(57)【要約】  ポリマー−生体分子コンジュゲートが、４成分縮合反応によって、一般に部位特異的又は部位選択的な様式で調製される。この方法を使用して、生体分子上の単一の部位に２つのポリマー分子が結合したコンジュゲートを調製し得る。これらのコンジュゲートは典型的には水溶性であり、有利な薬理学的特性（例えば、低下した免疫原性及び増大した循環時間）を有する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質又はポリペプチドの水溶性ポリマーとのコンジュゲートを調製する方法であって、
以下の成分（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）ＲＡ−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、（式中Ｒ’はＨ又は低級アルキルである）、
（ｂ）ＲＮ−ＮＨ２、
（ｃ）ＲＣ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、及び
（ｄ）ＲＩ−ＮＣ
を反応させて、ＲＡ、ＲＮ、ＲＣ及びＲＩによって示される各部分のうち少なくとも１つを組み込むコンジュゲート化生成物を形成するステップを含み、
（ａ）〜（ｃ）のうち少なくとも１つはタンパク質又はポリペプチドであり、（ａ）〜（ｄ）のうち少なくとも１つは水溶性ポリマーであり、（ａ）〜（ｄ）の任意の残りの成分は安定な非妨害性の化合物である方法。
【請求項２】
前記コンジュゲート化生成物が、ＲＩＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ’ＲＡ−ＮＲＮ−Ｃ（Ｏ）ＲＣ形態のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質又はポリペプチドが、（ａ）ＲＡ−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、（ｂ）ＲＮ−ＮＨ２及び（ｃ）ＲＣ−Ｃ（Ｏ）ＯＨから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質又はポリペプチドが（ａ）ＲＡ−Ｃ（Ｏ）Ｒ’である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリマーが、（ａ）ＲＡ−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、（ｂ）ＲＮ−ＮＨ２及び（ｃ）ＲＣ−ＣＯＯＨから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリマーがＲＩ−ＮＣである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリマーが官能化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリマーがＰＥＧイソニトリル化合物である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質又はポリペプチドが、（ａ）〜（ｃ）から選択される少なくとも１つの成分によって示され、前記ポリマーが、（ａ）〜（ｄ）から選択される少なくとも１つの異なる成分によって示され、（ａ）〜（ｄ）の任意の残りの成分が、標識部分、標的化部分及び他の安定な非妨害性の化合物から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質又はポリペプチドが、（ａ）〜（ｃ）から選択される１つの成分であり、前記ポリマーが、（ａ）〜（ｄ）から選択される異なる成分であり、（ａ）〜（ｄ）の残りの成分が、安定な非妨害性の化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
成分（ａ）〜（ｄ）のうち少なくとも１つが複数の化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質又はポリペプチドが、（ａ）〜（ｃ）から選択される１つの成分であり、前記ポリマーが、（ａ）〜（ｄ）から選択される２つの異なる成分であり、残りの成分が、安定な非妨害性の化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
医薬的ビヒクル中に生物学的に活性な分子の生体適合性ポリマーとのコンジュゲートを含む医薬組成物を調製する方法であって、
（ｉ）以下の成分（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）ＲＡ−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、（式中Ｒ’はＨ又は低級アルキルである）、
（ｂ）ＲＮ−ＮＨ２、
（ｃ）ＲＣ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、及び
（ｄ）ＲＩ−ＮＣ
を反応させて、ＲＡ、ＲＮ、ＲＣ及びＲＩによって示される各部分のうち少なくとも１つを組み込むコンジュゲート化生成物を形成するステップであって、
ＲＭと称される成分（ａ）〜（ｄ）のうち少なくとも１つが生物学的に活性な分子であり、ＲＰと称される成分（ａ）〜（ｄ）のうち少なくとも１つが生体適合性ポリマーであり、任意の残りの成分（ａ）〜（ｄ）が安定な非妨害性の化合物であるステップと、
（ｉｉ）前記コンジュゲート又はその医薬的に許容可能な塩を、医薬的ビヒクル中で製剤化するステップと、
を含む方法。
【請求項１４】
前記コンジュゲートが、ＲＩＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＲＡＲ’−ＮＲＮ−Ｃ（Ｏ）ＲＣ形態のものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記生物学的に活性な分子が、（ａ）ＲＡ−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、（ｂ）ＲＮ−ＮＨ２及び（ｃ）ＲＣ−Ｃ（Ｏ）ＯＨから選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記生物学的に活性な分子がＲＡ−Ｃ（Ｏ）Ｒ’である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリマーが水溶性である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリマーが（ｄ）ＲＩ−ＮＣである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリマーが官能化ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリマーがイソニトリル官能化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリマーが、利用可能なカルボニル官能基又はアミン官能基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記分子が、（ａ）〜（ｄ）から選択される少なくとも１つの成分によって示され、前記ポリマーが、（ａ）〜（ｄ）から選択される少なくとも１つの異なる成分によって示され、（ａ）〜（ｄ）の任意の残りの成分が、標識部分、標的化部分及び他の安定な非妨害性の化合物から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
前記分子が（ａ）〜（ｄ）から選択される１つの成分であり、前記ポリマーが（ａ）〜（ｄ）から選択される異なる成分であり、（ａ）〜（ｄ）の残りの成分が安定な非妨害性の化合物である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
前記ビヒクルが水性ビヒクルである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
ＲＩＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨＲＡ−ＮＲＮ−Ｃ（Ｏ）ＲＣ形態の水溶性コンジュゲートであって、
ＲＡ、ＲＮ及びＲＣのうち少なくとも１つがタンパク質又はポリペプチドであり、
ＲＩ、ＲＡ、ＲＮ及びＲＣのうち少なくとも１つがポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）であり、
ＲＩ、ＲＡ、ＲＮ及びＲＣの残りのメンバーが、標識部分、標的化部分及びＲから独立して選択され、Ｒは、水素、又は１〜８個の炭素原子並びに酸素、窒素及び硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する安定な有機部分である水溶性コンジュゲート。
【請求項２６】
ＲＩ、ＲＡ、ＲＮ及びＲＣの残りのメンバーが独立してＲの実施形態であり、ＲＩは水素ではない、請求項２５に記載のコンジュゲート。
【請求項２７】
ＲＩがＰＥＧである、請求項２５に記載のコンジュゲート。
【請求項２８】
ＲＣがタンパク質であり、ＲＩがＰＥＧであり、ＲＡ及びＲＮが、標識部分、標的化部分及びＲから独立して選択される、請求項２５に記載のコンジュゲート。
【請求項２９】
ＲＣがタンパク質であり、ＲＮがＰＥＧであり、ＲＡ及びＲＩが、標識部分、標的化部分及びＲから独立して選択され、ＲＩは水素ではない、請求項２５に記載のコンジュゲート。
【請求項３０】
ＲＣがタンパク質であり、ＲＮ及びＲＡの各々がＰＥＧであり、ＲＩが、標識部分、標的化部分又はＲであり、ＲＩは水素ではない、請求項２５に記載のコンジュゲート。
【請求項３１】
ＲＣがタンパク質であり、ＲＮがＰＥＧであり、ＲＩがＰＥＧであり、ＲＡが、標識部分、標的化部分又はＲである、請求項２５に記載のコンジュゲート。
【請求項３２】
ＲＡがタンパク質であり、ＲＮがＰＥＧであり、ＲＣ及びＲＩが、標識部分、標的化部分及びＲから独立して選択され、ＲＩは水素ではない、請求項２５に記載のコンジュゲート。
【請求項３３】
ＲＡがタンパク質であり、ＲＮがＰＥＧであり、ＲＩがＰＥＧであり、ＲＣが、標識部分、標的化部分又はＲである、請求項２５に記載のコンジュゲート。
【請求項３４】
構造ＲＣＡＰ（ＯＣＨＲ”ＣＨ２）ｎ−Ｘ−Ｎ≡Ｃを有する化合物であって、式中、ＲＣＡＰは安定な末端キャッピング基であり、Ｘは直接結合又は安定な連結部分を示し、Ｒ”はＨ又はメチルであり、ｎは１０と約２３００との間の整数である化合物。
【請求項３５】
ＲＣＡＰがアルキル、アシル又はアリールである、請求項３４に記載の化合物。
【請求項３６】
ＲＣＡＰがメチルである、請求項３５に記載の化合物。
【請求項３７】
Ｒ”がＨである、請求項３４に記載の化合物。
【請求項３８】
部分−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−が、約５０００ダルトンの分子量を有する、請求項３７に記載の化合物。
【請求項３９】
部分−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−が、約２００００ダルトンの分子量を有する、請求項３７に記載の化合物。
【請求項４０】
Ｘが、直鎖又は分枝鎖アルキル、アリール、シクロアルキル、エーテル、アミド及びそれらの組み合わせから選択される連結からなる、請求項３４に記載の化合物。
【請求項４１】
Ｘが、低級アルキル、シクロアルキル、アリール、並びに低級アルキル及びアリール又は低級アルキル及びシクロアルキルの組み合わせから選択される連結からなる、請求項４０に記載の化合物。
【請求項４２】
Ｘがシクロヘキシルである、請求項４１に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子の水溶性ポリマーとのコンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の調製、特に４成分縮合反応によるこのようなコンジュゲートの調製に関する。
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【背景技術】
【０００２】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような親水性ポリマーは、物質の免疫原性を低下させるため及び／又はその血中循環寿命を改善するために、ポリペプチド、薬物及びリポソームのような種々の物質の修飾のために使用されてきた（Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ＆  Ｈａｒｒｉｓ，１９９７）。例えば、非経口投与されるタンパク質は免疫原性であり得、短い薬理学的半減期を有する可能性がある。ある種のタンパク質は比較的水に不溶性でもあり得る。結果的に、患者におけるタンパク質の治療的に有用な血中レベルを達成することは困難であり得る。
【０００３】
タンパク質への親水性ポリマー、特にＰＥＧのコンジュゲート化（Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ＆  Ｈａｒｒｉｓ，１９９７）が、これらの困難を克服するためのアプローチとして記載されている。例えば、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．は、米国特許第４，１７９，３３７号において、生理的活性のかなりの部分をなお保持しながらもより低い免疫原性を有するＰＥＧ−タンパク質コンジュゲートを形成するための、酵素及びインスリンのようなタンパク質へのＰＥＧのコンジュゲート化を記載している。Ｖｅｒｏｎｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１１：１４１−１５２（１９８５））は、それぞれリボヌクレアーゼ及びスーパーオキシドジムスターゼへのコンジュゲート化のために、クロロギ酸フェニルでポリエチレングリコールを活性化することを記載している。Ｋａｔｒｅ  ｅｔ  ａｌ．は、米国特許第４，７６６，１０６号及び同第４，９１７，８８８号において、ポリマーコンジュゲート化によってタンパク質を可溶化することを記載している。米国特許第４，９０２，５０２号（Ｎｉｔｅｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．）及びＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１３５４０（Ｅｎｚｏｎ，Ｉｎｃ．）は、免疫原性を低下させ、半減期を増大させるための、組換えタンパク質へのＰＥＧ及び他のポリマーのコンジュゲート化を記載している。
【０００４】
ＰＥＧは、リポソームの血中循環寿命を改善することに使用されることも記載されている（米国特許第５，１０３，５５６号）。ＰＥＧポリマーは、リポソームが細網内皮系によって認識及び除去されないようにマスク又は遮蔽するために、脂質の極性頭部基に共有結合される。
【０００５】
生物学的に適切な分子へのＰＥＧの結合のための種々のコンジュゲート化化学が検討されてきた（Ｚａｌｉｐｓｋｙ，１９９５ａ）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、水溶性ポリマー、好ましくはＰＥＧポリマーの、生物学的に活性な分子又は生物学的に適切な分子、特にポリペプチドとのコンジュゲートを調製するための多用途の方法を提供する。生体分子へのコンジュゲート化は、部位特異的又は部位選択的な様式でしばしば実施できる。この方法により、例えば、アミン、カルボン酸又は合成により導入されたアルデヒド若しくはケトンから選択されるポリペプチド上の官能基でＰＥＧ鎖が結合することが可能となる。この方法はまた、所望される場合、コンビナトリアルな様式での多様なコンジュゲートの調製を提供する。
【０００７】
一態様において、本発明は、タンパク質又はポリペプチドの水溶性ポリマーとのコンジュゲートを調製する方法を提供し、この方法は、
以下の成分（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）ＲＡ−Ｃ（Ｏ）Ｒ’（カルボニル成分）、（式中Ｒ’はＨ又は低級アルキルであり、好ましくはＨ又はメチルであり、より好ましくはＨ（即ちアルデヒド）である）、
（ｂ）ＲＮ−ＮＨ２（アミン成分）、
（ｃ）ＲＣ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ（カルボン酸成分）、及び
（ｄ）ＲＩ−ＮＣ（イソニトリル成分）
を反応させて、ＲＡ、ＲＮ、ＲＣ及びＲＩによって示される各部分のうち少なくとも１つを組み込むコンジュゲート化生成物を形成するステップを含む。（ａ）〜（ｃ）のうち少なくとも１つはタンパク質又はポリペプチドである。即ち、この反応は、反応性カルボニルを有するタンパク質又はポリペプチド（ＲＡ−Ｃ（Ｏ）Ｒ’）、反応性アミンを有するタンパク質又はポリペプチド（ＲＮ−ＮＨ２）、及び／或いは反応性カルボン酸を有するタンパク質又はポリペプチド（ＲＣ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ）を含む。（ａ）〜（ｄ）のうち少なくとも１つは水溶性ポリマーである。即ち、この反応は、反応性カルボニルを有する水溶性ポリマー（ＲＡ−Ｃ（Ｏ）Ｒ’）、反応性アミンを有する水溶性ポリマー（ＲＮ−ＮＨ２）、反応性カルボン酸を有する水溶性ポリマー（ＲＣ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ）、及び／或いは反応性イソニトリルを有する水溶性ポリマー（ＲＩ−ＮＣ）を含む。
【０００８】
一実施形態において、このコンジュゲート化生成物は、成分（ａ）〜（ｄ）の各々のうち正確に１つの残基を組み込む、形態ＲＩＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ’ＲＡ−ＮＲＮ−Ｃ（Ｏ）ＲＣのものである。例えば成分（ａ）〜（ｄ）のうち１つが示された反応性官能基のうち１つより多くを有する他の実施形態（例えば、複数のアミノ基を有する成分ＲＮ−ＮＨ２又は複数のカルボン酸基を有する成分ＲＣ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ）において、このコンジュゲート化生成物は、他の成分のさらなる残基へとコンジュゲート化された当該成分を含んでもよい。
【０００９】
このポリマー及びこれらの成分から形成されたコンジュゲートは、好ましくは室温及び生理的ｐＨで水溶性である。
【００１０】
このタンパク質又はポリペプチドは、上記（ａ）〜（ｃ）から選択される少なくとも１つの成分によって示され、水溶性ポリマーは、上記（ａ）〜（ｄ）から選択される少なくとも１つの異なる成分によって示され、（ａ）〜（ｄ）の任意の残りの成分は、本明細書中で規定されるとおりの安定な非妨害性の化合物である。好ましい実施形態において、このタンパク質又はポリペプチドは、（ａ）〜（ｃ）から選択される単一の成分であり、ポリマーは、（ａ）〜（ｄ）から選択される異なる成分であり、（ａ）〜（ｄ）の残りの成分は、安定な非妨害性の化合物である。
【００１１】
これら残りの成分は、例えば、標的化部分、標識部分及び良性の（即ち、安定な非妨害性の）「プレースホルダー（ｐｌａｃｅｈｏｌｄｅｒ）」基から選択してもよい。好ましくは、これら残りの成分は、本明細書中で規定されるとおりの低分子量成分である。このような低分子量化合物には、好ましくは、基ＲＡ、ＲＮ、ＲＣ又はＲＩ（ＲＸによって示され得る）が、１〜１２個、好ましくは１〜８個の炭素原子並びに酸素、窒素及び硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する安定な有機部分であるものが含まれる。基ＲＡ、ＲＮ又はＲＣは、水素であってもよい。
【００１２】
好ましくは、ＲＸは、水素でもメチルでもない場合、アルキル、アルケニル、エーテル、ヒドロキシル、カルボン酸エステル、ケトン及びアミドから選択される連結を含む。非限定的な例には、低級アルキル基、シクロアルキル基、低級ヒドロキシアルキル基、低級アルキルエステル及び低級アルキルアミドが含まれる。
【００１３】
選択された実施形態において、このタンパク質又はポリペプチドは、（ｂ）ＲＮ−ＮＨ２及び（ｃ）ＲＣ−Ｃ（Ｏ）ＯＨから選択される。さらなる選択された実施形態において、この水溶性ポリマーは、（ａ）ＲＡ−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、（ｂ）ＲＮ−ＮＨ２及び（ｄ）ＲＩ−ＮＣから、或いは（ａ）ＲＡ−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、（ｂ）ＲＮ−ＮＨ２及び（ｃ）ＲＣ−ＣＯＯＨから選択される。なおさらなる実施形態において、このポリマーは、（ａ）ＲＡ−Ｃ（Ｏ）Ｒ’及び（ｂ）ＲＮ−ＮＨ２から選択される。上記実施形態において、Ｒ’は好ましくはＨである。別の好ましい実施形態において、成分（ｄ）ＲＩ−ＮＣは水溶性ポリマーである。
【００１４】
この水溶性ポリマーは、好ましくは官能化ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）（例えば、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）、或いは好ましい実施形態では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））である。このような官能化ポリアルキレンオキシド分子は、（このポリマーがそれぞれ、ＲＡ−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、ＲＮ−ＮＨ２、ＲＣ−ＣＯＯＨ又はＲＩ−ＮＣのいずれであるかに依存して、）利用可能なカルボニル官能基、アミン官能基、カルボキシル官能基又はイソニトリル官能基を有する。
【００１５】
本明細書中に記載されるコンジュゲート化方法での使用に適したイソニトリル官能基を有するＰＥＧ分子又はＰＰＯ分子は、それ自体が本発明の別の態様を形成する。このような分子は典型的に、構造ＲＣＡＰ（ＯＣＨＲ”ＣＨ２）ｎ−Ｘ−Ｎ≡Ｃを有し、式中Ｒ”はＨ又はメチルであり、ＲＣＡＰは安定な末端キャッピング基であり、Ｘは直接結合又は安定な連結部分を示し、ｎは１０と約２３００との間の整数であり、その結果、例えば、部分−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−は、Ｒ”がＨのとき、約４４０ダルトンと約１００，０００ダルトンとの間の分子量を有する。部分−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−についての例示的な分子量には、例えば、２０００ダルトン、５０００ダルトン、１０，０００ダルトン、２０，０００ダルトン及び４０，０００ダルトンが含まれる。
【００１６】
選択された実施形態において、ＲＣＡＰは、アシル、アリール又はアルキル（例えばメチル）である。リンカーＸは、好ましくは、アルキル、アリール、シクロアルキル、エーテル、アミド及びそれらの組み合わせから選択される連結からなる。より好ましくは、Ｘは、アルキル、シクロアルキル、アリール、並びにアルキル及びアリール又はアルキル及びシクロアルキルの組み合わせから選択される連結からなる。このリンカーは、好ましくは約１２原子長までである。
【００１７】
一実施形態において、成分（ａ）〜（ｄ）の各々は単一の化合物である。コンジュゲートのコンビナトリアル合成において有用な他の実施形態において、成分（ａ）〜（ｄ）のうち少なくとも１つは、複数の化合物を含む。
【００１８】
好ましくは、タンパク質又はポリペプチドの水溶性ポリマーとのコンジュゲートは、ヒト被検体を含む被検体にｉｎ  ｖｉｖｏで投与したときに、コンジュゲート化していないタンパク質又はポリペプチドと比較して、低下した免疫原性及び／又は循環中での増大した半減期を有する。
【００１９】
コンジュゲート化反応は、上記成分の種々の異なる組み合わせを含んでもよい。例には、水溶性ポリマー成分がＰＥＧで例示される以下の反応のサブセットが含まれる。しかし、他の水溶性ポリマー（例えばＰＰＯ）を、これらの反応のいずれかで使用してもよい。
【００２０】
反応の第１のサブセットにおいて、（ｃ）はタンパク質であり、（ａ）、（ｂ）及び（ｄ）のうち１つはＰＥＧ試薬であり、残りの成分は安定な非妨害性の化合物である。これらの反応において、（ｄ）がＰＥＧ−イソニトリル試薬であるか又は（ａ）がＰＥＧ−カルボニル試薬である場合、成分（ｂ）は好ましくは低分子量アミンであり、これは過剰に供給してもよい。（ｂ）がＰＥＧ−アミン試薬である場合、この試薬は好ましくは低ｐＫａのアミン（例えば、ＰＥＧオキシアミン、ＰＥＧヒドラジド、ＰＥＧカルバジド又はＰＥＧ芳香族アミン）である。
【００２１】
タンパク質分子上の単一の結合部位に２つのポリマー鎖をコンジュゲート化するのに有用な反応の関連するサブセットにおいて、（ｃ）はタンパク質であり、（ａ）、（ｂ）及び（ｄ）のうち２つはＰＥＧ試薬であり、残りの成分は安定な非妨害性の化合物である。
【００２２】
反応の第２のサブセットにおいて、（ａ）はアルデヒド基又はケトン基を含むように修飾されたタンパク質であり、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のうち１つはＰＥＧ試薬であり、残りの成分は安定な非妨害性の化合物である。これらの反応において、（ｂ）がＰＥＧ−アミン試薬である場合、この試薬は好ましくは低ｐＫａのアミン（例えば、ＰＥＧヒドラジド、ＰＥＧカルバジド又はＰＥＧ芳香族アミン）であり、（ｃ）は好ましくは過剰に提供された低分子量カルボン酸（例えば、緩衝剤成分又は添加剤としてのアセテート）である。（ｃ）がＰＥＧ−カルボキシル試薬である場合、（ｂ）は好ましくは過剰に提供された低分子量アミンである。
【００２３】
タンパク質分子上の単一の部位に２つのポリマー鎖をコンジュゲート化するのに有用な反応の関連するサブセットにおいて、（ａ）は反応性カルボニル（例えばアルデヒド基）を含むように修飾されたタンパク質であり、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のうち２つはＰＥＧ試薬であり、残りの成分は安定な非妨害性の化合物である。この場合、（ｂ）がＰＥＧ−アミン試薬であり、（ｄ）がＰＥＧ−イソニトリル試薬である場合には、ＰＥＧ−アミン試薬であるアミン試薬は好ましくは低ｐＫａのアミン（例えば、ＰＥＧヒドラジド、ＰＥＧカルバジド又はＰＥＧ芳香族アミン）であり、（ｃ）は好ましくは過剰に提供された低分子量カルボン酸（例えばアセテート）である。
【００２４】
反応の第３のサブセットにおいて、（ｂ）はタンパク質であり、（ａ）、（ｃ）及び（ｄ）のうち１つはＰＥＧ試薬であり、（ａ）、（ｃ）及び（ｄ）のうちの残り２つは安定な非妨害性の化合物である。これらの反応において、（ｄ）がＰＥＧ−イソニトリル試薬である場合、（ｃ）は好ましくは過剰に提供された低分子量カルボン酸である。
【００２５】
タンパク質分子に２つのポリマー鎖をコンジュゲート化するのに有用な反応の関連するサブセットにおいて、（ｂ）はタンパク質であり、（ａ）、（ｃ）及び（ｄ）のうち２つはＰＥＧ試薬であり、残りの成分は安定な非妨害性の化合物である。これらの反応において、（ａ）がＰＥＧ−カルボニル試薬であり（ｄ）がＰＥＧ−イソニトリル試薬である場合、（ｃ）は好ましくは過剰に提供された低分子量カルボン酸である。
【００２６】
別の態様において、本発明は医薬組成物を調製する方法を提供し、この組成物は、医薬的ビヒクル中に生物学的に活性な分子又は適切な分子の生体適合性ポリマー（好ましくは水溶性ポリマー）とのコンジュゲートを含み、この方法は、
（ｉ）以下の成分（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）ＲＡ−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、式中Ｒ’はＨ又は低級アルキルであり、好ましくはＨ又はＭｅであり、最も好ましくはＨである、
（ｂ）ＲＮ−ＮＨ２、
（ｃ）ＲＣ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、及び
（ｄ）ＲＩ−ＮＣ
を反応させて、ＲＡ、ＲＮ、ＲＣ及びＲＩによって示される各部分のうち少なくとも１つを組み込むコンジュゲート化生成物を形成するステップを含む。（一実施形態において、上述のように、このコンジュゲートは、ＲＡ、ＲＮ、ＲＣ及びＲＩによって示される各部分のうち正確に１つを組み込む、形態ＲＩＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＲＡＲ’−ＮＲＮ−Ｃ（Ｏ）ＲＣのものである。例えば成分（ａ）〜（ｄ）のうち１つが示される反応性官能基のうち１つより多くを有する他の実施形態（例えば、複数のアミノ基を有する成分ＲＮ−ＮＨ２又は複数のカルボン酸基を有する成分ＲＣ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ）において、このコンジュゲート生成物は、他の成分の複数の残基にコンジュゲート化された当該成分を含んでもよい。例えば、以下の実施例１６のヒアルロン酸コンジュゲートを参照のこと。
【００２７】
成分（ａ）〜（ｄ）のうち少なくとも１つは生物学的に活性な分子又は適切な分子であり、成分（ａ）〜（ｄ）のうち少なくとも１つは生体適合性の、好ましくは水溶性のポリマーであり、（ｉｉ）上記コンジュゲート又はその医薬的に許容可能な塩を、医薬的ビヒクル（好ましくは水性ビヒクル）中で製剤化する。形成されるコンジュゲートは好ましくは、室温及び生理的ｐＨで水溶性である。
【００２８】
コンジュゲートＲＩＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＲＡＲ’−ＮＲＮ−Ｃ（Ｏ）ＲＣの形成において、この生物学的に活性な分子は、上記（ａ）〜（ｄ）から選択される、好ましくは（ａ）〜（ｃ）から選択される少なくとも１つの成分によって示され、このポリマーは、上記（ａ）〜（ｄ）から選択される少なくとも１つの異なる成分によって示され、（ａ）〜（ｄ）の任意の残りの成分は、標識部分、標的化部分及び他の安定な非妨害性の化合物から選択される。好ましい実施形態において、この分子は（ａ）〜（ｃ）から選択される１つの成分であり、このポリマーは（ａ）〜（ｄ）から選択される異なる成分であり、（ａ）〜（ｄ）の残りの成分は、標識部分、標的化部分及び他の安定な非妨害性の化合物から選択される。典型的には、これら残りの成分は、本明細書中で規定されるとおりの低分子量化合物である。
【００２９】
好ましい実施形態において、この生物学的に活性な分子は、（ａ）ＲＡ−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、（ｂ）ＲＮ−ＮＨ２及び（ｃ）ＲＣ−Ｃ（Ｏ）ＯＨから、より好ましくは（ｂ）ＲＮ−ＮＨ２及び（ｃ）ＲＣ−Ｃ（Ｏ）ＯＨから選択される。選択された実施形態において、この分子はタンパク質又はポリペプチドである。
【００３０】
さらなる選択された実施形態において、このポリマーは、（ａ）ＲＡ−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、（ｂ）ＲＮ−ＮＨ２及び（ｄ）ＲＩ−ＮＣ、又は（ａ）ＲＡ−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、（ｂ）ＲＮ−ＮＨ２及び（ｃ）ＲＣ−ＣＯＯＨから選択される。なおさらなる実施形態において、このポリマーは、（ａ）ＲＡ−Ｃ（Ｏ）Ｒ’及び（ｂ）ＲＮ−ＮＨ２から選択される。このポリマーは、好ましくは官能化ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）（例えば、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）、又は好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、利用可能なカルボニル官能基、アミン官能基又はイソニトリル官能基を有するＰＥＧ分子））である。特定の一実施形態において、このポリマーは本明細書中で開示したとおりのＰＥＧイソニトリルである。
【００３１】
ステップ（ｉ）のコンジュゲート化反応は、上記反応の第１〜第３及び関連のサブセットを含む、上述の成分の種々の異なる組み合わせを含んでもよい。これらの反応におけるタンパク質は、別の生物学的に活性な分子（例えば、多糖、ポリヌクレオチド又は低分子薬物化合物）で置換してもよい。
【００３２】
好ましくは、生物学的に活性な分子のポリマーとのコンジュゲートは、ヒト被検体を含む被検体にｉｎ  ｖｉｖｏで投与したときに、コンジュゲート化していない生物学的に活性な分子と比較して、低下した免疫原性、低下した分解及び／又は循環中での増大した半減期を有する。
【００３３】
さらなる態様において、本発明は、形態
ＲＩＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＲＡＲ’−ＮＲＮ−Ｃ（Ｏ）ＲＣ
の水溶性コンジュゲートを提供し、式中、
ＲＡ、ＲＮ及びＲＣのうち少なくとも１つがタンパク質又はポリペプチドであり、
ＲＩ、ＲＡ、ＲＮ及びＲＣのうち少なくとも１つ、好ましくはＲＩがポリアルキレンオキシド、好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、
ＲＩ、ＲＡ、ＲＮ及びＲＣの残りのメンバーが、標識部分、標的化部分及びＲから独立して選択され、Ｒは、１〜１２個、好ましくは１〜８個の炭素原子並びに酸素、窒素及び硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する安定な有機部分である。ＲがＲＡ、ＲＮ又はＲＣの一実施形態である場合、Ｒは水素であってもよい。Ｒ’は好ましくはＨ又は低級アルキル（例えばＣＨ３）であり、より好ましくはＨである。
【００３４】
好ましくは、Ｒは、水素でもメチルでもない場合には、アルキル、アルケニル、エーテル、ヒドロキシル、カルボン酸エステル、ケトン及びアミドから選択される連結を含む。例には、低級アルキル基、シクロアルキル基、低級ヒドロキシアルキル基、低級アルキルエステル及び低級アルキルアミドが含まれる。
【００３５】
このコンジュゲートは好ましくは、室温及び生理的ｐＨで水溶性である。
【００３６】
水溶性コンジュゲートＲＩＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＲＡＲ’−ＮＲＮ−Ｃ（Ｏ）ＲＣにおいて、タンパク質又はポリペプチドを示す部分ＲＮ又はＲＣは、上述のように、この分子ＲＮ又はＲＣが示された官能基の複数の存在を含む場合（例えば、複数のアミノ基を有するポリペプチドＲＮ−ＮＨ２又は複数のカルボン酸基を有するポリペプチドＲＣ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ）、他の成分のさらなる残基に連結されていてもよい。一実施形態において、これらの部分は、残りの成分のさらなる残基には連結されない。即ち、このコンジュゲートは、各残基ＲＩ、ＲＡ、ＲＮ及びＲＣのうち正確に１つを含む。このようなさらなる残基の存在又は不在は、反応条件、例えば存在する成分のモル比によって制御可能である。
【００３７】
本発明は、上記条項の範囲内に、種々の組み合わせの上述の成分を有するコンジュゲートを含む。典型的には、このコンジュゲートは、１つ又は２つのＰＡＯ分子、好ましくはＰＥＧ分子にコンジュゲート化された単一のタンパク質分子又はポリペプチド分子を含む。このような組み合わせには、
ＲＣはタンパク質であり、ＲＩはＰＥＧであり、ＲＡ及びＲＮは標識部分、標的化部分及びＲから独立して選択され、
ＲＣはタンパク質であり、ＲＮはＰＥＧであり、ＲＡ及びＲＩは標識部分、標的化部分及びＲから独立して選択され、
ＲＣはタンパク質であり、ＲＡはＰＥＧであり、ＲＩ及びＲＮは標識部分、標的化部分及びＲから独立して選択され、
ＲＣはタンパク質であり、ＲＮ及びＲＡの各々はＰＥＧであり、ＲＩは標識部分、標的化部分又はＲであり、
ＲＣはタンパク質であり、ＲＮ及びＲＩの各々はＰＥＧであり、ＲＡは標識部分、標的化部分又はＲであり、
ＲＡはタンパク質であり、ＲＮはＰＥＧであり、ＲＣ及びＲＩは標識部分、標的化部分及びＲから独立して選択され、
ＲＡはタンパク質であり、ＲＮはＰＥＧであり、ＲＩはＰＥＧであり、ＲＣは標識部分、標的化部分又はＲであり、
ＲＡはタンパク質であり、ＲＣはＰＥＧであり、ＲＩ及びＲＮは標識部分、標的化部分及びＲから独立して選択され、
ＲＮはタンパク質であり、ＲＩはＰＥＧであり、ＲＡ及びＲＣは標識部分、標的化部分及びＲから独立して選択され、
ＲＮはタンパク質であり、ＲＡはＰＥＧであり、ＲＩはＰＥＧであり、ＲＣは標識部分、標的化部分又はＲであり、
ＲＮはタンパク質であり、ＲＣはＰＥＧであり、ＲＩ及びＲＣは標識部分、標的化部分及びＲから独立して選択され、或いは
ＲＮはタンパク質であり、ＲＣはＰＥＧであり、ＲＩはＰＥＧであり、ＲＡは標識部分、標的化部分又はＲである、コンジュゲートが含まれる。
【００３８】
上記組み合わせの選択された実施形態において、非タンパク質の非ＰＡＯ成分は、Ｒの実施形態である。他の実施形態において、１つのこのような非タンパク質の非ＰＡＯ成分は、標識部分又は標的化部分である。
【００３９】
本発明のこれら及び他の目的及び特徴は、添付の図面と組み合わせて以下の発明の詳細な説明を読めば、より完全に明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
Ｉ．定義
「ポリペプチド」は、本明細書中で使用する場合、特定の長さに限定されないアミノ酸のポリマーである。従って、例えば、用語ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質及び酵素は、ポリペプチドの定義内に含まれる。この用語は、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などのポリペプチドの発現後修飾をも含む。
【００４１】
用語「ポリマー」は、本明細書中で使用する場合、生物学的に活性な分子（これ自体ポリマー性であっても）にコンジュゲート化される、親水性の、好ましくはＰＥＧのような水溶性のポリマーをいうことを意図する。
【００４２】
「ＰＥＧ」とは、反復単位（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎを有するポリマーであるポリエチレングリコールをいい、ここでｎは好ましくは約１０〜約２３００であり、これは約４４０ダルトン〜約１００，０００ダルトンの分子量に対応する。これらのポリマーは、実質的に分子量範囲全体にわたって水溶性である。ポリペプチドへのコンジュゲート化について、ＰＥＧ分子量の好ましい範囲は、約２，０００〜約５０，０００ダルトン、より好ましくは約２，０００〜約４０，０００ダルトンである。ＰＥＧは、本明細書中に記載されるコンジュゲート化反応を妨害しない任意の基で末端キャップされていてもよい（例えば、適切な保護部分でブロックされたヒドロキシル、エステル、アミド、チオエーテル、アルコキシ又は種々の反応性基）。一般的な末端キャップされたＰＥＧは、メトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）である。ＰＥＧホモポリマーが好ましいが、この用語は、ＰＥＧの別のモノマーとのコポリマーを含むこともある。これは、例えば、プロピレングリコールのような別のエーテル形成モノマーであり得よう。
【００４３】
「生物学的に活性な」分子とは、生物学的活性を有することが公知の分子及び／又は治療用途若しくは診断用途が意図された分子をいい、特に、治療活性を有すると予測される分子をいう。このような分子は「生物学的に適切な」ということもある。
【００４４】
本明細書中に記載されるコンジュゲート化反応の反応成分に関して「安定な」及び／又は「非妨害性の」とは、反応成分が、コンジュゲート化反応におけるその意図された役割を果たす以外には、コンジュゲート化の条件下でいずれの化学反応も受けず、得られたコンジュゲート上に安定な生物学的に良性の置換基を提供することを意味する。
【００４５】
本明細書中で使用する場合、典型的には非妨害性の反応成分に関して、「低分子量」とは一般に、約５００ダルトン以下、好ましくは３５０ダルトン以下、より好ましくは２００ダルトン以下を意味する。
【００４６】
４成分縮合反応の成分に関して、「カルボニル」成分とは、本明細書中で使用する場合、アルデヒド又はケトンをいう。この成分はＲＡ−Ｃ（Ｏ）Ｒ’で示され得、式中、Ｒ’はＨ又は低級アルキルであり、好ましくはＨ又はメチルであり、より好ましくはＨであり（即ち、このときこのカルボニル成分はアルデヒドである）、かつＲＡは、本明細書中で規定されるとおりの、生物学的に活性な分子（例えば、タンパク質又はポリペプチド）、水溶性ポリマー又は安定な非妨害性の化合物の残基である。
【００４７】
「アルキル」とは、炭素及び水素を含む完全に飽和した非環状の一価の基をいい、直鎖でも分枝鎖でもよい。アルキル基の例は、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ヘプチル及びイソプロピルである。「シクロアルキル」とは、好ましくは３〜７個、より好ましくは５個又は６個の環炭素原子を有する、炭素及び水素を含む完全に飽和した環状の一価の基をいい、アルキルでさらに置換されていてもよい。シクロアルキル基の例には、シクロプロピル、メチルシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、エチルシクロペンチル及びシクロヘキシルが含まれる。
【００４８】
「低級アルキル」とは、１〜６個の炭素原子のアルキル基をいい、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、イソアミル、ｎ−ペンチル及びイソペンチルで例示される。選択された実施形態において、「低級アルキル」基は、１〜４個の炭素原子を有する。
【００４９】
「アシル」とは、カルボニル基（即ちＲ−（Ｃ＝Ｏ）−）に連結されたアルキル基（低級アルキル基であってもよい）をいう。
【００５０】
「ヒドロカルビル」は、炭素及び水素からなる基（即ち、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル及び非複素環式アリール）を包含する。
【００５１】
「アリール」とは、単環（例えばフェニル）、２つの縮合した環（例えばナフチル）又は３つの縮合した環（例えば、アントラシル又はフェナントリル）を有する、置換又は非置換の一価の芳香族基をいう。一般的には単環式基が好ましい。この用語は一般にヘテロアリール基を含み、これは、環中に１つ以上の窒素原子、酸素原子又は硫黄原子を有する芳香族環基（例えば、フリル、ピロール、ピリジル及びインドール）である。「置換」とは、アリール基中の１つ以上の環水素が、ハライド（例えば、フッ素、塩素又は臭素）；１個又は２個の炭素原子を含む低級アルキル基；或いはニトロ、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、メトキシ、ハロメトキシ、ハロメチル又はハロエチルで置換されていることを意味する。存在する場合、好ましい置換基には、フッ素、塩素、メチル、エチル及びメトキシが含まれる。
【００５２】
用語「医薬的に許容可能な塩」は、例えば、有機又は無機の対イオン（例えば、アルカリ金属又はアルカリ土類金属のカチオン（例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、バリウム又はカルシウム）；アンモニウム；或いは有機カチオン（例えば、ジベンジルアンモニウム、ベンジルアンモニウム、２−ヒドロキシエチルアンモニウム、ビス（２−ヒドロキシエチル）アンモニウム、フェニルエチルベンジルアンモニウム）など）を有するカルボン酸塩を包含する。他のカチオンには、塩基性アミノ酸（例えば、グリシン、オルニチン、ヒスチジン、フェニルグリシン、リシン及びアルギニン）のプロトン化形態が含まれる。
【００５３】
この用語はまた、有機酸又は無機酸から誘導される対イオンを有する、アミンのような塩基性基の塩を含む。このような対イオンには、クロライド、サルフェート、ホスフェート、アセテート、サクシネート、シトレート、ラクテート、マレアート、フマレート、パルミテート、コレート、グルタメート、グルタレート、タータレート、ステアラート、サリチレート、メタンスルホネート、ベンゼンスルホネート、ソルベート、ピクラート、ベンゾアート、シンナマートなどが含まれる。
【００５４】
「医薬的に許容可能な担体」は、ヒト被検体を含む被検体にコンジュゲートを医薬製剤として投与するのに適切な担体である。この担体は、典型的には、水性の生理食塩水、デキストロース、グリセロール又はエタノールのような水性ビヒクルである。緩衝剤、安定剤などのような不活性成分を、この製剤中に含めてもよい。本明細書中で使用する場合、「水性ビヒクル」は、その主要成分として水を含むが、上記のような溶質を含んでもよい。アルコール又はグリセロールのような共溶媒が存在してもよい。
【００５５】
使用され得る固体製剤は、典型的には、不活性賦形剤（例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース又はセルロースエーテル、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウムなど）を含む。このコンジュゲートはまた、当該分野で公知の方法に従って、脂質若しくはリン脂質中、リポソーム製剤中、又は経皮若しくは吸入製剤中の、懸濁物として製剤化してもよい。
【００５６】
ＩＩ．高分子コンジュゲート
本発明の特定の態様によれば、少なくとも１つの水溶性ポリマーにコンジュゲート化された少なくとも１つの生物学的に活性な分子を含む高分子コンジュゲート及びその調製方法が提供される。
【００５７】
これらのコンジュゲートは、図１（図中にはアルデヒド成分が示されている）に示されるように、カルボン酸成分、アミン成分、イソニトリル成分及びアルデヒド成分若しくはケトン成分を使用する４成分縮合（４ＣＣ）スキームを介して調製される。４成分反応の機構は、Ｕｇｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｕｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９５９）によって最初に記載され、最近再検討された（Ｄｏｍｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｇｉ，２０００）。
【００５８】
本発明によれば、上述の４成分は、カルボン酸成分、アミン成分及び反応性カルボニル（例えばアルデヒド）成分から選択される少なくとも１つの成分が、生物学的に活性な分子又は高分子（好ましくはポリペプチド）上に存在し、カルボン酸成分、アミン成分、イソニトリル成分及びカルボニル成分から選択される少なくとも１つの異なる成分が親水性ポリマー（好ましくはＰＥＧのようなポリエーテル）上に存在するように、選択される。この親水性ポリマーは好ましくは、水性媒体中で可溶性であり、従って好ましくは架橋されていない。
【００５９】
生物学的に活性な分子であることも親水性ポリマーであることも意図されない任意の残りの成分は、典型的に、安定な、安定な非妨害性の、好ましくは低分子量化合物として提供される。例えば、ギ酸又は酢酸をカルボン酸成分として使用してもよく、或いはｔｅｒｔ−ブチルイソニトリル又はシクロヘキシルイソニトリルをイソニトリル成分として使用してもよい。これらの成分は、コンジュゲート生成物の連結部分上に、本質的に不活性な置換基（例えば、メチル基又は他のアルキル基）を形成し得る。
【００６０】
これら残りの成分はまた、コンジュゲートに標識部分又は標的化部分を供給してもよい。例えば、ビオチン、クマリン−４−酢酸、７−アミノクマリン、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ  ＣＨ、葉酸及びキレート剤（例えばＤＴＰＡ）が、このような目的のために潜在的に利用可能である。
【００６１】
好ましくは、残りの成分の分子量は、コンジュゲートの形成を立体的に妨害しないような分子量である。好ましい分子量範囲は、５００ダルトン未満、より好ましくは３５０ダルトン未満、最も好ましくは２００ダルトン未満である。
【００６２】
これらの成分は、反応して、ＲＡ、ＲＮ、ＲＣ及びＲＩによって示される各部分のうち少なくとも１つを組み込むコンジュゲートを形成する。一実施形態において、上述のように、このコンジュゲートは形態：
【化１】
2008502788.tif 000004
のものであり、式中、ＲＩはイソニトリル成分由来であり、ＲＡは反応性カルボニル（例えばアルデヒド、このときＲ’＝Ｈ）成分由来であり、ＲＮはアミン成分由来であり、ＲＣはカルボン酸成分由来である。この反応について一般に受容された機構が図１中に示される。
【００６３】
例えば成分（ａ）〜（ｄ）のうちの１つが示される反応性官能基を１つより多く有する他の実施形態（例えば、複数のアミノ基を有する成分ＲＮ−ＮＨ２又は複数のカルボン酸基を有する成分ＲＣ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ）において、コンジュゲート生成物は、他の成分の複数の残基にコンジュゲート化された当該成分を含んでもよい。例えば、以下の実施例１６のヒアルロン酸コンジュゲートを参照のこと。このようなさらなる残基の存在、不在及び／又は数は、存在する成分のモル比のような反応条件によって制御可能である。
【００６４】
この反応は、「ワンポット」反応として実施できる。コンジュゲート化の効率は、アミン成分及びカルボニル成分を最初に縮合させることによって図１中に示される第１の中間体を生成し、引き続いてこの中間体を残りの成分と反応させることによって改善され得る場合がある（以下の実施例７及び１６を参照のこと）。
【００６５】
Ａ．生物学的に活性な分子
生物学的に活性な剤は、典型的には治療剤又は診断剤である。生物学的に活性な剤には、ポリマー性又はオリゴマー性の生体分子（例えば、タンパク質、多糖又は核酸）、或いは低分子化合物から選択される薬物物質が含まれる。「低分子」化合物は、ポリマーでもオリゴマーでもない有機化合物、無機化合物又は有機金属化合物として広く定義され得る。典型的に、このような化合物は、１０００ダルトン以下、又は一実施形態では５００ダルトン以下の分子量を有する。
【００６６】
生物学的に活性な分子は、本明細書中に記載される反応では、しばしばアミン成分又はカルボン酸成分である。このような官能基は、ポリペプチド又は種々の低分子薬物物質のような生物学的に活性な分子中に一般に存在する。
【００６７】
上述のように、生物学的に活性な分子が示された官能基の複数の存在を含む場合（例えば、複数のアミノ基を有するポリペプチドＲＮ−ＮＨ２又は複数のカルボン酸基を有するポリペプチドＲＣ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ）、コンジュゲート中のこの分子の残基は、残りの成分のさらなる残基に連結され得る。例えば、以下の実施例１６のヒアルロン酸コンジュゲートを参照のこと。このようなさらなる残基の存在又は不在は、存在する成分のモル比のような反応条件によって制御可能である。
【００６８】
異なる成分の官能基のうち１つより多くが生物学的に活性な分子中に存在する場合、反応条件は、好ましくは、他の反応よりも１つの反応に有利なように選択される。例えば、分子（例えばタンパク質）中のカルボン酸基よりもアミン基の反応を促進するために、この反応は、アセテートが、反応のカルボキシル成分として作用することにおいて分子上のカルボキシレート基と有効に競合するように、高いｐＨ（例えば、７〜８．５）及び／又は高濃度のアセテート緩衝液の存在下で実施できる。或いは、分子中のアミンよりもカルボン酸の反応を促進するために、この反応は低いｐＨで実施できる。例えば、ｐＨ４〜６で、ポリペプチド中のアミンは大部分がプロトン化される。タンパク質アミノ基の反応性をさらに抑制するために、反応混合物は、低分子量の、好ましくは低ｐＫａのアミン（例えば、ヒドラジド又は芳香族アミン）又はアミン含有緩衝剤（例えば、ＴＲＩＳ又はグリシンアミド）を過剰に含むこともできる。
【００６９】
好ましい実施形態において、生物学的に活性な分子（例えば、ポリペプチド又は糖ペプチド）は、反応物中のカルボニル（例えばアルデヒド）成分である。アルデヒドは、アミン又はカルボン酸と比較すると生物学的に活性な分子（例えばポリペプチド）中にはあまり一般的に存在しないが、このような分子中に反応性カルボニルを合成により組み込むための種々の方法が存在する。例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３：９６１４，１９９８）及びＭａｒｃａｕｒｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．３：３６９１−９４，２００１）は、ペプチド中に組み込むことができるケトアミノ酸の合成を記載している。糖タンパク質上の１，２−ｃｉｓジオール部分又は１，２−アミノアルコール部分の過ヨウ素酸酸化は、これらの化合物中にアルデヒド基を生成するための周知の方法である（例えば、Ｗｉｌｃｈｅｋ，１９８７；Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ，１９８７；Ｍｏｒｅｈｅａｄ，１９９１を参照のこと）。ガラクトピラノシド残基又はＮ−アセチルガラクトピラノシド残基上の６位のガラクトースオキシダーゼ媒介性の酸化は、糖タンパク質上にアルデヒド基を生成するための別の公知の方法である（Ｗｉｌｃｈｅｋ，１９８７）。セリン又はチロシンを含有するペプチド上でのアルデヒド官能基の導入は、これらのアミノ酸残基のヒドロキシル基の、それぞれ反応性のアルデヒド基及びケトン基への、ＤＭＳＯ／カルボジイミド媒介性の酸化によって達成できる（Ｄｉ  Ｂｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．１９７２）。アルデヒドはまた、適切なヘテロ二官能性試薬（例えば、Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）が記載したような４−ホルミル安息香酸ＮＨＳエステル）とポリペプチド上のアミンとの反応を介して、ポリペプチド中に組み込むこともできる。ペプチド又はアミノサッカライドのアミノ基は、例えばＹａｒｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）の方法によって、Ｎ−レブリノイル残基へと変換できる。
【００７０】
糖タンパク質の過ヨウ素酸酸化（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ  ｅｔ  ａｌ．；Ｗｉｌｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．）のような上記方法の多くは、ポリペプチド上の反応性カルボニルの部位特異的な生成を提供することによって、本発明の方法に従うポリマーの部位選択的なコンジュゲート化を可能にする。他の経路には、Ｎ末端にセリン又はスレオニンを含むペプチドの過ヨウ素酸媒介性の酸化が含まれ、これは、Ｎ末端のセリン又はスレオニンを反応性のＮ−グリオキサリル残基に変換する（Ｄｉｘｏｎ，１９８７；Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９２）。ペプチドのＮ末端アミノ基転移は、部位特異的様式で反応性カルボニル基を生成するための別の一般的な方法である（Ｄｉｘｏｎ，１９８４で検討）。
【００７１】
この様式で生成された反応性カルボニルは、生体分子の種々のヒドラジド化合物及びオキシアミン化合物とのコンジュゲート化に以前から使用されており、それぞれヒドラゾン及びオキシムが連結したバイオコンジュゲートを形成する（Ｇａｅｒｔｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９２；Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，１９９５ｃ；Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ａｎｄ  Ｍｅｎｏｎ−Ｒｕｄｏｌｐｈ，１９９７；Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，０７７，９３９号）。しかし、これらの連結は、特に競合するヒドロキシルアミン誘導体又はヒドラジン誘導体の存在下では、酸性ｐＨで不安定である。本明細書中に開示された方法に従って調製されたバイオコンジュゲートは、かなり高い安定性を提供する。
【００７２】
Ｂ．ポリマー
生物学的に活性な分子にコンジュゲート化すべきポリマーは、アミン、カルボン酸、アルデヒド若しくはケトン、又はイソニトリルから選択される反応性の基を含むか含むように修飾できる任意の生体適合性ポリマーであり得る。好ましくは、このポリマーは非免疫原性の親水性ポリマーである。このポリマーは好ましくは水溶性であり、従って、このポリマーは架橋されているべきではない。好ましくは、このポリマーは室温及び生理的ｐＨで水中で可溶性である。例示的な親水性ポリマーには、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチル−アクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリアスパルトアミド及び上記列挙したポリマーのコポリマー（例えば、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドコポリマー）が含まれる。これらのポリマーの多くの特性及び反応は、米国特許第５，３９５，６１９号及び同第５，６３１，０１８号に記載されている。好ましい実施形態において、このポリマーは、ＰＰＯ又はＰＥＧのようなポリ（アルキレンオキシド）であり、より好ましくはＰＥＧ（ポリエチレングリコール）ポリマーである（用語ポリアルキレン「オキシド」及びポリアルキレン「グリコール」は等価であることに留意されたい）。
【００７３】
アミン、イソニトリル、カルボキシル基、又はカルボニルを含むＰＥＧポリマーの調製方法は、以下の実施例１〜４に記載される。Ｚａｌｉｐｓｋｙ（１９９５ｂ）及びＺａｌｉｐｓｋｙ  ＆  Ｈａｒｒｉｓ（１９９７）も参照のこと。上記列挙したような親水性ポリマーの他のタイプは、ヒドロキシル含有ポリマーについて実施例１〜４の手順の修飾を使用して、或いは当業者に利用可能な合成手順に従って、同様に官能化できる。
【００７４】
ＰＥＧ−イソニトリル誘導体及びＰＰＯ−イソニトリル誘導体は、本発明以前には知られていなかった。このような誘導体において、ＰＥＧ分子量の好ましい範囲は約２，０００〜約５０，０００ダルトン、より好ましくは約２，０００〜約４０，０００ダルトンである。ＰＥＧは、イソニトリルと反応しないか本明細書中に記載されるコンジュゲート化反応を妨害しない任意の安定な末端キャッピング基で、非イソニトリル末端にて末端キャップしてもよい（例えば、適切な保護部分でブロックされたエステル、アミド、チオエーテル、ヒドロキシル、アルコキシ又は種々の反応性基）。一般的な末端キャップされたＰＥＧはメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）である。ＰＥＧホモポリマーが好ましいが、この用語はＰＥＧの別のモノマーとのコポリマーを含むこともある。これは、例えば、プロピレングリコールのような別のエーテル形成モノマーであり得よう。
【００７５】
本明細書中に提供されるようなＰＡＯ−イソニトリル化合物は、典型的には構造ＲＣＡＰ（ＯＣＨＲ”ＣＨ２）ｎ−Ｘ−Ｎ≡Ｃを有し、式中、ＲＣＡＰは安定な末端キャッピング基であり、Ｒ”はＨ又はメチル、好ましくはＨであり、Ｘは直接結合又は安定な連結部分を示し、ｎは１０と約２３００との間の整数であり、その結果、部分−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−は、Ｒ”がＨのとき、約４４０ダルトンと約１００，０００ダルトンとの間の分子量を有する。選択された実施形態において、ＲＣＡＰはアシル、アリール又はアルキル（例えばメチル）である。
【００７６】
リンカーＸは、直接結合でない場合、好ましくは、直鎖又は分枝鎖アルキル、アリール、シクロアルキル、エーテル、アミド及びそれらの組み合わせから選択される連結からなる。より好ましくは、Ｘは、低級アルキル、シクロアルキル、アリール、並びに低級アルキル及びアリール又は低級アルキル及びシクロアルキルの組み合わせから選択される連結からなる。アリールは好ましくは単環（例えばフェニル）であり、シクロアルキルは好ましくはシクロペンチル又はシクロヘキシルである。このリンカーは、好ましくは約１２原子長までであり、より好ましくは約８原子長までである。例示的なリンカーには、シクロヘキシル及び低級アルキル（例えば−（ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは１〜４である））が含まれる。
【００７７】
ＰＥＧ−イソニトリルの例示的な調製方法は、以下の実施例１に提供される。この方法は、ホルムアミド中間体（これは順に、ＰＥＧアミンのギ酸エチルとの反応によって調製される）の脱水を使用する。この経路は、安定なリンカー（例えば、アルキルリンカー又はシクロアルキルリンカー）を含むＰＥＧイソニトリルの調製に適合させることができよう。
【００７８】
ポリマー性アミン成分をポリペプチドへのコンジュゲート化に使用すべき場合、このポリマー上のアミン官能基は、ポリペプチド上のアミノ基より低いｐＫａを有することが好ましい。この様式において、上記のように、ポリペプチドとのコンジュゲート化は、ポリペプチド上のアミノ基（主に、約１０のｐＫａを有するリシン側鎖）がプロトン化され、従って非反応性であるが、塩基性の低いポリマー性アミンはプロトン化されず、従って反応性である４〜７のｐＨで実施できる。約３のｐＫａを有するＰＥＧカルバジド若しくはＰＥＧヒドラジド、又は典型的には約４のｐＫａを有する芳香族アミンにコンジュゲート化したＰＥＧが、この目的に適した試薬である。
【００７９】
本明細書中に記載されるコンジュゲート化反応の一実施形態において、２つの反応性成分が官能化ポリマー性試薬として提供され、例えば、ポリペプチド又は多糖は、そのカルボキシル基を介して、ＰＥＧ−アミン成分とＰＥＧ−カルボニル成分との間の反応によって形成された、予め形成されたＣ＝Ｎ連結されたジ−ＰＥＧ付加体と反応し得よう（例えば、以下の表１の項目４、実施例７）。或いは、ＰＥＧ−イソニトリル及びＰＥＧ−カルボニル（例えば、以下の表１の項目１０）は、２つのＰＥＧ鎖の単一部位での結合を達成するために使用できよう。従って、本反応は、１つのアミノ酸残基又は糖残基に連結された２つの結合したＰＥＧ鎖を有するポリペプチドコンジュゲートを提供できる（表１の項目４、５、７及び１０）。多腕（ｍｕｌｔｉａｒｍ）のＰＥＧ試薬及び代替的な化学で調製されたそれらのコンジュゲートの利点について、以前に記載されたものもある（Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；米国特許第５，９３２，４６２号）。
【００８０】
Ｃ．他の反応成分
一般に、コンジュゲート化反応は、４つの必要な官能基のうち１つを含む親水性ポリマーと、４つの必要な官能基のうち別のものを含む生物学的に活性な分子とを使用する。各々が４つの必要な官能基のうち異なる１つを含む２つ又は３つの異なるポリマー（又は生物学的に活性な分子）を選択することによって、２つ又は３つさえもの親水性ポリマー（又は分子）を含むコンジュゲートを生成することも可能であり得る。
【００８１】
残りの成分（存在する場合、一般に１つ又は２つ）は、安定な非妨害性の、好ましくは低分子量の化合物として提供される。「安定な」とは、成分が、コンジュゲート化反応におけるその意図された役割を果たす以外には、コンジュゲート化の条件下でいずれの化学反応も受けず、得られたコンジュゲート上に安定な生物学的に良性の置換基を提供することを意味する。「低分子量」とは、約５００ダルトン以下、好ましくは３５０ダルトン以下、より好ましくは２００ダルトン以下を意味する。例は、１〜１２個の炭素原子及び約４個までのヘテロ原子を有する化合物である。これらの添加物中のＲＮ、ＲＣ、ＲＡ及び／又はＲＩ（集合的にＲＸと呼ぶ）の性質は、ＲＸが、所望のコンジュゲート化反応、又は得られたコンジュゲートの活性若しくは保存安定性を有害に妨害しないかぎり、重要ではない。
【００８２】
ＲＸは、標的化部分又は標識部分を提供し得る。例には、フルオロフォア（例えば、クマリン、フルオレセイン）及び標的化部分若しくは結合部分（例えば、ビオチン、フォレート又はピリドキサール）が含まれる。他の標的化部分には、本明細書中に参考により組み込まれる共有に係る米国特許第６，６６０，５２５号中に記載されたものが含まれる。
【００８３】
或いは、ＲＸは、非活性の生物学的に良性の「プレースホルダー」基であり、これはＲによって示され得る。好ましくは、Ｒは１〜１２個の炭素原子を有し、約４個までのヘテロ原子を含んでもよい。より好ましくは、Ｒは１〜８個又は１〜６個の炭素原子を有する。ＲがＲＡ、ＲＮ又はＲＣの一実施形態である場合、Ｒは水素でもよい。Ｒ内の任意の官能基は、コンジュゲート化反応の条件下で安定であるべきである（標識部分又は標的化部分のなかには、本明細書中で規定されるとおりのＲの定義内に入り得るものもあることが理解される）。
【００８４】
Ｒは、上記定義のようなアリール基を含んでもよい。好ましくは、Ｒは非芳香族であり、水素でもメチルでもない場合、アルキル、アルケニル、エーテル、ヒドロキシル、カルボン酸エステル及びアミドから選択される連結を含む。Ｒの例には、低級アルキル基（例えば、メチル、エチル、イソプロピル又はｔｅｒｔ−ブチル）、シクロアルキル基（例えば、シクロヘキシル）、低級ヒドロキシアルキル基、低級アルキルエステル、低級アルキルケトン及び低級アルキルアミドが含まれる。溶媒又は緩衝液として一般に使用される化合物が使用され得る。このような成分の特定の例には、ＲＮ−ＮＨ２としてＴＲＩＳ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）又はグリシンアミド（Ｈ２ＮＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２）、ＲＣ−ＣＯＯＨとして酢酸、ＲＡ−ＣＨＯとしてアセトアルデヒド、及びＲＩ−ＮＣとしてｔｅｒｔ−ブチルイソニトリル、イソシアノ酢酸エチルエステル（Ｃ≡ＮＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＥｔ）又はイソシアノプロピオン酸エチルエステル（Ｃ≡ＮＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｅｔ）が含まれる。後者のイソニトリルは、１当量のβ−アラニンを各生成物コンジュゲート中に組み込むので、得られたコンジュゲートの特徴付けに有利である。標準的なアミノ酸分析を使用して、こうして形成された結合の数を決定することができる。
【００８５】
立体の考慮事項は、コンジュゲート化のために成分を選択する際に考慮すべきである。従って、大きい分子及び／又はポリマーが使用される場合、或いはこれらの実体のいずれかのうち１つより多くを使用すべき場合、残りの成分は、好ましくは小さい低分子量の化合物（例えば低級アルキル誘導体）である。
【００８６】
ＩＩ．反応条件
これらの反応は一般に、極性有機溶媒（例えば、メタノール、トリフルオロエタノール又はＤＭＦなど）中で実施されるが、水性媒体中で実施される４ＣＣ反応の限定的な例が文献中にある（ｄｅ  Ｎｏｕｙ，２０００；Ｖｒｅｄｂｌａｄ，１９７３；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，１９９３）。
【００８７】
反応条件は、ＲＡ、ＲＣ、ＲＩ及びＲＮによって示される各残基のうち正確に１つを有するコンジュゲートを生成するため、或いは（上述のように、これらの成分のうち１つより多くが多官能性である場合には）例えば成分のモル比の選択によって、選択された残基の複数の存在を有するように、調整できる。
【００８８】
反応条件はまた、上述の官能基のうち１つより多くを含み得る成分（例えば、アミン官能基及びカルボン酸官能基の両方を含むタンパク質）上の選択された官能基の反応に有利であるよう調整できる。反応条件は、それぞれカルボキシル成分として過剰な低分子量カルボン酸（例えばアセテート緩衝液）及び／又はアミン成分として低分子量アミン（例えばヒドラジド）を含むことによって、タンパク質上のカルボン酸又はアミンの反応を抑制するように調整してもよい。
【００８９】
タンパク質側鎖アミンの反応は、側鎖アミン（主に、約１０のｐＫａを有するリシン側鎖）がプロトン化され、従って非反応性である４〜７のｐＨで反応を実施することによっても抑制できる。この場合、反応することが所望されるアミン成分は、好ましくは低ｐＫａのアミンである。例えば、ＰＥＧ−アミン成分をタンパク質（又は反応性アミノ基を有する他の生体分子）へのコンジュゲート化に使用すべき場合、ＰＥＧ−アミン官能基は、タンパク質上のアミノ基よりも低いｐＫａを有することが好ましい。この様式で、ＰＥＧアミンは、タンパク質側鎖アミンがプロトン化されるｐＨ範囲で、プロトン化されず、従って反応性であろう。約３のｐＫａを有するＰＥＧカルバジド若しくはＰＥＧヒドラジド、又は典型的には約４のｐＫａを有するＰＥＧ−芳香族アミン試薬が、この目的に適した試薬である。
【００９０】
コンジュゲート化効率を増大させるために、ある場合には、アミン成分及びカルボニル成分を最初に縮合させることによって４ＣＣ反応の第１の中間体を生成し、次いでこれに、コンジュゲート化の完了のために残りの成分を添加することが有利である（以下の実施例７を参照のこと）。
【００９１】
コンジュゲート化反応は、４成分のうちの１つ又は反応条件を変化させ、それによって種々の程度の分子多様性を持つ混合物を生成して、同時に又は平行反応で複数のコンジュゲートを生成するためにも使用できる。この様式で生成された種々のバイオコンジュゲートは、種々の化学的特性及び／又は生物学的特性（例えば、分子量、ポリマー含量、レセプター結合又は細胞増殖）について迅速にスクリーニングできる。例えば、これら成分のうち１つとして異なるポリマー（例えば、ＲＩ−ＮＣの種々の実施形態（式中、ＲＩは異なるポリマーを示す））を使用することによって、１つの分子上の同じ位置に異なるポリマーが結合した複数のコンジュゲートを形成できよう。或いは、１つより多くの成分を示す特定の分子（例えば、Ｒ−Ｘの種々の実施形態（式中、Ｒはコンジュゲート化すべきポリマー又は分子であり、Ｘは、アミン、カルボン酸、アルデヒド若しくはケトン、及びイソニトリルから選択される複数の基を示す））を使用することによって、コンジュゲート中の異なる結合を介してポリマー及び／又は生物学的に活性な分子が結合した複数のコンジュゲートを形成できる。
【００９２】
ＩＩＩ．例示的な４成分縮合（４ＣＣ）コンジュゲート化計画
以下の表は、例示の目的のためにコンジュゲート化すべきタンパク質及びＰＥＧ分子を使用する、種々のコンジュゲート化計画の非限定的な例を示す。
表１．例示的なコンジュゲート化反応計画
【表１】
2008502788.tif 000005
【００９３】
計画１〜５において、タンパク質がカルボキシル成分であり、他の成分のうち少なくとも１つがＰＥＧ試薬であるので、このタンパク質のカルボキシル基はＰＥＧ化される。計画４及び５において、タンパク質１つ当たり２つのＰＥＧ鎖が結合される。
【００９４】
アミン成分がタンパク質ではない計画１〜８の各々において、上記のように、例えば低いｐＨ（４〜６）で操作することによって、タンパク質側鎖よりも所望のアミン成分ＲＮの反応に有利なように、方策をとってもよい。さらに、（計画２及び４〜７のように）ＰＥＧがアミン成分である場合、低ｐＫａのアミン（例えば、ＰＥＧ−ヒドラジド、ＰＥＧ−カルバジド、ＰＥＧ−オキシアミン又はＰＥＧ−芳香族アミン）を使用できる。ＰＥＧがアミン成分ではない場合（即ち、計画１、３及び８）、過剰のＴＲＩＳ（Ｈ２ＮＣ（ＣＨ２ＯＨ）３）のような低分子量アミンを使用でき、低ｐＫａのアミン（例えば、グリシンアミド、アセチルヒドラジド）を過剰に提供してもよい。
【００９５】
計画６〜８において、タンパク質又は糖タンパク質上の合成により誘導されたカルボニル基がＰＥＧ化される。このような計画は図２に示される。図２に示されるスキームにおいて、ＲＩは、小さい良性の残基、標識部分又は別のＰＥＧ鎖を示し得る。上記のように、このような反応は、タンパク質上の複数のアミノ基又はカルボキシル基のランダムなＰＥＧ化と比較して、結合の部位特異性の増大を提供できるので（図２）、特に魅力的である。
【００９６】
計画９〜１２において、タンパク質がアミノ成分であり、他の成分のうち少なくとも１つがＰＥＧ試薬であるので、このタンパク質のアミノ基はＰＥＧ化される。計画１０及び１２において、タンパク質１つ当たり２つのＰＥＧ鎖が、アミノ基及びカルボキシル基を介して結合される。計画９及び１０において、タンパク質上のアミノ基のみを反応させるべき場合、過剰の低分子量カルボキシル成分（例えば、示されるように酢酸）を、タンパク質上のカルボキシル基の反応を抑制するために使用してもよい。
【００９７】
一実施形態において、イソニトリル成分は、示されるようにイソシアノプロピオン酸エチルエステル（Ｃ≡ＮＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＥｔ）である。図１に示される機構から理解できるように、この成分は、コンジュゲート中でβ−アラニン部分（−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｅｔ）に変換され、これはコンジュゲート化タンパク質生成物のアミノ酸分析によって検出できる。このような分析は、コンジュゲートの組成を決定する及び／又はコンジュゲート化生成物の形成の完了を探索する、簡便な手段を提供する（実施例５、７、１０及び１１を参照のこと）。
【実施例】
【００９８】
以下の実施例は、本発明を例示することを意図するのであって、限定する意図はない。
【００９９】
実施例１〜４は、親水性ポリマー（これらの実施例ではＰＥＧで例示される）のようなコンジュゲート化反応の各成分を調製するための例示的手順を示す。
【０１００】
実施例５〜１６は、上記表１中に概説したような例示的コンジュゲート化プロトコルを示す。これらの各々は、生体分子の親水性ポリマー（これらの実施例ではＰＥＧで例示される）とのコンジュゲートを提供するワンポット手順である。実施例１６は、特定の成分の複数の残基を組み込むコンジュゲートを示す。
【０１０１】
実施例中の生体分子には、ラミニン由来の合成接着ペプチド、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）及びヒアルロン酸（ＨＡ）、結合組織障害の治療に使用されるグリコサミノグリカンが含まれる。
【０１０２】
（実施例１）
ＰＥＧ−イソシアニド（イソニトリル）誘導体の調製
分子量２０００ＤａのｍＰＥＧ（ｍＰＥＧ２Ｋ）について以下に記載される、ｍＰＥＧ−ＯＨのｍＰＥＧ−イソニトリルへの変換のための一般的な手順は、他の分子量のＰＥＧにも等しく適用可能である。
【０１０３】
Ａ．ｍＰＥＧ２Ｋ−ＮＨ３＋ＣＨ３ＳＯ３−（ｍＰＥＧアンモニウムメシレート）の調製
ｍＰＥＧ２Ｋメシレート（Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄ．２２：３４１（１９８４））（２０ｇ，９．６２ｍｍｏｌ）を、プラスチックボトル中で水酸化アンモニウム水溶液（２００ｍｌ）中に溶解し、６０℃で４８時間攪拌した。この溶液を室温まで冷却し、蒸発によりこの混合物からアンモニアを除去した。残渣を２４時間凍結乾燥し、イソプロパノールを使用して再結晶化した。得られた生成物を、Ｐ２Ｏ５で減圧乾燥した。アンモニウム塩の収率は９１％（１８．４３ｇ）であった。
【化２】
2008502788.tif 000006
【０１０４】
Ｂ．ｍＰＥＧ２Ｋ−ＮＨ−ＣＨＯ（ｍＰＥＧホルムアミド）の調製
上記のように調製したｍＰＥＧ２Ｋアンモニウムメシレート（０．５ｇ、０．２３８ｍｍｏｌ）を、６０℃でギ酸エチル（１０ｍｌ）中に溶解させた。この溶液にトリエチルアミン（０．１３３ｍｌ、０．９５４ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合物を６０℃で２４時間加熱し、その後ＴＬＣにより反応の完了が示された。過剰のギ酸エチルを蒸発によって除去し、残渣をイソプロパノール沈殿によって精製した。この生成物をＰ２Ｏ５で減圧乾燥した。収率は８８％（０．４２５ｇ）であった。
【化３】
2008502788.tif 000007
【０１０５】
Ｃ．ｍＰＥＧ２Ｋ−ＮＣ（ｍＰＥＧイソニトリル）の調製
上記のように調製したｍＰＥＧ２Ｋ−ホルムアミド（０．２ｇ、０．１ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（２ｍｌ）中に溶解させ、０℃に冷却した。この溶液に、四塩化炭素（３８μＬ、０．３９４４ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１３７μＬ、０．９８６ｍｍｏｌ）を添加し、この溶液を０℃で５分間窒素下で攪拌した。次いで、トリブチルホスフィン（９８．２６μＬ、０．３９４４ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。この反応混合物を室温で２４時間攪拌し、その間に、この反応混合物は暗褐色になった。溶媒を蒸発させ、生成物をイソプロパノール沈殿で精製した。収率は８８％（０．１７５ｇ）であった。ＩＲ（ニート）：２１５０（ＮＣ）、
【化４】
2008502788.tif 000008
【０１０６】
ｍＰＥＧ−シクロヘキシルイソシアニドを調製するために、Ｅ．Ｒａｎｕｃｃｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｆｅｒｒｕｔｔｉ（Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０：２９５１（１９９０））の文献手順に従って、ｍＰＥＧ−ＯＨをカルボニルジイミダゾールで最初に活性化し、次いで過剰の１，４−ジアミノシクロヘキサンと反応させた。得られたｍＰＥＧ−シクロヘキシルアミンを、ｍＰＥＧ−アンモニウムメシレートについて上記したのと類似の様式で、イソシアニドに変換した。
【０１０７】
（実施例２）
ＰＥＧ−アルデヒド誘導体の調製
ｍＰＥＧ−アセトアルデヒドの誘導体を、文献手順（例えば、Ｌｌａｎｏｓ  ａｎｄ  Ｓｅｆｔｏｎ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２４：６０６５（１９９１）；Ｓ．Ｍ．Ｃｈａｍｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：１３３（１９９４））によって調製した。
【０１０８】
芳香族アルデヒドｍＰＥＧ−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｃ６Ｈ４−ＣＨＯを、ｍＰＥＧ−アミンの４−カルボキシベンズアルデヒドとの反応によって調製した。
【０１０９】
ＰＥＧ−プロピオンアルデヒド誘導体は、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ又はＳｕｎＢｉｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。
【０１１０】
（実施例３）
ＰＥＧ−アミノ誘導体の調製
ＰＥＧ−アミノ誘導体は、種々の文献のプロトコル（Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（１９９５ｂ）で検討された）に従って調製した。例えば、ＰＥＧ−ヒドラジドは、Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．のＷＯ９２／１６５５５（１９９２）に記載されたように調製した。ＰＥＧ−カルバジドは、Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ＆  Ｍｅｎｏｎ−Ｒｕｄｏｌｐｈ（１９９７）に記載されたように調製した。グリシンエステル誘導体は、Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｃｈｅｍ．Ａ２１：８３９（１９８４）に記載されたように調製した。芳香族アミン誘導体は、Ｄ．Ｒｏｚｚｅｌｌ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３６：４７９（１９８７）；Ａ．Ｐｏｌｌａｋ  ａｎｄ  Ｇ．Ｍ．Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９８：２８９（１９７６）又はＭ．Ｗｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｒ．Ｓｔａｄｄｌｅｒ，Ｐｏｌｙｍｅｒ  ２９：１０６４（１９８８）に記載されたように調製した。
【０１１１】
（実施例４）
ＰＥＧ−カルボキシル誘導体の調製
ＰＥＧ−カルボキシル誘導体は、Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（１９９５ｂ）で検討されたような文献プロトコルに従って調製したか、市場供給者（Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ又はＳｕｎＢｉｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から入手した。
【０１１２】
（実施例５）
ＲＮ＝ｍＰＥＧ５Ｋ、ＲＡ＝ＣＨ３、ＲＩ＝ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｅｔ及びＲＣ＝ＢＳＡを利用した、ＰＥＧ−ＢＳＡの調製（計画２、表１を参照のこと）
この反応において、ＰＥＧを、カルボキシル成分として使用するウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にコンジュゲート化する。低ｐＫａのアミン成分（ｍＰＥＧ２０Ｋ−カルバジド）を、このタンパク質中のアミノ側鎖よりもアミン成分の反応に有利なように、ｐＨ５で使用する。
【０１１３】
ｐＨ５に調整したＭＥＳ緩衝液（２５ｍＭ）中のウシ血清アルブミン溶液（１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｌ）を、約２０倍モル過剰のｍＰＥＧ５Ｋ−カルバジド（２３５ｍｇ）、アセトアルデヒド（アセトニトリル中１Ｍ、５０μｌ）及び最後にイソシアノプロピオン酸エチルエステル（アセトニトリル中１Ｍ、５０μｌ）で処理する。得られた溶液を一晩攪拌し、次いで透析し、イオン交換クロマトグラフィーでさらに精製する。生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＭＳ及びアミノ酸分析で特徴付ける。
【０１１４】
（実施例６）
ＲＮ＝ｍＰＥＧ５Ｋ、ＲＡ＝ＣＨ３、ＲＩ＝ＣＨ２ＣＯ２Ｅｔ及びＲＣ＝ＨＡを利用した、ＰＥＧ−グラフト化ヒアルロン酸（ＨＡ）の調製（計画４、表１と類似）
この反応において、ＰＥＧを、カルボキシル成分として使用するカルボキシル化多糖であるヒアルロン酸（ＨＡ）にコンジュゲート化する。
【０１１５】
ヒアルロン酸ナトリウム（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ、６ｍｇ、１５μｍｏｌのカルボキシル）を、水（１．５ｍｌ）中に溶解させ、ＨＣｌでｐＨ４．５に酸性化する。この溶液にｍＰＥＧ５Ｋ−カルバジド（２５ｍｇ、５μｍｏｌ）を添加し、その後、アセトアルデヒド及びイソシアノ酢酸エチルエステル（０．１Ｍ、５０μｌ、各々５μｍｏｌ）のアセトニトリル溶液を添加する。この反応混合物を一晩攪拌し、次いで、蒸留水に対して十分に透析する（ＭＷＣＯ  １００ｋＤａ）。ＰＥＧ含量は、それぞれ２．０ｐｐｍ及び３．７ｐｐｍでの、ＨＡ及びＰＥＧのアセトアミドシグナル及びオキシエチレンシグナルの１Ｈ−ＮＭＲ積分によって決定する。
【０１１６】
（実施例７）
ＲＮ＝ｍＰＥＧ５Ｋ、ＲＡ＝ｍＰＥＧ５Ｋ、ＲＩ＝ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｅｔ及びＲＣ＝ＢＳＡを利用した、ＰＥＧ−ＢＳＡの調製（計画４、表１を参照のこと）
この反応において、２分子のＰＥＧを、カルボキシル成分として使用するウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にコンジュゲート化する。低ｐＫａのアミン成分（ｍＰＥＧ２０Ｋ−カルバジド）を、このタンパク質中のアミノ側鎖よりもアミン成分の反応に有利なように、ｐＨ５で使用する。
【０１１７】
それぞれカルバジド末端基及びアルデヒド末端基を有するｍＰＥＧ５Ｋの２つの誘導体（各々２５０ｍｇ＝５０μｍｏｌ）を、アセトニトリル溶液（２ｍｌ）中で縮合させて、４成分縮合反応中の第１の中間体である（ｍＰＥＧ）２−カルバゾンを形成させる。溶媒を蒸発によって除去し、ｐＨ５に調整したＭＥＳ緩衝液（２５ｍＭ）中のウシ血清アルブミン溶液（ＢＳＡ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｌ）を添加し、次にイソシアノプロピオン酸エチルエステル（アセトニトリル中１Ｍ、５０μｌ）を添加する。この反応溶液を一晩攪拌し、生成物を透析し、次いでイオン交換クロマトグラフィーでさらに精製する。生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＭＳ及びアミノ酸分析で特徴付ける。
【０１１８】
（実施例８）
ＲＮ＝ｍＰＥＧ５Ｋ、ＲＡ＝ＣＨ３、ＲＩ＝ｍＰＥＧ５Ｋ及びＲＣ＝ＢＳＡを利用した、ＰＥＧ−ＢＳＡの調製（計画５、表１と類似）
この反応において、２分子のＰＥＧを、カルボキシル成分として使用するウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にコンジュゲート化する。低ｐＫａのアミン成分（ｍＰＥＧ２０Ｋ−カルバジド）を、このタンパク質中のアミノ側鎖よりもアミン成分の反応に有利なように、ｐＨ５で使用する。
【０１１９】
ｐＨ５に調整したＭＥＳ緩衝液（２５ｍＭ）中のウシ血清アルブミン溶液（１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｌ）を、約２０倍モル過剰のｍＰＥＧ５Ｋ−カルバジド（２３５ｍｇ）、アセトアルデヒド（アセトニトリル中１Ｍ溶液、５０μｌ）及び最後にｍＰＥＧ５Ｋ−ＮＣ（２５０ｍｇ）で処理する。得られた溶液を一晩攪拌し、次いで透析し、イオン交換クロマトグラフィーでさらに精製する。生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＭＳで特徴付ける。
【０１２０】
（実施例９）
ＲＮ＝ｍＰＥＧ５Ｋ、ＲＡ＝ＣＨ３、ＲＩ＝ｍＰＥＧ５Ｋ及びＲＣ＝ＨＡを利用した、ＰＥＧ−グラフト化ＨＡの調製（計画５、表１を参照のこと）
この反応において、２分子のＰＥＧを、カルボキシル成分として使用するカルボキシル化多糖であるヒアルロン酸（ＨＡ）にコンジュゲート化する。
【０１２１】
ＨＡナトリウム塩（６ｍｇ、１５μｍｏｌのカルボキシル）を水（１．５ｍｌ）中に溶解させ、ＨＣｌでｐＨ４．５に酸性化する。この溶液にｍＰＥＧ５Ｋ−カルバジド（２５ｍｇ、５μｍｏｌ）を添加し、その後、アセトアルデヒドのＡＮアセトニトリル溶液（０．１Ｍ、５０μｌ、５μｍｏｌ）、及び最後にｍＰＥＧ５Ｋ−イソニトリル（３０ｍｇ）を添加する。この反応混合物を一晩攪拌し、次いで、蒸留水に対して透析する。ＰＥＧ含量は、それぞれ２．０ｐｐｍ及び３．７ｐｐｍでの、ＨＡ及びＰＥＧのアセトアミドシグナル及びオキシエチレンシグナルの１Ｈ−ＮＭＲ積分によって決定する。
【０１２２】
（実施例１０）
ＲＮ＝ｍＰＥＧ２０Ｋ、ＲＡ＝ＹＩＧＳＲ−ＮＨ２、ＲＩ＝ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｅｔ及びＲＣ＝ＣＨ３を利用した、ｍＰＥＧ−ＹＩＧＳＲ−ＮＨ２コンジュゲートの調製（計画６、表１を参照のこと）
この反応において、ｍＰＥＧを、そのＮ末端でアルデヒド基で誘導体化されたＹＩＧＳＲ（ラミニン由来の合成接着ペプチド）にコンジュゲート化する。
【０１２３】
ホスフェート緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７）中のペプチドＴＹＩＧＳＲ−ＮＨ２（５ｍＭ、０．４５０ｍｌ）を、水中過ヨウ素酸ナトリウムの新たな溶液（１００ｍＭ、５０μｌ）で暗中で４℃で５分間処理し、亜硫酸ナトリウム（２００ｍＭ、５０μｌ）でクエンチする。得られた溶液を、アセテート緩衝液（０．５Ｍ、１ｍｌ、ｐＨ４．５）中のｍＰＥＧ２０Ｋ−カルバジド（０．４５ｇ、２２μｍｏｌ）溶液と混合する。アセトニトリル中のイソシアノプロピオン酸エチルエステル（Ｃ≡ＮＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｅｔ）（２５０ｍＭ、０．１ｍｌ、２５μｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を室温で一晩インキュベートする。生成物を、透析とその後のイオン交換クロマトグラフィーによって精製し、ＭＳで特徴付ける。Ｎ末端コンジュゲート化を、配列決定及びアミノ酸分析によって確認する。
【０１２４】
（実施例１１）
ＲＮ＝ｍＰＥＧ２０Ｋ、ＲＡ＝ＥＰＯのグリカン、ＲＩ＝ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｅｔ及びＲＣ＝ＣＨ３を利用した、ＰＥＧ−ＥＰＯの調製（計画６、表１を参照のこと）
この反応において、ｍＰＥＧを、過ヨウ素酸塩で処理して分子のグリカン部分中にカルボニル官能基を生成したＥＰＯ（エリスロポエチン）にコンジュゲート化する。このタンパク質中のアミノ側鎖よりもアミン成分の反応に有利なように、低ｐＫａのアミン成分（ｍＰＥＧ２０Ｋ−カルバジド）を使用する。
【０１２５】
酢酸ナトリウム緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ５．０）中のエリスロポエチン溶液（ＥＰＲＥＸ（登録商標）、０．７６ｍｌ、１ｍｇ）を、過ヨウ素酸ナトリウム（８０ｍＭ、４０μｌ）で暗中で４℃で１０分間処理する。過剰な過ヨウ素酸塩を亜硫酸ナトリウム（３００ｍＭ、２０μｌ）でクエンチする。ｍＰＥＧ２０Ｋ−カルバジド（２０ｍｇ、１μｍｏｌ）を添加し、その後アセトニトリル中のイソシアノプロピオン酸エチルエステル（２０ｍＭ、５０μｌ、１μｍｏｌ）を添加する。得られたコンジュゲート化混合物を室温で２４時間インキュベートする。このコンジュゲートをイオン交換クロマトグラフィーによって精製し、ＭＳ、アミノ酸分析及びＳＤＳ−ＰＡＧＥで特徴付ける。グリカン特異的なコンジュゲート化を、オリゴ糖含量の決定によって確認する。
【０１２６】
（実施例１２）
ＲＮ＝ｍＰＥＧ５Ｋ、ＲＡ＝ＹＩＧＳＲ−ＮＨ２、ＲＩ＝ｍＰＥＧ５Ｋ及びＲＣ＝ＣＨ３を利用した、ｍＰＥＧ−ＹＩＧＳＲ−ＮＨ２コンジュゲートの調製（計画７、表１を参照のこと）
この反応において、２分子のｍＰＥＧを、そのＮ末端でアルデヒド基で誘導体化されたＹＩＧＳＲ（ラミニン由来の合成接着ペプチド）にコンジュゲート化する。
【０１２７】
ホスフェート緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７）中のペプチドＴＹＩＧＳＲ−ＮＨ２（５ｍＭ、０．４５０ｍｌ）を、水中過ヨウ素酸ナトリウムの新たな溶液（１００ｍＭ、５０μｌ）で暗中で４℃で１０分間処理し、亜硫酸ナトリウム（２００ｍＭ、５０μｌ）でクエンチする。得られた溶液を、アセテート緩衝液（０．５Ｍ、１ｍｌ、ｐＨ４．５）中のｍＰＥＧ５Ｋ−カルバジド（１１０ｍｇ、２２μｍｏｌ）溶液と混合する。実施例１に記載したように調製したＰＥＧ−イソニトリル誘導体（ｍＰＥＧ５Ｋ−ＮＣ、１２５ｍｇ、２５μｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を室温で一晩インキュベートする。生成物を、透析とその後のイオン交換クロマトグラフィーによって精製し、ＭＳで特徴付ける。Ｎ末端コンジュゲート化を、配列決定及びアミノ酸分析によって確認する。
【０１２８】
（実施例１３）
ＲＮ＝ｍＰＥＧ５Ｋ、ＲＡ＝ＥＰＯグリカン、ＲＩ＝ｍＰＥＧ５Ｋ及びＲＣ＝ＣＨ３を利用した、ＰＥＧ−ＥＰＯの調製（計画７、表１を参照のこと）
この反応において、２分子のｍＰＥＧを、過ヨウ素酸塩で処理して分子のグリカン部分中にアルデヒド官能基を生成したＥＰＯ（エリスロポエチン）にコンジュゲート化する。上記のように、このタンパク質中のアミノ側鎖よりもアミン成分の反応に有利なように、低ｐＫａのアミン成分（ｍＰＥＧ２０Ｋ−カルバジド）を使用する。
【０１２９】
酢酸ナトリウム緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ５．０）中のエリスロポエチン溶液（ＥＰＲＥＸ（登録商標）、０．７６ｍｌ、１ｍｇ）を、過ヨウ素酸ナトリウム（８０ｍＭ、４０μｌ）で暗中で４℃で１０分間処理する。過剰な過ヨウ素酸塩を亜硫酸ナトリウム（３００ｍＭ、２０μｌ）でクエンチする。ｍＰＥＧ５Ｋ−カルバジド（１００ｍｇ、１μｍｏｌ）を添加し、その後ｍＰＥＧ５Ｋ−イソニトリル（１００ｍｇ、１μｍｏｌ）を添加する。得られたコンジュゲート化混合物を室温で２４時間インキュベートする。このコンジュゲートをイオン交換クロマトグラフィーによって精製し、ＭＳ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥで特徴付ける。グリカン特異的なコンジュゲート化を、オリゴ糖含量の決定によって確認する。
【０１３０】
（実施例１４）
ＲＮ＝ＣＨ３、ＲＡ＝Ｈ、ＲＩ＝ｍＰＥＧ５Ｋ及びＲＣ＝ＢＳＡを利用した、ＰＥＧ−ＢＳＡの調製（計画１、表１と類似）
この反応において、ＰＥＧを、カルボキシル成分として使用したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にコンジュゲート化した。過剰の低分子量アミン成分（メチルアミン）を、このタンパク質中のアミノ側鎖よりもアミン成分の反応に有利なように、ｐＨ４．５で使用した。
【０１３１】
具体的には、６ｍｇのＢＳＡ（０．０９μｍｏｌ）を、８６０μｌのＨ２Ｏ中に溶解させ、ｐＨを０．２５Ｍ  ＨＣｌ（約５μｌ）で４．５に調整した。ホルムアルデヒド（９μｍｏｌ、１００倍過剰）及びメチルアミン（９μｍｏｌ、１００倍過剰）を添加し、その後ｍＰＥＧ５ＫＮ≡Ｃ（５ｍｇ、１μｍｏｌ、１１．１１倍過剰）を添加した。
【０１３２】
合計６個の２５μｌサンプルを、５分、１０分、１時間、４時間、７．５時間及び２４時間で採取し、各々を即座に２３０μｌの２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５、ＢＳＡよりも約２×１０５倍過剰）に添加して、反応を停止させた。
【０１３３】
これらの段階の各々での生成物の組成を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで特徴付けた。ＰＥＧ−タンパク質コンジュゲート生成物の量は時間と共に増大し、本質的に全ての出発ＢＳＡが、７．５時間の時点までに消費された。
【０１３４】
（実施例１５）
ＲＮ＝ＣＨ３、ＲＡ＝Ｈ、ＲＩ＝ｍＰＥＧ５Ｋ及びＲＣ＝リゾチームを利用した、ＰＥＧ−リゾチームの調製（計画１、表１と類似）
この反応において、ＰＥＧを、カルボキシル成分として使用したリゾチームにコンジュゲート化した。過剰の低分子量アミン成分（メチルアミン）を、このタンパク質中のアミノ側鎖よりもアミン成分の反応に有利なように、ｐＨ４．５で使用した。
【０１３５】
具体的には、１．４ｍｇのリゾチーム（０．０９μｍｏｌ）を、８６０μｌのＨ２Ｏ中に溶解させ、ｐＨを０．２５Ｍ  ＨＣｌ（約５μｌ）で４．５に調整した。ホルムアルデヒド（９μｍｏｌ、１００倍過剰）及びメチルアミン（９μｍｏｌ、１００倍過剰）を添加し、その後ｍＰＥＧ５ＫＮ≡Ｃ（５ｍｇ、１μｍｏｌ、１１．１１倍過剰）を添加した。
【０１３６】
合計６個の２５μｌサンプルを、５分、１０分、１時間、４時間、７．５時間及び２４時間で採取し、各々を即座に２３０μｌの２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５、ＢＳＡよりも約２×１０５倍過剰）に添加して、反応を停止させた。
【０１３７】
２つのさらなる反応を実行し、１つは３．１ｍｇ（０．２μｍｏｌ）のリゾチームを使用し、他方は７．７４ｍｇ（０．５μｍｏｌ）のリゾチームを使用した。他の試薬の量及び反応条件は変更しなかった。
【０１３８】
これらのサンプルを、７０００  ＭＷＣＯ  Ｍｉｎｉ透析ユニット（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）、５０ユニット）で、ＰＢＳ（４Ｌ、ｐＨ７．４）に対して４℃で一晩透析することによって精製した。各サンプルの生成物の組成を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで特徴付けた。
【０１３９】
ＰＥＧ−タンパク質コンジュゲート生成物の量は各反応において時間と共に増大したが、タンパク質のなかには２４時間でも未反応のままのものがあり、タンパク質のダイマー及びトリマーのいくらかの形成の証拠があった。
【０１４０】
（実施例１６）
ＰＥＧ−ＰＰＯ−ヒアルロン酸コンジュゲートの調製：ＲＮ＝ＰＰＯ、ＲＡ＝Ｈ、ＲＩ＝ｍＰＥＧ２Ｋ及びＲＣ＝ヒアルロン酸（計画５、表１と類似）
【化５】
2008502788.tif 000009
【０１４１】
（ａ）水（６ｍｌ）をヒアルロン酸ナトリウム（３２ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）に添加し、この溶液を透明になるまで室温で攪拌した（約３０分間）。ホルムアルデヒド（６μｌ、０．０８ｍｍｏｌ、Ｈ２Ｏ中３７％）をこの溶液に添加し、次いでＭｅＯＨ（１２ｍｌ）中のアミノ−官能化ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ（ＣＨ３）−ＮＨ２、１５０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を、２Ｎ  ＨＣｌ（約３６μｌ）で僅かに酸性化して、３〜３．５のｐＨとした。ｍＰＥＧイソニトリル（ｍＰＥＧ２０００−ＮＣ、１６８．０８ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合物を室温で５０時間攪拌し、淡褐色の透明な溶液を得、次いでこれを凍結乾燥した。ゲル様の残渣をＣＨ２Ｃｌ２で抽出して未反応のＰＰＯ及びＰＥＧを除去し、生成物を濾過し、Ｐ２Ｏ５で減圧乾燥した。収率：３６ｍｇ（１０％）。
【化６】
2008502788.tif 000010
【０１４２】
分析により、ＰＰＯ／ＰＥＧ１つ当たり約１６〜１７個のＨＡ反復単位（即ち、上記構造中のｍ＋ｎは約１６〜１７と等しい）を有するコンジュゲートが示された。従って、このコンジュゲートにおいて、複数の残基ＲＡ、ＲＩ及びＲＮが、ヒアルロン酸ポリマーによって示されるＲＣにコンジュゲート化されている（上記構造の描写は、ＰＰＯ／ＰＥＧ部分がＨＡポリマー鎖に沿って均等に分布していることを含意する意味では必ずしもない）。
【０１４３】
類似の反応を、以下のように、反応条件を変動させて実施した。
【０１４４】
（ｂ）より短い期間（２４時間）攪拌した以外は、上記反応条件を反復して、ＰＰＯ／ＰＥＧ部分１つ当たり約２１〜２５個のＨＡ反復単位を有するコンジュゲート（２８ｍｇ）を生成した。
【０１４５】
（ｃ）さらなる反応において、ｐＨをより高い値（４〜４．５）に調整したこと以外は（ａ）の元の条件に従った。この反応により、ＰＰＯ／ＰＥＧ部分１つ当たり約１０〜１１個のＨＡ反復単位を有するコンジュゲート（１８ｍｇ）を生成した。
【０１４６】
（ｄ）さらなる反応において、アミノ−官能化ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ−ＮＨ２）及びホルムアルデヒドを最初に合わせ、２時間攪拌し、その後ヒアルロン酸ナトリウムを添加した。次いで、この反応は、上記（ａ）の元の反応条件で記載されたとおりに進行した。この反応により、ＰＰＯ／ＰＥＧ部分１つ当たり約１１〜１４個のＨＡ反復単位を有するコンジュゲート（３３ｍｇ）を生成した。
【０１４７】
（ｅ）最後に、ｐＨをより高い値（４〜４．５）に調整したこと以外は（ｄ）の条件に従った。この反応により、ＰＰＯ／ＰＥＧ部分１つ当たり約１〜２個のＨＡ反復単位を有するコンジュゲート（７１．６ｍｇ）を生成した。
【０１４８】
上記結果により、より高いｐＨでの反応が、ＰＰＯ／ＰＥＧのＨＡポリマーへのより高いレベルのコンジュゲート化を生じる傾向が示される。ＨＡ及びＰＥＧ−イソニトリルの添加前のアミン成分及びアルデヒド成分の前反応は、類似ではあるがそれほど顕著ではない影響を有した。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】本明細書中にその特定の実施形態が記載された、４成分縮合反応の一般的に受容された機構を示す図である。
【図２】本発明の一実施形態に従う、アセテート緩衝液中で実施した（即ちＲＣ＝ＣＨ３）、ポリペプチド上の部位特異的に生成されたカルボニル基へのＰＥＧの結合を示すコンジュゲート化スキームを示す図である。この場合ＲＩは、例えば別のＰＡＯ鎖、標識又は小さい良性の残基であり得よう。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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