(57)【要約】  本発明は、好適な担体および公知の固定化方法を用いて、液体中の特定の生体粒子ならびに溶解した生体分子を認識し、かつそこから分離するための装置および方法を記載する。当該装置は、液体の不連続な処理と、直接的で連続的な処理の両者に用いることができる。本発明の適用範囲は、動物、バイオテクノロジー（生物学的研究を含む）および医学的診断である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物についての、バイオテクノロジー（生物学的研究を含む）および医学的診断での適用のための、細胞、生体粒子および分子を液体から単離するための装置であって、以下のものを含む装置：
ａ．  細胞、粒子および／または分子の混合物が配置される、生体適合性材料からなる反応容器；
ｂ．  必要とされる細胞、生体粒子および／または分子集団を認識し、かつそれらを結合する機能化微粒子；
ｃ．  細胞、生体粒子および／または分子の通過を許容するが、前記微粒子の通過を許容しない孔を有する１以上のメンブレンに基づく粒子分離系；
ｄ．  および、連続使用のために、細胞、生体粒子および／または分子の単離、分離、加工および除去のすべての工程を実行可能にするための、種々のホース系、メンブレン、ポンプおよび弁。
【請求項２】
特定の細胞、生体粒子および／または分子が体細胞、細胞レベル以下の構造、タンパク質および／または核酸であり、適用可能であれば、ウイルス、細菌および／または原生動物であり、ならびに液体が分泌物および排泄物、血液、リンパ、体液（liquor）、洗浄サンプル、あるいは器官採取物または栄養培地もしくは発酵沈殿由来の分離細胞の懸濁液であり、かつ細胞、生体粒子および／または分子を含有する、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
追加の機能化微粒子を使用することによって、細胞／生体粒子／分子の分離を細胞、生体粒子および／または分子の吸着の原理と組み合わせる、請求項１および２に記載の装置。
【請求項４】
併用される機能化微粒子同士がそのサイズに関して異なっている、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
機能化微粒子が２種以上の特異的リガンドを保持し、ゆえに２種以上の異なる細胞、生体粒子および／または分子が該微粒子に特異的に吸着する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項６】
追加のリガンドによって生細胞に関する細胞刺激機能をもたらすことができる、請求項４に記載の装置。
【請求項７】
細胞膜／メディエーター相互作用によって少なくとも１種の細胞タイプの刺激がもたらされる少なくとも２種の異なる細胞タイプを追加のリガンドによって分離する、請求項４に記載の装置。
【請求項８】
機能化微粒子が液体に懸濁され、自由可動性である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項９】
機械的作用によって微粒子を懸濁状態で維持する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１０】
微粒子が配備されている反応区画由来の液体をろ過によって微粒子と分離させる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１１】
特異的に吸着されないすべての成分の通過を許容するが、使用される微粒子の通過を許容しない直径を有する孔を特徴とするメンブレンをろ過に使用する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１２】
孔の直径が１μｍより大きく、１，０００μｍより小さい平面状または中空管メンブレンを分離に使用する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１３】
反応容器を使用して単離された細胞の追加の加工を行う、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１４】
細胞、生体粒子および／または分子を液体から分離するための方法であって、分離される細胞が特定の表面抗原により特徴づけられる方法。
【請求項１５】
細胞、生体粒子および／または分子を分離するための請求項１４に記載の方法であって、該表面抗原を認識する原理が天然または合成起源のリガンドである方法。
【請求項１６】
リガンドが抗体、抗体フラグメント、ペプチド、ポリペプチド、糖ペプチド、受容体、ステロイド、ホルモン、マイトジェン、抗原、スーパー抗原、成長因子、サイトカイン、レクチン（lektin）、ウイルスタンパク質、接着分子またはケモカインである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
リガンドが共有結合または非共有結合によって微粒子に結合している、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
固体担体として生体適合性ポリマーを使用する、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
リガンドが、好ましくはセファロースにカップリングされている、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
細胞、生体粒子および／または分子を連続して、または不連続に分離する、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
任意の数量の個別のモジュールとして、異なる機能化微粒子に応じて反応容器を順番に切り替えることができる、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
連続分離のために、機能化微粒子を反応容器に入れ、細胞、生体粒子および／または分子を含有する液体によりこれを流動させる、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
液体が血液である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
所定のバッファーを適用することによって、細胞、生体粒子および／または分子を微粒子から分離する、請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
細胞の放出および、必要であれば、別の細胞、生体粒子および／または分子の放出を同一反応容器中で実行する、請求項１４〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
液体の分離に使用されるメンブレンと同一のメンブレンでのろ過によって、細胞、生体粒子および／または分子を微粒子懸濁液から分離する、請求項１４〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
分離された細胞、生体粒子および／または分子を、ヒトへの適用を目的とせずに、分析および／または別の機械処理および／または加工のために使用する、請求項１４〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
分離された細胞、生体粒子および／または分子を、加工せずに、あるいは修飾して、疾患の研究または治療のために動物に投与することができる、請求項１４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
体外循環においてｅｘ ｖｉｖｏで血液を処理するための、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の装置および方法。
【請求項３０】
診断またはさらなる加工のための、細胞、生体粒子および／または分子の浄化、富化または濃縮に適している、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の装置および方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の説明
本発明は、細胞、生体粒子および／または分子を液体から単離するための装置および方法を記載する。本発明を使用し、適切な担体および公知の固定化方法を使用して、特定の生体粒子を認識し、かつ分離することができる。本発明の適用分野は、動物、バイオテクノロジー（生物学的研究を含む）および医学的診断である。
【背景技術】
【０００２】
細胞、生体粒子および／または分子を液体から単離することは多くの技術分野において重要であり、そのための多数の方法もまた公知である。
【０００３】
細胞の分析および細胞の分離は、数十年間、蛍光標示式細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて行われてきた。それは、表面マーカーによる特定の細胞集団の分析に好ましい方法である。ＦＡＣＳの適用は多数の細胞の単離に関する問題をもたらす。細胞を含有する媒体を高度に希釈する必要があり、大量の細胞に関しては分離時間が比較的長く、無菌的条件の確保が問題となる。総合すると、上記方法はかなりの費用を生じる。
【０００４】
ここ１０年以上の間、生体粒子および細胞の認識ならびに単離に磁気分離法が使用されるようになっている。この方法のためには、捕捉用分子に鉄を保持させるか、あるいは鉄のコアを含有する微粒子を捕捉用分子でコーティングする。その分離は強磁場によって行われる。とりわけＤｙｎａｌおよびＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃによって商業的に成功している免疫磁気分離は、シンプルで比較的好都合な価格の細胞分離法として確立されている。特にフローサイトメトリーと比較して、磁気分離は、比較的まれなタイプの細胞の単離に関して、例えば出生前診断のために母親の血液から胎児細胞を単離するにあたって、その価値が証明されている。別の適用は、次の処置を開始するために原発腫瘍の外科的除去後に血液中の腫瘍細胞を検出することである。
【０００５】
昨今、治療目的で、造血系のある種の悪性疾患を患っている患者由来の同系ＣＤ３４＋末梢血幹細胞が再移植のために日常的に取得されている。これは、好ましくは、磁気ビーズにカップリングされた特異的抗体で白血球を純化することによって行われる。血液／細胞提供時の細胞分画では、重力場での分離（遠心分離）用の、血液細胞の種々のサイズおよび特有の密度を利用するいくつかの系が利用可能である。
【０００６】
すべての選別方法の不都合はそれらを連続して実行できないことである。すなわち、血液またはリンパ球サンプルを採取し、細胞を免疫磁性粒子とインキュベートする。分離および洗浄後、磁性粒子から細胞を分離すると、治療目的で使用できるようになる。
【０００７】
ＦＡＣＳおよびＭＡＣＳの有用な概要は「Flow Cytometry and Sorting」（Melamed et al.編, Wiley & Sons, Inc., New York, 1990）に提供されている。
【０００８】
細胞を単離および／または除去する他の方法は、ＥＰ  １２３１１９５６Ａ２、ＵＳ  ６９０００２９、ＵＳ  ６４３２６３０、ＵＳ  ２００２００１２９５３Ａ１、ＤＥ  １００２２６３５Ａ１、ＵＳ  ５２４６８２９、ＵＳ  ５７３９０３３、ＵＳ  ５７６３２０３、ＥＰ  ００１６５５２Ａ１、ＷＯ  ００／３８７６２、ＥＰ  ０５０２２１３Ｂ１およびＥＰ  ０５５４４６０Ｂ１に記載されている。
【特許文献１】ＥＰ  １２３１１９５６Ａ２
【特許文献２】ＵＳ  ６９０００２９
【特許文献３】ＵＳ  ６４３２６３０
【特許文献４】ＵＳ  ２００２００１２９５３Ａ１
【特許文献５】ＤＥ  １００２２６３５Ａ１
【特許文献６】ＵＳ  ５２４６８２９
【特許文献７】ＵＳ  ５７３９０３３
【特許文献８】ＵＳ  ５７６３２０３
【特許文献９】ＥＰ  ００１６５５２Ａ１
【特許文献１０】ＷＯ  ００／３８７６２
【特許文献１１】ＥＰ  ０５０２２１３Ｂ１
【特許文献１２】ＥＰ  ０５５４４６０Ｂ１
【非特許文献１】「Flow Cytometry and Sorting」（Melamed et al.編, Wiley & Sons, Inc., New York, 1990）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、動物について、同様にバイオテクノロジー、例えば生物学的研究で、および医学的診断においても使用することができる、細胞、生体粒子および他の分子を分離するためのシンプルな系を開発するという課題に基づくものであった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、請求項１、１４および２９〜３０にしたがって理解され、下位の請求項は選択的なバリエーションである。
【００１１】
本発明は、分離対象の物質の混合物からなる物質に関して特異的リガンドを表面上に機能的に固定することができる場合であれば常に使用することができるシンプルな分離方法を記載する。実際の分離は、粒子サイズに基づく選別（ろ過、ふるい分け）によって行われる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
この課題の解決のために、特異的リガンドを固体担体にカップリングさせる標準的方法が使用される。
【００１３】
使用される固体担体は公知の生体高分子、例えば有機もしくは合成ポリマー由来のメンブレンまたは粒子である。表面は生体適合性であってよく、それには、コラーゲン、精製タンパク質、精製ペプチド、多糖類、例えばキトサン、アルギナート、デキストラン、セルロース、グリコサミノグリカンまたは合成ポリマー、例えばポリスチレン、ポリエステル、ポリエーテル、ポリ無水物、ポリアルキルシアノアクリラート、ポリアクリルアミド、ポリオルトエステル、ポリ酢酸ビニル、ブロックコポリマー、ポリプロピル、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）またはポリウレタンが含まれうる。それに加えて、ポリマーは乳酸ポリマーまたはコポリマー（乳酸および／またはグリコール酸（ＰＬＧＡ））を含有することができる。
【００１４】
使用される表面は生分解性または非生分解性であってよい。
【００１５】
細胞の表面上の標的分子の結合に使用される特異的リガンドは、天然であるか、あるいは合成性であってよく、例えば抗体、抗体フラグメント、ペプチド、ポリペプチド、糖ペプチド、可溶性受容体、ステロイド、ホルモン、マイトジェン、抗原、スーパー抗原、成長因子、サイトカイン、レプチン、ウイルスタンパク質、接着分子またはケモカインである。
【００１６】
特定の用途では、少なくとも１種の抗体または抗体フラグメントが使用され、その場合、特異的リガンドはそれらに共有結合されているか、あるいはスペーサーまたはリンカーを介してそれらに固定されている。
【００１７】
担体物質は任意の形状を呈してよい。毛細管としてのメンブレンまたは粒子は広い表面という利点を提供する。以下に記載する方法では、直径が１０μｍより大きく、８００μｍより小さい微粒子、好ましくは５０〜５００μｍの微粒子を使用する。他の課題に関しては、より大きい粒子または小さい粒子を使用することもできる。
【００１８】
特異的リガンド（例えばＣＤ３４またはＣＤ１ｄに対する抗体、またはＨＩＶ−ｇｐ１２０に対する抗体）で活性化された微粒子を、採取された血液とｅｘ ｖｉｖｏで接触させる。該血液は通例の抗凝固剤で処理されたものである。これは別個の反応区画で行う。反応区画が体外循環中に設置される場合、ホース接続部、弁、フィルターおよびポンプを安全装置に連結することによって、対応する抗凝血後に患者に対する副作用を伴わずに系を作動できるよう確保する。
【００１９】
標的細胞に機能化微粒子を結合させる。細胞を結合した微粒子の分離は、好ましくは管の形状の、メンブレン（スクリーン）を利用する静水圧によって行われる。該メンブレンはすべての血液成分を障害なく通過させるが（孔サイズは１０μｍより大きく、８００μｍより小さい）、微粒子を保持する。垂直方向および同様に接平面方向の圧力の両効果によってろ過を行うことができる。管中に残っている粒子は、反応容器に戻されるか、あるいは分析または調製のために導出される。
【００２０】
血液の流動を停止した後、微粒子から細胞を分離するために反応容器を使用することができる。このように分離された分散細胞を同一のプロセスによって粒子から除去することができ、そして診断上の適用に利用可能である。
【００２１】
別の適用は、対象となる細胞タイプがその要求される機能の達成のために表面分子および／または生体分子、例えば他の細胞タイプのサイトカインを必要とする場合に、共培養のために意図的に複数の細胞タイプを単離することである。
【００２２】
必要な細胞−細胞接触のために不可欠な標的細胞の十分な近接を達成するために、いくつかの特異的リガンドを１粒子上に結合させることができる。
【００２３】
この適用のための具体的細胞は、とりわけ、Ｔ細胞、Ｂ細胞または幹細胞であってよい。
【００２４】
本方法は不連続に使用することができ、連続して使用することもできる。材料、直径および表面修飾に関する粒子デザインにおける高い変動性により、動物について、医学的診断での、さらにバイオテクノロジーおよび生物学的研究においての適用の可能性の非常に大きな多様性が得られる。
【実施例１】
【００２５】
ラット全血からのＣＤ４陽性細胞の単離
Ａｓｃｉｔｉｓ抗体（ＲＩＢ５／２）について、プロトコルにしたがってＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｏｎｔａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＬＳＫ２ ＡＢＧ ２０）を使用した。
【００２６】
その後、ＳＤＳ変性ゲル（１０％）を用いて精製を確認した。
【００２７】
抗ＣＤ４抗体とポリメチルアクリラート（ＰＭＡ）粒子のカップリング
１．  ＰＭＡ１ｍｌ（粒径＝４０μｍ＋／−１０μｍ；１０ｍｇ／ｍｌ；ＣＯＯＨ／ＰＥＧ−ＣＯＯＨ修飾型）を３，０００×ｇで２分間遠心分離し、上清を捨て、１ｍｌの０．１Ｍ ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．３）中に加える。
【００２８】
２．  ０．５ｍｌの０．１Ｍ ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．３）中に２ｍｇのＥＤＣおよび２．４ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解し、ＰＭＡ粒子の懸濁液に加える。室温で１時間、撹拌しながらインキュベートする（粒子の活性化）。
【００２９】
３．  遠心分離によってＰＭＡ粒子を分離し、０．１Ｍ ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．３）で２回洗浄する。
【００３０】
４．  抗体１００〜１５０μｇを含む１ｍｌの０．１Ｍ ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．３）中に活性化済みＰＭＡ粒子を加え；カップリング反応を室温で１６時間（一晩）行う。
【００３１】
５．  １００μｌの１Ｍエタノールアミンを加えることによって自由な結合点を機能消失させ、その後１時間インキュベートする。
【００３２】
６．  遠心分離によって分離し、機能化ＰＭＡ粒子をＰＢＳで３回洗浄する。
【００３３】
７．  １ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に抗ＣＤ４ ＰＭＡ粒子を加え、４℃で保存する。ＰＥで標識されたヤギ抗マウス抗体を用いて抗体のカップリングを確認する（図１）。
【００３４】
全血からのＣＤ４陽性細胞由来の特異的な細胞単離
１．  ４ｍｌの抗凝血処理ラット全血を機能化抗ＣＤ４ ＰＭＡ粒子懸濁液１ｍｌ（粒子１ｍｇ）と混合する。
【００３５】
２．  室温で６０分間、振とうしながらインキュベートする。
【００３６】
３．  細胞スクリーン（４０μｍ）を有する特殊なチャンバーを用いて血液粒子混合物をろ過することによって、抗ＣＤ４ ＰＭＡ粒子（細胞が結合している粒子および細胞が結合していない粒子）を全血から分離する。
【００３７】
４．  抗ＣＤ４ ＰＭＡ粒子を３０ｍｌのＰＢＳ（１％ＦＣＳ）で洗浄する。
【００３８】
５．  スクリーンチャンバーから得た粒子を約１ｍｌのＰＢＳに加え、１５〜２０秒間ボルテックス（混合）する。
【００３９】
６．  顕微鏡解析のために粒子サンプルを取り出す（図２）。
【００４０】
７．  抗ＣＤ４ ＰＭＡ粒子での処理前および処理後にラット全血中の白血球フラクションをＦＡＣＳ解析する（図３および４）。
【００４１】
粒子からの細胞の分離および認定
１．  慎重な遠心分離によって細胞が付着している抗ＣＤ４ ＰＭＡ粒子を沈降させる。
【００４２】
２．  ＰＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、３ｍＭメルカプトエタノールおよび２０Ｕパパイン中に沈降物を加える。
【００４３】
３．  ３０分間混合しながらインキュベートする。
【００４４】
４．  細胞スクリーン（４０μｍ）を有する特殊なチャンバーを用いてろ過することによって細胞および粒子を分離し；３０ｍｌのＰＢＳ（１％ＦＣＳ）で粒子を洗浄し；細胞スクリーンから得た粒子を約１ｍｌのＰＢＳに加え；１５〜２０秒間ボルテックス（混合）し、洗浄を繰り返す。
【００４５】
５．  ３５０×ｇでの遠心分離によって単離リンパ球フラクションを濃縮し、ＦＡＣＳを用いて解析する（図５）。
【実施例２】
【００４６】
細胞ライセートからのタンパク質（ＩｇＧ）の単離
Ａｓｃｉｔｉｓ抗体（ＲＩＢ５／２）について、プロトコルにしたがってＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｏｎｔａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＬＳＫ２ ＡＢＧ ２０）を使用した。
【００４７】
その後、ＳＤＳ変性ゲル（１０％）を用いて精製を確認した。
【００４８】
抗ＣＤ４抗体（マウスＩｇＧ２）とポリメチルアクリラート（ＰＭＡ）粒子のカップリング
１．  ＰＭＡ１ｍｌ（粒径＝４０μｍ＋／−１０μｍ；１０ｍｇ／ｍｌ；ＣＯＯＨ／ＰＥＧ−ＣＯＯＨ修飾型）を３．０００×ｇで２分間遠心分離し、上清を捨て、１ｍｌの０．１Ｍ ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．３）中に加える。
【００４９】
２．  ０．５ｍｌの０．１Ｍ ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．３）中に２ｍｇのＥＤＣおよび２．４ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解し、ＰＭＡ粒子の懸濁液に加える。室温で１時間、撹拌しながらインキュベートする（粒子の活性化）。
【００５０】
３．  遠心分離によってＰＭＡ粒子を分離し、０．１Ｍ ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．３）で２回洗浄する。
【００５１】
４．  抗体１００〜１５０μｇを含む１ｍｌの０．１Ｍ ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．３）中に活性化済みＰＭＡ粒子を加え；カップリング反応を室温で１６時間（一晩）行う。
【００５２】
５．  １００μｌの１Ｍエタノールアミンを加えることによって自由な結合点を機能消失させ、その後１時間インキュベートする。
【００５３】
６．  遠心分離によって分離し、機能化ＰＭＡ粒子をＰＢＳで３回洗浄する。
【００５４】
７．  １ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中にマウスＩｇＧ ＰＭＡ粒子を加え、４℃で保存する。ＰＥで標識されたヤギ抗マウス抗体を用いて抗体のカップリングを確認する（図１）。
【００５５】
細胞ライセートからのヤギ抗マウスＩｇＧの特異的単離
１．  １ｍｌの細胞ライセート（ＨｅｐＧ２，４×１０６）を１ｍｇのヤギ抗マウスＩｇＧと混合する。
【００５６】
２．  機能化マウスＩｇＧ ＰＭＡ粒子懸濁液０．１ｍｌ（粒子１００μｇ）をタンパク質混合物に加える。
【００５７】
３．  室温で６０分間、振とうしながらインキュベートする。
【００５８】
４．  スクリーンメンブレン（１０μｍ）を有する特殊なチャンバーを用いてろ過することによって、細胞ライセートからマウスＩｇＧ ＰＭＡ粒子（ヤギ抗マウスＩｇＧが結合している粒子およびヤギ抗マウスＩｇＧが結合していない粒子）を分離する。
【００５９】
５．  各５ｍｌのＰＢＳを用いてＰＭＡ粒子を３回洗浄する。
【００６０】
粒子からのタンパク質の分離および確認
１．  スクリーンチャンバーから得た付着タンパク質を伴う機能化ＰＭＡ粒子を０．５ｍｌのクエン酸バッファー（ｐＨ２．２）に加え；３０分間インキュベートする。
【００６１】
２．  スクリーンメンブレン（１０μｍ）を有する特殊なチャンバーを用いてろ過することによって粒子を分離し；２ｍｌのクエン酸バッファーで粒子を洗浄する。
【００６２】
３．  クエン酸バッファー中の分離されたタンパク質を分析する（図６）。
【実施例３】
【００６３】
図７〜１１は、装置に基づく本発明の実現または、場合によっては、その一部分の実現の例を示す。図７は、連続使用に典型的に適用可能な系を示す。点在する矢印はホース系を表し、矢印の先端は液体の流動方向を示す。生物（哺乳動物）から出発し、血液ポンプおよび弁（図中で円形で示される）によって、体液、例えば血液をポンプするか、あるいは導いて、機能化粒子を含有する反応容器に入れる。機能化粒子は混合物中の体液の成分と相互作用することができるものである（図８）。次いで細胞混合物および機能化粒子を含む媒体を粒子分離系に導入する。一例では、細胞混合物および機能化粒子を含む媒体を導いて、スクリーンを通過させ、中空繊維メンブレンを通過させて、機能化粒子を伴わない細胞混合物と機能化粒子を伴う細胞混合物に分離する（図９）。機能化粒子を伴わない減少した濃度の混合物を弁によって導出し、該生物に導入する一方、機能化粒子を伴う細胞混合物およびそれらに結合している標的細胞／生体粒子／分子を反応容器に戻す（図７）。図１０は、中空繊維メンブレン内での分離の原理を典型例として示す。細胞混合物および機能化粒子を含む媒体を導いて中空管メンブレンを通過させるが、該中空管メンブレンは細胞混合物の通過のみを許容する孔サイズ（破線）を備えていて、したがって、この時点で媒体は標的細胞／生体粒子／分子をほとんど含有せず、一方、分離対象の標的細胞／生体粒子／分子を伴う機能化粒子は中空管系の内部に残留する。
【００６４】
図１１は、対応する粒子分離系の詳細を表す。該粒子分離系は、直径が異なる２種類の機能化粒子に関して使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】ＰＥ標識ヤギ抗マウス抗体を用いて標識した抗ＣＤ４ ＰＭＡ粒子の顕微鏡像を示す。
【図２】ラット全血とインキュベートした後の、抗ＣＤ４ ＰＭＡ粒子の顕微鏡像を示す。
【図３】ＰＭＡ粒子での処理前でのラット全血中の白血球フラクションのＦＡＣＳ解析を示す。
【図４】ＰＭＡ粒子での処理後でのラット全血中の白血球フラクションのＦＡＣＳ解析を示す。
【図５】単離リンパ球フラクションのＦＡＣＳ解析を示す。
【図６】細胞ライセートからのタンパク質分離の分析結果を示す。
【図７】連続使用に典型的に適用可能な系を示す。点在する矢印はホース系を表し、矢印の先端は液体の流動方向を示す。
【図８】混合物中の体液の成分と相互作用する機能化粒子を模式的に示す。
【図９】細胞混合物および機能化粒子を含む媒体を導いて、スクリーンを通過させ、中空繊維メンブレンを通過させて、機能化粒子を伴わない細胞混合物と機能化粒子を伴う細胞混合物に分離する、粒子分離系の一例を示す。
【図１０】中空繊維メンブレン内での分離の原理を典型例として示す。
【図１１】異なるサイズの２種類の機能化粒子を用いる分離系の一例を表す。
【図１】
2008507956.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2008507956.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成18年3月6日(2006.3.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物についての、バイオテクノロジー（生物学的研究を含む）および医学的診断での適用のための、細胞、生体粒子および分子を液体から単離するための装置であって、以下のものを含む装置：
ａ．  細胞、粒子および分子の混合物が配置される、生体適合性材料からなる反応容器；
ｂ．  必要とされる細胞、生体粒子および／または分子集団を認識し、かつそれらを結合する機能化微粒子であって、自由可動性であり、反応容器から粒子分離系へ導出することができる微粒子；
ｃ．  細胞、生体粒子および／または分子の通過を許容するが、前記微粒子の通過を許容しない孔を有する１以上のメンブレン／スクリーンに基づく粒子分離系であって、
細胞混合物および微粒子を含む媒体を、静水圧によって、微粒子を伴う細胞混合物と微粒子を伴わない細胞混合物とに分離するための、または
細胞混合物および微粒子を含む媒体を、静水圧によって、メンブレンを通過する、細胞に結合していない遊離の微粒子を含む細胞混合物と、機能化微粒子および標的細胞からなる特異的複合体のみを含有する、メンブレンの手前の媒体とに分離するための粒子分離系；
ｄ．  スクリーン／中空繊維メンブレンであって、微粒子を伴わない細胞混合物のみの通過を許容する孔サイズを備えているもの；
ｅ．  適用可能であれば、弁によって反応容器中へ液体をポンプ／導入するためのポンプ；
ｆ．  反応容器中へ液体をポンプ／導入するための弁；
ｇ．  微粒子を伴わない細胞混合物を粒子分離系から導出するための弁；
ｈ．  （Ａ）細胞混合物を含む液体を、機能化微粒子を含有する反応容器中へ弁によって導入またはポンプするためのホース系、（Ｂ）反応容器から細胞混合物および機能化微粒子を含む媒体を導いて、機能化微粒子を伴わない細胞混合物と機能化微粒子を伴う細胞混合物とに該媒体を分離するための中空繊維メンブレンを有するスクリーンを通過させるためのホース系、または反応容器から細胞混合物および機能化微粒子を含む媒体を導いて、該媒体を、メンブレンを通過する、細胞に結合していない遊離の微粒子を含む細胞混合物と、機能化微粒子および標的細胞からなる特異的複合体のみを含有するメンブレンの手前の媒体とに分離するためのスクリーンを通過させるホース系、（Ｃ）機能化微粒子を伴わない分離済み細胞混合物を弁によって導出するためのホース系、および（Ｄ）機能化微粒子およびそれに結合している細胞／生体粒子／分子を伴う分離済み細胞混合物を導いて反応容器に戻すホース系、または機能化微粒子およびそれに結合している細胞／生体粒子／分子を伴う細胞混合物を分析または調製のために導出するためのホース系；
ｉ．  および、連続使用のために、細胞、生体粒子および／または分子の単離、分離、加工および除去のすべての工程を実行可能にするための、種々のホース系、メンブレン、ポンプおよび弁。
【請求項２】
細胞または生体粒子を単独で、あるいは分子と組み合わせて単離するための、１種のスクリーンおよび１種のサイズの粒子のみを使用する、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
微粒子が特異的リガンドで機能化され、該特異的リガンドは微粒子に共有結合されているか、あるいはスペーサーまたはリンカーを介して固定されている、請求項１または２に記載の装置。
【請求項４】
特定の細胞、生体粒子および／または分子が体細胞、細胞レベル以下の構造、タンパク質および／または核酸であり、適用可能であれば、ウイルス、細菌および／または原生動物であり、ならびに液体が分泌物および排泄物、血液、リンパ、体液（liquor）、洗浄サンプル、あるいは器官採取物または栄養培地もしくは発酵沈殿由来の分離細胞の懸濁液であり、かつ細胞、生体粒子および／または分子を含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５】
追加の機能化微粒子を使用することによって、細胞／生体粒子／分子の分離を細胞、生体粒子および／または分子の吸着の原理と組み合わせる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項６】
併用される機能化微粒子同士がそのサイズに関して異なっている、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
機能化微粒子が２種以上の特異的リガンドを保持し、ゆえに２種以上の異なる細胞、生体粒子および／または分子が該微粒子に特異的に吸着する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項８】
追加のリガンドによって生細胞に関する細胞刺激機能をもたらすことができる、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
細胞膜／メディエーター相互作用によって少なくとも１種の細胞タイプの刺激がもたらされる少なくとも２種の異なる細胞タイプを追加のリガンドによって分離する、請求項６〜８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１０】
機能化微粒子が液体に懸濁され、自由可動性である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１１】
機械的作用によって微粒子を懸濁状態で維持する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１２】
微粒子が配備されている反応区画由来の液体をろ過によって微粒子と分離する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１３】
特異的に吸着されないすべての成分の通過を許容するが、使用される微粒子の通過を許容しない直径を有する孔を特徴とするメンブレン／スクリーンをろ過に使用する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１４】
孔の直径が１μｍより大きく、１，０００μｍより小さい平面状または中空管メンブレンを分離に使用する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１５】
反応容器を使用して単離された細胞の追加の加工を行う、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１６】
微粒子がポリメタクリラート、ポリアルキルシアノアクリラートまたはセファロースの表面を有する固体担体である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１７】
細胞、生体粒子および／または分子を液体から分離するための方法であって、以下のステップを含む方法：
−  細胞を含む液体をポンプするか、または弁によって導いて、適用可能であれば混合物中の該液体の成分と相互作用する機能化微粒子を含有する生体適合性反応容器に入れるステップ；
−  細胞混合物および機能化粒子を含む媒体を、反応容器から、スクリーンおよび中空繊維メンブレンを有する粒子分離系に導入するが、該スクリーンおよび中空繊維メンブレンは、機能化粒子を伴わない細胞混合物のみの通過を許容する孔サイズを備えており、その結果として、細胞混合物および機能化粒子を含む該媒体を静水圧によって該スクリーンおよび中空繊維メンブレンを通過させて、機能化粒子を伴わない細胞混合物と機能化粒子を伴う細胞混合物とに分離するステップ；
−  機能化粒子を伴わない分離済み細胞混合物を弁によって粒子分離系から導出するステップ；および
−  機能化粒子を伴う細胞混合物および、適用可能であれば、標的細胞／生体粒子／分子を導いて反応容器に戻すか、あるいは分析または調製のために導出するステップ。
【請求項１８】
適用可能であれば、特定の表面抗原により特徴づけられる細胞、生体粒子および／または分子を分離するための請求項１７に記載の方法であって、該表面抗原を認識する原理が天然または合成起源のリガンドである方法。
【請求項１９】
リガンドが抗体、抗体フラグメント、ペプチド、ポリペプチド、糖ペプチド、受容体、ステロイド、ホルモン、マイトジェン、抗原、スーパー抗原、成長因子、サイトカイン、レクチン（lektin）、ウイルスタンパク質、接着分子またはケモカインである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
リガンドが共有結合または非共有結合によって微粒子に結合している、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
固体担体として生体適合性ポリマーを使用する、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
使用目的に応じて、ポリマーが小さな内表面積（interne Oberflache）または大きな内表面積を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
リガンドが、好ましくは、ポリメタクリラート、ポリアルキルシアノアクリラートまたはセファロースにカップリングされている、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
リガンドが、好ましくは、セファロースにカップリングされている、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
細胞、生体粒子および／または分子を連続して、または不連続に分離する、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
任意の数量の個別のモジュールとして、異なる機能化微粒子に応じて反応容器を順番に切り替えることができる、請求項１７〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
異なる孔サイズ／メッシュ幅のメンブレン／スクリーンを有する複数の分離モジュールを、異なる様式で機能化された粒子を含む任意の数量の反応容器に順番に切り替えることができる、請求項１７〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
ポンプによって液体を反応容器に導入／ポンプする、請求項１７〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
連続分離のために、機能化微粒子を反応容器に入れ、細胞、生体粒子および／または分子を含有する液体によりこれを流動させる、請求項１７〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
液体が血液である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
所定のバッファーを適用することによって、細胞、生体粒子および／または分子を微粒子から分離する、請求項１７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
細胞の放出および、必要であれば、別の細胞、生体粒子および／または分子の放出を同一反応容器中で実行する、請求項１７〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
液体の分離に使用されるメンブレンと同一のメンブレンでのろ過によって、細胞、生体粒子および／または分子を微粒子懸濁液から分離する、請求項１７〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
分離された細胞、生体粒子および／または分子を、ヒトへの適用を目的とせずに、分析および／または別の機械処理および／または加工のために使用する、請求項１７〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
分離された細胞、生体粒子および／または分子を、加工せずに、あるいは修飾して、疾患の研究または治療のために動物に投与することができる、請求項１７〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
体外循環においてｅｘ ｖｉｖｏで血液を処理するための、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の装置および方法。
【請求項３７】
診断またはさらなる加工のための、細胞、生体粒子および／または分子の浄化、富化または濃縮に適している、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の装置および方法。
【請求項３８】
中空繊維メンブレンを中空管メンブレンとして設計する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項３９】
中空繊維メンブレンを中空管メンブレンとして設計し、その結果として、適用可能であれば、分離された細胞／生体粒子／分子を伴う機能化粒子が中空管系の内部に残留する、請求項１７〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
中空繊維メンブレンを中空管メンブレンとして設計し、その結果として、適用可能であれば、血液から分離された細胞／生体粒子／分子を伴う機能化粒子が、中空管系を有する体外循環の内部に残留する、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の装置および方法。
【手続補正書】
【提出日】平成19年4月2日(2007.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物についての、バイオテクノロジー（生物学的研究を含む）および医学的診断での適用のための、細胞、生体粒子および分子を液体から単離するための装置であって、以下のものを含む装置：
ａ．  細胞、粒子および／または分子の混合物が配置される、生体適合性材料からなる反応容器；
ｂ．  必要とされる細胞、生体粒子および／または分子集団を認識し、かつそれらを結合する機能化微粒子；
ｃ．  細胞、生体粒子および／または分子の通過を許容するが、前記微粒子の通過を許容しない孔を有する１以上のメンブレンに基づく粒子分離系；
ｄ．  および、連続使用のために、細胞、生体粒子および／または分子の単離、分離、加工および除去のすべての工程を実行可能にするための、種々のホース系、メンブレン、ポンプおよび弁。
【請求項２】
請求項１に記載の装置であって、
−  特定の細胞、生体粒子および／または分子が体細胞、細胞レベル以下の構造、タンパク質および／または核酸であり、適用可能であれば、ウイルス、細菌および／または原生動物であり、ならびに液体が分泌物および排泄物、血液、リンパ、体液（liquor）、洗浄サンプル、あるいは器官採取物または栄養培地もしくは発酵沈殿由来の分離細胞の懸濁液であり、かつ細胞、生体粒子および／または分子を含有するものであり；かつ／または
−  追加の機能化微粒子を使用することによって、細胞／生体粒子／分子の分離を細胞、生体粒子および／または分子の吸着の原理と組み合わせ、特に併用される機能化微粒子同士がそのサイズに関して異なっており、好ましくは追加のリガンドによって生細胞に関する細胞刺激機能をもたらすことができ、あるいは好ましくは細胞膜／メディエーター相互作用によって少なくとも１種の細胞タイプの刺激がもたらされる少なくとも２種の異なる細胞タイプを追加のリガンドによって分離するものであり；かつ／または
−  機能化微粒子が２種以上の特異的リガンドを保持し、ゆえに２種以上の異なる細胞、生体粒子および／または分子が該微粒子に特異的に吸着する、
上記装置。
【請求項３】
請求項１または２に記載の装置であって、
−  機能化微粒子が液体に懸濁され、自由可動性であり；かつ／または
−  機械的作用によって微粒子を懸濁状態で維持し；かつ／または
−  微粒子が配備されている反応区画由来の液体をろ過によって微粒子と分離させるものであり；かつ／または
−  特異的に吸着されないすべての成分の通過を許容するが、使用される微粒子の通過を許容しない直径を有する孔を特徴とするメンブレンをろ過に使用するものであり；かつ／または
−  孔の直径が１μｍより大きく、１，０００μｍより小さい平面状または中空管メンブレンを分離に使用するものであり；かつ／または
−  反応容器を使用して単離された細胞の追加の加工を行う、
上記装置。
【請求項４】
細胞、生体粒子および／または分子を液体から分離するための方法であって、分離される細胞が特定の表面抗原により特徴づけられる、上記方法。
【請求項５】
細胞、生体粒子および／または分子を分離するための請求項４に記載の方法であって、該表面抗原を認識する原理が天然または合成起源のリガンドであり、特に、リガンドが抗体、抗体フラグメント、ペプチド、ポリペプチド、糖ペプチド、受容体、ステロイド、ホルモン、マイトジェン、抗原、スーパー抗原、成長因子、サイトカイン、レクチン（lektin）、ウイルスタンパク質、接着分子またはケモカインである、上記方法。
【請求項６】
請求項４または５に記載の方法であって、
−  リガンドが共有結合または非共有結合によって微粒子に結合しており；かつ／または
−  固体担体として生体適合性ポリマーを使用し；かつ／または
−  リガンドが、好ましくはセファロースにカップリングされており；かつ／または
−  細胞、生体粒子および／または分子を連続して、または不連続に分離するものであり；かつ／または
−  任意の数量の個別のモジュールとして、異なる機能化微粒子に応じて反応容器を順番に切り替えることができるものであり；かつ／または
−  連続分離のために、機能化微粒子を反応容器に入れ、細胞、生体粒子および／または分子を含有する液体、好ましくは血液、によりこれを流動させるものであり；かつ／または
−  所定のバッファーを適用することによって、細胞、生体粒子および／または分子を微粒子から分離するものであり；かつ／または
−  細胞の放出および、必要であれば、別の細胞、生体粒子および／または分子の放出を同一反応容器中で実行するものであり；かつ／または
−  液体の分離に使用されるメンブレンと同一のメンブレンでのろ過によって、細胞、生体粒子および／または分子を微粒子懸濁液から分離するものであり；かつ／または
−  分離された細胞、生体粒子および／または分子を、ヒトへの適用を目的とせずに、分析および／または別の機械処理および／または加工のために使用するものであり；かつ／または
−  分離された細胞、生体粒子および／または分子を、加工せずに、あるいは修飾して、疾患の研究または治療のために動物に投与することができる、
上記方法。
【請求項７】
動物についての、バイオテクノロジー（生物学的研究を含む）および医学的診断での適用のための、細胞、生体粒子および分子を液体から単離するための装置であって、以下のものを含む装置：
ａ．  細胞、粒子および分子の混合物が配置される、生体適合性材料からなる反応容器；
ｂ．  必要とされる細胞、生体粒子および／または分子集団を認識し、かつそれらを結合する機能化微粒子であって、自由可動性であり、反応容器から粒子分離系へ導出することができる微粒子；
ｃ．  細胞、生体粒子および／または分子の通過を許容するが、前記微粒子の通過を許容しない孔を有する１以上のメンブレン／スクリーンに基づく粒子分離系であって、
細胞混合物および微粒子を含む媒体を、静水圧によって、微粒子を伴う細胞混合物と微粒子を伴わない細胞混合物とに分離するための、または
細胞混合物および微粒子を含む媒体を、静水圧によって、メンブレンを通過する、細胞に結合していない遊離の微粒子を含む細胞混合物と、機能化微粒子および標的細胞からなる特異的複合体のみを含有する、メンブレンの手前の媒体とに分離するための粒子分離系；
ｅ．  スクリーン／中空繊維メンブレンであって、微粒子を伴わない細胞混合物のみの通過を許容する孔サイズを備えているもの；
ｆ．  適用可能であれば、弁によって反応容器中へ液体をポンプ／導入するためのポンプ；
ｇ．  反応容器中へ液体をポンプ／導入するための弁；
ｈ．  微粒子を伴わない細胞混合物を粒子分離系から導出するための弁；
ｉ．  （Ａ）細胞混合物を含む液体を、機能化微粒子を含有する反応容器中へ弁によって導入またはポンプするためのホース系、（Ｂ）反応容器から細胞混合物および機能化微粒子を含む媒体を導いて、機能化微粒子を伴わない細胞混合物と機能化微粒子を伴う細胞混合物とに該媒体を分離するための中空繊維メンブレンを有するスクリーンを通過させるためのホース系、または反応容器から細胞混合物および機能化微粒子を含む媒体を導いて、該媒体を、メンブレンを通過する、細胞に結合していない遊離の微粒子を含む細胞混合物と、機能化微粒子および標的細胞からなる特異的複合体のみを含有するメンブレンの手前の媒体とに分離するためのスクリーンを通過させるホース系、（Ｃ）機能化微粒子を伴わない分離済み細胞混合物を弁によって導出するためのホース系、および（Ｄ）機能化微粒子およびそれに結合している細胞／生体粒子／分子を伴う分離済み細胞混合物を導いて反応容器に戻すホース系、または機能化微粒子およびそれに結合している細胞／生体粒子／分子を伴う細胞混合物を分析または調製のために導出するためのホース系；
ｄ．  および、連続使用のために、細胞、生体粒子および／または分子の単離、分離、加工および除去のすべての工程を実行可能にするための、種々のホース系、メンブレン、ポンプおよび弁。
【請求項８】
細胞、生体粒子および／または分子を液体から分離するための請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法であって、以下のステップを含む方法：
−  細胞を含む液体をポンプするか、または弁によって導いて、適用可能であれば混合物中の該液体の成分と相互作用する機能化微粒子を含有する生体適合性反応容器に入れるステップ；
−  細胞混合物および機能化粒子を含む媒体を、反応容器から、スクリーンおよび中空繊維メンブレンを有する粒子分離系に導入し、該スクリーンおよび中空繊維メンブレンは、機能化粒子を伴わない細胞混合物の通過のみを許容する孔サイズを備えており、その結果として、細胞混合物および機能化粒子を含む該媒体を静水圧によって該スクリーンおよび中空繊維メンブレンを通過させて、機能化粒子を伴わない細胞混合物と機能化粒子を伴う細胞混合物とに分離するステップ；
−  機能化粒子を伴わない分離済み細胞混合物を弁によって粒子分離系から導出するステップ；および
−  機能化粒子を伴う細胞混合物および、適用可能であれば、標的細胞／生体粒子／分子を導いて反応容器に戻すか、あるいは分析または調製のために導出するステップ。
【請求項９】
体外循環においてｅｘ ｖｉｖｏで血液を処理するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の装置および方法。
【請求項１０】
診断またはさらなる加工のための、細胞、生体粒子および／または分子の浄化、富化または濃縮に適している、請求項１〜９のいずれか１項に記載の装置および方法。
【国際調査報告】
2008507956.tif 000013
2008507956.tif 000014
2008507956.tif 000015
2008507956.tif 000016
2008507956.tif 000017
2008507956.tif 000018
2008507956.tif 000019
2008507956.tif 000020