(57)【要約】  本発明は、医薬品として使用するチオキソチアゾリジノン化合物、該化合物を含む医薬組成物、並びに白血病、白血病以外の癌及び悪性腫瘍、炎症性疾患などの白血球の細胞遊走に起因する病態の治療用医薬組成物を製造するための、小分子化合物である該チオキソチアゾリジノン化合物の用途に関する。該化合物は、αмインテグリンＩドメインの活性型立体配座を安定化させることによって、白血球の細胞遊走を阻害する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬品として使用する、下記式Ｉで表されるチオキソチアゾリジノン化合物。
【化１】
2008511594.tif 000004
（式中、
mは０、１又は２であり；
Xは、水素もしくは無置換又は低級アルキル基、水酸基、ハロゲンよりなる群から選ばれる少なくとも１つの置換基で置換されたシクロアルキル基又はフェニル基であり；
nは、０又は１であり；
Yは、フェニル基、フラニル基、インドール基及びピロール基よりなる群から選ばれる基であり、但し上記の基は、無置換であるか又は低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン、(３,５-ジメチルフェノキシ）プロポキシ基、及び無置換又は置換されたフェニル基よりなる群から選ばれる少なくとも１つの置換基で置換されており、該置換されたフェニル基は、その置換基としてハロゲン、ニトロ基、アミノ基及びカルボキシル基よりなる群から選ばれる少なくとも１つを有する。）
【請求項２】
式Ｉにおいて、mが0であり、Xが無置換又はメチル基でオルト置換されたフェニル基であり、nが１であり、Yが無置換のフェニル基であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
医薬品として使用するチオキソチアゾリジノン化合物であって、
(E)-５-(４-(３-(３,５-ジメチルフェノキシ)プロポキシ)-３-メトキシベンジリデン)-３-エチル-２-チオキソチアゾリジン-４-オン(ＩＭＢ-２)；
(Z)-３-ベンジル-５-((５-(３-ニトロフェニル)フラン-２-イル)メチレン)-２-チオキソチアゾリジン-４-オン(ＩＭＢ-６)；及び
(５Z)-５((E)-３-フェニルアリリデン)-２-チオキソ-３-o-トリルチアゾリジン-４-オン(ＩＭＢ-１０)
よりなる群から選ばれる化合物。
【請求項４】
下記式Ｉで表されるチオキソチアゾリジノン化合物と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【化２】
2008511594.tif 000005
（式中、
mは０、１又は２であり；
Xは、水素もしくは無置換又は低級アルキル基、水酸基、ハロゲンよりなる群から選ばれる少なくとも１つの置換基で置換されたシクロアルキル基又はフェニル基であり；
nは、０又は１であり；
Yは、フェニル基、フラニル基、インドール基及びピロール基よりなる群から選ばれる基であり、但し上記の基は、無置換であるか又は低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン、(３,５-ジメチルフェノキシ）プロポキシ基、及び無置換又は置換されたフェニル基よりなる群から選ばれる少なくとも１つの置換基で置換されており、該置換されたフェニル基は、その置換基としてハロゲン、ニトロ基、アミノ基及びカルボキシル基よりなる群から選ばれる少なくとも１つを有する。）
【請求項５】
式Ｉにおいて、mが０であり、Xが無置換又はメチル基でオルト置換されたフェニル基であり、nが１であり、Yが無置換のフェニル基であることを特徴とする請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
該チオキソチアゾリジノン化合物が、
(E)-５-(４-(３-(３,５-ジメチルフェノキシ)プロポキシ)-３-メトキシベンジリデン)-３-エチル-２-チオキソチアゾリジン-４-オン(ＩＭＢ-２)；
(Z)-３-ベンジル-５-((５-(３-ニトロフェニル)フラン-２-イル)メチレン)-２-チオキソチアゾリジン-４-オン(ＩＭＢ-６)；及び
(５Z)-５((E)-３-フェニルアリリデン)-２-チオキソ-３-o-トリルチアゾリジン-４-オン(ＩＭＢ-１０)
よりなる群から選ばれる化合物であることを特徴とする、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項７】
白血球細胞遊走に起因する病態の治療用医薬組成物を製造するための、下記式Ｉで表されるチオキソチアゾリジノン化合物の用途。
【化３】
2008511594.tif 000006
（式中、
mは０、１又は２であり；
Xは、水素もしくは無置換又は低級アルキル基、水酸基、ハロゲンよりなる群から選ばれる少なくとも１つの置換基で置換されたシクロアルキル基又はフェニル基であり；
nは、０又は１であり；
Yは、フェニル基、フラニル基、インドール基及びピロール基よりなる群から選ばれる基であり、但し上記の基は、無置換であるか又は低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン、(３,５-ジメチルフェノキシ）プロポキシ基、及び無置換又は置換されたフェニル基よりなる群から選ばれる少なくとも１つの置換基で置換されており、該置換されたフェニル基は、その置換基としてハロゲン、ニトロ基、アミノ基及びカルボキシル基よりなる群から選ばれる少なくとも１つを有する。）
【請求項８】
式Ｉにおいて、mが０であり、Xが無置換又はメチルでオルト置換されたフェニル基であり、nが１であり、Yが無置換のフェニル基であることを特徴とする請求項７に記載の用途。
【請求項９】
白血球細胞遊走に起因する病態が、白血病、白血病以外の悪性腫瘍及び癌、及び炎症性病態よりなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項７に記載の用途。
【請求項１０】
該チオキソチアゾリジノン化合物が、
(E)-５-(４-(３-(３,５-ジメチルフェノキシ)プロポキシ)-３-メトキシベンジリデン)-３-エチル-２-チオキソチアゾリジン-４-オン(ＩＭＢ-２)；
(Z)-３-ベンジル-５-((５-(３-ニトロフェニル)フラン-２-イル)メチレン)-２-チオキソチアゾリジン-４-オン(ＩＭＢ-６)；及び
(５Z)-５((E)-３-フェニルアリリデン)-２-チオキソ-３-o-トリルチアゾリジン-4-オン(ＩＭＢ-１０)
よりなる群から選ばれる化合物であることを特徴とする請求項７〜９のいずれかに記載の用途。
【請求項１１】
白血球細胞遊走に起因する病態の治療又は予防方法であって、上記の治療又は予防を必要とする哺乳類に、白血球細胞遊走を阻害するために有効な量の下記式Ｉで表されるチオキソチアゾリジノン化合物を投与することを包含する方法。
【化４】
2008511594.tif 000007
（式中、
mは０、１又は２であり；
Xは、水素もしくは置換されていないか又は低級アルキル基、水酸基、ハロゲンよりなる群から選ばれる少なくとも1つの置換基で置換されたシクロアルキル基又はフェニル基であり；
nは、０又は１であり；
Yは、フェニル基、フラニル基、インドール基及びピロール基よりなる群から選ばれる基であり、但し上記の基は、無置換であるか又は低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン、(３,５-ジメチルフェノキシ）プロポキシ基、及び無置換又は置換されたフェニル基よりなる群から選ばれる少なくとも１つの置換基で置換されており、該置換されたフェニル基は、その置換基としてハロゲン、ニトロ基、アミノ基及びカルボキシル基よりなる群から選ばれる少なくとも１つを有する。）
【請求項１２】
白血病、及び白血病以外の悪性腫瘍及び癌の治療又は予防方法であって、上記の治療又は予防を必要とする哺乳類に、白血病、及び白血病以外の悪性腫瘍及び癌を治療又は予防するために有効な量の下記式Ｉで表されるチオキソチアゾリジノン化合物を投与することを包含する方法。
【化５】
2008511594.tif 000008
（式中、
mは０、１又は２であり；
Xは、水素もしくは置換されていないか又は低級アルキル基、水酸基、ハロゲンよりなる群から選ばれる少なくとも1つの置換基で置換されたシクロアルキル基又はフェニル基であり；
nは、０又は１であり；
Yは、フェニル基、フラニル基、インドール基及びピロール基よりなる群から選ばれる基であり、但し上記の基は、無置換であるか又は低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン、(３,５-ジメチルフェノキシ）プロポキシ基、及び無置換又は置換されたフェニル基よりなる群から選ばれる少なくとも１つの置換基で置換されており、該置換されたフェニル基は、その置換基としてハロゲン、ニトロ基、アミノ基及びカルボキシル基よりなる群から選ばれる少なくとも１つを有する。）
【請求項１３】
炎症性病態の治療又は予防方法であって、上記の治療又は予防を必要とする哺乳類に、炎症性病態を治療又は予防するために有効な量の下記式Ｉで表されるチオキソチアゾリジノン化合物を投与することを包含する方法。
【化６】
2008511594.tif 000009
（式中、
mは０、１又は２であり；
Xは、水素もしくは置換されていないか又は低級アルキル基、水酸基、ハロゲンよりなる群から選ばれる少なくとも１つの置換基で置換されたシクロアルキル基又はフェニル基であり；
nは、０又は１であり；
Yは、フェニル基、フラニル基、インドール基及びピロール基よりなる群から選ばれる基であり、但し上記の基は、無置換であるか又は低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン、(３,５-ジメチルフェノキシ）プロポキシ基、及び無置換又は置換されたフェニル基よりなる群から選ばれる少なくとも1つの置換基で置換されており、該置換されたフェニル基は、その置換基としてハロゲン、ニトロ基、アミノ基及びカルボキシル基よりなる群から選ばれる少なくとも１つを有する。）
【請求項１４】
該チオキソチアゾリジノン化合物が、
(E)-５-(４-(３-(３,５-ジメチルフェノキシ)プロポキシ)-３-メトキシベンジリデン)-３-エチル-２-チオキソチアゾリジン-４-オン(ＩＭＢ-２)；
(Z)-３-ベンジル-５-((５-(３-ニトロフェニル)フラン-２-イル)メチレン)-２-チオキソチアゾリジン-４-オン(ＩＭＢ-６)；及び
(５Z)-５((E)-３-フェニルアリリデン)-２-チオキソ-３-o-トリルチアゾリジン-4-オン(ＩＭＢ-１０)
よりなる群から選ばれる化合物であることを特徴とする請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品として使用するチオキソチアゾリジノン化合物、該化合物を含む医薬組成物、並びに白血病、白血病以外の癌及び悪性腫瘍、炎症性疾患などの白血球の細胞遊走に起因する病態の治療用医薬組成物を製造するための、小分子化合物である該チオキソチアゾリジノン化合物の用途に関する。本発明のチオキソチアゾリジノン化合物は、αмインテグリンＩドメインの活性型立体配座を安定化させることによって、白血球の細胞遊走を阻害する。
【背景技術】
【０００２】
インテグリンは、細胞の接着、遊走、シグナル伝達に深く関与するヘテロ二量体性細胞表面受容体の大きなファミリーを形成する（Hynes, 2002）。αvβ3インテグリン及び白血球に特異的なαLβ2インテグリン及びαMβ2インテグリンの研究は、インテグリンの構造及び機能を理解する上で役立っている（Beglova et al., 2002; Luo et al., 2004; Ruoslahti, 1996; Salas et al., 2004; Shimaoka et al., 2003; Xiong et al., 2001; 及びXiong et al., 2002）。βインテグリンを含む一部のインテグリンは、αサブユニット中に、主要なリガンド結合部位として、挿入ドメイン（Ｉドメイン）を含有するのに対し、Ｉドメインを欠くインテグリンはα鎖及びβ鎖でリガンド結合ポケットを形成する（Hynes, 2002）。インテグリンの機能に影響を与える化合物に関しては、様々な炎症性病態、癌、その他の疾患の治療において有効に臨床利用できる可能性が非常に高いため、そのような化合物に対する関心はかなり高い。そのため、αLインテグリンＩドメインや他のインテグリンに対する小分子阻害剤が数多く見出されている（Goodman et al., 2002; Last-Barney et al., 2001; Liu et al., 2001;及びWeitz-Schmidt et al., 2001）。αLインテグリン拮抗剤は、ＩドメインのＣ末端のαヘリックス構造の下に結合することでアロステリックに作用し、Ｉドメインを、リガンドに対する親和性が低い立体配座の状態で安定化することにより、リガンド結合を妨ぐ（Last-Barney et al., 2001; Liu et al., 2001; Weitz-Schmidt et al., 2001）。また、β2インテグリンに選択的な他の小分子群に関しては、各小分子はインテグリンβ2-サブユニットのＩ-様ドメインに結合し、αLＩドメインの活性化を妨げるが、同時にＩ-様ドメイン及びストークドメインの活性型立体配座を誘導する（Shimaoka et al., 2003）。更に、最近αMβ2インテグリンに対する小分子拮抗剤が２種類同定された（Bansal et al., 2003）。該化合物は、補体タンパク質ｉＣ３ｂを阻害するが、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）−１のαMβ2インテグリンへの結合は阻害しない。また、該化合物は、白血球のフィブリノゲンへの接着、及び接着関連の酸化的バースト（oxidative burst）を阻害する。
【０００３】
以前我々は、ファージディスプレイ法を用いて、αM及びαLインテグリンの挿入ドメイン（Ｉドメイン）に対するＡＤＧＡＣＩＬＷＭＤＤＧＷＣＧＡＡＧ（以下、「ＤＤＧＷ」と称す）ペプチドリガンドの結合を見出した。ＤＤＧＷペプチドは、潜在型マトリックスメタロプロティナーゼ（ＭＭＰ）−２及び−９のインテグリン結合配列を模倣し、in vitro及びin vivoにおいて白血球遊走を阻害した（Stefanidakis et al., 2003; Stefanidakis et al., 2004）。ＤＤＧＷペプチド及び他のファージディスプレイ法によって得られたペプチドは、in vitro及び動物モデルでは良好に機能する（Koivunen et al., 1999; Koivunen et al., 2001; Pasqualini et al., 2000）が、急速に排出され、タンパク質分解されやすいため、臨床利用が制限されてしまう可能性がある。それゆえ、該ファージディスプレイペプチドを、ペプチドミメティックスに変換するか、もしくは小分子ライブラリーのスクリーニングを行って薬理学的に適した先導化合物を得る必要がある（Hyde-DeRuyscher et al., 2000; Kay et al., 1998; Ripka and Rich, 1998）。このような状況下において、我々は、上記ＤＤＧＷペプチドを用いて、αMインテグリンＩドメインを活性型立体配座に固定することで、αMβ2インテグリンが関与する白血球の細胞遊走を阻害する新規化合物群を見出した。
【０００４】
発明の概要 
我々は、以前、ファージディスプレイ法で、αMインテグリンの挿入ドメイン（Ｉドメイン）に結合するペプチドリガンドを見出した。該ペプチドは、プロマトリックスメタロプロティナーゼ−９（ｐｒｏＭＭＰ−９）とαMβ2インテグリンとの相互作用を阻害し、白血球遊走を抑制した。該ペプチドを活用して、組み合わせライブラリーをスクリーニングすることにより、今回、我々はαMβ2インテグリンに結合する新規な小分子化合物リガンドを見出した。驚くべきことに、該化合物は、αMインテグリンＩドメインの、リガンド、ｐｒｏＭＭＰ-９及びフィブリノゲンに対する結合を安定化させる。該化合物は、一次接着を助長も阻害もしなかったが、αMβ2インテグリン発現細胞に、ＥＤＴＡ処理による剥離に対する耐性を付与した。更に、該化合物が、ＭＭＰ-９活性に依存せずに白血球の細胞遊走を強力に阻害したことから、該細胞が剥離できないことが主な原因で遊走阻害が起きたことがわかる。上記の小分子αMβ2インテグリンリガンドは、白血病、白血病以外の悪性腫瘍及び癌、及び炎症性疾患などの活性型αMβ2インテグリン依存性の細胞遊走を特徴とする疾患の治療において有用である。
【０００５】
従って、本発明は、医薬品として使用する、下記式Ｉの化合物に関する。
【化７】
2008511594.tif 000002
（式中、
mは０、１又は２であり；
Xは、水素もしくは無置換又は低級アルキル基、水酸基、ハロゲンよりなる群から選ばれる少なくとも１つの置換基で置換されたシクロアルキル基又はフェニル基であり；
nは、０又は１であり；
Yは、フェニル基、フラニル基、インドール基及びピロール基よりなる群から選ばれる基であり、但し上記の基は、無置換であるか又は低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン、(３,５-ジメチルフェノキシ）プロポキシ基、及び無置換又は置換されたフェニル基よりなる群から選ばれる少なくとも１つの置換基で置換されており、該置換されたフェニル基は、その置換基としてハロゲン、ニトロ基、アミノ基及びカルボキシル基よりなる群から選ばれる少なくとも１つを有する。）
【０００６】
本発明は、また、下記式Ｉで表されるチオキソチアゾリジノン化合物と薬学的に許容される担体とを包含する医薬組成物の用途にも関する。
【化８】
2008511594.tif 000003
（式中、
mは０、１又は２であり；
Xは、水素もしくは無置換又は低級アルキル基、水酸基、ハロゲンよりなる群から選ばれる少なくとも１つの置換基で置換されたシクロアルキル基又はフェニル基であり；
nは、０又は１であり；
Yは、フェニル基、フラニル基、インドール基及びピロール基よりなる群から選ばれる基であり、但し上記の基は、無置換であるか又は低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン、(３,５-ジメチルフェノキシ）プロポキシ基、及び無置換又は置換されたフェニル基よりなる群から選ばれる少なくとも１つの置換基で置換されており、該置換されたフェニル基は、その置換基としてハロゲン、ニトロ基、アミノ基及びカルボキシル基よりなる群から選ばれる少なくとも１つを有する。）
【０００７】
更に本発明は、白血病及び炎症性病態などの白血球の細胞遊走に起因する病態の治療用医薬組成物を製造するための、上記式Ｉのチオキソチアゾリジノン化合物の用途にも関する。
【０００８】
更に本発明は、上記の用途に対応する方法、即ち、白血球の細胞遊走に起因する病態の治療及び予防方法、及び白血病、白血病以外の癌及び悪性腫瘍、又は炎症性病態の治療及び予防方法であって、上記式Ｉのチオキソチアゾリジノン化合物の少なくとも一種を上記の治療又は予防を必要とする哺乳類に投与することを包含する方法に関する。
【０００９】
本発明において、上記の「低級アルキル基」及び「低級アルコキシ基」における「低級」とは、これらの置換基がそれぞれ炭素数１〜６、好ましくは１〜４の置換基であることを意味する。低級アルキル基は、好ましくはメチル基又はエチル基である。低級アルコキシ基としては、メトキシ基が好ましい。シクロアルキル基の炭素数は、好ましくは３〜８、更に好ましくは４〜６であり、上記シクロアルキル基は、好ましくはシクロへキシル基である。
【００１０】
上記ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素である。
【００１１】
式Ｉで表されるチオキソチアゾリジノン化合物群の内、好ましいのは、mが０、Xが無置換又はメチル基でオルト置換されたフェニル基、nが１、Yが無置換のフェニル基である化合物である。該化合物の立体化学に関しては、Z-体であることが好ましいが、E-体でもよい。
【００１２】
更に好ましいチオキソチアゾリジノン化合物は、
(E)-５-(４-(３-(３,５-ジメチルフェノキシ)プロポキシ)-３-メトキシベンジリデン)-３-エチル-２-チオキソチアゾリジン-４-オン(本明細書ではＩＭＢ-２と記述)；
(Z)-３-ベンジル-５-((５-(３-ニトロフェニル)フラン-２-イル)メチレン)-２-チオキソチアゾリジン-４-オン(ＩＭＢ-６)；及び
(５Z)-５((E)-３-フェニルアリリデン)-２-チオキソ-３-o-トリルチアゾリジン-4-オン(ＩＭＢ-１０)
よりなる群から選ばれる化合物である。
【００１３】
本明細書においては、特に断りのない限り、「式Ｉの化合物」などの表現は、場合により、遊離塩基（又は遊離酸）の形の化合物のみならず、塩の形の化合物も包含する。但し、上記の塩には、薬学的に許容される塩のみが含まれる。
【００１４】
発明の詳細な説明 
我々は、αMＩドメインの活性型立体配座を安定化させる、新規な小分子リガンド化合物群を見出した。この小分子リガンド化合物群は、これまでに特定された従来のαM及びαLＩドメイン拮抗剤とは構造的に異なる（Bansal et al., 2003; Kelly et al., 1999; Liu et al., 2001; Shimaoka et al., 2003; Weitz-Schmidt et al., 2001）。本発明のリガンド化合物群の内、最も効果が高いＩＭＢ-１０は、組換えαMＩドメインの、そのリガンドであるｐｒｏＭＭＰ−９やフィブリノゲンへの結合を増進する。特筆すべきことに、ＩＭＢ−１０は、αMβ2インテグリン発現細胞に、カチオンキレート化剤であるＥＤＴＡに対する高い耐性をも付与するが、このことは活性αMＩドメインの安定化剤としての役割と矛盾しない。また、ＩＭＢ−１０は、αMβ2インテグリンを介した白血球遊走に対する非常に優れた阻害剤である。
【００１５】
式Ｉの化合物は、ＤＤＧＷペプチドを提示したファージのαMＩドメインに対する結合阻害剤として同定されたものの、該化合物は、ｐｒｏＭＭＰ-９／αMＩドメイン相互作用を阻害しなかった。このような該化合物の作用の違いについては、我々が、ＤＤＧＷペプチドの同定及びｐｒｏＭＭＰ-９／αMＩドメイン相互作用の確認をカルシウム含有緩衝液中で行ったことが原因かもしれない（Stefanidakis et al., 2003）。我々のデータによれば、ＤＤＧＷペプチドはＩドメインが閉じた型の立体配座に優先的に結合し、その一方でｐｒｏＭＭＰ-９は、開いた型の立体配座の方に結合しやすいものの、開いた型と閉じた型の立体配座の両方に結合する。ＩＭＢ化合物群が、ｐｒｏＭＭＰ-９とドメインとの相互作用を阻害することができないことは、ＩＭＢ化合物群とＤＤＧＷペプチドは、Ｉドメインの異なる部位に結合することを明確に示している。殆どの小分子化合物は、荷電しておらず、従って、荷電しているペプチドやタンパク質のリガンドと同じ部位に結合することはない。そのような荷電した配列モチーフは、インテグリンリガンドによく見られる（Arnaout et al., 2002）。従って、αMＩドメインに対する小分子リガンドは全てアロステリック拮抗剤である（Kelly et al., 1999; Last-Barney et al., 2001; Liu et al., 2001; Weitz- Schmidt et al., 2001）。実際に、上記のような荷電したペプチドリガンドの作用をそのまま模倣するような小分子化合物を見出すことは困難である。この点については、ファージディスプレイ法は、スループットの高いスクリーニングで用いられる小分子化合物で十分にカバーできなかった部位に結合する新規なリガンドを提供できる。当然、ファージディスプレイ法により、小分子化合物スクリーニングでは発見されなかったであろう生物学的に重要な部位を見出すことができる。
【００１６】
組換えαM及びαLＩドメインの活性化状態は、リガンドの結合する、金属イオン依存性接着部位（ＭＩＤＡＳ）とは異なる部位により制御することができる（Kallen et al., 1999; Xiong et al., 2000）。αMＩドメインのＣ末端近傍における単一点変異である Ile316→Gly は、構造的に活性な、開いた型の立体配座にＩドメインを固定する（Xiong et al., 2000）。閉じた型のαMＩドメイン構造においては、上記のIle316 残基は、αLＩドメインにおいてロバスタチンが結合する位置とほぼ同じ位置に見られる疎水性ソケットに存在する（Kallen et al., 1999）。リガンドが存在しない場合には、αMＩドメインの開いた型と閉じた型の立体配座が緊密にバランスの取れた平衡状態にあることは明白であり、タンパク質の１０〜１２％が開いた型の立体配座で存在する。一方、αLＩドメインは全てが閉じた型の立体配座をとる (McCleverty and Liddington, 2003）。上記のことから、αMＩドメインの活性型立体配座に対するリガンドが得られる可能性は高い。
【００１７】
ＩＭＢ-１０は、ｐｒｏＭＭＰ-９結合を阻害しないが、ＤＤＧＷペプチドと比べて遥かに有効な白血病細胞遊走阻害剤である。ＩＭＢ-１０は、β2インテグリン以外のインテグリンを発現するＨＴ１０８０繊維肉腫細胞の遊走に対して効果を示さず、β2インテグリン依存性の細胞遊走にのみ関与した。フィブリノゲン上の細胞の遊走を阻害するＩＭＢ-１０の能力は、小分子ゼラチナーゼ阻害剤（ＩｎｈＩ）が細胞遊走を阻害しなかったため、ゼラチナーゼ活性とは関連ないものと考えられる。更に、ＩＭＢ-１０は、細胞周囲におけるｕＰＡＲのゼラチナーゼ依存性タンパク質分解を阻害しなかった。我々のデータは、総合すると、ＩＭＢ-１０による白血病細胞の遊走阻害は、インテグリンに制御されたゼラチナーゼ活性によるものではなく、主に接着能の向上によるものであることを示している。接着が強すぎると、細胞の運動性を阻害する（Palecek et al., 1997）が、上記の我々の研究の如く、この現象を、細胞遊走の拮抗剤の開発に利用することができる。
【実施例】
【００１８】
化合物ライブラリーのスクリーニング  １０,０００種の小分子からなる組み合わせライブラリーをChemBridge社（カリフォルニア州、サンディエゴ）から購入した。組換えαMＩドメイン‐ＧＳＴ融合タンパク質を９６ウェルプレートに２０ｎｇ／ウェルの量で固定化して、ＤＤＧＷペブチド提示ファージによる競合アッセイの準備をした（Michishita et al., 1993）。化合物は、８種類の化合物をそれぞれ５μＭ濃度及びＤＭＳＯを１．２５％濃度で含有するプールの形で用いた。化合物をウェル中でプレインキュベートした後に、ＤＤＧＷファージを加えた（３×１０8 形質導入単位／ウェル）。対照として、可溶性ＤＤＧＷペプチド、対象ペプチド、及び提示なしのファージ（unrelevant phage）を各プレートに加えた。ファージの結合を公知の方法（Bjorklund et al., 2004）により抗ファージ抗体で検出した。阻害活性を有するプールは単一化合物で再試験した。阻害活性を有する化合物の１０μＭ濃度でのＤＤＧＷファージ結合阻害活性を補充データに示す。これらの化合物のＩＣ50値を算出するために、ＤＤＧＷペプチドと化合物から希釈系列（１０μＭ〜１５０ｎＭ）を作成し、ＤＤＧＷファージの結合を測定した。阻害剤なしの条件（媒体としてのＤＭＳＯのみ）での結果から、提示なしの対照ファージで得たバックグラウンド値を差し引いた値を１００％値として用いた。
【００１９】
αMインテグリンＩドメインに対する、ｐｒｏＭＭＰ−９及びフィブリノゲンの結合  触媒活性を欠くｐｒｏＭＭＰ−９−ΔＨＣ−Ｅ402Ｑ変異体を野生型ｐｒｏＭＭＰ−９−ΔＨＣから部位特異的変異導入法により作成し、ゼラチン−セファロースで精製した（Bjorklund et al., 2004）。得られた変異体ＭＭＰは構造的に野生型タンパク質と同一である（Rowsell et al., 2002）。ｐｒｏＭＭＰ−９−ΔＨＣ−Ｅ402Ｑ、無傷のｐｒｏＭＭＰ−９、又はフィブリノゲン（１００ｎｇ／ウェル）のＴＢＳ溶液でマイクロタイターウェルを被覆し、１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む溶液でウェルを飽和した。０．１％ＢＳＡのＴＢＳ溶液／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／１ｍＭ ＣａＣｌ2／１ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む溶液中で、ペプチド又は化合物の存在下又は非存在下に、可溶性αMインテグリンＩドメイン−ＧＳＴ融合タンパク質（２．５μｇ／ｍｌ）を加え、１時間インキュベートした。実験の一部では、１ｍＭ ＣａＣｌ2／１ｍＭ ＭｇＣｌ2の代わりに１０ｍＭ ＣａＣｌ2又は１０ｍＭ ＭｇＣｌ2を用いた。結合したＧＳＴ融合タンパク質を、抗ＧＳＴ抗体（１：２０００希釈）とペルオキシダーゼ結合抗ヤギ抗体（１：２０００希釈）で検出した。
【００２０】
インテグリンへの抗体結合の阻害  αMＩドメイン又は精製αMβ2インテグリン（５０ｎｇ／ウェル）をマイクロタイターウェルに塗布し、１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む溶液でウェルを飽和した。ＤＤＧＷペプチド又は化合物を表記の濃度でインテグリンと共に３０分間プレインキュベートした後、抗体としてＬＭ２／１、ＭＥＭ１７０、ＯＫＭ−１０、ＩＢ４又は対照ＩｇＧを最終濃度が１μｇ／ｍｌとなるように添加した。ＬＭ２／１抗体とＭＥＭ１７０抗体はαMインテグリンＩドメインを認識し、ＯＫＭ−１０抗体の結合するエピトープはαMＩドメインの外に位置している（Koivunen et al., 2001; Li et al., 1995; Stefanidakis et al., 2003）。抗体は４５分間インキュベートした後、ペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体で検出した。
【００２１】
細胞培養  ヒト単球性白血病細胞であるＴＨＰ−１、急性骨髄性白血病細胞であるＯＣＩ−ＡＭＬ−３及びヒトＨＴ１０８０繊維肉腫細胞を公知の方法で培養した（Koivunen et al., 1999; Koivunen et al., 2001; Stefanidakis et al., 2003）。細胞の生存率は、公知の方法（Bjorklund et al., 2004）により、３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド アッセイで測定した。
【００２２】
細胞の接着と遊走  細胞接着試験を公知の方法（Koivunen et al., 2001）で行なった。簡単に述べると、ＴＨＰ−１細胞（５０,０００個／ウェル）を５０ｎＭ ＰＤＢｕ（４β−フォルボール−１２，１３−ジブチレート、Sigma Aldrich製）で刺激してから、０．１％ＢＳＡ含有無血清ＲＰＭＩ培地中で、化合物又はＤＭＳＯの存在下又は非存在下に、フィブリノゲン（１０μｇ／ｍｌ）で被覆したマイクロタイターウェルに対する結合試験に付した。非接着細胞をＰＢＳ又は２．５ｍＭ ＥＤＴＡのＰＢＳ溶液で穏やかに洗浄して除去した。接着細胞はホスファターゼアッセイ（Koivunen et al., 2001）で定量した。あるいは、ＴＨＰ−１細胞を２０ｎＭ ＰＤＢｕで刺激してから、何も被覆していないプラスチックに対する結合試験に一晩付した。非接着細胞をＰＢＳで洗浄して除去してから、２．５ｍＭ ＥＤＴＡのＰＢＳ溶液で６回洗浄した。４０μｇ／ｍｌのＬＬＧ-Ｃ４-ＧＳＴ又はフィブリノゲンで被覆したトランスウェル（孔サイズ：５μｍ）を用いて細胞遊走試験を行なった（Koivunen et al., 2001）。ＴＨＰ−１細胞とＯＣＩ−ＡＭＬ−３細胞（５０,０００個／１００μｌ）を、１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地中で、ペプチド又は化合物の存在下又は非存在下に、４０ｎＭ ＰＤＢｕで細胞遊走を刺激ながら一晩遊走させた。５０μＭ濃度のゼラチナーゼ選択的阻害剤Ｉ（ＩｎｈＩ）（Calbiochem製）を用いて、フィブリノゲン上でのゼラチナーゼ依存性遊走を評価した。遊走した細胞をクリスタルバイオレットで染色して計数した（Koivunen et al., 2001）。ＴＨ１０８０細胞を、血清を塗布したトランスウェル上で公知の方法（Koivunen et al., 1999）で遊走させた。
【００２３】
ウロキナーゼ−プラスミノーゲン活性化因子受容体の細胞による開裂  細胞周囲ゼラチナーゼに依存性のｕＰＡＲ（ウロキナーゼ−プラスミノーゲン活性化因子受容体）の開裂を公知の方法（Bjorklund et al., 2004）で行なった。簡単に述べると、ＯＣＩ−ＡＭＬ−３細胞をＰＤＢｕで刺激するか又は未処理のままで、２０μＭ ＩＭＢ−１０、ゼラチナーゼ選択的阻害剤（ＩｎｈＩ）又は媒体（ＤＭＳＯ）の存在下で４８時間培養した。ｕＰＡＲとその開裂物であるｕＰＡＲ Ｄ２＋３を、ｕＰＡＲに対するポリクロナール抗体（399R、American Diagnostica製）を用いたウエスタンブロッティングで検出した。
【００２４】
in vivoでの好中球遊出試験  マウスによる実験は、ヘルシンキ大学の「動物実験に関する倫理委員会」により承認された。ヴィーキ研究所動物センター（Viikki Laboratory Animal Centre）で飼育したメスのＢＡＬＢ／ｃＯｌａＨｓｄマウスに、４％チオグリコレートブロスのＰＢＳ溶液１ｍｌを腹腔内（i.p.）注射した後、化学薬品（濃度が２０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌのものを２００μｌ）を静脈注射するか又は５分後にＰＢＳを静脈注射して、炎症を誘導した。３〜２４時間後に腹膜に遊走した細胞をヘモサイトメータで計数した。腹膜炎モデルのグループ間での統計的有意性を一元配置分散分析法（one-way ANOVA）で計算し、得られた差をボンフェローニ多重対比較試験法（Bonferroni pairwise multiple comparison tests）で解析した。ｐ＜０．０１の結果を有意であるとした。
【００２５】
結果 
ｐｒｏＭＭＰ−９／白血球インテグリン間の既に特徴付けた相互作用を阻害することによって白血病細胞遊走を阻止する小分子化合物を同定するために、組み合わせライブラリーのスクリーニングを行った。いくつかの化合物がこのスクリーニングによって同定されたが、それらの大部分は共通のチオオキソチアゾリジノン骨格を有していた（図１及び図７）。比較のために、ｉＣ３ｂ／αMβ2相互作用阻害性化合物（Bansal et al., 2003）の構造を示す（図１Ａ）。新たに同定された化合物は、αMＩドメインに対するＤＤＧＷファージの結合を特異的に阻害したが、ＭＭＰ−９のＣ末端ドメインに対するＣＲＶペプチドの結合に対しては影響を与えなかった（Bjorklund et al., 2004）（データは示さない）。同定した化合物の代表例であるＩＭＢ−２、ＩＭＢ−６、ＩＭＢ−８及びＩＭＢ−１０（図１Ｂ）を試験し、αMＩドメインに対するＤＤＧＷファージの結合の阻害の程度を表す指標であるＩＣ50値を測定した（図２Ａ）。最も効果的な化合物であるＩＭＢ−１０のＩＣ50値は０．４±０．２μＭであり、この値は可溶性ＤＤＧＷペプチドのＩＣ50値である２．６±０．５μＭより６倍も優れていた。試験したこれらの化合物は、αLＩドメインに対するＤＤＧＷファージの結合をも阻害した（データは示さない）が、この相互作用は、αMＩドメインに対するＤＤＧＷファージの結合よりもかなり弱かった（Stefanidakis et al., 2003）。
【００２６】
次に、αMＩドメインに対するｐｒｏＭＭＰ−９の結合に与えるこれらの小分子化合物の影響を評価した。αMＩドメインに対するＭＭＰ−９の結合部位を、ＭＭＰ−９の触媒ドメインに存在する、ＤＤＧＷ類似の負電荷を有する配列にマッピングした。しかし、ゼラチナーゼ選択的阻害剤がこの相互作用を阻止する（Stefanidakis et al., 2003）場合のように、Ｉドメイン結合活性がＭＭＰ−９の触媒活性に依存するのかどうかは、まだ知られていない。そこで、この疑問を解明するために、Ｖ型コラーゲン様ヒンジ領域とＣ末端ドメイン（ｐｒｏＭＭＰ−９−Ｅ402Ｑ−ΔＨＣ）とを欠く、触媒活性を有しないｐｒｏＭＭＰ−９変異体を調製した。固定化したｐｒｏＭＭＰ−９−Ｅ402Ｑ−ΔＨＣに対する可溶性αMＩドメイン−ＧＳＴの強い結合が観測され、この結合のレベルは無傷のｐｒｏＭＭＰ−９の場合に匹敵した（図２Ｂ）。ＧＳＴ単独ではｐｒｏＭＭＰ−９に結合しなかった。αMＩドメインとｐｒｏＭＭＰ−９−Ｅ402Ｑ−ΔＨＣとの間の相互作用は、ＤＤＧＷペプチドによって阻害された（図２Ｃ）。驚くべきことに、ＤＤＧＷファージアッセイによって同定されたにも拘らず、どの小分子化合物も、５０μＭ濃度においては、ｐｒｏＭＭＰ−９−Ｅ402Ｑ−ΔＨＣ（図２Ｃ）やｐｒｏＭＭＰ−９（図示しない）に対するαMＩドメインの結合を阻害しなかった。それどころか、αMＩドメイン結合活性はＩＭＢ化合物によって著しく高められた。活性化のレベルは、ファージアッセイにおけるＩＣ50値と相関していた。フィブリノゲンに対するαMＩドメインの結合は、小分子化合物の存在によってさらに高められた（図２Ｄ）。この予想外の現象は、同定された小分子化合物であるＩＭＢ化合物とＤＤＧＷとは結合部位に関して競合することはなく、実際にはＩＭＢ化合物がαMＩドメインの活性型立体配座を安定化させているということを示唆した。このように、αLＩドメインに対する既に同定された小分子リガンドがリガンドの結合を阻害するのとは対照的に、式Ｉの化合物は、リガンド結合活性の増大を引き起こす新規な活性を示すのである。
【００２７】
上記で示唆されたαMＩドメインの安定化を調べるために、結合アッセイを、Ｉドメインを不活型立体配座に維持するための１０ｍＭのＣａ2+の存在下と、Ｉドメインを活性型立体配座に維持するための１０ｍＭのＭｇ2+の存在下とで、それぞれ行った。マグネシウムと１０μＭ濃度のＩＭＢ−１０との存在下においてはαMＩドメインのｐｒｏＭＭＰ−９−Ｅ402Ｑ−ΔＨＣに対する強い結合が観測されたが、カルシウムの存在下では、カルシウムがＩＭＢ−１０による効果をほぼ完全に打ち消した（図３Ａ）。Ｃａ2+とＭｇ2+との両方を等モル濃度で用いた場合の結合の強さは、Ｃａ2+を単独で用いた場合とＭｇ2+を単独で用いた場合との中間であった。フィブリノゲンに対するαMＩドメインの結合についても、同様の効果が見られた（図３Ｂ）。
【００２８】
次に、ＤＤＧＷペプチド及びＩＭＢ化合物が、固定化したαMＩドメイン−ＧＳＴ融合タンパク質に結合する抗体と競合する能力を評価した。ＩＭＢ化合物は、それぞれのＤＤＧＷペプチドの阻害能に応じてｍＡｂＬＭ２／１結合を阻害し、５０μＭの濃度におけるＩＭＢ−６及びＩＭＢ−１０による阻害は７５％であった（図４Ａ）。また、ＩＭＢ化合物は、別のαMＩドメイン特異的抗体であるＭＥＭ１７０の結合を阻害した。ＤＤＧＷペプチドやロバスタチンは、抗体の結合に対しては顕著な効果は示さなかった。ＩＭＢ化合物はまた、精製したαMβ2インテグリンに結合する抗体ＬＭ２／１を阻害した。抗体ｍＡｂＩＢ４の結合は、ＩＭＢ−１０によっても阻害された。この抗体のエピトープは、β2-サブユニットのＩ-様ドメインに位置することが分かった（図４Ｂ）。抗体ＴＳ１／２２及び抗体ＭＥＭ８３のαLＩドメインに対する結合は、同様にＩＭＢ−１０による影響を受けたが、ＩＭＢ−８による影響を受けなかった。
【００２９】
細胞ベースの実験を行う前に、実験に用いる化合物が持ちうる毒性を試験した。血清含有培地において、化合物をＴＨＰ−１単球性白血病細胞及びＯＣＩ−ＡＭＬ−３急性骨髄性白血病細胞と共に４８時間培養した。ＩＭＢ−６は、溶解性が低いために、両細胞系に対して毒性を示したのに対し、ＩＭＢ-２、ＩＭＢ−８及びＩＭＢ-１０は、５０μＭの濃度で、細胞増殖に対して重要な影響は及ぼさなかった（データは示さない）。
【００３０】
被覆されていない細胞培養用プラスチックに対して接着することが、αMβ2インテグリン活性の特徴である（Yakubenko et al., 2002）。２０ｎＭのＰＢＤｕの存在下において、ＴＨＰ−１細胞をプラスチック上で培養すると、ＴＨＰ−１細胞はプラスチックに強く接着し、ＰＢＳによる洗浄に対して耐性を示した（図５Ａ）。上記の化合物は、ＴＨＰ−１細胞のこの活性に対して影響を与えなかった。興味深いことに、細胞を２．５ｍＭのＥＤＴＡで洗浄した際には、ＩＭＢ−１０で処理した細胞のかなりの部分が剥離せずに処理後も接着していた（図５Ａ及びＢ）。ＩＭＢ−８化合物及びゼラチナーゼ阻害剤ＩｎｈＩは、上記のような効果を示さなかった。フィブリノゲン上でも、剥離に対する耐性が向上していた。フィブリノゲンの場合においても、上記の化合物は、ＰＢＳによる洗浄に対して測定可能な影響を与えなかったが、ＩＭＢ−１０で処理した細胞は、ＥＤＴＡによる洗浄に対してより耐性が高かった（図５Ｃ）。ＯＣＩ−ＡＭＬ−３細胞を用いても類似の結果が得られた（図示せず）。ホルボールエステルによる活性化を行わなかった場合に、ＩＭＢ−１０が細胞接着を強化しないことは、Ｉドメインを活性化するのではなく、むしろ安定化することを示している（データは示さない）。
【００３１】
化合物の細胞遊走に対する影響を、トランスウェルアッセイで評価した。ＴＨＰ−１細胞は、β2インテグリン依存的に、合成ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴペプチド被覆上を遊走する（Koivunen et al., 2001）。ここで、ＬＬＧ−Ｃ４ペプチドと同様に、ＩＭＢ−１０は細胞遊走を強力に阻害した（図６Ａ）。ＩＭＢ−１０より活性が低い化合物であるＩＭＢ−２とＩＭＢ−８は、２５μＭの濃度では、顕著な細胞遊走阻害効果は示さなかった。１００μＭの濃度では、ＩＭＢ−２も阻害効果を発揮した（図示せず）。フィブリノゲンで被覆したトランスウェル上のαMβ2インテグリン依存性遊走の評価においても、上記と類似の結果を得た。この場合も、ＩＭＢ−１０は、２５μＭの濃度でＴＨＰ−１細胞並びにＯＣＩ−ＡＭＬ−３細胞の遊走を完全に阻害し、ＩＭＢ−２とＩＭＢ−８の活性は、ＩＭＢ−１０の活性より低かった（図６Ｂ）。ＤＤＧＷによっても阻害効果が得られたが、ゼラチナーゼ阻害因子であるＩｎｈＩは阻害効果を示さなかった。αMＩドメイン結合性化合物は、β2インテグリン依存性の細胞運動性に対して影響を与えなかった。ＨＴ１０８０繊維肉腫細胞を用いた実験の結果は、図６Ｃに示した。この細胞の遊走は、ゼラチナーゼ選択的な阻害剤であるＩｎｈＩにより部分的に阻害された。
【００３２】
ｐｒｏＭＭＰ−９は、細胞表面のαMβ2インテグリンと相互作用するので、我々は、細胞周囲のゼラチナーゼ活性に対するＩＭＢ化合物の影響を評価した。我々は、以前、ウロキナーゼ−プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）の細胞周囲におけるタンパク質分解がゼラチナーゼ活性に依存することを示した。ＰＤＢｕで刺激したＯＣＩ-Ｃ３-ＡＭＬ細胞を用いた実験においては、ウロキナーゼ−プラスミノーゲン活性化因子受容体やαMβ2インテグリンとは結合しない、開裂物であるｕＰＡＲ Ｄ２＋３が高レベルで検出された。ｕＰＡＲの開裂は、２０μＭ濃度のＩＭＢ−１０では阻害することはできなかったが、２０μＭ濃度のゼラチナーゼ選択的阻害剤（ＩｎｈＩ）は、ｕＰＡＲのタンパク質分解を抑制した。このことは、活性化されたインテグリンは、ゼラチナーゼによるタンパク質分解を防止しないことを示している（図６Ｄ）。
【００３３】
in vivoにおける炎症の抑制  白血球インテグリンは、適切な炎症反応に必要なので、チオグリコール酸で誘発したマウスの腹膜炎におけるＩＭＢ−１０の機能を試験した。このモデルにおいては、ＤＤＧＷペプチドは活性化された好中球の腹腔への遊走を強力に阻害した（Steianidakis et al., 2004）。炎症誘発の３時間後には、静脈注射したＩＭＢ-１０は腹膜へ遊走した白血球数を用量依存的に減少させた。ＩＭＢ-８は、好中球の凝集を阻害しなかった（図８Ａ）。２４時間後には、ＩＭＢ-１０で処理したマウスの白血球数は依然として低かったが、ＩＭＢ-８で処理したマウスは異なる結果を示した（図８Ａ）。２４時間後における遊出細胞の約５０〜６０％が好中球であり、残りは、主にマクロファージ及びＴ細胞であった。
【００３４】
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【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】（Ａ）αMβ2／ｉＣ３ｂ相互作用阻害性化合物（Bansal et al., 2003）と（Ｂ）本発明で同定した、好ましいαMＩドメイン結合性化合物の化学構造、並びにそれらのＤＤＧＷファージ結合アッセイにおける阻害活性。ＤＤＧＷ−αMＩドメイン相互作用のＩＣ50値は、それぞれ３回繰り返した、独立した３つの実験の平均値として計算する。
【図２】（Ａ）可溶性ＤＤＧＷペプチド又は化合物による、ＤＤＧＷファージの結合の用量依存的阻害。（Ｂ）無傷のｐｒｏＭＭＰ−９及び触媒活性を失った、Ｃ末端欠失ｐｒｏＭＭＰ-９-ΔＨＣ-Ｅ402Ｑに対する、αMＩドメイン−ＧＳＴ融合タンパク質の結合。可溶性ＧＳＴは単独ではＭＭＰ-９に結合しない。ＤＤＧＷペプチド（１００μＭ）、化学物質（５０μＭ）又は媒体（ＤＭＳＯ、１％）の存在下における、ｐｒｏＭＭＰ-９-ΔＨＣ-Ｅ402Ｑ（Ｃ）及びフィブリノゲン（Ｄ）へのαMＩドメインの結合。結合したタンパク質は、抗ＧＳＴ抗体で検出した。データは、３つのサンプルの平均±ＳＤで表した。実験は３回繰り返した。
【図３】１０μＭのＩＭＢ-１０又は媒体であるＤＭＳＯの存在下又は非存在下における、ｐｒｏＭＭＰ-９-ΔＨＣ-Ｅ402Ｑ（Ａ）及びフィブリノゲン（Ｂ）へのαMＩドメインの結合に対する、二価の陽イオンの影響。
【図４】（Ａ）ＤＤＧＷペプチド（１００μＭ）、化学的競合剤（５０μＭ）又は媒体（ＤＭＳＯ）の存在下又は非存在下における、組換えαMＩドメイン−ＧＳＴ融合タンパク質又はＧＳＴ単独に対する抗体の結合。結合した抗体は、ペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体で検出した。ＯＫＭ１０抗体のエピトープは、αMインテグリンＩドメイン以外の場所に位置する。（Ｂ）精製し、固定化したαMβ2インテグリンに対する抗体の結合。図中の化合物は、２５μＭの濃度で使用した。データは、３つのサンプルの平均±ＳＤで表した。実験は２〜４回繰り返した。
【図５】（Ａ）２５μＭの化合物又は媒体（ＤＭＳＯ）の存在下における、ホルボールエステル活性化処理済み又は処理なし（活性化なし）のＴＨＰ-１細胞のプラスチックに対する接着。ＴＨＰ-１細胞は一晩の間接着せしめた。ＰＢＳ又は２．５ｍＭ ＥＤＴＡのＰＢＳ溶液で洗浄した後も接着していた細胞の写真を撮影した。バーは２００μｍである。（Ｂ）ＥＤＴＡで洗浄後もプラスチックに接着していたＴＨＰ-１細胞を、ホスファターゼアッセイで定量した。（Ｃ）競合剤（２５μＭ）の存在下又は非存在下における、ＴＨＰ-１細胞のフィブリノゲンに対する接着。ＴＨＰ-１細胞を５０ｎＭのＰＤＢｕで刺激し、３０分間接着せしめた。ＰＢＳ又は２．５ｍＭ ＥＤＴＡで洗浄後、既知の細胞量のホスファターゼ活性と比較することで、接着した細胞を定量した。１回のアッセイを３組行い、それを最低３回繰り返した。
【図６】（Ａ）２５μＭの化合物又は１００μＭの可溶性ＬＬＧ-Ｃ４ペプチドの存在下における、合成ＬＬＧ-Ｃ４-ＧＳＴコーティング上のＴＨＰ-１細胞の遊走。ＧＳＴのみの上での遊走を対照として示した。（Ｂ）競合剤の存在下又は非存在下における、フィブリノゲン上のＴＨＰ-１細胞及びＯＣＩ-Ｃ４-ＡＭＬ細胞の遊走。いずれの細胞も、４０ｎＭ ＰＤＢｕで活性化させた後に、１６時間遊走せしめた。ゼラチナーゼ依存性の遊走の程度を評価するために、ゼラチナーゼ選択的な小分子阻害分子であるＩｎｈＩ（５０μＭ）を用いた結果を対照として示した。（Ｃ）競合化合物の存在下における、血清でコートしたトランスウェル上のＨＴ１０８０繊維肉腫の遊走。２〜３回の実験で得られた代表的な結果を示した。（Ｄ）ウロキナーゼ−プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）の細胞周囲におけるタンパク質分解。ＯＣＩ-ＡＭＬ-３細胞をＰＤＢｕで刺激するか又は未処理のままで、２０μＭのＩＭＢ-１０、ゼラチナーゼ選択的阻害因子（ＩｎｈＩ）又は媒体（ＤＭＳＯ）の存在下において、４８時間培養した。ｕＰＡＲとその開裂物であるｕＰＡＲ Ｄ２＋３は、界面活性剤に富んだ細胞溶解物のウエスタンブロッティングで検出した。
【図７】図中のパーセンテージは、１０μＭの濃度の化合物による、ＤＤＧＷファージの結合阻害を指す。
【図８】ＩＭＢ-１０は、in vivoにおける白血球の漸増を阻害した。マウスに腹膜炎を誘発させるために、チオグリコール酸（ＴＧ）を用いた。対照としてＰＢＳを用いた。ＩＭＢ-８又はＩＭＢ-１０をマウスに静脈注射（i.v.）した。腹膜腔に遊走した細胞を３〜２４時間後に採取し、計数した。示したデータは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）である。ＴＧを注射したマウスに見られる統計的な差を分散分析法（ＡＮＯＶＡ）で解析し、グループ間に見られた差を、ボンフェローニ検定（Bonfferoni Test）で比較した。図中のアスタリスク（＊）は、統計的有意性（p < 0.01）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【国際調査報告】
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