(57)【要約】ＥＧＦＲ突然変異Ｃ→Ｔを、ＥＧＦＲ  ｃＤＮＡの塩基２３６９に対応する位置において検出するように指向されるポリメラーゼ連鎖反応プライマーおよび方法。本発明は、ＥＧＦＲポリペプチドの位置７９０においてトレオニンのメチオニンによる置換をコードする、ＥＧＦＲ遺伝子の突然変異に対し各鎖の５′側ポリヌクレオチド鎖に対し、適切なＰＣＲ条件下でハイブリダイズするＰＣＲプライマーを提供する。本発明はまた、ＥＧＦＲ  ｃＤＮＡの塩基２３６９に対応する位置において突然変異Ｔを含む配列にはハイブリダイズするが、野生型Ｃを含む第２のＥＧＦＲポリヌクレオチドに対してはハイブリダイズしないＰＣＲプライマーを提供する。
2008529532.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の位置７９０において、トレオニンのメチオニンによる置換をコードするＥＧＦＲ遺伝子の突然変異に対し、５′側のポリヌクレオチド配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖に対して適切なＰＣＲ条件下でハイブリダイズするポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーであって、該ＰＣＲプライマーは、該突然変異位置の２００ヌクレオチド以内に結合する、ＰＣＲプライマー。
【請求項２】
長さが２００ヌクレオチド以下の請求項１に記載のＰＣＲプライマーであって、該ＰＣＲプライマーは、第１ヌクレオチド配列を含み、該第一ヌクレオチド配列は、
ａ）配列番号４−７および１２−１５から成る群から選ばれる配列；
ｂ）パラグラフａ）において与えられる配列の断片であって、少なくとも１１ヌクレオチド長の連続塩基配列から成り、該選ばれた配列よりもたかだか１塩基短い断片；
ｃ）パラグラフａ）において与えられる配列と最大５ヌクレオチド異なる配列；または、
ｄ）ａ）−ｃ）において与えられる配列の相補体、
から成る、請求項１に記載のＰＣＲプライマー。
【請求項３】
野生型上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ポリペプチドをコードする第１ポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチド断片に対して、適切なＰＣＲ条件下でハイブリダイズするＰＣＲプライマーであって、該プライマーは、ＥＧＦＲ  ｃＤＮＡの塩基２３６９に対応する位置において野生型Ｃを含むセンス鎖またはアンチセンス鎖に対してはハイブリダイズし、該ＰＣＲ条件下で、位置２３６９において突然変異Ｔを含む第２ＥＧＦＲポリヌクレオチドに対しては僅かにしかハイブリダイズしないかしかハイブリダイズしないかまたは全くハイブリダイズしない、ＰＣＲプライマー。
【請求項４】
長さが２００ヌクレオチド以下の請求項３に記載のＰＣＲプライマーであって、該プライマーは第一ヌクレオチド配列を含み、該第一ヌクレオチド配列は、
ａ）配列番号１４および１５から成る群から選ばれる配列；
ｂ）パラグラフａ）において与えられる配列の断片であって、少なくとも１１ヌクレオチド長の連続塩基配列から成り、該選ばれた配列よりもたかだか１塩基短い断片；
ｃ）パラグラフａ）において与えられる配列と最大５ヌクレオチド異なる配列；または、
ｄ）ａ）−ｃ）において与えられる配列の相補体、
から成る、ＰＣＲプライマー。
【請求項５】
突然変異型上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ポリペプチドをコードする第１ポリヌクレオチドまたはそのポリヌクレオチド断片に対して、適切なＰＣＲ条件下でハイブリダイズするＰＣＲプライマーであって、ＥＧＦＲ  ｃＤＮＡの塩基２３６９に対応する位置において突然変異Ｔを含むセンス鎖配列またはアンチセンス鎖配列に対してはハイブリダイズするが、該ＰＣＲ条件下で、位置２３６９において野生型Ｃを含む第２ＥＧＦＲポリヌクレオチドに対しては僅かにしかハイブリダイズしないかまたは全くハイブリダイズしない、ＰＣＲプライマー。
【請求項６】
長さが２００ヌクレオチド以下の請求項５に記載のＰＣＲプライマーであって、該プライマーは、第一ヌクレオチド配列を含み、該第一ヌクレオチド配列は、
ａ）配列番号１２および１３から成る群から選ばれる配列；
ｂ）パラグラフａ）において与えられる配列の断片であって、少なくとも１１ヌクレオチド長の連続塩基配列から成り、該選ばれた配列よりもたかだか１塩基短い断片；
ｃ）パラグラフａ）において与えられる配列と最大５ヌクレオチド異なる配列；または、
ｄ）ａ）−ｃ）において与えられる配列の相補体、
から成る、請求項５に記載のＰＣＲプライマー。
【請求項７】
サンプルにおいて上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）突然変異遺伝子を検出する方法であって、ＥＧＦＲ  ｃＤＮＡの塩基２３６９に対応する位置において突然変異Ｔを含むヌクレオチド配列を選択的に検出する手段によって該サンプルを探査すること、および、該位置における塩基がＴであることを特定すること、を含む、方法。
【請求項８】
前記手段が、前記位置における突然変異Ｔの検出と野生型Ｃの検出とを区別する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルが、癌または悪性であるか、あるいはそれが疑われる組織または細胞を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプルまたはその一部が、前記探査前に拡大される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルまたはその一部の核酸が、前記探査前に増幅される、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記探査が、
ａ）所望される場合、前記サンプルを処理してその中に含まれる前記核酸を放出させること；
ｂ）ＥＧＦＲ  ｃＤＮＡの塩基２３６９に対応する位置において前記突然変異Ｔを含む、前記センス鎖配列または前記アンチセンス鎖配列にはハイブリダイズするが、前記ＰＣＲ条件下で、位置２３６９において野生型Ｃを含む第２ＥＧＦＲポリヌクレオチドに対しては僅かしかハイブリダイズしないかまたは全くハイブリダイズしない第１ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーを含む組成物に、該サンプルから得られた該核酸を接触させること；および、
ｃ）第２ＰＣＲプライマーの存在下でＰＣＲ反応を実行し、塩基２３６９に対応する位置において突然変異Ｔを含むＰＣＲアンプリコンを得ること、
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＣＲ反応が、前記ＰＣＲアンプリコン中に標識を組み込み、前記特定が、該標識を検出することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記探査は、
ａ）所望される場合、前記サンプルを処理してその中に含まれる前記核酸を放出させること；
ｂ）ＥＧＦＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して適切なＰＣＲ条件下でハイブリダイズする一対のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーであって、ＥＧＦＲ  ｃＤＮＡの塩基２３６９に対応する位置を挟持することによってＰＣＲ混合物を与える一対のプライマーを含む組成物に、該サンプルから得られた該核酸を接触させること；
ｃ）該混合物に対してＰＣＲ反応を実行して、塩基２３６９に対応する位置を含むＰＣＲアンプリコンを得ること；および、
ｄ）以下：
ｉ）塩基２３６９に対応する位置に突然変異Ｔを持つアンプリコンを、該位置の６塩基内で切断するが、該位置に野生型Ｃを持つアンプリコンについてはそのように切断しないことによってか、または、
ｉｉ）塩基２３６９に対応する位置に野生型Ｃを持つアンプリコンを、該位置の６塩基内で切断するが、該位置に突然変異Ｔを持つアンプリコンについてはそのように切断しないことによって、
のいずれかによって該アンプリコンを切断する切断手段に、該アンプリコンを接触させること、
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＰＣＲ反応が、前記ＰＣＲアンプリコン中に標識を組み込み、前記特定が、切断され標識された該ポリヌクレオチドについて長さ多型を検出することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記探査が、
ａ）所望される場合、前記サンプルを処理してその中に含まれる前記核酸を放出させること；
ｂ）固相支持体の上に、該サンプルから得られた該核酸の少なくとも一部を固定すること；および、
ｃ）ＥＧＦＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ・オリゴヌクレオチドに、該固定された核酸を接触さること、ここで、該プローブの配列は、ＥＧＦＲ  ｃＤＮＡの塩基２３９６に対応する位置における突然変異Ｔに対して相補的な塩基を含み、かつ、適切なハイブリダイゼーション条件下で、該プローブは、位置２３６９において野生型Ｃを含むポリヌクレオチドに対して、僅かにしかハイブリダイズしないかまたは全くハイブリダイズしない、
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
前記プローブオリゴヌクレオチドが標識を含み、前記特定が該標識を検出することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記探査は、
ａ）所望される場合、前記サンプルを処理してその中に含まれる前記核酸を放出させること；
ｂ）ＥＧＦＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ・オリゴヌクレオチドを固相支持体に固定すること、ここで、該プローブの配列は、ＥＧＦＲ  ｃＤＮＡの塩基２３９６に対応する位置における突然変異Ｔに対して相補的な塩基を含み、該プローブは、位置２３６９において野生型Ｃを含むポリヌクレオチドに対し、僅かにしかハイブリダイズしないかまたは全くハイブリダイズしないこと；および、
ｃ）適切なハイブリダイゼーション条件下において、前記固定されたプローブに、該サンプルから得られた該核酸の少なくとも一部を接触させること
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸が標識を含み、前記特定が該標識を検出することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
癌を患っているか、または癌が疑われる被験体においてゲフィチニブまたはエルロチニブの治療作用に対する耐性を予測する方法であって、
ａ）該被験体からサンプルを得ること；
ｂ）ＥＧＦＲ  ｃＤＮＡの塩基２３６９に対応する位置に突然変異Ｔを含むヌクレオチド配列を選択的に検出する手段によって該サンプルを探査すること；
ｃ）該位置における塩基がＴであることを特定すること；
を含み、それによって、該被験体は、ゲフィチニブまたはエルロチニブによる治療に対して耐性を持つと予測される、
、前記方法。
【請求項２１】
前記手段が、前記位置における突然変異Ｔの検出と野生型Ｃの検出とを区別する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記サンプルが、癌または悪性であるか、それが疑われる組織または細胞を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記サンプルまたはその一部が、前記探査の前に拡大される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記サンプルまたはその一部の中の核酸が、前記探査の前に増幅される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記探査が、
ａ）所望される場合、前記サンプルを処理してその中に含まれる前記核酸を放出させること；
ｂ）ＥＦＧＲ  ｃＤＮＡの塩基２３６９に対応する位置において前記突然変異Ｔを含む、前記センス鎖配列または前記アンチセンス鎖配列に対してハイブリダイズする第１ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーであって、前記ＰＣＲ条件下において、位置２３６９において野生型Ｃを含む第２ＥＧＦＲポリヌクレオチドに対しては、僅かしかハイブリダイズしないかまたは全くハイブリダイズしない第１ＰＣＲプライマーを含む組成物に、該サンプルから得られた該核酸を接触させること；および、
ｃ）第２ＰＣＲプライマーの存在下においてＰＣＲ反応を実行し、塩基２３６９に対応する位置において突然変異Ｔを含むＰＣＲアンプリコンを得ること、
を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＰＣＲ反応が、前記ＰＣＲアンプリコンの中に標識を組み込み、前記特定が該標識を検出することを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記探査は、
ａ）所望される場合、前記サンプルを処理してその中に含まれる前記核酸を放出させること；
ｂ）ＥＧＦＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して適切なＰＣＲ条件下でハイブリダイズする一対のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーであって、ＥＧＦＲ  ｃＤＮＡの塩基２３６９に対応する位置を挟持することによってＰＣＲ混合物を与える一対のプライマーを含む組成物に、該サンプルから得られた該核酸を接触させること；
ｃ）該混合物に対してＰＣＲ反応を実行して、塩基２３６９に対応する位置を含むＰＣＲアンプリコンを得ること；および、
ｄ）以下、
ｉ）塩基２３６９に対応する位置に突然変異Ｔを持つアンプリコンを、該位置の６塩基内で切断するが、該位置に野生型Ｃを持つアンプリコンについてはそのように切断せしないこと、または、
ｉｉ）塩基２３６９に対応する位置に野生型Ｃを持つアンプリコンを、該位置の６塩基内で切断するが、ただし該位置に突然変異Ｔを持つアンプリコンについてはそのように切断しないこと
のいじれかによってアンプリコンを切断する切断手段に、該アンプリコンを接触させること、
を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＰＣＲ反応が、前記ＰＣＲアンプリコンの中に標識を組み込み、前記特定が、切断され標識された該ポリヌクレオチドの長さ多型を検出することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記探査は、
ａ）所望される場合、前記サンプルを処理してその中に含まれる前記核酸を放出させること；
ｂ）固相支持体の上に該サンプルから得られた該核酸の少なくとも一部を固定すること；および、
ｃ）ＥＧＦＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ・オリゴヌクレオチドに該固定された核酸を接触させることであって、ここで、該プローブの配列は、ＥＧＦＲ  ｃＤＮＡの塩基２３９６に対応する位置における突然変異Ｔに対して相補的な塩基を含み、適切なハイブリダイゼーション条件下で、該プローブは、位置２３６９において野生型Ｃを含むポリヌクレオチドに対して、僅かにしかハイブリダイズしないかまたは全くハイブリダイズしないこと、
を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記プローブ・オリゴヌクレオチドが標識を含み、前記特定が該標識を検出することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記探査は、
ａ）所望される場合、前記サンプルを処理してその中に含まれる前記核酸を放出させること；
ｂ）ＥＧＦＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ・オリゴヌクレオチドを固相支持体に固定することであって、該プローブの配列は、ＥＧＦＲ  ｃＤＮＡの塩基２３９６に対応する位置における突然変異Ｔに対して相補的な塩基を含み、かつ位置２３６９において野生型Ｃを含むポリヌクレオチドに対し、僅かにしかハイブリダイズしないかまたは全くハイブリダイズしないこと、；および、
ｃ）適切なハイブリダイゼーション条件下において、該固定されたプローブに、該サンプルから得られた該核酸の少なくとも一部を接触させること
を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
前記核酸が標識を含み、前記特定工程が、該標識を検出することを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
癌に罹患しているか、または癌が疑われる被験体においてゲフィチニブまたはエルロチニブの治療作用に対する耐性を予測するためのキットの製造における、ＥＧＦＲ  ｃＤＮＡの塩基２３６９に対応する位置に突然変異Ｔを含むヌクレオチド配列を選択的に検出する手段の使用。
【請求項３４】
少なくとも１個の容器と、該容器に含まれる、少なくとも１個のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーを含む組成物とを含むキットであって、該ＰＣＲプライマーは、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の位置７９０においてトレオニンのメチオニンによる置換をコードするＥＧＦＲ遺伝子の突然変異に対し５′側のポリヌクレオチド配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖にハイブリダイズし、ここで、該プライマーは、該突然変異位置の２００ヌクレオチド以内に結合する、キット。
【請求項３５】
以下、
ａ）ＥＧＦＲ  ｃＤＮＡの塩基２３６９に対応する位置に突然変異Ｔを持つポリヌクレオチドを、該位置の６塩基内で切断するが、該位置に野生型Ｃを持つポリヌクレオチドについてはそのように切断しないこと、または、
ｂ）ＥＧＦＲ  ｃＤＮＡの塩基２３６９に対応する位置に野生型Ｃを持つポリヌクレオチドを、該位置の６塩基内で切断するが、該位置に突然変異Ｔを持つポリペプチドについてはそのように切断しないこと、
のいずれかによってＥＧＦＲポリヌクレオチドを切断する切断手段をさらに含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
少なくとも１個の容器と、該容器に含まれ、ＰＣＲプライマーを含む組成物とを含むキットであって、該ＰＣＲプライマーは、適切なＰＣＲ条件下において、突然変異上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ポリペプチドをコードする第１ポリヌクレオチドまたはそのポリヌクレオチド断片にハイブリダイズし、該プライマーは、ＥＦＧＲ  ｃＤＮＡの塩基２３６９に対応する位置において突然変異Ｔを含むセンス鎖配列またはアンチセンス鎖配列に対してはハイブリダイズし、かつ該プライマーは、該ＰＣＲ条件下で、位置２３６９において野生型Ｃを含む第２ＥＧＦＲポリヌクレオチドに対しては、僅かにしかハイブリダイズしないかまたは全くハイブリダイズしない、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子またはＥＧＦＲタンパクにおける突然変異体であって、ＥＧＦＲの抑制を目的とするある種の癌治療に対する耐性の根本的原因となっている突然変異体の有無を試験する方法に関する。本発明はさらに、前記突然変異ＥＧＦＲを抑制する新規治療の開発法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）は、癌細胞の増殖および生存において重要な細胞機能の制御に与っているので、従来から硬組織腫瘍の治療における関連標的として特定されている。ＥＧＦＲは、種々の腫瘍において広く発現されるが、発現が高いと、多くの場合予後不良に結びつく。ＥＧＦＲの抑制を目的とする、新しいクラスの標的治療薬、チロシンキナーゼ阻害剤が出現した。例えばゲフィチニブ（イレッサ）およびエルロチニブ（タルセバ）の二つが知られている。これらの治療薬に対しある患者では初期に反応があるにも拘らず、未知の機序によって耐性が「獲得」され、最終的に患者の病気が進行する。
【０００３】
ＥＧＦＲは、肺癌において重要な役割を果たすと考えられている。しかしながら、非小細胞型肺癌（ＮＳＣＬＣ）症例のほんの一部にしかイレッサまたはタルセバ（構造については図１を参照）に反応しない。チロシンキナーゼ阻害剤であるゲフィチニブまたはエルロチニブに対して反応する患者の肺腺癌には、通常、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼドメインをコードするエキソンの中に機能増強型体細胞突然変異体が見られる。このような突然変異体は、アメリカのＮＳＣＬＣ症例の約１０％に認められるが［非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３］、東アジアではさらに高い発生率となっている［非特許文献２、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６］。ＮＳＣＬＣ関連突然変異体の約９０％は下記の内のいずれかである。すなわち、一つは、４個のアミノ酸Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａの除去を含むエキソン１９におけるマルチヌクレオチドのインフレーム欠失であり、もう一つは、エキソン２１のヌクレオチド２５７３における単一ヌクレオチド置換（Ｔ→Ｇ）であり、これは、位置８５８においてロイシンに代わるアルギニンの置換をもたらす（Ｌ８５８Ｒ）。これらの突然変異体は両方とも、小型分子のキナーゼ阻害剤であるゲフィチニブまたはエルロチニブに対する感受性と関連する［非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３］。残念ながら、これらの薬剤に対して著明な改善が見られた患者のほとんど全てで症状が進む結果となる。ＫＲＡＳ（ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２、Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウィルス癌遺伝子相同体、ＲＡＳファミリーの一員）突然変異体が、ゲフィチニブまたはエルロチニブに対する一次耐性のいくつかのケースと関連することが示されているが［非特許文献７］、「獲得」または「二次的」耐性の原因となる機序は未知である。
【０００４】
従って、この耐性の根本的な原因を特定し、それによって、診断テストの開発を可能とし、より効果的な治療の提供を可能とすることが従来技術において求められている。さらに、現行のＥＧＦＲ阻害剤に対し初期に反応があったにも拘らず癌の進行または再発を示す患者に対し、その治療を可能とする新規化合物が従来技術において求められている。
【非特許文献１】Ｌｙｎｃｈ  ＴＪ、Ｂｅｌｌ  ＤＷ、Ｓｏｒｄｅｌｌａ  Ｒ、Ｇｕｒｕｂｈａｇａｖａｔｕｌａ  Ｓ、Ｏｋｉｍｏｔｏ  ＲＡら、（２００４）Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｏ  ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５０：  ２１２９−２１３９
【非特許文献２】Ｐａｅｚ  ＪＧ、Ｊａｎｎｅ  ＰＡ、Ｌｅｅ  ＪＣ、Ｔｒａｃｙ  Ｓ、Ｇｒｅｕｌｉｃｈ  Ｈら、（２００４）ＥＧＦＲ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ：  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４：  １４９７−  １５００
【非特許文献３】Ｐａｏ  Ｗ、Ｍｉｌｌｅｒ  Ｖ、Ｚａｋｏｗｓｋｉ  Ｍ、Ｄｏｈｅｒｔｙ  Ｊ、Ｐｏｌｉｔｉ  Ｋら、（２００４）ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｒｅ  ｃｏｍｍｏｎ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｆｒｏｍ  「ｎｅｖｅｒ  ｓｍｏｋｅｒｓ」  ａｎｄ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｓ  ｔｏ  ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ  ａｎｄ  ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０１：１３３０６−  １３３１１
【非特許文献４】Ｈｕａｎｇ  ＳＦ、Ｌｉｕ  ＨＰ、Ｌｉ  ＬＨ、Ｋｕ  ＹＣ、Ｆｕ  ＹＮら、（２００４）  Ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｉｎ  Ｔａｉｗａｎ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：８１９５−８２０３
【非特許文献５】Ｋｏｓａｋａ  Ｔ、Ｙａｔａｂｅ  Ｙ、Ｅｎｄｏｈ  Ｈ、Ｋｕｗａｎｏ  Ｈ、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｔら、（２００４）Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４：  ８９１９−８９２３
【非特許文献６】Ｓｈｉｇｅｍａｔｓｕ  Ｈ、Ｌｉｎ  Ｌ、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｔ、Ｎｏｍｕｒａ  Ｍ、Ｓｕｚｕｋｉ  Ｍら、（２００４）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．Ｉｎ  ｐｒｅｓｓ
【非特許文献７】Ｐａｏ  Ｗ、Ｗａｎｇ  ＴＹ、Ｒｉｅｌｙ  ＧＪ、Ｍｉｌｌｅｒ  ＶＡ、Ｐａｎ  Ｑら、（２００５）ＫＲＡＳ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｔｏ  ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ  ｏｒ  ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ．  ＰＬｏＳ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：ｅｌ７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、ＥＧＦＲ  ｃＤＮＡの塩基２３６９に対応する位置におけるＥＧＦＲ突然変異Ｃ→Ｔの検出に向けたポリメラーゼ連鎖反応のプライマーを提供する。この突然変異体は、ＥＧＦＲタンパクの位置７９０において、野生型におけるトレオニンから変異種におけるメチオニンへの変化をコードする。この突然変異体は、ゲフィチニブまたはエルロチニブによる治療前、または治療の初期段階の患者ではごく僅かであることが明らかにされている。しかしながら、この突然変異体が、これらの薬剤に対する感受性を打ち消してしまうので、この突然変異体を宿す癌細胞が有利に選択され、結果、患者はさらなる治療に対して不応となる。本発明はさらに、患者において該突然変異体を検出する方法であって、その最終目的は、代替治療を開始可能とするために、不応症例を早期に特定するための方法を提供する。
【０００６】
第１局面では、本発明は、ＥＧＦＲポリペプチドの位置７９０においてトレオニンのメチオニンによる置換をコードするＥＧＦＲ遺伝子突然変異体に対し、各鎖の５′側のポリヌクレオチド鎖のセンス鎖またはアンチセンス鎖に対し、適切なＰＣＲ条件下でハイブリダイズするＰＣＲプライマーであって、前記突然変異体の２００ヌクレオチド以内に結合する、ＰＣＲプライマーを提供する。全体的プライマー構造は、配列番号４−７および１２−１５に基づいて与えられるが、これらの特定配列よりも大きい場合も、小さい場合もあり得る。その外、配列番号４−７および１２−１５によって示される配列中のいくつかの塩基が他の塩基によって置換される配列を持つプライマーも提供される。
【０００７】
もう一つの局面では、本発明は、適切なＰＣＲ条件下において、野生型ＥＧＦＲポリペプチドをコードする第１ポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチド断片にハイブリダイズするＰＣＲプライマーを提供する。その際、プライマーは、ＥＧＦＲ  ｃＤＮＡの塩基２３６９に対応する位置において野生型Ｃを含む、センス鎖配列またはアンチセンス鎖配列にはハイブリダイズするが、プライマーは、ＰＣＲ条件下、位置２３６９において突然変異Ｔを含む、第２ＥＧＦＲポリヌクレオチドに対しては僅かしか、または全くハイブリダイズしない。
【０００８】
さらに別の実施態様では、本発明は、適切なＰＣＲ条件下で、突然変異ＥＧＦＲポリペプチドをコードする第１ポリヌクレオチドまたはそのポリヌクレオチド断片に対してハイブリダイズするＰＣＲプライマーを提供する。その際、該プライマーは、ＥＧＦＲ  ｃＤＮＡの塩基２３６９に対応する位置において突然変異Ｔを含む、センス鎖配列またはアンチセンス鎖配列にはハイブリダイズするが、該プライマーは、ＰＣＲ条件下、位置２３６９において野生型Ｃを含む、第２ＥＧＦＲポリヌクレオチドに対しては僅かしか、または全くハイブリダイズしない。全体的プライマー構造は、配列番号１２および１３に基づいて与えられるが、これらの特定配列よりも大きい場合も、小さい場合もあり得る。その外、配列番号１２および１３によって示される配列中のいくつかの塩基が他の塩基によって置換される配列を持つプライマーも提供される。
【０００９】
さらに別の局面では、本発明は、サンプルにおいて上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）突然変異遺伝子を検出するための方法であって、ＥＧＦＲ  ｃＤＮＡの塩基２３６９に対応する位置において突然変異Ｔを含むヌクレオチド配列を選択的に検出する手段によってサンプルを探査すること、および、前記位置における塩基がＴであることを特定すること、を含む方法を提供する。ある重要な実施態様では、この手段は、前記位置における突然変異Ｔと野生型Ｃの検出を区別する。
【００１０】
一般的実施態様では、サンプルは、癌であるかまたは悪性であるか、あるいは、癌または悪性を疑われる組織または細胞を含む。このようなサンプルは、癌または悪性腫瘍を持つか、または持つことを疑われる被験体に起因し、バイオプシーまたは同様の外科処置によって得られる。
【００１１】
本方法のいくつかの優勢な実施態様では、探査は、
ａ）所望される場合、サンプルを処理してその中に含まれる核酸を放出させること；
ｂ）ＥＧＦＲ  ｃＤＮＡの塩基２３６９に対応する位置において突然変異Ｔを含む、センス鎖配列またはアンチセンス鎖配列にはハイブリダイズするが、ＰＣＲ条件下、位置２３６９において野生型Ｃを含む、第２ＥＧＦＲポリヌクレオチドに対しては僅かしか、または全くハイブリダイズしない第１ＰＣＲプライマーを含む組成物に、サンプルから得られた核酸を接触させること；および、
ｃ）第２ＰＣＲプライマーの存在下にＰＣＲ反応を実行し、塩基２３６９に対応する位置において突然変異Ｔを含むＰＣＲアンプリコンを得ること、
から成る諸工程を含む。
ＰＣＲ反応では、ＰＣＲアンプリコン中に標識を組み込むと有利である。こうすると特定工程は、該標識を検出することを含むことが可能になる。
【００１２】
本方法のしばしば用いられる別の実施態様では、探査は、
ａ）所望される場合、サンプルを処理してその中に含まれる核酸を放出させること；
ｂ）適切なＰＣＲ条件下で、ＥＧＦＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対してハイブリダイズする一対のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーであって、ＥＧＦＲ  ｃＤＮＡの塩基２３６９に対応する位置を挟持することによってＰＣＲ混合物を与える一対のプライマーを含む組成物に、サンプルから得られた核酸を接触させること；
ｃ）該混合物に対してＰＣＲ反応を実行して、塩基２３６９に対応する位置を含むＰＣＲアンプリコンを得ること；および、
ｄ）アンプリコンを切断手段に接触させることから成る諸工程を含み、接触手段は、
ｉ）塩基２３６９に対応する位置に突然変異Ｔを持つアンプリコンを、該位置の６塩基内で切断するが、ただし該位置に野生型Ｃを持つアンプリコンはそのように切断せず、または、
ｉｉ）塩基２３６９に対応する位置に野生型Ｃを持つアンプリコンを、該位置の６塩基内で切断するが、ただし該位置に突然変異Ｔを持つアンプリコンはそのように切断しない。
ＰＣＲ反応では、ＰＣＲアンプリコン中に標識を組み込むと有利である。こうすると特定工程は、切断標識ポリヌクレオチドについて長さ多型を検出することを含むことが可能になる。
【００１３】
本発明の一般的な、さらに別の実施態様では、探査は、
ａ）所望される場合、サンプルを処理してその中に含まれる核酸を放出させること；
ｂ）固相支持体の上にサンプルから得られた核酸の少なくとも一部を固定すること；
ｃ）ＥＧＦＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ・オリゴヌクレオチドであって、該プローブの配列は、適切なハイブリダイゼーション条件下において、ＥＧＦＲ  ｃＤＮＡの塩基２３９６に対応する位置における突然変異Ｔに対して相補的な塩基を含むが、位置２３６９において野生型Ｃを含むポリヌクレオチドに対しては、僅かしかまたは全くハイブリダイズしないプローブ・オリゴヌクレオチドに、固定された核酸を接触させること、
から成る諸工程を含む。
【００１４】
上述のものとは逆の方法の一般的実施態様では、探査は、
ａ）所望される場合、サンプルを処理してその中に含まれる核酸を放出させること；
ｂ）ＥＧＦＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ・オリゴヌクレオチドであって、該プローブの配列は、ＥＧＦＲ  ｃＤＮＡの塩基２３９６に対応する位置における突然変異Ｔに対して相補的な塩基を含むが、位置２３６９において野生型Ｃを含むポリヌクレオチドに対しては、僅かしかまたは全くハイブリダイズしないプローブ・オリゴヌクレオチドを、固相支持体に固定すること；および、
ｃ）適切なハイブリダイゼーション条件下に、サンプルから得られた核酸の少なくとも一部を固定されたプローブに接触させること、
から成る諸工程を含む。
固相支持体を含むこれらの実施態様では、固定されたパートナーに結合する成分は標識を含み、特定工程は該標識の検出を含む。
【００１５】
さらに別の局面では、本発明は、癌に罹患しているか、または癌が疑われる被験体においてゲフィチニブまたはエルロチニブの治療作用に対する耐性を予測する方法を提供する。この方法は、先行パラグラフに記載された、サンプルにおいて上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子突然変異を検出する方法に記載される工程を用い、位置２３６９において突然変異があることを陽性に見出した場合、該被験体は、ゲフィチニブまたはエルロチニブによる治療に対して耐性を持つと予測されると結論する。
【００１６】
さらに別の局面で、本発明は、少なくとも１個の容器、および、該容器に含まれる、先行パラグラフの中に記載された少なくとも１個のＰＣＲプライマーを含む組成物を含むキットを提供する。ある実施態様では、キットはさらに、切断手段であって、
ａ）ＥＧＦＲ  ｃＤＮＡの塩基２３６９に対応する位置に突然変異Ｔを持つポリヌクレオチドを、該位置の６塩基内で切断することによって、ただし該位置に野生型Ｃを持つポリヌクレオチドはそのように切断せず、または、
ｂ）ＥＧＦＲ  ｃＤＮＡの塩基２３６９に対応する位置に野生型Ｃを持つポリヌクレオチドを、該位置の６塩基内で切断することによって、ただし該位置に突然変異Ｔを持つポリペプチドはそのように切断せず、
ＥＧＦＲポリヌクレオチドを切断する切断手段を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本明細書に特定される特許、公開特許公報、および特許出願は全て、参照することによりその書の全体が、本明細書に一語一語そのまま現れるように本明細書に含められる。本明細書に特定される技術的出版物も全て引用により本明細書に含める。
【００１８】
省略形：ＣＭＬ、慢性骨髄性白血病；ＣＴ、Ｘ線断層写真；ｄｅｌ、欠失；ＥＧＦＲ、上皮増殖因子受容体；ＧＩＳＴ、消化管支質腫瘍；ＨＥＳ、好酸球増多症候群；ＮＳＣＬＣ、非小細胞型肺癌；ｐ−ＥＧＦＲ、リン−ＥＧＦＲ；ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ＰＣＲ制限断片長多型；ＳＮＰ、一塩基多型；ｔ−ＥＧＦＲ、全体ＥＧＦＲ．
アクセス番号：参照ＥＧＦＲ配列は、ＬｏｃｕｓＬｉｎｋアクセス番号１９５６、およびＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＴ＿０３３９６８から入手した。
【００１９】
ＥＧＦＲについては二つの記数システムを用いた。第１のシステムは、シグナル配列における開始メチオニンをアミノ酸−２４と表示する。第２は、本明細書で用いるのもこれであるが、メチオニンをアミノ酸＋１と表示する。抗体、例えば、Ｙ１０６８−特異的抗リン−ＥＧＦＲの供給業者は、第１の命名法を用いる。統一的であるために、我々は、Ｙ１０６８をＹ１０９２と見なす。同様に、本明細書で報告されるＴ７９０Ｍ突然変異体は、従来Ｔ７６６Ｍと呼ばれているものである。
【００２０】
本説明では、指示代名詞「ある」、および「その」は、単数であれ、複数であれ等価的な意味を持つ。これらの代名詞の特定の意味は、それらの使用される文脈から明白である。
【００２１】
本明細書で用いる「腫瘍」という用語は、悪性または良性を問わず、全ての新生の細胞成長および増殖と、全ての前癌および癌細胞ならびに組織を指す。
【００２２】
本明細書で用いる「癌」という用語は、無制限増殖、特殊化機能の喪失、恒久性、著明な転移能力、抗アポトーシス活性の著明な増加、急激な成長および増殖速度、および、いくつかの特徴的な形態的マーカーおよび細胞マーカーなどの特徴を持つ細胞または組織を指す。ある状況では、癌細胞は腫瘍の形を取り、そのような細胞は、動物体内の局所に存在するが、別の状況では、癌細胞は、例えば、白血球細胞のような独立の細胞として血流の中を循環する。
【００２３】
ゲフィチニブまたはエルロチニブに対して臨床的耐性を獲得した癌が、ＥＧＦＲキナーゼドメインにさらに突然変異体を出現させるかどうかを決めるために、我々は、これらの薬剤に対して初期には反応したものの、その後進行した１３名の患者について、彼等から得た腫瘍においてＥＧＦＲエキソン１８から２４の状態を調べた。これらのエキソンを、肉眼的に完全な腫瘍切除を完了した後、ゲフィチニブで治療中に病気が急速に再発した、１４番目の患者から得られた腫瘍細胞でも評価した。ゲフィチニブおよびエルロチニブに対する一次耐性に対しＫＲＡＳが関連することから［７］、我々はまた、これら６名の患者から得られた腫瘍細胞においてＫＲＡＳの状態を調べた。ＥＧＦＲにおいて新たに特定された「耐性」突然変異体−ＥＧＦＲゲノム配列におけるＴ７９０Ｍアミノ酸置換（別にＴ７６６Ｍとも呼ばれる）、２３６９Ｃ→Ｔ変異−を持つ細胞の選択的優位性を説明する努力の一環として、我々はさらに、たまたまＴ７９０Ｍ突然変異体を含むことが判明したＮＳＬＣ細胞系統、および、野生型および突然変異ＥＧＦＲ  ｃＤＮＡを一過性にトランスフェクトさせた細胞から得られた細胞分解物の両方を用い野生型または薬剤感受性のＥＧＦＲ突然変異に対する、耐性を持つと予想されるＥＧＦＲ突然変異の薬剤感受性の特徴を調べた。
【００２４】
配列番号１（表１に示す）は、ヒトのＥＧＦＲ突然変異遺伝子のｃＤＮＡ配列を示す。ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ突然変異体の有無を検出するために、配列決定のために用いたＥＧＦＲ断片を増幅するのに使用したプライマーペアには下線を施し、かつイタリック体で表した。突然変異のｔ２３６９ヌクレオチドは、拡大したボールド体で示す。野生型ＥＧＦＲ配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｘ００５８８，および、Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．“Ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ａｂｅｒｒａｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ａ４３１  ｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ”，Ｎａｔｕｒｅ３０９（５９６７）、４１８−４２５（１９８４）から公知である。翻訳された突然変異タンパク配列を配列番号２（表２）に示す。突然変異Ｍ７９０は、拡大したボールド体で示される。
【００２５】
【化１】
2008529532.tif 000003
【００２６】
【化２】
2008529532.tif 000004
本明細書で用いる「核酸」または「ポリヌクレオチド」、および類似の用語および語句は、天然のヌクレオチドから構成されるポリマーばかりでなく、合成または修飾ヌクレオチドから構成されるポリマーにも関する。従って、本明細書で使用する場合、ＲＮＡであるポリヌクレオチド、またはＤＮＡであるポリヌクレオチド、あるいはデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの両方を含むポリヌクレオチドは、天然の成分、例えば、天然の塩基およびリボースまたはデオキシリボース環を含んでもよいし、あるいは、それらは、後述するもののような、合成または修飾された成分から構成されていてもよい。本発明に用いられるポリヌクレオチドは、１本鎖であってもよく、または、塩基が対になった２本鎖構造であってもよく、あるいは、塩基が対になった３本鎖構造であってもよい。
【００２７】
核酸およびポリヌクレオチドは、長さが２０ヌクレオチド以上であっても、または３０ヌクレオチド以上、または５０ヌクレオチド以上、または１００以上、または１０００以上、または数千以上、または数十万以上であってもよい。本明細書で用いる「オリゴヌクレオチド」および、これに基づく同様の用語は、前パラグラフで述べたように、天然のヌクレオチドから構成される短いポリマーばかりでなく、合成または修飾ヌクレオチドから構成される短いポリマーをも指す。オリゴヌクレオチドは、長さが１０ヌクレオチド以上、または２０ヌクレオチド以上、または３０ヌクレオチド以上、または４０以上で、最大約５０であってもよい。オリゴヌクレオチドは化学的に合成されてもよいし、種々の用途がある中でも、ＰＣＲプライマーとして、またはプローブとして用いられてもよい。
【００２８】
前パラグラフで与えられたサイズ範囲には重複があるために、「ポリヌクレオチド」と「オリゴヌクレオチド」という用語同士は、本明細書では、本発明のプライマーまたはプローブを指すに当たって同義語として使用される可能性があることを理解しなければならない。
【００２９】
本明細書で用いる「ヌクレオチド配列」、「オリゴヌクレオチド配列」、または「ポリヌクレオチド配列」、および類似の用語は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが有する塩基配列ばかりでなく、該配列を所有するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド構造のいずれに対しても相互交換的に関わる。ヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列はさらに、その塩基配列が、本技術分野において通例として用いられる、塩基を表示する文字から成る特定配列の記載または口誦によって定義される、任意の、天然または合成ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに関する。
【００３０】
「ヌクレオシド」は、通例として、生化学、分子生物学、ゲノミクス、および本発明の分野に関連する類似の分野における当業者によって、グリコシド結合を通じてプリンまたはピリミジン塩基に連結するモノサッカリドを含むものと理解されているが、「ヌクレオチド」は、通常は、サッカリドの３′または５′位置（ペントースの場合）においてであるが、他の位置であってもよいその位置に、少なくとも１個のリン酸基を付着させたヌクレオシドを含む。ヌクレオチドの修飾体または誘導体は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの任意の配列位置において起こってもよい。オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの修飾体および誘導体は全て本発明に含まれ、特許請求の範囲内に納まる。修飾体または誘導体は、リン酸基、モノサッカリド、または塩基において起こることが可能である。
【００３１】
非限定的例として述べるのであるが、下記の説明は、全て、本発明のポリヌクレオチドの範囲内にある、いくつかのヌクレオチド修飾体または誘導体を提示する。モノサッカリドは、例えば、リボースまたはデオキシリボース以外のペントースまたはヘキソースであることによって修飾される。モノサッカリドはまた、ヒドロキシル基を、ヒドロまたはアミノ基によって置換することによって、または、別のヒドロキシル基をアルキル化またはエステル化することによって修飾してもよい。２′位置に置換基、例えば、２′−Ｏ−メチル、２′−Ｏ−エチル、２′−Ｏ−プロピル、２′−Ｏ−アリル、２′−Ｏ−アミノアルキル、または２′−デオキシ−２′−フルオロ基を置くと、それによって、オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーション能力が強化される。
【００３２】
オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドにおける塩基は、「未修飾」または「天然」の塩基であってもよく、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含む。さらに、これらの塩基は、修飾または置換を有する塩基であってもよい。修飾塩基の非限定的例としては、他の合成および天然の塩基、例えば、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５′−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの、６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシル、５−ハロ−シトシン、５−プロピル−ウラシル、５−プロピニル−シトシン、およびピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾ−ウラシル、６−アゾ−シトシン、６−アゾ−チミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ−、８−チオール−、８−チオアルキル−、８−ヒドロキシル−、および他の８−置換アデニン類およびグアニン類、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、および他の５−置換ウラシル類およびシトシン類、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−フルオロ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが挙げられる。さらにそれ以外の修飾塩基としては、３環ピリミジン、例えば、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−ｃｌａｍｐ類、例えば、フェノキサジンシチジン置換体（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３′，２′：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）が挙げられる。修飾塩基はさらに、プリンまたはピリミジン塩基が、他のヘテロ環、例えば、７−デアザアデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、および２−ピリドンによって置換される塩基を含んでもよい。さらにそれ以外の塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９１）３０，６１３に開示されるもの、および、Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されるものを含む。これらの塩基の内のいくつかは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増すのに特に有用である。そのようなものとして、５−置換ピリミジン類、６−アザピリミジン類、およびＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン類、例えば、２−アミノプロピニルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む置換体が挙げられる。５−メチルシトシン置換は、核酸２本鎖の安定性を０．６−１．２度増すことが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、現在好ましい塩基置換体であり、特に、２′−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合は好ましい。米国特許第６，５０３，７５４および第６，５０６，７３５号、およびこれらの引用文献を参照されたい。なお、これらを引用することにより本明細書に含める。修飾体はさらに、ポリアミン接合オリゴヌクレオチドを扱う米国特許第５，１３８，０４５および第５，２１８，１０５号；フォスフォロチオエートを含むリン酸キラル結合を取り込むオリゴヌクレオチドを扱う米国特許第５，２１２，２９５、第５，５２１，３０２号、第５，５８７，３６１号、および第５，５９９，７９７号；修飾バックボーンを持つオリゴヌクレオチドを扱う米国特許第５，３７８，８２５号、第５，５４１，３０７号および第５，３８６，０２３号；修飾された核塩基を扱う米国特許第５，４５７，１９１および５，４５９，２５５号；ペプチド核酸を扱う米国特許第５，５３９，０８２号；ベータ−ラクタムバックボーンを有するオリゴヌクレオチドを扱う米国特許第５，５５４，７４６号；オリゴヌクレオチドの合��を開示する米国特許第５，５７１，９０２号；アルキルチオヌクレオシドを開示する米国特許第５，５７８，７１８号；２′−Ｏ−アルキルグアノシン、２，６−ジアミノプリン、および関連化合物を扱う米国特許第５，５０６，３５１号；Ｎ−２置換プリンを有するオリゴヌクレオチドを扱う米国特許第５，５８７，４６９号；３−デアザプリンを有するオリゴヌクレオチドを扱う米国特許第５，５８７，４７０号；４′−デスメチルヌクレオシド接合類縁体を扱う米国特許第５，２２３，１６８号および第５，６０８，０４６号；バックボーン修飾オリゴヌクレオチド類縁体を扱う米国特許第５，６０２，２４０号および第５，６１０，２８９号；特に、２′−フルオロ−オリゴヌクレオチドの合成法を扱う米国特許第６，２６２，２４１号および第５，４５９，２５５号に開示されるものが挙げられる。
【００３３】
ヌクレオチド間の結合は、通常、３′−５′リン酸結合であるが、これは、天然のフォスフォジエステル結合、フォスフォチオエステル結合、またはさらに別の合成結合であってもよい。フォスフォロチオエートバックボーンを含むオリゴヌクレオチドは、そのヌクレアーゼ安定性が強化される。バックボーン修飾体の例としては、フォスフォロチオエート、キラルフォスフォロチオエート、フォスフォロジチオエート、フォスフォトリエステル、アミノアルキルフォスフォロトリエステル、メチルおよび他のアルキルフォスフォネート、例えば、３′−アルキレンフォスフォネート、５′−アルキレンフォスフォネート、およびキラルフォスフォネートが挙げられ、フォスフィネート、フォスフォロアミデート、例えば、３′−アミノフォスフォロアミデート、およびアミノアルキルフォスフォロアミデートが挙げられ、チオノフォスフォルアミデート、チオノアルキルフォスフォネート、チオノアルキルフォスフォトリエステル、セレノフォスフェート、およびボラノフォスフェートが挙げられる。さらにそれ以外の結合としては、フォスフォトリエステル、シロキサン、炭酸塩、カルボキシメチルエステル、アセタミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋型フォスフォルアミデート、架橋型メチレンフォスフォネート、架橋型フォスフォロチオエート、およびスルフォンヌクレオチド間結合が挙げられる。他のポリマー結合としては、上記の、２′−５′結合類縁体が挙げられる。米国特許第６５，０３，７５４号および第６，５０６，７３５号、およびこれらの引用文献を参照されたい。なお、これらを引用することにより本明細書に含める。
【００３４】
前述の説明に例示したものを含め、いかなる修飾でも、簡単に、本発明のポリヌクレオチドの中に取り込むこと、その範囲内に含めることが可能である。いずれのヌクレオチド修飾体であっても、その使用は、当業者によって理解されるように、同じ塩基対合性を持つ天然ヌクレオチドの使用と等価である。等価的ヌクレオチド修飾体は全て、本明細書に開示、請求されるとおり本発明の範囲内に納まる。
【００３５】
本明細書および特許請求の範囲に用いられる「相補体」、「相補的」、または「相補性」という用語、および類似の単語および語句は、生化学、分子生物学、ゲノミクス、および本発明の分野に関連する類似の分野における当業者によって通例として理解されるように、二つの配列であって、その塩基が、塩基毎に、互いに相補的な塩基対を形成する配列同士に関わる。相補配列を持つ、２本の１本鎖（ｓｓ）ポリヌクレオチドは、適切なバッファーおよび温度条件の下で互いにハイブリダイズして、２本鎖（ｄｓ）ポリヌクレオチドを形成することが可能である。非限定的例として述べるのであるが、天然の塩基を考えるなら、Ａおよび（ＴまたはＵ）は互いに相互作用を持ち、ＧおよびＣは互いに相互作用を持つ。別様に指示しない限り、「相補的」とは、「完全に相補的」を意味するという意図を持つ。すなわち、２本のポリヌクレオチド鎖が互いに整列すると、２本の鎖の内の少なくとも一部では、一方の鎖の連続塩基配列の内の各塩基が、対向鎖における同じ長さの連続塩基配列の相互作用塩基に対して相補的となる、そのような一部が見られる。
【００３６】
本明細書で用いる「放出する」、および類似の単語および語句は、核酸と結びつけて使用される場合、細胞または組織を処理する際、その中に含まれる核酸が、試薬、例えば、本発明の方法に用いられるＰＣＲプライマーとの相互作用に利用可能となるぐらい十分に処理される工程に関する。
【００３７】
本明細書で用いる「ハイブリダイズする」、「ハイブリダイゼーション」、および類似の単語および語句は、相補配列を持つ複数の鎖を互いに作用させることによって核酸、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド２本鎖を形成する工程に関する。相互作用は、複数の鎖のそれぞれに存在する相補的塩基で、特異的相互作用を持って対を形成する塩基のために起こる。複数の鎖が互いにハイブリダイズする能力は、下記のような種々の条件に依存する。核酸鎖同士は、各鎖において十分な数の対応位置が、相互に作用を持つことが可能なヌクレオチドで占められている場合に互いにハイブリダイズする。互いにハイブリダイズするポリヌクレオチド鎖同士は、完全に相補的であってもよい。それとは別に、２本のハイブリダイズしたポリヌクレオチドは、互いに「実質的に相補的」であってもよい。これは、それらのポリヌクレオチドが少数の不適合塩基を持つことを示す。天然の塩基も、本明細書に記述するような修飾された塩基も、相補的塩基対の形成に参加する。非限定的例として生化学者および分子生物学者を含む、本発明の分野に熟練した当業者であれば、２本鎖を形成する鎖同士の配列は、特異的に配列可能となるために互いに１００％相補的である必要はない。
【００３８】
本明細書で用いる「断片」および類似の単語および語句は、参照体の完全配列よりも短い、核酸、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの一部に関する。断片の中の塩基の配列は、参照体の対応部分の配列と変わらない。すなわち、参照体の対応部分と比較した場合断片には挿入も欠失もない。
【００３９】
本明細書で用いる「切断手段」、および類似の用語および語句は、ポリヌクレオチドを配列特異的やり方で切断する物質に関する。切断手段は、ポリヌクレオチドに対し、該ポリヌクレオチドの塩基の内、感受性を持つサブ配列においてのみ相互作用を持ち、そのポリヌクテオチドを、二つのより小さい断片に切断する。切断手段の非限定的例としては、制限ヌクレアーゼ、配列特異的リボザイム、切断活性を持つアプタマー、切断活性を持つ配列特異的有機分子が挙げられる。本発明の分野の当業者には既知の等価的切断手段であれば、いずれのものも本発明の範囲内にある。
【００４０】
「相補的ＤＮＡ」（ｃＤＮＡ）は、逆転写酵素によってｍＲＮＡ鋳型からコピーされ、ｍＲＮＡの配列に対して相補的な配列となる１本鎖ＤＮＡ分子である。当業者達はまた、そのような１本鎖ＤＮＡ分子、およびその相補的ＤＮＡ鎖を含む２本鎖ＤＮＡ分子を指すのにも“ｃＤＮＡ”という用語を用いる。
【００４１】
サンプル（癌組織バイオプシー、バイオプシーからレーザー組織捕獲によって得た癌細胞、または血清から単離した癌細胞）に含まれるＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ突然変異体の存在を検出するには様々な方法がある。そのような方法は、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ領域の上流と下流にある２本のプライマーにＤＮＡサンプルを接触させること、標準手順に従ってＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ領域を増幅すること、および、核酸サンプルの中に増幅された配列があるかどうかを検出することを含む。従って、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ上流および下流領域を認識し、結合することが可能なプライマー、およびＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ突然変異体に対する親和性を持つ核酸プローブは、本法を支える好ましい手段である。例えば、ＥＧＦＲエキソン２０全体は、ゲノムＤＮＡを鋳型として用い、かつ、それぞれ、エキソン２０の５′および３′イントロンのフランキング配列（このようなエキソン２０フランキング配列を、配列番号３で大文字で示す（表３、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＴ＿０３３９６８）を認識し、結合することが可能なプライマーペアを用い、ＰＣＲによって増幅することが可能である。ＥＧＦＲ  ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド２３６９を含むこのようなプライマーペアは断片を増幅することができ、次にその断片は、配列決定、制限長多型分析、または、２３６９Ｃ→Ｔ突然変異体の有無を決定するための他の任意の技術のために使用することが可能である。
【００４２】
【化３】
2008529532.tif 000005
これらの診断法に限定されることなく、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ突然変異体を検出するための方法であって、対立遺伝子コドンにおける制限部位の有無を認識するために制限酵素を用いる方法が提供される。ポリヌクレオチドの生産的切断をもたらす制限部位は、野生型の一方または他方、または多型対立遺伝子が存在する場合、適切に選択的な制限ヌクレアーゼによって得られる。
【００４３】
さらに本発明の意図するところは、ヒトにおける悪性腫瘍に関連した突然変異ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍを検出するための診断キットである。このようなキットは、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ突然変異体のＰＣＲ検出に有用な一組のプライマー、および、突然変異したＥＧＦＲ配列を含む陽性コントロール、および、非突然変異ＥＧＦＲ配列を含む陰性コントロールが含まれる複数の容器を含むことが好ましい。
【００４４】
図２は、本発明のプライマーのいくつかの実施態様の模式図を示す。本発明は、ＥＧＦＲ  ｃＤＮＡの位置２３６９に対応する塩基を含む、ＥＧＦＲのゲノムまたはｃＤＮＡ配列セグメントを増幅するためのプライマーとして使用可能な配列を開示する。この開示されるプライマー配列、例えば、配列番号４−７および１２−１５は、図２において、明るく陰影を施したブロックによって模式的に表される。図２は、ａ）“ＳＥＱ”として表される開示のプライマーは、その全長が最大２００ヌクレオチドにまで広がるさらに大きいポリヌクレオチドに任意に含まれてもよい実施態様を示す。
【００４５】
本発明はさらに、上記プライマー配列、すなわち配列番号４−７および１２−１５の内の任意の一つの断片で、長さが少なくとも１１ヌクレトチドであるプライマー配列（参照配列番号よりたかだか１塩基しか短くない、図２ｂに示されるもの）と共に、配列番号４−７および１２−１５に示す配列とは、最大５ヌクレオチドしか異ならず（図２ｃに描かれる）、この例では、３本の暗い垂直バーで表される３個の変異塩基を示すプライマー配列を提供する。
【００４６】
さらに本発明は、前述の配列の任意のものに対して相補的な配列も提供する（図２ｄに“ＣＯＭＰＬ”と表示される）。上記配列のいずれも、本発明のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの中に含まれる。前述したように、本発明の、いずれのプライマーポリヌクレオチドも、２００ヌクレオチドの上限まで、任意にさらに新たな塩基を含んでもよい。
【００４７】
本発明のプライマーは、増幅されるゲノム座位またはｃＤＮＡの各鎖に対して「実質的に」相補的であると表示される。これは、これらのプライマーが、ポリメラーゼ連鎖反応の進行を可能とする条件下において、それぞれの鎖にハイブリダイズするのに十分な相補性を持たなければならないことを意味する。言い換えると、プライマーは、突然変異体に隣接する５′および３′配列に対し、それらとハイブリダイズし、そのゲノム座位の増幅を可能とするほど十分な相補性を持たなければならない。従って、プライマー配列は、その標的配列に対して完全に相補的であることを要しないことがここでは見て取れる。従って、オリゴヌクレオチド配列を参照しながら使われる「実質的に同一」および類似の語句は、突然変異、例えば、本明細書において特定されるＳＮＰの有無を区別可能とするほど十分な特異性をもってハイブリダイズまたはアニールすることができる機能的能力を意味する。このことは、融解温度を測定し、それらが、問題のオリゴヌクレオチドが、正常な遺伝子配列、またはＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ遺伝子突然変異配列のどちらに結合したかを簡単に特定可能とするほど十分に異なっているかを見ることで測定可能である。本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、経過した反応工程の数に応じて指数関数的に増加する量の多型座位を生産する酵素連鎖反応である増幅過程に用いられる。通常、１本のプライマーは、多型座位の陰性（−）鎖に対して相補的であり、他方のプライマーは、陽性（＋）鎖に対して相補的である。プライマーをアニールして変性核酸とし、次いで酵素、ＤＮＡポリメラーゼでヌクレオチドを伸長させると、標的多型座位配列を含む、新たに合成された＋および−鎖が得られる。これらの新規合成配列も鋳型となるので、変性、プライマーアニーリング、および伸長から成るサイクルを繰り返すことによって、プライマーによって定められる領域（すなわち、標的多型座位配列）の指数関数的生産がもたらされる。連鎖反応の産物は、用いた特異的プライマーの末端に対応する終末部を持つ、独立した核酸２重鎖である。
【００４８】
ポリヌクレオチドの合成。本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、適切なものであれば任意の方法によって、例えば、通例のフォスフォトリエステルおよびフォスフォジエステル法、またはその自動化実施態様によって調製することが可能である。そのような一つの自動化実施態様では、ジエチルフォスフォロアミダイトが開始材料として用いられ、Ｂｅａｕｃａｇｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２：１８５９−１８６２，（１９８１）に記載されるように合成される。改変固相支持体においてオリゴヌクレオチドを合成するための一つの方法が、米国特許第４，４５８，０６６号に記載される。
【００４９】
オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、標準的合成技術、例えば、自動化ＤＮＡ合成機によって調製される。オリゴヌクレオチドの合成法としては、著名な化学的合成過程、例えば、Ｔ．Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｄｏｒｃａｓ  Ｊ．Ｓ．Ｂｒｏｗｎ  ｉｎ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．１−２４（１９９１）によって記載されるやり方に従って、表面誘導化粒子におけるヌクレオチドフォスフォロアミダイトの順次添加が挙げられるが、ただし、それに限定されない。なお、この文献を引用することにより本明細書に含める。
【００５０】
合成過程の一つの例は、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ＲＮＡフォスフォロアミダイトおよびチミジンフォスフォロアミダイト（Ｐｒｏｌｉｇｏ，ドイツ）を用いる。合成オリゴヌクレオチドは、脱保護され、ゲル精製され（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１５，１８８−２００）、次いで、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，マサチューセッツ州、米国）精製（Ｔｕｓｃｈｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：１１６５８−１１６６８）される。他のオリゴヌクレオチド合成法としては、フォスフォトリエステルおよびフォスフォジエステル法による固相オリゴヌクレオチド合成（Ｎａｒａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０）、および、Ｈ−フォスフォネート法（特に、Ｇａｒｅｇｇ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）“Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｉｃ  ｂｏｎｄｓ  ｖｉａ  ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ”，Ｃｈｅｍ．Ｓｃｒｉｐｔａ  ２５，２８０−２８２；およびＦｒｏｅｈｌｅｒ，Ｂ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８６ａ）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｖｉａ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ｈ−ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１４，５３９９−５４０７）、および支持体における合成（Ｂｅａｕｃａｇｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２：１８５９−１８６２）を始め、フォスフォロアミデート技術（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，”Ｖｏｌ．１５４，ｐｐ．２８７−３１４（１９８８），米国特許第５，１５３，３１９、５，１３２，４１８、４，５００，７０７、４，４５８，０６６、４，９７３，６７９、４，６６８，７７７、および４，４１５，７３２号、および、“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ，”Ｓ．Ａ．Ｎａｒａｎｇ，ｅｄｉｔｏｒ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７に記載される他のもの、およびそこに含まれる参考文献、および非フォスフォロアミダイト技術が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。固相合成は、不純物および過剰な試薬からオリゴヌクレオチドを分離するのに役立つ。固相支持体から切り離された後、オリゴヌクレオチドは、既知の技術を用いてさらに単離されてもよい。
【００５１】
精製されたものであれ、非精製形のものであれ、任意の核酸標本を、それが、多型座位を含む特異的核酸配列を含むか、含むことを疑われるものである限り、開始核酸（単数または複数）として用いることが可能である。従って、過程は、例えば、ＤＮＡ，またはメッセンジャーＲＮＡを含むＲＮＡを、ＤＮＡまたはＲＮＡが、単一鎖であれ、二重鎖であれ、増幅することが可能である。ＲＮＡを鋳型として用いる場合、この鋳型をｃＤＮＡに逆転写するために最適な酵素および／または条件が利用される。さらに、それぞれの１本鎖ずつを含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを用いてもよい。さらに、核酸混合物を用いても、あるいは、本明細書の先行増幅反応で生産された核酸を、同じ、または別のプライマーを用いてそのまま利用してもよい。増幅される特異的核酸配列、すなわち、多型座位は、より大きな分子の一分画であってもよいし、あるいは、最初から独立分子として存在し、特異的配列が核酸全体を構成するようになっていてもよい。増幅される配列は、最初から純粋形として存在する必要はない。該配列は、例えば、ヒトの全ＤＮＡに含まれるもののような複雑な混合物の一小分画として存在してもよい。
【００５２】
本発明で用いられるＤＮＡは、体内サンプル、組織試料等から、様々な技術、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ．ａｌ．ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｐ２８０−２８１，１９８２に記載される技術を用いて抽出されてもよい。抽出サンプルが不純な場合は、増幅前に、細胞、またはサンプルの動物細胞膜を開放し、核酸（単複）の鎖（単複）を暴露および／または分離するのに有効な量の試薬で、該サンプルを処理してもよい。鎖を暴露し、分離するための、この細胞分解および核酸変性工程によって、増幅をはるかに簡単に実行することが可能となる。
【００５３】
ＤＮＡ重合のための試薬は、プライマー伸長産物の合成を実現するよう機能するものであれば、酵素を含めどのような化合物またはシステムであってもよい。この目的のために好適な酵素としては、例えば、ポリメラーゼムテイン、逆転写酵素、他の酵素、例えば、熱安定性酵素（すなわち、変性を引き起こすほど十分に高い温度に曝された後でもプライマー伸長を実行する酵素）、例えば、Ｔａｑポリメラーゼを含む酵素が挙げられる。好適な酵素は、適切なやり方でヌクレオチド同士の組み合わせを助け、互いに、各多型座位核酸鎖に対して相補的なプライマー伸長産物を形成する。一般的に、合成は、各プライマーの３′末端において始まり、鋳型鎖にそって、合成が終了するまで５′方向に進行し、様々な長さの分子を生産する。
【００５４】
増幅産物は、放射性プローブを用いなくとも、サザーンブロットによってサンプルを分析することによって検出される。この過程では、例えば、極小濃度の多型座位の核酸配列を含むｃＤＮＡの小サンプルが増幅され、サザーンブロット技術か、またはそれと類似のものであるが、ドットブロット分析によって分析される。非放射性プローブまたは標識の使用は、高レベルの増幅信号によってやり易くなる。別態様として、増幅産物を検出するために使用されるプローブは、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤、または酵素によって、検出可能となるように直接または間接に標識されてもよい。当業者であれば、他にも、プローブに接着される好適な標識を思いつくであろうし、あるいは、通例の実験を用いてそのような標識を確認することができるであろう。好ましい実施態様では、増幅産物は、ＤＮＡを発光させる臭化エチジウムを含むアガロースゲルの上で混合物を分離することによって分析が可能である。
【００５５】
本発明の方法によって増幅される配列は、溶液において、または固相支持体に結合させた後で、特異的ＤＮＡ配列の検出のために通常適用される任意の方法、例えば、ＰＣＲ、オリゴマー制限（Ｓａｉｋｉ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：１００８−１０１２，（１９８５））、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブ分析（Ｃｏｎｎｅｒ，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：２７８，（１９８３））、オリゴヌクレオチドライゲーション・アッセイ（ＯＬＡ）（Ｌａｎｄｇｒｅｎ，ｅｔ．  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１００７，（１９８８））等によって、さらに評価、検出、配列決定等を実行することが可能である。ＤＮＡ分析に関する分子技術の総覧が提出されている（Ｌａｎｄｇｒｅｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：２２９−２３７，（１９８８））。
【００５６】
増幅法は、本明細書に記載され、かつ、当業者達によって一般的に用いられるものと同じＰＣＲによるものであることが好ましい。それとは別の増幅法も、本発明のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅されるＥＧＦＲ座位が、その別手段によっても同様に増幅される限り、使用が可能である。このような別法増幅システムとして、対象とする短いＲＮＡ配列とＴ７プロモーターで始める自己持続性配列複製が挙げられるが、ただしそれに限定されない。酵素、逆転写酵素は、ＲＮＡを複製してｃＤＮＡとし、次いで、この転写ＲＮＡを変性する。もう一つの核酸増幅技術は、核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ）である。これは、逆転写とＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用い、そのサイクルスキームを目標実現するために二つのプライマーを取り込む。ＮＡＳＢＡは、ＤＮＡかＲＮＡのどちらかで始め、どちらかで終わり、６０から９０分以内に１０８コピーまで増幅することが可能である。別態様として、核酸は、ライゲーション活性化転写（ＬＡＴ）によって増幅することも可能である。ＬＡＴは、一部１本鎖、一部２本鎖である１本のプライマーと組み合わせた１本鎖鋳型に基づいて動作する。増幅は、プロモーターオリゴヌクレオチドにｃＤＮＡを連結することから始まり、数時間以内に、増幅は１０８から１０９倍になる。対象とするＤＮＡ配列に相補的なＲＮＡに対し、ＭＤＶ−１と呼ばれるＲＮＡ配列を付着させることによって、ＱＢレプリカーゼが利用可能となる。サンプルと混合されると、ハイブリッドＲＮＡは、標本のｍＲＮＡの中にその相補体を見つけ、結合し、レプリカーゼを活性化して、対象とする、標識にそう配列をコピーする。もう一つの核酸増幅技術、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、対象配列の、二つの別々に標識された半分であって、サンプルの連続配列の存在下にリガーゼによって共有的に結合されて、新規標的を形成する半分同士を用いることによって作動する。修復連鎖反応（ＲＣＲ）核酸増幅技術は、二つの、相補的で、標的特異的オリゴヌクレオチドプローブ・ペア、熱安定ポリメラーゼとリガーゼ、および、標的配列を幾何学的に増幅するＤＮＡヌクレオチドを用いる。２塩基ギャップが、オリゴヌクレオチドプローブ・ペアを隔て、ＰＣＲは、正常のＤＮＡ修復を模倣して、このギャップを埋め、ギャップを接合する。鎖転移活性化（ＳＤＡ）による核酸増幅は、標的ＤＮＡに結合する５′末端に短いオーバーハングを有する、Ｈｉｎｃ  ＩＩの認識部位を含む短いプライマーを利用する。ＤＮＡポリメラーゼが、オーバーハングに対向するプライマーの一部に、イオウ含有アデニン類縁体を充填する。Ｈｉｎｃ  ＩＩが添加されるが、これは、未修飾のＤＮＡ鎖しか切断しない。５′エキソヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼが、ニック部位に進入し、最初のプライマー鎖を下流に向かって切り離し、新規プライマーを構築し、この新規プライマーがその後のプライマーとして作動する。ＳＤＡは、３７℃、２時間で１０７倍の増幅を実現する。ＰＣＲおよびＬＣＲと違って、ＳＤＡは、装置による温度サイクルを必要としない。本発明の方法において有用なもう一つの増幅システムは、ＱＢレプリカーゼシステムである。本発明ではＰＣＲが好ましい増幅法ではあるが、上記他の方法も、本発明の方法に記載される座位の増幅に使用することが可能である。
【００５７】
対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションによる、指定配列の変動を検出するには、従来技術で既知の、様々の方法を使用することが可能である。試験遺伝子は、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）によって探査し、かつ、各ＡＳＯが既知の突然変異配列を含んでいることが好ましい。ＡＳＯ分析は、特異的オリゴヌクレオチドプローブが、標的ポリヌクレオチド断片にハイブリダイズする能力を調べることによって、標的ポリヌクレオチド断片における特異的配列の変動を検出する。オリゴヌクレオチド配列は、突然変異配列（またはその相補配列）を含むことが好ましい。標的配列における配列変動の存在は、正常配列を含むオリゴヌクレオチドプローブが標的断片にハイブリダイズしない条件下において得られる、オリゴヌクレオチドプローブと標的断片との間のハイブリダイゼーションによって示される。配列変異（例えば、突然変異）オリゴヌクレオチドプローブと、標的ポリヌクレオチド断片との間にハイブリダイゼーションが欠如することは、標的断片に特異的配列変異（例えば、突然変異）が無いことを示す。好ましい実施態様では、試験サンプルを標準的ドットプロット方式で探査する。ＡＳＯに対応する配列を含む試験遺伝子内の各領域を、個別に固相表面に、例えば、膜における個別ドットとして投与する。各個別領域は、従来技術で既知の方法（例えば、Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．Ｂ．，１９８７、米国特許第４，６８３，２０２号に記載される実験的実施態様を参照されたい）を用い、別々のＰＣＲ増幅産物として生産される。
【００５８】
ＡＳＯ分析を実行するのに、ドットブロット方式に対する代替として使用が可能な膜依存方式としては、反転ドットブロット（多重増幅アッセイ）、および多重対立遺伝子特異的診断アッセイ（ＭＡＳＤＡ）が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【００５９】
反転ドットブロット方式では、既知の配列を持つオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、固相表面に固定され、次いで、標識された試験ポリヌクレオチドサンプルとハイブリダイズさせられる。この状況で、標識試験ポリヌクレオチドサンプルを準備するために、増幅前に、プライマー、またはＮＴＰが標識される。それとは別に、試験ポリヌクレオチドサンプルは、分離および／または合成後、標識してもよい。多重方式では、個別のサンプルは、単一の標的配列だけではなくて、試験遺伝子の中に多数の標的配列を含む。例えば、それぞれがＡＳＯ標的配列の内の少なくとも一つを含む、多数のＰＣＲ産物が、同じサンプルドット内に投与される。多数ＰＣＲ産物は、Ｃａｓｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，５８２，９８９号を用いる単一増幅反応において同時に生産することが可能である。従って、同じブロットを、その対応配列が、サンプルドットにおいて表される各ＡＳＯによって探査することが可能である。
【００６０】
ＭＡＳＤＡ方式は、各ブロット（多数標的配列を有するドットを含む）を探査するのに多数ＡＳＯを用いることによって多重方式の複雑性レベルを拡大させる。この実行過程は、Ａ．Ｐ．Ｓｈｕｂｅｒによる米国特許第５，５８９，３３０号、および、Ｍｉｃｈａｌｏｗｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５９（４）：Ａ２７２，ｐｏｓｔｅｒ  １５７３（１９９６年１０月）に詳細に記載される。これらの文書、それぞれ、その全体を、引用することにより本明細書に含める。先ず、多数ＡＳＯプローブと固定サンプルとの間のハイブリダイゼーションが検出される。この方法は、任意のドット中の多数の標的配列における突然変異体の存在は極めて稀であるから、何か陽性ハイブリダイゼーション信号が得られたとすれば、それは、対応する突然変異標的とハイブリダイズするプローブ混合物の中の単一ＡＳＯに由来するものであるとする予測に基づく。次に、このハイブリダイズＡＳＯが、ハイブダイゼーション部位からそれを分離し、そのヌクレオチド配列を決定することによって特定される。
【００６１】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブを設計する
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブは、任意の一組の条件下で標的配列と正確にハイブリダイズするように遺伝子工学的に加工された、短い、単一鎖ポリヌクレオチドである。通常、ＡＳＯプローブは、それぞれ、正常対立遺伝子、および配列変異と同一の配列を含むように設計される。標的に対するプローブのハイブリダイゼーションによって変異サンプルの決定が可能となる。厳格条件下では、単一塩基ペアほどの単純な変異を持つプローブでも、正常−変異２重鎖の不安定化作用により正常配列にハイブリダイズしない（Ｉｋｕｔａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：７９７−８１１（１９８７））。
【００６２】
ＡＳＯハイブリダイゼーションプローブは二つの基本的要求を満たさなければならない。（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｓｅｃｔｉｏｎ  ９．４，（１９９５））。先ず、同じプールで共に使用されるプローブは、ほぼ同じ長さを持たなければならない。プローブの標準的長さは、最適として１７塩基対であり、その範囲は、短い方は約１４、長い方は約２７であってもよい。突然変異体が長い挿入体を含む場合、より長いプローブが望ましい場合もある。第２に、不適合領域は、１７塩基対プローブの末端に置いてはならず、配列の真ん中、プローブの５′末端から約５−７塩基離れた位置に置かなければならない。さらに、不適合の設置は、比較的長いプローブの場合、末端ではなく、ポリヌクレオチド鎖の強力なハイブリダイゼーションおよび安定化を可能とする位置としなければならない。プローブの塩基組成における変動作用を抑えるために、ＡＳＯハイブリッドバッファーの場合（Ｓｈｕｂｅｒ，Ｔ．，米国特許第５，６３３，１３４号）のようにテトラメチルアンモニウムクロリドを使用する。ＡＳＯプローブは、ＤＮＡ合成機で合成すると好都合である。プローブは、当業者に馴染みの手段を用いて、同位元素、または非同位元素による検出剤によって標識することが可能である。本出願において略述される、プローブ製造および使用工程は、他の遺伝子配列に対しても応用可能である。
【００６３】
ドットブロット、反転ドットブロット、多重方式、およびＭＡＳＤＡ方式において使用が可能な好適な材料は、従来技術で既知であるが、ナイロン、およびニトロセルロース膜が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【００６４】
標的配列がＰＣＲ増幅によって生産される場合、開始材料は、染色体ＤＮＡであってもよい。その場合、そのＤＮＡが直接増幅される。それとは別に、開始材料はｍＲＮＡであってもよい。その場合、ｍＲＮＡは先ず逆転写されてｃＤＮＡとし、次に、これが、ＲＴ−ＰＣＲの既知の技術に従って増幅される（例えば、Ｇｅｌｆａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第５，５６１，０５８号を参照されたい）。
【００６５】
前述の方法は、少数の配列変動について中等度のスクリーニングをするのに好適である。しかしながら、高速で、コスト効率的で、大規模なスクリーニングのための分子技術における要求の下に、ＡＳＯの基本概念を統合する技術が開発されたが、突然変異体検出およびサンプル数の容量をはるかに上回る。前述の方法に代わるこれら別法としては、チップアレイ配列系技術が挙げられるが、ただしこれのみに限定されない。大規模アレイの使用は、沢山の配列変異の高速分析を可能とする。チップアレイの応用および開発に関する総覧が、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２：１１０−１１５（１９９６年３月）、およびＣｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，１：１８３−２００（１９９６年９月）によって提出されている。チップアレイの製造に関してはいくつかの方法が存在する。相違としては、固定オリゴヌクレオチドを付着させる固相支持体のタイプ、変異特定用標識技術、および、プローブに対する標的ポリヌクレオチドの配列関連技術における変化が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【００６６】
「ＤＮＡチップ」による大規模分析のための有望な方法論が、Ｈａｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４：４４１−４４７（１９９６）に詳細に記載される。なお、この文書の全体を引用することにより本明細書に含める。Ｈａｃｉａ等によって記載されるところでは、それぞれが２０ヌクレオチド長の、９６，０００超のオリゴヌクレオチドから成る高密度アレイが、光指示化学合成を用いて、単一のガラスまたはシリコンチップの上に固定される。オリゴヌクレオチドプローブの数と設計に応じて、配列の中の各塩基に対し変化の有無について尋問することが可能である。従って、チップに与えられたオリゴヌクレオチドは、集団においてこれまで見られたことがなかった配列変異をも含むことが可能であり、あるいは、集団の中で起こることが知られている突然変異のみに限定することも可能である。
【００６７】
チップ上に置かれたオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション前に、試験サンプルは、当業者にはよく知られた手段によって、分離され、増幅され、標識（例えば、蛍光マーカー）される。次に、試験サンプルは、固定されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせられる。固定プローブに対する、標的ポリヌクレオチドの配列系技術の強度を定量し、参照配列と比較する。得られた遺伝情報は、分子診断に使用することが可能である。
【００６８】
本発明のもう一つの実施態様では、癌の再発、または、肺癌の再発を見た被験体の基礎原因を診断するための方法であって、被験体の標的核酸配列を、該配列の増幅後、配列決定することを含む方法が提供される。ＥＧＦＲ遺伝子、またはその断片がクローンされ、次いで配列決定されて、突然変異の有無が判断される。この状況では、得られた配列を、天然の（野生型）ＥＧＦＲ遺伝子、またはその一部と比較すればよいだけである。
【００６９】
他のＤＮＡ配列決定法、例えば、Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｕｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３（１９７７）、またはＭａｘａｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５６０（１９７７）、または他の、従来技術で既知の方法を用いてもよい。
【００７０】
本発明の、もう一つの実施態様では、癌の再発を見た被験体から得たサンプルの標的核酸を、本発明の突然変異体の存在を検出し、突然変異体を検出する試薬に接触させることを含む方法を提供する。
【００７１】
もう一つの方法は、被験体から得たサンプルの標的核酸を、突然変異体の存在を検出し、突然変異体を検出する試薬に接触させることを含む。当業者には、いくつかのハイブリダイゼーション法がよく知られる。その多くは、本発明の実行に有用である。
【００７２】
本発明の方法に使用される材料は、診断キットの作製に理想的に好適である。そのようなキットは、それぞれ、本法で使用される独立要素の一つ以上を含む、瓶、チューブ等のような、１種以上の容器手段をしっかりと緊密に含む搬送手段を含んでもよい。例えば、容器手段の一つは、ＥＧＦＲ  ＤＮＡまたはその断片を増幅するための手段を含み、該手段は、被験体から得た前記標的ＤＮＡを増幅するために必要な、酵素（単複）およびオリゴヌクレオチドプライマーを含むようになっていてもよい。もう一つの容器は、突然変異体の有無を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブを含んでもよい。それとは別に、もう一つの容器は、突然変異配列は認識するが、野生型は認識しない、またはその逆の制限酵素を含んでもよい。
【００７３】
他の方法は、ＥＧＦＲタンパクのＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ形を特異的に検出するが、この突然変異体を含まないＥＦＧＲタンパクは検出しない抗体に、癌患者から得た癌組織サンプルを接触させることを含むことが可能である。それとは別に、癌患者の癌組織サンプルからタンパク抽出物を得て、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ突然変異体の有無について、この突然変異体の検出には特異的であるが、この突然変異体を含まないＥＧＦＲタンパクに対しては特異的ではない抗体を用いて、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、または、他のタンパク検出技術によって分析することが可能である。ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ突然変異を検出する抗体は、ハイブリドーマから得た抗体であってもよい。ハイブリドーマを作製するための典型的手順は下記の通りである。（ａ）マウスをある抗原で免疫化する；（ｂ）免疫化されたマウスから脾臓を摘出し、適当な媒体において脾臓縣濁液を作製する；（ｃ）縣濁脾臓細胞を、マウス骨髄細胞と融合する；（ｄ）未融合脾臓細胞、未融合骨髄細胞、および融合細胞から成る混合物を希釈し、未融合骨髄細胞または脾臓細胞の増殖を支持しない選択性媒体において培養する；（ｅ）ハイブリドーマを含む各容器の上清について、免疫原に対する抗体の存在に関して評価する；および、（ｆ）所望の抗体を生産するハイブリドーマを選択し、クローンする。一旦所望のハイブリドーマが選択、クローンされたならば、それからの抗体は、所望のハイブリドーマを適正な媒体中でインビトロ媒体することによって生産される。別法として、所望のハイブリドーマを直接マウスに注入し、抗体の濃縮量を得ることも可能である［Ｋｅｎｎｅｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ  ｎｅｗ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ］。げっ歯類脾臓細胞とげっ歯類骨髄細胞との融合によって生産されるハイブリドーマについては、文献中に、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，によって  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，５１１−５１９（１９７６）において；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．によってＮａｔｕｒｅ，２６６，５５０（１９７７）において；および、ＷａｌｓｈによってＮａｔｕｒｅ，２６６，５５０（１９７７）に；ＷａｌｓｈによってＮａｔｕｒｅ，２６６，４９５（１９７７）に記載される。本技術はまた、Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎによって、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｗｅｉｒ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌｏｎｄｏｎ），１９７９，ｐａｇｅｓ２５．１−２５．７、および、Ｋｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，上記によってやや詳細に記述されている。ハイブリドーマ技術によって生産される、ヒト腫瘍に対するモノクロナール抗体に関連する特許としては、米国特許第４，１８２，１２４および４，１９６，２６５号が挙げられる。癌細胞上の抗原に対して特異性を持つモノクロナール抗体に関する従来技術の代表的なものとして米国特許第４，３５０，６８３号がある。
【００７４】
ＥＧＦＲのチロシンキナーゼドメインにおける特異的突然変異体は、ゲフィチニブまたはエルロチニブに対する感受性と関連するが、この獲得耐性の機構についてはまだ報告されていない。他の疾患における、別のキナーゼ阻害剤イマチニブに関する類似の研究に基づき、ＮＳＣＬＣにおける薬剤耐性にＥＧＦＲのエキソン１９および２１突然変異体の関連が報告される前に、野生型ＥＧＦＲキナーゼドメインの位置７９０におけるトレオニンからメチオニンへの単一アミノ酸置換が、この薬剤耐性をもたらすことが予測された。Ｔｈｒ−７６６をメチオニンで置換する（ＡＣＧからＡＴＧ）ＣからＴへの転移は、インビトロにおいて、野生型ＥＧＦＲを背景として、ゲフィチニブ［２１］、および関連キナゾリン阻害剤、ＰＤ１５３０３５［２２］に対する耐性を付与することが示された。
【実施例】
【００７５】
（材料および方法）
組織の調達
パラフィンブロック、細針バイオプシー、および胸水を含む組織標本は、Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒのセンター内査察委員会によって承認されたプロトコールに従って得られた（プロトコール９２−０５５［７］およびプロトコール０４−１０３［プロトコール  Ｓ１］）。患者は全てインフォームドコンセントを提出した。
【００７６】
肺腫瘍におけるＥＧＦＲおよびＫＲＡＳの突然変異分析
腫瘍標本からゲノムＤＮＡを抽出し、ＥＧＦＲ（エキソン１８−２４）およびＫＲＡＳ２（エキソン２）分析のためのプライマーは既報の通りとした［３，７］。配列決定反応は全て、順行および逆行方向に行い、突然変異は全て、独立のＰＣＲ分離体から少なくとも２回確認した。
【００７７】
さらにエキソン２０突然変異（Ｔ７９０Ｍ）は、毛細管電気泳動装置（ＡＢＩ３１００  Ａｖａｎｔ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，カリフォルニア州、アメリカ合衆国）において、Ｔ７９０Ｍ突然変異（２３６９Ｃ→Ｔ）によって形成される新規ＮＩａＩＩＩ制限部位に基づく蛍光標識（ＦＡＭ）ＰＣＲ産物の長さ分析によって検出した。下記のプライマーを用いた。
【００７８】
ＥＧＦＲ  Ｅｘ２０Ｆ，５′−ＦＡＭ−ＣＴＣＣＣＴＣＣＡＧＧＡＡＧＣＣＴＡＣＧＴＴＧＡＴ−３′（配列番号４）、および、
ＥＧＦＲ  Ｅｘ２０Ｒ  ５′−ＴＴＴＧＣＧＡＴＣＴＧＣＡＣＡＣＡＣＣＡ−３′（配列番号５）。
較正のためにＮＳＣＬＣ細胞系統（Ｈ１９７５，Ｌ８５８Ｒ−およびＴ７９０Ｍ−陽性；Ｈ−２０３０，ＥＧＦＲ野生型）の連続混合希釈液を用いたところ、このアッセイでは、Ｈ１９７５  ＤＮＡが、試験される全体ＤＮＡの３％以上を含む時、Ｔ７９０Ｍ突然変異の存在が検出される。一方、直接の配列決定の感度は６％であった（データ示さず）。ただし、Ｈ１９７５細胞において、Ｔ７９０Ｍ突然変異を含む対立遺伝子は約２倍に増幅されている。
【００７９】
エキソンを含むＥＧＦＲ  ｃＤＮＡ断片を生成するために下記のプライマーを用いた。
【００８０】
ＥＧＦＲ２０９５Ｆ  ５′−ＣＣＣＡＡＣＣＡＡＧＣＴＣＴＣＴＴＧＡＧ−３′（配列番号６）、および、
ＥＧＦＲ２９４３Ｒ  ５′−ＡＴＧＡＣＡＡＧＧＴＡＧＣＧＣＴＧＧＧＧＧ−３′（配列番号７）
ＥＧＧＲ２０９５ＦおよびＥＧＦＲ２９４３Ｒによって標的とされる配列は、表１の下線をつけて示されたところである。ＰＣＲ産物は、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，カリフォルニア州、米国）を用い、メーカーの指示に従って連結され、プラスミドに挿入された。個々のクローンのＤＮＡの自動分注標本を、クローニングベクターのＴ７プライム部位を用いて配列決定した。
【００８１】
ＥＧＦＲ突然変異の機能分析
部位指向性突然変異クイック発生キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ，ラホヤ、カリフォルニア州、米国）を用い、野生型およびＥＧＦＲ突然変異の全長ｃＤＮＡの中に突然変異を導入し、既述のように発現ベクターにクローンした［３］。欠失（ｄｅｌ）Ｌ７４７−Ｅ７４９；Ａ７５０Ｐ突然変異を生成するために下記のプライマーを用いた。
【００８２】
順行  ５′−ＴＡＡＡＡＴＴＣＣＣＧＴＣＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＡＧＣＣＡＡＣＡＴＣＴＣＣＧＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧ−３′（配列番号８）、および、
逆行  ５′−ＣＣＴＴＧＴＴＧＧＣＴＴＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＴＧＧＣＴＣＣＴＴＧＡＴＡＧＣＧＡＣＧＧＧＡＡＴＴＴＴＡ−３′（配列番号９）
Ｔ７９０Ｍ突然変異を導入するために下記のプライマーを用いた。
【００８３】
順行  ５′−ＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴ−３′（配列番号１０）、および、
逆行  ５′−ＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＡＴＧＡＧＣＴ−３′（配列番号１１）
Ｌ８５８Ｒ突然変異ｃＤＮＡは前もって作製しておいた［３］。突然変異クローンは全て、さらに余分の突然変異が導入されていないことを確かめるために、再度、両方向から完全に配列決定した。各種ＥＧＦＲは、既報［３］通りに、２９３Ｔヒト胎生腎臓細胞において一過性に発現させた。細胞を、様々の濃度のゲフィチニブまたはエルロチニブによって処理した。
【００８４】
免疫ブロット法
細胞溶解、イムノブロッティング、および抗体試薬に関する詳細については、［３］の中の、方法および補足的方法を参照されたい。
【００８５】
細胞培養
ＮＳＣＬＣ細胞系統Ｈ１６５０、Ｈ１９７５、Ｈ２０３０、Ｈ２３４７、Ｈ２４４４、Ｈ３５８、およびＨ１７３４は、米国基準菌株保存機関（Ｍａｎａｓｓａｓ，バージニア州、米国）から購入した。Ｈ３２５５は、Ｂ．ＪｏｈｎｓｏｎおよびＰ．Ｊａｎｅの寄贈によるものである。細胞は、１０％ウシ胎児血清、１０単位／ｍｌのペニシリン、および１０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加した、完全培養液（ＲＰＭＩ−１６４０、米国基準菌株保存機関カタログ番号３０−２００１）において３７℃で５％ＣＯ２下に培養した。生存率実験では、完全培養液で培養した細胞を、黒色９６ウェル底部透明ＶｉｅｗＰｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，マサチューセッツ州、米国）に、ウェル当たり５，０００個細胞（Ｈ１９７５およびＨ２０３０）、または７，５００個（Ｈ３２５５）の密度で撒いた。一晩のインキュベーション後、細胞を、０．１％血清添加ＲＰＭＩ−１６４０培養液で２４時間培養した。次に、細胞（０．１％血清を含む補充ＲＰＭＩ−１６４０培養液）を、ゲフィチニブまたはエルロチニブの連続共存下４８時間インキュベートした。
【００８６】
生存率アッセイ
細胞生存率は、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ（Ｃａｌｃｅｉｎのアセトキシメチルエステル、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，オレゴン州、米国）を用いて定量した。ゲフィチニブまたはエルロチニブと一緒にインキュベーションした後、単層をＰＢＳ（カルシウムとマグネシウムを含む）で２度洗浄し、補充ＲＰＭＩ−１６４（血清無し）において７．５μｍｏｌのＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭと３０分インキュベートした。標識媒体を除去し、細胞を３度ＰＢＳで洗浄した。直後に、Ｃａｌｃｅｉｎ蛍光（４８５ｎｍ励起；５３５ｎＭ発射）を、Ｖｉｃｔｏｒ  Ｖ多数標識プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて検出した。各細胞系統について３回の独立実験を行った。各実験は、条件当たり４から８回の複製を含んでいた。
【００８７】
抗ＥＧＦＲ突然変異モノクロナールおよびポリクロナール抗体の産生
１群３匹から成る雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，マサチューセッツ州）に、１００ｕｌのＤｅｔｏｘアジュバント（ＲＩＢＩ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓ  Ｉｎｃ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ミズーリ州）に溶解した、Ｔ７９０Ｍ突然変異を含む、精製された短縮型ＥＧＦＲタンパクまたはその断片を５ｕｇ／用量で、０、３、７、１０、および１４日目に腹腔注入した。１７日目に動物を屠殺し、その脾臓を取り出し、既定の手順（米国特許第５，９３９，２６９および５，６５８，７９１号を参照、なお、これらの特許文書を引用することにより本明細書に含める）に従って、５０％ポリエチレングリコール４０００を用いて、リンパ球をマウス骨髄細胞系統６５３と融合させた。融合細胞を、９６ウェルのマイクロタイタープレートに、ウェル当たり２×１０５細胞の密度で撒き、次いで、融合後１日目にＨＡＴ選択を行った。次に、固定されたハイブリドーマ培養体の上清を、ビオチニル化ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ突然変異と反応させた。抗ＥＧＦＲ抗体に関して陽性のウェルを、その後の実験のためにさらに拡充しておいた。拡充してもこれらの培養体は安定であり、細胞系統は冷凍保存した。親培養体は各異性体に分け、次に、それらの、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ突然変異を捕捉し、特異的に認識する能力について定量した。
【００８８】
別法として、精製した突然変異タンパクペプチドに対して、ウサギポリクロナール抗血清を作った。ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ突然変異に対するポリクロナール抗体は、前記ペプチドを、０．０５％グルタルアルデヒドと共にフロイントの完全アジュバントに乳化させたキーホールリンペット・ヘモシアニンに結合させ、数箇所の皮下に注入することによって得た。フロイントの不完全アジュバントに乳化させた結合ペプチドによって４および７週後に追加免疫し、最後の注入の１０日後に瀉血した。
【００８９】
前述の手順に従って調製された抗体を、従来技術、例えば、米国特許第５，６０１，９８９、５，５６３，２４７、５，６１０，２７６、および５，４０５，９４１号で既知の標準的手順に従って、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ突然変異の発現および／または治療可能性に関して、腫瘍細胞を特定および／または診断（すなわち、癌組織の超薄切切片）するために使用する。なお、前記特許文書を、参照を通じて本明細書に含める。ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ突然変異の発現の監視にもこの同じ抗体を用いた。
【００９０】
（実施例１）
ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ突然変異の存在を確認するために、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドＰＣＲアッセイ（Ｇｕｏ，Ｚ．，Ｌｉｕ，Ｑ．＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｍ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｂｙ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５，３３１−３３５（１９９７））を、３′末端および３−ニトロピロール残基を含む、一塩基ミスマッチＰＣＲプライマーを用いて突然変異対立遺伝子を増幅することによって実行する。ＰＣＲ産物を、下記の３′突然変異対立遺伝子特異的プライマーによって形成する。
【００９１】
（５′ＣＡＣＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴ３′（配列番号１２）
または、
５′ＣＧＡＡＧＧＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＧ３′（配列番号１３））
は、３′末端において突然変異塩基に対する相補体を、３′末端の上流に３−ニトロピロール残基を含む。この突然変異対立遺伝子特異的プライマーは、凍結またはパラフィン包埋腫瘍から得られた突然変異ＤＮＡを増幅することはできるが、正常ＤＮＡの産物を増幅することはできない。同時に、野生型（ＷＴ）３′プライマー
（５′ＣＡＣＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＡＣ３′（配列番号１４）
または、
５′ＣＧＡＡＧＧＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡ３′（配列番号１５）
は、正常な野生型ＤＮＡのみは増幅するが、突然変異ＤＮＡは増幅できない。これらの実験から、腫瘍サンプルでは突然変異対立遺伝子が増幅されるが、一方、正常な隣接組織では対立遺伝子は増幅されないことが示された。
【００９２】
（実施例２  ＥＧＴＲ  Ｔ７９０Ｍ突然変異のクローン起源）
任意のサンプルにおける腫瘍細胞の相対的パーセンテージを上げる試みとして、腫瘍の、注意深いマイクロディセクションを行ったところ、Ｔ：Ｃ対立遺伝子の比は比例的に増加する。実施例１に記載したプライマーの一方、および、反対方向に増幅するもう一つのプライマーを用いてＰＣＲを実行し、その存在を求めるのが変異型であれ野生型であれ、ＥＧＦＲ配列に関して簡単に検出可能な断片が得られた。このようなプライマーの配列は、当業者によって簡単に設計することが可能である。この工程の結果から、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ突然変異は、クローン起源であることが証明された。
【００９３】
（実施例３  ゲノムＤＮＡにおけるＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍの存在に関するアッセイ）
ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ突然変異の検出用として、突然変異コドンにおける制限部位の有無を認識するために制限酵素ＮｌａＩＩＩが用いられる方法が提供される。この実施例では、エキソン２０のイントロン−エキソン境界に跨るプライマーを用いるアッセイが提供される。この蛍光による検出は、特異的ミスセンス突然変異によって生成される、ＰＣＲ制限断片長多型（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）を利用する。ヌクレオチド２３６９に跨る、エキソン２０特異的プライマーＥＧＦＲ  Ｅｘ２０Ｆ（配列番号４）およびＥＧＦＲ  Ｅｘ２０Ｒ（配列番号５）（表４の下線部分）を用いてＰＣＲ増幅を実行する。表４は、表３（配列番号３）に示す配列において、位置１６１９０４から１６２９７０までの比較的長いイントロン−エキソン２０−イントロンゲノム配列の一部を含む。エキソン２０の上流のイントロンの３′末端をゴシック体で示す。
【００９４】
【化４】
2008529532.tif 000006
野生型配列は、特異的ＮｌａＩＩＩ部位を含み、そのため、消化されると、１０６ｂｐの産物を生成する（方法、図３Ａ参照）。突然変異Ｔ２３６９ヌクレオチドの存在は、新規ＮｌａＩＩＩ制限消化部位を創成し、やや短い産物を生成する（９６ｂｐ、図３Ａ）。これは、蛍光毛細管電気泳動によって簡単に検出される。この試験は、直接の配列決定よりも約２倍感度が高い。この標識断片長アッセイでは、２３６９対立遺伝子の一方（野生型または突然変異）を切断するが、他方は切断しないものであれば、いずれの等価的手段であっても有用であると考えられる。このアッセイは、任意の既知の方法に適用が可能であるが、得られた断片が検出可能となるように、ＰＣＲアンプリコンに標識を組み込むことを要求する。
【００９５】
（実施例４  症例報告）
その病気が、ゲフィチニブまたはエルロチニブの治療中に進行した、６名の個人の３人において二次的ＥＧＦＲ突然変異を特定した（表５）。これら３名の患者の簡単な既往歴を下記に掲げる。
【００９６】
患者１
この６３歳の女性「禁煙家」（彼女の生涯で吸った煙草は１００本未満）は、最初、胸郭両側の瀰漫性陰影、および右側胸水を提示した。経気管支バイオプシーによって腺癌が明らかにされた。２サイクルの全身化学療法の最中に病気は進行し、その後、毎日２５０ｍｇのゲフィチニブを始めた。ゲフィチニブ開始前に得られた胸部Ｘ線（図４Ａ，左パネル）と２週間後（図４Ａ、中央パネル）のものを比較すると、著明な改善が認められた。９ヶ月後、胸部Ｘ線によって病気の進行が明らかにされた（図４Ａ、右パネル）。その後、患者に、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）の下で右肺基部の領域においてバイオプシーを行った（５Ａ、左パネル）。化学療法と組み合わせて、または毎日５００ｍｇ投与のいずれかを用いた、ゲフィチニブによる連続治療にも拘わらず、ゲフィチニブ治療開始後１２ヶ月で胸水滲出が再発した（図５Ａ、右パネル）。分子分析のために胸水を入手した。合計すると、この患者から、分析のために３個の腫瘍標本が得られた。最初の肺腫瘍バイオプシー、進行性肺病巣のバイオプシー、および胸水である。しかしながら、最初の経気管支バイオプシーを再検査したところ、標本は僅かな腫瘍細胞しか有しないことが判明した（表５）。
【００９７】
患者２
毎年９箱という喫煙歴を持つこの５５歳の婦人は、局所的侵襲を持つ気管支・肺胞癌のために、２年間に２回の摘出手術（右下葉および左上葉摘出術）を受けた。２年後、彼女の病気は、両側肺小結節を伴って再発し、全身化学治療中にもさらに進行した。その後、患者に毎日１５０ｍｇのエルロチニブを始めた。胸部の基礎的ＣＴにおいて、両側に無数の結節が認められた（図４Ｂ、左パネル）。これらの結節は、治療後４ヶ月でその数およびサイズが著明に減少した（図４Ｂ、中央パネル）。治療１４ヶ月後、疲弊のため、患者のエルロチニブ用量を毎日１００ｍｇに減らした。エルロチニブによる治療の２３ヶ月目に、ＣＴスキャンを撮ったところ、胸椎に、拡大しつつある硬化病巣が認められた。この病巣について、ＣＴ誘導バイオプシーを行い（図５Ｂ，左パネル）、エルロチニブ用量を毎日１５０ｍｇに増した。治療２５ヶ月後、病気は肺内で進行した（図４Ｂ、右パネル）。エルロチニブを中断し、肺の進行性病巣部位においてＸ線透視誘導コアニードルバイオプシーを行った（図５Ｂ、右パネル）。合計すると、この患者から、分析のために３個の腫瘍標本が得られた。最初の、切除された肺腫瘍、拡大する脊椎病巣のバイオプシー、および進行性肺腫瘍のバイオプシーである（表５）。
【００９８】
患者３
この５５歳の女性「禁煙家」は、その左下葉、胸膜、および縦隔リンパ節を侵す、気管支・肺胞癌の特徴を持つ腺癌のため、ほぼ４．５年間、週に１度パクリタキセルおよびトラスツズマブ［１７］による治療を受けた。治療は疲弊により中断された。その後、患者は摘出手術を受けた。多数の縦隔リンパ結節の転移的侵襲、およびゲフィチニブに対する反応を予測させる、当時知られた臨床的特徴（女性、禁煙家、気管支・肺胞変異組織学的所見）のため、彼女に対して、１ヵ月後、「補足的」ゲフィチニブ投与を行った（図４Ｃ、左パネル）。この薬剤は、彼女が新たに左側に悪性の胸水滲出を発症した３ヶ月後に中断した。ドレーン排出および全身化学療法にも拘わらず、胸水滲出は４ヶ月後再発し（図４Ｃ、右パネル）、その時点で分析のために胸水を採取した。合計すると、この患者から、分析のために２個の腫瘍標本が得られた。摘出手術によって得られた腫瘍、および胸水である（表５）。
【００９９】
【化５】
2008529532.tif 000007
（実施例５  患者の腫瘍は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性と関連するＥＧＦＲチロシンキナーゼドメイン突然変異を含む）
我々は、実施例１に記載の３名の患者から得た利用可能な腫瘍サンプル全てについて、前述の薬剤感受性ＥＧＦＲ突然変異に関して、エキソン１９および２１を直接ＤＮＡ配列決定する［３］ことによってスクリーニングした。患者１からの腫瘍サンプルは、ヌクレオチド２５７３においてＴ→Ｇ変化を示し、薬剤反応性腫瘍に一般的に観察されるエキソン２１のＬ８５８Ｒアミノ酸置換をもたらした。この突然変異は、進行性肺病巣（図６Ａ、上方パネル；表５）、および胸水浸出液の細胞（図６Ａ，下方パネル；表５）から得られたバイオプシー試料の中に存在していた。この試料のいずれも、細胞病理学的検査をしたところ、大部分腫瘍細胞から成っていた（表５）。興味あることに、トレースの比較から、突然変異対立遺伝子のコピー数の増加が起こったことが示唆されたことである。具体的に言うと、位置２５７３における、野生型（ヌクレオチドＴ）ピークの、突然変異（ヌクレオチドＧ）ピークに対する比は、肺バイオプシー標本（図６Ａ、上方パネル）では約１：１または１：２であるのに対し、胸水細胞は、突然変異Ｇピークが優勢であることを示した（図６Ａ、下方パネル）。これと一致して、ヌクレオチド２３６１に認められた一塩基多型（ＳＮＰ）（ＡまたはＧ）も、Ａ：Ｇの比に対応的変化を示した。すなわち、経気管支バイオプシーでは１：１比であったものが、胸水ではほぼ５：１比となった（図７Ａ）。注目すべきことに、我々は、最初の経気管支バイオプシー標本では２５７３Ｔ→Ｇ突然変異を検出しなかった（表５、データ示さず）。前述したように、この後者の標本は僅かな腫瘍細胞しか含まず、恐らく、直接配列決定によってＥＧＦＲ突然変異を検出するのに必要なレベルよりもさらに低い数であろうと思われた（［７］参照）。
【０１００】
最初の肺腫瘍および、骨および肺から得た２個の転移サンプルを含む、患者２の３個の標本は全て、１１ヌクレオチド（２２３８−２２４８）の排除、および２個のヌクレオチドＧおよびＣの挿入を含むエキソン１９の欠失を示した（図６Ｂ、全パネル；表５）。これらのヌクレオチド変化は、アミノ酸Ｌ７４７−Ｅ７４９を欠失させ、アミノ酸７５０をアラニンからプロリン（Ａ７５０Ｐ）へと変えた。ｄｅｌ  Ｌ７４７−Ｅ７４９；Ａ７５０Ｐ突然変異は、異なる様々なヌクレオチド変化を伴ってではあるが、以前にも報告された［２］。患者２の全てのサンプルにおいて、野生型配列は、約３：１の比で突然変異配列を上回っていた。
【０１０１】
患者３からの利用可能サンプルの両方とも、エキソン１９において１５ヌクレオチド（２２３６−２２５０）の欠失を含んでおり（表５；データ示さず）、これは、５個のアミノ酸（ｄｅｌ  Ｅ７４６−Ａ７５０）の除去をもたらした。この特異的欠失は既に報告されている［３］。突然変異ピーク対野生型ピークの比は、両標本において約１：１であった（データ示さず）。
【０１０２】
以上まとめると、これらの結果は、３名の患者の腫瘍は全て、チロシンキナーゼ阻害剤ゲフィチニブおよびエルロチニブに対する感受性と関連するＥＧＦＲ突然変異を含むことを示す。さらに、これらのデータは、個々の患者内において、脊椎、肺、および胸水に対する転移病巣または再発病巣も同じ突然変異を含むことを示す。この後の方の所見は、個人における再発および転移腫瘍細胞は、元々の先祖クローンに由来するとする考えを支持する。
【０１０３】
（実施例６  ゲフィチニブまたはエルロチニブの治療中に進行した病巣において、ＥＧＦＲキナーゼドメインに二次ミスセンス突然変異が検出された）
これらの患者において、ＥＧＦＲキナーゼドメインにおけるさらに別の突然変異が病気の進行に関連するのかどうかを決定するために、我々は、手元の腫瘍標本のＥＧＦＲ触媒領域をコードするエキソン（１８から２４まで）全てについて直接的配列決定を行った。
【０１０４】
腫瘍細胞を僅かしか含んでいない、患者１のゲフィチニブ治療前標本を分析したところ、当然のことながら野生型ＥＧＦＲ配列しか認められなかった（表５、データ図示せず）。しかしながら、ゲフィチニブ治療中の病気進行後に得られた、この患者の肺バイオプシー標本について順方向および逆方向におけるエキソン２０配列クロマトグラムを注意深く分析したところ、ヌクレオチド２３６９において、Ｃ→Ｔ突然変異を示唆する新たな小型ピークが明らかにされた（図７Ａ、上方パネル；表５）。このヌクレオチド変化は、位置７９０においてトレオニンの代わりとしてメチオニンの置換のもたらす（Ｔ７９０Ｍ）。この２３６９Ｃ→Ｔ突然変異は、ゲフィチニブ治療時にさらに病気が進行した後に得られた患者の胸水細胞ではさらに顕著なものとなった（図７Ａ，下方パネル；表５）。肺標本および胸水の分析から得られた、突然変異ピークの、野生型ピークに対する比の増加は、ヌクレオチド２５７３における突然変異Ｇピーク（Ｌ８５８Ｒをもたらす）の、野生型ピークに対する比の増加（上記参照；図６Ａ）と平行するのみならず、位置２３６１におけるＡ：Ｇ  ＳＮＰの比の増加（図７Ａ）とも平行した。これらの所見は、エキソン２０  Ｔ７９０Ｍ突然変異は、エキソン２１  Ｌ８５８Ｒ突然変異と同じ対立遺伝子の上に載っていること、および、これらの突然変異を抱える細胞のサブクローンが、薬剤治療中に出現することを意味する。
【０１０５】
患者２では、エルロチニブによる治療前に得られた腫瘍頻発サンプルは、ＥＧＦＲチロシンキナーゼドメインをコードするエキソンにおいて新たな突然変異を全く含んでいなかった（図７Ｂ、上方パネル；表５）。一方、患者の進行性骨および肺病巣は、ヌクレオチド２３６９において新たな小型ピークを含んでいた。これは、患者１で観察されたものと同じＣ→Ｔ突然変異を持つ腫瘍細胞サブクローンの存在を示唆する（図７Ｂ、中央および下方パネル；表５）。この後の二つのサンプルで見られる２３６９Ｔ突然変異の相対的大きさは、エキソン１９欠失の対応ピークの相対的大きさと相関するように見えた（図６Ｂ）。興味あることに、ヌクレオチド２３６１におけるＳＮＰ（ＡまたはＧ）は、患者２の標本において、エルロチニブ治療前には検出されたが、治療後には検出されなかった。これは、一方のＥＧＦＲ対立遺伝子が、治療の進行中に、増幅または欠失を経過したことを示唆する（図６Ｂ）。
【０１０６】
患者３は、患者２と類似の結果を示した。腫瘍頻発の治療前標本は、ｄｅｌ  Ｅ７４６−Ａ４５０エキソン１９欠失以外のＥＧＦＲ突然変異を示さなかった。具体的に言うと、エキソン２０では、二次変化は全く検出されなかった（図７Ｃ，上方パネル；表５）。ゲフィチニブ治療後に発症した胸水滲出液の細胞のＤＮＡを分析したところ、エキソン２０のヌクレオチド２３６９においてＣ→Ｔ突然変異が明らかにされた（図７Ｃ，下方パネル；表５）。これは、前述のＴ７９０Ｍ突然変異に対応する。位置２３６１のＡ：Ｇ  ＳＮＰの比において、この二つのサンプルの間に目覚しい変化は無かった。突然変異２３６９Ｔピークは小さかった。これは恐らく、この患者では、ゲフィチニブが、４ヶ月で、すなわち胸水腫瘍細胞が採取された時点で中断されたため、Ｔ７９０Ｍ突然変異を抱える細胞に対し選択的優位性が付与されなかったためであろう。
【０１０７】
２３６９Ｃ→Ｔ突然変異が、従来見過ごされていて、ＮＳＣＬＣでこの度見出されたＥＧＦＲ突然変異かどうかを決めるために、我々は、全て、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤による治療前に患者から摘出した、９６種の新鮮凍結腫瘍摘出標本［３］、および５９種のパラフィン包埋腫瘍標本［７］の分析から得られた、エキソン２０の配列トレースを再検査した。我々は、これら１５５個の腫瘍においてＴ７９０Ｍ突然変異の兆候を全く検出しなかった（データ示さず）。以上まとめると、我々の結果は、Ｔ７９０Ｍ突然変異は、ゲフィチニブまたはエルロチニブによる治療中に進行する病巣と相関することを示唆する。さらに、少なくとも患者１および２では、この突然変異を帯びる腫瘍細胞のサブクローンが、チロシンキナーゼ阻害剤による治療開始時点と、薬剤耐性の出現の間において現れるものと考えられる。
【０１０８】
さらに、前述のＴ７９０Ｍ突然変異を有する３名の患者についてさらに詳細に特徴解明を行った後、別の４名の患者が、イレッサまたはタルセバに対して耐性を発達させた後、Ｔ７９０Ｍ突然変異を有することが判明した。これら４名は、治療に対し最初は反応したが、その後再発した、合計１３名の患者に含まれる。表６は結果を要約する（表は、治療に全く反応せず、その後Ｔ７９０Ｍを有することが判明した患者のデータを含まない）。
【０１０９】
【化６】
2008529532.tif 000008
肺腺癌患者で、ゲフィチニブまたはエルロチニブによる治療で改善したが、その後進行した７名の患者（その症例報告は本明細書では提示されない）において、我々は、病気進行時に得られた腫瘍標本のＤＮＡを調べた。７名全ての患者において、我々は、薬剤感受性に関連するＥＧＦＲ突然変異（全てエキソン１９の欠失）を認めた。しかしながら、ＥＧＦＲのエキソン１８から２４において、位置２３６９におけるＣ→Ｔ変化を含め、さらに別の突然変異はまったく認められなかった（データ示さず）。これらの結果は、獲得薬剤耐性に関しては、さらに別の機構が存在することを意味する。
【０１１０】
（実施例７  患者の進行性腫瘍は、ＫＲＡＳ突然変異を欠く）
ＮＳＣＬＣの約４分の１において、ＫＲＡＳ２のエキソン２に突然変異が出現する。このような突然変異は、仮にあったとしても、ＥＦＧＲ突然変異に相伴うことはめったになく、ゲフィチニブまたはエルロチニブに対する一次耐性と関連する［７］。ＫＲＡＳの二次突然変異が、これらの薬剤に対する獲得耐性を付与するかもしれない可能性を評価するために、我々は、患者１から３を始めとして、Ｔ７９０Ｍ突然変異の兆候を欠く３名の新たな患者についても、その腫瘍標本のＫＲＡＳ２エキソン２について突然変異プロファイリングを実施した。これらの標本のいずれも、ＫＲＡＳにおいて全く変化を含まなかった（表５；および、データ示さず）。これは、これらの６名の患者において、ＫＲＡＳ突然変異は、薬剤耐性および腫瘍進行には関与しないことを示す。
【０１１１】
（実施例８  ＮＳＣＬＣ恒久細胞系統も、Ｔ７９０ＭとＬ８５８Ｒの両突然変異を含む）
我々は、８種のＮＳＣＬＣ恒久細胞系統において、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ（エキソン１８から２４）およびＫＲＡＳエキソン２のプロファイリングを行った（表７）。驚くべきことに、一つの細胞系統−Ｈ１９７５−は、位置２３６９において、前述のものと同じＣ→Ｔ突然変異（Ｔ７９０Ｍ）を含んでいた（図７Ｄ、下方パネル）。この細胞系統は、以前に、他の人々によって、エキソン２１に２５７３Ｔ→Ｇ突然変異（Ｌ８５８Ｒ）を含むことが示されており［１８］、それを我々も確認した（図７Ｄ、上方パネル）。さらに、Ｈ１９７５は、野生型ＥＧＦＲを帯びる他の肺癌細胞系統よりも、ゲフィチニブ抑制に対してより高い感受性を持つことが報告されている［１８］。この報告された実験では、エキソン１９および２１しか調べなかったようである。
【０１１２】
【化７】
2008529532.tif 000009
Ｈ１９７５の我々自身の分析（エキソン１８から２４）では、Ｔ７９０Ｍアミノ酸置換をもたらす突然変異２３６９Ｔピークが優勢であった。これは、野生型対立遺伝子と比較した場合の、突然変異対立遺伝子のコピー数の増加をしめす。突然変異ピークの、野生型ピークに対する比は、突然変異２５７３Ｇ（Ｌ８５８Ｒアミノ酸置換に対応）の、野生型ピークに対する比と同様であった（図７Ｄ、全パネル）。これは、Ｔ７９０ＭおよびＬ８５８Ｒ突然変異は、同じ増幅対立遺伝子の中に存在することを意味する。この可能性をさらに調べるために、我々は、ＲＴ−ＰＣＲを実行し、ＥＧＦＲのエキソン２０に跨り、エキソン１９から２１の配列を含むｃＤＮＡを生成した。次に、ＰＣＲ産物をクローンし、個別のコロニーについてＥＧＦＲ突然変異の有無について分析した。４個のクローンの４個のｃＤＮＡの配列クロマトグラムにおいて、２３６９Ｃ→Ｔ突然変異および２５７３Ｔ→Ｇ突然変異の両突然変異が認められた。これは、両突然変異が、同じ対立遺伝子に含まれることを裏付ける（データ示さず）。
【０１１３】
他のＮＳＣＬＣ細胞系統も、ＥＦＧＲまたはＫＲＡＳ突然変異のどちらかを帯びていたが、いずれも両方は持っていなかった（表７）。報告の通り、Ｈ３２５５は、Ｌ８５８Ｒ突然変異を含んでおり［１９］、Ｈ１６５０は、エキソン１９の欠失を含んでいた［１８］。他の分析細胞系統はいずれも、ＥＧＦＲチロシンキナーゼドメインをコードするエキソンにおいてさらに別の突然変異を含んではいなかった。
【０１１４】
（実施例９  新規ＰＣＲ制限断片長多型アッセイは、Ｔ７９０Ｍ突然変異の有無を独立に確認する）
前述のように、エキソン２０におけるＴ７９０Ｍ突然変異を示唆する突然変異ピークは、ある配列クロマトグラムでは小さかった。これらのピークが背景「ノイズ」によるものであるという可能性を排除するために、我々は、独立試験を開発することによって、特異的サンプルにおける２３６９Ｃ→Ｔ突然変異の存在を確認することを追求した。試験は、特異的ミスセンス突然変異によって生成されるＰＣＲ制限断片長多型（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）を利用する蛍光検出アッセイに基づく。ヌクレオチド２３６９に跨るエキソン２０特異的プライマーによるＰＣＲ増幅の後、野生型配列は、特異的ＮｌａＩＩＩ部位を含む。これは、消化されると、１０６−ｂｐ産物を生成する（方法；図３Ａ参照）。突然変異２３６９Ｔヌクレオチドの存在は、新たにＮｌａＩＩＩ制限消化部位を形成するので、やや短い産物（９７ｂｐ）を生産する。これは、蛍光毛細管電気泳動によって簡単に検出される。この試験は、直接配列決定法よりも約２倍感受性が高い（方法参照；データ示さず）。
【０１１５】
我々は、ＰＣＲ−ＲＦＬＰアッセイの特異性を確かめるために、先ずＨ１９７５細胞系統（これはＴ７９０ＭおよびＬ８５８Ｒの両突然変異を含む）のＤＮＡを用いた。予想通り、これらの細胞を分析することにより、９７−および１０６ｂｐ−の両断片が得られた。一方、Ｈ２０３０（これは野生型ＥＧＦＲを含む；表７）の分析は、１０６−ｂｐ断片のみを示した（図３Ａ）。これらのデータは、本試験が、ＤＮＡサンプルにおいて突然変異対立遺伝子の有無を簡単に示すことが可能であることを示す。しかしながら、この試験は半定量的なものであるにすぎない。なぜなら、突然変異９７−ｂｐ産物対野生型１０６−ｂｐ産物の比は、独立実験において約１：１から２：１まで変動するからである。
【０１１６】
我々は次に、Ｔ７９０Ｍアミノ酸置換に対応する、２３６９Ｃ→Ｔ特異的突然変異の有無について各種患者サンプルを評価するためにこのＰＣＲ−ＲＦＬＰを用いた。患者１における進行性骨および肺病巣のＤＮＡは、９７−および１０６−ｂｐの両断片を生産したが、元の腫瘍は生産しなかった（図３Ｂ）．突然変異産物の、野生型産物に対する比は、胸水由来細胞において比較的高く、これは、エキソン２０の直接配列決定で得られたクロマトグラムで見られたピークが比較的高いことと一致する（図７Ａ参照）。同様に、患者２および３の進行性病巣から得られたＤＮＡは、ＰＣＲ−ＲＦＬＰアッセイにおいて９７−および１０６−ｂｐ断片を生成したが（図３Ｂ）、一方、治療前標本は、９７−ｂｐ産物を生成しなかった。以上まとめると、独立アッセイから得られたこれらのデータからも、Ｔ７９０Ｍ突然変異は、３名全ての患者の進行性病巣に存在することが確認された。我々はさらに、直接配列決定によってＥＧＦＲエキソン１８から２４において二次突然変異を証明することができなかった、別の３名の患者において、そのいずれの標本においてもＴ７９０Ｍ突然変異を検出することができなかった（データ示さず）。
【０１１７】
（実施例１０．ＥＧＦＲ突然変異の生化学的性質）
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性と関連する突然変異を既に含むＥＧＦＲタンパクに対し、Ｔ７９０Ｍ突然変異がどのような影響を及ぼすかを定めるために、我々は、それぞれ、患者１および２に認められたエキソン２１および１９の突然変異をコードする特異的突然変異を、ＥＧＦＲ  ｃＤＮＡに導入した。対応するタンパク（［ｉ］Ｌ８５８Ｒ、およびＬ８５８ＲプラスＴ７９０Ｍ、［ｉｉ］ｄｅｌ  Ｌ７４７−Ｅ７４９；Ａ７５０Ｐおよびｄｅｌ  Ｌ７４７−Ｅ７４９；Ａ７５０ＰプラスＴ７９０Ｍ、および［ｉｉｉ］野生型ＥＧＦＲ、および野生型ＥＧＦＲプラスＴ７９０Ｍ）を、発現ベクターによる一過性トランスフェクションを通じて、内因性ＥＧＦＲレベルが極めて低い２９３Ｔ細胞において生産した［３］。血清無添加で、あらかじめゲフィチニブまたはエルロチニブで処理した各種細胞から得られた溶解物をイムノブロッティングによって分析した。抗ＥＧＦＲモノクロナール抗体を用い、ＥＧＦＲ総量（ｔ−ＥＧＦＲ）を定量した。サンプル当たりのタンパクの相対量のインディケータとしてアクチンを用いた。代行アッセイにおいて各種ＥＧＦＲキナーゼの薬剤感受性を評価するために、我々は、ｔ−ＥＧＦＲタンパクレベルに対する、ＥＧＦＲ上の「自己リン酸化」Ｔｙｒ−１０９２の相対レベルを測定する、Ｙ１０９２−フォスフェート特異的抗体（すなわち、リン酸−ＥＧＦＲ［ｐ−ＥＧＦＲ］）を用いた。我々はまた、一般的抗フォスフォチロシン試薬（ＲＣ−２０）を用いて、細胞タンパクの誘発されたチロシンリン酸化の総合パターンおよびレベルを評価した。
【０１１８】
ゲフィチニブは、チロシンリン酸化タンパクの低下（図８Ａ）、および、ｐ−ＥＧＦＲ：ｔ−ＥＧＦＲ比の減少（図８Ｂ）によって示されるように、薬剤濃度の増大と共に漸増的に野生型およびＬ８５８Ｒ  ＥＧＦＲの活性を抑制した。一方、野生型、および、Ｔ７９０Ｍ突然変異を含むＥＧＦＲ突然変異は、フォスフォチロシン誘発においても、ｐ−ＥＧＦＲ：ｔ−ＥＧＦＲ比のいずれにおいても著明な変化を示さなかった（図８Ａおよび８Ｂ）。Ｔ７９０突然変異を含む対応する突然変異種と比較した場合、同様の結果が、野生型およびｄｅｌ  Ｅ７４７−Ｌ７４７；Ａ７５０Ｐ  ＥＧＦＲに対してエルロチニブを用いた場合にも得られた（図８Ｃ）。これらの結果は、Ｔ７９０Ｍ突然変異は、ゲフィチニブまたはエルロチニブの、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性を抑制する能力を、臨床的に薬剤感受性と相関を持つとされるＥＧＦＲ突然変異（すなわち、Ｌ８５８Ｒ、またはエキソン１９欠失）においても弱体化することを示唆する。
【０１１９】
（実施例１１．Ｔ７９０ＭおよびＬ８５８Ｒ両突然変異を帯するＮＳＣＬＣ細胞系統の、ゲフィチニブまたはエルロチニブに対する耐性）
Ｔ７９０Ｍ突然変異の機能的結果についてさらに探求するために、我々は、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭによるアッセイを用い、ゲフィチニブまたはエルロチニブの存在下に培養された各種ＮＳＣＬＣ細胞系統の感受性を定量した。ベヒクル対薬剤処理生細胞による、この蛍光発生エステラーゼ基質の取り込みおよび貯蔵から、各種細胞系統間における相対的細胞生存率の比較が可能である［２０］。Ｌ８５８Ｒ突然変異を帯するが、他の、ＥＧＦＲ  ＴＫドメイン突然変異を含まないＨ３２５５細胞系統（表７）は、ゲフィチニブに対する治療に対して感受性を持ち、ＩＣ５０は約０．０１μｍｏｌであった（図９）。一方、Ｌ８５８ＲおよびＴ７９０Ｍ両突然変異（表７）を含むＨ１９７５細胞系統は、薬剤に対して約１００倍感受性が低く、ＩＣ５０は約１μｍｏｌであった（図９）。実際、Ｈ１９７５細胞の感受性は、野生型ＥＧＦＲ（エキソン１８から２４）およびＫＲＡＳ突然変異を含むＨ２０３０により近似していた（図９）。まったく同様の結果がエルロチニブについても得られた（図１０）。
【０１２０】
本発明は、その例示の実施態様を参照しながら、ここに開示され、図示されてきたわけであるが、改変、付加、および省略を含めた、全ての等価的実施態様は、明細書および特許請求の範囲に開示される、本発明の精神および範囲の中に含まれる。
【０１２１】
（参考文献）
【０１２２】
【化８】
2008529532.tif 000010
【０１２３】
【化９】
2008529532.tif 000011
【０１２４】
【化１０】
2008529532.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】ゲフィチニブおよびエルロチニブの化学構造。
【図２】本発明のポリヌクレオチドの各種実施態様の模式図。長さは２００ヌクレオチド以下で、１１ヌクレオチド以上。ｃ）では、影付き垂直バーは、置換されたヌクレオチドを模式的に表す。
【図３】新規ＰＣＲ−ＲＦＬＰアッセイは、ＥＧＦＲキナーゼドメインのエキソン２０におけるＴ７９０Ｍ突然変異体の存在を独立に確認する  （Ａ）アッセイの設計（詳細については本文参照）。“Ｆ”は蛍光標識、例えばＦＡＭを示す。このパネルの最下部において、本アッセイは、９７−ｂｐのＮｌａＩＩＩ切断産物をもって、Ｈ１９７５細胞系統においてＴ７９０Ｍ突然変異体の存在を実証する。この産物は、Ｈ２０３０  ＤＮＡには存在しない。野生型ＥＧＦＲの消化では１０６−ｂｐのＮｌａＩＩＩ産物が生成される。
【０１２６】
（Ｂ）このＰＣＲ−ＲＦＬＰアッセイは、３人の患者から得られた薬剤投与前サンプルは、検出可能なレベルの突然変異９７−ｂｐ産物を欠くのに対し、一方、病気進行後に得られた標本は、Ｔ７９０Ｍ突然変異体を含むことを示す。Ｐｔは患者。
【図４】患者１、２、および３から得られた画像所見  （Ａ）患者１．ゲフィチニブ治療前（０日目）、および治療中（１４日、および９ヶ月）における胸部Ｘ線撮影の連続記録。画像は、初期の反応と、その後の進行を示す。
【０１２７】
（Ｂ）患者２．エルロチニブ治療前（０日目）、および治療中（４ヶ月、および２５ヶ月）におけるＣＴ所見の連続記録。画像は、初期の反応と、その後の進行を示す。
【０１２８】
（Ｃ）患者３．肉学的に目視可能な病巣の完全な摘出後における、補足的ゲフィチニブ治療前（０日目）、および治療中（３ヶ月）における胸部Ｘ線撮影の連続記録。３ヶ月において見られた、左側の胸水滲出が４ヵ月後再発した。この時点で、分子分析のために液を採取した。
【図５】再試バイオプシー実験。バイオプシー針を白抜き矢印で示す。
【０１２９】
（Ａ）患者１．ゲフィチニブ治療１０ヶ月後における、進行性肺病巣のＣＴ誘導バイオプシー。２ヶ月後、右側胸水滲出からの液（右パネル）を、分子分析のために採取した。
【０１３０】
（Ｂ）患者２．進行性胸椎病巣のＣＴ誘導バイオプシー（左パネル）および、進行性肺病巣のＸ線透視誘導バイオプシー（右パネル）。
【図６Ａ】患者１および２において特定されたＥＧＦＲエキソン１９および２１突然変異体を有する配列クロマトグラム。
【０１３１】
（Ａ）患者１の腫瘍標本におけるＥＧＦＲエキソン２１の状態。増殖性肺病巣および胸水滲出から得られたＤＮＡは、位置２５７３において、通常のＬ８５８Ｒアミノ酸置換をもたらすＴ→Ｇヘテロ突然変異を示した。
【図６Ｂ】患者１および２において特定されたＥＧＦＲエキソン１９および２１突然変異体を有する配列クロマトグラム。
【０１３２】
（Ｂ）患者２の３個の標本は全て、同じエキソン１９のヘテロの欠失であって、残基７４７−７４９を除去し、位置７５０におけるアラニンをプロリンに変える欠失を示した。元の四色カラー配列トレースを白黒トレースに変換した。
【図７−１】各種臨床標本およびＮＳＣＬＣ細胞系統Ｈ１９７５におけるＴ７９０Ｍ  ＥＧＦＲエキソン２０突然変異体に関する配列クロマトグラム。元の四色カラー配列トレースを白黒トレースに変換した。
【０１３３】
（Ａ−Ｃ）３名の患者−患者１（Ａ）、患者２（Ｂ），および患者３（Ｃ）−の全てにおいて、二次突然変異体Ｔ７９０Ｍは、ゲフィチニブまたはエルロチニブいずれかの治療中の進行後に得られた病巣にのみ観察された。
【図７−２】各種臨床標本およびＮＳＣＬＣ細胞系統Ｈ１９７５におけるＴ７９０Ｍ  ＥＧＦＲエキソン２０突然変異体に関する配列クロマトグラム。元の四色カラー配列トレースを白黒トレースに変換した。
【０１３４】
（Ｄ）細胞系統Ｈ１９７５は、エキソン２１  Ｌ８５８Ｒ突然変異体（上方パネル）およびエキソン２０  Ｔ７９０Ｍ突然変異体（下方パネル）の両方を含む。星印は、ヌクレオチド２３６１における共通のＳＮＰ（ＡまたはＧ）を示す。矢印は、ヌクレオチド２３６９における突然変異体（Ｃ→Ｔ）を示す。これは、位置７９０においてトレオニン（ＡＣＧ）の代わりにメチオニン（ＡＴＧ）の置換をもたらす。逆方向では、突然変異ピークは緑色であり、一方、下段の青色ピークは、隣接ヌクレオチドからの「エコー」を表す。
【図８−１】Ｔ７９０Ｍ突然変異体を含むＥＧＦＲ突然変異細胞は、ゲフィチニブまたはエルロチニブによる抑制に対して耐性を持つ。
【０１３５】
野生型（ＷＴ）ＥＧＦＲ、または、下記の変化：Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ、Ｌ８５８Ｒ＋Ｔ７９０Ｍ、ｄｅｌ  Ｌ７４７−Ｅ７４９；Ａ７５０Ｐ、または、ｄｅｌ  Ｌ７４７−Ｅ７４９；Ａ７５０Ｐ＋Ｔ７９０Ｍを持つＥＧＦＲ突然変異をコードするプラスミドを、２９３Ｔ細胞に一過性にトランスフェクトした。３６時間後、細胞を２４時間血清欠乏下に置き、ゲフィチニブまたはエルロチニブで１時間処理し、次いで、抗ｐ−ＥＧＦＲ（Ｙ１０９２）、抗ｔ−ＥＧＦＲ、抗フォスフォチロシン（ｐ−Ｔｙｒ）、および抗アクチン抗体によるイムノブロット分析のために採取した。ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ突然変異体は、野生型ＥＧＦＲまたは薬剤感受性Ｌ８５８Ｒ  ＥＧＦＲ突然変異と組み合わせられると、ゲフィチニブによるチロシンリン酸化（Ａ）、またはｐ−ＥＧＦＲ（Ｂ）の抑制を阻止する。同様に、Ｔ７９０Ｍ突然変異体は、薬剤反応性ｄｅｌ  Ｌ７４７−Ｅ７４９；Ａ７５０Ｐ  ＥＧＦＲ突然変異と組み合わせられると、エルロチニブによるｐ−ＥＧＦＲの抑制を阻止する（Ｃ）。
【図８−２】Ｔ７９０Ｍ突然変異体を含むＥＧＦＲ突然変異細胞は、ゲフィチニブまたはエルロチニブによる抑制に対して耐性を持つ。
【０１３６】
野生型（ＷＴ）ＥＧＦＲ、または、下記の変化：Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ、Ｌ８５８Ｒ＋Ｔ７９０Ｍ、ｄｅｌ  Ｌ７４７−Ｅ７４９；Ａ７５０Ｐ、または、ｄｅｌ  Ｌ７４７−Ｅ７４９；Ａ７５０Ｐ＋Ｔ７９０Ｍを持つＥＧＦＲ突然変異をコードするプラスミドを、２９３Ｔ細胞に一過性にトランスフェクトした。３６時間後、細胞を２４時間血清欠乏下に置き、ゲフィチニブまたはエルロチニブで１時間処理し、次いで、抗ｐ−ＥＧＦＲ（Ｙ１０９２）、抗ｔ−ＥＧＦＲ、抗フォスフォチロシン（ｐ−Ｔｙｒ）、および抗アクチン抗体によるイムノブロット分析のために採取した。ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ突然変異体は、野生型ＥＧＦＲまたは薬剤感受性Ｌ８５８Ｒ  ＥＧＦＲ突然変異と組み合わせられると、ゲフィチニブによるチロシンリン酸化（Ａ）、またはｐ−ＥＧＦＲ（Ｂ）の抑制を阻止する。同様に、Ｔ７９０Ｍ突然変異体は、薬剤反応性ｄｅｌ  Ｌ７４７−Ｅ７４９；Ａ７５０Ｐ  ＥＧＦＲ突然変異と組み合わせられると、エルロチニブによるｐ−ＥＧＦＲの抑制を阻止する（Ｃ）。
【図９】ＥＧＦＲまたはＫＲＡＳにおいて各種突然変異を含むＮＳＣＬＣ細胞系統の間でゲフィチニブに対する感受性は異なる  ３種の表示のＮＳＣＬＣ細胞系統（Ｈ３２５５：Ｌ８５８Ｒ突然変異；Ｈ１９７５；Ｔ７９０ＭおよびＬ８５８Ｒ両突然変異体；野生型ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ突然変異（表７参照））を、漸増濃度のゲフィチニブの存在下に育成し、４８時間処理後に生細胞の密度を、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ蛍光アッセイを用いて測定した。ベヒクル処理細胞の蛍光を１００％として表した。結果は、各条件について４から８度の繰り返しを行った、３回の独立実験の平均±ＳＥである。同様の結果がエルロチニブについても得られた。
【図１０】ＥＧＦＲまたはＫＲＡＳにおいて各種突然変異を含むＮＳＣＬＣ細胞系統の間でエルロチニブに対する感受性は異なる。図９の説明を参照されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年3月7日(2008.3.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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