(57)【要約】  本発明は、インビトロ及びインビボで特異的に送達するための核酸の修飾に関する。より詳しくは、本発明は、ＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子の修飾に関する。本発明は、ＲＮＡ干渉又はアンチセンステクノロジーに対する送達及び特異性に関する機能を付与するためのＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子の修飾に関する。特異的な結合ドメインが、生物学的に活性な分子に接合した相補的核酸がハイブリダイズし得る核酸に組み込まれる。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ又はそれ以上の機能的実体（ＦＥ）を利用する複合体であって、このＦＥは、細胞外で（生物内部で）、経細胞で（細胞膜を横切って）そして／又は細胞内で（細胞内部の種々の位置へ）、この複合体が分解及び／若しくは除去されることを防ぎ得るものであり、この複合体の活性を増大し得るものであり、そして／又はこの複合体の移送を増大し得るものであるとし、この複合体は、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子を含み、ここでこのｓｉＲＮＡ分子は、第一の鎖及び第二の鎖を含み、そしてこのｓｉＲＮＡ分子は、次の仕方で修飾されていること、すなわち：
−少なくとも１つのアンカー結合ドメインが、このｓｉＲＮＡ分子の２つの鎖のうちのいずれか１つに組み込まれており、このアンカー結合ドメインは、核酸又はそのアナログであること、
−少なくとも１つのアンカー配列が、このアンカー結合ドメインとハイブリダイズされており、このアンカー配列は、核酸又はそのアナログであること、及び
−少なくとも１つの機能的実体（ＦＥ）が、この少なくとも１つのアンカー配列に連結されており、このＦＥが、１つ又はそれ以上の生物学的に活性な分子であること、
を特徴とする、上記複合体。
【請求項２】
アンカー結合ドメインが、他の鎖に対して１つ又はそれ以上のミスマッチを有する、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
アンカー結合ドメインが、他の鎖に対して１〜７のミスマッチを有する、請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
アンカー結合ドメインが、ｓｉＲＮＡ分子の一部である、請求項１に記載の複合体。
【請求項５】
アンカー結合ドメインが、１５までのヌクレオチドを含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項６】
アンカー結合ドメインが、３〜１２のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項７】
アンカー結合ドメインが、４〜８のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項８】
アンカーが、固定化核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）又はそれらの誘導体である、請求項１に記載の複合体。
【請求項９】
ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖が、アンカー配列の結合ドメインとして作用する、請求項１に記載の複合体。
【請求項１０】
ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖が、アンカー配列の結合ドメインとして作用する、請求項１に記載の複合体。
【請求項１１】
ｓｉＲＮＡ分子が、最大長さ３５の塩基対を有する、請求項１に記載の複合体。
【請求項１２】
ｓｉＲＮＡ分子が、１〜１２のヌクレオチドの３’突出及び／又は５’突出を有する、請求項１に記載の複合体。
【請求項１３】
ｓｉＲＮＡ分子が、２〜５のヌクレオチドの３’突出及び／又は５’突出を有する、請求項１に記載の複合体。
【請求項１４】
ｓｉＲＮＡ分子が化学修飾される、請求項１に記載の複合体。
【請求項１５】
アンカー結合ドメインが、ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの末端の伸長である、請求項１に記載の複合体。
【請求項１６】
複合体が、少なくとも１つのＦＥと少なくとも１つのアンカー配列との間に切断可能なリンカー分子を含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項１７】
複合体が、少なくとも１つのＦＥと少なくとも１つのアンカー配列との間に切断可能なリンカー分子を含み、そしてこのリンカーが、ジスルフィド架橋を含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項１８】
アンカー配列が、切断可能なリンカーを含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項１９】
アンカー配列が、切断可能なリンカーを含み、そしてこのリンカーが、ジスルフィド架橋を含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項２０】
アンカー配列が、少なくとも１つのアンカー結合ドメインとともに伸長される、請求項１に記載の複合体。
【請求項２１】
１つ又はそれ以上の機能的実体（ＦＥ）を、細胞膜を横切り、そして細胞内部の種々の位置に移送させる方法であって、ここで、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の複合体がトランスフェクションに使用される、方法。
【請求項２２】
１つ又はそれ以上の機能的実体（ＦＥ）を利用する複合体を作製する方法であって、このＦＥは、細胞外で（生物内部で）、経細胞で（細胞膜を横切って）そして／又は細胞内で（細胞内部の種々の位置へ）、この複合体が分解及び／若しくは除去されることを防ぎ得るものであり、この複合体の活性を増大し得るものであり、そして／又はこの複合体の移送を増大し得るものであるとし、この複合体は、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子を含み、そしてこのｓｉＲＮＡ分子は、第一の鎖及び第二の鎖を含み、そしてここでこの方法は、次の工程：
−少なくとも１つのアンカー結合ドメインを、このｓｉＲＮＡ分子に導入し、このアンカー結合ドメインは、核酸又はそのアナログであるものとすること、
−少なくとも１つのアンカー配列を、このアンカー結合ドメインとハイブリダイズさせ、このアンカー配列は、核酸又はそのアナログであるものとすること、そして
−少なくとも１つの機能的実体（ＦＥ）を、この少なくとも１つのアンカー配列に連結させ、このＦＥは、１つ又はそれ以上の生物学的に活性な分子であるものとすること、
を含む、上記方法。
【請求項２３】
１つ又はそれ以上の機能的実体（ＦＥ）を利用する複合体であって、このＦＥは、細胞外で（生物内部で）、経細胞で（細胞膜を横切って）そして／又は細胞内で（細胞内部の種々の位置へ）、この複合体が分解及び／若しくは除去されることを防ぎ得るものであり、この複合体の活性を増大し得るものであり、そして／又はこの複合体の移送を増大し得るものであるとし、この複合体は、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を含み、ここでこのｓｈＲＮＡ分子は、二本鎖領域及びヘアピンループを有し、そしてこのｓｈＲＮＡ分子は、次の仕方で修飾されていること、すなわち：
−少なくとも１つのアンカー結合ドメインが、このｓｈＲＮＡ分子に組み込まれており、このアンカー結合ドメインは、核酸又はそのアナログであるものとし、
−少なくとも１つのアンカー配列が、このアンカー結合ドメインとハイブリダイズされており、このアンカー配列は、核酸又はそのアナログであるものとし、そして
−少なくとも１つの機能的実体（ＦＥ）が、この少なくとも１つのアンカー配列に連結されており、このＦＥは、１つ又はそれ以上の生物学的に活性な分子であること、
を特徴とする、上記複合体。
【請求項２４】
アンカー結合ドメインが、ｓｈＲＮＡ分子の一部である、請求項２３に記載の複合体。
【請求項２５】
アンカー結合ドメインが、１５までのヌクレオチドを含む、請求項２３に記載の複合体。
【請求項２６】
アンカー結合ドメインが、３〜１２のヌクレオチドを含む、請求項２３に記載の複合体。
【請求項２７】
アンカー結合ドメインが、４〜８のヌクレオチドを含む、請求項２３に記載の複合体。
【請求項２８】
アンカーが、固定化核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）又はそれらの誘導体である、請求項２３に記載の複合体。
【請求項２９】
ｓｈＲＮＡ分子の二本鎖領域が、３５塩基対の最大長さを有する、請求項２３に記載の複合体。
【請求項３０】
ｓｈＲＮＡ分子が、１〜１２のヌクレオチドの３’突出及び／又は５’突出を有する、請求項２３に記載の複合体。
【請求項３１】
ｓｈＲＮＡ分子が、２〜５のヌクレオチドの３’突出及び／又は５’突出を有する、請求項２３に記載の複合体。
【請求項３２】
ｓｈＲＮＡ分子は化学修飾されている、請求項２３に記載の複合体。
【請求項３３】
アンカー結合ドメインが、ｓｈＲＮＡ分子のいずれかの末端の伸長である、請求項２３に記載の複合体。
【請求項３４】
アンカー結合ドメインが、ｓｈＲＮＡ分子のヘアピンループ中に存在する、請求項２３に記載の複合体。
【請求項３５】
アンカー結合ドメインが、ｓｈＲＮＡ分子の二本鎖領域の２つの鎖のうちの１つに存在する、請求項２３に記載の複合体。
【請求項３６】
アンカー結合ドメインが、一部分はヘアピンループ中に存在し、そして一部分はｓｈＲＮＡ分子の二本鎖領域の２つの鎖のうちの１つに存在する、請求項２３に記載の複合体。
【請求項３７】
アンカー結合ドメインが、ｓｈＲＮＡ分子の二本鎖領域の他の鎖に対して１つ又はそれ以上のミスマッチを有する、請求項３５または３６に記載の複合体。
【請求項３８】
アンカー結合ドメインが、ｓｈＲＮＡ分子の二本鎖領域の他の鎖に対して１〜７のミスマッチを有する、請求項３５または３６に記載の複合体。
【請求項３９】
複合体が、少なくとも１つのＦＥと少なくとも１つのアンカー配列との間に切断可能なリンカー分子を含む、請求項２３に記載の複合体。
【請求項４０】
複合体が、少なくとも１つのＦＥと少なくとも１つのアンカー配列との間に切断可能なリンカー分子を含み、そしてこのリンカーがジスルフィド架橋を含む、請求項２３に記載の複合体。
【請求項４１】
アンカー配列が、切断可能なリンカーを含む、請求項２３に記載の複合体。
【請求項４２】
アンカー配列が、切断可能なリンカーを含み、そしてこのリンカーが、ジスルフィド架橋を含む、請求項２３に記載の複合体。
【請求項４３】
アンカー配列が、少なくとも１つのアンカー結合ドメインとともに伸長される、請求項２３に記載の複合体。
【請求項４４】
１つ又はそれ以上の機能的実体（ＦＥ）を、細胞膜を横切り、そして細胞内部の種々の位置に移送させる方法であって、ここで、請求項２３〜４３のいずれか１項に記載の複合体がトランスフェクションに使用される方法。
【請求項４５】
機能的実体（ＦＥ）を利用する複合体を作製する方法であって、このＦＥは、細胞外で（生物内部で）、経細胞で（細胞膜を横切って）そして／又は細胞内で（細胞内部の種々の位置へ）、この複合体が分解及び／若しくは除去されることを防ぎ得るものであり、この複合体の活性を増大し得るものであり、そして／又はこの複合体の移送を増大し得るものであるとし、この複合体は、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を含み、そしてこのｓｈＲＮＡ分子は、二本鎖領域及びヘアピンループを有し、ここでこの方法は、次の工程：
−少なくとも１つのアンカー結合ドメインを、このｓｈＲＮＡ分子に導入し、このアンカー結合ドメインは、核酸又はそのアナログであるものとすること、
−少なくとも１つのアンカー配列を、このアンカー結合ドメインとハイブリダイズさせ、このアンカー配列は、核酸又はそのアナログであるものとすること、そして
−少なくとも１つの機能的実体（ＦＥ）を、この少なくとも１つのアンカー配列に連結させ、このＦＥは、１つ又はそれ以上の生物学的に活性な分子であるものとすること、
を含む、上記方法。
【請求項４６】
１つ又はそれ以上の機能的実体（ＦＥ）を利用する複合体であって、このＦＥは、細胞外で（生物内部で）、経細胞で（細胞膜を横切って）そして／又は細胞内で（細胞内部の種々の位置へ）、この複合体が分解及び／若しくは除去されることを防ぎ得るものであり、この複合体の活性を増大し得るものであり、そして／又はこの複合体の移送を増大し得るものであるとし、この複合体は、ＡＳ（アンチセンス）分子を含み、ここでこのＡＳ分子は、次の仕方で修飾されていること、すなわち：
−少なくとも１つのアンカー結合ドメインが、このＡＳ分子に組み込まれているか又は結合されており、このアンカー結合ドメインは、核酸又はそのアナログであるものとし、
−少なくとも１つのアンカー配列が、このアンカー結合ドメインとハイブリダイズされており、このアンカー配列は、核酸又はそのアナログであるものとし、そして
−少なくとも１つの機能的実体（ＦＥ）が、この少なくとも１つのアンカー配列に連結されており、このＦＥは、１つ又はそれ以上の生物学的に活性な分子であること、
を特徴とする、上記複合体。
【請求項４７】
アンカー結合ドメインが、ＡＳ分子の一部である、請求項４６に記載の複合体。
【請求項４８】
アンカー結合ドメインが、１５までのヌクレオチドを含む、請求項４６に記載の複合体。
【請求項４９】
アンカー結合ドメインが、３〜１２のヌクレオチドを含む、請求項４６に記載の複合体。
【請求項５０】
アンカー結合ドメインが、４〜８のヌクレオチドを含む、請求項４６に記載の複合体。
【請求項５１】
アンカーが、固定化核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）又はそれらの誘導体である、請求項４６に記載の複合体。
【請求項５２】
アンチセンス分子が、最大長さ３５の塩基を有する、請求項４６に記載の複合体。
【請求項５３】
ＡＳ分子が化学修飾される、請求項４６に記載の複合体。
【請求項５４】
アンカー結合ドメインが、ＡＳ分子の鎖のいずれかの末端の伸長である、請求項４６に記載の複合体。
【請求項５５】
複合体が、少なくとも１つのＦＥと少なくとも１つのアンカー配列との間に切断可能なリンカー分子を含む、請求項４６に記載の複合体。
【請求項５６】
複合体が、少なくとも１つのＦＥと少なくとも１つのアンカー配列との間に切断可能なリンカー分子を含み、そしてこのリンカーが、ジスルフィド架橋を含む、請求項４６に記載の複合体。
【請求項５７】
アンカー配列が、切断可能なリンカーを含む、請求項４６に記載の複合体。
【請求項５８】
アンカー配列が、切断可能なリンカーを含み、そしてこのリンカーが、ジスルフィド架橋を含む、請求項４６に記載の複合体。
【請求項５９】
アンカー配列が、少なくとも１つのアンカー結合ドメインとともに伸長される、請求項４６に記載の複合体。
【請求項６０】
１つ又はそれ以上の機能的実体（ＦＥ）を、細胞膜を横切り、そして細胞内部の種々の位置に移送させる方法であって、ここで、請求項４６〜５９のいずれか１項に記載の複合体がトランスフェクションに使用される方法。
【請求項６１】
機能的実体（ＦＥ）を利用する複合体を作製する方法であって、このＦＥは、細胞外で（生物内部で）、経細胞で（細胞膜を横切って）そして／又は細胞内で（細胞内部の種々の位置へ）、この複合体が分解及び／若しくは除去されることを防ぎ得るものであり、この複合体の活性を増大し得るものであり、そして／又はこの複合体の移送を増大し得るものであり、そしてこの複合体は、ＡＳ（アンチセンス）分子を含み、ここでこの方法が、次の工程：
−少なくとも１つのアンカー結合ドメインを、このＡＳ分子に組み込むか又は結合させ、このアンカー結合ドメインは、核酸又はそのアナログであるものとすること、
−少なくとも１つのアンカー配列は、このアンカー結合ドメインとハイブリダイズさせ、このアンカー配列が、核酸又はそのアナログであるものとすること、そして
−少なくとも１つの機能的実体（ＦＥ）を、この少なくとも１つのアンカー配列に連結させ、このＦＥは、１つ又はそれ以上の生物学的に活性な分子であるものとすること、
を含む、上記方法。
【請求項６２】
請求項１〜２０、請求項２３〜４３及び請求項４６〜５９のいずれか１項に記載の複合体でトランスフェクトされる細胞。
【請求項６３】
１つ又はそれ以上のｓｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子又はＡＳ分子を、細胞膜を横切り（細胞内で、細胞外で及び／又は経細胞で）、そして細胞内部の種々の位置へ移送し得る複合体を生産する構成要素を含むキットであって、このキットが、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子及び／又はＡＳ分子、少なくとも１つのアンカー結合ドメイン、このアンカー結合ドメインとハイブリダイズし得る少なくとも１つのアンカー配列、並びにこのアンカー結合ドメインに連結した少なくとも１つの機能的実体（ＦＥ）を含み、このＦＥが、１つ又はそれ以上の生物学的に活性な分子である、上記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の修飾、そして特に短い干渉（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡ及びショートヘアピン型（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ）ＲＮＡ並びにアンチセンス活性を有するオリゴヌクレオチドをインビトロ及びインビボで特異的に送達するための修飾に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、遺伝子発現が、サイレンシングされる遺伝子に相同な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって引き起こされるプロセスによって、抑制される現象である。ＲＮＡｉは自然に備わった機構であり、これはまた、遺伝子機能に関する情報の提供に使用され得、そして多くの生物に対して有用な研究ツールとなっている。遺伝子に基づいた治療としてのＲＮＡｉの使用は、特にウイルス感染、癌及び遺伝性の遺伝子障害において広範に研究されている。
【０００３】
阻害は、標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡの特異的分解によって引き起こされる。ｄｓＲＮＡは、より短い単位（短い干渉ＲＮＡ；ｓｉＲＮＡと呼ばれる）への切断によってプロセシングされ、これは、相同な標的ｍＲＮＡの認識及び標的化切断を導く。
【０００４】
代表的には、各々の３’末端に２つのヌクレオチド突出を有する２１マーのｄｓＲＮＡが、ＲＮＡレベルを減少させることによってタンパク質産生をダウンレギュレートし得ることを示した。この機構は、完全には理解されていないし、デザイン戦略も行われていない。しかし一般的なデザインルールは、サイレンシングを増大させるための両方の鎖の化学修飾とともに与えられている。
【０００５】
ｓｉＲＮＡは、合成ｓｉＲＮＡとして又はＲＮａｓｅ  ＩＩＩファミリーの酵素であるダイサー（Ｄｉｃｅｒ）によって後に切断される（図１の工程１）プラスミド発現性のより長い二本鎖ＲＮＡとしてのいずれかで細胞に導入され得る。ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＮＡ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ））複合体は、好ましくは５’末端の最も低いΔＧ（ギブズ自由エネルギー）を有する鎖に結合する。このｓｉＲＮＡ／ＲＩＳＣ複合体は、引き続いて標的化ＲＮＡを局在化させ、そしてこのアンチセンス鎖がその標的化ＲＮＡとハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションの際に、このｓｉＲＮＡ／ＲＮＡ構造が細胞によって認識され、そして標的化ＲＮＡが切断される。
【０００６】
ｓｉＲＮＡはまた、転写レベルで遺伝子発現を抑制し得る。この機構は完全には理解されていないが、プロモーターのＣｐＧ島に標的化されたｓｉＲＮＡが、細胞でのＤＮＡメチル化及びヒストンメチル化を誘導し得ることが示されている。同じタイプのデザインのｓｉＲＮＡが、転写的遺伝子サイレンシング及び転写後サイレンシングに使用され得る。Ｋａｗａｓａｋｉ  Ｈら、Ｎａｔｕｒｅ、２００４  Ｓｅｐ  ９；４３１（７００５）：２１１−２１７。
【０００７】
上述したように、ｓｉＲＮＡは、合成ｓｉＲＮＡとして又はプラスミド発現性のより長い二本鎖ＲＮＡとしてのいずれかで細胞に導入され得る。合成ｓｉＲＮＡで開始させるとき、ダイサー複合体による切断は必要ない。開始させるのに最も小さな分子は、各々の３’末端に２つのヌクレオチド突出を有する代表的には２１マーの二本鎖ＲＮＡの合成である。ダイサーによる消化が、ＲＩＳＣにｓｉＲＮＡを送り、従ってＲＮＡｉ効率を増大させると考えられるけれども、小さな分子は、インビボで細胞に入る可能性がより高い。受容体媒介性のエンドサイトーシスを通じて入るようにするためのリガンドとして生物学的に活性な分子を利用することは、特に生物学的に活性な分子をわずかのみ使用する場合には、一般に小さな複合体でより容易である。
【０００８】
ｓｉＲＮＡは、細胞に容易に取り込まれない。標的細胞の外側の細胞内部の移送、細胞膜を横切った移送及び／又は標的細胞内部の移送を増大させる複合体は、この新規なテクノロジーの有用性を大いに高める。
【０００９】
ＷＯ  ００／１５８２４は、生物学的膜を横切った核酸の移送、及び細胞内部でのこの核酸の特異的局在化のための方法及び複合体、バイオプレックス（Ｂｉｏｐｌｅｘ）を開示している。この方法は、機能的要素（本明細書では、ＦＥ及び機能的実体ともいう）及び結合要素（本明細書でアンカーという）から構成された合成の輸送実体を使用することに基づく。この機能的要素は例えば、特異的な生物学的機能をこれに結合した分子に付与する核局在化シグナル（ＮＬＳ）であり得る。生体膜と接触して、この輸送実体は、目的の核酸が生体膜を通して移送するのに備える。
【００１０】
ＷＯ  ０３／０９１４４３はさらに、安全性、機能性、効率性及び安定性に関してＷＯ  ００／１５８２４のバイオプレックステクノロジーを改善する。ＷＯ  ０３／０９１４４３に開示される輸送実体は、生物系に使用する前、膜表面で、又は膜を通過した後若しくは細胞に取り込まれた後に、制御様式で改変され得、そして改変されたときにこの輸送実体の性質を変化させる少なくとも１つの改変部位を含む。ＷＯ  ０３／０９１４４３はまた、生体膜を通しての輸送実体の移送方法、及び／又は細胞内部の特定の位置へのその指令方法に関する。
【００１１】
ｓｉＲＮＡの有効性を改変又は改善するために、ｓｉＲＮＡを修飾するいくつかの試みが提案されている。改善されたｓｉＲＮＡ二重鎖によるＲＮＡｉ活性の増強が、ＨｏｈｊｏｈによってＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５５７（２００４）１９３−１９８頁に記載された。種々のｓｉＲＮＡ二重鎖を、Ｐ．ルシフェラーゼ遺伝子に対して構築し、そしてＰ．ルシフェラーゼの発現抑制に対するこの二重鎖の効果を、Ｐ．ルシフェラーゼ遺伝子を保有するｐＧＬ３−コントロールプラスミド、及びＨｅＬａ細胞へのコントロールとしてＲ．ルシフェラーゼ遺伝子を保有するｐｈＲＬ−ＴＫ−プラスミドでこの二重鎖を同時トランスフェクションすることによって試験した。ｓｉＲＮＡ二重鎖のセンス鎖の３’末端に導入された１〜４のミスマッチは、培養哺乳動物細胞中で、通常のｓｉＲＮＡ二重鎖を超えてＲＮＡｉ活性を増強することを示した。
【００１２】
同様に、ＷＯ  ０３／０６４６２１は、１つ又はそれ以上のミスマッチが、ｓｉＲＮＡ二重鎖の全長に沿って導入され得ることを記載している。このミスマッチ塩基は、ｍＲＮＡ標的に対するアンチセンス鎖の結合親和性を減少させないように、ｓｉＲＮＡのセンス鎖に存在すべきである。ＷＯ  ０３／０６４６２１の記述に従って、この開示された方法によって生産されたｓｉＲＮＡは、以前利用可能なｓｉＲＮＡよりも著しく強力であった。
【００１３】
Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋら、Ｎａｔｕｒｅ、第４３２巻  （２００４）１７３−１７８頁は、ピロリジンリンカーによってｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端へコレステロールが接合し、それによって共有結合、すなわち不可逆的な結合を生成することを示した。この化学修飾されたｓｉＲＮＡは、肝臓及び空腸においてａｐｏＢ  ｍＲＮＡのサイレンシングを生じさせ、ａｐｏＢタンパク質の血漿レベルを減少させ、そして総コレステロールを減少させた。Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋらに従って、この修飾は、細胞培養物中で遺伝子サイレンシング活性を著しく低下させなかった。
【００１４】
コレステロールは、幾分非特異的な組織取り込みを生じさせる。一方、コレステロールは内因性物質なので、免疫応答を惹起する危険性が存在しない。大きな分子、例えばタンパク質は、特にそれらが微生物から誘導される場合、免疫応答を惹起することが公知である。再投与の可能性を考慮しなければならない。ｓｉＲＮＡに化学的に接合したより大きな分子を有することの別の難点は、この分子がＲＩＳＣからｓｉＲＮＡを遮蔽しかねないということである。
【００１５】
化学的に連結することによって、ｓｉＲＮＡにタンパク質及び他の生物学的に活性な分子を付加することは、多くの労力を必要とすることになる。いくつかのエンドソーム経路は、多数の受容体−リガンド相互作用に依存している。共有結合化学を用いる、ｓｉＲＮＡとのコンビナトリアルリガンド取り込みの研究は、時間がかかる上に極めて柔軟性が低い。ｓｉＲＮＡを効率よく送達するために多数の閾値が存在するので、１を超える生物学的に活性な分子が必要とされかねない。この送達の経路選定（ｒｏｕｔｉｎｇ）における特定タスクには、比活性が必要である。
【００１６】
共有結合の接合はまた、ｓｉＲＮＡ配列の選択において極めて柔軟性が低い。同一のＲＮＡを標的化するｓｉＲＮＡの混合物は、時折単一のｓｉＲＮＡよりも強力である。引き続いて、共有結合の接合は、あらゆるｓｉＲＮＡ配列に対して行う必要がある。同一の生物学的に活性な分子が、別のセットアップ、すなわち別のＲＮＡを標的化するｓｉＲＮＡの新規なセットに使用しようとする場合、すべてのｓｉＲＮＡを別々に接合させなければならない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、ＷＯ  ００／１５８２４及びＷＯ  ０３／０９１４４３に記載されたプラスミドベースのテクノロジーを利用し及び修飾することによってこれらの問題を回避し、そして従来のＲＮＡ合成後にｓｉＲＮＡ／ショートヘアピンＲＮＡ分子に機能を付加する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、１つ又はそれ以上の機能的実体（ＦＥ）を利用する複合体であって、このＦＥが、細胞外で（生物内部で）、経細胞で（細胞膜を横切って）そして／又は細胞内で（細胞内部の種々の）、この複合体が分解及び／若しくは除去されることを防ぎ得るものであり、この複合体の活性を増大し得るものであり、そして／又はこの複合体の移送を増大し得るものである複合体に関する。この複合体は、ｓｉＲＮＡ分子を含み、ここでこのｓｉＲＮＡ分子は、第一の鎖及び第二の鎖を含み、そしてこのｓｉＲＮＡ分子は、次の仕方で：
−少なくとも１つのアンカー結合ドメインが、このｓｉＲＮＡ分子の２つの鎖のうちの１つに組み込まれるか又は結合されており、このアンカー結合ドメインは、核酸又はそのアナログであること、
−少なくとも１つのアンカー配列が、このアンカー結合ドメインとハイブリダイズされており、このアンカー配列は、核酸又はそのアナログであること、及び
−少なくとも１つの機能的実体（ＦＥ）が、この少なくとも１つのアンカー配列に連結されており、このＦＥが、１つ又はそれ以上の生物学的に活性な分子であること、
で修飾される。
【００１９】
本発明の別の実施態様において、ショートヘアピンＲＮＡが、ｓｉＲＮＡと同様に修飾される。
【００２０】
なお別の実施態様において、本発明は、ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡと同様の様式で修飾されているアンチセンス（ＡＳ）分子に関する。
【００２１】
本発明はまた、細胞外で（生物内部で）、経細胞で（細胞膜を横切って）そして／又は細胞内で（細胞内部の種々の位置へ）、この複合体が分解及び／若しくは除去されることを防ぎ、この複合体の活性を増大し、そして／又はこの複合体の移送を増大するための複合体の生産方法及び生体膜を横切った複合体の移送方法に関する。
【００２２】
本発明は、以下の明細書中で、そして本明細書によってその全体が組み込まれた添付の一連の特許請求の範囲によって定義される。
【００２３】
本明細書及び特許請求の範囲において、以下の用語及び略語が使用される。
【００２４】
用語「機能的実体」（ＦＥ）は、それに連結した分子に、１つ又はそれ以上の特異的性質及び／又は生物学的機能を付与し得る任意の部分である生物学的に活性な分子をいう。非限定的な例として、本発明の複合体（又は任意の他の分子）に結合したＦＥは、作用部位からの複合体の分解及び／又は複合体の除去（クリアランス）を防ぎ得るものであり、これは、この複合体の活性を増大、すなわち遺伝子のダウンレギュレーションを増大し、そして／又は作用部位への複合体の移送を増大し得るものである。ＦＥの作用様式は、細胞外で（生物内部で）、経細胞で（細胞膜を横切って）そして／又は細胞内で（細胞内部の異なる位置へ）もたらされ得る。
【００２５】
「アンカー」又は「アンカー配列」は、好ましくはハイブリダイゼーションによって、その特定の標的に特異的かつ場合により可逆的に結合し得る任意の天然又は合成された核酸、核酸誘導体又は核酸アナログであり得る。アンカーの非限定的な例は、以下に記載されるＰＮＡ及びＬＮＡである。
【００２６】
「アンカー結合領域」又は「結合領域」は、アンカーに対応する特異的な領域であり、そして好ましくはハイブリダイゼーションによって、その特定のアンカー配列に特異的かつ場合により可逆的に結合し得る任意の天然又は合成された核酸、核酸誘導体又は核酸アナログであり得る。
【００２７】
「リンカー」（Ｌ）は、例えばＦＥ及びアンカーを連結する任意の化学切断可能な構造であり得る。切断可能なリンカーはまた、このアンカー配列又はＦＥ配列に包含され得る。好ましくはこのリンカーは、ＦＥの化学的／生化学的相互作用に関与しない。このリンカーは、好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又は天然若しくは合成された核酸ポリマーに類似するが、また任意の好適な合成ポリマー又は天然のポリマーであり得る。
【００２８】
「ＰＮＡ」は、ペプチド核酸の頭字語であり、これは、メチレンカルボニルリンカーを介して核酸塩基が結合したアミノエチルグリシン単位からなる偽ペプチド骨格を有するＤＮＡ模倣物である。ＰＮＡ分子は、相補的なｓｓＤＮＡ標的、ｄｓＤＮＡ標的、ＲＮＡ標的、ＰＮＡ標的並びに他のワトソン・クリック型及び／又はフーグスティーン型塩基対形成したオリゴヌクレオチド標的とハイブリダイズし得る。負電荷のＤＮＡと対照的に、ＰＮＡの中性骨格は、高い特異性を減少させることなく強力な結合をもたらす。ＰＮＡは本来ＡＳ目的で使用されたが、他分野への適用が見出された。本出願において、用語「ＰＮＡ」が、上記の骨格及び核酸塩基を含む任意のＤＮＡアナログを指し、従ってこの用語が、本明細書中に開示される特定の構造に限定されないことは勿論である。
【００２９】
「ＬＮＡ」は、固定化核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）の頭字語であり、これはまたＤＮＡ模倣物である。固定化核酸（ＬＮＡ）塩基は、リボフラノース環の２’酸素位と４’炭素位との間に架橋したメチレン炭素を含む。この制約が、オリゴヌクレオチド骨格を事前に構造化させ（ｐｒｅｏｒｇａｎｉｚｅｄ）、そして１つのＬＮＡ塩基置換当たりＴm値を１０℃増大させ得る。ＬＮＡは、ワトソン・クリック型塩基対形成に関しては天然の核酸に類似している。ＬＮＡ塩基は、標準的なＤＮＡ／ＲＮＡ合成プロトコルによって導入されるので、ＬＮＡは、純粋なＬＮＡオリゴマー又は混合性のＬＮＡ／ＤＮＡ／ＲＮＡオリゴマーとして合成され得る。さらにＬＮＡは、相補的核酸との結合が極めて効率的であり、そしてインビトロ及び培養哺乳動物細胞において有効なアンチセンス剤であり、そしてまた、おとり、アプタマー、ＬＮＡザイム（ＬＮＡｚｙｍｅ）及びＤＮＡ修正剤として有効であることが実証されている。本出願において、用語「ＬＮＡ」が、上記の骨格及び核酸塩基を含む全てのＤＮＡアナログを指し、従ってこの用語が、本明細書中に開示される特定の構造に限定されないことは勿論である。
【００３０】
用語「ハイブリダイズする」は、核酸又はその任意の誘導体若しくはアナログの相補的塩基の塩基対形成による全ての結合形成又は二重鎖形成をいう。
【００３１】
用語「ヘアピンループ」は、ＲＮＡの二重鎖構造領域を指し、同一鎖上の隣接又は近接した相補的配列間の塩基対形成によって形成され、この配列の間にある不対塩基が、一本鎖ループ（ヘアピンループ）を形成する。ヘアピンループはまた、ＤＮＡ及び他のワトソン・クリック型塩基対形成したオリゴヌクレオチドで形成され得る。
【００３２】
本発明は、ＲＮＡｉ活性を有する分子を最低限修飾することにより、ＲＮＡｉに送達及び特異性に関する機能を付加するための複合体及びこのような複合体の作製方法に関する。この修飾分子は、ＲＮＡｉ活性に影響を及ぼさないか、又はＲＮＡｉ活性を強力に増大させる。種々の機能的実体は、二本鎖ＲＮＡ分子の２つの鎖のうちのいずれか１つに、配列特異的様式でワトソン・クリック型塩基対形成によって、ＤＮＡアナログを通じて固着される。好ましくはこのＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ分子又はｓｈＲＮＡ分子である。類似のアプローチで、本発明はまた、アンチセンス（ＡＳ）活性を有する分子を最低限修飾することにより、アンチセンステクノロジーに送達及び特異性に関する機能を付加する方法を提供する。
【００３３】
さらに本発明は、機能的実体の選択によって改変されたｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ送達のプラットフォームに関する。機能的実体は、ＤＮＡアナログアンカーを通じてｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ分子に付加される。ｓｉＲＮＡに機能的実体を直接化学的に連結させることは、任意の組み合わせで適合性のある、種々のｓｉＲＮＡと種々の機能的実体とを組み合わせたモジュールセットアップを作製する可能性に制約を加える。本発明の複合体の種々の成分は別々に合成され、そして例えば、レポーター遺伝子のサイレンシングを内因性遺伝子に適用する場合は、ｓｉＲＮＡの標準的な合成しか必要としない。非限定的な例として、機能的実体は、ｓｉＲＮＡがｍＲＮＡ特異的でありながら組織特異的であり得る。
【００３４】
本発明の一実施態様は、１つ又はそれ以上の機能的実体（ＦＥ）を利用する複合体であって、このＦＥが、細胞外で（生物内部で）、経細胞で（細胞膜を横切って）そして／又は細胞内で（細胞内部の種々の位置へ）、この複合体が分解及び／若しくは除去されることを防ぎ得るものであり、この複合体の活性を増大し得るものであり、そして／又はこの複合体の移送を増大し得るものである複合体に関する。この複合体は、ｓｉＲＮＡ分子を含み、ここでこのｓｉＲＮＡ分子は、第一の鎖及び第二の鎖を含み、そしてこのｓｉＲＮＡ分子は、次の仕方で、すなわち：
−少なくとも１つのアンカー結合ドメインが、このｓｉＲＮＡ分子の２つの鎖のうちの１つに組み込まれるか又は結合され、このアンカー結合ドメインが、核酸又はそのアナログであること、
−少なくとも１つのアンカー配列が、このアンカー結合ドメインとハイブリダイズされ、このアンカー配列が、核酸又はそのアナログであること、及び
−少なくとも１つの機能的実体（ＦＥ）を、この少なくとも１つのアンカー配列に連結され、このＦＥが、１つ又はそれ以上の生物学的に活性な分子であること、
で修飾される。
【００３５】
ｓｉＲＮＡ分子に基づいた複合体に関する本発明の実施態様において、用語「この複合体の活性の増大」は、ＲＮＡｉ活性の増大（すなわち、遺伝子サイレンシング効果）を指す。
【００３６】
ｓｉＲＮＡ分子は、突出を有するか又は有さない最大長さおよそ３５の塩基対を有する二本鎖ＲＮＡ又はそのアナログであるべきである。好ましくはこのｓｉＲＮＡは、長さ１５〜３０の塩基対であり、そしてより好ましくは、長さ１７〜２５の塩基対である。この二本鎖ｓｉＲＮＡ分子の３’末端及び／又は５’末端のうちの少なくとも１つが、アンカーの結合ドメインとして選択される。このアンカー結合ドメインの長さは、アンカーの配列及び熱力学によって決定される。このアンカー結合ドメインの典型的な長さは、およそ１５ヌクレオチドまで、好ましくはおよそ３〜１２ヌクレオチド、そしてより好ましくはおよそ４〜８ヌクレオチドである。
【００３７】
アンカー結合ドメインのヌクレオチドは、オリジナルのｓｉＲＮＡ分子内にあっても、又は選択された鎖の２つの末端のうちのいずれか１つの伸長として存在してもよい。本発明の一実施態様において、このアンカー結合ドメインは、ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖に組み込まれ、そして別の実施態様においては、このアンチセンス鎖に組み込まれる。
【００３８】
図２は、本発明の複合体の一実施態様、並びにこのような複合体の構成方法、及びｓｉＲＮＡ分子に導入されたアンカー結合ドメインへのアンカーの結合を示す。
【００３９】
通常のｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖は、ＲＩＳＣを動員すると示唆されているので、アンカー結合ドメインとしてセンス鎖の３’末端を選択することは有利であり得る。次いでこのＲＩＳＣは鎖を解離し、そしてこのアンチセンス鎖を妥当な標的ＲＮＡ又はＤＮＡへ送る。研究により、ＲＩＳＣは、ΔＧに関して最も弱いｓｉＲＮＡの末端を優先的に攻撃し、そしてその５’末端が開いたどの鎖にでも結合することが示されている。アンカーが、センス鎖の３’末端にハイブリダイズするとき、ＲＩＳＣは、アンチセンス鎖の５’末端に結合する。
【００４０】
アンカーのハイブリダイゼーション効率をさらに増大させるために、アンカー結合ドメインのヌクレオチドは、第二の鎖に対して１つ又はそれ以上のミスマッチを有し得る。ミスマッチを導入することによって、アンカーと、アンカー結合ドメインを有さないＲＮＡ分子鎖との間の競合が減少され得る。好ましくは、このアンカー結合ドメインのヌクレオチドは、他の鎖に対して１〜７のミスマッチを有し得、そして好ましくは、２〜５のミスマッチを有し得る。
【００４１】
本発明の一実施態様において、アンカー結合ドメインとのアンカーのハイブリダイゼーションは可逆的である。アンカー結合ドメインとアンカーとの間のワトソン・クリック型塩基対形成は、塩基間の水素結合に基づく。所望であれば、アンカーの長さを減少させることによって、細胞内プロセシングの間にアンカーを脱離させることが可能である。他の分子と結合が競合しないときには、この結合親和性は、生理学的条件でｓｉＲＮＡ−アンカー−ＦＥの安定なハイブリッドを形成するに十分高い。しかし、ｓｉＲＮＡと親和性を有するタンパク質及び他の分子は、これらの弱い結合と競合し、アンカー−ＦＥ複合体の解放を導く。生物学的に活性な分子がＲＮＡ分子に直接共有結合で連結すると、この不安定性はなくなり、そして遺伝子サイレンシングに必要な相互作用をおそらく妨げる。
【００４２】
非限定的な例において、このアンカー結合ドメインは７塩基であり、このセンス鎖の３’末端は、選択された１つの塩基とともに伸長されている。従ってこのアンカー結合ドメインは、二重鎖内の４塩基及び３塩基の突出から構成される。アンカー結合ドメインとアンカーとの間のハイブリダイゼーション効率をさらに増大させるために、ミスマッチが優先的に導入されて、アンチセンス鎖とアンカーとの間の競合を減少又は排除する。
【００４３】
アンカーは、アンカー結合ドメインとハイブリダイズし得る任意の核酸又はそのアナログであり得る。一実施態様において、アンカーは、リボフラノース環内の２’と４’との間に架橋を有して、Ｃ３’−エンド／Ｎ型糖コンホメーションを安定化する。このようなアンカーは、ワトソン・クリックモデル又はフーグスティーンモデルに従ってＲＮＡと塩基対を形成するときに、高められた熱安定性を有する。短いアンカーが好ましいので（最大１５塩基）、Ｔｍは、選択されたアンカーの重要な性質である。好適なアンカーの例としては、固定化核酸（ＬＮＡ）、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋した核酸（ＥＮＡ）、架橋化核酸（ＢＮＡ）又はそれらのアナログが挙げられるがこれらに限定されない。完全に異なった骨格を有する他の候補は、デオキシリボ核グアニジン（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ｇｕａｎｉｄｉｎｅ）（ＤＮＧ）、モルホリノオリゴ及びペプチド核酸（ＰＮＡ）であり、これはまた配列特異的な塩基対形成を示す。インターカレーターがまた、好ましくはＤＮＡアナログと組み合わせて使用されて、結合親和性を増大し得る。インターカレーターの例は、インターカレート核酸（ＩＮＡ）及びアクリジンである。
【００４４】
本発明の特定の一実施態様において、ＬＮＡがアンカー配列として使用される。生理学的条件において、７塩基のみが、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）との安定なハイブリッド形成に必要とされる。このセンス鎖は、センス鎖の３’末端に位置する結合領域内のアンチセンス鎖に対してミスマッチである。この結合ドメインは、３塩基の突出及び二本鎖中に４塩基を含む。
【００４５】
本発明の一実施態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、およそ１〜１２のヌクレオチド、好ましくはおよそ２〜５のヌクレオチドの３’突出及び／又は５’突出を有する。
【００４６】
本発明のなお別の実施態様において、ｓｉＲＮＡ分子は化学修飾される。センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の化学修飾の例としては、１つ又はそれ以上の２’−Ｏ−メチル修飾化ピリミジンヌクレオチド、１つ又はそれ以上の２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾化ピリミジンヌクレオチド及び５’末端又は３’末端の少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結が挙げられるがこれらに限定されない。任意の突出を含むｓｉＲＮＡ分子のさらなる化学修飾は、当業者にとって常用の手順であり、そして明白である。
【００４７】
少なくとも１つの機能的実体（ＦＥ）が、アンカーに連結される。バイオプレックス特許（ＷＯ  ００／１５８２４、これは、全ての図面を含めその全体が、参照によって本明細書に組み込まれる）に記載される通り、ＦＥは、任意のアミノ酸ペプチド、炭水化物、脂質、核酸又は生物学的活性を有する他の分子、及びそれらの組み合わせであり得、任意の数の機能、例えば限定されないが構造的機能（例えば細胞膜の標的分子への結合）又は酵素的機能を与える。より具体的で非限定的な例は、細胞付着機能（例えば、ポリカチオン性ＦＥとの静電引力）、細胞インターナリゼーション（例えば、トランスフェリン、トリペプチドＲＧＤ、ＴＡＴ、トランスポータン（ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ）及び他の細胞膜透過性（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ）ペプチド（ＣＰＧ））、エンドソームエスケープ（融合タンパク質、例えばＨＡ２）並びに翻訳後の遺伝子サイレンシングの場合には核輸送（例えば、核局在化シグナル）である。より具体的には、肝臓取り込みについては、３つのアンテナ状のＮ−アセチル化ガラクトースアミンが、アシアロ糖タンパク質受容体を通じた肝細胞への取り込みに使用され得る。
【００４８】
本発明の別の実施態様において、ｓｈＲＮＡ分子は、本発明の複合体に使用され得る（図３を参照のこと）。ｓｈＲＮＡは、タイトなヘアピンループを作るＲＮＡの短い配列であり、そして遺伝子発現をサイレントにするために使用され得る。ｓｈＲＮＡは、通常８０ヌクレオチドより短く、好ましくは５０を超えない長さのヌクレオチドであり、そしてより好ましくは３５を超えない長さのヌクレオチドであり、ヘアピンループは、およそ２〜１２のこれらのヌクレオチドから構成される。
【００４９】
ダイサーは、二本鎖ＲＮＡに類似の様式でｓｈＲＮＡを認識し、そしてこれを予測可能な位置で切断し、代表的には３’末端に２塩基の突出を有する１９〜２２の塩基対の短い二本鎖ＲＮＡを生成する。次いでＲＩＳＣは二重鎖を分離し、そして鎖の一方と結合する。この機構は、ヘアピンループの存在を除いて図１に示される。ダイサーの活性がｓｉＲＮＡへのＲＩＳＣの動員を増強し、それによって遺伝子サイレンシングの効率を増大することが示唆されている。
【００５０】
ｓｈＲＮＡ配列を修飾することにより、特異性及び機能性が、ｓｉＲＮＡ分子と同様の様式でｓｈＲＮＡに付加され得る。ｓｉＲＮＡに適用されるのと同じ技術が、ヘアピンループの修飾に使用されて、アンカー結合ドメインとして作用し得る。ダイサーは、予測可能な位置でｓｈＲＮＡを切断するので、このヘアピン（デザイン如何によりおそらく付加的な塩基に沿って）は切り離され、そしてこれは遺伝子サイレンシングプロセスの一部ではない。従って、遺伝子サイレンシングプロセスの部分であるべき配列は、完全にマッチしたまま残され得るか、又は変異したまま、ミスマッチしたまま若しくは他の方法でデザインされたまま残され得る。
【００５１】
従って、本発明の一実施態様は、１つ又はそれ以上の機能的実体（ＦＥ）を利用する複合体であって、このＦＥが、細胞外で（生物内部で）、経細胞で（細胞膜を通して）そして／又は細胞内で（細胞内部の種々の位置へ）、この複合体が分解及び／若しくは除去されることを防ぎ得、この複合体の活性を増大し得、そして／又はこの複合体の移送を増大し得る複合体に関する。この複合体は、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を含み、ここでこのｓｈＲＮＡ分子は、二本鎖領域及びヘアピンループを有し、そしてこのｓｈＲＮＡ分子は、次の仕方、すなわち：
−少なくとも１つのアンカー結合ドメインが、このｓｈＲＮＡ分子に組み込まれており、このアンカー結合ドメインは、核酸又はそのアナログであること、
−少なくとも１つのアンカー配列が、このアンカー結合ドメインとハイブリダイズされており、このアンカー配列は、核酸又はそのアナログであること、及び
−少なくとも１つの機能的実体（ＦＥ）が、この少なくとも１つのアンカー配列に連結されており、このＦＥが、１つ又はそれ以上の生物学的に活性な分子であること、
で修飾される。
【００５２】
ｓｈＲＮＡ分子に基づいた複合体に関する本発明の実施態様において、用語「この複合体の活性の増大」は、ＲＮＡｉ活性の増大を指す。
【００５３】
アンカー結合ドメインの長さは、アンカーの配列及び熱力学によって決定される。このアンカー結合ドメインの典型的な長さは、およそ１５ヌクレオチドまで、好ましくはおよそ３〜１２ヌクレオチド、そしてより好ましくはおよそ４〜８ヌクレオチドである。
【００５４】
ｓｈＲＮＡのヘアピンループは、いかなる修飾も受けずにアンカー結合ドメインとして使用され得るか、又はヘアピンは、利用できるアンカー配列に対して任意の好適な配列に変更され得る。ループの一部のみ又はループ全体がアンカー結合ドメインとして使用され得るが、このアンカー結合ドメインはまた、部分的に二本鎖領域中及び部分的にヘアピンループ中に存在し得るか、又は二本鎖領域に完全に組み込まれ得る。さらにこのアンカー結合ドメインは、ｓｈＲＮＡの３’末端及び／若しくは５’末端に位置し得るか、又はｓｈＲＮＡの二本鎖領域のどこにでも位置し得る。従って、このアンカー結合ドメインは、ｓｈＲＮＡ分子の一部であり得るが、またｓｈＲＮＡ分子のいずれかの末端の伸長であり得る。好ましくは、ｓｈＲＮＡの二本鎖領域内にアンカー結合ドメインを有するとき、ミスマッチが、ｓｉＲＮＡに記載されたとおりに導入されるべきである。
【００５５】
本発明の一実施態様において、ｓｈＲＮＡ分子は、およそ１〜１２のヌクレオチド、好ましくはおよそ２〜５のヌクレオチドの３’突出及び／又は５’突出を有する。このｓｈＲＮＡ複合体はまた、ｓｉＲＮＡ分子に記載されたとおりに化学修飾され得る。
【００５６】
ｓｉＲＮＡに基づいた本発明の複合体について記載されたアンカー、アンカー結合ドメイン及びＦＥのさらなる特徴はまた、ｓｈＲＮＡに基づいた本発明の複合体に適用される。
【００５７】
図３は、本発明のｓｈＲＮＡの修飾についての非限定的な例の概略図を示す。このｓｈＲＮＡは、ダイサーによってｓｉＲＮＡに切断される。従って、ヘアピンループ及び隣接する塩基が、矢じり形で示されるように除去される。従って、切り離される領域は、結合ドメインとして作用するように修飾され得る。
【００５８】
ＲＮＡｉに加えて、本発明はまた、アンチセンステクノロジーに適用され得る。混同する危険性を減らすために、技術としてのアンチセンスを「ＡＳ」と表し、ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡの成分としてのアンチセンス鎖は、今まで通り「アンチセンス」と表す。
【００５９】
ＡＳは、サイレンシングしようとすうる遺伝子のＲＮＡに結合するようにデザインされた一本鎖のＤＮＡオリゴヌクレオチド（又はそのアナログ）である。作用因は、この場合ＲＮＡを消化することではなく、単にハイブリッド形成し、そしてＲＮＡのさらなるプロセシングを妨げることである。特定の状況において、ＡＳは、ＤＮＡの代わりに一本鎖ＲＮＡから構成され、結果としてＲＮアーゼによるｄｓＲＮＡの認識によってＲＩＳＣ非依存的に標的ＲＮＡを分解する。ＡＳはまた、ｓｉＲＮＡと同様の方法でＤＮＡメチル化及びヒストンメチル化を行い得、従って、標的はまたおそらくＤＮＡである。
【００６０】
従って別の実施態様において、本発明は、１つ又はそれ以上の機能的実体（ＦＥ）を利用する複合体であって、このＦＥは、細胞外で（生物内部で）、経細胞で（細胞膜を横切って）そして／又は細胞内で（細胞内部の種々の位置へ）、この複合体が分解及び／若しくは除去されることを防ぎ得るものであり、この複合体の活性を増大し得るものであり、そして／又はこの複合体の移送を増大し得るものである複合体に関する。この複合体は、アンチセンス（ＡＳ）分子を含み、ここでこのＡＳ分子は、次の仕方で、すなわち：
−少なくとも１つのアンカー結合ドメインが、このＡＳ分子に組み込まれているか又は結合されており、このアンカー結合ドメインは、核酸又はそのアナログであるものとし、
−少なくとも１つのアンカー配列が、このアンカー結合ドメインとハイブリダイズされており、このアンカー配列は、核酸又はそのアナログであるものとし、そして
−少なくとも１つの機能的実体（ＦＥ）が、この少なくとも１つのアンカー配列に連結されており、このＦＥが、１つ又はそれ以上の生物学的に活性な分子であること、
で修飾される。
【００６１】
ＡＳ分子に基づいた複合体に関する本発明の実施態様において、用語「この複合体の活性の増大」は、遺伝子サイレンシング効果の増大を指す。
【００６２】
ＡＳ分子の長さは、通常およそ１５〜３５ヌクレオチドであり、そして好ましくはおよそ１７〜２５ヌクレオチドである。アンカー配列は、ＡＳに結合するよう選択されるか、又はＡＳ配列の伸長に結合するよう選択されるかのいずれかであり得、すなわちアンカー結合ドメインは、任意の位置でＡＳ分子の一部であり得るか、又はＡＳ分子のいずれかの末端での伸長であり得る。
【００６３】
ＡＳ分子のアンカー結合ドメインの長さは、アンカーの配列及び熱力学によって決定される。このアンカー結合ドメインの典型的な長さは、およそ１５ヌクレオチドまでであり、好ましくはおよそ３〜１２ヌクレオチド、そしてより好ましくはおよそ４〜８ヌクレオチドである。短いアンカー結合ドメイン及びアンカー配列を有することにより、ＡＳがその標的（例えばＲＮＡ）とハイブリダイズするとＦＥを特異的に解放する。このＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドは、このＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中でハイブリダイズしている塩基対の数がより多いために、アンカー−ＡＳを超える融解温度を有する。この短いアンカーは弱すぎるので、例えば染色体ＤＮＡに干渉できない。アンカー配列又は標的領域に対するミスマッチは、アンカー結合ドメイン中に導入されない。しかし、アンカー結合ドメインがＡＳの伸長であるとき、このアンカー結合ドメインは、ＲＮＡに対してミスマッチされ得る。ミスマッチは、標的ＲＮＡとのハイブリダイゼーションの際にアンカーの制御解放をおそらく生じさせない。
【００６４】
ＡＳ分子とハイブリダイズするアンカー配列及びこのアンカー配列に結合したＦＥの特徴は、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡを含む実施態様についての特徴と同じである。
【００６５】
ｓｉＲＮＡ分子及びｓｈＲＮＡ分子と同様に、ＡＳ分子は化学修飾され得る。ＡＳ分子の化学修飾は、当業者にとって常用の手順であり、そして明白である。
【００６６】
図４は、ＡＳ  バイオプレックスの概略的で限定されない説明図であり、ＡＳ分子が標的と結合する際にＦＥを解放する。
【００６７】
本発明のなお別の実施態様において、アンカー及び／又はＦＥは、切断可能なリンカーの導入を通じて本発明の複合体（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はＡＳに基づいた複合体）から解放され得る。従って、ＲＩＳＣがＦＥ又はアンカーによって阻害されるときには、この問題は、複合体に挿入されたリンカーを切断することによって解決し得る。切断可能なリンカーの種々の変異体が存在する（全ての図面を含みその全体が、参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ  ０３／０９１４４３の開示をまた参照のこと）。
【００６８】
この切断可能なリンカー分子は、ＦＥとアンカー配列との間に導入され得るか、又は場合によりアンカー配列内に導入され得る。
【００６９】
使用され得るリンカーの１つの限定されない例は、ジスルフィド架橋である。ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ分子は、ＲＩＳＣアッセンブリーの前に結局細胞質におそらく行くことになるので、細胞質環境を還元することにより、スルフィドを還元し、架橋を破壊する。
【００７０】
図５は、切断可能なリンカーの還元を通じたアンカー及び／又はＦＥの解放の概略的で限定されない例である。左パネルは、アンカー配列内に導入されたジスルフィド架橋を示す。例えば細胞質の還元を通じて還元されると、このアンカーは、２つの短いアンカー配列に分割され、ΔＧが低すぎるので、ハイブリダイズしたままでいることができない。右パネルは、アンカーとＦＥとの間のリンカー内部に導入されたジスルフィド架橋を示す。
【００７１】
ｓｉＲＮＡの２本の鎖間及びｓｈＲＮＡの自己相補的領域内の熱安定性の増大が、ＲＩＳＣ誘導に、及び／又は標的ＲＮＡとの親和性を増大させるため使用され得る。またＡＳの効力は、標的ＲＮＡとの結合親和性の増大によって増大され得る。標的ＲＮＡとの親和性の増大、並びにｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡの内部安定性の増大は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡをＤＮＡアナログ（ＰＮＡ、ＥＮＡ、ＢＮＡ、ＬＮＡなど）でヌクレオチド置換することを通じて、又はインターカレーター（ＩＮＡ、アクリジンなど）によって獲得され得る。
【００７２】
このアンカー結合ドメインはまた、アンカーの結合安定性の増大のため及び／又はアンカー配列を可能な限り短く維持するために、より強力なハイブリダイズ性質を有するアナログで置換されたＤＮＡヌクレオチドを有し得る。生理学的条件において、４塩基対と同じ短さのＬＮＡ−ＬＮＡ二重鎖が報告されている。
【００７３】
バイオプレックスは、塩基数が制限されないプラスミドに対して第一に開発された（参照によって本明細書に組み込まれたＷＯ  ００／１５８２４及びＷＯ０３／０９１４４３を参照のこと）。このｓｉＲＮＡの最大長さは、好ましくは各々の末端にいくつかの塩基の突出を有する３５塩基対の二重鎖である。他に、ｓｉＲＮＡのＴｍが遺伝子サイレンシングに極めて重要であることが示されている。
【００７４】
従って、アンカー結合ドメイン、ＲＩＳＣ（及び／又は他のタンパク質）にアクセス可能であるはずの安定なｓｉＲＮＡ二重鎖サイレンシングドメインの、組み込みに使用され得る塩基はわずかしか存在しない。細胞内部又は生物内部にｓｉＲＮＡの種々の機能を与えるために、同一のｓｉＲＮＡに結合したいくつかの異なるＦＥを有することはおそらく興味深いものである。同様に、細胞内部又は生物内部にｓｈＲＮＡ／ＡＳの種々の機能を与えるために、同一のｓｈＲＮＡ又はＡＳ分子に結合したいくつかの異なるＦＥを有することはおそらく興味深いものである。
【００７５】
多数のＦＥを１つのアンカー配列に付加する多数の方法が存在する。第一に、ＦＥはアンカーから分枝し得る（図１６Ａ）。これは、十分に特徴付けられ、そして明確に画成された複合体を与える。しかしこのプラットフォームは柔軟性が小さい。別のアプローチは、アンカー配列を伸長することである。これは、次のアンカー及びそのＦＥにアンカー結合ドメインを提供し（図１６Ｂ）、複数のＦＥを容易に組み合わせ得るモジュールシステムを与え、プラットフォームをより柔軟性にする。
【００７６】
図１６Ｃは、すべてＦＥに特異的なアンカー配列を有する多数のＦＥの組み合わせを与えるこのモジュールシステムのさらなる改良を例示する。このアンカーは、ＦＥを有するのではなく、むしろアンカー領域及び多数のアンカー結合ドメインを有する直鎖又は分枝した長いオリゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドは、修飾若しくは非修飾塩基（ＤＮＡアナログ）又は両方の混合物を含み得る。
【００７７】
ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びＡＳ分子は、図１６に示された例示的な分子と同様に修飾され得る。
【００７８】
本発明はまた、１つ又はそれ以上の機能的実体（ＦＥ）を利用する複合体を作製する方法であって、このＦＥが、細胞外で（生物内部で）、経細胞で（細胞膜を横切って）そして／又は細胞内で（細胞内部の種々の位置へ）、この複合体が分解及び／若しくは除去されることを防ぎ得るものであり、この複合体の活性を増大し得るものであり、そして／又はこの複合体の移送を増大し得るものである上記の方法に関する。この複合体は、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子を含み、そしてこのｓｉＲＮＡ分子は、第一の鎖及び第二の鎖を含む。この方法は、次の工程：
−少なくとも１つのアンカー結合ドメインを、このｓｉＲＮＡ分子に導入し、このアンカー結合ドメインは、核酸又はそのアナログであるものとすること、
−少なくとも１つのアンカー配列を、このアンカー結合ドメインとハイブリダイズさせ、このアンカー配列は、核酸又はそのアナログであるものとすること、そして
−少なくとも１つの機能的実体（ＦＥ）を、この少なくとも１つのアンカー配列に連結させ、このＦＥは、１つ又はそれ以上の生物学的に活性な分子であるものとすること、
を含む。
【００７９】
このアンカー結合ドメインは、ｓｉＲＮＡ分子の２つの鎖のうちのいずれか１つに導入され得る。
【００８０】
さらに本発明はまた、１つ又はそれ以上の機能的実体（ＦＥ）を利用する複合体を作製する方法であって、このＦＥは、細胞外で（生物内部で）、経細胞で（細胞膜を横切って）そして／又は細胞内で（細胞内部の種々の位置へ）、この複合体が分解及び／若しくは除去されることを防ぎ得るものとし、この複合体の活性を増大し得るものであり、そして／又はこの複合体の移送を増大し得るものであるとする上記の方法に関する。この複合体は、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を含み、そしてこのｓｈＲＮＡ分子は、二本鎖領域及びヘアピンループを有する。この方法は、次の工程：
−少なくとも１つのアンカー結合ドメインを、このｓｈＲＮＡ分子に導入し、このアンカー結合ドメインは、核酸又はそのアナログであるものとすること、
−少なくとも１つのアンカー配列を、このアンカー結合ドメインとハイブリダイズさせ、このアンカー配列は、核酸又はそのアナログであるものとすること、そして
−少なくとも１つの機能的実体（ＦＥ）を、この少なくとも１つのアンカー配列に連結させ、このＦＥは、１つ又はそれ以上の生物学的に活性な分子であるものとすること、
を含む。
【００８１】
上記のそれぞれｓｉＲＮＡ分子及びｓｈＲＮＡ分子に基づいた複合体の特徴はまた、このような複合体の作製方法におけるこの複合体に適用される。
【００８２】
別の実施態様において、本発明は、１つ又はそれ以上の機能的実体（ＦＥ）を利用する複合体を作製する方法であって、このＦＥが、細胞外で（生物内部で）、経細胞で（細胞膜を横切って）そして／又は細胞内で（細胞内部の種々の位置へ）、この複合体が分解及び／若しくは除去されることを防ぎ得るものとし、この複合体の活性を増大し得るものとし、そして／又はこの複合体の移送を増大し得るものであるとする上記の方法に関する。この複合体は、ＡＳ分子を含む。この方法は、次の工程；
−少なくとも１つのアンカー結合ドメインを、このＡＳ分子に組み込むか又は結合させ、このアンカー結合ドメインは、核酸又はそのアナログであるものとすること、
−少なくとも１つのアンカー配列を、このアンカー結合ドメインとハイブリダイズさせ、このアンカー配列は、核酸又はそのアナログであるものとすること、そして
−少なくとも１つの機能的実体（ＦＥ）を、この少なくとも１つのアンカー配列に連結させ、このＦＥは、１つ又はそれ以上の生物学的に活性な分子であるものとすること、
を含む。
【００８３】
上記のＡＳ分子に基づいた複合体の特徴はまた、このような複合体の作製方法におけるこの複合体に適用される。
【００８４】
本発明はまた、１つ又はそれ以上のＦＥを、細胞膜を横切り、及び細胞内部の種々の位置に移送させる方法に関し、ここで上記のＡＳ分子に基づいた複合体は、トランスフェクションに使用される。特にこの方法は、次の工程；
−少なくとも１つのアンカー結合ドメインを、このＡＳ分子に組み込むか又は結合させ、このアンカー結合ドメインは、核酸又はそのアナログであるものとすること、
−少なくとも１つのアンカー配列を、このアンカー結合ドメインとハイブリダイズさせ、このアンカー配列は、核酸又はそのアナログであるものとすること、
−少なくとも１つの機能的実体（ＦＥ）を、この少なくとも１つのアンカー配列に連結させ、このＦＥは、１つ又はそれ以上の生物学的に活性な分子であるものとすること、そして
−この複合体を細胞又は生体膜に接触させること、
を含む。
【００８５】
上記のＡＳ分子に基づいた複合体の特徴はまた、細胞外で（生物内部で）、経細胞で（細胞膜を横切って）そして／又は細胞内で（細胞内部の種々の位置へ）、この複合体が分解及び／若しくは除去されることを防ぎ、この複合体の活性を増大し、そして／又はこの複合体の移送を増大するためのこのような複合体の作製方法及び細胞膜を通してこの複合体を移送する方法におけるこの複合体に適用される。
【００８６】
本発明はまた、１つ又はそれ以上のＦＥを、細胞膜を横切り、及び細胞内部の種々の位置に移送させる方法に関し、ここで上記のＲＮＡ分子に基づいた複合体は、細胞外で（生物内部で）、経細胞で（細胞膜を横切って）そして／又は細胞内で（細胞内部の種々の位置へ）、この複合体が分解及び／若しくは除去されることを防ぎ、この複合体の活性を増大し、そして／又はこの複合体の移送を増大するためにトランスフェクションに使用される。この方法は、次の工程：
−少なくとも１つのアンカー結合ドメインを、ＲＮＡ分子に導入し、このアンカー結合ドメインは、核酸又はそのアナログであるものとすること、
−少なくとも１つのアンカー配列を、このアンカー結合ドメインとハイブリダイズさせ、このアンカー配列は、核酸又はそのアナログであるものとすること、そして
−少なくとも１つの機能的実体（ＦＥ）を、この少なくとも１つのアンカー配列に連結させ、このＦＥは、１つ又はそれ以上の生物学的に活性な分子であるものとすること、
−この複合体を細胞又は生体膜に接触させること、
を含み、そしてここでこのＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ分子又はｓｈＲＮＡ分子である。
【００８７】
上記のそれぞれｓｉＲＮＡ分子及びｓｈＲＮＡ分子に基づいた複合体の特徴はまた、この複合体を、細胞膜を横切り、及び細胞内部の異なる位置に移送させる方法におけるこの複合体に適用される。
【００８８】
本発明はまた、上記のような複合体でインビトロ又はインビボでトランスフェクトされた細胞に関する。この細胞は、真核生物細胞又は原核生物細胞であり得る。真核生物細胞は、ヒト細胞又は非ヒト細胞であり得る。
【００８９】
本発明の複合体は、多くの方法、例えば限定されないが、マイクロインジェクション、本発明の複合体を含む溶液への細胞又は生物の浸漬、本発明の複合体の存在下での細胞膜のエレクトロポレーション、本発明の複合体のリポソーム媒介送達、トランスフェクション及び形質転換で細胞に導入され得る。本発明の複合体はまた、この複合体の取り込みを高める他の成分と一緒になって導入され得る。
【００９０】
さらに本発明はまた、上記の複合体を生産する構成要素を含むキットに関する。より具体的には、本発明は、１つ又はそれ以上のｓｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子又はＡＳ分子を、細胞膜を横切り（細胞内で、細胞外で及び／又は経細胞で）、及び細胞内部の種々の位置へ移送し得る複合体を生産する構成要素を包含するキットであって、このキットが、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子及び／又はＡＳ分子、少なくとも１つのアンカー結合ドメイン、このアンカー結合ドメインとハイブリダイズし得る少なくとも１つのアンカー配列、並びにこのアンカー結合ドメインに連結した少なくとも１つの機能的実体（ＦＥ）を含み、このＦＥが、１つ又はそれ以上の生物学的に活性な分子であるキットに関する。
【００９１】
要約すると、本発明は、ＲＩＳＣ複合体の結合に最低限影響を及ぼすか又は影響を及ぼすことなく、ＲＮＡｉに送達及び特異性に関する機能を付加するための複合体及びこのような複合体の作製方法を提供する。このＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ）は、化学修飾なしで修飾され得、従って通常のｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ分子として合成され得る。驚くべきことに、アンカー配列の結合にＲＮＡ分子の長い伸長は必要ではなく、それどころかいくつかのミスマッチの導入で十分である。非修飾ｓｉＲＮＡは、細胞レベルでむしろ非特異的であり、従って生物学的に活性な分子の結合を通じて、本発明は、ＲＮＡｉに細胞特異性を与え、そしてまたおそらく他のタンパク質をダウンレギュレートする。細胞特異性の導入はまた、ＲＮＡｉに安全性の局面を導入する。
【００９２】
実験
実施例１〜１０に使用される材料及び方法
【表１】
2008527993.tif 000003
【００９３】
【表２】
2008527993.tif 000004
【００９４】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａ／Ｓ、Ａａｒｈｕｓ、Ｄｅｎｍａｒｋから購入した。ＰＮＡを、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ  Ｓ．Ａ、Ｓｅｒａｉｎｇ、Ｂｅｌｇｉｕｍから購入した。ｓｉＲＮＡを、ＣｕｒｅＶａｃ、Ｇｅｒｍａｎｙから購入した。ＧａｌＮＡｃの合成及びＬＮＡオリゴマーへのその接合は、Ｗｅｓｔｅｒｌｉｎｄら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ．２００４；２１（５）：２２７−４１に詳細に記載される。
【００９５】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用する理由
多くの試験管研究に関して、ＲＮＡの代わりにＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いて研究することが好都合である。ＤＮＡはより安価で、より安定であり、そして数日以内に合成及び出荷される。
【００９６】
ＲＮＡの代わりにＤＮＡを使用するとき、ＬＮＡハイブリッド形成は好まれない。ＬＮＡは、ＲＮＡに対してＤＮＡよりも高い結合親和性を有し、差は、２〜５℃程度である。一方ＰＮＡは、ＲＮＡと比較して結合親和性に数度獲得する。すなわち、ＤＮＡとのハイブリダイゼーションは、ＲＮＡとのハイブリダイゼーションよりもなおより安定である。実施例１において、ＬＮＡは、バイオプレックスｓｉＲＮＡプラットフォームのさらなる開発のためのアンカーとして選択される。
【００９７】
取り込みに関して、ＲＮＡ及びＤＮＡの両方が負電荷骨格を有し、そして細胞膜によってはじかれる。従って本発明者らは、ＤＮＡ及びＲＮＡが、類似の様式で与えられたＦＥの受容体媒介性エンドサイトーシスに影響を及ぼしていることを示唆する。
【００９８】
用語「ｓｉＤＮＡ」は、ｓｉＲＮＡと同じデザインを有する二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドをいい、これは、差異が、ＲＮＡヌクレオチドの代わりにＤＮＡヌクレオチドである模倣体にデザインされる（すなわち、ウラシルの代わりにチミジン）。
【００９９】
複合体のアッセンブリ
合成ｓｉＲＮＡを、供給を受けたアニーリング緩衝液（ＣｕｒｅＶａｃ、Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と一緒に製造業者のプロトコルに従ってアニーリングした。
【０１００】
ＦＥを含むか又は含まないＬＮＡ又はＰＮＡのアンカーを、アンカー結合ドメインの数に対して過剰に添加した。アンカー結合ドメインの数と比較して１.２倍過剰のアンカーを使用して、確実にすべてのアンカー結合ドメインを占有するようにした。使用されたｓｉＲＮＡ及びＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ただ１つのアンカー結合ドメインを有し、すなわちｓｉＲＮＡ  １ｍｏｌが、アンカー１.２ｍｏｌとハイブリダイズした。ｓｉＲＮＡ又はＤＮＡオリゴヌクレオチドを、生理学的条件下（Ｒｉｇｎｅｓ緩衝液、１４７ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣｌ2及び１.１３ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ７.２）において、３７℃で３０分間インキュベートした。ＬＮＡ／ＰＮＡの終濃度は、代表的には１〜１０μＭの間であった。
【０１０１】
ＰＡＧＥ遅延シフトアッセイ
ハイブリッド形成を、９０Ｖで３時間の約２０％の非変性ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＴＢＥ緩衝液［８９ｍＭ  Ｔｒｉｓ、８９ｍＭホウ酸、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８.３］）で確認した。蛍光標識したオリゴヌクレオチドを、いかなる染色も行わずに検出し、非標識ヌクレオチドを、製造業者に与えられたプロトコルに従って、Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。ゲルを、ＢｉｏＲａｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ  ｐｒｏ  ｐｌｕｓ（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＵＳＡ）によって、異なる色素間を区別するためのレーザー及びフィルター設定でスキャンした。
【０１０２】
ルシフェラーゼアッセイ
プロトコルを含むルシフェラーゼアッセイキットを、ＢｉｏＴｈｅｍａ（Ｈａｎｉｎｇｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）から購入した。細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ですすぎ、そしてＲｅｐｏｒｔｅｒ溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｒａｔｉｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）で溶解した。Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｌｙｓｉｓ  ２０μＬを水８０μＬで希釈し、そして細胞に添加し、次いで１回凍結解凍した。溶解サンプル１０μＬを、マイクロプレートウェルに添加した。このプレートを発光読取り機にロードする前に、再構成されたルシフェリン基質１００μＬを各ウェルに添加した。再構成されたＡＴＰ基質同量を、装置により自動で添加した。発光を、ＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で測定した。
【０１０３】
実施例１．  アンカーとしてのＤＮＡ及びＰＮＡアナログの適合性の比較
ＤＮＡオリゴヌクレオチドとのｂｉｓ−ＰＮＡ（配列：Ｐ１、Ｐ２及びＰ３）ハイブリダイゼーション効率を、ＬＮＡ（配列：Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）と比較した。ハイブリダイゼーションを、０〜１５０ｍＭにわたるＮａＣｌの異なる塩濃度中で行った。３７℃で１時間のＬＮＡ及び／又はｂｉｓＰＮＡとｓｉＲＮＡ  ＬｕｃＥｘｔ（Ｓ２）とのインキュベーション後、サンプルをＰＡＧＥ（上記）に供した。ＬＮＡとのハイブリッドは、ＬＮＡを含まないｓｉＲＮＡよりも遅く移動し、そしてｂｉｓＰＮＡ−ｓｉＲＮＡハイブリッドは、なおより遅く移動した。従ってＰＡＧＥ遅延シフトアッセイは、ｓｉＲＮＡとハイブリッドを形成するアナログがどれであるかを示した。
【０１０４】
ＬＮＡ及びｂｉｓ−ＰＮＡが、伸長したｓｉＲＮＡ（Ｓ２）のアンカー結合ドメインとのハイブリダイゼーションで競合するとき、６マーのＬＮＡ（Ｌ２）オリゴヌクレオチドは、生理学的な塩濃度で７マーのｂｉｓ−ＰＮＡ（Ｐ３）よりも高い結合親和性を示した。
【０１０５】
使用した特異的なｓｉＲＮＡ配列（ＬｕｃＥｘｔ（Ｓ２））及びその対応するアンカー配列に関して、５塩基（Ｌ１）のアンカー長がハイブリダイゼーションの限界であることが見出され（すなわち、５塩基は十分ではなかった）、一方６塩基（Ｌ２）は、生理学的な塩濃度でｓｉＲＮＡの一本鎖部分とＬＮＡとの間のハイブリッド形成に十分であった。６マーのアンカー配列の場合、競合している塩基（センス及びＬＮＡの代わりに、ワトソン・クリック型塩基対形成するセンス及びアンチセンス）がおそらく存在し、そしてより遅い段階で、機能的部分がＬＮＡに接合するようである。これを考慮に入れて、７マーのＬＮＡ配列を、さらなる実験においてアンカーとして選択した。
【０１０６】
図６は、ＲＮＡとのハイブリッド形成に関する競合アッセイのＰＡＧＥ像を示す。ＤＮＡをまた同様の結果を有する標的として使用した。本発明者らは、アンカーとしてＬＮＡを用いてバイオプレックスｓｉＲＮＡを開発継続することを選択した。これにより、配列の選択が完全に自由になり、そして極めて短いアンカー結合ドメインが必要とされる。ｂｉｓ−ＰＮＡは、ワトソン・クリック型塩基対形成及びフーグスティーン型塩基対形成の両方を通じてハイブリダイズするので、ｂｉｓ−ＰＮＡは、ホモピリミジンのみに制限される。さらに、この二重タイプの塩基対形成は、より長い合成を必要とし、従ってより高価である。
【０１０７】
２つの異なるアンカー、ＬＮＡ及びｂｉｓ−ＰＮＡを利用する種々のデザイン戦略がこれ迄に試みられ、極めて短いアンカー結合ドメインが必要とされ、そして配列の選択が完全に自由であったため、ＬＮＡは本発明者らの実験条件下でより良い候補であると思われた。
【０１０８】
実施例２．  ＡＳからの機能的単位の制御解放
７塩基のＬＮＡアンカーを選択した。ＬＮＡは、ｂｉｓＰＮＡのように構成に制限されないので、配列を自由に選択し得る。ｓｉＲＮＡのデザインの推奨を満たすために、結合部位をｓｉＲＮＡの二本鎖部分「中に」移動させることを試みた。しかし、ＬＮＡがアンチセンス鎖による競合を受けるか否かはわからなかった。一連のｓｉＤＮＡを合成し、ここでアンチセンス鎖を、このセンス鎖に対して１つ又は複数の位置でミスマッチさせた。従ってＬＮＡは、いくつかの塩基に対して競合するはずである。
【０１０９】
センス鎖及びアンチセンス鎖が完全にマッチするならば、本発明者らの７マーのＬＮＡ（ＡＣＣＧＴＣＣＡ、Ｌ４）は結合しない。本発明者らは、どれほどのミスマッチが安定な複合体に必要とされるかを明らかにし、そして４つのうち２つが、位置している場所如何により受け入れられ得ることを見出した。一方、このＬＮＡがアンカー結合ドメインとハイブリダイズするならば、ｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間の塩基対形成は、このアンカー結合ドメインでは不可能となる。
【０１１０】
競合する塩基の許容性が低いことは、ＦＥと一緒になったアンカー配列をＡＳから制御解放する可能性を与える。一本鎖のＤＮＡアンチセンス分子が標的ｍＲＮＡを見出すと、アンカーは、７塩基のみの弱いハイブリダイゼーションに起因して離れることが期待される。
【０１１１】
アンチセンス（Ｄ１）及びアンカー（Ｌ４）を、上記のようにハイブリダイズさせた。標的（Ｄ２、Ｄ３又はＤ４）を、等モル比で添加し、そしてＲｉｇｎｅｓ塩溶液中３７℃でさらに１時間インキュベートした。ＰＡＧＥ遅延アッセイ（上記）により、アンチセンスのアンカー結合ドメイン中の１を超える塩基が標的に相補的ならば、アンカーは、標的のためにアンチセンスから解放されることが示された（図７を参照のこと）。
【０１１２】
実施例３．  修飾ｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング効率
１０００００個のＨｅｐＧ２細胞を、２４ウェルプレートの各ウェルに播種した。一晩のインキュベーション後、細胞を、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に与えられたプラスミドトランスフェクションのプロトコルに従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いてレポータープラスミド０.３μｇでトランスフェクトし、そして３７℃で一晩インキュベートした。次いでこの細胞を、製造業者に与えられたｓｉＲＮＡトランスフェクションのプロトコルに従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いてｓｉＲＮＡ  ２０ｐｍｏｌでトランスフェクトし、そしてダウンレギュレーションを７２時間後に測定した。
【０１１３】
ダウンレギュレーション（ｓｉＲＮＡ効率の尺度として）を、ＨｅｐＧ２細胞由来の溶菌液のルシフェラーゼアッセイ（上記）によって測定し、これを、ＧＦＰ／ルシフェラーゼ融合タンパク質の遺伝子を含むプラスミドで第一にトランスフェクトした。図８において、ｓｉＲＮＡの伸長形態が、オリジナルのｓｉＲＮＡと比較して効力が低いことが見出され得た。ＬＮＡ及びｂｉｓ−ＰＮＡの両方はさらに、少しではあるがそれでも遺伝子サイレンシングを減少させた。一方ｓｉＲＮＡ  ＬｕｃＧ２（Ｓ３）は、オリジナルの非ミスマッチｓｉＲＮＡ（Ｓ１）の改良版であった。繰り返すと、ＬＮＡアンカーは、いくらかその活性を減少させた。ＬＮＡによって引き起こされた効率の減少は、アンチセンス鎖の５’末端を開くことにより補償され得た。
【０１１４】
実施例４．  ＬＮＡを通じたｓｉＲＮＡへのＦＥの付加
機能的実体として炭水化物を用いた肝細胞によるＤＮＡの受容体媒介取り込みは、興味深いアプローチである。三量体のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）は、アシアロ糖タンパク質受容体への極めて高い結合親和性を有し、これは、肝細胞上で高度に発現される。三量体の糖をＬＮＡアンカーに接合させて（Ｌ５）、遺伝物質の特異的取り込みを増強させた。
【０１１５】
三量体の炭水化物単位の合成は、Ｗｅｓｔｌｉｎｄら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ．２００４；２１（５）：２２７−４１に詳細に記載される。本発明者らは、上記の実験で最も有望であることが見出された構築物を用いて継続することを選択した（図９を参照のこと）。
【０１１６】
一般的デザインにおいて２ヌクレオチドの伸長がすでに存在するので、アンカー結合ドメインとしてセンス鎖の３’末端を選択することが有利であり得る。通常のｓｉＲＮＡのセンス鎖の唯一の目的は、鎖を解離させるためにＲＩＳＣを動員し、そしてアンチセンス鎖を妥当な標的ｍＲＮＡに送ることであると考えられる。研究はまた、ＲＩＳＣが、ΔＧに関してｓｉＲＮＡの最も弱い末端を優先的に攻撃し、そしてその５’末端が開いたどのような鎖にも結合することを示している。アンカーが、図９のようにハイブリダイズするとき、ＲＩＳＣは、アンチセンス鎖の５’末端に結合する。
【０１１７】
ｓｉＲＮＡＬｕｃＧ２（Ｓ３）を、ＦＥとして三量体炭水化物、すなわち上記の（Ｌ５）を保持するアンカーにハイブリダイズした。レーン５〜８は、Ｌ５の滴定である。すでにＬ５及びＳ３の等モル比で、９０％を超えるｓｉＲＮＡがハイブリダイズした。従って、ＦＥは複合体形成を著しく妨げることはない。
【０１１８】
実施例５．  ＦＥを有するＬＮＡにハイブリダイズした修飾ｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング効率
ＨｅｐＧ２細胞を、実施例３の通りにｓｉＲＮＡ  ＬｕｃＧ２（Ｓ３）にハイブリダイズしたＬＮＡ３Ｓ（Ｌ５）（実施例４に記載）でトランスフェクトし、そして処理した。バイオプレックスｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング効果を、非修飾ｓｉＲＮＡと比較した。
【０１１９】
図１１に見て分るように、ｓｉＲＮＡの修飾及び機能的実体を有するアンカーの付加は、ルシフェラーゼのダウンレギュレーションを有意には引き起こさなかった。
【０１２０】
実施例６．  ＨｅｐＧ２細胞への取り込みの際のＦＥの効果
ｓｉＲＮＡの機能性は、ＦＥを保持するアンカーによって失われないが、ＦＥ（本実施例では炭水化物）は細胞相互作用に利用可能であろうか。
【０１２１】
肝細胞は、ＯＤＮ細胞膜受容体を通じて、より短いオリゴヌクレオチドをインターナライズすることが公知である。しかしこの経路は、受容体を１００倍過剰の無関係な短いオリゴヌクレオチド（Ｄ５）で飽和させることによって遮断され得る（ｄｅ  Ｄｉｅｓｂａｃｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０００  Ｆｅｂ  １５；２８（４）：８６８−７４）。
【０１２２】
１５００００個のＨｅｐＧ２細胞を、２４ウェル皿の各ウェル中で２４時間増殖させた。細胞をＰＢＳで洗浄し、そしてＣＯ2インキュベーター中３７℃で１時間、構築物２０ｐｍｏｌ及びおとり（Ｄ５）２ｎｍｏｌを含む無血清Ｏｐｔｉｍｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１５０μｌ中でインキュベートした（ＯＤＮ膜受容体を飽和させるため）。細胞をＰＢＳで洗浄し、そしてＴｒｙｐｓｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１００μＬの添加によってトリプシン処理して、結合したがインターナライズされない構築物を除去した。最後に、遠心分離によってトリプシンを除去し、そして細胞を、３％ウシ胎仔血清を補充したＰＢＳ  １ｍＬに再懸濁し、そして氷上に維持した。
【０１２３】
試験した構築物は、非ハイブリダイズｓｉＲＮＡ（Ｓ３）、Ｌ４及びＬ５（それぞれ炭水化物部分を有さないＬＮＡ及び有するＬＮＡ）とハイブリダイズしたＳ３であった。ｓｉＲＮＡを、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）による検出のために、ｃｙ−５標識した。非トランスフェクト細胞から検出されたｃｙ−５シグナルを、ネガティブとしてゲートし、より高い強度を有する細胞を、ポジティブとみなした。１００００個の細胞を各構築物に対して測定し、そしてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｎｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）で測定し、そしてＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ）で分析した。
【０１２４】
ＬＮＡアンカーに接合したＦＥは、裸のｓｉＲＮＡ（Ｓ３）及び炭水化物を有さないＬＮＡにハイブリダイズしたｓｉＲＮＡ（Ｓ３＋Ｌ４）と比較して、ｓｉＲＮＡ（Ｓ３＋Ｌ５）の細胞取り込みを劇的に増強した（図１２を参照のこと）。ポジティブ細胞のパーセンテージは、ｓｉＲＮＡを取り込んだ肝細胞の数に関連した。
【０１２５】
実施例７．  ＬＮＡＧ２にハイブリダイズしたｓｉＲＮＡ  ＬｕｃＧ２のインビボ活性の確認
修飾ｓｉＲＮＡがまた、遺伝子発現をインビボで阻害するか否かを調べるために、本発明者らは、流体力学的トランスフェクション方法を用いた。ｓｉＲＮＡは、尾静脈を通じて成熟マウスの肝臓に送達される（Ｌｅｗｉｓ  ＤＬ、Ｗｏｌｆｆ  ＪＡ。Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ａｎｄ  ｓｉＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｔｏ  ａｄｕｌｔ  ｍａｍｍａｌｓ  ｂｙ  ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２００５；３９２：３３６−５０）。
【０１２６】
マウスに、ルシフェラーゼ−発現プラスミドと組み合わせてｓｉＲＮＡなし、Ｓ３又はＳ３＋Ｌ５のうちの１つを同時注入した。すべてのｓｉＲＮＡ構築物は、ルシフェラーゼｍＲＮＡを標的化した。マウス（３０ｇ）に、リンゲル液２ｍｌ容量中のｓｉＲＮＡ構築物４０μｇ及びルシフェラーゼ−発現プラスミド１０μｇを、５〜８秒間継続して注入することにより与えた。本発明者らは、定量全身イメージング（ＩＶＩＳ  １００  ｓｙｓｔｅｍ、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｒａｔｉｏｎ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて注入の２４時間後に生きた動物中のルシフェラーゼ発現をモニターした。ルシフェリン（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｒａｔｉｏｎ）を、ＰＢＳ中の体重１ｋｇ当たりルシフェリン１５０ｍｇの用量で腹腔内経路で与えた。動物を、ルシフェリン注入から１０分後にアッセイし、そして曝露時間は３秒間であった。すべての実験方法の間、この動物を、２.５〜３.５％イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）の継続投与により麻酔した。すべての動物実験は、地方倫理委員会に承認され、そしてスウェーデンのガイドラインに従って実施された。
【０１２７】
Ｓ３又はＬ５にハイブリダイズしたＳ３は、図１３を見て分るように、ルシフェラーゼ遺伝子のダウンレギュレーションに対して等しい効力を表すことが示された。
【０１２８】
実施例８．  転写レベルでのｓｉＲＮＡ誘導性サイレンシング
最近の刊行物から（Ｈｏｎｇ  Ｋら、Ｂｉｏｍｏｌ  Ｅｎｇ．２００１  Ｏｃｔ  ３１；１８（４）：１８５−９２、Ｋａｗａｓａｋｉ  Ｈら、Ｎａｔｕｒｅ．２００４  Ｓｅｐ  ９；４３１（７００５）：２１１−２１７、Ｅｐｕｂ  ２００４  Ａｕｇ  １５、Ｊｅｎｋｅ  ＡＣら、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐ．２００４  Ｊｕｎ；３１（２）：８５−９０、Ｍｏｒｒｉｓ  ＫＶら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００４  Ａｕｇ  ２７；３０５（５６８８）：１２８９−９２、Ｅｐｕｂ  ２００４  Ａｕｇ  ０５）、本発明者らは、ｓｉＲＮＡをまた転写レベルでのサイレンシングに使用し得ることを学んだ。哺乳動物細胞での転写サイレンシングは、ヒストン脱アセチル化及びシトシンＤＮＡメチル化を含むクロマチン修飾に関連する。薬物での細胞の処理は、ｓｉＲＮＡによるサイレンシングを無効にする。トリコスタチン（ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ）（ＴＳＡ）及び５−アザシチジン（５−ａｚａＣ）は、それぞれヒストンデアセチラーゼ（ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ）及びＤＮＡメチルトランスフェラーゼの阻害剤である。これらの薬剤は、レポーター遺伝子の転写産物のＲＮＡ干渉に影響を及ぼさないことが示されている。
【０１２９】
これは核事象であるので、ＮＬＳを、ｓｉＲＮＡの移行に使用している。ｓｉＲＮＡ及びＮＬＳ−ペプチドの非共有結合性混合物は、サイレンシングの増大を示した。次いでバイオプレックス・テクノロジーは、定義された構築物の利点を有し、そしてインビボでの複合体の安定性を増大した（ＮＬＳ  ｓｉＲＮＡ複合体形成に関して）。本願で言及される通り、本発明者らはまた、細胞インターナリゼーション及び特異性に関する他の機能を付加し得る。
【０１３０】
ルシフェラーゼに対して同じｍＲＮＡを標的化するが、ＰＮＡ５７９（Ｐ４）に対するアンカー結合ドメインを有する新規なｓｉＲＮＡ（Ｓ４）を購入した。このｂｉｓＰＮＡはＮＬＳペプチドを有し、そしてｓｉＲＮＡを不活性である核に導く。本発明者らが、核のクロマチン内部のＤＮＡを標的化するｓｉＲＮＡを代わりに選択してみたら、核取り込みを促進するＮＬＳペプチドは、より良いサイレンシング効果を強力に与え得た。
【０１３１】
使用されたプロトコルは、上記の材料及び方法に記載されたプロトコルと同じである。ＰＡＧＥ遅延アッセイの結果を図１４に示した。ｓｉＲＮＡ  ＬｕｃＧ部位（Ｓ４）を、ＦＥとしてＮＬＳペプチド、すなわち上記の（Ｐ４）を保持するアンカーにハイブリダイズした。レーン５〜８は、Ｌ５の滴定である。Ｓ４に対して１.２倍過剰のＰ４で、９０％を超えるｓｉＲＮＡがハイブリダイズした。従って、ＦＥは複合体形成を妨げなかった。構築物濃度は正確ではないかもしれず、従って過剰であったことは、濃度測定及びピペッティングの影響であり得る。
【０１３２】
「転写レベルでのｓｉＲＮＡ誘導性サイレンシング」は、ＮＬＳ機能に関する概念の負の証明である。転写性ダウンレギュレーションは、ＤＮＡに結合させるためにｓｉＲＮＡを核内に導入しなければならないことを意味する。「通常の」翻訳後ダウンレギュレーションは、細胞質で行われる。ＲＩＳＣは、細胞質でｓｉＲＮＡに結合し、そして細胞質に位置するｍＲＮＡにアンチセンス鎖を導く。
【０１３３】
従って本発明者らは、翻訳後活性を有するｓｉＲＮＡにＮＬＳを付加することによって２つのテクノロジーを結び付けた。ルシフェラーゼ遺伝子の発現をダウンレギュレートするために、ｓｉＲＮＡを、ＲＩＳＣがｓｉＲＮＡに結合してｍＲＮＡを局在化する細胞質に局在化させなければならない。これに反してＮＬＳペプチドは、マッチするｍＲＮＡを見出すことができない核に直接ｓｉＲＮＡを移送する。
【０１３４】
実施例９．  核での遺伝子サイレンシング能
Ｃｏｓ−７細胞を、実施例３の通りにトランスフェクトし、そして処理した。ルシフェラーゼタンパク質のｓｉＲＮＡダウンレギュレーションを、上記の通りに測定した。通常のｓｉＲＮＡ（Ｓ１）を標準として使用した。修飾ｓｉＲＮＡ（ハイブリダイズしないか又はＬ４、Ｌ５、Ｓ４若しくはＳ５とハイブリダイズしたＳ３及びＳ５）の効力を、Ｓ１と比較したダウンレギュレーションの増大又は減少として測定した。従って、得られた値は、ｓｉＲＮＡ及び／又はアンカー及び／又はＦＥによって引き起こされたルシフェラーゼのダウンレギュレーションの相対的な増大又は減少を反映する。
【０１３５】
図１５を見て分るように、ｍＲＮＡレベルでサイレンシングを誘導するｓｉＲＮＡにＮＬＳを付加することにより活性が減少した。逆転したＮＬＳ配列を含む複合体であるＳ５＋Ｐ５は、Ｐ５を含まないＳ５に匹敵するダウンレギュレーションをもたらした。従ってＮＬＳは、ｓｉＲＮＡ複合体を核に移行させることにより効力を損失させた。
【０１３６】
Ｓ１とＳ５との間の差異は、修飾、すなわちＳ５のセンス鎖の伸長が原因である。ｓｉＲＮＡを、アンカー結合ドメインを与える最適な修飾によって試験していないが、ＮＬＳの効果は、ｓｉＲＮＡデザイン及びアンカー結合ドメインの重要性と同様に明らかに理解され得る。
【０１３７】
実施例１０．  ＮＬＳを有する複合体の細胞内位置
５００００個のＣｏｓ−７細胞を、２４ウェルプレートで２４時間増殖させた。この細胞をＰＢＳで洗浄し、そして３７℃でインキュベートした。一晩のインキュベーション後、細胞を製造業者に与えられたオリゴヌクレオチドトランスフェクションのプロトコルに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｓｉＲＮＡ  Ｓ５を模倣する蛍光標識された二本鎖ＤＮＡ（Ｄ６）１μｇでトランスフェクトした。細胞を、５％  ＣＯ2インキュベーター中３７℃で４時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、そして製造業者に与えられたプロトコルに従ってＤＡＰｉ核色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、次いでＰＢＳで洗浄し、そしてＰＢＳ中に維持した。
【０１３８】
Ｄ６を、ＮＬＳペプチド（Ｐ４）又は逆（不活性な）配列（Ｐ５）のいずれかと接合したＰＮＡとハイブリダイズさせ、そして細胞培養物に導入した。生細胞を、共焦点顕微鏡により分析した（結果は示さず）。
【０１３９】
このｓｉＲＮＡ複合体は、結合したＮＬＳペプチド（Ｓ５＋Ｐ４）を有するときに細胞核に蓄積した。逆ＮＬＳペプチドを使用したとき（Ｓ５＋Ｐ５）、シグナルは、細胞の全体にわたって均一に分配された。ＮＬＳペプチドとのｓｉＲＮＡの複合体形成は、ＮＬＳの効果に著しくは影響しなかった。
【０１４０】
実施例１１．  多数のＦＥを有するｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡＬｕｃＧ部位（Ｓ４）を、ｂｉｓＰＮＡアンカー（Ｐ６）に連結したＰＮＡの直鎖ストレッチを有するこのアンカーにハイブリダイズさせた。３３マーのＤＮＡオリゴヌクレオチド（Ｄ７）を、Ｄ７の５’末端でＰ６の直鎖ＰＮＡストレッチにハイブリダイズさせた。Ｌ５に対する２つのアンカー結合ドメインを、Ｄ７の３’末端に位置させた。
【０１４１】
複合体を、上記の条件下（１４７ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣｌ2及び１.１３ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ７.２のＲｉｇｎｅｓ緩衝液中、３７℃で３０分間）でアッセンブルさせた。ハイブリダイゼーションの順序を図１７に示す。連続的ハイブリダイゼーションを行うとき、次の構築物を添加する前に、サンプルをハイブリダイゼーションごとに３７℃で３０分間インキュベートした。複合体のビルディングブロックを、Ｓ４  ２０ｐｍｏｌ、Ｐ６  ２４ｐｍｏｌ、Ｄ７  ２９ｐｍｏｌ及びＬ５  ６９ｐｍｏｌの通りに添加した。ｓｉＲＮＡの終濃度は２μＭであった。
【０１４２】
複合体を、ＰＡＧＥシフトアッセイ（上記）に供した。結果を図１７Ａに示す。ハイブリダイゼーションの順序は大して重要ではない。ｓｉＲＮＡ複合体は、単にすべての構築物を同時に添加し、そして生理学的条件で３０分間インキュベートすることによってアッセンブルし得た。本実験において、ハイブリダイズしない構築物がゲル中で観察され得たので、過剰量を用いた。レーン４〜６は、複合体全体をすべて含み、これは、ゲル中で最も遅く移動したバンドであった。レーン９において、Ｌ５のみをロードし、そしてＳｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による標識が不十分であり、レーン３は、誤ってＤ７  １００ｐｍｏｌを過剰にロードした。
【０１４３】
実施例１２．  アンカー−ＦＥとのｓｉＲＮＡの安定性
ｓｉＲＮＡ  ＬｕｃＧ２（Ｓ３）を、上記のようにＦＥとして三量体炭水化物（Ｌ５）を有するＬＮＡアンカーにハイブリダイズした。
【０１４４】
複合体（Ｓ３又はＳ３＋Ｌ５）を、ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のｓｉＲＮＡ  １μＭの終濃度で３７℃でインキュベートした。特定の時間で、アリコート２０μＬを取り出し、ホルムアミド４０μＬと混合し、−７０℃に急速冷凍し、そして−２０℃で保管した。アリコートを、０時間、２４時間、４８時間及び７２時間で取り出し、引き続いてＰＡＧＥシフトアッセイ（上記）に供した。完全な複合体に対応するバンドを定量化し、そして図１８にプロットした。
【０１４５】
分解に対する抵抗性を、Ｓ３＋Ｌ５複合体について観察した（図１８）。分解は、ＦＥ、例えば限定されないがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をさらにハイブリダイズさせることによってさえも妨げられ得た。ｓｉＲＮＡ上にＦＥとしてＰＥＧを有することはまた、クリアランスを回避する有望な解決法である。ここでこの複合体のサイズは、３０ｋＤａをおそらく超えるはずである。
【０１４６】
特定の実施態様が本明細書中で詳細に開示されているが、これは、例示の目的のための例としてのみ行っており、添付の特許請求の範囲に対して限定されることは意図されない。特に、種々の置換、改変及び修飾が、特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく本発明に対して行われ得ることが本発明者らによって意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】ＲＮＡｉ機構の概要を示す。
【図２】本発明に従って構成された複合体の概略的で限定されない説明図である。パネル２Ａは、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を示す。パネル２Ｂは、アンカー結合ドメインが導入されているか又はアンカー結合ドメインが結合している二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を示す。パネル２Ｃは、アンカー結合ドメインが導入されているか又はアンカー結合ドメインが結合している二本鎖ｓｉＲＮＡ分子、及びＦＥが結合しているアンカー配列を示す。パネル２Ｄは、このアンカー配列がアンカー結合ドメインに結合した本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡ複合体を示す（点線は、代替がある実施態様を示す）。
【図３】アンカー結合ドメインがｓｈＲＮＡ分子に導入された本発明の実施態様の概略的で限定されない説明図を示す。このｓｈＲＮＡ分子は後に、ダイサーによってｓｉＲＮＡに切断される。従って、このヘアピンループ及び隣接する塩基が、矢じり形で示されるように除去される（点線は、代替がある実施態様を示す）。
【図４】本発明に従ったＡＳ（アンチセンス）バイオプレックスの概略的で限定されない説明図を示す。パネル４Ａは、ＡＳ分子を示す。パネル４Ｂは、アンカー結合ドメインが導入されているＡＳ分子を示す。パネル４Ｃは、ＡＳ分子へのアンカー−ＦＥ配列の結合を示す。パネル４Ｄは、その標的配列へのＡＳ分子の結合を示す。ＡＳ分子がその標的配列とハイブリダイズすると、このアンカー−ＦＥ配列は外れる（点線は、代替がある実施態様を示す）。
【図５】複合体が切断可能なリンカーを含む本発明の実施態様の概略図を示す。左パネル：ジスルフィド架橋が、アンカー配列内部に導入される。還元されると、このアンカーは２つの短いアンカー配列に分割され、ΔＧが低すぎるのでハイブリダイズしたままである。右パネル：ジスルフィド架橋が、アンカーとＦＥとの間のリンカー内部に導入される。還元されると、ＦＥが分離し、そしてｓｉＲＮＡ−ＬＮＡ三重鎖（ｔｒｉｐｌｅｘ）を元のまま残す。
【図６】ｂｉｓ−ＰＮＡとＬＮＡとの間の競合アッセイのＰＡＧＥシフトアッセイ像を示す。数字は、それぞれＲＮＡとＬＮＡ又はＲＮＡとｂｉｓＰＮＡのいずれかによって形成された塩基対の数を示す。塩濃度を、ｍＭで示す。
【図７】ＰＡＧＥシフトアッセイ像を示す。重複した塩基の数は、アンチセンス鎖上のアンカー結合ドメイン内の標的に相補的な塩基の数を表す。
【図８】ｓｉＲＮＡによるルシフェラーゼのダウンレギュレーションを示す。プラスミドは、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼを保持する。ｓｉＲＮＡなしと命名されたバーは、プラスミドだけでのトランスフェクションを表し、他のバーは、示されるようなｓｉＲＮＡと一緒のプラスミドの同時トランスフェクションを表す。ｓｉＲＮＡ／Ｂｔｋは、無関係のｓｉＲＮＡである（すなわち、ルシフェラーゼのｍＲＮＡと類似の配列を欠損しているので、阻害が特異的であれば、ルシフェラーゼ発現に影響を及ぼさないはずである）。
【図９】実験に使用された本発明の複合体の概略図である。機能的実体（ＦＥ）が、ｓｉＲＮＡ（例えばＳ３）とハイブリダイズした７マーのＬＮＡオリゴヌクレオチドアンカーに結合する。
【図１０】ＰＡＧＥ遅延シフトアッセイ像を示し、それぞれのレーンは、１：センス（Ｓ３ｓ）；２：センス＋０.８ＬＮＡ（Ｓ３ｓ＋Ｌ５）；３：アンチセンス（Ｓ３ａ）；４：ｓｉＲＮＡ（Ｓ３）；５：ｓｉＲＮＡ＋０.８ＬＮＡ（Ｓ３＋Ｌ５）；６：ｓｉＲＮＡ＋１.０ＬＮＡ（Ｓ３＋Ｌ５）；７：ｓｉＲＮＡ＋１.２ＬＮＡ（Ｓ３＋Ｌ５）；８：ｓｉＲＮＡ＋１.４ＬＮＡ（Ｓ３＋Ｌ５）である。
【図１１】ルシフェラーゼのダウンレギュレーションを示す。三重反復の平均及び標準偏差。
【図１２】ＨｅｐＧ２細胞中のｓｉＲＮＡ（Ｓ３）、ＬＮＡアンカーのみ（Ｌ４）にハイブリダイズしたＳ３及びＬ５にハイブリダイズしたＳ３のアシアロ糖タンパク質受容体媒介性取り込みを比較するＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【図１３】肝臓におけるｓｉＲＮＡ取り込みを示す。Ａ）Ｌ５にハイブリダイズしたＳ３、Ｂ）Ｓ３、Ｃ）ｓｉＲＮＡなし。
【図１４】ＰＡＧＥ遅延シフトアッセイ像を示し、それぞれのレーンは、１：センス（Ｓ５ｓ）；２：センス＋０.８ＰＮＡ５７９（Ｓ５ｓ＋Ｐ４）；３：アンチセンス（Ｓ５ａ）；４：ｓｉＲＮＡ（Ｓ５）；５：ｓｉＲＮＡ＋０.８ＰＮＡ５７９（Ｓ５＋Ｐ４）；６：ｓｉＲＮＡ＋１.０ＰＮＡ５７９（Ｓ５＋Ｐ４）；７：ｓｉＲＮＡ＋１.２ＰＮＡ５７９（Ｓ５＋Ｐ４）；８：ｓｉＲＮＡ＋１.４ＰＮＡ５７９（Ｓ５＋Ｐ４）である。
【図１５】同じ位置でルシフェラーゼｍＲＮＡを標的化する同じアンチセンス配列を共有するｓｉＲＮＡの比較を示す。ＦＥとセンス鎖の３’塩基置換の両方が、ｓｉＲＮＡのダウンレギュレーション能に影響を及ぼす。通常のｓｉＲＮＡ（Ｓ１）を標準として使用し、値は、Ｓ１と比較したダウンレギュレーションの増大又は減少を示す（標準偏差を示す）。
【図１６】多数のＦＥが、分枝したリンカーを通じて同じアンカーに結合する場合（Ａ）；アンカー配列が、アンカー結合ドメインとともに伸長する場合（Ｂ）；及びアンカーが、多数のアンカー結合ドメインを含む長い伸長を有する場合（Ｃ）の本発明の実施態様の概略的で限定されない図解である。
【図１７】パネルＡは、ＰＡＧＥ遅延シフトアッセイ像を示し、それぞれのレーンは、１：Ｓ４；２：Ｓ４＋Ｐ６；３：Ｓ４＋Ｐ６＋Ｄ７；４：Ｓ４＋Ｐ６＋Ｄ７＋Ｌ５；５：Ｓ４／Ｐ６／Ｄ７／Ｌ５；６：Ｌ５＋Ｄ７＋Ｐ６＋Ｓ４；７：Ｌ５＋Ｄ７＋Ｐ６；８：Ｌ５＋Ｄ７；９：Ｌ５；１０：Ｄ７；１１：Ｄ７＋Ｐ６である。この構築物を、記された順序と同じ順序で連続的に複合体に付加する。連続的ハイブリダイゼーション（上記）を＋で区分し、そして／は、同時に付加することを示す。パネルＢは、実施例１１に使用された複合体の概略的な図解を示す。
【図１８】示された時点でのｓｉＲＮＡ  ＬｕｃＧ２（Ｓ３）のみでの未分解のパーセンテージ、又はＦＥとして三量体の炭水化物を有するＬＮＡアンカーとハイブリダイズしたｓｉＲＮＡ  ＬｕｃＧ２（Ｓ３＋Ｌ５）の未分解のパーセンテージを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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