(57)【要約】本発明は、免疫賦活核酸を提供する。本発明のこの側面による特定の態様において、免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーの配列は少なくとも部分的に自己相補的である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊から選択される少なくとも１つのジヌクレオチドを含む免疫賦活オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドの配列が少なくとも部分的に自己相補的である、前記免疫賦活オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
オリゴヌクレオチドが、長さ約２〜約５０ヌクレオチドである、請求項１に記載の免疫賦活オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドの配列が、少なくとも４０パーセント自己相補的である、請求項１に記載の免疫賦活オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、喘息または病原体によって引き起こされる病気を有する脊椎動物を治療的に処置するための方法であって、請求項１に記載の免疫賦活オリゴヌクレオチドを脊椎動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項５】
投与の経路が、非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃、皮膚パッチ、点眼、点耳およびマウスウォッシュから選ばれる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドおよび生理的に許容し得るキャリヤーを含む医薬組成物。
【請求項７】
脊椎動物において免疫反応を惹起するための方法であって、請求項１に記載の免疫賦活オリゴヌクレオチドを脊椎動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項８】
投与の経路が非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃、皮膚パッチ、点眼、点耳およびマウスウォッシュから選ばれる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、喘息または病原体によって引き起こされる病気を脊椎動物において予防するための方法であって、請求項１に記載の免疫賦活オリゴヌクレオチドを脊椎動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項１０】
投与の経路が非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃、皮膚パッチ、点眼、点耳およびマウスウォッシュから選ばれる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
非ヌクレオチドリンカーによって結合されたオリゴヌクレオチドを少なくとも２つ含むイムノマーであって、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊から選ばれる少なくとも１つのジヌクレオチドを含み、オリゴヌクレオチドの配列が少なくとも部分的に自己相補的である、前記イムノマー。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチドが、長さ約２〜約５０ヌクレオチドである、請求項１１に記載のイムノマー。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドの配列が、少なくとも４０パーセント自己相補的である、請求項１１に記載のイムノマー。
【請求項１４】
癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、喘息または病原体によって引き起こされる病気を有する脊椎動物を治療的に処置するための方法であって、請求項１１に記載のイムノマーを脊椎動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項１５】
投与の経路が、非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃、皮膚パッチ、点眼、点耳およびマウスウォッシュから選ばれる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１１に記載のイムノマーおよび生理的に許容し得るキャリヤーを含む医薬組成物。
【請求項１７】
脊椎動物において免疫反応を惹起するための方法であって、請求項１１に記載のイムノマーを脊椎動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項１８】
投与の経路が、非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃、皮膚パッチ、点眼、点耳およびマウスウォッシュから選ばれる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、喘息または病原体によって引き起こされる病気を脊椎動物において予防するための方法であって、請求項１１に記載のイムノマーを脊椎動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項２０】
投与の経路が、非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃、皮膚パッチ、点眼、点耳およびマウスウォッシュから選ばれる、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
関連出願
本出願は、２００４年６月１５日に出願された米国仮出願第60/579,985号、および２００４年８月６日に出願された米国仮出願第60/599,362号の利益を主張する。上記出願の全体の教示は、参照によって本明細書に組み込む。
発明の分野
本発明は、オリゴヌクレオチド類似体による免疫刺激に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の概要
Tokunaga et al., J. Natl. Cancer Inst. 72 （1984） 955-96、Pisetsky et al.; Reich et al., Mol. Biol. Rep. 18 （1993） 217-221、Krieg et al.,Yi et al., Nature 374 （1995） 546-549およびSato et al., Science 273 （1996） 352-354は、特定の配列コンテクスト（ＣｐＧ  ＤＮＡ）において、非メチル化ＣｐＧ−ジヌクレオチドを含有する細菌ＤＮＡ、合成オリゴデオキシヌクレオチド、およびＤＮＡワクチンが、脊椎動物の免疫システムを活性化すると教示している。
【０００３】
Krieg et al., Annu. Rev. Immunol. 20 （2002） 709-760、Dalpke et al., Biol. Chem. 383 （2002） 1491-1500およびKandimalla et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 4 （2002） 122-129は、ＣｐＧ  ＤＮＡが、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応、およびＢ細胞による免疫グロブリンの産生を促進するＴｈ１サイトカインを産生するように、自然免疫細胞を誘導すると教示している。ＣｐＧ  ＤＮＡの免疫賦活特性は、癌、ウイルスおよび細菌感染、炎症性疾患を含む広い範囲の疾患適応のための治療薬として、ならびに免疫治療におけるアジュバントとしてのそれらの使用を可能にしてきた。
【０００４】
化学修飾に加え、多くの構造修飾がＣｐＧ  ＤＮＡの活性に影響してきた。Kandimalla et al., Nucleic Acids Res. 30 （2002） 4460-4469は、３’−３’結合を介した、２つの自由に利用できる５’末端を含むＣｐＧ  ＤＮＡが、ＣｐＧモチーフの複数コピーおよび単一の５’末端を含む標準のＣｐＧ  ＤＮＡよりも大きな活性を持っていると教示している。
【０００５】
Kandimalla et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 306 （2003） 948-953 は、ＣｐＧ  ＤＮＡにおける二次構造の存在が、二次構造の位置と性質に依存してそれらの活性に大きな影響を及ぼすこと、５’末端におけるヘアピン構造の存在が刺激活性を無効にすること、および３’末端における同じ構造が刺激活性にわずかな影響を持っているが、より低いＩＬ−６分泌を引き起こし、ヌクレアーゼに対するより高い安定性に寄与することを教示している。
オリゴヌクレオチド類似体の修飾によって、免疫反応を「カスタマイズ」する必要が残っている。
【発明の開示】
【０００６】
本発明の概要
第１の側面において、本発明は、配列が少なくとも部分的に自己相補的である、免疫賦活オリゴヌクレオチドを提供する。免疫賦活核酸は、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選ばれる、少なくとも１つのジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含み、ここで、Ｃはシチジンまたは２’−デオキシシチジンであり、Ｇはグアノシンまたは２’−デオキシグアノシンであり、
【０００７】
Ｃ＊は２’−デオキシチミジン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリン、２’−ジデオキシ−５−ハロシトシン、２’−ジデオキシ−５−ニトロシトシン、アラビノシチジン、２’−デオキシ−２’−置換アラビノシチジン、２’−Ｏ−置換アラビノシチジン、２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン、２’−デオキシ−Ｎ４−アルキル−シチジン、２’−デオキシ−４−チオウリジン、または他のピリミジンヌクレオシド類似体であり、Ｇ＊は２’−デオキシ−７−デアザグアノシン、２’−デオキシ−６−チオグアノシン、アラビノグアノシン、２’−デオキシ−２’置換−アラビノグアノシン、２’−Ｏ−置換−アラビノグアノシン、２’−デオキシイノシン、または他のプリンヌクレオシド類似体であり、ｐはホスホジエステル、ホスホロチオエート、およびホスホロジチオエートからなる群から選ばれるヌクレオシド間結合である。
【０００８】
ある態様において、免疫賦活核酸は長さ約２〜約５０ヌクレオチドである。特定の態様において、免疫賦活核酸は長さ約１２〜約２６ヌクレオチドである。ある態様において、オリゴヌクレオチドはそれぞれ約３〜約３５のヌクレオシド残基を、さらなる態様において約４〜約３０のヌクレオシド残基を、またさらなる態様において、約４〜約２０のヌクレオシド残基を有している。ある態様において、オリゴヌクレオチドは約５〜約１８、または約５〜約１４のヌクレオシド残基を有している。
【０００９】
本明細書において、用語「約」は正確な数字が重要ではないという意味を含む。したがって、オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオシド残基の数は重要でなく、そして１つもしくは２つ少ないヌクレオシド残基、または１〜数個の追加のヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドは、上記説明されたそれぞれの態様の均等物として考慮される。ある態様においては、１つまたは２つ以上のオリゴヌクレオチドは１１のヌクレオチドを有する。
【００１０】
第２の側面において、本発明は、非ヌクレオチドリンカーで結合された、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含むイムノマーを提供し、ここで免疫賦活オリゴヌクレオチドの配列は、少なくとも部分的に自己相補的である。本発明のこの側面にによる特定の態様において、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選ばれる、少なくとも１つのジヌクレオチドを含み、ここでＣはシチジンまたは２’−デオキシシチジン、Ｇはグアノシンまたは２’−デオキシグアノシンであり、
【００１１】
Ｃ＊は２’−デオキシチミジン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリン、２’−ジデオキシ−５−ハロシトシン、２’−ジデオキシ−５−ニトロシトシン、アラビノシチジン、２’−デオキシ−２’−置換アラビノシチジン、２’−Ｏ−置換アラビノシチジン、２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン、２’−デオキシ−Ｎ４−アルキル−シチジン、２’−デオキシ−４−チオウリジン、または他のピリミジンヌクレオシド類似体であり、Ｇ＊は２’−デオキシ−７−デアザグアノシン、２’−デオキシ−６−チオグアノシン、アラビノグアノシン、２’−デオキシ−２’置換−アラビノグアノシン、２’−Ｏ−置換−アラビノグアノシン、２’−デオキシイノシン、または他のプリンヌクレオシド類似体であり、ｐはホスホジエステル、ホスホロチオエート、およびホスホロジチオエートからなる群から選ばれるヌクレオシド間結合である。
【００１２】
ある態様において、免疫賦活核酸は長さ約２〜約５０ヌクレオチドである。特定の態様において、免疫賦活核酸は長さ約１２〜約２６ヌクレオチドである。ある態様において、オリゴヌクレオチドはそれぞれ約３〜約３５のヌクレオシド残基、または約４〜約３０のヌクレオシド残基、または約４〜約２０のヌクレオシド残基を有している。ある態様において、オリゴヌクレオチドは、約５〜約１８、または約５〜約１４のヌクレオシド残基を有している。
【００１３】
本明細書において、用語「約」は正確な数字が重要ではないという意味を含む。したがって、オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオシド残基の数は重要でなく、そして１つもしくは２つ少ないヌクレオシド残基、または１〜数個の追加のヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドは、上記説明されたそれぞれの態様の均等物として考慮される。ある態様においては、１つまたは２つ以上のオリゴヌクレオチドは１１のヌクレオチドを有する。
【００１４】
第３の側面において、本発明は医薬組成物を提供する。これらの組成物は、本発明の第１および第２の側面において開示されたいずれかの組成物を単独で、あるいは組み合わせて含み、かつ薬学的に許容し得るキャリヤーを含む。
【００１５】
第４の側面において、本発明は、脊椎動物において免疫反応を発生させるための方法を提供する。この方法は、本発明の第１、第２および第３の側面において開示されたいずれかの組成物を単独あるいは併用で脊椎動物に投与することを含む。本明細書中に開示された組成物は、非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃、皮膚パッチ、点眼、点耳およびマウスウォッシュを含むが、これらに限定されない、任意の好適な投与経路で投与されてもよい。
【００１６】
第５の側面において、本発明は、癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、喘息または病原体によって引き起こされる病気を有する脊椎動物を治療的に処置するための方法を提供する。この方法は、本発明の第１、第２および第３の側面において開示されたいずれかの組成物を単独あるいは併用で脊椎動物に投与することを含む。本明細書中に開示された組成物は、非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃、皮膚パッチ、点眼、点耳およびマウスウォッシュを含むが、これらに限定されない、任意の好適な投与経路で投与されてもよい。
【００１７】
第６の側面において、本発明は、癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、喘息または病原体によって引き起こされる病気を脊椎動物において予防するための方法を提供する。この方法は、本発明の第１、第２および第３の側面において開示されたいずれかの組成物を単独あるいは併用で脊椎動物に投与することを含む。本明細書中に開示された組成物は、非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃、皮膚パッチ、点眼、点耳およびマウスウォッシュを含むが、これらに限定されない、任意の好適な投与経路で投与されてもよい。
【００１８】
好ましい態様の詳細な説明
本明細書中に引用された、発行済み特許、特許出願および参考文献は、それぞれが参照により組み込まれるべく具体的かつ個別に示される場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。ここで引用されたいずれかの参考文献のいずれかの教示と本願明細書との間に矛盾がある場合は、後者が本発明に関して優先される。
【００１９】
本発明は、免疫治療用途のための免疫賦活剤としてのオリゴヌクレオチドの治療上の使用に関する。本発明はさらに、例えば、限定されずに、成人および小児用途、ヒトおよび獣医用途における、癌、自己免疫疾患、喘息、呼吸器アレルギー、食物アレルギー、および細菌、寄生虫およびウイルス感染の治療および／または予防などの免疫治療用途のために使用される免疫賦活化合物がもたらす免疫反応を、惹起、強化および改善するための方法を提供する。
【００２０】
アレルギー性喘息は、本発明の方法および化合物による処置のための特定の具体的な症状である。したがって、本発明はさらに免疫治療のための免疫賦活効果の最適水準を有する化合物、ならびにかかる化合物を製造および使用する方法を提供する。さらに、本発明の免疫賦活オリゴヌクレオチド／イムノマーは、ＤＮＡワクチン、抗体、アレルゲン、化学療法薬、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドとの併用で、アジュバントとして有用である。
【００２１】
第１の側面において、本発明は、その配列が、少なくとも部分的に自己相補的な、免疫賦活オリゴヌクレオチドを提供する。免疫賦活核酸は、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選ばれる、少なくとも１つのジヌクレオチドを含む核酸配列を含み、ここでＣはシチジンまたは２’−デオキシシチジンであり、Ｇはグアノシンまたは２’−デオキシグアノシンであり、
【００２２】
Ｃ＊は２’−デオキシチミジン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリン、２’−ジデオキシ−５−ハロシトシン、２’−ジデオキシ−５−ニトロシトシン、アラビノシチジン、２’−デオキシ−２’−置換アラビノシチジン、２’−Ｏ−置換アラビノシチジン、２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン、２’−デオキシ−Ｎ４−アルキル−シチジン、２’−デオキシ−４−チオウリジン、またはその他のピリミジンヌクレオシド類似体であり、Ｇ＊は２’−デオキシ−７−デアザグアノシン、２’−デオキシ−６−チオグアノシン、アラビノグアノシン、２’−デオキシ−２’置換−アラビノグアノシン、２’−Ｏ−置換−アラビノグアノシン、２’−デオキシイノシン、またはその他のプリンヌクレオシド類似体であり、ｐはホスホジエステル、ホスホロチオエート、およびホスホロジチオエートからなる群から選ばれるヌクレオシド間結合である。
【００２３】
ある態様において、免疫賦活核酸は長さ約２〜約５０ヌクレオチドである。特定の態様において、免疫賦活核酸は長さ約１２〜約２６ヌクレオチドである。ある態様において、オリゴヌクレオチドは約３〜約３５ヌクレオシド残基、または約４〜約３０ヌクレオシド残基、または約４〜約２０ヌクレオシド残基である。ある態様において、オリゴヌクレオチドは約５〜約１８、または約５〜約１４のヌクレオシド残基を有している。
【００２４】
本明細書において、用語「約」は正確な数字は重要ではないという意味を含む。したがって、オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオシド残基の数は重要でなく、そして１つもしくは２つ少ないヌクレオシド残基、または１〜数個の追加のヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドは、上記説明されたそれぞれの態様の均等物として考慮される。ある態様において、１つまたは２つ以上のオリゴヌクレオチドは１１のヌクレオチドを有する。
【００２５】
当業者に認識されるように、オリゴヌクレオチドの相補的配列は、分子間水素結合を可能にし、それにより二次構造をオリゴヌクレオチドに与える。さらなるオリゴヌクレオチドは共に結合することができ、それによって本発明のオリゴヌクレオチドの鎖またはマルチマーを形成する。
【００２６】
第２の側面において、本発明は、非ヌクレオチドリンカーで結合された、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含むイムノマーを提供し、ここで免疫賦活オリゴヌクレオチドの配列は少なくとも部分的に自己相補的である。本発明のこの側面による特定の態様において、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選ばれる、少なくとも１つのジヌクレオチドを含有し、ここでＣはシチジンまたは２’−デオキシシチジンであり、Ｇはグアノシンまたは２’−デオキシグアノシンであり、
【００２７】
Ｃ＊は２’−デオキシチミジン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリン、２’−ジデオキシ−５−ハロシトシン、２’−ジデオキシ−５−ニトロシトシン、アラビノシチジン、２’−デオキシ−２’−置換アラビノシチジン、２’−Ｏ−置換アラビノシチジン、２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン、２’−デオキシ−Ｎ４−アルキル−シチジン、２’−デオキシ−４−チオウリジン、または他のピリミジンヌクレオシド類似体であり、Ｇ＊は２’−デオキシ−７−デアザグアノシン、２’−デオキシ−６−チオグアノシン、アラビノグアノシン、２’−デオキシ−２’置換−アラビノグアノシン、２’−Ｏ−置換−アラビノグアノシン、２’−デオキシイノシン、または他のプリンヌクレオシド類似体であり、ｐはホスホジエステル、ホスホロチオエート、およびホスホロジチオエートからなる群から選ばれるヌクレオシド間結合である。
【００２８】
この側面において、免疫賦活核酸は、式（Ｉ）で示される構造を含む。
ドメインＡ−ドメインＢ−ドメインＣ （Ｉ）
ドメインは長さ約２〜約１２ヌクレオチドであってもよい。ドメインＡは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選ばれる、少なくとも１つのジヌクレオチドを含む、または含まない、回文または自己相補的ドメインを有する、５’−３’または３’−５’または２’−５’ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡであってもよく、ここで、Ｃはシチジンまたは２’−デオキシシチジンであり、Ｇはグアノシンまたは２’−デオキシグアノシンであり、
【００２９】
Ｃ＊は２’−デオキシチミジン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリン、２’−デオキシ−５−ハロシトシン、２’−デオキシ−５−ニトロシトシン、アラビノシチジン、２’−デオキシ−２’−置換アラビノシチジン、２’−Ｏ−置換アラビノシチジン、２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン、２’−デオキシ−Ｎ４−アルキル−シチジン、２’−デオキシ−４−チオウリジン、または他のピリミジンヌクレオシド類似体であり、Ｇ＊は２’−デオキシ−７−デアザグアノシン、２’−デオキシ−６−チオグアノシン、アラビノグアノシン、２’−デオキシ−２’置換−アラビノグアノシン、２’−Ｏ−置換−アラビノグアノシン、２’−デオキシイノシン、または他のプリンヌクレオシド類似体であり、ｐはホスホジエステル、ホスホロチオエート、およびホスホロジチオエートからなる群から選ばれるヌクレオシド間結合である。特定の態様において、免疫賦活ジヌクレオチドはＣｐＧではない。
【００３０】
特定の態様において、ドメインＡは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選ばれる２つ以上のジヌクレオチドを有する。
下記で「Ｘ」と表すドメインＢは、ドメインＡおよびＣを接合するリンカーであり、３’−５’結合、２’−５’結合、３’−３’結合、リン酸基、ヌクレオシド、または脂肪族、芳香族、アリール、環状、キラル、アキラル、ペプチド、炭水化物、脂質、脂肪酸、モノ−、トリ−またはヘキサポリエチレングリコール、またはヘテロ環状部分であり得る非ヌクレオシドリンカーであってもよい。
【００３１】
ドメインＣは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊およびＣｐＧ＊からなる群から選ばれる、少なくとも１つのジヌクレオチドを含む、または含まない、回文または自己相補的ドメインを有する、５’−３’または３’−５’、２’−５’ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＰｏｌｙＩ−ＰｏｌｙＣであってもよく、ここでＣはシチジンまたは２’−デオキシシチジンであり、Ｇはグアノシンまたは２’−デオキシグアノシンであり、
【００３２】
Ｃ＊は２’−デオキシチミジン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリン、２’−デオキシ−５−ハロシトシン、２’−ジデオキシ−５−ニトロシトシン、アラビノシチジン、２’−デオキシ−２’−置換アラビノシチジン、２’−Ｏ−置換アラビノシチジン、２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン、２’−デオキシ−Ｎ４−アルキル−シチジン、２’−デオキシ−４−チオウリジン、他のピリミジンヌクレオシド類似体であり、Ｇ＊は２’−デオキシ−７−デアザグアノシン、２’−デオキシ−６−チオグアノシン、アラビノグアノシン、２’−デオキシ−２’置換−アラビノグアノシン、２’−Ｏ−置換−アラビノグアノシン、２’−デオキシイノシン、または他のプリンヌクレオシド類似体であり、ｐはホスホジエステル、ホスホロチオエート、およびホスホロジチオエートからなる群から選ばれるヌクレオシド間結合である。
【００３３】
特定の態様において、免疫賦活ジヌクレオチドはＣｐＧではない。ある態様において、ドメインＢは好ましくは、ドメインＡおよびドメインＣのオリゴヌクレオチドを結びつける非ヌクレオチドリンカーであり、「イムノマー」と称される。特定の態様において、ドメインＣはジヌクレオチドＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、Ｃ＊ｐＧ＊またはＣｐＧ＊を有しない。
【００３４】
ある態様において、式（Ｉ）に含まれるオリゴヌクレオチドは長さ約２〜約５０ヌクレオチドである。特定の態様において、式（Ｉ）に含まれるオリゴヌクレオチドは長さ約１２〜約２６ヌクレオチドである。ある態様において、オリゴヌクレオチドはそれぞれ約３〜約３５のヌクレオシド残基、好ましくは約４〜約３０のヌクレオシド残基、さらに好ましくは約４〜約２０のヌクレオシド残基を有している。ある態様において、オリゴヌクレオチドは、約５〜約１８、または約５〜約１４のヌクレオシド残基を有している。
【００３５】
本明細書において、用語「約」は正確な数字は重要ではないという意味を含む。したがって、オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオシド残基の数は重要ではない、そして１つもしくは２つ少ないヌクレオシド残基、または１〜数個の追加のヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドは、上記説明されたそれぞれの態様の均等物として考慮される。ある態様においては、１つまたは２つ以上のオリゴヌクレオチドは１１のヌクレオチドを有する。
【００３６】
ここで用いられる自己相補的配列は、適切なアラインメントにより、Ｇ−Ｃ、Ａ−Ｔ、Ａ−Ｕおよび／またはＧ−Ｕゆらぎ対（wobble pair）間の分子内、またはさらに典型的には分子間の塩基対合を形成し得る塩基配列を示す。１つの態様において、自己相補性の程度は少なくとも５０パーセントである。例えば、少なくとも５０パーセント自己相補的である８−ｍｅｒは、４、５、６、７、または８対のＧ−Ｃ、Ａ−Ｔ、Ａ−Ｕおよび／またはＧ−Ｕゆらぎ塩基対を形成することができる配列を有してもよい。このような塩基対は、自己相補的免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーのいずれか一端に位置する塩基を含んでもよいが、必ずしもそうでなくてもよい。
【００３７】
核酸の安定化が、免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーにとって重要である場合、二本鎖核酸の一端または両端を、塩基対合またはその他の好適な方法のいずれかで一緒に「固定する」ことが有利であるかもしれない。自己相補性の度合いは、免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマー間のアラインメントに依存し得、かかるアラインメントは、単一のまたは複数のヌクレオシドオーバーハングを含んでも、含まなくてもよい。他の態様において、自己相補性の度合いは、少なくとも６０パーセント、少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、または１００パーセントでさえある。
【００３８】
異なる塩基配列の免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマー間の分子間塩基対合に対して、同じ考慮が当てはまる。したがって、複数個の免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーが一緒に使われる場合、複数個の免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーは、少なくとも部分的に互いに相補的である配列を含んでもよいが、そうでなくてもよい。１つの態様において、複数個の免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーは、第１の配列を有する免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマー、および第２の配列を有する免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーを含み、ここで、第１の配列と第２の配列とは、少なくとも５０パーセント相補的である。
【００３９】
例えば、少なくとも５０パーセント相補的である２つの８−ｍｅｒの間で、それらは４、５、６、７、または８対のＧ−Ｃ、Ａ−Ｔ、Ａ−Ｕ、および／またはＧ−Ｕゆらぎ塩基対を形成してもよい。このような塩基対は自己相補的免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーのいずれか一端に位置する塩基を含んでもよいが、必ずしもそうでなくてもよい。自己相補性の度合いは、免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマー間のアラインメントに依存し得、かかるアラインメントは、単一または複数のヌクレオシドオーバーハング含んでも含まなくてもよい。他の態様において、自己相補性の度合いは、少なくとも６０パーセント、少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、または１００パーセントでさえある。
【００４０】
非限定例として、特定の態様において、この側面の免疫賦活核酸は、式（ＩＩ）で表される構造を有する。
【化１】
2008502688.tif 000002
【００４１】
当業者に認識されるように、ドメインの配列が相補的であり、分子間水素結合を可能にするので、上記の免疫賦活核酸／イムノマー化合物は二次構造を有している。ドメインＡおよびＡ’は同一であってもなくてもよく、ドメインＡおよびＣは同一であってもなくてもよく、ドメインＡおよびＣ’は同一であってもなくてもよく、ドメインＡ’およびＣは同一であってもなくてもよく、ドメインＡ’およびＣ’は同一であってもなくてもよく、ドメインＢおよびＢ’は同一であってもなくてもよく、ドメインＣおよびＣ’は同一であってもなくてもよい。さらに、図１に示されるように、さらなるイムノマーが分子間水素結合を介して結合することができ、それによって、本発明のイムノマーの鎖またはマルチマーを形成する。ｎは、連続した、自己相補的イムノマー化合物の任意の数であり得る。
【００４２】
本明細書において、用語「相補的」は、核酸にハイブリダイズする能力を有することを意味する。かかるハイブリダイゼーションは通常、相補鎖間の水素結合、好ましくは、ワトソン・クリックまたはフーグスティーン（Hoogsteen）塩基対を形成する水素結合の結果であるが、その他の形態の水素結合ならびに塩基スタッキングもハイブリダイゼーションを導くことができる。
【００４３】
本明細書において「二次構造」は分子間水素結合を示す。分子間水素結合は二重鎖の核酸分子の形成をもたらす。
【００４４】
「回文配列」は逆向きの反復（すなわち、ＡおよびＡ’、ＢおよびＢ’などが通常のワトソン・クリック塩基対を形成することができる塩基である、ＡＢＣＤＥＥ’Ｄ’Ｃ’Ｂ’Ａ’などの配列）を意味する。in vivoで、このような配列は二本鎖構造を形成し得る。１つの態様において、ＣｐＧ核酸は回文配列を含む。この文脈で使われる回文配列は、ＣｐＧが回文の一部である回文を示す。ある態様において、ＣｐＧは回文の中心である。ほかの態様において、ＣｐＧ核酸は、回文を含まない。回文を含まない免疫賦活核酸とは、ＣｐＧジヌクレオチドが回文の一部ではないものである。かかるオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧが回文の中心ではない、回文を含んでもよい。
【００４５】
本発明において、用語「オリゴヌクレオチド」は、複数個の結合されたヌクレオシド単位から形成された、ポリヌクレオチドを示す。このようなオリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、既存の核酸源から得ることができるが、合成的な方法によって生成されることが好ましい。ある態様において、それぞれのヌクレオシド単位は、複素環塩基および、ペントフラノシル、２’−デオキシペントフラノシル、トレハロース、アラビノース、２’−デオキシ−２’−置換アラビノース、２’−Ｏ−置換アラビノースまたはヘキソース糖類を含む。ヌクレオシド残基は、多数の既知のヌクレオシド間結合のいずれかによって、互いに結合され得る。このようなヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、炭酸塩、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カーバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋ホスホン酸メチレン、架橋ホスホロチオエート、およびスルホンヌクレオシド間結合を含むが、これらに限定されない。
【００４６】
用語「オリゴヌクレオチド」はまた、１または２以上の立体特異的ヌクレオシド間結合（例えば、（ＲＰ）−または（ＳＰ）−ホスホロチオエート、アルキルホスホネートまたはホスホトリエステル結合）を有するポリヌクレオシドを包含する。本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」および「ジヌクレオチド」は、かかる任意のヌクレオシド間結合を、該結合がリン酸基を含むか否かにかかわらず有するポリヌクレオシドおよびジヌクレオシドを包含することを明示的に意図している。特定の態様において、これらのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエート結合、もしくはこれらの組み合わせであってもよい。
【００４７】
用語「オリゴヌクレオチド」はまた、限定されずに、タンパク質基、親油基、挿入剤、ジアミン、葉酸、コレステロールおよびアダマンタンを含む、さらなる置換基を有するポリヌクレオシドも包含する。用語「オリゴヌクレオチド」はまた、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、リン酸基を伴ったペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ−バックボーンオリゴヌクレオチド、およびアルキルリンカーまたはアミノリンカーを伴う主鎖部分を有するオリゴヌクレオチドを含むが、これらに限定されない、任意の他の核酸塩基を含むポリマーをも包含する。
【００４８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオシド、修飾ヌクレオシド、またはそれらの混合物を含むことができる。本明細書において、用語「修飾ヌクレオシド」は、修飾複素環塩基、修飾糖部分、またはこれらの組み合わせを含むヌクレオシドである。ある態様において、修飾ヌクレオシドは、ここで説明されるように、非天然ピリミジンまたはプリンヌクレオシドである。ある態様において、修飾ヌクレオシドは、２’−置換リボヌクレオシド、アラビノヌクレオシドまたは２’−デオキシ−２’−置換−アラビノシドである。
【００４９】
本発明において、用語「２’−置換リボヌクレオシド」または「２’−置換アラビノシド」は、ペントース部分の２’位にあるヒドロキシル基が、２’−置換または２’−Ｏ−置換リボヌクレオシドを生成するために置換された、リボヌクレオシドまたはアラビノヌクレオシドを含む。特定の態様において、かかる置換は、１〜６個の飽和または不飽和炭素原子を含む低級アルキル基、または、６〜１０個の炭素原子を有するアリール基によって行われ、ここでかかるアルキル、またはアリール基は非置換であってもよく、または例えば、ハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルボアルコキシ、またはアミノ基で置換されていてもよい。２’−Ｏ−置換リボヌクレオシド、または２’−Ｏ−置換−アラビノシドの例は、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−メチルアラビノシド、および２’−Ｏ−メトキシエトキシリボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−メトキシエトキシアラビノシドを含むが、これらに限定されない。
【００５０】
用語「２’−置換リボヌクレオシド」または「２’−置換アラビノシド」はまた、２’−ヒドロキシル基が、１〜６個の飽和または不飽和炭素原子を含む低級アルキル基、またはアミノもしくはハロ基で置換された、リボヌクレオシドまたはアラビノヌクレオシドも含む。かかる２’−置換リボヌクレオシドまたは２’−置換アラビノシドの例は、２’−アミノ、２’−フルオロ、２’−アリル、および２’−プロパルギルリボヌクレオシドまたはアラビノシドを含むが、これらに限定されない。
【００５１】
用語「オリゴヌクレオチド」は、ハイブリッドおよびキメラオリゴヌクレオチドを含む。「キメラオリゴヌクレオチド」は、２種類以上のヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドである。かかるキメラオリゴヌクレオチドの１つの非限定例は、ホスホロチオエート、ホスホジエステルまたはホスホロジチオエート領域および、アルキルホスホネートまたはアルキルホスホノチオエート結合などの非イオン結合を含む、キメラオリゴヌクレオチドである（例えば、Pederson et al.、米国特許第5,635,377号および第5,366,878号参照）。
【００５２】
「ハイブリッドオリゴヌクレオチド」は、２種類以上のヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドである。かかるハイブリッドオリゴヌクレオチドの１つの非限定例は、リボヌクレオチドまたは２’置換リボヌクレオチド領域、およびデオキシリボヌクレオチド領域を含む（例えば、Metelev and Agrawal、米国特許第5,652,355号、第6,346,614号および第6,143,881等参照）。
あるいは、本発明の核酸分子は、非ヌクレオチドリンカーで結合された２つのイムノマーであり得る。
【００５３】
本発明の特定の態様において、少なくとも１つの本発明の免疫賦活オリゴヌクレオチドは、式５’−Ｐｙｒ−Ｐｕｒ−３’の免疫賦活ジヌクレオチドを含み、ここでＰｙｒは天然ピリミジンヌクレオシドまたはそれらの類似体であり、Ｐｕｒは天然プリンヌクレオシドまたはそれらの類似体である。本明細書において、用語「ピリミジンヌクレオシド」は、ヌクレオシドの塩基成分がピリミジン塩基であるヌクレオシドを示す。同様に、用語「プリンヌクレオシド」は、ヌクレオシドの塩基成分がプリン塩基であるヌクレオシドを示す。本発明において、「合成」ピリミジンまたはプリンヌクレオシドは、天然に存在しないピリミジンまたはプリン塩基、天然に存在しない糖部分、またはこれらの組み合わせを含む。
【００５４】
特定の態様において、本発明の方法に使用される免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーにおけるピリミジンヌクレオシドは、構造（ＩＩＩ）：
【化２】
2008502688.tif 000003
【００５５】
式中：
Ｄは水素結合供与体であり；
Ｄ’は、水素、水素結合供与体、水素結合受容体、親水基、疎水基、電子求引基および電子供与基からなる群から選ばれ；
Ａは水素結合受容体または親水基であり；
Ａ’は、水素結合受容体、親水基、疎水基、電子求引基および電子供与基からなる群から選ばれ；
Ｘは炭素または窒素であり；そして
Ｓ’は、ペントースもしくはヘキソース糖環、または天然に存在しない糖である、
を有する。
【００５６】
特定の態様において、糖環は、リン酸部分、修飾リン酸部分、またはピリミジンヌクレオシドを他のヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体に結合するのに適した他のリンカー部分で誘導体化されている。
【００５７】
ある態様において、水素結合供与体は、−ＮＨ−、−ＮＨ２、−ＳＨおよび−ＯＨを含むが、これらに限定されない。好ましい水素結合受容体は、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、および芳香族複素環の環窒素原子、例えばシトシンのＮ３を含むが、これらに限定されない。
【００５８】
ある態様において、（ＩＩＩ）における塩基部分は、天然に存在しないピリミジン塩基である。好ましい天然に存在しないピリミジン塩基の例は、５−ヒドロキシシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｎ４−アルキルシトシン、またはＮ４−エチルシトシン、および４−チオウラシルを含むが、これらに限定されない。ある態様において、（ＩＩＩ）における糖部分Ｓ’は、天然に存在しない糖部分である。本発明において、「天然に存在する糖部分」は核酸の一部として天然に存在する糖部分、例えば、リボースおよび２’−デオキシリボースであり、そして「天然に存在しない糖部分」は、核酸の一部として天然に存在しない糖であるが、オリゴヌクレオチドのための主鎖として用いることができる任意の糖、例えばヘキソースである。アラビノースおよびアラビノース誘導体は、糖部分の非限定例である。
【００５９】
ある態様において、本発明の方法に使用される免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーにおけるプリンヌクレオシド類似体は、構造（ＩＶ）：
【化３】
2008502688.tif 000004
【００６０】
式中：
Ｄは水素結合供与体であり；
Ｄ’は、水素、水素結合供与体、および親水基からなる群から選ばれ；
Ａは水素結合受容体または親水基であり；
Ｘは炭素または窒素であり；
それぞれのＬは、独立して、Ｃ、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選ばれ；そして
Ｓ’はペントースもしくはヘキソース糖環、または天然に存在しない糖である、
を有する。
【００６１】
特定の態様において、糖環は、リン酸部分、修飾リン酸部分、またはピリミジンヌクレオシドを他のヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体に結合するのに適した他のリンカー部分で誘導体化されている。
【００６２】
特定の態様において、水素結合供与体は、−ＮＨ−、−ＮＨ２、−ＳＨおよび−ＯＨを含むが、これらに限定されない。好ましい水素結合受容体は、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、−ＮＯ２および芳香族複素環の環窒素原子、例えばグアニンのＮ１を含むが、これらに限定されない。
【００６３】
ある態様において、（ＩＶ）における塩基部分は天然に存在しないプリン塩基である。好ましい天然に存在しないプリン塩基の例は、６−チオグアニンおよび７−デアザグアニンを含むが、これらに限定されない。ある態様において、（ＩＶ）における、糖部分Ｓ’は、構造（ＩＩＩ）で説明されたように、天然に存在する糖部分である。
【００６４】
第３の側面において、本発明は医薬組成物を提供する。これらの組成物は、本発明の第１および第２の側面において開示されたいずれかの組成物を単独または組み合わせて含むと共に、薬学的に許容し得るキャリヤーを含む。
【００６５】
本明細書において、用語「生理的に許容し得る」は、本発明の第１、第２または第３の側面の組成物の有効性を妨げず、かつ、細胞、細胞培養物、組織または有機体などの生物系に適合できる物質を示す。特定の態様において、生物系は、脊椎動物などの生命体である。
【００６６】
本明細書において、用語「キャリヤー」は、任意の賦形剤、希釈剤、充てん剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、脂質、または医薬組成物への使用のために当該技術分野でよく知られているその他の物質を包含する。当然のことながら、キャリヤー、賦形剤、または希釈剤の特性は、特定の用途のための投与経路に依存することが理解されるだろう。これらの物質を含有する薬学的に許容し得る製剤の調合は、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, ISBN: 0-912734-04-3に開示されている。
【００６７】
本発明の医薬組成物はまた、ＥＦＧ、抗イディオタイプ癌ワクチン、Ｇｐ７５抗原、ＧＭＫメラノーマワクチン、ＭＧＶガングリオシド結合ワクチン、Ｈｅｒ２／ｎｅｗ、Ｏｖａｒｅｘ、Ｍ−Ｖａｘ、Ｏ−Ｖａｘ、Ｌ−Ｖａｘ、ＳＴｎ−ＫＨＬテラトープ（Theratope）、ＢＬＰ２５（ＭＵＣ−１）、リポソームイディオタイプワクチン、メラシン、ペプチド抗原ワクチン、毒素／抗原ワクチン、ＭＶＡベースのワクチン、ＰＡＣＩＳ、ＢＣＧワクチン、ＴＡ−ＨＰＶ、ＴＡ−ＣＩＮ、ＤＩＳＣ−ウイルス、およびＩｍｍｕｎＣｙｓｔ／ＴｈｅｒａＣｙｓから選ばれる癌ワクチンを含む、癌ワクチンを含んでもよい。
【００６８】
本発明の様々な態様において、本発明の第１、第２または第３の側面の組成物は、抗原に共有結合していてもよく、さもなければ、抗原と作動可能に連結していてもよい。本明細書において、用語「作動可能に連結する」は、本発明の第１、第２または第３の側面の組成物および抗原の両方の活性を維持する任意の連結を示す。かかる作動可能な連結の非限定例は、同じリポソームまたは他のかかる送達媒体または試薬の一部であることを含む。本発明の第１、第２または第３の側面の組成物が抗原と共有結合している態様において、かかる共有結合は、本発明の第１、第２または第３の側面の組成物の、免疫賦活オリゴヌクレオチドのアクセス可能な５’末端以外のいずれの位置であってもよい。例えば、抗原はヌクレオシド間結合に付着していてもよく、または非ヌクレオチドリンカーに付着していてもよい。あるいは、抗原自体が非ヌクレオチドリンカーであってもよい。
【００６９】
本発明の様々な態様において、本発明の第１、第２または第３の側面の組成物は、アンチセンス活性を持つオリゴヌクレオチドを含んでもよい。本明細書において、「アンチセンス活性」は、オリゴヌクレオチドが細胞または動物に導入されたとき、それと相補的な遺伝子の発現の低減を起こすことを意味する。
【００７０】
本発明の様々な態様において、本発明の第１、第２または第３の側面の組成物は、アプタマーであるオリゴヌクレオチド配列を含んでもよい。アプタマーは、他の分子に結びつく能力に基づいて、無作為なプールから選ばれた核酸分子である。核酸、タンパク質、小有機化合物、および生体全体にさえも結合するアプタマーが選択される。これらの新規分子は、医学および科学技術における多くの利用可能性を有している（例えば、Burgstaller P., et al. Curr Opin Drug Discov Devel. 5: 690-700 （2002）参照）。
【００７１】
本発明の医薬組成物は、非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃、皮膚パッチによる、もしくは点眼薬、点耳薬またはマウスウォッシュの形状を含むが、これらに限定されない、任意の好適な経路によって投与されてもよい。医薬組成物は、望ましい効果、例えば、癌治療、感染症治療および自己免疫疾患の治療を得る効果的な投与量および期間の、周知の手順を用いて送達することができる。
【００７２】
全身的に投与された場合、医薬組成物は、本発明の第１、第２および／または第３の側面の組成物の血中濃度を、約０．０００１マイクロモーラー〜約１０マイクロモーラーに到達させるのに十分な投与量で投与される。局所的な投与では、これよりかなり低い濃度が効果的であり得、また、かなり高い濃度が耐容され得る。特定の態様において、免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーの総投与量は、患者１人あたり１日約０．０００１ｍｇ〜体重１ｋｇあたり１日約２００ｍｇの範囲である。治療有効量の１種または２種以上の本発明の治療組成物を、個体に、単一の処置エピソードとして、同時にまたは順次投与することが望ましいだろう。
【００７３】
免疫賦活オリゴヌクレオチドは、以下の合成の手順にしたがって、イムノマーとして作製した。本発明の免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーは、図２および４に図式的に描かれるように、自動合成器およびホスホラミダイトアプローチを使用して、都合良く合成することができる。ある態様において、免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーは、線形合成アプローチ（図２参照）によって合成する。この合成のための代表的なリンカーは、図３に提示されている。本明細書において、用語「線形合成」は、イムノマーの一端で始まり、直線的に他端へ進む合成を示す。線形合成は、同一または非同一の（長さ、塩基組成および／または組み入れられた化学修飾に関して）単量体ユニットを、免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーへ組み込むことを可能にする。
【００７４】
免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーのための、合成の代替様式は、合成が中心リンカー部分から外側に向かう「パラレル合成」である（図４参照）。この合成方法のための代表的なリンカーは、図５に提示されている。米国特許第5,912,332号に開示されているように、固体支持体付着リンカーをパラレル合成に使用することができる。あるいは、制御細孔ガラス（controlled pore glass）支持体に付着させたリン酸塩などの、汎用的な固体支持体を使用することもできる。
【００７５】
免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーのパラレル合成は、線形合成に比べ様々な利点がある：（１）パラレル合成は、同一の単量体ユニットの組み込みを可能にする、（２）線形合成と違い、両方（または全て）の単量体ユニットが同時に合成され、それにより、合成工程の数および合成に必要とされる時間が、１単量体ユニットのそれと同じである、ならびに（３）合成工程の減少が、最終イムノマー生成物の純度および収率を高める。
【００７６】
線形合成またはパラレル合成のいずれかの手順よる合成の最後において、本発明の免疫賦活オリゴヌクレオチドまたはイムノマーは、修飾ヌクレオシドが組み込まれている場合は、濃縮アンモニア溶液によって、またはホスホルアミダイトの供給者により推奨されるとおりに都合良く脱保護することができる。免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマー製品は、好ましくは、逆相ＨＰＬＣにより精製し、脱トリチル化し、脱塩し、透析する。
【００７７】
本発明の第１、第２または第３の側面で開示された組成物は、免疫賦活オリゴヌクレオチドまたはイムノマーを、単体で、またはオリゴヌクレオチド／イムノマー接合体として含むことができる。オリゴヌクレオチド／イムノマー接合体は、上記のオリゴヌクレオチドまたはイムノマーと、該オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーに、アクセス可能な５’末端以外の位置で接合した抗原とを含む。ある態様において、非ヌクレオチドリンカーは、オリゴヌクレオチドに接合した抗原を含む。ある別の態様において、抗原は、オリゴヌクレオチドに、その３’末端以外の位置で接合される。ある態様において、抗原は、ワクチン効果をもたらす。免疫賦活オリゴヌクレオチドまたはイムノマーは、単体もしくはオリゴヌクレオチド／イムノマー接合体として、下記に論じる方法で投与することができる。
【００７８】
抗原は、病原体に関連した抗原、癌に関連した抗原、自己免疫疾患に関連した抗原、および他の疾患、例えば、限定されずに、動物疾患もしくは小児疾患、もしくは抗原がアレルゲンである疾患などに関連した抗原から任意に選ばれる。本発明において、用語「関連した」は、病原体、癌、自己免疫疾患、食物アレルギー、皮膚アレルギー、呼吸器アレルギー、喘息または他の病気が存在するときにその抗原が存在するが、病原体、癌、自己免疫疾患、食物アレルギー、皮膚アレルギー、呼吸器アレルギー、または病気がないときは、その抗原が存在しないか、または少ない量で存在することを意味する。
【００７９】
イムノマーは抗原に共有結合しているか、または、さもなければ抗原と作動可能に連結している。本明細書において、用語「作動可能に連結する」は、イムノマーおよび抗原の両方の活性を維持する任意の連結を意味する。このような、作動可能な連結の非限定例は、同じリポソームまたは他のかかる送達媒体または試薬の一部であることを含む。イムノマーが抗原に共有結合している態様において、かかる共有結合は、好ましくは、免疫賦活オリゴヌクレオチドのアクセス可能な５’末端以外の、イムノマーの位置にある。例えば、抗原は、ヌクレオシド間結合に付着してもよく、または非ヌクレオチドリンカーに付着してもよい。あるいは、抗原自体が、非ヌクレオチドリンカーであってもよい。
【００８０】
第４の側面において、本発明は脊椎動物において免疫反応を惹起および／または調節するための方法を提供し、かかる方法は、本発明のイムノマーまたはイムノマー接合体を脊椎動物に投与することを含む。ある様態において、脊椎動物は哺乳類である。本発明において、用語「哺乳類」はヒトを含むことを明示的に意図している。特定の態様において、イムノマーまたはイムノマー接合体は、免疫賦活を必要とする脊椎動物に投与される。
【００８１】
本明細書において、用語「調節すること」または「調節する」は、もとの免疫賦活核酸の免疫賦活活性に比較して、免疫賦活核酸の免疫賦活活性を増減することを意味する。
【００８２】
本発明のこの側面の方法において、イムノマーの投与は、任意の好適な経路によることができ、これは、非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、皮下、皮内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃、皮膚パッチによるもの、または点眼薬、点耳薬もしくはマウスウォッシュの形状でのものを含むが、これらに限定されない。イムノマーの治療組成物の投与は、疾患の症状または代理マーカーを低減するのに効果的な投与量および期間の周知の手順を用いて行うことができる。
【００８３】
全身的に投与する場合、治療組成物は、好ましくは、イムノマーの血中濃度を約０．０００１マイクロモーラー〜約１０マイクロモーラーに到達させるのに十分な投与量で投与する。局所的な投与では、これよりかなり低い濃度が効果的であり得、また、かなり高い濃度が耐容され得る。好ましくは、イムノマーの総投与量は、患者１人あたり１日約０．０００１ｍｇ〜体重１ｋｇあたり１日約２００ｍｇの範囲である。治療有効量の１種または２種以上の本発明の治療組成物を、個体に、単一の処置エピソードとして、同時にまたは順次投与することが望ましいだろう。
【００８４】
イムノマーまたはワクチンのいずれか一方、または両方は、適宜、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、コレラ毒素Ｂサブユニットなどの免疫原性タンパク質、または任意の他の免疫原性キャリヤータンパク質または非免疫原性キャリヤータンパク質に任意に結合していてもよい。限定されずに、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ＫＬＨ、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、アラム、およびＱＳ−２１を包含するサポニン、イミキモド、Ｒ８４８、またはそれらの組み合わせを含む、多種多様なアジュバントのうち任意のものを用いることができる。
【００８５】
トール様受容体（ＴＬＲ）は、感染のセンサーとして機能し、自然免疫反応および適応免疫反応の活性化を誘発する。ＴＬＲは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と呼ばれる、多種多様のリガンドを認識する。保存された病原体関連分子生成物を認識すると、ＴＬＲは、細胞内シグナル伝達ドメイン、トール／インターロイキン−１受容体（ＴＩＲ）ドメイン、および下流アダプタータンパク質ＭｙＤ８８を介して宿主防衛反応を活性させる。樹状細胞およびマクロファージは通常、トール様受容体（ＴＬＲ）リガンドおよびサイトカイン（例えば、インターロイキン−１β、ＩＬ−６および腫瘍壊死因子、ＴＮＦ）に反応するが、これらの細胞もこれらのサイトカインを産生する。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＴ細胞も前炎症性回路に関与している。
【００８６】
細菌化合物によるＴＬＲ刺激の後、自然免疫細胞は様々なサイトカインを放出する。ＴＬＲリガンドのいくらかの例は、リポタンパク質、ペプチドグリカン、ザイモサン（ＴＬＲ２）、二本鎖ＲＮＡ、ポリＩ：ポリＣ（ＴＬＲ３）、リポ多糖体、熱ショックタンパク質、タキソール（ＴＬＲ４）、フラジェリン（ＴＬＲ５）、ならびにイミダゾキノリン−Ｒ８４８、レシキモド、イミキモド、ｓｓＲＮＡ（ＴＬＲ７／８）、ベータ−リンパ球（ＴＬＲ１０）および尿路病原性大腸菌（ＴＬＲ１１）を含むが、これらに限定されない。
【００８７】
本発明のこの側面の方法は、免疫系のモデル研究に有益である。該方法は、ヒトまたは動物の病気の予防または治療処置のためにも有益である。例えば、小児用および獣医用ワクチン用途に有益である。
【００８８】
第５の側面において、本発明は、病気または疾患を有する脊椎動物を治療的に処置するための方法を提供し、かかる方法は、本発明のイムノマーまたはイムノマー接合体を脊椎動物に投与することを含む。さまざまな態様において、処置される病気または疾患は、癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、アレルギー、喘息または病原体によって引き起こされる病気である。病原体は、細菌、寄生虫、菌類、ウイルス、ウイロイドおよびプリオンを含む。投与は、本発明の第４の側面に開示されたように実施される。
【００８９】
本発明において、用語「アレルギー」は、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎（別名花粉症）、アレルギー性結膜炎、じんましん（urticaria）（別名じんましん(hives)）、呼吸器アレルギー、ならびにラテックス、医薬品および虫刺されなどの他の物質に対するアレルギー反応、またはアレルギー性鼻炎−副鼻腔炎、中耳炎およびＣＯＰＤが通常もたらす問題を含むが、これらに限定されない。用語「気道炎症」は、喘息を含むが、これに限定されない。喘息の具体的な例は、アレルギー性喘息、非アレルギー性喘息、運動誘発性喘息、職業性喘息、および夜間喘息を含むが、これらに限定されない。
【００９０】
アレルギー性喘息は、アレルギーと関連した気道閉塞に特徴付けられ、アレルゲンと呼ばれる物質によって誘発される。アレルギー性喘息の誘因は、空中花粉、カビ、動物の鱗屑、イエダニおよびゴキブリの糞を含むが、これらに限定されない。非アレルギー性喘息はウイルス感染、特定の医薬品または空気中に見出される刺激物によって引き起こされ、鼻および気道を悪化させる。非アレルギー性喘息の誘因は、空中の粉塵（例えば、石炭、チョークのちり）、空気汚染物質（例えば、タバコの煙、木の煙）、強い臭いまたはスプレー（例えば、香水、家庭用クリーナー、料理の煙霧、ペンキまたはニス）、ウイルス感染（例えば、風邪、ウイルス性肺炎、副鼻腔炎、鼻ポリープ）、アスピリン過敏性、および胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）を含むが、これらに限定されない。
【００９１】
運動誘発性喘息（ＥＩＡ）は、激しい身体的活動によって誘発される。ＥＩＡの症状は、大多数の喘息で苦しむ人において様々な程度でおこり、運動中に冷たい、乾いた空気を呼吸することの結果として誘発されるようである。ＥＩＡの誘因は、運動中に空中の花粉を呼吸すること、運動中に大気汚染物質を呼吸すること、ウイルス性気道感染を伴って運動すること、および冷たい、乾いた空気の中で運動することを含むが、これらに限定されない。職業性喘息は、職場に見出される刺激物および他の有害な恐れのある物資を吸い込むことに直接関連している。職業性喘息の誘因は、煙霧、化学物質、ガス、樹脂、金属、ちり、蒸気および殺虫剤を含むが、これらに限定されない。
【００９２】
本明細書において、用語「自己免疫疾患」は、免疫系によって「自己」タンパク質が攻撃を受ける疾患を示す。かかる用語は、自己免疫喘息を含む。
【００９３】
いずれの特定の理論に縛られることを望むことなく、先進国において細菌への暴露の減少が、喘息、アトピー性皮膚炎および鼻炎などのアレルギー疾患による、上昇した発生率、重症度および死亡率に部分的に関与している可能性がある。この仮説は、細菌感染または生成物が、実験動物モデルおよび臨床研究において、アレルギー性疾患の発症を抑制することができることに裏付けられている。非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドおよび／または修飾ＣｐＧジヌクレオチドを特定の配列コンテキスト（ＣｐＧ  ＤＮＡ）において含む、細菌ＤＮＡまたは合成オリゴデオキシヌクレオチドは、自然免疫反応を強く刺激し、それによって獲得免疫を強く刺激する。
【００９４】
ＣｐＧ  ＤＮＡへの免疫反応は、自然免疫細胞の活性化、Ｂ細胞の増殖、Ｔｈ１サイトカイン分泌の誘発、および免疫グロブリン（Ｉｇ）の産生を含む。ＣｐＧ  ＤＮＡによる免疫細胞の活性化は、分子パターン認識受容体である、トール様受容体９（ＴＬＲ９）を介して起こる。ＣｐＧ  ＤＮＡは、ＩＬ−１２およびＩＦＮγの分泌によって特徴付けられる、強いＴｈ１優位の免疫反応を誘発する。イムノマー（ＩＭＯ）は単体、またはアレルゲン接合体として、アレルギー性喘息のマウスモデルにおいて、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩｇＥの産生を減らし、かつ好酸球増加症を軽減した。ＩＭＯ化合物はまた、Ｔｈ２反応をＴｈ１反応に変換することにより、確立したアトピー性好酸球性気道疾患を効果的に回復させる。
【００９５】
アラムを伴うＯＶＡは、様々なマウスおよびラットモデルにおいて、Ｔｈ２優位の免疫反応を確立するために一般的に用いられている。Ｔｈ２免疫反応は、増大したＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３産生、上昇した総ＩｇＥ、ＩｇＧ１および抗原特異的ＩｇＥ、ＩｇＧ１の血中濃度、ならびにより低いＩｇＧ２ａレベルを含む。ＩＭＯ化合物は、マウスにおいて、確立されたＴｈ２優位の免疫反応を予防し、後退させる。マウスへの、ＩＭＯ化合物のＯＶＡ／アラムとの同時投与は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３産生を減少させ、抗原再刺激にさらされた脾臓細胞培養物において、ＩＦＮ−γ産生を誘発する。さらに、ＩＭＯ化合物は、これらのマウスにおいて、抗原特異的および総ＩｇＥを抑制し、ＩｇＧ２ａ産生を増強する。
【００９６】
ＯＶＡ／アラムおよびＩＭＯ化合物の注入は、マウスにおいて、Ｔｈ２関連サイトカイン、ＩｇＥおよびＩｇＧ１の低いレベル、ならびにＴｈ１関連サイトカインおよびＩｇＧ２ａの高いレベルによって特徴付けられる、リンパ球抗原リコール（antigen-recall）反応（Ｔｈ１タイプ）を誘発する。ＩＭＯ化合物の、マンソン住血吸虫卵および鶏卵リゾチームなどの、他の種類の抗原との同時投与も、Ｔｈ２反応の、Ｔｈ１優位の反応への逆転を、in vitroおよびin vivo研究においてもたらした。ここで説明されるように、ＩＭＯ化合物は、Ｔｈ２免疫反応の発生を効果的に予防し、強いＴｈ１反応を可能にする。
【００９７】
Ｔｈ２サイトカインは、ＩｇＥおよびＩｇＧ１産生へのＩｇアイソタイプスイッチを招くが、Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γは、Ｂ−リンパ球によるＩｇＧ２ａの産生を誘発する。ＯＶＡ／アラムおよびＩＭＯ化合物を注入されたマウスは、ＯＶＡ／アラムのみを注入されたマウスよりも、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３のより低いレベル、ならびにＩＦＮ−γのより高いレベルを産生し、より低いＩｇＥおよびＩｇＧ１レベル、およびより高いＩｇＧ２ａレベルを伴う。これは、抗原およびＩＭＯ化合物を受けたマウスにおける、Ｔｈ１サイトカインの誘導と免疫グロブリンアイソタイプスイッチとの間の密接な関係の存在を示唆している。
【００９８】
血清抗原特異的ＩｇＥおよび総ＩｇＥレベルは、ＯＶＡ／アラムのみを受けたマウスよりも、ＯＶＡ／アラムおよびＩＭＯ化合物を受けたマウスにおいて著しく低い。その一方、ＯＶＡ／アラムのみを注入されたマウスと比べて、ＯＶＡ−特異的ＩｇＧ１レベルはほとんど変わらず、総ＩｇＧ１レベルはわずかに減少した（データは示さず）。異なる反応は、ＩｇＥおよびＩｇＧ１クラススイッチの制御に関わる、異なるメカニズムの結果かもしれないが、両方のアイソタイプはＩＬ−４およびＩＬ−１３によって影響されている。例えば、ＩＬ−６は、ＩＬ−４存在下で、Ｂリンパ球がＩｇＧ１を合成することを促進する。
【００９９】
第６の側面において、本発明は、癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、喘息または病原体によって引き起こされる病気を脊椎動物において予防するための方法を提供する。この方法は、本発明の第１、第２および第３の側面において開示されたいずれかの組成物を、単独あるいは併用で脊椎動物に投与することを含む。病原体は、細菌、寄生虫、菌類、ウイルス、ウイロイドおよびプリオンを含む。投与は、本発明の第４の側面について開示されたように行う。
【０１００】
本発明のいずれの方法においても、免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーまたはそれらの接合体は、オリゴヌクレオチドまたはイムノマーの免疫賦活効果を減少させない、病気または症状を処置するために有益な他の任意の薬剤と組み合わせて投与することができる。本発明のこの側面に関して、用語「組み合わせて」は、同じ患者における同じ病気を処置する過程で、を意味し、オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマー、ならびに薬剤を、同時投与や、時間的に間隔をあけた任意の順序、例えば、連続的に他方の直後に一方を投与することから、数日あけて投与することまでを含む、任意の順序で投与することを含む。かかる併用療法は、２回以上のイムノマーの投与、およびこれと独立した薬剤の投与を含んでもよい。オリゴヌクレオチドおよび／またはイムノマーならびに薬剤の投与は、同一、または異なる経路によってもよい。
【０１０１】
本発明のいずれの方法においても、病気または症状を処置するため有益な剤は、ワクチン、抗原、抗体、細胞毒性薬、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチンおよび／または免疫反応の特異性または規模を増大させるためのアジュバント、またはサイトカイン、ケモカイン、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチドおよび修飾アミノ酸を含むペプチドなどの共刺激分子を含むが、これらに限定されない。さらに、剤は、抗原またはアレルゲンをコードするＤＮＡベクターを含むことができる。これらの態様において、本発明のイムノマーは、アジュバントとして様々に作用すること、および／または直接的な免疫賦活効果をもたらすことができる。
【０１０２】
以下の例は、本発明の特定の好ましい態様をさらに説明することを意図し、本発明の範囲を限定することを意図しない。
例
【０１０３】
例１：オリゴヌクレオチドの合成、精製および熱融解プロファイル
ＣｐＧオリゴヌクレオチド（免疫賦活オリゴヌクレオチド／イムノマー）を、PerSeptive Biosystem’s 8909 Expedite DNA合成装置（PerSeptive Biosystem, Boston, MA）で、β−シアノエチルホスホラミダイトを使用して、１〜２μモルスケールで合成した。ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、およびＴのホスホラミダイトは、PE Biosystems（Foster City, CA）から入手した。
【０１０４】
Iyer R.P., et al.（J. Am. Chem. Soc. 112: 1253-1254 (1990)）に開示されたように、ヨウ素酸化剤を、ホスホロチオエートバックボーン修飾を得るために使用した。全てのオリゴを、標準プロトコルを使用して脱保護し、ＨＰＬＣによって精製し、ＵＳＰ品質の洗浄用滅菌水に対して透析した。オリゴを凍結乾燥し、再び蒸留水に溶解し、２６０ｎｍにおける紫外吸光度から濃度を決定した。全てのオリゴを、純度および分子量について、それぞれＣＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（Applied Biosystem’s Voyager-DETM STR BiospectrometryTM Workstation）によって特徴付けた。
【０１０５】
完全長オリゴの純度は、ＣＧＥおよび／または変性ＰＡＧＥで測定したところ９０〜９６％の範囲であり、残りは１または２ヌクレオチド（ｎ−１およびｎ−２）短かった。全てのオリゴは、リムルス試験（現在はCambrex Bio Science Walkersville, Inc., Walkersville, MDとして知られるBio-Whittaker）で測定したところ、＜０．１ＥＵ／ｍＬより少ない内毒素を含有していた。
【０１０６】
熱融解研究は、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび２ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する、１０ｍＭのリン酸水素二ナトリウム、ｐＨ７．２±０．２の溶液１ｍＬ中で行った。溶液は９５℃まで１０分間加熱し、一晩４℃で貯蔵される前に、ゆっくりと室温に至るように放置した。オリゴヌクレオチド鎖の最終濃度は２．０μＭであった。ＵＶ熱融解測定を、０．５℃／分の加熱速度で、１ｃｍの路長のキュベットを使用して、ペルチェ熱制御装置およびパーソナルコンピュータに接続されたPerkin-Elmer Lambda 20 Spectrophotometerにより、２６０ｎｍで行った。融解温度（Ｔｍ）は、半解離（half-dissociation）の温度とみなし、一次導関数プロットから得た。それぞれのＴｍ値は、２または３回の独立した実験の平均であり、その値は±１．０℃の範囲内であった。
【０１０７】
例２：細胞培養条件および試薬
４〜８週齢ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６またはＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスからの脾臓細胞を、Zhao, Q., et al.（Biochem Pharmacol. 51: 173-182 (1996)）およびBranda, R.F., et al.（Biochem. Pharmacol. 45: 2037-2043 (1993)）に開示されたように、ＲＰＭＩ完全培地で培養した。マウスＪ７７４マクロファージ（American Type Culture Collection, Manassas, VA）は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清および抗生物質（１００ＩＵ／ｍＬのペニシリンＧ／ストレプトマイシン）を補充した、ダルベッコ変法イーグル培地で培養した。その他の全ての培養試薬は、Mediatech （Gaithersburg, MD）から購入した。
【０１０８】
例３：脾臓細胞増殖試験
典型的に、マウス（Ｂａｌｂ−Ｃ）脾臓細胞を、４８時間の間、０．１、１．０、および１０．０μｇ／ｍｌの濃度のイムノマー化合物とともに培養し、細胞増殖を、Zhao, Q., et al.（Biochem Pharmacol. 51: 173-182 (1996)）に開示されたように、３Ｈ−ウリジン取り込みによって測定した。
【０１０９】
例４：サイトカイン誘導試験
マウス脾臓細胞またはＪ７７４細胞を、それぞれ５×１０６または１×１０６細胞／ｍＬで、２４ウェルディッシュに蒔いた。ＴＥバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ）に溶解したイムノマー化合物を、最終濃度０．０３、０．１、０．３、１．０、３．０、または１０．０μｇ／ｍＬで、細胞培養物に添加した。細胞をその後３７°Ｃで２４時間インキュベートし、上清をＥＬＩＳＡ分析のために採取した。実験は、それぞれのイムノマー化合物について２、３回、そして各濃度について三重に（in triplicate）行った。ＩＬ−１２およびＩＬ−６の分泌は、Bhagat L., et al.（Biochem. Biophys. Res. Commun. 300: 853-861 (2003)）に開示されたように、サンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。サイトカイン抗体および標準物質を含む、必要な試薬は、BD Biosciences Pharmingen （San Diego, CA）から購入した。
【０１１０】
例５：マウス脾腫試験
雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（４〜６週、１９〜２１グラム）を、マウス３匹の群に分けた。イムノマー化合物を、無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、マウスに５ｍｇ／ｋｇの用量で皮下（ＳＣ）投与した。マウスを、４８時間後に犠牲にし、Zhao, Q., et al.（Biochem Pharmacol. 51: 173-182 (1996)）およびBranda, R.F., et al.（Biochem. Pharmacol. 45: 2037-2043 (1993)）に開示されるように、脾臓を採取し、重量を測定した。
【０１１１】
例６：ＮＦ−κＢ経路の活性化
トール様受容体９（ＴＬＲ９）が、細菌、プラスミドおよび合成ＤＮＡ中の非メチル化ＣｐＧ−ジヌクレオチドを認識すること（Hemmi H., et al. Nature 408: 740-745 (2000)）、ならびにストレスキナーゼ（Yi A.K., et al. J. Immunol. 161: 4493-4497 (1998)）およびＮＦ−κＢ経路（Stacey K.J., et al. J. Immunol. 157: 2116-2122 (1996)）を活性化することが示されている。イムノマー化合物で処置されたＪ７７４細胞における、ＮＦ−κＢ活性化は、Yu D., et al.（Biochem. Biophys. Res. Commun. 297: 83-90 (2002)）およびBhagat L., et al.（Biochem. Biophys. Res. Commun. 300: 853-861 (2003)）に開示されるように行い、ＥＭＳＡによって分析した。
【０１１２】
例７：ヒトＢ細胞および形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の分離
新たに採取した健康なボランティアの血液（CBR Laboratories, Boston, MA）からのＰＢＭＣは、フィコール密度勾配遠心法（Histopaque-1077, Sigma）によって分離し、Ｂ細胞を、製造会社の使用説明書に従って、ＣＤ１９細胞分離キット（Miltenyi Biotec）を使用したポジティブ選択によって、ＰＢＭＣから分離した。表１は、Ｃ５７ＢＬ／６脾細胞試験における、本発明のイムノマー化合物の免疫賦活活性を示す。
【０１１３】
表１  イムノマー構造およびＣ５７ＢＬ／６脾細胞試験（２４時間）
【表１】
2008502688.tif 000005
【表２】
2008502688.tif 000006
【表３】
2008502688.tif 000007
【０１１４】
標準字体はホスホロチオエート結合を示し、イタリック体はホスホジエステル結合を示す。
Ｇ１＝２’−デオキシ−７−デアザグアノシン
Ｇ２＝アラビノグアノシン
Ｃ１＝１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリン
Ｘ＝グリセロールリンカー
Ｙ＝Ｃ３リンカー
【０１１５】
例８：ヒトｐＤＣ培養ならびにＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βＥＬＩＳＡ
ｐＤＣは、ヒトＰＢＭＣから、製造会社の使用説明書に従って、ＢＤＣＡ−４細胞分離キット（Miltenyi Biotec）を使用して単離した。ｐＤＣを、９６ウェルプレートに、１×１０６細胞／ｍＬ、２００μＬ／ウェルで蒔いた。イムノマー化合物を、０．３、１．０、３．０、または１０．０μｇ／ｍＬの最終濃度で、細胞培養物に添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。その後上清を採取し、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βについて、ＥＬＩＳＡキット（ＰＢＬ）を用いて分析した。表２Ａ〜２Ｄは、１０．０μｇ／ｍＬの濃度の発明のイムノマー化合物に関する、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βの平均値±ＳＤを示す。
【０１１６】
表２Ａ  ヒトＤＣ試験におけるイムノマー構造および免疫賦活活性（２４時間）
【表４】
2008502688.tif 000008
【０１１７】
標準字体はホスホロチオエート結合を示す。
Ｇ１＝２’−デオキシ−７−デアザグアノシン
Ｇ２＝アラビノグアノシン
Ｘ＝グリセロールリンカー
【０１１８】
表２Ｂ  ヒトＤＣ試験におけるイムノマー構造および免疫賦活活性（２４時間）
【表５】
2008502688.tif 000009
【０１１９】
標準字体はホスホロチオエート結合を示す。
Ｇ１＝２’−デオキシ−７−デアザグアノシン
Ｇ２＝アラビノグアノシン
Ｇ３＝２’−デオキシイノシン
Ｃ１＝１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリン
Ｃ２＝アラビノシチジン
Ｃ３＝２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン
【０１２０】
表２Ｃ  ヒトＤＣ試験におけるイムノマー構造および免疫賦活活性（２４時間）
【表６】
2008502688.tif 000010
【０１２１】
【表７】
2008502688.tif 000011
【表８】
2008502688.tif 000012
【０１２２】
標準字体はホスホロチオエート結合を示す。
Ｇ１＝２’−デオキシ−７−デアザグアノシン
Ｇ２＝アラビノグアノシン
Ｃ１＝１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリン
Ｘ＝グリセロールリンカー
【０１２３】
表２Ｄ  ヒトＤＣ試験におけるイムノマー構造および免疫賦活活性（２４時間）
【表９】
2008502688.tif 000013
【０１２４】
【表１０】
2008502688.tif 000014
【０１２５】
【表１１】
2008502688.tif 000015
【表１２】
2008502688.tif 000016
【０１２６】
標準字体はホスホロチオエート結合を示し、イタリック体はホスホジエステル結合を示す。
Ｇ１＝２’−デオキシ−７−デアザグアノシン
Ｇ２＝アラビノグアノシン
Ｃ１＝１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリン
Ｘ＝グリセロールリンカー
Ｙ＝Ｃ３リンカー
【０１２７】
例９：サイトカイン分析
脊椎動物細胞、好ましくはＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞またはヒトＰＢＭＣにおける、ＩＦＮ−αの分泌を、サンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。サイトカイン抗体およびサイトカイン標準物質を含む、必要な試薬は、PharMingen, San Diego, CAから購入した。ＥＬＩＳＡプレート（Costar）は、５μｇ／ｍＬの適切な抗体とともに、ＰＢＳＮバッファー（ＰＢＳ／０．０５％アジ化ナトリウム、ｐＨ９．６）中、一晩、４℃でインキュベートし、その後、ＰＢＳ／１％ＢＳＡで、３７℃にて３０分間ブロッキングした。
【０１２８】
細胞培養上清およびサイトカイン標準物質を、適切にＰＢＳ／１０％ＦＢＳで希釈し、プレートに三重に加え、２５℃で２時間インキュベートした。プレートは、１μｇ／ｍＬの適切なビオチン化抗体でオーバーレイし、２５℃で１．５時間インキュベートした。その後、プレートを、ＰＢＳ−Ｔバッファー（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で十分に洗浄し、ストレプトアビジン接合ペルオキシダーゼ（Sigma, St. Louis, MO）を加えた後、さらに２５℃で１．５時間インキュベートした。プレートを、Sure Blue（登録商標）（Kirkegaard and Perry）発色試薬で発色させ、反応を、Stop Solution（Kirkegaard and Perry）を加えることで終止した。変色を、Ceres 900 HDI Spectrophotometer（Bio-Tek Instruments）で測定した。
【０１２９】
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、フィコール密度勾配遠心法（Histopaque-1077, Sigma, St. Louis, MO）によって、健康なボランティアの末梢血から単離した。簡潔に述べると、ヘパリン加血液を、コニカル遠心チューブ内のHistopaque-1077（等容積）上に層にし、４００×ｇで３０分間、室温で遠心分離した。単核細胞を含有するバフィーコートを注意深く取り出し、等張リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で、２５０×ｇでの１０分間の遠心分離によって、二度洗浄した。
【０１３０】
その後、得られた細胞ペレットをＬ−グルタミンを含み、１０％熱不活性化ＦＣＳおよびペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）が補充されたＲＰＭＩ１６４０培地（MediaTech, Inc., Herndon, VA）に再懸濁した。細胞を、２４ウェルプレート中で、異なる時間、オリゴヌクレオチドの存在下または不在下において、１×１０６細胞／ｍｌ／ウェルで培養した。培養期間の終わりに上清を採取し、ＩＦＮ−α（BioSource International）を含む様々なサイトカインを、サンドイッチＥＬＩＳＡで分析するまで、−７０℃で保存冷凍した。結果を、下記表３Ａ〜３Ｄに示す。
【０１３１】
全ての場合において、細胞培養上清中のＩＦＮ−αのレベルは、同じ実験状態下で構築されたＩＦＮ−αの標準曲線から計算した。
【０１３２】
表３Ａ  ヒトＰＢＭＣ試験におけるイムノマー構造および免疫賦活活性（２４時間）
【表１３】
2008502688.tif 000017
【０１３３】
標準字体はホスホロチオエート結合を示す。
Ｇ１＝２’−デオキシ−７−デアザグアノシン
Ｇ２＝アラビノグアノシン
Ｘ＝グリセロールリンカー
【０１３４】
表３Ｂ  ヒトＰＢＭＣ試験におけるイムノマー構造および免疫賦活活性（２４時間）
【表１４】
2008502688.tif 000018
【０１３５】
標準字体はホスホロチオエート結合を示す。
Ｇ１＝２’−デオキシ−７−デアザグアノシン
Ｇ２＝アラビノグアノシン
Ｇ３＝２’−デオキシイノシン
Ｃ１＝１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリン
Ｃ２＝アラビノシチジン
Ｃ３＝２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン
【０１３６】
表３Ｃ  ヒトＰＢＭＣ試験におけるイムノマー構造および免疫賦活活性（２４時間）
【表１５】
2008502688.tif 000019
【０１３７】
【表１６】
2008502688.tif 000020
【表１７】
2008502688.tif 000021
【０１３８】
標準字体はホスホロチオエート結合を示す。
Ｇ１＝２’−デオキシ−７−デアザグアノシン
Ｇ２＝アラビノグアノシン
Ｃ１＝１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリン
Ｘ＝グリセロールリンカー
【０１３９】
表３Ｄ  ヒトＰＢＭＣ試験におけるイムノマー構造および免疫賦活活性（２４時間）
【表１８】
2008502688.tif 000022
【０１４０】
【表１９】
2008502688.tif 000023
【０１４１】
【表２０】
2008502688.tif 000024
【表２１】
2008502688.tif 000025
【０１４２】
標準字体はホスホロチオエート結合を示し、イタリック体はホスホジエステル結合を示す。
Ｇ１＝２’−デオキシ−７−デアザグアノシン
Ｇ２＝アラビノグアノシン
Ｃ１＝１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリン
Ｘ＝グリセロールリンカー
Ｙ＝Ｃ３リンカー
【０１４３】
例１０：フローサイトメトリー分析
ＣＤ６９およびＣＤ８６の細胞表面マーカーを、BD Pharmingen（San Diego, USA）から購入した抗ヒトＣＤ６９−ＦｉｔｃおよびＣＤ８６−Ｆｉｔｃを用いて、Coulter Epics-XL Flow Cytometerで検出した。
【０１４４】
染色方法を、以下に簡潔に説明する。活性化された培養細胞を、染色バッファー（１％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３を含むＰＢＳ）中の１０％ヒトＡＢ血清（Sigma）で、４℃にて１時間ブロッキングし、抗体によって４℃で一晩染色した。ＰＢＭＣ（４×１０５）は、ＣＤ６９−ＦｉｔｃおよびＣＤ８６−Ｆｉｔｃで染色した。ＰＤＣ（２×１０５）は、ＣＤ８６−Ｆｉｔｃで染色した。細胞染色データをCoulter System II softwareで取得、分析した（下記表４Ａ〜４Ｆ参照）。
【０１４５】
表４Ａ  イムノマー構造およびヒトＰＢＭＣ（２×１０６細胞／ｍｌ）からのＤＣの発現（２４時間）
【表２２】
2008502688.tif 000026
【表２３】
2008502688.tif 000027
【０１４６】
標準字体はホスホロチオエート結合を示し
Ｇ１＝２’−デオキシ−７−デアザグアノシン
Ｇ２＝アラビノグアノシン
Ｘ＝グリセロールリンカー
【０１４７】
表４Ｂ  イムノマー構造およびヒトＰＢＭＣ（２×１０６細胞／ｍｌ）からのＤＣの発現（２４時間）
【表２４】
2008502688.tif 000028
【表２５】
2008502688.tif 000029
【０１４８】
標準字体はホスホロチオエート結合を示す。
Ｇ１＝２’−デオキシ−７−デアザグアノシン
Ｇ２＝アラビノグアノシン
Ｇ３＝２’−デオキシイノシン
Ｃ１＝１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリン
Ｃ２＝アラビノシチジン
Ｃ３＝２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン
【０１４９】
表４Ｃ  イムノマー構造およびヒトＰＢＭＣ（２×１０６細胞／ｍｌ）からのＤＣの発現（２４時間）
【表２６】
2008502688.tif 000030
【０１５０】
【表２７】
2008502688.tif 000031
【０１５１】
【表２８】
2008502688.tif 000032
【表２９】
2008502688.tif 000033
【０１５２】
標準字体はホスホロチオエート結合を示す。
Ｇ１＝２’−デオキシ−７−デアザグアノシン
Ｇ２＝アラビノグアノシン
Ｃ１＝１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリン
Ｘ＝グリセロールリンカー
【０１５３】
表４Ｄ  イムノマー構造およびヒトＰＢＭＣ（２×１０６細胞／ｍｌ）からのＤＣの発現（２４時間）
【表３０】
2008502688.tif 000034
【表３１】
2008502688.tif 000035
【０１５４】
標準字体はホスホロチオエート結合を示す。
Ｇ１＝２’−デオキシ−７−デアザグアノシン
Ｇ２＝アラビノグアノシン
Ｃ１＝１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリン
Ｘ＝グリセロールリンカー
【０１５５】
表４Ｅ  イムノマー構造およびヒトＰＢＭＣからのＤＣの発現（２４時間）
【表３２】
2008502688.tif 000036
【０１５６】
【表３３】
2008502688.tif 000037
【０１５７】
【表３４】
2008502688.tif 000038
【０１５８】
【表３５】
2008502688.tif 000039
【０１５９】
【表３６】
2008502688.tif 000040
【表３７】
2008502688.tif 000041
【０１６０】
標準字体はホスホロチオエート結合を示し、イタリック体はホスホジエステル結合を示す。
Ｇ１＝２’−デオキシ−７−デアザグアノシン
Ｇ２＝アラビノグアノシン
Ｃ１＝１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリン
Ｘ＝グリセロールリンカー
Ｙ＝Ｃ３リンカー
【０１６１】
表４Ｆ  イムノマー構造およびヒトＰＢＭＣからのＤＣの発現（２４時間）
【表３８】
2008502688.tif 000042
【０１６２】
【表３９】
2008502688.tif 000043
【表４０】
2008502688.tif 000044
【０１６３】
標準字体はホスホロチオエート結合を示し、イタリック体はホスホジエステル結合を示す。
Ｇ１＝２’−デオキシ−７−デアザグアノシン
Ｇ２＝アラビノグアノシン
Ｃ１＝１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリン
Ｘ＝グリセロールリンカー
Ｙ＝Ｃ３リンカー
【０１６４】
例１１：Ｂ細胞増殖試験
合計１×１０５のＢ細胞／２００mｌを、本発明のイムノマー化合物の０．３、１．０、３．０、または１０．０mｇ／ｍＬの濃縮で１６時間刺激し、その後０．７５mＣｉの［３Ｈ］−チミジンでパルスし、８時間後に採取した。放射活性の取り込みを、液体シンチレーションカウンタを使用して測定した。表５は、最終濃度１．０mｇ／ｍＬでのＢ細胞増殖の平均値±ＳＤを示す。
【０１６５】
表５  ヒトＢ−細胞増殖試験におけるイムノマー構造および免疫賦活活性（２４時間）
【表４１】
2008502688.tif 000045
【表４２】
2008502688.tif 000046
【０１６６】
標準字体はホスホロチオエート結合を示し、イタリック体はホスホジエステル結合を示す。
Ｇ１＝２’−デオキシ−７−デアザグアノシン
Ｇ２＝アラビノグアノシン
Ｃ１＝１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリン
Ｘ＝グリセロールリンカー
Ｙ＝Ｃ３リンカー
【０１６７】
均等物
前述の発明は、明瞭性および理解の目的のために詳細に開示されているが、本開示を読むことにより、本発明および添付された特許請求の範囲の真の範囲から逸脱することなく、形式および詳細に関する様々な変更が可能であることが当業者により理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１Ａ】本発明の様々な態様を表した図である。
【図１Ｂ】本発明の様々な態様を表した図である。ｍおよびｎは独立して０〜１０００である。
【図２】本発明のイムノマーの線形合成のための合成スキームを示した図である。図中、ＤＭＴｒ＝４，４’−ジメトキシトリチル、ＣＥ＝シアノエチルである。
【図３】本発明のイムノマーの線形合成に好適な代表的な小分子リンカーの群を示した図である。
【図４】本発明のイムノマーのパラレル合成のための合成スキームを示した図である。図中、ＤＭＴｒ＝４，４’−ジメトキシトリチル、ＣＥ＝シアノエチルである。
【図５】本発明のイムノマーのパラレル合成に好適な代表的な小分子リンカーの群を示した図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
2008502688.tif 000049
【図３】
2008502688.tif 000050
【図４】
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【図５】
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