(57)【要約】  本発明は、（ｉ）配列番号１の配列を含むこと又は該配列により構成されること、（ｉｉ）例えば、１つ以上のアミノ酸の置換、削除又は付加により、配列番号１の配列から誘導されるいかなる配列も含むこと又は該いかなる配列によっても構成されること、但し、該誘導体配列はホスフェートに結合するものとすること、（ｉｉｉ）好ましくは配列番号１の配列と少なくとも約８０％の相同性を有する、配列番号１の配列に相同性のいかなる配列も含むこと又は該いかなる配列によっても構成されること、但し、該相同性配列はホスフェートに結合するものとすること、あるいは、（ｉｖ）上記した配列の１つのいかなる断片も含むこと又は該いかなる断片によっても構成されること、但し、該断片はホスフェートに結合するものとし、このようないかなる断片も配列番号１の配列中の少なくとも約２０の連続したアミノ酸を含むことを特徴とする、タンパク質に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の配列を含むこと又は該配列により構成されること、
あるいは、特に１つ以上のアミノ酸の置換、削除又は付加により、配列番号１の配列から誘導されたいかなる配列も含むこと又は該いかなる配列によっても構成されること、但し、該誘導された配列はホスフェートに結合するものとすること、
あるいは、好ましくは配列番号１の配列と少なくとも約８０％の相同性を有する、配列番号１の配列に相同性のいかなる配列も含むこと又は該いかなる配列によっても構成されること、但し、該相同性配列はホスフェートに結合するものとすること、
あるいは、上記した配列の１つのいかなる断片も含むこと又は該いかなる断片によっても構成されること、但し、該断片はホスフェートに結合するものとし、特にいかなる断片も配列番号１の配列中の少なくとも約２０の連続したアミノ酸により構成されること、
を特徴とするタンパク質。
【請求項２】
配列番号２の配列若しくは配列番号３の配列を含むこと又は該配列により構成されること、
あるいは、特に１つ以上のアミノ酸の置換、削除又は付加により、配列番号２の配列若しくは配列番号３の配列から誘導されたいかなる配列も含むこと又は該いかなる配列によっても構成されること、但し、該誘導された配列はホスフェートに結合するものとすること、
あるいは、好ましくは配列番号２若しくは配列番号３の配列と少なくとも約８０％の相同性を有する、配列番号２若しくは配列番号３の配列に相同性のいかなる配列も含むこと又は該いかなる配列によっても構成されること、但し、該相同性配列はホスフェートに結合するものとすること、
あるいは、上記した配列の１つのいかなる断片も含むこと又は該いかなる断片によっても構成されること、但し、該断片はホスフェートに結合するものとし、特にいかなる断片も配列番号２若しくは配列番号３の配列中の少なくとも約２０の連続したアミノ酸により構成されること、
を特徴とする、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【請求項４】
請求項３に記載のヌクレオチド配列を含有する組換えベクター、特にプラスミド、コスミド、ファージ又はウイルスＤＮＡ。
【請求項５】
前記ベクターに挿入された請求項３に記載のヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチドの宿主細胞中での発現に必要なエレメントを含有する、請求項４に記載の組換えベクター。
【請求項６】
請求項４又は５の１項に記載の組換えベクターを使用して形質転換された、特にバクテリア、酵母、真菌細胞、植物又は哺乳動物細胞から選ばれる宿主細胞。
【請求項７】
活性成分として請求項１又は２に記載のタンパク質を、薬学的に許容されうる賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物。
【請求項８】
配列番号２又は配列番号３の配列により表されるタンパク質を活性成分として含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
請求項１又は２に記載のタンパク質、特に配列番号２又は配列番号３のタンパク質が、パラオキソナーゼタンパク質の変異体、特に、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１と組み合わされている、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
高リン酸血症に関連した関節炎又は疾患、例えば心臓血管疾患の予防又は処置を目的とする医薬を製造するための、請求項１又は２に記載のタンパク質、特に配列番号２又は配列番号３により表されるタンパク質の使用、あるいは、殺虫剤又は神経作用剤、例えば、ソマン、ＶＸ、サリン又はタブンにより引き起こされる中毒の予防若しくは処置の枠内又はアテローム性動脈硬化症の処置の枠内での、パラオキソナーゼタンパク質の変異体、特に、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１と組み合わせた、請求項１又は２に記載のタンパク質、特に配列番号２又は配列番号３の配列により表されるタンパク質の使用。
【請求項１１】
殺虫剤又は神経作用剤、ソマン、ＶＸ、サリン又はタブンにより引き起こされる中毒の予防又は処置を目的とする、同時使用又は別々の使用、又はある時間にわたり引き延ばされた使用のための、請求項１又は２に記載の少なくとも１つのタンパク質、特に配列番号２又は配列番号３のタンパク質と、少なくとも１つのパラオキソナーゼタンパク質の変異体、特に、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１を含む組み合わせ産物。
【請求項１２】
下記の工程：
請求項１又は２に記載のタンパク質、特に配列番号２又は配列番号３のタンパク質の種々のエピトープに対して指向されたウサギモノクローナル抗体をプレート上に固定し、そして該タンパク質を含有する分析されるべきヒト血清を上記したプレートに適用し、
プレートをすすぎそして洗浄し、
ペルオキシダーゼで標識されたウサギ抗体に対して指向された抗体を３０分間にわたってプレートに適用して、ウサギモノクローナル抗体、前記タンパク質及びウサギ抗体に対して指向された上記した抗体で三成分系複合体を形成し、
プレートをすすぎそして洗浄し、
ブレートに固定されたペルオキシダーゼをその基質と反応させ、そして反応を３０分の終わりに３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンで停止させ、
先の工程で形成された生成物の光学密度を分光光度計を使用して４５０nmで測定し、そしてこの測定値の標準曲線との比較は、血清中に存在する請求項１又は２に記載のタンパク質、特に配列番号２又は配列番号３のタンパク質の濃度を決定することを可能とする、
工程を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載のタンパク質、特に配列番号２又は配列番号３のタンパク質のアッセイ方法。
【請求項１３】
特に、請求項１２の方法に従ってアッセイされた請求項１又は２に記載のタンパク質、特に配列番号２又は配列番号３のタンパク質の量が、健康な個体の血液中に正常に存在するこのタンパク質の量より少ない場合の、高リン酸血症に関連した疾患のインビトロ診断、あるいは、
特に、請求項１２に記載の方法に従ってアッセイされた請求項１又は２に記載のタンパク質、特に配列番号２又は配列番号３のタンパク質の量が、健康な個体の血液中に正常に存在するこのタンパク質の量より多い場合の、低リン酸血症に関連した疾患のインビトロ診断、あるいは、
このような病理に対する個体の素因のインビトロ診断、
への請求項１２に記載のアッセイ方法の適用。
【請求項１４】
高リン酸血症に関連した疾患、例えば心臓血管疾患、特にアテロームプラークの形成に関連した心臓血管疾患のインビトロ診断、あるいは、上記した疾患の１つを進展される個体の素因のインビトロ診断への、請求項１３に記載の適用。
【請求項１５】
低リン酸血症に関連した疾患のインビトロ診断又は上記した疾患の１つを進展させる個体の素因のインビトロ診断への、請求項１４に記載の適用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、ヒト血清から得られた新規なホスフェート結合タンパク質（phosphate -binding proteins）、それを含有する医薬組成物及び、特に高リン酸血症（hyperphosphataemia）及び心臓血管疾患又は関節炎の処置の枠内のその使用である。
【０００２】
ホスフェートは、多数の生物学的機構に関与した非常に重要な分子である。ホスフェートは、特にリン脂質において、エネルギー生産機構（ＡＴＰ、ＡＤＰ）において、細胞シグナリングプロセス（cell signaling processes）において及び骨における遺伝子物質の組成において（リン酸カルシウムの形態において）見いだされる。
【０００３】
高リン酸血症は、生体における過剰のホスフェートに関連した病理でありそして、特に、動脈のアテローム性動脈硬化症及び石灰化のプロセスを促進することにより、心臓血管疾患の危険を増加させる（Dorozhkin and Epple, 2002; Amann et al., 2003; Blazheevich et al.,1975）。関節で石灰化が起こるにつれて、高リン酸血症は、関節炎（偽性痛風（pseudogout））も引き起こすことがある。
【０００４】
高リン酸血症の期間中血清において産生されたリン酸カルシウム塩は、種々の組織において異所性石灰化（ectopic calcification）を伴って軟質組織に沈着する：脈管（脳血管発作又は心臓血管発作）、関節（偽性痛風）、水晶体、腎臓間質（腎石灰症）、皮下（掻痒症）、肺及び膵臓。
【０００５】
かくして、腎不全に罹っている個体の死の半分は、高リン酸血症に関連した心臓血管疾患によるものである。これに関して、腸内腔においてホスフェートを錯化するある種のホスフェートキレート化剤は、現在医薬として使用されている。しかしながら、これらのキレート化剤がすべて生理学的であるとはかぎらない。これは、ある種の合併症又はそれらの使用に関する制限をもたらす。
【０００６】
マグネシウムを含有する製剤は、消化疾患（下痢）の出現により制限され、そして高マグネシウム血症の危険の故に禁止されるべきである。同様に、その有効性の故に長く使用される水酸化アルミニウムの処方箋は回避されなければならず、又はアルミニウム中毒（小赤血球低色素性貧血（microcytic hypochromic anemia）、骨軟化症、筋障害、痴呆）の危険の故に、少なくとも極めて短い期間に限定されなければならない。
【０００７】
カルシウム塩の処方箋は、低カルシウム血症及び高リン血症を治すための最善の手段であり、一方ではカルシトリオールの欠損にもかかわらず小腸により吸収されるカルシウムの量を増加させ、他方糞便中に排出されるリン酸カルシウムの形態において腸内腔のリンを錯化することを可能とする。しかしながら、カルシウムを含有するキレート化剤の主要な欠点は高カルシウム血症を誘発するという欠点であり、高カルシウム血症は、ある場合には、患者の２０％において認められた。この危険は、高リン血症を制限することができる他の製品の開発をもたらした。
【０００８】
現在最もよく使用される医薬はＲｅｎａｇｅｌ（登録商標）（Ramsdell; 1999）である。これは、ホスフェートをキレート化することができる非吸収性カチオンポリマーである。
【０００９】
本発明の目的は、錯化をもたらすことができる他のイオンの使用を必要とせず、そして現在のキレート化剤よりも広い使用の見込みを与える、ホスフェートに結合する新規な生理学的タンパク質キレート化剤を提供することである。
【００１０】
本発明は、
配列番号１の配列を含むこと又は該配列により構成されること、
あるいは、特に１つ以上のアミノ酸の置換、削除又は付加により、配列番号１の配列から誘導されたいかなる配列も含むこと又は該いかなる配列によっても構成されること、但し、該誘導された配列はホスフェートに結合するものとすること、
あるいは、好ましくは配列番号１の配列と少なくとも約８０％の相同性を有する、配列番号１の配列に相同性のいかなる配列も含むこと又は該いかなる配列によっても構成されること、但し、該相同性配列はホスフェートに結合するものとすること、
あるいは、上記した配列の１つのいかなる断片も含むこと又は該いかなる断片によっても構成されること、但し、該断片はホスフェートに結合するものとし、特にいかなる断片も配列番号１の配列中の少なくとも約２０の連続したアミノ酸により構成されること、
を特徴とするタンパク質に関する。
【００１１】
本発明は、
配列番号２の配列若しくは配列番号３の配列を含むこと又は該配列により構成されること、
あるいは、特に１つ以上のアミノ酸の置換、削除又は付加により、配列番号２の配列若しくは配列番号３の配列から誘導されたいかなる配列も含むこと又は該いかなる配列によっても構成されること、但し、該誘導された配列はホスフェートに結合するものとすること、
あるいは、好ましくは配列番号２若しくは配列番号３の配列と少なくとも約８０％の相同性を有する、配列番号２若しくは配列番号３の配列に相同性のいかなる配列も含むこと又は該いかなる配列によっても構成されること、但し、該相同性配列はホスフェートに結合するものとすること、
あるいは、上記した配列の１つのいかなる断片も含むこと又は該いかなる断片によっても構成されること、但し、該断片はホスフェートに結合するものとし、特にいかなる断片も配列番号２若しくは配列番号３の配列中の少なくとも約２０の連続したアミノ酸により構成されること、
を特徴とする上記したタンパク質に関する。
【００１２】
配列番号２の配列は、ヒトホスフェート結合タンパク質に相当する。この新規なタンパク質は、ヒト血漿において単離され、そしてその三次元構造は、それが「ホスフェート結合タンパク質」（ＰＢＰ）クラスに属することを示す。今後それはＨＰＢＰ（ヒトホスフェート結合タンパク質）とも呼ばれる。
【００１３】
配列番号３の配列は、配列番号２の配列と約９０％の同一性の百分率を有しそして配列番号２の配列と同じホスフェート結合性を有する、配列番号２のタンパク質配列と相同性のタンパク質に相当する。
【００１４】
本発明の配列のホスフェート結合性は、放射線標識による下記のホスフェート結合試験により証明されうる：
タンパク質をニトロセルロース膜に結合させる（吸引によるドットブロット）。膜を放射性緩衝剤（32Ｐ（１０mCi／ml, Amersham Biosciences）２M；Ｔｒｉｓ５０mM；pH８．０）中でインキュベーションさせる。
【００１５】
膜をＴｒｉｓ５０mM緩衝剤、pH８．０中で２×１分間すばやくすすぐ。写真フイルムを膜で露光させる（約４５分）ことにより、放射性ホスフェートに結合するゾーンを検出することが可能である（後の図３参照）。
【００１６】
本発明は、上記したタンパク質をコードするヌクレオチド配列にも関する。
【００１７】
本発明は、上記したヌクレオチド配列を含有する組換えベクター、特にプラスミド、コスミド、ファージ又はウイルスＤＮＡにも関する。
【００１８】
有利な態様に従えば、本発明は、上記した組換えベクターであって、該ベクターに挿入された上記したヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチドの宿主細胞中での発現に必要なエレメントを含有する組換えベクターに関する。
【００１９】
本発明は、特に上記した組換えベクターを使用して形質転換された、特にバクテリア、ウイルス、酵母、真菌（fungi）、植物又は哺乳動物細胞から選ばれる宿主細胞胞にも関する。
【００２０】
本発明は、活性成分として、上記したタンパク質、特に配列番号２又は配列番号３を薬学的に許容されうる賦形剤（vehicle）と組み合わせて含む医薬組成物にも関する。
【００２１】
本発明は、本発明のタンパク質、特に配列番号２又は配列番号３のタンパク質がパラオキソン加水分解活性（paraoxon hydrolysis activity）を有するパラオキソナーゼタンパク質（paraoxonase protein）の変異体（variant）と組み合わされている、上記した医薬組成物にも関する。
【００２２】
パラオキソナーゼの変異体の中でも、ヒト又は非ヒト起源の変異体ＰＯＮ１、ＰＯＮ２、ＰＯＮ３、例えば、配列番号４（ヒトＰＯＮ１；Hassett et al.,1991）、配列番号５（ヒトＰＯＮ２；Primo-Parmo et al., 1991）、配列番号６（ヒトＰＯＮ３；Reddy et al., 2001）、配列番号７（ウサギＰＯＮ１；Hassett et al., 1991）、配列番号８（ラットＰＯＮ１；Rodrigo et al., 1997）、配列番号９（マウスＰＯＮ１；Sorenson et al., 1995）、配列番号１０（マウスＰＯＮ２；Primo-Parmo et al., 1996）及び配列番号１１（マウスＰＯＮ３；Primo-Parmo et al., 1996）を挙げることができる。
【００２３】
本発明は、高リン酸血症に関連した疾患、例えば心臓血管疾患及び関節炎（偽性通風）の予防又は処置を目的とする医薬を製造するための上記したタンパク質、特に配列番号２又は配列番号３のタンパク質の使用にも関する。
「高リン酸血症」という用語は、生物における過剰のホスフェートを表す。より正確には、高リン酸血症は、１．４４ミリモル／l／（４５mg／l）より多い血漿中のホスフェート濃度の増加により定義され、この量は、総ホスフェートのアッセイ（無機質化プロセスの後に、比色法によるアッセイを行なう）により得られる。
【００２４】
有利な態様に従えば、本発明のタンパク質は、週のオーダーの長い期間にわたって最大量のホスフェートに結合するためには、静脈内形態で投与することができる。次いでタンパク質を排出することにより、大量のホスフェートがこのようにして急速に排出される。これは、透析の期間の間隔を置くこと及び透析の期間を減少させることを可能とする。
【００２５】
本発明は、更に詳しくは、心臓血管疾患の予防又は処置の枠内での、上記したタンパク質、特に配列番号２又は配列番号３の使用に関する。
【００２６】
本発明は、殺虫剤又は神経作用剤（nerve agents）、例えば、ソマン（soman）、ＶＸ、タブン又はサリンにより引き起こされる中毒の予防又は処置の枠内又はアテローム性動脈硬化症の処置の枠内で、タンパク質、例えばパラオキソナーゼタンパク質の変異体と組み合わせた、本発明に従うタンパク質、特に配列番号２又は配列番号３の配列により表されるタンパク質の使用にも関する。
【００２７】
本発明は、殺虫剤又は神経作用剤、例えば、ソマン、ＶＸ、タブン又はサリンにより引き起こされる中毒の予防又は処置を目的とする同時使用又は別々の使用、又はある時間にわたり引き延ばされた使用（use spread over time）のための、上記した少なくとも１つのタンパク質、特に配列番号２又は配列番号３のタンパク質及び少なくとも１つのパラオキソナーゼタンパク質の変異体を含む組み合わせ産物にも関する。
【００２８】
本発明のタンパク質、特に配列番号２のタンパク質をパラオキソナーゼタンパク質の変異体と共に組み合わせた使用は、特に殺虫剤又は神経作用剤により引き起こされる中毒の予防又は処置の枠内で、パラオキソナーゼの安定性を増加させることを可能とする。
【００２９】
本発明は、上記したタンパク質アッセイ方法であって、下記の工程：
本発明のタンパク質の種々のエピトープ（different epitopes）に対して指向されたウサギモノクローナル抗体（抗ＨＰＢ）をプレート上に固定し、そして該タンパク質（ＨＰＢ）を含有する分析されるべきヒト血清を上記したプレートに適用し、
プレートをすすぎそして洗浄し、
ペルオキシダーゼで標識されたウサギ抗体に対して指向された抗体（抗ＩＧｒａｂｂｉｔ−ｐｅｒ）を３０分間にわたってプレートに適用して、ウサギモノクローナル抗体、本発明に従うタンパク質及びウサギ抗体に対して指向された上記した抗体で三成分系複合体（抗ＨＰＢ−ＨＰＢ−抗ＩＧｒａｂｂｉｔ−ｐｅｒ）を形成し、
プレートをすすぎそして洗浄し、
ブレートに固定されたペルオキシダーゼをその基質と反応させ（商業的に入手可能なキット、Chemiluminescence Peroxidase Substrate(Sigma)）そして反応を３０分の終わりに３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ，Ｓｉｇｍａ）で停止させ、
先の工程で形成された生成物の光学密度を分光光度計を使用して４５０nmで測定し、そしてこの測定値の標準曲線との比較は血清中に存在する本発明に従うタンパク質（ＨＰＢ）の濃度を決定することを可能とする、
工程を含むことを特徴とする方法にも関する。
【００３０】
かくして、上記したアッセイ方法は、ＥＬＩＳＡ型イムノアッセイ法（Engvall et al., 1971）を使用する。
【００３１】
血漿中の本発明のタンパク質の濃度をアッセイするために、他の方法、例えば、
電気泳動法、又は
その活性の定量、
を使用することができる。
【００３２】
本発明は、
上記したアッセイ法の適用であって、
特に、上記した方法に従ってアッセイされた上記したタンパク質、特に配列番号２又は配列番号３のタンパク質の量が、健康な個体の血液中に正常に存在するこのタンパク質の量より少ない場合の、高リン酸血症に関連した疾患のインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）診断、あるいは、
特に、上記した方法に従ってアッセイされた上記したタンパク質、特に配列番号２又は配列番号３のタンパク質の量が、健康な個体の血液中に正常に存在するこのタンパク質の量より多い場合の、低リン酸血症に関連した疾患のインビトロ診断、あるいは、
このような病理に対する個体の素因（predisposition）のインビトロ診断、
への適用に関する。
【００３３】
本発明に従うタンパク質のレベルは、心臓血管疾患の危険に対する素因のインディケーターである。かくして、該タンパク質の低いレベルを有する個体は、血漿中のカルシウムとともに沈殿してリン酸カルシウムプレートを形成する、特に心臓血管疾患又は関節炎の危険を悪化させる因子である、遊離ホスフェートのより高いレベルを有するであろう。
【００３４】
このタンパク質の異常なレベルは、存在する病理の徴候でもある。例えば、高リン酸血症は、ホスフェートレベルを限定するために、タンパク質の増加した産生をトリガーすることができる。低いレベルも機能障害を示すことがある。
【００３５】
本発明は、高リン酸血症に関連した疾患、例えば心臓血管疾患、特にアテロームプラーク（atheroma plaques）の形成に関連した心臓血管疾患のインビトロ診断、あるいは、上記した疾患の１つを進展される個体の素因のインビトロ診断への上記した適用にも関する。
【００３６】
本発明は、低リン酸血症に関連した疾患のインビトロ診断又はこれらの疾患を進展させる個体の素因のインビトロ診断への上記した適用にも関する。
【００３７】
低リン酸血症に関連した疾患を特徴付ける臨床的又は生理学的徴候の中でも、
骨の脱ミネラル化（demineralization）、
骨格筋に影響を与える近位筋障害（proximal myopathy）並びに平滑筋に影響を与える嚥下困難及び腸閉塞を含む低リン酸血症の筋肉の発現（muscular manifestations）、
ＡＴＰの欠如による心肺不全、及び
代謝脳障害（metabolic encephalopathy）、
を挙げることができる。
【００３８】
実験の部
タンパク質の単離
配列番号２のタンパク質はGan et al.(1991)の下記の方法に従ってヒト血漿から得られる。
【００３９】
配列番号２のタンパク質は、Establissement de Transfusion Sanguine of Lyon-Beynostにより供給された凍結した血漿（〜２００ml）のバッグから精製する。血漿にＣａＣｌ2１M（１％ｖ／ｖ／ｖ）を添加することにより形成されたフィブリンクロットをろ過により血清から分離する。次いで血清を緩衝剤Ａ（Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ５０mM、ＣａＣｌ2１mM、ＮａＣｌ４M、pH８）と平衡化されたアフイニティーゲル（Cibacron 3GA-Agarose、C-1535,Sigma）４００mlと混合する。これらの条件下に、主としてＨＤＬｓ（高密度リポタンパク質）が吸着される。６〜８時間のインキュベーションの後、ゲルに吸着されなかったタンパク質を多孔度Ｎｏ．２のガラスろ板（fritted disc）でのろ過により除去する。この洗浄を、溶離物中にもはやタンパク質が検出されなくなるまで（２８０nmにおけるＵＶ吸収）行う。次いでゲルを緩衝剤Ｂ（Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ５０mM、ＣａＣｌ2１mM、pH８）と平衡化させ、次いでＸＫ５０／３０カラム（Pharmacia）に入れる。デオキシコール酸ナトリウム１g／l及び０．１％トリトンＸ−１００を緩衝剤Ｂに加えることにより溶離を行なう。アリールエステラーゼ活性を示す画分をＸＫ２６／７０カラム（Pharmacia）中に配列されそして緩衝剤Ｂ及び０．０５％トリトンＸ−１００と平衡化されたアニオン交換ゲル（DEAE Sepharose Fast Flow、Pharmacia）５０ml上に注入する。溶離をＮａＣｌ勾配により行なう。ＮａＣｌ、８７．５mMで第１プラトーに達して、ａｐｏＡ−Ｉ、パラオキソナーゼに関連したタンパク質（protein linked to paraoxonase）及び汚染タンパク質の大部分が除去される。ヒトパラオキソナーゼ（ＰＯＮ１）は、ＮａＣｌ、１４０mMの濃度でほぼ溶離される。保持されたすべての画分は、パラオキソナーゼ活性及びアリールエステラーゼ活性を示し、これらの活性は下記する試験に従って証明される。溶離された画分は一緒に戻されない。得られた画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは３８kDa〜４５kDaに含まれるバンドを示す（図１参照）。各精製は常に同じ見かけの質量分布をもたらすとはかぎらない。この僅かな不均質性（heterogeneity）は、ＰＯＮ１上の２グリコシル化された鎖の存在により説明されうる。
【００４０】
これらのバッチにおけるＰＯＮ１に加えて、他のタンパク質が、トリトンの代わりにＣ−マルトシドで置き換えそして沈殿剤として硫酸アンモニウムを使用することによって、結晶化により単離された。得られた結晶は、放射線結晶学（radiocrystallography）により特徴付けられそして本発明の配列番号２の配列に相当する未知のタンパク質の結晶である。結晶化は、現在では、このタンパク質を精製するための唯一の現存の方法である。
【００４１】
パラオキソナーゼ活性は、１MＮａＣｌ、pH１０．５の存在下に、グリシン５０mM／ＮａＯＨ、ＣａＣｌ2１mM緩衝剤中で測定されそして２５℃でサーモスタットで制御された複光束分光光度計（Shimazu UV 160A）によって決定される。加水分解の速度は、時間の関数としてパラオキソンの加水分解により放出されるｐ−ニトロフェノールの形成に相当する４１２nmにおける吸光度の変動に従って決定される、ε＝１８２９０Ｍ-1cm-1（Smolen, 1991）。
【００４２】
アリールエステラーゼ活性はトリス５０mM／ＨＣｌ、ＣａＣｌ2１mM緩衝剤、pH８中で測定されそしてサーモスタットで２５℃に制御された複光束分光光度計（Shimazu UV 160A）によって決定される。加水分解の速度は、時間の関数として酢酸フェニルの加水分解により放出されるフェノールの形成に相当する、２７０nmにおける吸光度の変動に従って決定される、ε＝１３１０Ｍ-1cm-1（Smolen, 1991）。
【００４３】
構造
配列番号２の結晶化されたタンパク質の構造は、Ｘ線結晶学により得られた。１．９Å解像度の構造が、ＳＩＲＡＳ（単一重原子同形置換法）法（図２）により得られた。
【００４４】
Ｘ線回折データは、ＥＳＲＦ（Grenoble）のＢＭ３０ラインで収集した。
【００４５】
重原子塩誘導体は、ウラニウム塩を含有する溶液中に結晶を浸漬することにより得られた。
【００４６】
像を積分し（integrated）、スケーリングし（scaled）そしてＸＤＳ２０００プログラム（Kabsch, 1995）及びＣＣＰ４  ｓｕｉｔｅ（COLLABORATIVE COMPUTATIONAL PROJECT, NUMBER 4.1994. "The CCP4 suite": Program for Protein Crystallography". Acta Cryst. D50, 760-763）と組み合わせた。
【００４７】
ウラニウム原子の位置を決定するためにＣＮＳ（BRUNGER,1998）及びＳｎＢ（Weeks, 1999）プログラムを使用した。ＳＩＲＡＳ技術により位相を得るために、ＳＨＡＲＰプログラム（Copyright (C)2001-2002 the Buster Development Group）を使用した。
【００４８】
３７２アミノ酸は、ＡＲＰ／ｗＡＲＰ（Perrakis, 1997）プログラムにより電子密度マップにおいて自動的に構成された。次いで、この第１のモデルをＣＮＳプログラムにより精緻化した。
【００４９】
電子密度マップの非常に良好な品質の故に、タンパク質の一次配列に８０％の信頼性を割り当てることが可能であった。ホスフェート分子の位置を決定することも可能であった。
【００５０】
得られた構造は、ヒトパラオキソナーゼに全然対応していない。電子密度からアミノ酸を同定することにより得られた配列決定は、このヒトタンパク質もその遺伝子もこれまでに記載されていないことを示す。故に、それは新規なタンパク質である。
【００５１】
本発明のタンパク質の構造は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのホスフェート結合性タンパク質との非常に強い相同性を示す。このバクテリアにおけるこのタンパク質は、ペリプラズム（periplasm）を横切ってホスフェートを輸送するのに役立つ。それは多くの原核生物で見出されるが、真核生物には見いだされない。
【００５２】
電子密度は、ホスフェート分子が、本発明の新規なタンパク質に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのそれにおけると同じ方式で結合されることも示した。
【００５３】
かくして、ヒト血漿から特徴付けられた本発明のタンパク質は、バクテリアタンパク質との非常に強い相同性を有すること及びそれはホスフェートに結合しそしてそれを輸送することができると結論することができる。
【００５４】
配列決定
ゲルにおける消化
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動ゲル（加熱しないで）によりパラオキソナーゼ−ＨＰＢＰ混合物を分離した。７０kDaの範囲のＨＰＢＰに相当するいくつかのバンドを切り出した。
【００５５】
これらのバンドに含有されたタンパク質の消化は、自動的消化システム、ＭａｓｓＰｒｅｐ  Ｓｔａｔｉｏｎ（Waters, Manchester, UK）によって行なった。ゲルバンドを、炭酸水素アンモニウム（ＮＨ4ＨＣＯ3）２５mMの溶液５０μl及びアセトニトリル５０μlで２回洗浄した。システインを、１０mMジチオトレイトール溶液５０μlで５７℃で還元しそして５５mMヨードアセトアミド５０μlでアシル化した。アセトニトリルで脱水した後、タンパク質を、１２．５ng／μlの修飾されたブタトリプシン１０μl（Promega, Madisson, WI, U.S.A）により又はＮＨ4ＨＣＯ3２５mM中のLysobacter enzymogenesのＬｙｓ−Ｃ（Roche Applied Science, Penzberg, Germany）により酵素的に消化した。消化を、周囲の温度で一夜行なった。開裂されたペプチドを６０％アセトニトリル溶液及び５％ギ酸で抽出した。
【００５６】
質量分光法分析
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ及びＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳ
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量測定を、Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ（登録商標）ＴＯＦ／ＴＯＦ（Bruker, Daltonik GmbH, Bremen, Germany）で行なった。この機器を、リフレクトロンモード（reflectron mode）で２５KVの最大加速電圧で使用した。マトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を使用してステンレス鋼標的の上で乾燥された標準ドロップ調製（standard drop preparation）によりサンプルを調製した。
【００５７】
ペプチド（ブラジキニン１〜７（ｍ／ｚ＝７５７．４００）、ヒトアンギオテンシンII（ｍ／ｚ＝１０４６．５４２）、ヒトアンギオテンシンＩ（ｍ／ｚ＝１２９６．６８５）、サブスタンスＰ（ｍ／ｚ＝１３４７．７３５）、ボンベシン（ｍ／ｚ＝１６１９．８２２）、レニン（ｍ／ｚ＝１７５８．９３３）、ＡＣＴＨ１〜１７（ｍ／ｚ＝２０９６．０８７）及びＡＣＴＨ１８−３９（ｍ／ｚ＝２４６５．１９９）の既知の溶液のモノアイソトープチャージ（monoisotopic charees）のピークのみを使用して、ＭＡＬＤＩ−ＭＳの外部較正を行なった。モノアイソトープペプチドの質量をＦｌｅｘａｎａｌｙｓｉｓ２．０プログラムを使用して自動的にアノテーションした。
【００５８】
ＭＳ／ＭＳスペクトルは、気相における追加の衝突なしに、切断されたイオン前駆体のレーザー誘導分解（"Laser-Induced Decomposition"）（ＬＩＤ）により得られた準安定イオンの分析により得られた。イオン前駆体を８kVに加速しそしてタイムドイオンゲート（timed ion gate）によって選択した。断片をＬＩＦＴセルにおいて１９kVにより更に加速し、そしてイオン反射器を通過した後に、それらの質量を測定した。
【００５９】
これらのＭＳ／ＭＳスペクトルの各々の新規な配列決定を、Full DeNovo Sequencing プログラム（Biotools, Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany）により行った。
【００６０】
ナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳ
Ｑ−ＴＯＦＩＩ直交ハイブリッド四重極（orthogonal hybrid quadrupole）（Micromass, Manchester, UK）により加速された飛行時間型質量分析計にカップリングされたＣａｐＬＣ（Waters, Manchester,UK）を使用して、ナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳを行った。逆相クロマトグラフィーによる分離を、分配予備カラム（partition pre-column）によって一定に保たれた２００nL／分の流量の下で毛細管（Pepmap C18, ７５μm内径、１５cm長さ、LC Packings）で行った。ＧＦＰ２ピコモル／μlを使用して較正を行った。
【００６１】
質量データ取得は、ＭＳモードとＭＳ／ＭＳモード間で自動的に切り替えるＭａｓｓＬｙｎｘプログラム（Micromass, Manchester, UK）により制御された。
【００６２】
発生したＭＳ／ＭＳスペクトルは、部分配列又は完全配列を得るために、新規に個々に配列決定された。これらの解釈は、各ＭＳ／ＭＳスペクトルに関する新規な自動的配列決定によりａ．ｐｋｌファイルを完全に処理することができるＰｅｐＳｅｑプログラム（MassLynx,Micromass）及びＰＥＡＫＳ  Ｓｔｕｄｉｏプログラム（Bioinformatics Solutions, Waterloo, Canada）を使用して行われた。
【００６３】
ホスフェート結合
配列番号２の本発明のタンパク質によるホスフェート結合は、下記の試験に従って証明された：
【００６４】
配列番号２の本発明のタンパク質（図３のカラムＡ−Ｆ）又はリソザイム１mg／ml（カラムＧ）又はβ−ラクトグロブリン、２００μlをニトロセルロースに適用した（吸引によるドットブロット）。
【００６５】
混合物を、トリス５０mM；pH８．０；32Ｐ（１０mCi／ml）２mMを含む混合物中に２時間３０分間インキュベーションする。
【００６６】
次いでpH８．０のトリス５０mMにより１分間２回すすぎを行い、次いで混合物を周囲の温度に４５分間さらす。
【００６７】
本発明のタンパク質は放射性ホスフェートに結合した（カラムＡ〜Ｆ）に結合したが、これに対して試験コントロールはそれに結合していなかった（カラムＧ及びＨ）ことが留意される（図３参照）。
【００６８】
配列番号２のタンパク質の役割及び使用
血漿中のこのタンパク質の濃度をアッセイするために、使用することができる方法は、
電気泳動法、
タンパク質の精製
その活性の定量
タンパク質にたいして指向されたポリクローナル／モノクローナル抗体を使用するタンパク質のイムノアッセイ、
である。
【００６９】
パラオキソナーゼとの組み合わせ
二次元電気泳動
ブロトコールにおいて先に述べた精製したタンパク質（４０μg）を、尿素９．８M、トリトンＸ１００、４％（ｖ／ｖ）、トリブチルホスフィン２mM、アムホリン（ampholine）３−１０（Bio-Lytes 3-10; Bio-Rad）０．２％（ｖ／ｖ）及びブロモフェノールブルー０．００１％（ｍ／ｖ）を含有する溶液１００μLと混合する。使用する用意のできたポリアクリルアミドゲルストリップ（IPG-Strips; Bio-Rad）（Ｔ：４％；Ｃ：３％）を使用する。予め確立された線状pH勾配を有するように、アムホリンは共有結合方式でポリアクリルアミドに結合した。使用したpH勾配は３〜１０．０である。
【００７０】
１．等電点電気泳動（ＩＥＦ）
ストリップを、Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＥＦ  Ｃｅｌｌ装置（Bio-Rad）においてタンパク質サンプルと接触させて置き、そして２０℃で１５時間実際に再水和させる（５０Ｖ一定）。次いで等電点電気泳動を２０℃で３段階で行う。第１に、２５０Ｖの低電圧を１５分間印加し、第２に、２５０〜４０００Ｖの勾配の上昇（５０μAストリップにより限定されたアンペア数）を２時間にわたりプログラムする。第３に、電圧を４時間４０００Ｖに一定に保つ。移行の後、ストリップを−２０℃で保存する。
【００７１】
先の精製プロトコールに従って、本発明のＨＰＢＰタンパク質を、ヒトパラオキソナーゼ（ＰＯＮ）（Fokine et al., 2003）と共精製する。上記したプロトコールにより二次元ゲルを作成することにより、２スポットを、それぞれ、本発明のタンパク質ＨＰＢＰ及びヒトパラオキソナーゼであるとしてＮ末端配列決定により同定する（図４参照）。２つのタンパク質はほぼ同じ分子質量（約４０kDa）及び異なる等電点、ＨＰＢＰについては６．９〜８．５及びＰＯＮ１については４〜５、を有する。ゲル上で２つのタンパク質を分離するのに成功するためには激しい条件（尿素９M及びトリトン４％）を使用することが必要であったこと、及び全く異なる等電点を有する２つのタンパク質がアニオン交換カラム（ＤＥＡＥセファロース）を通過した後に共精製されるという事実を考慮すると、それらは複合体を形成することにより結びついていると結論する。
【００７２】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】ヒトパラオキソナーゼ及び配列番号２の本発明のタンパク質の精製の枠内での最終画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。  カラムＡは分子量マーカーに対応し、そしてカラムＢ、Ｃ及びＤは、ヒト血漿の異なるバッグに由来する３つの異なる精製に対応する。それらは、３つともすべてヒトパラオキソナーゼ及びホスフェート結合タンパク質を含有する。
【図２】ホスフェート分子が結合している配列番号２の本発明のタンパク質の略図による構造を示す。
【図３】配列番号２の本発明のタンパク質にわるホスフェート結合の試験に対応する。  カラムＡ〜Ｆはヒト血漿の異なるバッグに由来する本発明のタンパク質の精製の異なるバッチに対応し、カラムＧは、リソソーム１mg／mlに対応し、そしてカラムＨはβ−ラクトグロビンに対応する。
【図４】配列番号２の本発明のタンパク質及びパラオキソナーゼの混合物の二次元電気泳動ゲルを示す。
【図５】配列番号２の本発明の結晶化したタンパク質の分子座標（molecular coordinates）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図５】
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【図５】
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【図５】
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【図５】
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【図５】
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【図５】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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