(57)【要約】本発明は、ＮＰＣ１  Ｌ１インヒビターの同定に有用である、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓワームにおいて行なわれる機能アッセイに関連している。このようなアッセイの実施に有用な組成物もまた、提供される。本発明は、腸のコレステロール吸収を阻害するか、上昇した総コレステロールを減少するか、上昇した低密度リポタンパクコレステロールを減少するか、上昇したアポリポタンパクＢを減少するか、ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するか、非家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するか、ホモ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するか、あるいはホモ接合性フィトステロール血症を処置もしくは予防する物質を同定するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸のコレステロール吸収を阻害するか、上昇した総コレステロールを減少するか、上昇した低密度リポタンパクコレステロールを減少するか、上昇したアポリポタンパクＢを減少するか、ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するか、非家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するか、ホモ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するか、あるいはホモ接合性フィトステロール血症を処置もしくは予防する物質を同定するための方法であって、該方法は：
（ａ）機能性ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドは有するが、機能性ｎｃｒ−１ポリペプチドおよび機能性ｎｃｒ−２ポリペプチドを欠くＣ．ｅｌｅｇａｎｓワームと、テストされる該物質とを接触させる工程；および
（ｂ）該ワームがｄａｕｅｒ表現型を示すかどうかを決定する工程；
を包含し、それにより、該ｄａｕｅｒ表現型が観察された場合、該物質が、腸のコレステロール吸収のインヒビターであるか、上昇した総コレステロールを減少し得るか、上昇した低密度リポタンパクコレステロールを減少し得るか、上昇したアポリポタンパクＢを減少し得るか、ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するのに有用であるか、非家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するのに有用であるか、ホモ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するのに有用であるか、あるいはホモ接合性フィトステロール血症を処置もしくは予防するのに有用であることが同定される、方法。
【請求項２】
前記表現型が視診により同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＮＰＣ１Ｌ１がヒトＮＰＣ１Ｌ１である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒトＮＰＣ１Ｌ１が配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
腸のコレステロール吸収を阻害するか、上昇した総コレステロールを減少するか、上昇した低密度リポタンパクコレステロールを減少するか、上昇したアポリポタンパクＢを減少するか、ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するか、非家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するか、ホモ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するか、あるいはホモ接合性フィトステロール血症を処置もしくは予防する物質を同定するための方法であって、該方法は：
（ａ）機能性ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドは有するが、機能性ｎｃｒ−１ポリペプチドおよび機能性ｎｃｒ−２ポリペプチドを欠くＣ．ｅｌｅｇａｎｓワームと、テストされる該物質とを接触させる工程；および
（ｂ）該ワームがキチナーゼを分泌するかどうかを決定する工程；
を包含し、それにより、キチナーゼが分泌されない場合、該物質が、腸のコレステロール吸収のインヒビターであるか、上昇した総コレステロールを減少し得るか、上昇した低密度リポタンパクコレステロールを減少し得るか、上昇したアポリポタンパクＢを減少し得るか、ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するのに有用であるか、非家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するのに有用であるか、ホモ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するのに有用であるか、あるいはホモ接合性フィトステロール血症を処置もしくは予防するのに有用であることが同定される、方法。
【請求項６】
基質４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリアセチルキト−トリオシドの切断を測定することでキチナーゼが検出される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＮＰＣ１Ｌ１がヒトＮＰＣ１Ｌ１である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒトＮＰＣ１Ｌ１が配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
腸のコレステロール吸収を阻害するか、上昇した総コレステロールを減少するか、上昇した低密度リポタンパクコレステロールを減少するか、上昇したアポリポタンパクＢを減少するか、ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するか、非家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するか、ホモ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するか、あるいはホモ接合性フィトステロール血症を処置もしくは予防する物質を同定するための方法であって、該方法は：
（ａ）機能性ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドを有し、かつレポーターに作動可能に連結する成体特異的Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓプロモーターを有するが、機能性ｎｃｒ−１ポリペプチドおよび機能性ｎｃｒ−２ポリペプチドを欠くＣ．ｅｌｅｇａｎｓ細胞とテストされる該物質を接触させる工程；および
（ｂ）該プロモーターによる発現が起こるかどうかを決定する工程：
を包含し、それにより、該発現が検出されない場合、該物質が、腸のコレステロール吸収のインヒビターであるか、上昇した総コレステロールを減少し得るか、上昇した低密度リポタンパクコレステロールを減少し得るか、上昇したアポリポタンパクＢを減少し得るか、ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するのに有用であるか、非家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するのに有用であるか、ホモ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するのに有用であるか、あるいはホモ接合性フィトステロール血症を処置もしくは予防するのに有用であることが同定される、方法。
【請求項１０】
前記ＮＰＣ１Ｌ１がヒトＮＰＣ１Ｌ１である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヒトＮＰＣ１Ｌ１が配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記成体特異的Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓプロモーターが、ｃｏｌ−１９プロモーターおよびｖｉｔ−２プロモーターからなる群から選択されるメンバーである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記リポーターが、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ  ＬｕｘＡ−Ｅ、ＦＭＮオキシドレダクターゼ；ａｍＦＰ４８６；ｚＦＰ５０６；ｚＦＰ５３８；ｄｓＦＰ４８３；ｄｒＦＰ５８３；ｃＦＰ４８４；Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ  ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓルシフェラーゼ；クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）；β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）；Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉルシフェラーゼ；Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ；Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼ；緑色蛍光タンパク質；β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）およびキチナーゼからなる群から選択されるメンバーである、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
ＮＰＣ１Ｌ１を生成する方法であって、該方法はプロモーターと作動可能に連結するＮＰＣ１Ｌ１をコードするポリヌクレオチドをＣ．ｅｌｅｇａｎｓ細胞に導入し、該細胞を増殖させる工程を包含する、方法。
【請求項１５】
前記ＮＰＣ１Ｌ１が前記増殖細胞から単離された、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
単離されたトランスジェニックＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓワームであって、該ワームの細胞が機能性ｎｃｒ−１タンパク質および機能性ｎｃｒ−２タンパク質を欠き、機能性ＮＰＣ１Ｌ１タンパク質を有する、ワーム。
【請求項１７】
機能性ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドは有するが、機能性ｎｃｒ−１ポリペプチドおよび機能性ｎｃｒ−２ポリペプチドを欠いているＮ２系統である、請求項１６に記載のワーム。
【請求項１８】
前記ＮＰＣ１Ｌ１がヒトＮＰＣ１Ｌ１である、請求項１６に記載のワーム。
【請求項１９】
前記ヒトＮＰＣ１Ｌ１が配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載のワーム。
【請求項２０】
請求項１６に記載のワームであって、該ワームの細胞がＣ．ｅｌｅｇａｎｓ染色体内に組み込まれたＮＰＣ１Ｌ１ポリヌクレオチドを含む、ワーム。
【請求項２１】
請求項１６に記載のワームであって、該ワームの細胞が、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓプロモーターと作動可能に結合する機能性ＮＰＣ１Ｌ１をコードするポリヌクレオチドを含む、ワーム。
【請求項２２】
前記プロモーターが、ｎｃｒ−１プロモーターおよびｎｃｒ−２プロモーターからなる群から選択される、請求項２１に記載のワーム。
【請求項２３】
２ａ系統、２ｂ系統、３系統、４ａ系統および４ｂ系統からなる群から選択される、単離されたトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓワーム。
【請求項２４】
単離されたトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓワームであって、該ワームの細胞が機能性ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドを含む、ワーム。
【請求項２５】
ｎｃｒ−１ｐ／ｈＮＰＣ１Ｌ１／４９．２６；ｎｃｒ−２ｐ／ｈＮＰＣ１Ｌ１／４９．２６およびｎｃｒ−１ｐ／ＧＦＰ／４９．２６からなる群から選択される、単離されたプラスミド。
【請求項２６】
配列番号７〜配列番号１４からなる群から選択される、単離されたオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００４年１２月１５日に出願された米国仮特許出願番号６０／６３６，３９０の利益を主張し、これは本明細書中にその全体が参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ細胞およびそれらを使用する方法に関連している。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
産業の発達した国家において主要な死因である、血管疾患の発病を起こす要因は、上昇した血清コレステロールである。２０歳と７４歳との間の年齢の１９％のアメリカ人が高血清コレステロールを有すると概算される。血管疾患の最も有病率の高い形態は、動脈壁の肥厚化および硬化に関連した状態である、動脈硬化である。大血管の動脈硬化を、アテローム性動脈硬化症と呼ぶ。アテローム性動脈硬化症は、血管障害（例えば、冠状動脈疾患、大動脈瘤、下肢の動脈疾患、および脳血管性疾患）における主な根本的な要因である。
【０００４】
コレステロールエステルは、アテローム性動脈硬化症の病変の主要成分であり、動脈壁細胞におけるコレステロールの主要な貯蔵形態である。コレステロールエステルの形成はまた、食事性コレステロールの腸吸収における工程でもある。ゆえに、コレステロールエステル形成の阻害および血清コレステロールの減少は、アテローム性動脈硬化症の病変形成の進行を阻害し得、動脈壁におけるコレステロールエステルの蓄積を減少し得、そして食事性コレステロールの腸吸収を遮断し得る。
【０００５】
哺乳動物および動物の全身コレステロールホメオスタシスの調節は、腸のコレステロール吸収、細胞のコレステロール輸送、食事性コレステロールおよびコレステロール生合成の調整、胆汁酸生合成の調整、ステロイド生合成の調整の調節、ならびにコレステロール含有の血漿リポタンパクの異化作用を包含する。腸のコレステロール吸収の調節は、血清コレステロールレベルを調節するための有効な手段であることが証明されている。
【０００６】
腸におけるコレステロール吸収を媒介する１つのタンパク質は、ＮＰＣ１Ｌ１タンパク質である。このＮＰＣ１Ｌ１タンパク質は、ＮＰＣ１を含むいくつかのタンパク質に対する配列類似性を有する。ＮＰＣ１Ｌ１のホモログが線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓにおいて同定されている。
【０００７】
線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓは、コレステロール栄養素要求系統である（実験室条件下で、ワームが生存するために外因性コレステロールが成長培地に加えられなければならない）（非特許文献１）。ゆえに、この生物は、コレステロールの輸送、吸収および機能のための有用なモデルとして働き得る（概説としては、非特許文献２を参照のこと）。ヒトＮＰＣ遺伝子のホモログの可能性のある、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの２つのタンパク質は、ｎｃｒ−１およびｎｃｒ−２と呼ばれる（Ｎｅｉｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ  Ｃ ｒｅｌａｔｅｄとして；以前はｎｐｃ−１およびｎｐｃ−２と呼ばれていた）。このＮＣＲ−１タンパク質およびＮＣＲ−２タンパク質は、ヒトＮＰＣ１と２７％同一であり、ヒトＮＰＣ１Ｌ１と２６％同一である。
【０００８】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓでのｎｃｒ−１およびｎｃｒ−２の役割は、両遺伝子に欠失変異を発生させることによって決定された（非特許文献３）。標準的な成長条件下で、ｎｃｒ−１変異体およびｎｃｒ−２変異体の両方が明白な表現型を示さなかった一方で、ｎｃｒ−１変異体はコレステロール欠如に対して過敏性を示した。このことは、コレステロールの取り込みもしくは利用における役割を示唆する。さらに、ｎｃｒ−１；ｎｃｒ−２の二重変異体は、好ましい条件下でも、新たな表現型（代替的生活段階であるｄａｕｅｒに恒常的に入る表現型（Ｄａｆ−ｃ表現型））を示した。Ｄａｕｅｒ幼虫は通常、混み合った条件、飢餓条件、もしくは高温の条件の下でのみ形成される（非特許文献４）。ゆえに、ｎｃｒ−２が、コレステロール感受性においてより限定的な役割を果たす一方で、ｎｃｒ−１およびｎｃｒ−２は、ｄａｕｅｒ形成において機能上重複しているようである。
【０００９】
動物がｄａｕｅｒになる決定を支配することが既に規定されている遺伝経路において、ｎｃｒ−１およびｎｃｒ−２のエピスタシス分析が行なわれた。ｎｃｒ−１およびｎｃｒ−２は、ｄａｆ−１２（そのシグナル伝達能力がｄａｕｅｒ形成に必要である核ホルモン受容体をコードする）の上流で作用すること（非特許文献５）、およびシトクロムＰ４５０類似遺伝子であるｄａｆ−９（ｄａｆ−１２のリガンドの生合成に関連していると考えられている）の上流で作用する（非特許文献６；非特許文献７）ことが示された。コレステロール欠如が、ｄａｆ−９もしくはｄａｆ−１２の弱い変異を強化し得るので（非特許文献６）、ｄａｆ−１２リガンドの生成にはコレステロール部分が重要であると考えられる。ゆえに、ｎｃｒ−１およびｎｃｒ−２は、ｄａｆ−９／ｄａｆ−１２経路へ供給するコレステロール輸送において役割を果たす。
【００１０】
コレステロール吸収インヒビターである、エゼチミブ（
【００１１】
【化１】
2008523807.tif 000002
特許文献１およびＲＥ３７７２１を参照されたい）は、腸のコレステロール吸収の減少において有効であることが示されてきた。エゼチミブを含む薬学的組成物は、Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．よりＺｅｔｉａ（登録商標）という商用名で市販されている。
【００１２】
エゼチミブ作用が作用するヒトにおける細胞標的は、ヒトＮＰＣ１Ｌ１タンパクである（特許文献２；特許文献３；Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ１９２５２２；非特許文献８および非特許文献９）。ＮＰＣ１Ｌ１媒介性コレステロール吸収を阻害する他の薬剤をとおしたアッセイは、記載されている（例えば、特許文献２；特許文献３を参照されたい）。
【特許文献１】米国特許第５，７６７，１１５号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４０１６１８３８号明細書
【特許文献３】国際公開第２００４／００９７７２号パンフレット
【非特許文献１】Ｃｈｉｔｗｏｏｄ，Ｄ．Ｊ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４：２７３−２８４（１９９９）
【非特許文献２】Ｋｕｒｚｃｈａｌｉａ，Ｔ．Ｖ．およびＳ．Ｗａｒｄ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５（８）：６８４−６８８（２００３）
【非特許文献３】Ｓｙｍ，Ｍ．，Ｍ．Ｂａｓｓｏｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０（９）：５２７−５３０（２０００）
【非特許文献４】Ｒｉｄｄｌｅ，Ｄ．Ｌ．およびＰ．Ｓ．Ａｌｂｅｒｔ（１９９７）．「Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄａｕｅｒ  ｌａｒｖａ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．」，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＩＩ．Ｄ．Ｌ．Ｒｉｄｄｌｅ，Ｔ．Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ，Ｂ．Ｊ．ＭｅｙｅｒおよびＪ．Ｒ．Ｐｒｉｅｓｓ（編），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：７３９−７６８．
【非特許文献５】Ａｎｔｅｂｉ，Ａ．，Ｗ．Ｈ．Ｙｅｈら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１４（１２）：１５１２−１５２７（２０００）
【非特許文献６】Ｇｅｒｉｓｃｈ，Ｂ．，Ｃ．Ｗｅｉｔｚｅｌら、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  １（６）：８４１−８５１（２００１）
【非特許文献７】Ｊｉａ，Ｋ．，Ｐ．Ｓ．Ａｌｂｅｒｔら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２９（１）：２２１−２３１（２００２）
【非特許文献８】Ｄａｖｉｅｓら，（２０００）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６５（２）：１３７−４５
【非特許文献９】Ｉｏａｎｎｏｕ，（２０００）Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．７１（１−２）：１７５−８１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、当該分野において、ＮＰＣ１Ｌ１インヒビターが同定され得る、代替的で、便利な高い処理能力を有する機能アッセイが依然として必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、とりわけ、当該分野においてＮＰＣ１Ｌ１インヒビターを同定するための便利な機能アッセイの必要性に取り組んでいる。
【００１５】
本発明は、腸のコレステロール吸収を阻害するか、上昇した総コレステロールを減少するか、上昇した低密度リポタンパクコレステロールを減少するか、上昇したアポリポタンパクＢを減少するか、ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するか、非家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するか、ホモ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するか、あるいはホモ接合性フィトステロール血症を処置もしくは予防する物質を同定するための方法を提供し、この方法は：（ａ）機能性ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドは有するが、機能性ｎｃｒ−１ポリペプチドおよび機能性ｎｃｒ−２ポリペプチドを欠くＣ．ｅｌｅｇａｎｓワームと、テストされる物質とを接触させる工程；および（ｂ）このワームがｄａｕｅｒ表現型を示すかどうかを決定する工程；を包含し、それにより、このｄａｕｅｒ表現型が観察された場合、この物質が、腸のコレステロール吸収のインヒビターであるか、上昇した総コレステロールを減少し得るか、上昇した低密度リポタンパクコレステロールを減少し得るか、上昇したアポリポタンパクＢを減少し得るか、ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するのに有用であるか、非家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するのに有用であるか、ホモ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するのに有用であるか、あるいはホモ接合性フィトステロール血症を処置もしくは予防するのに有用であることが同定される。本発明の実施形態において、このｄａｕｅｒ表現型は視診によって同定される。本発明の実施形態において、ＮＰＣ１Ｌ１はヒトＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号６）である。
【００１６】
本発明はまた、腸のコレステロール吸収を阻害するか、上昇した総コレステロールを減少するか、上昇した低密度リポタンパクコレステロールを減少するか、上昇したアポリポタンパクＢを減少するか、ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するか、非家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するか、ホモ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するか、あるいはホモ接合性フィトステロール血症を処置もしくは予防する物質を同定するための方法も提供し、この方法は：（ａ）機能性ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドは有するが、機能性ｎｃｒ−１ポリペプチドおよび機能性ｎｃｒ−２ポリペプチドを欠くＣ．ｅｌｅｇａｎｓワームと、テストされる物質とを接触させる工程；および（ｂ）このワームがキチナーゼを分泌するかどうかを決定する工程；を包含し、それにより、キチナーゼが分泌されない場合、この物質が、腸のコレステロール吸収のインヒビターであるか、上昇した総コレステロールを減少し得るか、上昇した低密度リポタンパクコレステロールを減少し得るか、上昇したアポリポタンパクＢを減少し得るか、ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するのに有用であるか、非家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するのに有用であるか、ホモ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するのに有用であるか、あるいはホモ接合性フィトステロール血症を処置もしくは予防するのに有用であることが同定される。本発明の実施例において、基質４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリアセチルキト−トリオシドの切断を測定することでキチナーゼが検出される。本発明の実施形態において、このＮＰＣ１Ｌ１はヒトＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号６）である。
【００１７】
本発明はまた、腸のコレステロール吸収を阻害するか、上昇した総コレステロールを減少するか、上昇した低密度リポタンパクコレステロールを減少するか、上昇したアポリポタンパクＢを減少するか、ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するか、非家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するか、ホモ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するか、あるいはホモ接合性フィトステロール血症を処置もしくは予防する物質を同定するための方法も提供し、この方法は：（ａ）機能性ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドを有するが、機能性ｎｃｒ−１ポリペプチドおよび機能性ｎｃｒ−２ポリペプチドを欠き、かつレポーターに作動可能に連結する成体特異的Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓプロモーターを有するＣ．ｅｌｅｇａｎｓ細胞とテストされる物質を接触させる工程；および（ｂ）このプロモーターによる発現が起こるかどうかを決定する工程；を包含し、それにより、この発現が検出されない場合、この物質が、腸のコレステロール吸収のインヒビターであるか、上昇した総コレステロールを減少し得るか、上昇した低密度リポタンパクコレステロールを減少し得るか、上昇したアポリポタンパクＢを減少し得るか、ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するのに有用であるか、非家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するのに有用であるか、ホモ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するのに有用であるか、あるいはホモ接合性フィトステロール血症を処置もしくは予防するのに有用であることが同定される。本発明の実施形態において、このＮＰＣ１Ｌ１はヒトＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号６）である。本発明の実施形態において、この成体特異的Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓプロモーターは、ｃｏｌ−１９プロモーターおよびｖｉｔ−２プロモーターからなる群から選択されるメンバーである。本発明の実施形態において、このレポーターは、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ  ＬｕｘＡ−Ｅ、ＦＭＮオキシドレダクターゼ（ＦＭＮ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｔｕｃｔａｓｅ）；ａｍＦＰ４８６；ｚＦＰ５０６；ｚＦＰ５３８；ｄｓＦＰ４８３；ｄｒＦＰ５８３；ｃＦＰ４８４；Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ  ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓルシフェラーゼ；クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）；β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）；Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉルシフェラーゼ；Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ；Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼ；緑色蛍光タンパク質；β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）およびキチナーゼからなる群から選択されるメンバーである。
【００１８】
本発明はまた、ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、ヒトＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号６））を生成する方法も包含し、この方法はプロモーターと作動可能に連結するＮＰＣ１Ｌ１をコードするポリヌクレオチドをＣ．ｅｌｅｇａｎｓ細胞に導入し、この細胞を増殖させる工程、および必要に応じてこのＮＰＣ１Ｌ１をこの増殖細胞から単離させる工程を包含する。
【００１９】
本発明はまた、トランスジェニックＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓワームも提供し、このワームの細胞は機能性ｎｃｒ−１タンパク質および機能性ｎｃｒ−２タンパク質を欠き、機能性ＮＰＣ１Ｌ１タンパク質を有する。本発明の実施形態において、このワームは、機能性ｎｃｒ−１タンパク質および機能性ｎｃｒ−２タンパク質を欠き、機能性ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチドを有する、Ｎ２系統である。本発明の実施形態において、このＮＰＣ１Ｌ１はヒトＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号６）である。本発明の実施形態において、このＮＰＣ１Ｌ１ポリヌクレオチドはＣ．ｅｌｅｇａｎｓ染色体（例えば、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶもしくはＸ）内に取り組まれる。本発明の実施形態において、ＮＰＣ１Ｌ１をコードするポリヌクレオチドは、プロモーター（例えば、ｎｃｒ−１プロモーターもしくはｎｃｒ−２プロモーター）と作動可能に結合する。
【００２０】
本発明の範囲はまた、機能性ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチド（例えば、ヒトＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号６））を有する、単離されたトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓワームも包含する。このＮＰＣ１Ｌ１遺伝子は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓプロモーター（例えば、ｎｃｒ−１プロモーターもしくはｎｃｒ−２プロモーター）と操作可能に結合し得る。
【００２１】
本発明は、２ａ系統、２ｂ系統、３系統、４ａ系統および４ｂ系統からなる群から選択される、単離されたトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓワームを提供する（以下を参照されたい）。
【００２２】
本発明は、ｎｃｒ−１ｐ／ｈＮＰＣ１Ｌ１／４９．２６；ｎｃｒ−２ｐ／ｈＮＰＣ１Ｌ１／４９．２６およびｎｃｒ−１ｐ／ＧＦＰ／４９．２６からなる群から選択される、単離されたプラスミドをさらに提供する。
【００２３】
また、本発明によって提供されるのは、配列番号７〜配列番号１４からなる群から選択される、単離されたオリゴヌクレオチドである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
（発明の詳細な説明）
ヒトＮＰＣ１Ｌ１は、ｎｃｒ−１および／もしくはｎｃｒ−２を代替し得、そして補足し得る。本明細書中に記載されているのは、ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、ヒトＮＰＣ１Ｌ１）の機能を阻害する化合物をスクリーニングするのに有用な機能アッセイである。本明細書中に記載されるアッセイはまた、ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、ヒトＮＰＣ１Ｌ１）の構造／機能の関連に向けられる多くの疑問を検討するのにも有用である。本発明のスクリーニングアッセイを使用して同定されたＮＰＣ１Ｌ１インヒビターは有用であり、とりわけ、腸のコレステロール吸収の阻害、総コレステロール、ＬＤＬコレステロールもしくはアポリポタンパクＢの減少、あるいは心臓血管疾患（高脂血症、高コレステロール血症、フィトステロール血症、アテローム性動脈硬化症、冠状心臓疾患、脳卒中、動脈硬化症、および食事性コレステロール吸収によって媒介されるかもしくは悪化させられる他の疾患が挙げられる）の処置もしくは予防のために有用である。
【００２５】
（分子生物学）
ｎｃｒ−１およびｎｃｒ−２の意味は、当該分野において周知である。実施形態において、このｎｃｒ−１およびｎｃｒ−２の遺伝子配列およびタンパク質配列は以下である：
ｎｃｒ−１のスプライシングされたコード領域（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｆ０２Ｅ８．６）：
【００２６】
【化２】
2008523807.tif 000003
【００２７】
【化３】
2008523807.tif 000004
ｎｃｒ−１タンパク質：
【００２８】
【化４】
2008523807.tif 000005
ｎｃｒ−２のスプライシングされたコード領域（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｆ０９Ｇ８．４）：
【００２９】
【化５】
2008523807.tif 000006
【００３０】
【化６】
2008523807.tif 000007
ｎｃｒ−２タンパク質：
【００３１】
【化７】
2008523807.tif 000008
本発明の実施形態において、ヒトＮＰＣ１Ｌ１遺伝子は以下のヌクレオチド配列を有する：
【００３２】
【化８】
2008523807.tif 000009
【００３３】
【化９】
2008523807.tif 000010
本発明の実施形態において、ヒトＮＰＣ１Ｌ１タンパク質は以下のアミノ酸配列を有する：
【００３４】
【化１０】
2008523807.tif 000011
【００３５】
【化１１】
2008523807.tif 000012
ヒトＮＰＣ１Ｌ１はまた、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０３７５２１、およびＮｏ．ＡＦ１９２５２２、ならびにＤａｖｉｅｓら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６５（２）：１３７−４５（２０００）、およびＩｏａｎｎｏｕ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．７１（１−２）：１７５−８１（２０００）にも開示されている；米国特許出願公開第２００４／０１６１８３８号も参照されたい。
【００３６】
本発明の実施形態において、ｖｉｔ−２プロモーターは以下のヌクレオチド配列を有する：
【００３７】
【化１２】
2008523807.tif 000013
【００３８】
【化１３】
2008523807.tif 000014
このｖｉｔ−２プロモーター配列はまた、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ５６９６６の下でも入手可能である。
【００３９】
本発明の実施形態において、ｃｏｌ−１９プロモーターは以下のヌクレオチド配列を有する：
【００４０】
【化１４】
2008523807.tif 000015
このｃｏｌ−１９プロモーター配列はまた、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ４１５５３の下でも入手可能である。
【００４１】
本発明の実施形態において、ｅｌｔ−２プロモーターは以下のヌクレオチド配列を有する：
【００４２】
【化１５】
2008523807.tif 000016
【００４３】
【化１６】
2008523807.tif 000017
【００４４】
【化１７】
2008523807.tif 000018
このｅｌｔ−２プロモーター配列はまた、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｚ４９８６７の下でも入手可能である。
【００４５】
本発明の実施形態において、ｇｅｓ−１プロモーターは以下のヌクレオチド配列を有する：
【００４６】
【化１８】
2008523807.tif 000019
このｇｅｓ−１プロモーター配列はまた、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ０３９０４６の下でも入手可能である。
【００４７】
本発明に従って、当該分野の範囲内の従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術が使用され得る。このような技術は、文献内で充分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（本明細書中では、「Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９」）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  編  １９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  編  １９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  編  （１９８５））；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  編（１９８４））；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，編（１９８６））；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照されたい。
【００４８】
「変異」もしくは「二重変異」は、生物（例えば、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓワーム）の遺伝物質における変化を意味し、この結果、親生物では見られなかった表現型の発現を生じる。本発明の実施形態において、ｎｃｒ−２、ｎｃｒ−１の二重変異は、ｎｃｒ−２およびｎｃｒ−１の機能、活性もしくは発現の任意の程度までの低下を生じる（例えば、このワームが親ワームの表現型と比較した場合にｄａｕｅｒ表現型を発現する可能性の任意の程度までの増加を生じる）変異を意味する。特定の遺伝子の変異としては、遺伝子、そのプロモーター、もしくは他の関連する調節因子の完全なノックアウト、ならびに点変異、内部欠失、切断、中断（例えば、異種配列の挿入）およびフレームシフトが挙げられる。
【００４９】
用語「機能性ＮＰＣ１Ｌ１」の意味は、いかなる当業者にとっても明らかである。例えば、実施形態において、この用語は、ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチド（例えば、ヒトＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号６））を意味し、これは、任意の検出可能なレベルの活性（例えば、コレステロール、エゼチミブもしくはエゼチミブの任意の誘導体との結合（例えば、ＳＣＨ３５４９０９（例えば、Ａｌｔｍａｎｎら，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１５８０（１）：７７−９３（２００２）を参照されたい））、インビボの腸のコレステロール吸収もしくはシトステロール吸収、マクロファージのコレステロール取り込み（例えば、Ａｌｔｍａｎｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３（５６６１）：１２０１−１２０４（２００４）；Ｄａｖｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（３２）：３３５８６−３３５９２（２００４）もしくはＳｅｅｄｏｒｆら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．３２０（４）：１３３７−１３４１（２００４）を参照されたい））を含むＮＰＣ１ｌ１機能を確認するための他のアッセイは、米国特許出願公開第２００４／０１６１８３８号中に記載されている。
【００５０】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」、もしくは「核酸分子」は、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、もしくはシチジン；「ＲＮＡ分子」）、もしくはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、もしくはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルのポリマー形態、もしくはそれらの任意のリン酸エステルアナログ（例えば、ホスホロチオエートおよびチオエステル）の一本鎖形態もしくは、そうでなければ二本鎖形態を含む。
【００５１】
「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、もしくは「ヌクレオチド配列」は、核酸（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）内の一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド」とも呼ばれる）であり、２つ以上のヌクレオチドの任意の鎖を意味する。
【００５２】
「コード配列」もしくは発現産物（例えば、ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、もしくは酵素）を「コードする」配列は、ヌクレオチド配列であり、発現された結果、この産物を産生する。
【００５３】
用語「遺伝子」は、１つ以上のＲＮＡ分子、タンパク質もしくは酵素の全てあるいは一部を含む、リボヌクレオチドもしくはアミノ酸の特定の配列をコードするか、あるいはこれらの特定の配列に対応するＤＮＡ配列を意味し、例えばこの遺伝子が発現される条件を決定する、調節ＤＮＡ配列（例えば、プロモーター配列）を含んでいても含まなくてもよい。遺伝子は、ＤＮＡからＲＮＡへ転写され得、このＲＮＡはアミノ酸配列に翻訳されてもされなくてもよい。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、一般的には約１００個のヌクレオチド以下（例えば、３０、４０、５０、６０、７０、８０もしくは９０）核酸を意味し、これは、遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、もしくは目的の他の核酸をコードするゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、もしくはｍＲＮＡ分子にハイブリッドされ得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、３２Ｐ−ヌクレオチド、３Ｈ−ヌクレオチド、１４Ｃ−ヌクレオチド、３５Ｓ−ヌクレオチド、もしくはビオチンのような標識が共有結合しているヌクレオチドの取り込みによって、標識され得る。一つの実施形態において、標識されたオリゴヌクレオチドは、核酸の存在を検出するためのプローブとして使用され得る。別の実施形態において、オリゴヌクレオチド（１つもしくは両方が標識され得る）は、遺伝子の全長もしくは遺伝子のフラグメントをクローニングするため、または核酸の存在を検出するためのいずれかのために、ＰＣＲプライマーとして使用され得る。一般的に、オリゴヌクレオチドは、合成的に調製され、好ましくは核酸合成機を使用して調製される。
【００５５】
「タンパク質配列」、「ペプチド配列」、もしくは「ポリペプチド配列」、または「アミノ酸配列」は、タンパク質、ペプチドもしくはポリペプチド中の一連の２つ以上のアミノ酸を意味し得る。「タンパク質」、「ぺプチド」、もしくは「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の連続する鎖を含む。
【００５６】
用語「単離されたポリヌクレオチド」もしくは「単離されたポリペプチド」は、それぞれポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ分子もしくはＤＮＡ分子、あるいは混合ポリマー）もしくはポリペプチドを含み、これらは通常細胞内で見出されるかもしくは組換えＤＮＡ発現系内で通常見出される他の成分から部分的にもしくは完全に分離されている。これらの成分としては、細胞膜、細胞壁、リボゾーム、ポリメラーゼ、血清成分および外来のゲノム配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
単離されたポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、好ましくは、本質的に同種の分子組成物であるが、若干の異質性を含み得る。
【００５８】
本明細書で使用される場合、ＤＮＡの「増幅」は、ＤＮＡ配列の混合物中の特定のＤＮＡ配列の濃度を上昇させるためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用を示し得る。ＰＣＲの説明に関しては、Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）  ２３９：４８７を参照されたい。
【００５９】
用語「宿主細胞」は、細胞による物質の産生（例えば、細胞による、遺伝子、ＤＮＡ配列もしくはＲＮＡ配列あるいはタンパク質の発現もしくは複製）のために、選択されたか、改変されたか、トランスフェクトされたか、形質転換されたか、育てられたか、もしくは使用されたかあるいは任意の方法で操作された、任意の生物の任意の細胞を含む。好ましい宿主細胞としてはＣ．ｅｌｅｇａｎｓ細胞が挙げられる。
【００６０】
核酸のヌクレオチド配列は、当該分野において公知の任意の方法で決定され得る（例えば、化学的塩基配列決定法もしくは酵素的塩基配列決定法）。ＤＮＡの「化学的塩基配列決定法」としては、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９７７）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５６０）の方法のような方法が挙げられ、この方法において、ＤＮＡは、個々の塩基特異的反応を使用してランダムに切断される。ＤＮＡの「酵素的塩基配列決定法」としては、Ｓａｎｇｅｒ（Ｓａｎｇｅｒら，（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３）の方法のような方法が挙げられる。
【００６１】
本明細書中の核酸は、天然の調節（発現制御）配列によって両脇を挟まれ得るか、もしくは異種配列（プロモーター、内部的リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）および他のリボゾーム結合部位配列、エンハンサー、反応要素、サプレッサ、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’−非コード領域および３’−非コード領域などが挙げられる）と結合し得る。
【００６２】
一般的に、「プロモーター」もしくは「プロモーター配列」は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼと（例えば、直接あるいは他のプロモーター結合タンパク質もしくはプロモーター結合物質をとおして）結合し得、そしてコード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。一般的に、プロモーター配列は、その３’末端において転写開始部位に結合され、そして上流（５’方向）へ伸びて、最少数の塩基、もしくは転写を任意のレベルで開始するために必要な因子を含む。プロモーター配列内に、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１でのマッピングによって便宜上定義される）、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出され得る。このプロモーターは、他の発現制御配列（エンハンサー配列およびレプレッサ配列が挙げられる）もしくは本発明の核酸と、作動可能に結合し得る。遺伝子発現を制御するために使用され得るプロモーターとしては、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｎｃｒ−１プロモーターもしくはｎｃｒ−２プロモーター、あるいは任意の成体特異的Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓプロモーター（ｃｏｌ−１９プロモーター（ＺＫ１１９３．１とも呼ばれる遺伝子）（Ａｂｒａｈａｎｔｅら  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４９：１３３５−１３５１（１９９８）；Ｔｈｅｉｎら  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ２２６：５２３９−５２５３（２００３））、およびｖｉｔ−２プロモーター（Ｃ４２Ｄ８．２とも呼ばれる遺伝子）（Ｇｒａｎｔ，Ｂ．およびＨｉｒｓｈ，Ｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  １０：４３１１−４３２６（１９９９））が挙げられるが、決してこれらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。他のプロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号および同第５，１６８，０６２号）、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｎｏｉｓｔら，（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復内に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら，（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら，（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）；原核生物の発現ベクター（例えば、β−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆら，（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：３７２７−３７３１）、もしくはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら，（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５）；Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ（１９８０）  ２４２：７４−９４内の「Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ」も参照されたい；および酵母もしくは他の真菌由来のプロモーター因子（例えば、Ｇａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーターもしくはア��カリホスファターゼプロモーターが挙げられる。
【００６３】
コード配列は、この配列がＲＮＡポリメラーゼによって媒介されるコード配列のＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）への転写を指向し、その後このＲＮＡはスプライシングされ得（それがイントロンを含む場合）、そして必要に応じてコード配列によってコードされるタンパク質に翻訳され得る場合、細胞内で転写制御配列および翻訳制御配列の「制御下にある」、転写制御配列および翻訳制御配列と「機能的に結合する」、あるいは「作動可能に結合する」もしくは「作動可能に連結する」。
【００６４】
用語「発現する」および「発現」は、遺伝子、ＲＮＡもしくはＤＮＡ配列内の情報を顕在化させるかまたはその顕在化を引き起こすこと；例えば、対応する遺伝子の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化させてタンパク質を産生することを意味する。ＤＮＡ配列は、細胞内でもしくは細胞によって発現され、「発現産質」（例えば、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）もしくはタンパク質）を形成する。発現産物そのものもまた、細胞によって「発現される」といってもよい。
【００６５】
用語「形質転換」は、核酸の細胞への導入を意味する。導入された遺伝子もしくは配列は、「クローン」と呼ばれ得る。導入されたＤＮＡもしくはＲＮＡを受ける宿主細胞は、「形質転換され」、そしてそれは「形質転換細胞」もしくは「クローン」である。宿主細胞に導入されるＤＮＡもしくはＲＮＡは、任意の供給源から得られ得る（宿主細胞と同属もしくは同種の細胞、あるいは異属もしくは異種の細胞からが挙げられる）。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓワームは、当該分野に公知の多くの技術（ミクロ注入および微粒子衝撃（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）が挙げられる（あとに議論する））により、ＤＮＡによって形質転換され得る。
【００６６】
用語「ベクター」は、ビヒクル（例えば、プラスミド）を含み、これによってＤＮＡ配列もしくはＲＮＡ配列が宿主細胞中に導入され、その結果その宿主を形質転換し、必要に応じて導入された配列の発現および／もしくは複製を促進する。
【００６７】
本発明で使用され得るベクターとしては、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組み込み可能なＤＮＡフラグメント、および宿主のゲノム内への核酸の導入を促進し得る他のビヒクルが挙げられる。プラスミドは、最も一般に使用されているベクターの形態であるが、同様の働きをし、そして当該分野において公知であるかもしくは公知になるベクターの他の全ての形態は本明細書中で使用されるのに適している。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら，Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８５および補遺，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，ならびにＲｏｄｒｉｇｕｅｚら（編），Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ，１９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡを参照されたい。
【００６８】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ細胞内のＤＮＡ片を維持するのに有用ないくつかのＣ．ｅｌｅｇａｎｓベクターは、当該分野において公知である。例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）は以下のＣ．ｅｌｅｇａｎｓベクターを販売している：ｐＴＵ＃６０−ＧＦＰ、ｐＴＵ＃６１−ＧＦＰ、ｐＴＵ＃６２−ＧＦＰおよびｐＴＵ＃６３−ＧＦＰ。Ｆｉｒｅら（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１８（１４）：４２６９−４２７０（１９９０））によって開示されている他のＣ．ｅｌｅｇａｎｓベクターは、ｐＡＳＴ１８ａ、ｐＡＳＴ１８ｂ、ｐＡＳＴ１９ｂ、ｐＡＳＴ１９ａ、ｐＰＤ２６．１４、ｐｌＣＴ１９ｈ、ｐｌＣＴ１９ｒおよびｐＡＳＴ（ＥＭＢＬ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ  Ｘ５３１２１〜Ｘ５３１２７を参照されたい）である。本発明の実施形態において、ＤＮＡは、ｐＰＤ４９．２６ベクター（Ｆｉｒｅら  Ｇｅｎｅ  ９３（２）：１８９−１９８（１９９０））を使用してＣ．ｅｌｅｇａｎｓ細胞内に導入され得る。
【００６９】
用語「発現系」は、宿主細胞および適合ベクターを意味し、これは適切な条件下で、ベクターによって保有されて宿主細胞内に導入されるタンパク質もしくは核酸を発現し得る。一般的な発現系としては、Ｅ．ｃｏｌｉの宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫の宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳動物の宿主細胞およびベクターが挙げられる。
【００７０】
本発明は、本発明のポリペプチドに対応するアミノ酸配列もしくは核酸配列に関する任意の表面的な改変もしくはわずかな改変を企図する。例えば、本発明において使用され得るｎｃｒ−１、ｎｃｒ−２およびＮＰＣ１Ｌ１のポリペプチド配列ならびにポリヌクレオチド配列は、上記（配列番号１〜６）に記載されている；本発明は、本明細書中に記載のｎｃｒ−１、ｎｃｒ−２および／もしくはＮＰＣ１Ｌ１配列を含む任意の実施形態（例えば、機能アッセイもしくはトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓワーム）、ならびにこれらの配列の任意の表面的な改変もしくはわずかな改変を含む実施形態を企図する。特に、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸の保存的改変体である配列を企図する。ポリヌクレオチド配列の「配列保存的改変体」は、この改変体中での所定のコドンにおける１つ以上のヌクレオチドの変化が、その位置にコードされたアミノ酸において変更を生じない改変体である。本発明のポリペプチドの機能保存的改変体もまた、本発明によって企図されている。「機能保存的改変体」は、この改変体中でのタンパク質もしくは酵素内の１つ以上のアミノ酸残基が、ポリペプチドの全体的コンフォメーションおよび機能を変更することなしに変化している改変体である（アミノ酸を類似の特性を有するアミノ酸に置換することが挙げられるが、決してこれに限定されない）。類似の特性を有するアミノ酸は、当該分野において周知である。例えば、交換可能であり得る極性／親水性アミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、スレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸が挙げられ；交換可能であり得る非極性／疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられ；交換可能であり得る酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、そして交換可能であり得る塩基性アミノ酸としては、ヒスチジン、リジンおよびアルギニンが挙げられる。
【００７１】
本発明は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｎｃｒ−１、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｎｃｒ−２およびラットＮＰＣ１Ｌ１、ヒトＮＰＣ１Ｌ１もしくはマウスＮＰＣ１Ｌ１をコードするポリヌクレオチド、およびこれらのフラグメント、ならびにこれらのポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸を含む実施形態（例えば、機能アッセイもしくはトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓワーム）を含む。好ましくは、この核酸は、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、さらに好ましくは中程度のストリンジェンシー条件下で、最も好ましくは高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。核酸分子は別の核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、もしくはＲＮＡ）に「ハイブリダイズ可能」であり、その場合、温度および溶液のイオン強度の適切な条件下で核酸分子の一本鎖形態が他の核酸分子にアニールし得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記を参照されたい）。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。典型的な低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、５５℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％ミルク、およびホルムアミドの無しで４２℃の条件であるか；もしくは４２℃で３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの条件である。典型的な中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、このハイブリダイゼーションが４２℃で４０％ホルムアミド含有の５×ＳＳＣもしくは６×ＳＳＣ内で行なわれることを除いては、低ストリンジェンシー条件と類似している。高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、このハイブリダイゼーション条件が５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣもしくは６×ＳＳＣ、および必要に応じて高温（例えば、４２℃より高温：５７℃、５９℃、６０℃、６２℃、６３℃、６５℃もしくは６８℃）で行なわれることを除いては、低ストリンジェンシー条件と類似している。一般的に、ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌおよび０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａである。ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が補足的配列を含むことが必要であるが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間のミスマッチが存在し得る。核酸をハイブリダイズするのに適切なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性の度合い（当該分野において周知の変数）に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性もしくは相同性の度合いが高ければ高いほど、核酸がハイブリダイズし得るストリンジェンシーは高くなる。１００ヌクレオチドの長さよりも長いハイブリッドについて、融解温度を計算するための式が得られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、９．５０−９．５１を参照されたい）。より短い核酸（すなわち、オリゴヌクレオチド）のハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要となり、そしてこのオリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照されたい）。
【００７２】
また、本発明中に含まれているのは、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む実施形態（例えば、機能アッセイもしくはトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓワーム）であり、これらの配列は、比較がＢＬＡＳＴアルゴリズムによって行なわれる場合、参照ｎｃｒ−１ヌクレオチド、ｎｃｒ−２ヌクレオチドもしくはＮＰＣ１Ｌ１ヌクレオチド（例えば、配列番号１、３もしくは５）およびｎｃｒ−１アミノ酸配列、ｎｃｒ−２アミノ酸配列、ＮＰＣ１Ｌ１アミノ酸配列（例えば、配列番号２、４もしくは６）と少なくとも約７０％同一であり、好ましくは少なくとも約８０％同一であり、さらに好ましくは少なくとも約９０％同一であり、そして最も好ましくは少なくとも約９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）同一であり、ここで、このアルゴリズムのパラメータは、各々の参照配列の全長に対する各々の配列間の最大マッチを得るように選択される。比較がＢＬＡＳＴアルゴリズム（ここで、このアルゴリズムのパラメータは、各々の参照配列の全長に対する各々の配列間の最大マッチを得るように選択される）によって行なわれる場合、配列番号２、４もしくは６の参照ｎｃｒ−１アミノ酸配列、ｎｃｒ−２アミノ酸配列もしくはＮＰＣ１Ｌ１アミノ酸配列と少なくとも約７０％類似であり、好ましくは少なくとも約８０％類似であり、さらに好ましくは少なくとも約９０％類似であり、そして最も好ましくは少なくとも約９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）類似であるアミノ酸配列を含むポリペプチドもまた、本発明に含まれる。
【００７３】
配列の同一性は、比較される２つの配列のヌクレオチド間もしくはアミノ酸間の正確なマッチを意味する。配列類似性は、非同一で、生化学的に関連しているアミノ酸間でのマッチ、ならびに、比較される２つのポリペプチドのアミノ酸間の正確なマッチの両方を意味する。類似した特性を共有し、交換可能であり得る生化学的に関連しているアミノ酸は上記で議論されている。
【００７４】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムに関する以下の参考文献は、本明細書中で参考として援用される：ＢＬＡＳＴ  ＡＬＧＯＲＩＴＨＭＳ：Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．ら，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら，（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら，（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６；Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．ら，（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１７：１４９−１６３；Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．ら，（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：６７−７０；ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ  ＳＣＯＲＩＮＧ  ＳＹＳＴＥＭＳ：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．ら，「Ａ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．」  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８）ｖｏｌ．５，補遺  ３．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編），ｐｐ．３４５−３５２，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．ら，「Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．」  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８）ｖｏｌ．５，補遺  ３．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編），ｐｐ．３５３−３５８，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．ら，（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３：６６−７０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．ら，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００；ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ  ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＳ：Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７；Ｄｅｍｂｏ，Ａ．ら，（１９９４）Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ．２２：２０２２−２０３９；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．「Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．」  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ．Ｓｕｈａｉ，編），（１９９７）ｐｐ．１−１４，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。
【００７５】
（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓワーム）
本発明の範囲は、機能性ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチド（例えば、ヒトＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号６））を有するｎｃｒ−２、ｎｃｒ−１の二重変異Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓワームを含む。二重変異ワームのＮＰＣ１Ｌ１は、任意の生物（ラット、マウスおよびヒトが挙げられる）に由来し得る。本発明の実施形態において、ｎｃｒ−２、ｎｃｒ−１の二重変異Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓワームは、ヒトＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号６）を有する。本発明の実施形態は、例えば、プラスミドベクター内の、もしくはＣ．ｅｌｅｇａｎｓ染色体内に組み込まれた、プロモーター（例えば、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｎｃｒ−１プロモーターもしくはｎｃｒ−２プロモーターあるいは腸特異的プロモーター（例えば、ｅｌｔ−２プロモーター（Ｆｕｋｕｓｈｉｇｅら  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９８：２８６−３０２（１９９８））もしくはｇｅｓ−１プロモーター（Ｋｅｎｎｅｄｙら  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２２９（４）：８９０−９０８（１９９３）））に作動可能に連結したＮＰＣ１Ｌ１遺伝子（例えば、ヒトＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号５））を有するｎｃｒ−２、ｎｃｒ−１の二重変異Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓワームを含む。本発明の実施形態において、本発明のＣ．ｅｌｅｇａｎｓワームは、Ｎ２系統の遺伝的バックグラウンド（Ｂｒｅｎｎｅｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７７：７１−９４（１９７４））、ｎｃｒ−２、ｎｃｒ−１の二重変異および機能性ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、ヒトＮＰＣ１Ｌ１（例えば配列番号６））を有する。本発明の別の実施形態において、本発明のＣ．ｅｌｅｇａｎｓワームは、Ｓｙｍら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：５２７−５３０（２０００））によって記載された、機能性ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、ヒトＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号６））を有するｎｃｒ−２、ｎｃｒ−１の二重変異体である。
【００７６】
本発明の範囲はまた、ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、ヒトＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号６））を含む、任意のＣ．ｅｌｅｇａｎｓワーム（例えば、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓワーム（例えば、Ｎ２系統））も含む。このようなワームは、例えばＮＰＣ１Ｌ１（例えば、ヒトＮＰＣ１Ｌ１）の組換え産生および単離に有用である。
【００７７】
本発明はまた、本明細書中に記載の任意のＣ．ｅｌｅｇａｎｓワーム（例えば、２ａ系統、２ｂ系統、３系統、４ａ系統もしくは４ｂ系統）も含む（下方を参照されたい）。
【００７８】
本発明の範囲は、本明細書に記載の任意のＣ．ｅｌｅｇａｎｓワーム（例えば、ヒトＮＰＣ１Ｌ１を含む、ｎｃｒ−２、ｎｃｒ−１の二重変異体）、ならびにこのようなワームから単離された任意の産物（このワームから得る各々の細胞が挙げられるが、これらに限定されない）を含む。さらに、本発明の範囲は、任意の成長段階（卵、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ２ｄ、Ｌ３、Ｌ４、ｄａｕｅｒおよび成体が挙げられる）の、本明細書中に記載の任意のＣ．ｅｌｅｇａｎｓワームを含む。
【００７９】
本発明の実施形態において、本発明のワームのＮＰＣ１Ｌ１は、例えば、任意のＣ．ｅｌｅｇａｎｓプロモーター（例えば、成体特異的プロモーター（ｃｏｌ−１９プロモーター（ＺＫ１１９３．１とも呼ばれる遺伝子）（Ａｂｒａｈａｎｔｅら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４９：１３３５−１３５１（１９９８）；Ｔｈｅｉｎら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ２２６：５２３９−５２５３（２００３））もしくはｖｉｔ−２プロモーター（Ｃ４２Ｄ８．２とも呼ばれる遺伝子）（Ｇｒａｎｔ，ＢおよびＨｉｒｓｈ，Ｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  １０：４３１１−４３２６（１９９９））が挙げられるが、これらに限定されない）と作動可能に連結する。
【００８０】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓワームの成長および繁殖は、当該分野において周知の標準技術を使用して行われ得る。例えば、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの標準的な培養技術および操作技術は、Ｓｕｌｓｔｏｎ  ＆  Ｈｏｄｇｋｉｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｎｅｍａｔｏｄｅ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ；Ｗｏｏｄ  ＷＢ．（編）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；１９８８）およびＢｒｅｎｎｅｒ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７７：７１−９４（１９７４）中で論じられている。
【００８１】
例えば、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓワームは、５１．３ｍＭのＮａＣｌ、０．２５％のＢａｃｔｏ−ペプトン、１．７％のバクト−アガー、０．０００５％のコレステロール、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＳＯ４、および２５ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．０を含み、Ｅ．Ｃｏｌｉ細胞を播種した（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７７：７１−９４（１９７４）を参照されたい）ＮＧＭ（線虫成長培地）アガープレート上で維持され得る。他の培地としては、（ｉ）３％酵母抽出物、３％大豆ペプトンおよび１０％加熱処理肝臓抽出物；（ｉｉ）３％Ｇｉｓｔｅｘ酵母抽出物、３％大豆ペプトンおよび１０％加熱処理肝臓抽出物；（ｉｉｉ）３％Ｇｉｓｔｅｘ酵母抽出物、３％大豆ペプトン、１％デキストロース、１％バクト−カシトン（ｂａｃｔｏ−ｃａｓｉｔｏｎｅ）および５００μｇ／ｍｌヘモグロビン；（ｉｖ）３％Ｇｉｓｔｅｘ酵母抽出物、３％大豆ペプトン、１％デキストロース、５０μｇ／ｍｌの酸沈殿させたヘミン塩化物（ｈｅａｍｉｎ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）；（ｖ）６％Ｇｉｓｔｅｘ酵母抽出物、１％デキストロース、１％バクト−カシトン、５０μｇ／ｍｌの酸沈殿させたヘミン塩化物；（ｖｉ）６％Ｇｉｓｔｅｘ酵母抽出物、１％デキストロース、５０μｇ／ｍｌの酸沈殿させたヘミン塩化物；および（ｖｉｉ）５％Ｇｉｓｔｅｘ酵母抽出物、１％デキストロース、５０μｇ／ｍｌの酸沈殿させたヘミン塩化物が挙げられる（例えば、Ｖａｎｆｌｅｔｅｒｅｎ，Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  ３２（８）：１０８７−１０８８（１９７６）を参照されたい）。
【００８２】
核酸でのＣ．ｅｌｅｇａｎｓの形質転換のための、当該分野において公知のいくつかのプロトコールがある。例えば、ミクロ注入法が、Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．５（１２）：３４８４−３４９６（１９８５）、Ｍｅｌｌｏら（ＥＭＢＯ  Ｊ．１０（１２）：３９５９−７０（１９９１））およびＫｉｍｂｌｅら，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９９：４５６−４５８（１９８２）によって記載されている。Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎらは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいてキメラ遺伝子を発現させるための方法を記載する（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９３（１）：４１−４６（１９８７））。Ｈｕｌｌらは、二本鎖のＲＮＡをＣ．ｅｌｅｇａｎｓ内に注入する方法を記載している（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６５：２３−５８（２００４））。Ｗｉｌｍら（Ｇｅｎｅ  ２２９（１−２）：３１−３５（１９９９））は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓワームの弾道的（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）形質転換（微粒子衝撃）を記載している。さらに、Ｐｒａｉｔｉｓら（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５７：１２１７−１２２６（２００１））は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの染色体組み込み変異体を産生するための方法を開示している。あるいは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ細胞内にポリヌクレオチドをエピソーム状で保持するためにプラスミドベクター（上記を参照されたい）が使用され得る。
【００８３】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの形質転換株が同定され得る便利な方法は、トランスジェニック動物内で容易に識別可能なＲｏｌｌｅｒ表現型を共形質転換マーカーとして生じる優性のｒｏｌ−６対立遺伝子を使用することによる（Ｋｒａｍｅｒら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２０８１−２０８９（１９９０））。例えば、プラスミドｐＲＦ４はｒｏｌ−６遺伝子を含む（Ｍｅｌｌｏら  ＥＭＢＯ  Ｊ．１０（１２）：３９５９−３９７０（１９９１））。
【００８４】
（アッセイ）
本発明は、ＮＰＣ１Ｌ１のインヒビターが素早くかつ便利に同定され得る細胞アッセイの方法を含む。本発明を一つの理論もしくは作用のメカニズムに限定せずに、一般的に、このアッセイは、ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号６）がＣ．ｅｌｅｇａｎｓワーム内のｎｃｒ−１、ｎｃｒ−２の二重変異体を補完するという知見に基づいている。Ｎｃｒ−２、Ｎｃｒ−１の二重変異ワームは、ｄａｕｅｒ表現型を発現するが；しかしながらこの二重変異体でのＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号６）の発現は、このワームをｄａｕｅｒ表現型からレスキューさせ、成体表現型を発現させる結果となる。ＮＰＣ１Ｌ１の阻害（例えば、タンパク質を阻害物質（例えば、エゼチミブ）と接触させることによる阻害）は、ｄａｕｅｒ表現型からのＮＰＣ１Ｌ１−依存的レスキューの逆転をもたらす。
【００８５】
例えば、本発明の実施形態において、ＮＰＣ１Ｌ１インヒビターの存在は、アッセイされるＣ．ｅｌｅｇａｎｓワームによるｄａｕｅｒ表現型の発現によって示される。ｄａｕｅｒ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ幼虫は、顕微鏡（例えば、解剖顕微鏡）のもとで、当業者によって視覚的に容易に同定され得る。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｄａｕｅｒ幼虫は、飢餓条件もしくは混み合った条件の下で形成され得る、発生停止した分散段階である。一般的に、ｄａｕｅｒワームは、Ｌ２幼虫よりも長く細い体型であり、より活動的でない。典型的に、ｄａｕｅｒ幼虫は、閉じた口を有し、摂食しない。コレステロール吸収（例えば、腸吸収）を阻害するか、上昇した総コレステロールを減少するか、上昇した低密度リポタンパクコレステロールを減少するか、上昇したアポリポタンパクＢを減少するか、ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するか、非家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するか、ホモ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するか、ホモ接合性フィトステロール血症を処置もしくは予防するか、あるいはＮＰＣ１Ｌ１（例えば、ヒトＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号６））を阻害する物質を同定するためのアッセイ方法の例は：（ａ）機能性ｎｃｒ−１ポリペプチド（例えば、配列番号２）および機能性ｎｃｒ−２ポリペプチド（例えば、配列番号４）を欠き、機能性ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号６）を有するＣ．ｅｌｅｇａｎｓワームと、テストされる物質とを接触させる工程；および（ｂ）このワームがｄａｕｅｒ表現型を示すかどうかを決定する（例えば、顕微鏡のもとで視覚的に同定される）工程；を包含し、それにより、このｄａｕｅｒ表現型が観察された場合、この物質が選択される。例えば、この幼虫は、ｄａｕｅｒ表現型の検出のためにテストされる物質にこのワームがさらされた後、数日間（例えば、１、２、３もしくは４日）にわたる時間経過において１回もしくは数回観察され得る。実施形態において、ワームをテストされる物質にさらした３日後にワームは１回観察される。本発明の実施形態において、任意のネガティブコントロールアッセイが、このアッセイと組み合わせて実施され、このネガティブコントロールアッセイは：（ａ）機能性ｎｃｒ−１ポリペプチド（例えば、配列番号２）および機能性ｎｃｒ−２ポリペプチド（例えば、配列番号４）を欠き、機能性ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチド（例えば、配列番号６）を有するＣ．ｅｌｅｇａｎｓワームと、コレステロール吸収（例えば、腸吸収）を阻害しないかもしくはＮＰＣ１Ｌ１（例えば、ヒトＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号６））を阻害しないと分かっているブランク物質とを接触させる工程；および（ｂ）このワームがｄａｕｅｒ表現型を示すかどうかを決定する（例えば、顕微鏡のもとで視覚的に同定される）工程を包含する。ブランク物質の存在下でのネガティブコントロール実験においてこのワームがｄａｕｅｒ表現型を示さないと確認された場合に、このアッセイが適切に機能していることの確認が提供される。本発明の実施形態において、任意のポジティブコントロールアッセイが、このアッセイと組み合わせて実施され、このポジティブコントロールアッセイは：（ａ）���能性ｎｃｒ−１ポリペプチド（例えば、配列番号２）および機能性ｎｃｒ−２ポリペプチド（例えば、配列番号４）を欠き、機能性ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチド（例えば、配列番号６）を有するＣ．ｅｌｅｇａｎｓワームと、コレステロール吸収（例えば、腸吸収）を阻害するかもしくはＮＰＣ１Ｌ１（例えば、ヒトＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号６））を阻害すると分かっているポジティブコントロール物質（例えば、エゼチミブ）とを接触させる工程；および（ｂ）このワームがｄａｕｅｒ表現型を示すかどうかを決定する（例えば、顕微鏡のもとで視覚的に同定される）工程を包含する。ポジティブコントロール物質の存在下でのポジティブコントロール実験においてこのワームがｄａｕｅｒ表現型を示すことが確認された場合に、このアッセイが適切に機能していることの確認が提供される。
【００８６】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓワームが成体（非−ｄａｕｅｒ幼虫）として同定され得る別の方法は、キチナーゼの存在を測定することである。キチナーゼ産生は、成体（非−ｄａｕｅｒワーム）の標識である（例えば、Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（４５）：４２５５７−４２５６４（２００１）を参照されたい）。コレステロール吸収（例えば、腸吸収）を阻害するか、ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、ヒトＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号６））を阻害するか、上昇した総コレステロールを減少するか、上昇した低密度リポタンパクコレステロールを減少するか、上昇したアポリポタンパクＢを減少するか、ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するか、非家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するか、ホモ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するか、あるいはホモ接合性フィトステロール血症を処置もしくは予防する物質を同定するためのアッセイ方法の例は：（ａ）機能性ｎｃｒ−１ポリペプチド（例えば、配列番号２）および機能性ｎｃｒ−２ポリペプチド（例えば、配列番号４）を欠き、機能性ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号６）を有するＣ．ｅｌｅｇａｎｓワームと、テストされる物質とを接触させる工程；および（ｂ）このワームがキチナーゼを分泌するかどうかを決定する工程；を包含し、それにより、キチナーゼが分泌されない場合、この物質が選択される。実施形態において、キチナーゼ産生は、テストされる物質にこのワームがさらされた後、数日間（例えば、１、２、３もしくは４日）にわたる時間経過において１回もしくは数回測定され得る。実施形態において、ワームをテストされる物質にさらした３日後にキチナーゼ発現は１回測定される。本発明の実施形態において、任意のネガティブコントロール実験が、このアッセイと組み合わせて実施され、このネガティブコントロール実験は以下の工程：（ａ）機能性ｎｃｒ−１ポリペプチド（例えば、配列番号２）および機能性ｎｃｒ−２ポリペプチド（例えば、配列番号４）を欠き、機能性ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号６）を有するＣ．ｅｌｅｇａｎｓワームと、コレステロール吸収（例えば、腸吸収）を阻害しないかもしくはＮＰＣ１Ｌ１（例えば、ヒトＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号６））を阻害しないと分かっているブランク物質とを接触させる工程；および（ｂ）このワームがキチナーゼを分泌するかどうかを決定する工程を包含する。ブランク物質の存在下でのネガティブコントロール実験においてこのワームがキチナーゼを分泌すると確認された場合に、このアッセイが適切に機能していることの確認が提供される。本発明の実施形態において、任意のポジティブコントロール実験が、このアッセイと組み合わせて実施され、このポジティブコントロール実験は：（ａ）機能性ｎｃｒ−１ポリペプチド（例えば、配列番号２）および機能性ｎｃｒ−２ポリペプチド（例えば、配列番号４）を欠き、機能性ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号６）を有するＣ．ｅｌｅｇａｎｓワームと、コレステロール吸収（例えば、腸吸収）を阻害するかもしくはＮＰＣ１Ｌ１（例えば、ヒトＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号６））を阻害すると分かっている物質（例えば、エゼチミブ）とを接触させる工程；および（ｂ）このワームがキチナーゼを分泌するかどうかを決定する工程を包含する。ポジティブコントロール物質の存在下でのポジティブコントロール実験においてこのワームがキチナーゼを分泌しないことが確認された場合に、このアッセイが適切に機能していることの確認が提供される。
【００８７】
このｄａｕｅｒ表現型がアッセイされるＣ．ｅｌｅｇａｎｓワームにおいて発現されるかどうかを決定する別の方法は、１つ以上の成体特異的プロモーターが発現されるかどうかを決定することである。成体特異的プロモーターが発現される場合、それは、このワームがｄａｕｅｒ幼虫ではなく成体であることを示す。成体特異的プロモーターが発現されなかった場合、それは、このワームが成体ではなく、その代わりにｄａｕｅｒ幼虫であることを示す。成体特異的プロモーターからの発現は、このプロモーターをレポーター遺伝子に作動可能に連結し、このレポーター遺伝子が発現されるかどうかを決定することで同定され得る。コレステロール吸収（例えば、腸吸収）を阻害するか、ＮＰＣ１Ｌ１（例えば、ヒトＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号６））を阻害するか、上昇した総コレステロールを減少するか、上昇した低密度リポタンパクコレステロールを減少するか、上昇したアポリポタンパクＢを減少するか、ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するか、非家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するか、ホモ接合性家族性高コレステロール血症を処置もしくは予防するか、あるいはホモ接合性フィトステロール血症を処置もしくは予防する物質を同定するためのアッセイ方法の例は：（ａ）機能性ｎｃｒ−１ポリペプチド（例えば、配列番号２）および機能性ｎｃｒ−２ポリペプチド（例えば、配列番号４）を欠き、機能性ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチド（例えば、配列番号６）を有し、レポーターと作動可能に連結する成体特異的Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓプロモーターを有するＣ．ｅｌｅｇａｎｓ細胞と、テストされる物質とを接触させる工程；および（ｂ）レポーターが発現されるかどうかを決定する工程；を包含し、それにより、レポーターが発現されなかった場合、この物質が選択される。成体特異的プロモーターが連結しているレポーターは、任意の当該分野に公知の適切なレポーター（本明細書中で議論したものが挙げられるが、決してそれらに限定されない）であり得る。実施形態において、レポーター発現は、テストされる物質にこのワームがさらされた後、数日間（例えば、１、２、３もしくは４日）にわたる時間経過において１回もしくは数回測定され得る。実施形態において、ワームをテストされる物質にさらした３日後にレポーター発現は１回測定される。本発明の実施形態において、任意のネガティブコントロール実験が、このアッセイと組み合わせて実施され、このネガティブコントロール実験は以下の工程：（ａ）機能性ｎｃｒ−１ポリペプチド（例えば、配列番号２）および機能性ｎｃｒ−２ポリペプチド（例えば、配列番号４）を欠き、機能性ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチド（例えば、配列番号６）を有し、リポーターに作動可能に連結する成体特異的Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓプロモーターを有するＣ．ｅｌｅｇａｎｓ細胞と、コレステロール吸収（例えば、腸吸収）を阻害しないかもしくはＮＰＣ１Ｌ１（例えば、ヒトＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号６））を阻害しないと分かっているブランク物質とを接触させる工程；および（ｂ）レポーターが発現されるかどうかを決定する工程を包含する。ブランク物質の存在下でのネガティブコントロール実験においてプロモーターによる発現が検出された場合に、このアッセイが適切に機能していることの確認が提供される。本発明の実施形態において、任意のポジティブコントロール実験が、このアッセイと組み合わせて実施され、このポジティブコントロール実験は以下の工程：（ａ）機能性ｎｃｒ−１ポリペプチド（例えば、配列番号２）および機能性ｎｃｒ−２ポリペプチド（例えば、配列番号４）を欠き、機能性ＮＰＣ１Ｌ１ポリペプチド（例えば、配列番号６）を有し、レポーターと作動可能に連結する成体特異的Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓプロモーターを有するＣ．ｅｌｅｇａｎｓ細胞と、コレステロール吸収（例えば、腸吸収）を阻害するかもしくはＮＰＣ１Ｌ１（例えば、ヒトＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号６））を阻害すると分かっている物質（例えば、エゼチミブ）とを接触させる工程；および（ｂ）レポーターが発現されるかどうかを決定する工程を包含する。ポジティブコントロール実験においてプロモーターによる発現が検出されなかった場合に、このアッセイが適切に機能していることの確認が提供される。
【００８８】
本発明の別の実施形態において、任意のネガティブコントロールアッセイが、本明細書中に記載の任意のアッセイと組み合わせて実施され、このネガティブコントロールアッセイは：（ａ）機能性ｎｃｒ−１ポリペプチド（例えば、配列番号２）および機能性ｎｃｒ−２ポリペプチド（例えば、配列番号４）を有する野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓワーム（例えば、Ｎ２系統のＣ．ｅｌｅｇａｎｓ）と、コレステロール吸収（例えば、腸吸収）を阻害する能力もしくはＮＰＣ１Ｌ１（例えば、ヒトＮＰＣ１Ｌ１（例えば、配列番号６））を阻害する能力についてテストされる物質とを接触させる工程；および（ｂ）このワームがｄａｕｅｒ表現型を示すかどうかを決定する（例えば、顕微鏡のもとで視覚的に同定される）工程を包含する。テストされる物質を与えられた野生型ワームによるｄａｕｅｒ表現型の呈示は、この物質がｄａｕｅｒ表現型を誘発し、必ずしもＮＰＣ１Ｌ１を阻害するわけではないことを示す。
【００８９】
本明細書中に記載のアッセイにおいて成体特異的プロモーターが使用されるレポーターとしては、プロモーターからの発現の検出を可能にする任意の遺伝子もしくはタンパク質が挙げられる。本明細書中で議論されたような成体特異的プロモーターと作動可能に結合し得るレポーター遺伝子の非制限的な列挙としては、Ａｎｔｈｏｚｏａからの赤色生物発光タンパク質、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ  ＬｕｘＡ−Ｅ、ＦＭＮオキシドレダクターゼ（ＦＭＮ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｔｕｃｔａｓｅ）、Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ  ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、Ｖｉｂｒｉｏ  Ｈａｒｖｅｙｉルシフェラーゼ、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；およびその種々の変異体）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、キチナーゼおよびエピトープタグが挙げられるが、これらに限定されない。典型的に、レポーター遺伝子の発現（例えば、成体特異的Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓプロモーターによる）は、レポーターの酵素活性を検出することによって（例えば、ルシフェラーゼレポーターの発光を検出することによって）検出される。レポーターという用語はまた、例えば、発現された際に、例えば、ノーザンブロット分析によるｍＲＮＡの検出によって、もしくはウェスタンブロット分析による翻訳されたタンパク質の検出によって、検出され得る任意の遺伝子もしくはオープンリーディングフレームも含む。例えば、用語「レポーター」は、作動可能に結合するＣ．ｅｌｅｇａｎｓプロモーター（例えば、野生型Ｎ２系統ゲノム内）の下流に天然で位置するか、もしくはこのプロモーターによって制御される任意の遺伝子を含む。例えば、本発明の実施形態において、Ｃｏｌ−１９プロモーターに連結するレポーターはＣｏｌ−１９遺伝子（ＺＫ１１９３．１）そのものである。前述のレポーターのいずれかの検出は、当該分野において周知の多くの方法のいずれかによって実施され得る。
【００９０】
Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ  ＬｕｘＡ−Ｅ、ＦＭＮオキシドレダクターゼ（ＦＭＮ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｔｕｃｔａｓｅ）構成物（例えば、米国特許出願公開第２００４０１４２３５６号内に開示されている）は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓプロモーター（例えば、成体特異的プロモーター）と作動可能に結合し得る。Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓルシフェラーゼの発光は、４９０ｎｍでの光放出を検出することで検出され得る。
【００９１】
Ａｎｔｈｏｚｏａからの種々の生物発光タンパク質もまたＣ．ｅｌｅｇａｎｓプロモーター（例えば、成体特異的プロモーター）と作動可能に結合し得る。例えば、Ｍａｔｚら（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：９６９−９７３（１９９９））は生物発光タンパク質（Ａｎｅｍｏｎｉａ  ｍａｊａｎｏからのａｍＦＰ４８６（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ１６８４２１）、Ｚｏａｎｔｈｕｓ種からのｚＦＰ５０６（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ１６８４２２）およびｚＦＰ５３８（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ１６８４２３）、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｔｒｉａｔａからのｄｓＦＰ４８３（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ１６８４２０）、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ種からのｄｒＦＰ５８３「赤」（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ１６８４１９）、およびＣｌａｖｕｌａｒｉａ種からのｃＦＰ４８４（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ１６８４２４）が挙げられる）を開示している（Ｇｒｏｓｓら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７（２２）：１１９９０−１１９９５（２０００）およびＦｒａｄｋｏｖら  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４７９：１２７−１３０（２０００）も参照されたい）。Ａｎｔｈｏｚｏａタンパク質の検出方法は、Ｍａｔｚら内で議論されており；この開示は参考として援用される。
【００９２】
コメツキムシ（Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ  ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓ）のルシフェラーゼ（例えば、Ｗｏｏｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４（４９０５）：７００−７０２（１９８９）によって開示されているようなもの）もまたＣ．ｅｌｅｇａｎｓプロモーター（例えば、成体特異性プロモーター）と作動可能に結合し得る。
【００９３】
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓプロモーター（例えば、成体特異的プロモーター）と作動可能に結合し得る。ＣＡＴは微生物由来で、アセチル補酵素Ａからクロラムフェニコールへのアセチル基の転移を触媒する。一般的に、ＣＡＴアッセイにおいて、トランスフェクトされた細胞のＣＡＴ含有溶解産物は、１４Ｃ−クロラムフェニコールとともにインキュベートされ、その後これはアセチル化される。その後、薄層クロマトグラフィーを使用してアセチル化１４Ｃ−クロラムフェニコールと非アセチル化１４Ｃ−クロラムフェニコールとが分離され得、オートラジオグラフィによって可視化される。必要であれば、放射線分布はスキャニングシステムによって定量され得る。ＣＡＴアッセイを実施する他の方法は当該分野においては周知である。
【００９４】
原核生物のβ−カラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）もまたＣ．ｅｌｅｇａｎｓプロモーター（例えば、成体特異的プロモーター）と作動可能に結合し得る。β−ｇａｌは天然でβ−ガラクトシド（例えば、ラクトース）の加水分解を触媒する。しかしながら、非生理的物質の使用もまた、分光測光法（例えば、Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＯＮＰＧ）を用いる）、蛍光比色法（例えば、４−メチル−ウンベリフェリル−β−ガラクトピラノシド化合物（ＭＵＧ）を用いる）によってもしくは化学発光を介して、トランスフェクトされた細胞の溶解産物中でのβ−ガラクトシダーゼ活性の定量を可能にする。化学発光による検出（例えば、１，２−ジオキセタン−ガラクトピラノシド誘導体で）は、他の２つの検出方法に比べて１００〜１，０００倍感度が高く、ゆえにルシフェラーゼアッセイに比べてなおさらに感度は高い。このシステムの主要な利点は、β−ガラクトシダーゼ活性もインサイチュで測定され得るということである。β−ｇａｌ活性を検出する方法は当該分野において周知である。
【００９５】
Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉルシフェラーゼは、ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢでコードされたαサブユニットおよびβサブユニットを有するダイマーのタンパク質（例えば、Ｊｏｈｎｓｔｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（１１）：４８０５−４８１１（１９８６）によって開示されている）であり、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓプロモーター（例えば、成体特異的プロモーター）と作動可能に結合し得る。ｌｕｘＡおよびｌｕｘＢのうちのただ１つが成体特異的プロモーターに融合された場合、残りの１つは細胞内で恒常的に発現されなければならない。Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉルシフェラーゼ発光は、４９０ｎｍで光を検出することで検出され得る。
【００９６】
北米ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）由来のルシフェラーゼ遺伝子（例えば、ＤｅＷｅｔら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７（２）：７２５−７３７（１９８７）によって開示されている）は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓプロモーター（例えば、成体特異的プロモーター）と作動可能に結合し得る。Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼは生物発光反応を触媒する。ルシフェラーゼアッセイにおいて、トランスフェクトされた細胞の溶解産物はルシフェリン、分子酸素、ＡＴＰおよびＭｇ２＋とともにインキュベートされる。このルシフェラーゼは、オキシルシフェリンおよびＣＯ２へのルシフェリンの酸化を触媒する。この反応において、５６２ｎｍの波長の光が発せられ、その後この光はすぐに消える。発せられた光はルミノメーターもしくは液体シンチレーション計算器で測定され得る。光の放出は溶解産物中のルシフェラーゼの量に比例する。このルシフェラーゼアッセイの感度は、補酵素Ａを反応調製物中に加えることでさらに増し、ＣＡＴアッセイよりも１０〜２０倍高い感度になる。
【００９７】
Ｒｅｎｉｌｌａ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のルシフェラーゼ（例えば、Ｌｏｒｅｎｚら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：４４３８−４４９２（１９９１）によって開示されている）もまた、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓプロモーター（例えば、成体特異的プロモーター）と作動可能に結合し得る。ホタルルシフェラーゼおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの活性は、一つのサンプル中で別々に測定され得る。ゆえに、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの活性は、異なるトランスフェクション実験を比較するための内部コントロールとして使用され得る。両方のルシフェラーゼとも、２つのｃｉｓ−エレメントの平行検査のための同時導入実験においてもまた使用される。
【００９８】
Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（例えば、Ｐｒａｓｈｅｒら（Ｇｅｎｅ  １１１（２）：２２９−３３（１９９２））によって開示されている）は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓプロモーター（例えば、成体特異的プロモーター）と作動可能に結合し得る。Ａ．ｖｉｃｔｏｒｉａクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質は、発光するためにさらなるタンパク質、基質もしくは補因子を必要としない。ＵＶ光もしくは青い光で照射された場合、これは緑色光を発し、インサイチュおよびインビボでの遺伝子発現の検査およびタンパク質の位置確認を可能にする。さらに、この遺伝子発現は実時間において観察され得る。Ａ．ｖｉｃｔｏｒｉａ  ＧＦＰは、蛍光を４８５ｎｍの光で励起させ、光出力を５３５ｎｍで測定することで検出され得る。
【００９９】
異なる吸収および放出の最大値を有するＧＦＰの変種もまた、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓプロモーター（例えば、成体特異的プロモーター）と作動可能に結合し得る。ＧＦＰの他の変種は哺乳動物の細胞内で発現するように特に設計されているか、もしくは３５倍までの高い蛍光を有する。強烈に減少した半減期を有するＧＦＰ系の補助を用いて、細胞内の動的プロセスもまたインビボで検査され得る。
【０１００】
変化した蛍光特徴を示すＡ．ｖｉｃｔｏｒｉａ変異体に関する参考文献としては、例えば、Ｈｅｉｍら（１９９５，Ｎａｔｕｒｅ  ３７３：６６３−６６４）が挙げられ、これはポリペプチドの蛍光強度を強めるＡ．ｖｉｃｔｏｒｉａのＳ６５での変異に関連している。Ａ．ｖｉｃｔｏｒｉａ変異体に関するさらなる参考としては、例えば、Ｅｈｒｉｇら，１９９５，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３６７：１６３−１６６；Ｓｕｒｐｉｎら，１９８７，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．４５（補遺）：９５Ｓ；Ｄｅｌａｇｒａｖｅら，１９９５，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：１５１−１５４；およびＹａｎｇら，１９９６，Ｇｅｎｅ  １７３：１９−２３が挙げられる。Ａ．ｖｉｃｔｏｒｉａのＧＦＰおよびその変異体に関する特許および特許出願の参考としては以下が挙げられる：米国特許第５，８７４，３０４号はポリペプチドのスペクトル特徴および蛍光強度を変化すると言われるＡ．ｖｉｃｔｏｒｉａのＧＦＰ変異体を開示している。米国特許第５，９６８，７３８号はスペクトル特徴を変化すると言われるＡ．ｖｉｃｔｏｒｉａのＧＦＰ変異体を開示している。１つの変異であるＶ１６３Ａは蛍光強度の増加をもたらすと言われている。米国特許第５，８０４，３８７号は増加した蛍光強度を有する（特に、４８８ｎｍのレーザー光による励起に対する反応において）と言われるＡ．ｖｉｃｔｏｒｉａの変異体を開示している。米国特許第５，６２５，０４８号はスペクトル特徴を変化すると言われるＡ．ｖｉｃｔｏｒｉａの変異体ならびに増加した蛍光強度を有するいくつかの変異体を開示している。関連する米国特許第５，７７７，０７９号は、Ａ．ｖｉｃｔｏｒｉａのＧＦＰポリペプチドに増加した蛍光強度を提供すると言われる変異のさらなる組み合わせを開示している。国際公開第９８／２１３５５号は、増加した蛍光強度を有すると言われるＡ．ｖｉｃｔｏｒｉａのＧＦＰ変異体を開示しおり、国際公開第９７／２００７８号、国際公開第９７／４２３２０号および国際公開第９７／１１０９４号も同様に開示している。国際公開第９８／０６７３７号はスペクトル特徴を変化すると言われる変異体を開示しており、そのいくつかは増加した蛍光強度を有すると言われる。
【０１０１】
Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子もまたＣ．ｅｌｅｇａｎｓプロモーター（例えば、成体特異的プロモーター）と作動可能に結合し得る。Ｅ．ｃｏｌｉのＧＵＳは、形質転換された植物内でマーカー遺伝子として所望する特徴を提供することが充分立証されている。組織もしくは細胞内でのβ−グルクロニダーゼ活性の組織化学的位置確認のために現在使用可能な基質は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルグルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）である。この基質はよく作用し、酵素活性の部位において青い沈殿物を生じる。他の基質としては、代謝されると青い産物を産生する４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧｌｃＵ）、および代謝されると明るい青色を生じるカルボキシウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＣＵＧｌｃＵ）である。
【０１０２】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ細胞ワーム内でのキチナーゼ産生は、当該分野において公知のいくつかの方法によって検出され得る。例えば、Ｅｌｌｅｒｂｒｏｃｋら，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ  ９（２）：１４７−５２（２００４）によって一つの方法が開示されている：蛍光発生性（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ）キチナーゼ基質（ＤＭＳＯ中の１０μｌの０．８ｍＭの４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリアセチルキト−トリオシドを、テストされるワームが入った９６−ウェルプレートの各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートする。１００μｌのアルカリ性緩衝液（１Ｍ  グリシン／１Ｎ  ＮａＯＨ、ｐＨ１０．６）を加えて、このアッセイを停止させる。フルオロメーター（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ）で、励起３６０／４０、放出４６０／４０、獲得７５でウェルを読み取る。
【０１０３】
他のレポーターとしては、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓプロモーター（例えば、成体特異的プロモーター）から直接発現され得るか、もしくはプロモーターに作動可能に連結するオープンリーディングフレームに付加され得るエピトープタグが挙げられる。このようなタグとしては、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、血球凝集素（ＨＡ）タグ、セルロース結合タンパク質（ＣＢＰ）タグおよびｍｙｃタグが挙げられる。このようなタグを検出する便利な方法は、ウェスタンブロット分析によるかもしくはＥＬＩＳＡによる方法である。
【実施例】
【０１０４】
以下の実施例は、本発明が何であるかを例示しかつさらに明確にするように意図されており、本発明を限定するものと解釈されるべきでない。本発明は、本明細書に示されるいかなるメカニズムもしくは理論によっても限定されるべきでない。実施例中に開示される任意の方法とともに開示される任意の組成物は本発明の一部である。
【０１０５】
（実施例１：ヒトＮＰＣ１Ｌ１の遺伝的分析）
本研究において、本発明者らは、ヒトＮＰＣ１Ｌ１はＣ．ｅｌｅｇａｎｓのｎｃｒ−１および／もしくはｎｃｒ−２を機能的に代替し得ることを証明した。特に、本発明者らは、ｎｃｒ−１プロモーターおよびｎｃｒ−２プロモーターの両方からｈＮＰＣ１Ｌ１を発現させ、ｎｃｒ−１；ｎｃｒ−２の二重変異体のｄａｕｅｒ−恒常的表現型をレスキューする能力を証明した。
【０１０６】
（材料および方法）
遺伝学。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの取り扱いおよび遺伝的操作の標準的方法は、Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ．（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７７：７１−９４（１９７４））によって記載されている。全ての実験を、２０℃で実施した。これらの実験において、単一変異であるｎｃｒ−１（ｎｒ２０２２）系統およびｎｃｒ−２（ｎｒ２０２３）系統ならびに二重変異であるＪＴ１０８００  ｎｃｒ−２（ｎｒ２０２３）；ｎｃｒ−１（ｎｒ２０２２）系統を使用した。本発明者らは、この系統の連続的な繁殖は、徐々に生存可能未満の動物を生じることが報告されたことを注記する（Ｌｉら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３１：５７４１−５７５２（２００４））。しかしながら、本発明者らの実験室の条件下では、本発明者らはこの表現型を観察しなかった。本発明者らはまた、Ｄａｆ−Ｃ表現型は本発明者らの条件下で完全に浸透性であり、本明細書に記載のレスキューアッセイの基礎であることも注記する。
【０１０７】
プラスミド構築物。プラスミドｐＰＤ４９．２６（Ｆｉｒｅら，Ｇｅｎｅ  ９３，１８９−１９８（１９９０））が、ｎｃｒ−１もしくはｎｃｒ−２プロモーターからヒトＮＰＣ１Ｌ１を発現するように設計された発現ベクターにとっての出発プラスミドであった。このｎｃｒ−１プロモーターを、プライマーｎｃｒ−１４ｋｂｓｐｈ５’：
【０１０８】
【化１９】
2008523807.tif 000020
およびプライマーｎｃｒ１ｐＢａｍ３’：
【０１０９】
【化２０】
2008523807.tif 000021
を使用してゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅させた。３８８９ｂｐのｎｃｒ−１プロモーターを含むプラスミドｎｃｒ−１ｐ／ｈＮＰＣ１Ｌ１／４９．２６をｐＰＤ４９．２６のＢａｍ  ＨＩ制限部位およびＮｈｅ  Ｉ制限部位に挿入し、ヒトＮＰＣ１Ｌ１（Ａｌｔｍａｎｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３，１２０１−４（２００４））をｐＰＤ４９．２６のＮｈｅ  Ｉ制限部位およびＫｐｎ  Ｉ制限部位に挿入した。
【０１１０】
ｎｃｒ−２プロモーターを、プライマーｎｃｒｐ２２４５：
【０１１１】
【化２１】
2008523807.tif 000022
およびプライマーｎｃｒ−２３’ｐｒｏｍ：
【０１１２】
【化２２】
2008523807.tif 000023
を使用してゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅させた。４１９８ｂｐのｎｃｒ−２プロモーターを含むプラスミドｎｃｒ−２ｐ／ｈＮＰＣ１Ｌ１／４９．２６をｐＰＤ４９．２６のＳｍａ  Ｉ制限部位に挿入し、ヒトＮＰＣ１Ｌ１（Ａｌｔｍａｎｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３，１２０１−４（２００４））をｐＰＤ４９．２６のＮｈｅ  Ｉ制限部位およびＫｐｎ  Ｉ制限部位に挿入した。
【０１１３】
ＧＦＰを、プライマーＧＦＰ５’Ｘｂａ：
【０１１４】
【化２３】
2008523807.tif 000024
およびプライマーＧＦＰ３’Ｎｏｔ：
【０１１５】
【化２４】
2008523807.tif 000025
を使用してｐＰＤ９５．６７（Ｆｉｒｅら，Ｇｅｎｅ  ９３，１８９−１９８（１９９０））から増幅させた。このＧＦＰのＰＣＲフラグメントの末端はＫｌｅｎｏｗ酵素を使用して平滑にした。このＧＦＰのＰＣＲフラグメントを、ｎｃｒ−１ｐ／ｈＮＰＣ１Ｌ１／４９．２６からヒトＮＰＣ１Ｌ１を取り除いて（制限酵素Ｎｈｅ  Ｉおよび  Ｅｃｏ  ＲＶでの消化、続いてＫｌｅｎｏｗ酵素での処理によって）作製した平滑部位に挿入した。得られたプラスミドをｎｃｒ−１ｐ／ＧＦＰ／４９．２６と命名した。さらに、このＧＦＰのＰＣＲフラグメントを、ｎｃｒ−２ｐ／ｈＮＰＣ１Ｌ１／４９．２６からヒトＮＰＣ１Ｌ１を取り除いて（Ｎｈｅ  Ｉおよび  Ｋｐｎ  Ｉでの消化、続いてＫｌｅｎｏｗ酵素での処理によって）作製した平滑制限部位に挿入した。得られたプラスミドをｎｃｒ−２ｐ／ＧＦＰ／４９．２６と命名した。ｎｃｒ−１プロモーターおよびｎｃｒ−２プロモーターの両方からの発現パターンは、以前に記載されている（Ｌｉら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３１、５７４１−５７５２（２００４））。本発明者らは、Ｌｉらが記載するｎｃｒ−２プロモーターからの発現パターンと本発明者らが観察した発現パターンとの間の以下の違いに気付いた。第一に、本発明者らのｎｃｒ−２ｐ／ＧＦＰ／４９．２６は、性腺鞘でＬｉら（２００４）によって示されたようには発現されない。第二に、本発明者らはほとんどの動物において腹側の神経索の全体にわたって発現を観察した。本発明者らは、野性型バックグランドおよびｎｃｒ−２（ｎｒ２０２３）；ｎｃｒ−１（ｎｒ２０２２）変異体バックグラウンドの両方における本発明者らの発現パターンを評価し、系統間での違いは見られなかった。
【０１１６】
ｎｃｒ−１ゲノムコード領域を含むゲノムフラグメントを、プライマーｎｃｒ５’ｓｍａ：
【０１１７】
【化２５】
2008523807.tif 000026
およびプライマーｎｃｒ１３’Ａ：
【０１１８】
【化２６】
2008523807.tif 000027
を使用してＰＣＲ増幅させた。得られたＰＣＲ産物は８３３８ｂｐの長さであり、ＡＴＧの直後に始まり、終止コドンの９９６ｂｐ後に終了した。ゆえに、これは、ＡＴＧが削除され、Ｓｍａ  Ｉ制限部位によって置換されたｎｃｒ−１ゲノムフラグメントを生じた。このＰＣＲフラグメントを、ｐＣＲＸＬベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に直接挿入した。
【０１１９】
ｎｃｒ−２ゲノムコード領域を含むが、ＡＴＧのちょうど３’で開始する７．３ｋｂのゲノムフラグメントを、プライマーｎｃｒ−２ｎｏＡＴＧ：
【０１２０】
【化２７】
2008523807.tif 000028
およびプライマーｎｃｒ−２３’ＵＴＲ：
【０１２１】
【化２８】
2008523807.tif 000029
を使用してＮ２ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅させた。このＰＣＲフラグメントを、ｐＴＯＰＯ  ＸＬベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に直接挿入した。
【０１２２】
ｎｃｒ−１の１番目のイントロンを、プライマーｎｃｒ−１３’イントロン１：
【０１２３】
【化２９】
2008523807.tif 000030
およびプライマーｎｃｒ−１５’イントロン１：
【０１２４】
【化３０】
2008523807.tif 000031
を使用して１．０４７ｋｂのフラグメントとしてＰＣＲ増幅させた。このＰＣＲフラグメントを、ｐＣＲ４  ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に直接挿入した。
【０１２５】
ｎｃｒ−２の１４番目のイントロンを、プライマー：Ｆ０９Ｇ８Ｆ２４３８：
【０１２６】
【化３１】
2008523807.tif 000032
およびプライマーＦ０９Ｇ８Ｒ５９６９：
【０１２７】
【化３２】
2008523807.tif 000033
を使用して、Ｎ２ゲノムＤＮＡから３．５ｋｂのフラグメントとしてＰＣＲ増幅させた。このＰＣＲフラグメントを、ｐＣＲ４  ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に直接挿入した。ｎｃｒ−２のイントロン１４は、ｃｏｌ−９１遺伝子のコード領域を含み；予備データは、この遺伝子の発現が、本発明者らのトランスジェニック動物を回復する能力を妨害していることを示唆した。ゆえに、本発明者らは、ＢｓｍＢ１での消化およびＴ４ポリメラーゼでの処理によってｃｏｌ−９１の２番目のエキソンにおけるフレームシフトを設計した。得られたフラグメントの配列解析は４ｂｐの欠失を示した。この欠失は、この遺伝子のコード領域内にフレームシフトを生じた。ｎｃｒ−２の１４番目のイントロンを有する、本研究において記載される全てのトランスジェニック動物は、ｃｏｌ−９１内にフレームシフトを有する形態を含む。
【０１２８】
ミクロ注入。そうでないことが記載されない限り、全てのプラスミドを、２０μｇ／ｍｌで、１００ｕｇ／ｍｌの優性ｒｏｌ−６の共形質転換マーカーｐＲＦ４（Ｍｅｌｌｏら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０、３９５９−３９７０（１９９１））と一緒に、二重変異体のｎｃｒ−２（ｎｒ２０２３）；ｎｃｒ−１（ｎｒ２０２２）系統内に注入した。系統を樹立し、同時に、この動物を、最終濃度が５μｇ／ｍｌのコレステロールの添加を含む標準的ＮＧＭプレート上で成長させた（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７７：７１−９４（１９７４））。
【０１２９】
レスキューアッセイ。成体のトランスジェニック動物をＮＧＭ−プレートに移した。このＮＧＭプレートは、外因性コレステロールが加えられないことを除いては標準的ＮＧＭプレートと類似していた。これらのプレートは、培地のアガーおよびペプトン成分に由来する残留程度のコレステロールをまだ有していた。これらの条件下で、このｎｃｒ−２（ｎｒ２０２３）；ｎｃｒ−１（ｎｒ２０２２）二重変異体はｄａｕｅｒ段階を容易に出なかった。このことは、ｄａｕｅｒ段階にほんの一時的に入る（１日かそれくらい後にこのｄａｕｅｒは回復し、正常な発生を続ける）標準的ＮＧＭプレート上で育った二重変異動物とは対照であった。成体のトランスジェニック動物に、２〜３時間ＮＧＭ−プレート上で卵を産ませ、その後取り出した。７５〜１２０時間後にＬ３段階から成体段階への進行に関してこれらのプレート上のＲｏｌｌｅｒの子孫を評価した。
【０１３０】
間接免疫蛍光検査法。動物をＢｅｔｔｉｎｇｅｒら（１９９６）中に記載のように固定した。ラットＮＰＣ１Ｌ１およびヒトＮＰＣ１Ｌ１を認識するポリクローナル抗体  Ａ１８０１（Ｉｙｅｒら，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１７２２：２８２−２９２（２００５））の１：２００の希釈液を固定したｎｃｒ−２（ｎｒ２０２３）；ｎｃｒ−１（ｎｒ２０２２）の二重変異ワームに、４℃で一晩あらかじめ吸収させた。上澄みを取り除き、固定したトランスジェニック動物もしくは固定した二重変異動物に、コントロールとして加えた。ＬｅｖｉｔａｎおよびＧｒｅｅｎｗａｌｄ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２５：３１０１−３１０９（１９９８）に記載されているように、ワームを洗浄し、Ｃｙ３−結合体化二次抗体とともにインキュベートし、再び洗浄し、そしてＭＴＩ  ＣＣＤカメラを備えたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｐｈｏｔ  ２  ＭＯＴ顕微鏡で見た。
【０１３１】
（結果）
ヒトＮＰＣ１Ｌ１がｎｃｒ−１および／もしくはｎｃｒ−２を機能的に代替し得るかどうかを決定するために、本発明者らは、ｎｃｒ−１プロモーターからヒトＮＰＣ１Ｌ１を発現させた。ｎｃｒ−２；ｎｃｒ−１変異体のバックグラウンドにトランスジェニック系統を作製することでレスキューが決定された。トランスジェニック系統を作製するために、テストプラスミドを可視の共形質転換マーカー（この場合、プラスミドｐＲＦ４（Ｍｅｌｌｏら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３９５９−３９７０（１９９１））とともに同時注入した。このプラスミドは、動物への注入の後、１本の染色体外の列（ａｒｒａｙ）に集合した。これらの染色体外列を有する動物を、視覚的検査で選択し、トランスジェニック系統を樹立した。
【０１３２】
このようにして、本発明者らは、テストプラスミドのｎｃｒ−２；ｎｃｒ−１恒常的ｄａｕｅｒ表現型をレスキューする能力を評価し得た。標準的（ＮＧＭ）培地上で恒常的に育てたｎｃｒ−２；ｎｃｒ−１変異動物は、ｄａｕｅｒ段階にほんの一時的に入った（これらは、２〜４日以内に回復し、そして成体に成長した）（Ｓｙｍら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：５２７−５３０（２０００））。しかしながら、本発明者が培地内のコレステロールを減少させた場合（本発明者らがＮＧＭ−培地で行なったように（材料および方法を参照されたい））、ｎｃｒ−２；ｎｃｒ−１変異動物はｄａｕｅｒとして停止するか、もしくは標準的ＮＧＭ培地で育ったものよりも有意に長くｄａｕｅｒ段階に留まるかのいずれかであった。
【０１３３】
まず、本発明者らは、プラスミドｎｃｒ−１ｐ／ｈＮＰＣ１Ｌ１／４９．２６もしくはｎｃｒ−２ｐ／ｈＮＰＣ１Ｌ１／４９．２６を、ｎｃｒ−２；ｎｃｒ−１変異バックグラウンドにおいてこれらのプラスミドを有するトランスジェニック動物を作製することにより、単独でもしくは一緒にテストした。ｎｃｒ−２ｐ／ｈＮＰＣ１Ｌ１／４９．２６を１００ｕｇ／ｍｌで注入することにより、２つの系統を作製し、２つのプラスミド、ｎｃｒ−１ｐ／ｈＮＰＣ１Ｌ１／４９．２６＋ｎｃｒ−２ｐ／ｈＮＰＣ１Ｌ１／４９．２６をそれぞれ１００ｕｇ／ｍｌで同時注入することにより、５つの系統を作製した。これらの系統のいずれも、ｎｃｒ−２；ｎｃｒ−１の変異動物のｄａｕｅｒ−恒常的表現型をレスキューする能力を何ら証明しなかった。
【０１３４】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの多くの遺伝子の適切な発現は、５’プロモーター領域に加えて、ゲノム調節因子を含めることによってのみ成し遂げられる。これらの調節因子はしばしばイントロンで見出され、所定の遺伝子の完全な発現の達成のために含まれなければならない（例えば、Ｓｔｒｕｈｌら，Ｃｅｌｌ  ７４：３３１−３４５（１９９３）およびＬｅｖｉｔａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：１２１８６−１２１９０（２００１）を参照されたい）。この目的のために、本発明者らは８ｋｂのゲノム領域をｎｃｒ−１遺伝子から増幅させた。それはＡＴＧの直後から始まり３’ＵＴＲまでの全ゲノム領域を含んだ。本発明者らの５’プライマーは、増幅の際に、独特のＳｍａ  Ｉ制限酵素部位を開始ＡＴＧの部位に挿入するようなやり方で設計された（材料および方法を参照されたい）。このＰＣＲフラグメントは、ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ）ベクター系内に直接クローニングされた。
【０１３５】
本発明者らは、ｎｃｒ−１の８ｋｂのゲノム領域とプラスミドｎｃｒ−１ｐ／ｈＮＰＣ１Ｌ１／４９．２６およびプラスミドｎｃｒ−２ｐ／ｈＮＰＣ１Ｌ１／４９．２６とを、ｎｃｒ−２；ｎｃｒ−１二重変異体内に同時注入した。プラスミドの同時注入は大きな染色体外列の無作為な集合体を生じるので、本発明者らは、８ｋｂのｎｃｒ−１のゲノムフラグメント上に含まれる調節領域は、もしかするとｈＮＰＣ１Ｌ１を発現するプラスミドに非常に接近して存在し、これらのプラスミドからの発現を強化させるのではないかと推論した。コントロールとして、本発明者らは、８ｋｂのｎｃｒ−１のゲノムフラグメントをｎｃｒ−１ｐ／ＧＦＰ／４９．２６とともに同時注入した。これらの実験の結果を、表１に示す。
【０１３６】
【表１】
2008523807.tif 000034
８ｋｂのｎｃｒ−１ゲノムフラグメントおよび共形質転換マーカーのみの注入は、ｎｃｒ−２（ｎｒ２０２３）；ｎｃｒ−１（ｎｒ２０２２）のＤａｆ−ｃ表現型の認知可能なレスキューをもたらさなかった（データーは示されていない）。この結果は、８ｋｂのｎｃｒ−１ゲノムフラグメントは生来のレスキュー活性を有しないことを示した。８ｋｂのｎｃｒ−１ゲノムフラグメントを、ｎｃｒ−１プロモーター（ｎｃｒ−１ｐ／ＧＦＰ／４９．２６）もしくはｎｃｒ−２プロモーター（ｎｃｒ−２ｐ／ＧＦＰ／４９．２６）からＧＦＰを発現するプラスミドとともに保有するトランスジェニック動物もまたレスキューされなかった（表１）。この結果は、染色体外列形成の間は８ｋｂのｎｃｒ−１ゲノムフラグメントは異常な組換え事象を受けず、それによりインタクトなｎｃｒ−１遺伝子を産生する（ｎｃｒ−１プロモーターおよびｎｃｒ−２プロモーターは、ｎｃｒ−１ゲノムフラグメントからの発現を駆動する）ことを証明した。最後に、ｎｃｒ−１プロモーターおよびｎｃｒ−２プロモーターからヒトＮＰＣ１Ｌ１を発現するトランスジェニック動物の４０〜５０％がｄａｕｅｒを恒常的に形成しなかった。これらの動物はｄａｕｅｒ段階に停止することなく発生が進んだ。さらに、ｎｃｒ−２プロモーターのみからｈＮＰＣ１Ｌ１を発現するトランスジェニック動物の２４〜７５％がレスキューを示した。これらの結果は、ヒトＮＰＣ１Ｌ１はｎｃｒ−１および／もしくはｎｃｒ−２を機能的に代替し得ることを示した。
【０１３７】
本発明者らが観察したレスキューがｈＮＰＣ１Ｌ１タンパク質発現の結果であると確認するために、本発明者らはまず、ｎｃｒ−１ｐ／ｈＮＰＣ１Ｌ１／４９．２６、ｎｃｒ−２ｐ／ｈＮＰＣ１Ｌ１／４９．２６および８ｋｂのｎｃｒ−１のゲノムフラグメントを含む染色体外列を染色体内に組み込んだ。それにより、この動物の全ての細胞がこれらのトランスジーンの安定形態を保有した。その後、間接免疫蛍光検査法によって固定したワームのタンパク質を検出するために、本発明者らは、ラットＮＰＣ１Ｌ１を指向し、またヒトタンパク質  Ａ１８０１にも交差反応する抗体（Ｉｙｅｒら，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１７２２：２８２−２９２（２００５））を、使用した。これらの研究において、全ての動物はｎｃｒ−２（ｎｒ２０２３）；ｎｃｒ−１（ｎｒ２０２２）のバックグラウンドにあった。これらの動物は、ｎｃｒ−１ｐ／ｈＮＰＣ１Ｌ１／４９．２６、ｎｃｒ−２ｐ／ｈＮＰＣ１Ｌ１／４９．２６および８ｋｂのｎｃｒ−１ゲノムフラグメント構築物を保有する染色体外列を保有した。本発明者らは、頭部の咽頭の前方球と後方球との間の一対のニューロン様細胞における特異的な発現を検出した。この発現は、これらの２つの細胞においてのみ、そしてＬ３段階よりも若い動物においてのみ見られる。興味深いことに、この時間的かつ空間的制限は、ｄａｆ−９プロモーターから見られる発現に対応し、これはＸＸＸ細胞に制限されることが示された（Ｊｉａら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２９：２２１−２３１（２００２））。この一対の細胞は、恒常的ｄａｕｅｒ表現型にとって決定的であることが証明された。野生型動物のＸＸＸ細胞のレーザー切除はｄａｕｅｒ形成を誘発する（Ｇｅｒｉｓｃｈら，Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  １：８４１−８５１（２００１））。
【０１３８】
表１に示す結果は、８ｋｂのｎｃｒ−１ゲノムフラグメントは、内因性のレスキュー活性は有しないが、ｎｃｒ−１ｐ／ｈＮＰＣ１Ｌ１構築物およびｎｃｒ−２ｐ／ｈＮＰＣ１Ｌ１構築物からの発現もしくは活性を増強させる調節領域を提供し得ることを示唆した。次に、本発明者らは、ｎｃｒ−２ゲノム領域もまた、ｈＮＰＣ１Ｌ１発現ベクターと共に同時注入された際にレスキュー活性を与えるこの能力を有するかどうかを評価することを所望した。単純化するために、本発明者らは、ｎｃｒ−２ｐ／ＧＦＰ／４９．２６発現構築物がｎｃｒ−１ゲノム領域と一緒の同時注入実験の際にレスキュー活性の増強を示したので、ｎｃｒ−２ｐ／ＧＦＰ／４９．２６発現構築物に集中する選択をした。
【０１３９】
本発明者らは、ｎｃｒ−２について同一の構築物を作製し、そこで本発明者らは７．３ｋｂのｎｃｒ−２ゲノム領域（開始ＡＴＧの下流の１コドンから停止コドンまで）（材料および方法を参照されたい）をＰＣＲ増幅させた。表２に示すように（下記）、このｎｃｒ−２ゲノム領域をｎｃｒ−２ｐ／ＧＦＰ／４９．２６とともに同時注入した場合、レスキュー活性は観察されなかった。この結果は、このｎｃｒ−２ゲノムフラグメントは、その対応するｎｃｒ−１と同様に、内因性のレスキュー活性を有しないことを示唆した。しかしながら、本発明者らが、ｎｃｒ−２の７．３ｋｂのゲノムフラグメントをｎｃｒ−２ｐ／ｈＮＰＣ１Ｌ１／４９．２６とともに同時注入した場合、本発明者らは、１８〜３９％のトランスジェニック動物がレスキューされたことを観察した。これらの結果は、ｎｃｒ−２ゲノムフラグメントもまた、ｎｃｒ−２プロモーターからの発現もしくは活性を増強し得る情報を有したことを示唆した。
【０１４０】
【表２】
2008523807.tif 000035
本発明者らは、ｎｃｒ−２ｐ／ＧＦＰ／４９．２６構築物を保有する染色体外列からのＧＦＰ発現と、８ｋｂのｎｃｒ−１ゲノム領域と共に同時注入されたｎｃｒ−２ｐ／ＧＦＰ／４９．２６構築物を保有する染色体外列とを比較することによりこの発現の強化を可視化することを試みた。後者の列からの発現が定性的により強いようであったが（データは示されていない）、本発明者らは、これらの列から生じる全体的に弱いシグナルに起因してこの違いを定量することは困難であることを見出した。
【０１４１】
全ｎｃｒ−１ゲノム領域および全ｎｃｒ−２ゲノム領域の両方とも、ｈＮＰＣ１Ｌ１がｎｃｒ−１プロモーターもしくはｎｃｒ−２プロモーターのいずれかから発現された場合に、Ｄａｆ−Ｃ表現型のレスキューを増強し得るので、本発明者らは、このプロセスにおいて重要な役割を果たし得るこれらのゲノム領域内でより特異的な配列を同定しようと試みた。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのイントロンは典型的に小さく、６５ヌクレオチドのサイズ中央値を有する（Ｓｐｉｅｔｈら，Ｊ．ａｎｄ  Ｌａｗｓｏｎ，Ｄ．（２００５）．Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｉｎ  Ｗｏｒｍｂｏｏｋ，ｖｏｌ．２００５（編集：Ｔｈｅ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ，ＷｏｒｍＢｏｏｋ，ｄｏｉ／１０．１８９５／ｗｏｒｍｂｏｏｋ．１．７．１）。本発明者らは、遺伝子ｐａｌ−１内の１．５ｋｂのイントロンによって証明されたように（このイントロンは調節情報を含むことが示されている）、より大きなイントロンは調節情報をより含みやすいと推論した（Ｚｈａｎｇら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１４：２１６１−２１７２（２０００））。本発明者らは、さらなる研究のために、ｎｃｒ−１の１番目のイントロン（８６１ｂｐ）およびｎｃｒ−２の１４番目のイントロン（１．８ｋｂ）を選択した。さらにまた、本発明者らは、本発明者らの分析をｎｃｒ−２ｐ／ｈＮＰＣ１Ｌ１／４９．２６発現ベクターに集中させた。表３（下方）に示すように、ｎｃｒ−１からの１番目のイントロンもしくはｎｃｒ−２からの１４番目のイントロンは、ｎｃｒ−２プロモーターからのｈＮＰＣ１Ｌ１のレスキュー活性を増強し得た。このことは、これらのイントロンが適切な細胞タイプ内でｎｃｒ−２プロモーターからの活性を増強する調節情報を含み得ることを示唆した。
【０１４２】
【表３】
2008523807.tif 000036
（考察）
本実施例において、本発明者らは、ヒトＮＰＣ１Ｌ１はｎｃｒ−１および／もしくはｎｃｒ−２を機能的に代替し得ることを証明した。ｎｃｒ−１／ｎｃｒ−２とヒトＮＰＣ１Ｌ１との間の相同性の程度がおおよそ３０％であっても、この程度の低い同一性での、ワーム遺伝子とヒト遺伝子との間のこの種の機能的保存の前例がある（例えば、Ｗｕら，Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：５０１−５０４（１９９８）を参照されたい）。ヒトＮＰＣ１Ｌ１は腸のコレステロール吸収と関連付けられてきたが、現在、このタンパク質の機能アッセイは、存在しない。本明細書中に記載のデータは、ヒトＮＰＣ１Ｌ１の機能アッセイの最初の記述を提供する。
【０１４３】
本発明者らは、ｎｃｒ−１遺伝子およびｎｃｒ−２遺伝子のゲノム領域は本アッセイにおいていくらかの調節情報を提供することを示した。このことにより、ｈＮＰＣ１Ｌ１遺伝子によるレスキューを証明することが可能になった。本発明者らは、ｈＮＰＣ１Ｌ１タンパク質は、実際に、関連する時間的および空間的パターンで発現され、そしてこの調節情報の少なくともいくつかはｎｃｒ遺伝子の大きなイントロン中で見出され得ることを示した。全ｎｃｒ−１ゲノム領域もしくは全ｎｃｒ−２ゲノム領域によって観察されるレスキューよりもレスキューの程度がかなり低いことから、本明細書中のテストされる２つのイントロンは全ての調節情報を含んではいないようである。さらに、ｎｃｒ−１のイントロン１およびｎｃｒ−２のイントロン１４の配列と、関連する線虫Ｃ．ｂｒｉｇｇｓａｅからの対応するイントロンとの比較により、実質的に相同な鎖は明らかにされなかった。このことは、これらのイントロン内に位置する任意の調節情報は拡散し得ることを示唆する。
【０１４４】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるヒトＮＰＣ１Ｌ１の機能アッセイに関するいくつかの用途がある。これによって、本発明者らは、タンパク質の詳細な構造／機能分析を実施することが可能になる。例えば、本発明者らは、タンパク質のどの部分（特異的膜貫通ドメインもしくはステロール−感知ドメインのような部分）がその機能において決定的であるかを明らかにし得る。さらに、本発明者らは、ヒト集団内で見出される一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）がどのような効果をこのタンパク質の機能にもたらすかを検査し得る。
【０１４５】
さらに、ヒトＮＰＣ１Ｌ１を発現するトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓは、このタンパク質の機能を阻害する化合物を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。このような化合物は、哺乳動物におけるコレステロール吸収に深い効果を有する。ヒトＮＰＣ１Ｌ１は、ｎｃｒ−２；ｎｃｒ−１変異動物のＤａｆ−ｃ表現型をレスキューし得、それによって、これらの成体まで進行させることを可能にする。本発明者らは、この表現型を利用した高処理能力のアッセイを使用し得る。例えば、成体動物は、動物が卵殻から孵化し得るようにキチナーゼを培地内に分泌する卵を産生する。ヒトＮＰＣ１Ｌ１を阻害する化合物は、成体段階への進行の欠損をもたらす。これらの動物は、ヒトＮＰＣ１Ｌ１が阻害されなかったトランスジェニック動物に比べて有意に低い量のキチナーゼを培地内に分泌する。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるキチナーゼ活性を利用した酵素アッセイは、ヒトプレセニリンのワームのホモログの機能に影響をおよぼす化合物を探すための手段として既に記載されている（Ｅｌｌｅｒｂｒｏｃｋら，Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ．９：１４７−１５２（２００４））。あるいは、ＧＦＰは、成体特異的プロモーター（例えば、ｃｏｌ−１９（Ｌｉｕら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：１２１：２４７１−２４７８（１９９５））から発現され得、これは成体段階を通じての進行および化合物によるこのプロセスの阻害を評価するためにモニターされ得る。
【０１４６】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態による範囲内に限定されるべきでない。実に、本明細書に記載の改変に加えて多種の本発明の改変が、前述の記載から当業者に明らかとなる。このような改変は添付の特許請求の範囲の範囲内であると意図される。
【０１４７】
特許、特許出願、アクセス番号、刊行物、製品の説明書、およびプロトコールは、本出願中の全体に引用されており、これらの開示は全ての目的で本明細書中にその全体が参考として援用される。
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年9月13日(2007.9.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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