(57)【要約】  呼吸器への吸入または他の表皮細胞の感染に直接伝達するのに適合した、微生物感染性疾患治療及び予防用コレクチン属タンパク質またはその類似体を含む噴霧乾燥粉末組成物、及びそれを製造する方法に関するものである。本発明の噴霧乾燥粉末組成物は、コレクチン属タンパク質またはその類似体を有効成分として含み、粒子サイズが０．１〜１０μｍであることを特徴とする。本発明の製造方法によって製造された噴霧乾燥粉末組成物は、ウイルス、細菌、真菌類などの感染を抑制する効果があり、吸入に適当な形態に製剤化されることによって、これら微生物による呼吸器感染や外傷の予防及び／または治療剤として直接感染部位や感染可能部位に有効成分を供給することができる形態に製剤化したものである。本発明の噴霧乾燥粉末組成物は、他の賦形剤と混合して錠剤（ｔａｂｌｅｔ）形態の剤形を製造するのにも使用することができる。【選択図】図３
2008526735.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つのコレクチン属タンパク質またはその類似体を有効成分として含み、粒子サイズが０．１〜１０μｍで、気道もしくは肺への吸入または他の表皮細胞の感染部位に直接伝達するのに適合した微生物感染性疾患治療及び予防用噴霧乾燥粉末組成物。
【請求項２】
粒子サイズが、３〜５μｍであることを特徴とする、請求項１に記載の噴霧乾燥粉末組成物。
【請求項３】
薬学的に許容可能な担体をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の噴霧乾燥粉末組成物。
【請求項４】
薬学的に許容可能な担体が、糖または生分解性高分子であることを特徴とする、請求項３に記載の噴霧乾燥粉末組成物。
【請求項５】
糖が、スクロースまたはラクトースであることを特徴とする、請求項４に記載の噴霧乾燥粉末組成物。
【請求項６】
生分解性高分子が、ポリビニルアルコールであることを特徴とする、請求項４に記載の噴霧乾燥粉末組成物。
【請求項７】
カゼイン（ｃａｓｅｉｎ）をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の噴霧乾燥粉末組成物。
【請求項８】
カゼインが、０．１〜２０重量％含まれることを特徴とする、請求項７に記載の噴霧乾燥粉末組成物。
【請求項９】
組換えマンノース結合型レクチン（ＭＢＬ）０．００１〜６０重量部、ＮａＣｌ０．１〜１０重量部、ＣａＣｌ２０．１〜１０重量部、及び糖５〜８０重量部を含む噴霧乾燥粉末組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、組換えＭＢＬ０．００１〜０．１重量部、ＮａＣｌ８〜９重量部、ＣａＣｌ２１〜２重量部、ラクトースまたはスクロース２０重量部、及びＰＶＡ０．５重量部を含む、請求項９に記載の噴霧乾燥粉末組成物。
【請求項１１】
微生物が、ウイルス、細菌または真菌類であることを特徴とする、請求項１〜９に記載の噴霧乾燥粉末組成物。
【請求項１２】
ウイルスが、流感ウイルス、ＨＩＶ（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス、ＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）コロナウイルス及びライノウイルス（ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）を含む外膜（ｅｎｖｅｌｏｐｅｓ）を有するウイルスであることを特徴とする、請求項１１に記載の噴霧乾燥粉末組成物。
【請求項１３】
細菌が、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、インフルエンザ菌（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）または化膿性連鎖球菌（Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｓ）を含むコレクチン属タンパク質が認知することができる糖（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）パターンを有する細菌であることを特徴とする、請求項１１に記載の噴霧乾燥粉末組成物。
【請求項１４】
真菌類が、ガンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）を含むコレクチン属タンパク質が認知することができる糖パターンを有する真菌であることを特徴とする、請求項１１に記載の噴霧乾燥粉末組成物。
【請求項１５】
コレクチン属タンパク質が、マンノース結合型レクチン、ＳＰ−Ａ（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ）、ＳＰ−Ｄ（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄ）、ＣＬ−Ｌ１（ｃｏｌｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｖｅｒ  １）、ＣＬ−Ｐ１（ｃｏｌｌｅｃｔｉｎ−ｐｌａｃｅｎｔａ  １）及びＣＬ−４３からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の噴霧乾燥粉末組成物。
【請求項１６】
コレクチン属タンパク質が、マンノース結合型レクチンであることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の噴霧乾燥粉末組成物。
【請求項１７】
（i）コレクチン属タンパク質またはその類似体及び糖が含まれた水溶液を製造する工程；
（ii）噴霧乾燥器を使用して噴霧空気圧力（spraying rate）５００〜２，０００ｌ／時、供給熱風の圧力（a hot air flow rate）４００〜１，２００ｌ／分、熱風温度５０〜２２０℃及び排気温度４２〜１５０℃の条件で前記工程（i）で製造された水溶液を噴霧乾燥（spray-drying）する工程；及び、
（iii）工程（ii）によって生成された粉末を収得する工程
を含む、少なくとも１つのコレクチン属タンパク質またはその類似体を含み；かつ呼吸器への吸入または表皮細胞の感染部位へのコレクチン属タンパク質の直接伝達に適合した噴霧乾燥粉末組成物の、製造方法。
【請求項１８】
工程（i）で水溶液が、コレクチン属タンパク質またはその類似体が０．０００５〜１０％（ｗ／ｖ）含有され、糖が０．１〜４％（ｗ／ｖ）含有されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
糖が、スクロースまたはラクトースであることを特徴とする、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
工程（i）で水溶液が、薬剤学的に許容される担体又は希釈剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
工程（i）で水溶液が、カゼインをさらに含むことを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
コレクチン属タンパク質が、マンノース結合型レクチン、ＳＰ−Ａ（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ）、ＳＰ−Ｄ（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄ）、ＣＬ−Ｌ１（ｃｏｌｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｖｅｒ  １）、ＣＬ−Ｐ１（ｃｏｌｌｅｃｔｉｎ−ｐｌａｃｅｎｔａ  １）及びＣＬ−４３からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
コレクチン属タンパク質が、マンノース結合型レクチンであることを特徴とする、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記粉末組成物の粒子サイズが、０．１〜１０μｍであることを特徴とする、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物感染性疾患治療及び予防用コレクチン属タンパク質またはその類似体を含む組成物に関するものである。この組成物は、呼吸器への吸入または他の表皮細胞の感染に直接伝達するのに適合する。本発明は、また直接感染部位に供給することができる前記組成物を噴霧乾燥粉末形態で生産する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
マンノース結合型レクチン（ｍａｎｎｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｌｅｃｔｉｎ：ＭＢＬ）は、人体血中に存在するタンパク質で、微生物による感染を克服する先天性免疫を担当していることが知られている。ＭＢＬは、体内に侵入した微生物表面タンパク質の特徴的な糖化形態（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ）を認識して、微生物と結合した後、下記の三種類の経路で微生物による感染を遮断する。第一の方法は、ＭＢＬが微生物の表面糖化タンパク質と結合体を形成した後、レクチン経路（ｌｅｃｔｉｎ  ｐａｔｈｗａｙ）を通じてＭＢＬ連関セリンプロテアーゼが活性化して、Ｃ４とＣ２を分割することで、補体系（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ）を活性化させるものである。二番目の方法は、微生物の表面糖化タンパク質に結合したＭＢＬ自体が、オプソニン（ｏｐｓｏｎｉｎ）として作用して中性球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）または大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）のような食菌細胞による食菌作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）を誘導するものである。三番目の方法は、ＭＢＬが微生物の表面糖化タンパク質と結合して、微生物が細胞内に侵入する感染性を中和させて（ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）微生物の増殖を遮断する方法である。したがって、ＭＢＬが微生物の侵入を防御するのにおいて最も重要な第一段階は、微生物を認知して結合することである。
【０００３】
ＭＢＬは、コレクチン属に属するタンパク質の一種でそれに属したタンパク質は、共通的にコラーゲンドメインと炭水化物認識ドメインを有する。ＭＢＬは、単位分子量が３２ｋＤａで、Ｃ−末端部位に炭水化物認識ドメイン（Ｃ−ｔｙｐｅ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ、ＣＲＤ）があって、Ｎ−末端部位にシステイン豊富地域（ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｒｉｃｈ  ｒｅｇｉｏｎ）があり、コラーゲンドメイン（ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｄｏｍａｉｎ）を有している。三つの単位分子ＭＢＬが集まって、コラーゲンドメインを通じて三重ラセン構造を有する単位複合体を形成するようになる。この三重ラセン複合体は、再びＮ−末端部位のシステインによる分子間ジスルフィド結合をするようになり、ＭＢＬの場合、六個までの複合体を形成することができるようになる。これは、コレクチン属に属しているＳＰ−Ａ（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ）、ＳＰ−Ｄ（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄ）、ＣＬ−Ｌ１（ｃｏｌｌｅｃｔｉｎ１−ｌｉｖｅｒ  １）、ＣＬ−Ｐ１（ｃｏｌｌｅｃｔｉｎ−ｐｌａｃｅｎｔａ  １）など、すべてのタンパク質の構造的特徴であり、これらコレクチン属に属しているタンパク質は、物理化学的に似た性格を有している。これらはまた、共通的に血清と肺表面で微生物に対する全面役防御（ｐｒｅｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｅｎｓｅ）において重要な役目をすることが知られている（Ｈａｎｓ−Ｊｕｒｇｅｎ  Ｈｏｐｐｅ  ａｎｄ  Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｂ．Ｍ．ｒｅｉｄ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４年，第３巻，１１４３−１１５８頁）。前記タンパク質の外にもコレクチン属に属したタンパク質には、牛のコングルチニン（ｂｏｖｉｎｅ  ｃｏｎｇｌｕｔｉｎｉｎ）のＣＬ−４３及びヒトコングルチニン類似タンパク質がある。
【０００４】
ＭＢＬは、多様な種類の微生物と結合することができることが知られている。ＭＢＬは、主に外皮膜を有するウイルスとよく結合する。代表的に流感ウイルス（Ｈａｔｒｓｈｏｒｎ  Ｋ．Ｌ．等，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９３年，第９１巻，１４１４頁；Ｋａｓｅ  Ｔ．等，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９９年，第９７巻，３８５頁）、ＨＩＶ（Ｅｚｅｋｏｗｉｔｚ  Ｒ．Ａ．等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９８９年，第１６９巻，１８５頁；Ｈａｕｒｕｍ  Ｊ．Ｃ．等，ＡＩＤＳ，１９９３年，第７巻，１３０７頁）、ヘルペスウイルス（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｃ．Ｂ．等，Ｓｃａｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４年，第３９巻，４３９頁）及びサスコロナ（ＳＡＲＳ  ｃｏｒｏｎａ）ウイルス（Ｋｓｉａｚｅｋ  Ｔ．Ｇ．等，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２００３年，第３４８巻，１９５３頁；Ｐｅｉｒｉｓ  Ｊ．Ｓ．Ｍ．等，Ｌａｎｃｅｔ，２００３年，第３６１巻，１３１９頁）などが含まれ、一般に風邪を起こすライノウイルス（ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）  などにもよく結合することが予想される。ＭＢＬは、バクテリアの中では、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（Ｎｅｔｈ  Ｏ．等，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０００年，第６８巻，６８８頁）、インフルエンザ菌（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（Ｖａｎ  Ｅ．等，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４年，第９７巻，４１１頁）などとよく結合し、菌類の中では、ガンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）（Ｔａｂｏｎａ  Ｐ．等，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９５年，第８５巻，１５３頁）とよく結合することが報告された。
【０００５】
ＭＢＬと結合する微生物の中で流感ウイルス、ライノウイルス、ＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）コロナウイルス、動物由来流感ウイルスなどは、主に呼吸器の上皮細胞に感染して症状を起こし、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）は、肺に感染を起こす。化膿性連鎖球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、外部傷にも感染して、ガンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）は、女性の膣炎と関連がある。これら呼吸器疾患及び外部感染の治療にＭＢＬを使用するためには、溶液状態で使用することは不適切なので、特殊な製剤化が求められる。ＭＢＬは、血液中に存在するタンパク質で、多くの研究がなされているが、ＭＢＬが上に言及された上皮細胞及び外部傷感染に対する防御及び対処にどの程度関与するかは、よく知られていない。単に、唾と母乳（Ｔｒｅｇｏａｔ  Ｖ．等，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．，２００２年，第１６（６）巻，３０４頁）などからＭＢＬが検出されたという報告がある。
【０００６】
流感ウイルスによる感染時にウイルスは、呼吸器表面の上皮細胞内に感染して、感染した細胞で増殖した後、外に出て、となりの上皮細胞をまた感染させるようになる。したがって、糖化された微生物表面タンパク質を認知して結合するＭＢＬを使用して流感ウイルスと結合させれば、ウイルスが上皮細胞に接触して感染することを遮断することができる。このように表面に露出した細胞に対する微生物の感染において、上で言及したＭＢＬの三種類先天的免疫機序の中で結合による物理的遮断による防御が可能であり、オプソニンでの作用による防御効果は、食細胞が表面に染み出る場合に可能である。
【０００７】
実際に培養細胞でウイルスによる感染が、ＭＢＬによって遮断される場合、ＭＢＬに結合する物理的中和だけでも、となりの細胞への微生物感染を充分に遮断することができることが観察された。その例として、ＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）コロナウイルスを培養した細胞に感染させる時、ＭＢＬを培養液の中に入れてやると、ウイルス感染が遮断されることを観察することができた（大韓民国特許出願第２００４−０１０６１９４号）。また、流感ウイルス感染でもこれと類似に、ＭＢＬがウイルスの感染を遮断することができるということが知られている（Ｗａｋａｍｉｙａ  Ｎ．等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９２年，第１８７巻，１２７０頁；Ｈａｒｔｌｅｙ  Ｃ．Ａ．等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９２年，第６６巻，４３５８頁；Ｐａｔｒｉｃｋ  Ｃ．Ｒ．等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９７年，第７１巻，８２０４頁；Ｋａｓｅ  Ｔ．等，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９９年，第９７巻，３８５頁）。
【０００８】
ＭＢＬを呼吸器感染または外傷に適用するためには、溶液状態ではない粉末形態に製剤化することが多くの面で好ましい。粉末形態の製剤は、感染した部位にＭＢＬを効果的に供給することができ、供給量を最大化することができ、局部的に使用するので副作用を減らすことができ、使用量を節減することができる。
【０００９】
タンパク質医薬品を粉末形態で製剤化するための方法は、一般的に凍結乾燥法と噴霧乾燥法が使用されている。現在、最も普遍的に使用されている粉末化方法は、凍結乾燥法である。凍結乾燥法は、熱に敏感なタンパク質に使用するのに適当な方法であるが、効果的に吸いこむことができる数μｍサイズの均一な粉末を作るのには適当ではない。また、凍結乾燥のために氷らせる過程で、タンパク質と溶媒成分が氷結晶の間で濃縮される傾向がある。このような濃縮効果は、タンパク質周辺のｐＨとイオン強度（ｉｏｎｉｃ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ）の急激な変化を起こして、タンパク質の変性と沈澱を誘発し得る（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  Ｐ．Ｌ．等，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１９７３年，第９２（６）巻，１７９５頁；Ｋｏｓｅｋｉ  Ｔ．等，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９０年，第１０７巻，３８９頁）。
【００１０】
これに反して、噴霧乾燥法は、液体試料を連続的に流しながら噴霧させて微細に分散した形態の水玉を作ると同時に熱風で瞬間的に乾燥させる方法で、多数の医薬品製剤化にすでに使用されている方法である。噴霧乾燥法は、吸入を通じて医薬品を気道や肺に運搬するのに適当なサイズの粒子に粉末を作ることができる長所があり、エネルギー消費が少ないため、生産現場で費用と時間を節約することができる（Ｂｒｏａｄｈｅａｄ  Ｊ．等，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍ．，１９９２年，第１８（１１＆１２）巻，１１６９頁）。一般的にタンパク質は、熱に安定しないため高温の熱風を使用する噴霧乾燥法をタンパク質医薬品の粉末化に適用した例は多くないが、オキシヘモグロビン（ｏｘｙｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，Ｌａｂｒｕｄｅ  Ｐ．等，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９８９年，第７８（３）巻，２２３頁）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ，Ｍμｍｅｎｔｈａｌｅｒ  Ｍ．  等，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１９９４年，第１１（１）巻，１２頁；Ｂｏｓｑｕｉｌｌｏｎ  Ｃ．，Ｊ．Ｃｏｎｔ．Ｒｅｌ．，２００４年，第９６巻，２３３頁）、ｔ−ＰＡ（Ｍμｍｅｎｔｈａｌｅｒ  Ｍ．等，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１９９４年，第１１（１）巻，１２頁）、ＤＮａｓｅ（Ｃｈａｎ  Ｈ．Ｋ．等，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１９９７年，第１４（４）巻，４３１頁）、副甲状線ホルモン（ＰＴＨ，Ｃｏｄｒｏｎｓ  Ｖ．等，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，２００３年，第９２（５）巻，９３８頁）、ヒト化単一クローン抗体（ａｎｔｉ−ＩｇＥ，Ｍａａ  Ｙ．Ｆ．等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１９９８年，第６０（３）巻，３０１頁）などに対する試みが行われている。
【００１１】
特に、呼吸器に使用する目的で噴霧乾燥したタンパク質組成物を製造する場合には、５  μｍ以下のサイズの粉末形態に製剤化することが好ましい。ここで、粉末のサイズ分布、模様、水分含有量などが治療効能において重要な要因になる（Ｈｉｃｋｅｙ  Ａ．Ｊ．等，Ｐｈａｒｍ．Ｔｅｃｈ．，１９９４年，第１８巻，５８頁）。このような粉末の物理的特性を決めるのに、熱風の供給速度及び温度、タンパク質溶液の供給速度及び噴霧圧力などの器機的条件（Ｍａａ  Ｙ．Ｆ．等，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１９９８年，第１５（５）巻，７６８頁）とタンパク質溶液が含む塩類、糖、賦形タンパク質など添加剤の種類及び濃度（Ａｎｄｙａ  Ｊ．Ｄ．等，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１９９９年，第１６（３）巻，３５０頁；Ｍａａ  Ｙ．Ｆ．等，Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈ．，１９９７年，第２（３）巻，２１３頁）が重要な要因として作用する。同時に、組換えヒトＭＢＬを噴霧乾燥して粉末型に製剤化しようとする時、重要に考慮しなければならない事項は、噴霧乾燥した組換えヒトＭＢＬ粉末を溶かした時、結合型糖化タンパク質及びセリンプロテアーゼの存在下にＭＢＬ結合型糖化タンパク質に特異的に結合して補体を活性化する効果を、噴霧乾燥前の溶液状態と同じく維持していなければならず、前記活性が長期的でも保存されなければならない。
【００１２】
しかし、今まで呼吸器の炎症などを治療する目的に、ヒト組換えＭＢＬ組成物を噴霧乾燥して製造する方法に対する研究成果は報告されておらず、呼吸器を通じた吸入や外傷に適用することができる噴霧乾燥による組換えヒトＭＢＬ組成物の製造方法に対する開発が切実に求められているのが実情である。
【００１３】
このような問題点を解決するために、本発明は、少なくても一つ以上のコレクチン属タンパク質を含む溶液に糖及び／またはタンパク質を添加することによって形成された粉末及び溶液を噴霧乾燥させたものを提供する。前記の粉末は、効能の低下なしに長期間保管することができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、コレクチン属タンパク質またはその類似体を有効成分として含み、粒子サイズが０．１〜  １０μｍで、呼吸器、他の体腔及び体表面の微生物感染部位に、感染性疾患治療及び予防用に直接伝達することができるコレクチン属タンパク質またはその類似体を含む、噴霧乾燥粉末組成物を提供する。
【００１５】
同時に、本発明は、（i）コレクチン属タンパク質またはその類似体及び糖が含まれた水溶液を製造する工程；（ii）噴霧乾燥器を使用して噴霧空気圧力５００〜２，０００ｌ／時、供給熱風の圧力４００〜１，２００ｌ／分、熱風温度５０〜２２０℃及び排気温度４２〜１５０℃の条件で、前記工程（i）で製造された水溶液を噴霧する工程；及び、（iii）前記工程（ii）によって生成された粉末を収得する工程を含む、呼吸器への吸入または表皮細胞感染治療に適合した、コレクチン属タンパク質またはその類似体を含む噴霧乾燥粉末組成物の製造方法を提供する。
【００１６】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００１７】
本発明は、コレクチン属タンパク質またはその類似体を有効成分として含み、粒子サイズが０．１〜  １０μｍで、呼吸器への吸入または他の表皮細胞の感染に直接伝達するのに適合した、微生物感染性疾患治療及び予防用コレクチン属タンパク質、またはその類似体を含む噴霧乾燥粉末組成物を提供する。
【００１８】
ここで、コレクチン属タンパク質と言うのは、共通的に炭水化物認識ドメインとコラーゲンドメインを含むタンパク質で、お互いに物理化学的性質が非常に類似である。類似体と言うのは、本来のコレクチン属タンパク質のアミノ酸配列の中で、一部アミノ酸に変異が存在するが機能的には等価であるタンパク質を意味する。前記類似体は、同一種または他種のコレクチン属タンパク質相同体と構造的、生理学的機能が類似の自然的または人為的突然変異体を全て含む。
【００１９】
コレクチン属タンパク質には、例えば、ＳＰ−Ａ（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ）、ＳＰ−Ｄ（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄ）、ＣＬ−Ｌ１（ｃｏｌｌｅｃｔｉｎ１−ｌｉｖｅｒ  １）、ＣＬ−Ｐ１（ｃｏｌｌｅｃｔｉｎ−ｐｌａｃｅｎｔａ  １）、ＣＬ−４３及びヒトコングルチニン類似タンパク質（ｈuｍａｎ  ｃｏｎｇｌｕｔｉｎｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）がある。前記コレクチン属に属するタンパク質は、全てＣ−末端にレクチンドメインを有していて炭水化物を認識して結合することができる（Ｈａｎｓ−Ｊｕｒｇｅｎ  Ｈｏｐｐｅ  ａｎｄ  Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｂ．Ｍ．  ｒｅｉｄ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４年，第３巻，１１４３−１１５８頁）。例えば、ＣＬ−４３は、ＨＩＶ−１の外皮を構成する糖タンパク質であるｇｐ１６０に結合して、ｇｐ１６０がＣＤ４受容体に結合することを抑制して（Ａｎｄｅｒｓｏｎ等  Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９０年，第３２巻，８１−８８頁）、ヒトコングルチニン類似タンパク質は、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０に結合して感染を防ぐ（Ｕｓｈｉｊｉｍａ等，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９２年，第８３巻，４５８−４６４頁）。ＳＰ−Ａ及びＳＰ−Ｄもさまざまな微生物に結合して感染を防ぐという事実が知られている（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ等，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９２年，第８９巻，１４３−１４９頁；ＭｃＮｅｅｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｏｎｒｏｄ，Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１９９３年，９１−９７頁；Ｋｕａｎ等，Ｊ．Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９２年，第９０巻，９７−１０６頁）。このような事実からコレクチン属に属するタンパク質は、全てマンノース結合型レクチンと同じく、本発明の微生物感染性疾患治療及び予防用噴霧乾燥粉末組成物の有効成分として含むことができるだろう。
【００２０】
前記コレクチン属に属するタンパク質は、商業的に市販される物質を購入したり組換えベクターなどを使用した当業界公知の分子生物学的技術を利用して使用することができる。例えば、ＣＬ−Ｐ１は、Ｒ＆Ｄシステムズ社のレコビナントヒトＣＬ−Ｐ１（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＣＬ−Ｐ１、カタログ番号：２６９０−ＣＬ）を購入して、本発明の組成物製作に使用することができる。
【００２１】
また、前記組成物は、好ましい組成例としては、０．００１〜６０重量部組換えＭＢＬ、０．１〜１０重量部ＮａＣｌ、０．１〜１０重量部ＣａＣｌ２、糖は５〜８０重量部を含み、より好ましくは、０．００１〜０．１重量部組換えＭＢＬ、８〜９重量部ＮａＣｌ及び１〜２重量部ＣａＣｌ２、２０重量部ラクトースまたは２０重量部スクロースと０．５重量部ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含む噴霧乾燥粉末組成物を挙げることができる。重量部は、組成物内の前記構成要素の重量の割合で、本願発明の組成物は、水溶液に溶解させた後、噴霧乾燥して製造され、前記構成要素は全て非揮発性なので、溶液製造時に使用された溶質の質量費が噴霧乾燥組成物の最終質量比になることは自明である。したがって、百分率またはモル濃度で表示された溶質の割合は、易しく重量部に換算される。例えば、溶液１リットル当たり１ｇの溶質の重量費を１に設定した場合、分子量が１１１のＣａＣｌ２のモル濃度も１０ｍＭは、１０×１０−３×１１１で計算して１．１１重量部になる。
【００２２】
前記コレクチン属タンパク質またはその類似体は、０．００１〜６０重量部含有することが好ましいが、特別にこれに制限されるものではなく、前記マンノース結合型レクチンは、特別これに制限されるものではないが、自然型マンノース結合型レクチンまたは組換えマンノース結合型レクチンであることが好ましく、組換えマンノース結合型レクチンであることがさらに好ましい。ここで、組換えマンノース結合型レクチンは、特別にこれに制限されるものではないが、少なくとも三重ラセン複合体が三つ以上に構成された単量体（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ）組換えマンノース結合型レクチンであることが好ましく、受託番号ＫＣＴＣ１０４７２ＢＰ（大韓民国公開特許第２００４−０１０６１９４号）の細胞株から生産されたものがさらに好ましい。
【００２３】
また、マンノース結合型レクチン含有噴霧乾燥粉末の粒子サイズは、呼吸器などへの吸入によって治療効果を得るためには、約５μｍ内外であることが好ましく、０．１〜４μｍであることがさらに好ましい。
【００２４】
同時に、本発明のコレクチン属タンパク質またはその類似体を含む噴霧乾燥粉末組成物は、前記有効成分以外に薬学的に許容可能な担体を追加的に含むことが好ましく、ここで、前記薬学的に許容可能な担体は、特別にこれに制限されるものではないが、糖であることが好ましく、前記糖は、特別にこれに制限されるものではないが、スクロースまたはラクトースであることが好ましい。ここで、前記糖の含量は、特別にこれに制限されるものではないが、５〜８０重量部含有することが好ましい。
【００２５】
一方、前記微生物は、ウイルス、細菌または真菌類であることが好ましく、前記ウイルスは特別にこれに制限されるものではないが、流感ウイルス、ＨＩＶ（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス、ＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）コロナウイルス及びライノウイルスであることが好ましく、細菌は特別にこれに制限されるものではないが、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、インフルエンザ菌（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）または化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｓ）であることが好ましく、真菌類は特別にこれに制限されるものではないが、ガンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）であることが好ましい。
【００２６】
また、本発明のコレクチン属タンパク質またはその類似体を含む噴霧乾燥粉末組成物は、剤形化された以後、安定的な活性のためにカゼインを追加的に含むことが好ましい。ここで、特別にこれに制限されるものではないが、カゼインは０．１〜２０重量部含有されることが好ましい。
【００２７】
一方、前記治療及び予防対象になる微生物は、ウイルス、細菌または真菌類であることが好ましく、前記ウイルスは特別にこれに制限されるものではないが、流感ウイルス、ＨＩＶ（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス、ＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）コロナウイルス及びライノウイルスを含む外膜を有するウイルスであることが好ましく、前記細菌は特別にこれに制限されるものではないが、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、インフルエンザ菌（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）または化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｓ）を含むＭＢＬが認知することができる糖パターンを有する細菌であることが好ましく、前記真菌類は特別にこれに制限されるものではないが、ガンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）を含むＭＢＬが認知することができる糖パターンを有する真菌であることが好ましい。
【００２８】
同時に、本発明は、（i）少なくとも１つのコレクチン属タンパク質またはその類似体及び糖が含まれた水溶液を製造する工程；（ii）噴霧乾燥器を使用して噴霧空気圧力５００〜２，０００ｌ／時、供給熱風の圧力４００〜１，２００ｌ／分、熱風温度５０〜２２０℃及び排気温度４２〜１５０℃の条件で前記工程（i）で製造された水溶液を噴霧する工程；及び、（iii）前記工程（ii）によって生成された粉末を収得する工程を含む、呼吸器への吸入または表皮細胞の感染部位に直接伝達するのに適合したコレクチン属タンパク質またはその類似体を含む噴霧乾燥粉末組成物の製造方法を提供する。
【００２９】
ここで、特別にこれに制限されるものではないが、工程（i）で水溶液はコレクチン属タンパク質またはその類似体が０．０００５〜１０％（ｗ／ｖ）含有され、糖が０．１〜４％（ｗ／ｖ）含有されることが好ましく、前記糖は特別にこれに制限されるものではないが、スクロースまたはラクトースであることが好ましく、工程（i）で水溶液は薬剤学的に許容される担体またはカゼインを追加的に含むことが好ましい。ここで、前記カゼインは特別にこれに制限されるものではないが、０．００５〜０．２％（ｗ／ｖ）含有されることが好ましい。
【００３０】
本発明者等は、肺炎などの細菌感染性呼吸器疾患の治療に有用なコレクチン属タンパク質またはその類似体を経口投与または注射による投与方式ではなく、エアゾール形態で直接吸入させることで、標的器官の上皮細胞に直接作用させることができる剤形を開発しようと鋭意研究努力した結果、通常の懸濁液組成物ではない微細粒子サイズの粉末組成物の形態に剤形化する場合、より効率的な投与が可能であることを認知するようになった。しかし、タンパク質製剤において、通常的な粉末製造方法である凍結乾燥方式によってコレクチン属タンパク質またはその類似体粉末組成物を製造する場合、吸入に適切なサイズ（５μｍ未満）の粒子が形成されないので、吸入型製剤には不適合である。したがって、適切なサイズの粒子の形成に有利な方法として噴霧乾燥方法を考慮するようになった。前記噴霧乾燥方法は、強い圧力で懸濁液を噴霧してそれを熱風によって乾燥する方式で、熱に弱いタンパク質の粒子を形成するには使用が制限される方法であり、極めて一部タンパク質に対する製剤化の例があるだけであり、コレクチン属タンパク質またはその類似体を前記方法で製剤化した例はない。
【００３１】
それで、本発明者等は、コレクチン属タンパク質またはその類似体を含む微細粉末組成物を製造するにおいて噴霧乾燥方法を適用する場合、前記コレクチン属タンパク質またはその類似体の活性及び安定性が維持されるのかどうかを分析した結果、噴霧乾燥方法で製造された微細粉末組成物が乾燥前のコレクチン属タンパク質またはその類似体を含む懸濁液とその活性面で大きな差がなく、常温で長期間安定的に保管されることを確認した。また、吸入に効率的な粒子サイズを有するコレクチン属タンパク質またはその類似体を含む粉末組成物を製造するために、添加剤としての糖の種類及び濃度を変化することによって最適の条件を確立し、粉末組成物の活性を維持する温度及び圧力条件を確立した。さらに、カゼインを含ませる場合、カゼインが含まれない対照群に比較して活性の維持が優れていることを確認することによって、より効果的な微生物感染性疾病の治療及び予防用組成物を製造することができた。
【００３２】
本発明の組成物は、エアゾール形態で直接吸いこむことができ、投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症等によってその範囲が多様である。投与量は、約５０μｇ／ｄｏｓｅ〜２０ｍｇ／ｄｏｓｅで、好ましくは１ｍｇ／ｄｏｓｅ〜５ｍｇ／ｄｏｓｅであり、一日一回ないし数回に分けて投与することがさらに好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。
【００３４】
ただし、下記の実施例は本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではなく、下記の実施例で使用される百分率（％）は、特別に言及しない限り、体積対重量（ｗ／ｖ）を意味する。
＜実施例１＞ＭＢＬ粉末の特性分析及び分析方法の確立
組換えＭＢＬを吸入や外傷に適用することができる形態、またはこれを使用して錠剤（ｔａｂｌｅｔ）に作ることができる形態であるＭＢＬ粉末に製剤化するためには、次の条件を満たさなければならない。噴霧乾燥方法で作られたＭＢＬ粉末が、エアゾール（aerosol）形態で吸入可能なサイズに作られなければならないし、ＭＢＬ構造的特徴である複合体形成の程度と分布が熱風によって噴霧乾燥する過程でも変化しないで維持されなければならないし、作られたＭＢＬ粉末を溶かした時にＭＢＬ結合型糖化タンパク質及びセリンプロテアーゼの存在下で補体を活性化する効果が維持されなければならない。また、このような特性を確認することができる分析方法の確立が必要である。
【００３５】
まず、一般的なタンパク質の噴霧乾燥条件でＭＢＬ粉末を生産した。噴霧乾燥のために使用したＭＢＬ溶液は、組換えＭＢＬ（Ｄｏｂｅｅｌ，Ｋｏｒｅａ）５μｇ／ｍｌ、ＮａＣｌ１５０ｍＭ、ＣａＣｌ２１０ｍＭ、スクロース０．４％（ｗ／ｖ）の組成に、１ｍｇ／ｍｌのカゼイン(ｃａｓｅｉｎ)を添加して調剤した。実験室用噴霧乾燥器（ＬａＰｌａｎｔ  ＳＤ−０５、ＵＫ）を使用した。ＭＢＬ溶液は、３．５ｍｌ／分の速度でペリスタルティックポンプを使用してノズル（直径：０．５ｍｍ）で供給し、噴霧空気の圧力は１６００ｌ／時で使用した。乾燥管で提供した熱風の圧力は、１１５０ｌ／分、温度は１００℃に維持して排気温度は６９℃に維持した。
【００３６】
前記方法によって白色の微細なＭＢＬ粉末が製造され、製造されたＭＢＬ粉末は下記の方法で特性を確認した。
＜実施例１−１＞ＭＢＬ粉末の微細粒子サイズ及び分布
粉末形態に製剤化された医薬品が効果的に気道や肺に吸入されるためには、エアゾール  形態で吸入されなければならない。ここで要求される微細粉末のサイズは、５μｍ程度またはそれ以下が適当であると知られている。レーザーゼータ電位測定機（ＯＴＳＵＫＡ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、ＥＬＳ−８０００、日本）を使用して、噴霧乾燥したＭＢＬ粉末のサイズと分布を観察した（図１）。
【００３７】
図１にみられるように、前記方法によって製造されたＭＢＬ粉末は、２．１８〜３．１８μｍのサイズで分布していて、平均サイズは２．５７±０．２４μｍであることが観察された。したがって、噴霧乾燥方法で効果的に気道や肺に吸入可能なサイズのＭＢＬ粉末を作ることができることを確認した。
＜実施例１−２＞ウエスタンブロット分析
ＭＢＬ構造上の特徴である複合体形成の程度と分布が熱風によって噴霧乾燥する過程でも変わらずに維持されるかどうかを調べた。ＭＢＬ粉末を適当な量の水に溶かした後、非変性条件でウエスタンブロット分析を遂行して噴霧乾燥前の試料との差異を観察した（図２）。
【００３８】
図２は、噴霧乾燥前後のＭＢＬが形態的に同じに維持されるかどうかをウエスタンブロット分析で確認した結果を示す写真である。前記の図でＭは分子量標識を示し、１は噴霧乾燥前のＭＢＬ溶液、そして、２はＭＢＬの噴霧乾燥粉末を示す。図２に見られるように、噴霧乾燥過程の前後で構造的に明らかな形態の変化は観察されなかった。ゆえに、噴霧乾燥法を使用して、ＭＢＬの構造的変化なしにＭＢＬ粉末製剤化が可能であることが確認された。
＜実施例１−３＞補体系でのＣ４活性化試験
噴霧乾燥法で製造されたＭＢＬ粉末が溶けた時、ＭＢＬ結合型糖化タンパク質及びセリンプロテアーゼの存在下に補体を活性化する効果が維持されるかどうかを、下記のような方法で調べた。まず、免疫反応用プレート（ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭ  Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ、Ｎｕｎｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）をウェル当り５００ｎｇのB型肝炎(hepatitis B)pre-S抗原でコーティングして、そこに噴霧乾燥前ＭＢＬ（対照群）と噴霧乾燥したＭＢＬ粉末を水に溶解させた後、各々ウェル当り２００ｎｇ、１００ｎｇ、５０ｎｇ、２５ｎｇ、１２．５ｎｇ、６．２５ｎｇ及び３．１２５ｎｇを添加して常温で２時間結合させた。ＭＢＬ結合型セリンプロテアーゼ（ＭＢＬ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ、ＭＡＳＰ）供給源で無−ＭＢＬ血清（ＭＢＬ−ｆｒｅｅ  ｓｅｒｕｍ、Ｄｏｂｅｅｌ、Ｋｏｒｅａ）を希釈緩衝液に１：１００に希釈してウェル当り１００μｌずつ入れて反応させた。洗浄緩衝液で６回洗浄した後、Ｃ４  ５００ｎｇを添加して、常温で２時間反応させた。抗−Ｃ４  抗体−ＨＲＰ（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ、ＵＫ）を１：１５００に希釈して常温で１時間反応させた後にＯＰＤ溶液１５０μｌを添加して２０分間発色させてＣ４ｂ沈殿物（ｄｅｐｏｓｉｔ）を測定した。５０μｌの３Ｍ  ＨＣｌを加えた後、４９２ｎｍでエライザ（ＥＬＩＳＡ）測定機でＯＤ値を測定した（図３）。
【００３９】
図３は、本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物（白丸）と対照群（黒丸）のＣ４活性化程度を比較したグラフである。
【００４０】
噴霧乾燥前のＭＢＬと噴霧乾燥後のＭＢＬは、類似な程度にＣ４活性化を誘導した。したがって、噴霧乾燥方法を使用して製造された粉末形態のＭＢＬ組成物は、呼吸器感染や外傷に適用するための活性を維持することを確認することができた。
【００４１】
前記実施例１で記述したように、一般的な噴霧乾燥方法で作られたＭＢＬ粉末は、１）吸入可能なサイズで作られ、２）ＭＢＬ構造上の特徴である複合体形成の程度と分布が維持され、３）補体を活性化する効果が維持されていることが分かった。ゆえに、ＭＢＬは、噴霧乾燥器を使用して粉末形態に製剤化が可能だということを確認することができた。
【００４２】
また、上の分析方法を使用して多様な条件で作られたＭＢＬ粉末を、比較分析した。
＜実施例２＞噴霧乾燥時に熱風の温度がＭＢＬ粉末の活性に及ぼす影響
大部分のタンパク質は、熱によって変性されやすく、変性されたタンパク質は生物学的活性を失うようになる。噴霧乾燥器は、熱風を使用して液体試料を粉末化するので、本発明では多くの温度条件で作られたＭＢＬ粉末が、ＭＢＬ結合型糖化タンパク質及びセリンプロテアーゼの存在下に補体を活性化する程度を比較分析した。
【００４３】
噴霧乾燥のために使用したＭＢＬ溶液は、５μｇ／ｍｌ組換えＭＢＬ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、２５０μｇ／ｍｌカゼイン、２％（ｗ／ｖ）スクロースの組成に調剤した。噴霧乾燥に適用した吸入／排気温度は、各々８０℃／５８℃、１００℃／６８℃、１１５℃／７８℃、１３０℃／８７℃、１５０℃／１００℃に設定した。
【００４４】
各々の温度条件で作られたＭＢＬ粉末組成物を適量の水に溶解して、前記実施例１〜３に記載した方法で補体系でのＣ４活性化の程度を測定して、噴霧乾燥前のＭＢＬ（対照群）溶液と比較した（図４〜６）。
【００４５】
図４〜６は、温度条件を異にして製造した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物のＣ４活性化程度を噴霧乾燥前のＭＢＬ溶液と比較したグラフである。ここで、各々の吸入／排気温度は、８０℃／５８℃（図４）、１００℃／６８℃（図５）、１１５℃／７８℃（図６）、１３０℃／８７℃（図７）及び１５０℃／１００℃（図８）で、白丸は本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物を示し、黒丸は対照群を示す。
【００４６】
図４〜８にみられるように、８０℃／５８℃と１００℃／６８℃の温度条件で噴霧乾燥されたＭＢＬは対照群ＭＢＬ溶液と類似な程度の活性を有するが、それ以上の温度条件で生産されたＭＢＬ粉末組成物の活性は、温度と反比例するように低くなることを確認した。ゆえに、より高い活性を有するＭＢＬ粉末組成物を作るためには、１００℃／６８℃以下の温度条件で噴霧乾燥することが効果適任であることが分かった。
＜実施例３＞ＭＢＬ粉末製造の時安定化のために添加剤に使用される糖の種類によるＭＢＬ粉末の特性
一般的にタンパク質の噴霧乾燥時の熱風によって粉末化されるタンパク質の物理的、生物学的安定性のために、多くの種類の糖を使用する。本発明では、噴霧乾燥過程でＭＢＬの安定化のための添加剤に使用する糖の種類（スクロース、ラクトース、トレハロース、プルラン等）によるＭＢＬ粉末の補体系活性化程度、微細粒子のサイズ及び分布、粉末の模様を調べた。噴霧乾燥のために使用したＭＢＬ溶液は、組換えＭＢＬ５μｇ／ｍｌ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ＣａＣｌ２１０ｍＭに２５０μｇ／ｍｌカゼインを添加したものを基本組成にして、そこに各々スクロース０．４％、ラクトース０．５％、トレハロース０．４％またはプルラン０．４％を含むように調剤して噴霧乾燥した。
＜実施例３−１＞補体系でのＣ４活性化試験
互いに異なる種類の糖を添加剤に使用して調剤したＭＢＬ溶液を噴霧乾燥した後、各々のＭＢＬ粉末が有する活性を前記実施例１〜３に記載した方法で測定して、噴霧乾燥前ＭＢＬ溶液（対照群）と比較した（図９〜１２）。図９〜１２は、添加剤に使用する糖の種類を異にして製造した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物のＣ４活性化程度を噴霧乾燥前のＭＢＬ溶液と比較したグラフである。白丸は、本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物を意味し、黒丸は対照群を意味する。
【００４７】
図９〜１２にみられるように、噴霧乾燥したＭＢＬの活性は、０．４％スクロース（図９）と０．５％ラクトース（図１０）を使用して製剤化した場合、対照群とほとんど類似に残っていて、０．４％トレハロース（図１１）と０．４％プルラン（図１２）を使用して製剤化した場合、活性が多く消失したことを確認した。ゆえに、噴霧乾燥時のＭＢＬの安定性のために使用する糖添加剤は、スクロースとラクトースがより効果的であることを確認した。
＜実施例３−２＞ＭＢＬ粉末の微細粒子サイズ及び分布
レーザーゼータ電位測定機（ＯＴＳＵＫＡ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、ＥＬＳ−８０００、日本）を使用して噴霧乾燥されたＭＢＬ粉末のサイズと分布を観察した（図１３及び表１）。
【００４８】
図１３は、添加剤に使用する糖の種類を異にして製造した、本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物のサイズ分布を確認したグラフである。ここで、黒丸は０．４％スクロース、白丸は０．５％ラクトース、黒三角形は０．４％トレハロースを使用して製剤化した噴霧乾燥ＭＢＬ粉末を意味し、白三角形は０．４％プルランを使用して製剤化した噴霧乾燥ＭＢＬ粉末を意味する。
【００４９】
図１３及び表１にみられるように、全体的なＭＢＬ粉末の平均サイズは、１．０４〜４．００μｍと示され、スクロース、ラクトースまたはトレハロースを添加剤として加えた場合、粉末粒子のサイズ分布が均一に生産されたことを確認した。しかし、プルランを添加剤として加えた場合はサイズ分布が０．３９〜１５．４３μｍで、均一ではなかった。ゆえに、吸入効果が良いことが期待されるＭＢＬ粉末を製造するためには、ＭＢＬ溶液にスクロース、ラクトースまたはトレハロースを添加剤に使用するのがプルランを添加剤に使用するより効果的であることが分かった。
【００５０】
【表１】
2008526735.tif 000003
【００５１】
＜実施例３−３＞ＭＢＬ粉末の模様
ＭＢＬ粉末の模様を走査電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＳＥＭ）で観察した（図１４〜１７）。
【００５２】
図１４〜１７は、添加剤に使用する糖の種類を異にして製造した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物粉末に対する電子顕微鏡写真である。ここで、図１４は０．４％スクロース、図１５は０．５％ラクトース、図１６は０．４％トレハロースを使用して製剤化した噴霧乾燥ＭＢＬ組成物粉末を示し、図１７は０．４％プルランを使用して製剤化した噴霧乾燥ＭＢＬ組成物粉末を示す。
【００５３】
図１４〜１７にみられるように、噴霧乾燥時のＭＢＬの安定性を維持するためにＭＢＬ溶液に添加剤に使用した糖の種類が、ＭＢＬ粉末の形の、お互いに異なる形態に観察することができ、レーザーゼータ電位測定機を使用して測定したＭＢＬ微細粉末粒子のサイズ分布と電子顕微鏡に観察されたサイズ分布が、大略的に一致することを確認することができた。
【００５４】
前記三種類の分析結果から、吸入に適当なサイズを有して補体系のＣ４活性がより良いＭＢＬ粉末組成物を製造するためには、ＭＢＬ溶液にスクロースやラクトースを添加剤に使用することが好ましいということが分かった。
＜実施例４＞糖の含量変化によるＭＢＬ粉末の特性分析
噴霧乾燥されるタンパク質の安定性を高めるために糖を添加剤に使用する時、使用する糖の種類とその濃度によって異なる結果を示す。本発明では、ＭＢＬの噴霧乾燥に適当な糖の濃度を各糖の種類別で調べた。ここでは、ＭＢＬ溶液にラクトースとスクロースを添加剤に使用して噴霧乾燥する時、生産されたＭＢＬ粉末の補体系のＣ４活性化程度、微細粉末粒子のサイズ及び分布、粉末の模様が添加剤に使用した糖の濃度によってどのような影響を受けるのかを説明しようとした。噴霧乾燥のために使用したＭＢＬ溶液は、組換えＭＢＬ５μｇ／ｍｌ、ＮａＣｌ１５０ｍＭ、ＣａＣｌ２１０ｍＭに２５０μｇ／ｍｌカゼインを添加したものを基本組成にして、そこにラクトースを添加剤に使用した場合には、各々０．５％、１％、２％及び４％になるように調剤して、スクロースを添加剤に使用した場合には、０．５％、１％、２％、４％及び８％になるように調剤して噴霧乾燥した。
＜実施例４−１＞補体系でのＣ４活性化試験
糖を添加剤に添加して生産したＭＢＬ粉末が、ＭＢＬ結合型糖化タンパク質及びセリンプロテアーゼの存在下で補体を活性化する効果を、前記実施例１〜３に記載した方法で測定して、同じ組成の噴霧乾燥前ＭＢＬ溶液（対照群）と比較した（図１８〜２１及び図２２〜２６）。
【００５５】
図１８〜２１は、添加剤に使用するラクトースの濃度を異にして製造した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物のＣ４活性化程度を噴霧乾燥前のＭＢＬ溶液と比較したグラフである。ここで、図１８はラクトース濃度０．５％、図１９は１％、図２０は２％及び図２１は４％が含有された懸濁液を意味し、白丸は本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物を意味し、黒丸は対照群を意味する。
【００５６】
図１８〜２１に見られるように、噴霧乾燥されたＭＢＬの活性は、ラクトース濃度を０．５％〜４％に変化した場合、全て対照群とほとんど類似に残っていた。特に、１％ラクトースの場合（図１９）ＭＢＬ活性が比較的高く維持され、０．５％ラクトースの場合対照群と比較して少しの差を示した。この結果から噴霧乾燥法で製造されたＭＢＬの活性を維持するためには、ＭＢＬ溶液のラクトース濃度が１〜２％になるように調剤するのが好ましいことを確認した。
【００５７】
図２２〜２６は、添加剤に使用するスクロースの濃度を異にして製造した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物のＣ４活性化程度を、噴霧乾燥前のＭＢＬ溶液と比較したグラフである。ここで、図２２はスクロース濃度０．５％、図２３は１％、図２４は２％、図２５は４％及び図２６は８％が含有された懸濁液を意味し、白丸は本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物を意味し、黒丸は対照群を意味する。
【００５８】
図２２〜２６に見られるように、噴霧乾燥されたＭＢＬの活性は、スクロース濃度を  ０．５％〜８％に変化した場合、全て対照群とほとんど類似に残っていた。特に、スクロースの場合、ＭＢＬ活性が１％（図２３）及び２％（図２４）では比較的高く維持されたが、８％スクロースの場合、対照群と比較して差を示した。この結果から、ＭＢＬ溶液のスクロース濃度が１〜２％になるように調剤するのが、噴霧乾燥したＭＢＬの活性を維持するのに好ましいことを確認した。
＜実施例４−２＞ＭＢＬ粉末の微細粒子サイズ及び分布分析
レーザー回折分析機（Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ  Ｍｉｃｒｏ、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｕ．Ｋ．）を使用して糖濃度を変化させて噴霧乾燥したＭＢＬ粉末のサイズと分布を観察した（図２７、図２８、表２及び表３）。
【００５９】
図２７は、添加剤に使用するラクトースの濃度を異にして製造した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物粉末のサイズ分布を確認したグラフである。ここで、黒丸はラクトース濃度０．５％、白丸は１．０％、黒三角形は２．０％及び白三角形は４．０％を各々使用して製剤化した噴霧乾燥ＭＢＬ粉末組成物を意味する。
【００６０】
【表２】
2008526735.tif 000004
【００６１】
前記表で、ＤＶ０．１は累積体積１０％での粒子の直径を示し、ＤＶ０．９は累積体積９０％での粒子の直径を示す。
【００６２】
図２７及び表２に見られるように、全体的なＭＢＬ粉末の平均サイズは、３．２２〜８．３２μｍと示された。噴霧乾燥した粉末のサイズは、ＭＢＬ安定化を目的に添加されたラクトースの濃度が高くなるにつれて大きくなる傾向が明らかに見られ、ラクトースを２％以上の濃度で添加すると、５μｍ以上の微細粉末分布が増加することが分かった。噴霧乾燥した粉末が、エアゾール（ａｅｒｏｓｏｌ）の形態で気道や肺に効果的に吸入されるためには、微細粉末のサイズが５μｍ以下で製剤化される時に効果的であることが知られている。ゆえに、ＭＢＬ溶液にラクトースを糖添加剤に使用する場合、２％以下の濃度で添加する時、効果的に吸いこむことができるサイズのＭＢＬ粉末を作ることができるということを確認した。
【００６３】
図２８は、添加剤に使用するスクロースの濃度を異にして製造した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物粉末のサイズ分布を確認したグラフである。ここで、黒丸はスクロース濃度０．５％、白丸は１．０％、黒三角形は２．０％、白三角形は４．０％及び黒逆三角形は８．０％を各々使用して製剤化した噴霧乾燥ＭＢＬ粉末組成物を意味する。
【００６４】
【表３】
2008526735.tif 000005
【００６５】
前記表で、ＤＶ０．１は累積体積１０％での粒子の直径を示し、ＤＶ０．９は累積体積９０％での粒子の直径を示す。
【００６６】
図２８及び表３に見られるように、全体的なＭＢＬ粉末の平均サイズは３．５２〜７．０７μｍと示された。噴霧乾燥した粉末のサイズは、ＭＢＬ安定化を目的に添加されたスクロース濃度とは明確な連関性を示さなかったが、スクロースを４％以上の濃度でＭＢＬ溶液に添加すると５μｍ以上の微細粉末分布が増加することが分かった。噴霧乾燥した粉末がエアゾール（ａｅｒｏｓｏｌ）の形態で気道や肺に効果的に吸入されるためには、微細粉末のサイズが５μｍ以下で製剤化される時に効果的であることが知られている。ゆえに、ＭＢＬ溶液にスクロースを糖添加剤に使用する場合、４％以下の濃度で添加する時に効果的に吸いこむことができるサイズのＭＢＬ粉末を作ることができるということを確認した。
＜実施例４−３＞ＭＢＬ粉末の模様分析
お互いに異なる濃度のラクトースとスクロースを添加剤として加えたＭＢＬ溶液を使用して生産したＭＢＬ粉末の模様を走査電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＳＥＭ、ＪＳＭ−５４００、ＪＥＯＬ、東京、日本）で観察した（図２９〜３２  及び図３３〜３７）。
【００６７】
図２９〜３２は、添加剤に使用するラクトースの濃度を異にして製造した本発明のＭＢＬ組成物粉末に対する電子顕微鏡写真である。ここで、図２９はラクトース濃度０．５％、図３０は１．０％、図３１は２．０％及び図３２は４．０％を各々使用して製剤化した噴霧乾燥ＭＢＬ組成物粉末を示す。
【００６８】
図３３〜３７は、添加剤に使用するスクロースの濃度を異にして製造した本発明のＭＢＬ組成物粉末に対する電子顕微鏡写真である。ここで、図３３はスクロース濃度０．５％、図３４は１．０％、図３５は２．０％、図３６は４．０％及び図３７は８．０％を各々使用して製剤化した噴霧乾燥ＭＢＬ組成物粉末を示す。
【００６９】
図２９〜３２及び図３３〜３７に示されたように、生産されたＭＢＬ粉末の模様は、糖添加剤の濃度が高いほど球の形態に近く変化することを確認することができ、各粉末のサイズも糖添加剤の濃度に比例して大きくなることを電子顕微鏡写真でも確認することができた。
【００７０】
前記の三種類の分析結果から、吸入効果と補体系でのＣ４活性がより良いＭＢＬ粉末を作るためには、ＭＢＬ溶液にスクロースまたはラクトースが１〜２％の濃度で添加されることが好ましいということが分かった。
＜実施例５＞ＭＢＬ粉末製造時の活性維持のために使用したＣａＣｌ２添加剤の濃度によるＭＢＬ粉末の特性分析
ＭＢＬが微生物表面の糖化タンパク質と結合する過程及び以後補体系を活性化させる過程で、ＣａＣｌ２存在が必須である。一般的に、血液内のＣａＣｌ２濃度は、ＭＢＬ活性に要求される５ｍＭ〜１０ｍＭ程度であることが知られているので、ＭＢＬを血管に注射する場合、ＣａＣｌ２を追加的に投与する必要がない。しかし、ＭＢＬ粉末を気道や肺に伝達する場合、吸入されたＭＢＬ粉末が気道や肺粘膜の体液に解けて活性を持たなければならないが、体液のＣａＣｌ２濃度はよく知られていない。したがって、吸入されたＭＢＬ粉末が体液に溶けて十分な活性を有するようにするために、製剤化時にＣａＣｌ２の添加を考慮する必要がある。
【００７１】
本発明では、噴霧乾燥時のＭＢＬの安定性及び粉末の生産過程に及ぼすＣａＣｌ２の影響を調べた。噴霧乾燥のために使用したＭＢＬ溶液は、組換えＭＢＬ５μｇ／ｍｌ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ＣａＣｌ２１０ｍＭ、スクロース２％を基本組成にして、そこに添加剤に使用したＣａＣｌ２の濃度を各々１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００ｍＭになるように調剤して噴霧乾燥した。
【００７２】
ＣａＣｌ２濃度を１００ｍＭ以上添加した場合、吸入可能な好ましい形態のＭＢＬ粉末が作られなかった。１０〜５０ｍＭの濃度範囲でＣａＣｌ２を添加剤に使用する場合、エアゾールの形態で吸入が可能であり、ＭＢＬ結合型糖化タンパク質及びセリンプロテアーゼの存在下で補体を活性化するＭＢＬ粉末を生産することができた。しかし、１０〜５０ｍＭの濃度範囲では、ＣａＣｌ２の濃度による有意性ある差異が発見されなかった。ゆえに、ＣａＣｌ２をＭＢＬの噴霧乾燥に添加剤に使用する時は、５０ｍＭ以下の濃度で使用することがさらに好ましいということを確認した。
＜実施例６＞糖とともにタンパク質を添加剤に使用して製造したＭＢＬ粉末の特性
一般的にタンパク質を安定的に製剤化する時に多様な種類のタンパク質が添加されたりする。本発明では、噴霧乾燥過程でＭＢＬの安定化のためにカゼイン（ｃａｓｅｉｎ）を添加した場合と添加しない場合（対照群）に生産されたＭＢＬ粉末の補体系活性化程度を分析した（図３８〜４１）。ここで、ＭＢＬの噴霧乾燥時に使用した添加剤の組成は、各々２％のスクロースまたはラクトースにして、そこに２５０μｇ／ｍｌのカゼインを添加したり添加しないでＭＢＬ粉末を製造した。
【００７３】
図３８〜４１は、ＭＢＬ溶液にカゼイン（ｃａｓｅｉｎ）を添加したり添加しない条件で製造した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物粉末のＣ４活性化程度を、噴霧乾燥前のＭＢＬ溶液と比較したグラフである。ここで、図３８はカゼインが含有された２％スクロースを使用した場合を示し、図３９はカゼインが含有されない２％スクロースを使用した場合を示し、図４０はカゼインが含有された２％ラクトースを使用した場合を示し、図４１はカゼインが含有されない２％ラクトースを使用した場合を示し、白丸は本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物を示し、黒丸は噴霧乾燥前のＭＢＬ溶液である対照群を意味する。
【００７４】
図１４ａ〜１４ｄに見られるように、糖とともにカゼインを添加して作ったＭＢＬ粉末のＣ４活性化程度は、カゼインを添加しないで製造されたＭＢＬ粉末の場合より活性がよく維持されることを確認することができた。特に、ラクトースを糖添加剤に使用する時は、カゼインの使用がより効果的であるということが分かった。
【００７５】
同時に、カゼインの濃度によるＭＢＬ粉末の特性を調べるために、多くの濃度のカゼインを添加してＭＢＬ溶液を噴霧乾燥し、製造されたＭＢＬ粉末の補体系活性化程度、微細粒子のサイズ及び分布、粉末の模様を前記実施例１に記載した方法によって比較、分析した。ここで、噴霧乾燥のために使用したＭＢＬ溶液は、組換えＭＢＬ５μｇ／ｍｌ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ＣａＣｌ２１０ｍＭ、スクロース０．８％を基本組成にして、そこにカゼインを各々０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌまたは２ｍｇ／ｍｌの濃度で添加して噴霧乾燥した。補体系のＣ４活性化程度は、カゼインを添加して製造したＭＢＬ粉末がカゼインを添加しないで製造したＭＢＬ粉末と比較して濃度に関係なく活性がよく維持されることを確認することができ、添加されたカゼインの濃度による活性の変化は観察されなかった。噴霧乾燥したＭＢＬ粉末のサイズ及び分布は、エアゾールの形態で吸入可能な２．１〜３．１μｍの間で測定され、カゼインの含有有無及び濃度の差による差異は見られなかった。ゆえに、ＭＢＬ溶液を噴霧乾燥する時、低い濃度のカゼインを添加して使用することがより好ましいということを確認した。
＜実施例７＞ＭＢＬ粉末製造時に添加剤で生分解性高分子の使用
薬物伝達系にたくさん使用されている生分解性高分子物質もＭＢＬの噴霧乾燥時の添加剤として使用可能かどうか調べた。先に言及された２％スクロース、２５０μｇ／ｍｌのカゼインとともに水によく溶けた生分解性高分子物質の一種であるポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を、各々０．０５、０．１、０．２、０．３または０．４％の濃度で組換えＭＢＬ溶液に入れて噴霧乾燥を実施した。製造されたＭＢＬ粉末のＣ４活性化程度は、０．４％未満のＰＶＡ濃度で溶液状態のＭＢＬとほとんど類似に保存され、０．４％ＰＶＡ添加時には溶液状態のＭＢＬより低くなることを確認した。上の結果から生分解性高分子物質のひとつであるＰＶＡも、０．２％以下の濃度でＭＢＬの噴霧乾燥時の添加剤に使用可能だということを確認することができた。
＜実験例１＞ＭＢＬ粉末の長期保管時の安定性分析
製造されたＭＢＬ粉末の長期保存時、ＭＢＬの生物学的活性が維持されるかどうかを調べるために苛酷温度条件での保存安定性を確認してみた。１年間の常温保存に相応する条件として知られている７０℃で２日、６０℃で４日間ＭＢＬ粉末を保管した後、ＭＢＬ結合型糖化タンパク質及びセリンプロテアーゼの存在下でＣ４補体の活性化程度を比較した（図４２〜４５）。ＭＢＬ５μｇ／ｍｌ、ＮａＣｌ１５０ｍＭ、ＣａＣｌ２１０ｍＭを基本組成にして、ラクトース（２％）を添加するかまたは上の基本組成にスクロース（２％）及びＰＶＡ（０．０５％）を添加した。これを各々の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物に製作して安定性分析を遂行した。
【００７６】
図４２〜４５は、苛酷温度条件で保管した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物のＣ４活性化程度を、常温で保管した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物と比較したグラフである。ここで、図４２は７０℃で２日間保管された２％ラクトース含有噴霧乾燥ＭＢＬ組成物を示し、図４３は７０℃で２日間保管された２％スクロース及び０．０５％ＰＶＡ含有噴霧乾燥ＭＢＬ組成物を示し、図４４は６０℃で４日間保管された２％ラクトース含有噴霧乾燥ＭＢＬ組成物を示し、図４５は６０℃で４日間保管された２％スクロース及び０．０５％ＰＶＡ含有噴霧乾燥ＭＢＬ粉末組成物を示す。
【００７７】
図４２〜４５に見られるように、試験に使用したすべてのＭＢＬ粉末組成物で、Ｃ４活性がそのまま維持されていることを確認することができた。常温で実験した場合、１年間の安定性が１００％維持された。
【００７８】
したがって、本発明で提案した製造方法は、ＭＢＬ活性に影響なしに粉末形態に製造することができ、製造されたＭＢＬ粉末は長期間活性が維持されることを確認した。
＜実験例２＞ＭＢＬ粉末と微生物の結合力分析
微生物の表面に発現される糖化タンパク質の種類は、微生物ごとに異なるため、ＭＢＬは微生物の種類によってお互いに異なる結合力を有する。溶液状態のＭＢＬと噴霧乾燥方法によって製造されたＭＢＬ粉末組成物の微生物に対する結合傾向を比較してみた（図４６及び図４７）。ここで、試験に使用したＭＢＬ粉末は、ＭＢＬ５μｇ／ｍｌ、ＮａＣｌ１５０ｍＭ、ＣａＣｌ２１０ｍＭを基本組成にして、そこに２％ラクトースまたは２％重量部スクロース及び０．５％ＰＶＡになるように添加剤を加えたＭＢＬ溶液を製造した。
【００７９】
まず、免疫反応用プレート（ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭ  Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ、Ｎｕｎｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に、ウェル当り１×１０７、１×１０５、１×１０３、１×１０１の微生物を各々コーティングして、そこに噴霧乾燥前ＭＢＬまたは噴霧乾燥したＭＢＬ粉末を水に溶かした後、それらを各々５μｇ／ｍｌの濃度でウェル当り１００μｌずつ添加して常温で２時間結合させた。反応液を除去した後、洗浄緩衝液で６回洗浄した。希釈緩衝液に抗−ＭＢＬ抗体（Ｄｏｂｅｅｌ、Ｋｏｒｅａ）を１：１０，０００に希釈してウェル当り１００μｌずつ添加して常温で１時間結合させた。反応液を除去した後、洗浄緩衝液で６回洗浄した。また、抗−マウス抗体−ＨＲＰ（ＫＰＬ、米国）を希釈緩衝液に１：１０，０００に希釈してウェル当り１００μｌずつ入れて常温で１時間反応させた。洗浄緩衝液で６回洗浄した後、ＴＭＢ基質溶液（ＫＰＬ、米国）１００μｌを添加して常温で３０分間発色させた。５０μｌの３Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を加えて発色反応を停止させた後、４５０ｎｍでエライザ（ＥＬＩＳＡ）測定機でＯＤ値を測定した（図４６及び４７）。
【００８０】
図４６は、噴霧乾燥前の溶液状態のＭＢＬが各種微生物と結合する程度を測定したグラフで、図４７は、本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ粉末組成物が各種微生物と結合する程度を測定したグラフである。ここで各グラフ中、ａは黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ２９２１３、ｂは黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＣＣＡＲＭ３１９７、ｃは 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＣＣＡＲＭ３１１４、ｄは表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）ＡＴＣＣ１２２２８、ｅは表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）ＣＣＡＲＭ３５０４８、ｆは化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｓ）ＡＴＣＣ８６６８、ｇはインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）ＡＴＣＣ５１９０７、ｈは 大便レンサ球菌（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）ＡＴＣＣ５１９０７、ｉはヘシウム菌（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）ＣＣＡＲＭ５０２８、ｊは肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＡＴＣＣ１００３１及び、ｋはガンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）を各々示し、図３４で黒い棒は２％ラクトースを添加剤として噴霧乾燥したＭＢＬ組成物を示して、灰色棒は２％スクロース及び０．０５％ＰＶＡを添加剤として噴霧乾燥したＭＢＬ組成物を示す。
【００８１】
図４６及び４７に見られるように、噴霧乾燥前のＭＢＬ溶液は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ２９２１３、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＣＣＡＲＭ３１９７、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）ＡＴＣＣ５１９０７、ガンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）には強い結合力を示し、黄色ブドウ球菌（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ）ＣＣＡＲＭ３１１４と化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｓ）ＡＴＣＣ８６６８には弱く結合し、表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）ＡＴＣＣ１２２８、表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）ＣＣＡＲＭ３５０４８、大便レンサ球菌（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ５１９０７）、ヘシウム菌（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）ＣＣＡＲＭ５０２８、肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＡＴＣＣ１００３１にはほとんど結合しないことが観察された。このようなＭＢＬの結合傾向は、二つの種類の添加剤で生産したＭＢＬ粉末でも類似に示された。結合程度においては、噴霧乾燥の前後、そして添加剤の種類によって若干の差がみられるが、これは実験的誤差であると予測される。
【００８２】
ＭＢＬを気道や肺など呼吸器で効果的に吸いこんだり外傷に適用したりするためには、ＭＢＬ溶液を粉末組成物の形態に製剤化することが必要である。ここで作られたＭＢＬ粉末組成物は、エアゾール形態で吸入可能なサイズで作られなければならないし、ＭＢＬ構造上の特徴である複合体形成の程度と分布を維持しなければならないし、ＭＢＬ結合型糖化タンパク質及びセリンプロテアーゼの存在下に補体を活性化する効果が維持されなければならない。以上で立証したように、本発明者等は、噴霧乾燥法を使用して、上の条件を満たすことができる本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ粉末組成物を開発し、噴霧乾燥したＭＢＬ粉末組成物の物理的及び生物学的特性が、ＭＢＬ溶液の調剤時に使用される添加剤の種類及び濃度によって大きく影響を受けることを確認して、活性が安定的に維持されながら、より効率的な投与が可能な形態のＭＢＬ粉末組成物製造方法を開発した。本発明の製造方法によって製造された噴霧乾燥ＭＢＬ粉末組成物は、ウイルス、細菌、真菌類などの感染を抑制する効果があり、吸入に適当な形態に製剤化されたため、これら微生物による呼吸器感染や外傷の予防及び／または治療剤に有用に使用することができ、本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ粉末組成物は、他の賦形剤と混合して錠剤（ｔａｂｌｅｔ）形態の剤形を製造するのにも使用することができる。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
微生物感染性疾患治療及び予防用コレクチン属タンパク質またはその類似体を含む噴霧乾燥粉末組成物及びそれを製造する方法に関するものである。本発明の製造方法によって製造された噴霧乾燥粉末組成物は、ウイルス、細菌、真菌類などの感染を抑制する効果があり、吸入に適当な形態に製剤化されたので、これら微生物による呼吸器感染や外傷の予防及び／または治療剤として有用に使用することができ、本発明の噴霧乾燥粉末組成物は、他の賦形剤と混合して錠剤（ｔａｂｌｅｔ）形態の剤形を製造するのにも使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物のサイズ分布を確認したグラフである。
【図２】噴霧乾燥の前後のＭＢＬが形態的に同じに維持されるかどうかをウエスタンブロット分析で確認した結果を示す写真である。
【図３】噴霧乾燥ＭＢＬ粉末のＣ４活性化程度を噴霧乾燥前のＭＢＬ溶液と比較したグラフである。
【図５−８】温度条件を異にして製造した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物のＣ４活性化程度を噴霧乾燥前のＭＢＬ溶液と比較したグラフである。
【図９−１２】添加剤に使用する糖の種類を異にして製造した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物のＣ４活性化程度を、噴霧乾燥前のＭＢＬ溶液と比較したグラフである。
【図１３】添加剤に使用する糖の種類を異にして製造した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物のサイズ分布を確認したグラフである。
【図１４−１７】添加剤に使用する糖の種類を異にして製造した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物粉末に対する電子顕微鏡写真である。
【図１８−２１】添加剤に使用するラクトースの濃度を異にして製造した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物のＣ４活性化程度を、噴霧乾燥前のＭＢＬ溶液と比較したグラフである。
【図２２−２６】添加剤に使用するスクロースの濃度を異にして製造した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物のＣ４活性化程度を、噴霧乾燥前のＭＢＬ溶液と比較したグラフである。
【図２７】添加剤に使用するラクトースの濃度を異にして製造した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物粉末のサイズ分布を確認したグラフである。
【図２８】添加剤に使用するスクロースの濃度を異にして製造した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物粉末のサイズ分布を確認したグラフである。
【図２９−３２】添加剤に使用するラクトースの濃度を異にして製造した本発明のＭＢＬ組成物粉末に対する電子顕微鏡写真である。
【図３３−３７】添加剤に使用するスクロースの濃度を異にして製造した本発明のＭＢＬ組成物粉末に対する電子顕微鏡写真である。
【図３８−４１】糖にカゼイン（ｃａｓｅｉｎ）が含まれるまたは含まれない添加剤を添加して製造した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物粉末のＣ４活性化程度を、噴霧乾燥前のＭＢＬ溶液と比較したグラフである。
【図４２−４５】苛酷な温度条件で保管した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物のＣ４活性化程度を、常温で保管した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物と比較したグラフである。
【図４６−４７】添加剤を異にして製造した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物が微生物と結合する傾向を、噴霧乾燥前のＭＢＬ溶液と比較したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年8月29日(2007.8.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
各々の温度条件で作られたＭＢＬ粉末組成物を適量の水に溶解して、前記実施例１〜３に記載した方法で補体系でのＣ４活性化の程度を測定して、噴霧乾燥前のＭＢＬ（対照群）溶液と比較した（図４〜８）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
図４〜８は、温度条件を異にして製造した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物のＣ４活性化程度を噴霧乾燥前のＭＢＬ溶液と比較したグラフである。ここで、各々の吸入／排気温度は、８０℃／５８℃（図４）、１００℃／６８℃（図５）、１１５℃／７８℃（図６）、１３０℃／８７℃（図７）及び１５０℃／１００℃（図８）で、白丸は本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物を示し、黒丸は対照群を示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
図３８〜４１に見られるように、糖とともにカゼインを添加して作ったＭＢＬ粉末のＣ４活性化程度は、カゼインを添加しないで製造されたＭＢＬ粉末の場合より活性がよく維持されることを確認することができた。特に、ラクトースを糖添加剤に使用する時は、カゼインの使用がより効果的であるということが分かった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
図４６は、噴霧乾燥前の溶液状態のＭＢＬが各種微生物と結合する程度を測定したグラフで、図４７は、本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ粉末組成物が各種微生物と結合する程度を測定したグラフである。ここで各グラフ中、ａは黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ２９２１３、ｂは黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＣＣＡＲＭ３１９７、ｃは 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＣＣＡＲＭ３１１４、ｄは表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）ＡＴＣＣ１２２２８、ｅは表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）ＣＣＡＲＭ３５０４８、ｆは化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｓ）ＡＴＣＣ８６６８、ｇはインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）ＡＴＣＣ５１９０７、ｈは大便レンサ球菌（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）ＡＴＣＣ５１９０７、ｉはヘシウム菌（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）ＣＣＡＲＭ５０２８、ｊは肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＡＴＣＣ１００３１及び、ｋはガンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）を各々示し、図４７で黒い棒は２％ラクトースを添加剤として噴霧乾燥したＭＢＬ組成物を示して、灰色棒は２％スクロース及び０．０５％ＰＶＡを添加剤として噴霧乾燥したＭＢＬ組成物を示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
【図１】本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物のサイズ分布を確認したグラフである。
【図２】噴霧乾燥の前後のＭＢＬが形態的に同じに維持されるかどうかをウエスタンブロット分析で確認した結果を示す写真である。
【図３】噴霧乾燥ＭＢＬ粉末のＣ４活性化程度を噴霧乾燥前のＭＢＬ溶液と比較したグラフである。
【図４−８】温度条件を異にして製造した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物のＣ４活性化程度を噴霧乾燥前のＭＢＬ溶液と比較したグラフである。
【図９−１２】添加剤に使用する糖の種類を異にして製造した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物のＣ４活性化程度を、噴霧乾燥前のＭＢＬ溶液と比較したグラフである。
【図１３】添加剤に使用する糖の種類を異にして製造した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物のサイズ分布を確認したグラフである。
【図１４−１７】添加剤に使用する糖の種類を異にして製造した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物粉末に対する電子顕微鏡写真である。
【図１８−２１】添加剤に使用するラクトースの濃度を異にして製造した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物のＣ４活性化程度を、噴霧乾燥前のＭＢＬ溶液と比較したグラフである。
【図２２−２６】添加剤に使用するスクロースの濃度を異にして製造した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物のＣ４活性化程度を、噴霧乾燥前のＭＢＬ溶液と比較したグラフである。
【図２７】添加剤に使用するラクトースの濃度を異にして製造した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物粉末のサイズ分布を確認したグラフである。
【図２８】添加剤に使用するスクロースの濃度を異にして製造した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物粉末のサイズ分布を確認したグラフである。
【図２９−３２】添加剤に使用するラクトースの濃度を異にして製造した本発明のＭＢＬ組成物粉末に対する電子顕微鏡写真である。
【図３３−３７】添加剤に使用するスクロースの濃度を異にして製造した本発明のＭＢＬ組成物粉末に対する電子顕微鏡写真である。
【図３８−４１】糖にカゼイン（ｃａｓｅｉｎ）が含まれるまたは含まれない添加剤を添加して製造した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物粉末のＣ４活性化程度を、噴霧乾燥前のＭＢＬ溶液と比較したグラフである。
【図４２−４５】苛酷な温度条件で保管した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物のＣ４活性化程度を、常温で保管した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物と比較したグラフである。
【図４６−４７】添加剤を異にして製造した本発明の噴霧乾燥ＭＢＬ組成物が微生物と結合する傾向を、噴霧乾燥前のＭＢＬ溶液と比較したグラフである。
【国際調査報告】
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