(57)【要約】  本発明は酵母ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）からのリンゴ酸シンターゼ１遺伝子（ＭＬＳ１）のＤＮＡ調節領域の単離に関する。本発明は更に、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞内に導入されＭＬＳ１  ５’調節プロモーターおよびＭＬＳ１  ３’調節ターミネーター領域の調節下で発現されうる異種タンパク質の発現に関する。該ＭＬＳ１プロモーターは、グルコースを含有する培地内では抑制され、グルコース飢餓条件下または酢酸が存在する場合には抑制解除される。
2008507266.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１、（ｂ）配列番号１の相補体、（ｃ）配列番号１に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも９９．９％の同一性を有する核酸配列、および（ｄ）ストリンジェントな条件下で配列番号１にハイブリダイズする核酸配列よりなる群から選ばれる核酸配列を含んでなる又はそれよりなる単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
（ａ）配列番号４、（ｂ）配列番号４の相補体、（ｃ）配列番号４に対して少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも９９．９％の同一性を有する核酸配列、および（ｄ）ストリンジェントな条件下で配列番号４にハイブリダイズする核酸配列よりなる群から選ばれる核酸配列を含んでなる又はそれよりなる単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
該ポリヌクレオチドがピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＭＬＳ１遺伝子の非コード領域の調節領域である、請求項１または２記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項４】
関心のあるタンパク質配列にインフレームで連結された、請求項１または２記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項５】
請求項１または２記載の単離されたポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項６】
請求項１または２記載の宿主細胞。
【請求項７】
ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ）（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サイクタリア（Ｐｉｃｈｉ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｍ）、ピチア・ピイェペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチプチス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）およびピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）よりなる群から選ばれる、請求項６記載の宿主細胞。
【請求項８】
ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属の宿主における異種タンパク質の製造方法であって、（ａ）請求項１または２記載のポリヌクレオチド配列を該宿主内に導入し、（ｂ）該宿主を培養して該異種タンパク質を製造する工程を含んでなる製造方法。
【請求項９】
該異種タンパク質が、エリスロポエチン、サイトカイン、例えばインターフェロン−ａ、インターフェロン−ｂ、インターフェロン−ｇ、インターフェロン−ｗおよび顆粒球−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、凝固因子、例えば因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸおよびヒトプロテインＣ、アンチトロンビンＩＩＩ、トロンビン、可溶性ＩｇＥ受容体ａ鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＧ融合体、ＩｇＭ、インターロイキン、ウロキナーゼ、キマーゼおよび尿トリプシンインヒビター、ＩＧＦ結合性タンパク質、上皮増殖因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮増殖因子−２、骨髄前駆体抑制因子−１、オステオプロテゲリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）、ａ−１−アンチトリプシン、ａ−フェトプロテイン、ＤＮアーゼＩＩ、ヒトプラスミノーゲンのクリングル３、グルコセレブロシダーゼ、ＴＮＦ結合タンパク質１、濾胞刺激ホルモン、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ、膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド、可溶性ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合体、グルカゴン様タンパク質１、ＩＬ−２受容体アゴニスト、および酵母α接合分泌ドメイン（単体または任意の異種配列との融合体）よりなる群から選ばれる、請求項８記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、調節ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの単離、そのような調節配列を含有するベクターおよび発現カセット、ならびに該ベクターおよび／または発現カセットを含む宿主細胞に関する。特に、本発明は、リンゴ酸シンターゼ遺伝子のプロモーター内の５’上流調節ヌクレオチド配列、およびリンゴ酸シンターゼ遺伝子のターミネーター領域内の３’下流調節ヌクレオチド配列、そのような調節配列を含有するベクターおよび発現カセット、ならびに該ベクターおよび／または発現カセットを含む宿主細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
メチロトローフ酵母ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）は組換えタンパク質発現に広く使用されている。ほとんどのピチア（Ｐｉｃｈｉａ）発現ベクターは非常に類似しており、アルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ１）由来のプロモーターを使用するよう設計されている。このメタノール誘導性プロモーターは効率的であり厳密に調節され、異種タンパク質の発現を誘導するために、ここ数年間、成功裏に使用されている（ＣｅｒｅｇｈｉｎｏおよびＣｒｅｇｇ，２０００）。
【０００３】
ＡＯＸＩプロモーターは、その利点にもかかわらず、タンパク質の大規模発現には理想的ではない。なぜなら、要求されるメタノールの量が工学面および安全面での難題をもたらし、例えば、大量のメタノールに関連した揮発性および爆発の危険がいずれの実験室においても重大な問題だからである。さらに、メタノールの添加は所望の組換えタンパク質の発現を誘導するだけでなく、ＡＯＸ１遺伝子によりコードされるタンパク質の発現をも誘導する。これは、代謝上の問題を引き起こす高レベルのアルコールオキシダーゼを与え、細胞の機能および分析を妨げうる（Ｚｕｐａｎら，２００４）。したがって、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における組換えタンパク質の発現のための効率的で厳密に調節されるプロモーターを得ることが望ましい。
【０００４】
イソクエン酸リアーゼおよびリンゴ酸シンターゼはグリオキサル酸回路の鍵酵素であり、エタノールまたは酢酸のようなＣ２基質上での酵母細胞の増殖に必要である。特に、リンゴ酸シンターゼ遺伝子の１つであるＭＬＳ１は非発酵性炭素源上で高度に転写され、これらの培地上での細胞増殖に必須である。ＭＬＳ１プロモーターは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においてレポータータンパク質に融合されると、２％  グルコースの存在下で基底レベルの発現を示し、糖制限条件下で１００倍以上、抑制解除される（Ｃａｓｐａｒｙら，１９９７）。さらに、グルコースおよび酢酸の両方の培地が宿主細胞のための好ましいグルコース、および異種タンパク質誘導のための要求される酢酸を供給する場合には、炭素源代謝を組換えタンパク質の誘導から脱共役させることが可能である。
【０００５】
したがって、酵母種ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）における組換え異種タンパク質の調節発現のためのプロモーターが望まれている。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるＭＬＳ１遺伝子の非コード領域のヌクレオチド配列を含有する調節領域を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明の単離されたポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１、（ｂ）配列番号１の相補体、（ｃ）配列番号１に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも９９．９％（類似性）（同一性）である核酸配列、および（ｄ）ストリンジェントな条件下で配列番号１にハイブリダイズする核酸配列よりなる群から選ばれる核酸配列を含む又はそれよりなる。
【０００７】
本発明は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるＭＬＳ１遺伝子の非コード領域のヌクレオチド配列を含有する調節領域を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明の単離されたポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号４、（ｂ）配列番号４の相補体、（ｃ）配列番号４に対して少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも９９．９％（類似性）（同一性）である核酸配列、および（ｄ）ストリンジェントな条件下で配列番号４にハイブリダイズする核酸配列よりなる群から選ばれる核酸配列を含む又はそれよりなる。
【０００８】
本発明は更に、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属の宿主における異種タンパク質の製造方法であって、（ａ）請求項１または２記載のポリヌクレオチド配列を該宿主内に導入し、（ｂ）該宿主を培養して該異種タンパク質を製造する工程を含む製造方法を提供する。
【０００９】
配列の簡単な説明
配列番号１：ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＭＬＳ１プロモーター。
【００１０】
配列番号２：ＰｐＭＬＳ１−Ｐ／ＵＰプライマー。
【００１１】
配列番号３：ＰｐＭＬＳ１−Ｐ／ＬＰプライマー。
【００１２】
配列番号４：ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＭＬＳ１転写ターミネーター。
【００１３】
配列番号５：ＰｐＭＬＳ１−ＴＴ／ＵＰプライマー。
【００１４】
配列番号６：ＰｐＭＬＳ１−ＴＴ／ＬＰプライマー。
【００１５】
配列番号７：マルチクローニング部位（ＭＣＳ）。
【００１６】
発明の詳細
定義
本明細書中で用いる用語および略語を以下に定義する。
【００１７】
本明細書中で用いる「単離されたポリヌクレオチド」は、該ポリヌクレオチドが由来する生物の天然に存在するゲノムにおいて該ポリヌクレオチドに隣接するヌクレオチド配列の一方または両方を欠くポリヌクレオチドを意味する。この語は、例えば、ベクターもしくは発現カセット、自律複製プラスミドもしくはウイルス、原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ内に組込まれた、または他のポリヌクレオチドから独立した別の分子として存在するポリヌクレオチドまたはその変異体を含む。それは、例えばポリペプチド配列をコードするもののようなハイブリッドポリヌクレオチドの一部である組換えキメラポリヌクレオチドをも含む。「単離されたポリヌクレオチド」は必ずしも、任意の隣接ＤＮＡ配列から物理的に取り出されたポリヌクレオチドを意味するわけではない。
【００１８】
本明細書中で用いる「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は互換的に用いられ、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドの重合（２以上の単量体）形態を意味する。ヌクレオチドは通常、ホスホジエステル結合により連結されているが、この語は、アミノエチルグリシン単位から構成される中性アミドバックボーン結合を含有する重合ヌクレオチドをも含む。したがって、この語は二本鎖および一本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡを含む。それは、該ポリヌクレオチドの非修飾形態だけでなく、公知タイプの修飾、例えば標識、メチル化、「キャップ」、天然で見出されるヌクレオチドの１以上の、類似体での置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結（例えば、メチルホスホナート、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマートなど）、付属部分（例えば、タンパク質、例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなど）、インターカレーター（例えば、アクリジン、プソラレンなど）、キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属など）、アルキレーター、修飾連結（例えば、αアノマー核酸など）を含有するものをも含む。ポリヌクレオチドには、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方が含まれる。
【００１９】
本明細書中で用いる「配列」は、単量体が重合体内で見出される直線状の順序、例えば、ポリペプチド内のアミノ酸の順序、またはポリヌクレオチド内のヌクレオチドの順序を意味する。
【００２０】
本明細書中で用いる、参照核酸配列の「変異体」は、配列においては必ずしも同一ではないが１以上の特定のセグメント内で互いに相同である核酸配列を含む。「縮重オリゴヌクレオチド」または「縮重プライマー」なる語は、配列においては必ずしも同一ではないが１以上の特定のセグメント内で互いに相同である標的核酸配列にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドを示すために用いられる。
【００２１】
本明細書中で用いる「相補的」または「相補体」なる語は、二本鎖核酸において水素結合により会合する塩基プリンおよびピリミジンの対形成を意味する。以下の塩基対が相補的である：グアニンおよびシトシン；アデニンおよびチミジン；ならびにアデニンおよびウラシル。本明細書中で用いるこれらの用語は完全な及び部分的な相補性を含む。
【００２２】
本明細書中で用いる「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基対形成により相補鎖と結合する過程を意味する。２つの同一ではないが非常に類似した相補的核酸のハイブリダイゼーションにおいて用いる条件は、それらの２つの鎖の相補性の度合およびそれらの鎖の長さによって異なる。したがって、この語は、完全なハイブリダイゼーションだけでなく、部分的なハイブリダイゼーションも含む。そのような技術および条件はこの分野の当業者によく知られている。
【００２３】
本明細書中で用いる「発現カセット」は、遺伝子とその発現に必要な調節領域（ベクター内に組込まれうるもの）とを含む遺伝的モジュールを意味する。
【００２４】
本明細書中で用いる「機能的に連結された」は、調節配列とコード配列との間の、配向または距離には無関係な任意の連結を意味し、ここで、該連結は、該調節配列が該コード配列の発現を制御するのを可能にする。
【００２５】
本明細書中で用いる「異種ＤＮＡコード配列」は、リンゴ酸シンターゼタンパク質またはリンゴ酸シンターゼタンパク質の任意のホモログを天然でコードしている配列以外の任意のコード配列を意味する。
【００２６】
本明細書中で特定の遺伝子に関して用いる「調節配列」または「調節領域」は、遺伝子のコード領域の発現の調節を得るのに必要または十分な、その遺伝子内のコードまたは非コードヌクレオチド配列を意味する。したがって、この語はプロモーター配列、調節タンパク質結合部位、上流アクチベーター配列などを含む。調節領域内の特定のヌクレオチドは複数の機能を果たしうる。例えば、特定のヌクレオチドはプロモーターの一部であることが可能であり、転写アクチベータータンパク質の結合に関与しうるる。
【００２７】
本明細書中で用いる「コード領域」は、タンパク質をコードする遺伝子部分を意味する。「非コード領域」なる語は、コード領域ではない遺伝子部分を意味する。
【００２８】
ピチア・パストリスＭＬＳ１プロモーターの単離および誘導
現在入手可能なピチア（Ｐｉｃｈｉａ）発現ベクターは、アルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ１）からのプロモーターを使用するよう設計されている。ＡＯＸ１誘導には大量のメタノールが要求され、このことが工学面および安全面での難題となっていることに加えて、グルコースからメタノールへの変換は大量のＡｏｘ１タンパク質の誘導からの代謝上の問題を引き起こすが、炭素源におけるこの変換は、しばしば、細胞溶解を引き起こす。
【００２９】
ＭＬＳ１プロモーター領域はピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ゲノムから未だクローニングされておらず、それがピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における異種タンパク質のタンパク質発現を促進することは未だ示されていない。本明細書に記載のこのプロモーターおよびターミネーター配列の単離は、異種タンパク質の誘導から炭素源代謝を脱共役させる可能性を伴ったピチア（Ｐｉｃｈｉａ）における異種タンパク質の調節を可能にする。なぜなら、グルコースおよび酢酸の両方の培地は該宿主細胞のための好ましいグルコースおよび異種誘導のために必要な酢酸を供給するからである。
【００３０】
本発明は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるＭＬＳ１遺伝子の非コード領域の一部である調節ヌクレオチド配列を提供する。１つの実施形態においては、ＭＬＳ１遺伝子の５’調節領域は誘導プロモーターであり、好ましくは、エタノールまたは酢酸により誘導され、また、グルコース飢餓条件下で抑制解除されうる。
【００３１】
本発明の１つの態様においては、５’プライマー（ＰｐＭＬＳｌ−Ｐ／ＵＰ）（配列番号２）および３’プライマー（ＰｐＭＬＳ  １−Ｐ／ＬＰ）（配列番号３）を使用して、ＭＬＳ１プロモーターを、ＭＬＳ１遺伝子の直上流の５’調節非コード領域に対応する９２５ヌクレオチドの断片（配列番号１）として、野生型ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＮＲＲＬＹ−１１４３０（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）からクローニングする（実施例１）。ついで、単離された断片を、同じクローニングプライマーを使用して配列決定して、ＭＬＳ１プロモーター配列を確認する。
【００３２】
本発明は、配列番号１、配列番号１の変異体、配列番号１の相補体または配列番号１の相補体の変異体を含有する調節領域を含む単離されたポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態においては、該ポリヌクレオチド（または変異体、または該ポリヌクレオチドもしくは該変異体のいずれかの相補体）は約１０００ヌクレオチド長未満である。もう１つの実施形態においては、該ポリヌクレオチドは約４ヌクレオチド〜約９２５ヌクレオチドである。より好ましくは、該ポリヌクレオチドは、配列番号１に示す９２５ヌクレオチドである。
【００３３】
本発明の１つの実施形態においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＭＬＳ１プロモーターの変異体である配列を含む又はそれよりなる核酸分子は配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有する。該核酸配列は、好ましくは、該野生型プロモーターに対して少なくとも７５％または８０％の同一性を有しうる。より一層好ましくは、該核酸配列は配列番号１に対して８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．９％またはより一層高い同一性を有しうる。
【００３４】
好ましい実施形態においては、本明細書に開示されているＭＬＳ１  ５’調節領域は、少なくとも１つのポリペプチドをコードする異種ＤＮＡコード配列に機能的に連結されうる約９２５ヌクレオチドの断片である。ＭＬＳ１  ５’調節領域に機能的に連結されうる少なくとも１つのポリペプチドをコードする適当な異種ＤＮＡコード配列には、例えば、ヒトプラスミノーゲンのクリングル３（Ｋ３）ドメイン（実施例２）が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明で使用される任意の異種ＤＮＡコード配列は、好ましくは、５’ＡＴＧ開始コドンおよび３’終止コドンを含有する。
【００３５】
また、ヒトＫ３ドメインに機能的に連結された、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＭＬＳ１遺伝子の５’調節領域に由来するＤＮＡ断片を含有するベクターを提供する。ＭＬＳ１遺伝子のプロモーター領域に対応する該ＤＮＡ断片は該宿主株におけるＫ３ドメインの発現を調節しうる。ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）においてＭＬＳ１プロモーターにより調節されるＫ３ドメインの一例を図２に示す。
【００３６】
本発明のもう１つの態様においては、異種ＤＮＡコード配列に機能的に連結されたＭＬＳ１プロモーターの組合せを適当なベクター内に挿入することが可能である。酵母の形質転換のための多数の有用なベクターが記載されており、当業者に公知である。該ベクターは、該ベクターが細菌または酵母において増殖増幅および迅速な増殖を引き起こすのを可能にする必要な要素を含有すべきである（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＣｒｅｇｇ，１９９８，Ｐｉｃｈｉａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）。
【００３７】
ＭＬＳ１  ５’調節領域に機能的に連結されうる異種ＤＮＡ配列には、以下のうちの１つがが含まれるが、それらに限定されるものではない：エリスロポエチン、サイトカイン、例えばインターフェロン−ａ、インターフェロン−ｂ、インターフェロン−ｇ、インターフェロン−ｗおよび顆粒球−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、凝固因子、例えば因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸおよびヒトプロテインＣ、アンチトロンビンＩＩＩ、トロンビン、可溶性ＩｇＥ受容体ａ鎖、ＩｇＧ（例えば、ａ−ＣＤ２０、ａ−ＣＤ３３、ａ−ＴＮＦａ、ａ−ＥＧＦＲ）、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＧ融合体、ＩｇＭ、インターロイキン、ウロキナーゼ、キマーゼおよび尿トリプシンインヒビター、ＩＧＦ結合性タンパク質、上皮増殖因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮増殖因子−２、骨髄前駆体抑制因子−１、オステオプロテゲリン、ａ−１−アンチトリプシン、ａ−フェトプロテイン、ＤＮアーゼＩＩ、ヒトプラスミノーゲンのクリングル３、グルコセレブロシダーゼ、ＴＮＦ結合タンパク質１、濾胞刺激ホルモン、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ、膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド、可溶性ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合体、グルカゴン様タンパク質１、ＩＬ−２受容体アゴニスト、および酵母α接合分泌ドメイン（単体または任意の異種配列との融合体）（Ｌａｒｏｕｃｈｅら，１９９４，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：１１１９−１１２４）。
【００３８】
もう１つの実施形態においては、ＭＬＳ１  ５’調節領域の誘導のための適当な宿主細胞には、好ましくは、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属の酵母が含まれる。本発明のピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属する酵母には、例えば、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ）（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サイクタリア（Ｐｉｃｈｉ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｍ）、ピチア・ピイェペリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチプチス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）および他の酵母が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらにもう１つの実施形態においては、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＭＬＳ１  ５’調節領域の誘導のための適当な宿主細胞には、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ），ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）およびピチア（Ｐｉｃｈｉａ）のような酵母が含まれる。和合性ベクターによる該宿主株内への該プロモーター領域の導入は、当業者に公知の適当な形質転換技術により達成されうる。ＭＬＳ１プロモーターおよびＫ３ドメインを含有するｐＢＫ３９６ベクターの形質転換に関しては、実施例２を参照されたい。
【００３９】
また、転写ターミネーターをコードするピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＭＬＳ１  ３’調節領域を、ｐＢＫ３９６におけるＡＯＸ１転写ターミネーターの代わりに使用することが可能である。５’プライマー（ＰｐＭＬＳ１−ＴＴ／ＵＰ）（配列番号５）および３’プライマー（ＰｐＭＬＳ１−ＴＴ／ＬＰ）（配列番号６）を使用して、ＭＬＳ１転写ターミネーター（配列番号４）を野生型ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＮＲＲＬＹ−１１４３０（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）からクローニングした（実施例２）。このターミネーター断片をＰＣＲにより増幅し、ｐＣＲ２．１ベクター内にサブクローニングした。ついでＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩターミネーター断片をこのベクターからｐＢＫ３９６内のＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ部位内にサブクローニングしてｐＢＫ３９８を得た（図１Ｆ）。
【００４０】
以下は、本発明の組成物および方法を例示する実施例である。これらの実施例は限定的なものと解釈されるべきではなく、該実施例は専ら例示目的で記載されている。
【実施例１】
【００４１】
ＭＬＳ１遺伝子のピチア・パストリス５’調節領域の単離
５’ＰｐＭＬＳｌ−Ｐ／ＵＰプライマー５’ＡＧＡＴＣＴＴＣＣＴＣＡＣＡＧＧＴＡＡＧＧＴＡＧＡＡＴＴＡＣＣ  ３’（配列番号２）および３’ＰｐＭＬＳ  １−Ｐ／ＬＰプライマー  ５’ＧＡＡＴＴＣＴＴＴＴＧＴＧＡＴＡＡＡＧＣＧＧＴＡＡ−ＡＴＣＴＧＧ  ３’（配列番号３）を使用して、ＭＬＳ１  ５’調節プロモーター領域を野生型ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＮＲＲＬＹ−１１４３０（ＡＴＣＣ）からクローニングした。ついで、同じクローニングプライマーを使用して、この９２５ｂｐのＤＮＡ断片を配列決定して、正しいＭＬＳ１プロモーター配列（配列番号１）を確認した。ついで、後記のとおりに該ＭＬＳ１プロモーターを発現ベクター内にサブクローニングしてｐＢＫ３９６を得た。
【実施例２】
【００４２】
プラスミドｐＢＫ３９６およびｐＢＫ３９８の構築ならびにＭＬＳ１プロモーターの制御下のクリングル３の発現
発明者が設計したマルチクローニング部位（ＭＣＳ）（配列番号７）をｐＵＣ１９ベクター（図１Ａ）のＡａｔＩＩ／ＡｆｌＩＩＩ部位内にサブクローニングしてベクターｐＢＫ２８９（図１Ｂ）を得た。ＡＯＸ１転写ターミネーター配列と１．２ｋｂのＡｈｄＩ／ＢｇｌＩＩゼオシン耐性カセット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とを含有する２５７ｂｐのＮｏｔ１／ＢａｍＨ１断片をｐＢＫ２８９内にサブクローニングしてｐＢＫ３４２．５を得た（図１Ｃ）。ＭＬＳ１遺伝子の５’調節領域を含有する９２５ｂｐ  ＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片をｐＢＫ３４２．５のＢｇｌＩＩ／ＥｃｐＲＩ部位内にサブクローニングしてｐＢＫ３８１（図１Ｄ）を得た。
【００４３】
平滑末端を得るために埋められた５’ＢｓｔＢＩおよび３’ＡｃｃＩ部位を有するヒトプラスミノーゲンクリングル３  ＤＮＡ配列をｐＢＫ３８１の平滑末端化ＡｆｅＩ部位内にサブクローニングしてｐＢＫ３９６（図１Ｅ）を得た。ＭＬＳ１  ３’ターミネーター領域をコードするＢａｍＨＩ／Ｎｏｔ１断片をｐＢＫ３９６内にサブクローニングしてＡＯＸ１ターミネーターを置換して、ｐＢＫ３９８（図１Ｆ）を得た。これらのベクターｐＢＫ３９６およびｐＢＫ３９８をＡｖｒＩＩ（該プラスミドのＭＬＳ１プロモーター領域内のＡｖｒＩＩ部位）で線状化した後、エレクトロポレーションによりピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＰＢＰ３３（ｈｉｓ４，ａｒｇ４，ｕｒａ３，ａｄｅ１，ｏｃｈ１：：ＵＲＡ３，ａｄｅ１：：ＡＤＥｌ）内に形質転換して株ＢＫＹ２８５を得た（実施例３を参照されたい）。
【実施例３】
【００４４】
ＢＫＹ２８５およびＢＫＹ２８５．１を得るためのピチア・パストリス株ＰＢＰ３３内へのｐＢＫ３８６およびｐＢＫ３８８ベクターの形質転換
１．酢酸ナトリウムを最終濃度０．３Ｍまで加えることにより、ｐＢＫ３８６およびｐＢＫ３８８のベクターＤＮＡを調製した。ついで１００％  氷冷エタノールを最終濃度７０％で該ＤＮＡサンプルに加えた。該ＤＮＡを遠心分離（１２０００ｇ×１０分）によりペレット化し、７０％  氷冷エタノールで２回洗浄した。該ＤＮＡを乾燥させ、５０ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）に再懸濁させた。形質転換すべきＰＢＰ３３酵母培養（前記）を、ＢＭＧＹ（緩衝化最少グリセロール：１００ｍＭ  リン酸カリウム，ｐＨ６．０；１．３４％  酵母窒素ベース；４×１０−５％  ビオチン；１％  グリセロール）内で、より小さな培養を〜２．６のＯ．Ｄ．まで成長させることにより、調製した。ついで該酵母細胞を、１Ｍ  ソルビトール中で３回洗浄し１ｍｌ以下〜２ｍｌの１Ｍ  ソルビトールに再懸濁させることによりエレクトロコンピテントにした。ベクターＤＮＡ（１〜２ｍｇ）を１００ｍｌのコンピテント酵母と混合し、氷上で１０分間インキュベートした。ついで、以下のパラメーターを使用するＢＴＸ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ  ６００で酵母細胞をエレクトロポレーションした：１．５ｋＶ、１２９オームおよび２５ｍＦ。１ｍｌのＹＰＤＳ（１％  酵母エキス、２％  ペプトン、２％  デキストロース、１Ｍ  ソルビトール）を、エレクトロポレーションされた細胞に加えた。ついで、形質転換された酵母を、ゼオシンを含有する選択寒天プレート上でプレーティングした。ＰＢＰ３３におけるｐＢＫ３８６はＢＫＹ２８５を与え、ＰＢＰ３３におけるｐＢＫ３８８はＢＫＹ２８５．１を与えた。
【００４５】
ピチア・パストリスＢＫＹ２８５およびＢＫＹ２８５．１のための培養条件
１００μｇ／ｍｌ  ゼオシンを含有するＹＰＤ培地上でインキュベーションした後、コロニーを再ストリークした。ゼオシン耐性クローンを選択し、緩衝化デキストロース複合培地（ＢＭＤＹ）（１％  酵母エキス、２％  ペプトン、１００ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０）、１，３４％  酵母窒素ベース、４×１０−５％  ビオチンおよび２％  グルコース）内で２日間増殖させ、ついで回収し、０．５％  ＮａＯＡｃを含有する緩衝化酢酸誘導培地−ＢＭＡｃＹに１日間再懸濁させた。
【実施例４】
【００４６】
ＭＬＳ１プロモーターおよびターミネーターにより調節されたクリングル３発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
株ＢＫＹ２８５におけるクリングル３タンパク質の誘導および非誘導培養をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図２）。適当な量のサンプルローディングバッファーおよび培地を、製造業者の指示（ＮｕＰＡＧＥ  ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ電気泳動系；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）に従い成型ゲルを含有するドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付した。該ゲルタンパク質をクーマシーブリリアントブルー染色（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で染色した。
【００４７】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１−１】図１Ａは、実施例２に記載されているとおりに使用されるｐＵＣ１９ベクターを示す。図１Ｂは、実施例２に記載の発現ベクターｐＢＫ２８９を示す。
【図１−２】図１Ｃは、実施例２に記載の発現ベクターｐＢＫ３４２．５を示す。図１Ｄは、実施例２に記載のｐＢＫ３８１を示す。
【図１−３】図１Ｅは、実施例２に記載のｐＢＫ３９６を示す。図１Ｆは、実施例２に記載のｐＢＫ３９８を示す。
【図２】株ＢＫＹ２８５からの培養上清のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーン１：分子量マーカー（ＭＷ）、レーン２：グルコース抑制（「非誘導」）培養上清、レーン３：グルコース飢餓（「誘導」）培養上清［これは、（実施例４に示すとおり）ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）誘導性ＭＬＳ１プロモーターの制御下のヒトプラスミノーゲンクリングル３レポータータンパク質の誘導を示す］。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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