(57)【要約】  ヒト抗原類に対するインシリコおよびインビボにおける高アフィニティと特異性を有する抗体類を設計し選択する方法類が提供される。ある特定の態様において、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対して高いアフィニティと特異性を有するヒト化または完全ヒト抗体類を設計し選択する方法類が提供される。特に、高いアフィニティでヒトＶＥＧＦに結合する能力を有するヒト化またはヒト抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体類が提供され、インビトロでＶＥＧＦ誘発内皮細胞増殖を阻害しかつインビボでＶＥＧＦ誘発新脈管形成を阻害する。これらの抗体類およびそれらの誘導体を、癌、ＡＭＤ、糖尿病網膜症、および病理的新脈管形成に由来する他の疾患類のような疾患の診断、予防および治療のような広い範囲の適用で使用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．２ｎＭに等しいかそれよりも小さい解離定数ＫdでヒトＶＥＧＦに特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項２】
解離定数Ｋdが０．１ｎＭに等しいかそれよりも小さい請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
解離定数Ｋdが０．０８ｎＭに等しいかそれよりも小さい請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
解離定数Ｋdが０．０５ｎＭに等しいかそれよりも小さい請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
解離定数Ｋdが０．０１ｎＭに等しいかそれよりも小さい請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
解離定数Ｋdが０．００５ｎＭに等しいかそれよりも小さい請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
前記抗体がｓｃＦｖの形態である請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
前記抗体がＦａｂの形態である請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
前記抗体が完全アセンブリ抗体の形態である請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
前記抗体がｓｃＦｖの形態でありかつ解離定数Ｋdが約４℃、２５℃、３７℃または４２℃で測定される請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
前記抗体がＦａｂの形態でありかつ解離定数Ｋdが約４℃、２５℃、３７℃または４２℃で測定される請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項１２】
前記抗体がＦａｂの形態でありかつ解離定数Ｋdが約３７℃で測定される請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項１４】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつアミノ酸配列
【化１】
2008504215.tif 000033
を含むＶLを有するモノクローナル抗体で、ここで、下線を付した領域は、それぞれ、ＶL／ＣＤＲ１，ＶL／ＣＤＲ２およびＶL／ＣＤＲ３と称され、一方、前記領域の残りはフレームワークと称され、ここで、Ｘ1はＤ，ＥまたはＡであり；Ｘ2は、ＩまたはＴであり；Ｘ3は、Ｖ，Ｅ，Ｋ，Ｒ，ＱまたはＴであり；Ｘ4は、ＭまたはＬであり；Ｘ5は、ＳまたはＴであり、Ｘ6は、ＳまたはＴであり；Ｘ7は、ＬまたはＶであり；Ｘ8は、ＡまたはＶであり；Ｘ9は、ＳまたはＴであり；Ｘ10は、Ｐ，Ｖ，Ｌ，ＡまたはＩであり；Ｘ11は、ＥまたはＤであり；Ｘ12は、ＲまたはＴであり；Ｘ13は，ＡまたはＶＩであり；Ｘ14は，ＴまたはＡであり；Ｘ15は，Ｔ、ＳまたはＡであり；Ｘ16は，Ｓ，Ｒ，Ｎ，Ｋ，ＨまたはＱであり；Ｘ17は，ＡまたはＳであり；Ｘ18は，ＱまたはＲであり；Ｘ19は，Ｓ，Ｄ、ＡまたはＰであり；Ｘ20は，Ｓ，Ｇ、Ｒ，ＴまたはＹであり；Ｘ21は，Ｔ，Ｎ，Ｓ、ＤまたはＫであり；Ｘ22は，ＹまたはＤであり；Ｘ23は，ＬまたはＩであり；Ｘ24は，Ａ，ＮまたはＴであり；Ｘ25は，ＫまたはＩであり；Ｘ26は，Ｑ，Ｋ，ＴまたはＩであり；Ｘ27は，Ｒ，Ｋ，Ｑ、Ｎ，Ｈ，ＳまたはＥであり；Ｘ28は，ＶまたはＬであり；Ｘ29は，ＩまたはＶであり；Ｘ30は，Ｆ，Ａ，Ｇ，ＤまたはＳであり；Ｘ31は，ＡまたはＴであり；Ｘ32は，ＳまたはＴであり；Ｘ33は，Ｎ，Ｓ，ＲまたはＴであり；Ｘ34は，Ａ，ＨまたはＱであり；Ｘ35は、ＳまたはＧであり；Ｘ36は、Ｐ，Ｔであり；Ｘ37は、Ｓ，Ｎ，Ｄ、ＧまたはＹであり；Ｘ38は、ＳまたはＴであり；Ｘ39は、ＧまたはＲであり；Ｘ40は、ＴまたはＡであり；Ｘ41は、ＳまたはＲであり；Ｘ42は、ＳまたはＲであり；Ｘ43は、ＰまたはＡであり；Ｘ44は、ＥまたはＤであり；Ｘ45は、Ｆ，ＶまたはＳであり；Ｘ46は、Ｖ，Ｔ，Ｉ、ＡまたはＳであり；Ｘ47は、ＹまたはＳであり；Ｘ48は、Ｓ，ＹまたはＮであり；Ｘ49は、ＳまたはＴであり；Ｘ50は、Ｔ，Ｖ，Ａ、Ｐ，Ｋ，Ｇ，ＳまたはＩであり；Ｘ51は、ＷまたはＹであり；Ｘ52は、ＱまたはＧであり；Ｘ53は、ＶまたはＬであり；およびＸ54は、Ｅ，ＤまたはＡである。
【請求項１５】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつアミノ酸配列
【化２】
2008504215.tif 000034
を含むＶLを有するモノクローナル抗体で、ここで、下線を付した領域は、ＶL／ＣＤＲ１、ＶL／ＣＤＲ２およびＶL／ＣＤＲ３とそれぞれ称され、一方、残りの領域は、フレームワークと称し、ここで、Ｘ1はＱＬまたはＮであり；Ｘ2は、Ｐ  Ａ  ＦまたはＳであり；Ｘ3は、ＶまたはＭであり；Ｘ4は、ＡまたはＴであり；Ｘ5は、ＧまたはＡであり；Ｘ6は、ＲまたはＳであり；Ｘ7は、ＳまたはＴであり；Ｘ8は、Ｓ，Ｔ、ＹまたはＮであり；Ｘ9は、ＩまたはＶであり；Ｘ10は、ＳまたはＲであり；Ｘ11は、Ｓ，Ｐ，Ｎ，ＡまたはＴであり；Ｘ12は，Ｎ，ＴまたはＹであり；Ｘ13は，ＬまたはＦであり；Ｘ14は，ＴまたはＡであり；Ｘ15は，Ｖ，ＬまたはＦであり；Ｘ16は，ＭまたはＩであり；Ｘ17は，Ｇ，ＴまたはＳであり；Ｘ18は，ＮまたはＤであり；Ｘ19は，ＱまたはＥであり；Ｘ20は，ＤまたはＥであり；Ｘ21は，ＦまたはＬであり；Ｘ22は，ＫまたはＲであり；Ｘ23は，ＧまたはＡであり；Ｘ24は，Ｑ，ＬまたはＲであり；Ｘ25は，ＡまたはＧであり；Ｘ26は，Ａ，ＳまたはＴであり；Ｘ27は，Ｎ，ＳまたはＴであり；Ｘ28は，ＴまたはＡであり；およびＸ29は，ＫまたはＱである。
【請求項１６】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつアミノ酸配列
【化３】
2008504215.tif 000035
（配列番号５４）
を含むＶLを有するモノクローナル抗体。
【請求項１７】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつアミノ酸配列
【化４】
2008504215.tif 000036
を含むＶHを有するモノクローナル抗体が提供され、ここで、下線を付した領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３とそれぞれ称され、一方、残りの領域は、Ｋａｂａｔ命名法に従いフレームワークと称し、ここで、Ｘ1はＥまたはＱであり；Ｘ2は、ＶまたはＧであり；Ｘ3は、ＱまたはＥであり；Ｘ4は、ＶまたはＬであり；Ｘ5は、ＳまたはＴであり；Ｘ6は、ＳＴまたはＲであり；Ｘ7は、ＡまたはＶであり；Ｘ8は、ＹまたはＦであり；Ｘ9は、Ｔ，Ｄ，Ｎ，ＳまたはＡであり；Ｘ10は、ＦまたはＬであり；Ｘ11は、Ｔ，Ｄ，Ｙ，Ａ，ＳまたはＮであり；Ｘ12は，Ｎ，ＨまたはＳであり；Ｘ13は，ＹまたはＦであり；Ｘ14は，Ｍ，Ｌ、ＩまたはＶであり；Ｘ15は，Ｉ，ＶまたはＬであり；Ｘ16は，ＬまたはＰであり；Ｘ17は，ＩまたはＶであり；Ｘ18は，ＹまたはＮであり；Ｘ19は，ＴまたはＮであり；Ｘ20は，ＥまたはＡであり；Ｘ21は，Ｐ、ＴまたはＳであり；Ｘ22は，ＡまたはＶであり；Ｘ23は，Ａ，Ｈ，Ｑ，Ｐ，ＤまたはＥであり；Ｘ24は，ＤまたはＥであり；Ｘ25は，ＫまたはＴであり；Ｘ26は，Ｖ，ＦまたはＬであり；Ｘ27は，ＦまたはＩであり；Ｘ28は，ＬまたはＲであり；Ｘ29は，ＤまたはＮであり；Ｘ30は、ＴまたはＮであり；Ｘ31は、ＳまたはＮであり；Ｘ32は、Ｔ，Ｑ，ＰまたはＫであり；Ｘ33は、Ａ，ＶまたはＰであり；Ｘ34は、ＬまたはＭであり；Ｘ35は、ＫまたはＲであり；Ｘ36は、ＨまたはＹであり；Ｘ37は、Ｓ，ＲまたはＴであり；およびＸ38は、ＧまたはＡである。
【請求項１８】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつ配列番号２−５４から構成される群から選択されたアミノ酸配列、さらに好適には配列番号１４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３６、配列番号３７、配列番号４４、配列番号４７および配列番号５４から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含むＶLを有するモノクローナル抗体が提供される。
【請求項１９】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつ配列番号５７−１１０および配列番号２８５−３１０から構成される群から選択されたアミノ酸配列、好適には配列番号６１−６４、配列番号６７、６８、７０、７５、８３、８８、８９、９０，９１，９２，９３、９４および９６−１１０から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含むＶHを有するモノクローナル抗体。
【請求項２０】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつ配列番号１９５−２０９から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含むＶL領域中ＣＤＲ２を有する（ＶL／ＣＤＲ２）モノクローナル抗体が提供される。
【請求項２１】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつ配列番号２１０−２２８から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含むＶL領域中ＣＤＲ３を有する（ＶL／ＣＤＲ３）モノクローナル抗体。
【請求項２２】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつ配列番号２２９−２６９から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含み、好適には配列番号２３２、２３５、２３７、２５１、２５５、２６３および２６５から構成される群から選択したアミノ酸配列を含むＶL領域中フレームワーク領域（ＦＲ）ＣＤＲ３を有する（ＶL／ＦＲ）モノクローナル抗体。
【請求項２３】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつアミノ酸配列
【化５】
2008504215.tif 000037
を含むＶH領域中ＣＤＲ１を有する（ＶH／ＣＤＲ１）モノクローナル抗体で、ここで、Ｘ1はＹまたはＦであり；Ｘ2は、Ｄ，Ｎ，Ｔ，ＳまたはＡであり；Ｘ3は、ＦまたはＬであり；Ｘ4は、Ｔ、Ｄ，Ｓ，Ｙ，ＡまたはＮであり；Ｘ5は、Ｈ，ＮまたはＳであり；Ｘ6は、ＹまたはＦであり；Ｘ7は、Ｍ、Ｌ、ＩまたはＶであるモノクローナル抗体。
【請求項２４】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつアミノ酸配列
【化６】
2008504215.tif 000038
を含むＶH領域中ＣＤＲ２を有する（ＶH／ＣＤＲ２）モノクローナル抗体で、ここで、Ｘ1はＩまたはＶであり；Ｘ2は、ＹまたはＮであり；Ｘ3は、ＴまたはＮであり；Ｘ4は、Ｐ、ＴまたはＳであり；Ｘ5は、ＡまたはＶであり；Ｘ6は、Ａ，Ｑ、Ｐ，Ｈ，ＤまたはＥであり；Ｘ7は、ＤまたはＥであり；およびＸ8は、ＫまたはＴであるモノクローナル抗体。
【請求項２５】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつ配列番号１３６−１５６から構成される群から選択したアミノ酸配列を含むＶH領域中ＣＤＲ２を有する（ＶH／ＣＤＲ２）モノクローナル抗体。
【請求項２６】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつアミノ酸配列
【化７】
2008504215.tif 000039
を含むＶH領域中ＣＤＲ３を有する（ＶH／ＣＤＲ３）モノクローナル抗体で、ここで、Ｘ1はＹまたはＨでありおよびＸ2はＲであるモノクローナル抗体。
【請求項２７】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつ配列番号３１１−３３７から構成される群から選択したアミノ酸配列を含むＶH領域中ＣＤＲ３を有する（ＶH／ＣＤＲ３）モノクローナル抗体。
【請求項２８】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつアミノ酸配列
【化８】
2008504215.tif 000040
を含むＶH領域中ＦＲを有する（ＶH／ＦＲ）モノクローナル抗体で、ここで、Ｘ1は、ＥまたはＱであり；Ｘ2は、ＱまたはＥであり；Ｘ3は、ＶまたはＬであり；Ｘ4は、ＳまたはＴであり；Ｘ5は、Ｓ、ＴまたはＲであり；Ｘ6は、ＡまたはＶであり；Ｘ7は、ＩまたはＶであり；Ｘ8は、ＦまたはＶであり；Ｘ9は、ＦまたはＩであり；Ｘ10は、ＬまたはＲであり、Ｘ11は、ＴまたはＮであり；Ｘ12は，ＳまたはＮであり；Ｘ13は，Ｔ，Ｑ、またはＫであり；Ｘ14は，ＡまたはＶであり；Ｘ15は，ＭまたはＬであり；およびＸ16は、ＧまたはＡであるモノクローナル抗体。
【請求項２９】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合し配列番号１と配列番号７０；配列番号１と配列番号６７；配列番号１と配列番号７５；配列番号１と配列番号８３；配列番号１４と配列番号５５；配列番号１と配列番号１０１；配列番号１と配列番号１００；配列番号１４と配列番号１０２；配列番号１と配列番号１０３；配列番号１と配列番号１０４；配列番号１と配列番号１０５；配列番号３６と配列番号１００；配列番号２６と配列番号１００；配列番号２８と配列番号１００；配列番号３７と配列番号１００；配列番号４４と配列番号１００；配列番号５４と配列番号１００；配列番号４７と配列番号１００から構成された群から選択したＶLおよびＶH対、好適には配列番号２８および６１；配列番号２８および６２；配列番号２８および６３；配列番号２８および６４；配列番号２８および６８；配列番号２８および８５；配列番号２８および８６；配列番号２８および８７；配列番号２８および８８；配列番号２８および８９；配列番号２８および９０；配列番号２８および９１；配列番号２８および９２；配列番号２８および９３；配列番号２８および９４；配列番号２８および９５；配列番号２８および９６；配列番号２８および９７；配列番号２８および９８；配列番号２８および９９；配列番号２８および１０６；配列番号２８および１０７；配列番号２８および１０８；配列番号２８および１０９；配列番号２８および１１０から構成される群から選択されるＶLおよびＶH対を有するモノクローナル抗体。
【請求項３０】
前記抗体が、１０ｎＭに等しいかまたはそれより小さい解離定数Ｋdを有する請求項１４〜２９のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項３１】
前記抗体が、１ｎＭに等しいかまたはそれより小さい解離定数Ｋdを有する請求項１４〜２９のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項３２】
前記抗体が、０．１ｎＭに等しいかまたはそれより小さい解離定数Ｋdを有する請求項１４〜２９のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項３３】
前記抗体が、０．０１ｎＭに等しいかまたはそれより小さい解離定数Ｋdを有する請求項１４〜２９のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互引用）
本出願は、標題“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｉｎ  Ｓｉｌｉｃｏ（タンパク質ライブラリのインシリコ産生と選択）”の２００３年５月２０日出願米国特許出願第１０／４４３，１３４の係属出願であり、これは、標題“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ（構造に基づく抗体ライブラリの選択およびアフィニティ成熟）”の２００２年５月２０日出願米国特許出願第１０／１５３，１５９の係属出願でありかつ標題“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｉｎ  Ｓｉｌｉｃｏ（抗体ライブラリのインシリコ産生アフィニティ成熟）”の２００２年５月２０日出願米国特許出願第１０／１５３，１７６の係属出願であり、それら両者ともに、標題“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｂｓｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｂｒａｒｙ（構造に基づくヒト抗体ライブラリの構築）”の２００２年４月１７日出願米国特許出願第１０／１２５，６８７号の係属出願であり、これは、標題“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｂｒａｒｙ（構造に基づくヒト抗体ライブラリの構築）”の２００１年４月１７日出願米国仮特許出願第６０／２８４，４０７号の利点を請求している。これらの出願類は、本文で参考として引用している。
【０００２】
本発明は、ヒト抗原類に対する抗体類およびこれらの標的類に対して高アフィニティの抗体類を産生する方法類を提供する。さらに詳細には、本発明は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に対するヒト化またはヒト抗体類およびこのような抗ＶＥＧＦ抗体類を産生する方法類を提供している。さらに、本発明は、これらの抗体類およびその誘導体類を用いてインビトロで新脈管形成を阻害するため，および，癌、慢性関節リウマチ、虚血性再潅流関連脳浮腫および傷害、皮質虚血、卵巣過形成および血管過形成、子宮内膜症、乾癬、糖尿病性網膜症、および他の眼科新脈管形成疾患類のような異常新脈管形成に関連した疾患の診断または治療のための組成物類、キット類および方法類を提供する。
【背景技術】
【０００３】
新脈管形成は、多くの生理および病理過程に関与している。新脈管形成は多くの段階から構成され、それらは、最終的に内皮細胞の増殖と分化、および管および空洞の形成（新脈管形成）をもたらす。新脈管形成を促進する因子には、ＶＥＧＦ，ａＦＧＦ，ｂＦＧＦ，ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＨＧＦ、ＴＮＦ−α、アンギオゲニン、ＩＬ−８等が含まれ、一方、新脈管形成を阻害する因子には、トロンボスポンジン（Ｇｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６６２４−６６２８（１９９０））、プロラクチンのＮ末端断片（Ｃｌａｐｐ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３３：１２９２−１２９９（１９９３））、プラスミノーゲンのクリングル５ドメイン（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：２９４６１−２９４６７（１９９６））、アンギオスタチン（Ｏ‘Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，７９：３１５−３２８（１９９４））、およびエンドスタチン（Ｏ‘Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，８８：２７７−２８５（１９９６））が含まれる。
【０００４】
血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）は、血管内皮細胞上においてそのレセプター類とともにそれらの新脈管形成を促進するように特異的に作用する成長因子である。新脈管形成は、既存の血管および／または循環内皮幹細胞からの新しい脈管構造発生に重要な役割を果たすことが、公知となっている（Ａｓａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５（５３０２）：９６４−９６７，１９９７；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２（５）：５４９−５５８、１９９８；Ｆｏｌｋｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎｇ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１０９３１−１０９３４，１９９２）。新脈管形成はまた、胚形成、創傷治癒および月経のような多くの生理プロセスにおいて必須の役割を果たしている。さらに重要なことには、新脈管形成がさらに、腫瘍形成、転移、糖尿病性網膜症等の病理状態にも関係している。固形腫瘍の成長には、酸素および栄養物供給のために腫瘍血管新生が必要であり、腫瘍細胞の転移が、腫瘍血管新生の結果としての血管を介して起こることが公知である。ＶＥＧＦは、腫瘍のためのこの血管新生において中枢的新脈管形成因子であると考えられている。したがって、腫瘍の成長と転移が、ＶＥＧＦの血管新生活性を中和するある物質類によって阻害できると予測される。最近の研究（Ｂｕｒｒｏｗｓ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｐｅ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，６４：１５５−１７４，１９９４；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：８９９６−９０００，１９９４）では、固形腫瘍の血管新生を標的とするこのような戦略を用いている。腫瘍細胞自体よりもむしろ腫瘍血管を標的にすることには、耐性腫瘍細胞の出現につながる可能性がないことおよび標的細胞に容易にアクセスできるという点において、ある利点を有している。さらに、多くの腫瘍細胞が酸素と栄養を単一血管に頼っているので、血管の破壊により抗腫瘍効果が増幅されることになる。
【０００５】
糖尿病のおよそ半分において、糖尿病性網膜症が糖尿病合併症のひとつとして出現する。毛細血管形成が、酸素不足により糖尿病性網膜症において促進されると考えられている。これらの毛細血管は、遅かれ早かれ、破裂出血し、瘢痕組織を形成し、網膜はく離につながる、加齢関連黄斑変性症は、網膜における病理的血管新生に関与することが明らかになったもうひとつの眼科疾患である。したがって、血管新生を阻害することで網膜症の発症を防止できることが予測される。Ｍｉｌｌｅｒらは、サルを用いた実験に基づき、ＶＥＧＦが栄養性網膜症の出現に非常に緊密に関連していると報告した（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．：Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４５，５７４−５８４（１９９４））。この理由のため、ＶＥＧＦの血管新生活性を中和する物質が糖尿病性網膜症およびＡＭＤの予防または治療に有用であると考えられている（Ｌｏｐｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔａｌｍｏ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３７：８５５−８６８（１９９６））。
【０００６】
病理状態における新脈管形成の一次刺激としてＶＥＧＦが認識されたことで、ＶＥＧＦ活性をブロックするためのさまざまな試みがなされることになった。阻害性抗ＶＥＧＦレセプター抗体類、可溶性レセプター構築体類、アンチセンス戦略、ＶＥＧＦに対するＲＮＡアプタマー類および低分子量ＶＥＧＦレセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）阻害剤類は、すべて、ＶＥＧＦシグナル伝達を妨害する用途で提案されている（Ｓｉｅｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．，１７（２）：２４１−２４８．，１９９８）。実際、ＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体類は、マウスにおいてヒト腫瘍移植片増殖ならびに腹水形成を阻害することが明らかとなっている（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ７：５３（１９９２）；Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：８４１−８４４（１９９３）；Ａｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１７：１８５−９０（１９９８）；Ｍｅｓｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１５３（４）：１２４９−１２５６，（１９９８）；Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５８（１２）：２５９４−２６００，（１９９８）；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５８（１２）：２６５２−２６６０，（１９９８）；Ｂｏｒｇｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：４０３２−４０３９（１９９６）；Ｂｏｒｇｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｓｔａｔｅ，３５（１）：１−１０，（１９９８））。さらに、抗新脈管形成分子類、抗ＶＥＧＦ抗体、およびＶＥＧＦ拮抗剤類を用いた同様の戦略が、ＡＭＤおよび糖尿病性網膜症の実験的治療に利用されてきた（Ａｄａｍｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１１４：６６−７１（１９９６））。治療適用のため、抗体類を通常工学的に作製し、もしそれらが元来マウス由来であるならばヒト化によって繰り返し投与して毒性を低下させ、さらに、アフィニティ成熟化により標的分子との結合アフィニティのような他の性質も改善させる（Ｗｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３４９：２９３−２９９，（１９９１）；Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（１６）：１０６７８−８４，（１９９７）；Ｐｒｅｓｔａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７：４５９３−４５９９，（１９９７）；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１；Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２７（１）：７８−８６）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これまでの研究では固形腫瘍増殖におけるＶＥＧＦの重要性、腫瘍治療における標的としてのその可能性が過小評価されてきたが、ＶＥＧＦ誘発新脈管形成を阻害する他の物質類を同定識別することは、治療オプションの数を増やす点で有益であろう。ＶＥＧＦがそのレセプターに結合するのを特異的に阻害する治療剤の開発は、より効果的に新脈管形成を標的にする重要な代替品となるであろうし、治療的に見て潜在的に改善された利点を有する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、所望の構造と機能を有するタンパク質類を工学的に作製するため、特に治療的見地から標的抗原に対する高い結合アフィニティ、インビトロおよびインビボで異常細胞増殖を効果的に阻害する能力および最小の毒性または副作用を含む望ましい性質を有する抗体類を工学的に作製するための革新的方法を提供する。
【０００９】
本発明は、第一に、インシリコおよびインビトロにおいてヒト抗原に対する高いアフィニティと特異性を有する抗体類を設計しかつ選択する方法類を提供する。いくつかの特別の態様において、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する高いアフィニティと特異性を有するヒト化または完全にヒトの抗体類を設計しかつ選択するための方法類が提供される。
【００１０】
本発明は、さらに、ＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体類を提供する。特に、高いアフィニティでヒトＶＥＧＦに結合できるヒト化またはヒト抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体類が提供される。好適には、これらの抗体類は、インビトロで内皮細胞のＶＥＧＦ誘発増殖を阻害しインビボでＶＥＧＦ誘発新脈管形成を阻害できる。これらの抗体類およびそれらの誘導体は、癌、ＡＭＤ、糖尿病性網膜症および病理的新脈管形成に由来する他の疾患のような疾患の診断、予防、および治療のようなさまざまな広い適用において使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
１態様において、ｓｃＦｖ，Ｆａｂまたは他の抗体形状で温度約４℃、２５℃、３７℃または４２℃で測定した解離定数Ｋdが０．２ｎＭに等しいかまたはそれよりも小さいか、適宜０．１ｎＭよりも小さいか、適宜０．０８ｎＭよりも小さいか、適宜０．０５ｎＭよりも小さいか、０．０１ｎＭよりも小さいか、または０．００５ｎＭよりも小さいヒトＶＥＧＦに特異的に結合するモノクローナル抗体が提供される。
【００１２】
好適には、前記抗ＶＥＧＦ抗体のＫdは、もしｓｃＦｖの形状でありかつ温度３５−３７℃で測定したならば、１ｎＭ未満で、適宜０．８ｎＭ未満で、適宜０．５ｎＭ未満で、適宜０．２ｎＭ未満で、適宜０．１ｎＭ未満で、適宜０．０８ｎＭ未満で、適宜０．０５ｎＭ未満で、適宜０．０１ｎＭ未満で、または適宜０．００５ｎＭ未満である。
【００１３】
また好適には、前記抗ＶＥＧＦ抗体のＫdは、もしＦａｂの形状でありかつ温度３５−３７℃で測定したならば、０．５ｎＭ未満で、適宜０．２ｎＭ未満で、適宜０．１ｎＭ未満で、適宜０．０８ｎＭ未満で、適宜０．０５ｎＭ未満で、適宜０．０１ｎＭ未満で、または適宜０．００５ｎＭ未満である。
【００１４】
インビトロにおけるＶＥＧＦ誘発内皮細胞増殖阻害において、前記抗ＶＥＧＦ抗体は、ｓｃＦｖ，Ｆａｂまたは他の抗体形状において、好適には、細胞増殖５０％阻害の有効用量ＥＤ50が、１０ｎＭに等しいかそれよりも小さく、適宜５ｎＭ未満で、適宜１ｎＭ未満で、適宜０．５ｎＭ未満で、適宜０．１ｎＭ未満で、適宜０．０５ｎＭ未満で、適宜０．０１ｎＭ未満である。
【００１５】
好適な態様において、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつアミノ酸配列
【化１】
2008504215.tif 000002
を含むＶLを有するモノクローナル抗体が提供され、ここで、下線を付した領域は、ＶL／ＣＤＲ１、ＶL／ＣＤＲ２およびＶL／ＣＤＲ３とそれぞれ称され、一方、残りの領域は、フレームワークと称し、ここで、Ｘ1はＤ，ＥまたはＡであり；Ｘ2は、ＩまたはＴであり；Ｘ3は、Ｖ，Ｅ，Ｋ，Ｒ，ＱまたはＴであり；Ｘ4は、ＭまたはＬであり；Ｘ5は、ＳまたはＴであり、Ｘ6は、ＳまたはＴであり；Ｘ7は、ＬまたはＶであり；Ｘ8は、ＡまたはＶであり；Ｘ9は、ＳまたはＴであり；Ｘ10は、Ｐ，Ｖ，Ｌ，ＡまたはＩであり；Ｘ11は、ＥまたはＤであり；Ｘ12は、ＲまたはＴであり；Ｘ13は，ＡまたはＶＩであり；Ｘ14は，ＴまたはＡであり；Ｘ15は，Ｔ、ＳまたはＡであり；Ｘ16は，Ｓ，Ｒ，Ｎ，Ｋ，ＨまたはＱであり；Ｘ17は，ＡまたはＳであり；Ｘ18は，ＱまたはＲであり；Ｘ19は，Ｓ，Ｄ、ＡまたはＰであり；Ｘ20は，Ｓ，Ｇ、Ｒ，ＴまたはＹであり；Ｘ21は，Ｔ，Ｎ，Ｓ、ＤまたはＫであり；Ｘ22は，ＹまたはＤであり；Ｘ23は，ＬまたはＩであり；Ｘ24は，Ａ，ＮまたはＴであり；Ｘ25は，ＫまたはＩであり；Ｘ26は，Ｑ，Ｋ，ＴまたはＩであり；Ｘ27は，Ｒ，Ｋ，Ｑ、Ｎ，Ｈ，ＳまたはＥであり；Ｘ28は，ＶまたはＬであり；Ｘ29は，ＩまたはＶであり；Ｘ30は，Ｆ，Ａ，Ｇ，ＤまたはＳであり；Ｘ31は，ＡまたはＴであり；Ｘ32は，ＳまたはＴであり；Ｘ33は，Ｎ，Ｓ，ＲまたはＴであり；Ｘ34は，Ａ，ＨまたはＱであり；Ｘ35は、ＳまたはＧであり；Ｘ36は、Ｐ，Ｔであり；Ｘ37は、Ｓ，Ｎ，Ｄ、ＧまたはＹであり；Ｘ38は、ＳまたはＴであり；Ｘ39は、ＧまたはＲであり；Ｘ40は、ＴまたはＡであり；Ｘ41は、ＳまたはＲであり；Ｘ42は、ＳまたはＲであり；Ｘ43は、ＰまたはＡであり；Ｘ44は、ＥまたはＤであり；Ｘ45は、Ｆ，ＶまたはＳであり；Ｘ46は、Ｖ，Ｔ，Ｉ、ＡまたはＳであり；Ｘ47は、ＹまたはＳであり；Ｘ48は、Ｓ，ＹまたはＮであり；Ｘ49は、ＳまたはＴであり；Ｘ50は、Ｔ，Ｖ，Ａ、Ｐ，Ｋ，Ｇ，ＳまたはＩであり；Ｘ51は、ＷまたはＹであり；Ｘ52は、ＱまたはＧであり；Ｘ53は、ＶまたはＬであり；およびＸ54は、Ｅ，ＤまたはＡである。
【００１６】
このようにして産生した抗体を所望のアフィニティを有するヒトＶＥＧＦに結合させると、このような好適なＶL配列類を、前記の好適なＶH配列類または他の抗体のＶHと組み合わせることもできる。
【００１７】
さらに別の好適な態様において、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつアミノ酸配列
【化２】
2008504215.tif 000003
を含むＶLを有するモノクローナル抗体が提供され、ここで、下線を付した領域は、ＶL／ＣＤＲ１、ＶL／ＣＤＲ２およびＶL／ＣＤＲ３とそれぞれ称され、一方、残りの領域は、フレームワークと称し、ここで、Ｘ1はＱＬまたはＮであり；Ｘ2は、Ｐ  Ａ  ＦまたはＳであり；Ｘ3は、ＶまたはＭであり；Ｘ4は、ＡまたはＴであり；Ｘ5は、ＧまたはＡであり；Ｘ6は、ＲまたはＳであり；Ｘ7は、ＳまたはＴであり；Ｘ8は、Ｓ，Ｔ、ＹまたはＮであり；Ｘ9は、ＩまたはＶであり；Ｘ10は、ＳまたはＲであり；Ｘ11は、Ｓ，Ｐ，Ｎ，ＡまたはＴであり；Ｘ12は，Ｎ，ＴまたはＹであり；Ｘ13は，ＬまたはＦであり；Ｘ14は，ＴまたはＡであり；Ｘ15は，Ｖ，ＬまたはＦであり；Ｘ16は，ＭまたはＩであり；Ｘ17は，Ｇ，ＴまたはＳであり；Ｘ18は，ＮまたはＤであり；Ｘ19は，ＱまたはＥであり；Ｘ20は，ＤまたはＥであり；Ｘ21は，ＦまたはＬであり；Ｘ22は，ＫまたはＲであり；Ｘ23は，ＧまたはＡであり；Ｘ24は，Ｑ，ＬまたはＲであり；Ｘ25は，ＡまたはＧであり；Ｘ26は，Ａ，ＳまたはＴであり；Ｘ27は，Ｎ，ＳまたはＴであり；Ｘ28は，ＴまたはＡであり；およびＸ29は，ＫまたはＱである。
【００１８】
このようにして産生した抗体を所望のアフィニティを有するヒトＶＥＧＦに結合させると、このような好適なＶL配列類を、前記の好適なＶH配列類または他の抗体のＶHと組み合わせることもできる。
【００１９】
さらに別の好適な態様において、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつアミノ酸配列
【化３】
2008504215.tif 000004
（配列番号５４）
を含むＶLを有するモノクローナル抗体が提供される。このようにして産生した抗体を所望のアフィニティでヒトＶＥＧＦに結合させると、このＶL配列類を、前記の好適なＶH配列類または他の抗体のＶHと組み合わせることもできる。
【００２０】
さらに別の好適な態様において、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつアミノ酸配列
【化４】
2008504215.tif 000005
を含むＶHを有するモノクローナル抗体が提供され、ここで、下線を付した領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３とそれぞれ称され、一方、残りの領域は、Ｋａｂａｔ命名法に従いフレームワークと称し、ここで、Ｘ1はＥまたはＱであり；Ｘ2は、ＶまたはＧであり；Ｘ3は、ＱまたはＥであり；Ｘ4は、ＶまたはＬであり；Ｘ5は、ＳまたはＴであり；Ｘ6は、ＳＴまたはＲであり；Ｘ7は、ＡまたはＶであり；Ｘ8は、ＹまたはＦであり；Ｘ9は、Ｔ，Ｄ，Ｎ，ＳまたはＡであり；Ｘ10は、ＦまたはＬであり；Ｘ11は、Ｔ，Ｄ，Ｙ，Ａ，ＳまたはＮであり；Ｘ12は，Ｎ，ＨまたはＳであり；Ｘ13は，ＹまたはＦであり；Ｘ14は，Ｍ，Ｌ、ＩまたはＶであり；Ｘ15は，Ｉ，ＶまたはＬであり；Ｘ16は，ＬまたはＰであり；Ｘ17は，ＩまたはＶであり；Ｘ18は，ＹまたはＮであり；Ｘ19は，ＴまたはＮであり；Ｘ20は，ＥまたはＡであり；Ｘ21は，Ｐ、ＴまたはＳであり；Ｘ22は，ＡまたはＶであり；Ｘ23は，Ａ，Ｈ，Ｑ，Ｐ，ＤまたはＥであり；Ｘ24は，ＤまたはＥであり；Ｘ25は，ＫまたはＴであり；Ｘ26は，Ｖ，ＦまたはＬであり；Ｘ27は，ＦまたはＩであり；Ｘ28は，ＬまたはＲであり；Ｘ29は，ＤまたはＮであり；Ｘ30は、ＴまたはＮであり；Ｘ31は、ＳまたはＮであり；Ｘ32は、Ｔ，Ｑ，ＰまたはＫであり；Ｘ33は、Ａ，ＶまたはＰであり；Ｘ34は、ＬまたはＭであり；Ｘ35は、ＫまたはＲであり；Ｘ36は、ＨまたはＹであり；Ｘ37は、Ｓ，ＲまたはＴであり；およびＸ38は、ＧまたはＡである。
【００２１】
このようにして産生した抗体を所望のアフィニティを有するヒトＶＥＧＦに結合させると、このような好適なＶH配列類を、前記の好適なＶL配列類または他の抗体のＶLと組み合わせることもできる。
【００２２】
さらに１態様において、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつ配列番号２−５４から構成される群から選択されたアミノ酸配列、好適には配列番号１４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３６、配列番号３７、配列番号４４、配列番号４７および配列番号５４から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含むＶLを有するモノクローナル抗体が提供される。
【００２３】
このようにして産生した抗体を所望のアフィニティでヒトＶＥＧＦに結合させると、この好適なＶL配列類を、前記の好適なＶH配列類または他の抗体のＶHと組み合わせることもできる。
【００２４】
１態様において、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつ配列番号５７−１１０および配列番号２８５−３１０から構成される群から選択されたアミノ酸配列、好適には配列番号６１−６４、配列番号６７、６８、７０、７５、８３、８８、８９、９０，９１，９２，９３、９４および９６−１１０から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含むＶHを有するモノクローナル抗体が提供される。
【００２５】
このようにして産生した抗体を所望のアフィニティでヒトＶＥＧＦに結合させると、このＶH配列類を、前記の好適なＶL配列類または他の抗体のＶLと組み合わせることもできる。
【００２６】
さらに１態様において、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつ配列番号１６４−１９４から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含むＶL領域中ＣＤＲ１（ＶL／ＣＤＲ１）を有するモノクローナル抗体が提供される。
【００２７】
このようにして産生した抗体を所望のアフィニティでヒトＶＥＧＦに結合させると、このような好適なＶL／ＣＤＲ１を、好適な軽鎖または他の軽鎖の他の領域および前記の好適な重鎖可変領域配列とまたは他の重鎖可変領域配列類と組み合わせることもできる。
【００２８】
さらに別の態様において、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつ配列番号１９５−２０９から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含むＶL領域中ＣＤＲ２（ＶL／ＣＤＲ２）を有するモノクローナル抗体が提供される。
【００２９】
このようにして産生した抗体を所望のアフィニティでヒトＶＥＧＦに結合させると、このような好適なＶL／ＣＤＲ２を、好適な軽鎖または他の軽鎖の他の領域および前記の好適な重鎖可変領域配列とまたは他の重鎖可変領域配列と組み合わせることもできる。
【００３０】
さらに別の態様において、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつ配列番号２１０−２２８から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含むＶL領域中ＣＤＲ３（ＶL／ＣＤＲ３）を有するモノクローナル抗体が提供される。
【００３１】
このようにして産生した抗体を所望のアフィニティでヒトＶＥＧＦに結合させると、このような好適なＶL／ＣＤＲ３を、好適な軽鎖または他の軽鎖の他の領域および前記の好適な重鎖可変領域配列とまたは他の重鎖可変領域配列と組み合わせることもできる。
【００３２】
さらに別の態様において、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつ配列番号２２９−２６９から構成される群から選択されたアミノ酸配列、および好適には配列番号２３２、２３５、２３７、２５１、２５５、２６３および２６５から構成される群から選択したアミノ酸配列を含むＶL領域中フレームワーク領域（ＦＲ）ＣＤＲ３（ＶL／ＦＲ）を有するモノクローナル抗体が提供される。
【００３３】
このようにして産生した抗体を所望のアフィニティを有するヒトＶＥＧＦに結合させると、このような好適なＶL／ＦＲを、好適な軽鎖または他の軽鎖のＣＤＲ領域および前記の好適な重鎖可変領域配列とまたは他の重鎖可変領域配列と組み合わせることもできる。
【００３４】
さらに１態様において、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつアミノ酸配列
【化５】
2008504215.tif 000006
を含むＶH領域中ＣＤＲ１（ＶH／ＣＤＲ１）を有するモノクローナル抗体が提供され、ここで、Ｘ1は、ＹまたはＦであり；Ｘ2は、Ｄ，Ｎ，Ｔ，ＳまたはＡであり；Ｘ3は、ＦまたはＬであり；Ｘ4は、Ｔ，Ｄ，Ｓ、Ｙ，ＡまたはＮであり；Ｘ5は、Ｈ，ＮまたはＳであり；Ｘ6は、ＹまたはＦであり；Ｘ7は、Ｍ，Ｌ，ＩまたはＶである。
【００３５】
さらに好適には、前記モノクローナル抗体のＶH／ＣＤＲ１は配列番号１１１−１３５から構成される群から選択されたアミノ酸を含む。
【００３６】
このようにして産生した抗体を所望のアフィニティを有するヒトＶＥＧＦに結合させると、このような好適なＶH／ＣＤＲ１を、好適な重鎖または他の重鎖の他の領域および前記の好適な軽鎖可変領域配列とまたは他の軽鎖可変領域と組み合わせることもできる。
【００３７】
１態様において、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつアミノ酸配列
【化６】
2008504215.tif 000007
を含むＶH領域中ＣＤＲ２（ＶH／ＣＤＲ２）を有するモノクローナル抗体が提供され、ここで、Ｘ1はＩまたはＶであり；Ｘ2は、ＹまたはＮであり；Ｘ3は、ＴまたはＮであり；Ｘ4は、Ｐ，ＴまたはＳであり；Ｘ5は、ＡまたはＶであり；Ｘ6は、Ａ，Ｑ，Ｐ、Ｈ，ＤまたはＥであり；Ｘ7は、ＤまたはＥであり；およびＸ8は、ＫまたはＴである。
【００３８】
好適には、前記モノクローナル抗体のＶH／ＣＤＲ２は、配列番号１３６−１５６から構成される群から選択したアミノ酸配列を含む。
【００３９】
このようにして産生した抗体を所望のアフィニティを有するヒトＶＥＧＦに結合させると、このような好適なＶH／ＣＤＲ２を、好適な重鎖または他の重鎖の他の領域および前記の好適な軽鎖可変領域配列とまたは他の軽鎖可変領域配列と組み合わせることもできる。
【００４０】
１態様において、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつアミノ酸配列
【化７】
2008504215.tif 000008
を含むＶH領域中ＣＤＲ３（ＶH／ＣＤＲ３）を有するモノクローナル抗体が提供され、ここで、Ｘ1はＹまたはＨであり、および、Ｘ2はＲである。
【００４１】
好適には、抗ＶＥＧＦ抗体ＶH／ＣＤＲ３は、配列番号３１１−３３７から構成される群から選択したアミノ酸配列を有する。
【００４２】
このようにして産生した抗体を所望のアフィニティを有するヒトＶＥＧＦに結合させると、このような好適なＶH／ＣＤＲ３を、好適な重鎖または他の重鎖の他の領域および前記の好適な軽鎖可変領域配列類とまたは他の軽鎖可変領域配列類と組み合わせることもできる。
【００４３】
１態様において、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつアミノ酸配列
【化８】
2008504215.tif 000009
を含むＶH領域中ＦＲ（ＶH／ＦＲ）を有するモノクローナル抗体が提供され、ここで、Ｘ1はＥまたはＱであり；Ｘ2は、ＱまたはＥであり；Ｘ3は、ＶまたはＬであり；Ｘ4は、ＳまたはＴであり；Ｘ5は、Ｓ、ＴまたはＲであり；Ｘ6は、ＡまたはＶであり；Ｘ7は、ＩまたはＶであり；Ｘ8は、ＦまたはＶであり；Ｘ9は、ＦまたはＩであり；Ｘ10は、ＬまたはＲであり；Ｘ11は、ＴまたはＮであり；Ｘ12は、ＳまたはＮであり；Ｘ13は，Ｔ，ＱまたはＫであり；Ｘ14は、ＡまたはＶであり；Ｘ15は、ＭまたはＬであり；および、Ｘ16は、ＧまたはＡである。
【００４４】
１態様において、ＶＥＧＦに特異的に結合しかつ配列番号１および７０；配列番号１および６７；配列番号１および７５；配列番号１および８３；配列番号１４および５５；配列番号１および１０１；配列番号１および１００；配列番号１４および１０２；配列番号１および１０３；配列番号１および１０４；配列番号１および１０５；配列番号３６および１００；配列番号２６および１００；配列番号２８および１００；配列番号３７および１００；配列番号４４および１００；配列番号５４および１００；配列番号４７および１００から構成される群から選択したＶLおよびＶH対、好適には配列番号２８および６１；配列番号２８および６２；配列番号２８および６３；配列番号２８および６４；配列番号２８および６８；配列番号２８および８５；配列番号２８および８６；配列番号２８および８７；配列番号２８および８８；配列番号２８および８９；配列番号２８および９０；配列番号２８および９１；配列番号２８および９２；配列番号２８および９３；配列番号２８および９４；配列番号２８および９５；配列番号２８および９６；配列番号２８および９７；配列番号２８および９８；配列番号２８および９９；配列番号２８および１０６；配列番号２８および１０７；配列番号２８および１０８；配列番号２８および１０９；配列番号２８および１１０から構成される群から選択されるＶLおよびＶH対を有するモノクローナル抗体が提供される。
【００４５】
ヒトＶＥＧＦに対する上記抗体の結合アフィニティは解離定数Ｋdにより表され、適宜１００ｎＭ未満であり、適宜１０ｎＭ未満であり、適宜８ｎＭ未満であり、適宜５ｎＭ未満であり、適宜１ｎＭ未満であり、適宜０．８ｎＭ未満であり、適宜０．５ｎＭ未満であり、適宜０．２ｎＭ未満であり、適宜０．１ｎＭ未満であり、適宜０．０８ｎＭ未満であり、適宜０．０５ｎＭ未満であり、適宜０．０１ｎＭ未満であり、適宜０．００５ｎＭ未満であり、ｓｃＦｖ，Ｆａｂまたは抗体の他の形態で温度約４℃、２５℃、３７℃または４２℃で測定する。
【００４６】
本発明に開示した全長ＶHおよびＶL、ＶH／ＣＤＲ，ＶH／ＦＲ，ＶL／ＣＤＲ、ＶL／ＦＲ（例  図１Ａおよび１Ｂに示したヒット変異体および図１Ｃおよび１Ｄに示したアミノ酸配列類）の組み合わせの結果としての抗体類も、また、本発明の範囲に含まれ；このような組み合わせには、米国特許出願第０９／０５６，１６０号、公報２００２／００３２３１５に開示した抗ＶＥＧＦ抗体類が含まない。
（発明の詳細な説明）
【００４７】
本発明は、所望の構造と機能を有するたんぱく質類、特に抗体類を工学的に作製する革新的方法を提供する。第一に、ヒト抗原に対する高いアフィニティと特異性を有する抗体類を設計しかつ選択する方法類を提供する。いくつかの特別の態様において、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対するヒト化または完全にヒトの、高いアフィニティと特異性を有する抗体類を設計しかつ選択するための方法類が提供される。別の面において、インビトロで新脈管形成を阻害するためのこれらの抗体類およびそれらの誘導体類を使用するため、および癌、慢性関節リウマチ、虚血性再潅流関連脳浮腫および傷害、皮質虚血、卵巣過形成および血管過形成、子宮内膜症、乾癬、糖尿病性網膜症、および他の眼科新脈管形成疾患類のような異常新脈管形成に関連した疾患の診断または治療のための組成物類、キット類および方法類を提供する。
【００４８】
１．ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ抗体類
ＶＥＧＦは、発生における重要な脈管新生因子であり、内皮細胞を刺激することによる固形腫瘍の増殖に関与している。マウスモノクローナル抗体が、ＶＥＧＦ依存性細胞増殖をブロックしインビボにおける腫瘍増殖を遅らせることがわかった（Ｋｉｍ  ＫＪ，  Ｌｉ  Ｂ，  Ｗｉｎｅｒ  Ｊ，  Ａｒｍａｎｉｎｉ  Ｍ，Ｇｉｌｌｅｔｔ  Ｎ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＨＳ，Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６２，８４１−８４４）。このマウス抗体をヒト化し（Ｐｒｅｓｔａ  ＬＧ，Ｃｈｅｎ  Ｈ，Ｏ‘Ｃｏｎｎｏｒ  ＳＪ，Ｃｈｉｓｈｏｌｍ  Ｖ，Ｍｅｎｇ  ＹＧ，Ｋｒｕｍｍｅｎ  Ｌ，Ｗｉｎｋｌｅｒ  Ｍ，Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７，４５９３−４５９９；Ｂａｃａ  Ｍ，Ｐｒｅｓｔａ  ＬＧ，Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  ＳＪ，Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２，１０６７８−１０６８４）およびファージディスプレイおよびオフ速度選択を用いてアフィニティ成熟させた（Ｃｈｅｎ  Ｙ，Ｗｉｅｓｍａｎｎ  Ｃ，Ｆｕｈ  Ｇ，Ｌｉ  Ｂ，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｇｅｒ  ＨＷ，ＭｃＫａｙ  Ｐ，  ｄｅ  Ｖｏｓ  ＡＭ（１９９９）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９３，８６５−８８１）。ＶＥＧＦとその親抗体の間で形成した複合体のＸ線構造が報告されており（Ｍｕｌｌｅｒ  ＹＡ，Ｃｈｅｎ  Ｙ，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｇｅｒ  ＨＷ，Ｌｉ  Ｂ，Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，  ＢＣ，Ｌｏｗｍａｎ  ＨＢ，  ｄｅ  Ｖｏｓ  ＡＭ（１９９８）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６，１１５３−１１６７）、さらにＶＥＧＦと成熟抗体との間に形成されたものについても報告されている（Ｃｈｅｎ  Ｙ，Ｗｉｅｓｍａｎ  Ｃ，Ｆｕｈ  Ｇ，Ｌｉ  Ｂ，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｇｅｒ  ＨＷ，ＭｃＫａｙ  Ｐ，ｄｅ  Ｖｏｓ  ＡＭ，Ｌｏｗｍａｎ  ＨＢ（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９３，８６５−８８１）。さらに、米国特許出願番号第０９／０５６，１６０、公報２００２／００３２３１５は、ある抗ＶＥＧＦ抗体類を開示している。ＶＥＧＦと抗ＶＥＧＦ抗体類に関するこれらの公報は、本文でその全文を参考として引用した。
【００４９】
本発明は、ヒトＶＥＧＦに高いアフィニティと特異性で結合する新規抗ＶＥＧＦ抗体類を提供する。これらの抗ＶＥＧＦ抗体類はヒト化され最適化され、結合アフィニティ、安定性、発現効率において研究、診断および治療適用に望ましいいくつかの重要性質を有する。
【００５０】
ヒトＶＥＧＦに対する本発明の選択された抗ＶＥＧＦ抗体類の結合アフィニティは解離定数Ｋdにより表され、適宜１００ｎＭ未満であり、適宜１０ｎＭ未満であり、適宜８ｎＭ未満であり、適宜８ｎＭ未満であり、適宜５ｎＭ未満であり、適宜１ｎＭ未満であり、適宜０．８ｎＭ未満であり、適宜０．５ｎＭ未満であり、適宜０．２ｎＭ未満であり、適宜０．１ｎＭ未満であり、適宜０．０８ｎＭ未満であり、適宜０．０５ｎＭ未満であり、適宜０．０１ｎＭ未満であり、適宜０．００５ｎＭ未満であり、ｓｃＦｖ，Ｆａｂまたは抗体の他の形態で温度約４℃、２５℃、３７℃または４２℃で測定する。
【００５１】
好適には、本発明の選択した抗ＶＥＧＦ抗体類のＫdは、もしｓｃＦｖの形態でかつ３５−３７℃で測定したならば、適宜１ｎＭ未満であり、適宜０．０８ｎＭ未満であり、適宜０．５ｎＭ未満であり、適宜０．２ｎＭ未満であり、適宜０．１ｎＭ未満であり、適宜０．０８ｎＭ未満であり、適宜０．０５ｎＭ未満であり、適宜０．０１ｎＭ未満でありまたは適宜０．００５ｎＭ未満である。
【００５２】
また、好適には、本発明の選択した抗ＶＥＧＦ抗体類のＫdは、もしＦａｂの形態でかつ３５−３７℃で測定したならば、適宜０．５ｎＭ未満であり、適宜０．２ｎＭ未満であり、適宜０．１ｎＭ未満であり、適宜０．０８ｎＭ未満であり、適宜０．０５ｎＭ未満であり、適宜０．０１ｎＭ未満でありまたは適宜０．００５ｎＭ未満である。
【００５３】
インビトロにおける内皮細胞のＶＥＧＦ誘発増殖の阻害において、選択した本発明の抗ＶＥＧＦ抗体類は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂまたは他の抗体形態であるならば１０ｎＭに等しいかそれより未満であり、適宜５ｎＭ未満であり、適宜１ｎＭ未満であり、適宜０．５ｎＭ未満であり、適宜０．１ｎＭ未満であり、適宜０．０５ｎＭ未満であり、または適宜０．０１ｎＭ未満であるＥＤ50（５０％細胞増殖阻害有効量）を有する。
【００５４】
好適な態様において、アミノ酸配列：
【化９】
2008504215.tif 000010
を含む軽鎖可変領域を有する抗ＶＥＧＦ抗体が提供され、ここで、下線を付した領域は、ＶL／ＣＤＲ１，ＶL／ＣＤＲ２およびＶL／ＣＤＲ３とそれぞれ称され、残りの領域は、フレームワークと称され、ここで、“Ｘ”と称された位置は、下記のアミノ酸類であることができる：
【化１０】
2008504215.tif 000011
【化１１】
2008504215.tif 000012
【００５５】
このような好適な軽鎖可変領域配列類は、このようにした作製した抗体がヒトＶＥＧＦに所望のアフィニティで結合するならば、前記の好適な重鎖可変領域配列類とまたは他の重鎖可変領域配列類と組み合わせることができる。
【００５６】
別の好適な態様において、アミノ酸配列：
【化１２】
2008504215.tif 000013
を含む軽鎖可変領域を有する抗ＶＥＧＦ抗体が提供され、ここで、下線を付した領域は、ＶL／ＣＤＲ１，ＶL／ＣＤＲ２およびＶL／ＣＤＲ３とそれぞれ称され、残りの領域は、フレームワークと称され、ここで、“Ｘ”と称された位置は、下記のアミノ酸類であることができる：
【化１３】
2008504215.tif 000014
【００５７】
このような好適な軽鎖可変領域配列類は、このようにした作製した抗体がヒトＶＥＧＦに所望のアフィニティで結合するならば、前記の好適な重鎖可変領域配列類とまたは他の重鎖可変領域配列類と組み合わせることができる。
【００５８】
さらに別の好適な態様において、アミノ酸配列：
【化１４】
2008504215.tif 000015
（配列番号５４）
を含む軽鎖可変領域を有する抗ＶＥＧＦ抗体が提供され、このような好適な軽鎖可変領域配列類は、このようにした作製した抗体がヒトＶＥＧＦに所望のアフィニティで結合するならば、前記重鎖可変領域配列類とまたは他の重鎖可変領域配列類と組み合わせることができる。
【００５９】
さらに別の好適な態様において、アミノ酸配列：
【化１５】
2008504215.tif 000016
を含む軽鎖可変領域を有する抗ＶＥＧＦ抗体が提供され、ここで、下線を付した領域は、ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３とそれぞれ称され、残りの領域は、Ｋａｂａｔ命名法によりフレームワークと称され、ここで、“Ｘ”と称された位置は、下記のアミノ酸類であることができる：
【化１６】
2008504215.tif 000017
【００６０】
さらに別の好適な態様において、アミノ酸配列：
【化１７】
2008504215.tif 000018
を含む重鎖可変領域を有する抗ＶＥＧＦ抗体が提供され、ここで、下線を付した領域は、ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３とそれぞれ称され、残りの領域は、Ｋａｂａｔ命名法によりフレームワークと称され、ここで、“Ｘ”と称された位置は、下記のアミノ酸類であることができる：
【化１８】
2008504215.tif 000019
【化１９】
2008504215.tif 000020
【００６１】
このような好適な重鎖可変領域配列類は、このようにした作製した抗体がヒトＶＥＧＦに所望のアフィニティで結合するならば、前記の好適な軽鎖可変領域配列類とまたは他の軽鎖可変領域配列類と組み合わせることができる。
【００６２】
１態様において、本発明は、下記：配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２７，配列番号２９，配列番号３０，配列番号３１，配列番号３２，配列番号３３，配列番号３４，配列番号３５，配列番号３８，配列番号３９，配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２および配列番号５３のうちのひとつのアミノ酸配列類を含む軽鎖可変領域、さらに好適には配列番号１４、配列番号２６，配列番号２８，配列番号３６，配列番号３７，配列番号４４、配列番号４７または配列番号５４を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗ＶＥＧＦ抗体が提供される。このような好適な軽鎖可変領域配列類は、このようにした作製した抗体がヒトＶＥＧＦに所望のアフィニティで結合するならば、前記の好適な重鎖可変領域配列類とまたは他の重鎖可変領域配列類と組み合わせることができる。
【００６３】
別の態様において、本発明は、下記：配列番号５７，配列番号５８，配列番号５９，配列番号６０，配列番号６５，配列番号６６，配列番号６９，配列番号７１，配列番号７２，配列番号７３，配列番号７４，配列番号７６，配列番号７７，配列番号７８，配列番号７９，配列番号８０，配列番号８１，配列番号８２，配列番号８４，配列番号８５，配列番号８６，配列番号８７のうちのひとつのアミノ酸配列類を含む軽鎖可変領域、さらに好適には配列番号６１、または配列番号６２，または配列番号６３，または配列番号６４，または配列番号６７、または配列番号６８、または配列番号７０、または配列番号７５、または配列番号８３、配列番号８８、または配列番号８９、または配列番号９０、または配列番号９１、または配列番号９２、または配列番号９３、または配列番号９４、または配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、または配列番号９９、配列番号１００、または配列番号１０１、または配列番号１０２、または配列番号１０３、または配列番号１０４、または配列番号１０５、または配列番号１０６、配列番号１０７または配列番号１０８、または配列番号１０９、配列番号１１０；または配列番号２８５−３１０のひとつを含むアミノ酸配列の重鎖可変領域を含む抗ＶＥＧＦ抗体が提供される。このような好適な重鎖可変領域配列は、このようにした作製した抗体がヒトＶＥＧＦに所望のアフィニティで結合するならば、前記の好適な軽鎖可変領域配列とまたは他の軽鎖可変領域配列と組み合わせることができる。
【００６４】
さらに別の態様において、本発明は、下記：配列番号１６４，配列番号１６５，配列番号１６６，配列番号１６７，配列番号１６８，配列番号１６９，配列番号１７０，配列番号１７１，配列番号１７２，配列番号１７３，配列番号１７４，配列番号１７５，配列番号１７６、配列番号１７７，配列番号１７８，配列番号１７９，配列番号１８０，配列番号１８１，配列番号１８２，配列番号１８３、配列番号１８４，配列番号１８５，配列番号１８６，配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、および配列番号１９４のひとつのアミノ酸配列類を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１領域を含む抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。軽鎖可変領域のこのように好適なＣＤＲ１配列は、このようにした作製した抗体がヒトＶＥＧＦに所望のアフィニティで結合するならば、好適な軽鎖または他の軽鎖の他の領域類および前記好適な重鎖可変領域配列とまたは他の重鎖可変領域配列と組み合わせることができる。
【００６５】
さらに別の態様において、本発明は、下記：配列番号１９５、配列番号１９６，配列番号１９７，配列番号１９８，配列番号１９９，配列番号２００，配列番号２０１，配列番号２０２，配列番号２０３，配列番号２０４，配列番号２０５，配列番号２０６，配列番号２０７、配列番号２０８，および配列番号２０９のひとつのアミノ酸配列類を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２領域を含む抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。軽鎖可変領域のこのような好適な配列は、このようにした作製した抗体がヒトＶＥＧＦに所望のアフィニティで結合するならば、好適な軽鎖または他の軽鎖の他の領域類および前記好適な重鎖可変領域配列とまたは他の重鎖可変領域配列と組み合わせることができる。
【００６６】
さらに別の態様において、下記：配列番号２１０，配列番号２１１，配列番号２１２，配列番号２１３，配列番号２１４，配列番号２１５，配列番号２１６，配列番号２１７，配列番号２１８，配列番号２１９，配列番号２２０，配列番号２２１，配列番号２２２，配列番号２２３，配列番号２２４，配列番号２２５，配列番号２２６，配列番号２２７および配列番号２２８のうちのひとつのアミノ酸配列類を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３領域を含む抗ＶＥＧＦ抗体が提供される。軽鎖可変領域のこのような好適なＣＤＲ３配列は、このようにした作製した抗体がヒトＶＥＧＦに所望のアフィニティで結合するならば、好適な軽鎖または他の軽鎖の他の領域類および前記好適な重鎖可変領域配列とまたは他の重鎖可変領域配列と組み合わせることができる。
【００６７】
さらに別の態様において、下記：配列番号２２９，配列番号２３０，配列番号２３１，配列番号２３３，配列番号２３４，配列番号２３６，配列番号２３８，配列番号２３９，配列番号２４０，配列番号２４１，配列番号２４２，配列番号２４３，配列番号２４４，配列番号２４５，配列番号２４６、配列番号２４７，配列番号２４８，配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５３、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２６１、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号２６７、配列番号２６８および配列番号２６９のうちのひとつのアミノ酸配列類を含む軽鎖可変領域のフレームワーク領域を含む抗ＶＥＧＦ抗体、さらに好適には、下記：配列番号２３２、配列番号２３５、配列番号２３７、配列番号２５１、配列番号２５５、配列番号２６３、および配列番号２６５のうちのひとつのアミノ酸配列類を含む軽鎖可変領域のフレームワーク領域を含む抗ＶＥＧＦ抗体が提供される。軽鎖可変領域のこのような好適なフレームワーク領域は、このようにした作製した抗体がヒトＶＥＧＦに所望のアフィニティで結合するならば、好適な軽鎖または他の軽鎖のＣＤＲ領域類および前記好適な重鎖可変領域配列とまたは他の重鎖可変領域配列と組み合わせることができる。
【００６８】
１態様において、本発明は、好適には下記：
【化２０】
2008504215.tif 000021
のうちのひとつのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１領域類を含む抗ＶＥＧＦ抗体を提供し、ここで、“Ｘ”と称した位置は、下記のアミノ酸類であることができるであろう：
【化２１】
2008504215.tif 000022
【００６９】
さらに好適には、重鎖可変領域のＣＤＲ１領域は、下記：配列番号１１１、配列番号１１３，配列番号１１４，配列番号１１５，配列番号１１６，配列番号１１７，配列番号１１８，配列番号１１９，配列番号１２０，配列番号１２１，配列番号１２２，配列番号１２３，配列番号１２４，配列番号１２５，配列番号１２６，配列番号１２７，配列番号１２８，配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、および配列番号１３５のうちのひとつのアミノ酸配列類を含む。重鎖可変領域のこのような好適なＣＤＲ１配列は、このようにした作製した抗体がヒトＶＥＧＦに所望のアフィニティで結合するならば、好適な重鎖または他の重鎖の他の領域類および前記の好適な軽鎖可変領域配列とまたは他の軽鎖可変領域配列と組み合わせることができる。
【００７０】
１態様において、本発明は、好適には下記：
【化２２】
2008504215.tif 000023
のうちのひとつのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２を含む抗ＶＥＧＦ抗体を提供し、ここで、“Ｘ”と称した位置は、下記のアミノ酸類であることができるであろう：
【化２３】
2008504215.tif 000024
【００７１】
さらに好適には、重鎖可変領域のＣＤＲ２領域は、下記：配列番号１３６、配列番号１３７，配列番号１３８，配列番号１３９，配列番号１４０，配列番号１４１，配列番号１４２，配列番号１４３，配列番号１４４，配列番号１４５，配列番号１４６，配列番号１４７，配列番号１４８，配列番号１４９，配列番号１５０，配列番号１５１，配列番号１５２，配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５および配列番号１５６のうちのひとつのアミノ酸配列類を含む。重鎖可変領域のこのような好適なＣＤＲ２配列は、このようにした作製した抗体がヒトＶＥＧＦに所望のアフィニティで結合するならば、好適な重鎖のまたは他の重鎖の他の領域類および前記の好適な軽鎖可変領域配列とまたは他の軽鎖可変領域配列と組み合わせることができる。
【００７２】
１態様において、本発明は、アミノ酸配列：
【化２４】
2008504215.tif 000025
を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗ＶＥＧＦ抗体を提供し、ここで、“Ｘ”と称した位置は、下記のアミノ酸類であることができるであろう：Ｘ1：ＹまたはＨでありＸ2：Ｒ。
【００７３】
好適には、前記抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号３１１−３３７で下記の配列類のうちのひとつのアミノ酸配列類を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３を有している：
【化２５】
2008504215.tif 000026
【００７４】
このような好適な重鎖可変領域のＣＤＲ３配列は、このようにした作製した抗体がヒトＶＥＧＦに所望のアフィニティで結合するならば、好適な重鎖のまたは他の重鎖の他の領域類および前記の好適な軽鎖可変領域配列類とまたは他の軽鎖可変領域配列類と組み合わせることができる。
【００７５】
１態様において、本発明は、好適には下記：
【化２６】
2008504215.tif 000027
のうちのひとつのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のフレームワーク領域を含む抗ＶＥＧＦ抗体を提供し、ここで、“Ｘ”と称した位置は、下記のアミノ酸類であることができるであろう：
【化２７】
2008504215.tif 000028
【００７６】
１態様において、本発明は、好適には、下記：配列番号１と配列番号７０；配列番号１と配列番号６７；配列番号１と配列番号７５；配列番号１と配列番号８３；配列番号１４と配列番号５５；配列番号１と配列番号１０１；配列番号１と配列番号１００；配列番号１４と配列番号１０２；配列番号１と配列番号１０３；配列番号１と配列番号１０４；配列番号１と配列番号１０５；配列番号３６と配列番号１００；配列番号２６と配列番号１００；配列番号２８と配列番号１００；配列番号３７と配列番号１００；配列番号４４と配列番号１００；配列番号５４と配列番号１００；配列番号４７と配列番号１００のＶLおよびＶH対のうちのひとつのアミノ酸配列類を含む軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む抗ＶＥＧＦ抗体を提供し、さらに好適には、配列番号２８と配列番号６１；配列番号２８と配列番号６２；配列番号２８と配列番号６３；配列番号２８と配列番号６４；配列番号２８と配列番号６８；配列番号２８と配列番号８５；配列番号２８と配列番号８６；配列番号２８と配列番号８７；配列番号２８と配列番号８８；配列番号２８と配列番号８９；配列番号２８と配列番号９０；配列番号２８と配列番号９１；配列番号２８と配列番号９２；配列番号２８と配列番号９３；配列番号２８と配列番号９４；配列番号２８と配列番号９５；配列番号２８と配列番号９６；配列番号２８と配列番号９７；配列番号２８と配列番号９８；配列番号２８と配列番号９９；配列番号２８と配列番号１０６；配列番号２８と配列番号１０７；配列番号２８と配列番号１０８；配列番号２８と配列番号１０９；および配列番号２８と配列番号１１０のＶLおよびＶH対のうちのひとつのアミノ酸配列類を含む軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。
【００７７】
本発明に開示した全長ＶHおよびＶL、ＶH／ＣＤＲ，ＶH／ＦＲ，ＶL／ＣＤＲ、ＶL／ＦＲ（例  図１Ａおよび１Ｂに示したヒット変異体および図１Ｃおよび１Ｄに示したアミノ酸配列類）の組み合わせの結果としての抗体類も、また、本発明の範囲に含まれ；このような組み合わせには、米国特許出願第０９／０５６，１６０号、公報２００２／００３２３１５に開示した抗ＶＥＧＦ抗体類が含まない。
【００７８】
２．ヒト化または全長ヒト抗ＶＥＧＦ抗体類の設計と構築方法論
本発明の抗体類は、たんぱく質ライブラリをインシリコおよびインビトロで構築選択することを必要とする革新的方法を用いて設計する。この方法論のさらに詳細な説明は、米国特許出願第１０／４４３、１３４、１０／１５３，１５９、１０／１５３、１７６、１０／１２５，６８７、および６０／２８４，４０７に記されており、それらは、本文でその全文を参考として引用する。
【００７９】
本発明によれば、生物学的にかつ治療上重要な標的分子に対する結合アフィニティ改善のような所望の生物機能を有する最適化たんぱく質類について効率的にたんぱく質ライブラリを作製しスクリーニングする革新的方法が提供される。この方法論を用いて、性質が向上したたんぱく質の新規変異体を作製することによって、たんぱく質類を最適化する。特に、この方法論を用いて、非ヒト抗体類のヒト化用ライブラリの設計と抗体類のアフィニティおよび他の性質を最適化する。抗体類のアミノ酸類および核酸類の新規変異体は、ヒトまたはヒト様配列類を用いて作製し、一方、それらの結合アフィニティ、安定性および発現効率を有意に改善する。
【００８０】
本発明のプロセスは、全生物、特にますます増大するヒトたんぱく質配列データベースを検索し、それらの特異的配列または変異を結合アフィニティおよび安定性のような実験的に試験した機能増強と関連付け、高い処理量でコンピュータ計算により行う。本発明の方法論を用いることによって、抗体のようなたんぱく質の機能的にはバイアスをかけた拡大ライブラリが、極めて多くのさまざまなたんぱく質配列類および機能的に関連した構造をインシリコでコンピュータ評価し、その後、インビトロまたはインビボで実験的スクリーニングおよび選択により試験して、構築できる。
【００８１】
本発明の１面において、所望の機能（類）を有するたんぱく質（類）を設計選択するための方法が提供される。この方法は、好適には、リードタンパク質中標的の構造的／機能的モチーフまたはドメインのアミノ酸配列に基づくたんぱく質配列類のインシリコ選択を介して、コンピュータで実施し、前記モチーフまたはドメインは、以下、“リード配列”と称する。前記リード配列を用いて、たんぱく質配列のデータベースを検索する。データベース選択は、設計したモチーフの具体的な機能的必要性に依存する。たとえば、もしリードたんぱく質が酵素でかつ前記標的モチーフが前記酵素の活性部位を含むならば、特定起源、生物、種またはそれらの組み合わせのたんぱく質類／ペプチド類のデータベースをさまざまな検索基準を用いて検索し、ヒット配列リストを得るが、そのそれぞれは、リードたんぱく質中の標的モチーフの代わりとなることができる。類似手法を用いて、リードたんぱく質の他のモチーフまたはドメインを設計することもできる。各モチーフ／ドメインの設計配列を組み合わせて、設計たんぱく質類のライブラリを作製できることもできる。さらに、治療または診断のようなヒト適用のため設計たんぱく質類の免疫原性を低下させるため、好適には、ヒト起源のたんぱく質類またはヒト化たんぱく質類のデータベースを検索し、抗体フレームワークのようなリードたんぱく質の足場として機能するリードたんぱく質部位由来のモチーフ用にヒットリストを得る。設計たんぱく質のライブラリを実験的に試験し、リードたんぱく質に対する改善された生物機能（類）を有するたんぱく質類を得ることができる。
【００８２】
本発明の特定の面において、本発明の方法論は、配列がさまざまであるがそれでいて機能的には互いに関連している抗体類の設計において実施される。設計した抗体配列に基づき、抗体類ライブラリを高い処理様式で構築し、非ヒト抗体の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）および／またはヒト化フレームワーク（ＦＲｓ）にさまざまな配列類を含ませる。この抗体類ライブラリを、新規または改善機能について、さまざまな広い範囲の標的分子についてスクリーニングできる。
【００８３】
さらに本発明において、以下、“リード配列”と称するリード抗体中ある領域のアミノ酸配列に基づく抗体配列類のインシリコ選択のための方法が提供される。このリード配列を用いて、たんぱく質配列のデータベースを検索する。データベース選択は、設計したモチーフの具体的な機能的要件に依存する。たとえば：
治療適用のため可変鎖のフレームワーク領域を設計するため、完全にヒトのイムノグロブリン配列類およびヒト生殖細胞系イムノグロブリン配列類のような進化上関連しているたんぱく質配列類を採取することを用いなければならないが、２−３の構造的に重要な部位については除く。これにより、この高度に保存された領域（フレームワーク領域について）中にできるだけ少ない外来変異を導入することにより前記配列の起源を保存することによって、免疫応答を低下させるであろう。一方、さまざまな種のイムノグロブリン配列類のような広範な配列データベース類またはｇｅｎｂａｎｋ中の関連のない配列類さえも用いて、この高度に可変の領域中において抗原に対する結合アフィニティを向上させるため、ＣＤＲｓを設計できる。この方法を用いることによって、広範な抗体配列類ライブラリを構築しインビトロまたはインビボにおいて実験的に改良したかまたは所望の機能（類）を有する抗体変異体類をスクリーニングできる。
【００８４】
１態様において、前記方法は、下記の段階を含む：リード抗体の重鎖（ＶH）または軽鎖（ＶL）の可変領域のアミノ酸配列を提供する段階；前記リード抗体のＣＤＲｓにおいて前記アミノ酸配列類を同定する段階；前記リード抗体のＶHまたはＶL中においてＣＤＲｓのひとつを選択する段階；選択したＣＤＲ中において少なくとも３個の連続的アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供する段階で、ここで、前記選択したアミノ酸配列はリード配列であり；前記リード配列を複数の試験たんぱく質配列類と比較する段階；および前記の複数の試験たんぱく質配列類から、前記リード配列に対して少なくとも１５％の配列同一性を有する少なくとも２個のペプチドセグメント類を選択する段階で、ここで、前記選択したペプチドセグメントは、ヒットライブラリを形成すること。
【００８５】
前記方法はさらに、前記ヒットライブラリのアミノ酸配列類をコードするＤＮＡセグメント類を含む核酸ライブラリを構築する段階を含むことができる。
【００８６】
適宜、前記方法はさらに、下記の段階を含むことができる：前記ヒットライブラリのアミノ酸位置変異プロフィールを作成する段階；前記ヒットライブラリのアミノ酸位置変異プロフィールを、このアミノ酸位置変異体類をそれらの対応する遺伝子コドン類にバック翻訳することにより核酸位置変異プロフィールに変換する段階；および前記核酸位置変異体類を組み合わせ法により組み合わせることにより、ＤＮＡセグメント類の変性核酸ライブラリを構築する段階。
【００８７】
適宜、前記遺伝子コドン類は、細菌中発現に好適なものとすることもできる。適宜、遺伝子コドン類は、ＤＮＡセグメント類の変性核酸ライブラリの多様性が不当な実験的努力を要することもなく実験的にカバーできる多様性の範囲内にあるように、選択した大きさを小さくすることもできるものであり、例えば、１×１０7未満、好適には１×１０6未満である。
【００８８】
別の態様において、前記方法は、下記の段階を含む：リード抗体の重鎖（ＶH）または軽鎖（ＶL）の可変領域のアミノ酸配列を提供する段階；前記リード抗体のＣＤＲｓおよびＦＲｓにおいて前記アミノ酸配列類を同定する段階；前記リード抗体のＶHまたはＶL中においてＣＤＲｓのひとつを選択する段階；選択したＣＤＲ中において少なくとも３個の連続的アミノ酸残基を含む第１アミノ酸配列を提供する段階で、ここで、前記選択したアミノ酸配列はＣＤＲリード配列であり；前記ＣＤＲリード配列を複数のＣＤＲ試験たんぱく質配列類と比較する段階；および前記の複数のＣＤＲ試験たんぱく質配列類から、前記ＣＤＲリード配列に対して少なくとも１５％の配列同一性を有する少なくとも２個のペプチドセグメント類を選択する段階で、ここで、前記選択したペプチドセグメントは、ＣＤＲヒットライブラリを形成し；前記リード抗体のＶHまたはＶL中においてＦＲｓのひとつを選択する段階；選択したＦＲ中において少なくとも３個の連続的アミノ酸残基を含む第２アミノ酸配列を提供する段階で、ここで、前記選択したアミノ酸配列はＦＲリード配列であり；前記ＦＲリード配列を複数のＦＲ試験たんぱく質配列類と比較する段階；および前記の複数のＦＲ試験たんぱく質配列類から、前記ＦＲリード配列に対して少なくとも１５％の配列同一性を有する少なくとも２個のペプチドセグメント類を選択する段階で、ここで、前記選択したペプチドセグメントは、ＦＲヒットライブラリを形成し；および前記ＣＤＲヒットライブラリとＦＲヒットライブラリを組み合わせてヒットライブラリを形成する段階。
【００８９】
本方法によれば、複数のＣＤＲ試験たんぱく質配列類は、ヒトまたは非ヒト抗体類のアミノ酸配列類を含むことができる。
【００９０】
また本方法によれば、複数のＦＲ試験たんぱく質配列類は、ヒト起源の、好適にはヒトまたはヒト化抗体類（例  ＶHまたはＶL中少なくとも５０％のヒト配列類、好適には少なくとも７０％のヒト配列類、さらに好適には少なくとも９０％のヒト配列類、および最も好適には少なくとも９５％のヒト配列類）、さらに好適には完全にヒトの抗体類、および最も好適にはヒト生殖細胞系抗体類のアミノ酸配列類を含むことができる。
【００９１】
また本方法によれば、複数のＣＤＲ試験たんぱく質配列類の少なくともひとつが、複数のＦＲ試験たんぱく質配列類と異なる。
【００９２】
さらに本方法によれば、複数のＣＤＲ試験たんぱく質配列類は、ヒトまたは非ヒト抗体配列類であり、複数のＦＲ試験たんぱく質配列類が、ヒト抗体配列類、好適にはヒト生殖細胞系抗体配列類である。
【００９３】
本方法はさらに、前記ヒットライブラリのアミノ酸配列類をコードするＤＮＡセグメント類を含む核酸ライブラリを構築する段階を含むことができる。
【００９４】
適宜、前記方法はさらに、下記の段階を含むことができる：前記ＣＤＲヒットライブラリのアミノ酸位置変異プロフィールを作成する段階；前記ＣＤＲヒットライブラリのアミノ酸位置変異プロフィールを、このアミノ酸位置変異体類をそれらの対応する遺伝子コドン類にバック翻訳することにより第１核酸位置変異プロフィールに変換する段階；および前記核酸位置変異体類を組み合わせ法により組み合わせることにより、ＤＮＡセグメント類の変性ＣＤＲ核酸ライブラリを構築する段階。
【００９５】
適宜、前記遺伝子コドン類は、細菌中発現に好適なものとすることもできる。適宜、遺伝子コドン類は、ＤＮＡセグメント類の変性核酸ライブラリの多様性が合理的でない実験的努力もなく実験的にカバーできる多様性の範囲内にあるように選択した大きさを小さくすることもできるものであり、例えば、１×１０7未満、好適には１×１０6未満である。
【００９６】
さらに別の態様において、前記方法は、下記の段階を含む：リード抗体の重鎖（ＶH）または軽鎖（ＶL）の可変領域のアミノ酸配列を提供する段階；前記リード抗体のＦＲｓにおいて前記アミノ酸配列類を同定する段階；前記リード抗体のＶHまたはＶL中においてＦＲｓのひとつを選択する段階；選択したＦＲ中において少なくとも３個の連続的アミノ酸残基を含む第１アミノ酸配列を提供する段階で、ここで、前記選択したアミノ酸配列は第１ＦＲリード配列であり；前記ＦＲリード配列を複数のＦＲ試験たんぱく質配列類と比較する段階；および前記の複数のＦＲ試験たんぱく質配列類から、前記ＦＲリード配列に対して少なくとも１５％の配列同一性を有する少なくとも２個のペプチドセグメント類を選択する段階で、ここで、前記選択したペプチドセグメントは、第１ＦＲヒットライブラリを形成する。
【００９７】
前記方法は、さらに、下記の段階を含むことができる：前記選択したＦＲと異なるＦＲ中において少なくとも３個の連続したアミノ酸残基を含む第２アミノ酸配列を提供する段階で、前記選択したアミノ酸配列は、第２ＦＲリード配列であり；前記第２ＦＲリード配列を複数のＦＲ試験たんぱく質配列類と比較する段階；および前記の複数のＦＲ試験たんぱく質配列類から、前記第２ＦＲリード配列に対して少なくとも１５％の配列同一性を有する少なくとも２個のペプチドセグメント類を選択する段階で、ここで、前記選択したペプチドセグメントは、第２ＦＲヒットライブラリを形成し；および前記第１ＦＲヒットライブラリと前記第２ＦＲヒットライブラリを組み合わせヒットライブラリを形成する段階。
【００９８】
本方法によれば、前記リードＣＤＲ配列は、選択したＣＤＲ中において少なくとも５個の連続したアミノ酸残基を含むことができる。前記選択したＣＤＲは、前記リード抗体のＶHＣＤＲ１、ＶHＣＤＲ２、ＶHＣＤＲ３、ＶLＣＤＲ１、ＶLＣＤＲ２、およびＶLＣＤＲ３から構成される群から選択することもできる。
【００９９】
また本方法によれば、前記リードＦＲ配列は、選択したＦＲ中において少なくとも５個の連続したアミノ酸残基を含むことができる。前記選択したＦＲは、前記リード抗体のＶHＦＲ１、ＶHＦＲ２、ＶHＦＲ３、ＶHＦＲ４、ＶLＦＲ１、ＶLＦＲ２、ＶLＦＲ３およびＶLＦＲ４から構成される群から選択することもできる。
【０１００】
本方法は、さらに、前記ヒットライブラリのアミノ酸配列類をコードするＤＮＡセグメント類を含む核酸または変性核酸ライブラリを構築する段階を含むこともできる。
【０１０１】
さらに本発明の別の面において、リード抗体中ある領域のアミノ酸配列すなわち“リード配列”とその３Ｄ構造に基づき、抗体配列類のインシリコ選択のための方法が提供される。前記リード配列の構造を用いて類似の３Ｄ構造類を有するセグメント類についてたんぱく質構造類のデータベース類をサーチする。これらのセグメント類を並べ、配列プロフィールを得るが、本文では以下、“リード配列プロフィール”と称する。このリード配列プロフィールを用いて、配列同一性が小さいがそれでいて構造的には類似のリード配列の系統発生的に遠いホモログ類についてたんぱく質配列類のデータベースをサーチする。本方法を用いることによって、多様な抗体配列類ライブラリを構築し、向上したかまたは所望の機能（類）を有する抗体変異体についてインビトロまたはインビボで実験的にスクリーニングできる。
【０１０２】
１態様において、本方法は、下記の段階を含む：リード抗体の重鎖（ＶH）または軽鎖（ＶL）の可変領域のアミノ酸配列を提供する段階；前記リード抗体のＣＤＲｓにおいて前記アミノ酸配列類を同定する段階；前記リード抗体のＶHまたはＶL中においてＣＤＲｓのひとつを選択する段階；選択したＣＤＲ中において少なくとも３個の連続的アミノ酸残基を含む第１アミノ酸配列を提供する段階で、ここで、前記選択したアミノ酸配列はリード配列であり；前記リード配列の３次元構造を提供する段階；前記リード配列の構造に基づきリード配列プロフィールを作製する段階；前記リード配列プロフィールを複数の試験たんぱく質配列類と比較する段階；および前記の複数の試験たんぱく質配列類から、リード配列に対して少なくとも１０％の配列同一性を有する少なくとも２個のペプチドセグメント類を選択する段階で、ここで、前記選択したペプチドセグメントは、ヒットライブラリを形成する。
【０１０３】
本方法によれば、前記リード配列の３次元構造は、Ｘ線結晶学、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光分析、および理論的構造モデル化による構造であることができる。
【０１０４】
本方法によれば、リード配列プロフィール作製段階には、下記を含むことができる：リード配列構造を複数の試験たんぱく質セグメント類の構造類と比較すること；前記リード配列と前記試験たんぱく質セグメント類の主鎖立体構造の平均平方根差を求めること；主鎖立体構造の平均平方根差が５オングストローム未満、好適には４オングストローム未満、さらに好適には３オングストローム未満、最も好適には２オングストローム未満である試験たんぱく質セグメント類を選択すること；および選択した試験たんぱく質セグメント類のアミノ酸配列とリード配列と並べて、リード配列プロフィールを作製すること。
【０１０５】
適宜、複数の試験たんぱく質セグメント類の構造は、たんぱく質データバンクから検索し得られる。
【０１０６】
適宜、リード配列プロフィール作製段階には、下記を含むことができる：リード配列構造を複数の試験たんぱく質セグメント類の構造類と比較すること；前記リード配列と前記試験たんぱく質セグメント類の主鎖立体構造のＺスコアを求めること；主鎖立体構造のＺスコアが２より大きいか、好適には３より大きいか、さらに好適には４より大きいか、最も好適には５より大きい試験たんぱく質セグメント類を選択すること；および選択した試験たんぱく質セグメント類のアミノ酸配列とリード配列と並べて、リード配列プロフィールを作製すること。
【０１０７】
適宜、リード配列プロフィール作製段階は、ＣＥ，ＭＡＰＳ，モンテカルロおよび３Ｄクラスタリングアルゴリズムから構成される群から選択したアルゴリズムによって実施できる。
【０１０８】
本方法は、さらに、前記ヒットライブラリのアミノ酸配列類をコードするＤＮＡセグメント類を含む核酸ライブラリを構築する段階を含むことができる。
【０１０９】
適宜、前記方法はさらに、下記の段階を含むことができる：前記ヒットライブラリのアミノ酸位置変異プロフィールを作成する段階；前記ヒットライブラリのアミノ酸位置変異プロフィールを、このアミノ酸位置変異体類をそれらの対応する遺伝子コドン類にバック翻訳することにより核酸位置変異プロフィールに変換する段階；および前記核酸位置変異体類を組み合わせ法により組み合わせることによりＤＮＡセグメント類の変性核酸ライブラリを構築する段階を含むことができる。
【０１１０】
さらに本発明の別の面において、リード抗体の３Ｄ構造に基づく抗体配列類のインシリコ選択のための方法が提供される。配列同一性が小さいがそれでいて構造的には類似のリード配列の系統発生的に遠いホモログ類についてたんぱく質配列類のデータベースをサーチするために用いる前記リード抗体の特定領域由来のリード配列または配列プロフィール。これらの系統発生的に遠いホモログ類はヒットライブラリを形成する。前記ヒットライブラリ中の配列類は、前記リード抗体の３Ｄ構造との構造的適合性評価に供するが、以下、“リード構造テンプレート”と称する。前記リード構造テンプレートと構造的に適合するヒットライブラリ中配列類を選択し、改良したかまたは所望の機能（類）を有する抗体変異体についてインビトロまたはインビボで実験的にスクリーニングする。
【０１１１】
１態様において、前記方法は、下記の段階を含む：リード抗体の重鎖（ＶH）または軽鎖（ＶL）の可変領域のアミノ酸配列を提供する段階で、前記リード抗体は、リード構造テンプレートと規定される公知の３次元構造を有し；前記リード抗体のＣＤＲｓにおいて前記アミノ酸配列類を同定する段階；前記リード抗体のＶHまたはＶL中においてＣＤＲｓのひとつを選択する段階；選択したＣＤＲ中において少なくとも３個の連続的アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供する段階で、ここで、前記選択したアミノ酸配列はリード配列であり；前記リード配列を複数の試験たんぱく質配列類を比較する段階；および前記の複数の試験たんぱく質配列類から、前記リード配列に対して少なくとも１０％の配列同一性を有する少なくとも２個のペプチドセグメント類を選択する段階で、ここで、前記選択したペプチドセグメントは、ヒットライブラリを形成し；前記ヒットライブラリのメンバーが構造的にリード構造テンプレートと構造的に適合するかどうかをスコア関数を用いて決定する段階；および前記リード配列に等しいかそれよりも優れているかまたは等しいスコアのヒットライブラリメンバー類を選択する段階。
【０１１２】
前記方法によれば、前記スコア関数は、静電気的相互作用、ファンデアワールス相互作用、静電気的溶媒和エネルギー、溶媒アクセス可能な表面溶媒和エネルギーおよび立体構造エントロピーから構成される群から選択されるエネルギースコア関数である。
【０１１３】
適宜、前記スコア関数は、アンバー（Ａｍｂｅｒ）フォースフィールド、チャーム（Ｃｈａｒｍｍ）フォースフィールド、ディスカバー（Ｄｉｓｃｏｖｅｒ）  ｃｖｆｆフォースフィールド類、ＥＣＥＰＰフォースフィールド類、グロモス（ＧＲＯＭＯＳ）フォースフィールド類、ＯＰＬＳフォースフィールド類、ＭＭＦＦ９４フォースフィールド、トリポス（Ｔｒｉｐｏｓ）フォースフィールド、ＭＭ３フォースフィールド、ドライディング（Ｄｒｅｉｄｉｎｇ）フォースフィールド、ＵＮＲＥＳフォースフィールド、および他の知識に基づく統計的フォースフィールド（平均フィールド）および構造に基づく熱力学ポテンシャル関数類から構成される群から選択されるフォースフィールドを取り込むものである。
【０１１４】
また本発明によれば、ヒットライブラリメンバー類選択段階には、式
△Ｅtotal＝Ｅvdw＋Ｅbond＋Ｅangle＋Ｅelectrostatics＋Ｅsolvation
に基づき計算したリード配列のそれよりも低いかまたはそれと同等の総エネルギーを有するヒットライブラリメンバー類を選択することを含む。
【０１１５】
また本方法によれば、ヒットライブラリメンバー類選択段階には、より精密なスコア関数
△Ｇb＝  △ＧMM  ＋ △Ｇsol ―  Ｔ△Ｓss
（式中、
△ＧMM ＝  △Ｇele ＋  △Ｇvdw （１）
△Ｇsol ＝  △Ｇele-sol ＋  △ＧASA （２）
を用いて、結合および非結合状態の差として計算したリード配列のそれよりも低いかまたはそれと同等の結合遊離エネルギーを有するヒットライブラリメンバー類を選択することを含む。
【０１１６】
前記方法はさらに、前記ヒットライブラリのアミノ酸配列類をコードするＤＮＡセグメント類を含む核酸ライブラリを構築する段階を含むことができる。
【０１１７】
適宜、前記方法は、下記の段階を含むことができる：前記ヒットライブラリのアミノ酸位置変異プロフィールを作成する段階；前記ヒットライブラリのアミノ酸位置変異プロフィールを、このアミノ酸位置変異体類をそれらの対応する遺伝子コドン類にバック翻訳することにより核酸位置変異プロフィールに変換する段階；および前記核酸位置変異体類を組み合わせ法により組み合わせることによりＤＮＡセグメント類の変性核酸ライブラリを構築する段階。
【０１１８】
さらに本発明の別の面において、リード抗体の３Ｄ構造または構造エンゼンブル、または複数抗体類の構造エンゼンブルに基づき、抗体配列類のインシリコ選択のための方法が提供され、以下ではまとめて、リード構造テンプレートと称する。配列同一性が小さいがそれでいて構造的には類似のリード配列の系統発生的に遠いホモログ類についてたんぱく質配列類のデータベースをサーチするために用いる前記リード抗体の特定領域由来のリード配列または配列プロフィール。これらの系統発生的に遠いホモログ類はヒットライブラリを形成する。前記ヒットライブラリのアミノ酸位置変異プロフィール（ＡＡ−ＰＶＰ）は、前記リード配列の各位置におけるアミノ酸変異体の出現頻度に基づき作製する。ＡＡ−ＰＶＰに基づき、ヒット変異ライブラリを、低頻度変異体のカットオフがある場合とない場合においてリード配列の各位置におけるアミノ酸変異体を組み合わせ法で組み合わせることによって、構築する。前記ヒットライブラリ中の配列類を、前記リード構造テンプレートとの構造的適合性を評価する。前記リード構造テンプレートと構造的に適合するヒットライブラリ中配列類を選択し、向上したかまたは所望の機能（類）を有する抗体変異体についてインビトロまたはインビボで実験的にスクリーニングする。
【０１１９】
１態様において、本方法は、下記の段階を含む：リード抗体の重鎖（ＶH）または軽鎖（ＶL）の可変領域のアミノ酸配列を提供する段階で、前記リード抗体は、リード構造テンプレートと規定される公知の３次元構造を有し；前記リード抗体のＣＤＲｓにおいて前記アミノ酸配列類を同定する段階；前記リード抗体のＶHまたはＶL中においてＣＤＲｓのひとつを選択する段階；選択したＣＤＲ中において少なくとも３個の連続的アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供する段階で、ここで、前記選択したアミノ酸配列はリード配列であり；前記リード配列の３次元構造を提供する段階；前記リード配列の構造に基づきリード配列プロフィールを作製する段階；前記リード配列プロフィールを複数の試験たんぱく質配列類と比較する段階；および前記の複数の試験たんぱく質配列類から、リード配列に対して少なくとも１０％の配列同一性を有する少なくとも２個のペプチドセグメント類を選択する段階で、ここで、前記選択したペプチドセグメントは、ヒットライブラリを形成し；リード配列の各位置におけるアミノ酸変異体の出現頻度に基づきヒットライブラリのアミノ酸位置変異プロフィールを作成する段階；前記ヒットライブラリ中のアミノ酸変異体類を組み合わせてヒット変異ライブラリを形成するヒット変異体類組み合わせを作製する段階；スコア関数を用いて、前記ヒット変異ライブラリのメンバーが前記リード構造テンプレートと構造的に適合するかどうかを決定する段階；および前記リード配列に等しいかまたはそれよりも優れたスコアのヒット変異ライブラリのメンバー類を選択する段階。
【０１２０】
本方法によれば、前記ヒットライブラリ中のアミノ酸変異体を組み合わせる段階には、カットオフのためのアミノ酸頻度の２％、好適には５％、さらに好適には８％、最も好適には１０％よりも高い出現頻度を有するアミノ酸変異体を選択すること、次にリード配列由来のアミノ酸類の一部をもしそれらがカットオフ後になくなったとしたらそれらを含め；ヒットライブラリ中の選択したアミノ酸変異体類を組み合わせてヒット変異ライブラリを形成するヒット変異体類の組み合わせを作製することを含む。
【０１２１】
本方法によれば、前記スコア関数は、静電気的相互作用、ファンデアワールス相互作用、静電気的溶媒和エネルギー、溶媒アクセス可能な表面溶媒和エネルギーおよび立体構造エントロピーから構成される群から選択されるエネルギースコア関数である。
【０１２２】
適宜、前記スコア関数は、アンバー（Ａｍｂｅｒ）フォースフィールド、チャーム（Ｃｈａｒｍｍ）フォースフィールド、ディスカバー（Ｄｉｓｃｏｖｅｒ）  ｃｖｆｆフォースフィールド類、ＥＣＥＰＰフォースフィールド類、グロモス（ＧＲＯＭＯＳ）フォースフィールド類、ＯＰＬＳフォースフィールド類、ＭＭＦＦ９４フォースフィールド、トリポス（Ｔｒｉｐｏｓ）フォースフィールド、ＭＭ３フォースフィールド、ドライディング（Ｄｒｅｉｄｉｎｇ）フォースフィールド、ＵＮＲＥＳフォースフィールド、および他の知識に基づく統計的フォースフィールド（平均フィールド）および構造に基づく熱力学ポテンシャル関数類から構成される群から選択されるフォースフィールドを取り込むものである。
【０１２３】
前記方法はさらに、前記ヒットライブラリのアミノ酸配列類をコードするＤＮＡセグメント類を含む核酸ライブラリを構築する段階を含むことができる。
【０１２４】
適宜、前記方法はさらに、下記の段階を含むことができる：ヒット変異ライブラリの選択したメンバー類を少なくとも２個のサブヒット変異ライブラリに分割する段階；１個のサブヒット変異ライブラリを選択する段階；前記選択したサブヒット変異ライブラリのアミノ酸位置プロフィールを、それらの対応する遺伝子コドン類にバック翻訳することにより核酸位置変異プロフィールに変換する段階；および前記核酸位置変異体類を組み合わせ法により組み合わせることによりＤＮＡセグメント類の変性核酸ライブラリを構築する段階を含むことができる。
【０１２５】
前記ヒット変異ライブラリを分割する段階には、前記リード配列と等しいかまたはそれより優れたスコアのヒット変異ライブラリメンバー１０−３０個を無作為に選択することを含むことができ、前記の選択したメンバー類は、サブ変異ライブラリを形成する。
【０１２６】
適宜、ヒット変異ライブラリを分割する段階には、ヒット変異ライブラリのアミノ酸位置変異プロフィールを作製し、ヒト変異プロフィールを結果として生成し；前記ヒト変異プロフィールを、ある距離限界（８Ａ乃至４．５Ａ）内のリード配列の構造または構造エンゼンブルのＣα、またはＣβまたは重原子のコンタクトマップに基づくサブ変異プロフィールのセグメント類に分割する段階を含むことができる。８オングストロームの距離内部、好適には６オングストローム内、さらに好適には５オングストローム内、および最も好適には４．５オングストローム内部の構造モデルまたはリード構造テンプレート。
【０１２７】
別の態様において、前記方法は、リード抗体の重鎖（ＶH）または軽鎖（ＶL）の可変領域のアミノ酸配列を提供する段階で、前記リード抗体は、公知の３次元構造を有し；前記リード抗体のそれとは異なるＶHまたはＶL中配列類を有する１個以上の抗体類の３Ｄ構造を提供する段階；前記リード抗体と前記１個以上の抗体類の構造を組み合わせて構造エンゼンブルを形成する段階；前記構造エンゼンブルは、リード構造テンプレートと称され；前記リード抗体のＣＤＲｓにおいて前記アミノ酸配列類を同定する段階；前記リード抗体のＶHまたはＶL中においてＣＤＲｓのひとつを選択する段階；選択したＣＤＲ中において少なくとも３個の連続的アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供する段階で、ここで、前記選択したアミノ酸配列はリード配列であり；前記リード配列を複数の試験たんぱく質配列類と比較する段階；前記複数の試験たんぱく質配列類から、リード配列に対して少なくとも１０％の配列同一性を有する少なくとも２個のペプチドセグメント類を選択する段階で、ここで、前記選択したペプチドセグメントは、ヒットライブラリを形成し；リード配列の各位置におけるアミノ酸変異体の出現頻度に基づきヒットライブラリのアミノ酸位置変異プロフィールを作成する段階；前記ヒットライブラリ中のアミノ酸変異体類を組み合わせてヒット変異ライブラリを形成するヒット変異体類組み合わせを作製する段階；スコア関数を用いて、前記ヒット変異ライブラリのメンバーが前記リード構造テンプレートと構造的に適合するかどうかを決定する段階；および前記リード配列に等しいかまたはそれよりも優れたスコアのヒット変異ライブラリメンバー類を選択する段階を含む。
【０１２８】
特定の態様において、前記方法は、下記の段階を含む：ａ）リード抗体の重鎖（ＶH）または軽鎖（ＶL）の可変領域のアミノ酸配列を提供する段階で、前記リード抗体は、公知の３次元構造を有し；ｂ）前記リード抗体のＣＤＲｓ中アミノ酸配列を同定する段階；ｃ）前記リード抗体のＶHまたはＶL領域中においてＣＤＲｓのひとつを選択する段階；ｄ）選択したＣＤＲ中において少なくとも３個の連続的アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供する段階で、ここで、前記選択したアミノ酸配列はリード配列であり；ｅ）前記リード配列を複数の試験たんぱく質配列類と比較する段階；ｆ）前記複数の試験たんぱく質配列類から、リード配列に対して少なくとも１０％の配列同一性を有する少なくとも２個のペプチドセグメント類を選択する段階で、ここで、前記選択したペプチドセグメントは、ヒットライブラリを形成し；ｇ）リード配列の各位置におけるアミノ酸変異体の出現頻度に基づきヒットライブラリのアミノ酸位置変異プロフィールを作成する段階；ｈ）前記ヒットライブラリ中のアミノ酸変異体類を組み合わせてヒット変異ライブラリを形成するヒット変異体類組み合わせを作製する段階；Ｉ）スコア関数を用いて、前記ヒット変異ライブラリのメンバーが前記リード構造テンプレートと構造的に適合するかどうかを決定する段階；ｊ）前記リード配列に等しいかまたはそれよりも優れたスコアのヒット変異ライブラリメンバー類を選択する段階；ｋ）ヒット変異ライブラリの選択したメンバー類のアミノ酸配列をコードするＤＮＡセグメント類を含む変性核酸ライブラリを構築する段階；ｌ）核酸ライブラリの多様性を決定しもし多様性が１×１０6よりも大きいならば、核酸ライブラリの多様性が１×１０6に等しいかそれよりも小さくなるまでｊ）からｌ）の段階を繰り返すこと；ｍ）前記変性核酸ライブラリのＤＮＡセグメント類を宿主生物の細胞中に導入する段階；ｎ）ヒットライブラリのアミノ酸配列を含む組み換え抗体類が宿主生物細胞中で産生されるように前記ＤＮＡセグメント類を前記宿主細胞中で発現させる段階；ｏ）１０6Ｍ-1を超えるアフィニティを有する標的抗原に結合する組み換え抗体を選択する段階；およびｐ）１０6Ｍ-1を超えるアフィニティを有する標的抗原に結合する組み換え抗体がまったく見出せないならば、段階ｅ）乃至ｏ）を繰り返すこと。
【０１２９】
別の特定の態様において、前記方法は、下記の段階を含む：ａ）リード抗体の重鎖（ＶH）または軽鎖（ＶL）の可変領域のアミノ酸配列を提供する段階で、前記リード抗体は、リード構造テンプレートと規定される公知の３次元構造を有し；ｂ）前記リード抗体のＣＤＲｓ中アミノ酸配列を同定する段階；ｃ）前記リード抗体のＶHまたはＶL領域中においてＣＤＲｓのひとつを選択する段階；ｄ）選択したＣＤＲ中において少なくとも３個の連続的アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供する段階で、ここで、前記選択したアミノ酸配列はリード配列と規定され；ｅ）前記リード配列を、１個以上の異なるアミノ酸残基により前記リード配列のアミノ酸残基の１個以上を置換することによって変異させ、リード配列変異ライブラリを作製し；ｆ）第１スコア関数を用いて前記リード配列変異ライブラリの１メンバーが前記のリード構造テンプレートと構造的に適合できるか決定する段階；ｇ）前記リード配列と等しいかまたはそれよりも優れたリード配列変異体類を選択する段階；ｈ）前記リード配列を複数の試験たんぱく質配列類と比較する段階；Ｉ）前記複数の試験たんぱく質配列類から、リード配列に対して少なくとも１０％の配列同一性を有する少なくとも２個のペプチドセグメント類を選択する段階で、ここで、前記選択したペプチドセグメントは、ヒットライブラリを形成し；ｊ）リード配列の各位置におけるアミノ酸変異体の出現頻度に基づきヒットライブラリのアミノ酸位置変異プロフィールを作成する段階；ｋ）前記ヒットライブラリ中のアミノ酸変異体類を組み合わせて、ヒット変異ライブラリを形成するヒット変異体類組み合わせを作製する段階；ｌ）選択したリード配列変異体類をヒット変異体類の組み合わせと組み合わせて、ヒット変異体ライブラリを作製すること；ｍ）スコア関数を用いて、前記ヒット変異ライブラリのメンバーが前記リード構造テンプレートと構造的に適合するかどうかを決定する段階；ｎ）前記リード配列に等しいかまたはそれよりも優れたスコアのヒット変異ライブラリメンバー類を選択する段階；ｏ）ヒット変異ライブラリの選択したメンバー類のアミノ酸配列をコードするＤＮＡセグメント類を含む変性核酸ライブラリを構築する段階；ｐ）核酸ライブラリの多様性を決定しもし多様性が１×１０6よりも大きいならば、核酸ライブラリの多様性が１×１０6に等しいかそれよりも小さくなるまでｎ）からｐ）の段階を繰り返すこと；ｑ）前記変性核酸ライブラリのＤＮＡセグメント類を宿主生物の細胞中に導入する段階；ｒ）ヒットライブラリのアミノ酸配列を含む組み換え抗体類が宿主生物細胞中で産生されるように前記ＤＮＡセグメント類を前記宿主細胞中で発現させる段階；ｓ）１０6Ｍ-1を超えるアフィニティを有する標的抗原に結合する組み換え抗体を選択する段階；およびｔ）１０6Ｍ-1を超えるアフィニティを有する標的抗原に結合する組み換え抗体がまったく見出せないならば段階ｅ）乃至ｓ）を繰り返すこと。
【０１３０】
さらに本発明の別の面において、リード抗体に基づき変異抗体類ライブラリを構築するためのコンピュータ実施方法が提供される。
【０１３１】
１態様において、本方法は、前記リード抗体のＣＤＲ領域中少なくとも３個の保存アミノ酸残基を含むアミノ酸配列をインプットとして採用し、前記アミノ酸配列はリード配列であり；前記リード配列を複数の試験たんぱく質配列類と比較するコンピュータ実行ロジックを用いること；前記複数の試験たんぱく質配列類から、リード配列に対して少なくとも１５％の配列同一性を有する少なくとも２個のペプチドセグメント類を選択すること；およびヒットライブラリを形成する選択したペプチドセグメント類をアウトプットとして作成することを含む。
【０１３２】
上記方法類のいずれかによれば、リード配列の長さは、好適には５−１００ａａ、さらに好適には６−８０ａａ，および最も好適には８−５０ａａである。
【０１３３】
また上記方法類のいずれかによれば、ＣＤＲｓ中アミノ酸配列を同定する段階は、Ｋａｂａｔ基準またはＣｈｏｔｈｉａ基準を用いることによって、実施される。
【０１３４】
前記方法類のいずれかによれば、また、前記リード配列は、前記リード抗体のＶHまたはＶL内部の特定領域、ＣＤＲ１，ＣＤＲ２またはＣＤＲ３由来のアミノ酸またはＣＤＲ１−ＦＲ２、ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３のような前記ＣＤＲとＦＲｓとの組み合わせ由来のアミノ酸と全長ＶHまたはＶL配列を含むことができる。前記リード配列は、好適には、選択したＣＤＲ中において少なくとも６個の保存アミノ酸残基類、好適には少なくとも７個の保存アミノ酸残基類、および最も好適には選択したＣＤＲ中アミノ酸残基全てを含む。
【０１３５】
上記方法類のいずれかによれば、また、前記リード配列は、選択したＣＤＲに最も隣接しているアミノ酸残基類の少なくとも１個を含むことができる。
【０１３６】
上記方法類のいずれかによれば、また、前記リード配列は、選択したＣＤＲに隣接しているＦＲｓの少なくとも１個を含むことができる。
【０１３７】
上記方法類のいずれかによれば、また、前記リード配列は、選択したＣＤＲのＣ末端またはＮ末端に隣接している１個以上のＣＤＲｓまたはＦＲｓを含むことができる。
【０１３８】
上記方法類のいずれかによれば、また、前記リード構造テンプレートは、完全に組み立てられたリード抗体、または前記リード抗体の重鎖または軽鎖可変領域（例  ＣＤＲ，ＦＲおよびその組み合わせ）の３Ｄ構造であることができる。
【０１３９】
また上記方法類のいずれかによれば、複数の試験たんぱく質配列類には、特にフレームワーク領域類のための好適には抗体配列類、さらに好適にはヒト抗体配列類、最も好適にはヒト生殖細胞系抗体配列類（Ｖ−データベース）を含む。
【０１４０】
また上記方法類のいずれかによれば、複数の試験たんぱく質配列類は、抗体類のＣＤＲｓについてのＮＩＨのｇｅｎｂａｎｋ、またはＳｗｉｓｓ−ＰｒｏｔデータベースまたはＫａｂａｔデータベースから検索して得ることができる。
【０１４１】
また上記方法類のいずれかによれば、前記リード配列を複数の試験たんぱく質配列類と比較する段階は、ＢＬＡＳＴ，ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ，プロフィールＨＭＭ、およびＣＯＢＬＡＴＨから構成される群から選択されたアルゴリズムによって実施される。
【０１４２】
また上記方法類のいずれかによれば、ヒットライブラリ中の選択したペプチドセグメント類のリード配列との配列同一性は、好適には少なくとも２５％、好適には少なくとも３５％および最も好適には少なくとも４５％である。
【０１４３】
また上記方法類のいずれかによれば、前記方法はさらに、下記の段階を含む：前記核酸または変性核酸ライブラリ中のＤＮＡセグメント類を宿主生物の細胞中に導入する段階；ヒットライブラリのアミノ酸配列を含む組み換え抗体類が宿主生物細胞中で産生されるように前記ＤＮＡセグメント類を前記宿主細胞中で発現させる段階；および１０6Ｍ-1を超えるアフィニティ、適宜１０7Ｍ-1を超えるアフィニティ、適宜１０8Ｍ-1を超えるアフィニティ、適宜１０9Ｍ-1を超えるアフィニティ、適宜２×１０9Ｍ-1を超えるアフィニティ、適宜５×１０9Ｍ-1を超えるアフィニティ、適宜１×１０10Ｍ-1を超えるアフィニティ、適宜５×１０10Ｍ-1を超えるアフィニティ、適宜１×１０11Ｍ-1を超えるアフィニティにより標的抗原に結合する組み換え抗体を選択する段階。
【０１４４】
前記組み換え抗体類は、完全に組み立てられた抗体類、Ｆａｂ断片類、Ｆｖ断片類または一重鎖抗体類であることができる。
【０１４５】
前記宿主生物には、細菌類、酵母、植物、昆虫および哺乳類を含むいかなる生物またはその細胞株を含むが、それらは移入された外来遺伝子配列を発現可能であるものであるが、ただしそれらに限定されない。
【０１４６】
前記組み換え抗体類は、完全に組み立てられた抗体類、Ｆａｂ断片類、Ｆｖ断片類または一重鎖抗体類であることができる。たとえば、前記組み換え抗体類は、細菌細胞中で発現されファージ粒子表面上でディスプレイされる。ファージ粒子上でディスプレイされた組み換え抗体類は、ＶHとＶLの間で形成されたニ重鎖ヘテロダイマーであることができる。ＶHとＶL鎖のヘテロダイマー化は、それぞれＶHとＶLに融合した２個の非抗体ポリペプチド鎖の間に形成されたヘテロダイマーにより促進することができる。たとえば、これらの２個の非抗体ポリペプチドは、ヘテロダイマー性のレセプター類ＧＡＢＡB Ｒ１（ＧＲ１）およびＲ２（ＧＲ２）からそれぞれ由来することができる。
【０１４７】
これとは別に、ファージ粒子上にディスプレイされた組み換え抗体類は、ペプチドリンカーにより連結されたＶHとＶLを含む一重鎖抗体であることができる。ファージ粒子表面上の一重鎖抗体のディスプレイは、ＧＲ１と一重鎖抗体の融合物およびＧＲ２とファージｐＩＩＩカプシドたんぱく質の融合物の間に形成されたヘテロダイマーによって促進することができる。
【０１４８】
スクリーニングするための標的抗原には、小分子類およびたんぱく質類、ペプチド類、核酸類およびポリカーボハイドレート類のような大分子類が含まれる。
【０１４９】
上記方法のいずれもさらに下記の段階を含むことができる：前記核酸または変性核酸ライブラリ中のＤＮＡセグメント類を宿主生物の細胞中に導入する段階；ヒットライブラリのアミノ酸配列を含む組み換え抗体類が宿主生物細胞中で産生されるように、前記ＤＮＡセグメント類を前記宿主細胞中で発現させる段階；および１０6Ｍ-1を超えるアフィニティにより標的抗原に結合する組み換え抗体を選択する段階。
【０１５０】
前記選択した組み換え抗体の標的抗原に対する結合アフィニティは、適宜１０7Ｍ-1を超え、適宜１０8Ｍ-1を超え、適宜１×１０9Ｍ-1を超え、適宜２×１０9Ｍ-1を超え、適宜５×１０9Ｍ-1を超え、適宜８×１０9Ｍ-1を超え、適宜１×１０10Ｍ-1を超え、適宜２×１０10Ｍ-1を超え、適宜５×１０10Ｍ-1を超え、適宜８×１０10Ｍ-1を超えまたは適宜１×１０11Ｍ-1を超える。
【０１５１】
選択した抗体のその抗原に対する結合アフィニティは、試験する抗体形態に応じて変動することがある。選択した試験抗体は、本発明の方法を用いることによって設計したＶHおよびＶLを含む一重鎖抗体（ｓｃＦｖ）の形態であることもできる。選択した試験抗体は、適宜、本発明の方法を用いることによって設計したＶHおよびＶLを含むＦａｂの形態であることもできる。おそらく立体構造が高度に可撓性であり不安定であるがゆえに、ｓｃＦｖ形態の選択抗体の結合アフィニティは、Ｆａｂ形態のそれよりも１−２桁小さいであろう。したがって、ｓｃＦｖ形態の選択抗体について、解離定数は、好適には１０6Ｍ-1より小さく、適宜１０7Ｍ-1を超え、適宜１×１０8Ｍ-1を超え、適宜２×１０8Ｍ-1を超え、適宜５×１０8Ｍ-1を超え、適宜８×１０8Ｍ-1を超え、適宜１×１０9Ｍ-1を超え、適宜２×１０9Ｍ-1を超え、適宜５×１０9Ｍ-1を超え、適宜８×１０9Ｍ-1を超え、適宜１×１０10Ｍ-1を超え、適宜５×１０10Ｍ-1を超えまたは適宜１×１０11Ｍ-1を超える。
【０１５２】
選択した組み換え抗体の標的高原に対する結合アフィニティは、また、ある温度（例  ４℃、２５℃、３５℃、３７℃または４２℃）で、例えばＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサー（実施例参照）のような機器を用いることによって、抗体と標的抗原との結合相互作用の動態研究で測定した解離定数Ｋdによって、表すこともできる。一般的に、測定したＫdが小さいほど、抗体のアフィニティは高くなり、測定温度が高くなるほど、同一抗体について測定したＫdは大きくなる。
【０１５３】
選択した抗体のＫdは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂの形態でまたは他の抗体形態で測定した温度約４℃、２５℃、３５℃、３７℃または４２℃において、適宜１００ｎＭよりも小さく、適宜１０ｎＭよりも小さく、適宜８ｎＭよりも小さく、適宜８ｎＭよりも小さく、適宜５ｎＭよりも小さく、適宜１ｎＭよりも小さく、適宜０．８ｎＭよりも小さく、適宜０．５ｎＭよりも小さく、適宜０．２ｎＭよりも小さく、適宜０．１ｎＭよりも小さく、適宜０．０８ｎＭよりも小さく、適宜０．０５ｎＭよりも小さく、適宜０．０１ｎＭよりも小さく、適宜０．００５ｎＭよりも小さい。
【０１５４】
上記態様のいずれかによれば、設計したたんぱく質類（例  抗体類）は合成でき、いかなる生物の細胞中でも発現でき、菌類、酵母、植物、昆虫および哺乳類を含むがこれらに限定されない。特定細胞タイプには、ドロソフィラスメラノガｓター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）細胞、サッカロマイセスセレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および他の酵母類、大腸菌、バシラスサブチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ＳＦ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ＢＨＫ，ＣＨＯ，ＣＯＳおよびＨｅＬａ細胞、線維芽細胞、シュワノーマ（Ｓｃｈａｗａｎｏｍａ）細胞株、不死化哺乳類骨髄およびリンパ節細胞株、ジュルカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞、肥満細胞および他の内分泌および外分泌細胞およびニューロン細胞が含まれるが、これらに限定されない。哺乳類細胞の例には、全タイプ（特に、メラノーマ、骨髄性白血病、肺、胸部、卵巣、結腸、腎臓、前立腺、すい臓および精巣のカルシノーマ）、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、リンパ球（Ｔ細胞およびＢ細胞）、肥満細胞、抗酸球、血管内膜細胞、肝細胞、単核球白血球、造血、ニューロン、皮膚、肺、腎、および筋細胞幹細胞類のような幹細胞類、破骨細胞、軟骨細胞および他の結合組織細胞類、ケラチノサイト、メラノサイト、肝細胞、腎細胞および脂肪細胞の腫瘍細胞類を含むが、それらに限定されない。
【０１５５】
好適には、設計したたんぱく質を、当業者に公知の方法により発現させた後、精製または単離する。精製方法の例には、電気泳動、分子、免疫およびイオン交換、疎水性、アフィニティ、および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィを含むクロマトグラフィ技術、およびクロマトフォーカシングが含まれる。必要な精製度は、設計したたんぱく質の用途に応じて変動するであろう。いくつかの場合、精製が全く必要ないであろう。
【０１５６】
上記態様のいずれかによれば、また、設計したたんぱく質類について、所望の機能、好適には公知の結合パートナーに対するそれらの結合、生理活性、安定性プロフィール（ｐＨ、温度、緩衝液条件）、基質特異性、免疫原性、毒性等のような生物機能についてスクリーニングできる。
【０１５７】
細胞に基づくアッセイを用いたスクリーニングにおいて、設計したたんぱく質は、好適には検出可能でおよび／または測定可能な方法で、改変細胞表現型に基づいて、選択することができる。表現型変化の例には、細胞形態、細胞増殖、細胞生存性、基質または他の細胞への接着、および細胞濃度における変化のような全体としての生理的変化；１個以上のＲＮＡ，たんぱく質類、脂質類、ホルモン類、サイトカイン類、または他の分子類の発現変化；１個以上のＲＮＡ、たんぱく質類、脂質類、ホルモン類、サイトカイン類、または他の分子類の平衡状態（すなわち、半減期）変化；１個以上のＲＮＡ、たんぱく質類、脂質類、ホルモン類、サイトカイン類、または他の分子類の局在変化；１個以上のＲＮＡ，たんぱく質類、脂質類、ホルモン類、サイトカイン類、レセプター類、または他の分子類の生物活性または特異的活性の変化；イオン類、サイトカイン類、ホルモン類、成長因子類、または他の分子類の分泌変化；細胞膜電位、分極、一体性または移送の変化；ウイルス類および細菌性病原体の感染性、感受性、潜伏性、接着、および取り込み変化のような全体としての物理的変化が含まれるが、それらに限定されない。
【０１５８】
上記態様のいずれかによれば、設計したたんぱく質類（例  抗体類）は、合成できまたはタグたんぱく質またはペプチドとの融合たんぱく質として発現させることもできる。前記タグたんぱく質またはペプチドは、設計したたんぱく質類の同定、単離、シグナル伝達、安定化、可とう性増加、分解増加、分泌、転座または細胞内保持の増加またはその発現の増強のために使用することができる。
【０１５９】
本発明は、さらに、下記を提供する：前記抗体をコードする単離核酸；ベクターで形質転換した宿主細胞により認識される配列を制御するように適宜機能できるように連結させたその核酸を含むベクター；このベクターを含む宿主細胞；核酸が発現されるように宿主細胞を培養すること、前記抗体を宿主細胞培養物から回収することを含む前記抗体産生プロセス。
【０１６０】
３．本発明の抗体類を使用する方法
本発明の方法類を用いることによって設計した抗体類は、癌、多発性硬化、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病および重症筋無力症のような自己免疫疾患、移植片対宿主疾患、心脈管系疾患、ＨＩＶ，肝炎ウイルス類、および単純ヘルペスウイルスのようなウイルス感染、菌感染、アレルギー、ＩＩ型糖尿病、貧血のような造血障害のようなさまざまな疾患類の診断または治療に使用できるが、それらに限定されない。
【０１６１】
前記抗体類は、また、診断または治療上の機能基と連結した結合物としてまたは化学療法または生物剤と併用して使用できる。
【０１６２】
本発明の抗体類は、アフィニティ精製物質類として使用することもできる。このプロセスにおいて、前記抗体類を、当該技術で周知の方法類を用いてセファデックスレジンまたはろ紙のような固相上に固定化する。前記固定抗体を、精製するＶＥＧＦたんぱく質（またはその断片）を含む試料に接触させ、その後、前記支持体をＶＥＧＦたんぱく質以外の試料中全物質を実質的に除去するであろう適切な溶媒で洗浄するが、前記ＶＥＧＦたんぱく質は、前記固体化抗体に結合している。最後に、前記支持体を、グリシン緩衝液ｐＨ５．０のような別の適切な溶媒で洗浄し、それは、ＶＥＧＦたんぱく質を前記抗体から放出するであろう。
【０１６３】
また、抗ＶＥＧＦ抗体類は、ＶＥＧＦたんぱく質の診断アッセイに有用で、例えば、その発現を特異的細胞類、組織類または血清中で検出する。このような診断方法類は、癌の診断において有用であることができる。
【０１６４】
診断適用のため、前記抗体は、検出可能な機能基で標識することもできる。たとえば、前記抗体は、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １および２、Ｃｏｌｉｇｅｎら編著、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｐｕｂｓ．（１９９１）に記載の技術を用いて35Ｓ，14Ｃ，125Ｉ，3Ｈおよび131Ｉのような放射性同位元素により標識でき、放射能は、シンチレーション計測により測定できる。
【０１６５】
前記抗体は、また、希土類キレート類（例  ユーロピウムキレート類）、フルオロセイン、ローダミンおよびその誘導体類、ダンシル、リサミン、フィコエリスリンおよびテキサスレッドのような蛍光標識を結合させることができる。前記蛍光標識は、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、同上に開示の技術を用いて、前記抗体に結合させることができる。蛍光は、蛍光計測計を用いて、定量できる。
【０１６６】
前記抗体は、米国特許４，２７５，１４９に開示のもののようなさまざまな酵素基質標識類により標識できる。前記酵素は、一般的に、発色性基質の化学的変化を触媒し、それは、さまざまな技術を用いて測定できる。たとえば、前記酵素は、基質の色変化を触媒でき、それは、分光分析により測定できる。これとは別に、前記酵素は、基質の蛍光または化学発光を変化させることがある。
【０１６７】
診断の１適用において、本発明は、ＶＥＧＦたんぱく質存在を決定する方法を提供し、前記方法は、ＶＥＧＦたんぱく質含有の疑いのある試料を抗ＶＥＧＦ抗体に暴露させることおよび前記抗体の試料への結合を決定することを含む。この用途のため、本発明は、前記抗体とこの抗体を用いてＶＥＧＦたんぱく質を検出するための指示書を含むキットを提供する。
【０１６８】
本発明の抗体類は、また、広範のさまざまな投与経路による運搬のために製剤化することができる。所望の純度を有する前記抗体を適宜生理的に許容でき凍結製剤または水溶液の形状の担体類、賦形剤類または安定化剤類（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することによって、前記抗体の治療製剤を保存用に調製する。たとえば、前記抗体類は、経口、局所、非経口、腹腔内、静脈内、動脈内、経皮的、舌下、筋肉内、直腸内、経頬肉で、鼻腔内に、膣内に、眼内に、局所運搬により（例えば、カテーテルによりまたはステントにより）、皮下、肥満細胞内に、関節内または髄腔内に投与することもできるしまたは共投与することもできる。
【０１６９】
疾患の種類および重篤度に応じて、抗体約１μｇ／ｋｇ乃至５０ｍｇ／ｋｇ（例  ０．１−２０ｍｇ／ｋｇ、０．５−１５ｍｇ／Ｋｇ、および１−１０ｍｇ／ｋｇ）が患者に投与するための初期候補投与量であり、例えば、１回以上の分離投与によるかまたは連続点滴により投与する。一般的な一日または毎週投与量は、約１μｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であることができ、それは、上記因子類に依存している。状態に応じて数日間以上にわたり繰り返し投与する場合には、疾患症状が所望したように抑制されるまで治療を繰り返す。しかし、他の投与処方も有用であることができる。この治療の経過は、例えばラジオグラフィ腫瘍イメージングを含む従来の技術やアッセイによって容易にモニタリングする。
【０１７０】
本発明の抗ＶＥＧＦ抗体類を用いて、抗ＶＥＧＦ抗体が治療活性を有する広範のさまざまな適応症を治療するために使用することができる。このような適応症には、再梗塞（例  冠、総頸動脈および脳病巣類）、良性腫瘍、原発性腫瘍および腫瘍転移を含むさまざまなタイプの癌類、内皮細胞の異常刺激（動脈硬化）、手術、異常創傷治癒、異常新脈管形成、組織線維化をもたらす疾患類、筋肉変性、反復性運動障害、高度には血管化されていない組織の障害、および臓器移植に関連した増殖性応答を含むがこれらに限定されない。
【０１７１】
良性腫瘍の例には、ヘマンギオーマ、肝細胞性アデノーマ、海綿状へマンギオーマ、病巣結節性過形成、聴神経腫、神経線維腫、胆管アデノーマ、胆管シスタノーマ、線維腫、脂肪腫類、平滑筋腫、中皮腫、奇形腫、肉腫類、結節性再生性過形成、トラコーマ類および発熱性肉芽腫類が含まれる。
【０１７２】
癌の具体的タイプには、白血病、乳癌、皮膚癌、骨癌、前立腺癌、肝癌、肺癌、脳癌、咽頭、胆嚢、膵臓、直腸、副甲状腺、甲状腺、副腎、神経組織、頭頸部、結腸、胃、気管支、腎臓の癌、基底細胞カルシノーマ、潰瘍化および乳頭状の両タイプの扁平細胞カルシノーマ、転移性皮膚カルシノーマ、骨肉腫、アーウィング肉腫、ベティキュラム細胞肉腫、骨髄腫、巨細胞腫瘍、小細胞肺癌、胆石、島細胞腫瘍、原発性脳腫瘍、急性および慢性リンパ球性および顆粒球性腫瘍、毛細胞腫瘍、アデノーマ、過形成、骨髄カルシノーマ、褐色細胞腫、粘膜神経腫、腸管神経節細胞腫、過形成角膜神経腫瘍、マルファン症候群様体質腫瘍、ウィルムス腫瘍、セミノーマ、卵巣腫瘍、平滑筋腫様腫瘍、頚部異形成およびインサイチュカルシノーマ、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、柔組織肉腫、悪性カルチノイド、局所皮膚病巣、菌状息肉腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、骨原性および他の肉腫、悪性カルシウム血症、腎細胞腫瘍、真性赤血球増加症、アデノカルシノーマ、多形成グリア芽細胞腫、白血病、リンパ腫、悪性メラノーマ、類表皮腫、および他のカルシノーマ類および肉種類を含むが、それらに限定されない。
【０１７３】
異常新脈管形成に関連した疾患には、慢性関節リウマチ、虚血性再潅流関連脳浮腫および傷害、皮質虚血、卵巣過形成および過血管、（多膿胞性卵巣症候群）、子宮内膜症、乾癬、糖尿病性網膜症、および未熟児網膜症（水晶体後方の線維形成性）、黄斑変性症、角膜移植拒絶、ニューロスキューラー緑内障およびオスターウェッバー症候群を含むが、これらに限定されない。ある特定の態様において、本発明の坑ＶＥＧＦ抗体類を、加齢関連黄斑変性症（ＡＭＤ）を治療するために使用することができる。
【０１７４】
網膜／脈絡膜の新血管形成の例には、ベストス（Ｂｅｓｔｓ）疾患、近視、眼の小窩、スターガルツ疾患類、ページェット疾患、静脈閉塞、動脈閉塞、鎌状細胞貧血、類肉腫、梅毒、弾性線維仮性黄色腫総頚動脈アボストラクティブ疾患類、慢性ブドウ膜炎／ガラス体炎、マイコバクテリア感染、ライム疾患、全身性エリテマトーデス、未熟児網膜症、エールズ疾患、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、ベーチェット病、網膜炎または脈絡膜炎を起こす感染、仮性眼ヒストプラスマ症、パーズプラニティス、慢性網膜はく離、超粘性症候群、トキソプラズマ症、外傷およびレーザー後合併症、ルベーシス（足根関節の新血管形成）関連疾患類および増殖性ガラス体網膜症のあらゆる形態を含む線維脈管性または線維組織の異常増殖が原因の疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７５】
角膜新血管形成の例には、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症、コンタクトレンズ過剰装着、異所性角膜炎、上輪部角膜炎、肥大した眼球結膜下組織の三角形班角膜炎複合、シェーグレン、酒さ性ざそう、ファイレクテニュローシス、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植拒絶、ムーレン潰瘍、テリエン辺縁変性、辺縁角膜溶解、多発性動脈炎、ウェーグナー肉腫、強膜炎、ペリフェゴイド放射状角膜石灰化、新血管形成性緑内障および水晶体後方の線維増殖、梅毒、マイコバクテリア感染症、脂質変性、化学物質火傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染症、ヘルペスゾスター感染症、プロトゾアン感染症およびカポジ肉腫が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１７６】
本発明の抗ＶＥＧＦ抗体類は、異常新血管形成に関連した疾患の治療のため、抗新血管形成剤と併用して使用できる。
【０１７７】
坑新血管形成剤の例には、レチノール酸およびその誘導体類、２−メトキシエストラジオール、ＡＮＧＩＯＳＴＡＴＩＮTMたんぱく質、ＥＮＤＯＳＴＡＴＩＮTMたんぱく質、スラミン、スクラミン、メタロプロテイネース−１の組織阻害剤、メタロプロテイネース−２の組織阻害剤、プラスミノーゲン活性化剤阻害剤−１、プラスミノーゲン活性化剤阻害剤−２、軟骨由来阻害剤、パクリタキセル、血小板因子４、プロタミンスルフェート（クルペイン）、硫酸化キチン誘導体類（クイーンクラブ殻から調製）、硫酸化多糖ペプチドグリカン複合体（ｓｐ−ｐｇ）、スタウロスポリン、マトリックス代謝の調節剤類で例えばプロリンアナログ類（（１−アゼチジン−２−カルボン酸（ＬＡＣＡ）、シスハイドロキシプロリン、ｄ，ｌ−３、４−デハイドロプロリン、チオプロリン〕、α、α−ジピリジル、β−アミノプロピオニトリルフマレート、４−プロピル−５−（４−ピリジニル）−２（３ｈ）−オキサゾリン；メソトレキセート、ミトキサトロン、ヘパリン、インタフェロン類、２マクログロブリン−血清、チンプ−３、カイモスタチン、ベータ．−シクロデキストリンテトラデカサルフェート、エポネマイシン；フマギリン、金ナトリウムチオマレート、ｄ−ペニシラミン（ＣＤＰＴ）、ベータ．−１−抗コラゲナーゼ−血清、□２−アンチプラスミン、ビスアントレン、ロベンザリット２ナトリウム、ｎ−（２−カルボキシフェニル−４−クロロアンスロニン酸２ナトリウムすなわち“ＣＣＡ”、サリドマイド；アンゴスタチックステロイド、カルゴボキシナミノルミダゾール；ＢＢ９４のようなメタロプロテイナーゼ阻害剤類が含まれるが、それらに限定されない。他の抗新血管形成剤には、これらの新血管形成成長因子類ｂＦＧＦ，ａＦＧＦ、ＦＧＦ−５、ＶＥＧＦイソフォーム類、ＶＥＧＦ−Ｃ，ＨＧＦ／ＳＦおよびＡｎｇ−１／Ａｎｇ−２に対するモノクローナル抗体類のような抗体類が含まれる。
【０１７８】
本発明の抗ＶＥＧＦ抗体類、好適には抗ＶＥＧＦ抗体類と治療上相乗効果を有するものは、抗ＶＥＧＦ抗体類と併用使用でき、これらの２種の薬物の治療効果をさらに増強する。前記治療剤の例には、アルキル化剤類、抗生物質類、抗代謝剤類、ホルモン剤類、植物由来物質類、および生物製剤類が含まれるが、それらに限定されない。
【０１７９】
アルキル化剤類の例には、ビスクロロエチルアミン類（ナイトロゲンマスタード類、例  クロラムブシル、シクロホスファマイド、イフォスファミド、メクロロエタミン、メルファラン、ウラシルマスタード）、アジリジン類（例  チオテパ）、アルキルアルコンスルホネート類（例  ブスルファン）、ニトロソウレア類（例  カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン）、従来にないアルキル化剤類（アルトレタミン、デカルバジン、およびプロカルバジン）、白金化合物類（カルボプラチンおよびシスプラチン）が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１８０】
抗生物質類の例には、アンスラサイクリン類（例  ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシンおよびアンスラセンエジオン）、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、プリカトマイシンが含まれるが、それらに限定されない。
【０１８１】
抗代謝剤類の例には、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メソトレキセート、ロイコボリン、ハイドロキシウレア、チオグアニン（６−ＴＧ）、メルカプトプリン（６−ＭＰ）、シタラビン、ペントスタチン、フルダラビンホスフェート、クラドリビン（２−ＣＤＡ）、アスパラギナーゼ、イマチニブメシレート（すなわちＧＬＥＥＶＡＣ（登録商標））、およびゲンシタビンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８２】
上記ホルモン剤類の例には、合成エストロゲン類（例  ジエチルスチベストロール）、抗エストロゲン剤類（例  タモキシフェン、トレミフェン、フルオキシメステロールおよびラロキシフェン）、抗アンドロゲン類（ビカルタミド、ニルタミド、フルタミド）、アロマターゼ阻害剤類（例  アミノグルテチイミド、アナストロゾールおよびテトラゾール）、ケトコナゾール、ゴセレリンアセテート、ロイプロリド、メゲストロールアセテートおよびミフェプリストンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８３】
植物由来物質類の例には、ビンカアルカロイド類（例  ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビンゾリジンおよびビノレルビン）、ポドフィロトキシン類（例  エトポシド（ＶＰ−１６）およびテニポシド（ＶＭ−２６））、カンプトテシン化合物類（例  ２０（Ｓ）カンプトテシン、トポテカン、ルビテカンおよびイリノテカン）、タキサン類（例  パクリタキセルおよびドセタキセル）が含まれるが、それらに限定されない。
【０１８４】
生物製剤類の例には、サイトカイン類のような免疫調節たんぱく質類、腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体類、腫瘍抑制剤遺伝子類、および癌ワクチン類が含まれるが、それらに限定されない。本発明の抗体と関連させて使用することもできるインタロイキン類の例には、インタロイキン２（ＩＬ−２）、およびインタロイキン４（ＩＬ−４）、インタロイキン１２（ＩＬ−１２）が挙げられるが、それらに限定されない。本発明の抗体と関連させて使用することもできるインタフェロン類の例には、インタフェロンａ、インタフェロンｂ（線維芽細胞インタフェロン）およびインタフェロンｇ（線維芽細胞インタフェロン）が挙げられるが、それらに限定されない。上記サイトカイン類の例には、エリスロポエイチン（エポイエチンａ）、顆粒球−ＣＳＦ（フィルグラスチン）、および顆粒球、マクロファージ−ＣＳＦ（サルグラモスチム）が含まれるが、それらに限定されない。サイトカイン以外の他の免疫調節剤類には、バシラス属カルメッテ−グエリン（Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）、レバミゾール、およびオクトレオチドが含まれるが、それらに限定されない。
【０１８５】
本発明の抗ＶＥＧＦ抗体類は、また、上記疾患類または状態類の治療において、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）またはそのムテインと併用できる。抗ＶＥＧＦ抗体とＴＮＦの投与は、所望の臨床的効果が得られるまで繰り返す。全身循環から分離されやすい四肢または他の部位に固形腫瘍が見出された場合には、前記抗体および／またはＴＮＦを分離した腫瘍または臓器に投与することもできる。他の態様において、抗ＦＧＦまたは抗ＰＤＧＦ中和抗体のようなＦＧＦまたは血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）アンタゴニストを、患者に対して前記抗ＶＥＧＦ抗体と関連投与する。抗ＶＥＧＦ抗体類による治療は、創傷治癒または望ましい新血管形成の間持続するのが最適である。
【０１８６】
腫瘍抗原類に対するモノクローナル抗体類で本発明の抗ＶＥＧＦ抗体類と関連使用できるモノクローナル抗体類の例には、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラストルズマブ）、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（リツキシマブ）、ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標）（ゲムツズマブオゾガミシン）、ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）（アレムツズマブ）、ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（イブリツモマブイウキセタン）、ＰＡＮＯＲＥＸ（登録商標）（エドレコロマブ）、ＢＥＸＸＡＲ（登録商標）（トシツモマブ）、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ）、およびＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）が含まれるが、それらに限定されない。
【０１８７】
腫瘍抑制剤遺伝子類の例には、ＤＰＣ−４，ＮＦ−１，ＮＦ−２，ＲＢ、ｐ５３、ＷＴ１，ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１８８】
腫瘍ワクチン類の例には、ガングリオシド類（ＧＭ２）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、□−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）（結腸癌および乳癌、肺癌、消化管および膵臓癌のような他のアデノカルシノーマ類によって産生）、メラノーマ関連抗原類（ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ１，３チロシナーゼ）、パピローマウイルスＥ６およびＥ７断片類、アントロガウス腫瘍細胞類および同種異系間腫瘍細胞類の全細胞または部分／融解物を含むが、それらに限定されない。
【０１８９】
アジュバントを用いて、ＴＡＡｓに対する免疫応答を促進することもできる。アジュバント類の例には、バシラス属カルメッテ−グエリン（ＢＣＧ）、エンドトキシンリポポリサッカライド類、カブトガニヘモシアニン（ＧＫＬＨ）、インタロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびサイトキサン、低用量で投与すると腫瘍誘発抑制を低下させると考えられている化学療法剤を含むが、それらに限定されない。
（実施例）
【０１９０】
１．ヒト化およびアフィニティ成熟のための抗ＶＥＧＦ抗体類のインシリコ設計
本発明が提供した方法論を用いて、非ヒト抗体類のヒト化のためのライブラリを設計しかつ抗体類のアフィニティおよび他の属性を最適化した。抗体類の新しいアミノ酸類および核酸類変異体を、ヒトまたはヒト様配列類により産生させ、それらの結合アフィニティ、安定性、発現を有意に改善する。
【０１９１】
本発明のプロセスは、全生物類、特にヒトのたんぱく質配列類のますます増えるデータベースを検索することおよびそれらの特異的配列類またはそれらの変異体を実験的に試験する結合アフィニティおよび安定性のような機能的増強と関連付けることによって、高処理量でコンピュータ計算により実施した。本発明の方法論を用いることによってインシリコで非常に多様なたんぱく質配列類と機能的に関連する構造類をコンピュータ計算により評価したことに基づいて、機能的にはバイアスを含む抗体類拡大ライブラリを構築し、その後、インビトロまたはインビボで実験的スクリーニングと選択により試験した。
【０１９２】
通常、前記方法は、リードたんぱく質中の標的構造／機能的モチーフまたはドメインの以下“リード配列”と称するアミノ酸配列に基づき、たんぱく質配列類をインシリコで選択することにより、コンピュータで実行した。前記リード配列を用いて、たんぱく質配列類のデータベースを検索した。データベースの選択は、設計したモチーフの具体的機能的要件に依存する。たとえば、もし前記リードたんぱく質が酵素で前記標的モチーフが前記酵素の活性部位を含むならば、特定起源、生物、種またはその組み合わせのたんぱく質類／ペプチド類のデータベース類を、さまざまな検索基準を用いて検討し、それぞれが前記リードたんぱく質中の標的モチーフの代わりとなることができる配列類のヒットリストを得る。同様の手法を用いて、リードたんぱく質の他のモチーフ類またはドメイン類を設計する。それぞれの各モチーフ／ドメインについての設計配列を組み合わせて、設計たんぱく質類のライブラリを作成する。さらに、治療または診断のようなヒト適用のための設計たんぱく質類の免疫性を低下させるため、好適にはヒト起源のたんぱく質類またはヒト化たんぱく質類のデータベースを検索して、特に抗体フレームワーク類のようなリードたんぱく質類の骨格として作用するリードたんぱく質の部位に由来するモチーフ用に、配列類のヒットリストを得る。設計したたんぱく質類のライブラリを実験的に試験して、リードたんぱく質に勝る改善された生物機能（類）を有するたんぱく質類を得る。
【０１９３】
この実施例において、本発明の方法論は、配列が多様であるがそれでいて機能的には互いに関連している抗ＶＥＧＦ抗体類の設計において、実施した。設計した抗体配列類に基づき、非ヒト抗体の相補性決定領域類（ＣＤＲｓ）および／またはヒト化フレームワーク類（ＦＲｓ）の多様な配列類を含む抗体類ライブラリを高処理量で構築した。この抗体ライブラリを、結合アフィニティおよび薬物動態性質のような機能改善についてヒトＶＥＧＦに対してスクリーニングした。
【０１９４】
坑ＶＥＧＦ抗体類設計において、以下“リード配列”と称するリードＶＥＧＦ抗体中ある領域またはモチーフのアミノ酸配列に基づき、抗体配列類のインシリコ選択を行った。前記リード配列を用いてたんぱく質配列類のデータベース類を検索した。データベースの選択は、設計したモチーフ類の具体的機能的用件に依存する。たとえば：治療適用のため可変鎖のフレームワーク領域類を設計するため、２−３の構造上重要な部位を除いて完全ヒトイムノグロブリン配列類およびヒト生殖細胞イムノグロブリン配列類のような進化上関連するたんぱく質配列類のコレクションを用いるであろう。これにより、この高度に保存された領域（フレームワーク領域類用）中に可能な限りわずかの外来変異を導入することにより前記配列類の元来の姿を維持することにより、免疫応答を低下させるであろう。一方、ｇｅｎｂａｎｋ中のさまざまな種のイムノグロブリン配列類または関連のない配列類のような多様な配列データベース類を用いて、この高度に保存された領域中における抗原類に対する結合アフィニティを向上させるため、ＣＤＲｓを設計できる。この方法を用いて、多様な抗体配列類のライブラリを構築して、改良されたかまたは所望の機能（類）を有する抗体変異体類をインビトロおよび／またはインビボで実験的にスクリーニングした。
【０１９５】
１）アフィニティ成熟のためにインシリコで設計した抗ＶＥＧＦ抗体ライブラリ類
マウス抗ＶＥＧＦ抗体の可変重鎖領域類およびフレームワーク類およびＣＤＲｓ（下線を付しかつ注解をつけた）のセグメント類のアミノ酸配列は：
【化２８】
2008504215.tif 000029
（配列番号２８３）
である。
【０１９６】
このＶH配列は以下、“親抗ＶＥＧＦ抗体”と称する。前記フレームワーク類とＣＤＲｓは、Ｋａｂａｔ基準に基づき命名する（Ｋａｂａｔ  ＥＡ，Ｒｅｄｉ−Ｍｉｌｌｅｒ  Ｍ．，Ｐｅｒｒｙ  ＨＭ，Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ  ＫＳ（１９８７）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  第４版、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）。
【０１９７】
抗体のＣＤＲとフレームワーク領域類は、さらに詳細には米国特許出願第１０／４４３，１３４、１０／１５３，１５９、１０／１５３，１７６、１０／１２５，６８７、および６０／２８４，４０７に記載されたモジュラーインシリコ進化設計アプローチを用いて、標的とした。これらの出願は、本文でその全文を参考として引用した。マウス抗ＶＥＧＦ抗体をリードたんぱく質として用いリード配列としてそのＶH  ＣＤＲ３を用いて、前記操作に従い、ＶH  ＣＤＲ３のデジタルライブラリ類を構築した。
【０１９８】
前記リード配列は、親抗ＶＥＧＦ抗体のＶH  ＣＤＲ３と隣接するフレームワーク領域類
【化２９】
2008504215.tif 000030
由来の２−３個のアミノ酸残基類を含む。ヒットライブラリは、配列データベースからＶH  ＣＤＲ３に対するヒットアミノ酸配列類を検索し選択することによって、構築した。変異体プロフィールは、ヒットライブラリに基づき各位置における全ての変異体類をリストして作成し、あるカットオフ値でフィルタリングしコンピュータ計算によるかまたは実験的な限界に留まるように、精製したヒット変異体ライブラリの大きさを小さくした。変異体プロフィールはまた、ｉ）フィットネスという観点から好適な領域をカバーする配列空間のサンプリング；ｉｉ）好適なペプチドエンゼンブル配列類を標的とする変性核酸ライブラリ類の分配および合成；ｉｉｉ）所望の機能について抗体ライブラリの実験的スクリーニング；およびｉｖ）さらに設計と最適化のため実験結果をフィードバック分析することを促進するため、作成した。
【０１９９】
リード構造テンプレート類は、ＶＥＧＦと抗ＶＥＧＦ抗体類との間に形成された複合体類の利用可能なＸ線構造類から得られた。ＶＥＧＦと親抗ＶＥＧＦ抗体の複合体構造を、１ＢＪ１と命名し、ＶＥＧＦと成熟抗ＶＥＧＦ抗体の間に形成されたそれを、１ＣＺ８と命名した。１ＣＺ８構造テンプレートによる結果は、相対的なスキャン配列類の相対的ランクオーダーは１ＢＪ１のそれらと同様であった。抗ＶＥＧＦ抗体類の構造モデル類も、また、使用できる。
【０２００】
ＶH  ＣＤＲ３に対するリード配列は、それぞれＮ末端およびＣ末端においてＶH  ＣＤＲ３配列に隣接する隣接フレームワーク領域類由来のアミノ酸残基ＣＡＫおよびＷＧにより、Ｋａｂａｔ分類に従って、親抗ＶＥＧＦ抗体から得る。親抗体のＶH  ＣＤＲ３配列のみを用いて、たんぱく質データベース類検索のためのＨＭＭを作成した。
【０２０１】
単一リード配列または構造的エンゼンブル類の配列類を用いて作成したＨＭＭを校正し、Ｋａｂａｔデータベース検索に用いた（Ｊｏｈｎｓｏｎ、ＧおよびＷｕ，ＴＴ（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２９、２０５−２０６）。期待値すなわちＥ値を超える全ての配列ヒット類を列挙し、ＨＡＭＭＥＲ２．１．１パッケージを用いて並べる。前記ヒットリストから重複配列を除いて、リードＨＭＭのための残りのヒット配列類でヒットライブラリを形成する。
【０２０２】
各位置における変異体プロフィールを用いて、ＡＡ−ＰＶＰ表を作成し（アミノ酸位置変異体プロフィール）、それは、各位置における各アミノ酸残基の出現回数を示す。
【０２０３】
この変異体プロフィールをフィルタリングし、あるカットオフ頻度で出現するかまたはそれ未満で出現する変異体類を取り除き、および／または構造に基づくスコアリングを用いて変異体リプロフィーリングと併用できる。配列プールからのこの変異体プロフィールは、変化可能であるかまたは固定されることができるリード配列中における位置類を同定するための情報データを提供する。前記部位は、３種のカテゴリーに分けられる：ｉ）構造上保存された部位は、進化を超えて保存されたままである。高頻度の残基類を用いてこれらの位置における標的モチーフの骨格を維持する；ｉｉ）可変の機能的ホットスポット類は、注目する変異誘発により標的とすべきである；ｉｉｉ）  ｉ）とｉｉ）の両者の併用により標的骨格を安定させ、一方、同時に、前記の機能的ホットスポット類中において可変性を付与する。
【０２０４】
機能的変異体類からのアミノ酸類セットを、それらの頻度に従って機能的ホットスポット類で変異体プロフィール中に含めるべきであり、その理由は、それらが進化的に選択されるかまたは最適化されるからである。さらに、各位置における変異体類は、フィルタリングするかまたは優先順位をつけることができ、コンピュータ計算および実験的制約に適合するように他の潜在的に有益な変異体類を取り込みまたは潜在的に望ましくない変異体類を排除することができる。
【０２０５】
変異体プロフィールは、各位置における好適なアミノ酸残基類および好適な改変されていない好適なオーダーの特異的変異体類について情報を与えるが、それは、極めて多くの組み換え体を包含する。頻度カットオフを用いたあるフィルタリングでは、コンピュータスクリーニングによって評価するかまたは直接実験的ライブラリにより標的化する必要のある組み合わせ配列類を減少させることができる。
【０２０６】
構造に基づくスコアリングを適用して、ヒットライブラリとヒット変異体ライブラリを形成するその組み合わせ配列類をスクリーニングした。親抗ＶＥＧＦ抗体のＶH  ＣＤＲ３の側鎖は、各残基位置において、ヒット変異体ライブラリからの対応するアミノ酸変異体類の回転異性体類によって置換した。回転異性体類の立体構造を、骨格依存性回転異性体ライブラリ（Ｂｏｗｅｒ  ＭＪ，Ｃｏｈｅｎ  ＦＥ、Ｄｕｎｂｒａｃｋ  ＲＬ（１９９７）ＪＭＢ  ２６７，１２６８−８２）を用いるプログラムＳＣＷＲＬ（登録商標）（２．１バージョン）を用いることによって、構築し最適化した。
【０２０７】
スコアリングは、最適回転異性体類を検索し抗原ＶＥＧＦ存在下および非存在下においてＣＯＮＧＥＮ中Ａｍｂｅｒ９４フォースフィールド〔Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ  ａｎｄ  Ｋａｒｐｌｕｓ（１９８７）  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２６：１３７−１６８〕を用いて、１００−２００段階によりエネルギーを最小化することによって、行った。ＶＥＧＦの有無により計算したスコアに基づく抗ＶＥＧＦ変異体ライブラリのエネルギースコアは、親配列類よりも大きなスコアを有するさまざまな変異体ライブラリ類について多くの配列類があることを示唆している。
【０２０８】
側鎖エントロピー、非極性溶媒和エネルギーおよび静電気的溶媒和エネルギーを含むより精密なカスタムスコアリング関数を用いて、スコアリングに用いた単純関数類を評価する。３個のエネルギー項を計算した：側鎖エントロピー、非極性溶媒和エネルギーおよび静電気的溶媒和エネルギー、およびループに対する骨格エントロピーも計算した。
【０２０９】
非静電気的溶媒和エネルギーは、ＣＯＮＧＥＮで実施するＧＥＰＯＬ（Ｐａｓｃｕａｌ−Ａｈｕｉｒ  ＪＬ、Ｓｉｌｌａ  Ｅ（１９９３）Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｃｈｅｍ  １１，１０４７−１０６０）コマンドを用いるスケールコンスタント  ７０ｃａｌ／ｍｏｌ／Ａ2（Ｔｕｎｏｎ  Ｉ、Ｓｉｌｌａ  Ｅ、Ｐａｓｃｕａｌ−Ａｈｕｉｒ  ＪＬ（１９９２）Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  ５、７１５−７１６）によりＧＥＰＯＬ９３アルゴリズムにより計算し、分子表面に対して比例するようにする。
【０２１０】
静電気的溶媒和エネルギーは、ＵＨＢＤプログラム（Ｄａｖｉｓ  ＭＥ，Ｍａｄｕｒａ  ＪＤ，Ｌｕｔｙ  ＢＡ、ＭｃＣａｍｍｏｎ  ＪＡ（１９９１）Ｃｏｍｐｕｔ  Ｐｈｙｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ６２、１８７−１９７）において実施する有限差ＰＢ（ＦＤＰＢ）を用いて計算する。この集束方法を、変異を取り巻く領域について用いる。自動化プロトコールは、３つのグリッド類を産生する：粗、細および収束グリッド類。前記グリッドユニット類は、それぞれ、１．５、０．５および０．２５オングストロームである。収束グリッドは、変異残基類が占めるデカルト容積をカバーする立方体グリッドである。細かいグリッドは、前記たんぱく質または複合体の全容積をカバーする立方体グリッドである。粗グリッドは、各軸において細かいグリッドの大きさのおよそ２倍に設定された立方体グリッドであり、細かいグリッドの容積のおよそ８倍をカバーする。粗グリッドは、ロングレンジの溶媒効果を説明するように作用し、細かいグリッドの境界条件を設定する。同様に、細かいグリッドは、たんぱく質内部の静電気的寄与を説明するように作用し、収束グリッドの境界条件を設定する。収束グリッドは、変異による局所効果の細部詳細を説明する。たんぱく質内部および外部の誘電定数は、それぞれ、４および７８に設定する。温度は、３００ケルビンに設定し、イオン強度は、１５０ｍＭに設定する。最大イテレーションは、２００に設定する。計算は、均一な誘電率により繰り返し、内部および外部の誘電率を両者ともに４に設定し、前記２個のエネルギー差は、コンピュータ計算する。後者の計算は、グリッドに電荷をもたらしたことによるエネルギーを示す。
【０２１１】
カスタムスコアリング関数またはＣＯＮＧＥＮ中Ａｍｂｅｒ９４フォースフィールド＋本文で使用したＵＨＢＤ中ＰＢ由来溶媒和項を用いた分子力学エネルギーは、ＭＭ−ＰＢＳＡまたはＭＭ−ＧＢＳＡに類似している。前記エネルギー関数は、特に分子動態計算による構造エンゼンブルを用いて配列およびその変異体類のスコアリングのためのより正確な方法を、エネルギー関数類のエンゼンブル平均に基づき（Ｋｏｌｌｍａｎ  ＰＡ，Ｍａｓｓｏｖａ  Ｉ、Ｒｅｙｅｓ  Ｃ，Ｋｕｈｎ  Ｂ，Ｈｕｏ  ＳＨ，Ｃｈｏｎｇ  ＬＴ，Ｌｅｅ  Ｍ，Ｌｅｅ  ＴＳ，Ｄｕａｎ  Ｙ，Ｗａｎｇ  Ｗ，Ｄｏｎｉｎｉ  Ｏ，Ｃｉｅｐｌａｋ  Ｐ，Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ  Ｐ，Ｃａｓｅ  ＤＡおよびＣｈｅａｔｈａｍ  ＴＥ  （２０００）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ．３３、８８９−８９７）提供する時、実験データと良好な一致を示す（Ｓｈａｒｐ  ＫＡ．（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ３３、３９−４８；Ｎｏｖｏｔｎｙ  Ｊ，Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ  ＲＥ、Ｄａｖｉｓ  Ｍ，Ｓｈａｒｐ  ＫＡ（１９９７）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６８、４０１−４１１）。
【０２１２】
上記のようなヒット変異体ライブラリ由来の変異体プロフィールを、好適な残基類のほとんどを維持しつつ、潜在的ライブラリサイズを小さくするためにフィルタリングした。望ましいスコアに基づくトップ配列類を選択する戦略および／または望ましい相互作用に関与するような残基類の存在を用いて、核酸ライブラリ設計のためのアミノ酸配列クラスターまたはクラスター類を同定した。上記にも述べたように、ＶH  ＣＤＲ３、ＣＤＲ２およびＣＤＲ１のぞれぞれのコンピュータ計算した検索配列類クラスターを選択して、さらにインビトロで実験し試験した。
【０２１３】
上記で構築したヒット変異体ライブラリを、１個の変性核酸ライブラリにより標的にした。前記核酸配列ライブラリプロフィールを、具体的生物についての最小サイズと組み合わせた最適コドン類を用いて作成した。変性核酸ライブラリは、各変性位置に塩基類混合物を取り込ませることによって、合成した。合成の組み合わせ効果の結果、この変性核酸ライブラリは、拡大アミノ酸ライブラリをコードする。
【０２１４】
ＶHおよびＶLに対する各位置における変性体を、それぞれ、ＶHおよびＶLアミノ酸位置変異体プロフィールで示した。ＶHおよび／またはＶL  ＣＤＲ３，ＣＤＲ２およびＣＤＲ１についての詳細な結果とＦＲ１２３を、抗ＶＥＧＦ  ＶHおよびＶL表に要約した。これらの実験は、本発明の方法類を用いることによって、多様な配列類と系統発生的距離ばかりでなく標的ＶＥＧＦ抗原に結合する改善結合アフィニティにより、抗体類を選択できた。
【０２１５】
図１Ａは、上記方法論を用いて設計した抗ＶＥＧＦ抗体類のＶLについてアミノ酸位置変異体プロフィール（ＡＡ−ＰＶＰ）である。ＶL鎖のＡＡ−ＰＶＰは、参考文献としてのＢａｃａら（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：１０６７８−１０６８４によるヒト化ＶL（配列番号１）を用いている。ドットは、参考として同一アミノ酸を示している。ＣＤＲｓは下線付き太字で示した。
【０２１６】
図１Ｂは、上記方法論を用いて設計した抗ＶＥＧＦ抗体類のＶHについてアミノ酸位置変異体プロフィール（ＡＡ−ＰＶＰ）である。ＶH鎖のＡＡ−ＰＶＰは、参考文献としてのＢａｃａら（１９９７）同上によるヒト化ＶH（配列番号５５）を用いている。ドットは、参考として同一アミノ酸を示している。ＣＤＲｓは下線付き太字で示した。
【０２１７】
上記方法類を用いることによって親抗ＶＥＧＦ抗体のリード配列に基づくインシリコ設計抗体ライブラリについて、新規ファージディスプレイシステムを用いることによって、抗原ＶＥＧＦに結合するそれらの能力を試験した。
【０２１８】
２）フレームワーク最適化のための抗ＶＥＧＦ抗体ライブラリの産生
マウスモノクローナル抗体は、ＶＥＧＦ依存性細胞増殖をブロックしかつインビボにおける腫瘍増殖を遅らせることがわかった（Ｋｉｍ  ＫＪ，Ｌｉ  Ｂ，Ｗｉｎｅｒ  Ｊ，Ａｒｍａｎｉｎｉ  Ｍ，Ｇｉｌｌｅｔｔ  Ｎ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＨＳ，Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ（１９９３）  Ｎａｔｕｒｅ  ３６２、８４１−８４４）。このマウス抗体を、抗原結合ループ移植後一部の重要フレームワーク位置において無作為変異を用いて、ヒト化した（Ｐｒｅｓｔａ  ＬＧ，Ｃｈｅｎ  Ｈ，Ｏ‘Ｃｏｎｎｏｒ  ＳＪ，Ｃｈｉｓｈｏｌｍ  Ｖ，Ｍｅｎｇ  ＹＧ，Ｋｒｕｍｍｅｎ  Ｌ，Ｗｉｎｋｌｅｒ  Ｍ，Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ（１９９７）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７、４５９３−４５９９；Ｂａｃａ  Ｍ，Ｐｒｅｓｔａ  ＬＧ，Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  ＳＪ、Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２、１０６７８−１０６８４）。通常、何回かの部位特異的変異誘発と選択後、ヒトまたはコンセンサスヒトフレームワークをある事前に決めた重要位置において親非ヒト抗体由来の非ヒトアミノ酸類で置換することによって、ヒト化抗体を産生する。これらのヒト化抗体類は通常、その親抗体の同系抗原に対して親抗体に比べて低いアフィニティで結合するであろう（その親マウス抗体に比べてヒト化抗ＶＥＧＦについて約６倍弱い、Ｂａｃａ  Ｍ，Ｐｒｅｓｔａ  ＬＧ，Ｏ‘Ｃｏｎｎｏｒ  ＳＪ，Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２、１０６７８−１０６８４、およびヒト化抗ＶＥＧＦの別のバージョンについて約２倍弱い、Ｐｒｅｓｔａ  ＬＧ，Ｃｈｅｎ  Ｈ，Ｏ‘Ｃｏｎｎｏｒ  ＳＪ，Ｃｈｉｓｈｏｌｍ  Ｖ，Ｍｅｎｇ  ＹＧ，Ｋｒｕｍｍｅｎ  Ｌ，Ｗｉｎｋｌｅｒ  Ｍ，Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７、４５９３−４５９９；Ｂａｃａ  Ｍ，Ｐｒｅｓｔａ  ＬＧ，Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  ＳＪ、Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２、１０６７８−１０６８４）参照）。この結合アフェニィティロスが、ＣＤＲｓにおけるアフィニティ成熟を用いることによって回復されるであろう（Ｃｈｅｎ  Ｙ，Ｗｉｅｓｍａｎ  Ｃ，Ｆｕｈ  Ｇ，Ｌｉ  Ｂ、Ｃｈｒｉｎｓｔｉｎｇｅｒ  ＨＷ，ＭｃＫａｙ  Ｐ，ｄｅ  Ｖｏｓ  ＡＭ、Ｌｏｗｍａｎ  ＨＢ（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２９３、８６５−８８１）。
【０２１９】
本発明の前記方法を用いて、我々は、フレームワーク最適化により、報告されたヒト化抗ＶＥＧＦ抗体配列よりも数倍（ｈＡＢ２について３．３倍、ｈＡＢ３について４倍およびｈＡＢ４について２倍）結合アフィテニィが高い数種のヒト化フレームワークを発見した（文献（Ｐｒｅｓｔａ  ＬＧ，Ｃｈｅｎ  Ｈ、Ｏ‘Ｃｏｎｎｏｒ  ＳＪ，Ｃｈｉｓｈｏｌｍ  Ｖ，Ｍｅｎｇ  ＹＧ，Ｋｒｕｍｍｅｎ  Ｌ，Ｗｉｎｋｌｅｒ  Ｍ，Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７、４５９３−４５９９）に報告されているヒト化抗ＶＥＧＦ抗体フレームワークについて、図２中のｈＡＢ１を参照）。報告されたヒト化抗ＶＥＧＦ抗体は、その対応するマウス抗体よりもおよそ２倍弱いので、我々のヒト化抗体類（ｈＡＢ２およびｈＡＢ３）は、対応するマウス抗体よりも、ヒト化によりおよそ２倍高い結合アフィニティを有するはずである。また、我々は、報告ヒト化抗体（ｈＡＢ１）に比べてヒト化抗体類のオン速度（Ｋon）を増加させるかまたはオフ速度（Ｋoff）を低下させるかまたはその両者により、上記の改善を達成できる（図２参照）。
【０２２０】
マウスＶＥＧＦ抗体のフレームワークｆｒ１２３領域のアミノ酸配列は：
【化３０】
2008504215.tif 000031
である。
【０２２１】
この配列を以下、“マウス抗ＶＥＧＦ抗体”のｆｒ１２３と称する、Ｐｒｅｓｔａ  ＬＧ，Ｃｈｅｎ  Ｈ，Ｏ‘Ｃｏｎｎｏｒ  ＳＪ，Ｃｈｉｓｈｏｌｍ  Ｖ，Ｍｅｎｇ  ＹＧ，Ｋｒｕｍｍｅｎ  Ｌ，Ｗｉｎｋｌｅｒ  Ｍ，Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７，４５９３−４５９９参照）。相対的に一定のフレームワーク４を、もし望むならば同一手法を用いて、設計できる。前記フレームワークおよびＣＤＲｓをＫａｂａｔ基準（Ｋａｂａｔ  ＥＡ，Ｒｅｄｉ−Ｍｉｌｌｅｒ  Ｍ，Ｐｅｒｒｙ  ＨＭ，Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ  ＫＳ（１９８７）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  第４版、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）により命名するが、ただし、他の分類も同様に使用できる。また、もし望むならばフレームワークＦＲ１またはＦＲ２またはＦＲ３およびＦＲ４の別々のセグメントをそれぞれ設計して、継ぎ合わせることもできる。ＣＤＲｓとＦＲｓの組み合わせを、同時に、各セグメントを設計するかまたはセグメント組み合わせを設計することによって、本文に記載の手法を用いて設計できる。ＣＤＲｓは、マウス抗ＶＥＧＦ由来の配列番号２８３中または本文に記載の手法を用いて設計したそれらにおけるものと同一である。しかし、異なるＣＤＲｓを同様に設計して、設計したＦＲ１２３ライブラリ類と組み合わせて用いることもできる。ヒットライブラリについての変異体プロフィール類を、マウス坑ＶＥＧＦ抗体のＶH  ＦＲ１２３のリード配列に基づくヒトＶH生殖細胞配列類を用いて作製し、あるカットオフ値を用いてフィルタリングする。各位置における変異体を、総エネルギーまたは他のスコアリング項を用いて、抗体構造との構造的適合性に基づき、並べることができる。いくつかの参考アミノ酸類が、その総エネルギーまたは特異的パッキングに基づきある位置で望ましいことがわかる。ただし、それらの出現頻度は極めて低い。ヒットライブラリについての変異体プロフィールを作成し、マウス坑ＶＥＧＦ抗体のＶH  ＦＲ１２３のリード配列に基づくＫａｂａｔ由来ヒトＶH配列を用いて、さらに正確にすることができる。フィルタリングした変異体プロフィールをさらにコンピュータによりスクリーニングして、もし抗体構造を用いるならば構造的適合性のランクオーダーを反映させる。ヒト対非ヒト配列類はＶH全鎖にわたって多くの位置で異なるが、他のヒト化アプローチで用いたアミノ酸ライブラリは、移植ＣＤＲｓに隣接する２−３の位置で無作為となることに注目しており、一方、好適な態様において、ヒト化ライブラリは、ＶHおよびＶL両鎖全体のさまざまな位置を標的にし、出発抗ＶＥＧＦ抗体についてそれらの位置で２−３の変異体類がある。
【０２２２】
好適な態様において、フレームワーク類ＦＲ１，ＦＲ２，ＦＲ３およびＦＲ４のような各モチーフまたは抗体のＦＲ１２３のようなその組み合わせは、モジュラーインシリコ進化設計手法を用いて、標的とすることができる。各モチーフまたはその組み合わせについて限られた数の立体構造（規範的構造と命名）があることがわかっている。抗体のこれらの構造的特長は、抗体構造を広く分析したものに基づく抗体のさまざまな領域における構造モチーフ類を用いることによって、進化的配列設計を試験するための優れたシステムを提供する。これらの構造および配列保存は、異なる種間でも見られる。実際、抗体類の足場すなわちイムノグロビンおりたたみ構造は、天然でもっともよく見られる構造のひとつであり、さまざまな抗体類および関連分子類でよく保存されている。
【０２２３】
好適な態様において、前記方法を用いて、また、配列に基づく手法またはＣＤＲｓにおける誘発構造変化を含む構造エンゼンブル類により抗体フレームワークを設計できる。マウス抗ＶＥＧＦ抗体フレームワークをリードたんぱく質として用いておよびそのＶH  ＦＲ１２３をリード配列として用いて、ＶH  ＦＲ１２３のデジタルライブラリを構築した。
【０２２４】
好適な態様において、ヒットライブラリを、ＶH  ＦＲ１２３をリード配列として用いてヒットアミノ酸配列類を検索しかつ選択することによって、構築した。変異体プロフィールは、ヒットライブラリに基づいて各位置で全変異体類を列挙し作成し、あるカットオフ値でフィルタリングして、作成したヒット変異体ライブラリの大きさをコンピュータによるかまたは実験的な限界内に留まるように小さくした。また、ｉ）フィットネスという観点から好適な領域をカバーする配列空間のサンプリング；ｉｉ）好適なペプチドエンゼンブル配列類を標的とする変性核酸ライブラリ類の分配および合成；ｉｉｉ）所望の機能について抗体ライブラリの実験的スクリーニング；およびｉｖ）さらに設計と最適化のため実験結果をフィードバック分析することを促進するため、作成した。
【０２２５】
リード構造テンプレート類は、ＶＥＧＦおよび抗ＶＥＧＦ抗体類との間に形成された複合体類の利用可能なＸ線構造類から入手した。ＶＥＧＦおよび親抗ＶＥＧＦ抗体の複合体構造は、１ＢＪ１と命名し、ＶＥＧＦと成熟抗ＶＥＧＦ抗体の間に形成されたものを、１ＣＺ８と命名した。１ＣＺ８構造テンプレートによる結果は、スキャンした配列類の相対的ランクオーダーにおいて１ＢＪ１による結果と同様であった。モデル化した構造または構造エンゼンブルまたはエンゼンブル平均を同様に用いて、配列をスクリーニングできる。ＶH  ＦＲ１２３のためのリード配列（配列番号２８３）を、マウス抗ＶＥＧＦ抗体からＫａｂａｔ分類に従い得る。単一リード配列を用いて作成したＨＭＭを校正し、ヒト重鎖生殖細胞配列データベースおよび／またはＫａｂａｔデータベース由来のヒト配列データベース（ヒト生殖細胞類およびヒト化配列類を含む）を検索した（Ｊｏｈｎｓｏｎ、ＧおよびＷｕ，ＴＴ（２００１）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２９、２０５−２０６）。期待値すなわちＥ値を超える全配列ヒット類を列挙し、ＨＡＭＭＥＲ２．１．１パッケージを用いて並べた。ヒットリストからあいまいな配列類を除去した後、リードＨＭＭのための残りのヒット配列類でヒットライブラリを形成する。ヒトＶH生殖細胞由来のヒット配列類の配列同一性は、リード配列の４０乃至６８％にわたっており、一方、Ｋａｂａｔデータベース（このデータベースは、検索感度とそれらの相対的ランク付け感度を高めるため、ｆｒ１２３断片に対して分析する）（もしヒト起源のイムノグロビン配列類を含むならば他のデータベースも用いるであろう）由来のヒトイムノグロビン配列類からのヒット配列類の対応する配列同一性は、約３０乃至７５％の範囲にわたっている。前記ヒット類の間の進化的距離は、プログラムＴｒｅｅＶｉｅｗ１．６．５（ｈｔｔｐ：／／ｔａｘｏｎｏｍｙ．ｚｏｏｌｏｇｙ．ｇｌａ．ａｃ．ｕｋ／ｒｏｄ／ｒｏｄ．ｈｔｍｌ）を用いることによって、分析できる。
【０２２６】
前記ＡＡ−ＰＶＰ表類は、各位置における各アミノ酸残基の出現回数を示している。ヒトＶH生殖細胞類由来のヒット配列類とＫａｂａｔ由来ヒトＶH配列類のそれとの間には、なんらかの差異がある：標的抗体類等の足場を安定化させるために構造的に重要なアミノ酸類からの非ヒト起源アミノ酸類。このフィルタリングした変異体プロフィールをさらにコンピュータで検索し、もし唯一の抗体構造を用いるならば構造的適合性のランクオーダーを反映させる。簡単に述べると、フレームワーク最適化のためのヒト起源の異なるデータベースを用いることで、アミノ酸類をフレームワーク最適化のために多様ではあるが強力に選択でき、それには、結合アフィニティおよび安定性を改善するためのヒト化を含む。治療用抗体類開発における我々の知識が増えたことで、より多くの抗体配列データが集積し、本発明を用いての我々の設計の指針となるであろう。重要位置およびこうした位置に関連したアミノ酸類を想定するための事前想定は、必要ではないであろう。この情報は本発明の方法を用いて自動的に明らかになるので、より多くのデータが蓄積されるに伴い、データベース中におけるその出現が多くなり、情報はさらに明確になるであろう。構造に基づく基準を用いて他の潜在的に有益な変異体類を含めるために変異体類を再度プロフィーリングしまたは優先順位をつけることができる。構造に基づくエネルギースコアリングにより、たんぱく質データベースから選択した配列のプロフィーリングに基づいて当初作成したヒット変異体ライブラリについて、各位置における変異体類出現頻度を再度プロフィーリングするための別の方法が提供される。頻度カットオフを用いたフィルタリングにより、コンピュータスクリーニングにより評価するかまたは直接実験的ライブラリ類によって標的化する必要のある組み合わせ配列類を少なくすることができる。変異体プロフィールに適用するカットオフによってさえも、実験的スクリーニングのための最終配列類中でスコアリングしかつ評価する必要のある組み合わせ配列類が、まだ、多数ある。
【０２２７】
構造に基づくスコアリングは、ヒットライブラリとヒット変異体ライブラリを形成する組み合わせ配列類をスクリーニングするために適用される。１ＣＺ８または１ＢＪ１中の抗ＶＥＧＦ抗体のＶH  ＦＲ１２３の側鎖を、骨格依存性回転異性体ライブラリ（Ｂｏｗｅｒ  ＭＪ，Ｃｏｈｅｎ  ＦＥ，Ｄｕｎｂｒａｃｋ  ＲＬ（１９９７）ＪＭＢ  ２６７，１２６８−８２）を用いるプログラムＳＣＷＲＬ（登録商標）（バージョン２．１）を用いることによって、各残基位置におけるヒット変異体ライブラリからの対応するアミノ酸変異体回転異性体によって、置換した。スコアリングは、エネルギーに関する項または最適回転異性体類およびＣＯＮＧＥＮ中Ａｍｂｅｒ９４フォースフィールドを用いたエネルギー最小化を用いて構造を最適化した後、各項についてのスケール関数とのそれらの組み合わせを用いて、抗原ＶＥＧＦの存在下または非存在下において行った〔ＢｒｕｃｃｏｌｅｒｉおよびＫａｒｐｌｕｓ（１９８７）  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２６：１３７−１６８〕。
【０２２８】
設計したフレームワークＶH  ｆｒ１２３は、マウス参考に関してその構造との良好な構造的適合性を有している。そのデータベースによって一部は規定されるフレームワーク最適化のヒト様特徴もまた、設計した配列類とヒト生殖細胞系またはヒト化フレームワーク類のそれとの系統発生的距離を分析することにより、測定した。
【０２２９】
上記のようなヒット変異体ライブラリ由来の変異体プロフィールは、カットオフ値よりも小さい出現頻度のアミノ酸類を取り除きおよび／または構造的足場とのそれらの適合性に基づく配列類をスクリーニングすることによって、ヒット変異体ライブラリから得た好適な残基類のほとんどを維持しつつ、潜在的ライブラリサイズを小さくするために、フィルタリングした。
【０２３０】
上記で構築したヒット変異体ライブラリを、変性オリゴヌクレオチド類により標的とした。上記で構築した変性核酸ライブラリは、ファージディスプレイシステム中にクローニングし、ファージディスプレイ抗体類（ｃｃＦｖ）を９６ウェルプレート上に塗布した固定ＶＥＧＦに対する結合に基づき、選択した。ライブラリを、ファージディスプレイベクターｐＡＢＭＤ１２中に取り込み、このベクター中では、抗ＶＥＧＦのＶHをライブラリにより置き換えておいた。結果として、ＶLおよびライブラリから作成したさまざまなＶHを対にして抗ＶＥＧＦの機能的ｃｃＦｖを形成した。次にファージディスプレイライブラリを用いて、固定ＶＥＧＦたんぱく質抗原に対してさらに選別した。
【０２３１】
変性位置のスキャン分布がこのように広く、それをカバーできるライブラリを作成するため、ライブラリを設計した部位における変性位置を有する複数の重複変性ＤＮＡオリゴヌクレオチド類を、合成した。前記のアセンブリプロセスは２個のＰＣＲ反応で構成されており、アセンブリＰＣＲと増幅ＰＣＲである。アセンブリオリゴは３５−４０量体により設計し、平均約６０℃の融点を有する１５−２０個の塩基類によって重複させた。増幅オリゴプライマー類（Ａｍｐ９３およびＡｍｐ９４）の１個の付加的ペアは、設計産物類の最終増幅のために新しく作成した。したがって、前記アセンブリＰＣＲには：等量の最終濃度８μＭのアセンブリオリゴプライマー類、０．８μＭのｄＮＴＰ，１×ｐｆｕ緩衝液（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）、およびｐｆｕターボ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）２．５単位を含んでいる。熱サイクルは、下記のように行った：９４℃で４５分、５８℃で４５分、７２℃で４５分を３０サイクル、および最終伸長は７２℃で１０分間行った。ＰＣＲ産物混合物を１０倍希釈し、増幅ＰＣＲ用テンプレートとして使用したが、ここでは、最終濃度１μＭで増幅プライマー類を添加したことを除いて、全試薬類は同じであった。熱サイクルは、下記のように行った：９４℃で４５分、６０℃で４５分、７２℃で４５分を３０サイクル、および最終伸長は７２℃で２０分間行った。最終産物（ＶHライブラリ）を精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｔｙＩで消化し、最終的にベクターｐＡＢＭＤ１２中にサブクローニングし、当初のマウスＶHを置き換えた。このライブラリを用いて、ＴＧ１コンピタント細胞類を電気的に形質転換し、次に増幅し、ヘルパーファージＫＯ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によりレスキューし、その後、標準的操作により３０℃で一晩、前記ライブラリにファージを産生させた。
【０２３２】
上記実施例で構築し説明したライブラリをスクリーニングするため、精製したホモダイマーＶＥＧＦたんぱく質（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）をコーティング緩衝液（０．０５Ｍ  ＮａＨＣＯ3，ｐＨ９．６）で指定濃度に希釈し、マキシソルブ（Ｍａｘｉｓｏｒｂ）ウェル（Ｎｕｎｃ）に一晩、４℃で固定した。塗布したウェルを次に、５％ミルクで１時間、３７℃でブロックし、その後、ＰＢＳ希釈ファージライブラリをウェルに適用し、３７℃で２時間インキュベーションした。このインキュベーション混合物はまた２％ミルクも含んでおり、非特異的結合を最小にした。インキュベーション終了時点で、ウェルを洗浄し、結合したファージをその後、１．４％トリエチルアミンで溶出させ、その後、ＴＧ１細胞感染次にＫＯ７ヘルパーファージレスキューにより増幅した。前記ファージ類を増幅するため、感染させかつレスキューしたＴＧ１細胞を次にカルベニシリンおよびカナマイシン存在下で一晩、３０℃で増殖させ、ファージライブラリを採取した。増幅させたファージ類をインプットライブラリとして用いて、次回のパニンクを行った。その間、５回目のパニング以降によるそれぞれのクローンをファージＥＬＩＳＡ用に無作為にサンプリングして、固定ＶＥＧＦに対する特異的結合を確認し、第５回目から第７回目のパニングで陽性率１００％であることが明らかになった。最終的に、プレート２×ＹＴ／カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）／カナマイシン（７０μｇ／ｍｌ）プレート上に増殖した単離クローン類を、第５回目パニング（Ｐ５）からの配列決定開始用にサンプリングし、ヒット位置を明らかにし前記設計に対するヒット配列類を明らかにした。
【０２３３】
図１Ｃは、（Ｂａｃａら（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２７２：１０６７８−１０６８４におけるようなヒト化ＶLのそれ（配列番号１）およびＫｉｍら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：８４１−８４４におけるマウス抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体（配列番号２８４）と比較して）選択した抗ＶＥＧＦ抗体類の全長ＶL、ＶL／ＣＤＲおよびＶL／ＦＲのアミノ酸配列類を示している。
【０２３４】
図１Ｄは、（Ｂａｃａら（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２７２：１０６７８−１０６８４におけるようなヒト化ＶHのそれ（配列番号５５）、Ｃｈｅｎら（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１におけるようなアフィニティ成熟ＶHのそれ（配列番号５６）、Ｋｉｍら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ３６２：８４１−８４４におけるようなマウス抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体（配列番号２８３）のそれと比較しての）選択した抗ＶＥＧＦ抗体類の全長ＶH、ＶL／ＣＤＲ、ＶH／ＣＤＲおよびＶH／ＦＲのアミノ酸配列類を示している。
【０２３５】
他者によって作成された抗ＶＥＧＦ抗体類との直接比較目的のため，本発明に開示のヒト化ＶL（配列番号１）は、Ｃｈｅｎら（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１に記載の抗体Ｙ０３１７のＶLと同じで；および本発明に開示したＶH（配列番号５５）は、Ｃｈｅｎら（１９９９）同上に説明されている抗体Ｙ０１９２のＶLと同一である。本発明に開示した前記ヒト化およびアフィニティ成熟ＶH（配列番号５６）は、Ｃｈｅｎら（１９９９）同上に記載の抗体Ｙ０３１７のＶHと同一である。
【０２３６】
選択した最適化後のＶHフレームワーク類はまた、ヒト生殖細胞ＶH３族と系統発生的距離の点で非常に近いヒト化ＶH配列とともにクラスターを作り、一方、マウスＶHフレームワークは、最適化ＶHフレームワーク類およびヒト生殖細胞から遠く離れている。ＶHの全ヒトイムノグルビンレパートリに対してヒット配列類を系統発生分析して、それらは実際、ヒト生殖細胞族ＩＩＩに極めて関連していることが示唆された。
【０２３７】
このことは、最適抗体類の完全にヒトのまたはヒト様配列類による最適フレームワーク設計における本発明の方法が、ヒト様およびエンゼンブル構造または構造平均からの構造テンプレートまたはテンプレート類との適合性のバランスが良好であることに依存しているという結論を支持する。
【０２３８】
記載の我々の発明方法類を用いて、我々は、フレームワーク最適化により、親または参考抗ＶＥＧＦ抗体配列（配列番号５５）よりも高い結合アフィニティを有する多数の重鎖（例  配列番号７０、配列番号６７および配列番号７５）ヒト化フレームワーク類を発見した。こうした改良は、主に、フレームワークヒト化のみによるオン速度（Ｋon）の大幅な増加とオフ速度（Ｋoff）のわずかの低下に由来している。図２Ａは、抗体類５個、親抗体（ｈＡＢ１）およびＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサーを用いたデザイナーライブラリから選択した抗ＶＥＧＦ抗体の最適化フレームワーク類（ｈＡＢ２，ｈＡＢ３，ｈＡＢ５）のアフィニティデータを示している。測定は、精製抗体がＣＭ５バイオチップ上に固定化した抗原（ＶＥＧＦ）に２５℃で結合するときの時間（ｘ軸）に対するＳＰＲ単位変化（ｙ軸）を測定することによって、行った。２個のヒト化フレームワーク類ｈＡＢ２およびｈＡＢ３は、フレームワーク最適化により、親／文献（Ｐｒｅｓｔａ  ＬＧ，Ｃｈｅｎ  Ｈ，Ｏ‘Ｃｏｎｎｏｒ  ＳＪ，Ｃｈｉｓｈｏｌｍ  Ｖ，Ｍｅｎｇ  ＹＧ，Ｋｒｕｍｍｅｎ  Ｌ，Ｗｉｎｋｌｅｒ  Ｍ，Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７、４５９３−４５９９）に報告されている参考抗ＶＥＧＦ抗体配列よりも結合アフィニティがおよそ４倍高く（一重鎖フォーマットで）、これらの２個のヒト化抗体類は、ヒト化により対応するマウス抗体よりもおよそ２倍高い結合アフィニティを有するはずである。
【０２３９】
２．候補抗体類の選択
１）ｃｃＦｖ−ヘテロダイマー性コイル状コイル安定化抗体
本発明は、ＶHおよびＶLへテロダイマー安定化のための新しい戦略を提供する。独自のヘテロダイマー化配列ペアを設計し、それを用いてＦａｂ様、機能的人工Ｆｖ断片ｃｃＦｖ（ＵＳ２０００３００２７２４７Ａ１）を作成した。この配列ペアは、特異的にコイル状コイル構造を形成し、ＧＡＢＡB−Ｒ１およびＧＡＢＡB−Ｒ２レセプター類の機能的へテロダイマー化を媒介する。ヘテロダイマー配列ペアのそれぞれは、ヘテロダイマーＧＡＢＡBＲ１およびＲ２のそれぞれのコイル状コイルドメインに由来した。ある抗体のＶHおよびＶLへテロダイマーを工学的に作成する目的で、配列類ＧＲ１およびＧＲ２のペアをそれぞれＶHおよびＶL断片のカルボキシ末端に融合させる。したがって、ＶHおよびＶLの機能的ペア形成ｃｃＦＶ（コイル状コイルＦｖ）は、ＧＲ１とＧＲ２の特異的へテロダイマー化により媒介される。組み換えｃｃＦｖ抗体断片類を分子量３５ｋＤａで発現させた。
【０２４０】
抗ＶＥＧＦ抗体のＶHおよびＶL配列類を、２個の融合たんぱく質類：ＶH−ＧＲ１およびＶL−ＧＲ２−ｐＩＩＩ融合物を発現するベクターにクローニングした。発現したＶH−ＧＲ１およびＶL−ＧＲ２−ｐＩＩＩ融合物はペリプラズム空間に分泌され、そこで、それらは二量体化し、コイル状コイルドメインで安定ｃｃＦｖ抗体を形成する。フィラメント状バクテリオファージの表面上でｃｃＦｖ抗体類をディスプレイするため、上記ベクターを細菌性ＴＧ１細胞に形質転換し、それをさらにＫＯ７ヘルパーファージで重複感染させた。
【０２４１】
２）アダプター媒介ファージディスプレイシステム
従来のファージディスプレイシステムにおいて、ファージ表面でディスプレイさせるため問題のたんぱく質をｐＩＩＩのようなファージカプシドたんぱく質に融合させる。この融合たんぱく質を、ＫＯ７のようなヘルパーファージが付与する野生型ファージたんぱく質類によりファージ粒子類に組み立てるであろう。ＵＳ２００３０１０４３５５Ａ１に記載のような新しいアダプター特異的ディスプレイシステムを用いて、ファージ表面上でさまざまな抗体断片類をディスプレイさせた。一般に、一重鎖可変断片のような抗体断片は、ヘテロダイマーを特異的に形成するアダプターペアによってファージ粒子表面に運搬され、ひとつは、発現ベクター中のディスプレイたんぱく質と融合し、他者は、ヘルパーベクター中のファージカプシドたんぱく質に融合させる。特に、ヘテロダイマー配列ペアであるＧＲ１およびＧＲ２のそれぞれは、それぞれ、ヘテロダイマーレセプター類ＧＡＢＡB  Ｒ１およびＲ２のコイル状コイルドメインに由来していた。抗体断片ディスプレイ目的のため、配列類ＧＲ１を原核生物発現ベクター中の抗体断片のカルボキシ末端に融合させ、一方、ＧＲ２はバクテリオファージゲノムのカプシドたんぱく質ＩＩＩのアミノ末端に融合させた。前記へテロダイマーは、コイル状コイルを特異的に形成する配列ペアにより形成され、ヘルパーファージにより発現ベクターを有する大腸菌をレスキューすると、抗体断片の機能的ディスプレイを媒介する。
【０２４２】
３）候補抗体ライブラリの作製
候補抗体類ライブラリのＤＮＡは、標準的ＰＣＲ操作を用いたＰＣＲアセンブリに基づき作製した。次に、このＤＮＡを制限酵素で消化し、精製し、上述のような適当なベクターに連結させた。連結後、ＤＮＡをＴＧ１細胞に形質転換した。ファージ類は、ヘルパーファージ感染によりＴＧ１細胞から調製した。感染ＴＧ１細胞を２×ＹＴ／Ａｍｐ／Ｋａｎ中で一晩、３０℃で増殖させた。ファージミッド粒子を、培養上清からＰＥＧ／ＮａＣｌにより沈殿させ、ＰＢＳ中に再度懸濁させた。
【０２４３】
４）候補抗体ライブラリの選択
候補抗体類のファージライブラリを、固定ＶＥＧＦに対するライブラリ選択のために使用した。精製した組み換えヒトＶＥＧＦ１６５をＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（カタログ番号８００５４−９９４）から購入した。ヒトＶＥＧＦの１６５番目アミノ酸残基変異体であるグリコシル化、ジスルフィド結合ホモダイマーは、見かけの分子量４２ｋＤを有している（Ｂｕｒｋｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０７：３４８（１９９５）；Ｎｅｕｆｅｌｄら．Ｐｒｏｇ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｓ．５：８９（１９９４）；Ｌｅｕｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１３０６（１９８９））。一般に、結合インキュベーション時間後、未結合ファージ類を洗浄して除去し、結合ファージ類を溶出し次回のパニング用に増幅させた。ファージディスプレイ用に通常用いられる同様の操作は、過去において例示されている（Ｂａｒｂａｓら、Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）。
【０２４４】
たとえば、２μｇ／ｍｌの精製ヒト組み換えＶＥＧＦ１６５  １００μｌのアリコットを、最初に、９６ウェルプレートの各ウェルに固定化した。ＰＢＳ中５％ミルクでブロックした後、２％ミルク／ＰＢＳ中ライブラリファージ類アリコットを前記ウェルに添加し、インキュベーションした。ファージ含有溶液をその後除去し、前記ウェルを洗浄した。結合ファージ類を最終的に１００ｍＭトリエチルアミンで溶出し、ＴＧ１培養物に添加し感染させた。感染ＴＧ１細胞から調製したファージ類を、結果的に次回のパニングに用いた。次に、陽性クローンをＶＥＧＦ抗原たんぱく質に対してＥＬＩＳＡにより確認し、ここで、固定化抗原に結合したファージ類は、ファージコートたんぱく質ｐＶＩＩＩに対するＨＲＰ結合抗Ｍ１３抗体とのインキュベーションにより検出した。基質ＡＢＴＳ〔２，２‘アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）〕を用いて、ＨＲＰ活性を測定した。陽性確認したそれらのクローン類のＤＮＡ類の配列を決定した。サンプリングしたＤＮＡ配列類を、次にアミノ酸配列類に翻訳した。選択した配列類を組み合わせ、新しい変異体類を作製した。選択した変異体類を発現させ、可溶性抗体断片類を産生させ、アフィニティを評価した。
【０２４５】
３．ヒトＰＢＬｓ由来ＶkおよびＶlの増幅
総ＲＮＡをヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）から抽出し、標準的操作でオリゴ−ｄＴプライマーと逆転写酵素を用いることによって、第１ストランドｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして用いた（第一ｃＤＮＡ合成キットは、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅから購入した）。抗体軽鎖可変遺伝子類を、ＰＣＲによって一重鎖ｃＤＮＡから増幅した。ＰＣＲプライマー類を設計し、Ｋａｂａ  Ｖ−遺伝子データベースに基づき合成した（表１）。Ｖｋ遺伝子類の全サブファミリ６個を増幅するため、４０個の生殖細胞ヒトＶｋ遺伝子類の５´末端を標的にした変性プライマー類６個および５個のヒトＪｋセグメント遺伝子類の３´末端を標的にした変性プライマー類３個を用いた。Ｖｌ遺伝子類の全サブファミリ１０個をＰＣＲ増幅するため、３１個の生殖細胞ヒトＶｌ遺伝子類の５´末端を標的にした変性プライマー類８個および４Ｊ１セグメント遺伝子類の３´末端を標的にした変性プライマー類２個を用いた。ＰＣＲ増幅ＶｋおよびＶｌ遺伝子類をさらに、ヒト抗ＶＥＧＦ抗体ＶHを有するファージミッドベクター中にクローニングし、ファージディスプレイライブラリを作製した。
【０２４６】
表１：ＶｋおよびＶｌ増幅用プライマー類
【表１】
2008504215.tif 000032
【０２４７】
４．可溶性抗体断片類の発現
生物物理分析目的のため、一重鎖可変断片（ｓｃＦｖ）フォーマットの可溶性抗体断片類を、原核生物（大腸菌）および真核生物（酵母）発現システム中で作製できる。ｓｃＦｖ構築物には、先の研究で記載されているように（Ｇ4Ｓ）3のリンカーで連結されたＶH断片およびＶL断片を含む（Ｂａｒｂａｓら、Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）。原核生物発現のために用いた発現ベクターは、図７に示した。例えばＢＬ２１のようなコンピタント細菌細胞類を調製し、当該技術で公知の方法に従い抗体断片を有するベクターで形質転換した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。形質転換細胞を、たんぱく質発現に適した条件下で培養する。このような条件は当業者に周知で、従って、本文では詳細に説明しない。発現した抗体類を当該技術で公知の従来法で採取し、それを用いてさらに分析する。酵母における発現は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入したＰｉｃｈｉａ発現キットを用いて製造業者の指示に従い実施した。全抗体類は、Ｃ末端でＨＡ−Ｈｉｓ６タグによりタグを付け、ＮＴＡおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム類により精製した。抗体断片類の純度および発現収率を求めるため、精製たんぱく質類２０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分析し、クーマシーブルーＲ−２５０による染色で見えるようにした。
【０２４８】
５．選択した抗体断片類のアフィニティ分析
ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサーアッセイを用いて、抗体アフィニティを求めた。ＶＥＧＦ抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入）をアミンカップリングによりＣＭ−５バイオセンサーシップにカップリングさせた。固定化後、ＶＥＧＦ応答ユニット類２００乃至１０００を有するＣＭ−５チップを、使用に先立ち、４℃に保持した。実験は全て、２５℃または３５℃で実施した。ＰＢＳ緩衝液中各サンプルを、流速２０μｌ／ｍｉｎでＢｉａｃｏｒｅ１０００（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてＶＥＧＦ表面上に注入し、各サイクル終点で結合抗体類をグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ１．５  １０μｌによりチップから除去した。各センサーグラムを記録し、ＰＢＳベースラインに標準化した。結合および解離速度定数を含む抗体アフィニティを求めるため、センサーグラムを、ＢＩＡ評価バージョン３ソフトウェアを用いて１：１ラングミュア結合モデルに適合する結合曲線によって、分析した。
【０２４９】
６．抗体断片類の安定性評価
明らかになった抗体断片類の安定性評価のため、ＰＢＳ中可溶性抗体類をそれぞれ、４℃、３７℃および４２℃でインキュベーションした。抗体濃度は、０．５μＭまたは１μＭであった。定めたインキュベーション時間の後、抗体溶液を２５℃で１時間置き、次にＢｉａｃｏｒｅ１０００中のＶＥＧＦ表面上に注いだ。抗体結合ＲＵを記録し、安定性分析に使用した。
【図面の簡単な説明】
【０２５０】
【図１Ａ】本発明のインシリコ方法論を用いることによって設計したＶLヒット変異体類のＡＡ−ＰＶＰプロフィールを示す。
【図１Ｂ】本発明のインシリコ方法論を用いることによって設計したＶHヒット変異体類のＡＡ−ＰＶＰプロフィールを示す。
【図１Ｃ−１】本発明による抗体類のある態様の全長ＶL、ＶL／ＣＤＲおよびＶL／ＦＲのアミノ酸配列類を示す。
【図１Ｃ−２】図１Ｃ−１のつづき。
【図１Ｃ−３】図１Ｃ−２のつづき。
【図１Ｃ−４】図１Ｃ−３のつづき。
【図１Ｃ−５】図１Ｃ−４のつづき。
【図１Ｃ−６】図１Ｃ−５のつづき。
【図１Ｃ−７】図１Ｃ−６のつづき。
【図１Ｃ−８】図１Ｃ−７のつづき。
【図１Ｃ−９】図１Ｃ−８のつづき。
【図１Ｃ−１０】図１Ｃ−９のつづき。
【図１Ｃ−１１】図１Ｃ−１０のつづき。
【図１Ｃ−１２】図１Ｃ−１１のつづき。
【図１Ｄ−１】本発明による抗体類のある態様の全長ＶH、ＶH／ＣＤＲおよびＶH／ＦＲのアミノ酸配列類を示す。
【図１Ｄ−２】図１Ｄ−１のつづき。
【図１Ｄ−３】図１Ｄ−２のつづき。
【図１Ｄ−４】図１Ｄ−３のつづき。
【図１Ｄ−５】図１Ｄ−４のつづき。
【図１Ｄ−６】図１Ｄ−５のつづき。
【図１Ｄ−７】図１Ｄ−６のつづき。
【図１Ｄ−８】図１Ｄ−７のつづき。
【図１Ｄ−９】図１Ｄ−８のつづき。
【図１Ｄ−１０】図１Ｄ−９のつづき。
【図１Ｄ−１１】図１Ｄ−１０のつづき。
【図１Ｄ−１２】図１Ｄ−１１のつづき。
【図１Ｄ−１３】図１Ｄ−１２のつづき。
【図１Ｄ−１４】図１Ｄ−１３のつづき。
【図２Ａ】ＢｉｏＣｏｒｅバイオセンサーを２５℃で用いたヒト化抗ＶＥＧＦ抗体の変異体類パネルのアフィニティ分析を示す。一重鎖フォーマットの抗体断片類は、下記のように発現させ、精製した。測定は、精製抗体がＣＭ５バイオチップに固定化したその抗原（ＶＥＧＦ）に結合した時に、時間（ｘ軸）に対してＳＰＲ単位（ｙ軸）の変化を２５℃で測定することによって行った。Ｋd値は、Ｋoffに対するＫonの比により計算した。各変異体抗体についてｈＡＢ１のそれに対する変異体Ｋdの割合も同様に計算した。Ｋonは、抗体断片（モル）濃度の複数の逆数と時間（秒）として表される会合速度定数として規定され；一方、Ｋoffは、時間（秒）の逆数として表される解離速度定数として規定され；Ｋdは解離定数であり、それは、モル濃度で表したＫonに対するＫoffの比率である。それぞれＶLおよびＶHとして、ｈＡＢ１は、配列番号１と配列番号５５（これは、もしＦａｂの形態であるならば、Ｃｈｅｎら（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１）に記載のように必然的にＦａｂ−１２を含むであろう）を含む；ｈＡＢ２は配列番号１と配列番号７０を含む；ｈＡＢ３は、配列番号１と配列番号６７を含む；ｈＡＢ４は、配列番号１と配列番号８３を含む；ｈＡＢ５は、配列番号１と配列番号７５を含む；ｈＡＢ９は、配列番号１４と配列番号１０２を含む；ｈＡＢ１０は、配列番号１と配列番号１０３を含む；ｈＡＢ１１は、配列番号１と配列番号１０４を含む；ｈＡＢ１２は、配列番号１と配列番号１０５を含む。
【図２Ｂ】図２Ａの説明に記載の通りである。
【図２Ｃ】ＢｉｏＣｏｒｅバイオセンサーを３５℃で用いたヒト化抗ＶＥＧＦ抗体の変異体類パネルのアフィニティ分析を示す。一重鎖フォーマットの抗体断片類は、下記のように発現させ、精製した。測定は、精製抗体がＣＭ５バイオチップに固定化したその抗原（ＶＥＧＦ）に結合したときに、時間（ｘ軸）に対してＳＰＲ単位（ｙ軸）の変化を３５℃で測定することによって行った。Ｋd値は、Ｋoffに対するＫonの比により計算した。各変異体抗体についてｈＡＢ１のそれに対する変異体Ｋdの割合も同様に計算した。それぞれＶLおよびＶHとして、ｈＡＢ１は、配列番号１と配列番号５５（これは、もしＦａｂの形態であるならば、Ｃｈｅｎら（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１）に記載のように必然的にＦａｂ−１２を含むであろう）を含む；ｈＡＢ７は、配列番号１と配列番号１０１を含む；ｈＡＢ８は、配列番号１と配列番号１００を含む；ｈＡＢ１３は、配列番号１と配列番号５６（これは、もしＦａｂの形態であるならば、Ｃｈｅｎら（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１）に記載のように必然的にＹ０３１７であろう）を含む；ｈＡＢ１４は、配列番号３６と配列番号１００を含む；ｈＡＢ１５は、配列番号２６と配列番号１００を含む；ｈＡＢ１６は、配列番号２８と配列番号１００を含む；ｈＡＢ３５は、配列番号２８と配列番号１０６を含む；ｈＡＢ３６は、配列番号２８と配列番号１０７を含む；ｈＡＢ３７は、配列番号２８と配列番号１０８を含む；ｈＡＢ３８は、配列番号２８と配列番号１０９を含む；ｈＡＢ３９は、配列番号２８と配列番号１１０を含む。
【図３】ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサーを用いて、６個のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体類のアフィニティ分析を示す。アッセイの前に、前記抗体類を１×ＰＢＳ中で４℃、３７℃、または４２℃で１６時間インキュベーションした。測定は、精製抗体がＣＭ５バイオチップ上に固定化した抗原（ＶＥＧＦ）に２５℃で結合するときの時間（ｘ軸）に対するＳＰＲ単位変化（ｙ軸）を測定することによって、行った。オン速度およびオフ速度変化は、１：１ラングミュア結合モデルを用いたデータ適合により求め、一方、Ｋdｓは、Ｋonに対するＫoffの比率により求めた。それぞれＶLおよびＶHの組成を、下記のように示した：それぞれＶLおよびＶHとして、ｈＡＢ１は、配列番号１と配列番号５５を含む；ｈＡＢ２は、配列番号１と配列番号７０を含む；ｈＡＢ３は、配列番号１と配列番号６７を含む；ｈＡＢ７は、配列番号１と配列番号１０１を含む；ｈＡＢ８は、配列番号１と配列番号１００を含む；ｈＡＢ１３は、配列番号１と配列番号５６を含む。
【図４】図３に示したヒト化抗ＶＥＧＦ抗体類の安定性データを要約した。ｙ軸は、精製抗体を４℃、３７℃および４２℃で１６時間、図３に示したようにインキュベーションした後、ＢＩＡｃｏｒｅを用いて２５℃で固定化ＶＥＧＦ抗原への結合において活性のままの抗体の百分率を示している。異なる条件における各抗体の最大結合は、４℃におけるそれに対する百分率として表した。
【図５】下記に述べたような大腸菌発現システムを用いて、ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体類の発現を示した。各抗体断片の発現レベルは、同一分画由来の精製物質と同一溶液を適用することによって、評価したが、これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クーマシーブルー染色によって検出される。それぞれＶLおよびＶHの組成を、下記のように示した：それぞれＶLおよびＶHとして、ｈＡＢ１は、配列番号１と配列番号５５を含む；ｈＡＢ３５は、配列番号２８と配列番号１０６を含む；ｈＡＢ３６は、配列番号２８と配列番号１０７を含む；ｈＡＢ３７は、配列番号２８と配列番号１０８を含む；ｈＡＢ３８は、配列番号２８と配列番号１０９を含む；ｈＡＢ３９は、配列番号２８と配列番号１１０を含む。
【図６】下記に述べたような真核生物システムを用いたヒト化抗ＶＥＧＦ抗体の発現を示す。各抗体断片の発現レベルは、同一分画由来の精製物質と同一溶液を適用することによって、評価したが、これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クーマシーブルー染色によって検出される。それぞれＶLおよびＶHの組成を、下記のように示した：それぞれＶLおよびＶHとして、ｈＡＢ１は、配列番号１と配列番号５５を含む；ｈＡＢ２は、配列番号１と配列番号７０を含む；ｈＡＢ３は、配列番号１と配列番号６７を含む；ｈＡＢ５は、配列番号１と配列番号７５を含む；ｈＡＢ７は、配列番号１と配列番号１０１を含む；ｈＡＢ８は、配列番号１と配列番号１００を含む；ｈＡＢ１３は、配列番号１と配列番号５６を含む。
【図７】大腸菌における可溶性抗体断片類の発現に用いたベクターマップを示している。
【図１Ａ】
2008504215.tif 000041
【図１Ｂ】
2008504215.tif 000042
【図１Ｃ−１】
2008504215.tif 000043
【図１Ｃ−２】
2008504215.tif 000044
【図１Ｃ−３】
2008504215.tif 000045
【図１Ｃ−４】
2008504215.tif 000046
【図１Ｃ−５】
2008504215.tif 000047
【図１Ｃ−６】
2008504215.tif 000048
【図１Ｃ−７】
2008504215.tif 000049
【図１Ｃ−８】
2008504215.tif 000050
【図１Ｃ−９】
2008504215.tif 000051
【図１Ｃ−１０】
2008504215.tif 000052
【図１Ｃ−１１】
2008504215.tif 000053
【図１Ｃ−１２】
2008504215.tif 000054
【図１Ｄ−１】
2008504215.tif 000055
【図１Ｄ−２】
2008504215.tif 000056
【図１Ｄ−３】
2008504215.tif 000057
【図１Ｄ−４】
2008504215.tif 000058
【図１Ｄ−５】
2008504215.tif 000059
【図１Ｄ−６】
2008504215.tif 000060
【図１Ｄ−７】
2008504215.tif 000061
【図１Ｄ−８】
2008504215.tif 000062
【図１Ｄ−９】
2008504215.tif 000063
【図１Ｄ−１０】
2008504215.tif 000064
【図１Ｄ−１１】
2008504215.tif 000065
【図１Ｄ−１２】
2008504215.tif 000066
【図１Ｄ−１３】
2008504215.tif 000067
【図１Ｄ−１４】
2008504215.tif 000068
【図２Ａ】
2008504215.tif 000069
【図２Ｂ】
2008504215.tif 000070
【図２Ｃ】
2008504215.tif 000071
【図３】
2008504215.tif 000072
【図４】
2008504215.tif 000073
【図５】
2008504215.tif 000074
【図６】
2008504215.tif 000075
【図７】
2008504215.tif 000076
【配列表】
2008504215000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年11月21日(2007.11.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．２ｎＭに等しいかそれよりも小さい解離定数ＫdでヒトＶＥＧＦに特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項２】
解離定数Ｋdが０．１ｎＭに等しいかそれよりも小さい請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
解離定数Ｋdが０．０８ｎＭに等しいかそれよりも小さい請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
解離定数Ｋdが０．０５ｎＭに等しいかそれよりも小さい請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
解離定数Ｋdが０．０１ｎＭに等しいかそれよりも小さい請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
解離定数Ｋdが０．００５ｎＭに等しいかそれよりも小さい請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
前記抗体がｓｃＦｖの形態である請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
前記抗体がＦａｂの形態である請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
前記抗体が完全アセンブリ抗体の形態である請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
前記抗体がｓｃＦｖの形態でありかつ解離定数Ｋdが約４℃、２５℃、３７℃または４２℃で測定される請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
前記抗体がＦａｂの形態でありかつ解離定数Ｋdが約４℃、２５℃、３７℃または４２℃で測定される請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項１２】
前記抗体がＦａｂの形態でありかつ解離定数Ｋdが約３７℃で測定される請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項１３】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつアミノ酸配列
【化１】
2008504215.tif 000187
を含むＶLを有するモノクローナル抗体で、ここで、下線を付した領域は、それぞれ、ＶL／ＣＤＲ１，ＶL／ＣＤＲ２およびＶL／ＣＤＲ３と称され、一方、前記領域の残りはフレームワークと称され、ここで、Ｘ1はＤ，ＥまたはＡであり；Ｘ2は、ＩまたはＴであり；Ｘ3は、Ｖ，Ｅ，Ｋ，Ｒ，ＱまたはＴであり；Ｘ4は、ＭまたはＬであり；Ｘ5は、ＳまたはＴであり、Ｘ6は、ＳまたはＴであり；Ｘ7は、ＬまたはＶであり；Ｘ8は、ＡまたはＶであり；Ｘ9は、ＳまたはＴであり；Ｘ10は、Ｐ，Ｖ，Ｌ，ＡまたはＩであり；Ｘ11は、ＥまたはＤであり；Ｘ12は、ＲまたはＴであり；Ｘ13は，ＡまたはＶＩであり；Ｘ14は，ＴまたはＡであり；Ｘ15は，Ｔ、ＳまたはＡであり；Ｘ16は，Ｓ，Ｒ，Ｎ，Ｋ，ＨまたはＱであり；Ｘ17は，ＡまたはＳであり；Ｘ18は，ＱまたはＲであり；Ｘ19は，Ｓ，Ｄ、ＡまたはＰであり；Ｘ20は，Ｓ，Ｇ、Ｒ，ＴまたはＹであり；Ｘ21は，Ｔ，Ｎ，Ｓ、ＤまたはＫであり；Ｘ22は，ＹまたはＤであり；Ｘ23は，ＬまたはＩであり；Ｘ24は，Ａ，ＮまたはＴであり；Ｘ25は，ＫまたはＩであり；Ｘ26は，Ｑ，Ｋ，ＴまたはＩであり；Ｘ27は，Ｒ，Ｋ，Ｑ、Ｎ，Ｈ，ＳまたはＥであり；Ｘ28は，ＶまたはＬであり；Ｘ29は，ＩまたはＶであり；Ｘ30は，Ｆ，Ａ，Ｇ，ＤまたはＳであり；Ｘ31は，ＡまたはＴであり；Ｘ32は，ＳまたはＴであり；Ｘ33は，Ｎ，Ｓ，ＲまたはＴであり；Ｘ34は，Ａ，ＨまたはＱであり；Ｘ35は、ＳまたはＧであり；Ｘ36は、Ｐ，Ｔであり；Ｘ37は、Ｓ，Ｎ，Ｄ、ＧまたはＹであり；Ｘ38は、ＳまたはＴであり；Ｘ39は、ＧまたはＲであり；Ｘ40は、ＴまたはＡであり；Ｘ41は、ＳまたはＲであり；Ｘ42は、ＳまたはＲであり；Ｘ43は、ＰまたはＡであり；Ｘ44は、ＥまたはＤであり；Ｘ45は、Ｆ，ＶまたはＳであり；Ｘ46は、Ｖ，Ｔ，Ｉ、ＡまたはＳであり；Ｘ47は、ＹまたはＳであり；Ｘ48は、Ｓ，ＹまたはＮであり；Ｘ49は、ＳまたはＴであり；Ｘ50は、Ｔ，Ｖ，Ａ、Ｐ，Ｋ，Ｇ，ＳまたはＩであり；Ｘ51は、ＷまたはＹであり；Ｘ52は、ＱまたはＧであり；Ｘ53は、ＶまたはＬであり；およびＸ54は、Ｅ，ＤまたはＡである。
【請求項１４】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつアミノ酸配列
【化２】
2008504215.tif 000188
を含むＶLを有するモノクローナル抗体で、ここで、下線を付した領域は、ＶL／ＣＤＲ１、ＶL／ＣＤＲ２およびＶL／ＣＤＲ３とそれぞれ称され、一方、残りの領域は、フレームワークと称し、ここで、Ｘ1はＱＬまたはＮであり；Ｘ2は、Ｐ  Ａ  ＦまたはＳであり；Ｘ3は、ＶまたはＭであり；Ｘ4は、ＡまたはＴであり；Ｘ5は、ＧまたはＡであり；Ｘ6は、ＲまたはＳであり；Ｘ7は、ＳまたはＴであり；Ｘ8は、Ｓ，Ｔ、ＹまたはＮであり；Ｘ9は、ＩまたはＶであり；Ｘ10は、ＳまたはＲであり；Ｘ11は、Ｓ，Ｐ，Ｎ，ＡまたはＴであり；Ｘ12は，Ｎ，ＴまたはＹであり；Ｘ13は，ＬまたはＦであり；Ｘ14は，ＴまたはＡであり；Ｘ15は，Ｖ，ＬまたはＦであり；Ｘ16は，ＭまたはＩであり；Ｘ17は，Ｇ，ＴまたはＳであり；Ｘ18は，ＮまたはＤであり；Ｘ19は，ＱまたはＥであり；Ｘ20は，ＤまたはＥであり；Ｘ21は，ＦまたはＬであり；Ｘ22は，ＫまたはＲであり；Ｘ23は，ＧまたはＡであり；Ｘ24は，Ｑ，ＬまたはＲであり；Ｘ25は，ＡまたはＧであり；Ｘ26は，Ａ，ＳまたはＴであり；Ｘ27は，Ｎ，ＳまたはＴであり；Ｘ28は，ＴまたはＡであり；およびＸ29は，ＫまたはＱである。
【請求項１５】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつアミノ酸配列
【化３】
2008504215.tif 000189
（配列番号５４）
を含むＶLを有するモノクローナル抗体。
【請求項１６】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつアミノ酸配列
【化４】
2008504215.tif 000190
を含むＶHを有するモノクローナル抗体が提供され、ここで、下線を付した領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３とそれぞれ称され、一方、残りの領域は、Ｋａｂａｔ命名法に従いフレームワークと称し、ここで、Ｘ1はＥまたはＱであり；Ｘ2は、ＶまたはＧであり；Ｘ3は、ＱまたはＥであり；Ｘ4は、ＶまたはＬであり；Ｘ5は、ＳまたはＴであり；Ｘ6は、ＳＴまたはＲであり；Ｘ7は、ＡまたはＶであり；Ｘ8は、ＹまたはＦであり；Ｘ9は、Ｔ，Ｄ，Ｎ，ＳまたはＡであり；Ｘ10は、ＦまたはＬであり；Ｘ11は、Ｔ，Ｄ，Ｙ，Ａ，ＳまたはＮであり；Ｘ12は，Ｎ，ＨまたはＳであり；Ｘ13は，ＹまたはＦであり；Ｘ14は，Ｍ，Ｌ、ＩまたはＶであり；Ｘ15は，Ｉ，ＶまたはＬであり；Ｘ16は，ＬまたはＰであり；Ｘ17は，ＩまたはＶであり；Ｘ18は，ＹまたはＮであり；Ｘ19は，ＴまたはＮであり；Ｘ20は，ＥまたはＡであり；Ｘ21は，Ｐ、ＴまたはＳであり；Ｘ22は，ＡまたはＶであり；Ｘ23は，Ａ，Ｈ，Ｑ，Ｐ，ＤまたはＥであり；Ｘ24は，ＤまたはＥであり；Ｘ25は，ＫまたはＴであり；Ｘ26は，Ｖ，ＦまたはＬであり；Ｘ27は，ＦまたはＩであり；Ｘ28は，ＬまたはＲであり；Ｘ29は，ＤまたはＮであり；Ｘ30は、ＴまたはＮであり；Ｘ31は、ＳまたはＮであり；Ｘ32は、Ｔ，Ｑ，ＰまたはＫであり；Ｘ33は、Ａ，ＶまたはＰであり；Ｘ34は、ＬまたはＭであり；Ｘ35は、ＫまたはＲであり；Ｘ36は、ＨまたはＹであり；Ｘ37は、Ｓ，ＲまたはＴであり；およびＸ38は、ＧまたはＡである。
【請求項１７】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつ配列番号２−５４から構成される群から選択されたアミノ酸配列、さらに好適には配列番号１４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３６、配列番号３７、配列番号４４、配列番号４７および配列番号５４から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含むＶLを有するモノクローナル抗体が提供される。
【請求項１８】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつ配列番号５７−１１０および配列番号２８５−３１０から構成される群から選択されたアミノ酸配列、好適には配列番号６１−６４、配列番号６７、６８、７０、７５、８３、８８、８９、９０，９１，９２，９３、９４および９６−１１０から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含むＶHを有するモノクローナル抗体。
【請求項１９】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつ配列番号１９５−２０９から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含むＶL領域中ＣＤＲ２を有する（ＶL／ＣＤＲ２）モノクローナル抗体が提供される。
【請求項２０】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつ配列番号２１０−２２８から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含むＶL領域中ＣＤＲ３を有する（ＶL／ＣＤＲ３）モノクローナル抗体。
【請求項２１】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつ配列番号２２９−２６９から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含み、好適には配列番号２３２、２３５、２３７、２５１、２５５、２６３および２６５から構成される群から選択したアミノ酸配列を含むＶL領域中フレームワーク領域（ＦＲ）ＣＤＲ３を有する（ＶL／ＦＲ）モノクローナル抗体。
【請求項２２】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつアミノ酸配列
【化５】
2008504215.tif 000191
を含むＶH領域中ＣＤＲ１を有する（ＶH／ＣＤＲ１）モノクローナル抗体で、ここで、Ｘ1はＹまたはＦであり；Ｘ2は、Ｄ，Ｎ，Ｔ，ＳまたはＡであり；Ｘ3は、ＦまたはＬであり；Ｘ4は、Ｔ、Ｄ，Ｓ，Ｙ，ＡまたはＮであり；Ｘ5は、Ｈ，ＮまたはＳであり；Ｘ6は、ＹまたはＦであり；Ｘ7は、Ｍ、Ｌ、ＩまたはＶであるモノクローナル抗体。
【請求項２３】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつアミノ酸配列
【化６】
2008504215.tif 000192
を含むＶH領域中ＣＤＲ２を有する（ＶH／ＣＤＲ２）モノクローナル抗体で、ここで、Ｘ1はＩまたはＶであり；Ｘ2は、ＹまたはＮであり；Ｘ3は、ＴまたはＮであり；Ｘ4は、Ｐ、ＴまたはＳであり；Ｘ5は、ＡまたはＶであり；Ｘ6は、Ａ，Ｑ、Ｐ，Ｈ，ＤまたはＥであり；Ｘ7は、ＤまたはＥであり；およびＸ8は、ＫまたはＴであるモノクローナル抗体。
【請求項２４】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつ配列番号１３６−１５６から構成される群から選択したアミノ酸配列を含むＶH領域中ＣＤＲ２を有する（ＶH／ＣＤＲ２）モノクローナル抗体。
【請求項２５】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつアミノ酸配列
【化７】
2008504215.tif 000193
を含むＶH領域中ＣＤＲ３を有する（ＶH／ＣＤＲ３）モノクローナル抗体で、ここで、Ｘ1はＹまたはＨでありおよびＸ2はＲであるモノクローナル抗体。
【請求項２６】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつ配列番号３１１−３３７から構成される群から選択したアミノ酸配列を含むＶH領域中ＣＤＲ３を有する（ＶH／ＣＤＲ３）モノクローナル抗体。
【請求項２７】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合しかつアミノ酸配列
【化８】
2008504215.tif 000194
を含むＶH領域中ＦＲを有する（ＶH／ＦＲ）モノクローナル抗体で、ここで、Ｘ1は、ＥまたはＱであり；Ｘ2は、ＱまたはＥであり；Ｘ3は、ＶまたはＬであり；Ｘ4は、ＳまたはＴであり；Ｘ5は、Ｓ、ＴまたはＲであり；Ｘ6は、ＡまたはＶであり；Ｘ7は、ＩまたはＶであり；Ｘ8は、ＦまたはＶであり；Ｘ9は、ＦまたはＩであり；Ｘ10は、ＬまたはＲであり、Ｘ11は、ＴまたはＮであり；Ｘ12は，ＳまたはＮであり；Ｘ13は，Ｔ，Ｑ、またはＫであり；Ｘ14は，ＡまたはＶであり；Ｘ15は，ＭまたはＬであり；およびＸ16は、ＧまたはＡであるモノクローナル抗体。
【請求項２８】
ヒトＶＥＧＦに特異的に結合し配列番号１と配列番号７０；配列番号１と配列番号６７；配列番号１と配列番号７５；配列番号１と配列番号８３；配列番号１４と配列番号５５；配列番号１と配列番号１０１；配列番号１と配列番号１００；配列番号１４と配列番号１０２；配列番号１と配列番号１０３；配列番号１と配列番号１０４；配列番号１と配列番号１０５；配列番号３６と配列番号１００；配列番号２６と配列番号１００；配列番号２８と配列番号１００；配列番号３７と配列番号１００；配列番号４４と配列番号１００；配列番号５４と配列番号１００；配列番号４７と配列番号１００から構成された群から選択したＶLおよびＶH対、好適には配列番号２８および６１；配列番号２８および６２；配列番号２８および６３；配列番号２８および６４；配列番号２８および６８；配列番号２８および８５；配列番号２８および８６；配列番号２８および８７；配列番号２８および８８；配列番号２８および８９；配列番号２８および９０；配列番号２８および９１；配列番号２８および９２；配列番号２８および９３；配列番号２８および９４；配列番号２８および９５；配列番号２８および９６；配列番号２８および９７；配列番号２８および９８；配列番号２８および９９；配列番号２８および１０６；配列番号２８および１０７；配列番号２８および１０８；配列番号２８および１０９；配列番号２８および１１０から構成される群から選択されるＶLおよびＶH対を有するモノクローナル抗体。
【請求項２９】
前記抗体が、１０ｎＭに等しいかまたはそれより小さい解離定数Ｋdを有する請求項１３〜２８のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項３０】
前記抗体が、１ｎＭに等しいかまたはそれより小さい解離定数Ｋdを有する請求項１３〜２８のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項３１】
前記抗体が、０．１ｎＭに等しいかまたはそれより小さい解離定数Ｋdを有する請求項１３〜２８のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項３２】
前記抗体が、０．０１ｎＭに等しいかまたはそれより小さい解離定数Ｋdを有する請求項１３〜２８のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【国際調査報告】
2008504215.tif 000195
2008504215.tif 000196
2008504215.tif 000197
2008504215.tif 000198