(57)【要約】本発明はとりわけ、癌を処置する方法、癌を処置するための組成物、並びに癌を診断及び／又は検出するための方法及び組成物を提供する。具体的には、本発明は、ＥｐｈＢ３の過剰発現に関連する癌を処置、診断及び検出するための組成物及び方法を提供する。幾つかの態様において、本発明は、ＥｐｈＢ３モジュレーター及び１つ以上の薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。ＥｐｈＢ３モジュレーターは、受容体のリン酸化の誘導、受容体のオリゴマー形成の誘導、受容体の内在化の誘導、受容体の分解の誘導、リガンド様ＥｐｈＢ３シグナル伝達の誘導、ＥｐｈＢ３が媒介する細胞−細胞接着の誘導、及びＥｐｈＢ３発現の阻害からなる群より選択される１つ以上の活性を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥｐｈＢ３モジュレーター及び１つ以上の薬学的に許容される担体を含む組成物であって、
該ＥｐｈＢ３モジュレーターが、受容体のリン酸化の誘導、受容体のオリゴマー形成の誘導、受容体の内在化の誘導、受容体の分解の誘導、リガンド様ＥｐｈＢ３シグナル伝達の誘導、ＥｐｈＢ３が媒介する細胞−細胞接着の誘導、及びＥｐｈＢ３発現の阻害からなる群より選択される１つ以上の活性を有する、組成物。
【請求項２】
前記組成物が無菌の注射剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＥｐｈＢ３モジュレーターが、ＥｐｈＢ３のリン酸化、ＥｐｈＢ３のオリゴマー形成、ＥｐｈＢ３受容体の内在化、及びＥｐｈＢ３の分解の１つ以上を誘導する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＥｐｈＢ３モジュレーターがＥｐｈＢ３の分解を誘導する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＥｐｈＢ３モジュレーターが、細胞内アダプタータンパク質へのＥｐｈＢ３の結合を刺激する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＥｐｈＢ３モジュレーターが、ＦＡＫ、Ｅｒｋ／ＭＡＰＫ経路、Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ経路、Ａｂｌ／Ａｒｇ、Ｆｙｎ、Ｓｒｃ、ＬＭＷ−ＰＴＰ、インターセクチン、Ｃｄｃ４２経路、Ｋａｌｉｒｉｎ又はＲａｃ経路の１つ以上を阻害及び／又は不活性化する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＥｐｈＢ３モジュレーターがＲ−ｒａｓを活性化及び／又は刺激する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＥｐｈＢ３モジュレーターがＲ−ｒａｓのリン酸化を誘導する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＥｐｈＢ３モジュレーターが、オリゴヌクレオチド、小分子、模倣物、可溶性受容体、デコイ又は抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＥｐｈＢ３モジュレーターが、少なくとも１×１０８Ｋａの親和性でＥｐｈＢ３と結合するモノクローナル抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＥｐｈＢ３モジュレーターが、ＥｐｈＢ３に選択的に結合し、１つ以上のＥｐｈＢ３関連生物活性を調節するモノクローナル抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記モノクローナル抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記モノクローナル抗体がＥｐｈＢ３のエピトープと結合し、該エピトープが配列番号１４〜４２４からなる群より選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記モノクローナル抗体がＥｐｈＢ３のエピトープと結合し、該エピトープが、リガンド結合ドメイン、ＴＮＦＲドメイン、第一のフィブロネクチンドメイン、及び第二のフィブロネクチンドメインからなる群より選択されるドメイン中にある、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
前記モノクローナル抗体がＥｐｈＢ３のリガンド結合ドメインのエピトープと結合し、該エピトープが配列番号１４〜１４８からなる群より選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記モノクローナル抗体がＥｐｈＢ３のＴＮＦＲドメインのエピトープと結合し、該エピトープが配列番号１６４〜２６２からなる群より選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記モノクローナル抗体がＥｐｈＢ３の第一のフィブロネクチンドメインのエピトープと結合し、該エピトープが配列番号２６３〜３０４からなる群より選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
前記モノクローナル抗体がＥｐｈＢ３の第二のフィブロネクチンドメインのエピトープと結合し、該エピトープが配列番号３８３〜４２４からなる群より選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１９】
前記モノクローナル抗体がＥｐｈＢ３のリガンド結合ドメインと結合しない、請求項１０に記載の組成物。
【請求項２０】
前記モノクローナル抗体がＥｐｈＢ２ともＥｐｈＢ４とも交差反応しない、請求項１０に記載の組成物。
【請求項２１】
前記モノクローナル抗体が、ＥｐｈＢ３のリン酸化、ＥｐｈＢ３のオリゴマー形成、ＥｐｈＢ３の内在化、及びＥｐｈＢ３の分解の１つ以上を誘導する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ＥｐｈＢ３モジュレーターが、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号４２５からなる群より選択される配列を有するオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
処置を必要とする患者における癌又は癌症状を処置する方法であって、請求項１に記載のＥｐｈＢ３モジュレーターの治療有効量を該患者に投与することを含む、方法。
【請求項２４】
前記ＥｐｈＢ３モジュレーターがＥｐｈＢ３の分解を促進する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＥｐｈＢ３モジュレーターが、ＥｐｈＢ３の発現を、対照に比べて少なくとも５０％阻害する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＥｐｈＢ３モジュレーターが、オリゴヌクレオチド、小分子、模倣物、可溶性受容体、デコイ又は抗体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＥｐｈＢ３モジュレーターが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体又はＦａｂフラグメントである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体が標識されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記標識が、酵素、放射性同位元素、毒素又はフルオロフォアである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体が、ＥｐｈＢ３以外のポリペプチドに対して、約１×１０５Ｋａ未満の結合親和性を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＥｐｈＢ３モジュレーターがモノクローナル抗体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記モノクローナル抗体が、少なくとも１×１０８Ｋａの親和性でＥｐｈＢ３と結合する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記モノクローナル抗体がＥｐｈＢ３のエピトープと結合し、該エピトープが配列番号１４〜４２４からなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記モノクローナル抗体がＥｐｈＢ３のエピトープと結合し、該エピトープが、リガンド結合ドメイン、ＴＮＦＲドメイン、第一のフィブロネクチンドメイン、及び第二のフィブロネクチンドメインからなる群より選択されるドメイン中にある、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記モノクローナル抗体がＥｐｈＢ３のリガンド結合ドメインのエピトープと結合し、該エピトープが配列番号１４〜１４８からなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記モノクローナル抗体がＥｐｈＢ３のＴＮＦＲドメインのエピトープと結合し、該エピトープが配列番号１６４〜２６２からなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記モノクローナル抗体がＥｐｈＢ３の第一のフィブロネクチンドメインのエピトープと結合し、該エピトープが、配列番号２６３〜３０４からなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記モノクローナル抗体がＥｐｈＢ３の第二のフィブロネクチンドメインのエピトープと結合し、該エピトープが配列番号３８３〜４２４からなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記モノクローナル抗体がＥｐｈＢ３のリガンド結合ドメインと結合しない、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
前記モノクローナル抗体がＥｐｈＢ２ともＥｐｈＢ４とも結合しない、請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】
前記モノクローナル抗体が、ＥｐｈＢ３のリン酸化、ＥｐｈＢ３のオリゴマー形成、ＥｐｈＢ３の内在化、及びＥｐｈＢ３の分解の１つ以上を誘導する、請求項３１に記載の方法。
【請求項４２】
前記癌が、卵巣癌、食道癌、大腸癌、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、肺癌、胃癌又は膵臓癌である、請求項２３に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＥｐｈＢ３モジュレーターが、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号４２５からなる群より選択される配列を有するオリゴヌクレオチドである、請求項２６に記載の方法。
【請求項４４】
従来の癌治療薬を前記患者に投与することを更に含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項４５】
前記患者を化学療法、放射線療法又は手術の１つ以上により処置することを更に含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項４６】
前記癌症状が、疼痛、死亡、体重減少、衰弱、摂食困難、血便、吐き気、嘔吐、肝転移、肺転移、骨転移、腹部膨満、鼓脹、腹腔内の体液、膣出血、便秘、腹部膨張、大腸穿孔、急性腹膜炎（感染、発熱、疼痛）、吐血、及び嚥下困難からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項４７】
患者におけるＥｐｈＢ３関連生物活性を調節する方法であって、該ＥｐｈＢ３生物活性を調節するのに有効な量の請求項１に記載のＥｐｈＢ３モジュレーターを該患者に投与することを含む、方法。
【請求項４８】
前記ＥｐｈＢ３モジュレーターがＥｐｈＢ３に選択的に結合するモノクローナル抗体である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記患者が、卵巣癌、食道癌、大腸癌、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、肺癌、胃癌又は膵臓癌の１つ以上に罹患しているか、罹患しやすい傾向にある、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＥｐｈＢ３モジュレーターが抗体であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでの治療抗体遺伝子導入を介して被験体に投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項５１】
ＥｐｈＢ３療法に感受性がある患者を同定するための方法であって、
（ａ）試料におけるＥｐｈＢ３の発現の証拠の有無を検出する工程であって、該試料におけるＥｐｈＢ３の発現の証拠の存在が、ＥｐｈＢ３療法の候補である患者を示し、該試料におけるＥｐｈＢ３の発現の証拠の不在が、ＥｐｈＢ３療法の候補ではない患者を示す、工程；
（ｂ）該患者がＥｐｈＢ３療法の候補である場合に、請求項１に記載の組成物の治療有効量を該患者に投与する工程；
（ｃ）該患者がＥｐｈＢ３療法の候補ではない場合に、従来の癌治療薬を該患者に投与する工程
を包含する、方法。
【請求項５２】
ＥｐｈＢ３の発現が、対照に比べて少なくとも３０％増加する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ＥｐｈＢ３の発現の証拠が、ＥｐｈＢ３のＲＮＡの測定により検出される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
ＥｐｈＢ３の発現の証拠が、ＥｐｈＢ３の発現産物の測定により検出される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記患者が、卵巣癌、食道癌、大腸癌、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、肺癌、胃癌又は膵臓癌の１つ以上に罹患しているか、罹患しやすい傾向にある、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
従来の癌治療薬を前記患者に投与することを更に含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
投与を必要とする患者における癌細胞の増殖を阻害するための方法であって、請求項１に記載のＥｐｈＢ３モジュレーターの治療有効量を該患者に投与することを含む、方法。
【請求項５８】
前記ＥｐｈＢ３モジュレーターが、ＥｐｈＢ３に選択的に結合し、受容体の分解を誘導するモノクローナル抗体である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＥｐｈＢ３モジュレーターが、ＥｐｈＢ３に選択的に結合し、ＥｐｈＢ３の発現を阻害するモノクローナル抗体である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
投与を必要とする患者における癌細胞表現型を阻害するための方法であって、請求項１に記載のＥｐｈＢ３モジュレーターの治療有効量を該患者に投与することを含む、方法。
【請求項６１】
前記癌細胞表現型が、軟寒天中のコロニー形成、及び三次元基底膜又は細胞外膜標本中の管状ネットワーク形成の１つ以上である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
従来の癌治療薬を前記患者に投与することを更に含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
化学療法、放射線療法又は手術の１つ以上によって前記患者を処置することを更に含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記癌細胞が、卵巣癌細胞、食道癌細胞、大腸癌細胞、前立腺癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、肺癌細胞、胃癌細胞又は膵臓癌細胞である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
患者における腫瘍を検出するための方法であって、造影剤と結合した、請求項１に記載のＥｐｈＢ３モジュレーターを含む組成物を該患者に投与する工程、ならびに該患者における該造影剤の位置を検出する工程を包含する、方法。
【請求項６６】
前記ＥｐｈＢ３モジュレーターが、小分子、オリゴヌクレオチド、模倣物、可溶性受容体、デコイ受容体又は抗体からなる群より選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記組成物が、造影剤と結合体化した抗ＥｐｈＢ３抗体を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記造影剤が、１８Ｆ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、７７Ｂｒ、８７ＭＳｒ、８６Ｙ、９０Ｙ、９９ＭＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１２７Ｃｓ、１２９Ｃｓ、１３１Ｉ、１３２Ｉ、１９７Ｈｇ、２０３Ｐｂ、又は２０６Ｂｉである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
ＣＨＯ又は骨髄腫細胞において抗ＥｐｈＢ３抗体を発現させるための方法であって、該ＣＨＯ又は骨髄腫細胞中で該抗ＥｐｈＢ３抗体をコードする核酸を発現させる工程を包含する、方法。
【請求項７０】
癌の阻害剤を同定するための方法であって、該癌は対照と比べたＥｐｈＢ３の過剰発現によって特徴付けられ、該方法は、ＥｐｈＢ３を発現する細胞と候補化合物とを接触させる工程、およびＥｐｈＢ３関連生物活性が誘導されるか否かを検出する工程を包含し、該誘導されたＥｐｈＢ３関連生物活性が、受容体のリン酸化、受容体のオリゴマー形成、受容体の分解、及び受容体のシグナル伝達からなる群より選択され、該ＥｐｈＢ３関連生物活性の誘導が癌の阻害剤を示す、方法。
【請求項７１】
癌の阻害剤を同定するための方法であって、該癌はＥｐｈＢ３の過剰発現によって特徴付けられ、該方法は、ＥｐｈＢ３を発現する細胞と候補化合物及びＥｐｈＢ３リガンドとを接触させる工程、ならびにＥｐｈＢ３関連生物活性が誘導されるか否かを検出する工程を包含し、該誘導されたＥｐｈＢ３関連生物活性が、受容体のリン酸化、受容体のオリゴマー形成、受容体の分解、及び受容体のシグナル伝達からなる群より選択され、該ＥｐｈＢ３関連生物活性の誘導が癌の阻害剤を示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般的に腫瘍学の分野に関する。より具体的には、本発明は、癌を処置する方法、癌を処置するための組成物、並びに癌を診断及び／又は検出するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
米国において癌は第二の主要な死因である。「癌」という用語は、種々のタイプの癌（即ち、乳癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌、膵臓癌）を説明するために使用されるが、各タイプの癌は、表現型レベル及び遺伝子レベルの両方で異なる。１つ以上の遺伝子の発現が変異のために調節不全になると、癌の増殖特性が調節されなくなり、細胞増殖はもはや調節できなくなる。
【０００３】
遺伝子はしばしば、癌遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子という２つのクラスに分類される。癌遺伝子は、正常な機能において細胞増殖を促進するが、特定の条件下でのみ促進する遺伝子である。癌遺伝子が変異し、その調節を失うと、あらゆる条件下で増殖を促進する。しかし、癌が真の意味で目的を果たすには、腫瘍抑制遺伝子の変異を得なければならないことが明らかになっている。腫瘍抑制遺伝子の正常な機能は、細胞増殖を停止させることである。腫瘍抑制因子には、ｐ５３、ｐ１６、ｐ２１及びＡＰＣが含まれ、これらは全て、正常に作用すると、細胞が調節不能に分裂及び増殖するのを妨げる。腫瘍抑制因子が突然変異するか、欠失すると、細胞増殖における抑制機構も消失し、細胞が制限なく増殖できるようになる。
【０００４】
幾つかの分子は、乳癌及び前立腺癌を含む種々の癌において過剰発現することが示されている。ＥｐｈＢ３は特定の癌細胞中に存在することが以前に示されたが、卵巣及び食道癌を含む幾つかのタイプの癌におけるＥｐｈＢ３の機能的役割については報告されていない。
【０００５】
ＥｐｈＢ３は、エフリン受容体チロシンキナーゼファミリーにおける受容体である。現在、ヒトにおいて１４種のＥｐｈ受容体及び８種のエフリンリガンドが知られている。エフリン受容体（Ｅｐｈｓ）及びそれらのリガンドであるエフリンは、特に神経系及び血管系において、多くの発生過程を媒介する。エフリンは又、腫瘍の発生、血管形成、転移成長及び細胞生存において役割を果たすことが知られている。それらの構造及び配列の関連性に基づき、エフリンは、グリコシルホスファチジルイノシトール結合により膜に固定されているエフリン−Ａ（ＥＦＮＡ）クラス、及び膜貫通タンパク質であるエフリン−Ｂ（ＥＦＮＢ）クラスに分類される。受容体のＥｐｈファミリーは、細胞外ドメイン配列の類似点、並びにエフリン−Ａ及びエフリン−Ｂリガンドを結合する親和性に基づいて２つのグループに分類される。Ｅｐｈ受容体は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ファミリーの最も大きなサブグループを構成する。
【０００６】
Ｅｐｈ受容体は癌と関係がある。ＥｐｈＡ１で形質転換され、ヌードマウスに移植されたＮＩＨ３Ｔ３細胞は、５〜６週間で１０ｍｍの腫瘍を生成するが、ベクター制御は同じ期間に腫瘍を生成しない（非特許文献１）。ＥｐｈＢ２は、正常組織に比べて、胃癌（１２／１６）、大腸癌（３／１１）、食道癌（３／６）、卵巣癌（１／７）、腎臓癌（１／２）及び肺癌（１／１）において高いレベルで発現する（非特許文献２）。ＥｐｈＢ６の発現は、悪性度の低い神経芽細胞腫と関連する。ＥｐｈＢ６のキナーゼドメインは活性でないため、この受容体は、天然のドミナントネガティブとして作用することが提案されている（非特許文献３）。
【０００７】
血管形成におけるエフリンの関与を示す証拠は益々増えてきている。エフリンＡ１、エフリンＢ１、エフリンＢ２、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３及びＥｐｈＢ４は、血管内で発現することが報告されている。エフリンＡ１は、ラット角膜モデルにおいて血管形成を誘導することができ、エフリンＡ１に対する抗体は、この同じモデルにおいてＴＮＦ−αが誘導する血管形成を阻害することができる（非特許文献４）。クラスター化されたエフリンＢ１は、奇形腫由来のマウス細胞株のＰ１９及びヒト腎臓微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）における細胞の接着及び毛細血管様の集合を誘導する（非特許文献５）。クラスター化されたエフリンＢ１及びエフリンＢ２は又、副腎皮質が誘導する微小血管内皮細胞（ＡＣＥ）の出芽を誘導することができる（非特許文献６）。アフリカツメガエルの胎児へのドミナントネガティブなＥｐｈＢ４受容体のＲＮＡインジェクションは、体節内血管が隣接する体節へ異常に伝達させる（非特許文献７）。ＥｐｈＢ２／ＥｐｈＢ３の二重ノックアウト、ＥｐｈＢ４及びエフリンＢ２ノックアウトマウスは全て、血管再構築欠陥を有する（非特許文献６；非特許文献８；特許文献１）。ＥｐｈＢ２は、大腸及び胃癌において上方制御されることが示されている（非特許文献２）。
【０００８】
エフリンは又、腫瘍の転移においても役割を果たしている。ＥｐｈＢ３又はＥｐｈＢ２の何れかで形質転換した２９３Ｔヒト上皮性腎臓細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、フィブロネクチン又はコラーゲンでコーティングした表面に対する細胞接着の減少を示す。２９３細胞の接着不良は、ＥｐｈＢ２によるＲ−ｒａｓのリン酸化反応、及びそれに続くインテグリン非活性化により媒介された（非特許文献９）。
【０００９】
エフリンは、活性化の際に信号を送ることによって機能するようと思われる。エフリンの結合は、Ｅｐｈの膜近傍の残基のリン酸化の原因となるＥｐｈ受容体のオリゴマー形成を誘導する。活性化されたＥｐｈは、シグナル伝達タンパク質の結合部位として作用する複数のリン酸化チロシンを有する（ＲａｓＧａｐｓ、Ｓｒｃ、ＬＭＷ−ＰＴＰ、ＦＡＫ、ｃｄｃ４２／Ｒａｃ、ＰＬＣｇ、ＰＩ３−キナーゼ、Ｇｒｂ２、Ｒｈｏ及びＰＤＺ含有タンパク質）。
【００１０】
Ｅｐｈ受容体（ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＢ２）の過剰発現は、受容体リン酸化の非存在下で形質転換を引き起こす。ＥｐｈＢ受容体は、Ｒａｓ−ＭＡＰ−キナーゼ経路及びＦＡＫシグナル伝達をネガティブに制御し、細胞増殖を低下させる。
【００１１】
（Ｈｅｋ２、Ｓｅｋ４、Ｍｄｋ５、Ｔｙｒｏ６、Ｃｅｋ１０及びＱｅｋ１０としても知られる）ＥｐｈＢ３は、エフリン−Ｂファミリーメンバー（エフリン−Ｂ１、エフリン−Ｂ２及びエフリン−Ｂ３）の受容体であり、正常組織及び特定の腫瘍及びガン細胞株中で発現することが知られている。しかし、これまでのところ、癌におけるＥｐｈＢ３の役割は解明されていない。
【特許文献１】国際公開第００／３０６７３号パンフレット
【非特許文献１】Ｍａｒｕら、  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  １９９０  Ｍａｒ；５（３）：４４５−７
【非特許文献２】Ｋｉｙｏｋａｗａら、  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９４  Ｊｕｌ  １５；５４（１４）：３６４５−５０
【非特許文献３】Ｔａｎｇら、  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９ａ  Ｊｕｎ；５（６）：１４９１−６
【非特許文献４】Ｐａｎｄｅｙら、  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５  Ａｐｒ  ２８；２６８（５２１０）：５６７−９
【非特許文献５】Ｓｔｅｉｎら、  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １９９８  Ｍａｒ  １；１２（５）：６６７−７８
【非特許文献６】Ａｄａｍｓら、  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １９９９  Ｆｅｂ  １；１３（３）：２９５−３０６
【非特許文献７】Ｈｅｌｂｌｉｎｇら、  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２０００  Ｊａｎ；１２８（２）：２６９−７８
【非特許文献８】Ｗａｎｇら、  Ｃｅｌｌ  １９９８  Ｍａｙ  ２９；９３（５）：７４１−５３
【非特許文献９】Ｚｏｕら、  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９９  Ｎｏｖ  ２３：９６（２４）：１３８１３−８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
このような癌におけるＥｐｈＢ３及びその役割を調節する組成物及び方法を特定することが必要とされている。本発明は、これら及びその他の重要な必要性を対象とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
幾つかの態様において、本発明は、ＥｐｈＢ３モジュレーター及び１つ以上の薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。ＥｐｈＢ３モジュレーターは、受容体のリン酸化の誘導、受容体のオリゴマー形成の誘導、受容体の内在化の誘導、受容体の分解の誘導、リガンド様ＥｐｈＢ３シグナル伝達の誘導、ＥｐｈＢ３が媒介する細胞−細胞接着の誘導、及びＥｐｈＢ３発現の阻害からなる群より選択される１つ以上の活性を有する。幾つかの実施形態において、組成物は無菌の注射剤である。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、ＥｐｈＢ３のリン酸化、ＥｐｈＢ３のオリゴマー形成、ＥｐｈＢ３受容体の内在化、及びＥｐｈＢ３の分解の１つ以上を誘導する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターはＥｐｈＢ３の分解を誘導する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、ＥｐｈＢ３と細胞内アダプタータンパク質との結合を促進する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、ＦＡＫ、Ｅｒｋ／ＭＡＰＫ経路、Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ経路、Ａｂｌ／Ａｒｇ、Ｆｙｎ、Ｓｒｃ、ＬＭＷ−ＰＴＰ、インターセクチン、Ｃｄｃ４２経路、Ｋａｌｉｒｉｎ又はＲａｃ経路の１つ以上を阻害及び／又は不活性化する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、Ｒ−ｒａｓを活性化及び／又は促進する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、Ｒ−ｒａｓのリン酸化を誘導する。
【００１４】
幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、オリゴヌクレオチド、小分子、模倣物、可溶性受容体、デコイ又は抗体である。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、少なくとも１×１０８Ｋａの親和性でＥｐｈＢ３と結合するモノクローナル抗体である。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、ＥｐｈＢ３を選択的に結合し、１つ以上のＥｐｈＢ３関連生物活性するモノクローナル抗体である。幾つかの実施形態において、モノクローナル抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である。幾つかの実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号１４〜４２４からなる群より選択されるＥｐｈＢ３のエピトープと結合する。幾つかの実施形態において、モノクローナル抗体はＥｐｈＢ３のエピトープと結合する。幾つかの実施形態において、ドメインは、リガンド結合ドメイン、ＴＮＦＲドメイン、第一のフィブロネクチンドメイン、及び第二のフィブロネクチンドメインからなる群より選択される。幾つかの実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号１４〜１４８からなる群より選択されるＥｐｈＢ３のリガンド結合ドメインのエピトープと結合する。幾つかの実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号１６４〜２６２からなる群より選択されるＥｐｈＢ３のＴＮＦＲドメインのエピトープと結合する。幾つかの実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号２６３〜３０４からなる群より選択されるＥｐｈＢ３の第一のフィブロネクチンドメインのエピトープと結合する。幾つかの実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号３８３〜４２４からなる群より選択されるＥｐｈＢ３の第二のフィブロネクチンドメインのエピトープと結合する。幾つかの実施形態において、モノクローナル抗体は、ＥｐｈＢ３のリガンド結合ドメインと結合しない。幾つかの実施形態において、モノクローナル抗体は、ＥｐｈＢ２ともＥｐｈＢ４とも交差反応しない。幾つかの実施形態において、モノクローナル抗体は、ＥｐｈＢ３のリン酸化、ＥｐｈＢ３のオリゴマー形成、ＥｐｈＢ３の内在化、及びＥｐｈＢ３の分解の１つ以上を誘導する。
【００１５】
幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号４２５からなる群より選択される配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００１６】
幾つかの態様において、本発明は、処置を必要とする患者における癌又は癌症状を処置する方法であって、ＥｐｈＢ３モジュレーターの治療有効量を患者に投与することを含む方法を提供する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターはＥｐｈＢ３の分解を促進する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、ＥｐｈＢ３の発現を、対照に比べて少なくとも５０％阻害する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、オリゴヌクレオチド、小分子、模倣物、可溶性受容体、デコイ又は抗体である。
【００１７】
幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体又はＦａｂフラグメントである。幾つかの実施形態において、抗体は標識される。幾つかの実施形態において、標識は、酵素、放射性同位元素、毒素又はフルオロフォアである。幾つかの実施形態において、抗体は、ＥｐｈＢ３以外のポリペプチドに対して、約１×１０５Ｋａ未満の結合親和性を有する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターはモノクローナル抗体である。
【００１８】
幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号４２５からなる群より選択される配列を有するオリゴヌクレオチドである。本方法の幾つかの実施形態において、癌は、卵巣癌、食道癌、大腸癌、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、肺癌、胃癌又は膵臓癌である。
【００１９】
幾つかの実施形態において、癌症状は、疼痛、死亡、体重減少、衰弱、摂食困難、血便、吐き気、嘔吐、肝転移、肺転移、骨転移、腹部膨満、腫脹、腹腔内の体液、膣出血、便秘、腹部膨張、大腸穿孔、急性腹膜炎（感染、発熱、疼痛）、吐血、及び嚥下困難からなる群より選択される。
【００２０】
幾つかの実施形態において、本方法は、従来の癌治療薬を患者に投与することを更に含む。幾つかの実施形態において、本方法は、化学療法、放射線療法又は手術の１つ以上による患者の処置を更に含む。
【００２１】
幾つかの態様において、本発明は、患者においてＥｐｈＢ３関連生物活性を調節する方法を提供する。本方法は、ＥｐｈＢ３生物活性を調節するのに有効な量のＥｐｈＢ３モジュレーターを患者に投与することを含む。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、ＥｐｈＢ３を選択的に結合するモノクローナル抗体である。幾つかの実施形態において、患者は、卵巣癌、食道癌、大腸癌、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、肺癌、胃癌又は膵臓癌に罹患しているか、罹患しやすい傾向にある。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは抗体であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでの治療抗体遺伝子導入を介して患者に投与される。
【００２２】
幾つかの更なる態様において、本発明は、ＥｐｈＢ３治療薬に感受性がある患者を特定する方法を提供する。本方法は、前記試料におけるＥｐｈＢ３の発現の証拠の有無を検出することを含む。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３の発現は、対照に比べて少なくとも３０％増加する。前記試料におけるＥｐｈＢ３の発現の証拠の存在は、ＥｐｈＢ３治療薬の対象である患者を示すのに対し、前記試料におけるＥｐｈＢ３の発現の形成の非存在は、ＥｐｈＢ３治療薬の対象でない患者を示す。本方法は又、患者がＥｐｈＢ３治療薬の対象である場合に、ＥｐｈＢ３モジュレーターの治療有効量を患者に投与し；患者がＥｐｈＢ３療法の対象でない場合に、従来の癌治療薬を患者に投与することを含む。
【００２３】
幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３の発現の証拠は、ＥｐｈＢ３のＲＮＡの測定により検出される。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３の発現の証拠は、ＥｐｈＢ３の発現産物の測定により検出される。幾つかの実施形態において、患者は、卵巣癌、食道癌、大腸癌、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、肺癌、胃癌又は膵臓癌の１つ以上に罹患しているか、罹患しやすい傾向にある。
【００２４】
幾つかの態様において、本発明は、処置を必要とする患者における癌細胞の増殖を阻害する方法であって、ＥｐｈＢ３モジュレーターの治療有効量を患者に投与することを含む方法を提供する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、ＥｐｈＢ３を選択的に結合し、受容体の分解を誘導するモノクローナル抗体である。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、ＥｐｈＢ３を選択的に結合し、ＥｐｈＢ３の発現を阻害するモノクローナル抗体である。
【００２５】
幾つかの更なる態様において、本発明は、処置を必要とする患者における癌細胞表現型を阻害する方法を提供する。本方法は、ＥｐｈＢ３モジュレーターの治療有効量を患者に投与することを含む。幾つかの実施形態において、癌細胞表現型は、軟寒天中のコロニー形成、及び三次元基底膜又は細胞外膜標本中のネットワーク形成の１つ以上である。幾つかの実施形態において、癌細胞は、卵巣癌、食道癌、大腸癌、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、肺癌、胃癌又は膵臓癌細胞からなる群より選択される。
【００２６】
本発明の更なる態様は、患者における腫瘍を検出する方法であって、造影剤と結合したＥｐｈＢ３モジュレーターを含む組成物を患者に投与し、患者における造影剤の位置を検出することを含む方法を提供する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、小分子、オリゴヌクレオチド、模倣物、可溶性受容体、デコイ受容体又は抗体からなる群より選択される。幾つかの実施形態において、組成物は、造影剤と結合した抗ＥｐｈＢ３抗体を含む。幾つかの実施形態において、造影剤は、１８Ｆ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、７７Ｂｒ、８７ＭＳｒ、８６Ｙ、９０Ｙ、９９ＭＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１２７Ｃｓ、１２９Ｃｓ、１３１Ｉ、１３２Ｉ、１９７Ｈｇ、２０３Ｐｂ、又は２０６Ｂｉである。
【００２７】
幾つかの更なる態様において、本発明は、ＣＨＯ又は骨髄腫細胞において抗ＥｐｈＢ３抗体を発現する方法を提供する。本方法は、ＣＨＯ又は骨髄腫細胞中で抗ＥｐｈＢ３抗体をコードする核酸を発現することを含む。
【００２８】
幾つかの態様において、本発明は、癌の阻害剤を同定するための方法であって、対照に比べてＥｐｈＢ３の過剰発現によって癌が特徴付けられる方法を提供する。本方法は、ＥｐｈＢ３を発現する細胞を候補化合物と接触させ、ＥｐｈＢ３関連生物活性が誘導されるか否かを検出することを含む。幾つかの実施形態において、誘導されたＥｐｈＢ３関連生物活性は、受容体のリン酸化、受容体のオリゴマー形成、受容体の分解、及び受容体のシグナル伝達からなる群より選択され、ＥｐｈＢ３関連生物活性の誘導が癌の阻害剤を示す。
【００２９】
幾つかの更なる態様において、本発明は、癌の阻害剤を同定するための方法であって、ＥｐｈＢ３の過剰発現によって癌が特徴付けられる方法を提供する。本方法は、ＥｐｈＢ３を発現する細胞を候補化合物及びＥｐｈＢ３リガンドと接触させ、ＥｐｈＢ３関連生物活性が誘導されるか否かを検出することを含む。幾つかの実施形態において、誘導されたＥｐｈＢ３関連生物活性は、受容体のリン酸化、受容体のオリゴマー形成、受容体の分解、及び受容体のシグナル伝達からなる群より選択され、ＥｐｈＢ３関連生物活性の誘導が癌の阻害剤を示す。
【００３０】
本発明のこれらの及びその他の態様を、本発明の以下の詳細な説明において説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
（詳細な説明）
本発明は、癌を処置、診断及び画像化する、具体的には、ＥｐｈＢ３に関連する癌を処置、診断及び画像化するための方法及び組成物を提供する。
【００３２】
ＥｐｈＢ３リガンドに結合すると、ＥｐｈＢ３はリン酸化された後、分解される。受容体のリン酸化、活性又は発現のレベルを測定する方法は、当該技術分野で既知であり、それらの作動性を検出するための候補ＥｐｈＢ３モジュレーターを試験するために使用することができる。このような方法の具体例は、例えば、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６２：２８４０  （２００２）；及びＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３：７９０７  （２００３）に記載されている。理論に束縛されることを望むわけではないが、ＥｐｈＢ３は、腫瘍の浸潤及び転移を増加させるインテグリンによる細胞接着及び運動性を調節するための他のエフリンと同様の機序により作用する。ＥｐｈＢ３の発現は又、大腸癌患者における遠隔転移の存在と関連がある。ＥｐｈＢ３に対する阻害剤は、血管形成、腫瘍浸潤又は転移等を調節することにより、種々のタイプの癌を処置するために使用することができるとされる。
【００３３】
定義
本明細書全体を通して、種々の定義が使用される。殆どの単語は、当業者により属性区分されるような意味を有する。以下又は本明細書のその他の場所に特別に定義された単語は、本発明の文脈において総じて定められる、及び当業者により通常理解されるように定められる意味を有する。
【００３４】
特に指示がない限り、本発明の実践においては、当該技術分野の範囲内に含まれる従来の化学、生化学、分子生物学、免疫学及び薬学の従来の方法が使用される。このような技法については文献で詳細に説明されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９９０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．  Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．  Ｋａｐｌａｎ，  ｅｄｓ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）；及びＨａｎｄｂｏｏｄ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｓ．  Ｉ−ＩＶ  （Ｄ．Ｍ．  Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，  ｅｄｓ．，  １９８６，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；及びＳａｍｂｒｏｏｋら、  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９８９）を参照されたい。
【００３５】
本明細書で使用される“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”という冠詞は、文脈において特に明示されない限り、複数の言及を含む。従って、抗体の言及には、複数の当該抗体の混合物が含まれる。
【００３６】
本明細書で使用される「約」という用語は、値の＋／−３０％、＋／−２０％、＋／−１０％、又は＋／−５％を意味する。
【００３７】
本明細書で使用される「ＥｐｈＢ３」という用語は、エフリンと結合する受容体を意味する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３は、ＥＦＮＡ及びＥＦＮＢと結合する受容体を意味する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３は、主としてＥＦＮＢと結合する受容体を意味する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３は、ＥＦＮＢ２及び／又はＥＦＮＢ３と結合する受容体を意味する。幾つかの実施形態において、「ＥｐｈＢ３」という用語は、エフリン受容体Ｂ３を意味する。ＧｅｎｅＣａｒｄおいては、ＥｐｈＢ３は、Ｅｐｈ受容体Ｂ３、エフリン受容体ＥｐｈＢ３、又はエフリンタイプＢ受容体３としても知られている。エフリン受容体Ｂ３の配列は、それぞれ参考として組み入れられている、受入番号ＮＭ＿００４４４３（ヌクレオチド配列；配列番号１）及びＮＰ＿００４４３４（アミノ酸配列；配列番号２）に説明されている。
【００３８】
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、交換可能に使用され、コード及び非コードアミノ酸、化学的又は生化学的に修飾され、又は誘導体化されたアミノ酸、及び修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドを含む、任意の長さのアミノ酸の重合形態を意味する。これらの用語には、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、異種又は同種リーダー配列を含む融合タンパク質、Ｎ−末端メチオニン残基を含む又は含まない融合タンパク質を含むがこれらに限定されない融合タンパク質；免疫標識タンパク質等が含まれる。
【００３９】
「個体」、「対象」、「宿主」及び「患者」という用語は、交換可能に使用され、診断、処置又は治療が求められる、何れかの対象、特にヒトを意味する。その他の対象には、牛、犬、猫、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、馬等が含まれる。幾つかの好ましい実施形態において、対象はヒトである。
【００４０】
本明細書で使用される「癌」は、原発性及び転移性癌を意味する。「癌細胞」という用語は、形質転換される細胞を意味する。これらの細胞は、癌を患っている患者、又は癌性にするためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質転換される細胞から分離することができる。癌細胞は、任意の組織又は細胞培養系を含む、種々のタイプの試料から由来することができる。幾つかの実施形態において、癌細胞は、過形成、腫瘍細胞又は腫瘍である。幾つかの実施形態において、癌細胞は、卵巣癌、大腸癌、食道癌、乳癌、前立腺癌、白血病、メラノーマ、肺癌、脳癌、肝臓癌、膵臓癌及びリンパ癌から分離される。幾つかの実施形態において、癌細胞は、公的に入手可能な、確立された細胞株から得られる。幾つかの実施形態において、癌細胞は、以前から存在していた患者の試料、又は癌細胞を含むライブラリーから分離される。幾つかの実施形態において、癌細胞が分離され、種々の宿主、例えば異種移植片に移植される。幾つかの実施形態において、癌細胞が形質転換され、ＳＣＩＤマウスモデルにおいて使用される。幾つかの実施形態において、癌は、卵巣癌、大腸癌又は食道癌である。幾つかの好ましい実施形態において、癌は、卵巣癌又は食道癌である。
【００４１】
本明細書で使用される「形質転換」という用語は、その子孫によって安定して遺伝する細胞の性質における何れかの変化を意味する。幾つかの好ましい実施形態において、「形質転換」は、正常な細胞の、例えば腫瘍の原因となり得る、癌性細胞への変化を意味する。幾つかの実施形態において、形質転換細胞は不死化されている。形質転換は、受容体のリン酸化の非存在下での受容体の過剰発現、ウイルス感染、癌遺伝子及び／又は腫瘍抑制遺伝子における突然変異、及び／又は細胞の増殖及び／又は不死化特性を変化させる任意の技術を含む、多くの因子によって引き起こされる。
【００４２】
本明細書で使用される「転移」という用語は、癌の起源、例えば原発性腫瘍から離れた部位に広がる癌を意味する。転移の部位には、骨、リンパ節、肺、肝臓及び脳が含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
本明細書で使用される「血管形成」という用語は、患者における血管の発生を意味する。
【００４４】
本明細書で使用される「臨床的エンドポイント」という用語は、癌を示す測定可能な現象を意味する。臨床的エンドポイントには、最初の転移に対する時間、次の転移に対する時間、転移のサイズ及び／又は数、腫瘍のサイズ及び／又は数、腫瘍の部位、腫瘍の悪性度、生活の質、疼痛等が含まれるが、これらに限定されない。当業者であれば、臨床的エンドポイントを決定及び測定する能力を有する。臨床的エンドポイントの測定方法は、当業者に既知である。
【００４５】
本明細書で使用される「試料」という用語は、患者由来の生物学的材料を意味する。本発明により試験される試料は任意の特定のタイプに限定されない。非限定的な具体例として、試料には、単細胞、多細胞、組織、腫瘍、体液、生体分子、前述の何れかの上清又は抽出物が含まれる。具体例には、生検のために除去される組織、切除時に除去される組織、血液、尿、リンパ組織、リンパ液、脳脊髄液、粘膜、及び大便試料が含まれる。使用される試料は、試験フォーマット、検出方法、及び試験される腫瘍、組織、細胞又は抽出物の性質に基づいて変化する。試料を調製するための方法は当該技術分野に周知であり、使用される方法と相性が良い試料を得るために容易に適合させることができる。
【００４６】
本明細書で使用される「生体分子」という用語には、ポリペプチド、核酸及び単糖類が含まれるが、これらに限定されない。
【００４７】
本明細書で使用される「調節する」という用語は、遺伝子、タンパク質、又は細胞の内側、外側又は表面にある何れかの分子の質又は量における変化を意味する。変化とは、分子の発現又はレベルの増加又は減少であってよい。「調節する」という用語には、増殖、分泌、接着、アポトーシス、細胞間シグナル伝達等が含まれるが、これらに限定されない、生物学的機能／活性の質又は量の変化が含まれる。例えば、「細胞分裂を調節する」という文脈において、この用語は、細胞分裂の速度、量又は程度に影響を及ぼすことを意味する。幾つかの実施形態において、用法は細胞分裂を完全に阻害する。他の実施形態において、本方法は細胞分裂の量を減少させる。他の実施形態において、本方法は、細胞分裂を阻止する。
【００４８】
本明細書で使用される「Ｎ−末端」という用語は、タンパク質の最初の１０アミノ酸を意味する。
【００４９】
本明細書で使用される「Ｃ−末端」という用語は、タンパク質の最後の１０アミノ酸を意味する。
【００５０】
本明細書で使用される「細胞間相互作用」という用語は、複数の細胞間の相互作用を意味する。幾つかの実施形態において、細胞間の相互作用は細胞シグナルを誘導する。細胞間相互作用は、例えば、ＰＫＨ２６及びＰＫＨ６７（Ｓｉｇｍａ）を含む、異なる蛍光性の膜染色を使用して標識された、共培養及び前培養の膜交換の観察が含まれるが、これらに限定されない、当業者に既知の多数の方法によって検出することができる。
【００５１】
本明細書で使用される「ドメイン」という用語は、生体分子の既知又は推測される機能に寄与する、生体分子の構造部分を意味する。ドメインは、それらの領域又は部分と同一の広がりを有していてもよく、領域の全て又は一部に加えて、特定の領域と異なる生体分子の部分を取り込んでいてもよい。
【００５２】
本明細書で使用される「リガンド結合ドメイン」という用語は、対応する天然の配列のＥｐｈＢ３受容体の少なくとも１種の定性的結合活性を維持する受容体の任意の部分又は領域を意味する。
【００５３】
「領域」という用語は、生体分子の一次構造の物理的に隣接する領域を意味する。タンパク質の場合、領域は、そのタンパク質のアミノ酸配列の隣接する部分によって定義される。幾つかの実施形態において、「領域」は生体分子の機能と関連する。
【００５４】
本明細書で使用される「部分」という用語は、生体分子の一次構造の物理的に隣接する領域を意味する。タンパク質の場合、部分は、そのタンパク質のアミノ酸配列の隣接する部分によって定義され、少なくとも３〜５個のアミノ酸、少なくとも８〜１０個のアミノ酸、少なくとも１１〜１５個のアミノ酸、少なくとも１７〜２４個のアミノ酸、少なくとも２５〜３０個のアミノ酸、及び少なくとも３０〜４５個のアミノ酸を意味する。オリゴヌクレオチドの場合、部分は、そのオリゴヌクレオチドの核酸配列の隣接する部分によって定義され、９〜１５個のヌクレオチド、少なくとも１８〜３０個のヌクレオチド、少なくとも３３〜４５個のヌクレオチド、少なくとも４８〜７２個のヌクレオチド、少なくとも７５〜９０個のヌクレオチド、及び少なくとも９０〜１３０個のヌクレオチドを意味する。幾つかの実施形態において、生体分子の部分は生物活性を有する。
【００５５】
本明細書で使用される「作動物質」という用語は、ＥｐｈＢ３と結合し、ＥｐｈＢ３の１つ以上の生物活性を活性化することのできる分子を意味する。ＥｐｈＢ３作動物質には、エフリン−Ｂ１、エフリン−Ｂ２及びエフリン−Ｂ３を含む、天然のＥｐｈＢ３が含まれる。
【００５６】
本明細書で使用される「誘導する」という語句は活性の促進を意味する。
【００５７】
本明細書で使用される「ＥｐｈＢ３の生物活性」という語句は、受容体の活性により影響されるＥｐｈＢ３の生物学的、生理学的、又は生化学的活性を意味する。ＥｐｈＢ３は、ＥｐｈＢ３のリガンド、オリゴヌクレオチド、小分子、模倣物、デコイ又は抗体を含むＥｐｈＢ３モジュレーターによって活性化される。ＥｐｈＢ３の生物活性の具体例には、受容体のリン酸化、受容体のオリゴマー形成、受容体の内在化の誘導、受容体の分解、シグナル伝達、ＥｐｈＢ３が媒介する細胞−細胞接着等が含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
本明細書で使用される「ＥｐｈＢ３に関連する細胞／腫瘍／試料」という語句等は、非癌性及び／又は非転移性細胞、試料、腫瘍又は他の病状に比べて、ＥｐｈＢ３発現の上昇する徴候によって特徴付けられる、細胞、試料、腫瘍又はその他の病状を意味する。幾つかの好ましい実施形態において、ＥｐｈＢ３関連細胞、試料、腫瘍又はその他の病状は、非転移性細胞、試料、腫瘍又はその他の病状に比べて、ＥｐｈＢ３発現の上昇する徴候によって特徴付けられる。
【００５９】
本明細書で使用される「モジュレーター」という用語は、癌と関連する、１つ以上の生理学的又は生化学的現象を調整する組成物を意味する。本明細書で使用される「ＥｐｈＢ３モジュレーター」は、ＥｐｈＢ３のリン酸化及び分解を促進する。幾つかの好ましい実施形態において、モジュレーターは、癌と関連する１つ以上の生物活性を阻害する。幾つかの実施形態において、モジュレーターは、小分子、抗体、模倣物、可溶性受容体、デコイ受容体又はオリゴヌクレオチドである。幾つかの実施形態において、モジュレーターは、リガンド結合を遮断するか、リガンド結合部位と競合することによって作用する。幾つかの実施形態において、モジュレーターはリガンド結合と独立して作用する。幾つかの実施形態において、モジュレーターはリガンド結合部位と競合しない。幾つかの実施形態において、モジュレーターは癌に関与する遺伝子産物の発現を遮断する。幾つかの実施形態において、モジュレーターは、癌に関与する複数の生体分子の物理的内在化を遮断する。幾つかの実施形態において、本発明のモジュレーターは、受容体のリン酸化、受容体のオリゴマー形成、受容体の内在化、受容体の分解、リガンド様ＥｐｈＢ３シグナル伝達、及びＥｐｈＢ３が媒介する細胞−細胞接着からなる群より選択される、１つ以上のＥｐｈＢ３の生物活性を誘導する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターはＥｐｈＢ３の発現を阻害する。
【００６０】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、標的タンパク質又はそのフラグメントに特異的である、モノクローナル及びポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、二官能性／二重特異性抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、及び相補性決定領域（ＣＤＲ）−グラフト抗体を意味する。「抗体」という用語には更に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける治療抗体遺伝子導入が含まれる。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ及びＦｖを含む抗体フラグメントも、本発明によって提供される。幾つかの好ましい実施形態において、抗体は、モノクローナル、ヒト化、霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）、一本鎖又はキメラ抗体である場合がある。
【００６１】
本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、ポリペプチドの抗原決定基を意味する。幾つかの実施形態において、エピトープは、エピトープに特異的である立体配置における３個以上のアミノ酸を含んでいてもよい。幾つかの実施形態において、エピトープは直鎖又は立体的なエピトープである。一般的に、エピトープは、少なくとも４個のアミノ酸、通常は少なくとも８〜１０個のアミノ酸からなる。アミノ酸の立体配置の決定方法は当該技術分野で既知であり、例えば、Ｘ線結晶学及び２次元核磁気共鳴が含まれるが、これらに限定されない。
【００６２】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、一連の結合したヌクレオチド残基を意味する。
【００６３】
本明細書で使用される「デコイ受容体」という用語は、少なくとも、ポリペプチド、模倣物、又は他のＥｐｈＢ３リガンドと結合することができる高分子の部分を意味する。
【００６４】
本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、治療有効量の薬物が個体に投与された場合に、個体における１つ以上の臨床的エンドポイント、癌細胞の増殖及び／又は生存、又は癌細胞の転移における減少又は逆転として観察される医療効果を生成する薬物の量を意味する。治療有効量は、通常、活性成分を含まない組成物を、同じ状態の個体に投与した場合に観察される効果と比較した効果によって決定される。対象にとって正確な有効量は、対象のサイズ及び健康状態、病態の性質及び程度、及び投与のために選択された治療薬又は治療薬の組み合わせに依存する。しかし、特定の健康状態に有効な量は、通常の実験によって決定され、臨床医の判断の範囲内に含まれる。
【００６５】
本明細書で使用される「細胞−細胞接着を調節する」という語句は、１個の細胞と他の細胞との接着又は細胞−細胞の接触における変化を意味する。幾つかの実施形態において、細胞接着は、本発明のモジュレーターによって阻害される。
【００６６】
本明細書で使用される「組み合わせて」又は「併せて」という用語は、本発明のＥｐｈＢ３モジュレーター及び他の治療投与計画の投与を意味する。
【００６７】
本明細書で使用される「感受性がある」という用語は、ＥｐｈＢ３治療薬が治療の満足できる方法である、即ち陽性に反応すると思われる患者を意味する。ＥｐｈＢ３治療薬に感受性がある癌患者は、ＥｐｈＢ３治療薬に感受性がない患者に比べて、高レベルのＥｐｈＢ３を発現する。ＥｐｈＢ３治療薬の良好な候補でない癌患者には、体内又は癌細胞中に、ＥｐｈＢ３を欠如するか低レベルで有する腫瘍試料を有する癌患者が含まれる。
【００６８】
本明細書で使用される「検出」という用語は、活性（例えば、遺伝子発現）又は生体分子（例えば、ポリペプチド）の徴候の確立、発見又は確認を意味する。
【００６９】
本明細書で使用される「相同的なヌクレオチド配列」又は「相同的なアミノ酸配列」という語句又はそれらの変形は、少なくとも特定の割合のヌクレオチドレベル又はアミノ酸レベルにおいて相同性によって特徴付けられる配列を意味し、「配列同一性」と交換可能に使用される。相同的なヌクレオチド配列には、タンパク質のイソ型をコードする配列が含まれる。このようなイソ型は、例えば、ＲＮＡの選択的なスプライシングの結果として、同じ生物の異なる組織中で発現され得る。イソ型は又、異なる遺伝子によってもコードすることができる。相同的なヌクレオチド配列には、ほ乳動物を含むがこれに限定されない、ヒト以外の種のタンパク質をコードするヌクレオチド配列が含まれる。相同的なヌクレオチド配列には又、天然の対立遺伝子変異、及び本明細書に記載のヌクレオチド配列の変異が含まれるが、これらに限定されない。相同的なアミノ酸配列には、保存的なアミノ酸配列を含み、ポリペプチドが同一の結合及び／又は活性を有するアミノ酸配列が含まれる。
【００７０】
相同性又は同一性の割合は、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  （Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．，  １９８１，  ２，  ４８２−４８９）のアルゴリズムを使用する初期設定を使用した、Ｇａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）により決定することができる。幾つかの好ましい実施形態において、プローブ及び標的の間の相同性は約５０％〜約６０％である。幾つかの実施形態において、核酸は、配列番号１又はその一部と、約６０％、好ましくは約７０％、更に好ましくは約８０％、更に好ましくは約８５％、更に好ましくは約９０％、更に好ましくは約９２％、更に好ましくは約９４％、更に好ましくは約９５％、更に好ましくは約９７％、更に好ましくは約９８％、更に好ましくは約９９％、最も好ましくは約１００％の相同性を有する。
【００７１】
相同性は又、ポリペプチドレベルである場合もある。幾つかの好ましい実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２又はその一部と、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９４％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％、及び約１００％の相同性を有する。
【００７２】
本明細書で使用される「プローブ」という用語は、種々の長さの核酸配列を意味する。幾つかの実施形態において、プローブは、少なくとも約１０個及び多くとも約６，０００個のヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態において、プローブは少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも５０個、又は少なくとも７５個の連続したヌクレオチドを含む。プローブは、同一、類似又は相補的な核酸配列の検出に使用される。より長いプローブは、通常、天然又は組換え供給源から得られ、標的配列に非常に特異的であり、オリゴマーよりも標的に対してより緩徐にハイブリダイズする。プローブは、一本又は二本鎖であり、ハイブリダイゼーションメンブレンをベースとするＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、又はＥＬＩＳＡのような技術において特異性を持たせるように設計される。
【００７３】
本明細書で使用される「混合」という用語は、同一の範囲内の１つ以上の化合物、細胞、分子等を組み合わせる工程を意味する。これは、例えば、試験管、シャーレ、又は１つ以上の化合物、細胞又は分子を混合することを可能にする任意の容器中で実施することができる。
【００７４】
本明細書で使用される「分離」という用語は、天然のポリヌクレオチド、ポリペプチド又は抗体と異なる環境にある、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体又は宿主細胞を意味する。細胞を分離する方法は、当業者に周知である。分離されるポリヌクレオチド、ポリペプチド又は抗体は、通常は実質的に精製されている。
【００７５】
本明細書で使用される「実質的に精製」という用語は、その自然環境から取り除かれ、自然に結合する他の成分を、少なくとも６０％、少なくとも７５％、及び少なくとも９０％含まない化合物を意味する。
【００７６】
本明細書で使用される「結合」という用語は、複数の生体分子又は化合物の物理的又は化学的相互作用を意味する。結合には、イオン性、非イオン性、水素結合、ファン・デル・ワールス力、疎水性相互作用が含まれる。結合は、直接的又は間接的の何れかであってもよく、間接的は、他の生体分子又は化合物の影響を介して、又は影響による。直接的結合は、他の生体分子又は化合物の影響を介して、又は影響によらないが、実質的に中間化学生成物がない相互作用を意味する。
【００７７】
本明細書で使用される「接触」なる用途は、１個の分子が第二の分子に物理的近接により一緒になることを意味する。分子は、緩衝液、塩、溶液等の何れの中にあってもよい。「接触させる」には、例えば、核酸分子を含むビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコ、又はマイクロアレイ等にポリヌクレオチドを置くことが含まれる。接触には又、例えば、ポリペプチドを含むビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコ、又はマイクロアレイ等に抗体を置くことが含まれる。接触は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。
【００７８】
本明細書で使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」又は「ストリンジェントな条件」は、プローブ、プライマー又はオリゴヌクレオチドがその標的配列とハイブリダイズするが、他の配列には最小数しか結合しない条件を意味する。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、種々の環境においてそれぞれ異なる。より長い配列は、より高温で、適切な補体と特異的にハイブリダイズする。一般的に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度及びｐＨにおける特異的配列についての融解温度（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、平衡状態において、標的配列に対する相補的なプローブの５０％が標的配列とハイブリダイズする温度である。標的配列は、Ｔｍにおいて一般的に過剰に存在するので、プローブの５０％は、平衡状態において、それらの補体とハイブリダイズする。通常、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３において約１．０Ｍナトリウムイオン未満、通常は約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン（又は他の塩）であり、温度は短いプローブ、プライマー又はオリゴヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）について少なくとも約３０℃であり、より長いプローブ、プライマー又はオリゴヌクレオチドについて少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件は又、ホルムアミド等の不安定化剤の添加によっても達成することができる。
【００７９】
本明細書で使用される「中程度のストリンジェントな条件」は、プローブ、プライマー又はオリゴヌクレオチドが、その標的配列と結合するが、その他の配列では限られた数と結合する条件を意味する。中程度の条件は、配列依存的であり、種々の環境においてそれぞれ異なる。中程度の条件は、当業者に周知であり、とりわけ、Ｍａｎｉｔａｔｉｓら、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９８９））に記載されている。
【００８０】
本明細書に記載の核酸組成物は、例えば、ポリペプチドを製造するため、生体試料（例えば、ヒト細胞の抽出物）中のｍＲＮＡ、又はこのような試料から製造されるｃＤＮＡの検出のためのプローブとして、ポリヌクレオチドの追加のコピーを生成するため、リボザイム又はオリゴヌクレオチド（一本鎖及び二本鎖）を生成するため、一本鎖ＤＮＡプローブとして、又は三本鎖を形成するオリゴヌクレオチドとして使用することができる。本明細書に記載のプローブは、例えば、試料中の本明細書に提供されるポリヌクレオチドの有無を検出するために使用することができる。ポリペプチドは、本明細書で更に詳細に議論する診断法、予後の予測法等に有用である、癌に関連するポリペプチドに特異的な抗体を生成するために使用することができる。ポリペプチドは、本明細書で更に詳細に議論するように、治療的研究のための標的としても有用である。本発明の抗体は又、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方の診断及び治療法を含む、本発明のポリペプチドを精製し、検出し、及び標的とするために使用することができる。例えば、抗体は、生体試料中の本発明のポリペプチドのレベルを定性的及び定量的に測定するための免疫試験において有用である。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  １９８８）を参照されたい。これらの及びその他の用途については、以下で更に詳細に記載する。
【００８１】
本明細書で使用される「造影剤」という用語は、当業者に既知の技術を使用して検出することができる本発明の抗体、小分子又はプローブと結合する組成物を意味する。本明細書で使用される「遺伝子発現の証拠」という用語は、遺伝子が発現される、測定可能な任意の兆候を意味する。
【００８２】
「薬学的に許容される担体」という用語は、抗体又はポリペプチド、遺伝子及び他の治療薬等の治療薬の投与のための担体を意味する。この用語は、組成物を投与された個体に有害な抗体の生成を誘導せず、過度の毒性なく投与することができる薬学的に許容される担体を意味する。適当な担体は、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体及び不活性ウイルス粒子等の、緩徐に代謝される大きな高分子であってもよい。このような担体は、当業者に周知である。治療組成物中の薬学的に許容される担体は、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノール等の液体を含んでもよい。湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝基質等の補助的な基質が、このような賦形剤中に存在していてもよい。
【００８３】
ＥｐｈＢ３リガンドに結合すると、ＥｐｈＢ３はリン酸化され、次いで分解される。従って、本発明は、ＥｐｈＢ３モジュレーターが癌細胞中におけるＥｐｈＢ３の発現のレベルを減少することにより、及び／又はリガンド様ＥｐｈＢ３シグナル伝達、ＥｐｈＢ３のリン酸化、及び／又はＥｐｈＢ３の分解の誘導により、細胞増殖及び侵襲を阻害することができるという発見にも一部基づく。そのため、癌細胞の増殖及び／又は転移は減少する。
【００８４】
本発明の方法及び組成物によって処置することができる癌の特定の具体例には、ＥｐｈＢ３を過剰発現する癌が含まれるが、これに限定されない。本発明は又、細胞接着、移動又は反発においてＥｐｈＢ３が役割を果たす、何れの細胞タイプに対しても応用可能である。幾つかの実施形態において、癌は卵巣癌、食道癌、大腸癌、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、肺癌、胃癌又は膵臓癌である。幾つかの実施形態において、本発明による処置及び／又は診断に影響されやすい癌は、ＥｐｈＢ３の過剰発現によって特徴付けられる。幾つかの実施形態において、このような癌は、対照に比べて少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、又は少なくとも約３００％のＥｐｈＢ３の過剰発現を示す。
【００８５】
本発明は、ＥｐｈＢ３の過剰発現と関連する疾患及び傷害の処置、阻害、予防及び管理、及びこのような疾患及び傷害の症状の処置、阻害、予防及び管理を提供する方法及び組成物を提供する。本発明の幾つかの実施形態は、癌細胞の増殖及び浸潤を阻害する組成物を含む、方法及び組成物に関する。
【００８６】
本発明は更に、癌又は癌転移を処置、阻害、予防又は管理するための方法及び組成物を提供する。本発明の更なる組成物及び方法は、本発明のＥｐｈＢ３モジュレーターと組み合わせて、他の活性成分を含む。幾つかの実施形態において、本方法は更に、患者に対して１つ以上の従来の癌治療薬を投与することを含む。幾つかの実施形態において、本発明の方法は更に、化学療法、放射線療法又は手術の１つ以上で患者を処置することを含む。
【００８７】
本発明は又、手術、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、及び生物学的療法等の、最新又は標準的な癌治療に対して、部分的又は完全に難治性になった、癌、又はその他の過剰増殖細胞障害又は疾患を処置、阻害、予防及び管理するための方法及び組成物を提供する。
【００８８】
本発明は又、本発明のＥｐｈＢ３モジュレーター、特にＥｐｈＢ３抗体を使用して癌を診断する及び／又は癌の進行を予測する診断及び／又は画像化方法を提供する。幾つかの好ましい実施形態において、本発明の方法は、腫瘍及び／又は転移の画像化及び場所を特定する方法、及び診断及び予後診断方法を提供する。幾つかの実施形態において、本発明の方法は、ＥｐｈＢｅ関連療法の妥当性を評価する方法を提供する。
【００８９】
ＥｐｈＢ３モジュレーター
本発明は、とりわけ癌を処置、診断、検出又は画像化するためのＥｐｈＢ３モジュレーターを提供する。
【００９０】
幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、オリゴヌクレオチド、小分子、模倣物、可溶性受容体、デコイ又は抗体である。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターはＥｐｈＢ３のリン酸化を誘導する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、ＥｐｈＢ３のオリゴマー形成を誘導する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、ＥｐｈＢ３の分解を誘導する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、ＥｐｈＢ３のオリゴマー形成を誘導し、ＥｐｈＢ３の分解を誘導する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、ＥｐｈＢ３の細胞内アダプタータンパク質への結合を促進する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、ＦＡＫ、Ｅｒｋ／ＭＡＰＫ経路、Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ経路を阻害及び／又は不活性化し、ＲａｓＧＡＰを活性化し、Ａｂｌ／Ａｒｇ、Ｆｙｎ、Ｓｒｃ、ＬＭＷ−ＰＴＰ、インターセクチン、Ｃｄｃ４２経路、Ｋａｌｉｒｉｎ又はＲａｃ経路を阻害及び／又は不活性化する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、Ｒ−Ｒａｓのリン酸化を起こす。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、Ｒ−Ｒａｓを不活性化するか、Ｓｙｎｄｅｃａｎを活性化する。
【００９１】
本明細書で使用される「細胞内アダプタータンパク質」という用語は、シグナル伝達複合体の異なる断片に接着するタンパク質を意味する。アダプタータンパク質は酵素活性を有していても有していなくてもよい。幾つかの実施形態において、アダプタータンパク質は、本質的な酵素活性を有するアダプタータンパク質であるＧｒｂ２である。幾つかの実施形態において、アダプタータンパク質は、酵素活性を有するアダプタータンパク質であるＲａｓＧＡＰである。
【００９２】
幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、ＥｐｈＢ３のリン酸化を、対照に比べて２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％上昇させる。受容体のリン酸化、活性又は発現のレベルを決定するための方法は当該技術分野で既知であり、それらの性質を決定するための候補ＥｐｈＢ３モジュレーターを試験するために使用することができる。このような方法の具体例は、例えば、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６２：２８４０  （２００２）；及びＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３：７９０７  （２００３）に記載されている。
【００９３】
幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、ＥｐｈＢ３のオリゴマー形成／分解／内在化を、対照に比べて２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％上昇させる。受容体のオリゴマー形成／分解／内在化のレベルを決定する方法は、当業者に既知である（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７（４）：３４０，  ２００２；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６４：７８１，  ２００４；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６３：７９０７，  ２００３を参照）。
【００９４】
幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、ＥｐｈＢ３のリン酸化を、対照に比べて２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％上昇させる。受容体のリン酸化のレベルを決定する方法は、当業者に既知である（例えば、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６２：２８４０，  ２００２；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６３：７９０７，  ２００３を参照）。
【００９５】
幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターはＥｐｈＢ３の発現を阻害する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３の発現は、対照に比べて２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％阻害される。ＥｐｈＢ３の発現レベルを決定する方法は、当業者に既知である。
【００９６】
抗体
幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは抗体である。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、又はＦａｂフラグメントである。抗体は、例えば、酵素、放射性同位元素又はフルオロフォアで標識することができる。幾つかの実施形態において、抗体は、ＥｐｈＢ３以外のポリペプチドについて約１×１０５Ｋａ未満の結合親和性を有する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、少なくとも１×１０８Ｋａの親和性でＥｐｈＢ３と結合するモノクローナル抗体である。幾つかの実施形態において、モノクローナル抗体は、ＥｐｈＢ３のリガンド結合ドメインと結合しない。
【００９７】
幾つかの実施形態において、モノクローナル抗体はＥｐｈＢ３のリン酸化を誘導する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターはＥｐｈＢ３のオリゴマー形成を誘導する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、ＥｐｈＢ３の分解を誘導する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、ＥｐｈＢ３のオリゴマー形成を誘導し、ＥｐｈＢ３の分解を誘導する。
【００９８】
本発明は又、例えば免疫試験を使用した、競合的結合を検出するために当該技術分野で既知の任意の方法によって決定されるように、本発明のエピトープへの抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。幾つかの実施形態において、抗体は、エピトープの結合を、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、又は少なくとも５０％競合的に阻害する。
【００９９】
幾つかの実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、霊長類化抗体、ファージ提示抗体、一本鎖抗体、又は前記の何れかのフラグメントからなる群より選択される。幾つかの好ましい実施形態において、抗体はヒト化抗体である。ヒト化抗体は、例えば、（１）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を、ヒトの骨格及び定常領域上にグラフトする（当該技術分野において、「ヒト化」を意味するプロセス）、或いは（２）非ヒト可変領域全体を移植するが、表面残基を置換することによってヒト様表面でこれらを覆う（当該技術分野で「合板（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）」と呼ばれるプロセス）ことを含む種々の方法によって得ることができる。本発明において、ヒト化抗体には、「ヒト化」及び「合板（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）」抗体の両方が含まれる。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリンの遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、内在性の免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することによって製造することができる。挑戦により、遺伝子再構成、組み立て、及び抗体レパートリーを含む全ての関連においてヒトにおいて認められるものと酷似するヒト抗体の生成が認められる。この手法は、例えば、参考として組み入れられている、米国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号、及び以下の科学出版物：即ち、Ｍａｒｋｓら、  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，  ７７９−７８３  （１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８５６−８５９  （１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，  ８１２−１３  （１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，  ８４５−５１  （１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８２６  （１９９６）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３  ６５−９３  （１９９５）；Ｊｏｎｅｓら、  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５  （１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ，  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８１：６８５１−６８５５  （１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ，  Ａｄｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ４４：６５−９２  （１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒら、  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６  （１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎ．  ２８：４８９−４９８  （１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３１（３）：１６９−２１７  （１９９４）；及びＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，  Ｃ．Ａ．ら、  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ４（７）：７７３−８３  （１９９１）に記載されている。
【０１００】
本発明の抗体は、種々の機序で機能する場合がある。幾つかの実施形態において、抗体は、抗体依存細胞毒性（ＡＤＣＣ）、抗体が標的とする細胞上での溶解攻撃を誘発する。幾つかの実施形態において、抗体は、例えば、抗原結合、アポトーシスの誘導及び補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を含む、複数の治療的機能を有する。
【０１０１】
幾つかの実施形態において、本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの作動物質として作用することができる。例えば、幾つかの実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドを部分的又は完全に使用した受容体／リガンド相互作用を崩壊する抗体を提供する。幾つかの実施形態において、本発明の抗体は、本明細書に開示されるエピトープ、又はその一部と結合する。幾つかの実施形態において、受容体への抗体の結合は受容体の分解を誘導する。幾つかの実施形態において、受容体への抗体の結合は受容体のオリゴマー形成を誘導する。幾つかの実施形態において、受容体への抗体の結合は受容体のリン酸化を誘導する。幾つかの実施形態において、受容体への抗体の結合は受容体の活性化を誘導する。受容体の活性化（即ちシグナル伝達）は、当該技術分野で既知の技術によって測定される場合がある。例えば、受容体の活性化は、免疫沈降、それに続くウェスタンブロット解析によって、受容体又はその基質のリン酸化（例えば、チロシン又はセリン／スレオニン）を検出することによって測定することができる。幾つかの実施形態において、リガンド活性又は受容体活性を、抗体の非存在下における活性の少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、又は少なくとも５０％調節する抗体が提供される。
【０１０２】
幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３抗体は、ＥｐｈＢ３の細胞内アダプタータンパク質への結合を促進する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３抗体は、１つ以上の細胞内アダプタータンパク質によって、ＥｐｈＢ３の細胞質ドメインの相互作用を遮断及び／又は妨害する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３抗体は、ＦＡＫ、Ｅｒｋ／ＭＡＰＫ経路、Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ経路を阻害及び／又は不活性化し、ＲａｓＧＡＰを活性化し、Ａｂｌ／Ａｒｇ、Ｆｙｎ、Ｓｒｃ、ＬＭＷ−ＰＴＰ、インターセクチン、Ｃｄｃ４２経路、Ｋａｌｉｒｉｎ又はＲａｃ経路を阻害及び／又は不活性化する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３抗体は、Ｒ−ｒａｓを不活性化するか、Ｓｙｎｄｅｃａｎを活性化する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３抗体はＲ−Ｒａｓのリン酸化を誘導する。
【０１０３】
本明細書で使用される「細胞内アダプタータンパク質」という用語は、シグナル伝達複合体の異なる断片に接着するタンパク質を意味する。アダプターは、酵素活性を有する場合もあれば、有さない場合もある。アダプタータンパク質の具体例は、当業者に既知である。例えば、Ｇｒｂ２は、本質的な酵素活性を有しないアダプタータンパク質であるが、ＲａｓＧａｐは酵素活性を有するアダプタータンパク質である。
【０１０４】
幾つかの実施形態において、本発明は活性化抗体を提供する。幾つかの実施形態において、活性化抗体は受容体作動物質として作用する。即ち、例えば、受容体のオリゴマー形成を誘導することによって、リガンドが媒介する受容体活性化の生物学的活性の全て又は一部の何れかを調節する。幾つかの実施形態において、抗体は、本明細書に開示される本発明のペプチドの特定の生物活性を含む、生物活性のための作動物質として指定される場合がある。抗体作動物質は、当該技術分野で既知の方法を使用して製造することができる。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇら、  Ｂｌｏｏｄ  ９２（６）：１９８１−１９８８  （１９９８）；Ｃｈｅｎら、  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５８（１６）：３６６８−３６７８  （１９９８）；Ｈａｒｒｏｐら、  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６１（４）：１７８６−１７９４  （１９９８）；Ｚｈｕら、  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５８（１５）：３２０９−３２１４  （１９９８）；Ｙｏｏｎら、  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６０（７）：３  １７０−３１７９  （１９９８）；Ｐｒａｔら、  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｓｃｉ．  １１１  （Ｐｔ２）：２３７−２４７  （１９９８）；Ｐｉｔａｒｄら、  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０５（２）：１７７−１９０  （１９９７）；Ｌｉａｕｔａｒｄら、  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ９（４）：２３３−２４１  （１９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎら、  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２（１７）：１１２９５−１  １３０１  （１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎら、  Ｎｅｕｒｏｎ  １４（４）：７５５−７６２  （１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒら、  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６（９）：１１５３−１１６７  （１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋら、  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ８（１）：１４−２０  （１９９６）を参照されたい。
【０１０５】
本発明の抗体は、単独で、又はその他の組成物と混合して使用される場合がある。抗体は更に、Ｎ−又はＣ−末端で異種ポリペプチドと組換え技術によって融合される場合もあれば、ポリペプチド又は他の組成物と化学的に結合（共有結合及び非共有結合を含む）される場合もある。例えば、本発明の抗体は、検出試験における標識として有用な分子、及び異種ポリペプチド、薬剤、放射性核種又は毒素等のエフェクター分子と組換え技術によって融合されるか結合していてもよい。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；及び欧州特許第３９６，３８７号を参照されたい。
【０１０６】
本発明は又、診断又は治療薬と結合した、抗体又はそのフラグメントを提供する。抗体は、例えば臨床試験手順の一部として、腫瘍の発生又は進行を監視するため、例えば、所定の治療投与計画の効果を決定するために診断において使用することができる。検出は、抗体を検出可能な物質と結合することによって促進することができる。検出可能な物質には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々の陽電子放出トモグラフィーを使用した陽電子放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンが含まれるが、これらに限定されない。検出可能な物質は、抗体（又はそのフラグメント）に直接結合するか、当該技術分野で既知の技術を使用して中間化学生成物（例えば、当該技術分野で既知のリンカー）によって間接的に結合する。例えば、本発明の診断薬として使用するための抗体に結合することができる金属イオンについて、米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。適切な酵素の具体例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ；適切な補欠分子族複合体の具体例には、ストレプトアビジン／ビオチン、及びアビジン／ビオチンが含まれ；適切な蛍光物質の例にはウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル又はフィコエリスリンが含まれ；発光物質の具体例にはルミノールが含まれ；生物発光物質の具体例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが含まれ；適切な放射性物質には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、又は９９Ｔｃが含まれる。
【０１０７】
幾つかの実施形態において、抗体又はそのフラグメントは、細胞分裂停止又は細胞破壊物質、治療薬、又は２１３Ｂｉ等のα放射体等の放射性金属イオン等の細胞毒素等の治療薬の一部と結合することができる。細胞毒素又は細胞毒性物質には、細胞に有害な任意の物質が含まれる。細胞毒素又は細胞毒性物質には、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コリヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びプロマイシン及びそれらの類似体又は同族体の１つ以上が含まれる。治療薬には、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ・クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧ダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧アクチノマイシン））、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、及び抗有糸分裂物質（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０８】
本発明の抗体複合体は、所定の生体応答を調節するために使用することができる。例えば、幾つかの実施形態において、薬剤の一部は、所望の生物活性を有するタンパク質ポリペプチド又はそのフラグメントであってもよい。このようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、又はジフテリア毒素等の毒素；腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、成長因子由来の血小板、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス剤、例えばＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ  Ｉ（国際出願公開第ＷＯ９７／３３８９９号を参照）、ＡＩＭ  ＩＩ（国際出願公開第ＷＯ９７／３４９１１号を参照）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ６：１５６７−１５７４  （１９９４））、ＶＥＧＩ（国際出願公開第ＷＯ９９／２３１０５号を参照）、血栓症薬剤又は抗血管形成剤、例えば、アンジオスタチン又はエンドスタチン；又は例えば、リンフォカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）又は他の成長因子等の生体応答調節剤が含まれる。
【０１０９】
又、本発明の抗体は、特に免疫試験又は標的抗原の精製に有用な固相担体に結合していてもよい。このような固相担体には、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、塩化ポリビニル又はポリプロピレンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１０】
このような治療薬の一部を抗体に結合するための技術は当該技術分野で周知であり、例えば、Ａｍｏｎら、  “Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｒｅｉｓｆｅｌｄら、（ｅｄｓ），  ｐｐ．２４３−５６  （Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．  １９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、  “Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”  ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  （２ｎｄ  Ｅｄ．），  Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、（ｅｄｓ），  ｐｐ．６２３−５３  （Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．  １９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，  “Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”，  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａら、（ｅｄｓ．），  ｐｐ．４７５−５０６  （１９８５）；“Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｒｅｓｕｌｔｓ，  Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｂａｌｄｗｉｎら、（ｅｄｓ．），  ｐｐ．３０３−１６  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）；及びＴｈｏｒｐｅら、  “Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  ６２：１１９−５８  （１９８２）を参照されたい。
【０１１１】
幾つかの実施形態において、本発明の抗体は、抗体へテロ複合体を形成するために第二の抗体と結合することができる（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号を参照）。
【０１１２】
幾つかの実施形態において、本発明は、治療薬の一部と結合した、又は結合していない、単独、又は例えば細胞毒性因子及び／又はサイトカインを含む他の薬剤と組み合わせて投与される治療抗体を提供する。
【０１１３】
幾つかの実施形態において、抗体は、細胞−細胞相互作用を崩壊又は妨害する。幾つかの実施形態において、抗体は、細胞移動、又はＥｐｈＢ３を発現する細胞の走化性能を阻害する。
【０１１４】
キメラ及びヒト化抗体に加えて、完全なヒト抗体を、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウス（例えば、それらの全てが参考として組み入れられている、米国特許第６，０７５，１８１号、第６，０９１，００１号、及び第６，１１４，５９８号を参照）、又はヒト免疫グロブリン遺伝子のファージ提示ライブラリー（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、  Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４  （１９９０）．Ｃｌａｃｋｓｏｎら、  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５２：６２４−６２８  （１９９１）；及びＭａｒｋｓら、  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２２：５８１−５９７  （１９９１）を参照）から得ることができる。
【０１１５】
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、（１９７５）  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９６の方法又はその修飾された方法によって製造することができる。通常、抗原を含む溶液を使用してマウスを免疫する。免疫は、生理食塩水中の抗原含有溶液を、好ましくは、フロイントの完全アジュバント等のアジュバント中で混合又は乳化し、混合液又はエマルジョンを非経口的に注射することによって実施することができる。当該技術分野で既知の任意の免疫方法を、本発明のモノクローナル抗体を得るために使用することができる。動物の免疫後、脾臓（及び場合により幾つかの大きなリンパ節）を取り出し単一細胞に分離する。脾臓細胞は、興味のある抗原でコーティングされたプレート又はウェルに細胞懸濁液を適用することによってスクリーニングすることができる。抗原に特異的な、Ｂ細胞が発現する膜に結合した免疫グロブリンはプレートに結合し、洗い流されない。次いで、得られたＢ細胞又は全ての分離された脾臓細胞は、ハイブリドーマを形成するためにミエローマ細胞と融合され、選択培地で培養される。得られた細胞を連続的又は限界希釈によりプレートに播き、興味のある抗原と特異的に結合する抗体（及び関係のない抗原と結合しない抗体）の生成について試験する。次いで、選択されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）−分泌ハイブリドーマをｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、組織培養ボトル又はホーローファイバーリアクター）又はｉｎ  ｖｉｖｏ（マウスの腹水）で培養する。
【０１１６】
発現のためのハイブリドーマの使用に代わるものとして、参考として組み入れられている、米国特許第５，５４５，４０３号；第５，５，４５，４０５号；及び第５，９９８，１４４号に開示されるように、抗体は、ＣＨＯ又はミエローマ細胞株等の細胞株中で製造することができる。即ち、細胞株は、それぞれ軽鎖及び重鎖を発現することができるベクターを遺伝子導入される。異なるベクター上の２種のタンパク質を導入することにより、キメラ抗体を製造することができる。参考として組み入れられている、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７：８；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、（１９９１）  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ３：８；及びＢａｎｃｈｅｒｅａｕ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７０。
【０１１７】
本発明の抗体は又、Ｆａｎｇら、（２００５），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，５８４−５９０で考察される通り、治療抗体遺伝子導入を介して対象に投与することができる。例えば、ＭＡｂの重鎖及び軽鎖をコードする配列の間に配置されるポリペプチドの酵素非依存的な共翻訳自己切断を媒介するペプチドを含むマルチシストロニックな発現カセットを送達するために、組換えベクターを生成することができる。発現は、両方のＭａｂ鎖の化学量論的量を誘導する。酵素非依存的な共翻訳自己切断を媒介するペプチドの好ましい具体例は、口蹄疫由来の２Ａペプチドである。
【０１１８】
全長の抗体の所望の親和性を保持する限りは、抗体のフラグメントは本発明の方法における使用に適している。従って、抗ＥｐｈＢ３抗体のフラグメントは、ヒト細胞で発現するＥｐｈＢ３細胞表面抗原、特にＥｐｈＢ３発現癌細胞の細胞表面のＥｐｈＢ３に結合する能力を保持している。このようなフラグメントは、対応する全長抗ＥｐｈＢ３抗体と同様の特性によって特徴付けられる。即ち、フラグメントは、ヒト細胞の表面上で発現するヒトＥｐｈＢ３抗原に特異的に結合する。
【０１１９】
抗ＥｐｈＢ３抗体又はその抗体フラグメントは、本発明の方法に使用される前に複合体化されてもよい。複合抗体を製造するための方法は当該技術分野で既知である。従って、抗ＥｐｈＢ３抗体は、関節標識又は間接標識法を使用して標識することができる。「関節標識」又は「間接標識法」は、キレート剤が、抗体と共有結合し、少なくとも１種の放射性核種がキレート剤に挿入されることを意味する。例えば、参考として組み入れられている、Ｓｒｉｖａｇｔａｖａ  ａｎｄ  Ｍｅａｓｅ  （１９９１）  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏ．  １８：５８９−６０３に記載されたキレート剤及び放射性核種を参照されたい。
【０１２０】
更に、抗体（又はそのフラグメント）は、細胞毒素、治療薬又は放射性金属イオン等の治療薬の一部と結合することができる。細胞毒素又は細胞毒性剤には、細胞に有害である任意の物質が含まれる。具体例には、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びプロマイシン及びそれらの類似体又は同族体が含まれる。治療薬には、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ・クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧ダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、及び抗有糸分裂物質（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の複合体は、所定の生体応答を修飾するために使用することができ、薬剤の一部は、古典的な化学治療薬を限定するとして解釈されない。例えば、薬剤の一部は、所望の生物活性を有するタンパク質又はポリペプチドであってもよい。このようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、又はジフテリア毒素等の毒素；腫瘍壊死因子、インターフェロン−α、インターフェロン−β、神経成長因子、成長因子由来の血小板、組織プラスミノーゲン活性化因子等のタンパク質；又は例えば、リンフォカイン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ又は他の成長因子等の生体応答調節剤が含まれる。
【０１２１】
このような治療薬の一部を抗体に結合するための技術は周知である。例えば、ＷＯ２００４０１０９５７Ａ２；Ａｒｎｏｎら、（１９８５）“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，”  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ｅｄ．  Ｒｅｉｓｆｅｌｄら、（Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．），  ｐｐ．２４３−２５６；ｅｄ．Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、（１９８７）  “Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”  ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，  ｅｄ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、（２ｄ  ｅｄ；Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．），  ｐｐ．６２３−６５３；“Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｒｅｓｕｌｔｓ，  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，”  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ｅｄ．  Ｂａｌｄｗｉｎら、（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８５），  ｐｐ．３０３−３１６を参照されたい。
【０１２２】
幾つかの実施形態において、抗体はＥｐｈＢ３遺伝子産物のＮ−末端に特異的である。他の実施形態において、抗体はＥｐｈＢ３遺伝子産物のＣ−末端に特異的である。幾つかの実施形態において、抗体は、タンパク質のＮ−及びＣ−末端の間にあるＥｐｈＢ３遺伝子産物の領域、ドメイン、一部又は断片に特異的である。幾つかの実施形態において、抗体は、Ｎ−末端と、Ｎ−及びＣ−末端の間にある領域との両方にわたる領域に特異的である。他の実施形態において、抗体は、Ｃ−末端と、Ｎ−及びＣ−末端の間にある領域との両方にわたる領域に特異的である。幾つかの実施形態において、抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドのエピトープに結合する。幾つかの実施形態において、抗体は、配列番号１４〜４２４のアミノ酸配列を有するエピトープを有するエピトープに結合する。
【０１２３】
幾つかの実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号１４〜４２４からなる群より選択されるＥｐｈＢ３のエピトープに結合する。幾つかの実施形態において、モノクローナル抗体は、リガンド結合ドメイン、ＴＮＦＲドメイン、第一のフィブロネクチンドメイン、及び第二のフィブロネクチンドメインからなる群より選択されるドメインに存在するＥｐｈＢ３のエピトープに結合する。幾つかの実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号１４〜１４８からなる群より選択されるＥｐｈＢ３のリガンド結合ドメインのエピトープに結合する。幾つかの実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号１６４〜２６２からなる群より選択されるＥｐｈＢ３のＴＮＦＲドメインのエピトープと結合する。幾つかの実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号２６３〜３０４からなる群より選択されるＥｐｈＢ３の第一のフィブロネクチンドメインのエピトープと結合する。幾つかの実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号３８３〜４２４からなる群より選択されるＥｐｈＢ３の第二のフィブロネクチンドメインのエピトープと結合する。
【０１２４】
幾つかの実施形態において、抗体のＥｐｈＢ３に対する結合親和性は少なくとも１×１０６Ｋａである。幾つかの実施形態において、抗体のＥｐｈＢ３に対する結合親和性は、少なくとも５×１０６Ｋａであり、少なくとも１×１０７Ｋａ、少なくとも２×１０７Ｋａ、少なくとも１×１０８Ｋａ、又はそれ以上である。本発明の抗体は又、本発明のポリペプチドに対する結合親和性に関して記載又は特定される。幾つかの実施形態において、結合親和性は、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、１０−１５Ｍ、又はそれ未満のものを含む。
【０１２５】
本発明の適切な抗体は、直鎖状又は立体的なエピトープ又はそれらの組み合わせを認識することができる。幾つかの実施形態において、抗体は、リガンド結合ドメイン（配列番号３）、ＴＮＦＲドメイン（配列番号４）、第一のフィブロネクチンドメイン（配列番号５）、又はＥｐｈＢ３の第二のフィブロネクチンドメイン（配列番号６）のエピトープに対して特異的である。これらのペプチドは、必ずしも１つのエピトープを正確にマッピングするのではないが、免疫原性でないＥｐｈＢ３配列を含むことが理解される。以下の配列は、アミノ酸数（即ち「ＡＡｎ」（ｎは配列番号２で表わされるアミノ酸配列のアミノ酸数である））によって示される。例えば、「ＡＡ８０−ＡＡ９０」の関連で、エピトープは、配列番号２の約アミノ酸８０〜配列番号２の約アミノ酸９０と定義される。エピトープの関連で、「約」という用語は、＋／−１又は２アミノ酸残基を意味する。
【０１２６】
ＡＡ１−ＡＡ２５；ＡＡ１−ＡＡ５０；ＡＡ１−ＡＡ８４；ＡＡ９−ＡＡ１７７；ＡＡ１−ＡＡ１０；ＡＡ５−ＡＡ２０；ＡＡ２０−ＡＡ２５；ＡＡ３５−ＡＡ４５；ＡＡ４８−ＡＡ５２；ＡＡ５０−ＡＡ１００；ＡＡ４０−ＡＡ９０；ＡＡ４５−ＡＡ６５；ＡＡ６５−ＡＡ７５；ＡＡ８０−ＡＡ９０；ＡＡ８８−ＡＡ９２；ＡＡ９９−ＡＡ１２０；ＡＡ９５−ＡＡ１１０；ＡＡ１０５−ＡＡ１２０；ＡＡ１００−ＡＡ１５０；ＡＡ１３２−ＡＡ１３７；ＡＡ１５０−ＡＡ２００；ＡＡ１５５−ＡＡ１７０；ＡＡ１９０−ＡＡ２１０；ＡＡ１９８−ＡＡ２０２；ＡＡ２００−ＡＡ２５０；ＡＡ２２０−ＡＡ２４０；ＡＡ２３８−ＡＡ２３４；ＡＡ２４５−ＡＡ２６５；ＡＡ２５０−ＡＡ３００；ＡＡ２９０−ＡＡ３３０；ＡＡ２９０−ＡＡ３０５；ＡＡ３００−ＡＡ３５０；ＡＡ３１０−ＡＡ３３０；ＡＡ３１７−ＡＡ３２２；ＡＡ３４８−ＡＡ３５２；ＡＡ３５０−ＡＡ４００；ＡＡ３８０−ＡＡ３９５；ＡＡ３８２−ＡＡ３８７；ＡＡ４０５−ＡＡ４９５；ＡＡ４００−ＡＡ４５０；ＡＡ４０５−ＡＡ４１５；ＡＡ４１５−ＡＡ４２５；ＡＡ４２５−ＡＡ４３５；ＡＡ４３７−ＡＡ５８２；ＡＡ４５０−ＡＡ５００；ＡＡ４４０−ＡＡ４６０；ＡＡ４４６−ＡＡ４４０；ＡＡ４６０−ＡＡ４７０；ＡＡ４６０−ＡＡ４６４；ＡＡ４７２−ＡＡ４７８；ＡＡ４７５−ＡＡ４９５；ＡＡ５００−ＡＡ５５０；ＡＡ５１１−ＡＡ５５９；ＡＡ５１５−末端（Ｃ−末端）。特定のＥｐｈＢ３エピトープを以下の表１に示す。
【０１２７】
本発明の抗体が結合できる他の潜在的なエピトープの予想方法は、当業者に周知であり、これには、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ解析（Ｋｙｔｅ，  Ｊ  ａｎｄ  Ｄｏｌｉｔｔｌｅ，  Ｒ．Ｆ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  （１９８２）  １５７：１０５−１３２）、Ｈｏｐｐ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ解析（Ｈｏｐｐ，  Ｔ．Ｐ．  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ，  Ｋ．Ｒ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （１９８１）  ７８：３８２４−３８２８；Ｈｏｐｐ，  Ｔ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ，  Ｋ．Ｒ．  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  （１９８３）  ２０：４８３−４８９；Ｈｏｐｐ，  Ｔ．Ｊ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  （１９８６）  ８８：１−１８）、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ解析（Ｊａｍｅｓｏｎ，  Ｂ．Ａ．  ａｎｄ  Ｗｏｌｆ，  Ｈ．，  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  （１９８８）  ４：１８１−１８６）、及びＥｍｉｎｉ解析（Ｅｍｉｎｉ，  Ｅ．Ａ．，  Ｓｃｈｌｉｅｆ，  Ｗ．Ａ．，  Ｃｏｌｏｎｎｏ，  Ｒ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｗｉｍｍｅｒ，  Ｅ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  （１９８５）  １４０：１３−２０）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２８】
本発明の抗体を記載するために使用する場合、「特異的」という用語は、標的タンパク質と他のポリペプチドとの間に局在化する配列の同一性、相同性又は類似性の可能な存在にもかかわらず、本発明の抗体の可変領域が、結合親和性を含む特性における測定可能な相違によって排他的に標的ポリペプチドを認識し結合することを示す。当業者は、抗体の可変領域外の配列、特に分子の定常領域との相互作用によって、このような特異的抗体が他のタンパク質（例えば、ＥＬＩＳＡ技術におけるＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質Ａ又は他の抗体）とも相互作用することを容易に理解する。本発明の抗体の結合特異性を決定するためのスクリーニング試験は周知であり、Ｈａｒｌｏｗら、（Ｅｄｓ．），  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  （１９８８），  Ｃｈａｐｔｅｒ  ６で考察されている通り、当該技術分野で通常に実施されている。
【０１２９】
抗体は、１）結合活性の閾値を示し、及び／又は２）既知の関連ポリペプチド分子と有意に交差反応しない場合に、「結合特異性」であると定義される。抗体の結合親和性は、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ解析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，  Ａｎｎ．  ＮＹ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ５１：６６０−６７２，  １９４９）によって、当業者により容易に測定することができる。幾つかの実施形態において、本発明の抗体は、標的エピトープ又は模倣物デコイと、Ｅｐｈ又はＥｃｋファミリーの他の既知のメンバーよりも、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５、及び少なくとも１０６倍高く結合する。
【０１３０】
幾つかの実施形態において、本発明の抗体は既知の関連ポリペプチド分子と結合しない。例えば、それらがＥｐｈＢ３ポリペプチドと結合する場合、標準的なウェスタンブロット解析（Ａｕｓｕｂｅｌら）を使用して既知の関連ポリペプチドと結合しない。既知の関連ポリペプチドの例には、ＥｐｈＡ５（エフリン受容体ＥｐｈＡ５）、ＥｐｈＢ２（エフリン受容体ＥｐｈＢ２）、ＥｐｈＢ４（エフリン受容体ＥｐｈＢ４）等のエフリン受容体タンパク質ファミリーの他のメンバーが含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、抗体は、ＥｐｈＢ３ポリペプチドに特異的に結合する抗体集団を分離するために、既知の関連ポリペプチドに対してスクリーニングすることができる。例えば、ヒトＥｐｈＢ３受容体ポリペプチドは、適当な緩衝液条件下で不溶性マトリックスに付着するエフリン受容体ファミリーポリペプチド（ＥｐｈＢ３を除いて）を含むカラムを通り過ぎる。このようなスクリーニングは、密接に関連するポリペプチドに対して非交差反応性のポリクローナル及びモノクローナル抗体の分離を可能にする（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  （ｅｄｓ．），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８８；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｏｌｉｇａｎら、（ｅｄｓ．），  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９９５）。特異抗体のスクリーニング及び分離は当該技術分野において周知である（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｐａｕｌ  （ｅｄｓ．），  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３；Ｇｅｔｚｏｆｆら、  Ａｄｖ．  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４３：１−９８，  １９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｇｏｄｉｎｇ，  Ｊ．Ｗ．  （ｅｄｓ．），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．，  １９９６；Ｂｅｎｊａｍｉｎら、  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２：６７−１０１，  １９８４）を参照）。このような試験の代表的な具体例には、同時免疫電気泳動法、ラジオイムノ試験（ＲＩＡ）、放射性免疫沈降法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロット又はウェスタンブロット試験、阻害又は競合試験及びサンドイッチ試験が含まれる。
【０１３１】
幾つかの実施形態において、本発明の抗体は、既知の関連ファミリーメンバーよりも少なくとも約１，０００倍、及び少なくとも約１０，０００倍大きい親和性を有する。幾つかの実施形態において、本発明の抗体の結合親和性は、ＥｐｈＢ３以外の関連ポリペプチドに対して、約１×１０５Ｋａ未満、約１×１０４Ｋａ未満、及び好ましくは１×１０３Ｋａ未満である。
【０１３２】
オリゴヌクレオチド
幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターはオリゴヌクレオチドである。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドはアンチセンス又はＲＮＡｉオリゴヌクレオチドである。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＥｐｈＢ３の領域、ドメイン、部分又は断片に相補的である。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約５〜約１００個のヌクレオチド、約１０〜約５０個のヌクレオチド、約１２〜約３５個のヌクレオチド、及び約１８〜約２５個のヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＥｐｈＢ３遺伝子の領域、部分、ドメイン又は断片に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも１００％の相同性を有する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３遺伝子の少なくとも１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個又は１００個の連続したヌクレオチドにわたって、実質的な配列相同性がある。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３遺伝子の全長にわたって実質的な配列相同性がある。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、中程度又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子に結合する。
【０１３３】
幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３及び配列番号４２５からなる群より選択される配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【０１３４】
幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であり、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）によって機能する。幾つかの実施形態において、ｄｓＲＮＡの一本鎖は、ＥｐｈＢ３遺伝子の領域、部分、ドメイン又は断片に対し、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％相同的である。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３遺伝子の少なくとも１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、又は１，０００個の連続したヌクレオチドにわたって、実質的な配列相同性がある。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３遺伝子の全長にわたって実質的な配列相同性がある。
【０１３５】
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において使用される。この配列は、ゲノム配列又はｃＤＮＡ配列に基づいてもよく（又は設計された形態）、特定の細胞又は組織中の同一、類似又は相補的なＤＮＡ又はＲＮＡの存在を増幅、確認又は検出するために使用される。オリゴヌクレオチドは又、遺伝子発現を調節するために使用することができる。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ配列の一部を含み、少なくとも約１０個のオリゴヌクレオチド及び約５００個のヌクレオチドを有する。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約１０ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、及び約２０ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは化学的に合成することができ、プローブとして使用することもできる。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは一本鎖である。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、二本鎖である少なくとも一部を含む。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドはＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチド（ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）である。
【０１３６】
小分子
幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは小分子である。本明細書で使用される「小分子」という用語は、約１０キロダルトン未満の分子量を有する、有機又は無機の非ポリマー性化合物を意味する。小分子の具体例には、ペプチド、オリゴヌクレオチド、有機化合物、無機化合物等が含まれる。幾つかの実施形態において、小分子は、約９ｋＤ、約８ｋＤ、約７ｋＤ、約６ｋＤ、約５ｋＤ、約４ｋＤ、約３ｋＤ、約２ｋＤ又は約１ｋＤ未満の分子量を有する。
【０１３７】
模倣物
幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは模倣物である。本明細書で使用される「模倣物」という用語は、ペプチドの活性を模倣する化合物を指すものとして使用される。模倣物は非ペプチドであり、非ペプチド結合により結合したアミノ酸を含んでいてもよい。参考として組み入れられている、１９９７年６月１０日に発行された米国特許第５，６３７，６７７号、及びその親出願は、模倣物の製造についての詳細なガイダンスを含む。手短く言えば、ＥｐｈＢ３受容体の三次元構造と特に相互作用するペプチドの三次元構造は、ペプチドでない分子によって複製される。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３模倣物は、ＥｐｈＢ３受容体の模倣物、又はＥｐｈＢ３受容体のリガンドの模倣物である。
【０１３８】
可溶性受容体
幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは可溶性受容体である。本明細書で使用される「可溶性受容体」という用語はＥｐｈ受容体、好ましくは、膜ドメインがないか、膜ドメインが崩壊している、ＥｐｈＢ３モジュレーターを意味する。
【０１３９】
デコイ受容体
幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、ＥｐｈＢ３受容体の少なくとも一部を含むデコイ受容体である。幾つかの実施形態において、デコイ受容体は、ＥｐｈＢ３リガンドについての天然のＥｐｈＢ３受容体と競争する。幾つかの実施形態において、デコイ受容体は、定量化、必要条件（ｑｕａｎｔｉｉｃａｔｉｏｎ）及び／又は可視化を促進するために標識される。他の実施形態において、デコイ受容体は更に、デコイ受容体及び／又はデコイ受容体−ＥｐｈＢ３複合体の単離及び／又は分離を促進するための部分を含む。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３受容体リガンドと結合したデコイ受容体は、影響を及ぼす上昇したシグナル（天然のＥｐｈＢ３受容体と比較し）をもたらす。幾つかの実施形態において、デコイ受容体は、ＥｐｈＢ３リガンドを捕獲することにより機能し、シグナル伝達ＥｐｈＢ３受容体と相互作用することから防止する、非シグナル伝達分子である。幾つかの実施形態において、デコイ受容体は、抗体又は抗体フラグメントと融合したＥｐｈＢ３受容体の少なくとも一部を含む。
【０１４０】
癌の治療／予防方法
本発明は、対象に、１つ以上のＥｐｈＢ３ＥｐｈＢ３モジュレーターの治療有効量を対象に投与することを含む、癌又は癌の症状を治療及び／又は予防する方法を提供する。幾つかの実施形態において、癌はＥｐｈＢ３の過剰発現と関連する。幾つかの実施形態において、癌は大腸癌、卵巣癌、食道癌又は肺癌又は神経芽細胞腫である。幾つかの好ましい実施形態において、癌は大腸癌である。幾つかの実施形態において、対象は癌に罹患している、又は癌に罹患しやすい傾向にあるものとして診断される。
【０１４１】
癌の症状は、当業者に周知であり、これには、疼痛、死亡、体重減少、衰弱、摂食困難、血便、吐き気、嘔吐、肝転移、肺転移、骨転移、腹部膨満、腫脹、腹腔内の体液、膣出血、便秘、腹部膨張、大腸穿孔、急性腹膜炎（感染、発熱、疼痛）、吐血、及び嚥下困難等が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４２】
調節化合物の治療有効量は、医化学者に周知の方法によって経験的に決定することができ、とりわけ、患者の年齢、病状の重症度、及び最終的な所望の医薬製剤に依存する。本発明のモジュレーターの投与は、例えば、吸入又は座剤、又は膣、直腸、尿道、頬及び舌下組織等の粘膜、経口的、局所的、鼻腔内、腹腔内、非経口的、動脈内、静脈内、リンパ管内、腫瘍内、筋肉内、間質内、動脈内、皮下、眼内、滑膜内、経上皮及び経皮的粘膜組織への投与によって実施することができる。好ましい実施形態において、モジュレーターは、洗浄、経口的又は動脈注射によって投与される。導入の他の適切な方法には、充電可能又は生分解性装置、及び遅延及び持続性ポリマー性装置が含まれる。上で考察した通り、本発明の治療用組成物は、他の既知の抗癌剤、又は他の既知の骨疾患治療法との併用療法の一部としても投与することができる。
【０１４３】
本発明は更に、患者における、ＥｐｈＢ３に関連する生物学的活性を調節する方法も提供する。本方法は、１つ以上のＥｐｈＢ３の生物学的活性を調節するのに十分な量のＥｐｈＢ３モジュレーターを患者に投与することを含む。ＥｐｈＢ３生物学的活性を測定するのに適切な試験は、上記及び下記に説明されている。
【０１４４】
本発明は又、処置を必要とする患者における癌細胞の増殖を阻害する方法であって、患者に、１つ以上のＥｐｈＢ３モジュレーターの治療有効量を投与することを含む方法も提供する。ＥｐｈＢ３に関連する細胞増殖を測定するのに適切な試験は、当業者に既知である。
【０１４５】
本発明は更に、処置を必要とする患者において、癌を阻害する方法を提供する。本方法は、患者が本明細書に記載されるようなＥｐｈＢ３治療薬の候補であるかを決定し、患者がＥｐｈＢ３治療薬の候補である場合に、１つ以上のＥｐｈＢ３モジュレーターの治療有効量を患者に投与することを含む。患者がＥｐｈＢ３治療薬の候補でない場合、患者は従来の癌治療で処置される。
【０１４６】
本発明は又、患者にＥｐｈＢ３モジュレーターの治療有効量を投与することを含む、患者における２種以上の細胞の相互作用を阻害する方法も提供する。ＥｐｈＢ３に関連する細胞相互作用を測定するのに適切な試験は、当業者に既知である。
【０１４７】
本発明は又、患者に、本明細書に開示されたＥｐｈＢ３組成物の治療有効量を投与することを含む、患者における１つ以上の癌の症状を調節する方法も提供する。
【０１４８】
本発明は又、処置を必要とする患者において、固定非依存性癌の増殖を阻害する方法であって、ＥｐｈＢ３モジュレーターの治療有効量を患者に投与することを含む方法も提供する。ＥｐｈＢ３に関連する固定非依存性癌の増殖を測定するための試験は実施例に説明されている。
【０１４９】
本発明は又、処置を必要とする患者において、癌細胞の移動を阻害する方法であって、ＥｐｈＢ３モジュレーターの治療有効量を患者に投与することを含む方法も提供する。ＥｐｈＢ３に関連する細胞の移動を測定するのに適切な試験は、当業者に既知である。
【０１５０】
本発明は又、処置を必要とする患者において、癌細胞の接着を阻害する方法であって、ＥｐｈＢ３モジュレーターの治療有効量を患者に投与することを含む方法も提供する。ＥｐｈＢ３に関連する細胞の接着を測定するのに適切な試験は、当業者に既知である。
【０１５１】
本発明は又、癌が発生しやすい、癌が転移しやすい患者、又は転移を有し、それによって再発しやすい患者を予防的に処置する方法も提供する。本方法は、例えば、癌又は転移性腫瘍の家族歴を有するか、癌転移についての遺伝的素因を示す、高い危険性の個体に特に有用である。幾つかの実施形態において、腫瘍はＥｐｈＢ３に関連する腫瘍である。更に、本方法は、外科的切除により除去されたか、従来の癌療法により治療された、ＥｐｈＢ３に関連する腫瘍を患っている、ＥｐｈＢ３に関連する腫瘍の再発を有する患者を予防するのに有用である。
【０１５２】
本発明は又、ＥｐｈＢ３モジュレーターの治療有効量を患者に投与することを含む、癌の進行を阻害し、及び／又は癌の退行を起こす方法も提供する。
【０１５３】
幾つかの実施形態において、抗癌処置を必要とする患者は、化学及び／又は放射線療法と組み合わせて、抗体、小分子、模倣物、可溶性受容体、デコイ受容体又はオリゴヌクレオチドを使用して処置される。例えば、抗体、小分子、模倣物、可溶性受容体、デコイ受容体又はオリゴヌクレオチドの投与に続き、患者は、抗癌放射線の治療有効量で処置される。幾つかの実施形態において、化学療法は、抗体、小分子、模倣物、可溶性受容体、デコイ受容体又はオリゴヌクレオチドと組み合わせて供給される。幾つかの実施形態において、抗体、小分子、模倣物、可溶性受容体、デコイ受容体又はオリゴヌクレオチドは、化学療法及び放射線療法と組み合わせて投与される。
【０１５４】
治療法は、１つ以上のＥｐｈＢ３モジュレーターの単回又は複数回の患者への投与を含む。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、無菌であり、発熱物質を含まず、薬学的に許容される担体又は希釈剤と共にＥｐｈＢ３モジュレーターを含む注射用薬学的組成物として投与される。
【０１５５】
幾つかの実施形態において、本発明の治療計画は、手術、放射線療法、ホルモン消失療法及び／又は化学療法を含むがこれらに限定されない従来の治療計画と一緒に使用される。本発明のＥｐｈＢ３モジュレーターの投与は、従来の癌治療の前、同時又は後に実施される。
【０１５６】
幾つかの実施形態において、２種以上の異なるＥｐｈＢ３モジュレーターが患者に投与される。
【０１５７】
幾つかの実施形態において、患者に投与されるＥｐｈＢ３モジュレーターの量は、血管形成を阻害するのに効果的である。幾つかの実施形態において、患者に投与されるＥｐｈＢ３モジュレーターの量は、ＥｐｈＢ３受容体の分解を誘導するのに効果的である。幾つかの実施形態において、患者に投与されるＥｐｈＢ３モジュレーターの量は、２種以上のＥｐｈＢ３受容体のオリゴマー形成を誘導するのに効果的である。幾つかの実施形態において、患者に投与されるＥｐｈＢ３モジュレーターの量は、ＥｐｈＢ３受容体のリン酸化を促進するのに効果的である。幾つかの実施形態において、患者に投与されるＥｐｈＢ３モジュレーターの量は、チロシンキナーゼ活性を促進するのに効果的である。幾つかの実施形態において、患者に投与されるＥｐｈＢ３モジュレーターの量は、癌の進行を阻害し、及び／又は癌の退行を起こすのに効果的である。
【０１５８】
臨床面
幾つかの実施形態において、本発明の方法及び組成物は、大腸癌、卵巣癌、小肺細胞癌、胃食道癌、胃癌、及び膵臓癌等に特に有用である。幾つかの実施形態において、本方法及び組成物は、組成物は、例えば肺転移を含む癌転移の治療及び／又は診断に有用である。
【０１５９】
薬学的組成物
本発明は又、本明細書に記載の１つ以上のＥｐｈｂ３モジュレーター及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物も提供する。
【０１６０】
幾つかの実施形態において、薬学的組成物は、溶液又は懸濁液の何れかとして注射剤として調製され；注射の前に、液体溶媒中の溶液に適した固体形態又は懸濁液を製造することができる。リポソームは、薬学的に許容される担体の定義中に含まれる。例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等の鉱酸塩；酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等の有機酸の塩等の薬学的に許容される塩は薬学的組成物中に存在する。薬学的に許容される賦形剤の詳細な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  （１９９５）  Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓに記載されている。
【０１６１】
ＥｐｈＢ３の検出方法
本発明は、ＥｐｈＢ３の検出方法も提供する。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３は患者中、又は患者の試料中に存在する。幾つかの実施形態において、本方法は、１つ以上のＥｐｈＢ３モジュレーターを含む組成物を患者に投与し、患者内の造影剤の位置を決定することを含む。幾つかの実施形態において、患者試料は癌細胞を含む。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、造影剤と結合するか、検出可能に標識されている。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは、造影剤と結合した抗ＥｐｈＢ３抗体であり、患者に投与され、１つ以上の腫瘍を検出し、又はＥｐｈＢ３治療薬に対する患者の感受性を決定する。標識された抗体は細胞上の高密度の受容体に結合し、それによって腫瘍細胞上に蓄積する。標準的な画像化技術を使用し、腫瘍の部位を検出することができる。
【０１６２】
本発明は又、ＥｐｈＢ３モジュレーターを含む組成物を試料と接触させ、試料中のＥｐｈＢ３モジュレーターの存在を検出することを含む、ＥｐｈＢ３を発現又は過剰発現する細胞又は腫瘍の画像化／検出方法も提供する。幾つかの実施形態において、試料は患者試料である。幾つかの実施形態において、患者試料は癌細胞を含む。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは造影剤と結合しているか、検出可能に標識されている。
【０１６３】
本発明は又、患者、細胞又は試料中に存在するＥｐｈＢ３の量を定量する方法も提供する。本方法は、１つ以上の抗体、プローブ又は小分子を患者又は試料に投与し、試料中に存在するＥｐｈＢ３の量を決定することを含む。幾つかの実施形態において、抗体、プローブ又は小分子は造影剤と結合しているか、検出可能に標識されている。このような情報は、例えば、腫瘍がＥｐｈＢ３に関連するかどうか、その結果、特定の治療を使用するべきか回避すべきかを示す。幾つかの実施形態において、当業者に周知の標準的技術を使用して、腫瘍細胞を含むと思われる試料を得、標識抗体、プローブ、オリゴヌクレオチド又は小分子と接触させる。結合していない、標識抗体、プローブ、オリゴヌクレオチド又は小分子を除去した後、細胞に結合した標識抗体、ペプチド、オリゴヌクレオチド又は模倣物の量、又は結合していないとして除去した抗体、ペプチド、オリゴヌクレオチド又は模倣物の量を決定する。この情報は、存在するＥｐｈＢ３の量と直接関連する。
【０１６４】
画像化は、当業者に周知の方法を使用して実施することができる。画像化は、例えば、ラジオシンチグラフィー、核磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）又はコンピュータ断層撮影（ＣＴスキャン）により実施することができる。造影剤のために最も一般的に使用される放射標識には、放射性ヨウ素又はイオジウムが含まれる。ＣＴスキャンによる画像化は、鉄キレート等の重金属を使用してもよい。ＭＲＩスキャンニングは、ガドリニウム又はマンガン等のキレートを使用してもよい。更に、陽電子射出断層撮影法（ＰＥＴ）は、酸素、窒素、鉄、炭素又はガリウムの陽電子放射体を使用して実行することができる。
【０１６５】
幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３モジュレーターは抗ＥｐｈＢ３抗体である。幾つかの実施形態において、モジュレーターは造影剤と結合しているか、検出可能に標識されている。幾つかの実施形態において、造影剤は、１８Ｆ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、７７Ｂｒ、８７ＭＳｒ、８６Ｙ、９０Ｙ、９９ＭＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１２７Ｃｓ、１２９Ｃｓ、１３１Ｉ、１３２Ｉ、１９７Ｈｇ、２０３Ｐｂ、又は２０６Ｂｉである。
【０１６６】
検出方法は、当業者に周知である。例えば、ポリヌクレオチドの検出方法には、ＰＣＲ、ノーザンブロット、サザンブロット、ＲＮＡ保護、及びＤＮＡハイブリダイゼーション（ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含む）が含まれるが、これらに限定されない。ポリペプチドの検出方法には、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、酵素活性試験、スロットブロット、ペプチドマスフィンガープリンティング、電気泳動、免疫化学及び免疫組織化学が含まれるが、これらに限定されない。検出方法の他の具体例には、全てが当業者に周知である、ラジオイムノ試験（ＲＩＡ）、化学発光免疫試験、蛍光免疫測定法、時間分解蛍光免疫測定法（ＴＲ−ＦＩＡ）、二色励起蛍光顕微鏡、又は免疫クロマトグラフ試験（ＩＣＡ）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の幾つかの好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドの発現はＰＣＲ法を使用して検出され、ポリペプチドの生成はＥＬＩＳＡ技術を使用して検出される。
【０１６７】
ＥｐｈＢ３治療薬に対する感受性を決定する方法
本発明は又、ＥｐｈＢ３治療薬に対する患者の感受性を決定する方法も提供する。本方法は、患者又は患者前記試料におけるＥｐｈＢ３の発現の証拠の有無を検出することを含む。患者又は前記試料におけるＥｐｈＢ３の発現の証拠の存在は、ＥｐｈＢ３治療薬に対して感受性である患者を示す。患者又は患者前記試料におけるＥｐｈＢ３の発現の証拠の非存在は、ＥｐｈＢ３治療薬に対する候補でない患者を示す。
【０１６８】
幾つかの実施形態において、第一にＥｐｈＢ３治療薬に対する感受性の患者を特定する治療法は、処置を必要とする患者に、造影剤と結合したＥｐｈＢ３抗体、プローブ、プライマー、又はオリゴヌクレオチドを含む組成物を投与し、患者における遺伝子又は遺伝子産物の徴候の有無を決定する。患者における、ＥｐｈＢ３の発現、特にＥｐｈＢ３の過剰発現の証拠の存在は、ＥｐｈＢ３治療薬のための候補患者を示し、患者におけるＥｐｈＢ３の発現の証拠の非存在は、ＥｐｈＢ３治療薬の候補でない患者を示す。幾つかの実施形態において、治療方法は、患者がＥｐｈＢ３治療薬の候補である場合に１つ以上のＥｐｈＢ３モジュレーターを患者に投与し、患者がＥｐｈＢ３治療薬の候補でない場合に従来の癌治療で患者を処置することを含む。
【０１６９】
スクリーニング方法
本発明は又、抗癌剤のスクリーニング方法も提供する。本方法は、ＥｐｈＢ３を発現する細胞を候補化合物と接触させ、ＥｐｈＢ３に関連する生物学的活性が調節されるかどうかを検出することを含む。幾つかの実施形態において、チロシンキナーゼ活性、受容体リン酸化、受容体オリゴマー形成、又は受容体分解の１つ以上の誘導が癌の阻害剤であることを示す。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３の発現の阻害が癌の阻害剤であることを示す。
【０１７０】
本発明は又、癌の阻害剤の特定方法も提供する。本方法は、ＥｐｈＢ３を発現する細胞を候補化合物及びＥｐｈＢ３リガンドと接触させ、ＥｐｈＢ３に関連する生物学的活性が調節されるかどうかを検出することを含む。幾つかの実施形態において、チロシンキナーゼ活性、受容体リン酸化、受容体オリゴマー形成、又は受容体分解の１つ以上の誘導が癌の阻害剤であることを示す。幾つかの実施形態において、ＥｐｈＢ３の発現の阻害が癌の阻害剤であることを示す。
【０１７１】
幾つかの実施形態において、例えば、受容体リン酸化を上昇させ、及び／又は受容体分解を誘導する能力についての推定上のモジュレーターをスクリーニングすることによる、抗癌剤、特に抗転移癌剤のスクリーニング方法を提供する。
【０１７２】
キット
幾つかの実施形態において、本発明は、ＥｐｈＢ３の過剰発現に関連する遺伝子又は遺伝子産物の画像化及び／又は検出のためのキットを提供する。本発明のキットは、検出可能な抗体、小分子、オリゴヌクレオチド、可溶性受容体、デコイ受容体、模倣物又はプローブ、及び本発明の方法を実施するための使用説明書を含む。場合により、キットは又、１つ以上の以下のもの、即ち、対照（陽性及び／又は陰性）、対照用容器、陽性及び／又は陰性の結果の代表的具体例の写真又は描写を含む。
【０１７３】
本明細書に記載された、それぞれの特許、特許出願、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号及び刊行物は、その全体において参考として組み入れられている。
【０１７４】
本明細書の記載内容に加えて、本発明の種々の改変についても、当業者であれば、上記の説明を考慮の上で明らかになるであろう。このような改変は又、添付の特許請求の範囲内に含まれるものとして意図される。本発明は更に、以下の実施例において更に実証するが、これらの実施例は、本発明の適用範囲を例示することを目的とし、限定すること目的としたものではない。
【実施例】
【０１７５】
（実施例１）  タンパク質のビオチン化
２個の１５ｃｍのシャーレ内で、細胞を約８５〜９０％密集になるまで培養し、１０ｍＬのＰＢＳで１回洗浄した。使用の直前に、０．５ｍｇ／ｍＬのビオチニル化溶液を、ＰＢＳ（ｐＨ８．０）及びＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（スルホスクシニミジル−６’−（ビオチナミド）−６−ヘキサナミドヘキサノエート）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．［米国イリノイ州ロックフォード］；カタログ番号２１３３８）を使用して、製造業者の指示に従って製造した。次いで、細胞表面のタンパク質を、７〜１０ｍＬのビオチニル化溶液を使用してビオチニル化して各プレートをコーティングし、室温にて１５分間インキュベートした。次いで、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）で１回、ＰＢＳ（ｐＨ８．０）で２回、細胞を洗浄した。次いで、プレートにＨａｎｋｓ培地を加え、細胞をこすり落として集め、１０ｍＬのこすり落とした細胞を１５ｍＬのファルコンチューブに移した。ビオチニル化細胞のチューブを１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を吸引して細胞ペレットをＰＢＳで１回洗浄した。次いで、細胞を再懸濁し、適当量（４００〜８００μＬ）の変性剤又は非変性溶解緩衝液を使用して、氷上で１５〜３０分間インキュベートして溶解した。次いで、細胞を１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して破片を除去し、上清を集めた。タンパク質濃度をビシンコニン酸（ＢＣＡ）比色分析法（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．［米国イリノイ州ロックフォード］）により定量し、抽出物を、エッペンドルフチューブに少しずつ入れ（凍結／解凍のサイクルを繰り返すことを回避するため）、エタノール／ドライアイス浴中で急速凍結させ、−７０℃に保存した。
【０１７６】
（実施例２）  クラスター形成したリガンド誘導性のＥｐｈＢ３のリン酸化
クラスター形成したリガンドを細胞に加える前に、抗ヒトＩｇＧ抗体を、エフリンＢ２−Ｆｃリガンドのクラスター形成を誘導するために、１０分間使用した。クラスター形成したリガンドを、６．２５μｇ／ｍＬの濃度で細胞に加え、細胞を饑餓状態の培地中で種々の時間インキュベートし、幾つかの時点における結果を観察した。インキュベーションの後、饑餓状態の培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した。次いで、細胞をプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を含む変性溶解緩衝液で溶解した。遠心分離によって溶解液は透明になり、次いで、タンパク質定量キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．［米国イリノイ州ロックフォード］）を使用して定量した。溶解液は、免疫沈降、又はウェスタンブロット解析のための電気泳動（１５μｇ／レーン）における直接の泳動のための何れかに使用された。
【０１７７】
（実施例３）  免疫沈降
全容量１０ｍＬ当たり、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  及び１錠のプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｏｒｐ．［米国インディアナ州インディアナポリス］）を含む免疫沈降（ＩＰ）緩衝液は、を調製した。組織内で製造したウサギポリクローナル抗体（Ａｂ）、抗ＥｐｈＢ３を、ＩＰ緩衝液で１：１００に希釈して一緒にし、ねじ蓋付きの試験管中の細胞溶解物に加え、ロッカープラットフォーム上で、４℃にて１〜２時間混合した。免疫沈降について、４０μＬの抗ウサギＩｇＧ結合ビーズ（ＥｐｈＢ３のクラスター形成実験について）又は１２０μＬのストレプトアビジンビーズ（ビオチニル化した表面タンパク質の解析について）の何れかを各チューブに加え、ロッキングプラットホーム上で４℃にて一晩、インキュベーションを続けた。次いで、チューブを７０００×ｇ、４℃にて２分間遠心分離し、上清を除去した。ビーズペレットを、冷却した洗浄緩衝液で４回洗浄し、次いで、還元剤を含む３０μＬの２×ＳＤＳ  Ｔｒｉｓ／グリシン試料緩衝液を、各チューブに加えた。次いで、試料緩衝液中のビーズを、９５℃にて２回、それぞれ５分ずつ煮沸し、ビーズから免疫沈降物を遊離させた。次いで、煮沸したビーズ溶液を１４，０００×ｇ、室温にて５分間遠心分離し、上清を除去して新しいチューブに移した。直ちに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの電気泳動により免疫沈降物を解析するか、−２０℃に保存した。標準的方法を使用してウェスタンブロット解析を実施した。電気泳動を行った免疫沈降物をポリアクリルアミドゲルから膜に移し、次いで、一次抗体（１：１０００に希釈した抗ホスホチロシン抗体４Ｇ１０（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｇｒｏｕｐ，ＬＬＣ［米国マサチューセッツ州ウォルサム］、又は１：１０００に希釈したウサギ抗ＥｐｈＢ３ポリクローナル抗体）を使用して緩徐に振盪しながら室温にて膜を調べた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）を使用して数回洗浄した後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合した適当な種特異的二次抗体を加え、ロッカープラットフォーム上で、室温にて３０分間インキュベートした。数回洗浄した後、膜上の反応性のバンドを、ＥＣＬ検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＫ）を使用して可視化した。
【０１７８】
（実施例４）  ＦＡＣＳ解析
解析のために、非透過性細胞を使用した。（冷）ＰＢＳ、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び０．１％アジ化ナトリウムを含むＦＡＣＳ緩衝液を調製した。解離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．［米国カリフォルニア州カールズバッド］）を使用して、接着細胞を剥離することにより細胞を集めた。解離緩衝液を中和するために、当量の増殖培地を加えた。次いで、５ｍＬのポリスチレン丸底チューブに細胞を一定分量入れた。各染色について、１００万個の細胞を１，０００ｒｐｍ、４℃にて５分間遠心分離し、細胞ペレットに一次抗体（１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中、６μｇまで）を加え、ボルテックスにより混合し、氷上で３０分〜１時間インキュベートした。１，０００ｒｐｍ、４℃にて５分間遠心分離することにより沈殿させた後、細胞を、３ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。２回目の洗浄及び遠心分離の後、二次抗体（５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に１μｇ）を細胞ペレットに加え、ボルテックスにより混合し、氷上で、暗所で３０分間インキュベートした。１，０００ｒｐｍ、４℃にて５分間の遠心分離によって沈殿させた後、細胞を、３ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。２回目の洗浄及び遠心分離後、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含む５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液に、５００μｇの細胞を再懸濁した（ＰＩは、１μｇ／μＬとして調製し、１：１００として使用した。１時間以内に、ＦＡＣＳ／フローサイトメトリー解析を行った。
【０１７９】
（実施例５）  ＥｐｈＢ３オリゴヌクレオチドは、ＳＷ６２０細胞の軟寒天増殖を阻害する。
【０１８０】
ＳＷ６２０細胞をアンチセンス（配列番号４２５）で処理するか、ＥｐｈＢ３に対するオリゴヌクレオチドを逆制御する。細胞を０．３５％の軟寒天に播種し、培養して７日後にＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅを使用して増殖を定量した。
【０１８１】
ＳＷ６２０細胞の接着非依存性細胞増殖によるＥｐｈＢ３遺伝子発現の効果を、軟寒天中のコロニー形成によって測定した。細胞がプレートに接着するのを防止するために、非組織培養処理プレートをポリ−ＨＥＭＡで最初に処理することによって、軟寒天試験を実施した。トリプシンを使用して非トランスフェクト細胞を集め、培地で２回洗浄した。血球計を使用して細胞をカウントし、培地中に１０４細胞／ｍＬに再懸濁した。５０μＬの一定量をポリＨＥＭＡでコーティングした９６ウェルプレートに入れ、形質転換した。各形質転換混合物について、担体分子、好ましくはリピトイド又はコレステロイドを、水中に０．５ｎＭの作用濃度になるように調製し、超音波処理を行って均一な溶液を得、０．４５μｍのＰＶＤＦ膜によりろ過した。次いで、アンチセンス又は対照オリゴヌクレオチドを無菌のミリポア水中に１００μＭの作用濃度になるように調製した。オリゴヌクレオチドを微量遠心管中、ＯｐｔｉＭＥＭＴＭに２μＭ、又はＯｐｔｉＭＥＭＴＭに約２０μｇオリゴ／ｍＬに希釈した。別の微量遠心管において、担体、通常、約１．５〜２ナノモルリピトイド／μｇアンチセンスオリゴヌクレオチドの量のリピトイド又はコレステロイドを、同じ容量の、オリゴヌクレオチドを希釈するために使用されるＯｐｔｉＭＥＭＴＭに希釈した。希釈したアンチセンスオリゴヌクレオチドを、直ちに希釈したリピトイドに加え、上下にピペッティングして混合した。オリゴヌクレオチドを、最終濃度約３００ｎＭになるまで細胞に加えた。３７℃にて約３０分間形質転換した後、細胞に最終濃度が０．３５％アガロースになるようにＧＴＧアガロースを、上下にピペッティングすることにより加えた。細胞層アガロースが固化した後、１００μＬの培地を各ウェルの上部に滴下した。増殖の出力について、２０μＬのＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅを各ウェルに加え、プレートを約１５分間振盪した。蛍光の表示（５３０ｎｍ励起／５９０ｎｍ発光）を、６〜２４時間のインキュベーション後に取得した。
【０１８２】
ＳＷ６２０細胞に対するＥｐｈＢ３アンチセンスオリゴヌクレオチドの適用は、コロニー形成の阻害をもたらし、ＥｐｈＢ３が接着非依存性の細胞増殖において役割を果たすことを示す。ＳＷ６２０細胞のコロニー形成の阻害をもたらす、これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、転移表現型の生成又は維持において役割を果たしていることを示す。
【０１８３】
（実施例６）  ＥｐｈＢ３腫瘍の検出法
複数の個体由来の正常細胞由来の全ＲＮＡを集め、逆転写し、ＥｐｈＢ３のプライマーを使用した定量ＰＣＲにかけた。８名の患者及び腫瘍周囲の正常組織由来のＬＣＭで切り出した細胞から増幅したＲＮＡを逆転写し、ＥｐｈＢ３のプライマーを使用した定量ＰＣＲにかけた。癌におけるｍＲＮＡのレベルは、腫瘍周囲のレベルよりも約４倍高いことがわかった。大腸癌試料におけるＥｐｈＢ３のレベルは、正常な大腸試料及び多くの他の正常組織試料よりも、大腸癌において有意に高いレベルで発現することが示された。例外は、大腸癌と同程度のレベルのＥｐｈＢ３を発現する正常な乳腺であった。
【０１８４】
（実施例７）  遺伝子発現の制御
腫瘍形成、例えば、転移表現型の促進における遺伝子産物の役割及び機能を確認するため、癌性細胞におけるポリヌクレオチドによって表わされる、別々に発現される遺伝子の発現を、アンチセンス及びＳｉＲＮＡノックアウト技術を使用して解析した。
【０１８５】
多くの異なるアンチセンス及びＳｉＲＮＡを生成し、遺伝子の発現を抑制する能力について試験した。一旦、合成及び定量し、オリゴマーを、細胞株のパネルにおける転写ノックアウトの効率についてスクリーニングした。ノックアウトの効率は、ライトサイクラー定量を使用したＲＮＡレベルの解析によって測定した。
【０１８６】
遺伝子発現を阻害する、各オリゴヌクレオチドの能力を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１又はＭＤＡ２３１（“２３１”）；ＳＷ６２０大腸結腸癌細胞；Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ細胞；ＨＣＴ１１６細胞、及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５又はＭＤＡ４３５細胞への形質転換によって試験した。
【０１８７】
各形質転換混合物について、担体分子（脂質、脂質誘導体、脂質様分子、コレステロール、コレステロール誘導体、又はコレステロール様分子）を、均一な溶液を得るために超音波処理し、０．４５μｍのＰＶＤＦ膜でろ過して、水中に０．５ｍＭの作用濃度になるようにして調製した。次いで、アンチセンス及びＳｉＲＮＡヌクレオチドを、無菌のミリポア水中に約１００μＭの作用濃度になるように調製した。オリゴヌクレオチドを、更に微量遠心管中、ＯｐｔｉＭＥＭＴＭ  に２μＭ、又はＯｐｔｉＭＥＭＴＭに約２０μｇオリゴ／ｍＬに希釈した。別の微量遠心管において、担体、通常、約１．５〜２ナノモル担体／μｇアンチセンスオリゴヌクレオチドの量のリピトイド又はコレステロイドを、同じ容量の、オリゴヌクレオチドを希釈するために使用されるＯｐｔｉＭＥＭＴＭに希釈した。希釈したアンチセンスオリゴヌクレオチドを、直ちに希釈したリピトイドに加え、上下にピペッティングして混合した。オリゴヌクレオチドを、最終濃度約３００ｎＭ（アンチセンスオリゴヌクレオチド）になるまで細胞に加えた。ＳｉＲＮＡを、最終濃度約６７ｎＭまで細胞に加えた。
【０１８８】
トランスフェクト細胞中の興味のある標的遺伝子と関連する標的ｍＲＮＡのレベルを、ＡＢＩ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ７０００ＴＭリアルタイムＰＣＲ装置を使用して癌細胞株中で定量した。標的ｍＲＮＡについての値を内部対照に対して規格化した。各２０μＬの反応物について、抽出したＲＮＡ（一般的に全量０．２〜１μｇ）を無菌の０．５又は１．５ｍＬの微量遠心管に入れ、全量１２．５μＬになるように水を加えた。２．５μＬの水、２．０μＬの１０×反応緩衝液、１０μＬのオリゴｄＴ（２０ピコモル）、１．０μＬのｄＮＴＰ混合物（各１０ｍＭ）、０．５μＬのＲＮＡｓｉｎ（登録商標）（２０単位）（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．［米国フロリダ州ハイアリア］）、及び０．５μＬのＭＭＬＦ逆転写酵素（５０単位）（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）を混合（記載の順々に）することにより調製した、７．５μＬの緩衝液酵素混合物を、各チューブに加えた。上下にピペッティングすることにより成分を混合し、反応混合物を４２℃にて１時間インキュベートした。各チューブの成分を増幅前に遠心分離した。
【０１８９】
ＡＢＩ  ｓｙｂｒマスターミックス、及び０．１７５ピコモルの各オリゴヌクレオチドを使用して、増幅混合物を調製した。ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ［米国オレゴン州ユージーン］）は、二重鎖ＤＮＡに結合した場合に蛍光を発する色素である。増幅の際に二重鎖ＰＣＲ産物が生成される場合、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン由来の蛍光は上昇する。増幅混合物の各２０μＬの一定量に、２μＬの鋳型ＲＴを加え、標準プロトコールに従って増幅を実施した。結果は、非トランスフェクト細胞、ベクターのみを形質転換した（モック形質転換）細胞、又は逆制御オリゴヌクレオチドで形質転換した細胞に比べて、関連する遺伝子産物の発現における減少割合として表す。
【０１９０】
（実施例８）  増幅における発現の効果
アンチセンス及びＳｉＲＮＡ法を使用して、細胞増殖の阻害における遺伝子発現の効果を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１又はＭＤ２３１（“２３１”）；ＳＷ６２０大腸結腸癌細胞；Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ細胞；ＨＣＴ１１６細胞、及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５又はＭＤＡ４３５細胞を含む、幾つかの細胞株中で評価した。
【０１９１】
９６ウェルシャーレにおいて、数日後に約８０〜９５％密集になる密度に細胞を播種した。オリゴヌクレオチド（アンチセンス又はＳｉＲＮＡ）をＯｐｔｉＭＥＭＴＭ中に２μＭに希釈した。次いで、試験に使用される特定の細胞タイプについて最適化するために選択される運搬媒体に、オリゴヌクレオチド−ＯｐｔｉＭＥＭＴＭを加えた。次いで、オリゴ／運搬媒体混合物を、細胞上で血清を含む培地中に更に希釈した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの最終濃度は約３００ｎＭであり、ＳｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの最終濃度は６７〜１００ｎＭであった。
【０１９２】
オリゴヌクレオチド（アンチセンス又はＳｉＲＮＡ）を前述のようにして調製した。細胞を３７℃にて、約４時間〜一晩で形質転換し、形質転換混合物を新鮮な培地に置換した。前述の通り形質転換を実施した。
【０１９３】
ＳＷ６２０細胞の増殖阻害をもたらすオリゴヌクレオチド（アンチセンス又はＳｉＲＮＡ）は、関連遺伝子が、癌性大腸細胞における癌表現型の生成又は維持において役割を果たすことを示す。ＭＤＡ２３１細胞の増殖阻害をもたらすオリゴヌクレオチド（アンチセンス又はＳｉＲＮＡ）は、関連遺伝子が、癌性乳腺細胞における癌表現型の生成又は維持において役割を果たすことを示す。
【０１９４】
（実施例９）  ＥｐｈＢ３エピトープ
抗体認識及び調製のためのＥｐｈＢ３の直鎖エピトープは、当該技術分野で既知の多数の方法によって特定することができる。幾つかの具体的な方法には、抗原のアミノ酸配列に由来するペプチドの抗体結合能力を調べることが含まれる。結合は、ＢＩＡＣＯＲＥ又はＥＬＩＳＡを使用することによって評価することができる。他の技術には、平面固相担体（チップ）上において、ペプチドライブラリーを抗体にさらし、固相スクリーニングにおいて使用される多数の方法の何れかによって結合を検出することが含まれる。更に、ファージ提示法を、バイオパンニングの数回のラウンドの後のエピトープの選択を含むペプチドのライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。
【０１９５】
以下の表１は、抗ＥｐｈＢ３抗体によって認識するのに適した直鎖エピトープとして特定されたＥｐｈＢ３（配列番号２）の領域を示す。
【０１９６】
（表１）
【０１９７】
【表１−１】
2008545750.tif 000002
【０１９８】
【表１−２】
2008545750.tif 000003
【０１９９】
【表１−３】
2008545750.tif 000004
【０２００】
【表１−４】
2008545750.tif 000005
【０２０１】
【表１−５】
2008545750.tif 000006
【０２０２】
【表１−６】
2008545750.tif 000007
【０２０３】
【表１−７】
2008545750.tif 000008
【０２０４】
【表１−８】
2008545750.tif 000009
【０２０５】
【表１−９】
2008545750.tif 000010
（実施例１０）  免疫組織化学
乳癌、大腸癌、卵巣癌、肺癌及び食道癌からなる、市販されているパラフィン包埋ヒト組織マイクロアレイ、及び正常組織アレイを、免疫組織化学法によりＥｐｈＢ３の発現を評価するために使用した（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．［米国カリフォルニア州サンフランシスコ］；Ｃｙｂｒｄｉ［米国メリーランド州ゲーサーズバーグ］；Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．［英国ケンブリッジ］）。形質転換していない、及びＥｐｈＢ３で形質転換した２９３Ｔ細胞を、発現を確認するための対照として使用した。
【０２０６】
組成機切片を脱パラフィンし、水で水和させた。２０ｌｂの圧力で、１：１０に希釈したＲｅｖｅａｌ（Ｂｉｏｃａｒｅ）を使用してＤｅｃｌｏａｋｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ［米国カリフォルニア州ウオールナットクリーク］）中で、抗原回復を実施した。ＤＡＫＯ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  ＰＬＵＳ（ＤＡＫＯ［米国カリフォルニア州カーペンテリア］）で、免疫化学的手法を実施した。Ａｖｉｄｉｎ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ［米国カリフォルニア州ベーリンゲーム］）、次いで、ＤＡＫＯペルオキシダーゼブロック（ＤＡＫＯ）を使用して内因性ペルオキシダーゼを抑制することによって、内因性のビオチンを阻害した。抗体希釈液（Ｖｅｎｔａｎａ［米国アリゾナ州トゥーソン］）を３０分間、次いで、一次抗体中で３０分間インキュベーションすることによって、内因性の免疫グロブリンを阻害した。ウサギ抗ヒトＥｐｈＢ３抗体（Ｃｈｉｒｏｎ［米国カリフォルニア州エメリービル］）及びウサギＩｇＧアイソタイプ対照（ＮｅｏＭａｒｋｅｒ［米国カリフォルニア州フレモント］）は４μｇ／ｍＬで使用した。ビオチニル化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメント山羊抗ウサギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメント特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ［米国カリフォルニア州ウェストグローブ］）、それに続くＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を検出のために使用した。Ｓｔａｂｌｅ  ＤＡＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ［米国カリフォルニア州カールズバッド］）を使用して、色素生成性のカラー化を実施した。対比染色としてマイヤーヘマトキシリンを用い、切片を、段階的なアルコール中で脱水し、キシレン中で透明にし、合成封入剤を使用してスライドガラスで覆った。
【０２０７】
（実施例１１）  遺伝子抑制
ＳｉＲＮＡノックダウン及び細胞をベースとする試験
２ｍＬの培地中、６ウェルプレートに２５０，０００〜３５０，０００細胞／ウェルに細胞を播種した。プレートを３７℃にて一晩インキュベートした。次の日に、培地を除去し、１．８ｍＬの完全培地を加えた。エッペンドルフチューブに、１００μＬのＯｐｔｉＭＥＭを加えた。１００ｎＭに希釈したｓｉＲＮＡ（２０μＭストック）及び３．７５Ｍに希釈した脂質（０．５ｍＭ）を一緒に加えて複合体を形成し、細胞に滴下して加えた。ＳｉＲＮＡを含む細胞を３７℃にて４時間〜一晩インキュベートし、完全培地に置換した。２４〜７２時間で細胞を集め、ＲＮＡ／タンパク質レベルを記録した。
【０２０８】
増殖試験（ＳＷ６２０；Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ；ＨＣＴ１１６；ＭＤＡ−ＭＢ−４３５又はＭＤＡ２３１；１８４Ｂ５及びＭＲＣ９細胞）
５×９６ウェルの平面プレートの７０μＬに３，０００〜５，０００細胞／ウェルになるように細胞を播種した。細胞を３７℃にて一晩インキュベートした。Ｍｕｌｔｉｍｅｋ９６を使用して、細胞を、約１００ｎＭのｓｉＲＮＡ及び５μＭの脂質で形質転換した。混合物を１０分間インキュベートし、複合体を形成した。各ウェルに３０μＬ加えた。形質転換を４〜６時間インキュベートし、次いで、完全培地に置換した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏキットにより、４〜５日間、増殖を記録した。それぞれの日に、１枚のプレートを試験した。
【０２０９】
軟寒天試験（ＳＷ６２０；Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ；ＨＣＴ１１６及びＭＤＡ４３５細胞）
ポリヘマをコーティングした丸底の９６ウェルプレートに、７０μＬ培地／ウェル（約５００細胞／ウェル）になるように、細胞を播種した。３０μＬの複合体を細胞に加えることにより、１００ｎＭのｓｉＲＮＡ及び３．８μＭの脂質を使用して細胞を形質転換した。約５０μＬ／ウェルの１．０５％アガロースを各ウェルに加え、十分に混合して細胞を分散させた。アガロースの上部に１００μＬの完全培地を加え、３７℃にて５〜７日間インキュベートした。
【０２１０】
形成されたコロニーにおける細胞増殖を定量するために、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（２０μＬ／ウェル）を使用した。プレートを３７℃にてインキュベートし、蛍光を測定した。
【０２１１】
スフェロイド試験（ＳＷ６２０；ＨＣＴ１１６；及びＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞）
細胞の植え付け
０．１％ＳＴＶを使用して細胞をトリプシン処理し、血球計を使用してカウントした。ポリ（ＨＥＭＡ）でコーティングした丸底９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ＃３７９９）の７０μＬ培地中に８〜１０，０００細胞／ウェルに播種されるように、希釈を計算した。ポリ（ＨＥＭＡ）は、細胞がプレートの底に接着することを防止する、既知の抗接着剤である。
【０２１２】
細胞の形質転換
スフェロイド試験のために細胞を形質転換するため、通常、細胞を同じ日に形質転換し、細胞は植え付けた細胞である（スフェロイドが完全に形成される前）。ｓｉＲＮＡは、３重で試験した。野生型（形質転換されていない細胞）及び陽性ｓｉＲＮＡ対照及び陰性ｓｉＲＮＡ対照（通常、Ｑｕｉａｇｅｎ  ｓｉＲＮＡのＱｉａＲｅｆ）を使用した。
【０２１３】
リピトイドプレート調製
細胞株のセット当たり１種の脂質を使用した。リピトイド化合物は、無菌水を使用して、０．５ｍＭ〜０．２ｍＭの濃度に希釈した。
【０２１４】
複合体の形質転換
混合プレート上で、３０μＬのＯｐｔｉＭＥＭに、４．５μＬの希釈脂質（０．２ｍＭ）を加えた。混合プレートに、３０μＬの希釈ｓｉＲＮＡ（０．７μＭ）を加え、混合した。室温にて１０分間静置し、複合体を形成させた。３０μＬのｓｉＲＮＡ／脂質複合体を、７０μＬの培地中の細胞に加え、混合した。Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｗａｖｅｒ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｒｏｃｋｅｒ上で３７℃にて４〜７日間インキュベートした。
【０２１５】
（実施例１２）  ＬＤＨ試験
ＬＤＨ出力のための収穫
細胞毒性検出を使用して、細胞毒性試験を実施した。
【０２１６】
Ｎｕｎｃから９６ウェルマイクロプレートを購入した。Ｃｈｉｒｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から細胞株を得、１０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ［米国メリーランド州ロックビル］）及び２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ［米国メリーランド州ウォーカーズビル］）を補充した適切な培地中で、３７℃にて５％ＣＯ２中で増殖させた。
【０２１７】
細胞毒性試験は、Ｒｏｃｈから購入した細胞毒性検出キット（ＬＤＨ）（＃１６４４７９３）を使用して実施した。４９０ｎｍフィルターを有するマイクロタイタープレート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、ＬＤＨ活性を記録した。
【０２１８】
０日に（形質転換の前）、次いで形質転換の１、２及び３日にプレーティングさえも評価するために、試験について、１日当たり１プレートを回収した。各試験について、上清及び細胞溶解物の療法が、乳酸デヒドロゲナーゼ又はＬＤＨ量について記録された。
【０２１９】
培養上清ＬＤＨ
試験プレートの各ウェルから、１００μＬの上清を集め、１００μＬの血清を含まない培地を含むＶ底の９６ウェルプレートに移し、回転させ（２，０００ｒｐｍ、５分間）、死滅細胞を除去した。次いで、遊離したＬＤＨ（ｒＬＤＨ）の量を定量するため製造業者の指示に従い、１００μＬを、新しい９６ウェルの平面プレートに移し、１００μＬのキット色素及び触媒（４５：１の比、暗所、室温にて〜２０分インキュベーション）を各ウェルに加えることにより、試験した。死滅した、又は原形質膜が損傷を受けた細胞の増加は、細胞上清へのＬＤＨの遊離の増加をもたらす。ＬＤＨ活性の増加は、限定された時間内に形成される色素（フォルマザン）の量に直接関連する。この色素の形成を４９０ｎｍで検出した。
【０２２０】
溶解ＬＤＨ
培養上清の除去後、プレートに接着した細胞を、２００μＬの培地／１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００溶液（等量の増殖培地を、血清を含まない培地中の２％ＴｒｉｔｏｎＸ１００に加える）中で４〜５回混合することにより溶解し、２００μＬをＶ底プレートに移した。５分後、２，０００ｒｐｍで回転させて破片を除去し、各ウェルについて１００μＬの溶解物を平底プレートに回収し、キット色素及び触媒を、培養上清についてと同じ条件で加えることによって試験した。これは、細胞内ＬＤＨ（ｉＬＤＨ）の量の測定を可能にする。
【０２２１】
試験の現像
色素及び触媒を−２０℃に保存し、使用前に２５℃の水浴で解凍した。触媒を含むバイアルを室温に戻し、１ｍＬのＵＦ  Ｈ２Ｏを加え、使用前に１０分間静置した。未使用の試薬は４℃に保存した。
【０２２２】
現像前に、プレートをサランラップに包み、４℃に約１週間保存した。各プレートのカラム１は、試験ブランクとして使用した。試薬をプレートに加えた後、プレートを暗所（覆った箱）に置き、室温にて２０分間インキュベートした。ブランクの正常値は０．２〜０．３のＯＤ４９０である。一般的に、希釈した試料に使用する時は、血清を含まない培地を使用して半分に希釈する。
【０２２３】
ＲＬＤＨ／ｔＬＤＨ比
遊離したＬＤＨ＋細胞内ＬＤＨ（ｔＬＤＨ＝ｒＬＤＨ＋ｉＬＤＨ）を加えることにより、ＬＤＨの全量を計算した。アンチセンス及び逆制御に関連する試料の間の細胞毒性の量を比較するため、遊離したＬＤＨ及び全ＬＤＨ（ｒＬＤＨ／ｔＬＤＨ）の比を使用した。この比率は、生細胞に対する死滅細胞の割合を表し、様々な細胞毒性効果による、異なるウェル内の細胞の異なる数を有するという問題を回避する。
【０２２４】
以上において、本発明をその特定の実施形態を参考に記載してきたが、本発明の趣旨及び適用範囲から逸脱することなく、種々の変更が行われる場合があり、同等物が置き換えられる場合があることを、当業者は理解するはずである。更に、特定の状況、材料、組成物、プロセス、又は処置手順を本発明の目的、趣旨及び適用範囲に適合させるために、多くの改変が行われる場合がもある。このような改変は全て、本発明の適用範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２２５】
【図１】図１Ａ及び１Ｂは、ＥｐｈＢ３の発現データを示す。図１Ａは、ＥｐｈＢ３が試験した大腸癌患者の３０％以上において５倍を超えて上方制御されることを示す。図１Ｂは、ＥｐｈＢ３が、基本的な正常組織と比べて高度に発現することを示す。
【図２】図２は、ＥｐｈＢ３  ｓｉＲＮＡを使用した大腸癌の固定非依存性増殖の阻害を示す。
【図３】図３は、種々の癌細胞及び正常細胞株におけるＥｐｈＢ３のノックダウン効果の概要を示す。
【図４】図４は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップを使用した、ｍＲＮＡレベルでのＥｐｈＢ３の差別的な発現を示す。
【図５】図５は、免疫組織化学データの概要を示す。
【図６】図６は、ＥｐｈＢの免疫組織化学データを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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