(57)【要約】本発明は、位置特異的標識試薬でリン酸化タンパク質遺伝情報のリン酸化位置特異的ラベリングのための方法及び収得されたラベルされたものを分析する方法に関するもので、より詳細には、求核性（ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｉｃ）標識試薬でリン酸化タンパク質のリン酸化位置をポリマーのゲル内に維持された状態そのまま標識するための方法と、求核体標識試薬の適切な選定によって、前リン酸化位置に新規タンパク質加水分解の単離可能な位置を発現する方法に関するものである。さらに、本発明はあらかじめゲル内で標識されたタンパク質のゲル内の単離と連続する収得ペプチドの質量分析によって、リン酸化タンパク質分析及びリン酸化位置同定方法に関するものである。前記のような構成の本発明は、生体内のタンパク質のリン酸化状態及びリン酸化程度を効果的に分析するのに有用であり、多様な疾病の診断及び治療剤開発等に応用され、タンパク質の生体内での役割等をより深く理解するのに寄与することができる。2008511311.tif 000006
2008511311.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ポリマー性ゲルマトリックス内に固定化されたリン酸化タンパク質のリン酸化位置を標識試薬混合物を使用して標識する工程、
ｂ）標識されたタンパク質を酵素で加水分解して加水分解されたペプチドを得る工程、及び
ｃ）前記加水分解されたペプチドを分析する工程とからなることを特徴とする、リン酸化タンパク質分析用ゲル内標識方法及び標識されたタンパク質分析を通じたタンパク質リン酸化位置同定方法。
【請求項２】
前記ポリマー性ゲルマトリックスが、ポリアクリルアミドゲルであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリアクリルアミドゲルが、１ないし３０％濃度のアクリルアミドを含む溶液から製造されるゲルから選択されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記標識試薬混合物が、塩基、標識物質、還元剤、及び金属触媒から選択される一つ以上を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記塩基が、無機塩基であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記塩基が、有機塩基であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記標識物質が、スルフヒドリル（ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ）官能基を有する化合物から選択されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記スルフヒドリル（ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ）官能基が、ジスルフィド（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）形態の標識物質を還元剤で還元することによって製造されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記還元剤が、トリス（２−シアノエチル）ホスフィン（ＴＣＮＥＰ）、トリス（２−カルボキシルエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリス（ハイドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰＰ）、及びトリブチルホスフィン（ＴＢＰ）からなる群から選択されるものであることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記スルフヒドリル（ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ）官能基が、標識反応工程前に塩基性加水分解または求核置換方法で保護されたスルフヒドリル基を脱保護することにより製造されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記標識物質が、グアニジノアルカンチオール、アミノアルカンチオール、メルカプトアルカノール、アルカンチオール、アルカンジチオール、ジアルキルアミノアルカンチオール及びアルコキシアルカンチオールからなる群から選択されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記標識物質が、グアニジノアルカンチオール、アミノアルカンチオール、メルカプトアルカノール、アルカンチオール、アルカンジチオール、ジアルキルアミノアルカンチオール及びアルコキシアルカンチオールからなる群から選択され、選択された標識物質を構成する少なくても一つ以上の原子が事実上の化学的構造及び反応性が同じで、質量値だけが他の同位元素に置換された（ｉｓｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ  ｃｏｄｅｄ）標識物質同等体であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記リン酸化位置が、リン酸化セリン及びリン酸化スレオニンから選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素が、加水分解酵素の中から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記酵素が、トリプシン、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ及びエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記加水分解されたペプチドが、クロマトグラフィーによって分離された後、またはクロマトグラフィーによる分離過程なしに質量分析機によって質量分析されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ａ）ポリアクリルアミドゲルに維持されたリン酸化タンパク質からリン酸基の脱リン酸化を誘導して、得られたタンパク質の脱リン酸化されたアミノ酸残基を、標識物質でゲル内標識を遂行する工程、
ｂ）リン酸化タンパク質のゲル内標識反応に使用された試薬をポリアクリルアミドゲルから標識されたタンパク質の流出なしに選択的に除去する工程、
ｃ）標識物質で標識されたタンパク質をプロテアーゼでゲル内加水分解してペプチド混合物を得る工程、及び
ｄ）ポリアクリルアミドゲルから流出する加水分解されたペプチド混合物をクロマトグラフィーで分離して質量分析する工程とからなることを特徴とする、リン酸化タンパク質分析用ゲル内標識化方法及び標識化されたタンパク質分析を通じたタンパク質リン酸化位置同定方法。
【請求項１８】
前記タンパク質からリン酸基の脱リン酸化が、塩基性水溶液条件で遂行されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリアクリルアミドゲルが、５ないし１５％濃度のアクリルアミドを含む溶液から製造されるゲルから選択されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記標識物質が、グアニジノエタンチオール、アミノエタンチオール、メルカプトエタノール、エタンジチオール、ジメチルアミノエタンチオール、トリメチルアンモニウムエタンチオール、ジエチルアミノエタンチオール、メトキシエタンチオール及びエトキシエタンチオールからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記標識物質が、グアニジノエタンチオール、アミノエタンチオール、メルカプトエタノール、エタンジチオール、ジメチルアミノエタンチオール、トリメチルアンモニウムエタンチオール、ジエチルアミノエタンチオール、メトキシエタンチオール及びエトキシエタンチオールからなる群から選択され、選択された標識物質を構成する少なくとも一つ以上の原子が事実上の化学的反応性が同じで、質量値だけが他の同位元素に置換された（ｉｓｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ  ｃｏｄｅｄ）標識物質同等体であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記標識物質が、自体のジスルフィド（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）形態から標識反応中に生成されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、位置特異的標識試薬でリン酸化タンパク質遺伝情報のリン酸化位置特異的ラベリングのための方法及び収得してラベルされたものを分析する方法に関するもので、より詳細には、求核性（ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｉｃ）標識試薬でポリマーのゲル内に維持された状態そのままで、リン酸化タンパク質のリン酸化位置を標識するための方法と求核体標識試薬の適切な選定によって、前リン酸化位置に新規タンパク質加水分解の単離可能な位置を発現する方法に関するものである。さらに、本発明はあらかじめゲル内で標識されたタンパク質のゲル内の単離と、連続する収得ペプチドの質量分析によるリン酸化タンパク質分析及びリン酸化位置の同定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一番重要な翻訳後修飾化（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のひとつであるタンパク質のリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）は、信号伝達、遺伝子発現、細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）において多くの細胞の過程を制御する重要な役割をする。したがって、リン酸化タンパク質を検知して、タンパク質のリン酸化反応状態を定量する方法を開発するのに相当な努力を要している。一般的に、生物学的培地においてタンパク質の翻訳後修飾化のひとつであるタンパク質のリン酸化は、セリン（ｓｅｒｉｎｅ）、スレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）及びリジン（ｌｙｓｉｎｅ）のようなアミノ酸残基で観察される。
【０００３】
タンパク質の可逆的リン酸化は、細胞内外間の信号伝逹において重要な役割を担当する。細胞信号伝逹過程（ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ）に参加する多くのタンパク質は、キナーゼ（ｋｉｎａｓｅ）という酵素によってリン酸化され、ホスホターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔａｓｅ）という酵素によって脱リン酸化される。多くの疾病が特定タンパク質の非正常的リン酸化／脱リン酸化と関連していることが明らかにされている。
【０００４】
非正常的なリン酸化または脱リン酸化のようなタンパク質リン酸化状態における異常（ｉｒｒｅｇｕｌａｒｉｔｙ）は、多くの疾病に関連していることが広く知られている。したがって、リン酸化状態の異常に対する効果的な診断方法の開発が、疾病に関連した生物学的状態の多様性を理解する上でとても重要であり、多様な疾病状態の診断及び治療に対する研究にも寄与するだろう。
【０００５】
リン酸化反応を分析することができる従来の伝統的な方法に代わって、マススペクトロメトリー（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）は、非常に適切なリン酸化タンパク質分析方法として脚光を浴びているが、より効果的なリン酸化タンパク質及びリン酸化ペプチドの分析のためには、前記マススペクトロメトリー分析法も解決しなければならないいくつかの問題点がある。第一に、タンパク質のリン酸化は、部分的翻訳後修飾化の結果で当量的以下の量で存在して、単離されたリン酸化ペプチドはサンプル混合物で他の非リン酸化されたペプチドより少ない量で存在する場合が多い。第二に、リン酸化タンパク質におけると同様にマイナスに荷電された修飾化は、トリプシンによる加水分解に対する活性が少ないことがあり得、関心のある領域に対する質量分析が難しいことがある。第三に、陽イオンモードでマイナスに荷電されたリン酸化ペプチドは、また他の非リン酸化されたペプチドによるイオン化抑制効果によってイオン化が抑制されることがあり、特にこのような効果は、ペプチド混合物の複雑性増加にしたがって増加する。第四に、質量分析においてリン酸化ペプチドからリン酸基の部分的脱リン酸化が、リン酸結合の化学的不安定性によって誘発され得る。それは、リン酸化タンパク質の質量分析感度を落とし、マススペクトルの解析を複雑にしてマス／マス（ＭＳ／ＭＳ）配列分析（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）で不完全なペプチド配列を惹起する。
【０００６】
リン酸化タンパク質から加水分解されたリン酸化ペプチドに対する精製、濃縮及び高感度質量分析のために、抗体を利用したアフィニティー濃縮（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）、固定化金属を利用したアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）濃縮、及びリン酸化位置の化学的標識方法等のいくつかの分析方法が開発された。前記方法の中で、リン酸化位置に対する化学的標識方法は、リン酸化タンパク質の分析において有用な方法であり、特に質量分析法を使用するタンパク質体の分析分野でリン酸化タンパク質分析のための効率的な分析道具である。何つかの化学的標識方法、特に塩基性条件の下でリン酸化ペプチドからリン酸基を脱リン酸化させて、その結果生成されたジヒドロアラニン（または、β−メチルジヒドロアラニン）を強い求核性を有する求核体標識物質で標識させる標識方法が開発され、リン酸化ペプチドの濃縮、ＭＳ／ＭＳ配列分析、及び相対的定量等のために使用された。メルカプトエタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）、メルカプトエチルアミン（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）、エタンジチオール（ｅｔｈａｎｅｄｉｔｈｉｏｌ）等のようなスルフヒドリル（ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ）作用基を有する試薬が、標識化反応のための求核体（ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅ）に一般的に選択される。化学的標識方法は、特に高い水素陽イオン親和性を有する化学的標識物質で、ペプチドに本来存在するリン酸基を代替させることにより、標識されたペプチドのイオン化効率を増加させてリン酸化ペプチドを高感度に分析することができる長所がある。化学的に標識されたペプチドは、質量分析で現われるイオン化抑制効果がなく、複雑なペプチド混合物においても非リン酸されたペプチドの検出感度により特筆するに値する非常に高い検出感度を示す。付加的に脱リン酸化（−９８Ｄａ）と化学的標識物質の標識化に起因したスペクトルにおけるペプチドの質量変化は、複雑な質量スペクトルにおいてリン酸化ペプチドを同定することと、リン酸化ペプチドでリン酸化の位置を決定するのに有益であろう。
【０００７】
リン酸化タンパク質のトリプシン加水分解で生成されたペプチド混合物からリン酸化ペプチドを高感度で検出するために、グアニジン（ｇｕａｎｉｄｉｎｅ）部分を含む標識試薬を使用するβ−離脱／化学的標識方法が、本発明の発明者の一人であるアン・ヨンヒ博士（Ｄｒ．Ａｈｎ，Ｙ．Ｈ．）等によって開発された。Ｏ−メチルイソウレア（Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ  ｉｓｏｕｒｅａ）を使用して、Ｃ−末端リジン残基にグアニジン化反応を誘導することにより、リジン残基から生成されたホモアルギニン残基は、陽イオン質量分析でペプチドの検出感度を大きく向上させるということが報告されている。グアニジン基は、アミノ基よりもさらに塩基性である。グアニジン部分と高い求核性チオール作用基を有するグアニジノエタンチオール（Ｇｕａｎｉｄｉｎｏｅｔｈａｎｅｔｈｉｏｌ；ＧＥＴ）は、リン酸化ペプチド及びリン酸化タンパク質のリン酸化位置標識のための標識試薬として、適切な構造を有する。ＧＥＴは、適切な還元試薬を使用してグアジノエチルジスルファイド（ＧＥＤＳ）から作ることができ、リン酸化ペプチド及びリン酸化タンパク質の標識化反応のための水溶液条件で作ることができる。
【０００８】
一方、リン酸化タンパク質に対する化学的標識方法は、リン酸化タンパク質を酵素で加水分解する前にタンパク質水準で遂行することができる。多様な化学的標識物質が開発され、リン酸化タンパク質を標識するのに利用された。すでに、タンパク質のリン酸化された位置に化学的に適切な構造の標識物質で標識されたタンパク質に対する酵素的単離において、その酵素の選択性は、標識された部分から影響を受ける。ナイト（Ｋｎｉｇｈｔ，Ｚ．Ａ．）等は、リン酸化タンパク質のリン酸化位置に対する標識試薬にアミノエタンチオールを使用した（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００３年９月，第２１巻（Ｎｏ．９），１０４７頁（非特許文献１））。すでに、リン酸化されたセリン残基がアミノエタンチオール標識で標識化されることで、生成されたアミノエチルシステイン残基は、トリプシンのようなプロテアーゼを使用した酵素的単離でリジン残基に似た役割をする。したがって、リン酸化されたアミノ酸残基を加水分解酵素によって認識され、単離され得る構造を有するように標識化させる方法は、リン酸化タンパク質でリン酸化の位置を解明するのにとても効果的な方法である。タンパク質の標識されたリン酸化の位置での加水分解に起因したペプチドは、Ｃ−末端アミノ酸としてアミノエチルシステインを有し、ＭＳ／ＭＳペプチド配列分析でアミノエチルシステインに起因する特徴的なｙ１切片イオンを有するだろう。また、本発明者等が発明した大韓民国特許出願第２００４−８０４６号（特許文献１）は、リン酸系タンパク質体（phosphoproteome）分析及びリン酸化位置分析のための選択的標識物質が記載されている。
【０００９】
【特許文献１】大韓民国特許出願第２００４−８０４６号
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００３年９月，第２１巻（Ｎｏ．９），１０４７頁
【発明の開示】
【００１０】
本発明でリン酸化タンパク質は、ゲル電気泳動のような多様な方法によってゲルマトリックス内に固定化することができる。ゲル内部に固定化されたリン酸化タンパク質は、リン酸化タンパク質のリン酸化されたアミノ酸残基に対する標識化反応の間、ゲルマトリックス内部に留まって、標識物質に標識されたタンパク質はまた、標識反応に使用された試薬の精製過程中にもゲルマトリックスに留まるようになる。標識されたタンパク質は、加水分解酵素等によって単離されて、収得された単離ペプチドはゲルから溶液内に放出されてペプチド質量分析に利用される。
【００１１】
本発明は、またゲル内のリン酸化位置標識反応を通じて、リン酸化アミノ酸残基をタンパク質加水分解酵素等によって単離が可能な標識されたアミノ酸残基に変えることにより、本来リン酸化されていたアミノ酸残基で加水分解酵素による単離が起きるように誘導する方法を提供する。本発明において、リン酸化位置標識試薬は、ポリマー性ゲルマトリックスに留まるリン酸化タンパク質のリン酸化アミノ酸残基からリン酸基のβ−離脱に起因して生成されたα，β−不飽和アミノ酸残基に標識される。そして、標識されたアミノ酸残基は、トリプシンのようなプロテアーゼによって酵素的な切断が可能な位置と認識される類似の構造的特性を有する。例えば、化学的標識反応によってリン酸化セリンから来由したグアニジノエチルシステインは、ホモアルギニンに類似でプロテアーゼによって単離されなければならないものと認識される。したがって、酵素による認識が可能な化学的標識物質で標識されたリン酸化タンパク質に対するゲル内の単離から、本来リン酸化されていたアミノ酸残基が加水分解されて生成されたペプチドを含むペプチド混合物を得る。
【００１２】
ポリマー性ゲルマトリックスに留まるリン酸化タンパク質に対するゲル内の化学的標識反応から得られた標識されたタンパク質に対する連続されたゲル内の加水分解から収得されたペプチドに対する質量分析は、試料タンパク質のリン酸化状態に対する多くの情報を提供する。標識化反応に起因するリン酸化アミノ酸残基での独特の質量変化は、ＭＳ／ＭＳ分析でリン酸化位置に対する重要な情報を提供する。また、本来リン酸化された残基だったが、標識化反応によって標識されたアミノ酸残基での酵素による加水分解は、標識されたアミノ酸残基をＣ−末端に有するペプチドを提供する。すなわち、結果的に本来リン酸化されていたアミノ酸残基をＣ−末端に有するペプチドを提供する。
【００１３】
最良の形態
本発明は、
１）ポリマー性ゲルマトリックス内に留まるリン酸化タンパク質からリン酸基の脱リン酸化と、収得された脱リン酸化アミノ酸残基に対する求核性標識物質によるゲル内のコンジュゲート付加工程、
２）ポリマー性ゲルマトリックスからリン酸化タンパク質のゲル内の化学的標識反応に使用された試薬の選択的除去工程、
３）本来リン酸化された残基だったが、標識化反応によって標識されたアミノ酸残基での加水分解の結果として、生成されたペプチドを含むペプチド混合物を得るために、ポリマー性ゲル内に留まる標識されたタンパク質のゲル内の単離工程、及び
４）ポリマー性ゲルマトリックスから遊離される単離されたペプチドをクロマトグラフィーで精製及び分離して質量分析する工程等で構成される、リン酸化タンパク質分析用ゲル内の標識化方法及び、ゲル内の加水分解方法を利用するタンパク質のリン酸化位置同定方法を提供する。
【００１４】
本発明において、前記工程１）で言及されたリン酸化タンパク質は、この分野で使用される通常的な方法によって多様な細胞及び細胞膜、細胞内の組職、他の臓器組職から製造することができる。また、リン酸化タンパク質は、他の環境または栄養状態によって、他の物理的または化学的ストレスにしたがって、または時間経過にしたがって感応して発現され、他の疾病状態に発現されたタンパク質から選択することができる。変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）、還元（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）、脱糖化（ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、システインアルキル化反応（ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ）または酸化反応（ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）のような通常の方法にしたがって製造されたリン酸化タンパク質が、ゲル電気泳動分野で使用される通常の方法にしたがって、ポリマー性ゲルマトリックスに固定化され得る。本発明では、必要により多様なゲル密度を有するゲルを使用することができる。必要なら、固定化されたタンパク質が広範囲に使用される１Ｄまたは２Ｄゲル電気泳動方法によって分離することができる。ゲルマトリックス内に一旦固定化された大部分のリン酸化タンパク質は、ゲルに留まって、染色、脱染色、システインアルキル化または酸化反応等のような多様な処理工程にわたって使用され得る溶液内に放出されない。したがって、ゲルマトリックスは、試料であるリン酸化タンパク質を擔持する容器のような役割をする。
【００１５】
本発明にしたがって、タンパク質を固定化するゲルマトリックスは、ゲルに維持されたリン酸化タンパク質のリン酸化残基特異的化学的標識反応のための反応基に利用することができる。適切な大きさに切られたリン酸化タンパク質を含む染色されたゲル切片は、通常の方法にしたがって脱染色される。β−離脱／標識物質付加方法は、リン酸化タンパク質のリン酸化位置の選択的標識のために溶液状態の反応に多く使用される。脱リン酸化反応であるβ−離脱工程は、次の反応式１で示される。
【００１６】
スキーム１
2008511311.tif 000003
【００１７】
前記スキーム１でアミノ酸残基は、ＸがＨの場合はリン酸化セリンで、ＣＨ3の場合にはリン酸化スレオニンである。
【００１８】
ポリマー性ゲルマトリックスに固定化されたリン酸化タンパク質からリン酸基のβ−離脱による脱リン酸化反応は、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋またはＢａ２＋のような周期律表の２族に属する金属の陽イオンを金属触媒として含む塩基性水溶性標識溶液を使用して遂行される。リン酸化タンパク質からリン酸基の脱リン酸化反応の結果、リン酸化タンパク質に存在するリン酸化セリン残基及び／またはリン酸化スレオニン残基は、それぞれデヒドロアラニン残基及び／またはβ−メチルデヒドロアラニン残基に転換される。α，β−不飽和コンジュゲートシステムを有する収得された脱リン酸化されたアミノ酸残基は、標識溶液に存在するチオール求核体に対して良好な受容体として作用する。したがって、ゲルマトリックス内に固定化されたタンパク質の脱リン酸化位置に適切な化学的標識の付加反応（Ｍｉｃｈａｅｌ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）を通じて、ゲル内に固定化されたリン酸化タンパク質の前リン酸化された位置が標識物質に標識された残基に変換される。付加反応は、次のスキーム２で示される。
【００１９】
スキーム２
2008511311.tif 000004
【００２０】
前記スキーム２でアミノ酸残基は、ＸがＨの場合はデヒドロアラニンで、ＣＨ3の場合にはβ−メチルデヒドロアラニンで、各々β−離脱によってリン酸化セリンとリン酸化スレオニンから生成され、Ｔａｑは標識物質を示す。
【００２１】
本発明での標識化合物は、リン酸基のβ−離脱から生成されたα，β−不飽和コンジュゲートシステムに対して、強い求核性を有する化合物で構成された群から選択することができる。チオール（ｔｈｉｏｌ）作用基を有する試薬を使用することが好ましい。本発明のチオール基は、ジスルフィド（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）またはチオエステル等のその前駆体形態から標識反応中に製造されたり、または標識反応前にあらかじめ製造されたりすることができる。標識試薬はまた、脱リン酸化されたアミノ酸残基に自身のコンジュゲート付加でリジンまたはアルギニンと類似の構造的特性を付与することができ、酵素的加水分解によって前リン酸化された位置である標識された位置でペプチド結合の切断が進行されることによりリジンまたはアルギニンと類似に作用するようにできる化合物からなる群から選択することができる。したがって、本来リン酸化されたアミノ酸残基だったが、標識反応によってリジンまたはアルギニンと類似の構造を有するように化学的に標識されたアミノ酸残基は、トリプシンのようなプロテアーゼによって加水分解され、その結果得られたペプチドでは、本来リン酸化されていたアミノ酸残基は、Ｃ−末端アミノ酸残基に相応する。上述したように、ナイト（Ｋｎｉｇｈｔ，Ｚ．Ａ．）等はアミノエチルシステインがトリプシンによって認識されて加水分解され得るリジン類似体を得るための化学的標識物質として使用することができると報告した。また、アン（Ａｈｎ，Ｙ．Ｈ．）等は、グアニジノエチルシステインは、ホモアルギニンと類似に作用することができてトリプシンによって加水分解され得ると報告した。ポリマー性ゲル内に固定化されたタンパク質のリン酸化アミノ酸残基に対するゲル内の化学的標識方法の代表的な一例として、タンパク質のリン酸化アミノ酸残基が化学的標識物質であるグアニジノエタンチオールによってグアニジノエチルシステインまたは、ｂ−メチルグアニジノエチルシステイン残基に転換されることを一例に挙げることができる。上述した過程にしたがって、グアニジノエタンチオールを標識物質に使用して塩基性水溶液状で標識化反応させると、リン酸化アミノ酸残基はゲル内でグアニジノエタンチオールで標識される。標識化反応に使用されたすべての試薬がポリマー性ゲルマトリックスから洗われた後、ゲルマトリックスにあるリン酸化残基特異的標識タンパク質を酵素を使用してゲル内の加水分解すると、前リン酸化されたアミノ酸残基である標識されたアミノ酸残基で加水分解されたペプチドを含むペプチド混合物を提供する。前リン酸化されたセリン残基である標識されたグアニジノエチルシステイン残基でのタンパク質加水分解は、次のスキーム３で示される。
【００２２】
スキーム３
2008511311.tif 000005
【００２３】
ゲル内の標識化反応は、リン酸化タンパク質の脱リン酸化反応と別個にまたは同時に遂行できる。標識物質である求核体はまた、標識化反応と同時にまたはあらかじめその前駆体の形態から生成され得る。また、標識物質を構成する少なくとも一つ以上の原子が化学的反応性は同じで質量値だけが他の同位元素で置換された（ｉｓｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ  ｃｏｄｅｄ）標識物質同等体を求核体に使用してお互いに異なる試料源から得られる同一タンパク質間のリン酸化状態に対する相対的定量を遂行することができる。
【００２４】
例えば、グアニジノエタンチオールと、それを構成する水素、炭素、窒素そしてイオウ原子等が各元素の同位元素に置換されたグアニジノエタンチオール同等体は、化学的構造及び化学的物性、反応性等がお互いに同じで、質量数においてのみ一定の差異を示す。したがって、ゲル内の標識化反応及び継続されるゲル内の加水分解反応で、それら二つの同等体は同一の反応性及び物性を示すようになり、標識されたペプチドに対する質量分析においてのみ、それぞれのペプチドに標識された同等体の質量数の差異が質量スペクトル上に現われる。したがって、標識物質に使用される二つの同等体の質量数の差にあたる質量差が見られるが、同一なアミノ酸配列を有する二つのペプチドに起因した二つの質量スペクトルの強度から二つの試料に各々存在する標識された二つのペプチド間の相対的な定量が可能である。このような相対的定量方法は、他の特定の標識物質を使用して、Ｇｏｓｈｅ，Ｍ．Ｂ．等によって発表されたことがあり(US 2002/0119505)、本発明でのゲル内の標識化反応及びゲル内の加水分解反応を利用したリン酸化タンパク質分析にもそのまま応用することができる。
【００２５】
本発明では高濃度の試薬を、ポリマー性ゲルマトリックス内に維持されたリン酸化タンパク質のゲル内の標識のために使用した。それら試薬は、標識されたタンパク質の継続的なゲル内の単離のために優先的にゲルから選択的に除去され、標識されたタンパク質は相変らずゲル内に泊まるようになる。したがって、ポリマー性ゲルマトリックスは、タンパク質試料を入れる容器のような役割をする。ゲルから標識化反応に使用された試薬の除去は、適切な緩衝溶液またはアセトニトリル、メタノール、エチルアルコール、イソプロパノール等の有機溶媒を一定部分含む緩衝溶液にゲルを静置しておくことにより遂行される。標識反応に使用した試薬が除去されたゲルは、アセトニトリルで洗浄して真空で乾燥する。
【００２６】
ゲル内の単離は、前記で言及したゲル内β−離脱／標識物質付加反応によって標識されたタンパク質に対して遂行される。この分野で広範囲に使用されている通常的な方法のように、多様なプロテアーゼをリン酸化残基が特徴的に標識されたタンパク質のゲル内単離のために使用することができる。特に、前記で言及したようにリン酸化された残基に特徴的に標識されたアミノ酸残基でタンパク質加水分解を導こうとする場合において、より選択的な単離のためにプロテアーゼの選択に注意することが好ましいい。例えば、化学的標識物質中のグアニジノエタンチオールは、ゲル内の標識化方法によってリン酸化セリンをグアニジノエチルシステインに転換させる。収得されたグアニジノエチルシステイン残基は、構造的にホモアルギニンに似ている。したがって、前記残基は、トリプシンのような広く使用されるプロテアーゼのみならずエンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃのようなアルギニン特異的プロテアーゼによって選択的に認識されて加水分解され得る。一方、アミノエタンチオールは、ゲル内の標識化方法によってリン酸化セリンをアミノエチルシステインに転換させる。収得されたアミノエチルシステイン残基は、構造的にリジンに似ている。したがって、前記残基はまた、トリプシンのような広く使用されるプロテアーゼのみならずエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃのようなリジン特異的プロテアーゼによって選択的に認識されて加水分解され得る。ゲル内の標識化反応に使用された標識物質によってプロテアーゼを選定することは、リン酸化残基特異的ゲル内標識化／ゲル内単離方法の付加的な長所であるといえる。
【００２７】
ゲルから遊離されるペプチドは、適切なクロマトグラフィーで前処理をしたりまたは前処理過程なしに各種ペプチド分析器具で分析したりすることができる。本来リン酸化されていた標識されたアミノ酸残基で起きるタンパク質加水分解酵素による単離は、リン酸化タンパク質でリン酸化された位置を解明するにおいて非常に効果的なことであると認識される。リン酸化残基特異的加水分解から得られたペプチドは、リン酸化残基特異的標識物質で標識された残基（すなわち、グアニジノエチルシステイン、アミノエチルシステイン等）をＣ−末端アミノ酸残基として有し、ＭＳ／ＭＳペプチド配列分析で標識されたアミノ酸残基に相応するｙ１切片イオンを示す。酵素単離において標識されたアミノ酸残基で加水分解が起きなかった場合にも、標識されたアミノ酸残基は、ＭＳ／ＭＳ配列分析で標識されたアミノ酸残基に起因した独特の質量差から解明することができる。また、標識されたペプチドに対する質量分析感度は、標識化を遂行しないリン酸化ペプチドに比べて大きく増加するという付加的な長所がある。
【００２８】
図２は、α−カゼイン（ｃａｓｅｉｎ）のＧＥＴ−標識ペプチド（シーケンス  ＶＰＱＬＥＩＶＰＮＳ＊ＡＥＥＲ、ｍ／ｚ  １６８２）のＭＳ／ＭＳスペクトルで、グアニジノエタンチオールでリン酸化アミノ酸残基が特徴的にゲル内標識されて、継続的にトリプシンでゲル内単離された後、質量分析が遂行された。Ｓ＊は、前リン酸化セリン残基がＧＥＴ−標識されたグアニジノエチルシステイン残基を示す。代表的に、ｍ／ｚ  １５６２．８に現われたピークは、前駆体ペプチドからグアニジノエタンチオールの中性離脱の結果発生したペプチド切片に起因する。ｍ／ｚ  ６９２．３に現われたピークは、前リン酸化セリン残基であるグアニジノエチルシステイン残基（Ｓ＊）のＮ−末端のペプチド結合の切断から起因したｙ５切片イオンに対応するものである。
【００２９】
図３は、α−カゼインのペプチド（シーケンス  Ｓ＊ＥＥＩＶＰＮＳ＊ＶＥＱＫ、ｍ／ｚ  １５６１）のＭＳ／ＭＳスペクトルで、ゲル内標識されて継続的にゲル内単離された後、質量分析して得た。Ｓ＊は、前リン酸化セリン残基がＧＥＴ−標識されたグアニジノエチルシステイン残基を示す。前リン酸化セリン残基であるグアニジノエチルシステイン残基のＮ−末端のペプチド結合の切断に起因した切片イオンに対応する二つのピーク（ｙ５及びｙ７）は、相対的に強いピーク強度で、それぞれｍ／ｚ  ６９１．３及び８７１．４で示される。したがって、タンパク質のリン酸化位置は、容易にそして明白に解明され得る。
【００３０】
図４は、β−カゼインのペプチド（シーケンス  Ｓ＊ＥＥＳＩＴＲ、ｍ／ｚ  ９２２）のＭＳ／ＭＳスペクトルで、ゲル内標識されて継続的にゲル内単離された後、質量分析して得た。Ｓ＊は、グアニジノエチルシステイン部分で、以前リン酸化されたセリン部分である。前記結果は、効果的なリン酸化タンパク質分析とリン酸化位置同定のための本発明のゲル内標識化／ゲル内単離方法の汎用性及び多様な適用可能性を示している。
【００３１】
図５は、マレイン酸脱水素酵素（ｍａｌａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ］のペプチド（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＧＦＳＧＥＤＡＴＰＡＬＥＧＡＤＶＶＬＩＳ＊，  ｍ／ｚ  ２０４９）のＭＳ／ＭＳスペクトルで、ゲル内グアニジノエタンチオール（ｇｕａｎｉｄｉｎｏｅｔｈａｎｅｔｈｉｏｌ）でリン酸化特異的標識され及び連続的にゲル内で分解される。Ｓ＊は、グアニジノエチルシステイン（ｇｕａｎｉｄｉｎｏｅｔｈｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ）部分で、前リン酸化セリン（ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ）部分である。前記ペプチドは、Ｓ＊であるＧＥＴ標識された部位がアミノ酸残基、グアニジノエチルシステインで標識された酵素的に切断できるＣ−末端残基に位置する配列を有している、前記ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルは、ペプチドのＹ１切片イオンに対応するＭ／Ｚ  ２０７．１で唯一のピークが見られる。
【００３２】
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によってさらに詳細に記述するが、本発明の範囲がこれに限定されるものではない。
【００３３】
実施例１：ゲルマトリックス内の固定化されたタンパク質試料の調製
タンパク質試料は、生物学的培地から通常的な方法にしたがって抽出して製造する。抽出されたタンパク質は、６Ｍグアニジン塩酸塩で変性される。タンパク質のシステイン残基のジスルフィド結合は、約３７℃で約１時間の間トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩で還元し、形成されたチオール基は、公知された方法にしたがってアルキル化反応を利用して保護したり、酸化反応を利用してスルホン酸に酸化したりされる。製造されたタンパク質または標準試料タンパク質は、ゲル電気泳動分野で使用する通常的な方法にしたがい、１Ｄまたは２Ｄゲル電気泳動方法によって分離することができ、ポリアクリルアミドゲル内に固定される。ポリアクリルアミドゲルは、必要によって多様なアクリルアミド濃度を有する溶液から製造される。ゲル内で分離したタンパク質は、通常的な方法によってクマシーブリリアントブルーＧ−２５０（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｇ−２５０）のような染色試薬または銀窒酸塩で染色して可視化される。
【００３４】
実施例２：ゲル内に固定化されたリン酸化タンパク質のゲル内標識
タンパク質を含む染色された部分のゲルを切り取ってゲル脱染色を遂行する。クマシブルーで染色されたゲルをメタノールまたはアセトニトリルを含むアンモニウムビカーボネート溶液に入れて脱染色を遂行する。銀窒酸塩で染色されたゲルは、３０Ｍｍカリウムフェリシアニドと１００ｍＭチオ硫酸ナトリウム１：１溶液を使用して脱染色する。脱染色されたゲルは、アセトニトリルで洗って真空で乾燥する。
【００３５】
標識溶液は、中和されたトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（以下「ＴＣＥＰ」と略称する）でグアニジノエタンジスルフィド塩酸塩（以下「ＧＥＤＳ  ２ＨＣｌ」と略称する）を還元させて製造した。０．５Ｍ  ＴＣＥＰ（２０μＬ）と０．５Ｍ  ＧＥＤＳ  ２ＨＣｌ（２０μＬ）をアルゴン下で混合した。反応容器を約４５℃で３０分の間静置した。５．０Ｎ  ＮａＯＨ（６μＬ）及び１．０Ｍ  ＢａＣｌ２（２μＬ）を反応容器に連続的に付加した。製造された標識溶液をタンパク質を含むゲルに付加して反応容器をアルゴン下で約４５℃で３時間静置した。ゲルを５０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸溶液で３回洗って、５０％アセトニトリル溶液（１ｍＬ）で一度洗った。継続してアセトニトリルで洗った後、真空で乾燥した。
【００３６】
実施例３：標識されたタンパク質のゲル内単離及び質量分析
５０ｍＭアンモニウムビカーボネート（４５μＬ）及びトリプシン（０．１ｍｇ／μＬ、６μＬ）の混合溶液をタンパク質を含むゲルに付加して反応溶液を約１２ないし１８時間３７℃で培養した。上澄み液をピペットで集めて、ゲルを５０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸溶液（１００μＬ）で洗って先の上澄み液と合わせた後、真空乾燥した。
【００３７】
前記の乾燥された試料を０．１％  ＴＦＡ溶液（２０ｕＬ）に溶解して、脱塩によって製造されたＣ１８トラップカラム（ｔｒａｐ  ｃｏｌｕｍｎ）（Ｉ．Ｄ  ２５０ｍｍ，  長さ３０ｍｍ，粒子サイズ５μｍ）にロービングして、２０μＬ／分の流量で濃縮した。分離されたペプチドは、マトリクス溶液（５０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸に溶解したＣＨＣＡ）で一回で混合される濃度勾配溶離条件で分離してＭＡＬＤＩ質量分析によって試料板に点滴した。また、前記の溶離したペプチド溶液は、ＥＳＩ質量分析器で直接分析できる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】グアニジノエタンチオールでリン酸化位置特異的標識と標識された位置に対する連続されたタンパク質加水分解を示す反応図である。
【図２】α−カゼイン（ｃａｓｅｉｎ）のＧＥＴ−標識ペプチド（シーケンス  ＶＰＱＬＥＩＶＰＮＳ＊ＡＥＥＲ、ｍ／ｚ  １６８２）のＭＳ／ＭＳスペクトルである。
【図３】α−カゼインのペプチド（シーケンス  Ｓ＊ＥＥＩＶＰＮＳ＊ＶＥＱＫ、ｍ／ｚ  １５６１）のＭＳ／ＭＳスペクトルである。
【図４】β−カゼインのペプチド（シーケンス  Ｓ＊ＥＥＳＩＴＲ、ｍ／ｚ  ９２２）のＭＳ／ＭＳスペクトルである。
【図５】マレイン酸脱水素酵素（ｍａｌａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ］のペプチド（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＧＦＳＧＥＤＡＴＰＡＬＥＧＡＤＶＶＬＩＳ＊，ｍ／ｚ  ２０４９）のＭＳ／ＭＳスペクトルで、ゲル内グアニジノエタンチオール（ｇｕａｎｉｄｉｎｏｅｔｈａｎｅｔｈｉｏｌ）でリン酸化特異的標識され及び連続的にゲル内で分解される。Ｓ＊は、グアニジノエチルシステイン（ｇｕａｎｉｄｉｎｏｅｔｈｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ）残基で、前ホスホセリン（ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ）残基である。
【図１】
2008511311.tif 000007
【図２】
2008511311.tif 000008
【図３】
2008511311.tif 000009
【図４】
2008511311.tif 000010
【図５】
2008511311.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成19年4月20日(2007.4.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ポリマー性ゲルマトリックス内に固定化されたグアニジン系リン酸化タンパク質のリン酸化位置を標識試薬混合物を使用して標識する工程、
ｂ）標識されたタンパク質を酵素で加水分解して加水分解されたペプチドを得る工程、及び
ｃ）前記加水分解されたペプチドを分析する工程とからなることを特徴とする、リン酸化タンパク質分析用ゲル内の標識方法及び標識されたタンパク質分析を通じたタンパク質リン酸化位置同定方法。
【請求項２】
前記ポリマー性ゲルマトリックスが、固定化させたリン酸化タンパク質を収容できる重合体であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリアクリルアミドゲルが、１ないし３０％濃度のアクリルアミドを含む溶液から製造されるゲルから選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標識試薬混合物が、塩基、標識物質、還元剤、及び金属触媒から選択される一つ以上を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記塩基が、無機塩基であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記塩基が、有機塩基であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記標識物質が、スルフヒドリル（ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ）官能基を有する化合物から選択されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記スルフヒドリル（ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ）官能基が、ジスルフィド（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）形態の標識物質を還元剤で還元することによって製造されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記還元剤が、トリス（２−シアノエチル）ホスフィン（ＴＣＮＥＰ）、トリス（２−カルボキシルエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリス（ハイドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰＰ）、及びトリブチルホスフィン（ＴＢＰ）からなる群から選択されるものであることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記スルフヒドリル（ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ）官能基が、標識反応工程前に塩基性加水分解または求核体置換方法で保護されたスルフヒドリル基を脱保護することにより製造されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記標識物質が、グアニジノアルカンチオール及び／または同一な化学的反応性を有するが質量だけ他の放射性同位元素を有する異性体であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記グアニジノアルカンチオールが、グアニジノエタンチオールであることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記リン酸化位置が、リン酸化セリン及びリン酸化スレオニンから選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素が、加水分解酵素の中から選択されるものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記酵素が、トリプシン、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼ及びＬｙｓ−Ｃからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記加水分解されたペプチドが、クロマトグラフィーによって分離された後、またはクロマトグラフィーによる分離過程なしに質量分析機によって質量分析されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ａ）ポリマー性ゲルマトリックスに固定されたリン酸化タンパク質にリン酸基をゲル内β−除去反応を遂行して、グアニジン基を有する求核性化学標識因子をゲル内マイケル（Ｍｉｃｈａｅｌ）付加反応を遂行する工程；
ｂ）ポリマー性ゲルマトリックスからゲル内マイケル（Ｍｉｃｈａｅｌ）付加反応により選択的除去剤を使用する工程、
ｃ）標識物質で標識されたタンパク質をプロテアーゼでゲル内加水分解してペプチド混合物を得る工程、及び
ｄ）ポリアクリルアミドゲルから流出する加水分解されたペプチド混合物をクロマトグラフィーで分離して質量分析する工程からなることを特徴とする、リン酸化タンパク質分析用ゲル内標識化方法及び標識化されたタンパク質分析を通じたタンパク質リン酸化位置同定方法。
【請求項１８】
前記タンパク質からリン酸基のβ−除去反応が、塩基性水溶液条件で遂行されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリアクリルアミドゲルが、５ないし１５％濃度のアクリルアミドを含む溶液から製造されるポリアクリルアミドゲルであることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記標識物質が、グアニジノアルカンチオール及び／または同一な化学的反応性を有するが質量だけ他の放射性同位元素を有する異性体であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記標識物質が、前記グアニジノアルカンチオールが、グアニジノエタンチオールであることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記標識物質が、自体のジスルフィド（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）形態から標識反応中に生成されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記リン酸化された部位が、ホスホセリン及び／またはホスホスレオニンであることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月24日(2007.5.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008511311000001.app
【国際調査報告】
2008511311.tif 000012
2008511311.tif 000013