(57)【要約】  本発明は、ARF媒介細胞増殖抑制の機構に関する。ARF-BP1は、新規ユビキチンリガーゼと特定され、ヒト細胞におけるARF含有核複合体の主要成分である。本発明は、ARF-媒介性p53活性化の新規機構を開示し、かつ、ARF-BP1が、ARFの、p53-非依存性およびp53-依存性腫瘍抑制機能の決定的作用因子であることを開示する。正常細胞におけるARF-BP1の不活性化は、p53を安定化し、p53-依存性アポトーシスを誘導する。p53-野生型細胞におけるARF-BP1の不活性化は、ARF誘導と同様のやり方で細胞増殖抑制を増進する。ARF-BP1は、p53に直接結合し、これをユビキチン化する、従って、内在性ARF-BP1の不活性化が、Mdm2ヌル細胞におけるARF-媒介性p53の安定化にとって決定的に重要である。ARF-BP1は、p53の状態に拘わらず腫瘍細胞増殖を抑制するための標的として、Mdm2よりも有利である。
2008513462.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号2記載の配列を有する単離ARF-BP1ポリペプチド。
【請求項２】
被験体が新形成を有するかどうかを決定する方法であって、被験体からの診断用サンプルをARF-BP1発現についてアッセイすることを含み、前記診断用サンプルにおいて正常よりも上昇したレベルのARF-BP1発現が検出されることを前記被験体における新形成の診断指標とする、前記方法。
【請求項３】
新形成が癌腫、リンパ性白血病、骨髄性白血病、悪性リンパ腫、悪性メラノーマ、骨髄増殖性疾患、肉腫、および混合型新形成である、請求項2記載の方法。
【請求項４】
新形成がp53-依存性またはp53-非依存性関連新形成である、請求項2記載の方法。
【請求項５】
被験体が新形成前駆症状または新形成に関する遺伝的素因を有するかどうかを決定する方法であって、被験体からの診断用サンプルをARF-BP1発現についてアッセイすることを含み、前記診断用サンプルにおいて正常よりも上昇したレベルのARF-BP1発現が検出されることを前記被験体における新形成前駆症状または新形成に関する遺伝的素因の診断指標とする、前記方法。
【請求項６】
被験体が新生物、新形成前駆症状または新形成に関する遺伝的素因を有するかどうかを決定する方法であって、被験体からの診断用サンプルをp53-ARF-BP1相互作用についてアッセイすることを含み、前記診断用サンプルにおいて正常よりも上昇したレベルのp53-ARF-BP1相互作用を新生物、新形成前駆症状または新形成に関する遺伝的素因の診断指標とする、前記方法。
【請求項７】
診断用サンプルがp53に反応性の作用因子およびARF-BP1に反応性の作用因子を用いてアッセイされる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
少なくとも一つの作用因子が検出可能マーカーで標識されている、請求項７記載の方法。
【請求項９】
少なくとも一つの作用因子が抗体である、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
診断用サンプルがARF-BP1をコードする核酸にハイブリダイズする核酸プローブを用いてアッセイされる、請求項2記載の方法。
【請求項１１】
核酸プローブがDNAまたはRNAである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも一つの核酸プローブが検出可能マーカーで標識されている、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
新形成の治療を受けた、または受けている被験体において新形成治療の有効性を評価する方法であって、被験体からの診断用サンプルをARF-BP1発現についてアッセイすることを含み、前記診断用サンプルにおける正常または低下したARF-BP1発現を新形成治療の成功の指標とし、前記診断用サンプルにおける正常よりも上昇したレベルの発現を新形成治療続行の必要性の指標とする、前記方法。
【請求項１４】
診断用サンプルにおける正常よりも上昇したレベルのARF-BP1発現が、前記診断用サンプルにおける正常よりも上昇したARF-BP1相互作用を検出することによって検出される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
新形成を有する被験体の予後を評価する方法であって、被験体からの診断用サンプルをARF-BP1発現についてアッセイすることを含み、前記診断用サンプルにおいてARF-BP1発現の低下が検出されれば前記被験体の予後が改善されたとし、前記診断用サンプルにおいてARF-BP1発現の上昇が検出されれば前記被験体の予後が悪化したとする、前記方法。
【請求項１６】
診断用サンプルにおけるARF-BP1発現が、前記診断用サンプルにおけるp53-ARF-BP1相互作用を検出することによって検出される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）p53と反応する少なくとも一つの作用因子；
（ｂ）ARF-BP1と反応する少なくとも一つの作用因子；および、
（ｃ）p53の発現およびARF-BP1の発現を検出するために適切な試薬、
を含む、新形成の検出に使用するキット。
【請求項１８】
少なくとも一つの作用因子が検出可能マーカーで標識されている、請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
被験体の新形成を治療する方法であって、被験体におけるp53の活性を上昇させることを含み、被験体においてp53の活性がp53-ARF-BP1相互作用の阻害によって上昇される、前記方法。
【請求項２０】
新形成が癌腫、リンパ性白血病、骨髄性白血病、悪性リンパ腫、悪性メラノーマ、骨髄増殖性疾患、肉腫、および混合型新形成である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
新形成がp53-依存性またはp53-非依存性関連新形成である、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
新形成がp53-非依存性関連新形成である、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
p53-ARF-BP1相互作用の阻害因子を被験体に投与することによってp53-ARF-BP1相互作用が阻害される、請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
阻害因子が被験体に、経口的投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与または皮下投与される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
細胞内でp53を脱ユビキチン化および／または安定化する方法であって、細胞とp53を脱ユビキチン化および／または安定化するために効果的な量のARF-BP1阻害因子とを接触させることを含む、前記方法。
【請求項２６】
接触がin vitroで行われる、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
接触がin vivoで行われる、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
ARF-BP1阻害因子を被験体に投与することによって、接触がin vivoで行われる、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
ARF-BP1阻害因子が被験体に経口的投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与または皮下投与される、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
被験体がヒトである、請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
ヒトが新形成を有している、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
新形成が、癌腫、リンパ性白血病、骨髄性白血病、悪性リンパ腫、悪性メラノーマ、骨髄増殖性疾患、肉腫、および混合型新形成である、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
新形成がp53-依存性またはp53-非依存性ARF-BP1-関連新形成である、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
新形成がp53-非依存性関連新形成である、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
ARF-BP1阻害因子が被験体の新形成を治療する、請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
細胞内でp53の脱ユビキチン化および／または安定性を調節する方法であって、p53の脱ユビキチン化および／または安定性を調節するために効果的な量のARF-ARF-BP1相互作用阻害因子と細胞とを接触させることを含む、前記方法。
【請求項３７】
細胞内でp53の脱ユビキチン化が増加し、p53の安定性が増加する、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
ARF-BP1相互作用の阻害が細胞増殖停止を誘導する、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
接触がin vitroで行われる、請求項３６記載の方法。
【請求項４０】
接触が被験体においてin vivoで行われる、請求項３６記載の方法。
【請求項４１】
接触が被験体に阻害因子を投与することによってin vivoで行われる、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
被験体がヒトである、請求項４０記載の方法。
【請求項４３】
ヒトが新形成を有する、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
新形成が、癌腫、リンパ性白血病、骨髄性白血病、悪性リンパ腫、悪性メラノーマ、骨髄増殖性疾患、肉腫、および混合型新形成である、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
新形成がp53-依存性またはp53非依存性関連新形成である、請求項４３記載の方法。
【請求項４６】
新形成がp53関連新形成である、請求項４３記載の方法。
【請求項４７】
p53-ARF-BP1相互作用の阻害因子が被験体の新形成を治療する、請求項４３記載の方法。
【請求項４８】
p53-ARF-BP1相互作用の阻害因子を同定する方法であって、
（ａ）p53およびARF-BP1を含むin vitro系を入手または作製する工程；
（ｂ）前記in vitro系を候補阻害因子と接触させる工程；および
（ｃ）前記候補阻害因子が前記in vitro系においてp53-ARF-BP1相互作用を阻害するかどうかを決定する工程、
を含む前記方法。
【請求項４９】
工程（ｃ）における決定が、工程（ｂ）のin vitro系におけるp53-ARF-BP1相互作用を、p53およびARF-BP1を含む第２のin vitro系にて前記候補化合物の非存在下におけるp53-ARF-BP1相互作用と比較することによって行われる、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
工程（ｃ）における決定が、工程（ｂ）のin vitro系におけるp53-ARF-BP1相互作用を、p53、ARF-BP1、候補阻害因子、および、抗-p53または抗-ARF-BP1を含む第２のin vitro系におけるp53-ARF-BP1相互作用と比較することによって行われる、請求項４８記載の方法。
【請求項５１】
請求項４８記載の方法によって同定される阻害因子。
【請求項５２】
ARF-関連疾患、ARF-BP1-関連疾患またはp53-関連疾患を治療する方法であって、被験体にARF-関連疾患、ARF-BP1-関連疾患またはp53-関連疾患を治療するに効果的な量の請求項５１記載の阻害因子を投与することを含む、前記方法。
【請求項５３】
-ARF-BP1相互作用の阻害因子の新形成を治療する方法における使用。
【請求項５４】
p53-ARF-BP1相互作用の阻害因子の新形成を治療する方法における使用。
【請求項５５】
効果的な量のp53-ARF-BP1相互作用の阻害因子、および、製薬的に許容できる担体を含む、医薬組成物。
【請求項５６】
効果的な量のARF-ARF-BP1相互作用の阻害因子および製薬的に許容できる担体、を含む医薬組成物。
【請求項５７】
p53と反応する作用因子を同定する方法であって、
（ａ）p53と候補作用因子とをARF-BP1の存在下で接触させる工程；および、
（ｂ）前記候補作用因子がp53-ARF-BP1相互作用を阻害する能力を評価する工程、
を含む、前記方法。
【請求項５８】
さらに以下の工程を含む、請求項５７記載の方法：
（ｃ）候補作用因子をARF-BP1またはp53を含む1以上の細胞と接触させる工程；および、
（ｄ）前記作用因子が前記1以上の細胞において1以上のARF-BP1-関連生物学的事象またはp53-関連生物学的事象に対して影響を与えるかどうかを決定する工程。
【請求項５９】
請求項５８記載の方法によって同定される作用因子。
【請求項６０】
ARF-BP1と反応する作用因子を同定する方法であって、
（ａ）候補作用因子をARFの存在下でARF-BP1と接触させる工程；および、
（ｂ）前記候補作用因子がARF-ARF-BP1相互作用を阻害する能力を評価する工程、
を含む、前記方法。
【請求項６１】
さらに以下の工程を含む、請求項６０記載の方法：
（ｃ）候補作用因子をARF、ARF-BP1またはp53を含む１以上の細胞と接触させる工程；および、
（ｄ）前記作用因子が前記１以上の細胞において1以上のARF-非依存性若しくは依存性関連生物学的事象、ARF-BP1-非依存性若しくは依存性関連生物学的事象またはp53-非依存性若しくは依存性関連生物学的事象に対して影響を与えるかどうかを決定する工程。
【請求項６２】
請求項６０記載の方法によって同定される作用因子。
【請求項６３】
ARFおよびARF-BP1を含む複合体。
【請求項６４】
p53およびARF-BP1を含む複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、2004年9月15日登録米国仮出願第60/610,506号の利益を主張する。なお、引用することにより、この出願を本明細書に含める。
政府利益の宣告
本発明は、NIH研究補助金第CA097403号の下一部政府の支援によって為された。従って、米国政府は、本発明においていくつかの権利を有する。
本発明は、ARF媒介性細胞増殖抑制の機構に関する。さらに詳細には、ARFのp53/Mdm2非依存性機能に関する。
【背景技術】
【０００２】
新形成は、新生物と呼ばれる細胞の異常増殖によって特徴付けられる。新生物は、白血病または腫瘍の形で現れ、良性のことも、悪性のこともある。特に、悪性新生物は、生命を脅かす、重大な病態をもたらすことがある。これまで、抗新生物方策、例えば、新生物を抱える患者の治療に効果的な化学療法剤を含めた方策の解明のために、相当な研究努力および資金が傾けられてきた。効果的な抗ガン剤としては、新生物に関連する細胞の急激な増殖を抑制する、またはコントロールするもの、新生物の後退または寛解をもたらすもの、および、一般にガンを患う患者の生存を延長するものが挙げられる。悪性新生物、すなわちガンを成功裡に治療するためには、全ての悪性細胞の除去が、それらの細胞が、原発部位に認められようと、局所的な／領域的な面積に拡大したものであろうと、あるいは、体の他の領域に転移したものであろうと、必要である。新生物治療ための主要療法は、手術と放射線療法（局所的、および局所／領域的新生物）、および化学療法（全身部位）である。
【０００３】
ガンを検出し、診断し、かつ治療するためには様々な方法があるにも拘わらず、この病気は、社会の全ての階層に現在でも蔓延し、しかも多くの場合致命的である。ガン患者の生存率を改善するには、検出のための代替方策（早期に新生物を特定することのできるマーカーの開発を含む）、および代替治療が必要であることはもちろんである。特に、腫瘍抑制因子、および腫瘍抑制経路をよりよく理解することは、新しい検出、診断、および治療法開発の基盤となると考えられる。
【０００４】
p53腫瘍抑制因子は、様々なタイプのストレスに反応して、増殖停止、アポトーシス、および細胞老化を含む抗増殖作用を発揮する（Levine, A.J., Cell 88:323-31, 1997; Oren, M., J. Biol. Chem. 274:36031-034, 1999）。p53は、多様な起源、例えば、DNA損傷反応（例えば、ATM/ATR活性化）、異常なガン遺伝子事象（例えば、MycまたはRas活性化）、および日常的細胞過程（例えば、増殖因子刺激）を含む起源からのシグナル伝達経路を監視する制御回路の中心点と考えられている。p53変異は、全てのヒト腫瘍の半分以上において精しく記録されている(Hollstein et al., Mutat Res. 431:199-209, 1999)一方で、p53経路の他の成分、例えば、ARF腫瘍抑制因子の欠陥が、野生型p53を保持する腫瘍細胞に観察されている(Sherr, C.J., Nat Rev Mol Cell Biol 2:731-737, 2001; Sharpless, N.E., DePinho, R.A., J. Clin Invest 113:160-8, 2004)。p53経路の活性化は、ヒトガンの普遍的と言わないまでも、一般的な特徴のようである。
【０００５】
p53活性化の機構は完全には理解されていなけれども、一般に、翻訳後修飾、例えば、ユビキチン化、リン酸化、およびアセチル化を必要とすると考えられている。p53のユビキン化は、先ず、乳頭腫感染細胞において発見された。これらの細胞では、p53分解は、ウィルスのE6タンパクおよび、E6-APと呼ばれるHECT-ドメイン含有ユビキチンリガーゼによって媒介される(Munger, K., Howley, P.M., Virus Res 89:213-228, 2002)。正常細胞では、Mdm2は、p53に対する特異的E3ユビキチンリガーゼとして働き、悪性に活性化されると、p53の腫瘍抑制活性に拮抗する能力を有する。p53調節におけるMdm2の重要な役割は、マウスで行われた実験において明らかにされている。すなわち、マウスでは、p53の不活性化は、Mdm2機能の消失による胎児の致死を完全に救済することが示された(Montest de Oca Luna, R., Wagner, D.S., Lozano, G., Nature 378:203-206, 1995)。
【０００６】
初期の実験では、Mdm2が、p53安定性制御の主要因子であることが示唆されたが、p53の分解は、最初に予期したよりももっと複雑である。本発明者は、Mdm2が、示差的に、p53のモノユビキチン化、ポリユビキチン化のいずれも、用量依存的に触媒することを見出した(Li, M., Brooks, C.L., Wu-Baer, F., Chen, D., Baer, R., Gu, W., Sicence 302:1972-1975, 2003)。低レベルのMdm2活性は、p53のモノユビキチン化と核外輸送を誘導し、一方、高レベルは、p53のポリユビキチン化と核内分解を誘導する。この機構は、様々な生理的背景の下に利用されている。一方で、Mdm2-媒介性ポリユビキチン化および核内分解性は、Mdm2が悪性に過剰発現している場合、または、DNA損傷反応の後期段階において、p53の機能抑制に重要な役割を演じている可能性がある。他方では、Mdm2-媒介性モノユビキチン化と、それに続くp53の細胞質移行は、Mdm2が低レベルに維持されている場合、ストレスを受けていない細胞におけるp53調節の重要な手段となっている可能性がある(Liら、2003、上述)。さらに、特に、内在性Mdm2活性がp53ポリユビキチン化を直接触媒するのに十分でない場合には、p53分解を促進するために新たな細胞因子が必要となる可能性がある。最近、ユビキチンリガーゼCOP1およびPir2がp53分解に直接関与することが報告された(Dornan, D., Wertz, L, Shimizu, H., Arnott, D., Frantz, G.D., Dowd, P., O'Rourke, K., Koeppen, H., Dixit, V.M., Nature 429:86-92, 2004)。従って、Mdm2はp53機能の重要な制御因子ではあるものの、p53分解は、in vivoでMdm2依存性およびMdm2非依存性の両経路を通じて起こる。
【０００７】
ARF（ヒトではp14ARF、マウスではp19ARFとして知られている）は、サイクリン依存性キナーゼのp16Ink4a抑制因子をコードする遺伝子であるInk4a、すなわちARF腫瘍抑制遺伝子座位の選択転写物と特定されている。その固有の第1エキソンのために、ARF転写物は、p16Ink4aとは無関係のタンパク質をコードする。にも拘わらず、ARFは、p16Ink4a同様、腫瘍感受性表現型を有するp14ARF欠損マウスにおいて実証されたように、腫瘍抑制機能を示す。ARFは、ガン遺伝子に反応し、少なくとも部分的にp53経路を誘導することによって異常な細胞増殖を抑制する(Sherrら、2001、上述)。ARFによるp53の誘導は、Mdm2を介して起こるように思われる。なぜなら、過剰発現ARFが直接Mdm2と相互作用を有し、p53分解を促進するその活性を抑制するからである(Zhang, Y., Xiong, Y., Yarbrough, W.G., Cell 92:125-34, 1998)。ARFは、Mdm2に結合してこれを隔離することによってp53を安定化し、かつ、Mdm2のユビキチンリガーゼ活性を直接阻害することによってp53機能を活性化し、そのMdm2/p53経路を調節する機構は複雑なようである。
【０００８】
興味あることに、ARFはまた、p53またはMdm2に依存しない腫瘍抑制機能を有する。例えば、ARFは、機能的p53遺伝子(Normand, G., Hemmati, P.G., Verdoodt, B. et al., J. Biol Chem 280:7118-30, 2005)、または、p21サイクリン依存性キナーゼ抑制因子をコードする遺伝子（p53の重要な転写標的）、を欠く腫瘍細胞において、細胞増殖停止を誘導することができるが、ARFはまた、Mdm2とp53の両方を欠くMEFの増殖をも抑制することもできる。これらの所見と一致して、ARF、p53、およびMdm2を欠く三重ノックアウトマウスの腫瘍感受性は、これらの遺伝子の内の一つだけを欠くマウスの感受性よりも有意に高い。最近、ARFは、p53-依存性およびp53-非依存性の両経路を通じて、マウスの皮膚ガンの増殖、進行、および転移を抑制することが示された(Kelly-Sprat, K.S., Gurley, K.E., Yasui, Y., Kemp, C.J., PLoS Biol. 2:E242, 2004)。ARFのp53-非依存性機能を媒介する、別の下流因子が存在する可能性がある。これらの因子の正体、および、これらの因子が、ARFによるp53-非依存性腫瘍抑制を媒介する機構は未知である。従って、p53経路の制御は、極めて興味深く、ガンの診断および治療の手段となり得る可能性を有するものではあるが、ARFのp53非依存性機能を媒介するこの経路、因子および機構について理解をさらに深めることは、新しい診断および治療法が開発される貴重な基盤を提供してくれるものと考えられる。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、新規タンパク質ARF-BP1の発見に基づく。このタンパク質は、不活性化されると、p53ヌル細胞（p53非含有細胞）において細胞増殖阻害を誘導し、p53野生型細胞ではp53-依存性アポトーシスを誘導する。この発見は、新形成、特に、p53に関連するガンの診断、監視、および治療において広範な意味を有する。
本発明によれば、驚くべきことに、ARF-BP1の不活性化は、p53-ヌル細胞において細胞増殖停止を誘導することが見出された。これは、ARF-BP1が、腫瘍抑制のp53非依存性経路の決定的媒介因子であることを示す。p53ヌル細胞における内在性ARF-BP1の不活性化は、ARF誘導を暗示する様式で細胞増殖抑制を誘導するが、Mdm2についてはそうではない。p53陽性細胞においてARF-BP1を不活性化すると、p53安定化が誘導され、p53-依存性アポトーシス反応が活性化される。従って、本発明の一つの局面は、ARFのp53-非依存性およびp53-依存性両方の腫瘍抑制機能を媒介する、ARF-BP1を含む、新規制御経路を特徴とする。
【００１０】
従って、本発明は、被験体の診断用サンプルにおいてARF-BP1の発現について定量することによって、前記被験体が新形成を有するかどうかを決定する方法を提供する。その際、ARF-BP1発現は、被験体における新形成の診断指標になる。
本発明は、被験体の診断用サンプルにおいてARF-BP1ペプチド発現について定量することによって、ガンに対する新形成前駆症状および遺伝的素因についてスクリーニングする方法を提供する。その際、ARF-BP1発現が検出されることは、被験体において癌腫に対する新形成前駆症状および遺伝的素因の診断指標になる。
本発明はまた、被験体の診断用サンプルにおいてARF-BP1について定量することによって、新形成について治療を受けたことがある、あるいは、現に受けている前記被験体における新形成治療法の効力を評価する方法を提供する。その際、診断用サンプルにおけるARF-BP1の発現低下または正常な発現は治療法の成功の指標となり、診断用サンプルにおけるARF-BP1の正常よりも上昇したレベルの発現は、新形成を治療する治療続行の必要性の指標となる。
本発明はさらに、被験体の診断用サンプルにおいてARF-BP1について定量することによって、新形成を抱える前記被験体の予後を評価する方法を提供する。その際、被験体の予後は、診断用サンプルにおけるARF-BP1発現の低下により改善されたことになり、被験体の予後は、診断用サンプルにおけるARF-BP1発現の上昇により悪化したことになる。
本発明はまた、新形成の検出に用いられるキットであって、(a)ARF-BP1と反応する作用因子、および(b)ARF-BP1の発現を検出するのに好適な試薬を含むキットを提供する。
【００１１】
さらに、治療を要する被験体において、前記被験体におけるARF-BP1の活性を下げることによって新形成を治療する方法を提供する。さらに、組成物が投与される被験体において新形成を治療するのに有効な量のARF-BP1発現またはARF-BP1タンパク質の阻害因子および製薬学的に受容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
本発明はさらに、細胞を、p53を脱ユビキチン化するのに十分な量のARF-BP1に接触させることによって、細胞におけるp53を脱ユビキチン化する方法を提供する。さらに提供されるのは、治療を要する被験体において、前記被験体の細胞におけるp53を脱ユビキチン化することによって新形成を治療する方法を提供する。
さらに、本発明は、p53と反応する作用因子を同定する方法であって、(a) ARF-BP1の存在下で候補作用因子をp53と接触させること、および、(b)ARF-BP1-p53相互作用を阻害する、候補作用因子の能力を評価することを含む方法に関する。場合により、本発明のこの方法はさらに、(c)候補作用因子を、p53を含む1以上の細胞に接触させること、および(d)前記薬剤が、前記1以上の細胞においてp53-関連生物学的事象に対して作用を有するかどうかを決定することを含んでもよい。
【００１２】
本発明はさらに、治療を要する被験体においてp53-関連病態を治療する方法であって、前記被験体においてp53関連病態を治療するのに有効な量の、ARF-BP1阻害因子を前記被験体に投与することによって治療する方法を提供する。
本発明の一つの局面では、ARF-BP1はARFに直接結合し、そのユビキチンリガーゼ活性は、ARFによって強力に阻害される。従って、本発明はまた、ARFおよびARF-BP1を含む複合体、および、ARF-BP1アミノ酸配列を含むARF-BP1変異体を提供する。
最後に、本発明は、ゲノムが内在性ARF-BP1遺伝子に欠損を含み、かつ、野生型に比較して機能的ARF-BP1タンパク質の発現の低下を示す非ヒト・トランスジェニック動物に関する。
本発明によれば、ARF-BP1は、p53-ヌルヒト細胞由来のARF-含有タンパク質複合体の主要成分と特定された。特に、本発明は、ARF-BP1、HECT（E6-AP-C-末端に対する相同体）含有ユビキチンリガーゼの特性を解明する。
本発明の別の局面は、ARF-BP1は、ARFおよびp53の両方とそれぞれ相互作用を有するが、Mdm2とは相互作用を有しないことを明らかにする。ARF-BP1は、Mdm2ヌル細胞においてARF媒介p53安定化のために必要である。
本発明は、ARF-BP1が普遍的標的となっていると考えられる腫瘍における治療的介入のための実際的方法を提供する。
本発明のさらに別の局面は、ARF-BP1が広く発現され、タンパク質のユビキチン化と一般的に関連するシグネチャーモチーフ（HECTおよびUBA）を含むことを明らかにする。ARF-BP1はp53のin vitroのユビキチン化を触媒し、p53-野生型細胞におけるRNAi-媒介内在性ARF-BP1不活性化はp53を安定化し、p53機能を活性化する。
本発明のさらに別の局面は、下記の説明に徴することによって明らかとなろう。
【００１３】
発明の詳細な記載
ARFはMdm2非依存的様式でp53を安定化することができ、ARF-BP1の不活性化は直接p53の活性化をもたらすので、本発明は、これまでその主要標的がMdm2であると考えられてきたARFが、in vivoでどのようにしてp53を活性化するか、その機構に関する現在の見地を改める。さらに、ARF-BP1の不活性化がp53ヌル細胞において細胞増殖阻害を誘導し、かつ、p53野生型細胞においてp53-依存性アポトーシスを誘導することを考慮すると、ARP-BP1はp53の状態によらず、腫瘍における治療的介入の普遍的標的である。
p53タンパク質の制御、従って、細胞増殖の制御用途に使用される外に、本発明のARF-BP1ペプチドはまた、治療薬剤（例えば、抗ガン剤）のin vitroスクリーニング法、新形成または前新形成状態および遺伝的疾患の診断と治療のためにも有用である。
【００１４】
ARF-BP1の同定はp53活性化におけるARF-媒介作用の新規局面を明らかにする
INK4a座位の、別様読み枠の産物であるARFポリペプチドは、真の腫瘍抑制因子であることは十分に受け容れられている(Sherr et al., 2001上述；Sharpless, N.E., DePinho, R.A., 2004上述)。p53経路の活性化におけるARFに関して最初の手がかりが、ARF-媒介性機能にとってp53の安定化が必須であることを示す組織培養実験からもたらされた(Kamijo, T., et al., Cell 91:649-659, 1997)。当時、p53のユビキチン化および分解におけるMdm2の役割は発見されたばかりであった(Haupt et al., Nature 387:296-299, 1997; Honda, R., Tanaka, H., Yasuda, H., FEBS Lett 420:25-27, 1997; Kubbutat, M.H., Jones, S.N., Vousden, K.H., Nature 387:299-303, 1997)。過剰発現状況で得られた結果にほとんど基づいて、ARFとMdm2の間の、この一見明白な結びつきは、ARF-媒介性p53活性化の主要経路(Sherr et al., 2001上述)として直ちに受け容れられた。この説は、この経路に関与する他の因子の可能性の余地を見かけ上まったく持たない。
【００１５】
しかしながら、一連の証拠により、p53のARF媒介性活性化は、単純なARF-Mdm2モデルよりもはるかに複雑であることが示された。例えば、ARF-Mdm2相互作用は過剰発現状況で発見された。しかしながら、正常細胞におけるMdm2の発現レベルは低い；正常細胞において内在性ARFが内在性Mdm2と相互作用を有するかどうかは、なお未解決の問題である。さらに、正常細胞で通常観察される低レベルのMdm2は優先的にp53のモノユビキチン化を触媒する(Li et al., 2003上述)。しかしながら、興味あることに、Laneのグループによる最近の研究により、ARFは、細胞においてp53のポリユビキチン化を阻止することはできるが、p53のMdm2媒介モノユビキチン化を阻害することができないことが示された(Xirodimas, D.P., Stephen, C.W., Lane, D.P., Oncogene 20:4972-83, 2001)。これらの研究は、決定的に重要な疑問を提起する：Mdm2のレベルが低い細胞にあってARFはどのようにしてp53を安定化するのか？p53分解におけるPir2およびCOP1の重要な役割を示した最近の研究はさらに、p53の安定化は、in vivoの別の経路を通じて作用しているのではないかという考えを支持する(Leng, R.P., Lin, Y., Ma, W., et al., Cell 112:779-91, 2003; Dorman, D. et al., Nature 429:86-92, 2004)。
【００１６】
本発明は、p53のARF媒介性活性化について、新たなMdm2-非依存性経路を発見した。本発明は、ARF-BP1が、in vitroとin vivoの両方においてp53と直接に相互作用し、p53のユビキチン化をMdm2-非依存的様式で触媒することを開示する。さらに、ARF-BP1媒介性のp53のユビキチン化はARFによって強力に阻害され、Mdm2ヌル細胞におけるARF媒介性p53安定化には内在性ARF-BP1の不活性化が決定的に重要である。従って、ARF-媒介性のp53安定化は、Mdm2-非依存性およびMdm2-依存性の両方の様式で行われ得る。
本発明は、ARFによる、p53に対するARF-BP1-媒介性、および、Mdm2-媒介性制御間の関係を明らかにする。生化学的精製によりARF-BP1がARPの主要標的と特定され、かつ、内在性ARF-BP1タンパク質とARFタンパク質間の相互作用は正常細胞において簡単に検出されるので、正常細胞におけるARF-媒介性のp53活性化は、少なくとも部分的に、in vivoにおいてARF-BP1機能を阻害することを通じて作用する。従って、ARF-BP1およびMdm2両方に対するARF-媒介性制御が協同してp53の安定化を調節し、p53-媒介性機能をより効果的に活性化すると考えられる。例えば、内在性Mdm2のレベルが高い場合、p53は、主にMdm2-媒介性ポリユビキチン化によって分解される。従って、p53活性を上方調節するために、ARF-Mdm2相互作用が決定的に重要になる。対照的に、内在性Mdm2のレベルが低い場合は、ARF-BP1のARF媒介性制御がp53活性化の最重要因子となると考えられる（図19）。最近のいくつかの研究によって、p53分解は、in vivoにおいて、Mdm2-依存性経路とMdm2-独立経路の両方によって媒介されるとの考えが支持されている(Leng et al., 2003、上述；Dornan et al., 2004、上述)。RNAiノックダウン法を用いることによって、p53の、既知のE3リガーゼのそれぞれによる、p53安定化に対する示差的作用を評価した。予期した通り、Mdm2の不活性化はp53の安定化を促進し、一方、COP1またはPir2のどちらかの不活性化も、僅かではあるが、p53を安定化した。注目すべきことに、ARF-BP1の不活性化は、p53安定化を強力に誘導し、p53-媒介性転写を活性化した（図8）。ARF-BP1 RNAiによって誘導されるp21とBax誘導のレベルは、p53の他のタイプのE3 siRNAによって誘導されるレベルよりも高く（図19A）、ARF過剰発現による作用ときわめて近似していた（図20）。これらのデータは、ARF-BP1は、ヒト細胞においてp53の主要ユビキチンリガーゼの一つであり、さらに重要なことに、ARF媒介性腫瘍抑制機能の最重要標的であることを示す。
【００１７】
ARF-媒介性p53活性化について二つの異なる経路、一つはARF-BP1ユビキチンリガーゼに基づくもの、もう一つはMdm2ユビキチンリガーゼに基づくもの、が存在することによって、p53機能についてさらに融通性の高い制御が可能となるが（図19B）、同時に、それらの生物学的重要性に関する疑問も提起される。例えば、腫瘍発生におけるMdm2の重要な役割は十分に確立されている。様々なタイプの腫瘍において、Mdm2の遺伝子増幅およびタンパク質過剰発現が見出されている(Michael, D., and Oren, M., Semin Cancer Biol 13:49-58, 2003)。従って、高レベルのMdm2を発現する細胞においては、ARF-Mdm2相互作用が特に重要と考えられる。興味あることに、本発明者は、乳ガン細胞系統の80%（16/20）においてARF-BP1は高度に発現されるが、一方、正常乳房細胞(MCF-10A)におけるARF-BP1の発現レベルは低い（図19C）ことを見出した。これは、乳ガンの腫瘍形成におけるARF-BP1関与の可能性を示唆する。
【００１８】
ARF媒介性ARF-BP1阻害は、p53非依存性細胞増殖制御にとって決定的に重要である
p53の安定化および活性化におけるARFの役割は十分に受け容れられているが、ARFも、機能的p53を欠く腫瘍において変異しているか、下方調節されていることが見出されている(Sherr et al., 2001、上述)。これは、ARF媒介性のp53-非依存性機能も、p53の腫瘍抑制機能にとって決定的に重要であることを示唆する。この考えと一致して、いくつかの実験によって、ARFは、p53非依存性細胞増殖抑制を誘導することが可能であることが示されている(Weber, J.D., et al., Genes Dev. 14:2358-65, 2000; Rocha, S., Campbell, K.J., Perkins, N.D., Mol. Cell, 12:15-25, 2003)。ARF-BP1は、p53ヌル細胞におけるARFの主要結合パートナーであるという我々の所見に基づいて、本発明者は、ARF-BP1が、ARF-媒介性機能、p53-独立性機能の最重要標的であると提案する。これは、p53非含有細胞において、Mdm2ではなく、ARF-BP1の不活性化が、ARF誘導を暗示する様式で細胞増殖抑制を誘導するという事実によっても支持される。
【００１９】
ARF-BP1のARF媒介性制御が、p53-非依存性細胞増殖の停止をもたらす正確な機構は将来の研究を必要とする。ARF-BP1は真正のユビキチンリガーゼであるから、ARP-媒介性p53-非依存性機能は、未同定のARF-BP1の基質を調節することによって作用していることが考えられる（図19）。ヌクレオプラスミン／B23およびリボソームサブユニットがARF媒介性リボソームRNAプロセッシングの制御に関与することを示す最近の研究(Itahana, K et al., Mol Cell 12:1151-64, 2003; Bertwistle, D, Sugimoto, M. Sherr, C.J., Moll Cell Biol 24:985-96, 2004)に基づいて、ARF-BP1が、B23機能またはリボソームのRNA処理に直接関与しているのかどうかが調べられた。本発明は、ARF-BP1は、in vivoおよびin vitroで、B23と相互作用するが、B23をユビキチン化および分解しないことを明らかにした（図22B）。ARF-BP1は、B23ユビキチン化を媒介せず、また、ARF-BP1の除去はB23レベルに影響を与えなかった。これらの結果は、B23は、ARF-BP1ユビキチンリガーゼ活性の標的ではないことを示す。さらに、ARF経路は、in vivoでは、ガン遺伝子の活性化と緊密に連結するので(Sherr, 2001、上述；Nilsson, J.A. Cleveland, J.L. Oncogene 22:9007-21, 2003; Sharpless and Depinho, 2004、上述)、ARF-BP1とARFの相互作用およびARF-BP1のユビキチンリガーゼ活性は、細胞内においてガン遺伝子活性化またはその他のタイプのストレスの際に制御されることが考えられる。
【００２０】
ガン治療における予想される可能性
ガンの発達において、p53経路の活性化は決定的に重要であり、恐らく必然的過程と思われる。数多くの研究によって、p53の活性化が、多くのガン治療剤の機能にとって決定的に重要であること、および、p53-依存性機能が、それらの薬剤の臨床効果において決定的役割を果たすことが示されている(Lane and Fisher, Nature 427:789-90, 2004; Lowe et al., 1994; Chresta and Hickman, Nature Medicine 2:745-6, 1996; Lutzker and Levine, Cancer Treat Rep, 87:345-56, 1996)。p53に関連する新薬発見についての最近の研究も、この問題に光を投げかけている(Surendran, A., Nature Medicine, 10:9, 2004)。Nutlinは、p53-Mdm2相互作用を遮断する小型分子であるが、p53経路を活性化することによって、in vivoで腫瘍細胞を効果的に殺すことが判明した(Vassilev, L.T. et al., Science 303:844-8, 2004)。一方、53遺伝子は、50%を超えるヒト腫瘍において変異しており、かつ、腫瘍由来p53点変異の多くが、ドミナントネガティブ作用を有することが示されている(Vogelstein et al., Nature 408:307-310, 2000)。p53を経路を特異的に標的する薬剤は、機能的p53を欠く腫瘍細胞を殺すに当たって困難に遭遇する可能性がある。
【００２１】
いくつかの局面で、ARF-BP1タンパク質は、腫瘍に対する治療的介入にとって適切な標的候補である。野生型p53を発現する腫瘍細胞におけるARF-BP1の不活性化は、p53の安定化をもたらし、p53-媒介性アポトーシスを活性化する。重要なことは、機能的p53を欠く腫瘍細胞におけるARF-BP1の抑制も細胞増殖抑制を誘導することである。ARF-BP1も酵素であり、そのユビキチンリガーゼ活性は、その媒介機能にとって決定的に重要である。従って、その酵素活性の阻害因子を求める薬剤スクリーニングは、腫瘍に対する治療的介入にとって有望な戦略となると考えられる。p53機能を特異的に抑制するタンパク質、例えば、Mdm2を標的とするやり方に対し、ARF-BP1の阻害因子は、p53の状態の如何に関わらず、腫瘍細胞増殖の阻止において効果的である筈である。
【００２２】
前記に鑑み、本発明は、被験体が新形成を有するかどうかを決定する方法を提供する。本明細書で用いる「被験体」は、ウシ、イヌ、ヒト、サル、マウス、ブタ、またはラットを含むが、これらに限定されない哺乳動物である。好ましくは、被験体はヒトである。本発明者は、本発明において（例えば、図16A-Dを参照されたい）、正常（DNA損傷していない）細胞に比べ、DNA損傷を被った細胞において、ARF-BP1相互作用の有意な増強、およびARF-BP1の発現の増強が検出されることを示した。従って、本発明の方法は、被験体の診断用サンプルにおいてARF-BP1の発現について定量することを含む。その際、正常よりも上昇したレベルのARF-BP1発現が検出されることは、被験体における新形成の診断指標となる。
【００２３】
本明細書で用いる「ARF-BP1」は、ARF-BP1タンパク質、および、「保存的置換体」を含むARF-BP1アナログの両方を含む。別様に指示しない限り、「タンパク質」とは、タンパク質、タンパク質ドメイン、ポリペプチド、またはペプチドを含むものとする。本明細書において下記にも用いられるように、ARF-BP1タンパク質は、図3に記述されるアミノ酸配列（配列番号2）を有する。
本明細書で用いる「ARF-BP1アナログ」は、ARF-BP1生物活性を有する、ARF-BP1タンパク質の機能的変種であって、ARF-BP1タンパク質と、60%以上の（好ましくは70%以上）アミノ酸配列の相同性を有する変種である。ARF-BP1「アナログ」は、相同な3次元配置を有する、ARF-BP1タンパク質の変種を含む。ARF-BP1およびARF-BP1アナログは、合成的または組み換え的に生産されてもよく、あるいは、天然の細胞から単離されてもよい。ARF-BP1は、通例の技術およびARF-BP1（配列番号2）をコードするcDNAを用いて、組み換え的に生産されるのが好ましい。
【００２４】
本明細書で用いる「保存的置換体」とは、アミノ酸置換体であって、置換されたアミノ酸残基と、類似の極性または立体配置を有する、あるいは、置換された残基と同じクラス（例えば、疎水性、酸性、または塩基性）に属するために、機能的に等価なアミノ酸置換体である。本明細書で定義される「保存的置換体」という用語は、ARF-BP1のp53との相互作用能力に対し重要でない効果を有する置換体を含む、特に、p53阻害因子の同定および設計、分子置換分析、および／または相同モデリングのために前記相互作用を使用する際においては、重要でない効果を有する置換体を含む。
【００２５】
本発明の方法を用い、被験体が新形成を有するか否かを決定し、それによって、前記被験体における新形成の診断が可能となる。本明細書で用いる「新形成」とは、正常細胞の増殖を惹起しない、または増殖の停止を引き起こさないであろう条件下で、新生物細胞（すなわち、腫瘍細胞のような新形成細胞）の、制御されない進行的増殖を指す。新形成は「新生物」を生じさせるが、これは、本明細書では、任意の新規の異常な増殖、特に、細胞増殖が制御されず進行的である組織の新規の増殖を意味すると定義される。従って、新形成は「ガン」を含む。ガンは、本明細書では、正常な制御を失い、不規則な増殖、分化の欠如、局所的組織侵入、および／または転移という独特の性質を有する、新形成細胞の増殖を指す。
【００２６】
本明細書において、新形成としては、同じタイプの組織における正常な増殖と比べ、被験体の組織における細胞の形態的不規則性の外に、被験体の組織における細胞の病的増殖が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。さらに、新形成は、侵襲性または非侵襲性かいずれかの、良性腫瘍および悪性腫瘍（例えば、乳房腫瘍）を含む。悪性新形成は、より高い程度の退生、細胞分化および方向性の喪失を示し、侵入および転移の性質を有する点で、良性新形成と区別される。本明細書に記載される本発明に従って評価、検出、診断、監視、または治療することが可能な新生物または新形成の例としては、癌腫、特に、膀胱ガン、乳ガン、子宮頸ガン、直腸ガン、頭部ガン、腎臓ガン、肺ガン、頸部ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、および、胃ガン；リンパ球白血病、特に、急性リンパ芽球性白血病および慢性リンパ球白血病；骨髄性白血病、特に急性単球白血病、急性前骨髄球白血病、および慢性骨髄球白血病；悪性リンパ腫、特にバーキットリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫；悪性メラノーマ；骨髄増殖性疾患；肉腫、特にユーイング肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、末梢性感覚上皮種、および滑膜肉腫；混合型新形成、特に、ガン肉腫およびホジキン病(Beers and Berkow （編）「診断・治療メルクマニュアル」(“Merck Manual of Diagnosis and Therapy”)、17版(Whitehouse Station, N.J.: Merck Research Laboratories, 1999)973-74, 976, 986, 988, 991)が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【００２７】
前述したように、全てのガンの50%を超えるものが、p53変異に関連する。従って、本発明の一つの実施態様では、本発明の方法および組成物は、p53経路の欠陥と関連する新形成を含むp53-関連新形成の評価、検出、診断、監視、および治療に関する。本発明の別の実施態様では、本発明の方法および組成物は、乳ガン、結腸ガン、白血病、肺ガン、悪性メラノーマ、卵巣ガン、または前立腺ガンの評価、検出、診断、監視、および治療に関する。
本発明の別の実施態様では、本発明の方法および組成物は、p53経路の欠陥と関連しない新形成を含むp53-非依存性新形成の評価、検出、診断、監視、および治療に向けられる。本発明の別の実施態様では、本発明の方法および組成物は、乳ガン、結腸ガン、白血病、肺ガン、悪性メラノーマ、卵巣ガン、または前立腺ガンの評価、検出、診断、監視、および治療に関する。
【００２８】
本発明の方法によれば、被験体の診断用サンプルは、in vitroまたはin vivoで評価することができる。アッセイがin vitroで実行される場合、被験体からの診断用サンプルは、標準的手順を用いて取り出すことができる。この診断用サンプルは、任意の骨、脳組織、乳房組織、結腸組織、筋組織、神経組織、卵巣組織、前立腺組織、網膜組織、皮膚組織、または、標準的バイオプシーによって取り出される軟部組織を含む組織であってもよい。さらに、診断用サンプルは、体液であって、脳脊髄液、心膜液、腹腔液、唾液、血清、および尿を含む体液であってもよい。さらに、被験体または患者から採取される診断用サンプルは、例えば、新生物を有することが知られる任意の組織、新生物を有することが疑われる任意の組織、または、新生物を有すると考えられる任意の組織であってもよい。
タンパク質は、従来技術で既知の標準法、例えば、要すれば組織からの抽出（例えば、タンパク質を可溶化する界面活性剤による）、次に、カラム、クロマトグラフィーにおけるアフィニティー精製（例えば、FTLC、およびHPLC）、免疫沈降法（例えば、ARF-BP1に対する抗体による）、および沈殿法（例えば、イソプロパノールおよび、トリゾールのような試薬による）を含む方法によって単離、精製されてもよい。タンパク質の単離および精製の次には電気泳動を行ってもよい（例えば、SDS-ポリアクリルアミデゲル上にて）。核酸は、従来技術で既知の標準的技術を用いて診断用サンプルから単離されてもよい。
【００２９】
本発明の方法によれば、被験体における新形成は、被験体の診断用サンプルを、ARF-BP1の発現についてアッセイすることによって診断されてもよい。その際、正常よりも上昇したレベルのARF-BP1発現が検出されることは、新形成を診断する指標になる。本明細書において、「発現」とは、遺伝子の、少なくとも1個のmRNA転写体への転写、あるいは、少なくとも1個のmRNAのタンパク質への翻訳を意味する。例えば、「ARF-BP1の発現」は、上に定義した通り、ARF-BP1遺伝子の、少なくとも1個のｍRNA転写体への転写、あるいは、少なくとも1個のｍRNAの、ARF-BP1タンパク質への翻訳を意味する。従って、診断用サンプルは、ARF-BP1タンパク質、ARF-BP1 cDNA、またはARF-BP1 mRNAをアッセイすることによって、ARF-BP1発現についてアッセイすることができる。ARF-BP1の適切な形態は、本明細書中で論じられる特定の技術に基づいて明らかである。
さらに、ある被験体または患者が新形成を有するかどうかを決めるために、診断用サンプルは、ARF-BP1タンパク質の任意の、または全ての形態（前駆体、内部タンパク質分解処理された形態、および、その他の翻訳後修飾によって得られる形態）の発現についてアッセイされてもよいことが了解される。さらに、本明細書に開示されるように、p53-ARF-BP1相互作用の増加を検出することによって、診断用サンプルにおける、ARF-BP1発現の正常よりも上昇したレベルをアッセイしてもよいことが了解される。従って、本発明の一つの実施態様において、正常よりも上昇したARF-BP1発現は、正常よりも上昇したレベルのp53-ARF-BP1相互作用を検出することによって検出される。
【００３０】
本明細書において「正常よりも上昇した」という語は、同じ性別で、同じ年齢の、非疾病被験体または患者（すなわち、新形成を有しない個体）から得られた同じタイプの診断用サンプルについて期待されるレベルよりも有意に高いレベルが検出されること（例えば、ARF-BP1の発現、p53-ARF-BP1相互作用、または、ARF-BP1-ARF相互作用等の検出）を指す。さらに、本明細書において、「有意に高い」とは、（例えば、ARF-BP1の発現、p53-ARF-BP1相互作用、または、ARF-BP1-ARF相互作用等の）正常よりも上昇したレベルと、（例えば、ARF-BP1の発現、p53-ARF-BP1相互作用等の）期待される（正常）レベルとの差が統計的に有意であることを意味する。
【００３１】
正常よりも上昇したARF-BP1発現（またはp53-ARF-BP1相互作用）は、そうでない場合に期待されるARF-BP1発現（またはp53-ARF-BP1相互作用）のレベルよりも少なくとも10%高いレベルのARF-BP1発現（またはp53-ARF-BP1相互作用）であることが好ましい。ARF-BP1発現（またはp53-ARF-BP1相互作用）が、特定の被験体または患者から採取した特定の診断用サンプルにおいて欠如することが予想される場合、その被験体または患者については、ARF-BP1発現（またはp53-ARF-BP1相互作用）の正常レベルはゼロである。ある特定の被験体または患者から採取したある特定の診断用サンプルが、低レベルの構成的ARF-BP1発現（またはp53-ARF-BP1相互作用）を有すると予想される場合、その低いレベルが、その被験体または患者のARF-BP1発現（またはp53-ARF-BP1相互作用）の正常レベルである。
【００３２】
ある被験体または患者から採取したある特定の診断用サンプルについて、期待される、または正常レベルのARF-BP1発現は、同年齢、同性の、非疾病被験体をアッセイすることによって簡単に定めることが可能である。例えば、男性におけるARF-BP1発現の正常量を決めるためには、診断用サンプルは、年齢が25から80の間の、少なくとも30名の、正常な、健康な男性から得ることができる。女性におけるARF-BP1発現の正常量を決めるためにも、同じような手順に従ってよい。一旦必要なまたは所望のサンプルが得られたならば、男性および女性におけるARF-BP1発現の正常量は、定量のための標準的アッセイ法、例えば、後述する、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット分析、または、タンパク質量測定用ELISAを用いて決定することができる。例えば、ELISAは、各サンプルについて二重に実施し、ARF-BP1タンパク質量の平均および標準偏差を決定してもよい。要すれば、ARF-BP1発現の正常量を定量する前に、さらに追加の被験体を募ってもよい。類似のタイプの手順を用い、ある被験体または患者から採取したある特定の診断用サンプルについてp53-ARF-BP1相互作用の、期待または正常レベルを決定することができる。
【００３３】
本発明の方法によれば、被験体の診断用サンプルをARF-BP1発現（またはp53-ARF-BP1相互作用）についてアッセイすることができ、診断用サンプルにおいて、ARF-BP1発現（またはp53-ARF-BP1相互作用）は、従来技術で簡単に定められるアッセイおよび検出法（例えば、免疫学的技術、ハイブリダイゼーション分析、蛍光画像技術、および／または、放射能検出等）の外に、本明細書に開示される任意のアッセイおよび検出法（例えば、免疫沈降法、ウェスタンブロット分析等）を用いて検出することができる。例えば、被験体の診断用サンプルは、ARF-BP1の阻害因子を用いてARF-BP1発現についてアッセイすることができる。本明細書において、「阻害因子」とは、興味の標的（例えば、ARF-BP1）に対して親和性を有する、結合する、阻害する、または、拮抗作用を有する作用因子を意味する。本明細書において用いる「作用因子」とは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸（DNAまたはRNAを含む）、抗体、Fab断片、F(ab')2断片、分子、化合物、抗生物質、薬剤、およびそれらの任意の組み合わせを含むものとする。Fab断片とは、抗体の、1価の抗原結合性断片であり、これは、パパイン消化によって生産される。F(ab')2断片は、抗体の、2価の抗原結合性断片であり、これは、ペプシン消化によって生産される。本発明の作用因子は、検出可能なマーカーまたはラベルで標識されるのが好ましい。
【００３４】
本発明の一つの実施態様では、ARF-BP1の阻害因子は抗体である。本明細書において、本発明の抗体は、ポリクローナルであっても、モノクローナルであってもよい。さらに、本発明の抗体は、当業者によく知られる技術によって生産することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、マウス、ウサギ、またはラットを精製タンパク質（例えば、ARF-BP1）によって免疫化することによって生産することができる。次に、モノクローナル抗体は、免疫化マウスから脾臓を取り出し、脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを形成することによって生産することができる。ハイブリドーマは、培養物として増殖するとモノクローナル抗体を生産する。
【００３５】
本発明で用いる抗体は、検出可能なマーカーまたはラベルで標識してもよい。抗体の標識は、種々の標識技術、ペルオキシダーゼ、従来技術で既知の化学的発光ラベル、および、従来技術で既知の放射能ラベルを含む標識技術を用いて実現してもよい。本発明の検出可能なマーカーまたはラベルは、例えば、非放射能、または蛍光マーカー、例えば、ビオチン、フルオレセイン(FITC)、アクリジン、コレステロール、または、カルボキシ-X-ローダミンであってもよい。これらは、蛍光、および従来技術でよく知られる他の画像化技術によって検出することが可能である。別態様として、検出可能なマーカーまたはラベルは、例えば、放射性同位元素を含む放射性マーカーであってもよい。放射性同位元素とは、検出可能な放射線を発する任意の同位元素、例えば、35S、32P、125I、3H、または14Cであってもよい。放射性同位元素によって発射される放射能は、従来技術でよく知られる技術によって検出することが可能である。例えば、放射性同位元素からのガンマ放射は、ガンマ画像化技術、特に、シンチグラフィー画像化法によって検出することが可能である。本発明の作用因子は、検出可能なマーカーまたはラベルで標識された、高い親和性を有する抗体（例えば、α-ARF-BP1）であることが好ましい。
【００３６】
本発明の作用因子が、ARF-BP1と反応する抗体である場合、被験体から採取される診断用サンプルは、アフィニティーカラムを通過させることによって精製してもよい。このカラムは、固相支持体、例えば、ビーズ、ゲル、またはプレートの形態である不溶性有機ポリマーのような固相支持体に付着したリガンドとしてARF-BP1抗体（例えば、α-ARF-BP1）を含む。固相支持体に付着させた抗体は、カラムの形態で使用することができる。好適な固相支持体の例としては、アガロース、セルロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、セファローズ、またはその他の不溶の有機ポリマーが挙げられるが、ただしそれらに限定されない。ARF-BP1抗体（例えば、α-ARF-BP1）はさらに、要すれば、スペーサー分子を介して固相支持体に付着させてもよい。作用因子および抗体の結合を確保するために好適な結合条件（例えば、温度、pH、および塩濃度）は、熟練した当業者によって簡単に決定することが可能である。好ましい実施態様では、ARF-BP1抗体（例えば、α-ARF-BP1）は、セファローズカラム、例えば、セファローズ4Bに付着される。
作用因子が抗体である場合、被験体の診断用サンプルは、標準的免疫学的検出技術と共に、ARF-BP1と免疫反応を有する1種以上の抗体を利用する結合実験によってARF-BP1発現をアッセイすることができる。例えば、アフィニティーカラムから溶出されたARF-BP1タンパク質を、ELISAアッセイ、ウェスタンブロット分析、フローサイトメトリー、または、その他の、抗原-抗体相互作用を用いる任意の免疫染色法で分析することができる。診断用サンプルは、ウェスタンブロッティングを用いてARF-BP1発現についてアッセイするのが好ましい。
【００３７】
別態様として、被験体の診断用サンプルは、前記被験体から採取した診断用サンプルから抽出された核酸のハイブリダイゼーション分析を用いて、ARF-BP1発現についてアッセイすることができる。本発明のこの方法によれば、ハイブリダイゼーション分析は、ｍRNAのノーザンブロット分析を用いて行われてもよい。この方法はまた、ARF-BP1をコードする核酸にハイブリダイズする、1種以上の核酸プローブによる、DNAのサザーンブロット分析を実行することによって行ってもよい。核酸プローブは、当業者には既知の種々の技術、例えば、下記を含む技術によって調製されてもよいがそれらに限定されない。その技術とは、すなわち、ARF-BP1核酸の制限酵素消化、および、ARF-BP1核酸のヌクレオチド配列の選択された部分に一致する配列を有するオリゴヌクレオチドの、市販のオリゴヌクレオチド合成機、例えば、Applied BiosystemsのModel 392 DNA/RNA合成機による自動化合成である。
【００３８】
本発明におけるARF-BP1の発現の（または、p53-ARF-BP1相互作用、または、ARF-BP1-ARF相互作用等の）検出の後には、被験体の診断用サンプルにおけるARF-BP1発現の程度を測定または定量するアッセイを行ってもよい。そのようなアッセイは当業者にはよく知られているが、例えば、免疫組織化学／免疫細胞化学、フローサイトメトリー、質量分析、ウェスタンブロット分析、または、ARF-BP1タンパク質の量を測定するためのELISAが挙げられる。例えば、免疫組織化学アッセイを用いるためには、組織の組織学的（パラフィン包埋）切片をスライドの上に設置し、次に、AFR-BP1に対する抗体とインキュベートしてもよい。次に、切片中に存在するARF-BP1の視像化を可能とするために、スライドを、色素、またはその他の比色システム（例えば、蛍光色素、放射性物質、または、高い電子走査能を有する作用因子）でタグ付けした（１次抗体に対する）第２抗体とインキュベートしてもよい。
本発明における診断用サンプルは、多くの場合、ARF-BP1発現（または、p53-ARF-BP1相互作用）について被験体または患者によってアッセイされるのでも、彼／彼女の主治医によってアッセイされるのでもなく、検査室の技師、またはその他の臨床医によってアッセイされることが想定される。従って、本発明の方法は、被験体または患者の診断用サンプルをARF-BP1発現についてアッセイした際に得られた結果の報告を、被験体または患者の主治医に提供することをさらに含む。
【００３９】
同様に、本発明は、被験体の診断用サンプルにおいてARF-BP1発現についてアッセイすることによって、前記被験体が新形成を有するかどうかを決定する方法を提供する。その際、診断用サンプルにおける正常よりも上昇したARF-BP1発現が検出されることが、被験体における新形成の診断指標となる。前述のように、ガンは、ARF-BP1、Mdm2、および／または、p53の欠陥を含む、p53経路の欠陥に関連する。従って、一つの実施態様では、本発明の方法および組成物は、p53-関連新形成の評価、検出、診断、監視、および治療に関する。別の実施態様では、本発明の方法および組成物は、p53-非依存性新形成の評価、検出、診断、監視、および治療に関する。
本発明の方法によれば、診断用サンプルは、前述したように、ARF-BP1タンパク質、ARF-BP1 cDNA、またはARF-BP1 mRNAをアッセイすることによって、ARF-BP1発現についてアッセイすることができる。ARF-BP1に関連して前述したように、ある被験体または患者から採取したある特定の診断用サンプルについて、期待される、または正常レベルのARF-BP1発現は、同年齢、同性の、非疾病被験体をアッセイすることによって簡単に決定することが可能である。
【００４０】
ある被験体または患者が新形成を有するかどうかを決めるために、診断用サンプルは、ARF-BP1タンパク質の任意の、または全ての形態（前駆体、内部タンパク質分解プロセッシングされた形態、および、その他の翻訳後修飾によって得られる形態）の発現についてアッセイできることが了解される。さらに、p53-ARF-BP1相互作用の増加を検出することによって、診断用サンプルにおける、p53の正常よりも上昇した発現、およびARF-BP1の正常よりも上昇した発現についてアッセイしてもよいことが了解される。従って、本発明の一つの実施態様では、診断用サンプルにおける正常よりも上昇したp53の発現、および正常よりも上昇したARF-BP1の発現は、前記診断用サンプルにおいて正常よりも上昇したp53-ARF-BP1相互作用を検出することによって検出される。さらに、診断用サンプルについてARF-ARF-BP1相互作用の増加を検出することによって、正常よりも低下したARFの発現、および正常よりも上昇したARF-BP1の発現をアッセイすることが可能であると考えられる。従って、本発明の一つの実施態様では、診断用サンプルにおける正常よりも上昇したp53の発現および正常よりも上昇したARF-BP1の発現は、前記診断用サンプルにおける、正常よりも上昇したp53-ARF-BP1相互作用を検出することによって検出される。本発明の別の実施態様では、診断用サンプルにおける正常よりも低下したARFの発現および正常よりも上昇したARF-BP1の発現は、前記診断用サンプルにおける、正常よりも上昇したARF-ARF-BP1相互作用を検出することによって検出される。
【００４１】
被験体の診断用サンプルは、本明細書に記載される方法に従って、ARF、ARF-BP1発現、および／または、p53-ARF-BP1相互作用についてアッセイすることができる。診断用サンプルにおけるp53発現、ARF-BP1発現、および／またはARF-BP1相互作用はまた、従来技術から簡単に求められるアッセイおよび検出法の外に、本明細書に開示される任意のアッセイおよび検出法によって検出することができる。
例えば、被験体の診断用サンプルは、前記被験体から採取した診断用サンプルから抽出された核酸のハイブリダイゼーション分析を用いて、ARF-BP1発現についてアッセイすることができる。この方法は、ARF-BP1をコードする核酸にハイブリダイズする核酸プローブを利用することが好ましい。一つの実施態様では、この核酸プローブは、検出可能なマーカーまたはラベルで標識される。別態様として、被験体の診断用サンプルは、ARF-BP1発現について、ARF-BP1と反応する作用因子を用いてアッセイすることもできる。本発明の作用因子は、検出可能なマーカーまたはラベルで標識されるのが好ましい。本発明の一つの実施態様では、ARF-BP1と反応する作用因子は抗体（例えば、抗ARF-BP1モノクローナル抗体）である。
本発明の作用因子が、ARF-BP1と反応する抗体である場合、被験体から採取される診断用サンプルは、アフィニティーカラムを通過させることによって精製することができる。このカラムは、ARF-BP1検出のための前述の技術に従って、固相支持体、例えば、ビーズ、ゲル、またはプレートの形を取る不溶の有機ポリマーである固相支持体に付着したリガンドとして、ARF-BP1抗体を含む。さらに、作用因子が抗ARF-BP1抗体である場合、被験体の診断用サンプルは、本明細書においてARF-BP1と関連して記載したように、標準的免疫学的検出技術と共に、ARF-BP1と免疫反応を有する1種以上の抗体を用いる結合実験を用いてARF-BP1発現についてアッセイすることができる。
【００４２】
本発明の方法においてARF-BP1発現、および／またはARF-ARF-BP1相互作用、および／またはp53-ARF-BP1相互作用を検出したその後は、被験体の診断用サンプルにおけるARF-BP1発現、および／またはARF-ARF-BP1相互作用、および／またはp53-ARF-BP1相互作用の程度を測定する、または定量するアッセイを行ってもよい。さらに、本発明の方法は、被験体または患者の診断用サンプルをARF-BP1発現、および／またはARF-ARF-BP1相互作用、および／またはp53-ARF-BP1相互作用についてアッセイした際に得られた結果の報告を、被験体または患者の主治医に提供する工程をさらに含んでもよい。
【００４３】
本発明はさらに、新形成の治療を受けたことがある、あるいは、現に受けている被験体または患者における新形成治療法の効力を評価する方法を提供する。本発明の方法は、ARF-BP1発現について前記被験体または患者の診断用サンプルをアッセイすることを含み、正常レベルのARF-BP1が検出されることは新形成治療法の成功の指標であり、正常よりも上昇したARF-BP1発現が検出されることは新形成治療法続行の必要性の指標となる。本発明の一つの実施態様では、正常よりも上昇したARF-BP1発現は、正常よりも上昇したp53-ARF-BP1またはARF-ARF-BP1相互作用の検出によって検出される。新形成は、p53-依存性新形成およびp53-非依存性新形成を含む、上述の新形成の内の任意のものであってよい。診断用サンプルは、上述のように、組織または体液であってよく、in vitroまたはin vivoにおいてARF-BP1の発現（またはp53-ARF-BP1相互作用および／またはARF-ARF-BP1相互作用）についてアッセイすることができる。さらに、前述の、種々のアッセイおよび検出および定量法の内の全てを用いて、ARF-BP1の発現（またはp53-ARF-BP1相互作用および／またはARF-ARF-BP1相互作用）についてアッセイすることができる。本発明のこの方法は、被験体または患者から採取した診断用サンプルにおいてARF-BP1の発現（またはp53-ARF-BP1相互作用および／またはARF-ARF-BP1相互作用）レベルの定期的評価を可能とすることによって、新形成治療法の効力を監視する手段を提供する。
【００４４】
本発明の方法によれば、被験体または患者の診断用サンプルは、新形成治療法の開始後任意の時点でアッセイし、ARF-BP1の発現（またはp53-ARF-BP1相互作用および／またはARF-ARF-BP1相互作用）レベルを評価することができる。例えば、ARF-BP1の発現（またはp53-ARF-BP1相互作用および／またはARF-ARF-BP1相互作用）レベルは、被験体または患者が現在新形成治療法を受けている間に評価することもできる。被験体または患者のアッセイされる診断用サンプルにおいて検出されるARF-BP1の発現（またはp53-ARF-BP1相互作用および／またはARF-ARF-BP1相互作用）レベルが、依然として正常を上回って上昇したままである場合、医師は、被験体のまたは患者の新形成治療法を続行することを選ぶことができる。被験体または患者の定量される診断用サンプルにおいてARF-BP1の発現（またはp53-ARF-BP1相互作用および／またはARF-ARF-BP1相互作用）レベルが、連続評価を通じて低下する場合、それは、新形成治療が効いていること、および、治療は減らすか、または止めることが可能であることの指標であり得る。被験体または患者のアッセイされた診断用サンプルにおいてARF-BP1の発現（またはp53-ARF-BP1相互作用および／またはARF-ARF-BP1相互作用）レベルが連続評価を通じて迅速に低下しない場合、それは、新形成治療が効いていないこと、および、治療用量を増加することも可能であることの指標であり得る。被験体または患者のアッセイされた診断用サンプルにおいてARF-BP1の発現（またはp53-ARF-BP1相互作用および／またはARF-ARF-BP1相互作用）が、正常よりも上昇したレベルでもはや検出されない場合、医師は、新形成治療は成功でありこの治療は止めてよいと結論することができる。
【００４５】
新形成が被験体または患者において再発したかどうかを決定するために、被験体または患者の新形成治療法の完了後にARF-BP1のレベルを評価することは、本発明の範囲内にある。従って、アッセイされた診断用サンプルにおけるARF-BP1の発現（またはp53-ARF-BP1相互作用および／またはARF-ARF-BP1相互作用）レベルの評価は、新形成を有すると診断された患者の経過追跡を実行する好適な方法を提供する可能性がある。さらに、アッセイされた診断用サンプルにおけるARF-BP1の発現（またはp53-ARF-BP1相互作用および／またはARF-ARF-BP1相互作用）レベルを、臨床または病理段階判定ツールとして、被験体または患者における新形成の程度を判断する手段として、かつ、適切な治療選択肢を確認する手段として用いることは、本発明の範囲内にある。
【００４６】
本発明はまた、新形成の治療を受けた、あるいは、現に受けている被験体における新形成治療法の有効性を、前記被験体の診断用サンプルをARF-BP1発現についてアッセイすることによって評価する方法を提供する。その際、診断用サンプルにおける正常レベルのARF-BP1が検出されることは新形成治療法の成功の指標であり、診断用サンプルにおける正常よりも上昇したARF-BP1発現が検出されることは新形成治療法続行の必要性の指標となる。本発明の一つの実施態様では、診断用サンプルにおける正常よりも上昇したARF-BP1発現は、前記診断用サンプルにおいて正常よりも上昇したp53-ARF-BP1相互作用の検出によって検出される。新形成は、p53-依存性新形成およびp53-非依存性新形成を含む、上述の新形成の任意のものであってよい。本発明の方法に使用される、好適な診断用サンプル、アッセイ、および検出および定量法は、既に上述した。
【００４７】
一般に、腫瘍負荷と、ガンを有する患者の生存の間には相関が存在する。従って、被験体の診断用サンプルを、ARF-BP1発現について定量することは、新形成を有する被験体または患者の予後に関する情報を提供する有用な手段である可能性のあることは、本発明においても考慮される。従って、本発明はさらに、新形成を有する被験体の予後を評価する方法であって、前記被験体の診断用サンプルをARF-BP1発現についてアッセイすることを含む方法を提供する。その際、被験体の予後は、前記被験体の診断用サンプルにおけるARF-BP1発現の低下と共に改善し、被験体の予後は、前記被験体の診断用サンプルにおけるARF-BP1発現の上昇と共に悪化する。本発明の一つの実施態様では、正常よりも上昇したARF-BP1発現は、正常よりも上昇したp53-ARF-BP1相互作用の検出によって検出される。本発明の方法に使用される、好適な診断用サンプル、アッセイ、および検出および定量法は、既に上述した。本発明の方法は、新形成を有すると診断された被験体または患者について、前記被験体または患者のアッセイされた診断用サンプルにおけるARF-BP1の発現（またはp53-ARF-BP1相互作用および／またはARF-ARF-BP1相互作用）レベルに基づいて、前記被験体または患者の予後を決定する手段を提供する。
【００４８】
本発明の方法によれば、被験体または患者の診断用サンプルは、前記被験体または患者における新形成の診断中、または診断後の任意の時点においてアッセイすることができ、ARF-BP1の発現（またはp53-ARF-BP1相互作用および／またはARF-ARF-BP1相互作用）レベルについて評価することができる。例えば、被験体または患者の初期予後を決定するために、アッセイされる診断用サンプルにおけるARF-BP1の発現（またはp53-ARF-BP1相互作用および／またはARF-ARF-BP1相互作用）レベルを、前記被験体または患者が新形成治療を受ける前に評価することができる。さらに、被験体または患者の予後が、治療経過中に多少なりとも好転したかを決定するために、アッセイされる診断用サンプルにおけるARF-BP1の発現（またはp53-ARF-BP1相互作用および／またはARF-ARF-BP1相互作用）レベルを、前記被験体または患者が新形成治療を受けている間に評価することもできる。
例を挙げて示すと、被験体または患者のアッセイされた診断用サンプルにおいて検出されるARF-BP1の発現（またはp53-ARF-BP1相互作用および／またはARF-ARF-BP1相互作用）レベルが顕著に高い、または顕著に高いままである場合、医師は、被験体のまたは患者の予後は望ましくないと結論してよい。被験体または患者の定量される診断用サンプルにおいてARF-BP1の発現（またはp53-ARF-BP1相互作用および／またはARF-ARF-BP1相互作用）レベルが連続評価を通じて低下する場合、それは、被験体または患者の予後が改善しつつあることの指標であり得る。被験体または患者のアッセイされる診断用サンプルにおいてARF-BP1の発現（またはp53-ARF-BP1相互作用および／またはARF-ARF-BP1相互作用）が、連続評価を通じて著明に低下しない場合、それは、被験体または患者の予後が改善していないことの指標であり得る。最後に、被験体または患者のアッセイされる診断用サンプルにおいてARF-BP1の発現（またはp53-ARF-BP1相互作用および／またはARF-ARF-BP1相互作用）が低いか、正常である場合、医師は、前記被験体または患者の予後は望ましいと結論してよい。
【００４９】
ARF-BP1が新形成を示す細胞において検出され得るという発見は、新形成を有する患者を特定する手段を提供し、かつ、新形成診断テストとして市販応用の可能性を示す。そのようなテストの開発は、一般的なスクリーニング過程を提供する。このような過程は、新形成、または新形成前駆状態、または新形成の遺伝的素因の早期検出および診断を助け、かつ、正常よりも上昇したARF-BP1の発現（またはp53-ARF-BP1相互作用および／またはARF-ARF-BP1相互作用）が検出された患者の経過追跡のための方法を提供することが可能である。
【００５０】
従って、本発明はさらに、新形成のアッセイ用キットであって、ARF-BP1と反応する作用因子、および、ARF-BP1の発現（およびp53-ARF-BP1相互作用および／またはARF-ARF-BP1相互作用）を検出するのに好適な試薬を含むキットを提供する。本発明はまた、新形成を検出するのに用いられるキットであって、(a)ARF-BP1と反応する少なくとも1種の作用因子、および、(b)ARF-BP1の発現を検出するのに好適な試薬、を含むキットを提供する。前記作用因子は、上述の任意のものであってよく、ARF-BP1の発現、p53-ARF-BP1相互作用、およびARF-ARF-BP1相互作用を検出または定量するための、上述のアッセイまたは方法の任意のものにおいて使用することができる。本発明の少なくとも1種の作用因子は、検出可能なマーカーまたはラベルで標識されることが好ましい。
【００５１】
上述したように、全てのガンの50%を超えるものがp53変異に関連する。従って、p53は、多くのガン治療における鍵であり、p53経路は特別な関心の的である。p53は一般的に安定なタンパク質ではない。p53の半減期は約20分であり、ユビキチン化（ユビキチンの結合）後、タンパク質分解経路においてプロテオソームによって極めて速やかに分解される。p53の安定化は、腫瘍抑制因子としてのこのタンパク質の効力にとって重要であると考えられている。
p53経路の欠陥に関連するいくつかのガンは、p53の欠陥によって起こるのではなく、ARF-BP1変異（例えば、コード領域における遺伝子変化による変異）および／または発現レベルにおけるARF-BP1調節の欠陥（例えば、ARF-BP1遺伝子のプロモーター領域における遺伝子変化によって起こる欠陥）によって起こるものであることが予測される。前記に鑑みて、細胞内のARF-BP1レベルを調節することは、p53の腫瘍抑制機能を増強し、かつ、この機能をARF-BP1自身の腫瘍抑制活性で補強するための手段となることは明白である。従って、本発明はさらに、治療を要する被験体の新形成を治療する方法であって、前記被験体にARF-BP1活性を下げることを含む方法を提供する。新形成は、p53-依存性新形成およびp53-非依存性新形成を含む、上述の新形成の任意のものであってよい。
【００５２】
本発明の方法によれば、被験体におけるARF-BP1の活性は、ARF-BP1を直接に標的とすることによって低下させることが可能である。さらに、被験体におけるARF-BP1活性は、前記被験体におけるARF-BP1の機能またはレベルを調節または制御する酵素またはその他の内在性分子を標的化することによって間接的に低下させることが可能である。本発明の方法では、被験体におけるARF-BP1活性は、少なくとも10%低下させることが好ましい。ARF-BP1活性は少なくとも20%低下させることが好ましい。
【００５３】
例えば、被験体におけるARF-BP1の活性は、前記被験体におけるARF-BP1の1種以上の機能を、直接的または間接的に、阻害、結合、または中和することによって（例えば、ARF-BP1と相互作用を有するタンパク質を調節または制御することによって）低下させてもよい。本明細書で用いる「阻害する」という用語は、被験体におけるARF-BP1の機能、特に、p53のユビキチン化、およびそれから導かれるp53の脱安定化を低下または消失させることを意味する。本発明の方法においては、被験体のARF-BP1は、例えば、上に定義した、ARF-BP1を阻害する、またはARF-BP1と反応する小型分子またはタンパク質模倣物を、前記被験体に投与することによって抑制してもよい。
【００５４】
被験体におけるARF-BP1の活性はまた、前記被験体においてARF-BP1発現の上方調節を、直接的または間接的に、阻止、抑制、または阻害することによって低下させてもよい。従って、本発明の一つの実施態様では、被験体におけるARF-BP1の活性は、前記被験体において新形成を治療するのに十分な量のARF-BP1発現の阻害因子を被験体に投与することによって低下させる。本明細書で用いる「発現の阻害因子」とは、ある特定のタンパク質の発現に対し拮抗的（抑制）または協調的（促進）作用を有する、任意の作用因子またはそれらの組み合わせであってもよい。従って、発現の調節因子とは、作用因子または拮抗因子であり得る。本発明の調節因子は、関心のあるタンパク質（例えば、ARF-BP1）の発現を阻害または下方調節する、任意のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸（DNAまたはRNAを含む）、抗体、Fab断片、F(ab')2断片、分子、化合物、抗生物質、および、薬剤、および、前記タンパク質と反応する作用因子を含む。
【００５５】
ARF-BP1の阻害因子は、簡単なスクリーニングアッセイを用いて特定することが可能である。例えば、ARF-BP1の阻害因子候補をスクリーニングするためには、ヒトの肺ガン細胞(H1299)を、マイクロタイタープレートに撒き、薬剤ライブラリーに接触させてもよい。次に、いかなるARF-BP1発現の低下または下方調節も従来技術で既知の核酸ハイブリダイゼーションおよび／または、ELISAを含む免疫学的技術を用いて検出することが可能である。さらなるARF-BP1発現の阻害因子は、従来技術で既知の、または、本明細書に開示されるスクリーニング工程を用いて特定することができる。ARF-BP1の阻害因子とは、ARF-BP1の発現を阻止または下方調節する作用因子である。このようにして、候補阻害因子も、新形成における細胞分裂または細胞増殖の速度が低下する、または停止することを示す指標としてARF-BP1発現を用いることによって、新形成増殖の抑制能力に関してスクリーニングすることが可能である。
【００５６】
新形成治療の有効性を上げるために、標的照準の効率を上げるために、および／または、p53脱ユビキチン化の効率を上げるために、ARF-BP1発現の阻害因子を、別の作用因子に結合させてもよく、あるいは、別の薬剤、例えば、抗ガン剤またはリボザイムと組み合わせて投与してもよいが、それらは本発明の範囲内にある。ARF-BP1発現阻害因子を結合し得る抗ガン剤の例としては、カルボプラチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、エトポシド、およびビンクリスチンが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
被験体におけるARF-BP1の活性はまた、in vivoで、被験体内部のARF-BP1のレベルを直接的または間接的に下げることによって低下させてもよい。例を挙げて説明すると、被験体におけるARF-BP1の活性は、前記被験体において新形成を治療するのに十分な量のARF-BP1結合タンパク質を被験体に投与することによって低下させることができる。
【００５７】
本発明の方法によれば、ARF-BP1阻害因子は、単独で、または、新形成の治療に使用される1種以上の抗ガン剤と組み合わせて、新形成を有する被験体に投与することができる。ARP-BP1結合タンパク質を組み合わすことのできる抗ガン剤の例としては、カルボプラチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、エトポシド、およびビンクリスチンが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
本発明の方法では、ARF-BP1発現の阻害因子、ARF-BP1タンパク質、または、ARF-BP1をコードする核酸配列は、新形成を有する被験体に対し、前記被験体において新形成を治療するのに十分な量として投与される。本明細書で用いる「新形成を治療するのに有効な」という句は、新形成に由来する臨床的障害または症状を緩和する、または抑えるのに有効であることを意味する。例えば、新形成の臨床的障害または症状は、被験体の被る任意の痛みまたは不快を低減する；そのような治療が無かったならば予想された程度を超えて被験体の生存を延長する；新形成の発達または拡大を抑制または阻止する；または、新形成における細胞の成熟および増殖を制限、中断、停止、またはその他のやり方で抑制することによって緩和または抑止されてもよい。被験体において新形成を治療するために効果的なARF-BP1発現の阻害因子、ARF-BP1タンパク質、またはARF-BP1をコードする核酸の量は、新形成の型、新形成の段階、患者の体重、患者の状態の重篤度および投与方法を含む各事例の具体的な要素に依存して変動するであろう。これらの量は熟練した者により容易に決定することができる。
【００５８】
本発明の方法では、ARF-BP1発現阻害因子、ARF-BP1タンパク質、または、ARF-BP1をコードする核酸配列は、既知の経路、例えば、経口投与、非経口投与（例えば、筋膜上、関節嚢胞内、上皮内、内皮内、筋肉内、眼窩内、腹腔内、脊髄内、胸骨内、血管内、静脈内、実質内、または、皮下投与）、経皮投与、および浸透圧ポンプによる投与を含む、ただしこれらに限定されない、経路によってヒトまたは動物被験体に投与することができる。一つの好ましい投与法は、非経口投与、静脈内または皮下注入による。
【００５９】
経口投与の場合、ARF-BP1阻害因子、タンパク質、または核酸は、カプセル、錠剤、散剤、顆粒、または懸濁液として提供されてもよい。この処方は、通例の添加剤、例えば、ラクトース、マンニトール、トウモロコシでん粉、またはジャガイモでん粉を有してもよい。この処方はまた、結合剤、例えば、結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、トウモロコシでん粉、またはゼラチンと共に提供されてもよい。さらに、この処方は、崩壊剤、例えば、トウモロコシでん粉、ジャガイモでん粉、またはナトリウムカルボキシメチルセルロースと共に提供されてもよい。この処方はまた、無水リン酸二水素カルシウムまたはでん粉グリコール酸ナトリウムと共に提供されてもよい。最後に、この処方は、例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤とともに提供されてもよい。
【００６０】
非経口投与の場合、ARF-BP1阻害因子、タンパク質、または核酸は、被験体の血液と好ましくは等張である、無菌の水性溶液と混合されてもよい。このような処方は、固体の活性成分を、生理的適合物質、例えば、塩化ナトリウム、グリシン等を含み、生理的条件と適合する緩衝されたpHを有する水に溶解して水溶液を生産し、次に前記溶液を無菌にすることによって調製することができる。この処方は、単位用量、または複数用量容器、例えば、密封カプセルまたは瓶に容れて提供されてもよい。この処方はまた、前述の任意のものを含む、任意の注入方式によってデリバリーすることができる。
【００６１】
経皮投与の場合、ARF-BP1阻害因子、タンパク質、または核酸は、前記調節因子、タンパク質、または核酸に対する皮膚の浸透性を増し、調節因子、タンパク質、または核酸が皮膚を貫いて浸透し血流に侵入するのを可能とする皮膚浸透増強剤、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、イソプロパノール、エタノール、オレイン酸、N-メチルピロリドン等と混合してもよい。前記増強剤および調節因子、タンパク質、または核酸の組成物はまた、ポリマー物質、例えば、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチレン／ビニールアセテート、ポリビニールピロリドン等と混合してもよい。これによってゲル形状の組成物が得られ、これを、塩化メチレンのような溶媒に溶解し、所望の粘度まで蒸発させ、次に、裏打ち物質に塗布してパッチを提供することができる。この阻害因子、タンパク質、または核酸は、被験体の新形成が局在する部位またはその近傍に経皮的に投与することができる。別態様として、阻害因子、タンパク質、または核酸は、全身投与を実現するために患部とは別の部位に経皮的に投与することができる。
【００６２】
本発明のARF-BP1阻害因子、タンパク質、または核酸はまた、浸透圧ミニポンプ、またはその他の徐放装置から放出またはデリバリーすることもできる。簡単な浸透圧ミニポンプからの放出速度は、放出オリフィスに配される、微小多孔性の、即応性ゲルによって調節することができる。浸透圧ミニポンプは、阻害因子、タンパク質、または核酸の徐放放出あるいは標的化デリバリーに有用であろう。
ARF-BP1発現の阻害因子がタンパク質であるかまたはARF-BP1タンパク質が治療選択肢である場合、本発明の方法においては、前記タンパク質をコードする核酸を被験体中で前記タンパク質の発現を可能とするやり方で被験体の十分な数の細胞中に導入することによって、前記タンパク質を被験体に投与または導入してもよい。治療タンパク質をコードする核酸の量は、上に定義したように、被験体において新形成を治療するのに有効な量のタンパク質を生産する量である。この量は当業者によって簡単に決めることが可能である。
【００６３】
ARF-BP1発現の阻害因子、またはARF-BP1タンパク質をコードする核酸、および、ARF-BP1発現の任意のヌクレオチド調節因子は、従来技術で既知の通例の手順、例えば、電気穿孔、DEAEデキストラントランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクション、モノカチオン性リポソーム融合、ポリカチオン性リポソーム融合、プロトプラスト融合、in vivo電場の形成、DNA被覆微小弾丸発射法、組み換え複製欠陥ウィルスによる注入、相同組み換え、in vivo遺伝子治療、エクスビボ遺伝子治療、ウィルスベクター、および、天然DNA転送、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、ただしそれらに限定されない。遺伝子治療に好適な組み換えウィルスベクターは、レトロウィルス、HSV、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、セムリキ森林ウィルス、サイトメガロウィルス、およびワクシニアウィルスが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
細胞における治療タンパク質の発現を実現するために、ARF-BP1発現の阻害因子、またはARF-BP1タンパク質そのものをコードする核酸を、通例の手順を用いてin vitroにおいて適切な細胞に導入することができる。次に、この、ARF-BP1発現の阻害因子、またはARF-BP1タンパク質を発現する細胞を被験体に導入して、新形成をin vivoにおいて治療することができる。このようなエクスビボ遺伝子治療法では、細胞は、被験体から取り出し、治療タンパク質をコードする核酸を取り込むようにDNA技術を実施し、次に、これを被験体に再導入することが好ましい。
【００６４】
ARF-BP1阻害因子、タンパク質、または核酸を含む処方物はさらに、製薬学的に許容できる担体と一緒にし、それによって医薬組成物を含むようにすることができるが、これも本発明の範囲内にある。従って、本発明はさらに、ARF-BP1発現の阻害因子、ARF-BP1タンパク質またはARF-BP1タンパク質をコードする核酸、および製薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物を提供する。この製薬学的に許容できる担体は、組成物の他の成分と適合的であり、そのレシピエントに対して有害でないという意味で「許容」できなければならない。許容できる製薬学的担体の例としては、特に、カルボキシメチルセルロース、結晶セルロース、グリセリン、アラビアゴム、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、散剤、生食液、アルギン酸ナトリウム、スクロース、でん粉、タルク、および水が挙げられる。本医薬組成物の剤形は、単位剤形として提供されると好都合である。
【００６５】
本発明の処方物は、製薬技術においてよく知られる方法によって調製することができる。例えば、ARF-BP1阻害因子、タンパク質、または核酸は、懸濁液または溶液として、担体または希釈剤と一緒にしてもよい。場合により、1種以上の補助成分（例えば、バッファー、芳香剤、界面活性剤等）も加えてよい。担体の選択は、投与ルートに依存するであろう。本医薬組成物は、新形成を治療するために、本発明のARF-BP1阻害因子、タンパク質、または核酸を被験体に投与するのに有用と考えられる。ARF-BP1阻害因子、タンパク質、または核酸は、本医薬組成物が投与される被験体において新形成を治療するのに有効な量として与えられる。その量は、前述のように、当業者には簡単に決めることが可能である。
本発明はさらに、被験体のp53活性を増大させる、または増強することによって前記被験体の新形成を治療する方法を提供する。その際、被験体のp53活性は、前記被験体におけるARF-ARF-BP1またはp53-ARF-BP1相互作用を阻害することによって増大または増強される。本発明の方法では、被験体のp53活性は、少なくとも10%増大または増強されることが好ましい。被験体のp53活性は、少なくとも20%増大または増強されることがより好ましい。新形成は、p53の状態に拘わらず、上記の内の任意のものであってよい。
【００６６】
本明細書に開示するように、本発明者は、アフィニティー精製p53結合因子の質量分析を用いて、ARF-BP1がp53に結合し、これをユビキチン化することを明らかにした。ARF-BP1阻害は、過剰なMdm2の存在下であってもp53を強力に活性化し、p53-依存性およびp53-非依存性細胞増殖抑圧およびアポトーシスを誘導する。重要なことに、ARF-BP1は、in vitroおよびin vivoの両方において、p53を特異的にユビキチン化する本来的酵素活性を有する。一方、細胞における触媒的に不活性なARF-BP1の点変異体の発現は、p53ユビキチン化の低下レベルを増し、p53を安定化する。これらの所見は、直接の脱ユビキチン化によってp53が安定化され得る重要な機構を明らかにする。前記に鑑み、本発明はさらに、p53を含む細胞においてp53を脱ユビキチン化および／または安定化する方法を提供する。この方法は、p53を脱ユビキチン化および／または安定化するのに有効な量のARF-BP1に細胞を接触させることを含む。
【００６７】
本発明の方法は、in vitroにおいて、または被験体のin vivoにおいて、p53を脱ユビキチン化する、あるいは、p53からユビキチンを取り除くために使用することができる。p53の脱ユビキチン化は、本明細書に開示される方法、分子過程、およびアッセイの内の任意のものを含む既知の過程によって検出することができる。p53の脱ユビキチン化を調節するARF-BP1の阻害能力によって、ARF-BP1は、前述のように、新形成、特にp53-関連新形成を治療するのに特に有用となる。従って、本発明の一つの実施態様では、被験体は新形成を有するヒトであり、ARF-BP1阻害はその新形成を治療する。
本発明の方法は、in vitroにおいて、または被験体のin vivoにおいて、p53の脱ユビキチン化を調節する（すなわち、p53からユビキチンを除去する、またはp53にユビキチンを加えることによって）ために使用することができる。本明細書に開示する通り、p53の脱ユビキチン化が増加されると、p53の安定性も増加する。p53のユビキチン化および脱ユビキチン化は、本明細書に開示される方法、分子過程、およびアッセイの内の任意のものを含む既知の過程によって検出されてよい。
【００６８】
本発明はまた、候補作用因子が、ARF-BP1-p53相互作用を阻害する能力を評価することによって、p53と反応する作用因子を同定する方法を提供する。別様に指示しない限り、「p53」は、p53タンパク質（GenBankアクセス番号CAA38095）とその保存的置換体、およびp53アナログの両方を含む。「p53アナログ」とは、p53の生物活性を持ち、p53タンパク質と60%以上の（好ましくは70%以上）アミノ酸配列相同性を有する、p53タンパク質の機能的変種である。本明細書において後述するように、「p53生物活性」という用語は、本明細書に記載されるアッセイ条件下において、ARF-BP1と検出可能な（ネガティブコントロールのバックグラウンド結合を約2倍、より好ましくは約5倍上回る）結合を示すタンパク質またはペプチドの活性を指す。ただし、アフィニティーは、p53のものと異なってもよい。
一つの実施態様では、競合結合アッセイにおいて、標準法を用い、ARF-BP1のp53に対する結合において、ARF-BP1を外すまたはそれに置き換わることによって、ARF-BP1とp53の相互作用を阻害する候補作用因子の能力を評価することができる。このような競合的結合アッセイでは、候補作用因子はp53に対する結合に関してARF-BP1と競合し、一旦p53に結合すると、p53に対するARF-BP1の結合を立体配置的に妨げ、それによってARF-BP1によるp53のユビキチン化を阻止する。競合的結合アッセイは、ARF-BP1-p53相互作用の阻害を評価するのに便利な方法である。なぜなら、その場合、p53とARF-BP1を含む未精製抽出物の使用が可能だからである。
【００６９】
従って、本発明はさらに、(c)ARF、ARF-BP1、またはp53を含む1以上の細胞に候補作用因子を接触させる工程；および(d)前記因子が、1以上の細胞において、1種以上の、ARF、ARF-BP1、またはp53-関連生物学的事象に対して影響を与えるかどうかを決定する工程を含む。本明細書で用いる「ARF-BP1-関連生物学的事象」とは、ARF-BP1活性が関与する生化学的または生理学的過程（例えば、新形成）を含む。本発明の一つの実施態様では、例えば、方法はさらに、(c)新生物の1以上の細胞（新形成細胞）に候補作用因子を接触させる工程；および(d)前記因子が、新形成細胞の増殖に作用を及ぼすかどうかを決定する工程を含む。本明細書で下記に用いる「ARF-BP1を含む」細胞とは、ARF-BP1、またはその誘導体または相同体が天然に発現される、または天然に生じる細胞である。
本明細書に記載されるデータを生成するために、下記の材料および方法を用いた。
【００７０】
プラスミドおよび抗体
ARF-BP1のcDNAをクローン化するために、ARF-BP1の全長をカバーする、5個の重複cDNA配列を、Marathon-Ready HeLa cDNA(Clontech, BD)からPCRによって増幅し、pcDNA3.1/V5-His-Topoベクター(Invitrogen)にサブクローン化した。配列確認後、cDNA配列同士をアッセンブルし、さらに発現ベクターにクローン化した。変異体構築物(ARF-BP1(M), ARF-BP1(R), ARF-BP1M(R))を調製するために、異なる領域に対応するcDNA配列を、前述の構築物から、QuickChange Site-Directed Mutagenesisキット(Stratagene)を用いてPCRによって増幅し、特異的制限酵素を用い全長ARF-BP1にサブクローニングした。HA-ARF-Flag構築物については、HAおよびFlag配列を、それぞれ、ARFのN末端およびC末端に、PCRによって導入し、pCIN4ベクターにサブクローン化した。Flag-p53、GST-ARF、およびGST-Mdm2を構築するために、それぞれの全長タンパク質に対応するcDNA配列を、他の発現ベクターからPCRによって増幅し、バクテリア内で発現させるために、pET-FlagまたはpGEX(GST)ベクターにサブクローン化した(Li et al., 2003、前述)。GST-ARF変異体構築物を調製するために、異なる領域に対応するcDNA配列を、ARF(wt)構築物からPCRによって増幅した。アデノウィルス-ARFを構築するために、cDNA ARFを先ずpShuttle-IRES-hrGFP-1ベクター(Stratagene)にクローンした。次に、この得られたプラスミドで、組換えのために、アデノウィルス骨格プラスミドpAdEasy-1を含む大腸菌株BJ5183を形質転換した。組換えアデノウィルスARFの増幅のためにAD-293細胞を用いた。
【００７１】
ARF-BP1抗血清を調製するために、ARF-BP1の191個のアミノ酸（残基3435-3626）に対応するDNA配列をPCRによって増幅し、pGEX-2Tにサブクローン化した(Luo, J. et al., Cell 107:137-48, 2001)。α-ARF-BP1抗血清をウサギにおいて精製GST-ARF-BP1(3435-3626)融合タンパク質(Covance)に対して惹起し、さらに抗原カラムにおいてアフィニティー精製した。p53-特異的モノクローナル(DO-1)およびポリクローナル(FL-392)抗体、抗-p21ポリクローナル、抗-Mdm2(SMP40)モノクローナル抗体、Mycポリクローナル抗体をSanta Cruzから購入した。抗-GFPモノクローナル、および抗-GSTモノクローナル抗体をClontechから購入した。抗-V5モノクローナル抗体をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。マウスモノクローナル(4C6/4)p14ARF、およびウサギポリクローナルp14ARF(ab470)抗体をAbcamから購入した。
【００７２】
ヒト細胞からのARF-複合体の精製
ヒト細胞からARF-含有タンパク質複合体を単離するために、エピトープ標識戦略を、若干の修正を加えたが事実上以前に記載された通りに行った(Luo, J. et al., Nature 408:377-81, 2000; Nikolaev, A.Y., et al., Cell 112:29-40, 2003)。簡単に言うと、HA-ARF-Flag発現細胞系統を得るために、p53非含有H1299細胞をpCIN-HA-ARF-Flagでトランスフェクションし、1 mg/ml G418(GIBCO)中で2週間選択した。このタグ付きARFタンパク質のレベルはウェスタンブロット分析によって検出した。H1299細胞における異所性ARFタンパク質の発現レベルが内在性タンパク質のレベルに極めて近似するという事実に基づいて、安定細胞株を選択し、複合体精製のために拡張した。このようにして、細胞を、10%ウシ胎児血清添加DMEMにて増殖し、集密近くにおいて収集した。細胞ペレットを、バッファーA(10 mM HEPES pH7.9, 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF、およびタンパク質阻害剤の混合物[Sigma])に再懸濁した。細胞を氷上で10分間膨潤させ、その後10% NP 40 (Fluka)を、0.5%の最終濃度となるまで加えた。このチューブを1分間激しく渦巻き攪拌した。ホモジェネートを4,000rpmで10分遠心した。核のペレットを、氷冷バッファーC(20 mM HEPES pH7.9, 0.4 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1mM PMSF、およびタンパク質阻害剤の混合物)に再懸濁し、チューブを4℃で45分間激しく搖動攪拌した。核抽出物をバッファーD(20 mM HEPES[pH7.9], 1 mM EDTA)で、最終的に100 mM NaCl濃度となるように希釈し、25,000 rpm, 4℃で2時間超遠心した。0.45/μmシリンジフィルター(NALGENE)によってろ過した後、この上清を、抗-FLAG抗体接合アガロース（Sigma）によるM2免疫沈降用の核抽出物として用いた。結合ポリペプチドをFLAGペプチドで溶出し、さらに、抗-HA抗体接合アガロース(Sigma)にてアフィニティー精製した。HAペプチド付属HAビーズからの最終溶出液を、4％-20％勾配ゲル(Novax)においてSDS-PAGEにて展開し、銀染色またはコロイド青染色分析に用いた。ゲルから特異的バンドを切り出し、質量分析ペプチド配列決定法を行った。
【００７３】
p53-ヌル細胞およびp53発現細胞におけるRNAIによる内在性ARF-BP1の除去
p53-ヌル細胞(H1299およびSaos-2)、およびp53-発現細胞（U2OS、MCF-7、およびA549）を、10%ウシ胎児血清添加DMEMにて維持した。HCT116およびHCT116-p53(-/-)細胞株は、B. Vogelstein研究室から恵与されたものである。内在性ARF-BP1のRNAi媒介性除去は、本質的に以前に記載された通りに行った(Elbashir, S.M. et al., Nature 411:494-498, 2001)。ARF-BP1 mRNA（ARF-BP1 #1）(AAUUGCUAUGUCUCUGGGACA)、または(ARF-BP1 #2) (AAGUAUCCCUACCACCUCAUG)に対応する、3'dTdTオーバーハング付き、21-ヌクレオチドsiRNAを合成した(Dharmacon)。2個のヌクレオチドを変化させた同じ配列(ARF-BP1 #1変異体)を特異的RNAiコントロールとして用いた。配列(AAGAGGACUCCGCUACUGACA)をMEF細胞に対するマウスARF-BP1 RNAiとして用いた。配列AAGGUGGGAGUGAUCAAAAGGをMdm2 RNAiとして用いた。RNAiトランスフェクションは、オリゴフェクタミン試薬(Invitrogen)を用いて行った。トランスフェクションの2時間前、約百万個の細胞を10 cmペトリ皿に撒いた。メーカーのプロトコール(Invitrogen)を用い、24-48時間間隔で3回細胞をトランスフェクトした。最低3回の連続トランスフェクション後、ウェスタンブロット分析、フローサイトメトリー分析、細胞数カウント、または免疫染色のために細胞を採取した。
【００７４】
BRDU標識
BrdU取り込みアッセイを、本質的に以前に記載された通りに行った(Yarbrough, W.G. et al., Cancer Res 62:1171-7, 2002)。簡単に言うと、20 gM BrdU(Calbiochem)を含む培養液中で2時間増殖し、次に70%エタノール中で固定した。DNAを変性し、細胞を、2N HCl, 0.5% Triton X-100(Sigma)で透過性にし、0.1 M Na2B4O7(pH8.5)で中和し、次にPBSに溶解した1%BSAでブロックした。製造業者のプロコール(Amersham)に従って抗-BrdUを加えた。1%BSA/PBSで洗浄後、細胞をAlexa488結合抗-マウスIgG(Molecular Probes)とインキュベートした。最後に、核を視像化するために細胞をDAPIによってカウンター染色した。
【００７５】
in vitroユビキチン化反応用成分のタンパク質精製
in vitroユビキチン化アッセイ用の精製成分を調製するために(Li et al., 2003、前述)、Rosetta (DE3) pLys(Novagen)細胞において、室温にて、Flag-p53、E3(GST-ARF-BP1 3760-4374)、およびGST-ARFを誘導し、タンパク質を、1%NP-40を含むバッファーBC500(20 mM Tris-HCl, pH7.3, 0.2 mM EDTA, 500 mM NaCl, 10%グリセロール、1 mM DTT、および0.5 mM PMSF)にて抽出し、グルタチオン-セファローズ(Pharmacia)またはM2ビーズ(Sigma)にて精製した。ウサギE1はCalbiochemから購入した。ウサギE2およびHis-Ubは精製タンパク質としてAffinity Inc.から購入した。
【００７６】
in vitroユビキチン化アッセイ
このin vitroユビキチン化アッセイは、若干の修正を加えて以前に記載された通りに行った(Li et al., 2003、前述)。自己ユビキチン化アッセイのために、200 ngのバクテリア生産GST-ARF-BP1(3760-4374)、またはその近似変異体を、10 μlの反応バッファー(40 mM Tris, 5 mM MgCl2, 2 mM ATP, 2 mM DTT, pH7.6)において、E1(10 ng)、E2(His-Ubc5a, 100 ng)、および5 μgのHis-ユビキチンを含む、その他の成分と混合した。400 ngのバクテリア生産GST-ARFまたはGST-ARF変異タンパク質を阻害因子として加えた。37℃にて60分後、SDSサンプルバッファーを加えて反応を停止させ、次いで、ウェスタンブロット分析のためにSDS-PAGEゲルによって分離した。
p53のユビキチン化のために、20 ngの細菌生産Flag-p53を、100 μlの反応バッファー(40 mM Tris, 5 mM MgCl2, 2 mM ATP, 2 mM DTT, pH7.6)において、E1(100 ng)、E2(His-UbcH5a, 1 μg)、E3(細菌生産GST-ARF-BP1(3760-4374))(400 ng)および20 μgの細菌生産His-HA-ユビキチンを含む、その他の成分と混合した。1 μgの細菌生産GST-ARFまたはGST-ARF変異タンパク質を阻害因子として加えた。37℃で2時間インキュベーション後、500 μlのFlag溶解バッファーの添加後、15 μlの抗-FLAG抗体-結合アガロースを加え、次いで4℃で一晩回転させた。溶出液を抗-p53(DO-1)抗体を用いウェスタンブロットで分析した。
【００７７】
本発明を、下記の実施例においてさらに詳細に説明する。これらの実施例は、例示的かつ非限定的なものと解すべきである。
【００７８】
実施例１
本実施例はp-53-ヌル細胞からのARF-会合核複合体の主要構成要素としてARF-BP1を同定したことを明らかにするものである。
ARF-媒介機能のin vivo標的を明らかにするために、エピトーグタグ法を用いてヒト細胞からARF-含有タンパク質複合体を単離した。この方法はHDACIおよびp53複合体のようなタンパク質複合体を精製するために本発明者らが開発したものであるが（Gu, W., Malik, S., Ito, M., Yuan, C.S., Fondeil, J.D., Zhang, X., Martinez, E., Qin, J., Roeder, R.G., Mol Cell 3:97-108, 1999; Luo, J., Su, P., Chen, D., Shiloh, A., Gu. W. Nature 408: 377-81, 2000; Nikolaev, A.Y., Li, M., Puskas, N., Qin, J., Gu, W., Cell 11:29-40, 2003）、タンパク質複合体の化学量論を改善するため幾つかの改変を行った。具体的には、N-末端HA-およびC-末端FLAGエピトープを含む二重タグ付けヒトARFタンパク質（HA-ARF-Flag（図１A））を安定に発現するヒト肺がんp53-ヌル細胞H1299細胞株の誘導体を作製した。ARFを過剰発現する細胞に起こるかもしれない非生理的相互作用を回避するため、異所性ARFタンパク質を内在性ARFと同様なレベルで発現するH1299誘導体を使用した（図１B）。したがって、このタグ付きタンパク質複合体は内在性ARF複合体の天然の状態を反映したものである。
【００７９】
ARFを含むタンパク質複合体を単離するため、HA-ARF-Flag発現H1299細胞およびコントロール細胞（親H1299細胞）からの核抽出物をまずM2（Flag抗体）アガロースビーズ上でアフィニティークロマトグラフィーにかけた。結合したタンパク質をFALGペプチドで溶出し、溶出物をHA-アフィニティーカラムでクロマトグラフィーにかけた。最後に、結合したタンパク質はHAペプチドでカラムから溶出させ、SDS-PAGEで分画し、銀染色により視覚化した（図１C）。既知のARF-結合タンパク質、B23/ヌクレオプラスミン(NPM)がこの複合体から同定された（図１C）。予想外に、HA-ARF-Flag発現H1299細胞からはARFと共に共精製された〜500 kDaの主要タンパク質(p500)バンドが見られたが（レーン２）、親H1299細胞からは見られず（レーン１）、このことはこのタンパク質がARFの特異的結合パートナーであることを示唆している。このタンパク質をARF-BP1（ARF-結合タンパク質１）と命名した。ウェスタンブロット解析によればこれらの複合体中に有意なレベルのMdm2は検出されず、ARFと共に共精製された副次的なバンド（図１C）の質量分光分析はMdm2配列を同定できなかった。従って、これらのデータはARF-BP1がこれらの細胞のARF-会合複合体の主要構成成分であることを示唆している。
【００８０】
実施例２
本実施例は新規なユビキチンE3リガーゼ、ARF-BP1の初期的特性解析を示したものである。
質量分光分析によるARF-BP1バンドのペプチド配列決定により、GeneBankデータベースの単一のcDNA部分クローン（アクセッション番号Gi 22090626）に合致する２つの配列が明らかになった。UREB1（上流イニシエーター-様配列結合タンパク質１）と名付けられたこのタンパク質の小さな断片は最初本発明者らによりプレプロダイノルフィン遺伝子プロモーターの結合タンパク質として同定されたが、その生物学的機能は以前には知られていなかった（Gu, J., Ren, K., Dubner, R., およびIadarola, M.J., Brain Res mol Brain Res. 24:77-88, 1994）。
【００８１】
cDNAをRACE（cDNA末端の迅速増幅）およびデータベース中の部分cDNA配列のホモロジーアランメントによって完全長ヒトARF-BP1をアッセンブルした。ヒトARF-BP1 cDNAは4374アミノ酸タンパク質（図2Aおよび３）をコードしており、ARF-BP1の完全長タンパク質は公表されたUREB1配列（Guら、1994既述）よりも3000アミノ酸以上長い。配列番号１はヒトARF-BP1タンパク質（図２A）をコードするDNA配列を表している。配列番号２はヒトARF-BP1タンパク質のアミノ酸配列を表している（図３）。
【００８２】
ARF-BP1のC-末端はいくつかのユビキチンE3リガーゼと共通のシグネチャーモチーフ（HECTドメイン）を有している（図２Aおよび２B）。保存された約350アミノ酸HECTドメインを共通にするHECTドメインはUbと触媒性チオールエステルを形成するCys残基を保持しており、このドメインは真性のE3リガーゼ酵素モチーフとして考えられている。ARF-BP1はまたユビキチン結合ドメイン（UBA）を含んでいる（図２Aおよび４）。このドメインは、DNA修復タンパク質Rad23またはCb1ユビキチンリガーゼのようなユビキチン化経路にリンクした種々のタンパク質に見られる短い配列である（Hicke, L.,およびDunn. R., Annu Rev Cell Dev Biol 19:141-172, 2003; Buchberger, A., Trends in Cell Biol. 12:216-221, 2002）。ノーザンブロット解析によりARF-BP1 mRNAはヒト組織の種々の型の細胞において普遍的に発現していることが示された（図２C）。
【００８３】
実施例３
本実施例はARF-BP1がin vitroおよびin vivoの両方でARFと相互作用することを明らかにするものである。
ARFとARF-BP1との物理的相互作用を確認するため、ARF-BP1のARFへのin vitro結合を評価した。ARFポリペプチドは大雑把には以下の２つの主要な機能的ドメインに分けることができる：１βエクソンによってコードされ、ARF-媒介p53作用およびp53非依存性ARF機能に重要であるN-末端領域（N-ARF：残基1-64）、および、ヒトとマウス対応物で保存されておらず機能が分かっていないC-末端領域。図５Aに示したように、35S-標識ARF-BP1（1-1014）（ARF-BP1のN-末端1014残基を含むポリペプチド）は固定化GST-ARFと結合しなかった（レーン７−９）。対照的に、35S-標識ARF-BP1（1015-4574）は完全長ARF(GST-ARF、レーン３)およびN-末端ARFドメイン（GST-N-ARF、レーン５）のいずれにも強く結合したが、C-末端ARFドメイン（GST-C-ARF、レーン６）またはGST単独（レーン２）には結合しなかった。興味深いことに、ARF-BP1はARF変異体に弱く結合したが（GST-ARFΔ1-14、レーン４）、これは最初の１４アミノ酸がARFとARF-BP1の相互作用を有意に損なうが完全には排除しないことを示している。
【００８４】
ARFとARF-BP1とのin vivo相互作用を確認するため、ARF-BP1の191アミノ酸断片（残基3435-3626）に対して誘起したアフィニティー精製ポリクローナル抗血清を得た。前記領域は既知のいずれのタンパク質とも明らかな相同性を示さない領域である。ウェスタンブロット解析をすると、この抗体はヒト細胞中のARF-BP1ポリペプチドを特異的に検出した（図５B、レーン１）。内在性ARF-BP1とARFポリペプチドとの相互作用を調べるため、未改変H1299細胞の細胞抽出物をα-ARF-BP1またはコントロールIgGで免疫沈降させた。ウェスタンブロット解析により、この抗体は内在性ARF-BP1を免疫沈降させることが明らかになった（図５B、上パネル、レーン３）；より重要なことに、ARFはα-ARF-BP1抗血清によって得られた免疫沈降物中に明瞭に検出された（図５B、下パネル、レーン３）がコントロールIgGでは検出されなかった（図５B、下パネル、レーン２）。逆に、内在性ARF-BP1はARF特異的抗体により容易に免疫沈降したが（図５C，レーン３）、コントロール抗体では沈降しなかった（図５C、レーン２）。これらのデータは、ARFとARF-BP1がin vitroおよびin vivoの両方において相互作用することを示している。
【００８５】
実施例４
本実施例は、ARF-BP1のHECTドメインがユビキチンリガーゼ活性を有しており、その活性がARFによって強く阻害されることを示すものである。
ARFはMdm2を核内にとどめることによってp53を安定化することができ、また、Mdm2の酵素活性を直接阻害することによってp53を安定化することができる。ARFがARF-BP1のユビキチンリガーゼ活性を阻害することができるかどうかを調べるため、ARF-BP1を精製構成成分を用いたin vitroアッセイにおいて酵素活性について調べた。ARF-BP1のHECTドメインを含むGST-ARF-BP1(3760-4374)ポリペプチド（図３、配列番号２）をバクテリアで発現させ、ほぼ均一にまで精製した。図５Dに示したように、GST-ARF-BP1(3760-4374)をユビキチン、E1、およびE2（UbcH5c）の存在下でインキュベーションするとARF-BP1のユビキチン-結合形態が容易に形成された（レーン２）。特に、この活性は組換え完全長ARFによって強く示された（レーン３）。さらに、結合結果（図５A）と一致して、ARFの進化的に保存されたN-末端もARF-BP1-媒介自己ユビキチン化を阻害したが、C-末端領域は阻害しなかった（レーン４、５）。これらのデータはARFがARF-BP1ユビキチン活性の強力な阻害因子として機能することを示唆している。
【００８６】
実施例５
本実施例は、ARF-BP1の不活性化がp53-ヌル細胞において細胞増殖抑制を誘導することを示すものである。
正常細胞においてARFはMdm2機能を阻害することによってp53を安定化および活性化するが、ARFはp53-ヌル細胞の増殖を阻害することもできる。ARFがARF-BP1機能を阻害することによってp53非依存性増殖抑制を誘導するかどうかを決定するため、内在性ARF-BP1の阻害が、p53-ヌル細胞においてARF誘導を暗示するような様式で細胞増殖を阻害するかどうかを調べた。p53-ヌルH1299細胞をARF-BP1特異的siRNA（ARF-BP1-RNA#1）またはコントロールsiRNA（GFP-RNAi）でトランスフェクションした。図６Aに示したように、ARF-BP1-RNA#1による三回の連続するトランスフェクション後、内在性ARF-BP1ポリペプチドのレベルは激しく低下した（上パネル、レーン３対レーン２）。p21およびMdm2（p53の２つの転写標的）の定常状態レベルはARF-BP1消失によって影響を受けなかった。予想外なことに、ARF-BP1-RNAi処理はこれらの細胞の増殖速度を有意に低下させた（図６B）。このことは、ARF-BP1不活性化が細胞増殖抑制を誘導することを示唆している。これらの細胞は内在性Mdm2発現をRNAiで減少させると僅かに速く増殖した（図６A、６B）。BrdU取込を監視することにより（図６C）、ARF-BP1ノックアウトはp53-ヌル細胞の増殖を阻害するが、Mdm2ノックダウンはp53-ヌル細胞の増殖を中程度に促進することが見いだされた。他のp53-ヌル細胞株（SaoS-2、図６Dおよび６E）およびARF-BP1 mRNAの異なる領域を認識する他のsiRNA（RNAi／ARF-BP1#2）によっても同様な結果が得られた（図７A-D）。
【００８７】
p53-ヌル細胞におけるARF-媒介細胞増殖はあまりよく解析されておらず、いくつかのp53-ヌルヒト細胞株においてARF発現がG2/M停止を誘導するという証拠がある（Normand, Gら、2005）。H1299細胞におけるARF-BP1不活性化によって媒介される細胞増殖停止の性質を解析するために、これらの細胞におけるARF発現の効果を調べた。図８に示したように、ARF発現はこれらの細胞のG2/M蓄積を誘導したが、明らかなアポトーシス細胞（サブG1）は観察されなかった（iii対i）。予想外なことに、これらの細胞におけるARF-BP1 RNAiによるARF-BP1の不活性化は同様なレベルのG2/M停止をもたらした（図８）。これらの結果は、ARF-BP1の不活性化はARF誘導を暗示するような様式でこれらのp53-ヌル細胞の増殖を阻害することを示すものである。
【００８８】
実施例６
本実施例は正常細胞内の内在性ARF-BP1の不活性化がp53を安定化させp53依存性アポトーシスを誘導することを明らかにするものである。
p53-陽性細胞におけるARFおよびARF-BP1相互作用の役割を更に調べるため、野生型p53を発現している細胞におけるARF-BP1不活性化の機能的結果をテストした。ヒト骨肉腫細胞U20SをARF-BP1特異的siRNA（ARF-BP1-RNAi#1）またはコントロールsiRNA（GFP-RNAi）でトランスフェクションした。予想外なことに、ARF-BP1発現のRNAi-媒介ノックダウンは内在性p53の定常状態レベルを上昇させ（図9A）、p53ポリペプチドの半減期を延長した（図９Bおよび10）。p53の転写標的であるp21およびBAXの発現はARF-BP1不活性化により強く誘導された（図９A）。ARF-BP1消失はまたプログラム細胞死も誘導した；図９Cに示したようにARF-BP1-RNAi#1処理U20S細胞の32.3％がアポトーシスを起こしたが(II)、コントロールトランスフェクション細胞では有意なアポトーシスは観察されなかった（I）。これらのデータはARF-BP1の不活性化がp53を安定化しp53によって媒介される機能を活性化することを示している。
【００８９】
Mdm2はARF-媒介p53活性化における一次標的であると考えられていたので、これらの結果は予想外のものであった。ARF-BP1消失によって誘導される特異的効果を確認するためコントロール実験を行った。
ARF-BP1 mRNAの異なる領域を認識する別のARF-BP1特異的siRNA（RNAi/ARF-BP1#2）（「方法」参照）を用いて内在性ARF-BP1タンパク質レベルのノックダウンを行った（点変異型siRNA（ARF-BP1-RNAi#1mut）ではノックダウンされない）（図７Dおよび11）。p53のレベルはこれらの細胞で上昇した。同様な結果は、MCF-7ヒト乳がん細胞（図１２）、A549ヒト肺腺ガン細胞（図１２）および正常ヒト繊維芽細胞（NHF-1）（図１３）を含む野生型p53機能を維持した種々の細胞株を用いても得られた。
ARF-BR-RN1-媒介効果の特異性を更に明らかにするため、レスキュー実験を行った。RNAi#1標的領域に点変異を含む（ARF-BR1(R)）新たな発現ベクターを作製した（図１４）。この変異体はARF-BP1 RNAi#1による効果に免疫性である。ARF-BP1のユビキチンリガーゼ活性の重要性を更に明らかにするため、別の変異体（ARF-BP1M(R)）を作製した。この変異体ではHECTドメインの保存シスチン残基がアラニンに置換されている（図１４Ａ）。in vitroユビキチンアッセイにより、HECTドメインのこの変異はARF-BP1のユビキチンリガーゼ活性を消失させることが確認された（図１４B）。
【００９０】
「レスキュー実験」を行うため、ARF-BP1-RNAi#1を用いたU2OS細胞のRNAiアッセイを採用した。レスキューはARF-BP1変異体（ARF-BP1(R)）の発現によって試みた。図９Dに示したように、ARF-BP1 RNAi#1処理後、内在性p53は安定化されp21が活性化された。ARF-BP1(R)発現はARF-BP1 RNAi#1によるこのp53安定化およびp21誘導を反転させた（レーン３対レーン２）。同様なレベルで発現させたHETC変異型（ARF−BP1M(R)）はこの効果のレスキューができなかった（レーン４対レーン２）（図９D）。H1299細胞においてこのアプローチをp53非依存性機能に関して用いた。ARF-BP1 RNAi#1処理によって誘導された細胞増殖阻害はARF-BP1(R)によってレスキューされたが、HECT変異型（ARF-BP1M(R)）によってはレスキューされなかった。このことはARF-BP1-RNAi媒介効果の特異性を示すだけではなくARF-BP1-媒介機能におけるユビキチンリガーゼ活性の重要性も示している。
【００９１】
ARF-BP1のこれらの効果がp53依存性であることを確認するため、siRNAアッセイを野生型p53を発現するおよび発現しない一対の同質遺伝型ヒト結腸直腸ガン細胞株で行った。図９Eに示したように、HCT116親細胞およびHCT116 p53(-/-)細胞をRNAi処理にかけたところ、ARF-BP1ノックダウンは親細胞においてはp53を安定化させp21を誘導したが、p53ヌル細胞においてはそうではなかった。対照的に、c-Mycおよびアクチンのようなコントロールタンパク質のレベルはこのRNAi処置によって影響を受けなかった。ARF-BP1消失はHCT116親細胞においてはアポトーシスを誘導したがp53-ヌルHCT116細胞では誘導しなかった（図１５）。親細胞ではMdm2の定常状態レベルもARF-BP1不活性化によって誘導され、このことはMdm2がp53の転写標的であるという事実と一致する。p53ヌル細胞におけるMdm2レベルはARF-BP1消失によっては影響されなかった（図９E）。このことはARF-BP1の不活性化はp53を安定化させるがMdm2安定化には影響を与えないことを示唆している。ARF-BP1不活性化が正常細胞においてp53を安定化および活性化させるに十分であることを明らかにすることにより、これらの結果はARF/ARF-BP1相互作用は少なくとも部分的にはARFによって誘導されるp53活性化に寄与していることを明らかにするものである。
【００９２】
実施例７
本実施例はARF-BP1がp53に直接結合してユビキチン化し、ARF-BP1-媒介p53ユビキチン化がARFによって阻害されることを明らかにするものである。
ARF-BP1がARF非存在下でp53に結合し得るかどうかを決定することによってp53とARF-BP1との機能的関係を評価した。図１６に示したように35S-標識in vitro-転写したARF-BP1（1015-4374）は固定化GST-p53ポリペプチドに強く結合したがGST単独には結合しなかった（レーン３対レーン２）。逆に、ARF-BP1とGST-Mdm2との間には有意な結合は検出されなかった（レーン４）。
ヒト細胞における内在性p53とARF-BP1タンパク質との間の相互作用を調べるため、U20S細胞からの細胞抽出物をα-ARF-BP1またはコントロールIgGで免疫沈降した。図16Bに見られるように、p53はα-ARF-BP1抗血清によって得られた免疫沈降物中には明瞭に検出されたが（レーン３）、コントロールIgGでは検出されなかった（レーン２、下パネル）。逆に、内在性ARF-BP1はp53-特異的モノクローナル抗体DO-1で容易に免疫沈降したが（図１７C、レーン３）、コントロール抗体では沈降しなかった（図１６C、レーン２）。このデータはp53がARF-BP1タンパク質とin vitroおよびin vivoの両方で直接相互作用しうることを示している。
【００９３】
ARF-BP1-媒介E3ユビキチンリガーゼがp53分解に関与しているかどうかを調べるため、Mdm2非存在下におけるARF-BP1のp53直接ユビキチン化を、全て精製構成物を用いて標準的なin vitroユビキチン化アッセイによって調べた。Flag-p53をGST-ARF-BP1とHA-タグ付きユビキチン（HA-Ub）、E1およびE2（UbcH5c）存在下でインキュベーションした。この反応のユビキチン-結合p53産物をFlag/M2ビーズで免疫沈降させ、p53-特異的抗体を用いてウェスタンブロット解析により視覚化した。図６Dに示したように、ARF-BP1によって高レベルのユビキチン化p53が生成された（レーン２）。ARF-BP1媒介p53ユビキチン化はARFの存在下で強く抑制された（レーン３）。図５Aに示した結合データに一致して、ARFのN-末端領域（N-ARF）はARF-BP1-媒介p53ユビキチン化の完全な阻害を維持していたが、C-末端領域（C-ARF）は効果を示さなかった（レーン４および５）。これらのデータはARF-BP1がp53に対してユビキチンリガーゼであることを明らかにし、p53のARF-BP1媒介ユビキチン化はARFによって抑制されることを示している。
【００９４】
実施例８
本実施例は、ARF-BP1がMdm2-ヌル細胞においてARF-媒介p53安定化に非常に重要であることを明らかにするものである。
ARF-BP1はMdm2非存在下でp53に結合してこれをユビキチン化するので、ARF/BP1相互作用がMdm2非依存性様式でp53を安定化するかどうかを調べた。ARF発現がMdm2-ヌル細胞においてp53安定化を誘導するかどうかを決定するため、Mdm2/p53二重ヌル細胞MEFをp53のみ、またはp53とARFの両方をコードした発現ベクターでトランスフェクションした。p53タンパク質レベルはARF過剰発現によりこれらの細胞において顕著に上昇し（図１７A）、このことはARFがMdm2非依存性様式でp53を安定化することを示している。
Mdm2非存在下でのp53分解における内在性ARF-BP1の役割を、ARF-BP1の不活性化がMdm2-ヌル細胞においてp53を安定化させるために十分であるかどうかを調べることによって確認した。p53/Mdm2二重ヌル細胞をp53発現ベクターおよびARF-BP1またはMdm2に特異的なsiRNAで同時トランスフェクションした。この細胞における内在性ARF-BP1発現の消失はp53の顕著な安定化を引き起こした（図１７B、図１８AおよびB）。Mdm2特異的siRNAによる処理はMdm2/p53-ヌル細胞のp53レベルに全く影響を与えなかった（図１７B、レーン３）。これによりARF-BP1不活性化によるp53安定化の特異性が確認された。
【００９５】
ARF-BP1がARFによって誘導されるMdm2非依存性p53安定化に関与している直接的な証拠を提供するため、Mdm2-ヌル細胞におけるARF-媒介p53安定化に対するARF-BP1の必要性を調べた。p53/Mdm2二重ヌル細胞をARF-BP1特異的siRNA並びにp53およびARFをコードする発現ベクターで同時トランスフェクションした。図１７Cに示したように、ARFによって誘導されるp53安定化はARF-BP1ノックダウン細胞において明瞭に減弱され（レーン６−９）、このことはARF-BP1がこれらの細胞におけるARF-媒介p53安定化に非常に重要であることを示している。対照的に、ARF-媒介p53安定化はMdm2 RNAiで処理した細胞中では無傷であった（図１７C、レーン２〜５）。これらの結果は、ARF−BP1がARF-媒介、Mdm2非依存性のp53安定化に非常に重要であることを示している。
【００９６】
実施例９
本実施例は、NPM/B23タンパク質はARF-BP1ユビキチンリガーゼ活性の酵素的標的でないことを明らかにするものである。
近年のいくつかの研究により、ARFによって媒介されるNPM/BP23はp53非依存性機能の重要な標的かもしれないことが示されている（Bertwistle et al., MCB 23: 8097, 2004; Kuo et al., Genes Dev. 18: 1862, 2004）。さらに、図１CのデータはNPM/B23がARF-会合核複合体の主要な構成成分であることを示している。ARF-BP1欠損がどのようにしてp53ヌル細胞において細胞周期停止を導くのか、そのE3活性の他の標的があるかどうか、および、ARF-BP1がp53非依存性機能制御に関してNPM/B53の分解を誘導するかどうかを調べるため、一連の実験を行った。その結果を図２１および２２に示す。GST-プル-ダウン-アッセイを用いて（図２２A）、NPM/B23がARF-BP1と直接相互作用することが見いだされた。ARF-BP1とNPM/B23とのin vivo相互作用を評価するために共免疫沈降アッセイを用いて（図２２B）、ウェスタンブロット解析により内在性ARF-BP1がB23と共免疫沈降することが分かった。Flag-B23の発現ベクターを293細胞にトランスフェクションすると、B23タンパク質はM2-ビーズにより免疫沈降した。NPM/B23がARF-BP1の基質であるかどうかを調べるため、ARF-BP1の酵素活性をin vitroアッセイにより決定した。バクテリアで発現させほぼ均一にまで精製したNPM/B23ポリペプチドをGST-ARF-BP1とユビキチンE1およびE2（UbcH5ｃ）存在下でインキュベーションした。図２２Cに示したように、抗-NPM/B23抗体を用いたウェスタンブロット解析をしたところ、NPM/B23の有意なユビキチン化は検出されなかった。これらの結果はARF-BP1がNPM/B23のユビキチン化を誘導できないことを示す。上述の結果と一致して、内在性ARF-BP1のRNAi-媒介ノックダウンは、図２２Dに示したように内在性NPM/B23の安定化には全く影響を与えなかった。これらの結果は、ARF-BP1がNPM/B23分解に関与していないことを示している。さらにこれらの結果はNPM/B23がARF-BP1ユビキチンリガーゼ活性の酵素的標的でないことを示している。
【００９７】
上述の発明を明瞭化と理解のためにある程度詳細に説明してきたが、本開示に基づいて当業者は請求項に記載した本発明の範囲を逸脱することなく態様および細部の種々の改変を行うことが可能であることは言うまでもない。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】図１A-Cはヒト細胞においてARF-BP1をARF-会合核複合体の主要な構成成分として同定したことを示している。図１AはHA-ARF-Flagタンパク質の模式図である。図１Bは、親細胞株H1299（レーン１）、ARF安定細胞株クローン#1（レーン２）およびARF安定細胞株クローン#2（レーン３）の細胞抽出物の抗ARF抗体を用いたウェスタンブロット解析による、ARF-安定株におけるHA-ARF-Flagおよび内在性ARF発現を表す。図１CはHA-ARF-Flag/H1299安定細胞株の核抽出物からのアフィニティー精製ARF-複合体（レーン２）および親H1299核抽出物からのコントロール溶出物（レーン１）の銀染色を示したものである。特異的ARF-相互作用タンパク質バンドを質量分光分析によって解析し、p500/ARF-BP1およびB23/NPM（ヌクレオホスミン）ペプチド配列を示した。
【図２】図２A-Cは、ARF-BP1がシグネチャーHECTモチーフおよびUBAドメインを含むことを示す。図２AはARF-BP1ポリペプチドの概略図である。図２BはヒトARF-BP1とマウスARF-BP1およびヒトE6-APのHECTドメインのアラインメントを示す。図中、相同なアミノ酸残基は囲みをして影をつけて強調した。図２Cは種々の型のヒト組織におけるARF-BP1の発現を示したものである。マルチ組織ノーザンフィルターをARF-BP1 cDNAプローブ（上）またはアクチンcDNAプローブとハイブリダイズさせた。
【図３】図３はARF-BP1のアミノ酸配列を示しており、配列番号２として特定した。
【図４】図４はARB-BP1のUBAドメインの存在および、ヒトARF-BP1、マウスARF-BP1、酵母rad23、ヒトHHR23A、ヒトCb1およびCb1-bとのアラインメントを示す。相同なアミノ酸残基は囲みをして影をつけて強調した。
【図５】図５A-DはARFがin vitroおよびin vivoでARF-BP1と相互作用し、ARF-BP1-媒介ユビキチンリガーゼ活性がARFによって阻害されることを示す。図５Aは、in vitro翻訳した35S-標識ARF-BP1(1015-4374)(レーン１−６)またはin vitro翻訳した35S-標識ARF-BP1(1-1014)（レーン７−９）を用いたプル-ダウンアッセイにおいて、野生型GST-ARF完全長タンパク質（レーン３，９）、変異型GST-ARF（GST-ARF(GST-ARFΔ1-14)(レーン４)、ARFタンパク質のN末端(1-64)（レーン５）、ARFのC末端(65-132)(レーン６)またはGSTのみ（レーン２，８）を用いて、ARF-BP1とGST-ARFとの直接的相互作用を示したものである。図５Bは、表示した全細胞抽出物、H1299細胞からのARF-BP1によるARFの免疫沈降物（レーン１）、およびARF-BP1特異的抗体による免疫沈降物（レーン３）またはコントロールIgG（レーン２）による免疫沈降物の、抗-ARFモノクローナル抗体（下）または抗-ARF-BP1抗体（上）によるウェスタンブロット解析を用いた、H1299細胞からのARFとARF-BP1の共免疫沈降を示す。図５Cは、全細胞抽出物、または抗-ARFポリクローナル抗体による免疫沈降物（レーン３）若しくはコントロールIgG（レーン２）による免疫沈降物の、抗-ARF-BP1特異的抗体（下）または抗-ARFモノクローナル抗体（上）によるウェスタンブロット解析を用いた、H1299細胞からのARF-BP1とARFとの共免疫沈降を示す。図５Dは、ARF-BP1のユビキチン化活性がARFによって阻害されることを、抗-GST抗体によるユビキチン結合物のウェスタンブロット解析を用いて調べたものである。in vitroユビキチン化アッセイは、GST-ARF-BP1(3760-4374)とE1、E2（His-UBCH5a）をユビキチン（レーン２）と共に、またはGST-ARF存在下（レーン３）GT-NARF存在下（レーン４）またはGST-CARF存在下（レーン５）でインキュベーションすることによって構成した。
【図６】図６A-Eは内在性ARF-BP1の不活性化はp53-ヌル細胞の細胞増殖停止を誘導するがMdm2についてはそうでないことを示している。図６Aは、コントロールRNAi（GFP-RNAi）（レーン１）、Mdm2 RNAi（レーン２）またはARF-BP1 RNAi#1（レーン３）で処理したH1299細胞の細胞抽出物の、ARF-BP1、Mdm2、p21およびアクチンに対する抗体によるウェスタンブロット解析を用いた、RNAiによる内在性ARF-BP1およびMdm2タンパク質の除去を表す。図６Bは、コントロールRNAi（GFP-RNAi）、Mdm2 RNAiまたはARF-BP1 RNAi#1で処理したH1299細胞の全体的な細胞増殖を表し、siRNA処理の3日後にクリスタルヴァイオレットで染色したものである。図６Cは、コントロールRNAi（GFP-RNAi）、Mdm2 NaiまたはARF-BP1 RNAi#1で処理したH1299細胞のBrdU取込を表し、RNAi処理の１日後に細胞を標識して染色したものである。図６DはARF-BP1のRNAi-媒介性消失がp53-ヌルSaoS-2細胞の細胞増殖阻害を誘導することを示す棒グラフであり、コントロールRNAi(GFP-RNAi)、Mdm2 RNAi、またはARF-BP1-RNAiでトランスフェクションした24時間後におけるBrdU陽性細胞のパーセンテージを表したものである。細胞は３つの独立の実験で計測して平均をとった。図６Eは、ARF-BP1のRNAi-媒介性消失がp53-ヌルSaoS-2細胞の細胞増殖阻害を誘導することを示す棒グラフであり、コントロールRNAi(GFP-RNAi)、Mdm2 RNAi、またはARF-BP1-RNAiでトランスフェクションした24時間後におけるSaos2細胞の数を示している。細胞は３つの独立の実験において計測して平均をとった。
【図７】図７A-Dは、内在性ARF-BP1の不活性化はp53-ヌルH1299細胞の細胞増殖停止を誘導し、U2OS細胞においてp53を安定化させるが、Mdm2についてはそうではないことを明らかにするものである。図７AはRNAiによる内在性ARF-BP1およびMdm2タンパク質の消失を示すものであり、コントロールRNAi（GFP-RNAi）（レーン１）、Mdm2 RNAi（レーン２）またはARF-BP1 RNAi#2（レーン３）で処理したH1299細胞抽出物の、ARF-BP1、Mdm2、p21およびアクチンに対する抗体によるウェスタンブロット解析を示したものである。図７BはコントロールRNAi（GFP-RNAi）、Mdm2 RNAiまたはARF-BP1 RNAi#2で処理したH1299細胞の増殖曲線を示した線グラフである。種々の型のsiRNAで処理した後、細胞を新鮮な培地中プレートあたり2x106個播種し、毎日計測した。図７Cは、コントロールRNAi（GFP-RNAi）、Mdm2 RNAiまたはARF-BP1 RNAi#2で処理したH1299細胞の全体的な細胞増殖を表しており、細胞はsiRNA処理の３日後にクリスタルヴァイオレットで染色した。図７DはヒトU2OS細胞におけるRNAiによる内在性のARF-BP1除去を示しており、未改変U2OS細胞（レーン１）、コントロールRNAi（GFP-RNAi）で処理したU2OS細胞またはARF-BP1 RNAi#2で処理したU2OS細胞（レーン３）の、ARF-BP1、p53、p21、baxおよびアクチンに対する抗体によるウェスタンブロット解析を示したものである。
【図８】図８A-BはARF-BP1の不活性化が、ARFの過剰発現と同様にH1299細胞のG2M停止を誘導することを示したものである。図８AはコントロールRNAi+コントロールウイルス処理(i)、ARF-BP1 RNAi(ii)、アデノウイルス-ARF処理(iii)およびARF-BP1 RNAi+アデノウイルス-ARF処理の細胞周期プロファイルを示したものである。図８BはH1299細胞のG2M停止を表す棒グラフである。
【図９】図９A-Eは、ARF-BP1がp53を安定化し、p53依存性アポトーシスを誘導することを示す。図９AはヒトU2OS細胞におけるRNAiによる内在性ARF-BP1ノックダウンを表したものであり、未改変U2OS細胞（レーン１）、コントロールRNAi(GFP-RNAi)で処理したU2OS細胞（レーン２）またはARF-BP1 RNAi#1で処理したU2OS細胞（レーン３）の細胞抽出物の、ARF-BP1、p53、p21、baxおよびアクチンに対する抗体を用いたウェスタンブロット解析を示したものである。図９Bは、ARF-BP1の不活性化が内在性p53タンパク質の半減期を延長することを示しており、ARF-BP1-RNAiまたはコントロールRNAiでトランスフェクションし、シクロヘキサミド（CHX）処理後示した時間（分）にて収集した細胞抽出物の抗-p53(DO1)抗体によるウェスタンブロット解析を示したものである。図９Cは、ARP-BP1の不活性化がアポトーシスを誘導することを示したものである。ARF-BP1-RNAiまたはコントロールRNAiでトランスフェクションしたU2OS細胞を、DNA含量に従って（PI染色）アポトーシス細胞（サブG1）について解析した。図９Dは、ARF-BP1 RNAi-媒介p53アップレギュレーションの抑止としてのARF-BP1(R)の再導入を表しており、コントロールRNAi(GFP-RNAi)（レーン２）、ARF-BP1-RNAi#2（レーン２）またはARF-BP1-RNAi#1とARF-BP1(R)の組み合わせ（レーン３）、ARF-BP1-RNAi#1とARF-BP1M(R)の組み合わせ（レーン４）で処理したU2OS細胞の細胞抽出物のARF-BP1、p53、p21およびアクチンに対する抗体を用いたウェスタンブロット解析を示したものである。図９Eは、コントロールRNAi（レーン１、３）またはARF-BP1-RNAi（レーン２，４）で処理した親HCT116細胞（レーン１，２）またはHCT116-p53-/-細胞（レーン３，４）からの細胞抽出物のARF-BP1、Mdm2、p53、p21、Mycおよびアクチンに対する抗体を用いたウェスタンブロット解析を示したものである。
【図１０】図１０は、コントロールRNAiまたはARF-BP1 RNAiで処理した細胞のp53半減期の定量化を示した線グラフである。
【図１１】図１１は、種々のARF-BP1 RNAiオリゴヌクレオチドの効果を示したものであり、コントロールRNAi（GFP-RNAi）（レーン１）、ARF-BP1-RNAi#1（レーン２）、ARF-BP1-RNAi#2（レーン３）またはARF-BP1-RNAi#1変異体（レーン４）で処理したU2OS細胞からの細胞抽出物のウェスタンブロット解析を示したものである。
【図１２】図１２は、RNAi-媒介性ARF-BP消失がA549およびMCF-7細胞においてp53活性化を誘導することを示しており、ARF-BP1-RNAi（レーン２，４）またはコントロールRNAiで処理したヒト肺腺ガン細胞A549（レーン１，２）またはヒト乳がん細胞MCF-7細胞（レーン３，４）からの全細胞抽出物の、抗-ARF-BP1、抗-p53(DO-1)、抗-Mdm2、抗-p21、および抗-アクチン抗体(AC-15)を用いた免疫ブロットを示している。
【図１３】図１３は、RNAi-媒介性ARF-BP1消失が正常ヒト線維芽細胞(NHF-1)においてp53活性化を誘導することを明らかにしている。ARF-BP1-RNAi（レーン２）またはコントロール-RNAi（レーン１）で処理した正常ヒト線維芽細胞(NHF-1)からの細胞抽出物の、抗-ARF-BP1、抗-p53（DO-1）、抗-p21、および抗-アクチン抗体(AC-15)によるウェスタンブロット解析。
【図１４】図１４A-Dは、HECTドメインがARF-BP1のユビキチンリガーゼ活性に非常に重要であることを明らかにし、ARF-BP1(R)の再導入はp53-ヌル細胞H1299においてARF-BP1 RNAiによる細胞増殖停止を抑止することを明らかにしたものである。図１４AはARF-BP1変異体（ARF-BP1(M)）、ARF-BP1#1 RNAi抵抗性構築物（ARF-BP1(R)）およびその変異体（ARF-BP1M(R)）の模式図である。図１４Bは、抗-GST抗体によるユビキチン結合体のウェスタンブロット解析により、HECTドメイン中の高度に保存されたCys残基におけるARF-BP1の点変異はARF-BP1のユビキチンリガーゼ活性を除去することを示したものである。in vitroユビキチンアッセイは、GST-ARF-BP1(3760-4374)（レーン１、２）またはGST-ARF-BP1-ca変異体（レーン３，４）をE1、E2（His-UBCH5a）およびユビキチン（レーン２、４）とインキュベーションすることによって構成した。図１４Cは、p53-ヌル細胞H1299におけるARF-BP1 RNAiによる細胞増殖停止をARF-BP1(R)の再導入により示したものである。細胞はsiRNA処理３日後にクリスタルヴァイオレットで染色した。図１４Dは３回の独立した実験の平均を用いて図１４Cの相対細胞数のパーセンテージを示した棒グラフである。
【図１５】図１５はHCT116細胞においてARF-BP1の不活性化はp53依存性アポトーシスを誘導することを示す棒グラフである。ARF-BP1-RNAiまたはコントロールRNAi(GFP-RNAi)で処理したHTC116細胞およびHCT116-p53(-/-)細胞のアポトーシス細胞の定量化。アポトーシス細胞はFACS解析（サブG1）により計数し、3回の独立の実験から平均をとった。
【図１６】図１６A-Dは、ARF-BP1がp53に結合してこれをユビキチン化すること、およびp53のARF-BP1-媒介性ユビキチン化がARFによって阻害されることを示している。図１６AはARF-BP1とGST-p53の直接相互作用を示している。GST-p53タンパク質（レーン３、７）、GST-Mdm2（レーン４、８）またはGSTのみ（レーン２，６）を、in vitro翻訳35S-標識ARF-BP1(1015-4737)レーン（１−４）またはARF-BP1(1-1041)（レーン５−８）を用いたGSTプル-ダウンアッセイに用いた。図１６BはU2OS細胞からのp53とARF-BP1の共免疫沈降を示したものである。p53モノクローナル抗体DO-1（下）またはARF-BP1特異的抗体（上）による、全細胞抽出物(WCE)（レーン１）または抗-ARF-BP1特異的抗体（レーン３）若しくはコントロールIgG（レーン２）による免疫沈降物のウェスタンブロット解析。図１６CはU2OS細胞からのARF-BP1とp53との共免疫沈降を示したものである。示した全細胞抽出物（WCE）（レーン１）およびp53モノクローナル抗体DO-1（レーン３）またはコントロール抗体との免疫沈降物の、抗-ARF-BP1特異的抗体（下）または抗-p53 DO-1抗体（上）によるウェスタンブロット解析。図１６Dはp53のARF-BP1-媒介性ユビキチン化がARFによって阻害されることを示している。Flag-p53とGST-ARF-BP1(3760-4374)とをE1、E2およびユビキチン（HA-Ub）の存在下でインキュベーション後、生成されたユビキチン結合物をFlag/M2で免疫沈降させ、抗-p53 DO1抗体を用いたウェスタンブロットによって解析した。組換えバクテリア発現GST-ARF、NARF(1-64)またはCARF-(65-132)をレーン３，４または５にそれぞれ加えている。
【図１７】図１７A-Cは、ARFがMdm2非依存性様式でp53安定化を誘導することおよび、ARF-BP1がMdm2-ヌル細胞においてARF-媒介性p53安定化に非常に重要であることを明らかにするものである。図１７Aは、ARFがMdm2-ヌル細胞においてp53を安定化することを示している。p53およびARFの発現ベクターでトランスフェクションしたMEF p53/Mdm2-二重ヌル細胞からの細胞抽出物のp53抗体（DO-1）によるウェスタンブロット解析。図１７BはARF-BP1不活性化がMdm2-ヌル細胞においてp53を安定化することを示している。p53発現ベクターと共にARF-BP1 RNAiまたはMdm2 RNAiでトランスフェクションしたMEF p53/Mdm2-二重ヌル細胞からの細胞抽出物の、53抗体（DO-1）によるウェスタンブロット解析。図１７Cは、Mdm2-ヌル細胞においてARF-媒介性p53安定化にARF-BP1が必要であることを明らかにしている。p53およびARFを発現するベクターと共にARF-BP1 RNAiまたはMdm2 RNAiでトランスフェクションしたMEF p53/Mdm2-二重ヌル細胞からの細胞抽出物の、抗p53抗体（DO-1）、抗-ARF、抗-ARF BP1および抗-GFP抗体を用いたウェスタンブロット解析。
【図１８】図１８A-Bは、ARF-BP1の不活性化がトランスフェクションしたp53タンパク質の半減期を延長することを明らかにするものである。図１８Aは、ARF-BP1-RNAiまたはコントロールRNAiでトランスフェクションし、シクロヘキサミド(CHX)処理後示した時点（時間）で回収したMEF p53/Mdm2-二重ヌル細胞からの細胞抽出物の、抗-p53(DO-1)抗体を用いたウェスタンブロット解析を示したものである。コントロールRNAiとARF-BP1 RNAiの時刻０におけるp53の基底強度が同等になるように、左パネル（レーン１−４）の曝露時間は右パネル（レーン５−８）の曝露時間よりも長い。図１８Bは、図１８Aで示したようにコントロールRNAiまたはARF-BP RNAiで処理したMEF p53/Mdm2-二重ヌル細胞におけるp53半減期の定量化を示した線グラフである。
【図１９】図１９A-Cは、ARF-BP1がARF腫瘍抑制機能の重要な媒介因子であることを示したものである。図１９Aは、ARF-BP1の低下がMdm2、COP1、Pirh2を含むp53に対する既知のリガーゼに比べてp53レベルに最も顕著な影響を与えることを示している。コントロールRNAi（レーン１）、Mdm2 RNAi（レーン２）、COP1 RNAi（レーン３）、Pirh2 RNAi（レーン４）およびAFR-BP1 RNAi（レーン５）で処理したU2OS細胞からの細胞抽出物の、ARF-BP1、Mdm2、Pirh2、p53、p21、Baxおよびアクチンに対する抗体を用いたウェスタンブロット解析。図１９Bは、ARFのp53依存性およびp53非依存性機能のARF-BP1およびMdm2による協同制御に関するモデルである。図１９Cは、乳がん細胞株におけるARF-BP1発現を示したものである。正常乳房細胞株MCF-10Aおよび正常ヒト線維芽細胞株と比較した、種々の乳がん細胞株からの細胞抽出物の抗-ARF-BP1特異的抗体および抗-アクチン抗体によるウェスタンブロット解析。
【図２０】図２０は、ARFの過剰発現がp53および他の転写因子(p21、Mdm2、Bax)を活性化することを、アデノウイルス-GFP（レーン１）、またはアデノウイルス-ARF（レーン２）を感染させたU2OSからの細胞抽出物のARF、Mdm2、p53、p21、Baxおよびアクチンに対する抗体を用いたウェスタンブロット解析により示したものである。
【図２１】図２１は、ARF-BP1がNPM/B23タンパク質の分解を標的とはしていないこと、および、NPM/B23タンパク質がARF-BP1ユビキチンリガーゼ活性の酵素的標的でないことを明らかにするものである。p53およびARF（レーン２、４）を発現するベクターとともにARF-BP1 RNAi（レーン３，５）またはMdm2 RNAi（レーン２，４）でトランスフェクションしたMEF p53/Mdm2-二重ヌル細胞の細胞抽出物の抗-p53抗体（DO-1）および抗-GFP抗体によるウェスタンブロット解析によって示されるように、プロテアソーム阻害はARFまたはARF-BP1 RNAiによって達成される以上にp53を安定化する。
【図２２】図２２A-Dは、ARF-BP1はin vivoおよびin vivoでB23と相互作用するがB23をユビキチン化せず、B23を分解しないことを示している。図２２Aは、ARF-BP1がin vitroでB23と相互作用することを示している。GST-B23タンパク質（レーン３）またはGSTのみ（レーン２）を、in vitro翻訳した35S-標識ARF-BP1(1015-4374)（レーン１−３）またはARF-BP1(1-1014)（レーン４−６）と共にGSTプル-ダウンアッセイに用いた。図２２Bは、ARF-BP1がin vivoでB23と相互作用することを示したものである。安定にFLAG-B23でトランスフェクションした細胞（レーン２および４）またはトランスフェクションしないコントロール（レーン１および３）からの全細胞抽出物（レーン１および２）または抗-FLAG M2ビーズ（IP/M2）による免疫沈降物（レーン３および４）の抗-ARF-BP1特異的抗体によるウェスタンブロット解析。図２２Cは、ARF-BP1がB23ユビキチン化を媒介しないことを示したものである。E1、E2およびユビキチン(HA-Ub)存在下でGST-B23とGST-ARF-BP1とをインキュベーションした後、抗-B23抗体を用いたウェスタンブロットにより反応物を解析した。図２２Dは、ARF-BP1の消失がB23レベルに影響を与えないことを示したものである。コントロールRNAi(GFP-RNAi)（レーン２，５）、ARF-BP1 RNAi（レーン３，６）で処理した、または処理しないSJSA細胞（レーン１−３）若しくはU2OS細胞（レーン４−６）の細胞抽出物のARF-BP1、p53、B23およびアクチンに対する抗体を用いたウェスタンブロット解析。
【図３】
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【図８】
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【図１０】
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【図１５】
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【図２１】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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