(57)【要約】  「ドルーゼン」として知られる細胞外沈着物は加齢のプロセスと共に眼の中に蓄積する。本発明は、ヒトまたは動物被験体でのドルーゼンもしくはドルーゼン類似沈着物の形成および／もしくは生合成を阻害するための、あるいはドルーゼンもしくはドルーゼン類似沈着物に関連した疾患または障害を予防または治療するための方法を提供する。
2008527005.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトもしくは動物被験体におけるドルーゼンもしくはドルーゼン類似沈着物の形成および／もしくは生合成を阻害する、または低下させるための、あるいはドルーゼンもしくはドルーゼン類似沈着物と関連する疾患もしくは障害を予防もしくは治療するための方法であって：
（Ａ）少なくとも１種類の
ｉ）ドルーゼンもしくはドルーゼン類似沈着物の形成もしくは生合成に関与する集合体の立体構造エピトープ；および
ｉｉ）ドルーゼンもしくはドルーゼン類似沈着物の形成もしくは生合成に関与する集合体の立体構造エピトープに結合する抗体：
を含む組成物を治療有効量で被験体に投与する工程を含む方法。
【請求項２】
工程Ａが立体構造エピトープに対する免疫反応を誘導することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程Ａで投与される組成物がペプチドを含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ペプチドが立体構造的に束縛されている、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、およびそれらの組み合わせから成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ペプチドが配列番号１を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
工程Ａで投与される組成物が、マウスまたはその他哺乳動物を、チオエステル結合を介して金コロイドに共有結合したアミロイドＡβから成る立体構造的に束縛された抗原で免疫感作して作られたモノクローナル抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
組成物が表面上にあり、それによってドルーゼンまたはドルーゼン類似沈着物の形成または生合成に関与する集合体の立体構造依存的エピトープに対応した形に組成物を立体構造的に束縛する、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
表面がフィルム、粒子、またはシートの表面を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
表面がタンパク質を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
タンパク質がベータプリーツシートを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
エピトープが表面に結合している、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
エピトープが表面に化学的に結合している、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
化学結合が共有結合である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
表面が、金、亜鉛、カドミウム、スズ、チタン、銀、セレニウム、ガリウム、インジウム、ヒ素、ケイ素、それらの混合物、およびそれらの組み合わせから成る群より選択される物質を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
表面が金粒子上にある、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
表面がコロイド検濁液中の金粒子上にある、請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
集合体が線維形成前集合体であり、約１０ｋＤａ〜約１００，０００，０００ｋＤａの範囲の分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
集合体が２〜２０個のサブユニットを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
集合体が５個のサブユニットを含む線維形成前集合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
集合体が８個のサブユニットを含む線維形成前集合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
アミロイドペプチドモノマーがエピトープを実質的に持たない、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
患者にドルーゼンまたはドルーゼン類似沈着物が観察され、方法を実行してドルーゼンまたはドルーゼン類似沈着物に関連する疾患の発生または病因を予防または阻止する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
疾患が脈絡網膜障害である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
疾患が黄斑変性である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
疾患が加齢に関係する黄斑変性である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
疾患が先天性停在性夜盲症である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
疾患がＩＩ型膜増殖性糸球体腎炎である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
疾患が弾性線維症である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
疾患が神経変性性疾患である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
疾患がアルツハイマー病である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
工程Ａで投与される組成物がモノクローナル抗体を含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
工程Ａで投与される組成物がポリクローナル抗体を含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
工程Ａで投与される組成物が、ドルーゼンまたはドルーゼン類似沈着物の形成または生合成に関与するＡβおよび／またはその他アミロイドのオリゴマー立体構造によって都合よく提示された立体構造依存的エピトープに結合する単離された抗体を含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
抗体がドルーゼンまたはドルーゼン類似沈着物の形成または生合成に関与する毒性オリゴマーの毒性の低下に有効である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
毒性オリゴマーが約１０ｋＤａ〜約１００，０００，０００ｋＤａの範囲内の分子量を有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ヒトまたは動物被験体の体内へのアミロイド病変またはアミロイド物質の形成を特徴とする疾患または障害を診断する方法であって、
Ａ）関心対象のアミロイド病変もしくはアミロイド物質中に存在するか、またはその生合成もしくは形成に関与する標的オリゴマーに結合する標識抗体を準備する工程；
Ｂ）標識抗体を被験体に、それが前記オリゴマーに結合するように投与する工程；および
Ｃ）標識抗体が蓄積した被験体体内の位置を同定および／またはマッピングおよび／または定量化する工程、を含む方法。
【請求項３８】
関心対象のアミロイド病変またはアミロイド物質がドルーゼンを含み、且つ工程Ｃが、標識抗体が蓄積した眼内の位置を同定および／またはマッピングおよび／または定量化することを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
工程Ｃが蛍光プローブ標識抗体を投与した後に蛍光血管造影法を実施する工程を含む、請求項３７または３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
ドルーゼンまたはドルーゼン類似沈着物内に存在するか、またはそれらの形成もしくは生合成に関与する標的オリゴマーに結合し、且つ請求項３７または３８に記載の方法の実施に使用可能な標識抗体。
【請求項４１】
アミロイド含有病変またはアミロイド含有物質が形成されるか、または今後形成される可能性のある、ヒトまたは動物被験体体内の場所に治療薬または診断薬を送り込むための方法であって、
Ａ）関心対象のアミロイド病変もしくはアミロイド物質内に存在するか、またはこれらの生合成もしくは形成に関与する標的オリゴマーに結合する抗体を準備する工程；
Ｂ）前記抗体を治療薬または診断薬に架橋またはその他方法で結合し、抗体／薬剤組成物を形成する工程；
Ｃ）前記抗体／薬剤組成物を、抗体／薬剤組成物が被験体体内の標的オリゴマーに結合するように被験体に投与する工程、を含む方法。
【請求項４２】
関心対象のアミロイド病変または物質がドルーゼンを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
関心対象のアミロイド病変またはアミロイド物質が、アルツハイマー病および／またはその他アミロイド脳症に関連する脳病変、斑、交錯物、線維、および／または線維形成前集合体を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
ヒトもしくは動物被験体でのドルーゼンもしくはドルーゼン類似沈着物の形成および／もしくは生合成を阻害するための、またはドルーゼンもしくはドルーゼン類似沈着物を低下させるため方法であって：
Ａ）被験体に、アミロイドベータ由来拡散可能リガンド（ＡＤＤＬ）またはアミロイドベータ由来拡散可能リガンド（ＡＤＤＬ）に結合する抗体を含む組成物を治療有効量で投与する工程、を含む方法。
【請求項４５】
ヒトもしくは動物被験体でのドルーゼンもしくはドルーゼン類似沈着物の形成および／もしくは生合成を阻害するための、またはドルーゼンもしくはドルーゼン類似沈着物を低下させるため方法であって：
Ａ）被験体に、ｉ）アミロイドＡβの残基１〜１７内にあるエピトープに結合する抗体、および／またはｉｉ）アミロイドＡ−ベータの免疫原断片を含むポリペプチド、および／またはｉｉｉ）アミロイドＡβの形成を阻害するその他組成物を含む組成物を治療有効量で投与する工程、を含む方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法の実施に使用可能な抗体／薬物の組み合わせ。
【請求項４７】
薬物がヒト化抗体を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
薬物がヒト化マウス抗体を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
薬物がヒト化ウサギ抗体を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
組成物が、チオエステル結合を介して金コロイドに共有結合したアミロイドＡβから成る立体構造的に束縛された抗原で免疫感作し、且つ抗体をヒト化することによって作製したモノクローナル抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
薬物が眼の中に直接送り込まれる、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
薬物が眼の中に注入される、請求５１に記載の方法。
【請求項５３】
ａ）ドルーゼンもしくはドルーゼン類似沈着物の形成および／もしくは生合成に関与する集合体の立体構造エピトープ、ならびに／あるいはｂ）ドルーゼンもしくはドルーゼン類似沈着物の形成および／もしくは生合成に関与する集合体の立体構造エピトープに結合する抗体、ならびに／あるいはｃ）アミロイドベータ由来拡散可能リガンド（ＡＤＤＬ）を含む組成物、ならびに／あるいはアミロイドベータ由来拡散可能リガンド（ＡＤＤＬ）に結合する抗体を含む組成物の、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法を実施するためにヒトまたは動物患者に投与される調製物の製造への使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、２００５年１月１４日出願の米国仮特許出願第６０／６４４，３８０号の優先権を主張し、その全体が参照によって明示的に本願に組み入れられる。
本出願はまた、ａ）２００２年９月１２日出願の米国仮特許出願第６０／４１０，０６９号の優先権を主張する２００３年９月１２日に出願のＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００３／２８８２９号の３７１条国内ステップ出願である、２００５年３月１１日出願の係属中米国特許出願第１０／５２７，６７８号、およびｂ）２００３年９月１２日出願の米国仮出願第６０／５０２，３２６号の優先権を主張する２００４年９月１２日出願の係属中の米国ＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２９９４６号の一部継続出願であり、このような関連出願は全て参照によってそっくりそのまま明示的に本願に組み入れられる。
【０００２】
本発明は概して医学治療のための組成物および方法に関する。より具体的には、本発明はドルーゼンもしくはドルーゼン類似物の沈着を阻害するための、および／またはドルーゼンもしくはドルーゼン類似物の沈着に関連する疾患を治療するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
異常な折りたたみ構造の集合したタンパク質から成る不溶性の細胞外沈着物の形成は、多くの神経変性疾患の顕著な特徴である。特にタンパク質の異常な折りたたみ構造、および集合はアルツハイマー病およびパーキンソン病のような多くのアミロイド疾患の病因の基礎を成しており、それによって可溶性タンパク質モノマーが線維形成前オリゴマーに変換してタンパク質の誤った折りたたみのステップ的なプロセスが始まり、不溶性のアミロイド線維へと進行していくと考えられている。
【０００４】
「ドルーゼン」として知られる細胞外沈着物は、加齢に伴いヒトの眼の中に蓄積することが知られている。ドルーゼンは検眼鏡検査により直接観察可能であり、相対サイズ、量、および形状に基づいて軟性ドルーゼンまたは硬性ドルーゼンのいずれかに分類可能である。ドルーゼンは、典型的には網膜色素上皮（ＲＰＥ）の基底膜およびブルッフ膜の内側コラーゲンの直下に形成される。黄斑内のドルーゼンの過剰域または融合域は、老化随伴性の黄斑変性症（ＡＭＤ）のような脈絡網膜障害の発生に関連する。
【０００５】
ドルーゼンは複数の免疫調整物質を含有していることが示されている。老化随伴性の黄斑変性の病理発生では、ドルーゼンの形成は黄斑上または付近での一連の局所的な炎症事象から起こると信じられている。いくつかの態様では、これらの局所的な炎症事象はアルツハイマー病の発生に関係するとされる脳組織内の局所的炎症事象に類似している。
【０００６】
最近のドルーゼンの特徴分析は、アミロイド沈着物と共通のタンパク質成分を明らかにした。しかしながらドルーゼンについて特徴的なアミロイド線維はまだ見つかっていない。アミロイド疾患では非線維性のオリゴマーが共通点であるという仮説が立てられている。異なるアミロイド性タンパク質とペプチドから成るオリゴマーは、最近開発された、共通構造を認識すると考えられる抗体によって検出可能である。重要なことは、オリゴマーが細胞毒性を示すことであり、このことはそれらが神経変性疾患の病因において何らかの役割を果たしていることを示唆する。
【０００７】
アミロイドベータ（Ａベータ、またはＡβ）はアルツハイマー病の病因に重要な役割を果たしているペプチドであり、「アミロイド小胞」として知られるドルーゼンの下部構造である小胞の構成要素中に存在することも分かっている。このことから、Ａβの沈着が網膜色素上皮の萎縮、ドルーゼン生合成、およびＡＭＤのような脈絡網膜障害、ならびにアルツハイマー病に関与する局所的炎症事象で重要な役割を果たしているという学説がたてられている。
【０００８】
ドルーゼン、またはドルーゼン類似の沈着物質は別の障害とも関連しているだろう。例えば現在の証拠は、ドルーゼンの存在と弾性線維症の発症との間に相関性があることを示唆している。弾性線維症は、皮膚内の弾性線維が過剰に形成される、および／または再配置する一群の状態を表すのに用いられる用語である。長い間太陽に曝されてきた皮膚は弾性線維症の兆候を示すことが予想されるが、太陽から保護されてきた体部領域の皮膚での弾性傷害の存在は血管新生ＡＭＤの発生と相関することが示されている。
【０００９】
ドルーゼン類似沈着物は特定の腎臓疾患の病理発生にも関与している。膜増殖性のＩＩ型腎炎として知られる腎臓障害を患う患者の亜群では、腎臓基底膜近く（および脾臓のような幾つかの腎臓外の部位）に無定形の高電子密度沈着物が見出されている。これらの沈着物を形成する患者は、「高密度沈着物疾患」に罹病していると言われる。これらの沈着物はドルーゼンに類似しており、高密度沈着物疾患の患者は、ＡＭＤを高頻度で発症する。腎臓の高密度沈着物はコンゴーレッドでは染まらず、β−プリーツ線維成分を欠いている。それ故にそれらはアミロイドと別のものである。しかしながらドルーゼンと同様に、高密度腎臓沈着物はビトロネクチン、免疫グロブリン、および補体Ｃ５に対する抗体と免疫反応性である。まとめると、これらのデータは高密度沈着物が組成的にはドルーゼンと同一ではないものの、類似していることを示唆している。
【００１０】
また、特発生心筋症に見られる透明な沈着物は、線維ではなくオリゴマーが蓄積する傾向を示すという意味でドルーゼンに類似している。このことはまた、眼のレンズ白内障についても言える。
【００１１】
最近のデータはまた、ドルーゼンがアテローム性動脈硬化症に関係する可能性も示唆している。これに関連して、ドルーゼンは、脂質、ビトロネクチン、アポリポタンパク質Ｅ、カルシウム、および補体成分を含むアテローム斑にも含まれている多数の構成要素を含有している。また、頸動脈でのアテローム性動脈硬化の発生と進行したＡＭＤとの間に臨床的な相関性が認められている。ドルーゼンとアテローム斑との間にはそれ以外の類似点もある。このように、少なくとも幾つかの例においては、ドルーゼンの形成とアテローム斑の形成に関与する共通の病理因子が存在するだろう。
【００１２】
ドルーゼン関連タンパク質の正確な起源はまだ分かっていない。いくつかのドルーゼン構成要素（例えばアミロイドＰ成分およびプロトロンビンのような血漿タンパク質）は、脈絡膜血管の外に出て、ＲＰＥに隣接する細胞外空間に入り、そこでそれらは１または複数の、ドルーゼン発生に関係するリガンドと結合するだろう。他のドルーゼン構成要素は、局所網膜、ＲＰＥ、および／または脈絡膜細胞から分泌されるだろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
出願者らは、特定の有毒なアミロイド類似オリゴマーがドルーゼンに含まれていることを明らかにした。本発明は、このような有毒オリゴマーを遮断または阻害することによってドルーゼン（およびおそらくは他のドルーゼン類似沈着物）の形成または生合成を阻害するための、ならびに／あるいはドルーゼンまたはドルーゼン類似物質の崩壊、分解、および／または浄化を促進するための方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明によれば、ドルーゼンの生合成、形成、および／または維持に関連する有毒アミロイド類似オリゴマーは、ヒトまたは動物被験体に、以下に記載、および組み入れられている米国特許出願第１０／５２７，６７８号明細書（これはＰＣＴ国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２８８２９号および国際公開第２００４／０２４０９０号パンフレットとして公開されたものに基づいている）に記載されている組成物を治療有効量で投与することで遮断または阻害可能である。これらの組成物は、アミロイドペプチド集合体上に存在する１種類以上の立体構造エピトープ、およびこのようなエピトープに対する抗体（例えば抗オリゴマー特異抗体）を含む。発明は更に、これら立体構造エピトープに結合する抗体だけでなく、このような抗体を作製する方法、ならびにこのような抗体を用いて疾患を検出、治療、および予防する、および／または潜在的治療法を特定（例えば薬物スクリーニング）するための方法も含む。
【００１５】
更に発明によれば、ドルーゼンの生合成、形成、および／または維持に関連する有毒アミロイド類似オリゴマーは、ヒトまたは動物被験体に、以下に記載する、および参照によって明示的に本願に組み入れられている同時係属中のＰＣＴ国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２９９４６号（国際公開第２００５／０２５５１６号パンフレットとして公開）に記載されている組成物を治療有効量で投与することで遮断または阻害可能である。これらの組成物は、アミロイド障害（例えばドルーゼン形成、老化随伴性黄斑変性等）に罹ったヒトまたは動物被験体でのアミロイド線維形成に関与する集合体またはオリゴマーの立体構造エピトープに特異的なポリクローナルおよびモノクローナル抗体（例えば抗オリゴマー特異抗体）、ならびにハイブリドーマおよびそれが産生するモノクローナル抗体を含む。また、このような抗体は、アルツハイマー病、黄斑変性、その他脈絡網膜病、およびその他様々なものに対するヒトまたは動物被験体の受動的免疫感作にも用いられる。モノクローナル抗体は、アミロイド疾患（例えば老化随伴黄斑変性）に関連する神経炎症を軽減するために、金または金含有化合物のような抗炎症剤と同時、または組み合わせて投与することができる。
【００１６】
より更には、発明により、本発明の方法を用いて、ドルーゼンの生合成または形成に関係しているアミロイドオリゴマーを無害化する抗オリゴマー特異的抗体をヒトまたは動物被験体に投与することによって、ドルーゼンおよび／またはドルーゼン関連障害に対し受動的免疫感作を行うこともできる。あるいは、本発明の方法を用いて、ドルーゼンの生合成または形成に関係する有毒アミロイドオリゴマーを排出させる抗オリゴマー特異的抗体の形成をもたらす特異抗原をヒトまたは動物被験体に投与することによって、能動的免疫感作を行うことができる。以下に記載し、且つ親出願の第１０／５２７，６７８号（ＰＣＴ国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２８８２９号に基づき、ＷＯ２００４／０２４０９０として公開されている）に記載されているこれらの抗原は、アミロイドオリゴマーを特異的に認識する立体構造依存的抗体の産生をもたらす特異的免疫反応を誘発する。
【００１７】
より更には、発明により、ヒトまたは動物被験体でのドルーゼンまたはドルーゼン類似沈着物の形成および／もしくは生合成を阻害するための、または低下させるための、あるいはドルーゼンまたはドルーゼン類似沈着物と関連する疾患または障害を予防または治療するための方法が提供される。このような方法は、一般的には被験者に、治療有効量の少なくとも次の１つを含む組成物を投与する工程を含む：
ｉ）ドルーゼンまたはドルーゼン類似沈着物の形成または生合成に関与する集合体の立体構造エピトープ；および
ｉｉ）ドルーゼンまたはドルーゼン類似沈着物の形成または生合成に関与する集合体の立体構造エピトープに結合する抗体。
【００１８】
発明の少なくとも幾つかの応用では、集合体は約２〜約２０個のサブユニットを含む。立体構造エピトープを被験体に投与する例では組成物はペプチドを含んでよく、少なくとも幾つかの態様に於いてはそのペプチドは下記配列番号１〜９に明記したアミノ酸配列を含んでもよい。抗体を被験者に投与する例では、抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよい。この応用のためのモノクローナル抗体は、マウスまたはその他哺乳動物を、以下記載するような立体構造的な束縛を受けている抗原を用いて免疫感作することによって作ることができる。発明の幾つかの態様では、被験体に投与される組成物は、ドルーゼンまたはドルーゼン類似沈着物の形成または生合成に関与する集合体の立体構造依存的エピトープに対応する形状に立体構造的に束縛することができる。このような立体構造的束縛は、所望の形状を有する物体の表面に組成物を結合、または会合させるような好適な方法によって達成可能である。表面はフィルム、粒子、シート、タンパク質等の上にあってもよい。幾つかの例では、組成物はβ−プリーツシートを含むタンパク質の表面に束縛されている。β−プリーツシートは、遠く離れていてもよいタンパク質鎖の二部分間に水素結合が形成されているタンパク質に存在する二次構造である。
【００１９】
より更には、発明によれば、抗オリゴマー特異的抗体をドラッグデリバリー剤として用いることができる。これに関しては、抗オリゴマー特異的抗体は、薬物またはその他治療薬に架橋または結合することができ、ドルーセンに直接、またはドルーゼン生合成またはドルーゼン形成に関係する有毒オリゴマーを狙った、薬物またはその他治療薬の送達を容易にできる。
【００２０】
より更には、発明によれば、抗オリゴマー特異的抗体は、当技術分野で周知である技術を用いて追跡可能な標識（例えば蛍光プローブ）で標識可能である。これらの標識抗体は、標識抗体がドルーゼン生合成またはドルーゼン形成に関係する有毒オリゴマーに結合するように静脈内注射またはその他の方法で投与可能である。次に蛍光血管造影または当技術分野で知られているその他好適な技術を用いて、眼の中またはその他の脈管構造の中の部位にある、この有毒オリゴマーが存在する領域を視覚化、局在化、マッピング、および／または定量化することができ、それによってドルーゼン沈着が発生しそうな、および／または既に発生している場所を決定することができる。
【００２１】
更には、発明によれば、ドルーゼンの生合成、形成、および／または維持に関連している有毒なアミロイド類似オリゴマーは、ヒトまたは動物被験体に治療有効量のアミロイドベータ由来ジスルフィドリガンド（ＡＤＤＬ）またはＡＤＤＬに結合する抗体を投与することによって遮断または阻害することができる。このような抗体およびＡＤＤＬの例は当技術分野で既知であり、参照によって本願に特に組み入れられる、公開されている米国特許出願第２００３／００６８３１６号明細書に記載されている。
【００２２】
より更には、発明によれば、ドルーゼンの生合成、形成、および／または維持に関連している有毒なアミロイド類似オリゴマーは、ヒトまたは動物被験体に、治療有効量の、アミロイドベータの残基１〜７内のエピトープおよび／またはアミロイドベータの免疫原性断片を含むポリペプチドに結合する抗体、ならびに／あるいは参照によって特に本願に組み入れられている米国特許第６，７８７，６３７号明細書；第６，７８７，１３９号明細書；第６，７８７，１３８号明細書；第６，７８７，１４３号明細書；第６，７８７，１４４号明細書；第６，７８７，１４０号明細書；第６，７８７，５２３号明細書；第６，７８７，４２７号明細書；第６，７５０，３２４号明細書、ならびに公開米国特許出願第２００４／０１７５３９４号明細書；第２００４／０１７１８１６号明細書；第２００４／０１７１８１５号明細書；第２００４／０１７０６４１号明細書；および第２００４／０１６６１１９号明細書に記載のアミロイドベータの形成を阻害するその他組成物を投与することによって遮断または阻害することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
発明の更なる態様および要素は、以下記載の詳細な説明および実施例を読むことで理解されるだろう。
定義
本願で使用される場合、次の用語は以下の意味を有するものとする。
【００２４】
用語「アジュバント」は、抗原と一緒に投与した時に抗原に対する免疫反応を高めるが、単独で投与した時には抗原に対し免疫反応を生じない化合物を指す。アジュバントは、リンパ細胞動員、Ｂおよび／またはＴ細胞の刺激、ならびにマクロファージの刺激を含む複数のメカニズムにより免疫反応を高めることができる。
【００２５】
用語「アミロイドベータ」、「Ａβ」、または「Ａベータペプチド」は、それぞれＡＤに関連している低分子可溶性オリゴマー、線維形成前集合体、原線維、およびアミロイド沈着物を含むペプチドを指す。アミロイドＡベータペプチドとしては、それぞれアミノ酸長が３９、４０、４１、４２、および４３アミノ酸であるＡ３９、Ａ４０、Ａ４１、Ａ４２、およびＡ４３が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
「アミロイドペプチド」は、アミロイドペプチド中間体、低分子可溶性オリゴマー、アミロイド線維、およびアミロイド斑を含む、アミロイド形状中に存在するペプチドである。
【００２７】
用語「抗体」は、例えば完全長の抗体（例えばＩｇＧ抗体）または抗原結合部分（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２もしくはｓｃＦｖ断片）を含むがこれらに限定されない無傷の抗体およびその結合断片を含めるのに用いられる。典型的には、断片は、それらが由来した無傷の抗体と抗原への特異的結合を巡って競合する。抗体またはその結合断片は、随意選択的に化学的に結合または発現して、他タンパク質との融合タンパク質となることができる。
【００２８】
「抗オリゴマー抗体」または「抗−オリゴマー」は、アミロイドペプチド集合体中間体とは結合するが、アミロイドペプチドモノマー、ダイマー、トリマー、またはテトラマーには特異的に結合しない抗体を指す。
【００２９】
引用の要素を１つ以上「含む」組成物または方法は、具体的に引用されていない他の要素を含んでもよい。例えば、アミロイドＡベータペプチドを含む組成物は、大型ペプチド配列の成分として、または複数の要素を含む組成物の一部として単離されたアミロイドＡベータペプチドを含んでもよい。
【００３０】
用語「エピトープ」または「抗原性決定基」は、Ｂおよび／またはＴ細胞が反応する抗原上の部位、あるいはそれに対し抗体が産生されるか、または抗体が結合する分子上の部位を指す。例えばエピトープは、エピトープを画定する抗体によって認識可能である。
【００３１】
「直線エピトープ」は、アミノ酸一次配列が認識されるエピトープを含んでいるエピトープである。直線エピトープは、典型的には固有配列を有する少なくとも３個の、より一般的には少なくとも５個の、例えば約８〜約１０個のアミノ酸を含む。
【００３２】
「立体構造エピトープ」は、直線エピトープとは対照的に、そのエピトープを含むアミノ酸の一次配列が、認識されるエピトープの成分を唯一規定するのものではないエピトープである（例えばアミノ酸の一次配列が、そのエピトープを画定している抗体による認識には必ずしも必要とされないエピトープ）。典型的には、立体構造エピトープは直線エピトープに比べ多くのアミノ酸を含む。立体構造エピトープの認識に関しては、抗体はペプチドまたはタンパク質の三次元構造を認識する。例えば、タンパク質分子が折りたたまれてある三次元構造を形成すると、立体構造エピトープを形成している特定のアミノ酸および／またはポリペプチド主鎖が隣り合うようになって、抗体はエピトープを認識することができるようになる。エピトープの立体構造を決定する方法としては、例えばｘ線結晶学２次元核磁気共鳴分光法、ならびに部位指定スピンラベリングおよび電子常磁性共鳴分光法が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、その開示が参照によってそっくりそのまま本願に組み入れられている、グレン、イー  モリス（Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．  Ｍｏｒｒｉｓ）編、「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第６６巻（１９９６）を参照。
【００３３】
「ドルーゼン類似」沈着物または「ドルーゼン類似」物質は、本願の中で参照される場合、それが、またはその生合成がオリゴマーの産生を含み、且つそのようなオリゴマーの生合成、形成、および／または維持が、アミロイドペプチド集合体上に見出される１つ以上の立体構造エピトープ、ならびに／あるいはそのようなエピトープに対する抗体（例えば抗オリゴマー特異抗体）によって遮断または阻害可能な細胞外タンパク質の沈着物である。このようなドルーゼン類似沈着物としては、ＩＩ型膜性増殖性糸球体腎炎に関連して腎臓基底膜近くにある高電子密度沈着物、および弾性線維症に関連する真皮または皮膚沈着物が挙げられるが、もとよりこれらに限定されない。
【００３４】
用語「免疫学的反応」または「免疫反応」は、レシピエントの患者において、アミロイドペプチドに対する有益な液性（抗体介在）および／または細胞性（抗原特異的Ｔ細胞またはそれらの分泌産物によって仲介される）の反応の発生に関係する。このような反応は、モノクローナル抗体の投与によって誘発される能動的な反応でも、または抗体または初回抗原刺激を受けたＴ細胞の投与によって誘発される受動的な反応でもよい。細胞性免疫反応は、クラスＩまたはクラスＩＩＭＨＣ分子と一緒にポリペプチドエピトープを提示することによって誘発されて、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞および／またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する。反応はまた単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、好塩基球、樹状細胞、星状細胞、小神経膠細胞、好酸球、または生得免疫のその他成分の活性化も含む。
【００３５】
「免疫原」は、場合によってはアジュバントと組み合わせて被験体に投与されることによって、それ自体に対する免疫反応を誘導することができる。
「単離された」とは、精製されている、実質的に精製されている、または部分的に精製されていることを意味する。「単離された」とは、自然に起こる環境以外の環境での存在も意味する。例えば、自然発生時に抗体が通常見出される全血血清中に存在しない抗体は単離された抗体である。
【００３６】
「低分子集合体」、「低分子アミロイド集合体」、「低分子オリゴマー」、および「低分子可溶性オリゴマー」は、アミロイドペプチドが４〜５以下のペプチドの集合体中に存在することを指す。一つの具体例では、低分子Ａは、ＡＤとの関連が見出された低分子可溶性オリゴマーを指す。
【００３７】
用語「患者」は、治療的、予防的、実験的、または診断的処置を受けるヒトまたは動物の被験体、あるいは自然に発生したかもしくは実験的に誘導された疾患を有するか、または疾患に罹りやすいヒトまたは動物（被験体および／もしくは実験動物モデルを含む）を含む。
【００３８】
「線維形成前集合体」、「ミセル集合体」、「高分子集合体中間体」、「高分子アミロイドペプチド集合体」、「高分子可溶性アミロイドペプチド集合体」、「アミロイドペプチド集合体」、「可溶性集合体中間体」、「アミロイドオリゴマー中間体」、「オリゴマー中間体」、および「オリゴマー集合体」もしくは簡単に「中間体」は、４つ以上の個別ペプチドまたはタンパク質モノマー、例えば５つ以上のペプチドまたはタンパク質モノマーを含む集合体を指す。最大サイズの線維形成前集合体は、線維形成を導く球状構造またはミセルおよび針状のミセルを含む。線維形成前集合体の分子量は、約１０ｋＤａ〜約１００，０００，０００ＫＤａの範囲内、例えば約１０ｋＤａ〜約１０，０００，０００または１，０００，０００ＫＤａの範囲内でよい。しかしながら、このサイズの範囲は限定的なものと解釈してはならず、線維形成前集合体は分子量の範囲によって規定されない。
【００３９】
「輪状原線維」は、３〜１０個の球状オリゴマーサブユニットが、電子または原子力顕微鏡写真で小孔として認められる中空中心を持つ輪状または環状の様式に配置されている線維形成前集合体の特別なサブセットである。
【００４０】
「原線維」は、アミロイドＡペプチドを含んで成る球状構造物を含む、曲線構造を形成する球状構造物の糸となり現れる線維形成前集合体である。
２存在物間の「特異的結合」は、少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９Ｍ−１、または１０１０Ｍ−１の親和性を意味する。特異的結合には１０８Ｍ−１より大きな親和性が好ましい。
【００４１】
用語「実質的に同一」とは、２つのペプチド配列が、例えば初期設定のギャップ加重を用いたプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴにより最適に並置された時に、少なくとも６５パーセントの配列一致率、例えば少なくとも８０パーセントもしくは９０パーセントの一致率、または少なくとも９５パーセント以上の配列一致率、例えば９９パーセント以上の配列一致率を共有することを意味する。
【００４２】
アラインメント中の同一でない残基位置は、保存的なアミノ酸置換、即ち同一分類または群の別のアミノ酸によるアミノ酸の置換によって異なることが好ましい。幾つかのアミノ酸は、次のように群分できる：群Ｉ（疎水性側鎖）：ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ：群ＩＩ（中性親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；群ＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；群ＩＶ（塩基性側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；群Ｖ（鎖の回転に影響する残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および群ＶＩ（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。非保存的置換は、これら群類の一つのメンバーを別の分類のメンバーで交換することを含んでよい。
【００４３】
配列の比較では、典型的には一つの配列を基準配列として、試験配列をこれと比較する。配列比較アルゴリズムを用いる時は、試験配列と基準配列がコンピュータに入力され、必要であればサブ配列調整をデザインし、配列アルゴリズムプログラムのパラメータをデザインする。そうすれば配列比較アルゴリズムを用いて、デザインしたプログラムパラメータに基づいて基準配列に対する試験配列の配列同一パーセントを計算することができる。配列比較の最適アラインメントは、例えばスミス＆ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ）、「Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．」第２巻、ｐ．４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、ニードルマン＆ワンチ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ）、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」第４８巻、ｐ．４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、ピアソン＆リップマン（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ）、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．」第８５巻、米国、（１９８８）ｐ．２４４４の類似法、コンピュータを使ったこれらアルゴリズムの手段（ウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウェア・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、ジェネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、マディソン科学博士（Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ）、米国ウィスコンシン州（ＷＩ）、ｐ．５７５または視覚的な検査によって実施できる。
【００４４】
配列同一パーセントまたは配列類似性の決定に好適なアルゴリズムの一つの例はＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これはアルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、ｅｔ  ａｌ．，）らの「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」第２１５巻、（１９９０）ｐ．４０３〜４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウエアは全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公的に入手可能である。一般的には初期設定のプログラムパラメータを用いて配列を比較することができるが、カスタマイズしたパラメータも使用することができる。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは初期設定値として、ワード長（Ｗ）３、予想値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用しており、例えば「Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．」、第８９巻、米国（ＵＳＡ）ｐ．１０９１５（１９８９）を参照。保存的置換は、同一分類のアミノ酸間の置換を含む。
【００４５】
「治療薬」または「治療法」は、患者の疾患の治療または予防に有用な物質である。発明の治療薬は、典型的には実質的に純粋である。このことは、薬剤が典型的には少なくとも約５０％ｗ／ｗ（重量／重量）の純度であること、ならびに治療の効力を妨害するタンパク質および汚染物が実質的に存在しないことを意味する。薬剤は少なくとも約８０％ｗ／ｗ、より好ましくは少なくとも９０％ｗ／ｗまたは約９５％ｗ／ｗの純度である。しかしながら通常のタンパク質精製技術を用いれば、９９％ｗ／ｗ以上の均一ペプチドを製造することができる。
【００４６】
ＡＭＤとドルーゼンとの相関関係
ドルーゼンの存在とＡＭＤとの間の相関関係は確立しているが、ドルーゼン形成の基本的原因ならびにＲＰＥおよび光受容体細胞変性におけるその役割については解明されていない。
【００４７】
最近の証拠は、ドルーゼン形成とＡＭＤがアルツハイマー病（ＡＤ）およびパーキンソン病（ＰＤ）のようなアミロイド疾患と類似性を持つことを示唆している。ＡＭＤと同様に、アミロイド疾患は加齢および沈着物の形成と強く相関している。更にこれらアミロイド沈着物は広範囲の脂質およびタンパク質を含んでおり、その多くはドルーゼンの中にも存在している。アミロイド沈着物とドルーゼンに共通する構成要素としては、ビンブラスチン、アミロイドＰ、アポリポタンパク質Ｅ、およびアルツハイマー病のアミロイド斑に関連しているアミロイドＡベータ（Ａβ）ペプチドのようなタンパク質が挙げられる。ヒトではＡＰＯＥ＊Ａ対立遺伝子がアルツハイマー病と強い正の関連性を示している。興味深いことに、トランスジェニックマウスでのＡＰＯＥ＊Ａ対立遺伝子の発現は、ヒトのＡＭＤに関連する病理に似た眼の変化を誘発した。これに加えてアミロイド沈着物ならびにドルーゼン中には急性期反応物質、補体成分、免疫調整因子、およびその他炎症メディエイターが存在しており、ＡＭＤおよびアミロイド疾患において炎症経路が共通の役割を果たしている可能性が示唆されている。ＡＭＤの眼だけでなく老化した眼についても、小型「硬性」ドルーゼンから大型「軟性」ドルーゼンまで様々なサイズおよび形状のドルーゼンの中に、Ｃ５、Ｃ５ｂ９、およびＣ３断片のような補体成分の存在が観察されていることは特に注目に値する。これらの観察は、補体活性化がドルーゼンの生合成に関係しているという考え方に一致する。補体因子Ｈの多形がＡＭＤのリスク因子を上昇させるという最近の発見と共に、この疾患の病因における炎症の役割に今大きな関心が集まっている。
【００４８】
上記の共通する類似性にも関わらずＡＭＤはこれまでアミロイド疾患としては分類されてこなかった。とりわけ大きな違いは、古典的なアミロイド疾患が典型的には大量のアミロイド線維を示すことである。例えばＡＤの例では、特徴となっている斑は主に線維性のアルツハイマーＡβペプチドから成るが、一方ＰＤに見られるレービー小体はα−シヌクレイン線維に富んでいる。これらアミロイド線維は、細長い、幅６〜１５ｎｍの、長さ不定の棒状構造物であり、共通の交差β構造を特徴としている。それらに関係する構造的特徴に加えて、アミロイド線維はチオフラビンＴおよびコンゴーレッド染色性といった特徴的な色特性も示す。ドルーゼンはチオフラビンＴおよびコンゴーレッドで染まるが、コンゴーレッド染色したアミロイド線維にしばしば見られる特徴的な青リンゴ色の複屈折は存在しない。ドルーゼンおよびサブＲＰＥ沈着物にはＡβペプチド、トランスサイレチン、免疫グロブリン軽鎖、およびアミロイドＡのようなアミロイドタンパク質を見出すことができるが、電子顕微鏡を使った研究は真性アミロイド線維の存在を示す証拠をほとんど示していない。これらの観察がＡＭＤを古典的なアミロイド疾患として見ることを妨げている。
【００４９】
アミロイド線維の形成は、モノマータンパク質が様々なオリゴマー型βシートを含む構造体となる立体構造の再構成を行い、最終的にアミロイド線維に変換される、タンパク質が誤って折りたたまれる多ステップの分子的カスケード事象である。様々なアミロイド疾患に関する多くの研究から、アミロイド線維ではなく線維形成前オリゴマーが主要な有毒作用物質らしいことが推測されている。この考えは、アミロイド疾患の病因としてアミロイド線維は必要ないことを証明した動物モデルによって裏付けられている。これらの結果は、顕著なアミロイド線維蓄積を示さずに病因性の線維形成前オリゴマーが存在する別の疾患が見つかる可能性を示唆している。最近の証拠は、デスミンが関係する心筋症がこのような疾患である可能性を示唆している。
【００５０】
ドルーゼン中の線維形成前アミロイドオリゴマーの存在
出願者らは、実験を行ってドルーゼン内に線維形成前アミロイドオリゴマーが存在しているか明らかにした。この疑問に答えるために、出願者らは最近開発された、線維形成前オリゴマーには結合するが、未変性もしくは線維性タンパク質には結合しない「抗オリゴマー」抗体を使用した。この抗体は当初アルツハイマーＡβペプチドに対して作られたものであるが、α−シンクレイン、島アミロイドポリペプチド、プリオンペプチド、ポリグルタミン、リソチーム、ヒトインスリン、および最近証明されたように、酵母プリオンタンパク質といった様々な他アミロイド原性タンパク質に由来する有毒オリゴマーも検出することが示されている。このことから、様々なタンパク質に由来する線維形成前アミロイドオリゴマーが共通の構造的特徴を持つことが示唆されている。重要なことは、この抗体がオリゴマー誘導毒性に対して強い保護作用も示すことであり、オリゴマーが実際に有毒種であることを示している。
【００５１】
この汎用抗アミロイドオリゴマー抗体の有用性は、免疫細胞化学研究からも確立されている。例えば、この抗体を用いてＡＤ疾患脳内に線維形成前オリゴマーが存在することが証明されている。これら有毒オリゴマーは老人斑に近接して見出されているが、その局在は線維斑の領域であることも示されており、このことはおそらくアミロイド線維沈着の初期ステップであることを示唆しているのだろう。更には、デスミン関連心筋症に関する上記の研究では、同じ抗体を免疫細胞化学研究に用いてアミロイドオリゴマーを確認している。
【００５２】
本研究では、抗オリゴマー抗体を使用することによってドルーゼンを含むドナーの眼の中に有毒なオリゴマーを検出することができたが、ドレーゼンのないコントロールの眼では検出できなかった。アミロイドオリゴマーの存在は、ＡＭＤの基礎病因がアミロイド疾患の基礎病因と関係している可能性を示唆している。
【００５３】
免疫蛍光顕微鏡は、ドルーゼンを含む眼の異なる領域にアミロイドオリゴマーの存在を示した。抗体反応性はドルーゼンの中心で最も高頻度に見られたが、本願では、蛍光シグナルは典型的にはブルッフ膜内側のコラーゲン層に近接して集中しており、明瞭な球状のサブドメインを形成している。我々がアミロイドオリゴマーコアと呼ぶこれらの構造は、ドルーゼンのサイズが変わる場合でも、サイズは大きく変動しなかった。最も小さいドルーゼン（＜２０μｍ）では、ドルーゼンの中身はアミロイドオリゴマーコアが占めていた（図１Ａおよび図１Ｂ）。大型のドルーゼンでは、コアは直径〜１５μｍを保っており、それらが「硬性」ドルーゼン（図１Ｃ〜Ｆ）の外観を持つか黄斑軟性ドルーゼン（図１ＧおよびＨ）の外観を持つかにかかわらずブルッフ膜に境を接するという同一の空間的関係を維持していた。これらのデータは、オリゴマーコアがドルーゼン生合成中の初期に起こる可能性、およびそれらが、ドルーゼンが大型化しても成長しないことを示唆している。
【００５４】
アミロイドオリゴマーコアの大きさは制限されると思われるが、ドルーゼン当たりのコアの数は変化した。特に大型のドルーゼンでは、複数のアミロイドオリゴマーコアを含むことが観察されることがあった。これはこれらのドルーゼンがより小さなドルーゼンの癒合から形成されていることを示唆している。しかしながら全てのドルーゼンがアミロイドオリゴマーコアを含むわけではない。しかし、大型のドルーゼンに対しアミロイドオリゴマーコアのサイズが小さいことを考えれば、多くのコアは断面の外にあるために検出されなかったと思われる。表１は、１９例の個人の眼より得た結果をまとめている。驚くべき事に、ドルーゼンを含む全ての眼については抗オリゴマー抗体の反応性が観察されたが、ドルーゼンを含まない、年齢を一致させたコントロールの眼または若年ドナーの目について、反応性は観察されなかった。これらのデータは、アミロイドオリゴマーの存在とドルーゼンとの間に直接の相関関係があることを明らかにしており、ドルーゼン生合成に於いてオリゴマーコアがある役割を果たしている可能性を示唆している。
【００５５】
ドルーゼン内にアミロイドオリゴマーコアが存在すること以外に、幾つかの例、特にブルッフ膜の肥厚が観察されている（図２Ｃおよび図２Ｄ）例では、ブルッフ膜および基部の直線状沈着物中ブルッフ膜下、（図２Ｅ〜Ｈ）にオリゴマーの染色が観察されている。ＲＰＥ（網膜色素上皮）においてはしばしば染色が観察された（図２Ｉ）。神経網膜（データ未表示）には染色は観察されなかった。このことから、抗体反応性もまたＡＭＤの特徴である別の病因的変化に関連している。
【００５６】
抗オリゴマー抗体の特異性を図２（ＩおよびＪ）に示すが、これは同一ドルーゼンから得た一連の切片である。このドルーゼンは抗オリゴマー反応性を示す点を複数含んでいた。切片を一次抗体なしでインキュベーションするか（データ未表示）、または抗体を前もってＡβ１−４０ペプチドから作成した線維形成前オリゴマーとインキュベーションしておくと染色は見られなかった（図２Ｊ）。我々は神経網膜から、またはドルーゼン／ＲＰＥ／ブルッフ膜を含む基礎組織から調製した組織ホメジェネート中の抗オリゴマー反応性の特異性をさらに試験するために、ＥＬＩＳＡを実施した。試験管内合成した線維形成前Ａβ１−４０オリゴマーを陽性コントロールとして用いた。図３Ａに示すように、オリゴマー特異的抗体が存在する時にはＡβ１−４０オリゴマーの量を増やすと用量依存的な反応が観察されたが、抗体を省いた時には反応は見られなかった。神経網膜から、およびドルーゼン／ＲＰＥ／ブルッフ膜を含む組織から調製した抽出物についても抗体反応性を比較した（図３Ｂ）。ドルーゼン含有組織から調製した抽出物については用量依存的な反応性が観察されたが、一次抗体が存在しない場合には反応性は観察されなかった。同一ドナーの眼の神経網膜から調製した抽出物については、反応性はほとんど観察されなかった。このことから、ドルーゼンに見られる陽性シグナルは、アミロイドオリゴマーに極めて特異的であると思われる。
【００５７】
従って、示したデータはアミロイドオリゴマーがドルーゼン内に存在するという意見を裏付けている。レーザー走査共焦点顕微鏡を使って切片を高倍率で更に調べると、アミロイドオリゴマーコアの中心に向かって密度が増加する、小さな小胞構造物の斑状パターンが明らかになった（図４Ａ）。時に斑状パターンはＲＰＥに向かって漸減する（図４Ｂ）。別の例では、小胞構造物は、ブルッフ膜の層を貫通するのが観察されている（図４Ｃ）。まとめると、これらのデータはアミロイドオリゴマーがＲＰＥ細胞、ドルーゼン、および脈絡膜の間を行き来できることを示唆している。
【００５８】
コアの小胞特性を確認するために、我々はまず間接免疫蛍光を用いてアミロイドオリゴマーコアを含むドルーゼンを特定した。次に、免疫金標識、続いて電子顕微鏡向けに隣接する連続切片を作製した（図４Ｄ）。金粒子の分布から判断して、これらの研究は実際にアミロイドオリゴマーが小胞構造物と関連していることを立証した。さらにこれら小胞構造物はブルッフ膜の近くに集中しておいるが、同様の構造はＲＰＥ近くにあるドルーゼン先端部に於いても標識されることがあった（データ未提示）。
【００５９】
アミロイドオリゴマーコアの構造は幾つかの点で樹状細胞突起に類似していると思われる。抗ＨＬＡ−ＤＲ（赤、テキサスレッド）と一緒に抗オリゴマー抗体（緑、ＦＩＴＣ）を用いた二重染色を行い、免疫反応性が重複して存在しているか確定した（図５Ａ〜Ｄ）。ドルーゼンの中（図５Ｂ）またはブルッフ膜の下に強いＨＬＡ−ＤＲ反応性を見ることができ、その場合、反応性はドルーゼンを貫通してオリゴマーコアに近接しており（図５Ｃ）、コアを完全に取り囲むことさえあった（図５Ｄ）。いくつかの例では、ＨＬＡ−ＤＲの反応性はアミロイドオリゴマーコアに近接していると思われる（図５Ｂ）。よく調べると、免疫蛍光シグナルは重複していないことは明らかである（図ＣおよびＤ）。従って、アミロイドオリゴマーコアは、前述したＨＬＡ−ＤＲ陽性樹状細胞突起とは別の構造物である。
【００６０】
ドルーゼンの切片を二重染色し、オリゴマーコアおよびドルーゼンの主要構成要素である急性期タンパク質のビトロネクチンを視覚化した（３８）（図５Ｅ〜Ｈ）。ドルーゼンは全て、ビトロネクチンについて陽性に染色されたが、オリゴマーコアはドルーゼンのサブセットにだけに存在した（例えば図５Ｆ）。ビトロネクチンは不均一な標識パターンを示す傾向があった。オリゴマーコアとビトロネクチンとの両方について陽性に反応したドルーゼンでは、それらのシグナルの重複は観察されなかった。オリゴマーコアがアミロイドＡβ（Ａ）から組立てられたものか確認するために、ドルーゼンを含有した切片をこれら２種類の構成要素について同時染色した（図５Ｉ〜Ｌ）。殆どのドルーゼンはＡβアッセンブリーかオリゴマーコアのどちらかを含んだが、両方は含まなかった。従来の報告に一致して、Ａβ反応性はドルーゼン内の小胞構造物に付随した（図５Ｋおよび図５Ｌ）。両方の抗体と反応した一例のドルーゼンでは、蛍光シグナルは重複して存在してはいなかった：アミロイドオリゴマーの反応性はＲＰＥに付随したが、Ａβの反応性はドルーゼン内の球状構造物を修飾した（図５Ｌ）。このことから、アミロイドオリゴマーは多くの既知ドルーゼン構成要素とは重複して存在していないと思われる。
【００６１】
様々なタイプの組織または培養細胞がアミロイド集合体の毒性に対し多様な感受性を示す。我々は、アミロイドオリゴマーが、ドルーゼンを含んだ眼の中で互いを近接させた場合にＲＰＥ細胞に対し有毒であるか検証した。図６は、Ａβ１−４０から作製した可溶性オリゴマーがヒトのＲＰＥ初代培養細胞に対し実際に有毒であることを示している。この毒性は、Ａ１１抗オリゴマー抗体をインキュベーション混合物に入れると強く遮断された。従って、ＲＰＥ細胞に近接したアミロイドオリゴマーの存在は、ドルーゼンを生合成中の細胞またはＡＭＤのこれら細胞の生理に負の影響を及ぼすだろう。
アミロイド原性タンパク質またはペプチドから作られる線維形成前のオリゴマー構造物は、アミロイド疾患の病理発生に関与すると考えられる。このような構造物は、最近開発された立体構造特異的ではあるが、配列特異的ではない抗体によって、組織切片中に原位置で検出可能である（２４）。この抗体を使用して、我々はドルーゼンを含む眼および萎縮性ＡＭＤを伴うと臨床診断された眼にアミロイドオリゴマーが存在することを証明した（表１）。重要なことは、ドルーゼンが存在しないコントロールの眼には反応性が観察されないことであり、アミロイドオリゴマーが疾患特異的プロセスであることを示唆している。線維形成前のアミロイドオリゴマーは初代ヒトＲＰＥ培養細胞に対し毒性であることが証明されたことから、それらが疾患プロセスでのそれらの消滅に関与している可能性がある。従って、ＡＭＤおよびアミロイド疾患は、タンパク質の類似する異常な折りたたみ構造を共有すると思われ、共通の病理発生経路を共有している可能性がある。
【００６２】
一つの共通点は、球状のＡβ会合体ならびにＡＤ斑に共通して見られる他の炎症前タンパク質がドルーゼン内にも存在しているという発見である。具体的には、電子顕微鏡で観察した時に単一のドルーゼンはＡβ構造物を含まないことも、または直径０．２５〜１０μｍの範囲の、高度に組織化された同心層を示すＡβ構造物を大量に含むこともあると報告されている。このことから、文献は、そのサイズ、形状、および分布の違いから、オリゴマー関連小胞とは構造的に異なるＡβ会合体を記載している。実際、我々のデータは、それらがドルーゼン内で重複して存在しないことを示している。しかしながら、Ａβモノマーがアミロイド線維に変形した時には、Ａβのエピトープがオリゴマー構造物内に隠されていることを指摘しておくことは重要である。それ故に、我々はドルーゼン中のオリゴマーコアがＡβから成っている可能性を排除することはできない。別のドルーゼンのサブドメインは、Ａｒａｃｈｅａ  ｈｙｐｏｇｅａ凝集素（ＰＮＡ）反応性を示すコア類似構造物を含む。これらの構造物は、本願に記載のオリゴマー構造物にある程度類似しているが、それらは直径が５〜３８μｍの範囲であり、一方アミロイドオリゴマーコアは典型的には１０〜１５μｍである。それ故に、本願で論じるオリゴマー構造物は、これまで記載されてきたドルーゼン内の下部構造とは明らかに異なると思われる。ドルーゼン内のオリゴマー構造物の組成はまだ決定されておらず、現在研究が行われている。
【００６３】
出願者らのデータは、ＡＭＤおよびアミロイド疾患が、ドルーゼンにアミロイド線維は観察されていないものの、共通の病因経路を共有している更なる証拠を提示している。これまでに線維が存在しない状況についてアミロイドタンパク質関連毒性が観察されている。例えばＡＤのトランスジェニックマウスモデルでは、ヒト野生型β−アミロイド前駆体タンパク質の過剰発現が学習不足、およびアミロイド斑形成を伴わないＡβ沈着を招いた。ＰＤのマウスモデルでは、野生型α−シヌクレインの過剰発現が運動異常およびα−シヌクレインを含有する非線維性封入体の形成を招いた。２型糖尿病の動物モデルであるヒト島アミロイドポリペプチドを発現しているトランスジェニックラットでは、膵臓島細胞のアポトーシスとアミロイド形成とは相関しなかった。これらの結果は、アミロイド線維の存在が病因の必要条件ではないことを示しており、有毒な線維形成前オリゴマーが細胞消失の基礎原因であることを暗示している。従って、ＡＭＤとデスミン関連心筋症とは、おそらく複数存在する、アミロイド疾患に関係するが顕著なアミロイド線維の沈着をまだ示していない疾患のうちの２つに過ぎないかもしれない。
【００６４】
ドルーゼンについてアミロイド線維の検出が困難な理由は明らかではないが、オリゴマーおよび線維の回転速度が重要だろう。上記したようにアミロイド線維形成はステップ的なプロセスであり、オリゴマーおよび線維の全体の収率は各ステップの基礎動態に依存している。このことから、線維沈着の程度が低いことを説明する可能性のある説明として、線維形成の速度が遅いことと、および排除速度が速いという２つが考えられる。アミロイド線維形成の速度は実験条件によって大きく左右されることが知られており、且つ生化学データは、適切な条件の下では、オリゴマーの安定性が、それらが線維に変換する前長期間維持することができることを示唆している。また、オリゴマーが線維に変換することができるようになる前にドルーゼンの外に出て行く可能性も考えられる。本研究はこのような浄化の直接的な証拠を提供していないが、オリゴマー構造物がブルッフ膜を貫通できることがこの可能性を示唆している。
【００６５】
ドルーゼン内のＨＬＡ−ＤＲ反応性に関する最近の免疫細胞化学データは、ドルーゼン内に樹状細胞突起が存在することを示唆している。樹状細胞は、異物を取り込み、且つ原理的にはアミロイドオリゴマー排除を容易にする抗原提示細胞である。実際、我々の研究は、Ｈａｇｅｍａｎらの報告と同様にしてＨＬＡ−ＤＲの存在がドルーゼン内の構造を活性化することを示している。これら推定樹状細胞の突起は、アミロイドオリゴマーよりもドルーゼンの中と周囲に多く見られるが、アミロイドオリゴマーコアに近接して見出されることもある。しかしながらそれらは重複して存在することはないと考えられる。
【００６６】
出願者のデータは、数を増しつつあるＡＭＤとアミロイド疾患との間の類似点を明らかにする証拠のリストを追加するものである。炎症前タンパク質がこれらの疾患に関連する細胞外沈着物中に同定されたことは特に意義深い。ＡＭＤの眼だけでなく高齢者の眼にも存在する特定のＲＰＥ細胞、小型ドルーゼン、および大型の軟性ドルーゼンの中に補体活性化を示す証拠が観察されている。この観察から、ドルーゼンの生物発生において、異常な免疫反応が何らかの役割を果たしているという仮説が立てられた。重要なことは、補体活性化の重要制御因子である補体因子Ｈの多形が、ＡＭＤの重要なリスク因子であることが明らかにされたことである。この発見によって、ＡＭＤの病因における補体活性化の役割に注目が集まっている。免疫反応の活性化する因子はなにか？我々は、本願で類似の分布を示すドルーゼン、ＲＰＥ細胞、および基底沈着物内にアミロイドオリゴマーが存在することを報告している。これらのオリゴマーが細胞に対し毒性を示すことでアミロイド疾患の病因に関係していることは注目すべきことである。ＲＰＥ細胞に近接してオリゴマーが存在することが、それらの細胞の機能を障害し、補体カスケードを活性化してドルーゼンの形成を招いている可能性がある。
【００６７】
まとめると、ドルーゼン内のアミロイドオリゴマーの存在は、ＡＭＤとアミロイド疾患とに、タンパク質の異常な折りたたみ構造と病理発生病因に関して共通点があることを示唆している。ＡＭＤおよびデスミン関連心筋症は、成熟したアミロイド線維ではなくオリゴマー中間体が蓄積する新しいアミロイド疾患分類の最初の例である可能性が高い。
【００６８】
ヒト組織。無傷ヒトドナーの眼はオレゴンライオンズサイト＆ヒアリングファウンデーション（Ｏｒｅｇｏｎ  Ｌｉｏｎｓ  Ｓｉｇｈｔ  ＆  Ｈｅａｒｉｎｇ  Ｆｕｎｄａｔｉｏｎ）、米国オレゴン州ポートランド（Ｐｏｒｔｌａｎｄ）およびアルツハイマー・ディジーズ・リサーチセンター、ニューパソロジー・コア（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｅ）南カリフォルニア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）より得た。下表１に示すように１９名の個人の眼を調べ、その内の４例に、ＡＭＤの臨床歴が記録されていた。
【００６９】
【表１】
2008527005.tif 000003
表１にまとめたデータは、オリゴマーの反応性がドルーゼン含有組織に特異的であることを示している。１９名のドナーの眼全体について、共焦点顕微鏡を使ってアミロイドの存在についてスクリーニングした。オリゴマー反応性はドルーゼンが存在するときのみ観察された。年齢を一致させた、ドルーゼンが存在しないコントロールの眼、またはドルーゼンを含まない若年者の眼にオリゴマー反応性は観察されなかった。
【００７０】
眼は全て４℃に保ち、検視後２４時間までに処理した。固定を、抗オリゴマー特異抗体を用いた抗原検出を妨害する可能性があることから避けた。眼球前極を取り除いた後、網膜を剥がし、解剖顕微鏡（ＭＺ１２５、Ｌｅｉｃａ（商標）、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ）を使ってドルーゼンの存在について眼球の後極を調べた。ドルーゼンを含む全ての領域を対象とした。コーティングしたステンレス鋼製のカミソリの刃を使って、組織を１ｃｍ  ｘ  ０．５ｃｍの長方形に切断し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ、サクラファインテック（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｉｃｈ）、米国カリフォルニア州トランス（Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）に包埋した。
【００７１】
共焦点免疫蛍光顕微鏡。凍結包埋組織をクリオスタット（Ｌｅｉｃａ（商標）  ＣＭ  ３０５０Ｓ、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ）を使って−２０℃で切片化した。厚さ８〜１０μｍの凍結切片を前もってきれいにしておいたｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（商標）プラススライド（ＶＷＲサイエンティフィック（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、米国ペンシルベニア州ウェスト・チェスター（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）の上に集め、３０分間風乾し、−２０℃に保管した。抗オリゴマー特異的抗体を用いた免疫細胞化学研究は前述したとおりに実施した。簡単に説明すると、切片をブロッキング液（２％ＢＳＡおよび２％ヤギ血清を含有するリン酸緩衝化食塩水）の中で一晩、４℃でブロッキングし、翌日アフィニティー精製した抗オリゴマー特異抗体（１．６ｍｇ／ｍｌ）と１時間、室温でインキュベーションした。次に切片を洗浄し、フルオロセイン標識ヤギ抗ウサギ抗体（１：１００、ベクターラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、米国カリフォルニア州バーリンゲーム（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）と１時間、室温でインキュベーションした。オリゴマーおよびＨＬＡ−ＤＲ、またはビトロネクチンおよびＡβのようなドルーゼン構成要素を検出するために、切片を上記通りに処理し、マウス抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ抗体（０．５ｍｇ／ｍｌ、ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、マウス抗ビトロネクチン抗体（１：２００、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）、またはＡβ、ペプチドの残基１７〜２４に対するものであるマウス抗Ａβ、抗体（１：１００、４Ｇ８、サイネット・ラボラトリーズ（Ｓｉｇｎｅｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とインキュベーションした。免疫染色した切片のデジタル画像を、ＬＳＭ５１０  Ｚｅｉｓｓレーザー走査共焦点顕微鏡（ソーンウッド（Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ）、米国ニューヨーク州（ＮＹ）を使って得た。
【００７２】
電子顕微鏡。最初に免疫蛍光を使って線維形成前オリゴマーを凍結切片について同定した。オリゴマーを含むことが分かったものの前後の連続切片を抗オリゴマー抗体とインキュベーションし、続いて５ｎｍの金標識ヤギ抗ウサギ抗体（テッド・ペラ（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ）、米国カリフォルニア州レッディング（Ｒｅｄｄｉｎｇ、ＣＡ）とインキュベーションした。切片を洗浄して、４％アガロース内に予備包埋した。次にアガロース包埋切片を短時間ＯｓＯ４で固定し、エタノール濃度を上げながら脱水し、エポキシ樹脂を浸透させてウルトラミクロトーム（Ｕｌｔｒａｃｕｔ  ＵＣＴ；Ｌｅｉｃａ（商標）、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ）を使って、電子顕微鏡向けに７０ｎｍで切片化した。画像を、透過型電子顕微鏡（ＥＭ１０；ツァイス（Ｚｅｉｓｓ）、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて得た。
【００７３】
可溶性Ａβオリゴマーの調製。Ａβオリゴマーは、当技術分野既知の技術に従って調製した。簡単に説明すると、１．０ｍｇのＡβを４００μｌの１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）に１０分間、室温で溶解した。溶液の一部（１００μｌ）を、シリコン処理したエッペンドルフチューブに入った９００μｌのｄｄＨ２Ｏに溶解した。１０分間のインキュベーションの後、サンプルを１５分間、１４，０００ｇで遠心分離し、上清分画を新しいシリコン処理チューブに移した。Ｎ２流を５〜１０分間吹き付けてＨＦＩＰを蒸発させた。次にサンプルをテフロンコートしたマイクロスターラーバーを使って５００ｒｐｍで２４〜４８時間、室温で攪拌した。一部を６〜１２時間間隔で採取して、球状オリゴマーの存在についてチェックした。
【００７４】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）。ＥＬＩＳＡは、組織ホモジェネートおよびＡβペプチドから作製したオリゴマーを用いて実施した。眼組織サンプルを処理するために、眼の後極で、神経網膜を下にあるＲＰＥ／ＢＭ／脈絡膜−複合体から剥がした。単離した組織（神経網膜または下側のＲＰＥ／ＢＭ／脈絡膜−複合体）を超音波処理装置（Ｍｉｃｒｏｓｏｎ（商標））を用いてｄｄＨ２Ｏ中でホモジェナイゼーションし、遠心分離して上清を集めた。ＥＬＩＳＡは抗オリゴマー特異的抗体を用いて、Ｋａｙｅｄと共同研究者らが記載した通りに実施した。簡単に説明すると、サンプルをコーティング緩衝液（０．１Ｍ重炭酸ナトリウム）で希釈し、９６ウエルマイクロプレート（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、米国ニュージャージー州フランクリンレイクス（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）のウエルに加えた。２時間、３７℃でインキュベーションした後、サンプルを３７℃で３％ＢＳＡ  ＴＢＳ−Ｔを用いてブロッキングした。抗オリゴマー抗体（１：２５００）を１００μｌ加え、１００μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧと１時間、３７℃でインキュベーションする前に、３７℃で１時間インキュベーションした。続いて３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いて発色させるために、反応を１００μｌの１ＭのＨＣｌを用いて停止し、プレートを４５０ｎｍで読みとった（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｐｌｕｓ、バイオラド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）。
【００７５】
細胞生存アッセイ。細胞の生存を、ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）に基づくアッセイ（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、米国ミズーリ州セントポール・ルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて分光光学的に評価した。ヒト胎児の眼から単離したＲＰＥ細胞を、アドバンスド・バイオサイエンス・リソーシーズ・インク（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，  Ｉｎｃ．）（米国カリフォルニア州アラメダ（Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）より得た。細胞は２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および１０％ウシ胎児血清を補充したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、３７℃で維持した。３〜４回継代した細胞をウエル当たり１０，０００細胞で９６ウエルプレートに接種し、〜９０％の周密度まで３〜４日間増殖させた。毒性アッセイの前に、培地を、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭに溶解した指示濃度のＡβオリゴマー単独または当モルのＡ１１抗オリゴマー抗体と一緒のものと交換した。この状態を三回繰り返した。４時間後、ＤＭＥＭに溶解したＭＴＴを細胞に加え更に４時間インキュベーションした。不溶性の結晶はＭＴＴ溶解溶液（１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１ＮのＨＣｌの無水イソプロパノール溶液）を加えて溶解し、吸光度を５７０ｎｍで測定した。
【００７６】
抗体の調製および治療応用
以下の各アミロイドペプチドは、本発明の抗体、例えばＡ−βペプチドオリゴマー中間体に対し産生された抗体が認識する立体構造エピトープを作り出すアミロイドペプチド集合体を形成することが示されている。これらペプチドの幾つかは、アミロイド沈着物を特徴とする疾患を持つヒトまたは動物のアミロイド沈着物中に存在している。本発明は、掲載のペプチドまたはタンパク質の配列、あるいは配列の幾つかと関連する特定の疾患に限定されない。本発明は、他のアミロイドペプチド集合体またはその他全てのアミロイドペプチド集合体に結合する本願に記載の抗体を予想している。特に、本発明は、他の疾患に関連するアミロイド前駆体集合体を形成する他のペプチドおよびタンパク質の配列への本発明の方法および組成物の応用も予想し、且つ包含している。
【００７７】
Ａ４０（配列番号１）
ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦ  ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ  ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ
Ａ４２（配列番号２）
ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ  ＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦ  ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ  ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ  ＩＡ
ヒトＩＡＰＰ（配列番号３）
ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱ  ＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳ  ＮＮＦＧＡＩＬＳＳＴ  ＮＶＧＳＮＴＹ
ヒトプリオン１０６−１２６（配列番号４）
ＫＴＮＭＫＨＭＡＧＡ  ＡＡＡＧＡＶＶＧＧＬ  Ｇ
最近、ステファニ（Ｓｔｅｆａｎｉ）と共同研究者ら（ブッシアンテイーニら（Ｂｕｃｃｉａｎｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ（２００２）「Ｎａｔｕｒｅ」第４１６巻、ｐ．５０７〜５１１）とは、疾患と無関係なタンパク質から作製したアミロイドペプチド集合体が生得的に細胞毒性であることを報告し、それらが疾患関連アミロイドペプチドと共通の構造を有する可能性を示唆した。次の疾患と無関係なアミロイドペプチドを含む疾患と無関係なアミロイドペプチド集合体が、本発明の抗体に結合することも示されている。
【００７８】
ポリグルタミン合成ペプチドＫＫ（Ｑ４０）ＫＫ（配列番号５）
ＫＫＱＱＱＱＱＱＱＱ  ＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱ  ＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱ  ＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱ  ＱＱＫＫ
ヒトリゾチーム（配列番号６）
ＭＫＡＬＩＶＬＧＬＶ  ＬＬＳＶＴＶＱＧＫＶ  ＦＥＲＣＥＬＡＲＴＬ  ＫＲＬＧＭＤＧＹＲＧ  ＳＬＡＮＷＭＣＬＡ  ＫＷＥＳＧＹＮＴＲＡ  ＴＮＹＮＡＧＤＲＳＴ  ＤＹＧＩＦＱＩＮＳＲ  ＹＷＣＮＤＧＫＴＰＧ  ＡＶＮＡＣＨＬＳＣＳ  ＡＬＬＱＤＮＩＡＤＡ  ＶＡＣＡＫＲＶＶＲＤ  ＰＱＧＩＲＡＷＶＡＷ  ＲＮＲＣＱＮＲＤＶＲ  ＱＹＶＱＧＣＧＶ
ヒトインスリン（配列番号７）
ＭＡＬＷＭＲＬＬＰＬ  ＬＡＬＬＡＬＷＧＰＤ  ＰＡＡＡＦＶＮＱＨＬ  ＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹ  ＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹ  ＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤ  ＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧ  ＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬ  ＡＬＥＧＳＬＱＫＲＧ  ＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣ  ＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ
ヒトトランスシレチン（配列番号８）
ＭＡＳＨＲＬＬＬＬＣ  ＬＡＧＬＶＦＶＳＥＡ  ＧＰＴＧＴＧＥＳＫＣ  ＰＬＭＶＫＶＬＤＡＶ  ＲＧＳＰＡＩＮＶＡＶ  ＨＶＦＲＫＡＡＤＤＴ  ＷＥＰＦＡＳＧＫＴＳ  ＥＳＧＥＬＨＧＬＴＴ  ＥＥＥＦＶＥＧＩＹＫ  ＶＥＩＤＴＫＳＹＷＫ  ＡＬＧＩＳＰＦＨＥＨ  ＡＥＶＶＦＴＡＮＤＳ  ＧＰＲＲＹＴＩＡＡＬ  ＬＳＰＹＳＹＳＴＴＡ  ＶＶＴＮＰＫＥ
ヒトアルファシヌクレイン（配列番号８）
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ  ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ  ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ  ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ  ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ  ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ  ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ  ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ  ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ  ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ  ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ  ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ  ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ  ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ
これに加えて、Ａ４２（Ａ２１Ｇ）フランドル突然変異体）、Ａ４２（Ｅ２２Ｑ）オランダ突然変異体、Ａ４２（Ｅ２２Ｇ）北極突然変異体、Ａ４２（Ｄ２３Ｎ）アイオワ突然変異体、Ａ４０（Ａ２１Ｇ）フランドル突然変異体）、Ａ４２（Ｅ２２Ｑ）オランダ突然変異体、Ａ４２（Ｅ２２Ｇ）北極突然変異体、Ａ４０（Ｄ２３Ｎ）アイオワ突然変異体、Ａ４０（Ｅ２２Ｑ＆Ｄ２３Ｎ）オランダおよびアイオワ突然変異体、Ａ３−４２（ｐＧｌｕ  ３）、Ａ３−４０（ｐＧｌｕ  ３）、Ａ８−４２、Ａ１７−４２、Ａ１−１６、Ａ３−１１、Ａ２５−３５、Ａ４−１６（３つの類似体、Ｃｙｓ１６Ａ４−１６、Ａｌａ４  Ａ４−１６、およびＡｌａ１０  Ａ４−１６）、Ｈｉｓ６  Ａ４０Ｃ４０（ＡβＣ４０のアミノ末端に６つのヒスチジンが追加されている）を含むがこれらに限定されない野生型Ａ４２、Ａ４０の変異体および断片から形成されたオリゴマー中間体も本発明の抗体によって認識される。発明の抗体が認識する他のオリゴマー中間体としては、ＩＡＰＰ内に自然に存在するシステインがアラニンで置換されているＩＡＰＰ（Ｃ２ＡおよびＣ７Ａ）から形成されたオリゴマー中間体、Ｑ残基の数が３２より多いポリグルタミンＫＫＱ４０ＫＫまたはポリグルタミン、カルシトニン、ＴＴＲおよびその変異体であるＴＴＲ  Ｐｒｏ５５、ＴＴＲ  Ｐｈｅ７８、ビトロネクチン、ポリリジン、ポリアルギニン、血清アミロイドＡ、シスタンチンＣ、ＩｇＧカッパ軽鎖、本願に開示された他アミロイドペップチドから作られたオリゴマー中間体、ならびに本願に開示されたアミロイド疾患に関連するアミロイド中間体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
本発明は、アミロイドオリゴマー中間体に対する特異的免疫反応を誘導するアミロイド疾患治療薬を提供する。発明の治療薬は、オリゴマー中間体に特異的に結合する抗体を含む。このような抗体は本出願に記載されているようなモノクローナル抗体でも、参照によって本願に組み入れられているＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２８８２９号に記載されているようなポリクローナル抗体でもよい。一つの有用な態様では、抗体は立体構造エピトープに結合する。本発明のヒト以外（例えばマウスまたはラット）のモノクローナル抗体の産生は、例えば動物を発明のオリゴマー中間体模擬物で免疫することによって達成できる。また精製したアミロイド中間体で動物を免疫することも考えられる。
【００８０】
発明のヒト化マウス抗体を、組換え体ＤＮＡ技術によってヒト以外の抗体のＣＤＲ領域をヒトの定常領域に連結することによって作ることができる。クィーンら（Ｑｕｅｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，）、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．」第８６巻、米国（ＵＳＡ）（１９８９）ｐ．１００２９〜１００３３および国際公開第９０／０７８６１号パンフレット（全ての目的について、参照によって組み入れられている）を参照。
【００８１】
ヒト抗体を、ファージディスプレイ法を用いて得ることができる。例えばダワーら（Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、国際公開第９１／１７２７１号パンフレットおよびマッカファティら（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，）ら、国際公開第９２／０１０４７号パンフレットを参照。これらの方法では、ファージのライブラリーを、そのメンバーがその外面上に異なる抗体を提示するように作製する。所望する特異性を持つ抗体を提示しているファージをアフィニティー濃縮によって選択する。オリゴマー中間体に対するヒト抗体はまた、少なくともヒトの免疫グロブリン遺伝子座の一区分と不活性化された内因性の免疫グロブリン遺伝子座をコードしているトランス遺伝子を持つヒト以外のトランスジェニック動物からも産生可能である。例えばロンバーグら（Ｌｏｎｂｅｒｇ、  ｅｔ  ａｌ．，）、国際公開第ＷＯ９３／１２２２７号パンフレット（１９９３）；（クッシェリアパティ（Ｋｕｃｈｅｒｉａｐａｔｉ、国際公開第９１／１０７４１号パンフレット（１９９１）（それぞれ、全ての目的について、参照によってそっくりそのまま組み入れられている）を参照。ヒト抗体は、競合結合実験によって選択することができるか、さもなければ特定のマウス抗体と同一のエピトープ特異性を持つように選択することができる。このような抗体は、おそらくマウス抗体の有用な機能特性を共有するだろう。
【００８２】
ヒトまたはヒト化抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥの定常領域、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む任意のイソ型を有するようにデザイン可能である。抗体はＦａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖのような個別の重鎖、軽鎖として、二本の軽鎖および二本の重鎖を含む四量体として、あるいはスペーサーを介して重鎖および軽鎖の可変ドメインが連結されている単鎖抗体として発現させることができる。
【００８３】
特定の例では、本発明の１または複数のアミロイドペプチド集合体免疫原を好適な担体に結合させることが望ましいだろう。好適な担体としては、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、破傷風毒素、またはジフテリア、大腸菌、コレラ、もしくはピロリ菌のようなその他病原性細菌の毒素、あるいは弱毒化した毒素誘導体が挙げられる。免疫反応を刺激または増進するためのアジュバントとして作用することができるその他担体としては、ＩＬ−１、ＩＬ−１とペプチド、ＩＬ−２、ＩＮＦ、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ、ならびにＭ１Ｐ１およびＲＡＮＴＥＳのようなケモカインが挙げられる。
【００８４】
本発明のモノクローナル抗体を用いた治療に好適なヒトまたは動物の被験体または患者としては、アミロイド疾患のリスクがあるが症状は示していない個体、ならびに既に症状もしくはアミロイド疾患のその他の証拠を示している個体が挙げられる。ＡＤを含む特定のアミロイド疾患の場合は、実質的に誰もがこの疾患に罹るリスクがある。
【００８５】
それ故に、本願に記載されているモノクローナル抗体、または親出願第１０／５２７，６７８号明細書（国際公開第ＷＯ２００４／０２４０９０号パンフレット）に記載されている同様のポリクローナル抗体、あるいはアミロイドオリゴマーの立体構造エピトープに対する抗体反応を被験体に誘発できる免疫原は、対象患者のリスク評価をすることなく一般集団に予防的に投与されてもよい。この方法は、ドルーゼンまたはドルーゼン類似沈着物と関連するか、または合併性を有することが知られている疾患に関する既知の遺伝的リスクを有する個体にとって特に有用である。このような個体は、ＡＭＤ、膜増殖性ＩＩ型糸球体腎炎、弾性線維症、その他のアミロイド疾患等と診断されるか、またはそのリスク因子（例えば家族歴、遺伝マーカー等）を有しているだろう。例えばＡＤのリスクの遺伝マーカーとしては、ＡＰＰ遺伝子の突然変異、特にＨａｒｄｙとＳｗｅｄｉｓｈの突然変異とそれぞれ呼ばれている位置７１７および位置６７０と６７１の突然変異が挙げられる（Ｈａｒｄｙ、ＴＩＮＳ、上記を参照）。ＡＤに関するリスクの別のマーカーはプレセニリン遺伝子、ＰＳ１およびＰＳ２の突然変異、ＡｐｏＥ４、ならびにＡＤ，高コレステロール血症またはアテローム性動脈硬化の家族歴である。
【００８６】
ＡＭＤ、膜増殖性ＩＩ型糸球体腎炎、弾性線維症、ＡＤ、およびその他アミロイド疾患の症状は、多くの医師には明らかである。例えばＡＭＤに罹病中の個体は、通常の眼検査で診断されることが多い。これに加えて、アミロイド疾患を持つ個体を識別するための多くの診断試験を利用することもできる。例えばＡＤの例では、このようなものとしてＣＳＦのタウおよびＡ４２レベルの測定が挙げられる。タウの増加、Ａ４２レベルの低下はＡＤの存在を表す。
【００８７】
予防治療応用では、ＡＭＤ、膜増殖性ＩＩ型糸球体腎炎、弾性線維症、ＡＤ、およびその他アミロイド疾患に罹りやすいと思われるか、そのリスク因子を持つ患者に、本発明の組成物または中間物を疾患のリスクを排除もしくは下げる、または発症を遅らせるのに十分な量投与される。別の治療応用では、本発明の組成物または中間物を、ドルーゼンまたはドルーゼン類似沈着物が観察されているか、あるいは既にＡＭＤ、膜増殖性ＩＩ型糸球体腎炎、弾性線維症、ＡＤ、またはドルーゼンもしくはドルーゼン類似沈着物と関連するその他疾患もしくは障害の兆候または症状を示している患者に、ドルーゼンもしくはドルーゼン類似沈着物の形成もしくは生合成を阻害する、および／または既に存在しているドルーゼンもしくはドルーゼン類似沈着物を減らす、および／またはＡＭＤ、膜増殖性ＩＩ型糸球体腎炎、弾性線維症、ＡＤ、またはドルーゼンもしくはドルーゼン類似沈着物と関連する疾患もしくは障害を治癒もしくは重篤度を緩和するのに十分な量投与する。これを達成するのに適した量は、治療的または薬学的有効量と定義される。予防および治療レジメンの両方において、本発明の治療薬は、十分な免疫状態が達成されるまで反復投与量で投与される。一般的には、患者の免疫状態はモニタリングされ、免疫状態が衰えれば更なる投薬が行われるだろう。
【００８８】
本発明の組成物の有効投与量は、上記の状態の治療に関しては、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、他の投与薬、および処置が予防的か治療的かを含む多くの異なる要因によって変わる。通常、患者はヒトであるが、狂牛病のような幾つかの疾患では、患者はウシのようなヒト以外の動物であることもあり、アルツハイマー病の場合には患者はイヌのこともある。治療用量を、滴定により安全性および効力を最適化する必要がある。抗体による受動免疫の場合、投与量は約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり、より一般的には約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５ｍｇ／ｋｇ宿主体重である。投与される免疫原の量は、アジュバントも投与されるかどうかによって変わり、アジュバントがない場合はより高用量が必要となる。例えば約１重量％の所望免疫原を含む溶液を０．１〜１００ｍｌ（ｃｃ）皮下注射すると、注射当たり１ｍｇから１ｇの免疫原投薬量が送り込まれる。注射のタイミングは、１日１回から年に１回、１０年に１回までと大きく変化するだろう。免疫源投与の一つの典型レジメンは、免疫およびそれに続く６週間隔のブースター注射から成る。別のレジメンは、免疫およびそれに続く１、２、および１２ヶ月後のブースター注射から成る。別のレジメンは、生涯２ヶ月毎の注射を含む。あるいは、ブースター注射は免疫反応のモニタリングによって指示された場合に不規則に行ってもよい。
【００８９】
免疫反応を誘導するための治療薬は、任意の好適投与経路、例えば非経口、局所、静脈内、経口、皮下、腹腔内、鼻内、または筋肉内投与経路によって投与されることができる。最も一般的な投与経路は皮下であるが、他の経路も等しく有効である。次に一般的な経路は筋肉内注射である。このタイプの注射は、腕または脚部の筋肉に最も一般的に行われる。腹腔内注射、動脈、頭蓋内、または皮内注射だけでなく静脈内注射も、免疫反応の発生に有効であろう。幾つかの方法では、治療薬は沈着物が蓄積しているか、または蓄積している可能性のある特定の組織内に直接注射される。
【００９０】
本発明のモノクローナル抗体は、随意選択的にアミロイド原性疾患の治療に少なくとも一部有効である他の薬物と組み合わせて投与されることができる。脳内にアミロイドの蓄積が起こるアルツハイマー病およびダウン症候群の場合、発明の治療薬は発明の組成物の血管−脳関門の通過を高める別の薬物と一緒に投与されることもできる。例えば以下に詳しく記載するように、抗炎症用量の金コロイドまたは金塩をモノクローナル抗体に随伴して（例えば前、同時、または後）投与し、ＡＤおよびその他アミロイド疾患に関連した脳の炎症を阻止することができる。
【００９１】
本発明の免疫原は、アジュバントと組み合わせて投与されることもある。本発明の免疫原とは多様なアジュバントを組み合わせて用い、免疫反応を惹起することができる。好ましいアジュバントは、反応の定量的な形に悪影響を及ぼす免疫原内の立体構造を起こさずに免疫原に対する内因性の反応を高める。好ましいアジュバントとしては、ミョウバン、３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）（ＧＢ２２２０２１１を参照）が挙げられる。ＱＳ２１は南米にあるキラヤ・サポニン（Ｑｕｉｌｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ）の木の樹皮から単離されたトリテルペングリコシドまたはサポニンである（ケンシールら（Ｋｅｎｓｉｌ，ｅｔ  ａｌ）、ワクチン・デザイン（Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ）内：「Ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（編集  ポウェル＆ニューマン、プレナムプレス（Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）、米国ニューヨーク州（ＮＹ）（１９９５）；および米国特許第５，０５７，５４０号明細書を参照）。別のアジュバントは、場合によってはモノホスホリル脂質Ａのような免疫刺激剤と組み合わされてよい、スクアレンまたはピーナッツオイルのような水中油系乳剤である。例えばストゥートら（Ｓｔｏｕｔｅ，ｅｔ  ａｌ）、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．第３３６巻、Ｐ３３６、８６〜９１（１９９１）、を参照。別の有用なアジュバントは「Ｂｉｏｗｏｒｌｄ  Ｔｏｄａｙ」、１９９８年１１月１５日（Ｎｏｖ．１５、１９９８）に記載されているＣｐＧである。あるいは免疫原はアジュバントに連結することもできる。しかしながらこのような連結は、免疫原を本質的に変えて、それに対する免疫反応の性質に悪影響を及ぼすようなものであってはならない。アジュバントは、活性作用物質と一緒に治療組成物の構成要素として投与されることもでき、または治療薬の投与前、同時、もしくは後に別々に投与されることもできる。
【００９２】
好ましい種類のアジュバントは水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムのようなアルミニウム塩（ミョウバン）である。このようなアジュバントは、ＭＰＬもしくは３−ＤＭＰ、ＱＳ２１、ポリグルタミン酸もしくはポリリジンのような重合体もしくは単量体アミノ酸のようなその他の特異的免疫刺激剤と一緒に、またはこれら無しに用いられることができる。
【００９３】
別の種類のアジュバントは、水中油形乳剤である。このようなアジュバントは、ムラミルペプチド（例えばＮ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（ＤＴＰ−ＤＰＰ）テラミド（登録商標））のようなその他特異的免疫刺激剤、またはその他細菌細胞壁成分と一緒に、あるいはそれら無しに用いることができる。水中油形乳剤としては、（ａ）５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５（場合によって様々量のＭＴＰ−ＰＥを含有）を含み、Ｍｏｄｅｌ  １１０Ｙマイクロフルイダイザー（マイクロフルーイディックス（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）、米国マサチューセッツ州ニュ−トン（Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）のような流動化装置を用いてミクロン以下の粒子に製剤化されたＭＦ５９（国際公開第９０／１４８３７号パンフレット）、（ｂ）１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ  ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有し、ミクロン以下の乳剤に流体化されるか、ボルテックスしてより大きな粒子サイズの乳剤にしたＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ  ８０、およびモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコラート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）から成る群から１種類以上の細胞壁成分、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（登録商標）を含有するＲｉｂｉ（登録商標）アジュバントシステム（ＲＡＳ）（リビ・イミュノケム（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）、米国モンタナ州ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）が挙げられる。
【００９４】
別の種類の好ましいアジュバントは、Ｓｔｉｍｕｌｏｎｓ（ＱＳ２１、アキュイラワーセスター（Ａｑｕｉｌａ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ）、米国マサチューセッツ州（ＭＡ）またはＩＳＣＯＭｓ（免疫刺激複合体）のようなそれから作られた粒子、ならびにＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸのようなサポニンアジュバントである。他のアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）が挙げられる。その他アジュバントには、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、およびＩＬ−１２のようなインターロイキン、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、組織壊死因子（ＴＮＦ）のようなサイトカイン、ならびに／あるいはＣＸＣＬ１０およびＣＣＬ５のようなケモカインがある。
【００９５】
アジュバントは単一組成物である免疫原と一緒に投与されることができ、あるいは免疫原投与の前、同時、または後に投与されることができる。免疫原およびアジュバントは同一バイアルに包装して供給されることができ、または別々のバイアルに包装され、使用前に混合されることもできる。免疫原およびアジュバントは、一般的には目的とする治療応用を表示したラベルと一緒に包装される。免疫原とアジュバントとを別々に包装する場合は、包装には一般的に使用前の混合を指示するものが入れられる。アジュバントおよび／または担体の選択はアジュバントを含有するワクチンの安定性、投与経路、投薬スケジュール、ワクチン接種対象となる種に対するアジュバントの効力に依存し、且つヒトの場合には、薬学的に許容されるアジュバントは、管轄の取り締まり機関によってヒトへの投与が認可されているか、承認可能なものである。例えば完全フロイントアジュバントはヒトへの投与には適していない。場合によっては２種類以上のアジュバントを同時に用いることができる。好ましい組み合わせとしては、ミョウバンとＭＰＬ、ミョウバンとＱＳ２１、ＭＰＬとＱＳ２１、およびＱＳ２１とＭＰＬとが挙げられる。また不完全フロイントアジュバントは（チャンら（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，）「Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ」第３２巻、（１９９８）ｐ．１７３〜１８６）、随意選択的に任意のミョウバン、ＱＳ２１、およびＭＰＬとの組み合わせ、ならびにそれら全てと組み合わせて用いることができる。
【００９６】
本発明の組成物は、各種その他薬学的に許容可能な構成要素を含む薬学的組成物として投与されることが多い。「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」（第１５版、マックパブリッシング社（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、米国ペンシルベニア州イートン（Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、１９８０）を参照。好ましい形態は、意図する投与様式および治療応用に依存する。組成物はまた、所望する調合に応じて薬学的に許容される無毒の担体または希釈剤を含むこともでき、これらは動物またはヒトへ投与する薬学的組成物の調合に普通に用いられる賦形剤として定義される。希釈剤は、組み合わせの生物活性に悪影響を及ぼさないように選択される。このような希釈剤の例は蒸留水、生理学的リン酸−緩衝化食塩水、リンガー液、デキストロース液、およびハンクス液である。これらに加えて、薬学的組成物または調合物は、その他の担体、アジュバント、または無毒の非治療薬、非モノクローナル抗体性安定化剤等を含んでもよい。しかしながら、完全フロイントのアジュバントのような動物への投与に好適ないくつかの試薬は、一般的にヒトへ使用する組成物には加えない。
【００９７】
薬学的組成物は、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびコポリマー（ラテックス機能化セファロース、アガロース、セルロース等のような）、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および脂質凝集体（油滴またはリポソームのような）のような大型のゆっくりと代謝される高分子を含むこともできる。これに加えて、これら担体は免疫刺激剤（即ちアジュバント）として機能することもできる。
【００９８】
非経口投与については、発明の組成物は、物質が水油、食塩水、グリセロール、またはエタノールのような無菌の液体でよい生理学的に受け入れ可能な希釈剤または薬学的担体中にある注射可能な投与量の溶液または懸濁として投与されることができる。
【００９９】
湿潤化剤または乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝化物質等のような補助物質は、組成物の中にあってもよい。薬学的組成物のその他構成要素は、石油、動物、植物、もしくは合成起源の油、例えばピーナッツオイル、大豆油、および鉱油である。一般的にはプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのようなグリコールが好ましい、特に注射液にとって好ましい液体担体である。
【０１００】
組成物は、注射可能な溶液または懸濁液として調製されることができる；注射前に溶液、懸濁液にするか、または液体賦形剤に加えるのに適した個体として調製されることもできる。調合物は、上記したように、アジュバント効果を高めるために、ポリ乳酸、ポリグリド、またはコポリマーと乳化またはリポソームもしくは微粒子に封入されることができる。「Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ」、第２４９巻（１９９０）、ｐ．１５２７および「Ｈａｎｅｓ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ」、第２８巻（１９９７）、ｐ．９７〜１１９を参照。本発明の組成物は、活性成分の持続的または拍動的放出が可能なように調合されることできるデポー注射製剤またはインプラント製剤の形で投与可能である。
【０１０１】
その他の投与様式に好適な追加の調合物は、経口、鼻内、および肺向けの調合物、座薬、および経皮適用剤である。
座薬の場合、結合材および担体としては、例えばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが挙げられる；このような座薬は活性成分を０．５％〜約１０％の範囲、例えば約１％〜約２％含む混合物から作ることができる。経口調合物は、薬学等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、および炭酸マグネシウムのような賦形剤を含む。これら組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、持続放出調合物または粉末の形を取り、活性成分を約１０％〜約９５％、例えば約２５％〜約７０％含むことができる。
【０１０２】
局所への適用は、経皮的または皮内デリバリーをもたらすことができる。局所投与は、コレラトキシンまたはその無毒化誘導体もしくはサブユニット、またはその他同様の細菌性毒素と一緒に組成物を同時投与することで促進することができる。グレンら（Ｇｌｅｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，）「Ｎａｔｕｒｅ」、第３９１巻、ｐ．８５１（１９９８）を参照。同時投与は混合物、または化学的架橋もしくは融合タンパク質として発現することによって得られる連結分子として構成要素を用いることにより達成することができる。
【０１０３】
あるいは経皮デリバリーは、皮膚パッチを用いることにより、またはトランスフェロゾームを用いることによって達成することができる。例えばポールら（Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，）「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」第２５巻、ｐ．３５２１〜２４（１９９５）；セブら（Ｃｅｖｃ  ｅｔ  ａｌ．，）「Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ」、第１３６８巻（１９９８）、ｐ．２０１〜１５を参照。
【０１０４】
金またはその他抗炎症剤の随伴投与
金の抗炎症作用は十分確立している。例えば、金コロイド注射製剤（Ｍｙｃｏｈｒｙｓｉｎｅ（商標）またはＳｏｌｇａｎａｌ（商標））はリウマチ関節炎の治療用に市販されている。経口投与向け金製剤（Ａｕｒａｎｏｆｉｎ（商標））も利用することができる。脳内の炎症はアルツハイマー病の原因または寄与因子と考えられているが、それは主にアルツハイマー病の患者の脳内に見出されるＡβが炎症性タンパク質として知られているからである。この観点からロフェコキシブ（Ｖｉｏｘｘ）およびナプロキセン（Ａｌｅｖｅ）のような非ステロイド系抗炎症薬を使用してアルツハイマー病の進行を遅らせることを提案している人もいる。同様に炎症は少なくともＡＭＤのような幾つかの網脈絡膜疾患でもある役割を果たしていると信じられており、幾つかの研究は日常的に抗炎症薬（例えば非ステロイド系抗炎症剤、スタチン）を服用している患者ではＡＭＤの発生率が低いことを示している。
【０１０５】
出願者は、組織病理学的観察に基づいて、金コロイドの皮下投与がアミロイド疾患のモデルとなるマウスの脳内において小グリアの活性化を下げることができると判断した。本発明は、神経炎症を下げるのに治療的に有効である量の金コロイド、金塩、またはその他抗炎症剤の被験者への投与を含む。幾つかの例では、金または抗炎症剤は、モノクローナル抗体または免疫原と一緒にすることができる。別の例では、金または抗炎症剤はモノクローナル抗体または免疫原と別々に投与できる。任意の好適な投与量、投薬スケジュール、または投与経路を用いることができる。例えばリウマチ関節炎治療用の市販金製剤は、リウマチ関節炎の治療について推奨されているものと同一の投与経路（Ｍｙｃｏｈｒｙｓｉｎｅ（商標）またはＳｏｌｇａｎａｌ（商標）の皮下注射、またはＡｕｒａｎｏｆｉｎ（商標）の経口投与））および投与量／投薬スケジュールで投与できる。
【０１０６】
前述の発明は、明瞭に理解できることを目的に詳しく説明したが、特定の態様が添付の請求項の範囲内で実行できることは明らかであろう。本願に引用した全ての刊行物および特許文書は、参照によって、全ての目的について、あたかもそれぞれを個別に記したのと同程度にそっくりそのまま本願に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】ドルーゼンのアミロイド原性オリゴマーの免疫局在を示す共焦点レーザー顕微鏡写真の図。特に図１Ａ、図１Ｃ、図１Ｅ、および図１Ｇは微分干渉コントラスト像である；図１Ｂ、図１Ｄ、図１Ｆ、および図１Ｈは、アミロイドオリゴマーコアの共焦点蛍光画像である（緑、ＦＩＴＣチャンネル）。図が示す様に、ドルーゼンは、ドルーゼン内中心部およびブルッフ膜に近接して蓄積するコア様構造形態内にアミロイドオリゴマー活性を示す。ＲＰＥ細胞質内のリポフスチン顆粒の自己蛍光は赤色で画像化されている（Ｃｙ３チャンネル）。（図１Ａおよび図１Ｂ）抗オリゴマー特異抗体は小型ドルーゼン（〜３０μｍ）内の球形構造（〜１５μｍ）を認識する。（図１Ｃ〜１Ｆ）２個の中心のコア構造を有する大型のドルーゼン。（図１Ｇおよび図１Ｈ）８１歳の女性ドナーより得た非常に大型の黄斑軟性ドルーゼン。ドルーゼンの大きさおよび形状に違いはあるが、アミロイドオリゴマーコアの大きさは１０〜１５μｍで一定であった。ＲＰＥ、網膜色素上皮；Ｂｍ、ブルッフ膜。バー＝１０μｍ。
【図２】ドルーゼンおよび肥厚したブルッフ膜内にアミロイドオリゴマーが存在していることを示す図。アミロイドオリゴマーの活性を、フルオロセイン（緑）で視覚化し、リポフスチンの自己蛍光はＣｙ３チャンネル（赤）を用いて視覚化した。大型のドルーゼンについては、あたかも大型ドルーゼンが複数の小型ドルーゼンが融合して形成されたことを示すように、複数のアミロイドオリゴマーコアが観察されることがあった（図２Ａおよび２Ｂ）。アミロイドオリゴマーコアは、そのサイズ、ならびにドルーゼン内およびブルッフ膜近傍での相対位置を維持している。ドルーゼンが存在する眼では、オリゴマーはブルッフ膜の上、特にブルッフ膜が肥厚して現れる場合には基底線（図２Ｃおよび２Ｄ）または基底薄層（図２Ｅ〜２Ｈ）の上の沈着物として蓄積することがあった。ＲＰＥ細胞内が染色されることも観察されている（図２Ｈ）。図２Ｃおよび図２Ｄはそれぞれ図２Ｄおよび図２Ｆの微分干渉コントラスト像である。抗体が凍結切片内でも特異的であることが、隣の大型ドルーゼンの切片で証明されている（図２Ｉおよび図２Ｊ）。複数のアミロイドオリゴマーコアが、抗オリゴマー抗体を用いて視覚化されている（図２Ｉ）。一次抗体を事前にＡβ１−４０ペプチドから合成したアミロイドオリゴマーとインキュベーションすると活性は失われた（図２Ｊ）。ＲＰＥ、網膜色素上皮；Ｂｍ、ブルッフ膜。バー＝１０μｍ。
【図３】抗オリゴマー抗体を用いた網膜抽出物のＥＬＩＳＡの図。（図３Ａ）Ａβ１−４０ペプチドから作製したオリゴマーの量を増やすと、抗オリゴマー特異抗体とインキュベーションした時に用量依存的な反応が起こった（黒丸）。一次抗体なしにＡβ１−４０ペプチドをインキュベーションした場合には、ほとんど、または全く反応性が認められなかった（白丸）。（図３Ｂ）抗オリゴマー特異抗体を、７６歳の男性ドナーより切除したＤｒ／ＲＰＥ／Ｂｍ組織から調製した抽出物と、量を増やしながらインキュベーションすると用量依存的な反応が観察された（黒丸）。一次抗体を省くと反応性はほとんど、または全く観察されなかった（白丸）。複数のドナー眼球の神経網膜（黒三角）から調製した抽出物は、抗オリゴマー特異抗体とインキュベーションした時に用量依存的な反応を示さなかった。Ｄｒ、ドルーゼン；ＲＰＥ、網膜色素上皮；Ｂｍ、ブルッフ膜。
【図４】ドルーゼン中のアミロイドオリゴマーコアの形態を高倍率で示す図。（図４Ａ〜４Ｃ）ドルーゼンの共焦点顕微鏡写真。アミロイドオリゴマーコアはフルオロセインで標識し（緑）、ＲＰＥ中のリポフスチンの自己蛍光は赤色で視覚化されている（Ｃｙ３チャンネル）。アミロイドオリゴマーコアは、中心に向かって密度を増す小型小胞構造物の集合体（白色矢印）から成っていると考えられている。これらの小胞構造物の幾つかは、ＲＰＥに向かって、密度を下げながら伸びていると思われる（Ｂ、矢ジリ）。時にアミロイドオリゴマーコアはブルッフ膜を貫通して脈絡膜に向かって伸びていることが分かる（図４Ｃ、矢ジリ）。アミロイドオリゴマーコアの超構造は、電子顕微鏡写真の中で免疫金標識されて描かれており（図４Ｄ、挿入図）、様々な大きさの小胞構造を金粒子が修飾している。Ｄでは、ブルッフ膜の上に最も高密度な金粒子の領域が認められる（長方形、図４Ｄ）。ＲＰＥ、網膜色素上皮；Ｂｍ、ブルッフ膜；Ｃｈ、脈絡膜。バー（図４Ｅ）＝２μｍ。バー（図４Ｆ）＝１００ｎｍ。
【図５】アミロイドオリゴマーコアと他の既知ドルーゼン成分との同時分布を示す図。全ての共焦点画像において、アミロイドオリゴマーコアはフルオロセインで標識されている。ＨＬＡ−ＤＲはテキサスレッドで標識されている（図５Ｂ〜５Ｄ）。両抗原は、大型ドルーゼンに存在するが（図５Ａ、微分干渉コントラスト；図５Ｂ、共焦点顕微鏡）、この時アミロイドオリゴマーコアはＨＬＡ−ＤＲ反応領域内に包まれている。倍率を上げると、これらのドルーゼンではアミロイドオリゴマーコアおよびＨＬＡ−ＤＲ反応性サブドメインが重複して存在していないことが明らかとなった。一つの例では、ＨＬＡ−ＤＲ反応性領域、おそらくは樹状細胞突起を表すと思われる領域が、脈絡膜を起点として、ブルッフ膜近くに達し、アミロイドオリゴマーコアである小胞構造が集まっている部分に接触することが観察される（図５Ｃ）。別の例では、ＨＬＡ−ＤＲ反応性は脈絡膜、ブルッフ膜、およびドルーゼンを取り囲む形で観察される。ドルーゼンの中では、ＨＬＡ−ＤＲ反応性はオリゴマーコアを囲む様に見え、重複しては存在していない（図５Ｄ）。同様に、共にテキサスレッドで標識したビンブラスチン（図５Ｆ〜５Ｈ）またはＡβ（図５Ｊ〜５Ｌ）も重複して存在していない。ＲＰＥ内のリポフスチンの自己蛍光もＣｙ３チャンネル内で視覚化されている。Ｄｒ，ドルーゼン；ＲＰＥ、網膜色素上皮；Ｂｍ、ブルッフ膜。バー（図４Ｅ）＝１０μｍ。
【図６】アミロイドオリゴマーは初代培養ヒトＲＰＥ細胞にとって有毒であることを示す図。細胞生存率はＭＴＴ還元によって評価した。Ａβから作られたアミロイドオリゴマーの量の増加は、培養ＲＰＥ細胞に対する用量依存的な毒性を示した。この毒性は、等モルの抗オリゴマー抗体Ａ１１を投与することによってほぼ遮断された。誤差バーは、Ｎ＝３での標準偏差を表している。
【図１Ａ】
2008527005.tif 000004
【図１Ｂ】
2008527005.tif 000005
【図１Ｃ】
2008527005.tif 000006
【図１Ｄ】
2008527005.tif 000007
【図１Ｅ】
2008527005.tif 000008
【図１Ｆ】
2008527005.tif 000009
【図１Ｇ】
2008527005.tif 000010
【図１Ｈ】
2008527005.tif 000011
【図２Ａ】
2008527005.tif 000012
【図２Ｂ】
2008527005.tif 000013
【図２Ｃ】
2008527005.tif 000014
【図２Ｄ】
2008527005.tif 000015
【図２Ｅ】
2008527005.tif 000016
【図２Ｆ】
2008527005.tif 000017
【図２Ｇ】
2008527005.tif 000018
【図２Ｈ】
2008527005.tif 000019
【図２Ｉ】
2008527005.tif 000020
【図２Ｊ】
2008527005.tif 000021
【図３】
2008527005.tif 000022
【図４Ａ】
2008527005.tif 000023
【図４Ｂ】
2008527005.tif 000024
【図４Ｃ】
2008527005.tif 000025
【図４Ｄ】
2008527005.tif 000026
【図５Ａ】
2008527005.tif 000027
【図５Ｂ】
2008527005.tif 000028
【図５Ｃ】
2008527005.tif 000029
【図５Ｄ】
2008527005.tif 000030
【図５Ｅ】
2008527005.tif 000031
【図５Ｆ】
2008527005.tif 000032
【図５Ｇ】
2008527005.tif 000033
【図５Ｈ】
2008527005.tif 000034
【図５Ｉ】
2008527005.tif 000035
【図５Ｊ】
2008527005.tif 000036
【図５Ｋ】
2008527005.tif 000037
【図５Ｌ】
2008527005.tif 000038
【図６】
2008527005.tif 000039
【配列表】
2008527005000001.app
【国際調査報告】
2008527005.tif 000040
2008527005.tif 000041
2008527005.tif 000042