(57)【要約】  本発明は、脊椎動物におけるトウモロコシＡｃ／Ｄｓ転移因子の使用に関する。
2008545391.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾Ａｃトランスポゼースに結合できる逆方向反復間に位置するポリヌクレオチドを含んでなる核酸断片。
【請求項２】
前記逆方向反復が、
（ａ）Ｄｓ因子の一部である逆方向反復、
（ｂ）Ｄｓ５’末端シス要求配列の一部およびＤｓ３’末端シス要求配列の一部である逆方向反復、
（ｃ）配列番号４５で記載されたヌクレオチド配列を有するＤｓ５’末端シス要求配列の一部および配列番号４９で記載されたヌクレオチド配列を有するＤｓ３’末端シス要求配列の一部である逆方向反復、
（ｄ）配列番号１のヌクレオチド３６５７〜３９０３で記載されたヌクレオチド配列を有するＤｓ５’末端シス要求配列の一部および配列番号１のヌクレオチド４３〜４１２で記載されたヌクレオチド配列を有するＤｓ３’末端シス要求配列の一部である逆方向反復、および
（ｅ）（ｃ）または（ｄ）のＤｓ５’末端シス要求配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するＤｓ５’末端シス要求配列の一部および（ｃ）または（ｄ）のＤｓ３’末端シス要求配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するＤｓ３’末端シス要求配列の一部であり、Ｄｓ５’末端シス要求配列およびＤｓ３’末端シス要求配列が前記修飾Ａｃトランスポゼースに結合できる逆方向反復、
よりなる群から選択される、請求項１に記載の核酸断片。
【請求項３】
ベクターの一部である請求項１に記載の核酸断片。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、魚のゲノム内に安定に組み込まれている請求項１に記載の核酸断片。
【請求項５】
前記修飾Ａｃトランスポゼースが、配列番号８に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、脊椎動物細胞のＤＮＡへのポリヌクレオチドの組込みを触媒する請求項１に記載の核酸断片。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが、オープンリーディングフレームの少なくとも一部を含んでなる請求項１に記載の核酸断片。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの発現制御領域を含んでなる請求項１に記載の核酸断片。
【請求項８】
前記発現制御領域が、プロモーター、エンハンサーまたはサイレンサーよりなる群から選択される請求項７に記載の核酸断片。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドが、オープンリーディングフレームの少なくとも一部に操作可能に結合したプロモーターを含んでなる請求項１に記載の核酸断片。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドを組み込むことのできるＤＮＡが、細胞ゲノムである請求項１に記載の核酸断片。
【請求項１１】
修飾Ａｃトランスポゼースまたは修飾Ａｃトランスポゼースをコードする核酸、および
前記修飾Ａｃトランスポゼースに結合できる逆方向反復間に位置するポリヌクレオチドを含んでなる核酸断片、
を含んでなる、脊椎動物細胞のＤＮＡにポリヌクレオチドを導入するための遺伝子導入系。
【請求項１２】
前記逆方向反復が、
（ａ）Ｄｓ因子の一部である逆方向反復、
（ｂ）Ｄｓ５’末端シス要求配列の一部およびＤｓ３’末端シス要求配列の一部である逆方向反復、
（ｃ）配列番号４５に記載されたヌクレオチド配列を有するＤｓ５’末端シス要求配列の一部および配列番号４９に記載されたヌクレオチド配列を有するＤｓ３’末端シス要求配列の一部である逆方向反復、
（ｄ）配列番号１のヌクレオチド３６５７〜３９０３に記載されたヌクレオチド配列を有するＤｓ５’末端シス要求配列の一部および配列番号１のヌクレオチド４３〜４１２に記載されたヌクレオチド配列を有するＤｓ３’末端シス要求配列の一部である逆方向反復、および
（ｅ）（ｃ）または（ｄ）のＤｓ５’末端シス要求配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するＤｓ５’末端シス要求配列の一部および（ｃ）または（ｄ）のＤｓ３’末端シス要求配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するＤｓ３’末端シス要求配列の一部であり、Ｄｓ５’末端シス要求配列およびＤｓ３’末端シス要求配列が前記修飾Ａｃトランスポゼースに結合できる逆方向反復、
よりなる群から選択される、請求項１１に記載の遺伝子導入系。
【請求項１３】
前記修飾Ａｃトランスポゼースが、配列番号８に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、脊椎動物細胞のＤＮＡへの前記ポリヌクレオチドの組込みを触媒する請求項１１に記載の遺伝子導入系。
【請求項１４】
前記修飾Ａｃトランスポゼースを含んでなる請求項１１に記載の遺伝子導入系。
【請求項１５】
前記修飾Ａｃトランスポゼースをコードする核酸を含んでなり、前記核酸がＲＮＡまたはＤＮＡである請求項１１に記載の遺伝子導入系。
【請求項１６】
前記修飾Ａｃトランスポゼースをコードする核酸を含んでなり、前記核酸が脊椎動物のゲノム内に安定に組み込まれている請求項１１に記載の遺伝子導入系。
【請求項１７】
前記核酸断片が、ベクターの一部である請求項１１に記載の遺伝子導入系。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチドが、脊椎動物のゲノム内に安定に組み込まれている請求項１１に記載の遺伝子導入系。
【請求項１９】
前記ポリヌクレオチドが、オープンリーディングフレームの少なくとも一部を含んでなる請求項１１に記載の遺伝子導入系。
【請求項２０】
前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの発現制御領域を含んでなる請求項１１に記載の遺伝子導入系。
【請求項２１】
前記発現制御領域が、プロモーター、エンハンサーまたはサイレンサーよりなる群から選択される請求項２０に記載の遺伝子導入系。
【請求項２２】
前記ポリヌクレオチドが、オープンリーディングフレームの少なくとも一部に操作可能に結合したプロモーターを含んでなる請求項１１に記載の遺伝子導入系。
【請求項２３】
前記ポリヌクレオチドを組込むことができるＤＮＡが、細胞ゲノムである請求項１１に記載の遺伝子導入系。
【請求項２４】
修飾Ａｃトランスポゼースに結合できる逆方向反復間に位置したポリヌクレオチドを含んでなる核酸断片を細胞に導入するステップを含んでなる、脊椎動物細胞のＤＮＡにポリヌクレオチドを導入する方法。
【請求項２５】
前記逆方向反復が、
（ａ）Ｄｓ因子の一部である逆方向反復、
（ｂ）Ｄｓ５’末端シス要求配列の一部およびＤｓ３’末端シス要求配列の一部である逆方向反復、
（ｃ）配列番号４５に記載されたヌクレオチド配列を有するＤｓ５’末端シス要求配列の一部および配列番号４９に記載されたヌクレオチド配列を有するＤｓ３’末端シス要求配列の一部である逆方向反復、
（ｄ）配列番号１のヌクレオチド３６５７〜３９０３に記載されたヌクレオチド配列を有するＤｓ５’末端シス要求配列の一部および配列番号１のヌクレオチド４３〜４１２に記載されたヌクレオチド配列を有するＤｓ３’末端シス要求配列の一部である逆方向反復、および
（ｅ）（ｃ）または（ｄ）のＤｓ５’末端シス要求配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するＤｓ５’末端シス要求配列の一部および（ｃ）または（ｄ）のＤｓ３’末端シス要求配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するＤｓ３’末端シス要求配列の一部であり、Ｄｓ５’末端シス要求配列およびＤｓ３’末端シス要求配列が前記修飾Ａｃトランスポゼースに結合できる逆方向反復、
よりなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記脊椎動物細胞が、そのゲノム内に安定に組み込まれている前記修飾Ａｃトランスポゼースを有する請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記修飾Ａｃトランスポゼースを前記細胞に導入することをさらに含んでなる請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記修飾ＡｃトランスポゼースをコードするＲＮＡまたはＤＮＡを、前記細胞に導入することをさらに含んでなる請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記修飾Ａｃトランスポゼースが、配列番号８に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、脊椎動物細胞のＤＮＡへの前記ポリヌクレオチドの組込みを触媒する請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸断片が、ベクターの一部である請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記ポリヌクレオチドが、オープンリーディングフレームの少なくとも一部を含んでなる請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの発現制御領域を含んでなる請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
前記発現制御領域が、プロモーター、エンハンサーまたはサイレンサーよりなる群から選択される請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ポリヌクレオチドが、オープンリーディングフレームの少なくとも一部に操作可能に結合したプロモーターを含んでなる請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
前記ポリヌクレオチドを組込むことのできるＤＮＡが、細胞ゲノムである請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞への前記ポリヌクレオチドの導入が、微量注入、電気穿孔、前記核酸断片とカチオン性脂質ベシクルまたはＤＮＡ縮合試薬とを組合わせること、およびウィルスベクター内へ前記核酸断片を組み込んで前記ウィルスベクターと前記細胞とを接触させること、よりなる群から選択される方法を用いることを含んでなる請求項２４に記載の方法。
【請求項３７】
遺伝子導入非ヒト脊椎動物を作出する方法であって、
修飾Ａｃトランスポゼースに結合できる逆方向反復間に位置したポリヌクレオチドを含んでなる核酸断片を、脊椎動物細胞に導入するステップ、
修飾Ａｃトランスポゼースまたは修飾Ａｃトランスポゼースをコードする核酸を、脊椎動物細胞に導入するステップ、
前記ポリヌクレオチドを前記細胞のゲノム内に安定に組み込ませるように前記脊椎動物細胞を培養して遺伝子導入脊椎動物細胞を作出するステップ、および
前記遺伝子導入脊椎動物細胞を遺伝子導入脊椎動物へと成長させるステップ、
を含んでなる方法。
【請求項３８】
前記逆方向反復が、
（ａ）Ｄｓ因子の一部である逆方向反復、
（ｂ）Ｄｓ５’末端シス要求配列の一部およびＤｓ３’末端シス要求配列の一部である逆方向反復、
（ｃ）配列番号４５に記載されたヌクレオチド配列を有するＤｓ５’末端シス要求配列の一部および配列番号４９に記載されたヌクレオチド配列を有するＤｓ３’末端シス要求配列の一部である逆方向反復、
（ｄ）配列番号１のヌクレオチド３６５７〜３９０３に記載されたヌクレオチド配列を有するＤｓ５’末端シス要求配列の一部および配列番号１のヌクレオチド４３〜４１２に記載されたヌクレオチド配列を有するＤｓ３’末端シス要求配列の一部である逆方向反復、および
（ｅ）（ｃ）または（ｄ）のＤｓ５’末端シス要求配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するＤｓ５’末端シス要求配列の一部および（ｃ）または（ｄ）のＤｓ３’末端シス要求配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するＤｓ３’末端シス要求配列の一部であり、前記Ｄｓ５’末端シス要求配列およびＤｓ３’末端シス要求配列が前記修飾Ａｃトランスポゼースに結合できる逆方向反復、
よりなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記修飾Ａｃトランスポゼースが、配列番号８に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、脊椎動物細胞のＤＮＡへの前記ポリヌクレオチドの組込みを触媒する請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記修飾Ａｃトランスポゼースを導入することを含んでなる請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記修飾Ａｃトランスポゼースをコードする核酸を導入することを含んでなり、前記核酸がＲＮＡまたはＤＮＡである請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記修飾Ａｃトランスポゼースをコードする核酸が、前記脊椎動物細胞のゲノム内に安定に組み込まれている請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記核酸断片が、ベクターの一部である請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
前記ポリヌクレオチドが、オープンリーディングフレームの少なくとも一部を含んでなる請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの発現制御領域を含んでなる請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
前記発現制御領域が、プロモーター、エンハンサーまたはサイレンサーよりなる群から選択される請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ポリヌクレオチドが、オープンリーディングフレームの少なくとも一部に操作可能に結合したプロモーターを含んでなる請求項３７に記載の方法。
【請求項４８】
遺伝子の機能を同定する方法であって、
対象となっている表現型または生化学的特徴に係わる挿入変異を有する脊椎動物細胞または個々の脊椎動物であって、遺伝子内にポリヌクレオチド挿入体を有し、前記ポリヌクレオチドが、修飾Ａｃトランスポゼースに結合できる逆方向反復の部分を含んでなる、前記脊椎動物細胞または個々の脊椎動物をスクリーニングすること、および
前記表現型または生化学的特徴と、遺伝子のヌクレオチド配列とを関連づけ、それにより遺伝子の機能を同定すること、
を含んでなる方法。
【請求項４９】
前記関連づけが、
前記挿入変異を有する遺伝子を同定すること、および
前記遺伝子のヌクレオチド配列を決定すること、
を含んでなる請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記遺伝子のホモログまたはオルソログについて配列データベースを探索するステップをさらに含んでなる請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
推定上の薬剤標的を同定する方法であって、
対象となっている表現型または生化学的特徴に係わる挿入変異を有する脊椎動物細胞または個々の脊椎動物であって、遺伝子内にポリヌクレオチド挿入体を有し、前記ポリヌクレオチドが、修飾Ａｃトランスポゼースに結合できる逆方向反復の部分を含んでなる、前記脊椎動物細胞または個々の脊椎動物を同定すること、および
同定された脊椎動物細胞または個々の脊椎動物に関して、前記遺伝子のヌクレオチド配列および前記遺伝子によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列を同定して、それにより推定上の薬剤標的を同定すること、
を含んでなる方法。
【請求項５２】
前記遺伝子のホモログまたはオルソログについて配列データベースを探索するステップをさらに含んでなる請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
化合物の作用部位を同定する方法であって、
挿入変異を有する脊椎動物細胞または個々の脊椎動物であって、遺伝子内にポリヌクレオチド挿入体を有し、前記ポリヌクレオチドが、修飾Ａｃトランスポゼースに結合できる逆方向反復の部分を含んでなる、前記脊椎動物細胞または個々の脊椎動物を、対象となっている化合物に曝露すること、
野生型脊椎動物細胞または個々の脊椎動物を、前記対象となっている化合物に曝露すること、
挿入変異を有する前記脊椎動物細胞または個々の脊椎動物、および前記野生型の脊椎動物細胞または個々の脊椎動物に及ぼす前記化合物の効果を評価すること、および
前記野生型脊椎動物細胞または個々の脊椎動物と比較して、前記化合物に応答しない挿入変異を有する前記脊椎動物細胞または個々の脊椎動物における遺伝子のヌクレオチド配列を同定して、それにより前記化合物の作用部位を同定すること、
を含んでなる方法。
【請求項５４】
前記遺伝子のホモログまたはオルソログについて配列データベースを探索するステップをさらに含んでなる請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
脊椎動物の挿入変異ライブラリーであって、前記ライブラリーの各メンバーが、遺伝子内にポリヌクレオチド挿入体を有し、前記ポリヌクレオチドが、修飾Ａｃトランスポゼースに結合できる前記逆方向反復の部分を含んでなり、前記ライブラリーが、前記脊椎動物ゲノムの遺伝子の少なくとも１５％にポリヌクレオチド挿入体を有する、ライブラリー。
【請求項５６】
前記ライブラリーのメンバーが、脊椎動物の精子細胞である請求項５５に記載のライブラリー。
【請求項５７】
前記ライブラリーのメンバーが、個々の脊椎動物である請求項５５に記載のライブラリー。
【請求項５８】
前記脊椎動物が、前記ポリヌクレオチド挿入体について異型接合性である請求項５７に記載のライブラリー。
【請求項５９】
前記脊椎動物が、前記ポリヌクレオチド挿入体について同型接合性である請求項５７に記載のライブラリー。
【請求項６０】
前記ライブラリーのメンバーが、一倍体脊椎動物胚である請求項５５に記載のライブラリー。
【請求項６１】
前記ライブラリーのメンバーが、脊椎動物の雌性発生二倍体胚である請求項５５に記載のライブラリー。
【請求項６２】
各ポリヌクレオチド挿入体に関連する遺伝子についてのＤＮＡ配列をさらに含んでなる請求項５５に記載のライブラリー。
【請求項６３】
前記遺伝子によりコードされたタンパク質についてのアミノ酸配列をさらに含んでなる請求項５５に記載のライブラリー。
【請求項６４】
前記遺伝子によりコードされたタンパク質についてのアミノ酸配列をさらに含んでなる請求項６２に記載のライブラリー。
【請求項６５】
遺伝子の機能を同定する方法であって、
前記ライブラリーの各メンバーが、遺伝子内にポリヌクレオチド挿入体を有し、前記ポリヌクレオチドが、修飾Ａｃトランスポゼースに結合できる前記逆方向反復の部分を含んでなり、前記ライブラリーが、前記脊椎動物ゲノムの遺伝子の少なくとも１５％にポリヌクレオチド挿入体を有する、対象となっている表現型に関する前記脊椎動物挿入変異ライブラリーの少なくとも１つのメンバーをスクリーニングすること、および
前記対象となっている表現型と、前記ライブラリーの遺伝子のＤＮＡ配列とを関連づけ、それにより前記遺伝子機能を同定すること、
を含んでなる方法。
【請求項６６】
前記遺伝子のホモログまたはオルソログについて配列データベースを探索するステップをさらに含んでなる請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記ライブラリーのメンバーが、脊椎動物の精子細胞、前記ポリヌクレオチド挿入体に対して異型接合性である脊椎動物個体、前記ポリヌクレオチド挿入体に対して同型接合性である脊椎動物個体、脊椎動物の一倍体胚および脊椎動物の雌性発生二倍体胚よりなる群から選択される請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
推定上の薬剤標的を同定する方法であって、
ライブラリーの各メンバーが、遺伝子内にポリヌクレオチド挿入体を有し、前記ポリヌクレオチドが、修飾Ａｃトランスポゼースに結合できる前記逆方向反復の部分を含んでなり、前記ライブラリーが、前記脊椎動物ゲノムの遺伝子の少なくとも１５％にポリヌクレオチド挿入体を有する、対象となっている表現型に関連する脊椎動物挿入変異ライブラリーのメンバーを同定すること、および
前記ライブラリーの同定されたメンバーについて、遺伝子のＤＮＡ配列および前記遺伝子によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列を同定して、それにより推定上の薬剤標的を同定すること、
を含んでなる方法。
【請求項６９】
前記遺伝子のホモログまたはオルソログについて配列データベースを探索するステップをさらに含んでなる請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記ライブラリーのメンバーが、脊椎動物の精子細胞、前記ポリヌクレオチド挿入体に対して異型接合性である脊椎動物個体、前記ポリヌクレオチド挿入体に対して同型接合性である脊椎動物個体、脊椎動物の一倍体胚および脊椎動物の雌性発生二倍体胚よりなる群から選択される請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記対象となっている表現型に関連するライブラリーの全てのメンバーが同定され、前記遺伝子のＤＮＡ配列および前記遺伝子によりコードされたタンパク質配列の全てが同定され、それにより推定上の薬剤標的の集団が同定される請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
化合物の作用部位を同定する方法であって、
ライブラリーの各メンバーが、遺伝子内にポリヌクレオチド挿入体を有し、前記ポリヌクレオチドが、修飾Ａｃトランスポゼースに結合できる前記逆方向反復の部分を含んでなり、前記ライブラリーが、前記脊椎動物ゲノムの遺伝子の少なくとも１５％にポリヌクレオチド挿入体を有する、脊椎動物挿入変異ライブラリーの少なくとも１つのメンバーを、対象となっている化合物に曝露すること、
野生型脊椎動物個体を前記対象となっている化合物に曝露すること、
前記ライブラリーのメンバーおよび前記野生型脊椎動物個体に及ぼす前記化合物の効果を評価すること、
前記野生型脊椎動物個体と比較して、前記化合物に応答しない前記ライブラリーのメンバーを同定すること、および
前記ライブラリーの同定されたメンバーにおける遺伝子のＤＮＡ配列を同定して、前記化合物の作用部位を同定すること、
を含んでなる方法。
【請求項７３】
前記遺伝子のホモログまたはオルソログについて配列データベースを探索するステップをさらに含んでなる請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記ライブラリーのメンバーが、脊椎動物の精子細胞、前記ポリヌクレオチド挿入体に対して異型接合性である脊椎動物個体、前記ポリヌクレオチド挿入体に対して同型接合性である脊椎動物個体、脊椎動物の一倍体胚および脊椎動物の雌性発生二倍体胚よりなる群から選択される請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記効果が、生化学的特徴、酵素、表現型または導入遺伝子について評価される請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
対象となっている遺伝子を同定する方法であって、
ライブラリーの各メンバーが、遺伝子内にポリヌクレオチド挿入体を有し、前記ポリヌクレオチドが、修飾Ａｃトランスポゼースに結合できる前記逆方向反復の部分を含んでなり、前記ライブラリーが、前記脊椎動物ゲノムの遺伝子の少なくとも１５％にポリヌクレオチド挿入体を有する、脊椎動物挿入変異ライブラリーのメンバーを、対象となっている特徴についてスクリーニングすること、
対象となっている特徴を有する前記ライブラリーの特定のメンバーにおいて前記対象となっている遺伝子の存在を関連づけること、および
前記ライブラリーの特定のメンバーに関連する前記遺伝子のＤＮＡ配列から対象となっている遺伝子を同定すること、
を含んでなる方法。
【請求項７７】
前記遺伝子のホモログまたはオルソログについて配列データベースを探索するステップをさらに含んでなる請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記ライブラリーのメンバーが、脊椎動物の精子細胞、前記ポリヌクレオチド挿入体に対して異型接合性である脊椎動物個体、前記ポリヌクレオチド挿入体に対して同型接合性である脊椎動物個体、脊椎動物の一倍体胚および脊椎動物の雌性発生二倍体胚よりなる群から選択される請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
請求項１１、１２、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２および２３のいずれか一項に記載の遺伝子導入系の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の背景］
本発明は、魚類、鳥類、および哺乳動物およびヒトを含む他の動物などの脊椎動物におけるトウモロコシＡｃ／Ｄｓ転移因子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景、特に、実施に関しさらに詳細を提供する事例を明らかにするために本明細書に用いられた刊行物および他の資料は、引用により、および便宜上、以下の著者によるテキストおよび日付で引用されており、添付の文献において著者のアルファベット順に列挙されており、その内容を本明細書に含める。
【０００３】
魚類を含む遺伝子導入動物は、発生、生理学および疾患の多くの面の研究にとって優れた脊椎動物モデルを提供する。この目的のために、多種多様な魚類を利用することができる。代表的な魚としては、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）、メダカ（Ｏｒｙｚｉａｓ  ｌａｔｉｐｅｓ）、ムンミチョグ（ｍｕｍｍｉｃｈｏｇ）（Ｆｕｎｄｕｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｃｌｉｔｕｓ）、キリフィッシュ（ｋｉｌｌｉｆｉｓｈ）（Ｇｅｎｕｓ  Ｆｕｎｄｕｌｕｓ）などの硬骨魚類、チャンネルナマズなどのナマズ（Ｇｅｎｕｓ  Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ）、一般的なコイなどのコイ（Ｇｅｎｕｓ  Ｃｙｐｒｉｎｕｓ）、およびマスまたはサケ（例えば、Ｇｅｎｕｓ  Ｓａｌｖｅｌｉｎｕｓ、Ｓａｌｍｏ、およびＯｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ）が挙げられる。ゼブラフィッシュは、発生、生理学および疾患の多くの面の研究のために確立されたモデルとなってきた。
【０００４】
ゼブラフィッシュは、発生、生理学および疾患の多くの面の研究に特に有用である。それらは、小型であり、子宮外発生であり、生殖期間が短い。５日齢で、各魚が心臓、脳、血液、および膵臓など、哺乳動物によって使用される器官系の大部分を完全に備える自由遊泳／採餌生物である。この１０年間のうちに、大規模な変異誘発スクリーニングから単離された変異ゼブラフィッシュ系統により、脊椎動物の発生についてより多くの理解が導かれた（ドリーバー（Ｄｒｉｅｖｅｒ）ら、１９９６年；ハフター（Ｈａｆｆｔｅｒ）ら、１９９６年；ゴリング（Ｇｏｌｌｉｎｇ）ら、２００２年）。これらの研究は、ゼブラフィッシュ変異体が、ヒトの疾患の良好なモデルとして役立ち得ることを示したが、ゼブラフィッシがこの能力において広範に使用されているわけではない。大多数の変異体は、化学的変異原、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＥＮＵ）を用いて作出されているため、ゼブラフィッシュの研究における今までで最も大きな限界は、これらの変異誘発スクリーニングから破壊された起因遺伝子の実体を判定することであった。ＥＮＵに誘導された点変異の同定には、面倒で時間のかかるポジショナルクローニングの作業が必要である。一方、レトロウィルスを用いる挿入変異誘発は効率的であり、この方法で変異した遺伝子は、最少の供給源で、同定に要するのはわずか２週間であり得る（ゴリング（Ｇｏｌｌｉｎｇ）ら、２００２年）。ゼブラフィッシュ精子におけるレトロウィルス挿入のバンクを作り出すことによって、ほぼ各遺伝子内に少なくとも１つの挿入の入ったライブラリーを、小型の冷凍庫内に作り出すことができる。全ての挿入体（ｉｎｓｅｒｔ）のゲノム位置の特徴決定および判定により、インビトロで、対象となっている変異を有する精子サンプルを卵を受精させるために用いることによるゼブラフィッシュにおける逆遺伝学を容易に実施することが可能になる。ランダムなスクリーニングの替わりに、研究者はこの方法で、対象となる変異を指示することにより、多くの時間と経費を節約できる。ライブラリーのさらに強力な使用法が、正方向の遺伝子スクリーニングに存在するであろう。
【０００５】
現在、数百の変異体系統について研究中である研究室の数を考慮すると、ゼブラフィッシュでクローニングされたＥＮＵ変異体の数は、今のところ依然としてきわめて少ない。１９９６年の２つの大規模なＥＮＵ変異誘発スクリーニングの完了以来、ＥＮＵで変異誘発した約１００の遺伝子が公表されている。実際、これらの遺伝子の多くは、厳密な位置クローニング作業を用いて同定されたものではなく、遺伝子および経路がすでに解読されている既知のショウジョウバエまたはマウスの変異体に特定の変異表現型が類似していたことを認識することによって見出されている（タルボット（Ｔａｌｂｏｔ）およびホプキンス（Ｈｏｐｋｉｎｓ）、２０００年）。これらの例では、破壊されたものを正しく単離するために、推定された発生経路における各遺伝子を変異に関して個々に調べる「候補遺伝子」アプローチが用いられた。この方法は、変異遺伝子のクローニングにはきわめて好結果が得られることは実証されているが、新規遺伝子／経路の発見には至らず、主に、他の生物の発生について知られていることの再提示であった。
【０００６】
ゼブラフィッシュにおける変異遺伝子クローニングに対するより好結果の得られるアプローチは、変異原としての偽型マウスレトロウィルスの使用であった。これらのレトロウィルスは、ゼブラフィッシュなどの広範囲の宿主細胞の感染を可能にする水疱性口炎ウィルスＧ被覆タンパク質を有する（イー（Ｙｅｅ）ら、１９９４年；エミ（Ｅｍｉ）ら、１９９１年；バーンズ（Ｂｕｒｎｓ）ら、１９９３年）。ウィルスＤＮＡは、その接合部配列を変化させることなく、主としてランダムな様式で、単一コピー物質としてゲノム内に挿入されるが、レトロウィルスは、それらの挿入部位として、遺伝子の５’末端を好むことが見出されている（ビジャヤ（Ｖｉｊａｙａ）ら、１９８６年；ローデホールド（Ｒｏｈｄｅｗｏｈｌｄ）ら、１９８７年；ムースレーナー（Ｍｏｏｓｌｅｈｎｅｒ）ら、１９９０年；シャーディン（Ｓｃｈｅｒｄｉｎ）ら、１９９０年）。さらに、レトロウィルス挿入体は、分子ビーコンとして役立ち、変異表現型を破壊遺伝子に連関させる方法を相当に簡便化させる。１つの欠点は、生殖細胞がまだ分裂している１０００から２０００細胞期で、該ウィルスをゼブラフィッシュの胚に注入する必要があるということである（レトロウィルス組込みに必要な事象）。これは、変異誘発始祖魚を作出するために、伝統的なＥＮＵ変異誘発法よりも多くの精密な検査領域を必要とする。平均、配偶子１個当たりのＥＮＵ破壊体よりも存在するレトロウィルス挿入体が少数であるため、レトロウィルスの変異誘発頻度は、化学的変異誘発の頻度よりも低い（１／１ＥＮＵ変異誘発Ｆ２ファミリーは、１／７レトロウィルスＦ２ファミリーに比較して、可視的な劣性変異を生じる（ゴリング（Ｇｏｌｌｉｎｇ）ら、２００２年）。
【０００７】
最近、大規模な発生スクリーニングを行うために、変異誘発のレトロウィルス法が用いられている。該スクリーニングにより、ゼブラフィッシュの発生に影響を与える５００超の変異体が作出され、これらの破壊遺伝子の半数以上がクローニングされている（ゴリング（Ｇｏｌｌｉｎｇ）ら、２００２年；アムスターナム（Ａｍｓｔｅｒｎａｍ）ら、１９９９年）。同定された破壊遺伝子の全てがヒトにおけるホモログを有するが、これらの破壊遺伝子のおよそ２０％は得られたタンパク質の生化学的機能の分類を可能にするような明瞭なモチーフまたは特徴のいずれも含有していないことが、この研究の結果により示された（ゴリング（Ｇｏｌｌｉｎｇ）ら、２００２年）。対照的に、今までＥＮＵ変異体からクローニングされた遺伝子は、新規性の程度がきわめて低い。
【０００８】
ゼブラフィッシュにおける逆遺伝学に関して大いに有望であることが示されている１つのアプローチは、モルホリノベースのオリゴヌクレオチドを用いた遺伝子ノックダウンの作出である（ヒースマン（Ｈｅａｓｍａｎ）、２００２年；ナーゼヴィシウス（Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓ）およびエッカー（Ｅｋｋｅｒ）、２０００年；エッカー（Ｅｋｋｅｒ）、２０００年）。この技法は、対象となっている遺伝子の翻訳開始部位に相補的な短い（２４量体）モルホリノオリゴヌクレオチドの作出に依存している（サマートン（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ）ら、１９９７年、サマートン（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ）およびウェラー（Ｗｅｌｌｅｒ）、１９９７年）。１〜２細胞期でモルホリノオリゴヌクレオチドを注入すると、内因性標的遺伝子のｍＲＮＡの翻訳が阻害される。この方法で、多くのＥＮＵ誘導変異体表現型が、該変異遺伝子に特異的なモルホリノオリゴヌクレオチドを注入することによってフェノコピーされ、該技法を原理とした証拠が確立されている（ヒースマン（Ｈｅａｓｍａｎ）、２００２年；ナーゼヴィシウス（Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓ）およびエッカー（Ｅｋｋｅｒ）、２０００年；エッカー（Ｅｋｋｅｒ）、２０００年）。またこれらのオリゴヌクレオチドは、インサイチュハイブリダイゼーションスクリーニングから同定された遺伝子の未知の遺伝子機能を調べるためにも好首尾で使用されている（サカグチ（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ）ら、２００１年；ツァング（Ｔｓａｎｇ）ら、２００２年）。
【０００９】
モルホリノアンチセンス技法はゼブラフィッシュ群に広く用いられているが、これには重大な限界がある。例えば、好ましい遺伝子のノックダウンを試験する機会の枠は、わずか２〜３日であり、したがって、この技法は主に、発生初期の研究に限定される。モルホリノは、安定な遺伝的な因子ではないため、各細胞におけるモルホリノオリゴヌクレオチドの量は、分裂の各回ごとに、分解および希釈によって減少する。したがって、所望の遺伝子が、多くの疾患遺伝子で推定される場合のように、この期間内に発現されなければ、この方法はうまく行かないであろう。該スクリーニングにおいて各胚にオリゴヌクレオチドを注入する必要があり、きわめて時間のかかる作業となるため、サプレッサーまたはエンハンサーモディファイヤーのスクリーニングを実施する能力もまた、モルホリノオリゴヌクレオチドでは限定されている。
【００１０】
高力価レトロウィルス生産における最近の進歩により、ゼブラフィッシュにおけるその利用が大いに簡便化された。ゼブラフィッシュにおける挿入変異誘発に用いられた最初のレトロウィルス構築体（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）のいくつかは、それらのＦ１後代のうちのわずか５％にしかプロウィルス組み込みを伝達した注入（始祖）魚を作出しなかった（リン（Ｌｉｎ）ら、１９９４年）。これらのＦ１魚によって伝達された挿入体の数もまた少なく、通常、配偶子１つ当たり、挿入体は１つであり、生殖系列１つ当たり、挿入体は合計５つ未満であった（リン（Ｌｉｎ）ら、１９９４年）。これらの構築体によって何らかの有意な変異誘発スクリーニングを行うためには、多くの年月の間ゼブラフィッシュの胚に注入を行い、５００，０００の挿入体を作出しなければならない。チェン（Ｃｈｅｎ）ら（２００２年）に見られるように、新規レトロウィルスベクターによりこの時間枠は著しく減少した。今日、レトロウィルス注入を行って２ヵ月間で５０万の挿入体を有する十分な始祖魚を作出できた人は二人いる（チェン（Ｃｈｅｎ）ら、２００２年）。さらに、レトロウィルス系の効率性により、各始祖魚に関し、現在、平均２５超の異なる挿入体が可能になっている。これらの魚は、容易に飼育でき、新規マーキング系によって個々の同定系に関してタグ化でき、研究者にとって小型サイズの水設備であるおよそ２００匹の魚用水槽に収容することができる。
【００１１】
挿入変異誘発は、ゼブラフィッシュにおける変異遺伝子のクローニングにとって、現在最も迅速な方法である。レトロウィルス挿入体は、破壊遺伝子に関する分子タグとして役立つのみならず、変異表現型との遺伝子関連性を確証するための貴重なマーカーとしても役立っている。化学的変異誘発法は、破壊遺伝子とマーカーとの緊密な関連性の確証に依存しなければならず、そのため、対象となっているゲノム領域は、ＢＡＣまたはＰＡＣクローンの配列決定によって扱うことのできる十分小型のサイズに狭まってしまう。化学的変異誘発による複雑さは、試験すべきマーカーが数百あり、それらを、相当な数（数千）の組換え魚について試験して、連関したマーカーが変異遺伝子座から分離していないことを示さなければならないということに由来する。胚変異のスクリーニングにおいて、数千の変異胚を作出することは通常問題にならない。しかし、特定の疾患（糖尿病、パーキンソン病、肥満症など）に特定的な表現型などの成体の表現型を調べる場合、連関した遺伝子座を見つける目的で必要な全ての組換え体を飼育するためには、法外な量の時間、スペース、および供給源が必要となるであろう。挿入変異誘発では、単に、変異魚からの制限酵素消化ＤＮＡのサザンブロットの実施および該変異体を生み出す一対の成体魚によって、連関が確証される。プローブとしてレトロウィルスの標識部分を用いて、全ての変異魚およびそれらの親は同一の分子サイズで移動する１つのバンドを有し、他方、表現型卵を生産しなかった魚の対は同一の挿入体を有さないことが予想される（すなわち、双方の魚とも連関するバンドを有さないと考えられる）。この方法において、破壊遺伝子に対して可能性の高い誘導を生み出すために、一握りの罹患魚を調べるだけでよいだろう。
【００１２】
挿入変異誘発により破壊された遺伝子をクローニングする最も時間のかかる態様は、レトロウィルス挿入体にフランクしているゲノムＤＮＡがエキソンの、または既知の遺伝子配列を含有しない場合にある。通常、候補連関挿入体が同定され、そのフランキング配列がクローニングされる場合、長さは数キロ塩基以下である。より長い断片を増幅するＰＣＲが無効であるためである。先行の研究において、この方法でクローニングされたフランキングＤＮＡの約三分の一は、それらの配列がデータベース探索において、相同性または同一性が判明しなかったという点で、有用な情報を持たないことが分かった（Ｇ．ゴリング（Ｇ．Ｇｏｌｌｉｎｇ、結果は公表されていない）。ゼブラフィッシュゲノムの最初の図がすぐに完成するであろうし、レトロウィルス挿入体にフランクしているＤＮＡの５０塩基未満を配列決定することによって、どの遺伝子が破壊されているかを同定することが可能であるはずなので、これはもう問題にはならないだろう。
【００１３】
マウスにおける逆遺伝学のアプローチにより、人の疾病に対して多くの洞察が提供された。研究者は、対象となる遺伝子を取り上げ、ＥＳ細胞内での相同的組換えによってその発現を破壊し、次いで、それらの細胞を胚に再導入して、標的化形質転換ノックアウト体を作出することができた。このアプローチは、ゼブラフィッシュまたはマウスおよびラット以外の他の脊椎動物モデル生物ではまだ成功が証明されていないが、標的化選択変異誘発と称される他の方法が開発され、特定の対象遺伝子において標的化破壊を生じさせた。標的化選択変異誘発は、先ず、ある生物の胚系ＤＮＡを変異誘発し、ＰＣＲを用いて対象遺伝子を増幅することによって達成される。次いで、野生型遺伝子と比較するためにＰＣＲ産物を配列決定することにより、対象遺伝子における変異体を含有するサンプルが同定される。ウィーンホールズ（Ｗｉｅｎｈｏｌｄｓ）らは最近、Ｒａｇ１遺伝子における変異体を単離するために、ゼブラフィッシュでこの技法を用いている。ランダムにＥＮＵ変異誘発した２７００近いオスからなる精子ライブラリーからＲａｇ１の２つのエキソンを配列決定することによって、研究者は１５の変異体を見出し、そのうちの１つは、未熟な停止コドンであった（ウィーンホールズ（Ｗｉｅｎｈｏｌｄｓ）ら、２００２年）。該方法論は実際有効ではあるが、大規模なスクリーニングでは厄介であると考えられる。１つの停止変異体を同定するために、２ヵ月間にわたっておよそ１２，５００の配列決定反応が実施された（ウィーンホールズ（Ｗｉｅｎｈｏｌｄｓ）ら、２００２年）。この方法をゼブラフィッシュのゲノム全体（約４０，０００の遺伝子）に外挿するには、およそ５億の配列決定反応が必要となる。より効率的な方法は、レトロウィルス挿入体から変異精子ライブラリーを創製することであろう。レトロウィルスは破壊された遺伝子座に対するタグとして役立ち得るため、必要とされる配列決定反応ははるかに少なくなると考えられる。ゼブラフィッシュゲノムが完成直前であることを考慮すると、配列決定すべき塩基の実際の数もまた、より少なくなるであろう。４〜５ヶ月間にわたって、３つの注入体により、１００万超の挿入体を有するのに必要なおよそ４０，０００のオス始祖体をルーチン的に作出することができた。これにより与えられる挿入密度は、１８００ｂｐごとに平均１つとなり、事実上、遺伝子１つごとに少なくとも１つの挿入となる。凍結ライブラリーを収容するためのスペース要件は、多くのｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーアレイに必要なものよりも小さくなると考えられる。
【００１４】
多くのモデル生物において、正方向の遺伝学は、重要なアプローチであった。しかし、ゼブラフィッシュで行われているほとんど全ての正および逆遺伝学は、機能欠失対立遺伝子の形態である。提案されたレトロウィルスゼブラフィッシュライブラリーに基づいた正方向の遺伝学アプローチは、機能的遺伝因子を加えることによって拡張されるであろう。レトロウィルスは、明白な機能欠失遺伝子破壊以外のさらなる機能を提供することができる。例えば、１つの大規模スクリーニングにおいて、使用される優勢レトロウィルスベクターは、遺伝子トラップカセットを有した（ゴリング（Ｇｏｌｌｉｎｇ）ら、２００２年；アムステルダム（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）ら、１９９９年）。この構築体を注入された始祖体のうち、各魚の生殖系列において少なくとも１回のトラップ事象があったことを、チェン（Ｃｈｅｎ）ら（２００２年）は見出した。該トラップベクター自体は、先の非トラップベクター以上に変異誘発的であると証明されたわけではないが（チェン（Ｃｈｅｎ）ら、２００２年）、それは、ショウジョウバエにおいて先に実施されたゼブラフィッシュにおける他の創造的スクリーニングの可能性を示した。これらの中に、特定の遺伝子発現パターンおよび誤発現／過剰発現スクリーニングについてのプロモーター含有ベクターについて魚をスクリーニングし得るエンハンサートラップ構築体がある。後者のアプローチは、Ｐ因子内のＧａｌ４結合部位がランダムに位置した挿入体の下流に位置する遺伝子の発現を駆動するハエにおいて好首尾で用いられている（ロース（Ｒｏｒｔｈ）ら、１９９８年；ヘイ（Ｈａｙ）ら、１９９７年）。例えば、眼特異的エンハンサーまたはテトラサイクリンオペレーターの制御下での制御様式でＧａｌ４蛋白質を発現する形質転換ハエ系は、Ｐ因子の下流遺伝子を、研究者の望み通り誤発現させるであろう。このような作業により、明白な機能欠失表現型を示さない遺伝子の機能を調べるための貴重な手段を提供すると考えられる。このような遺伝子は、ハエ、蠕虫および酵母の遺伝子の三分の二以上を構成していると予想される（サルストン（Ｓｕｌｓｔｏｎ）ら、１９９２年；デュジョン（Ｄｕｊｏｎ）ら、１９９４年；ミクロス（Ｍｉｋｌｏｓ）およびルビン（Ｒｕｂｉｎ）、１９９６年）。さらに高いパーセンテージの脊椎動物遺伝子が明白な機能欠失表現型を有していないという可能性が高い。これらの遺伝子はしばしば生物学的に重要である。例えば、マウスにおけるＮＰＹおよび／またはＡＧＲＰ機能の欠失は検出可能な異常を示すことはないが（キアン（Ｑｉａｎ）ら、２００２年；エリクソン（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ）ら、１９９６年）、機能獲得試験により、ＮＰＹおよびＡＧＲＰは、食物摂取の調節に重要な役割を演じていることが見出されている（レビン（Ｌｅｖｉｎｅ）およびモーリー（Ｍｏｒｌｅｙ）、１９８４年；クラーク（Ｃｌａｒｋ）ら、１９８４年；グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら、１９９７年；オルマン（Ｏｌｌｍａｎｎ）ら、１９９７年）。さらに、いくつかの製薬会社およびバイオテク会社において、それらの経路が肥満および糖尿病に対する薬剤発見の標的となっている（ハルフォード（Ｈａｌｆｏｒｄ）、２００１年）。
【００１５】
ヒトゲノムの最初の図において同定された遺伝子の半分はそれらに帰される機能を有さないと予想されている（ランダー（Ｌａｎｄｅｒ）ら、２００１年；ベンター（Ｖｅｎｔｅｒ）ら、２００１年）。これらの未知の遺伝子の生物学的役割を速やかに調べる能力が、多くの研究所および製薬会社の目標である。現在、これらの遺伝子試験を行うための最良の脊椎動物モデル生物はマウスである。相同的組換えおよびランダムレトロウィルス変異誘発により、マウスは機能的遺伝子研究にとっての生きた提供源となった。しかし、マウスの生物学に固有ないくつかの欠点が、遺伝子および遺伝子機能の同定に向けての迅速で大規模なアプローチの開発を妨げている。これらには、著しく広いスペース要件、一腹子サイズの小ささ、子宮内発生、飼育および維持の高コスト、および膨大な調節／動物操作要件が含まれる。ゼブラフィッシュでは、これらの問題に関してほぼ反対の状態である。ゼブラフィッシュは、発生のほとんどを通して透明であり、蛍光、発光または比色標識などの種々の技法を用いて光学顕微鏡により、内部器官の形態および機能を容易に可視化することができるという利点がある。したがって、正方向の遺伝学モデルとして発生中のゼブラフィッシュにより、脊椎動物の遺伝子および蛋白質の機能に対する理解が著しく拡大されると考えられる。
【００１６】
最近、ゼブラフィッシュ精子ライブラリーを作成する試みが少なくとも２つの会社によってなされ、実際、このライブラリーから１つの機能欠失遺伝子が公表された（ナーゼヴィシウス（Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓ）およびエッカー（Ｅｋｋｅｒ）、２０００年）。このライブラリーは、ＥＮＵにより変異誘発した魚から作成されたので、１つの変異体を単離するために数千のＰＣＲと配列決定反応が必要とされた。レトロウィルス挿入変異原を用いて、ゼブラフィッシュライブラリーを作成でき、次いで研究者によって利用することのできるスピードが大きく改善されると思われる。精子サンプルとして、および／またはおよそ２０，０００匹以下の魚、おそらくは２，０００匹以下の魚として収容するので、この挿入ライブラリーが占めるのはわずかなスペースである。これらの精子サンプルは、遺伝子および／または蛋白質の機能の研究のために、容易に生きた魚に再構成することができる。これらの魚は、遺伝子および／または蛋白質の機能の研究のために、容易に生殖させることができる。対象となっている特定の遺伝子の機能を試験するため、推定上の標的薬剤を同定する目的で疾患に関連した表現型に関するライブラリーのスクリーニングのため、有効な薬剤、毒素または他の化学物質の作用部位である遺伝子および蛋白質を同定する目的でこのような化合物に応答しない魚についてのライブラリーのスクリーニングのため、および既知の疾患遺伝子、または対象となっている他の遺伝子／蛋白質の発現または活性を変化させ得る化合物のスクリーニングのため、ゼブラフィッシュにおいて大量に収蔵されたクローニングレトロウィルス変異体は貴重な供給源となろう。
【００１７】
ＤＮＡトランスポゾンは、ゲノム内のある位置から他の位置へと移動できる移動性因子である。当然、トランスポゾンは、ゲノム内およびゲノム間のそれらの移動の結果、進化において役割を演じている。遺伝学者は、トランスポゾンを、遺伝子送達と挿入変異誘発の双方、または下等動物における遺伝子タグ化の道具として利用してきた（シャピロ（Ｓｈａｐｉｒｏ、１９９２年）が、最近まで脊椎動物において利用されたことはなかった。トランスポゾンは、逆方向末端反復により限定されたいくつかの遺伝子配列およびあるＤＮＡ源からトランスポゾンを切り出して他のＤＮＡ配列内にそれを貼り付ける作用をするトランスポゼース酵素からなる比較的単純な遺伝子系である（プラスターク（Ｐｌａｓｔｅｒｋ）、１９９３年）。自律トランスポゾンは、トランスポゼース遺伝子をトランスポゾン内に運び入れるが、一方、非自律トランスポゾンは、その移動のために他のトランスポゼース源を必要とする。
【００１８】
１つのよく知られた転移因子は、トウモロコシＡｃ／Ｄｓ因子である（シュア（Ｓｈｕｒｅ）ら、１９８３年；フェドロフ（Ｆｅｄｏｒｏｆｆ）ら、１９８３年；ポールマン（Ｐｏｈｌｍａｎ）ら、１９８４年）。トウモロコシＡｃ／Ｄｓ因子は、種々多様な植物種において転移することができる（オスボーン（Ｏｓｂｏｒｎｅ）およびベイカー（Ｂａｋｅｒ）、１９９５年）。さらに、修飾トランスポゼースにより触媒される好首尾なＤｓ転移が、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において実証されており（ワイル（Ｗｅｉｌ）およびクンゼ（Ｋｕｎｚｅ）、２０００年）、植物特異的な蛋白質は転移にとって必須でないことを暗示した。多数の他のトランスポゾン、例えば、ゼブラフィッシュにおけるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍａｕｒｉｔｉａｎａのｍａｒｉｎｅｒ因子（ファドゥール（Ｆａｄｏｏｌ）ら、１９９８年）、ゼブラフィッシュにおける線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）Ｔｃ３因子（ラズ（Ｒａｚ）ら、１９９８年）、哺乳動物およびゼブラフィッシュにおける合成トランスポゾン、スリーピングビューティー（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ）（ホリエ（Ｈｏｒｉｅ）ら、２００１年；ダビッドソン（Ｄａｖｉｄｓｏｎ）ら、２００３年；バルシウナス（Ｂａｌｃｉｕｎａｓ）ら、２００４年）、ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエルおよびマウスにおけるＯｒｙｚｉａｓ  ｌａｔｉｐｅｓからのＴｏｌ２（カワカミ（Ｋａｗａｋａｍｉ）ら、２０００年、カワカミ（Ｋａｗａｋａｍｉ）ら、２００４年、カワカミ（Ｋａｗａｋａｍｉ）およびノダ（Ｎｏｄａ）、２００４年）などに関して、異種動物宿主における転移が報告されている。しかし、既知のトランスポゾンで、植物と動物の双方に転移することが実証されているものはまだ無い。
【００１９】
異種トランスポゾンの使用は、多数のモデル種における遺伝子研究にとって強力な手段であった（パリノブ（Ｐａｒｉｎｏｖ）ら、１９９９年；スプラドリング（Ｓｐｒａｄｌｉｎｇ）ら、１９９５年）。異種因子を使用する利点は、非自律因子のゲノムコピーを一旦挿入された、新規宿主内にトランスポゼースがなければ非移動性であるが、トランスポゼースを細胞内に送達すれば移動性になり得るということである。
【００２０】
細胞内にＤＮＡを導入するための方法は知られている。これらには、限定はしないが、リン酸カルシウム、ポリエチレングリコールなどのＤＮＡ濃縮試剤、リポソーム、多層ベシクルなどの脂質含有試剤、およびウィルス媒介法が含まれる。これらの方法全てに限界がある。例えば、ＤＮＡ濃縮試剤およびウィルス媒介法に関してのサイズ制約がある。ウィルス法には、細胞に導入できる核酸の量が限られている。全ての方法が細胞の核酸内への送達核酸の組み込みを促進するわけではなく、ＤＮＡ濃縮法および脂質含有試剤は比較的調製が容易であるが、ウィルスベクター内への核酸の組み込みには多くの労力が費やされることが考えられる。また、ウィルス媒介法は、細胞型または組織型特異的であり得、ウィルス媒介法の使用により、インビボで使用する場合、免疫学的な問題を生じさせ得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
細胞内へＤＮＡを導入するための新規方法、特に、細胞の核酸内への種々の大きさの核酸断片の効率的な組込み、特に、細胞のゲノム内へのＤＮＡの組込みを促進する新規方法が依然として求められている。また、遺伝子欠失に関するスクリーニング、対象遺伝子の研究、対象遺伝子に関連した病態の治療または予防に有用な薬剤のスクリーニングに使用し得る脊椎動物（例えば、ゼブラフィッシュ、マウスなど）の挿入変異ライブラリーの開発が依然として求められている。
【００２２】
［発明の概要］
本発明は、魚類、鳥類、および哺乳動物ならびにヒトなどの他の動物を含む脊椎動物における修飾トウモロコシＡｃ／Ｄｓ転移因子の使用に関する。本発明のトランスポゾン系は、バイオテクノロジーの多くの分野に適用される。動物におけるベクターに関する転移因子の開発により、以下のことが可能になる。１）本出願に提供された方法を用いた、動物の染色体内への遺伝物質の効率的な挿入、２）挿入変異原としてのトランスポゾンの使用による、成長および発生に関与する遺伝子の同定、単離、および特徴決定、３）成長および発生を制御している転移調節配列の同定、単離、および特徴決定、４）定量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）分析用マーカー構築体の使用、５）成長および発生以外の経済的に重要な形質、すなわち、疾病抵抗性の遺伝子座の同定、および６）遺伝子療法用の非ウィルスベクター。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
したがって、第１の態様において、本発明は、脊椎動物における転移のための修飾ＡｃおよびＤｓ転移因子を提供する。一実施形態において、修飾Ｄｓ因子は、対象ポリヌクレオチドを含有し、ゲノム内に安定に組み込まれた該ポリヌクレオチド有する遺伝子導入脊椎動物を調製するために使用できる。第２の実施形態において、修飾Ｄｓ因子は、脊椎動物における挿入変異体を調製するために使用できる。一態様において、修飾Ｄｓ因子（Ｄｓ構築体としても知られている）は、Ｄｓ因子の５’末端と３’末端との間に位置した対象となっているポリヌクレオチドを含んでなる。
【００２４】
第２の態様において、本発明は、修飾Ａｃトランスポゼースまたはゲノム内に安定に組み込まれた修飾Ｄｓ因子のいずれかを含有する遺伝子導入脊椎動物を提供する。
【００２５】
第３の態様において、本発明は、修飾トウモロコシＡｃ／Ｄｓ転移因子を用いた、脊椎動物における転移のための方法を提供する。一実施形態において、修飾Ｄｓ因子または修飾Ｄｓ因子を含有するベクターを脊椎動物に導入する。この実施形態の一面において、修飾ＡｃトランスポゼースについてのＲＮＡと共に、修飾Ｄｓ因子または修飾Ｄｓ因子を含有するベクターを脊椎動物に導入する。第２の面において、ゲノム内に安定に組み込まれた、本明細書に記載された修飾Ａｃトランスポゼース遺伝子を含有する遺伝子導入脊椎動物に、修飾Ｄｓ因子または修飾Ｄｓ因子を含有するベクターを導入する。第３の面において、修飾Ａｃトランスポゼース蛋白質と共に、修飾Ｄｓ因子または修飾Ｄｓ因子を含有するベクターを脊椎動物に導入する。第４の面において、修飾トランスポゼース遺伝子を含有するベクターと共に、修飾Ｄｓ因子または修飾Ｄｓ因子を含有するベクターを脊椎動物に導入する。各々の場合に、修飾Ａｃトランスポゼース蛋白質は、脊椎動物における修飾Ｄｓ因子の転移を駆動する。
【００２６】
この第３の態様の第２の実施形態において、遺伝子導入脊椎動物を作出するために、修飾Ｄｓ因子が脊椎動物のゲノム内に安定に組み込まれる。遺伝子導入脊椎動物は、本明細書に記載された修飾Ｄｓ因子を用いて、本明細書に記載されたとおり調製される。この実施形態の１つの面において、修飾Ｄｓ因子を含有する遺伝子導入脊椎動物に修飾ＡｃトランスポゼースについてのＲＮＡが導入される。第２の面において、ゲノム内に安定に組み込まれた修飾Ａｃトランスポゼースについてのコード配列を含有する遺伝子導入脊椎動物を、修飾Ｄｓ因子を含有する遺伝子導入脊椎動物と交配する。第３の面において、修飾Ｄｓ因子を含有する遺伝子導入脊椎動物に、修飾Ａｃトランスポゼース蛋白質を導入する。第４の面において、修飾Ｄｓ因子を含有する遺伝子導入脊椎動物に、修飾トランスポゼース遺伝子を含有するベクターを導入する。各々の場合に、修飾Ａｃトランスポゼース蛋白質は、脊椎動物における修飾Ｄｓ因子の転移を駆動する。
【００２７】
第４の態様において、本発明は、遺伝子を変化させた細胞および動物の索引付きライブラリーを提供するために、標的脊椎動物の遺伝子における挿入変異体を提供する。本発明はまた、容易に操作され特徴決定されるライブラリーに細胞および動物を組織化する方法を提供する。一実施形態において、遺伝子変化させた細胞は、脊椎動物の胚を処置し、該胚を成体へと成長させ、成体脊椎動物を回収することによって生産される、ゼブラフィッシュなどの脊椎動物である。挿入変異を含有する成体脊椎動物は、始祖脊椎動物と称される。第２の実施形態において、遺伝子変化させた細胞は、脊椎動物の胚を処置し、該胚を成体へと成長させ、成体オスの精子を採集することによって生産される、脊椎動物の精子細胞である。挿入変異を含有するオス脊椎動物は、やはり始祖オスと称される。第３の実施形態において、始祖オスの原物精子を、解凍してから野生型メスの卵にインビトロ受精させ、所望の挿入体を有する脊椎動物を作出するために使用する。それらが成体になったら、新たに作出された全てのオスから第２の精子サンプルを採集する。これらの方法を用いることによって、該ライブラリーは、多数の遺伝子スクリーニングの完了を可能にする。該ライブラリーは、セットの各メンバーが少なくとも１つの遺伝子に少なくとも１つの変異を有するセットを含んでなり、該セットは集合的に、遺伝子の少なくとも１５％を含んでなる。
【００２８】
第５の態様において、本発明は、例えば、挿入体にフランキングするＤＮＡの配列決定により、該挿入体の特徴決定を提供する。
【００２９】
第６の態様において、本発明は、配列データベースを提供する。引き続いて、該配列データベースはライブラリーの索引として役立つ。本質的に、ライブラリーにおけるあらゆる精子細胞系および／またはそれらの始祖脊椎動物または子孫は、配列情報を用いて個々に目録化される。得られた配列は挿入変異に対して特異的である。このデータベースから対象となっている遺伝子を同定することができる。同定されたら、対応する変異精子細胞または変異精子魚を、その配列データに対するクロスレファレンスに基づいて、該ライブラリーから引き出すことができる。
【００３０】
第７の態様において、本発明は、遺伝子の機能を迅速に同定するための方法を提供する。上記のとおり作出された対象遺伝子の変異を含有する脊椎動物を、特定の表現型に関し、ノックアウトマウスを特定の表現型の判定のために試験するのと同じ様に調べることができる。本明細書で用いられる「表現型」とは、少なくとも１つの遺伝子または変異遺伝子の存在および作用によって生じる細胞または生物の定義可能で検出可能な遺伝性の形質を意味する。
【００３１】
第８の態様において、本発明は、遺伝子スクリーニングを実施するための方法を提供する。該方法における第１段階として、脊椎動物（または該ライブラリーを包含する脊椎動物）、またはそれらの子孫が使用できるか、あるいは、精子を、解凍してから野生型メスの卵にインビトロ受精させ、所望の挿入体を有する脊椎動物を作出するために使用する。同型接合型または異型接合型いずれかの状態の変異を有する注入メスの子孫から二倍体の脊椎動物をスクリーニングできるか、または受精後３日間生存し発生することが知られている一倍体の胚においてスクリーニングを実施できる。変異に関して同型接合の脊椎動物は、慣例的な交配法、一倍体胚の作出、または雌性発生二倍体胚の作出によって作出することができる。これらの方法は、先行技術に十分に記載されている（例えば、ゼブラフィッシュに関しては、ウェスターフィールド（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ）（２０００年）を参照）。上記の方法のいずれかを用いて調製された所望の挿入体を有する脊椎動物を用いて、インビボでの挿入変異の効果を試験することにより、遺伝子機能を試験することができる。この様式で、表現型を挿入変異および配列データと関連付けることができ、したがって、例えば、推定上の薬剤標的の新規な集合の同定が可能となる。該配列データはまた、対象遺伝子を同定し、ヒトなどの他の生物におけるホモログまたはオルソログの探索に使用される。
【００３２】
第９の態様において、本発明は、候補化合物をスクリーニングする方法を提供する。所望の挿入体を有する脊椎動物、すなわち、所望の変異を有する脊椎動物が上記のとおり作出される。これらの遺伝子導入脊椎動物を化合物に曝露させて、ある表現型に及ぼす該化合物の効果または対象となっているアッセイ結果を評価することができる。例えば、所望の挿入体を有する、または挿入体の全てを表す遺伝子導入脊椎動物に、試験化合物を投与することができる。特定の変異によって、もはやある化合物に応答しない脊椎動物をスクリーニング、および引き続いて同定することにより、前記化合物の作用にとって必要な蛋白質をコードする遺伝子を同定したことになるだろう。試験化合物は、対象遺伝子によってコードされた蛋白質の阻害剤または活性剤として作用することができる。この様式で、対象遺伝子に関連した病態を治療または予防するための薬剤として有用な化合物が同定される。
【００３３】
第１０の態様において、本発明は、脊椎動物における遺伝子療法のための修飾トウモロコシＡｃ／Ｄｓ転移因子の使用法を提供する。
【００３４】
［図面の簡単な説明］
図１Ａ〜１Ｃは、本発明に従って作製された構築体を示す図である。図１Ａは、５’と３’のＤｓシス要求配列（それぞれ、２５０ｂｐおよび３７０ｂｐ）の間に挿入された、３．１ｋｂのレポーター断片（ゼブラフィッシュケラチン８プロモーター下のＥＧＦＰ遺伝子）を担持するＤｓドナー構築体を示す図である。黒色矢印は、切り出しＰＣＲ用のプライマーを示し、灰色矢印はＴＡＩＬ−ＰＣＲ用の特異的プライマーを示す。図１Ｂは、インビトロ転写用のＳＰ６プロモーター、合成核局在化シグナルに融合させた切断Ａｃトランスポゼース（ＴＰアーゼ１０３〜８０７）のコード配列を含有するＴＰアーゼ構築体を示す図である。点線は、アフリカツメガエルのβ−グロビン遺伝子の５’および３’−ＵＴＲを表す。図１Ｃは、ＮＬＳ−、ＮＬＳＫ５Ｅ−、およびＮｏＮＬＳ−ＴＰアーゼのＮ末端アミノ酸配列を示す図である。ＮＬＳシグナルは、太活字で強調してある。ＮＬＳの配列は、配列番号２である。ＮＬＳに関して示される完全アミノ酸配列は、配列番号２０のアミノ酸残基１〜１５によって示されている。ＮＬＳＫ５Ｅの配列は、配列番号９である。ＮＬＳＫ５Ｅに関して示される完全アミノ酸配列は、配列番号４４のアミノ酸残基１〜１５によって示されている。ＮｏＮＬＳの配列は、配列番号３１であり、ＴＰアーゼ１０３〜８０７の最初の４アミノ酸残基、例えば、配列番号２０のアミノ酸残基１２〜１５を表している。
【００３５】
図２Ａ〜２Ｃは、Ｄｓ因子のＴＰアーゼ特異的切り出しおよび挿入を示す図である。図２Ａは、Ｄｓ切り出しアッセイを示す図である。ゼブラフィッシュ胚は、Ｄｓ構築体とＮｏＮＬＳ−、ＮＬＳＫ５Ｅ−、およびＮＬＳ−ＴＰアーゼＲＮＡ（レーン２、３および４に対応）およびＤｓ構築体のみ（レーン１）を注入された。注入１０時間後に注入された胚からＤＮＡを単離し、Ｄｓドナー部位にフランクするプライマーを用いたＰＣＲに供した。（Ｍ）１ｋｂ  ＤＮＡラダー（ＮＥＢ）。図２Ｂは、２種の異なるドナーベクターからの優勢切り出しフットプリントを示す図である。フランキングドナーベクターの欠失した、および変化したヌクレオチドは、それぞれ、太活字または下線にしてある。小文字は、Ｄｓ配列の境界を示す。ドナー１の切り出し前に関して、ヌクレオチド配列は、包含的にヌクレオチド２９から３９１７の配列番号１に示された配列である。ドナー１の切り出し後に関して、上列の配列は、配列番号３に示された配列であり、下列の配列は、配列番号４に示された配列である。ドナー２の切り出し前に関して、Ｄｓの５’のヌクレオチド配列は、配列番号６８であり、Ｄｓの３’のヌクレオチド配列は、配列番号６９である。「Ｄｓ」配列は、包含的にヌクレオチド５４からヌクレオチド３８９２の配列番号１に示された配列である。ドナー２の切り出し後に関して、上列の配列は、配列番号５に示された配列であり、下列の配列は、配列番号６に示された配列である。図２Ｃは、２種の異なる遺伝子導入Ｆ１魚のＤｓ挿入部位にフランクする配列の代表例を示し、特異的転移機序を示す図である。Ｄｓ末端配列は小文字で示され、フランキング配列は大文字で示されている。古典的８ｂｐ直接的標的重複は、太活字で下線が引いてある。上列におけるＤｓの５’の配列は、配列番号３２で示された配列であり、上列におけるＤｓの３’の配列は、配列番号３３で示された配列である。下列におけるＤｓの５’の配列は、配列番号３４で示された配列であり、下列におけるＤｓの３’の配列は、配列番号３５で示された配列である。「Ｄｓ」配列は、包含的にヌクレオチド５４からヌクレオチド３８９２の配列番号１に示された配列である。
【００３６】
図３Ａ〜３Ｆは、ＴＰアーゼの細胞内局在化に及ぼす種々のＮＬＳ配列の効果を示す図である。図３Ａ〜３Ｃは、ＮｏＮＬＳ−ＴＰアーゼ、ＮＬＳＫ５Ｅ−ＴＰアーゼおよびＮＬＳ−ＴＰアーゼゼブラフィッシュ上皮細胞のＧＦＰタグ化型の細胞成分局在化を示す図である。写真は細胞の輪郭を強調するために露出過度にした。図３Ｄ〜３Ｆは、ゼブラフィッシュ上皮細胞におけるＮｏＮＬＳ−、ＮＬＳＫ５Ｅ−およびＮＬＳ−ＥＧＦＰ融合タンパク質の細胞内局在化を示す図である。
【００３７】
図４は、Ｆ１魚におけるＤｓコピー数の評価を示す図である。個々のＦ１魚をｗｔと異系交配し、１２のランダムに選択したＧＦＰ陽性胚のＤＮＡをサザンブロット解析のために用いた。ＤＮＡサンプルをＥｃｏＲＩで消化し（Ｄｓ構築体は単一ＥｃｏＲＩ部位を含有する）、ＥＧＦＰ配列に関するＤＩＧ標識プローブとハイブリダイズさせた。（レーン１〜４）同一ファミリーからの４種の異なるＦ１魚の子孫（同一始祖魚Ｆ０由来）、（レーン５〜１１）異なるファミリーからのＦ１魚の子孫（異なるＦ０始祖魚由来）、（レーン２）ＧＦＰ陰性対照。
【００３８】
図５は、ゲノムＤｓ挿入体の転移を示す図である。上部：皮膚上皮および腸管に同等の弱いＧＦＰ発現パターンを示している、ゲノムにおける単一のＤｓ挿入を有する模倣物注入遺伝子導入魚。中央：脳、脊髄、耳、筋肉、生殖腺領域に異所性ＧＦＰ発現を示し、皮膚に斑入りモザイク発現を示している（コピー数の増加によると推定される）、ＴＰアーゼＲＮＡを注入した同じＤｓ挿入体を担持する魚の代表例。下部：Ｆ１世代の中で見られた新規発現パターンの例−脊索における発現は対照には存在しない。さらに、対照魚の皮膚上の点線パターンは、Ｆ１魚に存在せず、ドナーＤｓコピーが転移中に失われることを示している。
【００３９】
図６Ａ〜６Ｃは、転移したＨＥＫ２９３細胞の３例におけるＤｓの解析結果を示す図である。図６Ｂに示された「Ｄｓ」配列は、包含的にヌクレオチド１７からヌクレオチド４８１９の配列番号７０に示された配列である。これら３例におけるＤｓ（小文字）は、Ｄｓ末端配列に直に隣接した最初のヌクレオチドから始まるヒトＤＮＡ（大文字）（ドナーのベクターＤＮＡではない）によりフランクされている。これは、Ｄｓが、トランスポゼース媒介機序によってヒトゲノム内に組み込まれたことを示している。ＤＮＡ２の場合、挿入部位は、ｈＡＴトランスポゾンが新規位置に組み込まれる際にしばしば作出される古典的８ｂｐ直接的反復によって囲まれている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
［発明の詳細な説明］
本発明には、魚類、鳥類、および哺乳類を含む他の動物などの脊椎動物における修飾トウモロコシＡｃ／Ｄｓ転移因子の使用が記載される。本明細書で用いられる魚類とは、魚上綱（Ｐｉｓｃｅｓ）として集合的に称される綱の任意のメンバーを称する。商業的または科学的に関心対象となっている種に属する種々の魚類を使用することが好ましい。このような魚類としては、限定はしないが、サケ、マス、マグロ、ハリバット、ナマズ、ゼブラフィッシュ、メダカ、コイ、ティラピア、キンギョ、およびドジョウが挙げられる。哺乳動物としては、限定はしないが、ラットおよびマウスなどの齧歯類、ウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタなどの有蹄類、サル、類人猿およびヒトなどの霊長類が挙げられる。
【００４１】
本発明による修飾トウモロコシＡｃ／Ｄｓ転移因子の使用は、安定なゲノム組込みの生成、すなわち、宿主によって産生されるトランスポゼース活性による再転移または組換えの危険性除去に関して著しい利点を有する。例えば、元々メダカ魚から抽出されたＴｏｌ２因子の挿入は、宿主のトランスポゼースのために、この魚において不安定になる（コガ（Ｋｏｇａ）ら、）。トウモロコシＡｃ／Ｄｓ因子は、脊椎動物において有意に類似なホモログを有していない。
【００４２】
以下の記述において、本発明の態様は、簡便さのみを目的に、ゼブラフィッシュを引用して説明されている。当然、他の魚類および他の動物をゼブラフィッシュの替わりに使用することができる。実施例に示されるように、本発明は、魚類からヒトの範囲の全ての脊椎動物に応用可能である。したがって、本発明の修飾トウモロコシＡｃ／Ｄｓ転移因子は、多能性細胞（すなわち、造血幹細胞または他の幹細胞などの、後続体がいくつかの制限された細胞型に分化できる細胞）および全能性細胞（すなわち、後続体が生物における任意の細胞型になれる細胞、例えば、胚性幹細胞）の双方にＤＮＡを導入するために使用できる。好適な細胞としては、卵母細胞、卵が挙げられ、一または複数細胞の胚もまた本発明において考慮されている。遺伝子転移を目的として、本発明の修飾トウモロコシＡｃ／Ｄｓ転移因子は、種々の器官または組織の成熟細胞内へＤＮＡを導入するために使用できる。好適な細胞としては、限定はしないが、リンパ球、肝細胞、神経細胞、筋細胞、種々の血液細胞、および生物の種々の細胞が挙げられる。
【００４３】
本発明の使用に最も好ましい魚はゼブラフィッシュ、Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏである。ゼブラフィッシュは、一般的な無脊椎実験生物の利点の多くを有し、かつ、脊椎動物であるというさらなる利点を含むため、益々一般に好まれる実験動物になっている。ゼブラフィッシュの他の著しい利点は、線虫のように、ほとんど透明なことである（キンメル（Ｋｉｍｍｅｌ）、１９８９年）。一般的なゼブラフィッシュの管理と維持は、ストレイシンガー（Ｓｔｒｅｉｓｉｎｇｅｒ）（１９８４年）およびウェスターフィールド（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ）（２０００年）に記載されている。
【００４４】
本発明によると、魚類におけるＤｓ転移は修飾Ａｃトランスポゼースにより駆動される。１０２個のＮ末端アミノ酸を欠失している、Ａｃトランスポゼースの切断形（ＴＰアーゼ１０３〜８０７）（配列番号７および８）は、高活性であることが、以前に実証されている（ホウバ−ヘリン（Ｈｏｕｂａ−Ｈｅｒｉｎ）ら、１９９０年）。本発明の一実施形態において、この修飾Ａｃトランスポゼースは、合成核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含有するようにさらに修飾される。合成ＮＬＳは、ＴＰアーゼ１０３〜８０７のＮ末端に付加される。合成ＮＬＳは、転移反応を核に局在化させるために付加される。一実施形態において、該合成ＮＬＳは、ＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳに類似している。好ましい一実施形態において、この合成ＮＬＳは、アミノ酸配列ＭＧＰＰＫＫＫＲＫＶＥ（配列番号２）を有する。ＳＶ４０抗原に類似した合成ＮＬＳの替わりに、他の合成ＮＬＳ類を用いることもできる。一実施形態において、該合成ＮＬＳは修飾ＮＬＳである。修飾ＮＬＳの一実施形態は、アミノ酸配列ＭＧＰＰＥＫＫＲＫＶＥ（配列番号９）を有するＮＬＳＫ５Ｅである。該合成ＮＬＳをコードするヌクレオチド配列をＴＰアーゼ１０３〜８０７のコード配列の５’末端に付加して、修飾Ａｃトランスポゼースのコード配列を作出する。ＮＬＳ−ＴＰアーゼ１０３〜８０７のコード配列の一実施形態は、配列番号１０で記載される。ＮＬＳＫ５Ｅ−ＴＰアーゼ１０３〜８０７のコード配列の一実施形態は、配列番号３６で記載される。
【００４５】
本発明のさらなる実施形態において、本発明に利用される修飾Ａｃトランスポゼースは、最適にアラインさせた場合（適切なヌクレオチド挿入または欠失で）本明細書で検討されている修飾Ａｃトランスポゼースのヌクレオチド配列に、少なくとも約６０％、好ましくは、少なくとも約７０％、より好ましくは、少なくとも約８０％、最も好ましくは、少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を有し得る。ヌクレオチド配列を遺伝子コードに基づいて修飾し、同一のタンパク質をコードする異なるヌクレオチド配列を生成させることのできることは、当業者により認識されるところである。あるいは、本発明に利用される修飾Ａｃトランスポゼースは、修飾Ａｃトランスポゼースに関して本明細書に開示されたアミノ酸配列に、少なくとも約７５％、好ましくは、少なくとも約８５％、より好ましくは、少なくとも約９０％、最も好ましくは、少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。
【００４６】
同一性とは、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の２本の鎖間の合致の同一性によって決定される、２つのポリペプチド配列または２つのポリヌクレオチド配列の間の配列関連性の程度を意味する。同一性は容易に算出できる。２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の間の同一性を測定する多数の方法が存在するが、「同一性」という用語は、当業者に十分知られている（「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、レスク，Ａ．Ｍ．（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．）編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８８年；「Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ」、スミス，Ｄ．Ｗ．（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．）編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９３年；「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ」、パートＩ、グリフィン，Ａ．Ｍ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．）およびグリフィン，Ｈ．Ｇ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．）編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ニュジャージー州、１９９４年；「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、ホン・ヘインジ，Ｇ．（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７年；および「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ」、グリブスコフ，Ｍ．（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．）およびデベロイクス，Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９１年）。２つの配列間の同一性を判定するために一般に用いられている方法としては、限定はしないが、「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｇｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ」，マーチンＪ．ビショップ（Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ）編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンジエゴ、１９９４年、およびカリロ，Ｈ．（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．）およびリップマン，Ｄ．（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．）、ＳＩＡＭ．Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８：１０７３頁（１９８８）に開示されているものが挙げられる。同一性を判定する好ましい方法は、試験される２つの配列間に最大の合致を与えるように設計される。このような方法はコンピュータプログラム内にコード化される。２つの配列間の同一性を判定する好ましいコンピュータプログラム法としては、限定はしないが、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、マジソン、ウィスコンシン州）プログラムパッケージ（デベロイクス，Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７頁（１９８４年））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９０年）；アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９７年））が挙げられる。周知のスミス  ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ）演算法もまた、同一性の判定に使用できる。
【００４７】
一例として、参照ヌクレオチド配列に、少なくとも、例えば、９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、該ヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の各々１００個のヌクレオチド当たり、５つまでの点変異を含み得ることを除いて、ポリヌクレオチドの該ヌクレオチド配列が参照配列に同一であることを意味する。言い換えると、参照ヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一性であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るには、参照配列における５％までのヌクレオチドを欠失させることができるか、または他のヌクレオチドと置換できるか、または参照配列における全ヌクレオチドの５％までのヌクレオチドを参照配列内に挿入できる。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５末端位または３末端位に生じ得るか、または、それらの末端位の間の、参照配列におけるヌクレオチド間で個々に、または参照配列内の１つまたは複数の連続基において散在した、いずれかの場所において生じ得る。
【００４８】
さらに、修飾Ａｃトランスポゼース遺伝子は、本明細書で検討された修飾Ａｃトランスポゼースヌクレオチド配列と実質的な類似性を有するヌクレオチド配列を含み得る。「実質的な類似性」とは、本明細書において、該ヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列に十分に類似しており、中程度にストリンジェントな条件下でそれとハイブリダイズすることを意味する。類似性を判定するこの方法は、本発明が属する技術分野において十分知られている。簡単に述べると、中程度にストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム溶液）、０．５％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１．０ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）（ｐＨ８．０）の予備洗浄液および５５℃、５×ＳＳＣのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の使用を含み、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、第１巻、１０１−１０４頁、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８））に定義されている。
【００４９】
修飾Ａｃトランスポゼースは、インビトロで合成できるか、または生物源から単離できる。合成および単離のこのような方法は、当業者によく知られている。
【００５０】
修飾Ａｃトランスポゼースは魚に導入される。一実施形態において、修飾Ａｃトランスポゼースタンパク質が魚に導入される。該タンパク質は、微量注入などの慣例的技法を用いて魚に導入される。
【００５１】
第２の実施形態において、修飾ＡｃトランスポゼースについてのＲＮＡが魚に導入される。この実施形態により、修飾Ａｃトランスポゼース転写産物が、インビトロで合成できるか、または生物源から単離できる。一態様において、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよび修飾Ａｃトランスフェラーゼのコード配列を含有する核酸構築体が調製される。該ＲＮＡポリメラーゼプロモーターはＳＰ６プロモーターであることが好ましい。しかしながら、Ｔ７プロモーターなどの他のＲＮＡポリメラーゼプロモーターも使用できる。該核酸構築体はさらに、５’および３’−ＵＴＲおよびポリＡ尾部を含んでなる。アフリカツメガエルのβ−グロビン遺伝子の５’および３’−ＵＴＲおよびポリＡ尾部を用いることが好ましいが、任意の５’および３’−ＵＴＲが使用できる。あるいは、アフリカツメガエルのβ−グロビン遺伝子の５’および３’−ＵＴＲの替わりに、魚に固有の５’および３’−ＵＴＲが使用できる。同様に、アフリカツメガエルのβ−グロビン遺伝子のポリＡ尾部の替わりに、魚に固有のポリＡ尾部が使用できる。このような核酸構築体の一実施形態は、配列番号１１で記載される。このような核酸の第２の実施形態は、配列番号３７で記載される。
【００５２】
第３の実施形態において、修飾Ａｃトランスポゼース遺伝子は、魚のゲノム内に安定に組み込まれて、遺伝子導入魚が作出される。本明細書で用いられる遺伝子導入魚とは、外因性構築体が導入された魚、または魚の子孫を称する。構築体が導入された魚としては、構築体が導入された胚細胞から発生した魚が挙げられる。本明細書に用いられる外因性構築体は、動物に人工的に導入されるか、またはもともと人工的に導入された核酸である。人工的導入という用語は、通常の生殖または遺伝子交配による構築体の導入を除外することが意図されている。すなわち、交配育種による、動物の系統または血統への遺伝子または形質の本来の導入は除外されることが意図されている。しかし、該構築体を含有する魚からの外因性構築体（すなわち、もともと人工的に導入された構築体）の、通常の交配による移入により生産された魚は、外因性構築体を含有すると考えられる。このような魚は、外因性構築体が導入された魚の子孫である。本明細書に用いられる魚の子孫は、性的生殖またはクローニングによる魚の子孫であるとともに、それらにより遺伝材料が引き継がれた任意の魚である。この脈絡において、クローニングとは、魚のＤＮＡ、細胞と遺伝的に同一の魚の生産を称する。他の魚が子孫となる元の魚を、祖先魚または始祖魚と称する。本明細書に用いられる、細胞（例えば、胚細胞）からの魚の発生、または細胞の魚への発生とは、受精卵細胞または胚細胞（およびそれらの後代）が増殖、分裂、および分化して成体魚を形成する発生過程を称する。
【００５３】
修飾Ａｃトランスポゼースのコード配列を含有する遺伝子導入構築体を用いて、遺伝子導入魚が調製される。遺伝子導入構築体は、魚に導入して遺伝子導入魚を生産する遺伝材料である。このような構築体は、人工的に魚に導入される。導入の様式、および、多くの場合、遺伝子導入構築体の構造によって、このような遺伝子導入構築体は外因性構築体になる。遺伝子導入構築体は、開示された遺伝子導入魚に使用するために、任意の核酸配列から構成し得るが、遺伝子導入構築体は、発現産物をコードする配列に操作可能に結合した発現配列を組み合わせることが好ましい。遺伝子導入構築体はまた、魚のゲノム内の該構築体の発現、安定性または組み込みを補助する他の成分を含むことが好ましい。本明細書に用いられる、遺伝子導入構築体の成分とは、操作可能に結合されているものを言うか、または操作可能に結合されているとは、成分が意図された目的のために共に機能することが可能になるように結合されていること言う。例えば、プロモーターがコード領域の転写をもたらすように機能する場合、該プロモーターとコード領域とは操作可能に結合されている。
【００５４】
一態様において、遺伝子導入構築体は、上記のＲＮＡポリメラーゼプロモーター構築体である。第２の態様において、修飾Ａｃトランスポゼースのコード配列を含有する遺伝子導入構築体は、発現配列を含むように調製される。発現配列は、該構築体にコードされた発現産物の発現を媒介するために用いられる。本明細書に用いられる発現配列には、プロモーター、上流因子、エンハンサー、および応答因子が含まれる。開示された構築体に用いられる発現配列は、同型的な発現配列であることが好ましい。本明細書に用いられる、開示された遺伝子導入魚に用いられる遺伝子導入構築体の成分に関して、同型的とは、該成分が、関与する魚の種またはタイプに固有であるか、またはそれに由来することを示す。逆に、異型的とは、該成分が、関与する魚の種またはタイプに固有でもなく、それに由来するものでもないことを示す。
【００５５】
本明細書に用いられる発現配列は、２つの主要なクラス、プロモーターとエンハンサーに分けられる。プロモーターは、一般に、転写開始部位に関して比較的固定された位置において機能するＤＮＡの配列である。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼと転写因子との基本的相互作用に必要なコア因子を含有し、上流因子および応答因子を含有し得る。エンハンサーは一般に、転写開始部位から固定されていない距離で機能し、どちらの方向でもあり得るＤＮＡの配列を言う。エンハンサーは、近傍のプロモーターからの転写を増大する働きをする。エンハンサーはまた、転写の調節を媒介する応答因子を含有することが多い。プロモーターもまた、転写の調節を媒介する応答因子を含有し得る。
【００５６】
コードされたペプチドまたはタンパク質の発現のために、遺伝子導入構築体はまた、ＲＮＡに転写されたら、コードされた発現産物の翻訳を媒介する配列を必要とする。このような配列は一般に、転写されたＲＮＡの５’非翻訳領域に見られる。この領域は、転写開始部位と翻訳開始部位（すなわち、開始コドン）との間の構築体上の領域に相当する。構築体の５’非翻訳領域は、該構築体に用いられたプロモーターに通常連結した５’非翻訳領域、発現産物をコードする配列に通常連結した５’非翻訳領域、該プロモーターまたは発現産物をコードする配列に関連していない遺伝子の５’非翻訳領域、またはこれらの５’非翻訳領域のハイブリッドに由来し得る。該５’非翻訳領域は、該構築体が導入される魚と同型であることが好ましい。好ましい５’非翻訳領域は、通常、用いられるプロモーターに連結したものである。
【００５７】
開示された遺伝子導入魚に用いられる遺伝子導入構築体は、レポータータンパク質をコードし得る（発現の検出および定量化のため）。本明細書に用いられるレポータータンパク質は、発現の際に特異的に検出され得る任意のタンパク質である。レポータータンパク質は、発現配列からの発現の検出または定量化にとって有用である。例えば、レポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列を、組織特異的発現配列に操作可能に結合することにより、系統発生を詳しく研究することが可能になる。このような研究において、レポータータンパク質は、細胞移動などの発生過程のモニタリングのためのマーカーとして役立つ。多くのレポータータンパク質が知られており、他の生物における同様な目的に使用されている。これらには、特定の検出可能な産物を産生し得るβ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、およびアルカリホスファターゼなどの酵素、ならびに直接検出できるタンパク質が含まれる。実質的に任意のタンパク質が、例えば、該タンパク質に対する特異的抗体を用いることによって直接検出できる。
【００５８】
外因性因子を加える必要なしに直接検出可能なレポータータンパク質の使用は、ゼブラフィッシュ胚の発生時の遺伝子発現の検出および評価に好ましい。レポータータンパク質および組織特異的発現配列をコードする構築体を担持する遺伝子導入ゼブラフィッシュ胚により、発生制御遺伝子の空間的および時間的な発現パターンを分析する迅速なリアルタイムインビボシステムが提供される。
【００５９】
開示された遺伝子導入構築体は、該構築体の発現形態または安定性を改善する他の配列を含むことが好ましい。例えば、あるタンパク質をコードする構築体上にポリアデニル化シグナルを含むことにより、導入遺伝子からの転写産物がｍＲＮＡとして処理され、輸送されることが確実になる。発現構築体におけるポリアデニル化シグナルの同定および使用は十分に確立されている。遺伝子導入構築体に同種のポリアデニル化シグナルを使用することが好ましい。
【００６０】
上記の原理に従い、修飾Ａｃトランスポゼースのコード配列をプロモーターに操作可能に結合する。魚種において活性な任意のプロモーターが使用できる。たいていの哺乳動物のプロモーターは魚類においては十分働かないことが分かっているため、ゼブラフィッシュ、フグまたは他の魚種のゲノム制御配列を、対象となっているコード配列の上流、内部、および下流に特異的にクローニングしなければならないことが多く、これは当業者にとってルーチン的な操作によって達成することができる。
【００６１】
本明細書に定義されているとおり、ヌクレオチド配列は、他のヌクレオチド配列と機能的に関連させて置かれる場合、他のヌクレオチド配列に「操作可能に結合」される。例えば、コード配列がプロモーター配列に操作可能に結合されている場合、これは、該プロモーターが該コード配列の転写を促進し得ることを一般的に意味する。操作可能に結合されているとは、結合されているＤＮＡ配列が、典型的には隣接しており、必要な場合に、隣接してリーディングフレーム内にある２つのタンパク質コード領域に結合することを意味する。エンハンサーはプロモーターから数キロ塩基離れている場合に機能でき、イントロン配列が可変の長さであり得るため、いくつかのヌクレオチド配列は操作可能に結合しているが隣接していないことがあり得る。
【００６２】
該構築体は、マーカーまたはレポーター遺伝子を含んでなることがさらに好ましい。好ましい実施形態において、癌遺伝子の前に、蛍光タンパク質遺伝子（例えば、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、またはｄｓＲＥＤ２）またはリシフェラーゼタンパク質遺伝子などのレポーター遺伝子が置かれる。最も好ましい実施形態において、該マーカーは、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）である（ツァング（Ｚｈａｎｇ）ら、１９９６年）。ＥＧＦＰは、レポータータンパク質に対して高感度であるため好ましい。好ましい実施形態において、マーカーと癌遺伝子の融合が調製され、該融合遺伝子がプロモーターの制御下にあるようにする。
【００６３】
本明細書には特定のマーカーの使用が開示され検討されているが、本発明は、具体的に開示されたマーカーに決して限定されるものではない。さらに多くのレポータータンパク質が知られており、同様な目的に使用されている。これらには、特定の検出可能な産物を産生し得るβ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール、アシルトランスフェラーゼ、β−グルクロニダーゼおよびアルカリホスファターゼなどの酵素、ならびに直接検出できるタンパク質が含まれる。実質的に任意のタンパク質が、例えば、該タンパク質に対する特異的抗体を用いることによって直接検出できる。容易に検出できる任意のタンパク質をＥＧＦＰの替わりに使用できる。真核細胞の陽性または陰性の選択に好適なさらなるマーカー（および関連抗生物質）が、とりわけ、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）（２００１年）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、およびアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（１９９２年）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓに、定期的更新を含めて開示されている。開示されたマーカーのいずれか、ならびに当該技術分野において知られている他のものが、本発明を実施するために使用できる。
【００６４】
遺伝子導入魚は、本明細書に記載された構築体を用いて調製される。一実施形態において、一方法は、核酸、すなわち、受精した魚卵（すなわち、魚の胚など）または非受精魚卵の核酸内への、本明細書に記載された構築体またはベクターの導入を含む。受精した魚卵が用いられる場合、該方法は、その魚の胚を遺伝子導入魚へと発生させることを含む。非受精卵へ核酸を導入する場合、該方法は、卵を受精させ、その魚の胚を遺伝子導入魚へと発生させることを含む。機械的方法、化学的方法、親油的方法、レトロウィルス感染法、および電気穿孔などの当該技術分野において知られている種々の方法によって、核酸を卵内へ導入できる。代表的な機械的方法としては、例えば、微量注入が挙げられる。代表的な化学的方法としては、例えば、リン酸カルシウムまたはＤＥＡＥ−デキストランの使用が挙げられる。代表的な親油的方法としては、リポソームの使用および脂質媒介トランスフェクションのための他のカチオン性試剤が挙げられる。このような方法は、一般的に当該技術分野においてよく知られており、このような方法の多くが、例えば、「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ」、（Ｐ．Ａ．ノートン（Ｐ．Ａ．Ｎｏｒｔｏｎ）およびＬ．Ｆ．スチール（Ｌ．Ｆ．Ｓｔｅｅｌ）編、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｐｒｅｓｓ、２０００年）；および「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）に記載されている。魚を含む微量注入法はさらに、例えば、チェン（Ｃｈｅｎ）およびパワーズ（Ｐｏｗｅｒｓ）（１９９０年）ならびにフレッチャー（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ）およびデイビス（Ｄａｖｉｓ）（１９９１年）により十分に記載されている。魚を含む電気穿孔法はさらに、例えば、パワーズ（Ｐｏｗｅｒｓ）ら（１９９２年）およびルー（Ｌｕ）ら（１９９２年）により十分に記載されている。向汎性レトロウィルスベクターなどのレトロウィルスベクターの感染により魚の卵または胚にＤＮＡを導入する技法はさらに、例えば、バーンズ（Ｂｕｒｎｓ）ら（１９９３年）に記載されている。
【００６５】
導入遺伝子を含んでなるベクターまたは他の核酸は、発生の所望の段階での非受精卵または受精卵に導入できる。本明細書に記載された各々異なる導入遺伝子をコードする複数のベクターを使用することができる。受精卵、または胚を用いる場合、胚（すなわち、発生の一細胞期において）に核酸を導入することが好ましい。しかしながら、核酸は、二細胞期、四細胞期など、発生のより後期に投与することもできる。したがって、桑実胚、胞胚などに、核酸を導入できる。上記の遺伝子導入構築体を組み込んでいる少なくとも１つの単離核酸分子が、受精卵に導入される。また、発生のより後期で核酸が卵に導入される場合、例えば、桑実胚、胞胚などの少なくとも１つの細胞に、上記の遺伝子導入構築体を組み込んでいる少なくとも１つの単離核酸分子が導入される。
【００６６】
魚卵は標準的な方法により、適切な魚から得ることができる。魚の多くは、例えば、ペット店から商品として購買できる。受精卵は当該技術分野において知られた方法により得ることができる。例えば、所望のメス対オスの比率（約２：１など）を有する、所望の数の約３ヵ月齢から約１２ヶ月齢の魚などの適切な月齢の魚を、タンクなどの適切なサイズの容器に入れることができる。例えば、魚を交配後、約１０分から６０分などの適切な時間、タンク内の繁殖室内に入れることによって、卵を採取できる。このような方法は、例えば、カルプ（Ｃｕｌｐ）ら（１９９１年）に記載されている。あるいは、魚卵は、当業者に知られている方法によって人工的に受精させることができる。当業者は、このような受精魚卵を得る他の方法に精通している。
【００６７】
魚の卵または胚への核酸構築体の導入後、その魚卵または魚胚に、成体魚への発生に導く環境を提供する。このような環境としては、例えば、Ｅ３卵水中、２８．５℃で１５日間成長後、１６日目まで循環システム水中への導入を挙げることができる（ウェスターフィールド（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ）、２０００年）。
【００６８】
導入遺伝子を有する魚は、任意の好適な手段で同定することができる。蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、またはｄｓＲＥＤ２など）のようなレポータータンパク質の使用により、外因性因子を加えることなく直接検出でき、ゼブラフィッシュ胚発生時の遺伝子発現の検出または評価のために好ましい。レポータータンパク質をコードする構築体を担持する遺伝子導入ゼブラフィッシュ胚は、発生に関して制御された遺伝子の空間的および時間的発現パターンを分析するための迅速なリアルタイムインビボシステムを提供することができる。あるいは、遺伝子導入の可能性を有する魚のゲノムを、構築体配列の存在に関して探索することができる。実際に導入遺伝子を発現している遺伝子導入魚を同定するために、発現産物の存在をアッセイすることができる。このような同定に関するいくつかの技法が遺伝子導入動物に関して知られて使用されており、その多くを遺伝子導入魚に適用することができる。遺伝子導入構築体に存在するか、またはその特徴である核酸配列に関して、可能性があるか、または実際の遺伝子導入魚の探索は、サザンブロッティングまたはノーザンブロッティングによって達成されることが好ましい。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他のはレポーター特異的核酸増幅法を用いる検出も好ましい。遺伝子導入ゼブラフィッシュの同定に関する好ましい技法は、実施例に記載されている。
【００６９】
導入遺伝子は送達用ベクター内に含ませることができる。本明細書で用いられ、また当該技術分野で知られているベクターとは、標的細胞の形質転換（すなわち、個々の細胞の遺伝子材料を、ゲノム内への外因性ＤＮＡの組込みにより変化させる方法）を指示するように設計された遺伝子材料を含む核酸構築体を称する。微量注入された単一細胞受精の胚において、カセット内の核酸が転写でき、所望の場合は翻訳できるように、位置的に、および経時的に向きづけられた、すなわち、他の必要なまたは所望の因子に操作可能に結合された複数の遺伝子因子を、ベクターは含有できる。
【００７０】
当業者によく知られた、および例えば、本明細書に引用した参考文献に記載された方法に従って、ベクター内に上記の核酸配列を組み込むことによって組換え発現ベクターを構築できる。本発明に用いられる種々多様なベクターが知られている。好適なベクターとしては、プラスミドベクター、レトロウィルスベクター（例えば、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、１９９３年を参照）、アデノウィルスベクター（例えば、エルツルム（Ｅｒｚｕｒｕｍ）ら、１９９３年；ザブナー（Ｚａｂｎｅｒ）ら、１９９４年；デヴィッドソン（Ｄｅｖｉｄｓｏｎ）ら、１９９３年を参照）、アデノ随伴ウィルスベクター（例えば、フロッテ（Ｆｌｏｔｔｅ）ら、１９９３年を参照）、ヘルペスウィルスベクター（例えば、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）ら、１９９３年を参照）、およびレンチウィルスベクター（例えば、レーバー（Ｌｅｖｅｒ）ら、２０００年を参照）などのウィルスベクターが挙げられる。
【００７１】
開示された構築体および方法は、任意のタイプの魚に使用できる。本明細書に用いられる魚とは、集合的に魚上綱と称される綱の任意のメンバーを称する。商業的に、または科学的に関心対象となっている魚の種および変種に属する魚を使用することが好ましい。このような魚としては、限定はしないが、サケ、マス、マグロ、ハリバット、ナマズ、ゼブラフィッシュ、メダカ、コイ、ティラピア、キンギョ、およびドジョウが挙げられる。
【００７２】
開示された構築体および方法による使用に最も好ましい魚は、ゼブラフィッシュ、Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏである。ゼブラフィッシュは、一般的な無脊椎実験生物の利点の多くを有し、かつ、脊椎動物であるというさらなる利点を含むため、益々一般に好まれる実験動物になっている。ゼブラフィッシュの他の著しい利点は、線虫のように、ほとんど透明なことである（キンメル（Ｋｉｍｍｅｌ）１９８９年）。一般的なゼブラフィッシュの管理と維持は、ストレイシンガー（Ｓｔｒｅｉｓｉｎｇｅｒ）（１９８４年）およびウェスターフィールド（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ）（２０００年）に記載されている。
【００７３】
ゼブラフィッシュは容易に入手でき、ほとんど透明である。これらの特徴を考えると、レポータータンパク質をコードする構築体を担持する遺伝子導入ゼブラフィッシュ胚は、発生に関して制御された遺伝子の空間的および時間的発現パターンを分析するための迅速なリアルタイムインビボシステムを提供することができる。さらに、ゼブラフィッシュの胚発生はきわめて迅速である。２４時間のうちに、胚は、機能的な心臓および循環血液細胞を含む全ての主要器官の原基を発生させる（キンメル（Ｋｉｍｍｅｌ）、１９８９年）。同じ望ましい特徴のいくつかまたは全てを有する他の魚もまた好ましい。
【００７４】
種々の細胞系列において（細胞系列特異的発現）、発生の種々の時点で（発生に関して制御された発現または発生段階特異的発現）、種々の組織で（組織特異的発現）、導入遺伝子の発現を測定または同定することによって、開示された遺伝子導入魚における発現パターンの同定を達成することができる。これらの評価はまた、例えば、発生時の細胞系列における発現を測定する（および変化がある場合は、それを観察する）ことと組み合わせることができる。検出される発現産物の性質は、いくつかのこれらの分析の好適性に影響を及ぼし得る。一つの面では、魚の種々の組織を切開し、別個の組織サンプルにおいて発現をアッセイすることができる。ほとんど全ての発現産物を用いる際にこのような評価を実施することができる。この技法は遺伝子導入動物において一般的に用いられており、組織特異的発現の評価に有用である。発現は、生化学的に、酵素的に、表現型に関して、またはモデル魚において判定することができる。
【００７５】
この技法はまた、種々の発生段階で発現産物をアッセイすることにより発生の経過中での発現を評価するためにも使用できる。発現産物の検出が発生中の胚または魚を破壊または死滅させる、サンプル固定または他の処置を必要とする場合、複数の胚を使用しなければならない。これは、種々の胚における発現パターンが同じであるか、または類似していると予想される場合にのみ実用的である。これは、安定で予測可能な発現を有する開示された遺伝子導入魚を用いる場合である。発生時の導入遺伝子の発現のパターンを評価するより好ましい方法は、生きている胚および動物において検出できる発現産物を用いることである。
【００７６】
ゼブラフィッシュでは、神経系および他の器官原基は受精２４時間以内に現れる。ほとんど透明なゼブラフィッシュ胚が母親の外側で発生するため、系統前駆細胞の始点および移動が、遺伝子導入魚における発現産物の引き続く発現によってモニターすることができる。また、これらの魚において、特定の遺伝子の調節を調べることができる。
【００７７】
第４の実施形態において、修飾Ａｃトランスポゼースをコードする遺伝子を含有するベクターを魚に導入する。一態様において、修飾Ａｃトランスポゼースをコードする遺伝子は、上記のような遺伝子導入構築体である。微量注入などの慣例的技法を用い、修飾Ａｃトランスポゼース遺伝子を魚に導入するために、任意の好適なベクター、例えば、プラスミドベクター、ウィルスベクターなどを使用できる。
【００７８】
対象のＤＮＡ（ポリヌクレオチドとも称される）を担持する修飾Ｄｓ因子および修飾Ａｃトランスポゼースを魚に導入することにより、魚におけるＤｓ転移を達成する。一実施形態において、修飾Ｄｓ因子または修飾Ｄｓ因子を含有するベクターを魚に導入する。この実施形態の一態様において、修飾Ｄｓ因子または修飾Ｄｓ因子を含有するベクターを、修飾ＡｃトランスポゼースについてのＲＮＡと共に魚に導入する。第２の態様において、修飾Ｄｓ因子または修飾Ｄｓ因子を含有するベクターを、本明細書に記載された、安定にゲノムに組み込まれた修飾Ａｃトランスポゼース遺伝子をコードする配列を含有する遺伝子導入魚に導入する。第３の態様において、修飾Ｄｓ因子または修飾Ｄｓ因子を含有するベクターを、修飾Ａｃトランスポゼース蛋白質と共に、魚に導入する。第４の態様において、修飾Ｄｓ因子または修飾Ｄｓ因子を含有するベクターを、修飾トランスポゼース遺伝子を含有するベクターと共に、魚に導入する。各々の場合に、修飾Ａｃトランスポゼース蛋白質は、魚における修飾Ｄｓ因子の転移を駆動する。
【００７９】
第２の実施形態において、修飾Ｄｓ因子を魚ゲノムに安定に組み込んで、遺伝子導入魚を作出する。遺伝子導入魚は、本明細書に記載された修飾Ｄｓ因子を用いて、本明細書に記載されたとおり調製する。この実施形態の一態様において、修飾ＡｃトランスポゼースについてのＲＮＡを、修飾Ｄｓ因子を含有する遺伝子導入魚に導入する。第２の態様において、修飾Ａｃトランスポゼースをコードする配列を含有する遺伝子導入魚を、修飾Ｄｓ因子を含有する遺伝子導入魚と交配させる。第３の態様において、修飾Ａｃトランスポゼース蛋白質を、修飾Ｄｓ因子を含有する遺伝子導入魚に導入する。第４の態様において、修飾トランスポゼース遺伝子を含有するベクターを、修飾Ｄｓ因子を含有する遺伝子導入魚に導入する。各々の場合に、修飾Ａｃトランスポゼース蛋白質は、魚における修飾Ｄｓ因子の転移を駆動する。
【００８０】
Ｄｓ因子は、対象となっているポリヌクレオチドを含有するように修飾される。修飾Ｄｓ因子（Ｄｓ構築体とも称される）は、天然Ｄｓ因子の５’末端と３’末端との間に位置する対象ポリヌクレオチドを含んでなる。Ｄｓの５’末端および３’末端は、２つの短い末端逆方向反復配列および修飾Ａｃトランスポゼースに結合できる配列を含む、転移に必要な配列を含有する。転移後、魚のＤＮＡに組み込まれているポリヌクレオチドは、Ｄｓの５’末端および３’末端、ならびにそれらの間に位置している対象ポリヌクレオチドを含んでなる。一実施形態において、短い末端反復配列は、５’末端反復：ＴＴＴＣＡＴＣＣＣＴＧ（配列番号１２）および３’末端反復：ＴＴＴＣＡＴＣＣＣＴＡ（配列番号１３）である。他の実施形態において、修飾Ａｃトランスポゼースまたは天然Ａｃトランスポゼースによる転移に有用な、野生型Ｄｓ因子の５’末端および３’末端の修飾を行う。対象ポリヌクレオチドは、他の転移可能因子、例えば、Ｔｏｌ２、スリーピングビューティーなどを含有できる。
【００８１】
一実施形態において、Ｄｓの５’末端シス要求配列は、配列番号４５で示される。第２の実施形態において、Ｄｓの５’末端シス要求配列は、配列番号１のヌクレオチド３６５７〜３９０３として示される。一実施形態において、Ｄｓの３’末端シス要求配列は、配列番号４９で示される。第２の実施形態において、Ｄｓの３’末端シス要求配列は、配列番号１のヌクレオチド４３〜４１２として示される。
【００８２】
本発明のさらなる実施形態において、本発明に利用されるＤｓの５’末端および３’末端は、本明細書で検討された修飾Ｄｓの５’末端および３’末端のヌクレオチド配列に、最適にアラインされた場合（適切なヌクレオチドを挿入または欠失させて）、少なくとも約６０％、好ましくは、少なくとも約７０％、より好ましくは、少なくとも約８０％、最も好ましくは、少なくとも約９０％、９５％、または９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を有し得る。また、Ｄｓの５’末端および３’末端の配列は、本明細書で検討されたＤｓの５’末端および３’末端ヌクレオチド配列に実質的に類似したヌクレオチド配列を含み得る。Ｄｓの５’末端および３’末端は、本明細書に記載された修飾Ａｃトランスポゼースによって認識することができる。修飾Ａｃトランスポゼースは、Ｄｓの５’末端および３’末端に結合し、Ｄｓ５’末端と３’末端との間に位置する核酸の、魚細胞のゲノム内への組込みを触媒する。
【００８３】
Ｄｓの５’末端および３’末端は、インビトロ合成もできるし、生物学的供給源から単離することもできる。合成および単離のこのような方法は当業者によく知られている。
【００８４】
対象のポリヌクレオチドは、本明細書に記載されたようなマーカーまたはレポーター遺伝子であり得る。あるいは、対象ポリヌクレオチドは、標的魚のゲノム内に挿入されることが望まれる核酸の任意の遺伝子であり得る。このような対象ポリヌクレオチドは、当業者によく知られているような、プロモータートラップ、エンハンサートラップ、遺伝子トラップ、活性化タグ化、ＲＮＡまたはタンパク質の発現などに使用するために選択できる。例えば、対象ポリヌクレオチドは、本発明に従って作出された標的遺伝子導入魚、すなわち、修飾Ａｃトランスポゼースを用いてＤｓ構築体からのコード配列の転移に供された標的魚における蛋白質の発現のためにプロモーターに操作可能に結合させたコード配列であり得る。あるいは、対象ポリヌクレオチドは、エンハンサートラップのために弱いプロモーターに操作可能に結合させたマーカー配列であり得る。あるいは、対象遺伝子のポリヌクレオチドは、以前に特徴決定されていないプロモーター因子を同定するためのプロモーターのないマーカー配列であり得る（プロモータートラップと称される技法）。あるいは、対象ポリヌクレオチドは、米国特許第６，７０９，８６３号明細書に開示されているような活性化タグ化のために使用できる３−フレームＨｉｓ−タグＤＮＡ配列であり得る。
【００８５】
挿入変異に有用なＤｓ構築体は、Ｄｓ因子の５’末端および３’末端、ならびに本明細書に記載されたものなどの選択性マーカーなど、機能的転移性因子の作出に必要な機能を含有する。下流遺伝子の誘導性過剰発現などの特定の変異原性能力のために望ましい場合は、追加の機能性因子が含まれる。このような追加の機能性因子としては、細胞または組織特異的プロモーター、Ｇａｌ４オペレーター、テトラサイクリンオペレーター、ｅｆｌ−α遺伝子などのアフリカツメガエル基本プロモーター、ウサギβ−グロビンイントロン、ＭＡＺ転写停止部位、ｌｏｘＰ相同的組換え部位Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、基本ＴＡＴＡボックスを挙げることができる。細胞または組織特異的プロモーターの使用により、特定の細胞または組織における遺伝子の誤発現がもたらされる。
【００８６】
Ｇａｌ４／ＶＰ１６トランス活性化因子、ドキシサイクリン誘導時に転写を活性化すると考えられるＴｅｔ−ｏｎ（ｒｔＴＡ）トランス活性化因子、またはテトラサイクリンの添加によって構成的活性化が遮断され得るＴｅｔ−オフ（ｔＴＡ）トランス活性化因子の使用によって、誤発現が調節できる。酵母および細菌由来のエンハンサーは、これらのモジュールが多用性を提供するためのみならず、脊椎動物の転写因子によって認識され得るエンハンサーはウィルスの力価を低下できる理由でも使用される。しかし、適切な状況では、脊椎動物の転写因子もまた利用できる。下流遺伝子の発現を増強し、ウィルスが組み込み得る何らかの内因性イントロンをスプライスアウトするために、ウサギβ−グロビン遺伝子の第２のイントロンを含ませる。好ましい一態様において、これらの遺伝子産物は、種々のゼブラフィッシュプロモーター下で、またはこれらゼブラフィッシュプロモーターのホモログまたはオルソログ下で、それらが本明細書に記載された他のベクターのいずれかに存在し得る場合に、発現する。本明細書に用いられる「ホモログ」は、単一種の中の他の核酸またはポリペプチドに配列が類似した核酸またはポリペプチドであり、「オルソログ」は、１つの種から得られた、異なる種の核酸またはポリペプチドの機能的対応物である核酸またはポリペプチドである。多くの中でも、一例は、ゼブラフィッシュチロシンヒドロキシラーゼプロモーターまたはそのオルソログである。このプロモーター下でＧａｌ４蛋白質を発現させることにより、精子ライブラリーと組み合わせて、それらのチロシンヒドロキシラーゼ発現ニューロンにおいてのみ遺伝子を誤発現させることが可能となり、その魚における組織特異的作用を調べる一方、表現型分析を複雑にすると考えられる他の領域を除外することが可能になる。
【００８７】
標的相同的組換えのためにｌｏｘＰ部位を包含することは、挿入ライブラリーの遺伝子の特徴決定にきわめて有用である。例えば、転移性挿入体によって破壊されている遺伝子は、ｌｏｘＰ部位にフランクした野生型遺伝子およびＣｒｅリコンビナーゼを使用することによってその発現を回復させることができたであろう。また、ｌｏｘＰにフランクしたＧＦＰレポーターを挿入することによって、該遺伝子の発現パターンを調べることも可能である。先に記載したように、好ましい一態様において、これらの遺伝子産物は、種々のゼブラフィッシュプロモーター下で、またはこれらゼブラフィッシュプロモーターのオルソログ下で発現する。
【００８８】
転写の逆方向に、転写停止部位および合成の強力なポリアデニル化部位を含めることも有用であり得る。強度の変化する対立遺伝子のスペクトルはいくつかの状況では望ましいが、完全な機能喪失変異によるライブラリーを構築することが望ましい。転写停止部位およびポリアデニル化シグナルを付加することにより、挿入体がイントロンであるとしても、挿入部位で転写が停止し、切断転写産物が生じるはずである。この様式で、全ての必須な遺伝子がライブラリーに含まれるはずである。先に記載したように、好ましい一態様において、これらの遺伝子産物は、種々のゼブラフィッシュプロモーター下で、またはこれらゼブラフィッシュプロモーターのオルソログ下で発現する。
【００８９】
エンハンサーは、遺伝子の発現の調節を決定することが多い。プロモーターに操作可能に結合したレポーター遺伝子を含有する構築体の導入が、該構築体がエンハンサーのドメインに挿入される場合にのみ発現する、いわゆるエンハンサートラップ構築体において、この効果が見られている（オーカネ（Ｏ’Ｋａｎｅ）ら、１９８７年；アレン（Ａｌｌｅｎ）ら、１９８８年；コサリー（Ｋｏｔｈａｒｙ）ら、１９８８年；ゴスラー（Ｇｏｓｓｌｅｒ）ら、１９８９年）。このような場合、該構築体の発現は、新たに結合したエンハンサーのパターンによって調節される。したがって、標的魚におけるエンハンサーを同定するために、コイβ−アクチンプロモーターなどの最小のプロモーターおよびレポーター遺伝子のみを有するＤｓ構築体を使用できる。ゼブラフィッシュにおけるエキソントラップのためには、スリーピングビューティートランスポゾンが用いられている（バルシューナス（Ｂａｌｃｉｕｎａｓ）ら、２００４年）。
【００９０】
安定な遺伝子導入魚を生産するためには、魚胚内への核酸の単純な微量注入は一般に無効である。導入遺伝子送達のためのトランスポゾンベクターは、対象ポリヌクレオチドの胚種系の組込みを促進する。さらに、ベクター配列内でランダムな位置に生じ、通常コンカテマーである非特異的組込みとは異なり、宿主ＤＮＡ内へのトランスポゾン挿入は、通常単一であり、特定の境界を有する。そのことにより、それらの周囲の領域の同定が簡便化され（ＴＡＩＬ−ＰＣＲ、逆ＰＣＲ、および他の好適な技法を用いて）、トランスポゾンに伝達された導入遺伝子の安定な発現にとって最適である。
【００９１】
本発明は挿入変異誘発のために使用できる。Ｄｓは、魚ゲノム内に挿入されると、体細胞および遺伝性の胚種系変異を生じさせることができる。レトロウィルスまたは非特異的挿入とは異なり、トランスポゾンは、修飾Ａｃトランスポゼースが供給された場合、再び移動させることができる。周囲の遺伝子または欠失体への挿入を生じさせるためにそれを使用できる。Ｄｓ因子は、ＲＮＡまたはタンパク質の発現、プロモータートラップ、エンハンサートラップ、遺伝子トラップまたは活性化タグ化に用いるための種々の構築体を担持ことができる。このような方法は当業者によく知られている。
【００９２】
Ｄｓ因子はクロマチン、機能的ＤＮＡ配列の２つのタイプのいずれかに組み込むことができ、そこで、それは挿入変異、または結果をあまり生じないと考えられる非機能的クロマチンのために、有害な効果を有し得る。この「トランスポゾンタグ化」の力は、ほぼ２０年間、より簡便なモデルシステムにおいて利用されている（ビンガム（Ｂｉｎｇｈａｍ）ら、１９８１年；ベレン（Ｂｅｌｌｅｎ）ら、１９８９年）。トランスポゾンタグ化は、遺伝子導入ＤＮＡを遺伝子内に組み込み、それによって、挿入変異誘発によりそれらを活性化するために、遺伝子導入ＤＮＡが送達される古くからある技法である。この方法では、非活性化遺伝子が転移性因子によってタグ化され、次いで、変異対立遺伝子を回収するためにそれらを使用することができる。転移性因子の挿入により、遺伝子の機能を破壊でき、それによって特徴的な表現型を導くことができる。挿入はほぼランダムであるため、挿入による機能喪失変異体を作出する同じ操作が、細胞に新規な表現型を与える遺伝子の送達にしばしば使用することができる。増殖および発生において遺伝子産物の果たしている役割、ならびにそれらの調節の重要性を理解するために、機能獲得変異体を使用できる。
【００９３】
タグ化遺伝子を単離するいくつかの方法がある。全ての場合に、ゲノムＤＮＡは、慣例的技法により、変異動物の１つまたは複数の組織の細胞から単離される（種々の組織ならびに動物によって変わってくる）。該ＤＮＡは、トランスポゾンタグを切断する場合もあるし、切断しない場合もある制限エンドヌクレアーゼによって開裂される（既知の部位で開裂しない場合より多く）。次いで、得られた断片をプラスミド内に直接クローニングするか、トランスポゾンＤＮＡに対するプローブを用いて、同定用のファージベクターにクローニングすることができる（参考文献に関しては、カイザー（Ｋａｉｓｅｒ）ら、１９９５年を参照）。あるいは、多くの方法のうちのいずれかにおいて、該ＤＮＡをＰＣＲ増幅でき、我々は、イズヴァク（Ｉｚｓｖａｋ）およびイヴィックス（Ｉｖｉｃｓ）（１９９３年）のＬＭ−ＰＣＲ法ならびにデヴォン（Ｄｅｖｏｎ）ら（１９９５年）による修飾を用い、トランスポゾンプローブに対するハイブリダイゼーションによって同定した。代替法としては、逆ＰＣＲ（例えば、アレンデ（Ａｌｌｅｎｄｅ）ら、１９９６年）、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ（リュー（Ｌｉｕ）＆ウィティアー（Ｗｈｉｔｔｉｅｒ）、１９９５年）などが挙げられる。あるいは、ＰＣＴの替わりに他の増幅法を使用できる。次いで、クローニング法に関わりなく、同定されたクローンを配列決定する。トランスポゾンにフランクする配列（または他の挿入ＤＮＡ）を、挿入因子に対する非同一性により同定することができる。該配列を合わせ、次いで、他の先に特徴決定された遺伝子との相同性、または何らかの機能をコードする遺伝子または配列モチーフに対する部分的相同性に関して、核酸データベースを探索するために使用する。いくつかの場合、該遺伝子は、既知の蛋白質のいずれにも相同性を有さない。それは、他のものを比較する新規配列となる。コードされた蛋白質は、その回復を誘導する表現型を生じさせるその役割をさらに調べる中心となる。
【００９４】
記載された当該発明により、ゼブラフィッシュのゲノムの大規模遺伝子分析が可能になる。標準的技法による、または好ましくは、本明細書に記載されたＤｓ因子を胚に注入することによる胚のトランスフェクションによってライブラリーが構築される。また、注入を受けた胚は、５日目にそれらの卵黄を完全に消費してしまったら、適切な管理および給餌を受ける。このアプローチにより、ゼブラフィッシュにおいて、遺伝子１つ当たり、平均１つ超のＤｓ因子を有する十分な魚が生じる。
【００９５】
始祖オスが成体になり、相当量の精子を産生できるようになったら（約４ヵ月）、ゲノム内のどこに挿入体が入ったかに関して、該挿入体の特徴決定が行われる。簡単に述べると、精子採集の２日前に、注入を受けた各々のオスを野生型のメスと交配する。交配の成功したオスを使い捨ての１６オンスカップに２日間個別に保ち、その間、それらの一腹卵の全体的な健康を調べる。次いで、精子の凍結および保存のため、受精オスの精巣を除去する。各オスの５日齢子孫からのＤＮＡを抽出し、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ、逆ＰＣＲなどの慣例的技法を用いて分析する。
【００９６】
全ての始祖魚に関して、挿入体にフランクしているＤＮＡの配列決定を完成することによって挿入体のライブラリーが得られる。これらのサンプルは、液体窒素貯蔵単位で冷凍バイアル中に容易に収容される。安全性を目的として、各サンプルを、貯蔵のため、複数の液体窒素貯蔵単位に分割する。サンプルが試験に必要な場合、それを解凍してから、野生型メスの卵にインビトロ受精するために使用し、所望の挿入体を有する魚を作出する。多数の凍結／解凍サイクルは、精子サンプルの生存度を低下させるため、新たに作出されたオスが成体に達したら、それらの全てから第２の精子サンプルを作出する。該ライブラリーにより、多数の遺伝子スクリーニングの完成が可能になる。該ライブラリーは、一組の各メンバーが、少なくとも１つの遺伝子に少なくとも１つの変異を有する、ゼブラフィッシュ精子の一組または一集団を含んでなり、ゼブラフィッシュ精子のその組または集団は、少なくとも１５％の遺伝子、または少なくとも２０％の遺伝子、または少なくとも２５％の遺伝子、または少なくとも３０％の遺伝子、または少なくとも３５％の遺伝子、または少なくとも４０％の遺伝子、または少なくとも４５％の遺伝子、または少なくとも５０％の遺伝子、または少なくとも５５％の遺伝子、または少なくとも６０％の遺伝子、または少なくとも６５％の遺伝子、または少なくとも７０％の遺伝子、または少なくとも７５％の遺伝子、または少なくとも８０％の遺伝子、または少なくとも８５％の遺伝子、または少なくとも９０％の遺伝子、または少なくとも９５％の遺伝子、または少なくとも９８％の遺伝子、または少なくとも９９％の遺伝子、または１００％の遺伝子が１つの変異を含有することを集合的に含んでなる。
【００９７】
あるいは、魚の一組または一集団は、始祖魚またはそれらの子孫から作出され、その魚の組は挿入体の実質的に包括的なライブラリーを集合的に含んでなる。それらの魚およびそれらの子孫は、自動水槽システムにおいて容易に維持される。これらの魚は容易に飼育でき、個体同定システム用にタグ化でき、研究者にとって小さなサイズの水生設備であるおよそ２００匹の魚用タンクに貯蔵できる。該ライブラリーにより、多数の遺伝子スクリーニングの完成が可能になる。該ライブラリーは、一組の各メンバーが、少なくとも１つの遺伝子に少なくとも１つの変異を有する、ゼブラフィッシュの一組または一集団を含んでなり、ゼブラフィッシュのその組または集団は、少なくとも１５％の遺伝子、または少なくとも２０％の遺伝子、または少なくとも２５％の遺伝子、または少なくとも３０％の遺伝子、または少なくとも３５％の遺伝子、または少なくとも４０％の遺伝子、または少なくとも４５％の遺伝子、または少なくとも５０％の遺伝子、または少なくとも５５％の遺伝子、または少なくとも６０％の遺伝子、または少なくとも６５％の遺伝子、または少なくとも７０％の遺伝子、または少なくとも７５％の遺伝子、または少なくとも８０％の遺伝子、または少なくとも８５％の遺伝子、または少なくとも９０％の遺伝子、または少なくとも９５％の遺伝子、または少なくとも９８％の遺伝子、または少なくとも９９％の遺伝子、または１００％の遺伝子が１つの変異を含有することを集合的に含んでなる。
【００９８】
ゼブラフィッシュゲノムの図に基づき、挿入体にフランクしているＤＮＡの５０塩基未満の配列決定により、どの遺伝子が破壊されているかを確認することが可能になるはずである。挿入体の特徴決定の間に生じた配列により、ライブラリーの各精子サンプルまたは各魚において変異した遺伝子を同定し目録にする手段が提供される。このようなデータベースにより、開示された当該ライブラリーに関する索引と該ライブラリーを使用する供給源の双方が提供される。該ライブラリーは、（ａ）対象となっている遺伝子の機能の同定、（ｂ）有用な、または推定上の薬剤標的をコードし得る遺伝子のスクリーニング、（ｃ）薬剤、毒素および他の化学物質の作用部位として作用するタンパク質をコードし得る遺伝子のスクリーニング、および（ｄ）対象となっている遺伝子によってコードされるタンパク質に及ぼす調節作用に関する化合物のスクリーニング、のために使用できる。あるいは、該ライブラリーデータベース配列と当業者によく知られていると考えられる任意の他の配列データベースとの間で種々の比較を行うことができる。
【００９９】
該ライブラリーの新規な実用性は、核酸またはアミノ酸配列のいくらかの知見に基づいて、対象遺伝子に関するライブラリーデータベースを探索する能力にある。あるいは、該データベースは、所望の表現型の知見に基づいて対象遺伝子に関して探索できる。挿入変異のライブラリーによって、病態を生じることが知られているか、または生じると考えられている何らかの遺伝子における挿入を含有する精子サンプルまたは魚を同定することが可能である。同定された精子を用いて、変異を有する子孫魚を飼育することができ、それによって、コードされた遺伝子産物の機能獲得または機能喪失を試験する手段が可能になる。あるいは、同定された魚を用いて、コードされた遺伝子産物の機能獲得または機能喪失を試験することができる。挿入配列に特異的な他のオリゴヌクレオチドを有する指定された遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応法により、特定の遺伝子における変異に関して、該ライブラリーを探索できる。あるいは、全てのライブラリーの挿入からなるデータベースの標準的ＢＬＡＳＴクエリーを用いて、配列相同性によって該ライブラリーを探索できる。あるいは、あるメンバーがある病態に寄与することが知られている遺伝子ファミリー内の全ての挿入を回収するために該ライブラリーをスクリーニングできる。また、例えば、同定されたレトロウィルス挿入体が該遺伝子の近くに位置しているが、該遺伝子を破壊していない場合、照射を用いて部位特異的欠失を作出するために、該ライブラリーを使用できる。ある配列が同定されたら、該ライブラリーにおける特定の精子または特定の魚を評価でき、（ａ）対象となっている遺伝子の機能の同定、（ｂ）有用な、または推定上の薬剤標的をコードし得る遺伝子のスクリーニング、（ｃ）薬剤、毒素および他の化学物質の作用部位として作用するタンパク質をコードし得る遺伝子のスクリーニング、および（ｄ）対象となっている遺伝子によってコードされるタンパク質に及ぼす調節作用に関する化合物のスクリーニング、のために使用できる。これらの試験は、当業者によく知られている手段によって達成される。遺伝子導入ゼブラフィッシュは、当業者によく知られているように、該ライブラリーで見出された精子から直接作出される。
【０１００】
遺伝子変異は、しばしば疾病（例えば、乳癌、パーキンソン病、肥満症、血管拡張性失調症など）に関連している。本発明が定方向性の遺伝子発見を可能にすることを考えると、本発明のさらなる実施形態は、疾病の遺伝子的基礎を確定するための方法を含む。例えば、遺伝子変異は、細胞の正常な調節過程を変化させることによって、しばしば疾患状態に寄与し得る。したがって、所与の転写因子または調節タンパク質が所与の疾患に関連していたならば、そのタンパク質全体、またはそれからの関連ドメインを用いて、そのタンパク質によって直接的に、または間接的に調節されているか、またはそのタンパク質と相互作用する遺伝子を同定することができる。その結果、所与の疾患または疾患経路に関与する種々のタンパク質を同定するために、本発明を使用することができる。特に関心対象となっている疾患としては、限定はしないが、自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス、リウマチ様関節炎、炎症反応、血管形成術後血管炎症反応、細菌またはウィルス感染症、炎症性腸疾患、糖尿病、多発性硬化症、癌、喘息、筋ジストロフィー、アルツハイマー病、認知症および他の神経病、高血圧、ヘモクロマトーシス、ポルフィリア、ガラクトース血症、高リポタンパク血症、痛風、間質性肺疾患、血小板疾患、重症性筋無力症、先天性心臓疾患、嚢胞性線維症、および肥満症が挙げられる。また、本発明により定方向的な遺伝子発見が可能になることを考えると、本発明のさらなる実施形態には、遺伝子機能を同定する方法が含まれる。
【０１０１】
疾患に加えて、記載された当該方法およびライブラリーは、限定はしないが、寿命の延長、コレステロール低下、血圧低下、癌危険性の低下、糖尿病の低下、肥満症の低下、および冠動脈疾患、多発性硬化症、関節リューマチ、全身性エリテマトーデス、および炎症性腸疾患などの全ての炎症性疾患の重症度の減弱化または予防などの遺伝子的に判定された利益の分子的根拠の同定にも等しく十分に適している。
【０１０２】
また、既存のデータベースからのゲノムクローン、ならびに完全長ｃＤＮＡまたはプロモーターまたは他の調節配列双方の単離のための高特異的プローブを作出するために、該配列情報を使用できる。また、ヒトなどの十分に関連した種の相同遺伝子を単離するために、該プローブを使用できる。該遺伝子は単離されたら、過剰発現できるか、または対象となっている変異にホモ接合性の細胞および動物を作出するために使用できる標的ノックアウトベクターを作出するために使用できる。このような動物および細胞は、疾患（すなわち、癌、遺伝子異常、ＡＩＤＳなど）モデルとして、毒素感受性または治療薬の有効性に関するアッセイを行うための発生研究のため、および遺伝子送達および療法実験（例えば、インビボで特定の遺伝子欠損を補正する目的で設計される実験）のための宿主として特に有用であると考えられる。
【０１０３】
挿入変異のライブラリーにより、病態を生じさせることが知られている何らかの遺伝子に挿入を含有する精子サンプルまたは魚を同定することが可能である。同定された精子を用いて変異を有する子孫魚を飼育でき、それによってコードされた遺伝子サンプルの機能獲得または機能喪失を試験するための手段が可能になる。これらの魚は、コードされた遺伝子産物の機能獲得または機能喪失を試験するために直接用いることができる。挿入配列に特異的な他のオリゴヌクレオチドを有する指定された遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応法により、特定の遺伝子における変異に関して、該ライブラリーを探索できる。あるいは、すべてのライブラリー挿入体からなるデータベースの配列アラインメント解析を用いて、配列相同性により該ライブラリーを探索できる。例えば、ヘム生合成経路における酵素であるフェロケラターゼに変異を有するヒトは、光依存性溶血を示す病態である赤芽球増殖性プロトポルフィリン症および肝臓疾患を経験する。哺乳動物における非皮膚器官に対して光により間接的に開始される損傷を試験することは難しいが、ゼブラフィッシュを用いて、この病態を非侵襲的様式で試験することは可能である。さらに、パラロガス遺伝子において同様に作用している変異を同定し、ゼブラフィッシュにおいて得られた疾患表現型を試験することが可能である（チャイルズ（Ｃｈｉｌｄｓ）ら、２０００年）。
【０１０４】
記載された当該ライブラリーから入手できる情報を用いて作出された遺伝子導入動物は、（ａ）対象となっている遺伝子の機能の同定、（ｂ）有用な、または推定上の薬剤標的をコードし得る遺伝子のスクリーニング、（ｃ）薬剤、毒素および他の化学物質の作用部位として作用するタンパク質をコードし得る遺伝子のスクリーニング、および（ｄ）対象となっている遺伝子によってコードされるタンパク質に及ぼす調節作用に関する化合物のスクリーニング、に有用である。これらの動物はまた、基本的な生物学的過程ならびに、限定はしないが、加齢、癌、自己免疫疾患、免疫障害、脱毛症、腺障害、炎症性障害、糖尿病、関節炎、高血圧、アテローム硬化症、循環器病、肺疾患、神経系または骨格系の変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、喘息、発育障害または発育異常、不妊症、上皮潰瘍、および微生物病因などの疾患の研究にも有用である。
【０１０５】
本発明のライブラリーの一使用法は、遺伝子の機能を迅速に同定することである。本明細書に記載されたとおり作出された、対象となっている遺伝子の変異を含有する魚は、特定の表現型に関する判定のためにノックアウトマウスが試験されているのと同じほど、特定の表現型に関して調べることができる。本発明のこの態様に従い、該ライブラリーのこの使用法によって、慣例的な、および現在利用できるクローニング技法を用い、欠失した、または欠失され得る遺伝子の機能を同定することができる。本明細書に記載されたライブラリーを用いて、未知の、および／または特徴決定されていない遺伝子およびそれらの機能を迅速に同定することができる。これらの遺伝子によってコードされたタンパク質は、他の中でもとりわけ、ヒトの治療薬および診断薬として、および薬剤開発の標的として使用される。
【０１０６】
「既知」の遺伝子は、ある遺伝子の特徴決定のレベルに関する。本発明は、特徴決定された遺伝子の同定、ならびに特徴決定されていない遺伝子の同定を可能にする。種々のレベルの特徴決定が可能である。これらには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはタンパク質配列のクローニング、およびクローニングした配列に対する遺伝子の調節および機能の関連づけ（例えば、プロモーターおよびエンハンサー配列、オープンリーディングフレーム、イントロンなどの機能の認識）などの詳細な特徴決定が含まれる。特徴決定は、遺伝子および関連機能のマップ化、または部分的なアミノ酸またはヌクレオチド配列を有する、またはタンパク質の精製および機能の確認など、それほど詳細でないことがあり得る。ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が知られているか、またはタンパク質が単離されているが、機能が不明である場合のように、特徴決定は最小であり得る。あるいは、機能は知られていても関連タンパク質またはヌクレオチド配列が不明であるか、または知られてはいてもその機能に関連づけられていない場合がある。最後に、遺伝子の存在とその機能が双方とも不明であって特徴決定されない場合もある。本発明は、特徴決定のこれらのいずれか、または他の特定の程度で、任意の遺伝子の同定を可能にする。
【０１０７】
挿入体を有する遺伝子によって与えられる表現型に基づいて、対象遺伝子を同定することができる。選択可能な表現型の例としては、細胞増殖、成長因子依存性の成長、コロニー形成、細胞分化（例えば、ニューロン細胞、筋肉細胞、上皮細胞など）、アンカーレッジ依存性の成長、細胞因子（例えば、キナーゼ、転写因子、ヌクレアーゼなど）の活性化、細胞表面受容体／タンパク質の発現、細胞−細胞接着の獲得または喪失、移動、細胞活性化および病態の表現型が挙げられる。遺伝子機能の同定は重要である。なぜならば、遺伝子によってコードされたタンパク質または遺伝子自体が、観察された表現型の原因となっていると推定されるからである。したがって、遺伝子によってコードされたタンパク質または遺伝子自体が、治療または観察された表現型の誘導のための重要な治療薬または薬剤標的であり得る。また、該ライブラリーのこの使用法により、対象となっている特定の経路または病態、例えば糖尿病、に関与する遺伝子およびタンパク質の全てを同定することができる。このような遺伝子の同定により、対象となっている経路または疾患のための推定上の薬剤標的である遺伝子および／またはタンパク質の集合が提供される。これらの遺伝子は、該ライブラリーにおける特定のゼブラフィッシュの精子または魚に関連しているため、本明細書に記載されたとおり調製された遺伝子導入魚は、対象となっている疾患の治療または予防に使用される薬剤として可能性のあるものをスクリーニングするために使用することができる。
【０１０８】
このようなスクリーニングおよび本明細書に記載された他のスクリーニング法で、所望の挿入体を有するか、または全ての挿入体を表している遺伝子導入魚は、多数のアッセイを用いてスクリーニングすることができる。対象となっているタンパク質の特徴（例えば、分泌タンパク質対細胞内タンパク質）に依存して、生化学的活性、酵素活性、遺伝子調節、表現型の特徴および疾患モデルの活性、例えば、疾患モデルに関連した挿入導入遺伝子に対して細胞または生物が抵抗性、に関して、該ライブラリーをスクリーニングすることができる。当業者に知られているように、他のアッセイ様式もまた使用できる。また、該スクリーニングは、魚の種々の遺伝子状態について実施できる。一実施形態において、ゼブラフィッシュ精子挿入ライブラリーの少なくとも１つの精子細胞によってゼブラフィッシュ卵を受精させることによって作出した魚について、スクリーニングを実施できる。第２の実施形態において、ゼブラフィッシュ挿入ライブラリーの少なくとも１匹の始祖魚またはその子孫について、スクリーニングを実施できる。この実施形態の一態様において、その子孫は異型接合体である。この実施形態の第２の態様において、その子孫が同型接合体になるように交配された。第３の実施形態において、少なくとも１つの一倍体胚について、スクリーニングを実施できる。一倍体胚は、例えば、ウェスターフィールド（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ）（２０００年）によって記載されているとおりに調製できる。第４の実施形態において、少なくとも１つの雌性発生二倍体胚について、スクリーニングを実施できる。雌性発生二倍体胚は、例えば、ウェスターフィールド（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ）（２０００年）によって記載されているとおりに調製できる。本明細書に用いられているスクリーニングは、これらの実施形態の各々、ならびに、この先の本明細書に記載されている単離細胞または分泌産物もしくは排出産物を含むことが意図されており、本明細書に記載されている、ならびに当業者によく知られているインビボおよびインビトロのスクリーニング法を含むことが意図されている。
【０１０９】
対象遺伝子によってコードされたタンパク質、および対象遺伝子によってコードされたタンパク質が関与している生化学的経路の調節に及ぼす化合物の効果を評価するために、対象遺伝子を有する遺伝子導入魚を、該化合物に曝露することができる。例えば、対象遺伝子を有する遺伝子導入魚に、試験化合物を投与できる。あるいは、および好ましくは、遺伝子導入魚の入っている水中に該化合物を投与して、魚にそれらの鰓を介して物質を摂取させることができる。該化合物はまた、一倍体胚または雌性発生二倍体胚の入っている水中に投与することもできる。試験化合物に曝露した魚における該遺伝子、または該遺伝子によってコードされたタンパク質の発現を、曝露していないものと比較することにより、対象遺伝子によってコードされたタンパク質の調節に及ぼす該化合物の効果を評価できる。試験化合物は、該遺伝子の阻害剤または活性化剤のいずれかとして作用できる。この様式で、対象遺伝子に関連した病態の治療または予防のための薬剤として有用な化合物が同定される。同様に、当該ライブラリーを用いて、毒素、治療製品として可能性のあるものまたは他の化学物質をスクリーニングし、これらの化合物の作用部位、および該ライブラリーの遺伝子またはタンパク質に及ぼすこれらの化合物の効果を同定することができる。特定の変異に関して、ある化合物にもはや応答しない魚を同定することによって、前記化合物の作用に必要なタンパク質をコードする遺伝子が同定される。
【０１１０】
本発明はまた、当該方法を用いて同定され構築された種々の遺伝子型に関連した表現型を変化させるか、または修正する能力を示している化合物を同定するためのゼブラフィッシュモデルベースのアッセイを包含する。このようなモデルベースのアッセイはまた、組換え的に、または合成的に生産されたタンパク質または化合物などの化合物の純度および効力をアッセイするための標準としても使用できる。
【０１１１】
対象となっている化合物を同定するためのゼブラフィッシュベースのシステムに加えて、対象遺伝子によってコードされたタンパク質を阻害するか、活性化するか、またはそれに結合する化合物の同定に対して、他のインビトロシステムもまた使用できる。同定された化合物は、例えば、野生型および／または変異遺伝子産物の活性の調節に有用であり得る。インビトロシステムはまた、正常な調節的相互作用を破壊する化合物に関するスクリーニングにも利用できる。
【０１１２】
タンパク質に結合する化合物の同定に用いられるアッセイは、所与のタンパク質および試験化合物の反応混合物を、これら２つの成分が相互作用し、結合し、したがって、該反応混合物中で除去でき、および／または検出できる複合体を形成することを可能にする条件と十分な時間で調製することを含む。使用されるタンパク質は、スクリーニングアッセイの目標に依存して変化し得る。例えば、天然リガンドのアゴニストが探索される場合、アッセイシステムにおいて利点（得られた複合体の標識化、単離など）を与えるタンパク質またはポリペプチドを含有する完全長タンパク質、または融合タンパク質が利用できる。また、インビトロアッセイは、魚から分泌され、次いでアッセイされる物質、酵素などを含み得る。
【０１１３】
スクリーニングアッセイは種々の方法で行うことができる。このようなアッセイを行うための１つの方法は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質または試験物質を、固相に係繋し、該タンパク質と試験化合物または変異細胞との間の結合を検出することを含むであろう。このような方法の一実施形態において、受容体タンパク質反応物質を固体表面に係繋でき、係繋されていない試験化合物は、直接的または間接的に標識できる。該方法の他の実施形態において、試験タンパク質を固相に係繋し、標識化した抗体と複合化させる（また、モノクローナル抗体が用いられる場合、該タンパク質の所与の領域に特異的であることが好ましい）。次いで、タンパク質／抗体複合体の結合を破壊する能力に関して、試験化合物をアッセイできるであろう。
【０１１４】
あるいは、液相において反応を行い、反応産物を未反応成分から分離し、例えば、試験タンパク質、ペプチドまたは融合タンパク質に特異的な固定抗体、または、溶液中で形成された何らかの複合体を係繋するための試験化合物、および係繋された複合体を検出するため、可能な複合体の他の成分に特異的な標識抗体を用いて、複合体を検出することができる。
【０１１５】
タンパク質とその結合パートナーとの間の相互作用を妨げる化合物の同定に用いられる該アッセイシステムの基本的原理は、上記の試験タンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質、および結合パートナーを含有する反応混合物を、これら２つが相互作用し、結合し、したがって、複合体を形成することを可能にする条件と十分な時間で調製することを含む。阻害活性に関して化合物を試験するためには、試験化合物の存在下および不在下で反応混合物を調製する。試験化合物は反応混合物中に最初に含まれていてもよいし、試験タンパク質とその結合パートナーの添加に引き続いた時点で添加してもよい。対照反応混合物は、試験化合物なしで、またはプラセボと共にインキュベートする。次いで、試験タンパク質と結合パートナーとの間の何らかの複合体の形成を検出する。対照反応物に複合体が形成されるが、試験化合物を含有する反応混合物に形成されないことは、該化合物が試験タンパク質と結合パートナーとの相互作用を妨げていることを示している。
【０１１６】
上記のインビトロシステムおよびさらなるインビトロシステムに関するさらなる詳細は、米国特許第６，０８０，５７６号明細書に見ることができる。
【０１１７】
本発明に従って、種々の試験化合物を評価することができる。一定の実施形態において、試験される化合物は、ライブラリーに由来し得る（すなわち、化合物のライブラリーのメンバーである）。ペプチドのライブラリーの使用は当該技術分野で十分確立しているが、ベンゾジアゼピン（ブーニン（Ｂｕｎｉｎ）およびエルマン（Ｅｌｌｍａｎ）、１９９２年；デウィット（ＤｅＷｉｔｔ）ら、１９９３年）、ペプトイド（ズッカーマン（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ）、１９９４年）、オリゴカルバメート（チョ（Ｃｈｏ）ら、１９９３年）、およびヒダントイン（デウィット（ＤｅＷｉｔｔ）ら、１９９３年）などの他の化合物の混合物の生産を可能にした新規技法が開発されている。１０４〜１０５の多様性を有する小型有機分子の分子ライブラリー合成のためのアプローチが記載されている（カレル（Ｃａｒｅｌｌ）ら、１９９４年ａ；カレル（Ｃａｒｅｌｌ）ら、１９９４年ｂ）。
【０１１８】
生物学的ライブラリー、空間的アドレス可能平行固相または液相ライブラリー、デコンボリューションを要する合成的ライブラリー法、「１ビーズ１化合物」ライブラリー法、およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いるライブラリー法などの当該技術分野において知られた組み合わせライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを用いて、本発明の化合物を得ることができる。生物学的ライブラリー法は、ペプチドライブラリーに限定されているが、他の４種のアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは低分子化合物のライブラリーに適用できる（ラム（Ｌａｍ）、１９９７年）。分子ライブラリー合成のための他の代表的な方法は、例えば、エルブ（Ｅｒｂ）ら（１９９４年）、ホーウェル（Ｈｏｒｗｅｌｌ）ら（１９９６年）およびギャロップ（Ｇａｌｌｏｐ）ら（１９９４年）など、当該技術分野において見ることができる。
【０１１９】
化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、ホーテン（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ）ら、１９９２年）、またはビーズ上（ラム（Ｌａｍ）ら、１９９１年）、チップ（フォドル（Ｆｏｄｏｒ）ら、１９９３年）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号明細書）、胞子（米国特許第５，２２３，４０９号明細書）、プラスミド（カル（Ｃｕｌｌ）ら、１９９２年）またはファージ上（スコット（Ｓｃｏｔｔ）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）、１９９０年；デブリン（Ｄｅｖｌｉｎ）ら、１９９０年；クワーラ（Ｃｗｉｒｌａ）ら、１９９０年；フェリシ（Ｆｅｌｉｃｉ）ら、１９９１年）において提供できる。さらに他の実施形態において、組み合わせポリペプチドがｃＤＮＡライブラリーから生産される。
【０１２０】
活性に関してスクリーニングできる代表的な化合物としては、限定はしないが、ペプチド、核酸、炭水化物、有機低分子、および天然産物抽出ライブラリーが挙げられる。
【０１２１】
合理的な薬剤設計の目標は、例えば、ポリペプチドのより活性な、またはより安定な形態にある薬剤、または例えば、インビボでポリペプチドの機能を増強させるか、もしくは妨げる薬剤を作り上げるために、生物学的に活性な対象ポリペプチドの、またはそれらが相互作用する低分子（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤）の構造的類縁体を作製することである。合理的な薬剤設計に用いられるいくつかのアプローチとしては、三次元構造の解析、アラニンスキャン、分子モデル化および抗ｉｄ抗体の使用が挙げられる。これらの技法は当業者によく知られている。このような技法は、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドによって形成されたタンパク質複合体の三次元構造を規定する原子座標を提供すること、および前記原子座標に基づいて、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の相互作用を妨げることのできる化合物を設計するか、または選択することを含み得る。
【０１２２】
ポリペプチド活性を調節するか、またはそれに影響を与える物質を同定した後、該物質をさらに調べることができる。さらに、それを製造でき、および／または調製に、すなわち製造または製剤において、または医薬、製薬組成物または薬剤などの組成物において使用できる。これらを個体に投与できる。
【０１２３】
ポリペプチド機能の調節物質として同定された物質は、現存しているペプチドまたは非ペプチドであり得る。多くのインビボの製薬的使用において、非ペプチドの「低分子」がしばしば好ましい。したがって、該物質の模倣物または擬態物（特にペプチドの場合）が、製薬的使用のために設計できる。
【０１２４】
既知の製薬的活性化後に対する模倣物の設計は、「リード」化合物に基づいた製薬品の開発への公知のアプローチである。該活性化合物の合成が困難であるか、もしくは費用がかかる場合、または、特定の投与法に対してそれが不適当である場合、例えば、純粋なペプチドは、消化管内のプロテアーゼにより速やかに分解される傾向があるため、経口組成物には不適当な活性剤である場合、このアプローチが望ましいと考えられる。目的の性質に関して多数の分子のランダムなスクリーニングを避けるために、模倣物の設計、合成および試験が、一般に用いられる。
【０１２５】
ファルマコフォアを見出したら、ある範囲の供給源のデータ、例えば、分光学的方法、X線回折データおよびＮＭＲを用い、その物理的性質、例えば、立体化学、結合性、サイズおよび／または電荷に従って、その構造をモデル化する。このモデル化法には、計算解析、類似性マッピング（原子間の結合性よりむしろファルマコフォアの電荷および／または体積をモデル化する）および他の技法を用いることができる。このような技法としては、米国特許第６，０８０，５７６号明細書に開示されているものが挙げられる。
【０１２６】
次いで、そのファルマコフォアを模倣する化学的基がグラフトできる鋳型分子を選択する。該模倣物が合成し易く、薬理学的に許容される可能性が高く、インビボで分解しない一方、リード化合物の生物学的活性を保持するように、鋳型分子およびそれにグラフトされる化学的基を都合よく選択することができる。あるいは、模倣物がペプチドベースの場合、そのペプチドを環化してその剛性を増加させることにより、さらなる安定性を達成することができる。次に、このアプローチによって見出された模倣物を、それらが目的の性質を有しているかどうか、またはどの程度それが示されているかを見るためにスクリーニングできる。次いで、最適化または修飾を実施して、インビボまたは臨床試験のための１つまたは複数の最終的な模倣物に到達する。
【０１２７】
治療介入に関して、インビボで何らかの遺伝子の所与の表現型または発現の何らかの態様を逆転させるか、またはインビトロでタンパク質活性または結合パートナーとの結合を調節する任意の化合物が、ヒトにおけるさらなる開発または使用可能性のある候補として考えられることになる。試験試剤の投与量は、当該技術分野においてよく知られた方法を用いて、用量応答曲線を導き出すことによって決定できる。
【０１２８】
先に記述したとおり、本発明は、便宜上、ゼブラフィッシュを参照して記載した。当然、他の魚または他の動物を、ゼブラフィッシュの替わりに用いることができる。したがって、本発明は、魚類、鳥類、および哺乳動物などの他の動物を含む脊椎動物におけるトウモロコシのＡｃ／Ｄｓ転移因子の使用に関する。脊椎動物細胞はまた、修飾Ａｃトランスポゼースタンパク質の存在下、本発明の修飾Ｄｓ因子を組み込むこともできる。魚類、鳥類および他の動物の細胞が使用でき、限定はしないが、ラットまたはマウスなどの齧歯類、ウシ、ヤギ、ヒツジおよびブタなどの有蹄類を含む哺乳動物の細胞、またはヒトの細胞も使用できる。
【０１２９】
本発明の遺伝子導入系において、修飾Ａｃトランスポゼースタンパク質は、タンパク質または該タンパク質をコードする核酸として細胞内に導入できる。一実施形態において、該タンパク質をコードする核酸はＲＮＡであり、他の実施形態において、該核酸はＤＮＡである。さらに、修飾Ａｃトランスポゼースタンパク質をコードする核酸を、真核細胞に用いられるウィルスベクター、カチオン性脂質、または、電気穿孔または微粒子銃などの他の標準的トランスフェクション機構によって、細胞内へ組み込むことができる。修飾Ａｃトランスポゼースをコードする核酸の導入後、本発明の修飾Ｄｓ因子を同じ細胞内に導入することができる。あるいは、修飾Ａｃトランスポゼースタンパク質または修飾Ａｃトランスポゼースタンパク質をコードする核酸と同時に、本発明の修飾Ｄｓ因子を細胞内に導入できる。
【０１３０】
さらなる態様において、上記の修飾トウモロコシＡｃ／Ｄｓ転移因子は、遺伝子療法のための上記の遺伝子転移系の使用などにより、脊椎動物における遺伝子療法に有用である。遺伝子療法は、腫瘍細胞などの疾患細胞、または正常な宿主組織内に治療的遺伝子を移入することにより、癌などの多くの疾患の臨床結果を改善する可能性を有する。腫瘍細胞または腫瘍関連ストローマ内への遺伝子移入は、腫瘍細胞死滅の誘導、抗腫瘍免疫応答の刺激、血管新生の阻害、および腫瘍細胞増殖の制御のために用いられている。ウィルスベクターは、この原理の実証を得るために、動物モデルに、昆虫に、ヒトの臨床試験に用いられてきた。それにも関わらず、癌の遺伝子療法のための非ウィルスベクターの開発には相当な関心が持たれてきた。非ウィルスベクターはより単純であり、大規模製造が実行可能であり、臨床的使用にとってより安全な可能性がある。非ウィルスベクターは、遺伝子移入効率の低さおよび遺伝子発現の一時的または一貫した低下によって、かつて限定されていた。しかし、プラスミドベースのベクターおよび送達方法における最近の改善により、これらの障害が回避されつつある。遺伝子療法に使用するための非ウィルスベクター法は、トランスポゾンを含む（リュー（Ｌｉｕ）ら、２００６年；オールフェスト（Ｏｈｌｆｅｓｔ）ら、２００５年；エスナー（Ｅｓｓｎｅｒ）ら、２００５年；ハケット（Ｈａｃｋｅｔｔ）ら、２００５年；コンバース（Ｃｏｎｖｅｒｓｅ）ら、２００４年；リュー（Ｌｉｕ）ら、２００４年；イズヴァク（Ｉｚｖａｋ）およびイヴィックス（Ｉｖｉｃｓ）、２００４年；カミンスキー（Ｋａｍｉｎｓｋｉ）ら、２００２年；リチャードソン（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）ら、２００２年）。したがって、本明細書に記載された修飾トウモロコシＡｃ／Ｄｓ転移因子は、脊椎動物における遺伝子療法に有用である。
【０１３１】
本発明の実施には、他に指示しない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝子学、免疫学、細胞生物学、細胞培養および遺伝子導入生物学の慣例的な技法が用いられる。例えば、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、１９８２年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク）；サムブルック（Ｓｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク）；サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）、２００１年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、第３版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク）；アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（１９９２年）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、定期的更新を含む）；グローバー（Ｇｌｏｖｅｒ）、１９８５年、「ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード）；アナンド（Ａｎａｎｄ）、１９９２年；グスリー（Ｇｕｔｈｒｉｅ）およびフィンク（Ｆｉｎｋ）、１９９１年；ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）、１９８８年、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク）；ジャコビ（Ｊａｋｏｂｙ）およびパスタン（Ｐａｓｔａｎ）、１９７９年；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｄ．ハメス（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ）およびＳ．Ｊ．ヒギンス（Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ）編、１９８４年）；「Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ」（Ｒ．Ｉ．フレッシュニー（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ社、１９８７年）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６年）；Ｂ．パーバル（Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ）、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４年）；論文、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、ニューヨーク）；「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｈ．ミラー（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ）およびＭ．Ｐ．カロス（Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ）編、１９８７年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、１５４巻および１５５巻（ウー（Ｗｕ）ら編）；「Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（メイヤー（Ｍａｙｅｒ）およびウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ロンドン、１９８７年）；「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ウェア（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ）およびＣ．Ｃ．ブラックウェル（Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ）編、１９８６年）；リオット（Ｒｉｏｔｔ）、「Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、第６版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、オックスフォード、１９８８年；ホーガン（Ｈｏｇａｎ）ら、「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ」、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、１９８６年）；ウェスターフィールド，Ｍ．（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｍ．）、「Ｔｈｅ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｂｏｏｋ．Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）」、（第４版、Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｏｒｅｇｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ユージーン、２０００年）を参照されたい。
【実施例】
【０１３２】
本発明を以下の実施例を参照にして記載するが、これらは例示として提供するものであって、決して本発明を限定する意図はない。当業界でよく知られている標準的技法または下記に特に記載される技法が利用された。本発明が、ゼブラフィッシュおよびヒトの細胞系を利用する研究によって示される全ての脊椎動物に適用でき、それらに作用することを、これらの実施例は示している。
【０１３３】
実施例１
材料および方法
プラスミド構築体
ケラチン８（ｋｒｔ８）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ４４０６９０）の２．２５ｋｂのプロモーター下、ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）を含有する構築体を、シンガポ−ル国立大学のチュアン  ゴング（Ｚｈｉｙｕａｎ  Ｇｏｎｇ）博士から入手した。３．１ｋｂのｋｒｔ８：ＥＧＦＰ断片を、０．６ｋｂのミニＤｓ構築体（ウェイル（Ｗｅｉｌ）およびクンゼ（Ｋｕｎｚｅ）、２０００年）内へ入れた。
【０１３４】
プライマー「Ａｃ５’−１」：ＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＴＡＡＧＧＴＡＧＡＡＡＴＧＧＣＴＡＴＴＧＴＴＣＡＴＧＡＡＣＣＡＣＡ（配列番号１４）および「Ａｃ３」：ＧＴＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＴＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣ（配列番号１５）ならびに、鋳型として、ｐＷＬ８０プラスミド（ウェイル（Ｗｅｉｌ）およびクンゼ（Ｋｕｎｚｅ）、２０００年）を用いて、ＮＬＳ−ＴＰアーゼのｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した。プライマー「Ａｃ５’−２」：ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＣＣＴＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＴＡＡＧＧＴＡＧ（配列番号１６）および「Ａｃ３」：ＧＴＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＴＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣ（配列番号１７）を用いて、該産物を第２のＰＣＲにおける鋳型として用いた。切断Ａｃ  ＴＰアーゼ１０３〜８０７に融合させた核局在化配列（ＮＬＳ）（ＭＧＰＰＫＫＫＲＫＶＥ（配列番号２）およびＫｏｚａｋ配列を有する該産物を、ＢａｍＨＩによって消化し、ｐＳＰ６４ＴベクターのＢｇｌＩＩ部位にクローニングした（クリーグ（Ｋｒｉｅｇ）およびメルトン（Ｍｅｌｔｏｎ）、１９８４年）。ＮＬＳ−ＴＰアーゼ構築体のクローニング時に、該プライマーにおけるランダムな誤対合により、ＮＬＳＫ５Ｅ−ＴＰアーゼが偶然得られた。ＮｏＮＬＳ構築体を作製するために、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ならびにプライマー：ＣＴＣＡＡＣＴＴＴＧＧＣＡＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡＴＴＧＴＴＣＡＴＧＡＡＣＣＡＣＡＡＣＣ（配列番号３８）およびＧＧＴＴＧＴＧＧＴＴＣＡＴＧＡＡＣＡＡＴＡＧＣＣＡＴＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡＧ（配列番号３９）を用いて、対応するＮＬＳ配列を除去した。
【０１３５】
ＮＬＳ−ＴＰアーゼ−ＥＧＦＰおよびＮＬＳＫ５Ｅ−ＴＰアーゼ−ＥＧＦＰの融合構築体を作製するために、プライマーＡＧＡＧＧＧＡＴＣＣＡＧＣＴＣＡＧＡＡＴＡＡＡＣＧＣＴＣＡＡＣ（配列番号４０）およびＡＧＡＧＡＣＣＧＧＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＧＡＧＣＣＡＣＴＴＧＣＴＡ（配列番号４１）を用いて、ＮＬＳ−ＴＰアーゼおよびＮＬSＫ５Ｅ−ＴＰアーゼ断片をＰＣＲ増幅し、それを、ＡｇｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて、ｋｒｔ８−ＥＧＦＰプラスミド（ゴング（Ｇｏｎｇ）ら、２００２年）内にクローニングした。ＮＬＳ−ＥＧＦＰおよびＮＬＳＫ５Ｅ−ＥＧＦＰ構築体を作製するために、対応して、ＮＬＳ−ＴＰアーゼ−ＥＧＦＰおよびＮＬＳＫ５Ｅ−ＴＰアーゼ−ＥＧＦＰ構築体から、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ならびにプライマー：ＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＴＡＡＧＧＴＡＧＡＡＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣ（配列番号４２）およびＧＣＴＣＣＴＣＧＣＣＣＴＴＧＣＴＣＡＣＣＡＴＴＴＣＴＡＣＣＴＴＡＣＧＣＴＴＣＴＴＣＴ（配列番号４３）を用いて、Ａｃ  ＴＰアーゼ１０３〜８０７ＣＤＳ配列を欠失させた。
【０１３６】
ＲＮＡ調製および注入
ＴＰアーゼプラスミドをＢａｍＨＩ（ポリＡ尾部の切断下流）により線状化し、キャップドトランスポゼースＲＮＡのインビトロ転写のために用いた。ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ  ＳＰ６キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いた。該産物を、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、ドイツ国）を用いて精製した。２５〜５０ｐｇのインビトロ合成トランスポゼースｍＲＮＡと共に、５〜１０ｐｇのプラスミドＤＮＡを１〜２細胞期のゼブラフィッシュ胚に同時注入した。注入するＲＮＡの実際の量は、５０％の胚生存率を生じるように経験的に調整した。
【０１３７】
ゼブラフィッシュ
ゼブラフィッシュは、確立されたプロトコル（ウェスターフィールド（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ、２０００年）に従って維持した。
【０１３８】
Ｄｓ切り出し部位の解析
３．７ｋｂ長のＤｓを封入するＤｓドナー部位および１２０ｂｐのフランキング配列にフランクする２種のプライマーを設計した。該プライマーは、以下の配列を有する：ＧＡＧＡＡＴＴＴＣＡＣＴＴＧＴＴＧＡＣＴＡＧＡ（配列番号１８）およびＧＣＧＣＡＴＧＡＡＣＴＣＣＴＴＧＡＴＧＡＣ（配列番号１９）。長いドナー産物の増幅を防ぐために、伸長させず、短いアニーリング時間でのＰＣＲ条件を用いた：９４℃で３０秒および５５℃で１０秒を３５サイクル。これらの条件下で、１２０ｂｐのＤｓ切り出し産物のみを増幅することができ、過剰に存在した３．７ｋｂ長のドナー部位は増幅されなかった。産物は、１．８％のアガロースゲルを用いて分離した。該ゲルからバンドを切断し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、ドイツ国）を用いて精製し、ＡＢＩ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州）ならびにＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を製造元により供給されたＤａｔａ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅと共に用いて、配列決定した。
【０１３９】
Ｄｓフランキング配列の解析
プライマーの以下のセット：Ｄｓ５’−１：ＣＣＧＴＴＴＡＣＣＧＴＴＴＴＧＴＡＴＡＴＣＣＣＧ（配列番号２１）、Ｄｓ５’−２：ＣＧＴＴＣＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＴＴＡＣＣ（配列番号２２）、Ｄｓ５’−３：ＣＧＧＴＣＧＧＴＡＣＧＧＧＡＴＴＴＴＣＣ（配列番号２３）、Ｄｓ３’−１：ＣＧＡＴＴＡＣＣＧＴＡＴＴＴＡＴＣＣＣＴＴＣＧ（配列番号２４）、Ｄｓ３’−２：ＣＣＧＧＴＡＴＡＴＣＣＣＧＴＴＴＴＣＧ（配列番号２５）、Ｄｓ３’−３：ＧＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＣＧＧＴＡＧＡＧＧＴ（配列番号２６）、ＡＤ−１：ＷＧＴＧＮＡＧＮＡＮＣＡＮＡＧＡ（配列番号２７）、ＡＤ−２：ＷＣＡＧＮＴＧＷＴＮＧＴＮＣＴＧ（配列番号２８）、ＡＤ−３：ＳＴＴＧＮＴＡＳＴＮＣＴＮＴＧＣ（配列番号２９）、ＡＤ−４：ＮＣＡＳＧＡＷＡＧＮＣＳＷＣＡＡ（配列番号３０）を用いて、先に記載されたとおり（リュー（Ｌｉｕ）およびウィティアー（Ｗｈｉｔｔｉｅｒ）、１９９５年；パリノブ（Ｐａｒｉｎｏｖ）ら、２００４年）、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ（熱非対称インターレースＰＣＲ）を実施した。第２および第３の反応の産物を、１．８％のアガロースゲルを用いて分離した。「バンドシフト」対の個々のバンドを該ゲルから切断し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、ドイツ国）を用いて精製し、ＡＢＩ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州）ならびにＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を、製造元により供給されたＤａｔａ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅと共に用いて、Ｄｓ５’−３プライマーおよびＤｓ３’−３プライマーにより配列決定した。
【０１４０】
サザンブロットハイブリダイゼーション
ゲル電気泳動により、ＥｃｏＲＩ消化されたゲノムＤＮＡを分画化し、キャピラリーブロッティング（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年）によって、正に荷電させたナイロン膜（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、米国）に移しＵＶ照射により架橋させた。ＥＧＦＰに対するＤＮＡプローブを、ＰＣＲ  ＤＩＧ合成キットを用いて、ジゴキシゲニン（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、米国）により標識化した。我々は、ハイブリダイゼーションのために、ＤＩＧ  ＥａｓｙＨｙｂ  ＤＩＧ  ＷａｓｈおよびＢｌｏｃｋ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｅｔを用い、ハイブリダイズしたプローブの検出のために、アルカリホスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体およびＣＤＰ−Ｓｔａｒ化学発光基質（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、米国）を用いた。ハイブリダイゼーションおよび検出は、製造元の使用説明書に記載されているとおりに実施した。
【０１４１】
実施例２
実験設計
ゼブラフィッシュのゲノム内にＤｓ挿入を生じさせる目的で、非自律的Ｄｓ因子を有するドナー構築体、および修飾ＡｃトランスポゼースをコードするメッセンジャーＲＮＡからなる２成分系を利用した。ミニＤｓ因子（ウェイル（Ｗｅｉｌ）およびクンゼ（Ｋｕｎｚｅ）、２０００年）の５’末端と３’末端の間のシス要求配列に限定されているゼブラフィッシュの２．２５ｋｂケラチン８（ｋｒｔ８）プロモーター下で（ゴング（Ｇｏｎｇ）ら、２００２年）、ＤＦｓ構築体はＥＧＦＰ遺伝子を運んだ（図１Ａ）。第２の構築体は、ＳＶ４０ラージＴ抗原のシグナルに類似した動物特異的合成核局在化シグナル（ＮＬＳ；ＭＧＰＰＫＫＫＲＫＶＥ（配列番号２）に融合させた切断Ａｃトランスポゼース（ＴＰアーゼ１０３〜８０７）（ホウバ−ヘリン（Ｈｏｕｂａ−Ｈｅｒｉｎ）ら、１９９９０年）のコード配列を有した（図１Ｂ）。このようなキメラＮＬＳ−ＴＰアーゼ１０３〜８０７融合体（ＮＬＳ−ＴＰアーゼ）をコードする遺伝子を、インビトロ転写のためにＳＰ６プロモーターを含有するｐＳＰ６４Ｔプラスミド（クリーグ（Ｋｒｉｅｇ）およびメルトン（Ｍｅｌｔｏｎ）、１９８４年）内にクローニングした。このプラスミドはまた、アフリカツメガエルβ−グロビン遺伝子の５’−および３’−ＵＴＲｓおよびｄＡ３２ポリＡ尾部も含有した。２種の類似のＴＰアーゼ構築体をさらに作製した（図１Ｂおよび１Ｃ）。１つは、ＮＬＳのないＴＰアーゼ１０３〜８０７のみを含有し（ＮｏＮＬＳ−ＴＰアーゼ）、他方は、ＮＬＳの第５位にアミノ酸置換（ＫからＥへ）を含有した（ＮＬＳＫ５Ｅ−ＴＰアーゼ）。
【０１４２】
表１は、修飾Ａｃトランスポゼース構築体のヌクレオチド配列を示している。表１Ａは、ＮＬＳ含有構築体を示し、表１Ｂは、ＮＬＳＫ５Ｅ含有構築体を示している。プラスミド配列は小文字で示されている。ＳＰ６プロモーター（配列番号１１または３７のヌクレオチド７０〜８９）は、小文字の太いイタリックで示してある。Ｋｏｚａｋ配列（配列番号１１または３７のヌクレオチド１５２〜１５７）は、合成ＮＬＳのコード配列に先行するキャップに示されている（大文字、太活字および下線、配列番号１１または３７のヌクレオチド１５８〜１９０）。切断ＡｃＴＰアーゼ１０３〜８０７のコード配列は、大文字および太活字（配列番号１１または３７のヌクレオチド１９１〜２３０５）およびＡｃトランスポゼースの停止コドンおよび３’−ＵＴＲは、大文字で示されている（配列番号１１または３７のヌクレオチド２３０６〜２４７７）。β−グロビンの５’−ＵＴＲは、配列番号１１または３７のヌクレオチド８９〜１５０によって表されている。β−グロビンの３’−ＵＴＲは、配列番号１１または３７のヌクレオチド２４７８〜２６２４によって表されている。
【０１４３】
表２は、修飾ＡｃＴＰアーゼのアミノ酸配列を示している。表２Ａは、ＮＬＳ−Ａｃ  ＴＰアーゼ、および表２Ｂは、ＮＬＳＫ５Ｅ−Ａｃ  ＴＰアーゼを示している。合成ＮＬＳ（太活字、配列番号２０のアミノ酸１〜１１）またはＮＬＳＫ５Ｅ（太活字、配列番号４４のアミノ酸１〜１１）は、切断Ａｃ  ＴＰアーゼ１０３〜８０７に融合される（ウェイル（Ｗｅｉｌ）およびクンゼ（Ｋｕｎｚｅ）、２０００年；ホウバ−ヘリン（Ｈｏｕｂａ−Ｈｅｒｉｎ）ら、１９９０年；配列番号２０または４４のアミノ酸１２〜７１６）。
【０１４４】
表１
修飾Ａｃトランスポゼース構築体のヌクレオチド配列
Ａ．ＮＬＳ含有構築体
【表１−１】
2008545391.tif 000003
Ｂ．ＮＬＳＫ５Ｅ含有構築体
【表１−２】
2008545391.tif 000004
【０１４５】
表２
修飾Ａｃ  ＴＰアーゼのアミノ酸配列
Ａ．ＮＬＳ含有修飾Ａｃ  ＴＰアーゼ
【表２−１】
2008545391.tif 000005
Ｂ．ＮＬＳＫ５Ｅ含有修飾Ａｃ  ＴＰアーゼ
【表２−２】
2008545391.tif 000006
【０１４６】
表３は、修飾Ｄｓ構築体のヌクレオチド配列を示している。ゼブラフィッシュケラチン８（ｋｒｔ８）プロモーター下のＥＧＦＰ遺伝子は、５’−Ｄｓ末端配列の２４７ｂｐ（配列番号１のヌクレオチド３６５７〜３９０３）と３’−Ｄｓ末端配列の３７０ｂｐ（配列番号１のヌクレオチド４３〜４１２）との間に限定されており（ウェイル（Ｗｅｉｌ）およびクンゼ（Ｋｕｎｚｅ）、２０００年）太活字、下線の大文字で示されている。これらの２つのＤｓ末端配列は、「最小Ｄｓ」とも呼ばれ、それを短くすることによって、転移効率にさらに負の影響を及ぼすことを意味している。遺伝子導入魚の選択には、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子を用いた。ｋｒｔ８−プロモーター−ＥＧＦＰ（小文字）は、Ｄｓの５’末端配列と３’末端配列との間に限定された。ｋｒｔ８プロモーターは、配列番号１のヌクレオチド４３６〜２６７４を含む。ＥＧＦＰのコード配列は、配列番号１のヌクレオチド２６６９〜３６４４を含む。
【０１４７】
表３
ｋｒ８−プロモーター−ＥＧＦＰを担持するＤｓ構築体
【表３】
2008545391.tif 000007
【０１４８】
実施例３
Ｄｓドナー構築体とＴｐアーゼｍＲＮＡの同時注入は特異的Ｄｓ切り出しを生じさせる
インビトロ転写された、キャップドおよびポリアデニル化ＴＰアーゼｍＲＮＡを、非線状Ｄｓドナープラスミドと共に、１細胞期におけるゼブラフィッシュ胚に微量注入した。それらの胚を２８℃で１０時間インキュベートし、Ｄｓ配列にフランクするプライマーと共に切り出しＰＣＲによりゲノムＤＮＡを分析した（明細は方法を参照）。切り出し産物は、ＴＰアーゼｍＲＮＡ（ＮＬＳＫ５Ｅ−  ＴＰアーゼまたはＮｏＮＬＳ−ＴＰアーゼ）およびＤｓ構築体双方を注入した胚でのみ検出され、一方、Ｄｓ構築体のみを注入された対照胚は、期待される長さのＰＣＲ断片を生産しなかった（図２Ａ）。驚くべきことに、最高収量を生産したＮＬＳＫ５Ｅ−  ＴＰアーゼとは対照的に、ＮＬＳ−ＴＰアーゼはＤｓ切り出し産物を生産しなかった。ＮｏＮＬＳ−ＴＰアーゼは、ＮＬＳＫ５Ｅ−  ＴＰアーゼと同様なレベルでの切り出しを誘導するためには、５倍多いＲＮＡを必要とした。これらの予備的切り出しデータに基づき、ＮＬＳＫ５Ｅ−  ＴＰアーゼが最も生産的なものとして選択され、それを大多数の実験に用いた。ドナー部位からのＤｓ因子のＴＰアーゼ媒介切り出しは、ＰＣＲ増幅切り出し誘導体のヌクレオチド配列決定によりさらに確認された。これらの配列の解析により、切り出しは転移に一致して、Ｄｓ末端で特異的に生じることが判明した。切り出しＰＣＲ産物は種々の切り出し修復事象の混合を含むことが予想されたため、混合配列パターンは、Ｄｓと隣接ベクターとの結合部で始まると我々は予想した。しかし、優先的配列パターンは、優先的切り出しを示す異なるＤｓフランキング配列を有する２種のベクターからの産物に見られた（図２Ｂ）。優勢な切り出しフットプリントは、１つのＤｓ末端に直に隣接したフランキングヌクレオチドの欠失を含み、他方のＤｓ末端におけるフランキングヌクレオチドの変化または欠失を伴った。
【０１４９】
実施例４
核局在化シグナルはＡｃ  ＴＰアーゼの細胞内局在化および凝集に影響する
細胞内局在化に及ぼす種々のＮＬＳの効果を調べるために、３種全てのＴＰアーゼ（ＮｏＮＬＳ−、ＮＬＳ−、およびＮＬＳＫ５Ｅ−  ＴＰアーゼ）についてｋｒｔ８：ＴＰアーゼ−ＥＧＦＰ融合構築体を作製した。プロモーターｋｒｔ８は、細胞局在化の観察に非常に便利なモデルである大型で平たい細胞からなる上皮組織の単層での発現を駆動する。これらの構築体を、１細胞期のゼブラフィッシュ胚に注入し、２４ｈｐｆ期でＧＦＰ蛍光を観察した。３種のＴＰアーゼ構築体いずれの高レベル発現も胚に毒性であった。１５ｐｇのプラスミド注入により、発生２４時間のうちに、５０％超の致死率が生じ、生存胚の大部分はｋｒｔ特異的ＧＦＰ発現を欠いていた。３ｐｇのプラスミド注入により、主にＧＦＰ陰性胚が生じた。大量の（ＧＦＰ蛍光によって容易に可視）ＴＰアーゼ融合タンパク質の発現は細胞にとって毒性であったと我々は推定した。それにも関わらず、各々の場合に、上皮の形状を保持した低比率のＧＦＰ陽性細胞が見られ、したがって、その中におけるＧＦＰタグ化ＴＰアーゼの細胞内局在化の同定が可能であった（図３Ａ〜３Ｃ）。ＮｏＮＬＳ−ＴＰアーゼ−ＥＧＦＰは、主に細胞質への局在化、一方、ＮＬＳ−ＴＰアーゼ−ＥＧＦＰおよびＮＬＳＫ５Ｅ−  ＴＰアーゼ−ＥＧＦＰは、主に核への局在化が見られた。ＮｏＮＬＳ−ＴＰアーゼ−ＥＧＦＰおよびＮＬＳ−ＴＰアーゼ−ＥＧＦＰは、細胞質と核それぞれに、凝集体を形成する強い傾向を示し（図３Ａ〜３Ｃ）、これは、植物で報告されているアクチベーターＴＰアーゼ凝集体（ボーエム（Ｂｏｅｈｍ）ら、１９９５年；ハインライン（Ｈｅｉｎｌｅｉｎ）ら、１９９４年）に類似していた。反対に、ＮＬＳＫ５Ｅは、目視でのより高い発現レベルでも凝集体の増加はまれであった。ＮＬＳとＮＬＳＫ５Ｅの双方がゼブラフィッシュ細胞に機能的であることを確認するために、我々は、同様な実験において、ＮＬＳ−ＥＧＦＰとＮＬＳＫ５ＥＥＧＦＰとの融合タンパク質の細胞成分局在化を解析した（図３Ｄ〜３Ｆ）。ＮｏＮＬＳ−ＥＧＦＰ、ＮＬＳＫ５Ｅ−ＥＧＦＰおよびＮＬＳ−ＥＧＦＰそれぞれの分布における核対細胞質比の漸次的増加が見られた。
【０１５０】
実施例５
修飾Ａｃトランスポゼースは核局在化を必要とする高率の胚Ｄｓ挿入を誘導する
注入された胚を成体まで飼育し、ｗｔ魚と異系交配した。注入された胚におけるＧＦＰシグナルの強度および／または濃度に基づいた選択は全く行わなかった。注入された胚は全て、それらのＧＦＰ発現に関わりなく飼育された。ＮＬＳ−ＴＰアーゼまたはＮＬＳＫ５Ｅ−  ＴＰアーゼを注入された始祖魚（Ｆ０）のおよそ６０％がＧＦＰ−蛍光胚を含有する子孫（Ｆ１）を生産した（表４）。子孫の中のＥＧＦＰ陽性胚の比率も著しかった：約１０％の陽性始祖魚が、１００％ＧＦＰ陽性子孫を生産した１匹のＦ０魚を含め、複数の発現パターンを有する５０％超のＧＦＰ陽性を含有する子孫を生産した。可能性のある母親の発現を避けるために、比率は４ｄｐｆでカウントした（パリノブ（Ｐａｒｉｎｏｖ）ら、２００４年）。このことはまた、高転移活性を示すものと考えられ、また、Ａｃ／Ｄｓ単位が、恐らく発生の初期に生じたことを暗示していた。ＮｏＮＬＳ−ＴＰアーゼを注入された始祖魚は、著しく低い遺伝子導入率を生じた。Ｄｓ構築体のみを注入された対照集団では、ＧＦＰ陽性子孫は見られなかった（ゼブラフィッシュにおいて、環状ＤＮＡの組込みは無効である）。
【０１５１】
表４
種々のＴＰアーゼ構築体の遺伝子導入効率
【表４】
2008545391.tif 000008
遺伝子導入率は、スクリーニングされた始祖魚の総数のうち、ＧＦＰ陽性子孫を生産する始祖魚のパーセントとして算出されている。最後列は、Ｆ１子孫の中で最高のＧＦＰ陽性胚比を示している。
【０１５２】
実施例６
ゼブラフィッシュゲノム内への解離因子の組込み
熱非対称インターレースＰＣＲ「ＴＡＩＬ−ＰＣＲ」（リュー（Ｌｉｕ）およびウィティアー（Ｗｈｉｔｔｉｅｒ）、１９９５年）を用いて、Ｆ１魚においてＤｓ挿入体にフランクしているＤＮＡ配列を単離した。このようにして得られた２８の非重複フランキング配列は、ＧｅｎＢａｎｋまたはＥｎｓｅｍｂｌデータベースのゼブラフィッシュヌクレオチド配列に完全に対合した。各々の場合に、対合は、Ｄｓの５’末端または３’末端に隣接する最初のヌクレオチドから開始された。さらに、Ｄｓ挿入体は、典型的に植物におけるＡｃ／Ｄｓ挿入体および他のｈＡＴトランスポゾンを伴う、標的部位の古典的な８ｂｐの直接的複製によってフランクされた（図２Ｃ）。したがって、Ｄｓは、特異的ＴＰアーゼ媒介転移機構によってゼブラフィッシュのゲノム内に組み込まれた。数匹のＦ１魚では、元のＤｓドナーベクターに対応するフランキング配列を単離したが、それらは、同じＦ１魚において、さらに非ベクターフランキング配列を伴った。Ｄｓ挿入部位に同定された２８のうち２１が遺伝子内に見られ、活性転写領域に対して優先的である可能性を示唆した。
【０１５３】
ＥＧＦＰ特異的プローブを用いたサザンブロットハイブリダイゼーションにより、種々のＦ１子孫における優勢な複数の挿入が判明した（図４）。そのコピー数は、Ｆ１魚１匹当たり１つから７つ、またはそれ以上の挿入という範囲であり、１ゲノム当たり平均４つの挿入であった。同一ファミリーの異なるＦ１子孫（同一創始魚Ｆ０の子孫）は、しばしば、異なる独立した挿入体を担持した（図４、１〜４のレーン）。
【０１５４】
胚系列転移のこのような異常に高い頻度は、第１に、元の宿主因子が不必要であること、第２に、新たな宿主環境はＤｓ転移を抑制しないことを示唆している。
【０１５５】
実施例７
ゲノムＤｓ因子の転移
Ａｃ／Ｄｓの転移活性をさらに検証するために、皮膚の上皮および腸管にＥＧＦＰ発現を示す単一のＤｓ挿入体を担持する遺伝子導入魚の胚に、ＴＰアーゼｍＲＮＡを注入することによって、ゲノムのＤｓ挿入体を再移動させた（図５）。ＮＬＳ−ＴＰアーゼ（８５のうち８０）およびＮＬＳＫ５Ｅ−  ＴＰアーゼ（７２のうち６９）を注入された胚の９０％超が、脳、脊髄、筋肉、心臓、肝臓、生殖器領域などの種々の臓器において異所性ＥＧＦＰ発現を示した（図５）。ＥＧＦＰレポーターの異所性発現は、各々の場合で、切り出されたＤｓコピーの再挿入が首尾よくなされた結果として生み出されたエンハンサートラップ効果に帰する可能性が考えられる。模倣物を注入された対照魚では、このような効果は見られなかった。模倣物注入では、Ｄｓ配列を明らかに認識しないＴｏｌ２トランスポゼースのＲＮＡ（カエカミ（Ｋａｅａｋａｍｉ）ら、２０００年）を用いた。興味深いことに、ＮｏＮＬＳ−ＴＰアーゼの注入では、ＮＬＳ−ＴＰアーゼおよびＮＬＳＫ５Ｅ−  ＴＰアーゼに比較して、異所性ＧＦＰの発現ははるかに低い率（１６８の注入胚のうち９）であった。ＮｏＮＬＳ−ＴＰアーゼによって誘導された新規パターンは、より単純であり、通常は同じ細胞型の単一集団にのみ影響を及ぼした。この実験は、ＴＰアーゼがゲノム転移に関して核局在化を必要とすることをさらに支持する証拠である。ＮＬＳＫ５Ｅ−  ＴＰアーゼを注入された胚を、成熟するまで飼育し、ｗｔ魚と異系交配した。スクリーニングされた１３匹の始祖魚からの１０匹の子孫中（７７％）に新規発現パターンを有するＦ１胚が見られた（図５および表５）。我々が検出したのは、識別可能な新規パターンを生じさせた挿入のみなので、真の転移数はより高いはずであることに注意されたい。このような新規発現パターンを担持するＦ１胚から増幅させた配列は、元の魚系列には存在しない新規Ｄｓ挿入部位を現した。したがって、修飾Ａｃトランスポゼースは、あらゆる胚への注入によって供給されたベクター構築体により担持されたＤｓのみならず、ゼブラフィッシュの核ゲノム内に安定に組み込まれたＤ因子もまた効果的に転移できることは明らかである。異常に高い再挿入率に加えて、しばしば変化したＧＦＰ分離比が見られた（表５）。１３匹の創始魚のうち１匹が１：１（単一の対立遺伝子異型接合の親の異系交配に関する予想比）よりかなり高いＧＦＰ分離比を生じ、Ｄｓコピー数の増加を明示した。１３匹の始祖魚のうち５匹が、１：１よりかなり低いＧＦＰ分離を示し、ドナーＤｓの欠失を示していた。新規ＧＦＰ発現パターンの存在の観察により、または／および変化した分離比により、全部で１３匹のスクリーニングした始祖魚中、１１匹（８５％）にＴＰアーゼ活性を検出することができた。
【０１５６】
表５
ＲＮＡを注入した遺伝子導入系における再転移およびＤｓドナーの欠失
【表５】
2008545391.tif 000009
単一の異型接続Ｄｓ挿入体を担持する遺伝子導入胚に、ＮＬＳＫ５Ｅ−  ＴＰアーゼを注入し、成熟するまで飼育し、野生型の魚と異系交配した。Ｆ１世代で、新規発現パターンならびに変化したＧＦＰ分離が見られた。
【０１５７】
実施例８
ヒト胚腎細胞系のＤｓ転移
我々は、ヒト細胞におけるＤｓ転移もまた実証した。魚に用いたものとは異なる方法を利用した。修飾ＡｃトランスポゼースをコードするメッセンジャーＲＮＡの替わりに、ＣＭＶプロモーター下、修飾ＮＬＳＫ５Ｅ−ＡｃトランスポゼースのＯＲＦを含有するプラスミドＤＮＡ構築体を用いた。Ｄｓ構築体もまた異なっていた。Ｄｓ因子はＣＭＶプロモーター下、ＥＧＦＰ遺伝子を担持したが、ブラスチシジン耐性遺伝子（ＢＳＤ）および内部プラスミド複製源もまた含有した。２種のプラスミドをヒト胚腎細胞系ＨＥＫ２９３に共トランスフェクトし、ブラスチシジンについて選択した。該細胞を採取し、ＴＡＩＬ−ＰＣＲによりそれらのＤＮＡを解析し、ヒトゲノム内のＴＰアーゼ媒介Ｄｓ組込みの存在に関して配列決定した。Ｄｓの５’末端または３’末端に直に隣接した第１のヌクレオチドから始まるヒトヌクレオチド配列に完全に対合したそのようなフランキング配列が首尾よく得られた（図６）。さらに、１つの場合では、Ｄｓ挿入体は、ｈＡＴトランスポゾンを典型的に伴う、標的部位の古典的８ｂｐ直接的複製によりフランクされた。このように、ヒト細胞の細胞内環境もまた、Ｄｓ転移に好適である。
【０１５８】
材料および方法
ＨＥＫ２９３細胞系へのＡｃ／Ｄｓのトランスフェクション
１）５％ＣＯ２において２ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中、トランスフェクションの２４時間前に、６ウェルプレート当たり２．５×１０５のＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ＿１５７３）の細胞を接種した。
【０１５９】
２）細胞に各０．５ｍｇのプラスミド（ｐＤｓ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰ−Ｕｂ−ＢｓｄおよびｐＣＭＶ−Ａｃ）を共トランスフェクトした。推奨されたプロトコルに従い、ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ２トランスフェクション試薬（ＧＴＳ、カリフォルニア州、米国；カタログ番号Ｔ２０２０９６）をトランスフェクションに用いた。
【０１６０】
３）トランスフェクションの２４時間後、１０ｍｇ／ｍｌのブラスチシジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；＃Ｒ２１０−０１）を含有するＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中、９６ウェルプレートに単独細胞希釈細胞を接種した。抗生物質コロニーに耐性の抗生物質選択を６日間続けた。選択後、培地をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳに変え、ＧＦＰ陽性コロニーを６ウェルプレート内で集密になるまで増殖を続けさせた。
【０１６１】
４）フェノール／クロロホルム抽出、引き続いて、エタノール沈降を用いて、該細胞のＤＮＡを得た。
【０１６２】
５）ＴＡＩＬ−ＰＣＲにより、フランキング配列を得た。
【０１６３】
ヒト胚腎細胞系に用いられた構築体
【０１６４】
Ｄｓ構築体（ｐＤＳ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰ−Ｕｂ−Ｂｓｄ）（配列番号７０）
【０１６５】
ｂｐ１〜２９２、Ｄｓ５’末端シス要求配列：
【０１６６】
【化１】
2008545391.tif 000010
【０１６７】
ｂｐ２９３〜１６８７、ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰを含有するｐＥＧＦＰ−Ｎ３プラスミド断片（ｂｐ９〜１４０３）：
【０１６８】
【化２】
2008545391.tif 000011
【０１６９】
ｂｐ１６８８〜３４０３、ブラスチシジン耐性遺伝子（ＢＳＤ）を含有するｐＵＢＢＳＤ１プラスミド断片（ｂｐ１９１７〜３６３２）
【０１７０】
【化３】
2008545391.tif 000012
【０１７１】
ｂｐ３４０４〜４４６５、プラスミド複製源を含有するクローニングベクター断片：
【０１７２】
【化４】
2008545391.tif 000013
【０１７３】
ｂｐ４４６６〜４８３５、Ｄｓ３’末端シス要求配列：
【０１７４】
【化５】
2008545391.tif 000014
【０１７５】
ｂｐ４８３６〜６４９５、アンピシリン耐性遺伝子を含有するクローニングベクター断片：
【０１７６】
【化６】
2008545391.tif 000015
【０１７７】
Ａｃ−ＴＰアーゼ構築体（ｐＣＭＶ−Ａｃ）（配列番号７１）
【０１７８】
ＣＭＶプロモーター下、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１構築体のＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限部位内へのプライマー：Ａｃ５Ｂａｍ：ｇｃｇｃＧＧＡＴＣＣａｔａｃｇａｔｔｔａｇｇｔｇａｃａｃｔａｔａｇ（ｈａｂａ  ：５１）およびＡｃ３Ｎｏｔ：ｃｇａｔｃｇａｔｇｃＧＧＣＣｇＣＣＴＴＧＧＣＴＡＡＣＡＴＡＡＧＡＡＧ（配列番号５２）を用いたＰＣＲ増幅ＮＬＳＫ５Ｅ−ＴＰアーゼのクローニングにより、ＮＬＳＫ５Ｅ−ＴＰアーゼＯＲＦを担持するＤＮＡ構築体を作製した。
【０１７９】
ｂｐ１〜６６５、プロモーターＣＭＶを含有するｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミド断片（ｂｐ１〜６６５）：
【０１８０】
【化７】
2008545391.tif 000016
【０１８１】
ｂｐ６６５〜３０６６、ＮＬＳＫ５Ｅ−ＴＰアーゼＯＲＦ配列を含有する増幅断片：
【０１８２】
【化８】
2008545391.tif 000017
【０１８３】
ｂｐ３０６７〜６４００、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミド断片（ｂｐ１４００〜４７３３）：
【０１８４】
【化９】
2008545391.tif 000018
【０１８５】
トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の３例におけるＤｓの解析の結果は図６に示されている。これら３例のＤｓ（小文字）は、Ｄｓ末端配列に直に隣接した最初のヌクレオチドから始まるヒトＤＮＡによりフランクされている（大文字）（ドナーのベクターＤＮＡではない）。このことは、Ｄｓが、トランスポゼース媒介機構によってヒトゲノムに組み込まれることを示している。ｈＡＴトランスポゾンが新規な位置に組み込まれる場合にしばしば生じる、ＤＮＡ  ２挿入部位が古典的な８ｂｐ直接的反復に囲まれている場合。
【０１８６】
本発明を説明する文脈における（特に、以下の特許請求の範囲の文脈における）「１つの」および「１個の」および「その」および類似の記述語は、本明細書に別に指示されるか、または文脈により明らかに矛盾しない限り、単数と複数の両方を含む。用語の「含んでなる」、「有する」、「含む」および「含有する」は、別に注記されない限り、オープンエンドの用語として考えるべきである（すなわち、「限定はしないが、含む」を意味する）。本明細書における数値範囲の記述は、本明細書で別に指示されない限り、単に、別個の各数値がその範囲内に入ることを個々に述べることを省略する方法として用いられていることが意図されており、別個の各数値は、本明細書に個々に記述されているようにそれに組み込まれている。本明細書に記載された方法は全て、本明細書に別に指示されるか、または文脈により明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施できる。本明細書に提供されたいくつかの、または全ての例、または例示的語句（例えば、「など」）の使用は、本発明をより十分に明らかにすることのみが意図されており、別に請求しない限り、本発明の範囲に限定を設けるものではない。本発明における語句は、請求されていない要素がいずれも、本発明の実施に必須であることを示していると考えるべきではない。
【０１８７】
本発明の実施に関して本発明者の知っている最良の様式を含めて、本発明の実施形態が本明細書に記載してある。先の説明を読めば、それらの実施形態の変型は、通常の当業者にとって明らかになり得る。当業者が、適切な場合、そのような変型を用いることを本発明者は予想しており、また、本発明が本明細書に具体的に記載されたものとは別様に実施されることを、本発明者は意図している。したがって、本発明は、本明細書に添付された特許請求の範囲に記述された主題の、適用可能な法が許容する全ての修飾物および等価物を含む。さらに、上記の要素の可能な全ての変型におけるそれらの任意の組み合わせが、本明細書に別に指示されるか、または文脈により明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。
【０１８８】
参考文献
Allen et al. (1988).  “Transgene as probes for active chromosomal domains in mouse development.”  Nature 333:852-855.
Allende, M.L. et al. (1996).  “Insertional mutagenesis in zebrafish identifies two novel genes, pescadillo and dead eye, essential for embryonic development.”  Genes Dev 10:3141-3155.
Altschul, S.F. et al., (1990).  “Basic local alignment search tool.”  J Mol Biol 215:403-410.
Altschul, S.F. et al. (1997).  “Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.”  Nucleic Acids Res 25:3389-3402.
Amsterdam, A. et al. (1999).  “A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish.”  Genes Dev 13:2713-2724.
Andersen, J.K. et al. (1993).  “Herpesvirus-mediated gene delivery into the rat brain: specificity and efficiency of the neuron-specific enolase promoter.”  Cell Mol Neurobiol 13:503-515.
Balciunas, D. et al. (2004).  “Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon.”  BMC Genomics 5:62(1-15).
Bellen, H.J. et al. (1989).  “P-element-mediated enhancer detection: a versatile method to study development in Drosophila.”  Genes Dev 3:1288-1300.
Bingham, P.M. et al. (1981).  “Cloning of DNA sequences from the white locus of D. melanogaster by a novel and general method.”  Cell 25:693-704.
Boehm, U. et al. (1995). “One of three nuclear localization signals of maize Activator (Ac) transposase overlaps the DNA-binding domain.”  Plant J 7:441-451.
Bunin, B.A. and Ellman, J.A. et al. (1992). “A general and expedient method for the solid-phase synthesis of 1,4-benzodiazepine derivatives.”  J. Am. Chem. Soc. 114:10997-10998.
Burns, J.C. et al.. (1993).  “Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells.”  Proc Natl Acad Sci USA 90:8033-8037.
Carell, E. et al. (1994a).  “A Novel Procedure for the Synthesis of Libraries Containing Small Organic Molecules.”  Angew. Chem Int. Ed. Engl. 33:2059-2061.
Carell, E. et al. (1994b).  “A Solution-Phase Screening Procedure for the Isolation of Active Compounds from a Library of Molecules.”  Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061-2064.
Chen, T.T. and Powers, D.A. (1990).  “Transgenic fish.”  Trends Biotechnol 8:209-215.
Chen, W. et al. (2002).  “High-throughput selection of retrovirus producer cell lines leads to markedly improved efficiency of germ line-transmissible insertions in zebra fish.”  J Virol 76:2192-2198.
Childs, S. et al. (2000). “Zebrafish dracula encodes ferrochelatase and its mutation provides a model for erythropoietic protoporphyria.”  Curr Biol 10:1001-1004.
Cho, C.Y. et al. (1993).  “An Unnatural biopolymer.”   Science. 261:1303-1305.
Clark, J.T. et al. (1984).  “Neuropeptide Y and human pancreatic polypeptide stimulate feeding behavior in rats.”  Endocrinology 115:427-429.
Converse, A.D. et al. (2004).  “Counterselection and co-delivery of transposon and transposase functions for Sleeping Beauty-mediated transposition in cultured mammalian cells.”  Biosci Rep 24:577-594.
Cull, M.G. et al. (1992).  “Screening for Receptor Ligands Using Large Libraries of Peptides Linked to the C Terminus of the lac Repressor.”  Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869.
Culp, P. et al. (1991).  “High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs.”  Proc Natl Acad Sci USA 88:7953-7957.
Cwirla, S.E. et al. (1990).  “Peptides on Phage: A Vast Library of Peptides for Identifying Ligands.”  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382.
Davidson, A.E. (2003).  “Efficient gene delivery and gene expression in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon.”  Dev Biol 263:191-202.
Davidson, B.L. et al. (1993).  “A model system for in vivo gene transfer into the central nervous system using an adenoviral vector.”  Nature Genetics 3:219-223.
Devlin, J.L. et al. (1990).  “Random Peptide Libraries: A Source of Specific Protein Binding Molecules.”  Science 249:404-406.
Devon, R.S. et al. (1995).  “Splinkerettes--improved vectorettes for greater efficiency in PCR walking.”  Nucl Acids Res 23:1644-1645.
DeWitt, S.H. et al. (1993).  “Diversomers”: An Approach to Nonpeptide, Nonoligomeric Chemical Diversity.”  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909-6913.
Driever, W. et al. (1996).  “A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.”  Development 123:37-46.
Dujon, B. et al. (1994).  “Complete DNA sequence of yeast chromosome XI.”  Nature 369:371-378.
Ekker, S.C. (2000).  “Morphants: a new systematic vertebrate functional genomics approach.”  Yeast 17:302-306.
Emi, N. et al. (1991).  “Pseudotype formation of murine leukemia virus with the G protein of vesicular stomatitis virus.”  J Virol 65:1202-1207.
Erb, E. et al. (1994).  “Recursive Deconvolution of Combinatorial Chemical Libraries.”  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-11426.
Erickson, J.C. et al. (1996).  “Sensitivity to leptin and susceptibility to seizures of mice lacking neuropeptide Y.”  Nature 381:415-421.
Erzurum, S.C. et al. (1993).  “Protection of human endothelial cells from oxidant injury by adenovirus-mediated transfer of the human catalase cDNA”  Nucleic Acids Res 21:1607-1612.
Essner, J.J. et al. (2005).  “Awakening gene therapy with Sleeping Beauty transposons.”  Curr Opin Pharmacol 5:513-519.
Fadool, J.M. et al. (1998).  “Transposition of the mariner element from Drosophila mauritiana in zebrafish.”  Proc Natl Acad Sci USA 95:5182-5186.
Fedoroff, N. et al. (1983).  Isolation of the transposable maize controlling elements Ac and Ds.  Cell 35:235-242.
Felici, F. et al. (1991).  “Selection of antibody ligands from a large library of oligopeptides expressed on a multivalent exposition vector.”  J Mol. Biol. 222:301-310.
Fletcher, G.L., and Davis, P.L. (1991). “Transgenic fish for aquaculture.”  In Genetic Engineering, Setlow, J.K., ed., Plenum Press.
Flotte, T.R. et al. (1993).  “Stable in vivo expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator with an adeno-associated virus vector.”  Proc Natl Acad Sci USA 90:10613-10617.
Fodor, S. et al. (1993).  “Multiplexed biochemical assays with biological chips.”  Nature 364:555-556.
Gallop, M.A. et al. (1994).  “Applications of combinatorial technologies to drug discovery. 1. Background and peptide combinatorial libraries.”  J. Med. Chem. 37:1233-1251.
Golling, G. et al. (2002).  “Insertional mutagenesis in zebrafish rapidly identifies genes essential for early vertebrate development.”  Nat Genet 31:135-140.
Gong, Z. et al. (2002).  “Green fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8.”  Dev Dyn 223:204-215.
Gossler et al. (1989).  “Mouse Embryonic Stem Cells and Reporter Constructs to Detect Developmentally Regulated Genes.”  Science 244:463-465.
Graham, M., et al. (1997).  “Overexpression of Agrt leads to obesity in transgenic mice.”  Nat Genet 17:273-274.
Hackett, P.B. et al. (2005).  “Sleeping beauty transposon-mediated gene therapy for prolonged expression.”  Adv Genet 54:189-232.
Haffter, P. et al. (1996).  “The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish Danio rerio.”  Development 123:1-36.
Halford, J.C. (2001).  “Pharmacology of appetite suppression: implication for the treatment of obesity.”  Curr Drug Targets 2:353-370.
Hay, B.A. et al. (1997).  “P element insertion-dependent gene activation in the Drosophila eye.”  Proc Natl Acad Sci USA 94:5195-5200.
Heasman, J. (2002).  “Morpholino oligos: making sense of antisense?”  Dev Biol 243:209-214.
Heinlein, M. et al. (1994).  “In vivo aggregation of maize Activator (Ac) transposase in nuclei of maize endosperm and Petunia protoplasts.”  Plant J 5:705-714.
Horie, K. et al. (2001).  “Efficient chromosomal transposition of a Tc1/mariner- like transposon Sleeping Beauty in mice.”  Proc Natl Acad Sci USA. 98:9191-9196.
Horwell, D. et al (1996).  “'Targeted' molecular diversity: design and development of non-peptide antagonists for cholecystokinin and tachykinin receptors.”  Immunopharmacology 33:68-72.
Houba-Herin, N. et al. (1990).  “Excision of a Ds-like maize transposable element (Ac delta) in a transient assay in Petunia is enhanced by a truncated coding region of the transposable element Ac.”  Mol Gen Genet 224:17-23.
Houghten, R.A. et al. (1992).  “The use of synthetic peptide combinatorial libraries for the identification of bioactive peptides.”  Biotechniques 13:412-421.
Izsvak, Z. and Z. Ivics (1993).  “Two-stage ligation-mediated PCR enhances the detection of integrated transgenic DNA.”  Biotechniques 15:814-818.
Izsvak, Z. and Z. Ivics (2004).  “Sleeping beauty transposition: biology and applications for molecular therapy.”  Mol Ther 9:147-156.
Kaiser, K. et al. (1995).  “Eukaryotic transposable elements as tools to study gene structure and function.”  In Mobile Genetic Elements, Sheratt, D.J., ed., Oxford University Press, Oxford, pp. 69-100.
Kaminski, J.M. et al. (2002).  “Design of a nonviral vector for site-selective, efficient integration into the human genome.”  FASEB J 16:1242-1247.
Kawakami, K. and T. Noda (2004).  “Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells.”  Genetics. 166:895-899.
Kawakami, K. et al. (2000).  “Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage.”  Proc Natl Acad Sci USA 97:11403-11408.
Kawakami, K. et al. (2004).  “Excision of the Tol2 transposable element of the medaka fish Oryzias latipes in Xenopus laevis and Xenopus tropicalis.”  Gene 338:93-98.
Kimmel, C.B. (1989).  “Genetics and Early Development of Zebrafish.”  Trends Genet 5:283-288.
Koga, A. et al. (2002).  “Gene transfer and coining of flanking chromosomal regions using the medaka fish Tol2 transposable element.”  Mar Biotechnol (NY) 4:6-11.
Kothary et al. (1988).  “A transgene containing lacZ inserted into the dystonia locus is expressed in neural tube.”  Nature 335:435-437.
Krieg, P.A. and D.A. Melton (1984).  “Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs.”  Nucleic Acids Res 12:7057-7070.
Lam, K.S. (1997).  “Application of combinatorial library methods in cancer research and drug discovery.”  Anticancer Drug Des. 12:145-167.
Lam, K.S. et al. (1991).  “A new type of synthetic peptide library for identifying ligand-binding activity.”  Nature 354:82-84.
Lander, E.S. et al. (2001).  “Initial sequencing and analysis of the human genome.”  Nature 409:860-921.
Levine, A.S. and J.E. Morley (1984).  “Neuropeptide Y: a potent inducer of consummatory behavior in rats.”  Peptides 5:1025-1029.
Lever, A.M. (2000).  “Lentiviral vectors: progress and potential.”  Curr Opin Mol Ther 2:488-496.
Lin, S. et al. (1994).  “Integration and germ-line transmission of a pseudotyped retroviral vector in zebrafish.”  Science 265:666-669.
Liu, L. et al. (2005).  “Endothelial targeting of the Sleeping Beauty transposon within lung.”  Mol Ther 10:97-105.
Liu, L. et al. (2006).  “Sustained FVIII Expression and Phenotypic Correction of Hemophilia A in Neonatal Mice Using an Endothelial-Targeted Sleeping Beauty Transposon.”  Mol Ther Feb 3; [Epub ahead of print].
Liu, Y.G. and R.F. Whittier (1995).  “Thermal asymmetric interlaced PCR: automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YAC clones for chromosome walking.”  Genomics 25:674-81.
Lu, J.K. et al. (1992).  “Integration, expression and germ-line transmission of foreign growth hormone genes in medaka (Oryzias latipes).”  Molec Mar Biol Biotechnol 1:366-375.
Miklos, G.L. and G.M. Rubin (1996).  “The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms.”  Cell 86:521-529.
Miller, A.D. et al., (1993).  “Use of retroviral vectors for gene transfer and expression.”  Methods of Enzymology 217:581-599.
Mooslehner, K. et al. (1990).  “Retroviral integration sites in transgenic Mov mice frequently map in the vicinity of transcribed DNA regions.”  J Virol 64:3056-3058.
Nasevicius, A. and S.C. Ekker (2000).  “Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.”  Nat Genet 26:216-220. 
Ohlfest, J.E. et al. (2005).  “Nonviral vectors for cancer gene therapy: prospects for integrating vectors and combination therapies.”  Curr Gene Ther 5:629-641.
Ollmann, M.M. et al. (1997).  “Antagonism of central melanocortin receptors in vitro and in vivo by agouti-related protein.”  Science 278:135-138.
O'Kane, et al. (1987).  “Detection in situ of Genomic Regulatory Elements in Drosophila.”  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:9123-9127.
Osborne, B.I. and B. Baker (1995).  “Movers and shakers: maize transposons as tools for analyzing other plant genomes.”  Curr Opin Cell Biol 7:406-413.
Parinov, S. et al. (1999).  “Analysis of flanking sequences from Dissociation insertion lines: a database for reverse genetics in Arabidopsis.”  Plant Cell 11:2263-2270.
Parinov, S. et al. (2004).  “Enhancer trap transposable element as a tool for identification of developmentally regulated genes in zebrafish in vivo.”  Dev Dyn. 231:449-459.
Plasterk, R.H. (1993).  “Molecular mechanisms of transposition and its control.”  Cell 74:781-786.
Pohlman, R.F. et al. (1984).  The nucleotide sequence of the maize controlling element Activator.  Cell 37:635-643.
Powers, D.A. et al. (1992).  “Electroporation: a method for transferring genes into the gametes of zebrafish (Brachydanio rerio), channel catfish (Ictalurus punctatus), and common carp (Cyprinus carpio).”  Molec Mar Biol Biotechnol 1:301-308.
Qian, S. et al. (2002).  “Neither agouti-related protein nor neuropeptide Y is critically required for the regulation of energy homeostasis in mice.”  Mol Cell Biol 22:5027-5035.
Raz, E. et al. (1998).  “Transposition of the nematode Caenorhabditis elegans Tc3 element in the zebrafish Danio rerio.”  Curr Biol 8:82-88.
Richardson, P.D. et al. (2002).  “Gene repair and transposon-mediated gene therapy.”  Stem Cells 20:105-118.
Rohdewohld, H. et al. (1987).  “Retrovirus integration and chromatin structure: Moloney murine leukemia proviral integration sites map near DNase I-hypersensitive sites.”  J Virol 61:336-343.
Rorth, P. (1996).  “A modular misexpression screen in Drosophila detecting tissue-specific phenotypes.”  Proc Natl Acad Sci USA 93:12418-12422.
Rorth, P. et al. (1998).  “Systematic gain-of-function genetics in Drosophila.”  Development 125:1049-1057.
Sakaguchi, T. et al. (2001).  “A novel sox gene, 226D7, acts downstream of Nodal signaling to specify endoderm precursors in zebrafish.”  Mech Dev 107:25-38.
Sambrook et al. (1989). Molecular Cloning, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
Scherdin, U. et al. (1990).  “Transcriptionally active genome regions are preferred targets for retrovirus integration.”  J Virol 64:907-912.
Scott, J.K. and J.P. Smith (1990).  “Searching for Peptide Ligands with an Epitope Library.”  Science 249:386-390.
Shapiro, J.A. (1992).  “Natural genetic engineering in evolution.”  Genomics 86:99-111.
Shure, M. et al. (1983).  Molecular identification and isolation of the Waxy locus in maize.  Cell 35:225-233.
Spradling, A.C. et al. (1995).  “Gene disruptions using P transposable elements: an integral component of the Drosophila genome project.”  Proc Natl Acad Sci USA 92:10824-10930.
Streisinger (1984).  Attainment of Minimal Biological Variability and Measurements of Genotoxicity: Production of Homozygous Diploid Zebra Fish. Natl. Cancer Inst. Monogr. 65:53-58.
Sulston, J. et al. (1992).  “The C. elegans genome sequencing project: a beginning.”  Nature 356:37-41.
Summerton, J. and D. Weller (1997).  “Morpholino antisense oligomers: design, preparation, and properties.”  Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7:187-195.
Summerton, J. et al. (1997).  “Morpholino and phosphorothioate antisense oligomers compared in cell- free and in-cell systems.”  Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7:63-70.
Talbot, W.S. and N. Hopkins (2000).  “Zebrafish mutations and functional analysis of the vertebrate genome.”  Genes Dev 14:755-762.
Tsang, M. et al. (2002).  “Identification of Sef, a novel modulator of FGF signalling.”  Nat Cell Biol 4:165-169.
Venter, J.C. et al. (2001).  “The sequence of the human genome.”  Science 291:1304-1351.
Vijaya, S. et al. (1986).  “Acceptor sites for retroviral integrations map near DNase I- hypersensitive sites in chromatin.”  J Virol 60:683-692.
Weil, C.F. and R. Kunze (2000).  “Transposition of maize Ac/Ds transposable elements in the yeast Saccharomyces cerevisiae.”  Nat Genet 26:187-190.
Westerfield, M. (2000).  The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of Zebrafish (Danio rerio), 4th ed., University of Oregon Press, Eugene.
Wienholds, E. et al. (2002).  “Target-Selected Inactivation of the Zebrafish rag1 Gene.”  Science 297:99-102.
Yee, J.K. et al. (1994).  “A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes.”  Proc Natl Acad Sci USA 91:9564-9568.
Zabner, J. et al. (1994).  “Safety and efficacy of repetitive adenovirus-mediated transfer of CFTR cDNA to airway epithelia of primates and cotton rats.”  Nature Genetics 6:75-83.
Zhang, G. et al. (1996).  “An enhanced green fluorescent protein allows sensitive detection of gene transfer in mammalian cells.”  Biochem Biophys Res Commun 227:707-711.
Zuckermann, R.N. (1994). “Discovery of nanomolar ligands for 7-transmembrane G-protein-coupled receptors from a diverse N-(substituted)glycine peptoid library.”  J. Med. Chem. 37:2678-2685.
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、本発明に従って作製された構築体を示す図である。図１Ａは、５’と３’のＤｓシス要求配列（それぞれ、２５０ｂｐおよび３７０ｂｐ）の間に挿入された、３．１ｋｂのレポーター断片（ゼブラフィッシュケラチン８プロモーター下のＥＧＦＰ遺伝子）を担持するＤｓドナー構築体を示す図である。黒色矢印は、切り出しＰＣＲ用のプライマーを示し、灰色矢印はＴＡＩＬ−ＰＣＲ用の特異的プライマーを示す。図１Ｂは、インビトロ転写用のＳＰ６プロモーター、合成核局在化シグナルに融合させた切断Ａｃトランスポゼース（ＴＰアーゼ１０３〜８０７）のコード配列を含有するＴＰアーゼ構築体を示す図である。点線は、アフリカツメガエルのβ−グロビン遺伝子の５’および３’−ＵＴＲを表す。図１Ｃは、ＮＬＳ−、ＮＬＳＫ５Ｅ−、およびＮｏＮＬＳ−ＴＰアーゼのＮ末端アミノ酸配列を示す図である。ＮＬＳシグナルは、太活字で強調してある。ＮＬＳの配列は、配列番号２である。ＮＬＳに関して示される完全アミノ酸配列は、配列番号２０のアミノ酸残基１〜１５によって示されている。ＮＬＳＫ５Ｅの配列は、配列番号９である。ＮＬＳＫ５Ｅに関して示される完全アミノ酸配列は、配列番号４４のアミノ酸残基１〜１５によって示されている。ＮｏＮＬＳの配列は、配列番号３１であり、ＴＰアーゼ１０３〜８０７の最初の４アミノ酸残基、例えば、配列番号２０のアミノ酸残基１２〜１５を表している。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、Ｄｓ因子のＴＰアーゼ特異的切り出しおよび挿入を示す図である。図２Ａは、Ｄｓ切り出しアッセイを示す図である。ゼブラフィッシュ胚は、Ｄｓ構築体とＮｏＮＬＳ−、ＮＬＳＫ５Ｅ−、およびＮＬＳ−ＴＰアーゼＲＮＡ（レーン２、３および４に対応）およびＤｓ構築体のみ（レーン１）を注入された。注入１０時間後に注入された胚からＤＮＡを単離し、Ｄｓドナー部位にフランクするプライマーを用いたＰＣＲに供した。（Ｍ）１ｋｂ  ＤＮＡラダー（ＮＥＢ）。図２Ｂは、２種の異なるドナーベクターからの優勢切り出しフットプリントを示す図である。フランキングドナーベクターの欠失した、および変化したヌクレオチドは、それぞれ、太活字または下線にしてある。小文字は、Ｄｓ配列の境界を示す。ドナー１の切り出し前に関して、ヌクレオチド配列は、包含的にヌクレオチド２９から３９１７の配列番号１に示された配列である。ドナー１の切り出し後に関して、上列の配列は、配列番号３に示された配列であり、下列の配列は、配列番号４に示された配列である。ドナー２の切り出し前に関して、Ｄｓの５’のヌクレオチド配列は、配列番号６８であり、Ｄｓの３’のヌクレオチド配列は、配列番号６９である。「Ｄｓ」配列は、包含的にヌクレオチド５４からヌクレオチド３８９２の配列番号１に示された配列である。ドナー２の切り出し後に関して、上列の配列は、配列番号５に示された配列であり、下列の配列は、配列番号６に示された配列である。図２Ｃは、２種の異なる遺伝子導入Ｆ１魚のＤｓ挿入部位にフランクする配列の代表例を示し、特異的転移機序を示す図である。Ｄｓ末端配列は小文字で示され、フランキング配列は大文字で示されている。古典的８ｂｐ直接的標的重複は、太活字で下線が引いてある。上列におけるＤｓの５’の配列は、配列番号３２で示された配列であり、上列におけるＤｓの３’の配列は、配列番号３３で示された配列である。下列におけるＤｓの５’の配列は、配列番号３４で示された配列であり、下列におけるＤｓの３’の配列は、配列番号３５で示された配列である。「Ｄｓ」配列は、包含的にヌクレオチド５４からヌクレオチド３８９２の配列番号１に示された配列である。
【図３】図３Ａ〜３Ｆは、ＴＰアーゼの細胞内局在化に及ぼす種々のＮＬＳ配列の効果を示す図である。図３Ａ〜３Ｃは、ＮｏＮＬＳ−ＴＰアーゼ、ＮＬＳＫ５Ｅ−ＴＰアーゼおよびＮＬＳ−ＴＰアーゼゼブラフィッシュ上皮細胞のＧＦＰタグ化型の細胞成分局在化を示す図である。写真は細胞の輪郭を強調するために露出過度にした。図３Ｄ〜３Ｆは、ゼブラフィッシュ上皮細胞におけるＮｏＮＬＳ−、ＮＬＳＫ５Ｅ−およびＮＬＳ−ＥＧＦＰ融合タンパク質の細胞内局在化を示す図である。
【図４】図４は、Ｆ１魚におけるＤｓコピー数の評価を示す図である。個々のＦ１魚をｗｔと異系交配し、１２のランダムに選択したＧＦＰ陽性胚のＤＮＡをサザンブロット解析のために用いた。ＤＮＡサンプルをＥｃｏＲＩで消化し（Ｄｓ構築体は単一ＥｃｏＲＩ部位を含有する）、ＥＧＦＰ配列に関するＤＩＧ標識プローブとハイブリダイズさせた。（レーン１〜４）同一ファミリーからの４種の異なるＦ１魚の子孫（同一始祖魚Ｆ０由来）、（レーン５〜１１）異なるファミリーからのＦ１魚の子孫（異なるＦ０始祖魚由来）、（レーン２）ＧＦＰ陰性対照。
【図５】図５は、ゲノムＤｓ挿入体の転移を示す図である。上部：皮膚上皮および腸管に同等の弱いＧＦＰ発現パターンを示している、ゲノムにおける単一のＤｓ挿入を有する模倣物注入遺伝子導入魚。中央：脳、脊髄、耳、筋肉、生殖腺領域に異所性ＧＦＰ発現を示し、皮膚に斑入りモザイク発現を示している（コピー数の増加によると推定される）、ＴＰアーゼＲＮＡを注入した同じＤｓ挿入体を担持する魚の代表例。下部：Ｆ１世代の中で見られた新規発現パターンの例−脊索における発現は対照には存在しない。さらに、対照魚の皮膚上の点線パターンは、Ｆ１魚に存在せず、ドナーＤｓコピーが転移中に失われることを示している。
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、転移したＨＥＫ２９３細胞の３例におけるＤｓの解析結果を示す図である。図６Ｂに示された「Ｄｓ」配列は、包含的にヌクレオチド１７からヌクレオチド４８１９の配列番号７０に示された配列である。これら３例におけるＤｓ（小文字）は、Ｄｓ末端配列に直に隣接した最初のヌクレオチドから始まるヒトＤＮＡ（大文字）（ドナーのベクターＤＮＡではない）によりフランクされている。これは、Ｄｓが、トランスポゼース媒介機序によってヒトゲノム内に組み込まれたことを示している。ＤＮＡ２の場合、挿入部位は、ｈＡＴトランスポゾンが新規位置に組み込まれる際にしばしば作出される古典的８ｂｐ直接的反復によって囲まれている。
【図１】
2008545391.tif 000019
【図２】
2008545391.tif 000020
【図３】
2008545391.tif 000021
【図４】
2008545391.tif 000022
【図５】
2008545391.tif 000023
【図６−Ａ】
2008545391.tif 000024
【図６−Ｂ】
2008545391.tif 000025
【図６−Ｃ】
2008545391.tif 000026
【配列表】
2008545391000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成20年5月14日(2008.5.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008545391000001.app
【国際調査報告】
2008545391.tif 000075
2008545391.tif 000076
2008545391.tif 000077
2008545391.tif 000078