(57)【要約】（１）高いアッセイシグナル対バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）および広いアッセイシグナル対バックグラウンド範囲（Ｓ−Ｂ）を示し；（２）均一系であり；（３）非放射性であり；そして（４）リン酸特異的抗体を必要としない、インビトロのプロテインキナーゼアッセイ技術。このアッセイは、３価の金属イオン（例えばＧａ３＋、Ｆｅ３＋、Ａｌ３＋、Ｉｎ３＋、Ｒｕ３＋、Ｓｃ３＋、Ｙ３＋）を、増幅した発光近接アッセイアクセプタービーズまたはドナービーズの表面に、例えば、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ；カルボキシメチルリジンとも呼ばれる）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）または適切に置換されたＮ含有複素環、例えばトリアゾ複素環（例えば１−プロピルアミノ−４−アセタト−１，４，７−トリアザシクロノナンなどのトリアゾシクロノナネオノナン）などの適切なリンカーを媒介として、錯体形成させることを含む。
2008513794.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光増感剤を含むドナー粒子；
化学発光化合物を含むアクセプター粒子であって、該化合物は、該光増感剤が活性化されてそして該ドナー粒子および該アクセプター粒子が密に近接する場合、化学発光シグナルを発生することを特徴とするアクセプター粒子；および
ドナー粒子またはアクセプター粒子のうちの一つの表面に錯体形成する三価金属イオン
を含む組成物。
【請求項２】
活性化された光増感剤が、光源による励起によって、周囲の酸素を一重項酸素に変換する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記光源がレーザーである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記光増感剤がエンドペルオキシドである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記化学発光化合物がチオキセン誘導体である、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記粒子が水性媒体中に分散されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
密に近接する距離が、一重項酸素が水性溶液中をその寿命の間に動く距離をこえない、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記距離が２００ｎｍをこえない、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記粒子がポリマービーズである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記三価金属イオンが前記アクセプター粒子表面に錯体形成している、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記三価金属イオンが前記ドナー粒子表面に錯体形成している、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記三価金属イオンが、前記ドナー粒子または前記アクセプター粒子のうちの一つの表面に、Ｎ含有リンカーを媒介として、錯体形成している、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記三価金属イオンが、前記ドナー粒子または前記アクセプター粒子のうちの一つの表面に、カルボキシメチルリジンおよび１−プロピルアミノ−４−アセタト−１，４，７−トリアザシクロノナンリンカーのうちの一つを媒介として、錯体形成している、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記三価金属イオンが、Ｇａ３＋、Ｆｅ３＋、Ａｌ３＋、Ｉｎ３＋、Ｒｕ３＋、Ｓｃ３＋およびＹ３＋からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
光増感剤を含むドナー粒子；
化学発光化合物を含むアクセプター粒子であって、該化合物は、該光増感剤が活性化されてそして該ドナー粒子および該アクセプター粒子が密に近接する場合、化学発光シグナルを発生することを特徴とするアクセプター粒子；および
アクセプター粒子の表面に、１−プロピルアミノ−４−アセタト−１，４，７−トリアザシクロノナンリンカーを媒介として、錯体形成する三価金属イオン
を含む組成物。
【請求項１６】
アッセイに使用されるキットであって、該キットは、包装されたものの組み合わせで：アッセイを実施するための試薬であって、該試薬は、光増感剤を含むドナー粒子；化学発光化合物を含むアクセプター粒子であって、該化合物は、該光増感剤が活性化されてそして該ドナー粒子および該アクセプター粒子が密に近接する場合、発光シグナルを発生することを特徴とするアクセプター粒子；およびドナー粒子またはアクセプター粒子のうちの一つの表面に錯体形成された三価金属イオンを含む試薬を含むキット。
【請求項１７】
前記三価金属イオンが、前記ドナー粒子または前記アクセプター粒子のうちの一つの表面に、Ｎ含有リンカーを媒介として、錯体形成している、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記三価金属イオンが、前記ドナー粒子または前記アクセプター粒子のうちの一つの表面に、カルボキシメチルリジンおよび１−プロピルアミノ−４−アセタト−１，４，７−トリアザシクロノナンリンカーのうちの一つを媒介として、錯体形成している、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記三価金属イオンが、前記アクセプター粒子の表面に、１−プロピルアミノ−４−アセタト−１，４，７−トリアザシクロノナンリンカーを媒介として、錯体形成している、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
さらに三価金属媒介均一発光近接アッセイを実施するための使用説明書を含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項２１】
キナーゼ阻害化合物を検知する方法であって、該方法は：
光増感剤およびキナーゼによるリン酸化が可能な表面結合未リン酸化生体分子を含むドナー粒子ならびに粒子表面へ錯体形成した三価金属イオンおよび化学発光化合物（該化合物は、該光増感剤が活性化されてそして該ドナー粒子および該アクセプター粒子が密に近接する場合、発光シグナルを発生することを特徴とする）を含むアクセプター粒子を含む組成物を提供する工程；
候補キナーゼ阻害化合物を組成物に導入する工程；
キナーゼを組成物に導入する工程；および、
該候補阻害化合物を欠く対照の組成物から発せられる化学発光に対して相対的に減少した化学発光として観察される、候補阻害化合物によるキナーゼの阻害を検知することによって、該候補キナーゼ阻害化合物がキナーゼ阻害化合物であることを決定する工程
を包含する。
【請求項２２】
前記三価金属イオンが、前記アクセプター粒子の表面に、Ｎ含有リンカーを媒介として、錯体形成している、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記三価金属イオンが、前記アクセプター粒子の表面に、カルボキシメチルリジンおよび１−プロピルアミノ−４−アセタト−１，４，７−トリアザシクロノナンリンカーのうちの一つを媒介として、錯体形成している、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記三価金属イオンが、前記アクセプター粒子の表面に、１−プロピルアミノ−４−アセタト−１，４，７−トリアザシクロノナンリンカーを媒介として、錯体形成している、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記候補キナーゼ阻害化合物が前記キナーゼの導入の前に導入される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記候補キナーゼ阻害化合物および前記キナーゼが同時に導入される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
ホスファターゼ阻害化合物またはホスホジエステラーゼ阻害化合物を検知する方法であって、該方法は：
光増感剤およびホスファターゼまたはホスホジエステラーゼによる脱リン酸が可能な表面結合リン酸化生体分子を含むドナー粒子、ならびに粒子表面へ錯体形成した三価金属イオンおよび化学発光化合物（該化合物は、該光増感剤が活性化されそして該ドナー粒子および該アクセプター粒子が密に近接する場合、発光シグナルを発生することを特徴とする）を含むアクセプター粒子を含む組成物を提供する工程；
ホスファターゼまたはホスホジエステラーゼを組成物に導入する工程；
候補ホスファターゼ阻害化合物または候補ホスホジエステラーゼ阻害化合物を組成物に導入する工程；および、
該候補阻害化合物を欠く対照の組成物から発せられる化学発光に対して相対的に増加した化学発光として観察される、候補阻害化合物によるホスファターゼまたはホスホジエステラーゼの阻害を検知することによって、該候補ホスファターゼ阻害化合物または候補ホスホジエステラーゼ阻害化合物がホスファターゼ阻害化合物またはホスホジエステラーゼ阻害化合物であることを決定する工程
を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、「ＴＲＩＶＡＬＥＮＴ  ＭＥＴＡＬ  ＭＥＤＩＡＴＥＤ  ＨＯＭＯＧＥＮＥＯＵＳ  ＬＵＭＩＮＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＸＩＭＩＴＹ  ＡＳＳＡＹ」と題する、２００４年９月１７日に仮出願された、米国仮特許出願第６０／６１０，７９９号明細書（この開示は、その全体を、そしてすべての目的のために、本明細書において参考として援用する）の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、生物学的アッセイ、特にキナーゼアッセイを実施するための材料と方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
種々の細胞内タンパク質基質および脂質基質のリン酸化は、非常に多くの細胞プロセス（例えば、成長、増殖、アポトーシス、分化および細胞周期の進行）の中で中心的な役割を果たす。キナーゼ（他のキナーゼを包含する細胞酵素のリン酸化の原因である酵素）および脂質は、潜在的治療介入のための主要な標的クラスとして同定されてきた。キナーゼは、チロシン（即ち、リン酸化がチロシンアミノ酸残基で起こる）キナーゼかまたは、セリン／トレオニン（即ち、リン酸化がセリンアミノ酸残基かまたはトレオニンアミノ酸残基のいずれかで起こる）キナーゼのいずれかに大まかに分類される。これまでに同定されたおよそ５１８のヒトキナーゼのうち、およそ８５％がセリン／トレオニン（Ｓ／Ｔ）キナーゼであり、残りがチロシンキナーゼとして分類されている。（非特許文献１）。
【０００４】
潜在的キナーゼ阻害化合物の存在下に高スループットのキナーゼ活性の測定を可能にする、非常に多くのインビトロアッセイが記載されてきた。既存の高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）キナーゼアッセイに関する懸念としては、いずれのＨＴＳアッセイに関するもののように、検知試薬のコストおよびアッセイを有効にしそして最適化するための時間のコストが挙げられる。この目的のためには、非放射性アッセイは、放射性廃物の処分が非常に高価なので、高度に選好される。同様に、均一アッセイ（即ち、洗うステップを必要としないアッセイ）は、より少ない実験ステップしか必要とせず、それに伴いスクリーニングの人工産物の可能な供給源が縮小され、そして、高度なアッセイスループット、および装置の獲得および維持に関係する低い前払いおよび進行中の資金コストを典型的に提供して、よりＨＴＳに従順である。
【０００５】
これらの要求を満たす、一つの現在利用可能なインビトロキナーゼアッセイ技術が、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＬＡＳ，Ｉｎｃ．のＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭ（増幅発光近接均一アッセイ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  Ａｓｓａｙ））である。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭは、共役させられたドナービーズおよびアクセプタービーズ（直径がおよそ２５０ｎｍ）の間の生体分子相互作用に依存する。（非特許文献２）。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭキナーゼアッセイについては、ビオチン化ペプチド基質またはタンパク質基質が、ドナービーズに結合され、そして、もしリン酸化されれば、リン酸特異的抗体（典型的にはリン酸−チロシン特異的）と共役したアクセプタービーズと近接するように導かれる。（非特許文献３）。お互いに約２００ｎｍの範囲内にあるドナービーズおよびアクセプタービーズは、５２０ｎｍおよび６２０ｎｍの間を発する光として読み取られる発光シグナルを発する。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭキナーゼアッセイは、慣用的に１０をこえるシグナル対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）比を示し（非特許文献３）、そして大きなタンパク質基質を用いて使用され得る。しかし、高品質な抗ホスホチロシン抗体が、検知をリン酸特異的抗体に依存するアッセイ技術では利用可能であるのに、一般的な抗ホスホセリン抗体または抗ホスホトレオニン抗体は概して、丈夫なシグナルを生成するには十分には高品質ではない。従って、ホスホ−配列特異的抗体が必要とされるが、これはアッセイの最適化および有効化に必要とされる時間を増加し、そしてアッセイの全コストを増す。リン酸特異的抗体の使用は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭの、特定のＳ／Ｔキナーゼのスクリーニングまたは高いアフィニティもしくは高い特異性の抗体が利用可能でない他の酵素クラスのスクリーニングにおける使用を、あらかじめ排除する。
【０００６】
別の現在利用可能なインビトロ均一、非放射性キナーゼアッセイ技術が、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＩＭＡＰＴＭ（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）である。ＩＭＡＰＴＭは、表面に三価の金属イオンを錯体形成したナノ粒子を使用する。（非特許文献４）。三価の遷移金属（例えばＧａ３＋、Ｆｅ３＋、Ａｌ３＋、Ｉｎ３＋、Ｒｕ３＋、Ｓｃ３＋、Ｙ３＋）が高度のアフィニティおよび特異性をもってリン酸基に結合し得ることが知られるようになってからしばらく経つ。（非特許文献５；非特許文献６；および非特許文献７）。ＩＭＡＰＴＭは、リン酸化に続いてＩＭＡＰＴＭナノ粒子が結合したときの、蛍光標識ペプチド基質の蛍光偏光の増加に依存する。このシステムは、リン酸抗体と違って、ペプチド基質の遊離リン酸基を周りのアミノ酸に関係なく結合できるという利点を有する。しかし、蛍光偏光法は分子の可動性の変化を測定するので、生物学的システムの中では最大のシグナル範囲（Ｓ−Ｂ）は典型的に約３５０ｍＰに限られる。これは、約８の生物学的アッセイにおける理論的最大シグナル対バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）を与えるが、しかし実際はＳ／Ｂはしばしば２以下である（例えば非特許文献８を参照のこと）。そのうえ、基質がタンパク質または大きなタンパク質断片である状況では、大きな分子に本来そなわっている偏光度が高いので（即ち、Ｂ、バックグラウンドが著しく増加する）、Ｓ／Ｂは小さくなりすぎて使用可能ではない。低いシグナル対バックグラウンドを有するアッセイは、偽陽性を発生させる可能性がより高く、これはＨＴＳプログラムの全体的丈夫さおよび再現性に著しく影響し得る。（非特許文献９）。
【非特許文献１】Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｇ．，Ｗｈｙｔｅ，Ｄ．Ｂ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｒ．，Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．＆Ｓｕｄａｒｓａｎａｍ，Ｓ．，「Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２年，第２９８巻，ｐ．１９１２−３４
【非特許文献２】Ｕｌｌｍａｎ，Ｅ．Ｆ．ら，「Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｏｘｙｇｅｎ  ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｂｙ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ」，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１９９４年，第９１巻，ｐｐ．５４２６−３０
【非特許文献３】Ｗａｒｎｅｒ，Ｇ．，Ｉｌｌｙ，Ｃ．，Ｐｅｄｒｏ，Ｌ．，Ｒｏｂｙ，Ｐ．＆Ｂｏｓｓｅ，Ｒ．，「ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭｋｉｎａｓｅ  ＨＴＳ  ｐｌａｔｆｏｒｍｓ」，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００４年，第１１巻，ｐｐ．７２１−７３０
【非特許文献４】Ｓｐｏｒｔｓｍａｎ，Ｊ．Ｒ．，Ｄａｉｊｏ，Ｊ．＆Ｇａｕｄｅｔ，Ｅ．Ａ．，「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ  ｉｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ，２００３年，第６巻，ｐｐ．１９５−２００
【非特許文献５】Ｏｓｔｅｒｂｅｒｇ，Ｒ．，「Ｍｅｔａｌ  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｉｏｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ」，Ｎａｔｕｒｅ，１９５７年，第１７９巻，ｐｐ．４７６−４７７
【非特許文献６】Ｍｕｓｚｙｎｓｋａ，Ｇ．，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｌ．＆Ｐｏｒａｔｈ，Ｊ．，「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｎ  ｇｅｌ−ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｆｅｒｒｉｃ  ｃｈｅｌａｔｅ」，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８６年，第２５巻，ｐｐ．６８５０−３
【非特許文献７】Ｐｏｓｅｗｉｔｚ，Ｍ．Ｃ．＆Ｔｅｍｐｓｔ，Ｐ．，「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｇａｌｌｉｕｍ（ＩＩＩ）  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅｓ」，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．，１９９９年，第７１巻，ｐｐ．２８８３−２８９２
【非特許文献８】Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，２００３年，第８巻，６号，ｐｐ．６９４−７００
【非特許文献９】Ｗａｌｔｅｒｓ，Ｗ．Ｐ．＆Ｎａｍｃｈｕｋ，Ｍ．，「Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ｓｃｒｅｅｎｓ：ｈｏｗ  ｔｏ  ｍａｋｅ  ｙｏｕｒ  ｈｉｔｓ  ａ  ｈｉｔ」，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓ．，２００３年，第２巻，ｐｐ．２５９−２６６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、潜在的キナーゼ阻害化合物の存在下での信頼できる高スループットのキナーゼ活性測定を促進する、改良されたインビトロアッセイ技術が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、（１）高いアッセイシグナル対バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）および広いアッセイシグナル対バックグラウンド範囲（Ｓ−Ｂ）を示し；（２）均一系であり；（３）非放射性であり；そして（４）リン酸特異的抗体を必要としない、インビトロのキナーゼアッセイ技術を提供することによって、これらの論点と取り組む。本明細書において記載される発明は、タンパク質（または構成要素部分、例えばポリペプチドまたはペプチド）上の、または他の生体高分子（例えば、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、もしくはトリヌクレオチド、サイクリックヌクレオチドまたはリン酸基で置換したイノシトール）上のリン酸基の存在または欠如を認識するので、これはいかなるリン酸化反応酵素または脱リン酸反応酵素にも広く適用可能であり、そしてプロテインキナーゼおよび、リピドキナーゼ、ホスファターゼ、ホスホジエステラーゼおよびその他を包含する他の酵素類に対し、高度に丈夫で柔軟なアッセイ形式を提供する。
【０００９】
一つの場合、アッセイは、増幅発光近接アッセイドナービーズおよびアクセプタービーズとキナーゼおよびキナーゼ阻害化合物候補を組み合わせる工程を含む。ビーズの内の一つ、概してドナービーズは、その表面に、タンパク質、脂質または核酸（またはそれらの構成要素部分、例えば、タンパク質では、ペプチド）などの、キナーゼによるリン酸化が可能な生体分子を結合している。もう一方のビーズ、概してアクセプタービーズは、例えば、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ；カルボキシメチルリジンとも呼ばれる）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）または適切に置換されたＮ含有複素環、例えばトリアゾ複素環（例えば１−プロピルアミノ−４−アセタト−１，４，７−トリアザシクロノナンなどのトリアゾシクロノナネオノナン）などの適切なリンカーを媒介として、その表面に錯体形成した三価の金属イオンを有する。化学発光シグナルが、ドナー粒子およびアクセプター粒子が密に近接する場合（これは、キナーゼがその生体分子をリン酸化し、そして三価の金属イオンがリン酸基に結合する場合に起こる）に、発生する。もしキナーゼ阻害化合物候補がキナーゼ阻害化合物であるならば、キナーゼが阻害される程度に応じて、アッセイ組成物によって発せられた化学発光は、候補の阻害化合物を欠く対照の組成物から発せられる化学発光に対して相対的に、減少または除外させられる。これは、キナーゼ阻害のしるしもしくは測定を、またはその両方を提供する。
【００１０】
このようなアッセイを実施するために使用され得る組成物およびキットもまた提供される。
【００１１】
上記のように、本発明は本明細書においては主としてプロテインキナーゼアッセイまたはタンパク質構成要素部分（ポリペプチドまたはペプチドを包含する）のキナーゼアッセイに関して記載されているが、これはいずれのリン酸化反応酵素または脱リン酸反応酵素
にも広く適用可能である。本発明の組成物および工程の代替の使用は、リピドキナーゼ、ホスファターゼおよびホスホジエステラーゼを含む他の型の酵素のためのアッセイにおいてである。
【００１２】
ＰＩ３Ｋのようなリピドキナーゼについては、リン酸化反応はＰＩ−４，５−Ｐ２からＰＩ−３，４，５−Ｐである。ＰＩ（ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ））自体もまた基質として使用され得る。いったんＰＩまたはＰＩＰ２がリン酸化されると、ビーズは増加させられた化学発光シグナルを示す。ホスファターゼおよびホスホジエステラーゼについては、アッセイは、ホスファターゼおよびホスホジエステラーゼはリン酸基を取り除くので、キナーゼアッセイとは逆に働く（例えばホスファターゼインヒビターまたはホスホジエステラーゼインヒビターは、対照に対して相対的に高い化学発光シグナルを発生する）。
【００１３】
本発明のこれらおよび他の局面および利点が、以下に詳細に記載される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明の特定の実施形態への言及が、今詳しくなされる。特定の実施形態の例が付随する図面の中に例示されている。本発明はこれらの特定の実施形態に関連して記載されるのであるが、本発明をこのような特定の実施形態に限定する意図はないことが理解されよう。それどころか、代替物、改良物および同等物を、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神と範囲の範囲内に包含され得るとして、網羅することが意図される。以下の説明においては、非常に多くの特定の細目が、本発明の完全な理解を提供するために、示される。本発明は、これらの特定の細目の内のいくつかまたは全てがなくても実行され得る。他の例では、本発明を不必要に不明確にしないために、周知の工程作業は詳細には記載されていない。
【００１５】
（序文）
本発明は、（１）高いアッセイシグナル対バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）および広いアッセイシグナル対バックグラウンド範囲（Ｓ−Ｂ）を示し；（２）均一系であり；（３）非放射性であり；そして（４）リン酸特異的抗体を必要としない、インビトロのキナーゼアッセイ技術を提供した。本明細書において記載される発明は、タンパク質、タンパク質（またはそれの構成要素部分、例えばポリペプチドまたはペプチド）上か、または他の生体高分子（例えば、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、もしくはトリヌクレオチド、サイクリックヌクレオチドまたはリン酸基で置換したイノシトール）上かのリン酸基の存在または欠如を認識するので、これはいずれのリン酸化反応酵素または脱リン酸反応酵素にも広く適用可能であり、そしてプロテインキナーゼおよび、リピドキナーゼ、ホスファターゼ、ホスホジエステラーゼおよびその他を包含する他の酵素類に対し、高度に丈夫で柔軟なアッセイ形式を提供する。
【００１６】
一つの実施形態では、アッセイは、増幅発光近接アッセイドナービーズおよびアクセプタービーズとキナーゼおよびキナーゼ阻害化合物候補を組み合わせる工程を含む。ビーズの内の一つ、概してドナービーズは、その表面に、タンパク質、脂質または核酸（またはそれらの構成要素部分、例えば、タンパク質では、ペプチド）などの、キナーゼによるリン酸化が可能な生体分子を結合している。もう一方のビーズ、概してアクセプタービーズは、例えば、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ；カルボキシメチルリジンとも呼ばれる）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）または適切に置換されたＮ含有複素環、例えばトリアゾ複素環（例えば１−プロピルアミノ−４−アセタト−１，４，７−トリアザシクロノナンなどのトリアゾシクロノナネオノナン）などの適切なリンカーを媒介として、その表面に錯体形成した三価の金属イオン（例えばＧａ３＋、Ｆｅ３＋、Ａｌ３＋、Ｉｎ３＋、Ｒｕ３＋、Ｓｃ３＋、Ｙ３＋）を有する。このキナーゼアッセイ中の、および本発明によるいずれのアッセイ中のビーズの表面成分も逆にし得ることが、例えば三価の金属イオンがドナービーズ上にあり得、そしてキナーゼの基質（リン酸化／脱リン酸のための生体分子）がアクセプタービーズ上にあり得るということが、理解されるべきである。
【００１７】
化学発光シグナルは、ドナー粒子およびアクセプター粒子が密に近接する場合（これは、キナーゼが生体分子をリン酸化し、そして三価の金属イオンがリン酸基に結合する場合に起こる）に、発生する。本適用の目的のために、化学発光（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）（形容詞、ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）とは、いずれの蛍光光子またはりん光光子の放出も包含する、化合物（化学発光化合物）と一重項酸素を含む反応性化学物質種との化学反応に直接的または間接的に起因する光の放出をいう。もしキナーゼ阻害化合物候補が実際にキナーゼ阻害化合物であるならば、キナーゼが阻害される程度に応じて、アッセイ組成物によって放射せられる化学発光は、候補阻害化合物を欠く対照の組成物から発せられる化学発光に対して相対的に、減少または除外させられる。これは、キナーゼ阻害の兆候もしくは測定を、またはその両方を提供する。
【００１８】
このようなアッセイを実施するために使用され得る組成物およびキットもまた提供される。
【００１９】
本発明は今、一つの実施形態、キナーゼアッセイ、主としてプロテインキナーゼアッセイに関して説明される。
【００２０】
（三価金属媒介均一発光近接キナーゼアッセイ）
Ｆｅ３＋を含む三価の遷移金属イオンが、高度のアフィニティおよび特異性をもってリン酸基に結合し得ることが知られるようになってからしばらく経っており、そしてこの事実は、キナーゼアッセイにおいて、特に上述のＩＭＡＰＴＭ技術において利するよう使用されてきた。しかし、ＩＭＡＰＴＭ以外のキナーゼアッセイにおける三価金属イオンの使用は知られていない。一重項酸素のドナービーズでの発生およびアクセプタービーズへの伝搬は、上述のような、既存の増幅発光近接均一アッセイ技術の操作の鍵であるので、一重項イオン消光剤の存在は、現状技術によって禁忌とされる。上述したＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭアッセイ技術の供給業者は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭ製品とともに提供される文献に、ある種の遷移金属イオン（Ｆｅ３＋を含む）は、潜在的一重項酸素消光剤であることが示されており、そしてこれらの使用を回避することが強く勧められるとはっきりと言及している。Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭ，ｐａｇｅ  ２２，  ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，  Ｉｎｃ．（２００３）の全体を全ての目的につき本明細書において参考として援用する。それにもかかわらず、本発明者らは、上述の既存の増幅発光近接均一アッセイ技術において使用されるリン酸特異的抗体を、三価金属イオンと置き換えることが、より能力の高められたアッセイを提供することを思いがけなく発見した。
【００２１】
図１は、本発明による三価金属媒介均一発光近接キナーゼアッセイを実施するために適切な、組成物１００の成分を例示している。この近接アッセイは、共役させられたドナー１０２粒子とアクセプター１０４粒子との間の生体分子相互作用を利用することではたらく。一つの好ましい実施形態では、粒子は、Ｕｌｌｍａｎ，Ｅ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｏｘｙｇｅｎ  ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｂｙ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１，５４２６−３０（１９９４）および米国特許第６，７０３，２４８号（これらはその全体を全ての目的について本明細書において参考として援用する）において記載されるようなポリマーのビーズである。これらの出版物によるビーズは、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から入手可能で、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭビーズとして市販されている。ポリマーのビーズは、例えばポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリ塩化ビニル、ポリビニルナフタレンおよびポリメタクリル酸の中の１種以上のポリマーから構成され得る。適切なビーズはラテックス粒子の形であり得る。さらにまた、ポリマーのビーズは、例えば約０．１重量％〜約２５重量％の量で、高次のアルキル芳香族化合物および高次のアルキルオキシ芳香族化合物およびフルオロカーボンなどの可塑剤を含む。ビーズは，直径が約２０ｎｍ〜１００μｍ、例えば直径が約１７５ｎｍ〜２７５ｎｍ
であり得る。生物学的アッセイ、例えばキナーゼアッセイに使用される場合、ビーズは、適切な緩衝液などの水性媒体１１０に分散している。
【００２２】
ドナービーズ１０２は、光源による、例えばレーザーによる励起（活性化）の直後に、周囲の酸素を一重項酸素に変換する光増感剤を組み込む。適切な光増感剤の例としては、エンドペルオキシドまたはフタロシアニンが挙げられる。ドナービーズはまた、生体分子１０６の結合を促進するために、表面被覆１０３を有する。概して表面被覆は、生体分子１０６上のリンカー１０８に対して相補的である。例えば、ドナービーズ表面被覆１０３は、例えばストレプトアビジンなどのアビジンであり、そして生体分子１０６上の相補的リンカー１０８はビオチンである。他の適切なリンカーとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、プロテインＡ、プロテインＧおよび６×ヒスチジンで標識された分子のキレート化されたＮｉ２+（ｃｈｅｌａｔｅｄ  Ｎｉ２+  ｆｏｒ  ６ｘ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｔａｇｇｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）が挙げられる。適切なドナービーズは、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎドナービーズであり、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から入手可能である。
【００２３】
キナーゼアッセイについては、タンパク質、脂質または核酸（またはこれらの構成要素部分、例えばタンパク質については、ペプチド）などの生体分子１０６は、その生物学的活性を調節するキナーゼによるリン酸化が可能である。それはドナービーズの表面へ、ドナービーズ表面被覆１０３およびリンカー１０８を媒介として結合している。生体分子１０６は、個々のアッセイにおいて関心のあるキナーゼに基づいて選択される。例えば、アッセイの目的がプロテインセリン／トレオニンキナーゼＰＤＫ１の阻害因子を同定することであれば、生体分子１０６は、当技術分野で周知のような、ＰＤＫ１によるリン酸化が可能なタンパク質（または構成要素部分）であるだろう。本発明のアッセイを適合させ得るキナーゼのいくつかの例は以下の通りである：キナーゼは、Ａｋｔキナーゼファミリー、Ａｕｒｏｒａキナーゼファミリー、ＰＤＫ１，ＭＡＰＫＡＰ  Ｋ２、Ｅｒｋキナーゼファミリー、ＣＡＭＫキナーゼファミリー、サイクリン依存性キナーゼファミリー（例えば、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６）、ＲＡＦキナーゼファミリー、カゼインキナーゼファミリー、ＰＫＣファミリー、ＰＫＡファミリー、ＰＫＢファミリー、ＰＫＧファミリー、ＧＳＫ３β、ＲＯＣＫ、ＳＧＫ、ＲｓｋファミリーおよびＮｅｋファミリーを含むプロテインセリン／トレオニンキナーゼ；ＦＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−Ｋｉｔ、ＩＧＦＲ、インスリンレセプター、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ、ｃ−Ｍｅｔまたはｃ−Ｒｅｔなどのレセプターチロシンキナーゼ、およびＳｒｃ、Ｌｃｋ、Ｌｙｎ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｓｙｋ、Ｈｃｋ、ＡｂｌおよびＥｐｈファミリーなどの細胞質チロシンキナーゼを含むプロテインチロシンキナーゼ；または、ＰＩ３キナーゼ、ＰＩ４キナーゼまたはＰＩ５キナーゼなどのリピドキナーゼであり得る。
【００２４】
アクセプタービーズ１０４は、一重項酸素の存在下で化学発光シグナルを発生する化学発光化合物を組み込む。このように、活性化されたドナー１０２ビーズおよびアクセプター１０４ビーズが密に近接する場合、即ち、ビーズ間の距離が、一重項酸素がその寿命の間に水溶液中を動く距離をこえない距離（例えば約２００ｎｍをこえない距離）である場合、化学発光シグナルは、発生する。一つの実施形態では、化学発光化合物は、チオキセン誘導体であり、そして５２０ｎｍおよび６２０ｎｍの間で放射される光として読み取られる化学発光シグナルを放射する。
【００２５】
アクセプター粒子１０４は一般に、非特異的結合を防ぐために、デキストランまたはポリペプチドヒドロゲルの被覆などの表面被覆１１２を有する。これは、例えばアクセプター粒子１０４表面被覆１１２に共有結合したリンカー１１５を媒介として、ビーズ１０４表面に錯体形成する三価金属イオン１１４も有する。三価金属イオン１１４は、Ｇａ３＋、Ｆｅ３＋、Ａｌ３＋、Ｉｎ３＋、Ｒｕ３＋、Ｓｃ３＋、Ｙ３＋のうちの少なくとも一つであり得る。
【００２６】
三価金属イオンをクロマトグラフィー基体に錯体形成することが、６×Ｈｉｓ含有タンパク質の精製に典型的に使用される、二価Ｎｉ２+錯体形成ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ；カルボキシメチルリジンともいう）樹脂またはイミノ二酢酸（ＩＤＡ）樹脂を三価金属で置換することによって、可能であることが示されている。Ｐｏｒａｔｈ，Ｊ．，ＩＭＡＣ−ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｍｅｔａｌ  ｉｏｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｂａｓｅｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７，２５４−２５９（１９８８）（この文献は、その全体を全ての目的について本明細書において参考として援用する）。三価の金属イオンは、この技術を二価Ｎｉ２+錯体形成ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭアクセプタービーズへ適用することによって、本発明によるアクセプタービーズとして適切なポリマービーズに錯体形成され得ることがわかった。加えて、以下に続く実施例においてさらに説明されるように、三価金属イオンは、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭ非共役、「未処理」アクセプタービーズなどのアクセプタービーズとして適切な樹脂に直接に結合され得る。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭビーズは、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から入手可能である。
【００２７】
三価金属イオンは、本発明によるアクセプタービーズとして適切なポリマービーズに、例えばトリアゾシクロノナネオノナンなどのトリアゾ複素環などの、適切に置換されたＮ含有複素環であるリンカー１１５を媒介としてもまた、錯体形成され得る。化合物１−アセタト−４−ベンジル−トリアゾシクロノナンは、タンパク質精製および他の応用法のためのＮｉ／ＮＴＡの代替物として記載されてきた（Ｄ．Ｌ．Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌ．Ｌ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００５，１２７，２０１８−２０１９（および関連するＳｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、この文献は、その全体を全ての目的について本明細書において参考として援用する）。適切な置換は、トリアゾ複素環を、上記したようにデキストランまたはポリペプチドヒドロゲルの被覆などの、非特異的結合を防ぐ表面被覆１１２を概して有するアクセプタービーズ１０４の表面に結合するために、官能基を提供する。適切な置換基としては、カルボン酸基および遊離のアミンが挙げられる。このような適切なリンカー１１５の一つの特定の例は、１−プロピルアミノ−４−アセタト−１，４，７，−トリアザシクロノナン、
【００２８】
【化１】
2008513794.tif 000003
であり、この物質の調製は、以下に続く実施例において記載される。
【００２９】
理論によって束縛されることは意図しないが、トリアゾ複素環リンカー１１５は、三価金属イオンとより強く錯体形成し得、それによって、アッセイで反応停止として使用される金属イオンキレート化剤（例えばＥＤＴＡ）によるアクセプタービーズからのイオンの剥奪に抵抗すると考えられている。さらにまた、この型のリンカーの剛性はまた、錯体形成した金属イオンを、アクセプタービーズ表面から離して、ドナービーズの方に配向させ得、それによってアッセイからのシグナルを改善し得ると考えられている。
【００３０】
上記したように、化学発光シグナルは、活性化されたドナービーズおよびアクセプタービーズが密に近接して保持される場合に、発生する。これは、ビーズ上の表面結合基の間で生物学的相互作用がある場合に達成され得る。アクセプタービーズ１０４上の三価金属イオン１１４は、生体分子がキナーゼによってリン酸化された場合、生体分子１０６のリン酸基１１６と結合して、ビーズを密に近接するよう保持する。しかし、もし候補化合物がキナーゼ阻害化合物である場合、これは生体分子のリン酸化をおよびそれとともに化学発光シグナルの発生を阻害し、キナーゼが阻害される程度に応じて、アッセイ組成物によって放射せられる化学発光は、候補阻害化合物を欠く対照の組成物から発せられる化学発光に対して相対的に、減少または除外させられる。これは、キナーゼ阻害の兆候もしくは測定を、またはその両方を提供する。
【００３１】
従って、本発明によるアッセイは、キナーゼ阻害化合物を検出するために実施され得る。本方法は、光増感剤および表面に結合した、キナーゼによるリン酸化が可能な未リン酸化生体分子を有するドナー粒子、ならびに粒子表面に錯体形成する三価金属イオンおよび化学発光化合物を有するアクセプター粒子を含有する組成物を提供する工程を含む。化学発光化合物は、光増感剤が活性化されそしてドナー粒子およびアクセプター粒子が密に近接する場合、化学発光シグナルを発生することを特徴とする。キナーゼおよび候補キナーゼ阻害化合物は、候補化合物がない状態で、リン酸化が起こらないように組成物に導入される。これを行うためには多数の方法がある。リン酸化反応を開始するためには、３つの成分が存在しなければならない：キナーゼ、キナーゼの基質（例えば、リン酸化されるようなタンパク質（または構成要素部分）である生体分子）およびＡＴＰである。この３つのうちのいずれかの２つを組み合わせて、そして混合または化合物を含むウェルに添加する。阻害物候補は、リン酸化が起こるために必要な要素の全てが組み合わされる前に、加えられなければならない。そして次に第３の成分が加えられる。
【００３２】
次に、候補化合物がキナーゼインヒビターであるか否かが、候補阻害化合物を欠く対照の組成物から放射される化学発光に対して相対的に減少したまたは除外させられた化学発光として観察される、候補阻害化合物によるキナーゼの阻害を検知することによって、決定され得る。
【００３３】
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭ技術を用いて実施されるような、従来の発光近接アッセイにおいて、推奨される停止緩衝液は、広く知られた便利な金属キレート化剤であるＥＤＴＡを含むことには注意すべきである。本発明による三価金属イオン媒介発光近接アッセイは、三価金属イオンに対する、ＥＤＴＡとアクセプタービーズへ三価金属イオンを錯体形成するために使用されるリンカーとの相対的アフィニティーに依存して、ＥＤＴＡを含む停止緩衝液を使用してもよいし使用しなくてもよい。ＥＤＴＡのアフィニティーがリンカーよりも大きい場合、反応停止緩衝液が添加されたときビーズから三価金属イオンが剥奪される危険性を回避するため、アッセイでは代替の反応停止緩衝液が使用され得る。例えば、ＩＭＡＰＴＭバインディング緩衝液などの、ＥＤＴＡを含有しない、非ＥＤＴＡ緩衝液が、このような例では金属イオン剥奪を回避するために使用され得る。このような例では、低ｐＨ溶液もまた許容可能な停止緩衝液を提供し得る。リンカーのアフィニティーがＥＤＴＡよりも大きい場合、ＥＤＴＡが使用され得る。
【００３４】
したがって、本発明のいくつかの実施形態では、例えばＮＴＡ三価金属イオンリンカーを使用しているものでは、ＥＤＴＡが十分に強い金属キレート化剤でありアクセプタービーズからＮＴＡ錯体形成金属イオンを剥奪するかもしれないので、ＥＤＴＡ含有反応停止緩衝液は使用しない。他方では、ＥＤＴＡ含有反応停止緩衝液は、１−プロピルアミノ−４−アセタト−１，４，７−トリアザシクロノナンなどのトリアゾ複素環リンカーが使用される本発明の実施形態では使用され得る。それは、このようなリンカーは、ＥＤＴＡよりも強いアフィニティーで三価金属イオンと錯体形成し、それによってＥＤＴＡによってビーズから金属イオンが剥奪されるのを防ぐと考えられているからである。
【００３５】
（本発明の実施形態）
本発明は、例えば以下のような、組成物、キットまたは方法として実施され得る：
以下を含む組成物：光増感剤を含むドナー粒子；化学発光化合物を含むアクセプター粒子であって、化学発光化合物は、光増感剤が活性化されてそしてドナー粒子およびアクセプター粒子が密に近接する場合、化学発光シグナルを発生することを特徴とするアクセプター粒子；ドナー粒子またはアクセプター粒子のうちの一つの表面に錯体形成された三価金属イオン。
【００３６】
粒子表面に錯体形成された三価金属イオンならびに光増感剤および化学発光化合物のうちの一つを含むポリマー粒子を含む組成物。粒子は、光増感剤および化学発光化合物のうちの他方を含む第２の粒子が密に近接してそして光増感剤が活性化される場合、化学発光シグナルを発生することを特徴とし得る。
【００３７】
アッセイに使用されるキットであって、キットは、包装されたものの組み合わせで、以下を含む：アッセイを実施するための試薬であって、試薬は、光増感剤を含むドナー粒子；化学発光化合物を含むアクセプター粒子であって、化学発光化合物は、光増感剤が活性化されてそしてドナー粒子およびアクセプター粒子が密に近接する場合、化学発光シグナルを発生することを特徴とするアクセプター粒子；ドナー粒子またはアクセプター粒子のうちの一つの表面に錯体形成された三価金属イオンを含む試薬。キットはまた、以下に記載される本発明の態様による、キナーゼ阻害化合物を検知する方法などの、三価金属媒介均一発光近接アッセイを実施するための使用説明書を含み得る。
【００３８】
キナーゼ阻害化合物を検知する方法であって、この方法は以下を含む：光増感剤およびキナーゼによるリン酸化が可能な表面結合未リン酸化生体分子を含むドナー粒子ならびに粒子表面へ錯体形成した三価金属イオンおよび化学発光化合物（化学発光化合物は、光増感剤が活性化されてそしてドナー粒子およびアクセプター粒子が密に近接する場合、発光シグナルを発生することを特徴とする）を含むアクセプター粒子を含む組成物を提供する工程；候補キナーゼ阻害化合物を組成物に導入する工程；キナーゼを組成物に導入する工程；そして、候補阻害化合物を欠く対照の組成物から発せられる化学発光に対して相対的に減少した化学発光として観察される、候補阻害化合物によるキナーゼの阻害を検知することによって、候補キナーゼ阻害化合物がキナーゼ阻害化合物であることを決定する工程。
【００３９】
ホスファターゼ阻害化合物またはホスホジエステラーゼ阻害化合物を検知する方法であって、この方法は以下を含む：光増感剤およびホスファターゼまたはホスホジエステラーゼによる脱リン酸が可能な表面結合リン酸化生体分子を含むドナー粒子ならびに粒子表面へ錯体形成した三価金属イオンおよび化学発光化合物（化学発光化合物は、光増感剤が活性化されそしてドナー粒子およびアクセプター粒子が密に近接する場合、発光シグナルを発生することを特徴とする）を含むアクセプター粒子を含む組成物を提供する工程；ホスファターゼまたはホスホジエステラーゼを組成物に導入する工程；候補ホスファターゼ阻害化合物または候補ホスホジエステラーゼ阻害化合物を組成物に導入する工程；そして、候補阻害化合物を欠く対照の組成物から発せられる化学発光に対して相対的に増加した化学発光として観察される、候補阻害化合物によるホスファターゼまたはホスホジエステラーゼの阻害を検知することによって、候補ホスファターゼ阻害化合物または候補ホスホジエステラーゼ阻害化合物がホスファターゼ阻害化合物またはホスホジエステラーゼ阻害化合物であることを決定する工程。
【００４０】
本発明の組成物、キットまたは方法のいずれについても以下のことが成立する：活性化された光増感剤は、光源による励起の直後に周囲の酸素を一重項酸素に変換し得る。光源は、レーザーであり得る。光増感剤は、エンドペルオキシドであり得る。化学発光化合物は、チオキセン誘導体であり得る。アクセプター粒子およびドナー粒子は、水性媒体中に分散され得る。密な近接とは，一重項酸素がその寿命の間に水溶液中を動く距離をこえない距離（例えば約２００ｎｍをこえない距離）にあることである。粒子は、ポリマービーズであり得る。ポリマービーズは、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリ塩化ビニル、ポリビニルナフタレンおよびポリメタクリル酸からなる群から選択されるポリマーを含み得る。ポリマービーズは、約０．１重量％〜約２５重量％の、高次アルキル芳香族化合物と高次アルキルオキシ芳香族化合物とフルオロカーボンとからなる群から選択される可塑剤を含み得る。ある場合では、ポリマービーズは、直径が約２０ｎｍ〜約１００μｍであり得る。また他の場合では、ポリマービーズは、直径が約１７５ｎｍ〜約２７５ｎｍであり得る。ビーズは代わりになるべきものとして、ラテックス粒子を含み得る。ある場合、三価金属イオンは、アクセプター粒子表面へ錯体形成され得る；また他の場合、ドナー粒子表面へ錯体形成され得る。三価金属イオンは、ドナー粒子またはアクセプター粒子のうちの一つの表面に、カルボキシメチルリジンおよび１−プロピルアミノ−４−アセタト−１，４，７−トリアザシクロノナンリンカーのうちの一つなどの、例えば１−プロピルアミノ−４−アセタト−１，４，７−トリアザシクロノナンリンカーなどの、Ｎ含有リンカーを媒介として、錯体形成され得る。ドナー粒子はさらに、キナーゼによるリン酸化が可能な生体分子の結合を促進する表面被覆を含み得る。被覆は、相補結合対のうちの一つを含み得る。ドナービーズはさらに、生体分子の生物学的活性を調節するキナーゼによるリン酸化が可能な生体分子である、タンパク質、脂質、核酸およびこれらの構成要素部分からなる群から選択される表面結合生体分子を含み得る。キナーゼは、プロテインセリン／トレオニンキナーゼ、プロテインチロシンキナーゼおよびリピドキナーゼからなる群から選択され得る。例えば、キナーゼは、Ａｋｔキナーゼファミリー、Ａｕｒｏｒａキナーゼファミリー、ＰＤＫ１，ＭＡＰＫＡＰ  Ｋ２、Ｅｒｋキナーゼファミリー、ＣＡＭＫキナーゼファミリー、サイクリン依存性キナーゼ、ＲＡＦキナーゼファミリー、カゼインキナーゼファミリー、ＰＫＣファミリー、ＰＫＡファミリー、ＰＫＢファミリー、ＰＫＧファミリー、ＧＳＫ３β、ＲＯＣＫ、ＳＧＫ、ＲｓｋファミリーおよびＮｅｋファミリーからなる群から選択されるプロテインセリン／トレオニンキナーゼであり得；またはキナーゼは、レセプターチロシンキナーゼおよび細胞質チロシンキナーゼからなる群から選択されるプロテインチロシンキナーゼであり得；またはキナーゼは、ＦＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−Ｋｉｔ、ＩＧＦＲ、インスリンレセプター、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ、ｃ−Ｍｅｔおよびｃ−Ｒｅｔからなる群から選択されるレセプターチロシンキナーゼであり得；またはキナーゼは、Ｓｒｃ、Ｌｃｋ、Ｌｙｎ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｓｙｋ、Ｈｃｋ、ＡｂｌおよびＥｐｈファミリーからなる群から選択される細胞質チロシンキナーゼであり得；またはキナーゼは、ＰＩ３キナーゼ、ＰＩ４キナーゼおよびＰＩ５キナーゼからなる群から選択されるリピドキナーゼであり得る。生体分子はさらに、ドナービーズ上の表面被覆に相補的なリンカーを含み得る。ドナービーズ被覆は、アビジンを、例えばストレプトアビジンを含み得、そして生体分子上の相補的リンカーは、ビオチンを含み得る。アクセプタービーズ上の三価金属イオンとドナービーズ上のリン酸化生体分子のリン酸基との間の生物学的相互作用は、ビーズを密に近接させて保持し得る。三価金属イオンは、Ｇａ３＋、Ｆｅ３＋、Ａｌ３＋、Ｉｎ３＋、Ｒｕ３＋、Ｓｃ３＋およびＹ３＋からなる群から選択され得る。本発明の方法では、候補キナーゼ阻害化合物は、キナーゼ導入の前または導入と同時に導入され得、そしてＡＴＰがさらに組成物に導入され得る。
【実施例】
【００４１】
以下の実施例は、本発明の特定の態様と成分材料とそれらの調製とを例示するために提供される。実施例は、さらに本発明を例示するのに役に立つが、いかなる方法でも本発明の範囲を限定するつもりはない。
【００４２】
（実施例１）
材料と方法
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭストレプトアビジンドナービーズ、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭＮｉ２+−キレートアクセプタービーズおよびＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭ非共役、「未処理」アクセプタービーズは、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）から購入した。ＩＭＡＰＴＭバインディング緩衝液は、５×濃縮物としてＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）から購入した。三価金属イオン塩は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ（ＦｅＣｌ３）およびＡｌｆａ  Ａｅｓａｒ、Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ、ＭＡ（ＧａＣｌ３およびＡｌＣｌ３）から購入した。Ａｋｔ３キナーゼおよびビオチン化Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ基質は、Ｕｐｓｔａｔｅ、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、ＶＡから購入した。シアノ水素化ホウ素ナトリウムおよびカルボキシメチル−Ｌ−リジンは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。本明細書において記載される他の溶液は、ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡから入手した研究等級の材料から製造した。初めに、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭアクセプタービーズに三価金属イオンを錯体形成させる２つの方法が開発されそして以下に記載される。
【００４３】
（方法１）（Ｎｉ２+キレートＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭビーズ上のＮｉ２+の三価の金属イオンとの置換）
１）２５０μｇ（５０μｌの５ｍｇ／ｍｌ）のＮｉ２+キレートアクセプタービーズを遠心（４℃下１３，０００×ｇで２０分間）によりペレット化する。
【００４４】
２）ペレット化したビーズを、１ｍＬストリップ緩衝液（５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８）中に再懸濁する。ボルテックスし、超音波処理しそして暗所下３７℃で１時間インキュベートする。
【００４５】
３）０．１Ｍ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８で３回洗う（４℃下１３，０００×ｇで２０分間）。
【００４６】
４）１ｍＬの１００ｍＭ  Ｍ３+溶液（例えば、ＦｅＣｌ３、ＧａＣｌ３またはＧａＮＯ３）中に再懸濁する。ボルテックスし、超音波処理しそして暗所下３７℃で１時間インキュベートする。
【００４７】
５）１ｍＬのストレージ緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で２回洗う。
【００４８】
６）最後に洗ったものを１００μｌのストレージ緩衝液中に再懸濁する。
【００４９】
（方法２）（三価金属イオンのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭアクセプタービーズへのＮＴＡ（カルボキシメチルリジン）を媒介とした直接結合）
１）以下のものを１．５ｍｌ微量遠心管中に混合する
４００μｇの未処理ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭアルデヒドアクセプタービーズ（４０μｌの２０ｍｇ／ｍｌ）
１０μｌの１％Ｔｗｅｅｎ−２０
８μｌのＮａＣＮＢＨ４（シアノ水素化ホウ素ナトリウム）溶液（２５ｍｇ／ｍｌ）
４００μｇのカルボキシメチルリジン（４０μｌの２０ｍｇ／ｍｌの０．１Ｍ  ＭＯＰＳ、ｐＨ８溶液）
６２μｌの０．１Ｍ  ＭＯＰ、ｐＨ８
２）反応を、震とう下、暗所下３７℃で４８〜６０時間、インキュベートする。
【００５０】
３）１０μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５を加えることで、反応をブロックする。暗所下３７℃で１時間インキュベートする。
【００５１】
４）ビーズをペレット化し、上清をデカントしそしてボルテックスしながら２００μｌの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８中に再懸濁する。
【００５２】
５）ステップ４を２回繰り返す。
【００５３】
６）ビーズを、１．５ｍＭ  ＮａＯＨ中に調製した１００ｍＭ  Ｍ３+溶液（例えば、ＦｅＣｌ３、ＧａＣｌ３またはＧａＮＯ３）中に再懸濁する。暗所下３７℃で１時間インキュベートする。
【００５４】
７）ペレット化（４℃下１３，０００×ｇで２０分間）により洗いそして２００μｌの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８中に再懸濁する。
【００５５】
８）ステップ７を２回繰り返す。
【００５６】
９）最後の洗浄後、ペレットをアクセプタービーズストレージ緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中に再懸濁する。
【００５７】
（結果）
（方法１）
（プロトコール）。ビオチン化Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅペプチド（５５２μＭのストック溶液）およびＡＴＰ（１０ｍＭのストック溶液）を、コンプリートリアクション緩衝液（ＣＲＢ：１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％ＢＳＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．２）中で、それぞれ１μＭおよび２０μＭに希釈し、２×濃縮基質／ＡＴＰ溶液を作製した。Ａｋｔ３キナーゼ（Ｕｐｓｔａｔｅ、およそ２μＭのストック溶液）をＣＲＢ中で２０ｎＭに希釈し、２×濃縮キナーゼ溶液を作製した。１０μｌの２×基質／ＡＴＰ溶液を、１０μｌのＣＲＢのみかまたは１０μｌの２×Ａｋｔ３キナーゼ溶液かのいずれかに混合し（最終アッセイ濃度：１０ｎＭ  Ａｋｔ３、１０μＭ  ＡＴＰ、５００ｎＭ  Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ）そして室温下で２時間インキュベートした。対照として、いくつかの反応物を、潜在的なキナーゼ一般のインヒビターである、スタウロスポリン５μＭと１５分間プレインキュベートした。反応を、３０μｌの、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭストレプトアビジンドナー（１０μｇ／ｍｌ）ビーズおよび三価金属イオン錯体形成アクセプター（２０μｇ／ｍｌ）ビーズの混合物の３×濃縮ＩＭＡＰＴＭバインディング緩衝液の溶液を添加することで停止した。各条件に対する発光カウントを、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａで読み取り、そして図１および図２に示した（図１および図２に示された値は４反復の平均である）。
【００５８】
（方法２）
（プロトコール）。ビオチン化Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅペプチド（５５２μＭのストック溶液）およびＡＴＰ（１０ｍＭのストック溶液）を、コンプリートリアクション緩衝液（ＣＲＢ：１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％ＢＳＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．２）中で、１μＭに希釈し、２×濃縮基質／ＡＴＰ溶液を作製した。この溶液をその後、一続きの１：１希釈し、ペプチド濃度は固定されているが（１μＭ）、ＡＴＰ濃度は異なる（２０μＭ、１０μＭ、５μＭおよび２．５μＭ）溶液を作製した。Ａｋｔ３キナーゼ（Ｕｐｓｔａｔｅ，およそ２μＭのストック溶液）を、ＣＲＢで一続きで希釈し、２×濃縮キナーゼ溶液（２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭおよび２．５ｎＭ）を作製した。
【００５９】
１０μｌの２×基質／ＡＴＰ溶液のそれぞれを、１０μｌのＣＲＢのみかまたは１０μｌの２×Ａｋｔ３キナーゼ溶液濃度のそれぞれのいずれかに混合し（最終アッセイ濃度：１．２５ｎＭ〜１０ｎＭ  Ａｋｔ３、１．２５μＭ〜１０μＭ  ＡＴＰ、５００ｎＭ  Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ）、そして室温下で１時間および２時間インキュベートした。対照としていくつかの反応物を、５μＭのスタウロスポリンと１５分間プレインキュベートした。反応を、最後の２時間のインキュベーション期間の後に、最初に１５μｌのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭストレプトアビジンドナー（０．１μｇ／μｌ）ビーズの混合物の３×濃縮ＩＭＡＰＴＭバインディング緩衝液の溶液の添加、それに続けて１５μｌのＦｅ３+錯体形成アクセプター（０．２μｇ／μｌ）ビーズの３×濃縮ＩＭＡＰＴＭバインディング緩衝液の溶液の添加により停止した。それぞれの条件に対する発光カウントを、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａで読み取り、図３〜図６に示した。
【００６０】
（考察）
この結果は、三価金属イオン（Ｍ３+）置換ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭアクセプタービーズが、キナーゼアッセイを迅速に最適化し有効化するための強力で単純な方法をであり得ることを、明確に示す。Ｍ３+置換ビーズは容易に作製され、最初の実験において約２０のＳ／Ｂ比でＣｒｏｓｓｔｉｄｅのリン酸化を検知するのに成功した。
【００６１】
（実施例２）（三価金属イオンのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭアクセプタービーズへの１−プロピルアミノ−４−アセタト−１，４，７−トリアザシクロノナンを媒介とした直接結合）
三価金属イオンは、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭアクセプタービーズへ、１−プロピルアミノ−４−アセタト−１，４，７−トリアザシクロノナンまたは別のＮ含有複素環を媒介として、上記の方法２においてＮＴＡを媒介とした結合のために記載されているのと同じ方法で、結合し得る。簡単には、未処理ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭアルデヒドアクセプタービーズを、緩衝作用を受けた１−プロピルアミノ−４−アセタト−１，４，７−トリアザシクロノナン、Ｔｗｅｅｎ−２０およびＮａＣＮＢＨ４（シアノ水素化ホウ素ナトリウム）の溶液に混合し得る。反応を、震とう下で、暗所下３７℃下で４８時間〜６０時間インキュベートし、次に、暗所下３７℃下で１時間再びインキュベートする前に、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５の添加によってブロックする。ビーズを次にペレット化し、上清をデカントし、ペレット化したビーズを０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８に再懸濁する。ペレット化工程および再懸濁工程を２回繰り返し、ビーズを１．５ｍＭ  ＮａＯＨ中に調製した１００ｍＭ  Ｍ３+溶液（例えば、ＦｅＣｌ３、ＧａＣｌ３またはＧａＮＯ３）中に再懸濁し、そして暗所下３７℃下で１時間インキュベートする。ビーズを、次に、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８中で数回ペレット化および再懸濁することによって洗浄し、最終的にアクセプタービーズストレージ緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中に再懸濁する。
【００６２】
（実施例３）（１−プロピルアミノ−４−アセタト−１，４，７−トリアザシクロノナンの合成）
１−プロピルアミノ−４−アセタト−１，４，７−トリアザシクロノナンは、いずれの適切な技術によっても入手し得または調製し得、そして例えば、Ａ．Ｗａｒｄｅｎ，Ｂ．Ｇｒａｈａｍ，Ｍ．Ｔ．Ｗ．Ｈｅａｒｎ，Ｌ．Ｓｐｉｃｃｉａ  Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００１，３，２８５５−２８５８（およびＡｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（この文献はその全体を全ての目的について本明細書において参考として援用する）に見られる手順の以下の変形により合成されている。１，４，７−トリアザシクロノナン  ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（２．０ｇ）を、水（１２ｍＬ）に溶解した。水酸化ナトリウム（１．３ｇ）を、部分ごとに３０分にわたり加え、結果として生じた溶液を、室温下で１時間攪拌した。混合物を、真空中で濃縮し白色のペーストとし、これをさらにトルエンから数回濃縮乾燥した。トルエンを、結果として生じた残渣に加え、生じた懸濁液を、数分間超音波処理し、次に白色の固体を除去するためにデカントした。ジメチル酢酸ジメチルホルムアミドを、トルエン溶液に加え、そして混合物を、４時間加熱還流した。反応混合物を、室温まで冷却しそして濃縮しわずかに黄色のオイルとした。このオイルを、アセトニトリル（５ｍＬ）中に溶解し、そしてＮ−（３−ブロモプロピル）フタルイミド（２．１ｇ）を加え、濃い黄色の溶液とした。この溶液を、一晩中攪拌すると白色の沈殿物を生じ、これをろ過によって採取し、アセトニトリルおよびエーテルを用いて洗浄し（ろ液からは、追加の固体を回収した）２．２ｇ（理論値の６７％）の１−（Ｎ−（３−プロピル）フタルイミド）−１，４，７−トリアザシクロノナンオルトアミジニウムブロマイドを得た。ＬＣ／ＭＳ  Ｒｔ＝１．４分、ｍ／ｚ＝３２７であった。１−（Ｎ−（３−プロピル）フタルイミド）−１，４，７−トリアザシクロノナンオルトアミジニウムブロマイド（８７０ｍｇ）を、水（１０ｍＬ）中に溶解し、そして一晩中加熱還流し、次に真空中で濃縮した。残渣の水をトルエンと共蒸発させることで取り除き、粘着性の黄色オイルとし、これを直ちにアセトニトリルに溶解した。５分間の超音波処理の後、炭酸ナトリウム（２ｇ）とブロモ酢酸エチル（０．２９ｍＬ）を加え、そして生じた混合物を２日間加熱還流した。室温まで冷却した後、固体をろ過によって除去し、そしてろ液を真空中で濃縮し、黄色のオイルとした。このオイルを水に溶解しそしてクロロホルム中に抽出した。混合された有機物を硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過しそして濃縮して４９９ｍｇのわずかに黄色のオイルとした。このオイルを５Ｍ  ＨＣｌ（１１ｍＬ）中に溶解しそして２０時間９３℃下で加熱した。この溶液を室温まで冷却し、次に一晩中冷蔵庫中に置き、白色の沈殿物を形成させた。固体をろ過によって除去し、そしてろ液を濃縮しオイル状の残渣とし、これを臭化水素酸（４ｍＬ）および酢酸（４ｍＬ）中に溶解した。２層が観察されるまでエーテルを加え、そして混合物を冷蔵庫に３日間保管した。この結果生じた白色の固体を、窒素のブランケット下のろ過によって採取し、そして水で洗浄した。この固体をさらに真空中で乾燥し、３００ｍｇの表題の化合物を得た。ＬＣ／ＭＳ  Ｒｔ＝０．３��  ｍ／ｚ＝２４５であった。ＮＭＲ（１Ｈ、３００ＭＨｚ）は、公表されているデータと同じであった。
【００６３】
（代替の実施形態）
上記したように、本発明は本明細書において主としてプロテインキナーゼアッセイに言及して記載されるが、これはいずれのリン酸化反応酵素または脱リン酸反応酵素にも広く適用可能である。本発明の組成物および工程の代替の使用は、リピドキナーゼ、ホスファターゼおよびホスホジエステラーゼを含む、他の型の酵素のアッセイにおいてである。
【００６４】
ＰＩ３Ｋのような、リピドキナーゼについては、生理学的反応は、ＰＩ−４，５−Ｐ２〜ＰＩ−３，４，５−Ｐである。ＰＩ（ホスファチジルイノシトール）自体もまた基質として使用され得る。一旦ＰＩまたはＰＩＰ２がリン酸化されれば、ビーズはリン酸の付加によって増加したシグナルを示す。
【００６５】
ホスファターゼおよびホスホジエステラーゼについて、アッセイは、ホスファターゼおよびホスホジエステラーゼがリン酸基を取り除くので、キナーゼアッセイとは逆に働く（例えばホスファターゼインヒビターまたはホスホジエステラーゼインヒビターは、対照に対して相対的に高い化学発光シグナルを発生する）。
【００６６】
（結論）
本発明は、数個の好ましい実施形態に関して記載されたが、これは上で与えられた特定のものに限定されるべきではない。上記の好ましい実施形態の多くの変形形態が使用され得る。それゆえに、本発明は、以下の特許請求の範囲に言及して広く解釈されるべきである。
【００６７】
本明細書において引用された全ての参考文献は、その全体を全ての目的について参考として援用する。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、本発明による三価金属媒介均一発光近接キナーゼアッセイを実施するのに適切な組成物の成分を示す。
【図２】図２は、方法１においてテストされた各条件に対する発光カウントを示すグラフである。
【図３】図３は、方法１においてテストされた各条件に対する発光カウントを示すグラフである。
【図４】図４は、方法２においてテストされた各条件に対する発光カウントを示すグラフである。
【図５】図５は、方法２においてテストされた各条件に対する発光カウントを示すグラフである。
【図６】図６は、方法２においてテストされた各条件に対する発光カウントを示すグラフである。
【図７】図７は、方法２においてテストされた各条件に対する発光カウントを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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