(57)【要約】【課題】  特に「ガン」として知られる腫瘍性細胞を細胞の枯死に導くために、主として複数のペプチド結合を有するポリペプチドを提供すること。【解決手段】  前記ポリペプチドは膜結合タンパク質として細胞の表面に圧搾され、膜糖タンパク質の一点または数点において解糖化される。膜糖タンパク質は腫瘍性の細胞で、特に抗原としてヒト単クローン抗体ＰＭ−２に結合して、特に「ガン」細胞の枯死に寄与する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜結合タンパク質として細胞の表面に圧搾され一以上の点（膜糖タンパク質）であって、そのアミノ酸配列がインテグリン結合タンパク質ｐ８０（受入れ番号ＡＪ１３１７２０）またはＲＥＶ１（受入れ番号ＡＦ２０６０１９）であり、前記膜糖タンパク質を、腫瘍性の細胞によって表現し、非腫瘍性の細胞によっては表現することなく、抗原としてヒト単クローン抗体ＰＭ−２（ＤＳＭ受入れ番号：ＤＳＭ  ＡＣＣ２６００）とし、Ｎ−グリコシド的とＯ−グリコシド的とすることを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
前記ヒト単クローン抗体ＰＭ−２（ＤＳＭ受入れ番号：ＤＳＭ  ＡＣＣ２６００）を少くとも一つのＮ−グリコシル化炭化物残基（＝糖残基）により媒介したことを特徴とする前記請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
Ｎ−グリコシレーションをＰ−８０抗原の部分列（受入れ番号ＡＪ１３１７２０）のアミノ酸位置３３３，３５３，４５０及び５６８のうちの少くとも一つの部位に存在するものとしたことを特徴とする前記請求項１と２とのいずれかの一つによるポリペプチド。
【請求項４】
Ｎ−グリコシレーションをＲＥＶ１抗原の部分列（受入れ番号ＡＦ２０６０１９）のアミノ酸位置８１０，８３０，９２７及び１０４５のうちの少くとも一つの部位に存在するものとしたことを特徴とする前記請求項１と２のいずれかの一つによるポリペプチド。
【請求項５】
膜グリコプロティンをモノマーとするか、或は少くとも一つの同一のサブユニットまたは他のタンパク質と連合されるものから構成されるものとすることを特徴とする前記請求項第１項乃至第４項のいずれかの一項によるポリペプチド。
【請求項６】
膜グリコプロティンの分子量を凡そ８０乃至１６０ＫＤＡとすることを特徴とする前記第１項乃至第５項のいずれかの一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
膜グリコプロティンを大腸、膵臓、前立腺、子宮、卵管、副腎および／または肺および食道または肺、胃がん、乳房の管癌および非腫瘍性の細胞による腫瘍性の細胞によって示されるものとすることを特徴とする前記第１項乃至第６項のいずれかの１項に記載するポリペプチド。
【請求項８】
膜グリコプロティンを膵臓がん細胞株ＢＸＰＣ−３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６８７）の表面に発現されたものであることを特徴とする前記第１項乃至第７項のいずれかの１項に記載するポリペプチド。
【請求項９】
膜グリコプロティンを腫瘍性の上皮細胞の表面に露出されたものとすることを特徴とする前記請求項のいずれかの１項に記載されたポリペプチド。
【請求項１０】
ＰＭ−２抗体（ＤＳＭ受入れ番号：ＤＳＭ  ＡＣＣ２６００）と腫瘍性の細胞に関する膜糖タンパク質とを結合した後に、非腫瘍性の細胞でなく、前記腫瘍性の細胞に枯死を招ねかせるようにしたことを特徴とする前記各請求項のいずれかの１項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ＰＭ−２抗体（ＤＳＭ受入れ番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２６００）と腫瘍性の細胞とを結合した後に、細胞の増殖を前記細胞の膜糖タンパク質を介して抑制するようにしたことを特徴とする前記各請求項のいずれかの１項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記膜糖タンパク質を膵臓がん細胞株ＢＸＰＣ−３の膜抽出物から、溶解化と、粒度除外クロマトグラフィーとを利用して隔離することを特徴とする前記請求項第１項乃至第１１項のうちのいずれかの１項に記載するポリペプチド。
【請求項１３】
前記粒度除外クロマトグラフィーに陰イオン交換クロマトグラフィーの動作を追従させることを特徴とする請求項１２によるポリペプチドを得る方法。
【請求項１４】
ビボ（ｖｉｖｏ）投与後に免疫化により腫瘍と戦う役目を果す通常の薬学の付形剤とキャリアとを用いる薬剤の製造に関して前記の総ての請求項の内のいずれかの１項によるポリペプチドの製法。
【請求項１５】
腫瘍性の細胞について細胞枯死および／または細胞増殖抑制効果のある結合配位あるいは接着ペプチドを特に開発するため、前記のすべての請求項のいずれかの１項によるポリペプチドの用法。
【請求項１６】
放射性ヌクレオチド、蛍光標識、細胞毒、そして配位子または癒着性ペプチドに連結される細胞毒、配位子または癒着性ペプチドに結合される細胞毒あるいは成長抑制物質を特に開発するため、前記のすべての請求項のいずれかの１項によるポリペプチドの用法。
【請求項１７】
処理能力が優秀な選別法（ＨＴＳ）において作用物質を選別するようにする前記のすべての請求項のいずれかの１項によるポリペプチドの用法。
【請求項１８】
腫瘍マーカーとして前記のすべての請求項のいずれかの１項によるポリペプチドの用法。
【請求項１９】
抗原の存在、抗原の集積および／または抗原の量の証拠をＰＭ−２抗体（ＤＳＭ受入れ番号：ＤＳＭ  ＡＣＣ２６００）に膜糖タンパク質を特に結合して実行することを特徴とする前記のすべての請求項のいずれかの１項によるポリペプチドの用法。
【請求項２０】
ベクトルのアミノ酸配列の一部がＳＥＱ  ＮＯ  ＩＤ：１に指示されている配列に該当することを特徴とするアンチセンスベクトル。
【請求項２１】
ベクトルの核状物質の一部がＳＥＱ  ＮＯ  ＩＤ：２に示されている配列に該当することを特徴とするアンチセンスベクトル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  この発明はポリペプチドに関するものである。このポリペプチドは膜結合タンパク質として細胞表面に圧搾されているものであって、一つ乃至複数のポイントにおいてグリコシル化されており（メンブラン糖タンパク質）、そのアミノ酸配列は部分的に、または完全に、インテグリン結合タンパク質ｐ８０（受入れ番号ＡＪ１３１７２０）またはＲＥＶ１（受入れ番号ＡＦ２０６０１９）である。【０００２】  この発明はまた腫瘍治療、腫瘍診断および腫瘍研究に関する発明によるポリペプチドの使用に関するものである。
【背景技術】
【０００３】  化学療法の進歩発達にもかかわらず、「ガン」の有効な治療法は医学における最大の挑戦の的となっている。これを目標として、「ガン」の旱期診断ということが特に重要な役割を演ずるわけである。不安をいだいている尨大な数の「ガン」の患者が、その最初の診断の際に、すでに頗る病状の進んだ状態になっている。それだけではなく、組織の中に腫瘍細胞が存在することが早期に判っていても、「ガン」と戦う新規な手段、たとえば細胞の増殖を押えることや、その細胞の枯死を図る手段が阻害されている。神経成長因子／腫瘍壊死因子（ＮＧＦ／ＴＮＦ）などのような細胞表面の細胞枯死レセプターはリンパ球に広く発現されているが、また数多くの他の細胞類も見出されるので、「ガン」の治療にとって適切ではない。特に、生体外でのテストにおいて、これらの受容体についての配位子と抗体とは肝障害を招ねく。アポプトーシス（細胞枯死）の作用を行う腫瘍特異受容体（抗原）は、腫瘍性の細胞の表面に露出されるものであり、それ故に、「ガン」の治療にとって特に重要である。細胞枯死の作用を演ずるヒトの単クローン抗体にとって細胞枯死の効果は同一であって、「ガン」を分離する。ハイブリドーマ技術を利用すると、「ガン」患者の組織と健全なドナーから腫瘍性特異抗原を分離するのに成功する。特に、２種類のヒト単クローン腫瘍特異抗体とその抗原とを識別することは可能になっている。したがって、ヒト単クローン抗体ＳＣ−１はＣＤ−５５受容体に特に結合する（カンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１９９９年１０月号，１５，５９（２０），５２９９−５３０６，ヘンセル（Ｈｅｎｓｅｌ）氏外）。一方、ＰＡＭ−１抗体は、特にＣＦＲ−１受容体に結合する。（オンコル．レップ．（Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．）  ２００４年４月１１日（４），７７７−７８４  ブレンドレイン（Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ）外）。また、この種のヒト・単クローン抗体は「ガン」の治療と診断とに大きな役割を果すものである。これが「ガン」の治療に重要であるということは、腫瘍性の細胞の表面に該当する抗原を特に結合した後に、細胞の枯死および／または細胞の増殖を阻止することにある。【０００４】  ヒト単クローン抗体ＰＭ−２（ＤＥ  １０２  ３０５  １５６  Ａ１）（ＤＳＭ受入れ番号：ＤＳＭ  ＡＣＣ２６００）の扶助によって、現在では抗原（受容体）としてＰＭ−２抗体を明確に見出しているこの発明によるグリコ膜タンパクを同定することができる。この発明において同族のものが存在することを述べている抗原の質量分光分析の領域の一部としての配列の比較（図６を参照）は、少くとも、その研究の範囲において、この発明による抗原とｐ８０タンパク質またはＲＥＶ１（受入れ番号ＡＦ２０６０１９）として周知のタンパク質（ＮＣＢＩ受入れ番号ＡＪ１３１７２０）との間に、少くとも調査研究の領域において同族のものである関係が明らかにされている。【０００５】    ［定義］
「アポトーシス（細胞の枯死）」
アポトーシスとは細胞の自己死、すなわちＤＮＡの細分による細胞の自殺のことを言うのであって、細胞の細分と膜小胞の形成、いわゆる細胞枯死体の形成を伴う。最も多くの場合には真核細胞の死を招ねき、胚形成、変態、そして組織萎縮を発生する。細胞の枯死は、細胞死の生理学的な形式として、壊死（ネクローシス）の場合のように、炎症作用あるいは細胞の損傷などを初期に生ずることなく、必要としない細胞を極めて迅速に、きれいに除くものである。異常なコンディションの場合には、細胞の枯死は、また、「ガン」前駆細胞などの悪性の細胞を除去する働きをする。細胞の枯死は、腫瘍壊死因子は細胞毒性Ｔ−リンパ球や腫瘍壊死因子、グリココルチコルド及び抗体などのサイトカインによって広く阻害される。【０００６】  「グリコシレーション（糖鎖形成）」
膜グリコシレーションは、その細胞外の場所に糖が残留する（グリコカリックス）で、これはアスパラギン側鎖（Ｎ−結合）のアミドニトロゲンか、あるいはセリンの酸素原子か、またはトレオニン側鎖（Ｏ−結合）の酸素原子のいずれかに結合されている。側鎖にじかに関連している糖は通常、Ｎ−アセチルグルコミン酸か、あるいはＮ−アセチルガラクトサミンである。炭水化物は極めて多様な構造を形成することができる。まず第一に、数多くの単糖類は１種もしくは数種のＯＨ類を介して互に連鎖されることができる。第二として、Ｃ−１原子にとりついた連鎖はαまたはβ配置になることができる。これらの数多の結合を利用して、グリコメンブラン・タンパク質が少糖類（オリゴ糖類）を含有する拡大した領域を占めることができる。【０００７】  細胞の表面の炭水化物の構造［グリコシレーションの様式、グリコカリックス（細胞外皮）］が細胞内の認識について情報特性を具備することは知られている。したがって、例えば、免疫系統が標的細胞に対する同定および吸着に関するグリコシル化パターンを必要とするならば、このプロセスの順序についての構造の基本は、いまだに判っていないのである。【０００８】  ［インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）］はタンパク質である。これは細胞の表面に連結されていて、その脂肪親和性の部分は細胞壁（膜内外のタンパク質）を突きぬけており、その細胞外の成分はグリコシル化（グリコ膜タンパク質）である。癒着として知られている過程によって、インテグリンは細胞外基質と他の細胞とに細胞の結合を促進する。インテグリンのアミノ酸配列と三次元のタンパク質構造とに加えて、インテグリンに結合する糖の構造は結合の選択度に関して信頼性がある。インテグリンはアルファおよびベータ・サブユニットであるヘテロダイマーである。それには凡そ１０の異なるアルファ・サブユニットと、少くとも２倍もの多くの異なるベータ・サブユニットがある。インテグリンだけの受容体の形式について生ずる可変性は細胞癒着を行う通常の機序が完全に理解されているということを示すものである。インテグリン結合の特異性は細胞外Ｃａ２＋濃度によって、より一段と変調される。インテグリンが細胞外基質のＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列［ルオスラティ，ピアシュバー，サイエンス（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，  Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ）１９８７，２３８，４９１］にインテグリンに選択的に結合することは公知である。【０００９】  癒着の受容体について、インテグリンが特に情報の伝達に作用する。すなわち、細胞外の信号の細胞の内部への情報伝達を行い、そして細胞の内部から外部へと情報を伝達する。癒着とその結果に基づく細胞内部への信号は細胞内の反応を誘発させ、細胞骨格の再構成に導き、信号カスケードを誘導する。インテグリン結合タンパク質は癒着においてインテグリンが結合する相手である。【００１０】  細胞癒着プロセスは発現するパターンに調節効果があり、それが故に、受容体それ自体の特異性に調節効果がある。細胞接着メカニズムは、それ故、細胞の成長、細胞の泳動そして細胞分化に重要である。とくに、それには、細胞がその特殊な形状を喪失して転移性「ガン」細胞になる場合を含んでい��。【００１１】  ［腫瘍性の細胞］
新生物つまり腫瘍は異常な細胞集団であって（増殖因子が独立し）、同調しておらず、これという特別な目的のあるものでもなく、進行性のものである。腫瘍は２種類の成分から成っている。腫瘍性の細胞として知られていて、非腫瘍状支質、すなわち、連結組織と血管も、実質細胞である。この発明による抗原の腫瘍性の細胞も細胞を表わすものである。そして、これは抑制されない細胞分裂あるいは細胞枯死の機序をもっていない無制御の細胞である。この発明において、腫瘍性の細胞とは、障害を具備すると共に、正常な細胞周期とは掛け離れた細胞周期を備えていることを特徴とするものである。
【発明の開示】
【００１２】  先行文献［ウィックスラー（Ｗｉｘｌｅｒ）外、ＦＥＢＳレターズ（Ｌｅｔｔｅｒｓ）１９９９，４４５，３５１−３５５］から知られている配列（受入れ番号ＡＪ１３１７２０）はアルファーインテグリン結合タンパクｐ８０に関するコードで、これはアルファーインテグリンの近位領域と相互作用する。これらの結合特性はｐ８０が膜結合タンパクでなければならないことを示している。ｐ８０タンパクのグリコシレーションに関する詳細は不明である。
【００１３】  ヒトＲＥＶ−１タンパク（受入れ番号ＡＦ２０６０１９）も周知であって、また、少くともセクションに、この発明による抗原に相同する配列を備えている。デオキシチジルトランスフェラーゼ活動度はＲＥＶ１の機能として与えられる。デオキシチジルトランスフェラーゼは、恐らく、細胞核のＤＮＡの再現時に娘ＤＮＡ線維にデオキシチジレートの結合を触媒作用する。インテグリン結合タンパクｐ８０と比較して、ＲＥＶ１は膜結合タンパクではなくて、神経核に局在される。
【００１４】  同一のアミノ酸配列のポリペプチドは膜結合タンパク質として、また細胞核中のタンパク質としての双方を示すことができるということは、グリコレーションがポリペプチドの集積と機能との双方に関する役割を演ずるように、このタンパク質を同一の物質であるとすることは出来ない。
【００１５】  この発明の目的は腫瘍特異ヒト単クローン抗体ＰＭ−２が（ＤＳＭ受入れ番号：ＤＳＭＡＣＣ２６００）に結合し、そして腫瘍を治療するためと腫瘍の診断とのために、抗原を利用するために、抗原を同定し識別することにある。
【００１６】  ＰＭ−２抗体（ドイツ特許ＤＥ  １０２  ３０  ５１６  Ａ１号）は重鎖と軽鎖の分子を具備するヒト単クローン抗体であって、重鎖の場合も、軽鎖の場合も、抗体から抗体への構造が一定していて、抗体から抗体への構造について変化している領域が存在している。すなわち、抗体の断片、少くとも軽鎖の可変領域の少くとも一部が配列プロトコルの重鎮のＳＥＱ  ＮＯ．４および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３を構成しているものである。ＰＭ−２抗体はハイブリドーマ技法で生成された。ハイブリドーマ細胞（ＤＳＭ  ＡＣＣ２６００）はヘテロ−ミエロマ細胞ＨＡＢ１とＰ−リンパ球と前記細胞のサブクローンとの融合によって得られる。Ｐ−リンパ球はリンパ器官から、望ましくは「ガン」患者の脾臓またはリンパ節から採取することが望ましい。ヒト単クローン抗体ＰＭ−２は腫瘍性の細胞の表面に該当するＰＭ−２抗原に特に結合した後で、この細胞の枯死を開始するか、あるいは細胞の増殖を阻害する。ＰＭ−２抗体の細胞枯死の効果は細胞死ＥＬＩＳＡ検査法で詳細に説明されており、前掲ドイツ特許ＤＥ  １０２  ３０  ５１６  Ａ１号に詳述されている。
【００１７】  この目的を達成するために、この発明は抗原の性質に従うグリコ膜タンパク質を教示するのであって、腫瘍性の細胞によって圧搾されたもので非腫瘍性によるものではないこと、そして、抗原として特にヒトの単クローン抗体ＰＭ−２（ＤＳＭ受入れ番号：ＤＳＭＡＣＣ２６００）に結合し、Ｎ−グリコシド的でＯ−グリコシド的にグリコシル化されていることを特徴とするのである。
【００１８】  この発明による抗原は腫瘍特異性、すなわち、専ら腫瘍性細胞によるものである。ヒト単クローン抗体ＰＭ−２（ＤＳＭ受入れ番号：ＤＳＭ  ＡＣＣ２６００）を抗原に特に結合するために、この発明では、Ｎ−グリコシドとＯ−グリコシドとである糖鎖形成体が最も適切である。
【００１９】  この発明による抗原と、少くとも区分において同一な配列順序であるｐ８０タンパクとの両者は膜結合タンパク質である。ｐ８０タンパクはインテグリンを結合するということは、この発明による抗原が腫瘍の脱出に役立つということを示すものである。細胞癒着分子のように、インテグリンは血管新生に重要である。したがってαＶβ３インテグリンは腫瘍に供給する脈管の内皮細胞によって発現される。血管の上皮の細胞中に検出され、またインテグリンと相互作用を行ない、その阻害には血管新生阻止と同等の作用がある。インテグリンは血管を介して送られる腫瘍細胞を癒着させてしまうという重要な役割を演ずるということが判っているだけで、その他については何等判明していないのが現況である。
【００２０】  抗体ＰＭ−２の特別な結合に関して、この発明の抗原は、Ｎ−グリコシド結合グリコ構造が恐らく特別の役目を果すものと思われる。グリコシレーション部位をより正確に分析すると、これは当業者にとって周知となっているソフトウェアの手段によって実行されている（「ＵＫ  ＭＲＣ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｊｅｃｔ」“ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／Ｇｅｎｏｍｅ  Ｗｅｂ／ｐｒｏｔ−ａｎａｌ．ｈｔｍｌ”）。
【００２１】  専ら部分的に利用することのできる配列ｐ８０の（７７４アミノ酸）から出発して、これの分析で、Ｎ−グリコシレーションは特にアミノ酸の部位３３３，３４３，４５０及び５６８に存在する。完全に入手することが出来るＲＥＶ１タンパク質の配列順序で、該当する分析によって、ＲＥＶ１の場合に、Ｎ−グリコシレーションが、アミノ酸配列の位置８１０，８３０，９２７および１０４５の場所に生じた。
【００２２】  同じ方法で決定したＯ−グリコシレーション部位の数は意味ありげな趣きをもっていて、多かった。
【００２３】  ヒト単クローン抗体によって確認される抗原が単量体または複数の同様のサブユニットから作成される。２つの同一のサブユニット（二量体）あるいは別のタンパク質と連合したものである可能性は、広範な帯域幅の中で変化するまで、その分子量を免疫ブロット法（ウエスタン・プロット）で、現在まで、広いバンド幅の中で変化している。
【００２４】  タンパク質を表現する細胞は、既に、ＰＭ−２抗体のキャラクタリゼーションに関連して既に記載されている。それ故に、参考文献として、ＤＥ  １０２  ３０５  １５６  Ａ１を取り上げる。ハイブリドーマ（融合雑種腫瘍細胞）細胞株は抗体ＰＭ−２を生成するものであって、この細胞株は、「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約」に従って、「ドイツ国の微生物および細胞の寄託所」（ＤＳＭＺ）に一般に入手することが出来るようにＤＳＭ２６００として２００３年７月２日に寄託した。この発明による抗原の特性、とくに細胞株ＢＸＰＣ３（ＡＴＣＣナンバーＣＲＬ１６８７）の膵臓がん細胞が用いられている。それは抗原が前記がん細胞の表面に急速に作用するからである。
【００２５】  この発明によって抗原の免疫生物学の重要性を説明するために、抗原を腫瘍組織上皮細胞の表面に発現されたものとする。
【００２６】  以上のように決定づけたことが重要であることは、ＰＭ−２抗体を抗原に結合した後の腫瘍性細胞に細胞枯死を招ねくことを、この発明による抗原の治療の潜在能力とするからに外ならない。また、その代りに、ＰＭ−２抗体が腫瘍性細胞の表面に特異的に結合するので、その細胞の増殖が抑制される。前記両作用は腫瘍の治療について関心深いものである。
【００２７】  この発明の範囲内において、その発明による抗原を分離する方法が開発されているのである。当業者にとっては周知となっている洗浄剤の均質化と溶解化とを行った後に、抗原をクロマトグラフィー（色層分析）して精製する。特に、粒度除外クロマトグラフィーを、それ用として使用する。分離方法が改良されたので、粒度除外クロマトグラフィーを陰イオン交換クロマトグラフィーの形で、さらに利用する。この第二番目の精製段階によって、分離されたグリコメンブランタンパク質が改善される。
【００２８】  以上のようにして分離された抗原は、通常の薬用賦形剤と担体物質とを用いて薬剤として使用するようにすることが出来る。簡単なケースの場合には、通常のＮａｃｌ溶液で精製された抗原が投与された。
【００２９】  しかし、精製したグリコ膜タンパクは特殊の結合配位子または癒着ペプチドを明らかにするための抗原として使用される。原則として、このようにして同定されたポリペプチドはヒト単クローン抗体の配列順に区分だけが該当するだけであって、腫瘍性の細胞および／またはこれらの細胞の増殖を抑制する。この効果を促進するために、癒着ペプチドまた
2008502321.tif 000002
ることができる。
【００３０】  高処理能力のある選別法の一部として活動性の確認に、抗原のような、この発明によるグリコメンブランタンパク質を用いることが考えられる。そのような方法と、そうした方法の開発は当業者に知れ渡っており、医薬品の研究の分野にあって積極的に進められている。
【００３１】  この発明の範囲内において、その発明による抗原を腫瘍マーカーとして適用することは一向に差支えない。こうした場合に、腫瘍性の細胞の表面に、この発明による膜糖タンパク質の検出はＰＭ−２抗体によって行うことができる。配列プロトコル１と２とに記載されているベクトル挿入物によって、この発明による膜糖タンパク質が特に結合しているヒト単クローン抗体ＰＭ−２であることをアンチセンス検査によって明らかにされている。
【００３２】  例１  原料と方法
細胞培養：
「ガン」細胞株ＢＸＰＣ−３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６８７）を受容体を得るために用いた。比較研究、たとえば、ウエスタンブロット分析のために、良く知られている胃腺腫株２３１３２／８７（ＤＳＭＺ受入れ番号ＤＳＭ２０１）［ヘンセル（Ｈｅｎｓｅｌ）氏外、１９９９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８１：２２９−２３５）を用いた。これらの細胞は１０％ＦＣＳを補充して、ＲＰＭＩ−１６４０（ＰＡＡ，ウィーン，オーストリア）の８０％と、ペニシリン／ストレプトマイシン（両者とも１％）を合流して培養された。前述した研究によって、細胞がトリプシン／ＥＤＴＡで除かれ、リン酸塩緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）で２度洗浄された。
【００３３】  膜抽出物の調製：
腫瘍細胞から膜タンパク質を分離するのにヘンセル氏外（Ｈｅｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８１：２２９−２３５）に記載されている方法で細胞株ＢＸＰＣ−３を使用して行った。これを簡単に述べると、可干渉性の腫瘍細胞をＰＢＳを用いて２度洗浄し、細胞剥離器で除外し、遠心分離をして、低浸透緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，３ｍＭ  ＫＣｌ，３ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に懸濁した。１５分後に氷と超
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。上澄みをスイングロータにて、１００，０００ｇで３０分間遠心分離し、それによって膜をペレット状にした。ペレットを低浸透的緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１０％グリセロールと１％トリトンＸ−１００）に再び懸濁させた。タンパク分解酵素阻害薬（ボエルンゲル，マンハイム，ドイツ）をすべての溶液に添加した。
【００３４】  抗原の精製：
抗原の精製には薬剤（フライブルク，ドイツ）ＦＰＬＣユニットを使用するカラムクロマトグラフィーで行なわれた。サイズに無関係なクロマトグラフィーについては、ファーマジア・スーパーデックス（Ｐｈａｒｍａｚｉａ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００）（ＸＫ１６／６０）カラムに膜調合前５ｍｇを加えて、緩衝剤Ａ（１００ｍＭ  ｔｒｉｓ／Ｃｌ，ｐＨ７．５，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，４０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％トリトンＸ−１００）で効果をあらわした。次で、溶出液をウエスタンブロット分析によって抗体ＰＭ−２に反応させて、分割させ調べた。陽性の留分を緩衝剤Ａを用いてモノＱ（５／５列）に加えた。結合したタンパク質を緩衝剤Ｂ（１００ｍＭ，  ｔｒｉｓ／Ｃｌ，  ｐＨ７．５，１Ｍ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，１Ｍ  ＮａＣｌ，  １％  トリトンＸ−１００）を用いてライナーグラディエントの手段で洗浄し、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロット分析で分割して調べた。
【００３５】  ウエスタンブロッティング：
１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルとタンパク質のウエスタンブロッティングによる分離を、この発明に関してではなく、ほかの場合にヘンス氏外（Ｈｅｎｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８１：２２９−２３５）による記載のような標準的な状態で遂行した。簡単に述べると、ブロッテッドされたニトロセルロース膜は、２％脱脂粉乳を含有するＰＢＳで遮断され、次で１０ｐｇ／ｍｌ精製抗体１０３／５１で１時間の培養がなされた。ＰＢＳ＋０．０５％トゥイーン２０で３回洗液した後に、第二の抗体（ペルオキシダーゼ連結ハーレ抗ヒトＩｇＭ抗体（ディアノーバ，ハンブルク，ドイツ）が培養された。その反応はスーパーシグナル化学発光装置によってピアース（ＫＭＦ，セント，オースチン，ドイツ）から表示された。
【００３６】  適正なＳＤＣゲルに関するウェスタンブロットの手段によって同一性が認められた陽性の帯域はゲルから分離されて、ＭＡＬＤＩ分析のために使用される。
【００３７】  ＭＡＬＤＩペプチド分析：
ＳＤＳゲルから分離されているタンパク結合は凡そ１ｍｍ×１ｍｍの小片に切断される。そのゲル片はＤＴＴで洗浄され、還元され、ヨードアセトアミドによってＳ−アルキレートされ、各種の文献に記載されている［シエブチエンコ（Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ）氏外、１９９６ｂ  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．  ６８：８５０−８５８）ようにトリプシンで処理される。その溶液の０．３μｌを３７℃の温度で、３時間の消化後に、下流摘出手段を備えているブラッカーリフレックスＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの手段で質量分光分析（ＭＡＬＩＤＩ）を行った（ブラッカー，フランツェン，ブレーメン，ドイツ）。薄層塗抹標本テクニックを標本の作成に利用した［ジエンセン氏外，１９９６ラピッド，コムン  マス，スペクトロム（Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ）１０：１３７１−１３７８］。トリプシン消化ペプチド質量をハウスで発生されたペプチド探索プログラムによって少数タンパク配列データを探索するのに使用した。
【００３８】  ｐ８０アンチセンスのクローニングとトランスフェクション
ＲＮＡ分離、ｃＤＮＡ合成とＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）とは、他に記載［ヘンセル氏外，（Ｈｅｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｔ．，１９９９  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８１：２２９−２３５）］に記載されている通りに行なわれる。それを簡略に述べると、ｐ８０（受入れ番号ＡＪ１３１７２０号）のヌクレオチド配列の位置１８１から位置６８１に至るＰＣＲによって、断片の拡大のために、次のプライマーを用いた。すなわち、
Ｐ８０−Ｒｅｖ３’５’    ＣＴＧＴＴＣＣＡＴＡＣＧＡＴＴＴＴＣＡＴＧＣ    ３’
Ｐ８０−Ｒｅｖ５’５’    ＴＣＧＡＡＣＴＧＧＴＣＴＡＴＣＡＴＣＣＡＡ      ３’
【００３９】  増幅を次に示すサイクルプロフィルで行った。すなわち、９５℃で２分間；次で９４℃で３０秒；６０℃で３０秒；７２℃で６０秒で３５サイクル、そして、その後に７２℃で４分間行った。ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐ  ＳＫ（＋）ベクターのクローニングとＤＮＡの塩基配列決定法は、既に述べた（ヘンセル（Ｈｅｎｓｅｌ）氏外の１９９９  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８１：２２９−２３５）通りに遂行した。
【００４０】  挿入物をｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐ  ＳＫ（＋）ベクトルから適当とする制限酵素を用いて行い、そして、ｐＨｏｏｋ−２ベクトル（インヴィトロゲン，リーク，オランダ）にサブクローンした。いろいろなクローンを結果の良かったクローン化の配列にならって調べた。クローンをコード化した配列がプロモーターに対してアンチセンスの方にクローン化された。このクローンは増幅されて、ベクターはアンチセンス・トランスフェクションについて分離された。
【００４１】  ｐＨｏｏｋ−ａｎｔｉ：ＰＭ−２−Ｒによって細胞株ＢＸＰＣ−３の導入は供給者のマニュアルによって、主要因被検者（ＰＱＬａｂ，エルラーゲン，ドイツ）に従い完成された。このために、プラスミドＤＮＡは１０μｇ／ｍｌに希釈され、そしてその主要因試薬は１：１０の割合で血清遊離増殖培地に添加される。希釈されたプラスミドＤＮＡ（４５０μｌ）と、補足して希釈された主要因試薬（９０μｌ）と血清遊離培地（４６０μｌ）が室温において混合され培養された。６０ｍｌ細胞培養皿（７０％融合）を血清遊離成長媒質（４６０μｌ）をもって２度洗浄し、次で主要因／ＤＮＡ混合物を一滴ずつ加えた。それらの細胞を１８時間３７℃で７％ＣＯ２によって培養し、それから血清遊離増殖培地を１０％ＦＣＳの増殖培地に取りかえて、受容体タンパクが現われないうちの、さらに２４時間培養をつづけた。それによって、
ａ）細胞株ＢＸＰＣ−３が対照ベクトル（ｐ−ＨＯＯＫ−２）を貫通し、その他の部分      はｐ８０アンチセンス・ベクターを通した。
ｂ）導入後４８時間、細胞のサイトスピン標本を調製した。
ｃ）サイトスピン調製物をＰＭ−２抗体と対照抗体（専ら二次性抗体のみ）とによって      染色した。
ｄ）ｐ８０アンチセンス仲介物を以て貫通されている細胞は抗体ＰＭ−２の結合によっ      て、明確な還元を示している。
【００４２】  サイトスピンに関するＮ−グリコシダーゼによる消化作用：
使用した細胞はトリプシン／ＥＤＴＡによりその培養びんの基質から解離され、次でＲＰＭＩ−１６４０媒質＋１０％ＦＣＳを４℃において１時間かけて膜タンパク質を再生するために培養された。次で、サイトスピンが細胞で作られた。サイトスピンはＲＴにて夜通し乾燥された。乾燥後に、細胞は１００％アセトンで１０分間固定され、ＰＢＳで３度洗浄された。それから、固定された細胞は５ｍＵ／ｍｌ  Ｎ−グリコサイダーゼ（１００μｌリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．０）にて恒温器内で３７℃の温度で３時間消化された。次で、サイトスピン調合製剤はＰＢＳで３回に亘って洗浄され、免疫組織化学染色を異なる抗体について行なわせた。負の調節として、単にリン酸塩緩衝で培養されただけのサイトスピンが負の調節として用いられ、また、グリコシダーゼ処理をすることなく通常の免疫組織化学の染色が行なわれた。最終の染色は、その後に、顕微鏡で判定され、その結果は写真およびオリンパス顕微鏡とを利用して記録された。
【００４３】  サイトスピンに関するＮ−グリコシダーゼ：
ここにおいて、再び、細胞をトリプシンで除去し、培養液に於て１時間氷に再構成した。サイトスピンの調製とそれに続く固定の後に、細胞を３時間３７℃の温度において、２０μｌ／ｍｌ  Ｏ−グリコシダーゼ（１００μｌリン酸塩緩衝液ｐＨ６．８）を用いて培養した。対照として、サイトスピンをリン酸塩緩衝液だけで培養し、または培養せずに極く普通に染色した。免疫組織化学の染色については、次に述べるように行った。
【００４４】  生体細胞の免疫組織化学の染色とアセトン固定細胞：
生存力のある細胞を染色するために、細胞を解離し、洗浄し、細胞１ｍｌ当り１×１０６に希釈した。１ｍｌの細胞溶液を５分間かけて１５００ｇに遠心分離した。完全ＲＰＭＩで４０μｇ／ｍｌに希釈した抗体を最終容積１ｍｌの量にして、９０分間氷を用いて保った。次で、細胞を５分間かけて小球状にし、５００μｌ  ＰＲＭＩで再度解離した。サイトスピン標本を細胞溶液２００μｌで作成して、３０分間乾燥をした。細胞は３０分間アセトンに固定された。これをＴｒｉｓ／ＮａＣｌで３回洗浄した。ＨＲＰ−連結ヘーア抗ヒトＩｇＭ（ＤＡＫＯ）をＰＢＳ／ＢＳＡ（０．１％）に１：５０に希釈し、室温で３０分間保温した。３回洗浄の後に、前に述べたように染色を行った。
【００４５】  アセトンを固定した細胞を染色するために、シトスピンを１５分間、室温で乾燥し、前に述べたように、アセトンに固定した。それから、シトスピンをＰＢＳ／ＢＳＡ（０．１％）で１５分間遮断し、３０分間１０μｇ／ｍｌ一次の抗体で培養し、次で３度洗浄をした。二次の抗体での培養と染色とは、前に述べた通りにして行った。
【００４６】  例２  グリコシダーゼの結果
消化作用：
図１は膵臓「ガン」細胞ＢＸＰＣ−３の細胞の表面にＰＭ−２の抗体の結合に関するグリコシダーゼ消化作用の影響を示す。消化した後に、サイトスピンが陽性対照ＣＡＭケラチン（Ａ，Ｃ，Ｅ）とＰＭ−２（Ｂ，Ｄ，Ｆ）とによって免疫組織化学的に染色された。
【００４７】  図１のＡとＢとは酵素以外にグリコシダーゼ緩衝液中の細胞の培養後の制御を示すものである。図ＣとＤとは膵臓「ガン」細胞に抗体ＰＭ−２の結合に関するＮ−グリコシダーゼの効果を示す。Ｎ−グリコシダーゼをもって消化後には、もはや抗体ＰＭ−２で染色されない。このことは、抗体が受容体とは結合しないということで、それは特別に結合するために必要とする結合グリコ構造がＮ−グリコシダーゼの消化作用中に結合してしまうからである。
【００４８】  図１ＥとＦとは抗体ＰＭ−２の結合に関するＯ−グリコシダーゼの効果を示す。陽性対照の間に、図ＥのＣＡＭケラチンは変化した色を示すことなく、Ｏ−グリコシダーゼ酵素で消化後に、細胞はもはや抗体ＰＭ−２によって染色することが出来なくなっていることが判る。すなわち、Ｎ−結合糖のほかに、少くとも抗原のＯ−グリコシド結合がＰＭ−２抗体の特別な結合に起因するものである。
【００４９】  例３  アンチセンス・トランスフェクションの結果：
図２は抗体ＰＭ−２と生きている細胞染色（２００倍に拡大）の効果を示す。
【００５０】  図２の右側の縦列はＰＭ−２で染色されたＢＸＰＣ−３細胞株の細胞を示す。図の上列は非貫通細胞を示す。中央の列は中空ベクターで貫通された細胞を示す。いずれの場合も、細胞は別個のＰＭ−２抗体染色を示している。この染色は、細胞をアンチセンス・ベクターでトランスフェクションした後には極めて重要な形で減少する。このことは下の列の右側に、その画像を示す。この実験はＰＭ−２抗体が膜タンパク質に結合することを示すものであって、そのアミノ酸配列はｐ８０タンパク質のアミノ酸配列と、少くとも、その区分において同族のものである。
【００５１】  グリコシダーゼ消化作用の結合と一緒に、これは、そのアミノ酸配列が少くともｐ８０タンパク質に該当するグリコメンブラン・タンパク質はＰＭ−２抗体が特に結合する抗原である。
【００５２】  ウエスタンブロットの結果：
図３はＢＸＰＣ−３細胞と２３１３２／８７細胞として示される抗原のＰＭ−２抗体の助けをかりて行なわれる免疫特別エビデンスを示す。
【００５３】  例４  Ｎ−グリコシル化部位の決定：
図４ａと４ｂ、そして５ａと５ｂとに示されているグリコシレーション部位は［「ＵＫＭＲＣヒト・ゲノム・マッピング・プロジェクト」（ＵＫ  ＭＲＣ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｊｅｃｔ）］（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／Ｇｅｎｏｍｅ  Ｗｅｂ／ｐｒｏｔａｎａｌ．ｈｔｍｌ）のデータベースのソフトウェアによって決定されたのである。
【００５４】  例５：ＰＭ−２抗原のＭＡＬＤＩ分析：
図６はＰＭ−２抗体によってＳＤＳゲルから選択されたタンパク質帯域の質量分光器分析の結果を示す。質量スペクトロメータを利用して、ペプチド区分Ｎｏ．２，Ｎｏ．３，Ｎｏ．４及びＮｏ．６の比較はｐ８０タンパク質あるいはＲＥＶ１タンパク質と同族関係の配列を示している。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】膵臓がん細胞ＢＸＰＣ−３の細胞の表面にＰＭ−２抗体の結合に関するグリコシダーゼ消化作用の影響を示す図。同図の左側（ＡＣＥ）はＣＡＭケラチンを、右側（ＢＣＤ）はＰＭ−２を示す。
【図２】抗体ＰＭ−２と生きている細胞染色の効果を示す。同図の右列は染色された
2008502321.tif 000004ＢＸＰＣ−３細胞を、下段はアンチセンス・ベクターで貫通されたＢＸＰＣ−３細胞を示す。【図３】ＢＸＰＣ−３細胞と２３１３２／８７細胞がＰＭ−２抗体によって行なわれた免疫特別エビデンスを示す。
【図４ａ】ヒト・アルファーインテグリン結合タンパク質ｐ８０の部分的配列のポテンシァル・グリコシレーション部位の決定を示す。
【図４ｂ】図４ａの補充シート。
【図５ａ】ヒト・ＲＥＶ１タンパク質のポテンシァルＮ−グリコシレーション部位の決定を示す。
【図５ｂ】ヒト・ＲＥＶ１タンパク質のポテンシァルＮ−グリコシレーション部位の決定を示す。
【図６】ＰＭ−２抗原のＭＡＬＤＩ分析を示す。
【図１】
2008502321.tif 000005
【図２】
2008502321.tif 000006
【図３】
2008502321.tif 000007
【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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