Ab−Ag）が、10-1s-1以下、5×10-1s-1以下、10-2s-1以下、5×10-2s-1以下、10-3s-1以下、5×10-3s-1以下、10-4s-1以下、5×10-4s-1以下、10-5s-1以下、5×10-5s-1以下、10-6s-1以下、5×10-6s-1以下、10-7s-1以下、5×10-7s-1以下、10-8s-1以下、5×10-8s-1以下、10-9s-1以下、5×10-9s-1以下、もしくは10-10-1s-1以下である。さらに別の実施形態では、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合する本発明のFc変異体は、そのkoff速度（Fc変異体(Ab)+抗原(Ag)koff←Ab−Ag）が、約10-1s-1以下、約5×10-1s-1以下、約10-2s-1以下、約5×10-2s-1以下、約10-3s-1以下、約5×10-3s-1以下、約10-4s-1以下、約5×10-4s-1以下、約10-5s-1以下、約5×10-5s-1以下、約10-6s-1以下、約5×10-6s-1以下、約10-7s-1以下、約5×10-7s-1以下、約10-8s-1以下、約5×10-8s-1以下、約10-9s-1以下、約5×10-9s-1以下、もしくは約10-10-1s-1以下である。また別の実施形態では、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体は、そのkoff速度が、5×10-4s-1以下、10-5s-1以下、5×10-5s-1以下、10-6s-1以下、5×10-6s-1以下、10-7s-1以下、5×10-7s-1以下、10-8s-1以下、5×10-8s-1以下、10-9s-1以下、5×10-9s-1以下、もしくは10-10-1s-1以下である。別の実施形態では、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体は、そのkoff速度が、約5×10-4s-1以下、約10-5s-1以下、約5×10-5s-1以下、約10-6s-1以下、約5×10-6s-1以下、約10-7s-1以下、約5×10-7s-1以下、約10-8s-1以下、約5×10-8s-1以下、約10-9s-1以下、約5×10-9s-1以下、もしくは約10-10-1s-1以下である。
【０１１３】
別の実施形態では、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合する本発明のFc変異体の親和定数すなわちKa（kon／koff）が、少なくとも102M-1、少なくとも5×102M-1、少なくとも103M-1、少なくとも5×103M-1、少なくとも104M-1、少なくとも5×104M-1、少なくとも105M-1、少なくとも5×105M-1、少なくとも106M-1、少なくとも5×106M-1、少なくとも107M-1、少なくとも5×107M-1、少なくとも108M-1、少なくとも5×108M-1、少なくとも109M-1、少なくとも5×109M-1、少なくとも1010M-1、少なくとも5×1010M-1、少なくとも1011M-1、少なくとも5×1011M-1、少なくとも1012M-1、少なくとも5×1012M-1、少なくとも1013M-1、少なくとも5×1013M-1、少なくとも1014M-1、少なくとも5×1014M-1、少なくとも1015M-1、もしくは少なくとも5×1015M-1である。さらに別の実施形態では、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合する本発明のFc変異体の親和定数すなわちKa（kon／koff）が、少なくとも約102M-1、少なくとも約5×102M-1、少なくとも約103M-1、少なくとも約5×103M-1、少なくとも約104M-1、少なくとも約5×104M-1、少なくとも約105M-1、少なくとも約5×105M-1、少なくとも約106M-1、少なくとも約5×106M-1、少なくとも約107M-1、少なくとも約5×107M-1、少なくとも約108M-1、少なくとも約5×108M-1、少なくとも約109M-1、少なくとも約5×109M-1、少なくとも約1010M-1、少なくとも約5×1010M-1、少なくとも約1011M-1、少なくとも約5×1011M-1、少なくとも約1012M-1、少なくとも約5×1012M-1、少なくとも約1013M-1、少なくとも約5×1013M-1、少なくとも約1014M-1、少なくとも約5×1014M-1、少なくとも約1015M-1、もしくは少なくとも約5×1015M-1である。
【０１１４】
別の実施形態では、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体の解離定数すなわちKd（koff／kon）が、10-2M以下、5×10-2M以下、10-3M以下、5×10-3M以下、10-4M以下、5×10-4M以下、10-5M以下、5×10-5M以下、10-6M以下、5×10-6M以下、10-7M以下、5×10-7M以下、10-8M以下、5×10-8M以下、10-9M以下、5×10-9M以下、10-10M以下、5×10-10M以下、10-11M以下、5×10-11M以下、10-12M以下、5×10-12M以下、10-13M以下、5×10-13M以下、10-14M以下、5×10-14M以下、10-15M以下、もしくは5×10-15M以下である。さらに別の実施形態では、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体の解離定数すなわちKd（koff／kon）が、約10-2M以下、約5×10-2M以下、約10-3M以下、約5×10-3M以下、約10-4M以下、約5×10-4M以下、約10-5M以下、約5×10-5M以下、約10-6M以下、約5×10-6M以下、約10-7M以下、約5×10-7M以下、約10-8M以下、約5×10-8M以下、約10-9M以下、約5×10-9M以下、約10-10M以下、約5×10-10M以下、約10-11M以下、約5×10-11M以下、約10-12M以下、約5×10-12M以下、約10-13M以下、約5×10-13M以下、約10-14M以下、約5×10-14M以下、約10-15M以下、もしくは約5×10-15M以下である。
【０１１５】
Fc変異体の標的として考えられるその他のRTK分子として、未分化リンパ腫キナーゼ（ANK）、オーファンRTKが挙げられる。ALKは、初め、t(2;5)転座のためにヌクレオホスミン（npm/ALK）との融合タンパク質として同定された（Morrisら、1994）。この融合により、細胞内ALKキナーゼの構成的活性化が起こり、これが未分化リンパ腫を誘発することが明らかにされた。全長ALK受容体は、発生中の神経系に高度に発現し、生後ダウンレギュレートされることがわかっている（Iwaharaら、1997）。近年、ALKは、ヒトにおけるプレイオトロフィン（PTN）の細胞受容体であり、このチロシンキナーゼ受容体はヒトグリア芽細胞腫に過剰発現し、グリア芽細胞腫の異種移植片モデルの増殖について律速的であることがみいだされた（米国特許公開番号2002/034768）一実施形態では、本発明のFc変異体は、ALK（例：Genbank受託番号：Q9UM73）に免疫特異的に結合する。具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、ALKの細胞外ドメインに免疫特異的に結合する。別の実施形態では、本発明のFc変異体は、PTN（例：Genbank受託番号：NP 002816）に免疫特異的に結合する。具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、PTNとALKの結合を阻止する。
【０１１６】
６．１  Eph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体
前述したように、本発明は、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合する可変領域と、さらに少なくとも１つの高エフェクター機能アミノ酸残基（例えば、239D、330L、332Eが挙げられ、ここで、残基の番号付けはKabatにより記載されたEU指数によるものである）を含むFc領域とを含んでなるFc変異体を包含する。本発明はさらに、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合し、同等分子と比較して、改変されたADCCおよび／またはCDC活性と、１以上のFcリガンド（例えば、FcγR、C1q）に対し変更された結合親和性とを有する。本発明は具体的に、限定するものではないが、以下のものを含む抗Eph受容体抗体またはそのフラグメントから誘導されたFc変異体を包含する：Eph099B-102.147（ATCC受託番号PTA-4572）、Eph099B-208.261（ATCC受託番号PTA-4573）、Eph099B-210.248（ATCC受託番号PTA-4574）、Eph099B-233.152（ATCC受託番号PTA-5194）、（PCT公開番号WO 03/094859：参照としてその全文を本明細書に組み込む）；EA2（ATCC受託番号PTA-4380）、EA3、EA4、EA5（ATCC受託番号PTA-4381）、（PCT公開番号WO 04/014292：参照としてその全文を本明細書に組み込む）；LX-13およびscFv（ATCC受託番号PTA-6044）、（米国特許出願番号10/863,729：参照としてその全文を本明細書に組み込む）、および12G3H11（後述）ならびにこれらの類似体、誘導体、もしくは断片。具体的には、本発明のFc変異体は、12G3H11（表３参照）および／または表４に記載した抗体のいずれかに由来する可変領域の全部または一部（例えば、１以上のCDR）を含むものが考えられる。
【０１１７】
一実施形態では、Fc変異体は、12G3H11、すなわち、EphA2に結合するヒト化アゴニストモノクローナル抗体のFc変異体である。12G3H11の重および軽鎖の可変領域のDNAおよび推定アミノ酸配列をそれぞれ図2Aおよび2Bに示す。本明細書では、上記重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号64および配列番号65として示す（図2Aおよび2B）。また、本明細書では、上記重鎖可変領域および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号62および配列番号63として示す（図2Aおよび2B）。別の実施形態では、本発明のFc変異体は、12G3H11と同じエピトープに結合するか、または12G3H11と競合してEphA2に結合する。さらに別の実施形態では、Eph受容体に免疫特異的に結合する本発明のFc変異体は、12G3H11のFc変異体ではない。
【０１１８】
別の実施形態では、本発明のFc変異体は、3F2、すなわち、EphA2に結合するヒト化アゴニストモノクローナル抗体のFc変異体である。3F2の重および軽鎖の可変領域のDNAおよび推定アミノ酸配列をそれぞれ図3Aおよび3Bに示す。本明細書では、上記重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号68および配列番号69として示す（図3Aおよび3B）。また、本明細書では、上記重鎖可変領域および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号66および配列番号67として示す（図3Aおよび3B）。別の実施形態では、本発明のFc変異体は、3F2と同じエピトープに結合するか、または3F2と競合してEphA2に結合する。さらに別の実施形態では、Eph受容体に免疫特異的に結合する本発明のFc変異体は、3F2のFc変異体ではない。
【０１１９】
具体的実施形態では、本発明のFc変異体は、Eph受容体（前掲参照）に免疫特異的に結合する抗体またはそのフラグメントの抗原結合ドメイン（例えば、可変領域）またはその断片と、少なくとも１つの高エフェクター機能アミノ酸残基を含むFc領域を組み合わせることにより作製する。このような組換え抗体の作製方法は、当業者には周知であり、以下に詳しく説明する。
【０１２０】
一実施形態では、本発明のFc変異体は、他のEph受容体より、EphA2に優先的に結合する。別の実施形態では、本発明のFc変異体は、他のEph受容体より、EphA4に優先的に結合する。さらに別の実施形態では、本発明のFc変異体は、１以上のEph受容体複合体（例えば、Eph受容体−エフリンリガンド複合体）と免疫反応する。また別の実施形態では、本発明のFc変異体は、１以上のEph受容体に免疫特異的に結合する。１以上のEph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体によって結合されたEph受容体の組合せは、次の式で示される：EphA(x) + EphB(y)；EphA (x) + EphA (x)；EphB(y) + EphB(y)；式中、(x)は１、２、３、3a、3b、４、５、5a、5b、６、７もしくは８であり、(y)は１、２、2a、2b、３、４、５もしくは６である。具体的実施形態では、１以上のEph受容体と免疫反応するFc変異体は、例えば、EphA2 + EphA4、またはEphA2 + EphA3、またはEphA2 + EphB4、またはEphA4 + EphA3、もしくはEphA4 + EphB4に結合する。具体的には、１以上のEph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体は二重特異性抗体であることが考えられる。さらに、１以上のEph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体は、２以上のEph受容体の共通エピトープに結合する抗体であることも意図されている。さらにまた、１以上のEph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体は、１以上のEph受容体と交差反応する抗体であることも意図されている。加えて、本発明のFc変異体は、１以上のEph受容体（例えば、EphA2とEphA4）に対し同じ免疫反応性を有するものでも、あるいは、他の受容体より１つのEph受容体と強く免疫反応するものでもよい。
【０１２１】
本発明は、EphA2受容体に免疫特異的に結合するFc変異体であって、該抗体が、12G3H11、Eph099B-102.147、Eph099B-208.261、Eph099B-210.248、Eph099B-233.152、EA2、EA3、EA4、もしくはEA5のアミノ酸配列を有する可変重鎖（VH）ドメインを含む、上記Fc変異体を包含する。本発明はまた、EphA2受容体に免疫特異的に結合するFc変異体であって、該抗体が、12G3H11、Eph099B-102.147、Eph099B-208.261、Eph099B-210.248、Eph099B-233.152、EA2、EA3、EA4、もしくはEA5のアミノ酸配列を有する可変軽鎖（VL）ドメインを含む、上記Fc変異体を包含する。本発明はさらに、EphA2受容体に免疫特異的に結合するFc変異体であって、該抗体が、本明細書に開示のVLドメイン、もしくは他のVLドメインと組み合わせた本明細書に開示のVHドメインを含む、上記Fc変異体も包含する。本発明はさらに、EphA2受容体に免疫特異的に結合するFc変異体であって、該変異体が、本明細書に開示のVHドメイン、もしくは他のVHドメインと組み合わせた本明細書に開示のVLドメインを含む、上記Fc変異体も包含する。
【０１２２】
本発明は、EphA4受容体に免疫特異的に結合するFc変異体であって、該抗体が、LX-13またはscFv EA44のVHドメインのアミノ酸配列を有する可変重鎖（VH）ドメインを含む、上記Fc変異体を包含する。本発明はまた、EphA4受容体に免疫特異的に結合するFc変異体であって、該抗体が、LX-13またはscFv EA44のVLドメインのアミノ酸配列を有する可変軽鎖（VL）ドメインを含む、上記Fc変異体を包含する。本発明はさらに、EphA4受容体に免疫特異的に結合するFc変異体であって、該抗体が、本明細書に開示のVLドメイン、もしくは他のVLドメインと組み合わせた本明細書に開示のVHドメインを含む、上記Fc変異体も包含する。本発明はさらに、EphA4受容体に免疫特異的に結合するFc変異体であって、該変異体が、本明細書に開示のVHドメイン、もしくは他のVHドメインと組み合わせた本明細書に開示のVLドメインを含む、上記Fc変異体も包含する。
【０１２３】
本発明は、Eph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体であって、該抗体が、表３（後掲）に記載するVH CDRのいずれか１つのアミノ酸配列を有するVH CDRを含む、上記Fc変異体を包含する。本発明はまた、Eph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体であって、該抗体が、表３（後掲）に記載するVL CDRのいずれか１つのアミノ酸配列を有するVL CDRを含む、上記Fc変異体を包含する。本発明はまた、Eph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体であって、該Fc変異体が、表３に記載する１以上のVH CDRと、１以上のVL CDRを含む、上記Fc変異体を包含する。本発明はさらに、Eph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体であって、該Fc変異体が、表３（後掲）に記載するVH CDRおよびVL CDRのいくつかまたはすべての組合せを含む、上記Fc変異体を包含する。
【表３】
2008510007.tif 000004
【表４】
2008510007.tif 000005
【０１２４】
本発明はまた、12G3H11、Eph099B-102.147、Eph099B-208.261、Eph099B-210.248、Eph099B-233.152、EA2、EA3、EA4、EA5、LX-13またはscFv EA44、もしくはそれらの抗原結合フラグメントと競合して、Eph受容体に結合するFc変異体も包含する。このような抗体を同定するのに用いられる競合アッセイは、当業者には周知である。具体的実施形態では、周知のORIGEN分析で測定すると、１μg／mlの本発明の抗体は、ORIGEN TAG標識した12G3H11、Eph099B-102.147、Eph099B-208.261、Eph099B-210.248、Eph099B-233.152、EA2、EA3、EA4、EA5、LX-13もしくはscFv EA44が、ビオチン標識したEph受容体に結合するのを75％、80％、85％、もしくは90％阻止する。
【０１２５】
本発明はまた、当業者には周知のフレームワーク領域を含むFc変異体を提供する。一実施形態では、本発明の抗体またはそのフラグメントのフレームワーク領域はヒト由来か、もしくはヒト化されている。
【０１２６】
本発明は、任意の他の置換または改変（例えば、前述のFc置換）に加えて、突然変異（例えば、１以上のアミノ酸置換）を含む、12G3H11、Eph099B-102.147、Eph099B-208.261、Eph099B-210.248、Eph099B-233.152、EA2、EA3、EA4、EA5、LX-13もしくはscFv EA44のアミノ酸配列を有するFc変異体を包含する。一実施形態では、これら抗体における突然変異は、これらが免疫特異的に結合するEph受容体に対する該抗体の結合活性および／または親和性を維持もしくは増強する。当業者には周知の標準的方法（例えば、免疫検定法）を用いて、特定の抗原に対する抗体の親和性をアッセイすることができる。
【０１２７】
本発明は、Eph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体をコードする、一般に単離された核酸分子の使用を包含する。具体的実施形態では、単離された核酸分子は、Eph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体をコードし、その際、該Fc変異体は、１以上のFc置換（例えば、前記のもの）を含む、12G3H11、Eph099B-102.147、Eph099B-208.261、Eph099B-210.248、Eph099B-233.152、EA2、EA3、EA4、EA5、LX-13もしくはscFv EA44のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、単離された核酸分子は、Eph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体をコードし、その際、該Fc変異体は、12G3H11、Eph099B-102.147、Eph099B-208.261、Eph099B-210.248、Eph099B-233.152、EA2、EA3、EA4、EA5、LX-13もしくはscFv EA44のVHドメインのアミノ酸配列を有するVHドメインを含む。別の実施形態では、単離された核酸分子が、Eph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体をコードし、その際、該抗体は、12G3H11、Eph099B-102.147、Eph099B-208.261、Eph099B-210.248、Eph099B-233.152、EA2、EA3、EA4、EA5、LX-13もしくはscFv EA44のVLドメインのアミノ酸配列を有するVLドメインを含む。
【０１２８】
本発明は、Eph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体をコードする単離された核酸分子の使用を包含するが、その際、該Fc変異体は、表３に記載するVH CDRのいずれかのアミノ酸配列、および／または表４に記載する抗体のいずれかの重鎖由来のアミノ酸配列を有するVH CDRを含む。特に、本発明は、Eph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体をコードする単離された核酸分子の使用を包含し、その際、該抗体は、表３に記載するVH CDRのいずれかのアミノ酸配列、および／または表４に記載する抗体のいずれかの重鎖由来のアミノ酸配列を有する１、２、もしくはそれ以上のVH CDRを含む。
【０１２９】
本発明は、Eph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体をコードする単離された核酸分子の使用を包含するが、その際、該Fc変異体は、表３に記載するVL CDRのいずれかのアミノ酸配列、および／または表４に記載する抗体のいずれかの軽鎖由来のアミノ酸配列を有するVL CDRを含む。特に、本発明は、Eph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体をコードする単離された核酸分子の使用を包含し、その際、該抗体は、表３に記載するVL CDRのいずれかのアミノ酸配列、および／または表４に記載する抗体のいずれかの軽鎖由来のアミノ酸配列を有する１、２もしくはそれ以上のVL CDRを含む。
【０１３０】
本発明は、Eph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体をコードする単離された核酸分子の使用を包含するが、その際、該Fc変異体は、Eph受容体に免疫特異的に結合する、本明細書に記載のVHドメイン、VH CDR、VLドメイン、もしくはVL CDRの誘導体を含む。本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列に突然変異（例えば、付加、欠失、および／または置換）を導入するのに用いることができる当業者には周知の標準的方法（例えば、部位特異的突然変異誘発およびPCR仲介突然変異誘発など）を通常に用いて、アミノ酸置換を実施する。一実施形態では、VHおよび／またはVL CDR誘導体は、本来のVHおよび／またはVL CDRに対して、25以下のアミノ酸置換、20以下のアミノ酸置換、15以下のアミノ酸置換、10以下のアミノ酸置換、５以下のアミノ酸置換、４以下のアミノ酸置換、３以下のアミノ酸置換、２以下のアミノ酸置換を含む。別の実施形態では、VHおよび／またはVL CDR誘導体は、１以上の推定非必須アミノ酸残基（すなわち、抗体が、Eph受容体に免疫特異的に結合する上で重要ではないアミノ酸残基）で実施される保存的アミノ酸置換（例えば、前記のもの）を有する。あるいは、例えば、飽和突然変異誘発により、VHおよび／またはVL CDRコード配列の全部または一部に沿ってランダムに突然変異を導入し、得られた突然変異体を生物活性についてスクリーニングにすることにより、活性を保持する突然変異体を同定することができる。突然変異誘発後、コードした抗体を発現させ、抗体の活性を決定することができる。
【０１３１】
本発明は、可変軽鎖（VL）ドメインおよび／または可変重鎖（VH）ドメインに１以上の別のアミノ酸残基置換を含む、12G3H11、Eph099B-102.147、Eph099B-208.261、Eph099B-210.248、Eph099B-233.152、EA2、EA3、EA4、EA5、LX-13もしくはscFv EA44のFc変異体を含む。本発明はまた、１以上のVL CDRおよび／または１以上VH CDRに１以上の別のアミノ酸残基置換を含む、12G3H11、Eph099B-102.147、Eph099B-208.261、Eph099B-210.248、Eph099B-233.152、EA2、EA3、EA4、EA5、LX-13もしくはscFv EA44のFc変異体を含む。12G3H11、Eph099B-102.147、Eph099B-208.261、Eph099B-210.248、Eph099B-233.152、EA2、EA3、EA4、EA5、LX-13もしくはscFv EA44のFc変異体のVHドメイン、VH CDR、VLドメインおよび／またはVL CDRに置換を導入することにより作製した抗体は、in vitroおよびin vivoで、例えば、それがEph受容体および／またはFcγRに結合する能力について（例えば、限定するものではないが、ELISAおよびBIAcoreにより）、またはそれがADCCを仲介し、癌または１以上のその症状を予防、治療、管理もしくは改善する能力について試験することができる。
【０１３２】
本発明はまた、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体またはそのフラグメントの使用も包含し、その際、該Fc変異体は、12G3H11（すなわち、配列番号64および／または配列番号65）、3F2（すなわち、配列番号68および／または配列番号69）、Eph099B-102.147、Eph099B-208.261、Eph099B-210.248、Eph099B-233.152、EA2、EA3、EA4、EA5、LX-13もしくはscFv EA44の可変重鎖および／または可変軽鎖のアミノ酸配列に対し、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％同一の可変重鎖および／または軽鎖のアミノ酸配列を含む。本発明はまた、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体またはそのフラグメントの使用も包含し、その際、該Fc変異体は、12G3H11（すなわち、配列番号64および／または配列番号65）、3F2（すなわち、配列番号68および／または配列番号69）、Eph099B-102.147、Eph099B-208.261、Eph099B-210.248、Eph099B-233.152、EA2、EA3、EA4、EA5、LX-13もしくはscFv EA44の可変重鎖および／または可変軽鎖のアミノ酸配列に対し、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、もしくは少なくとも約99％同一の可変重鎖および／または軽鎖のアミノ酸配列を含む。本発明はさらに、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体またはそのフラグメントの使用を包含し、その際、該抗体または抗体フラグメントは、12G3H11、Eph099B-102.147、Eph099B-208.261、Eph099B-210.248、Eph099B-233.152、EA2、EA3、EA4、EA5、LX-13もしくはscFv EA44の１以上のCDRのアミノ酸配列に対し、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％同一の１以上のCDRのアミノ酸配列を含む。本発明はさらに、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体またはそのフラグメントの使用を包含し、その際、該抗体または抗体フラグメントは、12G3H11、Eph099B-102.147、Eph099B-208.261、Eph099B-210.248、Eph099B-233.152、EA2、EA3、EA4、EA5、LX-13もしくはscFv EA44の１以上のCDRのアミノ酸配列に対し、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、もしくは少なくとも約99％同一の１以上のCDRのアミノ酸配列を含む。２つのアミノ酸配列の同一性百分率の決定は、当業者には周知のあらゆる方法（例えば、BLASTタンパク質検索など）により実施することができる。
【０１３３】
本発明はまた、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体またはそのフラグメントの使用も包含し、その際、該Fc変異体は、12G3H11（すなわち、配列番号62および／または配列番号63）、3F2（すなわち、配列番号66および／または配列番号67）、Eph099B-102.147、Eph099B-208.261、Eph099B-210.248、Eph099B-233.152、EA2、EA3、EA4、EA5、LX-13もしくはscFv EA44のヌクレオチド配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされる。別の好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体またはそのフラグメントの使用を包含し、その際、該Fc変異体は、12G3H11、Eph099B-102.147、Eph099B-208.261、Eph099B-210.248、Eph099B-233.152、EA2、EA3、EA4、EA5、LX-13もしくはscFv EA44の１以上のCDRのヌクレオチド配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされる。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件としては、限定するものではないが、約45℃での6X塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）におけるフィルター結合DNAとのハイブリダイゼーションの後、約50〜65℃で0.2X SSC／0.1％SDSにおける１回以上の洗浄を行なうもの；約45℃での6X SSCにおけるフィルター結合DNAとのハイブリダイゼーションの後、約60℃で0.2X SSC／0.2％SDSにおける１回以上の洗浄のような高ストリンジェント条件、もしくは当業者には周知のその他のストリンジェントハイブリダイゼーション条件（例えば、Ausubel, F.M.ら、1989 Current Protocols in Molecular Biology, 第１巻、Green Publishing Associates, Inc.およびJohn Wiley and Sons, Inc., NY、6.3.1〜6.3.6および2.10.3頁）が挙げられる。
【０１３４】
本発明の様々な形態に含まれる抗体のさらに詳細な説明を以下に記載する。
【０１３５】
６．２  本発明の抗体
本発明のFc変異体には、限定するものではないが、合成抗体、モノクローナル抗体、オリゴクローナル抗体、組換えにより作製した抗体、イントラボディー（intrabodies）、多重特異性抗体、二重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、合成抗体、一本鎖FvFc（scFvFc）、一本鎖Fv（scFv）、ならびに抗イディオタイプ（抗Id）抗体が含まれる。特に、本発明に用いる抗体は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性の部分を含む。本発明の抗体は、あらゆるタイプ（例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY）、クラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2）もしくはサブクラスの免疫グロブリン分子でよい。
【０１３６】
本発明の変異体は、鳥類および哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、もしくはニワトリ）を含む動物に由来するものでよい。好ましくは、抗体はヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である。本明細書で用いる「ヒト」抗体とは、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体、ならびに、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、またはヒト遺伝子由来の抗体を発現するマウスから単離した抗体を包含する。
【０１３７】
抗体はあらゆるポリペプチドと同様に等電点（pI）を有し、これは、一般に、ポリペプチドが正味電荷を帯びていないpHとして定義される。溶液のpHがタンパク質の等電点（pI）と等しいとき、一般にタンパク質溶解度が最も低いことは当分野で周知である。抗体におけるイオン化可能残基の数および位置を改変して、pIを調節することにより、溶解度を最適化することができる。例えば、ポリペプチドのpIは、適切なアミノ酸置換を実施する（例えば、アラニンのような非荷電残基をリシンのような荷電アミノ酸で置換することにより）ことにより、操作することができる。特定の理論に拘束されるわけではないが、上記抗体のpIを変化させる抗体のアミノ酸置換により、抗体の溶解度および／または安定性を改善することができる。当業者であれば、特定の抗体について所望のpIを達成するのにどんなアミノ酸置換が最も適しているかわかるであろう。タンパク質のpIは、限定するものではないが、等電点電気泳動や、各種コンピューターアルゴリズム（例えば、Bjellqvistら、1993, Electrophoresis 14:1032参照）など、様々な方法により決定することができる。一実施形態では、本発明のFc変異体のpIは、約6.5、約7.0、約8.0、約8.5、もしくは約9.0より高い。別の実施形態では、本発明のFc変異体のpIは、6.5、7.0、8.0、8.5、もしくは9.0より高い。一実施形態では、本発明のFc変異体のpIに変化をもたらす置換は、Eph受容体に対する結合親和性を有意に減少させるものではない。具体的には、FcγRとの結合を改変させるFc領域の置換（前掲参照）が、pIも変化させることが考えられる。好ましい実施形態では、FcγR結合に所望する改変とpIに所望する改変の両方を実施するように、Fc領域の置換を具体的に選択する。本明細書で用いるpI値は、優勢な電荷形態のpIとして定義する。タンパク質のpIは、、限定するものではないが、等電点電気泳動や、各種コンピューターアルゴリズム（例えば、Bjellqvistら、1993, Electrophoresis 14:1032参照）など、様々な方法により決定することができる。
【０１３８】
抗体のFabドメインのTmは、抗体の熱安定性の優れた指標であり、貯蔵寿命の指標も提供しうる。Tmが低いほど、凝集が多く、安定性が低いことを示すのに対し、Tmが高いほど、凝集が少なく、安定性が高いことを示す。従って、Tmが高い抗体ほど好ましい。一実施形態では、Fc変異体のFabドメインは、少なくとも50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃もしくは120℃より高いTm値を有する。別の実施形態では、Fc変異体のFabドメインは、少なくとも約50℃、約55℃、約60℃、約65℃、約70℃、約75℃、約80℃、約85℃、約90℃、約95℃、約100℃、約105℃、約110℃、約115℃もしくは約120℃より高いTm値を有する。タンパク質ドメイン（例えば、Fabドメイン）の熱融解温度（Tm）は、当業者には周知の標準的方法、例えば、示差走査熱量測定法（例えば、Vermeerら、2000, Biophys. J. 78:394-404；Vermeerら、2000, Biophys. J. 79:2150-2154を参照）を用いて測定することができる。
【０１３９】
本発明のFc変異体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性もしくはそれ以上の多重特異性のいずれでもよい。多重特異性抗体は、所望の標的分子の様々なエピトープと免疫特異的に結合するか、あるいは、標的分子および異種エピトープ（例えば、異種ポリペプチドまたは固体支持材料）の両方と免疫特異的に結合することができる。例えば、国際公開番号WO 94/04690；WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；ならびにWO 92/05793；Tuttら、1991, J.Immunol. 147:60-69；米国特許第4,474,893号、第4,714,681号、第4,925,648号、第5,573,920号、および第5,601,819号；ならびに、Kostenlyら、1992, J. Immunol. 148:1547（各々、全文を参照として本明細書に組み込む）を参照されたい。一実施形態では、結合特異性の１つは、Eph受容体に対するものであり、もう一つは他のいずれかの抗原（すなわち、別のEph受容体、エフリン、シグナル伝達またはエフェクター分子）に対するものである。
【０１４０】
多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する。このような分子は通常、２つの抗原にしか結合しない（すなわち、二重特異性抗体、BsAb）が、これに加えてさらに特異性を備えた抗体、例えば、三重特異性抗体も本発明に含まれる。BsAbの例として、限定するものではないが、一方のアームがインテグリンαvβ3に対するものであり、他方のアームが別の抗原に対するものである。二重特異性抗体の作製方法は当分野では周知である。全長二重特異性抗体の伝統的作製方法は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づくが、その際、これら２つの鎖は異なる特異性を有する（Millsteinら、1983, Nature, 305：537-539；その全文を参照として本明細書に組み込む）。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな集まりのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ(quadroma)）は、様々な抗体分子からなる候補混合物を産生し、そのうちの１つだけが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製（通常クロマトグラフィー工程により実施される）は、かなり面倒で、しかも生成物の収率が低い。同様の手順がWO 93/08829、ならびにTrauneckerら、1991, EMBO J., 10:3655-3659に記載されている。より特異性の高い手法は、ジ−ダイアボディ（Di-diabody）、すなわち、四価二重特異性抗体の作製である。Di-diabodyの製造方法は当分野で周知である（例えば、Luら、2002, J Immunol Methods 279:219-32；Marvinら、2005, acta Pharmacolical Sinica 26:649参照）。
【０１４１】
別の手法によれば、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させる。融合は、ヒンジ、CH2、およびCH3領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインと行なうのが好ましい。一実施形態では、軽鎖結合に必要な部位を含む第１重鎖定常領域（CH1）は、融合物の少なくとも１つに存在する。免疫グロブリン重鎖融合物、および所望であれば、免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAを個別の発現ベクターに挿入し、好適な宿主生物に共トランスフェクションする。これにより、構築物に用いた３つのポリペプチド鎖の比率をまちまちして最適収率を得る場合に、３つのポリペプチド断片の相互比率を調節する上で大きなフレキシビリティーがもたらされる。しかし、等しい比率で少なくとも２つのポリペプチド鎖を発現させて高収率を得る、または比率が特に重要でない場合には、１つの発現に２または３つ全部のポリペプチド鎖のコード配列を挿入することが可能である。
【０１４２】
この手法の一実施形態では、二重特異性抗体は、一方のアームに第１結合特異性（例えば、Eph受容体）を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）から構成される。この非対称構造は、二重特異性分子の半分だけに免疫グロブリン軽鎖が存在して、容易な分離方法を提供することから、不要な免疫グロブリン鎖の組合せから所望の二重特異性化合物の分離を容易にする。この手法は、WO 94/04690（参照として本明細書にその全文を組み込む）に開示されている。二重特異性抗体の作製についてさらに詳しくは、例えば、Sureshら、1986, Methods in Enzymology, 121:210（参照として本明細書にその全文を組み込む）を参照されたい。WO 96/27011（参照として本明細書にその全文を組み込む）に記載されている別の手法によれば、組換え細胞培養物から回収したヘテロ二量体の百分率を最大にするように１対の抗体分子を作製することができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのCH3ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの１以上の小さいアミノ酸側鎖をこれより大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプロファン）で置換する。大きいアミノ酸側鎖をこれより小さい側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置換することにより、第２抗体分子の界面に、大きい側鎖と同じか、または類似したサイズの補償「キャビティー」が形成される。これにより、ホモ二量体のような望まない最終生成物と比較して、ヘテロ二量体の収率を高める機構が提供される。
【０１４３】
二重特異性抗体は、架橋または「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体の１つをアビジンと、他方をビオチンと結合させることができる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞にターゲッティングするのに（米国特許第4,676,980号）、また、HIV感染の治療のために（WO 91/00360、WO 92/200373、および欧州特許第03089号）に提案されている。尚、前記参照文献は、各々参照として本明細書にその全文を組み込むものとする。ヘテロコンジュゲートは、任意の好適な架橋方法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は、当分野で周知であり、米国特許第4,676,980号に開示されているものなど、多数の架橋方法がある。尚、前記参照文献は、各々参照として本明細書にその全文を組み込むものとする。
【０１４４】
本発明の少なくとも１つのヒンジ変更を含む２価以上の抗体が意図される。例えば、三重特異性抗体を作製することができる。例えば、Tuttら、J. Immunol. 147:60（1991）（参照として本明細書にその全文を組み込む）を参照されたい。
【０１４５】
本発明のFc変異体は、単一ドメイン抗体を含むが、そのような抗体として、ラクダ化単一ドメイン抗体が挙げられる（例えば、Muyldermansら、2001, Trends Biochem. Sci. 26:230；Nuttallら、2000, Cur. Pharm. Biotech. 1:253；ReichmannおよびMuyldermans, 1999, J. Immunol. Meth. 231:25；国際公開番号WO 94/04678およびWO 94/25591；米国特許第6,005,079号参照；これらの文献は、参照として本明細書にその全文を組み込む）。
【０１４６】
具体的に考慮される別の抗体は「オリゴクローナル」抗体である。本明細書に用いる用語「オリゴクローナル抗体」とは、異なるモノクローナル抗体の予定された混合物を意味する。例えば、国際公開WO 95/20401；米国特許第5,789,208号および第6,335,163号（参照として本明細書にその全文を組み込む）を参照されたい。オリゴクローナル抗体は、１以上のエピトープに対する抗体の予定された混合物からなり、単一細胞で作製するのが好ましい。さらに好ましくは、オリゴクローナル抗体は、多重特異性を有する抗体を作製できるように、共通の軽鎖と対を形成することができる複数の重鎖を含む（例えば、国際公開番号WO 04/009618参照；参照として本明細書に組み込む）。オリゴクローナル抗体は、単一標的分子（例えば、インテグリンαvβ3）上の複数のエピトープをターゲッティングしたい場合、特に有用である。当業者は、どの種類の抗体または抗体の混合物が意図する目的および所望のニーズに適用可能かを知っている、もしくは決定することができる。
【０１４７】
一実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、５日以上、10日以上、15日以上、好ましくは20日以上、25日以上、30日以上、35日以上、40日以上、45日以上、２ヶ月以上、３ヶ月以上、４ヶ月以上、もしくは５ヶ月以上の半減期（例えば、血清半減期）を有するFc変異体も包含する。別の実施形態では、本発明の抗体はまた、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、約５日以上、約10日以上、約15日以上、好ましくは約20日以上、約25日以上、約30日以上、約35日以上、約40日以上、約45日以上、約２ヶ月以上、約３ヶ月以上、約４ヶ月以上、もしくは約５ヶ月以上の半減期（例えば、血清半減期）を有するFc変異体も包含する。哺乳動物、好ましくはヒトにおける本発明の抗体の半減期の増加により、哺乳動物における該抗体または抗体フラグメントの血清力価が高くなるため、該抗体または抗体フラグメントの投与頻度を減らす、および／または投与しようとする該抗体または抗体フラグメントの濃度を低減することができる。In vivo半減期が増加した抗体は、当業者には周知の方法により作製することができる。例えば、in vivo半減期が増加した抗体は、FcドメインとFcRn受容体同士の相互作用に関与するものとして同定されたアミノ酸残基を改変（例えば、置換、欠失もしくは付加）することにより、作製することができる（例えば、国際公開番号WO 97/34631；WO 04/029207；米国特許第6,737,056号および米国特許公開番号2003/0190311を参照；これらは各々参照として本明細書にその全文を組み込む）。
【０１４８】
一実施形態では、本発明のFc変異体は、化学的に改変（例えば、１以上の化学成分を抗体に結合させる）してもよいし、そのグリコシル化を改変する、あるいは、抗体の１以上の機能特性を改変するように変更してもよい。
【０１４９】
さらに別の実施形態では、本発明のFc変異体のグリコシル化を改変する。例えば、非グリコシル化抗体を作製することができる（すなわち、抗体がグリコシル化を欠失している）。グリコシル化は、例えば、標的抗原に対する抗体の親和性を高めるように改変することができる。このような炭水化物変更は、例えば、抗体配列内の１以上のグリコシル化部位を改変することにより達成することができる。例えば、１以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位を除去して、その部位でのグリコシル化を排除するような１以上のアミノ酸置換を行うことができる。このようなグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を高めることを可能にする。このような手法についてさらに詳細には、米国特許第5,714,350号および第6,350,861号（いずれも、参照として本明細書にその全文を組み込む）に記載されている。
【０１５０】
前記に加えて、または代わりに、グリコシル化タイプを改変したFc変異体、例えば、フコシル残基の量を低減した低フコシル化抗体またはバイセクティング（bisecting）GlcNA構造が増加した抗体を作製することができる。このような改変グリコシル化パターンは、抗体のADCC能力を高めることが証明されている。このような炭水化物改変は、例えば、グリコシル化機構が改変された宿主細胞に該抗体を発現させることにより達成することができる。改変グリコシル化機構を有する細胞は当分野に記載されており、これを宿主細胞として用いて、そこに本発明の組換え抗体を発現させることにより、グリコシル化が改変された抗体を生産することができる。例えば、Shields, R. L.ら（2002）J. Biol. Chem. 277:26733-26740；Umanaら（1999）Nat. Biotech. 17:176-1、ならびに、欧州特許番号：EP1,176,195；PCT公開 WO03/035835；WO 99/54342（各々、参照として本明細書にその全文を組み込む）を参照されたい。
【０１５１】
さらに別の実施形態では、本発明のFc変異体のグリコシル化を改変する。例えば、非グリコシル化抗体を作製することができる（すなわち、抗体がグリコシル化を欠失している）。グリコシル化は、例えば、標的抗原に対する抗体の親和性を増大するように改変することができる。このような炭水化物変更は、例えば、抗体配列内の１以上のグリコシル化部位を改変することにより達成することができる。例えば、１以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位を除去して、その部位でのグリコシル化を排除するような１以上のアミノ酸置換を行うことができる。このようなグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を高めると考えられる。このような手法についてさらに詳細には、米国特許第5,714,350号および第6,350,861号（いずれも、参照として本明細書にその全文を組み込む）に記載されている。
【０１５２】
前記に加えて、または代わりに、グリコシル化タイプを改変したFc変異体、例えば、フコシル残基の量を低減した低フコシル化抗体またはバイセクティング（bisecting）GlcNA構造が増加した抗体を作製することができる。このような改変グリコシル化パターンは、抗体のADCC能力を高めることが証明されている。上記炭水化物変更は、例えば、グリコシル化機構が改変された宿主細胞に該抗体を発現させることにより達成することができる。改変グリコシル化機構を有する細胞は当分野に記載されており、これを宿主細胞として用いて、そこに本発明の組換え抗体を発現させることにより、グリコシル化が改変された抗体を生産することができる。例えば、Shields, R. L.ら（2002）J. Biol. Chem. 277:26733-26740；Umanaら（1999）Nat. Biotech. 17:176-1、ならびに、欧州特許番号：EP1,176,195；PCT公開 WO03/035835；WO 99/54342（各々、参照として本明細書にその全文を組み込む）を参照。
【０１５３】
６．３  抗体コンジュゲートおよび誘導体
本発明のFc変異体は、変更された（すなわち、任意のタイプの分子を抗体に共有結合させることにより）誘導体を含む。例えば、限定するものではないが、抗体誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化(pegylation)、リン酸化、アミド化、既知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドまたはその他のタンパク質との結合などにより、変更された抗体を含む。多数の化学的変更のいずれかを周知の技術（限定するものではないが、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成など）により実施することができる。さらに、誘導体は、１以上の非古典的アミノ酸を含んでいてもよい。
【０１５４】
in vivo半減期が増加した抗体またはそのフラグメントは、該抗体または抗体フラグメントに高分子量ポリエチレングリコール（PEG）のようなポリマー分子を結合させることにより作製することができる。PEGと該抗体または抗体フラグメントのNまたはC末端との部位特異的結合により、あるいはリシン残基に存在するイプシロン−アミノ基を介して、多機能リンカーを用いて、または用いずに、PEGを上記抗体または抗体フラグメントに結合させることができる。生物活性の損失を最小限にする線状または分枝ポリマー誘導体化を用いてもよい。結合の程度は、SDS-PAGEおよび質量分析法により密にモニターし、PEG分子と上記抗体の適正な結合を確実にする。例えば、サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーにより、未反応PEGを抗体−PEGコンジュゲートから分離してもよい。
【０１５５】
さらに、抗体をアルブミンに結合させることにより、抗体または抗体フラグメントをin vivoで安定性の高いものにする、またはin vivoで半減期の長いものにすることもできる。そのための技術は当分野では周知であり、例えば、WO 93/15199、WO 93/15200、およびWO 01/77137；ならびに欧州特許第413,622号（各々、参照として本明細書にその全文を組み込む）を参照されたい。本発明は、１以上の成分（限定するものではないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、小分子、模倣薬剤、合成薬剤、無機分子および有機分子）に結合または融合した抗体またはそのフラグメントの使用を包含する。
【０１５６】
一実施形態では、本発明は、異種タンパク質またはポリペプチド（あるいはその断片、好ましくは少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個、または少なくとも100個のアミノ酸のポリペプチド）に組換えにより融合、または化学的に結合（共有および非共有結合の両方を含む）させて、融合タンパク質を作製する抗体またはそのフラグメントの使用を包含する。別の実施形態では、本発明は、異種タンパク質またはポリペプチド（あるいはその断片、好ましくは少なくとも約10個、少なくとも約20個、少なくとも約30個、少なくとも約40個、少なくとも約50個、少なくとも約60個、少なくとも約70個、少なくとも約80個、少なくとも約90個、または少なくとも約100個のアミノ酸のポリペプチド）に、組換えにより融合、または化学的に結合（共有および非共有結合の両方を含む）させて、融合タンパク質を作製する抗体またはそのフラグメントの使用を包含する。融合は、必ずしも直接である必要はなく、リンカー配列を介して行なってもよい。例えば、特定の細胞表面受容体に特異的な抗体に上記抗体を融合または結合させることにより、このような抗体を用いて、in vitroまたはin vivoのいずれかで異種ポリペプチドを特定の細胞型にターゲッティングすることができる。異種ポリペプチドに融合または結合させた抗体は、当分野で周知の方法を用いて、in vitro免疫検定法および精製方法に用いることもできる。例えば、国際公開 WO93/21232；欧州特許第439,095号；Naramuraら、1994, Immunol. Lett. 39:91-99；米国特許第5,474,981号；Gilliesら、1992, PNAS 89:1428-1432；ならびにFellら、1991, Immunol. 146:2446-2452（各々、参照として本明細書にその全文を組み込む）を参照されたい。
【０１５７】
本発明は、抗体フラグメントに融合または結合した異種タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドを含む製剤も包含する。例えば、異種ポリペプチドをFabフラグメント、Fdフラグメント、Fvフラグメント、F(ab)2フラグメント、VHドメイン、VLドメイン、VH CDR、VL CDRあるいはそのフラグメントに融合または結合させることができる。ポリペプチドを抗体部分に融合または結合させる方法は、当分野では周知である。例えば、米国特許第5,336,603号、第5,622,929号、第5,359,046号、第5,349,053号、第5,447,851号および第5,112,946号；欧州特許第307,434号および第367,166号；国際公開番号WO 96/04388およびWO 91/06570；Ashkenaziら、1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539；Zhengら、1995, J. Immunol. 154:5590-5600；ならびにVilら、1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337- 11341（これらの参照文献は、参照として本明細書にその全文を組み込む）を参照されたい。
【０１５８】
遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エキソンシャフリング、および／またはコドンシャフリング（総称的に、「DNAシャフリング」と呼ぶ）の技術により、例えば、Eph受容体（例えば、前掲）に免疫特異的に結合する抗体の別の融合タンパク質を作製することもできる。DNAシャフリングを用いて、本発明の抗体またはそのフラグメントの活性を改変する（例えば、高い親和性と低い解離速度を有する抗体またはそのフラグメント）ことができる。例えば、米国特許第5,605,793号；第5,811,238号；第5,830,721号；第5,834,252号；および第5,837,458号； Pattenら、1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33；Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2): 76-82; Hanssonら、1999, J. Mol. Biol. 287:265-76；ならびにLorenzoおよびBlasco, 1998, Biotechniques 24(2): 308- 313（これらの参照文献および刊行物の各々は、参照として本明細書にその全文を組み込む）を参照されたい。抗体またはそのフラグメント、もしくはコードされた抗体またはそのフラグメントは、エラー−プローンPCR、ランダムヌクレオチド挿入もしくはその他の方法によりランダム突然変異誘発に付した後、組換えすることにより、改変することができる。一部がEph受容体に免疫特異的に結合する抗体または抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドの１以上の部分を、１以上の異種分子の１以上の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などで組み換えることもできる。
【０１５９】
さらに、抗体またはそのフラグメントをマーカー配列（例えば、ペプチド）と融合させて、精製を容易にすることができる。好ましい実施形態では、マーカーアミノ酸配列としては、特に、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、pQEベクター（QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA 91311）に付与されるタグがあり、その多くは市販されている。Gentzら、1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824に記載されているように、例えば、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の好適な精製を可能にする。精製に有用なその他のタグとして、限定するものではないが、赤血球凝集素「HA」タグ（インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質（Wilsonら、1984, Cell 37:767）由来のエピトープに対応する）および「フラグ」タグが挙げられる。
【０１６０】
別の実施形態では、本発明のFc変異体またはその類似体もしくは誘導体を診断または検出薬と結合させる。このような抗体は、特定の治療法の効力を決定するなどの臨床試験方法の一環として、癌の発生または進行をモニタリングまたは予測するのに有用となりうる。このような診断および検出は、限定するものではないが、以下に挙げる検出可能な物質と該抗体を結合させることにより達成することができる：各種酵素、例えば、限定するものではないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、もしくはアセチルコリンエステラーゼ；補欠分子族、例えば、限定するものではないが、ストレプトアビジンビオチンおよびアビジン／ビオチン；蛍光材料、例えば、限定するものではないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルもしくはフィコエリトリン；発光物質、限定するものではないが、例えば、ルミノール；生物発光物質、限定するものではないが、例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリン；放射性物質、例えば、限定するものではないが、ヨウ素（131I、125I、123I、121I）、炭素（14C）、イオウ（35S）、トリチウム（3H）、インジウム（115In、113In、112In、111In）、およびテクネチウム（99Tc）、タリウム（201Ti）、ガリウム（68Ga、67Ga）、パラジウム（103Pd）、モリブデン（99Mo）、キセノン（133We）、フッ素（18F）、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、ならびに117Tin；各種の陽電子放射断層撮影法を用いた陽電子放射金属、非放射性常磁性金属イオン、ならびに特定の放射性同位体に放射性標識または結合した分子。
【０１６１】
本発明はさらに、治療薬と結合した本発明のFc変異体またはそのフラグメントも包含する。
【０１６２】
抗体またはそのフラグメントを細胞毒、例えば、細胞分裂抑制または細胞致死薬、治療薬もしくは放射性金属イオン、例えば、α線放射物質などの治療薬成分と結合させることができる。細胞毒または細胞毒性物質は、細胞に有害なあらゆる物質を含む。例として以下のものが挙げられる：パクリタキセル、シトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、ミトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロパノロール、ピューロマイシン、エピルビシン、およびシクロホスファミド、ならびに、これらの類似体または相同体。治療薬として、限定するものではないが、抗代謝物（例：メトトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例：メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（BCNU）およびロムスチン（CCNU）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマニトール、ストレプトゾトシン、ミトマイシンＣ、ならびにシスジクロロジアミン白金（II）（DDP）シスプラチン）、アントラシクリン（例：ダウノロルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例：ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（AMC））、ならびに抗分裂誘発剤（例：ビンクリスチンおよびビンブラスチン）。治療薬成分のさらに広範なリストは、PCT公開WO 03/075957（参照として本明細書にその全文を組み込む）に記載されている。
【０１６３】
さらに、抗体またはそのフラグメントを所与の生物学的応答を変更する治療薬または薬剤成分と結合させてもよい。治療薬または薬剤成分は、従来の化学療法薬に限定されると解釈すべきではない。例えば、薬剤成分は、所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。このようなタンパク質として、例えば、以下のものが挙げられる：毒素、例えば、アブリン、リシンＡ、オンコナーゼ（または別の細胞傷害性RNase）、シュードモナス外毒素、コレラ毒素、ジフテリア毒素；タンパク質、例えば、腫瘍壊死因子、αインターフェロン、βインターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、アポトーシス因子、例えば、TNF-α、TNF-β、AIM I（国際公開番号WO 97/33899参照）、AIM II（国際公開番号WO 97/34911参照）、Fasリガンド（Takahashiら、1994, J. Immunol., 6:1567）、およびVEGI（国際公開番号WO 99/23105参照）、血栓形成剤および抗血管新生剤、例えば、アンジオスタチンまたはエンドスタチン；あるいは、生物学的応答改因子、例えば、リンホキン（例：インターロイキン-1（IL-1）、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-6（IL-6）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、および顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、もしくは成長因子（例：成長ホルモン（GH））。
【０１６４】
さらに、放射性金属イオンに結合させるのに有用な放射性物質または大環状キレート剤（放射性物質の例については前記参照）のような治療薬成分と結合させることができる。特定の実施形態では、大環状キレート剤は、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N’,N’’,N’’-テトラ酢酸（DOTA）であり、これらは、リンカー分子を介して抗体に結合することができる。このようなリンカー分子は、一般に当分野では周知であり、Denardoら、1998, Clin Cancer Res. 4:2483；Petersonら、1999, Bioconjug, Chem. 10:553；ならびに、Zimmermanら、1999, Nucl. Med. Biol. 26:943（各々、参照として本明細書にその全文を組み込む）に記載されている。
【０１６５】
治療薬成分を抗体と結合させる技術はよく知られている。限定するものではないが、アルデヒド／Schiff結合、スルフィドリル結合、酸不安定結合、シス−アコニチル結合、ヒドラゾン結合、酵素により分解可能な結合（概要は、Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53:171参照）など、当分野では周知の任意の方法により、成分を抗体と結合させることができる。治療薬成分を抗体と結合させる技術はよく知られており、例えば、以下を参照されたい：Arnonら、“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeldら、(編)、pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)；Hellstrom ら、“Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (第２版.), Robinsonら、(編)、pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)；Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies ‘84: Biological And Clinical Applications, Pincheraら、(編)、pp. 475-506 (1985)；“Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwinら、(編)、pp. 303-16 (Academic Press 1985)；ならびにThorpe ら、1982, Immunol. Rev. 62:119（各々、参照として本明細書にその全文を組み込む）。
【０１６６】
抗体をポリペプチド部分と融合または結合させる方法は、当分野では周知である。例えば、米国特許第5,336,603号；第5,622,929号；第5,359,046号；第5,349,053号；第5,447,851号、および第5,112,946号；欧州特許第307,434号；第367,166号；PCT公開番号WO 96/04388およびWO 91/06570；Ashkenaziら、1991, PNAS USA 88: 10535；Zhengら、1995, J. Immunol. 154:5590；ならびにVilら、1992, PNAS USA 89:11337（これらの参照文献は、参照として本明細書にその全文を組み込む）を参照されたい。抗体と上記成分との融合は、必ずしも直接である必要はなく、リンカー配列を介して行なってもよい。このようなリンカー分子は当分野では周知であり、Denardoら、1998, Clin Cancer Res. 4:2483；Petersonら、1999, Bioconjug, Chem. 10:553；Zimmermanら、1999, Nucl. Med. Biol. 26:943；Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53:171（各々、参照として本明細書にその全文を組み込む）に記載されている。
【０１６７】
あるいは、米国特許第4,676,980号（参照として本明細書にその全文を組み込む）でSegalにより記載されているように、抗体を第２抗体と結合させることにより、抗体へテロコンジュゲートを形成することもできる。
【０１６８】
抗体を固体支持体に結合させてもよく、これは、標的抗原の免疫検定または精製に特に有用である。このような固体支持体として、限定するものではないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルもしくはポリプロピレンが挙げられる。
【０１６９】
Eph受容体に免疫特異的に結合する抗体またはそのフラグメントと結合させる治療薬成分または薬剤は、被検者における特定の疾患に対し所望の予防または治療効果を達成するように選択しなければならない。臨床医またはその他の医療スタッフは、Eph受容体に免疫特異的に結合する抗体またはそのフラグメントにどの治療薬成分または薬剤を結合させるかを決定する際、次の事項：疾患の種類、その重症度、ならびに被検者の状態を考慮しなければならない。
【０１７０】
６．４  抗体の作製方法
本発明のFc変異体は、抗体を合成するための当分野では周知の任意の方法により、特に、化学的合成または組換え発現方法により作製することができる。
【０１７１】
Eph受容体に対するポリクローナル抗体は、当分野では周知の様々な方法により作製することができる。例えば、Eph受容体またはその免疫原性断片を各種宿主動物（限定するものではないが、ウサギ、マウス、ラットなど）に投与して、Eph受容体に特異的なポリクローナル抗体を含む血清の生産を誘導する。宿主の種に応じ、各種アジュバントを用いて免疫応答を高めることもでき、このようなアジュバントとして、限定するものではないが、フロイント（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムのような無機ゲル、リソレシチンのような界面活性剤、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルション、スカシガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびに、有用と考えられるヒトアジュバント、例えば、BCG（カルメットゲラン菌）およびコリネバクテリウム・パルブム（corynebacterium parvum）が挙げられる。このようなアジュバントは当分野では周知である。
【０１７２】
モノクローナル抗体は、当分野では周知の極めて多様な技術、例えば、ハイブリドーマ、組換え体、およびファージ展示技術、またはこれらの組合せの使用により作製することができる。例えば、当業者には周知であり、Harlowら、 Antibodies: A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第２版、1988）；Hammerlingら、 Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681（Elsevier, N.Y., 1981）（参照として本明細書にその全文を組み込む）に教示されているようなハイブリドーマ技術を用いて、モノクローナル抗体を作製することができる。本明細書で用いる用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術を用いて作製した抗体に限定されるわけではない。用語「モノクローナル抗体」は、真核生物、原核生物、もしくはファージクローンなどの単一クローンに由来する抗体を指すのであって、これを作製する方法を意味するのではない。
【０１７３】
ハイブリドーマ技術を用いて特定の抗体を作製およびスクリーニングする方法は当分野で常用され、周知である。簡単に言えば、マウスをEph受容体またはそのドメイン（例えば、細胞外ドメイン）で免疫し、免疫応答が検出された、例えば、Eph受容体に特異的な抗体がマウス血清中に検出されたら、マウスの脾を採取し、脾細胞を単離する。次に、周知の方法で脾細胞を好適な骨髄腫細胞、例えば、ATCCから入手可能な細胞系SP20由来の細胞と融合させる。さらに、RIMNS（反復免疫、多部位）技術を用いて、動物を免疫することができる（Kilpatrickら、1997, Hybridoma 16:381-9；参照として本明細書にその全文を組み込む）。ハイブリドーマは、限界希釈培養法により選択およびクローン化する。次に、本発明のポリペプチドに結合することができる抗体を分泌する細胞について、上記ハイブリドーマクローンを当分野で周知の方法によりアッセイする。陽性ハイブリドーマクローンを免疫することにより、一般に高レベルの抗体を含む腹水を生産させることができる。
【０１７４】
従って、抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することにより、モノクローナル抗体を生産することができ、その際、上記ハイブリドーマは、Eph受容体またはその免疫原性断片で免疫したマウスから単離した脾細胞を骨髄腫細胞と融合した後、Eph受容体に結合することができる抗体を分泌するハイブリドーマクローンについて、上記融合物から得られたハイブリドーマをスクリーニングすることにより作製する。
【０１７５】
本発明のFc変異体は、そのFc領域に新規のアミノ酸残基を含む。Fc変異体は、当業者には周知の多数の方法により作製することができる。その非制限的例は、抗体コード領域を単離（例えば、ハイブリドーマから）した後、単離した抗体コード領域のFc領域に１以上の所望の置換を導入することを含む。あるいは、１以上の高エフェクター機能アミノ酸残基を含むFc領域をコードするベクターに上記可変領域をサブクローン化してもよい。さらに別の方法および詳細については以下に記載する。
【０１７６】
当分野で周知の技術により、Eph受容体エピトープを特異的に認識する抗体フラグメントを作製することができる。例えば、パパイン（Fabフラグメントを作製）またはペプシン（F(ab’)2フラグメントを作製）のような酵素を用いて、免疫グロブリン分子のタンパク質分解切断により、FabおよびF(ab’)2フラグメントを作製することができる。F(ab’)2フラグメントは、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のCH1ドメインを含む。さらに、当分野で周知の様々なファージ展示方法を用いて、本発明の抗体を作製することもできる。
【０１７７】
ファージ展示方法では、機能的抗体ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面に該機能的抗体ドメインを展示する。特に、VHおよびVLドメインをコードするDNA配列は、動物のcDNAライブラリー（例えば、リンパ系組織のヒトまたはマウスcDNAライブラリー）から増幅する。VHおよびVLドメインをコードするDNAは、PCRによりscFvリンカーと一緒に組換え、ファージミドベクター（例えば、pCANYAB6またはpComb HSS）にクローン化する。大腸菌に上記ベクターをエレクトロポレーションし、大腸菌にヘルパーファージを感染させる。これらの方法で用いるファージは、典型的には、fdおよびM13を含む繊維状ファージであり、VHおよびVLドメインは通常、組換えにより、ファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIのいずれかと融合させる。目的のEph受容体エピトープに結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、例えば、標識抗原、あるいは固体表面またはビーズに結合または捕獲した抗原を用いて、抗原と一緒に選択または同定することができる。本発明の抗体を作製するのに用いることができるファージ展示方法の例として、以下の文献に開示されたものが挙げられる：Brinkmanら、1995, J. Immunol. Methods 182:41-50；Amesら、1995, J. Immunol. Methods 184:177-186；Kettleboroughら、1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958；Persicら、1997, Gene 187:9-18；Burtonら、1994, Advances in Immunology 57:191-280；PCT公開番号WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401、およびWO97/13844、ならびに米国特許第5,698,426号、第5,223,409号、第5,403,484号、第5,580,717号、第5,427,908号、第5,750,753号、第5,821,047号、第5,571,698号、第5,427,908号、第5,516,637号、第5,780,225号、第5,658,727号、第5,733,743号および第5,969,108号（各々、参照として本明細書にその全文を組み込む）。
【０１７８】
前記参照文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージからの抗体コード領域を単離し、これを用いて、全抗体、例えば、ヒト抗体、またはその他の所望の抗原結合フラグメントを作製した後、所望の宿主、例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母および細菌（例えば、以下に記載するもの）に発現させることができる。Fab、Fab’およびF(ab’)2フラグメントを組換えにより作製する技術は、以下の文献に開示されているような当分野で周知の方法を用いて、使用することもできる：国際公開番号WO 92/22324；Mullinaxら、1992, Bio Techniques 12(6):864-869；Sawaiら、1995, AJRI 34:26-34；ならびにBetterら、1988, Science 240:1041-1043（これらの文献は、参照として本明細書にその全文を組み込む）。
【０１７９】
全抗体を作製するためには、VHまたはVLヌクレオチド配列、制限部位、および該制限部位を保護する隣接配列を含むPCRプライマーを用いて、scFvクローンにおいてVHまたはVL配列を増幅させることができる。当業者には周知のクローニング技術を用いて、VH定常領域、例えば、ヒトγ定常領域を発現するベクターにPCR増幅VHドメインをクローン化し、また、VL定常領域、例えば、ヒトκまたはλ定常領域を発現するベクターにPCR増幅VLドメインをクローン化することができる。一実施形態では、定常領域は少なくとも１個の高エフェクター機能アミノ酸を含むFc領域である。別の実施形態では、VHまたはVLドメインを発現するベクターは、プロモーター、分泌シグナル、可変および定常ドメインの両方に対するクローニング部位、ならびに、ネオマイシンのような選択マーカーを含む。また、所望の定常領域を発現する１つのベクターにVHおよびVLドメインをクローン化してもよい。次に、当業者には周知の技術を用いて、重鎖変換ベクターおよび軽鎖変換ベクターを細胞系に共トランスフェクションすることにより、全長抗体、例えば、IgGを発現する安定または一過性細胞系を作製する。
【０１８０】
キメラ抗体は、抗体の様々な部分が様々な免疫グロブリン分子に由来する、分子である。キメラ抗体を作製する方法は当分野で周知である。例えば、Morrison, 1985, Science 229:1202；Oiら、1986, Bio Techniques 4:214；Gilliesら、1989, J. Immunol. Methods 125:191-202；ならびに米国特許第5,807,715号、第4,816,567号、第4,816,397号、および第6,311,415号（これらの文献は、参照として本明細書にその全文を組み込む）を参照されたい。
【０１８１】
抗体をヒトにおいてin vivoで用いる、in vitro検出アッセイで用いるなど、いくつかの使用の場合、ヒトまたはキメラ抗体を用いるのが好ましいこともある。ヒト被検者の治療のためには完全にヒトの抗体が特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを用いて、前記のファージ展示方法など、当分野で周知の様々な方法により作製することができる。また、米国特許第4,444,887号および第4,716,111号；ならびにPCT公開番号WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735、およびWO 91/10741（各々、参照として本明細書にその全文を組み込む）を参照されたい。
【０１８２】
ヒト化抗体は、予定した抗原に結合することができ、実質的にヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するフレームワーク領域と、実質的に非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するCDRとを含んでなる抗体、またはその変異体もしくはフラグメントである。ヒト化抗体は、少なくとも１つ、および典型的には２つの可変ドメイン（Fab、Fab’、F(ab’)2、Fabc、Fv）の実質的に全部を含み、該ドメインにおいて、CDR領域の全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリン（すなわち、供与抗体）のものに対応し、かつフレームワーク領域の全部または実質的に全部がヒト免疫グロブリン共通配列のものである。一実施形態では、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも一部、典型的には、ヒトグロブリンの該領域も含む。通常、上記抗体は、軽鎖と、重鎖の少なくとも可変ドメインのいずれも含む。この抗体はまた、重鎖のCH1、ヒンジ、CH2、CH3、およびCH4領域を含むこともある。ヒト化抗体は、IgM、IgG、IgD、IgAおよびIgEを含むあらゆるクラスの免疫グロブリン、ならびに、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を含むあらゆるイソタイプから選択することができる。通常、定常ドメインは、補体結合定常ドメインであり、そこでヒト化抗体が細胞傷害活性を呈示することが望ましく、またクラスは典型的にIgG.sub.1である。このような細胞傷害活性が望ましくない場合には、定常ドメインはIgG.sub.2クラスでもよい。ヒト化抗体は、１以上のクラスまたはイソタイプからの配列を含むものでよく、当業者であれば、所望のエフェクター機能を最適化するために特定の定常ドメインを容易に選択することができよう。ヒト化抗体のフレームワークおよびCDR領域は、親配列と正確に対応する必要はなく、例えば、少なくとも１個の残基の置換、挿入もしくは欠失により、供与体CDRまたは共通フレームワークに突然変異を誘発させて、当該部位のCDRまたはフレームワーク残基が共通または移入抗体のいずれかと対応しないようにすることもできる。しかし、このような突然変異は広範囲ではない。一実施形態では、ヒト化抗体残基の少なくとも75％が親フレームワーク領域（FR）およびCDR配列のそれと一致する。別の実施形態では、ヒト化抗体残基の少なくとも90％が親フレームワーク領域（FR）およびCDR配列のそれと一致する。別の実施形態では、ヒト化抗体残基の95％以上が親フレームワーク領域（FR）およびCDR配列のそれと一致する。さらに別の実施形態では、ヒト化抗体残基の少なくとも約75％が親フレームワーク領域（FR）およびCDR配列のそれと一致する。別の実施形態では、ヒト化抗体残基の少なくとも約90％が親フレームワーク領域（FR）およびCDR配列のそれと一致する。さらに別の実施形態では、ヒト化抗体残基の約95％以上が親フレームワーク領域（FR）およびCDR配列のそれと一致する。ヒト化抗体は、限定するものではないが、以下に挙げるような当分野で周知の様々な技術を用いて作製することができる：CDR移植（欧州特許第239,400号；国際公開番号WO 91/09967；ならびに米国特許第5,225,539号、第5,530,101号、ならびに第5,585,089号）、ベニアリング（veneering）またはリサーフェイシング（resurfacing）（欧州特許第592,106号および第519,596号；Padlan, 1991, Molecular Immunology 28（4/5）：489-498；Studnickaら、1994, Protein Engineering 7(6):805-814；およびRoguskaら、1994, PNAS 91:969-973）、チェーンシャフリング（米国特許第5,565,332号）、ならびに、例えば、以下の文献に開示された技術：米国特許第6,407,213号、米国特許第5,766,886号、WO 9317105；Tanら、J. Immunol. 169:1119-25 (2002)；Caldasら、Protein Eng. 13(5): 353 - 60 (2000)；Moreaら、Methods 20(3): 267-79 (2000)；Bacaら、J. Biol. Chem. 272(16): 10678-84 (1997)；Roguskaら、Protein Eng. 9(10): 895-904 (1996)；Coutoら、Cancer Res. 55 (23 Supp): 5973s - 5977s (1995)；Coutoら、Cancer Res. 55(8): 1717-22 (1995)；Sandhu JS, Gene 150(2): 409-10 (1994)；ならびにPedersenら、J. Mol. Biol. 235(3): 959-73 (1994)。多くの場合、フレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、CDR供与体抗体由来の対応残基で置換して、抗原結合を改変、好ましくは改善する。これらのフレームワーク置換の同定は、当業者には周知の方法、例えば、CDRおよびフレームワーク残基の相互作用のモデル化によって、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定する；配列比較によって、特定位置での特異フレームワーク残基を同定することにより、実施する（例えば、Queenら、米国特許第5,585,089号；およびRiechmannら、1988, Nature 332:323を参照のこと；これらの文献は、参照として本明細書にその全文を組み込む）。
【０１８３】
機能的内因性免疫グロブリンは発現することができないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて、ヒト抗体を作製することもできる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体をランダムに、または相同組換えによりマウス胚性幹細胞に導入する。あるいは、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域をマウス胚性幹細胞に導入してもよい。相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別に、またはこれと同時に、マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を非機能的にすることもできる。特に、JH領域の同型接合体欠失は、内因性抗体生産を阻止する。変更した胚性幹細胞を増殖し、胚盤胞にマイクロインジェクションすることにより、キメラマウスを作製する。キメラマウスを飼育して、ヒト抗体を発現する同型接合体子孫を生産させる。選択した抗原、例えば、Eph受容体またはその免疫原性断片を用いて、通常の方法によりトランスジェニックマウスを免疫する。通常のハイブリドーマ技術を用いて、免疫したトランスジェニックマウスから、抗原に対して指令されたモノクローナル抗体を取得することができる。トランスジェニックマウスが保有するヒト免疫グロブリントランスジーンは、Ｂ細胞分化中に再編成し、その後、クラススイッチおよび体細胞突然変異を受ける。従って、このような技術を用いて、治療に有用なIgG、IgA、IgMおよびIgE抗体を作製することができる。ヒト抗体を作製するこの技術の概要については、LonbergおよびHuszar（1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93）を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製する上記技術、ならびにこのような抗体を作製するプロトコルの詳細な記述については、例えば、以下に挙げる文献を参照されたい：PCT公開番号WO 98/24893、WO 96/34096、およびWO 96/33735、米国特許第5,413,923号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,569,825号、第5,661,016号、第5,545,806号、第5,814,318号、および第5,939,598号（これらの文献は、参照として本明細書にその全文を組み込む）。加えて、Abgenis, Inc.（カリフォルニア州フリーモント）、Genpharm（カリフォルニア州サンホセ）およびMedarex（ニュージャージー州プリンストン）と契約し、前述と同様の技術を用いて、選択した抗原に対するヒト抗体を供給してもらうこともできる。
【０１８４】
さらに、本発明の抗体を使用して、当業者には周知の技術により、Eph受容体を模倣する抗イディオタイプ抗体を作製することもできる（例えば、GreenspanおよびBona, 1989, FASEB J. 7(5):437-444；およびNissinoff, 1991, J. Immunol. 147(8):2429-2438参照）。例えば、Eph受容体に結合して、該Eph受容体がそのリガンドと結合するのを競合的に阻害する（当分野で周知であり、かつ以下に開示するアッセイにより決定される）本発明の抗体を用いて、Eph受容体結合ドメインを「模倣」し、その結果、Eph受容体および／またはそのリガンドと結合して、それらを中和する抗イディオタイプ抗体を作製することができる。このような抗イディオタイプ抗体またはそのFabフラグメントを治療プログラムに用いて、Eph受容体を中和することができる。本発明は、本発明の抗体またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの使用を含む方法を提供する。
【０１８５】
好ましい実施形態では、Eph受容体に免疫特異的に結合する抗体をコードするヌクレオチド配列を取得し、これを用いて、本発明のFc変異体を作製する。上記ヌクレオチド配列は、ハイブリドーマクローンDNAの配列決定により得られる。特定の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントをコードする核酸を含むクローンは入手できないが、抗体分子またはそのエピトープ結合フラグメントがわかっている場合には、免疫グロブリンをコードする核酸を化学的に合成してもよいし、好適な供給源（例えば、抗体を発現するために選択したハイブリドーマなど、抗体を発現する任意の組織または細胞から作製した抗体cDNAライブラリー、またはcDNAライブラリー、もしくは該組織または細胞から単離した核酸、好ましくはポリA + RNA）から、以下の方法で取得することも可能である：配列の3’および5’末端にハイブリダイズする合成プライマーを用いたPCR増幅；あるいは、特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いたクローニングにより、抗体をコードするcDNAライブラリーから例えば、cDNAクローンを同定する。次に、当分野で周知の方法を用いて、PCRにより作製した増幅核酸を複製可能なクローニングベクターにクローン化してもよい。
【０１８６】
抗体のヌクレオチド配列を決定したら、当分野で周知のヌクレオチド配列の操作方法、例えば、組換えDNA技術、部位指定突然変異誘発、PCRなどを用いて、抗体のヌクレオチド配列を操作し（例えば、以下の文献に記載される方法を参照：Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubelら、編、John Wiley & Sons (英国チシェスター、1998)；Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第３版、J. Sambrookら、編、Cold Spring Harbor Laboratory Press (ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、2001)；Antibodies: A Laboratory Manual, E. HarlowおよびD. Laneら、Cold Spring Harbor Laboratory Press (ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1988)；ならびにUsing Antibodies: A Laboratory Manual, E. HarlowおよびD. Lane、編、Cold Spring Harbor Laboratory (ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1999)；これらは、参照として本明細書にその全文を組み込む）、例えば、欠失、および／または挿入を抗体の所望の領域に導入することにより、様々なアミノ酸配列を有する抗体を作製することができる。
【０１８７】
好ましい実施形態では、Eph受容体に免疫特異的に結合することができる抗体のFc領域（例えば、前述）内で１以上の置換を実施する。一実施形態では、アミノ酸置換は１以上のFcリガンド（例えば、FγR、C1q）との結合を変更し、ADCCおよび／またはCDC活性を改変する。
【０１８８】
具体的実施形態では、常用の組換えDNA技術を用いて、フレームワーク領域内に１以上のCDCを挿入する。フレームワーク領域は、天然に存在する、または共通フレームワーク領域のいずれでもよく、好ましくはヒトフレームワーク領域である（例えば、ヒトフレームワーク領域の一覧は、Chothiaら、1998, J. Mol. Biol. 278:457-459を参照）。一実施形態では、フレームワーク領域とCDRの組合せにより作製したポリヌクレオチドは、Eph受容体に免疫特異的に結合する抗体をコードする。別の実施形態では、既述したように、フレームワーク領域内で１以上のアミノ酸置換を実施してもよく、また別の実施形態では、アミノ酸置換により抗体とその抗原の結合を改善する。さらに、このような方法を用いて、鎖内ジスルフィド結合に参加する１以上の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を実施して、１以上の鎖内ジスルフィド結合を欠失した抗体分子を作製することもできる。ポリヌクレオチドに対するその他の改変も本発明に含まれ、これらについて当業者は熟知している。
【０１８９】
６．５  Eph受容体に結合するポリペプチドおよび融合タンパク質
本発明は、Eph受容体に免疫特異的に結合するポリペプチドおよび融合タンパク質を包含する。
【０１９０】
一実施形態では、Eph受容体に免疫特異的に結合するポリペプチドまたは融合タンパク質は、本明細書に記載する、もしくは当業者には周知のin vivoまたはin vitroアッセイにおいて、Eph受容体とそのリガンドの相互作用を約25％、30％、35％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、もしくは98％阻害または低減する。これに関して、「約」とは±0.1％〜2.5％を意味する。別の実施形態では、Eph受容体に免疫特異的に結合するポリペプチドまたは融合タンパク質は、本明細書に記載する、もしくは当業者には周知のin vivoまたはin vitroアッセイにおいて、Eph受容体とそのリガンドの相互作用を有意に阻害しない。
【０１９１】
一実施形態では、Eph受容体に免疫特異的に結合するポリペプチドまたは融合タンパク質は、Fcドメインと融合したEph受容体に免疫特異的に結合するEph受容体リガンドまたはその断片を含む。具体的には、上記融合タンパク質のFcドメインは、少なくとも１つの前記高エフェクター機能アミノ酸および／または置換を含むことが意図される。好ましい実施形態では、上記Fcドメインは本発明のFc変異体のそれであり、以後Fc変異体のFcドメインを変異体Fcドメインと呼ぶ。Eph受容体リガンドの例として、限定するものではないが、エフリン-Aサブクラス（例：A1、A2、A3、A4、A5）のGPI膜アンカー型リガンド、およびエフリン-Bサブクラス（例：B1、B2、B3）の膜貫通ドメイン膜アンカー型リガンドが挙げられる。本発明の好ましいエフリン分子のアラインメントを図19に示す。
【０１９２】
別の実施形態では、Eph受容体に免疫特異的に結合するポリペプチドまたは融合タンパク質は、本発明の変異体Fcドメインと融合した生物活性分子を含む。これらの実施形態によれば、上記生物活性分子は、Eph受容体に免疫特異的に結合する。Eph受容体に免疫特異的に結合する生物活性分子としては、限定するものではないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、小分子、模倣物質、合成薬剤、無機分子、および有機分子が挙げられる。一実施形態では、Eph受容体に免疫特異的に結合する生物活性分子は、少なくとも５個、少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個もしくは少なくとも100個の連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドであり、しかも、本発明の変異体Fcドメインのアミノ酸配列とは異なるものである。別の実施形態では、Eph受容体に免疫特異的に結合する生物活性分子は、少なくとも約５個、少なくとも約10個、少なくとも約20個、少なくとも約30個、少なくとも約40個、少なくとも約50個、少なくとも約60個、少なくとも約70個、少なくとも約80個、少なくとも約90個もしくは少なくとも約100個の連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドであり、しかも、本発明の変異体Fcドメインのアミノ酸配列とは異なるものである。
【０１９３】
別の実施形態では、Eph受容体に免疫特異的に結合するペプチド、ポリペプチドもしくは融合タンパク質は、本発明の変異体Fcドメインと融合したEph受容体リガンド（例えば、エフリン-Aおよび／または-Bサブクラス、図19参照）またはその断片のアミノ酸配列に対し、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。さらに別の実施形態では、Eph受容体に疫特異的に結合するペプチド、ポリペプチドもしくは融合タンパク質は、本発明の変異体Fcドメインと融合したEph受容体リガンド（例えば、エフリン-Aおよび／または-Bサブクラス、図19参照）またはその断片のアミノ酸配列に対し、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、もしくは少なくとも約99％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０１９４】
本発明は、Eph受容体リガンド（例えば、エフリン-Aおよび／または-Bサブクラス、図19参照）、またはその断片をコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズする核酸分子によりコードされるポリペプチドと融合した本発明の変異体Fcドメインを含む、Eph受容体に免疫特異的に結合するポリペプチドまたは融合タンパク質を提供する。
【０１９５】
具体的実施形態では、Eph受容体に免疫特異的に結合するポリペプチドまたは融合タンパク質は、ストリンジェント条件下で、例えば、約45℃での6x塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）におけるフィルター結合DNAとのハイブリダイゼーションの後、約50〜65℃で0.2x SSC／0.1％SDSで１回以上洗浄することにより；高ストリンジェント条件下で、例えば、約45℃での6x SSCにおけるフィルター結合核酸とのハイブリダイゼーションの後、約68℃で0.1x SSC／0.2％SDSにおいて１回以上洗浄することにより；もしくは当業者には周知のその他のストリンジェントハイブリダイゼーション条件（例えば、Ausubel, F.M.ら、編、1989 Current Protocols in Molecular Biology, 第I巻、Green Publishing Associates, Inc.およびJohn Wiley & Sons, Inc., ニューヨーク、6.3.1〜6.3.6および2.10.3ページ）で、Eph受容体リガンド（例えば、エフリン-Aおよび／または-Bサブクラス、図19参照）またはその断片をコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズする核酸分子によりコードされるポリペプチドと融合した本発明の変異体Fcドメインを含む。
【０１９６】
本発明はまた、変異体Fcドメインを含む、Eph受容体に免疫特異的に結合するポリペプチドおよび融合タンパク質であって、精製を容易にするためにマーカー配列、限定するものではないが、例えば、ペプチドと融合した、上記ポリペプチドおよび融合タンパク質も包含する。好ましい実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド、特に、例えば、pQEベクター（QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA 91311）に賦与されるタグであり、その多くは市販されている。精製に有用なその他のタグとして、限定するものではないが、赤血球凝集素「HA」タグ（インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する）（Wilsonら、1984, Cell 37:767）および「フラグ」タグが挙げられる。
【０１９７】
本発明はさらに、本発明の変異体Fcドメインと融合した、Eph受容体に免疫特異的に結合するポリペプチドおよび融合タンパク質であって、さらに治療成分と結合した上記ポリペプチドおよび融合タンパク質も包含する。Eph受容体に免疫特異的に結合するポリペプチドまたは融合タンパク質は、細胞毒、例えば、細胞分裂抑制または細胞致死薬、治療利益を有すると考えられる薬剤、もしくは放射性金属イオン、例えば、α線放射物質などの治療薬成分と結合させることができる。細胞毒または細胞傷害性物質は、細胞に有害なあらゆる物質を含む。治療薬成分、および細胞毒もしくは細胞傷害性物質は前文に列挙した（第６．３節「抗体コンジュゲートおよび誘導体」を参照）。
【０１９８】
標準的組換えDNA技術、またはタンパク質合成技術、例えば、ペプチド合成装置を用いて、ポリペプチド、タンパク質および融合タンパク質を作製することができる。例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質もしくは融合タンパク質をコードする核酸分子は、自動DNA合成装置など、通常の技術により合成することができる。あるいは、アンカープライマーを用いて、遺伝子断片のPCR増幅を実施することもでき、これによって２つの連続した遺伝子断片の間に相補的突出部を形成し、次に、これらをアニーリングし、再増幅することにより、キメラ遺伝子配列を作製することができる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubelら、編、John Wiley & Son, 1992参照）。さらに、生物活性分子をコードする核酸を、変異体Fcドメインまたはそのフラグメントを含む発現ベクターにクローン化し、該生物活性分子と、変異体Fcドメインまたは変異体Fcドメインフラグメントをフレーム内で結合させることもできる。
【０１９９】
ポリペプチドを抗体の定常領域と融合または結合させる方法は当分野で周知である。例えば、米国特許第5,336,603号、第5,622,929号、第5,359,046号、第5,349,053号、第5,447,851号、第5,723,125号、第5,783,181号、第5,908,626号、第5,844,095号、および第5,112,946号；欧州特許第307,434号；第367,166号；第394,827号；国際公開番号91/06570、WO 96/04388、WO 96/22024、WO 97/34631、およびWO 99/04813；Ashkenaziら、1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539；Trauneckerら、1988, Nature, 331:84-86；Zhengら、1995, J. Immunol. 154:5590-5600；ならびにVilら、1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337- 11341（参照として本明細書にその全文を組み込む）を参照されたい。
【０２００】
生物活性分子と、Fcドメインまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列は、当業者が入手可能なあらゆる情報（すなわち、GenBank、文献、もしくは常用のクローニング）から取得することができる。Eph受容体リガンドをコードするヌクレオチド配列は、当業者が入手可能なあらゆる情報（例えば、GenBank、文献、もしくは常用のクローニング）から取得することができる。図３を参照されたい。ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、好適な発現ベクター、すなわち、挿入したタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクターに挿入することができる。本発明では様々な宿主ベクター系を用いて、タンパク質コード配列を発現させることができる。このようなものとして、限定するものではないが、ウイルス（例：ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）に感染した哺乳動物細胞系；ウイルス（例：バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；酵母ベクターを含む酵母などの微生物；あるいは、バクテリオファージ、DNA、プラスミドDNA、もしくはコスミドDNAで形質転換した細菌が挙げられる。ベクターの発現エレメントはその強度および特異性がそれぞれ異なる。使用する宿主ベクター系に応じて、多数の好適な転写および翻訳エレメントのいずれを用いてもよい。
【０２０１】
６．６  抗体および融合タンパク質の組換え発現
変異体Fcドメインを含むFc変異体または融合タンパク質（本明細書では「変異体Fcドメイン融合タンパク質」または「変異体Fcドメイン融合物」と呼ぶ）、その誘導体、類似体もしくはフラグメント（例えば、本発明の抗体の重または軽鎖もしくはその部分、または本発明の一本鎖抗体）の組換え発現は、抗体または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築を必要とする。本発明の抗体、または融合タンパク質の抗体分子もしくは重または軽鎖をコードするポリヌクレオチドを取得したら、抗体または融合タンパク質の作製のためのベクターを、当分野では周知の方法を用いた組換えDNA技術により作製する。従って、抗体または融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの発現によりタンパク質を作製する方法を本明細書に記載する。当業者には周知の方法を用いて、抗体または融合タンパク質をコードする配列、ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法として、例えば、in vitro組換えDNA技術、合成技術、およびin vivo遺伝子組換えなどが挙げられる。従って、本発明は、プロモーターに機能的に結合した、本発明のFc変異体または変異体Fc融合物をコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。このようなベクターとして、抗体分子の定常領域および抗体の可変領域をコードするヌクレオチド配列（例えば、国際公開番号WO 86/05807；国際公開番号WO 89/01036；および米国特許第5,122,464号）があり、また、変異体Fc融合物を作製するためのポリペプチドを全長抗体鎖（例えば、重または軽鎖）または完全変異体Fc融合タンパク質の発現のためのベクターにクローン化することもできる。
【０２０２】
通常の技術により発現ベクターを宿主細胞に移した後、トランスフェクションした細胞を通常の技術により培養して、本発明のFc変異体または変異体Fc融合タンパク質を作製する。従って、本発明は、異種プロモーターに機能的に結合した、本発明のFc変異体または変異体Fc融合タンパク質もしくはそのフラグメント、もしくはその重または軽鎖、もしくはその部分、あるいは本発明の一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を包含する。二本鎖抗体発現のための好ましい実施形態では、以下に詳述するように、重および軽鎖の両方をコードするベクターを宿主細胞に共発現させて、全免疫グロブリン分子を発現させることができる。
【０２０３】
様々な宿主発現ベクター系を用いて、本発明の抗体または融合タンパク質を発現させることができる（例えば、米国特許第5,807,715号参照）。好適な宿主発現系は、目的のコード配列を生産した後、精製することができるビヒクルを示すが、好適なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクションしたとき、in situで本発明の抗体または融合タンパク質分子を発現することができる細胞も示す。このような宿主発現系として、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：抗体または融合タンパク質コード配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAもしくはコスミドDNA発現ベクターで形質転換した細菌（例えば、大腸菌および枯草菌）などの微生物；抗体または融合タンパク質コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母（例えば、サッカロミセス・ピキア）；抗体または融合タンパク質コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV）に感染した植物細胞系、もしくは抗体または融合タンパク質コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）で形質転換した植物細胞系；あるいは、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノ後期プロモーター、ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、COS、CHO、BHK、293、NS0、および3T3細胞）。一実施形態では、大腸菌などの細菌細胞、また別の実施形態では、特に全組換え抗体または融合タンパク質分子を発現する場合、真核生物細胞を、組換え抗体または融合タンパク質分子の発現に用いる。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）は、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初期遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターと一緒に、抗体の有効な発現系である（Foeckingら、1986, Gene 45:101；およびCockettら、1990, Bio／Technology 8:2）。具体的実施形態では、Eph受容体に結合する抗体または融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーター、誘導的プロモーターもしくは組織特異的プロモーターにより調節する。
【０２０４】
細菌系では、発現させようとする抗体または融合タンパク質分子に意図する使用に応じて、多数の発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、抗体または融合タンパク質分子の医薬組成物を製造するために、このようなタンパク質を大量に生産したい場合には、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指令するベクターが望ましい。このようなベクターとして、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：大腸菌発現ベクターpUR278（Rutherら、1983, EMBO 12:1791）、そこで、抗体または融合タンパク質コード配列を個別に、lacZコード領域と同じフレーム内のベクターに結合させることにより、lac Z融合タンパク質を生産するようにしてもよい；pINベクター（Inouye & Inoye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109；Van Heeke & Schster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509）など。pGEXベクターを用いて、グルタチオン5-トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質のような外来ポリペプチドを発現させることもできる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合後、遊離グルタチオンの存在下での溶離により、溶解細胞から容易に精製することができる。pGEXベクターは、トロンビンまたはXa因子プロテアーゼ切断部位を含むことによって、クローン化標的遺伝子産物がGST部分から放出されるように設計されている。
【０２０５】
昆虫系では、オートグラファ・カリフォルニア核多角体病ウイルス（AcNPV）をベクターとして用いて、外来遺伝子を発現させる。このウイルスは、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）細胞で成長する。抗体または融合タンパク質コード配列を個別に、上記ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）にクローン化し、AcNPVプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下におくことができる。
【０２０６】
哺乳動物細胞では、多数のウイルス発現系を用いることができる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合には、目的の抗体または融合タンパク質コード配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三ツ組リーダー配列と結合させる。次に、このキメラ遺伝子をin vitroまたはin vivo組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入することができる。非必須領域（例えば、E1またはE3）へのウイルスゲノムの挿入により、生存可能で、感染宿主に抗体または融合タンパク質を発現することができる組換えウイルスが得られる（例えば、Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359を参照）。挿入した抗体コード配列の効率的な翻訳のために特定の開始シグナルが必要な場合もある。これらのシグナルは、ATG開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、開始コドンは、全挿入片の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームと位相が同じでなければならない。これらの外性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成いずれの多様な供給源のものでよい。適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含有させることにより、発現の効率を高めることができる（例えば、Bittnerら、1987, Methods in Enzymol. 153:516-544参照）。
【０２０７】
当業者には周知のいずれかのプロモーターまたはエンハンサーエレメントにより、抗体または融合タンパク質の発現を制御することができる。抗体または融合タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するのに用いることができるプロモーターとして、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：SV40初期プロモーター（BernoistおよびChambon, 1981, Nature 290:304-310）、ラウス肉腫ウイルスの3’長末端反復配列に含まれるプロモーター（Yamamotoら、1980, Cell 22:787-797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagnerら、1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinsterら、1982, Nature 296:39-42）、テトラサイクリン（Tet）プロモーター（Gossenら、1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547-5551）；βラクタマーゼプロモーターのような原核生物発現ベクター（Villa-Kamoroffら、1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731）、またはtacプロモーター（DeBoerら、1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25；”Useful protein from recombinant bacteria” in Scientific American, 1980, 242:74-94も参照）；ノパリンシンテターゼプロモーター領域を含む植物発現プロモーター（Herrera-Estrellaら、Nature 303:209-213）もしくはカリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター（Gardnerら、1981, Nucl. Acids Res. 9:2871）、ならびに光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼ（Herrera-Estrellaら、Nature 310:115-120）；酵母またはその他の真菌由来のプロモーターエレメント（例えば、Gal 4プロモーター）、ADC（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、PGK（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、ならびに、組織特異性を呈示し、かつトランスジェニック動物に用いられてきた下記の動物転写制御領域：膵腺房細胞で活性のエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Swiftら、1984, Cell 38:639-649；Ornitzら、1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409；MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515）；膵β細胞で活性のインスリン遺伝子制御領域（Hanahan, 1985, Nature 315:115-122）、リンパ系細胞で活性の免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedlら、1984, Cell 38:647-658；Adamesら、1985, Nature 318:533-538；Alexanderら、1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444）、精巣、乳房、リンパ系およびマスト細胞で活性のマウス乳房腫瘍ウイルス制御領域（Lederら、1986, Cell 45:485-495）、肝臓で活性のアルブミン遺伝子制御領域（Pinkertら、1987, Genes and Devel. 1:268-276）、肝臓で活性のαフェトプロテイン遺伝子制御領域（Krumlaufら、1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648；Hammerら、Science 235:53-58；肝臓で活性のα1-抗トリプシン遺伝子制御領域（Kelseyら、1987, Genes and Devel. 1:161-171）、骨髄性細胞で活性のβグロビン遺伝子制御領域（Mogramら、1985, Nature 315:338-340；Kolliasら、1986, Cell 46:89-94）；脳のオリゴデンドロサイト細胞で活性のミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Readheadら、1987, Cell 48:703-712）；骨格筋で活性のミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域（Sani, 1985, Nature 314:282-286）；ニューロン細胞で活性のニューロン特異的エノラーゼ（NSE）（Morelliら、1999, Gen. Virol. 80:571-83）；ニューロン細胞で活性の脳由来の神経栄養因子（BDNF）遺伝子制御領域（Tabuchiら、1998, Biochem. Biophysic. Res. Com. 253:818-823）；星状細胞で活性のグリア繊維酸性タンパク質（GFAP）プロモーター（Gomesら、1999, Braz J Med Biol Res 32(5):619-631；Morelliら、1999, Gen. Virol. 80:571-83）ならびに視床下部で活性の性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Masonら、Science 234:1372-1378）。
【０２０８】
抗体または融合タンパク質をコードする遺伝子の挿入片を含む発現ベクターは、次の３つの一般的手法により同定することができる：（a）核酸ハイブリダイゼーション、（b）「マーカー」遺伝子機能の存在または非存在、および（c）挿入した配列の発現。第１の手法では、発現ベクターにおけるペプチド、ポリペプチド、タンパク質もしくは融合タンパク質をコードする遺伝子の存在は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質もしくは融合タンパク質をコードする挿入遺伝子にそれぞれ相同の配列を含むプローブを用いた核酸ハイブリダイゼーションにより検出することができる。第２の手法では、抗体または融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列をベクターに挿入することによって起こる特定の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける閉鎖体の形成など）の存在または非存在に基づき、組換えベクター／宿主系を同定することができる。例えば、抗体または融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列をベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入した場合、マーカー遺伝子機能の非存在ににより、抗体または融合タンパク質をコードする遺伝子を含む組換え体を同定することができる。第３の手法では、組換え体により発現させた遺伝子産物（例えば、抗体または融合タンパク質）をアッセイすることにより、組換え発現ベクターを同定することができる。このようなアッセイは、例えば、in vitroアッセイ系における融合タンパク質の物理的または機能的特性（例えば、抗生物活性分子抗体との結合）に基づいて行なうことができる。
【０２０９】
加えて、挿入配列の発現をモジュレートする、または遺伝子産物を所望の特定の様式で変更およびプロセシングする宿主細胞を選択してもよい。特定のプロモーターからの発現を特定の誘導物質の存在下で高めることができる；このように、遺伝子工学的に作製した融合タンパク質の発現を制御することが可能である。さらに、様々な宿主細胞が、翻訳および翻訳後プロセシングおよび改変のための特有かつ特異的な機構を備えている（例えば、タンパク質のグリコシル化、リン酸化）。好適な細胞系または宿主系を選択して、発現させる外来タンパク質の所望の改変およびプロセシングを確実にすることができる。例えば、細菌系での発現は非グリコシル化産物を産生するが、酵母での発現はグリコシル化産物を産生する。遺伝子産物の一次転写物の適切なプロセシング（例えば、グリコシル化、リン酸化）のための細胞機構を備えた真核生物宿主細胞を用いてもよい。このような哺乳動物宿主細胞として、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、WI38、NS0、ならびに、特に、ニューロン細胞系、例えば、SK-N-AS、SK-N-FI、SK-N-DZヒト神経芽細胞腫（Sugimotoら、1984, J. Natl. Cancer Inst. 73:51-57）、SK-N-SHヒト神経芽細胞腫（Biochim. Biophys. Acta, 1982, 704:450-460）、Daoyヒト小脳髄芽腫（Heら、1992, Cancer Res. 52:1144-1148）、DBTRG-05MGグリア芽腫細胞（Kruseら、1992, In vitro Cell. Dev. Biol. 28A:609-614）、IMR-32ヒト神経芽細胞腫（Cancer Res., 1970, 30:2110-2118）、1321N1ヒト星状細胞腫（Proc. Natil Acad. Sci. USA, 1977, 74:4816）、MOG-G-CCMヒト星状細胞腫（Br. J. Cancer, 1984, 49:269）、U87MGヒトグリア芽腫−星状細胞腫（Acta Pathol. Microbiol. Scand., 1968, 74:465-486）、A172ヒトグリア芽腫（Olopadeら、1992, Cancer Res. 52:2523-2529）、C6ラットグリオーマ細胞（Bendaら、1968, Science 161:370-371）、Neuro-2aマウス神経芽細胞腫（Proc. Natil Acad. Sci. USA, 1970, 65:129-136）、NB41 A3マウス神経芽細胞腫（Proc. Natil Acad. Sci. USA, 1962, 48:1184-1190）、SCPヒツジ脈絡叢（Bolinら、1994, J. Virol. Methods 48:211-221）、G355-5、PG-4ネコ正常星状細胞（Haapalaら、1985, J. Virol. 53:827-833）、Mpfフェレット脳（Trowbridgeら、1982, In vitro 18:952-960）、ならびに正常細胞系 例えば、CTX TNA2ラット正常大脳皮質（Radanyら、1992, Proc. Natil Acad. Sci. USA 89:6467-6471）、例えば、CRL7030およびHsS578Bst。さらに、多様なベクター／宿主発現系が、様々な程度までプロセシング反応に作用しうる。
【０２１０】
組換えタンパク質の長期にわたる高収率生産のためには、多くの場合、安定した発現が望ましい。例えば、抗体または融合タンパク質を安定して発現させる細胞系を作製することができる。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを使うのではなく、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択マーカーにより制御されるDNAで宿主細胞を形質転換することができる。外来DNAの導入後、作製した細胞を濃縮培地で１〜２日増殖させてから、選択性培地に移す。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を賦与し、細胞がその染色体にプラスミドを安定的に組み込み、フォーカスを形成するまで増殖させてから、これらフォーカスをクローン化し、細胞系に増殖させることができる。この方法は、Eph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体または変異体Fc融合タンパク質を発現する細胞系を作製するのに有意に用いることができる。このような作製細胞系は、Eph受容体に免疫特異的に結合するポリペプチドまたは融合タンパク質の活性に作用する化合物のスクリーニングおよび評価に特に有用である。
【０２１１】
多数の選択系を用いることができ、このような選択系として、限定するものではないが、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（Wigletら、1977, Cell 11:223）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（SzybalskaおよびSzybalski, 1962, Proc. Natil Acad. Sci. USA 48:2026）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら、1980, Cell 22:817）遺伝子をあげることができ、これらはそれぞれtk-、hgprt-もしくはaprt-細胞で用いることができる。また、メトトレキセートに対する耐性を付与するdhfr（Wiglerら、1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567；O’Hareら、1981, Proc. Natil Acad. Sci. USA 78:1527）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt（MulliganおよびBerg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072）；アミノグリコシドG-418に対する耐性を賦与するneo（Colberre-Garapinら、1981, J. Mol. Biol. 150:1）；ならびに、ヒグロマイシンに対する耐性を付与するhygro（Santerreら、1984, Gene 30:147）遺伝子の選択基準として、抗代謝物耐性を用いることができる。
【０２１２】
組換え発現により本発明のペプチド、ポリペプチド、タンパク質もしくは融合タンパク質を作製したら、当分野では周知のタンパク質の精製方法、例えば、クロマトグラフィー（例：イオン交換、親和性、特にプロテインＡ後の特定の抗原に対する親和性により、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度、もしくはその他の標準的タンパク質精製技術により、それらを精製することができる。
【０２１３】
ベクター増幅により、抗体または融合タンパク質分子の発現レベルを高めることができる（詳しくは、BebbingtonおよびHentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, 第３巻（Academic Press、ニューヨーク、1987））。抗体または融合タンパク質を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能な場合には、宿主細胞の培養物に存在する阻害因子のレベルが高くなれば、マーカー遺伝子のコピー数も増加する。また、増幅領域は抗体遺伝子と関連しているため、抗体または融合タンパク質分子の生産も増加する（Crouseら、1983, Mol. Cell. Biol. 3:257）。
【０２１４】
宿主細胞を本発明の２つの発現ベクターで共トランスフェクションしてもよい。例えば、第１ベクターは、重鎖由来のポリペプチドをコードし、第２ベクターは、軽鎖由来のポリペプチドをコードする。２つのベクターは、同じ選択マーカーを含んでいてもよく、これによって重および軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする。あるいは、融合タンパク質または重鎖および軽鎖両ポリペプチドをコードし、また、これらを発現することができる単一ベクターを用いてもよい。融合タンパク質または重および軽鎖のコード配列はcDNAまたはゲノムDNAを含んでもよい。
【０２１５】
６．７  Eph受容体のアンタゴニスト
本発明は、少なくとも１つのEph受容体のアンタゴニストである本発明のFc変異体、または変異体Fc融合物を包含する。本明細書で用いる用語「アンタゴニスト」とは、Eph受容体のような標的分子の機能、活性および／または発現を阻止、阻害、低減もしくは中和する、あらゆるタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣物、糖タンパク質、抗体、抗体フラグメント、炭水化物、核酸、有機分子、無機分子、高分子、もしくは小分子を意味する。様々な実施形態で、アンタゴニストは、リン酸緩衝食塩水（PBS）のような対照と比較して、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％、別の分子の機能、活性および／または発現を低減する。さらに具体的には、少なくとも１つのEph受容体のアンタゴニストは、少なくとも１つのEph受容体の機能、活性および／または発現を阻害、低減もしくは中和するか、あるいは、少なくとも１つのEph受容体仲介の病因を低減する。
【０２１６】
アンタゴニストは、リガンドに対する受容体の結合または受容体に対するリガンドの結合を妨害する；リガンドにより活性化された細胞を無能力にするか、死滅させる；および／またはリガンドと細胞受容体の結合後、受容体またはリガンド活性化（例えば、チロシンキナーゼ活性化）またはシグナル伝達を妨害することにより、作用すると考えられる。アンタゴニストは、受容体−リガンド相互作用を完全に阻止するか、またはこのような相互作用を実質的に低減することができる。アンタゴニストによるこのような介入点は、本発明の目的に関してすべて同等とみなすものとする。従って、Eph受容体、EphリガンドまたはEph受容体とEphリガンドの複合体；本発明の変異体Fc領域と融合した可溶性Eph受容体または可溶性Ephリガンドに結合するアンタゴニスト（例えば、Fc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質（後述））、ならびに、本発明の変異体Fcと融合したEph受容体またはEphリガンドに結合する合成または天然配列ペプチドは、本発明の範囲に含まれる。加えて、本明細書に記載するEph受容体「アンタゴニスト」は、限定するものではないが、少なくとも１つのEph受容体と拮抗し、しかも癌細胞表現型（例えば、軟質寒天中でのコロニー形成、もしくは三次元基底膜または細胞外マトリックス調製物における管状網状体の形成）も阻害する。Eph受容体アンタゴニストは、非癌細胞と比較して癌細胞内に露出したEphエピトープに優先的に結合しても、結合しなくてもよく、またKoff速度は低くても、低くなくてもよい。
【０２１７】
本発明はまた、Eph受容体のアンタゴニストのスクリーニング方法も提供する。このようなスクリーニング方法として、限定するものではないが、Eph受容体活性（例えば、Eph受容体のリン酸化、Eph受容体タンパク質の分解、および下流Eph受容体仲介のシグナル伝達事象）、リガンド結合および／または血漿濃度をモニターするアッセイが挙げられる。前記およびその他の方法は後述（第６．９節「生物学的アッセイ」を参照）およびPCT公開番号WO 03/094859、WO 04/014292、WO 04/069264、WO 04/028551、WO 03/004057、ならびに米国特許第5,795,734号、および米国特許出願番号10/863,729、10/770,543（各々、参照として本明細書にその全文を組み込む）に記載されている。加えて、本発明は、このようなスクリーニング方法を用いて同定した抗体のADCC活性およびFcγRに対する結合親和性の両方を操作する方法も提供する。
【０２１８】
このようなスクリーニング方法から同定した抗体のFcを前述のように置換して、ADCC活性および／またはCDC活性を改変し、１以上のFcリガンド（例えば、FcγR、Clq）の結合親和性を変更することができる。このようなスクリーニング方法から同定した他のアンタゴニスト結合分子（例えば、Eph受容体リガンドおよびその変異体）を本発明の変異体Fcドメインと融合させることもできる。さらに、新たに同定したEph受容体アンタゴニスト抗体のFc変異体および新たに同定したEph受容体アンタゴニス体の変異体Fc融合物は、Eph受容体仲介および／または関連の疾患および障害の予防、管理および治療に有用であると考えられ、このような疾患として、限定するものではないが、炎症性疾患、自己免疫疾患、骨代謝に関連する疾患、血管新生に関連する疾患、Eph受容体の異常発現および／または活性に関連する疾患、および癌が挙げられる。このようなFc変異体および／または変異体Fc融合物を本発明の方法および製剤に用いることができる。
【０２１９】
６．８  Eph受容体の抗体アゴニスト
本明細書で用いる「アゴニスト」とは、Eph受容体のような標的分子の１以上の生物学的活性を活性化することができる、あらゆるタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣物、糖タンパク質、抗体、抗体フラグメント、炭水化物、核酸、有機分子、無機分子、高分子、もしくは小分子を意味する。様々な実施形態において、アゴニストは、リン酸緩衝食塩水（PBS）のような対照と比較して、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％、別の分子の機能、活性および／または発現を活性化する。さらに別の様々な実施形態では、アゴニストは、リン酸緩衝食塩水（PBS）のような対照と比較して、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、もしくは少なくとも約99％、別の分子の機能、活性および／または発現を活性化する。さらに具体的には、少なくとも１つのEph受容体のアゴニストは、少なくとも１つのEph受容体の機能、活性および／または発現を活性化する。具体的には、少なくとも１つのEph受容体を作動する作用により、少なくとも１つのEph受容体が仲介する病因の阻害または低減がもたらされることが考えられる。
【０２２０】
アゴニストは、例えば、標的分子を活性化するおよび／またはシグナル伝達を仲介することにより、作用すると考えられる。Eph受容体、EphリガンドもしくはEph受容体とEphリガンドの複合体に結合し、これらを活性化するFc変異体または変異体Fc融合タンパク質（後述）；Eph受容体を活性化する、本発明の変異体Fcと融合した可溶性Eph受容体または可溶性Ephリガンド、ならびに、Eph受容体、EphリガンドもしくはEph受容体とEphリガンドの複合体に結合し、これらを活性化する、本発明の変異体Fc領域に融合した合成または天然配列ペプチド、Eph受容体もしくはEphリガンドは、本発明の範囲に含まれる。
【０２２１】
加えて、本明細書に記載するEph受容体「アゴニスト」は、限定するものではないが、少なくとも１つのEph受容体を作動し、しかも癌細胞表現型（例えば、軟質寒天中でのコロニー形成、もしくは三次元基底膜または細胞外マトリックス調製物における管状網状体の形成）も阻害する。Eph受容体アゴニストは、非癌細胞と比較して癌細胞内に露出したEphエピトープと優先的に結合しても、結合しなくてもよく、そのKoff速度は低くても、低くなくてもよい。
【０２２２】
従って、一実施形態では、本発明のEph抗体（およびそのFc変異体）はEph受容体（例えば、Epha2および／またはEpha4）シグナル伝達を作動し、Eph受容体および／またはEph関連のポリペプチドのリン酸化を高める。
【０２２３】
本発明はまた、Eph受容体の抗体アゴニストのスクリーニング方法も提供する。このようなスクリーニング方法として、限定するものではないが、Eph受容体活性（例えば、Eph受容体のリン酸化、Eph受容体タンパク質の分解、および下流Eph受容体仲介のシグナル伝達事象）、リガンド結合および／または血漿濃度をモニターするアッセイが挙げられる。前記およびその他の方法は、後述（第６．９節「生物学的アッセイ」を参照）およびPCT公開番号WO 03/094859、WO 04/014292、WO 04/069264、WO 04/028551、WO 03/004057、ならびに米国特許出願番号10/863,729、10/770,543（各々、参照として本明細書にその全文を組み込む）に記載されている。加えて、本発明は、このようなスクリーニング方法を用いて同定した抗体のADCC活性およびFcγRに対する結合親和性の両方を操作する方法も提供する。
【０２２４】
このようなスクリーニング方法から同定した抗体のFcを前述のように置換して、ADCCおよび／またはCDC活性を改変し、１以上のFcリガンド（例えば、FcγR、Clq）の結合親和性を変更することができる。このようなスクリーニング方法から同定した他のアゴニスト結合分子（例えば、Eph受容体リガンドおよびその変異体）を本発明の変異体Fcドメインと融合させることもできる。さらに、新たに同定したEph受容体アゴニスト抗体のFc変異体および新たに同定したEph受容体アゴニストの変異体Fc融合物は、Eph受容体仲介および／または関連の疾患および障害の予防、管理および治療に有用であると考えられ、このような疾患として、限定するものではないが、炎症性疾患、自己免疫疾患、骨代謝に関連する疾患、血管新生に関連する疾患、Eph受容体の異常発現および／または活性に関連する疾患、ならびに癌が挙げられる。このようなFc変異体および／または変異体Fc融合物を本発明の方法および製剤に用いることができる。
【０２２５】
６．９  生物学的アッセイ
１以上の本発明のFc変異体、または変異体Fc融合タンパク質のアンタゴニストおよび／またはアゴニスト効果は、当分野で周知のいずれかの方法により決定することができる。このような方法として、限定するものではないが、後述する方法、ならびに以下の文献に記載されているものがある：PCT公開番号WO 04/014292、WO 03/094859、WO 04/069264、WO 04/028551、WO 03/004057、WO 03/040304、米国特許第5,795,734号、ならびに米国特許出願番号10/770,543、および10/863,729（各々、参照として本明細書にその全文を組み込む）。例えば、Eph受容体活性および／またはEph受容体の血漿濃度の阻害は、Eph受容体の活性および／または発現を測定する当分野で周知のいずれかの方法（限定するものではないが、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、RNase保護アッセイ、酵素活性アッセイ、in situハイブリダイゼーション、免疫組織化学、ならびに、免疫細胞化学など）によりアッセイすることができる。さらに具体的には、Fc変異体または変異体Fc融合タンパク質の活性は、Eph受容体との結合、他のEph受容体との交差反応性、Eph受容体リン酸化の阻害または刺激、Eph受容体分解、Eph受容体リガンド（例えば、エフリン）結合を測定することにより決定する。
【０２２６】
本発明のFc変異体、または変異体Fc融合タンパク質の結合特異性、親和性および機能的活性は、当分野で周知の様々なin vitro結合および細胞接着アッセイにより特性決定することができ、このような方法として、限定するものではないが、ELISA、ウエスタンブロット分析、細胞表面染色、リガンド−受容体相互作用の阻害、フローサイトメトリー分析、ならびに、以下の文献に開示されているものが挙げられる：PCT公開番号WO 04/014292、WO 03/094859、WO 04/069264、WO 04/028551、WO 03/004057、WO 03/040304、WO 00/78815、WO 02/070007、およびWO 03/075957、ならびに米国特許第5,795,734号、第6,248,326号、および第6,472,403号、ならびに米国特許出願番号10/770,543、および10/863,729；Pecheurら、2002, FASEB J. 16(10):1266-1268；Almedら、The Journal of Histochemistry & Cytochemistry 50:1371-1379（2002）（これらはすべて、参照として本明細書に組み込む）。例えば、Fc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質の親和性、結合特異性および解離速度（off-rate）は、親抗Eph受容体抗体との競合的結合アッセイを測定することにより、Eph受容体とエフリンの結合に対する本発明のFc変異体、または変異体Fc融合タンパク質の阻害活性を測定することにより、決定することができる。競合的結合アッセイの一例として、非標識Eph受容体の存在下でその量を増やしながら、目的のFc変異体と一緒に標識Eph受容体（例えば、3Hまたは125I）をインキュベートした後、標識Eph受容体に結合したモノクローナル抗体を検出することを含む放射免疫測定法がある。Eph受容体に対するFc変異体の親和性および結合解離速度は、スキャッチャードプロット分析によりデータから決定することができる。放射免疫測定法により、第２抗体との競合も決定することができる。この場合、非標識モノクローナル抗体の存在下でその量を増やしながら、標識化合物（例えば、3Hまたは125I）に結合したFc変異体と一緒にEph受容体
をインキュベートする。
【０２２７】
また、当分野では周知の表面プラスモン共鳴（SPR）アッセイを用いて、Fc変異体、または変異体Fc融合タンパク質の速度論的パラメーターを決定することもできる。SPRを用いた技術について詳しくは、Mulletら、2000, Methods 22:77-91；Dongら、2002, Review in Mol. Biotech., 82:303-23；Fivashら、1998, Current Opinion in Biotechnology 9:97-101；Richら、2000, Current Opinion in Biotechnology 11:54-61（これらはすべて、参照として本明細書にその全文を組み込む）を参照されたい。さらに、米国特許第6,373,577号；第6,289,286号；第5,322,798号；第5,341,215号；第6,268,125号に記載されている、タンパク質−タンパク質相互作用を測定するためのSPR装置およびSPR方法のいずれも本発明の方法で考慮され、これれら文献はすべて参照として本明細書にその全文を組み込むものとする。
【０２２８】
本発明のFc変異体または変異体Fc融合タンパク質の結合特異性は、限定するものではないが、Eph受容体との結合および他のEph受容体に対する交差反応性の測定など、当分野では周知の方法により評価することができる。加えて、結合親和性および特異性は、Eph受容体に対し親抗Eph受容体抗体との競合的結合アッセイにより；もしくは、Eph受容体とそのリガンド、エフリンの結合に対する本発明のFc変異体、または変異体Fc融合タンパク質の阻害活性を測定することにより、決定することができる。
【０２２９】
本発明のFc変異体、または変異体Fc融合タンパク質の阻害、アンタゴニストおよび／またはアゴニスト活性は、当分野では周知の多数の方法により試験することができ、このような方法として、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：リン酸化アッセイ（Koolpeら、2002, J Biol Chem 277:46974およびGuら、2001, Mol Cell Biol 21:4579）、細胞接着（Lawrensonら、2002, J Cell Sci 115:1059およびDavyら、2000, EMBO 19:5396）、上皮細胞遊走アッセイ、例えば、トランスウェル細胞遊走アッセイ（Choiら、1994, J Vascular Sur 19:125-134およびLeaveslyら、1993, J Cell Biol 121:163-170）、ならびに細胞球体化アッセイ（Miaoら、2000, Nature, Cell Bio. 2:62）、シグナル伝達アッセイ（Sharfeら、2002, Eur J Immunol 32:3745；Zouら、1999, PNAS U.S.A. 96:13813）（これらはすべて参照として本明細書にその全文を組み込む）。本発明のFc変異体、または変異体Fc融合タンパク質が癌細胞表現型を阻害する能力は、限定するものではないが、軟質寒天でのコロニー形成、三次元基底膜または細胞外マトリックス調製物（例えば、MATRIGEL（商標））における管状網状体形成を含むin vitroアッセイにより決定することができる。
【０２３０】
米国特許第5,766,863号、ならびにPCT公開番号WO 03/094859、WO 04/014292、WO 04/069264（これらはすべて参照として本明細書にその全文を組み込む）に記載されているように、リン酸化／分解アッセイを実施することができる。手短に言うと、Fc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質もしくは対照分子の存在下で、細胞を37℃で少なくとも15分インキュベートする。次に、細胞溶解物を好適な抗Eph抗体（例えば、抗Eph抗体は、Santa Cruz Biotechnolory, Inc（カリフォルニア州サンタクルス）などから市販されている）で免疫沈降させ、SDS-PAGEにより分離した後、抗ホスホチロシン抗体4G10（Upstate Biotechnology；ニューヨーク州レークプラシド）とPY20（BD Transduction Laboratories；ニュージャージー州フランクリンレークス）のカクテルを用いたウェスタンブロット分析に付す。Fc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質による処理後Eph受容体リン酸化が増加していれば、Fc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質がEph受容体を作動し、自己リン酸化を促進したと考えられ、また、リン酸化の低下はFc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質のアンタゴニスト活性と一致することを示している。ウェスタンブロット分析および免疫沈降は、これまで記載されている（Zantekら、1999, Cell Growth Diff. 10:629；参照として本明細書にその全文を組み込む）ように実施する。手短には、１％Triton X-100を含むトリス緩衝食塩水（Sigma；ミズリー州セントルイス）において細胞単層のデタージェント抽出物を抽出する。タンパク質濃度を測定（BioRad；カリフォルニア州ハーキュリーズ）後、1.5 mgの細胞溶解物を免疫沈降させ、SDS-PAGEにより分解してから、ニトロセルロース（PROTRAN（商標）、Schleicher and Schuell；ニューハンプシャー州キーン）に移す。増強した化学発光（Pierce；イリノイ州ロックフォード）およびオートラジオグラフィー（Kodak X-OMAT；ニューヨーク州ロチェスター）により抗体結合を検出する。
【０２３１】
細胞接着および細胞球体化アッセイはMiaoら（Nature Cell Biol. 2:62, 2000）（参照として本明細書にその全文を組み込む）に記載のように実施することもできる。細胞接着を試験するために、手短には、事前に各種ECMタンパク質またはポリ-L-リシンをコートした96-ウェルプレートへの細胞の平板培養を３回繰り返す。Fc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質の存在または非存在下で、１ウェルあたり１×105細胞の密度で細胞を培養し、37℃で30分接着させる。非接着細胞を洗浄によりウェルから除去し、接着細胞を固定、染色した後、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）読取り装置での吸光度を測定することにより、定量する。Fc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質で処理した細胞は、本発明のFc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質の非存在下で接着することができた対照細胞と比較して、ECMタンパク質処理ウェルへの弱い接着を示す。
【０２３２】
細胞球体化アッセイの場合には、ECMタンパク質をコートした６ウェル皿、または24ウェル皿のECMタンパク質コートカバースリップに細胞を平板培養する。細胞を48時間接着させた後、Fc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質を含む、または含まない培地で10分処理する。プレートまたはカバースリップを洗浄し、染色した後、顕微鏡で視覚化する。Fc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質で処理した細胞は、Fc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質を含まない培地で処理した細胞に比べ、細胞球体化を示すが、これはECMマトリックスへの接着の弱さを意味している。
【０２３３】
本発明の抗体が軟質ゲル中で癌細胞の形成を阻害する能力についてアッセイすることもできる（このようなアッセイは、例えば、Zelinskiら、2001, Cancer Res. 61:2301（参照として本明細書にその全文を組み込む）に記載のように実施することができる）。手短には、Fc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質もしくは対照溶液（PBS）の存在下で、細胞を37℃で７日軟質ゲル中に懸濁させる。Fc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質とインキュベートした後、細胞を洗浄し、抗Fc変異体および／または抗変異体Fc融合タンパク質第二モノクローナル抗体（第二mab）またはPBSのいずれかと一緒にインキュベートする。コロニー形成について顕微鏡で評点する。少なくとも３個の細胞を含むクラスターを陽性として評点する。
【０２３４】
三次元微小環境（例えば、MATRIGEL（商標））内での腫瘍細胞挙動から、乳房上皮細胞の分化状態および攻撃性を高い信頼度で予測することができる。Fc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質もしくは対照溶液（PBS）の存在下で、良性（MCF-10A）または悪性（MDA-MB-231）乳房上皮細胞の単層培養物をMATRIGEL（商標）でインキュベートする。MATRIGEL（商標）上の細胞の挙動をZelinskiら（2001, Cancer Res. 61:2301）に記載のように分析する。手短には、組織培養皿にMATRIGEL（商標）（Cpllaborative Biomedical Products；マサチューセッツ州ベッドフォード）をコートし、事前にFc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質もしくは対照溶液（PBS）と氷上で１時間インキュベートしておいた１×105 MDA-MB-231またはMCF-10A細胞を添加する。細胞を37℃のMATRIGEL（商標）上で24時間インキュベートし、オリンパスIX-70逆光顕微鏡を用いて細胞挙動を評価する。画像はすべて35mmフィルム（T-Max-400. Kodak；ニューヨーク州ロチェスター）に記録する。
【０２３５】
前記以外のin vitroアッセイの例、例えば、ウエスタンブロット分析、フローサイトメトリー分析、皮質骨および細胞外マトリックスタンパク質に対する細胞接着アッセイ、細胞遊走アッセイ、細胞侵入アッセイ、ならびに細胞増殖アッセイは、Pecheurら、2002, FASEB J. 16(10):1266-1268（参照として本明細書にその全文を組み込む）に記載されている。
【０２３６】
本発明のFc変異体、または変異体Fc融合タンパク質の抗癌活性は、癌の試験のための各種実験動物モデル、例えば、マウスEph受容体をヒトEph受容体で置換したscidマウスモデルまたはトランスジェニックマウス、ヒト異種移植片を含むヌードマウス、ハムスター、ウサギなどの動物モデルを用いて決定することができ、このような動物は当分野では周知であり、以下の文献に記載されている：Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development（1999, FiebigおよびBurger編）；Contributions to Oncology（1999, Karger）；The Nude Mouse in Oncology Research（1991, BovenおよびWinograd編）；ならびにAnticancer Drug Development Guide（1997, Teicher編）（参照として本明細書にその全文を組み込む）。例えば、本発明のFc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質がin vivoで腫瘍癌成長を阻害する能力は以下のようにしてアッセイするすることができる：MDA-MB-231乳癌細胞を無胸腺症マウスに皮下移植する。腫瘍が100 mm3の平均体積まで成長したら、３週間にわたり毎週２回Fc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質あるいは対照溶液（PBS）をマウスに腹腔内投与する。腫瘍成長を評価し、腫瘍体積を初期腫瘍体積（100 mm3）で割った比率として表す。腫瘍体積が1,000 mm3に達するまで、腫瘍成長を進行させる。処理後毎日マウス生存率を評点することにより、マウスの生存を評価する。同様に、動物、例えば、ヌードマウスに結腸癌細胞を継代させて、これらの動物に腫瘍を出現させることにより、結腸癌の動物モデルを作製する。ヌードマウスにおけるヒト結腸癌の正常位移植モデルについては、例えば、Wangら、1994, Cancer Research, 54:4726およびTooら、1995, Cancer Research, 55:681に記載されている。このモデルは、AntiCancer, Inc.,（カリフォルニア州サンディエゴ）により販売されている、いわゆる”METAMOUSS”に基づく。
【０２３７】
標的疾患または障害、例えば、炎症性疾患、自己免疫疾患、異常骨代謝もしくは異常血管新生に関連する疾患または障害、癌、Eph受容体の異常発現および／または活性に関連する疾患に関連する当分野で周知の様々な動物モデルを用いることができ、このようなモデルとして、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：ニワトリ漿尿膜（CAM）における成長因子または腫瘍誘導性血管新生（例えば、Ausprunkら（1980）Am. J. Pathol., 79:597-618；Ossonskiら（1975）Cancer Res., 40:2300-2309；Brooksら（1994）Science, 264:569-571およびBrooksら（1994）, Cell, 79:1157-1164参照）、ウサギにおけるV x 2癌細胞（例えば、Voelkelら、（1975）Metabolism 24:973-86参照）、BALB/c nu/nuマウスにおいて誘導した腫瘍、ならびに皮下移植したヒト骨断片を有するSCIDマウス（SCID−ヒト−骨モデル）。腫瘍モデルの別の例がTeicherら、Tumor Models in Cancer Research（Humana Press；ニュージャージー州トトワ、2001）に記載されている。
【０２３８】
本発明のプロトコルおよび製剤は、ヒトに使用する前に、所望の治療または予防活性についてin vitroで、次にin vivoで試験するのが好ましい。例えば、本発明の特定の治療プロトコル製剤または組合せ治療法の投与が必要であるかどうかを決定するのに用いることができるin vitroアッセイとして、患者の組織サンプルを培養して増殖し、これを本発明の製剤に暴露または接触させ、組織サンプルに対する該製剤の効果を観察する、in vitro細胞培養アッセイがある。組織サンプルは、患者からの生検により取得することができる。この試験により、個々の患者の治療に最も有効な予防または治療薬を確認することができる。様々な具体的実施形態では、自己免疫疾患、炎症性疾患、少なくとも１つのEph受容体の異常発現および／または活性に関連する疾患に関与する細胞型の代表的細胞を用いて実施することにより、本発明の製剤がこのような細胞型に所望の効果を有するかどうかを決定することができる。接触させた細胞の増殖レベルが低いほど、本発明の化合物が患者の状態を治療するのに有効であることを示している。あるいは、患者からの細胞を培養するのではなく、腫瘍または悪性細胞系、破骨細胞、内皮細胞もしくは内皮細胞系の細胞を用いて、本発明の製剤をスクリーニングしてもよい。当分野で標準的な多数のアッセイを用いて、このような生存および／または増殖を評価することができる：例えば、細胞増殖は、3Hチミジン取込みの測定により、直接細胞計数により、原癌遺伝子（例：fos、myc）または細胞周期マーカーのような既知遺伝子の転写活性の変化を検出することにより、評価し；細胞生存能力はトリパンブルー染色により、分化は、視覚による形態の変化などに基づき、それぞれ評価することができる。
【０２３９】
予防または治療薬は、ヒトで試験する前に、好適な動物モデル系、限定するものではないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ、ハムスターなどで試験することができる。
【０２４０】
当分野においてよく知られ、広範に用いられている主な動物モデルは、当分野で周知であり、前述のように記載されている。
【０２４１】
さらに、当業者には周知のアッセイを用いて、癌の治療または予防に対する本明細書に開示した組合せ治療薬の予防および／または治療有効性を評価することができる。
【０２４２】
６．10  予防および治療のための使用
前述のように、Eph受容体に免疫特異的に結合する薬剤を用いて、血管新生の阻害、Eph受容体仲介の、またはその影響を受ける他の機能、限定するものではないが、細胞増殖、細胞接着、細胞遊走、肉芽組織発生、および／または炎症の阻害が含まれる。従って、本発明は、癌またはその１以上の症状の予防、管理、治療もしくは改善および／または血管新生の阻害を目的とする、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合し、かつ、好ましくはその活性をモジュレートする薬剤の使用に関する。
【０２４３】
血管新生（新生血管形成とも呼ぶ）とは、組織内の既存の血管から新しい血管が形成する過程である。既述したように、Eph受容体は、この過程に特定の役割を果たすと考えられる。新しい血管形成または組織血管新生を必要とする様々な病状があり、この過程を阻害することが病状の阻害につながる。このように、成長または維持のために血管新生を必要とする病状は、Eph受容体仲介の疾患であると考えることができる。従って、これらの疾患の治療、もしくは重症度軽減の程度は、血管新生の阻害の程度に左右される。これらのEph受容体仲介の疾患として、例えば、免疫および非免疫炎症、血栓症、急性虚血性発作、慢性関節リウマチ、乾癬、血管の異常侵入に関連する疾患、例えば、糖尿病網膜症、血管新生緑内障、およびアテローム動脈硬化斑中の毛細血管増加、ならびに癌疾患などが挙げられる。
【０２４４】
このような癌疾患として、例えば、充実性腫瘍、腫瘍転移、血管線維腫、血管肉腫、水晶体後方、線維増殖、血管腫、カポジ肉腫、癌、癌肉腫、ならびに、腫瘍の成長を支持するのに新生血管形成を必要とするその他の癌が挙げられる。血管新生性と考えられる別の疾患として、乾癬および関節リウマチ、ならびに網膜疾患（例えば、黄斑変性）が挙げられる。
【０２４５】
このような癌のさらに別の例を以下に挙げる：白血病、限定するものではないが、例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、例えば、骨髄芽球性、前骨髄性、骨髄単球性、単球性、および赤白血病、ならびに骨髄異形成症候群；慢性白血病、限定するものではないが、例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ性白血病、ヘアリーセル白血病；真性赤血球増加；リンパ腫、限定するものではないが、例えば、ホジキン病、非ホジキン病；多発性骨髄腫、限定するものではないが、例えば、くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞性白血病、孤立性形質細胞腫および髄外形質細胞腫；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；有意性が不明なモノクローナル免疫グロブリン血症；良性モノクローナル免疫グロブリン血症；Ｈ鎖病；骨および結合組織肉腫、限定するものではないが、例えば、骨肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨大細胞腫瘍、骨の線維肉腫、軟骨腫、傍骨肉腫、軟組織肉腫、血管肉腫（血管肉腫）、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫；脳腫瘍、限定するものではないが、例えば、グリオーマ、星状細胞腫、脳幹グリオーマ、上衣細胞腫、希突起グリオーマ、非グリア腫瘍、聴音神経腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽腫、原発性脳リンパ腫；乳癌、限定するものではないが、例えば、腺癌、小葉（小細胞）癌、導管内癌、髄様乳癌、ムチン様乳癌、管状乳癌、乳頭状乳癌、パジェット病、および炎症性乳癌；副腎癌、限定するものではないが、例えば、クロム親和細胞腫および副腎皮質；甲状腺癌、限定するものではないが、例えば、乳頭または胞状甲状腺癌、髄様甲状腺癌および異形成甲状腺癌；膵臓癌、限定するものではないが、例えば、インスリーマ、ガストリノーマ、グリカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍、およびカルチノイドまたは膵島細胞腫；下垂体癌、限定するものではないが、例えば、クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、先端巨大病、および尿崩症；眼の癌、限定するものではないが、例えば、眼黒色腫（例：虹彩黒色腫、軟骨黒色腫、および繊毛体黒色腫）、ならびに網膜芽細胞腫；膣癌、例えば、扁平上皮癌、腺癌、および黒色腫；外陰癌、例えば、扁平上皮癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫、およびパジェット病；頚管癌、限定するものではないが、例えば、扁平上皮癌、および腺癌；子宮癌、限定するものではないが、例えば、子宮内膜癌および子宮肉腫；卵巣癌、限定するものではないが、例えば、卵巣上皮癌、境界腫瘍、生殖細胞腫瘍、および間質腫瘍；食道癌、限定するものではないが、例えば、扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、いぼ状癌、および燕麦細胞（小細胞）癌；胃癌、限定するものではないが、例えば、腺癌、菌状発生型（ポリープ状）、潰瘍形成型、表在拡大型、分散性拡大型、悪性リンパ腫、リンパ肉腫、線維肉腫、および癌肉腫；結腸癌；直腸癌；肝臓癌、限定するものではないが、例えば、肝細胞癌および肝芽腫；胆嚢癌、例えば、腺癌；胆管癌、限定するものではないが、例えば、乳頭状、結節状、およびびまん性；肺癌、例えば、非小細胞癌、扁平上皮癌（類表皮癌）、腺癌、大細胞癌および小細胞肺癌；精巣癌、限定するものではないが、例えば、生殖器腫瘍、セミトーマ、異形成、古典的（典型的）、精母細胞、非セミノーマ、胎生期癌、奇形腫、絨毛癌（卵黄嚢腫瘍）；前立腺癌、限定するものではないが、例えば、腺癌、平滑筋肉腫、および横紋筋肉腫；陰茎癌；口腔癌、限定するものではないが、例えば、扁平上皮癌；基底細胞癌；唾液腺癌、限定するものではないが、例えば、腺癌、粘液性類表皮癌、および腺様嚢胞癌；咽頭癌、限定するものではないが、例えば、扁平上皮癌、およびいぼ状癌；皮膚癌、限定するものではないが、例えば、基底細胞癌、扁平上皮癌および黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、悪性黒子黒色腫、末端部黒子黒色腫；腎臓癌、限定するものではないが、例えば、腎細胞癌、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行細胞癌（腎盤および／または子宮）；ウィルムス腫；膀胱癌、限定するものではないが、例えば、移行細胞癌、扁平上皮癌、腺癌、癌肉腫。前記に加えて、癌には、粘液肉腫、骨形成肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑膜性腫瘍、血管芽細胞腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支原生癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌および乳頭状腺癌も含まれる（このような疾患について詳しくは、Fishmanら、1985, Medicine, 第２版、J.B.Lipppincott Co., Philadelphia and Murphyら、1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc.,（米国）を参照）。
【０２４６】
従って、本発明は、癌、充実性腫瘍転移、ならびに、炎症性疾患、例えば、関節リウマチおよび乾癬、もしくはそれらの１以上の症状の予防、管理、治療もしくは改善、および／または血管新生またはそれに関連する状態の阻害を目的とする、少なくとも１つのEph受容体に免疫特異的に結合し、好ましくはその活性をモジュレートする薬剤の使用に関する。
【０２４７】
一実施形態では、本発明の方法および製剤は血管新生を阻害するために使用する。具体的実施形態では、本発明の方法および製剤は、充実性腫瘍における血管新生を阻害するために使用する。別の実施形態では、本発明の方法および製剤は、炎症を起こした血管新生組織（限定するものではないが、網膜組織および結合組織など）における血管新生を阻害するために使用する。
【０２４８】
さらに、本発明は、Eph受容体に免疫特異的に結合し、好ましくはこれを阻害するFc変異体であって、治療目的、さらに具体的には、癌の治療、予防、管理、もしくは改善に有用な上記Fc変異体を提供する。本発明に従い予防、管理、治療もしくは改善することができる癌の具体例として、限定するものではないが、頭部、頸部、眼、口、咽喉、食道、胸部、骨、肺、結腸、直腸、結腸直腸、もしくは胃腸管の各種器官、胃、脾、腎臓、骨格筋、皮下組織、転移性黒色腫、子宮内膜、前立腺、乳房、卵巣、精巣またはその他の生殖器官、皮膚、甲状腺、血液、リンパ節、腎臓、肝臓、膵臓、ならびに脳もしくは中枢神経系の癌が挙げられる。
【０２４９】
具体的実施形態では、本発明の方法および製剤は、Eph受容体を発現する原発性または二次性癌の予防、管理、治療もしくは改善に用いる。別の実施形態では、本発明の方法および製剤は、Eph受容体を発現しない原発性または二次性癌の予防、管理、治療もしくは改善に用いる。好ましい実施形態では、本発明の方法および製剤は、他の組織または器官（例えば、骨）に転移する可能性がある、または転移した癌の予防、管理、治療もしくは改善に用いる。別の好ましい実施形態では、本発明の方法および製剤は、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、黒色腫、骨癌もしくは乳癌の予防、管理、治療もしくは改善に用いる。Eph受容体を免疫特異的に阻害する薬剤を用いた方法としては、限定するものではないが、PCT公開番号WO 03/094859およびWO 04/014292、ならびに米国特許出願番号10/863,729（参照として本明細書にその全文を組み込む）に開示されているものがある。
【０２５０】
本発明は、Eph受容体の抗体、ならびにその他のアンタゴニストおよびアゴニストをスクリーニングする方法を提供する。さらに、本発明は、このようなスクリーニング方法を用いて同定した抗体および／またはその他のアンタゴニストまたはアゴニストの１以上のFcリガンド（例えば、FcγR、C1q）に対するADCCおよび／またはCDC活性および結合親和性を操作する方法も提供する。このような方法を用いて同定し、操作したEph受容体アンタゴニストおよびアゴニストは、単独または他の治療法と組み合わせて、Eph受容体仲介および／または関連の疾患および障害もしくはそれらの１以上の症状（限定するものではないが、癌、炎症性および自己免疫疾患など）の予防、治療、管理もしくは改善に用いることができる。
【０２５１】
本発明はまた、Eph受容体に免疫特異的に結合する変異体Fc融合タンパク質も提供する。この変異体Fc融合タンパク質は、単独または他の治療法と組み合わせて、Eph受容体仲介および／または関連の疾患および障害もしくはそれらの１以上の症状（限定するものではないが、癌、炎症性および自己免疫疾患など）の予防、治療、管理もしくは改善に用いることができる。
【０２５２】
具体的実施形態では、Eph受容体に免疫特異的に結合する本発明のFc変異体および／またはFc変異体融合タンパク質を癌またはその１以上の症状の予防、管理、治療もしくは改善のために用いる。好ましい実施形態では、癌または１以上のその症状の予防、管理、治療もしくは改善に用いる本発明のFc変異抗体および／またはFc変異体融合タンパク質は、Eph受容体のアンタゴニストである。
【０２５３】
本発明はまた、インテグリンαVβ3仲介の疾患および障害もしくはそれらの１以上の症状（限定するものではないが、癌、炎症性および自己免疫疾患など）の予防、治療、管理もしくは改善を目的とする、１以上のFcリガンド（例えば、FcγR、C1q）に対する結合親和性が変更され、かつADCCおよび／またはCDC活性が改変された、Eph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体および／またはFc変異体融合タンパク質であって、１成分（例えば、治療薬剤または薬剤）と結合または融合した、上記Fc変異体および／またはFc変異体融合タンパク質の使用も包含する。本発明はさらに、上記Fc変異体および／またはFc変異体融合タンパク質の、予防または治療効果を高める治療プロトコルも包含する。
【０２５４】
本発明は、組織または器官（例えば、骨）に転移する可能性がある、または転移した癌もしくはその１以上の症状の予防、管理、治療もしくは改善のための方法を提供し、この方法は、それが必要な患者に、予防または治療に有効な量の１以上の本発明のFc変異体および／またはFc変異体融合タンパク質を１以上の用量で投与することを含む。
【０２５５】
本発明は、癌もしくはその１以上の症状の予防、管理、治療もしくは改善のための方法を提供し、この方法は、それが必要な患者に、予防または治療に有効な量の１以上のFc変異体および／またはFc変異体融合タンパク質を１以上の用量投与することを含むが、その際、該Fc変異体および／またはFc変異体融合タンパク質は、１以上のFcリガンド（例えば、FcγR、C1q）に対する結合親和性が変更され、かつADCCおよび／またはCDC活性が改変された、Eph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体および／またはFc変異体融合タンパク質であって、１成分（例えば、治療薬剤または薬剤）と結合または融合している。Fc変異体を融合または結合させることのできる成分の例として、限定するものではないが、PCT公開番号WO 2003/075957（参照として本明細書にその全文を組み込む）に開示したものが挙げられる。１以上のFcリガンド（例えば、FcγR、C1q）に対する結合親和性が変更され、かつADCCおよび／またはCDC活性が改変されたFc変異体および／またはFc変異体融合タンパク質の例として、限定するものではないが、前文に開示した変異体が挙げられる。
【０２５６】
本発明は、Eph受容体仲介の疾患および障害もしくはその１以上の症状（限定するものではないが、癌、炎症性および自己免疫疾患もしくはその１以上の症状）の予防、管理、治療もしくは改善のためのプロトコルであって、１以上のFcリガンド（例えば、FcγR、C1q）に対する結合親和性が変更され、かつADCCおよび／またはCDC活性が改変され１以上のFc変異体および／またはFc変異体融合タンパク質を、予防または治療に有効な量の用量のFc変異体および／またはFc変異体融合タンパク質以外の１以上の治療薬の投与と組み合わせて用いる、上記プロトコルを包含する。本発明は、本発明のFc変異体および／または変異体融合タンパク質が、他の治療法（既存の標準的および実験的化学療法）の効力を増し、これと相乗し、その効能を高め、許容度を改善し、および／またはそれによる副作用を低減するという認識に一部基づいている。本発明の組合せ治療法は、付加的効力、付加的治療効果もしくは相乗効果を有する。本発明の組合せ治療法により、Eph受容体仲介の疾患および障害もしくはその１以上の症状（限定するものではないが、癌、炎症性および自己免疫疾患など）の予防、管理、治療もしくは改善のために、Fc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質と一緒に用いる治療薬（例えば、予防または治療薬）の用量を減らし、および／またはEph受容体仲介の疾患（例えば、癌）の被検者に対するこのような予防または治療薬の投与頻度を少なくして、該被検者のクオリティオブライフを改善する、および／または予防または治療効果を達成することができる。さらに、本発明の組合せ治療は、疾患（例えば、癌）のための既存の単一薬剤治療および／または既存の組合せ治療の投与に伴う不要な、または有害な副作用を軽減または解消し、これによって、治療プロトコルに対する患者のコンプライアンスを高める。
【０２５７】
一実施形態では、本発明は、Eph受容体仲介の疾患（例えば、癌）もしくはその１以上の症状を予防、管理、治療もしくは改善する方法を提供し、この方法は、インテグリンアンタゴニスト、標準的または実験的化学療法、ホルモン療法、生物学的療法／免疫療法および／または放射線療法の投与と組み合わせて、予防または治療に有効な量の用量のFc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質を、必要とする被検者に投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、Eph受容体仲介の疾患（例えば、癌）もしくはその１以上の症状を予防、管理、治療もしくは改善する方法を提供し、この方法は、外科手術と組み合わせて、単独で、あるいは、Eph受容体アンタゴニストおよび／またはEph受容体アゴニスト、標準的または実験的化学療法、ホルモン療法、生物学的療法／免疫療法および／または放射線療法の投与とさらに組み合わせて、予防または治療に有効な量の用量のFc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質を、必要とする被検者に投与することを含む。これらの実施形態によれば、Eph受容体仲介の疾患（例えば、癌）もしくはその１以上の症状を予防、管理、治療もしくは改善するために用いるFc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質は、１成分（例えば、治療薬剤または薬剤）と結合または融合させても、させなくてもよく、また、上記Fc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質は、Eph受容体に免疫特異的に結合するアゴニストまたはアンタゴニストである。
【０２５８】
治療または予防薬として、限定するものではないが、小分子、合成薬剤、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸（例えば、DNAおよびRNAヌクレオチド：限定するものではないが、アンチセンスヌクレオチド配列、三重らせん、ならびに生物学的に活性のタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドをコードするヌクレオチド配列）、抗体、合成または天然の無機分子、模倣薬剤、ならびに合成または天然の有機分子が挙げられる。Eph受容体仲介の疾患および障害（限定するものではないが、癌、炎症性および自己免疫疾患もしくはこれらに関連する症状など）の予防、治療、管理もしくは改善に有用であることが知られる、またはそのために使用されてきた、もしくは現在使用されている薬剤と、本明細書に記載の本発明のFc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質を組み合わせて用いることができる。
【０２５９】
前記の組合せ治療で用いようとする薬剤の例を以下に挙げるが、これらに限定されるわけではない：インテグリンアンタゴニスト（例えば、RGDペプチドおよびジスインテグリン）、標準的または実験的化学療法（例えば、ドキソルビシン、エピルビシン、シクロホスファミド、5-フルオロウラシル、タキサン（例：ドセタキセルおよびパシリタキセル）、ロイコボリン、レバミソール、イリノテカン、エストラムスチン、エトポシド、ビンブラスチン、ダカルバジン、ニトロソウレア（例：カルムスチンおよびロムスチン）、ビンカアルカロイド、白金化合物、シスプラチン、ミトマイシン、ビノレルビン、ゲンシタビン、カルボプラチン、ヘキサメチルメラミンおよび／またはトポテカン）、免疫調節薬（例えば、サイトカイン、抗体、インターロイキンおよび造血因子）、生物学的療法／免疫療法（例えば、タモキシフェン、LHRHアゴニスト、非ステロイド抗男性ホルモン、ステロイド抗男性ホルモン、エストロゲン、アミノグルテチミド、ヒドロコルチゾン、フルタミド投与中止、プロゲステロン、ケトコナゾール、プレドニゾン、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン-2、腫瘍壊死因子α、およびメルファラン）、抗炎症薬（例えば、非ステロイド抗炎症薬（NSAID）、ステロイド抗炎症薬、βアゴニスト、抗コリン作用薬、およびメチルキサンチン）、鎮痛薬（例えば、NSAID、サリチル酸塩、アセトミノフェン、麻酔薬、ならびに非麻薬および抗不安定薬の組合せ）。上記以外の薬剤、治療薬およびそれらの用量、投与経路ならびに推奨する用法は当分野で周知であり、Physician’s Desk Reference（第57版、2003）のような文献に記載されている。別の薬剤およびその他の組合せ治療は、PCT出願番号WO 02/070007；WO 04/066956；WO 03/075741；およびWO 03/075957（参照として本明細書にその全文を組み込む）に記載されている。
【０２６０】
前記の組合せ治療で用いられる薬剤のさらに別の例には、限定するものではないが、本発明の様々な実施形態で用いることができる抗癌薬の例（本発明の医薬組成物および投薬形態、ならびにキットを含む）も含まれ、限定するものではないが、以下に挙げるものを含む：アシビシン、アクラルビシン、塩酸アコダゾール、アクロニン、アドゼレシン、アルデロイキン、アルトレタミン、アンボマイシン、酢酸アメタントロン、アミノグルテチミド、アンサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタト、ベンゾデパ、ビカルタミド、塩酸ビサントレン、ビスナフィドジメシレート、ビゼレシン、硫酸ブレオマイシン、ブレキナールナトリウム、ブロピリミン、ブルスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カルベチメール、カルボプラチン、カルムスチン、塩酸カルビシン、カルゼレシン、セデフィンゴール、クロランブシル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン、クリスナトールメシレート、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、デカルバジン、デシタビン、デキソルマプラチン、デザグアニン、デザグアニンメシレート、ジアジクオン、ドセタキセル、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、ドロロキシフェン、クエン酸ドロロキシフェン、プロピオン酸ドロモスタノロン、デュアゾマイシン、エダトレキセート、塩酸エフロルニチン、エルサミトルシン、エノプラチン、エンプロメート、エピプロピジン、塩酸エピルビシン、エルブロゾール、塩酸エソルビシン、エストラムスチン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エタニダゾール、エトポシド、リン酸エトポシド、エトプリン、塩酸ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロクスリジン、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、フルオロシタビン、ホスキドン、ホストリエシンナトリウム、ゲムシタビン、塩酸ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、塩酸イダルビシン、イホスファミド、イルモフォスシン、インターロイキン2（組換えインターロイキン2またはrII2を含む）、インターフェロンα2a、インターフェロンα2b、インターフェロンαn1、インターフェロンαn3、インターフェロンβI a、インターフェロンγI b、イプロプラチン、塩酸イリノテカン、酢酸ランレオチド、レトロゾール、酢酸ロイプロリド、塩酸リアロゾール、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、塩酸ロソキサントロン、マソプロコール、マイタンシン、塩酸メクロレタミン、酢酸メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキセート、メトトレキセートナトリウム、メトプリン、メツレデパ、ミチンドミド、ミトカルシン、ミトクロミン、ミトギリン、ミトマルシン、マイトマイシン、ミトスペル、ミトタン、塩酸ミトキサントロン、マイコフェノール酸、ニトロソウレア、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペガスパルガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、硫酸ペプロマイシン、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、塩酸ピロキサントロン、プリカマイシン、プロメ���タン、ポルフィメルナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、塩酸プロカルバジン、プロマイシン、塩酸プロマイシン、ピラゾフリン、リボプリン、ログレチミド、サフィンゴール、塩酸サフィンゴール、セムスチン、シントラゼン、スパルフォセートナトリウム、スパルソマイシン、塩酸スピロゲルマニウム、スプロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌル、タリソマイシン、テコガランナトリウム、テガフル、塩酸テロキサントロン、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、クエン酸トレミフェン、酢酸トレストロン、リン酸トリシリビン、トリメトレキセート、グルクロン酸トリメトレキセート、トリプトレリン、塩酸ツブロゾール、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、硫酸ビンプラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデスチン、硫酸ビンデスチン、硫酸ビンピジン、硫酸ビングリシネート、硫酸ビンロイロシン、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンロシジン、硫酸ビンゾリジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、塩酸ゾルビシン。その他の抗癌薬として、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：20-epi1,25ジヒドロキシビタミンD3,5-エチニルウラシル、アビラテロン、アクラルビシン、アシルフルベン、アデシペノール、アドゼレシン、アルデスロイキン、ALL-TKアンタゴニスト、アルトレタミン、アンバムスチン、アミドクス、アミホスチン、アミノレブリン酸、アンルビシン、アンサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、アンドログラホリド、血管新生阻害剤、アンタゴニストＤ、アンタゴニストＧ、アンタレリクス、抗背方化形態形成タンパク質-1、抗男性ホルモン、抗エステロゲン、アンチネオプラストン、グリシン酸アフィジコリン、アポトーシス遺伝子モジュレーター、アポトーシス調節因子、アプリン酸、アラ-CDP DL PTBA、アルギニンデアミナーゼ、アスラクリン、アタメスタン、アトリムスチン、アキシナスタチン１、アキシナスタチン２、アキシナスタチン３、アザセトロン、アザトキシン、アザチロシン、バッカチンIII誘導体、バラノール、バチマスタト、BCR/ABLアンタゴニスト、ベンゾクロリン、ベンゾリスタウロスポリン、βラクタム誘導体、βアレチン、ベタクラマイシンＢ、ベツリン酸、bFGF阻害剤、ビカルタミド、ビサントレン、ビサジリジニルスペルミン、ビスナフィド、ビストラテンＡ、ビゼレシン、ブレフレート、ブロピリミン、ブドチタン、ブチオニンスルホキシミン、カルシポトリオール、カルホスチンＣ、カンプトテシン誘導体、カナリポクスIL 2、カペシタビン、カルボキサミド  アミノ  トリアゾール、カルボキシアミドトリアゾール、CaRest M3、CARN 700、軟骨由来の阻害剤、カルゼレシン、カゼインキナーゼ阻害剤（ICOS）、カスタノスペルミン、セクロピンＢ、セトロレリクス、クロロキノキサリンスルホアミド、シカプロスト、シスポルフィリン、クラドリビン、クロミフェン類似体、クロトリマゾール、コリスマイシンＡ、コリスマイシンＢ、コンブレタスタチンA4、コンブレタスタチン類似体、コナゲニン、クランベシジン816、クリスナトール、クリプトフィシン８、���リプトフィシンＡ誘導体、クラシンＡ、シクロペンタントラキノン、シクロプラタム、シペマイシン、シタラビンオクホスフェート、細胞溶解因子、シトスタチン、ダクリキシマブ、デシタビン、デヒドロジデムニンＢ、デストレリン、デキサメタゾン、デキシホスタミド、デキスラゾキサン、デキスベラパミル、ジアジクオン、ジデムニンＢ、ジドクス、ジエチルノルスペルミン、ジヒドロ5アザシジン、ジヒドロタキソール、ジオキサマイシン、ジフェニルスピロムスチン、ドセタキセル、ドコサノール、ドラセトロン、ドキシフリジン、ドロロキシフェン、ドロナビノール、デュオカルマイシンSA、エブセレン、エコムスチン、エデルホシン、エドレコロマブ、エフロルニチン、エレメン、エミテフル、エピルビシン、エプリステリド、エストラムスチン類似体、エストロゲンアゴニスト、エストロゲンアンタゴニスト、エタニダゾール、リン酸エトポシド、エキセメスタン、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フィルグラスチム、フィナステリド、フラボピリドール、フレゼラスチン、フルアステロン、フルダラビン、塩酸フルオロダウノルニシン、ホルフェニメクス、フォルメスタン、ホストリエシン、ホテムスチン、ガドリニウムテキサフィリン、硝酸ガリウム、ガロシタビン、ガニレリクス、ゲラチナーゼ阻害剤、ゲムシタビン、グルタチオン阻害剤、ヘプスルファム、ヘレグリン、ヘキサメチレンビサセタミド、ヒペリシン、イバンドロン酸、イダルビシン、イドキシフェン、イドラマントン、イルモフォシン、イロマスタト、イミダゾアクリドン、イミキモド、免疫刺激ペプチド、インスリン様成長因子１受容体阻害剤、インターフェロンアゴニスト、インターフェロン、インターロイキン、ヨーベングアン、ヨウドドキソルビシン、イポメアノール、イロプラクト、イルソグラジン、イソベンガゾール、イソホモハリコンドリンＢ、イタセトロン、ジャスプラキノリド、カハラリドＦ、ラメラリンN三酢酸、ランレオチド、レイナマイシン、レノグラスチム、硫酸レンチナン、レプトルスタチン、レオトロゾール、白血病阻害因子、白血球αインターフェロン、ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン、ロイプロレリン、レバミソール、リアロゾール、線状ポリアミン類似体、親油性二糖ペプチド、親油性白金化合物、リッソクリナミンド７、ロバプラチン、ロンブリシン、ロメトレキソール、ロニダミン、ロソキサントロン、ロバスタチン、ロキソリビン、ルルトテカン、ルテチウムテキサフィリン、リソフィリン、溶菌ペプチド、マイタンシン、マンノスタチンＡ、マリマスタト、マソプロコール、マスピン、マトリシリン阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、メノガリル、メルバロン、メテレリン、メチオニナーゼ、メトクロプラミド、MIF阻害剤、ミフェプリストン、ミルテホシン、ミリモスチム、ミスマッチ二本鎖RNA、ミトグアゾン、ミトラクトール、マイトマイシン類似体、ミトナフィド、ミトトキシン線維芽細胞成長因子サポリン、ミトキサントロン、モファロテン、モルグラモスチム、モノクローナル抗体、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、モノホスホリル脂質Ａ＋ミオバクテリア細胞壁sk、モピダモール、多剤耐性遺伝子阻害剤、多発性腫瘍サプレッサー１によ��療法薬、マスタード抗癌薬、ミカペロキシドＢ、マイコバクテリア細胞壁抽出物、ミリアポロン、N-アセチルジナリン、N-置換ベンザミド、ナファレリン、ナグレスチプ、ナロキソン＋ペンタゾシン、ナパビン、ナフテルピン、ナルトグラスチム、ネダプラチン、ネモルビシン、ネリドロン酸、中性エンドペプチダーゼ、ヌルタミド、ニサマイシン、酸化窒素モジュレーター、ニトロキシド抗酸化剤、ニトルリン、O6ベンジルグアニン、オクトレオチド、オキセノン、オリゴヌクレオチド、オナプリストン、オンダンセトロン、オンダンセトロン、オラシン、経口サイトカイン誘導剤、オルマプラチン、オサテロン、オキサリプラチン、オキサウノマイシン、パクリタキセル、パクリタキセル類似体、パクリタキセル誘導体、パラウアミン、パルミトイルリゾキシン、パミドロン酸、パナキシトリオール、パノミフェン、パラバクチン、パゼリプチン、ペガスパルガーゼ、ペルデシン、ペントサンポリスルフェートナトリウム、ペントスタチン、ペントロゾール、ペルフルブロン、ペルホスファミド、ペリリルアルコール、フェナジノマイシン、フェニル酢酸、ホスファターゼ阻害剤、ピシバニル、塩酸ピロカルピン、ピラルビシン、ピリトレキシム、プラセチンＡ、プラセチンＢ、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター、白金複合体、白金化合物、白金−トリアミン複合体、ポルフィメルナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニゾン、プロピルビスアクリドン、プロスタグラジンJ2、プロテアソーム阻害剤、プロテインＡを用いた免疫モジュレーター、プロテインキナーゼＣ阻害剤、プロテインキナーゼＣ阻害剤、ミクロアルガール、プロテインチロシンホスファターゼ阻害剤、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤、プルプリン、ピラゾロアクリジン、ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート、rafアンタゴニスト、ラルチトレキセド、ラモセトロン、rasファルネシルプロテイントランスフェラーゼ阻害剤、ras阻害剤、ras GAP阻害剤、デメチル化レテリプチン、レニウムRe 186エチドロネート、リゾキシン、リボザイム、RIIレチナミド、ログレチミド、ロヒツカイン、ロムルチド、ロキニメクス、ルビギノンB1、ルゴキシル、サフィンゴール、サイントピン、SarCNU、サルコフィトールＡ、サルグラモスチム、Sdi 1模倣物、セムスチン、セネッセンス由来のインヒビター１、セ
ンスオリゴヌクレオチド、シグナル伝達阻害剤、シグナル伝達モジュレーター、一本鎖抗原結合タンパク質、シゾフィラン、ソブゾキサン、ナトリウムボロカプテート、フェニル酢酸ナトリウム、ソルベロール、ソマトメジン結合タンパク質、ソネルミン、スパルフォシン酸、スピカマイシンＤ、スピロムスチン、スプレノペンチン、スポンジスタチン１、スクアラミン、幹細胞阻害剤、幹細胞分裂阻害剤、スチピアミド、ストロメリシン阻害剤、スルフィノシン、過度活性血管作用性腸管ペプチドアンタゴニスト、スラジスタ、スラミン、スワインソニン、合成グリコサミノグリカン、タリムスチン、タモキシフェンメチオジド、タウロムスチン、タキソール、タザロテン、テコガランナトリウム、テガフル、テルラピリリウム、テロメラーゼインヒビター、テモポルフィン、テモゾロミド、テニポシド、テトラクロロデカオキシド、テトラゾミン、タリブラスチン、チオコラリン、チオグアニン、トロンボポイエチン、トロンボポイエチン模倣物、チマルファシン、チモポイエチン受容体アゴニスト、チモトリナン、甲状腺刺激ホルモン、錫エチルエピオプルプリン、チラパザミン、チタノセンビクロリド、トプセンチン、トレミフェン、全能性幹細胞因子、翻訳阻害剤、トレチノイン、トリアセチルウリジン、トリシリビン、トリメトレキセート、トリプトレリン、トロピセトロン、ツロステリド、チロシンキナーゼインヒビター、チルホスチン、UBC阻害剤、ウベニメクス、尿生殖洞由来の成長阻害因子、ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト、バプレオチド、バリオリンＢ、ベクター系、赤血球遺伝子療法薬、ベラレソール、ベラミン、ベルジン、ベルテポルフィン、ビノレルビン、ビンキサルチン、ビタキシン、ボロゾール、ザノテロン、ゼニプラチン、ジラスコルブ、ならびにジノスタチンスチマラマー。別の抗癌薬は5-フルオロウラシルおよびロイコボリンである。
【０２６１】
本発明の方法および製剤は、限定するものではないが、頭部、頸部、眼、口、咽喉、食道、胸部、骨、肺、結腸、直腸、結腸直腸またはその他胃腸管の各種器官、胃、脾、腎臓、骨格筋、皮下組織、転移性黒色腫、子宮内膜、前立腺、乳房、卵巣、精巣またはその他の生殖器官、皮膚、甲状腺、血液、リンパ節、腎臓、肝臓、膵臓、ならびに脳もしくは中枢神経系の癌を予防、管理、治療もしくは改善するのに有用である。具体的実施形態では、本発明の方法および製剤は、Eph受容体を発現する原発性または二次性癌の予防、管理、治療もしくは改善に用いる。別の実施形態では、本発明の方法および製剤は、Eph受容体を発現しない原発性または二次性癌の予防、管理、治療もしくは改善に用いる。
【０２６２】
本発明の方法および製剤は、既存の標準的および実験的癌療法（例えば、限定するものではないが、化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、放射線療法、および／または外科手術）に対し部分的または完全に治療不応性の癌患者の管理または治療に有用である。
【０２６３】
６．１１製剤及び投与
前述のように、本発明は、Eph受容体仲介の疾患（例えば、癌）もしくはその１以上の症状の予防、管理、治療もしくは改善および／または血管新生の阻害を目的とする、１以上のEph受容体に免疫特異的に結合し、好ましくはこれを阻害する薬剤の使用に関する。従って、本発明は、１以上のFcリガンド（例えば、FcγR、C1q）に対する結合親和性が変更され、かつADCCおよび／またはCDC活性が改変された、Eph受容体に免疫特異的に結合する１以上のFc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質を含む製剤（例えば、医薬組成物）（本明細書では「本発明の製剤」または簡単に「製剤」とも呼ぶ）を提供する。具体的実施形態では、上記Fc変異体および／またはFc変異体融合タンパク質は、１以上のEph受容体のアンタゴニストである。別の具体的実施形態では、上記Fc変異体および／またはFc変異体融合タンパク質は、１以上のEph受容体のアゴニストである。
【０２６４】
一実施形態では、１以上のFc変異体および／またはFc変異体融合タンパク質を含む製剤（例えば、医薬組成物）は、液体製剤（本明細書では、「液体製剤」と呼び、総称「本発明の製剤」および「製剤」に具体的に含まれる）である。具体的実施形態では、液体製剤は、界面活性剤および／または無機塩を実質的に含まない。別の実施形態では、液体製剤は、約5.0〜約7.0、約5.5〜約6.5、約5.8〜約6.2、および約6.0のｐH範囲を有する。さらに別の具体的実施形態では、液体製剤は、5.0〜7.0、5.5〜6.5、5.8〜6.2、および6.0のｐH範囲を有する。さらにまた別の具体的実施形態では、液体製剤は、濃度が約１mM〜約100 mM、約５mM〜約50 mM、約10 mM〜約25 mMのヒスチジンを含む。別の具体的実施形態では、液体製剤は、濃度が１mM〜100 mM、５mM〜50 mM、10 mM〜25 mMのヒスチジンを含む。
【０２６５】
好ましい実施形態では、液体製剤は、濃度が約50 mg／ml、約75 mg／ml、約100 mg／ml、約125 mg／ml、約150 mg／ml、約175 mg／ml、約200 mg／ml、約225 mg／ml、約250 mg／ml、約275 mg／ml、もしくは約300 mg／mlの１以上のFc変異体および／またはFc変異体融合物を含む。一実施形態では、液体製剤は、以下に挙げる特性の１以上を呈示する：安定性；低レベル〜検出不可能なレベルの抗体フラグメント化および／または凝集；製造、調製および貯蔵中、抗体または抗体フラグメントの生物活性の喪失がほとんどまたは全くない。別の実施形態では、４℃または約４℃の適切な条件下で１年以内の貯蔵中、液体製剤の抗体活性の喪失は、50％以下、30％以下、20％以下、10％以下、あるいは５％もしくは１％以下である。さらに別の実施形態では、４℃または約４℃の適切な条件下で１年以内の貯蔵中、液体製剤の抗体活性の喪失は、約50％以下、約30％以下、約20％以下、約10％以下、あるいは約５％もしくは約１％以下である。抗体の活性は、それぞれの抗体について好適な抗原結合またはエフェクター機能アッセイにより決定することができる。別の好ましい実施形態では、液体製剤は、粘度および濁り度が低い。具体的実施形態では、液体製剤は、１℃〜26℃または約１℃〜約26℃の範囲内のあらゆる温度で10.00 cPまたは約10.00 cP以下の粘度を有する。粘度は、当分野では周知の多数の方法により決定することができる。例えば、ポリペプチド溶液の粘度はViscoLab 4000 Viscometer System（Cambridge Applied Systems）を用いて、測定することができ、これはViscoLab Piston（SN:7497, 0.355”, 1-20 cP）およびS6S Reference Standard（Koehler Instrument Company, Inc.）を備え、かつ水浴に接続されて、分析するサンプルの温度を調節する。所望の出発温度（例えば、２℃）のチャンバにサンプルを充填し、ピストンをサンプル中に下げる。サンプルをチャンバの温度まで平衡した後、測定を開始する。温度を所望の速度で所望の最終温度（例えば、≧25℃）まで上昇させる。そして時間経過による粘度を記録する。
【０２６６】
液体製剤は、１以上の賦形剤、例えば、サッカリド、アミノ酸（例えば、アルギニン、リシン、およびメチオニン）およびポリオールをさらに含むことが考えられる。液体製剤についてのその他の説明、調製および分析方法については、例えば、WO 03/106644；WO 04/066957；およびWO 04/091658（各々、参照として本明細書にその全文を組み込む）に記載されている。
【０２６７】
一実施形態では、本発明の製剤（例えば、液体製剤）は、内毒素および／または関連する発熱物質を実質的に含まない発熱物質非含有製剤である。内毒素とは、微生物の内部に閉じ込められ、該微生物が分解される、または死ぬとき、遊離する毒素を意味する。発熱物質はまた、細菌およびその他の微生物の外膜からの熱誘発性熱安定性物質（糖タンパク質）も含む。これら物質はいずれも、ヒトに投与すると、熱、低血圧およびショックを引き起こしうる。有害な作用が考えられるため、静脈内投与する医薬剤溶液から、たとえ低量であっても内毒素を除去するのが有利である。米国食品医薬品局（FDA）は、静脈内の薬剤適用の場合、１時間に体重１キログラム当たりの用量につき５内毒素単位（EU）の上限を定めている（The United States Pharmacopeial Convention, Pharacopeial Forum 26 (1):223（2000））。モノクローナル抗体の場合に考えられるように、体重１キログラム当たり数百から数千ミリグラムの量の治療タンパク質を投与する場合、微量の内毒素であっても除去するのが有利である。一実施形態では、組成物における内毒素および発熱物質レベルは、10 EU／mg以下、または５EU／mg以下、または１EU／mg以下、または0.1 EU／mg以下、または0.01 EU／mg以下、または0.001 EU／mg以下である。別の実施形態では、組成物における内毒素および発熱物質レベルは、約10 EU／mg以下、または約５EU／mg以下、または約１EU／mg以下、または約0.1 EU／mg以下、または約0.01 EU／mg以下、または約0.001 EU／mg以下である。
【０２６８】
必要とする被検者（例えば、ヒト）に投与しようとする１以上のFc変異体および／またはFc変異体融合物を含む製剤を、薬学的に許容される賦形剤で製剤化すべきであることは明らかであろう。本発明の製剤、特に医薬組成物の例として、限定するものではないが、PCT公開番号WO 02/070007；WO 04/066957およびWO 03/075957（各々、参照として本明細書にその全文を組み込む）に開示されているものが挙げられる。手短には、これらの製剤（例えば、液体製剤）に本発明のFc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質と一緒に含まれる賦形剤は、治療に用いる組成物の予想される投与経路に基づいて選択することができる。組成物の投与経路は、治療しようとする状態に応じて変わってくる。例えば、静脈内注射は、リンパ系癌または転移した腫瘍のような全身性疾患の治療に好ましいと考えられる。投与しようとする組成物の用量は、標準的用量応答試験と一緒に過度の実験を行なうことなく、当業者によって決定することができる。このような決定を実施する上で考慮すべき関連状況として、治療しようとする状態、投与しようとする組成物の選択、個々の患者の年齢、体重、および応答、ならびに患者の症状の重症度が挙げられる。例えば、実際の患者の体重を用いて、投与しようとする製剤における本発明のFc変異体および／または変異体Fc融合物の用量をミリリットル（mL）単位で計算することができる。「理想的」重量までの下方調節がないこともある。そのような状況では、以下の式により適切な用量を計算することができる：
用量（mL）＝［患者の体重（kg）×用量レベル（mg／kg）／薬剤濃度（mg／mL）］
状態に応じて、製剤を患者に経口、非経口、筋内、鼻内、膣内、直腸、舌、舌下、頬側、口腔内、静脈内、皮膚、皮下および／または経皮投与することができる。
【０２６９】
従って、当分野で周知の手段により、例えば、不活性希釈剤または食用担体を用いて、過度の実験を行なうことなく、経口、非経口、筋内、鼻内、膣内、直腸、舌、舌下、頬側、口腔内、静脈内、皮膚、皮下および／または経皮投与するための製剤を製造することができる。製剤は、ゼラチンカプセルに封入するか、または錠剤に圧縮することができる。経口治療投与の目的では、本発明の製剤に賦形剤を含有させ、錠剤、トローチ剤、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハース、チューイングガムなどの形態で使用することができる。
【０２７０】
また、錠剤、丸薬、カプセル、トローチ剤などに、結合剤、受容体、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、および／または香味料を含有させてもよい。結合剤の例として、微晶質セルロース、トラガカントおよびゼラチンが挙げられる。賦形剤の例として、デンプンおよびラクトースが挙げられる。崩壊剤の例として、アルギン酸、コーンスターチなどが挙げられる。滑沢剤の例として、ステアリン酸マグネシウムおよびステアリン酸カリウムが挙げられる。滑り剤の例は、コロイド状二酸化ケイ素である。甘味料の例として、ショ糖、サッカリンなどが挙げられる。香味料の例として、ハッカ、サリチル酸メチル、オレンジ香料などが挙げられる。このような各種製剤を製造するのに用いる材料は、使用する量で薬学的に純粋であり、かつ無毒でなければならない。
【０２７１】
本発明の医薬製剤は、例えば、静脈内、筋内、硬膜下腔内および／または皮下注射などにより、非経口投与することができる。非経口投与は、本発明の製剤を溶液または懸濁液に含有させることにより達成することができる。このような溶液または懸濁液として、滅菌希釈剤、例えば、注射用蒸留水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールおよび／またはその他の合成溶剤が挙げられる。非経口投与製剤には、抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールおよび／またはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸および／または亜硫酸水素ナトリウム；ならびにキレート剤、例えば、EDTAも含まれる。また、バッファー、例えば、酢酸、クエン酸およびリン酸バッファー；ならびに、等張性調節剤、例えば、塩化ナトリウムおよびデキストロースを添加してもよい。非経口投与製剤は、アンプル、使い捨て注射器および／またはガラスまたはプラスチック製の多用量バイアルに封入することができる。直腸投与は、直腸および／または大腸への製剤の投与を含む。これは、座薬および／または浣腸を用いて達成することができる。当分野で周知の方法により座薬製剤を製造することができる。経皮投与は、皮膚を通して製剤を経皮吸収させることを含む。経皮投与製剤として、パッチ、軟膏、クリーム、ゲル、軟膏剤などが挙げられる。本発明の製剤を患者に鼻内投与することができる。本明細書で用いる表現「鼻内投与（する）」とは、患者の鼻内経路および／または鼻腔の粘膜に製剤を投与することを含む。
【０２７２】
別の実施形態では、製剤（例えば、液体製剤）を皮下（すなわち、皮膚の下）投与により哺乳動物に投与する。この目的のために、注射器を用いて、製剤を注射することができる。しかし、製剤を投与するためのその他の装置を使用してもよく、そのような装置として、例えば、注射装置（例：Inject-easeおよびGenject device）、インジェクターペン（例：GenPen（商標））；自動インジェクター装置、針のない装置（例：MejiJectorおよびBioJector）；ならびに皮下パッチ送達系などが挙げられる。
【０２７３】
本発明の別の形態では、低速放出製剤を提供する。具体的実施形態では、低速放出製剤は、液体製剤を含む。低速放出製剤は、限定するものではないが、ポリマーナノまたは微粒子およびゲル（例えば、ヒアルロン酸ゲル）を含む多数の薬剤から製剤化することができる。利便性以外にも、低速放出製剤は、タンパク質薬剤の送達の場合、長時間にわたりタンパク質（例えば、Fc変異体および／または変異体Fc融合物）を分解または放出から保護し、また、タンパク質を特定の部位または身体区分に局所的に送達することよって全身への暴露を低減できるといった利点も提供する。
【０２７４】
本発明は、例えば、タンパク質（例えば、Fc変異体および／または変異体Fc融合物）を生物分解性ポリマーマトリックスに包理した注射可能な貯留物製剤も考慮する。用いることができるポリマーとして、限定するものではないが、乳酸およびグリコール酸のホモ−およびコ−ポリマー（PLGA）が挙げられる。PLGAは加水分解により分解し、最終的に酸性モノマーをもたらし、例えば、微小球の製造に用いる条件下で化学的に非反応性であるため、該タンパク質を変更することはない。皮下または筋内注射後、分散とポリマー分解を組み合わせてタンパク質を放出させる。様々な組成物および分子量のポリマーを用いることにより、加水分解速度を変動させ、放出を数日から数ヶ月持続させるさせることができる。別の形態では、本発明は、鼻内スプレー製剤を提供する。具体的実施形態では、鼻内スプレー製剤に本発明の液体製剤を含有させる。
【０２７５】
本発明の製剤は、本発明の方法に従い、癌、炎症性疾患および自己免疫疾患もしくはそれらの１以上の症状の予防、管理、治療もしくは改善のために用いることができる。一実施形態では、本発明の製剤は無菌であり、しかも、癌、炎症性疾患および自己免疫疾患、特にEph受容体仲介の疾患を有する被検者に対する特定の投与方法に適した形態をしている。
【０２７６】
本発明は、癌、炎症性疾患および自己免疫疾患（特にEph受容体仲介の疾患）もしくはそれらの１以上の症状を予防、管理、治療もしくは改善する方法を提供し、この方法は、以下のステップを含んでなる：（a）必要とする患者に、予防または治療に有効な量の、Eph受容体に免疫特異的に結合する１以上の本発明のFc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質を含む製剤を１用量投与し、（b）１用量以上の上記Fc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質を後に投与することにより、継続してEph受容体に免疫特異的に結合する上記Fc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質の血漿濃度を所望のレベル（例えば、約0.1〜約100μg／ml）に維持する。具体的実施形態では、上記Fc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質の血漿濃度を10μg／ml 、15μg／ml 、20μg／ml 、25μg／ml 、30μg／ml 、35μg／ml 、40μg／ml 、45μg／ml もしくは50μg／mlに維持する。具体的実施形態では、投与しようとする上記Fc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質の有効量は、１用量当たり、少なくとも１mg／kg〜100 mg／kgである。別の具体的実施形態では、投与しようとする上記Fc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質の有効量は、１用量当たり、少なくとも１mg／kg〜20 mg／kgである。別の具体的実施形態では、投与しようとする上記Fc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質の有効量は、１用量当たり、少なくとも４mg／kg〜10 mg／kgである。さらに別の実施形態では、投与しようとする上記Fc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質の有効量は、１用量当たり、50 mg／kg〜250 mg／kgである。さらにまた別の実施形態では、投与しようとする上記Fc変異体および／またはFc変異体融合タンパク質の有効量は、１用量当たり、100 mg〜200 mgである。
【０２７７】
本発明は、癌、炎症性および自己免疫疾患、特にEph受容体仲介の疾患の予防、治療、管理、改善、検出、モニタリングもしくは診断に使用するための、１以上のFcリガンド（例えば、FcγR、C1q）に対する結合親和性が変更され、かつADCCおよび／またはCDC活性が改変された、Eph受容体に免疫特異的に結合する１以上のFc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質であって、検出可能な薬剤、治療薬もしくは薬剤と結合または融合した上記Fc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質を１以上の容器に含むキットを提供する。
【０２７８】
本発明はまた、癌、炎症性および自己免疫疾患、特にEph受容体仲介の疾患の予防、治療、管理、改善、検出、モニタリングもしくは診断に使用するための、１以上のFcリガンド（例えば、FcγR、C1q）に対する結合親和性が変更され、かつADCCおよび／またはCDC活性が改変された、Eph受容体に免疫特異的に結合する、１以上のFc変異体および／または変異体Fc融合物を第１バイアルに含み、Eph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体以外の１以上の予防または治療薬を第２バイアルに含むキットを提供する。本発明はさらに、癌、炎症性および自己免疫疾患、特にEph受容体仲介の疾患の予防、治療、管理、改善、検出、モニタリングもしくは診断に使用するための、１以上のFcリガンド（例えば、FcγR、C1q）に対する結合親和性が変更され、かつADCCおよび／またはCDC活性が改変された、Eph受容体に免疫特異的に結合する１以上のFc変異体および／またはFc変異体融合物であって、治療薬もしくは薬剤と結合または融合した該Fc変異体および／またはFc変異体融合物を第１バイアルに含み、Eph受容体に免疫特異的に結合するFc変異体および／または変異体Fc融合タンパク質以外の１以上の予防または治療薬を第２バイアルに含むキットを提供する。上記キットはさらに、パッケージング材料および／または説明書を含む場合もある。
【実施例】
【０２７９】
７．実施例
以下に示す実施例を参照にしながら、本発明を説明する。これらの実施例は、説明の目的のために記載するにすぎず、本発明がこれら実施例に限定されると解釈すべきではない。むしろ本発明は、本明細書に記載する教示の結果明らかになるすべての変種を包含すると解釈すべきである。
【０２８０】
７．１  実施例１
抗体の新規Fc変異体の構築および発現
Fc- FcγRIIIβ複合体について入手可能な構造に関する情報に基づき、考えられるすべての単一突然変異を組み込む変性オリゴヌクレオチドを用いて、IgG1 Fc部分の推定FcγR接触残基の各々をランダムに突然変異させた。接触残基を４つの領域に分けた（RI：Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Pro238、Ser239；RII：Asp265、Ser267、Glu269；RII：Ser268およびRIV：Ala327、Leu328、Pro329、Ala330、およびIle332）。増幅およびライブラリー構築に用いるプライマーを表５に列挙する。scFv-Fcフォーマットに変換した抗体Vitaxin（商標）のIgG1をこの試験のモデルとして用いた。scFv-Fc を作製するために用いたVitaxin（商標）重および軽鎖の可変領域のDNAおよび対応アミノ酸配列を図１（それぞれパネルＡおよびＢ）に示す。次に、scFv-Fcを鋳型として利用し、Fc領域に単一突然変異を含む３つのFc突然変異ライブラリーを構築する。ライブラリーＩは、RI領域にすべての単一突然変異を含み；ライブラリーIIはRIIおよびRIII領域を含み；ライブラリーIIIはRIV領域を含む。オーバーラップPCR手法を用いて、突然変異を含む全Fc領域を合成した。
【表５】
2008510007.tif 000006
【０２８１】
2008510007.tif 000007
【０２８２】
2008510007.tif 000008
【０２８３】
７．１．１  材料と方法
Fcライブラリーの構築：FcライブラリーIを構築するために、プライマーMDAD-16、MDAD-2〜-6の等モル混合物、およびMDAD-20をPCR反応に用いた。PCR産物をゲル精製し、制限酵素Not I/Pciにより消化し、CMVプロモーターの制御下で発現ベクターpMIに結合させた。FcライブラリーIIを構築するために、RIIおよびRIII突然変異を組み込んだ２つのPCR産物を３：１のモル比で混合して、pMIベクターにクローン化した。プライマーMDAD-16、MDAD-17、MDAD-7〜-9の等モル混合物、およびMDAD-20を用いて、Fc領域を増幅することにより、RII突然変異を組み込み、また、プライマーMDAD-16、-18、-10および-20を用いて、Fc領域を増幅することにより、RIII突然変異を組み込んだ。FcライブラリーIIIについては、プライマーMDAD-16、MDAD-19、MDAD-11〜-15の等モル混合物、およびMDAD-20をPCR反応に用いた。
【０２８４】
トランスフェクション：３つのFcライブラリー（Ｉ、II、およびIII）のプラスミドをSal Iにより線状化し、エタノール沈降させた後、H2Oに再懸濁させた。50μgの各線状化ライブラリーDNAを個別に、エレクトロポレーションにより107個のNS0細胞にトランスフェクションした。エレクトロポレーション後、30 mlの増殖培地（グルタミンを含まないIMDM、１×GS助剤および２mM L-グルタミン）を含む試験管に上記細胞を移し、様々な希釈度で96-ウェルプレート（50μl／ウェル）に接種した。５％CO2を含む高湿空気中で細胞を37℃で培養した。
【０２８５】
安定トランスフェクションの選択：トランスフェクションから18〜24時間後、選択培地（増殖培地と同じだが、グルタミンを含まない）に移すことにより、scFv-Fc突然変異体を発現する、安定してトランスフェクションしたNSO細胞の選択を開始した。培地を毎週２回全量の半分交換した。２〜３週間のインキュベーション後、培養上清を回収し、抗体発現についてスクリーニングした。
【０２８６】
scFv-Fc変異体の精製：scFv-Fc突然変異体を含む培養上清を、プロテインＡスピンクロマトグラフィーキットを用いて、製造者のプロトコル（Pierce）に従い精製した。結合scFv-Fc突然変異体を0.1 Mクエン酸バッファーで溶離した後、PBS中で透析した。SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、すべてのタンパク質を分析し、抗ヒトIgGアッセイプレート（Becton Dickson）またはBCAキット（PIERCE）を用いて、上記タンパク質を定量ELISAに付すことにより、scFv-Fc濃度を決定した。
【０２８７】
ELISAによる抗体の定量：Fc変異体の発現レベルを決定するために、抗ヒトIgGをコートしたマイクロプレート（Becton Dickson）を用いた。培養上清を１：10および１：100の希釈でウェルに添加した。室温で１時間のインキュベーション後、プレートをPBST（PBS＋0.1％Tween 20）で洗浄し、１：60,000希釈で抗ヒトIgG（Pierce）と一緒にさらに１時間室温でインキュベートした。TME基質（Pierce）によりシグナルを検出し、450 nmでELISA読取り装置により測定した。pMIベクターに発現させた精製親Vitaxin（商標）scFv-Fcを標準として用いた（0.003μg〜10μg／mlの連続した希釈で）。
【０２８８】
７．２  実施例２
FcγRIIIAおよびFcγRIIBの細胞外ドメインの構築および発現
Fc変異体とFcγRの結合試験を容易にする目的で、大腸菌におけるストレプトアビジン融合タンパク質としての発現と、哺乳動物細胞における発現のためにFcγRIIIAおよびFcγRIIBの細胞外ドメインをサブクローン化した。分析のために作製したFcγRIIIAは低親和性（F158）アロタイプである。FcγRIIIAおよびFcγRIIBの２つの形態：ストレプトアビジン融合物として作製した「四量体」と、フラグ−タグとして作製した「モノマー」を作製した。
【０２８９】
７．２．１ 材料および方法
FcγRIIIAおよびFcγRIIBストレプトアビジン融合タンパク質（四量体）の細胞外ドメインの構築と細菌発現：プライマー対SA1／SA2、A1／A2、およびB1／B2（プライマーリストを参照、表５）を用いて、ストレプトアビジンと、FcγRIIIAおよびFcγRIIBの細胞外ドメインをそれぞれPCR増幅した。ヒト骨髄（Clontech）のcDNAライブラリーをFcγRIIIAおよびFcγRIIB増幅の鋳型として用い、Streptomyces avidiniiのゲノムDNAをストレプトアビジン増幅の鋳型として用いた。オーバーラップPCRを用いて、FcγRIIIA−ストレプトアビジンおよびFcγRIIB−ストレプトアビジンの融合遺伝子を集合させた。融合遺伝子を制限酵素Nco I／Nhe Iにより消化し、発現ベクターpET-28aにクローン化した。C. Gaoら（1997, PNAS USA 94:11777-82）に記載されているように、融合タンパク質を封入体として発現させ、透析により再生することにより、ゆっくりと尿素を除去した。再生した融合タンパク質を免疫ビオチンカラム（PIERCE）により、製造者の指示に従って精製した。
【０２９０】
FcγRIIIAおよびFcγRIIB（モノマー）の細胞外ドメインの構築と哺乳動物発現：FcγRIIIAおよびFcγRIIBの細胞外ドメインをヒト骨髄のcDNAライブラリー（Clontech）から、それぞれプライマーEA1／EA2およびEB1／EB2を用いてPCR増幅した（図５のプライマー一覧を参照）。PCR産物をXba I／Not Iにより消化し、CMVプロモーターの制御下で、哺乳動物細胞発現ベクターpMI226にクローン化することにより、FcγRIIIAおよびFcγRIIBの細胞外ドメインが、Ｃ末端でHis6タグ、次にFLAGタグで標識されたタンパク質を作製した。リポフェクタミン2000トランスフェクション試薬（Invitrogen）により、プラスミドDNAを一時的に293H細胞にトランスフェクションした。９日以内に３度の回収後、培養上清を抗FLAG M2アガロースカラム（Sigma）に通過させることによりタンパク質を精製した。カラムからFLAG標識FcγRIIIA／IIBタンパク質を溶離し、PBSに対して透析した。
【０２９１】
７．３  実施例３
Fc変異体の特性決定
Fcドメインの突然変異誘発（前記実施例１参照）後、以下に詳述するように、ELISAにより、scFv-FcフォーマットのFc変異体をFcγRIIIA四量体に対する結合増強についてスクリーニングした。数個のクローンについての結果を図５に示す。加えて、これらクローンのADCC活性をM21細胞に対して決定する。数個のクローンの結果を図６に示す。これらの試験に基づき、さらなる試験のために次の３つの置換を選択した：S239D、A330LおよびI332E。これら置換をインタクトなVitaxin（登録商標）IgG1重鎖のFc領域に導入し、Vitaxin（登録商標）軽鎖と共発現させることにより、全長Vitaxin（登録商標）Fc変異体IgG1分子を作製した。I332E置換を有するVitaxin（登録商標）Fc変異体をVitaxin（登録商標）-1Mと称し、３つの置換S239D、A330LおよびI332Eを有するVitaxin（登録商標）Fc変異体をVitaxin（登録商標）-3Mと称する。
【０２９２】
標準的20アミノ酸からなる各々を332位で置換したIgGフォーマットのVitaxin（登録商標）Fc変異体のパネルを作製した。これらの変異体を特性決定した。図7Aは、ELISAにより決定したこれらFc変異体のFcγRIIIAとの相対結合を示す。これらの条件下で、I332T、I332L、I332Fを含む数個の置換が結合増強を示し、最も著しいのがI332Eであるのがわかる。しかし、図7Bに示すように、ADCC活性に同様の増加を示したのはI332E置換だけであった。
【０２９３】
FcγRIIIAおよびFcγRIIB に対するVitaxin（登録商標）とVitaxin（登録商標）の１Fc変異体（I332E；Vitaxin-1M）についての代表的結合曲線を図8Aおよび8Bにそれぞれ示す。Vitaxin（登録商標）は、２つの細胞供給源、NSOおよびHEK293細胞から作製したが、これら２つのVitaxinの供給源の結合に差は認められなかった。次に、HEK293細胞からVitaxin（登録商標）Fc変異体を作製した。Vitaxin（登録商標）Fc変異体は、ELISAにより決定した結果、FcγRIIIAに対する結合親和性に約2.5倍の増加を示した（図8A）が、FcγRIIBに対する結合には、対応する変化はみられなかった（図8B）。
【０２９４】
FcγRIIIAと Vitaxin（登録商標）およびVitaxin（登録商標）Fc変異体の結合をBIAcore分析によりさらに分析した。Vitaxin（登録商標）およびVitaxin（登録商標）Fc変異体の結合は、可溶性受容体および固定抗体を用いて分析した（以下に示す方法を参照）。Vitaxin-1M Fc変異体の結合親和性は、親野生型Vitaxin抗体と比較して、およそ７倍増加しているのがわかった。また、FcγRIIIAに対するVitaxin-3M Fc変異体の相互作用をBIAcore分析により分析したところ、その結合親和性は約114 nMであり、親野生型Vitaxin抗体のそれより80倍近く優れていることがわかった。結果を表６にまとめる。
【表６】
2008510007.tif 000009
【０２９５】
M21細胞に対するADCCアッセイで、Vitaxin-1M Fc変異体の特性決定をさらに実施した。最初に、標的とエフェクター細胞の比を50：１に一定に維持し、２つの抗体の濃度を0.4〜1,000 ng／mlまで変化させた（図９）。次に、抗体の濃度を標的とエフェクター細胞の様々な比（6.25：１、12.5：１、25：１および50：１）について変化させた（図10）。両方のアッセイで、Vitaxin-1M Fc変異体（I332E）のADCC活性は、親野生型Vitaxin（登録商標）抗体のそれより約３倍高かった。
【０２９６】
また、様々なレベルのインテグリンαVβ3（図11）を発現する標的細胞に対するADCCアッセイで、Vitaxin-3M Fc変異体の特性決定を行なった。用いた標的細胞系はM21（高発現細胞）、DU145（低発現細胞）、A498およびACHN（中発現細胞）であった。標的とエフェクター細胞の２つの異なる比（50：１および25：１）と、１ウェル当たり４〜400 ngの抗体濃度を用いてアッセイを実施した。すべてのケースで、Vitaxin-3M Fc変異体のADCC活性は、野生型Vitaxin（登録商標）より高いことが認められた。Vitaxin-3M Fc変異体はまた、インテグリンαVβ3を発現するSKMEL28標的細胞に対し、野生型Vitaxin（登録商標）抗体と比較して高いADCC活性を有することもわかった（図18）。
【０２９７】
７．３．１  材料と方法
ELISA受容体結合アッセイ：マイクロプレートにプロテインＡ／Ｇ（PIERCE）溶液（0.25μg／ml）をコートし、４℃で一晩インキュベートした。残っている結合部位をすべて４％脱脂乳でブロックした。１ウェル当たり約25μlの突然変異抗体溶液を各ウェルに添加し、37℃で１時間インキュベートした。洗浄後、FcγRIIIA−ストレプトアビジンまたはFcγRIIB−ストレプトアビジン融合タンパク質（１％BSA）を37℃で１時間添加した後、洗浄し、ビオチン結合HRPに30分付した。30μlのテトラメチルベンジジン基質（Pierce）を添加した後、30μlの0.2 M H2SO4で中和した。吸光度を450 nmで測定した。
【０２９８】
332アミノ酸置換の作製：QuikChange（登録商標）II XL部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene、サンディエゴ）を用いて、プラスミドpMI331において野生型Vitaxin（登録商標）の重鎖をコードする遺伝子の332位にすべてのアミノ酸置換を実施した（図４）。Vitaxinを鋳型として用いて、オリゴ１〜19（表５）を使用することにより、イソロイシンを332位ですべて別の19個の異なるアミノ酸に置換した。さらに、DNA配列決定により突然変異を確認した。
【０２９９】
リポフェクタミン2000トランスフェクション試薬（Invitrogen）により、抗体遺伝子を含むプラスミドDNAを一時的に293H細胞にトランスフェクションした。９日以内に３度回収した後、プレパックプロテインAカラム（Amersham Biosciences；現在はGE healthcareに属す）を用いて、抗体を含む培養上清をアフィニティー精製した。結合抗体を溶出バッファー（100 mMグリシン、pH3.2）で溶離し、１Mトリスバッファー（pH8.0）により中和した後、PBS中で透析した。精製した全抗体をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析すると共に、抗ヒトIgGアッセイプレート（Becton Dickson）またはBCAキット（PIERCE）を用いた定量ELISAに充填し、IgG濃度を決定した。
【０３００】
Vitaxin（登録商標）-1M および3MFc変異体の作製：プラスミドpMI331において野生型Vitaxin（登録商標）の重鎖をコードする遺伝子の部位特異的突然変異誘発（前記の通り）によりI332E置換を作製した（図４参照）。突然変異体I332EをVitaxin 1Mと称する。さらに、プライマーとしてオリゴ20および21（表５参照）を、また鋳型としてVitaxin 1Mを用いて、２つの連続的部位特異的突然変異誘発（前記の通り）によりVitaxin 3Mを作製した。1M および3M Vitaxin（登録商標）Fc変異体の発現および精製を前記と同様に実施した。
【０３０１】
BIAcoreによる速度論的分析：ラン１では、BIAcore 3000装置（Pharmacia Biosensor；スエーデンUppsalsa）を用いた表面プラスモン共鳴検出により、固定化Vitaxin（登録商標）およびVitaxin（登録商標）Fc変異体IgGとFcγRIIIAの相互作用をモニタリングした。7,700〜9,400 RU（表６参照）の表面密度で、記載されている（Johnssonら、1992, Anal Biochem 198:268-277）ように、アミン結合キットを用いて、Vitaxin（登録商標）およびVitaxin（登録商標）Fc変異体IgGをCM5センサーチップ（Pharmacia Biosensor）のデキストランマトリックスに結合させた。0.15 M NaCl、3 mM EDTAおよび0.005％P20を含む0.01 M HEPES pH7.4にFcγRIIIAを連続的に、２μM〜7.8 nMまでの濃度で希釈した。各濃度の注入を２回繰り返した。結合実験はすべて、温度25℃、流量10μL／分で実施した。結合を25分モニターした。毎回FcγRIIIAを注入した後、30秒パルスの５mM HClでIgG表面を再生させた。IgG含有フローセルに連続的に結合させたブランク基準細胞にもIgG表面を通過させた。また、定常状態結合曲線も、バッファー注入を減じることにより注入人工産物について修正した。この二重修正データを、装置製造者（Pharmacia Biosensor；スエーデンUppsalsa）提供の定常状態等温式に適用することにより、それぞれの平衡結合定数（KD）を導き出した。これとは別に、各IgG表面から得たReqデータのスキャッチャードプロットを作成し、結合等温式の結果を確認した。
【０３０２】
ラン２では、BIAcore 3000装置（Pharmacia Biosensor；スエーデンUppsalsa）を用いた表面プラスモン共鳴検出により、固定化Vitaxin（登録商標）およびVitaxin（登録商標）Fc変異体IgGとFcγRIIIAの相互作用をモニターした。約8,200〜9,400 RU（表６参照）の表面密度で、記載されている（Johnssonら、1992, Anal Biochem 198:268-277）ように、アミン結合キットを用いて、Vitaxin（登録商標）およびVitaxin（登録商標）Fc変異体IgGをCM5センサーチップ（Pharmacia Biosensor）のデキストランマトリックスに結合させた。0.15 M NaCl、3 mM EDTAおよび0.005％P20を含む0.01 M HEPES pH7.4にFcγRIIIAを連続的に、16μM〜7.8 nMまでの濃度で希釈した。各濃度の注入を２回繰り返した。結合実験はすべて、温度25℃、流量10μL／分で実施した。結合を25分モニターした。毎回FcγRIIIAを注入した後、30秒パルスの５mM HClでIgG表面を再生させた。IgG含有フローセルに連続的に結合させたブランク基準細胞にもIgG表面を通過させた。また、定常状態結合曲線も、バッファー注入を減じることにより注入人工産物について修正した。この二重修正データを、装置製造者（Pharmacia Biosensor；スエーデンUppsalsa）提供の定常状態等温式に適用することにより、それぞれの平衡結合定数（KD）を導き出した。これとは別に、各IgG表面から得たReqデータのスキャッチャードプロットを作成し、結合等温式の結果を確認した。
【０３０３】
抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）アッセイ：抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）を４時間非放射性乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）放出アッセイ（Promega Corporation；ウィスコンシン州マディソン）でアッセイした。手短には、M21、A549、もしくはH358標的細胞を96ウェルのＵ型底プレート（１×104／50μl）に配分し、一連の抗体希釈液（50μl）と一緒に37℃で20分、前インキュベートした。次に、ヒトエフェクター細胞（100μl）を50：１〜25：１のエフェクター：標的比で添加した。ヒトエフェクター細胞は、リンパ球分離培地（MP Biomedicals；カリフォルニア州アービン）を用いて、健康なドナーから精製した末梢血液単核細胞（PBMC）であった。37℃で４時間のインキュベーション後、プレートを遠心分離し、30分の結合酵素アッセイを用いて、細胞上清へのLDHの放出を測定することにより、細胞死を分析した。次の式に従い、比溶解の百分率を計算した：％比溶解＝100×（Ex−Espon−Tspon）／（Ｔmax−Tspon）（式中、Exは、実験ウェルからの放出を示し、Esponは、エフェクター細胞だけの自然放出であり、Tsponは、標的細胞だけの自然放出であり、Ｔmaxは、溶解した標的細胞からの最大放出である）。
【０３０４】
ADCC試験に用いた細胞系は以下のものを含む：A498およびACHIN（インテグリンαVβ3の発現が中程度の腎細胞癌）、M21（インテグリンαVβ3発現が高レベルの黒色腫細胞）、DU145（インテグリンαVβ3の発現が低レベルの前立腺癌細胞系）、SKMEL28（インテグリンαVβ3を発現するが、ヒトEphA2はほとんどまたは全く発現しないヒト黒色腫細胞）。
【０３０５】
７．４  実施例４
その他のエピトープを認識する抗体のFc変異体
Vitaxin（登録商標）Fc変異体のADCC活性の顕著な改善を仮定して、12G3H11（12G3と略す）および3F2と称する２つの別の抗体に（I332E）置換を実施するが、これらは共にEphA2チロシン受容体キナーゼと結合する。12G3（図2A）および3F2（図3A）重鎖の可変領域を、前述のように作製した（第７．１および７．３節参照）wtおよび変異体Fcドメインに融合した。Vitaxin（登録商標）の軽鎖の可変領域を、対応する軽鎖可変領域（すなわち、12G3または3F2、例えば、ぞれぞれ図2Bおよび3B参照）で置換し、プラスミドによりインタクトな12G3または3F2抗体をコードした（Vitaxin（登録商標）をコードするプラスミドのマップについては図４を参照）。上記単一置換を含む抗体をそれぞれ12G3-1Mおよび3F2-1Mと称する。加えて、3F2にS239D、A330L、I332L三重置換を作製し、これを3F2-3Mと称する。
【０３０６】
数個のFcリガンドに対する3F2-wt、3F2-1Mおよび3F2-3M変異体の結合特性をELISAによりin vitroで調べた（図12）。FcγRIIIA四量体（図12、上のパネル）、FcγRIIIAモノマー（図12、中央のパネル）およびC1q（図12、下のパネル）に対する3F2および3F2のFc変異体（3F2-1Mおよび3F2-3M）の代表的結合曲線を示す。これらのデータから、両方の3F2 Fc変異体ともに、FcγRIIIAのモノマーおよび四量体形態に対する結合が改善していることがわかる。対照的に、3F2 Fc変異体はC1q結合が低下し、3F2-3MはC1q結合の低下が最大であった（図12、下のパネル）。
【０３０７】
FcγRIIIAと 3F2および3F2 Fc変異体の結合をBIAcore分析によりさらに分析した。3F2および3F2 Fc変異体の結合は、可溶性受容体および固定抗体を用いて分析した（以下に示す方法を参照）。3F2および3F2 Fc変異体について得られた結果（ラン３）は、Vitaxin（登録商標）およびVitaxin（登録商標）Fc変異体について得られたもの（ラン１および２）（Vitaxin（登録商標）1Mおよび3M Fc変異体では約７倍および80倍の結合改善）と類似しており、3F2および3F2 Fc変異体の場合、それぞれ約９倍および100倍であった。可変ドメインは一般にFcγRIIIA結合に影響を与えると考えられていないため、上記数値間の小さな差は、239H細胞対NSO細胞で生産された抗体（それぞれ、Vitaxin抗体および3F2抗体）間のグリコシル化のわずかな差を表すと思われる。結果を表６にまとめる。
【０３０８】
Fcリガンド相互作用を介した細胞表面への3F2-wt、3F2-1Mおよび3F2-3M Fc変異体の結合を調べた。２つの細胞型：THP-1細胞およびNK細胞を用いた。表面にどのFcリガンドが存在するかを決定するために、両細胞型をCD32(FcγRII)；CD64(FcγRI)もしくはCD16(FcγIII)を認識する抗体で染色した後、FACSで分析した。各Fcリガンドについて陽性の細胞染色の百分率を図13に表示する。図14パネルＡからわかるように、THP-1細胞は、CD32を主に発現し、細胞表面に存在するCD64は少量である。対照的に、NK細胞はほぼCD16だけを発現する（図13、パネルＢ）。3F2の３つの変異体（wt、1Mおよび3M）はすべて、同程度でTHP-1細胞に結合した。しかし、２つのFc変異体（3F2-1Mおよび3F2-3M）は、NK細胞に、より大きい程度で結合し、3F2-3M Fc変異体が結合に最大の増加を示した（図13、パネルＤ）。
【０３０９】
すべての変異体のADCC活性を調べた、図14Aおよび14Bに、２人の供与者由来のエフェクター細胞を用いて、A549標的細胞に対し、12G3H11-Fc（I332E）変異体および親12G3H11抗体を用いて実施したADCC活性を示す。アッセイは、標的：エフェクターの２つの異なる比（50：１および25：１）と、１ウェル当たり４〜400 ngの抗体濃度を用いて実施した。顕著にも、親抗体と比較して、12G3H11-Fc（I332E）変異体のADCC活性に10倍の増加が認められる。
【０３１０】
図15、16および17は、様々なレベルのEphA2を発現する標的細胞に対する3F2-wtおよび3F2 Fc変異体の活性を比較するADCCアッセイを示す。用いた標的細胞は、T23,1 A549およびHey8（高発現細胞）、SKOV3（中発現細胞）、A498およびSKMEL28（低発現細胞）であった。標的：エフェクター細胞の３つの異なる比（12.5：１〜100：１）と、0.02〜２μg／mlの抗体濃度を用いてアッセイを実施した。すべてのケースで、3F2-3M Fc変異体のADCC活性は、野生型3F2より高いことが認められた。3F2-1M Fc変異体の活性も3F2-wtより高かった。
【０３１１】
７．４．１  材料と方法
12G3および3F2 Fc変異体の作製：12G3および3F2 Fc変異体を作製するために、Xba I/Apa I制限部位（図４のプラスミドマップを参照）を用いて、Vitaxin（登録商標）1Mまたは3M重鎖（VH）の可変領域をコードするDNA配列を12G3または3F2重鎖の可変領域で置換することにより、12G3-1M、3F2-1Mおよび3F2-3M Fc変異体を作製した。また、SmaI／BsiWI制限部位（図４のプラスミドマップを参照）を用いて、Vitaxin（登録商標）軽鎖の可変領域をコードするDNA配列を12G3または3F2軽鎖の可変領域で置換した。12G3重および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号62および63として記載する。12G3重および軽鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号64および65として記載する。3F2重および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号66および67として記載する。3F2重および軽鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号68および69として記載する。
【０３１２】
リポフェクタミン2000トランスフェクション試薬（Invitrogen）により、12G3抗体遺伝子を含むプラスミドDNAを安定的に293H細胞にトランスフェクションした。3F2抗体遺伝子を含むプラスミドDNAは、エレクトロポレーションにより安定的にNSOにトランスフェクションした。プレパックプロテインＡカラム（Amersham Bioscience；現在はGE healthcareに属す）を用いて、細胞培養上清から抗体を精製した。結合抗体を溶出バッファー（100 mMグリシン、pH3.2）で溶離し、１Mトリスバッファー（pH8.0）により中和した後、PBS中で透析した。精製した全抗体をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析すると共に、抗ヒトIgGアッセイプレート（Becton Dickson）またはBCAキット（PIERCE）を用いた定量ELISAに付してIgG濃度を決定した。
【０３１３】
BIAcoreによる速度論的分析：ラン３では、BIAcore 3000装置（Pharmacia Biosensor；スエーデンUppsalsa）を用いた表面プラスモン共鳴検出により、固定化Vitaxin（登録商標）およびVitaxin（登録商標）Fc変異体IgGとFcγRIIIAの相互作用をモニターした。約7,700〜9,400 RU（表６参照）の表面密度で、記載されている（Johnssonら、1992, Anal Biochem 198:268-277）ように、アミン結合キットを用いて、Vitaxin（登録商標）およびVitaxin（登録商標）Fc変異体IgGをCM5センサーチップ（Pharmacia Biosensor）のデキストランマトリックスに結合させた。0.15 M NaCl、3 mM EDTAおよび0.005％P20を含む0.01 M HEPES pH7.4にFcγRIIIAを連続的に、16μMから7.8 nMまでの濃度で希釈した。各濃度の注入を２回繰り返した。結合実験はすべて、温度25℃、流速10μL／分で実施した。結合を25分モニタリングした。毎回FcγRIIIAを注入した後、30秒パルスの５mM HClでIgG表面を再生させた。IgG含有フローセルに連続的に結合させたブランク参照細胞にもIgG表面を通過させた。また、定常状態結合曲線も、バッファー注入を減じることにより注入人工産物について修正した。この二重修正データを、装置製造者（Pharmacia Biosensor；スエーデンUppsalsa）が提供する定常状態等温式に適用することにより、それぞれの平衡結合定数（KD）を導き出した。これとは別に、各IgG表面から得たReqデータのスキャッチャードプロットを作成し、結合等温式の結果を確認した。
【０３１４】
細胞表面結合：Miltenybiotec製のNK細胞単離キット（カタログ# 130-091-152）THP-1を用いて、健康な供与者からNK細胞を単離した：THP-1細胞の初期継代を使用した。FcγRのFACS染色のために、THP-1またはヒトNK細胞を１×106細胞／mlでFACSバッファー（PBS中１％BSA、pH7.2）に懸濁させ、0.5 mlの細胞を96ディープウェルプレートに移し、10μlの抗CD32-PE（Immunotech）、抗CD16-FITC（Pharmingen）または抗CD64-FITC（Pharmingen）を試験管に添加した。サンプルを40℃で30分インキュベートした。インキュベーション後、細胞をFACSバッファーで洗浄した。Guava EasyCyteを用いて、サンプルを分析した。
【０３１５】
抗体3F2とヒトNK細胞表面（FcγRIIIA）の結合のために、10μlの抗体希釈液（10μg／mlまたは１μg／ml）を細胞に添加し、４℃で30分インキュベートした。細胞をFACSバッファーで洗浄してから、ヤギ抗ヒトIgG(H+L)-FITC（Pierce）で30分４℃にて染色した。細胞を洗浄し、Guava EasyCyteで分析した。
【０３１６】
抗体3F2とTHP-1細胞表面（FcγRIおよびFcγRII）の結合のために、10μlの抗体希釈液（10μg／mlまたは１μg／ml）を細胞に添加し、４℃で30分インキュベートした。細胞をFACSバッファーで洗浄してから、ヤギ抗ヒトIgG(H+L)-FITC（Pierce）で30分４℃にて染色した。細胞を洗浄し、Guava EasyCyteで分析した。
【０３１７】
FcγRIIIA 四量体結合のためのELISA：マイクロプレートにプロテインＡ／Ｇ（PIERCE）溶液（0.25μg／ml）をコートし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをPBS／0.1％Tweenで洗浄し、残留結合部位をすべて１％BSAで遮断した。50μlの１：１希釈（5,000 ng／ml〜4.9 ng／ml）の試験抗体を各ウェルに添加し、37℃で60分インキュベートした。50μlの１：500希釈のFcγ四量体を各ウェルに添加し、37℃で60分インキュベートした後、洗浄した。50μlの１：1,000希釈のビオチン結合HRP（PIERCE）を各ウェルに添加した後、37℃で30分インキュベートした。30μlのテトラメチルベンジジン（TMB）基質（Pierce）を添加することにより検出を実施した後、30μlの0.2 M H2SO4で中和した。吸光度を450 nmで測定した。
【０３１８】
FcγRIIIA モノマー結合のためのELISA：マイクロプレートに、濃度が20μg／ml〜0.0019μg／ml の試験抗体50μlをコートし、４℃で一晩インキュベートした。50μlの10μg／ml FcγRIIIA-フラグタンパク質を各ウェルに添加し、37℃で60分インキュベートした。50μlの2.5μg／ml抗フラグ-ME-ビオチン（Sigma）を各ウェルに添加し、37℃で30分インキュベートした。50μlの１：1,000希釈のビオチン結合HRP（PIERCE）を各ウェルに添加した後、37℃で30分インキュベートした。30μlのテトラメチルベンジジン（TMB）基質（Pierce）を添加することにより検出を実施した後、30μlの0.2 M H2SO4で中和した。吸光度を450 nmで測定した。
【０３１９】
C1q結合のためのELISA：マイクロプレートに、濃度が20μg／ml〜0.0019μg／ml の試験抗体50μlをコートし、４℃で一晩インキュベートした。次に、37℃にて５％無脂肪粉乳でプレートを60分ブロックした。50μlの５μg／mlヒトC1q補体タンパク質（Quidal；サンディエゴ）を各ウェルに添加し、37℃で60分インキュベートした。50μlの１：1000希釈の抗補体C1q抗体（Biodesign）を各ウェルに添加し、37℃で60分インキュベートした。50μlの１：1,000希釈のロバ抗ヒツジ／ヤギ抗体結合HRP（PIERCE）を各ウェルに添加した後、37℃で60分インキュベートした。30μlのテトラメチルベンジジン（TMB）基質（Pierce）を添加することにより検出を実施した後、30μlの0.2 M H2SO4で中和した。吸光度を450 nmで測定した。
【０３２０】
抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）アッセイ：様々な標的細胞を用いて、抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）を第７．３．１節に記載したようにアッセイした。このアッセイに用いた標的細胞系は以下のものである：A549（高レベルのヒトEphA2を発現するヒト非小細胞肺腺癌細胞系）、T231（インディアナ大学医学センターの協力者、Kathy Millerから取得した、高レベルのヒトEphA2を発現する、MDA-MB-231ヒト乳腺癌細胞系の転移性の高い変異体、HeyA8（高レベルのヒトEphA2を発現するヒト卵巣腺癌）、SKOV3（中レベルのヒトEphA2を発現する腹水由来のヒト卵巣腺癌）、A498（低レベルのヒトEphA2を発現するヒト腎細胞癌）、SKMEL28（インテグリンαVβ3を発現するが、ヒトEphA2はほとんどまたは全く発現しないヒト黒色腫）。
【０３２１】
以上、本発明の具体的実施形態を説明の目的で記載してきたが、当業者には、添付の請求項に記載する本発明の範囲を逸脱することなく、具体的事項の様々な変更が可能であることは理解されよう。
【０３２２】
本明細書に記述した刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許および特許出願が具体的かつ個別に参照として本明細書に組み込まれると示されているのと同じ範囲まで、参照として本明細書に組み込むものとする。加えて、米国仮出願番号：60/601,634（2004年８月16日出願）および60/608,852（2004年９月13日出願）ならびに、”Integrin Antatonists With Enhanced Antibody Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity Activity”と題する米国出願（代理人事件整理番号：AE701US、2005年８月15日出願）は参照としてその全文を本明細書に組み込むものとする。
【図面の簡単な説明】
【０３２３】
【図１】抗体Vitaxin（登録商標）の可変領域のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列：（Ａ）重鎖可変領域（それぞれ配列番号１および配列番号３）；（Ｂ）軽鎖可変領域（それぞれ配列番号２および配列番号４）を示す。CDRに下線を引く。
【図２】抗EphA2抗体12G3H11（12G3と略す）の可変領域のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列：（Ａ）重鎖可変領域（それぞれ配列番号62および配列番号64）；（Ｂ）軽鎖可変領域（それぞれ配列番号63および配列番号65）を示す。CDRに下線を引く。
【図３】抗EphA2抗体3F2の可変領域のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列：（Ａ）重鎖可変領域（それぞれ配列番号66および配列番号68）；（Ｂ）軽鎖可変領域（それぞれ配列番号67および配列番号69）を示す。CDRに下線を引く。
【図４】全長IgGの作製に用いる発現プラスミドのマップを示す。SmaI／BsiWI制限部位を用いて、軽鎖可変領域をクローン化し、XbaI／ApaI制限部位を用いて重鎖可変領域をクローン化し、ApaI／NotI制限部位を用いて、重鎖の定常領域を置換する。
【図５】ELISAにより決定した、親scFv-Fcと比較したFcγRIIIAとの相対結合を特徴付けることによるVitaxin Fc変異体クローンのスクリーニングを示す。多数のクローンが改善された結合を有することがわかった。
【図６】細胞ベースアッセイにより決定したM21細胞に対する数個のVitaxin Fc変異体クローンの相対ADCC活性を示す。数個のFc変異体（I332Eを含む）が、親scFv-Fcより改善されたADCC活性を示した。
【図７】Vitaxin の332位で20個のアミノ酸をすべて置換した。FcγRIIIAに対する各332位Fc変異体での相対結合親和性をELISAにより決定した（パネルＡ）。各332位Fc変異体の相対ADCC活性を細胞ベースアッセイにより決定した（パネルB）。I332E Fc変異体は、結合およびADCC活性の両方で最も大きく改善されていることがわかった。
【図８】ELISAにより決定した、FcγRIIIA（Ａ）およびFcγRIIB（Ｂ）に対するVitaxin（登録商標）およびI332E（Vitaxin-1M）Fc変異体の結合を示す。FcγRIIIAに対するVitaxin-1M Fc変異体の結合は改善されているが、FcγRIIBに対する結合は変わらないことがわかる。
【図９】0.4〜1,000 ng／mlの様々な抗体濃度で、50：１のエフェクター：標的細胞比を用いた、Vitaxin（登録商標）およびI332E（Vitaxin-1M）Fc変異体の細胞ベースADCCアッセイ。I332EFc変異体は、広範な抗体濃度にわたり高いADCC活性を呈示する。
【図１０】１ウェル当たり様々な量2.5 ng〜200 ngの抗体で、エフェクター：標的細胞の様々な比を用いた、Vitaxin（登録商標）およびI332E（Vitaxin-1M）Fc変異体の細胞ベースADCCアッセイを示す。I332E Fc変異体は、すべてのＥ：Ｔ比で広範な抗体濃度にわたり高いADCC活性を呈示する。
【図１１】２つの異なるＥ：Ｔ比、および１ウェル当たり４ng〜400 ngの抗体量を用いて、様々なレベルのインテグリンαVβ3、A498（中）、DU145（低）、M21（高）およびACHN（中）を発現する数種の標的細胞系に対するVitaxin（登録商標）およびVitaxin S239D／A330L／I332E（Vitaxin-3M）Fc変異体の細胞ベースADCCアッセイを示す。すべてのケースで、S239D／A330L／I332E（Vitaxin-3M）Vitaxin Fc変異体が高いADCC活性を呈示する。
【図１２】FcγRIIIA四量体（パネルＡ）、FcγRIIIAモノマー（パネルＢ）およびC1q（パネルＣ）に結合する野生型抗EphA2抗体3F2および3F2 I332E（3F2-1M）および3F2 S239D／A330L／I332E（3F2-3M）Fc変異体のELISA分析を示す。3F2-1Mおよび3F2-3M Fc変異体は FcγRIIIAモノマーおよび四量体によく結合するが、3F2-3M Fc変異体は、野生型抗体または3F2-1M Fc変異体に比べて、相当よくモノマーに結合する。対照的に、3F2-1Mおよび 3F2-3M Fc変異体は野生型抗体よりもC1q結合が弱く、3M Fc変異体が最大の結合低下を示している。
【図１３】Fcドメイン相互作用による細胞と抗EphA2抗体3F2-WT、3F2-1Mおよび 3F2-3Mの結合のFACS分析。THP-1およびNK細胞を、FcγRI、FcγRIIおよびFcγRIIIに対する抗体（一般にそれぞれCD64、CD32およびCD16とも呼ぶ）で染色した。THP-1細胞はその細胞表面に、高レベルのCD32、中レベルのCD64および非常に低レベルのCD16を有する（パネルＡ）。NK細胞は、逆のプロフィール、すなわち、高レベルのCD16と低レベルのCD32およびCD64を示した（パネルＢ）。これら3F2の３つの形態（wt、1Mおよび3M）はすべて同程度でTHP-1細胞に結合する（パネルＣ）。しかし、これらの形態は、より高度にNK細胞に結合し、3F2-3M Fc変異体が最大の結合増加を示している（パネルＤ）。
【図１４】50 ：1のエフェクター：A549標的細胞比を用いた12G3H11（抗EphA2抗体）およびそのI332E Fc変異体の細胞ベースADCCアッセイ（パネルＡ）と、２つの異なるＥ：Ｔ比を用いた同様の試験（パネルＢ）を示す。両試験で、抗体の量は１ウェル当たり４ng〜400 ngであった。I332E Fc変異体は、すべてのＥ：Ｔ比で広範な抗体濃度にわたり高いADCC活性を呈示する。
【図１５】高（T231、A549）レベルのEphA2を発現する標的細胞に対する抗EphA2抗体3F2および3F2-1Mおよび 3F2-3M Fc変異体の細胞ベースADCCアッセイを示す。各アッセイで、抗体濃度は0.02μg／ml〜２μg／mlであった。Ｅ：Ｔ比はアッセイに応じて、12.5：１〜100：１に変化させた。3F2-3M Fc変異体がすべての細胞型に対して最も高いADCC活性を有することがわかった。3F2-1M Fc変異体は3F2野生型に比べ、多くの細胞型に対して高いADCC活性を示したが、一般に3F2-3M Fc変異体ほど活性ではなかった。
【図１６】高（Hey8）および中（SKOV3）レベルのEphA2を発現する標的細胞に対する抗EphA2抗体3F2-WT、3F2-1Mおよび 3F2-3M Fc変異体の細胞ベースADCCアッセイを示す。抗体濃度およびＥ：Ｔ比は図15と同じである。3F2-3M Fc変異体がすべての細胞型に対して最も高いADCC活性を有することがわかった。3F2-1M Fc変異体は3F-WTに比べ、ほとんどの細胞型に対して高いADCC活性を示したが、一般に3F2-3M Fc変異体ほど活性ではなかった。
【図１７】低（A498、SKMEL28）レベルのEphA2を発現する標的細胞に対する抗EphA2抗体3F2、3F2-1Mおよび 3F2-3M Fc変異体の細胞ベースADCCアッセイ。SKMEL28はインテグリンαVβ5を発現し、VitaxinおよびVitaxin-3M抗体の標的細胞としても用いた。抗体濃度およびＥ：Ｔ比は図15と同じである。3F2抗体のいずれも、SKMEL28に対して活性を有していないことがわかった。VitaxinおよびVitaxin-3M抗体のいずれも活性を有するが、Vitaxin-3M Fc変異体の活性の方が有意に高かった。
【図１８Ａ】現在知られているヒトEphファミリーの受容体のアラインメントを示す。次のタンパク質モチーフを楔型のように線で囲む：シグナル配列；エフリン受容体リガンド結合ドメイン；フィブロネクチンIII型ドメイン；膜貫通ドメイン；チロシンキナーゼ触媒ドメイン；SAMドメイン。
【図１８Ｂ】現在知られているヒトEphファミリーの受容体のアラインメントを示す（図18Aのつづき）。次のタンパク質モチーフを楔型のように線で囲む：シグナル配列；エフリン受容体リガンド結合ドメイン；フィブロネクチンIII型ドメイン；膜貫通ドメイン；チロシンキナーゼ触媒ドメイン；SAMドメイン。
【図１８Ｃ】現在知られているヒトEphファミリーの受容体のアラインメントを示す（図18Bのつづき）。次のタンパク質モチーフを楔型のように線で囲む：シグナル配列；エフリン受容体リガンド結合ドメイン；フィブロネクチンIII型ドメイン；膜貫通ドメイン；チロシンキナーゼ触媒ドメイン；SAMドメイン。
【図１８Ｄ】現在知られているヒトEphファミリーの受容体のアラインメントを示す（図18Cのつづき）。次のタンパク質モチーフを楔型のように線で囲む：シグナル配列；エフリン受容体リガンド結合ドメイン；フィブロネクチンIII型ドメイン；膜貫通ドメイン；チロシンキナーゼ触媒ドメイン；SAMドメイン。
【図１９】現在知られている、Eph受容体リガンドのヒトEphファミリーのアラインメントを示す。次のタンパク質モチーフを楔型のように線で囲む：シグナル配列；エフリン受容体ドメイン；膜貫通ドメイン（Ｂファミリーのみ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2008510007.tif 000032