(57)【要約】 ｉｎ  ｖｉｖｏでアルギニンの血漿濃度を低下させるための医薬製品の調製のためのアルギニンデイミナーゼを含む赤血球の使用。前記使用は肝細胞癌及び悪性黒色腫の如きアルギニン依存性腫瘍の治療又は一酸化窒素合成の阻害、及び敗血症性卒中の予防及び／又は治療に特に関連する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ  ｖｉｖｏで血漿アルギニンの濃度を低下させるための医薬製品の調製のためのアルギニンデイミナーゼを含む赤血球の使用。
【請求項２】
アルギニン依存性腫瘍の治療のための、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
肝細胞癌の治療のための、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
悪性黒色腫の治療のための、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
一酸化窒素合成を阻害するための、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
敗血症性卒中の予防及び／又は治療のための、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
乳癌の、神経芽細胞腫の又はＴ−細胞リンパ芽球性白血病の治療又は新脈管形成の阻害又は関連する疾患の治療のための、請求項２に記載の使用。
【請求項８】
アルギニンデイミナーゼを含む赤血球。
【請求項９】
医薬として許容される液体中に懸濁される、請求項８に記載の赤血球。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の、赤血球又は赤血球の懸濁物を含む医薬製品。
【請求項１１】
アルギニンの血漿濃度を低下させるための、請求項１０に記載の医薬製品。
【請求項１２】
アルギニン依存性腫瘍の治療のための、請求項１０に記載の医薬製品。
【請求項１３】
悪性黒色腫、肝細胞癌、乳癌、神経芽細胞腫及びＴ−細胞リンパ芽球性白血病から選ばれる腫瘍の治療のための又は新脈管形成の阻害又は関連する疾患の治療のための、請求項１２に記載の医薬製品。
【請求項１４】
ＮＯ合成を阻害するための、請求項１０に記載の医薬製品。
【請求項１５】
敗血症性卒中の予防及び／又は治療のための、請求項１４に記載の医薬製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血漿アルギニンの涸渇に、前記涸渇を提供する組成物に及び前記涸渇及び例えば、一酸化窒素の合成に対するその効果から恩恵を受けうる病理の治療に関する。したがって、本発明は悪性黒色腫及び肝細胞癌の如きいくつかの腫瘍の治療に、及び敗血症性卒中の予防及び治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書中に引用される全ての明細書、論文及び特許又は特許出願を本明細書中に援用する。
アルギニンは非必須アミノ酸である。それは、アルギニノ琥珀酸塩合成酵素及びアルギニノ琥珀酸塩リアーゼの活性により、２の段階でシトルリンから、尿素サイクルの過程において合成される。はじめの酵素はシトルリンのアルギニノ琥珀酸塩への変換を触媒し、及び第二の酵素はアルギニンへの変換を行う。アルギニンはアルギナーゼの活性の下でオルニチンへ代謝され、及びオルニチンは今度はオルニチントランスカルバモイラーゼにより触媒される反応によりシトルリンに変換されうる。
【０００３】
しかしながら、いくつかの型の腫瘍細胞はアルギニンが供給されることを必要とすることが示されており、及びこのことは、アルギニン栄養素要求と呼ばれるこれらの型の癌のための可能性のある治療としてアルギニン涸渇の考慮を導いた。アルギニンデイミナーゼの抗腫瘍活性は多くの出版物の主題になっている。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性は悪性黒色腫及び肝細胞癌に関して示されている。しかしながら、この酵素はいくつかの主要な欠点を有する。
【０００４】
アルギニンデイミナーゼは哺乳類において生成されないが、微生物から得られ、そのことはそれを哺乳類にとって高い抗原性を有する化合物にする。
【０００５】
さらに、この酵素は約５時間の次数の、哺乳類における非常に短い半減期を有し、及び有効であるためには高い用量で毎日投与されなければならない。これらの欠点を克服するために、著者は、より長い半減期（７〜９日間）を有するより低い抗原性の調合物になる、この酵素のペグ付加形、すなわち、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合されたアルギニンデイミナーゼを提案した。この主題を扱う研究のうち、私たちは黒色腫の及び肝細胞癌の治療に関する以下のものを挙げうる：Ｆ．  Ｉｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２００４，  ２２：  １８１５−１８２２；  Ｃ．  Ｍ．  Ｅｎｓｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００２，  ６２：  ５４４３−５４５０；  Ｆ．  Ｗ．  Ｈｏｌｔｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００２，  ８０：  ２５９−２７１；  Ｊ．  Ｓ．  Ｂｏｍａｌａｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａ，  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｒｔｉｃｌｅ  Ｎｏｖ／Ｄｅｃ  ２００３，  １，５：２８４−２９３；  Ｃｕｒｌｅｙ  Ｓ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，  ５０，  １２１４−６，  ２００３。
【０００６】
米国特許第４，９６５，８５７号は、アルギニンデイミナーゼが体外循環に対してはたらく反応器を用いる血液の体外治療に関する、全く異なる方法を提案する。
ペグ付加アルギニンデイミナーゼに基づく現行の治療は興味深いが、半減期がまだ短いので、短い間隔で繰り返される比較的大用量を投与する必要性に、及びアレルギー効果及び活性素の阻害を引き起こしうる活性素に対する抗体の値を誘発する危険性を伴う、長期間の高い用量での繰り返される投与に関連した毒性に関連したいくつかの制限を有する。
それゆえ、よりよいバイオアベイラビリティ（よりよい生物学的活性、延長された半減期）を有する私たちの自由になる活性製品を有することはかなり有益なことでありうる、及びそのことは、繰り返される治療の場合においてでさえも、投与される酵素の量を最適化し及び毒性を低下させ、及び免疫反応及び臨床アレルギーの危険性を制限することを可能にする。
【０００７】
赤血球を医薬製品のベクターとして用いる利点はずいぶん前に示された。それらは天然の生物適合性を有し、及び注入後、それらは既知のプロセスにより完全に生分解され、及びｉｎ  ｖｉｖｏで比較的長い半減期（ヒトにおいて約３０日間の次数の半減期）を有する。
【０００８】
尿素サイクルの天然酵素である、アルギナーゼの封入は提案され、及び彼らの赤血球中にこの酵素の欠損を示す高アルギニン血症患者の治療の範囲内で試験された（Ｃ．  Ｇ．  Ｍｉｌｌａｎ，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００４，  ９５；  ２７−４９；  Ｋ．  Ａｄｒｉａｅｎｓｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９８４，  １６，  ７：  ７７９−７８６）。そのねらいは内因性アルギナーゼ欠損に関連する代謝及び酵素欠損を補うことであった。
【０００９】
アルギナーゼは約９．５のアルカリ最適ｐＨを有し、及びその活性は生理学的ｐＨでは低い。対照的に、アルギニンデイミナーゼは約６．５の最適ｐＨを有し、生理学的ｐＨでその活性の７０％超を保持し、及びアルギニンに対するそのアフィニティはアルギナーゼのそれより１０００倍大きい：Ｂ．  Ｊ．  Ｄｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｄ．  Ｓｃｉ．  Ｍｏｎｉｔ．  ２００２，  ８，  ７：２４８−２５３。その研究において、一酸化窒素ＮＯの合成の阻害に関して、著者は細胞外アルギニンに対するアルギニンデイミナーゼの強い活性を報告するが、細胞内アルギニン（マクロファージ）に対する活性の欠如を報告する。
【００１０】
ＮＯは生体伝達物質であり、及び細胞外アルギニンから主に合成されると考えられる。敗血症性卒中はＮＯにより及び腫瘍壊死因子ＴＮＦαにより仲介される。Ｄｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  上記の及びＪ．  Ｂ．  Ｔｈｏｍａｓ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ２００２，  ３６３，  ５８１−５８７の研究から、ＮＯの合成の阻害は敗血症性卒中に対する治療として認識されている。ＮＯはまた、Ｌｉｎｄ  ＤＳ．  Ａｒｇｉｎｉｎｅ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ，  Ｊ．  Ｎｕｔｒ．  ２００４：２８３７Ｓ−４１中で報告されるように、癌化プロセスに関連するように見える。
【００１１】
アルギニンデイミナーゼはアルギナーゼよりはるかに大きなアルギニンの分解及びＮＯ合成の阻害についての可能性を有するように見える。しかしながら、この酵素は細胞内酵素活性を有さず、生理学的ｐＨはその最適ｐＨではなく、それは短い半減期を有し、及びそれは免疫反応を誘発するようである。
【００１２】
この複雑な状況から出発して、発明者は、血漿アルギニンの有効な分解及び／又は一酸化窒素ＮＯ合成の阻害を提供する技術的解決を提案することにねらいを定める。
したがって、本発明はｉｎ  ｖｉｖｏで血漿アルギニンの濃度を低下させるための医薬製品の調製のためのアルギニンデイミナーゼを含む赤血球の使用に関する。
【００１３】
アルギニンデイミナーゼは引用文献ＩＵＢＭＢ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ中のＥＣ  ３．５．３．６の下に同定される。使用される酵素は天然、合成又は人工起源のものであり又は遺伝子工学により得られうる（例えば、上記酵素をコードする遺伝子を発現するベクターの統合後のホスト細胞、例えば、Ｅ．  ｃｏｌｉにおける上記酵素の生成）。使用されうるアルギニンデイミナーゼは、例えば、ＥＰ−Ａ−１  ０１１  ７１７、ＥＰ−Ａ−０  ４１４  ００７、ＵＳ−Ａ−５  ３７２  ９４２、ＪＰ−Ａ−６０６２８６７、ＪＰ−Ａ−２０５３４９０、ＪＰ−Ａ−２０３５０８１中に示される。同等の様式で、本発明は、特にそれらの酵素活性を増大させるために改変された酵素でありうる、この酵素のアナログの使用を含む（ＥＰ−Ａ−０  ９８１  ６０７）。
【００１４】
本発明の目的は、血漿中のアルギニンの濃度を低下させることを意味する、血漿アルギニン涸渇である。理論に拘泥しようとすることなしに、血漿アルギニンは受動拡散により処理された赤血球に入ると考えられる。本発明に係る赤血球は、入ったアルギニンがアルギニンデイミナーゼにより分解される生物反応器のようにふるまう。本発明は他の利点を提供する。それらの寿命の終わりに、上記赤血球は肺においてはもちろん、主に肝臓、脾臓及び骨髄でマクロファージにより破壊される。このことはアルギニンデイミナーゼの標的化放出をもたらし、血漿アルギニンの局在的涸渇を引き起こす。この効果は肝細胞癌の如き、これらの器官に影響する、特に腫瘍の病理の治療において利用される。
【００１５】
本発明により採用される解決は注目すべき方法でいくつかの決定的な利点を混合することを可能にする、すなわち、上記酵素は免疫系から単離され、それにより上記酵素への免疫反応を発達する危険性を減少させる（それは繰り返される治療の場合に大きな利点である）ので、長期活性を許容する赤血球の寿命、一方で、上記酵素が８０％超の酵素活性を示す一般的に７．４未満のｐＨでの有利な、及び他方で、保存される環境における酵素の貯蔵。上記酵素は赤血球の膜により抗アルギニンデイミナーゼ抗体から保護され、及びその酵素活性はそれゆえ抗体が処置される患者の血中に存在するときでさえも保存される。さらに、上記酵素は細胞内アルギニンに対して作用しないので、健康な細胞は保存される。
【００１６】
本発明はそれゆえ、血漿アルギニン涸渇の有利な効果が示されているアルギニン依存性腫瘍における特に興味深い適用を発見する（例えば、Ｆ．  Ｉｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｃ．  Ｍ．  Ｅｎｓｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｆ．  Ｗ．  Ｈｏｌｔｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｊ．  Ｓ．  Ｂｏｍａｌａｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３、及びＣｕｒｌｅｙ  Ｓ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，以前に引用される  を参照のこと）。
【００１７】
本発明の第一の態様にしたがって、医薬製品はアルギニン依存性腫瘍の治療に意図される。アルギニン依存性により、私たちは、複製のためにアルギニンを必要とし、それらが必要とするアルギニンのいくらか又は全てを合成することができず、及びそれゆえアルギニンの供給を必要とする腫瘍細胞を含む腫瘍を意味する。血漿アルギニン涸渇はそれらの発達に必須であるアルギニンをこれらの細胞から奪い、これらの細胞の標的化された死、腫瘍成長の阻害又は腫瘍塊の退縮を引き起こすであろう。
【発明の開示】
【００１８】
１の特徴にしたがって、本発明は肝細胞癌又は初期の肝臓癌用医薬製品の調製のためのこれらの赤血球の使用に関する。
【００１９】
第二の特徴にしたがって、本発明は表在拡大型黒色腫及び結節性黒色腫の如き、そのさまざまな形態の悪性黒色腫の治療用医薬製品の調製のためのこれらの赤血球の使用に関する。
【００２０】
本発明の第二の態様にしたがって、本発明は一酸化窒素合成の阻害用医薬製品の調製のためのこれらの赤血球の使用に関する。上記医薬製品は、以前に引用されるＤｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２中に示されるように、少なくとも部分的に血漿アルギニンの分解を介して作用することが指摘されるべきである。
【００２１】
この態様の１の特徴にしたがって、本発明は敗血症性卒中の予防及び／又は治療用医薬製品の調製のためのこれらの赤血球の使用に関する。
【００２２】
本発明は以下の型の癌：
−乳癌（Ｓｈｅｎ  Ｗｅｉ−Ｃｈｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ＣａｌｉｆｏｒｎｉａＢｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｃｒｐ．ｏｒｇ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ＰａｇｅＧｒａｎｔ．ａｓｐ？ｇｒａｎｔ＿ｉｄ＝１９５４）
−神経芽細胞腫（Ｇｏｎｇ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２００３，  １０６：７２３−８）
−白血病（Ｇｏｎｇ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２０００，  Ｖｏｌ．  １４，８２６−９；  Ｎｏｈ  Ｅ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２００４，  １１２：５０２−８）；
のうちの１の治療のための又は新脈管形成の阻害及び：血管腫、血管線維腫、関節炎、糖尿病性網膜症、早発の網膜症、血管新生緑内障、角膜の疾患、退縮及び他の型の黄斑変性、翼状片、網膜変性、水晶体後線維増殖症、乾癬、毛細管拡張症、化膿性肉芽腫、脂漏性皮膚炎、ざ瘡、癌及び新脈管形成に関連する転移（ＷＯ  ０２０９７４１；Ｐａｒｋ  Ｉ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２００３，  ８９：９０７−１４）の如き関連する疾患の治療のための医薬製品の調製のためのこれらの赤血球の使用に関する。
【００２３】
本発明はまたアルギニンデイミナーゼを含む赤血球にも関する。
本発明はさらに医薬として許容される塩溶液（一般的に、赤血球のための標準の媒体、ＮａＣｌ及びグルコース、デキストロース、アデニン及びマンニトールから選ばれる１以上の成分を含む溶液；例えば、ＳＡＧ−マンニトール又はＡＤｓｏｌ）中のこれらの赤血球の懸濁物に関する。前記溶液は赤血球の保存を提供しうる、及びそれはＬ−カルニチンの如き保存剤を含みうる。前記懸濁物は使用のために又は使用前の希釈のために準備された状態で包装されうる。すぐに使用できる製品の最終ヘマトクリット値（必要な場合、使用前の希釈後）は好ましくは４０〜７０％である。それは好ましくは灌流により、静脈内に投与されうる。
【００２４】
上記懸濁物又は本発明にしたがう赤血球を含むどんな投与可能な調合物も本質的に本発明により含まれる医薬製品又は医薬組成物を構成する。前記医薬製品又は組成物は上記に挙げられるさまざまな適用のために特に意図されうる。それは例えば、灌流のための柔軟なバッグとして又は注入による投与のためのいくつかの他の形態で包装されうる。
【００２５】
本発明の１の特徴にしたがって、上記医薬製品は４０〜７０％の、好ましくは４５〜５５％の、及びより好ましくは５０％のヘマトクリット値の赤血球の懸濁物を含む。それは好ましくは１０〜２５０ｍｌの体積で包装される。医療処方に対応する量の封入された酵素が好ましくは全体として血液バッグ中に含まれる。医療処方は体重ｋｇ当たり１から２００ＩＵまで変化しうる。
【００２６】
本発明はまた特に静脈内経路による、注入又は灌流による、及び好ましくは灌流による、それを必要とする患者への有効な量の前記医薬製品の投与を含む、肝細胞癌及び悪性黒色腫の如きアルギニン依存型の癌又は上記に挙げられる他の癌性若しくは非癌性病理の１の治療方法にも関する。
【００２７】
興味深い様相にしたがって、患者は腫瘍の外科的切除後に処置される。
本発明はまた、特に静脈内経路による、注入又は灌流による、及び好ましくは灌流による患者への有効な量の前記医薬製品の投与を含む、一酸化窒素合成を阻害する及び／又は敗血症性卒中を予防する及び／又は治療することを意図される治療方法にも関する。
【００２８】
これらのさまざまな治療方法についての特に有利な様相にしたがって、患者は、彼自身の赤血球が上記酵素の封入のために処理された後、彼自身の赤血球で処置される。変形として、上記赤血球は１以上のドナーから得られる。
【００２９】
上記方法はしたがって、患者からの又は１以上のドナーからの１以上の血液サンプル、例えば、血液バッグ（単数又は複数）を回収すること、赤血球の沈殿物又は濃縮物の調製、本発明にしたがう酵素の組み込み及び上記酵素を組み込む赤血球のバッチの生成、それから静脈内経路による患者への上記懸濁物（医薬製品）の投与を含みうる。
【００３０】
典型的に、体重ｋｇ当たり１〜２００ＩＵの酵素に対応する体積の処理された赤血球の懸濁物が投与される。本発明の１の特徴にしたがって、４０〜７０％の、好ましくは４５〜５５％の、及びより好ましくは５０％のヘマトクリット値の、１０〜２５０ｍｌの赤血球の懸濁物が投与される。
【００３１】
特定の様相にしたがって、上記懸濁物は十分な期間、１５日〜３ヶ月の頻度で、好ましくは毎月投与される。
赤血球中に活性素を封入する技術は既知であり、及びここで好ましい溶解−再シールによる基礎技術は、当業者が引用しうる、特許ＥＰ−Ａ−１０１  ３４１及びＥＰ−Ａ−６７９  １０１中に示される。この技術にしたがって、透析器の第一の区画は赤血球の懸濁物で連続して供給され、一方で、第二の区画は赤血球を溶解するために赤血球の懸濁物に比較して低張である水溶液を含む；次に、再シール単位において、上記赤血球の再シールが浸透性及び／又は腫張性圧力を増大させることにより酵素の存在下で誘発され、その後上記酵素を含む赤血球の懸濁物が回収される。
【００３２】
今日までに示される変形のうち、優先権は、酵素の有効な、再現可能な、信頼できる及び安定な封入を提供する、フランス特許出願第０４０８６６７号中に示される方法に与えられるであろう。この方法は以下の段階を含む：
１−  ６５％以上のヘマトクリット値で等張溶液中に濃縮赤血球（ＰＲＢＣｓ）（又は球状濃縮物）を懸濁すること、＋１〜＋８℃の冷蔵、
２−  同じＰＲＢＣｓからの赤血球のサンプルについての浸透的もろさの計測、
ここで、段階１及び２はどんな順序（並行を含む）でも行われうる、
３−  ６５％以上のヘマトクリット値の赤血球の懸濁物及び＋１〜＋８℃に冷蔵された低張溶解溶液を透析カートリッヂに通すことを含む、＋１〜＋８℃で一定に維持される温度での（特に１の及び同じチャンバー内での）溶解及び酵素の取り込み（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｓａｔｉｏｎ）のための手順；溶解パラメーターは以前に計測された浸透的もろさの機能として調節される；及び
４−  高張溶液の存在下での、温度が＋３０〜＋４０℃である（特に第二のチャンバー内で行われる）再シール手順。
【００３３】
「取り込み（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｓａｔｉｏｎ）」は赤血球の内側への酵素の浸透を意味する。
本発明の第一の特徴にしたがって、ＰＲＢＣｓは６５％以上の、及び好ましくは７０％以上の高いヘマトクリット値で等張溶液中に懸濁され、及びこの懸濁物は＋１〜＋８℃で、好ましくは＋２〜＋６℃で、及び典型的に約＋４℃で冷蔵される。特定の様相にしたがって、上記ヘマトクリット値は６５〜８０％、及び好ましくは７０〜８０％である。
【００３４】
本発明の重要な特徴にしたがって、赤血球の浸透的もろさは溶解段階の直前に計測される。赤血球又はそれらを含む懸濁物は有利なことに溶解のために選択される温度に近い又は等しい温度である。本発明の他の有利な特徴にしたがって、一旦、浸透的もろさの計測が得られたら、それはすばやく利用される、すなわち、溶解手順はサンプルを取った後すぐに行われる。サンプルを取ること及び溶解開始の間のこの時間の遅れは好ましくは３０分以内、及びさらにより好ましくは２５又は２０分以内である。
【００３５】
透析が制御されることを許容する２のパラメーターは（後者の特徴の機能としての）透析器中で細胞がとどまる時間及び透析物の容量オスモル濃度である。これらの２のパラメーターは、溶解／再シールの段階を経験するために処理される赤血球の浸透抵抗性又は逆にもろさの特徴に関連して調節されなければならない。この浸透抵抗性は少なくとも１の以下のパラメーターにより特徴付けられうる：
ａ．溶血、すなわち、孔形成の開始が起こる媒体の容量オスモル濃度。
ｂ．曲線％溶血＝ｆ（媒体の容量オスモル濃度）の直線部分の傾きから決定される、溶血の速度Ｖ。
ｃ．ある容量オスモル濃度についての溶血の割合。
ｄ．５０％の溶血（Ｈ50）が得られる容量オスモル濃度。
ｅ．ある割合の溶血（例えば、５０％）を得るために取られる時間。
【００３６】
好ましい態様にしたがって、上記浸透抵抗性はパラメーターｂ、ｄ又はｂ及びｄの手段により特徴付けられる。
浸透的もろさはそれゆえ、サンプルを取ること及び溶解開始の間の短時間の遅れと矛盾しない、短い時間で計測されなければならない。本発明の１の特徴にしたがって、１以上のこれらの溶血パラメーターは半浸透膜をとおして既知の等張度の低張溶液、例えば、水（蒸留水等）に対して計測される。手動の方法が構想されうる。しかしながら、本発明の好ましい態様にしたがって、浸透的もろさは１５分未満で、より詳細には１２分未満で及び好ましくは１０分未満で赤血球のサンプルの浸透的もろさを計測するために設計された自動計測器械を用いて計測され、及び得られた結果は溶解パラメーターを調節し、及び溶解を開始するために短時間の遅れで利用される。
【００３７】
浸透的もろさは少なくとも部分的に、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ，  Ｌｏｎｄｏｎ  １９５６中のＪ．  Ｖ．  Ｄａｃｉｅにより示される手動技術を自動化する器械を用いて計測されうる。上記器械の例はＪ．  Ｄｉｄｅｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｈｅｍｏｒｈｅｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２３  （２０００）  ３１−４２による論文中に示される。原理は、評価されるべき赤血球の懸濁物のサンプル、及び好適な体積の既知の等張度の低張溶液、例えば、蒸留水が、ＮａＣｌイオンが上記溶液、例えば、蒸留水に拡散するにつれて赤血球のゆっくりとした溶血を作出するように、半浸透膜のそれぞれの側に入れられる装置の使用に基づく。時間にわたる溶血の進行は、８０８ｎｍの波長のレーザー放射を用いて、透過率を計測することによりモニターされる（比較、Ｊ．  Ｄｉｄｅｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｒｈｅｏｌｏｇｙ  ３７，  ２０００：  ４０９−４１６）。光電子セルは上記懸濁物をとおって透過される光における変動を計測する。例えば、計測は１０分間取られる。上記器械は１以上の上記に挙げられるパラメーターａ−ｅを提供する。
【００３８】
第一の様相にしたがって、浸透的もろさは、温度変動が計測に影響しない条件で、その開始温度が＋１〜＋８℃であるサンプルについて、好ましくはまたこの温度の蒸留水で計測される。第二の様相にしたがって、浸透的もろさは＋１〜＋８℃の温度で維持されるサンプルについて計測される。したがって、Ｊ．  Ｄｉｄｅｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（上記）中に示される計測器械は温度調節を許容するように改変されうる。前記温度は好ましくは溶解温度に近い又は等しい。
【００３９】
一旦、１以上のこれらのパラメーターが決定されたら、透析器中の細胞の流速又は上記酵素を封じ込める赤血球及び／又は所望の量の後者を得るために十分な透析物の容量オスモル濃度のいずれかを決定するために、前記パラメーター（単数又は複数）を考慮に入れる関係が適用されうる：
赤血球の流速＝［Ａ×（Ｈ50）］＋［Ｂ×（Ｖ）］＋Ｋ−Ａ及びＢ＝透析器及び溶解溶液の容量オスモル濃度に関して適合されうる変数−Ｋ＝調節のための定数。
【００４０】
透析物の容量オスモル濃度＝［Ｃ×（Ｈ50）］＋［Ｄ×（Ｖ）］＋Ｋ−Ｃ及びＤ＝透析器及び透析器中の赤血球の流速に関して適合されうる変数−Ｋ＝調節のための定数。
【００４１】
本発明の１の局面にしたがって、溶解手順は、赤血球の懸濁物の温度が＋１〜＋８℃であり、及び浸透的もろさが計測され、及び溶解パラメーターが記録されたとき開始される。
【００４２】
好ましい態様にしたがって、約５０％溶血をもたらすｇ／ＬでのＮａＣｌ濃度が計測され（パラメーターｄ．）、及び透析カートリッヂ中の赤血球懸濁物の流速は計測された濃度値にしたがって調節される。
【００４３】
本発明の局面にしたがって、溶解手順は、赤血球懸濁物の温度が＋１〜＋８℃であり、及び浸透的もろさが計測され、及び溶解パラメーターが記録されたとき開始される。
有利な特徴にしたがって、処理されるべきはじめの懸濁物は上記に挙げられる溶解−取り込みチャンバー中に入れられる。本発明の１の態様にしたがって、上記方法は温度制御で装備された冷蔵されたモヂュールを使用し、及びこのモヂュール中に、透析カートリッヂ、バッグに及び溶解溶液にカートリッヂをつなげるための管を含む使い捨ての滅菌取りはずし可能アセンブリーに既に接続された又はその後接続される、＋１〜＋８℃に冷蔵された赤血球の懸濁物のバッグが入れられ、及びさらに、上記モヂュールは赤血球の懸濁物の及び溶解溶液の循環を提供するための手段を有し、前記モヂュール内の温度は＋１〜＋８℃の温度で安定化される。冷蔵されたモヂュールは、それがバッグ及び使い捨て可能で取りはずし可能なアセンブリーを収容しうるような大きさにされる。前記単一の冷蔵されたモヂュール内の、さまざまな管によりつなげられた上記バッグ、透析カートリッヂ、及び溶解溶液の配置は本発明にしたがう方法の有利な特徴である。
【００４４】
用語「バッグ」は血液輸血及び血液誘導の分野において通常使用される柔軟なバッグ又はポーチをいう。
本発明の重要な局面にしたがって、段階は、透析器をとおる懸濁物の安定なヘマトクリット値を維持するように、上記バッグ中で均一な懸濁物中の赤血球を維持するよう取られる。本発明の特徴にしたがって、上記バッグはそれゆえに、上記バッグから及びバッグへの上記懸濁物の循環を提供するループの外部循環を提供される。
【００４５】
「透析カートリッヂ」は、イオン交換が起こり、区画のうちの１中に局在する水溶液の浸透圧が他方の区画中の塩を含む水溶液を導入することにより制御された様式で変えられることを可能にしうる、透析仕切りにより分離される２の区画を含むエレメントを意味する。この型のカートリッヂは医療分野において広く使用される。好ましい様相にしたがって、例えば、以下の詳述を有する中空繊維透析カートリッヂが使用される：１００〜４００μｍの繊維の内径、０．３〜２ｍ2の繊維の総外部表面、１０〜４０ｃｍの繊維の長さ、１．５〜８ｍｌ／ｈ．ｍｍＨｇの限外ろ過係数。
【００４６】
既に挙げられるように、溶解手順は上記バッグ中の懸濁物の温度が＋１〜＋８℃であるとき開始されうる。興味深い様相にしたがって、上記懸濁物の温度は外部ループ循環上に局在するセンサーの手段により制御される。
【００４７】
決定される浸透的もろさに因り、実行は２の主要なパラメーター、透析カートリッヂ中の赤血球の懸濁物の流速及び溶解溶液の容量オスモル濃度について取られうる、及び両方の場合において、溶解溶液について一定の流速を設定することは好ましい。上記流速の値は重要ではない。典型的に、上記に示される中空繊維透析カートリッヂについて、溶解溶液の流速は５０〜３００ｍｌ／分に、及び好ましくは１５０〜２５０ｍｌ／分に設定される。
【００４８】
溶解溶液は赤血球の懸濁物に比較して低張である塩溶液である。それが一定の値に設定されるとき、その容量オスモル濃度は典型的に２０〜１２０ｍＯｓｍ、好ましくは７０〜１１０ｍＯｓｍ、例えば、９０ｍＯｓｍの次数でありうる。
【００４９】
例として、溶解溶液はＮａ2ＨＰＯ4及び／又はＮａＨ2ＰＯ4及びグルコースの如き糖を含みうる。
第一の様相にしたがって、透析カートリッヂをとおる赤血球の懸濁物の流速は調節され、一方で、溶解緩衝液の流速及び容量オスモル濃度は固定される。より高い浸透的もろさは懸濁物のより高い流速を意味する。典型的に、上記に示される詳述のカートリッヂについて、流速は５〜２００ｍｌ／分、好ましくは１０〜４０ｍｌ／分の範囲内で変化することが必要であろう。
【００５０】
第二の様相にしたがって、溶解溶液の容量オスモル濃度は調節され、一方で、懸濁物の及び溶解溶液の流速は固定される。より高い浸透的もろさは溶解溶液の容量オスモル濃度を増大させることを意味する。典型的に、容量オスモル濃度は１０〜２００ｍＯｓｍ／ｌ、好ましくは２０〜１５０ｍＯｓｍ／ｌの範囲内で変化することが必要であろう。
【００５１】
第三の様相にしたがって、透析カートリッヂをとおる赤血球の懸濁物の流速、及び溶解溶液の容量オスモル濃度の両方は調節される。
封じ込められるべき酵素は懸濁物のバッグ中に存在しうる及び／又は好ましくは徐々に、透析カートリッヂの上流又は下流の懸濁物の循環中に導入されうる。導入される体積は小さいので、酵素の冷蔵は場合による。
【００５２】
好ましくは、赤血球の懸濁物は、例えば５００ｍｌの、特にバッグ中に提示される、列挙される病原体を伴わない、脱白血球化された、受容者に適合性の血液群のＰＲＢＣｓから生成される。上記赤血球は、それらが移植片／ホスト免疫反応を示しやすい高く免疫抑制された患者に意図されるとき、照射されうる（Ｒ．  Ｊ．  Ｄａｖｅｙ，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １９９５，  ２４（１−２）：１４３−１４９）。
【００５３】
本発明の特定の特徴にしたがって、上記懸濁物を調製するために使用される、はじめのＰＲＢＣｓは血液から赤血球以外の要素を除去するために事前に処理された。この型の処理、例えば、血漿又は保存溶液を除去するために塩溶液で洗浄することは当業者に知られる。
【００５４】
特定の様相にしたがって、洗浄は封じ込められるべき酵素の存在下で行われる。
洗浄は赤血球の洗浄のための四重バッグ又は４−バッグ技術の如き、通常の技術により行われうる（ＭａｃｏＰｈａｒｍａ法及びトランスファーバッグ）。ＣＯＢＥ  ２９９１  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ型の自動赤血球洗浄器を使用することもまた可能である。
【００５５】
本発明の他の特徴にしたがって、赤血球はそれらの浸透抵抗性を増大させる及び／又は均質化するための溶液で事前に処理されうる。上記溶液は当業者に知られる。例えば、Ｌ−カルニチンを含む溶液は赤血球の浸透抵抗性の改善を提供しうる。他の例として、私たちはヘパリンの、クエン酸塩−リン酸塩−デキストロース（ＣＰＤ）の及びマンニトールの溶液を挙げうる。
【００５６】
溶解段階中の温度は好ましくは＋２〜＋６℃、及びさらにより好ましくは約＋４℃に維持される。
再シールプロセスは好ましくは溶解された懸濁物を加熱し、及び高張再シール溶液を添加することにより実施される。再シール温度は＋３０〜＋４０℃でありうる。それは好ましくは＋３５〜＋３８℃、例えば、約３７℃である。インキュベーションは典型的に１５〜４５分間続きうる。
【００５７】
好ましくは、透析カートリッヂを出る懸濁物及び高張再シール溶液は、好ましくは連続して、中間バッグ中に導入される。そこで、上記懸濁物は加熱され、及び再シールを確実にするために十分な時間所望の温度でインキュベートされる。特定の局面にしたがって、上記中間バッグは加熱されたモヂュール又は容器中に置かれ、その内部温度は選択された温度に調節される。
【００５８】
変形として、懸濁物及び再シール溶液は中間バッグ中に導入される。全ての懸濁物がこのバッグ中に回収されたとき、それはシールされ、及び所望の温度での加熱及びインキュベーションのためにモヂュールに移される。
【００５９】
再シールされた赤血球の懸濁物はその後、十分に再シールされなかった又は再シールされなかった細胞、残留物及び細胞外ヘモグロビンを除去するために、１以上の段階の塩溶液での洗浄を経験しうる。
他の特徴にしたがって、上記赤血球は、例えば、Ｌ−カルニチンを含む赤血球貯蔵溶液中に包装される。
【００６０】
生成された赤血球は好ましくは＋１〜＋８℃、好ましくは＋２〜＋６℃の温度で、典型的には約＋４℃で貯蔵される。
生成物の最終ヘマトクリット値は好ましくは４０〜８０％、典型的には４０〜７０％である。
【００６１】
本発明は：
−冷蔵手段及び温度調節手段を含む、＋１〜＋８℃の温度で冷蔵されうるモヂュール、
−上記モヂュール内にフィットするために設計される及び一方で溶解溶液の供給に及び他方で赤血球の懸濁物の供給につなげられうる透析カートリッヂを含む、使い捨て可能な滅菌取りはずし可能アセンブリー、
−溶解カートリッヂをとおる赤血球の懸濁物の流速を制御する及び／又は処理されるべき赤血球の浸透的もろさの機能として、溶解溶液の容量オスモル濃度を調節するための手段
を含む溶解−再シール装置を用いて実行されうる。
【００６２】
１の態様にしたがって、取りはずし可能なアセンブリーは使い捨て可能キットであり、及び赤血球の懸濁物を含むためのバッグ及び前記バッグを透析カートリッヂにつなげる管を含み、及び上記モヂュールは赤血球の懸濁物をバッグからカートリッヂへ及びカートリッヂをとおって循環させるための前記管と結合してはたらくポンプを含み、前記ポンプは場合により流動調節手段に連結される。上記アセンブリーは滅菌性が維持されることを確実にする。
【００６３】
有利な特徴にしたがって、上記バッグはその両方の端をループでバッグにつなげられた管でさらに装備され、及び上記モヂュールは前記バッグからの及び前記バッグへのバッグの内容物の循環を提供するために前記管と結合してはたらくポンプを含む。
他の有利な特徴にしたがって、温度センサーは前記管のループ上に配置される。
【００６４】
他の特徴にしたがって、酵素注入管がバッグを透析カートリッヂの「血液」入口につなげる管につなげられる。
他の特徴にしたがって、透析カートリッヂは管により溶解溶液を含みうる瓶につなげられ、及び冷蔵されたモヂュールは前記瓶及び溶解溶液を透析カートリッヂへ及び透析カートリッヂをとおして循環させるために前記管に結合して作動しうるポンプを受けるための手段を含む。
【００６５】
１の特徴にしたがって、冷蔵及び温度制御手段はモヂュール内で＋２〜＋６℃の、及び好ましくは＋４℃の次数の温度を維持することができる。
他の特徴にしたがって、透析カートリッヂからの「血液」出口はモヂュールの外に導く又は導きうる出口管につなげられる。他の特徴にしたがって、活性素の注入のための管は前記出口管につなげられる。上記出口管は（好ましくは中間バッグへのその管口の少し上流の出口管への第二の管口を介して導入される）再シール溶液はもちろん、溶解後の赤血球の懸濁物を回収することができる第二のバッグ（中間バッグ）につなげられうる。前記バッグは第二のモヂュール内で＋３０〜＋４０℃、好ましくは＋３５℃〜＋３８℃に温度を制御する手段で装備された第二のモヂュール内で有利に配置される。
【００６６】
有利な態様にしたがって、使い捨て可能な取りはずし可能なアセンブリーは全ての以下のものを含む：バッグ、循環管、（そのような装置と連結して作動することが意図される注入装置又は容器で装備された）注入管、透析カートリッヂ、及び好ましくは溶解溶液の瓶。
【００６７】
好ましくは、取りはずし可能なアセンブリーはそれ自体冷蔵又は加熱のために意図される特定の手段を有しない。これらの機能はアセンブリーの２の部分が入れられるモヂュール又はチャンバーによってのみ提供される。
【００６８】
本発明に係る方法及び装置において使用されるポンプは好ましくは蠕動ポンプである；１の態様にしたがって、はじめのバッグからはじめのバッグへの懸濁物の再循環を提供するポンプ及び溶解緩衝液の循環のためのポンプは事前に決定された一定の回転スピードを有し、一方で、懸濁物を透析カートリッヂへ送るポンプは処理されるべき赤血球の浸透的もろさの機能として制御可能である回転スピードを有する。
【００６９】
上記酵素は好適な手段、例えば、対応する注入管につなげられる、場合により駆動される、固定流動シリンジポンプにより導入されうる。変形として、シリンジポンプは蠕動ポンプで置き換えられうる。
上記装置は溶解カートリッヂをとおる赤血球の懸濁物の流速の制御及び／又は処理されるべき赤血球の浸透的もろさの機能としての、溶解溶液の容量オスモル濃度の調節の手段を含む。
【００７０】
１の特徴にしたがって、流動調節手段は懸濁物を透析カートリッヂへ送るポンプを制御するよう設計される。他の代替の特徴にしたがって、調節手段は、容量オスモル濃度を低下させるための希釈により又は前記容量オスモル濃度を増大させるための好適な溶質の導入により、溶解溶液の容量オスモル濃度を調節するために設計される。変形として、処理されるべき赤血球の浸透的もろさに調節される容量オスモル濃度の溶解溶液はモヂュールに導入される。
【００７１】
好ましい様相にしたがって、上記装置は、オペレーターにより入れられる教示にしたがって（例えば、赤血球の懸濁物の流速に関するデータは直接的にオペレーターにより入れられる）又は浸透的もろさに関して、オペレーターにより入れられるデータにしたがって、溶解プロセス及び場合により再シールプロセスを制御するための電子手段を含む（上記電子手段はそれから溶解パラメーター、例えば、赤血球の懸濁物の流速を決定する及び調節するために設計される）。前記電子手段は好ましくは（赤血球の懸濁物についてモヂュール内で及び／又は温度センサーで温度を制御するための）温度センサーにつなげられる。前記手段はポンプ、例えば、透析カートリッヂをとおる懸濁物の圧及び流速を制御し及び作動しうる。
【００７２】
好ましくは、モヂュールは溶液及び懸濁物の設置及び循環の視覚による制御のために、ガラス表面で、少なくとも１の面上で装備される。
【００７３】
本発明はここで、図面について、非限定的な例として使用される態様に基づいてより詳細に示されるであろう：
【実施例】
【００７４】
実施例１：設置
引用ははじめに図１についてなされるであろう。点線により示される第一の箱は、それが開けられ及び閉められうるよう配置された、ガラスで覆われた前面（示されていない）を有する、平行六面体の全体的な形を有する、第一のモヂュール１を示す。このモヂュールの後ろに、蠕動ポンプＰ１、Ｐ２及びＰ３、及び示されていないが、ここで記述されるであろう取りはずし可能なアセンブリーを受けるための手段がある。ポンプＰ１及びＰ３は事前に決定された一定のデリバリーを有する。ポンプＰ２はそのデリバリーが変化するように制御される。
【００７５】
取りはずし可能なアセンブリーは、溶解されるべき赤血球の懸濁物を含む、容積に関して融通のきくバッグ２を含む。前記バッグ２は赤血球を懸濁物中に維持するようバッグから及びバッグへの循環を提供するために、ポンプＰ１と連結して作動する、ループの、柔軟な管３で装備される。前記バッグはさらにその基礎で透析カートリッヂ５の「血液」区画の入口につなげられる柔軟な管４につなげられる。前記管４は、バッグからカートリッヂへの懸濁物の循環を提供するポンプＰ２と連結して作動する。駆動されるシリンジポンプＰＳ１はカートリッヂ５の上流の管４につなげられ、及び前記シリンジポンプは酵素が赤血球の循環に導入されることを許容する。カートリッヂ５の「血液」区画の出口は、モヂュール１の外側へ開く出口の柔軟な管６につなげられる。第二の駆動されるシリンジポンプＰＳ２は管６につなげられ、及びこのシリンジポンプは酵素が溶解された赤血球の循環に導入されることを許容する。溶解溶液を含む瓶７はモヂュール１内に配置され、及びカートリッヂ５をとおる溶解溶液の循環を提供するためにポンプ３と連結して作動する柔軟な管８によりカートリッヂ５の「透析物」入口につなげられる。最後に、カートリッヂを出る溶解溶液は、モヂュール１の外側に位置される瓶１０内で終わる柔軟な放出管９によりモヂュール１から除去される。
【００７６】
出口管６は、それが開かれ及び閉められうるように配置された、ガラスで覆われた前面（示されていない）を有する、平行六面体の全体的な形を有する第二のモヂュール１１に続く。このモヂュールの後ろに、示されていないが、ちょうど部分的に示された取りはずし可能なアセンブリーの部分を形成するエレメントを受けるための手段がある。前記エレメントは、管６につなげられる、及び溶解された懸濁物が所蔵されるであろう、柔軟なバッグ１２を含む。駆動されるシリンジポンプＰＳ３は再シール生成物を注入するために、管６につなげられる。
【００７７】
取りはずし可能なアセンブリーは全て柔軟な透明プラスティックから成るので、プロセスは完全に見ることができる。
上記装置は示されていないさまざまな手段をさらに提供される：
−他のもののうち特に、その中を循環する懸濁物の温度を計測するための管３上に位置される温度センサー、及びモヂュール１内の温度Ｔ１を計測するための温度センサーを含む、モヂュール１の内部を冷却する及びその温度を＋２〜＋４℃に調節するための手段、
モヂュール１１はモヂュール１１の内部を加熱する及びその中の温度Ｔ２を＋３７〜＋３８℃に調節する手段をさらに提供される；温度センサーはモヂュールの内側にフィットされる。
−Ｄ１及びＤ２で、管内の赤血球の存在を検出するための（例えば、超音波の又は比色の）手段、
−透析カートリッヂの入口で圧を計測するための手段ＰＲ１。
−一方で温度及び圧センサー及び検出手段から来るデータ、及び他方で溶解パラメーターの設定に関連するデータを受ける電子装置；前記データに基づいて、上記装置はポンプＰ１、Ｐ２及びＰ３を制御する。プロセスフローチャートは図２中に示される。
【００７８】
上記電子装置は上記フローチャートを実行するために設計されるコンピューターを含む。
前記装置の実行は１２での、酵素を含む赤血球の懸濁物を含むバッグの回復を導く。
【００７９】
実施例２：アルギニンデイミナーゼを封入する赤血球の生成
４００ｍｌの血液を患者から採取する。４℃に維持される上記血液を脱白血球化し、及び血漿を除去するために塩溶液で洗浄し、及び８０％に調節されたヘマトクリットで、２５０ｍｌの容積を有する柔軟なバッグに入れる。
アルギニンデイミナーゼの水溶液を赤血球の懸濁物に添加し、ｍｌ当たり４００ＩＵの濃度の酵素及び７０％のヘマトクリットを得る。
【００８０】
１ｍｌの４℃の懸濁物を取り、及びそれを、その作動原理は上記に示された、以前に引用されるＪ．  Ｄｉｄｅｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００中に示される浸透的もろさを計測するための器具に入れる。計測は１０分間取られる。上記器具は５０％溶血を与える塩分濃度を決定することを可能にする。この塩分濃度は一般的にリットル当たり３〜５．５ｇ  ＮａＣｌである。
【００８１】
赤血球の懸濁物及び酵素を含む、２５０ｍｌ容量の柔軟なバッグ２を実施例１の設置に入れ、及び上記懸濁物及び低張溶解溶液を徐々に透析カートリッヂのそれぞれの区画に入れる。透析器中の赤血球の懸濁物の流速は、前の段階で決定された塩分濃度パラメーターの機能（浸透的もろさ又は抵抗性）として、１５〜３０ｍｌ／分に制御される。
再シール溶液をバッグ１２のすぐ上流の溶解された赤血球の懸濁物に１０％ｖ／ｖでラインに添加する。懸濁物をバッグ中で３７℃で３０分間インキュベートする。それをその後塩溶液で洗浄し、保存溶液をそれに添加し（ＳＡＧ−マンニトール）、その後上記バッグをそれが使用されるまで＋４℃で貯蔵する。
【００８２】
上記方法は純粋な赤血球のｍｌ当たり８０〜１８０ＩＵの酵素活性を有する赤血球を得ることを可能にする。
懸濁物の総体積は血液輸血の通常の実施にしたがって、静脈内灌流により患者に投与される。
【００８３】
実施例３：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析
アルギニンデイミナーゼはアルギニンをシトルリン及びアンモニアに変換するアルギナーゼ異化酵素である。研究の目的は一旦赤血球に封入されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａから得られたアルギニンデイミナーゼの涸渇活性を観察し及び確認することであった。この目的において、アルギニンデイミナーゼをロードされた赤血球はアルギニンを含む緩衝液とインキュベートされた。シトルリン及びアルギニン値は続いてＨＰＬＣ  ＭＳ  ＭＳ法により評価された。
【００８４】
アルギニンデイミナーゼをロードされた赤血球（ＲＢＣ）の調製
組換えＳｅＭｅｔ含有Ｌ−アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）の溶液（１２０ＵＩ／ｍｌ）はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに由来した。
【００８５】
新鮮なヘパリン化ＯＦ１マウス血液をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得、及び血漿及び軟膜を除去するために遠心分離した（４℃で８００ｇ、１０分間）。包装された赤血球をＮａＣｌ０．９％で３回（１：１  ｖ／ｖ）洗浄した（４℃で８００ｇ、１０分間）。最終的な洗浄後、赤血球を２０ＵＩ／ｍｌアルギニンデイミナーゼを伴って（ＣＧＲ−ＡＤＩ）又は伴わずに（ＣＧＲ−ＬＲ）混合し、及び上記ＲＢＣ懸濁物のヘマトクリットを（ＡＤＩ溶液又は塩水を用いて）７０％に調節した。
【００８６】
赤血球の溶解を透析バッグ（カットオフ１０Ｋｄ）への連続した流動透析プロセスにより得た。低張段階を４０ｍＯｓｍ／ｌの十分な体積の溶解緩衝液（ＮａＨ2ＰＯ4，２Ｈ2Ｏ  ０．７３ｇ／ｌ；Ｎａ2ＨＰＯ4，１２Ｈ2Ｏ  ５．０３５ｇ／ｌ；グルコース  ０．３６ｇ／ｌ）に対して４℃で６０分間行った。１００ｍｌの低張溶液を導入される１ｍｌの赤血球に対して添加した。回収後、溶解された赤血球の懸濁物を３７℃で１０分間インキュベートした。上記細胞をその後１／１０（ｖ／ｖ）の再シール溶液（アデニン  ０．３９ｇ／ｌ；イノシン  １５．６ｇ／ｌ；ピルビン酸ナトリウム  ６．４ｇ／ｌ；ＮａＨ2ＰＯ4，Ｈ2Ｏ  ４．９ｇ／ｌ；ＮａＨＰＯ4，１２Ｈ2Ｏ  １０．９ｇ／ｌ、グルコース  １１．５ｇ／ｌ；ＮａＣｌ  ５０ｇ／ｌ）中での３７℃で３０分間のインキュベーションにより再シールし、及びアニールさせた。再シール後、赤血球をＴｒｉｓ  ３１０ｍＯｓｍ／ｌ  ｐＨ７．４、ＢＳＡ  ４％中で３回洗浄した（４℃で８００ｇ、１０分間）。
全血、透析段階前及び後のＲＢＣ懸濁物をＣｏｂａｓ  Ｍｉｃｒｏｓ  ６０１  ＣＳ  １４／１２細胞カウンターを用いてヘマトクリット（Ｈｔ）、平均細胞体積（ＭＣＶ）、平均細胞ヘモグロビン（ＭＣＨＣ）及び平均血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）についてモニターした。ＣＧＩ−ＡＤＩ及びＣＧＲ−ＬＲ懸濁物は透析後２５％ヘマトクリットであった。
【００８７】
（ＡＤＩを含有する又は含有しない）ＲＢＣ懸濁物の等分を続くＡＤＩ活性計測のために透析段階前及び後に回収した。
【００８８】
ＡＤＩ活性の分析
ＡＤＩ活性の分析を透析前及び後に回収されたＲＢＣ懸濁物（ＣＧＲ−ＡＤＩ及びＣＧＲ−ＬＲ）の等分について行った。
【００８９】
透析前のＣＧＲ−ＡＤＩ及びＣＧＲ−ＬＲ等分のヘマトクリットをＮａＣｌ  ０．９％中での十分な希釈により７０％〜４０％に調節した。透析後のＣＧＲ−ＡＤＩ及びＣＧＲ−ＬＲ等分懸濁物のヘマトクリットは２５％であり、及び改変されなかった。封入されたＡＤＩの割合を全血中の又は上清中のＡＤＩ活性の計測により決定した。全血中のＡＤＩ活性を決定するために、ＲＢＣ懸濁物等分の１／３を液体窒素中で５分間凍結させ、及び３７℃で温め、及び１０μｌの５０ｍＭ  ＭＥＳ中の１０倍希釈の凍結ＲＢＣをその後酵素活性分析のために使用した。赤血球外の酵素活性を決定するために、ＲＢＣ懸濁物の他の２／３を４℃で１０分間遠心分離し、及び１０μｌの５０ｍＭ  ＭＥＳ中の２倍希釈の上清を酵素分析のために使用した。１０分間で形成されたシトルリンの量をＰｒｅｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓの比色分析により定量した。標準分析混合物は９００μｌ  ＭＥＳ緩衝液  ０．１Ｍ  ｐＨ６．０、ＭｇＣｌ2  ２０ｍＭ及び１０μｌの上清又は冷凍ＲＢＣサンプルを含んだ。反応を１ｍｌ  １０ｍＭ  Ｌ−アルギニンの添加により開始し、及び３７℃で５、１０、１５又は２０分間続けた。反応を１ｍｌの抗ピリン−ヂアセチルモノキシム溶液の添加によりこれらの異なる時間で停止させた。上記混合物を２０分間沸騰させ、及び４６６ｎｍでの吸収を計測した。標準曲線をシトルリンのストック溶液を適切に希釈することにより構築した。１５〜２０分間のＡＤＩ活性を酵素の１分当たりに形成されたシトルリンのマイクロモルとして定義した。全ての計測は二重で行った。
【００９０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能性分析
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析をアルギニンデイミナーゼをロードされた赤血球（ＣＧＲ−ＡＤＩ）をアルギニン含有緩衝液中でインキュベートし、及びアルギニン及びシトルリンアミノ酸両方の値を観察することにより完了した。反応の対照は同じ条件でインキュベートされるアルギニンデイミナーゼをロードされていない赤血球（ＣＧＲ−ＬＲ）で実現した。
【００９１】
１ｍｌの事前に温められたアルギニンデイミナーゼをロードされた赤血球（ＣＧＲ−ＡＤＩ）をＴｒｉｓ  ｐＨ７．４中の３００μＭ  アルギニン、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む１ｍｌの緩衝液と混合した。Ｔｒｉｓ緩衝液を３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、ｐＨ７．４で調製した。対照分析を等しい量のＣＧＲ−ＬＲを同じ条件下でアルギニン含有緩衝液と混合することにより行った。混合を上下運動により実現した。時間０を表す４００μｌのサンプルをエッペンドルフ管に直ちに回収し、及び４℃に置いた。混合物の残りを３７℃で３０分間インキュベートした。反応の終わりに、時間３０（３０分間）を表す４００μｌをエッペンドルフ中に回収し、及び４℃に置いた。回収された全ての４００μｌのサンプルについて、３／４（３００μｌ）を４℃で１０分間遠心分離した。遠心分離後、１００μｌ等分の上清を回収し、及び−２０℃で凍結させた。他の１／４を液体窒素中で５分間直接的に凍結させた。３７℃で温めた後、５０μｌ等分のサンプルを回収し、及び−２０℃で凍結させた。
それぞれのサンプル中のアルギニン及びシトルリン値をその後ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法により評価した。
【００９２】
結果：図３を参照のこと
３７℃で３０分以内に、ＡＤＩを取り込んだＲＢＣは媒体（上清）中に含まれるアルギニンを約１３５μｍｏｌ／Ｌから約４２μｍｏｌ／Ｌまで涸渇させることができる。同時に、媒体（赤血球外）中のシトルリン濃度は約１７から約１１０μｍｏｌ／Ｌに生成される。上清中のＡＤＩの活性は検出限界下（＜０．１ＵＩ／ｍｌ）であった。ＲＢＣペレット中で計測された活性は２．５６ＵＩ／ｍＬであった。それは、アルギニンデイミネーションは赤血球内ＡＤＩにより提供されること、及びアルギニンは赤血球に入りその中で消化されることを立証する。さらに、それは、赤血球中で生成されたシトルリンは赤血球膜をとおってＲＢＣ外の媒体にいくことを強く示唆する。
【００９３】
ＡＤＩが塩水により置き換えられる、プロセスされた赤血球である対照ＲＢＣｓに関して、ＲＢＣ外媒体からのアルギニンは３７℃で３０分以内に約１６５μｍｏｌ／Ｌから約１５７μｍｏｌ／Ｌまでだけ減少し、及びシトルリンは約１から約２μｍｏｌ／Ｌにだけ達する。この低い涸渇はＲＢＣｓ中に含まれるアルギナーゼの内因性活性により説明されうる。私たちは、アルギナーゼはＡＤＩに特異的であるアルギニン消化中にシトルリンを生成しないことを再び強調した。
【００９４】
実施例４：アルギニンデイミナーゼの２の調合物の注入に応答したマウス血漿中のアルギニン濃度の速度論研究
研究の目的はアルギニンデイミナーゼをロードされた赤血球の注入に応答したＯＦ１マウスにおけるアルギニン及びシトルリンの血漿薬物動態を追うことであった。
【００９５】
試験及び対照物質の調製
組換えＳｅＭｅｔ含有Ｌ−アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）（１２０ＵＩ／ｍｌ）はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに由来した。
【００９６】
遊離アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ＋ＲＢＣ）を、５０％のヘマトクリットで１０ＵＩ／ｍｌのパックされたＲＢＣの最終濃度を得るために、洗浄されたマウス赤血球（ＲＢＣ）及びＳａｇ−マンニトール１／３（ｖ／ｖ）（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ）中に希釈した。Ｓａｇ−マンニトールを添加前に１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2で補充した。
【００９７】
試験物質（ＡＤＩＬＥ）はアルギニンデイミナーゼをロードされた赤血球（ＲＢＣ）に存する。アルギニンデイミナーゼをロードされた赤血球の調製手順をＡＤＩのｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能性試験について示されるように決定した。透析前にＡＤＩを最終濃度５０ＵＩ／ｍｌを得るように洗浄されたパックされた赤血球と混合した。透析後、封入されたＲＢＣを１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2で補充したＳａｇ−マンニトール１／３（ｖ／ｖ）と混合した。最終ヘマトクリットを５０％に調節した。封入後に得られたＡＤＩ活性は５０％のヘマトクリットで８．３５ＵＩ／ｍｌの封入されたＲＢＣであった。
酵素を伴わない第三のサンプル（ＣＧＲ）を５０％の最終ヘマトクリットで（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2で補充した）Ｓａｇマンニトールで再懸濁した洗浄されたＲＢＣで調製した。塩溶液をＡＤＩの代わりに添加した。
【００９８】
全体の実験の間、全血、透析段階前及び後のＲＢＣ懸濁物をＣｏｂａｓ  Ｍｉｃｒｏｓ  ６０１  ＣＳ  １４／１２細胞カウンターを用いてヘマトクリット（Ｈｔ）、平均細胞体積（ＭＣＶ）、平均細胞ヘモグロビン（ＭＣＨＣ）及び平均血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）についてモニターした。等分のＲＢＣ懸濁物を続くＡＤＩ活性計測のために透析段階前及び後に回収した。ＡＤＩ活性計測を以前に示されるように決定した。
【００９９】
動物
５〜６週齢及び体重１８〜２２ｇの６４匹のＯＦ１雌マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ，  Ｆｒａｎｃｅ）から得た。動物を処置前に特定病原体フリー（ＳＰＦ）動物ケアにおいて７日間観察した。実験プロトコルはフランス農業研究省により認可された。６４匹の健康なＯＦ１マウスを４匹のマウスの１群及び２０匹のマウスの３群にランダム化した。処置されたマウスは２５０μｌの注入体積で静脈内経路により単一の注入を受けた。
【０１００】
処置スケヂュール
処置スケヂュールを以下のように選択した：群１からのマウスは処置されなかった；群２からのマウスは５０％のヘマトクリットの洗浄されたマウス赤血球（ＲＢＣ）により処置された；群３からのマウスはアルギニンデイミナーゼをロードされた赤血球（ＡＤＩＬＥ）の単一の注入を受けた；群４のマウスは５０％のヘマトクリットの洗浄されたマウスＲＢＣの懸濁物中の遊離アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ＋ＲＢＣ）の単一の注入を受けた。異なる生成物サンプルを二重盲検で投与した。
【０１０１】
処置後、マウスを心臓穿刺により殺した。Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ  Ｆｏｒｅｎｅ（Ｃｅｎｔｒａｖｅｔ，  Ｂｏｎｄｏｕｆｌｅ，  Ｆｒａｎｃｅ）を殺す前にマウスを麻酔するために使用した。マウスを殺すことは表中以下に示されるように行った。約８００μｌの全血をヘパリンリチウムガラス管中に回収し、及び回収後氷水浴中に直ちに維持した。血液サンプルを直ちに２，５００ｇで＋４℃で１０分間遠心分離し、血漿を得た。約２００μｌの血漿をプロピレン管に移し、直ちに−２０℃で冷凍した。残りの血液細胞ペレットをプロピレン管に移し、直ちに分析まで−２０℃で冷凍した。アルギニン及びシトルリンの値を血漿の１のバイアル及び血液細胞ペレットにおいて計測した。
【０１０２】
アミノ酸分析
血漿及び血液細胞ペレット中のアルギニン及びシトルリンの濃度をＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法によりアルギニン及びシトルリンの抽出後に計測した。
【０１０３】
【表１】
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【０１０４】
結果：図４〜５を参照のこと
１）赤血球ペレット中のアルギニンの投与量を考慮して、遊離の又は取り込まれたＡＤＩを受けたマウスにおいて濃度における強い及び速い減少が観察される。通常のＲＢＣを受けたマウスにおいては顕著な改変は観察されなかった。しかしながら、１２時間以内に、アルギニンにおける濃度はＡＤＩ遊離群（ＡＤＩ＋ＲＢＣ）については通常の値に戻り、及び取り込まれたＡＤＩ（ＡＤＩＬＥ）については少なくとも４８時間非常に低く維持される。
【０１０５】
２）アルギニンが涸渇されると同時に、シトルリンが生成される。しかしながら、高い値が４８時間までＡＤＩＬＥについて維持される一方で、高い値はＡＤＩ＋ＲＢＣ群について２４時間以内に通常の値に戻ることが観察される。通常のＲＢＣを受けたマウスにおいて顕著な改変は観察されなかった。
【０１０６】
このことはＡＤＩのＲＢＣへの取り込みは溶解／再シール段階により可能であること、及びＲＢＣにロードされたＡＤＩは遊離溶液中のＡＤＩよりはるかに長く有効であることを証明する。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】図１は本発明にしたがう溶解−再シール装置の図面である；
【図２】図２は方法のフローチャートである；
【図３】図３はＡＤＩ（アルギニンデイミナーゼ）を含有する又は含有しない赤血球の上清中のアルギニン対シトルリン濃度を示すグラフである；
【図４】図４及び５はアルギニン及びシトルリン濃度についての赤血球における薬物動態に相対的なグラフを示す；図４は、ＡＤＩＬＥ（アルギニンデイミナーゼをロードされた赤血球）、ＡＤＩ（遊離アルギニンデイミナーゼ）＋ＲＢＣ又はＲＢＣで処理された３群のマウスについての、（処理後４８時間までの）時間中のアルギニン濃度における変化を示し、及び図５は（処理後４８時間までの）時間中のシトルリン濃度における変化を示す。ＲＢＣ又はＢＣは赤血球を示すために本明細書中で使用される。
【図５】図４及び５はアルギニン及びシトルリン濃度についての赤血球における薬物動態に相対的なグラフを示す；図４は、ＡＤＩＬＥ（アルギニンデイミナーゼをロードされた赤血球）、ＡＤＩ（遊離アルギニンデイミナーゼ）＋ＲＢＣ又はＲＢＣで処理された３群のマウスについての、（処理後４８時間までの）時間中のアルギニン濃度における変化を示し、及び図５は（処理後４８時間までの）時間中のシトルリン濃度における変化を示す。ＲＢＣ又はＢＣは赤血球を示すために本明細書中で使用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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