(57)【要約】本発明は、Ａ’がＩｇＥ結合部分を表し、且つＢ’が抑制性受容体結合部分を表す化学式Ａ’−Ｂ’から成るＩｇＥ再標的化機能変更分子（ＥＲＦＡＭ）構成体、あるいは、Ａ’がＩｇＥ結合部分を表し、Ｘがリンカー部分を表し、且つＢ’が抑制性受容体結合部分を表す化学式Ａ’−Ｘ−Ｂ’の構成体を提供する。また、例えばアレルギー等ＩｇＥ関連疾患の治療の際に、これらを使用する方法を提供する。本発明は、ＩｇＥ抗体に結合し、ＩｇＥ抗体をアレルギーのアレルゲン依存的抑制剤に転換する分子に関係する。当該分子は、例えばアレルギーおよび他のＩｇＥ関連疾患の処置に、有用である。
2008513351.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ａ’−Ｂ’を含むＩｇＥ再標的化機能変更分子（ＥＲＦＡＭ）を含む組成物であって、ここで：
Ａ’はＩｇＥに結合する部分を表し；そして
Ｂ’は抑制性受容体に結合する部分を表し、
Ａ’およびＢ’は作動可能に連結される、組成物。
【請求項２】
Ａ’およびＢ’に作動可能に連結されるリンカー部分をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物は、前記ＩｇＥ、前記ＥＲＦＡＭおよび前記抑制性受容体を含む多量体複合体中に存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記Ｂ’は、ＩｇＧ４抗体のＦｃ部分によって結合される抗原に結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
Ｂ’はＩｇＧ４アイソタイプ抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が細胞結合性ＩｇＥに架橋しない、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記リンカーはポリエチレングリコールリンカーを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＥＲＦＡＭは、前記リンカーを含まない該ＥＲＦＡＭと比較して、延長した循環半減期または減少した免疫原性を有する、請求項２に記載の組成物。
【請求項９】
Ｂ’は、免疫受容体チロシン抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）含有受容体およびアポトーシス誘導受容体からなる群から選択される受容体に結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記（ＩＴＩＭ）含有受容体は、好塩基球、マスト細胞、Ｂ細胞、血小板および抗原提示細胞からなる群より選択される細胞の表面上に存在する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記（ＩＴＩＭ）含有受容体は、ＣＤ３１またはＣＤ３２Ｂである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
Ａ’またはＢ’が、ＩｇＥへの結合の際に直鎖状になる環状ペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
薬学的キャリアをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の組成物を含む、キット。
【請求項１５】
式Ａ’−Ｂ’を含む組成物であって、ここで：
Ａ’は、抗ＩｇＥ抗体またはその抗ＩｇＥ結合フラグメントを含み；そして
Ｂ’は、（ＩＴＩＭ）含有受容体に結合する抗体を含み、
Ａ’およびＢ’は、作動可能に連結されている、組成物。
【請求項１６】
Ａ’およびＢ’に作動可能に連結されたリンカー部分をさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記（ＩＴＩＭ）含有受容体は、ＣＤ３１またはＣＤ３２Ｂである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
アレルギーに罹患している被験体を処置する方法であって、該方法は、該被験体に、治療的有効用量の式Ａ’−Ｂ’を含むＥＲＦＡＭ分子を投与する工程を包含し、ここで：
Ａ’はＩｇＥに結合する部分を含み；そして
Ｂ’は抑制性受容体に結合する部分を含み、
Ａ’およびＢ’は作動可能に連結されており、
それによって該アレルギーに罹患している該被験体を処置する、方法。
【請求項１９】
Ａ’は抗ＩｇＥ抗体またはその抗ＩｇＥ結合フラグメントを含み、かつＢ’は（ＩＴＩＭ）含有受容体に結合する抗体を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＥＲＦＡＭ分子は、アレルゲン特異的ＩｇＧ４抗体を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
Ａ’およびＢ’に作動可能に連結されたリンカー部分をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
被験体におけるアレルギー反応を予防または軽減する方法であって、該方法は、該被験体のアレルゲンへの曝露の前または曝露と同時に、該被験体に、治療的有効用量の式Ａ’−Ｂ’を含むＥＲＦＡＭ分子を含むＥＲＦＡＭを投与する工程を包含し、ここで：
Ａ’はＩｇＥに結合する部分を含み；そして
Ｂ’は抑制性受容体に結合する部分を含み、
Ａ’およびＢ’は作動可能に連結され、
それによって、該被験体におけるアレルギー反応を予防または軽減する、方法。
【請求項２３】
Ａ’は抗ＩｇＥ抗体またはその抗ＩｇＥ結合フラグメントを含み、かつＢ’は（ＩＴＩＭ）含有受容体に結合する抗体を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
Ａ’およびＢ’に作動可能に連結されたリンカー部分をさらに含む、請求項２２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ＩｇＥ抗体に結合し、ＩｇＥ抗体をアレルギーのアレルゲン依存的抑制剤に転換する分子に関係する。当該分子は、例えばアレルギーおよび他のＩｇＥ関連疾患の処置に、有用である。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
全世界で５００万人以上の人々がアレルギーを患い、アレルギーの罹患率は急速に増加しており、主に小児および若年者に影響を及ぼしている。アレルギーに起因する年間医療費は、英国では£１０億を超え、また米国では＄１００億を超えているが、社会全体でのアレルギー医療費ははるかにこれらを上回ることは明らかである。
【０００３】
アレルギーは、ある種の抗原（アレルゲン）に対して特異的なＩｇＥ型抗体の産生によって特徴づけられ、これが免疫反応を引き起こす。これらアレルゲンが一旦体内に入ると、特異的ＩｇＥの存在が引き金となってアレルギー反応が生じる。ＩｇＥの生物学ならびにアレルギー疾患におけるその役割は、総説されている。例えば非特許文献１を参照のこと。ＩｇＥは、各アレルゲンとアレルギー−エフェクター細胞の活性化装置によって代表されるトリガー機構との間の連結を構築するため、アレルゲンが体内に進入したとき、ＩｇＥはアレルギー反応の引き金となる。ＩｇＥは、その二重機能性結合特性によってこのような連結を構築する：一つの端に２つのアレルゲン特異的結合部位（Ｆ抗原結合部位‐Ｆａｂ）を有し、もう一方の端では、その定常結合部位（Ｆｃ）で、高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）と結合する。
【０００４】
ＦｃεＲＩ分子は、それ自身が二重機能性分子である。その細胞外領域はＩｇＥと結合し、細胞内領域はシグナルカスケード活性化の引き金を引くことができる活性化部位を含有する。低親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩＩ／ＣＤ３２）もアレルギーに関係し得る。
【０００５】
他の研究は、アレルゲン特異的免疫療法（ＳＩＴ）の過程におけるＩｇＧ抗体の誘発ならびにその役割を扱っている。ＳＩＴは病原性ＩｇＥの増加につながるが、ＩｇＧおよびＩｇＧ４の量のさらなる上昇も導くことが示された。例えば、非特許文献２におけるＤＫ  Ｌｅｄｆｏｒｄによる総説を参照のこと。これは資格インビボ皮膚プリック試験力価測定法を用いてさらに文書化されており、これは、ＳＩＴ後に誘発されるアレルゲン特異的ＩｇＧの量が、皮膚反応における減少に相関することが例証されている。例えば、非特許文献３を参照のこと。実際に、アレルゲン特異的ＩｇＥ量は依然高いが、特異的ＩｇＧ４が増加しているときに、アレルゲン疾患に対する臨床反応性は、応急的免疫治療開始から数週間内に減少する。例えば、非特許文献４を参照のこと。
【非特許文献１】Ｇｏｕｌｄら、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００３年、２１：ｐ．５７９−６２８
【非特許文献２】ＲＦ  ＬｏｃｋｌｅｙおよびＳＣ  Ｂｕｋａｎｔｚ編、「ＡＬＬＥＲＧＥＮＳ  ＡＮＤ  ＡＬＬＥＲＧＥＮ  ＩＭＭＵＮＯＴＨＥＲＡＰＹ」、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  １９９９年，ｐ．３５９−３７１
【非特許文献３】Ｗｉｔｔｅｍａｎら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９６年、１０９：ｐ．３９６−３７５
【非特許文献４】Ｌａｃｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９７年、９９：ｐ．５３０−５３８
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明の範囲に含まれるのは、化学式Ａ’−Ｂ’を有する少なくとも１つのＩｇＥ再標的化機能変更分子（ＥＲＦＡＭ；ＩｇＥ−Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ−Ａｌｔｅｒｉｎｇ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）構成体であり、ここでＡ’はＩｇＥに結合する部分を表し、Ｂ’は抑制性受容体に結合する部分を表す。一部の実施様態において、Ａ’およびＢ’は作動可能に連結されている。あるいは、このＥＲＦＡＭは式Ａ’−Ｘ−Ｂ’を有し、ここでＡ’はＩｇＥに結合する部分を表し、Ｘはリンカー部分を表し、Ｂ’は抑制性受容体に結合する部分を表し、ここでＡ’−Ｘ−Ｂ’は作動可能に連結されている。ＥＲＦＡＭ構成体は、少なくとも１つのアレルゲンに対するアレルギー反応を含む、ＩｇＥ関連疾患および障害を処置するのに有用である。本発明の一実施様態において、ＥＲＦＡＭは、ＩｇＥに結合し、このＩｇＥをアレルギー抑制物に変換する。様々な実施様態において、ＥＲＦＡＭは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、あるいは少なくとも３つ以上のエピトープを特異的に認識して結合する。これは、少なくとも単一特異性である、少なくとも二重特異性である、もしくは少なくとも多重特異性であるともいわれる。具体的な実施様態では、ＥＲＦＡＭ構成体のＡ’およびＢ’部分は、第１および第２の特異性を提供する。ＥＲＦＡＭが少なくとも二重特異性である関連する実施様態において、第１の特異性はＩｇＥに対するものであり、第２の特異性はＩｇＧ４抗体のＦｃ部分と機能的に等価である。関連する実施様態において、少なくとも二重特異性のＥＲＦＡＭ組成物は、ＩｇＧ４アイソタイプの抗ＩｇＥ抗体部分から成る第１部分を含有し、ここでこの組成物は、ＩｇＥを含む少なくとも１つのエピトープに結合するが、細胞結合性ＩｇＥとは架橋しない。
【０００７】
ＥＲＦＡＭが少なくとも二重特異性である別の実施様態において、第１の特異性はＩｇＥに対するものであり、第２の特異性は抑制性細胞表面受容体の結合に対するものである。具体的な別の二重特異性ＥＲＦＡＭ組成物は、免疫受容体チロシン抑制モチーフ（ＩＴＩＭ；ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｍｏｔｉｆ）含有抑制性受容体およびアポトーシス誘発受容体から成る群から選択される抑制性細胞表面受容体を認識して結合する構造を含有する。
【０００８】
具体的な実施様態において、本発明は、アレルゲン特異的ＩｇＧ４抗体を含有するＥＲＦＡＭ分子を包含する。種々の実施様態では、少なくとも１つのＡ’部分あるいは少なくとも１つのＢ’部分は、ＩｇＥに結合したときにのみ自発的に直鎖状になる環状ペプチドである。この実施様態では、この環状ペプチドは、特異的にＩｇＥ分子に結合して直鎖状になる。さらに具体的な実施様態では、１つ以上のＩｇＥ特異的環状ペプチドを含有するＥＲＦＡＭ分子は、ＩｇＥとの結合後にこの環状ペプチドが直鎖状になった後、ＦｃγＲあるいは相応する抑制性受容体に結合する。
【０００９】
少なくとも１つのＡ’部分を少なくとも１つのＢ’部分に操作的に連結する様々なリンカーＸが、化学式Ａ’−Ｘ−Ｂ’によって包含される。具体的な実施様態において、リンカーＸは、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）リンカーから成る。他のリンカーＸ組成物は、２つ以上のポリペプチド部分を作動可能に連結することのできる、１つ以上のアミノ酸、ポリペプチド、あるいは当該分野において周知の任意の他の化学的部分を含有する。好ましい実施様態において、リンカーＸ組成物は非免疫原性である。ＰＥＧリンカーＸを含有するＥＲＦＡＭ組成物において、ＥＲＦＡＭは、体内における延長された循環半減期を有する。関連する実施様態において、ＰＥＧリンカーＸを含有するＥＲＦＡＭは、減少した免疫抗原性を有する。
【００１０】
特定の実施様態において、ＥＲＦＡＭ組成物は、薬学的キャリア内にある。好ましい実施様態では、治療的有効量のＥＲＦＡＭが提供される。また、容器内に少なくとも１つのＥＲＦＡＭ組成物を含むキットが提供される。
【００１１】
本発明はまた、ＥＲＦＡＭ組成物を使用する方法を提供する。一実施様態では、この方法は、ＩｇＥ関連過敏性反応の影響を制御するために、治療的有効量のＥＲＦＡＭ分子を、これを必要とする患者に投与する工程を包含する。具体的な実施様態において、この使用方法は、アレルギーを処置するためのものである。好ましい実施様態において、投与されるＥＲＦＡＭ分子は、アレルゲン特異的ＩｇＧ４抗体部分を含む。
【００１２】
最後に、ＥＲＦＡＭ分子を産生する少なくとも１つの方法が提供され、ここでこの方法は、ＥＲＦＡＭ分子を産生する工程、および不純物からＥＲＦＡＭ分子を精製する工程を包含する。
【００１３】
他に定義されない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が普通に理解するものと同じ意味を有する。本発明の実施または試行において、この明細書で記載されるものと類似または等価な方法および材料を使用することが可能であるが、適した方法および材料が、以下に記載される。この明細書で言及される全ての出版物、特許出願、特許、および他の参照物は、その全体が参考として援用される。抵触する場合、定義を含む本明細書が統制する。加えて、材料、方法および実施例は、説明のみのためのものであって制限することを意図していない。
【００１４】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明と特許請求の範囲から明白となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（詳細な説明）
（本発明のＥＲＦＡＭ構成体）
ＩｇＥ抗体をアレルゲン特異的アレルギー抑制物に転換する構成体が提供される。数種類のそのような抑制物が、本明細書中において説明され、ＩｇＥ再標的化機能変更分子（ＥＲＦＡＭ；ＩｇＥ−Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ−Ａｌｔｅｒｉｎｇ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）と呼ばれる。
【００１６】
ＥＲＦＡＭ結合の図解を、図１にて提供する。ＥＲＦＡＭは、ＩｇＥのＦｃ領域に結合する。ＥＲＦＡＭ結合の結果、他の分子は、ＩｇＥのＦｃ領域との相互作用が遮蔽され、その結果、ＩｇＥがＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩならびにＦｃεＲＩＩ）に結合するのを妨げる。同時に、ＥＲＦＡＭは、異なる機能を有する受容体に特異的な第２の結合部位を提供する。ＥＲＦＡＭがＩｇＥに結合する第１の結合、およびＥＲＦＡＭが異なる機能を有する受容体に結合する第２の結合によって、ＩｇＥをアレルギー抑制性抗体に変換する。
【００１７】
ＩｇＥは一般にアレルゲン特異的であるため、循環ＩｇＥおよびマスト細胞結合ＩｇＥとの結合によって、他の抗原に対する反応を阻害することなく、アレルゲンに対するＩｇＥ仲介免疫反応の抑制が可能となる。
【００１８】
加えて、ＥＲＦＡＭのＩｇＥへの結合は、対象とするどのアレルゲンに対しても特異的ではない。ＥＲＦＡＭは任意のＩｇＥと結合することができる。よって、免疫寛容性を誘導するために使用される、アレルゲン特異的免疫治療ならびに他の周知されている抗アレルギー治療とは異なり、ＥＲＦＡＭは、幅広い範囲の任意のアレルゲン（このアレルゲンに対して患者がアレルゲン特異的ＩｇＥ仲介アレルギー反応を有する）に対するアネルギーを誘導するための有効な治療である。
【００１９】
好ましくは、ＥＲＦＡＭは、アレルゲンもまた投与される場合にのみ活性であるアレルゲン依存的抑制物を生成を誘導する。これによって、アレルギー治療の有効な調節が可能となり、副作用が避けられる。
【００２０】
ＳＩＴは、抑制性ＩｇＧ抗体の産生の誘導を目標とする。よってＥＲＦＡＭの投与により、アレルギー反応の引き金となる既に存在する病原性ＩｇＥを抗アレルギー性ＩｇＧ様アレルギー抑制物に直接変質させることによって、例えばＳＩＴを迂回する。ＥＲＦＡＭはアレルゲン投与に関係せず、ＦｃεＲＩを架橋しないため、亢アレルギーの危険性はない。しかし、ＥＲＦＡＭそれ自体が免疫治療的であるわけではない。
【００２１】
一部の実施様態において、ＥＲＦＡＭ分子は、ＩｇＥに結合したとき、ＩｇＥに、ＩｇＧ４のようなアレルギー抑制性抗体の機能特性を付与する。一実施様態において、この分子は、ＩｇＥに結合するＩｇＧ４モノクローナル抗体である。
【００２２】
一部の実施様態において、ＥＲＦＡＭは、ＩｇＥ結合部位と、ＩｇＧ４のような抑制性受容体に結合する受容体に対する結合部位を含有する多重機能性非アナフィラキシー分子である。一部の実施様態において、このＥＲＦＡＭはまた、「リンカー」部分を含有する。このリンカー部分は、例えばＥＲＦＡＭ血清半減期を長くするのに有用である。あるいはこのＥＲＦＡＭ分子は、化学式Ａ’−Ｂ’によって表され、ここでＡ’は第１の機能要素（例えば、ＩｇＥ結合部位）を、Ｂ’は第２の機能要素（例えば、少なくとも１つの抑制性受容体に対する結合部位）を表す。あるいは、ＥＲＦＡＭは、化学式Ａ’−Ｘ−Ｂ’で表され、ここでＡ’は第１の機能要素（例えばＩｇＥ結合部位）を、Ｘはリンカー部分を、そしてＢ’は第２の機能要素（例えば、少なくとも１つの抑制性受容体に対する結合部位）を表す。
【００２３】
他の実施様態において、ＥＲＦＡＭ分子は、ＩｇＥ結合部位（第１機能）およびＩｇＧ４抗体のＦｃ部分と同様の機能的結合特性を有する部位（第２機能）を含有する、より小さな二重機能性分子である。これら２つの部位は、直接的に連結されるか、または所望する薬理学的特性および免疫学的特性をその分子に供与する第３部分を介して間接的に連結される。二重機能性分子は、例えばＰＣＴ公報ＷＯ  ９６／４０７８８、ＷＯ  ９８／０９６３８、ＷＯ  ０２／０８８３１２、およびＷＯ  ０２／１０２３２０に開示されている。
【００２４】
このように、好ましい実施様態において、ＥＲＦＡＭ分子は以下を有するような性質の二重機能性分子である：
（１）これらの分子の第１結合部位、即ちＩｇＥ結合部位は、好ましくは（しかし排他的ではない）ＩｇＧ４アイソタイプの抗ＩｇＥ抗体、もしくはこれらのフラグメント、またはＩｇＥに結合するペプチドもしくはペプチド模倣分子もしくはオリゴヌクレオチドである；
（２）第２結合部位、即ちＩｇＧ４結合部位またはその等価物。ここでこの部位は、ＩｇＧ４抗体のＦｃ部分と同様の機能的結合特性を有する。種々の実施様態において、これはＩｇＧ４抗体もしくはそのＦｃフラグメント、あるいは抗ＦｃγＲ抗体、もしくはペプチドあるいはペプチド模倣分子あるいはオリゴヌクレオチドアパトマーである。これらは全て、ＩｇＧ４のその受容体への結合と同様の効果を有する。適用可能な場合、第２部位を作り上げる受容体部分は、好ましくは、免疫受容体チロシン抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）含有抑制性受容体標的指向分子である。一般に、ＩＴＩＭは、抑制性受容体の細胞質テイル内の共通配列｛ＩＬＶ｝−ｘ−ｘ−Ｙ−ｘ−｛ＬＶ｝（配列番号３）を含有する。
（３）必要に応じて、第１結合部位と第２結合部位とを作動可能に連結するリンカー部分。このリンカーは、ＥＲＦＡＭ血清半減期の上昇、分解低下、および立体化学最適化を含む、一つ以上の機能を有し得る。この仲介部分は、上記部位に結合して所望する薬理学的および免疫学的特性をこの分子に供与し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分または機能的に等価な分子である。
【００２５】
同等の実施様態は、同様の効果を得るためにアレルギー患者に投与されるアレルゲン特異的ＩｇＧ４抗体によって表される。ＥＲＦＡＭ分子の個々の構成成分は、以下により詳細に記載される。
【００２６】
（ＥＲＦＡＭのＩｇＥ結合部分）
一部の実施様態では、ＥＲＦＡＭは、当該分野において公知のＩｇＥ結合ポリペプチドの配列を含有する。
【００２７】
ＥＲＦＡＭペプチド、抗体、アプタマー、他の化学物、ならびにこれらの等価物の公知のＩｇＥ結合部位部分としては、以下が挙げられる：
（ａ）抗体：Ｅ２５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ、特許取得）、ＴＮＸ−９０１（Ｔａｎｏｘ、ＷＯ  ９２／１７２０７）、または本明細書中に記載される他のＩｇＥ結合抗体が含まれるが、これらに限定されない；
（ｂ）ペプチド：ＷＯ  ９８／０４７１８（ＭＥ  Ｄｉｇａｎ）およびＷＯ  ９９／０５２７１（Ｇｏｕｌｄら）に記載されているペプチド、ならびに、天然のものであれ、合成したものであれ、他の任意のＩｇＥ結合ペプチド機能性配列が含まれるが、これらに限定されない。これらは、Ｌ−アミノ酸あるいはＤ−アミノ酸を含有し、またグリコシル化、ならびにリン酸化、ミリストイル化のような翻訳後修飾を含み得る；
（ｃ）アプタマー：Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５７：２２１−２３０，１９９６に記載されているヒトＩｇＥに高い親和性かつ高い特異性で結合するオリゴヌクレオチド、即ち３５−ヌクレオチド切断型ＩＧＥＬ  １．２（ｇｇｇａｇｇａｃｇａｕｇｃｇｇ；配列番号１）（Ｋｄ＝３０ｎＭ）によって代表される２’−ＮＨ２  ＲＮＡグループＡリガンド、あるいは３７−ヌクレオチド切断型ＤＩ  ７．４（ｇｇｇｇｃａｃｇｔｔｔａｔｃｃｇｔｃｃｃｔｃｃｔａｇｔｇｇｃｇｔｇｃｃｃｃ；配列番号２）（Ｋｄ＝１０ｎＭ）によって代表されるｓｓＤＮＡグループリガンドが含まれるが、これらに限定されない。これらは、ヒトＩｇＥのＦｃ１εＲＩとの相互作用を競合的に阻害して、ＩｇＥ特異的抗原あるいは抗ＩｇＥ抗体が引き起こす、ＩｇＥが仲介する細胞からのセロトニン放出を遮断する；
（ｄ）ペプチド模倣体：例えばテトラサイクリン化合物（例えば米国特許第５，９６５，６０５号を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
これらの公知のＩｇＥ結合部分を本発明に使用すること、または同様もしくは等価な機能を有する新規の部分を当業者が生成することが企図される。本明細書中で挙げられているこれらまたは他の刊行物は、本発明の一部であることが企図される。本明細書中で引用する全ての刊行物は、本明細書中に参考としてその全体が援用される。
【００２９】
抗ＩｇＥ非刺激性抗体を報告する刊行物には、ＰＣＴ公報ＷＯ  ９２／１７２０７、ＷＯ  ９２／２１０３１、ＷＯ  ９９／３８５３１、ＷＯ  ００／１６８０４、およびＷＯ  ０２／０７９２５７、さらに米国特許第６，３２９，５０９号などが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、例えばＦｃεＲＩα鎖フラグメントを介して、ＩｇＥと結合する可溶性ＦｃεＲＩ受容体またはその誘導体については、米国特許第６，０９０，３８４号、およびＰＣＴ公報ＷＯ  ９８／０４７１８ならびにＷＯ  ９９／０５２７１が挙げられる。特に、ＷＯ  ９８／０４７１８（ＭＥ  Ｄｉｇａｎ）は、ヒト血清アルブミンに融合したＩｇＥと結合し、循環内での存続期間が長くて副作用の危険性が低い、ＦｃεＲＩα鎖フラグメントを記載している。
【００３０】
ＩｇＥがその受容体に結合するのを阻害するペプチドあるいは他の化合物を報告する他の刊行物には、テトラサイクリン系化合物による、ＩｇＥのその受容体への結合阻害を報告するＣｈｅｎｇら、およびＨｅｓｋａに対する米国特許第５，９６５，６０５号；Ｈｅｌｍら、１９９７  Ａｌｌｅｒｇｙ  ５２：１１５５−１１６９；ＭｃＤｏｎｎｅｌｌら、１９９６  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ３：４１９−４２５；Ｉｗａｓａｋｉら、２００２  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ．２９３：５４２−５４８；ならびにＷｉｅｇａｎｄら、１９９６  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５７：２２１−２３０が含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】
ＩｇＥに特異的に結合する、さらなる当該分野において公知のアプタマーおよび他の化学部分が、ＥＲＦＡＭ分子の生成において使用され得る。あるいは、伝統的手法を用いて新規のＩｇＥ結合構造が発見される。この伝統的手法には、モノクローナル抗体、ファージディスプレイ、および／またはアプタマー技法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
（ＥＲＦＡＭのリンカー部分）
ＥＲＦＡＭの第１機能部分および第２機能部分は、共有結合によって互い直接結合される。あるいは、ＥＲＦＡＭの第１機能部分と第２機能部分は、リンカー（例えばグリコール、ポリペプチド配列、樹脂、炭水化物、ポリマー、あるいは以下に記載するような糖類）を介して間接的に結合する。リンカーが存在してもしなくとも、この結合複合体は、非免疫原性であることが好ましい。
【００３３】
ポリエチレングリコール（または他の構造体および化学部分）のようなリンカー分子は、これが存在する場合、「骨組み」を提供し、この骨組み上で、ＩｇＥ結合部位を作動可能に抑制性受容体の結合部分と連結して最終的なＥＲＦＡＭ分子を作製することができる。リンカー部分の企図される機能は、ＥＲＦＡＭ分子の血清半減期を上昇させること、分解を減少させること、分子サイズを大きくすること、および／またはＥＲＦＡＭ部分間の立体化学的関係を改変することである。例えば、ＥＲＦＡＭの分子サイズを大きくすることによって、リンカーは、ＥＲＦＡＭの急速な腎排出を抑制し、循環半減期を伸ばし、または他の有利な薬物動態学的特性を供与する。
【００３４】
薬剤の薬力学的特性を変えるためのペグ（ＰＥＧ）化法は、当業者に公知であり、本発明の一部であることが企図される。ＰＥＧポリマーは、分枝または非分枝であり、これには単一のＰＥＧサブユニットあるいは複数のＰＥＧサブユニットから構成されるＰＥＧポリマーが含まれる。あるいは、リンカーは、可動ヒンジ部のようなポリペプチド配列に、作動可能にフレーム内連結される。他のリンカー部分ならびにこれを作製する方法は、当業者に公知であり、一般的には、例えば化学的リンカー、ポリマー、ペプチド、ポリペプチド、糖、硬質ビーズ、合成分解性部分、炭水化物、およびグリセロールが挙げられ、より具体的には、ビオチン、ストレプトアビジン、サイトカイン、抗体ヒンジ領域、フィコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）、ポリエチレンジグリコール二酸、ＰＥＧモノアミン、ＭＰＥＧモノアミン、ＭＰＥＧヒドラジド、ＭＰＥＧイミダゾール、メトキシポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールとメトキシポリプロピレングリコールとのコポリマー、デキストラン、およびポリ乳酸−ポリグリコール酸が含まれる場合がある。例えば、米国特許第６，３０９，６３３号、同第６，５５２，１６７号、同第６，５４１，６１０号、ならびに同第６，５９２，８４７号を参照のこと。また、ポリペプチドの低分子量化合物（例えば、アミノレシチン、脂肪酸、ビタミンＢ１２、ならびにグリコシド）への結合はまた、当該分野において公知である。例えば、Ｒ．Ｉｇａｒｉｓｈｉら、Ｐｒｏｃｅｅｄ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１７，３６６，（１９９０）；Ｔ．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、Ｉｂｉｄ  １９，１０４，（１９９２）；Ｇ．Ｊ．Ｒｕｓｓｅｌ−Ｊｏｎｅｓ，Ｉｂｉｄ，１９，１０２，（１９９２）；Ｍ  Ｂａｕｄｙｓら、Ｉｂｉｄ，１９，２１０，（１９９２）を参照のこと。リンカー分子は、１価、２価、または多価である。
【００３５】
リンカーは、さらにスペーサーとして機能し得る。スペーサーは、任意の適切な所望する長さのものであり、この長さは、約１０〜２０ｎｍ、約２０〜４０ｎｍ、約４０〜６０ｎｍ、約６０〜１００ｎｍ、約５００ｎｍ、あるいは最大約１μｍあるいはそれ以上のような約１００ｎｍ以上を含む。
【００３６】
（ＥＲＦＡＭの抑制性受容体結合部分）
実施様態において、本発明のＥＲＦＡＭ分子は、抑制性受容体と相互作用する抑制性受容体結合分子を含有する。抑制性受容体結合分子には、抗体Ｆｃ領域のペプチドならびにフラグメントが含まれる。ＥＲＦＡＭの一部の実施様態では、ＩｇＧ４抗体またはそのＦｃγフラグメントが使用される。あるいは、ＦｃγＲへの結合は、ＦｃγＲに対する抗体（例えば、ＦｃγＲＩＩｂに対する抗体）またはそのフラグメント、等価な結合特性を有するペプチドまたはアプタマーによって確保される。ＦｃγＲ標的化治療は、当該分野において公知である。ＦｃγＲならびにＦｃγＲ標的化分子（抗体、二重機能性抗体、ペプチド）は、例えば、米国特許第４，９５４，６１７号（ＭＷ  Ｆａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ヒト単核食細胞上のＩｇＧのＦｃ受容体に対するモノクローナル抗体を開示している）；米国特許第６，３６５，１６１号（Ｙａｓｈｗａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．、抗Ｆｃ受容体結合剤を含有する治療化合物を開示している）；ならびにＰＣＴ公報ＷＯ  ９６／０８５１２（ＰＭ  Ｈｏｇａｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｆｃ結合能を持つポリペプチドを開示している）において、開示されている。
【００３７】
好ましい一実施様態において、上記ＥＲＦＡＭは、免疫受容体チロシン抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する抑制性受容体に結合する。このＩＴＩＭ含有抑制性受容体は、任意の免疫関連細胞の表面に存在する。免疫関連細胞の例には、好塩基球、マスト細胞、Ｂ細胞、血小板ならびに抗原提示細胞（ＡＰＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。ＡＰＣには、樹上細胞、マクロファージ、および単球が挙げられる。好ましくは、このＩＴＩＭ含有受容体は、好塩基球あるいはマスト細胞の表面上に存在する。典型的なＩＴＩＭ含有抑制性受容体は、ＣＤ３１であり、これはＰＥＣＡＭ−１（血小板／内皮細胞接着分子１）とも呼ばれていて、好塩基球上に存在する（Ｆｕｒｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｌｅｒｇｙ，１９９４；４９：８６１−５を参照のこと）。少なくとも部分的にはコラーゲン性糖タンパク質ＶＩ受容体からのシグナル伝達が阻害されることに起因して、ＣＤ３１の架橋によって血小板活性化が抑制されることが例証されている。（Ｎｅｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００１  ９７（８）：２３５１−７を参照のこと）。ＣＤ３１はまた、ＣＤ３１  ＩＴＩＭを介してＢリンパ球上の抗原受容体を阻害する（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００２；１００（１）：１８４−９３を参照のこと）。
【００３８】
別の典型的なＩＴＩＭ含有抑制性受容体は、ＣＤ３２Ｂ（ＦｃγＲＩＩｂしても公知）である。ＣＤ３２Ｂは、ＩｇＧのＦｃフラグメントに対する受容体であり、低親和性ＩＩｂである；（受託番号  ＮＰ＿００３９９２．２）。
【００３９】
他のＩＴＩＭ含有受容体は、当該分野において公知であり、これにはPCT公報ＷＯ  ９６／４０７８８（ＰＭ  Ｇｕｙｒｅ  ａｎｄ  Ｍ  Ｆａｎｇｅｒ）；ＷＯ  ９８／０９６３８（Ｋａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、ｇｐ４９Ｂ１とＦｃεＲＩ受容体との架橋を示す）；ＷＯ  ０２／０８８３１７（Ｓａｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＦｃγＲＩＩｂとＦｃεＲＩ受容体との架橋を示す）；ＷＯ  ０２／１０２３２０（Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＦｃγＲＩＩｂとＦｃεＲＩ受容体との架橋を示す）；ならびにＤａｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９５：５７７−５８５が挙げられるが、これらに限定されない。ＩＴＩＭ含有受容体は、ＩＴＩＭの有無に基づいて同定され得る。これらのモチーフは、当該分野において公知の方法によって同定され得る（Ｓｔａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ２００４，１６：４３５−４５６を参照のこと）。
【００４０】
好塩基球およびマスト細胞は、ＩＴＩＭ含有抑制性受容体を多数含有している。本発明は、別個に標的とする２つ以上のＥＲＦＡＭ分子の、患者への投与方法を提供する。ＥＲＦＡＭ分子は、連続的または同時に提供される。従って、複数のＥＲＦＡＭ間の相乗作用によって、より強力な抑制効果が達成される。
【００４１】
ある特定の患者集団では、ＩｇＧ４受容体、あるいはＥＲＦＡＭ第２機能部分が結合または標的とするＩＴＩＭ／抑制性受容体のみに結合するＥＲＦＡＭの影響を最小にすることが所望される。よって、ＥＲＦＡＭは、ＩｇＥに結合したときのみに自発的に直鎖状になる（「脱環状化」）環状ペプチドを含有し得る。このモデルでは、その次にのみ、ＥＲＦＡＭは続いてＦｃγＲ、あるいは相応する抑制性受容体に結合することができる。これは、非ＩｇＥ結合ＥＲＦＡＭによるＦｃγＲの「ブロッキング」を避ける。ＩｇＥとその高親和性受容体ＦｃεＲＩとの間の相互作用を阻害する合成環状ペプチドは、当該分野で公知である。例えば、ＭｃＤｏｎｎｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ３：４１９−４２５を参照のこと。同様の方法論を用いて、ＩｇＥに結合した時にのみ直鎖状になる環状ペプチドを作製することができる。一実施様態において、このペプチドは、末端システイン残基間のジスルフィド結合形成によって環状となる。これとは異なる実施様態において、この環状ペプチドは、Ｌ−アミノ酸ペプチドであり、そして／またはレトロ鏡像異性体Ｄ−アミノ酸ペプチドである。
【００４２】
（ＥＲＦＡＭのアポトーシス誘導受容体結合部分）
実施様態において、本発明のＥＲＦＡＭ分子は、アポトーシス誘導受容体と相互作用するアポトーシス誘導受容体結合分子を含有する。アポトーシス誘導受容体は当該分野において公知であり、これにはＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド受容体２、ＴＲＡＩＬ受容体２、ＴＮＦＲ１、Ｆａｓ、ＤＲ３、ならびにＡＩＲ／ＬＡＲＤが挙げられる。
［ビクターへ：この種のアポトーシス誘発受容体に関してあなたが知っている情報を追加してください］
（ＥＲＦＡＭの特性）
ＥＲＦＡＭ分子は、１つ以上の以下の特性を含有する。
【００４３】
・安全性：最初にアレルゲンを与えないので、アナフィラキシーの危険性が減少する。よって、一般に、投与のために病院環境は必要ではない。
【００４４】
・有効性：処置されるアレルギー患者は、一旦マスト細胞上に結合させたＥＲＦＡＭ修飾ＩｇＥ抗体（ＩｇＧ４様抗体）の量が、結合している非修飾ＩｇＥに対して「抑制」の比に到達すると、アナフィラキシー、喘息、鼻炎等の症状を伴わずに、自由に食物アレルゲンを食べることができるか、または環境的アレルゲンに身体を曝すことができる。実際に、ＥＲＦＡＭによってＩｇＥが「ＩｇＧ４様」抗体に転換されるため、血中ＩｇＥレベルは急速に減少する。
【００４５】
・ＥＲＦＡＭの効果はそのアレルゲンに限定される：標的とする抗体がＩｇＥのみであるため、他の抗原に対する抗体免疫反応による干渉が存在しない。しかし、ＥＲＦＡＭがＩｇＧ４受容体のみへ結合する影響が著しい場合もある。よって、一実施様態において、ＥＲＦＡＭは、ＩｇＥに結合し、続いてＦｃγＲに結合することが可能となった場合にのみ自発的に「脱環状化」する、環状ペプチドである。これによって、ＦｃγＲが非ＩｇＥ結合ＥＲＦＡＭによって「ブロック」されることがなくなる。
【００４６】
・ＥＲＦＡＭはアレルゲンに合わせる必要がない：アレルゲン特異性を担うのは既存のＩｇＥであるため、ＥＲＦＡＭは、アレルゲンに関わらず全てのＩｇＥ仲介アレルギーに対して有効である。実際、起因アレルゲンを同定する必要さえなく、唯一行う診断手法は、そのアレルギーがＩｇＥによって引き起こされていること（すなわち、ＩｇＥ量が増加していること）を確認することである。
【００４７】
・ＥＲＦＡＭを患者に合わせる必要がない：ＩｇＥ−Ｆｃは比較的一定であり、最終的な多型はそのＥＲＦＡＭへの結合に影響を及ぼさない。しかし、このような多型が、ＥＲＦＡＭが特定のＩｇＥに結合するのを妨げる場合、ＩｇＥもまた、その天然のリガンドである高親和性ＦｃεＲＩとの結合が不能となり、アレルギー反応は生じない。加えて、ＦｃγＲが多型を含有している場合もある。この場合、このＥＲＦＡＭの第２機能部分は、ペプチド、アプタマー、および／またはそのような多型受容体に対するモノクローナル抗体から構成され、このＥＲＦＡＭは、ＩｇＧ４Ｆｃ部分を含有するＥＲＦＡＭと比較して、より高い有効性を示す。
【００４８】
・ＥＲＦＡＭは迅速に作用する：処置される患者内でＥＲＦＡＭ結合ＩｇＥ／ＩｇＥ比が上昇するため、アレルギー症状は、数時間あるいは数日間の治療の間に消散する。一実施様態において、ＥＲＦＡＭはアナフィラキシーおよび喘息発作において使用され、アレルゲン誘導性のマスト細胞脱顆粒を止める。ＥＲＦＡＭ処方物は、単独で投与されるか、または抗ヒスタミン剤と共に投与される。
【００４９】
・必要とされるのは短期間の治療のみである：限られた期間に渡る数回の投与で十分である。これによって、長期間毎日または周期的な投与が避けられる。循環においてＥＲＦＡＭ結合ＩｇＥが優勢なアレルゲン特異的抗体となったときに、その半減期は天然ＩｇＧ４の半減期と一致することが好ましい。さらに、ＥＲＦＡＭの薬物動態力学的特性は、ペグ化あるいは他の修飾を用いて変更される。
【００５０】
・永続（長期）効果：即ち、アレルギーの再発がない。ＥＲＦＡＭ修飾ＩｇＥの存在によって、アナフィラキラシーに対する危険性がほぼまたは全くなくなると、Ｔ細胞は、アレルゲン特異的ＩｇＥ産生に替わるＩｇＧ４の自然産生を確保するために、アレルゲンに繰り返し暴露することによって徐々に免疫化される。アレルゲン許容を長期に誘導するための処置方法は、ＥＲＦＡＭを用いる１つ以上の処置方法と組み合わせて利用することができる。
【００５１】
・容易に受け入れられる：ＥＲＦＡＭはワクチンではなく、遺伝子ワクチン接種あるいは他の問題の薬剤に関係しない。実際、ＥＲＦＡＭは、単に患者自身の「病原性」ＩｇＥを、「天然に存在する」防御的ＩｇＧ４様抗体に転換させるだけである。
【００５２】
・より低費用：モノクローナルＩｇＧ抗体の分子量１５０、０００と比較して、ペプチドは一般に抗体よりも小さく、長さに応じて数千ダルトンの分子量を有する。このため、経済的大規模化が可能である。第１に、抗体の治療投与量はｍｇ／ｋｇであるが、これと等価なペプチドの投与量はマイクログラム／ｋｇである。第２に、一般にペプチド合成は抗体産生よりも廉価である。さらに、ペプチド合成は比較的容易であり、抗体（例えば、モノクローナル抗体）産生ほど高度な機器を必要としない。
【００５３】
・活性はアレルゲンの存在に依存する：ＥＲＦＡＭ分子は、その抗アレルギー活性が特異的ＩｇＥとアレルゲンとの双方によって発動され、それによって抑制性受容体と促進性受容体との共群形成を引き起こすため、アレルギー疾患を治療する他の分子とは区別される。特異的ＩｇＥとアレルゲンの双方が存在しない限り、この分子は抗アレルギー活性を持たない。従って、自然に発生する暴露が続くと、長期許容をもたらす。アレルギー疾患を処置するために設計された他の分子で、特異的なアレルゲンの存在に依存するこうした活性を有するものはない。
【００５４】
（ＥＲＦＡＭ活性の定量）
ＥＲＦＡＭ活性は、当業者に周知のアッセイを用いて定量される。例えば、ＥＲＦＡＭ活性は、ＩｇＥに結合するＥＲＦＡＭを測定することによって定量することができる。あるいは、ＥＲＦＡＭ活性は、抑制性受容体あるいは促進性受容体あるいは抑制性受容体に結合するＥＲＦＡＭを測定することによって、定量することができる。ＥＲＦＡＭ活性の下流での効果を測定するアッセイもある。
【００５５】
本発明の実施様態では、ＥＲＦＡＭ活性は、ＥＲＦＡＭがアレルゲン依存的ＩｇＥ仲介ヒト好塩基球活性化を阻害する能力を評価することによって、インビトロ系で試験される。このインビトロモデル系は当業者に周知であり、アレルギー反応の過程で生体内で起こる現象を再現する。
【００５６】
この系では、好塩基球は、Ｍｉｌｔｅｎｙ  Ｂｉｏｔｅｃ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ、カタログ番号１３０−０５３−４０１）から入手可能な好塩基球単離キットを使用する等によって、血液から精製される。
【００５７】
好塩基球を、アレルギーを持つ供与者から精製する場合、さらに処理することなくこれをアッセイに用いる。あるいは、好塩基球をアレルギーのない者から精製する場合、精製されたかまたはアレルギー供与者の血漿中に含まれるかのいずれかのアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の存在下でインキュベートすることによって、好塩基球を感作する。
【００５８】
好塩基球を、これもまた精製されたかまたはアレルギー供与者の血漿中に含まれるかのいずれかであるアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の存在下で、ＥＲＦＡＭと共にインキュベートする。この工程の間、ＥＲＦＡＭは血漿中のＩｇＥおよび好塩基球上のＦｃγＲと結合する。この好塩基球調製物にアレルゲンを加え、市販のＥＬＩＳＡ（Ｏｒｐｅｇｅｎ  Ｐｈａｒｍａ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，  ＧｅｒｍａｎｙのＢａｓｏｔｅｓｔ  （ｒ）、あるいは他のヒスタミンＥＬＩＳＡ：Ｎｅｏｇｅｎのカタログ番号＃４０９０１０またはＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｃｓ  Ｉｎｃの＃ＲＤＩ−ＲＥ５９２０１、もしくはＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈ製の＃２０１５）、あるいは放射免疫アッセイを用いてヒスタミン放出を定量することによって、活性化・脱顆粒を測定する。あるいは、フローサイトメトリーによって、好塩基球活性化を評価する。この系では、好塩基球脱顆粒の抑制能によって、ＥＲＦＡＭの効果を判定する。
【００５９】
（抗体部分）
本明細書中で使用する「抗体」という語は、免疫グロブリン分子ならびに免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫活性部分、即ち、抗原に特異的に結合する（抗原と免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子を指す。そのような抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ならびにＦａｂ発現ライブラリが挙げられるが、これらに限定されない。一般にヒトから得られる抗体分子は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ならびにＩｇＤの内のいずれかに関し、これらはその分子内に存在する重鎖の性質が互いに異なる。あるクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等のサブクラスを同様に持つ。さらに、ヒトでは、軽鎖は、カッパ鎖あるいはラムダ鎖である。本明細書中で抗体を指す語には、このようなヒト抗体種の全てのクラス、サブクラス、ならびに型を指す語が含まれる。
【００６０】
「エピトープ」という語には、免疫グロブリンあるいはＴ細胞受容体に特異的に結合することが可能な任意のタンパク質決定基が含まれる。エピトープ決定基は通常、アミノ酸あるいは糖側鎖等の、化学的活性表面群化分子から成り、通常は、特異的な電荷特性および特異的な三次元構造特性を有する。ポリペプチドあるいはそのフラグメントは、１つ以上の抗原エピトープを含有する。例えば、本発明の抗ＩｇＥ抗体は、ＩｇＥと特異的に結合し、その平衡結合定数（ＫＤ）は≦１μＭであって、好ましくは≦１００ｎＭ、より好ましくは≦１０ｎＭ、最も好ましいのは≦１００ｐＭ〜約１ｐＭであり、これは、放射性リガンド結合アッセイまたは当該分野で公知の類似のアッセイによって測定される。
【００６１】
本明細書中で使用する「抗原」、「抗原性」、「アレルゲン」、「アレルゲン性」という語は、生物体の免疫細胞に提示されたときに免疫反応を引き起こす物質を表すことが意図される。抗原は、Ｂ細胞受容体（即ちＢ細胞膜上の抗体）あるいはＴ細胞受容体が認識する、１つの免疫原性エピトープまたは複数の免疫原性エピトープを含有する。つまり、本明細書中で使用するこれらの語は、免疫反応（例えばピーナッツアレルゲン、ネコ鱗屑など）を誘発する任意の物質、および当業者に公知の適した条件下で抗原性が与えられるハプテンを指す。
【００６２】
本発明の構成体、あるいはその誘導体、フラグメント、類似体、同族体またはオルソログは、免疫特異的にアレルゲン性成分と結合する免疫反応の生成において、寛容原として利用される。例えば、ＥＲＦＡＭは、アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体と結合するとき、アレルゲンと間接的に結合する。
【００６３】
本発明のＩｇＥ、あるいはその誘導体、フラグメント、類似体、同族体、オルソログに対するポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体の産生には、当該分野において公知の様々な手法が用いられる。例えば、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ．，ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ｄ，１９８８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照のこと。これは、本明細書中に参考として援用される。
【００６４】
本発明は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体（あるいはヒト抗体）、Ｆａｂフラグメント（および単鎖抗体）、二重特異性抗体（２つ以上の異なる抗原に対して特異的な結合を有するモノクローナル抗体（好ましくは、ヒト抗体もしくはヒト化抗体））、ならびにヘテロ結合体化抗体（抗体は、２つの共役結合した抗体から構成される）の使用を包含する。また、本発明には、例えばその抗体のアレルギー治療における有効性を増進するような、エフェクター機能に関する抗体の修飾が含まれる。本発明はまた、化学式Ａ’−Ｂ’またはＡ’−Ｘ−Ｂ’として結合された抗体から成る免疫結合体に関係する。Ａ’およびＢ’部分から成る結合体は、プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）（ＳＰＤＰ）、イミノチオレーン（ＩＴ）、イミドエステルの二重機能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミド）、アルデヒド（例えば、グルタールアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えば、ビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）のような、様々な二重機能性タンパク質カップリング剤を使用して組み立てられる。例えば、ＥＲＦＡＭ構成体は、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製することができる。
【００６５】
（ＥＲＦＡＭの診断用途）
ＥＲＦＡＭは、タンパク質の局在および／または定量に関する分野で公知の方法にて使用される（例えば、適当な生理学的試料内のタンパク質の量を測定する際に使用するため、診断手法にて使用するため、画像化にて使用するためなど）。ある実施様態において、ＩｇＥあるいは抑制性受容体、抗原結合領域を含有するタンパク質、またはその誘導体、類似体、もしくは同族体に対する抗体は、薬理学的に活性な化合物として利用される。例えば、画像化のために使用される場合、抗体を検出可能な物質に結合させる（即ち、物理的に連結する）ことによって、検出を容易にすることができる。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、ならびに放射性物質が含まれる。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、あるいはアセチルコリンエステラーゼが含まれ、適切な補欠分子族複合体には、ストレプトアビジン／ビオチン、およびアビジン／ビオチンが含まれ、適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド、またはフィコエリスリンが含まれ、発光物質の例にはルミノールが含まれ、生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが含まれ、そして適切な放射性物質の例には１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、もしくは３Ｈが含まれる。
【００６６】
（ＥＲＦＡＭ治療）
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、および完全ヒト抗体を含む本発明のＥＲＦＡＭ構成体は、治療薬剤として企図される。そのような薬剤は、一般に、患者の疾患または障害を処置または予防するために使用される。アレルゲン仲介アレルギー反応を治療するために使用することが好ましい。抗体調製物を患者に投与し、一般に、これが標的に結合することによって効果を奏する。そのような効果は２種類の内の１つであり、投与された抗体分子と問題となっている標的抗原との間の、特別な性質の相互作用に依存している。最初の例では、この抗体の投与は、ＦｃεＲＩの、これが自然に結合する相手であるＩｇＥ抗体への結合を無効化または阻害し得る。この場合、ＥＲＦＡＭ分子はＩｇＥ  Ｆｃ領域に結合し、ＦｃεＲＩのαサブユニットがＩｇＥへ結合するのを遮断する。このようにして、ＥＲＦＡＭ分子は、マスト細胞結合ＩｇＥの架橋によって誘導されるカスケード反応を低減させる。
【００６７】
あるいは、アレルギー反応の抑制を誘導するエフェクター結合部位への結合能によって、ＥＲＦＡＭ分子が生理学的結果を導く効果がある。発明者はこれに束縛されることを望まないが、企図される一機構は、ＥＲＦＡＭ分子のＩｇＧ４部分が、抑制性サブユニットをＦｃ受容体複合体へ動員し、それによってこれが結合する刺激免疫細胞の活性化ではなく、抑制を導くカスケード反応を仲介する。
【００６８】
治療的有効量の抗体は、一般に、治療目的を達成するのに必要とされる量に関連する。投与するのに必要な量は、さらに、ＥＲＦＡＭ分子のその特異的抗原／受容体への結合親和力によって異なり、また、投与したＥＲＦＡＭ分子が、これを投与された患者の血体積中から除去される速度によって異なる。例えば、抗体あるいは抗体フラグメントの治療的有効投与量の一般的範囲は、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重であるが、これに限定されない。一般的な投与回数は、例えば、１日２回〜１週間に１回の範囲であり得る。好ましい一施様態において、ＥＲＦＡＭ分子ボーラスは、１回の注射で投与され、続いてＳＩＴ治療を行い、アナフィラキシーショック等の副作用の危険性を伴わずに永続寛容を誘導する。
【００６９】
（薬学的組成物）
本発明の抗体構成体は、当業者によって容易に認められる関連分子も合わせて、様々な疾患の治療のために薬学的組成物の形態にて投与することができる。そのような組成物の調製における原則および考慮事項、ならびに成分選択における指針は、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＹ、第１９版（Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｔ  ａｌ．編）  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１９９５；ＤＲＵＧ  ＡＢＳＯＲＰＴＩＯＮ  ＥＮＨＡＮＣＥＭＥＮＴ：ＣＯＮＣＥＰＴＳ，ＰＯＳＳＩＢＩＬＩＴＩＥＳ，ＬＩＭＩＴＡＴＩＯＮＳ，ＡＮＤ  ＴＲＥＮＤＳ，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌａｎｇｈｏｍｅ，Ｐａ．，１９９４；およびＰＥＰＴＩＤＥ  ＡＮＤ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  Ｉｎ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第４巻），１９９１，Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋにて提供されている。
【００７０】
ＥＲＦＡＭ構成体から成るペプチドは、化学的に合成するか、そして／または組換えＤＮＡ法によって産生することができる。例えば、Ｍａｒａｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９−７８９３（１９９３）を参照のこと。この組成物は、処置される特定の使用法に必要な１つ以上の活性成分を含有することができ、これは互いに悪影響を与えない補足的活性を有するものであることが好ましい。あるいは、または加えて、この組成物は、その組成物の機能を増進する薬剤（例えば、ＩＬ−２、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−β）、またはＩＬ−４もしくはＩＬ−１３に結合および／または隔絶する薬剤を含有することができる。そのような分子は、意図される目的に対して有効な組成および量にて適切に存在する。
【００７１】
活性成分は、例えば、コアセルベーション法または界面重合によって調製されるマイクロカプセル内に封入することができる。これらの例は、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリメチルメタクリレートマイクロカプセルであり、コロイド薬剤送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロ乳濁液、ナノ粒子、およびナノカプセル）またはマクロ乳濁液にて存在する。
【００７２】
インビボ投与のために使用される組成物は、滅菌される。滅菌濾過膜で濾過することによって、これは容易に達成される。
【００７３】
徐放性調製物が、調製され得る。徐放性調製物の適切な例には、抗体を含む固体疎水ポリマーから成る半透過マトリックスが含まれ、このマトリックスは、フィルムまたはマイクロカプセル等の成形物の形態にある。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール）、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン−ビニル酢酸、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドとから構成される注射可能なミクロスフェア）等の分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン−ビニル酢酸ならびに乳酸−グリコール酸等のポリマーによって１００日間を越える分子の放出が可能であるが、一部のヒドロゲルは、より短い期間タンパク質を放出する。
【００７４】
本発明のＥＲＦＡＭ構成体、およびその誘導体、フラグメント、類似体ならびに同族物は、投与に適切な薬学的組成物内に組み込まれ得る。そのような組成物は、典型的には、ＥＲＦＡＭ構成体と薬学的に受容可能なキャリアとから成る。本明細書中で使用する「薬学的に受容可能なキャリア」には、薬学的投与に適合する任意かつ全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等が含まれることが意図される。適切なキャリアは、この分野における標準的参照テキストである、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載されている（これは、本明細書中に参考として援用される）。そのようなキャリアまたは溶媒の好ましい例には、水、生理食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液、ならびに５％ヒト血清アルブミンが含まれるが、これらに限定されない。リポソームおよび固定油等の非水性キャリアを使用することもできる。薬学活性物質のための当該溶媒ならびに薬剤の使用法は、当該分野において周知である。任意の通常の溶媒あるいは薬剤で、その活性化合物に不適合である場合のみを除き、この組成物においてこれらを使用することが企図される。また、補助的活性物質を、この組成物に組み合わせることができる。
【００７５】
薬学的組成物は、意図する投与経路に適合するよう組成される。投与経路の例には、例えば静脈経由、腹腔内、皮下等の非経口的投与、経口投与（例えば吸入）、経皮投与（例えは局所的投与）経粘膜投与、直腸投与が含まれる。非経口投与、皮内投与、あるいは皮下投与のために使用する溶液あるいは懸濁液は、以下の成分を含有することができる。：注射用水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、あるいは他の合成溶媒等の滅菌希釈剤；ベンジルアルコールあるいはメチルパラベン等の抗細菌剤、アスコルビン酸あるいは亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤；酢酸、クエン酸、あるいはリン酸等の緩衝液、ならびに塩化ナトリウムあるいはデキストロース等の浸透圧を調製するための薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基を用いて調整することができる。非経口調製物は、ガラスあるいはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、または複数回用バイアルに封入することができる。
【００７６】
注射可能な使用法に適した薬学的組成物は、滅菌水性溶液（水溶性の場合）、あるいは、滅菌注射用溶液あるいは分散液を即座に調製するための分散液および滅菌粉末を含有する。静脈投与に関しては、適切なキャリアには、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、あるいは生理食塩水リン酸緩衝液（ＰＢＳ）が含まれる。全ての場合において、組成物は、簡便に注射可能状態になることができるよう、無菌かつ液体である。これは製造条件下ならびに保存条件下で安定であり、細菌ならびに真菌等の微生物の汚染作用に対抗して保存される。キャリアは、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ならびに液体ポリエチレングリコール等）を含有する溶媒あるいは分散媒、ならびに適切なこれらの混合物であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングを使用することによって、分散液の場合は必要とされる粒子サイズを維持することによって、そして界面活性剤を使用することによって、維持することができる。微生物の作用の予防は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等、様々な抗細菌剤ならびに抗真菌剤を使用することによって達成することができる。多くの場合、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール等の多価アルコール、塩化ナトリウムを、組成物内に含有することが好ましい。組成物内に、例えばモノステアリン酸アルミニウムならびにゼラチン等、吸収を遅らせる薬剤を包含させることによって、注射用組成物の長期吸収が可能となる。
【００７７】
滅菌注射用溶液は、必要量のＥＲＦＡＭ構成体を、必要とされる上記に列挙した成分の１つまたは組み合わせと共に、適切な溶媒に混合し、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、この活性化合物を、基本となる分散媒と上記に列挙した物の中から必要とされる他の成分とを包含する滅菌キャリア内と混合することによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合は、調製法は、前もって濾過殺菌した溶液から、活性成分の粉末に加えて任意の別の所望する成分を得る、真空乾燥法および凍結乾燥法である。
【００７８】
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤あるいは食用キャリアを含有する。これらはゼラチンカプセル内に封入されるか、あるいは圧縮されて錠剤となる。経口治療投与の目的のためには、この活性化合物は医薬品添加物と共に混合され、錠剤、トローチ、あるいはカプセルの形態で使用される。また経口組成物は、マウスウォッシュとして使用するための液体キャリアを用いて調製することもでき、この場合この液体キャリア内の化合物は、経口的に投与して勢いよく吐き出されるかまたはは飲み込まれる。薬学的に受容可能な結合剤および／または補助物質を、この組成物の一部として含有させることができる。この錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は、任意の以下の成分、あるいは同様の性質を有する化合物を含有することができる；微結晶性セルロース、トラガカントゴムあるいはゼラチン等の結合剤；澱粉あるいは乳酸等の医薬品添加物；アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、あるいはトウモロコシ澱粉等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムあるいはＳｔｅｒｏｔｅｓ等の潤滑剤；２酸化ケイ素コロイド等の滑剤；ショ糖あるいはサッカリン等の甘味料；あるいは、ペパーミント、サリチル酸メチル、あるいはオレンジ香料等の香味料。
【００７９】
一実施様態では、この活性化合物は、この化合物が体内から急速に排出されるのを防ぐキャリアと共に調製され（例えば、徐放性処方物）、これにはインプラントならびにマイクロカプセル送達系が含まれる。酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ならびにポリ乳酸のような生物分解性の生物適合ポリマーを使用することができる。そのような組成物を調製する方法は、当業者には明白である。材料は、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎならびにＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から購入することもできる。
【００８０】
投与を簡便にするため、および投与量を均一にするために、ＥＲＦＡＭ構成体を単位投薬形態に処方すると有利である。本明細書中で使用する単位投薬形態とは、処置される患者にとって単位投与量として適切な物理的に分離された単位物を指し、各単位物は、必要とされる薬学的キャリアと共に、所望する治療効果が生じるよう計算された所定量の活性化合物を含有する。この単位投薬形態物の内訳は、活性化合物独自の性質および達成しようとする具体的な治療的効果、ならびに個体の処置のためのそのような活性化合物を配合する技術における本質的限界によって決まり、そして直接これらに依存する。
【００８１】
この薬学的組成物は、容器、パック、キット、あるいはディスペンサー内に、投与のための使用説明書と共に包含することができる。一実施様態では、ＥＲＦＡＭは、抗ヒスタミン剤と共に、一キット内にまとめられる。別の実施様態では、ＥＲＦＡＭ製剤が、抗ヒスタミン剤を含有する。ＥＲＦＡＭ製剤は、患者がアレルゲンに暴露する前または曝露後短時間で投与することが理想的である。抗ヒスタミンを含有するＥＲＦＡＭ製剤は、アレルギー患者がアナフィラキシー反応を抑制するための大衆薬として使用するために、一まとめにされる。
【００８２】
（ポリマーが結合体化された治療的なＥＲＦＡＭ構成体）
本明細書の開示に基づき、当業者によって、化学修飾した（例えばポリマー結合体化）ＥＲＦＡＭ構成体が調製される。ＥＲＦＡＭ構成体への付加（ＥＲＦＡＭ構成体の「誘導体化」と呼ぶ）に最も適切な化学部分には、水溶性ポリマーが含まれる。接着相手となるタンパク質が、生理学的環境等の水性環境において沈殿しないため、水溶性ポリマーが有利である。一部の実施様態で、このポリマーは、治療製品または組成物の調製に関して、薬学的に受容可能である。
【００８３】
２つ以上のポリマー分子を同様に接着することも企図されるが、所望される場合、ＥＲＦＡＭ構成体との結合のために使用されるポリマー分子は１つである。一部の実施様態では、結合体化に、２つ、３つ、あるいは４つのポリマー分子が使用されるが、好ましくは３つのポリマー分子が結合体化に使用され、例えば、第１および第２ポリマー分子をＥＲＦＡＭ構成体のＮ末端アミノ酸に結合させ、第３ポリマー分子を内部アミノ酸（即ち、非末端アミノ酸）に結合体化する。結合体化されたＥＲＦＡＭ構成体は、インビボおよび非インビボの双方の適用において有用性がある。さらに、ポリマーの結合は、最終的な用途に適切となるよう、任意の他の官能基、部分、あるいは他の結合種を利用し得ることが理解される。例として挙げると、一部の用途では、ＵＶ分解耐性あるいは抗酸化力、もしくは持続的な血清滞留、あるいはその他の特性もしくは性質をポリマーに付与する機能部分を、ポリマーに共有結合的に結合させるのが有用である。さらに別の例として、一部の用途では、ポリマーの性質を変えて、ポリマーに、特性において反応性または架橋能を与えるため、結合体化した物質全体の様々な特性または性質を増進するために機能付与するのが有利である。従って、ポリマーは、意図する目的に関してＥＲＦＡＭ結合体化構成体の有効性を妨げない、任意の機能性、繰り返し官能基、結合状態、あるいは他の部分構成体を含有し得る。
【００８４】
当業者は、ポリマー／タンパク質結合体が治療的に使用されるか否か、もし使用されるならば、所望される投与量、循環時間、タンパク質分解耐性、および他の考察に基づいて、所望のポリマーを選択することができる。誘導体化の有効性は、所望する形態（例えば、浸透ポンプによって、または注射もしくは輸液によるか、あるいは経口用、経肺、もしくは他の送達経路のためにさらに組成する等）にてその誘導体を投与し、その有効性を決定することによって確認される。
【００８５】
適切な水溶性ポリマーには、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ１，３−ジオキソレン、ポリ１，３，６−トリオキサン、エチレン／マレイン酸無水コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランもしくはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレン酸化物／エチレン酸化物コポリマー、ポリオキシエチレレン化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。水中での安定性のため、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは製造において利点を有し得る。
【００８６】
ポリマーは、任意の適切な分子量のものであり、これは分枝または非分岐である。
【００８７】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に関して、簡便な操作ならびに製造のために、分子量は約２ｋＤと約１００ｋＤａとの間であることが好ましい（本明細書中で使用する「約」という語は、ポリエチレングリコールの調製において、一部の分子が、記載した分子量より大きいかまたはいくらか小さいことを意味する）。所望する治療特性（例えば、所望される持続放出時間；場合によっては生物学的活性に対する効果；扱いやすさ；抗原性の程度または欠如、および治療性タンパク質もしくはその改変体に対する公知のポリエチレングリコールの影響等）に応じて、他の大きさのものを使用する。一部の実施様態において、好ましい分子量は約１０ｋＤａである。
【００８８】
こうして接着させるポリマー分子の数は、多様であり得、当業者は機能に対するその効果を確認することができる。一つは、一誘導体化であっても、同一もしくは異なる化学部分（例えば、様々な分子量のポリエチレングリコール等のポリマー等）を有する、２、３、４、またはいくつかの誘導体化の組み合わせが提供されてもよい。ポリマー分子のタンパク質（あるいはポリペプチド）分子に対する割合は変動し、反応混合物中の濃度も同様に変動する。一般に、（タンパク質またはポリマーに到達しない過剰なものが存在しないという反応の有効性に関する）最適割合は、所望する誘導体化の程度（例えばモノ誘導体、ジ誘導体、トリ誘導体等）、選択するポリマーの分子量、ポリマーが分枝しているか分枝していないか、ならびに反応条件等の要因によって決まる。
【００８９】
一実施様態では、ポリエチレングリコール分子（あるいは他の化学部分）は、タンパク質の機能領域あるいは抗原領域に対する影響を考慮して、そのタンパク質に接着させる。当業者が利用することのできる接着方法は多数ある。例えば、ＥＰ  ０  ４０１３８４
（ＰＥＧのＧ−ＣＳＦへのカップリング）；Ｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−１０３５，１９９２（塩化トレシルを使用するＧＭ−ＣＳＦのペグ化を報告する）を参照のこと。
【００９０】
例えば、ポリエチレングリコールは、遊離アミノ基あるいはカルボキシル基等の反応性官能基を介して、アミノ酸残基を介して共有結合される。反応性官能基は、活性化ポリエチレングリコール分子が結合する官能基である。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基には、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。遊離カルボキシル基を有するものには、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、ならびにＣ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。また、ポリエチレングリコール分子を接着するための反応性官能基として、スルフヒドリル基が使用され得る。治療目的のために、一部の実施様態では、Ｎ末端あるいはリジン基での接着のような、アミノ基での接着が好ましい。受容体結合が所望される場合、受容体結合に重要な残基での接着は避けられる。
【００９１】
特にＮ末端化学修飾タンパク質が所望される場合がある。本発明のＥＲＦＡＭ組成物の説明としてはポリエチレングリコールを使用するが、様々な（分子量、分枝等）ポリエチレングリコール分子から、反応混合物におけるタンパク質（あるいはペプチド）に対するポリエチレングリコール分子の割合、実行するペグ化反応の種類、ならびに選択したＮ末端ペグ化タンパク質を得る方法を、選択することができる。Ｎ末端ペグ化調製物を得る方法（即ち、必要な場合、この部分を他のモノペグ化から分離する）は、ペグ化タンパク質分子の集団からＮ末端ペグ化物質を精製することによる。選択的Ｎ末端化学修飾は、還元的アルキル化によって達成され、これは特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な、様々な種類の一次アミノ基の他とは異なる反応性（リジン対Ｎ末端）を活用する。適切な反応条件下において、カルボニル基を含有するポリマーを用いて、Ｎ末端にて、実質的に選択的なタンパク質の誘導体化が達成される。例えば、リジン残基のイプシロンアミノ基（ｅ−アミノ基）とタンパク質のＮ末端残基のαアミノ基（ａ−アミノ基）との間のｐＫａが異なるという利益を得ることが可能なｐＨで反応を実行することによって、タンパク質を選択的にＮ末端ペグ化し得る。そのような選択的誘導体化によって、水溶性ポリマーのタンパク質への接着が調節される。即ち、ポリマーとの結合が、タンパク質のＮ末端にて優勢的に起こり、リジン側鎖アミノ基等の他官能基では顕著な修飾は起こらない。
【００９２】
還元的アルキル化を用いる際、水溶性ポリマーは上記の種類のものであり、タンパク質への結合のための１つの反応性アルデヒドを有する。１つの反応性アルデヒドを含むポリエチレングリコールプロピルアルデヒドが使用される。
【００９３】
本発明には、原核細胞で発現したか、真核細胞で発現したか、または合成されたＥＲＦＡＭの使用が包含される。
【００９４】
ペグ化は、当該分野において公知の任意のペグ化反応によって達成される。例えば、Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，３（２）：４−１０，１９９２；ＥＰ  ０  １５４  ３１６；ＥＰ  ０  ４０１  ３８４；ならびにその他本明細書中で引用されるペグ化に関する刊行物を参照のこと。ペグ化は、反応性ポリエチレングリコール（あるいは類似の反応性水溶性ポリマー）を用いて、アシル化反応あるいはアルキル化反応を介して達成される。
【００９５】
アシル化によるペグ化は、一般に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の活性エステル誘導体を反応させることに関係する。任意の既知の、あるいはこの後発見される反応性ＰＥＧ分子を使用して、このペグ化が達成される。好ましい活性化ＰＥＧエステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）へエステル化したＰＥＧである。本明細書中で使用する「アシル化」には、この治療性タンパク質とＰＥＧ等の水溶性ポリマーとの間の以下の種類の結合が含まれるが、これらに限定されない：アミド、カルバメート、ウレタン等。Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：１３３−１４０，１９９４を参照のこと。反応条件は、ペグ化の分野にて周知されているか、あるいは後に開発される任意のものから選択されるが、ＥＲＦＡＭ構成体がポリマー結合体となるのを不活性化する温度、溶媒、ならびにｐＨ等の条件は避ける。
【００９６】
アシル化によるペグ化は、一般に、ポリペグ化ＥＲＦＡＭ産物をもたらす。一部の実施様態において、この連結結合はアミドである。また、一部の実施様態において、得られる産物は、実質的に（例えば＞９５％）モノペグ化、ジペグ化、あるいはトリペグ化のみである。しかし、用いる特定の反応条件に応じて、より高い程度のペグ化を有する種が形成される場合がある。所望される場合、一例として透析、塩析、限界濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーならびに電気泳動を含む標準的な精製技術によって、より精製されたペグ化種を、未反応種等の混合物から分離する。
【００９７】
アルキル化によるペグ化は、一般に、還元剤の存在下で、ＰＥＧの末端アルデヒド誘導体をＥＲＦＡＭと反応させることに関係する。アルキル化によるペグ化も、ポリペグ化ＥＲＦＡＭ産物をもたらす。さらに、実質的にＥＲＦＡＭのＮ末端α−アミノ基でのみのペグ化（即ちモノペグ化タンパク質）を助長する反応条件を、巧みに設定することができる。モノペグ化あるいはポリペグ化のいずれの場合も、ＰＥＧ基は、−ＣＨ２−ＮＨ−基を介してタンパク質に接着させることができる。特に−ＣＨ２−基について、この種の結合を、本明細書中では「アルキル」結合と呼ぶ。
【００９８】
モノペグ化産物を作るための還元性アルキル化を介した誘導体化は、誘導体化に利用可能な様々な種類の一次アミノ基の様々に異なる反応性（リジン対Ｎ末端）を活用している。この反応は、リジン残基のｅ−アミノ基と、タンパク質のＮ末端残基のａ−アミノ基間の、ｐＫａの差異による有益性が得られるｐＨで実行される。そのような選択的誘導体化によって、アルデヒド等の反応性官能基を含有する水溶性ポリマーのタンパク質への接着が調節される。即ち、ポリマーへの接着は、タンパク質のＮ末端にて主に発生し、リジン側鎖のアミノ基等他の反応性官能基の著しい修飾は起こらない。
【００９９】
アシル化法とアルキル化法の双方で使用されるポリマー分子は、先に記載した水溶性ポリマーの中から選択される。選択されたポリマーは、１つの反応性官能基（例えば、アシル化のための活性エステルあるいはアルキル化のためのアルデヒド）を有するよう修飾され、その結果、重合の程度は本発明の方法において提供されるように調節される。例となる反応性ＰＥＧアルデヒドは、水に対して安定なポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、あるいはそのモノＣ１−Ｃ１０アルコキシもしくはアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。このポリマーは、分枝または非分枝である。アシル化反応については、選択したポリマーは１つの反応性エステル基を有している。一般に、通常哺乳類組換え発現系によってより便利に作られることから、水溶性ポリマーは、天然のグリコシル残基からは選択されないであろう。ポリマーは任意の分子量のものであり、分枝または非分枝である。
【０１００】
本明細書中で使用するための例示的な水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコールである。本明細書で使用するポリエチレングリコールは、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシポリエチレングリコールまたはアリールオキシポリエチレングリコール等、他のタンパク質を誘導体化するのに使用されてきている、ＰＥＧの任意の形態を含むことを意味する。
【０１０１】
一般に、化学的誘導体化は、生物学的活性物質を活性化ポリマー分子と反応させるために用いる任意の適切な条件下で実行される。ペグ化ＥＲＦＡＭを調製するための方法は、一般に（ａ）ＥＲＦＡＭ分子が１つ以上のＰＥＧ基と結合する条件下で、ＥＲＦＡＭタンパク質あるいはＥＲＦＡＭペプチドを、ポリエチレングリコール（ＰＥＧの反応性エステルあるいはアルデヒド誘導体）と反応させる工程、並びに（ｂ）反応産物を得る工程を包含する。一般に、アシル化反応に最適な反応条件は、既知のパラメーター並びに所望する結果に基づき、場合に応じて決定される。例えば、ＰＥＧ／タンパク質の割合を大きくするほど、ポリペグ化産物の割合が大きくなる等。
【０１０２】
モノポリマー／ＥＲＦＡＭの実施的に均一な集団を作るための還元的アルキル化は、一般に（ａ）ＥＲＦＡＭのアミノ末端でａ−アミノ基の選択的修飾を可能とするのに適切なｐＨでの還元的アルカリ化条件下で、ＥＲＦＡＭタンパク質あるいはＥＲＦＡＭペプチドを、反応性ＰＥＧと反応させる工程、並びに（ｂ）反応産物を得る工程を包含する。
【０１０３】
ｐＨはまた、利用しようとする、ポリマーのタンパク質に対する割合に、影響を及ぼす。一般に、ｐＨが低ければ、タンパク質に対してより過剰なポリマーが所望される（即ち、Ｎ末端ａ−アミノ基の反応性が低くなるほど、最適条件を達成するのにより多くのポリマーが必要とされる）。ｐＨが高い場合、ポリマー：タンパク質の割合は、さほど大きなものである必要がない（即ち、より多くの反応性官能基が利用できるほど、必要とされるポリマー分子はより少ない）。本発明の目的のためには、ｐＨは一般に３〜９の範囲内に収まり、好ましくは３〜６である。
【０１０４】
別の重要な検討事項は、ポリマーの分子量である。一般に、ポリマーの分子量が大きければ、タンパク質に結合するポリマー分子の数はより少ない。同様に、これらのパラメーターを最適にする際、ポリマーの分枝が考慮される。一般に、分子量がより大きければ（あるいはより分枝していれば）ポリマー：タンパク質の割合はより大きくなる。一般に、本明細書中で企図されるペグ化反応のためには、平均分子量は、約２ｋＤａから約１００ｋＤａであることが好ましい。好ましい平均分子量は、１０ｋＤａ等、約５ｋＤａから約５０ｋＤａである。
【０１０５】
一部の実施形態において、ＥＲＦＡＭは、そのポリペプチド上の末端反応性官能基を介してポリマーと連結される。代わりに、またはこれに加えて、ＥＲＦＡＭは、例えばＥＲＦＡＭ分子を構築する際に利用される天然のサブユニットのアミノ酸配列内に導入されたリジン残基等、内部リジン残基の側鎖アミノ基を介して連結される。従って、結合体は、非末端反応性官能基から分枝されていることも可能である。この反応性官能基を有するポリマーを、本明細書では「活性化ポリマー」と呼ぶ。この反応性官能基は、タンパク質の遊離アミノ基あるいは他の反応性官能基と選択的に反応する。
【０１０６】
リジン残基あるいはＥＲＦＡＭポリペプチドサブユニットあるいはその改変体のアミノ酸配列内に導入された残基の、アルファアミノ基あるいはイプシロンアミノ基等、任意の利用可能なＥＲＦＡＭアミノ基で、活性化ポリマー内において結合が起こり得る。ＥＲＦＡＭの遊離カルボキシル基、適切に活性化されたカルボニル基、ヒドロキシル基、グアニジル基、イミダゾール基、酸化炭水化物部分、並びにメルカプト基もまた、（利用可能であれば）結合部位として利用することができる。
【０１０７】
一般に、タンパク質濃度に応じて、タンパク質１モル当たり約１．０モルから約１０モルの活性化ポリマーが使用される。最終量は、反応程度を最大にし、一方生成物の非特異的修飾を最小にする量との間で釣り合う量であり、これは同時に、最適活性を維持する化学的性質を規定し、同時に、可能であればタンパク質の半減期を最適にする量である。一部の実施形態では、タンパク質の少なくとも約５０％の生物学的活性が保持され、別の実施形態では、ほぼ１００％が保持される。
【０１０８】
ポリマーは、当該分野で公知の方法を用いてＥＲＦＡＭポリペプチドと結合させることができる。例えば、一部の実施形態では、ポリアルキレングリコール部分を、ＥＲＦＡＭあるいは改変ＥＲＦＡＭのリジン基に結合させる。このリジン基への結合は、ＰＥＧスクシンイミジルスクシネート（ＳＳ−ＰＥＧ）並びにＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ−ＰＥＧ）等の、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステルを用いて達成することができる。適切なポリアルキレングリコール部分には、例えば、カルボキシメチル−ＮＨＳ、ノルロイシン−ＮＨＳ、ＳＣ−ＰＥＧ、トレシレート、アルデヒド、エポキシド、カルボニルイミダゾール、並びに炭酸ＰＮＰが含まれる。
【０１０９】
さらに別のアミン反応性ＰＥＧリンカーを、スクシンイミジル部分と置換することができる。これらには例えば、イソチオシアネート、炭酸ニトロフェニル、エポキシド、並びに炭酸ベンゾトリアゾールが含まれる。一部の実施形態において、条件は、反応の選択性及び程度を最大にするよう選択される。
【０１１０】
所望される場合、ＥＲＦＡＭは、例えばエンテロキナーゼ切断部位によって分離されるヒスチジンタグ（即ち１０ヒスチジン）等、後でタンパク質分解によって放出されることが可能なタグを含有することもできる。従って、ヒスチジンタグ改変体を、低分子量リンカー（例えば、トラウト試薬（Ｐｉｅｒｃｅ））と最初に反応させ、次に、これをリジンとＮ末端の双方に反応させ、続いてヒスチジンタグを放出させることによって、このリジン部分を選択的に修飾することができる。このポリペプチドは続いて、遊離ＳＨ基を含有し、この有利ＳＨ基は、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基、あるいは遊離ＳＨもしくは保護ＳＨ等の、チオール反応性ヘッド官能基を含有するＰＥＧで選択的に修飾することができる。
【０１１１】
トラウト試薬は、ＰＥＧ結合のための特異的部位を作ることとなる任意のリンカーと置き換えることができる。例をあげると、トラウト試薬は、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡ、あるいはＳＡＴＰ（全てＰｉｅｒｃｅから入手可能）に置き換えられる。同様に、タンパク質を、マレイミド基を挿入するアミン反応性リンカー（例えばＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳ、あるいはＧＭＢＳ）、ハロアセテート基を挿入するアミン反応性リンカー（例えばＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ）、あるいはビニルスルホン基を挿入するアミン反応性リンカーと反応させ、結果としてできる生成物を、遊離ＳＨを含有するＰＥＧと反応させる。採用されるリンカーの大きさに対する唯一の制限は、続くＮ末端タグ除去を妨げ得ないことである。
【０１１２】
従って、別の実施形態では、ポリアルキレングリコール部分は、ＥＲＦＡＭあるいは改変ＥＲＦＡＭ構成体のシステイン基と結合する。例えばマレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基、並びにチオール基を用いて、結合を遂げることが可能である。
【０１１３】
一部の実施形態では、組成物中のポリマー結合ＥＲＦＡＭは、ポリマーが存在しない状態の改変ＥＲＦＡＭの半減期と比べて、より長い血清半減期を持つ。代わりに、もしくはこれに加えて、組成物中のポリマー結合ＥＲＦＡＭはＧＦＲに結合するか、ＲＥＴを活性化するか、神経細胞の病的変化を正常にするか、あるいは神経細胞の生存を増進させるか、あるいはこれらの生理学的機能の組み合わせを達成する。
【０１１４】
一部の実施形態において、この組成物は、ポリエチレングリコール部分に結合した、安定した水溶性ポリマー結合ＥＲＦＡＭあるいは改変ポリマー結合ＥＲＦＡＭとして提供される。所望される場合、ＥＲＦＡＭあるいは改変ＥＲＦＡＭ構成体は、反応しやすい結合（ｌａｂｉｌｅ  ｂｏｎｄ）によってポリエチレングリコール部分に結合する。この反応活性的結合は、例えば生化学的加水分解、タンパク質分解、あるいはスルフヒドリル切断にて、切断されることが可能である。例えば、この結合は、生体内（生理学的）状態下で切断されることが可能である。
【０１１５】
溶媒、反応時間、温度、その他、並びに生成物精製法等、他の反応パラメーターは、当業者によって決定され得る。
【０１１６】
（ＥＲＦＡＭ構成体の合成及び単離）
改変ＥＲＦＡＭは、当該分野で公知の方法を用いて単離することができる。天然のＥＲＦＡＭサブユニットは、標準タンパク質精製法を用いる適切な精製手順によって、免疫細胞、ハイブリドーマ、あるいは組織源から単離することができる。あるいは、標準ペプチド合成法を用いて、改変ＥＲＦＡＭを化学的に合成することができる。短いアミノ酸配列の合成は、ペプチドの分野にてよく確立されている。例えば、Ｓｔｅｗａｒｔら，ＳＯＬＩＤ  ＰＨＡＳＥ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（２ｄ  ｅｄ．，  １９８４）を参照すること。
【０１１７】
別の実施形態において、ＥＲＦＡＭ構成体は、組換えＤＮＡ法によって作られる。例えば、リンカー部分がポリペプチドリンカーであるＥＲＦＡＭ構成体をコードする核酸分子を、例えば発現ベクター等のベクターに挿入することができ、その核酸を細胞に導入することができる。適切な細胞には、例えば哺乳類細胞（例えばヒト細胞あるいはチャイニーズハムスター卵巣細胞等）、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、並びに細菌細胞が含まれる。組換え細胞内で発現させる場合、その細胞を、ＥＲＦＡＭ構成体の発現が可能な条件下で培養することができる。所望する場合、ＥＲＦＡＭ構成体を細胞懸濁液から回収することができる。本明細書で使用する、「回収された」は、改変ポリペプチドが、細胞のこれらの成分あるいは回収手順の前に存在する培地から分離されていることを意味する。回収手順には、１つ以上の再生手順あるいは精製手順が含まれる場合がある。
【０１１８】
ＥＲＦＡＭ構成体は、当該分野で公知の任意の複数の手法を用いて構築することができる。このような一方法は、部位指向性変異誘発法であり、この方法では、コードされているＥＲＦＡＭ構成体内で、１つのアミノ酸（あるいは、所望される場合、前もって決定された少数のアミノ酸残基）を変更するために、１つの特定のヌクレオチド（あるいは、所望される場合、少数の特定のヌクレオチド）が変更される。当業者は、部位指向性変異誘発法が慣用的かつ広く用いられている技法であることを認識している。実際、多数の部位指向性変異誘発キットが市販されている。１つのこのようなキットは、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  （Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  Ｃａｌｉｆ．）から販売されている「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ」である。
【０１１９】
他に記載のない限り、本発明の実施には、当該分野の技術の範囲内にある、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、タンパク質化学、並びに免疫学の従来の技法を使用する。当該技法は文献にて記載されている。例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ  並びにＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．），１９８５；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．），１９８４；米国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら，）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．），１９８４；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．），１９８４；Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ），Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  （Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ），１９８４；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １５４及びＶｏｌｕｍｅ  １５５（Ｗｕら，ｅｄｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．），１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ＩからＶｏｌｕｍｅ  ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．），１９８６；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６を参照すること。
【０１２０】
ポリマー結合ＥＲＦＡＭ構成体
所望される場合、ポリマー結合ＥＲＦＡＭ構成体を、融合タンパク質として提供することができる。タンパク質の融合ポリペプチド誘導体にも、生物学的活性を保持する多様な構造形態の一次タンパク質が含まれる。本明細書で使用する「融合」は、同じリーディングフレーム内（即ち、「フレーム内」）にてタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子の遺伝的発現を通じる等、個々のペプチド骨格を介した、２つ以上のタンパク質あるいはその断片の、共直線性の共有結合を指す。タンパク質あるいはその断片は、その出自が異なることが好ましい。従って、一部の融合タンパク質には、改変ＥＲＦＡＭではない第２部分に共有結合した改変ＥＲＦＡＭ構成体あるいはフラグメントが含まれる。一部の実施形態において、この第２部分は、単量体として存在するポリペプチドに由来し、ＥＲＦＡＭ構成体に溶解性および／または生物学的利用性の増大を付与するために十分である。
【０１２１】
ポリマー結合ＥＲＦＡＭを含有する製薬組成物
また、本発明の修飾ＥＲＦＡＭ構成体を包含する製薬組成物も提供される。本明細書で使用する「製薬組成物」は、本発明のＥＲＦＡＭ構成体あるいはＥＲＦＡＭ結合体を含み、生理学的に利用可能な担体内に分散し、随意で１つ以上の生理学的に適合する成分を含有するものとして定義される。従って、この製薬組成物には、水等の賦形剤、１種以上の無機塩類、糖、界面活性剤、並びに不活性タンパク質等の１種以上の担体（例えばヘパリンあるいはアルブミン）を含有する場合がある。
【０１２２】
ＥＲＦＡＭ構成体は、それ自体が投与され、加えて製薬的に利用可能なエステル、塩、並びに他の生理学的機能を持つこれらの誘導体の形態で投与される。当該製薬組成物並びに薬品組成物において、修飾ＥＲＦＡＭ構成体は、１種以上の薬学的に利用可能な担体並びに随意で任意の他の治療性成分と共に利用される。
【０１２３】
担体は、組成物の他の成分に適合し、これの受容者にとって不適切に有害とならないという意味において、製薬利用に適合するものである。ＥＲＦＡＭ構成体は、本明細書で記載するような、所望する薬理学的効果、あるいは医学的に有益な効果を達成するのに有効な量で、且つ、所望する生体内での生物学的利用可能投与量あるいは濃度を達成するのに適切な量にて提供される。
【０１２４】
処方物には、腸管外投与に適切なものに加えて、非腸管外投与に適切なものも含まれ、具体的な投与様式には、経口、直腸、口腔内、局所、経鼻、経眼、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、鞘内、関節内、動脈内、くも膜下、気管支、リンパ、経膣、並びに子宮内投与が含まれる。エアロゾル並びに非経口投与（局所的投与並びに全身的投与両方）に適した処方物が好ましい。
【０１２５】
ＥＲＦＡＭ構成体が液体溶液を含む処方物にて利用される場合、この処方物は、経口的、気管支的、あるいは経腸的に投与されると有利である。ＥＲＦＡＭ構成体が液体懸濁処方物内に、あるいは生物的に適合する担体組成物内の粉体として使用される場合、この処方物を経口的、直腸的、あるいは気管支的に投与すると有利である。あるいは、担体ガス内粉体の噴霧化を介して、経鼻的にあるいは気管支経由で投与され、この噴霧化によって、患者が適切な噴霧化装置を含む呼吸回路から吸入する、粉体のガス状分散物が形成される。
【０１２６】
本発明のタンパク質を含む処方物は、便宜上、単位投与形態にて存在する場合があり、これは薬学の分野で周知の方法のいずれかによって調製される。一般に、当該方法には、活性成分を１種以上の補助成分を構成する担体と会合させる手順が含まれる。
【０１２７】
典型的には、この処方物は、活性成分を均一且つ緊密に、液体担体、微細に分割された固体担体、あるいはその両方と会合させることによって調製され、次に、必要に応じて、生成物を成形して所望する投与形態にする。
【０１２８】
経口投与に適切な本発明の処方物は、各々が前もって決定された量の活性成分を粉体あるいは顆粒として含有する、カプセル、カシェ剤、錠剤、あるいはトローチ等の個別の単位物として、あるいはシロップ、エリキシル、乳剤、あるいは１回分の液剤（ｄｒａｕｇｈｔ）等の水性液あるいは非水性液中の懸濁液として存在する場合がある。
【０１２９】
非経口投与に適切な処方物は、都合のよいことには、受容者の血液と等張であることができる（例えば生理食塩水等）、この活性結合体の滅菌水性調製物を含む。当該処方物には、懸濁化剤並びに増粘剤、あるいは、この化合物を血液成分あるいは１つ以上の臓器に向かわせるよう設計された他の微小粒子系が含まれる場合がある。この処方物は単位投与形態あるいは複数回投与形態にて存在する場合がある。
【０１３０】
経鼻スプレー組成物は、この活性結合体に保存剤並びに等張剤を含有する精製水性溶液を含む。当該処方物は、鼻粘膜に適合するｐＨ及び浸透圧の状態に調整することができる。
【０１３１】
直腸投与のための組成物は、カカオ脂、硬化脂肪、あるいは硬化脂肪系カルボン酸等の適切な担体と共に坐剤として存在する場合がある。点眼薬等の眼用処方物は、経鼻スプレーと同様の方法によって調製されるが、そのｐＨ及び等張性は眼に合わせて調整することができる。
【０１３２】
局所用処方物は、ミネラルオイル、鉱油、ポリヒドロキシアルコール、あるいは局所用製薬処方物に使用される他の基剤等の、１種以上の媒体に溶解された、あるいは懸濁された結合体を含む。
【０１３３】
前記成分に加えて、本発明の処方物にはさらに、稀釈剤、緩衝液、矯味矯臭剤、崩壊剤、界面活性剤、増粘剤、滑沢剤、保存剤（抗酸化剤を含む）等から選択される１種以上の補助成分が含まれる。前述の考察は、ＥＲＦＡＭ融合タンパク質（例えばＥＲＦＡＭ−ＨＳＡ融合体）にも適用される。
【０１３４】
従って、本発明には、本発明の説明となる用途として、ＥＲＦＡＭ構成体のインビトロ溶液内安定化に適した融合タンパク質の提供が含まれる。この融合タンパク質は、例えば、ＥＲＦＡＭ構成体のポリペプチド部分の酵素分解に対する耐性を増加させるために使用される場合があり、これは使用期限、室温安定性等を改良する対策を提供する。前記考察は、本発明のＥＲＦＡＭ構成体−血清アルブミン融合タンパク質（ヒト／ヒト化ＥＲＦＡＭ構成体−ヒト血清アルブミン融合タンパク質を含む。）にも適用されると理解される。
【０１３５】
治療方法
ポリマー結合ＥＲＦＡＭ構成体、及び改変ポリマー結合ＥＲＦＡＭ構成体並びに切断ポリマー結合ＥＲＦＡＭ構成体は、生きている動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトを含む霊長類体内の病理学的状態を処置あるいは緩和するために使用される場合があり、その障害あるいは疾患は免疫抑制型活性物の活性に対し応答するものである。好ましい病理学的状態は、患者内における不適当なアレルギー反応の状態である。
【０１３６】
活性分子作製の方法：
ファージディスプレイ（ＷＯ  ９０／０２８０９）によるペプチドリガンドの作製、及びアプタマーの作製（ＷＯ  ９２／１４８４３）は、これまでに記載されている。
【０１３７】
キット（ファージ及びそれぞれのオリゴヌクレオチドライブラリ）も、数多くの企業から市販されており、現在幅広く研究に使用されている。
【０１３８】
ＥＲＦＡＭあるいはＩｇＧ４を使用するアレルギー治療の方法
ＥＲＦＡＭ（あるいはアレルゲン特異的ＩｇＧ４）は、短期間の治療のためにアレルギー反応が起きている間に、もしくは当該反応のない間に、ＩｇＥ仲介アレルギーを有する患者に投与される。当業者は、治療的有効量を容易に決定することができ、最終目標は、処置を受けている患者においてアレルギー反応が劇的に減少する、あるいは消散することである。適切な期間の後（例えば翌日）、疑われるアレルゲンに対する皮膚プリック試験、あるいはアレルゲン誘発好塩基球脱顆粒（末梢血液を使用する）によって、ＥＲＦＡＭのアレルギー抑制効果を判定する。アレルギー反応が実際に減少していれば、免疫寛容を誘発してアレルギーを永久的に治療するために、ＥＲＦＡＭが保護する状態下でアレルゲンを投与する。
【０１３９】
本発明は、以下の実施例にてさらに詳細が記載されるが、これは特許請求の範囲において記載される発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【０１４０】
以下の実施例は、本発明の非限定的な種々の側面を例示することによって説明される。
【０１４１】
実施例１：抗ＩｇＥ抗体にＩｇＧ４抗体を結合させて得たＥＲＦＡＭ
抗ＩｇＥウサギポリクローナル抗体を、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ（Ｓｉｍｐｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。これは、ＫＪ  Ｄｏｒｒｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  ＨＨ  Ｂｅｎｎｉｃｈ（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｅ）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １９７８，４１：３−２６によって刊行されているように、ヒトＩｇＥ重鎖配列のＣε３ドメイン内に存在する残基３３５〜残基３５９のアミノ酸であるペプチドＧＶＳＡＹＬＳＲＰＳＰＦＤＬＦＩＲＫＳＰＴＩＴＣＬ（配列番号１）でウサギを免疫することによって得た。この抗体を、ＡｆｆｉｎｉｔｙＰａｋＴＭ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｖｉｄｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）に結合させたビオチン化標的ペプチド（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓによって合成）を使用してウサギ血清からアフィニティ精製し、さらにＳａｒｔｏｒｉｕｓ濃縮器（ＭＷＣＯ  １００，０００）を使用して濃縮した。抗体濃度は、ＰｉｅｒｃｅのＢＣＡタンパク質アッセイシステムを使用して測定した。ヒトＩｇＧ４抗体（ヒト骨髄腫血清からアフィニティ精製した）を、Ｓｉｇｍａ（カタログ番号Ｉ−４６８３）から購入した。ＥＲＦＡＭ化合物は、ＰｉｅｒｃｅのＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇキット（２３４５６）を用いてこの２つの抗体を架橋することによって作製した。
【０１４２】
概略を記すと、５００マイクロリットルのジメチルホルムアミドを加えて２ｍｇ  Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）を溶解し、続いて２８マイクロリットル（１０倍モルの過剰）を、２ｍｌの抗ＩｇＥ抗体（３ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ−ＥＤＴＡ溶液）に加え、スルフヒドリル基を分子に付加するために室温で３０分間インキュベートした。次に５ｍｇのヒドロキシアミンＨＣｌを１００マイクロリットルの結合緩衝液（キットのもの）にて溶解し、さらに２時間のインキュベーションの間に潜在的スルフヒドリル基を脱保護するために、ＳＡＴＡ修飾抗ＩｇＥ抗体に加えた。次に、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ濃縮器（ＭＷＣＯ  １００，０００）を使用して、未反応化合物を除去した。スルフヒドリル活性化抗体の濃度を、ＰｉｅｒｃｅのＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用して測定し、ＰＢＳ中に２ｍｇ／ｍｌとなるよう調整した。
【０１４３】
アフィニティ精製ヒトＩｇＧ４抗体を、上記キットの試薬を用いてマレイミド活性化した。２ｍｇのスルホ−スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を、２ｍｌのＰＢＳ中に溶解し、続いて１０マイクロリットル（１０倍モルの過剰）を５００マイクロリットルのヒトＩｇＧ４抗体（１ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ溶液）に加えた。３０分間インキュベーションした後、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ濃縮器（ＭＷＣＯ  １００，０００）を使用して、未反応のスルホ−ＳＭＣＣを除去した。マレイミド活性化抗体の濃度は、ＰｉｅｒｃｅのＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用して測定し、ＰＢＳ中に２ｍｇ／ｍｌとなるよう調整した。
【０１４４】
等量の２ｍｇ／ｍｌスルフヒドリル活性化抗ＩｇＥ抗体とマレイミド活性化ヒトＩｇＧ４抗体とを混合し、室温で６０分間インキュベートし、続いて１０ｍｌとなるようＰＢＳで稀釈して、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ濃縮器（ＭＷＣＯ  １００，０００）を使用して洗浄した。このＥＲＦＡＭ濃縮物はＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用して評価し、最終濃度２ｍｇ／ｍｌに調整した。ＥＲＦＡＭを２つに分注し、一方に、抗ＩｇＥ抗体の結合部位をブロックするためにＧＶＳＡＹＬＳＲＰＳＰＦＤＬＦＩＲＫＳＰＴＩＴＣＬ（配列番号１）の０．５ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ溶液を２０マイクロリットル加え、もう一方には等量のＰＢＳを加えた。ＥＲＦＡＭは、使用する少なくとも２４時間前まで４℃で保存した。
【０１４５】
末梢血単核細胞は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−８８８９）層上での遠心分離によって、血液から分離した。さらに、多形核好塩基球（ＰＢ）を、磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈのカタログ番号１３０−０５３−４０１、好塩基球単離キット）を使用して単離した。ＰＢに結合しているＩｇＥ分子は、Ｋｌｅｉｎら，Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１２６（４）：２７７−８５に記載されているように、乳酸緩衝液（１３．４ｍＭ乳酸、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ３．９）にて室温で３．５分間インキュベートすることによって剥離した。次に、Ｓｈｒｅｆｆｌｅｒら，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；１１３（４）：７７６−８２に記載されているように、ＰＢを、ＮＰ特異的キメラＩｇＥ抗体を含有する培養上清及びインターロイキン３（２ｎｇ／ｍｌ）存在下で、ＡＩＭ  Ｖ  細胞無血清培地にてインキュベートすることによってＮＰに感作した。
【０１４６】
次に、末梢血液単核細胞を再懸濁し（９６ウェルプレートにて、各ウェル当たり０．１ｍｌのＡＩＭ  Ｖ細胞培養液中に５０，０００個）、５０マイクロリットルのＡＩＭ  Ｖ透析ＮＰ特異的キメラＩｇＥ抗体を含有する、細胞培養物上清（これらをＮＰへ感作させるため）及び、２０マイクロリットルの２ｍｇ／ｍｌ  ＥＲＦＡＭ溶液（抗ＩｇＥ−ＩｇＧ４）あるいは、当量の、前もってブロッキングペプチドとインキュベートさせたＥＲＦＡＭ溶液存在下で一晩培養した。
【０１４７】
翌日、２０マイクロリットルのＮＰ−（６）−ウシ血清アルブミン（１ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに加え、さらに３７℃で１５分間インキュベートした。上清を回収して、後でヒスタミン放出を測定するために−２０℃で凍結し、一方細胞は、５ｍｌのＦＡＣＳ試験管に移して、４ｍｌの、１％ウシ胎仔血清及び０．１％アジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。続いて活性化状態を測定するために、ＰＢを染色した。活性化状態は、Ｂｏｕｍｉｚａら，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｙｇｙ．２００３；３３（２）：２５９−６５にて記載されているように、活性化マーカーであるＣＤ２０３ｃの、細胞表面での発現を評価することによって測定する。ＰＢを、抗ＩｇＥ  ＦＩＴＣ（Ｓｅｒｏｔｅｃ  ＳＴＡＲ９６Ｆ）、抗ＣＤ２０３ｃ  ＰＥ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ  ＩＭ３５７５）、ストレプトアビジン−ペリジニン−クロロフィルタンパク質複合体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ５５４０６４）と共に抗ＭＨＣＩＩビオチン（Ａｎｃｅｌｌ  １３１−０３０）、並びに抗ＣＤ４５  ＡＰＣ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ５５５４８５）で、室温で３０分間染色した。続いて未結合抗体を洗浄し、ＰＢを、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ装置を使用するフローサイトメトリによって分析した。
【０１４８】
図２に示した結果は、ＥＲＦＡＭ（抗ＩｇＥ−ＩｇＧ４）が好塩基球活性化（ＣＤ２０３ｃを発現するＩｇＥ＋細胞の割合として表している）を抑制し、一方で、ペプチドでブロックしたＥＲＦＡＭの抑制効果は減少していたことを示している。縦線は、３回行った測定の平均値＋標準偏差を表している。抗ＩｇＥ−ＩｇＧ４  ＥＲＦＡＭは、９３．９５％±０．６１％の好塩基球活性化を抑制することが確認され、ＥＲＦＡＭを、抗ＩｇＥを惹起したブロッキングペプチドと前もってインキュベートすると、その抑制活性は失われた。
【０１４９】
実施例２：ＩｇＥ結合オリゴヌクレオチドに抗ＦｃγＲ抗体を結合させて得たＥＲＦＡＭ
ＩｇＥ結合オリゴヌクレオチド５’−ＧＧＧＧＣＡＣＧＴＴＴＡＴＣＣＧＴＣＣＣＴＣＣＴＡＧＴＧＧＣＧＴＧＣＣＣＣ−３’（配列番号２）は、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｅｂｅｒｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。６個の炭素原子を含むスペーサーによってこのオリゴヌクレオチドに結合したチオール基を導入することによって、この５’末端を修飾した。このオリゴヌクレオチドのＩｇＥ結合特性は、Ｗｉｅｇａｎｄ  ＴＷ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＰＢ，Ｄｒｅｓｋｉｎ  ＳＣ，Ｊｏｕｖｉｎ  ＭＨ，Ｋｉｎｅｔ  ＪＰ，Ｔａｓｓｅｔ  Ｄ．（Ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｃ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＥ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｆｃ  ｅｐｓｉｌｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｉ），Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６；１５７（１）：２２１−３０によって報告されている。
【０１５０】
アフィニティ精製ヤギ抗ヒトＣＤ３２−Ｂポリクローナル抗体は、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（ｓｃ−１３２７１）から購入し、同様に、抗ヒトＣＤ−３２Ｂ抗体がＣＤ−３２Ｂに結合するのを妨げる、対応するブロッキングペプチド（カタログ番号ｓｃ−１３２７１Ｐ、これもＳａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ）も購入した。
【０１５１】
ＥＲＦＡＭ化合物は、ＰｉｅｒｃｅのＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｋｉｔ（２３４５６）を使用して、２つのオリゴヌクレオチドを抗ヒトＣＤ３２−Ｂ抗体に架橋させることによって作製した。アフィニティ精製抗ヒトＣＤ３２−Ｂ抗体は、上記キットの試薬を使用してマレイミド活性化した。２ｍｇのスルホ−スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を２ｍｌのＰＢＳに溶解し、続いて３マイクロリットル（１０倍モル過剰）を、１５０マイクロリットルの抗ヒトＣＤ３２−Ｂ抗体（１ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ溶液）に加えた。３０分間インキュベートした後、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ濃縮器（ＭＷＣＯ  １００，０００）を使用して、未反応のスルホ−ＳＮＣＣを除去した。マレイミド活性化抗体の濃度をＰｉｅｒｃｅのＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用して測定し、２ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液となるよう調整した。
【０１５２】
等量の、２ｍｇ／ｍｌ  スルフヒドリル含有ＩｇＥ結合オリゴヌクレオチドと、マレイミド活性化抗ＣＤ３２−Ｂ抗体をと混合して、室温で６０分間インキュベートし、続いてＰＢＳで１０ｍｌに稀釈し、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ濃縮器（ＭＷＣＯ  １００，０００）を使用して洗浄した。ＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用してこれの濃度を測定し、最終濃度を２ｍｇ／ｍｌに調整した。次に結果としてできる化合物を２つに分注した。一方の分注物には、抗ＣＤ３２−Ｂ抗体の結合部位をブロックするため、抗ＣＤ３２−Ｂ抗体が惹起されたペプチドの０．５ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ溶液を２０マイクロリットル加え、もう一方には等量のＰＢＳを加えた。このＥＲＦＡＭは、少なくとも使用する２４時間前まで４℃で保存した。
【０１５３】
末梢血単核細胞は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−８８８９）層上での遠心分離によって、血液から分離した。さらに、多形核好塩基球（ＰＢ）を、磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈのカタログ番号１３０−０５３−４０１、好塩基球単離キット）を使用して単離した。ＰＢに結合しているＩｇＥ分子は、Ｋｌｅｉｎら，Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１２６（４）：２７７−８５に記載されているように、乳酸緩衝液（１３．４ｍＭ乳酸、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ３．９）にて、室温で３．５分間インキュベートすることによって剥離した。次に、Ｓｈｒｅｆｆｌｅｒら，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；１１３（４）：７７６−８２に記載されているように、ＰＢを、ＮＰ特異的キメラＩｇＥ抗体を含有する細胞培養上清及びインターロイキン３（２ｎｇ／ｍｌ）存在下で、ＡＩＭ  Ｖ細胞無血清培地にてインキュベートすることによって感作した。
【０１５４】
次に、末梢血単核細胞を再懸濁し（９６ウェルプレートにて、各ウェル当たり０．１ｍｌのＡＩＭ  Ｖ細胞培養液中に５０，０００個）、５０マイクロリットルのＡＩＭ  Ｖ透析ＮＰ特異的キメラＩｇＥ抗体を含有する細胞培養物上清（これらをＮＰへ感作させるため。）及び、２０マイクロリットルの２ｍｇ／ｍｌ  ＥＲＦＡＭ溶液（ＩｇＥ結合オリゴヌクレオチド−抗ＣＤ３２−Ｂ）あるいは、等量の、前もってブロッキングペプチドとインキュベートさせたＥＲＦＡＭ溶液存在下で一晩培養した。
【０１５５】
翌日、２０マイクロリットルのＮＰ−（６）−ウシ血清アルブミン（１ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに加え、さらに３７℃で１５分間インキュベートした。上清を回収し、後でヒスタミン放出を測定するために−２０℃で凍結し、一方細胞は、５ｍｌのＦＡＣＳ試験管に移して、４ｍｌの、１％ウシ胎仔血清及び０．１％アジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。続いて活性化状態を測定するために、ＰＢを染色した。活性化状態は、Ｂｏｕｍｉｚａ  Ｒ，Ｍｏｎｎｅｒｅｔ  Ｇ，Ｆｏｒｉｓｓｉｅｒ  ＭＦ，Ｓａｖｏｙｅ  Ｊ，Ｇｕｔｏｗｓｋｉ  ＭＣ，Ｐｏｗｅｌｌ  ＷＳ，Ｂｉｅｎｖｅｎｕ  Ｊ．（Ｍａｒｋｅｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｓｏｐｈｉｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ  ｂｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ＣＤ２０３ｃ  ｉｎｓｔｅａｄ  ｏｆ  ＣＤ６３），Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ．２００３；３３（２）：２５９−６５にて記載されているように、活性化マーカーであるＣＤ２０３ｃの、細胞表面での発現を評価することによって測定した。ＰＢを、抗ＩｇＥ  ＦＩＴＣ（Ｓｅｒｏｔｅｃ  ＳＴＡＲ９６Ｆ）、抗ＣＤ２０３ｃ  ＰＥ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ  ＩＭ３５７５）、ストレプトアビジン−ペリジニン−クロロフィルタンパク質複合体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ５５４０６４）と共に抗ＭＨＣＩＩビオチン（Ａｎｃｅｌｌ  １３１−０３０）、並びに抗ＣＤ４５  ＡＰＣ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ５５５４８５）で、室温で３０分間染色した。続いて未結合抗体を洗浄し、ＰＢを、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ装置を使用するフローサイトメトリによって分析した。
【０１５６】
図２に示した結果は、ＥＲＦＡＭ（ＩｇＥ−結合オリゴヌクレオチド−抗ＣＤ３２−Ｂ）が好塩基球活性化（ＣＤ２０３ｃを発現するＩｇＥ＋細胞の割合として表している）を抑制し、一方で、ペプチドでブロックしたＥＲＦＡＭの抑制効果は減少していたことを示している。縦線は、３回行った測定の平均値＋標準偏差を表している。ＩｇＥ結合オリゴヌクレオチド−抗ＣＤ３２−Ｂ  ＥＲＦＡＭは、９５．７９％±０．５１％の好塩基球活性化を抑制することが確認され、ＥＲＦＡＭを、抗ＣＤ３２−Ｂ抗体が惹起されたブロッキングペプチドと前もってインキュベートした場合、その抑制活性は３４．８８％±１．９８％まで減少した。
【０１５７】
実施例３：抗ＦｃγＲ抗体を結合した抗ＩｇＥ抗体にポリエチレングリコールを結合させることによって得たＥＲＦＡＭ
抗ＩｇＥウサギポリクローナル抗体は、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ（Ｓｉｍｐｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。これは、ＫＪ  Ｄｏｒｒｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  ＨＨ  Ｂｅｎｎｉｃｈ（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｅ）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １９７８，４１：３−２６によって刊行されているように、ヒトＩｇＥ重鎖配列のＣε３ドメイン内に存在する残基３３５〜残基３５９のアミノ酸であるペプチドＧＶＳＡＹＬＳＲＰＳＰＦＤＬＦＩＲＫＳＰＴＩＴＣＬ（配列番号）でウサギを免疫することによって得られた。この抗体を、ＡｆｆｉｎｉｔｙＰａｋＴＭ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｖｉｄｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ  （Ｐｉｅｒｃｅ）に結合させたビオチン化標的ペプチド（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓによって合成）を使用してウサギ血清からアフィニティ精製し、さらにＳａｒｔｏｒｉｕｓ濃縮器（ＭＷＣＯ  １００，０００）を使用して濃縮した。抗体濃度は、ＰｉｅｒｃｅのＢＣＡタンパク質アッセイシステムを使用して測定した。ヤギ抗ヒトＣＤ３２−Ｂポリクローナル抗体は、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．から購入し（ｓｃ−１３２７１）、同様に、抗ヒトＣＤ３２−Ｂ抗体がＣＤ３２−Ｂに結合するのを阻害する、対応するブロッキングペプチド（これもＳａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．のカタログ番号ｓｃ−１３２７１Ｐ）も購入した。
【０１５８】
ＥＲＦＡＭ化合物は、ＰｉｅｒｃｅのＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｋｉｔ（２３４５６）を使用して、抗ＩｇＥ抗体を抗ヒトＣＤ３２−Ｂ抗体に架橋させることによって作製した。この架橋させた抗体に、さらに別の生物学的特性（免疫原生がより低く、より長い循環半減期を有する。）を有する分子を作製するために、活性化ポリエチレングリコール（分子量２０，０００ダルトン）を付加した。
【０１５９】
最初に、アフィニティ精製した抗ヒトＣＤ３２−Ｂ抗体を、上記キットの試薬を使用してマレイミド活性化した。２ｍｇのスルホ−スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を２ｍｌのＰＢＳに溶解し、続いて３マイクロリットル（１０倍モル過剰）を、１５０マイクロリットルの抗ヒトＣＤ３２−Ｂ抗体（１ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ溶液）に加えた。３０分間インキュベートした後、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ濃縮器（ＭＷＣＯ  １００，０００）を使用して、未反応のスルホ−ＳＮＣＣを除去した。マレイミド活性化抗体の濃度をＰｉｅｒｃｅのＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用して測定し、２ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液となるよう調整した。
【０１６０】
等量の２ｍｇ／ｍｌスルフヒドリル含有抗ＩｇＥ抗体とマレイミド活性化抗ＣＤ３２−Ｂ抗体とを混合し、室温で６０分間インキュベートして、続いて１０ｍＭホウ酸緩衝液ｐＨ  ８．５で１０ｍｌとなるよう稀釈し、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ濃縮器（ＭＷＣＯ  １００，０００）を使用して洗浄した。これの濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用して評価し、最終濃度を２ｍｇ／ｍｌに調整した。Ｂｅａｕｃｈａｍｐ  ＣＯ、Ｇｏｎｉａｓ  ＳＬ、Ｍｅｎａｐａｃｅ  ＤＰ、Ｐｉｚｚｏ  ＳＶ．（ポリエチレングリコール−タンパク質付加生成物を合成するための新しい方法；機能、受容体認識、及びジムスターゼ超酸化物、ラクトフェリン、並びに２−マクログロブリンのクリアランスに対する影響）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８３；１３１（１）：２５−３３によって記載されているように、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ，Ｆｌｕｋａカタログ番号９５１７２）を活性化した。概略を記すと、ＰＥＧをジオキサン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号２７，０５３−９）中に最終濃度５０  ｍＭとなるよう、３７℃に加熱して溶解し、続いて最終濃度０．５Ｍとなるよう１，１’−カルボニルジイミダゾール（Ｆｌｕｋａ、カタログ番号２１８６０）を加えた。この混合物を、振盪湯浴中にて３７℃で２時間インキュベートし、続いて、ＮＢＳ−ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓのＭｉｃｒｏＫｒｏｓ透析システム（カタログ番号Ｘ−１１Ｓ−１００）を使用して、２×１００ｍｌ  ＰＢＳ、続いて２×１００ｍｌの１０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液ｐＨ  ８．５でこれを透析した。０．１ｍｌのＥＲＦＡＭと０．１ｍｌの活性化ＰＥＧ（双方の化合物とも１０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液ｐＨ  ８．５に溶解させた）を次に混合し、４℃で４８時間インキュベートした。Ｓｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｍｉｎｉ−ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｕｎｉｔｃ（ＰｉｅｒｃｅのＭＷＣＯ  ３，５００  ｄａｌｔｏｎｓ、カタログ番号６９５５０）を使用する、ＰＢＳの透析（２×５０ｍｌ、透析各回６時間）によって、この緩衝液を置換し、続いてペグ化したＥＲＦＡＭを２つに分注した。一方の分注物には、抗ヒトＣＤ３２−Ｂ抗体の結合部位をブロックするため、抗ヒトＣＤ３２−Ｂ抗体を惹起したペプチドの０．５ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ溶液を２０マイクロリットル加え、もう一方には等量のＰＢＳを加えた。ＥＲＦＡＭは、少なくとも使用する２４時間前まで、４℃で保存した。
【０１６１】
末梢血単核細胞は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−８８８９）層上での遠心分離によって、血液から分離した。さらに、多形核好塩基球（ＰＢ）を、磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈのカタログ番号１３０−０５３−４０１、好塩基球単離キット）を使用して単離した。
【０１６２】
ＰＢに結合しているＩｇＥ分子は、Ｋｌｅｉｎ  Ｂｕｄｄｅ  Ｉ，ｄｅ  Ｈｅｅｒ  ＰＧ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｚｅｅ  ＪＳ，Ａａｌｂｅｒｓｅ  ＲＣ  （Ｔｈｅ  ｓｔｒｉｐｐｅｄ  ｂａｓｏｐｈｉｌ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｂｉｏａｓｓａｙ  ａｓ  ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｌｅｒｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＥ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ），  Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００１；１２６（４）：２７７−８５に記載されているように、乳酸緩衝液（１３．４ｍＭ乳酸、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ３．９）にて室温で３．５分間インキュベートすることによって剥離した。次に、Ｓｈｒｅｆｆｌｅｒ  ＷＧ、Ｂｅｙｅｒ  Ｋ、Ｃｈｕ  ＴＨ、Ｂｕｒｋｓ  ＡＷ、Ｓａｍｐｓｏｎ  ＨＡ．  （Ｍｉｃｒｏａｗｗａｙ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｈｉｓｔｏｒｙ，ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＩｇＥ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｍ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｌｌｅｒｇｅｎｉｃ  ｐｅａｎｕｔ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ），Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；１１３（４）：７７６−８２によって記載されているように、ＰＢを、ＮＰ特異的キメラＩｇＥ抗体を含有する培養上清及びインターロイキン３（２ｎｇ／ｍｌ）存在下で、ＡＩＭ  Ｖ  細胞無血清培地にてインキュベートすることによって感作した。
【０１６３】
こうして、末梢血単核細胞を再懸濁し（９６ウェルプレートにて、各ウェル当たり０．１ｍｌのＡＩＭ  Ｖ細胞培養液中に５０，０００個）、５０マイクロリットルのＡＩＭ  Ｖ透析ＮＰ特異的キメラＩｇＥ抗体を含有する、細胞培養物上（これらをＮＰへ感作させるため）及び、２０マイクロリットルの２ｍｇ／ｍｌ  ＥＲＦＡＭ溶液（抗ＩｇＥ抗体−ＰＥＧ−抗ＣＤ３２−Ｂ）あるいは、当量の、前もってブロッキングペプチドとインキュベートさせたＥＲＦＡＭ溶液存在下で一晩培養した。
【０１６４】
翌日、２０マイクロリットルのＮＰ−（６）−ウシ血清アルブミン（１ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに加え、さらに３７℃で１５分間インキュベートした。上清を回収し、後でヒスタミン放出を測定するために−２０℃で凍結し、一方細胞は、５ｍｌのＦＡＣＳ試験管に移して、４ｍｌの、１％ウシ胎仔血清及び０．１％アジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。続いて活性化状態を測定するために、ＰＢを染色した。活性化状態は、Ｂｏｕｍｉｚａ  Ｒ，Ｍｏｎｎｅｒｅｔ  Ｇ，Ｆｏｒｉｓｓｉｅｒ  ＭＦ，Ｓａｖｏｙｅ  Ｊ，Ｇｕｔｏｗｓｋｉ  ＭＣ，Ｐｏｗｅｌｌ  ＷＳ，Ｂｉｅｎｖｅｎｕ  Ｊ．（Ｍａｒｋｅｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｓｏｐｈｉｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ  ｂｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ＣＤ２０３ｃ  ｉｎｓｔｅａｄ  ｏｆ  ＣＤ６３），Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｙｇｙ．  ２００３；３３（２）：２５９−６５にて記載されているように、活性化マーカーであるＣＤ２０３ｃの、細胞表面での発現を評価することによって測定した。ＰＢを、抗ＩｇＥ  ＦＩＴＣ（Ｓｅｒｏｔｅｃ  ＳＴＡＲ９６Ｆ）、抗ＣＤ２０３ｃ  ＰＥ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ  ＩＭ３５７５）、ストレプトアビジン−ペリジニン−クロロフィルタンパク質複合体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ５５４０６４）と共に抗ＭＨＣＩＩビオチン（Ａｎｃｅｌｌ  １３１−０３０）、並びに抗ＣＤ４５  ＡＰＣ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ５５５４８５）で、室温で３０分間染色した。続いて未結合抗体を洗浄し、ＰＢを、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ装置を使用するフローサイトメトリによってＰＢを分析した。
【０１６５】
図２に示した結果は、ＥＲＦＡＭ（抗ＩｇＥ抗体−ＰＥＧ−抗ＣＤ３２−Ｂ）が好塩基球活性化（ＣＤ２０３ｃを発現するＩｇＥ＋細胞の割合として表している）を抑制し、一方で、ペプチドでブロックしたＥＲＦＡＭの抑制効果は減少していたことを示している。縦線は、３回行った測定の平均値＋標準偏差を表している。抗ＩｇＥ−ＰＥＧ−抗ＣＤ３２−Ｂ  ＥＲＦＡＭは、９５．２％±０．６８％の好塩基球活性化を抑制することが確認され、ＥＲＦＡＭを、抗ＣＤ３２−Ｂを惹起したブロッキングペプチドと前もってインキュベートすると、その抑制活性は失われた。
【０１６６】
実施例４：ＩｇＥ結合部分（抗ＩｇＥあるいはそのフラグメント、ペプチドあるいはオリゴヌクレオチド）を、抗ＦｃγＲ抗体（あるいはこれのＦａｂフラグメント）と結合させて得たＥＲＦＡＭ
抗ＩｇＥウサギポリクローナル抗体は、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ（Ｓｉｍｐｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。これは、ＫＪ  Ｄｏｒｒｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  ＨＨ  Ｂｅｎｎｉｃｈ（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｅ）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  １９７８，４１：３−２６によって刊行されているように、ヒトＩｇＥ重鎖配列のＣε３ドメイン内に存在する残基３３５〜残基３５９のアミノ酸であるペプチドＧＶＳＡＹＬＳＲＰＳＰＦＤＬＦＩＲＫＳＰＴＩＴＣＬ（配列番号１）でウサギを免疫することによって得た。この抗体を、ＡｆｆｉｎｉｔｙＰａｋＴＭ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｖｉｄｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ  （Ｐｉｅｒｃｅ）に結合させたビオチン化標的ペプチド（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓによって合成）を使用してウサギ血清からアフィニティ精製し、さらにＳａｒｔｏｒｉｕｓ濃縮器（ＭＷＣＯ  １００，０００）を使用して濃縮した。抗体濃度は、ＰｉｅｒｃｅのＢＣＡタンパク質アッセイシステムを使用して測定した。アフィニティ精製ヤギ抗ヒトＣＤ３２−Ｂポリクローナル抗体は、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．から購入した（ｓｃ−１３２７１）。ＥＲＦＡＭ化合物は、ＰｉｅｒｃｅのＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇキット（２３４５６）を使用してこの２つの抗体を架橋させることによって作製した。
【０１６７】
概略を記すと、５００マイクロリットルのジメチルホルムアミドを加えて２ｍｇ  Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）を溶解し、続いて２８マイクロリットル（１０倍モルの過剰となる）を、２ｍｌの抗ＩｇＥ抗体（３ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ−ＥＤＴＡ溶液）に加え、スルフヒドリル基をこの分子に付加するために室温で３０分間インキュベートした。次に５ｍｇのヒドロキシアミンＨＣｌを１００マイクロリットルの結合緩衝液（キットのもの）にて溶解し、さらに２時間のインキュベーションの間に潜在的スルフヒドリル基を脱保護するために、ＳＡＴＡ修飾抗ＩｇＥ抗体に加えた。次に、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ濃縮器（ＭＷＣＯ  １００，０００）を使用して、未反応化合物を除去した。スルフヒドリル活性化抗体の濃度は、ＰｉｅｒｃｅのＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用して測定し、ＰＢＳ中に２ｍｇ／ｍｌとなるよう調整した。
【０１６８】
アフィニティ精製抗ヒトＣＤ３２−Ｂ抗体は、前記キットの試薬を用いてマレイミド活性化した。２ｍｇのスルホ−スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を、２ｍｌのＰＢＳ中に溶解し、続いて３マイクロリットル（１０倍モルの過剰）を１５０マイクロリットルの抗ヒトＣＤ３２−Ｂ抗体（１ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ溶液）に加えた。３０分間インキュベーションした後、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ濃縮器（ＭＷＣＯ  １００，０００）を使用して、未反応のスルホ−ＳＭＣＣを除去した。マレイミド活性化抗体の濃度は、ＰｉｅｒｃｅのＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用して測定し、２ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液となるよう調整した。
【０１６９】
等量の２ｍｇ／ｍｌスルフヒドリル活性化抗ＩｇＥ抗体とマレイミド活性化抗ＣＤ３２−Ｂ抗体とを混合し、室温で６０分間インキュベートし、結果として生じた化合物を２つに分注した。一方に、抗ＩｇＥ抗体の結合部位をブロックするためにペプチドＧＶＳＡＹＬＳＲＰＳＰＦＤＬＦＩＲＫＳＰＴＩＴＣＬ（配列番号１）の０．５ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ溶液を２０マイクロリットル加え、もう一方には等量のＰＢＳを加えた。ＥＲＦＡＭは、使用する少なくとも２４時間前まで４℃で保存した。
【０１７０】
末梢血単核細胞は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−８８８９）レイヤーの遠心分離によって、血液から分離した。さらに、多形核好塩基球（ＰＢ）を、磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈのカタログ番号１３０−０５３−４０１、好塩基球単離キット）を使用して単離した。
【０１７１】
ＰＢに結合しているＩｇＥ分子は、乳酸緩衝液（１３．４ｍＭ乳酸、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ３．９）にて室温で３．５分間インキュベートすることによって剥離した。次に、末梢血単核細胞を再懸濁し（９６ウェルプレートにて、各ウェル当たり０．１ｍｌのＡＩＭ  Ｖ細胞培養液中に５０，０００個）、５０マイクロリットルのＡＩＭ  Ｖ透析ＮＰ特異的キメラＩｇＥ抗体を含有する細胞培養物上清（これらをＮＰへ感作させるため）及び、２０マイクロリットルの２ｍｇ／ｍｌ  ＥＲＦＡＭ溶液（抗ＩｇＥ＊抗ＣＤ３２−Ｂ）あるいは、当量の、前もってブロッキングペプチドとインキュベートさせたＥＲＦＡＭ溶液存在下で一晩培養した。
【０１７２】
翌日、２０マイクロリットルのＮＰ−（６）−ウシ血清アルブミンを各ウェルに加え、さらに３７℃で１５分間インキュベートした。上清を回収し、後でヒスタミン放出を測定するために−２０℃で凍結し、一方細胞は、５ｍｌのＦＡＣＳ試験管に移して、４ｍｌの、１％ウシ胎仔血清及び０．１％アジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。続いて、ＰＢを、抗ＩｇＥ  ＦＩＴＣ（Ｓｅｒｏｔｅｃ  ＳＴＡＲ９６Ｆ）、抗ＣＤ２０３ｃ  ＰＥ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ  ＩＭ３５７５）、ストレプトアビジン−ペリジニン−クロロフィルタンパク質複合体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ５５４０６４）と共に抗ＭＨＣＩＩビオチン（Ａｎｃｅｌｌ  １３１−０３０）、並びに抗ＣＤ４５  ＡＰＣ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ５５５４８５）で、室温で３０分間染色した。続いて未結合抗体を洗浄し、ＰＢを、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ装置を使用するフローサイトメトリによって分析した。
【０１７３】
図３に示した結果は、ＥＲＦＡＭ（作動可能に抗ＣＤ３２−Ｂを連結させた抗ＩｇＥ）が好塩基球活性化（ＣＤ２０３ｃを発現するＩｇＥ＋細胞の割合として表している）を抑制し、一方で、ペプチドでブロックしたＥＲＦＡＭの抑制効果は減少していたことを示している。縦線は、３回行った測定の平均値＋標準偏差を表している。
【０１７４】
実施例５：やはりアレルギー抑制効果作用のあるアレルゲン特異的ＩｇＧ４抗体によって表されるＲＦＡＭ等価物
アレルゲン特異的ＩｇＧ４は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｐｏｏｌｅ，  ＵＫ）の抗ヒトＩｇＧ４抗体を使用する、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＨＰカラム（Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，  ＵＫ、カタログ番号＃１７−０７１６−０１）等のアフィニティカラムで血漿から分離する。続いて溶出されたＩｇＧ４をＩｇＥ感作好塩基球に加え、先に記載したように、アレルゲン特異的ＩｇＧ４の、ＩｇＥ仲介好塩基球脱顆粒化能を測定する。
【０１７５】
実施例６：ＩｇＥ結合部分（抗ＩｇＥあるいはそのフラグメント、ペプチドあるいはオリゴヌクレオチド）を、抗ＣＤ３１抗体あるいはそのＦａｂフラグメントと結合させて得たＥＲＦＡＭ
抗ＩｇＥウサギポリクローナル抗体は、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ  （Ｓｉｍｐｓｏｎｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）から購入した。これは、ＫＪ  Ｄｏｒｒｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  ＨＨ  Ｂｅｎｎｉｃｈ  （Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｅ）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  １９７８，  ４１：３−２６によって刊行されているように、ヒトＩｇＥ重鎖配列のＣε３ドメイン内に存在する残基３３５〜残基３５９のアミノ酸であるペプチドＧＶＳＡＹＬＳＲＰＳＰＦＤＬＦＩＲＫＳＰＴＩＴＣＬ（配列番号１）でウサギを免疫することによって得た。この抗体を、ＡｆｆｉｎｉｔｙＰａｋＴＭ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｖｉｄｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ  （Ｐｉｅｒｃｅ）に結合させたビオチン化標的ペプチド（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓによって合成）を使用してウサギ血清からアフィニティ精製し、さらにＳａｒｔｏｒｉｕｓ濃縮器（ＭＷＣＯ  １００，０００）を使用して濃縮した。抗体濃度は、ＰｉｅｒｃｅのＢＣＡタンパク質アッセイシステムを使用して測定した。アフィニティ精製マウス抗ヒトＣＤ３１モノクローナル抗体は、Ｓｅｒｏｔｅｃ  から購入した（ＭＣＡ  １７３８）。ＥＲＦＡＭ化合物は、ＰｉｅｒｃｅのＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇキット（２３４５６）を使用してこの２つの抗体を架橋させることによって作製した。
【０１７６】
概略を記すと、５００マイクロリットルのジメチルホルムアミドを加えて２ｍｇ  Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）を溶解し、続いて２８マイクロリットル（１０倍モルの過剰となる）を、２ｍｌの抗ＩｇＥ抗体（３ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ−ＥＤＴＡ溶液）に加え、スルフヒドリル基をこの分子に付加するために室温で３０分間インキュベートした。次に５ｍｇのヒドロキシアミンＨＣｌを１００マイクロリットルの結合緩衝液（キットのもの）にて溶解し、さらに２時間のインキュベーションの間に潜在的スルフヒドリル基を脱保護するために、ＳＡＴＡ修飾抗ＩｇＥ抗体に加えた。次に、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ濃縮器（ＭＷＣＯ  １００，０００）を使用して、未反応化合物を除去した。スルフヒドリル活性化抗体の濃度は、ＰｉｅｒｃｅのＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用して測定し、ＰＢＳ中に２ｍｇ／ｍｌとなるよう調整した。
【０１７７】
アフィニティ精製抗ヒトＣＤ３１抗体は、上記キットの試薬を用いてマレイミド活性化した。２ｍｇのスルホ−スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を、２ｍｌのＰＢＳ中に溶解し、続いて３マイクロリットル（１０倍モルの過剰。）を１５０マイクロリットルの抗ヒトＣＤ３１抗体（１ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ溶液）に加えた。３０分間インキュベートした後、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ濃縮器（ＭＷＣＯ  １００，０００）を使用して、未反応スルホ−ＳＭＣＣを除去した。マレイミド活性化抗体の濃度は、ＰｉｅｒｃｅのＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用して測定し、ＰＢＳ中に２ｍｇ／ｍｌとなるよう調整した。
【０１７８】
等量の２ｍｇ／ｍｌメルカプト活性化抗ＩｇＥ抗体とマレイミド活性化抗ＣＤ３１抗体を混合し、室温で６０分間インキュベートし、結果生じた化合物を２つに分注した。一方に、抗ＩｇＥ抗体の結合部位をブロックするためにペプチドＧＶＳＡＹＬＳＲＰＳＰＦＤＬＦＩＲＫＳＰＴＩＴＣＬ（配列番号１）の０．５ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ溶液を２０マイクロリットル加え、もう一方には等量のＰＢＳを加えた。ＥＲＦＡＭは、使用する少なくとも２４時間前まで４℃で保存した。
【０１７９】
末梢血単核細胞は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−８８８９）層上での遠心分離によって、血液から分離した。さらに、多形核好塩基球（ＰＢ）を、磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈのカタログ番号１３０−０５３−４０１、好塩基球単離キット）を使用して単離した。
【０１８０】
ＰＢに結合しているＩｇＥ分子は、乳酸緩衝液（１３．４ｍＭ乳酸、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ３．９）にて室温で３．５分間インキュベートすることによって剥離した。次に、末梢血単核細胞を再懸濁し（９６ウェルプレートにて、各ウェル当たり０．１ｍｌのＡＩＭ  Ｖ細胞培養液中に５０，０００個）、５０マイクロリットルのＡＩＭ  Ｖ透析ＮＰ特異的キメラＩｇＥ抗体を含有する細胞培養物上清（これらをＮＰへ感作させるため）及び、２０マイクロリットルの２ｍｇ／ｍｌ  ＥＲＦＡＭ溶液（抗ＩｇＥ抗ＣＤ３１）あるいは、当量の、前もってブロッキングペプチドとインキュベートさせたＥＲＦＡＭ溶液存在下で一晩培養した。
【０１８１】
翌日、２０マイクロリットルのＮＰ−（６）−ウシ血清アルブミン（１ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ溶液）を各ウェルに加え、さらに３７℃で１５分間インキュベートした。上清を回収し、後でヒスタミン放出を測定するために−２０℃で凍結し、一方細胞は、５ｍｌのＦＡＣＳ試験管に移して、４ｍｌの、１％ウシ胎仔血清及び０．１％アジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。続いて、ＰＢを、抗ＩｇＥ  ＦＩＴＣ（Ｓｅｒｏｔｅｃ  ＳＴＡＲ９６Ｆ）、抗ＣＤ２０３ｃ  ＰＥ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ  ＩＭ３５７５）、ストレプトアビジン−ペリジニン−クロロフィルタンパク質複合体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ５５４０６４）と共に抗ＭＨＣＩＩビオチン（Ａｎｃｅｌｌ  １３１−０３０）、並びに抗ＣＤ４５  ＡＰＣ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ５５５４８５）で、室温で３０分間染色した。続いて未結合抗体を洗浄し、ＰＢを、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ装置を使用するフローサイトメトリによって分析した。
【０１８２】
図３に示した結果は、ＥＲＦＡＭ（抗ＩｇＥ−抗ＣＤ３１）が好塩基球活性化（ＣＤ２０３ｃを発現するＩｇＥ＋細胞の割合として表している）を抑制し、一方で、ペプチドでブロックしたＥＲＦＡＭの抑制効果は減少していたことを示している。縦線は、３回行った測定の平均値＋標準偏差を表している。
【０１８３】
実施例７：ＩｇＥ結合部分（抗ＩｇＥあるいはそのフラグメント、ペプチドあるいはオリゴヌクレオチド）を、抗抗ＦｃγＲ抗体あるいはそのＦａｂフラグメントと結合させることによって得たＥＲＦＡＭと、ＩｇＥ結合部分（抗ＩｇＥあるいはそのフラグメント、ペプチドあるいはオリゴヌクレオチド）を、抗ＣＤ３１抗体あるいはそのＦａｂフラグメントと結合させるこによって得られた別のＥＲＦＡＭとの混合物の効果
２つのＥＲＦＡＭ分子、抗ＩｇＥ−抗ＣＤ３２Ｂ並びに抗ＩｇＥ−抗ＣＤ３１を、先に記載したように作製した。これらを試験するために、これらの各々を２０マイクロリットル、記載したようにＰＢに加え、結果生じる抑制効果を評価した。
【０１８４】
実施例８：抗ＩｇＥ抗体に、抗ＦｃγＲ抗体のＦａｂフラグメントを結合させて得たＥＲＦＡＭ
抗ＩｇＥウサギポリクローナル抗体は、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ  （Ｓｉｍｐｓｏｎｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）から購入した。これは、ＫＪ  Ｄｏｒｒｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  ＨＨ  Ｂｅｎｎｉｃｈ  （Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｅ）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  １９７８，４１：３−２６によって刊行されているように、ヒトＩｇＥ重鎖配列のＣε３ドメイン内に存在する残基３３５〜残基３５９のアミノ酸であるペプチドＧＶＳＡＹＬＳＲＰＳＰＦＤＬＦＩＲＫＳＰＴＩＴＣＬでウサギを免疫することによって得た。この抗体を、ＡｆｆｉｎｉｔｙＰａｋＴＭ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｖｉｄｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ  （Ｐｉｅｒｃｅ）に結合させたビオチン化標的ペプチド（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓによって合成）を使用してウサギ血清からアフィニティ精製し、さらにＳａｒｔｏｒｉｕｓ濃縮器（ＭＷＣＯ  １００，０００）を使用して濃縮した。抗体濃度は、ＰｉｅｒｃｅのＢＣＡタンパク質アッセイシステムを使用して測定した。アフィニティ精製ヤギ抗ヒトＣＤ３２−Ｂポリクローナル抗体は、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（ｓｃ−１３２７１）から購入した。この抗体を、ＰｉｅｒｃｅのＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  Ｆａｂ  調製キット（カタログ番号４４８８５）を使用して、パパインで分解した。概略を記すと、４２ｍｇのシステインＨＣｌを１２ｍｌのリン酸緩衝液ｐＨ  １０に溶解して（両試薬ともキットのもの）、１２ｍｌの分解緩衝液を調製した。０．２ｍｌのパパインスラリーを１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、１ｍｌの分解緩衝液で３回洗浄した（１０００ｇで３０秒の遠心分離）。続いてこの緩衝液を除去し、１００マイクロリットルの抗ＣＤ３２−Ｂ及び１００マイクロリットルの緩衝液を加えた。このエッペンドルフを、３７℃の振盪湯浴中で１６時間インキュベートし、続いて再び遠心分離して分解された抗体を含有する上清を回収した。次に、この上清を別の１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移し、０．２ｍｌ固定化タンパク質Ａ（ＰｉｅｒｃｅのＩｍｍｕｎｏｐｕｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  抗体精製キットのもの、カタログ番号４４６６７）と混合してさらに室温で３０分間インキュベートした。遠心分離、及びＰｉｅｒｃｅのＳｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｚｅｒ  ＭｉｃｒｏＤｉａｌｙｓｉｓユニット（カタログ番号６９５５０）を使用する２×５０ｍｌ  ＰＢＳでの透析によって、Ｆａｂフラグメントを含有する上清を回収した。結果として得られたＦａｂ溶液を、Ｓｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｚｅｒ濃縮液（Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号６６５２８）を使用して濃縮した。最終Ｆａｂ濃度をＰｉｅｒｃｅのＢＣＡタンパク質アッセイキット（カタログ番号２３２２５）を使用して測定し、ｐＨ  ７．４のＰＢＳ中に０．５ｍｇ／ｍｌとなるよう調整した。
【０１８５】
ＥＲＦＡＭ化合物は、ＰｉｅｒｃｅのＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｋｉｔ（２３４５６）を使用して、抗体にこのＦａｂフラグメントを架橋させることによって作製した。
【０１８６】
概略を記すと、５００マイクロリットルのジメチルホルムアミドを加えて２ｍｇ  Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）を溶解し、続いて２８マイクロリットル（１０倍モルの過剰となる）を、２ｍｌの抗ＩｇＥ抗体（３ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ−ＥＤＴＡ溶液）に加え、スルフヒドリル基を分子に付加するために室温で３０分間インキュベートした。次に５ｍｇのヒドロキシアミンＨＣｌを１００マイクロリットルの結合緩衝液（キットのもの）にて溶解し、さらに２時間のインキュベーションの間に潜在的スルフヒドリル基を脱保護するために、ＳＡＴＡ修飾抗ＩｇＥ抗体に加えた。次に、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ濃縮器（ＭＷＣＯ  １００，０００）を使用して、未反応化合物を除去した。メルカプト活性化抗体の濃度は、ＰｉｅｒｃｅのＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用して測定し、ＰＢＳ中に２ｍｇ／ｍｌとなるよう調整した。
【０１８７】
抗ヒトＣＤ３２−Ｂ抗体のＦａｂフラグメントは、上記キットの試薬を用いてマレイミド活性化した。２ｍｇのスルホ−スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を、２ｍｌのＰＢＳ中に溶解し、続いて２マイクロリットル（１０倍モルの過剰。）を５０マイクロリットルの抗ヒトＣＤ３２−Ｂ抗体（０．５ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ溶液）に加えた。３０分間インキュベーションした後、ＰｉｅｒｃｅのＳｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｚｅｒ  ＭｉｃｒｏＤｉａｌｙｓｉｓユニット（カタログ番号６９５５０）を使用して、未反応のスルホ−ＳＭＣＣを除去した。
【０１８８】
等量の  ０．５ｍｇ／ｍｌスルフヒドリル活性化抗ＩｇＥ抗体とマレイミド活性化した抗ヒトＣＤ３２−Ｂ抗体のＦａｂフラグメントとを混合し、室温で６０分間インキュベートし、続いて結果として得られた化合物を２つに分注した。一方の分注物に、抗ＩｇＥ抗体の結合部位をブロックするためにペプチドＧＶＳＡＹＬＳＲＰＳＰＦＤＬＦＩＲＫＳＰＴＩＴＣＬ（配列番号１）の０．５ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ溶液を２０マイクロリットル加え、もう一方には等量のＰＢＳを加えた。ＥＲＦＡＭは、使用する少なくとも２４時間前まで４℃で保存した。
【０１８９】
末梢血単核細胞は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−８８８９）層上での遠心分離によって、血液から分離した。さらに、多形核好塩基球（ＰＢ）を、磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈの好塩基球単離キット、カタログ番号１３０−０５３−４０１）を使用して単離した。
【０１９０】
ＰＢに結合しているＩｇＥ分子は、乳酸緩衝液（１３．４ｍＭ乳酸、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ３．９）にて室温で３．５分間インキュベートすることによって剥離した。次に、末梢血単核細胞を再懸濁し（９６ウェルプレートにて、各ウェル当たり０．１ｍｌのＡＩＭ  Ｖ細胞培養液中に５０，０００個）、５０マイクロリットルのＡＩＭ  Ｖ透析ＮＰ特異的キメラＩｇＥ抗体を含有する、細胞培養物上清（これらをＮＰへ感作させるため）及び、２０マイクロリットルの２ｍｇ／ｍｌ  ＥＲＦＡＭ溶液（抗ヒトＣ３２−Ｂ抗体のＦａｂフラグメントを結合させた抗ＩｇＥ）あるいは、当量の、前もってブロッキングペプチドとインキュベートさせたＥＲＦＡＭ溶液存在下で一晩培養した。
【０１９１】
翌日、２０マイクロリットルのＮＰ−（６）−ウシ血清アルブミン（１ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに加え、さらに３７℃で１５分間インキュベートした。上清を回収し、後でヒスタミン放出を測定するために−２０℃で凍結し、一方細胞は、５ｍｌのＦＡＣＳ試験管に移して、４ｍｌの、１％ウシ胎仔血清及び０．１％アジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。続いて、ＰＢを、抗ＩｇＥ  ＦＩＴＣ（Ｓｅｒｏｔｅｃ  ＳＴＡＲ９６Ｆ）、抗ＣＤ２０３ｃ  ＰＥ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ  ＩＭ３５７５）、ストレプトアビジン−ペリジニン−クロロフィルタンパク質複合体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ５５４０６４）と共に抗ＭＨＣＩＩビオチン（Ａｎｃｅｌｌ  １３１−０３０）、並びに抗ＣＤ４５  ＡＰＣ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ５５５４８５）で、室温で３０分間染色した。続いて未結合抗体を洗浄し、ＰＢを、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ装置を使用するフローサイトメトリによって分析した。
【０１９２】
図４に示した結果は、ＥＲＦＡＭ（抗ヒトＣ３２−Ｂ抗体のＦａｂフラグメントを結合させた抗ＩｇＥ）が好塩基球活性化（ＣＤ２０３ｃを発現するＩｇＥ＋細胞の割合として表している）を抑制し、一方で、ペプチドでブロックしたＥＲＦＡＭの抑制効果は減少していたことを示している。縦線は、３回行った測定の平均値＋標準偏差を表している。抗ヒトＣ３２−Ｂ抗体のＦａｂフラグメントを結合させた抗ＩｇＥ  ＥＲＦＡＭは、８７．３８％±１．５５％の好塩基球活性化を抑制することが確認され、この抑制効果は、このＥＲＦＡＭを、抗ＩｇＥを惹起したブロッキングペプチドと前もってインキュベートすると、３０．８９％±２．４２％にまで減少した。
【０１９３】
均等論
本明細書にて特定の実施形態を詳細に開示してきたが、これは説明のみを目的とする例として行ったものであって、開示した発明の正しい形態、あるいは、添付された特許請求の範囲に関して制限することを意図しない。特に、特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な置換、変更、並びに改変が本発明に対してなされ得ることを、発明者らは企図している。様々な変更あるいは改変は、本明細書に記載された実施形態の知識を有する当業者にとって、慣用的な事項であると考えられる。他の側面、利点、及び改変は、添付の特許請求の範囲内にあると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１９４】
【図１】図１は、ＩｇＥ再標的化機能変更分子（ＥＲＦＡＭ）の設計および作用様式を表すものである。そのような分子は、そのＦｃ領域においてＩｇＥと結合し、その結果ＩｇＥのＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩおよびＦｃεＲＩＩ）への結合を阻害する。同時に、ＥＲＦＡＭは、異なる機能を有する受容体に特異的な異なる結合部位を提供し、それによってＩｇＥをアレルギー抑制性抗体に変換する。ＥＲＦＡＭ依存的再標的化によって、抗原が、ＦｃεＲＩ結合ＩｇＥと抑制性受容体（例えばＦｃγＲＩＩｂ）に結合したＩｇＥの双方を有する免疫エフェクター細胞（例えばマスト細胞あるいはＢ細胞）に到達した時、ＦｃεＲＩとＦｃγＲＩＩｂとの架橋がアレルギーエフェクター活性化の抑制を導く。
【図２】図２は、本発明の例示的なＥＲＦＡＭを使用する、好塩基球活性化の抑制を示す棒グラフである。
【図３】図３は、本発明の例示的なＥＲＦＡＭを使用する、好塩基球活性化の抑制を示す棒グラフである。
【図４】図４は、本発明の例示的なＥＲＦＡＭを使用する、好塩基球活性化の抑制を示す棒グラフである。
【図１】
2008513351.tif 000003
【図２】
2008513351.tif 000004
【図３】
2008513351.tif 000005
【図４】
2008513351.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成19年3月9日(2007.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008513351000001.app