(57)【要約】本発明は、リンパ球抑制性受容体として機能し、PD-I様分子でありT細胞上に発現される新たに同定されたB7受容体、zB7R1を提供する。本発明はまた、CD155に結合するzB7R1の能力の発見を提供する。治療、診断、および研究目的のための、zB7R1媒介性の負のシグナル伝達を調節する、およびそのカウンター受容体との相互作用を妨げるための方法および組成物もまた提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号:2のアミノ酸残基16〜140または配列番号:6のアミノ酸残基27〜208と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸残基の配列を含む単離された可溶性zB7R1ポリペプチドであって、T細胞活性化を媒介するポリペプチド。
【請求項２】
配列番号:2のアミノ酸残基16〜140または配列番号:6のアミノ酸残基27〜208と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸残基の配列を含む単離された可溶性zB7R1ポリペプチドであって、T細胞活性化を増加させるまたは上方制御するポリペプチド。
【請求項３】
配列番号:2のアミノ酸残基16〜140または配列番号:6のアミノ酸残基27〜208と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸残基の配列を含む単離された可溶性zB7R1ポリペプチドであって、T細胞活性化を減少させるまたは抑制するポリペプチド。
【請求項４】
配列番号:2、配列番号:3、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:9、および配列番号:10からなる群より選択されるアミノ酸の配列を含む、単離された可溶性zB7R1ポリペプチド。
【請求項５】
配列番号:25および配列番号:68からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離された可溶性zB7R1ポリペプチド。
【請求項６】
配列番号:1、配列番号:5、および配列番号:8からなる群より選択されるヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
5xSSC、5xデンハルト、0.5% SDS、サケ精子1 mg/ハイブリダイゼーション溶液25 mlを含む緩衝液中での65℃でインキューベションする一晩のハイブリダイゼーション、その後の65℃での0.2x SSC/0.1% SDSによる高ストリンジェンシー洗浄というストリジェントな条件下において、請求項6記載のポリヌクレオチドとハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチドであって、T細胞の共刺激を抑制する可溶性ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
以下の機能的に連結されたエレメントを含む発現ベクター：
転写プロモーター；
請求項1記載のポリペプチドをコードするDNA部分；および
転写ターミネーター。
【請求項９】
請求項8記載の発現ベクターが導入された培養細胞であって、DNA部分によってコードされるポリペプチドを発現する細胞。
【請求項１０】
以下の段階を含む、ポリペプチドを生成する方法：
請求項8記載の発現ベクターが導入された細胞であって、DNA部分によってコードされるポリペプチドを発現する細胞を培養する段階；および
発現されたポリペプチドを回収する段階。
【請求項１１】
請求項1記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体断片。
【請求項１２】
抗体がzB7R1とCD155との相互作用を遮断するまたは抑制する、請求項11記載の抗体または抗体断片。
【請求項１３】
抗体がCD155とzB7R1との相互作用を遮断するまたは抑制する、CD155に特異的に結合する抗体または抗体断片。
【請求項１４】
抗体がzB7R1とそのカウンター受容体との相互作用を置換するまたは増大させる、請求項11記載の抗体または抗体断片。
【請求項１５】
カウンター受容体がCD155である、請求項14記載の抗体。
【請求項１６】
ポリクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体に由来するヒト化抗体、抗体断片、中和抗体、およびヒトモノクローナル抗体からなる群より選択される、請求項11記載の抗体。
【請求項１７】
F(ab')、F(ab)、F(ab')2、Fab'、Fab、Fv、scFv、および最小認識単位からなる群より選択される、請求項11記載の抗体断片。
【請求項１８】
請求項11記載の抗体に特異的に結合する抗イディタイプ抗体を含む抗イディオタイプ抗体。
【請求項１９】
ポリクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体に由来するヒト化抗体、抗体断片、中和抗体、およびヒトモノクローナル抗体からなる群より選択される、請求項13記載の抗体。
【請求項２０】
F(ab')、F(ab)、F(ab')2、Fab'、Fab、Fv、scFv、および最小認識単位からなる群より選択される、請求項13記載の抗体断片。
【請求項２１】
請求項13記載の抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を含む抗イディオタイプ抗体。
【請求項２２】
配列番号:2のアミノ酸残基16〜140または配列番号:5のアミノ酸残基27〜208と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸残基の配列を含むポリペプチド；およびポリアルキルオキシド部分を含む融合タンパク質であって、T細胞活性化を媒介する融合タンパク質。
【請求項２３】
ポリアルキルオキシド部分がポリエチレングリコールである、請求項22記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
ポリエチレングリコールがポリペプチドのN末端またなC末端に結合している、請求項23記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
ポリエチレングリコールがmPEGプロピオンアルデヒドである、請求項23記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
ポリエチレングリコールが分枝状または直鎖状である、請求項23記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
ポリエチレングリコールが約5 kD、12 kD、20 kD、30 kD、40 kD、または50 kDの分子量を有する、請求項23記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
配列番号:68または配列番号:69と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸残基の配列を含むポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項２９】
免疫グロブリン重鎖定常領域がFc断片である、請求項28記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
免疫グロブリン重鎖定常領域がIgG、IgM、IgE、IgA、およびIgDからなる群より選択されるアイソタイプである、請求項28記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
IgGアイソタイプがIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4である、請求項30記載の融合タンパク質。
【請求項３２】
VASPドメインおよびzB7R1を含む融合タンパク質。
【請求項３３】
zB7R1が配列番号3を含む、請求項32記載の融合タンパク質。
【請求項３４】
配列番号:25を含む融合タンパク質。
【請求項３５】
以下を含む製剤：
配列番号:2のアミノ酸残基16〜140または配列番号:6のアミノ酸残基27〜208と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸残基の配列を含む、単離された可溶性ポリペプチド；および
薬学的に許容されるビヒクル。
【請求項３６】
請求項35記載の製剤を含むキット。
【請求項３７】
以下を含む製剤：
請求項11記載の抗体または抗体断片；および
薬学的に許容されるビヒクル。
【請求項３８】
以下を含む製剤：
請求項13記載の抗体または抗体断片；および
薬学的に許容されるビヒクル。
【請求項３９】
請求項37記載の製剤を含むキット。
【請求項４０】
請求項38記載の製剤を含むキット。
【請求項４１】
リンパ球活性を調節するための方法であって、zB7R1陽性リンパ球を、zB7R1媒介性シグナル伝達を調節し得る生物活性剤の、少なくとも1つのリンパ球活性を調節するのに有効な量と接触させる段階を含む方法。
【請求項４２】
薬剤がzB7R1媒介性シグナル伝達のアンタゴニストを含み、接触段階によりzB7R1シグナル伝達によって媒介されるリンパ球活性の減弱が抑制される、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
接触段階によりリンパ球活性が増加する、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
アンタゴニストがzB7R1とそのカウンター受容体との機能的相互作用を妨げ得る遮断薬を含む、請求項42記載の方法。
【請求項４５】
カウンター受容体がCD155である、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
遮断薬がzB7R1の細胞外ドメイン(配列番号:3)に特異的に結合し得る抗zB7R1抗体を含み、該結合によりzB7R1とそのカウンター受容体との相互作用が妨げられる、請求項44記載の方法。
【請求項４７】
遮断薬が可溶性zB7R1タンパク質を含む、請求項44記載の方法。
【請求項４８】
可溶性zB7R1タンパク質が選択されたアミノ酸残基配列の配列を含む、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
遮断薬が可溶性zB7R1融合タンパク質を含む、請求項44記載の方法。
【請求項５０】
遮断薬が抗zB7R1抗体、zB7R1ポリペプチド、およびzB7R1融合タンパク質からなる群より選択される、請求項44記載の方法。
【請求項５１】
薬剤がzB7R1媒介性シグナル伝達のアゴニストを含み、接触段階によりリンパ球活性が減少する、請求項41記載の方法。
【請求項５２】
アゴニストがzB7R1とそのカウンター受容体との機能的相互作用を模倣し得る模倣薬を含む、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
アゴニストがzB7R1とそのカウンター受容体との機能的相互作用を増大させ得る模倣薬を含む、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
リンパ球がTリンパ球であり、リンパ球活性が活性化、分化、増殖、生存、細胞溶解活性、およびサイトカイン産生からなる群より選択される、請求項41記載の方法。
【請求項５５】
リンパ球がBリンパ球であり、リンパ球活性が活性化、分化、増殖、生存、および抗体産生からなる群より選択される、請求項41記載の方法。
【請求項５６】
リンパ球活性が標的抗原に対する宿主免疫応答を含み、該標的抗原が病原体抗原、ワクチン抗原、およびそのカウンター受容体以外の腫瘍関連抗原からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項５７】
zB7R1陽性腫瘍細胞を有する患者における癌を治療するための方法であって、zB7R1媒介性シグナル伝達のアンタゴニストを患者に投与する段階を含み、該投与が該zB7R1陽性腫瘍細胞に対する宿主免疫応答を増加させるのに有効である方法。
【請求項５８】
アンタゴニストがzB7R1とそのカウンター受容体との機能的相互作用を妨げ得る遮断薬を含む、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
遮断薬がzB7R1の細胞外ドメイン(配列番号:3)に特異的に結合し得る抗zB7R1抗体を含み、該結合によりzB7R1とそのカウンター受容体との相互作用が妨げられる、請求項51記載の方法。
【請求項６０】
自己反応性zB7R1陽性リンパ球の存在を特徴とする自己免疫疾患を有する患者を治療するための方法であって、zB7R1媒介性シグナル伝達のアゴニストを患者に投与する段階を含み、該投与がzB7R1を発現する非リンパ系非腫瘍宿主細胞に対する自己反応性免疫応答を抑制するのに有効である方法。
【請求項６１】
アゴニストがzB7R1とそのカウンター受容体の機能的相互作用を模倣し得る模倣薬を含む、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
カウンター構造がCD155である、請求項40記載の方法。
【請求項６３】
カウンター構造がCD155である、請求項41記載の方法。
【請求項６４】
カウンター構造がCD155である、請求項61記載の方法。
【請求項６５】
T細胞をzB7R1アゴニストと接触させる段階を含む、T細胞活性化を抑制する方法。
【請求項６６】
T細胞をzB7R1アンタゴニストと接触させる段階を含む、T細胞活性化を上方制御する方法。
【請求項６７】
B細胞活性もまた上方制御される、請求項66記載の方法。
【請求項６８】
T細胞の共刺激を抑制する方法であって、T細胞を可溶性zB7R1ポリペプチドと接触させる段階を含み、その配列が配列番号:2のアミノ酸残基16〜140または配列番号:6のアミノ酸残基27〜208と少なくとも95%の同一性を有する配列を含む方法。
【請求項６９】
接触段階がポリペプチドをT細胞と共にインビトロで培養する段階を含む、請求項68記載の方法。
【請求項７０】
T細胞が患者内にある、請求項68記載の方法。
【請求項７１】
接触段階がポリペプチドを患者に投与する段階を含む、請求項68記載の方法。
【請求項７２】
接触段階がポリペプチドをコードする核酸を患者に投与する段階を含む、請求項70記載の方法。
【請求項７３】
(a) 患者から得られた細胞の子孫であり、細胞がポリペプチドを発現するように、ポリペプチドをコードする核酸分子をエクスビボでトランスフェクションまたは形質転換した組換え細胞を提供する段階；および(b) その細胞を患者に投与する段階を含む、請求項70記載の方法。
【請求項７４】
患者が、クローン病、潰瘍性大腸炎、移植片対宿主病、セリアック病、および過敏性腸症候群からなる群より選択される炎症性疾患に罹患している、請求項70記載の方法。
【請求項７５】
クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、移植片対宿主病、および過敏性腸症候群からなる群より選択される疾患に関連した症状または状態の少なくとも1つを治療する、予防する、その進行を抑制する、その発症を遅延させる、および/または軽減する方法であって、請求項35記載の製剤の有効量を患者に投与する段階を含む方法。
【請求項７６】
クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、移植片対宿主病、および過敏性腸症候群からなる群より選択される疾患に関連した症状または状態の少なくとも1つを治療する、予防する、その進行を抑制する、その発症を遅延させる、および/または軽減する方法であって、請求項37記載の製剤の有効量を患者に投与する段階を含む方法。
【請求項７７】
クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、移植片対宿主病、および過敏性腸症候群からなる群より選択される疾患に関連した症状または状態の少なくとも1つを治療する、予防する、その進行を抑制する、その発症を遅延させる、および/または軽減する方法であって、請求項38記載の製剤の有効量を患者に投与する段階を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
正および負の共刺激シグナルはT細胞活性の調節において重要な役割を果たし、これらのシグナルを媒介する分子は免疫調節薬の有効な標的であることが判明している。T細胞受容体(TCR)の結合に加えて正の共刺激がナイーブT細胞の最適な活性化に必要であるのに対し、負の共刺激は自己に対する免疫寛容の獲得およびエフェクターT細胞機能の終結に必要であると考えられている。抗原提示細胞(APC)の表面上のB7-1またはB7-2と相互作用することにより、原型T細胞共刺激分子であるCD28は、TCR結合に応答してT細胞の増殖および分化を促進するシグナルを放出し、CD28相同体細胞傷害性Tリンパ球抗原-4(CTLA-4)はT細胞増殖およびエフェクター機能の抑制を媒介する(Chambers et al., Ann. Rev. Immunol., 19:565-594, 2001；Egen et al., Nature Immunol., 3:611-618, 2002)。
【０００２】
B7ファミリーと相同性を有するいくつかの新規分子が発見されており(Abbas et al., Nat. Med., 5:1345-6, 1999；Coyle et al., Nat. Immunol., 2: 203-9, 2001；Carreno et al., Annu. Rev. Immunol., 20: 29-53, 2002；Liang et al., Curr. Opin. Immunol., 14: 384-90, 2002)、T細胞活性化におけるそれらの役割は解明が始まったばかりである。これらの新規な共刺激カウンター受容体には、B7h2、PD-L1、PD-L2、B7-H3、およびB7-H4が含まれる。
【０００３】
B7h2(Swallow et al., Immunity, 11: 423-32, 1999)は、B7RP-1(Yoshinaga et al., Nature, 402: 827-32, 1999)、GL50(Ling, et al., J. Immunol., 164:1653-7, 2000)、B7H2(Wang et al., Blood, 96: 2808-13, 2000)、およびLICOS(Brodie et al., Curr. Biol., 10: 333-6, 2000)としても知られており、活性化T細胞上の誘導性共刺激分子(ICOS)に結合し、T細胞増殖ならびにインターロイキン4(IL-4)およびIL-10などのサイトカインの産生を同時刺激する。
【０００４】
ヒトにおけるB7-Rl(Dong et al., Nat. Med., 5, 1365-9, 1999)としても知られるPD-L1(Freeman et al., J. Exp. Med., 192: 1027-34, 2000)、およびB7-DC(Tseng et al., J. Exp. Med., 193, 839-46, 2001)としても知られるPD-L2(Latchman et al., Nat. Immunol., 2: 261-8, 2001)は、T細胞およびB細胞上のプログラム死1(PD-1)受容体に結合するが、現時点ではこれらの相互作用の機能は議論を呼んでいる。PD-L1およびPD-L2がT細胞応答に対して抑制効果を有することを実証している報告もあれば(Freeman et al., J. Exp. Med., 192: 1027-34, 2000；Latchman et al., Nat. Immunol., 2: 261-8, 2001)、両カウンター受容体(B7-R1およびB7-DC)がT細胞増殖を正に調節し、IL-10またはインターフェロンγ(IFN-γ)の産生を特異的に増強することを示しているものもある(Dong et al., Nat. Med., 5, 1365-9, 1999；Tseng et al., J. Exp. Med., 193, 839-46, 2001)。
【０００５】
最後に、B7-H3およびB7-H4はいずれも新たに同定されたB7相同体であり、活性化T細胞上の現時点では未知であるカウンター受容体と結合し、CD4+ Tヘルパー(Th)細胞およびCD8+細胞障害性Tリンパ球(CTLまたはTc)の増殖を増強すること、ならびにIFN-γ発現を選択的に増強することが報告されている(Chapoval et al., Nat. Immunol., 2, 269-74, 2001；Sun et al., J. Immunol., 168, 6294-7, 2002)。
【０００６】
非リンパ組織においていくらかの発現を示すPD-1カウンター受容体を例外として、公知のB7ファミリーメンバーの発現は主としてリンパ系細胞に限定されている。まとめると、これらの研究から、B7ファミリーメンバーが、リンパ球上の同族受容体と相互作用して、細胞媒介性免疫応答の調節において重要な役割を果たす正または負の共刺激シグナルを提供する、リンパ系細胞上のカウンター受容体であることが明らかにされた。
【０００７】
特に、多くの自己免疫疾患には、自己反応性T細胞および自己抗体が関与していることが知られている。病原体を防ぐ免疫系の能力を損なうことなく、自己反応性リンパ球を抑制または排除し得る薬剤は非常に望ましい。逆に、養子免疫療法などの多くの癌免疫療法は、腫瘍特異的T細胞集団を拡大し、腫瘍細胞を攻撃して死滅させるようそれらを指向させる(Dudley et al., Science 298:850-854, 2002；Pardoll, Nature Biotech.,20:1207-1208, 2002；Egen et al., Nature Immunol., 3:611-618, 2002)。腫瘍攻撃を増強し得る薬剤は非常に望ましい。さらに、多くの様々な抗原(例えば、微生物抗原または腫瘍抗原)に対する免疫応答は、検出できるものの、そのような抗原を発現する病原体(例えば、感染性微生物または腫瘍細胞)によって媒介される疾患過程を防御するには不十分である場合が多い。多くの場合、抗原に対する対象の免疫応答を増強するのに役立つアジュバントを、抗原と共に対象に投与することが望ましい。また、特定の状況下においては、抗原に対する正常な免疫応答を抑制することが望ましい。例えば、移植を受けた患者では正常な免疫応答の抑制が望ましく、そのような免疫抑制活性を示す薬剤は非常に望ましい。
【０００８】
共刺激シグナル、特に正の共刺激シグナルはまた、B細胞活性の調節においても役割を果たしている。例えば、B細胞活性化および胚中心B細胞の生存は、抗原による刺激に加えてT細胞由来シグナルを必要とする。ヘルパーT細胞の表面上に存在するCD40カウンター受容体はB細胞の表面上のCD40と相互作用し、B細胞における多くのそのようなT細胞依存的効果を媒介する。興味深いことに、CTLA-4と類似している負の共刺激受容体はB細胞上で同定されていない。このことは、T細胞およびB細胞が抗原に応答するよう誘導される方法に基本的な相違が存在することを示唆し、自己寛容および抗体産生などのB細胞エフェクター機能の抑制の機構に関して意味合いをもっている。B細胞上に機能的なCTLA様分子が見出されるならば、その知見によって、B細胞刺激の機構に関する我々の理解が劇的に変わることになる。さらに、そのような受容体の同定により、B細胞活性化および抗体産生を調節することができ、免疫応答の調節に有用な新規治療薬の開発が提供される。
【０００９】
したがって、T細胞共刺激活性および/またはB細胞共刺激活性のいずれかまたは両方を有するさらなるB7ファミリーメンバー、それらのカウンター受容体、およびそれら由来の分子を同定する必要性が当技術分野において存在する。この必要性は主として、それらの根本的な生物学的重要性およびそれらの活性に影響し得る薬剤の治療可能性に基づく。共刺激シグナルを調節し得るそのような薬剤は、免疫応答の調節において著しく有用であり、非常に望ましい。
【発明の開示】
【００１０】
本発明は、これらの、および本明細書の教示から当業者に明らかとなるはずの他の用途のための、そのようなポリペプチドを提供する。
【００１１】
発明の詳細な説明
1. 概要
本発明は、新規な抑制性リンパ球受容体であるzB7R1の同定および特徴づけ、ならびにCD155(PVR)に結合するその能力の発見に関する。したがって本発明は、PD-1様分子であり、Tリンパ球で発現される、新たに同定されたB7受容体を提供する。本発明の新規受容体は「zB7R1」と命名され、これはCD28、CTLA-4、ICOS、PD-1、およびzB7R1とは異なる。例えば、zB7R1とそのカウンター受容体との天然の相互作用を調節するといった、zB7R1媒介性リンパ球シグナル伝達を調節するための方法および組成物もまた提供し、これらは免疫寛容、自己免疫、免疫抑制、および癌免疫療法を含む免疫療法に対して複数の治療用途を有する。
【００１２】
本明細書において初めて開示するように、zB7R1はTリンパ球活性の負の制御因子として作用し、zB7R1により媒介されるシグナル伝達によってzB7R1陽性リンパ球活性の抑制が起こる。zB7R1陽性T細胞では、zB7R1シグナル伝達が例えば、細胞周期進行、増殖、分化、生存、サイトカイン産生、および細胞溶解活性化などのTCR誘導性T細胞応答を抑制し得る。さらに、zB7R1陽性B細胞では、zB7R1シグナル伝達が、細胞周期進行、増殖、分化、生存、抗原提示、および抗体産生などのB細胞抗原受容体誘導性B細胞応答を抑制し得る。これらの知見により、病態の中でも特に癌および自己免疫疾患の治療を目的としてリンパ球活性を調節するための、zB7R1とそのカウンター受容体との相互作用を妨げ得る治療薬の使用が可能になる。
【００１３】
CD155(PVR)は、ZB7r1の対抗構造として同定された。CD155は、CD226(DNAM-1)およびCD96(Tactile)を含む少なくとも2つの他の受容体の対抗構造であることが報告されている。CD226およびCD96は、T細胞およびNK細胞上に発現される活性化受容体であることが示されており、CD155はこれらの分子を介して活性化を誘発し得る。CD155は非造血組織において広く発現していることが報告されており、多くの腫瘍および形質転換細胞種において過剰発現され得る。これらの腫瘍に対するT細胞応答に関するCD155の役割は、主としてCD155のzB7R1との結合であり、これにより腫瘍に対するT細胞およびNK細胞応答が抑制される。したがって、いずれかの分子に対する遮断抗体、またはいずれかのタンパク質の可溶型を含む、zB7R1-CD155相互作用を遮断する試薬は、ZB7r1を介する抑制シグナルを排除するか最小限に抑えることにより、腫瘍に対するT細胞およびNK細胞応答を促進することになる。本明細書に示す作動性抗体を用いて、T細胞に及ぼすzB7R1結合の抑制効果が実証されたことから、作動性抗ZB7r1抗体または可溶性受容体は、T細胞媒介性炎症性疾患および自己免疫疾患においてT細胞応答を抑制するための適切な候補である。
【００１４】
したがって本発明は、zB7R1アゴニストまたはアンタゴニストなどのzB7R1調節因子の新規使用を提供する。これらの調節因子は、可溶性受容体、またはzB7R1もしくはそのカウンター受容体、すなわちCD155に対する抗体であってよい。本発明はまた、ヒト炎症性疾患および自己免疫疾患において用いるための可溶性zB7R1ポリペプチド断片および融合タンパク質を提供する。本発明のzB7R1抗体および可溶性zB7R1受容体は、癌、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、関節炎、内毒素血症、炎症性腸疾患(IBD)、大腸炎、および本明細書に開示するその他の炎症状態などの特定のヒト疾患の治療において、zB7R1またはそのカウンター受容体(すなわちCD155)の活性を調節する、作動させる、遮断する、増加させる、抑制する、減少させる、拮抗する、または中和するために用いることができる。
【００１５】
ヒトzB7R1(互換的にzB7R1x1としても知られる)をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号:1により提供され；コードされるポリペプチドは配列番号:2に示される。zB7R1は、さらに別のB7ファミリーメンバーまたはカウンター受容体と結合するB7受容体である。zB7R1をコードするヒトcDNAクローン(配列番号:1)の解析により、約125アミノ酸残基(配列番号:2の残基16〜140；配列番号:3)の細胞外ドメイン、約23アミノ酸残基(配列番号:2の残基141〜163)の膜貫通ドメイン、および約81アミノ酸残基(配列番号:2の残基164〜244)の細胞内ドメインを含む244アミノ酸(配列番号:2)をコードするオープンリーディングフレームが明らかになった。zB7R1はまた、約96アミノ酸残基(配列番号:2の残基32〜127)のIgVドメインを有する。
【００１６】
zB7R1内には、2つのITIMドメイン、YFNV(配列番号:2のアミノ酸残基225〜228)およびYRSL(アミノ酸残基231〜234)が存在する。ITIMドメインの存在は、zB7R1が抑制効果を有し得るという徴候である。zB7R1内にはまた、2つのSH-3キナーゼ結合ドメイン、PSAP(配列番号:2のアミノ酸残基191〜194)およびPSPP(アミノ酸残基194〜197)が存在する。
【００１７】
zB7R1はまた、CまたはTであってよいnとして示される、配列番号:1のポリヌクレオチド289における多型を有する。zB7R1はまた、AまたはGであってよいnとして示される、配列番号:1のポリヌクレオチド359における少なくとも第2の多型を有し、AからGの変換により、配列番号:2のアミノ酸残基117(Xaaとして示される)におけるThrからAlaへの変換が起こる。
【００１８】
変種ヒトzB7R1(互換的にzB7R1x2としても知られる)をコードする別の例示的なヌクレオチド配列は、配列番号:5により提供され；コードされるポリペプチドは配列番号:6に示される。zB7R1x2は、さらに別のB7ファミリーメンバーまたはカウンター受容体と結合するB7受容体である。zB7R1x2をコードするヒトcDNAクローン(配列番号:5)の解析により、約182アミノ酸残基(配列番号:6の残基27〜208；配列番号:7)の細胞外ドメイン、約22アミノ酸残基(配列番号:6の残基209〜230)の膜貫通ドメイン、および約81アミノ酸残基(配列番号:6の残基231〜311)の細胞内ドメインを含む311アミノ酸(配列番号:6)をコードするオープンリーディングフレームが明らかになった。
【００１９】
マウスzB7R1をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号:8により提供され；コードされるポリペプチドは配列番号:9に示される。細胞外ドメインは配列番号:10に示される。
【００２０】
ヒトCD155(互換的にPVRとしても知られる)をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号:17により提供され；コードされるポリペプチドは配列番号:18に示される。CD155はzB7R1に結合することが示されており、したがってこのB7ファミリーメンバーのカウンター受容体である。zB7R1をコードするヒトcDNAクローン(配列番号:17)の解析により、約316アミノ酸残基(配列番号:18の残基28〜343；配列番号:19)の細胞外ドメイン、約24アミノ酸残基(配列番号:18の残基344〜367)の膜貫通ドメイン、および約50アミノ酸残基(配列番号:18の残基368〜417)の細胞内ドメインを含む417アミノ酸(配列番号:18)をコードするオープンリーディングフレームが明らかになった。
【００２１】
マウスCD155をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号:20により提供され；コードされるポリペプチドは配列番号:21に示される。細胞外ドメインは配列番号:22に示される。マウスCD155をコードするcDNAクローンの解析により、約319アミノ酸残基(配列番号:21の残基29〜347；配列番号:22)の細胞外ドメイン、約20アミノ酸残基(配列番号:21の残基348〜367)の膜貫通ドメイン、および約40アミノ酸残基(配列番号:21の残基368〜408)の細胞内ドメインを含む408アミノ酸(配列番号:21)をコードするオープンリーディングフレームが明らかになった。
【００２２】
したがって本発明の1つの局面において、本発明は、Tリンパ球活性の調節において、ならびに自己免疫疾患、炎症、乾癬、IBD、潰瘍性大腸炎、およびSLEを含む免疫障害の治療において有用である、zB7R1ポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。
【００２３】
本発明はまた、配列番号:2または3のアミノ酸配列の単離されたポリペプチド、およびその少なくとも15個の連続したアミノ酸残基を含むエピトープを提供する。例示的なポリペプチドには、配列番号:3、その抗原エピトープ、または機能的zB7R1結合断片を含むまたはそれらからなるポリペプチドが含まれる。さらに、本発明はまた、zB7R1の活性を作動させる、結合する、遮断する、抑制する、減少させる、増加させる、拮抗する、または中和する、上記の単離されたポリペプチドを提供する。
【００２４】
本発明はさらに、そのようなポリペプチドと特異的に結合する抗体および抗体断片を提供する。例示的な抗体には、アゴニスト抗体、中和抗体、ポリクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体に由来するヒト化抗体、およびヒトモノクローナル抗体が含まれる。例示的な抗体断片には、F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv、および最小認識単位が含まれる。中和抗体は好ましくは、その1つまたは複数のカウンター受容体との相互作用を遮断する、抑制する、減少させる、拮抗する、または中和するようにzB7R1と結合し；その1つまたは複数のカウンター受容体との相互作用を遮断する、抑制する、減少させる、拮抗する、または中和する抗zB7R1中和抗体もまた、本発明によって包含される。本発明は、担体および本明細書に記載のペプチド、ポリペプチド、または抗体を含む組成物をさらに含む。
【００２５】
したがって1つの態様においては、T細胞活性化およびおそらくはB細胞活性化を増加させるために、zB7R1シグナル伝達のアンタゴニストが提供される。好ましい態様において、そのようなアンタゴニストは、zB7R1とその1つまたは複数のカウンター受容体との天然の相互作用を妨げることができ、それによってzB7R1媒介性の負のシグナル伝達を抑制し、リンパ球活性化および増殖およびエフェクター機能を増加させる遮断薬を含む。
【００２６】
別の態様においては、T細胞活性化およびおそらくはB細胞活性化を抑制するために、zB7R1シグナル伝達のアゴニストが提供される。好ましい態様において、そのような生物活性剤は、zB7R1に結合し、zB7R1とその1つまたは複数のカウンター受容体との天然の相互作用を模倣するおよび/または増大させることができ、それによってT細胞活性化(およびおそらくはB細胞)および増殖およびエフェクター機能を抑制する模倣薬を含む。
【００２７】
1つの態様においては、B細胞およびT細胞活性を増加させるおよび/または上方制御するための生物活性剤および方法を提供する。好ましい態様において、そのような生物活性剤はzB7R1媒介性シグナル伝達のアンタゴニストを含む。特に好ましい態様において、そのような生物活性剤は本明細書に記載する遮断薬を含み、特定の態様において、そのような遮断薬はzB7R1とそのカウンター受容体との相互作用を妨げ得る。さらなる態様においては、zB7R1および/またはそのカウンター受容体遮断薬ならびにzB7R1媒介性シグナル伝達のその他のアンタゴニストを利用するアジュバント組成物を提供する。
【００２８】
別の態様においては、B細胞およびT細胞活性を抑制するおよび/または下方制御するための生物活性剤および方法を提供する。好ましい態様において、そのような生物活性剤はzB7R1媒介性シグナル伝達のアゴニストを含む。特に好ましい態様において、そのような生物活性剤は本明細書に記載する模倣薬を含み、特定の態様において、そのような模倣薬はzB7R1とそのカウンター受容体との相互作用を置換し得るおよび/または増大させ得る。さらなる態様においては、zB7R1および/またはそのカウンター受容体模倣薬ならびにzB7R1媒介性シグナル伝達のその他のアゴニストを利用する免疫抑制組成物を提供する。
【００２９】
さらなる態様においては、B細胞による免疫グロブリン産生を調節するための方法および組成物を提供する。
【００３０】
本明細書に記載する方法および組成物は、例えば、自己免疫、免疫抑制、癌免疫療法、および免疫アジュバントを含む免疫療法において有利に用いられる。
【００３１】
さらに、本発明はまた、薬学的に許容される担体、およびそのような発現ベクターまたはそのような発現ベクターを含む組換えウイルスの少なくとも1つを含む薬学的組成物を提供する。本発明は、薬学的に許容される担体および本明細書に記載するポリペプチドまたは抗体を含む薬学的組成物をさらに含む。
【００３２】
本発明はまた、配列番号:2もしくは6のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその断片と特異的に結合する抗体または抗体断片と特異的に結合する抗イディオタイプ抗体または抗イディオタイプ抗体断片を意図する。例示的な抗イディオタイプ抗体は、配列番号:3または7からなるポリペプチドと特異的に結合する抗体と結合する。
【００３３】
本発明はまた、zB7R1ポリペプチドおよび免疫グロブリン部分を含む融合タンパク質を提供する、そのような融合タンパク質において、免疫グロブリン部分は、ヒトFc断片などの免疫グロブリン重鎖定常領域であってよい。本発明は、そのような融合タンパク質をコードする単離された核酸分子をさらに含む。
【００３４】
本発明は、多量体zB7R1タンパク質、およびそのような多量体タンパク質、好ましくは四量体タンパク質を調製する方法であって、血管拡張作用因子刺激リン酸化タンパク質(VASP)ドメインおよびzB7R1またはCD155などの異種タンパク質を含む融合タンパク質をコードする発現ベクターを形質転換またはトランスフェクションした宿主細胞を培養する段階を含む方法に関する。具体的には、融合タンパク質に含まれるzB7R1またはCD155の部分は、そのタンパク質の細胞外ドメイン(すなわち、zB7R1に関しては配列番号:3もしくは7、またはCD155に関しては配列番号:22)であり、結果として得られる融合タンパク質は可溶性である。さらなる態様において、融合タンパク質はリンカー配列を含む。本発明のさらに別の態様においては、VASPドメインを用いて、類似したタンパク質構造パターンを有する配列を同定することができ、そのような類似したドメインを用いて異種タンパク質またはタンパク質ドメインを多量体化する融合タンパク質を作製することができる。
【００３５】
本発明のさらなる態様は、VASPドメインおよびzB7R1もしくはCD155またはそれらのタンパク質ドメインを含む融合タンパク質をコードする少なくとも1つ、最大で4つの異なる発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションした宿主細胞を培養することにより、可溶性ホモまたはヘテロ四量体zB7R1またはCD155タンパク質を調製する方法である。本態様において、4つのVASPドメインは優先的にホモまたはヘテロ四量体を形成する。この培養は、同じまたは異なる宿主細胞で行うことができる。VASPドメインは同じであっても異なってもよく、融合タンパク質はリンカー配列をさらに含んでもよい。本発明はまた、本方法および本方法によって生成される融合タンパク質において用いられるDNA配列、発現ベクター、および形質転換宿主細胞を包含する。
【００３６】
本発明はまた、可溶性受容体を含む単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、および多量体受容体などの、zB7R1細胞外ドメインを含むポリペプチドに結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。
【００３７】
別の局面においては、リンパ球活性を調節するための方法であって、Bリンパ球および/またはTリンパ球を、zB7R1活性を調節し得る生物活性剤と接触させる段階を含む方法を提供する。1つの態様において、生物活性剤は、負のzB7R1媒介性シグナル伝達を妨げることによりリンパ球活性の上方制御または増加をもたらす、例えばzB7R1またはzB7R1カウンター受容体遮断薬(すなわちCD155)などのzB7R1活性のアンタゴニストを含む。別の態様において、生物活性剤は、zB7R1媒介性の負のシグナル伝達を置換するまたは増大させることによりリンパ球活性の下方制御をもたらす、例えばzB7R1またはzB7R1カウンター受容体模倣薬などのzB7R1活性のアゴニストを含む。
【００３８】
さらなる局面においては、リンパ球活性を調節するための方法であって、Bリンパ球および/またはTリンパ球を、zB7R1とzB7R1カウンター受容体との相互作用を調節し得る生物活性剤と接触させる段階を含む方法を提供する。1つの態様においては、例えば、可溶性zB7R1カウンター受容体またはzB7R1遮断薬などのzB7R1アンタゴニストのような、zB7R1とzB7R1カウンター受容体(すなわちCD155)との天然の相互作用を妨げ得る生物活性剤を用いて、リンパ球活性および増殖を増加させる。別の態様においては、zB7R1とzB7R1カウンター受容体(すなわちCD155)との天然の相互作用を増大させ得るまたは置換し得る生物活性剤を用いて、リンパ球活性および増殖を抑制する。
【００３９】
適切なzB7R1遮断薬は、可溶性zB7R1ポリペプチドおよび融合タンパク質、zB7R1の細胞外ドメインの少なくとも一部に結合し、zB7R1媒介性シグナル伝達を妨げ得る抗zB7R1抗体、zB7R1受容体とそのリガントとの相互作用の小分子阻害剤などを含む、またはそれらからなる群より選択され得る。別のzB7R1アンタゴニストには、zB7R1核酸配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、抑制性RNA配列、zB7R1発現および/または細胞内シグナル伝達の小分子阻害剤などがさらに含まれる。
【００４０】
同様に、適切なzB7R1カウンター受容体遮断薬またはアンタゴニストは、zB7R1カウンター受容体(すなわちCD155)の細胞外ドメイン(配列番号:22)の少なくとも一部に結合し、zB7R1カウンター受容体とzB7R1との相互作用を妨げ得る抗zB7R1カウンター受容体抗体、zB7R1カウンター受容体とzB7R1との相互作用の小分子阻害剤、zB7R1カウンター受容体とzB7R1との相互作用を妨げ、zB7R1媒介性シグナル伝達を活性化できないように改変されたzB7R1カウンター受容体アミノ酸配列を有する可溶性zB7R1カウンター受容体ポリペプチドおよび融合タンパク質などを含む、またはそれらからなる群より選択され得る。別のzB7R1カウンター受容体アンタゴニストには、zB7R1カウンター受容体核酸配列(すなわちCD155；配列番号:20)に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、抑制性RNA分子、zB7R1カウンター受容体発現の小分子阻害剤などが含まれる。
【００４１】
適切なzB7R1模倣薬またはアゴニストは、zB7R1の細胞外ドメイン(配列番号:3または7)の少なくとも一部に結合し、zB7R1媒介性シグナル伝達を促進し得る機能活性化抗zB7R1抗体(「作動性抗体」)、細胞内で機能的zB7R1分子を組換えにより産生し得る遺伝子治療ベクター、zB7R1発現および/またはzB7R1媒介性シグナル伝達の小分子増強剤などを含む、またはそれらからなる群より選択され得る。同様に、適切なzB7R1カウンター受容体模倣薬は、zB7R1媒介性シグナル伝達を活性化し得る、CD155などの可溶性zB7R1カウンター受容体ポリペプチドおよび融合タンパク質、zB7R1カウンター受容体とzB7R1との相互作用の小分子増強剤、ならびにzB7R1カウンター受容体発現の増強剤、細胞内で機能的zB7R1カウンター受容体分子を組換えにより産生し得る遺伝子治療ベクターなどを含む、またはそれらからなる群より選択され得る。
【００４２】
したがってより具体的な態様においては、リンパ球活性を促進する、増大させる、および/または増加させるための方法であって、Bリンパ球またはTリンパ球をzB7R1媒介性シグナル伝達のアンタゴニストと接触させる段階を含む方法を提供し、そのようなアンタゴニストは、可溶性zB7R1ポリペプチド、可溶性zB7R1融合タンパク質、zB7R1の細胞外ドメインの少なくとも一部に結合し、zB7R1媒介性シグナル伝達を妨げ得る抗zB7R1抗体、zB7R1発現および/またはzB7R1媒介性シグナル伝達の小分子阻害剤、zB7R1カウンター受容体の細胞外ドメインの少なくとも一部に結合し、zB7R1カウンター受容体とzB7R1との相互作用を妨げ得る抗zB7R1カウンター受容体抗体、zB7R1カウンター受容体とzB7R1との相互作用の小分子阻害剤、zB7R1媒介性シグナル伝達を活性化できない可溶性zB7R1カウンター受容体ポリペプチドおよびzB7R1カウンター受容体融合タンパク質、ならびに抑制性RNA配列からなる群より選択される少なくとも1つの生物活性剤を含む。
【００４３】
特定の好ましい態様においては、抗原刺激に対する宿主免疫応答を増加させるための方法であって、zB7R1媒介性シグナル伝達の上記アンタゴニストの少なくとも1つを宿主に投与する段階を含む方法を提供する。望ましくは、抗原刺激は病原体抗原、ワクチン抗原、および/または腫瘍抗原に由来し得る。
【００４４】
具体的な態様においては、zB7R1カウンター受容体以外の腫瘍抗原に対する細胞免疫応答を促進するための方法であって、zB7R1媒介性の負のシグナル伝達を抑制し、それによって癌組織に存在するzB7R1カウンター受容体以外の腫瘍抗原に対するT細胞応答を増加させるために、本アンタゴニストまたは遮断薬の少なくとも1つを癌患者に投与する段階を含む方法を提供する。
【００４５】
さらなる具体的な態様においては、リンパ球活性を抑制する、減弱させる、および/または減少させるための方法であって、Bリンパ球またはTリンパ球をzB7R1媒介性シグナル伝達のアゴニストと接触させる段階を含む方法を提供し、そのようなアゴニストは、zB7R1媒介性シグナル伝達を活性化し得る可溶性zB7R1カウンター受容体ポリペプチドおよびzB7R1カウンター受容体融合タンパク質、zB7R1の細胞外ドメインの少なくとも一部に結合し、zB7R1媒介性シグナル伝達を促進し得る機能活性化抗zB7R1抗体、細胞内で機能的zB7R1分子を組換えにより産生し得る遺伝子治療ベクター、zB7R1発現および/またはzB7R1媒介性シグナル伝達の小分子増強剤、zB7R1カウンター受容体とzB7R1との相互作用の小分子増強剤、zB7R1カウンター受容体発現の小分子増強剤、ならびに細胞内で機能的zB7R1カウンター受容体分子を組換えにより産生し得る遺伝子治療ベクターからなる群より選択される。
【００４６】
特定の好ましい態様においては、抗原刺激に対する宿主免疫応答を抑制するための方法であって、zB7R1媒介性シグナル伝達の上記アゴニストの少なくとも1つを宿主に投与する段階を含む方法を提供する。望ましくは、抗原刺激は、自己免疫疾患の状況における自己抗原、または移植臓器および組織に存在するドナー抗原に由来し得る。
【００４７】
別の局面において、本発明は、zB7R1カウンター受容体発現細胞とzB7R1発現リンパ球との相互作用を調節するための生物活性剤および方法を提供する。好ましい態様においては、zB7R1カウンター受容体陽性腫瘍細胞とT細胞との相互作用を妨げるための生物活性剤および方法であって、結果として負のzB7R1媒介性シグナル伝達の抑制をもたらす生物活性剤および方法を提供する。特に好ましい態様において、T細胞はCD4+細胞またはCD8+細胞である。さらなる態様において、CD4+ T細胞はTh1細胞である。
【００４８】
別の好ましい態様においては、zB7R1カウンター受容体/CD155陽性非腫瘍非リンパ系細胞とzB7R1陽性T細胞との相互作用を模倣するまたは増強するための生物活性剤および方法であって、それによってT細胞活性が減少する生物活性剤および方法を提供する。特に好ましい態様において、T細胞はCD4+ T細胞またはCD8+ T細胞である。さらなる態様において、CD4+ T細胞はTh1細胞である。
【００４９】
さらなる局面において、zB7R1カウンター受容体発現腫瘍細胞の存在を特徴とする癌を治療するための方法を提供する。1つの態様において、これらの方法は、本明細書に開示するzB7R1媒介性シグナル伝達のアンタゴニストの少なくとも1つを単独で、または別の癌免疫療法、化学療法、および放射線療法手順と併用して哺乳動物対象に投与する段階を含む。好ましい態様においては、少なくとも1つのzB7R1アンタゴニストまたはCD155アンタゴニストを、zB7R1カウンター受容体陽性腫瘍細胞を有する対象に投与し、そのような遮断薬は、zB7R1とzB7R1カウンター受容体との相互作用を妨げ、zB7R1媒介性シグナル伝達を抑制し得る。好ましくは、そのような遮断薬の投与は、腫瘍細胞上のzB7R1カウンター受容体以外の腫瘍抗原に対するT細胞活性を増加させるのに、特に、細胞傷害性T細胞活性を増加させるのに有効である。さらにより好ましくは、本アンタゴニストの投与は、zB7R1カウンター受容体発現腫瘍細胞の増殖を抑制するのに有効である。
【００５０】
本明細書に提供する本zB7R1および/またはzB7R1カウンター受容体/CD155遮断が、それらの開示が参照により本明細書に明らかに組み入れられる米国特許第5,855,887号；同第5,811,097号；および同第6,051,227号、ならびにWO 00/32231に記載されるCTLA-4遮断と相乗的に併用され得ることもまた意図される。
【００５１】
さらなる局面において、自己免疫攻撃にさらされた非腫瘍非リンパ系宿主細胞におけるzB7R1カウンター受容体の非存在または異常な発現を特徴とする自己免疫障害を治療するための方法を提供する。1つの態様において、これらの方法は、本明細書に開示するzB7R1媒介性シグナル伝達のアゴニストの少なくとも1つを単独で、または別の免疫療法および/または免疫抑制手順と併用して哺乳動物対象に投与する段階を含む。好ましい態様においては、少なくとも1つのzB7R1またはCD155アゴニストを、自己反応性zB7R1陽性リンパ球を有する対象に投与し、そのようなアゴニストは、zB7R1とCD155の相互作用を置換し得るおよび/または増大させ得る。好ましくは、そのようなアゴニストの投与は、非腫瘍非リンパ系宿主細胞に対する自己反応性リンパ球活性、特に自己反応性CD8+ CTLおよびCD4+ Th1活性、ならびにB細胞活性の減少に効果的である。
【００５２】
なおさらなる局面においては、臓器および組織移植の結果を改善し、移植片生着を長くするための方法を提供する。1つの態様において、これらの方法は、本明細書に開示するzB7R1媒介性シグナル伝達のアゴニストまたはアンタゴニストの少なくとも1つの薬剤を単独で、または別の免疫療法および/または免疫抑制手順と併用して移植レシピエントに投与する段階を含む。好ましい態様においては、少なくも1つのzB7R1模倣薬(例えば、細胞表面zB7R1とそのカウンター受容体との結合を遮断する可溶性受容体、またはzB7R1に結合してシグナル伝達を誘導するアゴニスト抗体)を移植レシピエントに投与し、そのような模倣薬は、zB7R1とzB7R1カウンター受容体との相互作用を置換し得るおよび/または増大させ得る、ならびにzB7R1媒介性シグナル伝達を置換し得るまたは増大させ得る。好ましくは、そのような模倣薬の投与は、移植片に存在するドナー抗原に対するレシピエント免疫応答、特に細胞傷害性CTL応答およびB細胞応答を減少させるのに有効である。なおさらに好ましくは、そのような模倣薬の投与は、本明細書においてさらに詳述するように、Tヘルパー細胞応答を好ましくないTh-1型応答からより好ましいTh-2型応答に偏らせるのに有効である。
【００５３】
自己免疫疾患の治療
本発明はまた、自己免疫応答を抑制するための組成物および方法を提供する。好ましい態様においては、自己抗原を特異的に認識する自己反応性T細胞およびB細胞の活性を抑制するための組成物および方法を提供する。望ましくは、これらの組成物および方法を用いて、1つまたは複数の自己抗原によって媒介される非腫瘍細胞の死滅を抑制することができる。
【００５４】
自己免疫疾患の治療において用いるための好ましい組成物は、例えば上記の模倣薬、アゴニスト、またはアンタゴニストを含む、本明細書に記載するzB7R1シグナル伝達を媒介する薬剤を含む。特に好ましい薬剤には、zB7R1細胞外ドメイン(配列番号:3または7)またはその一部を含むzB7R1タンパク質断片；zB7R1細胞外ドメイン(配列番号:3)またはその一部を含むzB7R1-Ig融合タンパク質；機能活性化抗zB7R1またはCD155抗体；zB7R1またはそのカウンター受容体、CD155を模倣するペプチド(模倣物)；およびzB7R1とそのカウンター受容体との天然の相互作用を模倣する小分子化学組成物が含まれる。架橋様式でまたはポリクローナル混合物としてzB7R1に結合し得る組成物もまた好ましい。
【００５５】
本発明においては、自己免疫疾患に対する遺伝的アプローチもまた意図する。特に、遺伝子治療を用いて、T細胞上のzB7R1発現のレベルを増加させること、および/または自己反応性リンパ球による攻撃にさらされる非リンパ系細胞上のそのカウンター受容体の発現レベルを増加させることができる。比活性の上昇を示すzB7R1のアイソフォームまたは変種の使用もまた意図され、各方法の目的は、T細胞活性化に対して抑制的であるシグナル伝達を増強することである。
【００５６】
本発明はまた、癌を治療するため、特にB7陽性腫瘍細胞に対するzB7R1陽性リンパ球の活性を増加させるための組成物および方法を提供する。望ましくは、これらの組成物および方法を用いて、B7ファミリーメンバーを発現し得る腫瘍細胞の増殖を抑制することができる。
【００５７】
癌の治療において用いるための好ましい組成物は、例えばzB7R1遮断薬を含む、本明細書に記載するzB7R1媒介性シグナル伝達のアンタゴニストである。特に好ましい薬剤には、抗zB7R1抗体；zB7R1細胞外ドメインまたはその一部を含むタンパク質断片；BTLA細胞外ドメインまたはその一部を含むzB7R1-Ig融合タンパク質；機能遮断抗zB7R1抗体；zB7R1を模倣するペプチド(模倣物)；およびzB7R1とそのカウンター受容体をの天然の相互作用を妨げる小分子化学組成物が含まれる。
【００５８】
本発明においては、癌の治療に対する遺伝的アプローチもまた意図する。特に、遺伝子治療を用いて、T細胞上のzB7R1発現のレベルを減少させること、および/または腫瘍細胞上のzB7R1もしくはそのカウンター受容体(すなわちCD155)の発現レベルを減少させることができる。ドミナントネガティブ活性を示すzB7R1のアイソフォームの使用もまた意図され、各方法の目的は、T細胞活性化に対して通常抑制的であるシグナル伝達を抑制することである。遺伝的アプローチは、T細胞および腫瘍細胞それぞれに対してzB7R1ドミナントネガティブ変種、アンチセンス核酸、または低分子抑制性RNAの発現を標的化するための組織および細胞特異的プロモーターの使用を含み得る。本方法は、腫瘍標的化ウイルス、または腫瘍細胞を特異的に認識するその他の送達媒体の使用をさらに含み得る。本方法は、T細胞標的化ウイルス、またはT細胞を特異的に認識するその他の送達媒体の使用をさらに含み得る。
【００５９】
特に好ましいのは、腫瘍細胞に選択的に標的化することができ、非腫瘍細胞におけるzB7R1発現のレベルを有害レベルにまで減少させることなく腫瘍細胞におけるzB7R1発現を減少させることができる薬剤である。前駆体型を有する薬剤が非常に好ましい。これらの「プロドラッグ」は、典型的にその分布が腫瘍の近傍への分布に限定される酵素活性によって、腫瘍組織の近傍で活性型に変換される。
【００６０】
薬剤を腫瘍に選択的に送達する標的化部分と併用できる薬剤もまた非常に好ましい。これらの標的化部分は、腫瘍組織の近傍において薬剤の局所的高濃度を提供し、所望の反応をもたらすために投与すべき薬剤の量が低減される。
【００６１】
本発明においては、上記のように癌を治療するための併用療法の使用もまた意図する。
【００６２】
好ましい態様においては、免疫化を行い、腫瘍特異的T細胞免疫応答を促進する。本態様では、zB7R1活性化を抑制する生物活性剤を腫瘍関連抗原と併用して投与する。腫瘍関連抗原とzB7R1抑制性/カウンター受容体機能的模倣物の併用により、腫瘍特異的T細胞応答が促進され、T細胞は、生物活性剤が存在しない場合に腫瘍組織がもたらす抑制よりも低いレベルの抑制を受ける。
【００６３】
1つの局面において、本発明は癌を治療するための医薬品を提供する。
【００６４】
本発明はまた、T細胞およびB細胞活性を含む正常であるが望ましくない免疫応答を調節するための組成物および方法を提供する。好ましい態様において、移植組織および臓器に対する宿主リンパ球応答を抑制するための組成物および方法を提供する。望ましくは、これらの組成物および方法を用いて、移植組織の生存を長くすることができる。急性および/慢性移植片拒絶の予防において用いるための好ましい組成物は、例えば上記の模倣薬を含む、本明細書に記載するzB7R1媒介性シグナル伝達のアゴニストを含む。特に好ましい薬剤には、zB7R1細胞外ドメイン(配列番号:3または7)またはその一部を含むzB7R1ポリペプチド；zB7R1細胞外ドメイン(配列番号:3または7)またはその一部を含むzB7R1-Ig融合タンパク質；機能活性化抗BTLA抗体；そのカウンター受容体(すなわちCD155)を模倣するペプチド(模倣物)；およびzB7R1とそのカウンター受容体との天然の相互作用を模倣する小分子化学組成物が含まれる。一般的な免疫抑制戦略における有用性に加えて、本明細書に記載するzB7R1媒介性シグナル伝達の本アゴニストはまた、レシピエントのTヘルパー細胞免疫応答を好ましくないTh-1型応答からより好ましいTh-2型応答に偏らせることによる、組織および臓器移植における寛容の誘導に関して重要な意味を有し得る。
【００６５】
1つの局面において、本発明は、移植および免疫抑制において用いるための医薬品を提供する。
【００６６】
上記のzB7R1および/またはCD155もしくはその他のzB7R1カウンター受容体遮断薬、ならびにzB7R1媒介性シグナル伝達のその他のアンタゴニストの少なくとも1つを含むアジュバント組成物もまた提供する。上記のzB7R1および/またはzB7R1カウンター受容体模倣物、ならびにzB7R1媒介性シグナル伝達のその他のアゴニストの少なくとも1つを含む免疫抑制組成物もまた提供する。
【００６７】
本組成物および方法を、その他のT細胞共刺激経路の調節に基づく免疫療法と、特にICOS、PD-1、CTLA-4、および/またはBTLA調節と相乗的に併用することができることもさらに意図される。
【００６８】
別の局面において、本発明は、T細胞活性化を調節するために有用である生物活性剤をスクリーニングする方法を提供する。zB7R1発現B細胞および/またはT細胞とzB7R1カウンター受容体発現非リンパ系細胞との相互作用を妨げ、それによってzB7R1/zB7R1カウンター受容体相互作用の機能を拮抗するために、本明細書に提供するスクリーニング法によって同定された生物活性剤を用いて、zB7R1カウンター受容体発現細胞またはzB7R1発現細胞と反応させることができる。または、zB7R1カウンター受容体/zB7R1相互作用を模倣して、zB7R1/zB7R1カウンター受容体相互作用の非存在下においてT細胞抑制をもたらすために、生物活性剤を用いてzB7R1カウンター受容体発現細胞またはzB7R1発現細胞と反応させることができる。または、例えば会合を増加させるおよび抑制シグナルを増大させるために、生物活性剤を用いて、何らかの方法で天然のzB7R1/CD155(またはzB7R1と別のzB7R1カウンター受容体)相互作用を改変することができる。
【００６９】
別の局面において、本発明は、本明細書に開示する単離されたzB7R1および/またはzB7R1カウンター受容体核酸配列(すなわちCD155；配列番号:20)を含む発現ベクター、本明細書に開示する組換え核酸分子を含む組換え宿主細胞、ならびに宿主細胞を培養する段階および任意にそれによって産生されたポリペプチドを単離する段階を含む、zB7R1および/またはzB7R1カウンター受容体ポリペプチドを生成する方法を提供する。
【００７０】
さらなる局面においては、本明細書に開示するzB7R1、CD155、および/または別のzB7R1カウンター受容体タンパク質をコードする核酸を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。zB7R1、CD155、またはその他のzB7R1カウンター受容体ヌクレオチドは、zB7R1またはzB7R1カウンター受容体ポリペプチドの発現レベルの増加(循環レベルの増加を含み得る)を可能にする様式で動物に導入する。または、内因性のzB7R1またはzB7R1カウンター受容体核酸の発現を妨げるために、zB7R1、Cd155、またはzB7R1カウンター受容体核酸断片を用いて、内因性のzB7R1、CD155、またはzB7R1カウンター受容体対立遺伝子を標的化することができる(すなわち、zB7R1またはzB7R1カウンター受容体タンパク質遺伝子ノックアウトを有するトランスジェニック動物を作製する)。トランスジェニック動物は好ましくは哺乳動物、より好ましくはラットまたはマウスなどのげっ歯動物である。
【００７１】
本発明のこれらおよびその他の局面は、以下の詳細な説明を参照することにより明らかになると考えられる。さらに、種々の参考文献が以下において確認されるが、これらは全体として参照により組み入れられる。
【００７２】
2. 定義
以下の記載においては、いくつかの用語が頻繁に用いられる。本発明の理解を容易にするために、以下の定義を提供する。
【００７３】
本明細書において用いる「核酸」または「核酸分子」とは、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により作製された断片、ならびに連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかにより作製された断片などのポリヌクレオチドを指す。核酸分子は、天然ヌクレオチド(DNAおよびRNAなど)の単量体、もしくは天然ヌクレオチドの類似体(例えば、天然ヌクレオチドのα-鏡像異性体)、または両者の組み合わせから構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分に、および/またはピリミジン塩基もしくはプリン塩基部分に変化を有し得る。糖修飾には、例えば、ハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基による1つもしくは複数のヒドロキシル基の置換が含まれ、または糖はエーテルもしくはエステルとして官能基が付加され得る。さらに、糖部分全体を、アザ糖および炭素環式糖類似体などの、立体的および電子的に類似の構造体と置換することができる。塩基部分の修飾の例には、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジン、またはその他の周知の複素環式置換基が含まれる。核酸単量体は、ホスホジエステル結合、またはそのような結合の類似結合によって結合され得る。ホスホジエステル結合の類似結合には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート(phosphoroselenoate)、ホスホロジセレノエート(phosphorodiselenoate)、ホスホロアニロチオエート(phosphoroanilothioate)、ホスホラニリデート(phosphoranilidate)、ホスホロアミダートなどが含まれる。「核酸分子」という用語には、ポリアミド骨格に結合した天然または修飾核酸塩基を含む、いわゆる「ペプチド核酸」もまた含まれる。核酸は一本鎖または二本鎖のいずれかであってよい。
【００７４】
「核酸分子の相補体」という用語は、参照ヌクレオチド配列に対して逆方向である相補的ヌクレオチド配列を有する核酸分子を指す。
【００７５】
「縮重ヌクレオチド配列」という用語は、ポリペプチドをコードする参照核酸分子と比較して1つまたは複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列を意味する。縮重コドンはヌクレオチドの異なるトリプレットを含むが、同じアミノ酸残基をコードする(すなわち、GAUおよびGACトリプレットはそれぞれAspをコードする)。
【００７６】
「構造遺伝子」という用語は、メッセンジャーRNA(mRNA)に転写され、その後そのmRNAが特定のポリペプチドに特有であるアミノ酸配列に翻訳される核酸分子を指す。
【００７７】
「単離された核酸分子」とは、生物のゲノムDNA中に組み込まれていない状態の核酸分子である。例えば、細胞のゲノムDNAから分離された増殖因子をコードするDNA分子は、単離されたDNA分子である。単離された核酸分子の別の例は、生物のゲノム中に組み込まれていない化学的に合成された核酸分子である。特定の種から単離された核酸分子は、その種の染色体の完全なDNA分子よりも小さい。
【００７８】
「核酸分子構築物」とは、天然には存在しない配置で組み合わせかつ並置された核酸の部分を含むように人間の介入により修飾された、一本鎖または二本鎖の核酸分子である。
【００７９】
「線状DNA」は、遊離の5'および3'末端を有する非環状DNA分子を意味する。線状DNAは、酵素消化または物理的破壊により、プラスミドなどの閉環状DNA分子から調製することができる。
【００８０】
「相補的DNA(cDNA)」とは、逆転写酵素によってmRNA鋳型から形成される一本鎖DNA分子である。典型的に、mRNAの一部と相補的なプライマーが、逆転写の開始に用いられる。当業者はまた、このような一本鎖DNA分子およびその相補的DNA鎖からなる二本鎖DNA分子を指して、「cDNA」という用語を使用する。「cDNA」という用語はまた、RNA鋳型から合成されたcDNA分子のクローンも意味する。
【００８１】
「プロモーター」とは、構造遺伝子の転写を指示するヌクレオチド配列である。典型的に、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位に近い、遺伝子の5'非コード領域に位置する。転写の開始において機能するプロモーター内の配列エレメントは、共通ヌクレオチド配列によって特徴づけられる場合が多い。これらのプロモーターエレメントには、RNAポリメラーゼ結合部位、TATA配列、CAAT配列、分化特異的エレメント(DSE；McGehee et al., Mol. Endocrinol. 7: 551 (1993))、サイクリックAMP応答エレメント(CRE)、血清応答エレメント(SRE；Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1:47 (1990))、グルココルチコイド応答エレメント(GRE)、ならびにCRE/ATF(O'Reilly et al., J. Biol. Chem. 267:19938 (1992))、AP2(Ye et al., J. Biol. Chem. 269:25728 (1994))、SP1、cAMP応答エレメント結合タンパク質(CREB；Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993))、およびオクタマー因子などの他の転写因子の結合部位が含まれる(一般的には、Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (The Benjamin Cummings Publishing Company, Inc. 1987)、およびLemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303:1 (1994)を参照されたい)。プロモーターが誘導性プロモーターである場合には、転写速度は誘導物質に応じて増大する。これとは対照的に、プロモーターが構成的プロモーターである場合には、転写速度は誘導物質による調節を受けない。抑制性プロモーターもまた知られている。
【００８２】
「コアプロモーター」は、TATAボックスおよび転写開始点を含む、プロモーターの機能に不可欠なヌクレオチド配列を含む。この定義によれば、コアプロモーターは、活性を増強し得るかまたは組織特異的活性を付与し得る特定の配列の非存在下で、検出可能な活性を有する場合もあれば有さない場合もある。
【００８３】
「調節エレメント」とは、コアプロモーターの活性を調節するヌクレオチド配列である。例えば、調節エレメントは、特定の細胞、組織、または細胞小器官において独占的にまたは優先的に転写を可能にする細胞因子と結合する核酸配列を含み得る。このような種類の調節エレメントは通常、「細胞特異的」、「組織特異的」、または「細胞小器官特異的」様式で発現される遺伝子に付随している。
【００８４】
「エンハンサー」とは、転写開始部位に対するエンハンサーの距離または方向にかかわらず、転写効率を増大し得る調節エレメントの一種である。
【００８５】
「異種DNA」とは、所与の宿主細胞内に天然では存在しないDNA分子またはDNA分子の集団を指す。特定の宿主細胞に対して異種であるDNA分子は、宿主DNAが非宿主DNA(すなわち、外因性DNA)と結合している限り、宿主細胞種に由来するDNA(内因性DNA)を含む場合がある。例えば、転写プロモーターを含む宿主DNA部分に機能的に連結されたポリペプチドをコードする非宿主DNA部分を含むDNA分子は、異種DNA分子であると見なされる。逆に、異種DNA分子は、外因性プロモーターと機能的に連結された内因性遺伝子を含み得る。別の説明として、野生型細胞に由来する遺伝子を含むDNA分子は、そのDNA分子が野生型遺伝子を欠く変異細胞に導入される場合、異種DNAと見なされる。
【００８６】
「ポリペプチド」とは、天然で産生されようと合成で産生されようと、ペプチド結合で連結されたアミノ酸残基のポリマーである。約10アミノ酸残基未満のポリペプチドは一般に、「ペプチド」と称される。
【００８７】
「タンパク質」とは、1本または複数本のポリペプチド鎖を含む高分子である。タンパク質はまた、糖質基などの非ペプチド成分を含み得る。糖質およびその他の非ペプチド置換基は、タンパク質を産生する細胞によってタンパク質に付加され得、細胞の種類によって変化することになる。タンパク質は、本明細書ではそのアミノ酸骨格構造の観点から定義され；糖質基などの置換基は一般に規定しないが、それにもかかわらず存在する場合がある。
【００８８】
非宿主DNA分子によりコードされるペプチドまたはポリペプチドは、「異種」ペプチドまたはポリペプチドである。
【００８９】
「クローニングベクター」とは、宿主細胞内で自律的に複製する能力を有する、プラスミド、コスミド、またはバクテリオファージなどの核酸分子である。クローニングベクターは典型的に、ベクターの必須の生物学的機能を失うことのない確定した様式で核酸分子の挿入を可能とする1つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ならびにクローニングベクターで形質転換した細胞の同定および選択での使用に適したマーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む。マーカー遺伝子は典型的に、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を提供する遺伝子を含む。
【００９０】
「発現ベクター」とは、宿主細胞において発現される遺伝子をコードする核酸分子である。典型的に発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子、および転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は通常、プロモーターの制御下に置かれ、このような遺伝子はプロモーターに「機能的に連結された」と言われる。同様に、調節エレメントおよびコアプロモーターは、調節エレメントがコアプロモーターの活性を調節する場合、機能的に連結されている。
【００９１】
「組換え宿主」とは、クローニングベクターまたは発現ベクターなどの異種核酸分子を含む細胞である。本発明の状況において、組換え宿主の例は発現ベクターからzB7R1を産生する細胞である。対照的に、zB7R1は、zB7R1の「天然供給源」であり、発現ベクターを欠く細胞によって産生され得る。
【００９２】
「組込み形質転換体」とは、異種DNAが細胞のゲノムDNA中に組み込まれた組換え宿主細胞である。
【００９３】
「融合タンパク質」とは、少なくとも2つの遺伝子のヌクレオチド配列を含む核酸分子によって発現されるハイブリッドタンパク質である。例えば融合タンパク質は、親和性基質と結合するポリペプチドと融合したzB7R1ポリペプチドの少なくとも一部を含み得る。このような融合タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーにより大量のzB7R1を単離するための手段を提供する。
【００９４】
「受容体」という用語は、「カウンター受容体」と称する生物活性分子と結合する細胞結合型のタンパク質を示す。この相互作用は、細胞に対するカウンター受容体の効果を媒介する。受容体は、膜結合型受容体、細胞質受容体、または核内受容体であってよく；単量体(例えば、甲状腺刺激ホルモン受容体、βアドレナリン受容体)または多量体(例えば、PDGF受容体、成長ホルモン受容体、IL-3受容体、GM-CSF受容体、G-CSF受容体、エリスロポエチン受容体、およびIL-6受容体)であってよい。膜結合型受容体は、細胞外カウンター受容体結合ドメイン、および典型的にシグナル伝達に関与する細胞内エフェクタードメインを含む多ドメイン構造によって特徴づけられる。特定の膜結合型受容体では、細胞外カウンター受容体結合ドメインおよび細胞内エフェクタードメインは、完全な機能的受容体を含む別個のポリペプチド内に位置する。
【００９５】
一般に、カウンター受容体が受容体に結合することで受容体の高次構造が変化し、これによって細胞内でエフェクタードメインと他の分子の相互作用が起こり、次いで細胞の代謝変化が生じる。受容体-カウンター受容体相互作用と結びつけられることの多い代謝事象には、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、サイクリックAMP生成の上昇、細胞内カルシウムの動員、膜脂質の動員、細胞接着、イノシトール脂質の加水分解、およびリン脂質の加水分解が含まれる。
【００９６】
「可溶性受容体」とは、細胞膜に結合していない受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は最も一般的には、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、ならびに糖ホスホイノシトール(gpi)を介するような細胞膜へのその他の結合を欠いているカウンター受容体結合ポリペプチドである。可溶性受容体は、ポリペプチドの精製を提供するか、もしくは基材に対してポリペプチドを付着させるための部位を提供する親和性タグ、または免疫グロブリン定常領域配列などの追加のアミノ酸残基を含み得る。多くの細胞表面受容体は、タンパク質分解により生成されるかまたは選択スプライシングを受けたmRNAから翻訳される、天然の可溶性対応物を有する。可溶性受容体は単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、または多量体であってよく、多量体受容体は一般的に、10個以上のサブユニットを含まず、好ましくは7個以上のサブユニットを含まず、最も好ましくは、4個以上のサブユニットを含まない。受容体ポリペプチドは、このポリペプチドがそれぞれ膜繋留またはシグナル伝達を提供するための膜貫通および細胞内ポリペプチド部分の十分な部分を欠いている場合に、これらの部分を実質的に含まないと称される。例えば、zB7R1の代表的な可溶性受容体には、例として配列番号:3または7に示される可溶性受容体が含まれる。公知のB7ファミリーメンバーのどの配列が、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含まずに細胞外ドメインを含むかを明確に記載することは、十分に当業者のレベルの範囲内である。さらに、当業者は遺伝子コードを用いて、そのような可溶性受容体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを容易に決定することができる。
【００９７】
「分泌シグナル配列」という用語は、より大きなポリペプチドの成分として、それが合成される細胞の分泌経路を介してより大きなポリペプチドを方向づけるペプチド(「分泌ペプチド」)をコードするDNA配列を示す。より大きなポリペプチドは通常、分泌経路を介した移行過程において、切断されて分泌ペプチドが除去される。
【００９８】
「単離されたポリペプチド」とは、天然状態でポリペプチドと会合している糖質、脂質、またはその他のタンパク質性不純物などの混入細胞成分を本質的に含まないポリペプチドである。典型的に、単離されたポリペプチドの調製物は、高度に純粋な形態の、すなわち少なくとも約80%純粋、少なくとも約90%純粋、少なくとも約95%純粋、95%を超えて純粋(96%、97%、もしくは98%、またはそれ以上純粋など)、または99%を超えて純粋なポリペプチドを含む。特定のタンパク質調製物が単離されたポリペプチドを含むことを示すための1つの方法は、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)-ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルのクマシーブリリアントブルー染色後の、単一バンドの出現による。しかしながら「単離された」という用語は、二量体または他の様式でグリコシル化もしくは誘導体化された形態など、別の物理的形態での同じポリペプチドの存在を排除しない。
【００９９】
「アミノ末端」および「カルボキシル末端」という用語は、本明細書において、ポリペプチド内の位置を示すために用いられる。その状況が可能である場合、これらの用語は、近接性または相対位置を示すためにポリペプチドの特定の配列または部分に関して用いられる。例えば、ポリペプチド内の参照配列に対してカルボキシル末端側に位置する特定の配列は、参照配列のカルボキシル末端の近位に位置するが、必ずしも完全なポリペプチドのカルボキシル末端に位置するとは限らない。
【０１００】
「発現」という用語は、遺伝子産物の生合成を指す。例えば、構造遺伝子の場合、発現は、構造遺伝子のmRNAへの転写、およびmRNAから1つまたは複数のポリペプチドへの翻訳を含む。
【０１０１】
「スプライス変種」という用語は、本明細書において、遺伝子から転写される別の形態のRNAを示すために用いられる。スプライス変種は、転写後のRNA分子内の、またはあまり一般的ではないが転写後の別個のRNA分子間の、選択的スプライス部位の使用によって自然に起こり、同じ遺伝子から転写されたいくつかのmRNAを生じ得る。スプライス変種は、変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。スプライス変種という用語はまた、本明細書において、遺伝子から転写されたmRNAのスプライス変種によってコードされるポリペプチドを示すために用いられる。
【０１０２】
本明細書において用いる「免疫調節物質」という用語は、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、共刺激分子、造血因子など、およびこれらの分子の合成類似体を含む。
【０１０３】
「相補物/抗相補物対」という用語は、適切な条件下で非共有結合された安定な対を形成する非同一な成分を示す。例えば、ビオチンおよびアビジン(またはストレプトアビジン)は、相補物/抗相補物対の典型的なメンバーである。その他の例示的な相補物/抗相補物対には、受容体/カウンター受容体対、抗体/抗原(またはハプテンもしくはエピトープ)対、センス/アンチセンスポリヌクレオチド対などが含まれる。相補物/抗相補物対が後に解離されることを所望する場合には、相補物/抗相補物対は109 M-1未満の結合親和性を有することが好ましい。
【０１０４】
「抗イディオタイプ抗体」とは、免疫グロブリンの可変領域ドメインと結合する抗体である。本発明の状況において、抗イディオタイプ抗体は抗zB7R1抗体の可変領域と結合し、したがって抗イディオタイプ抗体はzB7R1のエピトープを模倣する。
【０１０５】
「抗体断片」とは、F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fabなどの、抗体の一部である。構造とは無関係に、抗体断片は、完全な抗体によって認識される同じ抗原と結合する。例えば抗zB7R1モノクローナル抗体断片は、zB7R1のエピトープと結合する。
【０１０６】
「抗体断片」という用語は、軽鎖の可変領域からなるポリペプチド、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Fv」断片、軽鎖および重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって連結された組換え一本鎖ポリペプチド分子(「scFvタンパク質」)、ならびに超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位などの、特定の抗原と結合する合成ポリペプチドまたは遺伝子改変ポリペプチドもまた含む。
【０１０７】
「キメラ抗体」とは、げっ歯類抗体に由来する可変ドメインおよび相補性決定領域を含み、抗体分子の残りの部分はヒト抗体に由来する組換えタンパク質である。
【０１０８】
「ヒト化抗体」とは、モノクローナル抗体のマウス相補性決定領域が、マウス免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変領域から、ヒト可変ドメインに移行された組換えタンパク質である。ヒトタンパク質に結合するまたはヒトタンパク質を中和するようなマウス抗体に由来する、ヒトにおいて治療的に使用するためのヒト化抗体の構築は、当業者の技術の範囲内である。
【０１０９】
本明細書において用いる「治療薬」とは、抗体部分と結合されて治療に有用な複合体を生じる分子または原子である。治療薬の例には、薬物、毒素、免疫調節物質、キレート剤、ホウ素化合物、光活性剤または色素、および放射性同位体などが含まれる
【０１１０】
「検出可能な標識」とは、抗体部分と結合されて診断に有用な分子を生じる分子または原子である。検出可能な標識の例には、キレート剤、光活性剤、放射性同位体、蛍光剤、常磁性イオン、またはその他のマーカー部分が含まれる。
【０１１１】
「親和性タグ」という用語は、本明細書において、第2ポリペプチドの精製もしくは検出を提供するか、または基材に対して第2ポリペプチドを付着させるための部位を提供する目的で、第2ポリペプチドに結合され得るポリペプチド部分を示すために用いられる。原理上は、抗体またはその他の特異的な結合剤が利用できる任意のペプチドまたはタンパク質を、親和性タグとして使用することができる。親和性タグには、ポリヒスチジン区域、プロテインA(Nilsson et al., EMBO J. 4:1075 (1985)；Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3 (1991))、グルタチオンSトランスフェラーゼ(Smith and Johnson, Gene 67:31 (1988))、Glu-Glu親和性タグ(Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952 (1985))、サブスタンスP、FLAGペプチド(Hopp et al., Biotechnology 6:1204 (1988))、ストレプトアビジン結合ペプチド、またはその他の抗原エピトープもしくは結合ドメインが含まれる。一般的には、Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95 (1991)を参照されたい。親和性タグをコードする核酸分子は、市販業者(例えば、Pharmacia Biotech、ニュージャージー州、ピスカタウェイ)から入手することができる。
【０１１２】
「裸の抗体」とは、抗体断片とは対照的に、治療薬と結合していない完全な抗体である。裸の抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびにキメラ抗体およびヒト化抗体などの特定の組換え抗体が含まれる。
【０１１３】
本明細書において用いる「抗体成分」という用語は、完全な抗体および抗体断片の両方を含む。
【０１１４】
「免疫複合体」とは、抗体成分と治療薬または検出可能な標識との複合体である。
【０１１５】
本明細書において用いる「抗体融合タンパク質」という用語は、抗体成分およびzB7R1ポリペプチド成分を含む組換え分子を指す。抗体融合タンパク質の例には、zB7R1細胞外ドメインおよびFcドメインまたは抗原結合領域のいずれかを含むタンパク質が含まれる。
【０１１６】
「標的ポリペプチド」または「標的ペプチド」とは、少なくとも1つのエピトープを含み、腫瘍細胞または感染性病原体抗原を保有する細胞などの標的細胞上で発現されるアミノ酸配列である。T細胞は、標的ポリペプチドまたは標的ペプチドに対する主要組織適合遺伝子複合体分子により提示されるペプチドエピトープを認識し、典型的に、標的細胞を溶解するか、または標的細胞の部位に他の免疫細胞を動員し、それにより標的細胞を死滅させる。
【０１１７】
「抗原ペプチド」とは、主要組織適合遺伝子複合体分子と結合して、T細胞によって認識されるMHC-ペプチド複合体を形成し、それによってT細胞への提示に基づいて細胞傷害性リンパ球応答を誘導するペプチドである。したがって抗原ペプチドは、適切な主要組織適合遺伝子複合体分子と結合すること、および細胞溶解、または抗原と結合するかもしくは抗原を発現する標的細胞に対する特定のサイトカインの放出などの細胞傷害性T細胞応答を誘導することができる。抗原ペプチドは、抗原提示細胞上でまたは標的細胞上で、クラスIまたはクラスII主要組織適合遺伝子複合体分子に関して結合され得る。
【０１１８】
真核生物では、RNAポリメラーゼIIが、構造遺伝子の転写を触媒してmRNAを産生させる。RNA転写産物が特定のmRNAの配列と相補的な配列を有するRNAポリメラーゼII鋳型を含むように、核酸分子を設計することができる。このようなRNA転写産物は「アンチセンスRNA」と称され、アンチセンスRNAをコードする核酸分子は「アンチセンス遺伝子」と称される。アンチセンスRNA分子は、mRNA分子と結合し、その結果mRNAの翻訳を抑制することができる。
【０１１９】
「zB7R1に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド」または「zB7R1アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、(a) zB7R1遺伝子の一部と安定な三本鎖を形成し得る、または(b) zB7R1遺伝子のmRNA転写産物の一部と安定な二本鎖を形成し得る配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【０１２０】
「リボザイム」とは、触媒中心を含む核酸分子である。この用語は、RNA酵素、自己スプライシングRNA、自己切断RNA、およびこれらの触媒機能を行う核酸分子を含む。リボザイムをコードする核酸分子は、「リボザイム遺伝子」と称される。
【０１２１】
「外部ガイド配列」とは、内因性リボザイムであるRNase Pを特定の細胞内mRNA種に導くことで、RNase PによるmRNAの切断をもたらす核酸分子である。外部ガイド配列をコードする核酸分子は、「外部ガイド配列遺伝子」と称される。
【０１２２】
「変種zB7R1遺伝子」という用語は、配列番号:2の修飾物であるアミノ酸配列(すなわち、配列番号:6)を有するポリペプチドをコードする核酸分子を指す。このような変種には、zB7R1遺伝子の天然の多型、および配列番号:2のアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換を含む合成遺伝子が含まれる。zB7R1遺伝子のさらなる変種形態は、本明細書に記載するヌクレオチド配列の挿入または欠失を含む核酸分子である。変種zB7R1遺伝子は、例えばその遺伝子が、配列番号:1のヌクレオチド配列を有する核酸分子またはその相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするかどうかを判定することによって、同定することができる。
【０１２３】
または、変種zB7R1遺伝子は配列比較によって同定することができる。2つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が、最大の一致を求めて整列させた際に同一である場合、2つのアミノ酸配列は「100%のアミノ酸配列同一性」を有する。同様に、2つのヌクレオチド配列のヌクレオチド残基が、最大の一致を求めて整列させた際に同一である場合、2つのヌクレオチド配列は「100%のヌクレオチド配列同一性」を有する。配列比較は、DNASTAR(ウィスコンシン州、マディソン)製のLASERGENEバイオインフォマティクス・コンピューティング・スイートに含まれるプログラムのような、標準的なソフトウェアプログラムを用いて行うことができる。最適なアライメントを決定することにより2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を比較するその他の方法は、当業者には周知である(例えば、Peruski and Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997)、Wu et al. (eds.), 「Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins」, Methods in Gene Biotechnology, pages 123-151 (CRC Press, Inc. 1997)、およびBishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2nd Edition (Academic Press, Inc. 1998)を参照されたい)。配列同一性を決定するための特定の方法については後述する。
【０１２４】
変種zB7R1遺伝子または変種zB7R1ポリペプチドを同定するために用いる特定の方法にかかわらず、変種遺伝子または変種遺伝子によってコードされるポリペプチドは、抗zB7R1抗体と特異的に結合する能力によって機能的に特徴づけられ得る。変種zB7R1遺伝子または変種zB7R1ポリペプチドはまた、本明細書に記載の生物学的または生化学的アッセイ法を用いて、1つまたは複数のそのカウンター受容体と結合する能力によって機能的に特徴づけられ得る。
【０１２５】
「対立遺伝子変種」という用語は、本明細書において、同じ染色体座を占める遺伝子の2つまたはそれ以上の別の形態のいずれかを示すために用いられる。対立遺伝子の変化は変異によって自然に生じ、集団内で表現型多型を生じ得る。遺伝子変異はサイレントである(コードされたポリペプチドに変化がない)場合もあれば、変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする場合もある。対立遺伝子変種という用語はまた、本明細書において、遺伝子の対立遺伝子変種によってコードされるタンパク質を示すために用いられる。
【０１２６】
「オーソログ」という用語は、異なる種に由来するポリペプチドまたはタンパク質の機能的対応物である、1つの種から得られるポリペプチドまたはタンパク質を示す。オーソログ間の配列の差は、種分化の結果である。
【０１２７】
「パラログ」とは、生物によって作製される、異なるが構造的に関連したタンパク質である。パラログは、遺伝子重複によって生じると考えられている。例えば、α-グロビン、β-グロビン、およびミオグロビンは相互にパラログである。
【０１２８】
本明細書において用いる「免疫応答」という用語は、T細胞および/またはB細胞応答、すなわち細胞性および/または体液性免疫応答の両方を含む。1つの態様においては、本明細書に開示する組成物および方法を用いて、ヘルパーT細胞(Th)応答、より好ましくはTh1細胞応答を減少させるまたは増強することができる。別の態様においては、本明細書に開示する組成物および方法を用いて、細胞傷害性T細胞(Tc)応答を減少させるまたは増強することができる。請求する方法を用いて、一次および二次免疫応答ならびにエフェクター機能(例えば、細胞溶解活性、サイトカインおよび抗体産生、ならびに抗原提示)を減少させるまたは増強することができる。対象の免疫応答は、例えば、抗体産生、免疫細胞増殖、サイトカインの放出、細胞表面マーカーの発現、細胞毒性などに関してアッセイすることにより、当技術分野において周知の方法を用いて当業者によって容易に決定され得る。
【０１２９】
「zB7R1シグナル伝達」、「zB7R1媒介性シグナル伝達」、「zB7R1媒介性の負のシグナル伝達」、およびこれらの変化形は、対応するリガンドによるzB7R1受容体の結合および/または活性化によって生じ、リンパ球活性の減弱および/または下方制御をもたらす、リンパ球における細胞内シグナル伝達を意味する。1つの局面において、zB7R1媒介性シグナル伝達は、SHP-1および/またはSHP-2の活性化を含む。
【０１３０】
本明細書において用いる「リンパ球活性」とは、B細胞およびT細胞の活性化、増殖、分化、および生存、ならびに細胞溶解活性(Tc)、サイトカイン産生(Th細胞)、抗体産生(B細胞)、および抗原提示(B細胞)を含むリンパ球細胞における関連のエフェクター免疫機能の免疫学的過程を指す。上記したように、このような過程の検出および/またはモニタリングに関しては、本明細書に提供する実施例に記載したアッセイ法を含むがこれらに限定されない、当業者に周知である数多くのアッセイ法が存在する。
【０１３１】
本明細書において用いる「zB7R1とそのカウンター受容体との相互作用」または「zB7R1とCD155との相互作用」という語句は、zB7R1受容体の刺激および関連する細胞内zB7R1シグナル伝達をもたらす、機能的なzB7R1カウンター受容体(すなわち、CD155)分子とリンパ球上の機能的なzB7R1受容体との直接的な物理的相互作用(例えば、結合)および/またはその他の間接的な相互作用を指す。同様に、「zB7R1とそのカウンター受容体との自然の相互作用」という語句は、zB7R1受容体の刺激および関連する細胞内zB7R1シグナル伝達をもたらす、CD155などの、機能的でありかつ内因的に発現されたカウンター受容体とリンパ球上の機能的でありかつ内因的に発現されたzB7R1受容体との直接的な物理的相互作用(例えば、結合)および/またはその他の間接的な相互作用を指す。
【０１３２】
本明細書において用いる「遮断薬」という用語は、zB7R1とそのカウンター受容体との相互作用を妨げる、ならびに/または例えばサイトカイン産生および/もしくは増殖によって測定される、カウンター受容体がリンパ球活性を抑制する能力を妨げる薬剤を含む。「遮断薬」という用語は、zB7R1が天然リガンドと結合する能力を抑制する、および/またはzB7R1がT細胞活性を抑制する能力を妨げる薬剤をさらに含む。例示的な薬剤には、機能遮断抗体、ならびにzB7R1とそのカウンター受容体との結合を遮断するが、リンパ球におけるzB7R1媒介性シグナルを促進することのできないペプチド(例えば、zB7R1融合タンパク質)、ペプチド模倣物、小分子などが含まれる。好ましい遮断薬には、zB7R1とSHP-1および/もしくはSHP-2との誘導性会合、またはSHP-1および/もしくはSHP-2とzB7R1との相互作用から生じるシグナル伝達を抑制し得る薬剤が含まれる。
【０１３３】
本明細書において用いる「模倣薬」という用語は、zB7R1とそのカウンター受容体との相互作用を模倣する、ならびに/またはzB7R1および/もしくはそのカウンター受容体がリンパ球活性を抑制する能力を増大させる、増強する、もしくは増加させる薬剤を含む。例示的な薬剤には、機能活性化抗体、ならびにzB7R1がそのカウンター受容体と結合する能力を増大させるもしくは増強する、またはzB7R1媒介性シグナル伝達の促進におけるカウンター受容体の役割を置換するペプチド(例えば、そのカウンター受容体の融合タンパク質)、ペプチド模倣物、小分子などが含まれる。
【０１３４】
本発明は、zB7R1遺伝子の機能的断片も含む。本明細書との関連において、zB7R1遺伝子の「機能的断片」とは、本明細書に記載するドメインであるか、または少なくとも抗zB7R1抗体と特異的に結合するzB7R1ポリペプチドの一部をコードする核酸分子を指す。
【０１３５】
標準的な解析法の不正確さのため、ポリマーの分子量および長さは概数値であると理解される。このような値が「約」Xまたは「およそ」Xと表記される場合、Xの記載値は±10%で正確であると理解される。
【０１３６】
3. zB7R1ポリヌクレオチドまたは遺伝子の作製
ヒトzB7R1遺伝子をコードする核酸分子は、配列番号:1または5に基づいたポリヌクレオチドプローブを使用して、ヒトcDNAライブラリーまたはヒトゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。これらの技法は標準的であって十分に確立されており、市販業者より入手可能なクローニングキットを用いて達成することができる。例えば、Ausubel et al., (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons 1995；Wu et al., Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc. 1997；Aviv and Leder, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:1408 (1972)；Huynh et al., 「Constructing and Screening cDNA Libraries in λgt10 and λgt11」, DNA Cloning: A Practical Approach Vol. I, Glover (ed.), page 49 (IRL Press, 1985)；Wu (1997), pages 47-52を参照されたい。
【０１３７】
ヒトzB7R1遺伝子をコードする核酸分子はまた、zB7R1遺伝子またはcDNAのヌクレオチド配列に基づいたヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により得ることができる。PCRを用いてライブラリーをスクリーニングする一般的な方法は、例えば、Yu et al., 「Use of The Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries」, Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Application, White (ed.), Humana Press, Inc., 1993によって提供されている。さらに、PCRを用いて関連遺伝子を単離する技法は、例えば、Preston, 「Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members」, Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), Humana Press, Inc. 1993によって記載されている。別法として、相互にプライミングする長いオリゴヌクレオチドおよび本明細書に記載のヌクレオチド配列を用いて、核酸分子を合成することにより、zB7R1遺伝子を得ることもできる(例えば、Ausubel (1995)を参照されたい)。ポリメラーゼ連鎖反応を用いる確立された技法により、少なくとも2 kb長のDNA分子を合成する能力が提供される(Adang et al., Plant Molec. Biol. 21:1131 (1993)、Bambot et al., PCR Methods and Applications 2:266 (1993)、Dillon et al., 「Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes」, Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), pages 263-268, (Humana Press. Inc. 1993)、およびHolowachuk et al., PCR Methods Appl. 4:299 (1995))。ポリヌクレオチド合成の総説に関しては、例えば、Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1994)、Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53:323 (1984)、およびClimie et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:633 (1990)を参照されたい。
【０１３８】
4. zB7R1およびCD155のポリヌクレオチドおよび遺伝子変種の作製
本発明は、本明細書に開示するzB7R1ポリペプチドをコードする、DNAおよびRNA分子を含む種々の核酸分子を提供する。当業者は、遺伝暗号の縮重の観点から、これらのポリヌクレオチド分子間で相当数の配列変化が可能であることを容易に認識すると考えられる。さらに本発明は、配列番号:2または5の受容体ポリペプチドと実質的に相同である少なくとも1つのzB7R1受容体サブユニットを含む単離された可溶性単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、および多量体受容体ポリペプチドもまた提供する。したがって本発明は、配列番号:1の縮重ヌクレオチドを含むzB7R1ポリペプチドコード核酸分子およびそれらのRNA同等物も意図する。
【０１３９】
表1は、縮重ヌクレオチド位置を示すための1文字コードを示す。「解」とは、コード文字により示されるヌクレオチドである。「相補体」は、相補的ヌクレオチドのコードを示す。例えば、コードYはCまたはTを示し、その相補体RはAまたはGを示し、AはTと相補的であり、GはCと相補的である。
【０１４０】
（表１）
2008544746.tif 000002
【０１４１】
所与のアミノ酸について可能なすべてのコドンを包含する縮重コドンを表2に記載する。
【０１４２】
（表２）
2008544746.tif 000003
【０１４３】
当業者は、アミノ酸をコードするすべての可能なコドンを代表する縮重コドンの決定において、多少のあいまいさが導入されることを理解すると考えられる。例えば、セリンの縮重コドン(WSN)は、場合によってはアルギニン(AGR)をコードし、またアルギニンの縮重コドン(MGN)は、場合によってはセリン(AGY)をコードし得る。フェニルアラニンおよびロイシンをコードするコドン間にも、同様の関係が存在する。このように、縮重配列により包含されるいくつかのポリヌクレオチドは変種アミノ酸配列をコードする可能性があるが、当業者は、配列番号:2のアミノ酸配列を参照することにより、そのような変種配列を容易に同定することができる。変種配列は、本明細書に記載する通りに機能性に関して容易に試験することができる。
【０１４４】
様々な種が「優先的コドン使用」を示し得る。一般的には、Grantham et al., Nucl Acids Res. 8:1893 (1980)、Haas et al. Curr. Biol. 6:315 (1996)、Wain-Hobson et al., Gene 13:355 (1981)、Grosjean and Fiers, Gene 18:199 (1982)、Holm, Nuc. Acids Res. 14:3075 (1986)、Ikemura, J. Mol. Biol. 158:573 (1982)、Sharp and Matassi, Curr. Opin. Genet. Dev. 4:851 (1994)、Kane, Curr. Opin. Biotechnol. 6:494 (1995)、およびMakrides, Microbiol. Rev. 60:512 (1996)を参照されたい。本明細書で用いる「優先的コドン使用」または「優先的コドン」という用語は、ある種の細胞で最も高い頻度で使用され、そのため各アミノ酸をコードする可能なコドン(表2を参照されたい)の中でも1個または少数のコドンが優先されるタンパク質翻訳コドンを指す専門用語である。例えば、アミノ酸スレオニン(Thr)はACA、ACC、ACG、またはACTによってコードされ得るが、哺乳動物細胞では、ACCが最も一般的に用いられるコドンであり；その他の種、例えば昆虫細胞、酵母、ウイルス、または細菌では、異なるThrコドンが優先的であり得る。当技術分野で公知の様々な方法により、特定の種における優先的なコドンを、本発明のポリヌクレオチドに導入することができる。例えば、優先的コドン配列を組換えDNAに導入することによって、特定の細胞種または種において、タンパク質の翻訳をより効率的にすることでタンパク質の産生を高めることができる。したがって、本明細書に開示する縮重コドン配列は、当技術分野で一般的に用いられる、および本明細書において開示する様々な細胞種または種におけるポリヌクレオチドの発現を最適化するための鋳型として役立つ。優先的コドンを含む配列を、様々な種において発現に関して試験し、最適化することができ、また本明細書に開示するように機能性に関して試験することができる。
【０１４５】
完全なもしくは部分的なヒトcDNAで、または開示した配列に基づく1組もしくは複数組の縮重プローブでプロービングするなどの種々の方法により、zB7R1をコードするcDNAを単離することができる。また、本明細書に開示する代表的なヒトzB7R1配列から設計したプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によりcDNAをクローニングすることもできる。加えて、cDNAライブラリーを用いて宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションすることができ、関心対象のcDNAの発現をzB7R1ポリペプチドに対する抗体で検出することができる。
【０１４６】
当業者は、配列番号:1に開示する配列がヒトzB7R1の1つの対立遺伝子を表すこと、ならびに対立遺伝子の変化および選択的スプライシングが起こると予想されること(すなわち、配列番号:5)を理解すると考えられる。この配列の対立遺伝子変種は、異なる個体に由来するcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーを標準的な手順に従ってプロービングすることにより、クローニングすることができる。サイレント変異を含む変種、および変異がアミノ酸配列の変化を生じる変種を含む、本明細書に開示するヌクレオチド配列の対立遺伝子変種は本発明の範囲に含まれ、また本明細書に開示するアミノ酸配列の対立遺伝子変種であるタンパク質についても同様である。zB7R1ポリペプチドの特徴を保持する、選択的スプライシングを受けたmRNAから生成されたcDNA分子も本発明の範囲に含まれ、またこのようなcDNAおよびmRNAによってコードされるポリペプチドについても同様である。これらの配列の対立遺伝子変種およびスプライス変種は、当技術分野で公知の標準的な手順に従って、様々な個体または組織に由来するcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーをプロービングすることによって、クローニングすることができる。
【０１４７】
上記の方法を用いて、当業者は、配列番号:2もしくは5と実質的に相同であるか、または配列番号:3、4、もしくは6、またはそれらの対立遺伝子変種のアミノ酸をコードし、かつ野生型zB7R1受容体のカウンター受容体結合特性を保持する可溶性zB7R1受容体を含む種々のポリペプチドを調製することができる。このようなポリペプチドはまた、本明細書において一般的に開示するような付加的なポリペプチド部分を含んでもよい。
【０１４８】
本発明の特定の態様において、単離された核酸分子は、本明細書に開示するヌクレオチド配列を含む核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る。例えば、このような核酸分子は、配列番号:1のヌクレオチド配列を含む核酸分子、もしくは配列番号:1と相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらの断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る。
【０１４９】
一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびpHにおいて、特定の配列の熱融点(Tm)より約5℃低く選択される。Tmとは、標的配列の50%が、完全に一致するプローブとハイブリダイズする(規定のイオン強度およびpHにおける)温度である。ハイブリダイゼーション後に核酸分子を洗浄して、ハイブリダイズしていない核酸分子をストリンジェントな条件下、または高度にストリンジェントな条件下で除去することができる。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Press 1989)；Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987)；Berger and Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987)；およびWetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227 (1990)を参照されたい。OLIGO 6.0(LSR；ミネソタ州、ロングレイク)およびPrimer Premier 4.0(Premier Biosoft International；カリフォルニア州、パロアルト)などの配列解析ソフトウェア、ならびにインターネット上のサイトは、ユーザー定義の基準に基づいた所与の配列の解析およびTmの計算に利用できるツールである。特定のポリヌクレオチドハイブリッドと共に用いるためのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を適合化することは、十分に当業者の能力の範囲内にある。
【０１５０】
本発明はまた、配列番号:2、3、6、もしくは7のポリペプチドまたはそれらのオーソログと実質的に類似した配列同一性を有する、単離されたzB7R1ポリペプチドを提供する。「実質的に類似した配列同一性」という用語は、本明細書において、配列番号:3に示される配列またはそれらのオーソログと少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%(96%、97%、98%など)の、または95%を超える配列同一性を有するポリペプチドを示すために用いられる。例えば、変種およびオーソログzB7R1受容体を用いて免疫応答を生じさせること、およびヒトzB7R1に対する交差反応性抗体を産生させることができる。このような抗体は、ヒト化すること、および本明細書に記載する通りに改変すること、ならびに乾癬、乾癬性関節炎、IBD、大腸炎、内毒素血症を治療するために、および本明細書に記載するその他の治療用途において治療的に用いることができる。
【０１５１】
本発明はまた、以下の2つの基準を用いて同定され得るzB7R1変種核酸分子も意図する：コードされるポリペプチドと配列番号:2のアミノ酸配列との間の類似性の決定、およびハイブリダイゼーションアッセイ法。そのようなzB7R1変種には、(1) 洗浄のストリンジェンシーが55℃〜65℃での0.1% SDSを含む0.5x〜2x SSCと同等であるストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号:1のヌクレオチド配列を有する核酸分子(またはその相補体)とハイブリダイズした状態を維持する、および(2) 配列番号:3のアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%の、または95%を超える(96%、97%、98%、または99%など)配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子が含まれる。または、zB7R1変種は、(1) 洗浄のストリンジェンシーが50℃〜65℃での0.1% SDSを含む0.1x〜0.2x SSCと同等である高度にストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号:1のヌクレオチド配列を有する核酸分子(またはその相補体)とハイブリダイズした状態を維持する、および(2) 配列番号:2のアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%の、または95%を超える(96%、97%、98%、もしくは99%、またはそれ以上など)配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子として特徴づけられ得る。
【０１５２】
パーセント配列同一性は従来の方法で決定される。例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603 (1986)、およびHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)を参照されたい。簡潔に説明すると、ギャップオープンペナルティ 10、ギャップ伸長ペナルティ 1、および表3(アミノ酸は標準的な1文字コードで表示)に示すHenikoff and Henikoff(前記)の「BLOSUM62」スコア行列を用いて、2つのアミノ酸配列をアライメントスコアが最適となるように整列させる。次いで、パーセント同一性を以下のように算出する：(［完全な一致の総数］/［長い方の配列の長さ＋2つの配列を整列させる目的で長い方の配列に導入されたギャップの数］)(100)。
【０１５３】
（表３）
2008544746.tif 000004
【０１５４】
当業者であれば、2つのアミノ酸配列を整列させるために利用できる多くの確立されたアルゴリズムが存在することを理解する。PearsonおよびLipmanの「FASTA」類似性探索アルゴリズムは、本明細書に開示するアミノ酸配列と推定zB7R1変種のアミノ酸配列によって共有される同一性レベルを調べるのに適したタンパク質アライメント法である。FASTAアルゴリズムについては、Pearson and Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)、およびPearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)によって記載されている。簡潔に説明すると、FASTAでは最初に、問い合わせ配列(例えば、配列番号:2または配列番号:3)と試験配列によって共有される、最も高い同一性密度(ktup変数が1の場合)または同一性対(ktup＝2の場合)を有する領域を、保存的アミノ酸の置換、挿入、または欠失を考慮することなく同定することにより、配列類似性を特徴づける。次いで、同一性密度の最も高い10の領域を、アミノ酸置換行列を用いて対のアミノ酸すべての類似性を比較することにより再スコア化し、最高のスコアに寄与する残基のみを含めるように領域の末端を「切り詰める」。「カットオフ」値(配列の長さおよびktup値に基づき、所定の式により算出される)よりも大きいスコアを有する領域がいくつか存在する場合には、切り詰めた当初の領域を調べて、その領域を結合してギャップを含む近似のアラインメントを形成できるかどうかを決定する。最後に、2つのアミノ酸配列の最もスコアの高い領域を、アミノ酸の挿入および欠失を認める改良Needleman-Wunsch-Sellersアルゴリズム(Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970)；Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974))を用いて整列させる。FASTA解析の例示的なパラメータは、ktup＝1、ギャップオープンペナルティ＝10、ギャップ伸長ペナルティ＝1、および置換行列＝BLOSUM62である。これらのパラメータは、Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)のAppendix 2に説明されているようにスコア行列ファイル(「SMATRIX」)を改良することによって、FASTAプログラムに導入することができる。
【０１５５】
FASTAを使用して、上記の比を用いて核酸分子の配列同一性を決定することもできる。ヌクレオチド配列を比較する場合には、他のパラメータセットを上記の通りに設定し、ktup値を1〜6、好ましくは3〜6、最も好ましくは3とすることができる。
【０１５６】
本発明は、本明細書に開示するアミノ酸配列と比較して、保存的アミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む。例えば、zB7R1アミノ酸配列中のアルキルアミノ酸がアルキルアミノ酸に置換されている、zB7R1アミノ酸配列中の芳香族アミノ酸が芳香族アミノ酸に置換されている、zB7R1アミノ酸配列中の硫黄含有アミノ酸が硫黄含有アミノ酸に置換されている、zB7R1アミノ酸配列中の水酸基含有アミノ酸が水酸基含有アミノ酸に置換されている、zB7R1アミノ酸配列中の酸性アミノ酸が酸性アミノ酸に置換されている、zB7R1アミノ酸配列中の塩基性アミノ酸が塩基性アミノ酸に置換されている、またはzB7R1アミノ酸配列中の二塩基性一カルボキシル基アミノ酸が二塩基性一カルボキシル基アミノ酸に置換されている、配列番号:2の1つまたは複数のアミノ酸置換を含む変種を得ることができる。一般的なアミノ酸の中で、例えば「保存的アミノ酸置換」は、以下の群のそれぞれにおけるアミノ酸間の置換によって説明される：(1) グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、(2) フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、(3)セリンおよびスレオニン、(4) アスパラギン酸およびグルタミン酸、(5) グルタミンおよびアスパラギン、ならびに(6) リジン、アルギニン、およびヒスチジン。BLOSUM62表は、500を超える関連タンパク質群の高度に保存された領域を表す、タンパク質配列部分の約2,000の局所的多重アライメントに由来するアミノ酸置換行列である(Henikoff and Henikoff、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:10915 (1992))。したがって、BLOSUM62置換頻度を用いて、本発明のアミノ酸配列に導入され得る保存的アミノ酸置換を規定することができる。(上記のように)化学的特性のみに基づいてアミノ酸置換を設計することも可能であるが、「保存的アミノ酸置換」という用語は好ましくは、-1を上回るBLOSUM62値で示される置換を指す。例えば、アミノ酸置換は、置換が0、1、2、または3というBLOSUM62値により特徴づけられる場合に保存的である。この系によれば、好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも1(例えば、1、2、または3)というBLOSUM62値により特徴づけられるが、より好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも2(例えば、2または3)というBLOSUM62値により特徴づけられる。zB7R1の特定の変種は、アミノ酸配列の変化が1つまたは複数の保存的アミノ酸置換に起因して、アミノ酸配列(例えば、配列番号:2、3、6、または7)と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%の、または95%を超える(96%、97%、98%、もしくは99%、またはそれ以上など)配列同一性を有することにより特徴づけられる。
【０１５７】
zB7R1遺伝子の保存的アミノ酸変化は、例えば、配列番号:1または5に記載のヌクレオチドの代わりにヌクレオチドを置換することにより導入することができる。そのような「保存的アミノ酸」変種は、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、リンカースキャニング突然変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応を用いる突然変異誘発などにより得ることができる(Ausubel (1995)；およびMcPherson (ed.), Directed Mutagenesis: A Practical Approach (IRL Press 1991)を参照されたい)。変種zB7R1ポリペプチドは、抗zB7R1抗体と特異的に結合する能力により同定することができる。
【０１５８】
本発明のタンパク質はまた、天然に存在しないアミノ酸残基も含み得る。天然に存在しないアミノ酸には、非限定的に、トランス-3-メチルプロリン、2,4-メタノプロリン、シス-4-ヒドロキシプロリン、トランス-4-ヒドロキシプロリン、N-メチルグリシン、アロ-スレオニン、メチルスレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、3-および4-メチルプロリン、3,3-ジメチルプロリン、tert-ロイシン、ノルバリン、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン、および4-フルオロフェニルアラニンが含まれる。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質に導入するいくつかの方法が、当技術分野において公知である。例えば、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAを用いてナンセンス変異を抑制するインビトロ系を用いることができる。アミノ酸を合成する方法およびtRNAをアミノアシル化する方法は、当技術分野において公知である。ナンセンス変異を含むプラスミドの転写および翻訳は典型的に、大腸菌(E. coli) S30抽出物、ならびに市販の酵素およびその他の試薬を含む無細胞系で行われる。タンパク質はクロマトグラフィーによって精製する。例えば、Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722 (1991)、Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301 (1991)、Chung et al., Science 259:806 (1993)、およびChung et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:10145 (1993)を参照されたい。
【０１５９】
第2の方法では、変異mRNAおよび化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAをマイクロインジェクションすることにより、アフリカツメガエル卵母細胞において翻訳を行う(Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991 (1996))。第3の方法では、置換しようとする天然アミノ酸(例えば、フェニルアラニン)の非存在下、かつ天然に存在しない所望のアミノ酸(例えば、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン、または4-フルオロフェニルアラニン)の存在下で、大腸菌細胞を培養する。天然に存在しないアミノ酸は、その天然対応物の代わりにタンパク質中に取り込まれる。Koide et al., Biochem. 33:7470 (1994)を参照されたい。天然に存在するアミノ酸残基は、インビトロ化学修飾により天然に存在しない種に変換することができる。化学修飾を部位特異的突然変異誘発と併用して、置換の範囲をさらに拡張することができる(Wynn and Richards, Protein Sci. 2:395 (1993))。
【０１６０】
限られた数の非保存的アミノ酸、遺伝暗号によりコードされないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、および非天然アミノ酸を、zB7R1のアミノ酸残基と置換することができる。
【０１６１】
本発明のポリペプチド中の必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャン突然変異誘発などの、当技術分野において公知の手順に従って同定することができる(Cunningham and Wells, Science 244:1081 (1989)、Bass et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:4498 (1991)、Coombs and Corey, 「Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering」, Proteins: Analysis and Design, Angeletti (ed.), pages 259-311 (Academic Press, Inc. 1998))。後者の技法においては、分子内のあらゆる残基に単一のアラニン変異を導入し、得られた変異分子を生物活性について試験して、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定する。同様に、Hilton et al., J. Biol. Chem. 271:4699 (1996)も参照されたい。
【０１６２】
配列解析を用いてzB7R1カウンター受容体結合領域をさらに規定することができるが、zB7R1結合活性(1つもしくは複数のカウンター受容体、または抗zB7R1抗体に対するzB7R1の結合など)において役割を果たすアミノ酸はまた、推定接触部位アミノ酸の変異と併用して、核磁気共鳴、結晶解析、電子線回折、または光親和性標識のような技法で決定される構造の物理的解析によって決定することができる。例えば、de Vos et al., Science 255:306 (1992)、Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899 (1992)、およびWlodaver et al., FEBS Lett. 309:59 (1992)を参照されたい。
【０１６３】
Reidhaar-Olson and Sauer(Science 241:53 (1988))またはBowie and Sauer(Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:2152 (1989))によって開示されているような、突然変異誘発およびスクリーニングの公知の方法を用いて、複数のアミノ酸置換を作製して試験することができる。簡潔に説明すると、これらの著者らは、ポリペプチド中の2か所またはそれ以上の位置を同時にランダム化し、機能的ポリペプチドを選択し、次いで変異誘発ポリペプチドの配列を決定して、各位置における許容可能な置換の範囲を決定する方法について開示している。用いることができるその他の方法には、ファージディスプレイ(例えば、Lowman et al., Biochem. 30:10832 (1991)、Ladner et al.、米国特許第5,223,409号、Huse, WO 92/06204)、および領域特異的突然変異誘発(Derbyshire et al., Gene 46:145 (1986)、およびNer et al., DNA 7:127, (1988))が含まれる。さらに、ビオチンまたはFITCで標識したzB7R1を、zB7R1カウンター受容体の発現クローニングのために用いることができる。
【０１６４】
開示するzB7R1のヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の変種は、Stemmer, Nature 370:389 (1994)、Stemmer, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91:10747 (1994)、およびWO 97/20078により開示されているDNAシャフリングによって作製することもできる。簡潔に説明すると、親DNAのランダムな断片化およびこれに続くPCRを用いた再構築による、ランダムに導入された点変異を生じるインビトロ相同組換えによって、変種DNA分子が作製される。この技法は、対立遺伝子変種または異なる種に由来するDNA分子などの親DNA分子のファミリーを用いて改良することで、この過程にさらなる多様性を導入することができる。所望の活性の選択またはスクリーニングの後に、突然変異誘発およびアッセイ法をさらに繰り返すことにより、所望の変異を選択しつつ同時に有害な変化に対して選択することによる配列の速やかな「進化」が提供される。
【０１６５】
本明細書に開示する突然変異誘発法をハイスループット自動スクリーニング法と併用して、宿主細胞内のクローニングされた変異誘発ポリペプチドの活性を検出することができる。生物活性のあるポリペプチド、または抗zB7R1抗体と結合するポリペプチドをコードする変異誘発DNA分子を宿主細胞から回収し、最新装置を用いて迅速に配列決定することができる。これらの方法により、関心対象のポリペプチド内の個々のアミノ酸残基の重要性を迅速に決定することができ、またこれらの方法は未知の構造のポリペプチドにも適用することができる。
【０１６６】
本発明はまた、zB7R1ポリペプチドの「機能的断片」、およびそのような機能的断片をコードする核酸分子を含む。核酸分子の常用的な欠失解析を行い、zB7R1ポリペプチドをコードする核酸分子の機能的断片を得ることができる。例として、配列番号:1または5のヌクレオチド配列を有するDNA分子をBal31ヌクレアーゼで消化して、一連の入れ子状態の欠失体を得ることができる。次いで、これらの断片を適切な読み枠で発現ベクターに挿入し、発現されたポリペプチドを単離して、抗zB7R1抗体と結合する能力に関して試験する。エキソヌクレアーゼ消化に代わる別の方法では、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を用いて、所望の断片の産生を特定化するために欠失または終止コドンを導入する。または、ポリメラーゼ連鎖反応により、zB7R1遺伝子の特定の断片を合成することができる。
【０１６７】
この一般的アプローチは、Horisberger and Di Marco, Pharmac. Ther. 66:507 (1995)によって要約されている、インターフェロンの片側または両側の末端における切断に関する研究によって例証される。さらに、タンパク質の機能解析の標準的な技法は、例えば、Treuter et al., Molec. Gen. Genet. 240:113 (1993)、Content et al., 「Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon」, Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.), pages 65-72 (Nijhoff, 1987)、Herschman, 「The EGF Receptor」, Control of Animal Cell Proliferation, Vol. 1, Boynton et al., (eds.) pages 169-199 (Academic Press 1985)、Coumailleau et al., J. Biol. Chem. 270:29270 (1995)；Fukunaga et al., J. Biol. Chem. 270:25291 (1995)；Yamaguchi et al., Biochem. Pharmacol. 50:1295 (1995)、およびMeisel et al., Plant Molec. Biol. 30:1 (1996)により記載されている。
【０１６８】
本発明はまた、本明細書に開示するアミノ酸配列と比較してアミノ酸変化を有する、zB7R1遺伝子の機能的断片を意図する。変種zB7R1遺伝子は、上記のように、開示のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列との同一性レベルを決定することにより、構造に基づいて同定することができる。構造に基づいて変種遺伝子を同定する別のアプローチでは、潜在的変種zB7R1遺伝子をコードする核酸分子が、配列番号:1または5などのヌクレオチド配列を含む核酸分子とハイブリダイズし得るかどうかを決定する。
【０１６９】
本発明はまた、zB7R1ポリペプチドの機能的断片、抗原エピトープ、zB7R1ポリペプチドのエピトープ含有部分、およびzB7R1ポリペプチドのそのような機能的断片、抗原エピトープ、エピトープ含有部分をコードする核酸分子の使用を含む。そのような断片は、B7受容体の活性を作動させる、結合する、遮断する、抑制する、増加させる、減少させる、拮抗する、または中和する抗体および結合パートナーの作製において使用するためのポリペプチドを作製するために用いられる。本明細書において定義する「機能的な」zB7R1ポリペプチドまたはその断片は、CD155などのzB7R1カウンター受容体と結合する、またはzB7R1媒介性シグナル伝達、または炎症、増殖、もしくは分化活性を遮断する、抑制する、減少させる、拮抗する、または中和する能力；または特殊な細胞機能を誘導もしくは抑制する能力；または抗zB7R1抗体、細胞、もしくはB7カウンター受容体と特異的に結合する能力を特徴とする。本明細書において先に記載したように、zB7R1は、本明細書に記載するその受容体構造およびドメインによって、B7ファミリーメンバーと見なされる。したがって本発明は、以下を含む融合タンパク質の使用をさらに意図する：(a) 上記のドメインの1つまたは複数を含むポリペプチド分子；および(b) これらのドメインの1つまたは複数を含む機能的断片。融合タンパク質の他のポリペプチド部分は、CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1、HHLA2、もしくはBTLAなどの別のB7ファミリー受容体により、または融合タンパク質の分泌を促進する非天然および/もしくは非関連の分泌シグナルペプチドによって付与され得る。
【０１７０】
本発明はまた、本明細書に記載のzB7R1ポリペプチドのエピトープ含有部分を含むポリペプチド断片またはペプチドを提供する。このような断片またはペプチドは、タンパク質全体を免疫原として使用した場合に抗体応答を誘発するタンパク質の部分である「免疫原性エピトープ」を含み得る。免疫原性エピトープ含有ペプチドは、標準的な方法を用いて同定することができる(例えば、Geysen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81：3998 (1983)を参照されたい)。
【０１７１】
対照的に、ポリペプチド断片またはペプチドは、抗体が特異的に結合し得るタンパク質分子の領域である「抗原エピトープ」を含み得る。ある種のエピトープはアミノ酸の直線状のまたは連続したひと配列からなり、そのようなエピトープの抗原性は変性剤によって破壊されない。タンパク質のエピトープを模倣し得る比較的短い合成ペプチドを用いて、タンパク質に対する抗体の産生を促進できることは、当技術分野において公知である(例えば、Sutcliffe et al., Science 219:660 (1983)を参照されたい)。したがって、本発明の抗原エピトープ含有ペプチド、抗原ペプチド、エピトープ、およびポリペプチドは、本明細書に記載するポリペプチドと結合する抗体を産生させるのに、ならびに中和性である、およびそのカウンター受容体の活性を作動させ得る、結合し得る、遮断し得る、抑制し得る、減少させ得る、拮抗し得る、または中和し得る抗zB7R1モノクローナル抗体を同定およびスクリーニングするのに有用である。本発明のそのような中和モノクローナル抗体は、zB7R1抗原エピトープに結合し得る。Hopp/Woods親水性プロファイルを用いて、配列番号:3において最も抗原性が高い可能性がある領域を決定することができる(Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78:3824-3828, 1981；Hopp, J. Immun. Meth. 88:1-18, 1986、およびTriquier et al., Protein Engineering 11:153-169, 1998）。このプロファイルは、スライドする6残基領域に基づく。埋もれたG、S、およびT残基、ならびに露出しているH、Y、およびW残基は無視される。zB7R1において、これらの領域は当業者によって決定することができる。さらに、例えばDNASTAR Proteanプログラム(DNASTAR, Inc.、ウィスコンシン州、マディソン)を用いてJameson-Wolfプロットにより予測される、配列番号:2におけるzB7R1抗原エピトープは、好ましい抗原エピトープとして役立ち、当業者によって決定することができる。このような抗原エピトープには、(1) 配列番号:2のアミノ酸残基80〜86；(2) 配列番号:2のアミノ酸残基163〜170；(3) 配列番号:2のアミノ酸残基163〜190；(4) 配列番号:2のアミノ酸残基175〜190；および(5) 配列番号:2のアミノ酸残基211〜221が含まれる。好ましい態様において、本発明の中和抗体が結合する抗原エピトープは、カウンター受容体-受容体結合に重要である配列番号:2の残基(および配列番号:3の対応する残基)を含むと考えられる。
【０１７２】
抗原エピトープ含有ペプチドおよびポリペプチドは、本明細書に開示するアミノ酸配列の少なくとも4〜10アミノ酸、少なくとも10〜15アミノ酸、または約15〜約30アミノ酸を含み得る。このようなエピトープ含有ペプチドおよびポリペプチドは、本明細書に記載するように、zB7R1ポリペプチドの断片化により、または化学的なペプチド合成により生成することができる。さらに、エピトープは、ランダムペプチドライブラリーのファージディスプレイによって選択することができる(例えば、Lane and Stephen, Curr. Opin. Immunol. 5:268 (1993)、およびCortese et al., Curr. Opin. Biotechnol. 7:616 (1996)を参照されたい)。エピトープを同定し、エピトープを含む短いペプチドから抗体を作製する標準的な方法は、例えば、Mole, 「Epitope Mapping」, Methods in Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), pages 105-116 (The Humana Press, Inc. 1992）、Price, 「Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies」, Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995)、およびColigan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, pages 9.3.1-9.3.5 and pages 9.4.1-9.4.11 (John Wiley & Sons 1997）によって記載されている。
【０１７３】
変種および融合タンパク質を含む任意のzB7R1ポリペプチドに関して、当業者は、上記の表1および表2に記載の情報を用いて、そのような変種をコードする完全な縮重ポリヌクレオチド配列を容易に作製することができる。さらに当業者は、標準的なソフトウェアを用いて、本明細書に記載のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に基づいてzB7R1変種を考案することができる。
【０１７４】
5. zB7R1およびCD155ポリペプチドの産生
完全長ポリペプチド；可溶性の単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、および多量体受容体；完全長受容体；受容体断片(例えば、カウンター受容体結合断片および抗原エピトープ)、機能的断片、および融合タンパク質を含む本発明のポリペプチドは、従来の技法に従って組換え宿主細胞において産生することができる。zB7R1またはCD155遺伝子を発現させるには、ポリペプチドをコードする核酸分子を、発現ベクターにおいて転写発現を制御する調節配列に機能的に連結し、次いでこれを宿主細胞に導入しなければならない。発現ベクターは、プロモーターおよびエンハンサーなどの転写調節配列に加えて、翻訳調節配列、および発現ベクターを有する細胞の選択に適したマーカー遺伝子を含み得る。
【０１７５】
真核細胞における外来タンパク質の産生に適した発現ベクターは典型的に、(1) 細菌宿主における発現ベクターの増殖および選択を提供するための細菌の複製開始点および抗生物質耐性マーカーをコードする原核生物のDNAエレメント；(2) プロモーターなどの、転写の開始を制御する真核生物のDNAエレメント；および（3）転写終結配列/ポリアデニル化配列などの、転写産物のプロセシングを制御するDNAエレメントを含む。上述したように、発現ベクターはまた、異種ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に導く分泌配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。例えば、zB7R1発現ベクターは、zB7R1遺伝子、および任意の分泌遺伝子に由来する分泌配列を含み得る。
【０１７６】
本発明のzB7R1またはCD155タンパク質は、哺乳動物細胞において発現され得る。適切な哺乳動物宿主細胞の例には、アフリカミドリザル腎細胞(Vero；ATCC CRL 1587)、ヒト胚腎細胞(293-HEK；ATCC CRL 1573)、ベビーハムスター腎細胞(BHK-21、BHK-570；ATCC CRL 8544、ATCC CRL 10314)、イヌ腎細胞(MDCK；ATCC CCL 34)、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO-K1；ATCC CCL61；CHO DG44 (Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986))、ラット下垂体細胞(GH1；ATCC CCL82)、HeLa S3細胞(ATCC CCL2.2)、ラット肝細胞癌細胞(H-4-II-E；ATCC CRL 1548)、SV40形質転換サル腎細胞(COS-1；ATCC CRL 1650)、およびマウス胚細胞(NIH-3T3；ATCC CRL 1658)が含まれる。
【０１７７】
哺乳動物宿主の場合、転写および翻訳調節シグナルは、調節シグナルが高レベル発現を有する特定の遺伝子と関連している、例えばアデノウイルス、ウシパピローマウイルス、シミアンウイルスなどの哺乳動物ウイルス起源に由来し得る。適切な転写および翻訳調節配列は、例えばアクチン、コラーゲン、ミオシン、およびメタロチオネイン遺伝子などの哺乳動物遺伝子から得ることもできる。
【０１７８】
転写調節配列は、RNA合成の開始を指示するのに十分なプロモーター領域を含む。適切な真核生物プロモーターには、マウスメタロチオネインI遺伝子のプロモーター(Hamer et al., J. Molec. Appl. Genet. 1:273 (1982))、ヘルペスウイルスのTKプロモーター(McKnight, Cell 31:355 (1982))、SV40初期プロモーター(Benoist et al., Nature 290:304 (1981))、ラウス肉腫ウイルスプロモーター(Gorman et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79:6777 (1982))、サイトメガロウイルスプロモーター(Foecking et al., Gene 45:101 (1980))、およびマウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーターが含まれる(一般的には、Etcheverry, 「Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture」, Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), pages 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)を参照されたい)。
【０１７９】
または、原核生物プロモーターが真核生物プロモーターによって調節される場合には、バクテリオファージT3 RNAポリメラーゼプロモーターなどの原核生物プロモーターを用いて、哺乳動物細胞におけるzB7R1遺伝子発現を制御することができる(Zhou et al., Mol. Cell. Biol. 10:4529 (1990)、およびKaufman et al., Nucl. Acids Res. 19:4485 (1991))。
【０１８０】
特定の態様において、zB7R1可溶性受容体ポリペプチド、zB7R1ポリペプチドの断片、CD155可溶性受容体、またはCD155ポリペプチドの断片をコードするDNA配列は、発現ベクターにおいて、一般的に転写プロモーターおよびターミネーターを含むその発現に必要な他の遺伝子エレメントに機能的に連結させる。ベクターはやはり一般的に、1つまたは複数の選択マーカーおよび1つまたは複数の複製開始点を含むが、当業者であれば、特定の系においては選択マーカーが別個のベクターに提供されてもよく、外因性DNAの複製が宿主細胞ゲノムへの組込みによって提供され得ることを認識すると考えられる。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクター、およびその他のエレメントの選択は、当業者のレベル内での日常的な設計事項である。そのような多くのエレメントが文献に記載されており、市販業者を通して入手することができる。可溶性受容体複合体の複数の成分は、個々の発現ベクターにおいて同時にトランスフェクションすることができ、または単一の発現ベクターに含めることができる。タンパク質複合体の複数の成分を発現させるそのような技術は、当技術分野において周知である。
【０１８１】
発現ベクターは、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソームを介したトランスフェクション、微粒子銃を介した送達、エレクトロポレーションなどを含む種々の標準的な技法を用いて、宿主細胞に導入することができる。トランスフェクションされた細胞を選択して増殖させることで、宿主細胞ゲノムに安定して組み込まれた発現ベクターを含む組換え宿主細胞が得られる。ベクターを真核細胞に導入する技法、および優性選択マーカーを用いてそのような安定した形質転換体を選択する技法は、例えば、Ausubel (1995)、およびMurray (ed.), Gene Transfer and Expression Protocols (Humana Press 1991)によって記載されている。
【０１８２】
例えば、1つの適切な選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性を提供する遺伝子である。この場合、選択はG-418などのネオマイシン系薬剤の存在下で行われる。選択系を用いて関心対象の遺伝子の発現レベルを増大させることもでき、この過程は「増幅」と称される。増幅は、形質転換体を低レベルの選択薬剤の存在下で培養し、次いで選択薬剤を増量して、導入遺伝子の産物を高レベルで産生する細胞を選択することによって行われる。適切な増幅可能な選択マーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)である。その他の薬剤耐性遺伝子(例えば、ハイグロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ)を使用することもできる。または、緑色蛍光タンパク質などの表現型変化を導入するマーカー、またはCD4、CD8、クラスI MHC、胎盤アルカリホスファターゼなどの細胞表面タンパク質を用いて、FACS選別または磁気ビーズ分離技術のような手段により、トランスフェクションされていない細胞からトランスフェクションされた細胞を選別することができる。
【０１８３】
zB7R1ポリペプチドはまた、ウイルス送達系を用いて培養哺乳動物細胞によって産生され得る。この目的における例示的なウイルスには、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノ随伴ウイルス(AAV)が含まれる。2本鎖DNAウイルスであるアデノウイルスは、現在最も詳しく研究されている異種核酸送達用の遺伝子移入ベクターである(総説に関しては、Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161 (1994)、およびDouglas and Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997)を参照されたい)。アデノウイルス系の利点には、比較的大きなDNA挿入物を収容できること、高力価になるまで増殖可能なこと、広範囲の哺乳動物細胞種に感染可能なこと、および種々のプロモーターを含む多くの利用可能なベクターとの使用を可能にする柔軟性が含まれる。
【０１８４】
アデノウイルスゲノムの一部を欠失させることにより、異種DNAのより大きな挿入物(最長7 kb)を収容することができる。これらの挿入物は、直接連結によって、または同時にトランスフェクションしたプラスミドとの相同組換えによって、ウイルスDNAに取り込まれ得る。1つの選択肢はウイルスベクターから必須のE1遺伝子を欠失させることであり、その結果ウイルスベクターは、E1遺伝子が宿主細胞から提供されない限り、複製することができない。アデノウイルスベクター感染ヒト293細胞(ATCC番号CRL-1573、45504、45505)を、例えば、接着細胞としてまたは比較的高い細胞密度の懸濁培養で培養して、かなりの量のタンパク質を産生させることができる(Garnier et al., Cytotechnol. 15:145 (1994)を参照されたい)。
【０１８５】
zB7R1またはCD155は、鳥類、真菌、昆虫、酵母、または植物細胞などの他の高等真核細胞で発現させることもできる。バキュロウイルス系は、クローニングされたzB7R1遺伝子を昆虫細胞に導入するための効率的な手段を提供する。適切な発現ベクターは、オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcMNPV)に基づき、ショウジョウバエ熱ショックタンパク質(hsp)70プロモーター、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス前初期遺伝子プロモーター(ie-1)および遅延型初期39Kプロモーター、バキュロウイルスp10プロモーター、ならびにショウジョウバエメタロチオネインプロモーターなどの周知のプロモーターを含む。組換えバキュロウイルスを作製する第2の方法では、Luckow(Luckow  et al., J. Virol. 67:4566 (1993))によって記載されているトランスポゾンに基づく系を利用する。トランスファーベクターを利用するこの系は、BAC-to-BACキットとして販売されている(Life Technologies、メリーランド州、ロックビル)。この系では、「バクミド(bacmid)」と称される大型プラスミドとして大腸菌内で維持されるバキュロウイルスゲノムに、zB7R1ポリペプチドをコードするDNAを移動させるためのTn7トランスポゾンを含むトランスファーベクター、PFASTBAC(Life Technologies)を利用する。Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990)、Bonning, et al., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994)、およびChazenbalk, and Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995)を参照されたい。さらにトランスファーベクターは、発現されるzB7R1ポリペプチドのC末端またはN末端における、エピトープタグ、例えばGlu-Gluエピトープタグ(Grussenmeyer et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 82:7952 (1985))をコードするDNAとのインフレームの融合物を含み得る。当技術分野において公知の技法を用いて、zB7R1遺伝子を含むトランスファーベクターで大腸菌を形質転換し、組換えバキュロウイルスの指標となる中断されたlacZ遺伝子を含むバクミドをスクリーニングする。次いで、組換えバキュロウイルスゲノムを含むバクミドDNAを、通常の技法により単離する。
【０１８６】
例示的なPFASTBACベクターは、かなりの程度まで改変することができる。例えば、ポリヘドリンプロモーターを除去し、バキュロウイルス感染の初期に発現され、分泌タンパク質の発現に有利なことが示されているバキュロウイルス塩基性タンパク質プロモーター(Pcor、p6.9、またはMPプロモーターとしても知られている)と置換することができる(例えば、Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990)、Bonning, et al., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994)、およびChazenbalk and Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995)を参照されたい)。このようなトランスファーベクター構築物では、短いまたは長い種類の塩基性タンパク質プロモーターを使用することができる。さらに、天然のzB7R1分泌シグナル配列を、昆虫タンパク質に由来する分泌シグナル配列で置換するトランスファーベクターを構築することができる。例えば、エクジステロイドグルコシルトランスフェラーゼ(EGT)、ミツバチメリチン(Invitrogen Corporation；カリフォルニア州、カールズバッド)、またはバキュロウイルスgp67(PharMingen：カリフォルニア州、サンディエゴ)に由来する分泌シグナル配列を構築物において使用し、天然のzB7R1分泌シグナル配列を置換することができる。
【０１８７】
組換えウイルスまたはバクミドは、宿主細胞をトランスフェクションするために用いられる。適切な昆虫宿主細胞には、Sf9(ATCC CRL 1711)、Sf21AE、およびSf21(Invitrogen Corporation；カリフォルニア州、サンディエゴ)などのヨトウガ(Spodoptera frugiperda)蛹卵巣細胞株IPLB-Sf-21由来細胞株、ならびにショウジョウバエSchneider-2細胞、およびイラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)由来HIGH FIVEO細胞株(Invitrogen)(米国特許第5,300,435号)が含まれる。市販の無血清培地を用いて、これらの細胞を培養および維持することができる。適切な培地は、Sf9細胞に関してはSf900 II(商標)(Life Technologies)またはESF 921(商標)(Expression Systems)であり；およびイラクサギンウワバ細胞に関してはEx-cellO405(商標)(JRH Biosciences、カンザス州、レネックサ)またはExpress FiveO(商標)(Life Technologies)である。組換えウイルスを使用する場合、細胞は典型的に約2〜5 x 105細胞の播種密度から1〜2 x 106細胞の密度まで増殖させ、その時点で組換えウイルス保存液を0.1〜10、より典型的には約3の感染効率(MOI)で添加する。
【０１８８】
バキュロウイルス系で組換えタンパク質を産生させるための確立された技法は、Bailey et al., 「Manipulation of Baculovirus Vectors」, Methods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (ed.), pages 147-168 (The Humana Press, Inc. 1991)、Patel et al., 「The baculovirus expression system」, DNA Cloning 2: Expression Systems. 2nd Edition, Glover et al. (eds.), pages 205-244 (Oxford University Press 1995）、Ausubel (1995), pages 16-37〜16-57、Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995）、およびLucknow, 「Insect Cell Expression Technology」, Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), pages 183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996）によって提供されている。
【０１８９】
酵母細胞を含む真菌細胞を用いて、本明細書に記載の遺伝子を発現させることもできる。この点において特に対象となる酵母種には、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、およびピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)が含まれる。酵母における発現に適したプロモーターには、GAL1(ガラクトース)、PGK(ホスホグリセリン酸キナーゼ)、ADH(アルコール脱水素酵素)、AOX1(アルコールオキシダーゼ)、HIS4(ヒスチジノール脱水素酵素)などのプロモーターが含まれる。多くの酵母クローニングベクターが設計されており、容易に入手することができる。これらのベクターには、YIpに基づくベクター(YIp5など)、YRpベクター(YRp17など)、YEpベクター(YEp13など)、およびYCpベクター(YCp19など)が含まれる。外因性DNAでS. セレビシエ細胞を形質転換し、それらから組換えポリペプチドを産生させる方法は、例えば、Kawasaki、米国特許第4,599,311号、Kawasaki et al.、米国特許第4,931,373号、Brake、米国特許第4,870,008号、Welch et al.、米国特許第5,037,743号、およびMurray et al.、米国特許第4,845,075号によって開示されている。形質転換細胞は、選択マーカーによって決定される表現型、一般的に薬剤耐性または特定の栄養素(例えば、ロイシン)の非存在下で増殖する能力により選択される。サッカロミセス・セレビシエにおける使用に適したベクター系は、Kawasaki et al.(米国特許第4,931,373号)によって開示されている、グルコース含有培地中での増殖によって形質転換細胞を選択することができるPOT1ベクター系である。酵母における使用に適したさらなるプロモーターおよびターミネーターには、解糖系酵素遺伝子(例えば、Kawasaki、米国特許第4,599,311号、Kingsman et al.、米国特許第4,615,974号、およびBitter、米国特許第4,977,092号を参照されたい)およびアルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーターおよびターミネーターが含まれる。米国特許第号4,990,446号、同第5,063,154号、同第5,139,936号、および同第4,661,454号もまた参照されたい。
【０１９０】
ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、クルイベロマイセス・フラジリス(Kluyveromyces fragilis)、トウモロコシ黒穂病菌(Ustilago maydis)、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ、ピキア・ギリエルモンジイ(Pichia guillermondii)、およびカンジダ・マルトーサ(Candida maltosa)を含むその他の酵母の形質転換系も、当技術分野において公知である。例えば、Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459 (1986)、およびCregg、米国特許第4,882,279号を参照されたい。アスペルギルス属(Aspergillus)細胞は、McKnight et al.、米国特許第4,935,349号の方法に従って利用することができる。アクレモニウム・クリソゲナム(Acremonium chrysogenum)を形質転換する方法は、Sumino et al.、米国特許第5,162,228号によって開示されている。ニューロスポラ属(Neurospora)を形質転換する方法は、Lambowitz、米国特許第4,486,533号によって開示されている。
【０１９１】
例えば、組換えタンパク質を産生させるための宿主としてのピキア・メタノリカの使用は、Raymond、米国特許第5,716,808号、Raymond、米国特許第5,736,383号、Raymond et al., Yeast 14:11-23 (1998)により、ならびにWO 97/17450、WO 97/17451、WO 98/02536、およびWO 98/02565において開示されている。P. メタノリカの形質転換に使用するDNA分子は通常、二本鎖の環状プラスミドとして調製し、好ましくは線状化してから形質転換に使用する。P. メタノリカでポリペプチドを産生させる場合、プラスミド中のプロモーターおよびターミネーターは、P. メタノリカアルコール利用遺伝子(AUG1またはAUG2)などのP. メタノリカ遺伝子のプロモーターおよびターミネーターであってよい。その他の有用なプロモーターには、ジヒドロキシアセトンシンターゼ(DHAS)、ギ酸脱水素酵素(FMD)、およびカタラーゼ(CAT)遺伝子のプロモーターが含まれる。宿主染色体へのDNAの組込みを促進するには、プラスミドの発現部分全体が、両末端において宿主DNA配列と隣接していることが好ましい。ピキア・メタノリカにおける使用に適した選択マーカーは、ホスホリボシル-5-アミノイミダゾールカルボキシラーゼ(AIRC；EC 4.1.1.21)をコードし、アデニンの非存在下でade2宿主細胞の増殖を可能とする、P. メタノリカADE2遺伝子である。メタノールの使用を最小限に抑えることが望ましい大規模な産業工程の場合には、両メタノール利用遺伝子(AUG1およびAUG2)が欠損している宿主細胞を用いることができる。分泌タンパク質を産生させる場合、宿主細胞は、液胞プロテアーゼ遺伝子(PEP4およびPRB1)が欠損していてよい。関心対象のポリペプチドをコードするDNAを含むプラスミドのP. メタノリカ細胞への導入を促進するには、エレクトロポレーションが用いられる。P. メタノリカ細胞は、電場強度2.5〜4.5 kV/cm、好ましくは約3.75 kV/cm、および時定数(t) 1〜40ミリ秒、最も好ましくは約20ミリ秒の指数関数的に減衰するパルス電場を用いるエレクトロポレーションにより形質転換することができる。
【０１９２】
発現ベクターは、植物プロトプラスト、無傷の植物組織、または単離された植物細胞に導入することもできる。発現ベクターを植物組織に導入する方法には、植物組織のアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)を用いた直接感染または共培養、微粒子銃を介した送達、DNA注入、エレクトロポレーションなどが含まれる。例えば、Horsch et al., Science 227:1229 (1985)、Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992)、およびMiki et al., 「Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants」, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al. (eds.), pages 67-88 (CRC Press, 1993）を参照されたい。
【０１９３】
または、原核生物宿主細胞においてzB7R1遺伝子を発現させることができる。原核生物宿主においてzB7R1ポリペプチドを発現させるために用いることのできる適切なプロモーターは当業者に周知であり、これには、T4、T3、Sp6、およびT7ポリメラーゼを認識し得るプロモーター、バクテリオファージλのPRおよびPLプロモーター、大腸菌のtrp、recA、熱ショック、lacUV5、tac、lpp-lacSpr、phoA、およびlacZプロモーター、枯草菌(B. subtilis)のプロモーター、バシラス属(Bacillus)のバクテリオファージのプロモーター、ストレプトミセス属(Streptomyces)プロモーター、バクテリオファージλのintプロモーター、pBR322のblaプロモーター、ならびにクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のCATプロモーターが含まれる。原核生物のプロモーターについては、Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277 (1987)、Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4th Ed. (Benjamin Cummins 1987)、およびAusubel et al. (1995)により概説されている。
【０１９４】
適切な原核生物宿主には、大腸菌および枯草菌が含まれる。大腸菌の適切な株には、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE、DH1、DH4I、DH5、DH5I、DH5IF'、DH5IMCR、DH10B、DH10B/p3、DH11S、C600、HB101、JM101、JM105、JM109、JM110、K38、RR1、Y1088、Y1089、CSH18、ER1451、およびER1647が含まれる(例えば、Brown (ed.),  Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)を参照されたい)。枯草菌の適切な株には、BR151、YB886、MI119、MI120、およびB170が含まれる(例えば、Hardy, 「Bacillus Cloning Methods」, DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (ed.) (IRL Press 1985)を参照されたい)。
【０１９５】
zB7R1ポリペプチドを大腸菌などの細菌で発現させる場合、ポリペプチドは、典型的に不溶性の顆粒として細胞質中に維持され得るか、または細菌の分泌配列によって細胞膜周辺腔に導かれ得る。前者の場合は、細胞を溶解し、顆粒を回収して、例えばグアニジンイソチオシアネートまたは尿素を用いて変性させる。次いで、尿素、および還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンの組み合わせの溶液に対して透析を行い、次に緩衝生理食塩水溶液に対して透析を行うなどして、変性剤を希釈することにより、変性ポリペプチドを再び折りたたんで二量体化することができる。後者の場合は、細胞を破砕して(例えば、超音波処理または浸透圧ショックによる)細胞膜周辺腔の内容物を放出させ、タンパク質を回収することにより、変性および再折りたたみを必要とすることなく、ポリペプチドを細胞膜周辺腔から可溶型でかつ機能的な形態で回収することができる。
【０１９６】
タンパク質を原核生物宿主で発現させる方法は、当業者に周知である(例えば、Williams et al., 「Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies」, DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 15 (Oxford University Press 1995）、Ward et al., 「Genetic Manipulation and Expression of Antibodies」, Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995）、およびGeorgiou, 「Expression of Proteins in Bacteria」, Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), page 101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)を参照されたい）。
【０１９７】
発現ベクターを細菌、酵母、昆虫、および植物の細胞に導入する標準的な方法は、例えばAusubel (1995)によって提供されている。
【０１９８】
哺乳動物細胞系により産生される外来タンパク質を発現させて回収する一般的な方法は、例えば、Etcheverry, 「Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture」, Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), pages 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996)によって提供されている。細菌系により産生されたタンパク質を回収する標準的な技法は、例えば、Grisshammer et al., 「Purification of over-produced proteins from E.coli cells」, DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), pages 59-92 (Oxford University Press 1995）によって提供されている。組換えタンパク質をバキュロウイルス系から単離する確立された方法は、Richardson (ed.),  Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995)によって記載されている。
【０１９９】
別の方法として、本発明のポリペプチドは、独占的固相合成、部分的固相法、断片縮合、または古典的な溶液合成により合成することができる。これらの合成法は当業者に周知である(例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963)、Stewart et al., 「Solid Phase Peptide Synthesis」 (2nd Edition), (Pierce Chemical Co. 1984)、Bayer and Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3 (1986)、Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press 1989)、Fields and Colowick, 「Solid-Phase Peptide Synthesis」, Methods in Enzymology Volume 289 (Academic Press 1997)、およびLloyd-Williams et al., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (CRC Press, Inc. 1997)を参照されたい)。「天然の化学的連結」および「発現タンパク質連結」などの、全体的な化学合成戦略の変法もまた標準的である(例えば、Dawson et al., Science 266:776 (1994)、Hackeng et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:7845 (1997)、Dawson, Methods Enzymol. 287:34 (1997)、Muir et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:6705 (1998)、およびSeverinov and Muir, J. Biol. Chem. 273:16205 (1998)を参照されたい)。
【０２００】
本発明のペプチドおよびポリペプチドは、配列番号:2の少なくとも6個、少なくとも9個、または少なくとも15個の連続したアミノ酸残基を含む。例として、ポリペプチドは、配列番号:2の少なくとも6個、少なくとも9個、または少なくとも15個の連続したアミノ酸残基を含み得る。本発明の特定の態様において、ポリペプチドは、これらのアミノ酸配列の20、30、40、50、100個、またはそれ以上の連続した残基を含む。そのようなペプチドおよびポリペプチドをコードする核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応のプライマーおよびプローブとして有用である。
【０２０１】
さらに、zB7R1またはCD155ポリペプチドおよびそれらの断片は、高等真核細胞において、単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、四量体(後述する)、または多量体として発現され得る。そのような細胞を用いて、少なくとも1つのzB7R1またはCD155ポリペプチドを含むzB7R1またはCD15単量体、ホモニ量体、ヘテロ二量体、四量体、および多量体受容体ポリペプチド(「zB7R1含有受容体」、「zB7R1含有受容体ポリペプチド」、「CD155含有受容体」、または「CD155含有受容体ポリペプチド」)を産生させることができ、またはそのような細胞をスクリーニング系におけるアッセイ細胞として用いることができる。本発明の1つの局面においては、zB7R1細胞外ドメイン(配列番号:3または7)を含む本発明のポリペプチドを培養細胞によって産生させ、この細胞を用いて、天然のカウンター受容体、ならびに天然のカウンター受容体のアゴニストおよびアンタゴニストを含む、受容体のカウンター受容体をスクリーニングする。このアプローチを要約すると、受容体をコードするcDNAまたは遺伝子を、その発現に必要な他の遺伝子エレメント(例えば、転写プロモーター)と結合し、得られた発現ベクターを宿主細胞に挿入する。DNAを発現し、機能的受容体を産生する細胞を選択して、これを種々のスクリーニング系において用いる。単量体、ホモニ量体、ヘテロニ量体、および多量体受容体複合体の各成分は、同じ細胞で発現させることができる。さらに、単量体、ホモニ量体、ヘテロニ量体、および多量体受容体複合体の成分は、複合体の構築を可能とし、上記のようにトランスフェクタントのスクリーニングを可能とするために、膜貫通ドメインまたはその他の膜融合部分と融合させることもできる。
【０２０２】
6. zB7R1およびCD155四量体ポリヌクレオチド、ポリペプチド、およびこれらの作製方法
本発明はまた、多量体、好ましくは四量体zB7R1またはCD155ポリペプチドを生成する方法を包含する。これらのタンパク質は、2006年4月13日に出願され、その全体が本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第60/60/791,626号においてさらに詳細に記載されている。これらの融合タンパク質は、VASPドメインおよびzB7R1またはCD155などの異種タンパク質ドメインを含む。VASPドメインは、多くの種に存在するVASP遺伝子に由来する。コイルドコイルタンパク質構造は多量体タンパク質形態を形成する能力にとって重要であるため、配列は、このような構造を形成すると予測される能力に関して選択される。本発明にとって特に望ましいのは、コイルドコイルタンパク質が四量体タンパク質構造を生成する能力である。特に好ましい態様では、ヒトVASP配列のアミノ酸343〜376(配列番号:23のアミノ酸5〜38)を利用する。このタンパク質の全長DNA配列は配列番号:24であり、このタンパク質の全長ポリペプチド配列は配列番号:25である。
【０２０３】
例えばロイシンジッパーといった他の種類の多量体化配列を用いた研究から、多量体化する分子の能力を消失することなく、ジッパー配列において限られた数の保存的アミノ酸置換が(d残基においてさえ)許容され得る場合が多いことが示された(Landschultz et al., (1989)、前記；)。したがって、VASPドメインの天然配列からの保存的変化は、本発明の範囲内であることが意図される。表4に、コイルドコイル構造によって許容されると予測される保存的変化を示す。
【０２０４】
（表４）
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【０２０５】
2つ以上の融合タンパク質を用いてヘテロ多量体タンパク質、例えばヘテロ四量体を生成する場合、使用するVASPドメインは両融合タンパク質に対して同じドメインであってもよいし、またはドメインが相互に会合し、多量体タンパク質を形成する能力を有する限りは、異なるVASPドメインであってもよい。
【０２０６】
VASPドメインは、機能(すなわち、異種タンパク質がI型膜タンパク質であるのか、またはII型膜タンパク質であるのか)および構築物の構築の容易さの考慮に基づいて、関心対象の異種タンパク質のN末端またはC末端側に置くことができる。さらに、VASPドメインをタンパク質の中央に配置して、第1異種配列、VASPドメイン、および第2異種配列を有する二重融合タンパク質を効率的に作製することができる。二重融合タンパク質の2つの異種配列は、同じであってもよいしまたは異なってもよい。
【０２０７】
具体的には、zB7R1またはCD155は、融合タンパク質を形成するために別のタンパク質に直接連結することができる；または、タンパク質は、これらが生物活性に必要とされる適切な二次構造および三次構造を形成するのを確実にするのに十分な距離だけ分離してもよい。適切なリンカー配列は、可動性の伸長した構造をとり、融合タンパク質の機能的ドメインと相互作用し得る規則正しい二次構造を生じる傾向を示さず、また融合ドメインの機能を妨げ得る疎水性または荷電性特性が最小限である。生物活性のあるタンパク質を産生するには、異種配列のN末端またはC末端を厳密に制限することは有利とならないと考えられるため、リンカー配列は15残基反復を考慮して構築すべきである。これらの考察以外は、リンカー配列の長さは、融合タンパク質の生物活性に有意に影響を及ぼすことなく変動し得る。リンカー配列は、親和性タグおよびシグナルペプチドを含む、融合タンパク質(または発現構築物)のありとあらゆる成分間で用いられ得る。例示的なリンカーはGSGG配列(配列番号:26)である。
【０２０８】
融合タンパク質のさらなる成分は、親和性タグであってよい。そのようなタグは融合タンパク質の生物活性を変更することなく、高度に抗原性であり、モノクローナル抗体などの特定の結合分子が可逆的に結合し得るエピトープを提供して、発現された融合タンパク質の迅速な検出および精製を可能にする。親和性タグはまた、タンパク質が大腸菌のような細菌で発現される場合に、細胞内分解に対する抵抗性を付与し得る。例示的な親和性タグは、FLAGタグ(配列番号:27)またはHIS6タグ(配列番号:28)である。精製のためにこのような親和性タグを活用して融合タンパク質を作製する方法は、米国特許第5,011,912号に記載されている。
【０２０９】
融合タンパク質のなおさらなる成分は、シグナル配列またはリーダー配列であってよい。これらの配列は一般的に、発現過程において宿主細胞から融合タンパク質を分泌させるために用いられ、リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列としても知られる。分泌シグナル配列は、産生しようとする異種タンパク質がそのような配列を有する場合には、異種タンパク質のものであってよく、または別の分泌タンパク質(例えば、t-PA)に由来してもよいし、もしくは新規に合成してもよい。分泌シグナル配列は、融合タンパク質DNA配列に機能的に連結する、すなわち2つの配列を正確な読み枠で結合し、新たに合成されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に導くように配置する。分泌シグナル配列は一般的に、関心対象のポリペプチドをコードするDNA配列の5'側に位置するが、ある種のシグナル配列は、関心対象のDNA配列の他所に位置してもよい(例えば、Welch et al.、米国特許第5,037,743号；Holland et al.、米国特許第5,143,830号を参照されたい）。
【０２１０】
したがって、本発明の核酸組成物は、上記のように、VASP-zB7R1またはVASP-CD155融合タンパク質のすべてまたは一部の調製に使用される。部分的または完全な遺伝子産物を発現させるために、本ポリヌクレオチド(cDNAまたは全長遺伝子を含む)を用いることができる。本ポリヌクレオチドを含む構築物は、合成により作製することができる。または、多数のオリゴデオキシリボヌクレオチドからの遺伝子およびプラスミド全体の一段階構築が、例えば、Stemmer et al., Gene (Amsterdam) (1995) 164(1):49-53に記載されている。本方法では、構築PCR(多数のオリゴデオキシリボヌクレオチド(オリゴ)からの長いDNA配列の合成)について記載されている。この方法はDNAシャフリング(Stemmer, Nature (1994) 370:389-391)に由来し、DNAリガーゼに依存しないが、代わりに構築過程において次第により長いDNA断片を構築するDNAポリメラーゼに依存する。適切なポリヌクレオチド構築物は、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載されているような標準的な組換えDNA技法を用いて、および組換えDNA研究に関する米国HHS、国立衛生研究所(NIH)指針に記載されている現行規則の下で精製される。
【０２１１】
本明細書に提供するポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子は、ベクター中にその分子を配置することによって増殖させる。プラスミドを含め、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターが用いられる。プラスミドの選択は、増殖が所望される細胞の種類および増殖の目的に依存する。所望のDNA配列を大量に増幅および作製するためには、特定のベクターが有用である。その他のベクターは、培養細胞での発現に適している。さらなる他のベクターは、動物またはヒト全体の細胞における移入および発現に適している。適切なベクターの選択は、十分に当技術分野の技術の範囲内である。多くのこのようなベクターは市販されている。部分的または全長ポリヌクレオチドは、典型的に、ベクター中の切断された制限酵素部位に対するDNAリガーゼ結合によって、ベクターに挿入される。または、所望のヌクレオチド配列は、インビボで相同組換えによって挿入することができる。典型的に、これは、ベクターに対して相同的な領域を所望のヌクレオチド配列に隣接して結合することによって達成される。相同領域は、オリゴヌクレオチドの連結によって、または例えば相同領域および所望のヌクレオチド配列の一部を両方含むプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって付加される。
【０２１２】
発現には、発現カセットまたは発現系を使用し得る。本発明のポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子産物は、例えば細菌、酵母、昆虫、両生動物、および哺乳動物の系を含む任意の簡便な発現系において発現させる。適切なベクターおよび宿主細胞は、米国特許第5,654,173号に記載されている。発現ベクターにおいて、異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド(zB7R1の細胞外ドメイン；すなわち配列番号:3または7など)は、所望の発現特性が得られるように必要に応じて調節配列と連結する。これらには、プロモーター(センス鎖の5'末端、またはアンチセンス鎖の3'末端に付加される)、エンハンサー、ターミネーター、オペレーター、リプレッサー、およびインデューサーが含まれ得る。プロモーターは、調節性または構成的であってよい。状況によっては、組織特異的または発達段階特異的プロモーターなどの、条件的活性プロモーターを使用することが望ましい場合がある。これらは、ベクターとの連結に関して上記した技法を用いて、所望のヌクレオチド配列に連結される。当技術分野において公知の任意の技法を用いることができる。換言すると、発現ベクターは、誘導性または構成的であってよい転写および翻訳開始領域、ならびに転写および翻訳の終結領域を提供し、コード領域は転写開始領域の転写制御下で機能的に連結されている。これらの制御領域は、VASP-異種融合タンパク質をコードするDNAにとって天然のものであってもよいし、または外因性供給源に由来してもよい。
【０２１３】
発現ベクターは一般的に、プロモーター配列の近傍に位置する利便な制限部位を有し、異種タンパク質をコードする核酸配列の挿入を提供する。発現宿主において作動する選択マーカーが存在してもよい。発現ベクターは融合タンパク質の産生に用いることができ、この場合、外因性融合ペプチドは付加的な機能性、すなわちタンパク質合成の増加、安定性、規定の抗血清との反応性、酵素マーカー(例えば、β-ガラクトシダーゼ)などを提供する。
【０２１４】
発現カセットは、転写開始領域、遺伝子またはその断片、および転写終結領域を含めて調製し得る。特に対象となるのは、通常は少なくとも約8アミノ酸長、より一般的には少なくとも約15アミノ酸長〜約25アミノ酸、および最大で遺伝子の完全なオープンリーディングフレームの長さまでの、機能的エピトープまたはドメインの発現を可能にする配列の使用である。DNAの導入後、構築物を含む細胞を選択マーカーによって選択し、細胞を拡大して、発現用に使用することができる。
【０２１５】
VASP-異種融合タンパク質は、発現の目的に応じて、従来の方法に従って原核生物または真核生物で発現させることができる。タンパク質を大量に産生させるためには、大腸菌、枯草菌、S. セレビシエなどの単細胞生物、バキュロウイルスベクターと併用する昆虫細胞、または脊椎動物、特に哺乳動物などの高等生物の細胞、例えばCOS 7細胞、HEK 293、CHO、アフリカツメガエル卵母細胞などを発現宿主細胞として用いることができる。状況によっては、多型VASPタンパク質が天然の折りたたみおよび翻訳後修飾の恩恵を受ける真核細胞において、多型VASP核酸分子を発現させることが望ましい。小ペプチドは実験室で合成することもできる。完全なVASP配列のサブセットであるポリペプチドは、機能上重要なタンパク質の部分を同定および調査するために用いることができる。
【０２１６】
関心対象の特定の発現系には、細菌、酵母、昆虫細胞、および哺乳動物細胞に由来する発現系が含まれる。これらの各カテゴリーの代表的な系を、以下に挙げる：細菌。細菌における発現系には、Chang et al., Nature (1978) 275:615；Goeddel et al., Nature (1979) 281:544；Goeddel et al., Nucleic Acids Res. (1980) 8:4057；EP 0 036,776；米国特許第4,551,433号；DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1983) 80:21-25；およびSiebenlist et al., Cell (1980) 20:269に記載されているものが含まれる。酵母。酵母における発現系には、Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1978) 75:1929；Ito et al., J. Bacteriol. (1983) 153:163；Kurtz et al., Mol. Cell. Biol. (1986) 6:142；Kunze et al., J. Basic Microbiol. (1985)25:141；Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. (1986) 132:3459；Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 202:302；Das et al., J. Bacteriol. (1984) 158:1165；De Louvencourt et al., J. Bacteriol. (1983) 154:737；Van den Berg et al., Bio/Technology (1990)8:135；Kunze et al., J. Basic Microbiol. (1985)25:141；Cregg et al., Mol. Cell. Biol. (1985) 5:3376；米国特許第4,837,148号および同第4,929,555号；Beach and Nurse, Nature (1981) 300:706；Davidow et al., Curr. Genet. (1985) 10:380；Gaillardin et al., Curr. Genet. (1985) 10:49；Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1983) 112:284-289；Tilburn et al., Gene (1983) 26:205-221；Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1984) 81:1470-1474；Kelly and Hynes, EMBO J. (1985) 4:475479；EP 0 244,234；ならびにWO 91/00357に記載されているものが含まれる。昆虫細胞。昆虫における異種遺伝子の発現は、米国特許第4,745,051号；Friesen et al., 「The Regulation of Baculovirus Gene Expression」, The Molecular Biology Of Baculoviruses (1986) (W. Doerfler. ed.)；EP 0 127,839；EP 0 155,476；およびVlak et al., J. Gen. Virol. (1988) 69:765-776；Miller et al., Ann. Rev. Microbiol. (1988) 42:177；Carbonell et al., Gene (1988) 73:409；Maeda et al., Nature (1985) 315:592-594；Lebacq-Verheyden et al., Mol. Cell. Biol. (1988) 8:3129；Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1985) 82:8844；Miyajima et al., Gene (1987) 58:273；ならびにMartin et al., DNA (1988) 7:99に記載されているように達成される。多くのバキュロウイルス株および変異株、ならびに対応する許容昆虫宿主細胞が、Luckow et al., Bio/Technology (1988) 6:47-55、Miller et al., Generic Engineering (1986) 8:277-279、およびMaeda et al., Nature (1985) 315:592-594に記載されている。哺乳動物細胞。哺乳動物発現は、Dijkema et al., EMBO J. (1985) 4:761、Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1982) 79:6777、Boshart et al., Cell (1985) 41:521、および米国特許第4,399,216号に記載されているように達成される。哺乳動物発現のその他の特徴は、Ham and Wallace, Meth. Enz. (1979) 58:44、Barnes and Sato, Anal. Biochem. (1980) 102:255、米国特許第4,767,704号、同第4,657,866号、同第4,927,762号、同第4,560,655号、WO 90/103430、WO 87/00195、および米国再発行特許第30,985号に記載されているように助長される。
【０２１７】
上記の宿主細胞、またはその他の適切な宿主細胞もしくは生物のいずれかを用いて、本発明のポリヌクレオチドまたは核酸を複製および/または発現させる場合、結果として得られる複製された核酸、RNA、発現されたタンパク質またはポリペプチドは、宿主細胞または生物の産物として、本発明の範囲内に含まれる。産物は、当技術分野において公知の任意の適切な手段によって回収される。
【０２１８】
選択したポリヌクレオチドに対応する遺伝子がひとたび同定されたならば、その遺伝子が本来存在する細胞内でその発現を調節することができる。例えば、細胞の内因性遺伝子は、細胞のゲノム中の、細胞における遺伝子の発現を少なくとも増強するのに十分な位置に挿入された外因性調節配列により調節され得る。調節配列は、米国特許第5,641,670号および同第5,733,761号(これらの開示は参照により本明細書に組み入れられる)に開示された通りに、相同組換えを介してゲノム中に組み込まれるように設計してもよく、またはWO 99/15650(その開示は参照により本明細書に組み入れられる)に開示された通りに、非相同組換えを介してゲノム中に組み込まれるように設計してもよい。
【０２１９】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターおよび宿主細胞を提供する。一般的に、本発明の組換えベクターおよび宿主細胞は単離されているが；しかし、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、遺伝子改変動物の一部であってもよい。
【０２２０】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクター(「構築物」)を提供する。組換えベクターには、本発明のポリヌクレオチドの増殖に用いられるベクターおよび発現ベクターが含まれる。ポリヌクレオチドの導入に有用なベクターには、哺乳動物細胞において一過性にまたは安定して維持されるプラスミドおよびウイルスベクター、例えばレトロウイルスに基づくベクター、アデノウイルスベクターなどが含まれる。遺伝子を細胞のゲノムにトランスフェクションするおよび/または組み込むためには、多種多様なベクターを用いることができる。または、適切な宿主細胞内に遺伝子を導入するために、マイクロインジェクション、融合などを用いてもよい。
【０２２１】
発現ベクターは一般的に、プロモーター配列の近傍に位置する利便な制限部位を有し、異種タンパク質をコードする核酸配列の挿入を提供する。発現宿主において作動する選択マーカーが存在してもよい。発現ベクターは融合タンパク質の産生に用いることができ、この場合、外因性融合ペプチドは付加的な機能性、すなわちタンパク質合成の増加、安定性、規定の抗血清との反応性、酵素マーカー(例えば、β-ガラクトシダーゼ)などを提供する。
【０２２２】
発現カセットは、転写開始領域、遺伝子またはその断片、および転写終結領域を含めて調製し得る。特に対象となるのは、通常は少なくとも約8アミノ酸長、より一般的には少なくとも約15アミノ酸長、少なくとも約25アミノ酸、少なくとも約45アミノ酸、および最大で遺伝子の完全なオープンリーディングフレームの長さまでの、機能的エピトープまたはドメインの発現を可能にする配列の使用である。DNAの導入後、構築物を含む細胞を選択マーカーによって選択し、細胞を拡大して、発現用に使用することができる。
【０２２３】
発現カセットは種々のベクター、例えばプラスミド、BAC、YAC、バクテリオファージ(λ、P1、M13など)、動物または植物ウイルスなどに導入することができ、このようなベクターは通常、発現ベクターを含む細胞の選択をもたらす能力を特徴とする。ベクターは、特にプラスミドもしくはウイルスとしての染色体外維持、または宿主染色体への組込みを提供し得る。染色体外維持を所望する場合には、プラスミドの複製のために開始点配列が提供されるが、これは低コピー数であっても高コピー数であってもよい。選択に関しては多種多様なマーカーが利用でき、詳細には毒素から防御する、より詳細には抗生物質から防御するマーカーが利用できる。選択される特定のマーカーは宿主の性質に従って選択するが、場合によっては栄養要求性宿主との補完を用いてもよい。DNA構築物の導入は、例えば接合、細菌の形質転換、カルシウム沈殿DNA、エレクトロポレーション、融合、トランスフェクション、ウイルスベクターによる感染、遺伝子銃といった、任意の簡便な方法を用いることができる。
【０２２４】
本発明はさらに、本発明の多型VASP核酸分子を含む宿主細胞を提供し、これは単離された宿主細胞であってよい。適切な宿主細胞には、大腸菌、枯草菌などの原核生物、バキュロウイルスベクターと併用する昆虫細胞、サッカロミセス・セレビシエなどの酵母細胞、または両生動物(例えば、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)卵母細胞)および哺乳動物、特にヒト(例えば、COS細胞、CHO細胞、HEK293細胞など)をはじめとする脊椎動物などの高等生物の細胞を含む真核生物が含まれ、これらを宿主細胞として用いることができる。宿主細胞は、多型VASP核酸分子の増殖を目的として、多型VASPポリペプチドの産生のため、または細胞内のVASP mRNAおよび/もしくはタンパク質および/もしくは生物活性のレベルを調節する薬剤を同定するための細胞に基づく方法において用いることができる。
【０２２５】
初代またはクローン化細胞および細胞株を、1つまたは複数のVASP-異種融合タンパク質多型をコードするDNAを含むベクターを導入することにより改変することができる。単離された多型VASP核酸分子は、1つまたは複数の変種配列、例えば通常存在する組み合わせのハプロタイプを含み得る。本発明の1つの態様においては、それぞれがVASP多型を含む2つまたはそれ以上の遺伝子改変細胞株の一群を、基質および/または発現アッセイ法に供する。この群はさらに、多型を含むその他の遺伝子配列、特に、そのいくつかが当技術分野において公知である肥満に関連した他の遺伝子/遺伝子変異といった、薬理遺伝学的スクリーニングに関して対象となるその他の配列によって遺伝子改変された細胞を含んでもよい。
【０２２６】
本核酸を用いて、遺伝子改変非ヒト動物を作製すること、または細胞株において部位特異的遺伝子改変を行うことができる。「トランスジェニック」という語は、VASP-異種融合タンパク質をコードするDNAが付加された、または宿主細胞において安定に伝播されたVASP-異種融合タンパク質をコードする外因性DNAを有する遺伝子改変動物を包含することが意図される。トランスジェニック動物は、相同組換えにより作製することができる。または、核酸構築物をゲノム中にランダムに組み込む。安定した組込みを行うためのベクターには、プラスミド、レトロウイルスおよびその他の動物ウイルス、YACなどが含まれる。対象となるのは、例えばウシ、ブタ、ヤギ、ウマなどのトランスジェニック哺乳動物であり、特に例えばラット、マウスなどのげっ歯動物である。
【０２２７】
相同組換えのためのDNA構築物は、VASP-異種融合タンパク質をコードするDNAの少なくとも一部を含み、標的遺伝子座に対する相同領域も含む。便宜的に、陽性選択および陰性選択用のマーカーも含める。相同組換えにより標的遺伝子改変を有する細胞を作製する方法は、当技術分野において公知である。哺乳動物細胞にトランスフェクションするための種々の技法に関しては、Known et al. (1990) Methods in Enzymology 185:527-537を参照されたい。
【０２２８】
胚性幹(ES)細胞に関しては、ES細胞株を用いることができ、または宿主、例えばマウス、ラット、モルモットなどからES細胞を新たに取得することもできる。そのような細胞は、適切な線維芽細胞フィーダー層上で、または白血病抑制因子(LIF)の存在下で培養する。ES細胞を形質転換した場合には、これを用いてトランスジェニック動物を作製することができる。形質転換後、細胞を適切な培地中のフィーダー層上にプレーティングする。構築物を含む細胞は、選択培地を用いて検出することができる。コロニーが増殖するのに十分な時間が経過した後、コロニーを拾い上げ、相同組換えの発生に関して解析する。次いで、相同組換えを示すコロニーを胚操作および胚盤胞注入に用いることができる。胚盤胞は4〜6週齢の過排卵雌から採取する。ES細胞をトリプシン処理し、改変細胞を胚盤胞の胞胚腔に注入する。注入後、胚盤胞を偽妊娠雌の各子宮角に戻す。その後、雌に出産させて、得られた同腹仔を構築物を有する変異細胞に関してスクリーニングする。胚盤胞とES細胞で異なる表現型を提供することにより、キメラ子孫を容易に検出することができる。キメラ動物を、VASP-異種融合タンパク質をコードするDNAの存在に関してスクリーニングし、改変を有する雄と雌を交配して、ホモ接合性子孫を作製する。トランスジェニック動物は、実験動物、家畜などの任意の非ヒト哺乳動物であってよい。トランスジェニック動物は、インビボ環境における候補薬物の効果を判定するために用いることができる。
【０２２９】
本発明は、VASPドメインおよび異種タンパク質を含む融合タンパク質をコードする少なくとも1つまたは最大で4つの異なる発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションした宿主細胞を培養することにより、可溶性ホモまたはヘテロ三量体タンパク質を調製する方法である。生物学的に機能するタンパク質を生成するため、4つのVASPドメインは優先的にホモまたはヘテロ四量体を形成する。効率的な産生が維持され得るのであれば、培養は同じ宿主細胞において行うこともでき、次いで培地からホモまたはヘテロ四量体タンパク質を単離する。理想的には、4つの異種タンパク質は、組成物の解析または得られた分子の精製が可能となるように、種々のタグ配列(すなわち、Hisタグ、FLAGタグ、およびGlu-Gluタグ)で異なって標識する。または、4つの成分を個別に生成し、意図した比率で組み合わせて所望のヘテロ四量体分子を得ることもできる。これらのヘテロ三量体分子の作製において用いるVASPドメインは、同じであっても異なってもよく、融合タンパク質はリンカー配列をさらに含んでもよい。1つの特定の態様において、ホモ四量体タンパク質を形成するために用いる異種タンパク質は、zB7R1の可溶性ドメインである。
【０２３０】
本発明のVASP四量体化ドメインを使用する1つの結果は、四量体型を形成することにより、異種タンパク質のそのリガンドまたは結合パートナーに対する親和性および結合活性を増加させる能力である。結合活性とは、複数の分子のより大きな分子に対する結合の強度を意味し、この状況は、これに限定されないが抗体による複合抗原の結合によって例証される。このような特徴は、例えば、VASPドメインを用いる異種受容体の四量体化を介して、その1つまたは複数のリガンドに対する複数の結合部位を形成することにより、多くの異種タンパク質に関して改良または形成される。親和性とは、単純な受容体-リガンド系の結合の強度を意味する。このような特徴は、例えば、受容体の四量体化を介して、単一のリガンドに対するより優れた結合特性を有する結合部位を形成することにより、本発明の四量体化ドメインを用いる異種タンパク質のサブセットに関して改良される。結合活性および親和性は、当業者に周知の標準的なアッセイ法、例えば以下の実施例に記載する方法を用いて測定することができる。四量体化ドメイン-異種タンパク質融合物とそのリガンドとの親和性または結合活性値(例えば、親和定数またはKa)が、単独の異種タンパク質とそのリガンドとのものよりも高い場合に、親和性または結合活性の改良が起こる。これらの特徴を測定する別の手段は平衡定数(Kd)であり、これは、本発明のVASP四量体化ドメインを用いて親和性または結合活性が改良されるのと共に減少が認められる。
【０２３１】
組換えVASP-異種融合タンパク質の生物活性は、組換え融合タンパク質が受容体または交差受容体などの同族分子に結合することによって媒介される。同族分子は、組換え融合タンパク質と同族分子との適切な高次構造に基づく非共有結合性相互作用で、組換え融合タンパク質と結合する分子と定義される。例えば、受容体の細胞外領域を含む組換え融合タンパク質の場合、同族分子は受容体の細胞外領域と結合するリガンドを含む。逆に、リガンドを含む組換え可溶性融合タンパク質の場合、同族分子はリガンドと結合する受容体(または結合タンパク質)を含む。
【０２３２】
組換え融合タンパク質の同族分子に対する結合は、生物活性のマーカーである。このような結合活性は、例えば、同族分子の結合ドメインに対する結合の競合(すなわち、競合結合アッセイ法)により決定することができる。リガンドを含む組換え融合タンパク質に関する競合結合アッセイ法の1つの形態では、放射標識可溶性受容体、および天然型のリガンドを発現する無傷の細胞を使用する。同様に、受容体を含む組換え融合タンパク質に関する競合アッセイ法では、放射標識可溶性リガンド、および天然型の受容体を発現する無傷の細胞を使用する。そのようなアッセイ法は実施例3に記載されている。天然型の同族分子を発現する無傷の細胞の代わりに、固相に結合した精製同族分子で代用することも可能である。競合結合アッセイ法は、標準的な方法を用いて行うことができる。競合オートラジオグラフィープレート結合アッセイ法もしくは蛍光活性化細胞選別により定量的もしくは半定量的な結果を得ることができ、またはスキャッチャードプロットを用いて定量的な結果を作成することができる。
【０２３３】
生物活性はまた、細胞増殖アッセイ法など、当技術分野において公知のバイオアッセイ法を用いて測定することもできる。例示的なバイオアッセイ法は、実施例4に記載されている。使用する細胞増殖アッセイ法の種類は、組換え可溶性融合タンパク質に依存する。例えば、天然型でT細胞に作用する組換え可溶性融合タンパク質に関するバイオアッセイ法では、当技術分野において公知の方法によって得られる精製T細胞を使用する。このようなバイオアッセイ法には、組換え可溶性融合タンパク質および最適レベル以下のCon AまたはPHAなどのマイトジェンの存在下において精製T細胞をインキュベートする共刺激アッセイ法が含まれる。同様に、天然型でB細胞に作用する組換え可溶性融合タンパク質については、精製B細胞を使用する。天然型の組換え可溶性融合タンパク質が作用する細胞種に基づいて、他の種類の細胞を選択することも可能である。増殖は、標準的な方法に従い、3Hチミジンなどの放射標識物質の取り込みを測定することにより決定する。
【０２３４】
生物活性を決定するためのさらに別の種類のアッセイ法は、二次分子の分泌の誘導である。例えば、ある種のタンパク質は、T細胞によるサイトカインの分泌を誘導する。T細胞を精製し、サイトカイン分泌を誘導するのに必要な条件下において(例えば、共同マイトジェンの存在下において)この細胞を組換え可溶性融合タンパク質で刺激する。サイトカイン分泌の誘導は、サイトカイン依存性細胞株の増殖を測定するバイオアッセイ法により決定する。同様に、酵素免疫測定法などの定量的(または半定量的)アッセイ法を用いて、天然型でB細胞に作用する組換え可溶性融合タンパク質で刺激した精製B細胞により分泌される免疫グロブリンの量を測定することにより、免疫グロブリン分泌の誘導を決定する。
【０２３５】
特定の異種タンパク質に対する結合パートナーが未知である場合には、VASP融合タンパク質を結合アッセイ法において使用し、そのような結合パートナーを探索することができる。これを実施する1つの方法は分泌捕獲アッセイ法と称され、実施例5に記載されるが、VASP融合タンパク質を用いて結合パートナーを同定するその他の方法も当業者に周知である。
【０２３６】
本発明のzB7R1アゴニストおよび/またはアンタゴニストポリペプチドならびに抗体をアッセイするための、zB7R1含有受容体の発現および受容体媒介性シグナルの伝達に使用するのに適した哺乳動物細胞には、zB7R1(またはzB7R1RA)と機能的複合体を形成し得る他の受容体サブユニットを発現する細胞が含まれる。好ましい態様において、細胞は、その増殖のために外因的に提供される造血増殖因子に依存する。この種の好ましい細胞株には、GM-CSF依存性ヒト白血病細胞株であるヒトTF-1細胞株(ATCC番号CRL-2003)およびAML-193細胞株(ATCC番号CRL-9589)、ならびにIL-3依存性マウスプレB細胞株であるBaF3(Palacios and Steinmetz, Cell 41: 727-734, (1985))が含まれる。その他の細胞株には、BHK、COS-1、およびCHO細胞が含まれる。適切な宿主細胞を、必要な受容体サブユニット、または所望の細胞応答に必要とされるその他の細胞成分を産生するよう操作することができる。細胞株は任意の種に由来する受容体サブユニットを発現するように操作することができ、それによって種特異性から生じる潜在的限界が克服されるため、このアプローチは有利である。ヒト受容体cDNAの種オーソログをクローニングし、同じ種に由来する細胞株において用いることができ、例えばBaF3細胞株においてマウスcDNAを用いることができる。
【０２３７】
機能的受容体を発現する細胞は、スクリーニングアッセイ法において用いられる。種々の適切なアッセイ法が当技術分野において公知である。これらのアッセイ法は、標的細胞における生物学的応答の検出に基づく。このような1つのアッセイ法は、細胞増殖アッセイ法である。細胞を被験化合物の存在下または非存在下で培養し、例えば、トリチウムチミジンの取り込みを測定することにより、または3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド(MTT)の代謝分解に基づく比色アッセイ法により、細胞増殖を検出する(Mosman, J. Immunol. Meth. 65: 55-63 (1983))。別のアッセイ形式では、レポーター遺伝子を発現するようにさらに操作された細胞を使用する。レポーター遺伝子を、受容体連関経路に応答するプロモーターエレメントと連結し、アッセイ法によりレポーター遺伝子の転写の活性化を検出する。この点で好ましいプロモーターエレメントは、血清応答エレメントまたはSREである。例えばShaw et al., Cell 56:563-572, (1989)を参照されたい。そのような好ましいレポーター遺伝子はルシフェラーゼ遺伝子である(de Wet et al., Mol. Cell. Biol. 7:725, (1987))。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、当技術分野において公知の方法を用いて発光により検出する(例えば、Baumgartner et al., J. Biol. Chem. 269:29094-29101, (1994)；Schenborn and Goiffin, Promega_Notes 41:11, 1993))。ルシフェラーゼ活性アッセイキットは、例えばPromega Corp.、ウィスコンシン州、マディソンから市販されている。この種の標的細胞株を用いて、化学物質のライブラリー、細胞馴化培地、真菌ブロス、土壌試料、水試料などをスクリーニングすることができる。例えば、細胞馴化培地試料のバンクを標的細胞においてアッセイして、カウンター受容体を産生する細胞を同定することができる。次いで、陽性細胞を用いて哺乳動物発現ベクターにおけるcDNAライブラリーを作製し、これをプールに分割し、宿主細胞にトランスフェクションして、発現させる。次に、トランスフェクションした細胞に由来する培地試料をアッセイし、続いて陽性細胞のプールを分割し、再度トランスフェクションして継代培養し、再度アッセイして、カウンター受容体をコードするクローニングされたcDNAを単離する。
【０２３８】
いくつかのzB7R1反応性細胞株が当技術分野において公知であり、または構築することができ、例としてBaf3/DIRS1/cytoR11細胞株(WO 02/072607)が挙げられる。さらに、いくつかのIL-22反応性細胞株が公知であり(Dumontier et al., J. Immunol. 164:1814-1819, 2000；Dumoutier, L. et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 97:10144-10149, 2000；Xie MH et al., J. Biol. Chem. 275:31335-31339, 2000；Kotenko SV et al., J. Biol. Chem. 276:2725-2732, 2001)、同様にIL-22受容体サブユニットzB7R1を発現する細胞株も公知である。例えば、以下の細胞はIL-22に反応性である：TK-10(Xie MH et al.、前記)(ヒト腎癌)；SW480(ATCC番号CCL-228)(ヒト結腸腺癌)；HepG2(ATCC番号HB-8065)(ヒト肝癌)；PC12(ATCC番号CRL-1721)(マウス神経細胞モデル；ラット褐色細胞腫)；およびMES13(ATCC番号CRL-1927)(マウス腎メサンギウム細胞株)。加えて、zB7R1(IL-22受容体)を発現するいくつかの細胞株もまた、IL-22に対する反応性細胞株の候補である：A549(ATCC番号CCL-185)(ヒト肺癌)；G-361(ATCC番号CRL-1424)(ヒト黒色腫)；およびCaki-1(ATCC番号HTB-46)(ヒト腎癌)。さらに、IL-22反応性細胞株を構築することができ、例として本明細書に記載するBaf3/cytoR11/CRF2-4細胞株が挙げられる(WO 02/12345）。これらの細胞をアッセイ法に使用して、zB7R1もしくはIL-22アンタゴニストまたは抗炎症因子としてのzB7R1の機能性を評価することができる。
【０２３９】
7. zB7R1またはCD155融合タンパク質および複合体の作製
zB7R1またはCD155類似体の1つの一般的なクラスは、本明細書に開示するアミノ酸配列の変異であるアミノ酸配列を有する変種である。zB7R1またはCD155類似体の別の一般的なクラスは、後述するような、抗イディオタイプ抗体およびその断片によって提供される。さらに、抗イディオタイプ可変ドメインを含む組換え抗体を類似体として使用することができる(例えば、Monfardini et al., Proc. Assoc. Am. Physicians 108:420 (1996)を参照されたい）。抗イディオタイプzB7R1抗体の可変ドメインはzB7R1に類似しているため、これらのドメインはzB7R1活性を提供し得る。抗イディオタイプ触媒抗体を作製する方法は、当業者に公知である(例えば、Joron et al., Ann. N Y Acad. Sci. 672:216 (1992)、Friboulet et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 47:229 (1994)、およびAvalle et al., Ann. N Y Acad. Sci. 864:118 (1998)を参照されたい）。
【０２４０】
zB7R1またはCd155類似体を同定するための別のアプローチは、コンビナトリアルライブラリーを用いることによって提供される。ファージディスプレイライブラリーおよびその他のコンビナトリアルライブラリーを構築してスクリーニングする方法は、例えば、Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press 1996)、Verdine、米国特許第5,783,384号、Kay et al.、米国特許第5,747,334号、およびKauffman et al.、米国特許第5,723,323号によって提供される。
【０２４１】
zB7R1およびCD155ポリペプチドは、インビボおよびインビトロ用途の両方を有する。例として、可溶型のzB7R1を細胞培養液に添加して、培養細胞によって産生されるzB7R1カウンター受容体の効果を抑制することができる。
【０２４２】
zB7R1の融合タンパク質を用いて、組換え宿主においてzB7R1を発現させること、および産生されたzB7R1を単離することができる。後述するように、特定のzB7R1融合タンパク質はまた、診断および治療において用いられる。ある種の融合タンパク質は、組換え宿主細胞からzB7R1ポリペプチドを導くペプチドを含む。zB7R1ポリペプチドを真核生物宿主細胞の分泌経路に導くために、分泌シグナル配列(シグナルペプチド、リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列とも称される)がzB7R1発現ベクター中に提供される。分泌シグナル配列はzB7R1に由来してもよいが、適切なシグナル配列は別の分泌タンパク質に由来してもよく、または新規に合成してもよい。分泌シグナル配列は、2つの配列を正確な読み枠で結合し、新たに合成されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に導くよう配置されるように、zB7R1コード配列に機能的に連結する。分泌シグナル配列は一般的に、関心対象のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の5'側に位置するが、ある種のシグナル配列は、関心対象のヌクレオチド配列の他所に位置してもよい(例えば、Welch et al.、米国特許第5,037,743号；Holland et al.、米国特許第5,143,830号を参照されたい）。
【０２４３】
哺乳動物細胞によって産生されるzB7R1または別のタンパク質の分泌シグナル配列(例えば、米国特許第5,641,655号に記載されている組織型プラスミノーゲンアクチベーターのシグナル配列)は、組換え哺乳動物宿主におけるzB7R1の発現に有用であるが、酵母細胞における発現には酵母のシグナル配列が好ましい。適切な酵母シグナル配列の例は、酵母接合フェロモンα因子(MFα1遺伝子によりコードされる)、インベルターゼ(SUC2遺伝子によりコードされる)、または酸性ホスファターゼ(PHO5遺伝子によりコードされる)に由来するシグナル配列である。例えば、Romanos et al., 「Expression of Cloned Genes in Yeast」, DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2nd Edition, Glover and Hames (eds.), pages 123-167 (Oxford University Press 1995)を参照されたい。
【０２４４】
zB7R1可溶性受容体ポリペプチドは、細胞外ドメイン、例えば、配列番号:2もしくは5または非ヒト受容体の対応する領域を含むポリペプチドをコードする切断型DNAを発現させることにより調製することができる。細胞外ドメインポリペプチドは、膜貫通および細胞内ポリペプチド部分を実質的に含まない形態で調製することが好ましい。宿主細胞からの受容体ドメインの輸送を指示するため、受容体DNAは、t-PA分泌ペプチドなどの分泌ペプチドをコードする第2のDNA部分と連結する。分泌される受容体ドメインの精製を容易にするため、ポリヒスチジンタグ、サブスタンスP、Flag(商標)ペプチド(Hopp et al., Biotechnology 6:1204-1210 (1988)；Eastman Kodak Co.、コネチカット州、ニューヘブンから市販されている)、または抗体もしくはその他の特異的結合剤が利用できる別のポリペプチドもしくはタンパク質などのC末端伸長を、受容体ポリペプチドに融合することができる。さらに、細胞外サイトカイン結合ドメインに由来するzB7R1抗原エピトープもまた、上記の通りに調製される。
【０２４５】
別のアプローチにおいては、zB7R1またはその他のB7受容体成分の受容体細胞外ドメインを、免疫グロブリン重鎖定常領域、典型的に2つの定常領域ドメインおよびヒンジ領域を含むが可変領域を欠くFc断片との融合物として発現させることができる(Sledziewski, AZ et al.、米国特許第6,018,026号および同第5,750,375号を参照されたい)。本発明の可溶性zB7R1ポリペプチドには、そのような融合物が含まれる。このような融合物は典型的に、Fc部分が相互にジスルフィド結合し、2つの受容体ポリペプチドが相互に近接して配置された多量体分子として分泌される。この種の融合物は、インビトロアッセイ手段として溶液から同族カウンター受容体をアフィニティー精製するため、カウンター受容体を特異的に滴定することによりインビトロでシグナルを遮断する、抑制する、または減少させるため、および融合物を非経口投与して循環するカウンター受容体と結合させ、それをこの循環から除去することによるインビボでのアンタゴニストとして用いることができる。カウンター受容体を精製するためには、zB7R1-Igキメラを、受容体-カウンター受容体結合を促進する条件(典型的には、生理的温度、pH、およびイオン強度近傍)下で、カウンター受容体を含む試料(例えば、細胞馴化培地または組織抽出物)に添加する。次いで、キメラ-カウンター受容体複合体を、固体支持体(例えば、不溶性樹脂ビーズ)上に固定化されたプロテインAを用いて混合物から分離する。次に、塩またはpH勾配を用いるなど、従来の化学的技法により、カウンター受容体を溶出する。別法では、キメラ自体を固体支持体に結合し、結合および溶出を上記の通り行うことができる。キメラは、血清アミロイドA(SAA)、C反応性タンパク質(CRP)などの急性期応答を含む炎症反応を調節するために、インビボで用いることができる。高い結合親和性を有するキメラを、(例えば、筋肉内、皮下、または静脈内注入により)非経口投与する。循環する分子はカウンター受容体と結合し、通常の生理的過程により循環から除去される。アッセイ法に用いるためには、Fc領域を介してキメラを支持体に結合し、ELISA形式で使用する。
【０２４６】
本発明の抗zB7R1および結合パートナーの単離を支援するためには、カウンター受容体結合受容体(または、抗体、相補物/抗相補物対の1つのメンバー)またはその結合断片および市販のバイオセンサー装置(BIAcore、Pharmacia Biosensor、ニュージャージー州、ピスカタウェイ)を用いるアッセイ系を有利に使用することができる。そのような受容体、抗体、相補物/抗相補物対のメンバー、または断片は、受容体チップの表面上に固定化する。この装置の使用は、Karlsson, J. Immunol. Methods 145:229-40, 1991、およびCunningham and Wells, J. Mol. Biol. 234:554-63, 1993により開示されている。受容体、抗体、メンバー、または断片は、アミンまたはスルフヒドリル化学を用いて、フローセル内の金フィルムに結合しているデキストラン繊維に共有結合する。被験試料にセルを通過させる。カウンター受容体、エピトープ、または相補物/抗相補物対の逆のメンバーが試料中に存在する場合、これはそれぞれ固定化された受容体、抗体、またはメンバーに結合し、媒体の屈折率の変化が生じ、金フィルムの表面プラズモン共鳴の変化として検出される。この系により、そこから結合親和性を計算することができるオン速度およびオフ速度の決定、ならびに結合の化学量論の評価が可能になる。または、カウンター受容体/受容体結合は、SELDI(商標)技術(Ciphergen, Inc.、カリフォルニア州、パロアルト)を用いて解析することもできる。さらに、上記のBIACORE技術を競合実験において用いて、異なるモノクローナル抗体がzB7R1ポリペプチド上の同じエピトープと結合するのかまたは異なるエピトープと結合するのかを決定することができ、したがって本発明の抗体のエピトープマッピングを支援することができる。
【０２４７】
カウンター受容体結合ポリペプチド(すなわち、CD155)はまた、当技術分野において公知の他のアッセイ系において使用することもできる。そのような系には、結合親和性を決定するためのスキャッチャード解析(Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660-72, 1949を参照されたい)、および熱量測定アッセイ法(Cunningham et al., Science 253:545-48, 1991；Cunningham et al., Science 245:821-25, 1991)が含まれる。
【０２４８】
本発明はさらに、種々の他のポリペプチド融合物、および1つまたは複数のポリペプチド融合物を含む関連の多量体タンパク質を提供する。例えば、可溶性zB7R1受容体は、米国特許第5,155,027号および同第5,567,584号に開示されている二量体化タンパク質との融合物として調製することができる。この点における好ましい二量体化タンパク質には、免疫グロブリン定常領域ドメイン、例えばIgGγ1およびヒトκ軽鎖が含まれる。免疫グリブリン-可溶性zB7R1融合物を遺伝子改変細胞において発現させて、種々の多量体zB7R1受容体類似体を生成することができる。補助的ドメインを可溶性zB7R1受容体と融合して、これを特定の細胞、組織、または高分子(例えば、コラーゲン、またはzB7R1カウンター受容体を発現している細胞)に標的化することができる。zB7R1ポリペプチドは、精製のための親和性タグおよび標的化ドメインなどの2つまたはそれ以上の部分と融合することもできる。ポリペプチド融合物はまた、1つまたは複数の切断部位を特にドメイン間に含んでもよい。Tuan et al., Connective Tissue Research 34:1-9, 1996を参照されたい。
【０２４９】
細菌細胞では、発現されるタンパク質の毒性を低減し、安定性を高め、また回収を増進させるために、異種タンパク質を融合タンパク質として発現させることが望ましい場合がある。例えば、zB7R1は、グルタチオンS-トランスフェラーゼポリペプチドを含む融合タンパク質として発現させることができる。グルタチオンS-トランスフェラーゼ融合タンパク質は典型的に可溶性であり、固定化グルタチオンカラムで大腸菌溶解液から容易に精製することができる。同様のアプローチにおいて、マルトース結合タンパク質ポリペプチドを含むzB7R1融合タンパク質を、アミロース樹脂カラムで単離することができ、また切断型プロテインA遺伝子のC末端を含む融合タンパク質を、IgG-セファロースを用いて精製することができる。異種ポリペプチドを融合タンパク質として細菌細胞中で発現させる確立された技法は、例えば、Williams et al., 「Expression of Foreign Proteins in E. coli Using Plasmid Vectors and Purification of Specific Polyclonal Antibodies」, DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2nd Edition, Glover and Hames (Eds.), pages 15-58 (Oxford University Press 1995)により記載されている。さらに、市販の発現系を利用することができる。例えば、PINPOINT Xaタンパク質精製システム(Promega Corporation；ウィスコンシン州、マディソン)は、発現中にビオチン化されるポリペプチドを含む融合タンパク質を、アビジンを含む樹脂によって単離する方法を提供する。
【０２５０】
原核細胞または真核細胞により発現される異種ポリペプチドを単離するのに有用なペプチドタグには、ポリヒスチジンタグ(ニッケルキレート樹脂に対する親和性を有する)、c-mycタグ、カルモジュリン結合タンパク質(カルモジュリンアフィニティークロマトグラフィーで単離される)、サブスタンスP、RYIRSタグ(抗RYIRS抗体と結合する)、Glu-Gluタグ、およびFLAGタグ(抗FLAG抗体と結合する)が含まれる。例えば、Luo et al., Arch. Biochem. Biophys. 329:215 (1996)、Morganti et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 23:67 (1996)、およびZheng et al., Gene 186:55 (1997)を参照されたい。このようなペプチドタグをコードする核酸分子は、例えばSigma-Aldrich Corporation(ミズーリ州、セントルイス)から入手することができる。
【０２５１】
融合タンパク質の別の形態は、zB7R1ポリペプチドおよび免疫グロブリン重鎖定常領域、典型的に2つまたは3つの定常領域ドメインおよびヒンジ領域を含むが可変領域を欠くFc断片を含む。例として、Chang et al.、米国特許第5,723,125号では、ヒトインターフェロンおよびヒト免疫グロブリンFc断片を含む融合タンパク質について記載している。インターフェロンのC末端は、ペプチドリンカー部分によりFc断片のN末端に連結される。ペプチドリンカーの例は、免疫学的に不活性なT細胞不活性配列を主に含むペプチドである。このような融合タンパク質において、例証となるFc部分は、溶液中で安定であり、かつ補体活性化活性をほとんどもたないヒトγ4鎖である。したがって本発明は、zB7R1部分のC末端がペプチドリンカーを介してFc断片のN末端に結合している、zB7R1部分およびヒトFc断片を含むzB7R1融合タンパク質を意図する。zB7R1部分は、zB7R1分子であってもその断片であってもよい。例えば、融合タンパク質は、配列番号:3のアミノ酸およびFc断片(例えば、ヒトFc断片)を含み得る。
【０２５２】
別の変形例では、zB7R1融合タンパク質は、IgG配列、IgG配列のアミノ末端に共有結合したzB7R1部分、およびzB7R1部分のアミノ末端に共有結合したシグナルペプチドを含み、IgG配列は以下の順序で以下のエレメントからなる：ヒンジ領域、CH2ドメイン、およびCH3ドメイン。したがって、IgG配列はCH1ドメインを欠いている。zB7R1部分は、zB7R1カウンター受容体と結合する能力など、本明細書に記載のzB7R1活性を示す。抗体部分および非抗体部分の両方を含む融合タンパク質を作製するこの一般的なアプローチは、LaRochelle et al., EP 742830(WO 95/21258)により記載されている。
【０２５３】
zB7R1部分およびFc部分を含む融合タンパク質は、例えばインビトロアッセイ手段として使用することができる。例えば、zB7R1-免疫グロブリン融合タンパク質を用いて生物試料中のzB7R1カウンター受容体の存在を検出することができ、この場合、zB7R1部分はカウンター受容体と結合するために用いられ、プロテインAまたは抗Fc抗体などの高分子が、融合タンパク質を固体支持体に結合するために用いられる。このような系を用いて、zB7R1とそのカウンター受容体との結合を妨げるアゴニストおよびアンタゴニストを同定することができる。
【０２５４】
抗体融合タンパク質のその他の例には、抗原結合ドメイン、およびzB7R1細胞外ドメインを含むzB7R1断片を含むポリペプチドが含まれる。このような分子は、zB7R1結合活性のために特定の組織を標的化する目的で用いることができる。
【０２５５】
本発明はさらに、種々のその他のポリペプチド融合物を提供する。例えば、生物学的機能を付与するドメインの一部またはすべてを、本発明のzB7R1と、サイトカイン受容体ファミリーの別のメンバーに由来する機能的に等価なドメインとの間で交換することができる。ポリペプチド融合物を組換え宿主細胞で発現させて、種々のzB7R1融合類似体を生成することができる。zB7R1ポリペプチドは、精製のための親和性タグおよび標的化ドメインなどの2つまたはそれ以上の部分またはドメインと融合することができる。ポリペプチド融合物はまた、1つまたは複数の切断部位を特にドメイン間に含んでもよい。例えば、Tuan et al., Connective Tissue Research 34:1 (1996)を参照されたい。
【０２５６】
融合タンパク質は、融合タンパク質の各成分を調製して、成分を化学的に結合することにより、当技術分野で公知の方法によって調製することができる。または、融合タンパク質の両成分を適切な読み枠でコードするポリヌクレオチドを公知の技法で作製して、本明細書に記載する方法により発現させることができる。融合タンパク質の酵素的切断および化学的切断の一般的な方法は、例えば、Ausubel (1995), pages 16-19〜16-25によって記載されている。
【０２５７】
zB7R1結合ドメインは、zB7R1カウンター受容体アゴニストの推定接触部位アミノ酸の変異と併用して、核磁気共鳴、結晶解析、電子線回折、または光親和性標識のような技法で決定される構造の物理的解析によって、さらに特徴づけることができる。例えば、de Vos et al., Science 255:306 (1992)、Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899 (1992)、およびWlodaver et al., FEBS Lett. 309:59 (1992)を参照されたい。
【０２５８】
本発明はまた、zB7R1ポリペプチドがポリマーと連結された、化学的に修飾されたzB7R1組成物を意図する。例示的なzB7R1ポリペプチドは、アミノ酸残基配列番号:3からなるポリペプチドのような、機能的な膜貫通ドメインを欠く可溶性ポリペプチドである。典型的にポリマーは水溶性であり、そのためzB7R1複合体は生理環境などの水性環境で沈殿しない。適切なポリマーの例は、アシル化用の活性エステルまたはアルキル化用のアルデヒドなどの単一の反応基を有するように修飾されたポリマーである。このようにすることで、重合の程度を制御することができる。反応性アルデヒドの例は、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはそのモノ-(C1〜C10)アルコキシもしくはアリールオキシ誘導体である(例えば、Harris et al.、米国特許第5,252,714号を参照されたい)。このようなポリマーは、分枝状であっても非分枝状であってもよい。さらに、ポリマーの混合物を用いてzB7R1複合体を作製することもできる。
【０２５９】
治療に用いられるzB7R1複合体は、薬学的に許容される水溶性ポリマー部分を含むべきである。適切な水溶性ポリマーには、ポリエチレングリコール(PEG)、モノメトキシ-PEG、モノ-(C1〜C10)アルコキシ-PEG、アリールオキシ-PEG、ポリ-(N-ビニルピロリドン)PEG、トレシルモノメトキシPEG、PEGプロピオンアルデヒド、ビス-スクシンイミジルカーボネートPEG、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、デキストラン、セルロース、またはその他の炭水化物に基づくポリマーが含まれる。適切なPEGは、例えば5,000、12,000、20,000、および25,000を含む約600〜約60,000の分子量を有し得る。zB7R1複合体はまた、そのような水溶性ポリマーの混合物を含んでもよい。
【０２６０】
zB7R1複合体の一例は、zB7R1部分、およびzB7R1部分のN末端に結合されたポリアルキルオキシド部分を含む。PEGは、1つの適切なポリアルキルオキシドである。例として、zB7R1はPEGで修飾することができ、その過程は「ペグ化」として知られている。zB7R1のペグ化は、当技術分野において公知であるペグ化反応のいずれかによって行うことができる(例えば、EP 0 154 316, Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249 (1992)、Duncan and Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27:290 (1994)、および Francis et al., Int J Hematol 68:1 (1998)を参照されたい)。例えば、ペグ化は、反応性ポリエチレングリコール分子を用いたアシル化反応またはアルキル化反応によって行うことができる。別のアプローチでは、zB7R1複合体は、PEGの末端水酸基またはアミノ基が活性化リンカーによって置換されている活性化PEGを濃縮することによって形成される(例えば、Karasiewicz et al.、米国特許第5,382,657号を参照されたい)。
【０２６１】
アシル化によるペグ化は典型的に、PEGの活性エステル誘導体とzB7R1ポリペプチドとを反応させることを必要とする。活性化PEGエステルの例は、N-ヒドロキシスクシンイミドにエステル化されたPEGである。本明細書で用いる「アシル化」という用語には、zB7R1と水溶性ポリマーとの以下の種類の結合が含まれる：アミド、カルバメート、ウレタンなど。アシル化によってペグ化zB7R1を調製する方法は、典型的に、(a) 1つまたは複数のPEG基がzB7R1に結合する条件下で、zB7R1ポリペプチドをPEG(PEGのアルデヒド誘導体の反応性エステルなど)と反応させる段階、および(b) 1つまたは複数の反応産物を得る段階を含む。一般に、アシル化反応の最適な反応条件は、公知のパラメータおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、PEG：zB7R1の比が大きいほど、ポリペグ化zB7R1産物の割合は大きくなる。
【０２６２】
アシル化によるペグ化産物は典型的に、リジンε-アミノ基がアシル連結基を介してペグ化されたポリペグ化zB7R1産物である。連結する結合の例はアミドである。典型的に、得られるzB7R1は少なくとも95%がモノペグ化、ジペグ化、またはトリペグ化されているが、反応条件に応じてより高次のペグ化が形成される場合もある。ペグ化種は、透析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの標準的な精製法を用いて、非結合zB7R1ポリペプチドから分離することができる。
【０２６３】
アルキル化によるペグ化は一般に、還元剤の存在下で、PEGの末端アルデヒド誘導体をzB7R1と反応させることを含む。PEG基は、-CH2-NH基を介してポリペプチドに結合され得る。
【０２６４】
さらに、本発明の抗zB7R1抗体または抗体断片を、本明細書に記載する当技術分野における方法を用いてペグ化することができる。
【０２６５】
モノペグ化産物を生成するための還元的アルキル化による誘導体化は、誘導体化に利用される異なる種類の一級アミノ基の異なる反応性を利用している。典型的に反応は、リジン残基のε-アミノ基とタンパク質のN末端残基のα-アミノ基とのpKaの差を利用できるpHで行われる。そのような選択的誘導体化により、アルデヒドなどの反応基を含む水溶性ポリマーのタンパク質への結合が制御される。ポリマーとの結合は、リジン側鎖アミノ基などの他の反応基を有意に修飾することなく、主にタンパク質のN末端で起こる。本発明は、zB7R1モノポリマー複合体の実質的に均一な調製物を提供する。
【０２６６】
モノポリマーzB7R1複合体分子の実質的に均一な集団を生成するための還元的アルキル化は、(a) zB7R1のアミノ末端でのα-アミノ基の選択的修飾を可能にするのに適したpHにおける還元的アルキル化条件下で、zB7R1ポリペプチドを反応性PEGと反応させる段階、および(b) 反応産物を得る段階を含み得る。還元的アルキル化に使用する還元剤は、水溶液中で安定であるべきであり、かつ還元的アルキル化の初期過程で形成されるシッフ塩基のみを還元し得るべきである。例示的な還元剤には、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン、およびピリジンボランが含まれる。
【０２６７】
モノポリマーzB7R1複合体の実質的に均一な集団に関して、還元的アルキル化反応条件は、zB7R1のN末端に対する水溶性ポリマー部分の選択的結合を可能とする条件である。そのような反応条件は一般に、リジンアミノ基とN末端のαアミノ基とのpKaの差を提供する。pHはまた、使用するポリマーとタンパク質の比に影響を及ぼす。一般に、N末端α基の反応性が低いほど最適な条件を得るためにより多くのポリマーを必要とすることから、pHが低いほど、タンパク質に対してより過剰なポリマーが必要となる。pHが高ければ、より多くの反応基を利用できることから、ポリマー：zB7R1はそれほど大きい必要はない。典型的に、pHは3〜9または3〜6の範囲内である。この方法は、zB7R1含有ホモ二量体、ヘテロ二量体、または多量体可溶性受容体複合体を作製するために用いることができる。
【０２６８】
検討すべき別の要因は、水溶性ポリマーの分子量である。一般に、ポリマーの分子量が大きいほど、タンパク質に結合され得るポリマー分子の数は減少する。ペグ化反応に関して、典型的な分子量は、約2 kDa〜約100 kDa、約5 kDa〜約50 kDa、または約12 kDa〜約25 kDaである。水溶性ポリマーとzB7R1のモル比は、一般に1:1〜100:1の範囲である。典型的に、水溶性ポリマーとzB7R1のモル比は、ポリペグ化に関して1:1〜20:1であり、モノペグ化に関して1:1〜5:1である。
【０２６９】
ポリペプチドおよび水溶性ポリマー部分を含む複合体を作製する一般的な方法は、当技術分野において公知である。例えば、Karasiewicz et al.、米国特許第5,382,657号、Greenwald et al.、米国特許第5,738,846号、Nieforth et al., Clin. Pharmacol. Ther. 59:636 (1996)、Monkarsh et al., Anal. Biochem. 247:434 (1997)を参照されたい。この方法は、zB7R1含有ホモ二量体、ヘテロ二量体、または多量体可溶性受容体複合体を作製するために用いることができる。
【０２７０】
本発明は、本明細書に記載の可溶性受容体または抗体などのペプチドまたはポリペプチドを含む組成物を意図する。そのような組成物は担体をさらに含み得る。担体は、従来の有機担体または無機担体であってよい。担体の例には、水、緩衝液、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などが含まれる。
【０２７１】
8. zB7R1またはCD155ポリペプチドの単離
本発明のポリペプチドは、混入する高分子、特に他のタンパク質および核酸に関して少なくとも約80%の純度まで、少なくとも約90%の純度まで、少なくとも約95%の純度まで、または95%を超える純度(96%、97%、98%、または99%を超える純度など)まで精製することができ、また感染物質および発熱物質を含まない。本発明のポリペプチドはまた、99.9%を超える純度である薬学的に純粋な状態まで精製することもできる。ある種の調製物において、精製ポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。
【０２７２】
分画法および/または従来の精製法を用いて、天然源(例えば、ヒト組織源)から精製されたzB7R1(またはCD155)の調製物、合成zB7R1ポリペプチド、ならびに組換え宿主細胞から精製された組換えzB7R1ポリペプチドおよび融合zB7R1ポリペプチドを得ることができる。一般に、試料の分画には、硫酸アンモニウム沈殿および酸またはカオトロープ抽出を用いることができる。例示的な精製段階は、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、FPLC、および逆相高速液体クロマトグラフィーを含み得る。適切なクロマトグラフィー媒体には、誘導体化デキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、専用のシリカなどが含まれる。PEI、DEAE、QAE、およびQの誘導体が適している。例示的なクロマトグラフィー媒体には、Phenyl-Sepharose FF(Pharmacia)、Toyopearl butyl 650(Toso Haas、ペンシルバニア州、モンゴメリービル)、Octyl-Sepharose(Pharmacia)などの、フェニル基、ブチル基、もしくはオクチル基で誘導体化された媒体；またはAmberchrom CG 71(Toso Haas)などのポリアクリル樹脂が含まれる。適切な固体支持体には、使用時の条件下で不溶性であるガラスビーズ、シリカに基づく樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋ポリアクリルアミド樹脂などが含まれる。これらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、および/または炭水化物部分でのタンパク質の結合を可能にする反応基で修飾することができる。
【０２７３】
カップリング化学の例には、臭化シアン活性化、N-ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化、ならびにカルボジイミドカップリング化学のためのカルボキシル誘導体およびアミノ誘導体が含まれる。これらのおよびその他の固体媒体は当技術分野において周知であって、広く使用されており、また市販業者から入手することができる。ポリペプチドを単離および精製するための特定の方法の選択は、常用的な設計の問題であり、一つには選択した支持体の性質によって決定される。例えば、Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology、1988)、およびDoonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press 1996)を参照されたい。
【０２７４】
zB7R1(またはCD155)の単離および精製のさらなる変形例を当業者は考案することができる。例えば、下記のように得られた抗zB7R1抗体を用いて、免疫アフィニティー精製により大量のタンパク質を単離することができる。
【０２７５】
本発明のポリペプチドはまた、特定の性質を利用して単離することもできる。例えば、固定化金属イオン吸着(IMAC)クロマトグラフィーにより、ポリヒスチジンタグを含むタンパク質を含むタンパク質をはじめとする、ヒスチジンに富んだタンパク質を精製することができる。簡潔に説明すると、最初にゲルに二価金属イオンを充填し、キレートを形成する(Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1 (1985))。ヒスチジンに富んだタンパク質は、使用した金属イオンに依存して様々な親和性でこの基質に吸着され、競合溶出、pHの低下、または強力なキレート剤の使用により溶出される。他の精製法には、レクチンアフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化タンパク質の精製が含まれる(M. Deutscher, (ed.), Meth. Enzymol. 182:529 (1990))。本発明のさらなる態様では、関心対象のポリペプチドとアフィニティータグ(例えば、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリンドメイン)との融合物を構築することで、精製が促進され得る。さらに、zB7R1細胞外ドメインのカウンター受容体結合特性を、例えばzB7R1含有可溶性受容体の精製に利用することができ；例えばこれは、適切なカウンター受容体をカラムに結合しておき、zB7R1含有受容体を結合させ、その後標準的なクロマトグラフィー法を用いて溶出するアフィニティークロマトグラフィーによる。
【０２７６】
zB7R1(またはCD155)ポリペプチドまたはその断片は、上記のように化学合成により調製することもできる。zB7R1ポリペプチドは、単量体の場合もあれば多量体の場合もあり；グリコシル化される場合もあればグリコシル化されない場合もあり；ペグ化される場合もあればペグ化されない場合もあり；最初のメチオニンアミノ酸残基を含む場合もあれば含まない場合もある。
【０２７７】
9. zB7R1タンパク質に対する抗体の作製
zB7R1に対する抗体は、例えばzB7R1発現ベクターの産物、または天然源から単離されたzB7R1を抗原として用いることで得ることができる。特に有用な抗zB7R1抗体は、zB7R1と「特異的に結合する」。抗体が以下の2つの特徴の少なくとも1つを示す場合に、抗体は特異的に結合すると見なされる：(1) 抗体がzB7R1と結合活性の閾値レベルで結合する、および(2) 抗体がzB7R1に関連するポリペプチドと有意に交差反応しない。
【０２７８】
第1の特徴に関しては、抗体がzB7R1ポリペプチド、ペプチド、またはエピトープと106 M-1またはそれ以上、好ましくは107 M-1またはそれ以上、より好ましくは108 M-1またはそれ以上、最も好ましくは109 M-1またはそれ以上の結合親和性(Ka)で結合する場合に、抗体は特異的に結合する。抗体の結合親和性は、例えばスキャッチャード解析(Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660 (1949))により、当業者によって容易に決定され得る。第2の特徴に関しては、例えば抗体が標準的なウェスタンブロット解析でzB7R1を検出するが、現在知られているポリペプチドを検出しない場合に、抗体は関連ポリペプチド分子と有意に交差反応しない。公知の関連ポリペプチドの例には、公知のサイトカイン受容体が含まれる。
【０２７９】
抗zB7R1抗体は、抗原性zB7R1エピトープ含有ペプチドおよびポリペプチドを用いて作製することができる。本発明の抗原エピトープ含有ペプチドおよびポリペプチドは、配列番号:2または本明細書に開示する別のアミノ酸配列内に含まれる少なくとも9個、または15〜約30個のアミノ酸の配列を含む。しかし、30〜50アミノ酸、または本発明のポリペプチドの全アミノ酸配列までを含む任意の長さを含む、本発明のアミノ酸配列のより大きな部分を含むペプチドまたはポリペプチドも、zB7R1と結合する抗体を誘導するのに有用である。エピトープ含有ペプチドのアミノ酸配列が、水性溶媒中で実質的な溶解性を提供するように選択されることが望ましい(すなわち、配列は比較的親水性の残基を含み、疎水性残基は典型的に回避される)。さらに、プロリン残基を含むアミノ酸配列も抗体産生に望ましい場合がある。
【０２８０】
例として、zB7R1の潜在的抗原部位は、LASERGENE(DNASTAR；ウィスコンシン州、マディソン)のPROTEANプログラム(バージョン3.14)により実行されるJameson-Wolf法(Jameson and Wolf, CABIOS 4:181, (1988))を用いて同定した。この解析では、初期設定パラメータを用いた。
【０２８１】
Jameson-Wolf法では、タンパク質構造予測の6つの主要なサブルーチンを組み合わせることにより、潜在的抗原決定基を予測する。簡潔に説明すると、最初にHopp-Woods法(Hopp et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 78:3824 (1981))を用いて、局所的親水性が最も高い領域を示すアミノ酸配列を同定した(パラメータ：平均7残基)。第2段階では、Eminiの方法(Emini et al., J. Virology 55:836 (1985))を用いて表面確率を計算した(パラメータ：表面決定閾値(0.6)＝1)。第3に、Karplus-Schultz法(Karplus and Schultz, Naturwissenschaften 72:212 (1985))により骨格鎖の柔軟性を予測した(パラメータ：柔軟性閾値(0.2)＝1)。解析の第4および第5段階では、Chou-Fasmanの方法(Chou, 「Prediction of Protein Structural Classes from Amino Acid Composition」, Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, Fasman (ed.), pages 549-586 (Plenum Press 1990))およびGarnier-Robsonの方法(Garnier et al., J. Mol. Biol. 120:97 (1978))を用いて、二次構造予測をデータに適用した(Chou-Fasmanパラメータ：高次構造表＝64タンパク質；α領域閾値＝103；β領域閾値＝105；Garnier-Robsonパラメータ：αおよびβ決定定数＝0)。第6のサブルーチンでは、柔軟性パラメータと疎水性親水性指標/溶媒露出度因子を組み合わせて、「抗原指標」と命名された表面輪郭値を決定した。最後に、内部領域に対する表面領域の可動性に由来するさらなる自由エネルギーを説明するために、各ピーク値の20、40、60、または80%を付加することによって主要な表面ピークを拡大するピーク拡大関数を抗原指標に適用した。しかし、ヘリックス領域は柔軟性に劣る傾向があるため、この計算はヘリックス領域内に存在する主要なピークには適用しなかった。
【０２８２】
この解析の結果から、配列番号:2の以下のアミノ酸配列が適切な抗原ペプチドを提供することが示唆された：Hopp/Woods親水性プロファイルを用いて、配列番号:3において最も抗原性が高い可能性がある領域を決定することができる(Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78:3824-3828, 1981；Hopp, J. Immun. Meth. 88:1-18, 1986、およびTriquier et al., Protein Engineering 11:153-169, 1998）。このプロファイルは、スライドする6残基領域に基づく。埋もれたG、S、およびT残基、ならびに露出しているH、Y、およびW残基は無視した。さらに、例えばDNASTAR Proteanプログラム(DNASTAR, Inc.、ウィスコンシン州、マディソン)を用いてJameson-Wolfプロットにより予測される、配列番号:2におけるzB7R1抗原エピトープは、好ましい抗原エピトープとして役立ち、当業者によって決定することができる。このような抗原エピトープには、(1) (1) 配列番号:2のアミノ酸残基80〜86；(2) 配列番号:2のアミノ酸残基163〜170；(3) 配列番号:2のアミノ酸残基163〜190；(4) 配列番号:2のアミノ酸残基175〜190；および(5) 配列番号:2のアミノ酸残基211〜221が含まれる。本発明は、zB7R1に対する抗体を作製するため、または本発明の中和モノクローナル抗体をスクリーニングするもしくは同定するための手段としての、抗原ペプチド1〜5のいずれか1つの使用を意図する。本発明は、zB7R1に対する抗体を作製するため、ならびにzB7R1カウンター受容体の活性を結合し得る、作動させ得る、遮断し得る、抑制し得る、減少させ得る、増加させ得る、拮抗し得る、または中和し得る抗zB7R1モノクローナル抗体を同定およびスクリーニングするための、本明細書に記載の任意の抗原ペプチドまたはエピトープの使用を意図する。
【０２８３】
組換えzB7R1タンパク質、または天然源から単離されたzB7R1に対するポリクローナル抗体は、当業者に周知の方法を用いて調製することができる。例えば、Green et al., 「Production of Polyclonal Antisera」, Immunochemical Protocols (Manson, ed.), pages 1-5 (Humana Press 1992)、およびWilliams et al., 「Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies」, DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 15 (Oxford University Press 1995)を参照されたい。zB7R1ポリペプチドの免疫原性は、ミョウバン(水酸化アルミニウム)またはフロイントの完全アジュバントもしくは不完全アジュバントなどのアジュバントを使用することで増大させることができる。免疫化に有用なポリペプチドには、zB7R1またはその一部と免疫グロブリンポリペプチドまたはマルトース結合タンパク質との融合物などの融合ポリペプチドもまた含まれる。ポリペプチド免疫原は、全長分子である場合もあれば、またはその一部である場合もある。ポリペプチド部分が「ハプテン様」である場合には、免疫化のためにこのような部分を高分子担体(キーホールリンペットヘモシニアン(KLH)、ウシ血清アルブミン(BSA)、または破傷風トキソイドなど)と有利に結合または連結することができる。
【０２８４】
ポリクローナル抗体は典型的に、ウマ、ウシ、イヌ、ニワトリ、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ヤギ、またはヒツジなどの動物で産生させるが、本発明の抗zB7R1抗体は類人猿の抗体に由来してもよい。診断上および治療上有用な抗体をヒヒで作製する一般的な技法は、例えば、Goldenberg et al. WO 91/11465、およびLosman et al., Int. J. Cancer 46:310 (1990)に見出すことができる。
【０２８５】
または、モノクローナル抗zB7R1抗体を作製することができる。特定抗原に対するげっ歯類モノクローナル抗体は、当業者に周知の方法により得ることができる(例えば、Kohler et al., Nature 256:495 (1975)、Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, Vol. 1, pages 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) [「Coligan」]、Picksley et al., 「Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli」, DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 93 (Oxford University Press 1995)を参照されたい)。
【０２８６】
簡潔に説明すると、zB7R1遺伝子産物を含む組成物をマウスに注射し、血清試料を採取して抗体産生の存在を確認し、脾臓を摘出してBリンパ球を取得し、Bリンパ球と骨髄腫細胞を融合してハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマをクローニングし、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養し、ハイブリドーマ培養物から抗体を単離することにより、モノクローナル抗体を得ることができる。
【０２８７】
さらに、本発明の抗zB7R1抗体は、ヒトモノクローナル抗体に由来してもよい。ヒトモノクローナル抗体は、抗原投与に応答して特定のヒト抗体を産生するように操作されたトランスジェニックマウスから得られる。この技法では、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座のエレメントが、内因性重鎖および軽鎖遺伝子座の標的破壊を含む胚性幹細胞株に由来するマウスの系列に導入される。このトランスジェニックマウスはヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、このマウスを用いてヒト抗体を分泌するハイブリドーマを作製することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、例えば、Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994)、Lonberg et al., Nature 368:856 (1994)、およびTaylor et al., Int. Immun. 6:579 (1994)によって記載されている。
【０２８８】
モノクローナル抗体は、種々の十分に確立した技法により、ハイブリドーマ培養物から単離および精製することができる。このような単離技法には、プロテインAセファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが含まれる(例えば、Coligan, pages 2.7.1-2.7.12およびpages 2.9.1-2.9.3；Baines et al., 「Purification of Immunoglobulin G (IgG)」, Methods in Molecular Biology, Vol. 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)を参照されたい)。
【０２８９】
特定の用途に関しては、抗zB7R1抗体の断片を調製することが望ましい場合がある。このような抗体断片は、例えば抗体のタンパク質加水分解によって得ることができる。抗体断片は、従来法による抗体全体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる。例として、抗体断片は、抗体をペプシンで酵素切断してF(ab')2と称される5S断片を提供することにより、作製され得る。この断片をチオール還元剤でさらに切断することで、3.5S Fab'一価断片を作製することができる。任意に、ジスルフィド結合の切断で生じるスルフヒドリル基に対する保護基を用いて、切断反応を行うことができる。別の方法として、ペプシンによる酵素切断により、2つの一価Fab断片およびFc断片が直接得られる。これらの方法は、例えば、Goldenberg、米国特許第4,331,647号、Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89:230 (1960)、Porter, Biochem. J. 73:119 (1959)、Edelman et al., Methods in Enzymology Vol. 1, page 422 (Academic Press 1967)、ならびにColigan, pages 2.8.1-2.8.10および2.10.-2.10.4によって記載されている。
【０２９０】
断片が、完全な抗体によって認識される抗原に結合する限りにおいて、重鎖の分離による一価の軽鎖-重鎖断片の形成、断片のさらなる切断、または他の酵素的、化学的、もしくは遺伝学的技法などの他の抗体切断法を用いることも可能である。
【０２９１】
例えば、Fv断片はVH鎖とVL鎖の結合を含む。この結合は、Inbar et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659 (1972)によって記載されているように、非共有結合であってよい。または、可変鎖は、分子間ジスルフィド結合により連結され得るか、またはグルタルアルデヒドなどの化学物質により架橋され得る(例えば、Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992)を参照されたい)。
【０２９２】
Fv断片は、ペプチドリンカーにより連結されたVH鎖およびVL鎖を含み得る。このような1本鎖抗原結合タンパク質(scFv)は、オリゴヌクレオチドにより連結されたVHドメインおよびVLドメインをコードするDNA配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。この構造遺伝子は発現ベクターに挿入され、この発現ベクターは次に大腸菌などの宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞は、2つのVドメインを架橋するリンカーペプチドを伴う1本のポリペプチド鎖を合成する。scFvを作製する方法は、例えば、Whitlow et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97 (1991)により記載されている(Bird et al., Science 242:423 (1988)、Ladner et al.、米国特許第4,946,778号、Pack et al., Bio/Technology 11:1271 (1993)、およびSandhu、前記もまた参照されたい)。
【０２９３】
例として、インビトロでリンパ球をzB7R1ポリペプチドに曝露し、ファージまたは類似のベクターの抗体ディスプレイライブラリーを選択することにより(例えば、固定化または標識zB7R1タンパク質またはペプチドを用いて)、scFvを得ることができる。潜在的なzB7R1ポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ(ファージディスプレイ)または大腸菌などの細菌上に提示されたランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ランダム突然変異誘発およびランダムポリヌクレオチド合成によるなど、いくつかの方法で得ることができる。これらのランダムペプチドディスプレイライブラリーを用いて、カウンター受容体もしくは受容体などのタンパク質もしくはポリペプチド、生体高分子もしくは合成高分子、または有機物質もしくは無機物質であり得る公知の標的と相互作用するペプチドをスクリーニングすることができる。このようなランダムペプチドディスプレイライブラリーを作製およびスクリーニングする技法は当技術分野において公知であり(Ladner et al.、米国特許第5,223,409号、Ladner et al.、米国特許第4,946,778号、Ladner et al.、米国特許第5,403,484号、Ladner et al.、米国特許第5,571,698号、およびKay et al., Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press, Inc. 1996))、またランダムペプチドディスプレイライブラリーおよびこのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えば、CLONTECH Laboratories, Inc.(カリフォルニア州、パロアルト)、Invitrogen Inc.(カリフォルニア州、サンディエゴ)、New England Biolabs, Inc.(マサチューセッツ州、ベバリー)、およびPharmacia LKB Biotechnology Inc.(ニュージャージー州、ピスカタウェイ)から市販されている。本明細書に開示したzB7R1配列を用いてランダムペプチドディスプレイライブラリーをスクリーニングし、zB7R1に結合するタンパク質を同定することができる。
【０２９４】
別の形態の抗体断片は、単一の相補性決定領域(CDR)をコードするペプチドである。CDRペプチド(「最小認識単位」)は、関心対象の抗体のCDRをコードする遺伝子を構築することで得られ得る。このような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応により抗体産生細胞のRNAから可変領域を合成することによって調製される(例えば、Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106 (1991)、Courtenay-Luck, 「Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies」, Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), page 166 (Cambridge University Press 1995)、およびWard et al, 「Genetic Manipulation and Expression of Antibodies」, Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (eds.), page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)を参照されたい)。
【０２９５】
または、抗zB7R1抗体は「ヒト化」モノクローナル抗体に由来してもよい。ヒト化モノクローナル抗体は、マウス相補性決定領域をマウス免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変領域からヒト可変ドメインに移すことによって作製される。次いで、ヒト抗体の典型的な残基が、マウスの対応物のフレームワーク領域において置換される。ヒト化モノクローナル抗体に由来する抗体成分を使用することで、マウス定常領域の免疫原性に関連する潜在的な問題が回避される。マウス免疫グロブリンの可変ドメインをクローニングする一般的な技法は、例えば、Orlandi et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:3833 (1989)によって記載されている。ヒト化モノクローナル抗体を作製する技法は、例えば、Jones et al., Nature 321:522 (1986)、Carter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:4285 (1992)、Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992)、Singer et al., J. Immun. 150:2844 (1993)、Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols (Humana Press, Inc. 1995)、Kelley, 「Engineering Therapeutic Antibodies」, Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), pages 399-434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)、およびQueen et al.、米国特許第5,693,762号 (1997)によって記載されている。
【０２９６】
さらに、本発明の抗zB7R1抗体または抗体断片を、本明細書に記載する当技術分野における方法を用いてペグ化することができる。
【０２９７】
ポリクローナル抗イディオタイプ抗体は、標準的な技法を用いて、動物を抗zB7R1抗体または抗体断片で免疫化することによって調製され得る。例えば、Green et al., 「Production of Polyclonal Antisera」, Methods In Molecular Biology: Immunochemical Protocols, Manson (ed.), pages 1-12 (Humana Press 1992)を参照されたい。また、Coligan, pages 2.4.1-2.4.7も参照されたい。または、上記の技法で抗zB7R1抗体または抗体断片を免疫原として用いて、モノクローナル抗イディオタイプ抗体を調製することもできる。別の方法では、ヒト化抗イディオタイプ抗体または類人猿の抗イディオタイプ抗体を、上記の技法で調製することができる。抗イディオタイプ抗体を作製する方法は、例えば、Irie、米国特許第5,208,146号、Greene, et al.、米国特許第5,637,677号、およびVarthakavi and Minocha, J. Gen. Virol. 77:1875 (1996)によって記載されている。
【０２９８】
抗zB7R1抗体を検出可能な標識と結合させて、抗zB7R1免疫複合体を形成することも可能である。適切な検出用標識には、例えば、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生物発光標識、またはコロイド金が含まれる。このような検出可能に標識された免疫複合体を作製および検出する方法は当業者には周知であり、以下にさらに詳述する。
【０２９９】
検出可能な標識は、オートラジオグラフィーで検出される放射性同位体であってよい。本発明の目的に特に有用な同位体は、3H、125I、131I、35S、32Pおよび14Cである。
【０３００】
抗zB7R1免疫複合体は、蛍光化合物で標識することもできる。蛍光標識された抗体の存在は、免疫複合体を適切な波長の光に曝露し、生じる蛍光を検出することにより判定される。蛍光標識化合物には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルアルデヒド、およびフルオレサミンが含まれる。
【０３０１】
または、抗zB7R1免疫複合体は、抗体成分を化学発光化合物と結合させることにより検出可能に標識することができる。化学発光タグ化免疫複合体の存在は、化学反応の過程で生じる発光の存在を検出することにより判定される。化学発光標識化合物の例には、ルミノール、イソルミノール、芳香性アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルが含まれる。
【０３０２】
同様に、生物発光化合物を用いて、本発明の抗zB7R1免疫複合体を標識することができる。生物発光とは、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を高める、生物系において見られる化学発光の一種である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することにより判定される。標識に有用な生物発光化合物には、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンが含まれる。
【０３０３】
または、抗zB7R1免疫複合体は、抗zB7R1抗体成分を酵素と連結することにより、検出可能に標識することができる。抗zB7R1-酵素複合体を適切な基質の存在下でインキュベートすると、酵素部分が基質と反応して、例えば分光光度手段、蛍光定量手段、または可視的手段によって検出され得る化合物部分を生じる。多特異的な免疫複合体を検出可能に標識するために用いることのできる酵素の例には、β-ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼが含まれる。
【０３０４】
当業者は、本発明に従って使用できるその他の適切な標識を熟知していると考えられる。マーカー部分と抗zB7R1抗体との結合は、当業者に公知の標準的な技法を用いて達成することができる。この関連における典型的な方法は、Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70:1 (1976)、Schurs et al., Clin. Chim. Acta 81:1 (1977)、Shih et al., Int'l J. Cancer 46:1101 (1990)、Stein et al., Cancer Res. 50:1330 (1990)、およびColigan、前記によって記載されている。
【０３０５】
さらに、免疫化学的検出の利便性および汎用性は、アビジン、ストレプトアビジン、およびビオチンと複合体を形成した抗zB7R1抗体を用いることにより高めることができる(例えば、Wilchek et al. (eds.), 「Avidin-Biotin Technology」, Methods In Enzymology, Vol. 184 (Academic Press 1990)、およびBayer et al., 「Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology」, Methods In Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), pages 149-162 (The Humana Press, Inc. 1992)を参照されたい)。
【０３０６】
免疫測定を実施するための方法は十分に確立されている。例えば、Cook and Self, 「Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays」, Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (eds.), pages 180-208 (Cambridge University Press, 1995)、Perry, 「The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology」, Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch and Lennox (eds.), pages 107-120 (Wiley-Liss, Inc. 1995)、およびDiamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996)を参照されたい。
【０３０７】
本発明はまた、zB7R1遺伝子発現の免疫学的診断アッセイ法を行うためのキットを意図する。このようなキットは、抗zB7R1抗体または抗体断片を含む少なくとも1個の容器を含む。キットはまた、zB7R1抗体または抗体断片の存在を示し得る1つまたは複数の試薬を含む第2の容器を含み得る。そのような指示試薬の例には、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生物発光標識、コロイド金などの検出可能な標識が含まれる。キットはまた、zB7R1抗体または抗体断片を用いてzB7R1タンパク質を検出する旨を使用者に伝える手段を含み得る。例えば、書面による指示書には、同梱された抗体または抗体断片を用いてzB7R1を検出できることが記載され得る。書記情報は容器に直接記載され得るか、または添付文書の形態で提供され得る。
【０３０８】
10. zB7R1のそのカウンター受容体に対する結合を作動させるまたは拮抗するための抗zB7R1抗体の使用
本明細書において有用な抗体を作製または選択するための別の技法は、リンパ球を可溶性zB7R1受容体ポリペプチドまたは抗原エピトープなどのその断片にインビトロで曝露すること、およびファージまたは類似のベクターの抗体ディスプレイライブラリーを選択すること(例えば、固定化または標識された可溶性zB7R1受容体ポリペプチド、または抗原エピトープなどのその断片を用いて)を含む。可溶性zB7R1受容体ポリペプチドまたは抗原エピトープのようなその断片などの潜在的結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ(ファージディスプレイ)または大腸菌などの細菌上に提示されたランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ランダム突然変異誘発およびランダムポリヌクレオチド合成によるなど、いくつかの方法で得ることができる。これらのランダムペプチドディスプレイライブラリーを用いて、カウンター受容体(すなわち、CD155)もしくは受容体などのタンパク質もしくはポリペプチド、生体高分子もしくは合成高分子、または有機物質もしくは無機物質であり得る公知の標的と相互作用するペプチドをスクリーニングすることができる。このようなランダムペプチドディスプレイライブラリーを作製およびスクリーニングする技法は当技術分野において公知であり(Ladner et al.、米国特許第5,223,409号；Ladner et al.、米国特許第4,946,778号；Ladner et al.、米国特許第5,403,484号、およびLadner et al.、米国特許第5,571,698号)、またランダムペプチドディスプレイライブラリーおよびこのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えば、Clontech(カリフォルニア州、パロアルト)、Invitrogen Inc.(カリフォルニア州、サンディエゴ)、New England Biolabs, Inc.(マサチューセッツ州、ベバリー)、およびPharmacia LKB Biotechnology Inc.(ニュージャージー州、ピスカタウェイ)から市販されている。本明細書に開示した可溶性zB7R1受容体ポリペプチドまたは抗原エピトープポリペプチド配列などのその断片を用いてランダムペプチドディスプレイライブラリーをスクリーニングして、zB7R1含有受容体ポリペプチドに結合するタンパク質を同定することができる。可溶性zB7R1含有受容体ポリペプチドと相互作用するこれらの「結合ポリペプチド」は、細胞にタグ付けするため；アフィニティー精製により相同体ポリペプチドを単離するために用いることができ；それらは薬物、毒素、放射性核種などに直接または間接的に結合させることができる。これらの結合ポリペプチドはまた、発現ライブラリーをスクリーニングするため、ならびに活性を作動させるおよび/または中和するため、例えば、zB7R1とそのカウンター受容体との相互作用を結合する、遮断する、抑制する、減少させる、拮抗する、または中和するためなどの解析法において用いることができる。結合ポリペプチドはまた、可溶性zB7R1含有受容体ポリペプチドの循環レベルを決定するため；根本的な病態または疾患のマーカーとして可溶性または非可溶性zB7R1含有受容体を検出または定量化するための診断アッセイ法において用いることができる。これらの結合ポリペプチドはまた、可溶性もしくは膜結合型zB7R1単量体受容体、またはzB7R1ホモ二量体、ヘテロ二量体、もしくは多���体ポリペプチドの結合(例えば、カウンター受容体に対する)およびシグナル伝達をインビトロおよびインビボで遮断または抑制するための「アンタゴニスト」として作用し得る。さらにまた、これらの結合ポリペプチドは、抗zB7R1単量体受容体または抗zB7R1ホモ二量体、ヘテロ二量体、もしくは多量体ポリペプチドとして役立ち、zB7R1活性およびzB7R1カウンター受容体活性またはタンパク質結合を抑制するのに有用である。本発明の天然受容体複合体に対する抗体、およびzB7R1エピトープ結合抗体、および抗zB7R1中和モノクローナル抗体は、それらがzB7R1に対してより特異的に作用することができ、そのカウンター受容体に対する結合を抑制することができることから、好ましい態様であると考えられる。さらに、本発明の抗体の作動、拮抗、および結合活性は、zB7R1カウンター受容体または任意の他のB7ファミリー受容体およびzB7R1含有可溶性受容体の存在下におけるzB7R1増殖、シグナル捕捉、ルシフェラーゼ、または結合アッセイ法、および本明細書に記載のその他の生物学的または生化学的アッセイ法においてアッセイすることができる。
【０３０９】
zB7R1受容体ポリペプチドに対する抗体(例えば、配列番号:2または5に対する抗体)または抗原エピトープなどのその断片は、インビボでzB7R1の炎症効果を抑制するため、関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎、炎症性皮膚疾患、内毒素血症、関節炎、喘息、IBD、大腸炎、乾癬性関節炎、またはその他のB7誘導性炎症状態に対する治療用途のため；zB7R1受容体を発現する細胞にタグ付けするため；アフィニティー精製により可溶性zB7R1含有受容体ポリペプチドを単離するため；可溶性zB7R1含有受容体ポリペプチドの循環レベルを決定する診断アッセイ法のため；根本的な病態または疾患のマーカーとして可溶性zB7R1含有受容体を検出または定量化するため；FACSを用いる解析法において；発現ライブラリーをスクリーニングするため；zB7R1アゴニストとして作用し得る抗イディオタイプ抗体を作製するため；ならびにzB7R1受容体機能を結合する、遮断する、抑制する、減少させる、もしくは拮抗するため、またはインビトロおよびインビボでzB7R1活性を結合する、遮断する、抑制する、減少させる、拮抗する、もしくは中和するための中和抗体またはアンタゴニストとして用いることができる。適切な直接的タグまたは標識には、放射性核種、酵素、基質、補因子、ビオチン、阻害剤、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子などが含まれ；間接的なタグまたは標識は、中間体としてのビオチン-アビジンまたはその他の相補物/抗相補物対の使用を特徴とし得る。本明細書における抗体はまた、薬物、毒素、放射性核種などに直接または間接的に結合させることができ、これらの複合体はインビボでの診断または治療用途のために用いられる。さらに、可溶性zB7R1含有受容体ポリペプチドに対する抗体またはその断片は、アッセイ法、例えばウェスタンブロットまたは当技術分野で公知のその他のアッセイ法において、変性または非変性zB7R1含有受容体ポリペプチドまたはその断片を検出するためにインビトロで用いることもできる。
【０３１０】
可溶性zB7R1受容体または可溶性zB7R1ホモ二量体、ヘテロ二量体、もしくは多量体受容体ポリペプチドに対する抗体は、対応する受容体を発現する細胞にタグ付けして、それらの発現レベルをアッセイするため、アフィニティー精製のため、受容体ポリペプチドの循環レベルを決定するための診断アッセイ法において、蛍光活性化細胞選別を用いる解析法において有用である。さらに、二価抗体および抗イディオタイプ抗体は、zB7R1の効果を模倣するためのアゴニストとして用いることも可能である。
【０３１１】
本明細書における抗体はまた、薬物、毒素、放射性核種などに直接または間接的に結合させることができ、これらの複合体はインビボでの診断または治療用途のために用いられる。例えば、可溶性zB7R1受容体または可溶性zB7R1ホモ二量体、ヘテロ二量体、もしくは多量体受容体ポリペプチドを認識する抗体または結合ポリペプチドを用いて、対応する抗相補物分子(すなわち、zB7R1を含有する可溶性または膜結合型受容体)を発現する組織または器官を同定または治療することができる。より具体的には、可溶性zB7R1含有受容体ポリペプチドに対する抗体、またはその生物活性断片もしくは一部を、検出可能分子または細胞毒性分子に結合させ、zB7R1発現癌などのzB7R1含有受容体を発現する細胞、組織、または器官を有する哺乳動物に送達することができる。
【０３１２】
適切な検出可能分子を、「結合ポリペプチド」(先に開示した結合ペプチドを含む)、抗体、またはその生物活性断片もしくは一部などの、zB7R1含有受容体ポリペプチドと結合するポリペプチドに直接または間接的に結合させることができる。適切な検出可能分子には、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子などが含まれる。適切な細胞毒性分子をポリペプチドまたは抗体に直接または間接的に結合させることもでき、これには細菌または植物毒素(例えば、ジフテリア毒素、シュードモナス(Pseudomonas)外毒素、リシン、アブリンなど)、およびヨウ素-131、レニウム-188、またはイットリウム-90などの治療用放射性核種(ポリペプチドもしくは抗体に直接結合させるか、または例えばキレート部分によって間接的に結合させる)が含まれる。結合ポリペプチドまたは抗体はまた、アドリアマイシンなどの細胞毒性薬に結合させてもよい。検出可能分子または細胞毒性分子の間接的結合に関しては、検出可能分子または細胞毒性分子を相補物/抗相補物対のメンバーと結合させることができ、この場合、もう一方のメンバーは結合ポリペプチドまたは抗体部分に結合させる。これらの目的に関して、ビオチン/ストレプトアビジンは例示的な相補物/抗相補物対である。
【０３１３】
別の態様においては、結合ポリペプチド-毒素融合タンパク質または抗体-毒素融合タンパク質を、細胞または組織の標的抑制または除去のために用いることができる(例えば、癌細胞または組織を治療するため)。または、結合ポリペプチドが複数の機能的ドメイン(すなわち、活性化ドメインまたはカウンター受容体結合ドメインおよび標的化ドメイン)を有する場合には、標的化ドメインのみを含む融合タンパク質が、検出可能分子、細胞毒性分子、または相補物分子を関心対象の細胞または組織種に導くために適していると考えられる。単一ドメインのみを含む融合タンパク質が相補物分子を含む場合、抗相補物分子を検出可能分子または細胞毒性分子に結合させることができる。したがって、このようなドメイン-相補物分子融合タンパク質は、一般的な抗相補物-検出可能分子/細胞毒性分子複合体の細胞/組織特異的送達のための一般的な標的化媒体となる。
【０３１４】
または、本明細書に記載するzB7R1受容体結合ポリペプチドまたは抗体融合タンパク質は、zB7R1受容体調節性アポトーシス経路を直接刺激することにより、標的組織のインビボ死滅を増強するために用いることができ、結果としてzB7R1含有受容体を発現する過剰増殖細胞の細胞死が起こる。
【０３１５】
11. zB7R1活性を有するポリペプチドまたはzB7R1に対する抗体の治療的使用
可溶性zB7R1活性を有するアミノ酸配列を用いて、CD155などのzB7R1カウンター受容体と結合させ、ひいてはzB7R1カウンター受容体と内因性zB7R1受容体との結合を妨げることにより、免疫系を調節することができる。抗zB7R1抗体などのzB7R1アンタゴニストを用いて、zB7R1カウンター受容体と内因性zB7R1受容体との結合を抑制することにより免疫系を調節することもできる。したがって本発明は、zB7R1活性を有するタンパク質、ポリペプチド、およびペプチド(可溶性zB7R1ポリペプチド、zB7R1ポリペプチド断片、zB7R1類似体(例えば、抗zB7R1抗イディオタイプ抗体)、およびzB7R1融合タンパク質など)を、十分量のこのポリペプチドを欠く、または過剰量のzB7R1カウンター受容体を産生する対象に対して用いることを含む。zB7R1アンタゴニスト(例えば、抗zB7R1抗体)もまた、過剰量のzB7R1カウンター受容体またはzB7R1を産生する対象を治療するために用いることができる。適切な対象には、ヒトなどの哺乳動物が含まれる。例えば、そのようなzB7R1ポリペプチドおよび抗zB7R1抗体は、乾癬、アトピー性皮膚炎、炎症性皮膚疾患、乾癬性関節炎、関節炎、内毒素血症、喘息、炎症性腸疾患(IBD)、大腸炎、および本明細書に開示するその他の炎症状態の治療において、zB7R1およびCD155を(単独でまたは共に)結合する、遮断する、抑制する、減少させる、拮抗する、または中和するのに有用である。
【０３１６】
zB7R1は乾癬の病理に関与していると考えられる。本発明は、特にzB7R1を結合する、遮断する、抑制する、減少させる、拮抗する、または中和する薬剤を投与することにより乾癬を治療する方法である。zB7R1に対するアゴニストは、zB7R1に結合する可溶性受容体、またはzB7R1もしくはzB7R1カウンター受容体に結合する抗体、一本鎖抗体、もしくは抗体断片、例えば抗zB7R1抗体であってよい。よってアンタゴニストは、zB7R1受容体の活性化を妨げる。
【０３１７】
乾癬は最も多く見られる皮膚疾患の1つであり、世界の人口の最大で1〜2%が罹患している。乾癬は、紅斑性の輪郭のはっきりした丘疹、および銀色の雲母状鱗片に覆われた円形斑を特徴とする慢性炎症性皮膚疾患である。乾癬の皮膚病変は、様々にそう痒性である。外傷領域が乾癬の病変を発症する場合が多い。さらに、感染、ストレス、および投薬(例えば、リチウム、β遮断薬、および抗マラリア薬)を含む他の外的要因が、乾癬を悪化させる場合がある。
【０３１８】
乾癬の最も一般的な種類は斑状と称される。斑状乾癬患者は安定した徐々に増殖する斑を有し、この斑は基本的に長期間変化しない。斑状乾癬が起こる最も一般的な領域は、肘、膝、臀裂、および頭皮である。発症は対称的となる傾向がある。逆位乾癬は、腋窩、鼠径部、乳腺下領域、および臍を含む間擦領域を侵し、また頭皮、手のひら、および足底を侵す傾向がある。個々の病変は輪郭の明確な斑であるが、その位置により湿性である場合がある。斑状乾癬は一般的に徐々に発症し、無痛性の経過をたどる。自然寛解することはまれである。
【０３１９】
発疹性乾癬(滴状乾癬)は、小児および若年成人に最もよく見られる。これは、乾癬非罹患個体または慢性斑状乾癬個体において急性的に発症する。患者は、しばしばβ型溶血連鎖球菌による上気道感染後に、多くの小さな紅斑性落屑性丘疹を示す。乾癬患者はまた、膿疱性病変を発症する場合がある。これらは手のひらおよび足底に局在する場合もあれば、または全身に広がって発熱、倦怠感、下痢、および関節痛を伴う場合もある。
【０３２０】
乾癬患者の約半数が爪の障害を有し、これは点状のへこみ、爪の肥厚、または爪下角化症として現れる。乾癬患者の約5〜10%が付随する関節の症状を訴え、これらは爪の障害を有する患者において最も頻繁に認められる。人によっては古典的な関節リウマチを併発するが、多くは乾癬に付随する5つの種類のうち1つに分類される関節疾患を有する：(1) 単一または少数の小さな関節に限定される疾患(症例の70%)；(2) 血清反応陰性関節リウマチ様疾患；(3) 遠位指節間関節の障害；(4) 「破壊性関節炎」の発症を伴う重度の破壊性関節炎；および(5) 脊柱に限定される疾患。
【０３２１】
乾癬は、zB7R1アゴニストとして作用する薬剤を投与することにより治療することができる。好ましいアンタゴニストは、zB7R1(配列番号:3)などのzB7R1に対する可溶性受容体、またはzB7R1もしくはそのカウンター受容体に結合する抗体、抗体断片、または一本鎖抗体である。そのようなアンタゴニストは、単独で、または潤滑剤、角質溶解薬、外用副腎皮質ステロイド、外用ビタミンD誘導体、アントラリン、メソトレキセートなどの全身性代謝拮抗薬、ソラレン紫外光治療(PUVA)、エトレチナート、イソトレチノイン、シクロスポリン、および外用ビタミンD3誘導体カルシポトリオールなどのその他の確立された治療と併用して投与することができる。さらに、そのようなアンタゴニストは、個体に皮下投与、静脈内投与、またはアンタゴニストを含むクリームもしくは経皮パッチを用いて経皮投与することができる。皮下投与する場合には、アンタゴニストを1つまたは複数の乾癬斑に注射することができる。経皮投与する場合には、アンタゴニストを含むクリーム、外用薬(ointment)、軟膏(salve)、または溶液を用いて、アンタゴニストを斑に直接投与することができる。
【０３２２】
zB7R1に対するアゴニストを、喘息、気管支炎、もしくは嚢胞性線維症、またはその他の炎症性肺疾患を有する人に投与して、その疾患を治療することができる。アンタゴニストは、静脈内投与、皮下投与、気管支洗浄、およびアンタゴニストを含む吸入薬の使用を含む任意の適切な方法により投与することができる。
【０３２３】
したがって、本発明の特定の態様は、乾癬、乾癬性関節炎、アトピー性皮膚炎、炎症性皮膚疾患、関節リウマチ、炎症性腸疾患(IBD)、クローン病、憩室症、喘息、膵炎、I型糖尿病(IDDM)、膵癌、膵炎、グレーブス病、結腸癌および腸癌、自己免疫疾患、敗血症、臓器または骨髄移植；内毒素血症、外傷、手術、または感染症に起因する炎症；アミロイドーシス；脾腫；移植片対宿主病；ならびに炎症の抑制、免疫抑制、造血細胞、免疫細胞、炎症細胞、もしくはリンパ球系細胞、マクロファージ、T細胞(Th1およびTh2細胞を含む)の増殖の減少、病原体もしくは抗原に対する免疫応答の抑制、またはzB7R1の抑制が望ましいその他の例などの炎症性および免疫性の疾患または状態における、アゴニストとしての可溶性zB7R1および抗zB7R1抗体の使用を対象とする。
【０３２４】
さらに、本明細書に記載するzB7R1ポリペプチドと結合する抗体または結合ポリペプチド、およびzB7R1ポリペプチド自体は、以下に対して有用である。
【０３２５】
急性炎症、外傷、組織損傷、手術、敗血症、または感染症の結果としての炎症、および喘息、炎症性腸疾患(IBD)、慢性大腸炎、脾腫、関節リウマチ、再発性急性炎症の発症(例えば、結核)などの慢性炎症疾患の治療において、ならびにアミロイドーシス、およびアテローム性動脈硬化症、キャッスルマン病、喘息、および急性期反応の誘導に関連するその他の疾患の治療において、zB7R1を介するシグナル伝達を遮断する、抑制する、減少させる、拮抗する、または中和するため。
【０３２６】
免疫細胞(例えば、リンパ球、単球、白血球)におけるzB7R1を介するシグナル伝達を妨げるまたは抑制するために、IDDM、多発性硬化症(MS)、全身性エリテマトーデス(SLE)、重症筋無力症、関節リウマチ、およびIBDなどの自己免疫疾患の治療において、zB7R1を介するシグナル伝達を、遮断する、抑制する、減少させる、拮抗する、または中和するため(Hughes, C et al., J. Immunol 153: 3319-3325, 1994)。または、zB7R1に対するモノクローナル抗体(MAb)などの抗体を、自己免疫疾患を治療するために、不要な免疫細胞を枯渇させるためのアンタゴニストとして用いることもできる。喘息、アレルギー、およびその他のアトピー性疾患は、免疫応答を抑制するためまたは有害な細胞を枯渇させるために、例えば可溶性zB7R1可溶性受容体に対するMAbで治療することができる。本発明のポリペプチドおよび抗体を用いて、zB7R1を介するシグナル伝達を遮断する、抑制する、減少させる、または拮抗することはまた、膵臓、腎臓、下垂体、および神経細胞の疾患に恩恵をもたらす場合もある。IDDM、NIDDM、膵炎、および膵癌が恩恵を受ける可能性がある。zB7R1は、拮抗性MAbが癌の増殖を抑制し、免疫介在性死滅を標的とする癌のMAb治療の標的として役立つ可能性がある(Holliger P, and Hoogenboom, H: Nature Biotech. 16: 1015-1016, 1998)。可溶性zB7R1に対するMabはまた、糸球体硬化症、膜性腎症、アミロイドーシス(他の組織の中でも腎臓を侵す)、腎動脈硬化症、様々な原因の糸球体腎炎、腎臓の線維増殖性疾患、ならびにSLE、IDDM、II型糖尿病(NIDDM)、腎腫瘍、およびその他の疾患に関連した腎機能障害などの腎症を治療するのに有用である可能性がある。
【０３２７】
IDDM、MS、SLE、重症筋無力症、関節リウマチ、およびIBDなどの自己免疫疾患の治療において、zB7R1を介するシグナル伝達を作動させる、増強する、増加させる、または惹起するため。抗zB7R1中和抗体およびモノクローナル抗体は、リンパ球またはその他の免疫細胞に、分化する、増殖を変更する、または自己免疫を改善するサイトカインもしくは細胞表面タンパク質の産生を変更するようにシグナルを送る可能性がある。具体的には、T細胞反応の調節により自己免疫応答が逸脱されて、疾患が改善される可能性がある(Smith JA et al., J. Immunol. 160:4841-4849, 1998)。同様に、作動性抗zB7R1モノクローナル抗体を用いて、関節リウマチ、喘息、アレルギー、およびアトピー性疾患に関与する免疫細胞にシグナルを送る、そのような細胞を枯渇させる、および逸脱させることができる。zB7R1を介するシグナル伝達はまた、膵臓、腎臓、下垂体、および神経細胞の疾患に恩恵をもたらす場合もある。IDDM、NIDDM、膵炎、および膵癌が恩恵を受ける可能性がある。zB7R1は、シグナル伝達性MAbが癌の増殖を抑制し、免疫介在性死滅を標的とする膵癌のMAb治療の標的として役立つ可能性がある(Tutt, AL et al., J Immunol. 161: 3175-3185, 1998)。同様に、腎細胞癌を、本発明のzB7R1含有可溶性受容体に対するモノクローナル抗体で治療することも可能である。
【０３２８】
本明細書に記載の可溶性zB7R1ポリペプチドは、上記のように自己免疫疾患、アトピー性疾患、NIDDM、膵炎、および腎機能障害の治療において、単独でまたは共にzB7R1活性を結合する、遮断する、抑制する、減少させる、拮抗する、または中和するために用いることができる。可溶型のzB7R1は、Th細胞によって媒介される抗体応答を促進するため、および/またはリンパ球もしくはその他の免疫細胞によるIL-4もしくはその他のサイトカインの産生を促進するために用いることもできる。
【０３２９】
さらに、炎症は、侵入物質を回避するための生物による防御反応である。炎症は、多くの細胞および液性メディエータを含むカスケード事象である。一方、炎症反応を抑制すると、宿主は免疫無防備状態になり得るが；しかしそのままにしておくと、炎症は、慢性炎症性疾患(例えば、乾癬、関節炎、関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患など)、敗血症ショック、および多臓器不全を含む重篤な合併症を引き起こし得る。重要なことに、これらの多様な疾患状態は、共通の炎症性メディエータを共有する。炎症により特徴づけられる総体的疾患は、ヒトの罹患率および死亡率に大きな影響を及ぼす。したがって、zB7R1、そのカウンター受容体、および抗zB7R1抗体などの、免疫応答の共刺激および/または抑制に本質的に関与する分子が、喘息およびアレルギーから自己免疫および敗血症ショックに至る膨大な数のヒトおよび動物疾患にとって非常に重要な治療可能性を有し得ることは明白である。
【０３３０】
1. 関節炎
骨関節炎、関節リウマチ、損傷の結果としての関節炎関節などを含む関節炎は、本発明のzB7R1分子などの抗炎症タンパク質の治療的使用から恩恵を受ける一般的な炎症状態である。例えば、関節リウマチ(RA)は全身を侵す全身性疾患であり、関節炎の最も多く見られる形態の1つである。これは関節を裏打ちする膜の炎症を特徴とし、これによって疼痛、硬直、発熱、発赤、および腫脹が生じる。炎症細胞は、骨および軟骨を消化し得る酵素を放出する。関節リウマチの結果として、炎症を起こした関節内層、滑膜が骨および軟骨に侵入して損傷を与え、いくつかある生理的影響の中でも特に関節悪化および激痛をもたらし得る。罹患関節はその形状および配置構造を失って、疼痛および運動障害を生じ得る。
【０３３１】
関節リウマチ(RA)は、特に、重度の障害および死亡率の上昇を引き起こす、炎症およびそれに続く組織損傷によって特徴づけられる免疫介在性疾患である。リウマチ様関節では、種々のサイトカインが局所的に産生される。2つの原型の炎症促進性サイトカインであるIL-1およびTNF-αが、滑膜炎症および進行性関節破壊に関与する機構において重要な役割を果たすことが、多くの研究から実証されている。実際に、RA患者にTNF-αおよびIL-1阻害剤を投与すると、炎症の臨床学的および生物学的徴候の飛躍的な改善、ならびに骨浸食および軟骨破壊の放射線学的徴候の低減が生じた。しかし、これらの有望な結果にもかかわらず、かなりの割合の患者がこれらの薬剤に応答せず、このことから、他のメディエータもまた関節炎の病態生理に関与していることが示唆される(Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2(2):135-149, 2002)。そのようなメディエータの1つは可溶性zB7R1タンパク質または抗zB7R1抗体であると考えられ、したがって本明細書に記載する可溶性B7R1-Fc、B7R1m-VASP CH6、または抗体もしくは結合パートナーなどの、zB7R1と結合するまたはzB7R1を媒介する分子は、関節リウマチおよびその他の関節炎疾患における炎症を軽減するための価値ある治療薬として役立つ可能性がある。
【０３３２】
当技術分野において公知である関節リウマチの動物モデルがいくつか存在する。例えば、コラーゲン誘導性関節炎(CIA)モデルでは、マウスはヒトの関節リウマチに非常によく似た慢性炎症性関節炎を発症する。CIAはRAと類似の免疫学的および病理学的特徴を共有するため、CIAモデルは潜在的なヒト抗炎症化合物をスクリーニングするための理想的なモデルとなる。CIAモデルは、発症するために免疫応答および炎症反応の両方に依存する、マウスの周知のモデルである。免疫応答は、抗原として与えられたコラーゲンに応答したB細胞とCD4＋ T細胞の相互作用を含み、抗コラーゲン抗体の産生をもたらす。炎症段階は、これらの抗体のいくつかがマウスの天然コラーゲンと交差反応し、補体カスケードを活性化する結果としての、炎症メディエータによる組織応答の結果である。CIAモデルを用いることの利点は、発症の基本的機構が公知である点である。II型コラーゲン上の関連するT細胞およびB細胞エピトープが同定されており、また免疫介在性関節炎に関連する種々の免疫学的パラメータ(例えば、遅延型過敏症および抗コラーゲン抗体)および炎症パラメータ(例えば、サイトカイン、ケモカイン、およびマトリックス分解酵素)が決定されており、したがってこれらを用いてCIAモデルにおける被験化合物の有効性を評価することができる(Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407-20, 1999；Williams et al., Immunol. 89:9784-788, 1992；Myers et al., Life Sci. 61:1861-78, 1997；およびWang et al., Immunol. 92:8955-959, 1995)。
【０３３３】
実施例21に示すように、マウスB7R1のmRNAレベルは、非CIAマウスと比較してCIAマウスの罹患足および流入領域(膝窩)リンパ節においてより高く、そのレベルは疾患重症度と関連している。さらに、あるグループにより、別のB7ファミリーメンバーであるB7相同タンパク質(B7h)に対する中和抗体を送達すると、対照マウスと比較してマウスCIAモデルにおいて症状が軽減されることが示されており(Iwai et al, J. Immunol. 169:4332, 2002)、したがって可溶性B7R1-FcおよびB7R1m-VASP CH6が関節炎などのヒト疾患の治療において有益であり得るという考えが支持される。中和性抗B7h抗体を投与すると、予防的に導入した場合に、またはモデルにおいて関節炎の症状が既に存在した後でも、動物における関節炎の症状は軽減された(Iwai et al, J. Immunol. 169:4332, 2002)。したがって、B7R1-FcまたはB7R1m-VASP CH6を用いて、癌、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、関節炎、内毒素血症、炎症性腸疾患(IBD)、大腸炎、および本明細書に開示するその他の炎症状態などの特定のヒト疾患を治療することができる。
【０３３４】
B7R1-FcもしくはB7R1m-VASP CH6、またはその他のzB7R1可溶性および融合タンパク質などの可溶性B7R1含有ポリペプチドをこれらのCIAモデルマウスに投与することにより、疾患の症状を改善し疾患の経過を変更するための可溶性B7R1-Fcの使用が評価される。さらに、炎症は関節リウマチの発症および進行に関与しているため、B7R1-Fc、B7R1m-VASP CH6、またはその他の可溶性受容体などの可溶性B7R1含有ポリペプチド、ならびに抗zB7R1抗体および融合タンパク質の全身投与または局所投与により、RAにおける炎症反応を潜在的に抑制することができる。一例として非限定的に、B7R1-FcまたはB7R1m-VASP CH6/マウス 10〜200 ugの注射(皮下、腹腔内、または筋肉内投与経路により週に1〜7回であり、これに限定されるわけではないが最長で4週間)により、疾患スコア(足スコア、炎症または疾患の発生率)が有意に減少し得る。B7R1-Fc投与の開始に応じて(例えば、コラーゲン免疫化の前もしくはその時点で、または疾患が既に進行した時点を含む、2回目のコラーゲン免疫化後の任意の時点で)、B7R1-FcまたはB7R1m-VASP CH6は、関節リウマチを予防する上でおよびその進行を妨げる上で有効であり得る。その他の潜在的治療薬には、CD155ポリペプチドまたは抗CD155抗体が含まれる。
【０３３５】
2. 内毒素血症
内毒素血症とは、通常、細菌およびその他の感染病原体などの感染体、敗血症、毒性ショック症候群に起因するか、または日和見感染などにさらされた免疫不全患者における重症状態である。本発明のzB7R1ポリペプチドおよび抗体などの治療上有用な抗炎症タンパク質は、ヒトおよび動物における内毒素血症の予防および治療を助け得る。zB7R1ポリペプチド、抗IL22RA抗体、または抗IL-22抗体もしくは結合パートナーは、内毒素血症における炎症および病理学的影響を低減するための価値ある治療薬として役立ち得る。
【０３３６】
リポ多糖(LPS)により誘発される内毒素血症は、感染症において病理学的影響を生じる多くの炎症促進性メディエータを作動させ、げっ歯動物におけるLPS誘発性内毒血症は、潜在的炎症促進薬または免疫調節薬の薬理学的効果を試験するために広く用いられている許容されるモデルである。グラム陰性菌で産生されるLPSは、敗血症ショックの発症における主要な原因物質である(Glausner et al., Lancet 338:732, 1991)。ショック様状態は実際に、LPSを動物に1回注射することにより実験的に誘発することができる。LPSに応答する細胞によって産生される分子は、病原体を直接または間接的に標的化し得る。これらの生物学的応答は侵入する病原体から宿主を防御するが、それらはまた害をもたらす可能性がある。したがって、重度のグラム陰性菌感染の結果として生じる先天性免疫の大規模な促進により、サイトカインおよびその他の分子の過剰な産生、ならびに発熱、低血圧、播種性血管内凝固、および多臓器不全を特徴とする致死的症候群である敗血症ショック症候群の発症が起こる(Dumitru et al. Cell 103:1071-1083, 2000)。
【０３３７】
LPSのこれらの毒性作用は、主に、複数の炎症性メディエータの放出をもたらすマクロファージ活性化と関連がある。これらのメディエータの中で、TNFは、中和性抗TNF抗体の投与によるLPS毒性の予防によって示されるように、重要な役割を担っているようである(Beutler et al., Science 229:869, 1985)。C57Bl/6マウスに大腸菌LPSを1μg注射すると、注射の約2時間後に、循環するIL-6、TNF-α、IL-1、および急性期タンパク質(例えば、SAA)の有意な上昇が起こることは十分に確立されている。これらのメディエータに対する受動免疫により死亡率が低下し得ることから、LPSの毒性はこれらのサイトカインによって媒介されるようである(Beutler et al., Science 229:869, 1985)。敗血症ショックを予防および/また治療するための潜在的免疫介入戦略には、抗TNF mAb、IL-1受容体アンタゴニスト、LIF、IL-10、およびG−CSFが含まれる。
【０３３８】
抗zB7R1抗体またはその他のzB7R1可溶性および融合タンパク質をこれらのLPS誘発性モデルに投与することにより、LPS誘発性疾患の症状を改善しその疾患の経過を変更するためのzB7R1の使用が評価される。
【０３３９】
3. 炎症性腸疾患、IBD
米国では、約500,000人の人々が、結腸および直腸(潰瘍性大腸炎)、または小腸および大腸の両方(クローン病)に影響を及ぼし得る炎症性腸疾患(IBD)に罹患している。これらの疾患の病因は不明であるが、これらの疾患には罹患組織の慢性炎症が関与している。zB7R1ポリペプチド、抗zB7R1抗体、または結合パートナーは、IBDおよび関連疾患における炎症および病理学的影響を低減するための価値ある治療薬として役立ち得る。
【０３４０】
潰瘍性大腸炎(UC)は、結腸の粘膜または最内層の炎症および潰瘍形成を特徴とする、一般に結腸と呼ばれる大腸の炎症性疾患である。この炎症は高い頻度で結腸を空にし、下痢を引き起こす。症状には、軟便および関連する腹部痙攣、発熱、ならびに体重減少が含まれる。UCの正確な原因は不明であるが、最近の研究から、身体が異物と見なす体内のタンパク質に対して身体の生来の防御機構が作用すること(「自己免疫応答」)が示唆されている。おそらくはそれらが腸内の細菌タンパク質に似ているため、これらのタンパク質が、結腸の内層を破壊し始める炎症過程を誘導または促進する可能性がある。結腸の内層が破壊されると、潰瘍が形成されて粘液、膿、および血液が放出される。この疾患は通常、直腸領域で始まり、最終的に大腸全体に広がり得る。炎症を繰り返して発症することで、腸壁および直腸壁は瘢痕組織を伴い肥厚する。結腸組織の死滅または敗血症は、重篤な疾患を併発し得る。潰瘍性大腸炎の症状は重症度が多様であり、その発症は段階的である場合もあれば、突発性である場合もある。呼吸器感染またはストレスを含む多くの要因により、発作が誘発され得る。
【０３４１】
現在のところUCについての治療法は存在しないが、治療は結腸内層の異常な炎症過程の抑制に重点が置かれている。この疾患を治療するためには、副腎皮質ステロイド、免疫抑制剤(例えば、アザチオプリン、メルカプトプリン、およびメトトレキセ−ト)、およびアミノサリチル酸を含む治療が利用できる。しかし、副腎皮質ステロイドおよびアザチオプリンなどの免疫抑制剤の長期使用は、骨の菲薄化、白内障、感染症、ならびに腎臓および骨髄への影響を含む重度の副作用をもたらし得る。現在の治療法で良好な結果が得られない患者では、手術も選択肢の1つである。手術は結腸全体および直腸の摘出を含む。
【０３４２】
慢性潰瘍性大腸炎を部分的に模倣し得る動物モデルがいくつか存在する。最も広く用いられているモデルは2,4,6-トリニトロベンスルホン酸/エタノール(TNBS)誘発性大腸炎モデルであり、これは結腸において慢性炎症および潰瘍形成を誘発する。直腸内点滴によりTNBSを感受性マウスの結腸に導入すると、それは結腸粘膜においてT細胞媒介性免疫応答を誘発し、この場合、大腸壁全体にわたるT細胞およびマクロファージの高密度浸潤を特徴とする重度の粘膜炎症が起こる。さらに、この組織病理像は、進行性体重減少(消耗)、出血性下痢、直腸脱、および大腸壁肥厚の臨床像を伴う(Neurath et al. Intern. Rev. Immunol. 19:51-62, 2000)。
【０３４３】
別の大腸炎モデルではデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)を使用し、これにより出血性下痢、体重減少、結腸短縮、および好中球浸潤を伴う粘膜潰瘍形成を呈する急性大腸炎が誘発される。DSS誘発性大腸炎は、リンパ過形成、局所的陰窩損傷、および上皮潰瘍形成を伴う、固有層への炎症細胞の浸潤によって組織学的に特徴づけられる。これらの変化は、上皮に対するDSSの毒性作用に起因して、固有層細胞の食作用ならびにTNF-αおよびIFN-γの産生によって生じると考えられている。一般的に使用されているにもかかわらず、ヒト疾患との関連性についてのDSSの機構に関するいくつかの問題点は末解決のままである。DSSは、SCIDマウスなどのT細胞欠損動物においても認められるため、T細胞非依存性モデルと見なされる。
【０３４４】
抗zB7R1抗体またはその他のzB7R1可溶性および融合タンパク質をこれらのTNBSまたはDSSモデルに投与することにより、胃腸疾患の症状を改善しその疾患の経過を変更するためのzB7R1の使用を評価することができる。さらに、zB7R1によってT細胞シグナル伝達が抑制されることを示す結果から、zB7R1またはそれに対する抗体などのその他のzB7R1アンタゴニストもまた、大腸炎/IBDモデルにおける症状を改善し疾患経過を変更するために用いることができるという概念の証明が得られる。
【０３４５】
4. 乾癬
乾癬は、700万人を超えるアメリカ人が罹患している慢性皮膚疾患である。乾癬は新しい皮膚細胞が異常に増殖する場合に起こり、古い皮膚が十分に素早く脱落しない部位に、炎症性の肥大したかつ鱗状の皮膚斑を生じる。最もよく見られる形態である斑状乾癬は、銀白色の鱗屑で覆われた炎症性皮膚斑(「病変」)を特徴とする。乾癬は少数の斑に限定される場合もあれば、皮膚の中程度から広範囲の領域を侵す場合もあり、頭皮、膝、肘、および体幹に最もよく現れる。乾癬は目立つものの、感染性の疾患ではない。この疾患の病因は、罹患組織の慢性炎症を含む。zB7R1ポリペプチド、抗zB7R1抗体、または抗IL-22およびzB7R1抗体もしくは結合パートナーは、乾癬、その他の炎症性皮膚疾患、皮膚および粘膜のアレルギー、ならびに関連疾患における炎症および病理学的影響を低減するための価値ある治療薬として役立ち得る。
【０３４６】
乾癬は、相当な不快感を招き得る、皮膚のT細胞媒介性炎症性疾患である。乾癬は、治療法がなく、あらゆる年齢の人々が罹患する疾患である。ヨーロッパおよび北アメリカの人口の約2%が乾癬に罹患している。軽度の乾癬を有する個体は局所薬により疾患を制御できる場合が多いが、世界中の100万人を超える患者は、紫外線または全身免疫抑制療法を必要とする。不運なことには、紫外線照射の不便性および危険性、ならびに多くの治療法の毒性のために、長期使用が制限される。さらに、患者は通常、乾癬を再発し、場合によっては免疫抑制療法の停止直後にリバウンドが起こる。
【０３４７】
さらに、本発明の抗zB7R1抗体およびzB7R1可溶性受容体は、本明細書に記載するいくつかの炎症性疾患に付随する、ならびに癌(例えば、化学療法および悪液質)および感染症に関する体重減少の予防および治療において用いることができる。例えば、重度の体重減少は、敗血症モデル、MS、RA、および腫瘍のモデルに関連した重要なマーカーである。さらに、体重減少は、癌、感染症、および炎症性疾患を含む多くのヒト疾患に関する重要なパラメータである。本発明の抗zB7R1抗体、ならびに可溶性zB7R1受容体およびそれに対する抗体などのzB7R1アンタゴニストは、本明細書に記載のzB7R1アデノウイルスを注射したマウスにおいて、体重減少を予防および治療する能力に関して試験することができる。そのようなzB7R1アンタゴニストの予防的または治療的投与計画を決定する方法は、当技術分野において公知であり、本明細書に記載の方法を用いて決定することができる。
【０３４８】
zB7R1可溶性受容体ポリペプチドおよびそれに対する抗体はまた、zB7R1またはzB7R1カウンター受容体の循環レベルを検出する診断系において、および急性期炎症反応に関連したzB7R1の検出において用いることも可能である。関連する態様では、本発明のzB7R1可溶性受容体に特異的に結合する抗体またはその他の物質を用いて、循環している受容体ポリペプチドを検出することができ；逆に、zB7R1可溶性受容体自体を用いて、循環しているまたは局所的に作用しているzB7R1ポリペプチドを検出することができる。zB7R1カウンター受容体またはzB7R1ポリペプチドのレベルの上昇または低下は、炎症または癌を含む病態を示し得る。さらに、zB7R1などの急性期タンパク質または分子の検出は、特定の疾患状態(例えば、乾癬、関節リウマチ、大腸炎、IBD)における慢性炎症状態を示し得る。そのような状態の検出は、疾患の診断において役立つと共に、医師が適切な治療を選択する上で役立つ。
【０３４９】
例えば、zB7R1に対する中和抗体には、zB7R1抗原エピトープと結合して、zB7R1活性を中和し得る中和モノクローナル抗体などの抗体が含まれる。したがって、zB7R1の抗原エピトープを有するペプチドおよびポリペプチドは、本明細書に記載するzB7R1ポリペプチドと結合する抗体を産生させるのに、ならびに中和性である、およびzB7R1の活性を結合し得る、遮断し得る、抑制し得る、減少させ得る、拮抗し得る、または中和し得る抗zB7R1モノクローナル抗体を同定およびスクリーニングするのに有用である。本発明のそのような中和モノクローナル抗体は、zB7R1抗原エピトープに結合し得る。
【０３５０】
本明細書に記載する他の疾患モデルに加えて、ヒト乾癬病変に由来する炎症組織に及ぼす抗zB7R1抗体の活性は、重症複合免疫不全(SCID)マウスモデルを用いてインビボで測定することができる。ヒト細胞を免疫不全マウスに移植したいくつかのマウスモデルが開発されている(まとめて異種移植モデルと称される)；例えば、Cattan AR, Douglas E, Leuk. Res. 18:513-22, 1994、およびFlavell, DJ, Hematological Oncology 14:67-82, 1996を参照されたい。乾癬のインビボ異種移植モデルとしては、ヒト乾癬皮膚組織をSCIDマウスモデルに移植し、適切なアンタゴニストを接種する。さらに、ヒト乾癬皮膚移植片をAGR129マウスモデルに移植し、適切なアンタゴニストを接種するような、当技術分野におけるその他の乾癬動物モデルを用いて、zB7R1アンタゴニストを評価することも可能である(例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Boyman, O. et al., J. Exp. Med. Online publication #20031482, 2004を参照されたい)。zB7R1の活性を結合する、遮断する、抑制する、減少させる、拮抗する、または中和する抗zB7R1抗体は好ましいアンタゴニストであるが、抗zB7R1抗体(単独でまたは他のB7アンタゴニストと併用して)、可溶性zB7R1、およびその他のzB7R1アンタゴニストをこのモデルにおいて用いることもできる。同様に、ヒト大腸炎、IBD、関節炎、またはその他の炎症病変に由来する組織または細胞をSCIDモデルにおいて用いて、本明細書に記載するzB7R1アンタゴニストの抗炎症性特性を評価することもできる。
【０３５１】
抗zB7R1抗体またはその誘導体、アゴニスト、複合体、もしくは変種を用いて炎症を消失させる、遅延させる、または減少させるように設計された治療は、ヒト炎症組織(例えば、乾癬病変など)を有するSCIDマウスまたは本明細書に記載のその他のモデルに、抗zB7R1抗体または可溶性zB7R1化合物を投与することによって試験することができる。治療の有効性は、当技術分野で周知の方法を用いて、治療集団における抗炎症効果の経時的な増加として測定され、統計学的に評価される。いくつかの例示的な方法には、例えば乾癬モデルでの表皮肥厚、真皮上皮における炎症細胞数、および不全角化の等級の測定が含まれるが、これらに限定されない。そのような方法は当技術分野において公知であり、本明細書に記載される。例えば、Zeigler, M. et al. Lab Invest 81:1253, 2001；Zollner, T. M. et al. J. Clin. Invest. 109:671, 2002；Yamanaka, N. et al.  Microbio.l Immunol. 45:507, 2001；Raychaudhuri, S. P. et al.  Br. J. Dermatol. 144:931, 2001；Boehncke, W. H et al.  Arch. Dermatol. Res. 291:104, 1999；Boehncke, W. H et al..  J. Invest. Dermatol. 116:596, 2001；Nickoloff, B. J. et al. Am. J. Pathol. 146:580, 1995；Boehncke, W. H. et al. J. Cutan. Pathol. 24:1, 1997；Sugai, J., M. et al. J. Dermatol. Sci. 17:85, 1998；およびVilladsen L.S. et al. J. Clin. Invest. 112:1571, 2003を参照されたい。炎症はまた、試料中に存在する炎症または損傷細胞数、IBDのスコア(体重減少、下痢、直腸出血、結腸の長さ)、足疾患スコア、およびCIA RAモデルの炎症スコアを定量化するために、フローサイトメトリー(またはPCR)などの周知の方法を用いて経時的にモニターしてもよい。例えば、そのようなモデルにおいて試験するのに適した治療戦略には、抗zB7R1抗体とzB7R1との相互作用の破壊に基づく、抗zB7R1抗体、その他のzB7R1アンタゴニスト(単独でまたは他のB7アンタゴニストと共に)、または関連する複合体もしくはアンタゴニストを用いる直接治療、または抗zB7R1抗体またはその誘導体、アゴニスト、複合体、もしくは変種を利用する細胞に基づく治療が含まれる。
【０３５２】
さらに、乾癬は、過形成性表皮核化細胞、ならびにCD4+メモリーT細胞、好中球、およびマクロファージを含む浸潤性単核細胞に関連する慢性炎症性皮膚疾患である(Christophers, Int. Arch. Allergy Immunol., 110:199, 1996)。現在、環境抗原が、この疾患の惹起およびその病理への寄与において重要な役割を果たすと考えられている。しかしながら、乾癬の病理を媒介すると考えられているのは、自己抗原に対する寛容の喪失である。樹状細胞およびCD4+ T細胞は、病理に至る免疫応答を媒介する抗原提示および認識において重要な役割を果たすと考えられている。本発明者らは、最近、CD4+CD45RB移入モデルに基づく乾癬のモデルを開発した(Davenport et al., Internat. Immunopharmacol., 2:653-672）。本発明の抗zB7R1抗体または可溶性zB7R1をマウスに投与する。疾患スコア(皮膚病変、炎症性サイトカイン)の抑制により、乾癬におけるzB7R1アンタゴニスト、例えば抗zB7R1抗体もしくはzB7R1可溶性受容体、またはzB7R1カウンター受容体に対する抗体などのその他のアンタゴニストの有効性が示される。
【０３５３】
5. アトピー性皮膚炎
ADは、ヘルパーT細胞サブセット2(Th2)の過活性化サイトカインを特徴とする一般的な慢性炎症性疾患である。ADの正確な病因は不明であるが、過活性Th2免疫応答、自己免疫、感染、アレルゲン、および遺伝的素因を含む多くの要因が関与している。疾患の重要な特徴には、乾皮症(皮膚の乾燥)、そう痒症(皮膚の痒み)、結膜炎、炎症性皮膚病変、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)感染、血中好酸球増加、血清IgEおよびIgG1の上昇、ならびにT細胞、肥満細胞、マクロファージ、好酸球浸潤を伴う慢性皮膚炎が含まれる。黄色ブドウ球菌による定着または感染はADを悪化させ、この皮膚疾患の慢性性を持続させることが認識されている。
【０３５４】
ADは喘息およびアレルギー性鼻炎患者において認められる場合が多く、アレルギー疾患の最初の症状であることが多い。西欧諸国における人口の約20％がこれらのアレルギー疾患に罹患し、先進諸国におけるADの発症率は理由がわからないが上昇している。ADは典型的に小児期に始まり、青年期を通して成人期まで持続し得る場合が多い。ADの現在の治療には、外用副腎皮質ステロイド、経口シクロスポリンA、タクロリムス(外用薬形態のFK506)などの非副腎皮質ステロイド免疫抑制剤、およびインターフェロンγが含まれる。ADに関する多様な治療にもかかわらず、多くの患者の症状は改善せず、または患者は投薬に対する副作用を有して、他のより有効な治療薬を探す必要がある。本発明の可溶性zB7R1ポリペプチドおよび抗zB7R1抗体は、アトピー性皮膚炎、炎症性皮膚疾患、および本明細書に開示するその他の炎症状態などの特定のヒト疾患の治療において、zB7R1を中和するために用いることができる。
【０３５５】
薬学的使用のために、本発明の可溶性zB7R1または抗zB7R1抗体は、従来法に従って非経口送達、特に静脈内または皮下送達用に製剤化する。静脈内投与は、ボーラス投与、例えばミニポンプもしくはその他の適切な技術を用いる制御放出、または典型的に1〜数時間にわたる注入による。一般的に、薬学的製剤は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、5%デキストロース水溶液などの薬学的に許容されるビヒクルと共に造血タンパク質を含む。製剤は、1つまたは複数の賦形剤、保存剤、溶解剤、緩衝剤、バイアル表面上でのタンパク質損失を防ぐためのアルブミンをさらに含み得る。そのような併用療法を利用する場合、サイトカインは単一製剤中に併用してもよく、または別の製剤として投与してもよい。製剤化方法は当技術分野において周知であり、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton PA, 1990に開示されている。治療用量は一般的に、0.1〜100 mg/kg患者体重/日の範囲であり、好ましくは0.5〜20 mg/kg/日の範囲であり、正確な用量は、治療すべき状態の性質および重症度、患者の体質などを考慮して、容認される基準に従って臨床医により決定される。用量の決定は当業者のレベルの範囲内である。タンパク質は一般的に、化学療法もしくは骨髄移植後28日までの期間にわたり、または血小板数＞20,000個/mm3、好ましくは＞50,000個/mm3が得られるまで投与する。より一般的には、タンパク質は1週間またはそれ未満にわたり、多くの場合1〜3日間にわたり投与する。一般的に、本発明の可溶性zB7R1または抗zB7R1抗体の治療有効量は、リンパ系または骨髄系前駆細胞の増殖および/または分化の臨床的に有意な増加を生じるのに十分な量であり、これは成熟細胞(例えば、血小板または好中球)の循環レベルの増加として現れる。したがって、血小板障害の治療は、血小板数が少なくとも20,000個/mm3、好ましくは50,000個/mm3に達するまで継続する。本発明の可溶性zB7R1または抗zB7R1抗体はまた、IL-3、IL-6、およびIL-11；幹細胞因子；エリスロポエチン；G-CSFおよびGM-CSFなどの他のサイトカインと併用して投与することもできる。併用療法の投与計画において、他のサイトカインの1日量は一般的に：EPO、150 U/kg；GM-CSF、5〜15 lg/kg；IL-3、1〜5 lg/kg；およびG-CSF、1〜25 lg/kgである。例えばEPOとの併用療法は、EPOレベルが低い貧血患者において適応とされる。
【０３５６】
一般的に、投与する可溶性zB7R1(またはzB7R1類似体もしくは融合タンパク質)または抗zB7R1抗体の用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全般的な医学的状態、および既往歴などの要因に応じて変動する。典型的には、約1 pg/kg〜10 mg/kg(薬剤量/患者体重)という範囲の用量の可溶性zB7R1または抗zB7R1抗体をレシピエントに提供することが望ましいが、状況に応じてこれよりも低用量または高用量を投与してもよい。
【０３５７】
対象に対する可溶性zB7R1または抗zB7R1抗体の投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、髄腔内、局所カテーテルによる潅流、または直接的病巣内注射であってよい。注射により治療タンパク質を投与する場合、投与は持続注入または単回もしくは複数回のボーラス投与によるものであってよい。
【０３５８】
さらなる投与経路には、経口、経粘膜、経肺、および経皮が含まれる。経口送達は、ポリエステル微粒子、ゼイン微粒子、プロテイノイド微粒子、ポリシアノアクリレート微粒子、および脂質に基づく系に適している(例えば、DiBase and Morrel,「Oral Delivery of Microencapsulated Proteins」, Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 255-288 (Plenum Press 1997)を参照されたい)。鼻腔内送達の実行可能性は、インスリン投与のような様式で例証される(例えば、Hinchcliffe and Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:199 (1999)を参照されたい)。zB7R1を含む乾燥粒子または液状粒子を調製し、乾燥粉末分散装置、液体エアロゾル発生装置、または噴霧器を用いて吸入させることができる(例えば、Pettit and Gombotz, TIBTECH 16:343 (1998)；Patton et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 35:235 (1999))。このアプローチは、エアロゾル化されたインスリンを肺に送達する携帯式の電動吸入装置である、AERX糖尿病管理システムによって例証される。研究の結果、48,000 kDaもの大きさのタンパク質が、低周波数超音波を利用することで皮膚を介して治療濃度で送達されることが示されており、これは経皮投与の実行可能性を示すものである(Mitragotri et al., Science 269:850 (1995))。エレクトロポレーションを用いる経皮送達は、zB7R1結合活性を有する分子を投与するための別の手段を提供する(Potts et al., Pharm. Biotechnol. 10:213 (1997))。
【０３５９】
可溶性zB7R1または抗zB7R1抗体を含む薬学的組成物は、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って製剤化することができ、それにより治療タンパク質は薬学的に許容される担体との混合物中に組み込まれる。組成物は、その投与がレシピエント患者によって許容され得る場合に、「薬学的に許容される担体」と表現される。滅菌リン酸緩衝食塩水は、薬学的に許容される担体の一例である。その他の適切な担体は当業者に周知である。例えば、Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995)を参照されたい。
【０３６０】
治療目的のために、可溶性zB7R1または抗zB7R1抗体分子および薬学的に許容される担体を、治療有効量で患者に投与する。本発明の治療分子と薬学的に許容される担体との混合物は、投与量が生理学的に有意である場合に、「治療有効量」で投与されると表現される。薬剤は、その存在によりレシピエント患者の生理機能に検出可能な変化が生じる場合に、生理学的に有意である。例えば、炎症の治療に用いられる薬剤は、その存在により炎症反応が軽減する場合に、生理学的に有意である。
【０３６１】
zB7R1(またはzB7R1類似体もしくは融合タンパク質)または抗zB7R1抗体を含む薬学的組成物は、液体形態、エアロゾル、または固体形態で提供することができる。液体形態は、注射用溶液および経口懸濁剤によって例証される。例示的な固体形態には、カプセル剤、錠剤、および制御放出形態が含まれる。後者の形態は、小型浸透圧ポンプおよび植込錠によって例証される(Bremer et al., Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997)；Ranade, 「Implants in Drug Delivery」, Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 95-123 (CRC Press 1995)；Bremer et al., 「Protein Delivery with Infusion Pumps」, Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 239-254 (Plenum Press 1997)；Yewey et al., 「Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant」, Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 93-117 (Plenum Press 1997))。
【０３６２】
リポソームは、治療ポリペプチドを対象の静脈内、腹腔内、髄腔内、筋肉内、皮下に、または経口投与、吸入、もしくは鼻腔内投与で送達するための1つの手段を提供する。リポソームとは、水性区画を囲む1つまたは複数の脂質二重層からなる微視的小胞である(一般的には、Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1):S61 (1993)、Kim, Drugs 46:618 (1993)、およびRanade, 「Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers」, Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 3-24 (CRC Press 1995)を参照されたい)。リポソームは組成が細胞膜と類似しており、その結果リポソームは安全に投与することができ、また生分解性である。調製法に応じて、リポソームは単層または多層の場合があり、またリポソームの大きさは0.02μm〜10μm超の直径で様々であり得る。種々の薬剤をリポソーム内に封入することができ：疎水性薬剤は二重層内に分配され、親水性薬剤は内部の水性空間に分配される(例えば、Machy et al., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987）、およびOstro et al., American J. Hosp. Pharm. 46:1576 (1989)を参照されたい)。さらに、リポソームの大きさ、二重層の数、脂質組成、ならびにリポソームの電荷および表面特性を変化させることにより、封入薬剤の治療利用能を制御することが可能である。
【０３６３】
リポソームは実質的にあらゆる種類の細胞に吸着し、次いで封入された薬剤を緩やかに放出し得る。または、吸収されたリポソームは、食作用性の細胞によりエンドサイトーシスで取り込まれ得る。エンドサイトーシスに続いて、リポソーム脂質がリソソーム内で分解され、封入薬剤が放出される(Scherphof et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 446:368 (1985))。静脈内投与後、小さなリポソーム(0.1〜1.0μm)は典型的に、主に肝臓および脾臓に位置する網内系の細胞によって取り込まれ、3.0μmより大きなリポソームは肺に蓄積する。網内系の細胞による小さなリポソームのこのような選択的取り込みは、化学療法薬をマクロファージおよび肝臓の腫瘍に送達するために用いられている。
【０３６４】
網内系は、大用量のリポソーム粒子による飽和、または薬理学的手段による選択的なマクロファージ不活性化を含むいくつかの方法によって回避され得る(Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta 802:428 (1984))。さらに、糖脂質またはポリエチレングリコール誘導体化リン脂質をリポソーム膜に取り込むと、網内系による取り込みが有意に減少することが示されている(Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991)；Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993))。
【０３６５】
リポソームはまた、リン脂質組成を変化させることにより、またはリポソームに受容体もしくはカウンター受容体を挿入することにより、特定の細胞または器官を標的化するように調製することができる。例えば、非イオン性界面活性剤を多量に含めて調製されたリポソームは、肝臓を標的化するために用いられている(Hayakawa et al.、特許第04-244,018号；Kato et al., Biol. Pharm. Bull. 16:960 (1993))。これらの製剤は、メタノール中でダイズホスファチジルコリン、α-トコフェロール、およびエトキシル化水素化ヒマシ油(HCO-60)を混合し、この混合物を真空下で濃縮し、次いで水によりこの混合物を再構成することで調製された。ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)とダイズ由来ステリルグルコシド混合物(SG)およびコレステロール(Ch)のリポソーム製剤もまた、肝臓を標的化することが示されている(Shimizu et al., Biol. Pharm. Bull. 20:881 (1997))。
【０３６６】
または、抗体、抗体断片、炭水化物、ビタミン、および輸送タンパク質などの種々の標的化カウンター受容体をリポソームの表面に結合させることができる。例えば、リポソームを分枝型ガラクトシル脂質誘導体で修飾して、もっぱら肝細胞表面上に発現されるアシアロ糖タンパク質(ガラクトース)受容体を標的化することができる(Kato and Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287 (1997)；Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull.20:259 (1997))。同様に、Wu et al., Hepatology 27:772 (1998)は、リポソームをアシアロフェチュインで標識すると、リポソームの血漿半減期が短くなり、肝細胞によるアシアロフェチュイン標識リポソームの取り込みが大きく促進されることを示している。一方、分枝型ガラクトシル脂質誘導体を含むリポソームの肝細胞への蓄積は、アシアロフェチュインを事前に注入することにより抑制され得る(Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull.20:259 (1997))。ポリアコニチル化(polyaconitylated)ヒト血清アルブミンリポソームは、リポソームを肝細胞に標的化するための別のアプローチを提供する(Kamps et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:11681 (1997))。さらに、Geho, et al. 米国特許第4,603,044号では、肝臓の特殊化した代謝細胞に付随する肝胆道受容体に対する特異性を有する肝細胞指向性リポソーム小胞送達系について記載している。
【０３６７】
組織標的化のためのより一般的なアプローチでは、標的細胞を、標的細胞によって発現されるカウンター受容体に特異的なビオチン化抗体で前標識する(Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998))。遊離の抗体を血漿から除去した後に、ストレプトアビジン結合リポソームを投与する。別のアプローチでは、標的化抗体をリポソームに直接結合する(Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998))。
【０３６８】
ポリペプチドおよび抗体は、タンパク質微小カプセル化の標準的な技法を用いてリポソーム内に封入することができる(例えば、Anderson et al., Infect. Immun. 31:1099 (1981)、Anderson et al., Cancer Res. 50:1853 (1990)、およびCohen et al., Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991)、Alving et al., 「Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies」, Liposome Technology, 2nd Edition, Vol. III, Gregoriadis (ed.), page 317 (CRC Press 1993)、Wassef et al., Meth. Enzymol. 149:124 (1987)を参照されたい)。上述したように、治療上有用なリポソームは様々な成分を含み得る。例えば、リポソームはポリ(エチレングリコール)の脂質誘導体を含み得る(Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993))。
【０３６９】
分解性ポリマー微粒子は、治療タンパク質の高度の全身性レベルを維持するように設計されている。微粒子は、ポリラクチド・グリコリド共重合体(PLG)、ポリ無水物、ポリ(オルトエステル)、非生物分解性エチルビニル酢酸ポリマーなどの分解性ポリマーから調製され、このポリマー内にタンパク質が封入される(Gombotz and Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332 (1995)；Ranade, 「Role of Polymers in Drug Delivery」, Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 51-93 (CRC Press 1995)；Roskos and Maskiewicz, 「Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery」, Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 45-92 (Plenum Press 1997)；Bartus et al., Science 281:1161 (1998)；Putney and Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998)；Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548 (1998))。ポリエチレングリコール(PEG)で被覆されたナノ粒子もまた、治療タンパク質を静脈内投与するための担体を提供し得る(例えば、Gref et al., Pharm. Biotechnol. 10:167 (1997)を参照されたい)。
【０３７０】
本発明はまた、zB7R1単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、または多量体可溶性受容体、およびzB7R1アンタゴニスト、例えば、抗zB7R1抗体もしくは結合ポリペプチド、または中和性抗zB7R1抗体などの、結合zB7R1活性を有するポリペプチドであって、上記のポリマーに連結された化学修飾ポリペプチドを意図する。
【０３７１】
当業者は、例えば、Ansel and Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th Edition (Lea & Febiger 1990)、Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995)、およびRanade and Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996)によって示されるように、他の剤形を考案することができる。
【０３７２】
例として、薬学的組成物は、zB7R1細胞外ドメインを有するポリペプチド、例えば、zB7R1単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、もしくは多量体可溶性受容体、またはzB7R1アンタゴニスト(例えば、zB7R1ポリペプチドと結合する抗体もしくは抗体断片、または中和性抗zB7R1抗体)を含む容器を含むキットとして提供され得る。治療ポリペプチドは、単回用量もしくは複数回用量の注射用溶液の形態で、または注射前に再構成される滅菌粉末として提供され得る。または、このようなキットは、治療ポリペプチドを投与するための乾燥粉末分散装置、液体エアロゾル発生装置、または噴霧器を含み得る。このようなキットは、薬学的組成物の適応および用法に関する書面情報をさらに含み得る。さらに、このような情報は、zB7R1組成物が、zB7R1に対する公知の過敏症を有する患者には禁忌であるという記述を含み得る。
【０３７３】
抗zB7R1抗体もしくは結合パートナー(または抗zB7R1抗体断片、抗体融合物、ヒト化抗体など)またはzB7R1可溶性受容体を含む薬学的組成物は、液体形態、エアロゾル、または固体形態で提供することができる。液体形態は、注射用溶液、エアロゾル、滴剤、トポロジー溶液(topological solution)、および経口懸濁剤によって例証される。例示的な固体形態には、カプセル剤、錠剤、および制御放出形態が含まれる。後者の形態は、小型浸透圧ポンプおよび植込錠によって例証される(Bremer et al., Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997)；Ranade, 「Implants in Drug Delivery」, Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 95-123 (CRC Press 1995)；Bremer et al., 「Protein Delivery with Infusion Pumps」, Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 239-254 (Plenum Press 1997)；Yewey et al., 「Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant」, Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 93-117 (Plenum Press 1997))。その他の固体形態には、クリーム剤、ペースト剤、その他のトポロジー適用(topological application)などが含まれる。
【０３７４】
リポソームは、治療ポリペプチドを対象の静脈内、腹腔内、髄腔内、筋肉内、皮下に、または経口投与、吸入、もしくは鼻腔内投与で送達するための1つの手段を提供する。リポソームとは、水性区画を囲む1つまたは複数の脂質二重層からなる微視的小胞である(一般的には、Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1):S61 (1993)、Kim, Drugs 46:618 (1993)、およびRanade, 「Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers」, Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 3-24 (CRC Press 1995)を参照されたい)。リポソームは組成が細胞膜と類似しており、その結果リポソームは安全に投与することができ、また生分解性である。調製法に応じて、リポソームは単層または多層の場合があり、またリポソームの大きさは0.02μm〜10μm超の直径で様々であり得る。種々の薬剤をリポソーム内に封入することができ：疎水性薬剤は二重層内に分配され、親水性薬剤は内部の水性空間に分配される(例えば、Machy et al., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987）、およびOstro et al., American J. Hosp. Pharm. 46:1576 (1989)を参照されたい)。さらに、リポソームの大きさ、二重層の数、脂質組成、ならびにリポソームの電荷および表面特性を変化させることにより、封入薬剤の治療利用能を制御することが可能である。
【０３７５】
リポソームは実質的にあらゆる種類の細胞に吸着し、次いで封入された薬剤を緩やかに放出し得る。または、吸収されたリポソームは、食作用性の細胞によりエンドサイトーシスで取り込まれ得る。エンドサイトーシスに続いて、リポソーム脂質がリソソーム内で分解され、封入薬剤が放出される(Scherphof et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 446:368 (1985))。静脈内投与後、小さなリポソーム(0.1〜1.0μm)は典型的に、主に肝臓および脾臓に位置する網内系の細胞によって取り込まれ、3.0μmより大きなリポソームは肺に蓄積する。網内系の細胞による小さなリポソームのこのような選択的取り込みは、化学療法薬をマクロファージおよび肝臓の腫瘍に送達するために用いられている。
【０３７６】
網内系は、大用量のリポソーム粒子による飽和、または薬理学的手段による選択的なマクロファージ不活性化を含むいくつかの方法によって回避され得る(Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta 802:428 (1984))。さらに、糖脂質またはポリエチレングリコール誘導体化リン脂質をリポソーム膜に取り込むと、網内系による取り込みが有意に減少することが示されている(Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991)；Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993))。
【０３７７】
リポソームはまた、リン脂質組成を変化させることにより、またはリポソームに受容体もしくはカウンター受容体を挿入することにより、特定の細胞または器官を標的化するように調製することができる。例えば、非イオン性界面活性剤を多量に含めて調製されたリポソームは、肝臓を標的化するために用いられている(Hayakawa et al.、特許第04-244,018号；Kato et al., Biol. Pharm. Bull. 16:960 (1993))。これらの製剤は、メタノール中でダイズホスファチジルコリン、α-トコフェロール、およびエトキシル化水素化ヒマシ油(HCO-60)を混合し、この混合物を真空下で濃縮し、次いで水によりこの混合物を再構成することで調製された。ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)とダイズ由来ステリルグルコシド混合物(SG)およびコレステロール(Ch)のリポソーム製剤もまた、肝臓を標的化することが示されている(Shimizu et al., Biol. Pharm. Bull. 20:881 (1997))。
【０３７８】
または、抗体、抗体断片、炭水化物、ビタミン、および輸送タンパク質などの種々の標的化カウンター受容体をリポソームの表面に結合させることができる。例えば、リポソームを分枝型ガラクトシル脂質誘導体で修飾して、もっぱら肝細胞表面上に発現されるアシアロ糖タンパク質(ガラクトース)受容体を標的化することができる(Kato and Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287 (1997)；Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull. 20:259 (1997))。同様に、Wu et al., Hepatology 27:772 (1998)は、リポソームをアシアロフェチュインで標識すると、リポソームの血漿半減期が短くなり、肝細胞によるアシアロフェチュイン標識リポソームの取り込みが大きく促進されることを示している。一方、分枝型ガラクトシル脂質誘導体を含むリポソームの肝細胞への蓄積は、アシアロフェチュインを事前に注入することにより抑制され得る(Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull. 20:259 (1997))。ポリアコニチル化ヒト血清アルブミンリポソームは、リポソームを肝細胞に標的化するための別のアプローチを提供する(Kamps et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:11681 (1997))。さらに、Geho, et al. 米国特許第4,603,044号では、肝臓の特殊化した代謝細胞に付随する肝胆道受容体に対する特異性を有する肝細胞指向性リポソーム小胞送達系について記載している。
【０３７９】
組織標的化のためのより一般的なアプローチでは、標的細胞を、標的細胞によって発現されるカウンター受容体に特異的なビオチン化抗体で前標識する(Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998))。遊離の抗体を血漿から除去した後に、ストレプトアビジン結合リポソームを投与する。別のアプローチでは、標的化抗体をリポソームに直接結合する(Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998))。
【０３８０】
zB7R1結合活性を有する抗zB7R1中和抗体および結合パートナー、またはzB7R1可溶性受容体は、タンパク質微小カプセル化の標準的な技法を用いてリポソーム内に封入することができる(例えば、Anderson et al., Infect. Immun. 31:1099 (1981)、Anderson et al., Cancer Res. 50:1853 (1990)、およびCohen et al., Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991)、Alving et al., 「Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies」, Liposome Technology, 2nd Edition, Vol. III, Gregoriadis (ed.), page 317 (CRC Press 1993)、Wassef et al., Meth. Enzymol. 149:124 (1987)を参照されたい)。上述したように、治療上有用なリポソームは様々な成分を含み得る。例えば、リポソームはポリ(エチレングリコール)の脂質誘導体を含み得る(Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993))。
【０３８１】
分解性ポリマー微粒子は、治療タンパク質の高度の全身性レベルを維持するように設計されている。微粒子は、ポリラクチド・グリコリド共重合体(PLG)、ポリ無水物、ポリ(オルトエステル)、非生物分解性エチルビニル酢酸ポリマーなどの分解性ポリマーから調製され、このポリマー内にタンパク質が封入される(Gombotz and Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332 (1995)；Ranade, 「Role of Polymers in Drug Delivery」, Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 51-93 (CRC Press 1995)；Roskos and Maskiewicz, 「Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery」, Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 45-92 (Plenum Press 1997)；Bartus et al., Science 281:1161 (1998)；Putney and Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998)；Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548 (1998))。ポリエチレングリコール(PEG)で被覆されたナノ粒子もまた、治療タンパク質を静脈内投与するための担体を提供し得る(例えば、Gref et al., Pharm. Biotechnol. 10:167 (1997)を参照されたい)。
【０３８２】
本発明はまた、上記のポリマーに連結された、化学修飾された抗zB7R1抗体もしくは結合パートナー、例えば抗体zB7R1抗体、またはzB7R1可溶性受容体を意図する。
【０３８３】
当業者は、例えば、Ansel and Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th Edition (Lea & Febiger 1990)、Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995)、およびRanade and Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996)によって示されるように、他の剤形を考案することができる。
【０３８４】
本発明は、抗zB7R1抗体の組成物、ならびに本明細書に記載する抗体、ペプチド、またはポリペプチドを含む方法および治療的使用を意図する。そのような組成物は担体をさらに含み得る。担体は、従来の有機担体または無機担体であってよい。担体の例には、水、緩衝液、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などが含まれる。
【０３８５】
12. トランスジェニックマウスの作製
zB7R1またはその改変型をコードする核酸を用いて、トランスジェニック動物または「ノックアウト」動物を作製することもでき、これらの動物は治療上有用な試薬の開発およびスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えば、マウスまたはラット)とは、導入遺伝子を含む細胞を有する動物であり、導入遺伝子は、出生前に(例えば、胚段階で)動物またはその動物の祖先に導入されたものである。導入遺伝子は、トランスジェニック動物が発生する元となる細胞のゲノムに組み込まれたDNAである。1つの態様においては、zB7R1タンパク質をコードするcDNAを用いて、確立された技法に従ってzB7R1タンパク質をコードするゲノムDNAをクローニングすることができ、このゲノム配列を用いて所望のDNAを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を作製することができる。トランスジェニック動物、特にマウスまたはラットなどの動物を作製する方法は、当技術分野において確立されており、例えば米国特許第4,736,866号および同第4,870,009号に記載されている。
【０３８６】
または、zB7R1の非ヒト相同体を用いて、zB7R1をコードする内因性遺伝子と動物の胚細胞に導入されたzB7R1をコードする改変ゲノムDNAとの間の相同組換えの結果として、zB7R1タンパク質をコードする遺伝子が欠損したまたは変化した「ノックアウト」動物を構築することができる。例えば、zB7R1タンパク質をコードするcDNAを用いて、確立された技法に従ってzB7R1タンパク質をコードするゲノムDNAをクローニングすることができる。zB7R1タンパク質をコードするゲノムDNAの一部は、欠失させるか、または組み込みをモニターするために用いることができる選択マーカーをコードする遺伝子などの別の遺伝子で置換することができる。典型的には、改変していない数キロベースの隣接DNA(5'末端および3'末端の両方における)をベクター中に含める。例えば、Thomas and Capecchi , Cell, 51:503 (1987)を参照されたい。このベクターを胚性幹細胞株に(例えば、エレクトロポレーションによって)導入し、導入したDNAが内因性DNAと相同組換えを起こした細胞を選択する。例えば、Li et al., Cell, 69:915 (1992)を参照されたい。次いで、選択した細胞を動物(例えば、マウスまたはラット)の胚盤胞に注入し、凝集キメラを形成させる。例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152を参照されたい。次に、キメラ胚を適切な偽妊娠雌代理母動物に移植し、この胚を出産までもっていき「ノックアウト」動物を作製することができる。生殖細胞中に相同組換えを起こしたDNAを有する子孫を標準的な技法により同定し、これを用いて、すべての細胞が相同組換えを起こしたDNAを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、例えば、特定の病態に対して防御する能力に関して、およびzB7R1タンパク質の非存在に起因する病態の発症に関して特徴づけることができる。本明細書に記載したモデルは変更可能であると理解される。例えば、「ノックイン」モデルを形成することができ、またはモデルは動物モデルよりもむしろ細胞に基づくものであってよい。
【０３８７】
本発明を以下の非制限的な実施例によりさらに説明する。
【０３８８】
実施例1
マウスzB7R1発現構築物
全長マウスzB7R1(配列番号:8)をコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを、相同組換えにより構築した。マウスzB7R1 cDNAの断片は、マウスzB7R1挿入点に隣接するベクター配列に相当する5'および3'末端における隣接領域を有する配列番号:29により同定されるポリヌクレオチド配列を用いて、プライマーzc51280(配列番号:30)およびzc51314(配列番号:31)を使用してPCRによって単離した。
【０３８９】
PCR反応混合物を2%アガロースゲルで泳動し、挿入物の大きさに相当するバンドを、QIAquick(商標) Gel Extraction Kit(Qiagen、カリフォルニア州、バレンシア)を用いてゲル抽出する。プラスミドpZMP21は、MPSVプロモーター、コード配列を挿入するための複数制限部位、終止コドン、大腸菌複製開始点を含む発現カセット；SV40プロモーター、エンハンサー、および複製開始点、DHFR遺伝子、およびSV40ターミネーターを含む哺乳動物選択マーカー発現ユニット；ならびにS. セレビシエにおける選択および複製に必要なURA3およびCEN-ARSを含む哺乳動物発現ベクターである。これは、pRS316(American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209にアクセッション番号77145として寄託されている)から回収された酵母遺伝子エレメント、ポリオウイルス由来の配列内リボソーム進入部位(IRES)エレメント、および膜貫通ドメインのC末端で切断されたCD8の細胞外ドメインを用いて、pZP9(American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209にアクセッション番号98668として寄託されている)から構築した。プラスミドpZMP21をBglIIで消化し、PCR挿入物との組換えに使用した。
【０３９０】
組換えは、BD In-Fusion(商標) Dry-Down PCR Cloningキット(BD Biosciences、カリフォルニア州、パロアルト)を用いて行った。10μl中のPCR断片と消化ベクターの混合物を凍結乾燥クローニング試薬に添加し、37℃で15分間および50℃で15分間インキュベートした。反応物は形質転換の準備ができた。組換え反応物2μlをOne Shot TOP10 Chemical Competent Cell(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド)に形質転換した。形質転換物を氷上で10分間インキュベートし、42℃の熱ショックを30秒間かけた。反応物を氷上で2分間インキュベートした(形質転換細胞が回復するのを助ける)。2分間インキュベートした後、300μlのSOC(2% Bacto(商標) Tryptone(Difco、ミシガン州、デトロイト)、0.5%酵母抽出物(Difco)、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM MgSO4、20 mMグルコース)を添加し、振盪機を用いて形質転換物を37℃で1時間インキュベートした。全形質転換物を1枚のLB AMPプレート(LBブロス(Lennox)、1.8% Bacto(商標) Agar(Difco)、100 mg/Lアンピシリン)にプレーティングした。
【０３９１】
プライマーzc51280(配列番号:30)およびzc51314(配列番号:31)をそれぞれ用いて、PCRによりコロニーをスクリーニングした。陽性コロニーを配列決定により確認した。正確な構築物を、mzB7R1FLpZMP21と命名した。
【０３９２】
実施例2
マウスzB7R1mFc2pZMP21
マウスzB7R1の細胞外ドメインおよびマウスFc2部分をコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを、相同組換えにより構築することができる。マウスzB7R1の細胞外ドメインのDNA断片は、マウスzB7R1挿入点に隣接するベクター配列およびマウスFc2配列に相当する5'および3'末端における隣接領域を有する配列番号:32を用いて、プライマーzc50437(配列番号:33)およびzc50438(配列番号:34)を使用してPCRによって単離する。
【０３９３】
PCR反応混合物を2%アガロースゲルで泳動し、挿入物の大きさに相当するバンドを、QIAquick(商標) Gel Extraction Kit(Qiagen、カリフォルニア州、バレンシア)を用いてゲル抽出する。用いた最初のプラスミドは、基礎ベクターとしてpZMP21を使用し、それに組み込まれたマウスFc2部分を有するpZMP21である。プラスミドpZMP21は、MPSVプロモーター、コード配列を挿入するための複数制限部位、終止コドン、大腸菌複製開始点を含む発現カセット；SV40プロモーター、エンハンサー、および複製開始点、DHFR遺伝子、およびSV40ターミネーターを含む哺乳動物選択マーカー発現ユニット；ならびにS. セレビシエにおける選択および複製に必要なURA3およびCEN-ARSを含む哺乳動物発現ベクターである。これは、pRS316(American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209にアクセッション番号77145として寄託されている)から回収された酵母遺伝子エレメント、ポリオウイルス由来の配列内リボソーム進入部位(IRES)エレメント、および膜貫通ドメインのC末端で切断されたCD8の細胞外ドメインを用いて、pZP9(American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209にアクセッション番号98668として寄託されている)から構築した。BTLAを切断除去するためにプラスミドhBTLA mFc2 pZMP21をEcoR1/BglIIで消化し、PCR挿入物との組換えに使用した。
【０３９４】
組換えは、BD In-Fusion(商標) Dry-Down PCR Cloningキット(BD Biosciences、カリフォルニア州、パロアルト)を用いて行った。10μl中のPCR断片と消化ベクターの混合物を凍結乾燥クローニング試薬に添加し、37℃で15分間および50℃で15分間インキュベートした。反応物は形質転換の準備ができた。組換え反応物2μlをOne Shot TOP10 Chemical Competent Cell(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド)に形質転換した。形質転換物を氷上で10分間インキュベートし、42℃の熱ショックを30秒間かけた。反応物を氷上で2分間インキュベートした(形質転換細胞が回復するのを助ける)。2分間インキュベートした後、300μlのSOC(2% Bacto(商標) Tryptone(Difco、ミシガン州、デトロイト)、0.5%酵母抽出物(Difco)、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM MgSO4、20 mMグルコース)を添加し、振盪機を用いて形質転換物を37℃で1時間インキュベートした。全形質転換物を1枚のLB AMPプレート(LBブロス(Lennox)、1.8% Bacto(商標) Agar(Difco)、100 mg/Lアンピシリン)にプレーティングした。
【０３９５】
プライマーzc50437(配列番号:33)およびzc50438(配列番号:34)を用いて、PCRによりコロニーをスクリーニングした。陽性コロニーを配列決定により確認した。正確な構築物を、mB7R1mFc2pZMP21(配列番号:69)と命名した。
【０３９６】
実施例3
B7/mFc2発現構築物
c末端をFcタグ化した可溶型のzB7R1を発現させるため、発現ベクターpZMP21 hB7R1/mFc2(配列番号:68)を調製した。5'末端および3'末端それぞれにおいてコードされるEcoRI部位およびBglII部位を有する、zB7R1の細胞外ドメイン(配列番号:3)およびmFcの最初の2アミノ酸(グルタミンおよびプロリン)を含む734塩基対断片をPCRにより作製した。
【０３９７】
このPCR断片は、プライマーzc48914(配列番号:35)およびzc48908(配列番号:36)を用いて、ヒト胎盤cDNAライブラリーから増幅することによって作製した。PCR反応条件は以下の通りであった：94℃で1分、60℃で1分、および72℃で2分の25サイクル；72℃で10分の1サイクル；その後の4℃での浸漬。エフェクター機能の定常2および定常3ドメインマイナスBALB-C IgGγ2a(mFc2)を含む699塩基対断片をPCRにより作製した。PCR断片は、プライマーzc48911およびac48915を用いて、mFc2を含む発現ベクター(mTACI/mFc2構築物#998)から増幅することによって作製した。PCR反応条件は以下の通りであった：94℃で1分、60℃で1分、および72℃で2分の25サイクル；72℃で10分の1サイクル；その後の4℃での浸漬。734塩基対zB7R1断片および699塩基対mFc2断片を、1%アガロースゲル電気泳動およびQiaQuickゲル抽出キット(Qiagen：28704)を用いるバンド精製によって精製した。酵母株SF838-9Dalphaを用いて、zB7R1断片およびmFc2断片の各精製バンドそれぞれの全量の1/5および1/25を、BglII消化により線状化し上記のようにバンド精製により精製したpZMP21に組み込んだ。ウラシル欠損寒天プレートで増殖し得る酵母を溶解し、エタノール沈殿によりDNAを抽出した。連結混合物2μlを、製造業者の指示に従って37μl DH10Bエレクトロコンピテント大腸菌(Gibco 18297-010)にエレクトロポレーションした。形質転換細胞をLB培地400μlで希釈し、100μg/mlアンピシリンを含むLBプレートにプレーティングした。制限消化によりクローンを解析し、陽性クローンをDNA配列決定に供してPCRの精度を確認した。
【０３９８】
次いで、上記の発現ベクターpZMP21 hB7R1/mfc2を用いて、一連のmFc2可溶性キメラタンパク質を構築した。zB7R1/mFc2は、クローントラック#101632を鋳型としてオリゴzc 50136(配列番号:37)およびzc50138(配列番号:38)を用いて、438塩基対断片をPCRすることにより構築した。得られたPCR産物を上記の通りにバンド精製し、EcoRIおよびBglIIで消化した。得られた産物を再度バンド精製した。pZMP21 hB7R1/mFc2もまたEcoRIおよびBglIIで消化し、9721塩基対のベクター骨格プラスmFc2を単離した。T4 DNAリガーゼを用いて、pZMP21 hB7R1/mFc2産物の1/50を438塩基対断片の3/50と連結させた。連結混合物2μlを、製造業者の指示に従って37μl DH10Bエレクトロコンピテント大腸菌(Gibco 18297-010)にエレクトロポレーションした。形質転換細胞をLB培地400μlで希釈し、100μg/mlアンピシリンを含むLBプレートにプレーティングした。制限消化によりクローンを解析し、陽性クローンをDNA配列決定に供してPCRの精度を確認した。次いで、3組のpZMP21 hB7R1/mFc2構築物200μgをそれぞれPvu I 200単位により37℃で3時間消化し、次にIPAで沈殿させて、1.5 mL微量遠心チューブ中で遠心沈降させた。ペレットから上清を廃棄し、ペレットを70%エタノール1 mLで洗浄し、室温で5分間インキュベートした。チューブを微量遠心機において14,000 RPMで10分間遠心し、ペレットから上清を廃棄した。次いで、滅菌環境においてペレットをPF-CHO培地750μlに再懸濁し、60℃で30分間インキュベートし、室温まで冷却した。5E6 APFDXB11細胞を3本のチューブそれぞれにおいて遠心沈降させ、DNA-培地溶液を用いて再懸濁した。DNA/細胞混合物を0.4 cmギャップキュベットに入れて、以下のパラメータを用いてエレクトロポレーションした：950μF、高電気容量、および300 V。次いでキュベットの内容物を採取してプールし、PF-CHO培地で25 mLに希釈し、125 mL振盪フラスコに入れた。フラスコを振盪機上の37℃、6% CO2のインキュベーターに入れ、120 RPMで振盪させた。細胞株を栄養選択に供した後、200 nMメトトレキセート(MTX)および次いで500 nM MTXに対する段階的増幅に供した。ウェスタンブロットにより発現を確認し、細胞株を拡大して、タンパク質精製を行った。
【０３９９】
実施例4
マウスzB7R1Avi-HISタグpZMP21
四量体分子を作製する試みにおいて、マウスzB7R1の細胞外ドメイン、Aviタグ、およびHISタグをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを構築した。マウスzB7R1の細胞外ドメインのDNA断片は、マウスzB7R1挿入点に隣接するベクター配列およびAviタグ配列の一部に相当する5'および3'末端における隣接領域を有する配列番号:39を用いて、プライマーzc51100(配列番号:40)およびzc51101(配列番号:41)を使用してPCRによって単離する。
【０４００】
PCR反応混合物を2%アガロースゲルで泳動し、挿入物の大きさに相当するバンドを、QIAquick(商標) Gel Extraction Kit(Qiagen、カリフォルニア州、バレンシア)を用いてゲル抽出する。プラスミドpZMP21は、MPSVプロモーター、コード配列を挿入するための複数制限部位、終止コドン、大腸菌複製開始点を含む発現カセット；SV40プロモーター、エンハンサー、および複製開始点、DHFR遺伝子、およびSV40ターミネーターを含む哺乳動物選択マーカー発現ユニット；ならびにS. セレビシエにおける選択および複製に必要なURA3およびCEN-ARSを含む哺乳動物発現ベクターである。これは、pRS316(American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209にアクセッション番号77145として寄託されている)から回収された酵母遺伝子エレメント、ポリオウイルス由来の配列内リボソーム進入部位(IRES)エレメント、および膜貫通ドメインのC末端で切断されたCD8の細胞外ドメインを用いて、pZP9(American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209にアクセッション番号98668として寄託されている)から構築した。プラスミドpZMP21AviHISをEcoR1で消化し、PCR挿入物との組換えに使用した。
【０４０１】
組換えは、BD In-Fusion(商標) Dry-Down PCR Cloningキット(BD Biosciences、カリフォルニア州、パロアルト)を用いて行った。10μl中のPCR断片と消化ベクターの混合物を凍結乾燥クローニング試薬に添加し、37℃で15分間および50℃で15分間インキュベートした。反応物は形質転換の準備ができた。組換え反応物2μlをOne Shot TOP10 Chemical Competent Cell(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド)に形質転換した。形質転換物を氷上で10分間インキュベートし、42℃の熱ショックを30秒間かけた。反応物を氷上で2分間インキュベートした(形質転換細胞が回復するのを助ける)。2分間インキュベートした後、300μlのSOC(2% Bacto(商標) Tryptone(Difco、ミシガン州、デトロイト)、0.5%酵母抽出物(Difco)、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM MgSO4、20 mMグルコース)を添加し、振盪機を用いて形質転換物を37℃で1時間インキュベートした。全形質転換物を1枚のLB AMPプレート(LBブロス(Lennox)、1.8% Bacto(商標) Agar(Difco)、100 mg/Lアンピシリン)にプレーティングした。
【０４０２】
プライマーzc51100(配列番号:40)およびzc51101(配列番号:41)を用いて、PCRによりコロニーをスクリーニングした。陽性コロニーを配列決定により確認した。正確な構築物を、mB7R1AviHISpZMP21と命名した。
【０４０３】
実施例5
ヒトzB7R1Avi-HISタグpZMP21
四量体分子を作製する試みにおいて、ヒトzB7R1の細胞外ドメイン(配列番号:3)、Aviタグ、およびHISタグをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを構築した。ヒトzB7R1の細胞外ドメインのDNA断片は、ヒトzB7R1挿入点に隣接するベクター配列ならびにAviタグ配列(配列番号:43)およびHISタグ配列(配列番号:44)に相当する5'および3'末端における隣接領域を有する配列番号:42を用いて、プライマーzc50485(配列番号:45)およびzc50729(配列番号:46)を使用してPCRによって単離する。
【０４０４】
PCR反応混合物を2%アガロースゲルで泳動し、挿入物の大きさに相当するバンドを、QIAquick(商標) Gel Extraction Kit(Qiagen、カリフォルニア州、バレンシア)を用いてゲル抽出する。プラスミドpZMP21は、MPSVプロモーター、コード配列を挿入するための複数制限部位、終止コドン、大腸菌複製開始点を含む発現カセット；SV40プロモーター、エンハンサー、および複製開始点、DHFR遺伝子、およびSV40ターミネーターを含む哺乳動物選択マーカー発現ユニット；ならびにS. セレビシエにおける選択および複製に必要なURA3およびCEN-ARSを含む哺乳動物発現ベクターである。これは、pRS316(American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209にアクセッション番号77145として寄託されている)から回収された酵母遺伝子エレメント、ポリオウイルス由来の配列内リボソーム進入部位(IRES)エレメント、および膜貫通ドメインのC末端で切断されたCD8の細胞外ドメインを用いて、pZP9(American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209にアクセッション番号98668として寄託されている)から構築した。PTAリーダーを切断除去するためにプラスミドpZMP21をEcoR1/BglIIで消化し、PCR挿入物との組換えに使用した。
【０４０５】
組換えは、BD In-Fusion(商標) Dry-Down PCR Cloningキット(BD Biosciences、カリフォルニア州、パロアルト)を用いて行った。10μl中のPCR断片と消化ベクターの混合物を凍結乾燥クローニング試薬に添加し、37℃で15分間および50℃で15分間インキュベートした。反応物は形質転換の準備ができた。組換え反応物2μlをOne Shot TOP10 Chemical Competent Cell(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド)に形質転換した。形質転換物を氷上で10分間インキュベートし、42℃の熱ショックを30秒間かけた。反応物を氷上で2分間インキュベートした(形質転換細胞が回復するのを助ける)。2分間インキュベートした後、300μlのSOC(2% Bacto(商標) Tryptone(Difco、ミシガン州、デトロイト)、0.5%酵母抽出物(Difco)、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM MgSO4、20 mMグルコース)を添加し、振盪機を用いて形質転換物を37℃で1時間インキュベートした。全形質転換物を1枚のLB AMPプレート(LBブロス(Lennox)、1.8% Bacto(商標) Agar(Difco)、100 mg/Lアンピシリン)にプレーティングした。
【０４０６】
プライマーzc50485(配列番号:45)およびzc50729(配列番号:46)を用いて、PCRによりコロニーをスクリーニングした。陽性コロニーを配列決定により確認した。正確な構築物を、hB7R1AviHISpZMP21と命名した。
【０４０７】
実施例6
zB7R1およびその他のB7ファミリーメンバーの発現のための刺激条件
A. 序文
公知のB7ファミリーメンバーがマウス骨髄由来樹状細胞(BMDC)において発現および/または上方制御される刺激条件は、培養DCと結合するzB7R1の能力を評価する上で役立つ。最初に、BALB/cマウス由来のFLT3LおよびGM-CSF/IL-4培養物において種々の刺激条件を用いて、公知のB7ファミリーの調節を検討した。第二に、BALB/c系統およびC57BL/6系統のマウス由来のFLT3L、GM-CSF、およびGM-CSF/IL-4培養骨髄細胞に対する、利用可能なマウス可溶性Fc融合タンパク質の結合を試験した。これについて以下にさらに詳述する。
【０４０８】
B. 方法
1) 骨髄の単離
8週齢雌BALB/cマウスまたは4カ月齢C57Bl/6マウス由来の骨髄を、大腿骨から採取した。骨髄を100μM細胞濾過器を通して濾過し、赤血球をACK溶解緩衝液で溶解し、細胞をRPMI「完全」培地(10% FCS、2 mM L-グルタミン、1 mM Na-ピルビン酸、0.1 mM NEAA、0.05 mM β-ME)に再懸濁した。次いで、適切な培養条件を用いて、細胞を1 x 106細胞/mlで6ウェルプレートにプレーティングした。
【０４０９】
(i) Flt3L BMDC細胞培養物の作製
100 ng/mlの組換えヒトFlt3リガンドの存在下において、骨髄細胞を培養した。培養5日目に、培地の半量を新鮮なFlt3L含有培地で置換した。培養7日目に細胞を回収した。
【０４１０】
(ii) GM-CSF/IL-4 BMDC細胞培養物の作製
それぞれ10 ng/mlの組換えマウスGM-CSFおよび組換えマウスIL-4(いずれもR&D Systems)の存在下において、骨髄細胞を培養した。培養3日目に、培地の半量を新鮮なGM-CSF/IL-4含有培地で置換した。培養6日目に細胞を回収した。
【０４１１】
(iii) GM-CSF BMDC細胞培養物の作製
6ウェルプレートの4 ml中に、20 ng/ml組換えマウスGM-CSFの存在下において骨髄細胞を培養した。培養3日目に新鮮なGM-CSF含有培地2 mlを各ウェルに添加し、6日目に培地の半量(3 ml)を新鮮なGM-CSF含有培地で置換した。培養7日目に細胞を回収した。
【０４１２】
2) FACS解析
染色および希釈はすべて、FACS洗浄緩衝液(PBS、1% BSA、0.1 % NaN3)中で行った。染色に先立って、FcBlock(0.25 ug/106細胞)を細胞に添加し、約5〜10分間インキュベートした。細胞はCD11cおよびB220で共染色した。データはすべてBD FACSCaliburで取得した。
【０４１３】
C. 細胞培養物の刺激：
1) 公知のB7ファミリー分子の調節の検討
24ウェルプレートの2 ml中に、培養細胞1 x 106細胞/mlでプレーティングし、100 ng/ml LPS、20 ng/ml IFNγ、1 ug/ml CD40L、または0.1 ug/ml MALP-2、12.5 ug/mlポリI:C、100 ng/ml LPS、0.1 ug/mlフラジェリン、1 ug/ml R848、および125 ng/ml CpG ODN1826を含むTLRリガンド混合物で刺激した。t＝0、24時間、48時間、72時間、および96時間において、細胞をB7ファミリー発現に関してフローサイトメトリーによりアッセイした。
【０４１４】
PE結合B7ファミリー抗体B7-1、B7-2、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-DC、ICOS、またはPD-1の1つで細胞を染色した。72時間および96時間の時点では、7-AADを用いて死細胞をゲートから外した（gate out）。
【０４１５】
Flt3L BMDC
(i) B7-1
いずれの時点においても非刺激細胞はB7-1を発現しており、発現はLPSおよびTLRリガンド混合物によりさらに上方制御された。IFNγおよびCD40L処理は、非刺激細胞と比較してB7-1発現に影響を及ぼさなかった。
【０４１６】
(ii) B7-2
いずれの時点においても非刺激細胞はB7-2を発現しており、発現はLPS、IFNγ、およびTLRリガンド混合物によりさらに上方制御された。CD40L処理は、非刺激細胞と比較してB7-2発現に影響を及ぼさなかった。
【０４１７】
(iii) B7-H1
24時間の時点において、非刺激細胞はB7-H1を発現しないが、LPS、IFNγ、およびTLRリガンド混合物は発現を誘導する。非刺激細胞は48時間までに低レベルのB7-H1を発現し始め、LPS、IFNγ、およびTLRリガンド混合物は、非刺激対照と比較してB7-H1の上方制御を引き続き示す。CD40L処理は、非刺激細胞と比較してB7-H1発現に影響を及ぼさなかった。
【０４１８】
(iv) B7-H2
いずれの時点においても、非刺激細胞はB7-H2を発現していた。IFNγおよびCD40L処理は、非刺激細胞と比較してB7-H2発現にほとんど影響を及ぼさなかった。TLRリガンド混合物による処理は、B7-H2発現を減少させるようであった。
【０４１９】
(v) PD-1
非刺激Flt3L樹状細胞はPD-1発現に関して陰性であったが、いずれの時点においてもTLRリガンド刺激により発現が誘導され、LPS(弱く)およびIFNγにより48時間、72時間、および96時間の時点で上方制御が誘導された。
【０４２０】
(vi) B7-H3、B7-H4、B7-DC、およびICOS
Flt3L生成樹状細胞では、いずれの時点においても、いずれの刺激条件によっても、B7-H3、B7-H4、B7-DC、およびICOSの発現は陰性であった。
【０４２１】
GM-CSF/IL-4 BMDC
(i) B7-1
いずれの時点においても非刺激細胞はB7-1を発現しており、72時間および96時間の時点において、発現はTLRリガンド混合物によりさらに上方制御された。LPS、IFNγ、およびCD40L処理は、非刺激細胞と比較してB7-1発現に影響を及ぼさなかった。
【０４２２】
(ii) B7-2
いずれの時点においても非刺激細胞はB7-2を発現しており、72時間および96時間の時点において、発現はIFNγおよびTLRリガンド混合物によりさらに上方制御された。72時間および96時間の時点において、LPSはB7-2発現を減少させた。CD40L処理は、非刺激細胞と比較してB7-2発現に影響を及ぼさなかった。
【０４２３】
(iii) B7-H1
非刺激GM-CSF/IL-4 BMDCは、B7-H1を高度に発現する。LPSは24時間の時点でのみ発現を上方制御し、IFNγおよびTLRリガンド混合物はいずれの時点においても発現を上方制御した。CD40L処理は、非刺激細胞と比較してB7-H1発現に影響を及ぼさなかった。
【０４２４】
(iv) B7-H2
いずれの時点においても、非刺激細胞はB7-H2を発現していた。48時間、72時間、および96時間の時点において、IFNγ処理は非刺激細胞と比較してB7-H2発現をわずかに上方制御した。その他の刺激条件はいずれも、非刺激細胞と比較してB7-H2発現に影響を及ぼさなかった。
【０４２５】
(v) B7-DC
非刺激GM-CSF/IL-4樹状細胞はPD-1発現に関して陽性であり、48時間、72時間、および96時間の時点において、IFNγ刺激は発現増加を誘導した。LPS、CD40L、およびTLRリガンド混合物は、非刺激対照と比較してB&-DC発現に影響を及ぼさなかった。
【０４２６】
(vi) B7-H3、B7-H4、PD-1、およびICOS
GM-CSF/IL-4生成樹状細胞では、いずれの時点においても、いずれの刺激条件によっても、B7-H3、B7-H4、PD-1、およびICOSの発現は陰性であった。
【０４２７】
2) 可溶性Fc融合タンパク質の結合
細胞は上記の通りに培養したが、刺激条件は以下のように変更した：(i) LPS 100 ng/ml、(ii) CD40L(1 ug/ml)およびIFNγ(20 ng/ml)、ならびに(iii) いくつかの変更を加えたTLRリガンド混合物(LPSを排除し、CpG ODN 1826の代わりにCpG ODN 2395を使用し(いずれもマウスTLR 9リガンドである)、R848の代わりにポリウリジル酸を使用した(いずれもTLR 7/8リガンドである))。フローサイトメトリーにより48時間の時点で、細胞を関心対象の利用可能なFc融合タンパク質に対する結合に関してアッセイした。
【０４２８】
マウスFc融合タンパク質pBTLA、zB7R1、zB7-H4mL、およびzB7-H4mS、ならびにヒトzB7-H3x2(陰性対照)およびR&D Systemsから購入したマウスICOS-Fc(陽性対照)を、Zenon Mouse IgG Labeling Kit(Molecular Probes)を用いてPEで標識し、細胞を染色するために使用した。色素7-AADを用いて、死細胞をゲートから外した。
【０４２９】
試験した条件のいずれにおいても、マウスpBTLA-Fc、zB7-H4mL-Fc、およびzB7-H4mS-Fcの結合は認められなかった。
【０４３０】
しかしながらマウスzB7R1-Fcは、BALB-c系統およびC57Bl/6系統のマウスのいずれにおいても、CD40L＋IFNγ刺激Flt3L培養細胞に結合するようであった。zB7R1-Fcの結合は、試験した条件において、GM-CSFおよびGM-CSF/IL-4培養細胞のいずれにおいても陰性であるようであった。
【０４３１】
D. 結論
樹状細胞に関して濃縮された細胞培養物において、B7-1、B7-2、B7-H1、B7-H2、B7-DC、およびPD-1が発現および/または上方制御される条件を同定した。さらに、対をなしていないB7ファミリーメンバーの未知の対応物を規定するために、これらの条件下で培養した細胞に対するオーファン受容体およびリガンドの蛍光標識Fc融合タンパク質の結合を試験した。具体的には、zB7R1の結合を誘導する1つの刺激条件(IFNg＋CD40L)が同定された。
【０４３２】
実施例7
zB7R1発現細胞の同定
A. 序文
zB7R1のカウンター受容体を発現する細胞源を同定することは、zB7R1の生物学の理解の助けとなり、またカウンター受容体のクローニングに役立つ。zB7R1-mFc2aの直接的蛍光複合体、および活性化CD11c+細胞がzB7R1と結合する主要な細胞種であると同定するための、系譜マーカーに特異的な蛍光結合抗体の混合物で表面を染色したマウス脾細胞を用いた。
【０４３３】
B. 手順
Ovaペプチド323-339に特異的なTCRが遺伝子導入されたDO11.10マウス脾臓を摘出し、つや消しスライドガラス間でつぶして単一細胞懸濁液を得た。懸濁液中の赤血球は、ACK溶解緩衝液を用いて溶解した。得られた細胞懸濁液を培地(RPMI＋10% FBS、グルタミン、ピルビン酸、pen-strep、および5X10-5 Mの2-メルカプトエタノール)で1 X 106細胞/ウェルになるよう調整し、1 uM OVAペプチド323-339と共に37Cでインキュベートした。0、24、48、および72時間の時点で細胞を回収し、フローサイトメトリーにより解析した。
【０４３４】
zB7R1-mIgGFc2a融合タンパク質を、製造業者の説明書に従ってZenon(商標) R-フィコエリトリンマウスIgG2a標識キット(Molecular Probes、オレゴン州、ユージーン、カタログ番号Z25155)を用いて、PEで直接標識した。各時点で回収した細胞を、5 ug/mlのZenon(商標)-PE標識zB7R1-mFc2aと共にFacs緩衝液(PBS＋2% BSA＋0.02% NaN3)中でインキュベートした。場合によっては、これらの結合実験はまた、40倍過剰量の非標識zB7R1-mFc2a(特異的遮断)または40倍過剰量のpB7H4L-mFc2a(非特異的遮断)の存在下において行った。対照ウェルはZenon(商標)標識試薬のみと共に、または同様に標識した非関連のFc融合タンパク質と共にインキュベートした。細胞は同時に、FACS緩衝液で適切に希釈した以下の抗原に対する抗体：CD11c-APC、CD11b-PerCP-CY5、CD49b-APC-CY7、CD3-PeCy7、CD19-FITC(BD Pharmingen)、CD8-PE-テキサスレッド、およびCD4-A405(Caltag)と共に氷上で30分間インキュベートした。細胞を2回洗浄し(各洗浄において、標識量の4倍のFacs緩衝液を添加して細胞を300Xgで5分間遠心し、上清を廃棄する)、次いでPBS中の2%パラホルムアルデヒドで20分間固定した。細胞を300Xgで5分間遠心し、2X105個細胞当たりFACs緩衝液200 ulに再懸濁し、4℃で最長5日間保存した。フローサイトメーター(FACSAria、Becton Dickenson)およびFACS Divaソフトウェアを用いて、試料を解析した。
【０４３５】
C. 結果
前方散乱および側方散乱ドットブロットを用いて、生細胞にゲートをかけた。次いで生細胞を、CD11bおよびCD11c発現、ならびに染色混合物中のその他の表面マーカーに関して解析した。1つの実験において、zB7R1-mFc2aの結合は、すべての時点においてCD11c細胞で認められた。同じ実験において、CD11b CD11c二重陽性細胞におけるzB7R1-mFc2aの結合は、48時間および72時間の時点でのみ認められた。別の実験において、zB7R1-mFc2aの結合は、48時間および72時間の時点でCD11c細胞およびCD11c CD11b二重陽性細胞において認められた。CD11b陽性CD11c陰性の細胞は、両実験においていずれの時点においても、標識試薬のみまたは非関連Fc融合タンパク質で染色した細胞よりも有意に高くzB7R1と結合しなかった。CD11c+ CD11b+/-表面表現型を有する細胞は、対照が平均蛍光660チャネルであるのに対して1952チャネルでzB7R1と結合した。過剰量の非標識zB7R1-mFc2aにより特異的に遮断した試料は、過剰量のpB7H4L-mFc2aで非特異的に遮断した試料が平均チャネル蛍光1682を有するのと比較して、平均チャネル蛍光781を有した。
【０４３６】
D. 結論
CD11c表面マーカーは大部分の樹状細胞上に認められ、活性化および静止脾臓細胞応答の混合物中でそれらを同定するために用いられる。zB7R1-mFc2aの樹状細胞表面に対する結合から、これらの細胞表面上に同族リガンドが存在することが示唆される。結合は、活性化樹状細胞において増加する。樹状細胞上のzB7R1とT細胞およびおそらくはその他の細胞種上のzB7R1との相互作用は、免疫応答の進行に影響を及ぼす。
【０４３７】
実施例8
非疾患対照と比較してマウス疾患モデルの選択された組織において調節されるマウスzB7R1 mRNA
A. 手順
以下のマウス疾患モデルから組織を得た：大腸炎、喘息、実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)、乾癬、およびコラーゲン誘導性関節炎(CIA)。動物モデルは以下の標準的手順に従って遂行し、これには適切な非疾患対照も含めた。大腸炎は、飲用水中のデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)により誘発し、モデルから単離した組織には、遠位結腸、近位結腸、および腸間膜リンパ節が含まれた。喘息は、抗原卵白アルブミンに対する感作および鼻腔内攻撃により誘発した。単離組織には、肺、脾臓、およびリンパ節が含まれた。EAEは、RIBIアジュバント中のMOG35-55ペプチドによる免疫化により誘発した。単離組織には、脳、リンパ節、および脊髄が含まれた。乾癬は、マイナー組織適合性ミスマッチマウスまたは同系免疫不全マウスに対するナイーブT細胞の養子移植により誘発した。単離組織には、損傷皮膚および隣接皮膚が含まれた。CIAはコラーゲン注射により誘発し、単離組織には足およびリンパ節が含まれた。標準的な手順を用いて、全組織からRNAを単離した。簡潔に説明すると、組織を回収して液体N2中で直ちに凍結し、次いで-80℃に移し処理時まで保存した。処理に際しては、組織をQiazol試薬(Qiagen、カリフォルニア州、バレンシア)中に入れ、製造業者の推奨に従ってQiagen Rneasyキットを用いてRNAを単離した。マウスzB7R1 mRNAの発現を、多重リアルタイム定量RT-PCR法(TaqMan)およびABI PRISM 7900配列検出システム(PE Applied Biosystems)により測定した。zB7R1 mRNAレベルはマウスヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼmRNAの発現に対して標準化し、比較閾値サイクル法(User Bulletin 2；PE Applied Biosystems)により決定した。マウスzB7R1のプライマーおよびプローブには、5'フォワードプライマー(配列番号:47)、リバース5'プライマー(配列番号:48)、およびプローブ(配列番号:49)が含まれた。
【０４３８】
B. 結果
マウスzB7R1 mRNA発現は、調べたすべての組織において検出された。最も高レベルの発現は、リンパ節および脾臓組織において認められた。より低レベルの発現は、皮膚、結腸、肺、脳、足、および脊髄組織において認められた。
【０４３９】
マウスzB7R1 mRNAは、非疾患対照由来の組織と比較して、DSS大腸炎の慢性モデル由来の組織において増加していた。Zb7r1は、非疾患対照と比較して、LNにおいて1.65倍、遠位結腸において3.2倍、および近位結腸において2.6倍増加していた。
【０４４０】
zB7R1 mRNAは、非疾患対照由来の組織と比較して、マウス喘息モデル由来の組織において増加していた。Zb7r1は、肺において5.4倍、脾臓において1.4倍、およびリンパ節において1.7倍増加していた。
【０４４１】
Zb7r1 mRNAは、非疾患対照由来の組織と比較して、EAEモデル由来の組織において増加していた。Zb7r1 mRNAは、疾患を早期発症した動物の脳において16.87倍、および重度の疾患スコアを有する動物では5.63倍増加していた。Zb7r1 mRNAは、疾患を早期発症した動物の脊髄において4.15倍、および重篤な疾患スコアを有する動物では6.93倍増加していた。
【０４４２】
zB7R1 mRNAは、非疾患対照由来の皮膚組織と比較して、乾癬モデル由来の皮膚組織において増加していた。Zb7r1 mRNAは、皮膚病変において2.24倍、および乾癬病変に隣接する皮膚組織において脾臓において3.07倍増加していた。
【０４４３】
zB7R1 mRNAは、非疾患対照由来の足組織と比較して、関節炎のCIAモデルのマウスに由来する全足組織において増加していた。Zb7r1 mRNAは、軽度疾患のスコアを有する動物において2.31倍、および重度疾患を有する動物において3.4倍増加していた。
【０４４４】
実施例9
VASP発現ベクターのクローニングおよび構築
ヒト血管拡張作用因子活性化リン酸化タンパク質(VASP)については、Kuhnel, et al., (2004) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 101: 17027により記載されている。VASPヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号:13および14として提供される。ヒトVASPタンパク質の四量体化ドメインのセンス鎖およびアンチセンス鎖をコードする2つの重複オリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドzc50629(配列番号:50)およびオリゴヌクレオチドZC 50630(配列番号:51)を用いて、固相合成により合成した。これらのオリゴヌクレオチドを55℃でアニールさせ、オリゴヌクレオチドプライマーzc50955(配列番号:52)およびzc50956(配列番号:53)を用いてPCRにより増幅した。
【０４４５】
増幅されたDNAを1.5%アガロースゲルで分画し、次いで製造業者の手順に従って(Qiagen、カリフォルニア州、バレンシア)Qiagenゲル単離キットを用いて単離した。単離されたDNAを、酵母組換えにより、BglII切断したpzmp21ベクターに挿入した。DNA配列決定によりベクターの予測される配列が確認され、これをpzmp21VASP-His6と命名した。
【０４４６】
ヒトzB7R1の細胞外ドメインを、ヒトzB7R1mFc2(配列番号:61)の制限酵素消化により作製した。EcoRIおよびBglII(Roche、インディアナ州、インディアナポリス)による二重消化を行い、細胞外ドメインを得た。この断片を2%アガロースゲル(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド)で分画し、次いで製造業者の手順に従って(Qiagen、カリフォルニア州、バレンシア)Qiagenゲル単離キットを用いて単離した。単離された断片を、連結によって(Fast Link Ligase、EPICENTRE、ウィスコンシン州、マディソン)、EcoRI/BglII切断したpZMP21VASP-His6ベクターに挿入した。この構築物をhzB7R1VASPpZMP21(配列番号:62)と命名した。
【０４４７】
マウスzB7R1の細胞外ドメインを、マウスzB7R1mFc2(配列番号:63)の制限酵素消化により作製した。EcoRIおよびBglII(Roche、インディアナ州、インディアナポリス)による二重消化を行い、細胞外ドメインを得た。この断片を2%アガロースゲル(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド)で分画し、次いで製造業者の手順に従って(Qiagen、カリフォルニア州、バレンシア)Qiagenゲル単離キットを用いて単離した。単離された断片を、連結によって(Fast Link Ligase、EPICENTRE、ウィスコンシン州、マディソン)、EcoRI/BglII切断したpZMP21VASP-His6ベクターに挿入した。この構築物をmzB7R1VASPpZMP21(配列番号:64)と命名した。
【０４４８】
これらのベクターは、全長遺伝子のアミノ酸1〜140(配列番号:2のアミノ酸1〜140)を含むzB7R1細胞外ドメイン(天然のシグナル配列を含む)、可動性リンカーGSGG(配列番号:27)、VASP四量体化ドメイン(配列番号:54のアミノ酸5〜38)、可動性リンカーGSGG(配列番号:27)、およびHis6タグアミノ酸残基(配列番号:54のアミノ酸43〜48)のコード配列を含む。
【０４４９】
実施例10
B7R1VASP-His6の発現および精製
製造業者の手順に従って(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド)Lipofectamine 2000を用いて、pzmp21B7R1VASP-His6ベクターをBHK570細胞にトランスフェクションし、培養物を10μMメトトレキセートに対して耐性であるトランスフェクタントに関して選択した。耐性コロニーを組織培養皿に移して拡大し、抗His(C末端)抗体(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド)を用いたウェスタンブロット解析によりB7R1VASP-His6の分泌に関して解析した。得られた細胞株BHK.B7R1VASP-His6.2を拡大した。
【０４５０】
A. BHK細胞からのB7R1VASP-His6の精製
精製は4℃で行った。BHK:B7R1VASP-His6.2による馴化培地約2 Lを、Pellicon-2 5kフィルター(Millipore、マサチューセッツ州、ベッドフォード)を用いて0.2 Lになるまで濃縮し、次いで10倍の20 mM NaPO4、0.5 M NaCl、15 mMイミダゾール、pH 7.5で緩衝液交換した。最終的な試料0.2 Lを、0.2 mmフィルター(Millipore、マサチューセッツ州、ベッドフォード)に通した。
【０４５１】
総容積20 mLを有するTalon(BD Biosciences、カリフォルニア州、サンディエゴ)カラムを充填し、20 mM Napi、15 mMイミダゾール、0.5 M NaCl、pH 7.5で平衡化した。流速0.2〜0.4 mL/分でカラムに培地を添加し、次いで5〜6 CVの平衡化緩衝液で洗浄した。流速4 mL/分の20 mM NaPO4、0.5 M NaCl、0.5 Mイミダゾール、pH 7.5により、カラムからB7R1VASP-His6を溶出した。10 mL画分を回収し、クマシー染色SDS-PAGEによりB7R1VASP-His6の存在について解析した。
【０４５２】
上記の通りに3回同様に実行して得られたTalon溶出液の混合プールを、Amicon Ultra 5k遠心フィルター(Millipore、マサチューセッツ州、ベッドフォード)を用いて60 mLから3 mLになるまで濃縮した。総容積318 mLを有するSuperdex 200カラムを50 mM Napi、110 mM NaCl、pH 7.3で平衡化し、試料3 mLを流速0.5 mL/分でカラムに注入した。一方は0.38 CVにおいておよび他方は0.44 CVにおいてカラムから溶出される、2つの280 nm吸光度ピークが認められた。四量体B7R1VASP-His6を含むと考えられる0.44 CVあたりに溶出される画分をプールして濃縮し、0.2 mm Acrodisc フィルター(Pall Corporation、ニューヨーク州、イーストヒルズ)を通して滅菌濾過し、-80℃で保存した。最終試料の濃度は、BCA(Pierce、イリノイ州、ロックフォード)により決定した。
【０４５３】
B. B7R1VASP-CH6のSEC-MALS解析
サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)の目的は、分子量(Mw)の推定のために大きさに基づいて分子を分離することである。SECシステムに静的光散乱検出が付加されれば、分子量の絶対測定が可能となる。分析物によって散乱される光の強度は、その質量および濃度に直接比例し、SEC溶出位置、構造、またはカラム充填剤との相互作用とは完全に無関係であるために、これは可能である。したがって、SEC、多角度レーザー光散乱(MALS)、および屈折率検出(RI)を併用することにより、分子量、会合状態、およびグリコシル化の程度を決定することができる。Mwに関する単分散試料のこれらの測定の精度限界は±2%である。
【０４５４】
実施例11
可溶性zB7R1と結合するCD155
可溶型のzB7R1を、マウスFc領域との、およびVaspタンパク質由来の四量体化ドメインとのインフレームの融合物として生成した(いずれも本明細書に記載してある)。これらのタンパク質は、FACS試薬として用いるためまたは蛍光顕微鏡観察のために、ビオチンで標識するかまたは蛍光色素と結合させた。これらの試薬を用いて、マウスの骨髄および脾臓由来の種々の主要な細胞種を結合に関して調べた。Flt-3リガンド(Flt3L)中で7日間培養し、その後CD40リガンド(CD40L)およびインターフェロン-g(IFNg)で活性化した骨髄由来の樹状細胞(DC)が、蛍光色素結合型またはビオチン化型の両zB7R1タンパク質と結合することが判明した。この活性化DC集団から発現ライブラリーを作製し、このライブラリーを一過性トランスフェクションによりCOS細胞に導入した。次いで、トランスフェクションした細胞のプールを、ビオチン化ZB7r1-Vaspタンパク質および蛍光顕微鏡観察を用いてzB7R1結合に関してスクリーニングした。結合活性を保有する単一プラスミドが回収されるまで、陽性プールを系統的に分類していった。核酸配列決定から、このプラスミドが、ヒトポリオウイルス受容体(PVR)、CD155(配列番号:17および18)のマウス相同体をコードすることが明らかになった。CD155はzB7R1トランスフェクション細胞と結合し、したがってこれはzB7R1と結合することが現在知られている1つのカウンター受容体である。
【０４５５】
実施例12
分泌捕獲アッセイ法のためのVASP-zB7R1発現
3組のmzB7R1/Vasp融合タンパク質構築物50μgをそれぞれPvu I 50単位により37℃で3時間消化し、次にIPAで沈殿させて、1.5 mL微量遠心チューブ中で遠心沈降させた。ペレットから上清を廃棄し、ペレットを70%エタノール1 mLで洗浄し、室温で5分間インキュベートした。チューブを微量遠心機において14,000 RPMで10分間遠心し、ペレットから上清を廃棄した。次いで、滅菌環境においてペレットをPF-CHO培地750μlに再懸濁し、60℃で30分間インキュベートし、室温まで冷却した。5E6 APFDXB11細胞を3本のチューブそれぞれにおいて遠心沈降させ、DNA-培地溶液を用いて再懸濁した。DNA/細胞混合物を0.4 cmギャップキュベットに入れて、以下のパラメータを用いてエレクトロポレーションした：950μF、高電気容量、および300 V。次いでキュベットの内容物を採取してプールし、PF-CHO培地で25 mLに希釈し、125 mL振盪フラスコに入れた。フラスコを振盪機上の37℃、6% CO2のインキュベーターに入れ、120 RPMで振盪させた。
【０４５６】
細胞株を栄養選択に供した後、200 nMメトトレキセート(MTX)および次いで500 nM MTXに対する段階的増幅に供した。ウェスタンブロットにより発現を確認し、細胞株を拡大して、タンパク質精製を行った。
【０４５７】
実施例13
リガンドをスクリーニングするためのVASP-zB7R1融合タンパク質の使用
上記の実施例12に記載した通りに、zB7R1VASP融合タンパク質を作製した。次いでこのタンパク質を用いて、以下に記載するようにその対応するリガンドをスクリーニングした。
【０４５８】
A) mBMDCライブラリーのスクリーニング：
分泌捕獲アッセイ法を用いて、mzB7R1をmCD155(配列番号:18)に対合させた。ビオチン化した可溶性mzB7R1/Vasp融合タンパク質を、分泌捕獲アッセイ法における結合試薬として用いた。刺激したマウス骨髄(mBMDC)由来のpZP-7NX cDNAライブラリーを、800クローンのプールでCOS細胞に一過性にトランスフェクションした。トランスフェクションしたCOS細胞に対するmzB7R1/Vasp-ビオチンの結合を、以下に記載する分泌捕獲アッセイ法を用いて行った。スクリーニングした72プールのうち、26プールにおいて陽性結合が認められた。これらのプールのうちの1つを選択し、DR10Bにエレクトロポレーションした。深底96ウェルブロック中のLB＋100 ug/mlアンピシリン1.2 ml中に400個の単一コロニーを拾い入れ、一晩培養した後、各プレートからDNAを単離した。トランスフェクションおよび分泌捕獲探索の後、この分類から単一の陽性ウェルが同定され、これを配列決定に供して、これがmCD155であることが確認された。この精製cDNAをトランスフェクションし、さらなる対照と共にmB7R1/Vasp-ビオチンでプロービングして、mCD155がmB7R1/Vasp-ビオチンと特異的にかつ再現性よく結合し、その他のvaspキメラとは結合しないことが確認された。
【０４５９】
B) COS細胞トランスフェクション
COS細胞のトランスフェクションは以下の通りに行った：無血清DMEM培地(DMEM 500 ml当たり非必須アミノ酸5 mlを含む) 25 ulの中のプールDNA 1 ugと、無血清DMEM培地25 ul中のCosfectin(商標) 1 ulを合わせる。次いで希釈されたDNAとcosfectinを混合し、その後室温で30分間インキュベートする。この混合物50 ulを、前日に12ウェル組織培養プレートにプレーティングしておいた8.5x105個COS細胞/ウェルに添加して、37℃で一晩インキュベートする。
【０４６０】
C) 分泌捕獲アッセイ法
分泌捕獲は以下の通りに行った：ウェルから培地を吸引した後、細胞をPBS中の1.8%ホルムアルデヒドで15分固定した。次いで細胞をTNT(H20中の0.1 M Tris-HCL、0.15 M NaCl、および0.05% Tween-20)で洗浄し、PBS中の0.1% Triton-Xで15分間透過処理し、再度TNTで洗浄した。細胞をTNB(H20中の0.1 M Tris-HCL、0.15 M NaCl、および0.5%ブロッキング試薬(NEN Renaissance TSA-Direct Kit))でブロッキングし、再度TNTで洗浄した。細胞を、2μg/ml mzB7R1/Vasp-ビオチン可溶性受容体融合タンパク質と共に1時間インキュベートした。次いで、細胞をTNTで洗浄した。細胞をPBS中の1.8%ホルムアルデヒドで15分間処理し、2度目の固定を行った。TNTで洗浄した後、細胞を1:1000希釈したストレプトアビジンHRPと共にさらにもう1時間インキュベートした。細胞を再度TNTで洗浄した。
【０４６１】
希釈緩衝液(NENキット)で1:50希釈したフルオレセインチラミド試薬で陽性結合を検出し、5分間インキュベートして、TNTで洗浄した。細胞は、TNTで1:5希釈したVectashield Mounting Media(Vector Labs、カリフォルニア州、バーリンゲーム)を用いて保存した。蛍光顕微鏡においてFITCフィルターを用いて、細胞を可視化した。
【０４６２】
実施例14
VASP-zB7R1融合タンパク質の生物活性
陰性選択により(Mitenyi Biotec、カリフォルニア州、オーバーン)、T細胞を末梢血から単離する。抗CD3(BD Biosciences、カリフォルニア州、サンディエゴ)で予めコーティングした96ウェル皿の各ウェルに、T細胞をプレーティングする。抗CD28(BD Biosciences、カリフォルニア州、サンディエゴ)および漸増濃度のzB7R1/VASPを、適切なウェルに添加する。培養物を37℃で4日間インキュベートし、その後1□Ci[3H]チミジン/ウェルで一晩標識する。増殖を取り込まれた[3H]チミジンとして測定し、培養液サイトカイン含有量をLuminex(テキサス州、オーステン)を用いて定量化する。zB7R1/VASPは、T細胞増殖およびサイトカイン放出の両方を強力に抑制する(Dong et al., Nature Med. 5: 1365-1369, 1999)。
【０４６３】
実施例15
zB7R1モノクローナル抗体
BALB/cマウスを、膜タンパク質として発現されるヒトzB7R1細胞外ドメイン(配列番号:3)をコードするDNAで免疫化した。細胞で発現されたヒトzB7R1に対して陽性血清力価を有するマウスに、可溶性zB7R1-Fc融合タンパク質の融合前の追加免疫を行った。
【０４６４】
高力価のマウス1匹から脾細胞を回収し、最適なPEG媒介融合手順でP3-X63-Ag8/ATCC(マウス)骨髄腫細胞と融合させた(Rockland Immunochemicals)。融合後9日間培養した後、それぞれ500 ng/mlの精製組換え融合タンパク質zB7R1-mFc2を特異的抗体標的として、およびpTACI mFc2融合タンパク質を非特異的抗体標的として用いるELISAによって、特異的抗体産生ハイブリドーマプールを同定した。交差反応性について調べるため、試料はマウスzB7R1に対しても調べた。特異的抗体標的に対してのみ陽性であるハイブリドーマプールを、抗体標的としてのp815/zB7R1細胞に結合する能力に関して、FACS解析によりさらに解析した。
【０４６５】
ELISA法において特異的陽性結果およびFACSアッセイ法において陽性結果をもたらすハイブリドーマプールを、限界希釈によって少なくとも2回クローニングした。
【０４６６】
以下の5つのクローンを回収し、アッセイ法において使用するために精製した：318.4.1.1、318.28.2.1、318.39.1.1、318.59.3.1、318.77.1.10。
【０４６７】
実施例16
抗zB7R1シグナル伝達抗体を検出するためのバイオアッセイ法
シグナル伝達抗体を検出および評価するために使用できるアッセイ法を開発する試みにおいて、関心対象の分子(すなわちzB7R1)の細胞外ドメインとマウスGCSFRの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインのキメラを発現するBaf3-STAT-ルシフェラーゼレポーター細胞株を構築した。関心対象の分子に対する抗体は、細胞表面上のそれらの標的分子の二量体化を媒介することができ、mGCSFR細胞内ドメインの二量体化および結果として起こるSTATシグナル伝達分子のリン酸化を引き起こし得る。リン酸化されたこれらのSTATは次に核に移動し、そこで組換えエンハンサー/プロモーター/cDNA構築物上に位置するSTAT応答エレメントに結合する。この結合によって、ルシフェラーゼタンパク質の転写および合成が起こり、簡便なアッセイ法を用いてこれを定量的に測定することができる。
【０４６８】
アッセイ細胞株は、ヒトzB7R1/mGCSFRキメラを含む発現ベクター(pZMP21Z)を、以前に使用したBaF3/KZ134細胞株に導入することによって構築した。この発現ベクターおよびそれに続く細胞株は、以下の段階を用いて構築した。
【０４６９】
ヒトzB7R1細胞外ドメインならびにマウスGCSFr膜貫通および細胞内ドメインPCR産物の作製
465 bpのヒトB7r1細胞外ドメインDNA断片は、Expand試薬(Roche, Applied Sciences、インディアナ州、インディアナポリス)ならびにZC53051(配列番号:55)およびZC54199(配列番号:56)を用いて、PCRにより作製した。これらのzB7R1増幅プライマーは、重複PCRおよび酵母組換えをそれぞれ可能とする、mGCSFRおよびpZMP21ベクターに対する相補的領域を付加した。
【０４７０】
1562 bpの膜貫通および細胞内ドメインマウスGCSFr DNA断片は、Expand試薬(Roche, Applied Sciences、インディアナ州、インディアナポリス)ならびにZC54198(配列番号:57)およびZC53248(配列番号:58)を用いて、PCRにより作製した。これらのmGCSF増幅プライマーは、重複PCRおよび酵母組換えをそれぞれ可能とする、hB7R1およびpZMP21ベクターに対する相補的領域を付加した。
【０４７１】
酵母組換えにおいて用いるためのヒトzB7R1-m.GCSFr重複PCR産物の作製
zB7r1 cDNAおよびマウスGCSFr cDNAを含むプラスミドを、鋳型として使用した。zB7r1断片およびGCSFr断片のPCR増幅は以下の通りに行った：95℃で2分の1サイクル；次の95℃で30秒、56℃で30秒、72℃で1.5分の30サイクル、続く72℃で7分の1サイクル、およびその後の4℃での保持。反応物を1.2%アガロースゲル上で可視化し、適切なバンドを切り出し、QIAquick Gel Extractionキット(Qiagen、カリフォルニア州、サンタクラリタ)を用いて精製した。
【０４７２】
zB7R1およびマウスGCSFr精製PCR産物を重複PCR反応における鋳型として用いて、1995 bpのキメラB7r1-m.GCSFr産物を作製した。Expand試薬(Roche, Applied Sciences、インディアナ州、インディアナポリス)、ならびにPCRプライマーとしてのZC53051(配列番号:59)およびZC53248(配列番号:60)を使用した。
【０４７３】
B7r1-マウスGCSFr断片のPCR増幅は以下の通りに行った：95℃で2分の1サイクル；次の95℃で30秒、56℃で30秒、72℃で1.5分の30サイクル、続く72℃で7分の1サイクルおよび4℃での保持。反応物を1.2%アガロースゲル上で可視化し、適切なバンドを切り出し、QIAquick Gel Extractionキット(Qiagen、カリフォルニア州、サンタクラリタ)を用いて精製した。
【０４７４】
ヒトzB7R1-m.GCSFr精製PCR産物のpZMP21Zへの酵母組換え
コンピテント酵母細胞株SF838-9D□を氷上で融解した。標準的な制限消化法によりBglIIで消化したpZMP21Zベクター1μlを、h.zB7r1-m.GCSFR精製PCR産物6μl、または陰性対照としてのTE緩衝液6μlと混合した。DNA混合物を酵母細胞45μlに添加し、混合して、個々の2 mm使い捨てエレクトロポレーションチャンバー(VWR、ペンシルバニア州、ウェストチェスター)に移した。750 V、25μFD、無限抵抗に設定したBiorad Genepulser(商標)(カリフォルニア州、ハーキュリーズ)を用いて、細胞にエレクトロポレーションした。1.2 M冷ソルビトール600μlを各チャンバーに直ちに添加した。各チャンバーからの150μlおよび300μlを、−URA DS寒天プレートにプレーティングし、30℃で72時間インキュベートした。各プレートからの酵母コロニーをH2O 1 mlに懸濁し、1.5 mlエッペンドルフチューブに移した。遠心により細胞をペレット化し、上清を除去した。各試料の固く詰まった酵母50μlに相当する量を別の1.5 mlエッペンドルフチューブに移し、酵母溶解緩衝液(25 Triton X、1% SDS、100 mM NaCl、10 mM Tris HCl、pH 8.0、1 mM EDTA) 100μlに再懸濁した。各チューブにZymolase(Zymo Research、カタログ番号E1001/E1002) 2μl(10 U)を添加し、続いて37℃で30分間インキュベートした。緩衝液P1(Qiagen) 150μlを添加し、次いでQIAprep Spin Miniprep Kitの段階2を行うことにより、溶解した細胞からミニプレップした。酵母からこのようにして精製されたプラスミドDNAを、製造業者の推奨に従って、DH10b Electormax(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド)にエレクトロポレーションした。クローンを単離して配列を決定し、標準的な方法を用いて大量プラスミド単離を行った。
【０４７５】
キメラヒトzB7R1-マウスGCSFrを発現するBaF3/KZ134細胞の構築
マウス骨髄に由来するインターロイキン-3(IL-3)依存性プレリンパ球系細胞株であるBaF3(Palacios and Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985；Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6.: 4133-4135, 1986)は、完全培地(10%加熱非働化ウシ胎仔血清、2 ng/mlマウスIL-3(mIL-3)(R + D、ミネソタ州、ミネアポリス)、2 mM L-グルタミン(Gibco-BRL)、および1 mM ピルビン酸ナトリウム(Gibco-BRL)を添加したRPMI培地(JRH Bioscience Inc.、カンザス州、レネックサ))で維持した。
【０４７６】
KZ134プラスミドは、4つの遺伝子に由来するSTAT転写因子結合エレメントを含む相補的オリゴヌクレオチドを用いて構築し、これらのエレメントには、改変c-fos Sis誘導性エレメント(m67SIEまたはhSIE)(Sadowski, h. et al., Science 261: 1739-1744, 1993)、p21 WAF1遺伝子由来のp21 SIE1(Chin，Y. et al., Science 272: 719-722, 1996)、□-カゼイン遺伝子の乳腺応答エレメント(Schmitt-Ney, M. et al., Mol. Cell. Biol. 11:3745-3755, 1991)、およびFcγ RI遺伝子のSTAT誘導性エレメント(Seidel，H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92:3041-3045, 1995)が含まれる。これらのオリゴヌクレオチドはAsp718-XhoI適合性末端を含み、標準的な方法を用いて、同じ酵素で消化したc-fosプロモーター(Poulsen, L.K. et al., J. Biol. Chem. 273:6229-6232, 1998)を有し、かつネオマイシン選択マーカーを含むレシピエントホタルルシフェラーゼレポーターベクターに連結した。KZ134プラスミドを用いて、標準的なトランスフェクションおよび選択方法により、BaF3細胞を安定にトランスフェクションしてBaF3/KZ134細胞株を作製した。
【０４７７】
RPMI培地(JRH Bioscience Inc.、カンザス州、レネックサ)で2回洗浄し、次いで107個細胞/mlの細胞密度でRPMIに再懸濁することにより、BaF3/KZ134細胞をエレクトロポレーション用に調製した。再懸濁したBaF3細胞1 mlをpZPMPZ/h.zB7r1-m.GCSFrプラスミドDNA 30μgと混合し、個々の使い捨てエレクトロポレーションチャンバー(Gibco-BRL)に移した。次いで細胞に、エレクトロポレーション装置(CELL-PORATOR(商標)；Gibco-BRL、メリーランド州、ベテスダ)により供給される2回の連続したショック(800 lFad/300 V；1180 lFad/300 V)を与えた。エレクトロポレーションした細胞を次に、2μg/mlピューロマイシン(Clontech、カリフォルニア州、パロアルト)を含む完全培地20 mlに移し、インキュベーター中に24時間置いた(37℃、5% CO2)。次いで細胞を遠心沈降させ、T75フラスコ中のμg/mlピューロマイシンおよび240μg/mlゼオシン(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド)選択を含む完全培地20 mlに再懸濁して、ゼオシン耐性プールを単離した。得られた安定な細胞株を、BaF3/KZ134/h.zB7r1-m.GCSFrと命名した。
【０４７８】
BaF3/KZ134/h.B7r1-m.GCSFr細胞においてSTATシグナル伝達を特異的に活性化するHzB7R1抗体
BaF3/KZ134/h.B7r1-m.GCSFr細胞において試験した抗体は：マウス抗ヒトzB7r1 318.4.1.1(E9310)、318.28.2.1(E9296)、318.39.1.1(E9311)、318.59.3.1(E9400)であった。これらの抗体を、以下のようにしてDynabeads M-450 Tosylactivated(Dynal Biotech ASA、ノルウェイ、オスロ)に結合させた：試料当たり50μl(2x107個ビーズ)を、2.0 mlエッペンドルフチューブ中で、0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.4〜8.0 1 mlで1回洗浄した。チューブをマグネットに1分間置いて、上清を除去した。ビーズを、リン酸ナトリウム緩衝液を用いて元の量に再懸濁した。2.0 mlエッペンドルフチューブ中で、各抗体10μgを洗浄したビーズ50μlと混合した。ビーズのみ(抗体なし)の対照も含めた。チューブをClay Adams Nutatorミキサー(Bectin-Dickinson、ニュージャージー州、フランクリンレイクス)に、室温で48時間置いた。次いでチューブをマグネットに1分間置いて、上清を除去した。次に、コーティングされたビーズを、PBS(Ca2+およびMg2+不含)、0.1% BSA(w/v)、および2 mM EDTA、pH 7.4 1 mlで4回洗浄した。
【０４７９】
細胞アッセイ法の設定においては、コーティングビーズおよびビーズのみ対照を、100μl中480,000、240,000、120,000、60,000、30,000、15,000、および7500ビーズ/ウェルの濃度で、Falcon U底96ウェルプレート(Bectin-Dickinson、ニュージャージー州、フランクリンレイクス)にプレーティングした。試料はそれぞれ3つ組でプレーティングした。STATシグナル伝達の陽性対照として、マウスIL-3希釈物を、100μl中2、1、0.5、0.25、0.13、0.6、および0.3 pg/mlの濃度で含めた。
【０４８０】
BaF3/KZ134/h.B7r1-m.GCSFrゼオシン耐性細胞をRPMIで3回洗浄し、血球計数器を用いて計数した。細胞をRPMIに再懸濁し、試料を含むプレートに、100μl中30,000個細胞/ウェルの濃度でプレーティングし、全ウェル容量を200μlとした。
【０４８１】
アッセイ物を37℃、5% CO2で24時間インキュベートし、その時点でBaF3細胞を1500 rpmで10分間の遠心によりペレット化させ、培地を吸引し、溶解緩衝液(Promega) 25μlを添加した。細胞溶解を室温で10分間行った後、ルシフェラーゼアッセイ基質(Promega) 40μlを添加し、基質添加の10秒後に生じた光を測定するルミノメーター(EG&G Berthold、モデルMicrolumat Plus LB 96V)でプレートを読み取ることによって、プレートをSTATレポーター構築物の活性化に関して測定した。
【０４８２】
このアッセイ法の結果から、B7r1抗体-ビーズ複合体が用量依存的様式でB7r1-m.GCSFrに結合し、STAT形成およびシグナル伝達をもたらす二量体化を引き起こしたことが示された。非結合抗体も非修飾ビーズもSTAT応答を誘発しなかった。
【０４８３】
本実施例では、B7ファミリーI型タンパク質(B7r1)の細胞外ドメイン、ならびにI型サイトカイン受容体スーパーファミリータンパク質(GCSFR)の膜貫通および細胞内ドメインをキメラとして発現させたが、これは抗体に曝露した場合に二量体化およびSTATシグナル伝達を誘導した。本方法はまた、他の受容体ファミリー由来のキメラと共に用いることもできる。シグナル伝達に関してマウスGCSFrを利用するキメラの例では、とりわけCD28、zTNFR14、およびFasの細胞外リガンド結合ドメインを含めていた。本方法の変化形は、適切なシグナル伝達経路に感受性のある細胞株アッセイ法と対をなす他の受容体ファミリー由来のキメラと共に用いることができる。例として、NFkB経路を介してシグナル伝達するキメラが挙げられる。これらのキメラは、KZ142のような、ルシフェラーゼcDNAプラスミドに融合されたNFkB応答性プロモーターもまた発現するNIH3T3細胞で発現させることができる。これらのキメラは、NFkBを介してシグナル伝達することが知られている、pTNFRSF4などのTNFファミリー分子の膜貫通および細胞内ドメインを用いて構築することができ、とりわけB7r1、CD28、TNFR14、およびFasなどの分子の細胞外ドメインを含めることができる。
【０４８４】
キメラ受容体を利用するさらなるインビトロアッセイ法は、zB7R1細胞内ドメインのシグナル伝達特性を調べる上で、およびシグナル伝達を媒介する細胞外ドメインに対する抗体を同定する上で有用である。zB7R1細胞内ドメインがリガンド結合に応答して生成する細胞シグナルの種類は、以下の方法で解明することができる。B7ファミリーメンバーであるhCD28の細胞外ドメインを、マウスzB7R1の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインに融合させる。次いでこのキメラを、マウスT細胞ハイブリドーマ細胞株、Teaにトランスフェクションする。このマウス細胞株は、IL2を分泌することによってT細胞受容体(TCR)結合に応答する。いくつかのB7ファミリーメンバーは、T細胞応答の大きさを変更することが示されており；例えば、CD3(TCR)と共にCD28に同時結合することにより、CD3結合のみの場合を上回ってIL2分泌が有意に増加する。このキメラを利用して、ヒトCD28細胞外ドメインに対する抗体は、mzB7R1細胞内ドメインの結合およびそれに続くシグナル伝達を媒介し得る。インビトロCD3/CD28共刺激アッセイ法においてIL2レベルをELISAにより定量化することができ、hzB7R1シグナル伝達ドメインの性質が明らかにされる。
【０４８５】
さらに、ヒトzB7R1細胞外ドメインを、TEaハイブリドーマにおいてmCD28細胞内ドメインと融合させることができる。そのようなキメラにより、zB7R1細胞外ドメインに対する抗体またはその他のリガンドのスクリーニングが可能になると考えられる。この結合により、mCD28細胞内ドメインを介した二量体化およびシグナル伝達が起こり得、それによってIL2分泌が増加する可能性が高い。したがって、zB7R1細胞外ドメインに作用する分子のこのようなスクリーニングは、zB7R1シグナル伝達機構が完全に理解される前に開始することができる。
【０４８６】
実施例17
ヒトPBMNCにおけるzB7R1発現
細胞を培養するため、正常な社内ドナーからの血液をフィコール勾配で分離し、PBMNC界面を回収し、PBSで洗浄した。細胞を計数し、100 ng/mlのLPSまたは抗CD3 mab＋抗CD28 mab(それぞれ、50 ng/mlおよび1 ug/ml)のいずれかを含む培養液200 ul中、2e5個細胞/ウェルで96ウェル丸底プレートにプレーティングした。いくらかの細胞は、0時点として保存した。24、48、および72時間の時点で、染色用に細胞を回収した。
【０４８７】
各時点において、96ウェルプレート中の細胞を遠心し、軽くたたいて培地を除去し、表面系譜マーカーに対する蛍光結合抗体の組み合わせをFacs染色緩衝液50 ulにて添加した(CD56-A488、CD19-PE、CD45RA-Cychrome、CD45RO-PE-Cy7、CD4-A405、CD8-A700、およびCD14-A750)。組み合わせには、A647色素と結合したmab抗B7R1(318.4.1)または同様に結合した対照mabのいずれかを含めた。いくつかの実験では、mab抗B7R1の結合を、20倍(g/g)過剰量のmB7R1受容体により競合した。各条件の染色は3つ組ウェルで行った。細胞を染色混合物と共に氷上で30分間インキュベートし、次いでFacs緩衝液で1.5回洗浄し、100 ul/ウェルの2%パラホルムアルデヒドで室温にて10分間固定した。プレートを遠心し、軽くたたいてパラホルムアルデヒドを除去し、細胞をFacs緩衝液200 ulに再懸濁し、LSRIIで読み取るまでアルミホイルで包んで4℃で保存した。
【０４８８】
LSRIIデータは、FacsDivaソフトウェアを用いて解析した。FSC X SSCドットプロットを用いて、生細胞集団ゲートを決定した。次いで、抗B7R1-A647 対 特異的系譜メーカーのドットプロットを用いて、生細胞を抗B7R1結合について解析した。
【０４８９】
B7R1発現の動態解析については、経時的に各系譜に関して、バックグラウンド蛍光(対照mab-A647、または20X g/g可溶性受容体を用いた遮断のいずれかによって決定される)を抗B7R1-A647染色から減算した。
【０４９０】
結果から、zB7R1が静止CD8+細胞およびNK細胞において発現されること、ならびに発現がCD4+細胞、CD8+細胞、およびNK細胞において活性化により上方制御されることが示された。CD19+細胞では検出可能な結合は認められず、またCD14+細胞にもCD11c細胞にも競合可能な結合は認められない。zB7R1の発現は、ナイーブT細胞と比較してメモリーT細胞において高かった。
【０４９１】
実施例18
zB7R1抗体によって抑制されるT細胞増殖
ヒト末梢血単核細胞(PBMC)から精製されたCD4 T細胞およびCD8 T細胞の増殖は、インビトロにおいてzB7r1に対する抗体によって抑制された。CD3に対する抗体(BD Biosciences 555329)は、T細胞抗原認識を模倣した。抗体によるCD3およびT細胞受容体の結合は、インビトロにおいて増殖するためのシグナルを提供した。このシグナルは、さらなるシグナルによって増強または抑制された。トシル活性化4.5□ビーズ(Dynal 140.13)に共有結合されたzB7r1に対する抗体は、インビトロにおいてT細胞の抗CD3誘導性増殖を抑制した。共刺激性抗CD28(BD Biosciences 555725)を添加しても、抗zB7r1の抑制効果は克服されなかった。さらに、抗zB7r1は、初期活性化マーカーCD69およびIL-2受容体CD25の発現、ならびにIL-2の産生を抑制した。
【０４９２】
トシル活性化ビーズを、抗CD3および抗zB7r1をT細胞に提示するための固相プラットホームとして使用した。健常ボランティア由来のヒトPBMCを、Ficoll-Paque(GE Healthcare)密度勾配によって回収した。CD4およびCD8は、磁気ビーズカラム(Miltenyi Biotec)によりPBMCから同時精製した。T細胞は、フローサイトメトリーによって増殖を評価するために、CFSE(Invitrogen)で標識した。ウェル当たり、1x 10E5個のCFSE標識T細胞および1x 10E5個のビーズをプレーティングした。培養物は、初期活性化マーカーを評価するために1日間、または増殖を評価するために3日間、5% CO2の加湿インキュベーター内で維持した。CD4およびCD8の増殖は、LSRII(Becton Dickinson)で測定した。
【０４９３】
抗zB7r1は、CD4メモリーおよびナイーブT細胞を同等に抑制した。具体的には、CD4 T細胞は前記の通りに精製し、次いでFACSAria(BD Biosciences)での細胞選別により、CD45RA高(ナイーブ)およびCD45RA低(メモリー)集団に分別した。細胞は上記の通りに培養し、その後72時間の時点で増殖について評価した。抗CD3を、固定量のzb7r1、対照、または抗CTLA-4と組み合わせて力価測定した。CD4メモリーおよびナイーブ細胞の増殖は、同程度に抑制された。
【０４９４】
抗zB7r1は、メモリーおよびナイーブCD4によるIL-2産生を抑制した。具体的には、CD3活性化メモリーおよびナイーブCD4細胞のIL-2産生は、抗zB7r1により抑制される。T細胞およびビーズは上記の通りに培養した。24時間時点におけるIL-2産生を、Luminex技術(Bio-Rad)により培養上清で評価した。
【０４９５】
実施例19
急性移植片対宿主病(GVHD)におけるzB7R1-VASP
本実験の目的は、B7R1-VASP可溶性タンパク質の予防的処置が、マウスにおける急性GVHD反応の発症および重症度に影響するかどうかを決定することであった。
【０４９６】
GVHDを惹起するため、C57Bl/6マウス由来の脾臓細胞7,500万個を、0日目として、DBA2 X C57Bl/6 F1マウス(BDF1)に静脈内送達によって注射する。細胞移植の前日から開始し実験期間を通して継続して1日おきに、マウスをB7R1-VASPタンパク質150 ugで腹腔内より処置する。体重を毎日モニターし、脾臓移植後12日目にマウスを屠殺する。FACS解析のために脾臓を回収し、血清用に血液を回収する。
【０４９７】
B7R1-VASPの予防的送達は、急性GVHD期の体重減少の重症度を有意に軽減する。
【０４９８】
実施例20
zB7R1-Fc処置マウスにおける遅延型過敏症
遅延型過敏症(DTH)は、特定抗原に対するT細胞応答の尺度である。この応答では、マウスをアジュバント中の特定タンパク質(例えば、ニワトリ卵白アルブミン、OVA)で免疫化し、その後同じ抗原(アジュバントなし)を耳に投与する。抗原投与後の耳介厚(ノギスで測定)の増加は、抗原に対する特異的免疫応答の尺度である。DTHは、3つの異なる段階で起こる細胞性免疫の1つの形態である：1) T細胞が抗原提示細胞(APC)の表面上に提示された外来タンパク質抗原を認識する認識段階、2) T細胞がサイトカイン(特にインターフェロン-γ；IFN-γ)を分泌し、増殖する活性化/感作段階、および3) 炎症(活性化マクロファージおよび好中球の浸潤を含む)および感染の最終的な消散を含むエフェクター段階。この反応は細胞内細菌に対する一次防御機構であり、可溶性タンパク質抗原または化学反応性ハプテンによって誘導され得る。古典的なDTH反応は、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)由来の精製タンパク質誘導体(PPD)を投与された個体において、注射された個体が一次TBから回復している場合、またはTBの予防注射を受けている場合に起こる。硬化およびDTHの特徴は、抗原注射の約18時間後までに検出可能となり、24〜72時間までに最大となる。明白な硬化の開始の遅延が、この反応の命名「遅延型」の理由である。すべての種において、DTH反応は、DTHに関与する初期サイトカイン、IFN-γを分泌する、抗原感作されたCD4+(およびより少ない低度にCD8+) T細胞の存在に極めて依存している。
【０４９９】
mB7R1-Fcの抗炎症効果を試験するため、I) 対照プラスミド、II) mCTLA-4-Fcプラスミド25 ug、およびIII) mB7R1-Fcプラスミド25 ugで処置した6群のC57Bl/6マウスを用いて、DTH実験を行った。これらのプラスミドはすべて、尾静脈から流体力学的に注射した。手短に説明すると、プラスミド25 ugを滅菌注射用生理食塩水2 mLに再懸濁した。各マウスに、プラスミド25 ugを含む生理食塩水2 mLを、尾静脈から単回静脈内注射した。注射は4〜8秒/マウスで行い、マウスの複数の器官で細胞トランスフェクションを引き起こす動圧をもたらした。処置は、OVA/RIBI感作の1日前(群1〜3)またはOVA再投与の1日前(群4〜6)に施した。マウス(6匹/群)を最初に、背中より、全量200 ulのRibiで乳化したニワトリ卵白アルブミン(OVA) 100 ugで免疫化した。7日後、マウスの左耳にPBS 10 ul(対照)、または右耳に10 ul量のPBS中のOVA 10 ug(アジュバントなし)を、皮内より再投与した。マウスの耳に注射する前に、すべてのマウスの耳介厚を測定した(0測定値)。抗原投与の24時間および48時間後に、耳介厚を測定した。0測定値と24時間測定値との耳介厚の差を表1に示す。対照プラスミド処置群における対照マウスは、抗原投与後24時間および48時間における耳介厚の増加によって示される強力なDTH反応を生じた。対照的に、抗原投与期にCTLA-4FcまたはB7R1Fcで処置したマウスは、対照と比較してより低度の耳介厚を有した。B7R1-Fc注射はまた、感作期にも耳介厚を抑制したが、24時間時点においてのみであった。これらの差は、スチューデントのt検定により決定して統計的に有意であった(表5、対対照プラスミドp値)。
【０５００】
（表５）遅延型過敏症(DTH)反応の抗原投与期または感作期に投与した場合にその反応を抑制するzB7R1
2008544746.tif 000006
【０５０１】
実施例21
非疾患組織と比較してコラーゲン誘発性関節炎(CIA)マウスの組織において調節されるB7R1
実験手順：
コラーゲン誘発性関節炎(CIA)モデルにおける様々な疾患程度を有するマウスから組織を得た。モデルは、雄DBA/1Jマウスをコラーゲンで免疫化するという標準的な手順に従って遂行し(以下の実施例22を参照されたい)、これには適切な非疾患対照も含めた。単離した組織には、罹患足および膝窩リンパ節が含まれた。標準的な手順を用いて、全組織からRNAを単離した。簡潔に説明すると、組織を回収して液体N2中で直ちに凍結し、次いで-80℃に移し処理時まで保存した。処理に際しては、組織をQiazol試薬(Qiagen、カリフォルニア州、バレンシア)中に入れ、製造業者の推奨に従ってQiagen Rneasyキットを用いてRNAを単離した。マウスzB7R1 mRNAの発現を、多重リアルタイム定量RT-PCR法(TaqMan)およびABI PRISM 7900配列検出システム(PE Applied Biosystems)により測定した。マウスzB7R1 mRNAレベルはマウスヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼmRNAの発現に対して標準化し、比較閾値サイクル法(User Bullein 2：PE Applied Biosystems)により決定した。マウスB7R1のプライマーおよびプローブには、フォワードプライマー5'(配列番号:65)、リバースプライマー5'(配列番号:66)、およびプローブ(配列番号:67)が含まれた。
【０５０２】
結果：
マウスB7R1 mRNA発現は、試験した組織において検出された。足と比較してリンパ節において、より高レベルの発現が認められた。B7R1 mRNAは、非疾患対照から得られた組織と比較して、関節炎のCIAモデルのマウスに由来する膝窩リンパ節および足において増加しており、そのレベルは疾患重症度と関連していた。B7R1 mRNAは、足においては、非疾患対照と比較して軽度疾患マウスにおいて約2.3倍、および重度疾患マウスにおいて約4倍増加していた。B7R1 mRNAは、リンパ節においては、非疾患対照と比較して軽度疾患マウスにおいて約1.5倍、および重度疾患マウスにおいて約1.8倍増加していた。
【０５０３】
実施例22
マウスコラーゲン誘発性関節炎(CIA)モデルにおいて疾患の発症率および進行を減少させるB7R1m-mFcおよびB7R1m-VASP CH6
マウスコラーゲン誘発性関節炎(CIA)モデル：10週齢雄DBA-1Jマウス(Jackson Labs)を、マウス13匹/群の3群に分割した。21日目に、動物に、完全フロイントアジュバント中に製剤化された1 mg/mlヒヨコII型コラーゲン(Chondrex、ワシントン州、レッドモンドにより調製された)50〜100μlを皮内尾部注射し、0日目とする3週間後に、不完全フロイントアジュバントで調製すること以外は同様の注射をした。−1日目から大部分のマウスが疾患の中等度症状を示す日までの様々な時点で、1.5週間にわたって1日おきに(しかし、投薬は4週間ほどまで延長してもよい)、B7R1m-mFcまたはB7R1m-VASP CH6を腹腔内注射として投与した。群にB7R1m-mFcまたはB7R1m-VASP CH6 150μg/動物/用量を投与し、対照群にはビヒクル対照、PBS(Life Technologies、メリーランド州、ロックビル)を投与した。動物は2回目のコラーゲン注射後に関節炎の症状を示し始め、大部分の動物は1.5〜3週間以内に炎症を発症した。疾患の程度は、ノギスを用いて足厚を測定することにより、および各足に対して臨床スコア(0〜3)：0＝正常、0.5＝つま先の炎症、1＝足の軽度炎症、2＝足の中等度炎症、および3＝足の重度炎症(以下に詳述する)を割り当てることにより、各足において評価した。
【０５０４】
疾患のモニタリング：
動物は2回目のコラーゲン注射後まもなく足の炎症の徴候を示し始め得て、動物によっては2回目のコラーゲン注射の前にも、つま先炎症の徴候を有し始め得る。大部分の動物は追加免疫注射の1〜3週間以内に関節炎を発症するが、動物によってはより長い時間を必要とする場合がある。このモデルにおける疾患発症率は典型的に95〜100%であり、動物40匹を用いた試験において、0〜2匹の非応答動物(観察の6週間後に決定される)が典型的に認められる。炎症が始まると、様々に低度の足またはつま先の炎症の一般的な一時的発生が起こり得ることに留意されたい。そのため、動物は、顕著で持続的な足の腫脹が生じるまで、確立した疾患を有すると見なされない。
【０５０５】
全動物を毎日観察して、足における疾患状態を評価したが、これは個々の足に対して定性的臨床スコアを割り当てることによって行った。各動物について毎日、4つの足を臨床疾患の状態に従ってスコア化した。臨床スコアを決定するため、足は3つの領域、すなわちつま先、足自体(手または足)、および手首または足首関節を有すると見なされ得る。これらの領域に関する炎症の程度および重症度は、以下を含めて留意した：腫脹に関する各つま先の観察；爪の裂けまたはつま先の発赤；いずれかの足における浮腫または発赤の任意の証拠の表記；腱または骨の微細な解剖学的境界の任意の消失の表記；任意の浮腫または発赤に関する手首または足首の評価；ならびに炎症が脚まで近接して広がっているかどうかの表記。1、2、または3という足スコアは、第1には重症度の全体的な印象に、および第2には罹患領域の数に基づく。臨床学的スコア化に用いる基準を以下に示す。
【０５０６】
臨床スコア：
0＝正常
0.5＝1つまたは複数のつま先が罹患しているが、つま先のみが炎症を起こしている
1＝足を含む軽度炎症(1領域)、1つまたは複数のつま先を含んでもよい
2＝足における中等度炎症、いくつかのつま先および/または手首/足首を含んでもよい(2領域)
3＝足、手首/足首、およびいくつかのまたはすべてのつま先における重度炎症(3領域)
【０５０７】
確立した疾患は、2日間続けて持続する、2またはそれ以上の等級の足炎症の定性的スコアとして定義する。確立した疾患が存在する時点で、その日にちを記録し、この日を「確立した疾患」を有した動物の最初の日として指定する。
【０５０８】
実験期間を通して血液を採取し、抗コラーゲン抗体の血清レベル、ならびに血清免疫グロブリンおよびサイトカインのレベルをモニターする。血清抗コラーゲン抗体は、疾患の重症度と良好に相関する。所定の日に動物を安楽死させ、血清用に血液を回収する。各動物から、組織学的検査のために罹患足1つを10% NBF中に採取し得て、1つをmRNA解析のために液体窒素中で凍結して-80℃で保存する。同様に、脾臓1/2、胸腺1/2、腸間膜リンパ節1/2、肝葉1つ、および左腎をRNA解析のためにRNAlater中に採取し、脾臓1/2、胸腺1/2、腸間膜リンパ節1/2、残りの肝臓、および右腎を組織学的検査のために10% NBF中に採取する。血清を回収し、免疫グロブリンおよびサイトカインアッセイ法のために−80℃で凍結する。
【０５０９】
試験したいずれの時点においても(予防的および治療的送達)、本明細書に記載する可溶性zB7R1-Fc融合タンパク質および本明細書に記載するzB7R1-VASP CH6を投与したマウス群は、発症率(予防的投与の場合)、足の炎症の発症および/または進行の遅延によって特徴づけられた。このモデルの8日目において、PBSを予防的に投与したマウスは、100%の疾患発症率を有し、大部分の足に顕著な腫脹を有した。しかしながら、zB7R1-Fc融合タンパク質を予防的に投与したマウスは、足の腫脹が有意に軽減され(PBS処置マウスと比較して関節炎スコアが2.3倍低い)、80%の発症率を有した。さらに、zB7R1-VASP CH6融合タンパク質で予防的に処置したマウスは、疾患から大きく防御され、これらのマウスの40%のみが関節炎症状を発症し、これは関節炎スコアの顕著な減少と関連していた(PBS処置マウスよりも3.5倍低い)。zB7R1-VASP CH6融合タンパク質はまた、疾患発症後に投与した場合に関節炎症状を軽減することができ、zB7R1-VASP CH6融合タンパク質で治療的に処置したマウスは、PBSで治療的に処置したマウスの約2倍低い関節炎スコアを有した。これらの結果から、本発明の可溶性zB7R1融合タンパク質によって、炎症、ならびに疾患の発症率および進行が軽減されることが示される。
【０５１０】
以上のことから、説明を目的として本発明の特定の態様を本明細書に記載したが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更が行われ得ることが理解されると考えられる。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲に制限される以外に、制限されることはない。
【配列表】
2008544746000001.app
【国際調査報告】
2008544746.tif 000007
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