(57)【要約】  本発明は一般式（Ｉ）を有する化合物に関する。式中、ＬａおよびＬｂの各々は、０〜１０個の主鎖原子を含む連結部位から独立に選択され、随意で置換されている。ＺａおよびＺｂの各々は独立に選択される錯形成部位であり、１個以上の窒素原子を含む。ＺａおよびＺｂのうちの一方または両方は同窒素原子を通じてそれぞれ遷移金属錯体ＭａＶａおよびＭｂＶｂに配位結合している。ＭａおよびＭｂの各々は独立に選択される遷移金属であり、ＶａおよびＶｂの各々は独立に選択される原子価基である。2008502715.tif 000024
2008502715.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式（Ｉ）を有する化合物。
【化１】
2008502715.tif 000014
式中、ＬａおよびＬｂの各々は独立に選択される連結部位であり、０〜１０個の主鎖原子を含み、随意で置換されており、
ＺａおよびＺｂの各々は独立に選択される錯形成部位であり、１個以上の窒素原子を含み、
ＺａおよびＺｂのうちの一方または両方は同窒素原子を通じてそれぞれ遷移金属錯体ＭａＶａおよびＭｂＶｂのうちの一方または両方に配位結合しており、
ＭａおよびＭｂの各々は独立に選択される遷移金属であり、
ＶａおよびＶｂの各々は独立に選択される原子価基である。
ただし次の化合物を除く。
【化２】
2008502715.tif 000015
【請求項２】
錯形成部位ＺａおよびＺｂの各々はヘテロ環である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ヘテロ環はイミダゾール、トリアジン、ピラジン、アクリジン、アゼピン、アジリジン、ベンゾジアジン、ビピリジン、ジアジン、イソキノリン、ラクタム、モルホリン、オキサジン、フェナントリジン、フェナントロリン、ピペラジン、プテリジン、プリン、ピリジン、ピロール、ピロリジン、キノリン、キノリジン、チアジアジン、チアジン、トリアジンおよびトロパンからなる群から選択される請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
錯形成部位ＺａおよびＺｂの各々は第１級または第２級のアミノ基である請求項１に記
載の化合物。
【請求項５】
第１級または第２級のアミノ基の窒素原子は１〜６個の主鎖炭素原子を有する脂肪族アルキル基に結合している請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
ＬａおよびＬｂの各々は飽和脂肪族炭化水素鎖である請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
遷移金属Ｍ１およびＭ２の各々はオスミウム、ルテニウム、鉄、レニウムおよび白金からなる群から独立に選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
原子価基ＶａおよびＶｂの各々はハロゲン化物、ピリジン、ビピリジン、フェナントロリン、イミダゾール、ジピリドフェナジン、ポルフィリンおよびそれらの誘導体からなる群から独立に選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
ＺａおよびＺｂは同一である請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
ＺａおよびＺｂはイミダゾール、プリン、ピペラジン、フェナントロリン、ピリジン、第１級アミンおよび第２級アミンからなる群から選択される請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
ＺａおよびＺｂは異なる請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
ＺａおよびＺｂはイミダゾールおよびモルホリンからなる群から選択される請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
ＬａおよびＬｂは同一である請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
ＬａおよびＬｂはエチルまたはプロピルである請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
１つの遷移金属錯体ＭａＶａのみが存在する請求項１に記載の化合物。
【請求項１６】
２つの遷移金属錯体ＭａＶａおよびＭｂＶｂが存在する請求項７に記載の化合物。
【請求項１７】
ＭｂはＭａと同一である請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
遷移金属Ｍａはオスミウムであり、原子価基Ｖａは２つのビピリジン（ｂｐｙ）配位子および１つのハロゲン配位子からなる請求項１５に記載の化合物。
【請求項１９】
次の化学式（II）を有する請求項１の化合物。
【化３】
2008502715.tif 000016
【請求項２０】
次の化学式（III ）を有する請求項１の化合物。
【化４】
2008502715.tif 000017
【請求項２１】
次の一般式（1i）を有する化合物。
【化５】
2008502715.tif 000018
式中、ＬａおよびＬｂの各々は独立に選択される連結部位であり、０〜１０個の主鎖原子を含み、随意で置換され、
ＺａおよびＺｂの各々は独立に選択される錯形成部位であり、１個以上の窒素原子を含む。
ただし次の化合物を除く。
【化６】
2008502715.tif 000019
［ここで、両Ｒは同一であり、以下からなる群から選択される］
【化７】
2008502715.tif 000020
【化８】
2008502715.tif 000021
【請求項２２】
次の一般式（Ｉ）を有する化合物の製造方法であって、
【化９】
2008502715.tif 000022
［式中、ＬａおよびＬｂの各々は、０〜１０個の主鎖原子を含む連結部位から独立に選択され、随意で置換されており、
ＺａおよびＺｂの各々は独立に選択される錯形成部位であり、１個以上の窒素原子を含み、
ＺａおよびＺｂのうちの一方または両方は同窒素原子を通じてそれぞれ遷移金属錯体ＭａＶａおよびＭｂＶｂのうちの一方または両方に配位結合しており、
ＭａおよびＭｂの各々は独立に選択される遷移金属であり、
ＶａおよびＶｂの各々は独立に選択される原子価基である］
１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物を、化学式（IV）：Ｈ２Ｎ−Ｌａ−Ｚａを有する第１級アミンおよび化学式（Ｖ）：Ｈ２Ｎ−Ｌｂ−Ｚｂを有する第１級アミンのうちの一方または両方と反応させることによって、ナフタレンジイミド中間体を形成する工程と、
同ナフタレンジイミド中間体を遷移金属錯体と反応させることによって、Ｚ１およびＺ２のうちの一方または両方の１個以上の窒素原子へ同遷移金属錯体を配位結合させる工程と、からなる方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の化学式（Ｉ）を有する化合物の二本鎖ＤＮＡ縫い込み型インターカレータとしての使用。
【請求項２４】
核酸の検出方法であって、
基質上に固定されている１つ以上の捕捉プローブを核酸と接触させることによって、核酸を捕捉プローブに交雑し、ハイブリッドを形成する工程と、捕捉プローブは試料に対して相補的なヌクレオチドシーケンスを有することと、
次の一般式（Ｉ）を有するＤＮＡ縫い込み型インターカレータ化合物とハイブリッドを接触させることによって、ハイブリッドをインターカレートする工程と、
【化１０】
2008502715.tif 000023
（式中、ＬａおよびＬｂの各々は、０〜１０個の主鎖原子を含む連結部位から独立に選択され、随意で置換されており、
ＺａおよびＺｂの各々は独立に選択される錯形成部位であり、１個以上の窒素原子を含み、
ＺａおよびＺｂのうちの一方または両方は同窒素原子を通じてそれぞれ遷移金属錯体ＭａＶａおよびＭｂＶｂのうちの一方または両方に配位結合しており、
ＭａおよびＭｂの各々は独立に選択される遷移金属であり、
ＶａおよびＶｂの各々は独立に選択される原子価基である）
インターカレートされたハイブリッドと有機酸を接触させる工程と、
有機酸に対して酸化電位または還元電位を印加する工程と、
有機酸の電気化学的応答を決定する工程と、からなる方法。
【請求項２５】
有機酸はアスコルビン酸である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
有機酸の電気化学的応答はボルタンメトリーまたはアンペロメトリーによって決定される請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な有機金属化合物に関する。詳細には、本発明は新規なナフタレンジイミド誘導体に関する。また本発明は、それらの化合物の調製方法、それらの化合物の使用、およびそれらの化合物を用いて核酸を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
この数十年間を通じて、核酸工学は遺伝子研究の多くの領域において不可欠な役割を担うほどに発展してきた。この分野においてなされた研究から、遺伝子型決定、疾病診断、生物学的試料の分析および他の多くの診断用途など、多くの有用な用途が現れている。現在、集中して研究がなされているのは、効率的な核酸増幅・検出手法を用いて短いターンアラウンド時間内により優れた感度および特異性を得るような、ＤＮＡバイオセンサの開発である。
【０００３】
ＤＮＡバイオセンサでは基本的な処理によって、プローブヌクレオチドシーケンスと試料由来の一本鎖ＤＮＡとのハイブリッド形成などの核酸認識イベントが、従来の検出方法によって検出可能な信号へと変換される。光学的（光）、電気的（電流）および電気化学的な検出方法ならびに周波数検出方法など、当該技術分野において知られている様々な種類の検出方法のうち、光学的検出方法が非常に広範に用いられるようになっている。
【０００４】
典型的には、光学的検出方法には蛍光分子の使用が必要である。蛍光分子（例えば、臭化エチジウム）を用いて標識付けされたターゲットヌクレオチドシーケンスのハイブリッド形成は、プローブヌクレオチドシーケンスとターゲットヌクレオチドシーケンスとの間のハイブリッド形成に伴う蛍光増加を監視することによって検出可能である。蛍光標識を表面修飾手法と共に用いることによって、高密度なＤＮＡアレイを構築することが可能となっている。高密度アレイに対して大規模に並行して反応を実行することによって、核酸シーケンスを迅速に解明し、分析に必要な時間を大幅に短縮することが可能である。
【０００５】
しかしながら、蛍光標識には幾つかの欠点が存在する。例えば、ターゲットＤＮＡへ蛍光分子を結び付けるには、長い時間を要する手順が伴う。さらに、サブナノモルレベルにて充分高感度にＤＮＡを検出する蛍光ベースの検出手法は、わずかしかない。そのような問題を回避するために、ＤＮＡハイブリッド形成イベントを超高感度に検出する電気化学的な検出方法が提案されている。
【０００６】
電気化学的なＤＮＡバイオセンサが報告されたのは、１９９０年頃からである。金ナノ粒子の使用、グアニンの直接酸化およびＤＮＡインターカレータの使用など、電気化学的検出方法を実施するための広範な種々の方法が開発されている。蛍光指示薬ではなくＤＮＡインターカレータをハイブリッド形成指示薬として用いると、蛍光指示薬を用い、長い時間を要する、従来のＤＮＡ検出手法において一般的に用いられるようなターゲットＤＮＡの標識付けが不要であることは知られていた。これに加えて、高価な光学機器も不要である。また、電気化学的バイオセンサの本質的な小型化およびその高度半導体技術との適合性によって、核酸アッセイ用の簡単、正確、かつ、安価なプラットフォームの提供が見込まれる。
【０００７】
低密度、高密度な電気化学ＤＮＡセンサアレイの製作は、いずれも成功されている。現在、高密度蛍光マイクロアレイの製造および実装は、高密度電気化学センサアレイの製造および実装よりも相当に安価である。しかしながら、低密度電気化学センサアレイには、蛍光性のアレイを超える次の利点が存在する：（ｉ）高価な光学デバイスに対する費用効
果的な代替物を提供すること、（ii）触媒作用とともに用いられる場合、超高感度であること、（iii ）ハイブリッド形成イベントを迅速に、かつ、直接的に、吸光耐性を有して検出すること、また懸濁下においても検出すること、（iv）携帯性を有し、頑丈、かつ、安価であり、取扱いの容易な電気部品しか必要でないこと。これらの利点によって、実地試験および在宅医療使用に適切な電気化学バイオセンサが可能となる。
【０００８】
触媒的／酵素的バイオセンサの開発において対処されることの必要な２つの基本的な問題は、信号に伴う大きな雑音と、試料アッセイの感度とである。現在、多くの電気化学バイオセンサには、信号対雑音比が低いことによる問題が存在する。静電的相互作用によって、大抵のＤＮＡインターカレータは二本鎖ＤＮＡ（ｄｓ−ＤＮＡ）に結合するのみならず、それより程度は少ないが一本鎖ＤＮＡ（ｓｓ−ＤＮＡ）分子にも結合する。改良されたインターカレータを得るために幾つかのアプローチが研究されている。
【０００９】
タケナカらはフェロセンをグラフトさせたナフタレンジイミド（ＮＤ）縫い込み型インターカレータを合成した（非特許文献１）。この縫い込み型インターカレータは、ｄｓ−ＤＮＡに対して通常のインターカレータより選択的に結合することが報告された。同様に、マキノらの開示したフェロセングラフトナフタレンジイミド縫い込み型インターカレータは、報告によると、電気化学的検出に４５０ｍＶ未満の電位しか必要としない（特許文献１）。シュトレー（Ｓｔｅｕｌｌｅｔ）らの開示したＮＤ縫い込み型インターカレータでは、１組のルテニウム錯体がＮＤスカフォードの側鎖の末端に各々配置されている。各ルテニウム錯体は、直鎖のアミド側鎖の有するビピリジン基に対し配位結合している（非特許文献２）。光励起されたルテニウム（II）ポリピリジンナフタレンジイミドの分子間電子移動消光に対するＤＮＡスカフォード化の影響については、さらに研究されており、ペンダント発色団がＤＮＡ二本鎖と弱く相互作用することが見出されている（非特許文献３）。
【００１０】
他のグループでは、化学的・生物学的な増幅機構を組込むことによって、ＮＤ縫い込み型インターカレータによる検出方法の感度を増強し、かつ検出限界を低下させるための、さらなる試みがなされた（非特許文献４〜６）。ソープ（Ｔｈｏｒｐ）らは、均一系電気触媒であるルテニウム−２，２’−ビピリジン錯体またはオスミウム−２，２’−ビピリジン錯体を用いてＤＮＡの直接的な検出を行うための電気触媒的なスキームを提案した（非特許文献７，８）。ＤＮＡ−酵素複合体をＤＮＡ認識イベントの電気化学的変換のための生物学的電気触媒として用いた者もある。また、ＤＮＡ認識イベントに関連して電極上に不溶生成物の析出を生じさせる生体−触媒複合体も、ＤＮＡ感知用の増幅システムとして用いられた（非特許文献９）。
【００１１】
酸化還元活性を有する遷移金属錯体が均一系触媒として用いられた研究では、得られた分析信号は、本質的に大きな、変動するバックグラウンド電流の上に重なっており、ハイブリッド形成の発生を示す分析信号は不明瞭であることが見出された。この大きなバックグラウンド電流は、触媒の直接酸化と、触媒によるオリゴヌクレオチド捕捉プローブ（ＣＰ）の触媒的酸化との結果であることが分かっている（非特許文献７，８）。触媒的酸化電流の除去に対して開発されている１つの解決策は、オリゴヌクレオチドＣＰをペプチド核酸に置き換えることである。しかしながら、触媒の直接酸化の問題は充分には扱われていなかった。酵素ベースのＤＮＡアッセイでは、バックグラウンド電流は非特異的な吸着および静電的相互作用など、非ＤＮＡ関連酵素捕集に直接関連することが知られている。
【００１２】
現在、触媒的ＤＮＡバイオセンサにおいてバックグラウンド電流の減少をもたらすための努力が行われている。最近の一研究では、ＤＮＡバイオセンサを二重層構成とすることによって、バックグラウンド電流を低減可能であることが見出された（非特許文献１０）。そのような二重層構成のバイオセンサを用いて、１．０μＬの溶滴中のわずか６００コ
ピーのターゲットＤＮＡ分子の検出に成功している。
【００１３】
この開発が行われたにもかかわらず、現在の触媒的バイオセンサには依然として制限が存在しており、法外に高い製造費を必要とせずにそれらの触媒的バイオセンサの性能を改良するには、継続的な努力が必要である。
【特許文献１】米国特許第６，３６８，８０７号明細書
【非特許文献１】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２０００年、７２巻、ｐ．１３３４−１３４１
【非特許文献２】有機合成化学に関する第１回国際電子会議（Ｆｉｒｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）−ＥＣＳＯＣ−１、Ｅ０００３、１９９７年９月１日〜３０日
【非特許文献３】Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９９年、３８巻、ｐ．５５２６−５５３４
【非特許文献４】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００３年、７５巻、ｐ．３２６７−３２６９
【非特許文献５】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００２年、７４巻、ｐ．４３７０−４３７７
【非特許文献６】Ｆ．Ｐａｔｏｌｓｋｙ，Ｅ．Ｋａｔｚ，Ｉ．Ｗｉｌｌｅｒ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２００２年、４１巻、ｐ．３３９８−３４０２
【非特許文献７】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２０００年、７２巻、ｐ．３７６４−３７７０
【非特許文献８】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００３年、７５巻、ｐ．６５８６−６５９２
【非特許文献９】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００４年、７６巻、ｐ．１６１１−１６１７
【非特許文献１０】Ａｎａｌｙｓｔ、１９９５年、１２０巻、ｐ．２３７１−２３７６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、本発明の一目的は、検出感度の改良されたＤＮＡ縫い込み型インターカレータとして用いることの可能な化合物を提供することである。この化合物は安価に製造されるとともに、簡単に用いられるため、マイクロアレイ化手法が生体医学研究およびヘルスケアにおいてより広範に利用されることを可能とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明では、電気触媒的遷移金属ペンダント基を用いて標識付けされたナフタレンジイミド誘導体を提供する。このナフタレンジイミド誘導体は、ＤＮＡインターカレート化合物として用いることが可能である。一態様では、本発明は一般式（Ｉ）を有する化合物に関する：
【００１６】
【化１】
2008502715.tif 000003
式中、ＬａおよびＬｂの各々は、０〜１０個の主鎖原子を含む連結部位から独立に選択され、随意で置換されており；ＺａおよびＺｂの各々は独立に選択される錯形成部位であり、１個以上の窒素原子を含み；ＺａおよびＺｂのうちの一方または両方は同窒素原子を通じてそれぞれ遷移金属錯体ＭａＶａおよびＭｂＶｂのうちの一方または両方に配位結合しており；ＭａおよびＭｂの各々は独立に選択される遷移金属であり；ＶａおよびＶｂの各々は独立に選択される原子価基である；ただし次の化合物を除く：
【００１７】
【化２】
2008502715.tif 000004
これらは非特許文献２（ｗｗｗ．ｍｄｐｉ．ｏｒｇ／ｅｃｓｏｃ／）および非特許文献３に、それぞれ開示されている。
【００１８】
さらに、本発明は一般式（1i）を有する化合物に関する：
【００１９】
【化３】
2008502715.tif 000005
式中、ＬａおよびＬｂの各々は独立に選択される連結部位であり、０〜１０個の主鎖原子を含み、随意で置換されており；ＺａおよびＺｂの各々は独立に選択される錯形成部位であり、１個以上の窒素原子を含む；ただし次の化合物を除く。
【００２０】
【化４】
2008502715.tif 000006
（ここで、両Ｒは同一であり、以下からなる群から選択される：）
【００２１】
【化５】
2008502715.tif 000007
【００２２】
【化６】
2008502715.tif 000008
これは、ａ）およびｂ）により定義され、非特許文献２（ｗｗｗ．ｍｄｐｉ．ｏｒｇ／ｅｃｓｏｃ／）および非特許文献３に開示されている特定の対称化合物は、本発明に係る化合物ではないことを意味する。ｃ）およびｄ）により定義され、やはりそれら２つの参照文献に開示されている特定の非対称化合物に対しても、同じことが当てはまる。しかしながら、ａ）に示すＲ基を用い、非対称化合物を生じる任意の他のサブコンビネーションは本発明の一部である。
【００２３】
別の態様では、本発明は、一般式（Ｉ）を有する化合物の製造方法に関する。この方法は、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物を化学式（IV）：Ｈ２Ｎ−Ｌａ−Ｚａを有する第１級アミンと、化学式（Ｖ）：Ｈ２Ｎ−Ｌｂ−Ｚｂを有する第１級アミンとのうちの一方または両方と反応させることによって、ナフタレンジイミド中間体を形成する工程と、ナフタレンジイミド中間体を遷移金属錯体と反応させることによって、Ｚ１およびＺ２のうちの一方または両方の１個以上の窒素原子へ金属錯体を配位結合させ
る工程と、からなる。
【００２４】
また、本発明は、化学式（Ｉ）の化合物の二本鎖ＤＮＡ縫い込み型インターカレータとしての使用に関する。
さらなる一態様では、本発明は核酸の検出方法に関する。この方法は、基質上に固定されている１つ以上の捕捉プローブを核酸と接触させることによって、核酸を捕捉プローブに交雑し、ハイブリッドを形成する工程と、捕捉プローブは試料に対して相補的なヌクレオチドシーケンスを有することと、一般式（Ｉ）を有するＤＮＡ縫い込み型インターカレータ化合物にハイブリッドを接触させることによって、ハイブリッドをインターカレートする工程と、インターカレートされたハイブリッドと有機酸を接触させる工程と、有機酸に対して酸化電位または還元電位を印加する工程と、有機酸の電気化学的応答を決定する工程と、からなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明は、錯形成能によって中央のジイミドスカフォードに結び付いた酸化還元活性な遷移金属錯体を有するナフタレンジイミド化合物が二本鎖ＤＮＡ縫い込み型インターカレータとして優れた特性を示す、という所見に基づく。親化合物である１，４，５，８−ナフタレンジイミドと比較して、本発明の化合物は二本鎖ＤＮＡに、より強く結合する。理論に拘束されようとするものではないが、ナフタレンジイミド基は「古典的な」縫い込み型インターカレーションモデルによってｄｓ−ＤＮＡに結合し、ペンダント遷移金属錯体基はＤＮＡと静電気的に相互作用することによってインターカレーションを強化する。これに加えて、酸化還元活性を有する遷移金属基によって、インターカレートした錯体の電気化学的応答を改良するために用いることの可能な電気触媒的な活性が提供される。この結果、本発明の化合物をインターカレータとして用いるバイオセンサによって、非常に高感度な検出を行うことが可能である。本発明においては、最適な条件の下では、本発明の化合物をインターカレータとして用いるバイオセンサによって、約０．２〜６００ｐＭの濃度にて特定のＤＮＡシーケンスを確実に検出可能であることが見出された。一定の条件の下では、その検出限界は約１００ｆＭ程度に低いことが見出された。
【００２６】
本発明の幾つかの利点は次のとおりである。第１に、化学式（Ｉ）の化合物は水溶性であるが、雰囲気条件の下で非常に安定であり、電子の移動度は高く、良好な速度論的および電気触媒的な効率を示す。これらの特性は、本発明の化合物中に存在する遷移金属錯体の電気活性能および電気触媒能と結び付けられて、高感度にターゲットＤＮＡシーケンスを検出するための興味深い手段を提供する。さらに、本発明の化合物は核酸および蛋白質に対するインターカレーションの強度が非常に強いため、癌および腫瘍用の医薬の適切な候補となることが見出された。これらの化合物を、生体分子に対する電気化学活性を有する標識など様々な用途に用いることが可能であり、ビオチン、ジゴキシン、蛋白質、抗原および抗体など生体親和性の種と反応するように機能化することによって、バイオアッセイ用に充分な生体親和性を本発明の化合物に付与することが可能である。
【００２７】
上記の一般式（Ｉ）において、ＬａおよびＬｂの各々は、錯形成部位とナフタレンジイミドスカフォードとの間に位置する連結部位を表す。ＬａおよびＬｂは独立に選択され、各々０〜１０個の主鎖原子を含む。本発明の一定の実施形態では、連結部位ＬａおよびＬｂは各々、２〜５個の主鎖原子を含む。例を挙げると、例えば、連結部位が１，４−置換シクロヘキシルまたはフェニル基から構成される場合、このシクロヘキシルまたはフェニル（アリル）基は連結部位に４個の主鎖炭素原子を与える。各主鎖原子に結合した水素原子は、例えば、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシまたはカルボキシル基に、随意に置き換えられる。連結部位の主鎖は炭素原子のみからなってもよく、炭素原子が窒素、酸素または硫黄原子に割り込まれていてもよい（即ち、ヘテロ鎖）。これは、連結部位が、例えば、エーテル基、チオエーテル基、エステル基またはアミド基を含み得ることを意味する（例
えば、英国特許第１，０６４，６２７号明細書または非特許文献３を参照）。主鎖原子が０個の場合（即ち、連結部位の存在しない場合）、ナフタレンジイミドスカフォードの窒素原子は錯形成部位に直接結合される。連結部位の鎖長を変化させることによって、本発明の化合物と、交雑したプローブとの間の相互作用を変化させることが可能である。
【００２８】
上記の化学式（Ｉ）により定義されるＬａおよびＬｂは、任意の直鎖もしくは分岐鎖の、置換もしくは無置換の、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリル、アシル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアルケニルまたはアリルキル基／ラジカルであることが可能である。本発明の化合物をＤＮＡインターカレータとして用いるとき、好適には、ＬａおよびＬｂは、分岐鎖または直鎖の、飽和アルキル基である。遷移金属基を有する炭素鎖の長さを変化させることによって遷移金属基間の距離を変化させる手段を提供するために、連結部位の炭素原子数を増減してもよい。
【００２９】
アルキル基は直鎖であってもよく、分岐鎖であってもよい。これは、アルキル基がアシル基、カルボニル基など他の連結部位に存在する場合、またはアミノ基に存在する場合にも当てはまり、このとき、アルキル基はそれらの基の置換部分である。一実施形態では、ＬａおよびＬｂの各々は飽和脂肪族炭化水素鎖である。化学式（Ｉ）を有する化合物において用いられる好適なアルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−プロピル、ブチル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニルおよびデシル基がある。
【００３０】
アルケニル基の例には、１つ以上の炭素−炭素二重結合を有する全ての脂肪族炭化水素が含まれる。この文脈では、アルケニル基は主鎖基として用いられるとき、１０個までの主鎖炭素原子を有することが可能である。
【００３１】
アルキニル基の例には、１つ以上の三重炭素炭素二重結合を含む、直鎖または分岐鎖の炭化水素原子が含まれる。本明細書では、アルキニル基は主鎖基として用いられるとき、１０個までの主鎖炭素原子を有してよい。
【００３２】
アリル基の例には、好適には、フェニル、ナフチル、トリルまたはヘテロアリルを含む、全ての炭素環式またはヘテロ環式の芳香族基が含まれる。また、アリル基は無置換であってもよく、例えば、ハロゲン、アルキル基、水酸基およびカルボキシル基など置換基によって置換されていてもよい。
【００３３】
シクロアルキル基は、通常、３〜８個の炭素原子、好適には、５〜６個の環炭素原子を含む飽和の環状炭化水素である。また、シクロアルキル基は、例えば、メチルまたはエチル基など１つ以上の同一のまたは異なるアルキル基によって置換されてよい。シクロアルキル基の例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチルである。置換されたシクロアルキル基の例は、例えば、４−メチル−シクロヘキシルまたは２，３−ジメチルシクロペンチルである。
【００３４】
シクロアルキルアルキル基は飽和炭化水素基であり、シクロアルキル置換されたアルキル基から誘導される。シクロアルキル基は、通常、５〜６個の環炭素原子を有する。シクロアルキルアルキル基の例は、シクロペンチルメチル、シクロペンチルエチル、シクロヘキシルエチルおよびシクロヘキシルメチルである。シクロアルキルアルキル基がさらに置換されてもよい。
【００３５】
シクロアルケニル基は不飽和環状炭化水素基であり、通常、３〜８個の環炭素原子を含む。シクロアルケニル基は少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有するが、２つ以上の二重結合を有してもよい。シクロアルケニル基がさらに置換されてもよい。
【００３６】
用いられ得るアリルキル基は、詳細には、ベンジル、フェネチルおよびナフチルメチル基である。全ての基は、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、ニトリル、アルコキシまたはカルボキシル基によって、随意に置換または多置換されてよい。
【００３７】
本明細書において用いられるハロゲンは、塩素、臭素、フッ素およびヨウ素のうちの任意の１つを表す。
本明細書では、連結部位の最後の主鎖原子は、錯形成部位の炭素原子または窒素原子に結合している原子である。錯形成部位は、例えば、ヘテロ環式芳香族環構造またはヘテロ環式脂肪族環構造であってもよく、アミノ基などのヘテロ脂肪族鎖であってもよい。この定義により、−Ｌ−Ｚ−部位が次の構造（非特許文献３、ｗｗｗ．ｍｄｐｉ．ｏｒｑ／ｅｃｓｏｃ／に開示）
【００３８】
【化７】
2008502715.tif 000009
を有する化合物は、連結部位に１４の主鎖原子を有する、即ち、１０を超える主鎖原子を有すると考えられるため、本発明の一部ではない。
【００３９】
化学式（Ｉ）では、錯形成部位ＺａおよびＺｂの各々は１個以上の窒素原子を含む。ＺａおよびＺｂの各々は独立して選択される。これは、ＺａおよびＺｂが同一であることも、異なることも可能であることを意味する。この１個以上の窒素原子は、適切な遷移金属錯体への配位結合を可能とする孤立電子対を提供する。
【００４０】
錯形成部位ＺａおよびＺｂは窒素原子を有する任意の適切な基であることが可能である。そのような基の例には、例えば、アミノまたはアミド基を有する脂肪族および芳香族部位や、−Ｎ＝Ｏ、−Ｃ≡Ｎ、−Ｎ＝Ｎ−または−Ｃ＝Ｎ−を有する芳香族および脂肪族基が含まれる。適切な脂肪族基のクラスは第１級および第２級のアミノ基である。第１級または第２級のアミノ基が用いられる特定の一実施形態では、アミノ基の窒素原子は、１〜６個の主鎖炭素原子を有する脂肪族アルキル基に結合している。そのようなアルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルおよびそれらの異性体が含まれる。
【００４１】
本発明の幾つかの実施形態では、錯形成部位ＺａおよびＺｂは、含窒素官能基または部位に加えて、遷移金属錯体上のより弱い配位子を置換可能な他の適切な官能基を含んでもよい。そのような官能基の例には、例えば、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＨ、−ＣＯＯＲおよび−ＳＯ３Ｈが含まれる。
【００４２】
別の実施形態では、錯形成部位はヘテロ環を含む。適切なヘテロ環には、非芳香族ヘテロ環および芳香族ヘテロ環の両方が含まれる（不飽和および飽和の）。ヘテロ環は単環式であることも二環式であることも可能であり、環の原子は、Ｃ、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選択される。適切なヘテロ環には、例えば、イミダゾール、トリアジン、ピラジン、アクリジン、アゼピン、アジリジン、ベンゾジアジン、ジアジン、イソキノリン、ラクタム、モルホリン、オキサジン、フェナントリジン、フェナントロリン、ピペラジン、プテリジン、プリン、ピリジン、ピロール、ピロリジン、キノリン、キノリジン、チアジアジン、チアジン、トリアジンおよびトロパンが含まれる。本発明において好適なヘテロ環
は、イミダゾール、プリン、フェナントロリン、ピペラジンおよびピリジンである。錯形成部位がイミダゾールである特定の一実施形態では、環の２個の窒素原子のうちの一方は連結部位に結合しており、環の他方の窒素原子が遷移金属錯体と錯形成している。
【００４３】
ＺａおよびＺｂのうちの一方または両方は、それぞれ遷移金属錯体ＭａＶａおよびＭｂＶｂに配位結合している。ここで、ＭａおよびＭｂの各々は独立に選択される遷移金属であり、ＶａおよびＶｂの各々は独立に選択される原子価基である。ハイブリッド形成検出に必要な所望の電気化学的応答に基づき、適切な遷移金属を選択することが可能である。
【００４４】
検出可能な電気化学的応答を生成するのに適切な、充分なレベルの酸化還元活性を示す任意の遷移金属が用いられてよい。３〜１２族、好適には５〜１１族、より好適には７〜１０族（ＩＵＰＡＣ、１９９０年）から選択される任意の金属が用いられてよい。遷移金属ＭａおよびＭｂは、その酸化状態に応じて、荷電化学種として存在してもよく、非荷電化学種として存在してもよい。典型的には、各遷移金属化学種は荷電したカチオンとして存在する、即ち、＋１、＋２、＋３または＋４の正電荷を有する。本発明において適切な遷移金属の特定の例には、次に限定されないが、ルテニウム、オスミウム、レニウム、鉄および白金が含まれる。オスミウム錯体に関連する高い触媒効率や低い酸化還元電位のため、本発明においてはオスミウムが好適である。
【００４５】
ＭａおよびＭｂのうちの一方または両方の配位原子価を満たすため、原子価基ＶａおよびＶｂは任意の数または種類の原子価メンバを含むことが可能である。例えば、Ｍａの配位原子価が６である場合、Ｍａは５個以下の原子価メンバに配位結合することが可能であり、各原子価メンバはＭａとの配位結合を確立させるために１組の非結合性電子を与える。錯形成部位は、遷移金属に配位結合するために、Ｍａから１つ以上の配位原子価を取り上げる。錯形成部位がビピリジンなど二座の化学種である場合、遷移金属から２つの配位原子価を取り上げる。用いることの可能な原子価メンバの例には、ハロゲン化物、ピリジン、ビピリジン、フェナントロリン、イミダゾール、ジピリドフェナジン、ポルフィリンおよびそれらの誘導体が含まれる。
【００４６】
化学式（Ｉ）の定義の範囲内にあり、ＤＮＡ縫い込み型インターカレータとして適切な化合物の１つのクラスは、錯形成部位ＺａおよびＺｂが異なる非対称化合物である。化学式（Ｉ）の非対称化合物は、１つまたは２つの遷移金属錯体を有してもよい。ＺａおよびＺｂの両方は各々、同じ種類の遷移金属錯体に結合してもよく、２つの異なる種類の遷移金属錯体に結合してもよい（例えば、Ｚａはオスミウム錯体とグラフトされ、Ｚｂはルビジウム錯体とグラフトされる）。遷移金属錯体が１つしか存在しない場合、ＺａまたはＺｂのいずれかが遷移金属錯体に結合する。そのような構造の化合物を得るために、ＺａおよびＺｂを適宜選択することが可能である。例えば、Ｚａは遷移金属錯体と錯形成可能な自由電子対を備える窒素原子を有する適切な部位から選択され、Ｚｂは錯形成に利用可能な自由電子対を有しない任意の部位から選択される。この例では、Ｚｂは、化合物のインターカレート特性に悪影響を及ぼさないか、または化合物の合成を妨げない限り、任意の適切な部位であることが可能である。
【００４７】
一実施形態では、本発明の非対称化合物はイミダゾールおよびモルホリンの錯形成部位を含む。イミダゾール錯形成部位は遷移金属錯体との配位結合を確立し、モルホリン錯形成部位は遷移金属錯体に結合しない。この非対称のインターカレータは１つの遷移金属ペンダント基しか有しない。本発明において想定される他のＺａおよびＺｂの組み合わせには、イミダゾール／ビピリジン、フェナントロリン／イミダゾール、およびピリジン／ビピリジンが含まれる。
【００４８】
特に好適な一実施形態では、化学式（Ｉ）の化合物は化学式（II）を有する非対称化合
物である。
【００４９】
【化８】
2008502715.tif 000010
上記の化学式（II）では、連結部位はエチル基である。一方の錯形成部位はイミダゾールであり、他方の錯形成部位はモルホリンである。この特定の実施形態では、遷移金属錯体は１つしか存在せず、イミダゾール基に配位結合している。モルホリン基は遷移金属錯体に結合していない。この実施形態における遷移金属はオスミウムであり、原子価基はビピリジンおよび塩化物の配位子を含む。各オスミウムカチオンによる全電荷は＋１であってもよく、＋２であってもよい。
【００５０】
別の特に好適な実施形態では、化学式（Ｉ）の化合物は化学式（III ）を有する対称化合物である。
【００５１】
【化９】
2008502715.tif 000011
上記の化学式（III ）から、２つの連結部位がプロピル基であることが理解される。２つの錯形成部位はイミダゾール基であり、存在する２つの遷移金属錯体はオスミウム錯体である。各オスミウム錯体はオスミウムカチオン、２個のビピリジン配位子および１個の塩素配位子を含んでおり、化学式（III ）の化合物の非酸化状態において＋２の全電荷を、酸化状態において＋４の全電荷を生じる。この場合、オスミウムの酸化状態は、それぞれＯｓ（III ）、Ｏｓ（IV）である。
【００５２】
上記の特定の化学式を有する化合物の全ての異性体や、２以上のそのような化合物の可能な全ての比率における混合物も本発明の範囲の内にある。
さらに本発明は、請求項１に定義される化合物を生成するために用いられる中間化合物に関する。これらの中間化合物は、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物を第１級アミンと反応させることによって得られるナフタレンジイミドの主な誘導体である。この第１級アミンは、化学式（Ｉ）の所望の化合物の連結部位および錯形成部位に相当する構造を有する。換言すると、化学式（IV）：Ｈ２Ｎ−Ｌａ−Ｚａを有するアミンおよび化学式（Ｖ）：Ｈ２Ｎ−Ｌｂ−Ｚｂを有するアミンのうちの一方または両方である。式中、Ｌａ、Ｌｂ、ＺａおよびＺｂの意味は上記の化学式（Ｉ）において定義したものと同じである。化学式（IV）、（Ｖ）のアミンが同一である場合、換言すると、単一のアミンが用いられる場合、相当する中間体は対称的になる。しかしながら、異なる２つのアミンが用いられる場合、非対称の中間体が得られる。
【００５３】
非特許文献２（ｗｗｗ．ｍｄｐｉ．ｏｒｇ／ｅｃｓｏｃ／）に開示の対称的な中間化合
物は本発明から除く。しかしながら、非対称化合物を導く本明細書に開示のリンカーおよび錯形成部位のサブコンビネーションは、本発明の一部である。
【００５４】
また本発明は、化学式（Ｉ）を有する化合物を調製する方法に関する。化学式（Ｉ）の化合物を形成するための一般的な合成経路は、２工程の製法である。この合成経路を図１に示す。この合成経路を以下に詳細に記載する。最初に、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物（以下、「二無水物」と呼ぶ）を１つまたは２つの第１級アミンと反応させることによって、ナフタレンジイミド誘導体（中間体）を形成する。この第１級アミンは、化学式（ｌ）の所望の化合物の連結部位および錯形成部位に相当する構造を有する。換言すると、化学式（IV）：Ｈ２Ｎ−Ｌａ−Ｚａを有するアミンおよび化学式（Ｖ）：Ｈ２Ｎ−Ｌｂ−Ｚｂを有するアミンのうちの一方または両方を、二無水物と反応させることによって、ナフタレンジイミド中間体を形成する。
【００５５】
上述のように、本発明の化合物は対称であることも、非対称であることも可能である。対称である、すなわち、ジイミドスカフォードに結び付いた２個のペンダント基が同じである化学式（Ｉ）の化合物を得ることが所望される場合、二無水物を１つのアミンと反応させる。この場合、二無水物上の２個の求核サイトが同じアミンによって置換されることによって、対称的なジイミド中間体が生成する。しかしながら、非対称化合物を得る場合には、異なる２種類のアミンを用いて二無水物と反応させてよい。
【００５６】
この反応では、第１級アミンは二無水物を攻撃する。理論に拘束されようとするものではないが、この反応は求核置換反応として分類され得る。反応の反応速度論を求める目的で、一般に知られている機構、即ち、二分子求核置換反応（ＳＮ２）機構が適用可能であり得る。仮定した機構の経路にかかわらず、以下の実施例に示すように反応を実行することが可能である。
【００５７】
一般に、反応に用いられる試薬のモル比は比較的広い範囲を通じて変更可能であり、使用する各反応物の特定の量は当業者に知られている。例えば、過剰なアミンを化学量的により少量の二無水物と反応させることが可能である。また、これと反対に、過剰な二無水物を少量のアミンと反応させることも可能である。
【００５８】
反応物間に充分な接触を提供する任意の適切な容器において、反応を実行することが可能である。簡便には、撹拌バッチ反応器を用いることが可能である。反応物は任意の順で反応器へ加えられてよい。例えば、上述の第１級アミンをエーテル、好適には環状エーテル（例えば、オキシラン、オキセタン、およびテトラヒドロフランなど５個以上の炭素原子を有する環状エーテル）などの極性有機溶媒に溶解することが可能である。エーテルの立体的に妨害されていない酸素原子は２つの非共有電子対を有するため、配位錯体の形成およびカチオンの溶媒和を促進する。続いて、混合物に二無水物を加え、この反応混合物を高温にて適切な時間、撹拌および還流して、ジイミド中間体を生成する。
【００５９】
対称な化学式（Ｉ）の化合物を得る場合には、単一のアミンを二無水物と反応させる。形成されるジイミド中間体は、析出によって直接得ることが可能である。例えば、既知の一調製方法では、所望の時間、還流を実行した後、最初に水−アセトンを反応混合物へ注ぎ、ジイミド中間体を溶解する。続いて、無水エーテルを加え、中間体を析出させることが可能である。２つのアミンが加えて非対称化合物を形成する場合、反応生成物には対称化合物および非対称化合物の両方が含まれる。この場合、溶媒抽出もしくはクロマトグラフィー、またはそのような手法の組み合わせなど、任意の従来の手段によって、非対称化合物を単離することが可能である。アルコールなどの極性溶媒と、例えば、トリクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエチレン、四塩化エチレンなどのハロゲン化炭化水素との組み合わせからなる溶離液を用いて、有効なクロマトグラフ分離手法を実施することが可
能である。随意では、単離した非対称生成物をさらに精製するために、クロマトグラフィーで分離した非対称化合物に適切な溶媒を加えることが可能である。ここにおいても、クロマトグラフ分離に用いたのと同じ溶離液を、溶媒として用いることが可能である。しかしながら、溶媒が溶離液とは異なる化合物であることも可能である。いずれの場合にも、次いで、塩酸などの無機酸水溶液を抽出用溶剤として用いる溶媒抽出によって、溶媒混合物から非対称化合物を抽出することが可能である。アルカリ性溶液、例えば、アンモニア水を抽出液に加えることによって、非対称化合物を析出させることが可能である。
【００６０】
本発明の特定の実施形態では、反応の第１工程において、化学式（VI）
【００６１】
【化１０】
2008502715.tif 000012
および化学式（VII ）
【００６２】
【化１１】
2008502715.tif 000013
を有するナフタレンジイミド中間体が形成される。
【００６３】
第２の反応工程では、配位子の交換によって遷移金属錯体がＺａおよびＺｂに存在する任意の利用可能な配位原子価に配位結合するように、ナフタレンジイミド誘導体を遷移金属錯体と反応させる。非対称化合物を形成するために、遷移金属錯体とは反応しないＺａまたはＺｂを錯形成部位に用いることが可能である。例えば、配位部位が利用可能なまたは適切な配位原子価を有しない場合、金属錯体は錯形成部位に結び付かない。錯形成部位に遷移金属錯体を結合させるために、好適には、金属錯体は、錯形成部位によって容易に置換され得る１つ以上の弱く結合する配位子を含む。
【００６４】
本発明の別の態様は、化学式（Ｉ）の化合物をＤＮＡ縫い込み型インターカレータとして用いる、ヌクレオチドシーケンスの検出方法に関する。電気触媒的なインターカレータとして化学式（Ｉ）の化合物を用いて構成される電気化学的なＤＮＡバイオセンサの感度は良好であり、幾つかの実施形態では、電気化学分析における検出の感度は１００ｆＭもの低い濃度にてターゲットＤＮＡを検出することが可能なほどであった。本発明の方法では、標識付けの手順が不要であるため、電気化学的検出の実用性が劇的に改良され得る。ｄｓ−ＤＮＡへの選択的なインターカレーションとＰＩＮＤ−Ｏｓの電気触媒作用との組み合わせによって、標識付けが不要で、簡単、かつ、直接的でありながら、高感度でもあるＤＮＡ定量化の方法が提供される。
【００６５】
本発明の方法では、化学式（Ｉ）の化合物の遷移金属基の電気触媒活性を利用して、ハイブリッド形成イベントを電気化学信号へ変換する。化学式（Ｉ）の化合物は交雑されたプローブに強くインターカレートするのみならず、ｄｓ−ＤＮＡ上へのインターカレート中に電気触媒活性を保持している。この電気触媒活性は容易に検出可能であり、本発明の方法におけるハイブリッド形成の高感度な指示薬として作用するように利用される。詳細には、本発明の方法では、典型的に行われるような捕捉プローブ電極にて生成される電流信号の測定は実行しない。本発明の方法では、テスト試薬に対して電気化学的分析が実行されるときに、その電気化学的応答の変化がハイブリッド形成を指示するように、化合物の遷移金属基の電気活性を利用して、テスト試薬の電気化学特性を変更する。テスト試薬は酸化および還元のうちの一方または両方が可能であり、かつ、酸化還元挙動が充分に特徴付けられている任意の有機化合物であることが可能である。そのような化合物の例は、アルコール、アルデヒドおよび酸である。本発明における好適な一実施形態では、テスト試薬はアスコルビン酸である。
【００６６】
この方法を実行する際には、例えば、最初に、核酸シーケンスを含む試料アッセイを適切な媒質中に配置することが可能である。次いで、所望のプローブを加え、随意で、ハイブリッド形成を援助するための１つ以上の組換え酵素の添加を伴ってよい。例えば、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）およびマグネシウムイオンのうちの一方または両方の添加など任意の適切な手段によって、ハイブリッド形成を開始することも可能である。その後、存在する交雑されたプローブのインターカレーションが生じるように、化学式（Ｉ）の化合物をアッセイに加えることが可能である。続いて、プローブを徹底的に洗浄して、インターカレートされていない化学式（Ｉ）の化合物、特に電極表面上に吸着され得る化合物を除去する。洗浄後、次いで、プローブがテスト試薬に入れられてもよい。テスト試薬に酸化電位または還元電位が印加され、その電位に対するテスト試薬の電気化学的応答、例えば、酸化／還元電位、ピーク電流などが分析される。
【００６７】
テスト試薬の電気化学的応答を決定するために、任意の典型的な電気化学的検出方法を用いることが可能である。本発明の好適な実施形態では、電気化学的検出方法はボルタンメトリーまたはアンペロメトリーである。ハイブリッド形成が生じた場合、ボルタンメトリーのピーク電流および酸化還元電位などテスト試薬の特性は、その特徴づけられた典型的な値とは異なる。
【００６８】
一般に、本発明の化合物を、様々な蛋白質、ペプチドおよび核酸の検出用のＤＮＡ縫い込み型インターカレータとして用いることが可能である。しかしながら、それらの化合物はそのような使用に限定されておらず、電気触媒的／電気活性な化合物の使用を必要とする他の適切な用途に適用することが可能である。
【００６９】
以下の実施例は本発明をより完全に示すために提示されており、本発明の範囲を限定するものとして解釈されない。
［実施例］
本発明の化合物を生成するための一般的な合成経路を、図１に示す。この合成経路を以下の実施例に適用し、それらの化合物の特定例がどのように製造されるかを示す。
【００７０】
実施例１：Ｏｓ（ｂｐｙ）２Ｃｌ２（ＰＩＮＤ−Ｏｓ）とグラフトしたＮ，Ｎ’−ビス［１（３−プロピル）−イミダゾール−１，４，５，８−ナフタレンジイミドの合成
Ａ）化学薬品
１（３−アミノプロピル）−イミダゾール（ＡＩ、９８％）および１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物（＞９５％）は、シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入した。２，２’−ビピリジン（９９％）はＡｖｏｃａｄｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（Ｌｅｙ
ｓｈａｍ  Ｌａｎｃｅｓｔｅｒ、英国）から得た。他の試薬は全てシグマ−アルドリッチから得て、さらなる精製を行わずに用いた。［オスミウム（２，２’−ビピリジン）２Ｃｌ２］Ｃｌ（Ｏｓ（ｂｐｙ）２Ｃｌ２）は、Ｋ２ＯｓＣｌ６（９９％、ステム・ケミカルズ）から合成し、続いてレイ（Ｌａｙ）による提案の手順を行った。この作業において用いられるＣＰは、アルファＤＮＡ（モントリオール、カナダ）による特注品だった。他のオリゴヌクレオチドは全て、１ｓｔ  Ｂａｓｅ  Ｐｔｅ社（シンガポール）による特注品だった。０．１５ＭのＮａＣｌおよび０．０２０Ｍのリン酸バッファからなるリン酸バッファ塩溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を支持電解質として用いた。
【００７１】
Ｂ）装置
電気化学実験は、弱電流モジュールを接続したＣＨインスツルメンツ・モデル６６０Ａエレクトロケミカル・ワークステーション（ＣＨインスツルメンツ、オースティン、テキサス州）を用いて実行した。３電極方式には、直径２ｍｍの金作用電極、小型のＡｇ／ＡｇＣｌ基準電極（サイプレス・システムズ、ローレンス、カンザス州）および白金線対向電極を用いた。直径２ｍｍの作用領域を越えて試料溶滴が広がるのを回避するために、ＣＰの固定化後の金電極にパターン形成された疎水性フィルムを付着させた。この作業において報告される電位は全て、Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極に対して表した。ＵＶ可視スペクトルはＡｇｉｌｅｎｔ  ８４５３  ＵＶ可視分光光度計上で記録した。質量分析計の実験は、Ｆｉｎｎｉｇａｎ／ＭＡＴ  ＬＣＱ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ、サンホセ、カリフォルニア州）を用いて実行した。他に言及される場合を除き、スペクトルは全て室温にて記録した。
【００７２】
Ｃ）合成手順
図１により、ＰＩＮＤ−Ｏｓの合成を概説する。ＰＩＮＤはＮＤの合成用の一般的な手順に従って調製した。３．０ｍｌのＡＩおよび３．０ｍｌのテトラヒドロフランからなる磁気的に撹拌されている混合物に対し、０．３０ｇの１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物を徐々に加えた。ほぼ詰りが生じないように添加速度を制御した。反応混合物を２４時間、還流し、次いで室温まで冷却した。次に、１０ｍｌのアセトン／水（３／１）混合物中に分散させ、次いで急速に撹拌されている５００ｍｌの無水エーテルへ注ぎ、化合物を析出させた。目の細かなガラスフィルターによる吸引濾過によって析出物を収集し、エタノールで簡単に洗浄した。クロロホルムからの結晶化によって精製を行い、真空下、４０℃で終夜乾燥して、０．２８ｇの暗赤色の結晶を得た。
【００７３】
ＰＩＮＤ−Ｏｓは１工程の配位子交換反応によって合成した。蒸留したばかりのエチレングリコールによるＯｓ（ｂｐｙ）２Ｃｌ２（０．３２ｇ，０．５２ｍｍｏｌ）の溶液８．０ｍｌを、１０分間かけて小量ずつＰＩＮＤ（０．１２ｇ，０．２５ｍｍｏｌ）へ加え、得られた混合物を２０〜４０分間、還流した。配位子交換反応の完了は、サイクリックボルタンメトリーによって監視した。次いで、紫色の反応混合物を、急速に撹拌されている１００ｍｌのＫＣｌ飽和エタノール中に徐々に注いだ。目の細かなガラスフィルターによる吸引濾過によって析出物を収集した。粗生成物をＰＢＳで洗浄し、３．０〜５．０ｍｌのエタノールに溶解し、ＫＣｌ飽和エタノールから再び析出させた。この析出物をエタノールからの結晶化によってさらに精製し、収率７８％で純粋な生成物を得た。この生成物は、ＰＢＳ中、ガラス状炭素電極にて一組の可逆的な酸化還元波を示し、そのＥ１／２は０．１２Ｖであった。ＰＩＮＤの２つのイミダゾール末端にて完全に二重の配位子交換が起こることを保証するために、Ｏｓ（ｂｐｙ）２をわずかに過剰（５〜１０％）とした。
【００７４】
電気活性なＰＩＮＤ−Ｏｓインターカレータの形成は、サイクリックボルタンメトリーによって簡便に監視することが可能である。エチレングリコールでの還流中、サイクリックボルタンメトリーのテストを１０分毎に行なった。図３には、最初の３０分間に得られ
た典型的なボルタンモグラムを示す。図３（トレース１）に見られるように、Ｏｓ（ｂｐｙ）２Ｃｌ２にＰＩＮＤを加える前には、−０．１１Ｖを中心として、Ｏｓ（ｂｐｙ）２Ｃｌ２の周知の酸化還元プロセスに対応する１組の可逆的なボルタンメトリーピークが得られた。ＰＩＮＤを加えると、ＰＩＮＤ−Ｏｓの形成を示す新たな１組のボルタンメトリーピークが０．１２Ｖに現われた（図３、トレース３）。この２組のボルタンメトリーピークは、反応混合物中のＯｓ（ｂｐｙ）２Ｃｌ２およびＰＩＮＤ−Ｏｓの２つの１電子移動過程に相当する。両電子移動過程は明確に分解され、非常に可逆的である。０．１２Ｖにおけるボルタンメトリーピークの強度は、反応時間とともに次第に増加した。同時に、−０．１１Ｖにおけるボルタンメトリーピークの強度は、次第に減少した。３０〜４０分の還流後、両酸化還元対は定常状態に達した（図３、トレース４）。−０．１１Ｖにおける微小なボルタンメトリーピークは過量のＯｓ（ｂｐｙ）２Ｃｌ２を表している。したがって、分離および精製後の、精製されたＰＩＮＤ−Ｏｓのボルタンメトリーのテストでは１組のボルタンメトリーピークしか示されず、精製工程が非常に有効であることが示唆される（図３、トレース２）。
【００７５】
Ｄ）ＰＩＮＤ−Ｏｓの特性記述
出発物質およびＰＩＮＤ−ＯｓのＵＶ−可視吸収スペクトルを、図４に示す。エタノール中の出発物質のスペクトルの重ね合わせによって示されるように、ＰＩＮＤ−Ｏｓのスペクトルは、ＮＤ部位およびＯｓ（ｂｐｙ）２Ｃｌ（ＡＩ）金属錯体の両方に由来する吸収スペクトルを合成したものである。可視領域（４００〜６００ｎｍ）は、特徴的なＯｓ（ｄπ）→ｂｐｙ（π＊）の金属−配位子電荷移動（ＭＬＣＴ）遷移からなり、３８３ｎｍ，３６２ｎｍのピークは、主として、基礎となるＭＬＣＴ吸収からの幾らかの寄与によるＰＩＮＤのπ→π＊遷移である。より短い波長では、ピークはＰＩＮＤおよびＰＩＮＤ−Ｏｓの両方に由来する配位子−中心遷移に相当する。ＰＩＮＤ−ＯｓのＭＬＣＴバンドはブロードになり、Ｏｓ（ｂｐｙ）２Ｃｌ２と比較して赤方へ変位している。恐らくこれは、オスミウム錯体内で２種類のＭＬＣＴ遷移：Ｏｓ＊→ｂｐｙおよびＯｓ＊→ＡＩ、を生じる配位子交換の直接的な結果である。ＰＩＮＤのイミダゾール基は共役しており、錯体の塩化物と比較して、この配位子にはより低いπ＊のレベルが生じる。
【００７６】
ＵＶの結果からは、ＰＩＮＤとＯｓ（ｂｐｙ）２Ｃｌ２との間のカップリングによって配位の結合が生じ、ＰＩＮＤの両方のイミダゾール末端がＯｓ（ｂｐｙ）２Ｃｌ２とグラフトすることが結論付けられる。
【００７７】
ＰＩＮＤ−Ｏｓの形成のより直接的な証拠は、電子スプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）を用いる、ＰＩＮＤおよびＰＩＮＤ−Ｏｓに対する一連の質量分析テストから導かれる。主なピークは、ｍ／ｚ  ７８０，４８３．３および２４２．３に見出された。これらはそれぞれ、ＰＩＮＤ−Ｏｓ／２、ＰＩＮＤ＋Ｈ＋および（ＰＩＮＤ＋２Ｈ＋）／２に対応する（図６）。ＥＳＩ−ＭＳスペクトルにおいてはモノグラフトされたＰＩＮＤが観察されなかったことから、Ｏｓ（ｂｐｙ）２Ｃｌ２の不完全なグラフト化を除外することが可能である。
【００７８】
電気化学的な特性記述では、ＰＩＮＤ−Ｏｓは、溶液中の非常に可逆的な酸化還元対に正に期待される特性を示した。−０．３０Ｖ〜＋０．７０Ｖに多数の電位サイクルを反復的に印可した後にもほとんど変化は観察されず、溶液におけるＰＩＮＤ−Ｏｓの良好な安定性を示している。５００ｍＶ／ｓ未満の低走査速度では、理想的なネルンスト式挙動を示す１電子交換系に期待される通りに、典型的な拡散制御ボルタンモグラムが記録された。即ち、ピーク電流は電位走査速度の平方根に比例し、電位ピーク間の分離は理論値である５９ｍＶに非常に近く、かつ、電位の走査速度からは独立している。そのような結果によって、オスミウム酸化還元中心は全て電極表面に達し、可逆的な不均一系電子移動を進行することが確認される。
【００７９】
実施例２：ＰＩＮＤ−Ｏｓを用いるＤＮＡ検出：ＵＶ分光測光および蛍光競合実験
Ａ）捕捉プローブ（ＣＰ）の固定化
ＣＰ固定化に先立って、０．０５０μｍアルミナスラリーを用いて金電極を徹底的に研磨し、水中で１０分間、超音波処理した。次いで、５〜１０分間、酸素プラズマ中で浄化し、無水エタノールに２０分間、浸漬して、酸化被膜を低減させた。ＣＰ単層は、１００μｇ／ｍｌのＣＰ溶液中に金電極を１６〜２４時間、浸漬することによって形成した。吸着後、任意の非特異的な吸着された材料を除去することを目的として、電極をＰＢＳで充分にすすぎ、ＰＢＳ中に２０分間、浸漬し、再びすすいで、空気流を用いて気流乾燥した。スチール（Ｓｔｅｅｌ）によって提案された手順によるカチオン酸化還元プローブを用いて電気化学的に評価すると、ＣＰの密度は１．１３〜１．３０×１０−１１ｍｏｌ／ｃｍ２の範囲にあることが分かった。ＤＮＡに関連しないＰＩＮＤ−Ｏｓ捕集を最小化するとともに、単層の品質および安定性を改良するため、ＣＰ被覆金電極を、１−メルカプトドデカン（ＭＤ）の２．０ｍｇ／ｍｌエタノール溶液に４〜６時間、浸漬した。未反応のＭＤ分子をすすいで落とし、電極を、撹拌されているエタノール中に１０分間、浸漬し、続いてエタノールおよび水を用いてすすぐことによって、洗浄した。風乾後、電極の準備は完了した。
【００８０】
Ｂ）ハイブリッド形成
図２のスキームに示すように、ターゲットＤＮＡのハイブリッド形成およびその電気化学的検出を、３つの工程によって実行した。最初に、５３℃に維持された湿度飽和環境のチャンバに電極を配置した。ターゲットＤＮＡを含むハイブリッド形成溶液のアリコート２．５μｌを、電極上に一様に広げた。次いで、５３℃にてブランクのハイブリッド形成溶液を用いて徹底的にすすぎ、１００μｇ／ｍｌのＰＩＮＤ−Ｏｓハイブリッド形成溶液のアリコート５．０μｌを用いて、３５℃で１０分間、インキュベートした。縫い込み型インターカレーションによって、交雑されたターゲットＤＮＡにＰＩＮＤ−Ｏｓを結び付けた。次いで、室温で１０分間、空冷し保持した後、ＮａＣｌ飽和のＰＢＳを用いて徹底的にすすいだ。ＡＡ電気酸化電流は、１．０ｍＭのＡＡを含むＰＢＳにおいて、アンペロメトリーによって測定した。低いＤＮＡ濃度では、各アンペロメトリー測定後に平滑化を行い、ランダム雑音と電磁干渉を除去した。
【００８１】
Ｃ）検出
ＰＩＮＤ−Ｏｓとｄｓ−ＤＮＡとの相互作用のモードを決定するために、サケ精子ＤＮＡの量を増大させて、ＰＩＮＤ−ＯｓのＵＶ可視分光光度測定を行った。ＵＶ可視分光光度法におけるインターカレーション結合の兆候は、縫い込み型インターカレータの縮合した平らな芳香族環系がｄｓ−ＤＮＡ塩基対の間に挿入されて、淡色効果が赤方へ変位することである。図４に示すように、ＤＮＡ塩基対／ＰＩＮＤ−Ｏｓの比が４．０となるようにＰＩＮＤ−ＯｓへＤＮＡを添加すると、３６１ｎｍ，３８０ｎｍのＮＤバンドは３５％減少し、３ｎｍ赤方へ変位した。ＤＮＡ塩基対／ＰＩＮＤ−Ｏｓの比が４．０未満でＮＤ吸光帯域の淡色効果は平坦となり、比が４．０以上を超えると一定の淡色効果が観察された。これは、ＰＩＮＤ−Ｏｓのｄｓ−ＤＮＡへの結合がＮＤの優先のインターカレーションによって起こることを示す。
【００８２】
化学式（Ｉ）の化合物のインターカレート性のより有効な推定値を得るために、競合実験を計画した。この方法の基本原理は、蛍光性、および非蛍光性の、２つのインターカレータを用いることである。最初に、蛍光性のインターカレータによってｄｓ−ＤＮＡを飽和させる。次いで、第２のインターカレータ、この場合にはＰＩＮＤ−Ｏｓを、徐々に濃度を増大させて系中へ導入する。競合実験では、系中のＰＩＮＤ−Ｏｓ分子の濃度の増大によってｄｓ−ＤＮＡの結合した蛍光分子がＰＩＮＤ−Ｏｓにより置換されてゆく間の蛍光強度の変化を監視した。対照蛍光指示薬として、周知の縫い込み型インターカレータで
ある臭化エチジウム（ＥＢ）を選択した。ＥＢは有効なＤＮＡインターカレータとして広範に研究されており、ＤＮＡアッセイに用いられる最も一般的な蛍光性インターカレータのうちの１つである。ＥＢはｄｓ−ＤＮＡに結合すると蛍光を２５倍に増大するので、蛍光測定において遊離のＥＢ分子には充分な感度および良好な識別性が提供される。加えて、ＥＢのインターカレーションの速度論は非常に高速であるため、平衡に達するために必要な時間を著しく短縮する。
【００８３】
我々のアプローチがこの研究に適切であることを保証するために、最初に、よく研究されている非蛍光性のインターカレータであるナフタレンジイミド（ＮＤ）を、濃度を増大させて（０〜１００μＭ）ＥＢ飽和ｄｓ−ＤＮＡ溶液へ加え、ゲル電気泳動実験を行った。この実験では、ＮＤの濃度の増大にしたがって、ｄｓ−ＤＮＡにインターカレートしたＥＢの蛍光強度が次第に減少することが示された。実験データから、結合定数Ｋｄは４．０×１０５と推定された。この値は、文献値と良く一致していた。続いて、同じアプローチを用いて、ＰＩＮＤ−ＯｓがＥＢと競合してｄｓ−ＤＮＡに結合する能力について調べた。結合能力を調査するため、異なる量のＰＩＮＤ−ＯｓをＥＢ飽和ｄｓ−ＤＮＡと混合した。
【００８４】
図８Ａに示すように、ＰＩＮＤ−Ｏｓはｄｓ−ＤＮＡに対する著しい結合親和性を示した。レーン１〜５は異なる比のＰＩＮＤ−Ｏｓ／ＥＢに相当する。ＰＩＮＤ−Ｏｓ／ＥＢの比が大きいほど、蛍光強度は小さい。より大きな比のＰＩＮＤ−Ｏｓ／ＥＢ（レーン２〜５）でｄｓ−ＤＮＡの蛍光強度がより小さかったことから、より多くのＰＩＮＤ−Ｏｓ分子がｄｓ−ＤＮＡに結合し、より多くの量のＥＢ分子が置き換えられることが示唆された。第２のレーンに示すように、１／８程度と低いＰＩＮＤ−Ｏｓ／ＥＢの分子の比では、インターカレートされたＥＢによる蛍光強度の減少と、遊離ＥＢによる蛍光強度の増大とによって明らかなように、５０％以上のｄｓ−ＤＮＡ結合ＥＢが置換された。これは、ＰＩＮＤ−ＯｓがＥＢよりもはるかに強いＤＮＡインターカレータであることを示唆している。実験データから推定された結合定数Ｋｄは６．１×１０６であり、ＮＤに対しほぼ１５倍の増強に相当する。ＮＤ基がｄｓ−ＤＮＡにインターカレートした後、ＰＩＮＤ−Ｏｓの２つのカチオン性のＯｓ（ｂｐｙ）２Ｃｌ基がｄｓ−ＤＮＡの各側のリン酸基とイオン対を形成し、ｄｓ−ＤＮＡの塩基対の間にＮＤをより強固に固定する、というのが、安定度定数増大についての妥当な説明である。加えて、ゲル像についてより詳細に考察すると、蛍光強度が弱くなるのに伴い、ＤＮＡ移動度に系統的な変化があったことが示された。ＰＩＮＤ−Ｏｓ／ＥＢの比が高いほど、ゲル像に出現するバンドは高くなり、ＤＮＡの移動度は遅くなる。質量分析法によって、ＥＢの分子量は３２４であり、ＰＩＮＤ−Ｏｓの分子量は１５６０であると決定される。加えて、ＰＩＮＤ−Ｏｓはジカチオン性である。ＰＩＮＤ−Ｏｓが嵩高く、ジカチオン性であることによって、より低い移動度が生じていることは明らかである。
【００８５】
実施例３：ＰＩＮＤ−Ｏｓを用いるＤＮＡ検出：交雑された錯体のボルタンメトリー分析
ＤＮＡ感知用途における電気活性な指示薬として、ＰＩＮＤ−Ｏｓを評価した。ポリ（Ａ）オリゴヌクレオチドをターゲットＤＮＡとして用い、ハイブリッド形成テストを行った。ポリ（Ｔ）ＣＰ被覆電極とハイブリッド形成させて、ターゲットＤＮＡを、その相補的なＣＰに選択的に結合させ、センサ表面上に固定した。ハイブリッド形成バッファですすぐことによって、非ハイブリッド形成関連ＤＮＡを全て洗い落とした。続くＰＩＮＤ−Ｏｓ溶液によるインキュベーション中、センサ表面にＰＩＮＤ−Ｏｓを配した。
【００８６】
ＣＰ修飾電極の、その相補的ＤＮＡとのハイブリッド形成前後のサイクリックボルタンモグラムを、図８Ｂに示す。ハイブリッド形成前には、ＰＩＮＤ−Ｏｓの酸化還元電位にて、１組の微小なボルタンメトリーピークが観察された（図８Ｂ、（１））。ハイブリッ
ド形成後には酸化還元電位のわずかな正への変位が観察され、ピーク電流は２０倍ほど増大した。ＮａＣｌ飽和ＰＢＳで充分に洗浄することによって、ほとんどの非ＤＮＡ関連ＰＩＮＤ−Ｏｓ捕集が除去されることが見出された。これらの結果は、ＰＩＮＤ−Ｏｓが選択的にｄｓ−ＤＮＡと相互作用し、かつ、ＰＩＮＤ−Ｏｓとｄｓ−ＤＮＡとの付加体の解離速度が非常に遅いことを明確に示している。これによって、高感度なＤＮＡバイオセンサの開発への道が開かれる。したがって、ＤＮＡを直接的に検出するための電気活性な指示薬として、インターカレートされたＰＩＮＤ−Ｏｓを用いることを評価した。検出限界は１．５ｎＭであった。
【００８７】
実施例４：ＰＩＮＤ−Ｏｓを用いるＤＮＡ検出：インターカレートされた錯体の存在下での有機酸のボルタンメトリーおよびアンペロメトリー分析
別のテストでは、ＡＡを含むＰＢＳ中のボルタンメトリーおよびアンペロメトリーによって、ターゲットＤＮＡとのハイブリッド形成前後の完成したセンサをテストした。図９には、ハイブリッド形成前後のＡＡのサイクリックボルタンモグラムを示す。比較のため、ブランクＰＢＳ中のターゲットＤＮＡ交雑センサも示す（図９、トレース１）。トレース２はハイブリッド形成前、かつ、ＰＩＮＤ−Ｏｓインキュベーションなしのセンサによって得られた。また、トレース３はハイブリッド形成後、かつ、ＰＩＮＤ−Ｏｓインターカレーション後のセンサに相当する。両方のセンサとも、ＡＡに対して完全な不可逆酸化過程を示した。ハイブリッド形成前には、ＡＡ酸化の陽極ピーク電位（Ｅｐ）は約０．９０Ｖであった。これは主にＭＤおよびアニオン性ＣＰの存在のためである。それらはいずれも、基礎をなす電極とＡＡとの間の電子交換を妨げる。ＰＩＮＤ−Ｏｓの存在によってＡＡ酸化の過電圧が大幅に低減し、Ｅｐ値が負に０．７４Ｖ〜０．１６Ｖも変位したことが分かる。ピーク前の酸化電流は急速に増大し、ピーク電流は約４倍に増大した。この酸化電位は、オスミウム−ビピリジン酸化還元ポリマー修飾電極におけるそうした過程について報告されたものと同様である。この劇的な改良の理由の一部は、インターカレートされたＰＩＮＤ−Ｏｓによって負電荷の一部が中和されることによって、静電反発力が低減されることである。より重要なことに、ＰＩＮＤ−Ｏｓインターカレーションの後のボルタンメトリー応答が充分に改良されるのは、Ｏｓ（ｂｐｙ）２Ｃｌ部位の純粋な触媒効果のためである。ピーク電流の増大および陽極の過電圧の減少によって、ＡＡが有効な電気触媒であることが示された。過電圧の変位は速度論的な効果によるものである。したがって、ＡＡから電極への電子移動の速度が非常に増大し、電子移動過程の可逆性は改良される。ターゲットＤＮＡ濃度が０．０３０〜１０ｎＭの範囲では、触媒的な電流はターゲットＤＮＡ濃度に比例し、検出限界である０．０２０ｎＭでは、インターカレートされたＰＩＮＤ−Ｏｓの直接的なボルタンメトリー検出の電流より７５倍大きいことが見出された。ＡＡ濃度の増大とともに、より大きな触媒的な電流が観察されたが、同時にバックグラウンド電流も増加するため、検出限界の改良はほとんど観察されなかった。
【００８８】
上述のボルタンメトリーの調査に基づくと、アンペロメトリーにおいてより良好な分析特性を達成する見込みは大いにあると思われる。特に有望であると思われる電気触媒作用の特徴は、低電位でＡＡの酸化が起こることである。著しく低い動作電位でアンペロメトリー検出を行うことによって、電位干渉は最小化し、バックグラウンド電流は低減されるので、信号対雑音比が改良され、検出限界がより低くなる。図１０に示すように、１．０ｍＭのＡＡをＰＢＳへ加えると、アンペロメトリー中の酸化電流は０．２０Ｖで０．１８μＡだけ増大した（図１０、トレース１）。非相補的なＣＰであるポリ（Ａ）をセンサ表面上に固定化した対照実験では、観察された増加分はわずかに０．０１７μＡであった（図１０、トレース２）。アンペロメトリーのデータは以前に得られたボルタンメトリーの結果によく合致し、ターゲットＤＮＡの高特異的および高感度な検出の成功が再び確認された。０．２０〜６００ｐＭの範囲で観察されたアンペロメトリー酸化電流とターゲットＤＮＡ濃度との間の比例関係の相関係数は、０．９９２であった。３の信号対雑音比として定義した検出限界は１００ｆＭであることが分かった。これは、直接的なボルタンメト
リーに対して１０００倍を超える感度の改良に当たる。
【００８９】
実施例５：非対称のインターカレータ−Ｎ−［１−（３−プロピル）−イミダゾール］−Ｎ’［−１（３−プロピル）−モルホリン］−１，４，５，８−ナフタレンジイミド（ＰＰＮＤ）の合成
Ａ）化学薬品および装置
Ｎ−（３−アミノプロピル）−モルホリンは、シグマ−アルドリッチ（セントルイス、ミズーリ州、米国）から得た。この実施例において用いた他の化学薬品および装置は全て、実施例１において用いたものと同一であった。
【００９０】
Ｂ）合成手順
化学式（Ｉ）の非対称化合物であるＰＰＮＤは、以下に概説する手順によって調製した。簡単には、１．０ｍｌのＮ−（３−アミノプロピル）−モルホリン、０．６０ｍｌのＮ−（３−アミノプロピル）−イミダゾールおよび１０ｍｌのテトラヒドロフランからなる磁気的に撹拌されている混合物に対し、０．４０ｇの１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物を徐々に加えた。ほぼ詰りが生じないように添加速度を制御した。反応混合物を２４時間、還流し、次いで室温まで冷却した。この反応混合物の溶媒を留去し、１：１（ＣＨＣｌ３：エタノール）ミス溶媒溶離液を用いるシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。クロマトグラフ分離の第２のバンドは主として非対称化合物を含む。それを収集し、溶媒を蒸発させ、溶媒抽出を用いてさらに精製した。クロマトグラフィーによって得られた生成物をトリクロロメタンＣＨＣｌ３に溶解することによって溶媒抽出を行い、次いで、０．０２０ＭのＨＣｌで抽出した。１０％のＮＨ３水溶液を添加することによって、純粋な非対称化合物を析出させた。次いで、真空下、４０℃で終夜乾燥して、０．１８ｇの暗赤色の結晶を得た。
【００９１】
Ｃ）ＰＰＮＤ−Ｏｓの特性記述
ＨＰＬＣ質量スペクトルによって、単離した結晶が純粋であったことは明らかである（収率：２４％）（図７）。ＰＰＮＤおよびＰＰＮＤ−ＯｓのＵＶ−可視吸収スペクトルを、図５に示す。ＰＰＮＤ−Ｏｓのスペクトルは、ＮＤ部位およびＯｓ（ｂｐｙ）２Ｃｌ金属錯体の両方に由来する吸収スペクトルを合成したものである。可視領域（４００〜６００ｎｍ）は、特徴的なＯｓ（ｄπ）→ｂｐｙ（π＊）の金属−配位子電荷移動（ＭＬＣＴ）遷移からなり、３８３ｎｍ，３６２ｎｍのピークは、主として、基礎となるＭＬＣＴ吸収からの幾らかの寄与によるＰＰＮＤのπ→π＊遷移である。より短い波長では、ピークはＰＰＮＤおよびＰＰＮＤ−Ｏｓの両方に由来する配位子−中心遷移に相当する。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】化学式（Ｉ）の化合物を得るための一般的な合成スキームの図。
【図２】本発明の化合物をターゲットオリゴヌクレオチドシーケンスの検出のためのインターカレータとして用いて、どのようにＤＮＡアッセイを行うかに関する概略図。この例では、アスコルビン酸によるＤＮＡバイオセンサの典型的なアンペロメトリー応答を示す。
【図３】Ｏｓ（ｂｐｙ）２（１）およびＰＩＮＤ−Ｏｓ（２）ならびにエチレングリコール中、ＰＩＮＤとともに還流して１０分後（３）および３０分後の（４）のＯｓ（ｂｐｙ）２Ｃｌ２に関する規格化したサイクリックボルタンモグラム。支持電解質としてＰＢＳを用い、１００ｍＶ／ｓの走査電位速度を印加した。
【図４】エタノール中のＰＩＮＤ−Ｏｓ（１）、Ｏｓ（ｂｐｙ）２Ｃｌ２（２）およびＰＩＮＤ（３）に関する規格化したＵＶ−可視吸収スペクトル。
【図５】エタノール中のＰＰＮＤ（１）およびＰＰＮＤ−Ｏｓ（２）に関する規格化したＵＶ可視スペクトル。
【図６】ＰＩＮＤおよびＰＩＮＤ−Ｏｓの電子スプレーイオン化質量スペクトル。
【図７】ＰＰＮＤ（１）およびＰＩＮＤ（２）の電子スプレーイオン化質量スペクトル。
【図８Ａ】ＰＩＮＤ−Ｏｓのｄｓ−ＤＮＡ結合性を示すゲル電気泳動の結果を示す図。レーン１〜５には、次のＰＩＮＤ−Ｏｓ対ＥＢの比を用いた：０／４０，２／４０，５／４０，１０／４０および２０／４０。
【図８Ｂ】５０ｎＭのポリ（Ａ）オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成前（１）および後（２）の、ポリ（Ｔ）オリゴヌクレオチド被覆電極に結合したＰＩＮＤ−Ｏｓのサイクリックボルタンモグラム。支持電解質としてＰＢＳを用い、１００ｍＶ／ｓの走査電位速度を印加した。
【図９】５．０ｎＭのポリ（Ａ）オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成およびＰＩＮＤ−Ｏｓとのインターカレーションの前（２）および後（３）の、ポリ（Ｔ）オリゴヌクレオチド被覆電極に結合したアスコルビン酸のサイクリックボルタンモグラム。支持電解質としてＰＢＳの１．０ｍＭアスコルビン酸溶液を用い、１００ｍＶ／ｓの走査電位速度を印加した。トレース（１）は比較用のブランクＰＢＳにおけるターゲットＤＮＡ交雑センサから得た。
【図１０】５０ｐＭのポリ（Ａ）オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成前（１）および後（２）の、ポリ（Ｔ）オリゴヌクレオチド被覆電極に結合したＰＩＮＤ−Ｏｓのアンペロメトリー応答の図。支持電解質としてＰＢＳを用い、０．２０Ｖの安定電位を印加した。
【図１】
2008502715.tif 000025
【図２】
2008502715.tif 000026
【図３】
2008502715.tif 000027
【図４】
2008502715.tif 000028
【図５】
2008502715.tif 000029
【図６】
2008502715.tif 000030
【図７】
2008502715.tif 000031
【図８Ａ】
2008502715.tif 000032
【図８Ｂ】
2008502715.tif 000033
【図９】
2008502715.tif 000034
【図１０】
2008502715.tif 000035
【手続補正書】
【提出日】平成18年8月11日(2006.8.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式（Ｉ）を有する化合物。
【化１】
2008502715.tif 000036
式中、ＬａおよびＬｂの各々は独立に選択される連結部位であり、２〜５個の主鎖原子を含み、随意で置換されており、
ＺａおよびＺｂの各々は独立に選択される錯形成部位であり、１個以上の窒素原子を含み、
ＺａおよびＺｂのうちの一方または両方は同窒素原子によってそれぞれ遷移金属錯体ＭａＶａおよびＭｂＶｂのうちの一方または両方に配位結合しており、
各連結部位の最後の主鎖原子は、それぞれの錯形成部位の窒素原子に結合しており、
遷移金属ＭａおよびＭｂの各々はオスミウム、ルテニウム、鉄、レニウムおよび白金からなる群から独立に選択され、
ＭａおよびＭｂの各々は独立に選択される遷移金属であり、
ＶａおよびＶｂの各々は独立に選択される原子価基である。
ただし次の化合物を除く。
【化２】
2008502715.tif 000037
【化３】
2008502715.tif 000038
【化４】
2008502715.tif 000039
【化５】
2008502715.tif 000040
【請求項２】
錯形成部位ＺａおよびＺｂの各々はヘテロ環である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ヘテロ環はイミダゾール、トリアジン、ピラジン、アクリジン、アゼピン、アジリジン、ベンゾジアジン、ビピリジン、ジアジン、イソキノリン、ラクタム、モルホリン、オキサジン、フェナントリジン、フェナントロリン、ピペラジン、プテリジン、プリン、ピリジン、ピロール、ピロリジン、キノリン、キノリジン、チアジアジン、チアジン、トリアジンおよびトロパンからなる群から選択される請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
錯形成部位ＺａおよびＺｂの各々は第１級または第２級のアミノ基である請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
第１級または第２級のアミノ基の窒素原子は１〜６個の主鎖炭素原子を有する脂肪族アルキル基に結合している請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
ＬａおよびＬｂの各々は飽和脂肪族炭化水素鎖である請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
原子価基ＶａおよびＶｂの各々はハロゲン化物、ピリジン、ビピリジン、フェナントロリン、イミダゾール、ジピリドフェナジン、ポルフィリンおよびそれらの誘導体からなる群から独立に選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
ＺａおよびＺｂは同一である請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
ＺａおよびＺｂはイミダゾール、プリン、ピペラジン、フェナントロリン、ピリジン、第１級アミンおよび第２級アミンからなる群から選択される請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
ＺａおよびＺｂは異なる請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
ＺａおよびＺｂはイミダゾールおよびモルホリンからなる群から選択される請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
ＬａおよびＬｂは同一である請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
ＬａおよびＬｂはエチルまたはプロピルである請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
１つの遷移金属錯体ＭａＶａのみが存在する請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】
２つの遷移金属錯体ＭａＶａおよびＭｂＶｂが存在する請求項１に記載の化合物。
【請求項１６】
ＭｂはＭａと同一である請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
遷移金属Ｍａはオスミウムであり、原子価基Ｖａは２つのビピリジン（ｂｐｙ）配位子および１つのハロゲン配位子からなる請求項１４に記載の化合物。
【請求項１８】
次の化学式（II）を有する請求項１の化合物。
【化６】
2008502715.tif 000041
【請求項１９】
次の化学式（III ）を有する請求項１の化合物。
【化７】
2008502715.tif 000042
【請求項２０】
次の一般式（Ｉ）を有する化合物の製造方法であって、
【化８】
2008502715.tif 000043
［式中、ＬａおよびＬｂの各々は独立に選択される連結部位であり、２〜５個の主鎖原子を含み、随意で置換されており、
ＺａおよびＺｂの各々は独立に選択される錯形成部位であり、１個以上の窒素原子を含み、
ＺａおよびＺｂのうちの一方または両方は同窒素原子によってそれぞれ遷移金属錯体ＭａＶａおよびＭｂＶｂのうちの一方または両方に配位結合しており、
各連結部位の最後の主鎖原子は、それぞれの錯形成部位の窒素原子に結合しており、
遷移金属ＭａおよびＭｂの各々はオスミウム、ルテニウム、鉄、レニウムおよび白金
からなる群から独立に選択され、
ＭａおよびＭｂの各々は独立に選択される遷移金属であり、
ＶａおよびＶｂの各々は独立に選択される原子価基である］
１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物を、化学式（IV）：Ｈ２Ｎ−Ｌａ−Ｚａを有する第１級アミンおよび化学式（Ｖ）：Ｈ２Ｎ−Ｌｂ−Ｚｂを有する第１級アミンのうちの一方または両方と反応させることによって、ナフタレンジイミド中間体を形成する工程と、
同ナフタレンジイミド中間体を遷移金属錯体と反応させることによって、ＺＡおよびＺＢのうちの一方または両方の１個以上の窒素原子へ同遷移金属錯体を配位結合させる工程と、からなる方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の化学式（Ｉ）を有する化合物の二本鎖ＤＮＡ縫い込み型インターカレータとしての使用。
【請求項２２】
核酸の検出方法であって、
基質上に固定されている１つ以上の捕捉プローブを核酸と接触させることによって、核酸を捕捉プローブに交雑し、ハイブリッドを形成する工程と、捕捉プローブは試料に対して相補的なヌクレオチドシーケンスを有することと、
次の一般式（Ｉ）を有するＤＮＡ縫い込み型インターカレータ化合物とハイブリッドを接触させることによって、ハイブリッドをインターカレートする工程と、
【化９】
2008502715.tif 000044
（式中、ＬａおよびＬｂの各々は独立に選択される連結部位であり、０〜１０個の主鎖原子を含み、随意で置換されており、
ＺａおよびＺｂの各々は独立に選択される錯形成部位であり、１個以上の窒素原子を含み、
ＺａおよびＺｂのうちの一方または両方は同窒素原子によってそれぞれ遷移金属錯体ＭａＶａおよびＭｂＶｂのうちの一方または両方に配位結合しており、
各連結部位の最後の主鎖原子は、それぞれの錯形成部位の窒素原子に結合しており、
ＭａおよびＭｂの各々は独立に選択される遷移金属であり、
ＶａおよびＶｂの各々は独立に選択される原子価基である）
インターカレートされたハイブリッドと有機酸を接触させる工程と、
有機酸に対して酸化電位または還元電位を印加する工程と、
有機酸の電気化学的応答を決定する工程と、からなる方法。
【請求項２３】
有機酸はアスコルビン酸である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
有機酸の電気化学的応答はボルタンメトリーまたはアンペロメトリーによって決定される請求項２２に記載の方法。
【国際調査報告】
2008502715.tif 000045
2008502715.tif 000046
2008502715.tif 000047
2008502715.tif 000048