(57)【要約】  生精子細胞を物理学的にソーティングすることなく、特徴に関して生精子細胞の集団を選択的に富化する方法を開示する。かかる富化した集団中に含まれる細胞は、ソーティング工程に付されないという利点から恩恵を受ける。生精子細胞の集団を選択的に富化する方法を利用する、雌性哺乳動物を注入する方法および精子分散液を形成する方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵を受精する精子細胞分散液中の精子細胞のサブ集団の能力を選択的に低下する方法であって：
液体中の標識した精子細胞の分散液を形成し、該液体は精子不動化を誘導する化学剤を含むかまたは温度を有し、ここに、精子細胞と関連する標識の存在、不存在または量が分散液中の精子細胞のサブ集団の遺伝子的、タンパク質的、構造的または機能的な特徴を示し；
該分散液を光学的に検査してサブ集団のメンバーとして個々の精子細胞を同定し；
該分散液中のサブ集団のメンバーの位置を決定し；ついで
該分散液内の異なる位置に一定用量のエネルギーを送達して、該分散液中の他の位置に存在する精子細胞に同様に影響を及ぼすことなく、卵を受精するサブ集団のメンバーの能力を選択的に低下する
ことを含む該方法。
【請求項２】
雌性哺乳動物に富化された精子細胞集団を注入する方法であって：
液体中の標識した精子細胞の分散液を形成し、該液体は精子不動化を誘導する化学剤を含むかまたは温度を有し、ここに、精子細胞と関連する標識の存在、不存在または量が分散液中の精子細胞のサブ集団の遺伝子的、タンパク質的、構造的または機能的な特徴を示し；
該分散液を光学的に検査してサブ集団のメンバーとして個々の精子細胞を同定し；
該分散液中のサブ集団のメンバーの位置を決定し；
該分散液内の異なる位置に一定用量のエネルギーを送達して、該分散液中の他の位置に存在する精子細胞に同様に影響を及ぼすことなく、卵を受精するサブ集団のメンバーの能力を選択的に低下し；ついで
その後に、雌性哺乳動物に該分散液またはその誘導物を注入する
ことを含む該方法。
【請求項３】
イン・ビトロ(in vitro)受精の方法であって：
液体中の標識した精子細胞の分散液を形成し、該液体は精子不動化を誘導する化学剤を含むかまたは温度を有し、ここに、精子細胞と関連する標識の存在、不存在または量が分散液中の精子細胞のサブ集団の遺伝子的、タンパク質的、構造的または機能的な特徴を示し；
該分散液を光学的に検査してサブ集団のメンバーとして個々の精子細胞を同定し；
該分散液中のサブ集団のメンバーの位置を決定し；
該分散液内の異なる位置に一定用量のエネルギーを送達して、該分散液中の他の位置に存在する精子細胞に同様に影響を及ぼすことなく、卵を受精するサブ集団のメンバーの能力を選択的に低下し；ついで
その後に、該分散液またはその誘導物を用いて、卵をイン・ビトロで受精させる
ことを含む該方法。
【請求項４】
凍結した精子分散液を形成する方法であって：
液体中の標識した精子細胞の分散液を形成し、該液体は精子不動化を誘導する化学剤を含むかまたは温度を有し、ここに、精子細胞と関連する標識の存在、不存在または量が分散液中の精子細胞のサブ集団の遺伝子的、タンパク質的、構造的または機能的な特徴を示し；
該分散液を光学的に検査してサブ集団のメンバーとして個々の精子細胞を同定し；
該分散液中のサブ集団のメンバーの位置を決定し；
該分散液内の異なる位置に一定用量のエネルギーを送達して、該分散液中の他の位置に存在する精子細胞に同様に影響を及ぼすことなく、卵を受精するサブ集団のメンバーの能力を選択的に低下し；ついで
その後に、分散液を低温保存する
ことを含む該方法。
【請求項５】
該液体が、精子不動化を誘導する化学剤を含む請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
該液体が、精子不動化を誘導する温度を有する請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
該液体が、精子不動化を誘導する化学剤を含み、かつ、精子不動化を誘導する温度を有する請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
精子細胞と関連する標識の量が、該精子細胞がX染色体を運搬している精子細胞であることを示す請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
精子細胞と関連する標識の量が、該精子細胞がY染色体を運搬している精子細胞であることを示す請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
該標識が、精子細胞の表面特異的な特徴に結合する蛍光色素、DNA選択的色素、ポリアミド、オリゴヌクレオチド、およびポリペプチドよりなる群から選択される請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
該標識がDNA選択的蛍光色素である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該標識がHoechst 33342、Hoechst 33258、またはSYBR14である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
一定用量のエネルギーが、放射線ビーム、レーザービーム、平行にした非レーザー光、集光した非−レーザー光、および集束した超音波エネルギーよりなる群から選択される請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
さらに、一定用量のエネルギーを受けていない精子細胞、非−投与細胞を精製することを含む請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
非−投与細胞を精製することが、分散液を遠心分離すること、および、投与した細胞を除去することを含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
非−投与細胞を精製することが、分散液を高密度培地と接触させることを含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
分散液を光学的に検査してサブ集団のメンバーとして個々の精子細胞を同定することが、該細胞の捕捉像を光学的に検査することを含む請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
分散液を光学的に検査する前に、分散液をマルチウェルプレートに分配する請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
該マルチウェルプレートが９６または３８４ウェルのプレートである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
該一定用量のエネルギーが、当該一定用量のエネルギーを受けていない精子細胞の生存能力と比較して、サブ集団のメンバーの生存能力を低下するのに十分である請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
該一定用量のエネルギーが、サブ集団のメンバーの死を引き起こすのに十分である請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
さらに、一定用量のエネルギーを送達した後に分散液を低温保存することを含む請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
該雌性哺乳動物が、ウシ、ウマまたはブタである請求項２、３、５、６または７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
雌性哺乳動物の注入を、細胞の投与を完了した後約7日、5日、3日、2日または1日以内に行う請求項２に記載の、または請求項２に従属する場合は請求項５ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
イン・ビトロ(in vitro)における卵の受精を、細胞の投与を完了した後約7日、5日、3日、2日または1日以内に行う請求項３に記載の、または請求項３に従属する場合は請求項５ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
さらに、受精卵を雌性哺乳動物の子宮に導入することを含む請求項３に記載の、または請求項３に従属する場合は請求項５ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
該分散液を、雌性哺乳動物の注入の前に低温保存しない請求項２に記載の、または請求項２に従属する場合は請求項５ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
該分散液を、雌性哺乳動物の注入の前に低温保存する請求項２に記載の、または請求項２に従属する場合は請求項５ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
該富化した分散液を、卵の受精の前に低温保存しない請求項３に記載の、または請求項３に従属する場合は請求項５ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
該富化した分散液を、卵の受精の前に低温保存する請求項３に記載の、または請求項３に従属する場合は請求項５ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
一定用量のエネルギーを受けていない精子細胞が、少なくとも85%のX染色体を運搬している精子細胞を含む請求項４ないし７のいずれか１項に記載の方法。 
【請求項３２】
一定用量のエネルギーを受けていない精子細胞が、少なくとも85%のY染色体を運搬している精子細胞を含む請求項４ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
一定用量のエネルギーを受けていない精子細胞が、少なくとも90%のX染色体を運搬している精子細胞を含む請求項４ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
一定用量のエネルギーを受けていない精子細胞が、少なくとも90%のY染色体を運搬している精子細胞を含む請求項４ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
一定用量のエネルギーを受けていない精子細胞が、少なくとも95%のX染色体を運搬している精子細胞を含む請求項４ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
一定用量のエネルギーを受けていない精子細胞が、少なくとも95%のY染色体を運搬している精子細胞を含む請求項４ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
一定用量のエネルギーを受けていない精子細胞が、少なくとも97%のX染色体を運搬している精子細胞を含む請求項４ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
一定用量のエネルギーを受けていない精子細胞が、少なくとも97%のY染色体を運搬している精子細胞を含む請求項４ないし７のいずれか１項に記載の方法。 
【請求項３９】
投与した分散液を凍結する前にストローに入れる請求項４または３１ないし３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
さらに、投与した分散液をさらなる標識で標識し、ここに、精子細胞と関連するさらなる標識の存在、不存在または量が投与した分散液中の精子細胞のサブ集団の遺伝子的、タンパク質的、構造的または機能的な特徴を示し；
投与した分散液を光学的に検査してサブ集団のメンバーとして個々の精子細胞を同定し；
投与した分散液中のサブ集団のメンバーの位置を決定し；ついで
該分散液内の異なる位置に一定用量のエネルギーを送達して、該分散液中の他の位置に存在する精子細胞に同様に影響を及ぼすことなく、卵を受精するサブ集団のメンバーの能力を選択的に低下する
ことを含む請求項４または３１ないし３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
該標識した精子細胞の温度が約0℃ないし約15℃である請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
該標識した精子細胞の温度が約1℃ないし約10℃である請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
該標識した精子細胞の温度が約2℃ないし約8℃である請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
該標識した精子細胞の温度が約3℃ないし約6℃である請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
該標識した精子細胞の温度が約4℃ないし約5℃である請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
該標識した精子細胞の温度が約5℃である請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
該標識した精子細胞の温度が約4℃である請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に精子細胞の集団の富化に関する。詳細には、本発明は、一般に精子細胞を物理学的にソーティングすることなく生精子細胞の集団を富化することに関する。
【背景技術】
【０００２】
人工授精（ＡＩ）および試験管内受精後の胚移植による動物の受精は、確立された慣習である。畜産業においては、1またはそれを超える望ましい特徴を有する子孫に向けた生殖成果に影響する能力は明らかな利点を有する。例えば、雌性を選ぶ子孫を予め選択して乳牛の生産を確保することは乳業における経済的利益であろう。ジェンダー富化精液またはジェンダー富化精子として知られている、精子をXおよびY染色体を運搬している細胞の富化した集団に分離することは、予め選択した子孫を達成する1つの方法である。
【０００３】
Johnsonら(米国特許第5,135,759号)は、フローサイトメーター／セルソーターを用いたDNA含量に従って無傷のXおよびY染色体を運搬している精子集団をXおよびY染色体を運搬している精子の富化集団に分離することを記載している。記載されているように、精子は30℃ないし39℃の温度にて１時間（39℃）ないし1.5時間（30℃）、DNA選択的色素と合する。ついで、フローサイトメーターを用いて、精子がレーザービームを通過する際に放出される蛍光の量を測定する。X染色体を運搬している精子はY染色体を運搬している精子よりも、種に応じてほぼ3%ないし5%多いDNAを含むため、X染色体を運搬している精子はY染色体を運搬している精子よりも大きな強度の蛍光を与える。所定の蛍光強度の単一の精子を含有する液滴は電荷を得、収集容器に静電気的に偏向される。ついで、収集されたジェンダー富化された精子集団は、マイクロインジェクションまたは人工授精のために使用する。注目に値するのは、この方法は、ジェンダー富化された精子集団を達成するために精子細胞を物理学的にソートすることを必要とする。
【０００４】
発明の概要
本発明の種々の態様の中に存在するものは、特徴に関して富化された、時として懸濁液という場合もあるが、精子分散液の調製方法である。1の形態において、例えば、本発明の方法を用いて、XまたはY染色体を運搬している精子に関して富化された精子分散液を調製する。
【０００５】
したがって、簡単には、本発明は精子細胞分散液中の精子細胞のサブ集団の卵を受精する能力を選択的に低下する方法に指向される。該方法には、精子不動化を誘導する化学剤を含むかまたは温度を有する液体中の標識した精子細胞の分散液を形成することを含み、ここに精子細胞に関連する標識の存在、不存在または量が分散液中の精子細胞のサブ集団の遺伝子的、タンパク質的、構造的または機能的な特徴を示す。さらに、該方法には、分散液を光学的に検査してサブ集団のメンバーとして個々の精子細胞を同定し；分散液中のサブ集団のメンバーの位置を決定し；ついで、分散液内の異なる位置に一定用量のエネルギーを送達して、分散液中の他の位置に存在する精子細胞に同様に影響することなく、卵に受精するサブ集団のメンバーの能力を選択的に低下することが含まれる。
【０００６】
さらに、本発明は、雌性哺乳動物に富化した精子細胞集団を注入する方法にも指向される。該方法には、精子不動化を誘導する化学剤を含むかまたは温度を有する液体中に標識した精子細胞の分散液を形成することを含み、ここに精子細胞に関連した標識の存在、不存在または量が分散液中の精子細胞のサブ集団の遺伝子的、タンパク質的、構造的または機能的な特徴を示す。該方法には、さらに、分散液を光学的に検査してサブ集団のメンバーとして個々の精子細胞を同定し；分散液中のサブ集団のメンバーの位置を決定し；ついで、分散液内の異なる位置に一定用量のエネルギーを送達して、分散液中の他の位置に存在する精子細胞に同様に影響することなく、卵に受精するサブ集団のメンバーの能力を選択的に低下し；その後、分散液またはその誘導物を雌性哺乳動物に注射することが含まれる。
【０００７】
本発明は、さらに、試験管内受精の方法に指向される。該方法には、精子不動化を誘導する化学剤を含むかまたは温度を有する液体中に標識した精子細胞の分散液を形成することを含み、ここに精子細胞に関連した標識の存在、不存在または量が分散液中の精子細胞のサブ集団の遺伝子的、タンパク質的、構造的または機能的な特徴を示す。該方法には、さらに、分散液を光学的に検査してサブ集団のメンバーとして個々の精子細胞を同定し；分散液中のサブ集団のメンバーの位置を決定し；分散液内の異なる位置に一定用量のエネルギーを送達して、分散液中の他の位置に存在する精子細胞に同様に影響することなく、卵に受精するサブ集団のメンバーの能力を選択的に低下し；その後、分散液またはその誘導物を用いて試験管内で卵を受精させることが含まれる。受精した卵子は、その後、雌性哺乳動物の子宮に導入し得る。
【０００８】
本発明は、さらに、凍結精子分散液を形成する方法に指向される。該方法には、精子不動化を誘導する化学剤を含むかまたは温度を有する液体中に標識した精子細胞の分散液を形成することを含み、ここに精子細胞に関連した標識の存在、不存在または量が分散液中の精子細胞のサブ集団の遺伝子的、タンパク質的、構造的または機能的な特徴を示す。該方法には、さらに、分散液を光学的に検査してサブ集団のメンバーとして個々の精子細胞を同定し；分散液中のサブ集団のメンバーの位置を決定し；分散液内の異なる位置に一定用量のエネルギーを送達して、分散液中の他の位置に存在する精子細胞に同様に影響することなく、卵に受精するサブ集団のメンバーの能力を選択的に低下し；その後、分散液を低温保存することが含まれる。
【０００９】
本発明の他の態様および特徴は、以後に部分的に明らかになり、部分的に指摘する。
【００１０】
発明の詳細な説明
有利には、本発明により生精子細胞の集団を、物理学的に細胞をソーティングすることなく特徴に関して富化し得る。この特徴は、例えば、精子細胞がXまたはY染色体を運搬しているか否かとし得る。あるいは、特徴は、改善された動物生産性（例えば、改善されたミルク産生のような）をコードするかまたは選択した細胞の低温保存を改善する脂質をコードする単一ヌクレオチド多型（「SNP」）の存在のような他の遺伝子特徴とし得る。特徴は、例えば有益な先体特徴を改善することによって子宮内性能を改善するタンパク質のような精子の性能を改善するためのタンパク質のようなタンパク質的特徴ともし得る。特徴は、例えば先体完全性のような構造的特徴、または例えば前進運動性のような機能的特徴ともし得る。
【００１１】
遺伝子的、タンパク質的、構造的または機能的な特徴に関する精子細胞集団の富化は、例えば、当該特徴を有する（または別法として、それを欠く）集団中の精子細胞を標識し、精子細胞を実質的に動けなくし、ついで動けない精子細胞に一定用量のエネルギーを選択的に投与して投与した細胞の生存能力を低下するかまたは少なくともイン・ビトロ(in vitro)またはイン・ビボ(in vivo)で（すなわち、注入後に）卵に受精する投与した細胞の能力を少なくとも低下することによって達成し得る。懸濁液という場合もあるが、分散液中の精子細胞は実質的に動けず、かつ選択的に標識されているため、分散液中の特定の位置にエネルギービームを送達して個々の精子細胞に投与し；この方法工程を繰り返す、すなわち分散液中の別個の位置に存在する動けない精子細胞に個別に投与し、例えば、望ましい特徴を有するサブ集団の細胞のパーセンテージに関して；精子細胞との受精によって生じた結果としてのある種の遺伝子的またはタンパク質的特徴を有する子孫のパーセンテージに関して；またはその両方に関して、分散液中の望ましい特徴を有する精子細胞のサブ集団を有効に富化し得る。
【００１２】
いずれにせよ、精子細胞の集団は、望ましい特徴を欠いている細胞から望ましい特徴を有する細胞を物理学的に分離することなく（すなわち、非−投与細胞から投与細胞を分離することなく）、特定のサブ集団について富化し得る。所望により、細胞のさらなる富化は、下記の方法に従って投与細胞および非−投与細胞を別のサブ集団に物理学的に分離することによって細胞をさらに精製することによって達成し得る。
【００１３】
精子細胞分散液
精子細胞の密度
一般的に、ある種の特徴において富化し得る集団を有する精子細胞分散液は、広範な範囲の精子細胞密度で調製し得る。しかしながら、典型的には、精子細胞密度は少なくとも約1 X 103精子/ml、一般的には約5 X 1010精子/mlを超えず、より好ましくは約5 X 108精子/mlを超えない分散液である。例えば、１の形態において、分散液は「比較的低い」密度で、すなわち約1 X 107精子/ml未満、好ましくは約1 X 106精子/ml未満、より好ましくは約1 X 103 ないし約5 X 106精子/ml、なおより好ましくは約1 X 103 ないし約1 X 106精子/ml、いまだより好ましくは約1 X 104ないし約1 X 105精子/ml、および最も好ましくは約1 X 105精子/mlの分散液で精子を含み得る。別の形態において、分散液は「中間」密度で、すなわち約1 X 107ないし1 X 108精子/mlの分散液で精子を含み得る。いまだ別の形態において、分散液は「比較的高い」密度、すなわち、少なくとも約1 X 108精子/ml、好ましくは約1 X 108ないし約5 X 1010精子/ml、より好ましくは約1.5 X 108ないし約2 X 1010精子/ml、いまだより好ましくは約1.5 X 108ないし約2 X 108精子/ml、およびなおより好ましくは約1.5 X 108精子/mlの分散液の密度で精子を含み得る。したがって、例えば、分散液は、１の形態において少なくとも約0.04 X 106 精子/mlの分散液；もう１の形態において少なくとも約1 X 106；もう１の形態において少なくとも約1.5 X 106；もう１の形態において少なくとも約2 X 106；もう１の形態において少なくとも約3 X 106;もう１の形態において少なくとも約0.5 X 107;もう１の形態において少なくとも約1 X 107;もう１の形態において少なくとも約1.25 X 107;もう１の形態において少なくとも約2 X 107;もう１の形態において少なくとも約3 X 107;もう１の形態において少なくとも約4 X 107;もう１の形態において少なくとも約5 X 107;もう１の形態において少なくとも約6 X 107; もう１の形態において少なくとも約7.0 X 107; もう１の形態において少なくとも約8 X 107; もう１の形態において少なくとも約9 X 107; もう１の形態において少なくとも約10 X 107; もう１の形態において少なくとも約11 X 107; もう１の形態において少なくとも約12 X 107; もう１の形態において少なくとも約1.0 X 108; もう１の形態において少なくとも約1.25 X 108; もう１の形態において少なくとも約1.5 X 108; もう１の形態において少なくとも約1.75 X 108; もう１の形態において少なくとも約2.0 X 108; もう１の形態において少なくとも約2.25 X 108; もう１の形態において少なくとも約2.5 X 108; もう１の形態において少なくとも約2.75 X 108; もう１の形態において少なくとも約3 X 108; もう１の形態において少なくとも約5 X 108; もう１の形態において少なくとも約7.0 X 108;またはなお少なくとも約8 X 108精子/ml分散液を含み得る。別の形態において、分散液は、約9 X 105未満; 約7 X 105未満; 約5 X 105未満; 約2 X 105未満; ; 約1 X 105未満; 約1 X 104未満、または約1 X 103精子／ml未満の分散液を含み得る。
【００１４】
精子の密度は、例えば哺乳動物の異なる種の中の変化、単一種の哺乳動物の中の変化、および単一哺乳動物の異なる射精の中の変化を含む多くの因子に基づいて変化し得る。例えば、ウシ精子はより高い密度で分散液中に存在し得るが、典型的には例えば約0.5mlないし約25mlの体積中で0.5 X 106精子/mlないし約8 X 107精子/mlのようなより小さな体積中で存在し得る。しかしながら、ブタ精子は、より低い密度で分散液中に存在し得るが、典型的には例えば約50mlないし約250mlの体積中で0.04 X 106精子/mlないし約1 X 107 精子/mlのようなより大きな体積中で存在し得る。
【００１５】
精子分散液中の精子の密度は、それによって精子細胞をその後に富化またはソートし得る方法にも依存し得る。例えば、精子細胞は、出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許出願公開番号2005/0112541に記載されているフローサイトメトリーを用いてソートし得る。かかる例においては、分散液は、典型的には、「中間」または「比較的高い」密度の精子のものとし得る。以下にさらに詳細に記載するように、他のソーティングまたは富化技術は、例えば本明細書に記載する色素および標識のようなマーカーで標識した、「比較的低い」密度の精子のようなより低い密度の精子から恩恵を受け得る。
【００１６】
精子分散液中の精子の密度は人工的に操作して特定の精子密度の分散液を達成することもできる。例えば授精ストロー中に含まれる、精子分散液中の精子の密度に対する操作は、分散液を保存し得る温度、保存期間の長さ、精子分散液中の精子をソートするかまたはしないか、それから精子を収集した雄性哺乳動物の種、それから精子を収集した哺乳動物の生殖能力、および注入すべき雌性哺乳動物の種のような因子に基づいて行い得る。
【００１７】
精子分散液中の精子の密度は、例えば遠心分離によるような精子を単純に濃縮することによっても影響し得る。かかる例においては、分散液は通常ペレット（最小限量の流体を含有する細胞の塊）および上清（可溶性の液体画分）と呼ばれるものに実質的に分離される。ついで、上清はペレットを破壊することなくデカンテーションし得、それによって最小限量のインヒビターを含有する精子細胞の比較的稠密なペレットを生じ得、効果は分散液の成分を変化させることなく分散液の体積を減少することである。その結果、ペレットの精子細胞は動けない状態のままである。
【００１８】
精子細胞の不動化
精子細胞の分散液には、実質的に低い運動性を有する精子細胞が含まれる。精子細胞分散液中の精子細胞の運動性の実質的な低下は、例えば精子細胞を運動インヒビターと接触させることによる、精子細胞の温度または精子細胞を取り囲む直接環境（すなわち、精子分散液）の温度を低下することによる、または両方の組合せによることを含む多くの方法で達成し得る。好ましい形態において、本発明の精子分散液中の精子細胞は、ある種の点において、副睾丸精子の特徴のようにふるまう；例えば集団中の精子細胞は実質的に動けず、および／または、それらは洗浄または新たに射精された精子と比較してより低い速度の内因性呼吸を有し得る。有利には、静止精子細胞という場合もある、動けない精子細胞は、インヒビター（または複数のインヒビター）から分離された際または温度における上昇に曝露された際に、運動に関して、および１の形態において運動および呼吸に関して、射精精子のような特徴（射精した精子の特徴ではない）でふるまう能力を有する。
【００１９】
１の形態において、例えば、インヒビター、温度の低下、または両方の組合せは、HTM-IVOS精子分析 (Hamilton-Thorne HTM-IVOSコンピュータ支援精子分析システムHamilton-Thorne Research, Beverly MA)によって測定した、通路速度（運動性または通路運動性という場合もある）、前進速度（前進運動性という場合もある）、またはそれらの両方を、同種の新鮮な射精液中の精子細胞の通路速度、前進速度またはその両方に対して、分散液中の少なくとも約50%の精子細胞で低下する。好ましくは、運動インヒビター、温度の低下、またはその両方は、HTM-IVOS精子分析 (Hamilton-Thorne HTM-IVOSコンピュータ支援精子分析システムによって測定した、通路速度、前進速度、またはそれらの両方を、同種の新鮮な射精液中の精子細胞の通路速度、前進速度またはその両方に対して、分散液中の少なくとも約60%の精子細胞で低下する。より好ましくは、運動インヒビター、温度の低下、またはその両方の組合せは、HTM-IVOS精子分析 (Hamilton-Thorne HTM-IVOSコンピュータ支援精子分析システムによって測定した、通路速度、前進速度、またはそれらの両方を、同種の新鮮な射精液中の精子細胞の通路速度、前進速度またはその両方に対して、分散液中の少なくとも約70%の精子細胞で低下する。いまだより好ましくは、運動インヒビター、温度の低下、またはその両方の組合せは、HTM-IVOS精子分析によって測定した、通路速度、前進速度、またはそれらの両方を、同種の新鮮な射精液中の精子細胞の通路速度、前進速度またはその両方に対して、分散液中の少なくとも約80%の精子細胞で低下する。なおより好ましくは、運動インヒビター、温度の低下、またはその両方の組合せは、HTM-IVOS精子分析によって測定した、通路速度、前進速度、またはそれらの両方を、同種の新鮮な射精液中の精子細胞の通路速度、前進速度またはその両方に対して、分散液中の少なくとも約90%の精子細胞で低下する。なおより好ましくは、運動インヒビター、温度の低下、またはその両方の組合せは、HTM-IVOS精子分析によって測定した、通路速度、前進速度、またはそれらの両方を、同種の新鮮な射精液中の精子細胞の通路速度、前進速度またはその両方に対して、分散液中の少なくとも約95%の精子細胞で低下する。最も好ましくは、運動インヒビターは、HTM-IVOS精子分析によって測定した、通路速度、前進速度、またはそれらの両方を、同種の新鮮な射精液中の精子細胞の通路速度、前進速度またはその両方に対して、分散液中の少なくとも約99%の精子細胞で低下する。
【００２０】
運動インヒビターを用いて、精子細胞分散液中の精子細胞の運動性を実質的に低下し得る。該インヒビターは精子運動性に対して押し下げる効果を有するいずれの範囲の組成物ともし得る。かかる組成物には、例えばウアバインのようなナトリウムチャネル・インヒビター；カリウムイオンを含む組成物；およびカリウムおよびナトリウムイオンを含む組成物が含まれる。例えば、分散液中の比較的高濃度のカリウムイオンは、精子運動性を押し下げる傾向がある。したがって、一般的に、分散液はカリウムイオンの供給源を含むことが好ましく、分散液中のカリウム濃度は少なくとも約0.05モル/Lであることが好ましい。より好ましくは、カリウム濃度は少なくとも約0.05モル/Lないし約0.5モル/Lである。なおより好ましくは、カリウム濃度は少なくとも約0.1モル/Lないし約0.3モル/Lである。最も好ましくは、カリウム濃度は約0.173モル/Lである。かかる分散液は、典型的に、必ずしもそうでなくてもよいが、ナトリウムイオンの供給源も含む。ナトリウムが存在する場合、ナトリウムに対するカリウムのモル比（カリウムイオン：ナトリウムイオン）は、各々、一般的に1:1以上であるが、一般的には8:1のモル比を超えないであろう。好ましくはナトリウムに対するカリウムのモル比は少なくとも約1.25:1である。なおより好ましくは、ナトリウムに対するカリウムのモル比は少なくとも約1.5:1である。なおより好ましくは、ナトリウムに対するカリウムのモル比は少なくとも約1.75:1である。なおより好ましくは、ナトリウムに対するカリウムのモル比は、少なくとも約1.78:1である。１の特定の形態において、ナトリウムに対するカリウムのモル比は、少なくとも約2:1である。いまだもう１の形態において、ナトリウムに対するカリウムのモル比は、少なくとも約3:1である。なおもう１の形態において、ナトリウムに対するカリウムのモル比は、少なくとも約4:1である。なおもう１の形態において、ナトリウムに対するカリウムのモル比は、少なくとも約5:1である。なおもう１の形態において、ナトリウムに対するカリウムのモル比は、少なくとも約6:1である。なおもう１の形態において、ナトリウムに対するカリウムのモル比は、少なくとも約7:1である。なおもう１の形態において、ナトリウムに対するカリウムのモル比は、少なくとも約8:1である。
【００２１】
精子分散液は、さらに、運動性の下方調節を高めることができる二酸化炭素のイオンまたは供給源を含み得る。この形態においては、二酸化炭素の供給源は、例えば、１またはそれを超える炭酸塩とし得る。１の現在好ましい形態において、精子分散液はNaHCO3およびKHCO3を含み、それによってカリウムおよびナトリウムイオンの供給源を提供し、（常圧に対して）高い二酸化炭素の分圧を提供する。例えば、１の現在好ましい形態において、分散液は、水溶液中にNaHCO3およびKHCO3を含み、好ましくは水中にNaHCO3、KHCO3およびC6H8O7・H2Oを含み；一般的に分散液中のKHCO3濃度は少なくとも約0.05モル/Lとし得る。より好ましくは、KHCO3濃度は少なくとも約0.05モル/L ないし約0.5モル/Lである。なおより好ましくは、KHCO3濃度は少なくとも約0.1モル/Lないし約0.3モル/Lである。１の特に好ましい形態において、分散液は、SalisburyおよびGraves, J. Reprod. Fertil., 6:351-359 (1963)に開示されいる、水中に0.097モル/LのNaHCO3、0.173モル/LのKHCO3、0.090モル/LのC6H8O7・H2Oを含む運動インヒビターを用いて形成する。精子細胞は、一般的にそれらが運動インヒビター（または複数の運動インヒビター）に曝されている限り、静止したままであろう。
【００２２】
分散液中にC6H8O7・H2Oが存在する場合、NaHCO3に対するKHCO3のモル比は前記したものとし得る。C6H8O7・H2Oに対するKHCO3のモル比は、一般的に、各々1:1以上とし得るが、一般的には8:1のモル比を超えないであろう。好ましくは、C6H8O7・H2Oに対するKHCO3のモル比は少なくとも約1.25:1からであろう。なおより好ましくは、C6H8O7・H2Oに対するKHCO3のモル比は、少なくとも約1.5:1である。なおより好ましくは、C6H8O7・H2Oに対するKHCO3のモル比は、少なくとも約1.75:1である。１の詳細な形態において、C6H8O7・H2Oに対するKHCO3のモル比は、少なくとも約1.78:1である。もう１の詳細な形態において、C6H8O7・H2Oに対するKHCO3のモル比は、少なくとも約2:1である。いまだもう１の形態において、C6H8O7・H2Oに対するKHCO3のモル比は、少なくとも約3:1である。なおもう１の形態において、C6H8O7・H2Oに対するKHCO3のモル比は、少なくとも約4:1である。なおもう１の形態において、C6H8O7・H2Oに対するKHCO3のモル比は、少なくとも約5:1である。なおもう１の形態において、C6H8O7・H2Oに対するKHCO3のモル比は、少なくとも約6:1である。なおもう１の形態において、C6H8O7・H2Oに対するKHCO3のモル比は、少なくとも約7:1である。なおもう１の形態において、C6H8O7・H2Oに対するKHCO3のモル比は、少なくとも約8:1である。１の特に好ましい形態において、分散液は、SalisburyおよびGraves, J. Reprod. Fertil., 6:351-359 (1963)に開示されるように、水中に0.097モル/L のNaHCO3、0.173モル/LのKHCO3、0.090モル/LのC6H8O7・H2Oを含む阻害緩衝液を用いて形成する。精子細胞は、一般的に、それらが運動インヒビター（または複数の運動インヒビター）に曝されている限り静止したままであろう。
【００２３】
現在までの実験事実は、さらに、精子分散液を当該分散液への酸素の拡散を減少または防止する雰囲気下に維持した場合に、精子細胞の全体的健康および他の生存特徴を改善し得ることを示唆している。このことは、精子分散液の上方の気体の雰囲気を、例えば二酸化炭素、窒素または周囲の空気に対して他の不活性気体の高い分圧を有する雰囲気で置きかえることによって達成し得る。詳細な形態において、分散液は空気に対して高い分圧の二酸化炭素を有する雰囲気下で維持する。好ましい形態において、分散液上の雰囲気は、少なくとも約0.0001 atmの二酸化炭素の分圧を有するが、一般的には大気圧にて約5 atm未満である。１の形態において、二酸化炭素の分圧は、大気圧にて約0.5 atmないし約2 atm；もう１の形態において、二酸化炭素の分圧は、大気圧にて約0.9 atmないし約2 atm；もう１の形態において、二酸化炭素の分圧は、大気圧にて約0.95 atmないし約2 atmである。特に好ましい形態において、分散液上の雰囲気は少なくとも0.9 atm；より好ましくは、少なくとも約0.95 atmの二酸化炭素の分圧を有する。
【００２４】
あるいは、または運動インヒビターの使用に加えて、精子細胞または分散液の温度を、動けなくなることを精子細胞に誘導するために変化し得る。温度誘導された精子不動化は、例えば精子細胞または分散液の温度を約0℃ないし約15℃まで、好ましくは約1℃ないし約10℃まで;より好ましくは約2℃ないし約8℃まで、なおより好ましくは約3℃ないし約6℃まで、およびなおより好ましくは約4℃ないし約5℃まで、およびなおより好ましくは約5℃まで低下することによって誘導し得る。しかしながら、好ましくは、精子細胞は、細胞の生存能力に実質的に有害に影響するかまたは精子細胞の標識に結合するもしくはそれを取り込む能力に顕著に影響する温度に曝さない。
【００２５】
1の形態において、精子細胞または精子分散液の温度は、精子細胞または精子分散液が約4℃ないし約50℃；好ましくは約7℃ないし約43℃；より好ましくは約10℃ないし約39℃；なお好ましくは約15℃ないし約30℃；および最も好ましくは約17℃ないし約25℃の範囲内の温度で存在し得るように変化し得る。特に好ましい形態において、精子細胞または取り囲む分散液の温度は約4℃とし得る。
【００２６】
精子細胞は、細胞が供給源哺乳動物から得られれば、いつでも低温に曝露し、それによって実質的に動けなくし得る。例えば、供給源哺乳動物から細胞を収集する際、細胞と緩衝液とを合する際、標識プロセスの前後、中間を含む、標識混合物を形成する際、または標識した細胞の分散液を形成する際に、精子細胞の温度を低下することができ、それによって精子不動化を誘導し得る。しかしながら、一般的に、精子不動化は、分散液の光学的検査の前に温度の低下によって誘導し得る。
【００２７】
例えば、精子細胞の温度は細胞の標識の後に低下させ（すなわち、精子不動化を誘導し得る）、それによって以下に論じるようなより好ましい温度で標識をすることが許容される。好ましい形態において、精子細胞または取り囲む分散液の温度は、標識の後であって細胞の光学的検査の前に低下させ得る（すなわち、精子不動化を誘導し得る）。
【００２８】
精子細胞をインヒビター、低温、またはそれらの両方の組合せに曝すと、精子が動けなくなることが誘導される。１の形態において、例えば、運動インヒビター、温度の低下、またはそれらの両方の組合せは、同種の新鮮な射精液中の精子細胞の運動性、前進運動性またはそれらの両方に対して、分散液中の少なくとも60%の精子細胞の運動性、前進運動性、またはそれらの両方を低下する。好ましくは、運動インヒビター、温度の低下、またはそれらの両方の組合せは、同種の新鮮な射精液中の精子細胞の運動性、前進運動性またはそれらの両方に対して、分散液中の少なくとも70%の精子細胞の運動性、前進運動性、またはそれらの両方を低下する。より好ましくは、運動インヒビター、温度の低下、またはそれらの両方の組合せは、同種の新鮮な射精液中の精子細胞の運動性、前進運動性またはそれらの両方に対して、分散液中の少なくとも80%の精子細胞の運動性、前進運動性、またはそれらの両方を低下する。好ましくは、運動インヒビター、温度の低下、またはそれらの両方の組合せは、同種の新鮮な射精液中の精子細胞の運動性、前進運動性またはそれらの両方に対して、分散液中の少なくとも90%の精子細胞の運動性、前進運動性、またはそれらの両方を低下する。好ましくは、運動インヒビター、温度の低下、またはそれらの両方の組合せは、同種の新鮮な射精液中の精子細胞の運動性、前進運動性またはそれらの両方に対して、分散液中の少なくとも99%の精子細胞の運動性、前進運動性、またはそれらの両方を低下する。
【００２９】
細胞は、好ましくは、使用する方法に関わりなく、分散液の光学的検査、サブ集団のメンバー細胞の位置の決定；およびサブ集団のメンバー細胞のエネルギー供給源での投与を許容するのに十分な時間動けなくする。投与した細胞を投与していない細胞から物理的に分離することが望ましい場合は、この方法工程を通して動けない状態に精子細胞を維持することも好ましいかもしれない。同様にして、精子細胞を低温保存すべき場合は、（低温保存の前に、投与した細胞を投与していない細胞から物理学的に分離するか否かとは独立して）それを低温保存工程を通して動けない状態に維持し得る。好ましい形態において、細胞は低温保存の工程を通して動けなくしておく。
【００３０】
動けない細胞は、例えば、不動化を誘導するために使用した方法に依存して、運動インヒビターから細胞を分離することによって、それらを空気に曝すことによって、細胞または細胞分散液の温度を（好ましくは新鮮に射精された精子の典型的な温度に）上昇させることによって、生理食塩水 (Salisburyら, 1963) またはTCA緩衝液またはPBSのような緩衝液で希釈することによって、またはそれらのいずれかの組合せによって、活動状態、すなわち新鮮な射精液の行動特徴、に戻し得る。典型的には、少なくとも約20%、好ましくは少なくとも約50%、より好ましくは少なくとも約60%、なおより好ましくは少なくとも約70%、なおより好ましくは少なくとも約80%、なおより好ましくは少なくとも約90%、なおより好ましくは少なくとも約95%、および最も好ましくは少なくとも約99%の活動状態に戻った細胞(すなわち、再活性化細胞）は、少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約60%、より好ましくは少なくとも約70%、なおより好ましくは少なくとも約80%、なおより好ましくは少なくとも約90%、なおより好ましくは少なくとも約95%、および最も好ましくは少なくとも約99%の、運動インヒビター（すなわち、新鮮な射精液の精子細胞の）と合する前の精子細胞の通路速度、前進速度、またはそれらの両方である、HTM-IVOS精子分析によって測定した通路速度、前進速度、またはそれらの両方を有するであろう。
【００３１】
哺乳動物からの細胞の収集
生きている精子の収集の種々の方法が知られている。かかる方法には、例えば、グローブをはめた手による方法（gloved-hand method）、人工膣の使用、および電気射精が含まれる。
【００３２】
収集の際またはその後に、収集した精子は、TCA、HEPES、PBSまたはその内容を出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許出願公開番号US 2005/0003472に開示されている他のいずれかの緩衝液のような、精子と和合性である多くの種々の緩衝液のいずれかと合することができる。例えば、典型的に1ミリリットルあたり約5億ないし約100億の精子細胞を含有するウシ精子試料は、供給源哺乳動物から緩衝液を含む容器に直接的に収集して精子懸濁液を形成し得る。あるいは、精子試料は空の容器に収集し、ついでその後に収集後数分ないし数時間以内に緩衝液と接触させて精子懸濁液を形成し得る。
【００３３】
あるいは、精子細胞は収集し、緩衝液の代わりにまたはそれに加えて運動インヒビターと接触させ、それによって精子分散液を形成してもよい。精子細胞は、動物から運動インヒビターを含む容器に直接的に収集して精子分散液を形成しても、あるいは、空の容器に収集し、その後に収集から数分間（または数時間でさえ）以内に運動インヒビターと合して精子分散液を形成し得る。
【００３４】
精子分散液は一定範囲の他の添加剤を含んで、精子生存能力を高めることもできる。例示的な添加剤には、タンパク質源、抗生物質、成長因子、および細胞内および／または細胞外で酸化／還元反応を調節する組成物が含まれる。これらの各添加剤の例は、例えば、各々その内容を出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許出願番号60/557,407および11/092,313号の開示で実証されているように、当該技術分野においてよく知られている。
【００３５】
細胞の標識
精子細胞は、（例えば、蛍光標識した抗体のような）細胞の外部に結合する標識ならびに（例えば、蛍光DNA選択的色素のような）細胞膜を横切り、細胞の内部内容物に結合する標識を含む多くの異なる標識のいずれかで標識し得る。一般的に、標識方法には、精子細胞と一定濃度の標識とを、細胞の生存能力に実質的に悪影響を与えることなく、所望の程度の標識を得るのに十分に長い時間、該標識の迅速かつ効率的な結合または取り込みを許容する温度およびpHで接触させることが含まれる（それによって、染色混合物という場合もある、標識混合物が形成される）。
【００３６】
精子は正味の精液の形態で、あるいは、遠心分離または精液を画分に分離する他の手段を使用することによって得た精子を含有する精液誘導物の形態で存在し得る。ついで、精子細胞を標識と接触その他、標識と合して、標識混合物を形成し；所望により、標識は固体または溶液の形態で存在してもよい。しかしながら、一般的には、標識、精子細胞またはそれらの両方は、緩衝液のような培地中に存在し得る。
【００３７】
１の形態において、精子細胞は緩衝液と合して精子懸濁液を形成する。例えば、TCA、HEPES、PBSまたは米国特許出願公開番号US 2005/0003472に開示されている緩衝液のような精子と和合性である多くの種々の緩衝液のいずれかを使用し得る。形成されたら、精子懸濁液は標識の供給源と合して標識混合物を形成し得；所望により、標識は固体または液体の形状で存在してもよく、さらに所望により、前記した緩衝液のいずれかをさらに含んでいてもよい。
【００３８】
もう１の形態において、標識は緩衝液と合して標識懸濁液を形成し、その標識懸濁液を、正味の精液、精子を含有する精液誘導体または精子懸濁液の形態の精子供給源と合して標識混合物を形成する。
【００３９】
好ましい形態において、運動インヒビターを含む緩衝液を用いて標識混合物を形成する。例えば、運動インヒビターは使用した緩衝液中に含めて精子懸濁液を形成することができ（それを、ついで標識と合する）、あるいは標識懸濁液中に含めて（それを、ついで精子の供給源と合する）標識混合物を形成することができる。いずれの場合においても、結果物は運動インヒビターおよび標識を含有する精子懸濁液である。
【００４０】
標識混合物は、例えば、その各々を出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第5,135,759号およびWO 02/41906に以前に記載されているような１またはそれを超えるUVもしくは可視光で励起可能なDNA選択的色素のような多くの標識のいずれかを用いることによって形成し得る。例示的なUV光で励起可能なDNA選択的色素には、各々Sigma-Aldrich社 (St. Louis, MO)から市販されているHoechst 33342およびHoechst 33258が含まれる。例示的な可視光で励起可能な色素には、Molecular Probes, Inc.社 (Eugene, OR)から市販されているSYBR-14およびWO 02/41906に記載されているビスベンズイミド-BODIPY（登録商標）コンジュゲート6-{[3-((2Z)-2-{[1-(ジフルオロボリル)-3,5-ジメチル-1H-ピロール-2-イル]メチレン}-2H-ピロール-5-イル)プロパノイル]アミノ}-N-[3-(メチル{3-[({4-[6-(4-メチルピペラジン-1-イル)-1H,3'H-2,5'-ビベンズイミダゾール-2'-イル]フェノキシ}アセチル)アミノ]プロピル}アミノ)プロピル]ヘキサンアミド (「BBC」)が含まれる。これらの各色素は単独または組み合わせて使用することができ；あるいは他の細胞浸透性のUVおよび可視光で励起可能な色素を単独または前記した色素と組み合わせて使用し得るが、但し、色素は別の場所で記載するようにソーティングを可能とする濃度で使用した場合に精子細胞の生存能力に対して許容し得ない程度まで有害な影響を与えてはならない。
【００４１】
あるいは、標識混合物は蛍光ポリアミド、より詳細にはそれにコンジュゲートした蛍光標識またはレポーターとポリアミドを用いて形成し得る。かかる標識は、核酸に結合した場合に蛍光性であろう。結合した蛍光標識またはレポーターを有するポリアミドの例には、例えば、その各々の内容を出典明示して本明細書の一部とみなすBestら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(21): 12063-12068 (2003)；Gygiら, Nucleic Acids Res., 30(13): 2790-2799 (2002)；米国特許第5,998,140号；米国特許第6,143,901号；および米国特許第6,090,947号に開示されているものが含まれる。
【００４２】
蛍光ヌクレオチド配列を使用して精子細胞を標識することもできる。かかるヌクレオチド配列は、標的または相補的な配列を含む核酸にハイブリダイズした場合に蛍光を発するが、非ハイブリダイズ状態にある場合は非−蛍光である。かかるオリゴヌクレオチドは、例えば、（出典明示して本明細書の一部とみなす）米国特許出願公開番号2003/0113765に開示されている。
【００４３】
性別特異的な抗体を使用して、標識混合物中の精子細胞を標識することもできる。この形態においては、例えば、性別特異的抗体を蛍光基（または等価のレポーター分子）とコンジュゲートし得る。抗体はX染色体を運搬している、あるいはY染色体を運搬している細胞上にのみ存在する抗原に結合するため、かかる細胞はそれらの蛍光（非標識細胞の非蛍光に対する）に基づいて選択的に同定し得る。さらに、１を超える性別特異的な抗体、各々の抗体はそれに結合した異なる蛍光基を有する、を同時に使用し得る。このことにより、各々の異なる蛍光に基づいて、X染色体を運搬しているおよびY染色体を運搬している細胞の区別が許容される。
【００４４】
ルミネセンス、発色選択的なナノクリスタルを用いても標識混合物中の精子細胞を標識し得る。量子ドットとも呼ばれるこれらの粒子は、各々出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第6,322,901号および第6,576,291号によって示されるごとく、当該技術分野でよく知られている。これらのナノクリスタルは、例えば、ペプチド、抗体、核酸、ストレプトアビジンおよび多糖を含む多くの生物材料にコンジュゲートされており（例えば、各々出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第6,207,392号；第6,423,551号；第5,990,479号および第6,326,144号を参照されたい）、それを用いて生物標的が検出されている（例えば、各々出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第6,207,392号および第6,247,323号を参照されたい）。
【００４５】
標識混合物中の標識の好ましい濃度は、一定範囲の変数の関数であり、それには、例えば標識が細胞の外部に結合するかまたはそれが細胞膜を横切らなければならないか；それが細胞膜を横切らなければならない場合は、選択した標識の細胞の透過性；標識混合物の温度；標識を行うのに許容される時間の量；および、望ましい選択性の程度が含まれる。一般的に、好ましくは標識の濃度は、精子の生存能力に実質的に有害な影響を与えることなく合理的に短時間で細胞の望ましい程度の標識を達成するのに十分なものである。例えば、標識混合物中のHoechst 33342、Hoechst 33258、SYBR-14またはBBCの濃度は、一般的には、約0.1μMないし約1.0M、好ましくは約0.1μMないし約700μM、およびより好ましくは約100μMないし約200μMである。特に好ましい形態において、染色混合物中のHoechst 33342、Hoechst 33258、SYBR-14またはBBCの濃度は、一般的に、約400μMないし約500μM、および最も好ましくは約450μMである。したがって、１セットの標識条件下において、Hoechst 33342の濃度は好ましくは約100μMである。もう１のセットの標識条件下において、Hoechst 33342の濃度は約150μMである。なおもう１のセット標識条件下において、濃度は好ましくは約200μMである。いまだもう１のセットの染色条件下において、Hoechst 33342の濃度は最も好ましくは約450μMである。
【００４６】
もう１の例として、例えば米国特許出願公開番号2001/0002314に記載されているような蛍光ポリアミドの濃度は、一般的に約0.1μMないし約1mM、好ましくは約1μMないし約1mM、より好ましくは約5μMないし約100μM、なおより好ましくは約10μMであろう。
【００４７】
形成したら、標識混合物はいずれの範囲の温度で維持してもよい。例えば、Hoechst 33342またはHoechst 33258を用いる標識は、典型的には約4℃ないし約50℃の範囲内で行うであろう。例えば、標識混合物は「比較的低い」温度、すなわち約4℃ないし約30℃で維持してもよく；この形態においては、温度は、好ましくは約20℃ないし約30℃、より好ましくは約25℃ないし約30℃、および最も好ましくは約28℃である。あるいは、標識混合物は「中間の」温度範囲内、すなわち約30℃ないし約39℃の温度で維持してもよく；この態様においては、温度は、好ましくは約34℃ないし約39℃、およびより好ましくは約37℃である。加えて、標識混合物は「比較的高い」温度範囲内、すなわち約40℃ないし約50℃の温度の範囲内で維持してもよく；この形態において、温度は好ましくは約40℃ないし約45℃、より好ましくは約40℃ないし約43℃、および最も好ましくは約41℃である。好ましい温度の選択は、一般的に、例えば、標識は細胞の外部に結合するか否かまたはそれは細胞膜を横切らなければならないか否か；それが細胞膜を横切らなければならない場合は、選択した標識に対する細胞の透過性；標識混合物中の標識（または複数の標識）の濃度；標識が行われることを許容する時間の量；および、望ましい選択性の程度を含む一定範囲の変数に依存する。
【００４８】
標識混合物のpHはいずれの範囲のpHで維持してもよい。例えば、Hoechst 33342またはHoechst 33258を用いる標識は、典型的には約5.0 ないし約9.0のpH範囲で行うであろう。例えば、標識混合物は「わずかに酸性の」pH、すなわち約5.0ないし約7.0で維持してもよい。好ましい形態において、pHは好ましくは約6.0ないし約7.0、より好ましくは約6.0ないし約6.5、および最も好ましくは約6.2である。あるいは、標識混合物は「わずかに塩基性の」pH、すなわち約7.0ないし約9.0で維持してもよい。この形態において、pHは好ましくは約7.0ないし約8.0、より好ましくは約7.0ないし約7.5、および最も好ましくは約7.3である。しかしながら、一般的に、標識を約7.0以外のpHで行う場合は、一旦望ましい程度の標識を得るために十分な時間が生じたら、標識混合物は約7.0のpHに調整するであろう。
【００４９】
所望により、標識混合物は添加物を含有して精子生存能力を高めてもよい。例示的な添加剤には、抗生物質、成長因子、または細胞試料収集に関して前記に論じたような細胞内および／または細胞外で酸化／還元反応を調節する組成物が含まれる。これらの添加剤は、それにしたがって標識混合物に添加し得る。
【００５０】
標識混合物中の精子細胞による標識の取込みまたは精子細胞に対する標識の結合は、望ましい程度まで標識した精子細胞の分散液を得るのに十分な時間続けることが許容される。その時間は、典型的には、細胞のサブ集団のメンバーを同定し得、分散液におけるその位置を決定し得るように、精子細胞または精子細胞のDNAに標識が結合するのに十分な時間である。好ましい期間の選択は、一般的に、例えば、標識が細胞の外部に結合するか否かまたはそれが細胞膜を横切らなければならないか否か；それが細胞膜を横切らなければならない場合は、選択した標識に対する細胞の透過性；標識混合物中の標識（または複数の標識）の濃度；標識混合物の温度；および、望ましい選択性の程度を含む一定範囲の変数に依存する。例えば、時間は、XおよびY染色体を運搬している精子細胞が２の間で異なる測定可能な蛍光強度に基づいて選択し得るように、それらのDNAに蛍光DNA選択的色素が結合するのに十分な時間とし得る。Hoechst 33342またはHoechst 33258を用いた標識の場合、典型的には、この時間は約160分以下、好ましくは約90分以下、なおより好ましくは約60分以下、および最も好ましくは約5分ないし約40分であろう。
【００５１】
ある種の標識、詳細にはある種の色素は、精子細胞を透過することができ、細胞の透過性を増大するさらなる介在なしにDNAに特異的に結合することができる。しかしながら、他の標識を用いる場合、標識する前に精子細胞を処理して生存能力または運動性を許容しえないほど低下することなく、透過の割合を増大させることが望ましい場合もある。当業者に知られているいずれか好適な方法を使用し得る。かかる方法には、エレクトロポレーション、細胞透過性を高める溶液、例えば温和な界面活性剤、または化学的ショックの使用が含まれる。他のまたはよりストリンジェントな技術を使用するのが望ましいまたは有利な場合、かかる処理には、当業者によって使用されて染料、色素、遺伝子またはベクターを生細胞に導入するためのリポソームまたは多くの技術の使用が含まれる。これらの方法には、限定されるものではないが、すべて当業者によく知られている、ウサギ、ヒツジ、ウシおよびブタに拡大されているためGordonら (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77(12): 73804 (1980))によって使用されるようなマイクロインジェクション；DEAE−デキストラン媒介移入；リン酸カルシウム共沈；および、他の技術が含まれる。いまだ他の例において、精子を遠心分離し、遠心した精子をもう１の培地に再懸濁して後の方法工程を妨害し得るある種の成分（それは精子分散液に以前に添加したものであり得る）を除去することが望ましいかもしれない。
【００５２】
標識に対する精子細胞の透過性を増大する１の特に好ましい方法は、その内容を出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第6,753,161号に開示されているオプトインジェクションのよく知られた方法である。一般的に、オプトインジェクションは、細胞を放射線のパルスと接触させることによって細胞を一時的に透過性とする方法である。細胞を照射し、細胞の照射の検出に基づいて同定および位置決定し、細胞を一時的に透過性とするのに十分な放射線のパルスにあてる。本発明に適用する場合、例えば、オプトインジェクションを用いて精子細胞を一時的に透過性とし、それによって、（例えば、DNAまたはRNAに結合する標識のような）細胞の内部内容物に結合する標識が細胞の中により簡単かつ効率的に入ることが許容される。したがって、オプトインジェクションを使用して、例えば、精子細胞をHoechst 33342、Hoechst 33258のような蛍光DNA選択的色素で、または蛍光ポリアミドで十分に標識するのに必要な時間を短縮し得る。
【００５３】
また、オプトインジェクションを用いて、低温で細胞を標識することもできる。以前は、精子細胞は、一般的に、より高い温度は増加した色素取込みを助けるため、例えば、30℃を超える、40℃もの温度にて蛍光DNA選択的色素で標識していた。かかる温度での標識は確かに実行可能であるが、精子細胞をより高温に、とりわけ長時間曝すことを回避することは有利になり得る。したがって、オプトインジェクションを用いて精子細胞を透過性にし得、それによって、なお高温における標識と典型的には関連する染色効率および速度をいまだ維持またはそれを超えつつ、低温における細胞の標識が許容される。
【００５４】
したがって、１の形態において、精子細胞、運動インヒビターおよび約100μMないし約200μMの濃度の色素を含む標識混合物を形成し、染色混合物を約41℃の温度に一定時間保持する。もう１の形態において、運動インヒビターは、25mLの精製水当たり0.204gのNaHCO3、0.433gのKHCO3および0.473gのC6H8O7・H2O(水中の0.097モル/LのNaHCO3、0.173モル/L のKHCO3、0.090モル/L のC6H8O7・H2O)を含む。
【００５５】
もう１の形態において、精子細胞、運動インヒビター、および約400μMないし約500μMの濃度の色素を含む標識混合物を形成し、染色混合物を約41℃の温度に一定時間保持する。もう１の形態において、色素濃度は450μMである。もう１の形態において、運動インヒビターは、25mLの精製水当たり0.204gのNaHCO3、0.433gのKHCO3、および0.473gのC6H8O7・H2O (水中の0.097モル/LのNaHCO3、0.173モル/LのKHCO3、 0.090モル/LのC6H8O7・H2O)を含む。
【００５６】
いまだもう１の形態において、精子細胞、運動インヒビター、および約100μMないし約200μMの濃度の色素を含む標識混合物を形成し、染色混合物を約28℃の温度に一定時間保持する。もう１の形態において、運動インヒビターは、25mLの精製水当たり0.204gのNaHCO3、0.433gのKHCO3、および0.473gのC6H8O7・H2O (水中の0.097モル/LのNaHCO3、0.173モル/LのKHCO3、 0.090モル/LのC6H8O7・H2O)を含む。
【００５７】
いまだもう１の形態において、精子細胞、運動インヒビター、および約400μMないし約500μMの濃度の色素を含む標識混合物を形成し、染色混合物を約28℃の温度に一定時間保持する。もう１の形態において、色素濃度は450μMである。もう１の形態において、運動インヒビターは、25mLの精製水当たり0.204gのNaHCO3、0.433gのKHCO3、および0.473gのC6H8O7・H2O (水中の0.097モル/LのNaHCO3、0.173モル/LのKHCO3、 0.090モル/LのC6H8O7・H2O)を含む。
【００５８】
標識細胞の分散液の形成
標識混合物を形成したら、標識混合物を用いて、その後に検査および投与する標識細胞の分散液を形成する。かかる分散液には、標識した精子細胞および精子不動化を誘導する化学剤が含まれる。あるいは、またはそれに加えて、分散液は、標識した精子細胞に加えて、前記した緩衝液のような液体を含んでいてもよく、ここでは細胞または液体の温度が精子不動化を誘導する。
【００５９】
標識した精子細胞は、多くの形態のうちのいずれで存在してもよい。例えば、標識した細胞はいまだ標識混合物の一部分とし得る。それ自体で、標識した細胞はいまだ過剰または非結合の標識中に存在し得る。あるいは、標識した細胞は、例えば細胞を洗浄することによるまたは細胞をスピンダウンすることによるように、遠心分離し、ついで細胞を非結合標識から分離することによるように、過剰または非結合の標識から分離し得る。かかる例においては、標識した細胞は、一般的に、細胞試料の収集に関して前記に論じたような緩衝液とその後に合するであろう。いずれにせよ、分散液中の精子細胞は、１またはそれを超える精子細胞と関連する標識の不存在または量が分散液中の精子細胞のサブ集団の遺伝子的、タンパク質的、構造的または機能的な特徴の同定を許容するように標識する。精子細胞は、精子不動化を誘導または増大する温度に維持し得る。
【００６０】
標識した細胞の分散液は、例えば、前記に論じた運動インヒビターのような精子不動化を誘導する化学剤も含み得る。化学剤は、例えば精子細胞の標識の前、その間または後のような、分散液の光学的検査の前のいずれの時点においても標識混合物または標識した細胞に添加し得る。化学剤は、前記に論じた多くの形態のいずれかの形態の標識した細胞（すなわち、いまだ標識混合物中かまたはそれから取り出された）と合し得る。特別の形態において、精子細胞および標識を含む標識混合物を形成し、ついで、標識混合物を精子不動化を誘導する化学剤と合する。あるいは、または化学剤に加えて、標識混合物の温度は、精子不動化を誘導または増大させるために、前記に論じたように低下し得る。
【００６１】
細胞の検査、決定および投与
標識した細胞の分散液を形成したら、該分散液を光学的に検査してサブ集団のメンバーとして個々の精子細胞を同定し、分散液中のサブ集団のメンバーの位置を決定し、および、エネルギービームを分散液内の異なる位置に送達して、分散液中の他の位置の精子細胞に同様に影響することなく、エネルギー源でサブ集団のメンバーを選択的に投与し、それによって投与した細胞の生存能力を低下するか、または少なくとも卵を受精させるその能力を低下する。
【００６２】
これらの工程は、典型的にはデバイスによって行い、商業的にはLEAP（登録商標）(Laser-Enabled Analysis and Processing) Technology Platform (Cyntellect, Inc., San Diego, CA)といわれる様式で行う。一般的に、この方法は、細胞をマーカーで標識して、細胞の混合物またはより大きな集団内の細胞のサブ集団の個々の細胞を同定および位置決定することが必要である。ついで、細胞の集団を照射し、サブ集団の個々の細胞の位置が同定されることを許容する。ついで、エネルギーのビームを発してサブ集団の同定した細胞における変化を誘導し得るように、処理レーザーを位置決定する。誘導される変化は通常は細胞死である。これらの方法およびデバイスは、さらに、各々出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第6,534,308号；第6,514,722号；第6,753,161号；および第6,642,018号に記載されている。
【００６３】
本発明において使用するエネルギー源は、ある種の用量で精子細胞に適用した場合に、分散液中の他の位置の精子細胞に最小限のまたは同様でない影響を与えつつ、投与された細胞の生存能力を低下するかまたは少なくとも卵に受精するその能力を低下するいずれの源ともし得る。典型的には、エネルギー源は、エネルギービームの形態で存在するであろう。好適なエネルギー源の例には、レーザー、平行にされたかまたは集光された非−レーザー光、ＲＦエネルギー、加速粒子、集束された超音波エネルギー、電子ビーム、または他の放射ビームが含まれる。しかしながら、好ましくは、エネルギー源はレーザーである。レーザーはコンパクトなサイズおよび最小限の熱発生でもって高い強度および比較的効率的なエネルギーの使用の利点を提供し、それによって周囲の細胞に著しい悪影響を及ぼすことなく単一の細胞の投与を許容するからである。
【００６４】
細胞は、光学検査および細胞の投与に好適ないずれの表面にも置き得る。一般的には、かかる表面は細胞を光学的に検査するために使用するエネルギー源ならびにサブ集団のメンバーを投与するために使用するエネルギー源に対して光学的に透明である水平面（上面、底面またはその両方のいずれか）を有するであろう。かかる好適な表面には、例えば、ガラス、プラスチックまたは他の関連するポリマー、およびPyrex（登録商標）が含まれ、平坦なスライド、ペトリ皿、シングルウェルプレート、またはマルチウェルプレートの形態で存在し得る。例は、例えば、米国特許第6,534,308号および第6,514,722号において論じられている。
【００６５】
精子細胞の試料は、例えば、マルチウェルプレートと一緒に使用するための多数の個々の試料に分割することによるごとき、幾つかのより小さな個々の試料に分割し得る。各試料（例えば、各ウェル内の）は同一の特徴について富化し得、それによって、各々が単一の特徴について富化された複数の試料を生成し得る。しかしながら、有利には、各試料は異なる特徴について富化し得る。例えば、精子細胞の試料は、より小さな個々の試料に分割し得、各個々の試料を９６ウェルプレートの１のウェルに位置させ得る。ついで、各ウェルの個々の試料を他の各ウェルにおける試料のものと異なる単一の特徴に関して富化し、異なる特徴に関して各々が富化された９６の個々の試料を生じ得る。
【００６６】
サブ集団のメンバー細胞にエネルギー源を投与したら、非−投与細胞（すなわち、エネルギーを投与しなかった精子細胞）を精製することによって細胞集団をさらに富化し得る。非−投与細胞の精製は、投与細胞または非−投与細胞のいずれかを分散液から除去し、特定の特徴について富化された非−投与細胞を含むサブ集団を生じることによって行い得る。例えば、該特定の特徴がY染色体を運搬している精子細胞である場合、非−投与細胞は、それが少なくとも約85%のY染色体を運搬している精子細胞；好ましくは、少なくとも約90%のY染色体を運搬している精子細胞；より好ましくは、少なくとも約95%のY染色体を運搬している精子細胞；なおより好ましくは、少なくとも約97%のY染色体を運搬している精子細胞；および、最も好ましくは、少なくとも約99%のY染色体を運搬している精子細胞を含むように精製し得る。あるいは、特定の望ましい特徴がX染色体を運搬している精子細胞である場合、非−投与細胞は、それが少なくとも約85%のX染色体を運搬している精子細胞；好ましくは、少なくとも約90%のX染色体を運搬している精子細胞；より好ましくは、少なくとも約95%のX染色体を運搬している精子細胞；なおより好ましくは、少なくとも約97%のX染色体を運搬している精子細胞；および、最も好ましくは、少なくとも約99%のX染色体を運搬している精子細胞を含むように精製し得る。
【００６７】
投与した分散液からの（すなわち、投与細胞および非−投与細胞の両方を含む精子細胞のより大きな集団からの）投与細胞または非−投与細胞のいずれかの除去は、当業者に知られている多くの手段のうちのいずれかによって達成し得る。かかる方法には、例えば、遠心分離によるような全体分散液のスピンダウン、およびその後の投与細胞を含有する上清の除去または毛管作用による吐き出し（wicking）が含まれる。もう１の方法には、分散液への高密度培地の添加が含まれる。分散液に添加し得る高密度培地には、例えばPercoll（登録商標）およびIsolate（登録商標）が含まれる。一般的に、高密度分離においては、生存可能な細胞（すなわち、本願に関する非−投与細胞）は高密度培地の上面に泳ぐことができ、その後、培地の上面からすくい取ることができるが、損傷した細胞または死細胞（すなわち、投与した細胞）は、高密度培地内に、一般的には大きな相内に分散したままであろう。かかる培地を使用する方法は当該技術分野でよく知られている。
【００６８】
有利には、標識した細胞の分散液は、異なる標識で標識した細胞のサブ集団を含み得る。各標識は、分散液中の精子細胞のサブ集団の異なる遺伝子的、タンパク質的、構造的または機能的な特徴を同定し得る。また、各標識は、精子細胞に結合した場合に個々に検出可能とし得る；すなわち、異なる標識を別々に検出することが可能である。例えば、標識は、異なる波長で各々蛍光を発し得る。
【００６９】
異なる標識を、標識混合物または標識した細胞の分散液に添加し得る。あるいは、異なる標識は、細胞の検査、決定または投与のいずれかの工程の後に添加し得る。しかしながら、好ましくは、異なる標識は、分散液の投与の後に添加するであろう。例えば、精子細胞のサブ集団のメンバーを投与したら、投与した分散液（投与細胞および非−投与細胞の両方を含む）または精製した投与分散液（非−投与細胞のみ含む）を異なる標識で再度標識し得、細胞の検査、決定および投与の方法を、一般的には前記に開示したように、精子細胞と関連付けた異なる標識の不存在または量に基づいて、繰り返し得る。
【００７０】
一般的には、異なる標識を用いて、一定用量のエネルギーを送達したサブ集団のメンバーを以前に同定するために使用した特徴とは異なるかもしれない（すなわち、投与すべきまたは投与しないべき細胞を以前に決定するために使用した特徴とは異なる）非−投与細胞のさらなる遺伝子的、タンパク質的、構造的または機能的特徴を同定し得る。このことは、すでに富化した細胞の集団をさらに富化する手法を提供する。
【００７１】
例えば、蛍光DNA選択的色素を用いて標識した細胞の分散液を形成し得る。ついで、分散液を光学的に検査してX染色体を運搬している個々の精子細胞を同定し得る。X染色体を運搬している精子細胞の位置はその後に決定し得、ついで、一定用量のエネルギーを１またはそれを超えるX染色体を運搬している細胞に送達し、それによって富化されたY染色体を運搬している生存可能な細胞集団を達成し得る。その後、投与した分散液（投与（X染色体を運搬している）および非−投与（Y染色体を運搬している）細胞の両方を含む）または精製した投与した分散液（非−投与細胞のみ含む）を、例えば、反応したまたは損傷した先体を有する細胞と接触した場合に、細胞蛍光、詳細には先体蛍光を誘導するフィコエリスリン−コンジュゲート・ラッカセイ・アグルチニン（PE−PNA）のような、先体の完全性を示すもう１の標識で標識し得る。ついで、PE−PNA蛍光を発する細胞の位置の光学同定および決定の工程を行い、これらの細胞にエネルギーを投与し得る。結果は、Y染色体を運搬し、非反応かつ非損傷の（すなわち、無傷の）先体を有する非−投与細胞のサブ集団である。例えば、Nagyら, Biol Reprod, 68: 1828-1835 (2003)を参照されたい。
【００７２】
細胞の低温延期
サブ集団のメンバー細胞にエネルギー源を投与したら、全体精子細胞集団（投与および非−投与細胞の両方）または集団の部分集団（非−投与細胞のみ）を、例えば受精手順において、後日使用するために冷却または凍結し得る。かかる場合においては、非−投与精子細胞は、低温延期剤（cryoextender）を添加して、冷却および凍結の結果としての生存能力または解凍後の運動性に対する影響を最小限にとどめるという恩恵を受け得る。
【００７３】
一般的に、低温延期剤は、タンパク質源、低温保護剤、および運動インヒビターを含み得る。含まれる場合には、タンパク質源を添加して細胞にサポートを提供し得る。タンパク質源は、非−投与精子細胞の生存能力に干渉せず、運動インヒビターと和合性であるいずれのタンパク質源ともし得る。普通のタンパク質源の例としては、ミルク（加熱ホモジナイズミルクおよびスキムミルクを含む）、ミルク抽出物、卵黄、卵黄抽出物、ダイズタンパク質およびダイズタンパク質抽出物が含まれる。かかるタンパク質は、約10%(v/v)ないし約30%(v/v)、好ましくは約10%(v/v)ないし約20%(v/v)、および、より好ましくは約20%(v/v)の濃度で見出し得る。
【００７４】
好ましくは低温保護剤を低温延期剤に含めて、低温ショックを軽減または予防し、あるいは、非−投与精子細胞の生殖能力を維持する。膨大な数の低温保護剤が当該技術分野において知られている。所与の延期剤と使用するのに好適な低温保護剤の選択は変化し得、凍結すべき精子を得た種に依存する。好適な低温保護剤の例には、例えば、グリセリン、ジメチルスルフォキシド、エチレングリコール、プロピレングリコール、トレハロース、Triladyl（登録商標）、およびそれらの組合せが含まれる。含まれる場合は、一般的には、これらの低温保護剤は、約1%(v/v)ないし約15%(v/v)、好ましくは約5%(v/v)ないし約10%(v/v)、より好ましくは約7%(v/v)、および最も好ましくは約6%(v/v)の量で低温延期剤中に存在する。
【００７５】
また、低温延期剤は、細胞試料収集に関して前記に論じた運動インヒビターを含み得る。運動インヒビター（または複数の運動インヒビター）は、それと一致する低温延期剤に添加し得る。
【００７６】
１の特別な形態において、低温延期剤は、運動インヒビター、水、Triladyl（登録商標）、卵黄およびピルビン酸を含む。いまだもう１の形態において、低温延期剤は、水中の0.097モル/LのNaHCO3、0.173モル/LのKHCO3、 0.090モル/LのC6H8O7・H2O、および水75mL当たり25gのTriladyl（登録商標）、25gの卵黄、および10mMのピルビン酸を含む。
【００７７】
もう１の特別な形態において、低温延期剤は、運動インヒビター、水、Triladyl（登録商標）および卵黄を含む。いまだもう１の形態において、低温延期剤は、水中の0.097モル/LのNaHCO3、0.173モル/LのKHCO3、0.090モル/LのC6H8O7・H2O、および水75mL当たり25gのTriladyl（登録商標）および25gの卵黄を含む。
【００７８】
所望により、低温延期剤は、抗生物質、または細胞試料収集に関して前記に論じたような細胞内および／または細胞外の酸化／還元反応を調節する組成物も含み得る。これらの各添加剤は、それと一致する低温延期剤に添加し得る。
【００７９】
全体精子集団の低温保存（すなわち、投与した分散液の低温保存）は、２のサブ集団（それらの各サブ集団は互いに実質的に異なる）を有する凍結分散液の形成を生じる。しかしながら、各サブ集団は、実質的に均一な細胞からなる。すなわち、各サブ集団は、単一のサブ集団の個々の細胞の各々が同一のサブ集団中の他の各細胞に共通する特徴を有する複数の細胞からなる。好ましい形態において、分散液は、前記した方法に従って、共通の特徴（または複数の共通の特徴）が存在するかまたは存在しないかに基づいて、分散液を精製することによって低温保存の前にさらに富化する。
【００８０】
したがって、例えば、本発明の方法を用いて、凍結精子分散液を形成することができ、該分散液は細胞の投与したサブ集団を含み、ここに投与したサブ集団の全ての細胞はX染色体を運搬している細胞であり、および細胞の非−投与サブ集団を含み、ここに非−投与サブ集団の全ての細胞はY染色体を運搬している細胞である。本発明のこの形態により、一定用量のエネルギーを受けていない細胞（すなわち、非−投与のY染色体を運搬している細胞）は、少なくとも約85%のY染色体を運搬している精子細胞；好ましくは少なくとも約90%のY染色体を運搬している精子細胞；より好ましくは少なくとも約95%のY染色体を運搬している精子細胞；なおより好ましくは少なくとも約97%のY染色体を運搬している精子細胞；および、最も好ましくは少なくとも約99%のY染色体を運搬している精子細胞を含むであろう。
【００８１】
あるいは、本発明の方法を用いて、凍結精子分散液を形成することができ、該分散液は細胞の投与したサブ集団および細胞の非−投与サブ集団を含み、ここに投与したサブ集団の全ての細胞はY染色体を運搬している細胞であって、ここに非−投与サブ集団の全ての細胞はX染色体を運搬している細胞である。本発明のこの形態により、非−投与X染色体を運搬している細胞は、少なくとも約85%のX染色体を運搬している精子細胞；好ましくは少なくとも約90%のX染色体を運搬している精子細胞；より好ましくは少なくとも約95%のX染色体を運搬している精子細胞；なおより好ましくは少なくとも約97%のX染色体を運搬している精子細胞；および、最も好ましくは少なくとも約99%のX染色体を運搬している精子細胞を含むであろう。
【００８２】
受精
本発明は、一般的に、前記した細胞分散液中の精子細胞のサブ集団の生存能力を選択的に低下する新規な方法を用いる、卵または雌性哺乳動物を受精する新規な方法も提供する。
【００８３】
標識した細胞の分散液の投与を行えば、投与した分散液（投与および非−投与細胞の両方を含む）を用いて、雌性哺乳動物を受精し得る。受精は、当業者によく知られている多くの方法のいずれかに従って行い得る。これらの方法には、例えば、マイクロインジェクション、人工授精、および当業者によく知られている他の方法が含まれる。例えば、投与および非−投与細胞の両方を含む投与した分散液、非−投与細胞のみ含む精製した分散液、またはいずれかの誘導物を用いて、例えば人工授精によるように、雌性哺乳動物に注入し得る。
【００８４】
あるいは、標識細胞の分散液の投与を行えば、該分散液を用いて卵を受精し、およびより詳細にはイン・ビトロ(in vitro)で卵を受精し得る。その後、受精卵を、例えば胚移植のような当業者によく知られている多くの手段のいずれかによって雌性哺乳動物の子宮に導入し得る。例えば、投与した分散液、精製した分散液、またはいずれかの誘導物を用いて、卵をイン・ビトロで受精し得る。つづいて、該受精卵は、雌性哺乳動物の子宮に導入し得る。
【００８５】
前記した分散液のいずれかを用いた雌性哺乳動物またはイン・ビトロの卵の受精は、例えば分散液の投与が完了した後の約７日以内に、好ましくは約5日以内に、より好ましくは約3日以内に、なおより好ましくは約2日以内に、および特別な形態においては約1日以内のような、分散液の投与が完了した後直ちに行い得る。かかる例においては、一般的に、分散液は、雌性哺乳動物またはイン・ビトロで卵を受精する前に（すなわち、分散液が新鮮であるかまたは新鮮な精子細胞を含む）低温保存しなくてもよく；その代わりに、それは、運動インヒビター中で維持し得、および／または、約2℃ないし約7℃、より好ましくは約3℃ないし約5℃、および最も好ましくは約4℃の温度で冷蔵し得る。あるいは、分散液は、低温保存し、ついで、雌性哺乳動物またはイン・ビトロで卵を受精する前に解凍し得る（すなわち、分散液は凍結／解凍するか、または分散液は凍結／解凍した精子細胞を含む）。典型的に、かかる例においては、低温保存分散液は、雌性動物またはイン・ビトロで卵を受精する直前に解凍するであろう。
【００８６】
本発明を詳細に記載してきたが、添付する特許請求の範囲に規定した発明の範囲から逸脱することなく修飾および変形が可能であることは明らかであろう。
【国際調査報告】
2008507287.tif 000002
2008507287.tif 000003
2008507287.tif 000004