(57)【要約】心筋梗塞に関連した遺伝子多型が提供される。より詳細には、心筋梗塞に関連した一塩基多型（ＳＮＰ）を含むポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドのうち１つによってコードされるポリペプチド、前記ポリペプチドに結合する抗体、前記ポリヌクレオチドのうち１つを含むマイクロアレイおよびキット、心筋梗塞の診断方法、ＳＮＰの検出方法、ならびに心筋梗塞用の薬剤組成物をスクリーニングする方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜６０および２４１〜２４４のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列の１０１番目の塩基を有する少なくとも８個の連続したフランキングヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、および前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号５７〜６０のヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号２４１〜２４４のヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号５７〜６０のヌクレオチド配列からなる群から選択され、男性であって喫煙しない被験者における心筋梗塞の診断に用いられる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号２４１、配列番号２４３および配列番号２４４のヌクレオチド配列からなる群から選択され、高いＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）値を有する被験者における心筋梗塞の診断に用いられる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号２４１、配列番号２４３および配列番号２４４のヌクレオチド配列からなる群から選択され、若い被験者における心筋梗塞の診断に用いられる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記若い被験者の年齢は５５歳以下である、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号２４１、配列番号２４２および配列番号２４４のヌクレオチド配列からなる群から選択され、糖尿病でない被験者における心筋梗塞の診断に用いられる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号２４１、配列番号２４２および配列番号２４４のヌクレオチド配列からなる群から選択され、喫煙する被験者における心筋梗塞の診断に用いられる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
配列番号２４３であり、高いトリグリセロール（ＴＧ）値を有する被験者における心筋梗塞の診断に用いられる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
８〜７０個の連続したヌクレオチドを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
８〜７０個の連続したヌクレオチドを含む、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
対立遺伝子特異的プローブである、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
対立遺伝子特異的プライマーである、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１６に記載のポリペプチドに特異的に結合する、抗体。
【請求項１８】
モノクローナル抗体である、請求項１７に記載の抗体。
【請求項１９】
請求項１または１２に記載のポリヌクレオチド；
請求項１または１２に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；または
前記ポリヌクレオチドのｃＤＮＡ；
を含む、ＳＮＰを検出するためのマイクロアレイ。
【請求項２０】
請求項１または１２に記載のポリヌクレオチド；
請求項１または１２に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；または
前記ポリヌクレオチドのｃＤＮＡ；
を含む、ＳＮＰを検出するためのキット。
【請求項２１】
被験者から核酸試料を単離する段階と、
配列番号１〜６０および２４１〜２４４のヌクレオチド配列からなる群から選択される１以上のポリヌクレオチドの多型部位での対立遺伝子を決定する段階と、
を含み、前記多型部位は前記ポリヌクレオチドの１０１番目のヌクレオチドに位置する、心筋梗塞の発生の危険度の変化を有する被験者を特定する方法。
【請求項２２】
前記対立遺伝子を決定する段階は、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーション、対立遺伝子特異的増幅、シークエンシング、５’ヌクレアーゼ分解、分子ビーコンアッセイ、オリゴヌクレオチド結合アッセイ、大きさ分析、および一本鎖配座多型からなる群から選択される方法によって行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記危険度の変化は、危険度の増加である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記危険度の変化は、危険度の減少である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
配列番号１〜６０および２４１〜２４４のヌクレオチド配列からなる群から選択される１以上のポリヌクレオチドの多型部位での対立遺伝子が危険対立遺伝子である場合、被験者は心筋梗塞の発生の危険度の増加を有すると判断する段階をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記被験者が男性であって喫煙をせず、前記ポリヌクレオチドは配列番号５７〜６０のヌクレオチド配列からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記被験者が高いＣＲＰ値を有し、前記ポリヌクレオチドは配列番号２４１、２４３および２４４のヌクレオチド配列からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記被験者が若く、前記ポリヌクレオチドは配列番号２４１、２４３および２４４のヌクレオチド配列からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記被験者が糖尿病ではなく、前記ポリヌクレオチドは配列番号２４１、２４２および２４４のヌクレオチド配列からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記被験者が喫煙し、前記ポリヌクレオチドは配列番号２４１、２４２および２４４のヌクレオチド配列からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記被験者が高いトリグリセロール（ＴＧ）値を有し、前記ポリヌクレオチドは配列番号２４３である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
前記ポリヌクレオチドは配列番号５７〜６０のヌクレオチド配列からなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ポリヌクレオチドは配列番号２４１〜２４４のヌクレオチド配列からなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
核酸分子を含む試験サンプルを、配列番号１〜６０および２４１〜２４４のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドであって、少なくとも８個の連続したヌクレオチドおよび前記ヌクレオチド配列の１０１番目の塩基を含むポリヌクレオチド、ならびに前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドと厳しい条件下で特異的にハイブリダイズする試薬に接触させる段階と、
ハイブリダイズした二本鎖の形成を検出する段階と、
を含む、核酸分子中のＳＮＰを検出する方法。
【請求項３５】
前記ハイブリダイズした二本鎖の形成を検出する段階は、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーション、対立遺伝子特異的増幅、シークエンシング、５’ヌクレアーゼ分解、分子ビーコンアッセイ、オリゴヌクレオチド結合アッセイ、大きさ分析、および一本鎖配座多型からなる群から選択される方法によって行われる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
候補物質を、配列番号１〜６０および２４１〜２４４のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドであって、少なくとも８個の連続したヌクレオチドおよび前記ヌクレオチド配列の１０１番目の塩基を含むポリヌクレオチド、ならびに前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに、結合複合体の形成に適した条件下で接触させる段階と、
前記ポリペプチドおよび前記候補物質からの結合複合体の形成を検出する段階と、
を含む、心筋梗塞用の薬剤組成物をスクリーニングする方法。
【請求項３７】
前記結合複合体の形成を検出する段階は、免疫沈殿、放射免疫分析（ＲＩＡ）、酵素免疫分析（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学、ウェスタンブロッティング、および蛍光励起細胞分取装置（ＦＡＣＳ）からなる群から選択される方法によって行われる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
アンチセンスヌクレオチドまたはＳｉ  ＲＮＡを、配列番号１〜６０および２４１〜２４４のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドであって、少なくとも８個の連続したヌクレオチドおよび前記ヌクレオチド配列の１０１番目の塩基を含むポリヌクレオチド、ならびに前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドと結合させる段階を含み、前記アンチセンスヌクレオチドおよびＳｉ  ＲＮＡは前記ポリヌクレオチドに特異的である、遺伝子発現を調節する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
関連特許出願の相互参照
本願は、韓国特許庁に２００５年５月１３日に提出された大韓民国特許出願第１０−２００５−００４０１６３号、および２００５年６月２日に提出された大韓民国特許出願第１０−２００５−００４７１９５号の利益を主張し、その開示は全体として本明細書中に参照として組み込まれる。
【０００２】
本発明は、心筋梗塞に関連した遺伝子多型およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
ヒトゲノムの塩基配列のうち９９．９％が同一である。個人の姿、行動、およびある疾患に対する感受性の多様性は、ヒトゲノムの塩基配列の残りの０．１％における部分的な違いによって生じる。すなわち、ヒトゲノムのうち約３百万の塩基配列の違いによって、個人、集団、人種、民族の間の多様性が生じる。塩基配列の違いは、異なる人種の皮膚の色のような表現型の区別だけでなく、疾患の分布の違いに寄与する。約３０億個の塩基対があり、ほぼ１．０ｋｂの間隔で多型が生じる塩基対が配置される。各人ごとに異なる塩基対は全部で約３百万個あり、これらの塩基対の変化を一塩基多型（ＳＮＰ）という。個人および集団の中での多様性、または疾患群と正常群との間の違いの原因は、３百万個のＳＮＰの解析を通して見出されうる。塩基配列全体の解析は必要ではない。
【０００４】
遺伝学の最も重要な目的は、人間の疾患のような表現型の違いをＤＮＡにおける違いにマッピングすることである。すべてのゲノムに存在する多型マーカーは、この目的を達成するための最良の手段である。個人を区別し、遺伝病に関連する遺伝子を見出すために、マイクロサテライトマーカーが多型マーカーとして通常用いられてきたが、ＤＮＡチップの開発に伴ってＳＮＰに関心が寄せられている。ＳＮＰの高い頻度、ＳＮＰの使用の安全性、およびすべてのゲノムにわたるＳＮＰの分布によって、大きなスケールでの自動ＳＮＰ検出が可能である。ＳＮＰは、医学の新しい分野である予測医学に寄与するであろう。例えば、個人の疾患を予測し、特定の医薬品に対する個人の反応を調べる革命的な工程が、ＤＮＡチップ技術および高速ＤＮＡ配列解析技術などの最新のバイオテクノロジーを用いることによって実施されうる。
【０００５】
ＳＮＰの研究は、人口集団の中で均等に分布する遺伝型の分析を含む。ＳＮＰを研究することによって、人口集団は遺伝型に従って区分でき、遺伝型に従って疾患群が有意に分布すれば、遺伝型と疾患との関係が確立されうる。ほとんどのＳＮＰの研究において、単一の遺伝型（ｓｉｎｇｌｅ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ）またはいくつかの遺伝型が疾患群と正常群で有意に異なる分布を有する場合、当該遺伝型による疾患の頻度の違いが解析されうる。
【０００６】
ヒトゲノムの３百万個のＳＮＰのうち、約１／６である約５１０，０００個のＳＮＰが遺伝子中に存在する。ＳＮＰは遺伝子の発現またはタンパク質の機能と直接関連するため、このようなＳＮＰの遺伝子における分布を知ることは非常に重要である。もし特定の疾患と関連している遺伝型が遺伝子の発現またはタンパク質の機能に影響を与えうるならば、前記遺伝子または前記タンパク質は、その疾患の原因である可能性が高い。この場合、前記遺伝子は、疾患の検出および治療の標的遺伝子となりうる。疾患に対する感受性もまた、前記遺伝子のＳＮＰ解析を用いて解析されうる。
【０００７】
プロモータのような遺伝子配列の転写調節部位のＳＮＰは、発現される遺伝子の量を調節できる。まれに、ＳＮＰはまた、ＲＮＡスプライシングに影響を与えるエクソン・イントロン境界にある配列、または３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）に位置するＲＮＡの安定性および翻訳効率に影響を与える。
【０００８】
すなわち、コーディング部位または転写調節部位および翻訳調節部位に位置するＳＮＰは、疾患に対する感受性を決定するための有用な指標でありうる。コーディング部位または転写調節部位および翻訳調節部位に位置するＳＮＰもあるが、タンパク質の発現および／または機能に影響を与えることが期待されない他のＳＮＰも、疾患との関連が見出されうる。国際的な研究は、人の疾患におけるこのようなＳＮＰの役割の解明を試みている。
【０００９】
ハプロタイプはＳＮＰよりも多くの情報を有し、連鎖不均衡に関する情報を含むため、ハプロタイプを用いた遺伝型の解析はより正確な結果を与える。特に、いくつかのＳＮＰが遺伝子の中に密に分布している場合、隣接したＳＮＰに関する組み合わせた情報を有するハプロタイプを用いた遺伝子解析は、遺伝子の機能と疾患との間の関係を見出すのに有効である。例えば、５−リポオキシゲナーゼ活性化ペプチド（ＦＬＡＰ）のハプロタイプは、ＳＮＰに比べて、心臓発作のより正確なマーカーであることがわかっており、心臓発作の臨界的な原因であると報告されている（Ｈｅｌｇａｄｏｔｉｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００４  Ｍａｒ；３６（３）：２３３−９）。その後、Ｄｅｃｏｄｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓは、このハプロタイプの結果の報告に基づいて、心臓発作の予防医学のためにＦＬＡＰのハプロタイプを含む酵素の阻害剤に関する研究を行い、第２フェーズの臨床試験が既に開始されている。
【００１０】
一方、心血管疾患は、全世界の工業化された国における主な死亡原因であり、韓国では１９７０年代から主な死亡原因となっている。韓国統計庁によれば、２００３年には、２４６，０００人の死亡者のうち２２，０００人（１００，０００人あたり９，０８７人、または９．１％）が心臓病および高血圧によるものであり、これらはガンおよび脳血管疾患に続く３番目の主な死亡原因である。
【００１１】
心血管疾患の中でも重要な部分を占める冠状動脈疾患は、通常、心臓に血液を供給する冠状動脈の閉塞または狭窄である動脈硬化によって生じる。冠状動脈の閉塞は心筋梗塞を示し、冠状動脈の狭窄は狭心症を示す。冠状動脈疾患の原因としては、高脂血症（高コレステロール血症）、高血圧、喫煙、糖尿病、遺伝的形質、肥満、運動不足、ストレスおよび更年期が知られている。冠状動脈疾患の複合的な因子を有する被験者は発生の危険度が高い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
技術的課題
現在、心臓内部および冠状動脈のＸ線および超音波撮影が、心血管疾患の診断に用いられうる。しかしながら、心筋梗塞を含む他のさまざまな心血管疾患および複雑な疾患の、他の物理的な技術を用いた診断または予測については、診断または予測は疾患が進行した段階である場合にのみ実施されうる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
技術的解決
発明の概要
本発明者らは、心筋梗塞に関連するＳＮＰを見出すための研究の結果として、心筋梗塞の発生確率および遺伝的感受性の予測を可能にするＳＮＰを発見した。
【００１４】
本発明は、心筋梗塞に関連する一塩基多型（ＳＮＰ）を提供する。
【００１５】
本発明はまた、前記ＳＮＰを含むポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。
【００１６】
本発明はまた、前記ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを提供する。
【００１７】
本発明はまた、前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。
【００１８】
本発明はまた、前記ポリヌクレオチドを含む、ＳＮＰを検出するためのマイクロアレイを提供する。
【００１９】
本発明はまた、前記ポリヌクレオチドを含む、ＳＮＰを検出するためのキットを提供する。
【００２０】
本発明はまた、心筋梗塞の発生の危険度の変化を有する被験者を特定する方法を提供する。
【００２１】
本発明はまた、核酸分子のＳＮＰを検出する方法を提供する。
【００２２】
本発明はまた、心筋梗塞のための薬剤組成物をスクリーニングする方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、遺伝子の発現を調節する方法を提供する。
【００２４】
本発明の一態様によれば、少なくとも８個の連続したヌクレオチドおよびヌクレオチド配列の１０１番目の塩基を含む、配列番号１〜６０および２４１〜２４４のヌクレオチド配列のポリヌクレオチド、ならびに前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドが提供される。
【００２５】
本発明の他の態様によれば、前記ポリヌクレオチドまたはその相補的なポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドが提供される。
【００２６】
本発明の他の態様によれば、前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが提供される。
【００２７】
本発明の他の態様によれば、前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体が提供される。
【００２８】
本発明の他の態様によれば、前記ポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または前記ポリヌクレオチドのｃＤＮＡを含む、ＳＮＰを検出するためのマイクロアレイが提供される。
【００２９】
本発明の他の態様によれば、前記ポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または前記ポリヌクレオチドのｃＤＮＡを含む、ＳＮＰを検出するためのキットが提供される。
【００３０】
本発明の他の態様によれば、被験者から核酸試料を単離する段階と、配列番号１〜６０および２４１〜２４４のヌクレオチド配列の中の１以上のポリヌクレオチドの多型部位での対立遺伝子を決定する段階と、を含み、前記多型部位は前記ポリヌクレオチドの１０１番目のヌクレオチドに位置する、心筋梗塞の発生の危険度の変化を有する被験者を特定する方法が提供される。
【００３１】
本発明の他の態様によれば、核酸分子を含む試験サンプルを、配列番号１〜６０および２４１〜２４４のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドであって、少なくとも８個の連続したヌクレオチドおよび前記ヌクレオチド配列の１０１番目の塩基を含むポリヌクレオチド、ならびに前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドと厳しい条件下で特異的にハイブリダイズする試薬に接触させる段階と、ハイブリダイズした二本鎖の形成を検出する段階と、を含む、核酸分子中のＳＮＰを検出する方法が提供される。
【００３２】
本発明の他の態様によれば、候補物質を、配列番号１〜６０および２４１〜２４４のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドであって、少なくとも８個の連続したヌクレオチドおよび前記ヌクレオチド配列の１０１番目の塩基を含むポリヌクレオチド、ならびに前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに、結合複合体の形成に適した条件下で接触させる段階と、前記ポリペプチドと前記候補物質との間の結合複合体の形成を検出する段階と、を含む、心筋梗塞用の薬剤組成物をスクリーニングする方法が提供される。
【００３３】
本発明の他の態様によれば、アンチセンスヌクレオチドまたはＳｉ  ＲＮＡを、配列番号１〜６０および２４１〜２４４のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドであって、少なくとも８個の連続したヌクレオチドおよび前記ヌクレオチド配列の１０１番目の塩基を含むポリヌクレオチドと結合させる段階を含み、前記アンチセンスヌクレオチドおよびＳｉ  ＲＮＡは前記ポリヌクレオチドに特異的である、遺伝子発現を調節する方法が提供される。
【００３４】
本発明の上述の態様および利点は、その詳細な実施形態の記載によってより明らかになるであろう。
【００３５】
発明の詳細な説明
本発明の一態様による心筋梗塞と関連した一塩基多型（ＳＮＰ）は、配列番号１〜６０および２４１〜２４４のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドであって、少なくとも８個の連続したヌクレオチドおよび前記ヌクレオチド配列の１０１番目の塩基を含むポリヌクレオチド、ならびに前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドを含む。
【００３６】
配列番号１〜６０および２４１〜２４４のうち１つを含むポリヌクレオチドは、多型配列である。多型配列は、ポリヌクレオチド配列中にＳＮＰが存在する多型部位を含むヌクレオチド配列である。前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡでありうる。
【００３７】
本明細書中で、ＳＮＰは、個人のＤＮＡに約１ｋｂごとにみられるＤＮＡ配列多型のうち最も多く見られる１塩基対の違いでありうる。
【００３８】
本発明の実施例では、心血管疾患、特に心筋梗塞と密接に関連するＳＮＰを見出すために、一連の選択が行われた。心筋梗塞の患者および健常者の血液からＤＮＡを単離し、増幅した。前記ＤＮＡのＳＮＰ配列の解析の後、患者と健常者との間で出現頻度が顕著に異なるＳＮＰを同定した。実施例で同定された６４個のＳＮＰおよびその遺伝子型を表１〜３に開示する。
【００３９】
【表１−１】
2008545377.tif 000002
【００４０】
【表１−２】
2008545377.tif 000003
【００４１】
【表１−３】
2008545377.tif 000004
【００４２】
【表１−４】
2008545377.tif 000005
【００４３】
【表１−５】
2008545377.tif 000006
【００４４】
【表１−６】
2008545377.tif 000007
【００４５】
表１および２において、「配列番号」は、本発明の明細書に記載された、ＳＮＰを含むポリヌクレオチド配列の識別番号である。
【００４６】
「ａｌｉａｓ＿ｉｄ」は、本発明者らによって任意に指定されたＳＮＰの番号である。
【００４７】
「ｃａｓ＿ｎｕｍ」および「ｃｏｎ＿ｎｕｍ」は、それぞれ、前記ＳＮＰを有する患者および健常者の数を示す。
【００４８】
Ａｌｌｅｌｅ「Ａ」および「ａ」は、それぞれ、シーケノム（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）社の均質的ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤ（商標）技術に従う配列実験において、低質量の対立遺伝子および高質量の対立遺伝子を表し、実験の便宜上任意に指定される。
【００４９】
「ｃａｓ＿ＡＡ」、「ｃａｓ＿Ａａ」および「ｃａｓ＿ａａ」は、それぞれ、「ＡＡ」、「Ａａ」および「ａａ」の遺伝子型を有する患者の数を表す。また、「ｃｏｎ＿ＡＡ」、「ｃｏｎ＿Ａａ」および「ｃｏｎ＿ａａ」は、それぞれ、「ＡＡ」、「Ａａ」および「ａａ」の遺伝子型を有する健常者の数を表す。
【００５０】
「ＧＴＸ＿ｐ−ｖａｌ」は、フィッシャーの正確確率検定（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔ）を用いて遺伝子を調べて得られたｐ−値である。ｐ−値が０．０５以下である場合、疾患群と正常群との間で遺伝子型は同じではない、すなわち、有意であると決定された。
【００５１】
「ａｌｌｅｌｅ＿ＯＲ」は、遺伝子型に基づく、正常群におけるＳＮＰの確率に対する疾患群のＳＮＰの確率であるオッズ比（ｏｄｄｓ  ｒａｔｉｏ）である。
【００５２】
「ａｌｌｅｌｅ＿ＯＲ＿ＬＢ」および「ａｌｌｅｌｅ＿ＯＲ＿ＵＢ」は、それぞれ、前記オッズ比の９５％信頼区間の下限および上限を示す。前記オッズ比が１を超える場合、「Ａ」が危険因子であり、前記オッズ比が１未満である場合、「ａ」が危険因子である。信頼区間が１を含む場合、前記遺伝子型と前記疾患との間の関係が有意であると決定することはできない。
【００５３】
「ｃｏｎ＿ＨＷＸ＿ｐ−ｖａｌ」は、正常群におけるハーディー−ワインバーグ平衡（Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）を示す。ｐ−値が０．０５以下である場合、正常群はハーディー−ワインバーグ平衡にあると決定することはできない。
【００５４】
「ｇｅｎｅ＿ｎａｍｅ」は、前記ＳＮＰが属する遺伝子の名称である。
【００５５】
「ＳＮＰ＿ｆｕｎｃｔｉｏｎ」は、遺伝子中の前記ＳＮＰの位置である。
【００５６】
「ＡＡ＿ｃｈａｎｇｅ」は、ＳＮＰによってアミノ酸が変化するか否かを示す。
【００５７】
「ＡＡ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎ」は、ＳＮＰ部位によってコードされるアミノ酸のポリペプチドにおける位置を示す。
【００５８】
【表２−１】
2008545377.tif 000008
【００５９】
【表２−２】
2008545377.tif 000009
【００６０】
【表３】
2008545377.tif 000010
【００６１】
「ｃａｓ＿ａ」、「ｃｏｎ＿ａ」および「Ｄｅｌｔａ」は、それぞれ、疾患群における「ａ」の頻度、正常群における「ａ」の頻度、および「ｃａｓ＿ａ」と「ｃｏｎ＿ａ」との間の差の絶対値を示す。ここで、「ｃａｓ＿ａ」は（遺伝子型「ａａ」の頻度×２＋遺伝子型「Ａａ」の頻度）／（疾病群のサンプル数×２）で与えられ、「ｃｏｎ＿ａ」は（遺伝子型「ａａ」の頻度×２＋遺伝子型「Ａａ」の頻度）／（正常群のサンプル数×２）で与えられる。
【００６２】
「ｃｈｉ−ｖａｌｕｅ」は、カイ二乗検定を通して得られた値であり、ｐ−値の計算に用いられた。「ｃｈｉ−ｅｘａｃｔ−ｐ−ｖａｌｕｅ」は、カイ二乗検定のフィッシャーの正確確率検定のｐ−値を示し、遺伝子型の数が５より小さい場合はカイ二乗検定の結果が不正確でありうるため、統計的な有意性をより正確に決定するために用いられる変数である。ｐ−値が０．０５以下である場合、疾患群と正常群との間で遺伝子型が同じではない、すなわち、有意であると決定された。
【００６３】
「ＯＲ」は、疾患群および正常群において、特定の遺伝子型がどの程度の頻度で見られるかを示す比であり、（疾患群において特定の遺伝子型を有する患者の数）×（正常群において特定の遺伝子型を有さない人の数）／（疾患群において特定の遺伝子型を有さない患者の数）×（正常群において特定の遺伝子型を有する人の数）として計算される。「ＯＲ＿ＬＢ」、「ＯＲ＿ＵＢ」は、それぞれ、有意水準５％でのＯＲの信頼区間の最小値および最大値を示す。
【００６４】
表３の４つのＳＮＰはすべてＡＧＴ遺伝子上に位置する。
【００６５】
本発明の一態様による心筋梗塞診断のためのハプロタイプは、配列番号５７〜６０のポリヌクレオチドから構成されうる。互いのＳＮＰの連鎖不均衡（ＬＤ）を表４に開示する。表４に示すように、４つのＳＮＰは、強いＬＤブロックを構成した。
【００６６】
【表４】
2008545377.tif 000011
【００６７】
例えば、前記ハプロタイプを構成する配列番号５７〜６０のポリヌクレオチドのうち、ＳＮＰ部位である１０１番目の塩基が危険対立遺伝子でありうる。すなわち、前記ハプロタイプは、表５のハプロタイプ番号１または２でありうる。
【００６８】
【表５】
2008545377.tif 000012
【００６９】
表５中、「Ａ」または「ａ」は対立遺伝子を示す。例えば、ハプロタイプ番号１は、対立遺伝子が「Ａ」、「Ａ」、「Ａ」および「ａ」である、４個のＳＮＰを含むハプロタイプである。「Ｈａｐ．ｓｃｏｒｅ」は、前記ハプロタイプがいかに良好に被験者を正常群と疾患群とに分類しうるかを示す。「ｐ．ｖａｌ」が０．０５以下である場合、遺伝子型と疾患との間の関係が有意であると決定された。
【００７０】
または、本発明の一実施形態による心筋梗塞診断のためのハプロタイプは、配列番号２４１〜２４４のポリヌクレオチドにより構成されうる。
【００７１】
前記ハプロタイプを構成する配列番号２４１〜２４４のポリヌクレオチドのうち、ＳＮＰ部位である１０１番目の塩基が危険対立遺伝子でありうる。すなわち、前記ハプロタイプは、表６のハプロタイプ番号４または７でありうる。
【００７２】
【表６】
2008545377.tif 000013
【００７３】
「Ｈａｐ．Ｆｒｅｑｔｏｔａｌ＿ｆｒｅｑ」は、疾患群および正常群のハプロタイプの頻度を示す。
【００７４】
「ｙ．０  ｃｏｎ＿ｆｒｅｑ」は、正常群のハプロタイプの頻度を示す。
【００７５】
「ｙ．１  ｃａｓ＿ｆｒｅｑ」は、疾患群のハプロタイプの頻度を示す。
【００７６】
心血管疾患の発生はさまざまなな環境的因子または習慣的因子に影響されうるため、遺伝的因子のみを用いて心血管疾患の発生可能性を予測することは難しい。ある特定の特徴を有する患者に有意に関連するＳＮＰを選択した。また、心血管疾患の患者に存在するが、健常者には存在しないＳＮＰを同定した。
【００７７】
その結果、男性の非喫煙者は、配列番号５７〜６０のヌクレオチド配列のＳＮＰの存在と心筋梗塞の発生との間に、より有意な関係を示した。これは、表７で男性の非喫煙者は、高いオッズ比を有することから示された。したがって、本発明の一実施形態によれば、心筋梗塞の診断のためのＳＮＰは、配列番号５７〜６０のヌクレオチド配列であり、被験者は男性の非喫煙者でありうる。
【００７８】
【表７】
2008545377.tif 000014
【００７９】
本発明の一実施形態によるポリヌクレオチドは、配列番号２４１、配列番号２４３または配列番号２４４のヌクレオチド配列であってもよく、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）値が高い被験者の心筋梗塞の診断に用いられうる。
【００８０】
血中ＣＲＰ値は、炎症の程度を示し、心血管疾患の危険度を測定するために用いられる。心血管疾患を有する更年期の女性被験者のＣＲＰ値が０．４２ｍｇ／ｄｌであるのに対し、心血管疾患でない更年期の女性被験者のＣＲＰ値は０．２８ｍｇ／ｄｌであった（Ｒｉｄｋｅｒ  ＰＭ，Ｈｅｎｎｅｋｅｎｓ  ＣＨ，Ｂｕｒｉｎｇ  ＪＥ，Ｒｉｆａｉ  Ｎ．，Ｃ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｗｏｍｅｎ，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，２０００，３４２：ｐｐ．８３６−８４３）。
【００８１】
配列番号２４１、配列番号２４３および配列番号２４４のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドを有する被験者では、ＣＲＰ数値が高い被験者ほど相対的に心血管疾患の発生の可能性が高いと見積もることができるため、ＣＲＰ値は限定されない。
【００８２】
【表８】
2008545377.tif 000015
【００８３】
また、本発明の一実施形態によるポリヌクレオチドは、配列番号２４１、配列番号２４３もしくは配列番号２４４のヌクレオチド配列、またはその相補的なポリヌクレオチドであってもよく、若い被験者の心血管疾患の診断に用いられうる。
【００８４】
心筋梗塞に関しては、４５歳を超える男性、更年期に入った５５歳を超える女性が危険群であると知られている。
【００８５】
配列番号２４１、配列番号２４３および配列番号２４４のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドを有する被験者においては、若い被験者ほど相対的に心血管疾患の発生の可能性が低いと見積もることができるため、年齢は限定されない。
【００８６】
【表９】
2008545377.tif 000016
【００８７】
本発明の一実施形態によるポリヌクレオチドは、配列番号２４１、配列番号２４２もしくは配列番号２４４のヌクレオチド配列、またはその相補的なポリヌクレオチドであってもよく、糖尿病を有していない被験者の心血管疾患の診断に用いられうる。
【００８８】
表１０は、被験者が糖尿病を有していないときの、本発明の実施例から得られた結果を含む。
【００８９】
【表１０】
2008545377.tif 000017
【００９０】
本発明の一実施形態によるポリヌクレオチドは、配列番号２４１、配列番号２４２もしくは配列番号２４４のヌクレオチド配列、またはその相補的なポリヌクレオチドであってもよく、喫煙する被験者の心血管疾患の診断に用いられうる。
【００９１】
表１１は、被験者が喫煙するときの、本発明の実施例から得られた結果を含む。
【００９２】
【表１１】
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【００９３】
本発明の一実施形態によるポリヌクレオチドは、配列番号２４３、またはその相補的なポリヌクレオチドであってもよく、高いＴＧ値を有する被験者の心血管疾患の診断に用いられうる。
【００９４】
Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｍｕｎｓｔｅｒ（ＰＲＯＣＡＭ）の８年間の予測疫学的試験の結果として、空腹時のＴＧ値は心血管疾患の頻度と定量的に関連することが明らかになった。被験者が非常に高いＴＧ値、例えば４００〜７９９ｍｇ／ｄｌを有する場合、心血管疾患の発生率は正常なＴＧ値に対して３倍以上増加することが明らかになった。
【００９５】
配列番号２４３のポリヌクレオチドを有する被験者においては、高いＴＧ値を示す被験者は相対的に心血管疾患の発生の可能性が高いため、ＴＧ値は限定されない。
【００９６】
【表１２】
2008545377.tif 000019
【００９７】
本発明の一実施形態においては、ＳＮＰを含むポリヌクレオチドは、少なくとも８個の連続したヌクレオチド、例えば８〜７０個の連続したヌクレオチドを含みうる。
【００９８】
本発明の一態様においては、ポリヌクレオチドは、配列番号１〜６０および２４１〜２４４のポリヌクレオチド、またはその相補的なポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする。前記ポリヌクレオチドは、対立遺伝子特異的でありうる。
【００９９】
前記ポリヌクレオチドは、少なくとも８個の連続したヌクレオチド、例えば８〜７０個の連続したヌクレオチドを含みうる。
【０１００】
対立遺伝子特異的ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの各対立遺伝子塩基に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。ハイブリダイゼーションは、配列番号１〜６０および２４１〜２４４の多型配列のうち、多型部位の塩基を特異的に区別するために行われうる。ハイブリダイゼーションは、厳しい条件下、例えば、１Ｍ以下の塩濃度および２５℃以上の温度で行われうる。例えば、５×ＳＳＰＥ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）および２５〜３０℃が、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーションに適した条件でありうる。
【０１０１】
本発明の一実施形態において、前記対立遺伝子特異的ポリヌクレオチドは、プライマーでありうる。プライマーとは、適切なバッファ中で適切な条件下で（例えば、４個の異なるヌクレオチド三リン酸、およびＤＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素のような重合剤の存在下、適当な温度で）、テンプレート指示ＤＮＡの合成を開始することができる一本鎖のオリゴヌクレオチドである。前記プライマーの長さは使用目的によって変わりうるが、本発明の実施形態においては１５〜３０個のヌクレオチドである。短いプライマー分子は、テンプレートと安定にハイブリダイズするために、より低い温度を必要としうる。プライマー配列は、必ずしもテンプレートと完全に相補的である必要はなく、前記テンプレートとハイブリダイズするのに十分に相補的であればよい。前記プライマーの３’末端は、配列番号１〜６０および２４１〜２４４の多型部位に対応するように配列される。前記プライマーは、多型部位を含む標的ＤＮＡとハイブリダイズし、前記プライマーと完全な相同性を有する対立遺伝子の増幅を開始する。前記プライマーおよび他方の側でハイブリダイズする他のプライマーが、プライマー対として用いられる。２つのプライマーから増幅が行われ、これはポリヌクレオチドに特異的対立遺伝子が存在することを意味する。本発明の一実施形態によれば、前記プライマーは、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）で用いられるポリヌクレオチド断片を含む。例えば、前記プライマーは、以下の実施例で用いられるプライマーでありうる。
【０１０２】
本発明の一実施形態によれば、対立遺伝子特異的ポリヌクレオチドは、プローブでありうる。前記プローブはハイブリダイゼーションプローブであり、これは核酸の相補的な鎖に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドである。このようなプローブとしては、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４，１４９７−１５００（１９９１）に記載されたペプチド核酸がある。本発明の一実施形態によれば、前記プローブは対立遺伝子特異的プローブである。多型部位が同じ種の２つの構成員に由来する核酸の断片に位置する場合、前記対立遺伝子特異的プローブは１つの構成員に由来するＤＮＡ断片にはハイブリダイズしうるが、他方の構成員に由来する断片にはハイブリダイズしえない。この場合、ハイブリダイゼーションの条件は、異なる対立遺伝子のハイブリダイゼーション強度に有意な差を与えるように、１つの対立遺伝子のみがハイブリダイズするのに適当でありうる。本発明の一実施形態によれば、前記プローブは、その中央部位（例えば、１５個のヌクレオチドからなるプローブの７番目の位置、または１６個のヌクレオチドからなるプローブの８番目または９番目の位置）が前記配列の多型部位となるように配列される。このように、異なる対立遺伝子に対するハイブリダイゼーションの差が得られうる。本発明の一実施形態によれば、前記プローブは、対立遺伝子を検出するための診断方法などに用いられうる。前記診断方法は、検出が核酸のハイブリダイゼーションを用いて行われるサザンブロッティング、またはあらかじめプローブが結合したマイクロアレイを用いる方法でありうる。
【０１０３】
本発明の一態様によるポリペプチドは、配列番号１〜６０および２４１〜２４４のポリヌクレオチドによってコードされる。
【０１０４】
特に、ＣＹＢＡ遺伝子に位置するＭＩ＿１５０３を含む配列番号５６のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸が変化した。ＭＳＴ１Ｒ遺伝子に位置するＭＩ＿１２６４を含む配列番号５０のポリヌクレオチドおよびポリメラーゼ・イオタ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｉｏｔａ）遺伝子に位置するＭＩ＿１２４８を含む配列番号５８のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸もまた変化した。３個のアミノ酸が変化した部位は、それぞれＣＹＢＡタンパク質の７２番目のアミノ酸、ＭＳＴ１Ｒタンパク質の１３３５番目のアミノ酸、およびポリメラーゼ・イオタタンパク質の７０６番目のアミノ酸である。
【０１０５】
本発明の一態様による抗体は、前記ポリペプチドに特異的に結合する。前記抗体は、モノクローナル抗体でありうる。
【０１０６】
本発明の一態様によるマイクロアレイは、配列番号１〜６０および２４１〜２４４のヌクレオチド配列のポリヌクレオチド、その相補的なポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドの１つとハイブリダイズするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドの１つによってコードされるポリペプチド、またはそのｃＤＮＡを含む。
【０１０７】
前記マイクロアレイは、前記ポリヌクレオチド、プローブもしくは前記プローブとハイブリダイズするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドの１つによってコードされるポリペプチド、またはそのｃＤＮＡを利用して、当業者に周知の一般的な方法を用いて調製されうる。
【０１０８】
例えば、前記ポリヌクレオチドは、アミノシラン、ポリ−Ｌ−リシン（ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）またはアルデヒドの活性基でコートされた基板に固定化されうる。また、前記基板は、シリコン、ガラス、石英、金属またはプラスチックから構成されうる。前記ポリヌクレオチドは、圧電法を利用したマイクロピペッティングによって、またはピンの形状のスポッタを利用して前記基板に固定化されうる。
【０１０９】
本発明の一態様によるキットは、配列番号１〜６０および２４１〜２４４のヌクレオチド配列のポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドの１つとハイブリダイズするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドの１つによってコードされるポリペプチド、またはそのｃＤＮＡを含む。
【０１１０】
前記キットは、ＳＮＰを含むＤＮＡを診断される被験者から単離し、前記ＤＮＡを増幅するために用いられるプライマーセットをさらに含んでもよい。適切なプライマーセットは、当業者によって決定されうる。例えば、本発明の実施例におけるプライマーセットが利用できる。また、前記キットは、重合反応のための試薬、例えば、ｄＮＴＰ、各種の重合酵素および発色剤などをさらに含んでもよい。
【０１１１】
本発明の一態様による特定方法は、心筋梗塞の発生の危険度の変化を有する被験者を特定するためのＳＮＰの利用を含む。
【０１１２】
前記特定方法は、被験者から核酸試料を単離する段階と、配列番号１〜６０および２４１〜２４４のうち１以上のポリヌクレオチドの多型部位での対立遺伝子型を決定する段階とを含み、前記多型部位は前記ポリヌクレオチドの１０１番目のヌクレオチドに位置する。
【０１１３】
本発明の一実施形態において、被験者からのＤＮＡの単離は、当業者に周知の方法を実行することによって実施されうる。例えば、ＤＮＡが組織もしくは細胞から直接精製されてもよく、または特定の部位がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などを使用して増幅され、その後単離されてもよい。本明細書中、ＤＮＡは、ＤＮＡだけではなく、ｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡも意味する。核酸は、例えば、ＰＣＲ増幅、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４，５６０（１９８９）；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，ｅｔｃ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１，１０７７（１９８８））、転写増幅（Ｋｗｏｈ，ｅｔｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，１１７３（１９８９）），自己維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，ｅｔｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，１８７４（１９９０））または核酸配列に基づいた配列増幅（ＮＡＳＢＡ）を用いて被験者から得られうる。
【０１１４】
単離されたＤＮＡのシークエンシングは、当業者に周知の多様な方法によって行われうる。例えば、核酸のヌクレオチドは、ジデオキシ法を用いて直接シークエンシングされうる。また、多型部位のヌクレオチドは、ＤＮＡをＳＮＰ部位の配列を含むプローブ、およびその相補的なプローブとハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーションの程度を調べることによってシークエンシングされうる。ハイブリダイゼーションの程度は、標的ＤＮＡの検出可能な指標を表示させ、ハイブリダイズされた標的を特異的に検出する方法を用いて、または電気信号を検出する方法を用いて測定されうる。
【０１１５】
特に、シークエンシングは、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーション（ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｂｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法、対立遺伝子特異的増幅（ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、シークエンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）法、５’ヌクレアーゼ分解（５’ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）法、分子ビーコンアッセイ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ  ａｓｓａｙ）法、オリゴヌクレオチド結合アッセイ（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）法、大きさ分析（ｓｉｚｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）法または一本鎖配座多型（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法を用いて行われうる。
【０１１６】
本発明の一実施形態において、心筋梗塞を診断する方法は、配列番号１〜６０および２４１〜２４４の１以上のポリヌクレオチドの多型部位での対立遺伝子が危険対立遺伝子である場合、被験者は心筋梗塞の発生の危険度の増加を有すると判断する段階をさらに含んでもよい。
【０１１７】
本発明の一実施形態によれば、危険対立遺伝子は、対立遺伝子「Ａ」を基準として決定される。疾患群における対立遺伝子「Ａ」の頻度が正常群における「Ａ」の頻度よりも高い場合、「Ａ」を危険対立遺伝子と考える。その反対の場合、「ａ」を危険対立遺伝子と考える。危険対立遺伝子を多く有する被験者ほど、心筋梗塞を有する可能性が高い。
【０１１８】
本発明の一実施形態において、危険度は、危険度の増加または危険度の減少でありうる。ある対立遺伝子の頻度が疾患群よりも正常群においてより高い場合、前記対立遺伝子を有する被験者の危険度は減少しうる。一方、ＳＮＰの対立遺伝子の頻度が正常群よりも疾患群においてより高い場合、前記対立遺伝子を有する被験者の危険度は増加しうる。
【０１１９】
本発明の一実施形態による心筋梗塞を診断する方法において、被験者は男性で喫煙をせず、被験者の多型部位での対立遺伝子を決定するポリヌクレオチドは配列番号５７〜６０のヌクレオチド配列でありうる。
【０１２０】
また、被験者は高いＣＲＰ値を有してもよく、このとき被験者の多型部位での対立遺伝子を決定するポリヌクレオチドは配列番号２４１、２４３または２４４のヌクレオチド配列でありうる。
【０１２１】
被験者は若くてもよく、このとき被験者の多型部位での対立遺伝子を決定するポリヌクレオチドは配列番号２４１、２４３または２４４のヌクレオチド配列でありうる。
【０１２２】
被験者は糖尿病ではなくてもよく、このとき被験者の多型部位での対立遺伝子を決定するポリヌクレオチドは配列番号２４１、２４３または２４４のヌクレオチド配列でありうる。
【０１２３】
被験者は喫煙をしてもよく、このとき被験者の多型部位での対立遺伝子を決定するポリヌクレオチドは配列番号２４１、２４２または２４４のヌクレオチド配列でありうる。
【０１２４】
被験者は高いＴＧ値を有してもよく、このとき被験者の多型部位での対立遺伝子を決定するポリヌクレオチドは配列番号２４３でありうる。
【０１２５】
本発明の一実施形態による心筋梗塞を診断する方法において、ハプロタイプが用いられうる。ポリヌクレオチドは配列番号５７〜６０から構成されうる。または、ポリヌクレオチドは配列番号２４１〜２４４から構成されうる。
【０１２６】
本発明の一態様による核酸分子中のＳＮＰを検出する方法は、核酸分子を含む試験サンプルを、配列番号１〜６０および２４１〜２４４のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドであって、少なくとも８個の連続したヌクレオチドおよび前記ヌクレオチド配列の１０１番目の塩基を含むポリヌクレオチド、ならびに前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドと厳しい条件下で特異的にハイブリダイズする試薬に接触させる段階と、ハイブリダイズした二本鎖の形成を検出する段階と、を含む。
【０１２７】
前記ハイブリダイズした二本鎖の形成を検出する段階は、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーション、対立遺伝子特異的増幅、シークエンシング、５’ヌクレアーゼ分解、分子ビーコンアッセイ、オリゴヌクレオチド結合アッセイ、大きさ分析、または一本鎖配座多型を用いて行われうる。
【０１２８】
本発明の一態様による心筋梗塞のための薬剤組成物をスクリーニングする方法は、候補物質を、配列番号１〜６０および２４１〜２４４のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドであって、少なくとも８個の連続したヌクレオチドおよび前記ヌクレオチド配列の１０１番目の塩基を含むポリヌクレオチド、ならびに前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに、結合複合体の形成に適した条件下で接触させる段階と、前記ポリペプチドおよび前記候補物質からの結合複合体の形成を検出する段階と、を含む。
【０１２９】
前記結合複合体の形成を検出する段階は、免疫沈殿（ｃｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、放射免疫分析（ＲＩＡ）、酵素免疫分析（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学、ウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）または蛍光励起細胞分取装置（ＦＡＣＳ）によって行われうる。
【０１３０】
本発明の一実施形態による遺伝子発現を調節する方法はアンチセンスヌクレオチドまたはＳｉ  ＲＮＡを、配列番号１〜６０および２４１〜２４４のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドであって、少なくとも８個の連続したヌクレオチドおよび前記ヌクレオチド配列の１０１番目の塩基を含むポリヌクレオチド、ならびに前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドと結合させる段階を含み、前記アンチセンスヌクレオチドおよびＳｉ  ＲＮＡは前記ポリヌクレオチドに特異的である。
【０１３１】
有利な効果
本発明による心筋梗塞に関連するＳＮＰおよびハプロタイプは、心筋梗塞の診断および治療ならびに遺伝子指紋解析に用いられうる。本発明のＳＮＰを含むマイクロアレイおよびキットを用いると、心筋梗塞を効果的に診断できる。本発明の心筋梗塞に関連したＳＮＰを解析する方法によれば、心筋梗塞の存在または危険度の存在を効果的に診断できる。
【実施例】
【０１３２】
最良の形態
以下、本発明を下記の実施例を参照してさらに詳細に説明する。下記の実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【０１３３】
実施例１
ＳＮＰの選択
心血管疾患と診断され、治療を受けた疾患群の血液からＤＮＡを単離し、心血管疾患の症状のない正常群の血液からＤＮＡを単離し、次いで特定のＳＮＰの出現頻度を解析した。いずれの群も韓国人から構成された。本発明の実施例のＳＮＰは、公開されたデータベース（ＮＣＢＩ  ｄｂＳＮＰ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／）またはシーケノム社のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅａｌｓｎｐ．ｃｏｍ／）のいずれかから選択された。ＳＮＰは、選択されたＳＮＰに近いプライマーを使用して解析された。
【０１３４】
１−１．ＤＮＡ試料の調製
心筋梗塞と診断された２２１人の韓国人男性患者からなる疾患群の血液からＤＮＡを抽出し、心筋梗塞の症状のない１９２人の韓国人男性からなる正常群からＤＮＡを抽出した。染色体ＤＮＡの抽出は、公知の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｐ．３９２，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）および市販のキット（Ｇｅｎｔｒａ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｄ−５０Ｋ）の説明書に従って行われた。抽出されたＤＮＡのうち、ＵＶ吸収比（２６０／２８０ｎｍ）が少なくとも１．７であるＤＮＡのみを選択した。
【０１３５】
１−２．標的ＤＮＡの増幅
分析しようとするＳＮＰを含む特定のＤＮＡ領域を含む標的ＤＮＡを、ＰＣＲを用いて増幅した。ＰＣＲは、一般的な方法を用いて行い、その条件は、以下に示す通りであった。はじめに２．５ｎｇ／ｍｌの標的ゲノムＤＮＡを準備した。次に、以下のＰＣＲ反応溶液を準備した。
【０１３６】
水（ＨＰＬＣグレード）  ３．１４□
１０×バッファ  ０．５□
ＭｇＣｌ２  ２５ｍＭ  ０．２□
ｄＮＴＰ混合物（ＧＩＢＣＯ）（各２５ｍＭ）  ０．０４□
Ｔａｑ  ｐｏｌ（ＨｏｔＳｔａｒｔ）（５Ｕ／□）  ０．０２□
フォワード／リバースプライマー混合物（１０μＭ）  ０．１□
ＤＮＡ  １．００□
総体積  ５．００□
ここで、前記フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、ＳＮＰから適当な位置で上流および下流を選択した。プライマーセットを表１３に示した。
【０１３７】
ＰＣＲの熱循環は、９５℃で１５分間維持し、続いて９５℃で３０秒、５６℃で３０秒、および７２℃で１分を合計４５回反復し、７２℃で３分間維持した後、４℃に保管した。その結果、２００ヌクレオチド以下の長さを有する標的ＤＮＡ断片を得た。
【０１３８】
１−３．増幅された標的ＤＮＡのＳＮＰの分析
標的ＤＮＡ断片におけるＳＮＰの分析は、シーケノム社の均質的Ｍａｓｓ  Ｅｘｔｅｎｄ（ｈＭＥ）法を用いて行った。ｈＭＥ法の原理は以下の通りである。まず、標的ＤＮＡ断片のＳＮＰの直前までの塩基に相補的なプライマー（伸長プライマーともいう）を調製した。次に、前記プライマーを標的ＤＮＡ断片とハイブリダイズさせ、ＤＮＡ重合を促進した。このとき、被験者のＳＮＰ対立遺伝子のうち、第１対立遺伝子の塩基（例えば、「Ａ」対立遺伝子）に相補的な塩基が添加された後、重合を終止させる試薬（終止混合物、例えば、ｄｄＴＴＰ）を前記反応溶液に添加した。その結果、標的ＤＮＡ断片に第１対立遺伝子（例えば、「Ａ」対立遺伝子）が含まれる場合には、前記第１対立遺伝子に相補的な１つの塩基（例えば、「Ｔ」）だけを有する産物が得られる。一方、標的ＤＮＡ断片に第２対立遺伝子（例えば、「Ｇ」対立遺伝子）が含まれる場合には、前記第２対立遺伝子に相補的な塩基（例えば、「Ｃ」）を有し、第１対立遺伝子の塩基（例えば、「Ａ」）まで伸びた産物が得られる。プライマーから伸びた産物の長さを質量分析を用いて決定し、標的ＤＮＡの対立遺伝子の型を決定した。具体的な実験条件は、以下の通りであった。
【０１３９】
まず、遊離ｄＮＴＰをＰＣＲ産物から除去した。このために、純水１．５３□、ｈＭＥバッファ０．１７□、エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）０．３０□を１．５ｍｌチューブに入れて混合し、ＳＡＰ酵素溶液を準備した。前記チューブを５，０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離した。その後、ＰＣＲ産物を前記ＳＡＰ溶液チューブに入れ、密封して３７℃で２０分、および８５℃で５分間維持した後、４℃で保管した。
【０１４０】
次に、前記標的ＤＮＡ産物をテンプレートとして均質な伸長を実施した。反応溶液は、以下の通りであった。
【０１４１】
水（ナノピュアグレード）１．７２８□
ｈＭＥ伸長混合物（２．２５ｍＭのｄ／ｄｄＮＴＰｓを含む１０×バッファ）０．２００□
伸長プライマー（各１００μＭ）０．０５４□
サーモシークエナーゼ（３２Ｕ／□）０．０１８□
総体積  ２．００□
前記反応溶液をよく混合した後、スピンダウン遠心分離した。前記反応溶液の入ったチューブまたはプレートを密封し、９４℃で２分間維持し、９４℃で５秒間、５２℃で５秒間、７２℃で５秒間を、合わせて４０回反復した後、４℃に保管した。得られた均質な伸長の産物を樹脂で洗浄し、塩の量を減少させた（ＳｐｅｃｔｒｏＣＬＥＡＮ、シーケノム社、＃１００５３）。均質な伸長に用いられた伸長プライマーを表１３に示した。
【０１４２】
【表１３−１】
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【０１４３】
【表１３−２】
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【０１４４】
【表１３−３】
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【０１４５】
【表１３−４】
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【０１４６】
得られた伸長産物について、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を用いて質量分析を行い、多型部位の配列を決定した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにおいては、分析しようとする物質はレーザー光を照射され、イオン化マトリックス（例えば３−ヒドロキシピコリン酸）と共に真空中を検出器まで飛行する。検出器までの飛行時間を計算し、質量を決定した。軽い物質は、重い物質よりもより短い時間で検出器に到達することができる。標的ＤＮＡにおけるＳＮＰのヌクレオチド配列は、質量の違いとＳＮＰの既知のヌクレオチド配列とに基づいて決定されうる。
【０１４７】
１−４．ＳＮＰの選択
心筋梗塞と診断され治療を受けた韓国人男性患者２２１人からなる疾患群の対立遺伝子頻度と、心筋梗塞の症状のない韓国人男性１９２人からなる正常群の対立遺伝子頻度とを比較した。前記頻度に基づいて、関連性試験（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）であるフィッシャーの正確確立検定を行った。
【０１４８】
対立遺伝子の９５％信頼区間でのオッズ比を用いてエフェクトサイズを仮定した。正常群がある対立遺伝子を疾患群よりも高い頻度で有する場合、この対立遺伝子は心筋梗塞の危険度の減少と関連があると決定され、他の対立遺伝子は心筋梗塞の危険対立遺伝子であると決定された。一方、疾患群がある対立遺伝子を正常群よりも高い頻度で有する場合、この対立遺伝子は危険対立遺伝子であると決定された。
【０１４９】
ＳＮＰの対立遺伝子関連性試験で、ｐ−値が０．０５以下である場合、前記ＳＮＰを顕著な遺伝子マーカーであると見なした。
【０１５０】
結果を表１〜３に示す。表１〜３に示すように、心筋梗塞に関連した６４個のＳＮＰが同定された。
【０１５１】
１−５．ハプロタイプの選択
ＤＮＡ修復に関連するポリメラーゼ・イオタ遺伝子の、配列番号５７〜６９の４個のＳＮＰを表５に開示する。また、配列番号２４１〜２４４の４個のＳＮＰを表６に開示する。
【０１５２】
１−６．ＳＮＰの環境的因子または習慣的因子依存性の調査
心筋梗塞と診断され治療を受けた２２１人の韓国人男性患者からなる疾患群と、心筋梗塞の症状のない１９２人の韓国人男性からなる正常群とを、それぞれ心筋梗塞と関連した環境的因子または習慣的因子に関する危険度の程度を考慮してサブグループに分類し、対立遺伝子頻度を比較した。結果を表７〜１２に示した。
【０１５３】
実施例２
ＳＮＰが固定されたマイクロアレイの調製
選択されたＳＮＰを基板上に固定してマイクロアレイを調製した。すなわち、２０個の連続したヌクレオチドを含む配列番号１〜６０および２４１〜２４４のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドが基板に固定され、各ＳＮＰ（前記ヌクレオチド配列の１０１番目の塩基）は、２０個のヌクレオチドの１１番目に位置した。
【０１５４】
まず、各ポリヌクレオチドのＮ−末端をアミン基で置換し、前記ポリヌクレオチドを、２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）のスポッティングバッファを用いてシリル化スライド（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ社製）上にスポッティングした。スポッティング後、乾燥器中で結合を誘導し、０．２％ＳＤＳ溶液で２分間、３次蒸留水で２分間洗浄して結合していないオリゴヌクレオチドを除去した。スライドの温度を９５℃に２分間上昇させて変性を誘導し、ブロッキング溶液（ＮａＢＨ４  １．０ｇ、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）３００ｍＬ、ＥｔＯＨ  １００ｍＬ）で１５分間、０．２％ＳＤＳ溶液で１分間、三次蒸留水で２分間洗浄して、次いで室温で乾燥させることでマイクロアレイを調製した。
【０１５５】
実施例３
マイクロアレイを利用した心筋梗塞の診断
心筋梗塞の発生または発生可能性を診断するために、実施例の１−１および１−２に記載の方法を利用して被験者の血液から標的ＤＮＡを単離し、蛍光物質で標識した。蛍光標識した標的ＤＮＡを、実施例２で調製したマイクロアレイと、ＵｎｉＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（ＴｅｌｅＣｈｅｍ社製）中で、４２℃で４時間ハイブリダイズさせた。スライドを２回、室温で５分間２×ＳＳＣで洗浄した後、空気中で乾燥させた。乾燥させたスライドをＳｃａｎＡｒｒａｙ５０００（ＧＳＩ  Ｌｕｍｏｎｉｃｓ社製）を用いてスキャンした。スキャン結果をＱｕａｎｔＡｒｒａｙ（ＧＳＩ  Ｌｕｍｏｎｉｃｓ社製）およびＩｍａＧｅｎｅソフトウェア（ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒ社製）を用いて解析した。心筋梗塞の発生の可能性およびそれに対する感受性を、本発明の一実施形態にによるＳＮＰを被験者が有しているか否かを同定することによって測定した。
【０１５６】
本発明は特にその典型的な実施形態を参照して説明され、記載されてきたが、当業者であれば、以下の特許請求の範囲によって定められた本発明の趣旨および技術的範囲から逸脱することなく、多様な変更および変形が可能であるということを理解することができるであろう。
【配列表】
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【国際調査報告】
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