(57)【要約】  本発明は、広範な交差反応性中和応答を生じるエピトープを発現する修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質、それらの使用方法、およびこれらのエピトープに結合する抗体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における投与の後に広範な交差反応性抗体応答を誘導する少なくとも１つのエピトープを含む、修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはその断片であって、該エンベロープタンパク質が、配列番号３の６５７位または配列番号２の６５９位に対応する残基に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはその断片。
【請求項２】
６５７位の置換がアラニンに代わってスレオニンである、請求項１に記載のＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはその断片。
【請求項３】
６５９位の置換がリシンに代わってスレオニンである、請求項１に記載のＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはその断片。
【請求項４】
アミノ酸配列番号５５を含む少なくとも１つの中和抗体エピトープを含む、修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはその断片。
【請求項５】
前記アミノ酸配列が配列番号２５を含む、請求項４に記載の修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはその断片。
【請求項６】
前記アミノ酸配列が配列番号２０を含む、請求項４に記載の修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはその断片。
【請求項７】
前記タンパク質が配列番号２、３、４、５、６、７、４３、４５、４７または４９のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはその断片。
【請求項８】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはその断片。
【請求項９】
前記エンベロープタンパク質が配列番号２、３、４、５、６、７、４３、４５、４７または４９からなる、請求項６に記載の修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはその断片をコードする核酸分子。
【請求項１１】
前記核酸分子が配列番号４２、４４、４６、４８、５０、５１、５２、５３または５４を含む、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１２】
前記核酸分子が配列番号４２、４４、４６、４８、５０、５１、５２、５３または５４からなる、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記核酸分子が１つ以上の発現調節因子に操作可能に連結された、請求項１０に記載の単離された核酸分子。
【請求項１４】
請求項１０に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
【請求項１５】
請求項１０に記載の核酸分子を含むように形質転換された宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１７】
前記宿主が原核宿主細胞および真核宿主細胞からなる群より選択される、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１０に記載の核酸分子で形質転換された宿主細胞を、前記核酸分子によってコードされるポリペプチドが発現する条件下で培養する工程を含む、ポリペプチドの産生方法。
【請求項１９】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはその断片と薬学的に許容され得る担体とを含む組成物。
【請求項２０】
前記組成物がヒトにおけるワクチンとして適している、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはその断片を含む融合タンパク質。
【請求項２２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の１つ以上の修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはその断片を、抗体の産生を誘導するのに十分な量投与する工程を含む、哺乳動物における抗体産生方法。
【請求項２３】
請求項１０に記載の１つ以上の核酸分子を、抗体の産生を誘導するレベルのＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはその断片を発現するのに十分な量投与する工程を含む、哺乳動物における抗体産生方法。
【請求項２４】
請求項２２または２３に記載の方法によって産生された、単離された抗体。
【請求項２５】
前記抗体がモノクローナルである、請求項２４に記載の単離された抗体。
【請求項２６】
前記抗体が広範な交差反応性ＨＩＶ−１エンベロープ中和抗体である、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体がＨＩＶ感染を阻害する、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体が、感染した個体に存在するＨＩＶの量を減少させる効果を有する、請求項２２または２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、全体が本明細書に参照によって援用される、米国仮特許出願第６０／６０４，８０２号明細書（２００５年８月２７日出願）の利益を主張するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質、ならびにエイズの予防および治療のためのワクチンとしてのそれらの使用方法に関する。
【０００３】
連邦支援の確認
本発明は、連邦の助成ＮＩＨ  １ＲＯ１  ＡＩ３７４３３によって資金を供給された研究から一部生じた。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）による感染を予防するためのワクチンを開発する取組みは、抗体の効果に対するウイルスの耐性によって、複雑になっている。特に、多様な系統のＨＩＶ−１の感染性を中和する抗体を誘導するワクチンを開発する取組みには、限られた成功しかなかった。中和抗体は、感染を完全に予防し得る唯一の免疫学的機構なので、ワクチンの成功に重要なようである。中和抗体は、殆どまたは全ての証明されたウイルスワクチンの効果の主な機構である（ガラッソー（Ｇａｌａｓｓｏ）（１９９７年）レーブン・プレスのアンチバイラル・エージェンツ・アンド・ディジージーズ・オブ・マン（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  Ｍａｎ、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ）、７９１−８３３頁）。ＨＩＶ−１での天然の感染であっても、強い中和抗体応答と関連しない。殆どの患者において、種々のＨＩＶ系統を中和する抗体が生じる前に、長年にわたって感染は進行する（クイナン（Ｑｕｉｎｎａｎ）ら（１９９９年）エイズ・リサーチ・アンド・ヒューマン・レトロバイラシーズ（ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）１５、５６１−７０頁）。かかる長期間の後であっても、個体がＨＩＶ−１の殆どの系統を中和する抗体を生じるのは稀である。
【０００５】
中和抗体の標的であるＨＩＶ−１の成分は、エンベロープタンパク質スパイクである。スパイクを含む必須の単位は、１２０ｋｄ表面タンパク質（ｇｐ１２０）および４１ｋｄ膜貫通タンパク質（ｇｐ４１）で構成されるダイマーである。スパイクは、かかるヘテロダイマーの三量体と考えられている。ｇｐ４１分子は複合体をウイルス膜にアンカーし、ｇｐ１２０分子は、ウイルスと標的細胞上の受容体との相互作用を媒介するようにｇｐ４１分子と結合する。中和抗体を誘導し、それらと相互作用するエピトープは、ｇｐ１２０およびｇｐ４１分子中にある。ＨＩＶ−１での標的細胞の感染は多段階過程であり、ウイルスｇｐ１２０分子が標的細胞上の主なウイルス受容体であるＣＤ４に結合したときに開始する。ＣＤ４への結合は、ウイルス補助受容体である、通常ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４のいずれかであるケモカイン受容体分子に結合できるように、エンベロープタンパク質スパイクのコンフォメーション変化を誘導する。補助受容体へのエンベロープタンパク質の結合は、結果として、ウイルスの膜および標的細胞が集まって融合を経るようになるさらなるコンフォメーション変化を生じると考えられている。一旦膜融合が起こると、ウイルスコアは標的細胞に侵入して、感染過程におけるそれに続く段階を開始し得る。エンベロープタンパク質中の中和エピトープは高度にコンフォメーション依存性であり、それらの多くは、ＣＤ４または補助受容体相互作用に続いて起こるコンフォメーション遷移の間に形成され得るのみである。ＨＩＶ−１を中和する抗体を誘導するよう意図されるワクチンは、免疫系への広範な交差反応性中和抗体を誘導するエピトープの提示を結果として生じ得るように調製される形態のエンベロープタンパク質を用いて設計される。
【０００６】
ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質ベースのワクチンの調製に対する非常に様々なアプローチが、広範な交差反応性中和抗体の誘導に関して試みられているが、限られた成功しかなかった。使用されたアプローチは、種々の組み換えＤＮＡ技術を用いて調製されたエンベロープタンパク質、エンベロープタンパク質複合体の特定の構造を表す合成ペプチド、エンベロープタンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏで発現する、生きたウイルスベクター、エンベロープタンパク質およびＣＤ４の共有結合した複合体、ならびに他の物質の投与を含んでいた。以前の研究は、特有のＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を免疫原として利用し、エンベロープタンパク質のワクチンとしての提示の２つの方法を利用し、その両方とも、ウイルスの表面でとるコンフォメーションによく似た形態でＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を提示するよう設計された（トン（Ｄｏｎｇ）ら（２００３年）ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）７７、３１１９−３１３０頁）。
【０００７】
これらの研究で用いられた特有のエンベロープタンパク質は、Ｒ２と呼ばれる（クイナン（Ｑｕｉｎｎａｎ）ら（１９９９年）エイズ・リサーチ・アンド・ヒューマン・レトロバイラシーズ（ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）１５、５６１−５７０頁、クイナン（Ｑｕｉｎｎａｎ）ら、（１９９８年）エイズ・リサーチ・アンド・ヒューマン・レトロバイラシーズ（ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）１４、９３９−９４９頁、トルコーラ（Ｔｒｋｏｌａ）ら（１９９５年）ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）６９、６６０９−６６１７頁、チャン（Ｚｈａｎｇ）ら（２００２年）ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ）７６、６４４−６５５頁）。このエンベロープタンパク質をコードする遺伝子は、ＨＩＶ−１の多くの異なる初代分離株を中和する抗体を有するＨＩＶ−１感染ドナー由来の細胞から回収された。初代分離株は中和するのが困難であることがよく知られており、感染したヒト由来の血清は、一般に、少数または限られた一部のＨＩＶ−１の系統しか中和しない。ドナー由来のエンベロープタンパク質遺伝子はクローン化され、それがコードするエンベロープタンパク質は、徹底的に特徴付けられている。エンベロープタンパク質がシュードタイピングとして公知の方法を用いてＨＩＶ−１の表面で発現される場合、ウイルスは特有の特徴を示す。これは、一次受容体であるＣＤ４なしで、ＨＩＶ−１補助受容体であるＣＣＲ５を発現する細胞を感染させることが可能である。ＨＩＶ−１の他の全ての天然に生じる系統は、感染にＣＤ４を必要とする。ウイルスの他の特徴から、エンベロープタンパク質は、殆どのエンベロープタンパク質がＣＤ４への結合の後までとらないコンフォメーションであることが示唆される。Ｒ２エンベロープタンパク質は、まずＣＤ４に結合しなければＨＩＶ−１の殆どの系統を中和しないモノクローナル抗体（Ｍａｂ）による中和に感受性がある。これらのＭａｂは、ＣＤ４誘導（ＣＤ４ｉ）エピトープに対して配向があるといわれている。これらのエピトープは補助受容体結合に必要なので、これらはＨＩＶ−１の系統の間で高度に保存されている。Ｒ２エンベロープタンパク質の可変領域３（Ｖ３）における稀な変異は、そのＣＤ４非依存的感染性ならびにＣＤ４ｉＭａｂに対するその感受性に必要である。この変異は、ＨＩＶ−１の他の系統に対する、同様だが変化しやすい効果を有し、その効果がある程度Ｒ２エンベロープタンパク質中の他の配列に依存することを示す。変異は、Ｖ３ループ構造の先端付近のプロリン置換を伴う。このプロリンは、疑いなくＶ３ループのコンフォメーションに対する重大な効果を有し、明らかにＥｎｖ全体のコンフォメーションに対する重大な効果を有する。広範な交差反応性中和を誘導するのに用いられる交差反応性ＣＤ４ｉエピトープの発現を明らかに引き起こされるのは、このＥｎｖである。
【０００８】
Ｒ２エンベロープタンパク質でのマウスおよびサルの免疫に、２つの方法が用いられた（トン（Ｄｏｎｇ）ら（２００３年）ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）７７、３１１９−３１３０頁）。一方の方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ発現のためのウイルス発現ベクターの使用を含み、他方はｇｐ４１分子の一部を失うよう遺伝子工学により作られた形態のエンベロープタンパク質の投与を含んでいた（ブローダー（Ｂｒｏｄｅｒ）ら（１９９４年）プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）９１、１１６９９−１１７０３頁、アール（Ｅａｒｌ）ら（１９９４年）ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）６８、３０１５−３０２６頁）。このタンパク質はｇｐ１４０と呼ばれ、インタクトなタンパク質スパイクに類似しているが、タンパク質を発現するよう遺伝子工学によって作られた細胞によって可溶性三量体分子として生成される。ｇｐ１４０タンパク質は、そのコンフォメーションをタンパク質アジュバント中で保持する。２つの免疫方法が、別々に、および連続して用いられている。
【０００９】
Ｒ２Ｅｎｖでのマウスおよびサルの免疫は、互いに類似した、Ｒ２エンベロープタンパク質のドナー由来の血清の交差反応性に類似した交差反応パターンを有する中和抗体を誘導した。Ｒ２のドナー由来の血清は、試験された全てのＨＩＶ−１サブタイプの系統を中和するが、ＤおよびＥサブタイプよりもＡ、Ｂ、ＣおよびＦサブタイプの系統をずっとよく中和する。免疫したマウスおよびサル由来の血清は、Ａ、Ｂ、ＣおよびＦサブタイプのＨＩＶ−１系統を中和するが、ＤまたはＥサブタイプのものを中和しない。このパターンの交差反応性は、Ｒ２エンベロープタンパク質で発現されるＣＤ４ｉ中和エピトープの交差反応性を反映すると推測される。サルにおいて誘導される応答が組み換えサル−ヒト免疫不全ウイルス（ＳＨＩＶ）の試験された３つの系統の１つを中和したことは注目すべきである。中和されなかった２つの系統は、ｇｐ４１における交差反応性エピトープに対して配向のあるＭａｂである２Ｆ５による中和に感受性がある。この発見が含意するのは、Ｒ２エンベロープタンパク質は、２Ｆ５エピトープを認識する抗体の効果的な誘発因子ではないかもしれないということである。２Ｆ５はヒトＭａｂなので、交差反応性中和抗体を有する他のドナー由来のエンベロープタンパク質は、２Ｆ５エピトープを認識する抗体のＲ２よりもよい誘発因子であろうエピトープを発現し得る。
【００１０】
２Ｆ５Ｍａｂは、発見されている３つの最も高度に交差反応性のある中和ヒトＭａｂの１つなので、特に重要である（トルコーラ（Ｔｒｋｏｌａ）ら（１９９５年）ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）６９、６６０９−６６１７頁）。その重要性は、２Ｆ５および他の２つの高度に交差反応性のあるＭａｂの組み合わせがＳＨＩＶでの感染からサルを保護し得ることを示した研究において詳細に記録されている（マスコラ（Ｍａｓｃｏｌａ）ら（１９９９年）ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）７３、４００９−４０１８頁、マスコラ（Ｍａｓｃｏｌａ）ら（２０００年）ネイチャー・メディシン（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．）６、２０７−２１０頁）。２Ｆ５によって認識されるコアエピトープは、エピトープマッピング研究によって、ウイルス膜付近のｇｐ４１外部ドメインの領域に位置決定されている。コアエピトープのアミノ酸配列は、配列ＥＬＤＫＷＡＳ（配列番号１）である。しかしながら、免疫原としてこの配列またはこの配列とさらなるフランキング配列のいずれかを含む合成ペプチドを用いた中和抗体の誘導の成功した報告はない。したがって、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質が２Ｆ５エピトープに対して配向のある中和抗体を誘導する能力は、さらなる、未だ同定されていない配列に依存するか、または分子のこの領域のコンフォメーションに依存するようである。ｇｐ４１のこの領域は、標的細胞へのウイルスの付着ならびにウイルスおよび細胞膜の融合の過程の間にコンフォメーション変化を経ると考えられている。ＨＩＶ−１の殆どの系統の実際の２Ｆ５中和エピトープが、融合に関連したコンフォメーション変化が起こるまで実際に形成されないことが合理的に可能である。標的細胞相互作用なしでエピトープを中和活性形態で発現したＨＩＶ−１エンベロープタンパク質は、２Ｆ５様抗体の誘導のためのワクチン接種投与計画における使用の、特によい候補であろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
これまでに、出願人らは、ＢＣＮ抗体を有する個体からの特有のＨＩＶ−１エンベロープタンパク質遺伝子の単離を示した（例えば、国際公開第００／０７６３１号パンフレット参照）。この遺伝子によってコードされるエンベロープタンパク質はＲ２と呼ばれ、そのアミノ酸配列、およびＣＤ４なしで標的細胞に感染する能力がユニークである。Ｒ２エンベロープタンパク質は、通常ＣＤ４存在下でのみ中和感受性のあるエピトープに対するＭａｂによる中和に対して感受性を有する点で変わっている。これらのＭａｂによる中和に対するＲ２エンベロープタンパク質のＣＤ４非依存性および感受性は、両方とも、タンパク質のＶ３における変わった配列に依存している。Ｒ２エンベロープタンパク質は、免疫されたマウスおよびサルに用いられており、各種においてＢＣＮ抗体を誘導した。Ｒ２に標的とされるものとは異なる中和エピトープに対する抗体を誘導するエンベロープタンパク質は、ＨＩＶ−１感染の予防における普遍的効果に近づいた免疫原の重要な構成要素であり得る。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
本発明は、ヒトを含む哺乳動物への投与の後に広範な交差反応性抗体応答を誘導する少なくとも１つのエピトープを含む、修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはその断片を包含し、該エンベロープタンパク質は、配列番号３の６５７位または配列番号２の６５９に対応する残基でアミノ酸置換を含む。ある実施形態において、６５７位の置換は、アラニンに代わってスレオニンであるが、別の実施形態において、６５９位の置換は、リシンに代わってスレオニンである。本発明の他の実施形態において、修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはその断片は、配列番号２、３、４、５、６、７、４３、４５、４７または４９のアミノ酸配列を含むか、または配列番号２、３、４、５、６、７、４３、４５、４７または４９のアミノ酸配列からなる。
【００１３】
別の実施形態において、修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはその断片は、アミノ酸配列番号５５を含む少なくとも１つの中和抗体エピトープを含む。いくつかの実施形態において、エピトープのアミノ酸配列は配列番号２０または２５を含む。
【００１４】
本発明はまた、前述の修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはその断片のいずれかをコードする核酸を包含する。いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号４２、４４、４６、４８、５０、５１、５２、５３または５４のヌクレオチド配列を含むか、配列番号４２、４４、４６、４８、５０、５１、５２、５３または５４のヌクレオチド配列からなる。さらなる実施形態において、核酸分子は１つ以上の発現調節因子に操作可能に連結される。本発明はまた、前述の核酸のいずれかを含む核酸ベクターを包含する。本発明はさらに、トランスフェクションまたは形質転換されてこれらの核酸分子またはベクターを含む宿主細胞を包含する。宿主細胞は、真核または原核宿主細胞であり得る。本発明はこの宿主細胞を、前記核酸分子によってコードされるポリペプチドが発現される条件下で宿主細胞を培養する工程を含む、ポリペプチドの生成方法を含む。
【００１５】
本発明は、上述のような、修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質もしくはその断片、またはこれらのポリペプチドをコードする核酸、および薬学的に許容され得る担体を含有する、組成物を含む。ある実施形態において、組成物は、ヒトにおけるワクチンとして適している。
【００１６】
本発明は、前述の修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはその断片を含む融合タンパク質を含む。本発明はまた、１つ以上の前述の修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはその断片を、抗体の産生を誘導するのに十分な量投与する工程を含む、哺乳動物において抗体を生じる方法を含む。本発明はさらに、前述の修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはその断片のいずれかをコードする少なくとも１つの核酸を、抗体の産生を誘導するレベルのＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはその断片を発現するのに十分な量投与する工程を含む、哺乳動物において抗体を生じる方法を含む。本発明は、これらの方法のいずれかによって生成された抗体を含む。ある実施形態において、抗体はモノクローナルであるが、他の実施形態において、抗体は広範な交差反応性ＨＩＶ−１エンベロープ中和抗体である。ある実施形態において、抗体は、ＨＩＶ感染を阻害し、かつ／または感染した個体に存在するＨＩＶの量を減少させるのに効果的である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
詳細な説明
ＨＩＶ−１感染した一群のドナーから、誰が広範な交差反応性中和抗体を有するかを同定した。ドナー由来の血清を、関連の遠いＨＩＶ−１の初代分離株の中和に関してスクリーニングして、広範に交差中和する（ＢＣＮ）と考えられるものを同定した。これらのエンベロープタンパク質およびそれらをコードする遺伝子は、本発明の主題である。
【００１８】
ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質
本発明は、広範な交差反応性中和抗体に結合するエピトープを発現する、単離または修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を包含する。通常、かかるエピトープは、エンベロープタンパク質の結合およびそれに続くエピトープを露出させるためのコンフォメーション変化によって現れるために、細胞表面受容体（例えば、ＣＤ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４等）へのエンベロープタンパク質の融合の間に一時的に発現されるのみである。したがって、エンベロープタンパク質が細胞表面受容体に結合しない場合、かかるエピトープは、一般にエンベロープタンパク質の表面に提示されず、そのため広範な交差反応性抗エンベロープタンパク質抗体の結合（または相互作用）に利用できない。本発明の単離されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質は、その表面に、細胞表面受容体への結合なしにこれらのエピトープを発現する。これらのエピトープの発現は、ＢＣＮ応答の誘導の原因である。
【００１９】
したがって、本発明は、広範な交差反応性中和抗体の産生および結合を誘導できるエピトープを含む、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはその断片を含む。ある実施形態において、エピトープは、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質が細胞表面受容体に結合しているか否かにかかわらず提示されるＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の三次元構造の構成要素を包含する。ある実施形態において、これらのエピトープは、修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質由来の直鎖状アミノ酸配列である。これらのエピトープは、殆どのＨＩＶエンベロープタンパク質において細胞表面受容体への結合の間に一時的に発現されるだけのエピトープ中のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含む。それにも関わらず、細胞表面受容体に結合したエンベロープタンパク質なしに三次元構造がタンパク質表面に提示される。これらのエピトープを含むＨＩＶ−１エンベロープタンパク質は、ヒトにおける広範な交差反応性中和抗体応答に関連する。発現されたエピトープを含むポリペプチドの例としては、配列番号２（１４００／４）、３（２４００／４）または５５が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
結果として広範な交差反応性中和抗血清を誘導するエピトープを有するエンベロープタンパク質を生じる、一次アミノ酸配列に修飾を含むＨＩＶ−１エンベロープタンパク質もまた、本発明に包含される。かかる置換は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方における、広範な交差反応性中和抗体応答の誘導を与える。かかる変化としては、配列番号２のアミノ酸残基６５９（１４００／４）および配列番号３の残基６５７（２４００／４）に対応する位置でのアミノ酸置換が挙げられるが、これらに限定されない。これらおよび他の位置のアミノ酸残基は、免疫原性を促進するように、単独で、または他の部位と組み合わせて、体系的に修飾され得る。Ｒ２エンベロープタンパク質（配列番号４１）は、高度に多様化した系統のＨＩＶ−１に対して活性のある中和抗体を誘導する例外的な能力を有し、この免疫原性は、残基３１３および３１４のプロリン−メチオニン配列の存在に対応する。アミノ酸残基３１３および３１４の、これらの位置のコンセンサス配列であるヒスチジン−イソロイシンでの置換は、通常発現にＨＩＶ−１エンベロープとその一次受容体であるＣＤ４との相互作用を必要とするエピトープの構成的発現をなくす。かかる修飾にもかかわらず、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質のコンフォメーションは、ビリオンの構成要素として存在する場合に感染性を維持するのに十分にインタクトなままである。かかる活性のあるエピトープのあるエンベロープタンパク質を有するＨＩＶ−１系統に感染した個体（すなわちヒト）は、複数のサブタイプのＨＩＶ−１のウイルス感染性を減少またはブロックする免疫応答を発現し得る。
【００２１】
本発明のエンベロープタンパク質は、１つ以上のエピトープ部位が修飾された、全長エンベロープタンパク質、および１つ以上の修飾エピトープ部位を含むその断片を含む。ある実施形態においては１つ以上のアミノ酸残基が欠失するが、別の実施形態においては、これらの部位の１つ以上が、エピトープのコンフォメーションを変化させる別のアミノ酸と置換される。置換され得るアミノ酸の例としては、任意の天然に生じるアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。置換され得る好ましい天然に生じるアミノ酸としては、スレオニン、リシンおよびプロリンが挙げられるが、これらに限定されない。修飾されたアミノ酸はまた、任意のエピトープ部位で置換され得る。
【００２２】
ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の既知のエピトープ部位の相対的位置は、複数のＨＩＶ−１エンベロープタンパク質配列のアミノ酸配列アラインメントによって決定され得る。他の系統のエンベロープタンパク質のアミノ酸およびヌクレオチド配列情報は、本明細書に参照によって援用されるクイケン（Ｋｕｉｋｅｎ）ら（２００２年）ロス・アラモス国立研究所ＬＡ−ＵＲ０３−３５６４のＨＩＶシークエンス・コンペンディウム（ＨＩＶ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＬＡ−ＵＲ０３−３５６４）において参照される。例示的なエピトープ部位としては、２Ｆ５および４Ｅ１０モノクローナル抗体の結合エピトープが挙げられる（ムスター（Ｍｕｓｔｅｒ）ら（１９９４年）ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）６８、４０３１−４０３４頁、ムスター（Ｍｕｓｔｅｒ）ら（１９９３年）ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）６７、６６４２−６６４７頁。２Ｆ５エピトープアミノ酸配列（ＥＬＤＫＷＡＳ（配列番号１））は、配列番号４の残基６５４〜６６０および配列番号６の残基６５７〜６６３に対応するが、４Ｅ１０エピトープ（ＮＷＦＤＩＴ（配列番号８））は配列番号４の残基６６３〜６６８および配列番号６の残基６６６〜６７１に対応する。同じアミノ酸残基番号を有し得ない、他のＨＩＶ−１分離株由来のエンベロープタンパク質における、２Ｆ５および４Ｅ１０モノクローナル抗体エピトープを同様に含む対応する残基は、本明細書中で述べるアミノ酸配列アラインメントによって容易に決定され得る。
【００２３】
別の実施形態において、本発明は、残基６６２に対応するアミノ酸に修飾を含む１つ以上の修飾エピトープ部位を含む、配列番号２、３、４、５、６、７、４３、４５、４７、または４９に示されるアミノ酸配列を含むＨＩＶ−１エンベロープタンパク質ならびにその断片を包含する。さらに別の実施形態において、本発明は、配列番号２２、３、４、５、６、７、４３、４５、４７または４９に示されるアミノ酸配列からなるＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を包含する。
【００２４】
核酸分子
本発明はさらに、１つ以上の修飾エピトープを好ましくは単離された形態で含む、単離もしくは修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはその断片をコードする、核酸分子を提供する。本明細書中で使用される場合、「核酸」は、上で定義したタンパク質またはペプチドをコードするＲＮＡまたはＤＮＡと定義されるか、かかるペプチドをコードする核酸配列に相補的であるか、単離または修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質をコードする核酸分子にオープンリーディングフレームにわたって適切なストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするか、または単離または修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質と少なくとも約７５％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％またはさらには９５％以上の同一性を共有するポリペプチドをコードする。
【００２５】
本発明の核酸分子はさらに、具体的にはオープンリーディングフレームにわたって、単離または修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質をコードする核酸分子の核酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％または９５％以上の同一性を共有する、核酸分子を含む。ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびアンチセンス分子、ならびに天然起源由来または合成のいずれでも、代替的バックボーンに基づくかまたは代替的塩基を含む核酸が、特に企図される。しかしながら、かかる核酸は、適切なストリンジェンシー条件下でコード、ハイブリダイズするか、または本発明のタンパク質をコードする核酸に相補的であるものを含む、いずれの従来技術の核酸に対しても新規であり自明でないとしてさらに定義される。
【００２６】
ヌクレオチドまたはアミノ酸配列レベルでの相同性または同一性は、配列相同性検索のために調整された、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘのプログラムによって使用されるアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴ（ベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ））解析によって測定され得る（アルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９７年）ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）２５、３３８９−３４０２頁およびカーリン（Ｋａｒｌｉｎ）ら（１９９０年）プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８７、２２６４−２２６８頁、共に参照によって完全に援用される）。ＢＬＡＳＴプログラムによって用いられるアプローチは、まず、ギャップありまたはなしで、クエリー配列とデータベース配列との間の類似したセグメントを考慮し、次いで同定された全ての対の統計上の有意性を評価し、最後に、予め選択された有意性の閾値を満たす対のみを要約する。配列データベースの相同性検索における基本的問題の説明については、参照によって完全に援用される、アルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９４年）ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）６、１１９−１２９頁を参照のこと。ヒストグラム、作図、アラインメント、期待値（すなわち、データベース配列に対する対を報告するための統計上の有意性閾値）、カットオフ、マトリックスおよびフィルター（低複雑度）に関する検索パラメータは、デフォルト設定である。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘによって用いられるデフォルトスコア行列は、８５を超える長さ（ヌクレオチド塩基またはアミノ酸）のクエリー配列に関して推奨されるＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（参照によって完全に援用される、ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）ら（１９９２年）プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８９、１０９１５−１０９１９頁）。
【００２７】
ｂｌａｓｔｎに関して、スコア行列は、Ｍ（すなわち１対のマッチした残基のリワードスコア）対Ｎ（すなわち、ミスマッチ残基のペナルティスコア）の比によって設定され、ここでＭおよびＮのデフォルト値はそれぞれ＋５および−４である。４つのｂｌａｓｔｎパラメータを、以下のように調節した。Ｑ＝１０（ギャップ開始ペナルティ）、Ｒ＝１０（ギャップ伸長ペナルティ）、ｗｉｎｋ＝１（クエリーの第ｗｉｎｋ目の位置で文字列ヒットを生じる）、およびｇａｐｗ＝１６（ギャップのあるアラインメントが生じるウィンドウ幅を設定する）。同等なＢｌａｓｔｐパラメータ設定は、Ｑ＝９、Ｒ＝２、ｗｉｎｋ＝１、およびｇａｐｗ＝３２であった。ＧＣＧパッケージ・バージョン１０．０で利用可能な配列間のベストフィット（Ｂｅｓｔｆｉｔ）比較はＤＮＡパラメータＧＡＰ＝５０（ギャップ開始ペナルティ）およびＬＥＮ＝３（ギャップ伸長ペナルティ）を使用し、タンパク質比較における同等の設定はＧＡＰ＝８およびＬＥＮ＝２である。
【００２８】
「ストリンジェントな条件」は、（１）洗浄に低イオン強度および高温、例えば０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ＳＤＳを５０℃〜６８℃で使用するもの、または（２）ハイブリダイゼーションの間にホルムアミド等の変性剤、例えば０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）を含む５０％（体積／体積）ホルムアミドを４２℃で使用するものである。別の例は、４２℃で０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中または６８℃で０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中の洗浄を伴う、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、ソニケートしたサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳおよび１０％硫酸デキストラン中４２℃でのハイブリダイゼーションである。当業者は、ストリンジェンシー条件を容易に適切に決定および変化させて明確で検出可能なハイブリダイゼーションシグナルを得ることができる。好ましい分子は、配列番号２、３、４、５、６および７を含むタンパク質をコードして機能的なタンパク質をコードする核酸配列の相補体と上述の条件下でハイブリダイズするものである。さらにより好ましい、ハイブリダイズする分子は、単離または修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質をコードする核酸のオープンリーディングフレームの相補鎖に上述の条件下でハイブリダイズするものである。例としては、配列番号４２、４４、４６、４８、５０、５１、５２、５３または５４に示されるヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用される場合、他のポリペプチドをコードする混入した核酸分子から核酸分子が実質的に分離された場合に、核酸分子は「単離された」といわれる。
【００２９】
本発明はさらに、エンベロープタンパク質に所望の修飾（すなわち、選択されたエピトープ中の１つ以上のアミノ酸の修飾）を含む、コード核酸分子の断片を提供する。本明細書中で使用される場合、コード核酸分子の断片は、タンパク質コード配列全体のうちのごく一部をいう。断片の大きさは、目的とする使用によって決定されよう。例えば、断片がタンパク質の活性部分（すなわち、本明細書に記載されるような、選択されたモノクローナル抗体エピトープまたはかかるエピトープの修飾）をコードするように選択される場合、断片はタンパク質の機能領域（すなわちエピトープ）をコードするのに十分大きい必要があろう。例えば、予測される抗原性領域に対応するペプチドをコードする断片が調製され得る。断片が核酸プローブまたはＰＣＲプライマーとして用いられる場合、断片の長さは、プロービング／プライミングの間に比較的少数の擬陽性を得るように選択される。
【００３０】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子配列を合成するのに用いられる本発明のコード核酸分子の断片（すなわち合成オリゴヌクレオチド）は、化学的技術、例えばマテウッチィ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）ら（１９８１年）ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）１０３、３１８５−３１９１頁のホスホトリエステル法によって、または自動化合成法を用いて、容易に合成され得る。また、遺伝子の種々のモジュラーセグメントを定義する一群のオリゴヌクレオチドの合成等の周知の方法、それに続く完全な修飾遺伝子を構築するオリゴヌクレオチドのライゲーションによって、より大きいＤＮＡセグメントを容易に調製し得る。
【００３１】
本発明のコード核酸分子はさらに、診断およびプローブ目的で、検出可能な標識を含むように修飾され得る。種々のかかる標識は当該技術分野で公知であり、本明細書に記載されるコード分子とともに容易に使用され得る。適した標識としては、ビオチン、放射性同位元素標識ヌクレオチド等が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、任意のかかる標識を容易に使用して、本発明の核酸分子の、標識された変異体を得ることができる。翻訳の間にタンパク質配列に組み込まれるアミノ酸の欠失、付加または変化による一次構造自体に対する修飾は、タンパク質の活性を破壊することなくなされ得る。かかる置換または他の変化は、結果として、本発明の企図される範囲内に包含される核酸によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質を生じる。
【００３２】
組み換え核酸
本発明はさらに、コード配列を含む組み換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）を提供する。本明細書中で使用される場合、ｒＤＮＡ分子は、ｉｎ  ｓｉｔｕで分子操作に供されたＤＮＡ分子である。ｒＤＮＡ分子を生じる方法は当該技術分野で周知であり、例えばコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレスのサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（２００１年）モレキュラー・クローニング−ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を参照のこと。好ましいｒＤＮＡ分子において、コードＤＮＡ配列は、発現制御配列および／またはベクター配列に、操作可能に連結される。
【００３３】
本発明のタンパク質ファミリーコード配列の１つが操作可能に連結されるベクターおよび／または発現調節配列の選択は、当該技術分野で周知のように、直接、所望の機能特性、例えばタンパク質発現、および形質転換される宿主細胞に依存する。本発明によって企図されるベクターは、少なくともｒＤＮＡ分子に含まれる構造遺伝子の、複製または宿主染色体への挿入、および好ましくは発現も、指示することができる。
【００３４】
操作可能に連結されたタンパク質コード配列の発現を調節するために用いられる発現調節因子は当該技術分野で公知であり、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナルおよび他の調節因子が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、誘導性プロモーターは、宿主細胞の培地中の栄養分に反応性がある等、容易に制御される。
【００３５】
ある実施形態において、コード核酸分子を含むベクターは、原核レプリコン、すなわちそれで形質転換された組み換えＤＮＡ分子の自律増殖および維持を細菌宿主細胞等の原核宿主細胞において染色体外で指示する能力を有するＤＮＡ配列を、含むであろう。かかるレプリコンは当該技術分野で周知である。また、原核レプリコンを含むベクターはまた、発現によって薬剤耐性等の検出可能なマーカーを与える遺伝子を含み得る。典型的な細菌の薬剤耐性遺伝子は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を与えるものである。
【００３６】
原核レプリコンを含むベクターはさらに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の細菌宿主細胞のコード遺伝子配列の発現（転写および翻訳）を指示することができる原核またはバクテリオファージプロモーターを含み得る。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写が起こるようになるＤＮＡ配列によって形成される発現調節因子である。細菌宿主に適合性のあるプロモーター配列は、典型的には、本発明のＤＮＡセグメントの挿入に簡便な制限酵素認識部位を含むプラスミドベクター中に提供される。ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ））、ｐＰＬおよびｐＫＫ２２３（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））が、かかるベクタープラスミドを代表する。
【００３７】
真核細胞に適合性のある発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞に適合性のあるものもまた、コード配列を含むｒＤＮＡ分子の形成に用いられ得る。ウイルスベクターを含む真核細胞発現ベクターは、当該技術分野で周知であり、いくつかの商業的供給源から入手可能である。典型的には、かかるベクターは、所望のＤＮＡセグメントの挿入に簡便な制限酵素認識部位を含んで提供される。ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））、ｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ（インターナショナル・バイオテクノロジース・インク（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．））、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ）、本明細書に記載されるベクターｐＣＤＭ８等の真核発現ベクターが、かかるベクターを代表する。
【００３８】
本発明のｒＤＮＡ分子の構築に用いられる真核細胞発現ベクターはさらに、真核細胞において効果的な選択可能なマーカー、好ましくは薬剤耐性選択マーカーを含み得る。好ましい薬剤耐性マーカーは、発現が結果としてネオマイシン耐性を生じる遺伝子、すなわちネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子である（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）ら（１９８２年）ジャーナル・オブ・モレキュラー・アプライド・ジェネティクス（Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．）１、３２７−３４１頁）。あるいは、選択可能なマーカーは別のプラスミド上に存在し得、２つのベクターは宿主細胞のコトランスフェクションによって導入され、選択可能なマーカーに適切な薬剤中で培養することによって選択される。本発明はさらに、本発明のタンパク質をコードする核酸分子で形質転換された宿主細胞を提供する。宿主細胞は、原核または真核のいずれかであり得る。
【００３９】
本発明のタンパク質の発現に有用な真核細胞は、細胞系が細胞培養方法に適合性があり、発現ベクターの増殖および遺伝子産物の発現に適合性のある限りは、限定されない。好ましい真核宿主細胞としては、酵母、昆虫および哺乳動物細胞、好ましくはマウス、ラット、サルまたはヒト細胞系由来のもの等の脊椎動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい真核宿主細胞としては、ＡＴＣＣからＣＣＬ６１として入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５８として入手可能なＮＩＨスイスマウス胚細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）等の真核組織培養細胞系が挙げられるが、これらに限定されない。任意の原核宿主を用いて、本発明のタンパク質をコードするｒＤＮＡ分子を発現し得る。好ましい原核宿主は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
【００４０】
本発明のｒＤＮＡ分子での適切な細胞宿主の形質転換は、典型的には用いられるベクターおよび使用される宿主系のタイプに依存する、周知の方法によって達成される。原核宿主細胞の形質転換に関して、エレクトロポレーションおよび塩処理法が典型的に使用され、例えば、コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら（１９７２年）プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）６９、２１１０頁、およびコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレスのサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（２００１年）モレキュラー・クローニング−ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を参照のこと。ｒＤＮＡを含むベクターでの脊椎動物細胞の形質転換に関しては、エレクトロポレーション、カチオン性脂質法または塩処理法が典型的に使用され、例えば、グレーアム（Ｇｒａｈａｍ）ら（１９７３年）バイロロジー（Ｖｉｒｏｌ．）５２、４５６頁、ウィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）ら（１９７９年）プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）７６、１３７３−１３７６頁を参照のこと。
【００４１】
形質転換が成功した細胞、すなわち本発明のｒＤＮＡ分子を含む細胞は、選択可能なマーカーに関する選択を含む、周知の技術によって同定され得る。例えば、本発明のｒＤＮＡの導入によって生じた細胞をクローニングして、シングルコロニーを生じ得る。これらのコロニー由来の細胞を採取し、溶解し、サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）（１９７５年）ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）９８、５０３−５０４頁またはベレント（Ｂｅｒｅｎｔ）ら（１９８５年）バイオテクノロジース（Ｂｉｏｔｅｃｈ．）３、２０８−２０９頁によって記載されるもの等の方法、または免疫学的方法を介してアッセイされる細胞から生成されるタンパク質を用いて、そのＤＮＡ内容物をｒＤＮＡの存在に関して検査し得る。
【００４２】
組み換えタンパク質の生成
本発明の単離または修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質をコードする組み換え核酸分子を作製する方法を、当業者は知っているであろう。さらに、当業者は、１つ以上のエピトープ部位に１つ以上の修飾を含む単離または修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質をコードする組み換え核酸分子に関して本明細書に記載されるように、これらの組み換え核酸分子を用いて、それによってコードされるタンパク質を得る方法を知っているであろう。ある実施形態において、組み換えエンベロープタンパク質またはその断片は、配列番号２の残基６５９に対応する位置でアミノ酸残基の置換（例えば、アラニンに代わってスレオニン）を含む。
【００４３】
本発明によれば、単離または修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の発現のための非常に多くのベクター系が使用され得る。例えば、ある型のベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶまたはＭｏＭＬＶ）、セムリキ森林熱ウイルスまたはＳＶ４０ウイルス等の動物ウイルスに由来するＤＮＡ要素を利用する。さらに、ＤＮＡを染色体に安定して組み込んだ細胞は、形質転換宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することによって選択され得る。マーカーは、例えば、栄養要求株の宿主へのプロトトロピー（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｙ）、除菌剤耐性、（例えば抗生物質）または銅等の重金属に対する耐性などを提供し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接連結されるか、または同時形質転換によって同じ細胞に導入されるかのいずれかであり得る。さらなる要素もまた、ｍＲＮＡの最適な合成に必要とされ得る。これらの要素としては、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサーおよび終止シグナルを挙げることができる。かかる要素を組み込むｃＤＮＡ発現ベクターとしては、オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）（１９８３年）モレキュラー・セル・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）３、２８０−２８９頁によって記載されているものが挙げられる。
【００４４】
本発明で用いられるベクターは、培養された真核細胞中で高レベルのＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を発現するよう、ならびにこれらのタンパク質を培地中に効率的に分泌するよう設計される。ある実施形態において、培地へのＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の標的化は、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の成熟したＮ末端に組織プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）プレプロシグナル配列をインフレームで融合することによって達成される。
【００４５】
ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質は、（ａ）ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質をコードする発現ベクターで哺乳動物細胞をトランスフェクションする工程、（ｂ）得られた、トランスフェト哺乳動物細胞を、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質が産生される条件下で培養する工程、（ｃ）細胞培地または細胞自体からＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を回収する工程によって生成され得る。
【００４６】
一旦、発現ベクター、またはコンストラクトを含むＤＮＡ配列が発現のために調製されると、発現ベクターは、適切な哺乳動物細胞宿主にトランスフェクションまたは導入され得る。例えばプロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーションまたは他の従来の技術等、種々の技術を使用してこれを達成し得る。プロトプラスト融合の場合、細胞は培地中で培養され、適切な活性に関してスクリーニングされる。
【００４７】
得られた、トランスフェクションされた細胞の培養、およびそのように生成されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の回収の、方法および条件は、当業者に周知であり、使用される特定の発現ベクターおよび哺乳動物宿主細胞に依存して変更または最適化され得る。
【００４８】
権利請求の対象となる本発明によれば、本発明のＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の発現に好ましい宿主細胞は、哺乳動物細胞系である。哺乳動物細胞系としては、例えば、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７）、ヒト胎児由来腎臓系２９３（ＨＥＫ２９３）、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＤＨＦＲ（ＣＨＯ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＤＨＦＲ（ＤＸＢ１１）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳癌（ＭＭＴ０６０５６２）、マウス細胞系（Ｃ１２７）および骨髄腫細胞系が挙げられる。
【００４９】
非哺乳動物ベクター／細胞系の組み合わせを利用する他の真核発現系を用いて、エンベロープタンパク質を生成し得る。これらのものとしては、バキュロウイルスベクター／昆虫細胞発現系および酵母シャトルベクター／酵母細胞発現系が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
培地からのＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の精製の方法および条件が本発明において提供されるが、これらの手順は、当業者に周知のように、変更および最適化され得ることが理解されるべきである。
【００５１】
本発明のＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはその断片はまた、任意の公知の合成技術によって調製され得る。従来、このタンパク質は、本明細書に参照によって援用されるメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）（１９６５年）によって最初に記載された固相合成技術を用いて調製され得る。他のペプチド合成技術は、例えば、ボダンスキー（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ）ら（１９７６年）、ワイリーのペプチド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｗｉｌｅｙ）に見ることができる。
【００５２】
ＨＩＶ−１エンベロープ融合タンパク質
ＨＩＶ−１エンベロープ融合タンパク質およびかかるタンパク質を生じる方法は、これまでに記載されている（米国特許第５，８８５，５８０号明細書）。今や、外来性遺伝子を発現する細胞を調製することは比較的簡単な技術である。かかる細胞は宿主として機能し、本発明の融合タンパク質に関しては、酵母、真菌、昆虫細胞、植物細胞または動物細胞が挙げられる。これらの宿主細胞の多くのための発現ベクターは、単離および特徴づけされており、従来の組み換えＤＮＡ技術を介した、目的の外来性ＤＮＡインサートを有するベクターの構築の出発物質として用いられている。ＤＮＡインサートの発現に用いられる宿主細胞に天然に由来しない場合、任意のＤＮＡが外来性である。外来性ＤＮＡインサートは、染色体外プラスミド上で、または宿主細胞への全体もしくは部分的な組み込み後に発現され得るか、または１つより多い分子形態の組み合わせとして宿主細胞中に実際に存在し得る。所望の外来性ＤＮＡの発現のための宿主細胞および発現ベクターの選択は、主として、宿主細胞の入手可能性およびその選好性の程度、宿主細胞が発現ベクターの複製を支持するか否か、ならびに当業者に容易に理解される他の要因に依存する。
【００５３】
目的の外来性ＤＮＡインサートは、このコード能力もしくは任意のかかるクローン配列またはそれらの組み合わせを有する任意の合成配列を含む融合タンパク質をコードする任意のＤＮＡ配列を含む。例えば、完全な組み換えＤＮＡ配列によってコードおよび発現される融合タンパク質が本発明に包含されるが、他の技術によって得られた融合タンパク質ペプチドを除外しない。
【００５４】
融合タンパク質の生成のための真核発現系の構築に有用なベクターは、そこにプロモーターおよび／またはオペレーター等の適切な転写活性化ＤＮＡ配列とともに操作可能に連結された、融合タンパク質のＤＮＡ配列を含む。他の典型的な特徴としては、適切なリボソーム結合部位、終止コドン、エンハンサー、ターミネーターまたはレプリコン要素を挙げることができる。これらのさらなる特徴は、制限エンドヌクレアーゼ消化およびライゲーション等の従来のスプライシング技術によって、適切な部位でベクターに挿入され得る。
【００５５】
酵母発現系は、組み換え真核発現系の好ましい種類であるが、一般に、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を、組み換えタンパク質を発現するための最適な種として使用する。サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の他の種は、組み換え酵母発現系に適しており、カルルスベルジェンシス（ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、ウバルム（ｕｖａｒｕｍ）、ロウキシイ（ｒｏｕｘｉｉ）、モンタヌス（ｍｏｎｔａｎｕｓ）、クルイベリ（ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、エロンジスポルス（ｅｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ）、ノルベンシス（ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、オビフォルミス（ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）およびジアスタティクス（ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および同様の酵母は、酵母において活性のある発現系の構築に有用な周知のプロモーターを有し、ＧＡＰ、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ２、ＰＨＯ５、およびα接合因子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
融合タンパク質の発現のための組み換え酵母発現系の構築に有用な酵母ベクターとしては、シャトルベクター、コスミドプラスミド、キメラプラスミド、および２ミクロン環状プラスミドに由来する配列を有するものが挙げられるが、これらに限定されない。これらのベクターへの、融合タンパク質をコードする適切なＤＮＡ配列の挿入は、原則的に、結果として、修飾されたベクターが形質転換または他の手段によって適切な宿主細胞に挿入される、融合タンパク質のための有用な組み換え酵母発現系を生じる。組み換え哺乳動物発現系は、本発明のワクチン／免疫原のための融合タンパク質の生成の別の手段である。一般に、宿主哺乳動物細胞は、細胞培養物中で効率的にクローンニングされた任意の細胞であり得る。しかしながら、哺乳動物発現の選択肢は器官培養物およびトランスジェニック動物を含むように拡張され得ることは、当業者に明らかである。組み換え哺乳動物発現系の構築の目的に有用な宿主哺乳動物細胞としては、ベロ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３、ＧＨ３、ＣＯＳ、ネズミＣ１２７またはマウスＬ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。哺乳動物発現ベクターは、ウイルスベクター、ＳＶ４０、ＢＰＶもしくは他のウイルスレプリコンを有し得るプラスミドベクター、または動物細胞のレプリコンのないベクターに基づき得る。哺乳動物発現ベクターに関する詳細な説明は、グラバー（Ｇｌｏｖｅｒ）（１９８５年）、ＩＲＬプレスのＤＮＡクローニング：プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）の論文に見ることができる。
【００５７】
融合タンパク質は、同じ有機的に合成されたペプチドと共有しない、アデニル化、カルボキシル化、Ｎ−およびＯ−グリコシル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化またはミリスチル化等のさらなる好ましい構造変化を有し得る。これらの追加の特徴は、場合により、組み換え発現系の適切な選択によって、選択され得るか、または好まれ得る。一方、融合タンパク質は、有機合成の原則および慣習によって伸長された配列を有し得る。
【００５８】
ワクチン組成物
ワクチンまたは免疫原性組成物中で用いられる場合、本発明の単離もしくは修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはその断片は、「サブユニット」ワクチンまたは免疫原として用いられ得る。かかるワクチンまたは免疫原は、安全性および生産のコストに関して、伝統的なワクチンと比較して大きな利益を提供する。しかしながら、サブユニットワクチンは、しばしば、全ウイルスワクチンよりも免疫原性が低く、その完全な能力に達するために、相当な免疫賦活能力を有するアジュバントが必要とされ得ることがあり得る。
【００５９】
現在、米国においてヒトへの使用に認可されたアジュバントとしては、アルミニウム塩（ミョウバン）が挙げられる。これらのアジュバントは、Ｂ型肝炎、ジフテリア、ポリオ、狂犬病およびインフルエンザを含むいくつかのワクチンに有用であった。他の有用なアジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）、ムラミルジペプジド（ＭＤＰ）、ＭＤＰの合成類似体、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−［１，２−ジパルミトイル−ｓ−グリセロ−３−（ヒドロキシホスホリルオキシ）］エチルアミド（ＭＴＰ−ＰＥ）、ならびに分解性油および乳化剤を含有する組成物が挙げられ、ここで油および乳化剤は、実質的に全てが直径１ミクロン未満である油滴を有するＯ／Ｗエマルションの形態で存在する。
【００６０】
本発明のワクチンまたは免疫原性組成物の製剤化は、効果的な量のタンパク質またはペプチド抗原を利用するであろう。すなわち、それに続くＨＩＶへの曝露からの保護を被験体に与えるように、アジュバントと組み合わせて被験体に特異的および十分な免疫学的応答を生じさせる量の抗原が含まれるであろう。免疫原性組成物として用いられる場合、製剤は、アジュバントと組み合わせて、診断または治療目的で用いられ得る特異的抗体を被験体に産生させる量の抗原を含むであろう。
【００６１】
本発明のワクチン組成物は、ＨＩＶ−１感染の予防または治療に有用であり得る。ＨＩＶ−１に苦しみ得る全ての動物はこの方法で治療され得るが、本発明は特に、勿論、ヒトにおける本発明のワクチンの予防的および治療的使用に関するものである。しばしば、所望の予防または治療効果を引き起こすために、１回より多い投与が必要とされ得る。正確なプロトコール（用量および頻度）は、標準的臨床手順によって確立され得る。
【００６２】
ワクチン組成物は、ワクチンを動物に誘導する任意の従来の方法で、通常注射によって、投与される。経口投与のために、ワクチン組成物は、他のタンパク質性物質の経口投与に用いられるものと同様な形態で投与され得る。上述のように、予防または療法のいずれかにおける使用のための正確な量および製剤化は、抗体の固有の純度および活性の環境、任意のさらなる成分または担体、投与の方法等に依存して変化し得る。
【００６３】
非限定的な例示として、投与されるワクチン投薬は、典型的には、抗原に関して、最小約０．１ｍｇ／用量、より典型的には最小約１ｍｇ／用量およびしばしば最小約１０ｍｇ／用量であろう。最大用量は、典型的にはそれほど重要でない。しかしながら、通常、投薬は５００ｍｇ／用量以下、しばしば２５０ｍｇ／用量以下であろう。これらの投薬は、任意の適切な薬学的ビヒクルまたは担体中に、その投薬を媒介するのに十分な体積で懸濁され得る。一般に、担体、アジュバント等を含む最終体積は、典型的には少なくとも０．１ｍｌ、より典型的には少なくとも約０．２ｍｌであろう。上限は、投与される量の実際的なことによって決定され、一般に約０．５ｍｌ以下〜約１．０ｍｌである。
【００６４】
代替的形式において、ワクチンまたは免疫原性組成物は、宿主動物中でＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはその断片を発現するワクチンベクターとして調製され得る。任意の入手可能なワクチンベクターが用いられ得、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（米国特許第５，６４３，５７６号明細書参照）、ポリオウイルス（米国特許第５，６３９，６４９号明細書参照）、ポックスウイルス（米国特許第５，７７０，２１１号明細書参照）およびワクシニアウイルス（米国特許第４，６０３，１１２号明細書および第５，７６２，９３８号明細書参照）が挙げられる。あるいは、タンパク質またはその断片をコードする裸の核酸を直接投与して抗原の発現をもたらし得る（米国特許第５，７３９，１１８号明細書参照）。
【００６５】
ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはその断片は、種々の組み合わせで免疫原として用いられ得る。例えば、１４／００／４等のｇｐ４１の１つ以上のエピトープに対する抗体を誘導すると期待されるエンベロープタンパク質を、Ｒ２等のｇｐ１２０のエピトープに対する抗体を誘導すると期待されるエンベロープ糖タンパク質と組み合わせて用い得る。さらなるエンベロープ糖タンパク質を、免疫養生法、特にさらなるエピトープに対する抗体を誘導するか、または異なるサブタイプのＨＩＶ−１によって発現される同じエピトープの変異体形態を示すエンベロープにおいて、組み合わせ得る。ＨＩＶ−１のある系統由来のｇｐ１２０およびＨＩＶ−１の他の系統由来のｇｐ４１等、これらのエンベロープ糖タンパク質の異なるセグメントを用い得る。
【００６６】
抗体および使用の方法
本発明はさらに、本発明の単離または修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質上の発現されたエピトープに対する、ヒト細胞への複数のサブタイプのＨＩＶ−１の結合のブロックならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏの両方でＨＩＶ−１によるヒト細胞の感染の予防のできるヒトモノクローナル抗体を提供する。ある実施形態において、エピトープ中のアミノ酸の１つ以上の置換または欠失によって修飾された公知のエピトープに対するこれらの抗体。公知の抗体エピトープの例としては、２Ｆ５および４Ｅ１０モノクローナル抗体エピトープが挙げられるが、これらに限定されない。２Ｆ５エピトープにおけるアミノ酸置換としては、配列番号２の残基６５９に対応する位置でのアラニンに代わってスレオニンが挙げられるが、これに限定されない。
【００６７】
本発明のモノクローナル抗体は、検出可能なマーカーで標識され得る。本発明の実施に有用な検出可能なマーカーは当業者に周知であり、放射性同位体、色素、またはペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ等の酵素であり得るが、これらに限定されない。また、本発明のモノクローナル抗体は、細胞毒性薬剤と結合され得る。
【００６８】
本発明はまた、本発明のエンベロープタンパク質に結合するヒトモノクローナル抗体に対して配向のある抗イディオタイプ抗体に関する。この抗イディオタイプ抗体はまた、検出可能なマーカーによって標識され得る。適した検出可能なマーカーは当業者に周知であり、放射性同位体、色素、またはペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ等の酵素であり得るが、これらに限定されない。
【００６９】
抗イディオタイプ抗体は、動物が本発明のＨＩＶ−１エンベロープタンパク質に結合するモノクローナル抗体を注射された場合に生成される。次いで、動物は、注射された抗体のイディオタイプ抗原決定基に対して配向のある抗体を産生する（ヴァッセルマン（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ）ら（１９８２年）プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）７９、４８１０−４８１４頁）。
【００７０】
あるいは、抗イディオタイプ抗体は、動物のリンパ系細胞を効果的な抗体産生量の抗原（すなわち、本発明のエンベロープタンパク質に結合するモノクローナル抗体）と接触させる工程、得られたリンパ系細胞を収集する工程、収集したリンパ系細胞を骨髄腫細胞と融合させて、それぞれがモノクローナル抗体を産生する一連のハイブリドーマ細胞を生成する工程、一連のハイブリドーマ細胞をスクリーニングして、結合できるモノクローナル抗体を分泌するものを同定する工程、そのように同定された得られたハイブリドーマ細胞を培養する工程、およびこの細胞によって産生された抗イディオタイプ抗体を別々に回収する工程によって生成される（クリーヴランド（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ）ら（１９８３年）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３０５、５６−５７頁）。上述の２つの方法のいずれかにおける抗イディオタイプ抗体の生成に用いられ得る動物としては、ヒト、霊長類、マウス、ラットまたはウサギが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
本発明の別の態様は、ヒト−マウス骨髄腫類似体とヒト抗体産生細胞とのこの融合によって生成されるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを提供する。好ましい実施形態において、抗体産生細胞は、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭ）、アメリカヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）もしくはフィトヘマグルチニン刺激正常ＰＢＭ（ＰＨＡＳ）等のマイトジェン刺激ＰＢＭ、またはエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換Ｂ細胞である。上述のヒト−マウス骨髄腫類似体は、ヒトＰＢＭ、マイトジェン刺激ＰＢＭおよびＥＢＶ形質転換Ｂ細胞と融合した場合、２５，０００個の融合細胞中１個より大きい、抗体分泌ハイブリドーマの増殖の平均融合効率を有する。本発明の特に有用な抗体産生ハイブリドーマは、本発明のＨＩＶ−１エンベロープタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマである。
【００７２】
本発明はまた、ヒト−マウス類似体を抗体産生細胞、特に本明細書中で上記に列挙された抗体産生細胞と融合させる工程を含む、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを生成する方法、ならびに前記ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体に関する。
【００７３】
本発明はさらに、ヒト細胞へのＨＩＶ−１の結合をブロックするのに効果的な量の、本発明のエンベロープタンパク質中の修飾されたエピトープに対するヒトモノクローナル抗体と、ＨＩＶ−１を接触させる工程、およびＨＩＶ−１によるヒト細胞の感染を予防する工程を含む、（ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で）ヒト細胞へのＨＩＶ−１の結合をブロックする方法、およびＨＩＶ−１によるヒト細胞の感染を予防する方法に関する。ある実施形態において、修飾されたエピトープは、２Ｆ５モノクローナル抗体エピトープであるが、別の実施形態においては、本明細書中で前述した４Ｅ１０モノクローナル抗体エピトープである。
【００７４】
診断試薬
本発明のＨＩＶ−１エンベロープタンパク質をイムノアッセイにおける診断試薬として用いて、抗ＨＩＶ−１抗体、具体的には抗エンベロープタンパク質抗体を検出し得る。多くのＨＩＶ−１イムノアッセイ形式が利用可能である。したがって、以下の説明はあくまで例示的なものであって、包括的なものではない。しかしながら、一般に、米国特許第４，７５３，８７３号明細書およびＥＰ０１６１１５０号明細書およびＥＰ０２１６１９１号明細書を参照のこと。
【００７５】
イムノアッセイプロトコールは、例えば、組成、直接反応、またはサンドイッチ型アッセイに基づき得る。プロトコールはまた、例えば、異種で固相支持体を用いるか、または同種で溶液中の免疫反応を伴い得る。殆どのアッセイは、標識された抗体またはポリペプチドの使用を伴った。標識は、例えば、蛍光、化学発光、放射活性、または色素分子であり得る。プローブからのシグナルを増幅するアッセイもまた公知であり、かかるアッセイの例は、ビオチンおよびアビジンを利用するもの、ならびにＥＬＩＳＡアッセイ等の、酵素標識および媒介イムノアッセイである。
【００７６】
典型的には、抗ＨＩＶ−１抗体のイムノアッセイは、生物試料等の試験試料を選択および調製する工程、ならびに、次いで抗原抗体複合体の形成が可能になる条件下で本発明のＨＩＶ−１エンベロープタンパク質とともにそれをインキュベートする工程を伴うであろう。かかる条件は当該技術分野で周知である。異種の形式において、タンパク質またはペプチドは、固相支持体に結合されて、インキュベーションの後のポリペプチドからの試料の分離を容易にする。用いられ得る固相支持体の例は、膜またはマイクロタイターウェルの形態のニトロセルロース、シートまたはマイクロタイターウェルのポリ塩化ビニル、ビーズまたはマイクロタイタープレートのポリスチレンラテックス、フッ化ポリビニイジン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｉｄｉｎｅ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、ジアゾ化ペーパー、ナイロン膜、活性化ビーズ、およびプロテインＡビーズである。最も好ましくは、ダイナテック、イミュロン（Ｄｙｎａｔｅｃｈ、Ｉｍｍｕｌｏｎ）（登録商標）マイクロタイタープレートまたは０．２５インチポリスチレンビーズが、異種の形式で用いられる。固相支持体は、典型的には、試験試料から分離された後、洗浄される。
【００７７】
一方、同種の形式において、試験試料は、当該技術分野で公知のように、形成される任意の抗原抗体複合体が沈殿する条件下で、溶液中でエンベロープタンパク質とともにインキュベートされる。沈殿した複合体は、次いで試験試料から、例えば遠心分離によって、分離される。抗ＨＩＶ−１抗体を含む、形成された複合体は、次いで、任意の数の技術によって検出される。形式に依存して、複合体は、標識された抗異種免疫グロブリンで検出され得るか、または、競合形式が用いられる場合、結合した、標識された競合する抗体の量を測定することによって検出され得る。これらおよび他の形式は、当該技術分野で周知である。
【００７８】
本発明のかかるアッセイにおいて有用な診断プローブとしては、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質に対する抗体が挙げられる。抗体は、当該技術分野で周知の標準的技術を用いて生成された、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであり得る（ハーローおよびレーン（Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ）（１９８８年）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレスのアンチボディース：ラボラトリーマニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）参照）。これらを用いて、タンパク質への特異的結合、およびそれに続くＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット等による抗体−タンパク質複合体の検出によって、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を検出し得る。これらの抗体を誘発するのに用いられる、単離または修飾されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質は、上述の変異体のいずれかであり得る。抗体はまた、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質のペプチド配列から、当該技術分野の標準的技術を用いて生成される（ハーローおよびレーン（Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ）、上掲）。免疫学的に重要な部分を含む、モノクローナルまたはポリクローナル抗血清の断片もまた、調製され得る。
【実施例】
【００７９】
以下の実行の例は、本発明の好ましい実施形態を特に示し、決して開示の残りを限定するものと解釈されるべきではない。他の一般的な形態は、当業者に明らかであろう。本明細書中で参照された、米国または外国特許を含む全ての参考文献は、その全体が参照によって本明細書に援用される。
【００８０】
実施例１：材料および方法
ＨＩＶ−１  ＢＣＮドナー
血清が潜在的な広範な交差中和抗体（ＢＣＮ）応答を有することが示されているＨＩＶ−１グループＭ感染ドナー（ベイルネート（Ｂｅｉｒｎａｅｒｔ）ら（２０００年）ジャーナル・オブ・メディカル・バイロロジー（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．）６２、１４−２４頁）は、ベルギー、アントワープ（Ａｎｔｗｅｒｐ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）の熱帯医学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（ＩＴＭ）のエイズ・リファレンスセンター（ＡＩＤＳ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ）の臨床コホートの一部である。６人の抗レトロウイルス（ＡＲＶ）ナイーブＨＩＶ−１  ＢＣＮドナーから末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を収集し、保存した。ウイルスエンベロープサブタイプ、地理的起源および試料収集の年月日を、表１に示す。比較のために、以前にクローン化および特徴付けしたＲ２エンベロープ（クイナン（Ｑｕｉｎｎａｎ）ら（１９９９年）エイズ・リサーチ・アンド・ヒューマン・レトロバイラシーズ（ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）１５、５６１−５７０頁、チャン（Ｚｈａｎｇ）ら（２００２年）ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）７６、６４４−６５５頁）を、本研究に含めた。
【００８１】
ＨＩＶ−１非ＢＣＮドナー
４人のＨＩＶ−１非ＢＣＮドナー（ＮＹＵ１４２３、ＣＡ１、ＬＹ１０９および９３ＢＲ０２９）の共培養したＰＢＭＣからのＤＮＡ抽出物を、復員軍人メディカル・センター（Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）から得た。ドナーＶＩ１３９９およびＶＩ１２７３由来の保管されたＰＢＭＣを、ＩＴＭから得た。ドナーＭＡＣＳ＃４、ＧＸＣ−４４  ＧＸＥ−１４およびＺ２Ｚ６のクローニングは、これまでに記載されている（クイナン（Ｑｕｉｎｎａｎ）ら（１９９８年）エイズ・リサーチ・アンド・ヒューマン・レトロバイラシーズ（ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）１４、９３９−９４９頁、チャン（Ｚｈａｎｇ）ら（１９９９年）ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）７３、５２２５−５２３０頁）。初代サブタイプＡ分離株９３ＲＷ２０．５（ガオ（Ｇａｏ）ら（１９９８年）ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）７２、５６８０−５６９８頁）を、ＮＩＨ  ＡＲＲＲＰから得た。本研究で用いた新しいドナー試料のウイルスエンベロープサブタイプおよび地理的起源を、表１に示す。
【００８２】
ＰＣＲ増幅およびクローニング
製造業者（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））に推奨されるように高忠実度ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼおよびサイクリングパラメータを用いたネスティドＰＣＲによって、エンベロープ遺伝子を増幅した。鋳型として、ＰＣＲのための鋳型ＤＮＡが共培養されたＰＢＭＣから抽出されたＶＩ１２４９、ＶＩ１８４３、ＶＩ１７９３、ＣＡ１、９３Ｂｒ０２９、ＮＹＵ１４２３、ＬＹ１０９を除く、全てのドナーの非培養ＰＢＭＣから抽出されたＤＮＡ。ＰＣＲにおいてｐＳＶ１１１９３ＲＷ２０．５を鋳型として用いて、ｐＳＶ７ｄ中でこの分離株をサブクローニングした。初回のＰＣＲに用いるプライマーは、Ｒｅｖ開始コドンを含んで設計し、コンセンサスサブタイプＢ配列に基づいた。２回目のＰＣＲのいくつかの場合において、ＨＩＶ−１サブタイプにかかわらず、新しいプライマーを再設計して、ｇｐ１６０の増幅に用いた。２回目のＰＣＲに用いる全てのプライマーを、ｐＳＶ７ｄ発現ベクターにおける適切な部位へのクローニングのための制限酵素部位を用いて設計した。ネスティドＰＣＲに用いたプライマーは以下の通りである。
【００８３】
１回目のプライマー
フォワード：５’ａｔｇｇａｇｃｃａｇｔａｇａｔｃｃｔａｇａｃｔａｇａｇｃｃｃｔｇｇａａｇｃａｔｃｃａｇｇａａｇｔｃａｇｃｃ−３’（配列番号９）
リバース：５’ｇｔｃａｔｔｇｇｔｃｔｔａａａｇｇｔａｃｃｔｇａｇｇｔｃｔｇｔｃｔｇｇａａａａｃｃｃ−３’（配列番号１０）
２回目のプライマー
フォワード：５’ａａａａｇｇｃｔｔａｇｇｃａｔｃｔｃｃｔａｔｇｇｃａｇｇａａｇａａｇｃｇｇ−３’（配列番号１１）
リバース：５’ｃｔｃｇａｇａｔａｃｔｇｃｔｃｃｃａｃｃｃｃａｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇｇｃ−３’（配列番号１２）
フォワード：５’ａｔａａｇａｇａａａｇａｇｃａｇａａｇａｃａｇｔｇｇｃａａｔｇａｇａｇ−３’（配列番号１３）
リバース：５’ｇｔｃａｔｔｇｇｔｃｔｔａａａｇｇｔａｃｃｔｇａｇｇｔｃｔｇａｃｔｇｇ−３’（配列番号１４）
ＰＣＲ産物を、０．７％アガロースゲル上で可視化し、キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）ゲル抽出キットで精製した。精製したエンベロープおよびｐＳＶ７ｄ発現ベクター（カイロン・コーポレーション（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））を、適切な制限酵素で消化した。消化産物を精製し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））とライゲートした。ライゲーション産物でのＤＨ５αコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の形質転換を、製造業者の推奨（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に従って行った。次いで、「社内の」クイックミニプレッププロトコールを用いて、およびゲル電気泳動によって、エンベロープ遺伝子の挿入に関してクローンをスクリーニングした。スクリーニングしたクローンは、各初代分離株について７２〜３５０の範囲であった。簡潔に述べると、クローンを、アンピシリン（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））を補充した２ｍｌ寒天ブロス中で一晩増殖させた。一晩の培養の後、細菌細胞を溶解し、ゲル電気泳動によって、ＤＮＡの大きさに基づいてプラスミドを分析した。
【００８４】
ヒト骨肉種（ＨＯＳ）細胞
ＣＤ４、およびＨＩＶ−１の補助受容体ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４を構成的に発現するヒト骨肉種（ＨＯＳ）細胞系を、ＮＩＨエイズ・リサーチ・アンド・リファレンス・リエージェント・プログラム（ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇａｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）（ＡＲＲＲＰ）から得た（チャン（Ｚｈａｎｇ）ら（２００２年）ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）７６、６４４−５５頁）。ＣＤ４非依存的感染に関して試験するために、ＣＤ４なしでいずれかの補助受容体を発現しているＨＯＳ細胞を用いた。ＨＯＳ細胞を、プラスミド安定性の維持のために１０％ウシ胎仔血清、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン−ストレプトマイシン（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））、タイロシン（Ｔｙｌｏｓｉｎ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、およびプロマイシンを補充したダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））中で維持した。
【００８５】
２９３Ｔ細胞
ヒト胎児由来腎臓細胞系（２９３Ｔ）を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）から得た。細胞を、１０％ウシ胎仔血清、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン−ストレプトマイシン（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））を補充したダルベッコ最小必須培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））中で維持した。
【００８６】
機能的エンベロープクローンのスクリーニングおよび選択
次いで、製造業者の指示（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））に従って、正確なサイズのクローンを、リン酸カルシウム／ＨＥＰＥＳバッファー技術を用いた、ｐＮＬ４−３．ｌｕｃ．Ｅ−Ｒ−（ＡＲＲＲＰ）およびｐＳＶ７ｄ−ｅｎｖプラスミドでの７０％〜８０％コンフルエント２９３Ｔ細胞（ＡＴＴＣ）の２４ウェルプレートコトランスフェクションにおいて、機能に関してスクリーニングした。各実験には、陽性および陰性対照プラスミドが含まれた。トランスフェクションの１８時間後、培地を除去し、０．１ｍＭ酪酸ナトリウム（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を補充した培地と交換した。細胞を、さらに２４時間増殖させた。上清を採取し、１６，０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離し、０．４５μｍ無菌ポアフィルター（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を通してろ過した。
【００８７】
感染性アッセイ
これまでに記載されているように、三連のウェルで感染性アッセイを行った（クイナン（Ｑｕｉｎｎａｎ）ら（１９９８年）エイズ・リサーチ・アンド・ヒューマン・レトロバイラシーズ（ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）１４、９３９−９４９頁）。簡潔に述べると、ろ過した偽ウイルス上清の２倍段階希釈物５０μｌを、３７℃で１〜２×１０４ＨＯＳ  ＣＤ４＋ＣＣＲ５＋またはＣＸＣＲ４＋細胞とともに、１５０μｌ体積でインキュベートした。偽型ウイルスによる細胞の感染後３日目に、蛍光測定に基づいて感染価を測定した。感染性の終点を決定するために、ルシフェラーゼ活性が陰性対照のものより少なくとも１０倍大きかった場合に、個々のウェルを陽性と考えた。次いで、機能的クローンの実際の力価を、２５ｃｍ３フラスコを用いて、ｐＮＬ４−３．ｌｕｃ．Ｅ−Ｒ−（ＡＲＲＲＰ）およびｐＳＶ７ｄ−ｅｎｖプラスミドのコトランスフェクションとそれに続く上述の感染性アッセイによって測定した。
【００８８】
機能的エンベロープクローンの配列決定およびＢＬＡＳＴ検索
感染性のあるクローンの確認後、これまでに記載されていないクローンに関して、ｇｐ１６０配列決定を行った。配列決定は、まず、ロス・アラモス国立研究所（Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）ＨＩＶ配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ）において、コンセンサスサブタイプＢ配列に基づいて設計された合計１４個のフォワードおよびリバースプライマーを用いて、両方の鎖で行った。しかしながら、サブタイプＢコンセンサスプライマーで成功しなかった配列領域に対して、必要に応じて、新しいプライマーを設計した。配列決定反応の後、パフォーマ（Ｐｅｒｆｏｍａ）ＤＴＲゲルろ過カートリッジ（エッジ・バイオシステムズ（Ｅｄｇｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ））を用いて生成物を精製し、過剰なｄＮＴＰおよび塩を除去した。アプライド・システムズ・モデル３１００ジェネティック・アナライザー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）でジデオキシサイクル配列決定技術を用いて、ヌクレオチド配列決定を行った。ＤＮＡスター（ＤＮＡ  Ｓｔａｒ）中のエディットシーク（Ｅｄｉｔｓｅｑ）およびシークマン（Ｓｅｑｍａｎ）プログラムを用いて配列アラインメントを行った（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）ら（１９８８年）ジーン（Ｇｅｎｅ）７３、２３７−２４４頁）。特有の配列の確認は、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｈｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）およびロス・アラモス国立研究所（Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）ＨＩＶデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ）を通じてアクセスした。
【００８９】
抗体
１１の広範な交差反応性モノクローナル抗体および２ドメインの可溶性ＣＤ４の一団を本研究で用い（表２）、種々の供給源から得たが、ＡＲＲＲＰを通じて入手可能である。６人のＢＣＮドナーおよび８人の非ＢＣＮドナー由来のポリクローナル血清をＩＴＭからドライアイス中で輸送した。ＡＲＲＲＰからＨＮＳ２血清を得た。補体を不活性化するために、血清を５６℃で３０分間インキュベートし、次いで使用まで−２０℃で保存した。
【００９０】
中和アッセイ
本研究で用いたエンベロープは、ＨＩＶ−１エンベロープサブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、ＣＲＦ０１＿ＡＥ、ＣＲＦ０２＿ＡＧ、ＣＲＦ１１＿ｃｐｘ、およびＢ／Ｆ組み換え体を代表した。これまでに記載されているように、中和アッセイを行った（チャン（Ｚｈａｎｇ）ら（２００２年）ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）７６、６４４−６５５頁）。簡潔に述べると、三連のウェルで、ヒトＭａｂまたはポリクローナル血清の２倍段階希釈物と２５μｌの偽ウイルス上清との１時間４℃でのプレインキュベーション、それに次ぐ９６ウェル組織培養プレート中での１５０μｌ体積の１〜２×１０４ＨＯＳ  ＣＤ４＋ＣＣＲ５＋またはＣＸＣＲ４＋細胞の感染によって、中和アッセイを行った。プレートを、３７℃、５％二酸化炭素中で３日間インキュベートし、次いでリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、１５μｌの１×ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）細胞溶解バッファー（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））で３０分間溶解した。マイクロルーマット・プラス（ＭｉｃｒｏＬｕｍａｔ  Ｐｌｕｓ）ルミノメーターを用いて、ルシフェラーゼ活性を読み取った。蛍光測定に基づいて感染性または中和価を測定し、終点は、試験試料からの平均結果が非中和対照平均値の５０％未満である、血清またはヒトＭａｂの最終希釈度と考えた。結果として９０％中和を生じる血清またはヒトＭａｂ濃度は、５０％中和を生じるものよりも常に２〜８（通常４）倍大きかった。ＭＡｂに対する各エンベロープクローンの中和アッセイを、少なくとも２回の独立した実験において行った。しかしながら、血清試料が限られていたために、殆どのエンベロープクローンに関して、血清を用いた実験は１回だけ行い、データが決定的でない場合は、２回行った。
【００９１】
実施例２：Ａ６５９Ｔの変異誘発
ｇｐ４１中の６５９位でのスレオニンの効果を研究するために、本発明者らは、２Ｆ５および４Ｅ１０に感受性（ＬＹ１０９）または耐性（ＮＹＵ１４２３）のある２つの非ＢＣＮエンベロープを選択した。これらのエンベロープにおいて、本発明者らは、製造業者の推奨に従って、ストラテジーン（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）部位特異的変異誘発キットを用いて残基６５９に対応する位置の保存されたアラニンをスレオニンに変異させた。変異誘発反応を、Ｄｐｎ１消化、およびＤＨ５αコンピテント細胞を用いた形質転換に供した。所望の変異を有するクローンをスクリーニングおよび確認するために、Ａ６６２Ｔ変異を担持する領域の配列決定に関して、各エンベロープから５つのクローンを選択した。ｈｕＭａｂ  ＩｇＧ１  ｂ１２、２Ｆ５、４Ｅ１０およびｓＣＤ４を用いた感染性および中和実験において、所望のＡ６５９Ｔを有するクローンを、野生型クローンと比較した。
【００９２】
実施例３：機能的ＨＩＶ−１  ｅｎｖ遺伝子を有する偽型ウイルスの中和
血清による、ＢＣＮおよび非ＢＣＮドナー由来のエンベロープタンパク質を有する偽型ウイルスの中和を、図１に示す。ＢＣＮドナー由来の血清による中和を上のパネルに示し、非ＢＣＮドナー由来の血清による中和を下のパネルに示す。血清ＨＮＳ２は、Ｒ２エンベロープタンパク質のドナー由来の標準血清である。ＢＣＮ血清は、ＢＣＮおよび非ＢＣＮウイルスの両方に対して、非ＢＣＮ血清よりも頻繁に中和していた。ＢＣＮおよび非ＢＣＮドナー由来のエンベロープタンパク質を有する偽型ウイルスの中和の頻度は、有意に異ならなかった。これらの結果は、ＢＣＮ血清の交差反応性をまさに確認したが、２つの異なるタイプのドナー由来のエンベロープタンパク質を発現するウイルスの間の差を示さなかった。
【００９３】
各ドナーについて、ルシフェラーゼ活性で測定すると、スクリーニングされたおよそ１０％のＥｎｖクローンは、ＣＤ４およびＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４のいずれかを発現するヒト骨肉種（ＨＯＳ）細胞の感染を媒介した。機能的だったもののうち、大部分は、同様のレベルの感染性を有し（データ示さず）、最も高いみかけの感染性を有するクローンを、さらなる特徴付けのために選択した。本研究で生じたＥｎｖは、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４に対して二重の向性を示したＺ２Ｚ６およびＶＩ１２４９を除いて、向ＣＣＲ５性であった（クイナン（Ｑｕｉｎｎａｎ）ら（１９９９年）エイズ・リサーチ・アンド・ヒューマン・レトロバイラシーズ（ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）１５、５６１−７０頁）。Ｅｎｖ  Ｚ２Ｚ６を有する希釈していない偽型ウイルスに感染したＣＣＲ５＋およびＣＸＣＲ４＋ＨＯＳ細胞中で検出されたルシフェラーゼ単位は、それぞれ１１３，３７９および６９３，１２２であった。ＶＩ１２４９を有する希釈していない偽型ウイルスに感染したＣＣＲ５＋およびＣＸＣＲ４＋ＨＯＳ細胞中で検出されたルシフェラーゼ単位は、それぞれ８５，０００および２３８，４７７ＬＵであった。Ｒ２  Ｅｎｖとは異なり、新しいＢＣＮ  Ｅｎｖのうち、ＣＤ４非依存的感染を媒介したものはなかった（データ示さず）。
【００９４】
ベイルネート（Ｂｅｉｒｎａｅｒｔ）ら（２０００年）およびドナーズ（Ｄｏｎｎｅｒｓ）ら（２００２年）による研究においてこれまでに同定されたＢＣＮおよび非ＢＣＮ血清（ベイルネート（Ｂｅｉｒｎａｅｒｔ）ら（２０００年）ジャーナル・オブ・メディカル・バイロロジー（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．）６２、１４−２４頁）、ドナーズ（Ｄｏｎｎｅｒｓ）ら（２００２年）エイズ（ＡＩＤＳ）１６、５０１−５０３頁）を、７人のＢＣＮおよび１１人の非ＢＣＮドナー由来のＥｎｖを有する偽型ウイルスの中和に関して試験した。ＢＣＮ血清は、血清がＰＢＭＣ収集と同じ時期に対応していたＥｎｖ  ２４／００／４およびＶＩ４２３の場合を除いて、ＢＣＮエンベロープクローンの発生に用いた試料の６ヵ月後に収集した試料であった。本研究で用いた特定の非ＢＣＮ  Ｅｎｖドナーに対応する血清は、入手できなかった。しかしながら、本研究で用いた非ＢＣＮ血清は、初代分離株ＣＡ４（サブタイプＦ）、ＣＡ１３（サブタイプＨ）およびＶＩ６８６（グループＯ）に対する低〜無中和能力に基づいて分類した一団の血清試料から選択した（ドナーズ（Ｄｏｎｎｅｒｓ）ら（２００２年）エイズ（Ａｉｄｓ）１６、５０１−５０３頁）。非ＢＣＮ血清ドナーに感染しているウイルスのＥｎｖサブタイプは入手できなかった。図２、パネルＡに示すように、ＨＮＳ２血清および他のＢＣＮ血清のぞれぞれは、ＢＣＮおよび非ＢＣＮ  Ｅｎｖ偽型ウイルスのそれぞれを、１：８〜１：２０４８の範囲の力価で中和した（ＩＴＭ研究からのＢＣＮ血清の全体の幾何平均力価（ＧＭＴ）＝１：１０９）。ＢＣＮ血清のうち、最も低いＧＭＴを有するものはＶＩ１２４９／８であった。このドナー由来の、より早期の血清は、これまでにベイルネート（Ｂｅｉｒｎａｅｒｔ）ら（２０００年）によって、本研究で用いた他のＢＣＮドナー由来の血清よりも低いレベルの交差反応性中和活性を有すると分類されている（ベイルネート（Ｂｅｉｒｎａｅｒｔ）ら（２０００年）ジャーナル・オブ・メディカル・バイロロジー（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．）６２、１４−２４頁）。さらに、このドナーは、サブタイプＣＲＦ０１＿ＡＥ系統に感染しており、かかる血清による非ＣＲＦ０１＿ＡＥ系統の交差反応性中和は低いと予想される（マスコラ（Ｍａｓｃｏｌａ）ら（１９９９年）ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）７３、４００９−４０１８頁）。比較すると、図２、パネルＢに示すように、７つの非ＢＣＮ血清のうち６つが、１つ以上のＥｎｖ偽型ウイルスを中和できず、これらの血清のＧＭＴは１：４５であり、これはＢＣＮ血清のＧＭＴより有意に低かった（スチューデントｔ検定によりｐ＝０．０１）。ＢＣＮおよび非ＢＣＮ血清の力価の差は、相同な偽型ウイルスに対する力価が比較に含まれない場合、有意なままであった（ｐ＝０．０２）。ＢＣＮおよび非ＢＣＮ血清は、２つの非ＢＣＮ  Ｅｎｖ、特にＣＡ１および９３Ｂｒ０２９を、１０２４ｙ以上の力価で中和した。Ｅｎｖ  ＣＡ１の、１４の多様なＨＩＶ−１血清による中和に対する低い特異性は、これまでに観察されている（ナイアムブ（Ｎｙａｍｂｉ）ら（１９９６年）ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）７２、��０２７０−１０２７０４頁）。図３に示すように、Ｅｎｖ  １４／００／４を有する偽型ウイルスは、ＢＣＮによって、非ＢＣＮ血清よりも有意に大きく中和された（スチューデントｔ検定によりｐ＝０．０３、多重比較に関する補正あり）。他のＥｎｖ偽型のうち、ＢＣＮによって非ＢＣＮ血清よりも有意に大きく中和されたものはなかった。これらの結果から、１４／００／４  Ｅｎｖが、非ＢＣＮ血清よりもＢＣＮにおいてより一般的である特異性のある中和抗体に対して感受性があり得ることが示唆される。ドナー１４／００／４の血清は、ベイルネート（Ｂｅｉｒｎａｅｒｔ）らによって記載されたＢＣＮ血清で最も能力の高いものであった（彼らの研究において血清ＶＩ１８０５として報告されている）（ベイルネート（Ｂｅｉｒｎａｅｒｔ）ら（２０００年）ジャーナル・オブ・メディカル・バイロロジー（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．）６２、１４−２４頁）。
【００９５】
実施例４：ＢＣＮおよび非ＢＣＮドナー由来のエンベロープクローン
本研究で用いたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の供給源を表１に示す。これまでに記載したＲ２エンベロープタンパク質を、他のＢＣＮドナー由来のエンベロープタンパク質との比較のために含んだ。エンベロープタンパク質は、６人の他のドナーからクローニングし、それぞれドナー１４および２４由来である２つのサンプリングデータを含んだ。それぞれの場合において、対になった試料を、約６ヵ月隔てて収集した。これらのドナーは欧州およびアフリカ出身で、主なサブタイプＡ、Ｂ、Ｅ、ＦおよびＧのものであるエンベロープタンパク質を含んでいた。非ＢＣＮエンベロープタンパク質はサブタイプＢ、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ（９３ＢＲ０２９）、Ｇ（ＬＹ１０９）、および複合体（ＣＡ１）のものであり、米国、南米、欧州、アフリカおよび中国出身のドナーから得た。Ｒ２を除く、用いたエンベロープタンパク質の全ては、アッセイに用いたレポーター細胞の感染に関してＣＤ４依存性であった。ルシフェラーゼ単位に関する、表に示す感染性は、ＣＤ４およびＣＣＲ５の両方を発現するＨＯＳ細胞に対する感染性を反映する。ＣＣＲ５のみ、またはＣＤ４および他の潜在的な補助受容体を発現する細胞は、バックグラウンドと同様のルシフェラーゼシグナルを生じた（すなわち、およそ１００〜２００ルシフェラーゼ単位）。
【００９６】
実施例５：モノクローナル抗体および可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）による、ＢＣＮおよび非ＢＣＮドナー由来のエンベロープタンパク質を有する偽型ウイルスの中和の比較
Ｍａｂによる、種々のエンベロープタンパク質を有する偽型ウイルスの中和を、表２および図４に示す。モノクローナル抗体およびｓＣＤ４による中和に対するＲ２系統の感受性は、これまでに報告された結果と同様であった。具体的には、Ｒ２ウイルスは、ｓＣＤ４およびＣＤ４結合部位に対するＭａｂ、ならびにＣＤ４ｉエピトープおよびＶ３領域エピトープに対するＭａｂによって中和された。これはまた、ｇｐ４１Ｍａｂ  ２Ｆ５および４Ｅ１０によっても中和された。対照的に、他のＢＣＮドナー由来のエンベロープタンパク質を有する偽型ウイルスは、ＣＤ４結合部位、ＣＤ４ｉエピトープまたはＶ３領域エピトープに対するＭａｂによって中和されたとしても、不十分にしか中和されなかった。したがって、他のＢＣＮエンベロープタンパク質のうち、Ｒ２のＣＤ４非依存的なＣＤ４ｉ  Ｍａｂ感受性表現型を有するようなものはなかった。非ＢＣＮドナー由来のエンベロープタンパク質を有する偽型ウイルスは、種々のリガンドに対して、様々に感受性があった。
【００９７】
Ｍａｂ  ２Ｆ５および４Ｅ１０に対するＢＣＮ  ｅｎｖの中和感受性の分布は、二分していた。ＢＣＮエンベロープタンパク質を有する偽型ウイルスは、ドナーＶＩ８４３由来のエンベロープタンパク質およびドナー２４からのより後期の試料（２４００／８）由来のエンベロープタンパク質を除いて、これらのＭａｂによる中和に対して高度に感受性があった。ドナーＶＩ８４３およびドナー２４からの後期の試料由来のエンベロープタンパク質は、他のＢＣＮエンベロープタンパク質よりもかなり耐性が高かった。非ＢＣＮドナー由来のエンベロープタンパク質の大部分は、中和に感受性のあるＢＣＮエンベロープタンパク質の群よりも、２Ｆ５および４Ｅ１０  Ｍａｂによる中和に対してより耐性が高かった。２Ｆ５は、６つのＢＣＮ  Ｅｎｖを０．２〜３μｇ／ｍｌの範囲のＩＤ５０力価で中和した（図４）。並行してアッセイしたＲ２  Ｅｎｖもまた、２Ｆ５中和に対して感受性があり、これまでの報告と矛盾がなかった（チャン（Ｚｈａｎｇ）ら（２００２年）ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）７６、６４４−６５５頁）。ＢＣＮ  ＥｎｖであるＶＩ８４３を有する偽型ウイルスは、５０μｇ／ｍｌでＭａｂ  ２Ｆ５による中和に耐性があった。それに対し、２Ｆ５は、非ＢＣＮ  Ｅｎｖを有する偽型ウイルスを、０．３９〜２５μｇ／ｍｌの範囲のＩＤ５０で中和した。Ｍａｂ  ２Ｆ５中和に対する、非ＢＣＮ  Ｅｎｖを有する偽型ウイルスの感受性は、初代ＨＩＶ−１分離株のこれまでの研究で観察されたものと同様であった（コンリー（Ｃｏｎｌｅｙ）ら（１９９４年）プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）９１、３３４８−３３５２頁、ムスター（Ｍｕｓｔｅｒ）ら（１９９４年）ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）６８、４０３１−４０３４頁、トルコーラ（Ｔｒｋｏｌａ）ら（１９９５年）ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）６９、６６０９−６６１７頁）。ＢＣＮ  Ｅｎｖを有する偽型ウイルスの殆どもまた、Ｍａｂ  ４Ｅ１０による中和に対して、０．２以下〜６．２５μｇ／ｍｌ未満の範囲のＩＤ５０で感受性があった。Ｅｎｖ  ＶＩ８４３は、２Ｆ５に対して耐性があったが、Ｍａｂ  ４Ｅ１０による中和に対して、ＩＤ５０＝１２．５μｇ／ｍｌで中間の耐性を示した。非ＢＣＮ  Ｅｎｖを有する偽型ウイルスの、４Ｅ１０による中和に対する感受性は、１．５６〜２５μｇ／ｍｌの範囲であった。包括的に感受性のある非ＢＣＮ  Ｅｎｖの１つである９３ＢＲ０２９は、非ＢＣＮ  Ｅｎｖのうち、ｇｐ４１Ｍａｂによる中和に対して最も感受性の高いものであったが、他方のＣＡ１は、ｇｐ４１Ｍａｂに対して中間の耐性を示した。
【００９８】
Ｍａｂ  ２Ｆ５による中和に対して高度に感受性ある２つのＢＣＮ  Ｅｎｖである１４／００／４および２４／００／４は、それぞれ、ベイルネート（Ｂｅｉｒｎａｅｒｔ）ら（ベイルネート（Ｂｅｉｒｎａｅｒｔ）ら（２０００年）ジャーナル・オブ・メディカル・バイロロジー（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．）６２、１４−２４頁）によって定義された最も能力の高いＢＣＮ抗体を有する２人のドナーの無培養ＰＢＭＣ試料に由来する。これらの２つのＥｎｖは、ｇｐ１２０エピトープを標的とする全てのＭａｂに対して耐性があり、２４／００／４はｓＣＤ４に対して耐性があった。同様に、Ｅｎｖクローン１４／００／４および２４／００／４を生じた試料の６ヵ月後に得られた無培養ＰＢＭＣ試料は、さらなるＥｎｖクローンの供給源であった。図５Ａおよび６Ａは、これらのドナー由来の早期および後期のＥｎｖを有する偽型ウイルスの２Ｆ５および４Ｅ１０感受性を示す。１４／００／８−３３および１４／００／８−８３と呼ばれる、ドナー１４／００由来の２つの後期のクローンのうち、１４／００／８−３３はＭａｂ  ２Ｆ５および４Ｅ１０による中和に対して感受性があったが、１４／００／８−８３は両方のモノクローナル抗体に対して比較的耐性があった（２Ｆ５  ＩＤ５０＝０．０１対＞１２．５μｇ／ｍｌ、４Ｅ１０  ＩＤ５０＝０．２対７．８μｇ／ｍｌ、図５Ａ）。ドナー２４／００由来の後期試料から得られた３つのＥｎｖクローンのうち、２４／００／８−４６および２４／００／８−２７５と呼ばれる２つのクローンは、Ｅｎｖ２４／００／４と同様にＭａｂ  ２Ｆ５による中和に対して感受性があったが、２４／００／８−２５８と呼ばれる後期クローンは、比較的耐性があった（図６Ａ）。このドナー由来の早期および後期のＥｎｖクローンは、Ｍａｂ  ４Ｅ１０に対して同様の感受性を示した。
【００９９】
これらの結果に基づいて、本発明者らは、あるＢＣＮドナー由来のエンベロープタンパク質がこれらの抗ｇｐ４１  Ｍａｂによる中和に対して感受性があり得、かつ非ＢＣＮドナー由来のエンベロープタンパク質よりも効率的にこれらのエピトープに対する交差反応性中和抗体を誘導もし得るという可能性を考慮した。ドナー２４由来の後期のエンベロープタンパク質（２４００／８）は、ドナーが２Ｆ５／４Ｅ１０領域に対する配向のある中和応答を発生した可能性を支持するさらなる証拠であろうエスケープ変異体を表し得る。
【０１００】
実施例６：ＢＣＮエンベロープタンパク質のアミノ酸配列
エンベロープタンパク質１４００／４および２４００／４のアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列解析の結果から推論されるように、配列表に配列番号２および３として示される。２つのタンパク質の配列は、一般に、他のＨＩＶ−１エンベロープタンパク質と同様であり、予測される可変ループ構造、ならびにｇｐ１２０およびｇｐ４１における重要な目印に対応する配列を有する。Ｒ２エンベロープタンパク質クローンのＣＤ４非依存性の広範な中和感受性表現型は、具体的にはＶ３ループの先端にすぐ隣接するプロリン−メチオニンモチーフを含む、その特有のＶ３領域配列に依存する。これらの残基の配置は、クローン１４／００４の３５６〜３５７位およびクローン２４００／４の３００〜３０１位に対応する。これらのクローンのそれぞれの配列は、これらの位置の２つの最も一般的な配列、ＨＩまたはＲＩに対応する。また、ＢＣＮドナー由来の他のエンベロープタンパク質クローンのうち、これらの位置にＰＭ配列を有するものはなかった（データ示さず）。
【０１０１】
２Ｆ５および４Ｅ１０エピトープでのＢＣＮエンベロープタンパク質の配列を、表３に示す。２Ｆ５  Ｍａｂによって認識される配列は、元々、クローン１４００／４の６５９〜６６５位（配列番号２）およびクローン２４００／４の６５４〜６６０位（配列番号３）に対応する、７アミノ酸配列ＥＬＤＫＷＡＳ（配列番号１）にマッピングされた（ムスター（Ｍｕｓｔｅｒ）ら（１９９４年）ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）６８、４０３１−４０３４頁、ムスター（Ｍｕｓｔｅｒ）ら（１９９３年）ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）６７、６６４２−６６４７頁）。それに続くさらなる研究によって、Ｍａｂの結合が主要なエピトープを包含する１３アミノ酸配列に対応する、２つのクローンの７０９〜７２２位および６４９〜６６２位に対応する配列によって影響されることが示された。Ｍａｂ  ４Ｅ１０によって認識される配列は、２つのクローンのそれぞれ６６８〜６７３位および６６３〜６６８位にアミノ酸ＮＷＦＤＩＳ（配列番号８）含む、２Ｆ５エピトープからわずかに遠位の６アミノ酸配列にマッピングされた。これらの位置のＢＣＮおよび非ＢＣＮクローンのぞれぞれの配列を、表３に示す。標準的な２Ｆ５エピトープ配列の第１の位置の変異（例えばＴ／Ａ）は、中和に対する耐性と関連がなかった。エピトープの第４の位置での変異（すなわちクローン２４００／８のＫ／Ｔ）、３〜６の位置（すなわちクローンＶＩ８４３のＤＫＷＡ（配列番号１５）、ＧＫＷＤ（配列番号１６））、および第７の位置（すなわちクローンＮＹＵ１４２３のＳ／Ｇ）は、２Ｆ５中和に対する耐性と潜在的に関連があった。４Ｅ１０エピトープで観察された変異のうち、そのＭａｂによる中和に対する耐性と一貫して関連のあるものはなかった。
【０１０２】
２Ｆ５コアエピトープの４位での２４００／８クローンのＫ／Ｔ変異の重要性を、さらに調べた。ｇｐ４１コードヌクレオチドに対応する配列を、ＰＣＲを用いて、２４００／４および２４００／８サンプリング年月日に得たリンパ球から抽出したゲノムＤＮＡからクローニングした。各試料年月日由来の１０または１１個のクローンを、表４に示すように、２Ｆ５領域で配列決定した。２４００／４試料年月日由来の１１個のクローンのうち８つは、この位置にリシンを有し、３つはスレオニンを有した。比較として、２４００／８試料年月日由来の１０個のクローンのうち７つは、この位置にスレオニンを有し、他の３つのクローンのぞれぞれは２Ｆ５コアエピトープにさらなる変異を有した。これらの結果から、存在する擬似種の間で、より後期の年月日ではＫ／Ｔ変異が一般的であることが示され、このエピトープで中和エスケープ変異が起こる可能性が支持される。エスケープ変異の発生は、ドナー２４がエピトープに対する配向のある中和抗体を有することを示すであろう。
【０１０３】
２Ｆ５エピトープでの１４００／４クローンの配列を、ＨＩＶデータベースの他の配列と比較した。１４００／４クローンの１位でのＥ／Ｔ置換は、データベースの６００を超える配列のうち１つの他の配列にのみ見られた。この変異の重要性を、ＮＹＵ１４２３およびＬＹ１０９クローンへのＥ／Ｔ置換の導入によって、さらに評価した。表５に示すように、効果の大きさは２つのクローンの間で実質的に異なったが、この置換によって、２Ｆ５および４Ｅ１０  Ｍａｂによる中和に対するクローンの感受性が増大した。１４人のドナー由来の後期のエンベロープタンパク質クローンであるクローン１４００／８を調製し、２Ｆ５アミノ酸配列の変化に関して評価した。表６に示すように、これらの試料年月日のそれぞれにおける２Ｆ５エピトープの主なアミノ配列は、ＴＬＤＫＷＡＳ（配列番号１７）であった。
【０１０４】
実施例７：Ａ６６２Ｔ置換の寄与
Ｅｎｖ  １４／００／４および１４／００／８−３３の６６２Ｔ配列は、非常に変わっている。本発明者らは、ＨＩＶおよびジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）データベースで、この置換を有する、ある他の配列を見出した（ＨＩＶ−１  ＡＲＭＡ０３７、受託番号ＡＹ０３７２７７）（カー（Ｃａｒｒ）ら（２００１年）エイズ（Ａｉｄｓ）１５、Ｆ４１−Ｆ４７頁）。この変わった変異がＭａｂ  ２Ｆ５中和に対する感受性を付与するか否かを調べるために、本発明者らは、部位特異的変異誘発を用いてＴ６６２Ａ変異をクローン１４／００／４に導入し、Ｍａｂ  ２Ｆ５中和に対してそれぞれ感受性および耐性のある非ＢＣＮクローン、ＮＹＵ１０２６およびＮＹＵ１４２３に復帰突然変異（Ａ６６２Ｔ）を導入した。Ｅｎｖ  １４／００／４へのアラニン置換によって、Ｅｎｖ  １４／００／４はＭａｂ  ２Ｆ５（ＩＤ５０＝０．４５対６．２５μｇ／ｍｌ）および４Ｅ１０（ＩＤ５０＝０．９対９．３４μｇ／ｍｌ）による中和に対する高度な感受性から比較的耐性に変化した。Ｅｎｖ  ＮＹＵ１０２６の同じ位置でのスレオニンの導入は、Ｍａｂ  ２Ｆ５（ＩＤ５０＝３．１３対０．３１μｇ／ｍｌ）および４Ｅ１０（ＩＤ５０＝１０．４１対０．７８μｇ／ｍｌ）による中和に対して逆の効果があった。Ｅｎｖ  １４／００／４およびＮＹＵ１０２６におけるこれらの置換の効果の大きさは、１４／００／８−８３と比較したＥｎｖクローン１４／００／４および１４／００／８−３３のＭａｂ  ２Ｆ５および４Ｅ１０による中和に対する感受性の相対的な差と同様であった。Ｅｎｖ  ＮＹＵ１４２３の同じ位置でのスレオニンの導入によって、Ｍａｂ  ２Ｆ５（ＩＤ５０＝１７．７対１０．４μｇ／ｍｌ）による中和に対する感受性の、小さいが一貫した増大が引き起こされ、Ｍａｂ  ４Ｅ１０による中和に対する感受性の有意な変化はなかった。結果から、残基６６２でのスレオニンの存在が、評価した特定のＥｎｖに依存する程度で、これらのＭａｂの両方による中和に対する感受性の増大に関連があることが示された。
【０１０５】
実施例８：Ｔｈｒ６６２はＢＣＮに相当に寄与する
ｇｐ４１のＭＰＥＲに対する抗体の誘導とのＴｈｒ６６２の可能な関係をさらに試験するために、本発明者らは、Ｅｎｖ  １４／００／４および１４／００／４  Ｔ６６２Ａ変異体を有する偽型ウイルスの、ＢＣＮ（１４／００／８、２４／００／８、ＨＮＳ２）および非ＢＣＮ（ＶＩ１０７７、ＶＩ１２９５、ＶＩ１４００）血清による中和に対する感受性を比較した。Ｔ６６２Ａ変異は、結果として、血清１４／００／８および２４／００／８による中和に対する、それぞれ２１１および２７倍の耐性を生じた。比較すると、変異は、ＨＮＳ２血清および非ＢＣＮ血清ＶＩ１２９５、ＶＩ１４００およびＶＩ１０７７による中和に対する効果がより小さく、この変異体の相対的耐性は１〜１０倍の範囲であった。したがって、非ＢＣＮ血清ではなくＢＣＮ血清１４／００／８および２４／００／８による中和に対する１４／００／４  Ｔ６６２Ａ変異体の感受性の減少は、ＢＣＮ血清がｇｐ４１の膜近位領域（ＭＰＥＲ）に対する配向のある比較的高い中和活性を有する可能性を支持する。
【０１０６】
実施例９：Ｋ６６５Ｔ置換の寄与
これまでの研究から、Ｋ６６５Ｎ変異が結果としてＨＩＶ−１初代分離株の２Ｆ５中和に対する不十分な結合および耐性を生じることが報告されている（コンリー（Ｃｏｎｌｅｙ）ら（１９９４年）プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）９１、３３４８−３３５２頁、ステイグラー（Ｓｔｅｉｇｌｅｒ）ら（２００１年）エイズ（ＡＩＤＳ）１７、１７５７−１７６５頁）。ドナー２４／００由来の３つの後期のエンベロープクローンのうち、１つ（２４／００／８−２５８）はＭａｂ  ２Ｆ５による中和に対する耐性があり、２Ｆ５エピトープ配列内に単一突然変異Ｋ６６５Ｔを示した。２Ｆ５による中和に対するこの変異の関連性を確認するために、本発明者らは、Ｋ６６５Ｔ点突然変異をＥｎｖ  ２４／００／４に導入した。この変異によって２Ｆ５に対する耐性が引き起こされたが、４Ｅ１０感受性には効果がなかった。
【０１０７】
実施例１０：ＢＣＮの２Ｆ５および４Ｅ１０エピトープの擬似種変化
Ｍａｂ  ２Ｆ５による中和に対して比較的耐性のある後期のＥｎｖ  １４／００／８−８３および２４／００／８−２５８が、これらのドナーにおける中和耐性エスケープ変異体の出現を示すか否かを決定するために、本発明者らは、これらのドナーのそれぞれにおける２Ｆ５および４Ｅ１０エピトープでの擬似種変化を調べた。この目的のために、ＰＢＭＣゲノムＤＮＡをＰＣＲの鋳型として用いて、本発明者らは、これらの２人のドナー由来の早期および後期のＰＢＭＣ試料からのｇｐ４１の膜近位領域のアミノ酸配列をクローニングおよび解析した。早期の１０個のうち９つおよび後期の全てのｇｐ４１クローンにおける中和感受性６６２Ｔ配列の存在は、ドナー１４／００において優性な中和耐性変異体が出現しなかったことの指標である。しかしながら、ドナー２４／００において、早期の１１個のうち８つ、および後期の１０個のうち３つだけのｇｐ４１クローンが、６６５Ｋ配列を有することがわかった。これらの結果から、クローン２４／００／８−２５８に代表される中和耐性変異体が、このドナーにおける優性な集団として出現し、中和エスケープ変異の出現と矛盾がないことが示される。
【０１０８】
実施例１１：ｉｎ  ｖｉｖｏでのＢＣＮ応答の発生
霊長類を含む哺乳動物におけるＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質免疫の効果を研究するために、所望のＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質を生成するＤＮＡ発現ベクターまたは精製されたＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質を含有する組成物のいずれかによって抗原の投与を達成し得る。
【０１０９】
ＤＮＡ発現ワクチンのために、ＤＮＡ発現養生法およびブースター免疫は、所望のＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質を発現する修飾されたワクシニアアンカラ（Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）またはＶＥＥ−ＲＰのいずれかを含む。同様の養生法が潜在的なＣＤ８Ｔ細胞応答を誘導することが、他の者によって示されている（ホートン（Ｈｏｒｔｏｎ）ら（２００２年）ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）７６、７１８７−７２０２頁、マコンキー（ＭｃＣｏｎｋｅｙ）ら（２００３年）ネイチャー・メディシン（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．）９、７２９−７３５頁）。
【０１１０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ発現ベクターのために、これまでに記載されているように、ｐＲＥＰＸ−Ｒ２ｇｐ１６０ΔＣＴ、ｐＣＶおよびｐＧＰｍをＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写の鋳型として用いて、ＶＥＥ−ＲＰ−ＨＩＶ−ｌｅｎｖＲ２ベクターを調製する（トン（Ｄｏｎｇ）ら（２００３年）ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）７７、３１１９−３１３０頁）。研究の０、１、２、１０、１２および１４週目に、ＶＥＥ−ＲＰ−ＨＩＶ−ｌｅｎｖＲ２を１０６．５フォーカス形成単位（ＦＦＵ）の用量で投与する。ｐＲｅｐＸにおけるＳＩＶｍａｃ２５１Ｅｎｖタンパク質（またはその変異体）のクローニングおよびそれに次ぐＶＥＥ−ＲＰ−ＨＩＶ−ｌｅｎｖＲ２に関する処理によって、ＶＥＥ−ＲＰ−ＳＩＶＥｎｖを調製する。投薬は、１０６．０または１０７．０ＦＦＵを含み、半分は静脈内に、半分は皮下に投与される。ＭＶＡは、これまでに記載されているように調製される（ホートン（Ｈｏｒｔｏｎ）ら（２００２年）ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）７６、７１８７−７２０２頁）。０．５ｍｌ中５×１０８ＰＦＵの用量を外側大腿に皮内投与する。コドン最適化ＳＩＶ  Ｅｎｖ遺伝子をＶＲ１０１２ベクターに挿入することによって、ＤＮＡプラスミドワクチンＶＲ−ＳＩＶＥｎｖを構築する（ハーチッカ（Ｈａｒｔｉｋｋａ）ら（１９９６年）ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．）７、１２０５−１２１７頁）。ＴＯＰ１０細胞（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中で、エンドトキシンフリーＤＮＡ精製キット（キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いることによって、プラスミドを増幅する。
【０１１１】
ｇｐ１４０Ｒ２またはその誘導体の生成。推定されるｇｐ４１膜貫通領域のすぐ前のアミノ酸６９２位のリシン残基の後に２つの翻訳終止コドンの挿入、ならびに５１７および５２０のアルギニンからセリンの置換を挿入してプロテアーゼ切断シグナルを崩壊させることによって、ｇｐ１４０Ｒ２コード配列を調製する（チェルペリス（Ｃｈｅｒｐｅｌｉｓ）ら（２００１年）ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）７５、１５４７−１５５０頁、クイナン（Ｑｕｉｎｎａｎ）ら（１９９９年）エイズ・リサーチ・アンド・ヒューマン・レトロバイラシーズ（ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．）１４、９３９−９４９頁）。遺伝子をワクシニアベクターｐＭＣＯ２にサブクローニングし、強力な合成ワクシニアウイルス早期〜後期プロモーターに連結する（キャロル（Ｃａｒｒｏｌｌ）ら（１９９５年）バイオテクニックス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）１９、３５２−３５４頁）。標準的な方法を用いることによって、ｇｐ１４０Ｒ２をコードする組み換えワクシニアウイルス（ｖＡＣ４）を生成する（ブローダー（Ｂｒｏｄｅｒ）ら（１９９４年）モレキュラー・バイオテクノロジー（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）１３、２２３−２４５頁）。ＢＳ−Ｃ−１細胞を感染させることによって組み換えｇｐ１４０Ｒ２糖タンパク質を生成し、レンチルレクチンセファロース４Ｂ親和性およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いることによって培養物上清からオリゴマーｇｐ１４０Ｒ２を精製する（アール（Ｅａｒｌ）ら（１９９０年）ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）６８、３０１５−３０２６頁、アール（Ｅａｒｌ）ら（２００１年）ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）７５、６４５−６５３頁）。ｇｐ１４０Ｒ２を、結合活性および大きさに関して分析する。
【０１１２】
初回免疫のために、ＱＳ−２１アジュバント（アンチジェニックス（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ））中でｇｐ１４０Ｒ２を調製する。各動物に、３００μｇのｇｐ１４０Ｒ２および１５０μｇのＱＳ−２１を、合計１ｍｌの体積を２回に分けた用量で後脚に筋肉内投与する。最終免疫のために、４００μｇのオリゴマーｇｐ１４０Ｒ２を１ｍｌのＲｉＢｉアジュバント（コリザ（Ｃｏｒｉｘａ））と組み合わせ、次いで分割した用量で後脚に筋肉内投与する。対照サルに、同一の体積の、ｇｐ１４０Ｒ２のないアジュバントを投与する。上述の例でｇｐ１４０Ｒ２をクローニング、精製および投与するが、その任意の所望の誘導体を含む任意のＥｎｖタンパク質に関して、同じ手順に従い得る。
【０１１３】
要約すると、ＢＣＮ抗体を有するドナー由来のエンベロープタンパク質をコードする遺伝子をクローニングした。これらの遺伝子の全ては、これまでに記載されている他のＨＩＶ−１遺伝子と比較して独特であった。これらの遺伝子のうち、これまでに記載されているＲ２エンベロープタンパク質を独特にしている特性を共有するものはなかった。ＢＣＮドナー由来のエンベロープタンパク質は、ｇｐ１２０エピトープに対するＭａｂによる中和に比較的耐性があるという共通の特性を有したが、殆どのものは２つのｇｐ４１エピトープに対する配向のあるＭａｂ、２Ｆ５および４Ｅ１０による中和に対して感受性があった。
【０１１４】
これらの結果から、Ｅｎｖの複雑な構造的相互作用に対する、この領域における中和エピトープの依存性の証拠が提供される。ＨＩＶ−１  Ｅｎｖがこれらのエピトープを標的とする抗体を誘導する能力は、これらのエピトープのコンフォメーション、およびおそらくウイルス−細胞相互作用プロセスの間にコンフォメーション変化が起こる様式に依存する。これらのエピトープに対する配向のあるＢＣＮ抗体を有するドナー由来のＥｎｖは、天然の状態で存在するか、または受容体／補助受容体相互作用の際に、免疫原性形態でＢ細胞に対してこれらのＭＰＥＲエピトープを提示するコンフォメーションを容易にとる。特定のＥｎｖがこれらのエピトープを提示する能力は、ｇｐ４１のこの領域の特異的配列、ならびにＥｎｖ複合体のこの領域と他のドメインとの間の相互作用の両方に依存するようである。ＢＣＮドナー由来のＥｎｖがＭＰＥＲエピトープに対する中和抗体を誘導したという、本発明者らの研究からの最も直接な証拠は、１４／００／４および１４／００／４（Ｔ６６２Ａ）偽型ウイルスの血清中和の比較の研究から生じた。中和への耐性に対する２Ｆ５エピトープ変異の効果は、ＢＣＮドナー１４／００および２４／００由来の血清に関して、他のドナー由来よりも実質的に大きかった。この結果の、最も可能性の高い解釈は、これらの２つの血清が比較的高いレベルのＭＰＥＲ特異的中和抗体を含んでいたということである。逆の解釈および仮説もまた可能である。ｇｐ１２０モノクローナル抗体ではなくＭＰＥＲに対するモノクローナル抗体による中和に対するＢＣＮドナー由来のＥｎｖの感受性の維持は、ＭＰＥＲにおけるエスケープ変異体の免疫学的選択の欠如を反映しているかもしれないが、ｇｐ１２０エスケープ変異の発生を反映しているかもしれない。その場合は、血清は、主にｇｐ１２０エピトープに対する中和抗体の形をとるべきである。さらに、ＢＣＮ血清による中和に対するＴ６６２Ａ変異の劇的な効果は、この場合ｇｐ１２０に対する配向のある抗体による中和に対する変異の効果を反映し得る。
【０１１５】
上述の実施例を参照しながら本発明を詳細に説明してきたが、本発明の趣旨を逸脱することなく、種々の変更がなされ得ることが理解される。本願で参照した、全ての引用した特許、特許出願および刊行物は、その全体が参照によって本明細書に援用される。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】広範な交差反応性（ＢＣＮ）抗体ありまたはなしのドナー由来の血清による、偽型ＨＩＶ−１株の中和。
【図２】ＢＣＮドナー（パネルＡ）および非ＢＣＮドナー（パネルＢ）由来の血清による、ＢＣＮ（■）および非ＢＣＮ（□）ドナーのＥｎｖを有する偽型ウイルスの中和。アッセイはトリプリケートで行った。結果は、単一の実験由来、またはいくつかの場合における２つの実験の平均である。中和価は、結果として５０％以上のルシフェラーゼ活性の阻害を生じる、最高血清希釈度として定義した。偽型ウイルスＶＩ８４３、ＶＩ１２４９、ＶＩ１７９３、９３ＢＲ２０．９およびＮＹＵ１０２６は、ドナーＶＩ０７４７由来の血清による中和に関して試験しなかった。水平な破線は、試験した偽型ウイルスの一団に対する、各血清の幾何平均力価を表す。ＢＣＮ血清のＧＭＴ＝１：１０９および非ＢＣＮ血清のＧＭＴ＝１：４５、ｐ＝０．０１。
【図３】ＢＣＮ血清および非ＢＣＮ血清による、１４／００／４  Ｅｎｖを有する偽型ウイルスの中和の比較。水平な破線は、それぞれＢＣＮおよび非ＢＣＮ血清によって１４／００／４  Ｅｎｖの中和に関して得られた幾何平均力価（ＧＭＴ）を示す。ＢＣＮおよび非ＢＣＮ血清による１４／００／４  Ｅｎｖの中和に関して得られた力価の幾何平均値および標準偏差を、両側スチューデントｔ検定によって比較した（補正係数が多重比較に適用され、ｐ＝０．０３）。
【図４】ＭａｂおよびｓＣＤ４による、ＢＣＮおよび非ＢＣＮ  Ｅｎｖを有する偽型ウイルスの中和。結果を、ＢＣＮおよび非ＢＣＮ  Ｅｎｖを有する偽型ウイルスに関して以下のように示す。Ｒ２（△）、１４／００／４（□）、２４／００／４（○）、ＶＩ４２３（▲）、ＶＩ８４３（◆）、ＶＩ１２４９（■）、およびＶＩ１７９３（◇）、全ての非ＢＣＮ  Ｅｎｖを（●）として示す。中和アッセイを三連で行い、示される結果は２回の独立した実験の幾何平均値である。Ｍａｂを、段階的２倍希釈物中の中和に関して試験した。５０％抑制量（ＩＤ５０）を、結果としてウイルス感染性の５０％以上の阻害を生じる最低濃度と定義した。
【図５】ｇｐ４１  Ｍａｂおよびポリクローナル血清による中和に対する感受性に対するＴｈｒ６６２の効果。Ａ：早期の１４／００／４（●）、ならびに後期の１４／００／８−３３（△）および１４／００／８−８３（□）を有する偽型ウイルスの変化しやすい感受性、Ｍａｂ  ２Ｆ５および４Ｅ１０による中和に対するドナー１４／００由来のＥｎｖクローン。相対的感染性は、培地と比較した、Ｍａｂ存在下で得られたルシフェラーゼ単位の比である。Ｂ：Ｔ６６２およびＡ６６２の、Ｍａｂ  ２Ｆ５および４Ｅ１０による中和に対する感受性に対する効果の比較。１４／００／４、ＮＹＵ１０２６およびＮＹＵ１４２３  Ｅｎｖを有する偽型ウイルスを、２Ｆ５および４Ｅ１０  Ｍａｂによる中和に関して比較した。部位特異的変異誘発を用いて、１４／００／４（Ａ６６２）、ＮＹＵ１０２６（Ｔ６６２）、およびＮＹＵ１４２３（Ｔ６６２）変異Ｅｎｖを構築した。野生型Ｅｎｖを有する偽型ウイルスを■として示し、変異Ｅｎｖを有する偽型ウイルスを□として示す。Ｃ：ＢＣＮおよび非ＢＣＮポリクローナル血清による、１４／００／４（Ｔ６６２）（■）および１４／００／４（Ａ６６２）（□）Ｅｎｖを有する偽型ウイルスの中和の比較段階的２倍希釈物中の中和に関して血清を試験した。５０％抑制量（ＩＤ５０）を、結果としてウイルス感染性の５０％以上の阻害を生じる最低血清希釈度と定義した。各血清のＩＤ５０を、線形回帰によって決定した。各棒の上方の数字は、各ポリクローナル血清による、１４／００／４（Ｔ６６２）および１４／００／４（Ａ６６２）を有する偽型ウイルスのＩＤ５０の差である。
【図６】Ｍａｂ  ２Ｆ５および４Ｅ１０による中和に対するドナー２４００のＥｎｖクローンにおけるＫ６６５Ｔ変異の効果。Ａ：ドナー２４／００由来の早期の２４／００／４（●）、ならびに後期の２４／００／８−４６（△）、２４／００／８−２７５（◇）および２４／００／８−２５８（□）Ｅｎｖクローンの、Ｍａｂ  ２Ｆ５および４Ｅ１０による中和に対する変化しやすい感受性。これらのＥｎｖを有する偽型ウイルスを、２つのＭａｂによる中和に関して試験した。示される各結果は１つの実験に由来し、２回の反復実験由来のものと本質的に同じである。全ての実験は三連で行った。Ｂ：Ｅｎｖ  ２４／００／８におけるＫ６６５Ｔ変異は、Ｍａｂ  ２Ｆ５による中和に対する耐性を決定する。２４／００／４（Ｋ６６５）（■）および２４／００／４（Ｔ６６５）（□）Ｅｎｖを有する偽型ウイルスを、Ｍａｂ  ２Ｆ５および４Ｅ１０による中和に関して試験した。アッセイは三連で行い、示される結果は２つの独立した実験の平均である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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