(57)【要約】  本発明は、抗核抗体に関連する疾患を治療する医薬品の調製におけるＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩の使用であって、このＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩が、抗核抗体のレベルを下方制御するのに十分な量で投与される使用に関する。本発明の別の態様は、ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩、並びにメチルプレドニゾロンを含む組合せ物と、ＳＬＥなど抗核抗体に関連する疾患の治療におけるその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗核抗体に関連する疾患を治療する医薬品の調製におけるＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩の使用であって、前記ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩が抗核抗体のレベルを下方制御するのに十分な量で投与される使用。
【請求項２】
疾患が、自己免疫性リウマチ疾患又は器官特異的自己免疫である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
自己免疫性リウマチ疾患が、薬剤誘発性狼瘡、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、及びリウマチ性関節炎から選択される、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
自己免疫性リウマチ疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
抗核抗体が、抗ＤＮＡ抗体である、請求項１から４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤が、Ｍｃl−１の発現を下方制御するのに十分な量である、請求項１から５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤が、タンパク尿症及び腎機能障害の発症を遅らせるのに十分な量である、請求項１から６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤が、糸球体及び管間質の変化を低下させるのに十分な量である、請求項１から７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤が、単核細胞の間質性蓄積を減少させるのに十分な量である、請求項１から８のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤が、（ＰＭＡ及びＣｏｎＡによって誘発された）Ｔ細胞増殖を阻害するのに十分な量である、請求項１から９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
医薬品が、メチルプレドニゾロンとの併用療法で使用するものである、請求項１から１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
対象の抗核抗体に関連する疾患を治療する方法であって、ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩を、抗核抗体のレベルを下方制御するのに十分な量で前記対象に投与することを含む方法。
【請求項１３】
対象の自己免疫疾患を、前記対象の抗核抗体のレベルを下方制御することによって治療する方法であって、ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩を、抗核抗体のレベルを下方制御するのに十分な量で投与することを含む方法。
【請求項１４】
対象の抗核抗体に関連する疾患を抗核抗体のレベルを下方制御することによって治療する方法であって、前記疾患が治療されるように、ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩を投与することを含む方法。
【請求項１５】
対象の抗核抗体のレベルを下方制御する方法であって、ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩を、抗核抗体のレベルを下方制御するのに十分な量で前記対象に投与することを含む方法。
【請求項１６】
疾患が、自己免疫性リウマチ疾患又は器官特異的自己免疫である、請求項１２から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
自己免疫性リウマチ疾患が、薬剤誘発性狼瘡、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、及びリウマチ性関節炎から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
自己免疫性リウマチ疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
抗核抗体が、抗ＤＮＡ抗体である、請求項１２から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤が、Ｍｃｌ−１の発現を下方制御するのに十分な量である、請求項１２から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤が、タンパク尿症及び腎機能障害の発症を遅らせるのに十分な量である、請求項１２から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤が、糸球体及び尿細管間質の変化を低下させるのに十分な量である、請求項１２から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤が、単核細胞の間質性蓄積を減少させるのに十分な量である、請求項１２から２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤が、ＰＭＡ及びＣｏｎＡによって誘発されたＴ細胞増殖を阻害するのに十分な量である、請求項１２から２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
対象にメチルプレドニゾロンを投与することをさらに含む、請求項１２から２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
メチルプレドニゾロン、並びにＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩が、同時に、連続して、又は個別に投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
細胞内の抗核抗体のレベルを下方制御する方法であって、前記細胞と、前記細胞の抗核抗体のレベルを下方制御するのに十分な量のＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩とを接触させることを含む方法。
【請求項２８】
抗核抗体に関連する疾患を治療する薬剤組成物であって、製薬上許容される希釈剤、賦形剤、又は担体と混合された、抗核抗体のレベルを下方制御するのに十分な量のＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤を含む薬剤組成物。
【請求項２９】
ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩、並びにメチルプレドニゾロンを含む組合せ物。
【請求項３０】
請求項２９に記載の組合せ物、及び製薬上許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含む薬剤組成物。
【請求項３１】
治療において同時に、連続して、又は個別に使用する組合せ製剤としての、ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩、並びにメチルプレドニゾロンを含む医薬品。
【請求項３２】
ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩、並びにメチルプレドニゾロンが、同時に投与される、請求項３１に記載の医薬品。
【請求項３３】
製薬上許容される担体、希釈剤、又は賦形剤をさらに含む、請求項３１又は３２に記載の医薬品。
【請求項３４】
抗核抗体に関連する疾患の治療で使用される請求項３１から３３のいずれかに記載の医薬品。
【請求項３５】
疾患が、自己免疫性リウマチ疾患又は器官特異的自己免疫である、請求項３４に記載の医薬品。
【請求項３６】
自己免疫性リウマチ疾患が、薬剤誘発性狼瘡、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、及びリウマチ性関節炎から選択される、請求項３５に記載の医薬品。
【請求項３７】
自己免疫性リウマチ疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である、請求項３６に記載の医薬品。
【請求項３８】
（ｉ）ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩；並びに
（ｉｉ）メチルプレドニゾロン
を含む、製薬上許容される希釈剤、賦形剤、又は担体と混合された薬剤組成物。
【請求項３９】
ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤が、プリン誘導体又はピリミジン誘導体である、請求項２８、３０、若しくは３８に記載の薬剤組成物、又は請求項３１から３７のいずれかに記載の医薬品。
【請求項４０】
ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤が、
【化１】
2008510784.tif 000023
及び薬剤として許容されるそれらの塩から選択される、請求項２８、３０、若しくは３８に記載の薬剤組成物、又は３１から３７のいずれかに記載の医薬品。
【請求項４１】
ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤が、ロスコビチン、オロモウシン、及びパルバラノールＡ、並びに薬剤として許容されるそれらの塩から選択される、請求項２８、３０、若しくは３８に記載の薬剤組成物、又は請求項３１から３７のいずれかに記載の医薬品。
【請求項４２】
ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤が、ロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩である、請求項２８、３０、若しくは３８に記載の薬剤組成物、又は請求項３１から３７のいずれかに記載の医薬品。
【請求項４３】
抗核抗体に関連する疾患を治療する医薬品の調製における請求項２９に記載の組合せ物の使用。
【請求項４４】
抗核抗体に関連する疾患を治療する医薬品の調製におけるＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩の使用であって、前記医薬品が、メチルプレドニゾロンと組み合わせて使用するものである使用。
【請求項４５】
抗核抗体に関連する疾患を治療する医薬品の調製におけるメチルプレドニゾロンの使用であって、前記医薬品が、ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩と組み合わせて使用するものである使用。
【請求項４６】
抗核抗体に関連する疾患を治療する医薬品の調製におけるＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩、並びにメチルプレドニゾロンの使用。
【請求項４７】
抗核抗体に関連する疾患を治療する医薬品の調製におけるＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩の使用であって、前記治療が、対象に、ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩、並びにメチルプレドニゾロンを、同時に、連続して、又は個別に投与することを含む使用。
【請求項４８】
疾患が、自己免疫性リウマチ疾患又は器官特異的自己免疫である、請求項４３から４７のいずれかに記載の使用。
【請求項４９】
自己免疫性リウマチ疾患が、薬剤誘発性狼瘡、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、及びリウマチ性関節炎から選択される、請求項４８に記載の使用。
【請求項５０】
自己免疫性リウマチ疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である、請求項４３から４９のいずれかに記載の使用。
【請求項５１】
抗核抗体が、抗ＤＮＡ抗体である、請求項４３から５０のいずれかに記載の使用。
【請求項５２】
抗核抗体のレベルを低下させる、請求項４３から５０のいずれかに記載の使用。
【請求項５３】
対象の抗核抗体に関連する疾患を治療する方法であって、前記対象に、治療上許容される量の
（ｉ）ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩；並びに
（ｉｉ）メチルプレドニゾロン
を投与することを含む方法。
【請求項５４】
ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩、並びにメチルプレドニゾロンが、製薬上許容される希釈剤、賦形剤、又は担体と混合される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩、並びにメチルプレドニゾロンが、同時に、個別に、又は連続して投与される、請求項５３又は５４に記載の方法。
【請求項５６】
対象にＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩を投与した後、前記対象にメチルプレドニゾロンを連続して又は個別に投与することを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
対象にメチルプレドニゾロンを投与した後、ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩を連続して又は個別に投与することを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩、並びにメチルプレドニゾロンが、個々の成分に関して治療有効量で各々投与される、請求項５３から５７のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩、並びにメチルプレドニゾロンが、個々の成分に関して治療量以下の量で各々投与される、請求項５３から５７のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
疾患が、自己免疫性リウマチ疾患又は器官特異的自己免疫である、請求項５３から５７のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
自己免疫性リウマチ疾患が、薬剤誘発性狼瘡、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、及びリウマチ性関節炎から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
自己免疫性リウマチ疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤が、プリン誘導体又はピリミジン誘導体である、請求項１から１１若しくは請求項４３から５２のいずれかに記載の使用、又は請求項１２から２７若しくは請求項５３から６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤が、
【化２】
2008510784.tif 000024
【化３】
2008510784.tif 000025
及び薬剤として許容されるそれらの塩から選択される、請求項１から１１若しくは請求項４３から５２のいずれかに記載の使用、又は請求項１２から２７若しくは請求項５３から６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤が、ロスコビチン、オロモウシン、及びパルバラノールＡから選択される、請求項１から１１若しくは請求項４３から５２のいずれかに記載の使用、又は請求項１２から２７若しくは請求項５３から６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤が、ロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩である、請求項１から１１若しくは請求項４３から５２のいずれかに記載の使用、又は請求項１２から２７若しくは請求項５３から６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６７】
実質的に本明細書に記載の通りであり、添付の図に基づく方法、使用、組合せ物、薬剤組成物、又は医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗核抗体に関連する疾患を治療する方法に関する。より具体的には、これだけに限らないが、本発明は、ヒトの全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの自己免疫性リウマチ疾患の治療方法、並びにその薬剤組成物及び組合せ物に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系の目的は、微生物、毒素、癌細胞、及び他人又は他の種からの外来性の血液又は組織など、潜在的有害物質（抗原）から身体を保護することである。抗原は、免疫応答によって破壊され、それには、抗体（抗原に付着し、それをより破壊されやすくする分子）及び感作リンパ球（特定の抗原を認識し破壊する特別な白血球）の産生が含まれる。
【０００３】
免疫系障害は、免疫応答が、不適当、過剰、又は不足しているときに起こる。自己免疫障害は、免疫系にそれ自体の組織に対する抗体を産生させるという免疫系の異常な機能化を特徴とするどんな疾患も指す。これは、免疫系が通常無視するはずである物質、即ち、正常な「自己」体組織に反応する過敏症反応によって引き起こされる。
【０００４】
通常、免疫系は、「自己」と「非自己」組織を区別することができる。いくつかの免疫系細胞（リンパ球）は、「自己」組織細胞に対して敏感であるが、これらの不完全なリンパ球は、通常、他のリンパ球によって制御（抑制）される。自己免疫障害は、正常な制御過程が中断されるとき、或いは正常な体組織が変化してもはや「自己」と認められない場合に起こる。
【０００５】
自己免疫障害は、一般に、体組織のうちの１種若しくは複数のタイプの破壊、器官の異常成長、又は器官機能の変化をもたらす。この障害は、たった１個の器官又は組織タイプに影響を及ぼす恐れもあり、或いは多数の器官及び組織に影響を及ぼす恐れもある。一般に自己免疫障害に影響を受ける器官及び組織としては、赤血球などの血液成分、血管、結合組織、甲状腺や膵臓などの内分泌腺、腎臓や肝臓などの器官、筋肉、関節、及び皮膚が挙げられる。
【０００６】
自己免疫障害又は自己免疫関連の障害の例としては、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アジソン病、Ｉ型糖尿病、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、薬剤誘発性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、ライター症候群、及びグレーブス病が挙げられる。
【０００７】
自己免疫疾患の症状は、疾患のタイプに応じて広く変化する。しかし、自己免疫疾患は、しばしば、疲労、眩暈、倦怠感（不調の非特異的な感覚）、熱、及び微熱など非特異的な症状を伴う。
【０００８】
特異的自己免疫疾患は、器官若しくは組織の機能低下（例えば、膵臓の島細胞は糖尿病で破壊される）及び／又は器官若しくは組織のサイズ増加（例えば、グレーブス病における甲状腺肥大）を生じる器官又は組織の破壊をもたらす。こうした症状は、特異的な障害、及び影響を受けた器官又は組織に応じて変わる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
自己免疫は、免疫系のバランスのとれた抑制によって制御される。その目的は、正常な体組織に対する免疫応答を低下させるが、微生物及び異常な組織に対する免疫応答をそのままにしておくことである。自己免疫疾患の臨床治療には、一般に、免疫応答を低下させるコルチコステロイド及び免疫抑制剤（シクロホスファミド又はアザチオプリンを含む）の使用が含まれる。しかし、これまで利用可能な治療の多くは、深刻な副作用を伴う。
【００１０】
本発明は、理想的に症状を低下させ、自己免疫過程を制御するが、疾患と闘う能力を維持することができる、自己免疫疾患を治療する代替治療法を提供しようとするものである。より詳細には、本発明は、抗核抗体に関連する疾患、特にヒトの全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患の治療に関する。本発明はまた、こうした障害の治療に適した薬剤の組合せ及び組成物を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の態様は、抗核抗体に関連する疾患を治療する医薬品の調製におけるＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩の使用であって、このＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩が、抗核抗体のレベルを下方制御するのに十分な量で投与される使用に関する。
【００１２】
本発明の第２の態様は、対象の抗核抗体に関連する疾患を治療する方法であって、前記方法が、ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩を、抗核抗体のレベルを下方制御するのに十分な量で対象に投与することを含む方法に関する。
【００１３】
本発明の第３の態様は、対象の抗核抗体に関連する疾患を、前記対象の抗核抗体のレベルを下方制御することによって治療する方法であって、前記方法が、ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩を、抗核抗体のレベルを下方制御するのに十分な量で投与することを含む方法に関する。
【００１４】
本発明の第４の態様は、対象の抗核抗体に関連する疾患を、抗核抗体のレベルを下方制御することによって治療する方法であって、前記方法が、前記疾患が治療されるように、ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩を投与することを含む方法に関する。
【００１５】
本発明の第５の態様は、対象の抗核抗体のレベルを下方制御する方法であって、前記方法が、ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩を、抗核抗体のレベルを下方制御するのに十分な量で対象に投与することを含む方法に関する。
【００１６】
本発明の第６の態様は、細胞の抗核抗体のレベルを下方制御する方法であって、前記方法が、前記細胞を、前記細胞の抗核抗体のレベルを下方制御するのに十分な量のＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩と接触させることを含む方法に関する。
【００１７】
本発明の第７の態様は、抗核抗体に関連する疾患を治療する薬剤組成物であって、前記組成物が、製薬上許容される希釈剤、賦形剤、又は担体と混合された、抗核抗体のレベルを下方制御するのに十分な量のＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤を含む薬剤組成物に関する。
【００１８】
本発明の第８の態様は、ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩、並びにメチルプレドニゾロンを含む組合せ物に関する。
【００１９】
第９の態様は、本発明による組合せ物、及び製薬上許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含む薬剤組成物に関する。
【００２０】
本発明の第１０の態様は、治療において同時に、連続して、又は個別に使用する組合せ製剤としての、ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩、並びにメチルプレドニゾロンを含む医薬品に関する。
【００２１】
本発明の第１１の態様は、製薬上許容される希釈剤、賦形剤、又は担体と混合された、ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩、並びにメチルプレドニゾロンを含む薬剤組成物に関する。
【００２２】
第１２の態様は、抗核抗体に関連する疾患を治療する医薬品の調製における本発明による組合せ物に関する。
【００２３】
本発明の第１３の態様は、抗核抗体に関連する疾患を治療する医薬品の調製におけるＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩の使用であって、この医薬品が、メチルプレドニゾロンと組み合わせて使用するものである使用に関する。
【００２４】
本発明の第１４の態様は、抗核抗体に関連する疾患を治療する医薬品の調製におけるメチルプレドニゾロンの使用であって、この医薬品が、ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩と組み合わせて使用するものである使用に関する。
【００２５】
本発明の第１５の態様は、抗核抗体に関連する疾患を治療する医薬品の調製における、ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩、並びにメチルプレドニゾロンの使用に関する。
【００２６】
本発明の第１６の態様は、抗核抗体に関連する疾患を治療する医薬品の調製におけるＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩の使用であって、前記治療が、その対象に、ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩、並びにメチルプレドニゾロンを、同時に、連続して、又は個別に投与することを含む使用に関する。
【００２７】
本発明の第１７の態様は、対象の抗核抗体に関連する疾患を治療する方法であって、前記方法が、その対象に、治療上許容される量のＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩、並びにメチルプレドニゾロンを投与することを含む方法に関する。
【００２８】
参照を容易にするために、次に、本発明のこれらの態様及びさらなる態様を、適切な節の見出しのもとに論じる。しかし、各節の教示は、必ずしも特定の節各々に限定されるものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤
本発明は、１個又は複数のＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤の使用に関する。疑念を排除するために、この阻害剤は、ＣＤＫ２、ＣＤＫ７、若しくはＣＤＫ９のうちのいずれか１個の阻害剤でも、又はそのいずれの組合せでもよい。
【００３０】
好ましい一実施形態では、この阻害剤は、ＣＤＫ２の阻害剤である。
【００３１】
別の好ましい実施形態では、この阻害剤は、ＣＤＫ７の阻害剤である。
【００３２】
別の好ましい実施形態では、この阻害剤は、ＣＤＫ９の阻害剤である。
【００３３】
別の好ましい実施形態では、この阻害剤は、ＣＤＫ７及びＣＤＫ９からなる阻害剤である。
【００３４】
ＣＤＫ活性を分析する方法は、当業者には周知であろう。さらなる詳細を、添付の実施例の節において概説する。
【００３５】
好ましくは、これらの阻害剤は、ＣＤＫ２、ＣＤＫ７、又はＣＤＫ９のうちの１個又は複数のＩＣ５０値が、１ｍＭ未満、より好ましくは１００μＭ未満、さらにより好ましくは５０μＭ未満、より好ましくは２５μＭ未満、より好ましくは１０μＭ未満、さらにより好ましくは１μＭ又は０．５μＭ又は０．１μＭ未満を示す。
【００３６】
ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤の適切な例としては、欧州特許第０８７４８４７Ｂ号（ＣＮＲＳ）、国際公開ＷＯ０３／００２５６５（Cyclacl Limited）、国際公開ＷＯ０４／０１６６１３（Cyclacl Limited）、国際公開ＷＯ０４／０１６６１２（Cyclacl Limited）に開示されたものなどのプリン誘導体；及び国際公開ＷＯ０１／７２７４５、国際公開ＷＯ０２／０７９１９３、国際公開ＷＯ０３／０２９２４８、国際公開ＷＯ０４／０４３９５３（すべてCyclacl Limited）に開示されたものなどのピリミジン誘導体が挙げられる。
【００３７】
本発明の好ましい一実施形態では、ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤は、
【００３８】
【化１】
2008510784.tif 000002
【００３９】
【化２】
2008510784.tif 000003
及びそれらの薬剤として許容される塩から選択される。
【００４０】
特に好ましい一実施形態では、ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤は、化合物［１］〜［３］、［５］〜［８］、［１１］、及び［１２］から選択される。
【００４１】
別の特に好ましい実施形態では、ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤は、化合物［４］、［９］、及び［１０］から選択される。
【００４２】
さらに別の特に好ましい実施形態では、ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤は、化合物［７］である。
【００４３】
これまで、ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤が、抗核抗体のレベルを低下させるのに効果があることは示唆されていなかった。また、こうした阻害剤が自己免疫障害の治療においてメチルプレドニゾロンと一緒に併用療法で使用され得るであろうことは、当技術分野でどんな教示も示唆もされていない。
【００４４】
好ましい一実施形態では、ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤は、ロスコビチン、オロモウシン、及びパルバラノールＡから選択される。
【００４５】
本発明のさらに好ましい実施形態では、ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤は、ロスコビチンである。
【００４６】
ロスコビチン、即ち、２−［（１−エチル−２−ヒドロキシエチル）アミノ］−６−ベンジルアミン−９−イソプロピルプリンはまた、２−（１−Ｄ，Ｌ−ヒドロキシメチルプロピルアミノ）−６−ベンジルアミン−９−イソプロピルプリンと記載される。本明細書では、「ロスコビチン」という用語は、分割されたＲ及びＳ鏡像異性体、その混合物、並びにそのラセミ化合物を包含する。
【００４７】
本明細書では、「ＣＹＣ２０２」という用語は、ロスコビチンのＲ鏡像異性体、即ち、２−（１−Ｒ−ヒドロキシメチルプロピルアミノ）−６−ベンジルアミノ−９−イソプロピルプリンを指し、その構造を以下に示す。
【００４８】
【化３】
2008510784.tif 000004
【００４９】
ロスコビチンのインビトロ活性は、以下の通りである。
【００５０】
【表１】
2008510784.tif 000005
【００５１】
自己免疫障害の治療におけるロスコビチンの使用は当技術分野の文書に記録されているが、これまで、それが抗核抗体のレベルを低下させるのに効果があることは示唆されていなかった。また、ロスコビチンが自己免疫障害の治療においてメチルプレドニゾロンと一緒に併用療法で使用され得るであろうことは、当技術分野でどんな教示も示唆もされていない。
【００５２】
本発明のすべての実施形態では、好ましくは、ロスコビチンは、Ｒ鏡像異性体の形、即ち、２−（１−Ｒ−ヒドロキシメチルプロピルアミノ）−６−ベンジルアミノ−９−イソプロピルプリンであり、以下、「ＣＹＣ２０２」と称す。
【００５３】
治療活性
前述のように、本発明は、抗核抗体に関連する疾患を治療する医薬品の調製におけるＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩の使用であって、このＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩が、抗核抗体のレベルを下方制御するのに十分な量で投与される使用に関する。
【００５４】
抗核抗体（ＡＮＡ）は、血液中に検出可能な異常な抗体であり、細胞の核内のある種の構造に結合する能力を有する。ＡＮＡは、免疫系が患者自身の体組織に対して炎症を引き起こす素因となる恐れがある患者に見られる。己自身の組織に対して向けられる抗体は、自己抗体と呼ばれる。免疫系が己自身の身体に不利に作用する傾向は、自己免疫と呼ばれる。
【００５５】
抗核抗体の存在は、自己免疫疾患の特徴である。抗核抗体は、タンパク質及び核酸成分を含む大きな細胞複合体にしばしば向かう抗体の多様なグループである。最も頻繁に生じる抗核抗体は、ＤＮＡタンパク質複合体又はＲＮＡタンパク質複合体の成分と反応する［W. J. Van Venrooijら、C. A. Von Mulenら］。研究から、一般に高力価であるこれらの自己抗体、即ち高親和性ＩｇＧ抗体の産生は、Ｔ細胞依存的であり、宿主の自己抗原によって推進されることが示された［M. Reichlinら］。
【００５６】
自己免疫性として定義される疾患では、組織損傷が、自己抗原に対応する免疫応答によって引き起こされることが示されなければならない。自己免疫疾患は、自己抗体及び／又は自己反応性Ｔ細胞によって媒介される恐れがあり、組織損傷は、抗原を有する細胞への直接攻撃、免疫複合体形成、又は局所炎症から生じる恐れがある。Ｔ細胞は、炎症又は細胞破壊に直接関与している可能性があり、それらはまた、自己抗体応答を持続するのに必要である。同様に、Ｂ細胞は、自己抗原特異的Ｔ細胞の応答を持続する上での重要な抗原提示細胞である可能性がある。
【００５７】
ＣＤ４Ｔ細胞は、Ｔ細胞によって認識されるペプチドに物理的に連結されるエピトープを結合するＢ細胞を選択的に活性化する。したがって、自己反応性Ｂ細胞と自己反応性Ｔ細胞はどちらも自己免疫が関与する疾患に必要である。
【００５８】
抗核抗体産生は、インビボでのみ研究され得る。というのは、これらの抗体の産生には、Ｂ細胞とＴ細胞を共に含む機能不全免疫系が必要であり、自己を認識する免疫細胞を選択且つ破壊できないことが求められるからである。
【００５９】
Ｔ細胞機能に関するインビトロアッセイは、自己免疫疾患の複雑な状況で免疫応答を調節することができる化合物を同定する適切なスクリーニングツールである。こうしたアッセイの１つは、Ｔ細胞増殖アッセイであり、そのさらなる詳細は、添付の実施例で説明する。抗核抗体産生が関与する自己免疫疾患では、正常なＴ細胞機能は、Ｂ細胞による自己抗体産生の刺激を必要とする。したがって、Ｔ細胞機能（Ｔ細胞機能の基準の１つは、免疫の刺激に応じて増殖する能力である）に影響を及ぼす化合物はまた、Ｂ細胞と情報交換するＴ細胞の能力を制御することによって、さらに、Ｔ細胞が自己免疫損傷部分に移動するのを阻止することによって自己抗体の形成を阻止すべきである。
【００６０】
本明細書では、「抗核抗体」という用語は、抗ＤＮＡ抗体、抗ＲＮＡ抗体と、タンパク質の核成分に対する抗体のどちらも含む。
【００６１】
抗核抗体に関連する疾患には、自己免疫性リウマチ疾患及び器官特異的自己免疫がある。
【００６２】
好ましくは、自己免疫性リウマチ疾患は、薬剤誘発性狼瘡、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、及びリウマチ性関節炎から選択される。
【００６３】
リウマチ性関節炎は、関節の内層及び／又は他の内部器官に炎症を伴う慢性自己免疫疾患である。リウマチ性関節炎は、全身に影響を及ぼし、関節炎の最も一般的な形の１つである全身性疾患である。それは、関節の内側を覆っている膜の炎症を特徴とし、それによって、疼痛、硬直、発熱、赤み、及び腫れが引き起こされる。炎症を起こした関節内層、即ち関節滑膜は、骨及び軟骨に侵入し、損傷を与える恐れがある。炎症細胞は、骨及び軟骨を消化することができる酵素を放出する。関係する関節は、その形状及びアライメントを喪失する恐れがあり、その結果疼痛が生じ、動きが低下する。症状としては、一般に、関節の炎症、腫れ、動作困難、及び疼痛が挙げられる。その他の症状としては、食欲不振、発熱、消耗感、及び貧血が挙げられる。
【００６４】
これまで、その治療法は、疼痛の軽減、炎症の低下、関節損傷の阻止又は遅延、並びに患者の機能及び健康改善に集中している。薬物は、２グループに分けることができる。即ち、（ｉ）関節痛、硬直、及び腫れの軽減を促進させる対症薬物（ＮＳＡＩＤＳ、アスピリン、鎮痛剤、コルチコステロイドなど）、並びに（ｉｉ）低用量のメトトレキサート、レフルノミド、Ｄ−ペニシラミン、スルファサラジン、金療法、ミノサイクリン、アザチオプリン、ヒドロキシクロロキン（またその他の抗マラリア薬）、シクロスポリン、生物学的薬剤などの疾患修飾性抗リウマチ薬である。
【００６５】
より好ましくは、自己免疫性リウマチ疾患は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である。
【００６６】
全身性エリテマトーデス
好ましい一実施形態では、本発明は、皮膚、関節、及び内部器官を含めた多くの器官系に影響を及ぼす恐れがある慢性の炎症性自己免疫障害である全身性エリテマトーデス（播種性エリテマトーデス、ＳＬＥ、狼瘡、狼瘡エリテマトーデスとしても知られる）の治療に関する。この疾患を抱える人々は様々な症状を呈する恐れがあるが、最も一般的な症状のいくつかには、極度の疲労、関節の痛み又は腫れ（関節炎）、原因不明の熱、発疹、及び腎臓の問題がある。現在、ＳＬＥに対する治療法はない。
【００６７】
この疾患は、男性の数の９倍の女性に影響を及ぼし、アフリカ出身の人々により一般的に見られる。これはどの年齢にも起こり得るが、大抵、１０〜５０歳の人々に現れる。ＳＬＥはまた、ある種の薬剤によって引き起こされる恐れがある。これが起こった場合、それは薬剤誘発性エリテマトーデスとして知られており、その薬物を中止すると、通常元に戻る。
【００６８】
この疾患の経過は、軽度の突発性疾病から重篤な致命的疾患に変わる恐れがある。これらの症状はまた、時間と共に特定の個人において大きく変化し、寛解及び悪化の期間を特徴とする。狼瘡の最も一般的ないくつかの症状としては、関節の痛み又は腫れ（関節炎）、原因不明の熱、及び極度の疲労が挙げられる。狼瘡のその他の症状としては、胸痛、脱毛、貧血（赤血球の減少）、口内炎、並びに風邪及びストレスからの指及びつま先の蒼白化又は紫色化が挙げられる。何人かの人々はまた、頭痛、眩暈、うつ、錯乱、又は発作を経験する。新たな症状が、最初の診断の数年後に現れ続ける恐れがあり、様々な症状が、様々な時に起こる恐れがある。その発症に、１個の器官系だけが関与する可能性がある。別の器官は、その後関与するようになる可能性がある。
【００６９】
狼瘡（lupus）は、フレアと呼ばれる疾病の期間、及び健康又は寛解の期間を特徴とする。一般に、ＳＬＥが診断されると、医師は、患者の年齢、性別、健康、症状、及び生活様式に基づく治療計画を作成するであろう。治療計画を作成する際に、医師は、いくつかの目的、即ち、フレアの阻止、フレアが起きたときのそれらの治療、並びに器官損傷及び合併症の最小化を挙げる。
【００７０】
これまで、多くの様々な治療が、ＳＬＥ罹患者に利用可能である。関節痛、胸痛、又は発熱を患う人々には、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）と呼ばれる炎症を低減させる薬剤が、しばしば使用される。ＮＳＡＩＤの一般的な副作用としては、胃の不調、胸やけ、下痢、及び体液貯留が挙げられ得る。何人かの罹患者はまた、肝臓、腎臓、さらには神経学的な合併症を発症する。
【００７１】
抗マラリア薬は、狼瘡を治療するのに一般に使用される別のタイプの薬剤である。それらは、一般に、疲労、関節痛、発疹、及び肺の炎症を治療するのに使用されるが、臨床研究によって、抗マラリア薬での連続的な治療がフレアの再発を阻止する可能性があることが分かった。抗マラリア薬の副作用には、胃の不調、及び極めてまれに目の網膜への損傷が挙げられ得る。
【００７２】
狼瘡治療の主力には、コルチコステロイドホルモンの使用が含まれる。コルチコステロイドは、急速に炎症を抑制することによって作用し、経口によって、皮膚に施用するクリームで、又は注射によって投与され得る。コルチコステロイドの短期の副作用としては、腫れ、食欲亢進、及び体重増加が挙げられる。これらの副作用は、一般に、薬剤を中止すると止まる。しかし、コルチコステロイドの摂取を急に中止することはしばしば危険である可能性があるので、長期間かけて患者にそれらをやめさせる必要がある。コルチコステロイドの長期の副作用としては、皮膚上の皮膚線条、骨の弱化又は損傷（骨粗しょう症及び骨壊死）、高血圧、動脈への損傷、高血糖（糖尿病）、感染症、及び白内障が挙げられ得る。一般に、用量が多いほど、且つそれらを長く摂取するほど、副作用の危険及び重さは大きくなる。
【００７３】
腎臓又は中枢神経系が狼瘡の影響を受ける患者には、免疫抑制剤を使用することができる。これらの免疫抑制剤は、免疫細胞の産生を妨害することによって過敏性の免疫系を抑制する。副作用としては、吐き気、嘔吐、脱毛、膀胱の問題、生殖能力の低下、並びにガン及び感染症の危険増加が挙げられ得る。副作用の危険は、治療の長さと共に増加する。狼瘡に対するその他の治療と同様に、免疫抑制剤が止められた後、再発の危険がある。
【００７４】
本発明は、ＳＬＥ及びその他の自己免疫性リウマチ疾患に代替の治療処置を提供する。具体的には、本発明は、少なくとも疾患の急性期において優れた治療効果を有するが、大きな長期副作用のない、免疫抑制剤及びステロイドに代わる治療を提供することを目的とする。
【００７５】
インビボ研究
研究は、マウスにおけるＣＹＣ２０２の効果及びＣＹＣ２０２／メチルプレドニゾロンの組合せの効果を調べるのに行われた。
【００７６】
ＮＺＢ／Ｗ一代雑種マウスは、自然発生的にヒトの全身性エリテマトーデスによく似た重篤な自己免疫疾患を発症する。この疾患は、初期の抗核抗体形成、タンパク尿症を伴う免疫複合体糸球体腎炎の発症、及び経時的な腎不全への進行と共に現れ、また、これらのマウスの早期死亡も引き起こす。これは、とりわけ、ヌクレオソーム、即ちヒストンに複合したＤＮＡが最も顕著であるように見える、核及び内在性抗原に対する自己抗体の形成を伴うＴ細胞及びＢ細胞の機能障害疾患である。
【００７７】
インビボでは、ヌクレオソームは、アポトーシス、即ち狼瘡で妨害されるように見える過程によって産生される。アポトーシス細胞の除去が不十分な状態では、ヌクレオソームは、重要な成分がヌクレオソーム特異的抗体及びヌクレオソーム／ＩｇＧ複合体であるＴ細胞依存性免疫応答を推進する自己抗原として作用する。これらは、糸球体基底膜の内因性成分に結合し、炎症を促進する。腎臓常在性の浸潤細胞によって過剰量産生されるサイトカイン及び化学誘引物質は、免疫複合体介在性損傷を増幅し、永続化する。
【００７８】
組織学的に、ＮＺＢ／Ｗマウスの糸球体変化は、局所的管外性増殖に関連する管内細胞過形成を含み、免疫型沈着物は、メサンギウム中に、且つ糸球体基底膜（ＧＢＭ）の内皮下面上に検出される。管損傷、間質性炎症、及び線維症は、深刻である。
【００７９】
陽性（サイクリン及びサイクリン依存性キナーゼ）及び陰性（サイクリン依存性キナーゼ阻害因子）細胞周期調節タンパク質が、細胞増殖及びアポトーシスを含めた損傷の免疫形及び非免疫形に対する細胞応答を調節する上で重要な役割を果たすことを示す証拠が増加している。メサンギウム細胞などの内因性糸球体細胞の増殖は、ＩｇＡ腎障害、狼瘡、膜性増殖性糸球体腎炎などの免疫介在性糸球体の損傷の形態に対する特徴的応答である。陽性細胞周期タンパク質（サイクリンＤ、Ｅ、Ａ）の発現並びにＣＤＫ２タンパク質のレベル及び活性は、メサンギウム細胞増殖を特徴とする実験用メサンギウム増殖性糸球体腎炎（Ｔｈｙ腎炎）において増大する。このモデルでは、ＣＤＫ２の阻害は、メサンギウム細胞の増殖及び基質タンパク質の蓄積を低下させ、腎機能を改善した。
【００８０】
本出願人によるインビボ研究によって、生後２カ月から、用量２００ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇのＣＹＣ２０２で処置したＮＺＢ／Ｗ  Ｆ１マウスは、媒体で処置したマウスより有意に長く（Ｐ＜０．０５）生存することが示された。研究終了（８カ月）時、媒体で処置した１３匹のＮＺＢ／Ｗマウスのうち４匹（３１％）だけが生存していたが、それぞれ２００ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇのＣＹＣ２０２で処置した１３匹のマウスのうちの１０匹（７７％）及び１４匹のマウスのうちの１０匹（７１％）が生存していた。生後５カ月（治療処置）からＣＹＣ２０２（１００ｍｇ／ｋｇ）を与えられたマウスのグループでは、その生存パーセンテージは、媒体で処置したマウスで記録されたものと差はなかった。
【００８１】
本発明の好ましい一実施形態では、ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤の量は、タンパク尿症及び腎機能障害の発症を遅らせるのに十分である。
【００８２】
重度のタンパク尿症（＞４ｍｇ／日）のマウスの累積パーセンテージを、実験グループのすべてにおいて疾患の様々な段階で評価した。媒体グループでは、タンパク尿症マウスのパーセンテージは、時間と共に次第に増加した。研究終了時、タンパク尿マウスのパーセンテージは、８５％であった。用量依存的な方法では、生後２カ月から予防的治療として投与したＣＹＣ２０２は、媒体に比べてタンパク尿症の発症を有意に遅延させた（タンパク尿マウスの％、８カ月時：２００ｍｇ／ｋｇでは２３％、媒体に対しＰ＜０．０１；１００ｍｇ／ｋｇでは４３％、媒体に対しＰ＜０．０５）。ＣＹＣ２０２を生後５カ月から狼瘡マウスに投与したとき、媒体に対してタンパク尿マウスのパーセンテージの低下傾向が観察されたが、統計的有意性には達しなかった。
【００８３】
５カ月及び８カ月時に、血清血中尿素窒素（ＢＵＮ）で評価する腎機能を測定した。５カ月時の血清ＢＵＮレベルは、すべての実験グループにおいて正常範囲内（＜２９ｍｇ／ｄｌ）にあった。媒体グループでは、腎機能は時間と共に悪化し、８カ月時で、生存している動物の５０％は、ＢＵＮレベルが＞３０ｍｇ／ｄｌであった。生後２カ月から予防的治療として投与したＣＹＣ２０２は、狼瘡マウスにより良好な腎機能をもたらしたが、生後５カ月以降に投与した場合は効果がなかった。
【００８４】
本発明の好ましい一実施形態では、ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤の量は、抗核、特に抗ＤＮＡ抗体のレベルを下方制御するのに十分である。
【００８５】
高い抗ＤＮＡ抗体レベルは、ＮＺＢ／Ｗ  Ｆ１マウスの特徴である。媒体を投与したマウスは、時間と共に抗ＤＮＡ抗体のレベル増加を示した。生後５カ月又は８カ月時、生後２カ月から両方の用量のＣＹＣ２０２で処置したマウスは、抗ＤＮＡ抗体レベルが媒体より有意に低いことを示した。生後５カ月からＣＹＣ２０２の投与を受けたマウスグループでは、抗ＤＮＡ抗体濃度は、８カ月時で媒体よりも数値的ではあるが有意ではなく低かった。
【００８６】
好ましい一実施形態では、ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤は、糸球体及び管間質（tubointerstitial）の変化を低下させるのに十分な量である。
【００８７】
研究終了時、媒体を投与したＮＺＢ／Ｗマウスは、局所的管外性増殖に関連する管内細胞過形成を伴う糸球体の変化を示した。免疫沈着物が、メサンギウム中に、且つ糸球体基底膜（ＧＢＭ）の内皮下面上に検出された。管損傷及び間質性炎症も観察された。生後２カ月からのＣＹＣ２０２の処置は、糸球体細胞過形成、免疫沈着物、及び尿細管間質性損傷を著しく制限した。これらの効果は、ＣＹＣ２０２が用量２００ｍｇ／ｋｇで与えられたとき、より明白であった。生後５カ月からＣＹＣ２０２を投与したマウスでは、腎臓形態に対して中程度の効果しか観察されなかった。
【００８８】
好ましい一実施形態では、ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤の量は、ＰＭＡ及びＣｏｎＡによって誘発されたＴ細胞増殖を阻害するのに十分である。
【００８９】
本発明の好ましい一実施形態では、ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤は、Ｍｃｌ−１の発現を下方制御するのに十分な量である。
【００９０】
好ましい一実施形態では、ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤の量は、単核細胞の間質性蓄積を減少させるのに十分な量である。
【００９１】
腎臓を、免疫組織化学法によってＦ４／８０陽性単球／マクロファージに関して分析した。Ｆ４／８０陽性細胞の顕著な蓄積が、媒体を投与したＮＺＢ／Ｗマウスの腎間質に存在した。生後２カ月から２００ｍｇ／ｋｇのＣＹＣ２０２で予防的に処置すると、Ｆ４／８０陽性単球／マクロファージの数が媒体に対して顕著に減少した。用量１００ｍｇ／ｋｇのＣＹＣ２０２は、単核細胞の間質性蓄積を統計的に有意な程度ではないが制限した。Ｆ４／８０陽性細胞数の減少は、治療的研究（生後５カ月からの処置）で観察された。
【００９２】
要約すれば、本研究の結果は、生後２カ月から予防的治療として投与したＣＹＣ２０２（２００及び１００ｍｇ／ｋｇ）が、媒体を投与した動物に比べて、ＮＺＢ／Ｗマウスの狼瘡の腎症状を遅延させ、顕著に延命させたことを明らかに示している。具体的には、ＣＹＣ２０２は、タンパク尿症及び腎機能障害の発症を遅延させ、単核細胞、糸球体細胞過形成、及び免疫沈着物の間質性蓄積を含めた糸球体及び尿細管間質の変化を制限した。その効果は、用量２００ｍｇ／ｋｇでより明白である。本研究の顕著な発見は、ＣＹＣ２０２による抗ＤＮＡ抗体レベルの減少であった。これは、おそらくＴ細胞に対するＣＹＣ２０２効果に起因する可能性があり、また、Ｂ細胞に影響を及ぼす可能性があった。インビトロ実験から、ＰＭＡ及びＣｏｎＡによって、並びに混合リンパ球反応において誘発されたＴ細胞増殖の濃度依存的阻害が、ＣＹＣ２０２の処置後に観察された。さらに、ＳＬＥでは、ヒストン又はヌクレオソームに特有の活性化された自己免疫Ｔヘルパー細胞が、Ｂ細胞の抗ＤＮＡ産生プラズマ細胞への分化を促進させる可能性があるという証拠がある（総説については、Rekvig, Arthritis & Rheumatism 48: 300-312, 2003を参照）。
【００９３】
ＣＹＣ２０２はまた、抗アポトーシスタンパク質ｍｃｌ−１の下方制御を含めた転写に効果があることが知られており、したがって、細胞の生存シグナルのバランスを変更することができる。アネルギーＴ細胞は、この作用機序に特に敏感な可能性がある。
【００９４】
生後５カ月からＣＹＣ２０２（１００ｍｇ／ｋｇ）の投与を開始すると、媒体マウスに対してタンパク尿マウスのパーセンテージ及び腎障害のパーセンテージが若干低下した。生存は改善されなかった。この小さな効果は、おそらく低用量に起因すると思われた。
【００９５】
組合せ物(combinations)
特に好ましい一実施形態では、この医薬品は、メチルプレドニゾロンとの併用療法で使用するものである。
【００９６】
本明細書では、「併用療法」という用語は、メチルプレドニゾロン並びにＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤を、同時でない場合、これら両方が同時間枠内に治療上作用することができる時間枠内で連続投与する治療を指す。
【００９７】
本発明の別の態様は、ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩、並びにメチルプレドニゾロンを含む組合せ物に関する。
【００９８】
好ましくは、この組合せ物は相乗効果を有する、即ち、この組合せ物は相乗的である。
【００９９】
メチルプレドニゾロンは、合成（人工）コルチコステロイドである。その化学名は、１１，１７，２１−トリヒドロキシ−６−メチル−（６ａ，１１ｂ）−プレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオンである。コルチコステロイドは、腎臓に隣接する副腎によって生産される天然由来の化学物質である。コルチコステロイドは、炎症を妨げ、多種多様な炎症性疾患において使用される。経口錠剤、カプセル、液体、局所用クリーム及びゲル、吸入器薬、点眼薬、注射液、並びに静脈注射溶液を含めた多数のコルチコステロイド製剤がある。メチルプレドニゾロンは、一般に、経口錠剤又は液体として処方される。
【０１００】
メチルプレドニゾロンは、炎症の迅速な抑制を実現するのに使用される。メチルプレドニゾロンが使用される炎症性状態の例としては、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、急性痛風性関節炎、乾癬性関節炎、潰瘍性大腸炎、及びクローン病が挙げられる。従来の治療が役に立たない深刻なアレルギー状態はまた、メチルプレドニゾロンに反応する可能性がある。例としては、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、薬物性皮膚炎、接触性皮膚炎、及びアトピー性皮膚炎が挙げられる。メチルプレドニゾロンで治療する慢性の皮膚状態としては、疱疹状皮膚炎、天疱瘡、重症の乾癬、及び重症の脂漏性皮膚炎が挙げられる。また、眼のブドウ膜、虹彩、結膜、及び視神経の慢性のアレルギー性状態及び炎症性状態も、メチルプレドニゾロンで治療される。
【０１０１】
別の態様は、本発明による組合せ物、及び製薬上許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含む薬剤組成物に関する。
【０１０２】
本発明の別の態様は、治療において同時に、連続して、又は個別に使用する組合せ製剤としてのＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩、並びにメチルプレドニゾロンを含む医薬品に関する。
【０１０３】
ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤、並びにメチルプレドニゾロンは、同時に、組み合わせて、連続して、又は別々に（投与計画の一部として）投与され得る。
【０１０４】
本明細書では、「同時に」は、２種の薬剤を同時に投与するという意味に使用され、「組み合わせて」という用語は、それらを、同時でない場合、それら両方が同時間枠内に治療上作用することができる時間枠内で「連続して」投与するという意味に使用される。したがって、「連続」投与によって、最初に投与した薬剤の循環半減期が、両薬剤が同時に治療有効量で存在するようであるならば、もう一方の薬剤は、一方の投与後、５分、１０分、又は数時間以内に投与することが可能になる。諸成分の投与間の時間差（delay）は、成分の正確な性質、それらの間の相互作用、及びそれぞれの半減期に応じて変わる。
【０１０５】
「組み合わせて」又は「連続して」とは異なり、本明細書では、「個別に」は、一方の薬剤ともう一方の薬剤を投与する間の差が著しい、即ち、２番目の薬剤を投与したとき、最初に投与した薬剤が、血流中に治療有効量でもはや存在しない可能性があるという意味に使用される。
【０１０６】
本発明のさらに別の態様は、
（ｉ）ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩、並びに
（ｉｉ）メチルプレドニゾロンを含む、製薬上許容される希釈剤、賦形剤、又は担体と混合された薬剤組成物に関する。
【０１０７】
別の態様は、抗核抗体に関連する疾患を治療する医薬品の調製における本発明による組合せ物に関する。
【０１０８】
本発明の別の態様は、抗核抗体に関連する疾患を治療する医薬品の調製におけるＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩の使用であって、この医薬品が、メチルプレドニゾロンと組み合わせて使用するものである使用に関する。
【０１０９】
本発明のさらに別の態様は、抗核抗体に関連する疾患を治療する医薬品の調製におけるメチルプレドニゾロンの使用であって、この医薬品が、ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩と組み合わせて使用するものである使用に関する。
【０１１０】
本発明のさらなる態様は、抗核抗体に関連する疾患を治療する医薬品の調製におけるＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩、並びにメチルプレドニゾロンの使用に関する。
【０１１１】
本発明の別の態様は、抗核抗体に関連する疾患を治療する医薬品の調製におけるＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩の使用であって、前記治療が、対象に、ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩、並びにメチルプレドニゾロンを、同時に、連続して、又は個別に投与することを含む使用に関する。
【０１１２】
本発明の別の態様は、対象の抗核抗体に関連する疾患を治療する方法であって、前記方法が、その対象に、治療上許容される量の
（ｉ）ＣＤＫ２及び／若しくはＣＤＫ７及び／若しくはＣＤＫ９の阻害剤、又は薬剤として許容されるその塩；並びに
（ｉｉ）メチルプレドニゾロンを投与することを含む方法に関する。
【０１１３】
前述の実施形態のすべてでは、好ましくは、ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤並びにメチルプレドニゾロンは、同時に又は連続して投与される。
【０１１４】
好ましい一実施形態では、ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤並びにメチルプレドニゾロンは、同時に投与される。
【０１１５】
特に好ましい一実施形態では、対象にＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤を投与してから、連続して又は個別に前記対象にメチルプレドニゾロンを投与する。
【０１１６】
本発明の別の態様は、治療有効量のＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤、続いて治療有効量のメチルプレドニゾロンを連続投与することを含む増殖性障害を治療する方法に関する。
【０１１７】
本発明の別の態様は、治療有効量のＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤、続いて治療有効量のメチルプレドニゾロンを連続投与することを含む増殖性障害の治療で使用する医薬品の製造におけるＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤の使用に関する。
【０１１８】
代わりの好ましい実施形態では、対象にメチルプレドニゾロンが投与された後、連続して又は個別に前記対象にＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤が投与される。
【０１１９】
特に好ましい一実施形態では、ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤並びにメチルプレドニゾロンは、連続して投与される。
【０１２０】
本発明の好ましい一実施形態では、ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤並びにメチルプレドニゾロンは、個々の成分に関して治療有効量で各々投与される。
【０１２１】
本発明の別の好ましい実施形態では、ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤並びにメチルプレドニゾロンは、個々の成分に関して治療量以下の量で各々投与される。
【０１２２】
好ましくは、ＣＤＫ２、ＣＤＫ７、又はＣＤＫ９の阻害剤は、前述の本発明の第１の態様に関する通りである。
【０１２３】
薬剤組成物
前に述べたように、本発明の様々な態様は、薬剤組成物に関する。
【０１２４】
本発明の化合物（薬剤として許容されるその塩、エステル、及び薬剤として許容される溶媒和物を含む）が単独で投与され得る場合でも、それらは、一般に、特にヒトの治療に関する製薬用担体、賦形剤、又は希釈剤との混合物として投与される。こうした薬剤組成物は、ヒト及び獣医学分野においてヒト又は動物使用向けとすることができる。
【０１２５】
本明細書に記載の薬剤組成物の種々多様な形状に適するこうした賦形剤の例は、"Handbook of Pharmaceutical Excipients", 2nd Edition, (1994), Edited by A Wade and PJ Wellerに見ることができる。
【０１２６】
治療用途に関して許容される担体又は希釈剤は、製薬技術分野において周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)に記載されている。
【０１２７】
適切な担体の例としては、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトール、及びその他同種類のものが挙げられる。適切な希釈剤の例としては、エタノール、グリセロール、及び水が挙げられる。
【０１２８】
製薬用担体、賦形剤、又は希釈剤の選択は、意図した投与経路及び標準的薬務に関して選択され得る。これらの薬剤組成物は、任意の適切な結合剤、潤滑剤、懸濁化剤、コーティング剤、可溶化剤を、担体、賦形剤、又は希釈剤として、或いは担体、賦形剤、又は希釈剤に加えて含むことができる。
【０１２９】
適切な結合剤の例としては、デンプン、ゼラチン、グルコースなどの天然糖、無水ラクトース、流動性（free-flow）ラクトース、β−ラクトース、トウモロコシ甘味料；アラビアゴム、トラガカント、アルギン酸ナトリウムなどの天然及び合成ゴム、カルボキシメチルセルロース、並びにポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１３０】
適切な潤滑剤の例としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、及びその他同種類のものが挙げられる。
【０１３１】
防腐剤、安定化剤、染料、さらにはフレーバリング剤も、薬剤組成物に付与することができる。防腐剤の例としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。抗酸化剤及び懸濁化剤も使用することができる。
【０１３２】
塩／エステル
本発明で使用する化合物は、塩又はエステル、特に、薬剤として許容される塩又はエステルとして存在することができる。
【０１３３】
本発明の化合物の薬剤として許容される塩には、適切なその酸付加塩又は塩基塩が含まれる。適切な薬剤塩の概説は、Berge et al, J Pharm Sci, 66, 1-19 (1977)に見ることができる。これらの塩は、例えば、鉱酸、例えば、硫酸、リン酸、ハロゲン化水素酸などの強い無機酸を用いて；酢酸など、非置換又は置換（例えばハロゲンによって）された炭素原子１〜４個のアルカンカルボン酸などの強い有機カルボン酸を用いて；飽和又は不飽和ジカルボン酸、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸、又はテトラフタル酸を用いて；ヒドロキシカルボン酸、例えば、アスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、又はクエン酸を用いて；アミノ酸、例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸を用いて；安息香酸を用いて；或いはメタンスルホン酸やｐ−トルエンスルホン酸など、非置換又は置換（例えばハロゲンによって）された（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル又はアリール−スルホン酸などの有機スルホン酸を用いて生成される。
【０１３４】
これらのエステルは、エステル化される官能基に応じて、有機酸又はアルコール／水酸化物を使用して生成される。これらの有機酸としては、酢酸など、非置換又は置換（例えばハロゲンによって）された炭素原子１〜１２個のアルカンカルボン酸などのカルボン酸；飽和又は不飽和ジカルボン酸、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸、又はテトラフタル酸；ヒドロキシカルボン酸、例えば、アスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、又はクエン酸；アミノ酸、例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸；安息香酸；或いはメタンスルホン酸やｐ−トルエンスルホン酸など、非置換又は置換（例えばハロゲンによって）された（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル又はアリール−スルホン酸などの有機スルホン酸が挙げられる。適切な水酸化物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アルミニウムなどの無機水酸化物が挙げられる。これらのアルコールとしては、非置換でも、例えばハロゲンで置換されていてもよい、炭素原子１〜１２個のアルカンアルコールが挙げられる。
【０１３５】
鏡像異性体／互変異性体
前述の本発明のすべての態様において、本発明は、適切な場合には、関与する化合物の鏡像異性体及び互変異性体すべての使用を含む。当業者は、光学的性質（１個又は複数の不斉炭素原子）又は互変異性特性を有する化合物を認識するであろう。対応する鏡像異性体及び／又は互変異性体は、当技術分野で周知の方法によって単離／調製され得る。
【０１３６】
立体異性体及び幾何異性体
本発明で使用する化合物は、立体異性体及び／又は幾何異性体として存在することができる。例えば、それらは、１個又は複数の非対称中心及び／又は幾何学的中心を有し、したがって、２個以上の立体異性形及び／又は幾何学形で存在することができる。本発明は、これらの薬剤の個々の立体異性体及び幾何異性体のすべて、並びにそれらの混合物の使用を企図する。特許請求の範囲で使用する用語は、適切な機能活性を保持する前記形態を備えたこれらの形態を包含する（但し同程度である必要はない）。
【０１３７】
本発明はまた、この薬剤又は薬剤として許容されるその塩の適切な同位体変形物のすべての使用も含む。本発明の薬剤又は薬剤として許容されるその塩の同位体変形物は、少なくとも１個の原子が、原子番号は同じであるが、原子質量が自然界で通常見られる原子質量と異なる原子で置換されているものとして定義される。この薬剤及び薬剤として許容されるその塩に組み入れることができる同位元素の例としては、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、及び塩素の同位元素、例えば、それぞれ２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌが挙げられる。この薬剤及び薬剤として許容されるその塩のある種の同位体変形物、例えば、３Ｈや１４Ｃなどの放射性同位元素が組み込まれたものは、薬剤及び／又は基質組織分布研究に有用である。トリチウム、即ち３Ｈ、及び炭素１４、即ち１４Ｃの同位元素は、調製及び検出性の容易さのために特に好ましい。さらに、重水素、即ち２Ｈなどの同位元素との置換は、高い代謝安定性、例えば、インビボでの半減期延長又は必要投与量の減少から生じるある種の治療的利点をもたらす可能性があり、したがっていくつかの状況で好まれ得る。本発明の薬剤及び本発明の薬剤として許容されるその塩の同位体変形物は、一般に、適切な試薬の適切な同位体変形物を使用して、従来の手順によって調製され得る。
【０１３８】
溶媒和物
本発明はまた、本発明の化合物の溶媒和物形態の使用を含む。特許請求の範囲で使用する用語は、これらの形態を包含する。
【０１３９】
多形体
本発明はさらに、様々な結晶形態、多形形態、含水形態、及び無水形態での本発明の化合物の使用に関する。これらの化合物が、その化合物の合成で使用される溶媒から精製及び／又は単離する方法をわずかに変更することによってこうした形態のいずれかの形態で単離され得ることは製薬業界で十分に確立されている。
【０１４０】
プロドラッグ
本発明はさらに、プロドラッグ形での本発明の化合物の使用を含む。こうしたプロドラッグは、一般に、１個又は複数の適切な基が、変形物がヒト又は哺乳動物の対象に投与されたとき元の形に戻ることができるように改変された化合物である。こうした反転は、通常、これらの対象中にもとから存在する酵素によって行われるが、インビボで反転を実行させるために、第２の薬剤をこうしたプロドラッグと一緒に投与することが可能である。こうした変形物の例としては、エステル（例えば前述のもののいずれか）が挙げられ、エステラーゼなどが反転を行うことができる。その他のこうした系は、当業者には周知である。
【０１４１】
投与
本発明の薬剤組成物は、口、直腸、膣、腸管外、筋肉内、腹腔内、動脈内、くも膜下腔内、気管支内、皮下、皮内、静脈内、鼻、頬、又は舌下の投与経路に適する可能性がある。
【０１４２】
経口投与では、特定の用途は、圧縮錠剤、ピル、錠剤、ゼラチン質カプセル（gellule）、ドロップ、及びカプセルからできている。好ましくは、これらの組成物は、有効成分を１回当たり１ｍｇ〜５０００ｍｇ、より好ましくは１０ｍｇ〜３０００ｍｇ含む。
【０１４３】
その他の投与形態は、静脈内、動脈内、くも膜下腔内、皮下、皮内、腹腔内、又は筋肉内に注射することができ、無菌溶液又は滅菌溶液から調製される溶液又は乳剤を含む。本発明の薬剤組成物はまた、坐薬、膣坐薬、懸濁剤、乳剤、ローション、軟膏、クリーム、ゲル、スプレー、溶剤、又は散布剤の形態とすることができる。
【０１４４】
経皮投与の代替手段は、皮膚用パッチ剤の使用によるものである。例えば、有効成分は、ポリエチレングリコール又は流動パラフィンの水性乳剤からなるクリームに組み込まれ得る。この有効成分はまた、必要とされる可能性がある安定化剤や防腐剤などと一緒に、白ろう又は白色ワセリン基剤からなる軟膏中に１〜１０重量％の濃度で組み込まれ得る。
【０１４５】
これらの注射剤形は、有効成分を１回当たり１０〜３０００ｍｇ、好ましくは１０〜１０００ｍｇ含むことができる。
【０１４６】
これらの組成物は、単位剤形で、即ち単位用量を含む個別分の形で、或いは単位用量の複合ユニット又はサブユニットの形で配合され得る。
【０１４７】
投与量
当業者は、不必要な実験を行うことなく対象に投与する本発明の組成物の１個の適切な投与量を容易に決定することができる。一般に、医師は、個々の患者に最も適するであろう実際の投与量を決定する。それは、使用する特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性及び活性の長さ、年齢、体重、一般的健康診断、性別、食事、投与の形態及び時間、排泄速度、複合薬、特定の病態の重さ、並びに個々の患者が受けている治療を含めた様々な因子に依存する。本明細書に開示する投与量は、平均的な場合の例である。もちろん、より多い又はより少ない投与量が正当である個々の例が存在する可能性があるが、それらは本発明の範囲内である。
【０１４８】
必要に応じて、この薬剤は、体重１ｋｇ当たり０．０１〜３０ｍｇ、例えば、体重１ｋｇ当たり０．１〜１０ｍｇ、より好ましくは０．１〜１ｍｇなどの投与量で投与され得る。
【０１４９】
例示的実施例では、１日当たり１０〜３５００ｍｇを１回又は複数回患者に投与する。
【０１５０】
本発明をまた、実施例によって、且つ以下の図を参照して例示する。
[実施例]
【０１５１】
ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ７及び／又はＣＤＫ９の阻害剤
様々な阻害剤化合物を、欧州特許第０８７４８４７Ｂ号（ＣＮＲＳ）、及び国際公開ＷＯ  ０３／００２５６５、国際公開ＷＯ  ０４／０１６６１３、国際公開ＷＯ  ０４／０１６６１２、国際公開ＷＯ  ０１／７２７４５、国際公開ＷＯ  ０２／０７９１９３、国際公開ＷＯ  ０３／０２９２４８、国際公開ＷＯ  ０４／０４３９５３（すべてCyclacel Limitedの名義）に記載の方法に従って調製した。
【０１５２】
キナーゼアッセイ
キナーゼ活性は、ＡＴＰからの放射性リン酸塩の適切なポリペプチド基質への組込みを測定することによって調べられた。組換えタンパク質キナーゼ及びキナーゼ複合体は、生成又は市販品購入から得た。これらのアッセイは、９６ウェルプレート、及び適切な基質と共に活性酵素２〜４μｇを添加した適切なアッセイ緩衝液（一般に、β−グリセロリン酸塩（２５ｍＭ）、ＭＯＰＳ（２０ｍＭ）、ＥＧＴＡ（５ｍＭ）、ＤＴＴ（１ｍＭ）、Ｎａ３ＶＯ３（１ｍＭ）、ｐＨ７．４）を使用して実施された。この反応は、Ｍｇ／ＡＴＰ混合物（ＭｇＣｌ２（１５ｍＭ）＋１ウェル当たり３０〜５０ｋＢｑの［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰを有するＡＴＰ（１００μＭ））の添加によって開始され、混合物を３０℃で所望によりインキュベートした。反応を氷上で停止させ、続いて、ｐ８１フィルタプレート又はＧＦ／Ｃフィルタプレート（Whatman Polyfiltronics社製、ケント州、英国）によりろ過した。７５ｍＭのオルトリン酸水溶液で３回洗浄した後、プレートを乾燥し、シンチラントを添加し、組み込まれた放射性活性をシンチレーションカウンタ（TopCount、Packard Instruments社製、パングボーン、バークシャー州、英国）で測定した。キナーゼアッセイ用の化合物をＤＭＳＯ中のストック１０ｍＭとして作製し、１０％ＤＭＳＯを含むアッセイ緩衝液で希釈した。データを、曲線近似ソフトウェア（GraphPad Prism version 3.00 for Windows、GraphPad Software社製、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を使用して分析し、その結果ＩＣ５０値（キナーゼ活性を５０％阻害する試験化合物の濃度）を決定した。
【０１５３】
ＣＤＫ７及び９アッセイ
９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、ＣＴＤペプチド基質（ビオチニル-Ahx-(Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser)4-NH2（１〜２ｍｇ／ｍＬ））、及び組換えヒトＣＤＫ７／サイクリンＨ、ＣＤＫ９／サイクリンＴ１、又はＣＤＫ９／サイクリンＫ（０．５〜２μｇ）を、様々な量の試験化合物の存在下で、ＭＯＰＳ（２０ｍＭ、ｐＨ７．２）、β−グリセロリン酸塩（２５ｍＭ）、ＥＧＴＡ（５ｍＭ）、ＤＴＴ（１ｍＭ）、バナジウム酸ナトリウム（１ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（１５ｍＭ）、及びＡＴＰ（１００μＭ）（微量の３２ＰγＡＴＰを含む）において全量２５μＬで３０℃で４５分インキュベートした。プレートを氷上に２分間置いて、反応を停止させた。アビジン（５０μｇ）を各ウェルに添加し、プレートを室温で３０分間インキュベートした。サンプルを９６ウェルＰ８１フィルタプレートに移動させ、７５ｍＭのリン酸で洗浄した（１ウェル当たり４×２００μＬ）。Microscint40シンチレーション液（５０μＬ）を各ウェルに添加し、各サンプルの３２Ｐ組込み量をPackard Topcountマイクロプレートシンチレーションカウンタを使用して測定した。
【０１５４】
ＣＹＣ２０２
ＣＤＫ２阻害剤ＣＹＣ２０２の投与がＮＺＢ／ＷＦ１狼瘡易発性マウスの腎疾患の発現を遅延させるのに有効かどうかを評価する研究を行った。
【０１５５】
実験の開始時に生後２カ月のＮＺＢｘＮＺＷ  Ｆ１雌マウス（Harlan Italy s.r.l.社製、ミラノ、イタリア）を使用した。動物の取扱いは、国内法（Decreto Legislativo n.116, Gazzetta Ufficiale suppl 40, 18 febbraio 1992, Circolare n.8, Gazzetta Ufficiale 14 luglio 1994）、並びに国際法及び政策（EEC Council Directive 86/609, OJL358-1, December 1987; Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, U.S. National Research Council, 1996）に従う制度ガイドラインに準拠して行われた。動物を１２時間暗所／１２時間明所サイクルで恒温室に収容し、標準食を与えた。
【実施例１】
【０１５６】
ＮＺＢｘＮＺＷ  Ｆ１マウスを、以下のグループに任意に割り当てた。
グループ１（ｎ＝１８）：胃管栄養法で媒体（ＨＣｌ５０ｍＭ）を毎日投与されるマウス
グループ２（ｎ＝１７）：胃管栄養法でＣＹＣ２０２（２００ｍｇ／ｋｇ）を毎日投与されるマウス
グループ３（ｎ＝１９）：胃管栄養法でＣＹＣ２０２（１００ｍｇ／ｋｇ）を毎日投与されるマウス
処置は生後２カ月から開始し（予防研究）、生後８カ月まで継続した。各グループの動物４〜５匹を、血清ＢＵＮ及び抗ＤＮＡ抗体循環レベルを評価するために生後５カ月時に屠殺した。
【０１５７】
追加グループのグループ４（マウス、ｎ＝１４）には、生後５カ月、即ち、免疫複合体沈着が活発に起こっているときから生後８カ月まで胃管栄養法で毎日ＣＹＣ２０２（１００ｍｇ／ｋｇ）を与えた（治療研究）。５匹の正常なＣＤ−１マウス（Charles River Italia社製、カルコ、イタリア）を対照として使用した。
【０１５８】
以下のパラメータを評価した。
尿タンパク排泄：生後５カ月まで毎月、その後２週間毎に測定。
屠殺時に測定：
血清中の抗ＤＮＡ抗体；
血清ＢＵＮ；
血清トランスアミナーゼ（ＡＳＴ、ＡＬＴ）；
腎組織構造；
単球／マクロファージの腎間質への蓄積。
【実施例２】
【０１５９】
狼瘡マウスを、以下のグループに任意に割り当てた。
グループ１（ｎ＝１０）：胃管栄養法で媒体（ＨＣｌ５０ｍＭ）を毎日投与されるマウス
グループ２（ｎ＝１５）：胃管栄養法でＣＹＣ２０２を用量２００ｍｇ／ｋｇ毎日投与されるマウス
グループ３（ｎ＝１２）：腹腔内注射でメチルプレドニゾロン（ＭＰＳ、Urbason、Hoechst s.p.a社製、ミラノ、イタリア）を用量１．５ｍｇ／ｋｇ毎日投与されるマウス
グループ４（ｎ＝１６）：ＣＹＣ２０２（２００ｍｇ／ｋｇ）をＭＰＳ（１．５ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせて毎日投与されるマウス
【０１６０】
処置は、免疫複合体沈着が活発に起こっている生後５カ月から開始し、媒体処置を受ける最後の動物が死亡した１２カ月まで継続した。５匹の正常なＣＤ−１マウス（Charles River Italia社製、カルコ、イタリア）を対照として使用した。
【０１６１】
以下のパラメータを評価した。
生存時；
尿タンパク排泄：生後５カ月まで毎月、その後２週間毎に測定；
血清ＢＵＮ：生後５カ月時（処置前）から研究終了時まで毎月測定；
腎組織構造：病状末期のマウス及び生後１２カ月まで生存したマウスから生検で評価；
Ｆ４／８０陽性単球／マクロファージの腎間質への蓄積（上記と同じ生検で評価）
【０１６２】
実施例１及び２：材料及び方法
タンパク尿症及び腎機能
尿タンパク質濃度を、標準としてウシ血清アルブミンを含むクマシーブルーＧ色素結合アッセイによって決定した。腎機能を、Reflotron試験（Roche Diagnostics Corporation社製、インディアナポリス州、米国）によってヘパリン加血におけるＢＵＮとして評価した。３０ｍｇ／ｄｌを超えるＢＵＮレベルを、異常と見なした（マウスに関するこの研究での正常範囲：１４〜２９ｍｇ／ｄｌ）。
【０１６３】
抗ＤＮＡ抗体
血清における抗ｄｓＤＮＡ自己抗体のレベルを、前述（Kidney Int, 53:726-734, 1998）の酵素免疫測定法（Diastat anti-ds DNA kit、Bouty Laboratory社製、ミラノ、イタリア）によって評価した。
【０１６４】
血清トランスアミナーゼ
ＡＳＴ及びＡＬＴの血清濃度を、自動分析器（ＣＸ５、Beckman Instruments Inc.社製、フラートン、カリフォルニア州）を使用して測定した。
【０１６５】
腎臓形態
光学顕微鏡：腎皮質の断片を、Dubosq-Brazilに固定し、アルコール中で脱水し、パラフィンに包埋した。切片（３μｍ）を、ヘマトキシリン、エオシン試薬、マッソン三色試薬、及び過ヨウ素酸シッフ試薬（ＰＡＳ染色）で染色した。
【０１６６】
糸球体の管内細胞過形成を、０〜３＋の採点システムによって半定量的な方法で評価した（０＝細胞過形成なし、１＋＝軽度、２＋＝中度、３＋＝重度）。病変に関与する全糸球体のパーセンテージに基づくその他の変化に関して単一採点を行った。管外性増殖を、０〜３＋で評価した（０＝細胞過形成なし、１＋＝関与する糸球体の２５％未満、２＋＝関与する糸球体の２５％〜５０％、３＋＝関与する糸球体の５０％超）。糸球体沈着を、０〜３＋で評価した（０＝沈着なし、１＋＝関与する糸球体の２５％未満、２＋＝関与する糸球体の２５％〜５０％、３＋＝関与する糸球体の５０％超）。尿細管の変化（萎縮、キャスト、及び拡張）並びに間質の変化（線維症及び炎症）を、０〜３＋で評価した（０＝変化なし、１＋＝サンプルの２５％未満に影響を及ぼす変化、２＋＝サンプルの２５〜５０％に影響を及ぼす変化、３＋＝サンプルの５０％超に影響を及ぼす変化）。少なくとも１００個の糸球体を、各生検に対して検査した。間質組織を採点するために、サンプル当たり少なくとも１０フィールドを低倍率（１０倍）で検査した。すべての腎生検を同じ病理学者によって一重盲検法で分析した。
【０１６７】
免疫組織化学法
マウス単球及びマクロファージ中に存在する細胞質内抗原に対するラットモノクローナル抗体（Ｆ４／８０、４μｇ／ｍｌ、Caltag Laboratories社製、バーリンゲーム、カリフォルニア州）を、免疫ペルオキシダーゼ法による浸潤細胞の検出に使用した。切片を０．３％Ｈ２Ｏ２を含むメタノール中で３０分間インキュベートして、内因性ペルオキシダーゼを失活させた。次いで、組織を、０．１％Triton X-100を含むＰＢＳ（０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．２）において３０分間透過処理し、次いで、正常なヤギ血清（Vector Laboratories社製）で３０分間インキュベートした。一次抗体、続いて、二次抗体（ビオチン化ヤギ抗ラットＩｇＧ、Vector Laboratories社製）、及びアビジン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ）溶液を４℃で一晩インキュベートし、ＤＡＢで最終的に発現させた。切片をハリスヘマトキシリンで対比染色した。一次抗体を除去することによって陰性対照を得た。Ｆ４０／８０標的細胞を、各動物につき少なくとも１０個の任意に選択した高性能顕微鏡視野（４００倍）においてカウントした。
【０１６８】
統計分析
データを平均±標準誤差（ＳＥ）として表す。生存曲線をログランク検定によって分析した。タンパク尿症のデータをフィッシャーの正確確率検定によって分析した。他のすべてのパラメータを、クラスカル・ウォリス検定によって分析した。統計的有意性をＰ＜０．０５として定義した。
【０１６９】
実施例１：結果
体重、飼料摂取量、及び水分摂取量
表１に示すように、狼瘡マウスは、研究中に体重が増加した。体重差は、実験グループ中に観察されなかった。生後２カ月〜５カ月の２週間毎に評価した飼料（表２）及び水分（表３）の摂取量は、媒体及びＣＹＣ２０２で処置したマウス間で同程度であった。
【０１７０】
狼瘡マウスの生存
生後２カ月から、用量２００ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇのＣＹＣ２０２で処置したＮＺＢ／Ｗ  Ｆ１マウスは、媒体マウスより有意に（Ｐ＜０．０５）長く生存した（表４及び図１を参照）。実際に、研究終了（８カ月）時、媒体で処置した１３匹のＮＺＢ／Ｗマウスのうち４匹（３１％）しか生存せず、２００ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇのＣＹＣ２０２で処置した場合、それぞれ１３匹のマウスのうち１０匹（７７％）及び１４匹のマウスのうち１０匹（７１％）が生存した。生後５カ月からＣＹＣ２０２（１００ｍｇ／ｋｇ）を投与したマウスのグループ（治療処置）では、生存パーセンテージは、媒体マウスで記録されたものと差はなかった。
【０１７１】
タンパク尿症及び腎機能
重いタンパク尿症（＞４ｍｇ／日）マウスの累積パーセンテージを、実験グループのすべての様々な段階の疾患において評価した。表５に示すように、媒体グループでは、タンパク尿症マウスのパーセンテージは、時間と共に次第に増加した（図２）。研究終了時、タンパク尿症マウスのパーセンテージは、８５％であった。予防的治療として投与したＣＹＣ２０２は、媒体に比べて用量依存的にタンパク尿症の発症を有意に遅延させた（タンパク尿症マウスの％、８カ月時：２００ｍｇ／ｋｇでは２３％、媒体に対してＰ＜０．０１；１００ｍｇ／ｋｇでは４３％、媒体に対してＰ＜０．０５）。ＣＹＣ２０２を生後５カ月から狼瘡マウスに投与した場合、媒体に対してタンパク尿症マウスのパーセンテージが低下する傾向が観察されたが、統計的有意性には達しなかった。
【０１７２】
５カ月及び８カ月時に、血清ＢＵＮで評価する腎機能を測定した。５カ月時の血清ＢＵＮレベルは、すべての実験グループにおいて正常範囲内（＜２９ｍｇ／ｄｌ）にあった。媒体グループでは、腎機能は時間と共に悪化し、８カ月時では、生存している動物の５０％は、ＢＵＮレベルが≧３０ｍｇ／ｄｌであった（表６）。予防的治療として投与したＣＹＣ２０２は、狼瘡マウスにより良好な腎機能をもたらしたが、後に投与した場合は効果がなかった。
【０１７３】
抗ＤＮＡ抗体
抗ＤＮＡ抗体レベルの上昇は、ＮＺＢ／Ｗ  Ｆ１マウスの特徴である。表７に示すように、媒体を投与したマウスは、時間と共に抗ＤＮＡ抗体のレベル増加を示した。生後５カ月又は８カ月時、生後２カ月から両方の用量のＣＹＣ２０２で処置したマウスは、抗ＤＮＡ抗体レベルが媒体より有意に低いことを示した。生後５カ月からＣＹＣ２０２の投与を受けたマウスグループでは、抗ＤＮＡ抗体濃度は、８カ月時で媒体よりも数値的ではないが有意に低かった（図３）。
【０１７４】
血清トランスアミナーゼレベル
血清ＡＬＴ及びＡＳＴレベルを、生後２カ月から２００ｍｇ／ｋｇのＣＹＣ２０２を投与した、又は生後５カ月から１００ｍｇ／ｋｇのＣＹＣ２０２を投与したＮＺＢ／Ｗ  Ｆ１マウスにおいて測定した。血清トランスアミナーゼレベルは、処置による変化はなく、数値は、対照マウスのものと類似していた（表８）。
【０１７５】
腎臓形態
表９に示すように、研究終了時、媒体を投与したＮＺＢ／Ｗマウスは、局所的管外性増殖に関連する管内細胞過形成を伴う糸球体の変化を示した。免疫タイプの沈着物が、メサンギウム中に、且つ糸球体基底膜の内皮下面上に検出された。管損傷及び間質性炎症も観察された。生後２カ月からのＣＹＣ２０２での処置は、糸球体細胞過形成、免疫沈着物、及び尿細管間質性損傷を著しく制限した。これらの効果は、ＣＹＣ２０２が用量２００ｍｇ／ｋｇで与えられたとき、より明白であった。生後５カ月からＣＹＣ２０２を投与したマウスでは、腎臓形態に対して中程度の効果しか観察されなかった。
【０１７６】
単球／マクロファージの間質性蓄積
腎臓を、免疫組織化学法によってＦ４／８０陽性単球／マクロファージに関して分析した。Ｆ４／８０陽性細胞の顕著な蓄積が、媒体を投与したＮＺＢ／Ｗマウスの腎間質に存在した（表１０）。２００ｍｇ／ｋｇのＣＹＣ２０２による予防的処置は、Ｆ４／８０陽性単球／マクロファージ数を媒体に対して顕著に減少させた。用量１００ｍｇ／ｋｇのＣＹＣ２０２は、単核細胞の間質性蓄積を統計的に有意な程度ではないが制限した。Ｆ４／８０陽性細胞数の減少は、治療研究で観察された。
【０１７７】
本研究の結果は、生後２カ月から予防的治療として投与したＣＹＣ２０２（２００及び１００ｍｇ／ｋｇ）が、媒体を投与した動物に比べて、ＮＺＢ／Ｗマウスの狼瘡腎症状を遅延させ、顕著に延命させたことを明らかに示している。具体的には、ＣＹＣ２０２は、タンパク尿症及び腎機能障害の発症を遅延させ、単核細胞の間質性蓄積を含めた糸球体及び尿細管間質の変化を制限し、その効果は、用量２００ｍｇ／ｋｇでより明白であった。本研究の顕著な発見は、ＣＹＣ２０２による抗ＤＮＡ抗体レベルの減少であった。これは、おそらくＴ細胞に対するＣＹＣ２０２効果に起因する可能性があり、また、Ｂ細胞に影響を及ぼす可能性がある。インビトロ実験から、ＰＭＡ及びＣｏｎＡによって、並びに混合リンパ球反応において誘発されたＴ細胞増殖の濃度依存的阻害が観察された。一方、ＳＬＥでは、ヒストン又はヌクレオソームに特有の活性化された自己免疫Ｔ細胞が、Ｂ細胞の抗ＤＮＡ産生プラズマ細胞への分化を促進することができるという証拠がある（総説については、Rekvig, Arthritis & Rheumatism 48: 300-312, 2003を参照）。
【０１７８】
生後５カ月からＣＹＣ２０２（１００ｍｇ／ｋｇ）の投与を開始すると、媒体マウスに対してタンパク尿症マウスのパーセンテージが若干低下し、腎障害が少し軽減した。生存は改善されなかった。
【０１７９】
実施例２：結果
体重
ＮＺＢ／Ｗ  Ｆ１マウスは、研究中に体重が増加した。体重差は、実験グループ中に観察されなかった。
【０１８０】
生存
生後５カ月からＣＹＣ２０２とメチルプレドニゾロン（ＭＰＳ）の組合せで処置したＮＺＢ／Ｗ  Ｆ１マウスは、媒体マウスより有意に（Ｐ＜０．０００１）長く生存した（表１１）。特に、媒体を投与したマウスすべてが死亡した１２カ月時に、この併用治療で処置した１６匹の動物のうち１０匹（６２％）が生存していた。単一治療を受けたマウスの生存曲線は、媒体グループのものと差はなかった。
【０１８１】
タンパク尿症
表１２は、この疾患の様々な段階で評価したタンパク尿症＞４ｍｇ／日のマウスの累積パーセンテージを示す。ＣＹＣ２０２とＭＰＳの組合せ（association）は、媒体に比べてタンパク尿症の発症を著しく遅らせた。７カ月から１０カ月の期間では、併用治療グループのタンパク尿症マウスの割合は、媒体グループのタンパク尿症マウスの割合より著しく低かった（６．２から４３．８％対４０から９０％）。単一治療として投与したＣＹＣ２０２又はＭＰＳは、媒体に比べてタンパク尿症の発症に部分的にのみ影響を及ぼすが、ＣＹＣ２０２グループの７．５カ月時に、タンパク尿症マウスのパーセンテージの著しい減少が観察された。
【０１８２】
腎機能
血清ＢＵＮで評価する腎機能を、５カ月（治療前）から１２カ月の毎月測定した。表１３は、ＢＵＮレベルが≧３０ｍｇ／ｄｌのマウスの累積パーセンテージを示している。５カ月時の血清ＢＵＮレベルは、すべての実験グループにおいて正常範囲内（即ち１４〜２９ｍｇ／ｄｌ）にあった。媒体グループでは、腎機能は、時間と共に悪化した。したがって、８カ月及び１２カ月時にそれぞれ８０％及び１００％の動物が、ＢＵＮレベル≧３０ｍｇ／ｄｌであった。対照的に、これらの時間ポイントで、併用治療のマウスのわずか２７％及び５３％が腎機能障害を呈した。単独投与したＣＹＣ２０２又はＭＰＳは、組み合わせて使用したときよりも低い腎臓保護効果を示した。
【０１８３】
腎臓形態
形態分析は、様々な時点の病状末期のマウス又は１２カ月時に屠殺したマウスから得た腎臓標本に対して行われた。データは表１４に報告している。媒体を投与したＮＺＢ／Ｗマウスは、局所的管外性増殖に関連する管内細胞過形成を伴う糸球体の変化を示した。免疫タイプの沈着物が、メサンギウム中に、且つ糸球体基底膜の内皮下面上に検出された。また、管損傷及び間質性炎症も観察された。ＭＰＳを加えたＣＹＣ２０２での処置は、糸球体細胞過形成、免疫沈着物、及び尿細管間質性損傷を著しく制限した。ＣＹＣ２０２又はＭＰＳを単独で投与したマウスでは、腎臓形態に対して中程度の効果が観察された。
【０１８４】
単球／マクロファージの間質性蓄積
腎臓を、免疫組織化学法によってＦ４／８０陽性単球／マクロファージに関して分析した。Ｆ４／８０陽性細胞の顕著な蓄積が、媒体を投与したＮＺＢ／Ｗマウスの腎間質に見られた（表１５）。ＣＹＣ２０２及びＭＰＳを併用投与すると、単球／マクロファージの数が媒体に対して６５％減少した（Ｐ＜０．０１）。単独投与したＣＹＣ２０２は、間質浸潤物を３３％減少させた。ＭＰＳ単独で処置したマウスのグループでは、単核細胞の間質性蓄積は、媒体グループに見られるものと類似していた。
【０１８５】
要約すれば、これらの結果は、低用量のメチルプレドニゾロンと組み合わせたＣＹＣ２０２が、狼瘡マウスの寿命を著しく延長させることを示した。特に、この処置を、疾患の確立期、即ち、免疫複合体沈着が活発に起こる生後５カ月から開始した。この併用治療は、タンパク尿症の発症を遅延させ、腎機能の損傷、並びに糸球体細胞過形成、免疫沈着物、及び尿細管間質変化の発現を制限した。単核細胞の腎間質への蓄積減少が示すように、抗炎症効果も示された。単一治療としてのＣＹＣ２０２又はメチルプレドニゾロンの投与は、中程度の腎臓保護効果をもたらした。
【０１８６】
結論として、疾患が確立した狼瘡マウスの狼瘡腎症状の改善及び延命におけるＣＹＣ２０２と低用量ＭＰＳの組合せによる治療効果の結果は、狼瘡腎炎の新たな治療の基盤を意味する可能性がある。
【０１８７】
実施例３及び４：材料及び方法
選択したＣＤＫ２、７、及び９阻害剤（転写阻害剤）、化合物［１］〜［１２］を、抗核抗体への影響に関する代用アッセイとして選択したＴ細胞増殖アッセイで試験した。
【０１８８】
前に述べたように、抗核抗体産生は、インビボでのみ研究され得る。というのは、これらの抗体の産生には、Ｂ細胞とＴ細胞を共に含む機能不全免疫系が必要であり、自己を認識する免疫細胞を選択できない且つ破壊できないことが求められるからである。しかし、Ｔ細胞機能に関するインビトロアッセイ（例えば、Ｔ細胞増殖アッセイ）は、自己免疫疾患の複雑な状況において免疫応答を調節することができる化合物を同定する適切なスクリーニングツールである。したがって、Ｔ細胞増殖アッセイは、抗核抗体に対する化合物の効果の基準を提供することができる。
【０１８９】
末梢血単核細胞の調製
２種の別々のアッセイ、実施例３及び４を実施した。３人又は４人の健常ドナーのバフィコート血液（それぞれ実施例３及び４）を、スコットランド国立輸血サービス（Scottish National Blood Transfusion Services）から得、BD Vacutainer（商標）ＣＰＴ細胞調製チューブ（採血容量（draw capacity）４ｍＬ、クエン酸ナトリウム含有、カタログ番号REF362781）において室温で３０分間３００ｇで遠心分離した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）層をピペットで回収し、５０ｍＬ容の遠心分離管に貯蔵し、次いで、３容量のハンクス緩衝塩溶液（ｗ／ｏ型、ＣａＣｌ２及びＭｇＣｌ２、Gibco社製#14175-053）において１５分間（室温）３００ｇで遠心分離することによって２回洗浄した。ＰＢＭＣを、１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁させ、生きた細胞の数をトリパンブルー排除によって決定した。
【０１９０】
細胞刺激及び処置
ＰＢＭＣを、ウェル培地当たり５０μＬにおいて１×１０５細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。アッセイ対照として、１００μＬ／ウェルのＲＰＭＩ１６４０組織培地／１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）において、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ白血病及びＬＰ−１多発性骨髄腫細胞をそれぞれ４０００及び５０００細胞／ウェルで播種し、実験中に刺激又は化合物処理することなく成長させた。すべての刺激物及び化合物を、組織培地において最終濃度の最高４倍になるようにし、次いで、各薬剤及び刺激物２５μＬを、最終容量が１００μＬ／ウェルになるように諸ウェルに添加した。非刺激対照では、刺激物の代わりに組織培地２５μＬをウェルに添加し、非処理細胞では、等量のＤＭＳＯ（最終０．１％）を含む２５μＬ／ウェルの組織培地を添加した。隣接する３個のウェルに各刺激／処理条件に関する処理を行い、分析のために平均値を計算した。
【０１９１】
実施例３では、これらの細胞を２時間放置して定着させた後、５０μｇ／ｍＬのＰＨＡ（フィトヘムアグルチニンＰＨＡ−Ｐ、Sigma社製、L9132）又は５０／２５０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ／Ｉ（ホルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸／イオノマイシン、Sigma社製、P8139/I0634）で刺激した。さらに、ＰＢＭＣを、濃度が０．５μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬのＣｏｎＡ（コンカナバリンＡ、Sigma社製、C5275）で刺激して、その刺激効果及び最適濃度を確認した。実施例４では、ＰＢＭＣを、播種直後に前述の５０μｇ／ｍＬ又は１０μｇ／ｍＬのＣｏｎＡで刺激した。
【０１９２】
実施例３では、刺激済又は非刺激ＰＢＭＣを、ＩＣ５０、２×ＩＣ５０、３×ＩＣ５０、及び４×ＩＣ５０の濃度の化合物［１］〜［１０］で処理した。これらの化合物を、刺激２時間前（播種時）、刺激時、及び刺激２時間後に添加し、次いで、細胞をそれぞれ、３７℃、５％ＣＯ２で、５０時間、４８時間、及び４６時間、又は刺激後４８時間まで化合物と共にインキュベートした。実施例４では、刺激済ＰＢＭＣを、化合物［１１］及び［１２］を加えた上記の化合物で処理し、すべての化合物を前述の濃度の他に０．５×ＩＣ５０及び０．２５×ＩＣ５０で試験した。これらの化合物を刺激直後に添加し、細胞を４８時間及び７２時間インキュベートした。これらのＩＣ５０は、腫瘍細胞パネルの当組織内（in-house）細胞障害アッセイによる平均７２時間ＩＣ５０に基づくものとした（表１６）。但し、当組織内のＩＣ５０データが利用できなかったので、このＩＣ５０は以前当組織内で用いた公表済ＩＣ５０に基づいていた化合物［１］及び［３］は除いた。
【０１９３】
ＢｒｄＵ  ＥＬＩＳＡ及びAlamar Blueアッセイ
刺激及び化合物処理後のＰＢＭＣの増殖活性を、細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ（比色法）キット（Roche社製、#1 647 229）を使用してＢｒｄＵ取り込みを測定することによって決定した。このキットは、３Ｈチミジン取り込み用の非放射性置換法である。細胞をＢｒｄＵで２時間標識してから収集した。次いで、プレートを室温で１０分間３００ｘｇで遠心分離機にかけ、上澄液をピペットでウェルから回収し、細胞を６０℃で１時間乾燥させた。FixDenat溶液をプレートに添加（１ウェル当たり１００μＬ）し、３０分間インキュベートし、次いで、軽くたたいて（flick）それを除去し、抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ溶液をプレートに添加（１ウェル当たり１００μＬ）し、９０分間インキュベートした。洗浄溶液（１ウェル当たり２００μＬ）で３回洗浄した後、プレートを基質溶液（１ウェル当たり１００μＬ）と共に３０分間インキュベートし、次いで、１ＭのＨ２ＳＯ４（１ウェル当たり２５μＬ）を添加し、Ascent Fluoroskanプレートリーダーで４５０ｎＭの光学濃度を読み取った。
【０１９４】
ＰＢＭＣの生存力を、Alamar Blue試薬（Biosource社製、#DAL1100）を使用して評価した。新しい２０％Alamar Blueを培地に作製し、最終濃度が１０％になるように各ウェルに１００μＬ添加した。収集時（４８時間又は７２時間）前にプレートをAlamar Blueと共に５％ＣＯ２下で３７℃で３時間インキュベートし、次いで、Tecan Ultraプレートリーダー上で励起波長５３５ｎＭ及び放射波長５９５ｎＭを使用して蛍光を読み取った。
【０１９５】
実施例３：結果
ＰＨＡで刺激すると、ＢｒｄＵ取り込みが非刺激細胞に比べて約７倍増加した。ＤＭＳＯ媒体での刺激は、ＰＨＡ刺激細胞又は非刺激細胞のＢｒｄＵ取り込み又は生存力に影響を及ぼさなかった（図４）。図５に示すように、試験した化合物すべてによるＰＨＡ刺激細胞の処理は、多くのケースで、ＢｒｄＵ取り込みを非刺激細胞で見られるレベルまで減少させた。ＢｒｄＵ取り込みの減少は、ＩＣ５０ほどの低い濃度で明らかであり、化合物［９］及び［１０］を除いて、依然として残っているＢｒｄＵ取り込みの量は、化合物濃度と相関関係はなく、このことは、これらの化合物がＩＣ５０で最大増殖阻害効果に達したということを共に示唆している。化合物［９］及び［１０］では、この効果は、明らかに濃度依存的であり、ＩＣ５０での３〜４倍多いＢｒｄＵ取り込みは、より高濃度で非刺激レベルに低下する。
【０１９６】
ほとんどの化合物では、刺激時間に対する化合物の処理時間は、ＢｒｄＵ取り込みレベルに大きな影響を及ぼさない。というのは、この刺激がＰＢＭＣ播種後の最初の４時間において依然として影響を及ぼしていないという可能性が高いからである。これに対する例外は、化合物［２］、［３］、及び［４］であり、驚くべきことに、これらでは、化合物の処理を刺激と同時に又は刺激後に開始したときよりも事前に化合物処理（２時間前）したときの方がＢｒｄＵ取り込みの減少が小さい（図５）。
【０１９７】
ＰＨＡ処理と同様に、ＰＭＡ／Ｉ刺激は、化合物が存在しない場合、ＢｒｄＵ取り込みを非刺激細胞の約７倍増加させる（図５）。化合物［４］、［９］、及び［１０］以外のすべての化合物による処理は、ＢｒｄＵ取り込みを、ＰＨＡ刺激細胞におけるＢｒｄＵ取り込みより減少させ、一般にすべての濃度において非刺激細胞で見られるレベルより低いレベルに減少させた。前述のように、ＰＭＡ／Ｉで刺激され、ＤＭＳＯで処理されたＰＢＭＣだけが、Alamar Blueアッセイで非常に低い生存力を示したが、ＢｒｄＵ取り込みは増加した（図４）。同様に、ＰＭＡ／Ｉ刺激細胞を化合物［４］、［９］、及び［１０］で処理した後に依然として残っているＢｒｄＵ取り込みは、Alamar Blue値が陰性であるにもかかわらず、ＰＨＡ刺激細胞におけるＢｒｄＵ取り込みより高かった。
【０１９８】
コンカナバリンＡの滴定は、ＣｏｎＡが、１０μｇ／ｍＬで最大効果に達して、濃度依存的にＰＢＭＣを刺激することを示している。次いで、ＢｒｄＵ取り込みは、非刺激レベルに低下し（より高濃度）、これは、ＰＢＭＣが試験した高濃度のＣｏｎＡのために生存できないことを示す生存力評価及び顕微鏡観察と一致する。ＰＨＡ及びＰＭＡ／Ｉと比べると、１０μｇ／ｍＬのＣｏｎＡでの刺激は、生存力を低下させることなく、ＢｒｄＵ取り込みを同等なレベル又は非刺激ＰＢＭＣの約６倍に増加させる（図７）。
【０１９９】
実施例４：結果
実施例３から、試験したすべての化合物が、ＩＣ５０ほどの低濃度で刺激済ＰＢＭＣ細胞の増殖活性に影響を及ぼすことが結論付けられた。ＩＣ５０より低い薬物濃度でのこの効果の濃度依存性を研究するのに、次の実験（実施例４）を実施した。化合物［１１］及び［１２］に加えて前に試験したすべての化合物について、より低い濃度、即ち０．５×ＩＣ５０及び０．２５×ＩＣ５０での処理、並びにＤＭＳＯ対照を追加して、前述の通りに処理を繰り返した。刺激に対する化合物の処理時間は増殖活性阻害の中心とは思われなかったので、播種直後に、ＰＢＭＣを刺激し、同時に化合物処理を行った。細胞を、前述同様のＰＨＡ又は１０μｇ／ｍＬのＣｏｎＡで刺激した。
【０２００】
４８時間、さらに延長して７２時間の時点で、非刺激細胞に比べて、ＰＨＡ刺激は、ＤＭＳＯ処理細胞のＢｒｄＵ取り込みを２０倍超増加させ、ＣｏｎＡ刺激では、１０倍超増加させ、ＤＭＳＯ媒体は、ＢｒｄＵ取り込み又は生存力に影響を及ぼさなかった（図８）。図９に示すように、ＰＨＡで刺激したとき、すべての化合物は、濃度依存的にＢｒｄＵ取り込みを減少させ、ＩＣ５０又は２×ＩＣ５０濃度でほぼ最大効果に達した。これは、すでに最大効果に達していたので、ＩＣ５０を超える濃度で濃度依存性が認められなかったというこれまでの観察を裏付けている。全体として、ＣｏｎＡで刺激したＰＢＭＣに同じ効果が見られたが、わずかにより低い濃度で最大効果に達した。これは、ＢｒｄＵシグナルが、最大効果のバックグラウンドレベルに低下し、これらのシグナルが、一般に、ＣｏｎＡ刺激細胞に関する高さがＰＨＡ刺激細胞の半分しかないので、アッセイ感度が前者に関してわずかに低い可能性があるという結果となり得る。
【０２０１】
前述同様に、化合物［４］、［９］、及び［１０］は、残りの化合物とはわずかに異なる挙動を示す。前の実験と一致して、化合物［９］及び［１０］では、ＩＣ５０を超える濃度で濃度依存性が明らかに見られ、次いで、それはより低い濃度に及んだ。４×ＩＣ５０では、ＢｒｄＵ取り込みは、さらに減少しており、シグナルは、ＣｏｎＡ刺激細胞のバックグラウンドレベルに接近したが、ＰＨＡ刺激細胞ではわずかに高かった。理論に拘泥するものではないが、これは、他の化合物と同様に増殖活性を完全に阻害するが、これを実現するにはより高い濃度が必要であることを示唆している。
【０２０２】
化合物［４］で処理した細胞では、ＢｒｄＵシグナルは、４×ＩＣ５０でさえ、どちらの刺激でもバックグラウンドレベルに低下していない。さらに、より高い濃度では、ＢｒｄＵ取り込みと化合物濃度の間にほとんど相関は見られず、これは本発明者らの先の結果と一致していた。理論に拘泥するものではないが、これは、増殖活性に対する化合物［４］の効果が、ほとんどの他の化合物と同様に約２×ＩＣ５０で最大になるが、実現された阻害の程度はより低いことを示唆している。
【０２０３】
Alamar Blueアッセイによる生存力評価から、ＰＢＭＣの生存力は刺激によってわずかに低下するが、一般に、化合物処理、ＤＭＳＯ処理、及び非処理のＰＢＭＣの間は匹敵していることが示された。さらに、Alamar Blueカウント数の低下は、化合物濃度の増加に関連しておらず、このことは、ＢｒｄＵ取り込みの減少が、化合物の細胞障害性効果によって引き起こされるものではなく、増殖活性阻害を純粋に表すものであることを裏付けている。
【０２０４】
要約すれば、これらの実験は、一連の転写阻害剤のいずれかで処理すると、Ｔリンパ球へのＰＨＡ又はＣｏｎＡ刺激の影響が変化し、その結果増殖活性の完全な阻害が濃度依存的にもたらされるということを示している。全体として、ＰＨＡ及びＣｏｎＡ刺激細胞に同じ傾向が見られるが、増殖の完全な阻害は、ＰＨＡ刺激細胞よりもＣｏｎＡ刺激細胞において低い薬物濃度で達するように思われる。これは、ＰＨＡよりもＣｏｎＡによって実現される低い総刺激の人工産物である可能性がある。ほとんどの化合物は、まず、０．２５×ＩＣ５０又は０．５×ＩＣ５０ほどの低い濃度で増殖活性阻害がいくらか見られ、次いで約２×ＩＣ５０で完全に阻害に達するという同じパターンに従うが、増殖活性の降下がどの程度急速であるかについては、化合物濃度の上昇に伴って違いがある。注目すべき例は、０．２５×ＩＣ５０もの低い濃度で完全な阻害に達する化合物［７］である。しかし、ＩＣ５０値は様々な細胞パネルからの平均に基づくので、異なる化合物の特定の濃度間の比較は注意して行わなければならない。
【０２０５】
記載したパターンの例外が、同じ影響を及ぼすのに他の化合物より高い濃度を必要とする化合物［９］及び［１０］、並びに他のものと同じ濃度依存に従うが、より高い濃度でも増殖活性の完全な阻害を実現することができない化合物［４］に見られる。
【０２０６】
これらの実験は、ＰＢＭＣ生存力は刺激によってわずかに減少するが、さらなる有意な減少は化合物の処理と関係がないことを示している。より重要なことには、生存力は、明らかに化合物濃度に依存しておらず、したがって、測定されたＢｒｄＵ取り込みの減少は、化合物の細胞障害ではなく増殖活性の真の阻害を表す。
【０２０７】
本発明の範囲及び精神から逸脱しない、本発明の様々な改変形態及び変更形態は、当分野の技術者には明らかである。本発明を、特に好ましい実施形態に関して説明してきたが、特許請求の範囲に記載した本発明は、こうした特定の実施形態に必要以上に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、当業者にとって明らかである、記載された本発明を実施するための形態に対する様々な改変は、本発明によって包含されることが意図される。
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【０２０８】
【表２】
2008510784.tif 000006
【０２０９】
【表３】
2008510784.tif 000007
【０２１０】
【表４】
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【０２１１】
【表５】
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【０２１２】
【表６】
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【０２１３】
【表７】
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【０２１４】
【表８】
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【０２１５】
【表９】
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【０２１６】
【表１０】
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【０２１７】
【表１１】
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【０２１８】
【表１２】
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【０２１９】
【表１３】
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【０２２０】
【表１４】
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【０２２１】
【表１５】
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【０２２２】
【表１６】
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【０２２３】
【表１７】
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【０２２４】
【表１８】
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【図面の簡単な説明】
【０２２５】
【図１】生後２カ月又は５カ月から投与量１００ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇのＣＹＣ２０２で処置したＮＺＢ／Ｗ  Ｆ１マウスの処置期間（数カ月）に対する生存パーセンテージを示す図である。
【図２】投与量１００ｍｇ／ｋｇ又は２００ｍｇ／ｋｇのＣＹＣ２０２で処置したＮＺＢ／Ｗ  Ｆ１マウスの処置期間（数カ月）に対するタンパク尿症マウスのパーセンテージを示す図である。
【図３】１００ｍｇ／ｋｇ又は２００ｍｇ／ｋｇのＣＹＣ２０２で処置したＮＺＢ／Ｗ  Ｆ１マウスの血清抗ＤＮＡ抗体（Ｕ／ｍｌ）を示す図である（対照媒体に対して）。
【図４】非処理又はＤＭＳＯ媒体で処理した、非刺激及び刺激されたＰＢＭＣ及び対照細胞のＢｒｄＵ取り込み（上）及び生存力（下）を示す図である。
【図５】刺激２時間前（−２ｈ）、刺激時（０ｈ）、及び刺激２時間後（＋２ｈ）に、４×ＩＣ５０、３×ＩＣ５０、２×ＩＣ５０、及びＩＣ５０の濃度のＤＭＳＯ（左上）又は諸化合物で処理したときの、ＰＨＡ又はＰＭＡ／Ｉで４８時間刺激されたＰＢＭＣ細胞間のＢｒｄＵ取り込みの差を示す図である。
【図６】刺激２時間前（−２ｈ）、刺激時（０ｈ）、及び刺激２時間後（＋２ｈ）に、４×ＩＣ５０、３×ＩＣ５０、２×ＩＣ５０、及びＩＣ５０の濃度のＤＭＳＯ（左上）又は諸化合物で処理したときの、ＰＨＡ又はＰＭＡ／Ｉで４８時間刺激されたＰＢＭＣ細胞間の生存力の差を示す図である。
【図７】コンカナバリンＡの滴定曲線が１０μｇ／ｍＬで最大刺激を示し（左上）、より高濃度で生存力低下を示す（右上）図である。ＢｒｄＵ取り込みの増加は、ＰＨＡ及びＰＭＡ／Ｉ刺激と同程度である（左下）。
【図８】ＤＭＳＯでの４８時間及び７２時間処理並びに非処理での、ＰＨＡ及びＣｏｎＡで刺激されたＰＢＭＣ並びに非刺激細胞のＰＢＭＣにおけるＢｒｄＵ取り込み（上）及び生存力（下）を示す図である。
【図９Ａ】４×ＩＣ５０、３×ＩＣ５０、２×ＩＣ５０、ＩＣ５０、０．５×ＩＣ５０、及び０．２５×ＩＣ５０の諸化合物並びにＤＭＳＯ対照で４８時間及び７２時間処理したＰＨＡ（左）及びＣｏｎＡ（右）刺激ＰＢＭＣのＢｒｄＵ取り込みを示す図である。
【図９Ｂ】４×ＩＣ５０、３×ＩＣ５０、２×ＩＣ５０、ＩＣ５０、０．５×ＩＣ５０、及び０．２５×ＩＣ５０の諸化合物並びにＤＭＳＯ対照で４８時間及び７２時間処理したＰＨＡ（左）及びＣｏｎＡ（右）刺激ＰＢＭＣのＢｒｄＵ取り込みを示す図である。
【図１０Ａ】４×ＩＣ５０、３×ＩＣ５０、２×ＩＣ５０、ＩＣ５０、０．５×ＩＣ５０、及び０．２５×ＩＣ５０の諸化合物並びにＤＭＳＯ対照で４８時間及び７２時間処置したＰＨＡ（左）及びＣｏｎＡ（右）刺激ＰＢＭＣの生存力を示す図である。
【図１０Ｂ】４×ＩＣ５０、３×ＩＣ５０、２×ＩＣ５０、ＩＣ５０、０．５×ＩＣ５０、及び０．２５×ＩＣ５０の諸化合物並びにＤＭＳＯ対照で４８時間及び７２時間処置したＰＨＡ（左）及びＣｏｎＡ（右）刺激ＰＢＭＣの生存力を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【国際調査報告】
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