(57)【要約】  被検者から採取されたサンプルにおける細胞又は体液のＧＳＫ−３レベルを測定することを含むアルツハイマー病の診断用の検査である。当該検査は、比較的非侵襲的なアルツハイマー病の診断方法を提供し、軽度の認識機能障害を有するどの個体がアルツハイマー病を発症するかを予測するに有用であり得る。
2008504551.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者から採取されたサンプルにおける細胞又は体液のＧＳＫ−３レベルを測定することを含む、アルツハイマー病を予測又は診断する方法。
【請求項２】
ＧＳＫ−３アイソタイプの総量が測定され、対照と比較されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
活性型ＧＳＫ−３及び不活性型ＧＳＫ−３の両方のレベルが測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＧＳＫ−３タンパク質又はＧＳＫ−３活性の２０％増大を検出することにより、アルツハイマー病が陽性と判定される、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項５】
被検者が軽度の認識機能障害であると診断されていることを特徴とする、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項６】
検査されるサンプルが血清又は血漿である、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項７】
アルツハイマー病の予測又は診断用の検査において使用するキットであって、
ＧＳＫ−３に対する抗体、
活性型ＧＳＫ−３に対する抗体
の少なくとも一方を含有することを特徴とする、キット。
【請求項８】
ＧＳＫ−３に対する抗体が抗ＧＳＫ−３ α／βであり、活性型ＧＳＫ−３に対する抗体が抗ＧＳＫ−３ α／β Ｔｙｒ２１６／２１９である、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
不活性型ＧＳＫ−３に対する抗体をさらに含有する、請求項７又は８に記載のキット。
【請求項１０】
不活性型ＧＳＫ−３に対する抗体が抗ＧＳＫ−３ α／β Ｓｅｒ２１／９である、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
アルツハイマー病の予測又は診断用の検査において使用する抗ＧＳＫ−３抗体又は抗不活性型ＧＳＫ−３抗体。
【請求項１２】
アルツハイマー病の予測又は診断用の検査において使用するキットの製造における、抗ＧＳＫ−３抗体、抗不活性型ＧＳＫ−３抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病の診断、及び、より具体的にはこの疾病の信頼できる早期診断に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、英国だけで６００，０００を超える人々がかかる悲惨な病気である。ＡＤ及びそれに関連する疾患の分子レベルでの理解は進んでいるものの、臨床評価の進歩はそれに見合ったものになっていない。数少ない治療可能な意識混濁の原因を排除するための補助的な検査を伴う臨床的面接によって診断が行われる。ＡＤの予防又は緩和のために特異的治療法が考え出されるにつれて、この疾病の診断における制限は臨床的により深い関連を持つことになると考えられ、さらに、治療の効率的な評価及び利用を大幅に遅らせる可能性がある。
【０００３】
疾病を緩和すると想定される療法の臨床試験を早期の認知症を患う人々を対象に行うことができれば、これらの臨床試験はより一層進展することになろう。ＡＤ及び他の疾患では認知度の低下に先行して神経病理学的変性が生じる（この変性は何年も前に始まる）との証拠があるため、疾病の緩和療法がおそらくは事実上の二次的予防法であろう。しかし、確定した認知症の鑑別診断が難しい一方で、完全な認知症候群の発症に先行する神経変性プロセスを確実に検出することは現在のところ不可能である。認知症の前駆期の独自のマーカーが存在せず（明らかに認識力が落ちている場合でさえ）、自覚的な記憶障害を伴うどの個体が完全な認知症へと進行するかを予測するのは困難である。
【０００４】
変化の測定にもまた、非常に問題がある。したがって、ＡＤ及びそれに関連する疾患において、３つの評価分野（鑑別診断、早期診断、及び変化の測定）の全ては現在ほとんど臨床的評価に限られ、バイオマーカーは使用されていない。アルツハイマー病協会及び国立老化研究所は疾病状態に対する独自のマーカーの差し迫った必要性を認めており、これらが主催するコンセンサスグループは成功するバイオマーカーの基準を策定した。バイオマーカーは、８０％を超える感度及び特異性を有する一方、「信頼性があり、再現性があり、非侵襲的であり、実行が簡単であり、且つ安価である」ことが理想的であろう。そのようなマーカーは未だ得られていない。
【０００５】
ＡＤ及び前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）は、高度にリン酸化されたタウタンパク質の凝集体によって特徴付けられるタウオパシーとして知られる疾患群の一種である。様々なタウキナーゼが同定され、その中ではグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）及びＣＤＫ５が最も良い候補であると思われる。しかし、これら両者がインビトロでタウをリン酸化することは示されているが、そのどちらかがインビボで修飾されるという証拠は、ニューロン及び遺伝子組み換えモデルにおいてはわずかしか存在しない。ＧＳＫ−３は神経原線維変化と共局在化することが示されており、ＣＤＫ５の前駆体であるｐ２５は死後のＡＤ脳に過剰に存在することが示されている。しかし、このような死後研究は、これらの所見が神経変性の原因なのかあるいは結果なのかという疑問を提起するものであり、このことは治療との直接的な関連を有する重要な問題である。
【０００６】
Bhatら(2004; Journal of Neurochemistry 89, 1313-1317)は、中枢神経系の疾病の治療のための薬剤ターゲットとしてＧＳＫ−３を論じている。彼らは、総ＧＳＫ−３レベルの増大がＡＤ脳において常に観察されたわけではないと述べているが、活性型のＧＳＫ−３βがＡＤ脳において増加することを示唆している。それにもかかわらず、彼らはＧＳＫ−３の阻害がＡＤの治療に有用である可能性を示唆し続けている。
【０００７】
ＡＤを含む様々な疾病の治療においてＧＳＫ−３阻害剤を利用することも、Eldar-Finkelmanによって論じられている(2002; Trends in Molecular Medicine 8, 126-132)。
【０００８】
しかし、これまでにＧＳＫ−３がＡＤの好適な予測マーカー又は診断マーカーとして示唆されたことは全くない。
【０００９】
実験室ベースのＡＤの診断学的検査を行うためのこれまでの試み
脳脊髄液（ＣＳＦ）におけるタンパク質の変化
ＡＤ患者のＣＳＦでは、高齢の対照と比較して、様々なタンパク質が異なっていることが示されている。１，１００人を超えるＡＤ患者を含む２５を超える研究において、ＥＬＩＳＡによるＣＳＦにおけるタウの定量化が大規模に実施されている。これらの研究では、タウの量はＡＤにおいて有意に且つ大幅に上昇している。ＡＤにおける他のＣＳＦの研究は、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）の代謝産物もまた、ＡＤにおいては変化するという証拠を提供している。これらに示されるように、可溶性ＡＰＰは、ＡＰＰの病原性変異の徴候を示すキャリア及び散発性ＡＤにおいて減少するが、海綿状脳症においても低い。Ａβ１−４２ペプチド、及び、全ての研究においてというわけではないが幾つかの研究ではＡβ１−４０ペプチドもまた、認知症において減少している。このように、ＣＳＦに関する研究により、ＡＤにおいて変化するキータンパク質（タウの増加及びＡβの減少）のみならず、さらに、ＡＤの病態生理と結びついていると推定される他の多くのタンパク質もまた変化することが明らかにされた。しかし、早期の変化に対して敏感であることが示されたものも、ＡＤと他の神経変性疾病とを区別することが示されたものもない。しかし、これらの全ての研究におけるより基本的な問題は、腰椎穿刺が侵襲的検査であり、早期診断又は変化のモニタリングのいずれかを目的とした日常的な検査においてはその使用が制限されると考えられる点において生じるものである。ＡＤにおける診断マーカーは、血清、血漿又は尿の分析に基づく検査の創出を伴う場合にのみ、臨床的に有効なものとなろう。
【００１０】
血清又は血漿におけるタンパク質変化
他の研究が血清又は血漿におけるタンパク質変化又は細胞変化の可能性を調査している。血清内のタウ免疫反応性を検出した研究はあるものの、認知症との関連性は認められなかった。Ａβ４２は、ＡＤの血清においては上昇するということが或る研究において報告されているが、この所見と、ＣＳＦにおいては対応して減少するということとを両立させることは困難であり、より多くの研究が必要である。おそらく、ＡＤにおける末梢マーカー（peripheral marker）の最も古い報告は、血小板膜の流動性の変化に関する報告（異論がないとはいえないが、依然として興味深い発見である）であった。
【００１１】
ＷＯ２００４／０２７４２９は、血中のグルタミン合成酵素を検査することによる、ＭＣＩの患者の間でＡＤを診断する方法及びＡＤ診断用のキットを開示している。グルタミン合成酵素は星状細胞特異的であるため、それは単に神経損傷の指標であるかもしれない。
【００１２】
したがって、末梢サンプルのみの検査を伴う、新規のＡＤ診断検査又は予測検査の必要性が存在する。
【発明の開示】
【００１３】
本発明の第１の態様によれば、被検者から採取されたサンプルにおける細胞又は体液のＧＳＫ−３レベルを測定することを含むＡＤを予測又は診断する方法が提供される。
【００１４】
ＧＳＫ−３とＡＤとの関連性は立証されており、この酵素を検査できることは、この検
査が容易に実行され所望の診断を提供することを意味する。
【００１５】
ＧＳＫ−３アイソタイプの総量が測定され、対照と比較され得る。このことは、被検者がＡＤであるかどうか、あるいはＡＤを発症する可能性があるかどうかについての指標を提供し得る。
【００１６】
好ましくは、活性型及び不活性型ＧＳＫ−３の両方のレベルが測定される。活性型ＧＳＫ−３の増大がＡＤの可能性を示す一方、不活性型ＧＳＫ−３のレベルは変わらないままである。
【００１７】
好ましくは、ＧＳＫ−３タンパク質又はＧＳＫ−３活性の２０％の増大を検出することにより、ＡＤ陽性であると判定される。このことは、ＡＤであること、又は今後ＡＤを発症する可能性があることを示し得る。
【００１８】
前述のいずれかの請求項に記載された方法において、ヒト被検者は軽度認識障害（ＭＣＩ）と診断されている。この検査は、ＭＣＩ患者がＡＤを発症しやすいかどうかを評価するのに特に有用であり得る。
【００１９】
前述のいずれかの請求項に記載された方法において、検査されるサンプルは血清又は血漿である。このことにより、侵襲的手段を必要としない、ＧＳＫ−３の存在を検査する特に簡易な方法が可能になる。
【００２０】
本発明の第２の態様によれば、ＧＳＫ−３に対する抗体及び活性型ＧＳＫ−３に対する抗体の少なくとも一方を含む、アルツハイマー病の予測又は診断用の検査において使用されるキットが提供される。
【００２１】
これらの抗体により、ＧＳＫ−３及び／又は活性型ＧＳＫ−３のレベルの測定が可能になる。
【００２２】
好ましくは、ＧＳＫ−３に対する抗体は抗ＧＳＫ−３ α／βであり、活性型ＧＳＫ−３に対する抗体は抗ＧＳＫ−３ α／β Ｔｙｒ２１６／２１９である。
【００２３】
上記キットは、不活性型ＧＳＫ−３に対する抗体（抗ＧＳＫ−３ α／β Ｓｅｒ２１／９であることが好ましい）をさらに含んでもよい。
【００２４】
本発明の第３の態様によれば、アルツハイマー病の診断又は予測用の検査において使用される抗ＧＳＫ−３抗体又は抗不活性型ＧＳＫ−３抗体が提供される。
【００２５】
本発明の第４の態様によれば、アルツハイマー病の診断又は予測用の検査に使用するキットの製造における、抗ＧＳＫ−３抗体、抗不活性型ＧＳＫ−３抗体の使用が提供される。
【００２６】
ＡＤ用バイオマーカーへの取り組み
ＧＳＫ−３はタウキナーゼであるため、ＡＤの発症機序に関与する可能性がある。しかし、死後のＡＤ脳におけるＧＳＫ−３の研究では一貫性のある結果は認められておらず、他のデータはＣＤＫ５等の他のタウキナーゼがより重要かもしれないことを示唆している。しかし、別の見解は、タウのリン酸化の変化は疾病の経過に対して全て二次的なものであって、一次的なものではないことを示唆している。早期ＡＤにおけるＧＳＫ−３のレベル、及び血液細胞等の入手容易な材料におけるＧＳＫ−３タンパク質及びＧＳＫ−３活性のマーカーがバイオマーカーとして機能する可能性を検討した。ＡＤにおける末梢サンプ
ル中のＧＳＫ−３の研究がこれまでに行われたことはない。しかし、ＧＳＫ−３タンパク質及びＧＳＫ−３活性は、他の病態における末梢サンプルにおいて測定されている。ＧＳＫ３は、これまでに総合失調症において検査され、矛盾する結果が得られている（Nadri他(2002) Psychiatry Research 112, 51-57）。総合失調症とアルツハイマー病との関係は知られていない。
【００２７】
この研究においては、ＧＳＫ−３タンパク質の総量（当該酵素のアルファアイソフォーム及びベータアイソフォームの両方）及び活性型酵素（Ｔｙｒ２１６／２１９でリン酸化される）及び不活性型酵素（Ｓｅｒ９／２１でリン酸化される）のレベルを比較した。白血球の粗抽出物をサンプルとして使用して、ＧＳＫ−３を標準的な定量的ウエスタンブロッティング法を用いて分析した。
【実施例】
【００２８】
実際的な応用
方法
被検者：  ＡＤを患う人々（ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡによりprobableとされる）を老年精神科(Old Age Psychiatry services)を通じて特定した。正常な高齢者を南ロンドンのＧＰに基づく年齢／性別の登録を通じて特定した。全ての被検者は、既知の体系的且つ有効な手順を用いて評価した。調査された被検者は、ＡＤ（ｎ＝２７）、軽度認識障害（一般にＡＤ前駆症状であるとみなされる）（ｎ＝１６）及び正常な対照（ｎ＝１５）であった。
【００２９】
サンプル：  静脈血をBD vacutainer K3Eの１５％チューブに採取する。血液は３，０００ｒｐｍで８分間遠心分離し、血漿を等分し、−７０℃で保存する。残った軟膜（buffy coat）をＰ２００ピペットを用いて注意深く回収する（多少の赤血球が入ってもよい）。軟膜を無菌のマイクロチューブに移し、使用まで−２０℃で保存する。
【００３０】
分析：  軟膜サンプルを解凍し、１５ｍｌ容のファルコンチューブ中の１０ｍｌの赤血球溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、及び１０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．６））に加えて、氷上で３０分間放置する。次いで、溶解したサンプルを２，８００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除去する。さらに１０ｍｌの溶解緩衝液を加え、チューブをボルテックスして、その後さらに２０分間氷上に放置する。
【００３１】
サンプルをもう一度、２，８００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除去する。得られたペレットに３００μｌの２×サンプル緩衝液を加え、ファルコンチューブからマイクロチューブに移して、１００℃で１０分間加熱する。
【００３２】
ウエスタンブロット分析のために、溶解したサンプル１０μｌを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにローディングし、１５０Ｖで６０分間分離させる。タンパク質は担体へ移し、次いでブロットして、総タンパク質に対する標準化のためのβ−アクチンＡＣ−１５抗体（Sigma）、総ＧＳＫ−３タンパク質に対するＧＳＫ−３ α／β抗体（Bioquote）、不活性型ＧＳＫ−３に対するＧＳＫ−３ α／β Ｓｅｒ２１／９抗体、及び活性型ＧＳＫ−３に対するＧＳＫ−３ α／β Ｔｙｒ２１６／２１９抗体（Signal Transduction）を用いて４℃で一晩プローブする。バンドは、化学発光ウエスタン検出キット(Amersham)で検出した。ブロット像は次いでＢｉｏ−Ｒａｄ  ＧＳ７１０スキャナーを用いてスキャニングされ、免疫反応を示すバンドの光学密度をＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ画像解析システムを用いて定量した。
【００３３】
結果
結果を図１に示す。ＧＳＫ−３タンパク質（アルファアイソフォーム及びベータアイソ
フォームの両方）及びＧＳＫ−３活性（Ｔｙｒ２１６／２１９のリン酸に特異的な抗体により表される）が、正常な高齢者の対照と比べてＭＣＩ及びＡＤにおいて高くなっている（ｐ＜０．０５）。不活性型ＧＳＫ−３のレベル（Ｓｅｒ２１／９抗体により表される）は変化しない。およそ２０％又はそれ以上のＧＳＫ−３タンパク質又はＧＳＫ−３活性の測定値は、ＡＤの存在又はＡＤの今後の発症の可能性の指標である。
【００３４】
結論
これらのデータは、アルツハイマー病において、また、重要なことには、ＭＣＩの前駆状態において、総タンパク質の増加及び不活性型酵素に対する活性型酵素の増加の両方により、循環白血球においてＧＳＫ−３の活性が増大することを示している。
【００３５】
上記方法は、例えば酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を含む他の免疫学的検出方法を開発することによって改良され得る。そのようなアプローチはそれら自体が臨床学的用途にすぐに役立つものである。したがって、白血球又はリンパ球等の末梢サンプルにおけるＧＳＫ−３タンパク質及びＧＳＫ−３活性の測定は、アルツハイマー病並びにそれに関連する認知症の効果的な診断、早期検出及び病期診断を可能にする。
【００３６】
ＧＳＫ−３タンパク質及びＧＳＫ−３活性の評価は、ＡＤを患う人々をＡＤと混同される恐れのある他の病気（例えば、うつ病もしくは不安神経症、又は血管性認知症もしくはレヴィー小体認知症等の認知症を引き起こす他の疾患などの、記憶障害を伴う可能性のある他の病気）と区別するための早期の診断的マーカー検査として用いることができる。これはまた、ＭＣＩ患者が認知症に進行する可能性があるかどうかを決定すること、又は治療に応じた疾病の進行をモニタリングすることに役立ち得る（現在のところ、症候性のマーカーのみが利用可能である）。従って、このマーカーは疾病の緩和のために考案された治療の効果をモニタリングすることを助け、臨床試験において疾病の緩和を示す代用マーカーとして使用することができる。これはまた、どのＡＤ患者が最も治療への反応性がありそうかを予測する手助けとなり得る。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１。
【図１】
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【国際調査報告】
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2008504551.tif 000005
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