(57)【要約】  本発明は、ラクトシルセラミドに関連する疾患、術後障害及び細菌感染の治療及び予防方法を包含する。本発明の方法は、一般に、ＶＥＧＦが引き起こす又は一因となる症状に罹患している又は罹患する恐れのある対象を治療するために、ＬａｃＣｅｒシンターゼ、（ＧａｌＴ−Ｖ／ＶＩ）、ＰＥＣＡＭ−１、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ又は関連する経路メンバーを含む、ＶＥＧＦ経路メンバーの活性を変化させる１つ又はそれ以上の化合物を、対象に投与することを提供する。本発明は、又、その様な症状を治療する能力を有する化合物を検出し解析する方法を提供する。【選択図】図１−１
2008510723.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）経路阻害剤の治療有効量を対象に投与することを含む、血管新生が関与する疾患又は症状に罹患している又は罹患する恐れのある対象を治療する方法。
【請求項２】
血管新生が関与する疾患又は症状が、癌、冠動脈性心臓病、腫瘍転移、炎症性血管障害又は糖尿病である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＶＥＧＦ経路が、ラクトシルセラミド・シンターゼ（ＬａｃＣｅｒシンターゼ）、ＶＥＧＦ、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血小板内皮細胞接着分子１（ＰＥＣＡＭ−１）、ラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）又はＰＬＡ２の１つ又はそれ以上の相互作用又は関与を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＶＥＧＦ経路阻害剤が、式Ｉ：
【化００１】
2008510723.tif 000006
式中、
Ｒ及びＲ１は、水素及び置換基を有する又は有していない直鎖状又は分岐鎖状のＣ１−Ｃ６アルキルから成る群から独立に選択され、そして更にＲ及びＲ１は、一緒になって５、６又は７員環を形成していてもよく；
Ｒ２は、１個から３個の二重結合を有する又は有していない、分岐鎖状又は直鎖状のＣ６−Ｃ３０アルキルから成る群から選択され；そして
Ｒ３は、１個から３個の二重結合を有する又は有していない、直鎖状又は分岐鎖状のＣ６−Ｃ２０アルキル及びアリール又は置換アリールから成る群から選択され、ここで、該置換アリールの置換基は、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、メチレンジオキシ、Ｃ１−Ｃ４メルカプト、アミノ又は置換アミノであり、ここで、該置換アミノの置換基はＣ１−Ｃ４アルキルである；
の化合物、又は薬学的に許容されるその塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ及びＲ１が一緒になって５、６又は７員環を形成する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｒ及びＲ１が一緒になってピロリジノ、モルホリノ、チオモルホリノ、ピペリジノ又はアザシクロヘプチル環を形成する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＶＥＧＦ経路阻害剤が、
１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール；
１−フェニル−２−ヘキサデカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール；
１−フェニル−２−ヘキサデカノイルアミノ−３−ピペリジノ−１−プロパノール；
１−フェニル−２−ヘキサデカノイルアミノ−３−ピロリジノ−１−プロパノール；
１−モルホリノ−２−ヘキサデカノイルアミノ−３−ヒドロキシオクタデカ−４，５−エン；
１−ピロリジノ−２−ヘキサデカノイルアミノ−３−ヒドロキシオクタデカ−４，５−エン；
（１Ｒ，２Ｒ）−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール（Ｄ−ＰＤＭＰ）；又は
トランス−（２Ｒ，３Ｒ）−１−ピロリジノ−２−ヘキサデカノイルアミノ−３−ヒドロキシオクタデカ−４，５−エン・塩化ケレリトリン；
の１つ又はそれ以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＶＥＧＦ経路阻害剤が、ＳＵ−１４９８、Ｇｏ６９７６、Ｇｏ６８５０、臭化ブロモフェナシル（ＢＭＢ）、フルオロホスホン酸メチルアラキドニル（ＭＡＦＰ）、カルボジチオ酸ピロリジン、塩化ジフェニレン・ヨードニウム及びＮ−アセチル−Ｌ−システイン；ＰＥＣＡＮ−１、ＰＬＡ２、ＬａｃＣｅｒ又はＬａｃＣｅｒシンターゼの抗体又はそのフラグメント；ＰＥＣＡＮ−１、ＰＬＡ２、ＬａｃＣｅｒ又はＬａｃＣｅｒシンターゼペプチド；ＰＥＣＡＮ−１、ＰＬＡ２、ＬａｃＣｅｒ又はＬａｃＣｅｒシンターゼＲＮＡｉの１つ又はそれ以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＲＮＡｉが、５’−ＣＧＧＡＧＵＧＡＧＵＧＧＣＵＵＡＡＣＡｄＴｄＴ−３’（センス）、５’−ＵＧＵＵＡＡＧＣＣＡＣＵＣＡＣＵＣＣＧｄＴｄＴ−３’（アンチセンス）又はそのフラグメント若しくは変異体の１つ又はそれ以上である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＰＥＣＡＭ−１、ＰＬＡ２、ＬａｃＣｅｒ又はＬａｃＣｅｒシンターゼ抗体が、ＩＧＡＱＶＹＥＱＶＬＲＳＡＹＡＫＲＮＳＳＶＮＤ（ＧａｌＴ−Ｖ）；ＩＧＭＨＭＩ---- ＲＬＹＴＮＫＮＳＴＬＮＧＴ（ＧａｌＴ−ＶＩ）；ＶＬＥＮＳＴＫＮＳＮＤＰＡＶＦＫＤＮＰＴＥＤＶＥＹＱＣＶＡＤＮ（ＰＥＣＡＭ−１）；ＰＥＲＬＰ；ＰＴＩＫＬＧＧＨＷＫＰ；ＰＲＷＫＶＡＩＬＩＰ；ＰＦＲＮＲＨＥＨＬＰ；ＰＶＬＦＲＨＬＬＰ；ＰＥＧＤＴＧＫＹＫＳＩＰ；ＰＥＮＦＴＹＳＰ；ＰＹＬＰ；ＰＣＰＥＫＬＰ；ＰＧＧＨＷＲＰ；ＰＲＷＫＶＡＶＬＩＰ；ＰＦＲＮＲＨＥＨＬＰ；ＰＩＦＦＬＨＬＩＰ；ＰＥＧＤＬＧＫＹＫＳＩＰ；ＰＥＬＡＰ；ＣＣ（Ｐ）−ｘ−Ｈ（ＬＧＹ）−ｘ−Ｃに特異的であり、且つ、ヒスチジンＨが、酵素（ＰＬＡ２）又はそのフラグメント若しくは変異体の活性部位である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ＰＥＣＡＭ−１、ＰＬＡ２、ＬａｃＣｅｒ又はＬａｃＣｅｒシンターゼペプチドが、ＩＧＡＱＶＹＥＱＶＬＲＳＡＹＡＫＲＮＳＳＶＮＤ（ＧａｌＴ−Ｖ）；ＩＧＭＨＭＩ---- ＲＬＹＴＮＫＮＳＴＬＮＧＴ（ＧａｌＴ−ＶＩ）；ＶＬＥＮＳＴＫＮＳＮＤＰＡＶＦＫＤＮＰＴＥＤＶＥＹＱＣＶＡＤＮ（ＰＥＣＡＭ−１）；ＰＥＲＬＰ；ＰＴＩＫＬＧＧＨＷＫＰ；ＰＲＷＫＶＡＩＬＩＰ；ＰＦＲＮＲＨＥＨＬＰ；ＰＶＬＦＲＨＬＬＰ；ＰＥＧＤＴＧＫＹＫＳＩＰ；ＰＥＮＦＴＹＳＰ；ＰＹＬＰ；ＰＣＰＥＫＬＰ；ＰＧＧＨＷＲＰ；ＰＲＷＫＶＡＶＬＩＰ；ＰＦＲＮＲＨＥＨＬＰ；ＰＩＦＦＬＨＬＩＰ；ＰＥＧＤＬＧＫＹＫＳＩＰ；ＰＥＬＡＰ；ＣＣ（Ｐ）−ｘ−Ｈ（ＬＧＹ）−ｘ−Ｃの１つ又はそれ以上であり、且つ、ヒスチジンＨが、酵素（ＰＬＡ２）又はそのフラグメント若しくは変異体の活性部位である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
対象が血管新生が関与する疾患又は症状の治療を要していること同定することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記同定が、癌、冠動脈性心臓病、腫瘍転移、炎症性血管障害、虚血再潅流傷害、高血圧又は糖尿病の診断を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＶＥＧＦ経路阻害剤が、対象に対して、経口で、筋肉内に、腫瘍内に、ステントで又は腹腔内に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
治療有効量のＶＥＧＦ阻害剤がＶＥＧＦ誘導のインビトロ血管新生／チューブ形成を減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
１つ又はそれ以上のＶＥＧＦ経路阻害剤が、医療器具上に被覆されている又は医療器具内に含有されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
医療器具が生分解性の生体高分子を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
医療器具がステントである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
対象の血管新生を低下させるＶＥＧＦ経路阻害剤の治療能を測定する方法であって：
侵襲的な外科的処置を対象に行い；
ＶＥＧＦ経路阻害剤を対象に投与し；そして
対象の血管成長を調べる；
ことを含む方法。
【請求項２０】
侵襲的な外科的処置が腫瘍切除である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
対象が動物モデルである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
動物モデルが腫瘍の異種移植片である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
対象の血管新生を低下させるＶＥＧＦ経路阻害剤の治療能を測定する方法であって：
対象の血管新生の治療前レベルを測定し；
治療有効量のＶＥＧＦ経路阻害剤を対象に投与し;そして
対象の血管新生の治療後レベルを測定する；
ことを含む方法。
【請求項２４】
血管新生の低下がＶＥＧＦ経路阻害剤が有効であることを示す、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
血管新生の治療前及び治療後のレベルが病変組織で測定される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
病変組織が、肺、心臓、肝臓、腫瘍又は脈管構造の１つ又はそれ以上である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
血管新生のレベルが、ＰＥＣＡＭ−１発現、ＧａｌＴ−Ｖ発現、チューブ形成又はＬａｃＣｅｒレベルによって測定される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
血管新生治療のためのＶＥＧＦ経路阻害剤候補の治療能を測定する方法であって：
細胞集団を準備し；
細胞を候補の組成物に接触させ；そして
候補組成物の、ＰＥＣＡＭ−１発現、ＧａｌＴ−Ｖ発現、チューブ形成又はＬａｃＣｅｒレベルの１つ又はそれ以上に対する効果を測定する；
ことを含む方法。
【請求項２９】
細胞を候補の化合物に接触させる前に、細胞をＶＥＧＦに接触させることを更に含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
細胞を候補の化合物に接触させた後に、細胞をＶＥＧＦに接触させることを更に含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）経路活性化剤の治療有効量を対象に投与することを含む、組織変性に罹患している又は罹患する恐れのある対象を治療する方法。
【請求項３２】
組織変性が、胎児の子宮内発育、全身性硬化、創傷治癒、虚血、再潅流傷害、糖尿病、冠動脈疾患、腫瘍成長に関係する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ＶＥＧＦ経路が、ラクトシルセラミド・シンターゼ（ＬａｃＣｅｒシンターゼ）、ＶＥＧＦ、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血小板内皮細胞接着分子１（ＰＥＣＡＭ−１）、ラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）又はＰＬＡ２の１つ又はそれ以上の相互作用又は関与を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
ＶＥＧＦ経路活性化剤が、式Ｉ：
【化００２】
2008510723.tif 000007
式中、
Ｒ及びＲ１は、水素及び置換基を有する又は有していない直鎖状又は分岐鎖状のＣ１−Ｃ６アルキルから成る群から独立に選択され、そして更にＲ及びＲ１は、一緒になって５、６又は７員環を形成していてもよく；
Ｒ２は、１個から３個の二重結合を有する又は有していない、分岐鎖状又は直鎖状のＣ６−Ｃ３０アルキルから成る群から選択され；そして
Ｒ３は、１個から３個の二重結合を有する又は有していない、直鎖状又は分岐鎖状のＣ６−Ｃ２０アルキル及びアリール又は置換アリールから成る群から選択され、ここで、該置換アリールの置換基は、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、メチレンジオキシ、Ｃ１−Ｃ４メルカプト、アミノ又は置換アミノであり、ここで、該置換アミノの置換基はＣ１−Ｃ４アルキルである；
の化合物のＬ−異性体、又は薬学的に許容されるその塩である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
Ｒ及びＲ１が一緒になって５、６又は７員環を形成する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
Ｒ及びＲ１が一緒になってピロリジノ、モルホリノ、チオモルホリノ、ピペリジノ又はアザシクロヘプチル環を形成する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ＶＥＧＦ経路阻害剤が、
１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール；
１−フェニル−２−ヘキサデカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール；
１−フェニル−２−ヘキサデカノイルアミノ−３−ピペリジノ−１−プロパノール；
１−フェニル−２−ヘキサデカノイルアミノ−３−ピロリジノ−１−プロパノール；
１−モルホリノ−２−ヘキサデカノイルアミノ−３−ヒドロキシオクタデカ−４，５−エン；
１−ピロリジノ−２−ヘキサデカノイルアミノ−３−ヒドロキシオクタデカ−４，５−エン；
のＬ−異性体の１つ又はそれ以上である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
対象が組織変性の治療を要していること同定することを更に含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
ＶＥＧＦ経路活性化剤が、対象に対して、経口で、筋肉内に、腫瘍内に、ステントで又は腹腔内に投与される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
対象の組織変性を低下させるＶＥＧＦ経路活性化剤の治療能を測定する方法であって：
対象の治療前の組織変性レベルを測定し；
ＶＥＧＦ経路活性化剤の治療有効量を対象に投与し；そして
対象の治療後の組織変性レベルを測定する；
ことを含む方法。
【請求項４１】
組織変性の低下がＶＥＧＦ経路活性化剤が有効であることを示す、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
組織変性の治療前及び治療後のレベルが病変組織で測定される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
病変組織が、胎児、肺、心臓、肝臓、脈管構造又は神経組織の１つ又はそれ以上のものである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
脈管構造が、心臓又は他の組織への側副血流を増加させる１つ又はそれ以上の心室微細血管の形成である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
組織変性のレベルが、ＰＥＣＡＭ−１発現、ＧａｌＴ−Ｖ発現、チューブ形成又はＬａｃＣｅｒレベルによって測定される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
組織変性治療のためのＶＥＧＦ経路活性化剤候補の治療能を測定する方法であって：
細胞集団を準備し；
細胞を候補組成物に接触させ；そして
候補組成物の、ＰＥＣＡＭ−１発現、ＧａｌＴ−Ｖ発現、チューブ形成又はＬａｃＣｅｒレベルの１つ又はそれ以上に対する効果を測定する；
ことを含み、且つ、ＰＥＣＡＭ−１発現、ＧａｌＴ−Ｖ発現、チューブ形成又はＬａｃＣｅｒレベルの１つ又はそれ以上の増加が、候補組成物が有効であり得ることを示す方法。
【請求項４７】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）経路阻害剤及びＶＥＧＦ経路活性化剤の治療有効量を対象に投与することを含む、血管新生に罹患している又は罹患する恐れのある対象を治療する方法。
【請求項４８】
阻害剤が特定の組織で血管新生を減少させ、そして活性化剤が他の組織で成長を促進させる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
阻害剤及び活性化剤が生分解性の生体高分子上に被覆されている又は生体高分子内に含有されている、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
阻害剤及び活性化剤がナノ粒子上に被覆されている、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００４年８月２０日に出願された、米国仮出願番号第６０／６０３，０１６号：発明の名称「血管内皮増殖因子及びラクトシルセラミドによって修飾された血管新生の治療法」の優先権を主張するものであり、その全を参照して本明細書に取り込む。
【背景技術】
【０００２】
血管新生、即ち、現存する血管からの毛細血管の発生は、胚発育及び創傷治癒の期間必要である。血管新生には、局部的に内皮細胞が血管基底膜を分解する一連の工程が含まれる。次いで、内皮細胞は、結合組織の間質に移動して増殖し、分化して最終的にはループ状毛細血管になる。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は血管新生のメディエーター（仲介物質）であり、非常に興味深いことに、四肢虚血及び心筋虚血を有する実験動物及びヒトの側副血流を増化させることが知られている３１。又、ＶＥＧＦが誘発する血管新生は、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症及び腫瘍転移に於いて立証されている３−５。
【０００３】
殆んどの研究では血管新生におけるＶＥＧＦの役割に焦点が当てられているが、この重大な表現型の変化の根底にあるメカニズムに関しては殆ど知られていない。特に、中性のスフィンゴ糖脂質の役割は知られていない。ラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）は、中性スフィンゴ糖脂質ファミリーの一員であり、モノシアロガングリオシドＧＭ３、ジシアロガングリオシドＧＤ３、並びにグロボトリオシルセラミドやラクトシルセラミド硫酸などのガングリオシドの生合成のための前駆体として働く極めて重要な役割を果たす。これらのスフィンゴ糖脂質は様々な生物学的機能を持つことが示されているが、ＬａｃＣｅｒは本来、細胞増殖、細胞接着及び細胞移動などの、総体的に血管新生に必要な事象に関わっている。最も重要なことは、ＬａｃＣｅｒが、血管新生を開始するための必要条件であるＰＥＣＡＭ−１遺伝子／タンパク質発現２２を誘導することが見出されたことである１０，１１。
【０００４】
既存の血管からの新しい毛細血管の発生（血管新生）及び内皮細胞の分化（脈管形成）は、健康状態及び病気の表現型に関する事象である１。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、脈管形新生び血管新生の過程に関わっている２。ＶＥＧＦの異常発現は、炎症、糖尿病合併症、心臓血管障害及び腫瘍転移など、幾つかの血管病理学において報告されている３。ＶＥＧＦは、その受容体であるＫＤＲ／ＦｌＫ−１と結合し、生理学的症状及びヒトアテローム性動脈硬化症において、その血管新生に及ぼす作用を仲介する４−６。
【０００５】
血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ−１）／ＣＤ３１は、内皮細胞で構成的に発現される内在性タンパク質である７。又、ＰＥＣＡＭ−１は、血小板、単球、好中球及びＴ細胞の特定のサブセットに発現している８。最近の研究は、ＰＥＣＡＭ−１の潜在的な役割を、血管新生及びインビトロの内皮細胞移動に関連付けるものである９，１０。例えば、ＰＥＣＡＭ−１を欠損したヒト中皮腫細胞株（ＲＥＮ）をヌードマウスに移植しても、血管新生は誘導されなかった。一方、ＰＥＣＡＭ−１を過剰発現させたＲＥＮ細胞１０は、当該マウスに血管新生を誘導した１１。更に、ＰＥＣＡＭ−１のモノクローナル抗体の使用により、マウスの腫瘍血管新生は阻害された１２。更に最近、O‘Breinらが報告した研究で、ＰＥＣＡＭ−１の血管新生における極めて重要な役割が解明された１３。彼らは、免疫受容体−チロシン基盤阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）に突然変異を持つ完全長のヒトＰＥＣＡＭ−１ｃＤＮＡをＲＥＮ細胞に移入したところ、ＶＥＧＦに応答したこれらの細胞の移動が阻害されること、並びにインビトロ血管新生アッセイにおいてチューブが形成されないことが観察された。
【０００６】
ラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）は、スフィンゴ糖脂質（ＧＳＬ）ファミリーの一員である。ＬａｃＣｅｒは哺乳類の組織に偏在的に存在し、複雑なＧＳＬ合成のための前駆体として極めて重要な役割を果たしている１４。その上、ＬａｃＣｅｒは、哺乳類細胞における増殖及び接着のような重大な表現型の変化に関与している１５−２１。近年、本発明者らは、ＬａｃＣｅｒが前単球細胞株（Ｕ−９３７）に於いて、ＰＫＣα及びε並びにＰＬＡ２を動員してＰＥＣＡＭ−１の転写発現及びタンパク質発現を促進させることを示した２２。家族性高コレステロール血症の患者の血漿２３及び心筋梗塞で死亡した患者の動脈の石灰化プラーク及び非石灰化プラーク２４，２５において、ＬａｃＣｅｒレベルの上昇が報告されている。同様に、心臓血管障害の患者２６及びａｐｏＥノックアウトマウスのようなアテローム性動脈硬化の動物モデル２７において、可溶性ＰＥＣＡＭ−１の血漿レベルの上昇が報告されている。
【０００７】
ＰＥＣＡＭ−１の発現はＶＥＧＦ誘導の脈管形成、そして又血管新生のための必要条件であり、そしてＬａｃＣｅｒはＵ９３７細胞におけるＰＥＣＡＭ−１発現を上方制御できることから、本発明者らは、たぶんＬａｃＣｅｒがＶＥＧＦ誘導ＰＥＣＡＭ−１発現及びヒト内皮細胞における血管新生において、第二の伝達因子としての役割を果たすものであろうという理論付けをした。本発明者らは、ＬａｃＣｅｒが、ＶＥＧＦ誘導ＰＥＣＡＭ−１発現及びＨＵＶＥＣ細胞における血管新生を仲介する重要なものであることを当該出願に開示するものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、当該技術分野に於いて、血管新生の診断方法、治療及び新しい治療のスクリーニング方法を見出す必要があることから、ラクトシルセラミドが調節する症状又は疾患を治療する、例えば、ＧａｌＴ−Ｖ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＰＥＣＡＭ−１又は他の経路メンバーを阻害して血管新生を治療又は防止する、更なる方法が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）に関連する疾患の治療及び予防の方法を包含するものである。特に、本発明者らは、ＬａｃＣｅｒシンターゼ（ＧａｌＴ−Ｖ）、ＰＥＣＡＭ−１、ＶＥＧＦＲ又は関連する経路メンバーの１つ又はそれ以上の活性を変え、ラクトシルセラミドが引き起こす及び／又は原因となる血管新生に関連する疾患又は症状に罹患している又は罹患する恐れのある対象を治療することを含む治療方法を見出した。本発明は、又、このような症状を治療するための治療能を有する化合物を検出及び解析する方法に関する。
【００１０】
より具体的には、本発明は、血管新生が関与する及び血管新生に関連する増殖性疾患、例えば、癌、冠動脈性心臓病、腫瘍転移、炎症性血管障害、炎症、虚血再潅流傷害、高血圧又は糖尿病を治療する方法を提供する。又、本発明は、血管新生に関連した組織分解に関連する疾患、例えば胎児の子宮内発育、全身性硬化症、創傷治癒、虚血、再潅流傷害、糖尿病、冠動脈疾患、腫瘍成長を含む疾患の治療方法を提供する。
【００１１】
本明細書の一態様では、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）経路阻害剤の治療有効量を対象に投与することを含む、血管新生に罹患している又は罹患する恐れのある対象を治療する方法を提供する。
【００１２】
一態様において、血管新生は、癌、冠動脈性心臓疾病、腫瘍転移、炎症性血管障害又は糖尿病に関連する。
【００１３】
別の態様において、ＶＥＧＦ経路は、ラクトシルセラミド・シンターゼ（ＬａｃＣｅｒシンターゼ、例えば、ＧａｌＴ−Ｖ／ＶＩ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血小板内皮細胞接着分子１（ＰＥＣＡＭ−１）、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）及びラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）の１つ又はそれ以上の相互作用又は関与を包含する。
【００１４】
一態様によれば、本発明の方法には、更に、血管新生の治療が必要な対象を同定することが含まれる。関連する態様において、治療が必要な対象の同定には、癌、冠動脈性心臓疾病、腫瘍転移、炎症性血管障害、虚血・再潅流傷害、高血圧又は糖尿病の診断が含まれる。
【００１５】
別の態様において、ＶＥＧＦ阻害剤及び／又は活性化剤は、移植可能な医療用具、例えば、生分解性の生体高分子ステント上に被覆して投与される。別の態様において、ＶＥＧＦ阻害剤及び／又は活性化剤は、ステント又はカテーテルを介して投与される。
【００１６】
別の態様によれば、対象の血管新生を低下させるＶＥＧＦ経路阻害剤又は活性化剤（例えば、調節剤）の治療能を測定する方法が提供されるが、対象に侵襲的な外科処置を施し、ＶＥＧＦ経路阻害剤を投与して、対象に於ける血管成長について調べることを含むものである。
【００１７】
一態様において、ＶＥＧＦ経路阻害剤又は活性化剤の治療能を測定するために、腫瘍異種移植片のような動物モデルが使われる。
【００１８】
別の態様において、血管新生が関与する疾患又は症状を治療するために、ＶＥＧＦ経路阻害剤の候補の治療能を測定する方法が提示され、そしてそれは、細胞集団を準備し；細胞を候補組成物と接触させ;そしてＰＥＣＡＭ−１発現、ＧａｌＴ−Ｖ発現、チューブ形成（例えば、インビトロ血管新生アッセイ）又はＬａｃＣｅｒレベルの１つ又はそれ以上について、候補組成物の効果を測定することを含む。
【００１９】
一態様によれば、本発明の方法は、更に、細胞を候補の化合物と接触させる前に、細胞をＶＥＧＦと接触させることを含む。
【００２０】
別の態様によれば、治療有効量の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）経路活性化剤を対象に投与することを含む、組織変性に罹患している又は罹患する恐れのある対象を治療する方法である。
【００２１】
一態様において、組織の変性は、胎児の子宮内発育、全身性硬化症、創傷治癒、虚血、再潅流傷害、糖尿病、冠動脈疾患、腫瘍成長に関連する。
【００２２】
一態様において、対象の組織変性を軽減させるＶＥＧＦ経路活性化剤の治療能を測定する方法が提供され、それには、対象の治療前の組織変性レベルを測定し；ＶＥＧＦ経路活性化剤の治療有効量の対象に投与し；そして対象の治療後の組織変性レベルを測定する；ことが含まれる。
【００２３】
一態様によれば、組織変性の減少は、ＶＥＧＦ経路活性化剤が有効であることを示す。関連する態様によれば、治療前及び治療後の組織変性のレベルは病変組織で測定される。
【００２４】
別の関連する態様において、病変組織は、胎児、肺、心臓、肝臓、脈管構造（例えば、心臓又は他の組織への側副血流を増加させるための心室微細血管の形成）又は神経組織の1つ又はそれ以上の組織である。
【００２５】
一態様において、組織変性のレベルは、ＰＥＣＡＭ−１発現、ＧａｌＴ−Ｖ発現、チューブ形成又はＬａｃＣｅｒレベルによって測定される。
【００２６】
別の態様において、組織変性を治療するための候補のＶＥＧＦ経路活性化剤の治療能を測定する方法であって、細胞集団を準備し；細胞を候補組成物と接触させ;そしてＰＥＣＡＭ−１の発現、ＧａｌＴ−Ｖの発現、チューブ形成又はＬａｃＣｅｒレベルの１つ又はそれ以上について、候補組成物の効果を測定する；ことを含み、且つ、ＰＥＣＡＭ−１の発現、ＧａｌＴ−Ｖの発現、チューブ形成又はＬａｃＣｅｒレベルの１つ又はそれ以上での増加が、候補組成物が有効であり得ることを示す方法が提供される。
【００２７】
一態様において、血管新生に関連する疾患を治療するためのＶＥＧＦ経路阻害剤及び活性化剤の併用投与の方法が提供される。一態様において、時間依存様式で投与するために、生分解性の生体高分子は、阻害剤と活性化剤を組み合わせて被覆されていてもよい。別の態様において、単一療法又は併用療法で使うために、阻害剤及び／又は活性化剤をナノ粒子上に被覆してもよい。
【００２８】
本発明の療法は、特に、望ましくない血管新生の治療及び予防に効果的である。下記実施例で説明する結果を参照されたい。
【００２９】
本発明の治療方法は、一般的に、血管新生が引き起こす又は一因となる症状に罹患している又は罹患する恐れのある対象を治療するために、例えば、ＬａｃＣｅｒシンターゼ（ＧａｌＴ−Ｖ／ＶＩ）ＰＥＣＡＭ−１、ＶＥＧＦＲ，ＶＥＧＦ，ＰＬＡ２又は関連する経路メンバーの活性を変えることができる化合物の治療有効量を、対象、とりわけ霊長類、殊にヒトなどの哺乳類に投与することを含む。好ましくは、投与した化合物が、標準のインビトロ細胞増殖アッセイにおいて、血管新生を少なくとも約１５％又は２５％阻害することである。その様なアッセイの例を以下に説明する。一般に、以下に定義した標準のインビトロＶＥＧＦ経路アッセイにおいて、投与した化合物のＩＣ５０が少なくとも約５００μＭを示すことが好ましく、より好ましくは、ＩＣ５０が約１００μＭ又はそれ以下、なおより好ましくは、以下に定義した標準のインビトロＶＥＧＦ経路アッセイにおいて、ＩＣ５０が約１〜１０μＭ又はそれ以下である。ＧａｌＴ−Ｖ活性を阻害することが出来る化合物は、本明細書では「ＶＥＧＦ経路阻害剤」として、又は他の類似した名称で呼ばれる。
【００３０】
本発明の治療方法において、血管新生を阻害するために使用するのに好適な化合物は、以下の式Ｉ：
【００３１】
【化００３】
2008510723.tif 000003
【００３２】
式中、
Ｒ及びＲ１は、水素及び置換基を有する又は有していない直鎖状又は分岐鎖状のＣ１−Ｃ６アルキルから成る群から独立に選択され、そして更にＲ及びＲ１は、一緒になって５、６又は７員環を形成していてもよく；
Ｒ２は、１個から３個の二重結合を有する又は有していない、分岐鎖状又は直鎖状のＣ６−Ｃ３０アルキルから成る群から選択され；そして
Ｒ３は、１個から３個の二重結合を有する又は有していない、直鎖状又は分岐鎖状のＣ６−Ｃ２０アルキル、アリール又は置換アリールから成る群から選択され、ここで、該置換アリールの置換基は、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、メチレンジオキシ、Ｃ１−Ｃ４メルカプト、アミノ又は置換アミノであり、ここで、該置換アミノの置換基はＣ１−Ｃ４アルキルである；
の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を包含する。
【００３３】
いくつかの態様において、Ｒ及びＲ１は、一緒になって５、６又は７員環を形成する。関連する態様において、Ｒ及びＲ１は、一緒になってピロリジノ、モルホリノ、チオモルホリノ、ピペリジノ又はアザシクロヘプチル環を形成する。
【００３４】
本発明の治療方法に使用する特に好ましい阻害剤の化合物は、
１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール；
１−フェニル−２−ヘキサデカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール；
１−フェニル−２−ヘキサデカノイルアミノ−３−ピペリジノ−１−プロパノール；
１−フェニル−２−ヘキサデカノイルアミノ−３−ピロリジノ−１−プロパノール；
１−モルホリノ−２−ヘキサデカノイルアミノ−３−ヒドロキシオクタデカ−４，５−エン；
１−ピロリジノ−２−ヘキサデカノイルアミノ−３−ヒドロキシオクタデカ−４，５−エン；
（１Ｒ，２Ｒ）−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール（Ｄ−ＰＤＭＰ）；又は
トランス−（２Ｒ，３Ｒ）−１−ピロリジノ−２−ヘキサデカノイルアミノ−３−ヒドロキシオクタデカ−４，５−エン・塩化ケレリトリン；
の１つ又はそれ以上である。
【００３５】
本発明の方法に使用する特に好ましい阻害剤化合物は、（１Ｒ，２Ｒ）−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール（Ｄ−ＰＤＭＰ）、トランス−（２Ｒ，３Ｒ）−１−ピロリジノ−２−ヘキサデカノイルアミノ−３−ヒドロキシオクタデカ−４，５−エン・塩化ケレリトリン、Ｇｏ６９７６、Ｇｏ６８５０、臭化ブロモフェナシル（ＢＭＢ）、フルオロホスホン酸メチルアラキドニル（ＭＡＦＰ）、カルボジチオ酸ピロリジン、塩化ジフェニレン・ヨードニウム及びＮ−アセチル−Ｌ−システインである。
【００３６】
他の好適な阻害剤としては、ＰＥＣＡＭ−１、ＬａｃＣｅｒ又はＶＥＧＦ経路抗体が挙げられる。同様に、ＶＥＧＦ経路ペプチド及びＲＮＡｉ分子が挙げられる。
【００３７】
血管新生の活性化のために、本発明の治療方法で使用する好適な化合物は、以下の式Ｉ：
【化００４】
2008510723.tif 000004
式中、
Ｒ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、上記で定義されたとおりである；
のＬ−異性体を包含する。
【００３８】
他のＶＥＧＦ経路阻害剤又は活性化剤化合物は、例えば、対照と対比させた阻害剤化合物候補のインビトロ試験などの簡単な試験により、ＶＥＧＦ経路活性を阻害又は活性化する能力、例えば、少なくとも１つの経路メンバーの活性を、対照よりも少なくとも１０％阻害又は活性化する能力を試験することにより、同定することができる。
【００３９】
本発明は、更に、ＶＥＧＦ経路を阻害又は活性化する化合物を検出及び分析し、そして上記の症状を治療又は予防する治療能を提示する方法に関する。好ましい検出及び分析方法には、ＶＥＧＦ応答細胞を調節する薬剤の治療的用量を測定するインビトロ及びインビボの両アッセイが含まれる。
【００４０】
本発明に従った好ましいインビトロ検出アッセイには、ＶＥＧＦ関連経路に付随する１つ又はそれ以上の工程が含まれる。そのアッセイには、以下の工程１）から工程４）：
１）ＶＥＧＦ応答細胞集団をＶＥＧＦと共に培養し；
２）公知の又は候補のＶＥＧＦ経路阻害剤を細胞に添加し；
３）ＶＥＧＦが関連する工程における特定した細胞分子の活性を測定し；そし
て、
４）公知の又は候補のＶＥＧＦ経路阻害剤の、細胞増殖、接着、１つ又はそれ以上のＶＥＧＦ経路メンバータンパク質発現又はチューブ形成などの細胞に及ぼす効果を測定する；
工程が含まれる。
【００４１】
当該アッセイにより、ＶＥＧＦ経路阻害剤又は活性化剤がＶＥＧＦ経路活性をそれぞれ低下又は上昇させる能力を効果的に測定することができる。本明細書で言及する「標準のインビトロＶＥＧＦ経路アッセイ」又はその他の同様な用語は、上記工程３）で測定される特定の細胞分子がＶＥＧＦ経路である場合には、上記の手順に於ける工程１）から工程４）を意味する。以下により詳しく述べるように、ＶＥＧＦに関連する工程又は経路における更なる特定の細胞分子を、本発明のその他のインビトロアッセイにより測定する。本発明のインビトロアッセイは、ＬａｃＣｅｒに応答する細胞又は組織の溶解物、又はその溶解物の精製画分を含め、ＬａｃＣｅｒに応答する殆どどの細胞集団を用いても実施可能である。アッセイに使用できる好適なＬａｃＣｅｒ応答細胞には、例えば、血管の脈管内膜に関係する細胞、特に、初代及び／又は不死化した内皮細胞及び平滑筋細胞、並びに白血球などの特定の免疫細胞が挙げられる。好ましいＬａｃＣｅｒ溶解物又は細胞亜分画にはＶＥＧＦ経路が含まれる。
【００４２】
本発明のインビトロ検出アッセイは、使用の目的に応じて適応させることができる。例えば、上記のように、ＶＥＧＦの発現は、特定の遺伝子及びタンパク質の発現レベル並びに細胞機能を変えることが明らかにされている。従って、上記の標準インビトロアッセイの工程３）は、添加したＶＥＧＦに応答した細胞増殖又は接着の測定を含めるように、そして細胞機能に及ぼすＶＥＧＦ経路阻害剤の作用を測定するように、変更することができる。本発明におけるアッセイで試験される公知の又は候補のＶＥＧＦ経路阻害剤は、単独の活性薬剤として、又は試験される他のＶＥＧＦ経路阻害剤を含めたその他の薬剤との併用で、使用することができる。殆どの場合、インビトロアッセイは、通常、培地にＶＥＧＦ経路阻害剤を添加しないこと以外は上記の工程と同様の試験条件での好適な対照アッセイと共に実施する。その場合、候補のＶＥＧＦ経路阻害剤は、対照に較べて少なくとも約１０％強い活性；より好ましくは対照に較べて少なくとも約２０％強い活性；なおより好ましくは対照に較べて少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、１００％、１５０％又は２００％強い活性を示すことにより、望ましい活性を示すものとして同定することができる。活性化剤は、活性化に於いて同様の活性を有するものである。
【００４３】
本発明は、又、例えば上記の本発明のアッセイに使用可能なＶＥＧＦ応答細胞を検出するアッセイを提供する。例えば、ＶＥＧＦに応答する可能性のある細胞にＬａｃＣｅｒを接触させ、次いで、先に考察したＶＥＧＦ関連タンパク質中の望ましい細胞分子又は機能を、添加したＬａｃＣｅｒの量に対応させて測定する。もし実施したアッセイに於いて、本明細書に提供されるアッセイにより測定した分子又は細胞機能の活性に較べて、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約５０％、そしてなおより好ましくは少なくとも約７０％又は１００％の変化（対照に対する）が示されれば、殆どの場合、細胞はＬａｃＣｅｒに応答性があると見なされる。本発明のアッセイは、培養細胞（即ち、初代細胞又は不死化細胞株）及び器官を含めた様々な細胞又は組織におけるＶＥＧＦ応答性を同定するために使用することができる。
【００４４】
本発明はまた、公知の又は候補のＶＥＧＦ経路阻害剤に於ける、例えば、細胞増殖及び細胞接着並びにＶＥＧＦ経路メンバーの遺伝子及びタンパク質発現といった、ＶＥＧＦに影響される細胞機能を調節する治療能を測定するためのインビボアッセイを提供する。モニターする細胞機能は、好適には、試験動物に既に存在するものであってもよく、又は、例えば、血管新生術などの侵襲的な外科的処置によって誘導された細胞機能であってもよい。これらの方法で好適にアッセイすることが出来る細胞機能には、例えば、血管細胞の増殖及び接着並びに血管再構築が含まれる。
【００４５】
本発明のインビボアッセイは、必要に応じて様々な形に変更することができる。例えば、本発明の幾つかの態様において、分析する血管は、動物から取り除いた後にインビトロでアッセイする、又は必要に応じてインビボでアッセイする。その他の態様において、ＶＥＧＦ経路阻害剤は、単独の活性薬剤として、又は試験する他のＶＥＧＦ経路阻害剤を含めたその他の活性化合物（例えば、プロブコール）と併用して、動物に投与される。殆どの態様において、所定のインビボアッセイにおけるＶＥＧＦ経路阻害剤の活性は、試験対象にＶＥＧＦ経路阻害剤を投与しないこと以外は試験アッセイと同条件でアッセイした好適な対照（例えば、擬似手術した動物）と比較される。多種多様な試験対象、特にウサギ、霊長類、各種のげっ歯類などの哺乳動物を用いることができる。
【００４６】
上で述べたように、検出アッセイ（インビトロ又はインビボのいずれであっても）は、多種多様のＶＥＧＦに応答する細胞、組織及び器官で行うことができる。更に、本発明のアッセイにより、ＶＥＧＦ関連経路における標的分子の活性及び機能を測定することで、有用なＶＥＧＦ経路阻害剤を検出することができる。この様に本発明のアッセイにより、数種の細胞、組織及び器官設定に於ける活性を測定することができる。
【００４７】
単一のＶＥＧＦ経路阻害剤を使った多項目検出アッセイ（例えば、インビトロ及び／又はインビボアッセイの組み合わせ）を使用すれば、検出の選択性及び感度を希望通りに拡大することができる。
【００４８】
その様な広範囲の試験は、更なる利点を提供する。従って、例えば、本発明のインビトロアッセイにより、効率的な多項目分析が可能となり、それによりＶＥＧＦ経路阻害剤の治療能を効率よく高確率で同定することができる。これは、多くの化合物を試験する必要がある場合に特に有用である。例えば、ＶＥＧＦ経路阻害剤ライブラリーを、コンビナトリアル型の化学操作を含めた標準的な合成方法で作成し、次いで本発明に基づいて試験することができる。
【００４９】
又、ＶＥＧＦが関連する工程の多くはＶＥＧＦ経路の“下流”にあり、それ故、アッセイは、活性なＶＥＧＦ経路の下流の分子及び細胞機能を含む。従って、ＶＥＧＦ経路活性における穏やかではあるが重要な変化は、容易に試験し得るシグナルとして登録することができる。
【００５０】
一態様によれば、対象の血管新生を低下させるＶＥＧＦ経路阻害剤の治療能を測定する方法は、対象の血管新生の治療前レベルを測定し；治療有効量のＶＥＧＦ経路阻害剤を対象に投与し;そして対象の血管新生の治療後レベルを測定する；ことを含む。一態様において、血管新生の減少は、ＶＥＧＦ経路阻害剤が有効であることを示す。関連する態様において、血管新生の治療前及び治療後レベルは、病変組織で測定される。
【００５１】
本発明の他の態様は、以下で考察する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５２】
上記考察のように、本発明は、血管新生に関連する症状を治療及び予防するための治療的方法を特徴とする。本発明の治療方法は、一般に、ＶＥＧＦ経路調節剤（例えば、阻害剤又は活性化剤）の治療有効量を、対象に、好ましくはその治療を必要とする患者に、投与することを含む。
【００５３】
ＶＥＧＦはまた、様々な血管新生が関連する症状を調節することができる細胞シグナル伝達分子であることが、偶然に見出された。即ち、ＶＥＧＦ経路メンバーの細胞レベルの変化が、疾患の進行又は重症度を変化させるのである。より具体的には、ＶＥＧＦ応答細胞において、ＶＥＧＦは、特定の細胞工程（本明細書で「ＶＥＧＦ関連工程」又は「ＶＥＧＦ関連経路」と呼ばれるものである）に於いて変化を生じさせるように作用するシグナル分子として機能することが、偶然に見出された。ＶＥＧＦ関連経路は、血管新生に関係する様々な機能に影響を与える。
【００５４】
本明細書で用いるＬａｃＣｅｒシンターゼの名称は以下の通りである：本来、ＬａｃＣｅｒシンターゼはヒト腎臓から精製され、特徴付けされた（J Biol Chem. 1982; 267: 7148-7153）。次いで、Nomuraらは、ラット脳ＬａｃＣｅｒシンターゼをクローン化し、ＧａｌＴ−２／ＧａｌＴ−ＩＶと命名した(J Biol Chem. 1998; 273:13570-13577)。その後、Gen Bankからの情報を分析し、ラット脳ＬａｃＣｅｒシンターゼとおおよそ６８％の相同性を有する別のβ−１，４ガラクトシルトランスフェラーゼの存在が明らかにされた（Glycobiology. 1998; 8:517-526）。このＬａｃＣｅｒシンターゼは、ＧａｌＴ−Ｖと命名された。生化学的及び機能的研究に基づき、ＧａｌＴ−Ｖは正真正銘のＬａｃＣｅｒシンターゼであることが示唆された（Kolmakova A. and Chatterjee S. Glycoconjugate J. 2005 in Press）。ＨＵＶＥＣ細胞のＧａｌＴ−Ｖは、ＲＴ−ＰＣＲ及びノーザンブロット分析に基づいた、主要なＬａｃＣｅｒシンターゼである（Kolmakova A. and Chatterjee S. Glycoconjugate J. 2005 in Press）。従って、本明細書において、本発明者らは、ＧａｌＴ−Ｖという用語を、ＨＵＶＥＣ細胞の酵素を特定して示すために使用している。酵素がＧａｌＴ−ＶかＧａｌＴ−ＶＩか解らない場合は、本発明者らはＬａｃＣｅｒシンターゼとしている。
【００５５】
「ポリペプチドを準備する」という用語は、例えば、ポリペプチドを購入又は作成することによって入手することを意味する。ポリペプチドは、公知の又は後に開発された如何なる生化学的技術によって作成してもよい。例えば、ポリペプチドは、培養細胞から得ることができる。培養細胞には、例えば、そのポリペプチドをコードする核酸部分を含む発現構築物を含む。
【００５６】
細胞及び／又は対象は、手術、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、免疫療法若しくはホルモン療法、又は自身で若しくは医療提供者が推奨又は禁止した他の療法を含む１つ又はそれ以上の抗血管新生療法で治療及び／又は接触させてもよい。
【００５７】
本明細書で用いられる「血管新生の治療、予防又は軽減」という用語は、本明細書に記載した治療的薬剤、例えば、ＶＥＧＦ経路阻害剤の予防的又は治療的な使用を意味する。
【００５８】
本明細書で用いられる「血管新生」という用語は、場合によっては、異常な血管新生によって引き起こされた又は異常な血管新生が関与する症状を意味する。即ち、異常に増加した又は減少した血管新生である。増加した血管新生に関連した症状としては、例えば、癌、冠動脈性心臓病、腫瘍転移、炎症性血管障害、炎症、虚血再潅流傷害、高血圧又は糖尿病に関連する血管新生が挙げられる。これらの増加した血管新生に関連した症状を、本明細書ではＶＥＧＦ経路阻害剤で治療される症状とする。減少した血管新生に関連した症状としては、例えば、胎児の子宮内発育、全身性硬化症、創傷治癒、虚血、再潅流傷害、糖尿病、冠動脈疾患、腫瘍成長に関連する組織変性が挙げられる。これらの減少した血管新生に関連した症状を、本明細書ではＶＥＧＦ経路活性化剤で治療する症状とする。
【００５９】
本明細書で用いられる「ＶＥＧＦ経路」及び「ＶＥＧＦ経路メンバー」という用語は、細胞のＶＥＧＦ刺激に反応するタンパク質及び他のシグナル伝達分子を意味する。例えば、ＶＥＧＦＲ、ＰＥＣＡＭ−１、ＬａｃＣｅｒシンターゼ及びＰＬＡ２などである。
【００６０】
本明細書で用いられる、ポリペプチド、又はその断片若しくは変異体の「減少したレベル」とは、特定の細胞又は対象にとっての発現が、平均、予想又は現実の低い値よりも低いことを意味する。
【００６１】
「実質的に精製された」とは、ポリペプチド、その断片又は変異体との関連で使われる場合、自然に結合する他の成分を少なくとも６０％、好ましくは７５％そしてより好ましくは９０％含まないことである。従って、「単離されたポリヌクレオチド」とは、実質的に精製されたポリヌクレオチドである。
【００６２】
「対象」という用語には、血管新生に罹患することができる生命体、又は本発明の化合物又は組成物の投与により別の利益を得ることのできるヒト及び非ヒト動物が含まれる。好ましいヒト動物には、本明細書に記載されるように、血管新生又はそれに関連した症状に罹患しているか若しくは罹患する傾向にあるヒト患者が含まれる。本発明の「非ヒト動物」という用語には、全ての脊椎動物、例えば哺乳動物、例えばマウス等のげっ歯類；及び、例えば、ヒツジ、イヌ、ウシ、鶏等の非ヒト霊長類；両生類、爬虫類などの非哺乳動物が挙げられる。
【００６３】
本明細書で用いられる、「予測する又は診断する」方法は、観察、試験又は状況に基づいた、対象に於ける症状の臨床的又はその他の評価を意味する。
【００６４】
「発現レベルの測定」は、現在公知の又は今後開発される発現レベルを測定するアッセイ又は方法、例えば、免疫学的技術、ＰＣＲ技術、免疫アッセイ、定量的免疫アッセイ、ウェスタンブロット若しくはＥＬＩＳＡ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、及び／又はノーザンブロットのいずれによるものであってもよい。レベルとは、ＲＮＡ又はタンパク質のものでよい。
【００６５】
サンプルは、例えば、拭き取り、生検、洗浄又は静脈切開によって対象から得ることができる。サンプルには、組織サンプル、血液、痰、気管支洗浄、吸引生検又は管路洗浄が含まれる。
【００６６】
本明細書で用いられる、「治療有効量」とは、単一又は複数用量を細胞又は対象に投与することにより、疾患を治療しないことを想定した場合よりも、患者の生存にまたは生存を延長させるのに有効である薬剤の量を意味する。
【００６７】
本明細書に記載される組成物は、例えば、全身に、腫瘍内に、経脈管的に、切除腫瘍床に、経口的に又は吸入によって投与することができる。
【００６８】
本明細書で用いられる「プライマー」という用語は、制限酵素消化物を精製したものなどの天然物か又は合成によって製造された物かを問わず、オリゴヌクレオチドを言い、それは、核酸鎖に相補的であるプライマーの伸長産物の合成が誘導される条件下に置かれた場合（即ち、ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼのような誘導剤の存在、そして好適な温度とｐＨにおいて）、合成の開始点として働く能力がある。プライマーは、増幅の効率を最もよくするためには一本鎖であることが好ましいが、二本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、伸長産物の調製に用いる前に、先ずプライマーの鎖を分ける処理をする。誘導剤の存在下で伸長産物の合成を開始するには、十分な長さのプライマーが必要とされる。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの起原及び使用する方法を含む多くの因子に依存している。
【００６９】
他に示されない限り、特定の核酸配列は、又、その保守的に修飾された異型（例えば、縮重コドン置換）及び相補的配列、並びに明確に示された配列を暗黙に含むものである。具体的には、縮重コドン置換は、１つ又はそれ以上の選択された（又は全ての）コドンの第３位が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成できる（Batzer et al., Nucleic Acid Res., 19:5081(1991); Ohtsuka et al., J, Biol. Chem. 260:2605-2608(1985); Rossolini et al., Mol. Cell Probes, 8:91-98(1994)）。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ，ｍＲＮＡ，オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドと互換的に使用される。
【００７０】
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書においては、アミノ酸残基のポリマーを意味するものとして互換的に使われる。これらの用語は、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が天然のアミノ酸に対応する人工の化学的模倣物であるアミノ酸ポリマーにあたり、同様に天然のアミノ酸ポリマー及び非天然のアミノ酸ポリマーにもあてはまる。
【００７１】
本明細書で用いられる「ポリメラーゼ連鎖反応」（ＰＣＲ）という用語は、ゲノムＤＮＡ混合物中の標的配列の断片の濃度を、クローニング又は精製することなしに増加させる、米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号及び同第４，９６５，１８８号の方法を言い、その全てを参照して本明細書に取り込む。本明細書でで用いられる「ＰＣＲ産物」及び「増幅産物」という用語は、変性、アニーリング及び伸長のＰＣＲ工程のサイクルを２つ又はそれ以上終了した後に生じた化合物の混合物を意味する。これらの用語は、１つ又はそれ以上の標的配列の断片の１つ又はそれ以上が増幅された場合も含む。
【００７２】
本明細書で用いられる「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」という用語は、細菌酵素を言い、その各々は二本鎖ＤＮＡの特定のヌクレオチド配列を又は近傍を切断する。
【００７３】
本明細書で用いられる「組み換えＤＮＡ分子」という用語は、ＤＮＡ断片が分子生物学的技術によって結合されて成るＤＮＡセグメントを意味する。
【００７４】
本明細書で用いられる、核酸配列は、たとえ大きなオリゴヌクレオチドの内にあったとしても、５’及び３’末端を有するように言うこともできる。直鎖状又は環状ＤＮＡ分子のいずれにおいても、個々の要素は、「上流」に、「下流」の５’に、又は３’要素のように呼ばれる。この用語は、転写が、ＤＮＡ鎖に沿って５’から３’に進行することを反映している。連鎖遺伝子の転写を指令するプロモータ及びエンハンサー要素は、一般にコーディング領域の５’末端又は上流に位置する。しかしエンハンサー要素は、それがプロモータ要素及びコーディング領域の３’末端にあっても、その効果を発揮することができる。転写終了及びポリアデニル化シグナルは、コーディング領域の３’又は下流に位置する。
【００７５】
本明細書で用いられる、１つの遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドは、遺伝子のコーディング領域を含むＤＮＡ配列、換言すれば遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列、を意味する。コーディング領域は、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの形態のいずれかに存在すればよい。エンハンサー／プロモータ、スプライス部位、ポリアデニル化シグナルなどの好適な調節要素は、もし転写の適切な開始及び／又はＲＮＡ一次転写産物の正確な処理が必要であれば、遺伝子のコーディング領域に近接した位置に置いてもよい。或いは、本発明のベクター内に使用されるコーディング領域は、内因性のエンハンサー／プロモータ、スプライス部位、介在配列、ポリアデニル化シグナルなど、又は内因性及び外因性の調節要素の両者の組み合わせを含んでいてもよい。
【００７６】
２つ又はそれ以上の核酸又はポリペプチド配列に照らして「相同」又は「パーセント相同性」のという用語は、比較画面に一致が最大になるよう整列させて比較する場合、又は次の配列比較アルゴリズムの１つを使って若しくは手動で整列させ目視検査によって測定した領域を指定した場合に於いて、同一の２つ若しくはそれ以上の配列又は部分配列、又は特定のパーセントのアミノ酸残基又は同一のヌクレオチドを有する（即ち、特定の領域内で６０％の相同性、場合により、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％の相同性を有する）ことを意味する。その様な配列は、結果的に「実質的に相同である」と言われる。この定義は、同様に、試験配列の相補配列にも当てはまる。場合により、少なくとも約５０アミノ酸長又はヌクレオチド長の領域、又より好ましくは、７５〜１００アミノ酸長又はヌクレオチド長の領域に於いて相同性を有していてもよい。
【００７７】
配列を比較するためには、一般に、１つの配列を対照配列とし、それに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使う場合は、試験配列及び対照配列をコンピュータに入れ、必要なら部分列座標を指定し、そして配列アルゴリズムのパラメータを指定する。初期設定プログラムのパラメータを使うことができ、又は、代わりのパラメータを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムが、対照配列と比較した試験配列のパーセント配列相同性を、プログラムのパラメータに基づいて計算する。
【００７８】
本明細書で用いられる「比較画面」とは、比較する２つの配列を最適に整列させて、同じ連続的な位置数を有する対照配列と比較するが、２０〜６００、一般に約５０〜約２００、より一般に約１００〜約１５０から成る群から選択されるどれか１つの連続的な位置数のセグメントとの照合を含むものである。比較する配列の整列の方法は、当該技術分野では周知である。比較のために最適な配列のアラインメントは、例えば、Smith & Watermanの局所的な相同性アルゴリズム (Adv. Appl. Math., 2:482(1981)) によって、Needleman & Wunshの相同性整列アルゴリズム (J. Mol. Biol., 48:443(1970)) によって、Pearson & Lipmanの類似性検索法 (Proc. Natl. Acad. Sci. U,S.A., 85:3444(1988)) によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実施 (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) によって、又は手動の整列及び目視検査（例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubell et al., eds. 1995 supplement)を参照のこと）によって行うことができる。
【００７９】
本明細書で用いられる「抗体」とは、標的因子、担体、標識、毒素又は薬剤などの別の化合物の結合しているか如何に関わらず、特異的な免疫反応の活性を有する如何なる分子をも意味する。抗体は、通常「Ｙ」型に会合し、それらの間に共有結合の有る若しくは無い２つの軽鎖及び２つの重鎖を含むが、この用語は、又、Ｆａｂ分子、Ｆａｂタンパク質又は抗原に対する結合親和性を有する一本鎖ポリペプチドなどの、反応性のフラグメント又は普通の組成のフラグメントのいずれをも意味する。Ｆａｂは、抗原に結合するフラグメントを意味する。本明細書でで用いられる「Ｆａｂ分子」とは、重鎖及び／又は軽鎖の可変部分を含み、結合活性を示す抗体分子の領域を意味する。「Ｆａｂタンパク質」には、１つの重鎖及び１つの軽鎖（通常、Ｆａｂとして知られる）の会合体、並びに抗体Ｙの２つの枝部分に対応する（通常、Ｆ（ａｂ）２として知られる）４量体が含まれ、会合体が特定の抗原若しくは抗原ファミリーと選択的に反応する能力があれば、上記の会合のいずれかが共有結合若しくは非共有結合のどちらであってもよい。
【００８０】
「抗体」という用語は、本明細書では広義に用いられ、ポリクローナル及びモノクローナル抗体の両方を含む。無傷の免疫グロブリン分子に加え、「抗体」とは、本明細書に開示したタンパク質と相互作用する能力ということで選択されているものであれば、上記免疫グロブリン分子のフラグメント又はポリマー、及びヒト又はヒト化バージョンの免疫グロブリン分子又はそのフラグメントのことである。抗体は、本明細書に記載のインビトロアッセイ又は類似した方法を用いて目的の活性を試験することができ、その後、インビボでのそれらの治療及び／又は予防活性を、公知の臨床的試験方法に従って試験する。
【００８１】
本発明の抗体は、例えば、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ経路、ＰＥＣＡＭ−１などのＶＥＧＦ経路メンバーに対するものである。
【００８２】
抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、遺伝子組み換え体、例えばキメラ又はヒト化、完全ヒト型、非ヒト型、例えば、ネズミ、一本鎖抗体又は完全合成物であってもよい。キメラ型、ヒト化、しかし最も好ましくは、完全なヒト型抗体が、例えば、ヒト患者の治療的処置及び診断への繰り返し投与を含む適用には望ましい。関連する態様において、抗体は、毒素と結合させてもよい。
【００８３】
治療方法及び組成物
本発明は、血管新生に罹患している又は罹患する恐れのある対象を治療する、予防及び治療方法を提供する
【００８４】
本発明は、更に、対象の血管新生を治療する方法、即ち、対象の血管新生を軽減させるのに有効な本発明の医薬組成物の１つ又はそれ以上の用量を対象に投与し、それにより血管新生を治療する、対象の血管新生を治療する方法を提供する。
【００８５】
本明細書で用いる「血管新生関連の疾患」及び「異常な血管新生」という用語は、無症候期及び症候期の両方を言い、そして増大した血管新生（例えば、癌、冠動脈性心臓病、腫瘍転移、炎症性血管障害又は糖尿病）及び低下した血管新生（組織分解）を言う。
【００８６】
本明細書で用いる「異常な血管新生」は、増大した血管新生（例えば、癌、冠動脈性心臓病、腫瘍転移、炎症性血管障害又は糖尿病）及び低下した血管新生（組織分解）を言う。
【００８７】
本明細書で用いる「治療」という用語は、異常な血管新生を有する又は有する恐れのある患者に、回復、治癒、軽減、除去、変化、修復、改良、改善又は感染若しくは感染の症状に影響を与えることを目的に、治療薬剤を適用又は投与すること、又は患者から分離された組織又は細胞株に対して治療薬剤を適用又は投与することと定義される。治療薬剤には、本明細書に記載したように、ペプチド、抗体又はそれらのフラグメント、低分子、脂質、及び核酸が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８８】
「有効量」という用語は、患者の症状の改良をもたらす血管新生を軽減若しくは増加させるのに十分な、又は望ましい生物学的結果、例えば、血管新生を軽減する又は増加させる、を達成するのに十分な投与量又は容量を言う。
【００８９】
「薬学的に許容される賦形剤又は媒体」には、例えば、水、生理食塩水、グリセリン、エタノールなどが挙げられる。更に、そのような媒体には、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの補助剤が含まれていても良い
【００９０】
本発明の治療方法は、一般に、ＶＥＧＦ経路の阻害剤又は活性化剤の治療有効量を、このような治療を必要とする哺乳類などの対象、特にヒトなどの霊長類の対象に投与することを包含する。本発明の治療方法はまた、本明細書に定義した式Ｉで表される化合物の有効量を、本明細書に開示された適応で、このような治療を必要とする対象、特にヒトなど哺乳類の対象に投与することを包含する。
【００９１】
種々のＶＥＧＦ経路阻害剤を、本発明の治療方法に用いることができる。簡単な試験、例えば、上記で定義したような標準のインビトロアッセイで、好適なＶＥＧＦ経路阻害剤を容易に同定することができる。好ましいＶＥＧＦ経路阻害剤には、プロパノール骨格を含むものが包含される。一般に、本発明の治療方法に用いるのに好ましいのは、以下の式Ｉ：
【化００５】
2008510723.tif 000005
（式中、
Ｒ及びＲ１は、水素、及びアミノ、ヒドロキシ又はメルカプトのような置換基を有する又は有していない直鎖状又は分岐鎖状のＣ１−Ｃ６アルキルから成る群から、それぞれ独立に選択され、そして更にＲ及びＲ１は、一緒になって、ピロリジノ、モルホリノ、チオモルホリノ、ピペリジノ又はアザシクロヘプチル等のような５、６又は７員環の置換基を形成することができ；
【００９２】
Ｒ２は、１〜３個の二重結合を有する又は有していない分岐鎖状又は直鎖状のＣ６−Ｃ３０アルキルから成る群から選択され；そして
【００９３】
Ｒ３は、１〜３個の二重結合を有する又は有していない直鎖状又は分岐鎖状のＣ６−Ｃ２０アルキル、炭素環式アリール（例えば、フェニル）などのアリール、又は炭素環式アリール（例えば、フェニル）などの置換アリールから成る群から選択され、ここにおける置換アリールの置換基は、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、メチレンジオキシ、Ｃ１−Ｃ４メルカプト、アミノ又は置換アミノであり、ここでの置換アミノの置換基は、好適にはＣ１−Ｃ４アルキルであって良い）
で表される化合物である。
【００９４】
上記式Ｉの好適な化合物及び他のＶＥＧＦ経路阻害剤は、公知の方法によって容易に製造でき、又、市場から入手することもできる。例えば、「Abe, A. et al., (1992) J. Biochem. 111:191-196」、「Inokuchi, J. et al., (1987) J. Lipid Res. 28:565-571」、「Shukla, A. et al., (1991) J. Lipid Res. 32:73」、「Vunnam R.R. et al., (1980) Chem. and Physics of Lipids 26:265」、「Carson, K. et al., (1994) Tetrahedron Lets. 35:2659」及び「Akira, A. et al., (1995) J. Lipid Research 36:611」を参照されたい。
【００９５】
ＶＥＧＦ経路阻害剤としては、例えば、ＳＵ−１４９８、Ｇｏ６９７６、Ｇｏ６８５０、ブロモフェナシルブロミド（ＢＭＢ）、メチル−アラキドニル・フルオロホスホナート（ＭＡＦＰ）、ピロリジン・カルボジチオ酸、塩化ジフェニレン・ヨードニウム及びＮ−アセチル−Ｌ−システインも含まれる。
【００９６】
ＶＥＧＦ経路阻害剤としては、例えば、ＰＥＣＡＭ−１、ＬａｃＣｅｒ、又はＬａｃＣｅｒシンターゼ抗体若しくはそのフラグメントが挙げられる。典型的な抗体として、ＶＥＧＦ誘導のインビトロ血管新生／チューブ形成を軽減させるＬａｃＣｅｒシンターゼ（ＧａｌＴ−Ｖ／ＶＩ）抗体も含まれる。本明細書に記載された方法に使用するその他の典型的な抗体には、ＩＧＡＱＶＹＥＱＶＬＲＳＡＹＡＫＲＮＳＳＶＮＤ及びＩＧＭＨＭＩ---- ＲＬＹＴＮＫＮＳＴＬＮＧＴを含む、ＧａｌＴ−Ｖペプチド配列に特異的な抗体が挙げられる。本明細書に記載された方法に有用な更なる抗体は、次のＬａｃＣｅｒシンターゼ（ＧａｌＴ−Ｖ／ＶＩ）配列に特異的な抗体である：
【００９７】
ヒトＧａｌＴ−Ｖペプチド：
（１１５）ＲＥＬＰ（１１９）
（１４５）ＰＴＩＫＬＧＧＨＷＫＰ（１５５）
（１６０）ＰＲＷＫＶＡＩＬＩＰ（１６９）
（１６９）ＰＦＲＮＲＨＥＨＬＰ（１７８）
（１７８）ＰＶＬＦＲＨＬＬＰ（１８６）
（３１６）ＰＥＧＤＴＧＫＹＫＳＩＰ（３２８）
【００９８】
ヒトＧａｌＴ−ＶＩペプチド：
（９７）ＰＥＮＦＴＹＳＰ（１０４）
（１０４）ＰＹＬＰ（１０７）
（１０７）ＰＣＰＥＫＬＰ（１１３）
（１４３）ＰＧＧＨＷＲＰ（１４９）
（１４５）ＰＲＷＫＶＡＶＬＩＰ（１６３）
（１６３）ＰＦＲＮＲＨＥＨＬＰ（１７２）
（１７２）ＰＩＦＦＬＨＬＩＰ（１８０）
（３１１）ＰＥＧＤＬＧＫＹＫＳＩＰ（３２２）
（３７４）ＰＥＬＡＰ（３７８）
【００９９】
ＶＥＧＦ経路阻害剤としては、例えば、ＰＥＣＡＭ−１、ＬａｃＣｅｌ又はＬａｃＣｅｒシンターゼｓｉＲＮＡ分子も含まれる。例えば、５’−ＣＧＧＡＧＵＧＡＧＵＧＧＣＵＵＡＡＣＡｄＴｄＴ−３’（センス），５’−ＵＧＵＵＡＡＧＣＣＡＣＵＣＡＣＵＣＣＧｄＴｄＴ−３’（アンチセンス）がある。
【０１００】
ＶＥＧＦ経路阻害剤としては、例えば、ＰＥＣＡＭ−１、ＬａｃＣｅｒ、又はＬａｃＣｅｒシンターゼペプチド若しくはそのフラグメントも含まれる。典型的なペプチドには、次のＬａｃＣｅｒシンターゼ（ＧａｌＴ−Ｖ／ＶＩ）ペプチドが含まれる：
【０１０１】
ヒトＧａｌＴ−Ｖペプチド：
（１１５）ＲＥＬＰ（１１９）
（１４５）ＰＴＩＫＬＧＧＨＷＫＰ（１５５）
（１６０）ＰＲＷＫＶＡＩＬＩＰ（１６９）
（１６９）ＰＦＲＮＲＨＥＨＬＰ（１７８）
（１７８）ＰＶＬＦＲＨＬＬＰ（１８６）
（３１６）ＰＥＧＤＴＧＫＹＫＳＩＰ（３２８）
【０１０２】
ヒトＧａｌＴ−ＶＩペプチド：
（９７）ＰＥＮＦＴＹＳＰ（１０４）
（１０４）ＰＹＬＰ（１０７）
（１０７）ＰＣＰＥＫＬＰ（１１３）
（１４３）ＰＧＧＨＷＲＰ（１４９）
（１５４）ＰＲＷＫＶＡＶＬＩＰ（１６３）
（１６３）ＰＦＲＮＲＨＥＨＬＰ（１７２）
（１７２）ＰＩＦＦＬＨＬＩＰ（１８０）
（３１１）ＰＥＧＤＬＧＫＹＫＳＩＰ（３２２）
（３７４）ＰＥＬＡＰ（３７８）
【０１０３】
その他の有用なペプチドとしては、ＬａｃＣｅｒがＰＥＣＡＭ−１発現を誘導するためにはホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）の活性化が必要であるため、ＰＬＡ２のペプチドが含まれ（Gong, N., Chatterje, S. et al., Proc Natl Acad Sci USA. 101:6490-6495 (2004)）、そして本明細書で、ＰＬＡ２阻害剤がヒト内皮細胞におけるＶＥＧＦ／ＬａｃＣｅｒ誘導の血管新生を軽減させることが提示される。ＰＬＡ２ペプチドの使用は、ＰＬＡ２活性を軽減させ、ひいてはＰＥＣＡＭ−１発現及び対象の血管新生を軽減させることができる。ＰＬＡ２ペプチドの典型的な配列には、ＣＣ（Ｐ）−ｘ−Ｈ（ＬＧＹ）−ｘ−Ｃ配列を有するペプチドが含まれ、ここでは、ヒスチジン（Ｈ）は酵素の活性部位である。
【０１０４】
その他のｓｉ−ＲＮＡ及びペプチドは想像され、本発明の開示（例えば、配列及びスクリーニング法）の便益を有する当業者は、その他のその様なｓｉ−ＲＮＡ及びＶＥＧＦ経路ペプチド阻害剤の製造及び仕様方法を理解するであろう。例えば、ｓｉ−ＲＮＡは、以下の配列を用いて構築する事ができる:ＡＦ３８６６３（ＧａｌＴ−Ｖ）、ＡＦ３８６６４（ＧａｌＴ−ＶＩ）、ＮＭ＿００８８１６、ＮＭ＿０００４４２、（ＰＥＣＡＭ１）、ＮＭ＿０７７４３５、ＮＭ＿００１０２５３７０、ＮＭ＿００１０２５３６９、ＮＭ＿００１０２５３６８、ＮＭ＿００１０２５３６７、ＮＭ＿００３３７６、ＮＭ＿００１０２５３６６、（ＶＥＧＦ）、Ｘ９４２６３、ＸＭ＿４９７９２１、ＡＢ０６５３７２、ＡＪ３１９９０８、Ｄ６４０１６、ＮＭ＿００２０１９、（ＶＥＧＦＲ）、及びＮＭ＿０００３００、ＢＣ００５９１９、（ＰＬＡ２）、これらの全体は、参照することによって本明細書に組み込まれている。
【０１０５】
本発明の治療方法において、治療化合物は、いくつかの方式の何れかによって、対象に投与することができる。例えば、ＶＥＧＦ経路阻害剤又は活性化剤は、標的症状の発症を抑える又は重症度を軽減するための予防薬として、投与することができる。或いは、ＶＥＧＦ経路阻害剤は、標的症状の経過中に投与することができる。
【０１０６】
治療化合物は、単独で、又は１つ又はそれ以上の治療薬剤との併用で、従来の賦形剤、即ち薬学的に許容される有機若しくは無機の担体物質で、非経口、腸溶性又は鼻腔内投与に好適であり、活性化合物と有害な反応をせずその受容体に害のない賦形剤との混合物の医薬組成物として対象に投与することができる。好適な薬学的に許容される担体として、水、塩溶液、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリド及びジグリセリド、ペトロエトラル（petroethral）脂肪酸エステル、ヒドロキシメチル・セルロース、ポリビニルピロリドン等が含まれるが、これらに限定されない。医薬製剤は、滅菌することが出来、必要により、例えば、潤滑剤、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、着色剤、香味及び／又は芳香物質などの助剤と混合されるが、これらは、活性化合物と有害な反応を起こさない。
【０１０７】
このような組成物は、非経口投与に使うためには、特に溶液又は懸濁液の形態に；経口投与のためには、特に錠剤又はカプセルの形態に；経鼻投与のためには、特に粉剤、点鼻薬、又はエアロゾルの形態に;経膣的、局所的には、例えば、クリームの形態に;直腸的には、例えば坐剤の形態；などに調製できる。ＶＥＧＦ経路阻害剤又は活性化剤はまた、ステントを経由して投与しても良い。典型的なステントは、米国特許出願第２００５０１７７２４６号；同第２００５０１７１５９９号；同第２００５０１７１５９７号；同第２００５０１７１５９８号；同第２００５０１６９９６９号；同第２００５０１６５４７４号；同第２００５０１６３８２１号；同第２００５０１６５３５２号；及び同第２００５０１７１５９３号に記載されている。
【０１０８】
医薬品は、単位剤形で都合よく投与することができ、そして医薬業界に周知の何れかの方法、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980) に記載の方法、で調製することができる。非経口投与のための製剤は、一般的な賦形剤として無菌の水又は生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物起原のオイル、水素化ナフタレンなどを含んでも良い。特に、生体適合性、生分解性のラクチドポリマー、ラクチド／グリコリド共重合体、又はポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体は、ある特定のＶＥＧＦ経路の阻害剤の放出を制御するために有用な賦形剤である。
【０１０９】
その他の潜在的に有用な非経口的送達システムとしては、エチレン−酢酸ビニル共重合体粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み式注入システム及びリポソームが含まれる。吸入投与のための製剤は、賦形剤として、例えば、乳糖を含み、又は例えば、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココール酸、及びデオキシコール酸を含む水溶液でもよく、又は点鼻薬の形態で投与するための油性溶液、又は鼻腔内に適用するジェルであっても良い。非経口投与のための製剤は、同様に、口腔投与のためのグリココール酸、直腸投与のためのメトキシサリチル酸、又は膣内投与のためのクエン酸を含む。その他の送達システムは、治療薬剤を手術部位に直接投与する、例えば、バルーン血管形成の後、ステントを用いてＶＥＧＦ経路阻害剤を投与する。
【０１１０】
ＶＥＧＦ経路調節剤（例えば、阻害剤又は活性化剤）は、単独の活性医薬品として、又は他の活性成分、例えば、プロブコール、公知の抗酸化物質（例えば、ビタミンＣ又はＥ）又はその他の化合物と併用して、本治療方法に用いることができる。本明細書で使用される調節剤は、ＶＥＧＦ経路阻害剤又は活性化剤を言う。
【０１１１】
治療組成物中の、１つ又はそれ以上の治療化合物の濃度は、投与されるＶＥＧＦ経路阻害剤又は活性化剤の用量、使用する組成物の化学的性質（例えば、疎水性）、及び意図する投与の様式及び経路を含む多くの因子によって変化する。概括的に言えば、１つ又はそれ以上のＶＥＧＦ経路阻害剤又は活性化剤は、非経口投与のために約０．１〜１０％ｗ／ｖの化合物を含む、水性の生理的緩衝液の溶液で与えられる。
【０１１２】
特定の治療に用いる活性化合物の実際に好ましい量は、例えば、使用される特定の化合物、処方される特定の組成物、投与の様式、対象の特性、例えば、種、性別、体重、一般的な健康状態、及び対象の年齢によって変わるものと理解される。所定の投与プロトコルに最適な投与の割合は、前述の指針に関して実施される従来の用量測定テストを用いることによって、当業者は容易に確認することができる。好適な用量の範囲には、１日当たり約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／（ｋｇ・体重）が含まれる。
【０１１３】
本発明の治療化合物は、プロトン化した水溶性の形態で、例えば、薬学的に許容される塩として、一般的には、例えば、塩酸塩、硫酸塩若しくはリン酸塩などの無機酸付加塩、又は酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩若しくはクエン酸塩などの有機酸付加塩のような、酸付加塩として好適に投与される。本発明の治療化合物の薬学的に許容される塩にはまた、金属塩、特にナトリウム塩又はカリウム塩などのアルカリ金属塩；マグネシウム又はカルシウム塩のようなアルカリ土類金属塩;アンモニウム又はテトラメチルアンモニウム塩のようなアンモニウム塩;リジン、グリシン又はフェニルアラニン塩のようなアミノ酸付加塩が挙げられる。
【０１１４】
好ましいＶＥＧＦ経路調節剤（例えば、阻害剤及び活性化剤）は、標準の細胞増殖アッセイにおいて顕著な活性を示す。好ましくは、ＶＥＧＦ経路阻害剤は、好適な対照アッセイと比較して、細胞増殖を少なくとも１５又は２５％、好ましくは少なくとも５０％阻害する。このようなアッセイにおいて、約０．１〜１００μＭ、好ましくは約１〜５０μＭの所望のＶＥＧＦ経路阻害剤又は活性化剤が用いられる。典型的な細胞増殖アッセイとして、生存細胞を計数すること、及び乳酸デヒドロゲナーゼのような、特定のクエン酸サイクル酵素の活性を測定することを包含する。好ましいアッセイは、１つ又はそれ以上の検出可能な標識ヌクレオシドのＤＮＡへの取り込みを、例えば、：
ａ）好適な細胞を培地中で培養して、
１）候補のＶＥＧＦ経路阻害剤又は活性化剤を添加し、
２）３Ｈチミジンのような放射線標識ヌクレオシドを、一般には約０．１〜１００μＣｉの量で添加し；
ｂ）前記細胞を、例えば、約６〜２４時間インキュベートし、一般にはその後洗浄し；そして
ｃ）その間のＤＮＡへの放射線標識ヌクレオシドの取り込みを、アッセイ培養と同一に調製し、候補のＶＥＧＦ経路阻害剤又は活性化剤を含まない条件下でインキュベートした対照培養と、対比させることにより測定する。
測定は、標識ＤＮＡをトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）でフィルター上に沈殿させ、続いてシンチレーションカウンターで測定することを含めた幾つかの方法によって実施することができる。このアッセイに関する開示のために、例えば、「Chatterjee, S., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1991) 181:554」、「Chatterjee, S. et al., (1982) Eur. J. Biochem. 120:435」を参照されたい。
【０１１５】
本明細書で言及する「標準のインビトロ細胞増殖アッセイ」又はその他の類似の語句は、上記の工程ａ）から工程ｃ）を含むアッセイを言う。１つの好ましい細胞増殖アッセイの例は、大動脈平滑筋細胞（ＡＳＭＣｓ）、特にヒト、ウシ又はウサギから得た細胞を使用する。好適なプロトコルは、標準の方法に従ったＡＳＭＣｓの調製及びマイクロタイタープレート内でハムＦ−１０などの好適な培地でのＡＳＭＣｓの培養を含む。所望のＶＥＧＦ経路阻害剤又は活性化剤は、次いで、培地に、好ましくは最終濃度が培地１ｍＬ当たり約１〜１００μｇ、より好ましくは約１〜５０μｇに溶解し、続いて、約１〜５日間、好ましくは約１日又はそれ以下の間インキュベートする。インキュベーション後、標準の細胞増殖、例えば、上記のトリチウム化チミジンの取り込み又は乳酸デヒドロゲナーゼアッセイを実施することができる。アッセイは、好ましくは、５％〜１０％で変えて、３回行われる。例えば、「Ross, R., J. Cell. Biol. (1971) 50:172」、「Chatterjee, S. et al, (1982) Eur. J. Biochem. 120:435」、「Bergmeyer, H.V. In Principles of Enzymatic Analysis. (1978) Verlag Chemie, NY.」を参照されたい。
【０１１６】
更に、好ましいＶＥＧＦ経路阻害剤又は活性化剤は、従来の細胞接着アッセイにおいて顕著な活性を示す。好ましくは、ＶＥＧＦ経路阻害剤は、好適な対照アッセイと比較して、細胞接着を少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％又はそれ以上阻害する。好ましくは、ＶＥＧＦ経路活性化剤は、好適な対照アッセイと対比して、細胞接着を少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％又はそれ以上活性化する。そのようなアッセイにおいて、約０．１〜１００μＭ、好ましくは約１〜５０μＭの所望のＶＥＧＦ経路阻害剤又は活性化剤が用いられる。例えば、好ましい細胞接着アッセイは、以下の工程を含む：
ａ）検出可能な標識、例えば、検出可能な標識を作り出すことが出来る有色の、放射性の、発光性の（例えば、蛍光又はリン光）、又は酵素的な標識により、第１の免疫細胞集団、好ましくはある特定の白血球を標識し；
ｂ）第１の細胞集団を、検出可能な標識、例えば、有色の、放射性の、発光性の（例えば、蛍光又はリン光）又は酵素的な標識、好ましくは工程ａ）で用いた標識と異なる標識で、標識された第２の内皮細胞集団と接触させ；そして
ｃ）第１の細胞集団と第２の細胞集団の間の如何なる接着も検出する。
【０１１７】
本明細書で言及する「標準のインビトロ細胞接着アッセイ」又はその他の類似の語句は、上記の工程ａ）から工程ｃ）を含むアッセイを言う。工程ｃ）における検出は、顕微鏡、特に共焦点顕微鏡検査及びＦＡＣＳを含めた蛍光ベースの顕微鏡撮影；自動細胞分別技術、ＥＬＩＳＡ及びＲＩＡのような免疫学的方法；及びシンチレーション計数法など、様々な方法で行うことができる。好ましい細胞接着アッセイに関する開示は、以下の例を参照されたい。
【０１１８】
好ましいインビトロ細胞接着アッセイは、多形核白血球（ＰＭＮｓ及び／又はミオサイト）又は血小板及び増加した内皮細胞接着を、所望のＶＥＧＦ経路阻害剤又は活性化剤と接触させる前、接触中又は接触後に測定する。ＰＭＮｓ又はミオサイトは、以下に詳述した標準の方法に従って、収集し精製することができる。ＰＭＮｓ又はミオサイトは、次いで、蛍光Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ染料（例えば、緑色）又はＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭなどの好適な蛍光色素とインキュベーションして標識する。ほぼ同時に、標準の細胞培養法に従ってスライド又はプラスチック製滅菌ペトリ皿などの好適な基質上に調製した単層の内皮細胞を、ＶＥＧＦ経路阻害剤又は活性化剤と接触させ、そして蛍光Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ染料（例えば、オレンジ）などの別の蛍光色素で標識する。次に、ＰＭＮｓ又はミオサイト及び内皮細胞を、３７℃で約１０分〜数時間、好ましくは約３０分間インキュベートする。次いで、非接着細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの生理学的に許容される緩衝液でスライドから洗い落とす。次いで、接着している細胞を、蛍光プレート読み取り機の使用などの標準的な方法で計量する。スライド上の接着細胞数は、単層の内皮細胞上のＰＭＮ／ｍｍ２の数を発現させることを含めた幾つかの方法で定量することができる。或いは、接着細胞を、顕微鏡で視覚化し撮影した顕微鏡写真撮影の後の検査によって定量することができる。次いで、細胞接着性を、顕微鏡写真の検査によって評価する。以下の実施例を参照されたい。
【０１１９】
特に好ましいのは、前に述べた方法に従ってＡＳＭＣｓで実施したＧａｌＴ−Ｖアッセイである。例えば、「Chatterjee, S. and Castiglione, E. (1987) Biochem. Biophys. Acta, 923:136」及び「Chatterjee, S. (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm., 181:554」を参照されたい。
【０１２０】
更に好ましいインビトロの細胞接着アッセイとしては、特異性のある抗体、特に接着分子を特異的に結合する能力を有するモノクローナル抗体を用いた、ＰＭＮｓ上の接着分子の免疫学的検出が含まれる。特に好ましいアッセイには、フローサイトメトリーを含む。
【０１２１】
上に記載したインビトロの細胞接着アッセイは、ＩＣＡＭ−１（細胞内接着分子−１）、Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）、ＬＦＡ−１及びセレクチンのような種々の特定の接着分子の分析と互換性がある。
【０１２２】
本発明の別の好ましいアッセイは、以下のａ）からｄ）までの工程を含む：
ａ）ＶＥＧＦ応答細胞の集団を、例えば、約１ｍｇリポタンパク質欠乏血清／タンパク質／ｍＬ培地又はそれ以下の、リポタンパク質欠乏血清培地で、好ましくは集密になるまで培養し；
ｂ）前記細胞を、好ましくは好適な分散性緩衝液、例えば、カコジル酸緩衝液に回収し；
ｃ）回収した細胞を、一般的に約０．１〜１００μＣｉの量の［１４Ｃ］−ＵＤＰ−ガラクトースのような、検出可能に標識されたヌクレオシド二リン酸糖供与体などの検出可能に標識された分子と好ましくはインキュベートし；そして
ｄ）ＶＥＧＦ経路の酵素の活性を指標として、ＬａｃＣｅｒ形成を測定する。
【０１２３】
殆どの場合、一般的な上記のアッセイには、公知のＶＥＧＦ応答細胞が用いられ、アッセイ中の細胞を維持するのに好適な培地、例えばイーグルの最小必須培地（ＨＭＥＭ）又はハムのＦ−１０培地、中で培養される。
【０１２４】
更に好ましいＶＥＧＦ経路阻害剤及び活性化剤としては、ＶＥＧＦ経路の酵素アッセイ又は経路メンバーの遺伝子若しくはタンパク質発現で測定した場合、ＶＥＧＦ経路メンバーの少なくとも２〜５倍強い阻害又は活性化を示すものが含まれる。より好ましいのは、少なくとも約５〜１０培強い阻害又は活性化を示すＶＥＧＦ経路阻害剤及び活性化剤であり、更により好ましくは、約１０〜５０培強い阻害又は活性化である。発現の測定方法は、本明細書の実施例に記載されている。
【０１２５】
特に好ましいＶＥＧＦ経路阻害剤としては、１つ又はそれ以上のＶＥＧＦ経路の酵素を特異的に阻害する能力を有するものが含まれる。即ち、同定されたＶＥＧＦ経路阻害剤が、その他の酵素に対しては比較的弱い阻害剤である。重要なこととして、ＶＥＧＦ経路阻害剤は、その他のＶＥＧＦ関連酵素の非選択的な阻害によって起こる望ましくない薬理学的な作用を排除しなければならない。
【０１２６】
本発明のインビボアッセイは、インビトロアッセイで好適な活性を示すＶＥＧＦ経路阻害剤及び活性化剤の、それに続く評価のために特に有用である。バルーン血管形成術などの侵襲的外科的処置を伴う動脈再狭窄のウサギモデルが好ましい。１つの好適なプロトコルは、好適な媒体又は１つ又はそれ以上の目的のＶＥＧＦ経路阻害剤を配合した媒体をウサギに投与することに関する。投与するＶＥＧＦ経路阻害剤の量は、目的の外科的処置に伴う損傷のレベルを含めた、幾つかの条件によって変動する。バルーン血管形成術が施された例において、ウサギは一般的に、１回投与（例えば、ｉ．ｍ．又はｉ．ｐ．）が約０．５〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１〜２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約１０ｍｇ／（ｋｇ・ウサギ体重）で候補のＶＥＧＦ経路阻害剤の投与を受ける。好ましい処方計画では、侵襲的な外科的処置を行う２４時間前にＶＥＧＦ経路阻害剤の投与を開始し、次いで、外科的処置の後の１５日間ＶＥＧＦ経路阻害剤の投与の継続を規定する。その他のプロトコルにおいては、毎日のＶＥＧＦ経路阻害剤の注射を、侵襲的な外科的処置の後、約２〜１２週間実施する。毎日のＶＥＧＦ経路阻害剤の注射、例えば、ｉ．ｍ．又はｉ．ｐ．が、一般的に好ましい。その後、ウサギを安楽死させ、試験のために血管、好ましくは大動脈を切除する。続いて血管をホルマリンで固定し、標準的な組織学的手法を用いて血管内皮、中皮及び外皮の増殖を分析する。
【０１２７】
「侵襲的な外科的処置」という用語は、血管内皮に対する著しい損傷を伴ない、例えば、心臓、肝臓又は腎臓などの器官又は手足に影響を与える、医学又は獣医学の技法を意味する。そのような血管には、大動脈、冠状血管、大腿骨及び腸骨の動脈及び静脈が挙げられる。侵襲的な外科的処置は、例えば、心臓手術、腹と胸部の両方に関する手術、動脈手術、器具（例えば、血管ステント又はカテーテル）の配置又は動脈内膜切除を含む技法に関係する（典型的なステント及びカテーテル、並びにそれらの使用法は、米国特許出願第２００５０１７７２４６号；同第２００５０１７１５９９号；同第２００５０１７１５９７号；同第２００５０１７１５９８号；同第２００５０１６９９６９号；同第２００５０１６５４７４号；同第２００５０１６３８２１号；同第２００５０１６５３５２号及び同第２００５０１７１５９３号に記載されている）。好ましい侵襲的な外科的処置は、血管形成術、特にバルーン血管形成術である。好ましくは、侵襲的な外科的処置は、霊長類、特にヒト、げっ歯類若しくはウサギ、又はブタ、イヌ若しくはネコなどの家畜動物などの哺乳類に行われる。
【０１２８】
その他のＶＥＧＦ経路阻害剤及び活性化剤のスクリーニング法は、以下の工程を含む：
１）ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）及び／又は内因性ＰＥＣＡＭ−１発現欠如のヒト中・内皮腫細胞株［ＲＥＮ−野生型（ＷＴ）］及び／又はヒトＰＥＣＡＭ−１を発現するＲＥＮ（ｍｔ−ｒｈＰＥＣＡＭ−１）を培養し；
２）前記細胞を、候補のＶＥＧＦ経路阻害剤又は活性化剤と接触させ；
３）前記細胞の、ＬａｃＣｅｒレベル及び／又はＬａｃＣｅｒシンターゼ、ＰＥＣＡＭ−１、ＰＬＡ２、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲの１つ又はそれ以上の発現を分析する。
【０１２９】
ＬａｃＣｅｒ、ＬａｃＣｅｒシンターゼ、ＰＥＣＡＭ−１、ＰＬＡ２，ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲの遺伝子及びタンパク質の発現は、リアルタイムのＰＣＲ、ＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ、ウェスタンブロット及び当業者が知る他の方法によって測定される。
【０１３０】
ＰＥＣＡＭ−１の典型的なプライマーの配列は、それぞれ（順方向）５’ＴＧＡＣＣＣＴＴＣＴＧＣＴＣＴＧＴＴ３’及び（逆方向）５’ＴＧＡＧＡＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＣＡＴＣ３’である。β−アクチンのプライマーは、例えば、それぞれ（順方向）５’ＡＧＧＴＣＡＴＣＡＣＴＡＴＴＧＧＣＡＡＣＧＡ３’及び（逆方向）５’ＣＡＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＧＡＡＴＴＧＡＡＴＧＴＡＧＴＴ３’を含んでも良い。
【０１３１】
対象の血管新生を低下させるＶＥＧＦ経路阻害剤の治療能を測定する方法は、治療前の対象の血管新生のレベルを測定し；ＶＥＧＦ経路阻害剤の治療有効量を対象に投与し；そして治療後の対象の血管新生のレベルを測定する；ことを含む。一態様において、血管新生の低下は、ＶＥＧＦ経路阻害剤が有効であることを示す。関連する態様において、治療前及び治療後の血管新生のレベルは、病変組織で測定される。
【０１３２】
対象における、治療能又は治療の有効性を評価する方法は、血管新生の治療前のレベルを業界で公知の方法（例えば、ＶＥＧＦ経路メンバーの発現レベル、理学的診断、組織の目視検査、腫瘍の治療前、治療中及び治療後の様々な時間での退化又は成長の、例えばキャリパー（caliper）による測定、）によって測定し、次いでＶＥＧＦ経路阻害剤又は活性化剤の治療有効量を対象に投与することを含む。化合物を投与した後の適切な時間（例えば、初期段階の治療の後）、例えば、２時間、４時間、８時間、１２時間又は７２時間後に、再度血管新生のレベルを測定する。血管新生の変調は、治療の有効性を示す。血管新生のレベルは、治療期間中、定期的に測定される。例えば、治療の更なる有効性を評価するために、血管新生は数時間毎、数日毎、数週間毎に検査される。血管新生の減少は、阻害剤による治療が有効であることを示す。記載した方法は、ＶＥＧＦ経路阻害剤による治療から便益が得られる対象の選別又は選択に使うことができる。
【０１３３】
本明細書に記載の方法によれば、病変組織は、肺、心臓、肝臓、腫瘍又は脈管構造の１つ又はそれ以上である。血管新生のレベルは、ＰＥＣＡＭ−１発現、ＧａｌＴ−Ｖ発現、チューブ形成又はＬａｃＣｅｒレベルによって測定することができる。
【０１３４】
上記のように、本発明は、血管新生に関連する症状を治療又は予防する治療能を持つＶＥＧＦ経路阻害剤及び活性化剤を検出し、解析する方法を含む。ＶＥＧＦ経路の活性は、本明細書に参照される方法によって測定することができる。
【０１３５】
概説すれば、本明細書に開示された新規なＶＥＧＦ関連の工程が、血管新生関連の症状に対するＶＥＧＦ経路の活性の変化と関連することが明らかになっている。本発明の検出方法は、１つ又はそれ以上のＶＥＧＦ経路メンバーを含むようにフォーマットされている。より具体的には、その検出方法には、細胞血管新生を調節するように働く分子の活性を測定する特定の工程が含まれる。
【０１３６】
ＶＥＧＦ関連の工程は、ＶＥＧＦに応答する細胞に見られる。ＶＥＧＦ応答の細胞は、１つ又はそれ以上の特定の細胞分子又は好適な量のＶＥＧＦと接触した後の血管新生のような機能の変化を表す、不死化した細胞株又は初代培養の細胞（例えば、組織又は器官から得られた）であり得る。
【０１３７】
より具体的には、１つの方策又は組み合わせの方策により、ＶＥＧＦ応答の細胞を同定することができる。例えば、１つの取り組みとして、約１×１０５個の細胞を好適な培地の入ったペトリ皿に播種する。細胞の初代培養のために、動物から所望の組織又は器官を得て、標準的な方法に従って（例えば、超音波、機械的攪拌、及び／又はこの分野で知られる分散剤、例えば、洗浄剤及びプロテアーゼによって）分散させる。１日又は数日後、増殖培地をペトリ皿から除き、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。次に、細胞を好適な培地に約１〜５時間馴化させ、この時点でＶＥＧＦを培養液に添加する。添加するＶＥＧＦの量は、テストする個々の細胞又は組織の種類などの幾つかの条件に依存する。しかし大抵の場合、ＶＥＧＦは、培地１ｍＬ当たり約１μｇ〜１ｍｇ、好ましくは約１μｇ〜５００μｇ、そしてより好ましくは約１μｇ〜５０μｇの濃度で培養液に添加される。細胞を約１〜６０分、好ましくは約１〜１０分又はそれ以下の間、ＶＥＧＦと接触させた後、培地を除去し、以下に詳細に記したような適した溶解緩衝液で細胞を溶解させる。次いで、添加したＶＥＧＦに対する細胞の応答を、本明細書に記載した何れかの方法に従ってアッセイする。
【０１３８】
特に好ましいＶＥＧＦ応答の哺乳類細胞には、血管内皮に付随する細胞、例えば、器官又は手足、特に心臓又は腎臓細胞の脈管構造に付随する細胞が含まれる。より具体的には、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）及び内皮細胞である。
【０１３９】
好ましいＶＥＧＦ経路阻害剤には、同様に、ＶＥＧＦに曝した後、ＶＥＧＦ関連経路において１つ又はそれ以上の特定の分子を調節する優れた能力を示す阻害剤が含まれる。特に好ましい化合物は、約０．１〜１００μｇ／ｍＬ、好ましくは約１〜１０μｇ／ｍＬの濃度のインビトロ検出アッセイで、分子の活性が（好適な対照アッセイと比較して）少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、そしてより好ましくは少なくとも９０％又はそれ以上の減少又は増加を示す。分子の活性は、合成、分解又は貯蔵の変化；タンパク質の修飾、例えば、リン酸化、又はある特定の酵素の様にアロステリックな作用を含めた、幾つかの容易に検出可能な方式の何れかで、減少又は増加することができる。
【０１４０】
特に、もし目的の分子が酵素の場合、好ましいＶＥＧＦ経路阻害剤には、以下に記載した酵素アッセイで優れた活性を示す阻害剤が含まれる。好ましくは、そのようなアッセイにおけるＩＣ５０値が約２０μＭ以下、より好ましくはＩＣ５０値が約１μＭ以下である。
【０１４１】
対照実験は、一般に、特定のアッセイの使用に合わせて調整される。例えば、殆どの対照実験は、一定量のテスト化合物を受容した細胞と平行して、テストサンプル（例えば、ＶＥＧＦ応答の細胞集団又はその溶解物）を、ＶＥＧＦ経路阻害剤で処理する代りに、培地、生理食塩水、緩衝液又は水で処理することを含む。次いで、所望のアッセイを本方法に従って行う。好適な対照実験の具体的な例を、以下に記載する。
【０１４２】
本発明の検出方法は、同様に、ＶＥＧＦ経路の活性を調節する、特定の成長因子、サイトカイン及びリポタンパク質を含む、生物源から得られたＶＥＧＦ経路阻害剤又は活性化剤を同定するために使うことができる。
【０１４３】
本発明の検出方法には、更に、ＶＥＧＦが関連する生化学的工程の特定の分子の活性を測定するアッセイが含まれる。測定は、化学発光試験、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分離、核酸の分離及び精製、ＳＤＳ−ＰＡＧＡゲル電気泳動、オートラジオグラフィー、シンチレーション計数、デンシトメトリー、ノーザン及びウェスタンブロット・ハイブリダイゼーション及び免疫アッセイ（例えば、ＲＩＡ及びＥＬＩＳＡ試験）のような標準的な実験室操作で実施することができる。一般的に、多くの標準的な方法に関する考察については、「Sambrook et al. in Molecular Cloning: A Laboratory Mannual (2nd ed. 1989)」及び「Ausubel et al.(1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York」を参照されたい。これらの開示内容は、参照することによって本明細書に組み込まれている。
【０１４４】
一態様において、本発明のインビトロアッセイは、ＶＥＧＦ応答の細胞のある特定の酵素の活性を測定する。酵素の活性は、ＶＥＧＦ及び／又はＰＤＭＰ若しくはその他の下記のような特定のＶＥＧＦ経路阻害剤に細胞を曝した後、変調することが見出されている。
【０１４５】
更に、本明細書に開示されたＶＥＧＦ経路阻害剤によって変調されることが見出された１つ又はそれ以上の酵素を測定するインビトロのアッセイが提供される。
【０１４６】
例えば、ヌクレオシド三リン酸の取り込み、特にグアニジンヌクレオシド三リン酸（ＧＴＰ）のような環状ヌクレオシド三リン酸の、ｒａｓ−ＧＴＰ結合タンパク質によるｒａｓタンパク質への取り込み（例えば、ｒａｓ−ＧＴＰ負荷）のような、癌遺伝子タンパク質への取り込みは、ヌクレオシド三リン酸（例えば、ＧＴＰ）のｒａｓタンパク質への取り込みの直接的検出を含めた多数の独特のアプローチによって測定することができる。例えば、１つのアプローチでは、ＶＥＧＦ応答の細胞を、放射性オルトリン酸（例えば、３２Ｐ標識）を用いて代謝的に標識し、細胞内のＧＴＰを検出可能に標識する。標識した細胞を、ＬａｃＣｅｒと、続いてＶＥＧＦ経路阻害剤とインキュベートし、次いで洗浄し、そしてＲＩＰＡ（以下を参照されたい）のような好適な溶解緩衝液中に溶解する。引き続いて、細胞溶解液を好適なＴＬＣプレート上で分離する。ＴＬＣプレートをＸ線フイルムに曝し、必要により濃度測定を行い、Ｒａｓタンパク質へのＧＴＰの取り込みを定量する。ｒａｓ−ＧＴＰ負荷を検出するための好ましい方法は、「Chatterjee, S. et al., (1997) Glycobiology, 7:703」に開示されている。
【０１４７】
ＶＥＧＦ経路の酵素活性を測定するための方法もまた、提供される。例えば、一つのアプローチとして、ＶＥＧＦ応答の細胞を、ＶＥＧＦ及び潜在的なＶＥＧＦ経路阻害剤とインキュベートし、洗浄し、次いでＶＥＧＦに曝してから約１〜６０分後、好ましくは１〜１０分又はそれ以下の後に回収する。全細胞溶解液を調製し、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動にかける。ゲルを好適な膜支持体に移し、次いで、ウェスタンブロット・ハイブリダイゼーション法に従い、ＶＥＧＦ経路メンバーを対象にする抗体で探索する。
【０１４８】
ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ経路阻害剤による変調を測定するための好適なインビトロの更なる方法は、細胞増殖因子の発現を監視することを含む。そのような解析の好ましい増殖性細胞因子は、増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）である。１つの好ましいアプローチにおいて、培養した細胞を、ＶＥＧＦと、続いてＶＥＧＦ経路阻害剤とインキュベートし、次いで好適な緩衝液で洗浄する。培養細胞内のＰＣＮＡは、ＰＣＮＡに特異的に結合する能力のあるモノクローナル抗体（例えば、ＰＣ１０抗体）を使って検出（必要により、定量）することができる。「Sasaki, et al., (1993) Cytometry 14:876-882」を参照されたい。次いで、ＰＣＮＡは、フローサイトメトリー又は固定した細胞切片の免疫組織化学的視覚化を含む種々の免疫学的方法によって、細胞で検出することができる
【０１４９】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、冠動脈性心臓疾患、糖尿病の血管合併症、炎症性血管疾患及び腫瘍転移に付随する血管新生に関わっている。しかし、ＶＥＧＦ誘導の血管新生が、ラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）のようなグリコスフィンゴリピドと関わりを持つメカニズムは知られていない。ＶＥＧＦ誘導の血管新生へのＬａｃＣｅｒの関与を実証するために、本発明者らは、ＨＵＶＥＣｓにおけるｓｉＲＮＡが介在するＬａｃＣｅｒシンターゼ発現（ＧａｌＴ−Ｖ／ＶＩ）のサイレンシングを用いた。この遺伝子サイレンシングは、ＶＥＧＦ誘導のＰＥＣＡＭ−１発現及び血管新生を著しく阻害した。次に、本発明者らは、ＬａｃＣｅｒシンターゼ及びグルコシルセラミドシンターゼの阻害剤であり、ＶＥＧＦ誘導のＰＥＣＡＭ−１発現及び血管新生を著しく軽減するＤ−トレオ−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール（Ｄ−ＰＤＭＰ）を使用した。興味あることに、これらの表現型の変化は、ＬａｃＣｅｒによって無効にされるが、グルコシルセラミド、ジガラクトシルセラミド及びセラミドなどの構造的に関連する化合物によっては無効にされない。内因性のＰＥＣＡＭ−１発現が欠如しているヒト内皮細胞株（ＲＥＮ）において、ＶＥＧＦ／ＬａｃＣｅｒによるＰＥＣＡＭ−１発現及びチューブ形成／血管新生の刺激が起こらなかった。しかし、ヒトＰＥＣＡＭ−１遺伝子／タンパク質を発現するＲＥＮ細胞では、ＶＥＧＦ及びＬａｃＣｅｒの両方はＰＥＣＡＭ−１タンパク質発現及びチューブ形成／血管新生を誘導した。実際、ＬａｃＣｅｒではなくＶＥＧＦ誘導の血管新生は、ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤であるＳＵ−１４９８によって軽減された。同様に、ＶＥＧＦ／ＬａｃＣｅｒ誘導のＰＥＣＡＭ−１発現及び血管新生は、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）及びホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）阻害剤によって軽減された。更に、ＶＥＧＦ／ＬａｃＣｅｒ誘導のＰＥＣＡＭ−１発現は、ＮＦ−ｋＢ阻害剤の１−ピロリジン・カルボジチオ酸（ＰＤＴＣ）、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤のジフェニレン・ヨードニウム（ＤＰＩ）及び抗酸化物質のアセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）によって阻害された。これらの結果は、ＶＥＧＦ処理した内皮細胞で産生されるＬａｃＣｅｒは、ＰＥＣＡＭ−１発現及び血管新生のために重要なシグナル伝達分子として働くことを示している。この発見及び本発明者らの報告の中で明らかにされた試薬は、更なるインビトロ及びインビボの研究のための抗血管新生薬として有用である。
【０１５０】
抗体
本明細書に記載した方法において有用な抗体は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＬａｃＣｅｒシンターゼ、ＬａｃＣｅｒ、ＰＥＣＡＭ−１及びＰＬＡ２を含む、ＶＥＧＦ経路メンバーに特異的な抗体である。特に好ましい抗体は、ＶＥＧＦ経路メンバーの活性を阻害する抗体である。本明細書に記載した方法において有用な抗体を産生する方法は、以下に更に十分に説明する。
【０１５１】
典型的な抗体には、ＶＥＧＦ誘導のインビトロ血管新生／チューブ形成を特異的に減少させるＬａｃＣｅｒシンターゼ（ＧａｌＴ−Ｖ／ＶＩ）抗体が含まれる。本明細書に記載された方法に使用するその他の典型的な抗体は、ＩＧＡＱＶＹＥＱＶＬＲＳＡＹＡＫＲＮＳＳＶＮＤ及びＩＧＭＨＭＩ---- ＲＬＹＴＮＫＮＳＴＬＮＧＴを含むＧａｌＴ−Ｖペプチド配列に特異的な抗体である。本明細書に記載された方法に有用な更なる抗体は、次のＬａｃＣｅｒシンターゼ（ＧａｌＴ−Ｖ／ＶＩ）配列に特異的な抗体である：
【０１５２】
ヒトＧａｌＴ−Ｖペプチド：
（１１５）ＲＥＲＬＰ（１１９）
（１４５）ＰＴＩＫＬＧＧＨＷＫＰ（１５５）
（１６０）ＰＲＷＫＶＡＩＬＩＰ（１６９）
（１６９）ＰＦＲＮＲＨＥＨＬＰ（１７８）
（１７８）ＰＶＬＦＲＨＬＬＰ（１８６）
（３１６）ＰＥＧＤＴＧＫＹＫＳＩＰ（３２８）
【０１５３】
ヒトＧａｌＴ−ＶＩペプチド：
（９７）ＰＥＮＦＴＹＳＰ（１０４）
（１０４）ＰＹＬＰ（１０７）
（１０７）ＰＣＰＥＫＬＰ（１１３）
（１４３）ＰＧＧＨＷＲＰ（１４９）
（１４５）ＰＲＷＫＶＡＶＬＩＰ（１６３）
（１６３）ＰＦＲＮＲＨＥＨＬＰ（１７２）
（１７２）ＰＩＦＦＬＨＬＩＰ（１８０）
（３１１）ＰＥＧＤＬＧＫＹＫＳＩＰ（３２２）
（３７４）ＰＥＬＡＰ（３７８）
【０１５４】
ヒト部分及び非ヒト部分の両方を含むキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、標準的な組み換えＤＮＡ技術を使って作ることができる。このようなキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、当業者で公知の組み換えＤＮＡ技術によって、例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎらの国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号、Ａｋｉｒａらの欧州特許出願第１８４，１８７号、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉらの欧州特許出願第１７１，４９６号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎらの欧州特許出願第１７３，４９４号、ＮｅｕｂｅｒｇｅｒらのＰＣＴ国際特許公報第８６／０１５３３号、Ｃａｂｉｌｌｙらの米国特許公報第４，８１６，５６７号、Ｃａｂｉｌｌｙらの欧州特許出願第１２５，０２３号、「Better et al. (1988) Science 240:1041-1043」、「Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443」、「Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526」、「Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218」、「Nishimura et al. (1987) Canc. Res. 47:999-1005」、「Wood et al. (1985) Nature 314:446-449」、「Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559」、「Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207」、「Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214」、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号；「Jones et al. (1986) Nature 321:552-525」、「Verhoeyanet al. (1988) Science 239:1534」及び「Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060」に記載される方法を用いて製造することができる。
【０１５５】
完全なヒト抗体は、ヒトの患者の治療上の処置のために特に望ましい。このような抗体は、内因性の免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖遺伝子を発現できないが、ヒトの重鎖及び軽鎖遺伝子を発現出来る遺伝子導入マウスを使うことによって産生することができる。例えば、「Lonberg and Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93」、米国特許第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、 同第５，５６９，８２５号、 同第５，６６１，０１６号、及び同第５，５４５，８０６号を参照されたい。更に、「Abgenix, Inc. (Fermont, Calif.)」及び「Medarex, Inc. (Princeton, N.J.)」などの会社は、契約により上記と同様の技術を用いて選択した抗原に対するヒト抗体を供給することができる。
【０１５６】
選択したエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導選択」と呼ばれる技術を用いて産生することができる。このアプローチにおいて、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体が、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導するために使われる。この技術は、「Jespers et al. (1994) Bio/Technology 12:899-903」に記載されている。
【０１５７】
本明細書で使われる「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体集団から得られた抗体、即ち、抗体分子の小さなサブセットとして存在する自然に起きた突然変異を除き、集団の中の個々の抗体が同一である抗体を言う。本明細書におけるモノクローナル抗体は、特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種から誘導された抗体又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一であるか又は同種であり、一方、その鎖の残りの部分は別の種から誘導された抗体又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一であるか又は同種である「キメラ」抗体、並びに、所望の拮抗阻害的活性を示す限り、その様な抗体のフラグメントを包含する（米国特許第４，８１６，５６７号、及び「Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7851-6855 (1984)」を参照されたい）。  
【０１５８】
本発明のモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を産生するいかなる手法を用いても作ることができる。例えば、本発明のモノクローナル抗体は、「Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)」に記載されている様な、ハイブリドーマ法を使って製造することができる。ハイブリドーマ法では、一般的には、マウス又はその他の適切な宿主動物を免疫剤で免疫し、免疫剤と特異的に結合する抗体を産生するリンパ球を誘導する。
【０１５９】
モノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号（Cabilly et al.）に記載されているような、組み換えＤＮＡ法によって作ることができる。開示されたモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手法を用いて（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力を持つオリゴヌクレオチド・プローブを用いることにより）容易に分離し、配列を測定することができる。抗体又は抗体の活性フラグメントのライブラリーは、同様に、例えば、Ｂｕｒｔｏｎらの米国特許第５，８０４，４４０号及びＢａｒｂａｓらの米国特許第６，０９６，５５１号に記載のファージ提示法の技術を使って産生し、そして選別することができる。
【０１６０】
インビトロの方法はまた、一価の抗体の製造に好適である。抗体のフラグメント、特にＦａｂフラグメントを産生するための抗体の消化は、当業者に公知な日常的な技術を使って行うことができる。例えば、消化は、パパインを用いて行うことができる。パパイン消化の例は、１９９４年１２月２２日に公開された国際特許公報第９４／２９３４８号及び米国特許第４，３４２，５６６号に記載されている。抗体のパパイン消化は、一般に、Ｆａｂフラグメントと呼ばれ、各々が単一の抗原結合部位を持つ同一の２個の抗原結合フラグメント、及び残りのＦｃフラグメントを産生する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を持ち、抗原と架橋結合する能力を保持するフラグメントを与える。
【０１６１】
本明細書で用いる「抗体又はそのフラグメント」という用語は、二重又は多重の抗原又はエピトープ特異性を持つキメラ抗体及びハイブリッド抗体、ハイブリッドフラグメントを含めたＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなどの一本鎖抗体及びフラグメントを包含する。従って、特異的抗原と結合する能力を保持する抗体フラグメントが提供される。例えば、ＨＩＶｇｐ１２０結合活性を保持する抗体フラグメントは、「抗体又はそのフラグメント」という用語の意味に含まれる。このような抗体及びフラグメントは、当業者に公知の技術で作ることができ、そして実施例で説明する方法及び一般的な抗体の生産及び抗体の特異性並びに活性の選別法（「Harlow and Lane. Antibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Publications, New York (1988)」を参照されたい）に従って、特異性及び活性を選別することができる。同様に、例えば、米国特許第４，７０４，６９２号（参照することによって本明細書に取りいれられている）に記載されているような、抗体フラグメントと抗原結合タンパク質の複合体（一本鎖抗体）も、「抗体又はそのフラグメント」の意味に包含される。
【０１６２】
フラグメントは、その他の配列に結合しているか否かに関わらず、もし抗体又は抗体フラグメントの活性が非修飾の抗体又は抗体フラグメントに比較して著しく変わるか損なわれなければ、挿入、削除、置換、又は特定の領域若しくは特異的なアミノ酸残基の選択的な修飾を含むことができる。これらの修飾は、ジスルフィド結合が作れるアミノ酸の除去／付加、生物寿命の延長、分泌特性の変更など、幾つかの追加の特性を付与することができる。何れの例においても、抗体又は抗体フラグメントは、その同族抗原との特異的結合のような、生物活性の特性を持たなければならない。抗体又は抗体フラグメントの機能性又は活性の領域は、タンパク質の特定の領域に突然変異を起こさせ、次に発現させ、発現したポリペプチドをテストすることによって同定することができる。このような方法は、当業者には容易に明らかであり、抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸の部位特異的突然変異を含むことができる（Zoller, M. J. Curr. Opin. Biotechnol. 3:348-354 (1992)）。
【０１６３】
本明細書で用いる「抗体」又は「抗体類」という用語は、同様に、ヒト抗体及び／又はヒト化抗体を言う。多くの非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット又はウサギ由来の抗体）は、当然ヒトにおいては抗原性を示し、従ってヒトに投与した場合、好ましくない免疫反応を起こす。それ故、本発明の方法におけるヒト又はヒト化抗体の使用は、ヒトに投与された抗体が好ましくない免疫反応を引き起こす機会を低下させる働きをする。
【０１６４】
ヒト抗体もまた、その他の技術の何れかを使うことによって調製することができる。ヒトモノクローナル抗体の生産技術の例として、「Cole et al.,（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan Liss, p.77(1985)）」及び「Boerner et al.,（J. Immunol. 147(1):86-95 (1881)）」によって記載された方法が挙げられる。ヒト抗体（及びそのフラグメント）もまた、ファージ提示ライブラリーを用いて産生することができる（Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227:381(1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581(1991)）。
【０１６５】
ヒト抗体はまた、遺伝子導入動物から得ることができる。例えば、免疫付与に応答のヒト抗体の全領域を産生することができる、遺伝子導入の変異マウスが記載されている（例えば、「Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-255(1993)」、「Jakobovits et al., Nature 362:255-258(1993)」及び「Bruggermann et al., Year in Immunol. 7:33(1993)」を参照されたい）。特に、これらのキメラ及び生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖の結合域（Ｊ（Ｈ））遺伝子のホモ接合体欠失は、内因性の抗体産生を完全に阻害し、ヒト生殖系列抗体遺伝子配列をその生殖系列変異マウスにうまく移せば、抗原チャレンジ上でヒト抗体を産生する結果となる。
【０１６６】
抗体のヒト化技術は、一般に、１つ又はそれ以上の抗体分子のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作するための、組み換えＤＮＡ技術の使用を必要とする。従って、非ヒト抗体（又はそのフラグメント）のヒト化された形態は、キメラ抗体、又は非ヒト抗体（ドナー）からの抗原結合部位の部分を含む抗体鎖（又は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’若しくは抗体のその他の抗原結合部位のような、そのフラグメント）がヒト（受容体）抗体の枠組みの中に組み込まれた形態である。
【０１６７】
ヒト化抗体を産生するため、受容体（ヒト）抗体分子の１つ又はそれ以上の相補性測定領域（ＣＤＲｓ）からの残基は、所望の抗原結合特性（例えば、標的抗原に対するあるレベルの特異性と親和性）を有することが知られるドナー（非ヒト）抗体分子の１つ又はそれ以上のＣＤＲｓからの残基で置き換えられる。幾つかの例では、ヒト抗体のＦｖ骨格残基（ＦＲ）が、相当する非ヒト残基で置き換えられる。ヒト化抗体はまた、受容体抗体にも、取り込まれたＣＤＲ又は骨格配列にも無い残基を含むことができる。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒト源からの、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基を有する。実際には、ヒト化抗体は、通常幾つかのＣＤＲ残基及び可能性のある幾つかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体の類似した部位からの残基で置換されたヒト抗体である。ヒト化抗体は、一般に、通常はヒト抗体の、少なくとも定常領域（Ｆｃ）の部分を含む（「Jones et al., Nature 321:522-525(1986); Reichmann et al., Nature 332:323-327(1988)」及び「Presta, Curr. Opin. Struct. Biol. 2:593-596(1992)」を参照されたい）。
【０１６８】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野では公知である。例えば、ヒト化抗体は、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者らの方法（Jones et al., Nature 321:522-525(1986)；Reichmann et al., Nature 332:323-327 (1988)；Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)）に従い、げっ歯類ＣＤＲｓ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の相当する配列を置き換えることによって産生することができる。ヒト化抗体の産生に使うことができる方法はまた、米国特許第４，８１６，５６７号（Cabilly et al.）；同第５，５６５，３３２号（Hoogenboom et al.）；同第５，７２１，３６７号（Kay et al.）；同第５，８３７，２４３号（Deo et al.）；同第５，９３９，５９８号（Kucherlapati et al.）；同第６，１３０，３６４号（Jakobovits et al.）；及び同第６，１８０，３７７号（Morgan et al.）に記載されている。
【０１６９】
医薬組成物及びキット
本明細書に記載された治療薬の低分子物質、ペプチド、核酸及び抗体は、医薬組成物に処方し、キットで提供することができる。医薬製剤は、送達のために医療器具上又はナノ粒子上に被覆されても良い。
【０１７０】
「薬学的に許容される担体」という語句は、認められた技術であり、本発明の化合物を哺乳類に投与するために好適な、薬学的に許容される材料、組成物又は媒体を含む。担体には、対象薬剤を身体の１つの器官、又は部分から、身体の別の器官又は部分に運ぶ若しくは移行させることに関わる、液体若しくは固体の充填剤、稀釈剤、賦形剤、溶媒又はカプセル化材が含まれる。各々の担体は、製剤のその他の成分との適合性及び患者に対して有害ではないという意味において「許容し得る」ものでなければならない。薬学的に許容される担体として提供できる材料の例には、乳糖、グルコース及びショ糖などの糖類；コーンスターチ及びジャガイモ澱粉などの澱粉類；カルボキシメチルセルロース・ナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロースなどのセルロース及びその誘導体；トラガカント粉末；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバター及び坐剤ワックスなどの賦形剤；ピーナツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及び大豆油などの油類；プロピレングリコールなどのグリコール類；グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール類；オレイン酸エチル及びラウリル酸エチルなどのエステル類；寒天；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質不含水；等張生理食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール;リン酸緩衝液、及び医薬製剤に使用される非毒性の適合性の良いその他の物質が挙げられる。
【０１７１】
湿潤剤、乳化剤並びにラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、更に着色剤、離型剤、被覆剤、甘味料、香味料並びに芳香剤、防腐剤及び抗酸化物質もまた、組成物中に存在させることができる。
【０１７２】
薬学的に許容される抗酸化物質の例としては：アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム等の水溶性抗酸化物質；パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロール等の脂溶性抗酸化物質；及びクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等の金属キレート剤が挙げられる。
【０１７３】
本発明の製剤には、経口、鼻腔、局所、経皮、口腔、舌下、筋肉内、腹腔内、直腸、膣及び／又は非経口投与に、好適な製剤が含まれる。製剤は、単位用量の形態で都合よく提供でき、製薬技術分野に周知の方法で調製することができる。担体物質と組み合わせて単一用量の形態にする活性成分の量は、一般的には、化合物が治療効果を生み出す量である。一般には、１００パーセントの内、活性成分の量は約１パーセント〜約９９パーセント、好ましくは約５パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約１０パーセント〜約３０パーセントの範囲になる。
【０１７４】
これらの製剤又は組成物の調製方法は、本発明の抗体又は複合体を、担体及び、場合により１つ又はそれ以上の補助的な成分と会合させる工程を含む。一般的に、製剤は、本発明の化合物を液体の担体若しくは微粉末の固体の担体、又は両方と、均一にそして密接に会合させ、次いで、必要に応じて生成物を成形することによって調製される。
【０１７５】
経口投与に好適な本発明の製剤は、カプセル、カシェ剤、丸薬、錠剤、ドロップ（香味付けした基材、通常ショ糖及びアカシア又はトラガカントを使用）、粉剤、顆粒、又は水性若しくは非水性液体の溶液又は懸濁液として、又は水中油若しくは油中水のエマルジョンとして、又はエリキシル若しくはシロップとして、トローチ（ゼラチン及びグリセリン、又はショ糖及びアカシアのような不活性基材を使用）及び／又はうがい薬等としての形態で、それぞれが所定の量の本発明の化合物を活性成分として含む製剤であればよい。本発明の化合物は、又、ボーラス、舐剤又は練り物として投与しても良い。
【０１７６】
経口投与のための本発明の固形の剤形（カプセル、錠剤、丸薬（ピル）、糖衣錠、粉剤、顆粒など）では、活性成分は、クエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウム、及び／又は次の何れか：澱粉、乳糖、ショ糖、グルコース、マンニトール、及び／又はケイ酸などの充填剤又は増量剤；例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖及び／又はアカシアなどの結合剤；グリセリンなどの保湿剤；寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカ澱粉、アルギン酸、或る種のケイ酸塩及び炭酸ナトリウムなどの崩壊剤；パラフィンなどの溶液遅延剤；第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤；例えば、セチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロールなどの湿潤剤；カオリン及びベントナイト粘土などの吸収剤；タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム及びそれらの混合物などの潤滑剤；及び着色剤の様な薬学的に許容される担体の１つ又はそれ以上と混合される。カプセル、錠剤及び丸薬の場合は、医薬組成物は、又、緩衝剤を含む。同じようなタイプの固形の組成物はまた、ラクトース又は乳糖、更に高分子量ポリエチレングリコールなどを用いた軟質及び硬質ゼラチンカプセルに充填剤として使われる。
【０１７７】
錠剤は、場合によって、１種又はそれ以上の補助成分を加えて、圧縮又は成形によって作られる。圧縮錠剤は、結合剤（例えばゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性稀釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えば、グリコール酸澱粉ナトリウム又は架橋カルボキシメチルセルロース・ナトリウム）、界面活性又は分散剤を用いて調製される。成形錠剤は、不活性の液体稀釈剤で加湿した粉末化合物の混合物を、好適な機械で型打ちして作られる。
【０１７８】
糖衣錠、カプセル、丸薬及び顆粒のような、本発明の医薬組成物の錠剤及びその他の固形剤形は、場合により、腸溶性の被覆剤及びその他の製薬技術分野で公知の被覆剤のような被覆剤を用いて得る又は調製することができる。それらはまた、活性成分の放出を遅く又は制御するように製剤化されても良く、そこには、例えば、所望の放出特性を与えるために比率を変えたヒドロキシプロピルメチルセルロース、その他の高分子マトリックス、リポソーム及び／又はミクロスフェアが用いられる。それらは、例えば、細菌除去フィルターを通しての濾過、又は使用直前に無菌水若しくはその他の注射用無菌溶媒に溶かすことができる無菌の固形組成物の形態への滅菌剤の組み込みによって、滅菌することができる。これらの組成物はまた、場合により乳白剤を含み、そしてそれが消化管の或る部分で活性成分のみを、又は活性成分を優先的に、場合により徐放的に放出させる組成物でも良い。使用出来る埋め込み型の組成物の例には、高分子物質及びワックスが含まれる。活性成分は、同様に、適切であれば１種又はそれ以上の上記の賦形剤と共に、マイクロカプセル化した形態にすることができる。
【０１７９】
本発明の化合物の経口投与用の液体剤形には、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルが含まれる。活性成分の他に、液体剤形には、例えば、水又はその他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、オイル類（特に、綿実、ピーナツ、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシ及びゴマ油）、グリセリン、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル並びにそれらの混合物などの、当該技術分野で一般に使われる不活性稀釈剤が含まれて良い。
【０１８０】
不活性稀釈剤以外に、経口の組成物には、湿潤剤、乳化及び懸濁剤、甘味料、香味料、着色剤、芳香剤並びに防腐剤などの補助剤を含めることができる。
【０１８１】
懸濁液には、活性化合物の他に、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロオキシド、ベントナイト、寒天及びトラガカント、及びそれらの混合物などの懸濁剤が含まれる。
【０１８２】
本発明の医薬組成物の直腸内又は膣内投与のための製剤は、１つ又はそれ以上の本発明の化合物と１つ又はそれ以上の、例えば、カカオバター、ポリエチレングリコール、坐剤ワックス又はサリチル酸塩などの非刺激性の好適な賦形剤又は担体と混合して調製され、そして室温では固体であるが体温では液体であり、従って、腸又は膣腔内で融解し活性成分を放出する坐剤として提供される。
【０１８３】
膣内投与に好適な本発明の製剤には、ペッサリー、タンポン、クリーム、ジェル、ペースト、泡沫又は当該技術分野に適切であることが知られている担体を含む噴霧製剤が含まれる。
【０１８４】
本発明の化合物の局所又は経皮投与のための剤形には、粉剤、噴霧剤、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ジェル、溶液、貼布及び吸入剤が挙げられる。活性化合物を、無菌条件下で、薬学的に許容される担体と、そして防腐剤、緩衝液又は必要な推進剤の何れかと混合する。
【０１８５】
軟膏、ペースト、クリーム及びジェルは、本発明の活性化合物に加えて、動物及び植物脂肪、オイル、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、タルク及び酸化亜鉛又はそれらの混合物などの、賦形剤を含んでも良い。
【０１８６】
粉剤及び噴霧剤は、本発明の活性化合物に加えて、乳糖、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム及びポリアミド粉末又はこれらの物質の混合物などの、賦形剤を含むことができる。噴霧剤は、更に、クロロフルオロヒドロカーボン及びブタンやプロパンなどの揮発性の無置換炭化水素のような、通例の（スプレー用）高圧ガスを含むことができる。
【０１８７】
経皮貼布は、本発明の化合物の制御した身体への送達を提供するという追加の利点を有する。このような剤形は、化合物を適切な溶媒に溶解又は分散させることによって作ることができる。吸収促進剤もまた、皮膚を通過する化合物の流れを増加させるために使うことができる。このような流れの速度は、速度制御膜を備えるか又は活性化合物をポリマーマトリックス若しくはゲルに分散させるかの何れかによって制御することができる。
【０１８８】
眼科用製剤、眼軟膏剤、粉剤、溶液なども、同様に、本発明の範囲内であることを意図している。
【０１８９】
非経口投与に好適な本発明の医薬組成物は、１つ又はそれ以上の薬学的に許容される無菌等張の水性若しくは非水性溶液、分散液、懸濁液若しくは乳液、又は使用直前に無菌の注射可能な溶液若しくは分散液に再構成される無菌粉末（抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、製剤を意図する受け手の血液と等張にさせる溶質、又は懸濁剤若しくは増粘剤を含んでもよい）と組み合わせて、１つ又はそれ以上の本発明の化合物を包含する。
【０１９０】
本発明の医薬組成物に用いられる好適な水性及び非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの好適な混合物、オリーブオイルなどの植物油、並びにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材の使用、分散液の場合は必要な粒子サイズの保持、及び界面活性剤の使用によって保持することができる。
【０１９１】
これらの組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤のような補助剤を含んでも良い。微生物の作用の阻止は、種々の抗菌及び抗カビ剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などによって確保できる。組成物中に、糖類、塩化ナトリウムなどの等張剤を含ませることは望ましい。又、注射可能な製剤形態での持続吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンのような吸収を遅らせる薬剤を含ませることによってもたらすことができる。
【０１９２】
幾つかのケースでは、薬剤の効果を持続させるために、皮下又は筋肉内注射からの薬剤の吸収を遅らせることが望ましい。これは、水溶解性の悪い結晶又はアモルファス原料の懸濁液を使用することで達成できる。薬剤の吸収速度は薬剤の溶解速度に依存し、言い換えると、結晶の大きさ及び結晶形態に依存する。他方、非経口的に投与する薬品形態の吸収を遅延させるには、薬品を油性の媒体に溶解又は懸濁させることで達成される。
【０１９３】
注射可能な持続性薬剤形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドのような生分解性のポリマー内に対象化合物のマイクロカプセル・マトリックスを形成させて作られる。ポリマーに対する薬剤の比率、及び使用する特定のポリマーの性質によって、薬剤放出の速度を調節することができる。その他の生分解性のポリマーの例としては、ポリ（オルソエステル）及びポリ（無水物）が挙げられる。持続性薬剤の注射可能な製剤もまた、身体組織適合性を有するリポソーム又はミクロエマルジョンに封入することによって製造される。
【０１９４】
本発明の製剤は、経口的、非経口的、局所的又は直腸的に投与される。それらは、勿論、それぞれの投与経路に好適な形態で与えられる。例えば、それらは、錠剤又はカプセルの形態で、注射、吸入、点眼薬、軟膏、座薬などによって、注射、注入又は吸入によって投与；ローション又は軟膏によって局所的に；座薬によって直腸的に、投与される。経口投与が好ましい。
【０１９５】
本明細書に用いられる「非経口投与」及び「非経口的に投与された」という語句は、腸内及び局所的な投与以外の投与方法を意味し、通常は注射により、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内及び胸骨内への注射及び注入が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１９６】
本明細書に用いられる「全身投与」、「全身的に投与した」、「末梢投与」及び「末梢的に投与した」という語句は、直接中枢神経系への投与以外で、化合物、薬剤又はその他の物質が患者の体（系）に入り、従って代謝の対象になるような投与、及びその他の同じ様な方法、例えば皮下投与、を意味する。
【０１９７】
化合物は、治療のために、経口的、例えば噴霧剤によるような経鼻的、直腸的、膣内的、非経口的、嚢内的、及び粉剤、軟膏若しくはドロップによるような口腔内及び舌下を含む局所的、を含めた何れかの好適な経路によって、人間及びその他の動物に投与される。
【０１９８】
選択された投与の経路に関わらず、好適な水和形態で用いられる本発明の化合物及び／又は本発明の医薬組成物は、当業者に公知の従来の方法で、薬学的に許容される剤形に製剤される。
【０１９９】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、特定の患者に所望の治療反応を与えるのに有効な活性成分の量、組成及び投与方法を、患者に毒性を与えることなしに得るように、変えることができる。
【０２００】
選択される用量レベルは、使用される特定の本発明の化合物又はそのエステル、塩若しくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄速度、治療期間、使用した特定の化合物と配合して使用される他の薬品、化合物及び／又は材料、治療する患者の年齢、性別、体重、症状、一般的な健康及び過去の病歴、及び医療技術分野で公知の要因を含めた、さまざまな要因に依存する。
【０２０１】
当該技術分野で通常の技量を有する医師又は獣医師は、必要な医薬組成物の有効量を容易に測定し処方することができる。例えば、医師又は獣医師は、医薬組成物中に使用された本発明の化合物の投与量を、所望の治療効果を得るために必要なレベルよりも低いレベルで開始し、所望の効果が得られるまで投与量を徐々に増加させることができる。
【０２０２】
一般に、本発明の化合物の好適な毎日の用量は、治療効果を与えるのに有効な最低用量の化合物の量になる。このような有効用量は、一般に上記の構成要素に依存する。一般に、本発明の化合物の患者への静脈内及び皮下用量は、表示された鎮痛効果のために使用する場合、体重１ｋｇ当たり１日約０．０００１〜約１００ｍｇ、より好ましくは体重１ｋｇ当たり１日約０．０１〜約５０ｍｇ、更により好ましくは体重１ｋｇ当たり１日約１．０〜約１００ｍｇの範囲である。有効量は、血管新生又は付随する疾患を治療する有効量である。
【０２０３】
必要に応じて、活性化合物の有効な毎日の用量は、１回量として、又は２、３、４、５、６回又はそれ以上の回数で、１日内に適切な間隔で別々に投与する分割用量として、場合により単位剤形で、投与することができる。
【０２０４】
本発明の化合物を単独で投与することは可能であるが、医薬組成物として化合物を投与することが好ましい。更に、本明細書に記載された医薬組成物は、ＨＩＶに感染している対象の治療を援助する１つ又はそれ以上のその他の活性成分と共に投与することができる。関連する態様において、本発明の医薬組成物は、１つ又はそれ以上の更なる活性成分で、ＨＩＶ感染又は関連する疾患若しくは障害を有する対象の治療を援助する成分を含めるように製剤化される。
【０２０５】
上記のように製造された抗体及び複合体は、上記で説明した免疫アッセイを実施するための好適な使用説明書、及びその他の必要な試薬の入ったキットで提供することができる。キットはまた、使用する特定の免疫アッセイによって、好適な標識物及びその他の梱包された試薬及び材料（即ち、洗浄用の緩衝液など）が含まれる。上記のような標準の免疫アッセイは、これらのキットを使って行うことができる。医薬組成物は、使用説明書、例えば投与するための文書化した説明書、特に血管新生又は付随した疾患を治療又は予防するための抗体又は複合体の使用のための説明書と一緒に、容器、パック、キット又は包装箱に入れられる。その容器、パック、キット又は包装箱にも、例えば、異常な血管新生に罹った対象の治療を援助する１つ又はそれ以上の更なる活性成分が含められても良い。
【０２０６】
ＬａｃＣｅｒシンターゼｍＲＮＡを標的とするＲＮＡｉ組成物
ＶＥＧＦ経路阻害剤はまた、例えば、ＰＥＣＡＭ−１、ＬａｃＣｅｒ、ＬａｃＣｅｒシンターゼ、又はＰＬＡ２ｓｉＲＮＡ分子を包含する。例えば、５’−ＣＧＧＡＧＵＧＡＧＵＧＧＣＵＵＡＡＣＡｄＴｄＴ−３’（センス）、５'−ＵＧＵＵＡＡＧＣＣＡＣＵＣＡＣＵＣＣＧｄＴｄＴ−３’（アンチセンス）を含む。ＲＮＡｉ分子は、ＶＥＧＦ経路メンバーの何れか１つのｍＲＮＡの何れかの部分にも干渉するであろう。
【０２０７】
本明細書で使用される「ＲＮＡ干渉」（「ＲＮＡｉ」）という用語は、ＲＮＡの選択的な細胞内分解を表す。ＲＮＡｉは、外来ＲＮＡ（例えば、ウイルスＲＮＡ）を除去するのに自然に細胞内で起こる。自然のＲＮＡｉは、その他の類似のＲＮＡ配列に対して分解の仕組みを指示するフリーのｄｓＲＮＡから切断された断片を経て進行する。他方、ＲＮＡｉは、人の手によって、例えば、標的遺伝子の発現を抑制するために、開始することができる。ＲＮＡｉに有用なＲＮＡｉ分子は、本明細書で、ときに、小干渉（small interfering）ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡ）という。
【０２０８】
「低下させる又は阻害する」は、ＲＮＡ干渉に使用されるアンチセンスヌクレオチドオリゴマー又はｄｓＲＮＡで処理されなかった試料と比較して、上記のアッセイ（「発現」を参照）によって検出された、タンパク質又は核酸のレベルで、好ましくは２０％又はそれ以上、より好ましくは５０％又はそれ以上、及び最も好ましくは７５％又はそれ以上の減少をもたらす能力を意味する。
【０２０９】
「標的特異的ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を指示する、標的ｍＲＮＡ配列に充分に相補的な配列」を有するｓｉＲＮＡは、ｓｓ−ｓｉＲＮＡが、ＲＮＡｉ機構又はプロセスによる標的ｍＲＮＡの分解を引き起こすのに充分な配列を有していることを意味する。
【０２１０】
本発明の種々の手法は、値、レベル、特徴、特性、性質等と、本明細書において「妥当な対照」と相互交換可能に表される「好適な対照」と比較することを包含している。「好適な対照」又は「妥当な対照」は、比較の目的に有用である当該技術分野に公知の何れかの対照又は標準である。一態様において、「好適な対照」又は「妥当な対照」は、本明細書に記載されているように、ＲＮＡｉの手法を実行する前に決定される値、レベル、特徴、特性、性質等である。例えば、転写速度、ｍＲＮＡレベル、翻訳速度、タンパク質レベル、生物活性、細胞特性又は性質、遺伝子型、表現型等は、本発明のｓｉＲＮＡを細胞又は生体に導入する前に決定することができる。別な態様において、「好適な対照」又は「妥当な対照」は、細胞又は生体、例えば、正常な遺伝形質を示す、例えば、対照又は正常細胞若しくは生体において決定される値、レベル、特徴、特性、性質等である。更に別の態様において、「好適な対照」又は「妥当な対照」は、前もって定義された値、レベル、特徴、特性、性質等である。
【０２１１】
「標的特異的ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を指示する標的ｍＲＮＡ配列に充分に相補的な配列」であるストランドを有するＲＮＡｉ剤は、前記ストランドが、ＲＮＡｉ機構又はプロセスによってｍＲＮＡの分解を引き起こすのに充分な配列を有することを意味する。
【０２１２】
「小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」（又、当該技術分野において「短い干渉（short interfering）ＲＮＡ」と呼ばれる）は、ＲＮＡ干渉を指示する又は介在することができる、約１０〜５０ヌクレオチド（又はヌクレオチド類縁体）を含む単離されたＲＮＡ分子を意味する。ｓｉＲＮＡは、分解される標的遺伝子又はｍＲＮＡを同定するのに用いられる、好ましくは１０ヌクレオチド長を越える、より好ましくは１５ヌクレオチド長を越える、及び最も好ましくは１９ヌクレオチド長を越えるものである。１９〜２５ヌクレオチド長の範囲が、ｓｉＲＮＡには最も好ましい大きさである。ｓｉＲＮＡはまた、ｓｉＲＮＡ二重鎖の両方のストランドが、単一のＲＮＡ分子の中に包含される、短いヘアピン（short hairpin）ＲＮＡｓを包含することもできる。ｓｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ（大きなｄｓＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組み換え技術により作られたＲＮＡの、特異的に切断された産物）、更に１つ又はそれ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、及び／又は改変によって、自然に生成したＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡ、の何れの形態も包含する。このような改変は、例えば、２１〜２３ｎｔＲＮＡの末端へ、又は（ＲＮＡの１つ又はそれ以上のヌクレオチドの）内部への非ヌクレオチド物質の付加を包含することができる。好ましい態様では、前記ＲＮＡ分子は、３’ヒドロキシル基を含有する。本発明のＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチド、又はデオキシリボヌクレオチドを包含する非標準的なヌクレオチドを含むこともできる。総体的に、全てのこのような改変ＲＮＡは、ＲＮＡの類縁体として表される。本発明のｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介在する能力を有している天然のＲＮＡに充分に類似していることだけが必要である。本発明のＲＮＡｉ薬剤は、又、小ヘアピン（small hairpin）ＲＮＡｓ（ｓｈＲＮＡ）、及びｓｈＲＮＡｓを発現するように遺伝子工学的に処理された発現構造を包含することもできる。ｓｈＲＮＡｓの転写は、ポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩＩ）プロモーターで開始され、４〜５−チミジン転写終結部位の位置２で終結すると考えられる。発現に際しては、ｓｈＲＮＡｓは、３’ＵＵ−突出とステムループ構造に折れ曲がっていると考えられ、次いで、これらｓｈＲＮＡｓの末端が処理されて、ｓｈＲＮＡｓが約２１〜２３ヌクレオチド長のｓｉＲＮＡ様の分子に変換される（Brummelkamp et al., Science 296:550-553(2002); Lee et al., (2002), supra; Miyagishi and Taira, Nature Biotechnol. 20:497-500(2002); Paddison et al., (2002), supra; Paul, (2002), supra; Sui, (2002), supra; Yu et al., (2002), supra）。
【０２１３】
ｓｉＲＮＡｓはまた、「単一ストランド小干渉ＲＮＡ分子」を含み、「単一ストランド小干渉ＲＮＡ分子」は「ｓｓ−ｓｉＲＮＡ分子」又は「ｓｓ−ｓｉＲＮＡ」である。ｓｓ−ｓｉＲＮＡは、相当する遺伝子標的を配列特異的に抑制する活性な単一ストランドｓｉＲＮＡ分子である。好ましくは、ｓｓ−ｓｉＲＮＡ分子は、約１０〜５０又はそれ以上のヌクレオチド長を有する。より好ましくは、ｓｓ−ｓｉＲＮＡ分子は、約１９〜２３のヌクレオチド長を有する。ｓｓ−ｓｉＲＮＡ分子を含む組成物に加えて、本発明のその他の態様は、前記ｓｓ−ｓｉＲＮＡ分子を製造する方法及び前記ｓｓ−ｓｉＲＮＡ分子を使用する方法（例えば、研究及び／又は治療方法）を包含する。
【０２１４】
本明細書で使用される「特異的にハイブリダイズする」又は「特異的に検出する」という用語は、サンプル核酸の少なくともおよそ６つの連続したヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子の能力を表している。
【０２１５】
「標的遺伝子」は、遺伝子の発現が選択的に阻害される又は「抑制される（silenced）」、例えば,ＶＥＧＦ経路の遺伝子である。このサイレンシング（抑制）は、細胞のＲＮＡｉシステムによって遺伝子工学的に処理されたＲＮＡ前駆体から創成されたｓｉＲＮＡにより、標的遺伝子のｍＲＮＡを切断することによって達成される。ＲＮＡ前駆体の二重鎖ステムの一部分又はセグメントは、標的遺伝子のｍＲＮＡの約１８〜約４０又はそれ以上のヌクレオチド長の切片に相補的である、例えば完全に相補的であるアンチセンスストランドである。
【０２１６】
本発明は、一般的に、ＶＥＧＦ経路メンバーの遺伝子及びそれらの産物を用いて、それらの発現を阻害することによる血管新生の治療及び管理に関する。本発明の一態様は、細胞を、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＬａｃＣｅｒシンターゼ、ＰＥＣＡＭ−１遺伝子の１つ又はそれ以上の合成又は発現を、阻害をもたらすのに充分な量で、阻害する化合物と接触させることを含む方法を指向している。理論によって限定されることなく、阻害は、ＶＥＧＦ経路メンバーのＤＮＡ又はｍＲＮＡを選択的に標的とすることを通して、即ち、遺伝子の複製、転写、接合又は翻訳における何れかの工程を妨げることによって、達成される。ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＬａｃＣｅｒシンターゼ、ＰＥＣＡＭ−１の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号、ＡＦ３８６６３（ＧａｌＴ−Ｖ）、ＡＦ３８６６４（ＧａｌＴ−ＶＩ）、ＮＭ＿００８８１６、ＮＭ＿０００４４２、（ＰＥＣＡＭ１）、ＮＭ＿０７７４３５、ＮＭ＿００１０２５３７０、ＮＭ＿００１０２５３６９、ＮＭ＿００１０２５３６８、ＮＭ＿００１０２５３６７、ＮＭ＿００３３７６、ＮＭ＿００１０２５３６６、（ＶＥＧＦ）、Ｘ９４２６３、ＸＭ＿４９７９２１、ＡＢ０６５３７２、ＡＪ３１９９０８、Ｄ６４０１６、ＮＭ＿００２０１９、（ＶＥＧＦＲ）及びＮＭ＿０００３００、ＢＣ００５９１９、（ＰＬＡ２）で開示されており、これらの全ては、参照することにより本明細書に取り入れられている。
【０２１７】
ＲＮＡｉは著しく効率的な方法であって、これにより２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、動物及び植物細胞において相同ｍＲＮＡの配列特異的な分解を誘導する（Hutvagner and Zamore (2002), Curr. Opin. Genet. Dev., 12, 225-232; Sharp (2001), Genes Dev., 15, 485-490）。哺乳類細胞において、ＲＮＡｉは、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の２１−ヌクレオチド（ｎｔ）二本鎖によって引き起こすことができ（Chiu et al. (2002), Mol. Cell., 10, 549-561; Elbashir et al. (2001), Nature, 411, 494-498）、又は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを有するＤＮＡ鋳型を使用してインビボで発現する、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、機能性小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、又はその他のｄｓＲＮＡによって引き起こすことができる（Zeng et al. (2002), Mol. Cell. 9, 1327-1333; Paddison et al. (2002), Genes Dev., 16, 948-958; Lee et al. (2002), Nature Biotechnol., 20, 500-505; Paul et al. (2002), Nature Biotechnol., 20, 505-508; Tuschl, T. (2002), Nature Biotechnol., 20, 440-448; Yu et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(9), 6047-6052; McManus et al. (2002), RNA, 8, 842-850; Sui et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(6), 5515-5520）。
【０２１８】
本発明は、「小干渉ＲＮＡ分子」（「ｓｉＲＮＡ分子」又は「ｓｉＲＮＡ」）、そのｓｉＲＮＡ分子を製造する方法、及びそのｓｉＲＮＡ分子を使用する方法（例えば、研究及び／又は治療方法）を特色とする。本発明のｓｉＲＮＡ分子は、センス・ストランド及び相補的アンチセンス・ストランドからなる二本鎖であり、アンチセンス・ストランドはＲＮＡｉを介在する標的ｍＲＮＡに充分に相補性を有している。好ましくは、ストランドがアニールされるときに、１、２又は３残基のオーバーハングが、二重鎖の一方又は両方の端に起こるようには配列が整列しない（即ち、対立のストランドに相補塩基が生じない）ストランドの末端に少なくとも１、２又は３塩基があるように、ストランドが整列する。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は、約１０〜５０又はそれ以上のヌクレオチド長を有しており、即ち、各々のストランドは１０〜５０ヌクレオチド長（又はヌクレオチド類縁体）を含んでいる。より好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は、約１６〜３０、例えば、各々のストランドは１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチド長を有するものであって、それらのストランドの１つは、例えば、少なくとも８０％（又はそれ以上、例えば、８５％、９０％、９５％又は１００％）相補的であり、例えば、３、２、１又は０個のミスマッチヌクレオチドを有しており、その標的領域は、野生型と変異対立遺伝子の間で、少なくとも１塩基対だけ異なっているような標的領域であり、例えば機能獲得変異を含む標的領域に実質的に相補的であり、そしてその他のストランドは、第一のストランド、小干渉ＲＮＡ分子に同一又は実質的に同一である。
【０２１９】
一態様において、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＬａｃＣｅｒシンターゼ、ＰＥＣＡＭ−１の１つ又はそれ以上の発現は、ＲＮＡｉとして示されるＲＮＡ干渉技術の使用によって阻害される。ＲＮＡｉは、非常に効率的で特異的な様式で標的遺伝子の発現の選択的ノックダウンを可能とする。この技術は、細胞に、標的遺伝子のエキソン部分に相当する配列を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を導入することを含む。ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子のｍＲＮＡの急速な分解を引き起こす。例えば、「Hammond et al., Nature Rev Gen 2: 110-119 (2001)；Sharp, Genes Dev 15: 485-490 (2001)」を参照されたい。両文献は、参照することによってその全文が本明細書に取り入れられている。
【０２２０】
ＲＮＡｉ技術の成功した利用法及び手順は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、「Waterhouse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(23): 13959-13964 (1998)」に記載されている。本発明のｓｉＲＮＡｓは、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＬａｃＣｅｒシンターゼ、ＰＥＣＡＭ−１ｍＲＮＡの１つ又はそれ以上の、選択的分解を調節することができる。
【０２２１】
本発明のｓｉＲＮＡは、「二本鎖小干渉ＲＮＡ分子」（「ｄｓ−ｓｉＲＮＡ」）及び「単一ストランド小干渉ＲＮＡ分子」（「ｓｓ−ｓｉＲＮＡ」）、ｓｉＲＮＡ分子を製造する方法、及びｓｉＲＮＡ分子を使用する方法（例えば、研究及び／又は治療方法）を包含する。
【０２２２】
ｄｓ−ｓｉＲＮＡ分子と同様に、ｓｓ−ｓｉＲＮＡ分子は、約１０〜５０又はそれ以上のヌクレオチド長を有する。より好ましくは、ｓｓ−ｓｉＲＮＡ分子は、約１５〜４５又はそれ以上のヌクレオチド長を有する。更により好ましくは、ｓｓ−ｓｉＲＮＡ分子は、約１９〜４０又はそれ以上のヌクレオチド長を有する。本発明のｓｓ−ｓｉＲＮＡ分子は、本明細書において定義されるように、標的特異的ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を指示する標的ｍＲＮＡ配列に「充分に相補的」である配列を更に有し、即ち、ｓｓ−ｓｉＲＮＡはＲＮＡｉ機構又はプロセスによって、標的ｍＲＮＡの分解を引き起こすのに充分な配列を有している。ｓｓ−ｓｉＲＮＡ分子は、全ての残基が標的分子の残基に相補的であるように、設計することができる。一方、分子内において、その分子の安定性を増し、及び／又は処理活性を増強するように置換することができる。置換は、鎖内に行うことができ、又は、鎖の末端の残基に行うことができる。５’−末端は、最も好ましくは、リン酸化される（即ち、リン酸、二リン酸又は三リン酸基を含む）。活性薬剤がｓｓ−ｓｉＲＮＡ分子の場合、３’ヒドロキシルである必要はないので、ｓｉＲＮＡの３’末端は、ＲＮＡｉを容易にするためにヒドロキシル基であってもよい。特徴付けられるのは、３’末端（即ち、３’糖のＣ３）がヒドロキシル基を欠いているｓｓ−ｓｉＲＮＡ分子（即ち、３’糖（例えば、リボース又はデオキシリボース）に３’ヒドロキシル又はＣ３ヒドロキシルを欠いているｓｓ−ｓｉＲＮＡ分子）である。
【０２２３】
本発明のｓｉＲＮＡは、それらの糖−リン酸骨格又はヌクレオシドへの修飾を包含する。これらの修飾は、ある種の細胞におけるｓｉＲＮＡによって起こされると報告されている一般的パニック反応を避けながら、選択的遺伝子阻害を促進するように調整することができる。更に、修飾は、１つ又はそれ以上の内因性酵素の作用からｓｉＲＮＡを保護するために、塩基に導入することができる。
【０２２４】
本発明のｓｉＲＮＡは、酵素的に生産することができ、又は全部若しくは部分的に合成することができる。更に、本発明のｓｉＲＮＡは、インビボ又はインビトロで合成することができる。生物学的に合成されるｓｉＲＮＡには、内因性又はクローン化された外因性ＲＮＡポリメラーゼをインビボで転写するために使用してもよいし、クローン化ＲＮＡポリメラーゼをインビトロで使用することもできる。化学的又は酵素的に合成されたｓｉＲＮＡは、好ましくは、細胞に導入される前に精製される。
【０２２５】
ｓｉＲＮＡと標的領域の間には１００％の配列相同性があることが好ましいが、本発明を実施するには必要とされない。配列中にある程度の修飾を含有するｓｉＲＮＡ分子も、本発明の目的に充分に使用することができる。このような修飾は、自然に生じたものであれ、意図的に導入されたものであれ、変異、欠失又は挿入を包含するが、これらに限定されるものではない。ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＬａｃＣｅｒシンターゼ、ＰＥＣＡＭ−１の１つ又はそれ以上の発現を阻害するために使用することができるｓｉＲＮＡの特異的な例は、実施例７に詳細に記載されている。
【０２２６】
ｓｉＲＮＡによって誘導される標的ＲＮＡの切断反応は、高度に配列特異的である。一般的に、標的遺伝子の部分と一致しているヌクレオチド配列を含有するｓｉＲＮＡは、阻害するために好ましい。しかしながら、ｓｉＲＮＡと標的遺伝子の間での１００％の配列相同性は、本発明を実施するためには必要ではない。従って、本発明は、遺伝変種、菌株多形性、又は進化的分岐により予期される配列変異に耐えることができる利点を有している。例えば、標的配列に対して、挿入、欠失、及び単一点突然変異を有するｓｉＲＮＡ配列もまた、阻害に有効であることが見出されている。或いは、ヌクレオチド類縁体置換又は挿入を有するｓｉＲＮＡ配列は、阻害に有効である。
【０２２７】
更に、ｓｉＲＮＡ分子の全ての部分が標的認識に等しく寄与するものでもない。ｓｉＲＮＡの中心のミスマッチは、最も重大であり、標的ＲＮＡ切断を本質的に止めることになる。対照的に、ｓｉＲＮＡの３’ヌクレオチドは、標的認識の特異性に顕著には寄与しない。特に、標的ＲＮＡに相補的であるｓｉＲＮＡ配列の残基３’（例えば、ガイド配列）は、標的ＲＮＡ切断に重大な意味を持たない。
【０２２８】
配列相同性は、当該技術分野で公知の配列比較及び整列アルゴリズムによって決定することができる。２つの核酸配列（又は２つのアミノ酸配列）の同一割合を決定するために、配列が、最適比較の目的のために整列される（例えば、最適整列のために第一配列又は第二配列にギャップを導入することができる）。次いで、相当するヌクレオチド（又はアミノ酸）の位置にあるヌクレオチド（又はアミノ酸残基）を比較する。第一配列中の位置が、第二配列中の相当する位置に同じ残基によって占拠されている場合、分子はその位置において同一である。２つの配列間の相同性の割合は、それらの配列に共通する同一の位置の数の関数（即ち、相同性の割合（％ホモロジー）＝同一位置の数／位置の総数×１００）であり、場合によって、導入されたギャップの数及び／又は導入されたギャップの長さに対するスコアにはペナルティが科される。
【０２２９】
２つの配列の間の配列の比較及び相同性の割合の決定は、数学アルゴリズムを用いて得ることができる。一態様において、アラインメントは、充分に相同性をもって並んでいる配列のある特定の部分には生じていたが、相同性が低レベルである部分（即ち、部分的に一致した配列）には、生じなかった。配列の比較に利用される部分的な整列アルゴリズムの、好ましい、非限定的な例としては、「Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68」のアルゴリズムであり、「Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77」において改良されたアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、「Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10」のＢＬＡＳＴプログラム（Ｖｅｒ．２．０）に取り入れられている。
【０２３０】
別の態様において、アラインメントは、好適なギャップを導入することによって最適化され、相同性の割合は整列した配列の長さ（即ち、ギャップのある一致した配列）で決定される。比較の目的のためにギャップのある一致した配列を得るために、「Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402」に記載されているように、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。別の態様において、アラインメントは、好適なギャップを導入することによって最適化され、相同性の割合は、整列した配列の完全な長さ（即ち、広範囲の配列）で決定される。配列の広範囲の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい、非限定的な例としては、「Myers and Miller, CABIOS (1989)」のアルゴリズムがある。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウエアパッケージの一部である、ＡＬＩＧＮプログラム（Ｖｅｒ．２．０）に取り入れられている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０ウエイト残差表、ギャップ長さペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用することができる。
【０２３１】
ｓｉＲＮＡと標的遺伝子の部分との間の配列相同性は、９０％より大きい、例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相同である配列が好ましい。他方、ｓｓ−ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子転写産物の一部とハイブリダイズすることができる（例えば、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃又は７０℃、１２〜１６時間のハイブリダイゼーション、次いで洗浄する）、ヌクレオチド配列（又は、オリゴヌクレオチド配列）として、機能的に定義することができる。付加的な好ましいハイブリダイゼーション条件は、以下の条件を包含する：１ＸＳＳＣ中７０℃で、又は１ＸＳＳＣ、５０％ホルムアミド中５０℃でハイブリダイゼーションし、次いで０．３ＸＳＳＣ中７０℃で洗浄する、又は４ＸＳＳＣ中７０℃で、又は４ＸＳＳＣ、５０％ホルムアミド中５０℃でハイブリダイゼーションし、次いで１ＸＳＳＣ中６７℃で洗浄する。長さが５０塩基対未満であると予想されるハイブリッドのためのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの溶融温度（Ｔｍ）未満の５〜１０℃であるべきであり、ここで、Ｔｍは、以下の式により決定される。長さが１８塩基対未満のハイブリッド用には：Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数（＃））＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数（＃））である。長さが１８〜４９塩基対のハイブリッド用には：Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４（Ｇ＋Ｃの割合（％））−（６００／Ｎ）であり、ここにおけるＮは、ハイブリッド中の塩基数であり、そして［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーションバッファー中のナトリウムイオンの濃度（１ＸＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）である。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションの厳密な条件の追加の実施例は、「Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. chapters 9 and 11」、及び「Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F.M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., section 2.10 and 6.3-6.4」に提供されており、これらは、参照することにより本明細書に取り入れられている。同一のヌクレオチド配列の長さは、少なくとも、約１０、１２、１５、１７、２０、２２、２５、２７、３０、３２、３５、３７、４０、４２、４５、４７又は５０塩基であろう。
【０２３２】
好ましい態様において、本発明のＲＮＡ分子は、血清中又は細胞培養の増殖培地中で安定性が改善されるよう修飾される。安定性を高めるために、３’−残基が分解に対して安定化され、例えば、プリンヌクレオチド、特にアデノシン又はグアノシンヌクレオチドから成るように選択され得る。他方、修飾された類縁体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば、２’−デオキシチミジンによるウリジンの置換は、耐性があり、ＲＮＡ干渉の効率に影響しない。例えば、２’ヒドロキシルがないと、組織培養培地でのｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ抵抗性を著しく向上させることができる。
【０２３３】
本発明の一態様において、ＲＮＡ分子は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド類縁体を含有してもよい。ヌクレオチド類縁体は、標的特異性活性、例えば、ＲＮＡｉ介在の活性が、例えば、ＲＮＡ分子の５’−末端及び／又は３’−末端の領域において実質的に影響されないような所に位置していてもよい。特に、末端は、修飾されたヌクレオチド類縁体によって安定化することができる。
【０２３４】
好ましいヌクレオチド類縁体は、糖及び／又は骨格が修飾されたリボヌクレオチドを包含する（即ち、リン酸−糖骨格の修飾を包含する）。例えば、天然のＲＮＡのホスホジエステル結合は、少なくとも１つの窒素又はイオウのヘテロ原子を含有するように修飾してもよい。好ましい骨格が修飾されたリボヌクレオチドにおいて、隣接するリボヌクレオチドに結合するホスホエステル基は、例えば、ホスホチオエート基の修飾基によって置換される。好ましい糖修飾リボヌクレオチドにおいて、２’ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２又はＯＮから選択される基によって置換され、ここでのＲは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、アルケニル又はアルキニルであり、そしてハロは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩである。
【０２３５】
核酸塩基修飾リボヌクレオチド、即ち、天然に存在する核酸塩基の代わりに少なくとも１つの天然に存在しない核酸塩基を含有するリボヌクレオチドもまた、好ましい。塩基は、アデノシンデアミナーゼの活性を遮断するように修飾してもよい。修飾された核酸塩基の例としては、これらに限定されないが、５’位がウリジン及び／又はシチジンで修飾された、例えば、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン；８位がアデノシン及び／又はグアノシンで修飾された、例えば、８−ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば、７−デアザ−アデノシン；Ｏ−及びＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えば、Ｎ６−メチルアデノシンが含まれる。上記の修飾は、組み合わせることができるのは注目すべきである。
【０２３６】
本発明の核酸組成物は、本明細書に記載するようなｓｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ誘導体の両方を包含する。例えば、組成物の薬物動態を変更するのに、例えば、身体中における半減期を増加させるために、架橋することを用いることができる。従って、本発明は、２つのストランドが架橋するように、核酸の２つの相補のストランドを有するｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ誘導体を包含する。本発明はまた、３’末端（例えば、ペプチド）、有機組成物（例えば、染料）等に結合した非核酸部分を有するｓｉＲＮＡ誘導体を包含する。このようなｓｉＲＮＡ誘導体の修飾は、対応するｓｉＲＮＡに比べて、得られたｓｉＲＮＡ誘導体の細胞取り込みを改善し、又は細胞標的活性を増強することができ、対応するｓｉＲＮＡに比べて、細胞においてｓｉＲＮＡ誘導体を追跡するのに有用であり、又はｓｉＲＮＡ誘導体の細胞取り込みの安定性を改善する。
【０２３７】
本明細書にあげられた全ての文献は、その全文が、参照することによって本明細書に取り込まれている。
（実施例）
【０２３８】
本発明は、これにより限定されるものではない、以下の実施例により更に説明される。
【実施例１】
【０２３９】
試薬
材料及び方法は、ｈｔｔｐ：／／ｃｉｒｃｒｅｓ．ａｈａｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇにおいて広範囲に入手可能なオンラインデータに見出すことができる。
【０２４０】
細胞培養
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）及び内皮細胞増殖培地ＥＧＭ（登録商標）は、Ｃａｍｂｒｅｘ（Walkersville, MD）から購入し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＥＧＭ（登録商標）培地中で培養した。内因性ＰＥＣＡＭ−１発現を欠失したヒト中内皮腫細胞株［ＲＥＮ野生型（ＷＴ）］及びヒトＰＥＣＡＭ−１を発現するＲＥＮ（ｍｔ−ｒｈＰＥＣＡＭ−１）は、「Dr. Steven Albelda, University of Pennsylvania Medical Center, USA」により提供された。ＲＥＮ−ＷＴを、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０で増殖させた。ＲＥＮ（ｍｔｒｈＰＥＣＡＭ−１）を、Ｇ４１８（０．５ｇ／Ｌ、Gibco）を含む同じ培地で培養した。
【０２４１】
ＬａｃＣｅｒシンターゼの測定
指示された時間間隔で、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、脂質を抽出し、ＨＰＴＬＣによるグリコスフィンゴリピドの測定を、前に記載したように実施した１９。
【０２４２】
ＬａｃＣｅｒシンターゼ活性の測定
ＶＥＧＦとインキュベーションした細胞におけるＬａｃＣｅｒシンターゼの活性は、前に記載されたように、ヌクレオチド糖供与体としてのＵＤＰ−［１４Ｃ］ガラクトース及び受容体としてのグルコシルセラミドを採用して測定した１９。
【０２４３】
ＬａｃＣｅｒシンターゼ（ＧａｌＴ−ＶｓｉＲＮＡ）合成及びトランスフェクション
（Ｎ１９）ＴＴ規則によるヒトＧａｌＴ−ＶｃＤＮＡ（GeneBank受入番号第ＡＦ０３８６６３号）のｓｉＲＮＡ配列は、それぞれ、５’−ＣＧＧＡＧＵＧＡＧＵＧＧＣＵＵＡＡＣＡｄＴｄＴ−３’（センス）、５’−ＵＧＵＵＡＡＧＣＣＡＣＵＣＡＣＵＣＣＧｄＴｄＴ−３’（アンチセンス）であった。使用したスクランブル（陰性対照）ｓｉＲＮＡは、それぞれ、５’−ＡＵＧＧＵＧＡＵＵＡＧＡＣＵＧＵＡＣＣｄＴｄＴ−３’（センス）、５’−ＡＡＧＣＧＵＡＣＵＡＧＧＡＵＧＡＧＵＡｄＴｄＴ−３’（アンチセンス）であった。ＨＵＶＥＣｓは、製造者によって提供されるプロトコールに従って、オリゴフェクタミン（Invitrogen）を使用して、ｓｉＲＮＡ二重鎖でトランスフェクションした。
【０２４４】
リアルタイム逆転写酵素ＰＣＲ
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍで実施した。プライマー対を設計し（Primer Quest-Integrated DNA technologies）、そして１ｓｔＢＡＳＥ（Singapore）から合成した。ＰＥＣＡＭ−１のプライマー配列は、それぞれ、（フォーワード）５’ＴＧＡＣＣＣＴＴＣＴＧＣＴＣＴＧＴＴ３’及び（リバース）５’ＴＧＡＧＡＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＣＡＴＣ３’である。β−アクチンプライマーは、それぞれ、（フォーワード）５’ＡＧＧＴＣＡＴＣＡＣＴＡＴＴＧＧＣＡＡＣＧＡ３’及び（リバース）５’ＣＡＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＧＡＡＴＴＧＡＡＴＧＴＡＧＴＴ３’であった。温度サイクリング条件は以下の通りであった：９４℃で１０分の初期変性、次いで、それぞれ、９４℃／３０秒、６０℃／４０秒及び７２℃／１分での４０サイクルの増幅、そして最終伸長は、７２℃で１０分間実施した。
【０２４５】
ウエスタン免疫ブロット分析
タンパク質２５ｇを１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに溶解し、ニトロセルロース膜に移した。膜結合の１次抗体を西洋わさびペルオキシダーゼにより可視化し、２次抗体を化学発光キットを使用して結合した。フィルムを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｃａｎｎｅｒを使用して密度測定的にスキャニングし、Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔソフトウエアを使用して解析した。
【０２４６】
インビトロ血管新生／チューブ形成アッセイ
インビトロ血管新生アッセイは、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｃ． (Temecula, CA)から市販されているキットを用いて実施した。
【０２４７】
統計解析
全てのアッセイは、２回又は３回行い、値は、平均値±Ｓ．Ｄ．で表した。スチューデントのＴ検定を、データの統計的有意差を評価するのに使用した。Ｐ＜０．０５を有意とした。
【実施例２】
【０２４８】
ＶＥＧＦのＰＥＣＡＭ−１ｍＲＮＡ及びタンパク質発現の誘導
ＰＥＣＡＭ−１発現に対するＶＥＧＦの効果を、ＨＵＶＥＣｓを種々の濃度のＶＥＧＦ（５〜３０ｎｇ／ｍｌ）を用い、異なった時間間隔でインキュベーションすることによって定量した。ＰＥＣＡＭ−１ｍＲＮＡの発現の用量依存的な増加があった。ＰＥＣＡＭ−１の最大のｍＲＮＡの発現が、ＨＵＶＥＣｓをＶＥＧＦで処理（３０ｎｇ／ｍｌで４時間）した場合、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定して観察された（図１Ａ）。同様に、ＨＵＶＥＣｓをＶＥＧＦ２５ｎｇ／ｍｌで異なった時間処理した場合、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより明らかにされたように、最大のＰＥＣＡＭ−１ｍＲＮＡの発現が、４〜５時間で観察され、その後減少した（図１Ｂ）。更に、ＰＥＣＡＭ−１タンパク質発現は、ＶＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）で４時間インキュベーションの後に最大であった（図１Ｃ）。ＨＵＶＥＣｓを、ＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）と種々の時間間隔でインキュベーションした場合、ＰＥＣＡＭ−１タンパク質の発現は４時間で最大であった（図１Ｄ）。
【実施例３】
【０２４９】
ＶＥＧＦのＬａｃＣｅｒ合成の促進及びこれのＤ−ＰＤＭＰによる阻害
図２Ａに示すように、ＨＵＶＥＣｓをＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）で処理すると、時間依存的様式でＬａｃＣｅｒのデノボ（de novo）生合成が、有意に促進され（図２Ａ、パネルＡの白四角形）、これはインキュベーション開始１０分後の早期に起こり、その後ＶＥＧＦ処理細胞でより高いまま継続した。著しく対照的に、２０μＭのＤ−ＰＤＭＰ［（グルコシルセラミドシンターゼの阻害剤；セラミドからグルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）の合成を遮断する）、及びＬａｃＣｅｒシンターゼの阻害剤］で、前処理したＨＵＶＥＣｓは、ＶＥＧＦ誘導のＬａｃＣｅｒ生合成を軽減した（図２Ａ、パネルＡの斜線四角形）。ＶＥＧＦは、又、インキュベーション１０分という早期に、ＧｌｃＣｅｒの生合成を促進し（図２Ａ、パネルＢの白四角形）、そしてＤ−ＰＤＭＰ前処理は、インキュベーション開始１０分後の早期にＶＥＧＦ誘導ＧｌｃＣｅｒ合成を阻害した（図２Ａ、パネルＢの斜線球）。他方、ＬａｃＣｅｒのα−ガラクトシル化の産物であり、ＶＥＧＦで処理された細胞で合成されるＧｂＯｓｅ３Ｃｅｒは、のレベルは、Ｄ−ＰＤＭＰの存在、不存在に関わらず同じようなレベルであった（データは示していない）。
【実施例４】
【０２５０】
ＶＥＧＦ誘導のＰＥＣＡＭ−１発現のＤ−ＰＤＭＰによる阻害及びＬａｃＣｅｒによる回復
Ｄ−ＰＤＭＰ（１０〜３０μＭ）でのＨＵＶＥＣｓの前処理は、ＶＥＧＦ誘導のＰＥＣＡＭ−１発現の濃度依存性の阻害を発揮した（図２Ｂ）。ＨＵＶＥＣｓをＤ−ＰＤＭＰ（２０μＭ）で９０分間前処理し、次いでＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）でインキュベーションすると、ＰＥＣＡＭ−１ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を無効にした。そして、これはＬａｃＣｅｒによって回避された（図２Ｃ、３Ｂ）。
【実施例５】
【０２５１】
ＬａｃＣｅｒのＰＥＣＡＭ−１発現及び血管新生でのＤ−ＰＤＭＰの阻害効果の特異的回復
ＨＵＶＥＣｓをＧｌｃＣｅｒ、ＤＧＤＧ又はＣ２セラミド（各々、２．５μＭ）と４時間インキュベートした場合、ＨＵＶＥＣｓはＰＥＣＡＭ−１発現を誘導しなかった（図３Ａ）。更に、ＨＵＶＥＣｓをＤ−ＰＤＭＰで処理し、次いでＧｌｃＣｅｒ、ＤＧＤＧ又はＣ２セラミドとインキュベーションすると、ＶＥＧＦ誘導のＰＥＣＡＭ−１発現（図３Ｂ）及び血管新生（図３Ｃ、パネルｅ、ｆ及び図３Ｄ）に対するＤ−ＰＤＭＰの阻害効果を回避することができなかった。対照的に、ＬａｃＣｅｒは、Ｄ−ＰＤＭＰ及びＶＥＧＦの存在／不存在とは無関係にＰＥＣＡＭ−１発現及び血管新生を有意に誘導した（図３Ｂ、Ｃのパネルｂ及び図３Ｄ）。これらの観察は、ＶＥＧＦ誘導のＰＥＣＡＭ−１発現及び血管新生は、強く関連しており、ＬａｃＣｅｒによって調節されることを示唆する。
【実施例６】
【０２５２】
ＰＰＭＰのＶＥＧＦ誘導のＰＥＣＡＭ−１発現及び血管新生の阻害及びＬａｃＣｅｒによるその回避
グルコシルセラミド・シンターゼの特異的阻害剤である、ＰＰＭＰ（２０μＭ）でＨＵＶＥＣｓを前処理すると、ＶＥＧＦ誘導のＰＥＣＡＭ−１発現及び血管新生が軽減される結果となる（図４Ａ、Ｂ）ことが見出された。ＬａｃＣｅｒは、ＶＥＧＦ誘導のＰＥＣＡＭ−１発現及び血管新生に対するＰＰＭＰの阻害効果を逆転させた（図４Ａ、Ｂ）。ＧｌｃＣｅｒはまた、ＰＥＣＡＭ−１発現及び血管新生に関するＰＰＭＰの阻害効果を逆転させた（図４Ａ、Ｂ）が、ＬａｃＣｅｒに比較するとより少ない程度であった。それ故、これらの結果は、ＬａｃＣｅｒシンターゼのＶＥＧＦ標的は、ＨＵＶＥＣｓにおけるＰＥＣＡＭ−１発現及び血管新生において決定的に重要な意味があることを示唆している。
【実施例７】
【０２５３】
ＬａｃＣｅｒシンターゼ（ＧａｌＴ−Ｖ）遺伝子除去のＰＥＣＡＭ−１発現及び血管新生の軽減
ＬａｃＣｅｒが、ＶＥＧＦ誘導のＰＥＣＡＭ−１発現及び血管新生を介在するのに明確に必要とされるか否かを調べるために、本発明者らは、ヒトＧａｌＴ−Ｖを対象とするｓｉＲＮＡ二重鎖を用いて、ＧａｌＴ−Ｖ遺伝子発現を抑制させた。ＧａｌＴ−Ｖを過剰発現しているＨＵＶＥＣｓ及び変異ＣＨＯ細胞株の２つの別々の調製物から調製した細胞溶解物を用いたウエスタン免疫ブロット法から、ウサギポリクローナルＧａｌＴ−Ｖ抗体（ＩｇＧ）が、見かけの分子量約５５ＫＤａを有するＧａｌＴ−Ｖと特異的に反応することが明らかになった（図５Ａ）。更に、ＧａｌＴ−Ｖ特有のｓｉＲＮＡ二重鎖（１００ｎＭ）のトランスフェクションは、ＨＵＶＥＣｓにおけるタンパク質発現を著しく減少させた（約７０％ＧａｌＴ−Ｖ）（図５Ｂ）。更に、これらの細胞におけるＧａｌＴ−Ｖ酵素の活性は、又、スクランブルｓｉＲＮＡ処理細胞と比較した場合、約６２％減少した（図５Ｃ）。更に、ＧａｌＴ−Ｖの発現が抑制されたＨＵＶＥＣｓ（GalT-V silenced HUVECs）におけるＶＥＧＦのＰＥＣＡＭ−１発現、及び血管新生に対する効果を調べた。スクランブルｓｉＲＮＡトランスフェクションの細胞（図６Ｂ、パネルＢ）と比較した場合、ＶＥＧＦで処理したＬａｃＣｅｒシンターゼ（ＧａｌＴ−Ｖ）抑制細胞で、ＰＥＣＡＭ−１発現（図６Ａ）及び鈍化した血管新生（図６Ｂ、パネルＤ及び図６Ｃ）において、変化が見られなかった。これらの結果は、ＬａｃＣｅｒは、ＨＵＶＥＣｓにおけるＶＥＧＦ誘導ＰＥＣＡＭ−１発現及び血管新生を介在することの証拠を提供している。
【実施例８】
【０２５４】
ＰＥＣＡＭ−１のＶＥＧＦ／ＬａｃＣｅｒ誘導の血管新生での必要性
ＰＥＣＡＭ−１が、ＶＥＧＦ／ＬａｃＣｅｒ誘導血管新生に絶対的に必要とされるかどうかを調べるために、は、ＰＥＣＡＭ−１モノクローナル抗体でＨＵＶＥＣｓを前処理し、次いで、ＶＥＧＦ又はＬａｃＣｅｒでインキュベーションした。マウスのＩｇＧ前処理細胞ではないＰＥＣＡＭ−１ｍＡｂ（モノクローナル抗体）において、ＶＥＧＦ／ＬａｃＣｅｒ後処理は、血管新生を顕著には誘導しなかった（図７Ａ、パネルｅ、ｆ及びｇ）。更に、ＰＥＣＡＭ−１が、ＶＥＧＦ／ＬａｃＣｅｒ血管新生に極めて重要であるかどうかを理解するため、本発明者らは、表現型の上では内皮細胞に似ているが、しかし内因性ＰＥＣＡＭ−１発現を欠いているＲＥＮ（ＷＴ）細胞において実験を実施した。他方、２．５ｋｂ完全なヒトＰＥＣＡＭ−１ｃＤＮＡを、ＰＥＣＡＭの構成的発現のためにＣＭＶプロモーターの下で、哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Invitrogen）にクローン化し、ＲＥＮＷＴにトランスフェクションし、前記２７したようにＲＥＮ（ｍｔ−ｒｈＰＥＣＡＭ−１）を作成した。ＲＥＮ（ＷＴ）細胞においては、ＶＥＧＦ／ＬａｃＣｅｒは、２％のＦＢＳ処理細胞（図８Ａ）と比較した場合、インビトロでの血管新生アッセイ（図８Ｂ、Ｃ）でチューブ様構造を形成することができなかった。他方、ヒトＰＥＣＡＭ−１遺伝子でトランスフェクションしたＲＥＮ細胞において、ＶＥＧＦ／ＬａｃＣｅｒは、対照（図８Ｄ）と比較した場合、インビトロでの血管新生アッセイでチューブ形成を誘導した（図８Ｅ、Ｆ）。従って、これらの実験の結果は、ＰＥＣＡＭ−１発現は、ＶＥＧＦ／ＬａｃＣｅｒ誘導の血管新生に必要であることを示している。更に、ＨＵＶＥＣｓをＶＥＧＦ受容体（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）の拮抗薬ＳＵ１４９８で前処理し、次いでＬａｃＣｅｒでなくＶＥＧＦでインキュベーションすると、チューブ形成／血管新生を誘導することができなかった。このことは、ＶＥＧＦが血管新生を導き出すために、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を必要とすることを示唆している（図７ｃ、ｄ及びｈ）。これらの観察は、ＬａｃＣｅｒが、ＨＵＶＥＣｓにおけるＰＥＣＡＭ−１発現及び血管新生を導く、ＶＥＧＦ誘導のシグナル伝達経路において、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の下流側に存在することを示唆している。
【実施例９】
【０２５５】
ＰＫＣ及びＰＬＡ２阻害剤のＬａｃＣｅｒ誘導の血管新生の軽減
ＰＫＣ阻害剤ＣＣ（５．０μＭ）、ＧＯ６８５０及び６９７６（５０ｎＭ）並びにＰＬＡ２阻害剤ＢＰＢ（１０μＭ）及びＭＡＦＰ（３．０μＭ）は、媒体（ＤＭＳＯ）のみで処理した細胞と比較した場合、ＶＥＧＦ／ＬａｃＣｅｒ誘導ＰＥＣＡＭ−１発現（図１Ａのオンラインデータ補充を参照されたい）及びチューブ形成（図１Ｂのオンラインデータ補充を参照されたい）を無効にした。このことは、ＬａｃＣｅｒが、ＰＫＣ及びＰＬＡ２を補充することによってＰＥＣＡＭ−１発現を誘導し、そしてこれらはＬａｃＣｅｒがＰＥＣＡＭ−１発現及び血管新生を誘導するために補充することができる下流のシグナル伝達の事象であることを示唆している。
【実施例１０】
【０２５６】
ＶＥＧＦ／ＬａｃＣｅｒのＮＦ−κＢ活性化を通してのＰＥＣＡＭ−１発現の誘導
ＮＡＣ、ＮＡＰＤＨオキシダーゼ阻害剤（ＤＰＩ）、又はＮＦ−κＢ阻害剤（ＰＤＴＣ）のような抗酸化剤で、ＨＵＶＥＣｓを前処理すると、ＶＥＧＦ／ＬａｃＣｅｒ誘導のＰＥＣＡＭ−１（図２Ａのオンラインデータ補充を参照）及び細胞質内ＮＦ−κＢ発現（図２Ａのオンラインデータ補充を参照されたい）を著しく鈍化させた。この結果は、ＶＥＧＦがＬａｃＣｅｒのデノボ合成を誘導し、代わりに外部から添加したＬａｃＣｅｒが、多分、ＰＥＣＡＭ−１発現を誘導するためにＮＦ−κＢを活性化することができるＮＡＤＰ（Ｈ）オキシダーゼを経由して、フリーラジカル生成を引き起こすことができることを示唆している１７−１９。
【実施例１１】
【０２５７】
Ｌ−ＰＤＭＰのＰＥＣＡＭ−１発現及び血管新生の活性化
Ｌ−ＰＤＭＰは、ＬａｃＣｅｒシンターゼの強力な活性化剤であることは以前から知られていた１７，３０。従って、ＰＥＣＡＭ−１発現及び血管新生に対してＬ−ＰＤＭＰの効果があることが確定されている。細胞をＬ−ＰＤＭＰの濃度を増加しつつ処理すると、ＰＥＣＡＭ−１発現（図３Ａのオンラインデータ補充を参照されたい）及び血管新生（図３Ｂのオンラインデータ補充を参照されたい）を有意に誘導した。これらの観察は、ＰＤＭＰの立体異性体が、ＬａｃＣｅｒシンターゼ、ＰＥＣＡＭ−１発現及び血管新生の上方及び下方の調節に関与していることを示している。
【０２５８】
ＶＥＧＦが血管新生を誘導するのにＬａｃＣｅｒを補充することができるメカニズムを確定するために、薬理学的及び分子的手法の両方をＬａｃＣｅｒ生合成の責任酵素を操作するのに採用した。ＶＥＧＦがＬａｃＣｅｒシンターゼ活性を誘導するので、先ず、本発明者らは、当初ＧｌｃＣｅｒシンターゼの阻害剤であること１３が示され、後に精製したＬａｃＣｅｒシンターゼで阻害剤であることが証明されたＤ−ＰＤＭＰを採用した３０，３３，３４。本発明者らの検討は、ＶＥＧＦがＬａｃＣｅｒ／ＧｌｃＣｅｒ合成を誘導し、ＰＥＣＡＭ−１遺伝子／タンパク質発現及び血管新生が、Ｄ−ＰＤＭＰによって用量依存性の様式で阻害される証拠を提供した。更に、この阻害効果は、ＬａｃＣｅｒによって回避されるが、ＧｌｃＣｅｒによっては回避されず、このことは、ＶＥＧＦが、血管新生を誘導するＬａｃＣｅｒシンターゼを標的とすることを示唆している。最近、Ｐａｎｎｕ３５は、神経細胞におけるＩＦＮ（インターフェロン）又はリポ多糖類（ＬＰＳ）処理もまた、ＬａｃＣｅｒを補充して誘導性の酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）を誘導し、マウスにおける脊髄損傷、ラットにおける星状細胞のＴＮＦ誘導増殖及び脊髄損傷における星膠症を促進することを実証した。これらの事象は、Ｄ−ＰＤＭＰ及びアンチセンスが介在したＬａｃＣｅｒシンターゼ（ＧａｌＴ−２）サイレンシングによって無効にされた３６。
【０２５９】
これまでに、Ｄ−ＰＤＭＰはまた、神経突起伸長を軽減し、破骨細胞形成３７，３８及び大動脈平滑筋細胞増殖１５を改善することが示されている。Ｄ−ＰＤＭＰは、セラミドの細胞レベルを上げることによってアポトーシスを誘導することができるが、上記検討において３７，３８及び本発明の検討において、Ｄ−ＰＤＭＰ（２０μＭ）で４〜６時間までは、ＨＵＶＥＣｓにおいてアポトーシスを誘導しなかった（データは示していない）。総体的には、Ｄ−ＰＤＭＰは、インビボ及びインビトロでの多様な表現型の変化におけるＬａｃＣｅｒシンターゼ／ＬａｃＣｅｒの役割を詳細に調べるために広く使用されている。対照的に、ＬａｃＣｅｒシンターゼの活性を促進する立体異性体Ｌ−ＰＤＭＰ３０は、本発明者らの検討においてＰＥＣＡＭ−１発現及び血管新生を促進した。従って、ＰＤＭＰの立体異性体は、ＬａｃＣｅｒシンターゼを標的とするので、以前の検討の細胞増殖１５−２２及び血管新生／チューブ形成のような表現型変化を変更することができる。
【０２６０】
ＶＥＧＦ作用の標的はＬａｃＣｅｒシンターゼであってＧｌｃＣｅｒシンターゼでないことを、更に確定するため、本発明者らは、ＧｌｃＣｅｒシンターゼの特異的阻害剤であるＰＰＭＰを使用した。再度、ＰＰＭＰ様、Ｄ−ＰＤＭＰはまた、ＶＥＧＦ誘導のＰＥＣＡＭ−１発現及び血管新生を軽減し、これはＬａｃＣｅｒによって回避された。本発明者らの検討において、ＰＥＣＡＭ−１発現及び血管新生を誘導するＶＥＧＦにおけるＬａｃＣｅｒシンターゼ／ＬａｃＣｅｒの役割を究明するための、より直接的方法は、ｓｉＲＮＡ介在の遺伝子除去を採用することであった。ＬａｃＣｅｒシンターゼ／ＧａｌＴ−Ｖ発現をＨＵＶＥＣｓで抑制し、次いでＶＥＧＦ誘導のＰＥＣＡＭ−１タンパク質発現及び血管新生に対するその効果を比較した。図６Ａ、Ｂに纏めた結果は、ＨＵＶＥＣｓにおけるＬａｃＣｅｒシンターゼ（ＧａｌＴ−Ｖ）ｓｉＲＮＡサイレンシングは、ＧａｌＴ−Ｖ遺伝子／タンパク質除去の約７０％減少に寄与し、ＶＥＧＦ誘導のＰＥＣＡＭ−１発現及び血管新生を軽減することを示している。ＨＵＶＥＣｓはまた、ＧａｌＴ−Ｖに加えて別のＬａｃＣｅｒシンターゼである、ＧａｌＴ−ＶＩも有していることが観察された。しかしながら、ノーザンブロットアッセイに基づくと、ＧａｌＴ−Ｖは、ＨＵＶＥＣｓにおける総ＬａｃＣｅｒシンターゼの約９０％を構成している（データは示していない）。
【０２６１】
本発明者らの本検討において、（ＰＥＣＡＭ−１を欠いている）ＲＥＮ細胞は、ＶＥＧＦ／ＬａｃＣｅｒ誘導の血管新生に反応しなかった。対照的に、ＰＥＣＡＭ−１に対して全長ｃＤＮＡを発現するＲＥＮ細胞のＶＥＧＦ／ＬａｃＣｅｒ処理は、血管新生のインビトロでのアッセイにおいて、ＰＥＣＡＭ−１発現及びチューブ様構造の形成に関して強く応答した（図８）。ＨＵＶＥＣｓでＰＥＣＡＭ−１抗体の使用は、血管新生を軽減したことも観察された１０，１１。従って、ＬａｃＣｅｒシンターゼの薬理学的及び／又は遺伝学的操作は、ＰＥＣＡＭ−１遺伝子／タンパク質発現及び血管新生に悪影響を与えた。
【０２６２】
ＰＫＣ／ＰＬＡ２の特異的阻害剤を使用して、本発明の検討において、ＶＥＧＦはＬａｃＣｅｒのデノボ合成を誘導し、次に、このＬａｃＣｅｒがＰＫＣ／ＰＬＡ２を補充して、ＨＵＶＥＣｓで血管新生／チューブ形成を誘導することが見出された。更に、本発明者らはまた、前単球細胞株（Ｕ−９３７）において、ＬａｃＣｅｒは細胞質内のＰＫＣα／εの細胞膜への転位を促進し、これは、それらタンパク質の活性化に起因すると考えられることを実証した２２。
【０２６３】
最近、腫瘍血管新生におけるスフィンゴシン（Sphinogoshine）−１−リン酸受容体−１の必要性がインビボＲＮＡ干渉を使用して実証された４１。本発明の検討は、血管新生が、重要な意味をもつ多面的事象であるから、細胞が、器官修復、増殖及び発生の要求を満たすため種々のスフィンゴリピドを補充することができるという方向を指摘している。本発明者らの本検討は、ＰＥＣＡＭ−１、ＬａｃＣｅｒシンターゼ阻害剤及び／又はＧａｌＴ−ＶｓｉＲＮＡに対する抗体の使用は、ＶＥＧＦ誘導血管新生を軽減することができ、そして抗血管新生療法における、かけがえのない薬剤として非常に役立つであろうことを示唆している。
【０２６４】
本発明は、その好ましい態様に関連して詳細に記載されている。しかしながら、本明細書での開示を考慮するならば、当業者には、以下の特許請求の範囲に説明されている本発明の精神及び範囲内での改変及び改良することができることは、理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２６５】
【図１−１】図１は、ＨＵＶＥＣｓにおいて、ＰＥＣＡＭ−１ｍＲＮＡ転写及びタンパク質発現に及ぼす、ＶＥＧＦの濃度及び時間依存性の作用の影響を示す。図１Ａは、細胞を異なる濃度のＶＥＧＦ（０〜３０ｎｇ／ｍＬ）で４時間処理した。ＶＥＧＦで処理した細胞から全ＲＮＡを抽出し、全ＲＮＡ量の等量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに使用した。等量のｃＤＮＡを確認するために、内部対照としてβ−アクチンを使用した。図１Ｂは、ＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）で異なる時間処理したＨＵＶＥＣｓ細胞において、ＰＥＣＡＭ−１の遺伝子発現の変化を正確に測定するために、定量的リアルタイムのＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した。示した図は、３回繰り返して同様の結果が出た実験の代表であり、棒グラフ中に示した数値は、平均値±ＳＤである。
【図１−２】図１は、ＨＵＶＥＣｓにおいて、ＰＥＣＡＭ−１ｍＲＮＡ転写及びタンパク質発現に及ぼす、ＶＥＧＦの濃度及び時間依存性の作用の影響を示す。図１Ｃは、種々の濃度のＶＥＧＦで４時間処理したＨＵＶＥＣｓ細胞において、ＰＥＣＡＭ−１のウェスタンブロット分析を示し、下のパネル図は、タンパク質発現の密度測定による定量を示す。図１Ｄは、ＰＥＣＡＭ−１発現でのＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）の経時変化を測定するために、ＰＥＣＡＭ−１のウェスタンブロット分析を示し、下のパネル図は、タンパク質発現の密度測定による定量を示す。示した図は、３回繰り返して同様の結果が出た実験の代表であり、棒グラフ中に示した数値は、平均値±ＳＤである。
【図２−１】図２は、ＨＵＶＥＣｓ細胞において、ＶＥＧＦの活性化並びにＤ−ＰＤＭＰのＬａｃＣｅｒ／ＧｌｃＣｅｒ生合成及びＰＥＣＡＭ−１発現の阻害を示す。  図２Ａは、細胞を、［１４Ｃ］パルミチン酸塩（１μＣｉ／ｍＬ）で３７℃にて２４時間代謝的に標識した。次いで、細胞を洗浄し、Ｄ−ＰＤＭＰ（２０μＭ）の存在及び非存在下で、６０分間インキュベートした。次に、ＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）を添加して、３７℃でインキュベーションを継続した。表示した時間間隔で、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、脂質を抽出し、そして材料と材料の項に記載したように、ＬａｃＣｅｒ含量を測定した。ＬａｃＣｅｒ量（パネルＡ）及びＧｃｌＣｅｒ量（パネルＢ）の対照（ＤＭＳＯ；媒体処理細胞）の値は、それぞれ２１．７６ｎｍｏｌ／（ｍｇ・タンパク質）及び９．７７ｎｍｏｌ／（ｍｇ・タンパク質）であった。表示した各々の点は、２通りの、３回の別の実験の平均値±ＳＤである。白四角形（□）は、表示した時間間隔でのＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）処理した細胞を示し、黒四角形（■）は、Ｄ−ＰＤＭＰ（２０μＭ）での前処理に続いて、ＶＥＧＦとインキュベートした細胞を示す。
【図２−２】図２Ｂは、種々の濃度のＤ−ＰＤＭＰで９０分間処理し、続いてＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）で４時間処理したＨＵＶＥＣｓにおけるＰＥＣＡＭ−１発現のウェスタンブロット分析を示す。ｎ＝３；媒体対照−ＰＢＳ又はＤＭＳＯに対して、＊Ｐ＜０．００１；ＶＥＧＦに対して、＊＊Ｐ＜０．０５。  図２Ｃは、ＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）で４時間、又はＬａｃＣｅｒ（２．５μＭ）及びＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）で４時間の何れかで、処理したＨＵＶＥＣｓにおけるＰＥＣＡＭ−１ｍＲＮＡ発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを示す。いくつかの実験では、細胞はＤ−ＰＤＭＰ（２０μＭ）で９０分間前処理し、続いてＶＥＧＦ／ＬａｃＣｅｒで４時間処理した。ｎ＝３；ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ＋ＬａｃＣｅｒに対して、＊Ｐ＜０．００１；媒体対照に対して、＊＊Ｐ＜０．００１；Ｄ−ＰＤＭＰ＋ＶＥＧＦに対して、＊＊＊Ｐ＜０．０５。
【図３−１】図３は、ＬａｃＣｅｒが、ＨＵＶＥＣｓのＰＥＣＡＭ−１発現及びチューブ形成／血管新生を特異的に誘導することを示す。  図３Ａは、ＨＵＶＥＣｓにおいて、ＬａｃＣｅｒが特異的にＰＥＣＡＭ−１を誘導することを実証するために、ＰＥＣＡＭ−１発現を行った。細胞を、ＬａｃＣｅｒ及びＤＧＤＧ、ＧｌｃＣｅｒ又はＣ２Ｃｅｒなどのその同族体と、２．５μＭで４時間処理した。続いて、細胞溶解物をウェスタン免疫ブロットアッセイのための処理をし、ＰＥＣＡＭ−１発現を測定した。［ｎ＝３；ＶＣ−媒体対照（ＤＭＳＯ）に対して、＊Ｐ＜０．００１］。  図３Ｂは、ＬａｃＣｅｒがＤ−ＰＤＭＰのＰＥＣＡＭ−１発現での阻害作用を特異的に回避することを実証するための、ＰＥＣＡＭ−１発現のウェスタンブロット分析を示す（ｎ＝３；媒体対照に対して、＊Ｐ＜０．００１；Ｄ−ＰＤＭＰ処理細胞に対して、＊＊Ｐ＜０．０５）。
【図３−２】図３Ｃは、上部のパネルは、ＨＵＶＥＣｓにおいて血管新生を誘導するＬａｃＣｅｒ／ＶＥＧＦの作用を表し、ＬａｃＣｅｒがＤ−ＰＤＭＰのＶＥＧＦ誘導の血管新生に及ぼす阻害作用を特異的に逆転させる。下部のパネル図３Ｄは、「実験方法」の項で説明したように、チューブ形成の定量的測定を示す（ｎ＝３；媒体対照細胞に対して、＊Ｐ＜０．００１；ＶＥＧＦ又はＬａｃＣｅｒ処理細胞に対して、＊＊Ｐ＜０．０５、及びパネルＤに対して、＃Ｐ＜０．０５）。
【図４】図４は、ＨＵＶＥＣｓにおけるＶＥＧＦ／ＬａｃＣｅｒ誘導のＰＥＣＡＭ−１発現及び血管新生に及ぼすＰＰＭＰの作用を示す。  図４Ａは、ＶＥＧＦ単独で４時間、又はＰＰＭＰによる前処理（９０分）の後ＬａｃＣｅｒ又はＧｌｃＣｅｒと４時間インキュベートした細胞における、ＰＥＣＡＭ−１発現のウェスタン免疫ブロットアッセイを示す（ｎ＝３；対照細胞に対して、＊Ｐ＜０．００１；ＶＥＧＦ処理細胞に対して、＊＊Ｐ＜０．００１；ＰＰＭＰ＋ＧｌｃＣｅｒ細胞に対して、＊＊＊Ｐ＜０．０５）。  図４Ｂは、ＨＵＶＥＣｓにおけるＶＥＧＦ／ＬａｃＣｅｒの血管新生促進作用、及びＶＥＧＦ誘導の血管新生に及ぼすＰＰＭＰの阻害作用を示す。ＨＵＶＥＣｓを、ＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）で４時間処理し、又はＤ−ＰＤＭＰ（２０μＭ）で９０分、続いてＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）、ＧｌｃＣｅｒ（２．５μＭ）又はＬａｃＣｅｒ（２．５μＭ）で４時間インキュベートし、そしてインビトロでの血管新生アッセイを先に説明した通りに実施した（ｎ＝３；対照細胞ＰＢＳ又はＤＭＳＯ  Ａに対して、＊Ｐ＜０．００１；ＶＥＧＦ又はＬａｃＣｅｒに対して、＊＊Ｐ＜０．００１；ＰＰＭＰ＋ＶＥＧＦに対して、＊＊＊Ｐ＜０．０５；ＶＥＧＦ＋ＶＥＧＦに対して、＃Ｐ＜０．００１）。
【図５】図５は、ヒトＧａｌＴ−Ｖを対象とするｓｉＲＮＡを用いる、ＧａｌＴ−Ｖ発現のサイレンシングを示す。  図５Ａは、ウサギポリクローナル抗ヒトＧａｌＴ−Ｖの特異性を確認するために実施した免疫ブロット分析を表す。レーン１〜２は、ＨＵＶＥＣｓの細胞溶解物で、レーン３〜４は、ヒトＧａｌＴ−Ｖを過剰発現するＣＨＯ−Ｋ１（ＭＴ）細胞を負荷した。  図５Ｂは、ＨＵＶＥＣｓに、表示の濃度のＧａｌＴ−Ｖを標的にする二本鎖ｓｉＲＮＡ、スクランブル配列（ｓｉＲＮＡの陰性対照）又はＯＦ（オリゴフェクタミン）単独をトランスフェクションした。次に、トランスフェクションの４８時間後に、細胞を溶解させて回収し、図に示した様にＧａｌＴ−Ｖタンパク質レベルを、ＧａｌＴ−Ｖ抗体又はβ−アクチンをプローブにした免疫ブロット法で解析した。ＧａｌＴ−Ｖ発現は、β−アクチン発現で標準化した場合の％対照で表し、相対的な定量値は免疫ブロットの下に示した。  図５Ｃは、ＨＵＶＥＣｓに、スクランブルしたＧａｌＴ−ＶのｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ）又はＧａｌＴ−ＶのｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ）の何れかをトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後に細胞を溶解し、「材料と方法」に述べたように、Ｃｅｒシンターゼの酵素活性を測定した。示したデータは、同じ様な結果が出た２つの同一の実験の代表である（スクランブルしたＧａｌＴ−ＶのｓｉＲＮＡ又はＯＦ単独に対して、＊Ｐ＜０．０５）。
【図６】図６は、ＧａｌＴ−Ｖのサイレンシングが、ＨＵＶＥＣｓにおけるＶＥＧＦ誘導のＰＥＣＡＭ−１発現及び血管新生を鈍らせることを示す。  図６Ａは、ＧａｌＴ−Ｖに特異的なｓｉＲＮＡ、又はスクランブルしたｓｉＲＮＡの何れかをトランスフェクションし、ＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）の存在又は非存在下で４時間処理した、ＨＵＶＥＣｓにおける、ＰＥＣＡＭ−１タンパク質発現の免疫ブロット分析を示す。括弧で示した数値は、β−アクチンで標準化した場合のＰＥＣＡＭ−１タンパク質の定量的発現レベルである。    図６Ｂは、ＧａｌＴ−ＶのｓｉＲＮＡ又はスクランブルしたｓｉＲＮＡの何れかをトランスフェクションし、ＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）で４時間処理した細胞における血管新生アッセイを示す。  図６Ｃは、チューブ形成の定量的測定を示す。前述の実験は２回繰り返したもので、示した免疫ブロットは、再現性の有る結果（＊Ｐ＜０．０５）が出たものの代表である。
【図７−１】図７は、ＬａｃＣｅｒ／ＶＥＧＦ誘導の血管新生にＰＥＣＡＭ−１が必要とされることを示す。  図７Ａは、ＨＵＶＥＣｓを、ＳＵ１４９８で１時間又は抗ヒトＰＥＣＡＭ−１ｍＡｂで１時間の何れかで前処理し、次いで、ＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）／ＬａｃＣｅｒ（２．５μＭ）に４時間曝して、次に、「材料と方法」の項に述べたようにチューブ形成アッセイを実施した。
【図７−２】図７Ｂは、血管新生の定量的分析を示す（ＰＢＳ又はＤＭＳＯの何れかで処理した媒体対象に対して、＊Ｐ＜０．００１；ＶＥＧＦに対して、＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図８】図８は、ＰＥＣＡＭ−１の欠乏が、インビトロで血管新生を誘導しないことを示す。ＲＥＮ（ＷＴ）［Ａ］は、ＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）［Ｂ］若しくはＬａｃＣｅｒ（２．５μＭ）［Ｃ］で、又はＲＥＮ（ｒｈＰＥＣＡＭ−１）［Ｄ］は、ＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）［Ｅ］若しくはＬａｃＣｅｒ［Ｃ］で４時間刺激し、次いで、血管新生アッセイを先に説明したように行った。本明細書に示した結果は、同じような結果となる実験のセットを３通り実施して得たものである。
【０２６６】
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【図１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【配列表】
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