(57)【要約】  バイオ層干渉計を用いた酵素検定が開示される。固定された基質または基質捕捉フォーマットを用いて検定が行なわれてもよい。特定の実施形態では、この検定は、標識されていない基質を用いて行われる。この方法は、酵素検定測定に広く適用され、in vivoまたはin vitroで行なうことができ、複数の測定を容易に並行して行なうことができる。
2008527354.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光ファイバを介して光源に結合された光学要素を提供するステップであって、前記光学要素は、（ａ）少なくとも５０ｎｍ離れた近位の反射表面および遠位の反射表面と、（ｂ）酵素基質分子の層であって、酵素が基質と反応するにつれて前記近位の反射表面からの反射ビームと前記遠位の反射表面からの反射ビームとの間の干渉が変化するように配置された前記酵素基質分子の層とを含み、前記反射ビームは前記光ファイバ内に結合される前記ステップと、
前記光学要素を酵素に曝すステップと、
前記反射ビーム間の干渉の変化を検出するステップであって、この変化が酵素活性を表す前記ステップと、
を具備することを特徴とする酵素活性を検定するための方法。
【請求項２】
前記酵素がヒドロラーゼまたはトランスフェラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素が、プロテアーゼ、ホスファターゼ、グリコシラーゼ、またはエステラーゼである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素が、ヌクレオチドトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼまたはホスホトランスフェラーゼである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
第２の光ファイバを介して光源に結合された第２の光学要素を提供するステップであって、前記第２の光学要素は、（ｃ）少なくとも５０ｎｍ離れた近位の反射表面および遠位の反射表面と、（ｄ）酵素結合分子の層であって、酵素が該酵素結合分子の層と結合するにつれて前記第２の光学要素の前記近位の反射表面からの第２の反射ビームと前記第２の光学要素の前記遠位の反射表面からの第２の反射ビームとの間の干渉が変化するように配置された前記酵素結合分子の層とを含み、前記第２の反射ビームは前記光ファイバ内に結合される前記ステップと、
前記第２の反射ビーム間の干渉の変化を検出するステップであって、この変化が酵素量を表す前記ステップと、
を更に具備することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記酵素結合分子の層が、抗−酵素抗体、抗−酵素抗体のフラグメント、または抗−酵素ｓｃＦｖ分子を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
光ファイバを介して光源に結合された光学要素を提供するステップであって、前記光学要素は、（ａ）少なくとも５０ｎｍ離れた近位の反射表面および遠位の反射表面と、（ｂ）検体結合分子の層であって、酵素基質またはその一部分が該検体結合分子の層に結合するにつれて前記近位の反射表面からの反射ビームと前記遠位の反射表面からの反射ビームとの間の干渉が変化するように配置された前記検体結合分子の層とを含み、前記反射ビームは前記光ファイバ内に結合される前記ステップと、
前記光学要素を酵素と反応した基質または酵素と反応する基質に曝すステップであって、これにより、前記基質または前記基質の一部分を前記検体結合分子の層に結合させる前記ステップと、
前記反射表面の光学的厚さの変化を検出するステップであって、この変化が酵素活性を表す前記ステップと、
を具備することを特徴とする酵素活性を検定するための方法。
【請求項８】
前記酵素がヒドロラーゼまたはトランスフェラーゼである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記酵素が、プロテアーゼ、ホスファターゼ、グリコシラーゼ、またはエステラーゼである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵素が、ヌクレオチドトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼまたはホスホトランスフェラーゼである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記光学要素と前記基質との間に半透膜を入れるステップをさらに具備する、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記基質が支持体に結合している、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
第２の光ファイバを介して光源に結合された第２の光学要素を提供するステップであって、前記第２の光学要素は、（ｃ）少なくとも５０ｎｍ離れた第２の光学要素の近位の反射表面および第２の光学要素の遠位の反射表面と、（ｄ）酵素結合分子の層であって、酵素が該酵素結合分子の層と結合するにつれて前記第２の光学要素の近位の反射表面からの第２の反射ビームと前記第２の光学要素の遠位の反射表面からの第２の反射ビームとの間の干渉が変化するように配置された前記酵素結合分子の層とを含み、前記第２の反射ビームは前記光ファイバ内に結合される前記ステップと、
前記第２の反射ビーム間の干渉の変化を検出するステップであって、この変化が酵素量を表す前記ステップと、
を更に具備することを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記検体結合分子の層が、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、またはレクチンを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
前記酵素結合分子の層が、抗−酵素抗体、抗−酵素抗体のフラグメント、または抗−酵素ｓｃＦｖ分子を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記曝すステップの前に、酵素を不活化するステップをさらに具備することを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
光ファイバを介して光源に結合されるのに適した光学要素を具備し、この光学要素が、（ａ）少なくとも５０ｎｍ離れた近位の反射表面および遠位の反射表面と、（ｂ）酵素基質分子の層であって、酵素が基質と反応するにつれて前記近位の反射表面からの反射ビームと前記遠位の反射表面からの反射ビームとの間の干渉が変化するように配置された前記酵素基質分子の層とを含むことを特徴とするアセンブリ。
【請求項１８】
光ファイバを介して光源に結合されるのに適した光学要素を具備し、この光学要素が、（ａ）少なくとも５０ｎｍ離れた近位の反射表面および遠位の反射表面と、（ｂ）酵素が基質と反応するにつれて前記近位の反射表面からの反射ビームと前記遠位の反射表面からの反射ビームとの間の干渉が変化するように配置された検体結合分子の層とを含むことを特徴とするアセンブリ。
【請求項１９】
バイオ層干渉計に結合されるのに適したグラスファイバと、
前記グラスファイバを基質層または検体結合分子の層で誘導体化するための試薬および指示と、
を具備することを特徴とするキット。
【請求項２０】
前記グラスファイバの末端を光学的に活性化させるための試薬および指示を更に具備することを特徴とする請求項１９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素活性を測定するのに有用な干渉計を用いた方法および構成物に関する。
【０００２】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮出願番号第６０／６４５，１５３号（２００５年１月１９日出願）および米国仮出願番号第６０／６４２，４５４号（２００５年１月７日出願）の利益を請求し、これら両方の出願は本明細書中にあらゆる目的のためにその内容全体が組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
酵素は、生化学反応に触媒作用し、多くの治療および産業で適用される多くの種類のタンパク質を表す。酵素製品の一連の開発および製造では、酵素活性の測定が必要であることが多い。単純な酵素活性測定方法、好ましくは標識を使わず酵素／基質相互作用の摂動を妨害しない酵素活性測定方法があれば広く適用できる。治療または産業で適用される酵素または酵素阻害剤に基づく生成物を開発し、製造する際には、プロセス全体にわたって酵素活性をモニタリングすることが重要である。酵素検定は、典型的には、基質に作用する酵素が検出可能なシグナル変化をもたらすような様式で基質を標識する必要がある。標識された酵素基質は市販されていないことが多く、この場合、この酵素基質を合成するのも複雑である場合がある。多くの酵素製品を開発する企業にとって、単純で平易な活性測定方法を研究開発環境下および製造環境下で行なうことは、主要な任務となる。標識された基質が必要な場合、酵素活性測定に時間と、費用とがかかり、不便である。サンプル中に存在する酵素量の定量にも特定の活性測定が必要である。例えば、酵素固定化免疫測定（ＥＬＩＳＡ）に基づく検定による定量にも特定の活性測定による時間と費用がかかり、サンプルがさらに必要になる。本発明は、単純なファイバに基づくリアルタイム酵素活性検定を提供することにより、従来技術のこれらの欠点およびその他の欠点に対処するものである。この酵素活性検定は、非常に多くのサンプルを並行して処理でき、少量のサンプルに適した特定の活性測定方法を提供可能で、いくつかの実施形態では、標識されていない基質を用いて検定を行なうことができる。
【発明の開示】
【０００４】
本発明は、特許請求の範囲によって定義されるべきであり、この項目の内容は特許請求の範囲を限定するものとみなされるべきではない。ファイバを用いた干渉計を使用して酵素活性を検定するためのアセンブリ、キット、および方法が開示される。一実施形態では、本検定は、光ファイバを介して光源に結合された光学要素を提供するステップを具備し、この光学要素は、少なくとも５０ｎｍ離れた近位の反射表面および遠位の反射表面を有する。酵素基質分子の層は、酵素が基質と反応するにつれて、上記近位の反射表面からの反射ビームと上記遠位の反射表面からの反射ビームとの間の干渉が変化するように配置される。上記反射ビームは上記光ファイバ内に結合される（coupled）。上記光学要素を酵素に曝し（exposed）、上記反射ビーム間の干渉の変化を検出する。検出された変化は酵素活性を表す。
【０００５】
さらに別の実施形態では、光学要素において上記酵素基質分子の層が検体結合分子の層に置き換えられる。上記近位の反射表面からの反射ビームと上記遠位の反射表面からの反射ビームとの間の干渉は、酵素が基質と反応するにつれて、そして、反応中の基質またはその一部が検体結合分子に結合するにつれて、変化する。好ましい実施形態では、検体結合分子は、抗体、抗体フラグメント、一本鎖Ｆｖ分子（「ｓｃＦｖ」）、アビジン、ストレプトアビジン、またはビオチンを含む。
【０００６】
別の実施形態では、上記光学要素と検定溶液との間に半透膜が配置される。別の実施形態では、上記基質は支持体（例えば、マイクロタイターウェルまたはビーズ）に接続する。
【０００７】
さらに別の実施形態では、上記分子の層を含み、酵素に特異的に結合する類似の第２の要素が提供される。第２の要素は、酵素に曝され（第１の要素が曝されるのと同時または異なる時間に）、反射ビーム間の干渉の変化が検出される。この変化は酵素濃度または酵素量を表す。この方法は特定の活性測定を行なうのに有用である。好ましい実施形態では、酵素結合分子は、抗−酵素抗体、抗−酵素抗体のフラグメント、またはｓｃＦｖ分子を含む。
【０００８】
本発明の上記の特徴および他の特徴、局面、および利点は、以下の記載および添付の図面を参照してさらによく理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（利点および有用性）
簡潔に説明すると、以下にさらに詳細に記載されるように、ファイバを使用する干渉計を用いた酵素活性を検定するためのアセンブリ、キット、および方法が記載される。
【００１０】
本アプローチのいくつかの特徴を記載しておく。非常に少量のサンプル（例えば数ｎＬ）を用いて測定を行なうことができる。in vivoまたはin vitroで測定を行なうことができる。いくつかの実施形態では、標識されていない基質を用いて測定を行なうことができ、他の実施形態では、基質はアセンブリによって捕捉可能な部分を含む。好ましい実施形態では、この部分は結合対の一種であり、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、ハプテン、抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、またはレクチンであり、光学要素は、これらの対に相補的な構成を含む。これらの実施形態では、同じ種類の光学要素（すなわち、結合対のうち１つ）を、他の結合対を含む基質を用いる広範囲の酵素検定に使用することができる。
【００１１】
このアプローチの利点は数多く存在する。本発明がファイバを用いた干渉計による測定を提供するため、酵素量を測定するためのモジュールを含むことにより、感度が高く、非常に多くのサンプルを並行して測定可能で、特定の活性測定に簡単に適用することができる。
【００１２】
本発明は、例えば、酵素または酵素阻害剤の発見、改変、最適化、生成などを含む、このような活性測定が有用であるという任意の状況において、酵素活性の測定に有用である。本発明は、任意の種類の酵素、例えば、ヒドロラーゼ、グリコシラーゼ、エステラーゼ、およびトランスフェラーゼ、またはこのような酵素の阻害剤を用いて行なわれてもよい。
【００１３】
（定義）
特許請求の範囲および明細書中で使用される用語は、他に特定されない限り、以下に記載されるように定義される。
【００１４】
用語「in vivo」は、生体中で起こるプロセスを指す。
【００１５】
本明細書中で使用される省略語としては、以下のものが挙げられる。
ｄｓＤＮＡ  −  二本鎖ＤＮＡ；
ｄＮＴＰ  −  デオキシヌクレオチドトリホスフェート類；
Ｂ−ＡＴＰ  −  ビオチン化−ＡＴＰ；
ＰＥＧ  −  ポリエチレングリコール；
ＰＭＳＦ  −  フェニルメチルスルホニルフルオリド。
【００１６】
本明細書中および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形をあらわす「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、他の内容を明確に示していない限り、複数形のものも含むことを注記しておかねばならない。
【００１７】
（本発明のアセンブリ）
本発明のアセンブリは、バイオ層干渉計に接続し、基質または検体結合分子の層を保持するのに適したバイオセンサチップを含む。検体結合分子は、実施例として用いられるものによって限定されることなく、結合対の１つ、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、ハプテン、抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、またはレクチンであってもよい。
【００１８】
（本発明のキット）
本発明のキットは、バイオ層干渉計に接続するのに適したグラスファイバと、グラスファイバを基質層または検体結合分子層で誘導体化するための試薬および指示とを含み、場合により、グラスファイバの末端を活性化するための試薬および指示と、パッケージングとを含む。
【００１９】
（本発明の方法）
概して、本発明の方法は、バイオ層干渉計（ＢＬＩ）センサを含むアセンブリおよび装置、例えば、共有出願である米国出願番号第１０／９８１，９０１（２００４年１１月４日出願）、Ｈｏｎｇ  Ｔａｎ他、標題「Ｆｉｂｅｒ−Ｏｐｔｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｐｈａｓｅ−Ｓｈｉｆｔ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ」、代理人番号第２４３７７−０９６１１ＵＳ（この内容は参照することにより本明細書中にその全体が組み込まれる）に記載されるものを用いて行なわれる。
【００２０】
簡潔にいうと、センサは、グラスファイバの一端を光学的に活性化することによって調製される。活性化ステップは、ファイバ表面をバフ研磨し、Ｔａ2Ｏ5で表面をコーティングし、ＳｉＯ2層でコーティングし、洗浄し受動的吸収によって、酵素基質または結合対の１つを固定化し、および／または共有結合させることを含む。
【００２１】
酵素活性を検定するための２つの広範囲で一般的なフォーマットが本発明の範囲に含まれる。第１のフォーマットでは、基質は、バイオ層干渉計（ＢＬＩ）センサの表面に固定される。第２のフォーマットでは、ＢＬＩセンサは、基質に結合可能な分子を有する表面を含む。第２のフォーマットでは、半透性膜が、ＢＬＩセンサと検定溶液との間に場合により含まれるか、または基質は、支持体、例えば、マイクロタイターウェルまたはビーズに結合される。これらの実施形態は、ヒドロラーゼを用いて基質の全長をＢＬＩセンサに結合させないか、または結合を遅らせるために特に有用である。第２のフォーマットでは、酵素活性に関する情報は、干渉シグナルの動的状態にある成分および静的状態にある成分の両方から誘導することができる。
【００２２】
バイオ層干渉計（ＢＬＩ）センサは、その光学層検出表面の厚みの変化をナノメートル以下で測定することができる。生物学的サンプルの分析は、バイオ分子がセンサ表面に結合し、光学層の厚みが変化する検定フォーマットを設計することによって可能である。光学層の厚みの変化量は、結合分子の質量または分子量に比例する。バイオ層干渉計は、センサ表面に固定化された基質を有し、酵素活性が基質分子量を増加または減少させ、光学層の厚みが対応して変化する酵素を測定するような構造にすることができる。
【００２３】
本発明は、酵素活性測定（一例であり限定されないが、ヒドロラーゼ（プロテアーゼを含む）、グリコシラーゼ、エステラーゼ、トランスフェラーゼ（ヌクレオチドトランスフェラーゼおよびホスホトランスフェラーゼを含む）の測定が挙げられる）に広く適用することができる。これらについて以下にさらに詳細に考察される。
【００２４】
（実施例）
本発明を実施するための特定の実施形態の例を以下に示す。これらの実施例は単に説明の目的で与えられ、本発明の範囲をいかなる様式でも限定することを意図しない。使用した数（例えば、量、温度など）は正確であるように心がけたが、いくつかの実験誤差および偏差はもちろん許容されるべきである。他に特定されない限り、手順は室温（典型的には２０〜２３℃）で行なわれる。
【００２５】
本発明の実施は、他に言及されない限り、タンパク質化学、生化学、組み換えＤＮＡ技術および薬理学の従来の方法を当該技術分野の技術の範囲内で使用する。このような技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  （Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９９３）；  Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．，  ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９８９）；  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．Ｋａｐｌａｎ  ｅｄｓ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）；  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９９０）；  Ｃａｒｅｙ  ａｎｄ  Ｓｕｎｄｂｅｒｇ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）  Ｖｏｌｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ（１９９２）を参照。
【００２６】
実施例１：ＢＬＩ分子量検出の評価
ＢＬＩが検出可能な結合分子の最小分子量を図１および２に示す。図１には、ストレプトアビジンに結合した９００ダルトンの分子量を有するビオチン−ＰＥＧ接合体でコーティングされたＢＬＩセンサを示す。ＢＬＩセンサおよびセンサをコーティングする方法は、共有の米国非仮出願第１０／９８１，９０１号（２００４年１１月４日出願）、Ｈｏｎｇ  Tan他、標題「Ｆｉｂｅｒ−  Ｏｐｔｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｐｈａｓｅ−Ｓｈｉｆｔ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ」、代理人番号第２４３７７−０９６１１ＵＳに詳細に記載される。図２は、ストレプトアビジンに結合したビオチン（分子量２３０ダルトン）でコーティングしたＢＬＩセンサを示す。このデータは、記載の干渉方法で約２５０ダルトンの分子量の結合を容易に検出できることを示し、５００〜１０００ダルトンの分子量範囲の分子により光学層の厚みを実質的に変化させることができることを示す。ＢＬＩの最小分子サイズ検出に基づいて、固定された基質を有するＢＬＩセンサを構成し、２５０〜１０００ダルトンの基質で分子サイズを変化させる酵素の活性をモニタリングすることができる。
【００２７】
ＢＬＩの最小分子サイズ検出限界が小さいため、多数の酵素にＢＬＩを適用することができる。以下の限定されない実施例によって、本発明およびこのような測定法の特定の例に従って活性を測定可能な酵素を分類する。
【００２８】
実施例２：ヒドロラーゼ（hydrolase）活性の測定
ヒドロリアーゼは、Ｃ−Ｏ、Ｃ−Ｎ、Ｃ−Ｃまたは無水リン酸結合の開裂に触媒作用する酵素である。
【００２９】
サブグループ１：プロテアーゼ（ペプチド結合に作用する酵素）に固定された基質のフォーマット
【００３０】
このフォーマットの特徴は、ＢＬＩグラスファイバセンサの表面にプロテアーゼ基質が固定され、共有の米国出願番号第１０／９８１，９０１号（２００４年１１月４日出願）、Ｈｏｎｇ  Tan他、標題「Ｆｉｂｅｒ−Ｏｐｔｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｐｈａｓｅ−Ｓｈｉｆｔ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ」、代理人番号第２４３７７−０９６１１ＵＳ（本明細書中に参照して組み込まれる）および以下の文献に記載される方法を用いることである。ファイバを酵素を含有するサンプルに浸し、光学層の厚みの変化をモニタリングする。
【００３１】
基本となる検定プロトコルは、バイオ層干渉計（ＢＬＩ）センサをインキュベートして酵素を含有する酵素溶液中で酵素基質を固定化することである。使用された基質の量は、例えば、共有の米国出願番号第１０／９８１，９０１号（２００４年１１月４日出願）、Ｈｏｎｇ  Tan他、標題「Ｆｉｂｅｒ−Ｏｐｔｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｐｈａｓｅ−Ｓｈｉｆｔ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ」、代理人番号第２４３７７−０９６１１ＵＳ（本明細書中に参照して組み込まれる）に完全に記載される技術を用いて、バイオ層干渉計（ＢＬＩ）技術を用いた光学相のシフトの変化によって定量される。例えば、光学相のシフトの変化は、加水分解活性が、酵素活性によるＢＬＩセンサからの基質の消失を測定することによって概算されるため、溶液中の酵素活性の量に比例する。
【００３２】
固定されたカゼイン基質によるスブチリシン活性の測定
方法
光学信号のベースラインは、光学的に活性化されたファイバセンサチップの末端をＰＢＳに浸すことによって定められ、共有の米国非仮出願番号第１０／９８１，９０１号（２００４年１１月４日出願）、Ｈｏｎｇ  Tan他、標題「Ｆｉｂｅｒ−Ｏｐｔｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｐｈａｓｅ−Ｓｈｉｆｔ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ」、代理人番号第２４３７７−０９６１１ＵＳ（本明細書中に参照して組み込まれる）に記載される干渉法および装置を用いて光学信号をモニタリングする。次に、０．５ｍｇ／ｍＬのポリ−Ｄ−リシン溶液（ＰＢＳ中、ｐＨ７．４）中でチップを１５分間インキュベートすることによってファイバをポリ−Ｄ−リシンでコーティングする。ＰＢＳ中でチップを１０分間インキュベートすることによって結合していないポリ−Ｄ−リシンを洗い流した。
【００３３】
５０μｇ／ｍＬのカゼイン溶液（５０ｍＭのリン酸Ｎａ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７）中でチップを１５分間インキュベートすることによってファイバをカゼイン層［Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ］でコーティングした。ＰＢＳ中でチップを１０分間インキュベートすることによって結合していないカゼインを洗い流した。
【００３４】
固定したカゼインを有するファイバを種々の濃度（１、１０、５０μｇ／ｍＬ）のスブチリシン［Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ］溶液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７）中でインキュベートした。光学信号をモニタリングしながら上述のそれぞれの手順を行なった。
【００３５】
結果および考察：
図３にこの実施例の結果を示す。光学的な痕跡は、時間の関数として計算されたバイオ層の厚みを示す。明らかに、カゼインを結合させるとバイオ層の厚みは大きくなり、スブチリシンとともにインキュベートすると厚みは小さくなった。この痕跡は、試験範囲内では、高濃度のスブチリシンを用いると、変化が速くなり、しかも大きくなり、明らかに用量依存効果を示す。
【００３６】
酵素活性に対するプロテアーゼ阻害剤の効果
方法
ファイバセンサチップを調製し、上述のようにカゼインでコーティングした。１個のファイバを５０ｕｇ／ｍＬのスブチリシン溶液（５０ｍＭのリン酸Ｎａ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７）中でインキュベートした。
【００３７】
他のファイバを、あらかじめ混合し、あらかじめインキュベートしておいた５０μｇ／ｍＬのスブチリシンおよび３ｍＭのＰＭＳＦ［Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ］の溶液（この混合物を３７℃で２０分間インキュベートした）（５０ｍＭのリン酸Ｎａ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７）中でインキュベートした。光学信号をモニタリングしながら上述のそれぞれの手順を行なった。
【００３８】
結果および考察：
スブチリシン溶液中でインキュベートしたファイバから得られた痕跡は、予想どおりにチップ表面からカゼインが消失していた（図４）。このことは、酵素溶液中でインキュベートした後の痕跡において迅速に時間依存変化を示す。スブチリシンおよび（プロテアーゼ阻害剤の）ＰＭＳＦのスブチリシン／ＰＭＳＦ混合物中でファイバをインキュベートしても、光学信号の時間依存変化は見られず（図５および６）、このことは、３ｍＭのＰＭＳＦによってスブチリシンが阻害されたことを示す。
【００３９】
基質捕捉フォーマット
基質捕捉フォーマットは、液相でのプロテアーゼによる基質の消化、ＢＬＩセンサ表面への基質の結合を伴う。基質の結合は、基質のタンパク分解により光学層の厚みが変化するのを検出可能なように設計された。１つの好ましい実施形態では、ストレプトアビジン／ビオチン結合対を使用して、基質捕捉を行なった。図７は、ビオチンを用いたタグペプチド基質に結合する２種のアプローチを示す。プロテアーゼが複数の開裂部位を有する場合、消化により十分に小さな分子サイズのペプチドを生成するため、ビオチンは特定の部位で交換される必要はない。１個の開裂部位を有し、タンパク分解によって最も小さなペプチドフラグメントが残るようなビオチン置換の位置を有する基質を設計することもできる。ビオチンまたは別の結合対の１つで基質を誘導体化する方法は、当業者に十分既知であり、既存の基質分子の生化学的改変を含むか、または誘導体化されたサブユニットの合成を含む。このような方法は、例えば参照して組み込まれ、以下に説明される［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ，  １９８８）；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｃｌｉｆｔｏｎ，  Ｎ．Ｊ．），  Ｖ．２８３，２００４）］に記載される。
【００４０】
実施例３：基質補足を用いたトリプシン活性の測定
基質補足フォーマットを用い、チトクロムＣを基質として用いてトリプシン活性の測定を行う。チトクロムＣは約１２キロダルトンの分子量を有し、８個のトリプシン開裂部位を有する。標準的なビオチン−ＮＨＳ誘導体［Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ］を使用して、チトクロムＣを結合する。カップリング条件は、標準的な緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７）バッファーを使用する。ビオチン−ＮＨＳをチトクロムＣと５  対  １（ビオチン  対  チトクロムＣ）のカップリングモル比で混合する。典型的に、チトクロムＣ分子１個あたり１個のビオチンが置換したものが得られる。ストレプトアビジンでコーティングされたＢＬＩセンサを約２０ｎｍの酸化タンタル層および約７００ｎｍの二酸化ケイ素層を有する０．６ｍｍ直径のグラスファイバを０．５ｍｇ／ｍｌのポリ−Ｄ−リシンを含有するＰＢＳ溶液中に上述のように浸すことによって調製した。室温で１５分経過後、ファイバをＰＢＳで洗浄し、Ｎ−スクシンイミジイル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）［Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ］で標識したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１ｍｇ／ｍｌ溶液に浸し、２０分間インキュベートし、その後にＰＢＳで洗浄する。次いで、ファイバを５０ｍＭジチオールスレイトール溶液に室温で３０分間浸す。ＰＢＳで洗浄した後、ファイバをＳＭＣＣで標識した２０ｕｇ／ｍｌのストレプトアビジンを含有する溶液に入れ、６０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄する。使用するまでファイバをＰＢＳ中で保存する。
【００４１】
基質補足フォーマットを用いたプロテアーゼ活性の基本的な検定は、約１μｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌの範囲のビオチン化チトクロムＣ溶液、トリプシンサンプルを典型的に、１％ｗｔ／ｗｔの比率で添加することを伴う。消化時間の後、ストレプトアビジンでコーティングされたセンサを基質補足のため酵素／基質混合物に入れた。トリプシンがストレプトアビジンに作用するのを防ぐため、グラスファイバを添加する前に、基質混合物を煮沸するかまたはプロテアーゼ阻害剤（例えば、アプロチニン）と添加することによって酵素を不活化することができる。ビオチン化ペプチドを結合させた際に光学層の厚みを測定することにより基質サイズの変化をＢＬＩセンサを用いて評価することができる。図８は、薄い光学層を用いてさらに小さなペプチドを産生するプロテアーゼ活性の検定フォーマットを示す。
【００４２】
サブグループ２：グリコシラーゼ（ＯまたはＳまたはＮグリコシル結合を加水分解する酵素）
【００４３】
固定された基質フォーマット
以下の実施例はデキストラナーゼについて記載するが、同じ方法を他の多糖類を加工する酵素（例えば、アミラーゼおよびセルラーゼ）に適用することができる。最初にデキストランと過ヨウ素酸ナトリウムとを反応させ、デキストランポリマーに反応性アルデヒド基を導入することによって、デキストランをタンパク質でコーティングされたＢＬＩセンサに接続する。次いで、タンパク質でコーティングされたＢＬＩセンサ（例えば、上述の実施例の方法に従って調製したもの）をデキストラン溶液に浸す。デキストランのアルデヒド基がタンパク質の遊離アミノ基の結合を形成し、デキストランを最後の層として有するＢＬＩセンサを得る。デキストラナーゼ活性の測定は、デキストランでコーティングされたセンサをデキストラナーゼ含有サンプルに浸すことによって可能である。デキストラナーゼの加水分解活性により、固定されたデキストランの分子サイズが減少し、光学層の厚みが薄くなることで検出される。
【００４４】
基質捕捉フォーマット
基質捕捉フォーマット中のグリコシラーゼの測定は、多糖類基質をビオチン化することによって達成される。デキストラナーゼの実施例で、デキストランを過ヨウ素酸ナトリウムと反応させ、アルデヒド基を生成した後、著しく過剰のビスアミン（例えばエチレンジアミン）を添加した。ビスアミンの１個のアミノ基がデキストランのアルデヒドとカップリングし、残った第２の遊離アミンが後に続く反応でビオチン−ＮＨＳとカップリングする。ビオチン-ＮＨＳ反応のカップリングモル比は、デキストラン１モルあたり約１モルのビオチン置換物が得られるように選択される。基質補足フォーマットを用いるデキストラナーゼ活性の検定は、プロテアーゼの第２の実施例と同様であり、ビオチン化デキストラン基質をデキストラナーゼサンプルとともにインキュベートし、ビオチン化デキストランをストレプトアビジンでコーティングれたＢＬＩセンサに結合させる。デキストラナーゼ活性により、小さなデキストランフラグメントが生成し、これは光学層が薄くなることによって測定される。
【００４５】
実施例４：エステラーゼ活性の測定
サブグループ３；エステラーゼ（エステル結合に作用する酵素）
エステラーゼのいくつかの例としては、ヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅなど）、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、およびセリン／スレオニンホスファターゼが挙げられる。ＤＮａｓｅ  Ｉをエステラーゼ活性を測定する一例として使用する。ＤＮａｓｅ  Ｉ  はオリゴヌクレオチドの４つの塩基すべてを３塩基ずつ開裂させ、約３０〜４０塩基対を有し、一端にビオチン基を有するｄｓＤＮＡは標準的なＤＮＡ合成技術を用いる販売業者によって調製される。ビオチン化ｄｓＤＮＡをストレプトアビジンでコーティングされたＢＬＩセンサに結合させる。次いで、センサをＤＮａｓｅ  Ｉをバッファー：１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５、２．５  ＭｇＣｌ2、０．５ｎＭのＣａＣｌ2中に含有するサンプルに浸し、光学層の厚みの減少をモニタリングする。ビオチンで標識されたｄｓＤＮＡとＤＮａｓｅ  Ｉとを液相中で混合し、基質をストレプトアビジンでコーティングされたセンサに結合させることにより、代わりの基質捕捉フォーマットを実施する。
【００４６】
実施例５：トランスフェラーゼ活性の測定
トランスフェラーゼは、メチル、グリコシル、またはホスホ基の他の化合物への転移を触媒作用する酵素である。加水分解酵素とは対照的に、トランスフェラーゼは基質の分子サイズを大きくするので、その活性は光学層の厚みの増加としてＢＬＩセンサで検出される。
【００４７】
サブグループ１：ヌクレオチドトランスフェラーゼ
ヌクレオチドトランスフェラーゼは、ＤＮＡまたはＲＮＡポリマーへのヌクレオチドの組み込みに触媒作用する。図９は、一例としてＤＮＡポリメラーゼＩ活性を測定するためのフォーマットを示す。末端ヌクレオチドのいずれかにビオチンが組み込まれた１０〜３０ヌクレオチドのＤＮＡテンプレートを販売業者から得る。ＤＮＡポリメラーゼＩを５’→３’方向でヌクレオチドに組み込み可能なオリゴヌクレオチドプライマーでＤＮＡテンプレートをハイブリダイズした。ビオチン結合したＤＮＡテンプレートをＤＮＡポリメラーゼ工程の前または後にストレプトアビジンでコーティングされたセンサに結合させることができる。ポリメラーゼ工程の条件（例えば、酵素の結合、ｄＮＴＰ、バッファー処方など）は、確立されたプロトコルに従う。ｄＮＴＰは約４００ダルトンの分子量を有するため、１〜２ヌクレオチドが組み込まれても光学厚みの変化として検出することができる。
【００４８】
ヌクレオチドトランスフェラーゼの活性を測定するための代わりのアプローチは、図１０に示されるようなハプテン組み込みに基づく。ＤＮＡポリメラーゼＩと、ビオチン化ＡＴＰを含むｄＮＴＰの混合物とを混合し、ハイブリダイズしたプライマーを有するＤＮＡテンプレートを作成した。ニックトランスレーションで一般的に使用されるためＢ−ＡＴＰは商業的に入手できる。ポリメラーゼ工程の後、ストレプトアビジンでコーティングされたＢＬＩセンサをサンプル混合物中に入れる。約６００ダルトンの分子量を有する組み込まれていないＢ−ＡＴＰは、ストレプトアビジンに結合しても光学層をそれほど大きくしないが、ＤＮＡテンプレートに組み込まれたＢ−ＡＴＰはＤＮＡの分子量に依存して光学層の厚みを非常に大きくする。
【００４９】
サブグループ２：ホスホトランスフェラーゼ
ホスホトランスフェラーゼは、ヒドロキシルを含有する化合物、典型的に、チロシン、セリン、またはスレオニン残基を有するペプチドへのホスフェート基転移に触媒作用する。ホスホリル化アミノ酸またはホスホリル化アミノ酸を含む特定の配列に結合する１００種を超えるモノクローナル抗体が市販されている。キナーゼ活性の多くの検定が報告されており、ホスホリル化ペプチド基質に対する抗体を使用して市販されている。図１１は、抗−ホスホチロシン抗体を用いた検定について記載する。標準的な方法によって抗体を最初にビオチン化し、ストレプトアビジンでコーティングされたセンサに結合させる。基質（Ｇｌｕ4Ｔｙｒ）nをチロシンキナーゼおよびＡＴＰとともにインキュベートし、その後、抗−ホスホチロシンでコーティングされたセンサをサンプルに入れる。ホスホリル化ペプチドの結合により光学層の厚みが大きくる。
【００５０】
図１２は、特定のキナーゼについてホスホリル化アミノ酸配列に対する抗体を用いた検定を示す。この場合、キナーゼはタンパク質キナーゼＣであり、抗体は市販のリン酸化タンパク質キナーゼＣ基質である。図１３は、キナーゼ活性化検定の例示的なフォーマットを示す。この例では、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）を別の酵素であるＭＥＫ１でホスホリル化することによって活性化する。市販の抗−ホスホＭＡＰＫをＢＬＩセンサに結合させ、ＭＡＰＫの活性を検出する。
【００５１】
本発明は好ましい実施形態および種々の代わりの実施形態を参照して特定的に示され、記載されるが、種々の形態および詳細の変化は、本発明の精神および範囲を逸脱することなくなされることが当業者によって理解される。
【００５２】
本明細書中で引用された全ての参考文献、発行された特許および特許出願は、あらゆる目的のために、その内容全体が本明細書中に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】最小分子サイズの検出を示すグラフである。
【図２】最小分子サイズの検出を示す別のグラフである。
【図３】３種類の酵素濃度でスブチリシン活性を測定した結果を示すグラフである。
【図４】５０ｕｇ／ｍｌでスブチリシン活性を測定した結果を示すグラフである。
【図５】スブチリシン活性に対するプロテアーゼの阻害効果を示すグラフである。
【図６】スブチリシン活性に対するプロテアーゼの阻害効果を示す第２のグラフである。
【図７】基質捕捉フォーマットのための基質調製を示す図である。図７Ａは、複数のプロテアーゼ開裂部位を有する基質を示し、図７Ｂは、１個の（または数個の）開裂部位を有する基質を示す。
【図８】基質捕捉フォーマット検定の原理を示す図である。
【図９】ヌクレオチドトランスフェラーゼ活性を検出する方法を示す図である。
【図１０】ハプテン組み込みを用いてヌクレオチドトランスフェラーゼ活性を検出する方法を示す図である。
【図１１】ホスホリル化基質に対する抗体を用いてホスホトランスフェラーゼ活性を検出する方法を示す図である。
【図１２】タンパク質キナーゼＣ活性を検出する方法を示す図である。
【図１３】マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化を検出する方法を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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