(57)【要約】  各集団が単一の蛍光色素で標識化されたマイクロ粒子集団のアレイを、マルチプレックスアッセイで使用するために提供する。上記集団は仮想的多次元アレイを形成し、各マイクロ粒子は、２つの異なった蛍光検出チャネルでの蛍光強度によって同定される。上記アレイは、２種以上の分析物を、例えばフローサイトメトリーによって、そして標識化試薬を例えば顕微鏡法で同時に検出するためのマルチプレックス多分析物アッセイを含めた様々なアッセイで有用である。多次元アレイを形成するのに、単一染色されたマイクロ粒子を使用することにより、マルチプレックスアッセイの作製は大幅に単純化される。
2008538609.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ粒子の集団のアレイであって、
各セットがマイクロ粒子の複数の集団を含有する複数のセットを含み、
１セット中のマイクロ粒子集団は、各集団が測定可能に異なる蛍光強度を示すように、異なったレベルの単一の蛍光色素で標識化され；
異なったセット中のマイクロ粒子は異なった蛍光色素で標識化され；かつ、
前記蛍光色素のすべてが、一対の検出チャネルを用いて検出可能な光を発光し、かつ前記２つの検出チャネルにおける相対発光が、異なった蛍光色素間で識別可能に異なっていることを特徴とするアレイ。
【請求項２】
前記アレイが少なくとも３セットのマイクロ粒子集団を含むことを特徴とする請求項１に記載のアレイ。
【請求項３】
前記アレイが少なくとも４セットのマイクロ粒子集団を含むことを特徴とする請求項１に記載のアレイ。
【請求項４】
前記アレイが少なくとも５セットのマイクロ粒子集団を含むことを特徴とする請求項１に記載のアレイ。
【請求項５】
前記アレイが少なくとも２０集団のマイクロ粒子を含むことを特徴とする請求項２に記載のアレイ。
【請求項６】
前記アレイが少なくとも３０集団のマイクロ粒子を含むことを特徴とする請求項２に記載のアレイ。
【請求項７】
試料中の複数の分析物を検出するためのマイクロ粒子のアレイであって、
ａ）請求項１に記載のマイクロ粒子のアレイと、
ｂ）同一特異性の試薬が同一集団中のマイクロ粒子と結合され、異なった特異性の試薬が異なった集団中のマイクロ粒子と結合される複数の分析物特異試薬と
を含むことを特徴とするアレイ。
【請求項８】
試料中の複数の分析物を検出するためのマイクロ粒子のアレイであって、
ａ）請求項２に記載のマイクロ粒子のアレイと、
ｂ）同一特異性の試薬が同一集団中のマイクロ粒子と結合され、異なった特異性の試薬が異なった集団中のマイクロ粒子と結合される複数の分析物特異試薬と
を含むことを特徴とするアレイ。
【請求項９】
試料中の複数の分析物を検出するためのマイクロ粒子のアレイであって、
ａ）請求項３に記載のマイクロ粒子のアレイと、
ｂ）同一特異性の試薬が同一集団中のマイクロ粒子と結合され、異なった特異性の試薬が異なった集団中のマイクロ粒子と結合される複数の分析物特異試薬と
を含むことを特徴とするアレイ。
【請求項１０】
試料中の複数の分析物を検出するためのマイクロ粒子のアレイであって、
ａ）請求項４に記載のマイクロ粒子のアレイと、
ｂ）同一特異性の試薬が同一集団中のマイクロ粒子と結合され、異なった特異性の試薬が異なった集団中のマイクロ粒子と結合される複数の分析物特異試薬と、
を含むことを特徴とするアレイ。
【請求項１１】
試料中の複数の分析物を検出するためのマイクロ粒子のアレイであって、
ａ）請求項５に記載のマイクロ粒子のアレイと、
ｂ）同一特異性の試薬が同一集団中のマイクロ粒子と結合され、異なった特異性の試薬が異なった集団中のマイクロ粒子と結合される複数の分析物特異試薬と
を含むことを特徴とするアレイ。
【請求項１２】
試料中の複数の分析物を検出するためのマイクロ粒子のアレイであって、
ａ）請求項６に記載のマイクロ粒子のアレイと、
ｂ）同一特異性の試薬が同一集団中のマイクロ粒子と結合され、異なった特異性の試薬が異なった集団中のマイクロ粒子と結合される複数の分析物特異試薬と
を含むことを特徴とするアレイ。
【請求項１３】
前記分析物特異試薬の少なくとも１つが、抗原である分析物に特異的に結合する抗体であるか、あるいは、前記分析物特異反応物の少なくとも１つが、抗体である分析物に特異的に結合する抗原であることを特徴とする請求項７に記載のアレイ。
【請求項１４】
前記分析物が、タンパク質、ペプチド、ホルモン、ハプテン、抗原、抗体、受容体、酵素、核酸、多糖、化学物質、重合体、病原体、毒素、有機薬物、無機薬物、細胞、組織、微生物、ウイルス、細菌、真菌、藻類、寄生生物、アレルゲン、汚染物質、またはこれらの組合せからなるセットから選択されることを特徴とする請求項７に記載のアレイ。
【請求項１５】
試料中の複数の分析物を測定する方法であって、
ａ）試料を、マイクロ粒子−分析物複合体の形成を可能にするのに十分な時間、請求項７に記載のマイクロ粒子のアレイと接触させるステップと、
ｂ）前記マイクロ粒子−分析物複合体を励起光に露出するステップと、
ｃ）前記一対の検出器チャネルのそれぞれにおける前記マイクロ粒子の蛍光を測定するステップと、
ｄ）ステップ（ｃ）で測定された蛍光から、前記マイクロ粒子と結合した前記分析物特異試薬の特異性を同定し、それによって前記マイクロ粒子−分析物複合体中に存在する分析物を同定するステップと、
ｅ）前記マイクロ粒子−分析物複合体中に存在する分析物の量を測定するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
前記試料を、１セットの蛍光標識化された分析物特異試薬とさらに接触させ、前記セットは測定される分析物に対して特異的な分析物特異試薬を含有することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出がフローサイトメトリーによって行われることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、参照により本明細書に組み込まれている２００５年４月２０日出願の米国仮出願第６０／６７３４７１号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、標識されたマイクロ粒子のアレイに関する。そのようなアレイは、生物学的検出アッセイなどのマルチプレックスアッセイにおいて、また、より詳細にはフローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡の分野において特に有用である。
【背景技術】
【０００３】
フローサイトメータは、光散乱および粒子蛍光に基づいた粒子の特性分析を可能にする周知の分析ツールである。フローサイトメータでは、励起光、すなわち通常は１本または複数のレーザに各粒子を露出することによって、粒子を個々に分析し、粒子の光散乱および蛍光特性を測定する。分子、分析物結合ビーズ、個々の細胞、またはその小成分などである粒子を通常は分光的に異なる１種または複数の蛍光色素で標識化し、検出すべき異なった色素それぞれにつき１つの多数の光検出器を用いて検出を行う。フローサイトメータは、例えばＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（米国カリフォルニア州サンホゼ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ））から市販されている。
【０００４】
フローサイトメトリー開発の初期において、結合対の一方の要素（ｍｅｍｂｅｒ）でコーティングされたマイクロ粒子（ビーズ）を用いて、様々なタイプのリガンド結合アッセイを実施できるであろうことが認識された。例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）など、捕捉試薬としての分析物特異的な結合物質でコーティングされたビーズと、これも通常はｍＡｂである、レポータ試薬としての蛍光色素で標識された第２の分析物特異結合物質とを用いて、サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイフォーマットでイムノアッセイを実施できる。これらのコーティングされたビーズおよびレポータを、対象とする分析物を含有する（もしくは含有している疑いがある）試料と共にインキュベートし、ビーズ−分析物−レポータ複合体の形成を可能にする。フローサイトメトリーによる分析は、ビーズ−分析物−レポータ複合体の存在の検出と、試料中に存在する分析物の定量的尺度としての、上記複合体に関連したレポータ蛍光の量の同時測定との両方を可能にする。
【０００５】
各タイプのビーズが特有の分析物特異的結合物質でコーティングされた１セットの識別可能なビーズを用いて、一試料中の複数の分析物の同時分析を行えるであろうことも、フローサイトメトリー開発の初期に認識された。検出するべき各種の分析物あたり１種のビーズセットおよび蛍光標識化されたレポータ試薬を、対象とする分析物を含有する試料と共にインキュベートして、存在する分析物それぞれのビーズ−分析物−レポータ複合体の形成を可能にし、その結果得られる複合体をフローサイトメトリーによって分析して同定し、試料中に存在する分析物を任意選択で定量化する。上記複合体に結合した分析物の同一性はビーズの同一性によって示されるので、すべてのレポータ試薬に同じ蛍光色素を用いて、複数の分析物を同時検出することができる。識別可能なマイクロ粒子のセットを作製および使用するための多数の方法が文献に記載されている。
【０００６】
特許文献１（１９８０年２月１３日発行）および非特許文献１には、それぞれのサイズのマイクロ粒子が異なった標的特異抗体でコーティングされている、サイズによって識別される複数のマイクロ粒子の使用が文献に記載されている。
【０００７】
Ｔｒｉｐａｔｚｉｓの特許文献２（１９８４年１１月２８日発行；対応する特許文献３も参照）には、様々な濃度の２種以上の蛍光色素でマイクロ粒子を標識化することによって形成されるマイクロ粒子の多次元アレイも文献に記載されている。アレイ中のマイクロ粒子は、蛍光色素のレベルによって一意的に同定される。Ｔｒｉｐａｔｚｉｓは、試料中の多数の分析物をフローサイトメトリーによって同時検出するためのそのようなアレイの使用について記述し、さらに、顕微鏡法における標識としてのそれらの使用も記述している。
【０００８】
特許文献４（１９８５年２月１２日発行）および「Method and Apparatus for Distinguishing Multiple Subpopulations of Cells」という名称の特許文献５（１９８８年１月５日発行）には、マイクロ粒子がそれぞれの色素の蛍光強度を別々に測定することによって同定される、２つの異なった色素で識別可能に標識化されたマイクロ粒子の使用も文献に記載されている。
【０００９】
フローサイトメトリーによって多数の分析物を同時分析するための一次元アレイおよび２次元アレイは共に市販されている。蛍光強度のレベルによって識別可能な単一染色ビーズの１次元アレイの例には、ＢＤ（商標）  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国カリフォルニア州サンホゼ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ））およびＣｙｔｏ−Ｐｌｅｘ（商標）フローサイトメトリーマイクロスフェア（Ｄｕｋｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ））が含まれる。蛍光強度（５つのレベル）およびサイズ（２つのサイズ）の組合せによって識別可能なビーズの２次元アレイの一例が、ＱｕａｎｔｕｍＰｌｅｘ（商標）マイクロスフェア（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国インディアナ州フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ））である。２つの色素それぞれの蛍光レベルによって識別可能な二重染色ビーズの２次元アレイの例も文献に記載されている（非特許文献２および３参照）。
【００１０】
上述のマイクロ粒子アレイはそれぞれ、それらの有用性を制限する欠点を有する。異なったサイズのマイクロ粒子に基づいたアレイは、１つのマイクロ粒子に結合できる捕捉試薬の量が粒径に依存し、それがアッセイの感度およびダイナミックレンジに影響するので問題である。したがって、すべての分析物に関して一定のアッセイ性能を得るために、一定のサイズのマイクロ粒子を用いることが望ましい。単一色素の蛍光強度における相違に基づいた１次元アレイは、通常、約１０の異なったマイクロ粒子集団に限定される。これは、広範なアッセイに有用であるが、より多数の分析物の同時検出を可能にする、より多数の異なったマイクロ粒子集団を有することが望ましい。２つの異なった色素の蛍光強度の相違に基づいた２次元配列は、はるかに大きなアレイを可能にするが、製造するのが有意に、より困難であり、かつそれに続くデータ分析の難しさが増大している。
【００１１】
【特許文献１】英国特許第１５６１０４２号明細書
【特許文献２】欧州特許第０１２６４５０号明細書
【特許文献３】カナダ特許第１２４８８７３号明細書
【特許文献４】米国特許第４４９９０５２号明細書
【特許文献５】米国特許第４７１７６５５号明細書
【特許文献６】米国特許第４６０９６８９号明細書
【特許文献７】米国特許第４３２６００８号明細書
【特許文献８】米国特許第５３２６６９２号明細書
【特許文献９】米国特許第５７２３２１８号明細書
【特許文献１０】米国特許第５５７３９０９号明細書
【特許文献１１】米国特許第５７８６２１９号明細書
【特許文献１２】米国特許第６５１４２９５号明細書
【非特許文献１】Fulwyler and McHugh, 1990, Methods in Cell Biology 33:613-629
【非特許文献２】McDade and Fulton, April 1997, Medical Device & Diagnostic Industry
【非特許文献３】Fulton et al., 1997, Clinical Chemistry 43(9):1749-1756
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、単一染色されたマイクロ粒子の集団から形成された多次元アレイに関する。単一染色されたマイクロ粒子を多次元アレイの形成に使用することは、マルチプレックスアッセイの作製を大幅に単純化し、それでもなお、多重染色されたマイクロ粒子から形成されたアレイが有する利点の大部分を提供する。
【００１３】
本発明の多次元アレイは、複数のセットのマイクロ粒子集団を含有し、１セット中の異なった集団は、同一の蛍光色素を用いて、異なった複数の蛍光レベルで標識化され、異なったセット中の集団は、異なった蛍光色素で標識化され、同一の２つの検出チャネルで測定される、各蛍光色素の発光は、２つの検出チャネルで異なった相対量の発光を示す。好ましい実施形態では、上記アレイは、少なくとも３セット、より好ましくは少なくとも４セット、そして、より好ましくは少なくとも５セットのマイクロ粒子集団を含有する。
【００１４】
本発明は、オーバーラップした発光スペクトルを有する分光的に類似した蛍光色素を用いることによって、それぞれが単一蛍光色素の蛍光強度の相違に基づいた複数の１次元アレイから実際的に多次元のアレイを生成でき、さらに、２つの検出チャネルを用いて、３つ以上の１次元アレイから生成されたそのようなアレイを分析することができるという驚くべき知見に基づいている。上記蛍光色素のオーバーラップした発光スペクトルにより、同じ２つの検出チャネルを用いて、上記蛍光色素それぞれからの発光を検出することが可能となる。
【００１５】
本発明の多次元アレイの蛍光特性は、アレイを励起光に露出し、２つの検出チャネルのそれぞれで各マイクロ粒子の蛍光を測定することによって、各集団におけるマイクロ粒子の同定を可能にするものである。この結果得られる蛍光データは、フローサイトメトリーで通常使用されているような、２つの検出チャネルの強度を２本の軸上にプロットした二次元ドットプロットにプロッティングできる。各集団は、二次元ドットプロット中に一意的に位置するクラスターとして現れるであろう。
【００１６】
典型的な蛍光色素の発光スペクトルの幅は、通常、望ましくない特性と見なされる。例えば、フローサイトメトリーでは、可能な場合、発光スペクトルのオーバーラップが最小限であり、異なった色素を検出するのに異なった検出器チャネルが使用されるように、蛍光色素を選択する。検出感度を最大にするために、各検出器チャネルは、可能な限り、それによって検出することが意図されている単一色素の発光最大にそれが対応するように選択する。もう一方の色素の発光スペクトルの幅によって引き起こされる、もう一方の色素から検出される発光は、しばしば「スピルオーバー」または「クロストーク」と呼ばれ、望ましくなく、以前に記載されているこれらの方法における色素蛍光の独立的測定の障害となる。
【００１７】
対照的に、本発明は、発光スペクトルの幅および２つの検出チャネルで得られる発光を蛍光色素の識別に利用する。類似した発光ピークを有する異なった蛍光色素の発光スペクトルは、２つのチャネルのそれぞれに、異なった程度で重なるであろう。そして、その結果、２つのチャネルで異なった相対発光を示すであろう。したがって、異なった色素で標識化されたマイクロ粒子集団（すなわち異なったセットのもの）、および異なった量の同一色素で標識されたマイクロ粒子集団（すなわち同一セットのもの）の両方を、２つの検出器チャネルにおける異なった発光強度によって識別することができる。
【００１８】
本発明のマイクロ粒子アレイは、本質的には、マルチプレックス粒子アレイが使用されるか、もしくは有用である任意の適用で使用でき、それらには、上記マイクロ粒子が、リガンド結合アッセイ用の固体基質または標識化試薬として使用される適用も含まれる。上記アレイの好ましい使用は、２つ以上分析物を同時検出するために、例えばフローサイトメトリーまたは顕微鏡を用いて、マルチプレックス結合アッセイを実施することである。そのようなアッセイでの使用には、集団内のマイクロ粒子は同じ既知の特異性を有する試薬でコーティングされ、かつ、異なった集団のマイクロ粒子は異なった特異性を有する試薬でコーティングされるように、分析物特異試薬でマイクロ粒子がコーティングされる。２つの検出チャネルで測定されたマイクロ粒子蛍光から決定されるマイクロ粒子集団の同一性により、分析物特異試薬を介した、マイクロ粒子に結合した分析物の同定が可能となる。当業者ならば、サンドイッチハイブリダイゼーションフォーマットおよび競合アッセイフォーマットを含めた多くの異なった任意のアッセイフォーマットを用いて検出を実施できることを理解するであろう。
【００１９】
本明細書に開示した多次元アレイを含む組成物およびキットも、この開示によって理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
明瞭とするために以下の定義を示す。別段の指示がない限り、すべての用語は、当該技術分野で一般的である通りに使用される。本明細書に引用されたすべての参考文献は、上記のものも下記のものも共に、参照により本明細書に組み込む。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「マイクロ粒子」という用語は、「マイクロビーズ」または「ビーズ」と同義的に使用される。これらの用語は、直径がナノメートルからマイクロメータの範囲、通常は直径が約０．０１〜１０００μｍ、好ましくは約０．１〜１００μｍ、より好ましくは約１〜１００μｍ、そしてフローサイトメトリーでの使用には通常約１〜１０μｍである小さな粒子を指す。マイクロ粒子は、いかなる形でもありうるが、通常はほぼ球形である（「マイクロスフェア」）。
【００２２】
マイクロ粒子は、標的特異的な試薬、反応物、および標識など、その他の物質がそれに結合できる固体支持体または基質として働く。マイクロ粒子は、限定されるものではないが、ポリスチレンなどの重合体；ジビニルベンゼンなどの他の共重合体を含有するポリスチレン；ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）；ポリビニールトルエン（ＰＶＴ）；スチレン／ブタジエン、スチレン／ビニルトルエンなどの共重合体；ラテックス；またはシリカ（例えばＳｉＯ２）などのその他の物質を含めたいかなる適切な物質（またはそれらの組合せ）でも作製できる。
【００２３】
本発明での使用に適したマイクロ粒子は、当技術分野で周知であり、多くの供給源から購入可能である。本発明の蛍光マイクロ粒子の調製に適した、様々なサイズおよび重合体組成の未染色マイクロスフェアは、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国インディアナ州カーメル（Ｃａｒｍｅｌ））、Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社（米国オレゴン州ポートランド（Ｐｏｒｔｌａｎｄ））、Ｄｙｎａｌ社（米国ニューヨーク州グレートネック（Ｇｒｅａｔ  Ｎｅｃｋ））、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社（米国ペンシルベニア州ウォーリントン（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ））、Ｓｅｒａｄｙｎｅ社（米国インディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ））、Ｍａｇｓｐｈｅｒｅ社（米国カリフォルニア州パサディナ（Ｐａｓａｄｅｎａ））、Ｄｕｋｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（米国カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ））、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ社（米国イリノイ州リバティービル（Ｌｉｂｅｒｔｙｖｉｌｌｅ））、およびＲｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ社（仏国パリ）を含めた様々な供給源から購入可能である。小球体を調製するための化学物質単量体は、多数の供給源から購入可能である。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「マイクロ粒子集団」は、実用的な製作公差内で、同じサイズ、形、組成であり、かつ同じ種類および量の色素分子で標識された合成マイクロ粒子など、測定するべきパラメータに関して、本質的に同じ光学的性質を有するマイクロ粒子の一群を指す。例えば、無標識のマイクロ粒子、第１の濃度における第１の色素で標識されたマイクロ粒子、第２の濃度における第１の色素で標識されたマイクロ粒子、および第３の濃度における第２の色素で標識されたマイクロ粒子ビーズは、４つの異なったビーズ集団を構成することができよう。
【００２５】
本発明のマイクロ粒子アレイは、「検出器チャネル」または「検出チャネル」と呼ばれる特定の周波数範囲で発光された蛍光を検出する能力を有する測定器を用いて検出する。通常、そのような測定器は、光電子増倍管または光ダイオードなど、複数の光検出器を含有し、各光検出器によって検出される波長の範囲は、当技術分野で周知の通り、周波数依存フィルター、ダイクロイックミラー、または他の分散性構成要素の使用によって決定される。別法では、蛍光顕微鏡で一般的なように、分析中に分散性構成要素を変えることによって、複数の周波数範囲で同一の検出器を使用することができる。
【００２６】
本発明のアレイ中のマイクロ粒子の同定では、十分に近く、そのため各色素の発光スペクトルの部分が各チャネルに入る２つの検出器チャネルを用いる。上記検出器チャネルは、オーバーラップしないチャネルか、もしくは部分的にオーバーラップしたチャネルであってもよい。色素および対応する適切な検出チャネルの選択は周知であり、当業者の能力の範囲内にある。
【００２７】
検出チャネルの選択は、使用される用途および計測手段に依存するであろう。例えば、マイクロ粒子蛍光を検出するのに２つのチャネルを使用し、レポータ蛍光を検出するのに３番目を使用するフローサイトメータで用いるためには、レポータチャネル内へのマイクロ粒子発光のスピルオーバーを最小にするのが有利である。したがって、チャネルの選択は、利用可能な測定器および色素によって課せられる制約の中で、マイクロ粒子発光を検出するのに使用される２つのチャネルがレポータチャネルから離れたスペクトルとなるように行う。この場合も、適合した色素およびチャネルの選択は周知であり、当業者の能力内にある。
【００２８】
「分析物」という用語は、本明細書では広義に使用され、分析、検出、測定、または標識化される任意の物質を指す。分析物の例には、これらに限定されないが、タンパク質、ペプチド、ホルモン、ハプテン、抗原、抗体、受容体、酵素、核酸、多糖、化学物質、重合体、病原体、毒素、有機薬物、無機薬物、細胞、組織、微生物、ウイルス、細菌、真菌、藻類、寄生生物、アレルゲン、汚染物質、およびこれらの組合せが含まれる。例えば細胞の検出は、通常、細胞表面分子など、特定の成分を検出することによって行われること、および成分も全体のままの細菌も両方とも分析物として記述できることが理解されよう。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「分析物特異試薬」または「標的特異試薬」は、試料に潜在的に存在する他の分析物と比較して、対象とする分析物または標的に選択的に結合する任意の試薬を広範に包含する。標的（分析物）および標的特異（分析物特異）試薬は、一対の結合対の要素であり、この対のいずれの要素も、対のもう一方の要素に選択的に結合する標的特異試薬として使用できる。標的および標的特異試薬対の例には、抗原および抗原特異抗体；ホルモンおよびホルモン受容体；ハプテンおよび抗ハプテン；ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン；酵素および酵素補因子；ならびにレクチンおよび特定の糖質が含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
好ましい標的特異試薬は、抗体または、抗原に特異的に結合する（免疫応答する）抗原結合部位を含んだその断片である。
【００３１】
（Ｉ．マイクロ粒子アレイ）
本発明のアレイは、マイクロ粒子の集団を含み、各マイクロ粒子は単一の蛍光色素によって標識化される。アレイは、複数のセットのマイクロ粒子集団からなり、各セットは複数のマイクロ粒子集団を含有する。１セット中のマイクロ粒子集団は、各集団が測定可能に異なった平均蛍光強度を示すように同一の蛍光色素を用いて標識化される。異なったセットのマイクロ粒子集団は、異なった蛍光色素によって標識化され、上記蛍光色素のすべてを同一の励起光で励起することができ、各色素の発光スペクトルは、同じ２つの検出チャネルを用いて検出可能であり、上記２つの検出チャネルにおける発光の相対量は、異なった色素間で識別可能に異なっている。
【００３２】
アレイ中のマイクロ粒子は、マイクロ粒子を励起光に露出し、２つの検出チャネルのそれぞれで各マイクロ粒子の蛍光を測定することによって検出され、一意的に同定される。励起光は、１つの光源からでも、複数の光源からでもよく、狭帯域でも、広帯域でもよい。励起光源の例には、レーザ、発光ダイオード、およびアーク灯が含まれる。マイクロ粒子の同定に使用される検出チャネルの中に発光される蛍光は、単一の光源による励起に続いて測定してもよく、あるいは、異なった光源による励起に続いて別々に測定してもよい。マイクロ粒子色素を励起するのに別々の励起光源を用いる場合、色素は、アレイを構築するのに使用された全色素が、使用される励起光源のそれぞれによって励起可能となるように選択することが好ましい。
【００３３】
例えば、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒデュアルレーザフローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、米国カリフォルニア州サンホゼ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ））は、４８８ｎｍおよび６３５ｎｍの励起レーザを有し、それは、空間的に個別の領域のフロー流に焦点を合わされており、検出光学は、４８８ｎｍのレーザによる励起の後では、ＦＬ１、ＦＬ２、およびＦＬ３と名付けられた３つの検出チャネルで、６３５ｎｍのレーザによる励起の後では、ＦＬ４と名付けられた第４の検出チャネルで光を測定するように設計されている。実施例に記載する好ましい実施形態では、マイクロ粒子集団を同定するための２つの検出チャネルとして、ＦＬ３およびＦＬ４が選択される。したがって、この実施形態では、４８８ｎｍのレーザによる励起の後では一方のチャネル、ＦＬ３が測定され、６３５ｎｍのレーザによる励起の後では第２のチャネル、ＦＬ４が測定される。この実施例における色素および検出チャネルの選択は、既存の市販装置の配置に鑑みて行った。別法では、単一のレーザによる励起の後で、ＦＬ３およびＦＬ４の両方で発光を測定するようにフローサイトメータを構成することができよう。
【００３４】
マイクロ粒子から得られる蛍光データは、フローサイトメトリーで通常に用いられているように、２つの検出チャネルの強度の値を２本の軸上にプロットした二次元ドットプロットにプロッティングすることによって分析することが好ましい。マイクロ粒子の各集団は、二次元ドットプロット中に一意的に位置するクラスターをもたらすであろう。ドットプロットで予測されるパターンは、以下の分析から見ることができる。
【００３５】
Ｆｉ１およびＦｉ２を、それぞれ蛍光チャネル１および２における第ｉ染色された集団の平均蛍光測定値とし、Ｒｉ＝Ｆｉ２／Ｆｉ１を、第ｉ集団の強度の比率とする。２つのチャネルにおける相対発光は蛍光色素の発光スペクトルの特性であるので、各色素の強度比率は一定である。したがって、チャネル２および１における平均蛍光強度がそれぞれ縦軸および横軸にプロットされる線形×線形ドットプロットでは、異なった量の同一蛍光色素（すなわち同じセットの集団）で染色されたマイクロ粒子集団は、Ｆｉ２＝Ｒｉ・Ｆｉ１線上にのり、この線の勾配は、２つのチャネルにおける発光比率に等しいＲｉとなる。異なったセットの集団は、異なった勾配（異なった、２つのチャネルにおける発光比率）を有する線上にのり、ドットプロットの異なった領域中に示すであろう。
【００３６】
フローサイトメトリーによって得られる蛍光強度データは、通常、対数変換されたデータを用いてプロッティングされる。対数変換された値を使用して、ｌｏｇ（Ｆｉ２）＝ｌｏｇ（Ｒｉ）＋ｌｏｇ（Ｆｉ１）。したがって、ｌｏｇ×ｌｏｇドットプロット上では、全セットの集団が、勾配が同一であるが、「ｙ切片」が異なる線上にのると予測される。図２および３は、ｌｏｇ×ｌｏｇドットプロットで提示されたデータを示す。
【００３７】
（ＩＩ．蛍光色素）
本発明で使用するのに適した蛍光色素（蛍光染料）は、イメージング用途（例えばフローサイトメトリー）での使用に適した多数の色素のうちいずれからも選択することができる。例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社（米国オレゴン州ユージン（Ｅｕｇｅｎｅ））およびＥｘｃｉｔｏｎ社（米国オハイオ州デイトン（Ｄａｙｔｏｎ））など、様々な供給源から多数の色素が市販されており、それらによって、望ましいスペクトル特性を有する１セットの色素を選択するのに、大きな柔軟性が与えられている。
【００３８】
異なったセットのマイクロ粒子集団を標識化するのに本発明で使用する色素は、各色素の発光スペクトルが、同じ２つの検出チャネルを用いて検出可能であり、上記２つの検出チャネルにおける発光の相対量が、異なった色素間で識別可能に異なるように選択する。候補色素の選択は、色素の発光スペクトルに基づいてごく普通に行うことができる。その後、候補色素は、各色素の濃度系列を用いてマイクロ粒子集団を染色し、続いてその結果を分析することによって実験的に評価する。その後、上記染色マイクロ粒子における適したサブセットを、単一アレイで共に使用するために選択する。
【００３９】
用途に応じて、色素を追加の判定規準に基づいて選択してもよい。例えば、結合量を測定するのに追加のレポータ蛍光色素を用いる結合アッセイでマイクロ粒子を使用する実施形態では、レポータ蛍光を測定するのに使用するチャネル内へのマイクロ粒子発光のスピルオーバーを最小にするのが有利である。検出チャネルは、マイクロ粒子発光を検出するのに使用される２つのチャネルがレポータチャネルから分光的に離れるように選択され、使用される色素は、レポータチャネルへのマイクロ粒子発光のスピルオーバーが最小となるように選択される。
【００４０】
適したセットを選択することができる蛍光色素の例には、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー、アクリジンレッド、およびアクリジンイソチオシアネートなどのアクリジンおよび誘導体；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−ｌ−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−（ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホン酸（ルシファーイエローＶＳ）；Ｎ−（４−アニリノ−ｌ−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ブリリアントイエロー；クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクルアリン（７−ａｍｉｎｏ−４−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｃｏｕｌｕａｒｉｎ）（クマラン１５１（ｃｏｕｍａｒａｎ１５１））などのクマリンおよび誘導体；シアノシン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７などのシアニンおよび誘導体；４’，６−ジアミジノ−２−フェニリンドール（ＤＡＰＩ）；５’，５”−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチルアミノクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロスチルベン−２，２’ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−ｌ−スルホニルクロライド（ＤＮＳ、塩化ダンシル）；４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよびエオシンイソチオシアネートなどのエオシンおよび誘導体；エリトロシンＢおよびエリトロシンイソチオシアネートなどのエリトロシンおよび誘導体；エチジウム；５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセインクロロトリアジニル、ナフトフルオレセイン、およびＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）などのフルオレセインおよび誘導体；フルオレサミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）；サンゴ礁由来蛍光タンパク質（ＲＣＦＰ）；リサミン（商標）；リサミンローダミン、ルシファーイエロー；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロン；オルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローズアニリン；ナイルレッド；オレゴングリーン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレン、ピレン酪酸、１−ピレン酪酸スクシンイミジルなどのピレンおよび誘導体；リアクティブレッド４（シバクロン（商標）ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）；６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、４，７−ジクロロローダミンリサミン、塩化ローダミン−Ｂ−スルホニル、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホロダミンＢ、スルホロダミン１０１、スルホロダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（テクサスレッド）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミンおよびイソチオシアン酸テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）などのローダミンおよび誘導体；リボフラビン；ロゾール酸およびテルビウムキレート誘導体；キサンテン；またはこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。当業者に知られている他の蛍光色素、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社（米国オレゴン州ユージン（Ｅｕｇｅｎｅ））およびＥｘｃｉｔｏｒｓ社（米国オハイオ州デイトン（Ｄａｙｔｏｎ））から購入可能なもの、またはそれらの組合せも使用してよい。
【００４１】
以下にさらに説明するように、特定の色素または特定のクラスの色素の適合性が、マイクロ粒子がそれによって標識化される方法に依存することは、当業者には明らかであろう。例えば、大きな蛍光タンパク質は、マイクロ粒子の表面に色素を結合させることによってマイクロ粒子を標識化するのに適しているかもしれないが、浴染法を用いて内部標識化（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｌａｂｅｌｉｎｇ）するのにはおそらく適していないであろう。適した候補色素は、使用される標識化方法に基づいてごく普通に選択することができる。
【００４２】
（ＩＩＩ．マイクロ粒子の標識化）
蛍光色素は、様々な方法で、例えば、製造中におけるマイクロスフェアへの蛍光色素の共重合によって（共に本明細書に参照より組み込まれているSchwartsら(1975)の特許文献６およびRembaum(1982)の特許文献７を参照のこと）；重合工程中におけるマイクロスフェアへの蛍光色素の包括法によって；または事前に調製されたマイクロスフェアへの蛍光色素の非共有結合取込みによって（それぞれが参照により本明細書に組み込まれている特許文献８〜１２を参照のこと）、均一なマイクロスフェアに組み入れられている。マイクロスフェアを標識化する方法は、本発明の重要な態様ではなく、制御可能な量の色素でのマイクロ粒子の標識化を可能にするいかなる方法も用いることができる。
【００４３】
好ましい実施形態では、周知の方法に従った、マイクロスフェアの浴染によって、本発明の蛍光標識化されたマイクロスフェアを調製する。浴染法は文献に記載されており（例えば、特許文献８〜１２を参照）、それらは、複数の色素を用いた浴染法について記載しているが、それらは、マイクロ粒子を単一色素で染色するのにも等しく適用可能である。
【００４４】
（ＩＶ．使用の方法）
本発明のマイクロ粒子アレイは、マルチプレックスマイクロ粒子アレイが使用されるか、もしくは有用であるいかなる用途でも、本質的には使用でき、それらには、上記マイクロ粒子が、リガンド結合アッセイ用の固体基質または標識化試薬として使用される用途も含まれる。
【００４５】
上記アレイの好ましい使用は、２つ以上分析物を同時検出するために、例えばフローサイトメトリーまたは顕微鏡を用いて、マルチプレックス結合アッセイを実施することである。そのようなアッセイでの使用には、集団内のマイクロ粒子は同じ既知の特異性を有する試薬でコーティングされ、かつ、異なった集団のマイクロ粒子は異なった特異性を有する試薬でコーティングされるように、分析物特異試薬でマイクロ粒子をコーティングする。マイクロ粒子蛍光から決定されたマイクロ粒子集団の同一性は、分析物特異試薬を介した、マイクロ粒子に結合した分析物の同定を可能にする。
【００４６】
分析物検出アッセイは、競合的フォーマットおよび非競合的フォーマットを用いて実施できる。非競合的アッセイの例には、マイクロ粒子に結合した分析物の検出を容易にするために、第２の分析物特異試薬（レポータ）が標識化されているサンドイッチアッセイが含まれる。マイクロ粒子アレイ、および検出するべき各種の分析物あたり１種の蛍光標識レポータ試薬を、対象とする分析物を含有する（もしくは含有している疑いがある）試料と共にインキュベートし、存在する分析物それぞれのビーズ−分析物−レポータ複合体の形成を可能にする。その結果得られる複合体を、好ましくはフローサイトメトリーによって分析して、同定し、試料中に存在する分析物を任意選択で定量化する。上記複合体に結合した分析物の同一性はビーズの同一性によって示されるので、すべてのレポータ試薬に同じ蛍光色素を用いて複数の分析物を同時検出することができる。
【００４７】
競合アッセイでは、分析物を含有している疑いがある試料を、マイクロ粒子アレイ、およびコーティングされたマイクロ粒子によって提供される限定された数の結合部位に対して分析物と競合できる分析物類似体と共にインキュベートする。一実施形態では、レポータ蛍光色素で標識化された分析物類似体を、マイクロ粒子上の結合部位を飽和するのに十分な濃度で提供する。分析物の存在は、マイクロ粒子に結合した標識化された分析物類似体と競合し、それによってそれらの数を減少させ、結果として、マイクロ粒子に随伴するレポータ蛍光の測定可能な減少をもたらす。
【００４８】
代替の一実施形態では、本発明のマイクロ粒子アレイは、試薬を標識化するのに有用である。各集団のマイクロ粒子は標的特異試薬でコーティングされ、上記標的は標識化される任意の分子である。標的分子が、マイクロ粒子をコーティングする標的特異試薬に結合するのを可能にするのに十分な時間、試料をアレイと共にインキュベートし、それによって上記分子を標識化する。本発明の多次元アレイの使用は、多数の異なった標的分子の標識化を可能にするが、これらの標識を一意的に同定するのに、若干２つの検出チャネルのみを必要とする。好ましい実施形態では、蛍光顕微鏡法における標識化試薬として、本発明のマイクロ粒子アレイを用いる。
【００４９】
抗体または他の標的特異試薬をマイクロ粒子に結合させる方法は、当技術分野で知られている。市販されているマイクロ粒子は、通常、周知の化学を用いて抗体の共有結合化を容易にするために、アミノ基またはカルボキシル基を提供する。しかし、当業者によって使用されているいかなる方法を利用してもよい。
【実施例】
【００５０】
以下の実施例は、いかにして本発明を作製および使用するかに関する完全な開示および記述を当業者に提供するために提示するものであり、発明者らが、その発明として考えている範囲を限定するのものでも、あるいは下記の実験が実施されたすべての実験であること、もしくはそれら以外の実験が行われなかったことを発明者らが表すものでもない。
【００５１】
（実施例１）
（マイクロ粒子アレイの調製）
この実施例は、フローサイトメトリーで使用するためのマイクロ粒子アレイを調製する好ましい方法を説明する。
【００５２】
ここで記載するアレイは、検出アッセイで使用することが意図されており、このアッセイでは、マイクロ粒子を分析物特異試薬でコーティングし、標識化されたレポータ試薬を、マイクロ粒子に結合した分析物の量を測定するのに使用する。検出アッセイの感度を最大にするために、特に明るい蛍光色素、好ましくはフィコエリトリン（ＰＥ）で、レポータ試薬を標識化することが望ましい。フィコエリトリンは、５７８ｎｍの発光極大を有する。したがって、ＰＥ標識化されたレポータ試薬を測定するのに適切な検出チャネルが確保されていると仮定して、アレイを調製する。
【００５３】
（１．検出チャネル）
マイクロ粒子蛍光を測定するのに使用される検出チャネルは、フローサイトメータを用いて利用できるチャネルの中から選択する。好ましいフローサイトメータは、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメータおよびＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｒａｙ（商標）フローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国カリフォルニア州サンホゼ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ））である。フィルターは、検出器チャネルを決定するものであるが、これら２台の測定器（標準的で、市販の構成である）間で若干異なる。
【００５４】
ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒデュアルレーザフローサイトメータは、４８８ｎｍおよび６３５ｎｍの励起レーザを有する。４８８ｎｍのレーザによる励起に続く蛍光は、以下の検出チャネルで測定される。
【００５５】
ＦＬ１：５３０／３０ｎｍ（５１５〜５４５ｎｍ）
ＦＬ２：５８５／４２ｎｍ（５６４〜６０６ｎｍ）
ＦＬ３：６７０ｎｍロングパス（＞６７０ｎｍ）
【００５６】
６３５ｎｍのレーザによる励起に続く蛍光は、以下の検出チャネルで測定される。
ＦＬ４：６６１／１６ｎｍ（６５３〜６６９ｎｍ）
【００５７】
ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメータを用いて、ＦＬ２チャネルは、ＰＥ標識化されたレポータを測定するのに使用され、マイクロ粒子集団は、ＦＬ３およびＦＬ４検出器チャネルにおける発光から同定される。
【００５８】
ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｒａｙフローサイトメータは、５３２ｎｍおよび６３５ｎｍの励起レーザを有する。５３２ｎｍのレーザによる励起に続く蛍光は、以下の検出チャネルで測定される。
黄色：５８５／４２ｎｍ（５６４〜６０６ｎｍ）
遠赤色：６８５ｎｍロングパス（＞６８５ｎｍ）
【００５９】
６３５ｎｍのレーザによる励起に続く蛍光は、以下の検出チャネルで測定する。
ＮＩＲ（近赤外）：７８０／６０ｎｍ（７５０〜８１０ｎｍ）
赤色：６６１／１６ｎｍ（６５３〜６６９ｎｍ）
【００６０】
ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｒａｙフローサイトメータを用いて、黄色検出チャネルは、ＰＥ標識されたレポータ試薬を測定するのに使用され、ビーズ集団は、赤色および遠赤色検出器チャネルにおける発光から同定される。
【００６１】
（２．色素）
候補色素は、上述の通り、それらの発光スペクトルに基づいて、ビーズ集団の同定で使用するために選択された２つの検出チャネルで、すべての色素が発光するように、ごく普通の方法で選択される。加えて、色素は、ＰＥ検出チャネル（ＦＬ２または黄色）における、色素の発光が最小となるように選択される。好ましいセットの好ましい色素は、以下の実施例に記載されている。
【００６２】
（３．マイクロ粒子の調製）
アレイの構築に使用するのに適した未染色のマイクロ粒子は、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国インディアナ州カーメル（Ｃａｒｍｅｌ））より入手した７．７ミクロン、１０％固形分ポリマービーズである。染色の前に、ビーズを以下の通り調製する。１５ｍｌのＭｅＯＨで３回、ビーズを洗浄する。次に、ビーズを、１５ｍｌの無水ＭｅＯＨ（ＭｇＳＯ４処理）で洗浄し、その後、１７．５ｍｌの無水ＭｅＯＨ中に懸濁させる。染色するために、小さな撹拌子をそれぞれ含有する別々のチューブに、１ｍｌ分（３．８６ｘ１０７個のビーズ）を入れて、撹拌する。
【００６３】
（４．染色溶液の調製）
各色素について、下記の表に示す割合の染色試薬からなる一連の染色溶液１．０ｍｌを調製する。
【００６４】
【表１】
2008538609.tif 000003
【００６５】
別法では、１，４ジオキサンの代わりに、ＣＨ２Ｃｌ２など、別の適した有機溶剤を用いることができる。
【００６６】
（５．ビーズの染色）
室温で激しく撹拌しながら、洗浄済みビーズの１ｍｌ調製物を含有する別々のチューブに、１ｍｌの各染色溶液を添加する。ビーズ／色素混合物を暗中、５０℃で、１時間、撹拌し、ビーズに色素を吸着させる。
【００６７】
染色の後、１０ｍｌのＭｅＯＨを各チューブに添加する。チューブをボルテックスにかけ、その後、３０００ｒｐｍで、４分間、遠心分離して、染色されたビーズをペレットにする。ペレットを、５ｍｌのＭｅＯＨで２回洗浄し、次に１０ｍｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１％ＮａＮ３で洗浄し、その後、３ｍｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１％ＮａＮ３に懸濁する。この結果得られる染色済みビーズ溶液の濃度は、約１０４／μｌ（１０７／ｍｌ）である。
【００６８】
（６．ビーズ集団の試験および選択）
上述の通り、各候補色素を用いて染色を行って、各セットが異なった候補色素で染色され、かつ各セットが異なった濃度の同一色素で染色された一連のビーズ集団を含有する複数のビーズセットを作製する。上記複数のビーズセットは、適したアレイがそれから選択される候補アレイを表す。適したアレイの選択は実験的に決定され、選択された色素および染色効率などの多数のパラメータに依存するであろう。
【００６９】
上記候補アレイから適したアレイを選択するために、ビーズ集団を、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメータまたはＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｒａｙ（商標）フローサイトメータのいずれかで、上述の検出器チャネルを用いて分析し、上記２つの検出器チャネルのそれぞれにおける、各ビーズからの蛍光強度データを二次元ドットプロットにプロッティングする。同時にオンスケール（すなわちドットプロットの縁に圧縮されていないデータ）であり、かつ他のビーズ集団と本質的にオーバーラップしない明確に定義されたクラスターを形成するビーズ集団を、複合アレイで使用するために選択する。
【００７０】
加えて、ビーズからの発光をＰＥチャネル（ＦＬ２または黄色）において測定して、ＰＥ標識されたレポータ分子を測定するのに使用されるチャネルへのスピルオーバーの量を測定する。ＰＥチャネルへのスピルオーバーは、レポータ試薬の測定における障害を最小にするために、最小限であることが好ましい。
【００７１】
アレイで使用されるビーズ集団の選択が実験的であるため、ビーズの染色および分析は、既存のアレイにビーズが増加的に付加される反復過程であると予測される。実験結果に基づいて、通常の方法で、染色手順に適切な調整を加えることができる。例えば、色素強度が強過ぎるために、最初に染色されたセット中のほとんどの集団がオフスケールとなり、そのため、サブセットのみが最終アレイで使用するために選択された場合、追加のビーズ集団は、より低い色素濃度を用いて染色することができる。アレイ中に包含させるために選択された最初の染色集団を用いたその後の分析は、アレイサイズの拡張を可能にするであろう。さらに、異なった色素で染色された追加セットのビーズ集団を、既存のセットに増加的に付加して、アレイのサイズを拡張することができる。
【００７２】
（実施例２）
（２９集団のアレイ）
ビーズサブセットは、下記の表に記載する色素のそれぞれを用いて、本質的には実施例１に記載の通りに調製した。すべての色素は、Ｅｘｃｉｔｏｎ社（米国オハイオ州デイトン（Ｄａｙｔｏｎ））から入手した。励起極大および発光極大は、エタノール中、メタノール中、またはジクロロメタン中のいずれかで測定したが、ある程度、測定に使用された溶媒に依存し、異なった溶媒を用いると、わずかに異なった結果が得られる可能性のあることが知られている。
【００７３】
【表２】
2008538609.tif 000004
【００７４】
これらの色素（ＬＤＳ７５１を除く）の発光スペクトルを図１に示す。ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｒａｙフローサイトメータを用いて決定された検出チャネルの境界も示されている。
【００７５】
上記色素の１つで異なった量に染色されたビーズ集団を各々含有する染色済みビーズのセットを組み合わせ、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｒａｙフローサイトメータで上述の通りに分析した。一意的に識別可能であり、かつ遠赤色×赤色ドットプロットで同時にオンスケールであるビーズ集団を、最終のマルチプレックスビーズセットで使用するために実験的に選択した。図２は、２９の識別可能なビーズ集団を含有する選択されたビーズアレイのドットプロット（遠赤色×赤色）を示す。最終セットで使用された、各サブセットからのビーズ集団の数が、上記の表に示されている。
【００７６】
ＰＥチャネル（黄色）における、ビーズ集団の発光も測定した（結果は示されていない）。観測されたスピルオーバーは、全集団で最小限のものであった。
【００７７】
（実施例３）
（拡張アレイ）
本質的に上述の通りに調製した、ＬＤＳ７６５（Ｅｘｃｉｔｏｎ、米国オハイオ州デイトン（Ｄａｙｔｏｎ））を用いて染色したビーズセットを包含させることにより、実施例２に記載のビーズアレイを増加的に拡張した。測定された上記色素の励起極大および発光極大を下記の表に示す。
【００７８】
【表３】
2008538609.tif 000005
【００７９】
この分析では、染色済みビーズのセットを、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメータで、上述の通りに分析した。ＬＤＳ７６５で染色されたセットからのビーズ集団を、以前に構築したアレイのビーズ集団と比較して、上記集団が、一意的に識別可能であり、かつ同時にオンスケールとなるように選択した。２９集団のアレイに３つの集団を付加することができた。図３は、３２の識別可能なビーズ集団を含有する選択されたビーズアレイのドットプロット（ＦＬ３×ＦＬ４）を示す。
【００８０】
ＰＥチャネル（ＦＬ２）における、ビーズ集団の発光も測定した（結果は示されていない）。観測されたスピルオーバーは、全集団で最小限のものであった。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】実施例２および３に記載のアレイで使用される、オーバーラップした複数の色素の発光スペクトルを示す図である。
【図２】実施例２に記載の、２９の異なった集団のビーズを含有するアレイのドットプロットを示す図である。
【図３】実施例３に記載の、３２の異なった集団のビーズを含有するアレイのドットプロットを示す図である。
【図１】
2008538609.tif 000006
【図２】
2008538609.tif 000007
【図３】
2008538609.tif 000008
【国際調査報告】
2008538609.tif 000009