(57)【要約】  マイトジェン活性化キナーゼタンパク質（ＭＡＰＫ）の新規なリン酸化部位が見出された。このリン酸化部位においてリン酸化されたＭＡＰＫは、ＭＡＰＫにより媒介される病態の診断マーカーとして使用することができる。
2008545434.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位にリン酸化残基を含むＭＡＰＫタンパク質、または該リン酸化残基を含む該タンパク質の断片
｛ここで、
・該異なるリン酸化部位は、マウスｐ３８αアイソフォームの１２３番のトレオニン残基（Ｔｈｒ１２３）、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にある、リン酸化に感受性のアミノ酸残基であり、かつ、
・該異なるリン酸化部位におけるリン酸化により、該ＭＡＰＫタンパク質の活性化およびその基質に対する活性が妨げられる｝、および
ｂ）ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位、または該リン酸化部位周辺の領域に負電荷またはかさ高い残基を含むＭＡＰＫタンパク質、または該リン酸化残基を含む該タンパク質の断片
｛ここで、
・該異なるリン酸化部位は、マウスｐ３８αアイソフォームの１２３番のトレオニン残基（Ｔｈｒ１２３）、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にある、リン酸化に感受性のアミノ酸残基であり、かつ、
・該リン酸化部位、または該リン酸化部位周辺の領域における負電荷またはかさ高い残基の導入により、該ＭＡＰＫタンパク質の活性化およびその基質に対する活性が妨げられる｝
から選択される、ＭＡＰＫタンパク質。
【請求項２】
前記ＭＡＰＫタンパク質が、種に関わらずＥＲＫ、ＪＮＫおよびｐ３８タンパク質キナーゼ、ならびにそれらの各アイソフォームから選択されるものである、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記ＭＡＰＫタンパク質が哺乳類のｐ３８である、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記ＭＡＰＫタンパク質がマウスｐ３８αアイソフォームであり、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するものである、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記ＭＡＰＫタンパク質が、
・式（Ｉ）：
Ｔｈｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ      （Ｉ）
［式中、
Ｔｈｒはトレオニンであり、
Ｔｙｒはチロシンであり、
Ｘａａはアミノ酸、好ましくは、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシンおよびプロリンから選択されるアミノ酸の残基である］
のアミノ酸三つ組残基を含む活性化セグメント；および
・式（ＩＩ）：
Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ      （ＩＩ）
［式中、
Ｓｅｒはセリンであり、
Ｇｌｕはグルタミン酸であり、
Ｇｌｙはグリシンである］
のアミノ酸三つ組残基を含む活性化セグメント
から選択される活性化セグメントを含んでなるものである、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項６】
配列番号２で示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項７】
活性なＭＡＰＫにより媒介される病態の診断における、または該病態を発症する被検体のリスクもしくは疾病素因を判定するための、または該病態を有する被検体に施された療法の効果を評価もしくはモニタリングするための、または該病態の病期もしくは重篤度および／または進行を分析するための、ならびに該病態の治療に有用な可能性のある化合物の同定における、請求項１に記載のタンパク質の使用。
【請求項８】
活性なＭＡＰＫにより媒介される前記病態が、癌、心疾患、感染性疾患、神経細胞疾患、肺疾患および炎症性疾患を含む、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
被検体において活性なＭＡＰＫにより媒介される病態を検出するための、または該病態を発症する被検体のリスクもしくは疾病素因を分析するためのin vitro法であって、
ａ）該被検体からの生体サンプルにおいて、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＭＡＰＫタンパク質を検出し、かつ／またはそのレベルを定量すること、および
ｂ）そのレベルを対照サンプルのレベルと比較すること
を含んでなり、そのレベルが対照サンプルのレベルよりも低い場合に、活性なＭＡＰＫにより媒介される前記病態を発症する被検体のリスクが示される、方法。
【請求項１０】
活性なＭＡＰＫにより媒介される病態を有する被検体に施された療法の効果を評価もしくはモニタリングするための、または活性なＭＡＰＫにより媒介される病態の病期もしくは重篤度および／または進行を分析するためのin vitro法であって、
ａ）該被検体からの生体サンプルにおいて、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＭＡＰＫタンパク質を検出し、かつ／またはそのレベルを定量すること、および
ｂ）そのレベルを同じ被検体からの対照サンプルのレベルと比較すること
を含んでなる、方法。
【請求項１１】
活性なＭＡＰＫタンパク質により媒介される病態の治療に有用な可能性のある化合物を同定するためのin vitro法であって、
ａ）候補化合物をＭＡＰＫタンパク質と接触させること、および
ｂ）該ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位におけるＭＡＰＫタンパク質のリン酸化を検出すること、および
ｃ）該リン酸化部位が、（ｉ）用いたＭＡＰＫタンパク質がマウスｐ３８αアイソフォームであった場合にはそのＴｈｒ１２３であるかどうか、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にある、リン酸化に感受性のアミノ酸残基であるかどうか、および（ｉｉ）該異なるリン酸化部位におけるリン酸化により該ＭＡＰＫタンパク質の活性化が妨げられるかどうかを分析すること、
を含んでなるか、あるいは、
ｉ）該ＭＡＰＫタンパク質をリン酸化し得る化合物または該リン酸化の効果を模倣する化合物から選択される候補化合物をＭＡＰＫタンパク質と接触させること、
ｉｉ）該ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントのリン酸化部位におけるＭＡＰＫタンパク質のリン酸化を検出して、ＭＡＰＫの活性化に対する候補化合物の効果を測定するか、または該ＭＡＰＫタンパク質上でリン酸化を模倣する効果を検出して、ＭＡＰＫの活性化に対する候補化合物の効果を測定すること、
ｉｉｉ）候補化合物の存在下で基質に対するＭＡＰＫタンパク質の活性を分析して、競合化合物の存在下におけるその基質に対するＭＡＰＫタンパク質のドッキングおよび／または活性の阻害を調べること、ならびに
ｉｖ）（ｉ）マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３（用いたＭＡＰＫタンパク質が該タンパク質であった場合）におけるリン酸化部位が候補化合物によって影響を受けるかどうか、および（ｉｉ）該リン酸化部位におけるリン酸化により該ＭＡＰＫタンパク質の活性化が妨げられるかどうかを分析すること、
を含んでなる、方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＭＡＰＫタンパク質と結合することができ、かつ／または請求項１〜６のいずれか一項に記載のＭＡＰＫタンパク質を検出することができる、化合物。
【請求項１３】
抗体；または
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＭＡＰＫタンパク質と結合することができる化合物であって、マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にあるアミノ酸残基において該ＭＡＰＫタンパク質と結合し、該化合物がリン酸化部位Ｔｈｒ１２３で会合すると、その活性化セグメントでのＭＡＰＫタンパク質のリン酸化が低下し、それによりその活性化および／またはその基質に対する活性が妨げられる、化合物；または
ｐ３８のドッキング領域と結合することができ、その領域において負電荷の導入を模倣することができる化合物であって、マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３もしくはその周辺領域、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にあるアミノ酸残基において負電荷またはかさ高い残基を導入し、該化合物がリン酸化部位Ｔｈｒ１２３またはＴｈｒ１２３の周辺領域で会合すると、ＭＡＰＫタンパク質の活性化が妨げられる、化合物；または
ｐ３８のドッキング領域と結合することができ、その領域において負電荷の導入を模倣することができる化合物であって、マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にあるアミノ酸残基において負電荷またはかさ高い残基を導入し、該化合物がリン酸化部位Ｔｈｒ１２３で会合すると、その基質に対するＭＡＰＫタンパク質の活性が損なわれる化合物
である、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
前記抗体が、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むエピトープと結合し得る抗体である、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
活性なＭＡＰＫにより媒介される病態を発症する被検体のリスクもしくは疾病素因を分析するための、または該病態を有する被検体に施された療法の効果を評価もしくはモニタリングするための、または該病態の病期もしくは重篤度および／または進行を分析するための、ならびに該病態の治療に有用な可能性のある化合物の同定における、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項１６】
（ｉ）ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位をリン酸化する化合物をコードする核酸配列（該異なるリン酸化部位は、マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にある、リン酸化に感受性のアミノ酸残基であり、該異なるリン酸化部位におけるリン酸化により、該ＭＡＰＫタンパク質の活性化が妨げられる）、または
（ｉｉ）ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位におけるリン酸化を妨げる化合物をコードする核酸配列、または
（ｉｉｉ）ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位をリン酸化する化合物（該異なるリン酸化部位は、マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にある、リン酸化に感受性のアミノ酸残基であり、該異なるリン酸化部位におけるリン酸化により、該ＭＡＰＫタンパク質の活性化が妨げられる）、または
（ｉｖ）ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位におけるリン酸化を妨げる化合物
を含んでなる、ベクター。
【請求項１７】
治療上有効な量の、
（ｉ）ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位をリン酸化する化合物であって、該異なるリン酸化部位がマウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にあるリン酸化に感受性のアミノ酸残基であり、該異なるリン酸化部位におけるリン酸化により該ＭＡＰＫタンパク質の活性化が妨げられる、化合物；または
（ｉｉ）ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位においてリン酸化を模倣する化合物であって、該異なるリン酸化部位がマウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にあるリン酸化に感受性のアミノ酸残基であり、該異なるリン酸化部位におけるリン酸化により該ＭＡＰＫタンパク質の活性化が妨げられる、化合物；または
（ｉｉｉ）ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位においてリン酸化を阻害する化合物；または
（ｉｖ）請求項１６に記載のベクター；または
（ｖ）請求項１〜６のいずれか一項に記載のＭＡＰＫタンパク質と結合することができる化合物であって、マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にあるアミノ酸残基においてＭＡＰＫタンパク質と結合し、該化合物がリン酸化部位Ｔｈｒ１２３で会合すると、その活性化セグメントでのＭＡＰＫタンパク質のリン酸化が低下し、それによりその活性化および／またはその基質に対する活性が妨げられる、化合物；または
（ｖｉ）ｐ３８のドッキング領域と結合することができ、その領域において負電荷の導入を模倣することができる化合物であって、マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３もしくはその周辺領域、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にあるアミノ酸残基において負電荷またはかさ高い残基を導入し、該化合物がリン酸化部位Ｔｈｒ１２３またはＴｈｒ１２３の周辺領域で会合すると、ＭＡＰＫタンパク質の活性化が妨げられる、化合物；または
（ｖｉｉ）ｐ３８のドッキング領域と結合することができ、その領域において負電荷の導入を模倣することができる化合物であって、マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にあるアミノ酸残基において負電荷またはかさ高い残基を導入し、該化合物がリン酸化部位Ｔｈｒ１２３で会合すると、その基質に対するＭＡＰＫタンパク質の活性が損なわれる、化合物
を、所望により薬学上許容される担体とともに含んでなる、医薬組成物。
【請求項１８】
キナーゼを含んでなる、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記キナーゼが、ＧＲＫ２キナーゼまたは機能的に活性なその断片である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
活性なＭＡＰＫにより媒介される病態の治療のための医薬組成物の製造における、
（ｉ）ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位をリン酸化する化合物であって、該異なるリン酸化部位がマウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にある、リン酸化に感受性のアミノ酸残基であり、該異なるリン酸化部位におけるリン酸化により該ＭＡＰＫタンパク質の活性化が妨げられる、化合物；または
（ｉｉ）ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位においてリン酸化を模倣する化合物であって、該異なるリン酸化部位がマウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にある、リン酸化に感受性のアミノ酸残基であり、該異なるリン酸化部位におけるリン酸化により該ＭＡＰＫタンパク質の活性化が妨げられる、化合物；または
（ｉｉｉ）ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位においてリン酸化を阻害する化合物；または
（ｉｖ）請求項１６に記載のベクター；または
（ｖ）請求項１〜６のいずれか一項に記載のＭＡＰＫタンパク質と結合することができる化合物であって、マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にあるアミノ酸残基においてＭＡＰＫタンパク質と結合し、該化合物がリン酸化部位Ｔｈｒ１２３で会合すると、その活性化セグメントでのＭＡＰＫタンパク質のリン酸化が低下し、それによりその活性化および／またはその基質に対する活性が妨げられる、化合物；または
（ｖｉ）ｐ３８のドッキング領域と結合することができ、その領域において負電荷の導入を模倣することができる化合物であって、マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３もしくはその周辺領域、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にあるアミノ酸残基において負電荷またはかさ高い残基を導入し、該化合物がリン酸化部位Ｔｈｒ１２３またはＴｈｒ１２３の周辺領域で会合すると、ＭＡＰＫタンパク質の活性化が妨げられる、化合物；または
（ｖｉｉ）ｐ３８のドッキング領域と結合することができ、その領域において負電荷の導入を模倣することができる化合物であって、マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にあるアミノ酸残基において負電荷またはかさ高い残基を導入し、該化合物がリン酸化部位Ｔｈｒ１２３で会合すると、その基質に対するＭＡＰＫタンパク質の活性が損なわれる、化合物
の使用。
【請求項２１】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＭＡＰＫタンパク質、または請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のＭＡＰＫタンパク質と結合し、かつ／またはそれを検出することができる化合物を含んでなる、キット。
【請求項２２】
活性なＭＡＰＫにより媒介される病態の診断のため、または該病態を発症する被検体のリスクもしくは疾病素因を判定するため、または該病態を有する被検体に施された療法の効果を評価もしくはモニタリングするため、または該病態の病期もしくは重篤度および／または進行を分析するため、ならびに該病態の治療に有用な可能性のある化合物の同定において有用な、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記ＭＡＰＫタンパク質が、哺乳類ｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３においてリン酸化された哺乳類ｐ３８キナーゼである、請求項２１または２２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）の新規なリン酸化部位、該リン酸化部位における改変ＭＡＰＫ、およびそれらの適用に関する。
【０００２】
発明の背景
マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）
ＭＡＰＫという用語は、３つのキナーゼカスケード、ＥＲＫ、ＪＮＫおよびｐ３８と、それらの各アイソフォームを含む[Pearson G, et al , 2001 , “Mitogen-activated protein (MAP) kinase pathways: Regulation and Physiological Functions”, Endocrine Reviews 22(2):153-183]。これらのキナーゼにより媒介される細胞作用は数多く、増殖、分裂、分化、運動、浸透圧応答、ストレス応答、炎症、癌など、細胞の生活環全体にわたっている。
【０００３】
ある種の細胞外刺激の検出はＭＡＰＫＫＫと呼ばれる最初のキナーゼに伝達され、この標的が別のキナーゼＭＡＰＫＫのセリンおよびトレオニンである。このリン酸化は、活性化セグメントと呼ばれ、この３モジュール方式のカスケードの最初の標的を有する、限定されたＴ−Ｘａａ−Ｙ三つ組残基または三アミノ酸モチーフ（ここで、Ｔはトレオニンであり、Ｙはチロシンであり、Ｘａａは、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシンまたはプロリンなどのアミノ酸残基である）中のセリン残基とトレオニン残基をリン酸化することによりＭＡＰＫＫの活性化を決定付ける。ＭＡＰＫは、セリンおよびトレオニンにおいて、転写因子、他のキナーゼ、構造エレメントなどのいくつかの基質のリン酸化を担うエフェクターキナーゼである。
【０００４】
ｐ３８
タンパク質ｐ３８ＭＡＰＫ、またはｐ３８は、セリン／トレオニンキナーゼのファミリーに属する酵素であり、紫外線、浸透圧ショック、熱などの外的ストレスシグナルに対する細胞応答に重要な役割を果たしている。このため、このタンパク質はストレス活性化タンパク質キナーゼまたはＳＡＰＫとしても知られている。ｐ３８は他のキナーゼのリン酸化および転写因子の活性化を介して遺伝子発現を制御することにより、また、重要なメッセンジャーＲＮＡの安定性の調節により、その調節の役割を果たしている。
【０００５】
組織が違えば分布が異なり、また、種々のｐ３８阻害剤に対して感受性の異なる４つのｐ３８アイソフォームがあるが、最も研究され、従って最もよく知られているものがαアイソフォームであり、好適な刺激で処理した後に多くの細胞種（造血系組織および非造血系組織の双方）でその活性化が見られている。しかし、このような違いにもかわらず、総てのｐ３８アイソフォームが、細胞シグナル伝達カスケードのｐ３８の上流に見られる酵素であるＭＫＫ６／ＭＫＫ３によりリン酸化される活性化セグメントＴｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒを含む１２のアミノ酸からなる活性化ドメインを持っている。
【０００６】
ｐ３８は、サイトカインおよび炎症プロセスの進行を担う他の分子の産生を媒介し、いくつかの心臓病および炎症現象の場合に細胞ストレスにより誘導される種々の生理状態に、ならびに細胞周期の制御に関わる細胞機能の必須レギュレーターである。
【０００７】
数年にわたって、種々の疾病の発症または進行におけるｐ３８の関与が分析されてきた。心不全の確立および発症におけるｐ３８活性化の重要性はすでに確立されている。大動脈狭窄後の構成的活性化がマウスの実験モデルで、また、高塩含量の食餌を与えた高血圧ラットのモデルで観察されている。ヒトでは、ｐ３８は進行した冠動脈疾患の後に心不全に罹患した心臓で活性化される。いくつかのグループがヒトおよびラットの心筋の末期心不全でｐ３８の活性化の低下を観察していることから、ｐ３８の活性化の調節は心臓病の発症に不可欠なものであると思われる。また、当技術分野の現状では、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を用いることで、炎症性疾患、肺疾患または神経疾患など、心疾患とは異なる他の病態におけるｐ３８ＭＡＰＫの関与も報告されている。これらの病態は総て、それらが活性ｐ３８、すなわち、リン酸化されたＴｈｒ１８０残基およびＴｙｒ１８２残基を有するｐ３８を含むという特徴を持つ。
【０００８】
他方、癌患者に由来する細胞で、化学療法と放射線療法の双方が、腫瘍細胞の死滅を誘導するシグナルに関与すると思われるｐ３８の活性化をもたらすことが観察された。
【０００９】
活性ｐ３８の存在を特徴とする種々の疾病の治療において最も広く普及している戦略は、その活性の薬理学的阻害、またはＷＯ２００５／０３２５５１、ＷＯ２００４／０２１９８８、ＥＰ１５３４２８２もしくはＣＡ２４９７４４８に記載されているようなその活性化の阻害を他の治療薬と組み合わせたものからなる。
【００１０】
ＧＲＫ
Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、心血管系または免疫系の機能に不可欠な役割を果たしている種々のメッセンジャーの作用を媒介する。ヘテロ三量体Ｇタンパク質との相互作用に加え、活性化されたＧＰＣＲはＧタンパク質共役型受容体キナーゼ（ＧＲＫ）およびアレスチンと呼ばれる調節タンパク質とも相互作用する。構造類似性に基づき、ＧＲＫファミリーの７メンバー（ＧＲＫ１〜７）は、ＧＲＫ１、ＧＲＫ２／３、ＧＲＫ４／５／６およびＧＲＫ７の４つのサブファミリーに分類されており、ＧＲＫ２／３とＧＲＫ５／６は生物内で偏在分布している。しかしながら、ＧＰＣＲシグナル伝達を変化させ、これらの病態の誘発および／または進行に寄与する機構は知られていない。
【００１１】
これらのタンパク質は、新たなシグナル伝達経路を開始する他の細胞タンパク質の動員および調節が可能なことに加え、リガンドにより活性化された後の受容体の細胞内機能または動力学の迅速な調整に不可欠な役割を果たすことから、それらはＧＰＣＲにより媒介されるシグナル伝達の不可欠なモジュレーターであるとともにその成分でもある。うっ血性心不全、心肥大、高血圧症または関節リウマチなどの炎症プロセスといった病態において、いくつかのＧＲＫのレベルおよび機能が変更されている。
【００１２】
他方、心筋症および心不全の発症におけるＳＡＰＫの重要な役割が知られ、選択的なＧＰＣＲの活性化が心筋におけるこれらのキナーゼの慢性的活性化を促し、このステップは心室肥大から心不全への進行に不可欠なものであることも知られている。
【発明の開示】
【００１３】
一つの態様において、本発明は、
ａ）ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位にリン酸化残基を含むＭＡＰＫタンパク質、または該リン酸化残基を含む該タンパク質の断片
｛ここで、
・該異なるリン酸化部位は、マウスｐ３８αアイソフォームの１２３番のトレオニン残基（Ｔｈｒ１２３）、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にある、リン酸化に感受性のアミノ酸残基であり、かつ、
・該異なるリン酸化部位におけるリン酸化により、該ＭＡＰＫタンパク質の活性化およびその基質に対する活性が妨げられる｝、および
ｂ）ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位、または該リン酸化部位周辺の領域に負電荷またはかさ高い残基を含むＭＡＰＫタンパク質、または該リン酸化残基を含む該タンパク質の断片
｛ここで、
・該異なるリン酸化部位は、マウスｐ３８αアイソフォームの１２３番のトレオニン残基（Ｔｈｒ１２３）、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にある、リン酸化に感受性のアミノ酸残基であり、かつ、
・該リン酸化部位、または該リン酸化部位周辺の領域における負電荷またはかさ高い残基の導入により、該ＭＡＰＫタンパク質の活性化およびその基質に対する活性が妨げられる｝
から選択される、ＭＡＰＫタンパク質（本明細書では「本発明のＭＡＰＫタンパク質」という場合もある）に関する。
【００１４】
本明細書において「同等位置にある」との用語は、ＭＡＰＫタンパク質のアミノ酸配列の多重アライメントにより、マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３に相当する、ＭＡＰＫタンパク質のアミノ酸の位置を指す。
【００１５】
「ＭＡＰＫタンパク質」との用語は、種にかかわらずＥＲＫ、ＪＮＫおよびｐ３８タンパク質キナーゼ、ならびにそれらの各アイソフォームを含む。これらのキナーゼおよびそれらの機能ならびに細胞作用に関する情報は、Pearson et al [Pearson G , et al., 2001, “Mitogen-activated protein (MAP) kinase pathways: Regulation and Physiological Functions”, Endocrine Reviews 22(2):153-183]が記した総説に見出すことができる。該ＭＡＰＫタンパク質のアミノ酸配列に関する情報は、当業者に公知の好適なデータベース（例えば、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ、ＮＣＢＩなど）に見出すことができる。ＭＡＰＫキナーゼは様々な種に広く分布しており、それらの基本構造は種々のファミリー（ＥＲＫ、ＪＮＫおよびｐ３８）の種々のメンバー間で広く保存されている。
【００１６】
ＭＡＰＫタンパク質はとりわけ、好適なキナーゼによりリン酸化を受けやすい少なくとも１つの残基を含む活性化セグメントの存在を特徴とする。
【００１７】
特定の実施態様では、該活性化セグメントは式（Ｉ）：
Ｔｈｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ      （Ｉ）
［式中、
Ｔｈｒはトレオニンであり、
Ｔｙｒはチロシンであり、
Ｘａａはアミノ酸残基である］
のアミノ酸三つ組残基を含む。
【００１８】
特定の実施態様では、Ｘａａはアスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシンおよびプロリンから選択されるアミノ酸残基である。
【００１９】
特定の哺乳類ｐ３８αアイソフォームの場合では、この活性化セグメントはそのアミノ酸配列の１８０〜１８２番に式（Ｉ）のアミノ酸三つ組残基を含む。
【００２０】
もう１つの特定の実施態様では、該活性化セグメントは式（ＩＩ）：
Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ      （ＩＩ）
［式中、
Ｓｅｒはセリンであり、
Ｇｌｕはグルタミン酸であり、
Ｇｌｙはグリシンである］
のアミノ酸三つ組残基を含む。
【００２１】
本発明の一つの実施態様では、本発明のＭＡＰＫタンパク質は、ＥＲＫ、ＪＮＫおよびｐ３８キナーゼから選択される。例として、特定の実施態様では、本発明のＭＡＰＫタンパク質はｐ３８である。ｐ３８キナーゼは様々な種に広く分布しており、その基本構造は広く保存されている（図１０）。特定の実施態様では、ｐ３８は、例えばヒト、齧歯類などの哺乳類のｐ３８であり、そのアイソフォーム（ａ、β、γまたはδ）のいずれであってもよい。特定の実施態様では、該ｐ３８はマウスｐ３８のαアイソフォーム（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）であり、そのアミノ酸配列は配列番号１で示されている（ＧｅｎＢａｎｋ，受託番号Ｐ４７８１１）。
【００２２】
本発明者らは、驚くべきことに、ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なる、リン酸化を受けやすい部位におけるＭＡＰＫタンパク質のリン酸化がＭＡＰＫタンパク質の活性を阻害することができることを見出した。ここで、ＭＡＰＫタンパク質の活性化は、既知のように、また、すでに示したように、該活性化セグメント、例えば特に前記アミノ酸三つ組残基に存在するリン酸化を受けやすい残基（例えば、トレオニンまたはチロシン）のリン酸化を介して生じる。
【００２３】
実際、本発明者らが行った研究では、マウスｐ３８αアイソフォームの１２３番のトレオニン残基（Ｔｈｒ１２３）のリン酸化が、該ｐ３８の活性化セグメントに存在する式（Ｉ）のアミノ酸三つ組残基のそれぞれ１８０番および１８２番に存在するトレオニン残基およびチロシン残基のリン酸化を妨げることが明らかに示された。結果として、ｐ３８は活性化できず、従って、シグナル伝達カスケードにおいてその機能を果たすことができず、これはこの細胞シグナル伝達カスケードにおけるＭＡＰＫの活性化が関与する疾病の治療に特に有用であり得る。
【００２４】
当業者ならば、この新規なリン酸化部位におけるリン酸化だけでなく、新たなリン酸化部位またはその部位の周辺領域に負電荷またはかさ高い残基を導入しても、ＭＡＰＫタンパク質の活性化およびその基質に対する活性を妨げる作用が生じ得ることが理解できるであろう。
【００２５】
よって、本発明は、ＭＡＰＫタンパク質に存在する、ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なる、マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にある、リン酸化に感受性のアミノ酸残基など、一度リン酸化されると該ＭＡＰＫタンパク質の活性化を阻害することができるという特性を有する、新規なリン酸化部位の存在を教示するものである。
【００２６】
上述の異なるリン酸化部位の具体的な位置は対象とするＭＡＰＫタンパク質（ＥＲＫ、ＪＮＫまたはｐ３８）、そのアイソフォーム、および動物種によって異なるが、そのリン酸化後（または該リン酸化部位もしくは該部位の周辺領域に負電荷もしくはかさ高い残基を導入した後）の対象とするＭＡＰＫタンパク質の活性化を阻害する機能も、その位置的等価性や一致性も変わらない。これまでに述べた位置的特徴および機能的特徴を備えたリン酸化部位を含むＭＡＰＫタンパク質は本発明の範囲内に含まれる。よって、本発明のＭＡＰＫタンパク質は、Ｔｈｒ１２３においてリン酸化されたマウスｐ３８タンパク質αアイソフォームを含むだけでなく、そのオーソログタンパク質、すなわち、共通の祖先遺伝子から生じ、様々な種で同じ機能を果たすタンパク質、ならびにそれらのアイソフォームおよびリン酸化部位がこの位置（Ｔｈｒ１２３）にあるか別の異なる位置にあるか、また、リン酸化アミノ酸がトレオニンと違うアミノ酸であるかにかかわらず、ＭＡＰＫタンパク質群に含まれる他のキナーゼ（ＥＲＫおよびＪＮＫ）も含む。
【００２７】
さらに、本発明のＭＡＰＫタンパク質はまた、新規なリン酸化部位または該部位の周辺領域に負電荷またはかさ高い残基を有する改変ＭＡＰＫタンパク質、例えば、Ｔｈｒ１２３または該部位の周辺領域に負電荷またはかさ高い残基を含む改変型マウスｐ３８タンパク質αアイソフォーム、そのオーソログタンパク質だけでなく、それらのアイソフォームおよび負電荷またはかさ高い残基がこの位置（Ｔｈｒ１２３）にあるか別の異なる位置にあるか、また、改変アミノ酸がトレオニンと違うアミノ酸であるかにかかわらず、ＭＡＰＫタンパク質群に含まれる他のキナーゼ（ＥＲＫおよびＪＮＫ）も含む。本発明によれば、該新規なリン酸化部位または該部位の周辺領域に導入可能な負電荷の限定されない例は当業者には明らかであり、例えば、負電荷を提供し得るいずれの分子または化合物であってもよく、例えば、リン酸基を有するペプチドが挙げられ、このペプチドは該リン酸部位またはその周辺領域に結合し、その部位においてリン酸化の効果を模倣することができる。本発明によれば、該新規なリン酸化部位または該部位の周辺領域に導入可能なかさ高い残基の限定されない例は当業者には明らかであり、例えば、該リン酸部位またはその周辺領域に結合し、その部位においてリン酸化の効果を模倣することができるいずれの分子であってもよく、例えばペプチドまたは低分子量化合物が挙げられ、本発明者らは特定の理論に縛られるものではないが、このような該かさ高い残基は、ＭＡＰＫタンパク質の活性化およびその基質に対する活性を妨げるＭＡＰＫタンパク質のコンフォメーション変化を生じ得ると考えられる。本明細書において、（新規な）リン酸化部位の周辺領域」とは、負電荷またはかさ高い残基によりそこに導入された改変が該ＭＡＰＫタンパク質の活性化およびその基質に対する活性を妨げるようなリン酸化部位周囲の領域を意味する。ＭＡＰＫタンパク質の活性化およびその基質に対する活性を妨げるまたは阻害する作用を判定する好適なアッセイは添付の実施例で示されているので、当業者ならばその情報を用いてこのような「リン酸化部位の周辺領域」を特定することができる。
【００２８】
特定の実施態様では、本発明のＭＡＰＫタンパク質は、ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位にリン酸化残基を含むＭＡＰＫタンパク質の断片であり、ここで、従前に述べたように、該異なるリン酸化部位は、マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にある、リン酸化に感受性のアミノ酸残基であり、該異なるリン酸化部位におけるリン酸化により、該ＭＡＰＫタンパク質の活性化が妨げられる。
【００２９】
該断片の長さは幅広い範囲で異なり得るが、例えば、３〜３０の間のアミノ酸残基、一般には５〜２５の間のアミノ酸残基、好ましくは１０〜２０の間のアミノ酸残基である。しかしながらやはり、所望により、この断片はより多数のアミノ酸残基を含み得る。有利には、この断片は本発明のＭＡＰＫタンパク質のエピトープを含む。特定の実施態様では、該断片は、エピトープＱＫＬｐＴＤＤＨＶＱＦＬＩＹ（ここで、「ｐＴ」はリン酸化されたＴｈｒ１２３残基を表し、残りの文字はマウスｐ３８キナーゼαアイソフォームの一文字コードに基づくアミノ酸表記を示す）に相当する配列番号２を含んでなる。該エピトープは進化を経て保存性が高いことから、該配列番号２は種々の種のｐ３８のオーソログタンパク質間の該エピトープのコンセンサス配列であるとみなすことができる。
【００３０】
もう１つの特定の実施態様では、本発明のＭＡＰＫタンパク質は、ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位（または該部位の周辺領域）に負電荷またはかさ高い残基を含むＭＡＰＫタンパク質の断片であり、ここで、従前に述べたように、該異なるリン酸化部位は、マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にある、リン酸化に感受性のアミノ酸残基であり、該異なるリン酸化部位における改変（負電荷またはかさ高い残基）により該ＭＡＰＫタンパク質の活性化が妨げられる。該断片の長さは幅広い範囲で異なり得るが、例えば、３〜３０の間のアミノ酸残基、一般には５〜２５の間のアミノ酸残基、好ましくは１０〜２０の間のアミノ酸残基である。しかしながらやはり、所望により、この断片はより多数のアミノ酸残基を含み得る。有利には、この断片は本発明のＭＡＰＫタンパク質のエピトープを含む。
【００３１】
ＭＡＰＫ活性化が関与している病態がいくつか知られている。非限定例を挙げれば、種々の疾病と活性なｐ３８、すなわち、活性化セグメントに存在するリン酸化残基において、例えば、哺乳類（マウス）ｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１８０残基およびＴｙｒ１８２残基においてリン酸化されているｐ３８との間に存在する関係が知られている。従って、ＭＡＰＫの活性化が、本発明で特定されるＭＡＰＫの新規なリン酸化部位または新規なリン酸化部位の周辺領域におけるリン酸化、または負電荷もしくはかさ高い残基の導入（例えば、Ｔｈｒ１２３におけるリン酸化は、哺乳類（マウス）ｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１８０およびＴｙｒ１８２残基におけるリン酸化を妨げる）により妨げられ得る（ＭＡＰＫの活性化セグメントに存在するリン酸化部位におけるリン酸化を妨げる）という事実、そしてまた、Ｔｈｒ１２３またはＴｈｒ１２３の周辺領域におけるリン酸化または負電荷もしくはかさ高い残基の導入はｐ３８のその基質に対するドッキングおよび活性を妨げ得るという事実は重要な生物学的意味を持ち、これはとりわけ活性なＭＡＰＫにより媒介される病態の診断において、または該病態を発症する被検体のリスクもしくは疾病素因を判定するために、または該病態を有する被検体に施された療法の効果を評価もしくはモニタリングするために、または該病態の病期もしくは重篤度および／または進行を分析するために、ならびに該病態の治療に有用な可能性のある化合物の同定において有用である。本発明のＭＡＰＫタンパク質はこの意味で重要な役割を果たし得る。
【００３２】
「被検体」との用語は、ヒトを含む動物種のいずれのメンバーも含み、例を挙げれば、該被検体はヒト、家庭内動物、齧歯類などの哺乳類、好ましくは年齢や人種を問わず男性および女性のヒトであり得る。
【００３３】
本明細書において「活性なＭＡＰＫにより媒介される病態」との用語は、活性なＭＡＰＫ、すなわち、活性化セグメントに存在するリン酸化残基においてリン酸化されたＭＡＰＫが関与する、または役割を果たす病態を含む。活性なＭＡＰＫにより媒介される病態の非限定例としては、癌、心疾患、感染性疾患、神経細胞疾患（neuronal disease）、肺疾患および炎症性疾患が挙げられる。該疾病の非限定としては、心筋梗塞、心肥大、高血圧症、心筋炎、血管形成術性傷害、心筋不全、ウイルスまたは細菌感染、神経細胞死または他の細胞種の死滅、アルツハイマー病、乾癬、関節リウマチ、自己免疫性神経炎、クローン病、癌（癌腫、白血病、リンパ腫、肉腫など）、血餅形成、化学療法および放射線療法に対する反応、虚血／再潅流に対する応答などが挙げられる。
【００３４】
よって、本発明のＭＡＰＫタンパク質は診断マーカーとして、または活性なＭＡＰＫにより媒介される病態、例えば癌、感染性疾患、神経疾患（nervous disease）、神経細胞疾患（neuronal disease）、肺疾患または炎症性疾患などを発症する被検体の疾病素因マーカーとして有用なタンパク質である。活性なＭＡＰＫの存在が上述の活性なＭＡＰＫにより媒介される病態に不随していることが分かれば、本発明で特定されるリン酸化部位におけるリン酸化、または該リン酸化部位もしくは該部位の周辺領域における負電荷もしくはかさ高い残基の導入は該ＭＡＰＫの活性化を妨げることから、本発明のＭＡＰＫタンパク質が同定されれば、該病態を発症するリスクまたは疾病素因が低いことが示される。特定の実施態様では、本発明のＭＡＰＫタンパク質は、哺乳類ｐ３８の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位においてリン酸化された哺乳類ｐ３８タンパク質、例えば、Ｔｈｒ１２３でリン酸化された哺乳類ｐ３８、または該リン酸化残基を含むタンパク質の断片である。
【００３５】
特定の実施態様では、本発明は、活性なＭＡＰＫにより媒介される病態を発症する被検体のリスクまたは疾病素因を分析するためのin vitro法であって、
ａ）該被検体からの生体サンプルにおいて本発明のＭＡＰＫタンパク質を検出し、かつ／またはそのレベルを定量すること、および
ｂ）そのレベルを対照サンプルのレベルと比較すること
を含んでなり、そのレベルが対照サンプルのレベルよりも低い場合に、活性なＭＡＰＫにより媒介される前記病態を発症する被検体のリスクが示される方法を提供する。
【００３６】
例えば血液、血清、血漿、組織など、被検体由来の実質的にいずれの生体サンプルでも使用可能である。該サンプルは常法により得ることができる。対照サンプルは、活性なＭＡＰＫにより媒介される病態に罹患しておらず、参照値またはベースライン値を含む対照に由来するサンプルである。
【００３７】
本発明のＭＡＰＫタンパク質の検出および／またはレベル（濃度）の定量は、例えば免疫化学法（下記参照）によるなど、当業者に公知の常法により測定することができる。
【００３８】
本発明のＭＡＰＫタンパク質はまた、例えば、癌、心疾患、感染性疾患、神経疾患、神経細胞疾患、肺疾患または炎症性疾患など、活性なＭＡＰＫにより媒介される病態を有する被検体に施された療法の効果を評価またはモニタリングするために使用することもできる。この点で、例えば本発明で特定されるリン酸化部位におけるリン酸化、または該リン酸化部位もしくは該部位の周辺領域における負電荷もしくはかさ高い残基の導入により、ＭＡＰＫの活性化を妨げる処置を行えば、該病態を有する被検体に施された療法の効果を分析し、有効でなければ、治療を改良するか、またはカスタマイズした療法を施すことができるようになる。特定の実施態様では、本発明のＭＡＰＫタンパク質は、哺乳類ｐ３８の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位においてリン酸化された哺乳類ｐ３８タンパク質、例えば、Ｔｈｒ１２３においてリン酸化された哺乳類ｐ３８、または該リン酸化残基を含むタンパク質の断片である。
【００３９】
本発明のＭＡＰＫタンパク質はまた、例えば、癌、心疾患、感染性疾患、神経疾患、神経細胞疾患、肺疾患または炎症性疾患など、活性なＭＡＰＫにより媒介される病態の病期もしくは重篤度および／または進行を分析するために使用することもできる。この点で、本発明のＭＡＰＫタンパク質が同定されれば、この種の病態のより良い進行の指標となる。特定の実施態様では、本発明のＭＡＰＫタンパク質は、哺乳類ｐ３８の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位においてリン酸化された哺乳類ｐ３８タンパク質、例えば、Ｔｈｒ１２３においてリン酸化された哺乳類ｐ３８、または該リン酸化残基を含むタンパク質の断片である。
【００４０】
特定の実施態様では、本発明は、活性なＭＡＰＫにより媒介される病態を有する被検体に施された療法の効果を評価もしくはモニタリングするための、または活性なＭＡＰＫにより媒介される病態の病期もしくは重篤度および／または進行を分析するためのin vitro法であって、
ａ）該被検体からの生体サンプルにおいて本発明のＭＡＰＫタンパク質を検出し、かつ／またはそのレベルを定量すること、および
ｂ）そのレベルを同じ被検体からの対照サンプルのレベルと比較すること
を含んでなる方法を提供する。
【００４１】
両レベル間の比較は、治療の有効性および／または病態の進行の指標となる。この場合において、目的を達成するためには、対照サンプルは、処置を行う前または処置後の期間に、その有効性および病態の進行を分析するために被検体から得たサンプルとされる。
【００４２】
本発明のＭＡＰＫタンパク質の検出および／またはそのレベル（濃度）の定量は、例えば免疫化学法（下記参照）によるなど、当業者に公知の常法により測定することができる。
【００４３】
本発明のＭＡＰＫタンパク質はまた、例えば、癌、心疾患、感染性疾患、神経疾患、神経細胞疾患、肺疾患または炎症性疾患など、活性なＭＡＰＫにより媒介される病態の治療に有用な可能性のある化合物を同定するために使用することもできる。この点で、該ＭＡＰＫの活性化を妨げる化合物は、心疾患、感染性疾患、神経疾患、神経細胞疾患、肺疾患または炎症性疾患の治療に使用することができ、また、被検体に化学療法または放射線療法を行った後にＭＡＰＫを活性化すると腫瘍細胞死を誘導するシグナルがもたらされるので、本発明のＭＡＰＫを脱リン酸化する化合物を癌治療に使用することもできる。特定の実施態様では、本発明のＭＡＰＫタンパク質は、哺乳類ｐ３８の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位においてリン酸化された哺乳類ｐ３８タンパク質、例えば、Ｔｈｒ１２３においてリン酸化された哺乳類ｐ３８、または該リン酸化残基を含むタンパク質の断片、またはＴｈｒ１２３もしくはＴｈｒ１２３領域の周辺領域に化合物が結合し、Ｔｈｒ１２３もしくはＴｈｒ１２３残基の周辺領域においてリン酸の負電荷もしくはかさ高い残基の存在を模倣するｐ３８である。
【００４４】
特定の実施態様では、本発明はＭＡＰＫタンパク質により媒介される病態の治療に有用な可能性のある化合物を同定するin vitro法であって、
ａ）候補化合物をＭＡＰＫタンパク質と接触させること、および
ｂ）該ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位におけるＭＡＰＫタンパク質のリン酸化を検出すること、および
ｃ）該リン酸化部位が、（ｉ）用いたＭＡＰＫタンパク質がマウスｐ３８αアイソフォームであった場合にはそのＴｈｒ１２３であるかどうか、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にある、リン酸化に感受性のアミノ酸残基であるかどうか、および（ｉｉ）該異なるリン酸化部位におけるリン酸化により該ＭＡＰＫタンパク質の活性化が妨げられるかどうかを分析すること、
を含んでなるか、あるいは、
ｉ）候補化合物（例えば、該ＭＡＰＫタンパク質をリン酸化し得る化合物または該リン酸化の効果を模倣する化合物）をＭＡＰＫタンパク質と接触させること、
ｉｉ）該ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントのリン酸化部位におけるＭＡＰＫタンパク質のリン酸化を検出して、ＭＡＰＫの活性化に対する候補化合物の効果を測定するか、または該ＭＡＰＫタンパク質上でリン酸化を模倣する効果を検出して、ＭＡＰＫの活性化に対する候補化合物の効果を測定すること、
ｉｉｉ）候補化合物の存在下で基質に対するＭＡＰＫタンパク質の活性を分析して、競合化合物の存在下におけるその基質に対するＭＡＰＫタンパク質のドッキングおよび／または活性の阻害を調べること、ならびに
ｉｖ）（ｉ）マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３（用いたＭＡＰＫタンパク質が該タンパク質であった場合）におけるリン酸化部位が候補化合物によって影響を受けるかどうか、および（ｉｉ）該リン酸化部位におけるリン酸化により該ＭＡＰＫタンパク質の活性化が妨げられるかどうかを分析すること、
を含んでなる方法を提供する。
【００４５】
この候補化合物は、特定の実施態様では、ＭＡＰＫタンパク質と接触した際に、ＭＡＰＫタンパク質をリン酸化し得る化合物（例えば、キナーゼなど）または該リン酸化の効果を模倣する化合物であり得る。競合化合物は、特定の実施態様では、ＭＡＰＫタンパク質をリン酸化し得る化合物（例えば、キナーゼなど）であり得る。
【００４６】
タンパク質のリン酸化ならびにＭＡＰＫタンパク質上でリン酸化を模倣する効果の判定は、当業者に公知の常法で行うことができる。タンパク質のリン酸化状態、またはある特定のタンパク質においてリン酸化されているアミノ酸残基を決定するためには種々のアッセイが知られており、例えば、放射標識ＡＴＰを用いたin vitroキナーゼ活性アッセイ、このようにしてリン酸化および標識されたタンパク質の二次元電気泳動（あるタンパク質において多くのアミノ酸残基がどのようにリン酸化されているか分析することができる）、リン酸化状態を測定するタンパク質を予め精製したものに対する質量分析、指定突然変異誘発とその後の精製タンパク質を用いたin vitroキナーゼ活性アッセイ、トリプシン消化後のリン酸化タンパク質の二次元分離を含むホスホ−ペプチド分析、またはリン酸化されているタンパク質のアミノ酸残基またはエピトープを特異的に認識する該タンパク質の抗体に使用を意図した、技術的には最も単純なウエスタンブロットが挙げられる。タンパク質中のリン酸化残基を検出する技術は当業者により広く知られており、当技術分野の水準に含まれる。
【００４７】
特定の実施態様では、該ＭＡＰＫタンパク質は哺乳類ｐ３８などのｐ３８キナーゼであり、リン酸化は該哺乳類ｐ３８αアイソフォームに存在するＴｈｒ１２３残基で行われる。
【００４８】
別の態様では、本発明は、本発明のＭＡＰＫタンパク質と結合することができ、かつ／または本発明のＭＡＰＫタンパク質を検出することができる化合物に関する。特定の実施態様では、該化合物は、本発明のＭＡＰＫタンパク質と結合し、かつ／または検出することができる抗体である。
【００４９】
本明細書において［抗体」との用語は、キメラまたは組換え抗体、ならびにモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、またはＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）２フラグメントなどのそのタンパク質分解フラグメントを含むものとする。さらに、この抗体の可変領域をコードするＤＮＡを他の抗体に挿入し、このようにしてキメラ抗体を作製することができる。単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、抗原と結合し、免疫グロブリンの軽鎖および重鎖可変領域と相同または類似のアミノ酸配列対（ＶＨ−ＶＬまたはｓｃＦｖ結合）を含む抗体の特徴的な能力を有する単純な鎖から形成されたポリペプチドであり得る。抗体の軽鎖および重鎖可変領域と類似のポリペプチドは、それが望ましければ、リンカーペプチドを介して結合することができる。抗体の作製方法は当業者に周知であり、当技術分野の水準に含まれる。
【００５０】
例を挙げれば、本発明により提案される抗体は、本発明のＭＡＰＫタンパク質に存在するエピトープと結合し、かつ／またはそれを検出することができる抗体である。特定の実施態様では、本発明のＭＡＰＫタンパク質は、哺乳類ｐ３８の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位においてリン酸化された哺乳類ｐ３８タンパク質、例えば、Ｔｈｒ１２３においてリン酸化された哺乳類ｐ３８、または該リン酸化残基を含むタンパク質の断片である。特定の実施態様では、該抗体は哺乳類ｐ３８キナーゼの断片に含まれるエピトープと結合することができ、該断片はリン酸化されたＴｈｒ１２３残基、または他のＭＡＰＫタンパク質における同等位置にある（一致する）残基を含む。別の特定の実施態様では、該抗体は、進化を経て保存性の高いエピトープである、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むエピトープと結合することができる抗体であり、従って、この配列番号２は、種々の種の相同なｐ３８タンパク質間で、このエピトープのコンセンサス配列であるとみなすことができる。
【００５１】
別の特定の実施態様では、本発明のＭＡＰＫタンパク質と結合することができる化合物は、本発明により特定される新規なリン酸化部位［すなわち、マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にあるアミノ酸残基］、または該部位の周辺領域において該ＭＡＰＫタンパク質と結合する化合物であり、該化合物はその活性化セグメントにおけるＭＡＰＫタンパク質のリン酸化に低下をもたらし、それにより、その活性化および／またはその基質に対する活性を妨げ、例えば、該リン酸化部位または該部位の周辺領域のいずれかにおいて負電荷もしくはかさ高い残基を導入する化合物である。該化合物の非限定例としては、
（ｉ）ｐ３８のドッキング領域と結合することができ、その領域において負電荷（例えば、リン酸基）の導入を模倣することができる化合物、例えば、マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３（またはその周辺領域）、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にあるアミノ酸残基において負電荷またはかさ高い残基を導入し、該化合物がリン酸化部位Ｔｈｒ１２３またはＴｈｒ１２３の周辺領域で会合すると、ＭＡＰＫタンパク質の活性化が妨げられる化合物、または
（ｉｉ）ｐ３８のドッキング領域と結合することができ、その領域において負電荷（例えば、リン酸基）の導入を模倣することができる化合物、例えば、マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にあるアミノ酸残基において負電荷またはかさ高い残基を導入し、該化合物がリン酸化部位Ｔｈｒ１２３で会合すると、その基質に対するＭＡＰＫタンパク質の活性が損なわれる化合物
が挙げられる。
【００５２】
別の態様では、本発明は、活性なＭＡＰＫにより媒介される病態を発症する被検体のリスクもしくは疾病素因を分析するための、または該病態を有する被検体に施された療法の効果を評価もしくはモニタリングするための、または該病態の病期もしくは重篤度および／または進行を分析するための、ならびに該病態の治療に有用な可能性のある化合物の同定における、本発明のＭＡＰＫタンパク質と結合することができ、かつ／または本発明のＭＡＰＫタンパク質を検出することができる化合物の使用に関する。
【００５３】
別の態様では、本発明は、
（ｉ）ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位をリン酸化する化合物をコードする核酸配列（ここで、該異なるリン酸化部位は、マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にある、リン酸化に感受性のアミノ酸残基であり、該異なるリン酸化部位におけるリン酸化により、該ＭＡＰＫタンパク質の活性化が妨げられる）、または
（ｉｉ）ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位におけるリン酸化を妨げる化合物をコードする核酸配列、または
（ｉｉｉ）ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位をリン酸化する化合物（ここで、該異なるリン酸化部位は、マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にある、リン酸化に感受性のアミノ酸残基であり、該異なるリン酸化部位におけるリン酸化により、該ＭＡＰＫタンパク質の活性化が妨げられる）、または
（ｉｖ）ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位におけるリン酸化を妨げる化合物
を含んでなるベクター（以下、本発明のベクター）に関する。
【００５４】
特定の実施態様では、該ＭＡＰＫタンパク質は哺乳類ｐ３８キナーゼであり、そのリン酸化は、該哺乳類ｐ３８の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位、例えば哺乳類ｐ３８のＴｈｒ１２３で起こる。
【００５５】
本発明のベクターはウイルスベクターであっても非ウイルスベクターであってもよく、当業者に周知であり、療法、例えば、遺伝子療法において使用することができる。
【００５６】
特定の実施態様では、本発明のベクターは、ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位をリン酸化する化合物をコードする核酸配列（ここで、該異なるリン酸化部位は、マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にある、リン酸化に感受性のアミノ酸残基であり、該異なるリン酸化部位におけるリン酸化により、該ＭＡＰＫタンパク質の活性化が妨げられる）、またはＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位をリン酸化する化合物（ここで、該異なるリン酸化部位は、マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にある、リン酸化に感受性のアミノ酸残基であり、該異なるリン酸化部位におけるリン酸化により、該ＭＡＰＫタンパク質の活性化が妨げられる）を含む。該異なるリン酸化部位におけるリン酸化は、該ＭＡＰＫタンパク質の活性の阻害をもたらし、従って、本発明のベクターは活性なＭＡＰＫにより媒介される病態の治療に有用であり得る。
【００５７】
別の特定の実施態様では、本発明のベクターは、ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位におけるリン酸化を妨げる化合物をコードする核酸配列、またはＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位におけるリン酸化を妨げる化合物、例えば、ＧＲＫ２キナーゼ阻害剤などのキナーゼ阻害剤または該リン酸化部位を脱リン酸化するホスファターゼなどを含む。該リン酸化部位のリン酸化が妨げられるので、ＭＡＰＫタンパク質の活性化が促進され、被検体に放射線療法または化学療法を行った後に活性なＭＡＰＫタンパク質が存在すると腫瘍細胞の死滅がもたらされるので特に癌の治療にとって重要であり得る。従って、この場合、本発明のベクターは、活性なＭＡＰＫにより媒介される病態、特に癌の治療に有用であり得る。
【００５８】
本発明のベクターの特定の実施態様では、ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位をリン酸化する化合物は、キナーゼ、または該キナーゼの特徴的機能を遂行することができる機能的に活性なその断片、例えば、本発明に示されているように、マウスｐ３８αアイソフォームなどの哺乳類ｐ３８に存在するＴｈｒ１２３残基をリン酸化するＧＲＫ２キナーゼまたは機能的に活性なその断片である。
【００５９】
別の態様では、本発明は、治療上有効な量の、
（ｉ）ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位をリン酸化する化合物（ここで、該異なるリン酸化部位は、マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にある、リン酸化に感受性のアミノ酸残基であり、該異なるリン酸化部位におけるリン酸化により、該ＭＡＰＫタンパク質の活性化が妨げられる）、または
（ｉｉ）ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位においてリン酸化を模倣する化合物（ここで、該異なるリン酸化部位は、マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にある、リン酸化に感受性のアミノ酸残基であり、該異なるリン酸化部位におけるリン酸化により、該ＭＡＰＫタンパク質の活性化が妨げられる）、または
（ｉｉｉ）ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位におけるリン酸化を妨げる化合物、または
（ｉｖ）本発明のベクター、または
（ｖ）本発明により特定される新規なリン酸化部位、または該部位の周辺領域においてＭＡＰＫタンパク質と結合する本発明のＭＡＰＫタンパク質と結合することができ、その活性化セグメントにおけるＭＡＰＫタンパク質のリン酸化に低下をもたらし、それにより、その活性化および／またはその基質に対する活性を妨げ、例えば、該リン酸化部位または該部位の周辺領域のいずれかにおいて負電荷もしくはかさ高い残基を導入する化合物、または
（ｖｉ）ｐ３８のドッキング領域と結合することができ、その領域において負電荷（例えば、リン酸基）の導入を模倣することができる化合物｛例えば、マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３（またはその周辺領域）、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にあるアミノ酸残基において負電荷またはかさ高い残基を導入し、該化合物がリン酸化部位Ｔｈｒ１２３またはＴｈｒ１２３の周辺領域で会合すると、ＭＡＰＫタンパク質の活性化が妨げられる｝、または
（ｖｉｉ）ｐ３８のドッキング領域と結合することができ、その領域において負電荷（例えば、リン酸基）の導入を模倣することができる化合物｛例えば、マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にあるアミノ酸残基において負電荷またはかさ高い残基を導入し、該化合物がリン酸化部位Ｔｈｒ１２３で会合すると、その基質に対するＭＡＰＫタンパク質の活性が損なわれる｝
を、所望により薬学上許容される担体とともに含んでなる医薬組成物に関する。
【００６０】
特定の実施態様では、該ＭＡＰＫタンパク質は哺乳類ｐ３８キナーゼであり、そのリン酸化は、該哺乳類ｐ３８の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位、例えば、哺乳類ｐ３８のＴｈｒ１２３で起こる。
【００６１】
特定の実施態様では、本発明の医薬組成物は、ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位をリン酸化する化合物、例えば、キナーゼ、または該キナーゼの特徴的機能を遂行することができる機能的に活性なその断片、例えば、ＧＲＫ２キナーゼまたは機能的に活性なその断片を含んでなる。該キナーゼは哺乳類ｐ３８のＴｈｒ１２３をリン酸化する。
【００６２】
別の特定の実施態様では、本発明の医薬組成物は、ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位におけるリン酸化を妨げる化合物を含んでなる。
【００６３】
別の特定の実施態様では、本発明の医薬組成物は、本発明のベクターを含んでなる。
【００６４】
活性なＭＡＰＫにより媒介される病態の予防および／または治療におけるそれらの投与については、有効化合物（ベクターを含む）は治療上有効な量で、好適な医薬組成物中、１以上の薬学上許容される担体、アジュバントまたは賦形剤とともに処方される。
【００６５】
医薬組成物の例としては、好適な投与法、例えば、経口、皮下、腹腔内、静脈内などによる投与のための固形組成物（例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤など）が挙げられ、一般に治療する疾病の慢性性のために典型的には経口投与される。
【００６６】
特定の実施態様では、該医薬組成物は、経口投与固体または液体医薬形であり得る。経口投与医薬形の例としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、溶液、懸濁液などが挙げられ、結合剤、希釈剤、崩壊剤、滑沢剤および湿潤剤などの通常の賦形剤を含むことができ、常法により製造することができる。これらの医薬組成物はまた、例えば、滅菌、凍結乾燥溶液、懸濁液または好適な投与形での製品の形態で非経口投与するために適したものとすることができ、この場合、該医薬組成物は、バッファー、界面活性剤などの好適な賦形剤を含む。いずれの場合でも、賦形剤は選択された医薬投与形に応じて選択される。種々の医薬投与形およびそれらの製法の総説は、書籍”Tratado of Farmacia Galenica”, of C. Fauli i Trillo, 10th Edition, 1993, Luzan 5, S. A. de Edicionesに見出すことができる。
【００６７】
一般に、投与する治療上有効な量（またはベクター）は、他の因子の中でも、治療される被検体、該被検体が罹患している病態の重篤度、選択された投与形などに依存する。このため、本発明で述べられている用量は、当業者は単に指針と考えるべきであり、用量は前述の変数に従って調整しなければならない。本発明の医薬組成物はやはり、２５〜７５ｍｇ／ｋｇ／日の間からなる典型的な１日総量で、１日１回以上、例えば１日１回、２回、３回または４回投与することができる。
【００６８】
本発明の医薬組成物は、併用療法を提供するため、活性なＭＡＰＫにより媒介される病態の予防および／または治療に有用な他の付加的薬剤とともに使用することができる。該付加的薬剤は同じ医薬組成物の一部であってもよいし、あるいはまた本発明により提供される医薬組成物と同時投与または非同時投与するための別個の組成物の形態で提供することもできる。
【００６９】
別の態様において、本発明は、活性なＭＡＰＫにより媒介される病態の治療のための医薬組成物の製造における、
（ｉ）ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位をリン酸化する化合物（ここで、該異なるリン酸化部位は、マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にある、リン酸化に感受性のアミノ酸残基であり、該異なるリン酸化部位におけるリン酸化により、該ＭＡＰＫタンパク質の活性化が妨げられる）、または
（ｉｉ）ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位においてリン酸化を模倣する化合物（ここで、該異なるリン酸化部位は、マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にある、リン酸化に感受性のアミノ酸残基であり、該異なるリン酸化部位におけるリン酸化により、該ＭＡＰＫタンパク質の活性化が妨げられる）、または
（ｉｉｉ）ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位におけるリン酸化を妨げる化合物、または
（ｉｖ）本発明のベクター、または
（ｖ）本発明により特定される新規なリン酸化部位、または該部位の周辺領域においてＭＡＰＫタンパク質と結合する本発明のＭＡＰＫタンパク質と結合することができ、その活性化セグメントにおけるＭＡＰＫタンパク質のリン酸化に低下をもたらし、それにより、その活性化および／またはその基質に対する活性を妨げ、例えば、該リン酸化部位または該部位の周辺領域のいずれかにおいて負電荷もしくはかさ高い残基を導入する化合物、または
（ｖｉ）ｐ３８のドッキング領域と結合することができ、その領域において負電荷（例えば、リン酸基）の導入を模倣することができる化合物｛例えば、マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３（またはその周辺領域）、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にあるアミノ酸残基において負電荷またはかさ高い残基を導入し、該化合物がリン酸化部位Ｔｈｒ１２３またはＴｈｒ１２３の周辺領域で会合すると、ＭＡＰＫタンパク質の活性化が妨げられる｝、または
（ｖｉｉ）ｐ３８のドッキング領域と結合することができ、その領域において負電荷（例えば、リン酸基）の導入を模倣することができる化合物｛例えば、マウスｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３、またはアミノ酸配列の多重アライメントにより規定される別のＭＡＰＫタンパク質の同等位置にあるアミノ酸残基において負電荷またはかさ高い残基を導入し、該化合物がリン酸化部位Ｔｈｒ１２３で会合すると、その基質に対するＭＡＰＫタンパク質の活性が損なわれる｝
の使用に関する。
【００７０】
特定の実施態様では、該ＭＡＰＫタンパク質は哺乳類ｐ３８キナーゼであり、そのリン酸化は、該哺乳類ｐ３８の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位、例えば哺乳類ｐ３８のＴｈｒ１２３で起こる。
【００７１】
特定の実施態様では、ＭＡＰＫタンパク質の活性化セグメントに存在するリン酸化部位とは異なるリン酸化部位をリン酸化する該化合物は、キナーゼ、または該キナーゼの特徴的機能を遂行することができる機能的に活性なその断片、例えば、哺乳類（マウス）ｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３をリン酸化するＧＲＫ２キナーゼまたは機能的に活性なその断片である。
【００７２】
別の態様では、本発明は、本発明のＭＡＰＫタンパク質、または従前に述べたように、本発明のＭＡＰＫタンパク質と結合し、かつ／または本発明のＭＡＰＫタンパク質を検出することができる化合物を含むキットに関する。
【００７３】
特定の実施態様では、本発明により提供されるキットは、活性なＭＡＰＫにより媒介される病態の診断において、または該病態を発症する被検体のリスクもしくは疾病素因を判定するために、または該病態を有する被検体に施された療法の効果を評価もしくはモニタリングするために、または該病態の病期もしくは重篤度および／または進行を分析するために、ならびに該病態の治療に有用な可能性のある化合物の同定において使用することができる。特定の実施態様では、該ＭＡＰＫタンパク質は、哺乳類ｐ３８αアイソフォームのＴｈｒ１２３においてリン酸化された哺乳類ｐ３８キナーゼである。
【００７４】
別の態様では、本発明は、治療を必要とする被検体に本発明により提供される医薬組成物を投与することを含む、活性なＭＡＰＫにより媒介される病態の治療方法に関する。
【００７５】
以下の実施例は本発明の例示であり、その範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００７６】
ＧＲＫ２酵素によるｐ３８タンパク質のＴｈｒ１２３のリン酸化
Ｉ．材料および方法
製品
【００７７】
用いた試薬および製品は総て分析級である。塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化アンモニウム、塩化マンガンおよび塩化マグネシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、スクロース、尿素、トリス、  ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グリシン、氷酢酸、塩酸、エタノール、エタノール、ブタノールおよびグリセロールはＭｅｒｃｋにより供給されたものである。ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）、フッ化ナトリウム、デオキシコール酸、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコールビス（２−アミノエチレンエーテル）−Ｎ−Ｎ−Ｎ’−Ｎ’−四酢酸）、β−メルカプトエタノール、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、ヘパリン、オルトバナジン酸ナトリウム、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、Ｐｏｎｃｅａｕ  ｒｅｄ、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０、アプロチニン、トリプシン阻害剤、アジ化ナトリウム、Ａタンパク質−セファロースはＳｉｇｍａにより供給されたものである。ＰＭＳＦ（フェニル−メチル−スルホニルフロリド）、ベンズアミジン、還元型グルタチオン、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、アンピシリンおよびカナマイシン抗生物質、ならびにＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）はＲｏｃｈｅから入手したものである。ＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチルエチレンジアミン）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、過硫酸アンモニウム、ブロモフェノールブルー、クーマシーブルー、既知分子量の染色済みタンパク質標品、ニトロセルロース紙およびＢｒａｄｆｏｒｄ試薬はＢｉｏ−Ｒａｄにより供給されたものである。Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅａｕ試薬はＰａｎｒｅａｃから、ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）はＣａｒｌｏ−Ｅｒｂａから入手したものである。放射性［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ同位体はＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにより供給されたものであり、メチオニン−システイン代謝マーカー混合物［３５Ｓ］はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒにより供給されたものであった。
【００７８】
用いた構築物およびプラスミド
本明細書では次のプラスミドを用いた。
【００７９】
ＧＲＫ
ラットｐＣＭＶ−ＧＲＫ３構築物は、Ｓ.  Ｃｏｔｅｃｃｈｉａ博士（スイス、ローザンヌ大学）より提供されたものである。
【００８０】
ウシｐＣＤＮＡ３−ＧＲＫ２、ウシｐＣＤＮＡ３−ＧＲＫ２−Ｋ２２０ＲおよびｐＣＤＮＡ３−ＧＲＫ５構築物はＪ．  Ｌ．  Ｂｅｎｏｖｉｃ博士の研究室（米国フィラデルフィア、トーマス・ジェファーソン大学）より提供されたものである。
【００８１】
ＧＲＫ２のｐＣＥＦＬ−ＤＮＡｃアンチセンス構築物は、Ｃ．Ｓｈａｙｏ博士より提供されたものである。
【００８２】
ｐ３８ＭＡＰＫモジュール
構成的に活性な突然変異体ｐＣＤＮＡ３−ＭＫＫ６β（Ｅ）（ｐＣＤＮＡ３−ＭＫＫ６β  （Ｇｌｕ）：ＭＫＫ６Ｓ２０７Ｅ／Ｔ２１１Ｅは、Ｊ．  Ｍ  Ｒｅｄｏｎｄｏ博士(the Centro of Biologia Molecular Severe Ochoa (Severo Ochoa Molecular Biology Centre, マドリッド)より提供されたものであり、彼はまた、マウスｐＣＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−ｐ３８α構築物およびｐＧＥＸ２Ｔ−ｐ３８α原核生物発現ベクターも提供した。
【００８３】
ＧＳＴとの融合タンパク質の産生を意図したｐＧＥＸ４Ｔ−Ｍｘｉ２およびｐＧＥＸ４Ｔ−Ｍｘｉ２Δ１７ベクターは、カンタブリア大学のＰ.  Ｃｒｅｓｐｏ博士およびＶ．Ｓａｎｚｓ博士より寄贈されたものである。
【００８４】
その他
エンプティーｐＣＤＮＡ３ベクターはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのものである。
【００８５】
プラスミドｐＣＥＦＬ−ＥＧＦＰは、Ｃ．Ｍｕｒｇａ博士(Centro of Biologia Molecular Severo Ochoa)より提供されたものである。
【００８６】
ｐＢＣ１２ＢＩ−β２−ＡＲ構築物は、Ａ．Ｒｕｉｚ−Ｇｏｍｅｚ博士(Centro of Biologia Molecular Severo Ochoa)より提供されたものである。
【００８７】
Ｒａｆ−１ＹＹ３４０／３４１ＤＤ突然変異体は、Ａ.Ｓ．Ｄｈｉｌｌｏｎ博士(Beatson Institute for Cancer Research, Glasgow, UK)より提供されたものである。
【００８８】
ｐＴｒｃＨｉｓＢは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手したものである。
【００８９】
細胞培養
細胞系統の確立
確立された数種の細胞系統を用いた：ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手し、ＣＯＳ−７細胞（ミドリザル腎臓細胞）およびＳｆ９（スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)）細胞はＡＴＣＣ(American Type Culture Collection)から入手した。個別のＰ−１００、Ｐ−６０（Ｆａｌｃｏｎ）プレートまたはマルチウェルＭ６、Ｍ１２もしくはＭ２４（Ｆａｌｃｏｎ，Ｃｏｓｔａｒ）上、ＨＥＫ２９３およびＣＯＳ−７細胞は、２ｍＭグルタミン、１０％ウシ胎児血清および抗生物質混合物（５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、０．０１％ストレプトマイシンおよび０．０６３％ペニシリンＧ）を添加したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、単層で増殖させた。
【００９０】
同様に、ＥＢＮＡ（ＨＥＫ由来、ＥＢＮＡ抗原をコードするプラスミドでトランスフェクトしたもの）細胞から、また、ネオマイシン耐性ｐＣＤＮＡ３−ＧＲＫ２ベクターから作出した、ＧＲＫ２を安定発現する二塊培養物(two mass-cultures)を用い、従って、それらは２００μｇ／ｍｌゲネチシン（ネオマイシンＧ４１８，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の存在下で培養した。
【００９１】
ＡＴＣＣから入手した脂肪細胞前駆細胞系統３Ｔ３−Ｌ１、ならびにそれから作出した安定系統を、１０％新生ウシ血清（ＮＣＳ）とともにグルタミンおよび抗生物質を添加したＤＭＥＭ培地で維持した。ｐＣＤＮＡ３−ＧＲＫ２およびｐＣＤＮＡ３−Ｋ２２０Ｒで安定トランスフェクトされた集団に７５０μｇ／ｍｌゲネチシンを加えた。脂肪細胞への分化条件は以下に詳説する。
【００９２】
これらの細胞種は総て、５〜７％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中、３７℃でインキュベートした。
【００９３】
Ｓｆ９細胞は、ＣＯ２雰囲気を用いず２７℃で、ウシ胎児血清およびゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を添加したＧｒａｃｅ培地（Ｇｉｂｃｏ）中、３×１０５細胞／ｍｌの懸濁液で１５０ｒｐｍで攪拌しながら増殖させたか、またはＰ−１００もしくはＰ−１５０プレート上で単層にて増殖させた。
【００９４】
ネズミパクロファージ(pacrophage)の一次培養物を得、標準的なプロトコールを用いて維持した。本質的には、Ｍａｒｃ  Ｃａｒｏｎ博士（ノースカロライナ、デューク大学）(Duke University, North Carolina)から厚意により寄贈された３か月齢のＣ５７ＢＬ／６  ＧＲＫ２＋／＋および＋／−マウスの腹腔内にチオグリコール酸ナトリウム（１ｍｌ）を注射した。４日後、腹腔マクロファージをＰＢＳによる１５ｍｌ腹腔洗浄により単離した。１００万個の細胞をＭ１２プレートの各ウェルに播種し、５％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ培地中で付着させ、十分洗浄した。得られたマクロファージを、ＲＰＭＩ０．５％ＦＣＳ中、詳細に示した濃度の大腸菌(E. Coli)（Ｓｉｇｍａ）由来ＬＰＳを用い、加湿チャンバー内、３７℃で１６時間評価した。
【００９５】
トランスフェクション
ＨＥＫ２９３細胞およびＣＯＳ−７細胞の一時的トランスフェクションは、リポフェクタミン／ＰＬＵＳ法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、Ｐ−１００  Ｐ−６０プレートにて７０〜８０％の間の集密度で行った。Ｆｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＪｅｔＰｅｉ（Ｐｏｌｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）またはＥｓｃｏｒｔ−ＩＩ（Ｓｉｇｍａ）などの試薬とともに他のトランスフェクションプロトコールも用いたが、一番よく用いた方法はリポフェクタミン法であった。要するに、トランスフェクション前日に１５×１０６細胞（ＨＥＫ２９３）をＰ−６０に、あるいは用いるプレートの表面に相関した細胞数をプレーティングした。以降、プロコールはＰ−６０プレートについて述べる。翌日、高純度プラスミドＤＮＡ（Ｑｕｉａｇｅｎにより供給されたアフィニティーカラムで単離し、無菌ＭｉｌｌｉＱ水に再懸濁させたもの）（Ｐ−６０の場合では３〜５μｇ）、ＰＬＵＳ試薬（Ｐ−６０では８μｌ）およびＯＰＴＩＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ）（Ｐ−６０では２５０μｌ）の混合物（１）を調製し、室温で１５分間インキュベートした。各実験において、プレート一定量当たりの総ＤＮＡ量が一定となるように必要量のエンプティーベクター（一般に、ｐＣＤＮＡ３）を加えた。並行して別の試験管でリポフェクタミン（Ｐ−６０では１２μｌ）を、（２）ＯＰＴＩＭＥＭ（Ｐ−６０では２５０μｌ）と混合し、これもインキュベートする。１５分後、（１）と（２）を同じ比率で混合し、調製された混合物をさらに１５分間インキュベートし、最後に、予めＯＰＴＩＭＥＭ（Ｐ−６０では２ｍｌ）で覆ったプレートに注ぐ（最終反応混合物：Ｐ−６０では０．５ｍｌ）。これらの細胞をトランスフェクション培地でこの３７℃で３時間インキュベートし、その後、トランスフェクション培地を除去し、１０％血清を添加したＤＭＥＭ培地に置き換える。翌日、培地を新鮮な培地に交換し、実験のために培養を行う前に少なくとも２４時間細胞を再生させる。一般に、細胞の処理、回収および溶解はトランスフェクション４８時間後に行った。
【００９６】
ＧＲＫ２およびｐ３８ＭＡＰＫ
ＧＲＫ２およびＦｌａｇ−ｐ３８α会合実験では、１：１：１比のＧＲＫ２（またはＧＲＫ２−Ｋ２２０Ｒ）、Ｆｌａｇ−ｐ３８αおよびβ２−アドレナリン受容体を使用した（一般に、ｐ６０では各１μｇ）。
【００９７】
漸増量のＧＲＫ２、ＨＥＫ２９３細胞の過剰発現アッセイでは、通常６または１２（Ｍ６またはＭ１２）マルチウェルプレートに播種し、ｐＣＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−ｐ３８α、ｐＣＤＮＡ３−ＭＫＫ６ＣＡＭ、および漸増量のｐＣＤＮＡ３−ＧＲＫ２ベクター（図に示されている）でトランスフェクトした。一般に、Ｍ６の場合には、１００ｎｇのＦｌａｇ−ｐ３８α、１００ｎｇのＭＫＫ６ＣＡＭ、および０〜１μｇのＧＲＫ２を用いた。総ての点で、この全ＤＮＡ量をｐＣＥＦＬ−ＥＧＦＰ、および対照点の場合にはｐＣＤＮＡ３−ＭＫＫ６ＣＡＭの代わりにエンプティーｐＣＤＮＡ３とともに完全に用いた。
【００９８】
Ｍ６マルチウェルプレートでのＧＲＫ２アンチセンスＤＮＡトランスフェクションでは、ＤＮＡの使用量が若干異なった：１５０ｎｇのｐＣＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−ｐ３８α、５０ｎｇのｐＣＤＮＡ３−ＭＫＫ６ＣＡＭ、および０．５μｇ〜２μｇのｐＣＥＦＬ−ＧＲＫ２  アンチセンス（ＡＳ）ベクターまたは同量のｐＣＥＦＬ−ＥＧＦＰ。総ての点で、この全ＤＮＡ量をエンプティーｐＣＥＦＬベクターとともに完全に用いた。
【００９９】
同様の過剰発現アッセイで、Ｍ６中の細胞を、１５０ｎｇのｐＣＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−ｐ３８α  ＷＴまたはｐＣＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−ｐ３８α  Ｔ１２３Ｄおよび５０ｎｇのｐＣＤＮＡ３−ＭＫＫ６ＣＡＭ（またはエンプティーｐＣＤＮＡ３）で一時的にトランスフェクトした（常に２反復）。
【０１００】
各場合に明示した特異的抗体を用いる免疫検出とその後の電気泳動（ウエスタンブロット）により細胞溶解液（細胞溶解液総量のおよそ１０％）を分析することで種々のタンパク質の一時的発現を確認した。
【０１０１】
細胞の処理
一時的にトランスフェクトした細胞の刺激処理は総ての場合おいてトランスフェクション４８時間後に行った。種々の薬剤で刺激した後、冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を洗浄し、スクラパーを用いて回収した。細胞を回収する溶解バッファーは、実施する特定の免疫沈降法によって異なる。
【０１０２】
ＨＥＫ２９３細胞の１０μＭイソプロテレノール（Ｓｉｇｍａ）による刺激は、血清を含まない培養培地にて３７℃で行った。これらの実験では、血清中に存在する化合物からの刺激を最小限にするために、刺激前約２時間、無血清状態（血清飢餓状態）で細胞を維持した。
【０１０３】
０．５Ｍ  ＮａＣｌ（Ｍｅｒｃｋ）による刺激は、細胞インキュベーター内で１５分間行った。
【０１０４】
脂肪細胞の分化
細胞培養はＮＣＳ血清の１０％ＤＭＥＭ培地で行った。しかしながら、以下に記載されている分化プロセスは総て、イオン交換樹脂および活性炭にウシ胎児血清を連続的に吸着させることにより、ＡＸＣ血清枯渇状態（イオン交換樹脂）で実施しなければならない。ＡＸＣ血清はthe Instituto of Investigaciones Biomedicas (Biomedical Research Institute)のキッチンサービスにより提供されたものである。細胞を集密状態まで増殖させ、４μＭのビオチン（Ｓｉｇｍａ）を添加したＤＭＥＭ−１０％ＡＸＣ培地にプレーティングした（Ｐ−１００では５×１０５）。翌日、培地を新鮮培地に交換する。細胞を再び集密状態に達するまでさらに３日間増殖させ、その日を「０日目」とする。分化０日目に、細胞を、０．５μＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍＭ  ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＭＢＸ，Ｓｉｇｍａ）および１μＭインスリン（Ｓｉｇｍａ）を含有する培地で培養し、さらに３日間そのままとする。３日目にこの脂肪細胞分化誘導処理の培地を、４μＭビオチンと１μＭインスリンを添加したＤＭＥＭ−１０％ＡＸＣに置き換え、その後の分化を進め、３日おきに培地を交換する。６日目から１５日目、脂肪細胞がその細胞質に蓄積した脂肪滴に結合する親油性構成物の赤色染色剤であるオイルレッドで染色することにより脂肪細胞分化を分析した。このため、細胞をホルマリン（３７％ホルムアルデヒド）で５分間固定し、冷ＰＢＳで洗浄した。これらの細胞を、オイルレッド（０．２％イソプロパノールｗ／ｖに溶解）と水の６０：４０（ｖ／ｖ）溶液を予め濾過したもとともにインキュベートする。ＰＢＳで十分洗浄し、細胞を光学顕微鏡下で可視化する。各実験プレートにつき、計２５視野の細胞を計数する。
【０１０５】
突然変異体の作出
点突然変異体
大多数の突然変異体は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅｓ指定の突然変異誘発プロトコールによって作出した。要するに、ポリメラーゼとして熱安定性Ｐｆｕを用い、逆平行突然変異誘発オリゴヌクレオチド（特定の各突然変異体に関しては以下に示す、これを用いてサーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ（登録商標）９７００）にて）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った）を作製した。完全な状態で増幅されたベクターをＤｐｎＩで消化して鋳型ＤＮＡまたは親ＤＮＡを除去し、消化産物を競合細菌に形質転換し、それからの突然変異の組み込みは、各種プラスミド（Ｓｐ６、Ｔ７、Ｔ３またはｐＧＥＸベクター中にクローニングされているタンパク質を配列決定するために特異的なもの）の特異的なプライミングオリゴヌクレオチドを用いてＳＩＤＩ(Servicio Interdepartamental of Investigacion, Interdepartmental Research Service)にて配列決定することにより確認することができる。
【０１０６】
ｐ３８Ｔ１２３Ａ
オリゴヌクレオチドＦＷＤ：５’ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＴＧＣ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＣＴＧ  ＧＣＣ  ＧＡＣ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ＧＴＴ  ＣＡＧ  ３’（配列番号３）
オリゴヌクレオチドＲＥＶ：５’ＣＴＧ  ＡＡＣ  ＧＴＧ  ＧＴＣ  ＧＴＣ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＣＴＧ  ＧＣＡ  ＣＴＴ  ＣＡＣ  ３’（配列番号４）
【０１０７】
これらの突然変異誘発ＰＣＲ産物を、ｐＣＤＮＡ３のｐ３８のＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）を裏打ちするプライミングヌクレオチドＳＰ６およびＴ７を用い、またはＡｍｅｒｓｈａｍ  ｐＧＥＸプラスミドシリーズを配列決定するための特異的ヌクレオチドを用いて配列決定した。
【０１０８】
ｐ３８Ｔ１２３Ｄ
オリゴヌクレオチドＦＷＤ：５’ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＴＧＣ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＣＴＧ  ＧＡＣ  ＧＡＣ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ＧＴＴ  ＣＡＧ  ３’（配列番号５）
オリゴヌクレオチドＲＥＶ：５’ＣＴＧ  ＡＡＣ  ＧＴＧ  ＧＴＣ  ＧＴＣ  ＧＴＣ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＣＴＧ  ＧＣＡ  ＣＴＴ  ＣＡＣ  ３’（配列番号６）
【０１０９】
末端切断型突然変異体
ｐ３８αの少なくとも８０のアミノ酸に相当する末端切断型タンパク質ＧＳＴ−２８０−３６０ｐ３８を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇａｔｅｗａｙシステムを用いて作出した。このレコンビナーゼによる多価クローニング法により、真核生物宿主および原核生物宿主の、いくつかのエピトープを含む多数のプラスミドを対象とするタンパク質またはタンパク質断片の発現が可能となる。
【０１１０】
まず、翻訳したいｐ３８αのＯＲＦ領域を裏打ちするレコンビナーゼの標的、ａｔｔＢ配列の組み込みを可能とするオリゴヌクレオチドを設計する必要があった。それらはＧａｔｅｗａｙではＧＴＷと呼ばれる。オリゴヌクレオチドＧＴＷ−ＦＷＤを、翻訳されるｐ３８の最初のアミノ酸（Ａｌａ２８１、ヌクレオチド配列では下線で示されている）がａｔｔＢ１配列と同じ位相となるように作製した。オリゴヌクレオチドＧＴＷ−ＲＥＶには翻訳の終結コドンを組み込んである（下線で示されている）。このプラスミドｐＧＥＸ２Ｔ−ｐ３８αをＰＣＲで鋳型として用いた。
【０１１１】
オリゴヌクレオチドＧＴＷ−ＦＷＤ：５’ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＡＡＧ  ＴＴＴ  ＧＴＡ  ＣＡＡ  ＡＡＡ  ＡＧＣ  ＡＧＧ  ＣＴＴ  ＣＧＣ  ＴＧＴ  ＣＧＡ  ＣＣＴ  ＡＣＴ  ＧＧＡ  ＧＡＡ  ＧＡＴ  Ｇ  ３’（配列番号７）
【０１１２】
オリゴヌクレオチドＧＴＷ−ＲＥＶ：５’ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ＴＴＴ  ＧＴＡ  ＣＡＡ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＧＴＣ  ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＣＴＣ  ＣＡＴ  ＴＴＣ  ＴＴＣ  ＴＴＧ  ＧＴＣ  ３’（配列番号８）
【０１１３】
２４０ｂｐ  ＰＣＲ産物の、ｐＤＯＮＯＲ（商標）２０１ベクターへのクローニングは、ａｔｔＢ配列により媒介される、ＰＣＲ産物とｐＤＯＮＯＲベクターとの組換えからなるＢＰ−クロナーゼ反応  （２５℃で少なくとも１時間）により行った。プロテイナーゼ−Ｋ１０を３７℃で１０分間加えることで反応を停止させた。組換え産物であるＤＮＡを用いてＤＨ５α細菌を形質転換し、カナマイシンで選択した。
【０１１４】
次に、意図するプラスミド、すなわち、融合時に組換え配列からＧＳＴまでが同じ位相にある、そこにクローニングされたタンパク質の原核生物での発現を保証するｐＤＥＳＴ１５（ｐ３８のＣ末端断片も真核生物発現プラスミドｐＤＥＳＴ２７に導入されたが、その結果は省略した）を選択した。ＬＲ−クロナーゼ反応は、エントリークローン（ｐＤＯＮＯＲ−２８０−３６０ｐ３８）およびベクターとして線状化したｐＤＥＳＴ１５を用い、酵素ＬＲ−クロナーゼ混合物を２５℃で１時間インキュベートすることにより行った。このサンプルをプロテイナーゼ−Ｋとともに３７℃で２０分間インキュベートすることで反応を停止させ、ａｔｔＢオリゴヌクレオチドを用いて配列決定を行うことで適正かどうかを確認した後、得られたＤＮＡを用いてＢＬ２１細菌を形質転換し、それからＧＳＴ−２８０−３６０  ｐ３８構築物を精製した。
【０１１５】
ＤＮＡサブクローニング
Ｃ末端ヒスチジンタグを有するＭＡＰＫＡＰＫ２（ＭＫ２）の発現および精製のため、より安定な発現のためにプロリン豊富なＮ末端領域を削除したプラスミドｐＦｔｘ５−ＭＫ２ΔＮ１を、Ｐｈｉｌ  Ｃｏｈｅｎ博士(University of Dundee, Scotland, UK)から入手し、プライマー：５’ＧＧＧ  ＧＣＣ  ＡＴＧ  ＧＴＣ  ＡＡＧ  ＴＣＣ  ＧＧＣ  Ｃ  ３’（配列番号９）および５’ＣＣＣＣ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＴＧ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＡＧＣ  ＣＧＣ  ＡＧＣ  ３’（配列番号１０）を用い、ＰＣＲ反応で鋳型として使用した。
【０１１６】
この産物をｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ（太字）にサブクローニングした。
【０１１７】
精製組換えタンパク質およびポリペプチド
活性型ＭＥＫＫ６／ＭＥＫＫ３はＵｐｓｔａｔｅより供給されたものである。
【０１１８】
ＧＲＫ２の精製は、バキュロウイルス中のＧＲＫ２構築物に感染させたＳｆ９細胞から、Ａ．  Ｒｕｉｚ−Ｇｏｍｅｚ博士が行った。
【０１１９】
常法に従い、ウシの網膜からロドプシンを精製した。このようにして、ロドプシンがタンパク質の９０％以上を占める調製物が得られる（クーマシーブルー染色により評価）。
【０１２０】
融合タンパク質ＧＳＴ−ｐ３８、ＧＳＴ−ＡＴＦ２、ＧＳＴ−ＭＥＦ２Ａ、ＧＳＴ−Ｍｘｉ２、ＧＳＴ−ＭｘｉΔ１７およびＧＳＴ−２８０−３６０ｐ３８、ＧＳＴ−ｐ３８Ｔ１２３Ａおよびｐ３８Ｔ１２３Ｄを、簡単に記載されている常法に従って精製した。これらの構築物で大腸菌を形質転換させ、それらの発現をＩＰＴＧで誘導する。細菌を沈降させ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８、１％トリトンＸ−１００、２ｍｇ／ｍｌリゾチームおよびプロテアーゼ阻害剤中で溶解させ、その後、この細菌溶解液に音波処理を施し、明澄化する。これをグルタチオン−セファロース４Ｂ（登録商標）（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムにロードし、最低３時間流し、カラムをＰＢＳで洗浄した後、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８、５ｍＭ還元型グルタチオン（Ｓｉｇｍａ）でタンパク質を溶出させる。得られたタンパク質の純度および濃度を変性ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲルで確認する。これらのタンパク質をコードするプラスミドの起源は前節で明示されているか、または本発明者らが作製したものである場合は、適宜割り付けられている。
【０１２１】
ＭＢＰ（ミエリン塩基性タンパク質）またはＰＨＡＳ−Ｉ（リン酸化型、Heat and Acid Stable-regulated by Insulin）などの特異的ｐ３８基質はそれぞれＳＩＧＭＡおよびＳｔｒａｔａｇｅｎｅから入手した。ｐ３８キナーゼによるリン酸化反応で用いるＭＡＰＫの特異的に基質として記載されているＡＰＲＴＰＧＧＲＣペプチドは、ＣＢＭＳＯのＳｅｒｖｉｃｉｏ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃａ（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ｓｅｒｖｉｃｅ）が合成したものである。これをトリス２０ｍＭ  ｐＨ７．６に終濃度０．５ｍＭまで溶解させた。
【０１２２】
タンパク質測定は、標準曲線を作製するための標品としてウシ血清アルブミンを用い、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法またはＬｏｗｒｙらの方法によって行った。
【０１２３】
電気泳動
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
一次元ゲル
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルとしては、Ｌａｅｍｍｌｉにより記載されている方法に従い、実験により必要とされる解像度に応じて７〜１２％の範囲のアクリルアミド−ビスアクリルアミド％を用いた。分子量標品としては次のタンパク質を用いた：ミオシン（２００ｋＤａ）、β−ガラクトシダーゼ（１１６．２５ｋＤａ）、ホスホリラーゼＢ（９７．４ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６６．２ｋＤａ）、オボアルブミン（４５ｋＤａ）、炭酸脱水酵素（３１ｋＤａ）、ダイズトリプシン阻害剤（２１ｋＤａ）およびリゾチーム（１４ｋＤａ）（Ｒａｉｎｂｏｗ  Ｍａｒｋｅｒｓ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）。場合によっては、ゲルをクーマシーブルーで染色した。タンパク質を分離した後、タンパク質が［γ−３２Ｐ］ＡＴＰで標識されている場合にはゲルをオートラジオグラフィーにかけ、タンパク質が［３５Ｓ］−メチオニンで標識されている場合にはゲルをフルオログラフィーにかける。両場合とも、メタノール：酢酸（５０：１０）中で２０分間の固定段階が必要である。代謝標識では、多くの場合、Ａｍｐｌｉｆｙ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）とともに２０分間インキュベートすることでシグナルを増幅させ、その後、ゲルを乾燥させ、１００ＮＩＦのＡｇｆａ  Ｃｕｒｉｘ  ＲＰ２  Ｘ線フィルムに露光する。
【０１２４】
二次元ゲル
ｐ３８におけるＧＲＫ２によるリン酸化の基質残基数を分析する目的で、両タンパク質を以下に明示する反応条件でインキュベートした。得られたリンタンパク質を二次元ゲルで分離した。８Ｍ尿素を含む４％アクリルアミド−ビスアクリルアミドゲルで、最終ｐＨ範囲３〜１０の両性電解質の分解用混合物（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用い、等電点電気泳動または１回目の電気泳動を行った。あるいは場合により、一次元目はＢｉｏｒａｄのプレアセンブルストリップ（ＩＰＧストリップ、ｐＨ範囲３〜１０）を用いて行った。二次元目は８％ゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥで行い、リンタンパク質をオートラジオグラフィーにより検出した。
【０１２５】
核酸のＴＡＥ−アガロースゲル電気泳動
ＤＮＡ断片の分離は、０．８〜１％水平アガロースゲルで行った。用いた電気泳動バッファーはＴＡＥ（４０ｍＭトリス−酢酸、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）であり、サンプルのチャージングバッファーは５０％グリセロール、０．４％ブロモフェノールブルーおよび０．４％キシレンブルーであった。分子量標品は、食細胞のＨｉｎｄＩＩＩおよびΦ２９（the Centro de Biologia Molecular (Molecular Biology Centre)の発酵事業部により供給）による酵素消化の断片であった。
【０１２６】
プロテオミクスシーケンシング
目的の翻訳後修飾の位置決定は、the Servicio de Proteomica del Centro de Biologia Molecular “Severo Ochoa” (http://www.cbm.uam.es/mkfactory.esdomain/webs/CBMSO/plt_Servicio_Pagina.aspx?IdServicio=29&IdObjeto=118)内にあるCardiovascular Networkのthe Servicio de Proteomica del Nodo UAM (Umversidad Autonoma of Madrid) (UAM Node Proteomic Service)により行われた。
【０１２７】
サンプルを電気泳動により分離し（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ８％）、ゲルを染色する。このポリアクリルアミドゲルから分析するバンドを切り取り、トリプシン消化を行う（Ｐｒｏｍｅｇａのトリプシン）。
【０１２８】
トリプシン処理ペプチドの混合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化−タイム・オブ・フライト、ＢｒｏｋｅｒのＡｕｔｏｆｌｅｘモデル）により分析した。要するに、ペプチド種を結晶化によりマトリックスに吸着させ、その後、それらはレーザーからの短いパルスの発生により、プロトン化形態で非結合形となる。このサンプルイオン化法は飛行時間の分析機に接続している。実際に、単独ロードされたペプチドはそれらの質量に比例した運動エネルギーを得、検出器に衝突するまで真空管を「飛行」する。消化物上清の小アリコート（０．５μｌ）をそのまま、マトリックスとしてＤＨＢ（２，５−ジヒドロキシ安息香酸）およびサンプルホルダーとしてＡｎｃｈｏｒ−Ｃｈｉｐ  ｓｕｒｆａｃｅ（Ｂｒｕｋｅｒ）を用い、反射鏡を備えたＢｒｕｋｅｒのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型オートフレックスモデルの質量分析計で分析した。得られたスペクトルは最終的に、質量−電荷比（ｍ／ｚ）に従って分離されたペプチドに相当する。ＧＳＴ−ｐ３８とＧＲＫ２−リン酸化ＧＳＴ−ｐ３８のフラグメント化スペクトルを比較し、候補ペプチドを探した。
【０１２９】
この示唆を確認するため、これらにサンプルに対して、個々のペプチドのフラグメント化スペクトル（ＭＳ／ＭＳ）が得られる、別種の質量分析を行った：Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｎｎｉｇａｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡのエレクトロスプレー／質量分析−イオントラップＥＳ／ＭＳ−ＩＴ，Ｄｅｃａ−ＸＰモデル）。イオン化の前、イオン化はキャピラリー内で、すなわち、液体サンプルで行えることから、候補ペプチド（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより予め「懸濁」されている）はＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー）により分離した。内径１８０μｍのカラム（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｋｅｙｓｔｏｎｅの０．１８ｍｍ×１５０ｍｍ  ＢｉｏＢａｓｉｃ  １８ＲＰカラム）を、［メタルニードルキット」インターフェース（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｎｎｉｇａｎ）とともにマイクロスプレーモードにて流速１５μｌ／ｍで用い、ペプチドの溶出（９０分）の場合には、溶媒Ｂ５％〜６０％の勾配とした。このクロマトグラフィーをイオントラップ質量分析計に接続する。このフラグメント化法では、サンプルに強い電場をかけ、その結果として荷電した液滴が生じ、溶媒が蒸発した後、そのサンプル混合物のペプチドに相当する放射イオンが生じる。これらは好ましくはＮ末端で、また、ヒスチジンやアルギニンやリシン残基で複数のプロトンを生じることができる。イオントラップ分析機は、エレクトロスプレーによるイオン化からのイオンを分離することができる三次元電場を生じる。このように最終的にはフラグメント化スペクトルまたはＭＳ／ＭＳスペクトルが得られ、それは「ＳＩＭ」（単イオンモニタリング）モードで操作すると、候補ペプチドのフラグメント化スペクトルに限られる。サンプルを高感度モードで分析し、次のｍ／ｚ９３７．５１および９７７．５１をモニタリングする。「推定上の」リン酸化ペプチドのフラグメント化系列を理論的に推定した後、ｂおよびｙ”系列のいくつかの酵素を得られたスペクトルに割り付ける。
【０１３０】
免疫プロトコール
表Ｉは用いた一次抗体を示す。
【０１３１】
電気泳動後の免疫検出（「イムノブロットまたはウエスタンブロット」）
分析用サンプル（精製タンパク質、細胞溶解液または細胞下画分など）を、市販の分子量標品（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とともにＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離する。このようにして分離されたタンパク質を、炭酸バッファー（３ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２０％メタノール、ｐＨおよそ１０）中、７５分間の液体転写により（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｃｅｌｌを用い、１２×１４ｃｍゲルの場合には５０Ｖ、または３０Ｖでは１２０分間）、ニトロセルロースフィルター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ）に移す。このニトロセルロース膜をＰｏｎｃｅａｕレッドで染色した後、非特異的結合部位があれば遮断する目的で５％脱脂粉乳（Ｍｏｈｃｏ）またはＢＳＡ  ５％を添加したＴＢＳ培地（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中、４℃で一晩インキュベートした。遮断培地を除去した後、この膜を、１％ＴＢＳ−ＢＳＡに希釈した（表Ｉ）対応する抗体と接触させた。膜を濃ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０〜０．１５％で３回（３×１０分）洗浄した後、１：５０，０００希釈した二次抗体（一次抗体がポリクローナルである場合はペルオキシダーゼに結合したウサギ抗免疫グロブリンおよびモノクローナル抗体の場合はマウス抗免疫グロブリン、双方ともＮｏｒｄｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）とともにインキュベートする。最後に、現像のため、ペルオキシダーゼがＨ２Ｏ２の存在下でルミノール基質の酸化を触媒する化学発光法（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いる。定量は露光フィルムのレーザーデンシトメトリーにより行った（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ３００Ａ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）。
【０１３２】
ポリクローナル抗リン−Ｔｈｒ１２３ｐ３８血清は、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙにより、ウサギにおいてネズミｐ３８α由来のペプチドＱＫＬ  ｐＴ  ＤＤＨＶＱＦＬＩＹＣを免疫原として用いて作製され、その後、２つのペプチドおよび抗リンペプチドアフィニティーカラムを連結することで精製された。抗Ｈｉｓ抗体はＳｉｇｍａから購入した。
【０１３３】
ｐ３８およびＥＲＫの活性の測定
種々の活性化刺激によって生じたトランスフェクトｐ３８およびトランスフェクトＥＲＫの活性の程度の測定は、免疫検出法により行った。リン酸化され、これらのキナーゼ型に関して活性化ものとしか反応しない特異的抗体（それぞれ抗リンｐ３８および抗リンＥＲＫ、表Ｉの記載を参照）。
【０１３４】
一般に様々な期間（ｐ３８の場合は２時間、ＥＲＫの場合は一晩）飢餓状態（無血清培地）に置いたＨＥＫ２９３細胞を刺激し、溶解細胞を処理した後、両タンパク質の活性化セグメントのリン特異的抗体を用いてリンタンパク質の免疫検出を行った。この最初の免疫検出を現像した後、バッファー：２％ＳＤＳ、１００ｍＭβ−メルカプトエタノール、６２．５ＭｍトリスＨＣｌ、ｐＨ６．７を用いて免疫複合体を遊離させ、この膜の、全抗ｐ３８または抗ＥＲＫ抗体との再インキュベーションを行った。レーザーデンシトメーターでバンドの定量を行った。総ての場合で、抗リンタンパク質抗体で検出されたバンドに関して得られた値を細胞内で発現した全ｐ３８またはＥＲＫ量に対してノーマライズした。このようにすれば、ベースライン条件に関して異なるキナーゼの刺激の増強が表される。しかしながらいくつかの場合では、最初の現像が二回目に干渉する危険があれば、一方はリン特異的抗体で、もう一方は全タンパク質に対する抗体で別々に現像した２つの異なる膜の濃度測定により活性化を評価した。
【０１３５】
免疫沈降
免疫沈降を行う全サンプルまたは細胞溶解液を、プロテアーゼ阻害剤（ＳＴＩダイズトリプシン阻害剤）およびベンズアミジン１００μｇ／ｍｌ、ＰＭＳＦ  ２００μｇ／ｍｌおよびアプロチニン１０μ／ｍｌを添加した種々のバッファーに希釈する。バッファーは、以下に明示するように、各場合において使用する抗体によって変更した。総ての場合で、攪拌しながら４℃で最低１時間溶解させた後、サンプルを遠心分離し（２４０００ｘｇ）、アリコートを採取し（およそ１０％）、特定のタンパク質の発現を確認した。残りのサンプルにＢＳＡ（ｐ６０では５００μｇ）および各場合において相当量の抗体を加えた。４℃で一晩免疫沈降を行った。翌日、抗体がポリクローナルかモノクローナルかによって３０μｌの５０％Ａタンパク質−セファロース（Ｓｉｇｍａ）またはＧタンパク質−セファロース（Ｚｙｍｅｄ）をそれぞれ加え、４℃で９０分以上インキュベートした。抗体を樹脂と共有結合させた場合にはこの工程は省略し、その場合には５〜１０μｌの「免疫樹脂」を加えた。免疫複合体を遠心分離により回収し、上清を除去した後、１０〜１５ｍｌの洗浄バッファーで３〜５回洗浄した（８００ｘｇ、５分）。
【０１３６】
免疫沈降物の目的がリン酸化反応である場合、これらを、ＡＴＰを含まない同じインキュベーションバッファーでさらに２回洗浄した（２×１０〜１５ｍｌ）。
【０１３７】
免疫沈降タンパク質を電気泳動ブレーキングバッファーに再懸濁させ、一般に、後に完全なサンプルをロードするため、好適なパーセンテージのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で５分間煮沸した。
【０１３８】
ＲＩＰＡ（放射性免疫沈降アッセイ）バッファー
この可溶化バッファーは特にＧＲＫの免疫沈降において広く用いられている：３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、２％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、１％デオキシコール酸および０．２％ＳＤＳ。
【０１３９】
「Ｍ２抗ｆｌａｇ」免疫沈降バッファー
Ｍ２抗ｆｌａｇ抗体による免疫沈降のため、細胞を１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー  ｐＨ７．４（０．１Ｍ  ＮａＨＰＯ４およびＮａＨ２ＰＯ４の母液から調製）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１％ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルドシドに採取した。溶解後、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよびプロテアーゼ阻害剤からなる生理食塩水バッファーで３００μｌとした（ｐ６０プレートの場合）。最後に、免疫沈降物を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％トリトンＸ−１００、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５ｍＭ  ＮａＦ、２０ｍＭピロリン酸からなるバッファー中で洗浄した。
【０１４０】
プルダウン実験
タンパク質ＧＳＴ、ＧＳＴ−ｐ３８ｗｔ、ＧＳＴ−ｐ３８Ｔ１２３ＡおよびＧＳＴ−ｐ３８Ｔ１２３Ｄを細菌で発現させ、グルタチオン−セファロース４Ｂ（ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）とその後標準的な手順(Murga, C et al High affinity bindibg of beta-adrenergic receptor kinase to microsomal membranes. Modulation of the activity of bound kinase by heterotrimeric G protein activation J Biol Chem 271, 985-994 (1996))を用いて単離した。Ｈｉｓ−ＭＡＰＫＡＰＫ２をＰｒｏｂｏｎｄ樹脂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示に従い用いて精製した。ＭＫＫ６ＣＡＭはＵｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した。各図の凡例に詳細に示されたタンパク質量を結合バッファー（２５ｍＭトリスｐＨ７．５、０．２５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＮａＦおよび０．５％ＢＳＡ）中、３０℃で３０分間、絶えず攪拌しながらインキュベートした。ＭＡＰＫＡＰＫ２のプルダウンのためにはＡＴＰ（５０μＭ）を加えた。沈降物を、０．５％トリトンＸ１００を含有する同じバッファーで３回洗浄した（１０ｍｌ）。沈降した複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウエスタンブロットにより現像した。
【０１４１】
リン酸化アッセイ
組換えタンパク質のin vitroリン酸化
ＧＲＫ２によるｐ３８のリン酸化
組換えＧＳＴ−ｐ３８およびＧＲＫ２（濃度が明示されている速度パラメーターの算出のための実験以外は、２５〜１５０ｎＭで双方とも当モル）をｐ３８リン酸化バッファー（２５ｍｍ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、５０μＭ  ＡＴＰ、２０００〜３０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ）中、最終量４０μｌでインキュベートした。通常、リン酸化反応を３０℃で３０分間行う。二次元電気泳動またはプロテオミクスシーケンシングを意図するサンプルの場合は、反応は１または２時間に延長する。
【０１４２】
化合物ヘパリンおよびＳＢ２０３５８０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ＧＲＫ２およびｐ３８阻害剤はそれぞれ、各キナーゼの完全な阻害を保証するために、ＩＣ５０の１０倍濃度、すなわち、ヘパリンでは１．５μＭおよびＳＢでは０．５μＭで用いた。用いた基質はＭＢＰ（各点１４μｇ）またはｐ３８の場合はＰＨＡＳ−Ｉ（終濃度２５ｎｇ／μｌ）およびＧＲＫ２の場合はカゼイン（各点７５μｇ）であった。
【０１４３】
リン酸化を停止させた後のサンプルの処理は、タンパク質の分離が８％ゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で行われる場合以外は、前述の場合と同じである。
【０１４４】
ＧＳＴと融合するタンパク質：ｐ３８α、Ｍｘｉ２、Ｍｘｉ２Δ１７および２８０−３６０  ｐ３８（各０．５μｇ）を、リン酸化バッファー（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、５０μＭ  ＡＴＰ、２０００〜３０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ）中、３０℃で３０分間、組換えＧＲＫ２（２００ｎＭ）とともにインキュベートした。特異的ＧＲＫ２阻害剤としてヘパリン（１５０ｎＭ）を含めた。ＳＤＳとともにブレーキングバッファーを加えることで反応を停止させた。サンプルを８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。同量のタンパク質が含まれていることを確認するため、ゲルにおいてクーマシーブルー染色によりこれらを可視化した。その後、ゲルを乾燥させ、タンパク質に組み込まれた放射活性（３２Ｐ）を検出した。
【０１４５】
ＧＲＫ２によるリン酸化の過程部位（Ｔ１２３）において正確なｐ３８突然変異体を作出し、従前に記載したように精製し、ｐ３８リン酸化バッファー（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ  ７．５、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、５０μＭ  ＡＴＰ、２０００〜３０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ）中、最終量４０μｌで、ＧＲＫ２によるリン酸化を行った。ＧＲＫ２およびｐ３８アイソフォームの相対濃度（１０〜８０ｎＭ）は図に示されているように様々であった。
【０１４６】
ＭＫＫ６ＣＡＭによるｐ３８のリン酸化
リン酸化アッセイ（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１５ｍｍ  ＮａＦ、５０μＭ  ＡＴＰおよび１０００〜２０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ）を、組換えＭＫＫ６ＣＡＭ（４０ｎｇ）（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のリン酸化基質として融合タンパク質ＧＳＴ−ｐ３８  ＷＴ、ＧＳＴ−ｐ３８  Ｔ１２３ＡおよびＧＳＴ−ｐ３８  Ｔ１２３Ｄ（１５０ｎＭ）を用い、in vitroで行った。従前の場合と同様に、３０℃で３０分間反応させ、タンパク質を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。同量のタンパク質が含まれていることを確認するため、ゲルにおいてクーマシーブルー染色によりこれらを可視化した。その後、各ｐ３８アイソフォームにおいて組み込まれた放射活性を測定した。
【０１４７】
ｐ３８によるＡＰＲＴＰＧＧＲＲペプチドのリン酸化
ＨＥＫ２９３、Ｆｌａｇ−ｐ３８α細胞を、Ｍ２抗Ｆｌａｇ−アガロースを用いて免疫沈降させた。免疫沈降物を１０〜１５ｍｌのＭ２バッファーで３回、同量のリン酸化バランシングバッファー（１５ｍＭ  ＮａＦ、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５および１０ｍＭ酢酸マグネシウム）で２回洗浄した。最後の洗浄において、免疫−アガロース複合体を１ｍｌのバッファーに再懸濁させ、Ｆｌａｇ−ｐ３８の免疫沈降と対比させるために各点１０％を分離した（１００μｌ）。残りの免疫沈降Ｆｌａｇ−ｐ３８で、ＡＰＲＴＰＧＧＲＲペプチドを基質として用いてキナーゼアッセイを行った。反応を、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１５ｍＭ  ＮａＦ、５０μＭ  ＡＴＰおよび５００〜１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰおよび１〜２ｍＭの基質ペプチドからなるリン酸化バッファー中、最終量２５μｌで行った。明示されている場合には、in vitroにおいて、ＳＢ２０３５８０を終濃度０．５μＭで加える。３０℃で３０分間リン酸化させ、その後、１５μｌの３０％ＴＣＡを加えることで停止させた。タンパク質を遠心分離（２５，０００ｘｇ、１５分、４℃）により沈降させ、各反応からリン酸化されたペプチドを含む上清を回収する。Ｗｈａｔｍａｎ  Ｐ８１濾紙を１ｃｍ×１ｃｍ角に切り取ったものをこのペプチド溶液に浸した。これらを乾燥させ、７５ｍＭリン酸で十分洗浄し、最後に、吸収されたペプチドが組み込んでいる放射活性をＣｅｒｅｎｋｏｖで定量した。このペプチドに対するｐ３８の活性を、各場合において、そのペプチドのみに相当する点で検出されたベースライン（またはバックグラウンド）活性と対比させる。
【０１４８】
ｐ３８によるＡＴＦ２およびＭＥＦ２Ａの基質のリン酸化
ＧＳＴと結合したＡＴＦ２およびＭＥＦ２Ａ型を用いてＧＳＴ−ｐ３８の触媒活性を試験した。ほとんどの場合で、自家生産した２μｇのＧＳＴ−ＡＴＦ２またはＧＳＴ−ＭＥＦ２Ａを用いた。リン酸化条件は前述の場合で示したものと同じである。しかしがら、図に適宜指摘した場合には、０．２μｇの基質を用い、リン酸化を１５分しか行わなかった。
【０１４９】
配列比較
ｐ３８のオーソログとアイソフォームの比較
マルチプルアライメントの生成はＣｌｕｓｔａｌＸプログラム(http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalX/)を用いて行い、Ｐｅｒｄｉｇｕｅｒｏ博士(del Centro Nacional of Investigaciones Oncologicas, (National Centre for Oncological Research)、マドリッド)によりギャップ導入によって手動で調整した。
【０１５０】
データの数学的・統計的解析
実験は最低２回行い、一般に各点を２反復または３反復で行った。データは平均値と平均値の標準偏差（±ＳＥＭ）で表した。
【０１５１】
酵素反応の速度定数を算出するため、これらのキナーゼのミカエリス−メンテン挙動を仮定した。速度パラメーター：ミカエリス−メンテン定数（Ｋｍ）および最大速度（Ｓｍａｘ＝Ｓｏ（ＰＯ４３−組み込みｎｍｏｌ／酵素ｍｇ／分）を推定することができるアルゴリズムとともに提供されている「カレイダグラフ」プログラムを用いてグラフを作成した。
【０１５２】
「スチューデントの両側ｔ検定」（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ）および自由度ｎ−１により統計分析を行った、なお、この場合の帰無仮説は統計的有意性を決定しようとする状況または状態とベースラインまたは対照状況との間に有意差がないというものである。各場合において得られた帰無仮説（ｐ）を採択する確率に対応する値は、図に示されているようにｐ＜０．００１〜ｐ＜０．０００１の範囲であった。
【０１５３】
ＩＩ．結果
ＧＲＫ２とｐ３８ＭＡＰＫの間の機能的相互作用
ｐ３８はＧＲＫ２によりリン酸化される
本発明者らは、心臓の生理および高血圧症、うっ血性心不全または狭心症などの心血管疾患の病因(ethiology)の双方におけるＧＲＫ２およびその基質受容体の主要な関与が分かり、さらに心筋の発達およびその結果としての機能におけるｐ３８ＭＡＰＫモジュールの重要性が分かったので、ＧＲＫ２の活性およびＭＡＰＫによるその発現の調整を制御する機構を研究した。うっ血性心不全におけるＧＲＫ２レベルの上昇とｐ３８の不活性化との間には逆の相関がある。さらに、ＧＲＫ２のレベルは、例えば関節リウマチなどの炎症型の疾病では低下している。
【０１５４】
次に、本発明者らは、ＧＲＫ２とｐ３８の間にあり得る相互作用を研究することにした。最初の実験アプローチは、両タンパク質のリン酸化アッセイであった。図１のパネルＡは、ＧＲＫ２がｐ３８をリン酸化することを示している。ＧＲＫ２の存在により何らかの方法でｐ３８の自己リン酸化が起こったという可能性を排除するため、ＧＲＫ２阻害剤として広く用いられているヘパリン（１６ｎｇ／μｌ）を、ヘパリンがｐ３８の触媒活性に影響を及ぼさないことが予め確認されているリン酸化アッセイに含めた。同じパネルは、ＧＲＫ２の触媒活性にはより低いｐ３８のリン酸化が伴い、従って、ＧＲＫ２のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼの活性は、ＧＳＴ−ｐ３８に組み込まれている放射性標識に直接的に帰因することを示す。これらの実験はＧＲＫ２によるＧＳＴのリン酸化の陰性対照を用い、ＧＳＴタンパク質とｐ３８のＯＲＦとの間の結合領域を調べることにより完了した。
【０１５５】
最近の刊行物には、ＴＡＢ１との相互作用により刺激されたｐ３８の自己リン酸化について記載されており、ｐ３８の特異的ＡＴＰの競合的阻害剤であるピリジニルイミダゾールＳＢ２０３５８０がリン酸化アッセイに含められた。図１のパネルＢは、ＭＢＰ（ミエリン塩基性タンパク質）など、ｐ３８の一般的基質に対するｐ３８の触媒活性のＳＢ２０３５８０阻害剤の効果を示している。ｐ３８αのベースライン活性は小さいことが分かっているので、ＭＢＰの大きなリン酸化は観察されず、そうであったとしてもＳＢ２０３５８０による阻害が検出される。次の２つのレーンは、ピリジニルイミダゾールがＧＲＫ２のキナーゼ活性に影響を及ぼさないことを示している。最後に、このオートラジオグラフィーの最後の２つのレーンは、ｐ３８の自己リン酸化活性がＧＲＫ２が存在する増強されることを示している。記載されているこれらの実験の最終的な結論は、ｐ３８はin vitroでＧＲＫ２によりリン酸化されるということである。
【０１５６】
リン酸化が、ＭＫＫ３およびＭＭＫ６などのｐ３８活性化キナーゼ（ＭＡＰＫＫ）によりリン酸化され得る残基では起こらなかったということを確認するため、非放射性条件（言い換えれば、ｓｉｎ［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰを用いない）でリン酸化反応を行い、抗Ｐ−ｐ３８のリン特異的抗体を用いて免疫検出を行った（図１のＣ）。この抗体は、配列中のエピトープをｐ３８のトレオニン１８０またはチロシン１８２でリン酸化されることを認識する。下のパネルに見られるように、組換えタンパク質ＭＫＫ６が存在する場合のみ、記載の抗体によるリンｐ３８の認識が得られる。上のパネルでは、ＧＳＴを認識する抗ＧＲＫ２抗体により全タンパク質が検出された（ＧＳＴ−ｐ３８参照）。これらの実験は、ＧＲＫがＴ１８０とは異なる残基でｐ３８をリン酸化することを示す。
【０１５７】
ＧＲＫ２はｐ３８を迅速かつ高い親和性でリン酸化する
反応の速度パラメーターの研究は、この反応がin vivoで起こるということを示している。図１は、リン酸化の速度の特徴を示している。まず、経時的反応の実験（パネルＤ）を行うと、リン酸がすぐに（５分後）検出されるということが示され、最大リン酸化の５０％に達するまで平均１５分と見られる。ＧＲＫ２は、チューブリン、シヌクレイン(sinuclein)およびホスドゥシン(phosducin)などのいくつかの非粒子基質をリン酸化し得る取捨選択性のキナーゼである。その基質に対してＧＲＫ２が示す親和性は多様である。従って、双方のサブタイプに応じて、シヌクレインおよびβ−チューブリンのＫｍは１〜２μＭ前後である。ｐ３８の場合、Ｋｍ＝８０ｎＭの値（図１の表、パネルＥを参照）は、ホスドゥシンおよびホスドゥシンに類似のタンパク質などのＧＲＫ２の他の生理学的基質に関して記載されているもの（ＰｈＤおよびＰｈＬＰ、Ｋｍ４０〜１００ｎＭ）またはｍ２−ムスカリン受容体のものに近い。Ｃｅｒｅｎｋｏｖによる少なくとも３回の定量で認められた化学量論的値は、０．４〜０．８ｍｏｌ  Ｐｉ／ｍｏｌ  ｐ３８の範囲であり、ＧＲＫ２によるリン酸化部位の存在を示す。
【０１５８】
ＧＲＫ２とｐ３８はアゴニストに依存して相互作用する
ＧＲＫ２は、シグナル伝達と細胞輸送の双方に関与するいくつかのタンパク質を相互作用する。よって、ＧＲＫ２は、Ｇαｑ、Ｇβγ、ＰＯＫαおよびγ、クラスリン(clathrin)、ＧＩＴ（ＧＲＫ相互作用タンパク質）およびカベオリン(caveolin)、加えてその相互作用がその活性に対する調整を行う他の分子（リン脂質、Ｃａ２＋−カルモジュリナ(calmodulina）、キナーゼなど）と相互作用する。ＧＲＫ２は調節キナーゼであり、その触媒活性はその種々のドメイン間の分子内反応により制限を受ける。このため、そのｐ３８との会合能力を観察するために、β２ＡＲ受容体（これらのよりｐ３８の活性化はなされない）での刺激により、その活性なコンフォメーションの獲得を試みた。β２ＡＲ受容体、Ｆｌａｇ−ｐ３８およびＧＲＫ２をコードするプラスミドで一時的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を用いた。細胞を一晩飢餓状態にした後、１０μＭ濃度のイソプロテレノールアゴニストで刺激した。これらの条件で免疫沈降を行うと、免疫沈降物中にＧＲＫ２キナーゼが検出され、β２ＡＲ受容体での刺激によりこの作用が増強される（図２のパネルＡ）。図２を構成する種々の項目に示されているように、イソプロテレノール曝露５分後に最大会合が見られる。他方、両キナーゼは基準条件（０分）でもともに免疫沈降することが分かるので、両キナーゼ間の会合はβ２ＡＲの刺激に従ったものではないということが認められる。パネルＡには、抗Ｆｌａｇ免疫沈降の薬剤対照（Ｃｎｅｇ）と、ｐ３８の別の注目に値する刺激（ＮａＣｌ）がこのような会合を誘発しないという証明が含まれている。最後に、これらの条件でのｐ３８の活性化レベルが示される。これらは第一に、イソプロテレノールによるｐ３８の活性化があまり強いものではないこと、第二に、活性化が小さいほどＧＲＫ２とよく結合することを示す。
【０１５９】
「相互」免疫沈降アッセイ（すなわち、同じ細胞系で、免疫沈降物中でのｐ３８の検出のために抗ＧＲＫ２抗体を用いる）を行った。Ｂでは、ｐ３８とＧＲＫ２がアゴニストに依存して相互作用することが認められた（イソプロテレノールの５分）。Ｃでは、ＧＲＫ２の濃度を引き下げてもなおＦｌａｇ−ｐ３８との結合が温存された。β２ＡＲアゴニストにより刺激した５分後に再び結合の上昇が見られた。
【０１６０】
Ｄでは、ＧＲＫ２の触媒的に不活性な突然変異体であるＫ２２０Ｒとの、ｐ３８の免疫共沈降能を調べた。ＧＲＫ２−Ｋ２２０ＲおよびＧＲＫ２−ＷＴの発現レベルが低いほど（３つめのパネル）、その突然変異体がそれ自体ｐ３８とよりよく会合できるだけでなく、その相互作用がβ２ＡＲ刺激に依存しないように見えるということが見て取れる。
【０１６１】
ＧＲＫ２の過剰発現は、ｐ３８の、ＭＫＫ６キナーゼにより活性化される能力を低下させる
ｐ３８とその最も一般的なアクチベーターの１つＭＫＫ６との境界を調べた。交差している可能性のあるアクチベーターを限定および分離するために、このＭＡＰＫＫの構成的に活性な突然変異体ＭＫＫ６ＣＡＭを用いた。図３のＡは、ＨＥＫ２９３細胞における一時的トランスフェクション実験の代表的パネルを示し、ここでは、Ｆｌａｇ−ｐ３８およびＭＫＫ６ＣＡＭとともに、漸増量のｐＣＤＮＡ３−ＧＲＫ２プラスミドが過剰発現された（常に、この全ＤＮＡ量をｐＣＤＮＡ３−ＧＦＰとともに完全に用いた）。細胞内で発現されるＧＲＫ２量が多くなるほど、ＭＫＫ６ＣＡＭに依存したｐ３８の活性化が低下したことが認められる。この過剰発現により、同じ細胞の結果の評価を正確なものとすることができる。確かに、Ｆｌａｇ−ｐ３８の免疫検出だけが取り上げられるので、トランスフェクト細胞が選択され（従って、ＧＲＫ２とＭＫＫ６ＣＡＭの作用を受ける）、残りのものの作用が無視される。他方、内因性のｐ３８はどんな場合でもこれらの細胞で検出するのが難しい。一定量のＧＲＫ２を発現する細胞として、異なる量のＧＲＫ２を安定発現する２集団のＨＥＫ２９３を用い、Ｆｌａｇ−３８およびＭＫＫ６ＣＡＭ（またはその対照）をコードするＤＮＡをそれらに一時的に導入した。これらの結果はＢにまとめられており、それらはこの系において、この場合にもｐ３８の、ＭＫＫ６ＣＡＭにより活性化される能力の低下が見られることを示す。
【０１６２】
ＧＲＫ２の過剰発現はペプチド基質に対するｐ３８のキナーゼ活性を低下させる
次に、アクチベーターＭＫＫ６ＣＡＭの刺激および外因性基質に対する漸増量のＧＲＫ２の刺激を受けたｐ３８の触媒活性を調べた。このために、ＨＥＫ２９３細胞を、最適な発現が起こるのに必要な日数、血清を含む培地に置き、その結果、ＧＲＫ２は、ＬＰＡなど、血清中に存在する因子により刺激され、そのシグナルがＧＰＣＲから生じる。細胞を回収し、アガロース樹脂に結合されたモノクローナル抗ｆｌａｇ抗体により認識されたＦｌａｇ−ｐ３８キナーゼをそれらから免疫沈降させた。各点（常に２反復で実施）において、免疫沈降物のアリコートを、免疫検出によりその量を確認するために保存した（図４のＢに挿入されたパネルを参照）。繰り返し洗浄した免疫沈降物を、次に、ペプチド基質ＡＰＲに対するリン酸化反応で試験した。このペプチドは、その配列の最初の３つのアミノ酸のためにそのように呼ばれるが、ＭＢＰの残基９４番〜１０２番に相当し、これらの酵素のリン酸化コンセンサスを有するかどうかＭＡＰＫの活性を調べるためにこれまで用いられてきたものである。Ａは、ＧＲＫ２の発現レベルとこれらの条件でｐ３８が到達した活性化状態の双方を示す細胞溶解液対照を含む。Ｂの分析により、異なる結論が出てくる。１つは、各点において、免疫沈降したｐ３８の触媒活性が、Ａにおいて抗リンｐ３８抗体で検出されたその個々の触媒活性と相関し、ＧＲＫ２の過剰発現により不鮮明になるという特徴があるということである。２つ目は、培養培地の血清中に存在する刺激を受けたＦｌａｇ−ｐ３８もまた、ペプチド−基質ＡＰＲに比べて有意ではないものの触媒活性を有するということである。従って、これらのレベルはグラフによる定量の参照と考えられた。最後に、ＡＰＲペプチドのリン酸化は、ＳＢ２０３５８０によるその明確な阻害を考えれば、ｐ３８に厳格に依存していたことを強調しなければならない。
【０１６３】
ＧＲＫ２レベルの低下はＭＫＫ６ＣＡＭよるｐ３８のより大きな活性化に作用する
これまでの結果を確認するために、相互実験を行った。言い換えれば、ＧＲＫ２がｐ３８活性に負の影響を及ぼすかどうかということである。ＧＰＣＲに対するキナーゼ活性とは独立に、ＧＲＫ２レベルに低下は、同じ流れでＭＫＫ６ＣＡＭにより、より強い抗リン−ｐ３８シグナルをもたらすはずである。ＧＲＫ２に対するＤＮＡアンチセンス（ＡＳ）の漸増量の一時的トランスフェクションを行うため、ＨＥＫ２９３細胞を用い（図５Ａの左側）、その並行対照を、同量のＧＦＰをコードするプラスミド（Ｃ）とした。図は代表的な実験のパネルを示す。ＧＲＫ２レベルにおいて、用いたＤＮＡ量に応じて平均２０〜５０％の低下が得られる。これらのデータは、最初のＧＲＫ２過剰発現実験から何が推論できるか、すなわち、細胞内のＧＲＫ２量が少ないほど、ｐ３８がＭＫＫ６ＣＡＭによりより高い活性かを受け得るということが実証する。この作用の代表的なグラフ推計を添付する（図５Ａの右側）。ｐ３８の活性化レベル（抗リン−ｐ３８／抗ｐ３８）を、各状況で、ＧＲＫ２（ＡＳ）の低下が大きいか、それともＧＦＰ（Ｃ、対照）の低下が大きいか、ベースラインの活性と対比させる。
【０１６４】
これらの同じ実験で、Ｆｌａｇ−ｐ３８の活性化をベースライン条件で評価する。ｐ３８αの休止時の活性、すなわち、ＭＫＫ６ＣＡＭを含まない場合の活性は通常欠損している。これを、化学発光中に長時間露光させたままにすることで免疫検出により検出することができる（図５のＢで過剰発現として表される）。よって、見られるように、ＭＫＫ６ＣＡＭの非同時トランスフェクション条件におけるｐ３８の活性化特性はこの構成的に活性な突然変異体の活性化を受けたｐ３８の特性を模倣する。これらの変数のうち１つ、ｐ３８の不定活性化に意味を持つＭＫＫ６ＣＡＭの過剰発現を除外すると、より大きな、またはより小さな全ＧＲＫ２のレベルの存在下で影響を受けたｐ３８のベースライン活性のデータがより定量的となる。よって、ＭＫＫ６ＣＡＭを含まない場合のＦｌａｇ−ｐ３８αの活性化の定量から得られたデータは図の下段に示されている。ＤＮＡアンチセンスの各点においてＧＦＰの並行対照とｐ３８の活性化を関連づけると、ＧＲＫ２の存在量が少ないほど、ｐ３８がその細胞アクチベーターの最良の基質となるという顕著な傾向が得られる（図５Ｂのグラフ）。従って、アステリスクで示した有意性は、ＤＮＡアンチセンスの各点において統計学的なスチューデントのｔ検定でその各ＧＦＰ対照と比較したところ、ｐ＜０．０５の値が得られたということを表している。
【０１６５】
末端切断型構築物によるｐ３８におけるＧＲＫ２によるリン酸化部位の位置は、ｐ３８−ＧＲＫ２相互作用における三元構造決定因子の関与を示す
Ｍｘｉ２は、Ｃ末端がｐ３８αの場合とは異なるｐ３８の選択プロセセイング変異体である。Ｍｘｉ２は、タンパク質Ｍａｘと相互作用させるために二重ハイブリッド実験で最初に単離されたタンパク質である。アミノ酸１から２８０まではｐ３８αと同じであるが、全く違う１７残基のＣ末端を有する（図６のスキームを参照）。Ｍｘｉ２の他、末端切断型突然変異体ＭｘｉΔ１７（厳密にはｐ３８αΔ８０に相当する）を用い、ｐ３８のＣ末端のセリンまたはトレオニンがＧＲＫ２のリン酸化の標的であったことを決定した。タンパク質精製の標準的方法により融合タンパク質を得、それらのＧＲＫ２基質となり得る能力をｐ３８αと比べて試験した（図６のＡ）。匹敵する量のｐ３８α、Ｍｘｉ２およびＭｘｉΔ１７を用い、後者の２つはＧＲＫ２によりリン酸化されなかった。さらに、Ｍｘｉ２とＭｘｉΔ１７において識別可能なリン酸化の痕跡は、ヘパリンの存在下でのｐ３８αのリン酸化に相当するものより弱い。この図にはまた、これらの各キナーゼの自己リン酸化対照も含まれている。
【０１６６】
これらの結果から、ｐ３８α配列の最後の８０個のアミノ酸を生成および精製し、再びＧＳＴと融合させた。この構築物はＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅの突然変異誘発プロトコールにより作製し、Ｇａｔｅｗａｙのｅｌ多価系において、ＧＳＴ−２８０−３６０  ｐ３８αをコードするＤＮＡ断片を段階的に含めた。驚くことに、この融合タンパク質を精製し、ＧＲＫ２に対して試験した後、リン酸化の痕跡は何ら得られなかった。これらの結果を図６のＢに示す。これらは、ＧＳＴ−ＭｘｉΔ１７およびＧＳＴ−ｐ３８αのよりも多いＧＳＴ−２８０−３６０  ｐ３８αを用いたところ（ＷＢ抗ＧＳＴ、下のパネル）、最初の２つはリン酸化されるが、最後のものはリン酸化される。
【０１６７】
このデータから、タンパク質ｐ３８αＷＴに存在しており、その末端切断型Ｎ末端およびＣ末端には存在しない構造決定因子がＧＲＫ２による認識とその後のリン酸化に必要であるものと推論される。
【０１６８】
ＧＲＫ２は１残基においてｐ３８をリン酸化する
ＧＲＫ２によりリン酸化された残基を決定するための前述のアプローチの不適切な点を確認した後、残基をプロテオミクス技術により検索した。計算された化学量論がリン酸化部位のみに相当することを確認するため、ＧＲＫ２およびｐ３８のリン酸化アッセイを二次元電気泳動により分離した。その結果を図７のＡに示す。最初の電気泳動では、ホスホリルを組み込んだ結果としてのタンパク質の等電点における変化を利用し、２回目の電気泳動では、通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、タンパク質をその質量に応じて分離した。ＧＲＫ２の存在下でのリン酸化に相当するパネルにおいてのみ、ＧＳＴ−ｐ３８に相当する強い放射活性バンドが観察できる。同様に、このパネルでは、拡散した３２Ｐの痕跡を識別することができ、ＧＲＫ２の多重自己リン酸化を示す。
【０１６９】
the Servicio de Proteomica of the Centro de Biologia Molecular Severo Ochoa(http://www.cbm.uam.is/mkfactory.esdomain/webs/CBMSO/plt_Servicio_Pagina.aspx?IdServicio=29&IdObjeto=118)内にあるthe Servicio de Proteomica del Nodo UAM of the Cardiovascular Networkにおいて、翻訳後修飾を確認した。ＧＲＫ２によりリン酸化されたＧＳＴ−ｐ３８およびＧＳＴ−ｐ３８のフラグメント化スペクトルを比較することにより、トリプシン消化およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の後、リン酸化サンプル中にペプチドの存在が得られ、その質量を、各サンプルで検出された別のペプチドの質量に８０Ｄａを足したものに相当し得た。実際に、ＧＲＫ２によるリン酸化を受けたサンプルにリン酸基で翻訳後修飾されたこのペプチド（１９５４．３３０＝１８７４．３２６＋８０）が少量ではあるが排他的に存在することが観察された。この図（図７のＢ）には、この推定されるリン酸化保持痕跡が検出されたスペクトルの領域を拡大したものが含まれている。なお、完全な図は材料および方法の節に示されている。質量スペクトルの詳細な分析により、トリプシン消化の結果である候補ペプチドＬＴＤＤＨＶＱＦＬＩＹＱＩＬＲの同定が可能となる。
【０１７０】
この示唆を確認するため、候補ペプチドをＨＰＬＣにより分離し、これまでに認められたペプチドに相当するイオンを個々にモニタリングするさらに精密な質量分析：エレクトロスプレー／質量分析−Ｉｏｎｉｃ  Ｔｒａｍｐ（ＩＳ／ＭＳ−ＩＴ）を行った。結果は、第一に、高速液体クロマトグラフィーからの、両サンプルでモニタリングされたペプチドの溶出時間に関する情報を示す。ＧＲＫ２によるリン酸化からのペプチドは早くに溶出することが認められ、これはペプチドを疎水性により分離し、極性の低いペプチドがより長く保持されるというクロマトグラフィーの基礎によるものである。
【０１７１】
第二に、両ペプチドのフラグメント化スペクトルおよび得られたペプチドに対する系列の割り付けを示す。この分析により、リン酸化保持体としての候補ペプチドＬＴＤＤＨＶＱＦＬＩＹＱＩＬＲのトレオニンが同定できた。図８では、各サンプルにおけるその種々の種の総ペプチド質量に相当するピークが黄色で強調されており、リン酸化サンプルと非リン酸化サンプルのスペクトルの間の特異種に相当する９３８．３Ｄａピークがオレンジ色で強調されている。
【０１７２】
これらの分光光度的アプローチおよびプロテオミクス的アプローチの最終的な結論は、ｐ３８におけるＧＲＫ２のリン酸化はｐ３８α配列のトレオニン１２３で起こるということであった。
【０１７３】
ｐ３８αのトレオニン１２３の突然変異はＧＲＫ２のリン酸化を妨げる
ＧＲＫ２によるリン酸化の標的残基を確認する目的で、ｐ３８αのＴ１２３における２つの突然変異体を作出した。突然変異体ｐ３８αＴ１２３ＡはＧＲＫ２によりリン酸化できないｐ３８形態に相当し、突然変異体ｐ３８αＴ１２３Ｄは、アスパラギン酸の負電荷ならびに側鎖の長さにより、トレオニン１２３の構成的リン酸化形態を模倣するものである。融合タンパク質ＧＳＴ−ｐ３８αＴ１２３ＡおよびＧＳＴ−ｐ３８αＴ１２３Ｄを精製し、常にタンパク質ｐ３８αＷＴを対照として、ＧＲＫ２によるリン酸化を行った（図９のＡ）。このキナーゼに対して基質が低濃度および等濃度である場合、この２つの突然変異体はいずれもＧＲＫ２基質とはならないことが確認され、このリン酸化の基質としてはトレオニン１２３であることが確実となった。図のＡにはまた、抗ｐ３８抗体による免疫検出により定量されたｐ３８の総量の対照も含まれている。Ｂには、ｐ３８αの代表的スキームを尺度化したものが含まれており（データベースＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔの受託番号Ｑ１６５３９，www.expasy.org）、ここでは、ほとんどタンパク質全体を含む大きなキナーゼドメインを強調しなければならない。ＣＤと呼ばれる小領域がタンパク質の末端に位置に、ｐ３８の基質およびアクチベーター双方にとっての共通ドッキングドメインを形成し、ＭＡＰＫファミリーにおけるタンパク質−タンパク質認識を媒介することが見出されている。ＭＫＫ３からの、またＭＥＦ２ｈａｓからのペプチドを伴うｐ３８結晶を分析したところ、このドッキング溝の記述を修正し、完成させることができた。
【０１７４】
トレオニン１２３はアイソフォーム間および種間で保存性の高い残基である
図１０は、本発明者らが作製した種々のｐ３８タンパク質配列の２つのアライメントを示す。上のパネルでは、種々の種のｐ３８のαアイソフォーム（データベースＳｗｉｓｓ−ＰｒｏｔではＭＫ１４）：Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ（一般のコイ、ＭＫ１４Ａ＿ＣＹＰＣＡ：  Ｑ９０３３６）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ、ＭＫ１４Ａ＿ＤＲＯＭＥ：  Ｏ６２６１８）、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ（アフリカツメガエル、ＭＫ１４＿ＸＥＮＬＡ：  Ｐ４７８１２）、Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー、ＭＫ１４＿ＰＡＮＴＲ：  Ｑ９５ＮＥ７）、Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ、ＭＫ１４＿ＣＡＮＦＡ：  Ｏ０２８１２）、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト、ＭＫ１４＿ＨＵＭＡＮ：  Ｑ１６５３９）、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス、ＭＫ１４＿ＭＯＵＳＥ：  Ｐ４７８１１）およびＲａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ラット、ＭＫ１４＿ＲＡＴ：  Ｐ７０６１８）を比較した。簡単なカラーコードを用いて、ｐ３８間で同一のアミノ酸（黄色）、コンセンサスと同じ保存性の高いアミノ酸のオーソログ（青色）、コンセンサスと等価な保存性の高いアミノ酸（緑色）を区別する。残りの非保存残基は白いままである。より大きな変動を示した領域は、厳密にｐ３８のキナーゼドメインの外側のものであり、その中のＣ末端領域が強調され、そこにＣＤドメインが存在し、このドメインの酸性アミノ酸は、基質、アクチベーターおよびデアクチベーターの塩基性アミノ酸との静電気的相互作用の確立のおかげで、その認識が可能となっている。アラインされた全ｐ３８αの配列におけるＴ１２３の位置は赤い楕円で強調されている。ほとんど総てのアイソフォームにトレオニン１２３が存在しているだけでなく、それが見られない場合にはその場所で同じようにリン酸化可能なセリンが見られる。さらに、ＧＲＫ２によるリン酸化のコンセンサスを形成すると仮定される酸性アミノ酸が並ぶ領域は総てのオーソログで保存されている。
【０１７５】
次に、本発明者らが記載した調節がｐ３８の４つの優れたアイソフォームα、β、γおよびδ総てに共通のものであり得るかどうかを検討した。このため、酵母のｐ３８アイソフォーム：カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）のＨＯＧ１（Ｑ９２２０７）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＨＯＧ１（Ｐ３２４８５）、シゾサッカロミセス・ポンベ(Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）のＳｔｙ１（Ｑ０９８９２）；ヒト、マウス、ラットおよびアフリカツメガエルのｐ３８のγアイソフォーム（アライメントのアイソフォームＭＫ１２、Ｐ５３７７８、Ｏ０８９１１、Ｑ６３５３８、Ｐ４７８１２）；ヒト、チンパンジー、マウスおよびラットのｐ３８のδアイソフォーム（アイソフォームＭＫ１３：それぞれアライメントのＯ１５２６４、Ｑ９Ｎ２７２、Ｑ９Ｚ１Ｂ７およびＱ９ＷＴＹ９）；ショウジョウバエのｐ３８の２つのアイソフォーム（ＭＫ１４＿ＤＲＯＭＥ、Ｏ６２６１８およびＯ６１４４３）、ヒトのβアイソフォーム（β２は、それに存在する８つのアミノ酸の選択的プロセシングにより挿入を欠いているという点で最初に単離されたβと異なる。このβアイソフォームは少量であるので単離が難しく、このβ型は通常β２変異体と呼ばれる）およびマウスのβアイソフォーム（（ＭＫ１１：Ｑ１５７５９、Ｑ９ＷＵＩ１）；最後にＸｅｎｏｐｕｓのαアイソフォーム（ＭＫ１４）、Ｃｙｐｒｉｎｕｓのαアイソフォーム（これまでに比較に含められたアイソフォームＭＫ１４ＡおよびアイソフォームＭＫ１４Ｂ、Ｑ９Ｉ９５８）、チンパンジー、イヌ、ヒト、マウス、およびラットのαアイソフォームの残基１２０〜１４０を含む領域を事前にアラインした。それらの総てで、酵母由来のものでさえも高い保存性が顕著である。目的のトレオニン（ｐ３８αヒトのＴ１２３）に関しては、後生動物の脊椎動物共通部分(vertebrates-even)ならびにその周辺アミノ酸で保存が見られると言え、そこには酸性残基ＤおよびＥが見られる。よって、このアライメントがこの残基の厳密な位置で中段を行ったとしても、ｐ３８のδアイソフォームはなお保存される。アライメントに含まれるアイソフォームで、唯一相同という点でセリンまたはトレオニンを欠いているものはヒトｐ３８γである。
【０１７６】
ＧＲＫ２によるｐ３８のリン酸化は、その基質に対するｐ３８の触媒活性とＭＫＫ６基質となる能力を低下させる
図１１および１２は、ＧＲＫ２のリン酸化がｐ３８のＴ１２３上にあり得る機能的コンセンサスを決定するために計画された実験を示す。まず、ｐ３８に対するＧＲＫ２のリン酸化がin vitroにおいてＭＫＫ６ＣＡＭによるその活性化を低下させるかどうかを検討した。ＧＳＴ−ｐ３８ならびに突然変異体ＧＳＴ−ｐ３８Ｔ１２３ＡおよびＧＳＴ−ｐ３８Ｔ１２３に対するＭＫＫ６ＣＡＭのリン酸化実験で得られた２反復の結果を図１１のＡを構成するパネルに示す。同量の組換えタンパク質（クーマシーブルー）で、ＧＳＴ−ｐ３８Ｔ１２３Ｄは、他の２つのｐ３８（３２Ｐ）ｉよりもＭＫＫ６ＣＡＭ基質としてかなり劣っていた。
【０１７７】
次に、ＭＫＫ６ＣＡＭによりリン酸化した場合のこのＧＳＴ−ｐ３８Ｔ１２３Ｄの能力の低下がin vitroにおけるその触媒活性の低下と相関しているかどうかを検討した。このため、いくつかのリン酸化アッセイを行い、これには、ＧＳＴ−ｐ３８のベースライン活性が検出できないために、活性化キナーゼＭＫＫ６ＣＡＭを含める必要があった。図１１のＢでは、ＧＳＴとの融合タンパク質として予め精製されたＧＳＴ−ｐ３８ＷＴならびに２つの突然変異体ＧＳＴ−ｐ３８Ｔ１２３ＡおよびＧＳＴ−  ｐ３８Ｔ１２３Ｄの、ＡＴＦ２などの既知のｐ３８基質をリン酸化する能力を調べた。よって、各リン酸化反応には基質、ＭＡＰＫおよびＭＡＰＫＫが含まれる。代表的な実験（３２Ｐ）を示し、各点は２反復である（クーマシーブルー）。よって、これらの実験は、ｐ３８Ｔα１２３ＤはＧＳＴ−ＡＴＦ２に対する最小限の触媒活性を欠くが、ｐ３８αおよびｐ３８Ｔα１２３Ａはそれを同様にリン酸化することを示す。
【０１７８】
ＡＴＦ２はＪＮＫによってもリン酸化されるので、より特性の高いｐ３８基質でこのデータを確認することにした。最近、ｐ３８とともに結晶化されたということ、そしてまた、好ましいｐ３８基質であるということにより、ＧＳＴ−ＭＥＦ２Ａを精製した。図１２は、この基質を用いて行ったアッセイを示す。Ａは、これまでの推論を合わせたものであり、ＭＥＦ２Ａに対するｐ３８Ｔα１２３Ｄの活性は完全に無効とされるが、突然変異体ｐ３８Ｔα１２３Ａはこの基質をリン酸化する能力を保持する。また、リン酸化が、クーマシーブルー染色により検出されるＧＳＴ−ＭＥＦ２Ａ基質の移動度の相関的変化を伴うということも認められた。タンパク質のリン酸化亢進にとっては、その電気泳動移動度の変化に関係するというのは通常のことであり、これは変性ポリアクリルアミドゲルおよびＳＤＳゲルであっても認めることができる。リン酸化アッセイを全体的に分析した後、さらに、突然変異体ｐ３８Ｔα１２３ＡはＭＫＫ６ＣＡＭによっては適正にリン酸化されないが、試験した２つの基質に対して低いキナーゼ活性を有するということも見出すことができた。ｐ３８Ｔα１２３Ａとｐ３８αＷＴの間のこの示差的作用をより詳細に分析することにし、そのため本発明者らは個々のベースライン活性、すなわち、活性化キナーゼＭＫＫ６が存在しない、ＭＥＦ２Ａに対する場合に着目した（図１２のＢ）。ｐ３８のベースライン活性は、十分量の基質および長時間露光の条件で評価することができ、Ｔ１２３における各突然変異体が野生型キナーゼよりも小さいベースライン触媒活性を持っているかどうかを確認することができる。ｐ３８Ｔα１２３Ａは、ｐ３８αＷＴとｐ３８Ｔα１２３Ｄの中間様の挙動を示す。よって、突然変異体ｐ３８Ｔ１２３Ａは、より限定的な酵素条件で（１０分の１の基質で１５分のリン酸化；図１２のパネルＣ）、ｐ３８αＷＴに対して、最初の実験で示されたものよりも大きな触媒作用を持つ。
【０１７９】
ｐ３８Ｔ１２３Ｄ突然変異体はin situにおいてＭＫＫ６ＣＡＭにより活性化される能力が低い
ＨＥＫ２９３細胞における最初のデータと一致する説明が並行して得られる結果を、この同じ系で確認した。まず、発現ｐＣＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−ｐ３８Ｔ１２３Ｄ突然変異体を真核生物においてＰＣＲにより作出した。次に、ＨＥＫ２９３におけるＧＲＫ２の過剰発現または低下と同様の実験アプローチに従い、Ｆｌａｇ−ｐ３８ＷＴおよびＦｌａｇ−ｐ３８Ｔ１２３ＤをアクチベーターＭＫＫ６ＣＡＭでともにトランスフェクトした。図１３のグラフは、Ｆｌａｇ−ｐ３８Ｔ１２３Ｄの活性化（そのベースライン活性に対して）をＦｌａｇ−ｐ３８ＷＴの活性化と比較して、その著しい低下を示す。細胞におけるｐ３８Ｔ１２３Ｄの活性化は、野生型キナーゼの活性化よりもおそらく低い。これらの実験により示された免疫検出の例示的パネルもこの図に含まれている。
【０１８０】
図１４では、ｐ３８またはそのＴ１２３における突然変異体に対する基質（ＭＫ２）およびアクチベーター（ＭＫＫ６）の結合を、精製タンパク質を用いたin vitro結合アッセイにより分析したものである。示されているように、Ｔ１２３Ｄ突然変異体の、ＭＫ２またはＭＫＫ６と会合する能力は、Ｔ１２３Ａ突然変異体または野生型タンパク質に関しては著しく損なわれている。
【０１８１】
ＧＲＫ２はインスリンにより誘導された脂肪細胞前駆体３Ｔ３−Ｌ１系統の分化に負の調節を行う
ＧＲＫ２によるｐ３８の調節の研究が可能な脂肪細胞前駆体系統３Ｔ３−Ｌ１を細胞モデルとして用いた。これらの繊維芽細胞は、ある種の刺激（中でもインスリンが卓越している）を受けた際に、約２週間の処理の終了時に脂肪細胞表現型を獲得するので特に注目される。この分化は、赤色の親油性染色剤で染色され、３Ｔ３−Ｌ１の細胞質のほぼ全体を占める脂肪滴の蓄積により容易に識別できる。
【０１８２】
ｐ３８の生理学的機能の１つは、細胞ストレスに対する最もオーソドックスな応答以外では、分化プロセスにおけるその役割である。３Ｔ３Ｌ１繊維芽細胞の特定の場合では、脂肪細胞への分化がＳＢ２０３５８０により遮断され、ＭＫＫ６ＣＡＭが存在すれば十分であるという条件ではｐ３８の関与が証明されている。その発現が分化経路を変化させる転写因子Ｃ／ＥＢＰ（ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質）およびＰＰＡＲγ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ）は、ｐ３８による調節を受けると思われる。より具体的には、Ｃ／ＥＢＰβはｐ３８によりおそらくリン酸化され、次に分化の初期段階ではじめて活性となり、その後、その制御下にあるＰＰＡＲγおよび脂肪細胞マーカーの発現を促進する。
【０１８３】
ＧＲＫ２が３Ｔ３Ｌ１の脂肪細胞分化に持ち得る作用を調べるため、ネオマイシン耐性をもたらすプラスミドｐＣＤＮＡ３−ＧＲＫ２およびｐＣＤＮＡ３−ＧＲＫ２Ｋ２２０Ｒで安定トラスフェクトした系統を作出した。両場合においてＧＲＫ２レベルが３Ｔ３Ｌ１系統に比べて効果的に過剰発現したことを適宜確認した後（図１５のグラフに挿入された枠）、標準的なプロトコールに従って分化を誘発した。３Ｔ３Ｌ１細胞は、脂肪生成刺激の不在下で繊維芽細胞の健全な外観を呈し（３Ｔ３Ｌ１の対照に相当する写真）、赤い脂肪滴により示される脂肪細胞の表現型に明らかに変化し、これらの細胞は球形の形態を獲得している（写真３Ｔ３Ｌ１の＋インスリン）。安定なＧＲＫ２の場合、１視野当たりの脂肪細胞数は、繊維芽細胞がこのキナーゼの内在レベルを有する場合より明らかに少ない。また、３Ｔ３Ｌ１−Ｋ２２０Ｒ細胞に関して、脂肪生成作用は対照細胞の場合より実質的に大きい。よって、ＧＲＫ２は、インスリンが媒介する脂肪細胞形態の獲得を阻害するが、Ｋ２２０Ｒはこれを刺激する。さらに、この作用はｐ３８依存的であるが、薬理学的阻害剤ＳＢ２０３５８０を添加すると、脂肪細胞分化全体が逆転する。さらに、分化処理を受けていないプレートを実験の内部対照として取っておいた場合、安定なＫ２２０Ｒは他の細胞よりも脂肪細胞へ自然変換を受けることがはるかに多い。３ｔの細胞系統の各々における１視野当たりの脂肪細胞数が右側のグラフに表されている。視野とは、ｐ１００またはｐ６０の各々において光学顕微鏡で見られる領域であると理解される。通常、各プレートで無作為に計２５視野までを計数した。このデータの有意性をスチューデントの両側ｔ検定（ｐ＜０．００１）で計算した（各安定細胞系統を３Ｔ３Ｌ１と比較）。
【０１８４】
図１６および１７のデータから、Ｔ１２３においてリン酸化されたｐ３８のペプチドに対して作製されたポリクローナル抗血清はＧＲＫ２によりin vitroでリン酸化されたｐ３８タンパク質を認識することができるが、他の残基においてＭＫＫ６によりリン酸化されたものは認識することができない、そして、Ｔ１２３Ａ突然変異体はこの抗体によっては免疫検出されないことから、この認識はＴ１２３残基に特異的であるという結論が導き出される。また、ＧＲＫ２の過剰発現はこの抗体によるこのエピトープの免疫検出の増強を促進することができ、ＧＲＫ２不活性突然変異体（Ｋ２２０Ｒ）が過剰発現される場合にはこのシグナルは低下する。
【０１８５】
【表１】
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2008545434.tif 000004
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【図面の簡単な説明】
【０１８６】
【図１】ＧＲＫ２がin vitroにおいて直接ｐ３８をリン酸化することを示す。図１Ａは、ｐ３８がＧＲＫ２によりリン酸化されることを示す。バキュロウイルス系により精製した組換えＧＲＫ２（５０ｎＭ）を、ｐ３８リン酸化バッファー（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、５０μＭ  ＡＴＰ、２０００〜３０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ）中、ＧＲＫ２活性を阻害するためのヘパリン（５０ｎｇ／μｌ）を含み、または含まずに、最終量４０μｌで５０ｎＭの組換えｐ３８（ＧＳＴ−ｐ３８）とともに３０℃で３０分間インキュベートした。キナーゼ自己リン酸化対照も同じ条件で行った。ＳＤＳローディングバッファーを加えることで反応を停止させ、タンパク質を８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、オートラジオグラフィーにより現像した。図１Ｂは、ＧＲＫ２が直接ｐ３８をリン酸化し、その自己リン酸化を促進しないことを示す。リン酸化反応は図１Ａに関して示した通りに行った。ヘパリンおよびＳＢ２０３５８０化合物、ＧＲＫ２およびｐ３８阻害剤をそれぞれ、個々のキナーゼの完全な阻害を保証するためにＩＣ５０濃度の１０倍、すなわち、ヘパリンでは１．５μＭ、ＳＢ２０３５８０では０．５μＭで用いた。使用基質は、ｐ３８に対してＭＢＰ（各点１４μｇ）およびカゼイン（各点７５μｇ）であった。ＳＤＳローディングバッファーを加えることで反応を停止させ、タンパク質を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、オートラジオグラフィーにより検出した。図１Ｃは、ＧＲＫ２がその活性化セグメントのｐ３８をリン酸化しないことを示す。これらのリン酸化反応は、従前に記載した条件で放射性ＡＴＰの不在下で開始させた。４０ｎｇのＭＫＫ６ＣＡＭ（ＭＫＫ６／ＭＫＫ３，Ｕｐｓｔａｔｅ）を、in vitroにおけるＧＳＴ−ｐ３８のリン酸化に用いた。より大きなタンパク質の場合では、電気泳動分離後に検出用に用いる抗体は、ＧＲＫ２およびＧＳＴ−ｐ３８（ＧＳＴ−ＰＦ２融合タンパク質（ここで、ＰＦ２はＧＲＫ２のＣ末端断片である）に対する抗体を用いて本発明者らの研究室で作製した抗ＰＦ２抗体ポリクローナル血清）を認識する。ｐ３８の活性化状態を検出するために用いるＴ１８０／Ｙ１８２のリン酸特異的抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇのものである。図１Ｄは、ＧＲＫ２によるｐ３８のリン酸化の時間依存性を示す。インキュベーション時間が、示されているように０〜９０分の範囲であること以外は、従前に示したものと同じ条件でリン酸化させた。両タンパク質（ＧＲＫ２  ７９．６ｋＤａ、ＧＳＴ−ｐ３８  ６８ｋＤａ）の移動度を矢印で示す。Ｃｅｒｅｎｋｏｖにより定量した後、切り取ったゲルのバンドで得られたデータを右側に示す。図１Ｅは、リン酸化速度パラメーターを示す。切片Ｄのデータについては、１５分の反応を、初速条件のリン酸化速度定数を決定するための時間とみなした。リン酸化反応は、ＧＲＫ２濃度を固定したまま（２５ｎＭ）、ｐ３８濃度を１２．５から４００ｎｍまで変化させてすでに記載したようにして行った。ＳＤＳローディングバッファーを加えることで反応を停止させ、タンパク質を８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、オートラジオグラフィーにより検出し、Ｃｅｒｅｎｋｏｖにより定量した。速度パラメーター：ミカエリス−メンテン定数（Ｋｍ＝７９．５６ｎＭ）および最大速度（Ｓｍａｘ＝０．９ｎｍｏｌの組み込みＰＯ４３−／ｍｇ  ＧＲＫ２−１分−１）を導き出すことができるアルゴリズムを提供するＫａｌｅｉｄａｇｒａｐｈプログラムでグラフを作製した。
【図２】ＧＲＫ２およびｐ３８は独立にβ２−アドレナリン作動性（β２−ＡＲ）受容体刺激に関連することを示す。図２Ａ：ＨＥＫ２９３細胞をｐＣＤＮＡ３−ＧＲＫ２、ｐＢＣ１２ＢＩ−β２−ＡＲおよびｐＣＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−ｐ３８α（各ＤＮＡ１μｇ／ｐ６０）ベクターで一時的にトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後、２時間血清飢餓後、細胞をアドレナリン作動性アゴニストイソプロテレノール（ＩＳＯ、１０μＭ）で５もしくは１０分間刺激したか、または刺激しなかった（０分、ＩＳＯ）。同様に、β２−ＡＲ受容体を過剰発現しない細胞を０．５Ｍ  ＮａＣｌで１５分間刺激した。これらの細胞を、アガロースと結合したＭ２抗Ｆｌａｇ抗体との免疫沈降に好適なバッファーに可溶化し、これらの細胞溶解液の一部（１０％）を過剰発現対照（細胞溶解液パネル）用に採取した後、これらの免疫複合体を４℃で一晩インキュベートした。免疫沈降したタンパク質（Ｉｐ抗Ｆｌａｇ）を電気泳動ブレーキングバッファーに再懸濁させ、結合したタンパク質を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で分離した。電気転写の後、タンパク質を抗ｐ３８で、また、ＧＲＫ２に対する抗体、抗ＰＦ２で検出した（それぞれ上のパネルと下のパネル）。この図には、Ｆｌａｇ−ｐ３８αの不在下、そして、１０μＭのイソプロテレノール刺激の不在下の陰性免疫沈降対照（Ｃｎｅｇ）も含まれている。この細胞溶解液パネルでは、上のＧＲＫ２、および下のｐ３８活性化状態は抗リン−ｐ３８抗体により検出されたものである（表１参照）。図２Ｂ：２Ａに記載したものと同じアプローチで、過剰発現タンパク質をＧＲＫ２に対する抗体、抗ＰＦ２で免疫沈降させ、その免疫共沈降物を、各刺激点（イソプロテレノール０分および５分、左上のパネル）において抗ｐ３８で検出した。Ｆｌａｇ−ｐ３８発現制御（上側）およびＧＲＫ２発現制御（下側）および全免疫沈降ＧＲＫ２（左下のパネル）を隣のパネルに示す。１０μＭイソプロテレノールに曝して５分後に刺激された両タンパク質間の会合を再び検出する。図２Ｃ：この場合には、内因性のＧＲＫ２がｐ３８よりも低い総量（０．５μｇＤＮＡ）で免疫共沈降したことを確認するために、β２−ＡＲおよびＦｌａｇ−ｐ３８αをコードするベクターのみをＨＥＫ２９３細胞に導入した。１０μＭイソプロテレノールで処理して５分後にＦｌａｇ−ｐ３８αとＧＲＫ２間の会合が生じる（左上および左下のパネルを参照）。右側のパネルにより、細胞溶解液におけるＧＲＫ２の発現（上側、抗ＰＦ２）およびｐ３８の発現（下側、抗ｐ３８）が確認される。図２Ｄ：Ａ節に記載したものと同じ実験で、触媒的に不活性なＧＲＫ２−Ｋ２２０Ｒ突然変異体がＦｌａｇ−ｐ３８と免疫共沈降することができるかどうかを調べた。上の２つのパネルはそれぞれ、２つのＧＲＫ２アイソフォームの免疫共沈降と総免疫強沈降ｐ３８を示す。この２つの細胞溶解液パネルは、ＧＲＫ２とＧＲＫ２−Ｋ２２０Ｒの過剰発現（上側、抗ＰＦ２）ならびに各点でのＦｌａｇ−ｐ３８活性化状態（下側、抗リン−ｐ３８）を示す。Ａで記載したように、Ｍ２抗Ｆｌａｇ−アガロース抗体の非特異的(non-nspecific)免疫沈降対照（Ｃｎｅｇ）を実施した。
【図３】ＧＲＫ２がどのようにしてＭＫＫ６ＣＡＭによるｐ３８の活性化を低下させ得るのかを示す。図３Ａ：通常６または１２穴（Ｍ６またはＭ１２）のマルチウェルプレート中に播種したＨＥＫ２９３細胞をｐＣＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−ｐ３８α、ｐＣＤＮＡ３−ＭＫＫ６ＣＡＭおよび漸増量のｐＣＤＮＡ３−ＧＲＫ２ベクターで一次的にトランスフェクトした。この実験では、Ｍ６プレートを用い、ＤＮＡ導入量は、Ｆｌａｇ−ｐ３８  １００ｎｇ、ＭＫＫ６ＣＡＭ  １００ｎｇおよびＧＲＫ２  ０〜１μｇとした。総ての点で、この全ＤＮＡ量をｐＣＥＦＬ−ＥＧＦＰおよび対照（ＣＴＲＬ）の場合にはｐＣＤＮＡ３−ＭＫＫ６ＣＡＭの代わりにエンプティーｐＣＤＮＡ３とともに完全に用いた。４８時間後、これらの細胞をＭ２バッファー中に溶解させることで採取した。上のパネルは過剰発現ＧＲＫ２を示す。ｐ３８活性化状態は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇの抗リン−ｐ３８で評価し、そして最初の免疫検出の抗体を放出した後に、同じ会社の全抗ｐ３８で検出した。現像時の低分解飽和を避けるために、わずかに露光したオートラジオグラフィーが示されていることに注意。図３Ｂ：ｐＣＤＮＡ３−ＧＲＫ２で安定にトランスフェクトされ、従って２種の異なるＧＲＫ２レベルを過剰発現するＥＢＮＡ２９３細胞の２倍培養物をＦｌａｇ−ｐ３８およびＭＫＫ６ＣＡＭでトランスフェクトした。Ｆｌａｇ−ｐ３８活性化状態をＡの場合と同様に測定した。さらに、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの抗ＭＫＫ６／ＳＫＫ３抗体を用いて適正なＭＫＫ６ＣＡＭ発現を確認した。
【図４】これらの実験は、ＧＲＫ２がｐ３８の触媒活性を低下させることを示す。図４Ａ：ｐ６０に播種したＨＥＫ２９３細胞を０．５μｇのｐＣＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−ｐ３８α、０．５μｇのｐＣＤＮＡ３−ＭＫＫ６ＣＡＭ（または対照では０．５μｇのエンプティーｐＣＤＮＡ３、ＣＴＲＬ）、および１または２μｇのｐＣＤＮＡ３−ＧＲＫ２（＋）ベクターで一時的にトランスフェクトした（各点２反復で実施）。ｐＣＤＮＡ３−ＧＲＫ２μｇの代わりにｐＣＥＦＬ−ＥＧＦＰ（−）を用い、対照実験を並行して行った。全ＤＮＡ量をエンプティーｐＣＤＮＡ３とともに完全に用いた。４８時間後、これらの細胞を溶解させ、細胞溶解液の一部を採取し、それらからＦｌａｇ−ｐ３８を免疫沈降させた。Ａのパネルは、ＧＲＫ２（抗ＰＦ２）とＭＫＫβＣＡＭ（抗ＭＫＫ６）の過剰発現とＦｌａｇ−ｐ３８（抗リン−ｐ３８）の活性化を示す。図４Ｂ：これらの免疫沈降物を１５ｍｌのＭ２バッファーで３回、ＡＴＰを含まないリン酸化バッファー（１５ｍＭ  ＮａＦ、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５および１０ｍＭ酢酸マグネシウム）１５ｍｌで２回洗浄した。最後の洗浄工程で、アガロース−免疫複合体を１ｍｌのバッファーに再懸濁させ、各点の１０％を分離し、Ｆｌａｇ−ｐ３８の免疫沈降と対比させた（Ｂのグラフに挿入したパネル）。キナーゼアッセイは、基質としてＡＰＲＴＰＧＧＲＲペプチド（もとはＣａｌｂｉｏＣｈｅｍにより提供され、その後、ＣＢＭＳＯのＳｅｒｖｉｃｉｏ  ｄｅ  Ｑｕｉｍｉｃａ  ｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ）により合成）を用い、免疫沈降したＦｌａｇ−ｐ３８を用いて実施した。これらの反応は、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１５ｍＭ  ＮａＦ、５０μＭ  ＡＴＰおよび５００〜１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰおよび２ｍＭのペプチド基質からなるリン酸化バッファー中、最終量２５μｌで実施した。（＋ＳＢ）と明示されている場合には、このin vitro反応にＳＢ２０３５８０を終濃度０．５μＭで加えた。３０℃で３０分間リン酸化させた後、１５μｌの３０％ＴＣＡを加えることで反応を停止させた。タンパク質を遠心分離（２５０００ｘｇ、１５分、４℃）により沈降させ、各反応からリン酸化されたペプチドを含む上清を回収した。Ｗｈａｔｍａｎ  Ｐ８１濾紙を１ｃｍ×１ｃｍ角に切り取ったものをこのペプチド溶液に浸した。これらを乾燥させ、７５ｍＭリン酸で十分洗浄し、吸収されたペプチドが組み込んでいる放射活性をＣｅｒｅｎｋｏｖで定量した。これらの活性レベルをＭＫＫ６ＣＡＭの不在下のＦｌａｇ−３８（ＣＴＲＬ）によるペプチド基質のリン酸化と対比させる。
【図５】ＧＲＫ２レベルの低下がin situにおけるＭＫＫ６ＣＡＭによるｐ３８の活性化をより大きくすることを示す。図５Ａ：Ｍ６プレートに播種したＨＥＫ２９３細胞を１５０ｎｇのｐＣＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−ｐ３８α、５０ｎｇのｐＣＤＮＡ３−ＭＫＫ６ＣＡM、および０．５μｇから２μｇまで漸増量のｐＣＥＦＬ−ＧＲＫ２アンチセンス（ＡＳ）ベクター、または対照（Ｃ）として同量のｐＣＥＦＬ−ＥＧＦＰで一時的にトランスフェクトした。全点で、全ＤＮＡ量をエンプティーｐＣＥＦＬベクターとともに完全に用いた。これらの細胞を溶解させ、各点で、全量のＧＲＫ２（上のパネル、抗ＰＦ２）、ｐ３８活性化  （中段のパネル、抗リン−ｐ３８）および全ｐ３８（下のパネル、抗ｐ３８Ｎ）の免疫検出を行った。代表的な実験の２μｇ点（ＧＦＰおよびアンチセンス）からのデータをグラフに示す。この２つの条件の各々のｐ３８活性化レベルを、ＭＫＫ６ＣＡＭを含まない個々の対照と対比させた。図５Ｂ：定常のｐ３８活性化はＧＲＫ２の量により調整される。ＨＥＫ２９３細胞のＭ６プレートを１００ｎｇのｐＣＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−ｐ３８α、また、０．５μｇ〜２μｇのｐＣＥＦＬ−ＧＲＫ２アンチセンスまたはｐＣＥＦＬ−ＥＧＦＰで一時的にトランスフェクトした。各点の全ＤＮＡ量をｐＣＥＦＬとともに完全に用いた。全量のＧＲＫ２（抗ＰＦ２、上のパネル）、ｐ３８の活性化状態（中段のパネル、抗リン−ｐ３８、化学発光現像の際に過剰に露光したオートラジオグラフィー）および全ｐ３８（下のパネル、抗ｐ３８）を電気転写およびこれらの条件での免疫検出により評価した。独立した３回の試験から得られたデータの平均値（±ＳＥＭ）を図の下側のグラフに２反復で示す。スチューデントの両側ｔ検定の統計値（＊ｐ＜０．００５）を適用して有意性を判定した。
【図６Ａ】組み込み型構造決定因子を有するｐ３８のみがＧＲＫ２基質であることを示す。図６Ａ：ＧＳＴと融合したタンパク質（タンパク質スキームの黒い長方形）を、プラスミドｐＧＥＸ２Ｔ−ｐ３８α、ｐＧＥＸ４Ｔ−Ｍｘｉ２およびｐＧＥＸ４Ｔ−Ｍｘｉ２Δ１７で形質転換した細菌から精製した：ｐ３８α、Ｍｘｉ２およびＭｘｉ２Δ１７。Ｍｘｉｌアイソフォームは、ＧＲＫ２リン酸化部位の制限を試みるためにＣ末端切断型突然変異体として用いた。組換えＧＲＫ２（２００ｎＭ）をリン酸化バッファー（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、５０μＭ  ＡＴＰ、２０００〜３０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ）中、各融合タンパク質０．５μｇとともに３０℃で３０分間インキュベートした。ヘパリン（１５０ｎＭ）を特異的ＧＲＫ２阻害剤として含めた。ＳＤＳブレーキングバッファーを加えることで反応を停止させた。これらのサンプルを８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。同量のタンパク質が含まれていることを確認するため、まず、ゲルにおいてクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色により可視化した。次に、このゲルを乾燥させ、タンパク質に組み込まれている放射活性（３２Ｐ）を検出した。
【図６Ｂ】組み込み型構造決定因子を有するｐ３８のみがＧＲＫ２基質であることを示す。図６Ｂ：ｐ３８αの末端８０個のアミノ酸に相当する末端切断型ＧＳＴ−２８０−３６０ｐ３８タンパク質をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇａｔｅｗａｙ系により作製した。ｐ３８  Ｎ末端としてＭｘｉ２Δ１７、Ｃ末端として２８０−３６０  ｐ３８、そして全ｐ３８αを用い、Ａ節に記載したものと同じ条件でリン酸化アッセイを行った。リン酸化はオートラジオグラフィー（３２Ｐ）により検出し、これらのアッセイに用いたタンパク質量の対照実験を、抗ＧＳＴ抗体を用いたウエスタンブロット法により並行して行った。リン酸化されていないＧＳＴ−２８０−３６０ｐ３８タンパク質の存在は明らかに見られた。ＳＴＤ、標準分子量タンパク質の移動度。
【図７】ＧＲＫ２はｐ３８を１残基でリン酸化することを示す。図７Ａ：ＧＲＫ２によるｐ３８のリン酸化を二次元電気泳動で分析し、これは従前に記載したものと同じ条件で行った。等電点電気泳動ローディングバッファーを加えることで反応を停止させた。電気泳動の一次元目はｐＨ３〜１０の両性電解質勾配で行った。二次元目は８％ポリアクリルアミドゲルにより分離した。両タンパク質（ＧＲＫ２  ７９．６ｋＤａ；ＧＳＴ−ｐ３８  ６８ｋＤａ）の移動度を矢印で示す。図７Ｂ：非放射性リン酸化アッセイからのサンプルを、プロテオミクスシーケンシングを目的としてゲルに流した。バンドを可視化するためにゲルを染色し、ＧＳＴ−ｐ３８に相当するバンドをゲルから切り取り、トリプシン消化を行った。得られたペプチドをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより分析した。得られた質量スペクトルの領域の拡大図を示すが、ＧＲＫ２によるリン酸化から得られたサンプルのみにリン酸化ペプチドの存在（質量１，９４５．３３０に相当）が検出された。
【図８】ＧＲＫ２はｐ３８を１残基でリン酸化することを示す。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｂｒｏｋｅｒ  Ａｕｔｏｆｌｅｘモデル）で得られたデータによれば、リン酸化を有する候補としてのトリプシン処理ペプチド：ＬＴＤＤＨＶＱＦＬＩＹＱＩＬＲが同定された。これらの示唆を確認するため、サンプルを、アナライザーが候補ペプチドのみをフラグメント化するようにＳＩＭ（ｓｉｎｇｌｅ  ｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）モードで作動するＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＩＴ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｄｅｃａ−ＸＰモデル）により分離した。一連のもの（フラグメント化の過程に応じてｂｎまたはｙ”ｎと呼ばれる）を認識可能なペプチド質量に割り付けた。リン酸化サンプルからの、分析したペプチド中に存在するトレオニンにおけるリン酸化を示すΔｂ８系に相当する質量を下のスペクトルに示す。同様に、ペプチドの全質量（黄色い楕円内）を両場合で確認した。図の右側に挿入した小さな枠は、リン酸化サンプルおよび対照からの同じペプチドのＨＰＬＣカラムにおける溶出の違いに関する情報を示す。親水性が大きくなるほど、数十秒早く溶出する。
【図９】in vitroにおいてｐ３８  Ｔ１２３ＡおよびＴ１２３Ｄ突然変異体はＧＲＫ２によりリン酸化されない。図９Ａ：ＧＳＴと融合したｐ３８Ｔ１２３Ａおよびｐ３８Ｔ１２３Ｄタンパク質は、原核生物発現プラスミドｐＧＥＸ２Ｔにおいて指定突然変異誘発により作製した。組換えＧＳＴ−ｐ３８Ｔ１２３ＡおよびＧＳＴ−ｐ３８Ｔ１２３Ｄタンパク質がＧＲＫ２基質となる能力を、野生型ＧＳＴ−ｐ３８ＷＴタンパク質と比べ、図に示した終濃度でアッセイした。上のパネルは得られたリン酸化（３２Ｐ）を表し、下のパネルはアッセイで抗ｐ３８Ｎ  ＷＢにより使用された組換えタンパク質の量を示す。図９Ｂ：ｐ３８αの代表的スキーム。キナーゼドメイン伸張、仮説としてＧＲＫ２により調節されるＴＧＹ活性化セグメントおよびＬＴＤＤ配列の同じものの内での位置など、機能的特徴が強調されている。基質の調節およびアクチベーターの会合に最初に関与するＣＤモチーフも強調されている。
【図１０】トレオニン１２３は、ｐ３８アクチベーターと基質のドッキング溝(docking groove)の外面に位置する保存性の高い残基であることを示す。示されている複数のアライメントは、Ｐｅｒｄｉｇｕｅｒｏ博士によるＣｌｕｓｔａｌＸプログラム(http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalX/)により作製されたものである。波線はアライメントを調整するためのギャップの導入である。総てのアイソフォームで同じ残基が黄色の背景に赤で強調され、青および緑の背景はそれぞれアラインされたタンパク質の間での大分布または小分布に応じた保存的置換を示す。非保存的アミノ酸は白い背景のままで残してある。コンセンサスは複数の各アライメントの末尾に赤い楕円で示され、トレオニン１２３領域が強調され、加えて下側の配列比較に矢印で示されている。
【図１１】ｐ３８Ｔ１２３Ｄ変異体はin vitroにおいて、ＭＫＫ６ＣＡＭにより活性化されず、ＡＴＦ２に対するキナーゼ活性を欠いていることを示す。図１１Ａ：in vitroで、組換えＭＫＫ６ＣＡＭ（４０ｎｇ）リン酸化基質（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）として融合タンパク質ＧＳＴ−ｐ３８ＷＴ、ＧＳＴ−ｐ３８Ｔ１２３ＡおよびＧＳＴ−ｐ３８Ｔ１２３Ｄ（１５０ｎＭ）を用いてリン酸化アッセイ（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１５ｍＭ  ＮａＦ、ＡＴＰ５０μＭおよび１０００〜２０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ）を行った。これらの反応は３０℃で３０分間行い、タンパク質を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。各点におけるｐ３８の量をクーマシーブルー染色により可視化した。その後、各ｐ３８アイソフォームの放射活性を測定した。オートラジオグラフィー（３２Ｐ）は、２反復で行った３つの独立したアッセイの代表的な実験を示す。図１１Ｂ：これらの同じアッセイでは、ＭＫＫ６ＣＡＭにより活性化されるＧＳＴ−ｐ３８ＷＴ、ＧＳＴ−ｐ３８Ｔ１２３ＡおよびＧＳＴ−ｐ３８Ｔ１２３Ｄが２μｇのＧＳＴ−ＡＴＦ２をリン酸化できるかどうかを評価する。全ＧＳＴ−ＡＴＦ２対照（クーマシーブルー）の代表的なオートラジオグラフィー（３２Ｐ）が添付されている。
【図１２】ｐ３８トレオニン１２３はＭＥＦ２Ａ基質に対する適切な触媒活性に必要であることを示す。図１２Ａ：in vitroにおいて、組換えＭＫＫ６ＣＡＭ（４０ｎｇ）および２μｇのＧＳＴ−ＭＥＦ２Ａの存在下（＋）または不在下（−）で、図に示されている融合タンパク質を用いてリン酸化を行った。アッセイは３０分間行った。これらのタンパク質を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＣＢＢで染色し、組み込まれた放射活性（３２Ｐ）を検出した。独立に行った３つのアッセイの代表的な実験のパネルを示す。図１２Ｂ：ＭＫＫ６ＣＡＭアクチベーターの不在下での３つのｐ３８融合タンパク質のベースライン活性を従前に記載した条件で評価した。長時間露光した後の代表的なオートラジオグラフィーを示す。
【図１３】ｐ３８  Ｔ１２３Ｄ突然変異体は、in situにおいてＭＫＫ６ＣＡＭによっては野生型ｐ３８によるよりも活性化が低いことを示す。従前に記載したものと同様の過剰発現試験で、Ｍ６に常に２反復で播種したＨＥＫ２９３細胞を、１５０ｎｇのｐＣＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−ｐ３８α  ＷＴ、またはｐＣＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−ｐ３８α  Ｔ１２３Ｄおよび５０ｎｇのｐＣＤＮＡ３−ＭＫＫ６ＣＡＭ（またはエンプティーｐＣＤＮＡ３）でトランスフェクトした。抗リン−ｐ３８抗体によるｐ３８の活性化を評価した。これら２つのアイソフォームの各々について、ＭＫＫ６ＣＡＭによる活性化をベースラインの状態と対比させ、特定の活性化レベルを得る。各実験で１００％の活性化をｐ３８α  ＷＴの活性化とした。３つの独立し実験のデータ（±ＳＥＭ）を示す。スチューデントの両側ｔ検定を行い、＊ｐ＜０．０００１を得た。右側のパネル（ウエスタンブロット）がこれらの実験の１つを示す。
【図１４】ｐ３８  Ｔ１２３Ｄ突然変異体は基質と結合せず、ＭＫＫ６と会合しないか、またはＭＫＫ６によりリン酸化されないことを示す。精製したＧＳＴ−ｐ３８およびそのＴ１２３突然変異体（３００ｎＭ）を、陰性対照としてＧＳＴを用いたプルダウンアッセイにおいて、精製ＭＫＫ６（３ｎＭ）またはＨｉｓタグ付きＭＡＰＫＡＰＫ２（ＭＫ２，２０ｎＭ）の存在下でインキュベートした。沈降したタンパク質を、抗ＭＫＫ６抗体、抗ヒスチジン抗体（Ｈｉｓ−ＭＫ２の場合）または抗ＧＳＴ抗体（ＧＳＴ−ｐ３８全量の場合）を用い、ウエスタンブロットにより現像した。総てのパネルにおいて、結果は２反復で行った３つの独立した実験の代表例である。
【図１５】ＧＲＫ２がどのようにして繊維芽細胞から脂肪細胞へのｐ３８依存性の分化を低下させるかを示す。ｐＣＤＮＡ３−ＧＲＫ２およびｐＣＤＮＡ３−ＧＲＫ２Ｋ２２０Ｒで安定してトランスフェクトされた３Ｔ３Ｌ１系統を作出した。各細胞系統で得られ、３Ｔ３Ｌ１のレベルを比較するＧＲＫ２（抗ＧＲＫ２）発現対照を含める。これらの細胞に対して標準的な分化処理を行い、１５日目に細胞をホルマリンで固定し、脂肪細胞が蓄積している脂肪と結合する親油性染色剤であるオイルレッドで染色した。脂肪細胞の表現型（赤色）を有する細胞を顕微鏡下、計２５視野で計数した。２つの独立した実験の代表的な写真を２反復で示す。分化過程でインスリンによる刺激の無い３Ｔ３Ｌ１細胞（対照）の写真も含めてある。グラフはこれらの実験の脂肪細胞数（±ＳＥＭ）を表している。３Ｔ３Ｌ１細胞に対する各安定系統のスチューデントの両側ｔ検定を行い、＊ｐ＜０．０００１を得た。１０μＭのＳＢ２０３５８０での薬理処理によるｐ３８依存対照実験も並行して行った。
【図１６】ヒト培養細胞から免疫沈降したｐ３８の抗リン−Ｔｈｒ１２３抗体による認識とＧＲＫ２によるｐ３８のin vitroリン酸化を示す。図１６Ａ：ＨＥＫ２９３細胞をマウスＦｌａｇ−ｐ３８αおよびＧＲＫ２またはその不活性突然変異体（ＧＲＫ２−Ｋ２２０Ｒ）の発現ベクターでトランスフェクトした。溶解前、血清を含まずに１６時間細胞を培養した。Ｆｌａｇ−ｐ３８を抗ｆｌａｇ（Ｍ２）抗体により免疫沈降（ＩＰＰ）させ、電気泳動および転写の後、リン酸化されたタンパク質を、アフィニティーカラムで精製した特異的抗体（Ｐ−ｐ３８−Ｔ１２３、希釈溶液１：２００）を用いたウエスタンブロット（ＷＢ）により、Ｔｈｒ１２３において検出した。同じ膜を全抗ｐ３８（ｐ３８）でも現像し、免疫沈降前の細胞抽出液（細胞溶解液）中に含まれるタンパク質に相当する別の膜も抗ＧＲＫ２  ４３６−６８９（ＧＲＫ２）で現像した。図１６Ｂ：Ｓ  ＧＳＴ−ｐ３８（５０ｎＭ）を単独、または精製ＧＲＫ２（１５０ｎＭ）または４０ｎｇの構成的に活性なＭＫＫ６ＣＡＭとともに、リン酸化バッファー中、非放射性標識ＡＴＰの存在下、３０℃で３０分間インキュベートした。上のパネルはリン酸化型のｐ３８のＴｈｒ１２３に対するポリクローナル抗体で現像したものである。中段のパネルはｐ３８のＴｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２残基のリン特異的抗体（抗Ｐｐ３８）とともにインキュベートしたものであり、下段の現像では全ｐ３８に対する抗体を用いた。
【図１７】抗リン抗体はトレオニン１２３においてＧＲＫ２によりリン酸化されたｐ３８を認識する（この条件でｐ３８のＴ１２３突然変異体は認識しないため）ことを示す。ＧＳＴ−ｐ３８ｗｔおよびＧＳＴ−ｐ３８Ｔ１２３Ａ（７０ｎＭ）を単独で、または精製ＧＲＫ２（２５ｎＭ）または組換えＭＫＫ６ＣＡＭ（２ｎｇ）とともにインキュベートした。なお、示されている場合には、ヘパリン（１００ｎｇ／μｌ）、特異的ＧＲＫ２阻害剤を加えた。ＧＳＴｐ３８タンパク質のリン酸化は、ウエスタンブロットにより、抗リンＴ１２３を用いて、また、全ＧＳＴ−ｐ３８は抗ＧＳＴを用いて分析した。データは３つの独立した実験の代表例である。
【図１８】ＧＲＫ２部分的依存性のマウスから抽出したマクロファージのリポ多糖に応答したｐ３８の活性化レベルとＴＮＦの分泌レベルを示す。野生型Ｃ５７ＢＬ／６（＋／＋）またはＧＲＫ２半接合性（＋／−）マウス由来の腹膜ミクロファージ。それらを２時間無刺激下に置いた後、培地に１６時間、細菌のリポ多糖（ＬＰＳ：０．５μｇ／ｍｌ）を加えた。炎症性サイトカイン（ＴＮＦα）の産生を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｔｒａｋ）により定量した。このプロセスがｐ３８活性に依存することを確認するため、ＬＰＳを加える前にＳＢ２０３５８０（３０μＭ）を３０分間用いた。４つの独立した実験で処理した１０個体のマウスの平均±ＳＤを示す。データはＭ２４の１穴当たり１０６細胞から得られたＴＮＦα分泌に相当する＊ｐ＜０．００５（スチューデントのｔ検定による）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年2月15日(2008.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８６】
【図１Ａ】ＧＲＫ２がin vitroにおいて直接ｐ３８をリン酸化することを示す。図１Ａは、ｐ３８がＧＲＫ２によりリン酸化されることを示す。バキュロウイルス系により精製した組換えＧＲＫ２（５０ｎＭ）を、ｐ３８リン酸化バッファー（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、５０μＭ  ＡＴＰ、２０００〜３０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ）中、ＧＲＫ２活性を阻害するためのヘパリン（５０ｎｇ／μｌ）を含み、または含まずに、最終量４０μｌで５０ｎＭの組換えｐ３８（ＧＳＴ−ｐ３８）とともに３０℃で３０分間インキュベートした。キナーゼ自己リン酸化対照も同じ条件で行った。ＳＤＳローディングバッファーを加えることで反応を停止させ、タンパク質を８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、オートラジオグラフィーにより現像した。
【図１Ｂ】ＧＲＫ２がin vitroにおいて直接ｐ３８をリン酸化することを示す。図１Ｂは、ＧＲＫ２が直接ｐ３８をリン酸化し、その自己リン酸化を促進しないことを示す。リン酸化反応は図１Ａに関して示した通りに行った。ヘパリンおよびＳＢ２０３５８０化合物、ＧＲＫ２およびｐ３８阻害剤をそれぞれ、個々のキナーゼの完全な阻害を保証するためにＩＣ５０濃度の１０倍、すなわち、ヘパリンでは１．５μＭ、ＳＢ２０３５８０では０．５μＭで用いた。使用基質は、ｐ３８に対してＭＢＰ（各点１４μｇ）およびカゼイン（各点７５μｇ）であった。ＳＤＳローディングバッファーを加えることで反応を停止させ、タンパク質を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、オートラジオグラフィーにより検出した。
【図１Ｃ】ＧＲＫ２がin vitroにおいて直接ｐ３８をリン酸化することを示す。図１Ｃは、ＧＲＫ２がその活性化セグメントのｐ３８をリン酸化しないことを示す。これらのリン酸化反応は、従前に記載した条件で放射性ＡＴＰの不在下で開始させた。４０ｎｇのＭＫＫ６ＣＡＭ（ＭＫＫ６／ＭＫＫ３，Ｕｐｓｔａｔｅ）を、in vitroにおけるＧＳＴ−ｐ３８のリン酸化に用いた。より大きなタンパク質の場合では、電気泳動分離後に検出用に用いる抗体は、ＧＲＫ２およびＧＳＴ−ｐ３８（ＧＳＴ−ＰＦ２融合タンパク質（ここで、ＰＦ２はＧＲＫ２のＣ末端断片である）に対する抗体を用いて本発明者らの研究室で作製した抗ＰＦ２抗体ポリクローナル血清）を認識する。ｐ３８の活性化状態を検出するために用いるＴ１８０／Ｙ１８２のリン酸特異的抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇのものである。
【図１Ｄ】ＧＲＫ２がin vitroにおいて直接ｐ３８をリン酸化することを示す。図１Ｄは、ＧＲＫ２によるｐ３８のリン酸化の時間依存性を示す。インキュベーション時間が、示されているように０〜９０分の範囲であること以外は、従前に示したものと同じ条件でリン酸化させた。両タンパク質（ＧＲＫ２  ７９．６ｋＤａ、ＧＳＴ−ｐ３８  ６８ｋＤａ）の移動度を矢印で示す。Ｃｅｒｅｎｋｏｖにより定量した後、切り取ったゲルのバンドで得られたデータを右側に示す。
【図１Ｅ】ＧＲＫ２がin vitroにおいて直接ｐ３８をリン酸化することを示す。図１Ｅは、リン酸化速度パラメーターを示す。切片Ｄのデータについては、１５分の反応を、初速条件のリン酸化速度定数を決定するための時間とみなした。リン酸化反応は、ＧＲＫ２濃度を固定したまま（２５ｎＭ）、ｐ３８濃度を１２．５から４００ｎｍまで変化させてすでに記載したようにして行った。ＳＤＳローディングバッファーを加えることで反応を停止させ、タンパク質を８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、オートラジオグラフィーにより検出し、Ｃｅｒｅｎｋｏｖにより定量した。速度パラメーター：ミカエリス−メンテン定数（Ｋｍ＝７９．５６ｎＭ）および最大速度（Ｓｍａｘ＝０．９ｎｍｏｌの組み込みＰＯ４３−／ｍｇ  ＧＲＫ２−１分−１）を導き出すことができるアルゴリズムを提供するＫａｌｅｉｄａｇｒａｐｈプログラムでグラフを作製した。
【図２Ａ】ＧＲＫ２およびｐ３８は独立にβ２−アドレナリン作動性（β２−ＡＲ）受容体刺激に関連することを示す。図２Ａ：ＨＥＫ２９３細胞をｐＣＤＮＡ３−ＧＲＫ２、ｐＢＣ１２ＢＩ−β２−ＡＲおよびｐＣＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−ｐ３８α（各ＤＮＡ１μｇ／ｐ６０）ベクターで一時的にトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後、２時間血清飢餓後、細胞をアドレナリン作動性アゴニストイソプロテレノール（ＩＳＯ、１０μＭ）で５もしくは１０分間刺激したか、または刺激しなかった（０分、ＩＳＯ）。同様に、β２−ＡＲ受容体を過剰発現しない細胞を０．５Ｍ  ＮａＣｌで１５分間刺激した。これらの細胞を、アガロースと結合したＭ２抗Ｆｌａｇ抗体との免疫沈降に好適なバッファーに可溶化し、これらの細胞溶解液の一部（１０％）を過剰発現対照（細胞溶解液パネル）用に採取した後、これらの免疫複合体を４℃で一晩インキュベートした。免疫沈降したタンパク質（Ｉｐ抗Ｆｌａｇ）を電気泳動ブレーキングバッファーに再懸濁させ、結合したタンパク質を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で分離した。電気転写の後、タンパク質を抗ｐ３８で、また、ＧＲＫ２に対する抗体、抗ＰＦ２で検出した（それぞれ上のパネルと下のパネル）。この図には、Ｆｌａｇ−ｐ３８αの不在下、そして、１０μＭのイソプロテレノール刺激の不在下の陰性免疫沈降対照（Ｃｎｅｇ）も含まれている。この細胞溶解液パネルでは、上のＧＲＫ２、および下のｐ３８活性化状態は抗リン−ｐ３８抗体により検出されたものである（表１参照）。
【図２Ｂ】ＧＲＫ２およびｐ３８は独立にβ２−アドレナリン作動性（β２−ＡＲ）受容体刺激に関連することを示す。図２Ｂ：２Ａに記載したものと同じアプローチで、過剰発現タンパク質をＧＲＫ２に対する抗体、抗ＰＦ２で免疫沈降させ、その免疫共沈降物を、各刺激点（イソプロテレノール０分および５分、左上のパネル）において抗ｐ３８で検出した。Ｆｌａｇ−ｐ３８発現制御（上側）およびＧＲＫ２発現制御（下側）および全免疫沈降ＧＲＫ２（左下のパネル）を隣のパネルに示す。１０μＭイソプロテレノールに曝して５分後に刺激された両タンパク質間の会合を再び検出する。
【図２Ｃ】ＧＲＫ２およびｐ３８は独立にβ２−アドレナリン作動性（β２−ＡＲ）受容体刺激に関連することを示す。図２Ｃ：この場合には、内因性のＧＲＫ２がｐ３８よりも低い総量（０．５μｇＤＮＡ）で免疫共沈降したことを確認するために、β２−ＡＲおよびＦｌａｇ−ｐ３８αをコードするベクターのみをＨＥＫ２９３細胞に導入した。１０μＭイソプロテレノールで処理して５分後にＦｌａｇ−ｐ３８αとＧＲＫ２間の会合が生じる（左上および左下のパネルを参照）。右側のパネルにより、細胞溶解液におけるＧＲＫ２の発現（上側、抗ＰＦ２）およびｐ３８の発現（下側、抗ｐ３８）が確認される。
【図２Ｄ】ＧＲＫ２およびｐ３８は独立にβ２−アドレナリン作動性（β２−ＡＲ）受容体刺激に関連することを示す。図２Ｄ：Ａ節に記載したものと同じ実験で、触媒的に不活性なＧＲＫ２−Ｋ２２０Ｒ突然変異体がＦｌａｇ−ｐ３８と免疫共沈降することができるかどうかを調べた。上の２つのパネルはそれぞれ、２つのＧＲＫ２アイソフォームの免疫共沈降と総免疫強沈降ｐ３８を示す。この２つの細胞溶解液パネルは、ＧＲＫ２とＧＲＫ２−Ｋ２２０Ｒの過剰発現（上側、抗ＰＦ２）ならびに各点でのＦｌａｇ−ｐ３８活性化状態（下側、抗リン−ｐ３８）を示す。Ａで記載したように、Ｍ２抗Ｆｌａｇ−アガロース抗体の非特異的(non-nspecific)免疫沈降対照（Ｃｎｅｇ）を実施した。
【図３】ＧＲＫ２がどのようにしてＭＫＫ６ＣＡＭによるｐ３８の活性化を低下させ得るのかを示す。図３Ａ：通常６または１２穴（Ｍ６またはＭ１２）のマルチウェルプレート中に播種したＨＥＫ２９３細胞をｐＣＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−ｐ３８α、ｐＣＤＮＡ３−ＭＫＫ６ＣＡＭおよび漸増量のｐＣＤＮＡ３−ＧＲＫ２ベクターで一次的にトランスフェクトした。この実験では、Ｍ６プレートを用い、ＤＮＡ導入量は、Ｆｌａｇ−ｐ３８  １００ｎｇ、ＭＫＫ６ＣＡＭ  １００ｎｇおよびＧＲＫ２  ０〜１μｇとした。総ての点で、この全ＤＮＡ量をｐＣＥＦＬ−ＥＧＦＰおよび対照（ＣＴＲＬ）の場合にはｐＣＤＮＡ３−ＭＫＫ６ＣＡＭの代わりにエンプティーｐＣＤＮＡ３とともに完全に用いた。４８時間後、これらの細胞をＭ２バッファー中に溶解させることで採取した。上のパネルは過剰発現ＧＲＫ２を示す。ｐ３８活性化状態は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇの抗リン−ｐ３８で評価し、そして最初の免疫検出の抗体を放出した後に、同じ会社の全抗ｐ３８で検出した。現像時の低分解飽和を避けるために、わずかに露光したオートラジオグラフィーが示されていることに注意。図３Ｂ：ｐＣＤＮＡ３−ＧＲＫ２で安定にトランスフェクトされ、従って２種の異なるＧＲＫ２レベルを過剰発現するＥＢＮＡ２９３細胞の２倍培養物をＦｌａｇ−ｐ３８およびＭＫＫ６ＣＡＭでトランスフェクトした。Ｆｌａｇ−ｐ３８活性化状態をＡの場合と同様に測定した。さらに、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの抗ＭＫＫ６／ＳＫＫ３抗体を用いて適正なＭＫＫ６ＣＡＭ発現を確認した。
【図４】これらの実験は、ＧＲＫ２がｐ３８の触媒活性を低下させることを示す。図４Ａ：ｐ６０に播種したＨＥＫ２９３細胞を０．５μｇのｐＣＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−ｐ３８α、０．５μｇのｐＣＤＮＡ３−ＭＫＫ６ＣＡＭ（または対照では０．５μｇのエンプティーｐＣＤＮＡ３、ＣＴＲＬ）、および１または２μｇのｐＣＤＮＡ３−ＧＲＫ２（＋）ベクターで一時的にトランスフェクトした（各点２反復で実施）。ｐＣＤＮＡ３−ＧＲＫ２μｇの代わりにｐＣＥＦＬ−ＥＧＦＰ（−）を用い、対照実験を並行して行った。全ＤＮＡ量をエンプティーｐＣＤＮＡ３とともに完全に用いた。４８時間後、これらの細胞を溶解させ、細胞溶解液の一部を採取し、それらからＦｌａｇ−ｐ３８を免疫沈降させた。Ａのパネルは、ＧＲＫ２（抗ＰＦ２）とＭＫＫβＣＡＭ（抗ＭＫＫ６）の過剰発現とＦｌａｇ−ｐ３８（抗リン−ｐ３８）の活性化を示す。図４Ｂ：これらの免疫沈降物を１５ｍｌのＭ２バッファーで３回、ＡＴＰを含まないリン酸化バッファー（１５ｍＭ  ＮａＦ、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５および１０ｍＭ酢酸マグネシウム）１５ｍｌで２回洗浄した。最後の洗浄工程で、アガロース−免疫複合体を１ｍｌのバッファーに再懸濁させ、各点の１０％を分離し、Ｆｌａｇ−ｐ３８の免疫沈降と対比させた（Ｂのグラフに挿入したパネル）。キナーゼアッセイは、基質としてＡＰＲＴＰＧＧＲＲペプチド（もとはＣａｌｂｉｏＣｈｅｍにより提供され、その後、ＣＢＭＳＯのＳｅｒｖｉｃｉｏ  ｄｅ  Ｑｕｉｍｉｃａ  ｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ）により合成）を用い、免疫沈降したＦｌａｇ−ｐ３８を用いて実施した。これらの反応は、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１５ｍＭ  ＮａＦ、５０μＭ  ＡＴＰおよび５００〜１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰおよび２ｍＭのペプチド基質からなるリン酸化バッファー中、最終量２５μｌで実施した。（＋ＳＢ）と明示されている場合には、このin vitro反応にＳＢ２０３５８０を終濃度０．５μＭで加えた。３０℃で３０分間リン酸化させた後、１５μｌの３０％ＴＣＡを加えることで反応を停止させた。タンパク質を遠心分離（２５０００ｘｇ、１５分、４℃）により沈降させ、各反応からリン酸化されたペプチドを含む上清を回収した。Ｗｈａｔｍａｎ  Ｐ８１濾紙を１ｃｍ×１ｃｍ角に切り取ったものをこのペプチド溶液に浸した。これらを乾燥させ、７５ｍＭリン酸で十分洗浄し、吸収されたペプチドが組み込んでいる放射活性をＣｅｒｅｎｋｏｖで定量した。これらの活性レベルをＭＫＫ６ＣＡＭの不在下のＦｌａｇ−３８（ＣＴＲＬ）によるペプチド基質のリン酸化と対比させる。
【図５】ＧＲＫ２レベルの低下がin situにおけるＭＫＫ６ＣＡＭによるｐ３８の活性化をより大きくすることを示す。図５Ａ：Ｍ６プレートに播種したＨＥＫ２９３細胞を１５０ｎｇのｐＣＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−ｐ３８α、５０ｎｇのｐＣＤＮＡ３−ＭＫＫ６ＣＡM、および０．５μｇから２μｇまで漸増量のｐＣＥＦＬ−ＧＲＫ２アンチセンス（ＡＳ）ベクター、または対照（Ｃ）として同量のｐＣＥＦＬ−ＥＧＦＰで一時的にトランスフェクトした。全点で、全ＤＮＡ量をエンプティーｐＣＥＦＬベクターとともに完全に用いた。これらの細胞を溶解させ、各点で、全量のＧＲＫ２（上のパネル、抗ＰＦ２）、ｐ３８活性化  （中段のパネル、抗リン−ｐ３８）および全ｐ３８（下のパネル、抗ｐ３８Ｎ）の免疫検出を行った。代表的な実験の２μｇ点（ＧＦＰおよびアンチセンス）からのデータをグラフに示す。この２つの条件の各々のｐ３８活性化レベルを、ＭＫＫ６ＣＡＭを含まない個々の対照と対比させた。図５Ｂ：定常のｐ３８活性化はＧＲＫ２の量により調整される。ＨＥＫ２９３細胞のＭ６プレートを１００ｎｇのｐＣＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−ｐ３８α、また、０．５μｇ〜２μｇのｐＣＥＦＬ−ＧＲＫ２アンチセンスまたはｐＣＥＦＬ−ＥＧＦＰで一時的にトランスフェクトした。各点の全ＤＮＡ量をｐＣＥＦＬとともに完全に用いた。全量のＧＲＫ２（抗ＰＦ２、上のパネル）、ｐ３８の活性化状態（中段のパネル、抗リン−ｐ３８、化学発光現像の際に過剰に露光したオートラジオグラフィー）および全ｐ３８（下のパネル、抗ｐ３８）を電気転写およびこれらの条件での免疫検出により評価した。独立した３回の試験から得られたデータの平均値（±ＳＥＭ）を図の下側のグラフに２反復で示す。スチューデントの両側ｔ検定の統計値（＊ｐ＜０．００５）を適用して有意性を判定した。
【図６Ａ】組み込み型構造決定因子を有するｐ３８のみがＧＲＫ２基質であることを示す。図６Ａ：ＧＳＴと融合したタンパク質（タンパク質スキームの黒い長方形）を、プラスミドｐＧＥＸ２Ｔ−ｐ３８α、ｐＧＥＸ４Ｔ−Ｍｘｉ２およびｐＧＥＸ４Ｔ−Ｍｘｉ２Δ１７で形質転換した細菌から精製した：ｐ３８α、Ｍｘｉ２およびＭｘｉ２Δ１７。Ｍｘｉｌアイソフォームは、ＧＲＫ２リン酸化部位の制限を試みるためにＣ末端切断型突然変異体として用いた。組換えＧＲＫ２（２００ｎＭ）をリン酸化バッファー（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、５０μＭ  ＡＴＰ、２０００〜３０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ）中、各融合タンパク質０．５μｇとともに３０℃で３０分間インキュベートした。ヘパリン（１５０ｎＭ）を特異的ＧＲＫ２阻害剤として含めた。ＳＤＳブレーキングバッファーを加えることで反応を停止させた。これらのサンプルを８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。同量のタンパク質が含まれていることを確認するため、まず、ゲルにおいてクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色により可視化した。次に、このゲルを乾燥させ、タンパク質に組み込まれている放射活性（３２Ｐ）を検出した。
【図６Ｂ】組み込み型構造決定因子を有するｐ３８のみがＧＲＫ２基質であることを示す。図６Ｂ：ｐ３８αの末端８０個のアミノ酸に相当する末端切断型ＧＳＴ−２８０−３６０ｐ３８タンパク質をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇａｔｅｗａｙ系により作製した。ｐ３８  Ｎ末端としてＭｘｉ２Δ１７、Ｃ末端として２８０−３６０  ｐ３８、そして全ｐ３８αを用い、Ａ節に記載したものと同じ条件でリン酸化アッセイを行った。リン酸化はオートラジオグラフィー（３２Ｐ）により検出し、これらのアッセイに用いたタンパク質量の対照実験を、抗ＧＳＴ抗体を用いたウエスタンブロット法により並行して行った。リン酸化されていないＧＳＴ−２８０−３６０ｐ３８タンパク質の存在は明らかに見られた。ＳＴＤ、標準分子量タンパク質の移動度。
【図７】ＧＲＫ２はｐ３８を１残基でリン酸化することを示す。図７Ａ：ＧＲＫ２によるｐ３８のリン酸化を二次元電気泳動で分析し、これは従前に記載したものと同じ条件で行った。等電点電気泳動ローディングバッファーを加えることで反応を停止させた。電気泳動の一次元目はｐＨ３〜１０の両性電解質勾配で行った。二次元目は８％ポリアクリルアミドゲルにより分離した。両タンパク質（ＧＲＫ２  ７９．６ｋＤａ；ＧＳＴ−ｐ３８  ６８ｋＤａ）の移動度を矢印で示す。図７Ｂ：非放射性リン酸化アッセイからのサンプルを、プロテオミクスシーケンシングを目的としてゲルに流した。バンドを可視化するためにゲルを染色し、ＧＳＴ−ｐ３８に相当するバンドをゲルから切り取り、トリプシン消化を行った。得られたペプチドをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより分析した。得られた質量スペクトルの領域の拡大図を示すが、ＧＲＫ２によるリン酸化から得られたサンプルのみにリン酸化ペプチドの存在（質量１，９４５．３３０に相当）が検出された。
【図８−１】ＧＲＫ２はｐ３８を１残基でリン酸化することを示す。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｂｒｏｋｅｒ  Ａｕｔｏｆｌｅｘモデル）で得られたデータによれば、リン酸化を有する候補としてのトリプシン処理ペプチド：ＬＴＤＤＨＶＱＦＬＩＹＱＩＬＲが同定された。これらの示唆を確認するため、サンプルを、アナライザーが候補ペプチドのみをフラグメント化するようにＳＩＭ（ｓｉｎｇｌｅ  ｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）モードで作動するＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＩＴ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｄｅｃａ−ＸＰモデル）により分離した。一連のもの（フラグメント化の過程に応じてｂｎまたはｙ”ｎと呼ばれる）を認識可能なペプチド質量に割り付けた。リン酸化サンプルからの、分析したペプチド中に存在するトレオニンにおけるリン酸化を示すΔｂ８系に相当する質量を下のスペクトルに示す。同様に、ペプチドの全質量（黄色い楕円内）を両場合で確認した。
【図８−２】図８−１に関連して、リン酸化サンプルおよび対照からの同じペプチドのＨＰＬＣカラムにおける溶出の違いに関する情報を示す。親水性が大きくなるほど、数十秒早く溶出する。
【図９】in vitroにおいてｐ３８  Ｔ１２３ＡおよびＴ１２３Ｄ突然変異体はＧＲＫ２によりリン酸化されない。図９Ａ：ＧＳＴと融合したｐ３８Ｔ１２３Ａおよびｐ３８Ｔ１２３Ｄタンパク質は、原核生物発現プラスミドｐＧＥＸ２Ｔにおいて指定突然変異誘発により作製した。組換えＧＳＴ−ｐ３８Ｔ１２３ＡおよびＧＳＴ−ｐ３８Ｔ１２３Ｄタンパク質がＧＲＫ２基質となる能力を、野生型ＧＳＴ−ｐ３８ＷＴタンパク質と比べ、図に示した終濃度でアッセイした。上のパネルは得られたリン酸化（３２Ｐ）を表し、下のパネルはアッセイで抗ｐ３８Ｎ  ＷＢにより使用された組換えタンパク質の量を示す。図９Ｂ：ｐ３８αの代表的スキーム。キナーゼドメイン伸張、仮説としてＧＲＫ２により調節されるＴＧＹ活性化セグメントおよびＬＴＤＤ配列の同じものの内での位置など、機能的特徴が強調されている。基質の調節およびアクチベーターの会合に最初に関与するＣＤモチーフも強調されている。
【図１０】トレオニン１２３は、ｐ３８アクチベーターと基質のドッキング溝(docking groove)の外面に位置する保存性の高い残基であることを示す。示されている複数のアライメントは、Ｐｅｒｄｉｇｕｅｒｏ博士によるＣｌｕｓｔａｌＸプログラム(http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalX/)により作製されたものである。波線はアライメントを調整するためのギャップの導入である。総てのアイソフォームで同じ残基が黄色の背景に赤で強調され、青および緑の背景はそれぞれアラインされたタンパク質の間での大分布または小分布に応じた保存的置換を示す。非保存的アミノ酸は白い背景のままで残してある。コンセンサスは複数の各アライメントの末尾に赤い楕円で示され、トレオニン１２３領域が強調され、加えて下側の配列比較に矢印で示されている。
【図１１】ｐ３８Ｔ１２３Ｄ変異体はin vitroにおいて、ＭＫＫ６ＣＡＭにより活性化されず、ＡＴＦ２に対するキナーゼ活性を欠いていることを示す。図１１Ａ：in vitroで、組換えＭＫＫ６ＣＡＭ（４０ｎｇ）リン酸化基質（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）として融合タンパク質ＧＳＴ−ｐ３８ＷＴ、ＧＳＴ−ｐ３８Ｔ１２３ＡおよびＧＳＴ−ｐ３８Ｔ１２３Ｄ（１５０ｎＭ）を用いてリン酸化アッセイ（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１５ｍＭ  ＮａＦ、ＡＴＰ５０μＭおよび１０００〜２０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ）を行った。これらの反応は３０℃で３０分間行い、タンパク質を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。各点におけるｐ３８の量をクーマシーブルー染色により可視化した。その後、各ｐ３８アイソフォームの放射活性を測定した。オートラジオグラフィー（３２Ｐ）は、２反復で行った３つの独立したアッセイの代表的な実験を示す。図１１Ｂ：これらの同じアッセイでは、ＭＫＫ６ＣＡＭにより活性化されるＧＳＴ−ｐ３８ＷＴ、ＧＳＴ−ｐ３８Ｔ１２３ＡおよびＧＳＴ−ｐ３８Ｔ１２３Ｄが２μｇのＧＳＴ−ＡＴＦ２をリン酸化できるかどうかを評価する。全ＧＳＴ−ＡＴＦ２対照（クーマシーブルー）の代表的なオートラジオグラフィー（３２Ｐ）が添付されている。
【図１２】ｐ３８トレオニン１２３はＭＥＦ２Ａ基質に対する適切な触媒活性に必要であることを示す。図１２Ａ：in vitroにおいて、組換えＭＫＫ６ＣＡＭ（４０ｎｇ）および２μｇのＧＳＴ−ＭＥＦ２Ａの存在下（＋）または不在下（−）で、図に示されている融合タンパク質を用いてリン酸化を行った。アッセイは３０分間行った。これらのタンパク質を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＣＢＢで染色し、組み込まれた放射活性（３２Ｐ）を検出した。独立に行った３つのアッセイの代表的な実験のパネルを示す。図１２Ｂ：ＭＫＫ６ＣＡＭアクチベーターの不在下での３つのｐ３８融合タンパク質のベースライン活性を従前に記載した条件で評価した。長時間露光した後の代表的なオートラジオグラフィーを示す。
【図１３】ｐ３８  Ｔ１２３Ｄ突然変異体は、in situにおいてＭＫＫ６ＣＡＭによっては野生型ｐ３８によるよりも活性化が低いことを示す。従前に記載したものと同様の過剰発現試験で、Ｍ６に常に２反復で播種したＨＥＫ２９３細胞を、１５０ｎｇのｐＣＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−ｐ３８α  ＷＴ、またはｐＣＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−ｐ３８α  Ｔ１２３Ｄおよび５０ｎｇのｐＣＤＮＡ３−ＭＫＫ６ＣＡＭ（またはエンプティーｐＣＤＮＡ３）でトランスフェクトした。抗リン−ｐ３８抗体によるｐ３８の活性化を評価した。これら２つのアイソフォームの各々について、ＭＫＫ６ＣＡＭによる活性化をベースラインの状態と対比させ、特定の活性化レベルを得る。各実験で１００％の活性化をｐ３８α  ＷＴの活性化とした。３つの独立し実験のデータ（±ＳＥＭ）を示す。スチューデントの両側ｔ検定を行い、＊ｐ＜０．０００１を得た。右側のパネル（ウエスタンブロット）がこれらの実験の１つを示す。
【図１４】ｐ３８  Ｔ１２３Ｄ突然変異体は基質と結合せず、ＭＫＫ６と会合しないか、またはＭＫＫ６によりリン酸化されないことを示す。精製したＧＳＴ−ｐ３８およびそのＴ１２３突然変異体（３００ｎＭ）を、陰性対照としてＧＳＴを用いたプルダウンアッセイにおいて、精製ＭＫＫ６（３ｎＭ）またはＨｉｓタグ付きＭＡＰＫＡＰＫ２（ＭＫ２，２０ｎＭ）の存在下でインキュベートした。沈降したタンパク質を、抗ＭＫＫ６抗体、抗ヒスチジン抗体（Ｈｉｓ−ＭＫ２の場合）または抗ＧＳＴ抗体（ＧＳＴ−ｐ３８全量の場合）を用い、ウエスタンブロットにより現像した。総てのパネルにおいて、結果は２反復で行った３つの独立した実験の代表例である。
【図１５】ＧＲＫ２がどのようにして繊維芽細胞から脂肪細胞へのｐ３８依存性の分化を低下させるかを示す。ｐＣＤＮＡ３−ＧＲＫ２およびｐＣＤＮＡ３−ＧＲＫ２Ｋ２２０Ｒで安定してトランスフェクトされた３Ｔ３Ｌ１系統を作出した。各細胞系統で得られ、３Ｔ３Ｌ１のレベルを比較するＧＲＫ２（抗ＧＲＫ２）発現対照を含める。これらの細胞に対して標準的な分化処理を行い、１５日目に細胞をホルマリンで固定し、脂肪細胞が蓄積している脂肪と結合する親油性染色剤であるオイルレッドで染色した。脂肪細胞の表現型（赤色）を有する細胞を顕微鏡下、計２５視野で計数した。２つの独立した実験の代表的な写真を２反復で示す。分化過程でインスリンによる刺激の無い３Ｔ３Ｌ１細胞（対照）の写真も含めてある。グラフはこれらの実験の脂肪細胞数（±ＳＥＭ）を表している。３Ｔ３Ｌ１細胞に対する各安定系統のスチューデントの両側ｔ検定を行い、＊ｐ＜０．０００１を得た。１０μＭのＳＢ２０３５８０での薬理処理によるｐ３８依存対照実験も並行して行った。
【図１６】ヒト培養細胞から免疫沈降したｐ３８の抗リン−Ｔｈｒ１２３抗体による認識とＧＲＫ２によるｐ３８のin vitroリン酸化を示す。図１６Ａ：ＨＥＫ２９３細胞をマウスＦｌａｇ−ｐ３８αおよびＧＲＫ２またはその不活性突然変異体（ＧＲＫ２−Ｋ２２０Ｒ）の発現ベクターでトランスフェクトした。溶解前、血清を含まずに１６時間細胞を培養した。Ｆｌａｇ−ｐ３８を抗ｆｌａｇ（Ｍ２）抗体により免疫沈降（ＩＰＰ）させ、電気泳動および転写の後、リン酸化されたタンパク質を、アフィニティーカラムで精製した特異的抗体（Ｐ−ｐ３８−Ｔ１２３、希釈溶液１：２００）を用いたウエスタンブロット（ＷＢ）により、Ｔｈｒ１２３において検出した。同じ膜を全抗ｐ３８（ｐ３８）でも現像し、免疫沈降前の細胞抽出液（細胞溶解液）中に含まれるタンパク質に相当する別の膜も抗ＧＲＫ２  ４３６−６８９（ＧＲＫ２）で現像した。図１６Ｂ：Ｓ  ＧＳＴ−ｐ３８（５０ｎＭ）を単独、または精製ＧＲＫ２（１５０ｎＭ）または４０ｎｇの構成的に活性なＭＫＫ６ＣＡＭとともに、リン酸化バッファー中、非放射性標識ＡＴＰの存在下、３０℃で３０分間インキュベートした。上のパネルはリン酸化型のｐ３８のＴｈｒ１２３に対するポリクローナル抗体で現像したものである。中段のパネルはｐ３８のＴｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２残基のリン特異的抗体（抗Ｐｐ３８）とともにインキュベートしたものであり、下段の現像では全ｐ３８に対する抗体を用いた。
【図１７】抗リン抗体はトレオニン１２３においてＧＲＫ２によりリン酸化されたｐ３８を認識する（この条件でｐ３８のＴ１２３突然変異体は認識しないため）ことを示す。ＧＳＴ−ｐ３８ｗｔおよびＧＳＴ−ｐ３８Ｔ１２３Ａ（７０ｎＭ）を単独で、または精製ＧＲＫ２（２５ｎＭ）または組換えＭＫＫ６ＣＡＭ（２ｎｇ）とともにインキュベートした。なお、示されている場合には、ヘパリン（１００ｎｇ／μｌ）、特異的ＧＲＫ２阻害剤を加えた。ＧＳＴｐ３８タンパク質のリン酸化は、ウエスタンブロットにより、抗リンＴ１２３を用いて、また、全ＧＳＴ−ｐ３８は抗ＧＳＴを用いて分析した。データは３つの独立した実験の代表例である。
【図１８】ＧＲＫ２部分的依存性のマウスから抽出したマクロファージのリポ多糖に応答したｐ３８の活性化レベルとＴＮＦの分泌レベルを示す。野生型Ｃ５７ＢＬ／６（＋／＋）またはＧＲＫ２半接合性（＋／−）マウス由来の腹膜ミクロファージ。それらを２時間無刺激下に置いた後、培地に１６時間、細菌のリポ多糖（ＬＰＳ：０．５μｇ／ｍｌ）を加えた。炎症性サイトカイン（ＴＮＦα）の産生を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｔｒａｋ）により定量した。このプロセスがｐ３８活性に依存することを確認するため、ＬＰＳを加える前にＳＢ２０３５８０（３０μＭ）を３０分間用いた。４つの独立した実験で処理した１０個体のマウスの平均±ＳＤを示す。データはＭ２４の１穴当たり１０６細胞から得られたＴＮＦα分泌に相当する＊ｐ＜０．００５（スチューデントのｔ検定による）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８−１】
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【図８−２】
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【図１８】
2008545434.tif 000027
【図１Ａ】
2008545434.tif 000028
【図１Ｂ】
2008545434.tif 000029
【図１Ｃ】
2008545434.tif 000030
【図１Ｄ】
2008545434.tif 000031
【図１Ｅ】
2008545434.tif 000032
【図２Ａ】
2008545434.tif 000033
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
2008545434.tif 000037
【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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