(57)【要約】【課題】欠失の傾向を有する可能性がある配列領域を特定するために、発現ベクターに組み込む前に外来ＤＮＡ配列をスクリーニングできる方法を提供すること。【解決手段】外来ＤＮＡ配列を適切なベクターによる発現に最適化する方法は、（ｉ）前記外来ＤＮＡのヌクレオチドコドン使用頻度を最適化して、前記外来ＤＮＡ配列が発現される宿主細胞のコドン使用頻度に変更する手順と、（ｉｉ）コドンが最適化されたＤＮＡ配列を改変して、前記宿主細胞内での前記外来ＤＮＡの発現を阻害又は下方制御し得るいずれかの配列部位を変更する手順と、（ｉｉｉ）相同組換えに基づく推定欠失機構に関係する全配列を除去するために、前記外来ＤＮＡ配列のヌクレオチドコドン使用頻度を変更する手順と、を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来ＤＮＡ配列を適切なベクターによる発現に最適化する方法であって、
（ｉ）前記外来ＤＮＡのヌクレオチドコドン使用頻度を最適化して、前記外来ＤＮＡ配列が発現される宿主細胞のコドン使用頻度に変更する手順と、
（ｉｉ）コドンが最適化されたＤＮＡ配列を改変して、前記宿主細胞内での前記外来ＤＮＡの発現を阻害又は下方制御し得るいずれかの配列部位を変更する手順と、
（ｉｉｉ）相同組換えに基づく推定欠失機構に関係する全配列を除去するために、前記外来ＤＮＡ配列のヌクレオチドコドン使用頻度を変更する手順と、を含む方法。
【請求項２】
前記外来ＤＮＡは異種タンパク質をコードする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記外来ＤＮＡは抗体をコードする請求項１記載の方法。
【請求項４】
抗体コード配列に組み込まれるためのリンカー配列を、一次アミノ酸配列中の３重複配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１）を保持しつつ設計する設計手順を更に含み、
前記リンカー配列は、ＤＮＡコード配列から除去された実質的にすべての重複配列を有する請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記抗体又は結合物の設計手順を、手順（ｉｉｉ）の前に行う請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記宿主細胞内での前記外来ＤＮＡの発現を阻害又は下方制御し得る配列要素は、陰性要素又は反復配列、スプライシング部位、内部ＴＡＴＡボックス、及び内部リボソーム侵入部位のようなシス活性化モチーフからなる群より選択される請求項１から５いずれか記載の方法。
【請求項７】
前記外来ＤＮＡ配列の発現に適するベクターにおける、請求項１から６いずれか記載の方法で解析され就職された外来ＤＮＡ配列の使用。
【請求項８】
前記ベクターはトランスジェニック発現系に導入される請求項７記載の使用。
【請求項９】
前記トランスジェニック発現系はトランスジェニック鳥類である請求項８記載の使用。
【請求項１０】
前記トランスジェニック鳥類はニワトリである請求項９記載の使用。
【請求項１１】
前記ベクターはレンチウイルスベクターである請求項７から１０いずれか記載の使用。
【請求項１２】
前記ベクターはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）である請求項７から１１いずれか記載の使用。
【請求項１３】
前記リンカー配列は配列番号１の配列を有するリンカー配列。
【請求項１４】
組換え抗体のためのリンカー配列であって、そのヌクレオチド配列は、短い重複配列、ＧＧＣ、及びＴＣＣを、隣接コドンとして有しないリンカー配列。
【請求項１５】
組換え抗体系外来遺伝子の発現のためのリンカー配列であって、配列番号３の配列を有するリンカー配列。
【請求項１６】
組換え抗体系外来遺伝子の発現のためのリンカー配列であって、配列番号４の配列を有するリンカー配列。
【請求項１７】
トランジェニック鳥類を作製する方法であって、
前記トランジェニック鳥類において発現させる１以上の異種タンパク質をコードする外来ＤＮＡ配列を準備する手順と、
前記外来ＤＮＡの異種タンパク質コード領域のヌクレオチドコドン使用頻度を最適化して、前記外来ＤＮＡ配列が発現されるトランジェニック鳥類のコドン使用頻度に変更する手順と、
コドンが最適化されたＤＮＡ配列を改変して、前記宿主鳥類内での前記外来ＤＮＡの発現を阻害又は下方制御すると予測されるいずれかのコード配列領域を変化させる手順と、
相同組換えに基づく推定欠失機構に関係する全配列を除去するために、前記外来ＤＮＡ配列のヌクレオチドコドン使用頻度を変更する手順と、
前記外来ＤＮＡ配列を含むベクターを鳥類ゲノムに組み込む手順と、
前記配列によってコードされる前記異種タンパク質を生産するために前記外来ＤＮＡ配列を発現させる手順と、を含む方法。
【請求項１８】
前記トランスジェニック鳥類は、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ウズラ、ガチョウ、ダチョウ、キジ、クジャク、ホロホロチョウ、ハト、白鳥、チャボ、又はペンギンである請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記トランスジェニック鳥類は、キメラ鳥類又はモザイク鳥類である請求項１７又は１８記載の方法。
【請求項２０】
前記異種タンパク質の発現を組織特異的に行う請求項１７から１９いずれか記載の方法。
【請求項２１】
前記異種タンパク質の発現を卵管で行う請求項１７から２０いずれか記載の方法。
【請求項２２】
前記異種タンパク質の発現を卵内で行う請求項１７から２１いずれか記載の方法。
【請求項２３】
前記異種タンパク質の発現を卵白で行う請求項１７から２２いずれか記載の方法。
【請求項２４】
鳥類において外来タンパク質を発現する方法であって、
前記鳥類において発現させる１以上の外来タンパク質をコードする外来ＤＮＡ配列を準備する手順と、
請求項１から６いずれか記載の方法で前記外来ＤＮＡ配列を解析する手順と、
前記外来ＤＮＡ配列を含むベクターを鳥類ゲノム内で発現させる手順と、
発現された抗体タンパク質を前記鳥類から得る手順と、を含む方法。
【請求項２５】
鳥類の卵管内で外来タンパク質を発現する方法であって、
請求項１から６いずれか記載の方法を用いて解析された外来ＤＮＡ配列を準備して、前記外来ＤＮＡ配列によってコードされる異種タンパク質の発現を阻害又は下方制御し得るコード配列のいずれかの部位を除去又は置換する手順と、
記外来ＤＮＡ配列を鳥類ゲノムに組み込む手順と、
前記外来ＤＮＡ配列に操作可能に連結されたプロモータを用いて前記外来ＤＮＡコード配列を発現させる手順と、
前記トランスジェニック鳥類によって発現される外来タンパク質を得る手順と、を含む方法。
【請求項２６】
前記外来ＤＮＡコード配列をウイルスベクターのバックボーンに挿入し、このベクターを鳥類細胞に挿入する請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
１以上の外来タンパク質を含む鳥類卵の生産における、請求項１から６いずれか記載の方法を用いて解析された外来ＤＮＡ配列の使用。
【請求項２８】
異種タンパク質製品の生産における、１以上の外来タンパク質を含む鳥類卵の生産における、請求項１から６いずれか記載の方法を用いて解析された外来ＤＮＡ配列の使用であって、前記タンパク質製品は前記外来ＤＮＡ配列の少なくとも一部の転写及び翻訳によって製造される使用。
【請求項２９】
請求項１から６いずれか記載の方法を用いて解析された１以上の外来ＤＮＡ配列を含む発現ベクター。
【請求項３０】
請求項２９記載の発現ベクターが形質転換された宿主細胞。
【請求項３１】
請求項１から６、１７から２６いずれか記載の方法を使用するためのキットであって、使用説明書と、前記方法を使用するプロトコルとを備えるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ベクター系、特にレンチウイルスベクターにおいて、改変された導入遺伝子コンストラクトの効果的な転写および翻訳を達成するために改良した方法を提供する。当該方法は、導入遺伝子を含むウイルスベクターゲノムがトランスジェニック鳥類などの動物の生殖細胞系列に安定的に組み込まれることを可能にする無傷の機能導入遺伝子配列を有するウイルスベクターゲノムの生産を容易にする。該導入遺伝子が発現されると、組換え型タンパク質産物が生産され、トランスジェニック鳥類の場合では、目標とするタンパク質をトランスジェニック鳥の卵のなかに生産させることができる。
【背景技術】
【０００２】
組換え型タンパク質の伝統的な製造方法には、細菌または哺乳類の細胞を用いた生産方法がある。これに代わる製造方法は、タンパク質の生産にトランスジェニック動物および植物を用いるものである。
【０００３】
タンパク質をベースとした多数のバイオ医薬品が、トランスジェニックマウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギおよびウシなどの種々の哺乳動物の乳汁中に発現されている。当該系は世代時間が長い傾向があり、より大型の哺乳動物では遺伝子導入された初代動物から、乳汁を生産できる段階まで発達するには数年かかる。
【０００４】
このほかの問題点は、乳汁の生化学的複雑さと、ヒトと動物との間の進化的保存性に関するものであり、これにより、医薬品を生産する哺乳動物に該医薬品に対する有害反応が起こる可能性がある（Ｈａｒｖｅｙら、２００２年）。
【０００５】
製薬学的に重要なタンパク質、特に組換え型ヒト抗体のための製造媒体となる可能性があるものとして、ニワトリの卵の使用に関心が高まっている。
【０００６】
ニワトリの卵に基づいたタンパク質製造系は、哺乳動物の細胞培養またはトランスジェニック哺乳動物系の使用に比べ利点がいくつかある。ニワトリは世代時間が短く（２４週間）、このためトランスジェニックニワトリ群を速やかに確立することができる。さらに、トランスジェニック動物の生産施設のための設備投資は、細胞培養のための設備投資よりはるかに少なくてすむ。細胞培養に比べ、遺伝子導入によるタンパク質生産の促進に必要な特別な処理装置はほんのわずかである。このように設備投資が少なければ、遺伝子導入による治療薬の単位あたりの生産コストは細胞培養で生産される治療薬よりも低くなる。そのうえトランスジェニック系は、精製のバッチサイズおよび頻度に関して多大な柔軟性を提供する。この柔軟性は、バッチサイズを最適化することにより、精製における資本コストおよび操業コストをさらに削減させることにつながる可能性がある。
【０００７】
さらに、遺伝子導入タンパク質の生産は市場への導入速度を速めることになる。トランスジェニック哺乳動物は、乳汁１リットルあたり数グラムのタンパク質を生産することができ、大量生産を商業的に実行可能なものとすることができる（Ｗｅｃｋ、１９９９年）。またさらに、鳥では世代時間が短いため、生産の迅速なスケールアップが可能である。
【０００８】
鳥類の卵、特にニワトリの卵は、タンパク質の生産手段として細胞培養を上回る大きな利点をいくつか提供する。さらに鳥類系は、哺乳動物または植物に基づく他のトランスジェニック生産系を超える重要な利点を提供する。
【０００９】
トランスジェニック哺乳動物の生産に使用される方法を鳥の遺伝子操作に直接適用することは、産卵鶏の生殖系の特別な特徴のため、これまで可能ではなかった。
【００１０】
卵形成の複雑さにより、ヒヨコ胚発達の初期段階は比較的アクセスしにくい段階である。早期の段階の胚にアクセスするために採用される方法では、通常、ドナーである雌鳥を屠殺して胚を得るか、または輸卵管に直接注射を行なうことが必要である。トランスジェニック哺乳動物の生産方法は、ほぼ例外なく受精卵のマイクロインジェクションに重点が置かれており、この方法ではインビトロで前核にＤＮＡを微量注入し、操作した当該卵を代理母に移して満期まで発育させるが、この方法は雌鳥では実行不可能である。
【００１１】
トランスジェニック鳥類の作製には、一般的な方法が４つ開発されている。（ｉ）胚盤の細胞質へのＤＮＡマイクロインジェクションを用いてトランスジェニックニワトリを作製する方法、（ｉｉ）インビトロで始原生殖細胞のトランスフェクションを行ない、適切に準備したレシピエントに移植する方法、（ｉｉｉ）発癌性レトロウイルス由来の遺伝子導入ベクターを使用する方法、（ｉｖ）ヒヨコ胚細胞をインビトロで培養し、培養した細胞をレシピエント胚に導入することによりキメラ鳥を作製する方法である（Ｐａｉｎら、・１９９６年）。キメラを作製する前に胚細胞をインビトロで遺伝子操作することができ、これによりキメラなトランスジェニック鳥が生じる。
【００１２】
レンチウイルスはレトロウイルスの亜群であり、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）などの種々の霊長類ウイルスならびに非霊長類ウイルス（たとえば、マエディビスナウイルス（ＭＷ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ））が含まれる。これらのウイルスは特に遺伝子治療の開発において関心がもたれており、これは、レンチウイルスが宿主細胞ＤＮＡに不可逆的に組み込まれるというレトロウイルスの一般的な特徴を有するだけでなく、非増殖細胞を感染させる能力も有するからである。レンチウイルス感染の生物学はＣｏｆｆｉｎら（１９９７年）の総説を参照できる。
【００１３】
ウイルスベクターを設計する際に考慮すべき重要事項は、細胞のゲノムに安定的に組み込まれる能力である。これまでの研究から、遺伝子導入媒体として用いるオンコレトロウイルスベクターは、発生過程における遺伝子発現抑制効果により成功率がやや低いことが示されている。マウスに関するＰｆｅｉｆｅｒら（２００２年）およびＬｏｉｓら（２００２年）の研究から、ＨＩＶ−１に基づくレンチウイルスベクターは発生過程で発現が抑制されないことが示された。
【００１４】
レンチウイルスベクターに関する開発研究の大半はＨＩＶ−１系に焦点を当ててきたが、これは主に、ヒトに病原性を示すためにＨＩＶが最も十分に特徴付けられているレンチウイルスであるという事実によるものである。当該ベクターは、調節遺伝子およびアクセサリー遺伝子を除去して複製を不可能にすることにより、複製能力をなくすように設計される傾向がある。こうしたベクターの最新型は、調節遺伝子のほぼすべて、アクセサリー遺伝子のすべてが除去される程度まで最小化されている。
【００１５】
レンチウイルス属のウイルスは、類似したゲノム構成、類似した複製サイクル、成熟マクロファージを感染させる能力など、多数の類似した特徴を有する（ＣｌｅｍｅｎｔｓおよびＰａｙｎｅ、１９９４年）。当該レンチウイルスの１つがウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）である。レンチウイルス属の他のウイルスに比べ、ＥＩＡＶは比較的単純なゲノムを有し、該ゲノムは、レトロウイルスのｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子のほかにわずか３つの調節／アクセサリー遺伝子（ｔａｔ、ｒｅｖおよびＳ２）からなる。安全かつ効果的なレンチウイルスベクター系の開発は、ベクター自体のデザインに依存することになる。効果的な機能を得るためには、形質導入するベクターとしての機能を保ちながら、ベクターのウイルス構成要素を最小限に抑えることが重要である。
【００１６】
オンコレトロウイルスベクター系およびレンチウイルスベクター系は、形質導入可能な細胞の種類および動物種の範囲を広げるために改変することができる。これは、該ウイルスのエンベロープ糖タンパク質を他のウイルスのエンベロープタンパク質に置き換えることによって達成される。ＥＩＡＶレンチウイルスベクターにパッケージされた導入遺伝子を生殖細胞系列に安定的に発現させることが可能である（ＭｃＧｒｅｗら、２００４年）。この方法は、外来ＤＮＡの関連断片を合成することと、観察された最適なニワトリの頻度にコドン使用頻度を変えること（口語で「チキナイゼーション（ニワトリ化）」と言われるプロセス）を必要とする。当該プロセスは、特定の外来ＤＮＡ配列の効果的な転写および翻訳を十分に可能にし、その結果、得られた鳥で目的のタンパク質を発現させると考えられる。しかし一部のタンパク質配列は、安定的に発現できるように改変が必要であることが示されている。
【００１７】
ガングリオシドＧＤ３に特異的であるＲ２４として知られるネズミ抗体を使用して、「ミニボディ」と呼ばれる組換え型抗体様結合分子が作製された。このミニボディの構造は、伝統的な抗体ＶＨおよびＶＬドメインと、これに結合したリンカーおよびＩｇＧ１のＦｃドメインから構成された。ＥＩＡＶをベースとしたレンチベクターにこのミニボディのためのコード配列がパッケージされたが、ミニボディタンパク質産物の発現は達成できなかった。
【００１８】
その後、Ｒ２４ミニボディを含有する種々のウイルスゲノムから直接増幅したＲＴ−ＰＣＲ産物が解析された結果、外来Ｒ２４ミニボディのコード配列の一部または全部を包含する多数の欠失が起こっていることが確認された。これらの欠失の５’および３’範囲を表す配列が解析された結果、異常スプライシングがこれらの欠失の原因ではないことが示された。当該欠失は小さい（５〜１０ｂｐ）直列反復配列によって特徴付けられているようであり、このことから、観察された外来ＤＮＡコード配列の変化は、これまで知られていない相同的組換えに基づく機構が原因であることが示唆されている。
【００１９】
Ｃｈ’ａｎｇらはこれまでに、ネズミ白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）の組み込まれたプロウイルスゲノムにおける内部欠失を報告しており、研究中に確認された３つの欠失はいずれも、７つのヌクレオチドの直列反復配列に挟まれたていたと述べている（Ｃｈ’ａｎｇら、１９８９年）。短い直列反復配列によって挟まれたＤＮＡ配列に関する特定の欠失は、他のレトロウイルス遺伝子（Ｃｏｆｆｉｎによる総説、１９８５年）のほか、種々の原核生物および真核生物の遺伝子（Ｏｍｅｒら１９８３年、およびＬｅｖｙら１９８５年の論文）においても観察されている。短い直列反復配列に挟まれた欠失は、・鳥肉腫ウイルスｓｒｃ遺伝子にも観察されている（Ｏｍｅｒら、１９８３年）。提案された機構は、たとえば、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素などＤＮＡ複製機構のずれであることが示唆されている。しかし、Ｒ２４ミニボディベクター系に観察された欠失は、逆転写されたウイルスＲＮＡゲノムから直接増幅したＲＴ−ＰＣＲ産物に存在したことから、この機構によって説明することはできない。そうではなく、宿主細胞のＲＮＡポリメラーゼ（Ｒｐｏｌ  ＩＩ）が、パッケージング細胞株へのプラスミドのトランスフェクション直後にウイルスゲノムの転写時に欠失を誘導した可能性が高い。この結論を支持するように、一部の宿主ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは鋳型スイッチの能力を有することが知られており（Ｎｕｄｌｅｒら、１９９６年）、さらに、ＲＮＡ組換えはヘアピンループなどの三次元構造の存在により影響を受けることも知られている（ＷｈｉｔｅおよびＭｏｒｒｉｓ、１９９５年）。
【００２０】
レンチウイルスベクターのバックボーンに組み込むときに欠失が発生する傾向を検討するために、別の外来遺伝子配列、すなわち、７９１Ｔ／３６として知られる組換え型ネズミ抗ＣＤ５５抗体の遺伝子配列が評価された。欠失に関与することが知られている配列が７９１Ｔ／３６に保存されていた。
【００２１】
したがって、一部の複合タンパク質をコードする遺伝子内の特定の配列は、レンチウイルスベクターバックボーンに組み込まれると欠失を経験しやすいと考えられる。欠失の程度は遺伝子ごとに劇的に異なる可能性が高く、したがって予測不可能であると考えられる。Ｒ２４ミニボディの発現に関連して示されているように、導入遺伝子からのタンパク質の発現がもはや不可能である程度まで欠失が起こることがあり、言い換えれば、トランスジェニック系における該タンパク質の発現を妨げることになる。
【００２２】
欠失の傾向を有する可能性がある配列の領域を特定するために、発現用ベクターに組み込む前に外来ＤＮＡ配列をスクリーニングできれば、大いに望ましいことである。
【非特許文献１】Ｃｈ’ａｎｇ  ＬＹ，  Ｙａｎｇ  ＷＫ，  Ｍｙｅｒ  ＦＥ，  Ｋｏｈ  ＣＫ，  Ｂｏｏｎｅ  ＬＲ（１９８９）．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６８，  ２４５−２５５．
【非特許文献２】Ｃｌｅｍｅｎｔｓ  ＪＥ  ＆  Ｐａｙｎｅ  ＳＬ（１９９４）  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．  ３２（２），９７−１０９．
【非特許文献３】Ｃｏｆｆｉｎ  Ｊ（１９８５）．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  （Ｒ  Ｗｅｉｓｓ，  Ｎ  Ｔｅｉｃｈ，  ＨＥ  Ｖａｒｍｕｓ  ｅｄｓ）２，１７−７４．
【非特許文献４】Ｇｒａｆ  Ｍ，  Ｂｏｊａｋ  Ａ，  Ｄｅｍｉ  Ｌ，  Ｂｉｅｌｅｒ  Ｋ，  Ｗｏｌｆ  Ｈ，  Ｗａｇｎｅｒ  Ｒ（２０００）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７４，１０８２２−８２６．
【非特許文献５】Ｈａｒｖｅｙ  ＡＪ，  Ｓｐｅｋｓｎｉｊｄｅｒ  Ｇ，  Ｂａｕｇｈ  ＬＲ，  Ｍｏｒｒｉｓ  ＪＡ，  Ｉｖａｒｉｅ  Ｒ（２００２）  Ｐｏｕｌｔ．  Ｓｃｉ  ．８１（２），２０２−１２．
【非特許文献６】Ｈｏｒｔｏｎ  ＲＭ，  Ｈｕｎｔ  ＨＤ，  Ｈｏ  ＳＮ，  Ｐｕｌｌｅｎ  ＪＫ，  Ｐｅａｓｅ  ＬＲ．（１９８９）  Ｇｅｎｅ７７（１），６１−８．
【非特許文献７】Ｌｅｖｙ  ＤＥ，  Ｌｅｒｎｅｒ  ＲＡ，  Ｗｉｌｓｏｎ  ＭＣ（１９８５）．  Ｃｅｌｌ  ４１，２８９−  ２９９．
【非特許文献８】Ｌｏｉｓ  ｃ，  Ｈｏｎｇ  ＥＪ，  Ｐｅａｓｅ  Ｓ７  Ｂｒｏｗｎ  ＥＪ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  Ｄ（２００２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５（５５５６），８６８−７２．
【非特許文献９】Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｓａｌａｓ  Ｅ（１９９９）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，４５８−６４．
【非特許文献１０】ＭｃＧｒｅｗ  ＭＪ，  Ｓｈｅｒｍａｎ  Ａ，  Ｅｌｌａｒｄ  ＦＭ，  Ｌｉｌｌｉｃｏ  ＳＧ，  Ｇｉｌｈｏｏｌｅｙ  ＨＪ，  Ｋｉｎｇｓｍａｎ  ＡＪ，  Ｍｉｔｒｏｐｈａｎｏｕｓ  ＫＡ  ＆  Ｓａｎｇ  Ｈ（２００４）  ＥＭＢＯ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５（７），７２８−３３．
【非特許文献１１】Ｎｕｄｌｅｒ  Ｅ，  Ａｖｅｔｉｓｓｏｖａ  Ｅ，  Ｍａｒｋｏｖｔｓｏｖ  Ｖ，  Ｇｏｌｄｆａｒｂ  Ａ  （１９９６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３，２１１−２１７．
【非特許文献１２】Ｏｍｅｒ  ＣＡ，  Ｐｏｇｕｅ−ｇｅｉｌｅ  Ｋ，  Ｇｕｎｔａｋａ  Ｒ，  Ｓｔａｓｋｉｓ  ＫＡ，  Ｆａｒａｓ  ＡＪ  （１９８３；  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ５４，８８９−８９３．
【非特許文献１３】Ｐａｉｎ  Ｂ，  Ｃｌａｒｋ  ＭＥ，  Ｓｈｅｎ  Ｍ，  Ｎａｋａｚａｗａ  Ｈ，  Ｓａｋｕｒａｉ  Ｍ，  Ｓａｍａｒｕｔ  Ｊ，  Ｅｔｃｈｅｓ  ＲＪ  （１９９６）．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２（８），２３３９−４８．
【非特許文献１４】Ｐｆｅｉｆｅｒ  Ａ，  Ｉｋａｗａ  Ｍ，  ｄａｙｎ  Ｙ，  Ｖｅｒｍａ  ＩＭ  （２００２）  ＰＮＡＳ  ９９（４），２１４０−４５．
【非特許文献１５】Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｒ，  Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｍ，  Ｎａｓｉｏｕｌａｓ  Ｇ，  Ｆｅｌｂｅｒ  ＢＫ，  Ｐａｖｌａｋｉｓ  ＧＮ  （１９９７）  ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１（７），４８９２−９０３．
【非特許文献１６】Ｓｈａｗ  Ｇ，  Ｋａｍｅｎ  Ｒ（１９８６）．  Ｃｅｌｌ  ４６（５），６５９−６７．
【非特許文献１７】Ｓｐｉｅｓ  Ｍ，  Ｂｉａｎｃｏ  ＰＲ，  Ｄｉｌｌｉｎｇｈａｍ  ＭＳ，  Ｈａｎｄａ  Ｎ，  Ｂａｓｋｉｎ  ＲＪ，  Ｋｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉ  ＳＣ  （２００３）．  Ｃｅｌｌ  １１４（５），６４７−５４．
【非特許文献１８】Ｔｒａｎ  ＤＰ，  Ｋｉｍ  ＳＪ，  Ｐａｒｋ  ＮＪ，  Ｊｅｗ  ＴＭ，  Ｍａｒｔｉｎｓｏｎ  ＨＧ（２００１）．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２１（２１），７４９５−５０８．
【非特許文献１９】Ｔｒｉｎｈ  Ｒ，  Ｇｕｒｂａｘａｎｉ  Ｂ，  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＬ，  Ｓｅｙｆｚａｄｅｈ  Ｍ  （２００４）．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４０，７１７−７２２．
【非特許文献２０】Ｗｈｉｔｅ  ＫＡ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓ  ＴＪ  （１９９５）ＲＮＡ  １，１０２９−１０４０．  Ｗｅｅｋ，  Ｅ．  １９９９  ’Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌｓ：  ’ｍａｒｋｅｔ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ  ｎｏｗ  ａ  ｒｅａｌｉｔｙ’  Ｄ＆ＭＤ  ｒｅｐｏｒｔｓ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明の発明者らは、驚くべきことに、解析すべき外来ＤＮＡ配列を欠失または他の配列変異を起こすと予測される配列領域を決定できるスクリーニング方法を開発した。いったん、このような配列領域が特定されれば、これらの配列を改変することができる。さらに、このような改変は、外来ＤＮＡ配列をベクターバックボーンに組み込む前に、有利に行なうことができる。したがってこの方法は、導入遺伝子を含むウイルスベクターゲノムがトランスジェニック鳥類などの動物の生殖細胞系列に安定的に組み込まれることを可能にする無傷の機能導入遺伝子配列を有するウイルスベクターゲノムの生産を容易にし、これによって、非ヒト動物、特に鳥類などのトランスジェニック系における組換え型タンパク質の生産に使用できる。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明の第１態様によれば、外来ＤＮＡ配列を適切なベクターによる発現に最適化する方法であって、（ｉ）前記外来ＤＮＡのヌクレオチドコドン使用頻度を最適化して、前記外来ＤＮＡ配列が発現される宿主細胞のコドン使用頻度に変更する手順と、（ｉｉ）コドンが最適化されたＤＮＡ配列を改変して、前記宿主細胞内での前記外来ＤＮＡの発現を阻害又は下方制御し得るいずれかの配列部位を変更する手順と、（ｉｉｉ）相同組換えに基づく推定欠失機構に関係する全配列を除去するために、前記外来ＤＮＡ配列のヌクレオチドコドン使用頻度を変更する手順と、を含む方法が提供される。
【００２５】
一実施形態において、この方法は手順（ｉ）及び（ｉｉｉ）を含む。別の実施形態において、この方法は手順（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含む。更に別の実施形態において、この方法は手順（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）を含む。
【００２６】
前記宿主細胞内での前記外来ＤＮＡの発現を阻害又は下方制御し得る配列要素としては、陰性要素又は反復配列、スプライシング部位、内部ＴＡＴＡボックス、及び内部リボソーム侵入部位のようなシス活性化モチーフが挙げられる。
【００２７】
従って、本発明の実施形態は、前記宿主細胞内での前記外来ＤＮＡの発現を阻害又は下方制御し得る配列要素の存在について外来ＤＮＡ配列を解析することまで及び、特に前記配列要素としては陰性要素又は反復配列、スプライシング部位、内部ＴＡＴＡボックス、及び内部リボソーム侵入部位のようなシス活性化モチーフが挙げられる。
【００２８】
陰性要素は、例えばＡＴ又はＧＣリッチであったり、重要なＲＷＡ二次構造に寄与したり、又は具体的機能が起因するＴＡＴＡボックス、カイ配列、リボソーム侵入部位、ＡＲＥ、ＩＮＳ、ＣＲＳ、スプライシングシグナル、又はポリアデニルかシグナルといったコンセンサス配列と予測されるような一般配列等、２カテゴリの１つに一般に適する。
【００２９】
ＴＡＴＡボックスは、転写開始部位（５’  ＴＡＴＡＡＡＡ  ３’  ：この配列は転写開始部位を正確に決定する際に重要となる）の上流２５ヌクレオチド付近に位置する真核生物ポリメラーゼＩＩによって転写される大部分の遺伝子のプロモータ領域において発見されるコンセンサス配列と定義できる。
【００３０】
ＲｅｃＢＣＤ酵素は、二重鎖ＤＮＡの損傷部位において相同組換えを開始するヘテロ三量体ヘリカーゼ／ヌクレアーゼである。その活性のいくつかは、転移酵素でシスに認識されるＤＮＡカイ配列（５’  ＧＣＴＧＧＴＧＧ  ３’  ）によって調節されている（Ｓｐｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ，  ２００３））。
【００３１】
内部リボソーム侵入部位は、機能的基準及び大きな配列相同性を共有することが報告されていないことに基づいて通常定義される。しかし、インシリコ配列解析プログラムは、公知のＩＲＥＳ配列が導入遺伝子内に存在しないことを検証した（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｓａｌａｓ，  １９９９で総説される）。アデニンリッチ要素（ＡＲＥ）は、一過的に発現される遺伝子由来のｍＲＮＡの３’ＵＴＲ内に頻繁に位置するＡＵリッチ配列と定義される。ＡＲＥ配列の導入は、ｍＲＮＡを不安定化するのに充分であり、ｍＲＮＡのプロセス経路の認識シグナルとして提案されている（Ｓｈａｗ  ＆  Ｋａｍｅｎ，  １９８６）。
【００３２】
阻害要素（ＩＮＳ）及びシス活性リプレッサ配列（ＣＲＳ）は、いずれもＨＩＶモデル系において当初報告されており、１つの仮説によればｍＲＮＡの不安定性に寄与する細胞性因子の結合部位である（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  １９９７）。かかる配列をＨＩＶ転写物から除去すると、その転写物の発現が大きく促進することが実証され、前述したＩＮＳ又はＣＲＳ配列の不存在又は除去を検証することが、導入遺伝子の最適化手順の間望まれる。
【００３３】
３タイプのコンセンサススプライシングシグナルが報告されている。第１は、切除される配列（イントロン）の５’末端と定義されるスプライシングドナー（Ｃ又はＡ、Ａ、Ｇ／Ｇ  Ｔ、Ａ又はＧ、Ａ、Ｇ、Ｔ）である。第２は、切除される配列の３’末端と定義されるスプライシングアダプタ（Ｔ又はＣ，  ｎ，  Ｎ，  Ｃ又はＴ，  Ａ，  Ｇ／ｇ）である。第３は、切除される配列内に位置する分岐点配列（ＴＡＣＴＡＡＣ）であり、スプライシング反応間のラリアット形成に関与する。
【００３４】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写終了は、通常、機能的ポリアデニル化シグナル（ポリＡ）の存在を要する。脊柱動物のコアポリＡシグナルは、ポリＡ切断部部位に隣接する２つの認識部位からなる。典型的には、ほとんど不変のＡＡＵＡＡヘキサマーが、Ｕ又はＧＵ残基リッチのより可変な要素の２０〜５０ヌクレオチド上流に位置する。新生転写物の切断は、これら２要素の間で起こり、５’切断産物への２５０以下のアデノシン（ポリＡテイル）の付加につながる（Ｔｒａｎ  ｅｔ  ａｌ，  ２００１）。
【００３５】
前述したいくつか又はすべての配列要素を保持する結果は、保持される配列の性質に応じて変動する。これらは、種々異なる機構によるが異種コード配列の発現を低減することから、陰性要素として記述される。例えば、異種コード配列内に同属スプライシング配列を保持することで、形質転換遺伝子産物の発現を消滅、低減、又は制限するスプライシング及び切除が高効率化し得る。対照的に、ＩＮＳ要素を保持しても、ＲＮＡ組み込みに影響を及ぼさず、むしろｍＲＮＡが所望のコードされる遺伝子産物の大部分の転移が起こる前に高速分解の標的にされる。いずれの機構も、異種タンパク質発現の減少という同じ一般的結果を生み出す。本発明のこの態様の一実施形態において、本発明の発現最適化方法によって解析され任意に改変された外来ＤＮＡ配列は、トランスジェニック発現系において発現され得るベクターに含まれる。
【００３６】
トランスジェニック発現系は、非ヒト哺乳動物であってよい。更に別の実施形態において、トランスジェニック発現系は、鳥類、特にニワトリ又はウズラであってよい。
【００３７】
本発明の一実施形態において、外来ＤＮＡは、ベクターの内部プロモータの制御下にあり宿主細胞によって発現される異種タンパク質をコードする。
【００３８】
本発明の一実施形態において、ベクターはレンチウイルスベクターである。別の実施形態において、ベクターはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）である。本発明は、レンチウイルスベクターとして、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ−Ｉ及びＨＩＶ−２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、非霊長類ウイルス（例えばマエディ−ビスナウイルス（ＭＷ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマの伝染性の貧血症ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、及びウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ））も提供する。
【００３９】
本発明のこの態様の一実施形態において、外来ＤＮＡは、組換え抗体その他の結合フラグメント又は結合物である異種タンパク質をコードしてよい。
【００４０】
抗体又は結合物等をコードする外来ＤＮＡ配列の解析は、抗体又は結合物に組み込まれるためのＤＮＡコード配列から除去された実質的にすべての重複配列を有するリンカー配列を、一次アミノ酸配列中の３重複配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１）を保持しながら設計する手順を更に含んでよい。この手順は、本発明のこの態様の方法の一部として実施される場合には手順（ｉｉｉ）の前に行うことが好ましい。
【００４１】
具体的には、かかる手順は、手順（ｉｉ）の完了後で手順（ｉｉｉ）の実施前に行われるため、以後この手順を本発明のこの態様の方法における手順（ｉｉｂ）と表記する。
【００４２】
ここで定義されるように、用語「コドン最適化」は、外来ＤＮＡ配列のコドン使用頻度が、発現を向上するためにベクターが挿入され発現される非ヒト哺乳類動物細胞型において最も頻繁に使用されるコドンをコードするために意図的にバイアスされるように、コドン使用頻度を変更する手順を指す。例えば、トランスジェニック発現系がニワトリのとき、コドン使用頻度の変更は、ニワトリ種において最も一般に使用されるコドンに発現をバイアスするために特定のコドンを変化させる。ニワトリで実施するとき、ヌクレオチド配列のコドン使用頻度を変更する手順は、外来ＤＮＡ配列の「ニワトリ化」と口語的に表記され得る。
【００４３】
具体的には、ここで定義されるように、用語「ニワトリ化」は、非変更形態においてヌクレオチド配列（コドン）によってコードされるアミノ酸配列をコードするニワトリ種で最も一般的な３ヌクレオチドによってコドンがコードされるように、ヌクレオチド配列内のコドン使用頻度を意図的に変更する手順を指す。トランスジェニックニワトリにおける発現のため、外来ＤＮＡ配列によって形成されるコドンは、ニワトリにおける最も頻繁なコドン使用パターンに最適化される。しかし、ベクターが発現される任意の鳥類種又は非ヒト哺乳動物の最も頻繁なコドン使用頻度に最適化することもできる。
【００４４】
ニワトリ化の方法例として、アミノ酸バリンは４つの異なるコドン、ＧＴＧ、ＧＴＡ，  ＧＴＴ、及びＧＴＣによってコードされるが、鳥類ではＧＴＧが最も頻繁に使用される（４６％  ＧＴＧ，  １１％  ＧＴＡ，  １９％  ＧＴＴ、２３％  ＧＴＣ）。ヒトＩｇＧＦｃＤＮＡをニワトリ化するためには、すべてのバリンコドンがＡＡＧに変換される。リジンは２つの異なるコドン、ＡＡＧ及びＡＡＡによってコードされるが、鳥類ではＧＴＧが最も頻繁に使用される（５８％対４２％）。配列中のすべてのＡＡＡコドンがＡＡＧに変換される。すべてのコドンの変更が必要とされる訳ではない。例えば、アスパラギン酸としては、２つの異なるコドン、ＧＡＴ及びＧＡＣが略均等に使用されるため、ニワトリ化手順において変更する必要はない。
【００４５】
本発明のこの態様の方法の手順（ｉ）及び（ｉｉ）で概略されるようなコドン使用頻度及び配列改変は、異種導入遺伝子からの遺伝子発現の最適化として当業者に公知である（例えば、Ｇｒａｆ  ｅｔ  ａｌ  ．  ，  ２０００参照）。
【００４６】
本発明のこの態様の方法の手順（ｉ）及び（ｉｉ）は、典型的には、同様の配列設計サービスを提供するＧｅｎｅａｒｔ  ＧｍｂＨ  （Ｇｅｒｍａｎｙ，  ｗｗｗ．ｇｅｎｅａｒｔ．ｃｏｍ）又は組織と協力して実施される。Ｇｅｎｅａｒｔによる手順（ｉ）及び（ｉｉ）の実施は、配列最適化を行うために配列設計及び解析を可能とするコンピュータ配列設計の実施を含む。この方法は、配列を解析し、コドン使用頻度を交換し、コドン交換による配列変化が陰性要素又は繰返しを導入しないことを確保するために得られる配列を解析する手順を含む。タンパク質発現にヌクレオチド配列を最適化する方法の具体的記載は、国際公開ＷＯ２００４／０５９５５６に見出すことができ、その全容は参照して本明細書に援用される。得られる塩基配列を、手順（ｉｉｉ）に示されるようにして更に改変する。任意に、前述した追加的な手順（ｉｉｂ）を手順（ｉｉｉ）の実施の前に行うことができる。
【００４７】
最終的な配列は、外来ＤＮＡ配列の合成の開始前に、問題配列が再導入されていないかを再確認するために再解析してもよい。
【００４８】
この方法は、手順（ｉｉｂ）及び手順（ｉｉｉ）を、発現される外来ＤＮＡ配列に応じて適切な配列での利用に適合させるだけで、必要に応じてあらゆるタンパク質配列での使用に適合できる。
【００４９】
スクリーニング方法のモジュール性は、トランスジェニック動物の作成に使用される場合、レンチウイルスベクター等のベクターに組み込んだ後、欠失の危険があり得る任意の外来ＤＮＡ配列に適用し得る点で、高度に適合化させる。例えば、サイトカイン又はホルモンのような酵素又は生物活性タンパク質等の標準的導入遺伝子のコード配列を解析してよく、同様に、非ヒト哺乳類トランスジェニック系における発現に適する治療的タンパク質等の他のタンパク質の配列を解析してもよい。
【００５０】
更に、スクリーニング方法は、抗体その他の同様の結合フラグメント又は結合物の配列のスクリーニングに使用できる。「抗体」はイムノグロブリンであり、天然、又は部分的もしくは完全に合成的に作成される。この用語は、抗体結合ドメインであり又はそれに相同な結合ドメインを有するいかなるポリペプチド、タンパク質、又はペプチドも包含する。抗体の例は、イムノグロブリン異性体、その異性体サブクラス、Ｆａｂ，  ｓｃＦｖ，  Ｆｖ，  ｄＡｂ，  Ｆｄのような抗体結合ドメインを含むフラグメント、組換え型二重特異性抗体である。抗体はヒト化されていてよく、ヒト化抗体には部分的ヒト化（キメラ）又は完全ヒト化された抗体が含まれうる。
【００５１】
しかし、本発明のこの態様のスクリーニング方法が組換え抗体系導入遺伝子の発現最適化に使用される場合、改変リンカー配列の使用が推奨される。
【００５２】
リンカー配列の発展
広く商業的に入手可能なリンカーの例はＲＰＡＳマウスｓｃＦＶモジュール（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）であり、リンカー配列は、以下の配列番号１のヌクレオチド配列を有する。
ＧＧＴ  ＧＧＡ  ＧＧＣ  ＧＧＴ  ＴＣＡ  ＧＧＣ  ＧＧＡ  ＧＧＴ  ＧＧＣ  ＴＣＴ  ＧＧＣ  ＧＧＴ  ＧＧＣ  ＧＧＡ  ＴＣＧ
【００５３】
本発明は、設計され、以下の配列番号３のヌクレオチド配列を有する新規リンカーも提供する。
ＧＧＧ  ＧＧＡ  ＧＧＧ  ＧＧＣ  ＡＧＣ  ＧＧＣ  ＧＧＡ  ＧＧＧ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＧＣ  ＧＧＴ  ＧＧＧ  ＧＧＡ  ＴＣＴ
【００５４】
配列番号３のヌクレオチド配列は、配列番号４の配列を有するアミノ酸配列をコードする。
ＧＩｙ  ＧＩｙ  ＧＩｙ  ＧＩｙ  Ｓｅｒ  ＧＩｙ  ＧＩｙ  ＧＩｙ  ＧＩｙ  Ｓｅｒ  ＧＩｙ  ＧＩｙ  ＧＩｙ  ＧＩｙ  Ｓｅｒ
【００５５】
繰返しＤＮＡ配列を排除するよう設計するとともに、配列設計及びリンカー配列の解析の間に適用される第２の制限は、隣接コドンとしてＧＧＣ及びＴＣＣを回避することであった。例えば、広く商業的に入手可能なリンカーであるＲＰＡＳマウスｓｃＦＶモジュール（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（配列番号５）は、隣接配列としてのＧＧＣ及びＴＣＣの存在を評価し、以下の配列が確認される。
配列番号５：ＧＧＧ  ＧＧＡ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＴＣＣ  ＧＧＧ  ＧＧＡ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＴＣＣ  ＧＧＧ  ＧＧＡ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＴＣＣ
【００５６】
ｐＲｌ２８（Ｒ２４ミニボディ発現をドライブするＣＭＶプロモータ）及びｐＬＥ３８（Ｒ２４ミニボディ発現をドライブする組織特異的プロモータ）等のいくつかのＥＩＡＶ系レンチウイルスベクターコンストラクトからの以前のＰＣＲデータから、推定相同組換え系機構における繰返しがＲ２４ミニボディコード配列内の欠失を発生させていると示唆されたことから、再設計を行った。新規リンカーは、それを含む組換えタンパク質の発現レベルの低下を引き起こすことが知られている、コドンのいわゆる「スローペア」であるＧＧＡ、ＧＧＣ（Ｔｒｉｎｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）の使用も回避する。
【００５７】
非推定リンカー配列の使用は公知である。しかし、本発明は、ウイルスベクター導入遺伝子から短い重複配列を除去するために、リンカー内のコドン選択を変更する外来ＤＮＡ配列の改変を更に提供する。
【００５８】
本発明の更なる態様は、異種タンパク質の少なくとも一部をコードする単離ＤＮＡであて、本発明のスクリーニング方法で解析されたＤＮＡを提供する。
【００５９】
本発明の更なる態様は、組換え抗体系導入遺伝子の発現のためのリンカー配列であって、配列番号３のヌクレオチド配列を有する配列を提供する。
【００６０】
本発明の更なる態様は、組換え抗体系導入遺伝子の発現のためのリンカー配列であって、配列番号４のヌクレオチド配列を有する配列を提供する。
【００６１】
本発明の更なる態様は、トランジェニック鳥類を作製する方法であって、前記トランジェニック鳥類において発現させる１以上の異種タンパク質をコードする外来ＤＮＡ配列を準備する手順と、前記外来ＤＮＡの異種タンパク質コード領域のヌクレオチドコドン使用頻度を最適化して、前記外来ＤＮＡ配列が発現されるトランジェニック鳥類のコドン使用頻度に変更する手順と、コドンが最適化されたＤＮＡ配列を改変して、前記宿主鳥類内での前記外来ＤＮＡの発現を阻害又は下方制御すると予測されるいずれかのコード配列領域を変化させる手順と、相同組換えに基づく推定欠失機構に関係する全配列を除去するために、前記外来ＤＮＡ配列のヌクレオチドコドン使用頻度を変更する手順と、前記外来ＤＮＡ配列を含むベクターを鳥類ゲノムに組み込む手順と、前記配列によってコードされる前記異種タンパク質を生産するために前記外来ＤＮＡ配列を発現させる手順と、を含む方法を提供する。
【００６２】
本発明の外来ＤＮＡ配列を含むベクターを調整する際、外来ＤＮＡ配列は、関連する制御領域及び発現調節領域とともにパッケージされる。当業者は、ベクターの好ましいパッケージ方法に気づくであろう。
【００６３】
本発明は、トランスジェニック鳥類も提供する。トランスジェニック鳥類は、鳥類種のあらゆるメンバーであり、特にニワトリであり、鳥類細胞の１以上は、細胞ゲノム内に組み込まれ、ベクターに含まれる外来遺伝子材料を含む。かかる遺伝子材料の導入に適した遺伝子導入技術は当業者に公知である。
【００６４】
本発明の方法は、あらゆるトランスジェニック鳥類の生成に使用でき、特に限定されないが、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ウズラ、ガチョウ、ダチョウ、キジ、クジャク、ホロホロチョウ、ハト、白鳥、チャボ、及びペンギンが挙げられる。しかしニワトリが好ましい。トランスジェニック鳥類によって発現される異種タンパク質は、特に限定されないが、ヒト及び／又は獣医目的での治療及び診断利用を含む種々の用途を有するタンパク質であってよく、抗体、抗体フラグメント、抗体誘導体、単鎖抗体フラグメント、融合タンパク質、ペプチド、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン類、成長因子、またはいかなる組換えタンパク質をコードする配列を含んでよい。
【００６５】
本発明は、更にキメラ鳥類又はモザイク鳥類に及び、外来遺伝子材料は鳥類細胞のすべてではないがいくつかにおいて発見される。
【００６６】
一実施形態において、トランスジェニック鳥類は、卵管内で外来遺伝子材料を翻訳タンパク質の形で発現し、卵内へ組み込まれる。
【００６７】
レンチウイルスベクター発現コンストラクトは、ベクターによってコードされる異種タンパク質の発現を特異的組織に方向付け（組織特異的発現）るために使用できる。一実施形態において、かかる組織特異的発現は、卵内へ異種タンパク質が組み込まれるように方向付けされる。それは卵白又は卵黄内であってよいが、タンパク質が卵白内に存在することが好ましい。次にタンパク質は、当業者に公知の常法によって卵白又は卵黄から単離される。
【００６８】
本発明の更なる態様は、鳥類の卵管内で外来タンパク質を発現する方法であって、本発明の方法を用いて解析された外来ＤＮＡ配列を準備して、前記外来ＤＮＡ配列によってコードされる異種タンパク質の発現を阻害又は下方制御し得るコード配列のいずれかの部位を除去又は置換する手順と、記外来ＤＮＡ配列を鳥類ゲノムに組み込む手順と、前記外来ＤＮＡ配列に操作可能に連結されたプロモータを用いて前記外来ＤＮＡコード配列を発現させる手順と、前記トランスジェニック鳥類によって発現される外来タンパク質を得る手順と、を含む方法を提供する。
【００６９】
一実施形態において、本発明の第１態様のスクリーニング方法で解析された外来ＤＮＡコード配列はウイルスベクターのバックボーンに挿入され、このベクターを鳥類細胞に挿入される。
【００７０】
プロモータが、鳥類の輸卵管のマグナム部分の管状腺細胞内で外来ＤＮＡ配列によってコードされる異種タンパク質の「組織特異的」発現を行うことが好ましい。「組織特異的」発現は、異種タンパク質の特異的組織で発現させ、他の組織では異種タンパク質の発現が排除される。異種タンパク質の組織特異的発現を鳥類の卵管に方向付けると予測されるプロモータの一例は、オバルブミンプロモータである。
【００７１】
本発明のこの態様の更なる態様において、プロモータは、外来ＤＮＡコード配列によってコードされる異種タンパク質の発現を卵管の他の組織に方向付けるために、必要に応じて改変されてよい。
【００７２】
外来タンパク質は、治療的に有用なタンパク質であり得る。特に、発現される異種タンパク質は、抗体又は同様の結合フラグメントもしくは結合物であってよい。
【００７３】
本発明の更なる態様は、鳥類において１以上の外来タンパク質を発現する方法であって、発現させる外来タンパク質をコードする外来ＤＮＡ配列を準備する手順と、本発明のスクリーニング方法を用いて前記外来ＤＮＡ配列を解析する手順と、前記外来ＤＮＡ配列を含むベクターを鳥類ゲノム内で発現させる手順と、発現された抗体タンパク質を前記鳥類から得る手順と、を含む方法を提供する。
【００７４】
本発明のこの態様の一実施形態において、１以上の異種タンパク質は、組織特異的、最も好ましくは、卵管細胞での組織特異的発現を用いて鳥類の卵管内で発現される。別の実施形態において、外来タンパク質は、鳥類の輸卵管のマグナム部分の管状腺細胞内で発現され、外来タンパク質は卵白に蓄積する。代替的又は追加的に、異種タンパク質は卵白に蓄積し、血液に分泌され得る。
【００７５】
更なる実施形態において、鳥類はニワトリである。
【００７６】
一実施形態において、卵管内で発現される異種タンパク質は抗体である。更なる実施形態において、抗体は「ヒト化」される。
【００７７】
本発明の更なる態様は、本発明の第１態様のスクリーニング方法を用いて解析された外来ＤＮＡ配列の、外来タンパク質を含む鳥類卵の生産における使用を提供する。一実施形態において、外来タンパク質は卵白内に蓄積される。更なる実施形態において、外来タンパク質は卵黄内に含まれる。
【００７８】
本発明の更なる態様は、本発明の第１態様のスクリーニング方法で解析された外来ＤＮＡ配列の、異種タンパク質製品の生産における使用であって、前記タンパク質製品は前記外来ＤＮＡ配列の少なくとも一部の転写及び翻訳によって製造される使用を提供する。
【００７９】
本発明の更なる態様は、本発明の第１態様のスクリーニング方法で解析された１以上の外来ＤＮＡ配列を含む発現ベクターを提供する。
【００８０】
更なる態様は、前述した発現ベクターが形質転換された宿主細胞を提供する。
【００８１】
一実施形態において、発現ベクターはレンチウイルスベクターであり、特にＥＩＡＶである。
【００８２】
一実施形態において、宿主細胞は非ヒト哺乳類細胞である。更なる実施形態において、宿主細胞は、鳥類細胞であり、特にニワトリ細胞である。
【００８３】
本発明の更なる態様において、本発明のいずれかの方法を使用するためのキットであって、使用説明書と、前記方法を使用するプロトコルとを備えるキットが提供される。
【００８４】
本発明の各態様の好ましい特徴及び実施形態は、特に要求がない限りにおいて、他の各態様として変更すべき点が変更される。
【００８５】
定義
本明細書では、「ベクター」、「ウイルスベクター」および「発現用ベクター」という用語は置き換え可能に使用しており、外来ＤＮＡ配列の、プロモータにより誘導される発現、すなわち転写とこれに続く翻訳を可能にする任意の核酸、好ましくはＤＮＡを指している。
【００８６】
ウイルスベクターゲノムは「複製欠損」であることが好ましく、すなわち、該ベクターのゲノムは、独自に複製して感染性ウイルス粒子が産生されうるほど十分な遺伝情報だけを備えていないことが好ましい。レンチウイルスベクターの場合では、該ゲノムは機能遺伝子ｇａｇ、ｅｎｖまたはｐｏｌを欠いていることになる。
【００８７】
「レンチウイルス」という用語は、本発明に特に好ましいレトロウイルス科の亜科を指している。レンチウイルスには、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）などの種々の霊長類ウイルスならびに非霊長類ウイルス（たとえば、マエディビスナウイルス（ＭＷ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）・が含まれる。
【００８８】
「ウイルスベクターゲノム」とは、ウイルスゲノムからの配列を備えたポリヌクレオチドを指し、該ウイルスゲノムは、かかるポリヌクレオチドのＲＮＡ版をウイルス粒子にパッケージすることが十分に可能で、パッケージされたＲＮＡポリヌクレオチドが逆転写されて宿主細胞の染色体に組み込まれるようになるものをいう。プロモータ配列や、異種ペプチドをコードする外来ＤＮＡ配列などの異種配列も、ウイルスベクターゲノムの一部であってよい。
【００８９】
本明細書で核酸分子を説明するために使用している「組換え型」という用語は、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成または合成に由来するポリヌクレオチドを指しており、その由来または操作により、自然界で結び付いているポリヌクレオチドの全部または一部とは結び付いておらず、および／または自然界で連結されているもの以外のポリヌクレオチドと連結されているものをいう。
【００９０】
本明細書でタンパク質またはポリペプチドを説明するために使用している「組換え型」という用語は、組換え型ポリヌクレオチドの発現により生産されるポリペプチドを指す。
【００９１】
本明細書で使用している「核酸」という用語には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、およびそれらの類似体が含まれる。
【００９２】
「外来ＤＮＡ配列」とは、その転写発現を望む核酸配列である。外来ＤＮＡ配列は一般に、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする。
【００９３】
「欠失」とは、ウイルスベクターゲノムの元のプラスミドコピーに存在するＤＮＡ配列の領域が逆転写の過程で失われる事象をいう。このため欠失した配列は、複製不能なレンチウイルスベクターの粒子が生産されるパッケージング過程で、元のプラスミドから転写された一本鎖ＲＮＡ分子の一部または全部から失われている。プラスミドＤＮＡ配列は常に無傷のまま維持され、欠失は、一本鎖ＲＮＡの２つのコピーが逆転写されてタンパク質の外被内で組み立てられるパッケージング過程における転写過程で起こることに注意されたい。
【００９４】
さらに、細胞で正常に発現されない未改変の核酸配列またはポリペプチドは異種であるとみなされる。本発明のベクターは、同一のまたは異なる挿入部位に挿入された１つ以上の外来ＤＮＡ配列を有することが可能で、挿入部位で各外来ＤＮＡ配列は、該配列の発現を可能にする調節核酸配列に操作可能に連結される。このため、本発明から得られるベクターは、・単量体、二量体および多量体タンパク質などの種々のタイプのタンパク質を発現させるために使用できると考えられる。
【００９５】
本発明で説明したベクターは「異種タンパク質」を発現させるために使用できる。
【００９６】
本明細書で使用しているように、「異種」という用語は、外来種に由来する核酸配列もしくはポリペプチド、または同一の種から由来する場合はその原形が実質的に改変された核酸配列またはポリペプチドを指す。
【００９７】
適切な異種ペプチドは、治療活性または他の商業的関連性のある用途を有する組換え型タンパク質であってもよい。発現されうる異種タンパク質の例として、インターフェロンアルファ、ベータおよび／またはガンマなどのサイトカイン、インターロイキン、第ＶＩＩＩ因子などの造血因子が挙げられる。１つの実施形態では、該異種ペプチドは抗体の重鎖または軽鎖をコードするものであってもよく、ネズミ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体など任意のタイプの抗体の重鎖または軽鎖であることが可能であり、この２つの鎖は同一の抗体または異なる抗体に由来することができる。
【００９８】
別に定義されていない限り、本明細書に使用した技術用語および科学用語はすべて、本発明の技術分野における当業者に広く理解されている意味を有するものである。
【００９９】
本明細書の全体を通して、文脈からそうではないことが求められていない限り、「包含する」もしくは「含む」という用語、または「包含している」、「含んでいる」などの変形は、記載した整数または整数群を含めることを意味すると理解されると思われるが、任意の他の整数または整数群を除外することを意味しているのではない。
【実施例】
【０１００】
実施例１
Ｒ２４ミニボディ−ＲＴ−ＰＣＲデータ
【０１０１】
ＥＩＡＶレンチウイルスベクターとともに使用するＲ２４ミニボディの全配列を図１に示す。該組換え型抗体分子は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインの上流に挿入された、マウスＶＨ、リンカーおよびマウスＶＬから構成される標準的ｓｃＦＶ断片からなる（図２）。該配列を、２種類のプロモータの下流に導入し、１つは大域的プロモータであるヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）即時型初期プロモータであった。もう１つは、トランスジェニック鳥類内で空間時間的に限定された様式でＲ２４ミニボディを活発に発現させるように設計した組織特異的プロモータ候補であった。
【０１０２】
ウイルスゲノムプラスミドｐＲＩ２８（プラスミドマップは図３、全配列は図４に示す）を作製するために、ｈＣＭＶプロモータの下流にＲ２４を挿入した。該ゲノムプラスミドをＤ１７イヌ骨肉種細胞に一過性にトランスフェクションし、その後、細胞培地についてＥＬＩＳＡを行なった結果、６００ｎｇ／ｍｌレベルのヒトＩｇＧ１が分泌されていることが示された。この結果から、ｐＲＩ２８ゲノムの発現能が確認された。標準的なトランスフェクション手法により、パッケージされたｐＲＩ２８の複製不能ＲＮＡゲノムを得た。次に、Ｄ１７細胞をｐＲＩ２８ウイルスで形質導入した。続いて、これらの細胞から収集した培地をＥＬＩＳＡにより分析した結果、ヒトＩｇＧ１の分泌は検出されなかった。パッケージされたウイルスからウイルスＲＮＡも収集し、ｐＲＩ２８ゲノムの構造をＲＴ−ＰＣＲにより解析した。ＲＴ−ＰＣＲにより、パッケージされたｐＲＩ２８ウイルスの試料にはゲノム集団が混在していることが示され、そのすべてがｐＲＩ２８プラスミドの均一な調製物から転写されたものであった。最も著しい違いはゲノムの３’末端に見出され（図５）、そこから、明らかに完全長の産物および不完全長の産物が増幅され得た。明らかに不完全長の多数のＲＴ−ＰＣＲ産物をクローニングして塩基配列決定を行なった結果、欠失事象はＲ２４コード配列の一部または全部を包含していることが確認された。当該欠失事象の一部の位置を図６に示す（以後は独自の「ｌｔ」番号で引用する）。図６に示した欠失事象の性質を考えると、当該ゲノムはＲ２４ミニボディを発現できないと予測されることに注意されたい。
【０１０３】
上記ｌｔ欠失事象を慎重に解析した結果、該欠失は、小さい（５〜１０ｂｐ）直列反復配列により輪郭が描かれていることが明らかになった。この結果は、当該配列要素がＥＩＡＶと適合性がない可能性があることを示している。
【０１０４】
導入遺伝子欠失事象における短い直列反復配列要素の役割を、同類のウイルスゲノムに関する研究によりさらに確認した。同一のＲ２４ミニボディコード配列を組織特異的プロモータ候補の下流に挿入して、プラスミドｐＬＥ３８を作製した（ゲノムマップの概略図を図７に示す）。標準的なトランスフェクション手法により、パッケージされたｐＬＥ３８の複製不能ＲＮＡゲノムを得た。ｐＲＩ２８での記述とまったく同様にＲＴ−ＰＣＲ法を完了したところ、ｐＲＩ２８と同様に、ウイルスゲノムの３’末端から明らかに不完全長のＰＣＲ産物が増幅されており、これらはＲ２４コード配列の一部または全部を包含していた。ＰＣＲ産物のクローニングおよび配列解析により、先にｐＲＩ２８ウイルスでも検出された１つの特定の欠失産物であるｌｔ１が頻繁に存在することが示された（図６の欠失マップを参照）。ｌｔ１欠失産物の全配列を図８に示す。
実施例２−ｐＲＩ２８からのＲ２４ミニボディ配列データの解釈
【０１０５】
Ｒ２４ミニボディでは、問題がある可能性のある短い直列反復配列が２種類存在し、１つはｓｃＦＶ領域自体（ＶＨ、リンカーおよびＶＬ）のなかにあり、もう１つはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン内に存在する。Ｒ２４ミニボディの構造の概略図は図２に示している。
ＶＨドメイン
【０１０６】
ＶＨ内ではＲ２４ミニボディ配列に、問題のある反復配列が４つ確認され、第１は５’末端に位置し（図９のＬＰ、Ｌｅｕ  Ｐｒｏ、欠失ｌｔ１６に関与する）、第２はＣＤＲ２内に位置し（ＫＧ、欠失ｌｔ１５に関与する）、第３はＦＷ３にあり（ＤＴ、欠失ｌｔ１１および１３に関与する）、第４はリンカー配列より前のＶＨの３’末端に位置する（ＬＴ、欠失ｌｔ１に関与する）。
リンカー／ＶＬドメイン
【０１０７】
リンカーおよびＶＬドメインには問題のある反復配列が４つ確認された。第１はリンカー内に位置し（図１０のＧＳ、欠失ｌｔ４および５に関与する）、第２はＦＷ１内に位置し（ＬＳ、欠失ｌｔ６に関与する）、第３はＣＤＲ２にあり（ＴＳ、欠失ｌｔ３に関与する）、第４はＦＷ３配列にある（ＹＳ、欠失ｌｔ２に関与する）。
ＩｇＧ１  Ｆｃ
【０１０８】
上記の項では、Ｒ２４ミニボディから３’ウイルス由来配列までの欠失を取り上げた。下線を引いた配列はこれらの欠失の５’末端を表している。しかし、Ｒ２４ミニボディと当該遺伝子の５’末端までの配列との間の組換え事象により生じた可能性のある欠失も検出された。これらの事例では、３’決定因子がＲ２４ミニボディのＩｇＧ１  Ｆｃドメイン内に位置していた。現在、該配列内で、これらの欠失に関連または隣接したプロリンリッチ領域が２箇所特定されている。
【０１０９】
Ｒ２４ミニボディにおいて欠失（個別のｌｔ番号で引用する）と関連する問題のある可能性のある８つの配列を図１１に要約する。先に記述したステップ（ｉｉｉ）の解析により導入遺伝子候補から除去されるのは、該欠失の輪郭を描く短い直列反復配列である。ベクターＮｔｉソフトウェア（Ｉｎｆｏｒｍａｘ  Ｉｎｃ．，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または同等物を用いて、ＤＮＡ配列をスクリーニングして該配列の存在を確認できる。導入遺伝子が組換え型抗体でない場合は、上記残基のすべてが保存される可能性は低い。トランスジェニック鳥類発現系は組換え型抗体を発現できると考えられ、この場合は上記残基が保存され、特に一部は、相補性決定領域（ＣＤＲ）での残基よりも高い保存性を示すことが知られている可変ドメイン下位領域であるフレームワーク領域（ＦＲ）内で保存が起こる。
【０１１０】
これは、市販されている多数の組換え型抗体にとって最適なエフェクタードメインであるために多数の導入遺伝子候補で確実に保存されなければならないＩｇＧ１  Ｆｃにも関連していることである。Ｒ２４ミニボディを用いた研究から、いくつかの欠失決定因子が該ドメイン内に位置している可能性があることが示されており、たとえば、ＤＮＡのポリピリミジントラクトによりコードされる２つのプロリンリッチタンパク質領域は、上記欠失に一貫して関連または隣接している。したがって、該ポリピリミジントラクトを除去することが推奨される。ニワトリはほぼ等しい頻度で４つのコドンを使用してＰｒｏ／Ｐをコードすることから、得られるタンパク質の複数のプロリン残基をコードしたままの状態でＤＮＡ配列のポリピリミジントラクトを除去するために、コドン使用頻度を変えることが可能である。
実施例３−「修復した」Ｒ２４ミニボディ
【０１１１】
短い直列反復配列とこれに関連する欠失との関連性を検討して確立するために、Ｒ２４ミニボディ配列からｌｔ１配列（５’ＣＴＧ  ＡＴＣ  ３’）を除去し、同時に非反復配列を有するリンカーで置き換えることにした。次に、パッケージされたＲＮＡゲノムのかなりの割合にｌｔ１欠失事象が存在することが示されていたｐＬＥ３８として設計されたベクターを用いて、この修復の効果をテストした。
【０１１２】
制限酵素ＢｓｐＥＩによるｐＬＥ３８の消化により、５’ｌｔ１反復配列および古いリンカーの除去が可能になり、新しいリンカーをコードし、かつｌｔ１配列が除去された新しいＤＮＡ断片で置換することができる（図１２を参照）。「修復したＲ２４」を作製するためにｐＬＥ３８に挿入した置換ＤＮＡ断片の全配列を図１３に示す。完成したプラスミドをｐＬＥ５６と呼んだ。
【０１１３】
次に、修復および未修復の２つのプラスミドのセットを並行してパッケージし、ＲＮＡゲノムの構造のほか、形質導入された細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれた導入遺伝子の構造をＰＣＲにより解析した。
実験データ−ｐＬＥ３８およびｐＬＥ５６
【０１１４】
修復したＲ２４ミニボディからのウイルスＲＮＡのリアルタイムｑＰＣＲ法により、明らかに許容レベルの該ゲノムが良好にパッケージされ、ｌｔ１修復が力価に悪影響を与えていないことが立証された。ＥＬＩＳＡ法ではＲ２４ミニボディの発現を検出できなかったが、該ベクターに含まれるプロモータからの発現は原理的には組織特異的でなければならず、該プロモータがインビトロで活性であることを期待しなかったため、これは陽性の結果である。これらのウイルスで形質導入された細胞からのゲノムＤＮＡについて実施したリアルタイムｑＰＣＲにより、ＥＩＡＶパッケージングシグナルにまたがる産物がうまく増幅され、これにより細胞の形質導入状態が確認され、組み込みの不足ではなく、漏出性卵アルブミンプロモータ活性の不足がＥＬＩＳＡの陰性結果の原因であることを示す証拠が提供された。
【０１１５】
さらに、両ウイルスにおけるゲノムの３’末端にまたがるＰＣＲ反応を行なった結果、ｐＬＥ５６で形質導入した細胞に限ってゲノムＤＮＡから完全長の産物がうまく増幅された。これは、パッケージされたｐＬＥ３８（未修復）のＲＮＡゲノムからｌｔ１欠失産物が優勢に増幅された結果とは正反対である。しかし、ｐＬＥ３８テストシステムでは、推定されるより小さい欠失産物の存在を廃するにはｌｔ１の修復のみでは不十分であった。この結果の説明として最も可能性が高いのは、問題の可能性のある他の短い直列反復配列要素の存在であり、５’ｌｔ１反復配列のみを除去したため、「修復した」Ｒ２４内にはほかにも保持されている可能性がある。この可能性は、第１に、図１１に列記したＥＩＡＶに非適合性の可能性のある配列を他の導入遺伝子に適用できるかどうか評価することと、第２に、ＥＩＡＶに非適合性の可能性のある配列をすべて除去した導入遺伝子で内部欠失の頻度を評価することによってのみ検討することができる。
細菌における不安定性
【０１１６】
事例証拠から、Ｒ２４ミニボディで使用した先のリンカー配列は細菌において不安定であったことが示された。個々の反復配列要素の欠失が検出された。ｐＬＥ５６などの多数の発現用ベクターにうまくクローンニングされた新規のリンカーでは、このような問題に遭遇していない。
実施例４−抗ＣＤ５５ミニボディ（７９１Ｔ／３６）
【０１１７】
Ｒ２４ミニボディを用いた研究の成果として、ＥＩＡＶに非適合の可能性がある多数の配列が特定された。Ｒ２４をベースとしない導入遺伝子に当該配列が存在するかどうか判断することに関心を向けた。このため、Ｒ２４で特定したＥＩＡＶに非適合の可能性がある配列をＥＩＡＶレンチウイルスベクターバックボーンに組み込んだときに該配列に欠失が起こると予測されるとして、該配列を別の導入遺伝子に適用できるかどうか判断するために、抗ＣＤ５５ミニボディＤＮＡ配列を評価した。該ミニボディとＲ２４ミニボディとの間で直接配列比較を行なった。該ミニボディに、問題のある領域が８箇所特定され、これらの領域を図１４に要約する。
【０１１８】
図１４の表の行１は、Ｒ２４ミニボディとＣＤ５５ミニボディではｌｔ１６欠失事象に関与する残基が完全に一致していることを示している。これは、当該残基が、両コンストラクトが共有する基本的なリゾチームのシグナルペプチドによりコードされているからである。別の導入遺伝子、すなわちサイトカインをベースとした産物を合成する前に、該シグナルペプチドのコドン使用頻度を改変した。これまでに解析したインターフェロンベータ遺伝子に基づいた別の遺伝子コンストラクトでは、改変した該シグナルペプチドには依然としてｌｔ１６反復配列が存在しているが、対応するｌｔ１６欠失が確認されていない。したがって、少なくともミニボディを含有しないベクターでは、欠失を引き起こすのにｌｔ１６反復配列の存在だけでは不十分であるようであり、たとえばリンカードメインなど、別の因子が関与していなければならないと思われる。しかし、シグナルペプチドのコドン使用頻度をさらに改変して、この要素を取り除くことが賢明である。
【０１１９】
図１４の表の行２は、Ｒ２４ミニボディとＣＤ５５ミニボディの間で２つのアミノ酸のうち１つだけがマッチしていることを示している（ＫＧ対ＫＤ）。ニワトリはＬｙｓ／Ｋに対し、ほぼ等しい頻度で２つのコドンを使用するため、アミノ酸特異性を保ったままコドンを変えて、抗ＣＤ５５からｌｔ１５反復配列要素を除去できると考えられる。
【０１２０】
図１４の表の行３は、Ｒ２４ミニボディとＣＤ５５ミニボディとの間で２つのアミノ酸のうち１つだけがマッチしていることを示している（ＤＴ対ＤＳ）。上記のＬｙｓ／Ｋと同じく、ニワトリはＡｓｐ／Ｄに対し、ほぼ等しい頻度で２つのコドンを使用するため、この場合もアミノ酸特異性を保ったままコドンを変えて、抗ＣＤ５５ミニボディからｌｔ１１／１３反復要素を除去できると考えられる。
【０１２１】
この表の行４は、Ｒ２４ミニボディで最も問題が大きいｌｔ１反復をコードするＬＩ配列に言及している。この欠失は現在、Ｒ２４ミニボディをベースとしたｐＲＩ２８およびｐＬＥ３８の２つのレンチベクターで確認されている。幸い、現時点では、抗ＣＤ５５ミニボディと配列相同性はない。
【０１２２】
この表の行５は、Ｒ２４ミニボディと抗ＣＤ５５ミニボディではｌｔ４および５欠失事象に関与する残基が完全にマッチしていることを示している。これは、ミニボディのｓｃＦＶ構成要素の構築時にＶＨドメインとＶＬドメインを結合するために使用したリンカーがこれらの残基をコードしているためである。いくつかの行の証拠は、該リンカーは発現試験に使用するには最適でない可能性があることを示しており、また、事例証拠から、大腸菌における反復配列の不安定性や、該リンカーに３つの直列反復配列を与える二次構造の可能性が示されており、Ｇｅｎｅａｒｔ社や文献に反復配列とＲＮＡポリメラーゼとの相互作用に関する議論もある。Ｒ２４ミニボディのリンカーは、図１５に示すように、新しいリンカーに取り替えることができる。これは、（ＧＧＧＳ）４アミノ酸パターンを保持しているが、コドン使用頻度を変えて相同性を最小限に抑えている。
【０１２３】
下線を引いた文字は、元のリンカーで問題のある配列を強調しており、ＧＧＣ  ＴＣＣは実際に３回反復されている。新しいリンカーでは、直列反復配列が撤廃されており、ＧＧＣ  ＴＣＣ配列はまったく存在せず、その交換後のＧＧＡ  ＴＣＴは１回だけ存在する。この新しいリンカーは、ＥＩＡＶレンチベクター系で使用するための抗ＣＤ５５もしくは他の任意のｓｃＦＶまたはミニボディの遺伝子合成時に使用することを推奨する。
【０１２４】
図１４の行６は、ｌｔ６反復についてＲ２４ミニボディと抗ＣＤ５５ミニボディとの間で２つのうち１つがマッチしていることを示している（ＬＳ対ＬＬ）。ニワトリはＬｅｕに対しＣＴＧコドンを好むため、該配列を変えないことが最良であると考えられる。行７も、ｌｔ３反復についてＲ２４と抗ＣＤ５５との間で２つのうち１つがマッチしていることを示している（ＴＳ対ＡＳ）。ニワトリはＳｅｒ／Ｓに対し６つの異なるコドンを使用するため、ｌｔ３反復配列要素を効果的に取り除くために使用できる選択肢はいくつか存在する。最後に行８は、Ｒ２４ミニボディのｌｔ３欠失に関与する残基ＹＳは抗ＣＤ５５ミニボディでは保存されないため、この位置では配列の改変が必要ないことを示している（ＹＳ対ＦＴ）。
ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン
【０１２５】
Ｆｃドメイン内の２つの多プロリン領域を除去することも推奨される。ニワトリは４つのコドンをほぼ等しい頻度で使用してＰｒｏ／Ｐをコードすることから、コドン使用頻度を変えることにより、得られるタンパク質のプロリン残基をコードしたままＤＮＡ配列のポリピリミジン領域を除去することが可能である。
【０１２６】
我々の現在の知見状況を考慮に入れ、上記の推奨事項をすべて使用して、ＥＩＡＶレンチベクターに使用する最適な抗ＣＤ５５ミニボディ配列を作製した。最適化した当該配列を図１６および１７に示す。
【０１２７】
ＤＮＡ配列は著しく変わったが、一次アミノ酸配列は単離した元の配列から変化していないことに注目されたい。新しい５’および３’延長配列を追加して、鳥類のトランスジェニック試験系における遺伝子発現を促進し、新しいリンカーを導入して、対応するＲ２４ミニボディ分子に存在する直列反復配列を撤廃した。Ｒ２４ミニボディと抗ＣＤ５５ミニボディとの間で保存される位置のほか、コード配列内の他のすべての場所についても、問題の可能性があることが確認された反復配列モチーフをすべて除去した。
【０１２８】
結論を述べると、抗ＣＤ５５ミニボディコード配列の上記解析により、Ｒ２４をベースとしない導入遺伝子に対する当該導入遺伝子最適化方法の妥当性が実際に立証された。
実施例５−抗ＣＤ５５抗体（７９１Ｔ／３６）
【０１２９】
本文書の実施例４で提示したデータは、ＥＩＡＶと適合性がない可能性のある短い直列反復配列を除去するという方針が、Ｒ２４をベースとしない分子、この場合は抗ＣＤ５５ミニボディに適用できることを示した。この研究の次の段階は、配列最適化のプロセスを本明細書に記載したように正確に適用した後、ＥＩＡＶレンチウイルスベクターに存在する導入遺伝子配列内の内部欠失の頻度を評価することであった。
【０１３０】
しかし、実施例４に記載した抗ＣＤ５５ミニボディをコードする導入遺伝子を作製するのではなく、導入遺伝子最適化の同じ方針を二重鎖マウス／ヒトキメラ抗ＣＤ５５抗体に適用することとした。図１８は、上記両分子の構造を略図で示したものである。
【０１３１】
当該キメラ抗体は、ヒトＩｇＧ１重鎖およびヒトカッパ型軽鎖の上流にそれぞれ挿入したマウス重鎖および軽鎖両方に由来する可変領域からなる。両分子の一次配列は、本明細書に記載した導入遺伝子最適化の段階的プロセスを行う前に、コンピュータ内で組み立てた。図１９および２０は、キメラ重鎖および軽鎖それぞれの一次アミノ酸配列を示している。両一次アミノ酸配列は、両タンパク質の分泌を可能にするため、内在ニワトリリゾチーム遺伝子からのシグナルペプチドを追加する５’延長配列を含んでいることに注意されたい。
【０１３２】
本発明の第一の態様において定義したステップに従って最適化のプロセスを実施した。すなわち、望ましい一次アミノ酸配列をＧｅｎｅａｒｔ社（ドイツ）に提供し、ニワトリのコドン使用頻度の好みに基づいてＤＮＡコドンが割り当てられ、このプロセスは「チキナイゼーション（ニワトリ化）」と呼ばれる。次に、最適化プロセスのステップ（ｉｉ）を完了し、これによりニワトリ化した基本配列を解析して、負の要素すなわち反復配列のほか、スプライス部位、内部ＴＡＴＡボックスまたはリボゾーム進入部位などのシス作用性モチーフなど、遺伝子発現にマイナスの影響を及ぼすと予測される要素を検出した。配列を改変することにより、当該要素をすべて除去した。続いて、ニワトリ化した当該第二世代配列を解析し、図１１に示したように問題がある可能性のある配列をすべて取り除いた（最適化プロセスのステップ（ｉｉｉ））。当該第三世代配列をＧｅｎｅａｒｔ社に再び送り、上記改変が、負の要素すなわち反復配列のほか、スプライス部位、内部ＴＡＴＡボックスまたはリボゾーム進入部位などのシス作用性モチーフなど、遺伝子発現にマイナスの影響を及ぼすと予測される要素を再導入していないことを確認した。このプロセスを、問題がある可能性があることが確認された反復配列を除去するために設計したすべての改変箇所について繰り返し行ない、コドン使用頻度が依然として最適であり、かつ、負の要素が再導入されていないことを確実にした。遺伝子合成により、キメラ抗ＣＤ５５重鎖および軽鎖の最終版を作製した。
【０１３３】
両抗ＣＤ５５コード配列は、個々のｐＣＲＳｃｒｉｐｔベクターバックボーンに組み込んで供給され、重鎖（図２１、ｐＬＥ１２１）は制限酵素ＰｍｌＩにより、軽鎖（図２２、ｐＬＥ１２０）はＳｍａＩにより切り出すことができた。続いて、組織特異的プロモータ候補の下流に導入遺伝子を導入したベクターゲノムを構築することにより、最適化した導入遺伝子の発現を支援するＥＩＡＶレンチウイルスベクター系の能力を分析した。
抗ＣＤ５５抗体と組織特異的プロモータ候補に基づいた発現コンストラクト
【０１３４】
重鎖および軽鎖配列を別々に組織特異的プロモータ候補の下流に挿入して、それぞれプラスミドｐＬＥ１１８およびｐＬＥ１１９を作製した。ｐＬＥ１１８およびｐＬＥ１１９両方のゲノム構成は、Ｒ２４が、関連する重鎖または軽鎖配列に置換されていることを除けば、図７のｐＬＥ３８について示した概略図と同一である。
【０１３５】
標準的なトランスフェクション手法を用いて、ウイルスゲノムのパッケージングを完了した。ゲノムＲＮＡを収集してＲＴ−ＰＣＲにより解析し、さらに、該ウイルス粒子を用いて宿主細胞を形質導入し、続いて該細胞からゲノムＤＮＡを収集した。次に、ゲノム構造のＰＣＲ解析を完了した。
【０１３６】
パッケージされたウイルスゲノムから増幅した産物のＲＴ−ＰＣＲと、これに続くクローニングおよびＤＮＡ塩基配列決定により、パッケージされたｐＬＥ１１８およびｐＬＥ１１９のゲノム内に無傷の抗ＣＤ５５のそれぞれ重鎖および軽鎖が存在することが示唆された。興味深いことに、ｐＬＥ１１９ゲノムから１つの欠失産物が特定され、この欠失をｌｔ２３０とした。ｌｔ２３０欠失の範囲を表示したｐＬＥ１１９の３’末端の全配列を図２３に示す。当該欠失の５’および３’範囲の輪郭を描いている短い直列反復配列の存在に注目されたい。このデータは、本文書に概略を記載した推定上の相同的組換えに基づく機構により、Ｒ２４をベースとしないＥＩＡＶレンチウイルスベクター導入遺伝子内に内部欠失が発生することを示した最初の証拠である。このため、ｌｔ２３０を挟んでいる反復配列を、導入遺伝子最適化プロセスのステップ（ｉｉｉ）において除去すべき配列のリストに追加した。すべての当該配列を図２４に列記する。
【０１３７】
ｐＬＥ１１８およびｐＬＥ１１９を形質導入した細胞のゲノムＤＮＡを解析した結果、主に完全長の増幅産物が得られた。たとえば、組織特異的プロモータ候補内から３’ＬＴＲまでまたがり、かつ導入遺伝子コード配列を包含するＰＣＲ反応により、ｐＬＥ１１８ウイルスで形質導入した細胞のゲノムＤＮＡから、無傷の重鎖配列の存在を示唆する２１２４ｂｐの産物が生じた（図２５、列５）。同一のＰＣＲ反応により、ｐＬＥ１１９ウイルスで形質導入した細胞のゲノムＤＮＡから、無傷の軽鎖配列の存在を示唆する１３９８ｂｐの産物が生じた（図２５、列１３）。両導入遺伝子コード配列は同一のリゾチーム由来リーダーペプチドを共有しており、このため、ＰＣＲプライマーを共用できることに注意されたい。ｐＬＥ１１９で形質導入した細胞のゲノムＤＮＡからはｌｔ２３０欠失産物が増幅されなかったことから、該産物は大多数の分子種ではないことが示唆される。
【０１３８】
この研究から結論がいくつか導き出される。第１は、Ｒ２４で得られた結果とは対照的に、上記ベクターからは無傷の最適化した抗体コード配列がＰＣＲでうまく増幅されたことである。第２は、ＣＤ５５配列に新規のｌｔ欠失が発見されたことである。本出願は、Ｒ２４ミニボディを用いた研究の成果として確認された問題の可能性のある配列をすべて除去する手順を詳しく述べている。抗ＣＤ５５試験系ではＲ２４でみられた欠失産物がまったく検出できなかったことは、当該配列が欠失機構に直接関与しているという結論を裏付けている。たとえば、抗ＣＤ５５軽鎖の早期の反復では、ｌｔ１６反復配列（ＣＴｇ  ＣＣＣ  Ｃ）が存在した。これは、問題の可能性のあるこれらの反復配列を除去するためのスクリーニング時に確認されたものであり、後期の反復ではＣＴｇ  ＣＣＴ  Ｃに変化していたが、コードされるアミノ酸は未変化のまま維持される。最終的に最適化した抗ＣＤ５５軽鎖配列にはｌｔ１６欠失事象の証拠が決定的にまったく検出されず、先に述べたＲ２４の結果とは対照的であった。
【０１３９】
しかし、抗ＣＤ５５抗体の配列に新規のｌｔ欠失が検出されれば、問題のある可能性がある別の配列が提供され、該配列は、本明細書で開示した方法により最適化されるさらなる導入遺伝子では除去されることになる。
実施例６−他の種への移行可能性
【０１４０】
本明細書に記載した導入遺伝子最適化プロセスは、たとえばウズラ  Ｃｏｔｕｒｎｉｘ  ｃｏｔｕｒｎｉｘなどの他の種で発現するように設計した異種コード配列に適用できる。図２６に示すように、ウズラのコドン使用頻度はニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）のコドン使用頻度とほぼ同一である。このため、最適化のプロセスは、本発明の第一の態様で定義したステップに従って実施できると考えられる。すなわち、望ましい一次アミノ酸配列をＧｅｎｅａｒｔ社（ドイツ）に提供し、ウズラまたはニワトリのコドン使用頻度に基づいてＤＮＡコドンが割り当てられるが、これはウズラおよびニワトリならびに他の鳥類の間でコドンバイアスに非常に高度の保存性が認められることによるものである。続いて最適化プロセスを完了し、これにより、基本の配列を解析してまず、遺伝子発現にマイナスの影響を及ぼすと予測される配列要素を検出し、次に、図２４に示したように問題の可能性のある配列をすべて除去する。
【０１４１】
本明細書に引用した文書はすべて、参照により本明細書に組み込まれている。本発明の範囲から逸脱することなく、記載した本発明の実施形態に対し種々の変更および変化があることは、当業者には明白である。特定の好ましい実施形態と関連させながら本発明を説明してきたが、特許請求の範囲に示したとおり本発明は、当該実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際に、本発明を実施する上記の態様に種々の変更があることは当業者には明らかであり、種々の変更は本発明によりカバーされるように意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】ｐＲｌ２８及びｐＬＥ３８の構築に使用したＲ２４ミニボディの全ＤＮＡ配列を示す。開始コドン及び二重停止コドンは大文字で表す。
【図２】Ｒ２４ミニボディの模式的構造を示す。
【図３】レンチウイルスベクターゲノムｐＲｌ２８のプラスミドマップ。
【図４】レンチウイルスベクターゲノムｐＲｌ２８の完全ＤＮＡ配列を示す。
【図５】ｐＲｌ２８ウイルスのＲＮＡゲノムの予測構造を示す。
【図６】レンチウイルスベクターｐＲｌ２８内のＲ２４コード配列内で特定された、欠失の相対位置付きの図を示す（個別の「ｌｔ」番号で示す）。
【図７】ｐＬＥ３８のＲＮＡゲノムの予測構造の代表図を示す。
【図８】完全Ｒ２４コード配列を包含するｐＬＥ３８ゲノムの３’末端の完全配列を示す（開始コドン及び二重停止コドンを太い大文字で示す）。５’ＬＴＲ配列も太字で示す。ｌｔ１繰返しのコピーはいずれもイタリック体で示し、ｌｔ１欠失後に欠損した配列には下線を付す。ｌｔ１繰返しの５’コピーが欠失後に保持されているため、下線を付していないことに留意されたい。
【図９】Ｒ２４ミニボディＶＨドメインアミノ酸配列を示す。Ｒ２４ミニボディのアミノ酸配列は１文字コードで示す。イタリック体は、ＦＲ及びＣＤＲに位置する、この領域の５’及び３’末端の残基を示す。太字は、３フレームワーク領域を含む残基を示す（図の右側欄のキー）。標準文字はＣＤＲを含む残基を示す。下線文字は、問題のＤＮＡ繰返しによってコードされるアミノ酸残基を示す。
【図１０】Ｒ２４ミニボディＶＬドメインアミノ酸配列を示す。Ｒ２４ミニボディのアミノ酸配列は１文字コードで示す。イタリック体は、ＦＲ及びＣＤＲに位置する、この領域の５’及び３’末端の残基を示す。リンカードメインの残基は、５’末端においてイタリック体にされている。太字は、３フレームワーク領域を含む残基を示す（図の右側欄のキー）。標準文字はＣＤＲを含む残基を示す。下線文字は、問題のＤＮＡ繰返しによってコードされるアミノ酸残基を示す。
【図１１】Ｒ２４ミニボディにおける潜在的に問題の８配列、及び関連する欠失（個々のｌｔ番号で示す）を示す。
【図１２】ｐＬＥ３８における３’末端の図を示す。＊は、Ｒ２４コード配列内の欠失のいくつかに関連し「ｌｔ１」で示される短い２つの繰返し配列の位置を示す。「ｌｔ１」配列が除去された置換配列である、５’ｌｔ１繰返しに隣接する２つのＢｓｐＥＩ部位の位置は太い黒線で示す。
【図１３】ｌｔ１修復手順の間にｐＬＥ３８に挿入されたＢｓｐＥＩフラグメントの全配列を示し、制限酵素部位は太字で示す。
【図１４】Ｒ２４ミニボディ内の８つの問題配列と、抗ＣＤ５５ミニボディ内の対応する残基との比較を示す表。
【図１５】標準Ｒ２４内に存在する天然で改変されたリンカーと、修復されたリンカーとによってコードされるＤＮＡ及びアミノ酸の配列を示す。
【図１６】最適化抗ＣＤ５５ミニボディの一次アミノ酸配列を示す。
【図１７】最適化抗ＣＤ５５ミニボディのＤＮＡ配列を示す。
【図１８】抗体及びミニボディの相対的構造を比較する図を示す。
【図１９】抗ＣＤ５５抗体の重鎖の一次アミノ酸配列を示す。
【図２０】抗ＣＤ５５抗体の軽鎖の一次アミノ酸配列を示す。
【図２１】ｐＬＥ１２１のプラスミドマップを示す。抗ＣＤ５５抗体重鎖はｐＣＲｓｃｒｉｐｔベクター内でＧｅｎｅａｒｔによって販売される。
【図２２】ｐＬＥ１２０のプラスミドマップを示す。抗ＣＤ５５抗体重鎖はｐＣＲｓｃｒｉｐｔベクター内でＧｅｎｅａｒｔによって販売される。
【図２３】全抗ＣＤ５５コード配列を包含するｐＬＥ１１９の３’末端の完全配列を示す（開始コドン及び二重停止コドンを太字及び大文字で示す）。５’ＬＴＲも太字で示す。ｌｔ２３０繰返しのコピーはいずれもイタリック体で示し、ｌｔ１欠失後に欠損した配列には下線を付す。ｌｔ２３０繰返しの５’コピーが欠失後に保持されているため、下線を付していないことに留意されたい。
【図２４】図１１に示される表の改訂版であり、Ｒ２４及び抗ＣＤ５５を用いて決定された問題の繰返し配列を列挙する。
【図２５】ｐＬＥ１１８及びｐＬＥ１１９がそれぞれ形質転換された細胞のゲノムＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物の、エチジウムブロミド染色１％アガロースゲルを示す。ＰＣＲプライマーは、全重鎖及び軽鎖をコードする配列を包含する組織プロモータ候補から３’ＬＴＲまで、各ゲノムの３’末端を増幅する。ｐＬＥ１１８及びｐＬＥ１１９形質転換細胞から増幅された２１２４ｂｐ及び１３９８ｂｐの産物は、無傷の抗ＣＤ５５コード配列の存在を示す。小さい増幅産物が存在しないことに留意されたい。
【図２６】ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）及びウズラ（Ｃｏｔｕｒｎｉｘ  ｃｏｔｕｒｎｉｘ）におけるコドン使用頻度をようやくする２つの表を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図４】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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