(57)【要約】本発明はプロテアーゼのアレルギー性を比較し、評価するための方法を提供する。特に本発明はヒトにおけるアレルギー反応を誘発する任意のプロテアーゼのポテンシャルを質的に評価する手段を提供する。更に、本発明は、各種製品に用いるために、減少したアレルギー性を有するプロテアーゼを選択するための手段を提供する。【選択図】図１
2008538921.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望のサイトカインを少なくとも１つのセリンプロテアーゼに曝して、免疫原性が減少しているサイトカインを生成する工程を含む、所望のサイトカインの免疫原性を減らす方法。
【請求項２】
前記サイトカインがヒトサイトカインである、請求項１の方法。
【請求項３】
前記サイトカインがＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−１２、及びＩＬ−１０からなる群より選択される請求項２の方法。
【請求項４】
前記セリンプロテアーゼがバチルスレンタススブチリシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）、バチルスアミロリケファシエンススブチリシン（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）、並びに前記バチルスレンタススブチリシン（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）及び前記バチルスアミロリケファシエンススブチリスン（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）の変異体から成る群より選択される請求項１の方法。
【請求項５】
前記スブチリスンがＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌである請求項４の方法。
【請求項６】
減少した免疫原性を有する前記サイトカインの活性を前記所望のサイトカインの活性と比較する工程を更に含む請求項１の方法。
【請求項７】
前記末梢血液細胞を少なくとも１つのセリンプロテアーゼに曝して細胞表面マーカーが除去された末梢血液細胞を生成する工程を含む、末梢血液細胞から細胞表面マーカーを除去する方法。
【請求項８】
前記細胞表面マーカーがＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ４、及びＣＤ８から選択される、請求項７の方法。
【請求項９】
前記末梢血液細胞が単核細胞である請求項７の方法。
【請求項１０】
前記セリンプロテアーゼが、バチルスレンタススブチリシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）、バチルスアミロリケファシエンススブチリシン（Ｂ．  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）、Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ、並びに前記バチルスレンタススブチリスン（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）及び前記バチルスアミロリケファシエンススブチリスン（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）の変異体から成る群より選択される請求項７の方法。
【請求項１１】
前記セリンプロテアーゼがＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌ及びＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌ変異体Ｎ１５５Ｇである請求項１０の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプロテアーゼのアレルギー性を比較し、評価するための方法を提供する。特に本発明はヒトにおいてアレルギー反応を誘発する任意のプロテアーゼのポテンシャルを質的に評価する手段を提供する。更に、本発明は、減少したアレルギー性を有するプロテアーゼを選択して、各種製品に用いるための手段を提供する。
【背景技術】
【０００２】
プロテアーゼを含むタンパク質は、潜在的に、生命を脅かす免疫反応を誘発する能力を有している。このことは、最終製品及び最終生産物中に幅広くタンパク質を用いることの障害となっている。すなわち、免疫反応を誘発する可能性は米国食品医薬品機構（ＡＤＦ）に注目されており、新たなタンパク質療法が承認される前後において、アレルギー性試験が要求されている。しかしながら、アレルギー性を評価するための動物モデルは数多く存在するが、ヒトにおけるアレルギー性を識別するための評価方法は存在しない。
【０００３】
すなわち、プロテアーゼを含むタンパク質のアレルギー性は、酵素の工業的生産において長期間懸念されてきた。工場及び研究室作業員が職業上タンパク質（例えば、プロテアーゼ）に汚染されると、感作を生じることが報告されている。特定のタンパク質に対する感作は、通常、個人がそのタンパク質に免疫反応を示すがどうかを示す試験（タンパク質スキンパッチ）により評価される。
【０００４】
工業的プロテアーゼの製造は、タンパク質に曝された作業員において感作を誘発することが示されている（例えば、Ｎｏｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ.  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ６３：９８  [１９７９]；  Ｐｅｐｙｓ  ｅｔ  ａｌ.，  Ｃｌｉｎ.  Ａｌｌｅｒｇｙ  １５：１０１  [１９８５]；  Ｖａｎｈａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｃｃｕｐ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｅｄ．，  ５７：１２１  [２０００]；  Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  ３０：１５１１  [２０００]；及びＳａｒｌｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｆｕｎｄ．  Ａｐｐｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．，  ３９：４４  [１９９７]参照のこと）。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｈｙｇｉｅｎｉｓｔｓにより定義されている職業上の暴露ガイドラインは６０ｎｇ／ｍ３（Ｇｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：７３７  [１９９７]）である。労働の実施及び制御に関する政策の実施により職業的にアレルゲンに曝される作業員が減らすことができる（例えば、Ｓａｒｌｏ，  Ａｎｎ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ９０：３２  [２００３]；  ａｎｄ  Ｙａｍａｇｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １６６：７２８２  [２００１]参照のこと）。
【０００５】
感作の割合は、取り扱う物質にも依存するが、年間３乃至１１パーセントであると報告されている（Ｓａｒｌｏ，  Ａｎｎ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ９０：３２  [２００３]；  ａｎｄ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  Ｓｃｉ．，  ４３：３９  [１９９８]）。２つの特に関連の高いプロテアーゼ、バチルスレンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）、及びＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌは、アレルゲン曝された工業作業員において、特に高い割合で感作を誘発することが知られている。しかしながら、職業的暴露の間に出会うプロテアーゼの量は  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて細胞表面マーカーに確実に影響して、Ｔｈ２反応を制御するのに必要な酵素のレベルと矛盾する。従って、Ｔ細胞分化成分、特にＴｈ分化及びＴｈ分化のプロセスとタンパク質分解活性の間の関係を含むファクターに関しては、依然として知られていない。
【０００６】
ＣＤ４＋Ｔ細胞の分化パスウェイの間にＣＤ４＋Ｔ細胞が活性すると、抗原提示細胞による抗原特異シグナルを生じる。抗原シグナリング（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の分化の結末を制御する因子は複雑であるが、サイトカイン仲介シグナリング（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を含む。サイトカインＬＩ−４及びＬＩ−２は、天然ＣＤ−４Ｔ細胞の指令系統に含まれ、それぞれＴｈ２及びＴｈ４になる。ＬＩ−４はＴｈ２の反応の進行に必須である（Ｌｅ  Ｇｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １７２：９２１  [１９９０]）。Ｔ細胞活性の他の現れとして、無反応性（ｎｏｎ−ｒｅｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ）の誘発がある。多くのメカニズムが存在し、抗原に対する耐性が確立される。前記耐性は、発育中の胸腺及び外来抗原に反応する周辺の両方における活性化の欠失メカニズム；抗原に対する特異性を有するＴ細胞が隠退した抗原に対して反応しない、クローンのイグノランス（ｉｇｎｏｒａｎｃｅ）；及び調節Ｔ細胞による反応の活性抑制を含む。ＴＧＦ−ベータ、及びＩＬ−１０は調節Ｔ細胞の生成に必須であることが示されているので、調節Ｔ細胞の分化はサイトカインシグナルによっても影響を受ける（例えば、  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １９８：１８７５  [２００３]；  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ，  １０５：１１６２  [２００５]参照のこと）。ＩｇＥ仲介過感反応はＴｈ２  ＣＤ+４細胞の優先的な分化により特徴付けられる免疫反応のサブセットを生じる。アレルギー反応の誘発は粘膜表面において発生する傾向がある（例えば、肺及び腸）。肺及び腸の中の調節Ｔ細胞は、非アレルギー性の固体においてアレルギー反応のタイプを制御していると考えられている。従って、抗原特異反応の調節不全がアレルギーとなる。Ｔｈ２タイプ反応に出会ったタンパク質に対する通常の非アレルギー反応から免疫反応を誘発するアレルゲンの性質は、完全に理解されていない。しかしながら、多くの呼吸器系のアレルゲンを含む多くのアレルゲンはタンパク質分解活性を有していることが発見された。例えば、花粉アレルゲンは、各種ペプチダーゼを含む多くのタンパク質の混合複合物である。また、多くの組換えアレルゲンタンパク質もタンパク質分解活性を示す（例えば、  Ｈｅｗｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｌｌｅｒｇｙ  ５３：６０  [１９９８]；  ａｎｄ  Ｂａｇａｒｏｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．，  ４７：５９３  [１９９８]参照のこと）。
【０００７】
タンパク質分解活性のアレルギーポテンシャルへの寄与については調査がなされている。失活したプロテアーゼがアレルギー性を示さないことからタンパク質分解活性はアレルギー反応を誘発するのに必須であることが発見された（例えば、  Ｓｈａｋｉｂ  ａｎｄ  Ｇｏｕｇｈ,  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  ３０：７５１  [２０００]；  Ｐｏｌｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １７０：１７４６  [２００３]；  ａｎｄ  Ｋｈｅｒａｄｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６９：５９０４  [２００２]参照のこと）。幾つかの実験において、タンパク質分解性アレルゲンを正常な非アレルギータンパク質と一緒に投与すると、第二タンパク質に対するＩｇＥ反応を誘発した。このことは、タンパク質分解活性提携しながら活性化するということを示している。タンパク質分解活性が免疫反応に影響するというメカニズムは、前記活性が細胞表面調節分子上に影響することに起因するものであると説明されている。これらの及び他の反応に基づいて、応答細胞の表面からＣＤ２３及びＣＤ２５を除去することは、免疫反応におけるタンパク質分解活性の役割を合理的に説明している。それにも関わらず、本分野において用いられている方法はタンパク質のアレルギー性におけるプロテアーゼ活性の寄与について充分に研究してはいなかった。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明はプロテアーゼの比較可能なアレルギー性を評価する手段を提供する。特に、本発明はヒトにおいてアレルギー反応を誘発する任意のプロテアーゼに対するポテンシャルを質的に評価する手段を提供する。更に本発明は各種製品に用いるために低いアレルギー性を有するプロテアーゼを選択する方法を提供する。
【０００９】
幾つかの好ましい態様において、本発明はヒト及び他の動物から得られるサイトカイン上のプロテアーゼ活性を決定するための方法及び組成物を提供する。幾つかの更なる好ましい態様において、細胞表面マーカーを除去するプロテアーゼの能力を評価するための方法又は組成物が提供される。
【００１０】
幾つかの代替的な特に好ましい態様において、本発明は各種サイトカインにおけるセリンプロテアーゼの活性を決定するのに好適な組成物及び方法を提供する。幾つかの最も好ましい態様において、前記プロセスはスブチリシンである。幾つかの更なる好ましい態様において前記プロテアーゼはＢＰＮ’Ｙ２１Ｌ．バチルスレンタススブチリシン、スブチリシンＣａｒｓｂｅｒｇ、ＬＧ２１スブチリシン、及びＮ１５５Ｇスブチリシンである。しかしながら、本発明はスブチリシンを特定のものに限定することを意図してはいない。
【００１１】
幾つかの追加的な好ましい態様において、本発明は、他の動物から得られたサイトカインのほかにヒトサイトカインを含む各種サイトカイン上のプロテアーゼの活性を決定するのに好適な組成物及び方法を提供する。幾つかの態様において、インターロイキン、インタフェロン、及び形質転換成長因子からなる群より選択されるすくなくとも１つのサイトカイン上のプロテアーゼの活性を評価するための組成物及び方法が提供される。しかしながら、本発明を特定のクラス又は群のサイトカインに限定することは意図していない。
【００１２】
本発明は所望のサイトカインの免疫原性を減らす方法を提供する。前記方法は、所望のサイトカインを少なくとも１つのセリンプロテアーゼに曝して免疫原性の低いサイトカインを生成する工程を含む。幾つかの態様において、前記サイトカインは、ヒトサイトカインである。幾つかの好ましい態様において、前記サイトカインはＩＬ−４、ＩＬ−３、ＩＬ−１２及びＩＬ−１０から成る群より選択される。更なる態様において、前記セリンプロテアーゼは、バチルスレンタススブチリスン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）、バチルスアミロリケファシエンススブチリシン（Ｂ．  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）、並びに、前記バチルスレンタススブチリスン（Ｂ．  ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）及びバチルスアミロニケファシエンンススブチリスン（Ｂ．  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）の変異体から成る群より選択される。幾つかの好ましい態様において、前記スブチリスンはＢＰＮ’Ｙ２１Ｌである。幾つかの追加的な態様において、前記方法は更に所望のサイトカインと低い免疫原性を有するサイトカインの活性を比較する工程を含む。更なる追加的な態様において、低い免疫原性を有す複数のサイトカインが生成される。
【００１３】
本発明は、末梢血液細胞から細胞表面マーカーを除去するための方法を提供する。前記方法は、末梢血液細胞を少なくとも１つのセリンプロテアーゼに曝して細胞表面マーカーが除去された末梢血液細胞を生成する工程を含む。幾つかの態様において、前記細胞表面マーカーはＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ４、及びＣＤ８から成る群より選択される。幾つかの好ましい態様において、前記末梢血液細胞は単核細胞である。追加的な態様において、前記セリンプロテアーゼはバチルスレンタススブチリシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）、バチルスアミロリケファシエンススブチリスン（Ｂ．  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）、Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ、ＬＧ１２並びにバチルスレンタススブチリシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）及びバチルスアミロリケファシエンススブチリシン（Ｂ．  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）の変異体から成る群より選択される。更なる好ましい態様において、前記セリンプロテアーゼはＢＰＮ’Ｙ２１Ｌ及びＢＰＮ’Ｙ２１７変異体Ｎ１５５Ｇから成る群より選択される。
【００１４】
図１は、細胞表面分子の発現における酵素活性を示すグラフである。ヒト抹消血液単核細胞をＰＢＳ中６０分の反応時間で記載の酵素濃度で処理した。酵素反応を２％のＦＣＳで停止した。ＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌを黒四角で示す。スブチリシンを白ひし形で示す。パネルＡ及びＢにおいて、ＦＳＣ／ＳＳＣパラメーターを用いて単核球についてＰＢＭＣをゲートした。一方パネルＣ乃至Ｅについて、ＦＳＣ／ＳＳＣパラメーターを用いてリンパ球上でＰＢＭＣをゲートした。パネルＦは、ＰＨＡブラストをＦＳＣ／ＳＳＣ上にゲーティングして３０分間酵素で処理した結果を示す。パネルＡは、ＣＤ８６の結果を示す。パネルＢはＨＬＡ−ＤＲの結果を示す。パネルＣはＣＤ３の結果を示す。パネルＤはＣＤ４の結果を示す。パネルＥはＣＤ８の結果を示す。パネルＦはＣＤ２５の結果を示す。
【００１５】
図２はＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌ及びバチルスレンタススブチリシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）が、ヒトサイトカインにおいて異なる活性を有することを示している。これらのグラフにおいて、ＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌ（四角）、スブチリシン（ひし形）、又はＮ５５１Ｇ（トライアングル）は５％ヒト血清中３７℃で１８時間、記載のサイトカインとインキュベートした（パネルＡはＩＬ−４の結果を示す。パネルＢはＩＬ−１３の結果を示す。パネルＣはＩＬ−２０ｐ７０の結果を示す。パネルＤはＩＬ−１０の結果を示す。）。残りのサイトカインレベルはＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。
【００１６】
図３はバチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ及びバチルスレンタススブチリシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）がＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２及びＴＧＦ−βにおいて同様の活性を有することを示す。ＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌ（四角）、バチルスレンタススブチリシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）又はバチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ（三角）を記載のサイトカインとともに、５％ヒト血清中３７℃で１８時間インキュベートした（パネルＡはＩＬ−４の結果を示す。パネルＢはＴＧＦ−βの結果を示す。パネルＣはＩＬ−１２ｐ７０の結果を示す。パネルＤはＩＬ−１０の結果を示す。）。残りのサイトカインレベルはＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。
【００１７】
図４は酵素活性がＩＬ−４の機能活性を減らすことを示すグラフである。これらの実験において、５００ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−４を記載の濃度のバチルスレンタススブチリシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）（ひし形）、ＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌ（四角）、又はバチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ（三角）で３７℃、一晩処理した。酵素をＰＭＳＦの添加により失活させ、その後、１ウェル当り２×１０４個のＴＦ−１細胞を添加した。分化は３日目に測定した。未処理対照培地は５００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４を含み、３１０９９ＣＰＭの平均値を示した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
発明の説明
本発明はプロテアーゼのアレルギー性を比較し、評価するための方法を提供する。特に本発明は任意のプロテアーゼのヒトにおけるアレルギー反応を誘発するポテンシャルを質的に評価する手段を提供する。更に、本発明は各種製品に用いるために、減少したアレルギー性を有するプロテアーゼを選択するための手段を提供する。
【００１９】
定義
ここに違った形で定義されない限り、そしてここに使ったすべての技術用語、科学用語は、一般的に、この発明の属する分野の当業者によって理解されているのと同じ意味を持っている。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、  ２ｄ  ｅｄ．、  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９４）、及びＨａｌｅ  ａｎｄ  Ｍａｒｈａｍ、Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、  Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ、  ＮＹ  （１９９１）は本発明で用いられる全般的な用語の多くについての一般的な辞書である。ここに説明されたそれらに類似しているか、等しいどのような方法と原料でも本発明の実行またはテストに用いることができるけれども、好適な方法と原料は説明される。従って、すぐ下で定義された用語はこの明細書によってより完全に定義される。
【００２０】
本明細書において、「免疫反応」の語は、免疫原に対して生物個体（例えば、ヒト又の動物）において増強される免疫学的反応を言う。この語は、液体（すなわち、抗体−仲介）、細胞、及び非特異的、免疫反応を含むがこれらに限定されない、すべてのタイプの免疫反応を含む。幾つかの態様において、この語は集団の免疫レベル（すなわち、特定の抗原に対して「免疫」がある及び／又は特定の抗原に対して「免疫がない」ヒトの数）を示す。
【００２１】
本明細書で用いる「減らされた免疫原性」は本来の野生型（例えば、親又は源）タンパク質と比較したときの変異体（例えば、誘導体）タンパク質に見られる免疫反応の低減を意味する。本発明の好ましい態様において、源タンパク質と比較したときに、ｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、より小さいロバスト免疫反応を刺激する変異体タンパク質が提供される。減らされた免疫原性を有するこれらのタンパク質は、生物製品、タンパク質治療、食品及び飼料、パーソナルケア製品、界面活性剤並びに、他の治療法、検査方法等の他に他の消費製品を含むがこれらに限定されない各種製品に用いることができる。
【００２２】
本明細書において、「高められた免疫原性」の語は、本来の野生型（例えば、親又は源）タンパク質と比較したときに、変異体（例えば、誘導体）タンパク質に見られる免疫反応が高められていることを意味する。本発明の好ましい態様において、源タンパク質と比較して、ｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、より高いロバスト免疫反応を刺激する変異体タンパク質が提供される。高められた免疫原性を有するこれらのタンパク質は、各種治療法、検査方法等の他にワクチン、生物生成物、治療、食品及び飼料添加剤を含むがこれらに限定されない各種製品に用いることができる。
【００２３】
本明細書で用いるように、「減らされたアレルギー性」の語は、本来の野生型（例えば、親又は源）タンパク質と比較したときに、変異体（例えば、誘導体）タンパク質に見られるアレルギー性免疫反応が低減されていることを意味する。本発明の好ましい態様において、源タンパク質と比較したときに、ｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、より小さいロバストアレルギー反応を刺激する変異体タンパク質が提供される。低められたアレルギー性を有するこれらのタンパク質は、生物製品、タンパク質治療、食品及び飼料、パーソナルケア製品、界面活性剤並びに、他の治療法、検査方法等の製品を含むがこれらに限定されない各種製品に用いることができる。
【００２４】
本明細書で用いる「サンプル」の語は、最も広い意味に用いられる。しかしながら、好ましい態様において、この語は、解析され、同定され、修飾され、及び／又は他の組成物と比較される所望の組成物を含むサンプル（例えば、アリコート）を意味する。
【００２５】
本明細書で用いる「Ｔリンパ球」及び「Ｔ細胞」の語は、Ｔ細胞前駆体  (Ｔ細胞レセプター遺伝子を再構築していないＴｈｙ１陽性細胞を含む)から、成熟T細胞(すなわち、ＣＤ４又はＣＤ８のどちらか一方に陽性である表面ＴＣＲ陽性細胞)までの、Ｔリンパ系統内のあらゆる細胞を含む。
【００２６】
本明細書で用いる、「細胞表面マーカー」の語は、特定のタイプの細胞の表面で発現する分子（「マーカー」）を意味する。例えば、Ｔ細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ８６等を含むがこれらに限定されない各種「ＣＤ」（「クラスター分類（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）」）マーカーをその表面に発現させる。従って、細胞表面上の各種分子の発現は、お互いの細胞サブセットの区別に用いられる。
【００２７】
本明細書において、細胞表面マーカーの「除去」は、細胞表面分子を除去する効果のあるプロテアーゼを用いて、このプロテアーゼで処理した細胞の表面にマーカーが発現しないようにすることを意味する。プロテアーゼ処理が完全に全ての細胞表面マーカーを除去することは意図していないが、幾つかのケース及び／又は特定の条件下においては起こりうることである。
【００２８】
本明細書で用いる「タンパク質」の語は、アミノ酸及び当業者によりタンパク質と認められているあらゆる物質を意味する。「タンパク質」「ペプチド」及びポリペプチドの語は互換的に使用される。ペプチドがプロテアーゼのタンパク質であるということは、当業者は文脈から理解することができる。
【００２９】
本明細書で用いる、「所望のタンパク質」の語は、解析、同定、及び／又は修飾されるタンパク質（例えば、プロテアーゼ）を意味する。組み替えタンパク質の他に自然発生タンパク質も本発明に用いることができる。すなわち、本発明は、ヒト（及び／又の動物）の免疫原性反応を特徴付ける、及び／又は調節するのに好適なあらゆるタンパク質を用いることができる。幾つかの態様において、ホルモン、サイトカイン、抗原、酵素、構造タンパク質、及び結合タンパク質を含むタンパク質が本発明に用いることができる。幾つかの好ましい態様において、「所望のタンパク質」は「所望のサイトカイン」である。
【００３０】
本明細書において、「サイトカイン」の語は、免疫システムにおいて細胞の中の多くの重要な相互作用を制御する可溶性媒体を意味する。サイトカインは細胞内シグナルペプチド及びグリコプロテインの多様なグループを含む。大部分は遺伝的及び構造的に似通っている。各サイトカインは各種刺激に対する反応における細胞タイプにより選択され、標的細胞の成長、移動性、分化、及び／又は機能に対して独特の影響を生じる。総じて、サイトカインは免疫及び炎症システムにおいてだけでなく、外傷治癒、造血、血管新生、及び他の多くのプロセスに含まれる。この語は、構造及び通常用いられている学名に関係なく全ての各種サイトカインを含むことを意図している。例えば、この語は「モノカイン」（すなわち単核球により生成されるサイトカイン）のほかに「リンフォカイン」（すなわち、リンパ球により生成されるサイトカイン）も含むことを意図する。
【００３１】
本明細書で用いる「サイトカインレセプター」の語は、サイトカインを認識して結合するレセプター分子を意味する。この語は細胞に結合するサイトカインレセプターのほかに可溶性サイトカインレセプターも含むことを意味する。この語は、サイトカインレセプターへのアミノ酸及び／又は核酸配列の置換、欠失、及び／又は付加を含む、修飾されたサイトカインレセプター分子（即ち、変異サイトカインレセプター）も含むことを意図する。従って、この語は野生型のほかに、組み換えサイトカインレセプター、合成サイトカインレセプター、並びに変異体サイトカインレセプターを含むことを意図する。
【００３２】
本明細書において用いる「野生型」及び「天然」タンパク質は、自然界に見られるものである。「野生型源」及び「野生型遺伝子」の語は、本明細書において互換的に使用され、宿主細胞中に本来ある又は自然発生する配列を意味する。幾つかの態様において、この野生型配列はタンパク質工学的な目的における開始点である所望の配列を意味する。
【００３３】
本明細書において用いられる、「プロテアーゼ」は天然プロテアーゼの他に組換えプロテアーゼも意味する。この「プロテアーゼ」の語は、関連するプロテアーゼのプレ型、プロ型の他にプロテアーゼの成熟型も意味する。プロテアーゼのプレプロ型は、プロテアーゼのアミノ末端に作動可能に結合している配列、及びこのプロ配列のアミノ末端に作動可能に結合している「プレ」又は「シグナル」配列を有するプロテアーゼの成熟型を含む。プロテアーゼは、プロテアーゼ又はペプチドのペプチド結合を切断するために作用する酵素である。自然発生プロテアーゼは、例として、α−アミノアシルペプチドヒドロラーゼ、ペプチジルアミノ酸ヒドロラーゼ、アシルアミノヒドロラーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、チオールプロテアーゼ、カルボキシルプロテアーゼ、及びメタロプロテアーゼ等を含むがこれらに限定されない。エンド−及びエキソ−プロテアーゼのほかに、セリン、メタロ、チオ、及び酸プロテアーゼも含まれる。幾つかの好ましい態様において、キモトリプシン及びスブチリシン等のセリンプロテアーゼが用いられる。キモトリプシン及びスブチリシンはアスパラギン、ヒスチジン、及びセリンを含む触媒トリアド（ｔｒｉａｄ）を有する。スブチリシンプロテアーゼにおいて、カルボキシ末端からのアミノ酸の相対的な順番は、アルパラギン酸−ヒスチジン−セリンである。キモトリプシンプロテアーゼにおいて、カルボキシ末端からのアミノ酸の相対的な順番は、ヒスチジン−アルパラギン酸−セリンである。スブチリシンは通常バクテリア、糸状菌、又は酵母の源から得られるが、本明細書で用いる「スブチリシン」の語は、上で定義したスブチリシンプロテアーゼの触媒トライアド（ｔｒｉａｄ）を有するセリンプロテアーゼを意味する。更に、ヒトスブチリシンは、例えば、ヒト由来プロテアーゼのケキシンファミリーのような、スブチリシン活性を有するヒト由来のプロテアーゼである。スブチリシンは当業者に知られており、例えば、バチスルアモロリケノフォルミススブチリシン（Ｂ．  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）（ＢＰＮ’）、バチスルレンタススブチリシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）、（例えば、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）スブチリシン）、バチルススブチススブチリシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）、バチルスレンタススブチリシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）（例えば、米国特許Ｎｏ．４，７６０、０２５（ＲＥ３４，６０６）、米国特許Ｎｏ．５，２０４，０１５、米国特許Ｎｏ．５，１８５，２５８、ＥＰ０３２８２９９及びＷＯ８９／０６２７９参照のこと）。
【００３４】
本明細書において、機能的に似ているプロテアーゼは「関連プロテアーゼ」と定義される。幾つかの態様において、これらのプロテアーゼは、固体のクラス間の違い（例えば、バクテリアスブチリシンと糸状菌スブチリシン）を含む、異なる遺伝子及び／又は種（例えば、バチルススブチリススブチリシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｓｕｂｔｉｔｌｅｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）及びバチルスレンタススブチリシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ））由来である。追加的な態様において、関連プロテアーゼは同じ種から提供される。すなわち、本発明を任意の源からの関連プロテアーゼに限定することは意図していない。
【００３５】
本明細書において、「誘導体」という用語は、前駆体タンパク質（例えば、天然プロテアーゼ）に対し、Ｃ末端とＮ末端のうちの一方もしくは両方に１個以上のアミノ酸を付加し、あるいは、そのアミノ酸配列内の１つ又は異なるいくつかの部位において1個以上のアミノ酸を置換し、あるいは、このタンパク質の一端もしくは両端またはそのアミノ酸配列内の１個所以上の部位において１個以上のアミノ酸を欠損させるか、又はそのアミノ酸配列内の１個所以上の部位において１個以上のアミノ酸を挿入することによって得られるタンパク質（例えば、プロテアーゼ）を意味する。タンパク質誘導体は、未修飾タンパク質をコードするＤＮＡ配列を修飾し、得られたＤＮＡ配列を適当な宿主細胞中で形質転換し、修飾ＤＮＡ配列を発現させることにより調製することが好ましい。
【００３６】
関連（及び誘導体）タンパク質は、「変異体プロテアーゼ」も含む。好ましい態様において、変異体プロテアーゼは、一方の親プロテアーゼ及び他方の親プロテアーゼと比較すると、いくつかのアミノ酸残基のみが異なる。異なるアミノ酸残基の数は、１以上であり、好ましくは、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０または、それ以上である。ある態様において、変異体間で異なるアミノ酸の数は、１から１０の間である。特に好ましい態様において、関連プロテアーゼ及び特定の変異体プロテアーゼは、少なくとも、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、及び、９９％のアミノ酸配列の相同性を有する。加えて、本明細書で用いられる関連プロテアーゼ又は変異体プロテアーゼは、プロミネント領域の数が、他の関連プロテアーゼ又は親プロテアーゼとは異なる。例えば、幾つかの態様において、変異体プロテアーゼは、親タンパク質とは異なる１、２、３、４、５、又は１０の対応するプロミネント領域を有する。１つの態様において、変異体のプロミネント対応領域は、免疫反応のバックグラウンドレベルのみを生産する。
【００３７】
本明細書で用いている「対応する」残基とは、プロテアーゼまたはペプチド内に列挙された位置にある各残基、あるいはプロテアーゼまたはペプチド内に列挙された各残基と類似、相同もしくは同等である残基を意味する。
【００３８】
本明細書で用いる「対応する領域」の語は、通常、関連プロテアーゼ又は親プロテアーゼ中の類似する位置を言う。
【００３９】
本明細書で用いる「類似の(アナロガス)配列」は所望のタンパク質と、同じ機能、三次構造及び/又は、保存残基を有するタンパク質内の配列を言う。具体的な好ましい態様において、類似の配列は、エピトープ又はエピトープの近くにある配列を含む。例えば、アルファヘリックス又はベータシート構造を含むエピトープ領域内で、類似配列内で置換されたアミノ酸は、同じ特定の構造を維持していることが好ましい。
【００４０】
本明細書で用いる「相同(ホモログ)タンパク質」とは、所望のタンパク質（例えば、プロテアーゼ）と同様な作用、構造、抗原性反応/または免疫原性反応を有するタンパク質（例えば、プロテアーゼ）を意味する。相同タンパク質（例えば、プロテアーゼ）と所望のタンパク質（例えば、プロテアーゼ）とは、必ずしも進化の上で関係がなくてもよい。従って、この用語は、異なる種から得られる機能的に同じタンパク質(例えば、プロテアーゼ)を含むと考えられる。好ましい実施態様としては、所望のタンパク質内のエピトープを相同タンパク質からの類似のセグメントで置換すれば、変化による混乱を少なくすることができるので、所望のタンパク質と同様な三次および/または一次構造を有する相同タンパク質を用いることが望ましい。従って、多くの場合、相同性の高いタンパク質は、エピトープの置換の最も好ましい供給源となる。あるいは、所与のタンパク質のヒトにおける類似体に関心を向けることも有利である。
【００４１】
ここで用いる「相同遺伝子」とは、異なる種由来の、または通常は関連種由来の一組の遺伝子対をいい、それぞれが対応し、それぞれ同一または非常に類似しているものをいう。当該用語は種形成(すなわち、新しい種の進化)により分離した遺伝子(例えばオーソロガス遺伝子)、及び遺伝子重複により分離した遺伝子(例えばパラロガス遺伝子)を包含する。
【００４２】
ここで用いる「オーソログ」及び「オーソロガス遺伝子」とは種形成により共通祖先の遺伝子(すなわち相同遺伝子)から進化した異なる種の遺伝子をいう。通常、オーソロガスは進化の過程において同じ機能を保持する。新しく配列決定されたゲノムのオーソロガスを同定することで、信頼性の高い遺伝子機能の推測ができる。
【００４３】
ここで用いる「パラログ」及び「パラロガス遺伝子」とはゲノム内で重複していることにより関連した遺伝子をいう。オーソログは進化の過程を通して同じ機能を維持するが、パラログはいくつかの機能は最初の機能に関連するが、それに加えて新しい機能も有している。パラログ遺伝子の例としては、限定されないが、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ及びトロンビンをコードする遺伝子が挙げられ、これらは全てセリンプロテアーゼであり、同じ種内で一緒に発生する。
【００４４】
配列間の相同性の程度は、本発明の技術分野で知られている適切な方法で決定することができる(例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．，２：４８２  [１９８１]；  Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，  ４８：４４３[１９７０]  ；  Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４  [１９８８]；  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  (Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ)のＧＡＰ，  ＢＥＳＴＦＩＴ，  ＦＡＳＴＡ，及びＴＦＡＳＴＡ等のプログラム；  及び  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，  １２：  ３８７-３９５  [１９８４]参照のこと)。
【００４５】
例えば、ＰＩＬＥＵＰは、配列のホモロジーのレベルを決定するのに有用なプログラムである。ＰＩＬＥＵＰは、累進的で対合的な配列法を用いて関係する配列の群から多重配列アラインメントを作り出す。アラインメントを作るための関係性の集積を示す系統樹(ｔｒｅｅ)もプロットすることができる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅの累進的アラインメント方法を簡素化したものである(Ｆｅｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．，  ３５：３５１-３６０  [１９８７])。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐによって述べられた方法と同じである(Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，  ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１-１５３  [１９８９])。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターは、３．００のデフォルトギャップウエイト、０．１０のデフォルトギャップレングス、及び、ウエイトエンドギャップを含んでいる。他の有用なアルゴリズムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等によって述べられたブラストアルゴリズムである(Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，  ２１５：４０３-４１０，  [１９９０]；  ａｎｄ  Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５８７３-５７８７  [１９９３])。ある具体的なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２プログラムである(Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０-４８０  [１９９６]参照のこと)。「Ｗ」、「Ｔ」及び「Ｘ」のパラメーターは、アラインメントの速度及び感度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、ワード長(Ｗ)１１、ＢＬＯＳＵＭ６２得点マトリックス(Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ‘ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、  ８９：ｐ１０９１５(１９８９)参照)アラインメント(Ｂ)５０、期待値(ｅ)１０、Ｍ’５、Ｎ’-４、および両ストランドの比較を用いる。
【００４６】
本明細書で用いる「ヌクレオチド配列の相同性の割合(％)」は、候補配列中にある、配列のヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド残基の割合として定義される。
【００４７】
本明細書で用いる、「ハイブリダイゼーション」の語は、本発明の技術分野で知られているように、塩基の対合を通じて、核酸のストランドに相補的なストランドが結合するプロセスであると定義される。
【００４８】
本明細書で用いる、「最大ストリンジェンシー」は通常約Ｔｍ−５℃(プローブのＴｍより５℃低い)で起こり、「高ストリンジェンシー」はＴｍより約５〜１０℃低く、「中間ストリンジェンシー」はプローブのＴｍより約１０〜２０℃低く、そして「低ストリンジェンシー」はＴｍより約２０〜２５℃低い。機能上、最大ストリンジェンシー条件はハイブリダイゼーションプローブと同一な配列を同定するために用いることができ、中から低いストリンジェンシーなハイブリダイゼーションは相同なポリヌクレオチド配列を同定するために用いることができることは当業者に理解されている。
【００４９】
本明細書で用いる「等しい残基」の語は、特定のアミノ酸残基を共有するタンパク質を言う。例えば、等しい残基は、Ｘ線結晶化学によって同定される三次構造を有するあるタンパク質(例えば、所望のプロテアーゼ)の三次構造のホモロジーレベルを検出することによって同定される。等しい残基は、前駆体タンパク質の特定のアミノ酸残基の2個以上の主鎖原子の原子座標が位置合わせ後に０．１３ｎｍ、好ましくは０．１ｎｍ以内であるものと定義される。位置合わせは、対象とする非水素タンパク質原子の原子座標について最大の重複を生じるように最良のモデルが配向、配置された後に達成される。この最良のモデルは、結晶学及びタンパク質の特徴付け/解析の分野において当業者に知られている方法を用いて検出され、利用できる最高の解像度において回折実験データの最低のＲファクターが得られる結晶学的なモデルである。
【００５０】
いくつかの態様において、修飾には、好ましくは、前駆体酵素のアミノ酸配列をコードする「前駆体ＤＮＡ配列」を用いるが、前駆体タンパク質の操作によってでも行うことができる。保存されない残基の場合には、1以上のアミノ酸の置換は、自然界に見られるものに対応しないアミノ酸配列を有する変異体を生産する置換に限定される。好ましい態様において、保存残基の場合、そのような置換は自然発生的する配列にはならない。本発明によって提供される誘導体は、更に、タンパク質の特徴を変える化学修飾も含む。
【００５１】
幾つかの好ましい態様として、タンパク質遺伝子は、適切な発現プラスミドに結合される。次いで、このクローン化したタンパク質遺伝子は、タンパク質遺伝子を発現するための形質転換または形質移入に用いられる。このプラスミドは、プラスミド複製に必要なよく知られたエレメントを含有するように宿主内で複製可能なように設計されるか又は宿主染色体中に組み込まれるように設計することができる。必要なエレメントは、効率的な遺伝子発現のために提供される(例えば、目的の遺伝子に作動可能なように結合したプロモーター)。いくつかの実施態様として、必要なエレメントは、もしそれが、外因性である又はタンパク質遺伝子の内性ターミネーター領域により提供される転写ターミネーター(真核宿主細胞のポリアデニル化領域)を認識するならば遺伝子自身の相同プロモーター  (即ち、その宿主細胞により転写される)として与えられる。いくつかの態様として、プラスミド感染宿主細胞の連続的な培養維持を可能にする抗生物質抵抗性遺伝子のような選択遺伝子も含まれる。
【００５２】
プロテアーゼを含む好ましい態様において、カゼイン、ケラチン、エラスチン、及びコラーゲンを含むがこれらに限定されない市販の基質に対する所望のプロテアーゼの相互作用を評価することにより所望のプロテアーゼ活性と変異体プロテアーゼ活性を決定し比較する。すなわち、プロテアーゼ活性は当業者に知られている好適な方法により決定される。プロテアーゼ活性を決定するための典型的なアッセイは、スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅニトロアニリド（ＳＡＡＰＦｐＮＡ）（サイテーション（ｃｉｔａｔｉｏｎ））アッセイ、及び２，４，６−トリニトロベンゼンスルホネートナトリウム塩（ＴＮＢＳ）アッセイを含むがこれらに限定されない。ＳＡＡＰＦｐＮＡアッセイにおいて、プロテアーゼはペプチドとｐ−ニトロアニリンとの間の結合を切断して４０５ｍｍに吸収を持つ黄色の液体を生成する。ＴＮＢＳ色反応方法は、基質を遊離アミノ基を含むポリペプチドへの酵素的な加水分解を測定する。これらのアミノ基はＴＮＢＳを反応して黄色の複合体を形成する。従って、より濃い発色を示す反応により、活性がより高いことが示される。この黄色は当該分野において既知の各種解析法又はスペクトロフォトメーターにより決定される。
【００５３】
変異体プロテアーゼの他の特徴は、当該分野において既知の方法により決定される。典型的な特徴は、熱安定性、アルカリ安定性、及び各種基質、緩衝液、又は製品中での特定のプロテアーゼの安定性を含むがこれらに限定されない。
【００５４】
例えば、アルカリ安定性は当該分野で知られている好適な方法により測定される。好ましい態様において、アルカリ安定性における実質的な変化は、前駆体プロテアーゼと比較したときに、変異体の酵素活性の半減期が少なくとも約５％又はそれ以上の増加又は減少する（大部分の態様において、好ましくは増加する）。
【００５５】
更に、熱安定性は、当該分野で知られている好適な方法により決定することができる。好ましい態様において、熱安定性における実質的な変化は、比較的高温及び中性ｐＨにさらして、前駆体プロテアーゼと比較したときに、変異体の酵素活性の半減期が少なくとも約５％又はそれ以上の増加又は減少する（大部分の態様において、好ましくは増加する）。
【００５６】
発明の詳細な説明
本発明はプロテアーゼのアレルギー性を比較し、評価するための方法を提供する。特に本発明はヒトにおけるアレルギー反応を誘発する任意のプロテアーゼのポテンシャルを質的に評価する手段を提供する。更に、本発明は、各種製品に用いるために、減少したアレルギー性を有するプロテアーゼを選択するための手段を提供する。
【００５７】
通常の空気アレルゲンによるタンパク質分解活性はＴｈ２反応の促進として説明されてきた。Ｄｅｒ  ｐ１等のタンパク質分解性アレルゲンはＴ及びＢ細胞の表面から免疫調節細胞表面マーカーを除去する。工業的プロテアーゼはアレルギー反応を含むみ及びその可能性を有することが知られている。更に、工業的プロテアーゼは職業的に暴露された作業員において別のアレルギーの可能性を示す。本明細書において多く述べているように、３つの工業的プロテアーゼ、バチルスレンタススブチリシン（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）、ＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌ及びバチルスリケニフォルミススブチリシン（Ｂ．ｌｉｃｈｎｉｆｏｒｍｉｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）の細胞表面マーカー及びヒトサイトカインに対する影響を、アレルギー誘発のメカニズムの可能性について評価し、及びこれらの他の可能性に関しても評価した。
【００５８】
本明細書において、ＣＤ２５、ＣＤ８、及びＣＤ４の除去を含む、細胞表面マーカーに対してこれらのプロテアーゼが似た影響を有することが発見された。これらのプロテアーゼは、ヒトＩＬ−１０（即ち、インターロイキン−１０）、ＴＧＦ−β（即ち、軽質転換因子β）、及びＩＬ−３に対して、有意な特異性（ＩＣ５０値がｎｇ／ｍｌの範囲である）を示すことが発見された。本発明を特定のメカニズムに限定することを意図しないけれども、観察されたアレルギーポテンシャルの違いの少なくとも１つの説明は、ＩＬ−４の活性に依存すると考えられる。即ち、関係するサイトカインの調節細胞上のこれらのプロテアーゼの活性がアレルギー性全体を説明することができると予測される。上で示したように、本発明を特定のメカニズムに限定することを意図してはいないけれども、サイトカイン対するタンパク質分解活性が、アレルギー誘発の一般的なメカニズムの少なくとも１つであることが予測される。
【００５９】
ＣＤ４＋Ｔ細胞分化経路に沿ったこれらの活性化は抗原提示細胞による抗原特異的シグナルを生じる。抗原シグナルの分化発生を制御する因子は複雑であるが、サイトカイン仲介シグナルを含んでいる。サイトカインＩＬ−４及びＩＬ−１２は天然ＣＤ４＋Ｔ細胞の介入によりそれぞれＴｈ２及びＴｈ１細胞になる。ＩＬ−４はＴｈ２反応の進行に必要とされている（例えば、Ｌｅ  Ｇｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，１７２：９２１［１９９０］参照）。Ｔ細胞活性の他の結果は、無反応性の誘発である。数多くのメカニズムがあり、それによって、発育の間の胸腺の外因性の抗原に反応する周辺における活性メカニズムの欠損、クローンの「イグノランス」（即ち、抗原に特異性を有するＴ細胞が封じ込められた抗原に対して反応を反応しない）、及び調節Ｔ細胞による反応の抑制を含む、抗原に対する耐性が確立されると信じられている。調節Ｔ細胞の分化は、ＴＧＦ−β及びＩＬ−１０等のサイトカインシグナルに影響され、それらの生産に必要であることも示されている（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９８：１８７５及びＬｅｖｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １０５：１１６２［２００５］参照）。
【００６０】
ＩｇＥ仲介過感作反応はＴｈ２ＣＤ４＋Ｔ細胞の優位な分化を特徴とする免疫反応のサブセットを生じる。アレルギー反応の誘発は粘膜表面で発生する傾向がある（例えば、肺及び腸）。本発明を特定のメカニズムに限定することを意図するわけではないが、肺及び腸の中の調節Ｔ細胞は非アレルギー性固体においてアレルギー性タイプの反応を制御していると信じられている。従って、抗原特異反応の調節の不具合は、幾つかの固体においてアレルギーを生じる結果になることが予測される。Ｔｈ２タイプの反応に遭遇したタンパク質が通常の非アレルギー反応から免疫反応を生じるアレルゲンの性質は完全には理解されていない。しかしながら、多くの呼吸器系におけるアレルゲンを含む多くのアレルゲンはタンパク質分解活性を有すると説明されている。例えば、花粉アレルギーは、各種ペプチダーゼを含む多くのタンパク質の混合複合体であり、多くの組換えアレルゲンタンパク質もタンパク質分解活性を示す（Ｈｅｗｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｌｅｒｇｙ  ５３：６０［１９９８］、及びＢａｇａｒｏｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．，４７：５９７［１９９８］参照）。
【００６１】
幾つかの実験において、不活性化されたプロテアーゼがアレルギー性を示さなかったことから、タンパク質分解活性はアレルギー反応を誘発するのに必要とされることが発見された（例えば、Ｓｈａｋｉｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  ３０：７５１［２０００］；Ｐｏｌｌｐｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７０：１７４６［２００２］；及びＫｈｅｒａｄｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９：５９０４［２００２］参照）。タンパク質分解活性を有するアレルゲンを通常の非アレルギー性タンパク質と共に投与すると、第二タンパク質に対するＩｇＥ反応を誘発することが発見された。このことは、タンパク質分解活性が提携しながら作用していることを示している。タンパク質分解活性が免疫反応に影響するというメカニズムは、細胞表面調節分子への影響を制御することを基に説明されている。反応している細胞からＣＤ２３及びＣＤ２５を除去すると、免疫反応におけるタンパク質分解活性の役割を十分に説明することができる。しかしながら、本発明をプロテアーゼ及び免疫反応を含む特定のメカニズムに限定することは意図しない。
【００６２】
すでに説明したように、工業的プロテアーゼの生産は曝された作業員において感作を誘発することが示されている（例えば、Ｃｕｌｌｉｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｏｖｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，上記；Ｐｅｐｙｓ  ｅｔ  ａｌ．，上記；Ｖａｎｈａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  上記；及びＳｃｈｗｅｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，上記、参照）。上で示したように、感作の割合は、年間３乃至１１パーセントの範囲である（例えば、Ｓａｌｏ  ａｎｄ  Ｋｒｉｃｈｎｅｒ  上記；及びＳａｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｕｎｄ．Ａｐｐｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，上記参照）。しかしながら、２つの高い特に関連するプロテアーゼ、バチルスレンタススブチリシン（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）及びＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌは、曝された工場作業員において、明瞭に区別することができる異なる割合の感作を誘発する。労働の実施及び制御に関する政策の実施により職業的にアレルゲンに曝される作業員が減らすことができる（例えば、Ｓａｌｏ  ａｎｄＫｒｉｃｈｎｅｒ、上記；及びＳａｌｏ、  上記参照）。職業的暴露中にであうプロテアーゼの量はｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて細胞表面に確実に影響し、Ｔｈ２反応を誘発するのに必要な酵素の量と一致しない。従って、本発明を開発する間、Ｔｈ細胞分化を制御し、及びタンパク質分解活性によく反応する他の因子を調査した。２つの関連する工業的プロテアーゼのポテンシャルの違いを評価するために、各種試験を行い、ヒトサイトカインに対する各種工業的プロテアーゼ活性の可能性を評価した。
【００６３】
本発明の開発の間に得られた結果はヒトサイトカインがセリンプロテアーゼアレルギーに対して異なる感受性を有することを示している。調節Ｔ細胞に関係するサイトカインは試験された３つのプロテアーゼのよるタンパク質分解活性に最も感受性が高かった。ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、及びＴＧＦ−βに対するＩＣ５０値は、１００ｎｇ／ｍｌ未満であった。対照的に、Ｔｈ１反応の確立に関係するサイトカイン、ＩＬ−１２及びＴＮＦ−γは比較的感受性が低く、ＩＣ５０の値がμｇ／ｍｌのレベルであった。面白いことに、比較的低いアレルゲン性を有するＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌが、他の２つの関連するセリンプロテアーゼよりもＩＬ−４上で有意な活性を示したので、Ｔｈ２サイトカインＩＬ−４は、アレルゲンポテンシーのインジケーターになると考えられる。しかしながら、本発明を特定のサイトカイン又はプロテアーゼ、単独又はこれらの組合せに限定することは意図しない。
【００６４】
ＩＬ−１０及びＴＧＦ−βはマウス及びヒトの両方において調節Ｔ細胞の分化及びエフェクター機能の両方に関係するサイトカインである（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，上記；Ｇｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３８９:７３７［１９９７］；Ｙａｍａｇｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６６：７７２８２［２００１］；Ｒｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，１９２：２９５［２０００］；及びＡｋｂａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２：７２５［２００１）参照）。非アレルギー性固体において、調節Ｔ細胞がアレルギータイプの反応を制御していると信じられていることから、試験されたプロテアーゼのアレルギー性質は、タンパク質抗原に反応する調節細胞の分化の抑制を介して、及び／又は前から存在している調節Ｔ細胞よる抑制活性の阻害を介して、免疫調節サイトカインＩＬ−１０及び／又はＴＧＦ−βのレベルを減らすことが予測される（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ａｒｃｈ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３５：７３  ［２００４］；  及びＡｋｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ.  Ｍｅｄ．，  １９９：５６７  ［２００４］）参照）。しかしながら、本発明特定のメカニズムに限定することは意図しない。
【００６５】
サイトカインはアレルギー性反応の進展に寄与していると説明されていることから、ＩＬ−１３上に影響するプロテアーゼは重要である（Ｈｅｒｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １７０：２４８８［２００３］参照）。それゆえ、アレルギー反応が起きている微環境でこのサイトカインを減らすとアレルギー反応を減らすことが予測される。しかしながら、ＩｇＥ誘発及び好酸球増加とは別に、ＩＬ−１３は気道の過感作（ＡＨＲ）及び粘膜の分泌を誘発することが示されていることから、ＩＬ−１３もアレルギー性喘息の進展において独特の役割を果たしていることが予測される（Ｇｒｕｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：２２６１［１９９８］；  Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：２２５８［１９９８］；  及びＦｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６７：１７６９［２００１］参照）。ＩＬ−４の通常のレベルの存在下におけるＩＬ−１３レベルの低下は、ＡＨＲ及び粘膜分泌性喘息を伴わないＩｇＥ仲介アレルギー反応を示す結果となる。マウスにおけるこれらの酵素の経年試験の間、気道過感作は起こらなかった（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｕｎｄ．  Ａｐｐｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．，  ３４：１５［１９９６］参照）。アスペルギルスタンパク質分解酵素のマウス経年試験においても、ＡＨＲの誘発を示さなかった（Ｋｈｅｒａｍｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照）。ＡＨＲの進展とは関係なく、これらの特定の酵素は独特のタイプのアレルギー反応を誘発した。しかしながら、上で述べたように、本発明を特定のメカニズムに限定することは意図しない。
【００６６】
他の調節メカニズムもプロテアーゼ活性に影響されていることが予測される。例えば、ＣＤ８＋サプレッサー細胞は、アレルギー性炎症のマウスモデルにおいて抑制調節を示すことが近年説明され、証明されてきた（例えば、Ｓｔｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ３４：１８１７［２００４］参照）。本明細書で述べるように、細胞表面のＣＤ８は、酵素、他のメカニズムに対してとても敏感であり、それゆえ、酵素が抑制反応を修飾することが予測される。ＩＬ−２レセプターアルファ鎖（ＣＤ２５）は活性化したＴ細胞とＣＤ４の両方のマーカーであり、ｆｏｘｐ３発現は調節Ｔ細胞のマーカーである。バチルスレンタススブチリシン（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）及びＢＰＮ’Ｙ２１７はＰＨＡ誘導ＰＢＭＣブラストの表面から、とても低い酵素濃度でＣＤ２５を除去する。細胞表面からのＣＤ２５の除去は引き続き起こるＴ細胞の活性化に影響することが予測される。即ち、このことは、一つのメカニズムとして提唱されており、それゆえ、幾つかの他のタンパク質分解アレルゲンはそれらの影響を仲介している（例えば、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  １８７：２７１［１９９８］；及びＳｈａｋｉｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  １９：３１３［１９９８］参照）。本明細書で説明する酵素の２つは職業的暴露の作業員において、異なるアレルギー性能を有しており、バチルスレンタススブチリシン（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）はＢＰＮ’Ｙ２１７よりも強い。しかしながら、本明細書で説明するように、ＣＤ２５を含む、細胞表面マーカー全体への影響は異ならない。唯一の有意な違いは、ＩＬ−４に対するタンパク質分解特異性である。低いアレルギー性プロテアーゼはＩＬ−４に対して有意に低いＩＣ５０の値を示す。この結果は、より高いアレルゲンであるバチルスレンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）が微環境における適合性を変えずに、ＩＬ−４のレベルを脱して（ｌｅａｖｉｎｇ）、ＩＬ−１０及びＴＨＧ−βの局所的濃度を減らし、調節活性を減らすことによりその影響を仲介することを示している。このことは、Ｔｈ２に基づく免疫反応の進行をサポートすることが予測される。しかしながら、上で述べたように、本発明を任意の特定のメカニズムに限定することは意図しない。
【００６７】
影響を生ずるのに必要な濃度がとても低いことから、サイトカイン上のプロテアーゼの作用は濃度に関係があることが予測された。公知の細胞表面マーカー発現におけるタンパク質分解性アレルゲン分子の影響とは対照的に（ＣＣＤ２５除去のために５−１０μｇ／ｍｌ（Ｓｈａｋｉｂ  ｅｔ  ａｌ．，上記））、本明細書で述べたタンパク質分解活性に対する結果は、ｐｇ／ｍｌレベルのサイトカインに対するＩＣ５０レベルを示した。これらのアッセイ全ては、５％ヒト血清を含む培地で実施されたので、サイトカイン分子の有意な特異性が示された。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて影響が観察されるのに必要な、他のプロテアーゼの濃度とは異なり、工業的にセッティングされているこれらのプロテアーゼの暴露はとても低い。しかし、このような濃度においてもｉｎ  ｖｉｖｏにおいてアレルギータイプの反応が引き起こされている。例えば、Ｄｅｒ  ｐ１は１０μｇ／マウスの濃度でｉｎ  ｖｉｖｏにおいて投与すると、Ｔｈ２及びＩｇＥに対してゆるぎ（ｓｋｅｗｉｎｇ）を引き起こす一方で、この濃度はｉｎ  ｖｉｒｔｏで生物学的影響を示すのに必要な濃度を同じではない（Ｇｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １９０：１８９７［１９９９］参照）。同様に、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて、アスペルギルスフミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）プロテアーゼは３３μｇ／マウスの濃度でＴｈ２反応の発生に活性を示す（Ｋｈｅｒａｄｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照）。
【００６８】
多くのアレルゲンは、タンパク質分解活性を有していると報告されている（Ｈｅｗｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｌｌｅｒｇｙ  ５３：６０  ［１９９８］；  Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １：９５  ［２００１］；  及びＷｉｄｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  ３０：５７１  ［２０００］）。更に、花粉粒子はサブスタンスＰ及びアンギオテンシン１及び２等の免疫調節ペプチドに対する活性を有するセリンエンドペプチダーゼを含む、タンパク質の混合複合体から成る（Ｂａｇａｒｏｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．，  ４７：５９３  ［１９９８］；  及びＢａｇａｒｏｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｅｓｐ．  Ｃｅｌｌ  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．，  １８：３６３  ［１９９８］）。もし、免疫調節サイトカイン上のタンパク質分解活性が調節細胞の失活を引き起こし、引き続きアレルギータイプの反応が引き起こるならば、近くに存在する抗原に対する免疫反応も影響されるであろう。この影響は非アレルギー性タンパク質におけるプロテアーゼの増強効果を説明する（Ｋｈｅｒａｄｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  上記；  Ｋｕｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ａｒｃｈ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １２９：１２９  ［２００２］；  及びＳａｒｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １００：４８０  ［１９９７］）。このことは、アレルギー性ドナーが単一のタンパク質に対して本当にアレルギー性を有しているという観察についての１つの説明を提供する。
【実施例】
【００６９】
以下の実施例は、特定の好ましい態様及び本発明の側面を説明する。説明される実施例に本発明を限定することは意図しない。
【００７０】
以下の実験に関する開示においては、次の略語が適用される：ｅｑ（等価物）；Ｍ(モル濃度の)；μＭ（マイクロモル濃度の）；Ｎ（ノルマル）；ｍｏｌ(モル)；ｍｍｏｌ(ミリモル)；μｍｏｌ(マイクロモル)；ｎｍｏｌ(ナノモル)；ｇ(グラム)；ｍｇ(ミリグラム)；ｋｇ（キログラム）；μｇ(マイクログラム)；Ｌ(リットル)；ｍｌ(ミリリットル)；μｌ(マイクロリットル)；ｃｍ(センチメートル)；ｍｍ(ミリメートル)；μｍ(マイクロメートル)；ｎｍ(ナノメートル)；℃(摂氏温度)；ｈ（時間）；ｍｉｎ（分）；ｓｅｃ（秒）；ｍｓｅｃ（ミリ秒）；ｘｇ（倍比重）；Ｃｉ（キュリー）；ＯＤ（光学密度）；ダルベッコ(Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ)リン酸緩衝溶液(ＤＰＢＳ)；ＨＥＰＥＳ(Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン―Ｎ−［２−エタンスルホン酸］)；ＨＢＳ(ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩液)；ＳＤＳ(ドデシル硫酸ナトリウム)；トリス−ＨＣｌ（トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン-塩酸）；ＩＣ５０（５０％の抑制濃度）；Ｋｌｅｎｏｗ（ＤＮＡポリメラーゼＩラージ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント）；ｒｐｍ（１分間当たりの回転数）；ＥＧＴＡ(エチレングリコール-ビス(β−アミノエチルエーテル)Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸)；ＥＤＴＡ(エチレンジアミン四酢酸)；ＳＰＴ＋（皮膚針試験陽性）；ＡＴＣＣ(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ)、ロックビル、メリーランド州)；ＢＤＩＳ（ベクトン−ディックソンイムノサイトメトリーシステム、サンジョース、カリフォルニア）；ベンダーメドシステム（ベンダーメドシステム、ビエナ、オーストリア）；セダーレーン（セダーレーンラボラトリーズ、オンタリオ、カナダ）；ギブコ及びギブコ／ライフテクノロジーズ（ギブコ／ライフテクノロジーズ、グランドアイランド、ニューヨーク州）；シグマ  (シグマ・ケミカル社、セントルイス、ミズーリ州)；ファルマシア
(ファルマシア・バイオテク社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)；パーセプティブ（パーセプティブバイオシステム；フラミングハム、マサチューセッツ州）；プロクター＆ギャンブル（プロクターアンドギャンブル、シンシナティー、オハイオ州）；ジェネンコア（ジェネンコアインターナショナル、パロアルト、カリフォルニア州）；エンドゲン（エンドゲン、ウォーバン、マサチューセッツ州）；セダーレン（セダーレン、トロント、カナダ）；ダイナル（ダイナル、ノルウェイ）；ノボ（ノボインダストリアル  Ａ／Ｓ、コペンハーゲン、デンマーク）；バイオシンセシス（バイオシンセシス、スイスヴィラ、テキサス州）；Ｒ＆Ｄシステム（Ｒ＆Ｄシステムインク、ミネアポリス、ニュージャージー州）；トリラックスベータ（トリラックスベータ、ウォーレス、フィンランド）；ウォーレス（ウォーレス、トラーク、フィンランド）；デュポン／ＮＥＮ（デュポン／ＮＥＮリサーチプロダクツ、ボストン、マサチューセッツ州）；トムテック（ハムデン、コネチカット州）；およびストラタジーン  (ストラタジーン、ラ・ホーヤ、カナダ)。
【００７１】
以下の実施例において、以下のプロテアーゼを用いた。バチルスレンタススブチリシン（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｕｔｉｌｉｓｉｎ）（スイスポートアソシエーションＮｏ．Ｐ２９６００）、ＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌ（スイスポートアソシエーションＮｏ．Ｐ００７８２）、バチルスリケニフォルミススブチリシン（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）（「Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ」；アセッションＮｏ．ＡＡＵ４００１７）、ＬＧ−１２（バチスル種、アセッションＮｏ．Ｕ３９２３０）及びＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌ  Ｎ１５５Ｇ（「Ｎ１５５Ｇ」；このプロテアーゼは、合成培地ｓｕｕｃ−ｐＡＡＰＦにおいて０．１％酵素までタンパク質分解活性を減らすアミノ酸置換を有するＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌの変異体である）。これらの酵素は、Ｂｉｏ  Ｃａｄ７００Ｅシステム（パーセプティブ）、及びポリスチレン細孔ビーズのＰＯＲＯＳ  ＨＳ／Ｍレレジン（パーセプティブ）を用いた培地ブロスから精製され、１ｍＭＣａＣｌ２、ｐＨ５．８、２０ｍＭＭＥＳ中、約４５ｍｇ／ｍｌで使用される。スブチリシンのアリコートは−２０℃で使用されるまで凍結した。
【００７２】
ＥＬＩＳＡ  試験
ＥＬＩＳＡアッセイは、試験酵素に曝した後のサイトカインの活性を決定するために用いた。これらの試験において、精製された組換えサイトカインはＲ＆Ｄシステムより購入した。サイトカインは活性酵素と共に、５％ヒトＡＢ血清含有ＲＰＭ−１６４０（ギブコ）中で、３７℃１２乃至１８時間培養した。酵素活性は１ｍＭＰＭＳＦで停止した。ＥＬＩＳＡはＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０及びＴＨＧ−βのためのＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステム）を用いて行った。インスタントＥＩＬＳＡキット（ベンダーメドシステムズ）をＩＬ−４及びＩＮＦ−γの測定のために用いた。全てのキットは、仕様説明書に従って使用した。ＩＣ５０の値は検量線を用いて、５０％の値のためには傾斜方程式を解くことにより回帰曲線から計算した。
【００７３】
細胞表面切断アッセイ
抹消血液単核細胞（ＰＢＭＣ）はスタンフォード血液センター（パロアルト、カリフォルニア）から購入した軟膜ドナーから調製した。軟膜物質はＤＰＢＳで希釈され、不連続のＬｙｍｐｈｏｐａｑｕｅグラジエント（ギブコ）上に分散された。ＰＢＭＣはＤＰＢＳ（ギブコ）中１０６細胞／ｍｌになるように懸濁され、その後、各種濃度のスブチリシンとともに室温で１時間インキュベートされた。２％ＦＣＳ（シグマ）をＤＰＢＳ中に添加して、反応を停止し洗浄を繰り返した。酵素処理の後、細胞をＤＰＢ中で懸濁し、蛍光標識した、抗体で３０分間室温でインキュベーションした。細胞をＤＰＳで洗浄し、その後、ＦＡＣＣａｌｉｂｕｒｅフローサイトメトリー（ＢＤＩＳ）で解析し、データをセルクエストソフトフェアー（ＢＤＩＳ）で解析した。
【００７４】
機能アッセイ
ＴＦ−１細胞（ＣＲＬ−２００３）をＡＴＣＣから購入した。ＩＬ−４とプロテアーゼを一晩インキュベーションした後、ＰＭＳＦを最終濃度が１ｍＭになるように添加した、ＴＦ−１細胞を３回洗浄し、９６ウェルプレート中で１ウェル当たり２×１０４の細胞を酵素処理した細胞と培養した。培地を３７℃、５％ＣＯ２中で、４８時間インキュベーションした。その後、トリチウム化したチミジン、０．５ｕＣｉを各ウェルに添加した。培地を１８時間後に収穫し、Ｔｒｉ−Ｌｕｘシンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ）を用いてシンチレーションカウントを行った。
【００７５】
実施例１
細胞表面マーカー
これらの実験は、プロテアーゼにより細胞表面分子の除去が、後の免役反応のタイプに影響するかどうかを評価するために行う。特に、本明細書で述べるプロテアーゼは異なるアレルギーポテンシャルを有しているので、これらの細胞表面マーカーを除去することにより影響が区別可能であるかどうかを評価するために行う。ヒトＰＢＭＣをバチルスレンタススブチリスン（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｕｔｉｌｉｓｉｎ）及びＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌで処理した。処理後、細胞表面マーカーの存在をフローサイトメトリーを用いて検出した（図３）。いずれの酵素もヒト単核球の表面からＨＬＡ−ＤＲをＣＤ８６を除去しなかった。実際に、酵素処理の結果はＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲの僅かではあるが再現性のある上向き調節となった。酵素は、ＣＤ３発現においても影響を及ぼさなかった。バチルスレンタススブチリスン（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｕｔｉｌｉｓｉｎ）及びＢＰＮ’Ｙ２１７ＬはＣＤ４の発現及びＩＣ５０において同一の活性を示した。しかしながら、ＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌ処理は高投与において発現レベルを低め、ＩＣ５０を低めた。ＰＢＭＣの表面から除去されたＣＤ４及びＣＤ８の両方のＩＣ５０の値は、μｇ／ｍｌの範囲であった。従って、この試験の結果は、細胞表面マーカーは、ＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌ  及びバチルスレンタススブチリスン（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｕｔｉｌｉｓｉｎ）の両方により同様に除去されることを示す。
【００７６】
実施例２
ヒトサイトカイン上のセリンプロテアーゼの活性
ヒトサイトカインにおけるセリンプロテアーゼの活性を決定することを意図するこれらの実験において、ＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌ及びバチルスレンタススブチリスン（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｕｔｉｌｉｓｉｎ）を５％ヒト血清中で、組換えヒトサイトカインと３７℃で一晩インキュベーションした。対照として、ＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌ変異体Ｎ１５５Ｇも試験した。Ｎ１５５Ｇはテトラペプチド基質ｓｕｃｃ−ｐＡＡＰＦ上で対照酵素活性の０．１％の活性を示すことがわかっている。インキュベーションの後、プロテアーゼ活性をＰＭＳＦを最終濃度１ｍＭで添加して停止した。残りのサイトカインレベルをＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。図２はＩＬ−４、ＩＬ―１３、ＩＬ−１２及びＩＬ−１０の結果を示すグラフである。
【００７７】
ＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌ及びバチルスレンタススブチリスン（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｕｔｉｌｉｓｉｎ）はＩＬ−４以外の試験されたサイトカインの全てにおいて等しい活性を示すことがわかった。ＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌ及びスブチリスンの間には、ＩＬ−４の検出可能なレベルを減らすのに必要な酵素のレベルにおいて有意な違いが存在する。以下の表１で示すように、ＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌは約６０倍以上の活性がある。これらのデータは示した２つの実験の結果を示す。表１において、「ＮＤ」は試験を行っていなことを示す。これらの酵素はＩＬ−３においてｎｇ／ｍｌの範囲で活性であった。一方、ＩＬ−１０においては、μｇ／ｍｌの投与の範囲で活性が見られた。従って、これらの試験において見られた結果はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてセリンプロテアーゼが低いレベルにおいてヒトサイトカインに上で活性があることを示している。
【表１】
2008538921.tif 000003
【００７８】
これらの試験から得られた結果は、低いアレルゲン性は、ＩＬ−４上においてより活性を有することを示す。上で述べたように、４つの異なるセリンプロテアーゼのヒトサイトカインに対する活性を試験した。バチルスリケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｉｍｉｓ）プロテアーゼＣａｒｌｓｂｅｒｇ及びバチルスレンタススブチリスン（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎｅ）はアレルギー性の動物において等しい活性を有し、職業的に暴露された作業員においてほど同じ割合の感作を誘発する（例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃａｌ．Ｓｃｉ．，４３：３９［１９９８］参照）。
【００７９】
ＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌは動物モデルにおいて活性が低く、Ｃａｒｌｓｂｅｒｇの約０．３倍のポテンシャルを有していた。ＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌはヒトにおいて、Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ又はバチルスレンタススブチリスン（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｕｔｉｌｉｓｉｎ）よりも低い感作の割合を示す。バチルスレンタススブチリスン（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｕｔｉｌｉｓｉｎ）及びＣａｒｌｓｂｅｒｇの両者は、それらの同様なアレルギーポテンシーと同様に、試験されたサイトカインにおいて、等しいレベルの活性を示した（図３参照）。ＩＣ５０の値は、ＩＬ−１２においてμｇ／ｍｌであり、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−βにおいて２００ｎｇ／ｍｌ未満であった。例外はヒトＩＬ−４であり、バチルスレンタススブチリスンＢ．ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｕｔｉｌｉｓｉｎ）及びＣａｒｌｓｂｅｒｇはＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌと比較してかなり低い活性を示した。
【００８０】
ＬＧ−１２プロテアーゼはヒトサイトカイン全体に対してより活性が高い。しかしながら、そのＩＬ−４に対して示した活性に依存して、バチルスレンタススブチリスン（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｕｔｉｌｉｓｉｎ）及びＢＰＮ’２１７Ｌの間を仲介するアレルギー性を有することが予測される。ＬＧ−１２に対するヒト暴露のデータは無い。
【００８１】
表１が示すように、ヒトサイトカインにおけるプロテアーゼの活性は通常ＩＣ５０がμｇ／ｍｌのレンジ及びＩＣ５０がｎｇ／ｍｌのレンジの２つのカテゴリーに分類される。セリンプロテアーゼの切断に対するサイトカインのコンパチビリティーは、ＩＬ−１２及びＩＮＦ−γに見られた。ＩＬ−４はバチルスレンタススブチリスン（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｕｔｉｌｉｓｉｎ））及びＣａｒｌｓｂｅｒｇに対して耐性がある。感受性の高いサイトカインはＩＬ−１３、ＩＬ−１０、及びＴＨＦ−βを含む。感受性の高いサイトカインに対するＩＣ５０の値は１００ｎｇ／ｍｌ未満であるとされた。
【００８２】
これらの試験に含まれる酵素は高いセリンプロテアーゼ活性を有することが知られており、ＥＬＩＳＡアッセイ成分を活性化する能力があるので、これらの試験に用いた３つのプロテアーゼは試験され、及びこのアッセイの大部分において用いられている試薬でコートされたマウスＩｇＧ１ＥＬＩＳＡプレート検出可能な影響が見られなかった。このことは、試験されたサイトカイン上のタンパク質分解活性が生物学的機能に影響しないだけでなくＥＬＩＳＡアッセイにおいて検出されうる能力が崩壊されていることを示している。この試験のために、ヒトＩＬ−４を図２及び３において示したＥＬＩＳＡアッセイに用いたのと同様にプロテアーゼで処理した。インキュベーション及びＰＭＳＦでの酵素反応停止の後、ＴＦ−１細胞に反応したＩＬ−４をウェルに添加した。ＴＦ−１細胞の分化を３日目に検出した（図４参照）。ＴＦ−１細胞による分化の減少は、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるＩＬ−４の減少と一致していた。従って、タンパク質分解活性はヒトＩＬ−４の機能活性を減らす。
【００８３】
本明細書で言及する全ての特許及び刊行物は本発明が属する分野における当業者のレベルを示すために用いる。全ての特許及び刊行物は、明確に及び別個に参照により本明細書に援用される範囲において、参照により本明細書に援用される。
【００８４】
本発明の好ましい態様を説明したけれども、当業者は開示された態様の明らかな各種変更をすることができ、そのような変更は本発明の範囲内であることは理解されるであろう。
【００８５】
当業者は、本明細書において述べたほかに、言及した目的、結果及び利益を得るために本発明が適していることを理解する。本明細書で述べた組成物及び方法は、好適な態様であり、例示であり、本発明をこれらの態様に限定することを意図しない。当業者にとって、本発明の範囲の精神を逸せずに、本発明の各種置換及び変更をなし得ることは明らかである。
【００８６】
例示的に本明細書において開示された本発明は、本明細書において特定されていない任意の構成要素又は限定がなくても実施することができる。用いた文言及び表現は、説明のための言葉であり、限定をするための言葉ではない。それらの特徴を示す、又は説明する又はその一部分に等しいものを含むそのような文言及び表現の使用を意図するものではない。しかし、特許請求の範囲内における可能な変更は意図される。したがって、本発明は好ましい態様により説明されるけれども、ここで開示されたコンセプトの任意の特徴、修飾、及び変更は当業者によりなされ、そのような修飾の変更は本明細書において開示する特許請求の範囲内であると考えられる。
【００８７】
本発明は幅広く一般的に説明されている。包括的な開示の範囲内に当たる各下位概念も本発明の一部を形成する。このことは、削除された物質が本明細書に記載されているかどうかに関わらず、類概念から任意の主題を削除した条件付け又は負の限定を伴う、本発明の包括的な説明を含む。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】図１は、細胞表面分子の発現における酵素活性を示すグラフを提供する。
【図２】図２はＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌ及びバチルスレンタススブチリシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）が、ヒトサイトカインにおいて異なる活性を有することを示している。
【図３】図３はバチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ及びバチルスレンタススブチリシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）がＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２及びＴＧＦ−βにおいて同様の活性を有することを示す。
【図４】図４は酵素活性がＩＬ−４の機能活性を減らすことを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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