(57)【要約】新生児髄膜炎（ＭＮＥＣ）原因病原菌である大腸菌株のオープンリーディングフレームおよび特にＭＮＥＣ感染に対する免疫化組成物の調製に関わるこれらのサブセットを開示する。また、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする本発明の核酸、および本発明のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体に関する。本発明のポリペプチド、核酸および抗体を、医薬品用および患者の免疫反応を上昇させるための薬剤の製造に用いることができる。また、本発明は、薬学的に許容し得る担体との混合物中に、本発明のポリペプチド、核酸または抗体を含む医薬組成物に関する。さらに、本発明は、薬学的に許容し得る担体との混合物中に、本発明のポリペプチドを２個以上含む医薬組成物に関する。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物はワクチンアジュバントをさらに含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号
【化１】
2008529558.tif 000152
【化２】
2008529558.tif 000153
【化３】
2008529558.tif 000154
【化４】
2008529558.tif 000155
【化５】
2008529558.tif 000156
【化６】
2008529558.tif 000157
【化７】
2008529558.tif 000158
【化８】
2008529558.tif 000159
【化９】
2008529558.tif 000160
からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）アミノ酸配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したアミノ酸のフラグメントであるアミノ酸配列；または、
（ｄ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有し、アミノ酸配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したアミノ酸のフラグメントを有するアミノ酸配列、
を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
（ａ）配列番号５１２、２４５４、２４５６、２６７８、２６９２、４５９６、４７４８、７００４，７０５２、８１６８、４６２８および５７００からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）アミノ酸配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したアミノ酸のフラグメントであるアミノ酸配列；または、
（ｄ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有し、アミノ酸配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したアミノ酸のフラグメントを有するアミノ酸配列、
を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
（ａ）配列番号８５６４、２７２８、９８７２、４６７２、５６８０、５３４、３２２２、３２２６および７００４からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ）アミノ酸配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したアミノ酸のフラグメントであるアミノ酸配列；または、
（ｄ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有し、アミノ酸配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したアミノ酸のフラグメントを有するアミノ酸配列、
を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記フラグメントが、（ａ）の少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
医薬品用の請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
（ａ）配列番号
【化１０】
2008529558.tif 000161
【化１１】
2008529558.tif 000162
【化１２】
2008529558.tif 000163
【化１３】
2008529558.tif 000164
【化１４】
2008529558.tif 000165
【化１５】
2008529558.tif 000166
【化１６】
2008529558.tif 000167
【化１７】
2008529558.tif 000168
【化１８】
2008529558.tif 000169
からなる群より選択されるヌクレオチド配列；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
（ｃ）ヌクレオチド配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドのフラグメントであるヌクレオチド配列；または、
（ｄ）ヌクレオチド配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有し、ヌクレオチド配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドのフラグメントを有するヌクレオチド配列、
を含む、核酸。
【請求項７】
（ａ）配列番号５１１、２４５３、２４５５、２６７７、２６９１、４５９５、４７４７、７００３、７０５１、８１６７、４６２７および５６９９からなる群より選択されるヌクレオチド配列；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
（ｃ）ヌクレオチド配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドのフラグメントであるヌクレオチド配列；または、
（ｄ）ヌクレオチド配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有し、ヌクレオチド配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドのフラグメントを有するヌクレオチド配列、
を含む、請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
（ａ）配列番号８５６３、２７２７、９８７１、４６７１、５６７９、５３３、３２２１、３２２５および７００３からなる群より選択されるヌクレオチド配列；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
（ｃ）ヌクレオチド配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドのフラグメントであるヌクレオチド配列；または、
（ｄ）ヌクレオチド配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有し、ヌクレオチド配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドのフラグメントを有するヌクレオチド配列、
を含む、請求項６に記載の核酸。
【請求項９】
請求項１、２、３または４のポリペプチドをコードする、請求項６〜８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドに対し特異的である、モノクローナル抗体。
【請求項１１】
薬学的に許容し得る担体との混合物中に、請求項１〜４に記載のポリペプチド、請求項１〜９に記載の核酸、または請求項１０に記載の抗体を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
薬学的に許容し得る担体との混合物中に、請求項１〜４に記載のポリペプチドを２個以上含む、医薬組成物。
【請求項１３】
ワクチンアジュバントをさらに含む、請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項１４】
（ａ）配列番号５１１、２４５３、２４５５、２６７７、２６９１、４５９５、４７４７、７００３、７０５１、８１６７、４６２７および５６９９からなる群より選択されるヌクレオチド配列；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
（ｃ）ヌクレオチド配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドのフラグメントであるヌクレオチド配列；または、
（ｄ）ヌクレオチド配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有し、ヌクレオチド配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドの断片を有するヌクレオチド配列、
によってコードされる、１つまたは複数のポリペプチドを発現または過剰発現する１つまたは複数の外膜小胞体（ＯＭＶ）を含む、免疫原性組成物。
【請求項１５】
（ａ）配列番号８５６３、２７２７、９８７１、４６７１、５６７９、５３３、３２２１、３２２５および７００３からなる群より選択されるヌクレオチド配列；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
（ｃ）ヌクレオチド配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドの断片であるヌクレオチド配列；または
（ｄ）ヌクレオチド配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有し、ヌクレオチド配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドのフラグメントを有するヌクレオチド配列、
によってコードされる、１つまたは複数のポリペプチドを発現または過剰発現する１つまたは複数の外膜小胞体（ＯＭＶ）を含む、免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記フラグメントが、（ａ）の少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む、請求項１４または１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
患者の免疫反応を上昇させるための薬剤の製造における、請求項１〜４に記載のポリペプチド、請求項６〜９に記載の核酸、請求項１０に記載の抗体、または請求項１４〜１６に記載の免疫原性組成物の使用。
【請求項１８】
患者に請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項１４〜１６に記載のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を投与する工程を含む、患者の免疫反応を上昇させる方法。
【請求項１９】
前記免疫反応がＥｘＰＥＣ感染、特にＭＮＥＣ感染を防御する、請求項１７に記載の使用、または請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中で引用される全ての文書は、その全体が参考として援用される。
（関連出願）
本願は、２００５年２月１８日に出願された米国仮特許出願番号６０／６５４，６３２および２００５年８月２９日に出願された米国仮特許出願番号６０／７１２，７２０の利益を主張する。これらの出願の教示は、本明細書中にその全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、大腸菌の生物学の分野におけるものであり、特に腸管外病原性大腸菌（ＥｘＰＥＣ）株に対し免疫化する際に使用される免疫原に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
大腸菌ほど用途の広い微生物は少ない。哺乳動物の正常な腸管微生物叢の重要なメンバーである他、組み換えＤＮＡ技術の宿主として広く用いられている。しかしながら、大腸菌は致命的な病原体でもある。
【０００４】
大腸菌株は、伝統的に共生株または病原性株のいずれかに分類され、病原性株は腸管株または腸管外株に下位分類される。分類は「Ｋ」抗原に基づき得る。最もよく研究されている「Ｋ」抗原は「Ｋ１」抗原であるが、これは新生児髄膜炎を発症する大腸菌株の中で毒性のある主要な決定基であると考えられている。血清型Ｂ群髄膜炎菌の莢膜サッカライドと同様、Ｋ１抗原はα−２，８−結合シアル酸のホモポリマーである。
【０００５】
多座位酵素電気泳動（ＭＬＥＥ）等のより最近の分類技術では、大腸菌は５つの系統発生群（Ａ、Ｂ１、Ｂ２、ＤおよびＥ）に分類され、これらの分類は伝統的な分類と一致しない。例えば、ＭＬＥＥ  Ｂ１群には共生株および病原性株の双方が含まれ、Ｄ群には腸管株および腸管外株の双方が含まれる。
【０００６】
大腸菌の腸管外病原性株（または「ＥｘＰＥＣ」株［非特許文献１］）は、ＭＬＥＥ  Ｂ２群およびＤ群に分類され、尿路病原性（ＵＰＥＣ）株と髄膜炎／敗血症関連（ＭＮＥＣ）株との双方が含まれる。ＵＰＥＣ株は尿路感染（ＵＴＩ）の原因となり、膀胱炎の一般的な原因となる。また、ＵＰＥＣ株は腎盂腎炎（および敗血症等のその合併症）およびカテーテル関連感染の原因となる。ＭＮＥＣ株は２５〜４０％の範囲の致死率で新生児髄膜炎の原因となり（新生児１０００人あたり０．１）、敗血症の症例の約１／６に該当する。
【０００７】
以前のＥｘＰＥＣワクチンの多くは、細胞溶解物または細胞構造物に基づいている。ＳＯＬＣＯＵＲＯＶＡＣ（登録商標）には、６種のＥｘＰＥＣ株を含む１０個の異なる加熱死菌が含まれ、非特許文献２では、第ＩＩ相臨床試験の成功例が報告されている。ＵＲＯ−ＶＡＸＯＭ（登録商標）は、１８種の選ばれた大腸菌株の凍結乾燥細菌溶解物を含有する経口錠剤ワクチンである［非特許文献３］。Ｂａｃｔｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ社は、６〜１０種の異なる株由来の線毛に基づくＵＴＩワクチンを開発したが、この製品はすでに使われていない。ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ社は、ＦｉｍＨ付着因子複合体に基づくＭＥＤＩ５１６と呼ばれる製品を開発した［非特許文献４］が、第ＩＩ相臨床試験で十分な効果が認められなかった。さらに、このワクチンには正常な腸管微生物叢中の非病原性Ｆｉｍ＋ｖｅにも作用する危険性があり、その膀胱特異性付着機構のため、ＵＰＥＣ株に対してのみ有効であり、他のＥｘＰＥＣ株は制御されずに残されると考えられる。
【０００８】
従って、粗細胞溶解物からより明確な分子に変わる必要、およびワクチン中の封入体に適したさらなる抗原、特に臨床ＥｘＰＥＣ株内で普遍であるが、共生株では見いだされない抗原を同定する必要を含め、ＥｘＰＥＣワクチンを改良する必要がある。ＥｘＰＥＣ群中では特に、ＭＮＥＣ株に対して免疫化するに適した抗原を同定する必要がある。
【０００９】
これらの必要性を満たす１つの方法が、特許文献１に報告されており、発明者らは、ＭＬＥＥ型Ｂ２およびＤのゲノム中に存在するが、ＭＬＥＥ型ＡおよびＢ１郡には存在しない遺伝子を探索している。減法ハイブリダイゼーションに基づくさらなる相対的アプローチが、特許文献２および非特許文献５に報告されている。ＥｘＰＥＣ株中の毒性遺伝子は、特許文献３において同定されている。非特許文献６では、ＵＰＥＣ大腸菌株５３６中の４個の病原性アイランドの解析を開示している。
【００１０】
特許文献４では、非病原性大腸菌株中に存在しない配列を同定するため、ＵＰＥＣ（Ｏ６：Ｋ２：Ｈ１）株ＣＦＴ０７３［非特許文献７、参考文献１１］のゲノム配列を使用している。非特許文献８では、ＵＰＥＣである大腸菌ヒト腎盂腎炎分離菌５３６（Ｏ６：Ｋ１５：Ｈ３１）のゲノム配列と、ＧＦＴ０７３（ＵＰＥＣ）株、ＥＤＬ９３３（腸管出血性）株およびＭＧ１６５５株（非病原性実験室株）の配列データとの比較を開示している。病原性株のゲノム配列は、寄託番号ＡＥ００５１７４、ＢＡ０００００７およびＮＣ−００４４３１のデータベースで入手できる。非病原性株由来の配列は、寄託番号Ｕ０００９６で入手できる。
【００１１】
病原性大腸菌株、特にＥｘＰＥＣ株、さらに詳細にはＭＮＥＣ株に対する免疫化に用いるさらなる抗原を提供することが、本発明の目的である。
【特許文献１】国際公開第０３／０７４５５３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０１／６６５７２号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０４／００５５３５号パンフレット
【特許文献４】米国特許出願公開第２００３／０１６５８７０号明細書
【非特許文献１】Ｒｕｓｓｏ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ（２０００）１８１：１７５３−１７５４
【非特許文献２】Ｕｅｈｌｉｎｇら  Ｊ  Ｕｒｏｌ（１９９７）１５７：２０４９−２０５２
【非特許文献３】Ｔａｍｍｅｎ  Ｂｒ  Ｊ  Ｕｒｏｌ（１９９０）６５：６−９
【非特許文献４】Ｌａｎｇｅｒｍａｎｎら  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７６：６０７−６１１
【非特許文献５】Ｊａｎｋｅら  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ（２００１）１９９：６１−６６
【非特許文献６】Ｄｏｂｒｉｎｄｔら  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ（２００２）７０：６３６５−６３７２
【非特許文献７】Ｗｅｌｃｈら  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２００２）９９：１７０２０−１７０２４
【非特許文献８】Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００３；１  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １  Ｊｕｌｙ：ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｐ１．３−１１
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明者らは、新生児髄膜炎（ＭＮＥＣ）の原因である大腸菌株由来の様々なオープンリーディングフレームを同定し、ＭＮＥＣ感染に対する免疫化用組成物を調製するために特に関心がある、これらのオープンリーディングフレームのサブセットを同定した。
【００１３】
一態様では、本発明は（ａ）配列番号
【００１４】
【化１９】
2008529558.tif 000002
【００１５】
【化２０】
2008529558.tif 000003
【００１６】
【化２１】
2008529558.tif 000004
【００１７】
【化２２】
2008529558.tif 000005
【００１８】
【化２３】
2008529558.tif 000006
【００１９】
【化２４】
2008529558.tif 000007
【００２０】
【化２５】
2008529558.tif 000008
【００２１】
【化２６】
2008529558.tif 000009
【００２２】
【化２７】
2008529558.tif 000010
からなる群より選択されるアミノ酸配列；（ｂ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；（ｃ）アミノ酸配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したアミノ酸のフラグメントであるアミノ酸配列；または（ｄ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有し、アミノ酸配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したアミノ酸のフラグメントを有するアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。特定の実施形態では、本発明の態様のポリペプチドは、（ａ）の少なくとも１個のＢ細胞エピトープを有するフラグメントを含む。
【００２３】
第２態様では、本発明は（ａ）配列番号５１２，２４５４、２４５６、２６７８、２６９２、４５９６、４７４８、７００４、７０５２、８１６８、４６２８および５７００からなる群より選択されるアミノ酸配列；（ｂ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；（ｃ）アミノ酸配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したアミノ酸のフラグメントであるアミノ酸配列；または（ｄ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有し、アミノ酸配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したアミノ酸のフラグメントを有するアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。特定の実施形態では、本発明の態様のポリペプチドは、（ａ）の少なくとも１個のＢ細胞エピトープを有するフラグメントを含む。
【００２４】
他の態様では、本発明は（ａ）配列番号８５６４、２７２８、９８７２、４６７２、５６８０、５３４、３２２２、３２２６および７００４からなる群より選択されるアミノ酸配列；（ｂ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；（ｃ）アミノ酸配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したアミノ酸のフラグメントであるアミノ酸配列；または（ｄ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有し、アミノ酸配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したアミノ酸のフラグメントを有するアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。特定の実施形態では、本発明の態様のポリペプチドは、（ａ）の少なくとも１個のＢ細胞エピトープを有するフラグメントを含む。
【００２５】
また、本発明は（ａ）配列番号
【００２６】
【化２８】
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【００２７】
【化２９】
2008529558.tif 000012
【００２８】
【化３０】
2008529558.tif 000013
【００２９】
【化３１】
2008529558.tif 000014
【００３０】
【化３２】
2008529558.tif 000015
【００３１】
【化３３】
2008529558.tif 000016
【００３２】
【化３４】
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【００３３】
【化３５】
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【００３４】
【化３６】
2008529558.tif 000019
からなる群より選択されるヌクレオチド配列；（ｂ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；（ｃ）ヌクレオチド配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドのフラグメントであるヌクレオチド配列；または（ｄ）ヌクレオチド配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有し、ヌクレオチド配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドのフラグメントを有するヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
【００３５】
他の態様では、本発明は（ａ）配列番号５１１、２４５３、２４５５、２６７７、２６９１、４５９５、４７４７、７００３、７０５１、８１６７、４６２７および５６９９からなる群より選択されるヌクレオチド配列；（ｂ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；（ｃ）ヌクレオチド配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドのフラグメントであるヌクレオチド配列；または（ｄ）ヌクレオチド配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有し、ヌクレオチド配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドのフラグメントを有するヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
【００３６】
さらなる態様では、本発明は（ａ）配列番号８５６３、２７２７、９８７１、４６７１、５６７９、５３３、３２２１、３２２５および７００３からなる群より選択されるヌクレオチド配列；（ｂ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；（ｃ）ヌクレオチド配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドのフラグメントであるヌクレオチド配列；または（ｄ）ヌクレオチド配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有し、ヌクレオチド配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドのフラグメントを有するヌクレオチド配列を含む核酸に関する。
【００３７】
また、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする本発明の核酸、および本発明のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体に関する。
【００３８】
本発明のポリペプチド、核酸および抗体を、医薬品用および患者の免疫反応を上昇させるための薬剤の製造に用いることができる。
【００３９】
また、本発明は、薬学的に許容し得る担体との混合物中に、本発明のポリペプチド、核酸または抗体を含む医薬組成物に関する。さらに、本発明は、薬学的に許容し得る担体との混合物中に、本発明のポリペプチドを２個以上含む医薬組成物に関する。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物はワクチンアジュバントをさらに含む。
【００４０】
さらに、本発明は、（ａ）配列番号５１１、２４５３、２４５５、２６７７、２６９１、４５９５、４７４７、７００３、７０５１、８１６７、４６２７および５６９９からなる群より選択されるヌクレオチド配列；（ｂ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；（ｃ）ヌクレオチド配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドのフラグメントであるヌクレオチド配列；または（ｄ）ヌクレオチド配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有し、ヌクレオチド配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドのフラグメントを有するヌクレオチド配列でコードされる、１つまたは複数のポリペプチドを発現または過剰発現する１つまたは複数の外膜小胞体（ＯＭＶｓ）を含む免疫原性組成物に関する。
【００４１】
また、本発明は（ａ）配列番号８５６３、２７２７、９８７１、４６７１、５６７９、５３３、３２２１、３２２５および７００３からなる群より選択されるヌクレオチド配列；（ｂ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；（ｃ）ヌクレオチド配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドのフラグメントであるヌクレオチド配列；または（ｄ）ヌクレオチド配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有し、ヌクレオチド配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドのフラグメントを有するヌクレオチド配列でコードされる１つまたは複数のポリペプチドを発現または過剰発現する少なくとも１つまたは複数のＯＭＶを含む免疫原性組成物に関する。
【００４２】
また、本発明は、患者に本発明の医薬組成物または免疫原性組成物を投与する工程を含む、患者の免疫反応を上昇させる方法に関する。特定の実施形態では、免疫反応はＥｘＰＥＣ感染、特にＭＮＥＣ感染を防御する。
【００４３】
本発明のさらなる態様を以下に記述する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
（発明の詳細な説明）
本発明者らは、Ｋ１／Ｂ２  ＭＮＥＣ株由来の４９９５個のオープンリーディングフレームを同定し、ＭＮＥＣ株に対する免疫原性組成物を調製するために特に関心があるこれらのオープンリーディングフレームのサブセットを同定した。
【００４５】
ポリペプチド
本発明は、実施例に開示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。これらのアミノ酸配列は、偶数の配列番号２〜９９９０として配列表中に与えられる。
【００４６】
配列番号２〜９９９０内の好ましいアミノ酸配列を表２に示す。さらに好ましいアミノ酸配列は、従来技術で同定されていないもの、例えば参考文献５，６，７，８，９，１０，１１および１３のいずれでも同定されていないものである。
【００４７】
また、本発明は、ヌクレオチド配列番号９９９１〜１０２７３または配列番号１０２７４内のいずれか１つのヌクレオチド配列でコードされるポリペプチドを提供する。核酸内のコード配列が開始コドンで始まり、停止コドンで終了することが好ましい。好ましいポリペプチドは従来技術で同定されていないもの、例えば参考文献５，６，８，１０および１１において同定されていないものである。
【００４８】
また、本発明は、実施例で開示されたアミノ酸配列と配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。同様に、本発明は、配列番号９９９１〜１０２７３または配列番号１０２７４内でコードされるアミノ酸配列と同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。特定の配列によって、配列同一性の程度は５０％より大きい（例えば６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）ことが好ましい。これらのポリペプチドにはホモログ、オルトログ、対立遺伝子変異体および突然変異体が含まれる。典型的には、２つのポリペプチド配列間の５０％以上の同一性は、機能的に等価であることを示すと考えられる。ポリペプチド間の同一性は、ギャップ開放ペナルティ＝１２、ギャップ伸長ペナルティ＝１のパラメーターを有するアフィンギャップ検索を使用して、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社）により実行されるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジー検索アルゴリズムで決定されることが好ましい。
【００４９】
実施例の配列と比較すると、これらのポリペプチドは１つ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０等）の保存性アミノ酸置換、すなわち１個のアミノ酸の、関連する側鎖を有する他のアミノ酸による置換を含み得る。遺伝的にコードされるアミノ酸は、一般に４種類のファミリーに分類される：（１）酸性アミノ酸、すなわちアスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性アミノ酸、すなわちリジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性アミノ酸、すなわちアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性アミノ酸、すなわちグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは芳香族アミノ酸として分類されることがある。一般に、これらファミリー内の単一アミノ酸の置換は、生物活性に大きな影響を与えない。さらに、ポリペプチドは参照配列に対して１つ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０等）の単一アミノ酸の欠失を有し得る。また、ポリペプチドは参照配列に対して１つ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０等）の挿入（例えば１、２、３、４または５個のアミノ酸それぞれの挿入）を含み得る。
【００５０】
好ましいポリペプチドには脂質化されたポリペプチド、外膜に位置するポリペプチド、内膜に位置するポリペプチド、またはペリプラズムに位置するポリペプチドが含まれる。これらの範疇の１つより多くに当てはまるポリペプチド、例えば外膜に位置する脂質化ポリペプチドが特に好ましい。リポタンパク質はシグナルペプチドの翻訳プロセシング後、脂質が共有結合的に付着したＮ末端システインを有し得る。
【００５１】
脂質化し得るポリペプチドには配列番号
【００５２】
【化３７】
2008529558.tif 000020
が含まれる。配列番号５６６２（ＯＲＦ０２８３１）および８５６４（ＯＲＦ０４２８２）が好ましいリポタンパク質である。
【００５３】
好ましいポリペプチドは、表２に列記するものである。
【００５４】
さらに、本発明は実施例に開示されたアミノ酸配列のフラグメントを含むポリペプチドを提供する。同様に、本発明は配列番号９９９１〜１０２７３または配列番号１０２７４内でコードされたアミノ酸配列のフラグメントを含むポリペプチドを提供する。そのフラグメントは、配列から少なくともｎ個の連続したアミノ酸を有する必要があり、特定の配列によっては、ｎは７以上である（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上）。フラグメントは配列の少なくとも１個のＴ細胞、好ましくはＢ細胞エピトープを有し得る。Ｔ細胞およびＢ細胞エピトープは、実験的に同定（例えばＰＥＰＳＣＡＮ［参考文献１４、１５］または類似の方法）、または予測できる（例えばＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原インデックス［参考文献１６］、マトリックスに基づくアプローチ［参考文献１７］、ＴＥＰＩＴＯＰＥ［参考文献１８］、神経ネットワーク［参考文献１９］、ＯｐｔｉＭｅｒ＆ＥｐｉＭｅｒ［参考文献２０、２１］、ＡＤＥＰＴ［参考文献２２］、Ｔｓｉｔｅｓ［参考文献２３］、親水性［参考文献２４］、抗原インデックス［参考文献２５］、または参考文献２６に記載の方法等）。他の好ましいフラグメントは、（ａ）本発明のポリペプチドのＮ末端シグナルペプチド、（ｂ）Ｎ末端シグナルペプチドを有さない上記ペプチド、（ｃ）１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＮ末端アミノ酸残基を持たない上記ペプチドである。
【００５５】
他の好ましいフラグメントは潜在性開始コドン（ＡＴＧ、ＧＴＧ、ＴＴＧ）でコードされるアミノ酸で始まるフラグメントである。指定された開始コドンの開始コドン下流によりコードされるメチオニンで開始するフラグメントは、本発明のポリペプチドである。
【００５６】
他の好ましいフラグメントは、本発明のポリペプチドおよび参考文献５、６、８、１０および１１のいずれかにおいて同定されたポリペプチドに共通のフラグメントである。
【００５７】
本発明のポリペプチドは、例えば化学合成（全体または部分的）、プロテアーゼを用いるより長いポリペプチドの分解、ＲＮＡからの翻訳、細胞培養（例えば組み換え発現体）、生物自体（例えば、細菌培養後または患者から直接）からの精製等、多くの方法で調製できる。４０個未満のアミノ酸長のペプチドの好ましい産生方法には、インビトロ化学合成［参考文献２７、２８］が含まれる。ｔＢｏｃまたはＦｍｏｃ［参考文献２９］法に基づく方法等の固相ペプチド合成が特に好ましい。酵素合成法［参考文献３０］を部分的または全体で使用し得る。化学合成の代替として、生物合成を使用し得る、例えば、ポリペプチドを翻訳により産生し得る。これは、インビトロまたはインビボに実施され得る。一般に、生物学的方法はＬ−アミノ酸に基づくポリペプチドの産生に限られるが、翻訳機構（例えばアミノアシルｔＲＮＡ分子の翻訳機構）の操作を使用し、Ｄ−アミノ酸（または、ヨードチロシンもしくはメチルフェニルアラニン、アジドホモアラニン等の他の非天然アミノ酸）の導入が可能になる［参考文献３１］。しかしながら、Ｄ−アミノ酸が含まれる場合、化学合成を使用することが好ましい。本発明のポリペプチドは、Ｃ末端および／またはＮ末端に共有結合修飾を有し得る。
【００５８】
本発明のポリペプチドは、様々な形を取ることができる（例えば天然型、融合、グリコシル化、非グリコシル化、脂質化、非脂質化、リン酸化、非リン酸化、ミリストイル化、非ミリストイル化、単量体、多量体、粒子状、変性等）。
【００５９】
本発明のポリペプチドは、精製または実質的に精製された形、すなわち他のポリペプチドを実質的に含まない（例えば天然起源ポリペプチドを含まない）、特に他のＥｘＰＥＣまたは宿主細胞ポリペプチドを含まない形で提供されることが好ましく、一般に、少なくとも純度約５０％（重量単位）、通常は少なくとも純度９０％、すなわち、組成物の約５０％未満、より好ましくは約１０％未満（例えば５％以下）が、他の発現ポリペプチドから構成される。本発明のポリペプチドは、好ましくはＥｘＰＥＣ、より好ましくはＭＮＥＣポリペプチドである。
【００６０】
本発明のポリペプチドは、固体支持体に結合され得る。本発明のポリペプチドは、検出可能な標識（例えば放射性または蛍光標識、またはビオチン標識）を有し得る。
【００６１】
用語「ポリペプチド」は、任意の長さのアミノ酸ポリマーを指す。ポリマーは直鎖状または分枝状であり、修飾アミノ酸を有し得、アミノ酸以外が介在し得る。用語「ポリペプチド」は、天然または、介入、例えばジスルフィド結合生成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識化合物との共役結合等の任意の操作もしくは修飾により、修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。例えば、１つまたは複数のアミノ酸アナログ（例えば非天然アミノ酸等を含む）を含むポリペプチド、ならびに当技術分野で既知の他の修飾も定義に含まれる。ポリペプチドは一本鎖または会合鎖として生じることができる。本発明のポリペプチドを、天然または非天然に（すなわち、ポリペプチドが対応する天然起源ポリペプチドにおいて見出されるグリコシル化パターンとは異なるグリコシル化パターンを有する）グリコシル化することができる。
【００６２】
本発明のポリペプチドは、少なくとも４０個のアミノ酸長である（例えば、少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３５０、４００、４５０、５００またはそれ以上）。本発明のポリペプチドは、５００個より短いのアミノ酸長である（４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３５０、４００または４５０個のアミノ酸より長くない）。
【００６３】
本発明は配列−Ｘ−Ｙ−または−Ｙ−Ｘ−を有するポリペプチドを提供し、ここで−Ｘ−が上記に定義したアミノ酸配列であり、−Ｙ−が上記で定義した配列ではない、すなわち、本発明は融合タンパク質を提供する。ポリペプチドをコードする配列のＮ末端コドンがＡＴＧでない場合、そのコドンは、コドンが開始コドンとして翻訳されるとき生じるＭｅｔとしてでなく、そのコドンに対する標準アミノ酸として翻訳される。
【００６４】
本発明は、ポリペプチド発現を誘導する条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程を有する本発明のポリペプチドの産生方法を提供する。
【００６５】
本発明は、本発明のリペプチドが化学的手法を用いて部分的または全体に合成される、ポピペプチドの産生方法を提供する。
【００６６】
本発明は、本発明のポリペプチド２個以上（例えば２、３、４、５、６またはそれ以上）を含む組成物を提供する。異なるポリペプチドを、異なる細菌の代謝および／またはシグナル経路に含まれるように選び得る。例えば、それは以下の範疇の２、３、４、５、６またはそれ以上の選択である：付着因子；自己輸送体タンパク質；毒素；鉄獲得タンパク質；および特に組み込み外膜タンパク質を含む膜結合タンパク質等。抗原のこのような組み合わせは、細菌のライフサイクルの異なる局面に対する免疫反応を標的とし得る。
【００６７】
本発明は、式ＮＨ２−Ａ−［−Ｘ−Ｌ−］ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨで表されるハイブリッドタンパク質を提供する。式中、Ｘは上記に定義した本発明のポリペプチドであり、Ｌは任意のリンカーのアミノ酸配列であり、Ａは任意のＮ末端のアミノ酸配列であり、Ｂは任意のＣ末端のアミノ酸配列であり、ｎは１より大きい整数である。ｎの値は２とｘとの間であり、ｘの値は通常３、４、５、６、７、８、９または１０である。ｎは、好ましくは２、３または４であり、最も好ましくは２である。各ｎの場合に、−Ｘ−は同じであっても異なっていてもよい。［−Ｘ−Ｌ−］の各ｎの場合に、リンカーのアミノ酸配列−Ｌ−は、存在してもしなくてもよい。例えば、ｎ＝２の場合、ハイブリッドはＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨ等であってもよい。リンカーのアミノ酸配列−Ｌ−は、一般的には短い（例えば、２０個以下のアミノ酸、すなわち１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、３、２、１個である）。例えば、クローニングを容易にする短いペプチド配列、ポリグリシンリンカー（すなわち、Ｇｌｙｎ、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）およびヒスチジンタグ（すなわちＨｉｓｎ、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）が含まれる。他の好適なリンカーのアミノ酸配列は、当業者に自明と思われる。−Ａ−および−Ｂ−は、一般的には短い任意の配列である（例えば、４０個以下のアミノ酸、すなわち３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個である）。例えば、ポリペプチドを輸送するよう命令するリーダー配列、あるいはクローニングまたは精製を容易にする短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、すなわちＨｉｓｎ、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）が含まれる。他の好適なＮ末端およびＣ末端のアミノ酸配列は、当業者に自明であると思われる。
【００６８】
本発明のポリペプチドのインビボ免疫原性を評価するために、様々な試験を使用することができる。例えば、ポリペプチドを組み換えで発現し、使用し、免疫ブロットにより患者の血清をスクリーニングすることができる。ポリペプチドと患者の血清との間の陽性反応は、患者が問題となるタンパク質に対する免疫反応をすでに開始している、すなわち、そのタンパク質が免疫原であることを示している。この方法を使用し、免疫主体タンパク質を同定することができる。
【００６９】
抗体
本発明は、本発明のポリペプチドと結合する抗体を提供する。これらの抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよく、任意の好適な手法（例えば、組み換え発現）で産生し得る。ヒト免疫系との適合性を向上するため、抗体はキメラまたはヒト化され得［例えば参考文献３２および３３］、または完全にヒト抗体が使用され得る。抗体には、検出可能な標識が含まれ得る（例えば臨床診断用）。本発明の抗体は、固体支持体に結合し得る。本発明の抗体は、中和抗体であることが好ましい。
【００７０】
モノクローナル抗体は、その抗体が標的とする個々のポリペプチドの同定と精製に特に有用である。本発明のモノクローナル抗体は、免疫分析、放射線免疫分析（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着体分析（ＥＬＩＳＡ）等の試薬としても用いられ得る。これらの用途では、放射性同位元素、蛍光分子または酵素等の分析的に検出可能な試薬で抗体を標識化することができる。上記の方法で産生されたモノクローナル抗体を、本発明のポリペプチドの分子的同定および特徴付け（エピトープマッピング）にも使用し得る。
【００７１】
本発明の抗体は、好ましくは、大腸菌のＥｘＰＥＣ株に特異性である。すなわち、他の細菌と比較して（例えば非ＥｘＰＥＣ大腸菌および非大腸菌細菌と比較して）、ＥｘＰＥＣ大腸菌に優先的に結合する。より好ましくは、抗体は、ＭＮＥＣ株に特異的である。すなわち、他のＥｘＰＥＣ大腸菌との比較を含む他の細菌と比較してＭＮＥＣ細菌と優先的に結合する。
【００７２】
本発明の抗体は、精製または実質的に精製された形で提供されることが好ましい。一般的には、他のポリペプチドを実質的に含まない組成物中に抗体が存在し、例えば組成物の９０％（重量比）未満、通常６０％未満、より普通には５０％未満の他のポリペプチドから構成される。
【００７３】
本発明の抗体は、任意のイソタイプ（例えばＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、すなわちα、γまたはμ重鎖）であることができるが、一般にはＩｇＧである。ＩｇＧイソタイプ内では、抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブクラスであってもよい。本発明の抗体は、κまたはλ軽鎖を有してもよい。
【００７４】
本発明の抗体は、全抗体、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ａｂ）フラグメント等の抗体フラグメント、Ｆｖフラグメント（非共有結合へテロダイマー）、一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）等の一本鎖抗体、ミニ抗体、オリゴ抗体を含む様々な形を取ることができる。用語「抗体」は、特定の起源を意味せず、ファージ提示法等の従来にない方法で得られた抗体も含む。
【００７５】
本発明は、（ａ）抗体−抗原複合体の形成に適した条件下で本発明の抗体を生物試料と接触させる工程、（ｂ）上記複合体を検出する工程を含む、本発明のポリペプチドの検出方法を提供する。
【００７６】
本発明は、（ａ）抗体−抗原複合体の形成に適した条件下で本発明のポリペプチドを生物試料（例えば血液または血清試料）と接触させる工程、（ｂ）上記複合体を検出する工程を含む、本発明の抗体の検出方法を提供する。
【００７７】
好ましい抗体は、当技術分野において周知の抗体よりかなり大きい親和性を有する本発明のポリペプチドと結合する。親和性は、当技術分野において周知の抗体より少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍程大きいことが好ましい。
【００７８】
核酸
本発明は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸を提供する（例えば奇数の配列番号１〜９９８９）。また、本発明は、配列番号９９９１〜１０２７３のいずれか１つを有する核酸を提供する。
【００７９】
本発明は、このようなヌクレオチド配列と配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。配列間の同一性は、上記のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジー検索アルゴリズムで決定されることが好ましい。特定の配列によっては、配列同一性の程度は、５０％より大きいことが好ましい（例えば６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）。
【００８０】
また、本発明は、これらの核酸とハイブリダイズすることが可能な核酸を提供する。ハイブリダイゼーション反応を異なる「厳密性」の条件下で行うことができる。ハイブリダイゼーション反応の厳密性を増加させる条件は、広く知られており、文献に記載されている（例えば参考文献３４の７．５２頁）。当該条件としては、（厳密性の順で）インキュベーション温度２５℃、３７℃、５０℃、５５℃および６８℃；緩衝液濃度１０×ＳＳＣ、６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ（ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび５ｍＭクエン酸緩衝液）およびこれらの緩衝液系を用いる等価物；ホルムアミド濃度０％、２５％、５０％および７５％；インキュベーション時間５分〜２４時間：洗浄工程１回、２回またはそれ以上；洗浄インキュベーション時間１、２または１５分；および洗浄液６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣまたは脱イオン水が含まれる。ハイブリダイゼーション技術およびその最適化は、当技術分野において周知である［例えば参考文献３４〜３７等参照］。
【００８１】
ある実施形態では、本発明の核酸は、低度の厳密性の条件下で標的にハイブリダイズするが、他の実施形態では、中程度の厳密性の条件下でハイブリダイズする。好ましい実施形態では、高度の厳密性の条件下でハイブリダイズする。低度の厳密性ハイブリダイゼーション条件の典型的なセットは、５０℃、１０×ＳＣＣである。中程度の厳密性ハイブリダイゼーション条件の典型的なセットは、５５℃、１×ＳＣＣである。高度の厳密性ハイブリダイゼーション条件の典型的なセットは、６８℃、０．１×ＳＣＣである。
【００８２】
これらの配列のフラグメントを有する核酸も提供される。これらのフラグメントは、その配列由来の少なくともｎ個の連続したヌクレオチドを有する必要があり、特定の配列によっては、ｎは１０以上である（例えば１２、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００またはそれ以上）。好ましいフラグメントは、本発明の核酸配列、および参考文献５、６、８、１０および１１のいずれかにおいて同定された核酸配列と共通のフラグメントである。
【００８３】
本発明は、式５’−Ｘ−Ｙ−Ｚ−３’の核酸を提供する。式中、−Ｘ−はｘ個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり、−Ｚ−はｚ個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり、−Ｙ−は（ａ）奇数の配列番号１〜９９８９から選ばれた核酸配列のフラグメント、（ｂ）配列番号９９９１〜１０２７３の任意の１つのフラグメント、（ｃ）配列番号１０２７４のフラグメント、または（ｄ）（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）の補体のいずれかからなるヌクレオチド配列であり、上記核酸５’−Ｘ−Ｙ−Ｚ−３’は（ｉ）配列番号１〜９９８９由来、配列番号９９９１〜１０２７３、もしくは配列番号１０２７４内の奇数番号の核酸のフラグメント、または（ｉｉ）（ｉ）の補体のいずれでもない。
【００８４】
−Ｘ−および／または−Ｚ−部分は、プロモーター配列（またはその補体）を含み得る。
【００８５】
本発明は、配列番号１０２７４由来の少なくともｎ個の連続したヌクレオチドを有する核酸を提供する。ここで、ｎは１０以上、例えば１２、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、１００００、１０００００、１００００００またはそれ以上である。この核酸は、少なくとも部分的に１本鎖であり得、ハイブリダイゼーションプローブおよび／または増幅プライマーとして作用することができる。ある実施形態では、フラグメントは従来技術のＥｘＰＥＣ配列のフラグメントでない、またはそれを含まない。例えば参考文献５、６、７、８、９、１０、１１および１３のいずれかで具体的に開示された核酸配列のフラグメントでない。他の実施形態では、そのフラグメントは、従来技術のＥｘＰＥＣ配列のフラグメントである、例えば参考文献５、６、７、８、９、１０、１１および１３のいずれかで具体的に開示された核酸配列のフラグメントと同一である。
【００８６】
本発明は、これらの配列と相補的な配列を有する核酸を含む（例えばアンチセンスまたはプローブ用、またはプライマー用）。
【００８７】
本発明の核酸をハイブリダイゼーション反応（例えばノーザンまたはサザンブロット、または核酸マイクロアレイまたは「遺伝子チップ」）、増幅反応（例えばＰＣＲ、ＳＤＡ、ＳＳＳＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、ＮＡＢＳＡ等）、および他の核酸技術で使用できる。
【００８８】
本発明に記載の核酸は、様々な形を取ることができる（例えば１本鎖、２本鎖、ベクター、プライマー、プローブ、標識化等）。本発明の核酸は、環状または分枝状であってもよいが、一般に直鎖状である。特に、指定または要求しない限り、核酸を利用する本発明の任意の実施形態では、２本鎖状、および２本鎖状を構成する２本の相補的１本鎖状のそれぞれを利用し得る。アンチセンス核酸と同様、プライマーおよびプローブは一般に１本鎖である。
【００８９】
本発明の核酸は、精製または実質的に精製された形、すなわち他の核酸を実質的に含まない（例えば天然起源核酸を含まない）、特に他のＥｘＰＥＣまたは宿主細胞核酸を含まない形で提供されることが好ましく、一般に少なくとも純度約５０％（重量比）であり、通常は少なくとも純度約９０％である。本発明の核酸は、ＥｘＰＥＣ核酸であることが好ましい。
【００９０】
本発明の核酸を、多くの方法、例えば全体または部分的な化学合成（例えばＤＮＡのホスホロアミダイト合成）、ヌクレアーゼ（例えば制限酵素）を用いるより長い核酸の分解、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリー由来のより短い核酸またはヌクレオチドの結合（例えばリガーゼまたはポリメラーゼを用いる）等で調製し得る。
【００９１】
本発明の核酸は、固体支持体（例えばビーズ、プレート、フィルター、フィルム、スライド、マイクロアレイ支持体、樹脂等）に結合され得る。本発明の核酸を、例えば放射性または蛍光標識、またはビオチン標識で標識化し得る。これは、核酸を検出技術で使用する場合、例えば核酸がプライマーまたはプローブである場合に、特に有用である。
【００９２】
用語「核酸」は、一般的に任意の長さのヌクレオチドのポリマー形を意味し、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはそのアナログを含む。核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡ，ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが含まれる。また、修飾骨格（例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）またはホスホロチオエート）または修飾塩基を含むようなＤＮＡまたはＲＮＡアナログが含まれる。従って、本発明にはｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組み換え核酸、分枝核酸、プラスミド、ベクター、プローブ、プライマー等が含まれる。本発明の核酸がＲＮＡの形である場合、核酸は５’キャップを有していても有さなくてもよい。
【００９３】
本発明の核酸は、配列を有するが、非ＥｘＰＥＣ配列（例えば上記に定義した式５’−Ｘ−Ｙ−Ｚ−３’の核酸における）を有してもよい。これは、核酸標的に相補的な第１配列と、核酸標的に相補的でない第２配列を有し得るプライマーとして特に有用である。プライマー中の任意のこのような非相補的配列は、相補的配列に対し５’端であることが好ましい。典型的な非相補的配列は、制限部位またはプロモーター配列を有する。
【００９４】
本発明の核酸を、多くの方法、例えば、化学合成（少なくとも部分的）、ヌクレアーゼ（例えば制限酵素）を用いるより長い核酸の分解、ゲノムまたはＤＮＡライブラリー由来のより短い核酸の結合（例えばリガーゼまたはポリメラーゼを使用）等で調製できる。
【００９５】
本発明の核酸は、ベクターの部分、すなわち１つまたは複数の細胞タイプの形質導入／形質移入のために設計された核酸コンストラクトの部分であってもよい。例えば、ベクターは、挿入したヌクレオチドの単離、伝播および複製のために設計された「クローニングベクター」、宿主細胞中でのヌクレオチド配列の発現のために設計された「発現ベクター」、組み換えウイルスまたはウイルス様粒子の産生を結果的にもたらすように設計された「ウイルスベクター」、または１種類より多いベクターの属性を有する「シャトルベクター」であってもよい。好ましいベクターはプラスミドである。「宿主細胞」には、個々の細胞、または外因性核酸の受容体である、または受容体であった培養細胞が含まれる。宿主細胞には、単一宿主の子孫細胞が含まれ、自然、偶発または計画的な突然変異および／または変化により、子孫細胞は最初の親細胞と必ずしも（形態または全ＤＮＡ補体において）完全に同一である必要はない。宿主細胞には、インビボまたはインビトロで本発明の核酸により形質移入または感染した細胞が含まれる。
【００９６】
核酸がＤＮＡである場合、ＲＮＡ配列中の「Ｕ」がＤＮＡ中の「Ｔ」で置換されることが好ましい。同様に、核酸がＲＮＡである場合、ＤＮＡ配列中の「Ｔ」がＲＮＡ中の「Ｕ」で置換される。
【００９７】
核酸に関連して用いられる用語「補体」または「相補的」とは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対を指す。従って、Ｃの補体はＧであり、Ｇの補体はＣであり、Ａの補体はＴ（またはＵ）であり、Ｔ（またはＵ）の補体はＡである。Ｉ（プリンイノシン）等の塩基を、例えば補体ピリミジン（ＣまたはＴ）に使用することも可能である。「補体」または「相補的」は、方向も意味する、すなわち５’−ＡＣＡＧＴ−３’の補体は、５’−ＴＧＴＣＡ−３’でなく５’−ＡＣＴＧＴ−３’である。
【００９８】
例えば、ポリペプチドを産生するため、生物試料中の核酸の検出用ハイブリダイゼーションプローブとして、核酸のさらなるコピーを生成するため、リボザイムもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドを生成するため、１本鎖ＤＮＡプライマーもしくはプローブとして、または３重鎖形成オリゴヌクレオチドとして、本発明の核酸を使用することができる。
【００９９】
本発明は、本発明の核酸が化学的手法を用いて全体または一部で合成される。核酸の産生方法を提供する。
【０１００】
本発明は、本発明のヌクレオチド配列を有するベクター（例えばクローニングベクターまたは発現ベクター）、およびこのようなベクターを用いて形質転換した宿主細胞を提供する。
【０１０１】
また、本発明は、ＥｘＰＥＣ核酸配列内に含まれる鋳型配列を増幅するためのプライマー（例えばＰＣＲプライマー）を備え、第１プライマーおよび第２プライマーを備えるキットを提供する。キットでは、第１プライマーが上記鋳型配列と実質的に相補性があり、第２プライマーが上記鋳型配列の補体と実質的に相補性があり、実質的な相補性を有する上記プライマーの一部が増幅される鋳型配列の末端を示す。第１プライマーおよび／または第２プライマーには、検出可能な標識（例えば蛍光標識）が含まれ得る。
【０１０２】
本発明は、１本鎖または２本鎖核酸（またはそれらの混合物）に含まれるＥｘＰＥＣ鋳型核酸配列の増幅を可能にする、第１および第２の１本鎖オリゴヌクレオチドを備えるキットを提供する。このキットは、（ａ）第１オリゴヌクレオチドが上記鋳型核酸配列と実質的に相補性があるプライマー配列を有し、（ｂ）第２オリゴヌクレオチドが上記鋳型核酸配列の補体と実質的に相補性があるプライマー配列を有し、（ｃ）第１および／または第２オリゴヌクレオチドが上記鋳型核酸と相補性がない配列を有し、（ｄ）上記プライマー配列が増幅される鋳型配列の末端を示す。特徴（ｃ）の非相補的配列は、プライマー配列の下流（すなわち５’側）であることが好ましい。これらの配列（ｃ）の１つまたは双方は、制限部位［例えば参考文献３８］またはプロモーター配列［例えば参考文献３９］を有してもよい。第１オリゴヌクレオチドおよび／または第２オリゴヌクレオチドには検出可能な標識（例えば蛍光標識）が含まれてもよい。
【０１０３】
鋳型配列はゲノム配列（例えば配列番号１０２７４）の任意の部分でよい。例えば、鋳型配列はｒＲＮＡ遺伝子（例えばＴｕｒｅｎｎｅら、２０００、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３８：５１３−５２０）またはタンパク質コード遺伝子であり得る。鋳型配列はＥｘＰＥＣに特異的であることが好ましく、ＭＮＥＣに特異的であることがより好ましい。
【０１０４】
また、本発明は、コンピュータ読み取り可能な媒体（例えばフロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、ＣＲ−ＲＯＭまたはＤＶＤ等）および／または配列表内の１つまたは複数の配列を含むコンピュータデータベースを提供する。媒体は配列番号１０２７４を含むことが好ましい。
【０１０５】
本発明は、（ａ）本発明の核酸プローブをハイブリダイゼーション条件下で生物試料と接触させる工程、および（ｂ）上記二重鎖を検出する工程を含む、本発明の核酸の検出方法を提供する。
【０１０６】
本発明は、本発明の核酸をハイブリダイゼーション条件下で生物試料と接触させる工程を含む、生物試料（例えば血液）の検出方法を提供する。その方法は、核酸増幅（例えばＰＣＲ、ＳＤＡ、ＳＳＳＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡ等）またはハイブリダイゼーション（例えばマイクロアレイ、ブロット、溶液中のプローブとのハイブリダイゼーション等）を含み得る。臨床試料中のＥｘＰＥＣのＰＣＲ検出が報告されている［例えば参考文献４０参照］。核酸に基づく臨床検査は一般的に参考文献４１に記載されている。
【０１０７】
本発明は、標的配列のフラグメントが核酸プライマーの伸長によって調製される。標的配列のフラグメントの調製方法を提供する。標的配列および／またはプライマーは本発明の核酸である。プライマー伸長反応には核酸の増幅が含まれる（例えばＰＣＲ、ＳＤＡ、ＳＳＳＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡ等）。
【０１０８】
本発明の核酸増幅は、定量的および／またはリアルタイムである。
【０１０９】
本発明のある実施形態では、核酸は少なくとも７個のヌクレオチド長であることが好ましい（例えば
【０１１０】
【化３８】
2008529558.tif 000021
個のヌクレオチドまたはそれ以上）。
【０１１１】
本発明のある実施形態では、核酸は多くとも５００個のヌクレオチド長であることが好ましい（例えば
【０１１２】
【化３９】
2008529558.tif 000022
個のヌクレオチドまたはそれ以下）。
【０１１３】
本発明のプライマーおよびプローブ、ならびにハイブリダイゼーションに用いられる他の核酸は、１０〜３０の間のヌクレオチド長であることが好ましい（例えば
【０１１４】
【化４０】
2008529558.tif 000023
個のヌクレオチド）。
【０１１５】
変異細菌
本発明は、本明細書で同定された遺伝子の１つまたは複数の発現がノックアウトされた大腸菌細菌を提供する。遺伝子ノックアウトの技術は周知であり、大腸菌のノックアウト突然変異体は以前に報告されている。
【０１１６】
ノックアウトはコード領域の同質遺伝子欠失を用いて行われることが好ましいが、例えばプロモーターの欠失または突然変異、開始コドンの欠失または突然変異、アンチセンス阻害、阻害ＲＮＡ等の好適な技術を使用し得る。しかしながら、得られた細菌では、遺伝子産物をコードするｍＲＮＡが存在しない、および／またはその翻訳が阻害される（例えば野生型レベルの１％未満に）。
【０１１７】
この細菌はノックアウト遺伝子の代わりにマーカー遺伝子、例えば抗生物質耐性マーカーを有し得る。
【０１１８】
小胞体
参考文献４２はｍｌｔＡ（ムレイン溶菌性トランスグリコシダーゼ）、またはｔｏｌＡ、ｔｏｌＱ、ｔｏｌＢ、ｐａｌおよび／またはｔｏｌＲ等の大腸菌Ｔｏｌ−Ｐａｌ複合体［参考文献４３］成分の１つまたは複数のノックアウトによる、ＭＮＥＣ株由来の小胞体の調製を記載している。小胞体の表面上の保護抗原の量および／または免疫接触可能「汚染」を増加するために、細菌の染色体に１つまたは複数の遺伝的変化を加えることにより、または「ａｄ−ｈｏｃ」エピゾーム要素（例えば発現ベクター）の挿入により、これらの小胞体を改善することができる。
【０１１９】
このような改善を達成する１つの方法は、本発明のポリペプチドの保護抗原の発現を上方調節することである。標的タンパク質の発現を増加するための多くの総合戦略は、当技術分野において周知であり、２つの広い範疇に分けることができる。その１つは、染色体の修飾（例えば野生型プロモーターのより強いプロモーターによる置換、天然リプレッサー遺伝子の不活性化等）に依存し、内因性遺伝子の発現を増加する。もう１つはエピソーム要素（例えば高コピー数プラスミド、遺伝子操作標的遺伝子を内蔵するベクター）による組み換え発現、または染色体中の外来性保護標的遺伝子の融合に基づいている。これらのアプローチそれぞれの具体例を参考文献４４〜５０に見出すことができる。
【０１２０】
小胞体の免疫原性および選択性を増加させるさらなる方法は、免疫優性非保護抗原の発現を下方制御すること、または共生株中に見出されるタンパク質と相同のタンパク質を下方調節することである。ＬＰＳの脂質Ａ部分の解毒化により潜在的小胞体毒性を減少することにより、さらに求められる改善が成される。他のグラム陰性病原体由来の改善された小胞体を産生するための同様な変化が、先に報告されている（例えば参考文献５１および５２参照）。
【０１２１】
上記戦略の全てをそれぞれ単独で、または組み合わせて用い、免疫原性組成物に用いられる改善された小胞体を得ることができる。本発明は、ｍｌｔＡおよび／またはそのＴｏｌ−Ｐａｌ複合体のノックアウトを有する病原性大腸菌細菌（特にＭＮＥＣ）、および（ｉ）ポリペプチドをコードする染色体性遺伝子と自然に会合するプロモーターより高いポリペプチドの発現レベルを提供するプロモーターの制御下にある本発明のポリペプチドをコードする染色体遺伝子、（ｉｉ）本発明のポリペプチドをコードする自律複製染色体外要素、および／または（ｉｉｉ）野生型ＬＰＳと比較して大腸菌ＬＰＳのリピドＡ部分の毒性を減少するための遺伝的修飾の１つまたは複数を提供する。
【０１２２】
本発明は、細菌の培養中に培地中へ放出される小胞体等の細菌を培養することにより得られる小胞体も提供する。
【０１２３】
医薬組成物
本発明は、（ａ）本発明のポリペプチド、抗体、小胞体および／または核酸、および（ｂ）薬学的に許容し得る担体を有する組成物を提供する。これらの組成物は例えば免疫原性組成物として、または診断試薬として、またはワクチンとして好適である。本発明のワクチンは、予防（すなわち感染防止）または治療（すなわち感染の処置）のためのいずれかであるが、一般的には予防のためである。
【０１２４】
特定の態様では、本発明は、（ａ）は配列番号５１１、２４５３，２４５５，２６７７、２６９１，４５９５、４７４７、７００３、７０５１、８１６７、４６２７および５６９９からなる群より選択されるヌクレオチド配列；（ｂ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；（ｃ）ヌクレオチド配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドのフラグメントであるヌクレオチド配列；または（ｄ）ヌクレオチド配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有し、ヌクレオチド配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドのフラグメントを有するヌクレオチド配列でコードされる、１つまたは複数のポリペプチドを発現または過剰発現する、１つまたは複数の外膜小胞体（ＯＭＶ）を含む、免疫原性組成物を提供する。
【０１２５】
他の態様では、本発明は、（ａ）配列番号８５６３、２７２７，９８７１、４６７１，５６７９、５３３、３２２１、３２２５および７００３からなる群より選択されるヌクレオチド配列；（ｂ）アミノ酸配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；（ｃ）ヌクレオチド配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドのフラグメントであるヌクレオチド配列；または（ｄ）ヌクレオチド配列（ａ）と少なくとも８０％の配列同一性を有し、ヌクレオチド配列（ａ）由来の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドのフラグメントを有するヌクレオチド配列でコードされる、１つまたは複数のポリペプチドを発現または過剰発現する、１つまたは複数の外膜小胞体（ＯＭＶ）を含む、免疫原性組成物を提供する。
【０１２６】
「薬学的に許容される担体」には、その組成物を受容する個体に有毒である抗体の産生をそれ自体が誘発しない担体が含まれる。好適な担体は典型的には、タンパク質、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー、スクロース、トレハロース、ラクトースおよび脂質凝集体（例えば油滴またはリポソーム）等の大きく、ゆっくりと代謝される高分子である。このような担体は、通常の技術を有する当業者に周知である。ワクチンは、水、食塩水、グリセロール等の希釈剤を含み得る。さらに、湿潤剤または乳化剤等の補助剤、ｐＨ緩衝物質が存在してもよい。滅菌されパイロゲンを含まない生理食塩水は典型的な担体である。薬学的に許容される賦形剤については、参考文献２８９に記載されている。
【０１２７】
本発明の組成物には、抗菌剤、具体的には複数投与形式にパッケージ化された抗菌剤が含まれる。
【０１２８】
本発明の組成物は、界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ８０等のＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）を含んでももよい。界面活性剤は、一般に例えば０．０１％の低レベルで存在する。
【０１２９】
本発明の組成物は、等張性を得るため、ナトリウム塩（例えば塩化ナトリウム）を含み得る。濃度１０±２ｍｇ／ｍｌ  ＮａＣｌが典型的である。
【０１３０】
本発明の組成物は、一般に緩衝剤を含む。リン酸緩衝液が典型的である。
【０１３１】
本発明の組成物は、糖アルコール（例えばマンニトール）またはジサッカライド（例えばスクロースまたはトレハロース）を、例えば１５〜３０ｍｇ／ｍｌで含み、具体的にはそれらは凍結乾燥されるか、凍結乾燥された材料から再構築された材料を含む。凍結乾燥するための組成物のｐＨは、凍結乾燥前に約６．１に調整されてもよい。
【０１３２】
本発明のポリペプチドは、他の免疫調節剤と組み合わせて投与し得る。特に、その組成物は通常ワクチンアジュバントを含む。後述するように、アジュバントはＴＨ１アジュバントおよびＴＨ２アジュバントからなる１つまたは複数の群から選ばれ得る。本発明の組成物中で使用し得るアジュバントには以下が含まれるが、それらに限定されない。
【０１３３】
Ａ．無機物含有組成物
本発明のアジュバントとして使用するに適した無機物含有組成物には、アルミニウム塩およびカルシウム塩等の無機塩が含まれる。本発明は水酸化物（例えばオキシ水酸化物）、リン酸塩（例えばヒドロキシリン酸塩、オルソリン酸塩）、硫酸塩等の無機塩、または異なる無機化合物の混合物（例えばリン酸塩アジュバントと水酸化物アジュバントと、必要あれば過剰なリン酸塩との混合物）を含み、その化合物は任意の形を取り（例えばゲル、結晶、不定形等）、塩への吸着が好ましい。無機物含有組成物は、金属塩の粒子として調合される［参考文献５４］。
【０１３４】
アルミニウム塩は、Ａｌ３＋の投与量が１回投与あたり０．２〜０．１ｍｇであるように本発明のワクチンに含まれ得る。
【０１３５】
他の実施形態では、本発明のアジュバントはリン酸アルミニウムと水酸化アルミニウムとの双方を含む。より具体的な実施形態では、アジュバントは、水酸化アルミニウムより多くのリン酸アルミニウムを含み、例えば水酸化アルミニウムに対するリン酸アルミニウムの比は、重量比で２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１または９：１より大きい。さらに具体的には、ワクチン中のアルミニウム塩はワクチン投与量あたり０．４〜１．０ｍｇ、またはワクチン投与量あたり０．４〜０．８ｍｇ、またはワクチン投与量あたり０．５〜０．７ｍｇ、またはワクチン投与量あたり約０．６ｍｇである。
【０１３６】
一般的に、好ましいアルミニウム系アジュバント、またはリン酸アルミニウムに対する水酸化アルミニウム等の複数のアルミニウム系アジュバントの比は、所望のｐＨでアジュバントとして抗原が反対電荷を帯びるように分子間の静電引力の最適化により選ばれる。例えば、ｐＩ約４のリン酸アルミニウムアジュバントは、ｐＨ７．４でリゾチームを静電的に吸着するがアルブミンを吸着しない。アルブミンを標的としたい場合は、水酸化アルミニウムがアジュバントとして選ばれる（例えばｐＨ１１．４で）。または、水酸化アルミニウムをリン酸塩で前処理するとそのｐＩを下げ、より塩基性の抗原に対する好ましいアジュバントとなる。
【０１３７】
典型的なリン酸アルミニウムアジュバントは、ＰＯ４／Ａｌモル比が０．８４〜０．９２である非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、０．６ｍｇＡｌ３＋／ｍｌで含まれる。例えば投与量あたりの複合体についてＡｌ３＋５０〜１００μｇで、低い投与量のリン酸アルミニウムの吸着が使用され得る。リン酸アルミニウムが使用され、アジュバントに抗原を吸着しないことが望まれる場合、遊離リン酸イオンを溶液中に含むことが有利である。
【０１３８】
Ｂ．油エマルジョン
本発明でアジュバントとしての使用に適した油エマルジョンには、ＭＦ５９（５％スクワレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０および０．５％Ｓｐａｎ８５；ミクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に調合［参考文献５３の第１０章；参考文献５５〜５７および参考文献５８の第１２章も参照］）等のスクワレン−水エマルジョンが含まれる。ＭＦ５９はＦＬＵＡＤ（商標）インフルエンザウイルス３価サブユニットワクチン中のアジュバントとして用いられる。エマルジョンがクエン酸イオン、例えば１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液を含むことが有利である。
【０１３９】
組成物で使用するために特に好ましいアジュバントは、サブミクロン水中油エマルジョンである。本明細書中での使用に好ましいサブミクロン水中油エマルジョンは、スクワレン／水エマルジョンであり、場合によっては４〜５％ｗ／ｖスクワレン、０．２５〜１．０％ｗ／ｖＴｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）および／または０．２５〜１．０％ｗ／ｖＳｐａｎ８５（ソルビタントリオレエート）、また場合によってはＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’，２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を含むサブミクロン水中油エマルジョン等のＭＴＰ−ＰＥの各種量を含むスクワレン／水エマルジョンである。サブミクロン水中油エマルジョン、その製造方法、組成物中に使用されるムラミルペプチド等の免疫刺激剤は参考文献５５、５９および６０に詳細に記載されている。
【０１４０】
スクワレン、トコフェロールおよびＴｗｅｅｎ８０のエマルジョンを使用することができる。このエマルジョンはリン酸緩衝食塩水を含んでもよい。また、Ｓｐａｎ８５（例えば１％）および／またはレシチンを含んでもよい。これらのエマルジョンは２〜１０％のスクワレン、２〜１０％のトコフェロールおよび０．３〜３％のＴｗｅｅｎ８０を有し、より安定なエマルジョンが得られるのでスクワレン：トコフェロールの重量比は１以下である。このようなエマルジョンの１つはＴｗｅｅｎ８０をＰＢＳ中に２％溶液になるように溶解し、次いでこの溶液９０ｍｌをＤＬ−α−トコフェロール５ｇとスクワレン５ｍｌの混合物と混合し、この混合物をミクロ流体化することにより製造することができる。得られたエマルジョンは、サブミクロン油滴、例えば平均粒径１００〜２５０ｎｍ、好ましくは約１８０ｎｍの油滴を有する。
【０１４１】
スクワレン、トコフェロールおよびＴｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００）のエマルジョンを使用できる。
【０１４２】
スクワレン、ポリソルベート８０およびポロキサマー４０１（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｌ１２１）のエマルジョンを使用できる。このエマルジョンはリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）中で調合できる。このエマルジョンはムラミルジペプチドに対する有用な配送媒体であり、「ＳＡＦ−１」アジュバント（［参考文献６１］；０．０５〜１％Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％スクワレン、２．５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％ポリソルベート８０）中でトレオニル−ＭＤＰと共に使用されている。「ＡＦ」アジュバント（［参考文献６２］；５％スクワレン、１．２５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％ポリソルベート８０）中と同様、Ｔｈｒ−ＭＤＰを含まずに使用することもできる。ミクロ流体化が好ましい。
【０１４３】
完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＣＡＦ）および不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＩＦＡ）は、本発明のアジュバントとして使用し得る。
【０１４４】
Ｃ．サポニン製剤［参考文献５３の第２２章］
サポニン製剤も本発明のアジュバントとして使用し得る。サポニンは、広範囲の植物種の樹皮、葉、幹、根および花にさえ見られるステロールグリコシドとトリテルペノイドグリコシドとの異種グループである。キラヤサポニンの木の皮から単離されたサポニンがアジュバントとして広く研究されている。また、サルサパリラ、コゴメナデシコ（ブライダーベール）およびサポナリア（ソープワート）由来のサポニンが市販されている。サポニンアジュバント製剤にはＱＳ２１等の精製製剤の他、ＩＳＣＯＭ等の脂質製剤が含まれる。
【０１４５】
サポニン成分は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製されている。これらの技術を用いて、ＱＳ７、ＱＳ１７，ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃを含む、具体的な精製分画が同定されている。サポニンがＱＳ２１であることが好ましい。ＱＳ２１の製造法は参考文献６３に開示されている。また、サポニン製剤はコレステロール等のステロールを含んでもよい［参考文献６４］。
【０１４６】
サポニンとコレステロールとの組み合わせを用い、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる独自粒子を形成することができる［参考文献５３の第２３章］。具体的には、ＩＳＣＯＭはホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリン等のリン脂質も含む。ＩＳＣＯＭに任意の既知のサポニンを使用することができる。ＩＳＣＯＭが１つまたは複数のＱｕｉｌＡ，ＱＨＡおよびＱＨＣを含むことが好ましい。ＩＳＣＯＭは参考文献６４〜６６にも記載されている。場合により、ＩＳＣＯＭは追加の界面活性剤を欠いていてもよい［参考文献６７］。
【０１４７】
サポニン系アジュバントの開発のレビューは、参考文献６８および６９に見られる。
【０１４８】
Ｄ．ウイロソームおよびウイルス様粒子
ウイロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）も本発明でアジュバントとして使用できる。これらの構造は、一般に、場合によってはリン脂質と組み合わせた、または調合したウイルス由来の１つまたは複数のタンパク質を含有する。それらのタンパク質は一般に非病原性、非複製であり、一般に天然のウイルスゲノムをまったく含まない。ウイルスタンパク質は組み換え技術により産生されるか、全ウイルスから単離され得る。ウイロソームまたはＶＬＰで使用するに適したこれらのウイルスタンパク質には、インフルエンザウイルス（ＨＡまたはＮＡ等）、Ｂ型肝炎ウイルス（コアまたはカプシドタンパク質等）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡファージ、Ｑβファージ（被覆タンパク質等）、ＧＡファージ、ｆｒファージ、ＡＰ２０５ファージおよびＴｙ（レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１）由来のタンパク質が含まれる。ＶＬＰは参考文献７０〜７５に詳しく記載されている。ウイロソームは、例えば参考文献７６に詳しく記載されている。
【０１４９】
Ｅ．細菌性誘導体または微生物誘導体
本発明で使用するに適したアジュバントには、腸管細菌リポポリサッカライド（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、リピドＡ誘導体、免疫刺激オリゴヌクレオチドおよびＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒化誘導体等の細菌性誘導体または微生物誘導体が含まれる。ＬＰＳの非毒性誘導体にはモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が含まれる。３ｄＭＰＬは４，５、または６アシル化鎖と３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡとの混合物である。３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ由来の好ましい「小粒子」は参考文献７７に開示されている。このような３ｄＭＰＬの「小粒子」は、０．２２μｍの膜を通して滅菌するのに十分な大きさである［参考文献７７］。他の非毒性ＬＰＳ誘導体には、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体、例えばＲＣ−５２９等のモノホスホリルリピドＡ模倣体が含まれる［参考文献７８，７９］。
【０１５０】
リピドＡ誘導体には、ＯＭ−１７４等の大腸菌由来のリピドＡ誘導体が含まる。ＯＭ−１７４は例えば参考文献８０および８１に記載される。
【０１５１】
本発明のアジュバントとして使用するに適した免疫刺激オリゴヌクレオチドには、ＣｐＧモチーフ（リン酸結合でグアノシンと結合した非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）を含むヌクレオチド配列が含まれる。２本鎖ＲＮＡ、および回文式配列またはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチドも、免疫刺激性であることが示されている。
【０１５２】
ＣｐＧはホスホロチオ酸修飾等のヌクレオチド修飾／アナログを含むことが可能で、２本鎖または１本鎖である。参考文献８２，８３および８４は、例えばグアノシンの２’−デオキシ−７−デアザグアノシンによる置換等の可能なアナログ置換を開示している。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献８５〜９０に詳しく議論されている。
【０１５３】
ＣｐＧ配列はモチーフＧＴＣＧＴＣまたはＴＴＣＧＴＴ等のＴＬＲ９を目的とし得る［参考文献９１］。ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮ等のＣｐＧ配列はＴｈ１免疫反応を誘発することに対して特異的であり得、ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮ等のＢ細胞反応をより誘発することに対してより特異的である。ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは参考文献９２〜９４に記載されている。ＣｐＧがＣｐＧ−Ａであることが好ましい。
【０１５４】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体認識のために接近できるように構成される。場合によっては、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列がそれぞれの３’末端で付着し、「免疫物質」を形成する。例えば参考文献９１および９５〜９７参照。
【０１５５】
他の免疫刺激性オリゴヌクレオチドには２本鎖ＲＮＡ、または回文式配列を含むオリゴヌクレオチド、またはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。
【０１５６】
細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒化誘導体を、本発明のアジュバントとして使用し得る。そのタンパク質は大腸菌（大腸菌熱不安定性エンテロ毒素「ＬＴ」）、コレラ菌（「ＣＴ」）または百日咳菌（「ＰＴ」）由来であることが好ましい。解毒化ＡＤＰ−リボシル化毒素の粘膜アジュバントとしての使用は参考文献９８に、非経口アジュバントとしての使用は参考文献９９に記載されている。毒素または類毒素はＡサブユニットおよびＢサブユニットの双方を有する完全毒素の形であることが好ましい。Ａサブユニットは、解毒化突然変異体を含むことが好ましく、Ｂサブユニットは突然変異していないことが好ましい。アジュバントがＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２およびＬＴ−Ｇ１９２等の解毒化ＬＴ突然変異体であることが好ましい。ＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒化誘導体、特にＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２のアジュバントとしての使用は参考文献１００〜１０７に見られる。アミノ酸置換に対する参照番号は、参考文献１０８に示したＡＤＰ−リボシル化毒素のＡサブユニットおよびＢサブユニットの配置に基づくことが好ましく、特にその全文を参照により本明細書に援用する。
【０１５７】
式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物、またはその塩も、アジュバントとして使用できる。
【０１５８】
【化４１】
2008529558.tif 000024
参考文献１０９に定義したように、ＥＲ８０３０５８、ＥＲ８０３７３２、ＥＲ８０４０５３、ＥＲ８０４０５８、ＥＲ８０４０５９、ＥＲ８０４４４２、ＥＲ８０４６８０、ＥＲ８０４７６４、ＥＲ８０３０２２またはＥＲ８０４０５７である。
【０１５９】
【化４２】
2008529558.tif 000025
Ｆ．ヒト免疫モジュレーター
本発明でアジュバントとして使用するに適したヒト免疫モジュレーターにはインターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５，ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［参考文献１１０］）等のサイトカイン［参考文献１１１］、インターフェロン（例えばインターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子ならびにマクロファージ炎症タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）およびＭＩＰ１β［参考文献１１２］が含まれる。
【０１６０】
Ｇ．生物接着剤およびムコ接着剤
生物接着剤およびムコ接着剤も本発明でアジュバントとして使用し得る。好適な生物接着剤には、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア［参考文献１１３］またはポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリサッカライドおよびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体等のムコ接着剤が含まれる。キトサンおよびその誘導体も本発明でアジュバントとして使用し得る［参考文献１１４］。
【０１６１】
Ｈ．ミクロ粒子
ミクロ粒子も本発明のアジュバントとして使用し得る。生分解性で非毒性材料（例えばポリαヒドロキシン酸、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトン等）からなる材料とポリラクチド−コ−グリコライドから作成されるミクロ粒子（すなわち直径約１００ｎｍ〜１５０μｍ、より好ましくは直径約２００ｎｍ〜３０μｍ、最も好ましくは直径約５００ｎｍ〜１０ｎｍの粒子）が好ましく、場合によっては負荷電表面（例えばＳＤＳで）または正荷電表面（例えばＣＴＡＢ等の陽イオン性界面活性剤で）を有するように処理される。
【０１６２】
Ｉ．リポソーム（参考文献５３の第１３および１４章）
アジュバントとして使用するに適したリポソーム製剤の例は、参考文献１１５〜１１７に記載されている。
【０１６３】
Ｊ．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル製剤
本発明で使用するに適したアジュバントには、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル［参考文献１１８］が含まれる。このような製剤には、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステルの界面活性剤［参考文献１１９］の他、オクトキシノール等の少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステルの界面活性剤［参考文献１２０］が含まれる。好ましいポリオキシエチレンエーテルは以下の群より選ばれる。ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ｌａｕｒｅｔｈ９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【０１６４】
Ｋ．ホスファゼン、例えばＰＣＰＰ
例えば参考文献１２１および１２２に記載のように、ホスファゼンアジュバントにはポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］（ＰＣＰＰ）が含まれる。
【０１６５】
Ｌ．ムラミルペプチド
本発明でアジュバントとして使用するに適したムラミルペプチドの例には、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）が含まれる。
【０１６６】
Ｍ．イミダゾキノリン化合物
イミダゾキノリンアジュバントはＩｍｉｑｕｉｍｏｄ（Ｒ−８３７）［参考文献１２３、１２４］、Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ（Ｒ−８４８）［参考文献１２５］、およびそのアナログおよび塩（例えば塩化水素塩）が含まれる。免疫刺激性イミダゾキノリンに関するより詳細な内容は、参考文献１２６〜１３０に見られる。
【０１６７】
Ｎ．チオセミカルバゾン化合物
チオセミカルバゾン化合物、本発明のアジュバントとして使用に適する化合物の配合方法、製造方法およびスクリーニング方法の例として、参考文献１３１の記載が挙げられる。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−α等のサイトカインの産生のためのヒト抹消血単核細胞の刺激に特に有効である。
【０１６８】
Ｏ．トリプタンスリン化合物
トリプタンスリン化合物、本発明のアジュバントとして使用に適する化合物の配合方法、製造方法およびスクリーニング方法の例として、参考文献１３２の記載が挙げられる。トリプタンスリン化合物は、ＴＮＦ−α等のサイトカインの産生のためのヒト抹消血単核細胞の刺激に特に有効である。
【０１６９】
Ｐ．ヌクレオシドアナログ
（ａ）イサトラビン（ＡＮＡ−２４５；７−チア−８−オキソグアニン）：
【０１７０】
【化４３】
2008529558.tif 000026
およびそのプロドラッグ；（ｂ）ＡＮＡ９７５；（ｃ）ＡＮＡ−０２５−１；（ｄ）ＡＮＡ３８０；（ｅ）参考文献１３３〜１３５に開示の化合物；以下の式を有する化合物：
【０１７１】
【化４４】
2008529558.tif 000027
等の様々なヌクレオシドアナログをアジュバントとして使用できる。
式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立にＨ、ハロ、−ＮＲａＲｂ、−ＯＨ、Ｃ１−６アルコキシ、置換Ｃ１−６アルコキシ、複素環、置換複素環、Ｃ６−１０アリール、置換Ｃ６−１０アリール、Ｃ１−６アルキルまたは置換Ｃ１−６アルキルであり；
Ｒ３はないか、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、置換Ｃ６−１０アリール、複素環または置換複素環であり；
Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立にＨ、ハロ、複素環、置換複素環、−Ｃ（Ｏ）−Ｒｄ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキルであるか、または共に結合してＲ４−５中のように５員環を形成し；
【０１７２】
【化４５】
2008529558.tif 000028
Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立にＮ、Ｃ、ＯまたはＳであり；
Ｒ８はＨ、ハロ、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、−ＯＨ、ＮＲａＲｂ、−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−Ｒｃ、−Ｏ−（Ｃ１−６アルキル）、−Ｓ（Ｏ）ｐＲｅまたは−Ｃ（Ｏ）−Ｒｄであり；
Ｒ９はＨ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、複素環、置換複素環またはＲ９ａであり、Ｒ９ａは：
【０１７３】
【化４６】
2008529558.tif 000029
Ｒ１０およびＲ１１はそれぞれ独立にＨ、ハロ、Ｃ１−６アルコキシ、置換Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＲａＲｂまたは−ＯＨであり；
ＲａおよびＲｂはそれぞれ独立にＨ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、Ｃ６−１０アリールであり；
各Ｒｃは独立にＨ、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、Ｃ１−６アルキルまたは置換１−６アルキルであり；
各Ｒｄは独立にＨ、ハロ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、置換Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、−ＮＨ（置換Ｃ１−６アルキル）、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２、−Ｎ（置換ＣＣ１−６アルキル）２、Ｃ６−１０アリールまたは複素環であり；
各Ｒｅは独立にＨ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、置換Ｃ６−１０アリール、複素環または置換複素環であり；
各Ｒｆは独立にＨ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、ホスフェート、ジホスフェートまたはトリホスフェートであり；
各ｎは独立に０、１、２または３であり；
各ｐは独立に０、１または２であるか；または
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの薬学的に許容し得る塩、（ａ）〜（ｆ）のいずれかの互変異性体、または互変異性体の薬学的に許容し得る塩である。
【０１７４】
Ｑ．ホスフェート含有非環式骨格に結合した脂質
ホスフェート含有非環式骨格に結合した脂質を含むアジュバントには、ＴＬＲ４拮抗剤Ｅ５５６４が含まれる［参考文献１３６、１３７］。
【０１７５】
【化４７】
2008529558.tif 000030
Ｒ．小分子免疫促進剤（ＳＭＩＰ）
ＳＭＩＰには以下が含まれる：
・Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
・Ｎ２、Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
・Ｎ２−エチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
・Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
・１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
・Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
・Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
・Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−ペンチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
・Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロペ−２−ニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
・１−（２−メチルプロピル）−２−［（フェニルメチル）チオ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン
・１−（２−メチルプロピル）−２−（プロピルチオ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン
・２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エタノール
・２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エチル酢酸
・４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン
・Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）Ｎ４、Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
・Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
・Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４、Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
・Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４、Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
・１−｛４−アミノ−２−［メチル（プロピル）アミノ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル｝−２−メチルプロパン−２−オール
・１−［４−アミノ−２−（プロピルアミノ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−２−メチルプロパン−２−オール
・Ｎ４，Ｎ４−ジベンジル−１−（２−メトキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン。
【０１７６】
Ｓ．プロテオソーム
１つのアジュバントは、第２グラム陰性細菌由来のリポサッカライド製剤と組み合わせた第１グラム陰性細菌から調製された、外膜タンパク質プロテオソーム製剤であって、外膜タンパク質プロテオソームとリポサッカライド製剤とは安定な非共有結合アジュバント複合体を形成する。このような複合体には、髄膜炎菌外膜とリポポリサッカライド類とからなる複合体である「ＩＶＸ−９０８」が含まれる。それらはインフルエンザワクチンに対するアジュバントとして使用されている［参考文献１３８］。
【０１７７】
Ｔ．他のアジュバント
免疫刺激剤として作用する他の物質は、参考文献５３の第７章、参考文献５３、５８に開示されている。その他の有用なアジュバント物質には以下が含まれる。
・メチルイノシン−５’−モノホスフェート（ＭＩＭＰ）［参考文献１３９］
・以下の式を有するポリヒドロキシル化ピロリジン化合物［参考文献１４０］：
【０１７８】
【化４８】
2008529558.tif 000031
式中、Ｒは水素、直鎖状または分枝状、未置換または置換、飽和または不飽和アシル、アルキル（例えばシクロアルキル）、アルケニル、アルキニルおよびアリール基、またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体からなる群より選ばれる。それらの例にはカスアリン、カスアリン−６−α−Ｄ−グルピラソース、３−エピ−カスアリン、７−エピ−カスアリン、３，７−ジエピ−カスアリン等が含まれるが、それらに限定されない。
・γイヌリン［参考文献１４１］またはアルガムリン等のその誘導体
・参考文献１４２に開示された化合物
・アシルピペラジン化合物、インドレジオン化合物、テトラヒドライソキノリン（ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンズイミダゾールキノリン（ＡＢＩＱ）化合物［参考文献１４４，１４５］、ヒドラフタルアミド化合物、ベンゾフェノン化合物、イソオキサゾール化合物、ステロール化合物、キナジリノン化合物、ピロール化合物［参考文献１４６］、アンスラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラゾピリミジン化合物およびベンザゾール化合物［参考文献１４７］を含み参考文献１４３に開示された化合物。
・ロキソリビン（７−アリル−８−オキソグアノシン）［参考文献１４８］
・アミノプロピル−ジメチル−ミリストレイルオキシ−プロパナミウムブロマイド−ジフィタノイルホスファチジル−エタノールアミン（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（商標））またはアミノプロピル−ジメチル−ビス−ドデシルオキシプロパナミウムブロマイド−ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミン（ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ：ＤＯＰＥ）等の陽イオン性脂質および（通常中性）共脂質。（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（ｓｙｎ−９−テトラデセネイルオキシ）−１−プロパナミウム塩が好ましい［参考文献１４９］。
【０１７９】
本発明は、１つまたは複数の上記で特定したアジュバントの組み合わせを含み得る。例えば、以下の組み合わせを本発明のアジュバント組成物として使用し得る：（１）サポニンおよび水中油エマルジョン［参考文献１５０］；（２）サポニン（例えばＱＳ２１）＋毒性ＬＰＳ誘導体（例えば３ｄＭＰＬ）［参考文献１５１］；（３）サポニン（例えばＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えばＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（随意に＋「ステロール」）［参考文献１５２］；（５）３ｄＭＰＬと例えばＱＳ２１および／または水中油エマルジョンとの組み合わせ［参考文献１５３］；（６）１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ  ８０（商標）、５％プルロニンブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰを含むＳＡＦ、サブミクロンエマルジョンにミクロ流体化するか、渦流攪拌して大きい粒子サイズのエマルジョンとする；（７）２％スクワレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、ならびにモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジマイコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群より選択される１つまたは複数の細菌細胞壁成分、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））を含むＲｉｂｉ（商標）アジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；（８）１つまたは複数の無機塩（アルミニウム塩等）＋ＬＰＳの非毒性誘導体（３ｄＭＰＬ等）；および（９）１つまたは複数の無機塩（アルミミウム塩等）＋免疫刺激性オリゴヌクレオチド（ＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列）。
【０１８０】
本発明の組成物は、尿路病原体感染を効果的に標的にするために、細胞媒介免疫反応と共に体液性免疫反応を誘発することが好ましい。この免疫反応は、長期持続性（例えば中和）抗体と、ＭＮＥＣ関連抗原に曝されると迅速に反応することが可能な細胞媒介免疫とを誘導することが好ましい。
【０１８１】
細胞媒介免疫と体液性免疫とを開始および／または増強するために、２つのタイプのＴ細胞、ＣＤ４およびＣＤ８が一般に必要であると考えられている。ＣＤ８  Ｔ細胞はＣＤ８共受容体を発現し、一般に細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と呼ばれている。ＣＤ８  Ｔ細胞はＭＨＣクラスＩ分子上に提示された抗原を認識、またはそれと作用することができる。ＣＤ４  Ｔ細胞はＣＤ４共受容体を発現し、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合した抗原ペプチドを認識する。ＭＨＣクラスＩＩ分子と相互作用して、ＣＤ４細胞はサイトカイン等の因子を分泌することができる。これらの分泌されたサイトカインはＢ細胞、細胞障害性Ｔ細胞、マクロファージおよび免疫反応に関与する他の細胞を活性化することができる。ヘルパーＴ細胞またはＣＤ４＋細胞は、２つの機能的に異なるサブセット、すなわちサイトカインおよびエフェクター機能で異なるＴＨ１表現型とＴＨ２表現型とにさらに分類することができる。
【０１８２】
活性化ＴＨ１細胞は、細胞性免疫を増強するため（抗原特異性ＣＴＬ産生の増加を含み）、細胞内感染に反応する場合に特に価値がある。活性化ＴＨ１細胞は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−βの１つまたは複数を分泌し得る。ＴＨ１免疫反応は、マクロファージ、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞およびＣＤ８細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化することにより局部炎症反応を生じ得る。ＩＬ−２でＢおよびＴ細胞の成長を刺激することにより、ＴＨ１免疫反応は免疫反応を拡大する働きをし得る。ＴＨ１刺激Ｂ細胞はＩｇＧ２ａを分泌し得る。
【０１８３】
活性化ＴＨ２細胞は抗体の産生を増強するため、細胞外感染に反応する場合に特に価値がある。活性化ＴＨ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０の１つまたは複数を分泌し得る。ＴＨ２免疫反応はＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡおよび先の保護のための記憶Ｂ細胞を産生し得る。
【０１８４】
増強された免疫反応には、増強されたＴＨ１免疫反応およびＴＨ２免疫反応の１つまたは複数を含み得る。増強されたＴＨ１免疫反応には、ＣＴＬの増加、ＴＨ１免疫反応を伴う１つまたは複数のサイトカインの増加（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−β等）、活性化マクロファージの増加、ＮＫ活性の増加、またはＩｇＧ２ａ産生の増加の１つまたは複数が含まれる。増強されたＴＨ１免疫反応には、ＩｇＧ２ａ産生の増加が含まれることが好ましい。増強されたＴＨ２免疫反応には、ＴＨ２免疫反応に伴うサイトカインの１つまたは複数（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０等）の増加、またはＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡおよび記憶Ｂ細胞の産生の増加の１つまたは複数が含まれ得る。増強されたＴＨ２免疫反応にＩｇＧ１産生の増加が含まれることが好ましい。
【０１８５】
ＴＨ１免疫反応を、ＴＨ１アジュバントを用いて誘発し得る。ＴＨ１アジュバントは、アジュバントなしの抗原の免疫と比較して、一般にＩｇＧ２ａ産生の増加レベルを誘発する。本発明で使用するに適したＴＨ１アジュバントには、例えばサポニン製剤、ウイロソームおよびウイルス様粒子、腸内細菌リポポリサッカライド（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、免疫刺激性オリゴヌクレオチドが含まれ得る。ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド等の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、本発明で使用するための好ましいＴＨ１アジュバントである。
【０１８６】
ＴＨ２免疫反応を、ＴＨ２アジュバントを用いて誘発し得る。ＴＨ２アジュバントは、アジュバントなしの抗原の免疫と比較して、一般にＩｇＧ１産生のが増加レベルを誘発する。本発明で使用するに適したＴＨ２アジュバントの例には、無機物含有組成物、オイルエマルジョン、ＡＤＰリボシル化毒素およびその解毒化誘導体が含まれる。アルミニウム塩等の無機物含有組成物は、本発明で使用するのに好ましいＴＨ２アジュバントである。
【０１８７】
本発明はＴＨ１アジュバントとＴＨ２アジュバントとの組み合わせからなる組成物を含むことが好ましい。このような組成物は増強されたＴＨ１およびＴＨ２反応、すなわちアジュバントなしの免疫と比較してＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ双方の産生の増加を誘発することが好ましい。ＴＨ１アジュバントとＴＨ２アジュバントとの組み合わせからなる組成物が、単一アジュバントによる免疫と比較して（すなわちＴＨ１アジュバント単独の免疫またはＴＨ２アジュバント単独の免疫と比較して）ＴＨ１および／またはＴＨ２免疫反応の増加を誘発することがさらに好ましい。
【０１８８】
免疫反応は、ＴＨ１免疫反応およびＴＨ２免疫反応の一方または双方であってよい。免疫反応は、増強されたＴＨ１反応と増強されたＴＨ２反応の一方または双方を提供することが好ましい。
【０１８９】
増強された免疫反応は全身性および粘膜免疫反応の一方または双方であってよい。免疫反応は、増強された全身免疫反応と増強された粘膜免疫反応の一方または双方を提供することが好ましい。粘膜免疫反応がＴＨ２免疫反応であることが好ましい。粘膜免疫反応には、ＩｇＡ産生の増加が含まれることが好ましい。
【０１９０】
水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムアジュバントの使用が特に好ましく、抗原は一般にこれらの塩に吸着される。リン酸カルシウムがまたさらに好ましいアジュバントである。
【０１９１】
本発明の組成物のｐＨは６〜８の間、約７であることが好ましい。緩衝液を使用することにより、安定なｐＨを維持し得る。組成物が水酸化アルミニウム塩を有する場合、ヒスチジン緩衝液を使用することが好ましい［参考文献１５４］。組成物は滅菌されている、および／またはパイロジェンを含まない。本発明の組成物はヒトに対して等張であってよい。
【０１９２】
組成物はバイアル中で提供されるか、または充填済み注射器中で提供される。注射器は針付きまたは針なしでもよい。注射器は、組成物の１回投与量を含むが、バイアルは１回投与量または複数回投与量を含んでよい。注射可能組成物は通常は液体溶液または懸濁液である。あるいは、組成物は、溶液または懸濁液のために固体形（例えば凍結乾燥）、あるいは注射前に液体媒体で提供されてもよい。
【０１９３】
本発明の組成物は１回投薬剤または複数回投薬剤として梱包されてもいよい。複数回投薬製剤では、予備充填注射器よりもバイアルが好ましい。有効投与体積を経験的に確立し得るが、注射用組成物の典型的なヒトに対する投与量は０．５ｍｌである。
【０１９４】
本発明の組成物を使用前にその場で調製する（すなわち、組成物が凍結乾燥物で提供される）キットとして提供される場合、そのキットは２つのバイアルを有するか、または１つの充填済み注射器と１個のバイアルとを有し、注射器の内容物を注射前にバイアルの内容物と反応させて使用する。
【０１９５】
従って、本発明は第１成分と第２成分を有するキットを提供し、第１成分は１つまたは複数のポリペプチド、抗体、小胞体および／または本発明の核酸を含み、第２成分は以下の１つまたは複数を有する：組成物を患者に投与するための説明書、注射器または他の配送器具、アジュバント、および／または薬学的に許容し得る調合溶液。
【０１９６】
また、本発明は、本発明の免疫原組成物で予備充填された配送器具（例えば注射器）を提供する。
【０１９７】
ワクチンとして使用される免疫原組成物は免疫的に有効量の抗原の他、必要に応じて任意の他の成分を有する。「免疫的に有効量」とは、１回投与または一連の投与のいずれであっても、個体に対するその量の投与が治療または予防に有効であることを意味する。この量は治療する個体の健康状態と体調、年齢、処置される個体の分類群（例えば非ヒト霊長類、霊長類等）、個体の免疫系の抗体合成能、所望する防御の程度、ワクチンの配合、医学的状態の処置医の評価、および他の関連する因子で変化する。その量は通常の試行により決定することができる比較的広い範囲に入ると予想され、投与量あたりの各髄膜炎菌サッカライド抗原の典型的な量は１μｇ〜１０ｍｇの間である。
【０１９８】
薬剤の使用
本発明は、患者に治療的に有効量の本発明の組成物を投与する工程からなる患者の処置方法を提供する。患者は疾患自体の危険のある患者であるか、または妊婦である（母体免疫［参考文献１５５］）。
【０１９９】
本発明は、医薬（例えば免疫原性組成物またはワクチン）または診断薬として使用する本発明の核酸、ポリペプチド、小胞体または抗体を提供する。また、本発明は（ｉ）ＥｘＰＥＣ細菌で発症する疾患および／または感染を治療もしくは予防する医薬、（ｉｉ）ＥｘＰＥＣ細菌に対して高まる抗体の存在を検出するための診断薬、および／または（ｉｉｉ）ＥｘＰＥＣ細菌に対する抗体を生じ得る試薬の製造における、本発明の核酸、ポリペプチド、小胞体または抗体の使用を提供する。上記ＥｘＰＥＣ細菌は任意の抗原型または株であるが、ＭＮＥＣ細菌、例えばＫ１抗原型および／またはＢ２ＭＬＥＥ型であることが好ましい。
【０２００】
本発明は菌血症、髄膜炎、尿路感染、腎盂腎炎および／または膀胱炎等の疾患の予防および／または治療に有用である。本発明は敗血症および／または髄膜炎の治療に特に有用である。
【０２０１】
患者はヒトであることが好ましい。ヒトは子供（例えば０〜１８歳、または０〜５歳）、青年期（例えば１５〜１９歳）、成人（例えば１９〜５４歳）または老人（例えば５５歳以上）である。女性の青年期および成人が好ましい患者群である。子供または青年期を対象とするワクチンを、例えば安全性、投与量、免疫原性等を評価するために成人に投与してもよい。
【０２０２】
他の可能な患者動物にはＥｘＰＥＣに感染の担体である犬が含まれる［参考文献１５６、１５７］。
【０２０３】
治療処置の効力をチェックする１つの方法は、本発明の組成物の投与後に感染をモニターすることである。予防処置の効力をチェックする１つの方法は、投与後のポリペプチドに対する免疫反応をモニターすることである。本発明の組成物の免疫原性を、試験対象（例えば年齢１２〜１６ヶ月の子供、または動物モデル、例えばマウスモデル）に投与し、ＩｇＧのＥＬＩＳＡ力価（ＧＴＭ）を含む標準パラメーターを決定することにより原性を決定することができる。これらの免疫反応を一般に組成物の投与後約４週間測定し、組成物の投与前に測定した値と比較する。１回の投与量を超える組成物を投与する場合、１回を超える投与後測定を行う。敗血症の成体マウスモデル、ＵＴＩのマウスモデル、および幼児ラットの髄膜炎からの受動防御を用いても、効力を評価し得る。
【０２０４】
ポリペプチド抗原の投与は免疫誘導処置の好ましい方法である。本発明の抗体の投与は、また別の好ましい方法である。受動免疫のこの方法は、新生児または妊婦に対し特に有用である。この方法は具体的にはヒト型または完全にヒトのモノクローナル抗体を使用する。
【０２０５】
一般に本発明の組成物を患者に直接投与する。直接配送は非経口注射（例えば皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内または組織の腸内空間）、または直腸内、経口（例えば錠剤、スプレー）、膣内、局所、経皮、経皮膚、鼻腔内、舌下、眼球内、口腔内、腸内または他の粘膜投与により行い得る。太腿または上腕への筋肉内投与が好ましい。針を用いて、注射し得る（例えば皮下針）が、針を用いない注射も使用し得る。典型的な筋肉内投与量は０．５ｍｌである。
【０２０６】
本発明を全身および／または粘膜免疫を誘発するために用い得る。増強された全身および／または粘膜免疫が増強されたＴＨ１および／またはＴＨ２免疫反応に反映されることが好ましい。増強された免疫反応にＩｇＧ１および／またはＩｇＧ２ａおよび／またはＩｇＡの増加が含まれることが好ましい。
【０２０７】
投薬処置は、１回投与スケジュールでも複数回投与スケジュールでも可能である。１次免疫スケジュールおよび／または追加免疫スケジュールでも複数回投与を使用し得る。１次投与スケジュールの後に追加投与スケジュールを行ってよい。複数回投与スケジュールでは、同じ経路または、例えば非経口免疫刺激投与と粘膜追加投与、粘膜免疫刺激投与と非経口追加投与等の異なる経路で様々な量を投与し得る。免疫刺激投与間の好適なタイミング（例えば４〜１６週）および免疫刺激投与と追加投与との間の好適なタイミングを経験的に決定することができる。例えば、予防接種の一次コースには１〜１０回の独立な投与が含まれ、その後免疫反応を維持および／または強化するために必要な連続時間間隔、例えば２回目の投与に対し１〜４ヶ月、必要な場合はその後の投与（１回または複数回）は数ヶ月後に行われる。
【０２０８】
細菌感染は身体の様々な領域に影響するので、組成物は様々な形で調製される。例えば、液体または懸濁液のいずれかで注入物質として組成物を調製し得る。注射前の液体媒体中の溶液または懸濁液として適した固体形を調製することができる（例えば凍結乾燥または噴霧乾燥組成物）。組成物を局所投与用、例えば軟膏、クリームまたは粉末として調製してもよい。組成物を経口投与用、例えば錠剤またはカプセル、またはスプレー（必要あれば風味付）として調製してもよい。組成物を肺投与用、例えば微粉末またはスプレーを用いる吸入薬として調製してもよい。組成物を座薬またはペッサリーとして調製してもよい。」組成物を鼻、口腔または眼球投与用、例えばスプレー、点眼薬、げるまたは粉末として調製してもよい［例えば参考文献１５８、１５９］。組成物は、患者へ投与する直前に組み合わせた組成物を再構成するように設計されたキットの形でもよい。このようなキットは液体の形の１つまたは複数の抗体と、１つまたは複数の凍結乾燥抗原を有し得る。
【０２０９】
実質的に他のワクチンと同時（例えば同じ医療相談または健康管理専門医への外来受診中）に、例えば麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、ｂ型インフルエンザ桿菌混合ワクチン、ヒト乳頭種ワクチン、不活性化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、肺炎球菌混合ワクチン、髄膜炎菌混合ワクチン等と実質的に同時に本発明の組成物を患者に投与してもよい。同様に、それらのワクチンを抗生物質、特にＭＮＥＣに対し活性である抗生物質化合物と実質的に（例えば同じ医療相談または健康管理専門医への外来受診中に）同時に患者に投与してもよい。
【０２１０】
本発明の組成物の別の抗原性成分
また、本発明は、本発明のポリペプチドを有する組成物、および１つまたは複数の以下の別の抗原を提供する。
−  血清型Ｃ由来の参考文献１６０で開示されたオリゴサッカライド［参考文献１６１も参照］または参考文献１６２のオリゴサッカライド等の髄膜炎菌Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹ（好ましくは４種全て）由来のサッカライド抗原。
−  参考文献１６３〜１７１に開示されたような髄膜炎菌血清型Ｂ由来の抗原等。
−  肺炎連鎖球菌由来のサッカライド抗原［例えば参考文献１７２，１７３，１７４］
−  不活性化ウイルス等のＡ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば参考文献１７５、１７６］。
−  表面および／またはコア抗原等のＢ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば参考文献１７６、１７７］。
−  ジフテリア毒素［例えば参考文献１７８の第３章参照］等のジフテリア抗原、例えばＣＲＭ１９７突然変異体［例えば参考文献１７９］。
−  Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば参考文献１８０］。
−  ＨＩＶ由来の抗原［参考文献１８１］。
−  破傷風毒素等の破傷風抗原［例えば参考文献１７８の第４章］。
−  百日咳完全毒素（ＰＴ）等の百日咳菌由来の抗原および百日咳菌由来の糸状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、場合によってはパータクチンおよび／または凝集原２および３と組み合わせる［例えば参考文献１８２、１８３］。
−  Ｂ型インフルエンザ菌由来のサッカライド抗原［例えば参考文献１６２］。
−  ＩＰＶ等のポリオ抗原［例えば参考文献１８４、１８５］。
−  麻疹、流行性耳下腺炎および／または風疹抗原［例えば参考文献１７８の第９、１０、１１章］。
−  水痘抗原
−  赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質等のインフルエンザ抗原［例えば参考文献１７８の第１９章］。インフルエンザ抗原は間流行期（年間）インフルエンザ株由来でもよい。インフルエンザ抗原は爆発的流行を引き起こす可能性を有する株由来でもよい（すなわち、現在流行中の株中の赤血球凝集素と比較して新規赤血球凝集素を有するインフルエンザ株、または鳥類で病原性であり、人類中に水平伝播する可能性を有するインフルエンザ株、またはヒトに病原性であるインフルエンザ株）。インフルエンザ抗原は卵または培養細胞中で生育したウイルス由来でもよい。
−  カタラリヌ菌由来の抗原［例えば参考文献１８６］。
−  減乳性連鎖球菌（Ｂ型連鎖球菌）由来のサッカライド抗原。
−  減乳性連鎖球菌（Ｂ型連鎖球菌）由来のタンパク質抗原［例えば参考文献１８７、１８８］。
−  淋病由来の抗原［例えば参考文献１８９〜１９２］。
−  クラミジア肺炎菌由来の抗原［例えば参考文献１９３〜１９９］またはクラミジア肺炎菌由来の抗原との組み合わせ［例えば参考文献２００］。
−  クラミジアトラコマチス由来の抗原、またはクラミジアトラコマチス由来の抗原の組み合わせ［例えば参考文献２０１］。
−  ポルフィロモナスジンジバリス由来の抗原［例えば参考文献２０２］。
−  凍結乾燥不活性化ウイルス［例えば参考文献２０４、ＲａｂＡｖｅｒｔ（商標）］等の狂犬病抗原［例えば参考文献２０３］。
−  呼吸合胞性ウイルス（ＲＳＶ［参考文献２０５、２０６］）および／またはパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ３［参考文献２０７］）等のパラミキソウイルス由来の抗原。
−  炭疸菌由来の抗原［例えば参考文献２０８、２０９、２１０］。
−  化膿連鎖球菌（Ａ型連鎖球菌）由来の抗原［例えば参考文献１８８、２１１、２１２］。
−  黄色ブドウ球菌由来の抗原［例えば参考文献２１３］。
−  黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルスの４つの血清型、マダニ媒介脳炎ウイルス、西ナイルウイルス等のフラビウイルス群（フラビウイルス属）中のウイルス由来の抗原。
−  古典的ブタコレラウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルスおよび／またはボーダー病ウイルス由来等のペスチウイルス抗原。
−  例えばパルボウイルスＢ１９由来のパルボウイルス抗原。
−  ヒト乳頭腫（ＨＰＶ）抗原［参考文献２１４］。
【０２１１】
組成物はこれらその他の抗原の１つまたは複数を含有してもよい。
【０２１２】
好ましい淋病抗原にはｎｇｓ１３（ＯｍｐＡ）、ＯｍｐＨ、ｎｇｓ５７６（ペプチジル−プロリルｃｉｓ／ｔｒａｎｓイソメラーゼ（ＰＰＩａｓｅ）タンパク質）、ｎｇｓ４１およびｎｇｓ１１７の１つまたは複数が含まれる。
【０２１３】
好ましいＨＰＶ抗原にはＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１が含まれる。
【０２１４】
好ましいクラミジアトラコマチス抗原には、ＷＯ０５／００２６１９に開示されたＣＴ０４５、ＣＴ０８９、ＣＴ２４２、ＣＴ３１６、ＣＴ３８１、ＣＴ３９６、ＣＴ３９８、ＣＴ４４４、ＣＴ４６７、ＣＴ５４７、ＣＴ５８７、ＣＴ８２３、ＣＴ７６１の１つまたは複数、およびこれら抗原の特定の組み合わせが含まれる。
【０２１５】
好ましいＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原には、ＷＯ０５／０８４３０６に開示されたＣｐｎ０３２４、Ｃｐｎ０３０１、Ｃｐｎ０４８２、Ｃｐｎ０５０３、Ｃｐｎ０５２５、Ｃｐｎ０５５８、Ｃｐｎ０５８４、Ｃｐｎ０８００、Ｃｐｎ０９７９、Ｃｐｎ０４９８、Ｃｐｎ０３００、Ｃｐｎ００４２、Ｃｐｎ００１３、Ｃｐｎ４５０、Ｃｐｎ０６６１、Ｃｐｎ０５５７、Ｃｐｎ０９０４、Ｃｌｐｎ０７９５、Ｃｐｎ０１８６およびＣｐｎ０６０４の１つまたは複数、およびこれら抗原の特定の組み合わせが含まれる。
【０２１６】
好ましいＧＢＳ抗原にはＧＢＳ８０、ＧＢＳ１０４、ＧＢＳ５９、ＧＢＳ６７、ＧＢＳ３２２およびＧＢＳ２７６の１つまたは複数が含まれる。
【０２１７】
他の実施形態では、泌尿生殖器および／または性感染病に対して女性を防御するために設計されたワクチン中で使用するに適した、１つまたは複数のさらなる非大腸菌抗原と、本発明の抗原とが組み合わされる。例えば、その抗原を減乳性連鎖球菌、クラミジアトラコマチス、淋病、ヒト乳頭種ウイルスおよび単純疱疹ウイルスからなる群由来の抗原と組み合わせ得る。ヒト乳頭種ウイルスを使用する場合、それらはＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１の１つまたは複数に由来し得る。
【０２１８】
他の実施形態では、本発明の抗体の組み合わせは、高齢のまたは免疫無防備状態の個人を防御するために設計されたワクチン中で使用するのに適した、１つまたは複数のさらなる非ＥｘＰＥＣ抗原と組み合わされる。例えば、上記の抗原の組み合わせは、エンテロコッカス  フェカリス、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、緑膿菌、レジオネラニューモフィラ菌、リステリア菌、髄膜炎菌、インフルエンザおよびパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）からなる群由来の抗原と組み合わせ得る。
【０２１９】
毒性タンパク質抗原は、必要あれば解毒化される（例えば化学的および／または遺伝的手段による百日咳毒素の解毒化［参考文献１８３］）。
【０２２０】
ジフテリア抗原が組成物に含まれる場合、破傷風および百日咳抗原も含まれることが好ましい。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、ジフテリアおよび破傷風抗原も含まれることが好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリアおよび破傷風抗原も含まれることが好ましい。従ってＤＴＰの組み合わせが好ましい。
【０２２１】
サッカライド抗原は複合体の形であることが好ましい。複合体のための担体タンパク質には細菌毒素（ジフテリア毒素または破傷風毒素等）、髄膜炎菌外膜タンパク質［参考文献２１５］、合成ペプチド［参考文献２１６、２１７］、熱ショックタンパク質［参考文献２１８、２１９］、百日咳タンパク質［参考文献２２０、２２１］、インフルエンザ桿菌由来のタンパク質Ｄ［参考文献２２２、２２３］、サイトカイン［参考文献２２４］、リンフォカイン［参考文献２２４］、インフルエンザ桿菌タンパク質、ホルモン［参考文献２２４］、成長因子［参考文献２２４］、クロストリジウム  ディフィシルクロス由来の毒素Ａまたは毒素Ｂ［参考文献２２５］、鉄取り込みタンパク質［参考文献２２６］、Ｎ１９タンパク質［参考文献２２８］等の様々な病原体由来の抗原［参考文献２２７］由来の複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ［参考文献２２９］、肺剥離［参考文献２３０］等が含まれる。好ましい担体タンパク質はＣＲＭ１９７タンパク質である［参考文献２３１］。
【０２２２】
組成物中の抗原は典型的にはそれぞれ少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般に、任意の与えられた抗原の濃度は、その抗原に対する免疫反応を誘起するに十分である。
【０２２３】
抗原がアルミニウム塩に吸着されていることが好ましい。
【０２２４】
核酸免疫処置
上記の免疫原性組成物はＭＮＥＣ由来のポリペプチド抗原を含む。本発明の免疫原性組成物中にタンパク質抗原を使用する代わりに、その抗原をコードする核酸（好ましくはプラスミドの形のＤＮＡ）を使用し、核酸免疫処置に基づく組成物、方法および使用が得られる。核酸免疫処置は現在開発された分野であり（例えば参考文献２３２〜２３９参照）、多くのワクチンに応用されている。
【０２２５】
免疫原をコードする核酸は患者に配送後にインビボで発現し、発現した免疫原が免疫系を刺激する。活性成分は典型的には（ｉ）プロモーター、（ｉｉ）免疫原、場合によってはプロモーターと結合した免疫原をコードする配列、および場合によっては（ｉｉｉ）選択性マーカーを有する核酸ベクターの形を取る。好ましいベクターは、さらに（ｉｖ）複製起点、および（ｉｉ）の下流であり、作動的に結合する転写ターミネーターを有する。一般に、（ｉ）および（ｖ）は真核性であり、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）は原核性である。
【０２２６】
好ましいプロモーターはウイルスプロモーター、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーターである。ベクターはまた、プロモーター以外にそのプロモーターと機能的に相互作用する転写調節配列（例えばエンハンサー）を含んでもよい。好ましいベクターは最初期ＣＭＶエンハンサー／プロモーターを含み、より好ましいベクターはＣＭＶイントロンＡも含む。免疫原コード配列がプロモーターの制御下にあるように、プロモーターは免疫原をコードする下流配列と作動的に結合している。
【０２２７】
マーカーを使用する場合、そのマーカーが微生物宿主中（例えば原核細胞、細菌、酵母中で）で機能することが好ましい。マーカーは原核性選択マーカー（例えば原核性プロモーターの制御下に転写される）であることが好ましい。便宜上、典型的なマーカーは抗生物質耐性遺伝子である。
【０２２８】
本発明のベクターはプラスミド等の自己複製または染色体外ベクターであることが好ましい。
【０２２９】
本発明のベクターは複製起点を有することが好ましい。複製起点は、原核細胞中では活性であるが、真核細胞中では活性でないことが好ましい。
【０２３０】
従って、好ましいベクターはベクター選択用の原核性マーカー、すなわち原核性複製起点を含むが、免疫原コード配列の転写を駆動する真核性プロモーターも含む。従って上記ベクターは、（ａ）ペプチドを発現せずに原核宿主中で増幅され選択されるが、（ｂ）増幅されずに真核宿主中で発現する。この配置は核酸免疫処理ベクターにとって理想的である。
【０２３１】
本発明のベクターはコード配列の下流に真核性転写停止配列を有してもよい。これにより転写レベルが増大する。コード配列がそれ自体を有さない場合、本発明のベクターがポリアデニル化配列を有することが好ましい。好ましいポリアデニル化配列はウシ成長ホルモン由来である。
【０２３２】
本発明のベクターは複数のクローニング部位を有してもよい。
【０２３３】
免疫原とマーカーとをコードする配列以外に、第２真核コード配列を有し得る。免疫原と同じ転写産物から第２真核性ポリペプチドの転写を行うため、ベクターはまた第２配列の上流にＩＲＥＳを有してもよい。または、免疫原コード配列がＩＲＥＳの下流であってもよい。
【０２３４】
本発明のベクターは非メチル化ＣｐＧモチーフ、例えばグアノシンの前に共通のシトシンを有し、２個の５’プリンと２個の３’ピリミジンで挟まれた非メチル化ＤＮＡ配列を有し得る。非メチル化の形で、これらのＤＮＡモチーフはいくつかのタイプの免疫細胞の強力な刺激因子であることが示されている。
【０２３５】
ベクターは標的を定めて配送される。受容体媒介ＤＮＡ治療技術は、例えば参考文献２４０〜２４５に記載されている。遺伝子治療プロトコールにおける局所投与では、核酸を含む治療用組成物は、ＤＮＡ約１００ｎｇ〜約２００ｍｇの範囲で投与される。また、約５００ｎｇ〜５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜１００μｇの濃度範囲を遺伝子治療プロトコールで使用できる。作用方法（例えばコードされた遺伝子産物のレベルを増大または阻害するための）、および形質転換および発現の効力等の因子が、最終的な効力に必要な投与量に影響する検討項目である。組織のより広い範囲で大きな発現が望まれる場合、陽性の治療結果を得るためにはより多量のベクターの投与、または投与の連続プロトコールにおける同量の再投与、または異なる隣接または近接組織部分への数回の投与が必要である。あらゆる場合に、臨床試験における定期的実験により最適治療効果の特定の範囲が決定される。
【０２３６】
遺伝子配送媒体を用いてベクターを配送することができる。遺伝子配送媒体はウイルス起源または非ウイルス起源である（一般的に参考文献２４６〜２４９参照）。
【０２３７】
所望の核酸を配送し、所望の細胞中で発現させるためのウイルス系ベクターは、糖技術分野において公知である。ウイルス系媒体の例には組み換えレトロウイルス（例えば参考文献２５０〜２６０）、αウイルス系ベクター（例えばシンビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロス川ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２）、これらのウイルスのハイブリッドまたはキメラも使用し得る）、ポックスウイルスベクター（例えばワクシナ、伝染上皮腫、カナリアポックス、修飾ワクシナアンカラ等）、アデノウイルスベクター、およびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが含まれるが（例えば参照文献２６１〜２６６参照）、それらに限定されない。殺菌アデノウイルス［参考文献２６７］に結合したＤＮＡの投与も使用できる。
【０２３８】
非ウイルス配送媒体および方法も用いられ、殺菌アデノウイルスのみに結合した、または結合しないポリカチオン縮合ＤＮＡ［例えば参考文献２６７］、リガンド結合ＤＮＡ［参考文献２６８］、真核細胞配送媒体細胞［例えば参考文献２６９〜２７３］、および核電荷中和または細胞膜との融合が含まれるが、それらに限定されない。裸のＤＮＡを用いることもできる。裸のＤＮＡ導入法は参考文献２７４および２７５に記載されている。遺伝子配送媒体として作用できるリポソーム（例えば免疫リポソーム）は参考文献２７６〜２８０に記載されている。その他のアプローチは参考文献２８１および２８２に記載されている。
【０２３９】
使用するに適したさらなる非ウイルス配送には、参考文献２８２に記載されるような機械的配送システムが含まれる。さらに、コード配列およびその発現産物を、光重合ハイドロゲル材料の沈殿により、またはイオン化放射線の使用により配送することができる［例えば参考文献２８３および２８４］。コード配列の配送のために使用し得る遺伝子配送のための他の従来の方法には、例えば手持型遺伝子転送粒子銃［参考文献２８５］、または転送遺伝子を活性化するためのイオン化放射線の使用が含まれる［参考文献２８３および２８６］。
【０２４０】
例えばミクロ粒子への吸着によるＰＬＧ（ポリ（ラクチド−コ−グリコリド））ミクロ粒子を用いるＤＮＡ配送が特に好ましい方法であり、場合によっては負荷電表面（例えばＳＤＳ処理）または正荷電表面（例えばＣＴＡＢ等の陽イオン界面活性剤処理）を有するように処理される。
【０２４１】
一般的記述
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含する。例えばＸを含むとは、Ｘのみからなるか、または何か別のもの、例えばＸ＋Ｙを含み得る。
【０２４２】
数値ｘに関連する用語「約」は、例えばｘ±１０％を意味する。
【０２４３】
用語「実質的に」は「完全に」を除外しない。例えばＹが「実質的にない」組成物は、Ｙが完全になくてもよい。必要な場合、用語「実質的に」は本発明の定義から除外し得る。
【０２４４】
配列表中のアミノ酸配列におけるＮ末端残基は、一般に対応するヌクレオチド配列中の最初のコドンでコードされるアミノ酸として与えられる。最初のコドンがＡＴＧでない場合（例えば配列番号
【０２４５】
【化４９】
2008529558.tif 000032
【０２４６】
【化５０】
2008529558.tif 000033
）、配列が開始コドンとして作用するとき、メチオニンとして翻訳されるが、配列が融合パートナーのＣ末端であるとき、指定された非メチオニンアミノ酸として翻訳されることが理解される。任意の指定された非メチオニン残基（例えば配列番号
【０２４７】
【化５１】
2008529558.tif 000034
）の代わりにＮ末端メチオニン残基（例えばホルミルメチオニン残基）を有する配列表の各アミノ酸配列を特に開示し、包含する。また、本発明は配列中の任意の内部メチオニン残基で開始する配列表の各アミノ酸配列も特に開示し包含する。
【０２４８】
上記テキストに示すように、本発明の核酸およびポリペプチドは以下の配列を含み得る。
【０２４９】
（ａ）配列表に開示された配列と同一（すなわち同一性１００％）の配列；
（ｂ）配列表に開示された配列を同じ同一度を共有する配列；
（ｃ）１、２、３，４，５、６、７、８，９または１０個の単一ヌクレオチドまたはアミノ酸の変化（欠失、挿入、置換）を有する配列であって、（ａ）または（ｂ）の配列と比較して別々な場所にあるか、または隣接する配列；および
（ｄ）対比較配置アルゴリズムを用いて該配列から特定の配列で整列した場合、ｐモノマー（ｐ＞ｘの場合）へ伸長する配置ではｐ−ｘ＋１個のこのようなウインドウが存在するように、開始点（５’Ｎ末端）から終了点（３’Ｃ末端）へ移動するｘモノマー（アミノ酸またはヌクレオチド）の移動ウインドウでは、各ウインドウは少なくともｘ−ｙ個の同一配置モノマーを有する。ここでｘは２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００から選ばれ、ｙは０．５０．０．６０、０．７０、０．８０、０．８５、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９から選ばれ、ｘ−ｙが整数でない場合は最近似整数へ桁上げされる。
【０２５０】
好ましい対比較アルゴリズムは、デフォルトパラメーター（例えばギャップ開放ペナルティ＝１０．０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．５、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用）を用いるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｈグローバル整列アルゴリズム［参考文献２８７］である。このアルゴリズムはＥＭＢＯＳＳパッケージ中のニードルツール中で実行すると便利である。
【０２５１】
本発明の核酸およびポリペプチドは、これらの配列（ａ）〜（ｄ）のＮ末端／５’および／またはＣ末端／３’に続くさらなる配列をさらに有し得る。
【０２５２】
特に断らない限り、当業者の技術範囲で本発明の実施は、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬学の従来の方法を採用する。このような技術は文献中に十分に説明されている。例えば参考文献２８９〜２９６等を参照。
【０２５３】
（実験の部）
以下は、本発明を実行するための具体的な実施形態または形態の例である。例は説明の目的のみで提供され、決して本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【０２５４】
使用した数値（例えば量、温度等）の精度を保障する努力を行ったが、当然、いくらかの実験誤差および偏差は許されるものとする。
【０２５５】
（本発明を実施するための形態）  
ＭＮＥＣ株ＩＨＥ３０３４
ＩＨＥ３０３４は、ＭＮＥＣ病原型の公知の大腸菌株である。参考文献２９７の表１は、ＩＨＥ３０３４がＯ１８：Ｋ１：Ｈ７／９血清型として分類され、ＥＣＯＲグループＢ２に属することを報告している。水平転移ＤＮＡ要素についての既知の病原性関連遺伝子はｓｆａＩＩ、ｉｂｅＡ、ｉｒｏ、ｋｐｓ（グループＩＩ）、ｆｙｕＡおよびｍａｌＸである。その株は、細胞致死膨隆毒素に対しコードするｃｄｔ遺伝子クラスターも運ぶ。
【０２５６】
大腸菌Ｋ１株ＩＨＥ３０３４の配列決定から２８３の連結フラグメントが得られた。これらは長さの減少順にまとめた配列番号９９９１〜１０２７３として与えられる。
【０２５７】
大腸菌Ｋ１株ＩＨＥ３０３４のゲノム配列の解析により、４９９５のオープンリーディングフレームを同定したが、それらはＯＲＦｎｎｎｎｎと命名され、ｎｎｎｎｎは０００１〜０４９９５の間の番号である。これらのＯＲＦの配列は配列番号１〜９９９０として与えられ、奇数配列番号はＤＮＡ配列であり、偶数配列番号はアミノ酸配列である。ｎｎｎｎｎの番号付けを配列番号に変換することが可能で、配列表の番号付けは以下の通りである：アミノ酸配列に対しては配列番号＝ｎｎｎｎｎ×２；ヌクレオチド配列に対しては配列番号＝［ｎｎｎｎｎ×２］−１。従って、表１に示すように、ＯＲＦ１２３４は配列番号２４６７および２４６８として見出される。
【０２５８】
４９９５のＯＲＦのイニシャル機能注釈記号は表１に与えられる。
【０２５９】
表３は共生株ＯＲＦとの相同性が低いＯＲＦを示す（合計１１９４）。これらのＯＲＦは、核酸試験および免疫交差反応性の双方の関係で共生株に対する病原性大腸菌株の特異性を与えるために好ましい。潜在的病原性島はＯＲＦ０００２８〜７０、ＯＲＦ０００３３０〜３５３、ＯＲＦ００６５５〜６８７、ＯＲＦ００８８３〜９１０、ＯＲＦ０１０３１〜１０５８、ＯＲＦ１０７８〜１１１９、ＯＲＦ１１８６〜１２２８、ＯＲＦ１３１３〜１３７６、ＯＲＦ０１４７９〜１５１４、ＯＲＦ０１５２３〜１５４３、ＯＲＦ０１５５０〜１５７８、ＯＲＦ０１８１０〜１８６５、ＯＲＦ０２２９５〜０２３１５、ＯＲＦ０２３５１〜２３７５、ＯＲＦ０２３８２〜２４０５、ＯＲＦ０２４３６〜２４７２、ＯＲＦ０２７８８〜０２８１６、ＯＲＦ０２８４４〜２８９１、ＯＲＦ０３０１１〜３０５６、ＯＲＦ０３３４０〜３３６５、ＯＲＦ０３４９９〜３５２２、ＯＲＦ０４４１６〜４４３９、ＯＲＦ０４６６１〜４６７９、ＯＲＦ０４９１５〜４９３０およびＯＲＦ０４９４６〜４９６６の範囲に位置している。
【０２６０】
本発明者らが加えた様々な評価基準に基づき、免疫原としての使用のために４９９５のＯＲＦの１４２のサブセット（２．８％）を選んだ。これらの１４２のＯＲＦは表２に列記されている。サブセット選択のための基準には共生大腸菌由来のＯＲＦとの低い相同性、１００ａａ以上の長さ、および好適な細胞局在性が含まれる（表２の下に示す）が、それらに限定されない。
【０２６１】
これらの１４２個のタンパク質をコードする遺伝子をクローン化し、細菌中（例えば非病原性実験室大腸菌宿主、または枯草菌または巨大菌等のバチルス）で発現し、精製し、使用して、試験動物（例えばマウス）を免疫処理する。マウス内で感作した血清をウエスターンブロット、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析で解析し、インビトロおよびインビボ実験でさらに試験した。好適なインビトロ実験には、補体媒介殺菌および／またはオプソニン食菌活性を誘導する抗体の能力の試験、ヒト上皮細胞またはその他の細胞株へのＭＮＥＣ株（または精製抗原）の結合を妨害する能力の試験、および／または大腸菌細菌（例えばＫ１株）の脳毛細血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）への付着／侵入阻害能の試験が含まれる。菌血症および髄膜炎に対する効力を試験するための好適なインビトロ実験には、大腸菌Ｋ１株で攻撃された５日齢ラットへの能動および／または受動全身免疫処理および抗原投与、および成体マウスのＭＮＥＣ株による免疫処理および腹腔内感染である。
【０２６２】
タンパク質の細菌ライフサイクルに対する重要性を、同質遺伝ノックアウト突然変異体を作成することにより試験できる。また、突然変異体を使用し、抗原で感作した血清がその抗原に対し特異的であることを確認することができる。マイクロアレイを使用して、発現パターンを研究することができる。複数の異なるＥｘＰＥＣ株由来の遺伝子の配列決定により、保存性および／または可変性を評価できる。
【０２６３】
ＭＮＥＣに対し特異的であり、非病原性株（共生株および実験室株）にはない、予想された表面暴露タンパク質を選ぶために分析を行った。選択後、これらのタンパク質を発現させ、精製して、使用して、マウスを免疫処理する。
【０２６４】
参考文献４３から、任意の大腸菌のｔｏｌ−ｐａｌ遺伝子の突然変異により、天然の外膜タンパク質を含む小胞体が形成することが知られている。ＭＮＥＣ株および非病原性株の小胞体中に存在するタンパク質を比較することにより、潜在的抗原として使用し得るタンパク質の小さなグループを選ぶことができる。
【０２６５】
共生および病原性大腸菌におけるλレッド媒介遺伝子操作
この方法は、野生型大腸菌株由来のｔｏｌＲ遺伝子を不活性化するために使用される迅速ＰＣＲに基づく方法である［参考文献２９８］。簡単に言えば、第１工程は標的遺伝子（ｔｏｌＲ）と耐性マーカーカセットの上流および下流領域を独立に増幅する工程からなる。工程１で得られた２つのＰＣＲ産物を、ＡＢカセットの増幅プロジューサーと等モル濃度で混合し、第２ラウンドのＰＣＲ（３方向ＰＣＲ）に供し、標的遺伝子と相同である上流および下流の５００ｂｐ（またはそれ以上）の領域ではさまれた耐性マーカーカセットを作成する。第３工程で、大量（１μｇ）の所定の直鎖状ＤＮＡをλレッドコンピテント細胞中にエレクトロポーレーションする。
【実施例】
【０２６６】
（小胞体の調製）
１．ＴＣＡ沈殿による小胞体の調製
プレート生育した細菌をＬＢ培地に播種し、穏やかに振盪して３７℃で終夜インキュベーションした。培養細胞を使用して、２００ｍｌのＬＢにＯＤ６００ｎｍが０．１で播種する。培養細胞を４０００×ｇで１０分間遠心分離し、上澄を０．２２ｍｍのフィルターを通して濾過し残存細菌を除去した。
【０２６７】
ジピリジル（０．２５ｍＭ）をＬＢ培地に添加することによる鉄限定条件下で同じ実験を行った。
【０２６８】
１００％（ｗ／ｖ）ＴＣＡでの溶液の最終濃度１０％、０．４％（ｗ／ｖ）デオキシコーレートを培養上澄に加えることにより、沈殿を生成させた。４℃、３０分間で沈殿を進行させた。沈殿を４℃、２０００×ｇで１０分間遠心分離して沈殿を回収した。ペレットを１０％ＴＣＡ（ｗ／ｖ）で１回、無水エタノールで２回洗浄した。ペレットを高速乾燥機で乾燥し、−２０℃で保存した。
【０２６９】
野生株および突然変異株をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、そこから野生株より突然変異株の上澄中により多くのバンドがあることが観測された。バンドを無秩序に取り出すと、上澄中の全てのタンパク質が膜タンパク質であることが分かった。
【０２７０】
２．超遠心分離による小胞体の調製
培養上澄を４℃で２時間、２０００００×ｇで超遠心分離した。ペレットをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中に懸濁させ、−２０℃で貯蔵した。
【０２７１】
３．小胞体のグアニジウム変性
グアニジウム変性の前に小胞体をエタノールで沈殿させた。最終濃度９０％で冷無水エタノールを加えることにより、ＰＢＳ中の１０μｇのＯＭＶが沈殿した。−２０℃で２０分間、沈殿を進行させた。１３０００×ｇで１０分間遠心分離して沈殿を回収した。ペレットを５０ｍｌの６Ｍグアニジウム、１５ｍＭ  ＤＴＴ、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０溶液で再懸濁した。
【０２７２】
６０℃で６０分間、変性を進行させた。消化前に溶液を１．５Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０溶液で１／８に希釈し、希釈液に５ｍｇのトリプシンを加えた。３７℃で終夜、消化を進行させた。最終濃度０．１％のギ酸を加えて反応を停止した。Ｏａｓｉｓ抽出カートリッジを用いてペプチドを抽出した。ＬＣ−結合ＭＳ−ＭＳでペプチドを分析した。
【０２７３】
４．表面消化
ＰＢＳ中の１０ｍｇの小胞体に５ｍｇにトリプシンを加え、３７℃で３時間インキュベーションした。最終濃度０．１％のギ酸を加え反応を停止した。３０Ｋｄａカットオフフィルターを通して濾過してペプチドを回収し、Ｏａｓｉｓ抽出カートリッジで抽出した。ペプチドをＬＣ結合ＭＳ−ＭＳで分析した。
【０２７４】
（小胞体分析）
タンパク質定量
ＢＳＡを標準試料として用い、タンパク質をＢｒａｄｆｏｒｄ法により定量した。
【０２７５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ電気泳動装置を用い、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）４〜１２％ポリアクリルアミドゲルで試料を分析した。試料をＳＤＳ試料緩衝液（０．０６Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、５％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、１０ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー）中に懸濁し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の前に１００℃で５分間加熱した。加熱後、ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅで染色した。
【０２７６】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル
タンパク質のバンドまたはスポットをゲルから切り出し、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム／アセトニトリル（５０／５０、ｖ／ｖ）で洗浄し、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ遠心機（Ｓａｖａｎｔ製）で乾燥した。５ｍＭ炭酸水素アンモニウム、０．０１２ｍｇの配列解析グレードトリプシンを含む７〜１０ｍｌの溶液を加えることにより、乾燥スポットを３７℃で２時間消化した。消化後、０．６ｍｌをマトリックスプレスポット標的上に載せ、空気乾燥した。スポットを７０％エタノール、０．１％トリフルオロ酢酸溶液０．６ｍｌで洗浄した。ウルトラフレックスＭＡＬＤＩ  ＴＯＦマススペクトロメーター上でマススペクトルを得た。標的上にプレスポットした標準試料の組み合わせを用いて、スペクトルを外部補正した。Ｍａｓｃｏｔプログラムによるコンピュータ作成指紋を用い、質量範囲７００〜３０００Ｄａの実験的に生成したペプチドの単一同位体ピークの自動および手動比較により、タンパク質を同定した。
【０２７７】
２次元電気泳動
２００ｍｇの小胞体をＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ再膨潤溶液（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、２％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ、２％（ｗ／ｖ）ＡＳＢ１４、２％（ｖ／ｖ）ＩＰＧ緩衝液、ｐＨ３〜１０ＮＬ、２ｍＭ  ＴＢＰ、６５ｍＭ  ＤＴＴ）に再懸濁し、７ｃｍのＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅＤｒｙＳｔｒｉｐ（ｐＨ３〜１０ＮＬ）上に終夜吸着させた。次いでタンパク質を２次元電気泳動で分離した。ＩＰＧｐｈｏｒ等電点電気泳動ユニットを用いて第１次元泳動を行い、１５０Ｖ／３５分、５００Ｖ／３５分、１０００Ｖ／３０分、２６００Ｖ／１０分、３５００Ｖ／１５分、４２００Ｖ／１５分、最後に５０００Ｖを順次印加し、各１０ｋＶｈに達した。第２次元泳動では、ストリップを４Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、３０％グリセロール、２％ＳＤＳ、５ｍＭ  ＴＢＰ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、２．５％アクリルアミド、ブロモフェノールブルー０．２％中で２回の１０分間インキュベーションにより平衡し、次いでタンパク質を１次元４〜１２％プレキャストポリアクリルアミドゲル上で分離した。
【０２７８】
ゲルをコロイド状クーマシーブルーで染色し、Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ  ＳＩで走査した。画像をＩｍａｇｅ  Ｍａｓｔｅｒ  ２Ｄ  Ｅｌｉｔｅソフトウエアで解析した。
【０２７９】
ナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳ
ナノスプレー線源を備えたＱ−ＴｏＦミクロＥＳＩ質量分析計に接続したＣａｐＬＣ  ＨＰＬＣシステム上のナノＬＣによりペプチドを分離した。Ｃ１８トラップカラム（内径３００μｍ×５ｍｍ）を通して試料をＡｔｌａｎｔｉｓ  Ｃ１８ＮａｎｏＥａｓｅカラム（内径１００μｍ×１００ｍｍ）に負荷した。０．１％ギ酸溶液中の２％〜６０％の９５％ＡＣＮの５０分勾配、流速４００ｎｌ／分でペプチドを溶離した。溶離されたペプチドをＭａｓｓＬｙｎｘソフトウエアバージョン４．０を用いる自動化データ依存取得プログラムに供した。ここで、ＭＳ／ＭＳフラグメンテーションのために複数荷電ペプチドをｍ／ｚ範囲４００〜２０００にわたって自動的に選択するためにＭＳ探索走査を用いた。３つの異なる成分まで同時にＭＳ／ＭＳフラグメンテーションに供した。データ取得後、個々のＭＳ／ＭＳスペクトルを組み合わせ、ＭａｓｓＫｙｎｘで平滑化し重心を合わせた。ＭＡＳＣＯＴのライセンスされたバージョンでペプチドの検索と同定をバッチモードで行った。ＭＡＳＣＯＴ検索パラメーターは：（１）種別：ＥｘＰＥＣ、（２）失われた断片の可能な数（トリプシン消化に対してのみ）：６、（３）可変翻訳後修飾：メチオニン酸化、（４）ペプチド許容度：±５００ｐｐｍ、（５）ＭＳ／ＭＳ許容度：±０．３Ｄａ、および（６）ペプチド電荷：＋１〜＋４。以前のプラットホームに関しては、ＭＡＳＣＯＴ確立解析で定義された有意性ヒットのみを考慮した。少なくとも１個のペプチドからのタンパク質同定の承認のためのスコア閾値を、ＭＡＳＣＯＴによりトリプシン消化に対して１８、プロテナーゼＫ消化に対して３６と設定した。
【０２８０】
結果
上記解析の結果として、さらに１０個の好ましい抗原が同定された。すなわちｏｒｆ０３５２６（配列番号：７０５１＋７０５２）、ｏｒｆ０１３３９（配列番号：２６７７＋２６７８）、ｏｒｆ００２５６（配列番号：５１１＋５１２）、ｏｒｆ０１３４６（配列番号：２６９１＋２６９２）、ｏｒｆ０４０８４（配列番号：８１６７＋８１６８）、ｏｒｆ０２３７４（配列番号：４７４７＋４７４８）、ｏｒｆ０３５０２（配列番号：７００３＋７００４）、ｏｒｆ０２２９８（配列番号：４５９５＋４５９６）、ｏｒｆ０１２２８（配列番号：２４５５＋２４５６）、ｏｒｆ０１２２７（配列番号：２４５３＋２４５４）、ｏｒｆ０２３４１（配列番号：４６２７＋４６２８）およびｏｒｆ０２８５０（配列番号：５６９９＋５７００）。これらは表４に記されるが、これらのタンパク質のＵＰＥＣ株ＣＦＴ０７３のタンパク質に対する同一性も与えられる。さらに好ましい抗原は、上記と同じ方法で同定されたＣＦＴ０７３株由来の好ましい抗原と６０％より高い同一性を表す抗原である。これらの好ましい抗原はｏｒｆ０４２８２（配列番号：）８５６３＋８５６４、ｏｒｆ０１３６４（配列番号：２７２７＋２７２８）、ｏｒｆ０４９３６（配列番号：９８７１＋９８７２）、ｏｒｆ０２３３６（配列番号：４６７１＋４６７２）、ｏｒｆ０２８４０（配列番号：５６７９＋５６８０）、ｏｒｆ００２６７（配列番号：５３３＋５３４）、ｏｒｆ０１６１１（配列番号：３２２１＋３２２２）、ｏｒｆ０１６１３（配列番号：３２２５＋３２２６）およびｏｒｆ０３５０２（配列番号：７００３＋７００４）である。
【０２８１】
（抗原分析）
全身感染のマウスモデル
病原性および非病原性大腸菌株間の比較ゲノム解析により選ばれた多数の抗原をスクリーニングするため、古典的病原性分析に基づく防御モデルを確立した。
【０２８２】
実験モデル（免疫処置および感染）は、病原性ＩＨＥ３０３４大腸菌株の腹腔内接種で抗原投与した５週齢ＣＤ１異系交配マウスを使用する。免疫投与量は、成体マウスの８０％を７２時間以内に殺すことができる細菌量として実験的に決定され、ＩＨＥ３０３４株では１×１０７ｃｆｕ／マウスに相当する。
【０２８３】
病原性因子および潜在的防御抗原として記載された２種のタンパク質を陽性対照として使用した。これらのタンパク質はＩｂｅＡ［参考文献２９９］およびＩｒｏＮ（配列番号：２６９１、２６９２；参考文献３００、３０１）である。組み換えタンパク質が発現し、免疫処理分析で使用された。
【０２８４】
免疫処理プロトコール
以下の表に示されるように、フロインドのアジュバントを用いて１５０μｌのタンパク質溶液の皮下注射でマウスを３回免疫処理した。
【０２８５】
【表１】
2008529558.tif 000035
最初の免疫処理の前日（前免疫血清）、第３４日および第４８日（抗原投与前日）に血液試料を採集した。免疫処理動物由来の動物由来の血清をウエスターンブロットおよびＥＬＩＳＡで試験し、抗体力価を決定した。
【０２８６】
（抗原投与）
第４８日に大腸菌ＩＨＥ３０３４株を凍結保存からＬＢ寒天プレート上にストリークし、インキュベーター中、３７℃で終夜（ＯＮ）インキュベーションした。第４９日にＯＮプレート培養細胞を使用して５０ｍｌのＬＢ培地にＯＤ６００＝０．１になるように接種し、培養細菌がＯＤ６００＝０．６（ＩＨＥ３０３４株５×１０８ｃｆｕ／ｍｌに相当）に達するまで３７℃で１．５時間、攪拌しながら生育させた。培養細胞を細菌濃度が１×１０８／ｍｌになるまで生理食塩水で希釈し（典型的には２ｍｌの細菌培養液を８ｍｌの生理食塩水で希釈）、標準プレートカウント法を用いてプレートし、接種液を検証した。１×１０７ＩＨＥ３０３４細菌を含む１００μｌの細胞懸濁液を、１ｍｌ注射器を用いて対照および免疫処理マウスに腹腔内注射した。感染後の２４、４８および７８時間における各動物グループ中の死亡数を記録した。
【０２８７】
抗原投与から７２時間の予防接種群中の生存率と対照群中の生存率とを比較することにより、予防接種による防御を評価する。対照群に対する生存率を、以下の式を用いて計算する：
［（予防接種群中の生存率）−（対照群中の生存率）］／（対照群中の生存率）
結果
陽性対照ＩｒｏＮおよびＩｂｅＡにより免疫処理を上記のように行った。図３および４が示すように、ＩＨＥ３０３４による抗原投与後のマウスの生存率は、ＩｒｏＮまたはＩｂｅＡいずれによる免疫処理後でも増加している。
【０２８８】
次に熱不活性化ＩＨＥ３０３４による免疫処理を行った。図１に示すように、熱不活性化ＩＨＥ３０３４による免疫処理後のＩＨＥ３０３４による抗原投与後にマウスの生存率は増加した。
【０２８９】
ＩＨＥ３０３４ΔＴｏｌ−Ｒ由来の小胞体による免疫処理も行った。図２に示すように、ＩＨＥ３０３４ΔＴｏｌ−Ｒによる免疫処理後のＩＨＥ３０３４による抗原投与後のマウスの生存率は増加する。
【０２９０】
免疫処理の研究
本発明の組成物が得られるように、抗原を選択し組み合わせた。ＢＡＬＢ／ｃマウスを９つのグループに分け、以下のように免疫処理した。
【０２９１】
【表２】
2008529558.tif 000036
マウスを２週間間隔で免疫処理した。最後の免疫処理から２〜３週間後、全てのマウスに適当なＭＮＥＣ株を抗原投与した。粘膜免疫処理を用いた場合（例えば鼻腔内）、動物モデルに粘膜抗原投与を行い粘膜免疫原の防御効果を試験した。抗原投与直前にマウスから採血し、投与した抗原に対する抗体力価を測定した。
【０２９２】
マウス抗原投与のため、病原性細菌を好適な培地中で生育させる。細菌を遠心分離で採集し、再懸濁し、抗原投与接種のために順次希釈した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに抗原投与し、暴露後３０日間、毎日観察した。
【０２９３】
全細菌および精製組み換えタンパク質についてのＥＬＩＳＡ分析を用いて、異なる免疫処理レジメから得られるマウス血清中で全ＩｇＧおよびＩｇＧ／ＩｇＧ２Ａサブタイプを測定することができる。さらに、免疫処理マウスから分離された脾臓細胞および／またはＰＢＭＣ中の抗原特異性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＴＨ細胞の評価を多重パラメーターＦＡＣＳ解析で行い、抗原特異性Ｔ細胞のサイトカイン発現特性を評価することができる。特に、Ｔ細胞の精製抗原によるインビトロ刺激後のＩＦＮ−γおよびＩＬ５の産生を測定することができる。さらに、各抗原／ワクチン製剤で免疫処理したマウス由来の脾臓細胞および／またはＰＢＭＣを、最終免疫処理投与後１０〜１２日に採集し、ＭＮＥＣ細菌で刺激することができる。刺激の４時間後、以後の１２時間にＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡを細胞に加え、サイトカイン分泌を妨害する。その後、細胞を固定し、抗体で染色してＩＦＮ−γおよびＩＬ−５を発現するＭＮＥＣ特異性Ｔ細胞を検出する。
【０２９４】
当業者に公知の様々な方法により、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）よりＴ細胞を単離することができる。例えば、付随物およびＢ細胞を除去することにより、Ｔ細胞集団をＰＢＬ集団から「濃縮」することができる。特に、抗ＭＨＣクラスＩＩモノクローナル抗体を用いて非Ｔ細胞を除外することにより、Ｔ細胞濃縮を行うことができる。同様に、非Ｔ細胞の特定の群を減少させるために他の抗体を使用することができる。例えば、Ｂ細胞を減少させるために抗Ｉｇ抗体が使用でき、マクロファージを減少させるために抗ＭａｃＩ抗体を使用できる。
【０２９５】
当業者に公知の技術により、Ｔ細胞をいくつかの異なるサブ集団に分割することができる。細胞表面マーカーＣＤ４およびＣＤ８の発現の差に基づき、２つの主要なサブ集団を単離することができる。例えば、上記のようにＴ細胞を濃縮後、ＣＤ４特異性抗体を用いてＣＤ４＋細胞を濃縮することができる。この抗体を磁気ビーズ等の固体支持体に結合する。逆に、ＣＤ４に対し特異的な抗体を使用して（ＣＤ４＋を除去するため）ＣＤ８＋細胞を濃縮できる、または固体支持体に結合したＣＤ８抗体を使用してＣＤ８＋Ｔ細胞を単離できる。形質導入の前または後にＭＮＥＣ感染患者由来のＣＤ４リンパ球をエクスビボで増殖できる。
【０２９６】
Ｔ細胞の精製後、精製Ｔ細胞をリンパ球の成長と活性化を促進するｒＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５を含むがそれに限定されない様々なサイトカインで予備刺激する。
【０２９７】
ＭＮＥＣ特異性Ｔ細胞を上記の免疫原性ポリペプチドで活性化し得る。ＭＮＥＣ特異性Ｔ細胞はＣＤ８＋またはＣＤ４＋である。ＮＭＥＣ特異性ＣＤ８＋細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子と複合体化した上記のポリペプチドまたはその断片のいずれかを表示するＭＮＥＣ感染細胞を殺すことのできる細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）である。Ｃｈｌａｍｙｄｉａ特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞を、例えば５１Ｃｒ放出分析で検出できる。５１Ｃｒ放出分析は、これらのエピトープの１つまたは複数を表示する標的細胞をＭＮＥＣ特異性ＣＲ８＋Ｔ細胞が溶菌する能力を測定する。ＩＦＮγ等の抗ウイルス剤を表示するＭＮＥＣ特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞も本明細書で考慮され、免疫学的方法により、好ましくは上記ＭＮＥポリペプチドの１つまたは複数によるインビトロ刺激の後、ＩＦＮ−γまたは同様なサイトカインに対する細胞間染色により検出することができる。ＭＮＥＣ特異性ＣＤ４＋Ｔ細胞をリンパ球増殖分析で検出することができる。リンパ球増殖分析は、ＭＮＥＣ特異性ＣＤ４＋Ｔ細胞が上記ポリペプチドの１つまたは複数と反応して増殖する能力を測定する。
【０２９８】
本発明は、実施例のみを用いて、説明したものであり、本発明の範囲と趣旨の範囲内で変更し得ることが理解されると思われる。
【０２９９】
【表３−１】
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【０３００】
【表３−２】
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【０３０１】
【表３−３】
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【０３０２】
【表３−４】
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【０３０３】
【表３−５】
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【０３０４】
【表３−６】
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【０３０５】
【表３−７】
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【０３０６】
【表３−８】
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【表３−９】
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【０３０８】
【表３−１０】
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【０３０９】
【表３−１１】
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【０３１０】
【表３−１２】
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【表３−１４】
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【０３２０】
【表３−２２】
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【表３−２３】
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【０３２２】
【表３−２４】
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【０３２３】
【表３−２５】
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【表３−２６】
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【０３２５】
【表３−２７】
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【０３２６】
【表３−２８】
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【０３２７】
【表３−２９】
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【０３２８】
【表３−３０】
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【０３２９】
【表３−３１】
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【０３３０】
【表３−３２】
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【０３３１】
【表３−３３】
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【０３３２】
【表３−３４】
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【０３３３】
【表３−３５】
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【０３３４】
【表３−３６】
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【０３３５】
【表３−３７】
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【０３３６】
【表３−３８】
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【０３３７】
【表３−３９】
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【０３３８】
【表３−４０】
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【０３３９】
【表３−４１】
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【０３４０】
【表３−４２】
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【０３４１】
【表３−４３】
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【０３４２】
【表３−４４】
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【０３４３】
【表３−４５】
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【０３４４】
【表３−４６】
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【０３４５】
【表３−４７】
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【０３４６】
【表３−４８】
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【０３４７】
【表３−４９】
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【０３４８】
【表３−５０】
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【０３４９】
【表３−５１】
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【０３５０】
【表３−５２】
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【０３５１】
【表３−５３】
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【０３５２】
【表３−５４】
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【０３５３】
【表３−５５】
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【０３５４】
【表３−５６】
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【０３５５】
【表３−５７】
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【０３５６】
【表３−５８】
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【０３５７】
【表３−５９】
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【０３５８】
【表３−６０】
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【０３５９】
【表３−６１】
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【０３６０】
【表３−６２】
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【０３６１】
【表３−６３】
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【０３６２】
【表３−６４】
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【０３６３】
【表３−６５】
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【０３６４】
【表３−６６】
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【０３６５】
【表３−６７】
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【０３６６】
【表３−６８】
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【０３６７】
【表３−６９】
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【０３６８】
【表３−７０】
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【０３６９】
【表３−７１】
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【０３７０】
【表３−７２】
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【０３７１】
【表３−７３】
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【０３７２】
【表３−７４】
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【０３７３】
【表３−７５】
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【０３７４】
【表３−７６】
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【０３７５】
【表３−７７】
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【０３７６】
【表３−７８】
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【０３７７】
【表３−７９】
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【０３７８】
【表３−８０】
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【０３７９】
【表３−８１】
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【０３８０】
【表３−８２】
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【０３８１】
【表３−８３】
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【０３８２】
【表３−８４】
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【０３８３】
【表３−８５】
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【０３８４】
【表３−８６】
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【０３８５】
【表３−８７】
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【０３８６】
【表３−８８】
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【０３８７】
【表３−８９】
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【０３８８】
【表３−９０】
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【０３８９】
【表３−９１】
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【０３９０】
【表３−９２】
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【０３９１】
【表３−９３】
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【０３９２】
【表３−９４】
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【０３９３】
【表３−９５】
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【０３９４】
【表３−９６】
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【０３９５】
【表３−９７】
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【０３９６】
【表３−９８】
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【０３９７】
【表３−９９】
2008529558.tif 000135
【０３９８】
【表３−１００】
2008529558.tif 000136
【０３９９】
【表４】
2008529558.tif 000137
【０４００】
【表５−１】
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【０４０１】
【表５−２】
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【０４０２】
【表５−３】
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【０４０３】
【表５−４】
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【０４０４】
【表６】
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（参考文献（これらの内容は本明細書中に参考として援用される））
【０４０５】
【化５２】
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【０４０６】
【化５３】
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【０４０７】
【化５４】
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【０４０８】
【化５５】
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【０４０９】
【化５６】
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【０４１０】
【化５７】
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【０４１１】
【化５８】
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【０４１２】
【化５９】
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【０４１３】
【化６０】
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【図面の簡単な説明】
【０４１４】
【図１】図１は、加熱不活性化ＩＨＥ３０３４または対照（フィシオール）で免疫化し、ＩＨＥ３０３４を抗原投与後のマウスの経時的な生存率、および２４時間後の菌血症レベル（ｃｆｕ／ｍｌ）を示す。
【図２】図２は、加熱不活性化細菌（上図）またはΔＴｏｌＲ変異体由来の小胞体（下図）のいずれかで免疫化後、ＩＨＥ３０３４を抗原投与後のマウスの生存率を示す。免疫原をＩＨＥ３０３４株または対照株（ＤＨ５）から調製した。
【図３】図３は、ＩｒｏＮまたは対照で免疫化後、ＩＨＥ３０３４を抗原投与後のマウスの生存率（上図）、および血清抗ＩｒｏＮ  Ｉｇ力価（下図）を示す。
【図４】図４は、図３と同様であるが、ＩｒｏＮの代わりにＩｂｅＡを使用した例を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年1月11日(2008.1.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008529558000001.app
【国際調査報告】
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2008529558.tif 000176
2008529558.tif 000177
2008529558.tif 000178
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