(57)【要約】  ５，６−ジヒドロ−３，９−ジヒドロキシインドロ［２，１−ａ−イソキノリン１２イル］［４−［２−（１−ピペリジニル）エトキシ］フェニル］−メタノン及びアルゾキシフェンを含む或る種の化合物は、多発性硬化症患者の乏突起膠細胞及び神経細胞を保護するために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多発性硬化症を有する患者に、５，６−ジヒドロ−３，９−ジヒドロキシインドロ［２，１−ａ−イソキノリン１２イル］［４−［２−（１−ピペリジニル）エトキシ］フェニル］−メタノン及びアルゾキシフェン、その異性体、ラセミ体及びエナンチオマー、並びに薬学的に許容される該化合物の塩から成る群から選択される化合物の治療的有効量を投与することを含む患者の神経細胞又は乏突起膠細胞を保護することにより多発性硬化症患者を治療する方法。
【請求項２】
有効量が日毎で投与され、そして約０.００１から約１００ｍｇ／ｋｇ患者体重／日の範囲である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多発性硬化症の治療法に関する。特に、本発明は、本明細書に開示された或る種の化合物、それらの異性体、ラセミ体、エナンチオマー、それらの塩及びそれらを含有する医薬を用いる、多発性硬化症患者の神経細胞及び／又は乏突起膠細胞の保護に関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性硬化症（ＭＳ）は、ＣＮＳ（中枢神経系）ミエリンの脱落、乏突起膠細胞死及び軸索破壊を起こす自己免疫疾患の一つであり、重篤な機能障害を引き起こす。ＭＳは、男性よりも２〜３倍高い発生率で女性に起こり（Duquette, et al., 1992. Can. J. Neurol. Sci. 19: 466-71）、エストロゲンは妊娠第二及び第三の３ヶ月期の間疾病重症度を軽減させるが（Confavreux et al., 1998. N Eng J Med 339: 285-291）、ＭＳの臨床症状は分娩後に悪化することが報告されている（Evron et al., 1984. Am. J. Reprod. Immunol. 5: 109-113; Mertin and Rumjanek 1985. J. Neurol Sci. 68: 15-24; Grossman, 1989. J. Steroid Biochem. 34: 241-245; Confavreux et al., 1998. N. Engl. J. Med. 339: 285-291）。エストリオールによる治療はガドリニウム増強病変及びＭＲＩ体積を減少させる（Voskuhl and Palaszynski, 2001. Neuroscientist. 7(3): 258-270; Sicotte et al., 2002. Ann Neurol. 52: 421-428）。更にエストロゲンは、げっ歯類のＥＡＥ（実験的アレルギー性脳脊髄炎）において、免疫応答の変化、臨床症状の改善及びミエリン形成の増強をもたらす（Curry and Heim 1966. Nature 81: 1263-1272; Kim et al., 1999. Neurology. 52: 1230-1238; Ito et al., 2002. Clin Immunol. 102(3): 275-282）。エストロゲンは、細胞毒誘導の細胞死から乏突起膠細胞を保護することが報告されており（Takao et al., 2004. J Neurochem. 89: 660-673）、１７β−エストラジオール（Ｅ２）は多数の乏突起膠細胞の精密な相互接続過程を加速させることが報告されている（Zhang et al., 2004. J Neurochem 89: 674-684）。
【０００３】
エストロゲンは、細胞生存、軸索萌芽、再生反応、シナプス伝達及びニューロン新生の増強によって、変性疾患及び傷害に応答して直接的に保護する役割を果たすという証拠が増加している。ＣＮＳにおいてエストロゲン合成の増加及び障害部位におけるエストロゲン受容体発現の増強があり（Garcia-Segura et al., 2001. Prog. in Neurobiol. 63: 29-60）、エストロゲン介在の細胞保護は、β−アミロイドの細胞毒性、興奮毒性及び酸化的ストレスを含む神経変性の多くのインビトロモデルで示されている（Behl et al., 1995.  Biochem. Biophys. Res. Commun. 216,473-482; Goodman et al., 1996. J. Neurochem. 66: 1836-1844; Green et al., 1997. J. Neurosci. 17: 511-515; Behl et al., 1999. Trends Pharmacol. Sci. 20: 441-444）。最近の臨床研究では、エストロゲン補充療法もまた、アルツハイマー病及び統合失調症の危険性を軽減させ発症及び進行を遅延させることができることを示唆している（概説として、Garcia-Segura et al., 2001. Prog. in Neurobiol. 63: 29-60参照）。Ｅ２は、血液脳関門を通過する脂溶性ホルモンであり、覚醒、注意、心的状態及び認知を助成して脳システムを保持する（Lee and McEwan, 2001. Annu. Rev. Pharmacol. & Toxicol. 41: 569-591）。更に、天然のエストロゲン及びタモキシフェンのような合成の選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭ）は、両者共に虚血性脳梗塞によって生じる神経損傷を軽減し、更にＥ２又はラロキシフェンのどちらかは、１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン誘導の毒性に対してニューロンを保護する（Callier, et al., 2001. Synapse 41: 131-138; Dhandapani and Brann, 2003. Endocrine 21: 59-66）。
【０００４】
エストロゲンの神経保護効果は、ｂｃｌ−２発現の調節、ｃＡＭＰ及び分裂促進因子活性化キナーゼ情報伝達経路の活性化、細胞内カルシウム恒常性の調節、抗酸化剤活性の強化及び／又はホルモン制御の転写因子として作用し得る、エストロゲン受容体（ＥＲ）の活性化を通して仲介される（Mangelsdorf, et al., 1995. Cell 83: 835-839; Katzenellenbogen, et al., 1996. Mol. Endocrinol. 10: 119-131; Singer et al., 1996. Neurosci. Lett. 212: 13-16; Singer et al., 1998. Neuroreport 9: 2565-2568; Singer et al., 1999. Neurosci. Lett. 212: 13-16; Weaver et al., 1997. .  Brain Res. 761: 338-341; Watters and Dorsa, 1998. J. Neurosci. 18: 6672-6680; Singh et al., 1999. J. Neurosci. 19: 1179-1188; Alkayed et al., 2001. J. Neurosci. 21: 7543-7550; Garcia-Segura et al., 2001. Prog. in Neurobiol. 63: 29-60）。特性が明らかにされた２つのエストロゲン受容体のＥＲα及びＥＲβは、核内転写因子として機能するクラスＩホルモン受容体ファミリーに属する。ＥＲα及びＥＲβ（ｍＲＮＡ又はタンパク質の形態）は、末梢神経系のミエリン形成細胞であるシュワン細胞、並びにＣＮＳの神経細胞である星状細胞及び乏突起膠細胞を含む神経系細胞型で発現する（Miranda and Toran-Allerand, 1992; Santagati, et al., 1994; Kuiper, et al., 1996; Mosselman, et al., 1996; Thi et al. 1998; Platania, et al., 2003）。ＣＮＳのミエリン形成細胞でありＭＳで失われる乏突起膠細胞において、ＥＲαは核内に存在すると報告されているのに対し、ＥＲβは細胞質性で、生体内免疫反応性であり、細胞質及びミエリン鞘中に容易に検出できる（Zhang et al., 2004. J Neurochem 89: 674-684）。最近、Arvanitisらは、分離したＣＮＳミエリン、脊髄及び脳切片のミエリン鞘、並びに乏突起膠細胞の原形質膜のＥＲβに類似したＥＲを報告している（Arvanitis at al., 2004. J Neurosci Res. 75: 603-613）。
【０００５】
ＥＲβのリガンドである小分子又は古典的なＥＲα以外の部位でエストロゲン効果を選択的に模倣する化合物を用いることによって、ＭＳにおけるエストロゲンの有益な効果を模倣及び／又は増強させることは、小分子がＥＲαが介在するエストロゲンの厄介な「ホルモン性の」作用を持たないという点において、ＭＳの治療に有利になると思われる。これら他のＥＲ部位には、最近確認された、神経細胞に存在が確認されており発生学的に調節されているＥＲ−Ｘ（Toran-Allerand 2004. Endocrinology 145:1069-1074）、又は細胞表面情報伝達を遺伝子転写と統合させる種々の経路をエストロゲンに始動させる、ＧＰＲ３０が含まれる（Kanda and Watanabe 2003. J Invest Derm 121: 771-780）。
【０００６】
これらの化合物は同様に、シャルコー・マリー・ツース病、ペリツェウス・メルツバッハー病、脳脊髄炎、視神経脊髄炎、副腎白質ジストロフィー、ギラン・バレー症候群及び脊髄損傷、神経障害並びに神経損傷を含めたミエリン形成グリア細胞（乏突起膠細胞又はシュワン細胞）が損傷を受ける疾患を含めた他の脱髄疾患の治療又は予防に使うことができる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
５，６−ジヒドロ−３，９−ジヒドロキシインドロ［２，１−ａ］−イソキノリン−１２−イル）［４−［２−（１−ピペリジニル）エトキシ］フェニル］−メタノン及びアルゾキシフェンを含む或る種の化合物は、多発性硬化症患者の乏突起膠細胞及び神経細胞を保護するために有用である。
【０００８】
本発明は、また、前述の化合物の無機又は有機酸との付加塩に関する。
【０００９】
１つ又はそれ以上の不斉中心を含有する化合物は、異性体の形態を有し;それらの異性体及び混合物は本発明の一部を形成する。それらの化合物のラセミ体及びエナンチオマーもまた、本発明の一部を形成する。
【００１０】
本発明で使われる用語は、本明細書で定義された意味を有する。
ａ）「薬学的に許容される塩」は、本発明の化合物で作ることが可能な酸付加塩又は塩基付加塩の何れをも意味する。
【００１１】
「薬学的に許容される酸付加塩」は、式Ｉで示される塩基性化合物の、非毒性の有機酸又は無機酸の付加塩である。好適な塩を形成する無機酸の具体例として、塩酸、臭化水素酸、硫酸及びリン酸、並びに第二リン酸ナトリウム及び硫酸水素カリウムなどの酸金属塩が挙げられる。好適な塩を形成する有機酸の具体例として、モノカルボン酸、ジカルボン酸及びトリカルボン酸が挙げられる。その様な酸の実例として、例えば、酢酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタール酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、桂皮酸、サリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、ｐ−トルエンスルホン酸及びメタンスルホン酸、並びに２−ヒドロキシエタンスルホン酸などのスルホン酸類がある。一酸塩又は二酸塩の何れでも形成させることができ、それらの塩は水和物の形態又は実質的に無水物の何れの形態でも存在し得る。一般的には、これらの化合物の酸付加塩は、遊離塩基の形態と比較して、水及び種々の親水性有機溶媒に対する溶解性が高く、概してより高い融点を示す。
【００１２】
「薬学的に許容される塩基付加塩」は、式Ｉで示される化合物の、非毒性の有機塩基又は無機塩基の付加塩を意味する。その例には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム又は水酸化バリウムなどのアルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物；アンモニア、並びにメチルアミン、トリメチルアミン及びピコリンのような脂肪族、脂環式又は芳香族アミンがある。エステルが加水分解されないように適切な塩の選択が重要となる。適切な塩の選択基準は、当業者には知られている。
【００１３】
ｂ）「患者」とは、例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、モルモット及びヒトのような霊長類などの温血動物を意味する。
【００１４】
ｃ）「治療する」又は「治療すること」とは、症状を緩和させること、一時的に若しくは恒久的にのいずれかで症状の原因を除去すること、又は発症及び特定した障害若しくは状態の進展を予防若しくは遅らせることを含むが、しかしこれらに限定されない、いずれの処置をも意味する。
【００１５】
ｄ）「治療的有効量」とは、特定の障害又は状態を治療する上で効果的な化合物の量を意味する。
【００１６】
ｅ）「薬学的に許容される担体」とは、医薬組成物、即ち患者に投与できる剤形の形成を可能にするために本発明の化合物と混合する、非毒性の溶媒、分散剤、賦形剤、補助剤又は他の物質である。その様な担体の一例は、通常、非経口投与に使われる薬学的に許容されるオイルである。
【００１７】
ｆ）「立体異性体」とは、空間的に原子の配向性だけが異なる個々の分子の全ての異性体を指す一般用語である。それには、鏡像異性体（エナンチオマー）、幾何（シス／トランス）異性体、及び互いに鏡像関係でない２つ以上の不斉中心を持つ化合物の異性体が含まれる。
【００１８】
上記の状態に罹患した患者の治療において、選択された化合物は、化合物の治療的有効量を生物的な利用を可能にするいかなる形態、又は経口的、舌下的、口腔的、皮下的、筋肉内的、静脈内的、経皮的、鼻腔内的、直腸的、局所的などを含むいかなる方法でも投与することができる。製剤技術の当業者は、治療しようとする状態又は障害のために選択された化合物の固有の性質、病期、患者の状態及び他の関連する状況に応じて、適正な形態及び投与方法を決定することができる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences,
18th Edition, Mack Publishing Co. (1990)を参照。この文献は、参照により本明細書に組み入れられる。
【００１９】
本発明の組成物は、例えば、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、液剤、シロップ剤、カシェ剤、チューインガム剤などの形態で経口的に投与することができ、１つ又はそれ以上の以下の補助剤：微結晶セルロース、トラガントゴム又はゼラチンなどの結合剤；澱粉又は乳糖などの賦形剤、アルギン酸、プリモゲル（Primogel）、コーンスターチなどのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム又はステロテックス（Sterotex）などの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；及びショ糖又はサッカリンなどの甘味料が加えられ、又はペパーミント、サリチル酸メチル又はオレンジ香料などの着香料を含むことができる。投薬単位形態がカプセルの場合、上記の種類の物質の他にポリエチレングリコール又は脂肪油のような液状担体を含んでも良い。他の投薬単位形態では、投薬単位の物理的形態を修飾する、例えば被覆剤のような他の種々の物質を含んでも良い。従って、錠剤又は丸剤は、糖、シェラック又はその他腸溶性の被覆剤でコーティングしてもよい。シロップは、本化合物の他に、甘味料としてのショ糖及び或る種の保存剤、染料及び着色剤並びに着香料を含んでも良い。
【００２０】
本発明の化合物は、また、局所的に投与することができ、その場合、担体は、好適には、溶液、軟膏又はゲル基剤が含んで良い。基剤には、例えば、１つ又はそれ以上のワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、蜜蝋、鉱油、水及びアルコールのような稀釈剤、並びに乳化剤及び安定剤が含んで良い。
【００２１】
液剤又は懸濁剤は、同様に、１つ又はそれ以上の以下の補助剤：注射用水、食塩溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒のような滅菌稀釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩のような緩衝剤、及び塩化ナトリウム又はブドウ糖のような等張性を調整する薬剤を含んでもよい。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器又は反復投与バイアルに封入することができる。
【００２２】
本発明の化合物が治療的作用の能力を示す用量範囲は、特定の化合物、状態の重症度、患者、製剤、患者が罹っている潜在的な他の疾患の状態、及び同時に患者に投与される他の薬物によって変化し得る。一般に、式Ｉの化合物は、約０.００１ｍｇ／ｋｇ患者体重／日から約１００ｍｇ／ｋｇ患者体重／日の間の用量で治療的活性を示す。
【００２３】
本明細書で考察した全ての刊行物及び特許の内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００２４】
神経保護作用アッセイ
ヒト神経芽細胞腫細胞株由来の細胞、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸及び炭酸水素ナトリウムを含むＥＭＥＭ（Earleの塩類を含むEagleの最小必須培地）中で、ポリ−Ｄ−リジンをコーティングしたCoster Biocoat 96-wellプレートに、ウェル当たり５０,０００細胞を塗布した。細胞は、５％ＣＯ2下、３７℃のインキュベーターで１晩増殖させた。次の日、培地を除去し、新鮮な培地と置き換えた。細胞をＳＥＲＭで１時間前処理し、ＳＩＮ−１（３−モルホリノシドノンイミン、ペルオキシ亜硝酸を生成）を最終濃度が２ｍＭ又は１０ｍＭになるように添加した。２４時間後、培地を除去し、Promega cytotox 96 kit (カタログ番号：G1780)を用いてＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）活性をアッセイした。結果は、ＳＩＮ−１の毒性に対するパーセント保護として計算した。
【００２５】
ＦＲＫ１／２のウェスタンブロッティング
ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸及び炭酸水素ナトリウムを含む２ｍＬのＥＭＥＭ中で、６ウェルのポリスチレン培養プレートに、ウェル当たり２×１０6細胞を塗布した。細胞を、５％ＣＯ2下、３７℃のインキュベーターで１晩増殖させた。
【００２６】
次の日、２００μＬの培地を除去し、最大で最終濃度の１０倍にした化合物を含む培地２００μＬを細胞に投与した。適切な時間インキュベートした後、培地を吸引除去し、細胞を冷したＰＢＳで２回洗浄した。次に細胞を、プロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤を含む１００μＬのＲＩＰＡバッファーで溶解させた。
【００２７】
ウェスタンブロッティングのために、２０μｇのタンパク質を、β−メルカプトエタノールを含むLaemmliサンプルバッファー中９５℃で変性させ、次に４〜２０％勾配Ｔｒｉｓ・グリシン・ＳＤＳゲル上にロードし、７０ボルトで完結するまで電気泳動した。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、適切な抗体を用いてホスホ−ＥＲＫ１／２及び全ＥＲＫ１／２を調べた。バンドはＥＣＬウェスタンブロッティング化学発光基質を使って検出した。ホスホ−ＥＲＫのＥＬＩＳＡには、Assay Designs社のＥＬＩＳＡキットを使用した。
【００２８】
Ｂｃｌ−２ルシフェラーゼ
ＳＫ−Ｎ−ＭＣ Ｂｃｌ−２（ｎｅｏ）クローン２１８を、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、炭酸水素ナトリウム及び２００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含むフェノールレッド不含ＥＭＥＭ中で、Packard Viewプレートに、ウェル当たり２５,０００細胞を塗布した。細胞を、５％ＣＯ2下、３７℃のインキュベーターで１晩増殖させた。
【００２９】
２日目に、培地を除去し、ＩＴＳサプリメント（BD Biosciences # 35 4352）を含む無血清ＥＭＥＭに置き換えた。培地を３日及び４日目に再度交換し；４日目に、最終液量が１００μＬ中で、細胞に化合物を投与した。投与後２４時間に、１００μＬのSteadyGlo(Promega # E2510)を添加し、Packard Topcount液体シンチレーション・カウンターでルシフェラーゼを測定した。
【００３０】
乏突起膠細胞毒性アッセイ
初代ラット乏突起膠細胞前駆細胞は、産後２〜３日齢ラット（Sprague Dawley）の大脳から得た。髄膜を除去し、組織を機械的に解離させた。細胞をＴ７５フラスコに塗布し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで培養した。
【００３１】
富化したＯＬＰを、星状細胞の単層から機械的に分離して集め、細胞分裂促進因子であるＰＤＧＦ−ＡＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）を補足した無血清培地（ＳＦＭ）に拡張した。
【００３２】
成熟乏突起膠細胞にするために、塗布後２４時間の前駆細胞をＩＧＦ−１（１０ｎｇ／ｍＬ）を補足したＳＦＭに切り替え、実験的アッセイの前に、細胞をこの条件で７日間増殖させた。
【００３３】
細胞を、ウェル当たり１０,０００個で９６ウェル・プレートに塗布した。培地を新鮮な培地に交換し、細胞を化合物で１時間前処理した。毒素を、次のような最終濃度になるように添加した：
Ｓｉｎ−１：  １０ｍＭ；
ピロガロール：  ５００μＭ；
Ｃ２セラミド：  １００μＭ；
カンプトテシン：  １０μＭ。
【００３４】
２４時間後、培地を除去し、Promega cytotox 96 kit (カタログ番号：G1780)を用いてＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）活性をアッセイした。結果は、毒素誘導の毒性に対するパーセント保護として計算した。
【００３５】
ＳＩＮ−１（３−モルホリノ−シドノンイミン、ペルオキシ亜硝酸を生成）、Ｃ２セラミド、カンプトテシン、スタウロスポリン、ＳＮＡＰ（Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン、酸化窒素を生成）及びピロガロール（スーパーオキシド・アニオンを生成）のような毒性薬剤で起こる細胞死に対して、これらの化合物の神経保護作用の有効性を評価した。インビトロで評価した標的細胞は、ヒト神経芽細胞腫の細胞株（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）、並びにげっ歯類乏突起膠細胞前駆細胞の初代培養及び対応するその成熟細胞である。これらの化合物による保護を、１７−β−エストラジオール及びタモキシフェンと比較した（下の表１を参照）。この神経保護作用のメカニズムは、古典的な核（ゲノム）のＥＲα又はβを用い、ＭＡＰＫ ｐ４０／ｐ４２（ＥＲＫ１／２）のリン酸化に対する役割を評価することにより検討した。
【００３６】
結果
【表１】
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【００３７】
試験した両化合物は、神経細胞及び乏突起膠細胞を保護する様に思われる。これは、ＭＥＫ阻害剤でありＥＲＫ経路に特異的であるＵ−Ｏ１２６の神経保護阻害によって確認される、ＥＲＫ１／２リン酸化の上方制御によって媒介される様に思われる。
【国際調査報告】
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