(57)【要約】本教示は標的配列を選択的に増幅し、検出するための組成物、方法およびキットに関する。一部の実施形態において、標的配列を選択的に増幅する環状化可能なプローブおよび／またはプローブ対が開示される。選択的に増幅された標的配列の検出方法である標的配列の選択的な増幅方法も開示される。開示された方法の一定の実施形態は、環状化可能なプローブ、第１プローブと第２プローブを含むプローブ対、またはその両方を含む。一定の実施形態において、多数の異なる環状化可能なプローブ、多数の異なるプローブセットまたは多数の異なる環状化可能なプローブおよび多数の異なるプローブセットが、多数の異なる標的配列を、通常は多重反応で選択的に増幅または検出するために提供される。
2008527979.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）第１標的相補性部分、（ｂ）第２標的相補性部分、および（ｃ）スペーサー部分を含み、該第１標的相補性部分は、４ヌクレオチド塩基：（１）Ａ、（２）Ｃ、（３）Ｇおよび（４）Ｔ、ＵまたはＴおよびＵのうち３つを含むが、第４ヌクレオチド塩基を含まず、該第２標的相補性部分および該スペーサー部分は、それぞれ該第１標的相補性部分と同じ３ヌクレオチド塩基を含むが第４ヌクレオチド塩基を含まない、プローブ。
【請求項２】
前記第１標的相補性部分、前記第２標的相補性部分、または該第１標的相補性部分および該第２標的相補性部分が、さらにユニバーサル塩基を含む、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
前記ユニバーサル塩基が前記プローブに存在しない第４ヌクレオチド塩基の代わりに用いられる、請求項２に記載のプローブ。
【請求項４】
標的相補性部分を含むプローブであって、該プローブにおいて、該標的相補性部分が、４ヌクレオチド塩基：（１）Ａ、（２）Ｃ、（３）Ｇおよび（４）Ｔ、ＵまたはＴおよびＵのうち３つを含むが第４ヌクレオチド塩基を含まず、該プローブ中のいずれかのさらなるヌクレオチド塩基が該標的相補性部分と同じ３ヌクレオチド塩基を含むが第４ヌクレオチド塩基を含まない、プローブ。
【請求項５】
前記標的相補性部分がさらにユニバーサル塩基を含む、請求項４に記載のプローブ。
【請求項６】
前記ユニバーサル塩基が、前記プローブに存在しない第４ヌクレオチド塩基の代わりに用いられる、請求項５に記載のプローブ。
【請求項７】
第１プローブと第２プローブを含むプローブ対であって、該プローブ対において、該第１プローブが、４ヌクレオチド塩基：（１）Ａ、（２）Ｃ、（３）Ｇおよび（４）Ｔ、ＵまたはＴおよびＵのうち３つを含むが第４ヌクレオチド塩基を含まない第１標的相補性部分を含み、該第２プローブが、該第１標的相補性部分と同じ３ヌクレオチド塩基を含むが第４ヌクレオチド塩基を含まない第２標的相補性部分を含む、プローブ対。
【請求項８】
前記第１プローブ、前記第２プローブ、または該第１プローブおよび該第２プローブが、さらにユニバーサル塩基を含む、請求項７に記載のプローブ対。
【請求項９】
前記ユニバーサル塩基が、前記プローブに存在しない第４ヌクレオチド塩基の代わりに用いられる、請求項８に記載のプローブ。
【請求項１０】
多数の非標的配列の存在下で標的配列を選択的に増幅する方法であって、該方法において、
４ヌクレオチド塩基：（１）Ａ、（２）Ｃ、（３）Ｇおよび（４）Ｔ、ＵまたはＴおよびＵのうち３つを含むが第４ヌクレオチド塩基を含まないプローブを該標的配列にハイブリダイズさせる工程；
（ａ）伸長酵素および（ｂ）４ヌクレオチド塩基：（１）Ａ、（２）Ｃ、（３）Ｇおよび（４）Ｔ、ＵまたはＴおよびＵのうち３つを含むが第４ヌクレオチド塩基を含まない第１反応組成物中で該標的配列を選択的に増幅する工程であって、該反応組成物中の該３ヌクレオチド塩基のそれぞれが該プローブ中の該３ヌクレオチド塩基の１つの相補体である第１増幅産物を作る工程を含む、方法。
【請求項１１】
前記プローブがさらにユニバーサル塩基を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記選択的に増幅する工程が、等温増幅を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
さらにライゲーション剤を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１増幅産物が、さらにレポーター基、親和性タグ、移動度変更剤、ハイブリダイゼーションタグ、プライマー結合部分、レポータープローブ結合部分またはそれらの組合せを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
さらに、前記第１増幅産物を増幅して、第２増幅産物を生じる工程を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１増幅産物、前記第２増幅産物、または該第１増幅産物および該第２増幅産物が、さらにレポーター基、親和性タグ、移動度変更剤、ハイブリダイゼーションタグ、プライマー結合部分、レポータープローブ結合部分またはそれらの組合せを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
さらに、鎖侵入構造を作る工程を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記鎖侵入構造が、ＰＮＡを含むオリゴマーを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的配列が二本鎖であり、少なくとも部分的に変性している、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記変性が、熱変性、化学変性、ヘリカーゼまたはそれらの組合せを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
さらに、連結型プローブを遊離する工程を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
前記遊離する工程が、熱変性、化学変性、ヘリカーゼ、ＰＮＡオリゴマー、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴマーを含むプライマー、またはそれらの組合せを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記選択的に増幅する工程がサーモサイクリングを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２４】
標的配列を検出する方法であって、該方法において、
（ａ）第１標的相補性部分、（ｂ）第２標的相補性部分および（ｃ）スペーサー部分を含み、該第１標的相補性部分が４ヌクレオチド塩基：（１）Ａ、（２）Ｃ、（３）Ｇおよび（４）Ｔ、ＵまたはＴおよびＵのうち３つを含むが第４ヌクレオチド塩基を含まず、該第２標的相補性部分と該スペーサー部分のそれぞれが該第１標的相補性部分と同じ３ヌクレオチド塩基を含むが第４ヌクレオチド塩基を含まないプローブを該標的配列にハイブリダイズさせる工程；
該プローブの５’−末端を該プローブの３’−末端に連結して、連結型プローブを作る工程；
第１プライマーを該連結型プローブにハイブリダイズさせる工程；
４ヌクレオチド塩基：（１）Ａ、（２）Ｃ、（３）Ｇおよび（４）Ｔ、ＵまたはＴおよびＵのうち３つを含むが第４ヌクレオチド塩基を含まない第１反応組成物中で、該ハイブリダイズされた第１プライマーを選択的に増幅して、該反応組成物中の該３ヌクレオチド塩基のそれぞれが該第１標的相補性部分中の該３ヌクレオチド塩基の１つの相補体である第１増幅産物を作る工程；および
該第１増幅産物またはその代理物を検出する工程を含む、方法。
【請求項２５】
前記第１標的相補性部分、前記第２標的相補性部分、または該第１標的相補性部分および該第２標的相補性部分が、さらにユニバーサル塩基を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記連結する工程が、リガーゼ、化学ライゲーション剤、または光ライゲーションを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１プライマーが、ＰＮＡ、ＬＮＡまたは両方を含むオリゴマーを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１プライマーが、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴマーを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
さらに、前記ハイブリダイズさせる工程が、ギャップオリゴヌクレオチドを含み、前記プローブの３’−末端への該プローブの５’−末端の前記連結が、（ａ）該ギャップオリゴヌクレオチドの３’−末端への該プローブの５’−末端の連結と（ｂ）該ギャップオリゴヌクレオチドの５’−末端への該プローブの３’−末端の連結を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記ハイブリダイズしたプローブの３’末端が前記ハイブリダイズしたプローブの５’末端に隣接するまで伸張させる、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記標的配列が微生物に由来する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
さらに、鎖侵入構造を生じる工程を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記鎖侵入構造が、ＰＮＡを含むオリゴマーを含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記標的配列が二本鎖であり、少なくとも部分的に変性している、請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
前記変性が、熱変性、化学変性、ヘリカーゼまたはそれらの組合せを含む請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記検出工程が、捕捉表面、マイクロ流体装置、マルチウエル反応容器またはそれらの組合せを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３７】
前記検出工程が、化学発光または生物発光を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３８】
前記検出工程が、伸長酵素、スルフリラーゼおよびルシフェラーゼを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記検出工程が、レポータープローブを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項４０】
前記検出工程が、リアルタイム検出装置を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記第１増幅産物が、さらにレポーター基、親和性タグ、移動度変更剤、ハイブリダイゼーションタグ、プライマー結合部分、レポータープローブ結合部分またはそれらの組合せを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項４２】
前記検出工程が、移動度に依存する分析技術、質量分析計、マイクロアレイまたはそれらの組合せを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項４３】
前記増幅する工程が、等温増幅を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項４４】
前記等温増幅が、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記増幅する工程が、サーモサイクリングを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項４６】
さらに、前記連結型プローブを遊離する工程を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項４７】
前記遊離が、熱変性、化学変性、ヘリカーゼ、ＰＮＡオリゴマー、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴマーを含むプライマー、またはそれらの組合せを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
標的配列を検出する方法において、
（ａ）第１標的相補性部分、（ｂ）第２標的相補性部分および（ｃ）スペーサー部分を含み、該第１標的相補性部分が４ヌクレオチド塩基：（１）Ａ、（２）Ｃ、（３）Ｇおよび（４）Ｔ、ＵまたはＴおよびＵのうち３つを含むが第４ヌクレオチド塩基を含まず、該第２標的相補性部分と該スペーサー部分のそれぞれが該第１標的相補性部分と同じ３ヌクレオチド塩基を含むが第４ヌクレオチド塩基を含まないプローブを該標的配列にハイブリダイズさせる工程；
該プローブの５’−末端を該プローブの３’−末端に連結して、連結型プローブを作る工程；
第１プライマーを該連結型プローブにハイブリダイズさせる工程；
４ヌクレオチド塩基：（１）Ａ、（２）Ｃ、（３）Ｇおよび（４）Ｔ、ＵまたはＴおよびＵのうち３つを含むが第４ヌクレオチド塩基を含まない第１反応組成物中で、該ハイブリダイズした第１プライマーを選択的に増幅して、該反応組成物中の該３ヌクレオチド塩基のそれぞれが該第１標的相補性部分中の該３ヌクレオチド塩基の１つの相補体である第１増幅産物を作る工程；
第２プライマーを該第１増幅産物にハイブリダイズさせる工程；
該ハイブリダイズした第２プライマーを増幅して第２増幅産物を作る工程；および
該第１増幅産物、該第２増幅産物、該第１増幅産物および該第２増幅産物、またはそれらの代理物を検出する工程を含む、方法。
【請求項４９】
前記第１標的相補性部分、前記第２標的相補性部分、または該第１標的相補性部分および該第２標的相補性部分が、さらにユニバーサル塩基を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記連結する工程が、リガーゼ、化学ライゲーション剤、または光ライゲーションを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記第１プライマーが、ＰＮＡ、ＬＮＡまたは両方を含むオリゴマーを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記第１プライマーが、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴマーを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
さらに、前記ハイブリダイズさせる工程が、ギャップオリゴヌクレオチドを含み、前記プローブの３’−末端への該プローブの５’−末端の前記連結が、（ａ）該ギャップオリゴヌクレオチドの３’−末端への該プローブの５’−末端の連結と（ｂ）該ギャップオリゴヌクレオチドの５’−末端への該プローブの３’−末端の連結を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記ハイブリダイズしたプローブの３’末端が該ハイブリダイズしたプローブの５’末端に隣接するまで伸張させる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記標的配列が微生物に由来する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
さらに、鎖侵入構造を生じる工程を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
前記鎖侵入構造が、ＰＮＡを含むオリゴマーを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記標的配列が二本鎖であり、少なくとも部分的に変性している、請求項４９に記載の方法。
【請求項５９】
前記変性が、熱変性、化学変性、ヘリカーゼまたはそれらの組合せを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記検出する工程が、捕捉表面、マイクロ流体装置、マルチウエル反応容器またはそれらの組合せを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項６１】
前記検出する工程が、化学発光または生物発光を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項６２】
前記検出する工程が、伸長酵素、スルフリラーゼおよびルシフェラーゼを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記検出する工程が、レポータープローブを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項６４】
前記検出する工程が、リアルタイム検出装置を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記第１増幅産物、前記第２増幅産物、または該第１増幅産物および該第２増幅産物が、さらにレポーター基、親和性タグ、移動度変更剤、ハイブリダイゼーションタグ、プライマー結合部分、レポータープローブ結合部分またはそれらの組合せを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項６６】
前記検出する工程が、移動度に依存する分析技術、質量分析計、マイクロアレイまたはそれらの組合せを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項６７】
前記選択的に増幅する工程が、等温増幅を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項６８】
前記等温増幅が、ＲＣＡを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記増幅がサーモサイクリングを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項７０】
さらに、前記連結型プローブを遊離することを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項７１】
前記遊離が、熱変性、化学変性、ヘリカーゼ、ＰＮＡオリゴマーまたはそれらの組合せを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
標的配列を検出する方法であって、該方法において、
４ヌクレオチド塩基：（１）Ａ、（２）Ｃ、（３）Ｇおよび（４）Ｔ、ＵまたはＴおよびＵのうち３つを含むが第４ヌクレオチド塩基を含まない少なくとも１つの標的相補性部分を含むプローブを該標的配列にハイブリダイズさせる工程；
該ハイブリダイズしたプローブまたはその代理物を選択的に増幅する工程；および
該標的配列またはその代理物を検出する工程を含む方法。
【請求項７３】
前記プローブの前記標的相補性部分が、ユニバーサル塩基を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記選択的に増幅する工程が、４ヌクレオチド塩基：（１）Ａ、（２）Ｃ、（３）Ｇおよび（４）Ｔ、ＵまたはＴおよびＵのうち３つを含むが第４ヌクレオチド塩基を含まない第１反応組成物であって、該反応組成物中の該３ヌクレオチド塩基のそれぞれが前記標的相補性部分中の前記３ヌクレオチド塩基の１つの相補体である第１反応組成物を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
さらに、標的代理物を増幅するための工程を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
さらに、鎖侵入構造を生じるための工程を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
前記鎖侵入構造が、ＰＮＡを含むオリゴマーを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記標的配列が二本鎖であり、さらに該標的配列を変性するための工程を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７９】
前記変性が、熱変性、化学変性、ヘリカーゼまたはそれらの組合せを含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
さらに連結のための工程を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項８１】
前記連結のための工程が、リガーゼ、化学ライゲーション剤、または光ライゲーションを含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
さらに、前記連結型プローブを遊離するための工程を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項８３】
さらに、ルミネセンスを生じるための工程を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項８４】
前記ルミネセンスを生じるための工程が、伸長酵素、スルフリラーゼおよびルシフェラーゼを含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記検出のための工程が、レポータープローブを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項８６】
前記検出する工程が、リアルタイム検出装置を含む請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記検出のための工程が、レポーター基、親和性タグ、移動度変更剤、ハイブリダイゼーションタグ、プライマー結合部分、レポータープローブ結合部分またはそれらの組合せを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項８８】
前記検出のための工程が、移動度に依存する分析技術、質量分析計、マイクロアレイまたはそれらの組合せを含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記選択的な増幅のための工程が、等温増幅を含む請求項７３に記載の方法。
【請求項９０】
前記等温増幅が、ＲＣＡ、ＳＤＡ、ＬＡＭＰ、ＮＤＡ、ＨＤＡ、ＲＰＡ、直線的標的等温多量体化と増幅（ＬＩＭＡ）、核酸配列型増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写仲介増幅（ＴＭＡ）またはＲＡＭＰを含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
微生物標的配列を検出するための方法であって、該方法において、
（ａ）第１標的相補性部分、（ｂ）第２標的相補性部分および（ｃ）スペーサー部分を含み、該第１標的相補性部分が４ヌクレオチド塩基：（１）Ａ、（２）Ｃ、（３）Ｇおよび（４）Ｔ、ＵまたはＴおよびＵのうち３つを含むが第４ヌクレオチド塩基を含まず、該第２標的相補性部分と該スペーサー部分のそれぞれが該第１標的相補性部分と同じ該３ヌクレオチド塩基を含むが第４ヌクレオチド塩基を含まないプローブを該微生物標的配列にハイブリダイズさせる工程；
該プローブの５’−末端を該プローブの３’−末端に連結して、連結型プローブを作る工程；
第１プライマーを該連結型プローブにハイブリダイズさせる工程；
４ヌクレオチド塩基：（１）Ａ、（２）Ｃ、（３）Ｇおよび（４）Ｔ、ＵまたはＴおよびＵのうち３つを含むが第４ヌクレオチド塩基を含まない第１反応組成物中で、該ハイブリダイズされた第１プライマーを選択的に増幅して、該反応組成物中の該３ヌクレオチド塩基のそれぞれが該第１標的相補性部分中の該３ヌクレオチド塩基の１つの相補体である第１増幅産物と無機ピロリン酸塩（ＰＰｉ）を作る工程；
該ＰＰｉをアデノシン５’−ホスホ硫酸とスルフリラーゼに接触させてアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を作る工程；
該ＡＴＰをルシフェリンとルシフェラーゼに接触させてルミネセンスを発生させる工程；および
該ルミネセンスを該微生物標的配列の代理物として検出する工程を含む、方法。
【請求項９２】
前記プローブが、さらにユニバーサル塩基を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記ユニバーサル塩基が、前記標的相補性部分に存在しない第４ヌクレオチド塩基の代わりに用いられる、請求項９２に記載のプローブ。
【請求項９４】
前記連結が、リガーゼ、化学ライゲーション剤、または光ライゲーションを含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９５】
前記第１プライマーが、ＰＮＡ、ＬＮＡまたは両方を含むオリゴマーを含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９６】
前記第１プライマーが、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴマーを含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
さらに、鎖侵入構造を生じる工程を含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９８】
前記鎖侵入構造が、ＰＮＡを含むオリゴマーを含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
前記標的配列が二本鎖であり、少なくとも部分的に変性している、請求項９２に記載の方法。
【請求項１００】
前記変性が、熱変性、化学変性、ヘリカーゼまたはそれらの組合せを含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記検出する工程が、捕捉表面、マイクロ流体装置、マルチウエル反応容器またはそれらの組合せを含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項１０２】
前記選択的な増幅がＲＣＡを含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ＲＣＡが、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼまたはＴ７  ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
微生物標的配列を検出する方法であって、該方法において、
（ａ）第１標的相補性部分、（ｂ）第２標的相補性部分および（ｃ）スペーサー部分を含み、該第１標的相補性部分が４ヌクレオチド塩基：（１）Ａ、（２）Ｃ、（３）Ｇおよび（４）Ｔ、ＵまたはＴおよびＵのうち３つを含むが第４ヌクレオチド塩基を含まず、該第２標的相補性部分と該スペーサー部分のそれぞれが該第１標的相補性部分と同じ該３ヌクレオチド塩基を含むが第４ヌクレオチド塩基を含まないプローブを該微生物標的配列にハイブリダイズさせる工程；
該プローブの５’−末端を該プローブの３’−末端に連結して、連結型プローブを作る工程；
第１プライマーを該連結型プローブにハイブリダイズさせる工程；
４ヌクレオチド塩基：（１）Ａ、（２）Ｃ、（３）Ｇおよび（４）Ｔ、ＵまたはＴおよびＵのうち３つを含むが第４ヌクレオチド塩基を含まない第１反応組成物中で、該ハイブリダイズされた第１プライマーを選択的に増幅して、該反応組成物中の該３ヌクレオチド塩基のそれぞれが該第１標的相補性部分中の該３ヌクレオチド塩基の１つの相補体である第１増幅産物とＰＰｉを作る工程；
第２プライマーを該第１増幅産物にハイブリダイズさせる工程；
該ハイブリダイズされた第２プライマーを増幅して、第２増幅産物とＰＰｉを作る工程；
該ＰＰｉをアデノシン５’−ホスホ硫酸とスルフリラーゼに接触させてＡＴＰを作る工程；
該ＡＴＰをルシフェリンとルシフェラーゼに接触させてルミネセンスを発生させる工程；
該ルミネセンスを該微生物標的配列の代理物として検出する工程を含む、方法。
【請求項１０５】
前記プローブが、さらにユニバーサル塩基を含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ユニバーサル塩基が、前記標的相補性部分に存在しない第４ヌクレオチド塩基の代わりに用いられる、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記連結が、リガーゼ、化学ライゲーション剤、または光ライゲーションを含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記第１プライマーが、ＰＮＡ、ＬＮＡまたは両方を含むオリゴマーを含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０９】
前記第１プライマーが、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴマーを含む、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記標的配列が二本鎖であり、少なくとも部分的に変性している、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１１】
前記変性が、熱変性、化学変性、ヘリカーゼまたはそれらの組合せを含む、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記検出する工程が、捕捉表面、マイクロ流体装置、マルチウエル反応容器またはそれらの組合せを含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１３】
前記選択的に増幅する工程がＲＣＡを含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１４】
前記ＲＣＡが、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼまたはＴ７  ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記検出する工程が、ルミノメーター、フルオロメーターまたは両方を含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１６】
前記標的配列が、土試料、空気試料、水試料、食物試料、表面スワブまたは臨床試料に存在する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１１７】
前記標的配列が、土試料、空気試料、水試料、食物試料、表面スワブまたは臨床試料に存在する、請求項２５に記載の方法。
【請求項１１８】
前記標的配列が、土試料、空気試料、水試料、食物試料、表面スワブまたは臨床試料に存在する、請求項４９に記載の方法。
【請求項１１９】
前記標的配列が、土試料、空気試料、水試料、食物試料、表面スワブまたは臨床試料に存在する、請求項７３に記載の方法。
【請求項１２０】
前記標的配列が、土試料、空気試料、水試料、食物試料、表面スワブまたは臨床試料に存在する、請求項９２に記載の方法。
【請求項１２１】
前記標的配列が、土試料、空気試料、水試料、食物試料、表面スワブまたは臨床試料に存在する、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１２２】
前記標的配列がヒト由来である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記標的配列がヒト由来である、請求項２５に記載の方法。
【請求項１２４】
前記標的配列がヒト由来である、請求項４９に記載の方法。
【請求項１２５】
前記標的配列がヒト由来である、請求項７３に記載の方法。
【請求項１２６】
請求項２に記載のプローブを含むキット。
【請求項１２７】
さらに、第１プライマーと、ライゲーション剤、第１伸長酵素、第２伸長酵素、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼおよび第２プライマーの少なくとも１つとを含む、請求項１２６に記載のキット。
【請求項１２８】
前記第１伸長酵素が、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはそれらの組合せを含む、請求項１２７に記載のキット。
【請求項１２９】
請求項５に記載のプローブを含むキット。
【請求項１３０】
さらに、第１プライマーと、ライゲーション剤、第１伸長酵素、第２伸長酵素、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼおよび第２プライマーの少なくとも１つとを含む、請求項１２９に記載のキット。
【請求項１３１】
前記第１伸長酵素が、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはそれらの組合せを含む、請求項１３０に記載のキット。
【請求項１３２】
請求項８に記載のプローブ対を含むキット。
【請求項１３３】
さらに、第１プライマーと、ライゲーション剤、第１伸長酵素、第２伸長酵素、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼおよび第２プライマーの少なくとも１つとを含む、請求項１３２に記載のキット。
【請求項１３４】
前記第１伸長酵素が、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはそれらの組合せを含む請求項１３３に記載のキット。
【請求項１３５】
（ａ）標的相補性部分を含むプローブ、（ｂ）第１プライマー、および（ｃ）ライゲーション手段、第１伸張手段、第２プライマー、第２伸長手段、遊離手段およびルミネセンス発生手段の少なくとも一つの手段を含むキットであって、該キットにおいて、該プローブの第１標的相補性部分は、４ヌクレオチド塩基：（１）Ａ、（２）Ｃ、（３）Ｇおよび（４）Ｔ、ＵまたはＴおよびＵのうち３つを含むが第４ヌクレオチド塩基を含まない、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（分野）
本教示は一般的に核酸増幅と検出に関する。さらに具体的には、開示された組成物、方法およびキットは、典型的には、４ヌクレオチドのうち３つを含むが４ヌクレオチド全ては含まないプローブまたはプローブ対を用いて、非標的核酸の存在下で、特定の核酸標的を選択的に増幅および／または検出するために有用である。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）等の多くの現在の核酸増幅方法は、試料中に存在する可能性のある非標的核酸の存在のために、感度と選択性の制限を受けうる。時には、これらの「バックグラウンド」配列は、興味のある核酸配列に比べて非常に過度に存在することもある。高いバックグラウンドの存在下で標的配列を選択的に増幅し、検出する試薬と方法が有用であろう。例えば、限定するものではないが、土、空気および水の試料、または生物兵器テロ物質を含むと疑われる試料（例えば、ワールドワイドウェブ上のｂｔ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／Ａｇｅｎｔ／ＡｇｅｎｔｌｉｓｔにおけるＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌリストを参照）；２つ以上の源からの核酸を潜在的に含む法医学試料；および比較的少量の標的配列を潜在的に含む血液、血清、唾液、腫瘍または他の生検材料など臨床試料等の、しかし、これらに限定されない食物、環境試料中の病原体または指標微生物の検出が挙げられる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（要旨）
本教示は、典型的には、「バックグラウンド」、例えば、非標的核酸の存在下で標的配列を選択的に増幅および検出する組成物、方法およびキットに関する。ある実施形態において、標的配列は、試料等の特定の核酸集団中の少数種または極度の少数種を表す。本教示にしたがえば、そのような標的が、典型的には、バックグラウンドの広範な事前の除去の必要性なしに選択的に増幅することができる。
【０００４】
本教示の一部の実施形態において、標的に特異的なプローブが提供される。あるプローブの実施形態は、（ａ）第１標的相補性部分、（ｂ）第２標的相補性部分、および（ｃ）スペーサー部分を含み、該第１標的相補性部分は、４ヌクレオチド塩基：（１）Ａ、（２）Ｃ、（３）Ｇおよび（４）Ｔ、ＵまたはＴおよびＵのうち３つを含むが第４ヌクレオチド塩基を含まない。第１標的相補性部分に存在する３ヌクレオチド塩基は、通常、第２標的相補性部分とスペーサー部分にも存在するが、第１標的相補性部分に存在しない第４ヌクレオチド塩基は存在しない。一部の実施形態において、開示されたプローブの標的相補性部分はさらにユニバーサル塩基を含む。別の実施形態では、プローブ対において、その各プローブが、４ヌクレオチド塩基：（１）Ａ、（２）Ｃ、（３）Ｇおよび（４）Ｔ、ＵまたはＴおよびＵのうち３ヌクレオチド塩基を含むか、またはそれらからなるか、または基本的にそれらからなるが、第４ヌクレオチド塩基を含まない標的相補性部分を含むプローブ対が提供される。
【０００５】
一部の実施形態にしたがえば、標的に特異的なプローブ（以下、「標的特異的プローブ」という）、標的に特異的なプローブ対（以下、「標的特異的プローブ対」という）またはその両方を使用する標的核酸を検出する方法が提供される。他の実施形態において、標的特異的プローブ、標的特異的プローブ対またはその両方を含む、標的核酸を選択的に増幅する方法が提供される。一定の実施形態は、多数の異なる標的配列を選択的に増幅または検出するための多数の異なる標的特異的プローブ、多数の異なるプローブ対、またはそれらの両方を含む。
【０００６】
一部の開示された方法は少なくとも１つの標的相補性部分を含むプローブを標的配列にハイブリダイズさせることを含む。一部実施形態において、プローブの標的相補性部分は４ヌクレオチド塩基のうち３つを含むが第４ヌクレオチド塩基を含まない一方で、他の実施形態では、標的相補性部分は、プローブ特異性を高めるために、第４ヌクレオチド塩基の代わりにユニバーサル塩基を含むか、またはその両方を含む。そのような方法は、第１増幅産物等の、しかし、これに限定されない、ハイブリダイズしたプローブまたはハイブリダイズしたプローブの代理物を選択的に増幅する工程；および増幅させたプローブまたはその代理物を検出する工程も含む。一部の方法は、さらに、二本鎖標的配列、または標的配列を含む二本鎖核酸を変性させる工程；鎖侵入構造を作る工程；（ｉ）第１標的相補性部分と第２標的相補性部分を含むプローブ、（ｉｉ）それぞれが標的相補性部分を含む第１プローブと第２プローブを含むプローブ対、（ｉｉｉ）ギャップオリゴヌクレオチドおよびプローブまたはプローブ対のどちらか、または（ｉｖ）それらの組合せを連結する工程；連結型プローブを遊離させる工程；第１増幅産物、第２増幅産物、それらいずれかの代理物、またはそれらの組合せを増幅する工程；ルミネセンスを発生する工程；検出する工程；またはそれらの組合せからなる。
【０００７】
通常、大過剰の非標的配列の存在下で標的配列を選択的に増幅するか、または標的配列を検出する方法も開示される。そのような方法は、（ｂ）４ヌクレオチド塩基のうち３つを（ａ）（ｉ）含むか、（ｉｉ）これらからなるか、または（ｉｉｉ）これらから実質的になるが、第４ヌクレオチド塩基は含まず；かつユニバーサル塩基（ｃ）を含むことができるが、含まなくてもよい本教示のプローブまたはプローブ対、ならびにまたヌクレオチド欠損第１反応組成物を用いる。
【０００８】
本教示の選択的な増幅方法と検出方法にしたがえば、プローブを標的配列にハイブリダイズさせ、次に選択的な増幅がヌクレオチド欠損第１反応組成物で生じる。必ずではないが、選択的な増幅前に、通常はハイブリダイズしたプローブまたはハイブリダイズしたプローブ対を連結して連結型プローブを形成する。第１反応組成物は、４ヌクレオチドのうち三つを含むが、第４ヌクレオチドは含まない点でヌクレオチド欠損である。当業者は、第１反応組成物中に第４ヌクレオチド塩基が無いことが、すべての４ヌクレオチドを含む配列の増幅を阻害することを理解するだろう。よって、ヌクレオチド欠損反応組成物中に存在するヌクレオチド三リン酸の相補体であるヌクレオチド塩基は含むが、欠けているヌクレオチドは含まない配列が選択的に増幅される一方で、４つのすべてのヌクレオチドを含む他の配列は増幅されない。
【０００９】
開示された一部の方法において、標的配列は微生物に由来する。一部の実施形態において、標的配列は、土試料、空気試料または水試料等の、しかし、これらに限定されない環境試料または表面スワブに存在する。他の実施形態において、標的試料はヒト等の哺乳類に由来し、その配列は、通常は、例えば癌または遺伝的疾患等の、しかし、これらに限定されない該哺乳類の特定の状態または生理的状態の指標である。ある状況では、ヒト標的配列が、法医学的評価または人物同定のために選択的に増幅および／または検出される。
【００１０】
本方法のいくつかを実施するキットも開示される。あるキットの実施形態は、４ヌクレオチド塩基：（１）Ａ、（２）Ｃ、（３）Ｇおよび（４）Ｔ、ＵまたはＴおよびＵのうち三つを含むが、第４ヌクレオチド塩基は含まないプローブを包含する；そのようなプローブはユニバーサル塩基をさらに含むことができるが、それを含む必要はない。あるキットの実施形態は、４ヌクレオチド塩基：（１）Ａ、（２）Ｃ、（３）Ｇおよび（４）Ｔ、ＵまたはＴおよびＵのうち三つからなるか、または基本的にこれらからなるが、第４ヌクレオチド塩基は含まないプローブおよび／またはプローブ対を包含する。あるキットの実施形態は、ユニバーサル塩基および４ヌクレオチド塩基：（１）Ａ、（２）Ｃ、（３）Ｇおよび（４）Ｔ、ＵまたはＴおよびＵのうち三つからなるか、または基本的にこれらからなるが、第４ヌクレオチド塩基は含まないプローブおよび／またはプローブ対を包含する。
【００１１】
本教示のこれらの特徴や他の特徴をここに説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（実施形態の説明）
前記の一般的な説明と下記の詳細な説明の両方が単に例示的で、説明的なものであって、本教示の範囲の限定を意図するものではないことを理解されたい。本出願において、単数形の使用は特に具体的に示されない限り、複数形を含む。例えば、「１つのプローブ」（“ａ  ｐｒｏｂｅ”）は２つ以上のプローブが存在しうることを意味する；例えば、特定のプローブ種のひとつ以上のコピーならびに特定のプローブタイプの１つ以上のバージョンが存在しうる。また、「含む」、「包含する」、「挙げられる」（“ｃｏｍｐｒｉｓｅ”、“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”、“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”、“ｃｏｎｔａｉｎ”、“ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ”、“ｃｏｎｔａｉｎｓ”、“ｉｎｃｌｕｄｅ”、“ｉｎｃｌｕｄｅｓ”および“ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ”）は限定することを意図するものではない。「および／または」はその慣用の意味、すなわち、この用語の前後のものは共に使われるか、または単独で使われることを意図する。例示的な目的のためであって、限定ではない「Ｘおよび／またはＹ」は「Ｘ」または「Ｙ」または「ＸおよびＹ」を意味しうる。
【００１３】
ここで用いられるセクションの表題は単に構成の目的のためであって、記載された主題を限定するものとして決して理解されるべきでない。本出願で挙げられた特許、特許出願、記事、本、論文およびインターネットウェブページ等の、しかし、これらに限定されないすべての文献および類似の資料は各種用途に応じて、参照により明確にそれら全体がここに組み込まれる。組み込まれた文献および類似の材料の１つ以上が、定義された用語、用語の使われ方、記載された技術等の、しかし、これらに限定されない点で本出願とは異なるか、矛盾する場合は本出願が優先する。
【００１４】
（Ｉ．定義）
ここで使用される「親和性タグ」との用語は、多成分複合体の一成分をいい、ここで多成分複合体の各成分は特異的に相互作用するか、互いに結合する。例示的な多成分親和性タグ複合体として、例えば、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、および２−イミノビオチン、デスチオビオチン、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、ＣａｐｔＡｖｉｄｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）等の、しかしこれらに限定されないビオチン、ストレプトアビジンまたはアビジンの誘導体等の、しかしこれらに限定されないリガンドとそれらのレセプター；マルトース−マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、カルシウム−カルシウム結合タンパク質／ペプチド（ＣＢＰ）等の、しかし、これらに限定されない結合タンパク質／ペプチドおよびそれらの結合パートナー；例えば、ｃ−ＭＹＣ（例えば、ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、ＨＡ（例えば、ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）、ＶＳＶ−Ｇ（例えば、ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ）、ＨＳＶ（例えば、ＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤ）、Ｖ５（例えば、ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）およびＦＬＡＧ  Ｔａｇ（登録商標）（例えば、ＤＹＫＤＤＤＤＫＧ）およびそれらの対応する抗エピトープ抗体等の、しかし、これらに限定されないエピトープタグ；例えば、ジニトロフェノール（“ＤＮＰ”）およびジゴキシゲニン（“ＤＩＧ”）等の、しかし、これらに限定されないハプテンおよびそれらの対応する抗体；アプタマーおよびそれらの結合パートナー；対応する金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）材料および抗ポリ−Ｈｉｓ抗体等の、しかし、これらに限定されないポリ−Ｈｉｓタグ（例えば、ペンタ−Ｈｉｓおよびヘキサ−Ｈｉｓ）およびそれらの結合パートナー；フルオロフォアおよびその対応する抗フルオロフォア抗体等が挙げられるが、これらに限定されない。一定の実施形態において、親和性タグは分離手段の一部、検出手段の一部、またはそれら両方である。
【００１５】
ここで用いられる「またはそれらの組合せ」との用語は、その用語に先立って列挙された事項のすべての並び換えおよび組合せをいう。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃまたはそれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣまたはＡＢＣの少なくとも１つを含むことを意図し、もし、順番が特定の文脈において重要であるのなら、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣまたはＣＡＢも含まれる。この例を続けると、明確に包含されるのは、ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢ等の１つ以上の事項や用語の繰返しを含む組合せである。当業者は、文脈から明らかでない限り、任意の組合せ中の事項または用語の数には通常限定がないことを理解するだろう。
【００１６】
ここで用いられる「対応する」との用語は、その用語が言及する要素間の特定の関係をいう。例えば、本教示のプローブは、それが特異的にハイブリダイズする標的配列に対応しており、その逆の場合も同じである。プローブ対の第１プローブは該プローブ対の第２プローブに対応する。プライマーは、対応する連結型プローブ、対応する第１増幅産物、対応する第２増幅産物またはそれらの組合せのプライマー結合部分にアニールするように設計される。本プローブまたはプローブセットの標的相補性部分は、対応する標的配列または標的配列の相補体の相補的または実質的に相補的な領域にハイブリダイズするように設計される。限定されるわけではないが、例えば、ストレプトアビジンに対するビオチン結合等、特定の親和性タグは対応する親和性タグに結合する。特定のハイブリダイゼーションタグはその対応するハイブリダイゼーションタグ相補体およびその他にアニールする。
【００１７】
「酵素的に活性のあるその変異体または改変体」との用語は、ポリメラーゼ、リガーゼ、ヌクレアーゼ、伸長酵素、増幅手段等の酵素または酵素種に関連して用いられる場合、必要に応じて連結、増幅または消化等の少なくとも一部の所望の酵素活性を保持する対応する酵素または酵素種に由来する１つ以上のポリペプチドをいう。さらに、この用語の範囲にあるのは、例えば、クレノー断片、ストッフェル断片、または対応する酵素よりも大きさの小さい組換え発現断片および／またはポリペプチド等の、しかし、これらに限定されない切断産物等の、しかし、これらに限定されない酵素活性のあるフラグメント；「野生型」またはコンセンサスアミノ酸配列とは異なる変異体等の自然発生突然変異体、物理的および／または化学変異原を用いて作られた変異体、および例えばランダムおよび部位特異的変異誘発技術等の、しかしこれらに限定されない遺伝子改変変異体等の、しかし、これらに限定されない対応する酵素の変異型；および核酸ナンセンス変異、ミスセンス変異およびフレームシフト変異によるアミノ酸挿入と欠失および変更である（例えば、Ｓｒｉｓｋａｎｄａ  ａｎｄ  Ｓｈｕｍａｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６（２）：５２５−３１，１９９８；Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（１７）：５０９０−５１００，２００３を参照）；キメラ酵素（例えば、ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｄｅｍｉｄｏｖ  ａｎｄ  Ｂｒｏｕｄｅ，ｅｄｓ．，Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，（“Ｄｅｍｉｄｏｖ  ａｎｄ  Ｂｒｏｕｄｅ”を参照）、特に１．１章）；可逆的に改変されたヌクレアーゼ、リガーゼおよび伸長酵素、例えば、限定するものではないが、米国特許第５，７７３，２５８号に記載されたもの；遺伝子シャフリング技術から得られた生物活性ポリペプチド（例えば、米国特許第６，３１９，７１４号および米国特許第６，１５９，６８８号を参照）、少なくとも部分的に１つ以上の対応する酵素に由来する天然または遺伝子組換えの両方のスプライス変異体；異なる温度感受性を付与するように改変された酵素（例えば、米国特許第５，７７３，２５８号、米国特許第５，６７７，１５２号および米国特許第６，１８３，９９８号を参照）；グリコシル化、ジスルフィド結合、ヒドロキシル側鎖およびリン酸塩側鎖の付加、除去または変化、または架橋等の、しかし、これらに限定されない天然配列の１つ以上のアミノ酸に対する改変を含む少なくとも部分的に１つ以上のそのような酵素に対応するポリペプチド（但し、そのような改変ポリペプチドは少なくとも一部の望ましい触媒活性を保持する）；等である。「酵素活性のあるその変異体または改変体」との用語が特定の酵素または酵素種に関連して使用される場合の意味の範囲内に明確にあるのは、該酵素の酵素活性のある変異体、該酵素の酵素活性のある改変体または該酵素の酵素活性のある変異体および該酵素の酵素活性のある改変体である。（例えば、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、伸長酵素またはリガーゼ等の、しかし、これらに限定されない）酵素または��素の集団が添付の請求の範囲を含めてここで列挙されている場合、該酵素または酵素タイプの酵素活性のある変異体または改変体が明確に含まれると理解されたい。
【００１８】
当業者は、当分野で知られている適当なアッセイを用いて酵素活性を測定できることを容易に理解することができるだろう。よって、ポリメラーゼ触媒活性の適当なアッセイは、例えば、適当な条件下でｒＮＴＰまたはｄＮＴＰを温度依存的に新生ポリペプチド鎖に取り込む改変体の能力を測定することを含んでよい。同様に、リガーゼ触媒活性の適当なアッセイは、例えば、ここに開示されたような適当な反応基を含み、かつ隣接してハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドを連結する能力を含んでよい。そのようなアッセイのプロトコールは、とりわけ、Ｓａｍｂｍｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，３ｄ  ｅｄ．（２００１）（“Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ”）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，２ｄ  ｅｄ；（１９８９）（“Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．”）；Ａｕｓｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００４年１２月までのアップデート（“Ａｕｓｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．”）を含む；およびＨｏｕｓｂｙ  ａｎｄ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：４２５９−６６，  １９９８）に見られるだろう。
【００１９】
「伸長酵素」との用語は、適当なヌクレオチド三リン酸、補因子、緩衝液等の、しかし、これらに限定されない適当な反応条件下で、ハイブリダイズしたプライマーの５’〜３’伸長を温度依存的に触媒することのできるポリペプチドをいう。典型的には、伸長酵素は、例えば、逆転写酵素等の、しかし、これらに限定されないＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ等の、しかし、これらに限定されないＤＮＡポリメラーゼであり、少なくとも一定の条件下では、ＤＮＡポリメラーゼのこれらの種類の両方の性質を共有するＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡ依存性が挙げられる。一定の実施形態において、伸長酵素は、例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素等のレトロウイルス逆転写酵素等の、しかし、これらに限定されない逆転写酵素である。例えば、Ｍｇ２＋ではなくＭｎ２＋の存在下で逆転写を示すＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ）等の、これらに限定されない一定のＤＮＡポリメラーゼは一部の条件下で逆転写酵素活性を有する（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＡｃｃｕＲＴ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  ＫｉｔおよびＨｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｕｓ種Ｚ０５に由来する組換えポリメラーゼを含む；両キットともＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより入手）も参照）。同様に、ＡＭＶ逆転写酵素とＭＭＬＶ逆転写酵素等の、しかし、これらに限定されない一定の逆転写酵素は一定の条件下でＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。伸長酵素の説明は、とりわけ、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ、第３版、Ｎｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｘ，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２０００（“Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ”）、特に、２６章と２９章；Ｒ．Ｍ．Ｔｗｙｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ．Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９９）；およびＥｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｇｕｉｄｅ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ（１９９８）に見ることができる。
【００２０】
「ハイブリダイズしている」および「アニーリングしている」との用語、およびこれらの用語の変形、例えば、アニールされた、ハイブリダイゼーション、アニールする、ハイブリダイズする等の用語は互換的に用いられ、二本鎖、三重鎖または他の高次構造の形成をもたらす、１つの核酸と別の核酸とのヌクレオチド塩基対形成相互作用を意味する。主要な相互作用は、典型的には、Ｗａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋおよびＨｏｏｇｓｔｅｅｎタイプの水素結合によりヌクレオチド塩基に特異的なもの（例えばＡ：Ｔ、Ａ：ＵおよびＧ：Ｃ等）である。ある実施形態において、塩基のスタッキングと疎水性相互作用は二本鎖安定性にも寄与するだろう。プローブ、レポータープローブおよびプライマーが相補的および実質的に相補的な標的配列、連結型プローブ、第１増幅産物および／または第２増幅産物にハイブリダイズする条件は、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８５）およびＪ．Ｗｅｔｍｕｒ  ａｎｄ  Ｎ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：３４９以下参照（１９６８）に記載されるように当分野でよく知られている。一般的に、そのようなアニーリングが起こるかどうかは、とりわけ、プローブ、プライマーおよびレポータープローブおよびそれらの相補的配列のハイブリダイズする領域の長さ、ｐＨ、温度、一価または二価のカチオンの存在、ハイブリダイズする領域中のＧおよびＣヌクレオチドの比、媒体の粘度および変性剤の存在により影響される。そのような変数はハイブリダイゼーションに必要とされる時間に影響を与える。さらに、プライマーまたはレポータープローブ中の一定のヌクレオチド類似体または溝バインダーの存在はハイブリダイゼーション条件に影響を与えうる。よって、好ましいアニーリング条件は特定の適用に依存するだろう。しかし、そのような条件は、過度の実験なしに、当業者により慣用的に決定することができる。
【００２１】
ここで用いる「ハイブリダイゼーションタグ」との用語は、該タグを成分とする要素か、または該タグがハイブリダイズする要素（例えば、連結型プローブ、第１増幅産物、第２増幅産物、これらのいずれかの代理物（ＺｉｐＣｈｕｔｅ（登録商標）試薬等が挙げられるが、これらに限定されない））の分離（バルク分離が挙げられるが、これに限定されない）；該タグが結合した要素の捕捉表面への繋留または付着（分離および／または検出を含んでよい）；対応するハイブリダイゼーションタグ相補体のアニーリング；またはそれらの組合せに用いることのできるオリゴヌクレオチド配列をいう。ある実施形態において、同一のハイブリダイゼーションタグが、バルク分離、捕捉表面付着またはそれらの組合せを達成するために多数の異なる要素とともに用いられる。ある実施形態において、ハイブリダイゼーションタグは、ハイブリダイゼーションタグを含む要素に固有の「アドレス」または識別物質を提供する。ある実施形態において、限定するものではないが、このアドレスは、例えば、対応するハイブリダイゼーションタグ相補体を含むマイクロアレイまたはビーズアレイ等の、しかし、これらに限定されない秩序的捕捉表面上の特定のアドレスまたは位置にハイブリダイズする対応要素を同定するために用いることができる。ある実施形態において、独自のハイブリダイゼーションタグを含むプライマーは増幅産物に取り込まれるので、ハイブリダイゼーションタグは該増幅産物またはその代理物を検出するレポータープローブに結合するように引き続き用いることができる（例えば、米国特許第６，２７０，９６７号を参照）。「ハイブリダイゼーションタグ相補体」とは、通常、対応するハイブリダイゼーションタグの少なくとも一部に相補的であるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドをいう。多用な実施形態において、ハイブリダイゼーションタグ相補体は、マイクロアレイ上の多重解読等の同定のための捕捉表面に対してハイブリダイゼーションタグ：要素複合体を付着させるため、または他の目的のための捕捉部分として働き；バルク分離手順用の「プルアウト」配列として働き；または捕捉部分とプルアウト配列との両者として働く。ある実施形態において、ハイブリダイゼーションタグ相補体は、レポーター基、移動度変更剤、レポータープローブ結合部分またはそれらの組合せを含む。ある実施形態において、ハイブリダイゼーションタグ相補体は対応するハイブリダイゼーションタグにアニールし、引き続いて、該ハイブリダイゼーションタグ相補体の少なくとも一部が遊離して、検出される。ある実施形態において、検出は、ハイブリダイゼーションタグ相補体またはハイブリダイゼーションタグ相補体の少なくとも一部上にあるレポーター基、またはそれに付着したレポーター基の検出を含む。
【００２２】
典型的には、ハイブリダイゼーションタグとそれらの対応するハイブリダイゼーションタグ相補体は、内部自己ハイブリダイゼーションを最小化し、かつ標的配列またはバックグラウンド配列、異なる種類のハイブリダイゼーションタグ相補体、プライマーの標的に特異的な部分等の、しかし、これらに限定されない試料または反応組成物中の異なるハイブリダイゼーションタグ種、ヌクレオチド配列との架橋を最小化するように選択されるが、ハイブリダイゼーションタグとその対応するハイブリダイゼーションタグ相補体とのハイブリダイゼーションを容易にするように修正できるものでなければならない。ハイブリダイゼーションタグ配列およびハイブリダイゼーションタグ相補体配列は、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／１２０１４およびＰＣＴ公開ＷＯ９６／４１０１１および欧州公開第ＥＰ７９９，８９７号に記載のようなコンピューターアルゴリズムおよびサンタルシアのアルゴリズムおよびパラメーター（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：１４６０−６５，１９９８）等の、しかし、これらに限定されない任意の適当な方法により選択することができる。ハイブリダイゼーションタグの説明は、とりわけ、米国特許第６，３０９，８２９号（そこでは「タグセグメント」と称されている）；米国特許第６，４５１，５２５号（そこでは「タグセグメント」と称されている）；米国特許第６，３０９，８２９号（そこでは「タグセグメント」と称されている）；米国特許第５，９８１，１７６号（そこでは「グリッドオリゴヌクレオチド」と称されている）；米国特許第５，９３５，７９３号（そこでは「識別タグ」と称されている）；およびＰＣＴ公開ＷＯ０１／９２５７９（そこでは「指定可能な支持体に特異的な配列」と称されている）；およびＧｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９２：２５１−２６２，１９９９）（そこでは「ジップコード」および「ジップコード相補体」と称されている）に見ることができる。当業者は、定義により、ハイブリダイゼーションタグとその対応するハイブリダイゼーションタグ相補体は互いに相補的であること、ハイブリダイゼーションタグとハイブリダイゼーションタグ相補体との用語は相対的なものであり、本質的にほとんどの文脈で互換可能に用いることができることを理解するだろう。
【００２３】
ハイブリダイゼーションタグはプローブ、プライマー、増幅産物またはそれらの組合せの末端またはその近くに配置することができ；またはハイブリダイゼーションタグは内部に配置することができる。ある実施形態において、ハイブリダイゼーションタグは、プローブ、プライマー、増幅産物、レポータープローブまたはそれらの組合せに、リンカーアームを経て付着させる。ある実施形態において、リンカーアームは切断可能である。
【００２４】
ある実施形態において、ハイブリダイゼーションタグは長さが少なくとも１２塩基であり、長さが少なくとも１５塩基であり、長さが１２〜６０塩基であり、または長さが１５〜３０塩基である。ある実施形態において、ハイブリダイゼーションタグは、長さがｌ２塩基、１５塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、３０塩基、４５塩基または６０塩基である。ある実施形態において、少なくとも２つのハイブリダイゼーションタグ：ハイブリダイゼーションタグ相補体二本鎖は、互いの１０℃以下のΔＴｍ範囲（Ｔｍａｘ−Ｔｍｉｎ）に含まれる融解温度を有する。ある実施形態において、少なくとも２つのハイブリダイゼーションタグ：ハイブリダイゼーションタグ相補体二本鎖は互いの５℃以下のΔＴｍ範囲に入る融解温度を有する。
【００２５】
「微生物」との用語は広い意味で用いられ、藍色細菌を含む真正細菌等のコロニー生物体；古細菌；原生動物；藻類等の真菌類；ウイルス；およびウイロイド等、非細胞生物および単細胞生物が挙げられる。例示的な微生物として、腸内毒素原性系統等の、しかしこれに限定されない大腸菌、黄色ブドウ球菌等しかしこれに限定されないブドウ球菌種、連鎖球菌種、Ａ型肝炎ウイルス、カンピロバクター種、サルモネラ種、ランブル鞭毛虫、クリプトスポリジウムパルバムおよびクリプトスポリジウムムリスしかしこれに限定されないクリストポリジウム種、ロタウイルス、アスペルギルス種、炭疽菌等の、しかし、これに限定されないバシラス種、ブルセラ種、ペスト菌、大痘瘡（天然痘ウイルス）、野兎病菌および出血熱ウイルス（例えば、エボラおよびマールブルグ；ラッサ熱ウイルス、マチュポウイルス等のアレナウイルス）、結核菌、ボツリヌス菌および野兎病菌が挙げられる。
【００２６】
ここで用いる「移動度変更剤」との用語は、例えば、要素（例えば、プローブ、プライマー、増幅産物またはそれらの組合せ）に加えられると、それが共有結合的にまたは非共有結合的にハイブリダイズまたは結合した要素の移動度依存分析技術における移動度に影響を与えるポリマー鎖等の、しかし、これに限定されない分子的実体をいう。一部実施形態において、移動度変更剤は、要素にハイブリダイズまたは結合したときに電荷／並進摩擦抵抗を変化させる；または対応する要素にハイブリダイズまたは結合した場合に、例えば、クロマトグラフィー用分離媒体での示差的な溶出特性または篩マトリックスまたは非篩マトリックスでの示差的な電気泳動移動度等の、しかし、これらに限定されない示差的な移動度を付与する；またはそれらの両方を行なう（例えば、米国特許第５，４７０，７０５号および米国特許第５，５１４，５４３号；Ｇｒｏｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４５２７−３４，１９９４を参照）。一定の実施形態において、移動度変更剤を含まない多数の異なる連結型プローブおよび／または増幅産物は移動度依存分析技術において同一または実質的に同一の移動度を有する。典型的には、そのような連結型プローブおよび／または増幅産物はそのような種がさらに適当な移動度変更剤を含む場合に移動度依存分析技術で分離されうるか、または実質的に分離されうる。
【００２７】
「レポーター基」との用語はここでは広い意味で用いられ、同定可能なタグ、標識または部分をいう。当業者は、多くの異なる種類のレポーター基が本教示に個々に、または１つ以上の異なるレポーター基と組合せて用いることができることを理解するだろう。レポーター基という用語は、親和性タグ等の、しかし、これらに限定されない多要素間接レポーターシステムの要素、および蛍光クエンチャーと暗クエンチャー（非蛍光クエンチャー（ＮＦＱ）としても知られる）とを含む対等の、しかし、これらに限定されない蛍光レポーター基−クエンチャー対等の多要素相互作用レポーター基またはレポーター基対も包含する。
【００２８】
一定の実施形態において、レポーター基は、蛍光シグナル、化学発光シグナル、生物発光シグナル、リン光シグナルまたは電気化学発光シグナルを発する。例示的なレポーター基として、フルオロフォア、放射性同位元素、色素原、酵素、エピトープタグ等の（しかし、これに限定されない）抗原、半導体ナノ結晶（量子ドット等）、重金属、染料、リン光基、化学発光基、電気化学的検出部分、親和性タグ、結合タンパク質、リン光体、希土類キレート、遷移金属キレート、近赤外染料（“Ｃｙ．７．ＳＰｈ．ＮＣＳ”、“Ｃｙ．７．ＯｐｈＥｔ．ＮＣＳ”、“Ｃｙ７．ＯｐｈＥｔ．ＣＯ２Ｓｕ”およびＩＲＤ８００（例えば、Ｊ．Ｆｌａｎａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．８：７５１−５６（１９９７）；およびＩＲＤ８００ホスホロアミダイトによるＤＮＡ合成、ＬＩ−ＣＯＲ定期報告＃１１１、ＬＩ−ＣＯＲ社、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）、トリス（ビピリダル）ルテニウム（ＩＩ）（Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋としても知られる）、Ｏｓ（１，１０−フェナントロリン）２ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン２＋（Ｏｓ（ｐｈｅｎ）２（ｄｐｐｅｎｅ）２＋としても知られる）、ルミノール／過酸化水素、Ａｌ（ヒドロキシキノリン−５−スルホン酸）、９，１０−ジフェニルアントラセン−２−スルホネートおよびトリス（４−ビニル−４’−メチル−２，２’−ビピリダル）ルテニウム（ＩＩ）（Ｒｕ（ｖ−ｂｐｙ３２＋）としても知られる）等の、しかし、これらに限定されない電気化学発光標識が挙げられる。
【００２９】
レポーター基との用語は、ビオチン：アビジン、抗体：抗原、（結合タンパク質とそれらのリガンド等の、しかし、これらに限定されない）リガンド：レセプター等の親和性タグ等の、しかし、これらに限定されない多要素間接レポーターシステムの要素も包含し、ここで１要素は、検出可能なシグナルの潜在性をもたらすために該システムの１つ以上の他の要素と相互作用する。例示的な多要素レポーターシステムとして、ビオチンレポーター基およびストレプトアビジン結合体化フルオロフォア（またはその逆）を含むオリゴヌクレオチド；ＤＮＰレポーター基とフルオロフォア標識抗ＤＮＰ抗体を含むオリゴヌクレオチド等が挙げられる。一定の実施形態において、レポーター基、特に多要素レポーター基は検出に必ずしも使用されないが、例えば、ビオチンレポーター基およびストレプトアビジン被覆捕捉表面、またはその逆；ジゴキシゲニンレポーター基および抗ジゴキシゲニン抗体またはジゴキシゲニン結合アプタマーを含む捕捉表面；ＤＮＰレポーター基および抗ＤＮＰ抗体またはＤＮＰ結合アプタマーを含む捕捉表面等の、しかし、これらに限定されない単離／分離用親和性タグとして働く。レポーター基を核酸に付着させる詳細な手順は、とりわけ、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９６；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（２０００）、補足（“Ｂｅａｕｃａｇｅ”）を含む；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，９ｔｈｅｄ．，Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，２００２；およびＰｉｅｒｃｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ａｎｄ  Ｃａｔａｌｏｇ  ２００３−２００４，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，２００３に見ることができる。
【００３０】
また、蛍光クエンチャーと暗クエンチャー（非蛍光クエンチャーとしても知られる）等の、しかし、これらに限定されないフルオロフォア−クエンチャー対等の多要素相互作用レポーター基もレポーター基との用語の範囲内にある。蛍光クエンチャーは、フルオロフォアから発する蛍光シグナルを吸収することができ、十分な蛍光エネルギーを吸収した後、蛍光クエンチャーは固有波長における蛍光、例えば蛍光共鳴エネルギー転移における蛍光を発することができる。例えば、限定するものではないが、ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ対はＦＡＭの励起ピークである４９２ｎｍで照射され、ＴＡＭＲＡの発光ピークである５８０ｎｍで蛍光を発することができる。蛍光レポーター基と適切に対となる暗クエンチャーはフルオロフォアからの蛍光エネルギーを吸収するが、それ自体は発光しない。むしろ、暗クエンチャーは吸収されたエネルギーを通常は熱として消散する。例示的な暗クエンチャーまたは非蛍光クエンチャーとして、ダブシル、ブラックホールクエンチャー、アイオワブラック、ＱＳＹ−７、アブソリュートクエンチャー、エクリプス非蛍光クエンチャー、金ナノ粒子等の金属クラスター等が挙げられる。例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ等のヌクレアーゼプローブ等の、しかし、これに限定されないフルオロフォアクエンチャー対を含むある種の二重標識化プローブは対のメンバーが物理的に分離しているときに蛍光を発することができる。例えば、分子指標等のハイブリダイゼーションプローブやスコルピオンプライマー等の伸長プローブ等の、しかし、これらに限定されない、フルオロフォア−クエンチャー対を含む他の二重標識化プローブは対のメンバーが空間的に分離している場合に蛍光を発することができる。フルオロフォア−クエンチャー対は当分野でよく知られており、多様なレポータープローブのために広く用いられている（例えば、Ｙｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３６：２６６−７５，２００４；Ｄｕｂｅｒｔｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：３６５−７０，２００１；およびＴｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ，１８：１１９１−９６，２０００）。
【００３１】
一定の実施形態において、レポーター基は、適当な条件下で、検出可能な電気化学発光（ＥＣＬ）を発することのできる電気化学発光部分を含む。ＥＣＬにおいて、電気化学発光部分の励起は電気化学的に促進され、化学発光放出を任意に検出することができる。例示的な電気化学発光レポーター基種として、６２０ｎｍの発光波長を有するＲｕ（ｂｐｙ）３２＋およびＲｕ（ｖ−ｂｐｙ）３２＋；５８４ｎｍの発光波長を有するＯｓ（ｐｈｅｎ）２（ｄｐｐｅｎｅ）２＋；４２５ｎｍの発光波長を有するルミノール／過酸化水素；４９９ｎｍの発光波長を有するＡｌ（ヒドロキシキノリン−５−スルホン酸）；および４２８ｎｍの発光波長を有する９，１０−ジフェニルアントラセン−２−スルホネート等が挙げられる。プローブおよびプライマーに取り込むのに適するように改変されたこれらの３種類の電気化学発光レポーター基の形態は市販されており、または当分野で知られている技術を用いて、過度の実験なしに合成することができる。例えば、アミノリンカー基により核酸配列にカップリングさせるＲｕ（ｂｐｙ）３２＋Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが記載されている（米国特許第６，０４８，６８７号を参照）；およびＯｓ（ｐｈｅｎ）２（ｄｐｐｅｎｅ）２＋とＡｌ（ＨＱＳ）３３＋のスクシンイミドエステルが合成され、類似の方法を用いて核酸配列に付着させることができる。Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋電気化学発光レポーター基は、市販のｒｕ−ホスホロアミダイトを用いて核酸配列に合成的に取り込むことができる（ＩＧＥＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）（例えば、Ｏｓｉｏｗｙ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．４０：２５６６−７１，２００２を参照）。
【００３２】
ルテニウム、オスミウム、白金、パラジウムおよび他の遷移金属のさらに別の多芳香性化合物およびキレートが電気化学発光性質を示した。ＥＣＬと電気化学発光部分の詳細な説明は、とりわけ、Ａ．Ｂａｒｄ  ａｎｄ  Ｌ．Ｆａｕｌｋｎｅｒ，Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（２００１）；Ｍ．Ｃｏｌｌｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍ．Ｗｉｇｈｔｍａｎ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６５：２５７６（１９９３）；Ｄ．Ｂｒｕｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍ．Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７４：３１５７（２００２）；Ａ．Ｋｎｉｇｈｔ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１８：４７（１９９９）；Ｂ．Ｍｕｅｇｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７５：１１０２（２００３）；Ｈ．Ａｂｒｕｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０４：２６４１（１９８２）；Ｋ．Ｍａｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：１０６０９（１９９６）；Ｍ．Ｃｏｌｌｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｗｉｇｈｔｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１８８３以下参照（１９９５）；および米国特許第６，４７９，２３３号（リン光ランタニドおよび遷移金属レポーター基の考察に関しては、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：ｅ１１４，２００２も参照）。
【００３３】
ここで用いられる「鎖侵入構造」との用語は、二本鎖核酸、例えば、二本鎖標的配列と、ＰＮＡを含むオリゴマー等の、しかし、これに限定されない少なくとも１つの他の成分とを含むハイブリダイゼーション複合体をいい、ここで、核酸の１つの鎖は置換（すなわち、「ループアウト」）されている。一部の実施形態において、鎖侵入構造は、例えば、ＰＮＡオープナー、ｂｉｓ−ＰＮＡまたはＰＮＡクランプ等の、しかし、これらに限定されない偽相補性ＰＮＡ（ｐｃＰＮＡ）等の、しかし、これらに限定されないＰＮＡオリゴマーを含む。Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｉｌｓｅｎ，ｅｄ．，Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００４、特に第５章と第１０章、およびＤｅｍｉｄｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３：１０８−１２２（Ｄｅｍｉｄｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：５９５３−５８，２００２；Ｋａｉｈａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１：１１１１８−２５，２００２；およびＬｏｈｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：１１８０４−０８，１９９９）に一般に記載されているように、一部実施形態において、鎖侵入構造は（ＰＮＡ）２−ＤＮＡ侵入三重鎖としても知られる「Ｐ−ループ」、またはＰＮＡ拡張ＤＮＡループとしても知られる「ＰＤ−ループ」を含む。典型的には、鎖侵入構造の第３成分は、標的配列がループアウトされるように設計され、プローブハイブリダイゼーションを受け易くしている。
【００３４】
ここで用いられる「代理物」との用語は、その検出または同定が対応する連結型プローブ、第１増幅産物、第２増幅産物またはそれらの組合せの存在を示して、対応する標的配列の存在を推測させる任意の分子または部分をいう。例示的な代理物として、消化された増幅産物またはその一部；増幅産物または増幅産物代理物から切断または放出される部分；増幅産物または増幅産物代理物の相補鎖または対応物；ＴａｑＭａｎプローブの切断断片またはスコルピオンプライマーの産物等のその切断および増幅産物等の、しかし、これらに限定されない増幅産物または他の増幅産物代理物にアニールされるか、アニールされたレポータープローブ；ＺｉｐＣｈｕｔｅ（登録商標）試薬（典型的にはハイブリダイゼーションタグ相補体、移動度変更剤およびレポーター遺伝子、一般的には蛍光レポーター基を含む分子または複合体；例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ品番４３４４４６７Ｒｅｖ．Ｃを参照；また米国仮特許出願第６０／５１７４７０も参照）またはハイブリダイゼーションタグ相補体の部分等の、しかし、これらに限定されない増幅産物または別の増幅産物代理物にアニールされるか、アニールされたハイブリダイゼーションタグ相補体；化学反応および／または酵素反応からの検出可能な発光等が挙げられるが、これらに限定されない。第２増幅産物は、対応する第１増幅産物、対応する連結型プローブおよび対応する標的配列の代理物として働くことができること；第１増幅産物は、対応する連結型プローブおよび対応する標的配列の代理物として働くことができること；および連結型プローブは、対応する標的配列の代理物として働くことができることを理解されたい。よって、これらの代理物のいずれかの検出は、対応する標的配列が試料中に存在するという推論を直接的または間接的に可能とする。
【００３５】
「Ｔｍ」および「融解温度」は互換的に用いられ、プローブ−標的配列複合体、第１プライマー−連結型プローブ複合体、第２プライマー−第１増幅産物複合体、第１プライマー−第２増幅複合体および二本鎖標的配列等の、しかし、これらに限定されない二本鎖核酸分子の集団の半分（５０％）が解離する温度をいう。核酸を含むキメラオリゴマー等、Ｔｍを計算するための幾つかの式とコンピューターアルゴリズムは当分野でよく知られている。１つのそのようなオリゴヌクレオチドの予測式にしたがえば、Ｔｍ＝（４×Ｇ＋Ｃの数）＋（２×Ａ＋Ｔの数）である。プローブまたはプライマー等の特定のオリゴヌクレオチドのＴｍは、過剰な実験なしに、慣用的な方法を用いて慣用的に決定することもできる。融解温度およびそれらの計算の説明は、とりわけ、Ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｒａｐｌｅｙ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２０００（“Ｒａｐｌｅｙ”）；Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｅｘｉｑｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｎｏｔｅ  ＬＮＡ  ０２／０７．２００２，Ｅｘｉｑｏｎ  Ａ／Ｓ；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍｏｌｌｅｒ，ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｂａｓｉｃｓ，Ｂｉｏｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２０００（“ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ”）；Ｆｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：３３５７−６３，１９９６；およびインターネット上、とりわけ、“ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｓｕｐｐｏｒｔ／ｔｅｃｈｔｏｏｌｓ／ｃａｌｃ／”、“２０７．３２．４３．７０／ｂｉｏｔｏｏｌｓ／ｏｌｉｇｏｃａｌｃ／ｏｌｉｇｏｃａｌｃ．ａｓｐ”および“ｗｗｗ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．ｌｌｎｌ．ｇｏｖ／ＭＢ＿ｅｌｖｅｓ／ｔｍｃａｌｃ．ｈｔｍｌ”に見ることができる。
【００３６】
ここで用いられる「移動度依存分析技術」との用語は、１つ以上の分離技術で異なる分子種の移動速度の差に基づいて異なる分子種を分離する手段をいう。例示的な移動度依存分析技術としては、電気泳動、クロマトグラフィー、沈降、例えば勾配遠心分離、場流動分画、多段抽出技術等が挙げられる。移動度依存分析技術の説明は、とりわけ、米国特許第５，４７０，７０５号、米国特許第５，５１４，５４３号、米国特許第５，５８０，７３２号、米国特許第５，６２４，８００号および米国特許第５，８０７，６８２号；ＰＣＴ公開ＷＯ０１／９２５７９；Ｄ．Ｒ．Ｂａｋｅｒ，Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）；Ｂｉｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｍ．Ａ．Ｖｉｊａｙａｌａｋｓｈｍｉ，ｅｄ．，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕ．Ｋ．（２００３）；Ｋｒｙｌｏｖ  ａｎｄ  Ｄｏｖｉｃｈｉ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２：１１１Ｒ−１２８Ｒ（２０００）；Ｓｗｉｎｎｅｙ  ａｎｄ  Ｂｏｒｎｈｏｐ，Ｅ１ｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２１：１２３９−５０（２０００）；Ｃｒａｂｔｒｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２１：１３２９−３５（２０００）；およびＡ．Ｐｉｎｇｏｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｓｔｕｄｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｃｈｅｒｓ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ（２００２）に見ることができる。
【００３７】
ヌクレオシドとの用語は、プリンヌクレオチド塩基、デアザプリンヌクレオチド塩基またはピリミジンヌクレオチド塩基、例えば、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、チミン（Ｔ）、７−デアザアデニン、７−デアザグアノシン等をペントースに１’位で結合させた化合物をいう。ヌクレオチド塩基がプリンまたは７−デアザプリンである場合、ペントースはプリンまたはデアザプリンの９位でヌクレオチド塩基に結合し、ヌクレオチド塩基がピリミジンである場合、ペントースはピリミジンの１位でヌクレオチド塩基に結合する（例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９２）。ここで用いられる「ヌクレオチド」との用語は、ヌクレオシドのリン酸エステル、例えば、エステル化の最も普通の部位がペントースのＣ−５位に結合したヒドロキシル基であるトリリン酸エステルをいう。ここで用いられる「ヌクレオチド」とはヌクレオシドとヌクレオチドの両方を含む一連の化合物をいう。
【００３８】
（標的配列および非標的配列を含む）「核酸」または「核酸配列」との用語は、二本鎖または単鎖のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、それらのα−アノマー形等、ヌクレオチドモノマーのポリマー（そのようなポリマーの類似体を含む）をいう。モノマーは「ヌクレオチド間結合」、例えば、ホスホジエステル結合により連結され、ここで用いられる「ホスホジエステル結合」との用語はホスホジエステル結合、または会合対イオン、例えばＨ＋、ＮＨ４＋、Ｎａ＋を、そのような対イオンが存在する場合に含むそのリン酸類似体を含む結合をいう。核酸が、“ＡＴＧＣＣＴＧ”等の文字配列により表される場合、特に断りがないか、または文脈から明らかにならない限り、ヌクレオチドは左から右に５’〜３’の順序にあることを理解するだろう。典型的には、核酸配列は数モノマー単位（それらが時にオリゴヌクレオチドと称される場合、例えば５〜９０）から数千モノマーヌクレオチド単位以上までの大きさの範囲にある。
【００３９】
核酸配列として、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ｃＤＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、断片化核酸、およびミトコンドリア等の細胞内小器官から得られる核酸が挙げられるが、これらに限定されない。とりわけ、開示された方法またはキットの性能を標準化および／または確証するために用いることのできる「コントロール配列」または「スタンダード」等、試料または反応組成物中に「スパイク」される合成標的配列も、本教示の範囲内にある。
【００４０】
「類似体」との用語は、他で一般的に記載されているように（例えば、Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０；Ｅｎｇｌｉｓｃｈ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３０：６１３−２９，１９９１；Ａｇａｒｗａｌ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４；およびＳ．Ｖｅｒｍａ  ａｎｄ  Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：９９−１３４，１９９８）、ヌクレオチドおよび／または核酸配列に関連して用いられる場合、改変ヌクレオチド塩基部分、改変ペントース部分および／または改変ホスフェート部分を有し、ポリヌクレオチドの場合、改変ヌクレオチド間結合を有する合成類似体を含む。一般的に、改変ホスフェート部分は、リン原子が＋５酸化状態にあり、１つ以上の酸素原子が非酸素部分、例えばイオウに置換されたホスフェートの類似体を含む。例示的なホスフェート類似体として、会合対イオン、例えばＨ＋、ＮＨ４＋、Ｎａ＋を、そのような対イオンが存在する場合に含むホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート、ボロノホスフェートが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な改変ヌクレオチド塩基部分として、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、シュードウリジン、Ｃ−５プロピン、イソシトシン、イソグアニン、２−チオピリミジンおよび他の同様な類似体が挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましいヌクレオチド塩基類似体は、Ｓｕｌｆｏｎｉｃｓ社，Ａｌａｃｈｕａ，ＦＬ（例えば、Ｂｅｎｎｅｒら、米国特許第５，４３２，２７２号）またはロックされた核酸（ＬＮＡ）類似体（例えば、Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５４：３６０７−３０，１９９８）から利用できるイソ−Ｃおよびイソ−Ｇ核酸塩基類似体である。例示的な改変ペントース部分として、２’位または３’位が水素、ヒドロキシ、アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシおよびフェノキシ）、アジド、アミノまたはアルキルアミノ、フルオロ、クロロ、ブロモ等である２’改変または３’改変が挙げられるが、これらに限定されない。改変ヌクレオチド間結合は、ホスフェート類似体、アキラル（ａｃｈｉｒａｌ）かつ無電荷のサブユニット間結合を有する類似体（例えば、Ｓｔｅｒｃｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍ．５２：４２０２，１９８７）およびアキラルのサブユニット間結合を有する無電荷モルホリノ系ポリマー（例えば、米国特許第５，０３４，５０６号）が挙げられる。一部のヌクレオチド間結合類似体として、モルホリデート、アセタール、およびポリアミド連結複素環が挙げられる。疑似相補性ペプチド核酸（まとめて「ＰＮＡ」）等のペプチド核酸として知られるヌクレオチド類似体の一クラスでは、慣用の糖およびヌクレオチド間結合が２−アミノエチルグリシンアミド骨格ポリマーで置換されている（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１４９７−１５００，１９９１；Ｅｇｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：１８９５−１８９７  １９９２；Ｄｅｍｉｄｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：５９５３−５８，２００２；Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｉｅｌｓｅｎ，ｅｄ．，Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００４）。オリゴヌクレオチド合成と類似体の説明は、とりわけ、Ｓ．Ｖｅｒｍａ  ａｎｄ  Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：９９−１３４（１９９９）；Ｊ．Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１：１６５−８７（１９９０）；Ｂｅａｕｃａｇｅ；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄ  ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ  ａｎｄ  Ｇａｉｔ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６；および米国特許第４，３７３，０７１号、米国特許第４，４０１，７９６号、米国特許第４，４１５，７３２号、米国特許第４，４５８，０６６号、米国特許第４，５００，７０７号、米国特許第４，６６８，７７７号、米国特許第４，９７３，６７９号、米国特許第５，０４７，５２４号、米国特許第５，１３２，４１８号、米国特許第５，１５３，３１９号および米国特許第５，２６２，５３０に見ることができる。「４ヌクレオチド塩基：（１）Ａ、（２）Ｃ、（３）Ｇおよび（４）Ｔ、ＵまたはＴおよびＵのうち３つであるが、第４ヌクレオチド塩基ではない」等の用語は、本明細書中および添付の請求の範囲において、用いられる類似の用語は類似体を含みうることを理解されたい。
【００４１】
「ユニバーサル塩基」または「ユニバーサルヌクレオチド」との用語はここでは一般的に互換的に用いられ、オリゴヌクレオチド中の天然のヌクレオチドまたは天然の塩基の２つ以上を置換しうるヌクレオチド類似体をいう。ユニバーサル塩基は、典型的には、窒素原子を含むか含まない芳香環を含み、二本鎖を安定化させる芳香環スタッキングを一般的に使用する。一部のユニバーサル塩基はペントース糖のＣ−１’炭素に共有結合してユニバーサルヌクレオチドを作ることができる。一部のユニバーサル塩基は他のヌクレオチド塩基と特異的に水素結合をしない。一部のユニバーサル塩基は疎水性スタッキングによる同一の核酸鎖上の隣接するヌクレオチド塩基と相互作用するだろう。例示的なユニバーサル塩基として、デオキシ−７−アザインドールトリホスフェート（ｄ７ＡＩＴＰ）、デオキシイソカルボスチリルトリホスフェート（ｄＩＣＳＴＰ）、デオキシプロピニルイソカルボスチリルトリホスフェート（ｄＰＩＣＳＴＰ）、デオキシメチル−７−アザインドールトリホスフェート（ｄＭ７ＡＩＴＰ）、デオキシルｍＰｙトリホスフェート（ｄｌｍＰｙＴＰ）、デオキシＰＰトリホスフェート（ｄＰＰＴＰ）、デオキシプロピニル−７−アザインドールトリホスフェート（ｄＰ７ＡＩＴＰ）、３−メチルイソカルボスチリル（ＭＩＣＳ）、５−メチルイソカルビル（５ＭＩＣＳ）、イミダゾール−４−カルボキサミド、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、ヒポキサンチン、イノシン、デオキシイノシン、５−フルオロデオキウリジンおよび４−ニトロベンズイミジゾールが挙げられる。ユニバーサル塩基の詳細な説明は、とりわけ、Ｌｏａｋｅｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：２４３７−４７，２００１；Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２９１１−１４，２０００；Ｌｏａｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：４２６−３５，１９９７；Ｖｅｒｍａ  ａｎｄ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：９９−１３４，１９９８；公開ＰＣＴ出願ＵＳ０２／３３６１９および米国特許第６，４３３，１３４号および米国特許第６，４３３，１３４号に見ることができる。当業者は、通常、ユニバーサル塩基が慣用の合成技術を用いてオリゴヌクレオチドプローブに取り込めることを理解するだろう。
【００４２】
（ＩＩ．試薬）
「標的配列」との用語は、選択的に増幅または検出される核酸配列をいう。しばしば、標的配列が選択されるが、これは標的配列が特定の微生物、微生物の関連種、生検試料中の悪性細胞等の、しかし、これに限定されない組織または臨床試料中の特定の細胞種の診断上の指標、法医学試料中のヒト同定マーカー等であるためである。標的配列は、通常は、診断される試料の全核酸組成のわずかに一部を構成するだけなので、慣用の方法によるそれらの増幅および／または検出は未解決となりうるだろう。
【００４３】
本教示にしたがえば、原核生物、真核生物、植物、動物およびウイルス等の、しかし、これらに限定されない生物またはかつて生きていた生物から標的配列を得ることができる。標的配列は細胞の核、例えばゲノムＤＮＡから生じ、核外核酸、例えば、プラスミド、ミトコンドリア核酸、多様なＲＮＡ等であってよい。標的核酸配列は標的核酸がＲＮＡである場合、ｃＤＮＡに最初に逆転写されうる。さらに、標的配列は二本鎖または単鎖の形で存在してよい。
【００４４】
開示された方法で使用される標的配列を得るために多様なよく知られた技術が利用できる。標的配列が生体マトリックスから単離により得られる場合、好ましい単離技術として、（１）例えば、フェノール／クロロホルム有機試薬（例えば、Ａｕｓｂｅｌら）、好ましくは自動化ＤＮＡ抽出器、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から入手できるモデル３４１ＤＮＡ抽出器を用いる有機抽出およびそれに続くエタノール沈殿；（２）固定相吸着法（例えば、米国特許第５，２３４，８０９号；Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １０：５０６−５１３，１９９１）；および（３）典型的には「塩析」法と称される塩誘発ＤＮＡ析出法（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６（３）：９−１０，１９８８）が挙げられる。最適には、上記単離方法のそれぞれに先んじて、試料からの不要なタンパク質の除去を助けるために、酵素消化工程、例えばプロテイナーゼＫまたは他の類似のプロテアーゼによる消化を行なう（例えば、米国特許出願第１０／６１８，４９３号を参照）。当業者は、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ＴｒａｎｓＰｒｅｐＳｙｓｔｅｍ，ＢｌｏｏｄＰｒｅｐ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＮｕｃＰｒｅｐ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＰｒｅｐＭａｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ，ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ６１００  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ＰｒｅｐＳｔａｔｉｏｎおよびＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ６７００  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（すべてがＡｐｐＩｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより市販）等の、しかし、これらに限定されない多くの試料調製キットおよび装置が市販されていることを理解している。
【００４５】
一部実施形態において、標的配列は微生物に由来する。別の実施形態において、標的配列はヒト等の哺乳類に由来し、その配列は典型的には、該哺乳類において、例えば、癌または遺伝性疾患等の、しかし、これらに限定されない特定の状態または生理学的状態の指標である。一定の状況において、ヒト標的配列が法医学的評価または人物同定のために選択的に増幅および／または検出される。
【００４６】
一部の実施形態において、環状化可能な標的特異的プローブが提供される（例えば図１を参照）。そのようなプローブは典型的には（ａ）第１標的相補性部分、（ｂ）第２標的相補性部分および（ｃ）スペーサー部分を含む。プローブの第１標的相補性部分は、４ヌクレオチド塩基：（１）Ａ、（２）Ｃ、（３）Ｇおよび（４）Ｔ、ＵまたはＴおよびＵのうち三つを含むが、第４ヌクレオチド塩基は含まない。これらのヌクレオチド塩基は典型的にはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはそれらの組合せの形態にある。第１標的相補性部分に存在する３ヌクレオチド塩基は典型的には第２標的相補性部分およびスペーサー部分にも存在するが、第１標的相補性部分に存在しない第４ヌクレオチド塩基は存在しない。例示目的であって、限定のためではないが、本教示の１つの例示的なプローブはヌクレオチド塩基Ａ、ＣおよびＧを含むが、ヌクレオチド塩基Ｔ、ＵまたはＴおよびＵは含まない；別の例示的なプローブは（ｉ）Ｃ、ＧおよびＵ、（ｉｉ）Ｃ、ＧおよびＴ、または（ｉｉｉ）Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵを含むが、ヌクレオチド塩基Ａは含まない等々である。一定の実施形態において開示されたプローブは３ヌクレオチド塩基からなるが、第４ヌクレオチド塩基は含まない；別の実施形態において、標的特異的プローブはヌクレオチド塩基の三つから基本的になるが、第４ヌクレオチド塩基は含まない。
【００４７】
当業者は、ヌクレオチド塩基ＴとＵは一般的に互換的に用いることができることを理解するだろう。例えば、配列ＴＡＣＴＡＣ、ＵＡＣＴＡＣおよびＵＡＣＵＡＣは基本的に同等と一般的に見なされ、本教示の目的のために、「Ｔ、ＵまたはＴおよびＵ」は１つのヌクレオチド塩基と考えることができる。当業者は、例えば、シトシンの類似体としての５−メチルシトシン等の、しかし、これに限定されないヌクレオチド塩基類似体が本教示の意図の範囲にあることも理解するだろう。
【００４８】
一部の実施形態において、一対の標的特異的プローブ（「プローブ対」とも称する）が提供され、ここでは各プローブ対が第１プローブおよび対応する第２プローブを含む（例えば、図２を参照）。各プローブ対のプローブは、第１標的相補性部分を含む第１プローブおよび第２標的相補性部分を含む第２プローブにより、同一の標的配列の対応する領域とハイブリダイズするように設計される。各プローブ対の２つの標的相補性部分は、４ヌクレオチド塩基：（１）Ａ、（２）Ｃ、（３）Ｇおよび（４）Ｔ、ＵまたはＴおよびＵのうち３つを含むが、第４ヌクレオチド塩基は含まず、両方の標的相補性プローブ部分が、同じ３ヌクレオチド塩基を含むが第４ヌクレオチド塩基を含まない。典型的には、プローブ対中のさらなるヌクレオチドもまた同じ３ヌクレオチド塩基を含むが第４ヌクレオチド塩基を含まない。一部の実施形態において、第１プローブの第１相補性部分、対応する第２プローブの第２標的相補性部分、または第１プローブの第１標的相補性部分および対応する第２プローブの第２標的相補性部分の両方がユニバーサル塩基を含む。一部の実施形態において、４ヌクレオチド塩基：（１）Ａ、（２）Ｃ、（３）Ｇおよび（４）Ｔ、ＵまたはＴおよびＵのうち３つを含むが第４ヌクレオチド塩基を含まない標的相補性部分を含むプローブが提供される。
【００４９】
一部実施形態において、環状化可能なプローブおよび／またはプローブ対は４ヌクレオチド塩基：（１）Ａ、（２）Ｃ、（３）Ｇおよび（４）Ｔ、ＵまたはＴおよびＵのうち３つからなるが、第４ヌクレオチド塩基は含まない。別の実施形態において、環状化可能なプローブおよび／またはプローブ対はユニバーサル塩基および４ヌクレオチド塩基：（１）Ａ、（２）Ｃ、（３）Ｇおよび（４）Ｔ、ＵまたはＴおよびＵのうち３つからなるが、第４ヌクレオチド塩基は含まない。別の実施形態において、環状化可能なプローブおよび／またはプローブ対は４ヌクレオチド塩基：（１）Ａ、（２）Ｃ、（３）Ｇおよび（４）Ｔ、ＵまたはＴおよびＵのうち３つから基本的になるが、第４ヌクレオチド塩基は含まない。別の実施形態において、環状化可能なプローブおよび／またはプローブ対はユニバーサル塩基および４ヌクレオチド塩基：（１）Ａ、（２）Ｃ、（３）Ｇおよび（４）Ｔ、ＵまたはＴおよびＵのうち３つから基本的になるが、第４ヌクレオチド塩基は含まない。一部実施形態において、プローブ中にさらなるヌクレオチド塩基が存在する場合、それらは標的相補性部分と同じ３ヌクレオチド塩基を含むか、それらから基本的になるか、またはそれらからなるが、第４ヌクレオチド塩基を含まない。
【００５０】
当業者は多くのユニバーサル塩基のいずれかが本教示のプローブおよびプローブセットに取り込むことができること、および同じユニバーサル塩基を全体にわたって使用できること、または得られるプローブまたはプローブセットが使用反応条件下で対応する標的配列と特異的にハイブリダイズできるのであれば、異なるユニバーサル塩基を使用してよいことを理解する。各標的相補性部分の長さや適用およびプローブの機能性の少なくとも一部に依存しながら、スペーサーはいろいろな数のヌクレオチドを含むことができること、およびスペーサーは繰返し配列を含むことができるが、それらを含む必要はないことを理解されたい。
【００５１】
さらに、当業者は、標的配列および反応条件の少なくとも一部に基づき、３ヌクレオチド塩基の多様な組合せを、開示されたプローブおよび／またはプローブ対に用いてよいことも理解するだろう。異なるプローブのＴｍは互いに異なってよいが、それらのそれぞれのＴｍはよく知られた式／アルゴリズムを用いて予測でき、または慣用的な方法を用いて決定できること、および１つ以上の適当なヌクレオチド塩基の組合せを目的とする適用に使用するために得ることができることを理解されたい。プローブおよびプライマー設計に関する一般的な情報は、とりわけ、Ｄｉｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５；Ｒａｐｌｅｙ；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ；およびＫｗｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ，１８：９９９−１００５，１９９０に見ることができる。開示されたプローブの標的相補性部分およびプライマーの配列特異的部分は、必要に応じて、標的配列、連結型プローブ、第１増幅産物および第２増幅産物における相補的配列に対する特異的なアニーリングを可能とするのに十分に長いものとする。
【００５２】
一部実施形態において、開示されたプローブまたはプローブ対の標的相補性部分中のユニバーサル塩基は、存在しない第４ヌクレオチド塩基の代わりに取り込まれる（例えば、図１と図２）。一部の実施形態において、プローブの特異性を広げるために、例えば、細菌種の異なる株、微生物の同じ属の関連種または標的配列内の無関係なＳＮＰ部位の交互の対立遺伝子等で異なるが密接に関連する標的配列にプローブをハイブリダイズするために、ユニバーサル塩基が含められる。一部実施形態において、ユニバーサル塩基は、欠けた第４ヌクレオチド塩基を置換することとプローブ特異性を拡大することの両方に用いられる。一部実施形態において、プローブまたはプローブセットのすべてのユニバーサル塩基が同一である一方で、他の実施形態では、少なくとも二つの異なるユニバーサル塩基をプローブまたはプローブセットに組み込む。一部実施形態において、ユニバーサル塩基は、標的配列の相補体中で４ヌクレオチド塩基のうち最も出現頻度の低い塩基の代わりに組み込まれる。
【００５３】
「プライマー」という用語は、第１プライマーまたは第２プライマーに関連して用いられる場合、対応する連結型プローブ、第１増幅産物、第２増幅産物またはそれらの組合せにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドまたはキメラオリゴマーを意味する。プライマーは、プライマー伸張反応の開始点として作用することのできるオリゴヌクレオチドまたはキメラオリゴマーであり、伸張する時、プライマーは通常は得られる増幅産物に組み込まれるようになる。本教示にしたがえば、第１プライマーは対応する連結型プローブとハイブリダイズし、一部の実施形態では、対応する第２増幅産物とハイブリダイズするように設計される；第２プライマーは対応する第１増幅産物とハイブリダイズするように設計される。ある実施形態において、第１プライマー、第２プライマーまたはその両方は、ユニバーサルプライマーのプライマー結合部位等の、しかし、これに限定されないユニバーサルプライミング配列をさらに含む。「ユニバーサルプライマー」は、連結型プローブ、増幅産物またはそれらの組合せの２つ以上の種にハイブリダイズし、それらの増幅を開始させるように設計された配列である。
【００５４】
本教示の一定のキメラオリゴマーを含めて、プローブ、プローブセット、プライマーおよび他の合成配列は、化学合成技術等の、しかし、これに限定されない慣用の方法、例えば、ホスホロアミダイト化学およびＥｘｐｅｄｉｔｅ８９００核酸合成システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）等の核酸合成機、またはＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素等の、しかし、これらに限定されない酵素的手段により合成できる（例えば、Ｍｙｅｒ  ａｎｄ  Ｄａｙ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３０：５８４−９３，２００１；Ｒａｐｌｅｙ；Ａｕｓｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．；Ｆｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ，Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：３３５７−６３，１９９６；Ｌｏａｋｅｓ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４０３９−４３，１９９４；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−０８，１９８５；Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｉｅｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｅｇｈｏｌｍ，ｅｄｓ．，Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９、特に２．４章；およびＢｒａａｓｃｈ  ａｎｄ  Ｃｏｒｅｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３：９７−１０７，２００１を参照）。プローブは、必要に応じて、合成中、または合成後改変技術によりライゲーションに適したものとすることができる。核酸およびキメラオリゴマー合成技術は一般的には限定されないことを理解されたい。一定の実施形態において、環状化可能なプローブ、プローブ対の第１プローブ、プローブ対の第２プローブ、第１プライマー、第２プライマーまたはそれらの組合せは、プライマー結合部位、レポータープローブ結合部位、プロモーター配列、レポーター基、移動度変更剤、親和性タグ、ハイブリダイゼーションタグ、リボソーム結合部位またはそれらの組合せを含む。
【００５５】
本教示にしたがえば、「伸長酵素」との用語は、適当なヌクレオチド三リン酸、補因子、緩衝液等の、しかし、これらに限定されない適切な反応条件下で、ハイブリダイズしたプライマーの５’〜３’伸張を鋳型依存的に触媒することのできるポリペプチドをいう。例示的な伸長酵素として、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ等のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；ＡＭＶ逆転写酵素等の逆転写酵素等の、しかし、これに限定されないＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ；およびバクテリオファージＴ３、ＳＰ６またはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ等のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。一定の実施形態において、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ等の伸長酵素は熱安定性である。伸長酵素の説明は、とりわけ、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ，３ｄ  ｅｄ．，Ｎｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｘ，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２０００（“Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ”）、特に２６章と２９章；Ｒ．Ｍ．Ｔｗｙｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ．Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９９）；およびＥｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｇｕｉｄｅ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ（１９９８）に見ることができる。
【００５６】
本教示による「ライゲーション剤」または「ライゲーション手段」との用語は、リガーゼ、化学ライゲーション剤および光ライゲーション等の、しかし、これらに限定されない核酸の互いの連結を達成できる多くの酵素剤または非酵素剤を含む。例えば、リガーゼは、適当な条件下、隣接するプローブの３’−ＯＨと５’−ホスフェートとの間または環状化可能なプローブの末端間にホスホジエステル結合を形成する酵素ライゲーション剤である。温度感受性リガーゼとして、バクテリオファージＴ４リガーゼおよび大腸菌リガーゼが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な耐熱性リガーゼとして、Ａｆｕリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ｔｆｌリガーゼ、Ｍｔｈリガーゼ、Ｔｔｈリガーゼ、Ｔｔｈ  ＨＢ８リガーゼ、Ｔｓｃリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ種ＡＫ１６Ｄリガーゼ、Ａｐｅリガーゼ、ＬｉｇＴｋリガーゼ、Ａａｅリガーゼ、ＲｍリガーゼおよびＰｆｕリガーゼが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｈｏｕｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：ｅ１０，２０００；Ｔｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：１４４７−５４，２０００；Ｎａｋａｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：６５０−５６，２００２；およびＳｒｉｓｋａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：２２２１−２８，２０００を参照）。当業者は、ＤＮＡリガーゼやＲＮＡリガーゼ等の多くの耐熱性リガーゼが、好熱性または超好熱性の生物、例えば、そうした好熱性または超好熱性の生物に感染するウイルスも含めて、ある種の真正細菌や古細菌から得ることができること、およびそのようなリガーゼが開示された方法やキットに用いることができることを理解するだろう。
【００５７】
化学ライゲーション剤として、カルボジイミド、臭化シアン（ＢｒＣＮ）、Ｎ−シアノイミダゾール、イミダゾール、１−メチルイミダゾール／カルボジイミド／シスタミン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）および紫外線等の活性化剤、縮合剤および還元剤が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、自己ライゲーション、すなわち、連結剤の非存在下での自発的なライゲーションも、ここでの教示の範囲内にある。化学ライゲーション法の手順および適当な反応基の説明は、とりわけ、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２７：８７５−８１，１９９９；Ｇｒｙａｚｎｏｖ  ａｎｄ  Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：１４０３−０８，１９９３；Ｇｒｙａｚｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２：２３６６−６９，１９９４；Ｋａｎａｙａ  ａｎｄ  Ｙａｎａｇａｗａ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：７４２３−３０，１９８６；Ｌｕｅｂｋｅ  ａｎｄ  Ｄｅｒｖａｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：３００５−０９，１９９２；Ｓｉｅｖｅｒｓ  ａｎｄ  ｖｏｎ  Ｋｉｅｄｒｏｗｓｋｉ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：２２１−２４，１９９４；Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：３３００−０４，１９９９；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｋｏｏｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２３２６−３３，１９９４；Ｐｕｒｍａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：３７１３−１９，１９９２；Ａｓｈｌｅｙ  ａｎｄ  Ｋｕｓｈｌａｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：２９２７−３３，１９９１；Ｃｈｕ  ａｎｄ  Ｏｒｇｅｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３６７１−９１，１９８８；Ｓｏｋｏｌｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２３２：１５３−５５，１９８８；Ｎａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｇｉｌｈａｍ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５：２７２２−２８，１９６６；Ｊａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．４：５９５−６０５，１９９７；および米国特許第５，４７６，９３０号に見ることができる。
【００５８】
適当な波長の光をライゲーション剤として用いる光ライゲーションも本教示の範囲内にある。ある実施形態において、光ライゲーションは、４−チオチミジン（ｓ４Ｔ）、５−ビニルウラシルおよびその誘導体、またはそれらの組合せ等であるがこれらに限定されないヌクレオチド類似体を含むプローブを含む。ある実施形態において、ライゲーション剤は、（ａ）ＵＶ−Ａ範囲（約３２０ｎｍ〜約４００ｎｍ）、ＵＶ−Ｂ範囲（約２９０ｎｍ〜約３２０ｎｍ）の光、またはそれらの組合せ、（ｂ）約３００ｎｍ〜約３７５ｎｍの波長の光、（ｃ）約３６０ｎｍ〜約３７０ｎｍの波長の光、（ｄ）約３６４ｎｍ〜約３６８ｎｍの波長の光、または（ｅ）約３６６ｎｍの波長の光を含む。ある実施形態において、光ライゲーションは可逆的である。光ライゲーションの説明は、とりわけ、Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．４２：３９−４０，１９９９；Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．Ｓｕｐｐｌ．１：１８５−８６，２００１；Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｐｐｌ．，２：１５５−５６，２００２；Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２６：３３００−０４，１９９８；およびワールドワイドウェブ上のｓｂｃｈｅｍ．ｋｙｏｔｏ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓａｉｔｏ−ｌａｂに見ることができる。
【００５９】
本教示の文脈で用いられる場合、「ライゲーションに適する」との用語は、環状化可能なプローブの１つ以上の末端、または特定のライゲーション剤のために適当に反応性のある基を含むプローブセットのプローブの１つ以上の末端をいう。例えば、環状化可能なプローブの３’−および５’−末端またはプローブセットの末端または２つの対応するプローブが挙げられるが、これらに限定されない。反応基の例示的な対として、プローブの３’末端上のヌクレオチド３’−ヒドロキシル基および同一または対応する第２プローブの５’末端上のヌクレオチド５’−ホスフェート基；ホスホロチオエートおよびトシレートまたはヨウ化物；エステルおよびヒドラジド；ＲＣ（Ｏ）Ｓ−、ハロアルキルまたはＲＣＨ２Ｓおよびα−ハロアルキル；チオホスホリル基とブロモアセトアミド基が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ある実施形態において、標的特異的プローブの５’−末端および３’−末端は標的配列上で隣接的にハイブリダイズしてライゲーションを可能とする。他の実施形態において、プローブの５’−末端および３’−末端がハイブリダイズする場合、それらは直接隣接していなく、ギャップ充填工程を用いて、プローブの５’−末端をプローブの３’−末端の近位まで伸張させる。さらに別の実施形態において、プローブの５’−末端と３’−末端の間にギャップが存在して、「ギャップオリゴヌクレオチド」がプローブのそれらの２末端間のギャップにおいてハイブリダイズして、例えば特異性を高めることができる。そのような実施形態において、プローブの５’−末端と３’−末端はギャップオリゴヌクレオチドの３’−末端と５’−末端にそれぞれ連結させることができる。本教示にしたがえば、ギャップヌクレオチドは４ヌクレオチド塩基のうち３つを含むが、第４のものは含まず、かつ使用されているプローブまたはプローブセットに調和するユニバーサル塩基を潜在的に含むように設計されること；およびギャップ充填は４ヌクレオチド塩基のうち３つの取り込みをともなうが、第４のものは取り込まず、かつ使用されているプローブまたはプローブセットに調和するユニバーサル塩基の潜在的な取り込みをともなうことを理解されたい。
【００６０】
広い意味で用いられる発光（ルミネセンス）とは、温度を有意に上げずに光を発生する、生物発光、化学発光、リン光、電気化学発光および蛍光等の、しかし、これらに限定されないプロセスをいう。ここで用いられる「ルミネセンス発生手段」との用語は、酵素反応か化学反応をそれぞれ使用する生物発光方法または化学発光方法等の、しかし、これらに限定されないルミネセンスまたは光を発生する方法をいう。例示的なルミネセンス発生手段として、例えば、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、Ｇａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｃｅｐｓルシフェラーゼ、Ｐｌｅｕｒｏｍａｍｍａルシフェラーゼ等の、しかし、これらに限定されない種に由来する酵素ルシフェラーゼおよびその基質、典型的にはルシフェリンまたはコエレンテラジン；ルミノール化学発光；ビス（２，４，６−トリクロロフェニル）オキサレート（ＴＣＰＯ）等のパーオキシオキサレートおよび過酸化水素；ヘキサシアノ鉄酸カリウムを触媒とするルミナールと過酸化水素が挙げられる。ルミネセンスおよびルミネセンス発生手段の説明は、とりわけ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３３，ＤｅＬｕｃａ  ａｎｄ  ＭｃＥｌｒｏｙ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６；およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３０５，Ｚｉｅｇｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｌｄｗｉｎ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，２０００に見ることができる。
【００６１】
「レポータープローブ」との用語は、第１増幅産物、第２増幅産物、増幅産物代理物またはそれらの組合せに結合またはアニールするヌクレオチドの配列、ヌクレオチド類似体の配列またはヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体をいい、強度の変化または放射波長の変化等の、しかし、これらに限定されない変化で検出された場合、対応する標的配列を同定するために用いられる。大部分のレポータープローブはそれらの作用様式に基づいて分類することができ、例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ等の、しかし、これに限定されないヌクレアーゼプローブ（例えば、Ｌｉｖａｋ，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １４：１４３−１４９，１９９９；Ｙｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３６：２６６−７５，２００４を参照）；スコルピオンプライマー、ＬｕｘＴＭプライマー、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ等の伸長プローブ；分子指標、Ｅｃｌｉｐｓｅプローブ、ライトアッププローブ、単標識レポータープローブの対、ハイブリダイゼーションプローブ対またはこれらの組合せ等のハイブリダイゼーションプローブが挙げられるが、これらに限定されない。一定の実施形態において、レポータープローブは、アミド結合、ＬＮＡ、ユニバーサル塩基またはそれらの組合せを含み、ステムループレポータープローブ構成とステムのないレポータープローブ構成が挙げられる。一定のレポータープローブは単標識される一方で、他のレポータープローブは二重標識される。隣接してハイブリダイズしたプローブ間の蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を用いる二重プローブシステムは、レポータープローブとの用語の意図された範囲内にある。
【００６２】
一定の実施形態において、レポータープローブは、蛍光レポーター基、（暗クエンチャーおよび蛍光クエンチャー等の、しかし、これらに限定されない）クエンチャーレポーター基、親和性タグ、ハイブリダイゼーションタグ、ハイブリダイゼーションタグ相補体またはそれらの組合せを含む。ある実施形態において、ハイブリダイゼーションタグ相補体を含むレポータープローブは、対応するハイブリダイゼーションタグにアニールし、多成分レポーター基のメンバーは、多成分レポーター基の対応するメンバーを含むレポータープローブ、またはそれらの組合せに結合する。例示するレポータープローブとして、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ；スコルピオンプローブ（スコルピオンプライマーともいう）；Ｌｕｘ（登録商標）プライマー；ＦＲＥＴプライマー；Ｅｃｌｉｐｓｅプローブ；ハイブリダイゼーションプローブ対；ＦＲＥＴ系分子指標、多色分子指標、アプタマー指標、ＰＮＡ指標および抗体指標等の、しかし、これらに限定されない分子指標；レポーター基標識化ＰＮＡクランプ、レポーター基標識化ＰＮＡオープナー、レポーター基標識化ＬＮＡプローブ、およびナノ結晶、金属ナノ粒子および類似のハイブリッドプローブを含むプローブが挙げられる（例えば、Ｔｙａｇｉ  ａｎｄ  Ｋｒａｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０３−０８，１９９５；Ｎａｚａｒｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：２５１６−２１，１９９７；Ｆｉａｎｄａｃａ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１１：６０９−１３，２００１；Ｄｕｂｅｒｔｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：３６５−７０，２００１；Ｚｅｌｐｈａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２８：３０４−１５，２０００；およびＷｉｌｈｅｌｍ  ａｎｄ  Ｐｉｎｇｏｕｄ，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２：１１２０−２８，２００３を参照）。一定の実施形態において、レポータープローブは、さらに、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブとＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢ−ＮＦＱプローブ（両者ともにＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより入手）等の、しかし、これらに限定されない溝バインダーを含む。一定の実施形態において、レポータープローブ検出は蛍光偏光検出を含む（例えば、Ｓｉｍｅｏｎｏｖ  ａｎｄ  Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：ｅ９１，２００２を参照）。
【００６３】
（ＩＩＩ．技術）
本教示にしたがって、標的配列を選択的に増幅する方法および標的配列を検出する方法が提供される。一部実施形態において、本教示のプローブは、プローブまたはプローブ対の第１と第２標的相補性部分を経て標的配列にハイブリダイズする。一部実施形態において、プローブの５’−末端および３’−末端は標的配列にハイブリダイズする場合、直接隣接している（例えば、図１と図２を参照）。他の実施形態において、ハイブリダイズしたプローブの末端間には当初ギャップまたは空間が存在し、これは、例えば、当分野で公知のギャップオリゴヌクレオチドまたは「ギャップ充填」を用いて充填する（例えば、Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９：２２５−３２，１９９８を参照）。図３に概略的に示された一例において、プローブ１２はプローブの末端間に空間を持ちながら標的配列１３にハイブリダイズするので、対応する「ギャップオリゴヌクレオチド」１４は標的配列１３にもハイブリダイズできる。プローブの５’−末端および３’−末端は、ギャップオリゴヌクレオチドの３’−末端および５’−末端にそれぞれ隣接する。図４に概略的に示される別の例示的実施形態において、例示的プローブ対の第１プローブ１５と第２プローブ１６の相対する側の末端間には、それら２つのプローブが標的配列１７に最初にハイブリダイズする時に空間が存在する（図４Ａ）。第２プローブ１６の３’末端は、例えば、伸長酵素を用いる「ギャップ充填」により伸張できるので、伸張させたプローブ１６＊の新しく合成された３’−末端が第１プローブ１５の５’−末端に隣接することとなる（図４Ｂ；「ギャップ充填」配列を斜線で示す）。
【００６４】
ハイブリダイズしたプローブの末端、および必要に応じて、ギャップオリゴヌクレオチドは、各末端がライゲーションに適しているのであれば、ともに連結して連結型プローブ−標的複合体を形成することができる。一部実施形態では、酵素ライゲーション手段が用いられる。一部実施形態では、化学的手段または光ライゲーション手段等の非酵素ライゲーション手段が用いられる。一部実施形態において、例えば、熱変性；塩基性ｐＨ（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム）、ホルムアルデヒド、尿素、（ある程度の）ＤＭＳＯ、およびカチオンキレート剤等の、しかし、これらに限定されない化学変性；ヘリカーゼ；または、例えば、標的配列の少なくとも一部に相補的な一定のＰＮＡ分子および／またはｐｃＰＮＡ分子またはそれらの組合せ等の、しかし、これらに限定されない鎖侵入構造の形成等の、しかし、これらに限定されない方法によって、連結型プローブは標的配列から外される。別の実施形態において、連結型プローブは第１プライマーにより遊離させられるか、少なくとも一部外されるが、この場合、第１プライマーはＤＮＡ−ＰＮＡキメラまたはＤＮＡ−ＬＮＡキメラ等の、しかし、これらに限定されないキメラオリゴマーを含む。当業者は、多くのキメラ第１プライマーオリゴマーが起こりうるのは、それらが（ｉ）連結型プローブにハイブリダイズでき、そうすることにより連結型プローブを連結型プローブ−標的複合体から少なくとも部分的に外し、かつ（ｉｉ）伸長酵素により伸張可能である場合であることを理解するだろう。一部実施形態において、ＰＮＡオリゴマーまたはキメラオリゴマー等の、しかし、これらに限定されないオリゴマーは連結型プローブ−標的配列複合体の標的配列の一部にハイブリダイズして連結型プローブを遊離させるか、もしくは少なくとも部分的に外して、引き続いて、第１プライマーは連結型プローブに結合する。一部実施形態において、連結型プローブは、第１プライマーハイブリダイゼーションの前に、またはその結果として、外されることはない。
【００６５】
第１プライマーは連結プライマーにハイブリダイズし、ハイブリダイズしたプライマーは第１反応組成物中で伸張して第１増幅産物を作る。典型的には、第１プライマーは、上流側のライゲーション部位において、またはその近くで連結型プローブにハイブリダイズするために、非連結型プローブではなく、連結型プローブのみが増幅させられる。第１反応組成物は、４ヌクレオチド塩基のうち３塩基のみが、通常、ヌクレオチド三リン酸の形で存在する点でヌクレオチド欠損であり、この場合、反応組成物中の３ヌクレオチド塩基は連結型プローブ中のヌクレオチド塩基と相補的である。当業者は、４つのＮＴＰのうち１つが第１反応組成物には欠けているので、たとえ誤ったプライミングが起ころうと（一部の限定された不成功の増幅は起こりうるが）、すべての４ヌクレオチド塩基を含むバックグラウンド配列は増幅されない。しかし、３ヌクレオチド塩基のみ（および任意にユニバーサル塩基）を含む連結型プローブは適当な第１反応組成物中で増幅させることができる。よって、ヌクレオチド欠損反応組成物はバックグラウンド配列の増幅を支持しないが、適当な連結型プローブの増幅は支持するために、たとえ誤ったプライミングが起こっても、バックグラウンド配列ではなく連結型プローブが選択的に増幅される。当業者は、異なるユニバーサル塩基等の、しかし、これに限定されないユニバーサル塩基を含む連結型プローブが、本教示の適当なヌクレオチド欠損の第１反応組成物中で選択的に増幅させることもできることを理解するだろう。
【００６６】
一定の実施形態において、第２プライマーを第１増幅産物にハイブリダイズさせ、増幅させて第２増幅産物を作る。一部実施形態において、第１増幅産物は、第２増幅産物が作られる前に、第１反応組成物中の少なくとも一部の非標的配列から分離させる。一定の実施形態において、第２プライマーおよびすべての４ヌクレオチド塩基（すなわち、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ、ＵまたはＴおよびＵ）、および第１増幅産物を用いて作られた第２増幅産物を鋳型として含む第２反応組成物を形成する。一部実施形態において、第２反応組成物は第１プライマーを含み、第２増幅産物はさらなる第１増幅産物を作る鋳型として働く。
【００６７】
ローリングサークル増幅を含む１つの例示的な実施形態を図５Ａ〜図５Ｄに示す。図５Ａに示されるように、第１標的相補性部分１９、第２標的相補性部分２０およびスペーサー２１を含む環状化可能なプローブ１８は標的配列２２にハイブリダイズし、プローブの５’−末端はその３’−末端に連結して連結型プローブ２３を生じる（図５Ｂを参照）。図５Ｂに示されるように、第１プライマー２４は連結型プローブ２３にハイブリダイズし、標的配列２２を外す。開示された方法の一部実施形態において、ライゲーション産物−標的複合体は、例えば、熱変性か化学変性等の、しかし、これらに限定されない方法によってプライマーハイブリダイゼーション前に遊離させる。図５Ｂに戻ると、第１反応組成物中で、ハイブリダイズした第１プライマー２４は第１伸長酵素により鋳型依存的に選択的に増幅させられて第１増幅産物２５を生じる。第１伸長酵素が強い鎖置換活性を有する場合、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）が起こりうる。図５Ｃに示されるように、第１プライマー結合部位がＲＣＡにより連結型プローブ２３から外されると、第１プライマー２４のさらなるコピーがハイブリダイズし、伸長酵素により伸張させられて、さらなる第１増幅産物２５を生じる。無機ピロリン酸塩（“ＰＰｉ”として示される）が重合反応の産物として生じる。一部実施形態において、ＰＰｉはルミネセンス発生技術の基質として働いて検出可能な光の発生をもたらし、対応する標的配列が存在するとの推定を可能とする。
【００６８】
一部実施形態において、（取り込まれた第１プライマー２４を含む）遊離の第１増幅産物２６は第２増幅産物を作る鋳型として働く（図５Ｄを参照）。第２プライマー２７は遊離の第１増幅産物２６にハイブリダイズし、第２伸長酵素により増幅させられて、第２増幅産物（５Ｄの点線として示される）とＰＰｉを、通常第２反応組成物中に作る。第２増幅産物はさらなる第１増幅産物合成の鋳型として働くことができる。そのような第２増幅産物とさらなる第１増幅産物の合成は、ＰＣＲ等の、しかし、これに限定されない指数関数的増幅技術を用いて実施することができる。一部実施形態において、第１伸長酵素は、例えば、バクテリオファージｐｈｉ  ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ等の、しかし、これらに限定されない強い鎖置換活性を有するポリメラーゼである。一部実施形態において、第１伸長酵素と第２伸長酵素は同一である。別の実施形態において、第１伸長酵素と第２伸長酵素は異なる酵素である。一定の実施形態において、第２伸長酵素は、例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）等の、しかし、これらに限定されない耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。一部実施形態において、ＰＰｉおよびさらなるＰＰｉはルミネセンス発生技術の基質として働く（例えば、図６を参照）。
【００６９】
一定の実施形態において、プローブ対の第１プローブと第２プローブは対応する標的配列とハイブリダイズし、ともに連結して、連結型プローブを生じる。一部実施形態において、連結型プローブは連結型プローブ−標的複合物から遊離する。第１プライマーは連結型プローブの対応するプライマー結合部位にハイブリダイズし、選択的な増幅が、第１伸長酵素を含むヌクレオチド欠損の第１反応組成物中で起こり、第２増幅産物合成の鋳型として働くことのできる第１増幅産物を生じる。一部実施形態において、標的配列は二本鎖であり、プローブの結合を助けるように少なくとも部分的に変性している。一部実施形態において、二本鎖配列の変性として、熱変性、化学変性、ヘリカーゼ、ＰＮＡを含むオリゴマー、化学量論的に過剰なプライマーおよび／またはプローブまたはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。一部実施形態において、連結型プローブの遊離として、熱変性、化学変性、ヘリカーゼ、ＤＮＡ−ＰＮＡキメラオリゴマーを含む第１プライマー等の、しかし、これに限定されないＰＮＡを含むオリゴマー、化学量論的に過剰なプライマーまたはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
一定の実施形態において、第１増幅産物はバックグラウンド配列から分離され、第１増幅産物、第２プライマー、第２伸長酵素およびすべての４つのＮＴＰを含む第２反応組成物を形成する。適当な条件下で第２プライマーは第１増幅産物とハイブリダイズし、増幅が起こって第２増幅産物を生じる。当業者は、さらなる第１増幅産物の合成の鋳型として第２増幅産物が通常働きうることを理解するだろう。一部の実施形態において、第２反応組成物はさらに第１プライマーを含み、さらなる第１増幅産物とさらなる第２増幅産物が、例えば、ＰＣＲ等の、しかし、これに限定されない指数関数的増幅により通常作られる。
【００７１】
一部実施形態において、第２増幅産物、第１と第２増幅産物またはそれらの代理物が検出されて、対応する標的配列が試料中に存在することを示す。一部実施形態において、第１増幅産物、第２増幅産物または第１と第２増幅産物は、プライマー結合部位、レポータープローブ結合部位、プロモーター配列、レポーター基、移動度変更剤、親和性タグ、ハイブリダイゼーションタグ、リボソーム結合部位またはそれらの組合せを含む。
【００７２】
一定の方法は、第１増幅産物および／または第２増幅産物等の、しかし、これらに限定されない、ハイブリダイズしたプローブおよび／またはハイブリダイズしたプローブの代理物の増幅または連結型プローブおよび／または連結型プローブの代理物の増幅の工程と、増幅産物またはその代理物を検出する工程を含む。一部の方法は第１増幅産物を生じる連結型プローブを選択的に増幅する工程を含み；別の方法は第１増幅産物、第２増幅産物、それぞれの代理物またはそれらの組合せを増幅する工程をさらに含む。一部の方法は、さらに、鎖侵入構造を作る工程等の、しかし、これに限定されない、標的配列または標的配列を含む二本鎖核酸の変性工程；（ｉ）第１標的相補性部分と第２標的相補性部分、（ｉｉ）それぞれが標的に選択的にハイブリダイズする第１プローブと第２プローブを含むプローブ対、（ｉｉｉ）ギャップオリゴヌクレオチドおよびプローブまたはプローブ対、または（ｉｖ）それらの組合せを含むプローブを連結する工程；連結型プローブを遊離する工程；ルミネセンスを発生する工程；またはそれらの組合せからなる。
【００７３】
一定の方法によれば、検出は、必ずではないが、通常は等温的に実施される多酵素ルミネセンス発生反応過程を含み、それら方法の一実施形態を図６に概略的に示す。最初に、連結型プローブを本教示にしたがってライゲーション剤により作る。連結型プローブを伸長酵素により選択的に増幅して、第１反応組成物中に第１増幅産物（１ＡＰ）と無機ピロリン酸塩（ＰＰｉ）を作る。任意に、第２反応組成物を形成し、第２増幅産物とさらなるＰＰｉを作る。ＰＰｉをアデノシン５’−ホスホ硫酸（ＡＰＳ）とスルフリラーゼに組合せてアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）を作る。次に、スルフリラーゼ発生ＡＴＰをルシフェリンとホタルルシフェラーゼに組合せてＰＰｉとアデニル−ルシフェリンを形成し、これを引き続いてオキシルシフェリンへと酸化して、ルミネセンスを発生させる。発生したルミネセンスは例えばルミノメーターを用いて検出することができ、試料中の標的配列の存在を増幅産物の間接的な検出により推量できる。
【００７４】
開示された方法の一部の実施形態において、第１増幅産物は第２増幅産物を生じさせる前に標的配列およびバックグラウンド配列から分離される。一部実施形態において、そのような分離は、親和性タグの対、ハイブリダイゼーションタグおよびその相補物またはそれら両方を含む。一部の実施形態において、第１増幅産物、第２増幅産物またはそれら両方は、レポーター基、親和性タグ、プライマー結合部位、ハイブリダイゼーションタグ、移動度変更剤、レポータープローブ結合部分またはそれらの組合せを含む。
【００７５】
本教示によるライゲーションは、ヌクレオチド間結合が、環状化可能なプローブの相対する末端の間か、標的配列上で隣接してハイブリダイズするプローブ対のプローブの相対する末端の間に形成される酵素的または非酵素的な手段を含む。典型的には、アニールされたプローブの相対する末端はライゲーションに適する（ライゲーションに対する適合性は使用されるライゲーション手段の関数である）。一定の実施形態において、ライゲーションは少なくとも１つのギャップ充填手順も含み、ここでは２つのプローブの末端は当初隣接してハイブリダイズしないが、第１プローブの３’−末端が、伸長酵素により第２プローブの５’−末端に隣接するまで１つ以上のヌクレオチドにより伸張させる。別の実施形態において、ハイブリダイズした環状化可能なプローブの３’−末端はギャップ充填反応でプローブの５’−末端に隣接するまで伸張させる。次に、ヌクレオチド間結合を適当なライゲーション手段によりこれらの隣接する末端間に形成することができる。ヌクレオチド間結合として、ホスホジエステル結合形成を挙げることができるが、これに限定されない。そのような結合形成として、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼまたはそれら両方により酵素的に造られたものを挙げることができるが、それらに限定されない。他のヌクレオチド間結合として、チオホスホリルアセチルアミノ基を形成するα−ハロアシル基とホスホチオエート基の間、５’−ホスホロチオエステルを形成するホスホロチオエート基およびトシレート基またはヨウ化物の基の間、およびピロリン酸結合の間等の適当な反応基間の共有結合形成が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
化学ライゲーションは、適当な条件下、自己ライゲーション等により自発的に起こりうる。もしくは、「活性」剤または還元剤を用いることができる。活性剤または還元剤の例として、カルボジイミド、臭化シアン（ＢｒＣＮ）、イミダゾール、１−メチルイミダゾール／カルボジイミド／シスタミン、Ｎ−シアノイミダゾール、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）および光ライゲーションに用いられるような紫外線等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
本教示にしたがえば、ライゲーションは、一般的に、環状化可能なプローブまたは第１プローブおよびプローブ対の対応する第２プローブの標的相補性部分を対応する標的配列上の各相補性領域にハイブリダイズさせ；プローブ（または第１プローブ）の３’末端をプローブ（または第２プローブの）の５’末端に連結して連結型プローブを形成することからなる。次に、連結型プローブを選択的に増幅する。
【００７８】
本教示による増幅は、連結型プローブ、第１増幅産物、第２増幅産物、それらの代理物またはそれらの組合せの少なくとも一部を通常は鋳型依存的に相補鎖として再生もしくはコピーさせる、広い範囲の直線的または指数関数的な増幅技術等の、しかし、これらに限定されない手段を包含する。増幅工程を実施する例示的な手段として、例えば、ＲＣＡに組合わせたオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ／ＲＣＡ）およびＯＬＡ／ＲＣＡ／ＰＣＲ等の、しかし、これらに限定されない多様なバージョンまたはそれらの組合せを含むＰＣＲ、プライマー伸張、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、多置換増幅（ＭＤＡ）、核酸鎖型増幅（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、転写仲介増幅（ＴＭＡ）、単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ（登録商標）およびＲｉｂｏ−ＳＰＩＡ（登録商標）、ＮｕＧｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ループ仲介等温増幅（ＬＡＭＰ）等が挙げられる。例示増幅技術の説明は、とりわけ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．；Ａｕｓｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．；ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｄｉｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｒａｐｌｅｙ；米国特許第６，０２７，９９８号；ＰＣＴ公開ＷＯ９７／３１２５６およびＰＣＴ公開ＷＯ０１／９２５７９；Ｅｈｒｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１６４３−５０（１９９１）；Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，５：７９５−８００，２００４；Ｆａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｌ８：５６１−６４（２０００）；およびＲａｂｅｎａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ２８：９７−１０２（２０００）；Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９：２２５−３２，１９９８；Ｂａｒａｎｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８８−９３（１９９１）；Ｂｉ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：２９２４−２９５１（１９９７）；Ｚｉｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２７：ｅ４０（１９９９）；およびＤｅｍｉｄｏｖ  ａｎｄ  Ｂｒｏｕｄｅに見ることができる。増幅との用語が意図する意味には、代理物増幅法、分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）、Ｈｙｂｒｉｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｉｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、シグナル増幅技術（ＳＡＴ：Ｔｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）およびインベーダー技術（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）等の構造特異的ヌクレアーゼ技術等の、しかし、これらに限定されないシグナル増幅技術も含まれる。シグナル増幅技術の説明は、とりわけ、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｎｇｓｍｏｒｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：２１−７，２００１；およびＡｎｄｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：２９−４４，２００１に見ることができ���。
【００７９】
一定の実施形態において、増幅は、連結型プローブ、第１増幅産物、第２増幅産物またはそれらの組合せ中の相補的または実質的に相補的な配列にプライマーをハイブリダイズし；伸長酵素を用いて、鋳型依存的にヌクレオチドの少なくとも一つの鎖を合成し；新しく形成した核酸二本鎖を変性して鎖を分離する連続的な工程のサイクルを含む。このサイクルは繰返しても繰返さなくてもよい。一実施形態において、ヌクレオチド鎖の合成はヌクレオチド欠損反応組成物中での選択的な増幅を含む。増幅は熱サイクルを含むか、または等温的に実施することができる。一定の実施形態において、新しく形成された核酸二本鎖は最初に変性させなくてもよいが、１つ以上のそれに続く工程でそれらの二本鎖の形で用いることができ、一方または両方の鎖が標的配列の代理物として働くことができるが、そのように働く必要はない。一定の実施形態において、単鎖増幅産物が作られ、標的代理物として働くことができるが、そのように働く必要はない。
【００８０】
プライマー伸張は、鋳型にアニールしたプライマー、例えば連結型プローブまたは増幅産物を、伸長酵素等の増幅手段を用いて５’⇒３’の方向で伸張することからなる増幅技術である。一定の実施形態によれば、適当な条件下で、伸長酵素はプライマーの３’末端で始まる鋳型鎖に相補的なヌクレオチドを取り込むことによりアニールされたプライマーを増幅して相補性鎖を生じることができる。一部実施形態において、プライマー伸張はヌクレオチド欠損反応組成物中で実施され、増幅産物を選択的に増幅させる。一部実施形態において、強い鎖置換性を有する伸長酵素がプライマー伸張の第１伸長酵素として用いられる。一定の実施形態において、２つのプローブ末端またはプローブ対がともに連結できるように、環状化可能なプローブのハイブリダイズした末端間のギャップまたは標的配列にハイブリダイズするプローブセットの２つのプローブ間のギャップを充填するためにプライマー伸張を用いることができる。一定の実施形態において、プライマー伸張に用いられる伸長酵素は５’−エキソヌクレアーゼ活性を欠くか、または実質的に欠く。
【００８１】
一定の実施形態において、増幅工程は等温的に実施される。一部実施形態において、等温増幅は、ＲＣＡ法の変法を含めたＲＣＡを含む。一部実施形態において、増幅は、ＰＣＲ等の、しかし、これに限定されない熱サイクルを含む。
【００８２】
分離は、連結型プローブ、第１増幅産物、第２増幅産物またはそれらの組合せから少なくとも一部の未反応成分、少なくとも一部の試薬、または一部の未反応成分と一部の試薬との両方を除去する手段を含む。当業者は、多くのよく知られた分離手段が開示された方法に有用となりうることを理解するだろう。分離工程を実施するための例示的な手段／技術として、例えば、等電点電気泳動およびキャピラリー電気泳動法等の、しかし、これらに限定されないゲル電気泳動；誘電泳動；ビーズ、ミクロスフェア等を用いる蛍光活性化ソーティング技術等の、しかし、これに限定されないフローサイトメトリー；ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、サイズ排除（ゲルろ過）クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー等の、しかし、これらに限定されない液体クロマトグラフィー；ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、マルトース−マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）およびカルシウム−カルシウム結合ペプチド等の親和性タグ結合；アプタマー標的結合；ハイブリダイゼーションタグ−ハイブリダイゼーションタグ相補物アニーリング；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ、ＥＳＩ−ＴＯＦ、タンデム質量分析法（ＭＳ−ＭＳ）、ＬＣ−ＭＳおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ等の、しかし、これらに限定されない質量分析法；マイクロ流体装置等が挙げられる。分離技術および分離−検出技術の議論は、とりわけ、Ｒａｐｌｅｙ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ；Ａｕｓｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．；Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｐ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃｏｌｂｕｒｎ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９２；Ｔｈｅ  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｓｉｕｚｄａｋ，ＭＣＣ  Ｐｒｅｓｓ，２００３；ＰＣＴ公開ＷＯ０１／９２５７９；およびＭ．Ｌａｄｉｓｃｈ，Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ａｎｄ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，２００１に見ることができる。
【００８３】
一定の実施形態において、分離工程は、例えば、キャピラリー電気泳動法等の、しかし、これに限定されない移動度に依存する分析技術を含む。ここで用いられる「移動度依存分析技術」との用語は、１つ以上の分離技術において異なる分子種の異なる移動速度に基づいて異なる分子種を分離する手段をいう。例示的な移動度に依存する分析技術として、電気泳動、クロマトグラフィー、質量分析法、沈降、例えば、勾配遠心分離、場流動分画、多段階抽出等が挙げられる。移動度に依存する分析技術の説明は、とりわけ、米国特許第５，４７０，７０５号、米国特許第５，５１４，５４３号、米国特許第５，５８０，７３２号、米国特許第５，６２４，８００号および米国特許第５，８０７，６８２号；ＰＣＴ公開ＷＯ０１／９２５７９；Ｄ．Ｒ．Ｂａｋｅｒ，Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅ１ｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）；Ｂｉｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｍ．Ａ．Ｖｉｊａｙａｌａｋｓｈｍｉ，ｅｄ．，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕ．Ｋ．（２００３）；Ｋｒｙｌｏｖ  ａｎｄ  Ｄｏｖｉｃｈｉ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２：１１１Ｒ−１２８Ｒ（２０００）；Ｓｗｉｎｎｅｙ  ａｎｄ  Ｂｏｒｎｈｏｐ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２１：１２３９−５０（２０００）；Ｃｒａｂｔｒｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２１：１３２９−３５（２０００）；およびＡ．Ｐｉｎｇｏｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｓｔｕｄｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ（２００２）に見ることができる。
【００８４】
一定の実施形態において、連結型プローブ、第１増幅産物、第２増幅産物またはそれらの組合せは移動度に依存する分析技術により分離する。一定の実施形態において、連結型プローブ、第１増幅産物、第２増幅産物またはそれらの組合せは液体クロマトグラフィーにより分解（分離）する。ここでの教示に使用される例示的な固定相クロマトグラフィー媒体として、逆相媒体（例えば、Ｃ−１８またはＣ−８固相）、イオン交換媒体（特に陰イオン交換媒体）および疎水性相互作用媒体が挙げられる。一定の実施形態において、連結型プローブ、第１増幅産物、第２増幅産物またはそれらの組合せはミセル動電毛管クロマトグラフィー（ＭＥＣＣ）により分離する。
【００８５】
逆相クロマトグラフィーは、アイソクラチック、またはさらに一般的には直線的、曲線的または段階的な溶媒勾配を用いて実施され、ここでは水性溶媒中のアセトニトリルまたはイソプロパノール等の非極性溶媒の量をクロマトグラフィー実行中に増加させて各分析物の固相に対する親和性にしたがって分析物を逐次溶出させる。連結型プローブや増幅産物等の核酸配列の分離のために、イオンペアリング剤（例えば、テトラ−アルキルアンモニウム）を通常は溶媒中に含めてホスフェートの電荷を遮蔽する。
【００８６】
連結型プローブ、増幅産物および他の代理物の移動度は、固相または固定相に対するプローブの親和性を変えるポリマー鎖を含む移動度変更剤を用いることにより変えることができる。例えば、逆相クロマトグラフィーでは、連結型プローブおよび／または増幅産物の固定相に対する増加した親和性が、適度に疎水性の尾部（例えば、ＰＥＯ含有ポリマー、短いポリペプチド等）を移動度変更剤に加えることにより達成できる。さらに長い尾部は固相に対するさらに高い親和性を付与するので、溶出させる増幅産物および／または増幅産物代理物のためにさらに高い非極性溶媒濃度（およびさらに長い溶出時間）を必要とする。
【００８７】
一定の実施形態において、連結型プローブ、第１増幅産物、第２増幅産物、それらの代理物またはそれらの組合せは篩マトリクスまたは非篩マトリクスでの電気泳動により分離する。一定の実施形態において、電気泳動分離はキャピラリチューブ中でキャピラリー電気泳動法により実施する（例えば、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｇｒｏｓｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｌｂｕｒｎ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９２を参照）。開示された教示に使用する例示的な篩マトリクスとして、ビスアクリルアミドに共有結合で架橋したポリアクリルアミド等の共有結合性架橋マトリクス；直鎖ポリマーで形成したゲルマトリクス（例えば、米国特許第５，５５２，０２８号参照）；およびゲルを含まない篩媒体（例えば、米国特許第５，６２４，８００号；Ｈｕｂｅｒｔ  ａｎｄ  Ｓｌａｔｅｒ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１６：２１３７−２１４２（１９９５）；Ｍａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６６（１０）：１７７７−１７８０（１９９４）参照）が挙げられる。電気泳動媒体は、ポリヌクレオチドを一本鎖の形態に保持するために７Ｍのホルムアミド等の核酸変性剤を含有してよい。適当なキャピラリー電気泳動法装置、例えば、ＡＢＩ  ＰＲｌＳＭ（登録商標）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒシリーズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が市販されている。
【００８８】
一定の実施形態において、ハイブリダイゼーションタグ相補体として、ハイブリダイゼーション増強剤が挙げられ、ここで用いられる「ハイブリダイゼーション増強剤」との用語は２つの核酸間のハイブリダイゼーションを増強、安定化、さもなければ正に作用するように働く部分、例えばインターカレーター（例えば、米国特許第４，８３５，２６３号を参照）、副溝バインダー（例えば、米国特許第５，８０１，１５５号を参照）および架橋官能基を意味する。ハイブリダイゼーション増強剤がハイブリダイゼーションタグ−ハイブリダイゼーションタグ相補体二本鎖との相互作用を可能にするように移動度変更剤に付着する限り、ハイブリダイゼーション増強剤は移動度変更剤のいずれの部分に付着させてもよい。一定の実施形態において、ハイブリダイゼーション増強剤は副溝バインダー、例えば、ネトロプシン、ジスタマイシン等を含む。
【００８９】
当業者は、連結型プローブ、第１増幅産物、第２増幅産物またはそれらの組合せが、例えば、限定はされないが、ゲル電気泳動、ゲルろ過、質量分析法またはＨＰＬＣにより分子量および長さまたは移動度に基づいて分離され、しばしば分離−検出技術の組み合わせで検出されうることを理解するだろう。一定の実施形態において、連結型プローブ、第１増幅産物、第２増幅産物またはそれらの組合せは、重力、電気、遠心力、水圧、空気圧または磁力の少なくとも１つの力を用いて分離される。
【００９０】
一定の実施形態において、親和性タグは、それが結合した要素、例えば、連結型プローブ、第１増幅産物、第２増幅産物またはそれらの組合せを、試料、第１反応組成物、第２反応組成物またはそれらの組合せの少なくとも１つの構成要素から分離するために用いる。一定の実施形態において、連結型プローブ、第１増幅産物、第２増幅産物またはそれらの組合せを捕捉表面に結合させるために、例えば、限定するわけではないが、ビオチニル化結合プローブ、ビオチニル化増幅産物、ビオチニル化代理物またはそれらの組合せを、ストレプトアビジンを含む捕捉表面に結合させるために親和性タグが用いられる。一定の実施形態において、連結型プローブ、第１増幅産物、第２増幅産物、代理物またはそれらの組合せを捕捉表面に結合させるためにアプタマーが用いられる（例えば、Ｓｒｉｓａｗａｔ  ａｎｄ  Ｅｎｇｅｌｋｅ，ＲＮＡ  ７：６３２−６４１（２００１）；Ｈｏｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｌｄ  Ｄｅｓ．３：４２３−３１（１９９８）；Ｓｒｉｓａｗａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２９（２）：ｅ４，２００１を参照）。
【００９１】
一定の実施形態において、ハイブリダイゼーションタグ、ハイブリダイゼーションタグ相補体またはハイブリダイゼーションタグおよびハイブリダイゼーションタグ相補体は、それが結合した要素を、試料、反応組成物等の少なくとも１つの構成要素から分離するために用いる。一定の実施形態において、ハイブリダイゼーションタグは、連結型プローブ、第１増幅産物、第２増幅産物、代理物またはそれらの組合せを捕捉表面に付着させるために用いる。一定の実施形態において、連結型プローブ、第１増幅産物、第２増幅産物、代理物またはそれらの組合せは、同一のハイブリダイゼーションタグを含む。例えば、限定するわけではないが、同一のハイブリダイゼーションタグ相補体を用いる多数の異なる要素：ハイブリダイゼーションタグ種の分離、同一のハイブリダイゼーションタグ相補体を含む捕捉表面への多数の異なる要素：ハイブリダイゼーションタグ種の繋留等が挙げられる。
【００９２】
一定の実施形態において、分離工程は捕捉表面を含み、例えば、ビオチニル化第１増幅産物、ビオチニル化第２増幅産物、または増幅産物のビオチニル化代理物のストレプトアビジン被覆捕捉表面への結合が挙げられるが、これらに限定されない。一定の実施形態において、検出は捕捉表面を含む。適当な捕捉表面として、マイクロアレイ、適当に処理されたか被覆された反応容器および表面、ビーズ（例えば、磁気ビーズ、ラテックスビーズ、金属ビーズ、ポリマービーズ、マイクロビーズ等が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｔｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：７５６−５９（２００１）；Ｇｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９２：２５１−６２（１９９９）；Ｓｒｉｓａｗａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：ｅ４（２００１）；Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：６３１−３５，２００１；およびＳｔｅａｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１４０−４５，補足を含む，２００３を参照）。当業者は、捕捉表面の形と組成が一般的に限定されるものではないことを理解するだろう。
【００９３】
一定の実施形態において、第１増幅産物および／または第２増幅産物等の、しかし、これらに限定されない標的代理物を、マイクロアレイまたはビーズ等の、しかし、これらに限定されない捕捉表面にハイブリダイズまたは付着する。一定の実施形態において、捕捉表面に結合した代理物はレポーター基を含まないが、標識された実体の結合代理物へのハイブリダイゼーションに起因して間接的に検出される。そのような標識された実体として、標識されたハイブリダイゼーションタグ相補体、分子指標等のレポータープローブ、ライトアッププローブ、標識されたＬＮＡプローブ、標識されたＰＮＡプローブまたは捕捉表面の捕捉プローブが挙げられるが、これらに限定されない。一定の実施形態において、標識された実体は蛍光レポーター基およびクエンチャーを含む。
【００９４】
「検出する」および「検出」との用語はここでは広い意味で用いられ、標的配列の存在を決定または推測する技術を包含する。一部の実施形態において、代理物の存在が直接または間接に検出され、対応する標的配列の存在を推測させる。例えば、酵素カスケード反応により発生するルミネセンスの検出（例えば図６を参照）またはＴａｑＭａｎプローブ等のヌクレアーゼレポータープローブが切断される場合に発生する蛍光の検出において、検出可能な発光／蛍光シグナルが対応する増幅産物の代理物として働く検出が挙げられるが、これに限定されない。一部の実施形態において、リアルタイム検出法等の、しかし、これに限定されない検出は、さらに検出可能なシグナルの定量を含む。
【００９５】
一定の実施形態において、検出工程は、装置、すなわち、コンピューターアルゴリズムを含みうるが、含まなくてもよい自動化または半自動化検出手段を用いることからなる。一定の実施形態において、検出装置は、グラフ、モニター、電子スクリーン、磁気媒体、スキャナープリントアウトまたは他の二次元または三次元ディスプレイ上で標的代理物の観察または測定されたパラメーターの強度をグラフで示すか、および／または観察または測定されたパラメーターを記録する装置を含むか、または検出装置はそれらに連結される。一定の実施形態において、検出工程は、例えば、グラフ化、記録または読み取りコンポーネントまたは装置に結合させたルミノメーター；少なくとも１つの蛍光スキャナーおよび少なくとも１つのグラフ化、記録または読み取りコンポーネントを含むキャピラリー電気泳動装置；吸光度モニターまたは蛍光スキャナーおよびグラフレコーダーを連結したクロマトグラフィーカラム；記録および／または検出コンポーネントを含む質量分析計に連結したクロマトグラフィーカラム；またはスキャナーやＣＣＤカメラ等のデータ記録装置を有するマイクロアレイ等の、しかし、これらに限定されない装置に組合せるか、または少なくとも１つの分離工程の継続である。一定の実施形態において、検出工程は、例えば、Ｑ−ＰＣＲ等のリアルタイム分析等の、しかし、これに限定されない増幅工程に組み合わされる。検出工程を実施する例示的な手段として、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１００遺伝アナライザー，ＡＢＩ  ＰＲｌＳＭ（登録商標）３１００−Ａｖａｎｔ遺伝アナライザー、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７００  ＤＮＡアナライザー、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７３０  ＤＮＡアナライザー、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７３０ｘ／ＤＮＡアナライザー（これらすべてはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから得られる）；ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７３００リアルタイムＰＣＲシステム；およびマイクロアレイと関連ソフトウエア、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）１７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および他の市販のアレイシステム、とりわけ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ＡｇｉｌｅｎｔおよびＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能なものが挙げられる（Ｇｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９２：２５１−６２，１９９９；Ｄｅ  Ｂｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｎｅｒｖａ  Ｂｉｏｔｅｃ  １４：２４７−５２，２００２；およびＳｔｅａｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１４０−４５、補足を含む，２００３も参照）。例示的なソフトウエアとして、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ（登録商標）ソフトウエア、ＧｅｎｅＳｃａｎ（登録商標）分析ソフトウエアおよびＧｅｎｏｔｙｐｅｒ（登録商標）ソフトウエア（すべてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより得られる）が挙げられる。
【００９６】
一部実施形態において、検出は手持ちサイズの装置、手動または視覚による読み取りまたは評価、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態において、検出は自動化または半自動化デジタルまたはアナログ読み取りを含む。一部実施態様において、検出はリアルタイム分析または終点分析を含む。一部実施形態において、検出は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｌｏｗ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ａｒｒａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）等の、しかし、これに限定されないマイクロ流体装置を含む。一部実施形態において、検出はリアルタイム検出装置を含む。例示的なリアルタイム装置として、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７０００配列検出システム、ＡＢＩ  ＰＲｌＳＭ（登録商標）７７００配列検出システム、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００リアルタイムＰＣＲシステム、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００リアルタイムＰＣＲシステム、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ  ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム（すべてがＡｐｐＩｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより得られる）；ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）システム（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）；Ｍｘ３０００Ｐ（登録商標）リアルタイムＰＣＲシステム、Ｍｘ３００５Ｐ（登録商標）リアルタイムＰＣＲシステム、およびＭｘ４０００（登録商標）多重定量ＰＣＲシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）；およびＳｍａｒｔサイクラーシステム（Ｃｅｐｈｅｉｄ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃにより配給）が挙げられる。リアルタイム装置の説明は、とりわけ、それらの各メーカーのユーザーズマニュアル；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ；Ｄｅｍｉｄｏｖ  ａｎｄ  Ｂｒｏｕｄｅ；および米国特許第６，８１４，９３４に見ることができる。
【００９７】
一定の実施形態において、標的代理物は蛍光レポーター基を含まないが、それらの対応する質量対電荷比（ｍ／ｚ）に基づいて検出、定量される。例えば、一部実施形態において、第１増幅産物と第２増幅産物に取り込まれる質量タグ、電荷タグ、切断可能な部分または同位元素等の、しかし、これらに限定されない質量分析適合レポーター基を含む第１プライマーおよび／または第２プライマーが質量分析計検出に用いることができる（例えば、Ｈａｆｆ  ａｎｄ  Ｓｍｉｍｏｖ，Ｎｕｃｌ．，Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３７４９−５０，１９９７；およびＳａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：ｅ６３，２００３を参照）。増幅産物または増幅産物の一部は質量分析法により検出されて対応する標的配列の存在が推量できる。一部実施形態において、第１プライマーおよび／または第２プライマー、またはそれらの両方は制限酵素部位、切断可能な部分等を含み、検出のために引き続く増幅産物の一部の遊離を容易とする。一定の実施形態において、多数の代理物が液体クロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動法により分離され、ＥＳＩまたはＭＡＬＤＩに供され、質量分析法によって検出される。質量分析法の説明は、とりわけ、Ｔｈｅ  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇａｒｙ  Ｓｉｕｚｄａｋ，ＭＣＣ  Ｐｒｅｓｓ，２００３に見ることができる。本教示に使用される例示的な質量分析計として、ＡＰＩ２０００（登録商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム、ＡＰＩ３０００（登録商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム、ＡＰＩ４０００（登録商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム、ＡＰＩ４０００（登録商標）ＱＴＲＡＰ（登録商標）システム、ＱＳＴＡＲ（登録商標）システム、ＱＴＲＡＰ（登録商標）システム、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４７００  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ＡｎａｌｙｓｅｒおよびＶｏｙａｇｅｒ（登録商標）Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（登録商標）シリーズの装置（すべてがＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから得られる）；ＰｒｅｍｉｅｒおよびＱ−ＴＯＦ装置（関連ソフトウエアと適当な初期分離システムを含む）（Ｗａｔｅｒｓ）；およびＬＴＱシリーズ、ＬＣＱシリーズおよびＱｕａｎｔｕｍ装置（関連ソフトウエアと適当な初期分離システムを含む）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｅｇａｎ）が挙げられる。
【００９８】
一定の実施形態において、レポータープローブまたはレポータープローブの切断部分、遊離したハイブリダイゼーションタグ相補体のレポーター基またはハイブリダイゼーションタグ相補体の一部等の代理物が直接または間接に検出される。例えば、ステムループ指標やステムのない指標等の分子指標、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、ＬｉｇｈｔＳｐｅｅｄ（登録商標）ＰＮＡプローブ、またはマイクロアレイ捕捉プローブ等の、しかし、これらに限定されないクエンチャー含有の標識されたレポータープローブへの標的代理物のハイブリダイズが挙げられるが、これに限定されない。一定の実施形態において、ハイブリダイゼーションは、代理物を含めた第１増幅産物および／または第２増幅産物への分子指標のハイブリダイズ等のハイブリダイゼーションは溶液中で起こる。他の実施形態において、第１増幅産物または第２増幅産物またはレポータープローブは捕捉表面に結合し、対応するレポータープローブ、第１増幅産物または第２増幅産物のハイブリダイゼーションの際に蛍光が発せられる（例えば、ＥｖｉＡｒｒａｙｓ（登録商標）およびＥｖｉＰｒｏｂｅｓ（登録商標）、Ｅｖｉｄｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを参照）。ある実施形態において、そのようなハイブリダイゼーション現象は同時か、ほとんど同時に検出することができる。
【００９９】
一定の実施形態において、検出は単鎖標的代理物を含み、例えば、代理物、または遊離ハイブリダイゼーションタグ相補体のレポーター基（例示的な標的代理物）に取り込まれた蛍光レポーター基等、検出される単鎖分子に不可欠なレポーター基；ＰＮＡ指標、ＬＮＡ指標、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、スコルピオンプライマーまたはライトアッププローブ等の、しかし、これらに限定されないハイブリダイゼーションタグ相補体またはレポータープローブ等、検出される単鎖標的代理物とハイブリダイズする分子上のレポーター基の検出等の、しかし、これに限定されない検出が挙げられる。
【０１００】
一定の実施形態において、例えば、第１増幅産物：第２増幅産物複合体等の、しかし、これに限定されない二本鎖標的代理物が検出される。一部の実施形態において、そのような二本鎖代理物は、レポーター基をによって標識されているかまたは分子指標等の標識された実体と併せて用いて、例えば、限定されるものではないが、ＰＮＡオープナー、ＰＮＡクランプおよび三本鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）を用いた三本鎖形成、または二本鎖分子の局所的開環により検出される（例えば、Ｄｒｅｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  １４：２６９−８３，２０００；Ｚｅｌｐｈａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２８：３０４−１５，２０００；Ｋｕｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１０９７−１１０３，２００２；Ｋｎａｕｅｒｔ  ａｎｄ  Ｇｌａｚｅｒ，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０：２２４３−２２５１，２００１；Ｌｏｈｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．８：５０３−０９，１９９７を参照）。一定の実施形態において、標的代理物は一連のホモプリン配列を含む。
【０１０１】
一定の実施形態において、検出はレポーター基の検出可能なシグナル、または通常は標的代理物の存在に起因するレポーター基の検出可能なシグナルの変化を測定または定量することからなる。例えば、限定されるわけではないが、ある種の分子指標、ＬＮＡプローブ、ＰＮＡプローブおよびライトアッププローブ等の、しかし、これらに限定されないハイブリダイズしていないレポータープローブは、ハイブリダイズした時に定量的に増加する低いレベルだが、検出可能なシグナルを発するだろう（例えば、Ｓｖａｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８１：２６−３５，２０００；Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ  ａｎｄ  Ｊｅｏｎｇ，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７５：２４８−５３，１９９９；およびＳｉｍｅｏｎｏｖ  ａｎｄ  Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：ｅ９１，２００２を参照）。一定の実施形態において、検出は蛍光偏光の測定を含む。当業者は、使用される分離手段および／または検出手段が一般的に限定されないことを理解する。むしろ、多様な分離手段と検出手段が対応する標的配列の有無を推測させるのであれば、それら多様な手段は開示された方法とキットの範囲内にある。
【０１０２】
本教示にしたがって、連結型プローブを生成する工程は開示されたライゲーション剤および／またはライゲーション技術を用いて実施でき；標的配列代理物等の、しかし、これに限定されない標的配列を選択的に増幅する工程は、連結型プローブ、第１プライマー、第１伸長酵素およびヌクレオチド欠損第１反応組成物を用いて実施でき；第１増幅産物を生成する工程および第２増幅産物を生成する工程は、第１プライマー、第２プライマー、開示された増幅手段および（ヌクレオチド欠損反応組成物を用いた選択的な増幅等の、しかし、これに限定されない）増幅技術を用いて実施でき；遊離工程は、変性手段等の、しかし、これに限定されない開示遊離手段を用いて実施でき；標的配列の検出工程または標的配列代理物の検出工程は装置等の開示された検出手段を用いて実施できる。
【０１０３】
（ＩＶ．一定のキット）
本教示は主題の方法の遂行を迅速に行なうように設計されたキットも提供する。キットは開示された方法を実施するために必要とされる二つ以上の成分を組合わせることにより目的の方法の遂行を迅速に行なうように働く。キットはエンドユーザーによる測定の必要性を最小とする測定前単位量にて各成分を含んでよい。キットは１つ以上の開示された方法を実施するための説明書を含んでよい。好ましくは、キットの各成分は互いに共同して作用するように最適化させる。
【０１０４】
一部実施形態において、キットは環状化可能なプローブ、プローブ対またはそれらの両方を含む。一部のキットは、多数の異なる標的配列を選択的に増幅および／または検出するために、多数の異なる環状化可能なプローブ、多数の異なるプローブセットまたは多数の異なる環状化可能なプローブおよび多数の異なるプローブセットを含む。一定のキットはさらに第１伸長酵素、第２伸長酵素、第１プライマー、第２プライマー、ライゲーション剤、ＡＴＰスルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、一定の開示された方法を実施するための手持ちサイズの装置、コントロール標的配列、ＡＰＳ、ｄＮＴＰｓ、ｒＮＴＰｓまたはそれらの組合せを含む。一部の実施形態において、第１伸長酵素、第２伸長酵素またはそれらの両方は、ＤＮＡポリメラーゼを含み、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼまたはそれらの組合せを含むが限定されるわけではない。一部の実施形態において、ライゲーション手段はＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼ、化学ライゲーション手段または光ライゲーション手段を含む。一部実施形態において、ルミネセンス発生手段は、ルシフェラーゼと適当な基質、例えばルシフェリンを含む。一部の実施形態において、コントロール標的配列は、アッセイ較正および／または確証目的のために「内部コントロール」配列または「スタンダード」配列を含む。
【０１０５】
一部実施形態において、キットは本教示のプローブまたはプローブ対と、第１プライマー、第２プライマー、ライゲーション手段、第１伸張手段、第２伸張手段、遊離手段および（ルミネセンス発生手段等の、これに限定されない）検出手段の少なくとも一つの手段とを含む。
【実施例】
【０１０６】
（Ｖ．例示的実施形態）
上で説明した本教示は実施例によりさらによく理解されるだろう。以下の実施形態は単に例示を目的とするものであり、本教示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１０７】
本教示は標的配列の選択的な増幅と検出のための組成物、方法およびキットに関する。一部の実施形態において、標的配列を選択的に増幅する環状化可能なプローブおよび／またはプローブ対が開示される。選択的に増幅された標的配列の検出方法である標的配列の選択的な増幅方法も開示される。開示された方法の一定の実施形態は、環状化可能なプローブ、第１プローブと第２プローブを含むプローブ対、ヌクレオチド欠損反応組成物またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態において、多数の異なる環状化可能なプローブ、多数の異なるプローブセットまたは多数の異なる環状化可能なプローブおよび多数の異なるプローブセットが、多数の異なる標的配列を、通常は多重反応で選択的に増幅または検出するために提供される。一定の開示された方法によると、連結型プローブ、第１増幅産物、第２増幅産物、それらの代理物またはそれらの組合せ等の、しかし、これらに限定されない標的配列の代理物が選択的に増幅される。一部実施形態において、選択的に増幅された標的配列またはそれらの代理物は直接または間接に検出されて、対応する標的配列の存在を示す。
【０１０８】
例示的な環状化可能なプローブを概略的に図１に示す。プローブ１は、第１標的相補性部分２、第２標的相補性部分３およびスペーサー４を含む。プローブ１は、この実施形態において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのリステリオリシン遺伝子のセグメントである標的配列５にハイブリダイズしていることが示されている。例示的な標的配列のヌクレオチド配列は５’−ＡＣＡＡＡＴＧＴＧＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＴＧ−３’（配列番号１）である。第１標的相補体部分２と第２標的相補体部分３のそれぞれが（ｉ）３つのヌクレオチドＡ、ＣおよびＴ（ただしＧではない）および（ｉｉ）ユニバーサルヌクレオチド（図１における“Ｎ”）を含む。当業者は、Ｕヌクレオチド塩基が、通常、プローブハイブリダイゼーションに実質的に影響を与えることなく、Ｔヌクレオチド塩基の代わり、またはそれに加えてプローブに組み入れることができることを理解するだろう。スペーサー４はヘキサヌクレオチドリピートＣＡＴＴＣＡの１０コピー（“ＣＡＴＴＣＡ）１０”と示される）を含む。
【０１０９】
当業者は、標的配列に対するプローブのハイブリダイゼーションが実質的に不安定化しないのであれば、同一のユニバーサル塩基をプローブ全体にわたって用いてよいこと、または異なるユニバーサル塩基を取り込んでよいことを理解するだろう。当業者は、スペーサーが６０ヌクレオチドよりも長くても短くてもよいことや繰返しサブユニットを含まなくてもよいことを理解し、この例において、ヌクレオチド塩基（ｉ）Ｃ、（ｉｉ）Ａおよび（ｉｉｉ）Ｔ、ＵまたはＴおよびＵのいずれの組合せもユニバーサル塩基とともに、またはそれなしに使用することができるが、自己ハイブリダイゼーションを利する組合せは通常は好ましくない。使用される標的配列およびハイブリダイゼーション条件に少なくとも一部は基づき、標的相補性部分は、例示された１８量体よりも長くても短くてもよいことも理解するだろう。
【０１１０】
第１プローブ６と第２プローブ９がその対応する標的配列５にハイブリダイズした例示プローブ対を図２に示す。第１プローブ６は第１標的相補性部分７および任意の順方向プライマー結合部位８（“ＦＰＢＳ”として示す）を含む。第２プローブ９は第２標的相補性部分１０および任意の逆方向プライマー結合部位１１（“ＲＰＢＳ”として示す）を含む。例示的なプローブ対の第１標的相補性部分７と第２標的相補性部分１０は（ｉ）ユニバーサル塩基Ｎと（ｉｉ）ヌクレオチドＣ、ＧおよびＴ（ただし、Ａではない）を含む。典型的には、開示されたプローブおよびプローブ対の末端はライゲーションに適するか、ライゲーションに適するようにできる。例えば、限定されるものではないが、図２に示されるように、ヒドロキシル基を含む第１プローブ６の３’−末端（“３’ＯＨ”として示す）および５’ホスフェート基を含む第２プローブ９の５’−末端（“ｐ−５’”として示す）はライゲーション剤が例えばリガーゼである場合にライゲーションに適する。
【０１１１】
別の例示的な実施形態において、試料はＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓが存在するかどうか評価する。ビルレンス因子「リステリオリシン」をコードする遺伝子に位置する標的配列は、ＡＡＡＴＧＴＧＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡ（配列番号２）である。
【０１１２】
【数１】
2008527979.tif 000003
（配列番号３）の配列を有する合成９６量体の環状化可能なプローブは慣用の方法を用いて合成され、５’−リン酸化される（図１を参照）。プローブの第１標的相補性部分は下線で示され、第２標的相補性部分は斜体で示され、スペーサーはヘキサヌクレオチド配列“ＣＡＴＴＣＡ”の１０リピートを含む６０量体であり；“Ｎ”は、使用される条件下でプローブを標的配列にハイブリダイズさせるユニバーサル塩基である。
【０１１３】
プローブ（１μＬの５０ｐｍｏｌ／μＬ）を、２μＬの試料（２５ｐｍｏｌ／μＬ）、１．４７５μＬ脱イオン水、０．５μＬのＳＮＰｌｅｘリガーゼ緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．０２５μＬのＳＮＰｌｅｘリガーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と２００μＬマイクロ遠心チューブ中で混合して、ライゲーション反応組成物を作る。チューブを５１℃で２時間、加熱ブロック中でインキュベートし、連結型プローブ−標的配列複合体を生成させ、次に４℃に冷却する。５μＬのｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  ＥｎｇＩａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ  ＭＡ；“ＮＥＢ”）、０．５μＬの１０ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン溶液（ＮＥＢ＃Ｂ９００１Ｓ）、０．５μＬの１１５μＭのＡＰＳ溶液（Ａｌｅｘｉｓ  Ｐｌａｔｆｏｒｍｓ）、０．５μＬの３．２ｍＵ／μＬのＡＴＰスルフリラーゼ溶液、５μＬ（５０μＭ）の第１プライマー、５μＬの第２プライマー、２１μＬのヌクレアーゼを含まない水、ライゲーション反応組成物（５μＬ）および０．７５μＬの１０Ｕ／μＬのｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ溶液（ＮＥＢ＃Ｍ０２６９）を含む第１反応組成物をガラス製のコニカルバイアル中に作る。このバイアルをパラフィルムでカバーし、水加熱ブロック中で１０分間、３７℃でインキュベートする。２．５μＬのＡＴＰ  Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ａｓｓａｙ  Ｍｉｘストック溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号ＦＬ−ＡＡ）をバイアルに加え、これを次にＴＤ２０／２０ルミノメーター（Ｔｕｒｎｅｒ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）内に置く。４μＬ体積のアルファ−チオールｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ（それぞれ２５０ｐｍｏｌ）をＨａｍｉｌｔｏｎ  ＣＲ７００定速シリンジ（Ｈａｍｉ１ｔｏｎ  Ｃｏ．，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）内に吸引し、ルミノメーター注入ポートに注入する。残りの反応はルミノメーター説明書に従って実施し、生じたルミネセンスが検出され、これは試料がＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを含むことを示している。
【０１１４】
開示された教示は多様な用途、方法および組成物により説明してきたが、多様な変更や改良がここでの教示と離れることなく行なわれうることを理解されたい。前記の実例は開示された教示をさらによく説明するために提供されるものであって、これら教示の範囲の限定を意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】図１は本教示の例示的なプローブを示す。プローブ５はその５’末端がリン酸化され（“ｐ”と示される）、かつその３’−末端に遊離ヒドロキシル基（“ＯＨ”と示される）を有する。“Ｎ”は例えば５−ニトロインドール等の、しかし、これに限定されないユニバーサル塩基を表す。標的配列５の中央に示される線は単に例示目的のためであって、標的配列の２つのセグメント間の空間を示すものではない。
【図２】図２は本教示の例示的なプローブ対を示す。標的配列５の中央に示される線は単に例示目的のためであって、標的配列の２つのセグメント間の空間を示すものではない。
【図３】図３は本教示の実施形態を概略的に示す。
【図４】図４Ａと図４Ｂは本教示の実施形態を概略的に示す。
【図５Ａ】図５Ａ〜図５Ｄは本教示の実施形態を概略的に示す。曲線の矢印記号および“ＰＰｉ”は対応する反応による無機ピロリン酸塩の放出を示す。
【図５Ｂ】図５Ａ〜図５Ｄは本教示の実施形態を概略的に示す。曲線の矢印記号および“ＰＰｉ”は対応する反応による無機ピロリン酸塩の放出を示す。
【図５Ｃ】図５Ａ〜図５Ｄは本教示の実施形態を概略的に示す。曲線の矢印記号および“ＰＰｉ”は対応する反応による無機ピロリン酸塩の放出を示す。
【図５Ｄ】図５Ａ〜図５Ｄは本教示の実施形態を概略的に示す。曲線の矢印記号および“ＰＰｉ”は対応する反応による無機ピロリン酸塩の放出を示す。
【図６】図６は本教示の実施形態を概略的に示す。“ＦＴＣＰ”：第１標的相補性部分；“ＳＴＣＰ”：第２標的相補性部分；“１ＡＰ”：第１増幅産物；“ＰＰｉ”：無機ピロリン酸塩；“ＡＰＳ”はアデノシン５’−ホスホ硫酸を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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