(57)【要約】  標的ポリペプチドのアミノ酸配列を、そのポリペプチドをコードする標的ＤＮＡ配列を改変することにより改変する方法であって、標的ＤＮＡ配列にトランスポゾンを導入するステップを含み、該トランスポゾンは、その末端のそれぞれに向かう第１の制限酵素の認識配列を含み、該認識配列は、トランスポゾンの残りの部分にも、標的ＤＮＡ配列中にも、あるいは標的ＤＮＡ配列を含む構築物中にも存在せず、該第１の制限酵素の認識配列は、アウトサイドカッターである第１の切断酵素によって認識され、また、該トランスポゾンの末端の端を越えて位置するＤＮＡ切断部位を該第１の制限酵素が有するように位置することを特徴とする方法、が提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ポリペプチドのアミノ酸配列を、そのポリペプチドをコードする標的ＤＮＡ配列を改変することにより改変する方法であって、標的ＤＮＡ配列にトランスポゾンを導入するステップを含み、該トランスポゾンは、その末端のそれぞれに向かう第１の制限酵素の認識配列を含み、該認識配列は、トランスポゾンの残りの部分にも、標的ＤＮＡ配列中にも、あるいは標的ＤＮＡ配列を含む構築物中にも存在せず、該第１の制限酵素の認識配列は、アウトサイドカッターである第１の切断酵素によって認識され、また、該トランスポゾンの末端の端を越えて位置するＤＮＡ切断部位を該第１の制限酵素が有するように位置することを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、挿入又は置換によって改変される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つのアミノ酸が、前記標的ポリペプチドのアミノ酸配列に挿入される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
単一のアミノ酸が、前記標的ポリペプチドのアミノ酸配列に挿入される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つのアミノ酸が、前記標的ポリペプチドのアミノ酸配列から欠失される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
単一のアミノ酸が、前記標的ポリペプチドのアミノ酸配列から欠失される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ａ）前記トランスポゾン、前記標的ＤＮＡ及びトランスポザーゼ酵素を混合することを含む転移反応を行うステップ、
ｂ）前記トランスポゾンに含まれる第１の制限酵素の認識配列を認識する第１の制限酵素により、（ａ）由来のＤＮＡを消化するステップ、
ｃ）前記トランスポゾンを含まないＤＮＡを分離するステップ、
ｄ）（ｃ）由来のＤＮＡの分子内ライゲーション反応を行うステップ、及び
ｅ）（ｄ）由来のＤＮＡからタンパク質を発現させるステップ
を含む、請求項３〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記標的ポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸で置換される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
前記標的ポリペプチドのアミノ酸配列の単一のアミノ酸が別のアミノ酸で置換される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ａ）前記トランスポゾン、前記標的ＤＮＡ及びトランスポザーゼ酵素を混合することを含む転移反応を行うステップ、
ｂ）前記トランスポゾンに含まれる第１の制限酵素の認識配列を認識する第１の制限酵素により、（ａ）由来のＤＮＡを消化するステップ、
ｃ）前記トランスポゾンを含まないＤＮＡを分離するステップ、
ｄ）（ｃ）由来のＤＮＡと第２のＤＮＡ配列との分子間ライゲーションを行うステップであって、第２のＤＮＡ配列は少なくとも２つの第２の制限酵素の認識部位を含み、第２の制限酵素の認識部位は切断部位の少なくとも１つが第２のＤＮＡ配列の末端にはないように位置することを特徴とする、ステップ、
ｅ）（ｄ）由来のＤＮＡで宿主生物を形質転換し、前記第２のＤＮＡ配列を含む細胞を選択するステップ、
ｆ）（ｅ）において選択される細胞からＤＮＡを単離し、そのＤＮＡを第２の制限酵素の認識部位を認識する第２の制限酵素で消化するステップであって、第２の制限酵素はアウトサイドカッターであることを特徴とする、ステップ、
ｇ）（ｆ）由来のＤＮＡの分子内ライゲーションを行うステップ、及び
ｈ）（ｇ）由来のＤＮＡからタンパク質を発現させるステップ
を含む、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２の制限酵素が、前記第１の制限酵素と同じである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２のＤＮＡ配列が、第２のＤＮＡ配列を含まない細胞と比較して選択可能な特徴を第２のＤＮＡ配列を含む宿主細胞に与える遺伝子を含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的ポリペプチドのアミノ酸配列が、さらなるアミノ酸配列の挿入により改変される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）前記トランスポゾン、前記標的ＤＮＡ及びトランスポザーゼ酵素を混合することを含む転移反応を行うステップ、
ｂ）前記トランスポゾンに含まれる第１の制限酵素の認識配列を認識する第１の制限酵素により、（ａ）由来のＤＮＡを消化するステップ、
ｃ）前記トランスポゾンを含まないＤＮＡを分離するステップ、
ｄ）さらなるアミノ酸配列をコードする第３のＤＮＡ配列と（ｃ）由来のＤＮＡとの分子間ライゲーションを行うステップ、及び
ｅ）（ｄ）由来のＤＮＡからタンパク質を発現させるステップ
を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記さらなるアミノ酸配列が、全タンパク質、タンパク質ドメイン又はタンパク質断片である、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質断片がエピトープである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記タンパク質断片が結合ドメインである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記タンパク質断片がアロステリック部位である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記タンパク質断片は明確な機能領域である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記タンパク質断片がオリゴマー化の接合部分である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記第３のＤＮＡ配列が、第３のＤＮＡ配列を含まない細胞と比較して選択可能な特徴を第３のＤＮＡ配列を含む宿主細胞に与える遺伝子を含む、請求項１４〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記第３のＤＮＡ配列が、前記標的ＤＮＡのものと同じオープンリーディングフレームを有する、請求項１４〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記第３のＤＮＡ配列が終止コドンを含む、請求項１４〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記第３のＤＮＡ配列が開始コドンを含む、請求項１４〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記第１の制限酵素がＩＩＳ型酵素である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記第１の制限酵素がＭｌｙＩである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記トランスポゾンは標的部位の選択性が低い、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記トランスポゾンがｍｉｎｉ−Ｍｕ、ＡＴ−２又はＴｎ５のうちの１つに由来する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記トランスポゾンが、トランスポゾンを含まない細胞と比較して選択可能な特徴をトランスポゾンを含む宿主細胞に与える遺伝子を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記トランスポゾンが、５’末端として５’−ＮＧＡＣＴＣ−３’及び３’末端として５’−ＧＡＧＴＣＮ−３’のＤＮＡ配列を含むか、又は、５’末端として５’−ＮＮＮＮＧＡＣＴＣ−３’及び３’末端として５’−ＧＡＧＴＣＮＮＮＮ−３’のＤＮＡ配列を含むか、又は、５’末端として５’−ＴＧＴＴＧＡＣＴＣ−３’及び３’末端として５’−ＧＡＧＴＣＡＡＣＡ−３’のＤＮＡ配列を含むか、又は、５’末端として５’−ＣＴＧＡＣＴＣ−３’及び３’末端として５’−ＧＡＧＴＣＡＧ−３’のＤＮＡ配列を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記標的ＤＮＡがプラスミド中に保持される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記プラスミドがｐＮＯＭ又はその誘導体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
末端のそれぞれに向かって制限酵素の認識配列を含むトランスポゾンであって、該認識配列はトランスポゾンの残りの部分には存在せず、アウトサイドカッターである制限酵素に対する認識配列であり、また、トランスポゾンの末端の端を越えて位置するＤＮＡ切断部位を該制限酵素が有するように位置していることを特徴とする、トランスポゾン。
【請求項３４】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法に使用するに適した、請求項３３に記載のトランスポゾン。
【請求項３５】
それぞれの制限酵素の認識配列が、トランスポゾンの末端から１から２０ヌクレオチドの位置に存在している、請求項３３又は３４に記載のトランスポゾン。
【請求項３６】
それぞれの制限酵素の認識配列が、トランスポゾンの末端から１、２、３、４又は５ヌクレオチドの位置に存在している、請求項３５に記載のトランスポゾン。
【請求項３７】
前記制限酵素がＭｌｙＩである、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載のトランスポゾン。
【請求項３８】
５’末端として５’−ＮＧＡＣＴＣ−３’及び３’末端として５’−ＧＡＧＴＣＮ−３’のＤＮＡ配列を含む、請求項３７に記載のトランスポゾン。
【請求項３９】
５’末端として５’−ＮＮＮＮＧＡＣＴＣ−３’及び３’末端として５’−ＧＡＧＴＣ
ＮＮＮＮ−３’のＤＮＡ配列を含む、請求項３７に記載のトランスポゾン。
【請求項４０】
５’末端として５’−ＴＧＴＴＧＡＣＴＣ−３’及び３’末端として５’−ＧＡＧＴＣＡＡＣＡ−３’のＤＮＡ配列を含む、請求項３７に記載のトランスポゾン。
【請求項４１】
５’末端として５’−ＣＴＧＡＣＴＣ−３’及び３’末端として５’−ＧＡＧＴＣＡＧ−３’のＤＮＡ配列を含む、請求項３７に記載のトランスポゾン。
【請求項４２】
５’末端及び／又は３’末端のＤＮＡ配列において少なくとも１つの変異を含み、転移能力を有することを特徴とする、請求項４０又は４１に記載のトランスポゾン。
【請求項４３】
図１に示されるＤＮＡ配列を有するプラスミド。
【請求項４４】
請求項４３に記載のプラスミドの誘導体であるプラスミド。
【請求項４５】
請求項３３〜４２のいずれかに記載のトランスポゾンを含むキット。
【請求項４６】
請求項４３又は４４に記載のプラスミドをさらに含む、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
トランスポザーゼをさらに含む、請求項４５又は４６に記載のキット。
【請求項４８】
少なくとも１つの緩衝液をさらに含む、請求項４５〜４７のいずれかに記載のキット。
【請求項４９】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項４５〜４８のいずれかに記載のキット。
【請求項５０】
請求項１〜３２のいずれかに記載の方法で使用するための、請求項４５〜４９のいずれかに記載のキット。
【請求項５１】
標的ポリペプチドに突然変異を導入することがそのポリペプチドの検出可能な活性を変えるか否かを判定する方法であって、請求項１〜３２のいずれかに記載の方法を含み、
ａ）改変されていない標的ポリペプチドと比較して、改変された標的ポリペプチドの活性の相違をスクリーニングするステップ、及び
ｂ）改変された標的ポリペプチドをシークエンシングして、アミノ酸の挿入、欠失又は置換の位置を決定するステップ
をさらに含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的ポリペプチドにおける少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失又は置換によって標的ポリペプチドのアミノ酸配列を変える方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の突然変異
自然界では、無数のタンパク質を、生命体に適応した機能を発揮するように進化させてきた。遺伝子配列の変化は、タンパク質のアミノ酸組成の変化に翻訳される。自然界では、ヌクレオチドの置換、欠失又は挿入が、進化の過程において利用されている(Chothia, C.他(2003) Science 300 1701-1703)。単一のヌクレオチドの置換が、その特定の位置でアミノ酸をコードする情報を変えることによってアミノ酸の特性に変化をもたらし得る。選択圧は、３つのヌクレオチド又はこれらの倍数の欠失又は挿入が、遺伝子のリーディングフレームを維持するため好ましいことを意味している(Taylor, M.他(2004) Genome Res. 14 555-566)。分岐進化の過程において、多くの置換及び挿入−欠失（インデル）突然変異によって、タンパク質の組成の変化がもたらされる(Taylor, M.他(2004)、Lesk, A.M.(2001)著「タンパク質構造概論(Introduction to protein architecture)」Oxford University Press, Oxford、Pascarella, S.及びArgos, P.(1992) J. Mol. Biol. 224 461-471)。これらの変化の多くは、タンパク質の特性、特に、折り畳み、リガンド又は基質結合、タンパク質−タンパク質相互作用、並びに温度依存性の活性及び安定性に対して多大な影響を持つ。例えば、置換突然変異導入による免疫グロブリン可変ドメインの配列変化はアミノ酸の欠失及び挿入によって促進され(de Wildt, R.M.他(1999) J. Mol. Biol. 294 701-710)、また、構造的に相同なサブチリシンセリンプロテアーゼの間では、触媒作用、基質認識及びカルシウム結合に重要であることが知られている領域などにおいて、様々な置換及びインデル事象が観察されている(Siezen, R.J.及びLeunissen, J.A.(1997) Protein Sci. 6 501-523)。
【０００３】
標的遺伝子全体にわたるランダムな突然変異の導入は、タンパク質の特性を変える有力な方法である(Tao, H.及びCornish, V.W.(2002) Curr. Opin. Chem. Biol. 6 858-864及びArnold, F.H.(2001) Nature 409 253-257を参照されたい)。現行の技術の大部分は、アミノ酸の置換に至る点突然変異の導入に焦点を当てている(Dalby, P.A.(2003) Curr. Opin. Struct. Biol. 13 500-505、Lutz, S.及びPatrick, W.M.(2004) Curr. Opin. Biotechnol. 15 291-297及びその中の参考文献)。これらの方法は通常、１つのコドンにつき１つのヌクレオチド塩基対を変化させることに限定されるため、その位置で利用可能なアミノ酸の種類は限定され、あるいは自然発生的な遺伝的多様性に依存することになる。いくつかの方法、例えばペンタペプチド走査突然変異法(scanning mutagenesis)(Hallet, B.他(1997 Nucleic Acids Res. 25 1866-1867、以下にさらに記載))、並びにランダム挿入及び欠失（ＲＩＤ）(Murakami, H.他(2002) Nat. Biotechnol. 20 76-81)が、アミノ酸の挿入を行うために使用されてきた。ＲＩＤ法は、単一アミノ酸の欠失の導入に利用可能性があるが、現在までのところはアミノ酸の置換又は挿入の導入のみに適用されている。さらに、この処理は複雑であり、好ましくない二次的突然変異が導入される傾向がある(Murakami, H.他(2002))。
【０００４】
単一コドンの挿入又は欠失は、自然界で観察されるインデル突然変異の最も一般的な形態の１つであり、進化の過程に対する重要性を示している(Taylor, M.他(2004))。このような事象をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて模倣することにより、タンパク質構造及びタンパク質機能に対するインデル突然変異の影響に関する我々の理解が進み、また、特定の用途に対するタンパク質の特性を向上させる我々の能力が高められることになろう。現在、イン
デル突然変異を導入する最も一般的な方法は理論的設計によるものであるため、欠失させるべき残基の決定には構造的情報が必要になり、またそれぞれの突然変異に対して別々のオリゴヌクレオチドが必要になるだろう。
【０００５】
トランスポゾン
トランスポゾンは、ＤＮＡ配列にランダムに挿入することができる、遺伝子情報の可動性の断片である(Reznikoff他(1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 266 729-734)。ほとんどのトランスポゾンは、これに関する共通の一般的なメカニズムに従う(Mizuuchi(1992) Annu. Rev. Biochem. 61 1011-1051、Craig(1995) Science 270 253-254)。トランスポゾンは、そのそれぞれの末端に逆向き反復配列から成る認識配列を有しており、すなわちこの末端は逆方向の同一配列を有している。トランスポザーゼ酵素はこれらの認識配列を認識して結合することによって、タンパク質−ＤＮＡ複合体を形成する。その後、このタンパク質−ＤＮＡ複合体が、ＤＮＡの切断反応及び連結反応を触媒することによって、標的ＤＮＡへのトランスポゾンの挿入を促進する。例えば、Ｍｕトランスポゾンの場合、ＭｕＡがトランスポザーゼとして作用する。Ｍｕトランスポゾンの挿入前に、標的ＤＮＡにおいて５ｂｐの互い違いの切断が行われる。反対側のＤＮＡ鎖上に生じた５ｂｐのギャップは、必要に応じて宿主生物により、あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて適切な酵素を使用することにより補われる。その結果、トランスポゾンの挿入に加えて、トランスポゾンの片側に５ｂｐの標的ＤＮＡの反復が生じる。Ｔｎ５トランスポゾンの場合、９ｂｐの互い違いの切断を行い、トランスポゾンの片側に９ｂｐの標的ＤＮＡの反復がもたらされる(Reznikoff他(1999)、Steiniger-White他(2004) Curr. Opin. Struct. Biol. 14 50-57)。特に、ｍｉｎｉ−Ｍｕ及びＴｎ５転移反応は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用に適合するようになっており、この反応は、標的部位の優先度が非常に低いため、トランスポゾンの挿入を所与の遺伝子における任意の点で行うことができる(Goryshin及びReznikoff(1998)
J. Biol. Chem. 273, 7367-7374、Haapa他(1999) Nuc. Ac. Res. 27, 2777-2784)。
【０００６】
制限酵素
制限エンドヌクレアーゼは、特定のヌクレオチド配列を認識してＤＮＡを切断する酵素の種類である。ＩＩ型酵素は、特定の種類の制限エンドヌクレアーゼである。それら酵素の認識部位は、パリンドロームであるか、部分的にパリンドロームであるか、又は中断されたパリンドロームである。ランダムにＤＮＡを切断するＩ型及びＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼとは異なり、ＩＩ型酵素は、通常、認識配列内の特定の部位でＤＮＡを切断する。ＩＩＳ型酵素は、一般的なＩＩ型酵素に当てはまらないいくつかの特徴を有する亜型である。これらのＩＩＳ型酵素は、一般的に認識配列の外側で切断された少なくとも１本の鎖によって、パリンドロームではない又は非対称のヌクレオチド配列を認識する（これらのＩＩＳ型酵素は、いわゆる「アウトサイドカッター（outside cutter）」である）。このようなＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの１つの例は、ＭｌｙＩである。ＭｌｙＩは、パリンドロームではないＤＮＡ配列を特異的に認識し、認識配列から５ｂｐ離れた部位を切断することにより、平滑末端を形成する（５’ＧＡＧＴＣＮＮＮＮＮ↓３’、認識配列には下線が付され、ＮはＧ、Ａ、Ｔ又はＣのいずれかが許容されることを示し、矢印は切断位置を示す）。他のＩＩ型酵素は、ＩＩＢ亜型、ＩＩＥ亜型、ＩＩＧ亜型及びＩＩＰ亜型であり、これらはＩＩＳ型の亜型といくつかの特徴を共有する。例えば、これらの亜型の内のいくつかは、アウトサイドカッターとして分類される。
【０００７】
既知のタンパク質の突然変異導入法
米国特許第５，８４３，７７２号は、ＡＴ−２として知られる人工のトランスポゾンに関する。ＤＮＡベクターから平滑末端化したトランスポゾンを分離させるために、制限酵素の認識部位が付加された。認識配列自体の内部で切断する制限酵素によって、制限酵素の認識部位が認識される。この特許は主として、人工のトランスポゾンを形成し、それらをＤＮＡ配列に挿入する方法に関する。
【０００８】
Vilen他(J. Virol.(2003) 77 123-134)は、ウイルスゲノムにおける遺伝子をマッピングするためのトランスポゾンの使用に関する。Vilen他に開示されているトランスポゾンは、標的ポリペプチドのアミノ酸配列を変える方法において使用するには適していない。
【０００９】
米国特許第４，８３０，９６５号は、ＤＮＡ配列をトランスポゾン内の点に挿入させるための制限酵素の認識部位の導入に関する。制限酵素の認識部位は、トランスポゾンの末端には位置していない。
【００１０】
米国特許第５，７２８，５５１号は、上述のペンタペプチド走査突然変異法に関し、以下でより詳細に論じられる。コドン挿入による突然変異誘発の方法の案について言及されてはいるが、そのような方法が行われたことを示すデータは提供されていない。トランスポゾンの末端近くにＳｒｆＩ制限酵素の認識配列を位置させ、このＳｒｆＩ制限酵素がその認識配列内で切断することを提案している。標的ＤＮＡにこのようなトランスポゾンを挿入し、次いでＳｒｆＩを使用して取り除くことにより、トランスポゾンが取り除かれた結果としてギャップを有する標的ＤＮＡがもたらされるが、このギャップの末端は、該ＤＮＡのＳｒｆＩ切断位置の結果として、いくつかのトランスポゾン由来のヌクレオチドを含む。したがって、挿入されるコドンの配列は、トランスポゾンの末端の配列によって部分的に決定されるので、所与のトランスポゾンを使用して挿入することができる特定のコドンは限定されることになろう。
【００１１】
Hayes他(Applied & Environmental Microbiology(1990) 56, 202-209)は、遺伝子ノックアウトを形成するためにトランスポゾンを使用すること、及び細胞内のプラスミド複製に必須の遺伝子の位置をマッピングするためにトランスポゾン内の制限酵素部位を使用することに関する。
【００１２】
ＴＥＭ−１は、β−ラクタム系抗生物質に対する菌の耐性の主因の１つであることから、臨床的に重要なタンパク質である。ＴＥＭ−１には、新規の広範なスペクトル（ＥＳ）のβ−ラクタム系抗生物質に対する耐性を与えるように進化した多くの自然変異体が存在する（http://www.lahey.org/Studies/temtable.asp、参考文献の例として、Matthew, M.
& R.W.Hedges(1976) J. Bacteriol. 125 713-718、Chanal, C.M.他(1989) Antimicrob. Agents Chemother. 33 1915-1920、Goussard, S.及びCourvalin, P.(1999) Antimicrob. Agents Chemother. 43 367-370、が挙げられる。)。ＴＥＭ−１の自然発生的な欠失変異体は存在しないが、ＥＳ  β−ラクタムに対する菌の耐性の一因となるＳＨＶ−９及びＳＨＶ−１０(Prinarakis, E.E.他(1997) Antimicrob. Agents Chemother. 41 838-840)並びにＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＰＣ１(Zawadzke, L.E.他(1995) Protein Eng. 8 1275-1285)のような相同的なβ−ラクタマーゼにおいては、アミノ酸の欠失が観察されている。ＴＥＭ−１は多くのタンパク質工学の研究の焦点でもあり(Matagne, A.他(1998) Biochem. J. 330(Pt2) 581-598)、そのような研究として、どのアミノ酸残基が突然変異に耐性がないかを判定するための全てのアミノ酸のランダム置換(Huang, W.他(1996) J. Mol. Biol. 258
688-703)、指向進化(例えばCamps, M.他(2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 100 9727-9732、Stemmer, W.P.(1994) Nature 370 389-391)、及びペンタペプチド走査突然変異法(Hayes, F.他(1997) J. Biol. Chem. 272 28833-28836)などが挙げられる。ペンタペプチド走査突然変異法は、トランスポゾンの挿入、及びＮｏｔＩ（５’ＧＣ↓ＧＧＣＣＧＣ３’）又はＰｍｅＩ（５’ＧＴＴＴ↓ＡＡＣ３’）等の、標準的な、レアカットな（rare-cutting）ＩＩ型制限酵素によるトランスポゾンの除去に関する。この方法の主な欠点は、導入することができる配列変化が制限されているということである。トランスポゾンを除去するための制限酵素消化の際には、常に、制限部位を含むトランスポゾンの断片と共に、標的ＤＮＡの５ｂｐの重複領域が、最終的な修飾された標的ＤＮＡに組み込まれる。したがって、このことは、通常５アミノ酸長より大きい、所定の組のアミノ酸の挿入をも
たらす。アミノ酸の置換又は欠失はサンプルにならず、単一アミノ酸などの程度の小さい挿入もまたサンプルにはならない。
【００１３】
上記の方法に関する改善点は、米国公開特許第２００５／００７４８９２号に開示されている。その文献に開示されている方法においては、トランスポゾンが標的ＤＮＡ配列に挿入され、このトランスポゾンはＩＩＳ型ではない制限酵素を使用して切り出され、トランスポゾンの切り出しによって形成されるギャップを有する標的ＤＮＡが残される。ギャップのそれぞれの末端には、いくつかのトランスポゾン由来のヌクレオチド及びトランスポゾンの挿入により生じる重複ヌクレオチドが含まれる。この方法で使用されるトランスポゾンは市販されており、この処理に使用するために改変されてはいない。さらに、この方法は、さらなる非転移ＤＮＡ配列を順次挿入及び欠失させることを含み、最終的に標的ＤＮＡ配列からトランスポゾン由来のヌクレオチドを取り除くための複数の制限エンドヌクレアーゼによる消化工程を伴う。この冗長な処理によって、最終的に標的ＤＮＡ配列内への単一コドンの挿入、欠失又は置換が可能になる。
【００１４】
「分子スイッチ」の形成
所望の入力に応じてその性質を変えることができる分子を設計及び生成する能力によって、新規の検出及び変換装置が作られる重要で新たな可能性が生じるであろう。この分子スイッチの概念は、化学信号を検出し、この化学信号を適切な細胞応答に変換する先導の役割を果たすタンパク質と共に、自然界において十分に確立されている(Monod他(1963) J. Mol. Biol. 6 306-329、Changeux及びEdelstein(2005) Science 308 1424-1428)。出力が所望の入力と対になるタンパク質を作出することは、対象物質に合わせて調整した（tailored）バイオセンサーや新規のインテリジェント材料の形成等の、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでの多種多様の用途に対する可能性を有する。天然のタンパク質スイッチを使用することが最も簡単であると考えられるが、これらは、定まった生物学的状況の範囲内において特定の機能を果たすように進化しており、特定の用途に必要な特性は有していないかもしれない。したがって、分子スイッチを形成するための一般的な試みとして、本来は異種であるタンパク質の機能を結合しても良い。
【００１５】
天然のアロステリックタンパク質は、空間的に異なる調節部位及び活性部位を有する(Monod他(1963)、Changeux及びEdelstein(2005))。調節部位へのエフェクター分子の結合は、急速に且つ可逆的にタンパク質活性を直接調節することができる立体構造変化を引き起こす。任意の人工のアロステリックタンパク質がこのメカニズムを模倣することが理想的であろう。天然のスイッチの再構築に比べて簡単でより効果的な戦略としては、結合による立体構造変化を通じて本来は異種であるタンパク質の機能を結合することである(Buskirk及びLiu(2005) Chem. Biol. 338 633-641、Hahn及びMuir(2005) Trends Biochem. Sci.
30 26-34、Ostermeier(2005) Prot. Eng. Des. Sel. 18 359-364)。所望の調節（例えば小分子依存性の立体構造変化）及びレポーター（例えば酵素活性）機能を有するタンパク質が用いられる。小分子が結合した際に調節ドメインで起こる立体構造事象を、出力信号を調節するレポータードメインに伝達させることができるような方法で、この２つのタンパク質を結び付ける必要がある。このような立体構造事象を結び付ける１つの試みとして、ドメイン挿入と呼ばれる方法を使用することがあげられ、この方法では１つのタンパク質ドメインが、もう１つのタンパク質ドメイン内に挿入される(Doi及びYanagawa(1999) FEBS Lett. 457 1-4、Ostermeier(2005) Protein Eng. Des. Sel. 18 359-364)。そのようにして２つの共有のリンクが生成され、２つのドメイン間の自由度を低下させてそれらの構造を密接に連関させ、任意の立体構造変化の伝達を促進する。より従来型に近い末端−末端の方法で連結されたドメインは、それら２ドメイン間での連絡がなく、一般的にはそれぞれが独立に機能するであろう。
【００１６】
この方法の成功の鍵は、両タンパク質の機能を維持し、且つ立体構造事象の伝達を可能
にさせつつ全ドメインの挿入を許容する、タンパク質内部の部位を同定することである。天然の多ドメインタンパク質の分析は、ドメインの挿入が比較的一般的な進化事象であることを示唆している(Jones他(1998) Protein Sci. 7 233-242、Aroul-Selvam他(2004) J.
Mol. Biol. 338 633-641)。いくつかのタンパク質工学の研究により、タンパク質が、別のタンパク質のドメイン全体などの大きな挿入を許容し得ることも示されている。しかし、挿入を許容し、且つカップリングを可能にする部位は明らかではないかもしれない。例えば、レポータータンパク質を活性部位に近接して挿入することは、立体構造変化を直接触媒中心に伝達させることによってカップリングを強化するだろうが、酵素活性にとっては過度に有害であると考えてよいだろう。
【００１７】
現在のところ、２つのタンパク質の機能を連結するために、タンパク質ドメイン全体の挿入を許容する標的タンパク質内の部位を予測することは、非常に困難である。この障害を克服するために、ある１つのタンパク質を別のタンパク質にランダムに挿入するという進化的な試みを行うことができる。遺伝子レベルでこれを行うには、挿入が行われるタンパク質をコードする遺伝子のランダムな位置に単一の切断が導入されなくてはいけない。ＤＮＡ中にそのような切断を生成するために使用される１つの方法として、非特異的なエンドヌクレアーゼであるＤＮａｓｅＩの使用が挙げられる(Guntas及びOstermeier(2004) J. Mol. Biol. 336 263-273)。ＤＮａｓｅＩを使用するにあたっての問題点は、ＤＮａｓｅＩがＤＮＡにおいて単一の切断を形成することが難しいことが知られていること、並びにこの非特異的なエンドヌクレアーゼによる消化が一定の間隔で縦列重複(tandem duplications)及び様々なサイズの段階的欠失(nested deletions)を生じさせることである。このことによって、タンパク質においてフレームシフト、大きな挿入、及び大きな欠失がもたらされ、その結果ライブラリーの質の低下、及びサンプリングが必要な変異体の数の増加につながるであろう。本発明の方法は、タンパク質レベルでのそのような大きな欠失又は挿入を導入することはなく、研究者は、挿入ドメインを有する任意の連結配列の大きさを決定することが可能になる。挿入された遺伝子に関して可能な読み枠は３つだけであり（これは、１つのコドンに関するトランスポゾンの挿入点に依存する）、正しい読み枠となる可能性は、ＤＮａｓｅＩを使用する場合には６つの内の１つであるが、本発明の方法を使用する場合には３つの内の１つにまで増大する。
【発明の開示】
【００１８】
［発明の概要］
本発明は、標的遺伝子全体にわたるランダムな位置でのトリプレットヌクレオチドの欠失又はヌクレオチドの挿入を導入する新規の方法に関する。さらに、特定の位置でのアミノ酸配列の全範囲をカバーするアミノ酸の置換を可能にするようにこの技術を変更することができる。その上、エピトープ、タンパク質断片又は全タンパク質ドメインでさえもコードするこができる、より長鎖長のＤＮＡの挿入が可能になるように、この技術をさらに適応させることができる。
【００１９】
ｂｌａ遺伝子によってコードされるＴＥＭ−１  β−ラクタマーゼに対するアミノ酸のインデルの影響を測定することによって、この技術を試験した。
【００２０】
したがって、本出願において概説された新しい技術は、ＴＥＭ−１に対して開かれた配列空間並びにＴＥＭ−１の構造及び機能に対するこのような突然変異の影響をさらに調査することによって、既存の知識を補完することになろう。さらに、この技術の使用の好適な例を挙げることにより、本出願において概説された技術の正当性が明らかになるだろう。
【００２１】
本発明の第１の態様によれば、標的ポリペプチドのアミノ酸配列を、そのポリペプチドをコードする標的ＤＮＡ配列を改変することによって改変する方法が提供される。この方
法は、標的ＤＮＡ配列にトランスポゾンを導入するステップを含み、このトランスポゾンは、その末端のそれぞれに向かう第１の制限酵素の認識配列を含み、この認識配列は、トランスポゾンの残りの部分にも、標的ＤＮＡ配列にも、あるいは標的ＤＮＡ配列を含む構築物（例えばプラスミド又はベクター）中にも存在せず、この第１の制限酵素の認識配列は、アウトサイドカッターである第１の制限酵素によって認識され、かつ、トランスポゾンの末端の端を越えて位置するＤＮＡ切断部位を第１の制限酵素が有するように位置する。
【００２２】
本明細書を通して使用される「アウトサイドカッター（outside cutter）」という用語は、制限酵素の認識配列の外側のＤＮＡを切断する制限酵素を示す、当該技術分野で既知の用語である。アウトサイドカッターである制限酵素の大部分は、ＩＩＳ型の亜型に属するが、ＩＩＢ亜型、ＩＩＥ亜型、ＩＩＧ亜型及びＩＩＰ亜型の成員もアウトサイドカッターとして分類することができる。
【００２３】
本明細書を通して使用される「トランスポゾンの末端の端を越えて」という語句は、トランスポゾンが標的ＤＮＡ配列に組み込まれる場合、第１の制限酵素の切断部位がトランスポゾンのＤＮＡ配列内には位置せず、標的ＤＮＡ配列内に位置するように、第１の制限酵素の切断部位がトランスポゾン配列の外側にあるということである。
【００２４】
好都合なことに、本発明は、対象のポリペプチド全体にわたる点における、１又は複数のアミノ酸の挿入、欠失及び置換の効果を研究するための単純なツールを提供する。好都合なことに、アウトサイドカッターである酵素により認識される第１の制限酵素の認識配列に対する必要条件によって、本発明の方法の使用による標的ポリペプチドにおける単一アミノ酸の挿入、欠失又は置換が可能になる。さらに好都合なことに、切断部位がトランスポゾンの末端の端を越えるような認識配列の位置決めとともに、アウトサイドカッターである酵素を使用することによって、トランスポゾンの末端に位置するヌクレオチドを含む、挿入後の標的ＤＮＡ配列からの全トランスポゾンＤＮＡ配列の切除が可能になり、付加的なステップを必要とすることなくそのようなヌクレオチドの除去が可能になる。したがって、本発明の方法は、既知の方法よりも単純であり、迅速であり、それ故に経済的である。
【００２５】
例えば、この方法は、ＭｕＡトランスポザーゼを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏでの標的ＤＮＡ配列に正確且つ効果的に挿入され得るＤＮＡ要素であるｍｉｎｉ−Ｍｕトランスポゾンの特性を利用することができる(Haapa, S.他(1999) Nucleic Acids Res. 27. 2777-2784)。この反応は、標的部位の選択性が非常に低いため、トランスポゾンの挿入を所与の遺伝子における任意の点で行うことができる。この技術の基礎として、例えば、人工トランスポゾンＡＴ−２(Devine, S.E.及びBoeke, J.D.(1994) Nucleic Acids Res. 22 3765-3772)又はＴｎ５トランスポゾン(Goryshin及びReznikoff(1998) J. Biol. Chem. 273 7367-7374)などの、他のトランスポゾンもまた使用することができる。驚くべきことに、本発明者は、トランスポゾンの末端を変えることによって、トランスポゾンを認識するトランスポザーゼ酵素の能力を低下させることなく、本発明の方法に使用するのに適するようにトランスポゾンを構築することができることを見出している。例えば、ｍｉｎｉ−Ｍｕの末端を変える突然変異が、トランスポゾンを認識するＭｕＡトランスポザーゼの能力に悪影響を及ぼす可能性があることがこれまでに示されてきた(Goldhaber-Gordon他(2002) J. Biol. Chem. 277 7703-7712、Goldhaber-Gordon他(2003) Biochemistry 42 14633-14642)。本発明の方法で使用されるトランスポゾンは、標準的な、改変されていないｍｉｎｉ−Ｍｕのものと同様の転移効率を維持する。
【００２６】
アミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、挿入又は置換によって変わり得る。好ましくは、単一のアミノ酸が欠失、挿入又は置換される。
【００２７】
少なくとも１つのアミノ酸が、標的ポリペプチドのアミノ酸配列に挿入される場合、又は少なくとも１つのアミノ酸が、標的ポリペプチドのアミノ酸配列から欠失される場合、本発明の第１の態様による方法は、以下の
ａ）トランスポゾン、標的ＤＮＡ及びトランスポザーゼ酵素を混合することを含む転移反応を行うステップ、
ｂ）トランスポゾンに含まれる第１の制限酵素の認識配列を認識する第１の制限酵素で、（ａ）由来のＤＮＡを消化するステップ、
ｃ）トランスポゾンを含まないＤＮＡを分離するステップ、
ｄ）（ｃ）由来のＤＮＡの分子内ライゲーション反応を行うステップ、及び
ｅ）（ｄ）由来のＤＮＡからタンパク質を発現させるステップ
を含むことが好ましい。
【００２８】
例えば、宿主生物を（ｄ）由来のＤＮＡで形質転換することができ、その結果、このタンパク質が宿主生物中で発現する。あるいは、人工的な発現システム（例えばRoche Diagnostics Ltd(Lewes, United Kingdom)製のＲａｐｉｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ等）を使用して、このタンパク質を（ｄ）由来のＤＮＡから発現させることができる。
【００２９】
当業者であれば、ＤＮＡからのタンパク質の発現に利用可能な選択肢を知っていることだろう。
【００３０】
標的ポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸が異なるアミノ酸で置換される場合、本発明の第１の態様による方法は、以下の
ａ）トランスポゾン、標的ＤＮＡ及びトランスポザーゼ酵素を混合することを含む転移反応を行うステップ、
ｂ）トランスポゾンに含まれる第１の制限酵素の認識配列を認識する第１の制限酵素で、（ａ）由来のＤＮＡを消化するステップ、
ｃ）トランスポゾンを含まないＤＮＡを分離するステップ、
ｄ）（ｃ）由来のＤＮＡと第２のＤＮＡ配列との分子間ライゲーションを行うステップであって、第２のＤＮＡ配列は少なくとも２つの第２の制限酵素の認識部位を含み、第２の制限酵素の認識部位は切断部位の少なくとも１つが第２のＤＮＡ配列の末端にはないように位置することを特徴とする、ステップ、
ｅ）（ｄ）由来のＤＮＡで宿主生物を形質転換し、第２のＤＮＡ配列を含む細胞を選択するステップ、
ｆ）（ｅ）において選択される細胞からＤＮＡを単離し、そのＤＮＡを第２の制限酵素の認識部位を認識する第２の制限酵素で消化するステップであって、第２の制限酵素はアウトサイドカッターであることを特徴とする、ステップ
ｇ）（ｆ）由来のＤＮＡの分子内ライゲーションを行うステップ、及び
ｈ）（ｇ）由来のＤＮＡからタンパク質を発現させるステップ
を含むことが好ましい。
【００３１】
例えば、宿主生物を（ｇ）由来のＤＮＡで形質転換することができ、その結果、このタンパク質が宿主生物中で発現する。あるいは、人工的な発現システム（例えばRoche Diagnostics Ltd製のＲａｐｉｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ等）を使用して、このタンパク質を（ｇ）由来のＤＮＡから発現させることができる。
【００３２】
第２のＤＮＡ配列を含まないＤＮＡが第２のＤＮＡ配列を含むＤＮＡから分離されるように、上記のステップ（ｆ）の後に、付加的な分離ステップ（ｆ１）が続くことが好ましい。したがって、第２のＤＮＡ配列を含まないＤＮＡはステップ（ｇ）で使用される。
【００３３】
上記のステップ（ｄ）において、「切断部位が第２のＤＮＡ配列の末端にはない」という語句は、切断部位が第２のＤＮＡ配列の末端に由来する１又は複数のヌクレオチドである、すなわち、切断部位が第２のＤＮＡ配列内にあるように、第２の制限酵素の認識部位が位置していることを示す。当業者は、１又は複数のアミノ酸が置換されるという所望の結果を得るために必要な第２の制限酵素の認識部位の位置を容易に認識するであろう。
【００３４】
第２の制限酵素は、第１の制限酵素と同じであってもよい。第２のＤＮＡ配列は、第２のＤＮＡ配列を含まない細胞と比較して選択可能な特徴を、第２のＤＮＡ配列を含む宿主細胞に与える遺伝子を含むことが好ましい。本明細書を通して使用される「選択可能な特徴」という用語は、例えば（この細胞が細菌である場合）、抗生物質含有培地で成長する能力を指すことがある。
【００３５】
標的ポリペプチドのアミノ酸配列が、さらなるアミノ酸配列の挿入により変えられる場合、本発明の第１の態様による方法は、
ａ）トランスポゾン、標的ＤＮＡ及びトランスポザーゼ酵素を混合することを含む転移反応を行うステップ、
ｂ）トランスポゾンに含まれる第１の制限酵素の認識配列を認識する第１の制限酵素で、（ａ）由来のＤＮＡを消化するステップ、
ｃ）トランスポゾンを含まないＤＮＡを分離するステップ、
ｄ）さらなるアミノ酸配列をコードする第３のＤＮＡ配列と（ｃ）由来のＤＮＡとの分子間ライゲーションを行うステップ、及び
ｅ）（ｄ）由来のＤＮＡからタンパク質を発現させるステップ
を含むことが好ましい。
【００３６】
例えば、宿主生物を（ｄ）由来のＤＮＡで形質転換することができ、その結果、このタンパク質が宿主生物中で発現する。あるいは、人工的な発現システム（例えばRoche Diagnostics Ltd製のＲａｐｉｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ等）を使用して、このタンパク質を（ｄ）由来のＤＮＡから発現させることができる。
【００３７】
さらなるアミノ酸配列は、完全長のタンパク質、タンパク質ドメイン又はタンパク質断片であり得る。タンパク質断片は、エピトープ、結合ドメイン、アロステリック部位、金属結合部位等の明確な機能領域、又はオリゴマー化の接合部分（oligomerisation interface）であり得る（しかしながらこれらに限定されない）。第３のＤＮＡ配列は、第３のＤＮＡ配列を含まない細胞と比較して選択可能な特徴を、第３のＤＮＡ配列を含む宿主細胞に与える遺伝子を含むことが好ましい。
【００３８】
第３のＤＮＡ配列は、標的ＤＮＡがタンパク質に翻訳される際に単一のキメラタンパク質が形成されるように、標的ＤＮＡのものと同様のオープンリーディングフレームを有しても良い。あるいは、又は付加的には、第３のＤＮＡ配列は終止コドン及び／又は開始コドンを含んでもよい。
【００３９】
本発明による方法の好ましい実施形態においては、第１の制限酵素はＩＩＳ型酵素であり、最も好ましくはＭｌｙＩである。
【００４０】
トランスポゾンは、標的部位の選択性が低いことが好ましい。トランスポゾンは、ｍｉｎｉ−Ｍｕ、ＡＴ−２又はＴｎ５の内の１つに由来してもよい。トランスポゾンは、トランスポゾンを含まない細胞と比較して選択可能な特徴を、トランスポゾンを含む宿主細胞に与える遺伝子を含むことが好ましい。より好ましくは、トランスポゾンは、５’末端として５’−ＮＧＡＣＴＣ−３’（配列番号１）及び３’末端として５’−ＧＡＧＴＣＮ−
３’（配列番号２）（好ましくは、５’末端として５’−ＴＧＡＣＴＣＧＧＣＧＣＡ−３’（配列番号３）及び３’末端として５’−ＴＧＣＧＣＣＧＡＧＴＣＡ−３’（配列番号４））のＤＮＡ配列を含むか、あるいは、５’末端として５’−ＮＮＮＮＧＡＣＴＣ−３’（配列番号５）及び３’末端として５’−ＧＡＧＴＣＮＮＮＮ−３’（配列番号６）（好ましくは、５’末端として５’−ＴＧＡＡＧＡＣＴＣＧＣＡ−３’（配列番号７）及び３’末端として５’−ＴＧＣＧＡＧＴＣＴＴＣＡ−３’（配列番号８））のＤＮＡ配列を含む。ここで、Ｎは任意のヌクレオチドである。別の方法においては、トランスポゾンは、５’末端として５’−ＴＧＴＴＧＡＣＴＣ−３’（配列番号９）及び３’末端として５’−ＧＡＧＴＣＡＡＣＡ−３’（配列番号１０）のＤＮＡ配列を含むか、又はさらに別の方法では、５’末端として５’−ＣＴＧＡＣＴＣ−３’（配列番号１１）及び３’末端として５’−ＡＡＧＡＧＴＣＡＧ−３’（配列番号１２）のＤＮＡ配列を含む。
【００４１】
標的ＤＮＡは、プラスミド、好ましくはｐＮＯＭ又はその誘導体等の構築物に保持されていてもよい。
【００４２】
本発明の第２の態様によれば、その末端のそれぞれに向かって制限酵素の認識配列を含むトランスポゾンが提供され、この認識配列がアウトサイドカッターである制限酵素により認識され、この認識配列はトランスポゾンの残りの部分に存在せず、また、トランスポゾンの末端の端を越えて位置するＤＮＡ切断部位を制限酵素が有するように位置する。好ましくは、それぞれの制限酵素の認識配列は、トランスポゾンの末端から１又は複数のヌクレオチドの位置に、より好ましくはトランスポゾンの末端から１〜２０ヌクレオチドの位置に、さらにより好ましくはトランスポゾンの末端から１〜１０ヌクレオチドの位置に、最も好ましくはトランスポゾンの末端から１、２、３、４又は５ヌクレオチドの位置に存在する。好都合なことに、このことによって、本発明の第１の態様による方法において、トランスポゾンをツールとして使用することが可能になり、対象のポリペプチド全体にわたる点における、１又は複数のアミノ酸の挿入、欠失及び置換の効果の研究が可能になる。
【００４３】
驚くべきことに、本発明者は、トランスポゾンの末端を変えることによって、トランスポゾンを認識するトランスポザーゼ酵素の能力を低下させることなく、本発明の第１の態様による方法に使用するのに適したトランスポゾンを構築することができることを見出している。例えば、ｍｉｎｉ−Ｍｕの末端を変える突然変異が、ＭｕＡトランスポザーゼのトランスポゾンを認識する能力に対して悪影響を与える可能性があることがこれまでに示されている(Goldhaber-Gordon他(2002) J. Biol. Chem. 277 7703-7712、Goldhaber-Gordon他(2003) Biochemistry 42 14633-14642)。本発明の方法で使用されるトランスポゾンは驚くべきことに、標準的な改変していないｍｉｎｉ−Ｍｕのものと同様の転移効率を維持している。
【００４４】
好ましい実施形態において、制限酵素はＩＩＳ型酵素であり、最も好ましくはＭｌｙＩである。トランスポゾンは、５’末端として５’−ＮＧＡＣＴＣ−３’及び３’末端として５’−ＧＡＧＴＣＮ−３’（好ましくは、５’末端として５’−ＴＧＡＣＴＣＧＧＣＧＣＡ−３’及び３’末端として５’−ＴＧＣＧＣＣＧＡＧＴＣＡ−３’）のＤＮＡ配列を含んでもよい。あるいは、トランスポゾンは、５’末端として５’−ＮＮＮＮＧＡＣＴＣ−３’及び３’末端として５’−ＧＡＧＴＣＮＮＮＮ−３’（好ましくは、５’末端として５’−ＴＧＡＡＧＡＣＴＣＧＣＡ−３’及び３’末端として５’−ＴＧＣＧＡＧＴＣＴＴＣＡ−３’）のＤＮＡ配列を含み得る。さらに別法として、トランスポゾンは、５’末端として５’−ＴＧＴＴＧＡＣＴＣ−３’及び３’末端として５’−ＧＡＧＴＣＡＡＣＡ−３’のＤＮＡ配列を含んでもよい。別の選択肢として、トランスポゾンは、５’末端として５’−ＣＴＧＡＣＴＣ−３’及び３’末端として５’−ＧＡＧＴＣＡＧ−３’のＤＮＡ配列を含んでもよい。トランスポゾンが転移の能力を維持し、また制限酵素の認識部位
が必要な位置にあれば、これらの末端配列は変異を包含してもよい。
【００４５】
例えば、ＩＩＳ型の制限酵素ＭｌｙＩに対する認識配列を組み込むように、ｍｉｎｉ−Ｍｕトランスポゾンの両末端の近傍を修飾してもよい。ｍｉｎｉ−Ｍｕトランスポゾンは、そのトランスポゾンを含む大腸菌細胞をクロラムフェニコールの存在下で成長させることができるＣａｍR遺伝子を包含する。当業者であれば、本明細書中に記載の方法に対して適切なありふれた修正がなされ、また必要に応じて追加のステップが付加される場合には、ＭｌｙＩ以外の制限酵素に対する認識配列をトランスポゾンに導入してもよいことを理解するだろう。このような修正は当業者にとってはありふれたものである。
【００４６】
本発明の第３の態様によれば、図１で示されるＤＮＡ配列を有するプラスミド又は図１で示されるＤＮＡ配列を有するプラスミドの誘導体が提供される。「図１で示されるＤＮＡ配列を有するプラスミドの誘導体」という用語は、例えば、ＤＮＡ配列のサイレント突然変異、別の選択マーカーによるｂｌａ遺伝子の置換、又は、ｏｒｉ領域、マルチクローニングサイトもしくはｂｌａ遺伝子等のプラスミドの必須要素を１つも形成しない配列のようなＤＮＡ配列の非必須要素の変更によって、図１で示されるプラスミドから調製されたプラスミドを意味する。この用語は、図１のＤＮＡ配列における点、好ましくは（しかし任意に）マルチクローニングサイトに挿入された、付加的な対象ＤＮＡ配列を有する、図１で示されるＤＮＡ配列も包含する。図１で示されるＤＮＡ配列を有するプラスミドの誘導体のＤＮＡ配列は、本発明の第１の態様による方法で使用される第１の制限酵素に対する認識配列を含まず、本発明の方法で使用することが意図される。「図１に示されるＤＮＡ配列を有するプラスミドの誘導体」という用語は、ｐＵＣ１８プラスミドを包含することは意図しない。
【００４７】
本発明の第４の態様によれば、本発明の第２の態様によるトランスポゾンを含むキットが提供される。好ましくは、このキットは、本発明の第３の態様によるプラスミドをさらに含む。キットは、好適なトランスポザーゼ、並びに／又は酵素反応に必要な緩衝液、並びに／又はスクリーニング及び／若しくはＤＮＡシークエンシング処理に使用するに適したオリゴヌクレオチドをさらにまた含んでもよい。最も好ましくは、キットは、本発明の第１の態様による方法に使用されるものである。
【００４８】
本発明の第５の態様によれば、ある標的ポリペプチドに突然変異を導入することがそのポリペプチドの検出可能な活性を変えるか否かを判定する方法が提供され、その方法は、本発明の第１の態様による方法及び以下の
ａ）改変されていない標的ポリペプチドと比較して、改変された標的ポリペプチドの活性の相違をスクリーニングするステップ、及び
ｂ）改変された標的ポリペプチドをシークエンシングして、アミノ酸の挿入、欠失又は置換の位置を決定するステップ
をさらに含む。
【００４９】
検出可能な活性の例としては、タンパク質が酵素である場合には基質結合活性、タンパク質が抗体である場合には抗原結合活性、タンパク質が受容体である場合にはリガンド結合活性が挙げられる。当業者は、他のタンパク質の種類の活性を評価することができる手段を容易に理解するであろう。
【００５０】
ほんの一例として、図１〜図１０を参照して本発明の実施の形態を記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
材料
細菌株：大腸菌ＤＨ５α（ｓｕｐＥ４４、ΔｌａｃＵ１６９、（φ８０  ｌａｃＺΔＭ
１５）、ｈｓｄＲ１７、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｒｅｌＡ１）。
【００５２】
プラスミド：ｐＵＣ１８、ｐＥｎｔｒａｎｃｅｐｏｓｏｎ（Ｃａｍr）(Finnzymes, Esboo, Finland)及びｐＮＯＭ。
【００５３】
トランスポゾン：挿入−欠失突然変異誘発に使用されるトランスポゾンは、ｍｉｎｉ−Ｍｕ（ＣａｍR−３）に基づいている。
【００５４】
抗生物質：アンピシリン及びクロラムフェニコール(両者ともMelford Laboratories, Ipswich, UK)。
【００５５】
ＤＮＡ関連酵素：ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(Promega Corp., Madison, WI, USA)、Ｅｘｔｅｎｓｏｒ  Ｈｉ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ酵素(Abgene, Epsom, UK)、ＭｌｙＩ、ＸｈｏＩ、ＢｇｌＩＩ及びＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼ(NE Biolabs, Beverly, MA, USA)、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ(Abgene)、ＭｕＡトランスポザーゼ(Finnzymes)、ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ(Epicentre, Madison, WI, USA)。
【００５６】
遺伝子：ＴＥＭ−１  β−ラクタマーゼをコードするＢｌａ遺伝子。
【００５７】
ＤＮＡ精製キット：Promega Corp.製のＷｉｚａｒｄ（登録商標）Ｐｌｕｓ  ＳＶキットを使用して、細胞培養物からプラスミドＤＮＡを単離した。アガロースゲル又はＰＣＲ反応物から、Qiagen Ltd(Crawley, UK)製のＱｉａｑｕｉｃｋ（商標）ゲル抽出キット又はＰＣＲ精製キットをそれぞれ使用して、ＤＮＡを単離した。
【実施例】
【００５８】
方法及び結果
＜実施例１＞
本実施例は、図２で示されるｂｌａ遺伝子におけるランダムな位置でのトリプレットヌクレオチドの欠失を含む変異体のライブラリーを形成する方法を示す。要約すると、この処理は、４つの主なステップから構成される。
ステップ１：ＭｕＤｅｌトランスポゾンを標的プラスミド又は標的遺伝子に挿入する。
ステップ２：プラスミドに組み込まれたＭｕＤｅｌを含む細胞はＣａｍR遺伝子を含むためクロラムフェニコール存在下で成長することができる。当該プラスミドを単離してプールし、ＭｌｙＩ消化によってトランスポゾンを取り除く。
ステップ３：分子内ライゲーションにより、ヌクレオチド塩基対が除かれた標的遺伝子の再形成がもたらされる。
ステップ４：得られたライブラリーを選択又はスクリーニングして、必要な特性を有するこれらの変異体を選択する。
【００５９】
図２において、斜線のブロックはトランスポゾンを示し、黒色のブロックはｂｌａ遺伝子を示し、ギャップは（本実施例のための）欠失点を示し、灰色のブロックは、再ライゲーションした標的遺伝子における（本実施例のための）欠失点を示し、太い点線は残りのプラスミド骨格を示す。
【００６０】
以下の場合には、前記の処理をｂｌａ遺伝子以外の標的遺伝子に適用することもできる。
１．図２のステップ４での選択又はスクリーニングするステップに対する適切な改変であって、標的遺伝子によってコードされるタンパク質に適した改変がなされる場合、及び
２．好ましくない制限部位が全く存在しないか、又は標的遺伝子から取り除かれる場合
。
【００６１】
改変されたｍｉｎｉ−Ｍｕトランスポゾン及び新たに構築されたｐＮＯＭプラスミドを使用した本実施例を以下に詳細に記載する。本実施例においては、制限エンドヌクレアーゼＭｌｙＩはトリプレットヌクレオチドの欠失に必須ではあるが、当業者によって理解されるように、適切なステップを修正し、また必要に応じて追加のステップが加えられる場合、ＭｌｙＩのものと同様の特性を有する他の制限エンドヌクレアーゼを使用することができる。
【００６２】
前記の手順がうまく働くように、標的ＤＮＡ又は標的ＤＮＡを含むプラスミドは、いかなるＭｌｙＩ制限部位も含んではならない。ＭｌｙＩの認識配列はわずか５ｂｐ長であるため、多くのプラスミドは少なくとも１つあるいはそれ以上のＭｌｙＩ制限部位を有している。例えば、ｐＵＣ１８は、ｂｌａ遺伝子内の１つ、ｐＭＢ１複製起点（ｏｒｉ）内の１つ、及びマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）内のもう１つを含む、４つのＭｌｙＩ制限部位を有する。
【００６３】
ｐＮＯＭの構築
そこで、ＭｌｙＩ部位を全く含まず、かつ有用なＭＣＳを含む、好適なプラスミドを構築した。この新規のベクターはｐＮＯＭと呼ばれる。このプラスミドの大部分は、ｏｒｉ領域及びｂｌａ遺伝子を含めて、ｐＵＣ１８から提供された。ＴＥＭ−１  β−ラクタマーゼの一次構造を破壊しないように、サイレント突然変異の導入によって、ｂｌａ遺伝子に存在するＭｌｙＩ部位を取り除いた。理論的な突然変異がどのようにプラスミド複製に影響を与え得るかが不明だったので、ＭｌｙＩ認識配列を形成するヌクレオチドの中の２つがランダム化されたライブラリーを形成することにより、ＭｌｙＩ部位のｏｒｉ領域からの除去を達成した。有用なクローニング部位を含むように、ＭＣＳ部位を構築した。
【００６４】
特に明記しない限り、Ｅｘｔｅｎｓｏｒ  Ｈｉ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ酵素ミックス及びそれが供給する緩衝液(Abgene)を用いて、全てのＰＣＲ反応を行った。ｐＵＣ１８及び人工のＭＣＳからｐＮＯＭプラスミドを構築した。ＤＮＡ配列から任意のＭｌｙＩ制限部位を取り除くように、いくつかの段階において、ＰＣＲによって、ｐＵＣ１８の−１〜１９７９ｂｐの領域を増幅した。ＰＣＲ反応混合物は、鋳型としての０．１ｎｇ／μｌのｐＵＣ１８  １μｌ、１０μＭの好適なプライマー３μｌ（以下のプライマーの組み合わせを参照のこと）、２０ｍＭのｄＮＴＰ混合物３μｌ（５ｍＭのｄＡＴＰ、５ｍＭのｄＴＴＰ、５ｍＭのｄＧＴＰ及び５ｍＭのｄＣＴＰから成る）、１０×Ｅｘｔｅｎｓｏｒ緩衝液１  ５μｌ、５単位／μｌのＥｘｔｅｎｓｏｒ  Ｈｉ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ酵素ミックス０．５μｌから構成され、滅菌した分子生物学的品質の水で５０μｌに合わせた。それぞれの場合において、以下に示すようにＰＣＲを行った。
ステップ１：９４℃で２分間
ステップ２：９４℃で１０秒間
ステップ３：５５℃で３０秒間
ステップ４：６８℃で９０秒間
さらに２９回、ステップ２〜ステップ４を繰り返す
ステップ５：６８℃で７分間。
【００６５】
断片Ｆ１は、ｐＵＣ１８の−１〜９８９ｂｐから構成され、化学合成したオリゴヌクレオチドの形態の一本鎖ＤＮＡ（「プライマー」と称される）であるＤＤＪｄｉ００６（５’ＧＡＡＡＣｔＣＧａＧＡＧＡＣＧＡＡＡＧＧＧＣＣＴＣＧＴＧＡＴＡＣＧ３’、配列番号１３）及びＤＤＪｄｉ００４（５’ＣＡＴＣＣＡＴＡＧＴＴＧＣＣＴＧＡＣＴｇＣＣＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＡＴＡＡＣ３’、配列番号１４）を用いたＰＣＲによって生成した。ここで、小文字は突然変異誘発を受けるヌクレオチドを示す。ＤＤＪｄｉ００６にはＸｈ
ｏＩ部位が導入され、ＤＤＪｄｉ００４はｂｌａ遺伝子からＭｌｙＩ部位が取り除かれている。
【００６６】
断片Ｆ２は、ｐＵＣ１８の９７２〜１５０７ｂｐから成り、プライマーＤＤＪｄｉ００３（５’ＧＴＴＡＴＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＧＧｃＡＧＴＣＡＧＧＣＡＡＣＴＡＴＧＧＡＴＧ３’、配列番号１５）及びＤＤＪｄｉ００８（５’ＣＣＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＧＡＣＡＣ３’、配列番号１６）のプライマーを使用したＰＣＲによって生成した。ＤＤＪｄｉ００３はＤＤＪｄｉ００４と相補的であり、小文字は突然変異誘発を受けるヌクレオチドを示す。
【００６７】
断片Ｆ３は、ｐＵＣ１８の１４９０〜１９７９ｂｐから成り、プライマーＤＤＪｄｉ００７（５’ＧＴＧＴＣＴＴＡＣＣＧＧＧＴＴＧＧＮＮＴＣＡＡＧＡＣＧＡＴＡＧＴＴＡＣＣＧＧＡ３’、配列番号１７）及びＤＤＪｄｉ００９（５’ｃｔｔｃｃｔｃｇｃｔｃａｔａｔｇＣＴＣＧＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＴＧＣ３’、配列番号１８）のプライマーを使用したＰＣＲによって生成した。ＤＤＪｄｉ００７は、ｐＵＣ１８の複製領域のｐＭＢ１  Ｏｒｉ起点におけるＭｌｙＩ部位と対応する２つのランダム化ヌクレオチドを含んでいた（すなわち、それぞれの位置での任意のヌクレオチドは「Ｎ」で表す）。ＤＤＪｄｉ００９は、その５’末端に向かうＮｄｅＩ認識部位を含んでいた。
【００６８】
アガロースゲル電気泳動後に、断片Ｆ１、Ｆ２及びＦ３を単離精製した。末端プライマーとして、ＤＤＪｄｉ００６及びＤＤＪｄｉ００９を使用して、単一のＰＣＲ反応においてそれぞれの断片を共にスプライシングして、断片Ｆ４を形成した。このＰＣＲ反応では６８℃での伸長温度を１２０秒に延長した。アガロースゲル電気泳動後に、２００５ｂｐの生成物を単離精製した。推奨される条件下（０．１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ））で、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩエンドヌクレアーゼによって断片Ｆ４を消化した。Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋ（商標）ＰＣＲ精製キットを使用して、制限消化混合物からＤＮＡを精製した。
【００６９】
断片Ｆ５は、新規のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含み、ｐＥＴ２２ｂのＭＣＳに基づいている。６８℃での伸長時間を６０秒にしたことを除いて、標準的なＰＣＲ条件を使用して、鋳型としてプライマーｐＥＴ−Ｆ（５’ＡＴＧＣＧＴＣＣＧＧＣＧＴＡＧＡＧＧＡ３’、配列番号１９）及びｐＥＴ−Ｒ（５’ＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧＴＧ３’、配列番号２０）並びにｐＥＴ２４ｂを使用したＰＣＲによって、断片Ｆ５を生成した。得られた３５１ｂｐの生成物を精製して、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化し、続いて、ゲル電気泳動後に単離精製した。
【００７０】
製造業者によって推奨される条件下（３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＤＴＴ及び１ｍＭのＡＴＰ）で、３Ｕ／μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ(Promega Corp.)１μｌを使用して、ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩで消化したＦ４及びＦ５断片を２５℃で共にライゲーションした。ライゲーション混合物の１／１０を使用して、Ｂｉｏｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（商標）(Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, UK)を使用したエレクトロポレーションによって、大腸菌ＤＨ５α  ５０μｌを形質転換した。エレクトロポレーションの直後に、細胞にＳＯＣ培地５００μｌを加えて、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート後の、エレクトロポレーションした大腸菌ＤＨ５α細胞を約５０μｌ及び約５００μｌ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上に広げ、３７℃で一晩インキュベートした。断片Ｆ４及びＦ５の正確なライゲーションは、ｐＮＯＭプラスミドの形成を意味する。
【００７１】
１００μｇ／ｍｌのアンピシリンの存在下で成長することができる５つの別個の大腸菌
ＤＨ５αコロニーを選択して、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢブロス５ｍｌに移し、この培養物を回転式振盪培養器で３７℃で一晩インキュベートした。５つの培養物のうちの３つからプラスミドＤＮＡを精製した。プラスミドＤＮＡをＮｄｅＩ又はＭｌｙＩによる制限分析にかけ、プラスミドの性質及び全てのＭｌｙＩ部位が取り除かれていることを確認した。ｐＮＯＭの供給源として１つのクローンが選択され、ＤＤＪｄｉ００３及びＤＤＪｄｉ００９を使用し、ＰＣＲによってＯｒｉ領域を増幅させることによって、ＤＤＪｄｉ００７におけるＮＮヌクレオチドによる突然変異を確認した。この領域のシークエンシングはできなかったが、ＭｌｙＩによる制限分析によって、この領域がＭｌｙＩ部位を有しないことを再確認した。ｐＮＯＭのＤＮＡ配列を図１に示す。
【００７２】
ＭｕＤｅｌの構築
ランダムなトリプレットヌクレオチドの欠失の形成に使用するために、元のＭｕファージ由来のトランスポゾンであるｍｉｎｉ−Ｍｕ（ＣａｍR−３）を改変した。ここでは、トランスポゾン内の選択マーカーとして、ＣａｍR遺伝子を使用する。このＣａｍR遺伝子は、大腸菌又は任意の他の適当な生物の選択株に対し、特定の条件下において、その生物を生存可能にさせるか、又はその生物とトランスポゾン配列を含まない他の細胞とを差別化する特徴をその生物に示させる選択的利点を与える別の遺伝子と交換することができる。
【００７３】
トリプレットヌクレオチドを欠失させる能力は、図３で概説されるように、トランスポゾンの挿入メカニズム及び２つの導入された制限部位の位置に依存する。特定の制限部位を標的遺伝子に挿入するための媒体として働くように、ｍｉｎｉ−Ｍｕトランスポゾンを改変した（図３Ａ）。選択された制限エンドヌクレアーゼは、その認識配列の外側５ｂｐを切断して平滑末端を形成する、ＩＩＳ型酵素であるＭｌｙＩであった（切断プロファイル：５’ＧＡＧＴＣ（Ｎ5）↓３’）。ＭｌｙＩ認識部位を、トランスポゾン挿入部位から１ｂｐ離れて位置させ、ＭｕＤｅｌを形成させる（図３Ａ）。２つの必要な点突然変異の両者が、ＭｕＡ結合に関与するＲ１領域の外側に位置していることにより、トランスポゾン反応の効率に潜在的に影響を与え得るタンパク質−ＤＮＡ相互作用に対する妨害を最小にできる。ＭｕＤｅｌの転移は、標的ＤＮＡにおける５ｂｐの互い違いの切断を介して生じ、その結果、大腸菌によるギャップ修復後にはこれらの５ｂｐの重複がもたらされるであろう（図３Ｂ）。ＭｌｙＩによるＤＮＡの消化によって、両末端における４つの付加的なヌクレオチド塩基対と共にトランスポゾンが標的遺伝子から取り除かれる。２つの平滑末端の分子内ライゲーションによって、３つのヌクレオチドの、標的遺伝子からのインフレーム(in-frame)での欠失がもたらされる（図３Ｂ）。
【００７４】
特に明記しない限り、全てのＰＣＲ反応は、Ｅｘｔｅｎｓｏｒ  Ｈｉ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ酵素ミックスを用いて上記のように実施された。フォーワードプライマー及びリバースプライマーの両方として、オリゴヌクレオチドＤＤＪｄｉ００５（５’ＧＣＴＴＡＧＡＴＣＴＧＡｃｔＣＧＧＣＧＣＡＣＧＡＡＡＡＡＣＧＣＧＡＡＡＧ３’（配列番号２１）、小文字は突然変異誘発を受けるヌクレオチドを示す）を使用し、鋳型として機能する原型のｍｉｎｉ−Ｍｕ（ＣａｍR−３）トランスポゾン０．１ｎｇを含むＰＣＲによって、ＭｕＤｅｌトランスポゾンを構築した。１３２２ｂｐの生成物を精製し、３７℃でＢｇｌＩＩによって消化した（反応条件：１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＤＴＴ）。アガロースゲル電気泳動後に消化したトランスポゾンを単離精製した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用して、ＢｇｌＩＩ消化ｐＥｎｔｒａｎｃｅｐｏｓｏｎ（ＣａｍR）にライゲーションすることによって、新規のトランスポゾンＭｕＤｅｌを示すＤＮＡを再クローニングした。ライゲーション混合物の１／１０を使用して、Ｂｉｏｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（商標）を使用したエレクトロポレーションによって、大腸菌ＤＨ５α  ５０μｌを形質転換した。エレクトロポレーションの直後に、細胞にＳＯＣ培地５００μｌを加えて、細胞を３７℃で１
時間インキュベートした。インキュベーション後のエレクトロポレーションした大腸菌ＤＨ５α細胞を約５０μｌ及び約５００μｌ、２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレート上に広げ、３７℃で一晩インキュベートした。２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールの存在下で成長できる６つの別個の大腸菌ＤＨ５αコロニーを２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む別のＬＢ寒天プレート上にレプリカプレーティングした。熱安定性酵素としてＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、及びプライマーとしてｐＵＣ−Ｆ（５’ＡＧＣＴＧＧＣＧＡＡＡＧＧＧＧＧＡＴＧＴＧ３’、配列番号２２）及びｐＵＣ−Ｒ（５’ＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴ３’、配列番号２３）を使用したＰＣＲ反応における鋳型ＤＮＡの供給源として、元のコロニーの一部を使用した。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに関する上記の条件を使用して、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ混合物は、１０×反応緩衝液５μｌ（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、５００ｍＭのＫＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、２５ｍＭのＭｇＣｌ2  ３μｌ、２０ｍＭのｄＮＴＰ  ３μｌ、１０μＭのオリゴヌクレオチドプライマー１．５μｌ、適当な大腸菌コロニー、及び５Ｕ／μｌのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌを含んでいた。反応混合物を滅菌した分子生物学的品質の水で５０μｌに合わせた。反応混合物を以下の熱サイクル条件に供した。
ステップ１：９４℃で３分間、その後Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌを添加
ステップ２：９４℃で２０秒間
ステップ３：５５℃で２０秒間
ステップ４：７２℃で９０秒間
さらに２９回、ステップ２〜ステップ４を繰り返す
ステップ５：７２℃で５分間。
【００７５】
１５０４ｂｐの生成物を精製し、３７℃でＭｌｙＩによって消化して（反応条件：５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．９）、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを追加）、アガロースゲル電気泳動で分析することにより、ＭｌｙＩ認識配列の存在を確認した。ＭｕＤｅｌトランスポゾンを含むコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢブロス５ｍｌに移し、この培養物を回転式振盪器において３７℃で一晩インキュベートし、プラスミドＤＮＡを精製した。プライマーｐＵＣ−Ｆ及びｐＵＣ−Ｒを使用して、プラスミドＤＮＡをシークエンシングすることによって、ＭｕＤｅｌの配列を確認した。上記の条件下においてＢｇｌＩＩで消化することによって、プラスミドからＭｕＤｅｌトランスポゾンを放出させ、アガロースゲル電気泳動後に精製した。
【００７６】
転移反応及び大腸菌細胞への形質転換
３０℃で３時間、ｍｉｎｉ−Ｍｕ及びＭｕＤｅｌトランスポゾンによる転移を行い、その後７５℃で１０分間加熱して不活性化させた。反応混合物は、反応緩衝液２μｌ（１２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１２５ｍＭのＭｇＣｌ2、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、及び５０％（ｖ／ｖ）のグリセロール）、０．２２μｇ／ｍｌのＭｕＡトランスポザーゼ１μｌ、および以下に示すような、様々な量の標的ＤＮＡ及びトランスポゾンから構成された。Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ（ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングしたバクテリオファージλＤＮＡの６．６ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ断片を含むｐＵＣ１９）及びｐＵＣ１８によって供給された対照ＤＮＡの鋳型を使用して、ＭｕＤｅｌを使用した転移反応の効率を試験した。ライブラリーの構築にｐＮＯＭプラスミドを使用した。３６０ｎｇ（対照ＤＮＡ）又は１００ｎｇ（ｐＵＣ１８又はｐＮＯＭ）の標的プラスミドＤＮＡ、及びｍｉｎｉ−Ｍｕ（ＣａｍR−３）（２０ｎｇ）又はＭｕＤｅｌ（２０ｎｇ又は１００ｎｇ）が、反応混合物中に存在していた。反応物を３０℃で３時間放置した後、７５℃で１０分間加熱して不活性化させた。１μｌ又は２μｌを使用して、エレクトロポレーションにより大腸菌ＤＨ５α細胞を形質転換した。２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天上にこの細胞をプレーティングして、ＣａｍR
遺伝子、すなわちｍｉｎｉ−Ｍｕ又はＭｕＤｅｌトランスポゾンを含む細胞を選択した。
【００７７】
導入される突然変異が転移効率を損なうか否かを試験するために、標的ＤＮＡ基質としてｐＵＣ１８を使用した。ｍｉｎｉ−Ｍｕトランスポゾン（２０ｎｇ）による転移反応は、転移反応混合物の１／１０（２μｌ）を用いたエレクトロポレーションによる形質転換後に、２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールプレート上で約９９個の大腸菌ＤＨ５αコロニーが成長する結果をもたらした。ｍｉｎｉ−Ｍｕトランスポゾンを２０ｎｇ又は１００ｎｇのＭｕＤｅｌで置き換えた結果、それぞれ約１００個及び４３０個のコロニーが成長した。従って、驚くべきことに、トランスポゾンの末端で突然変異が導入されたにも関わらず、ＭｕＤｅｌは、依然として転移反応の有効な基質として働く。
【００７８】
このように、標的遺伝子内のランダムな位置でトリプレットヌクレオチドの欠失を形成させる方法の一般的な概要が図２に示される。ＴＥＭ−１  β−ラクタマーゼは、いくつかのβ−ラクタム系抗生物質に対する耐性に関与する臨床的に重要な酵素であり、この酵素の突然変異が、新たなＥＳ  β−ラクタムに対する耐性をもたらし得るため、標的としてＴＥＭ−１  β−ラクタマーゼをコードするｂｌａ遺伝子を選択した。活性型の変異体は大腸菌においてアンピシリンに対する耐性を付与し、細胞の成長を可能にするため、このことは簡単な選抜方法も提供する。新規のベクターであるｐＮＯＭがｂｌａ遺伝子の供給源として使用され、従って、ＭｕＤｅｌ挿入に関する標的ＤＮＡとして働く。
【００７９】
上記の記載の別法として、ｐＮＯＭとは無関係な対象遺伝子をトランスポゾンの挿入の標的として使用することができる。必要に応じて、トランスポゾンの挿入後に、標準的な手法を使用して、対象遺伝子をｐＮＯＭ又は別の好適なベクターにクローニングすることができる。あるいは、対象の遺伝子へのトランスポゾンの挿入後、通常は生物中において修復される、トランスポゾン反応の結果として形成されるＤＮＡ鎖に存在するギャップを、適切なギャップ修復法及びライゲーション法を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで修復することができる。
【００８０】
ＭｕＤｅｌのｐＮＯＭへの挿入の位置は、プラスミド全体にわたって均等に分布するはずなので、ｂｌａ遺伝子領域に挿入されるＭｕＤｅｌを含む細胞を選択する方法が必要になる。ＭｕＤｅｌトランスポゾンのプラスミドＤＮＡへの転移により、大腸菌にクロラムフェニコール耐性が付与されるため、ＭｕＤｅｌの挿入されたｐＮＯＭを含む細胞の選択が可能になる。ｂｌａ遺伝子領域内に挿入されたＭｕＤｅｌを有するこれらのコロニーはＴＥＭ−１の発現が低下し、これにより細胞のアンピシリンの存在下で成長する能力が影響を受ける。
【００８１】
トランスポゾンにより破壊されたｂｌａ遺伝子を有するコロニーの選択
大腸菌ＤＨ５αの転移混合物による形質転換後、２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール存在下で成長する４８個のコロニーを選択し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールの両者のＬＢ寒天プレートに再びプレーティングした。４８個のコロニーの中で、２２個のコロニーがクロラムフェニコールのプレート上でのみ成長し、それらはこの領域に対するトランスポゾンの挿入により破壊されたｂｌａ遺伝子を有すると考えられ、したがってＢＬＡDELライブラリーの成員として選択された。ＭｕＤｅｌトランスポゾンの存在を確認するために、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（上記の方法）及びｂｌａ遺伝子に隣接するプライマーＤＤＪｄｉ０１０（５’ＴＣＣＧＣＴＣＡＴＧＡＧＡＣＡＡＴＡＡＣＣＣＴＧ３’、配列番号２４）及びＤＤＪｄｉ０１１（５’ＣＴＡＣＧＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧＣＴＣＡＧＴＧ３’、配列番号２５）を使用して、２２個のコロニーそれぞれに対してＰＣＲを行った。
【００８２】
制限分析及び挿入したトランスポゾンを包含するクローンの選択
ＰＣＲ生成物を精製して、（これまでに記載された反応条件）ＭｌｙＩで制限分析を行うことによって、トランスポゾンの様々な挿入位置を確認した（図４）。ＭｌｙＩによる、直鎖ＰＣＲ断片（ｐＮＯＭのｂｌａ遺伝子領域のみを含む）の消化によって、ＭｕＤｅｌトランスポゾン及びｂｌａ遺伝子（１３１０ｂｐ）の内の８ｂｐが取り除かれ、ＭｕＤｅｌ挿入点によって長さが異なる２つの断片が生成する（図４Ａ）。制限分析は、ＭｕＤｅｌの挿入がランダムに起こり、トランスポゾンはこの領域にただ１つだけ挿入されたことを示した（図４Ｂ、レーン１〜８及び１０〜１６は、ＢＬＡDELライブラリーの異なる成員を示し、レーン９は、φ１７４  ＤＮＡ−ＨａｅＩＩＩ分子量ラダーである。アスタリスクで標識したバンドは、トランスポゾンに対応する）。それぞれのレーン由来の２つのより小さな断片の質量分析によって、２つの断片の大きさを足すと、ＰＣＲ生成物からＭｕＤｅｌを除いたものにほぼ等しくなることを確認した。ｂｌａ遺伝子内のトランスポゾンの位置を確定するプライマーとして、ＤＤＪｄｉ０１０及びＤＤＪｄｉ０１１を使用して、２２個のＰＣＲ生成物をシークエンシングした。配列分析によって、トランスポゾンの挿入がｂｌａ遺伝子内のランダムな位置で起こるという制限分析を確認し、その位置は図４Ｃで縦軸で示される。
【００８３】
２２個のコロニーのそれぞれからＭｕＤｅｌの挿入されたｐＮＯＭプラスミドを単離し、等量のプラスミドをそれぞれプールして、ＭｌｙＩで制限消化した後に、アガロースゲル電気泳動を行った。アガロースゲル電気泳動後に、ＭｕＤｅｌを除いた直鎖ｐＮＯＭに対応するバンドを単離精製した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ及び直鎖ｐＮＯＭ  約１０ｎｇを使用して、分子内ライゲーションを行った（上述の反応条件）。反応系を２５℃で１０分間、その後１６℃で１０時間放置した。ライゲーション混合物１μｌによるエレクトロポレーションによって、大腸菌ＤＨ５α細胞を形質転換した。エレクトロポレーションの直後に、ＳＯＣ培地５００μｌを細胞に加えて、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後の形質転換した細胞系５０μｌ及び５００μｌを１５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。プレートを３７℃で一晩放置し、９４ＢＬＡDELライブラリー及び２つのｐＮＯＭ含有コロニーを選択し、ＬＢ培地２００μｌ及び１５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む９６ディープウェル(deep-well)培養プレートに移した。細胞を強く振盪しながら、３７℃で１６時間成長させた。−８０℃での保存用に１０％（ｖ／ｖ）まで滅菌グリセロールを加えた。
【００８４】
ＴＥＭ−１  β−ラクタマーゼ活性に対する突然変異の影響
大腸菌の成長を妨げるアンピシリンの最小阻害濃度（ＭＩＣ）を測定することによって、それぞれのコロニーのＴＥＭ−１  β−ラクタマーゼ活性をｉｎ  ｖｉｖｏで測定した。９６プロング(prong)複製フォークを使用して、５０、１００、５００、２５００、５０００、７５００又は１００００μｇ／ｍｌのＡｍｐを含むＮｕｎｃ  Ｏｍｎｉｔｒａｙ（商標）プレート内のＬＢ寒天上に９６ウェルプレートにおけるコロニーをそれぞれ、レプリカプレーティングして、３７℃で１６時間インキュベートした。
【００８５】
アンピシリンに対する元のコロニーそれぞれのＭＩＣを図５に示す。ここでは、行（Ａ〜Ｈ）及び列（１〜１２）を表示するのに使用された９６ウェルマイクロプレートフォーマットによる、ライブラリーＢＬＡDELのそれぞれ選択された成員に対するアンピシリンＭＩＣの測定値を示す。ボックスの中の値は、５００、２５００、５０００及び１００００μｇ／ｍｌのアンピシリンのＭＩＣ値、又は１００００μｇ／ｍｌを超えるアンピシリンのＭＩＣ値を示す。数字の後にＸで印を付けられたボックスは、ｂｌａ遺伝子配列情報を有する変異体を示す。全ての細胞は、５０μｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリンで成長した。１４個の変異体は、ＭＩＣが５００μｇ／ｍｌであり、これはＴＥＭ−１活性の低下を示していた。６つの変異体のみが２５００μｇ／ｍｌのＭＩＣを有しており、３０個の変異体は５０００μｇ／ｍｌのＭＩＣを有していた。アンピシリンのＭＩＣが７５００μｇ／ｍｌである変異体はなく、１５個の変異体の成長が１００００μｇ／ｍ
ｌのアンピシリンで阻害された。２つの野生型ｐＮＯＭ対照を含む残りの３１個のコロニーは１００００μｇ／ｍｌのアンピシリンでも生存可能であった。このようなＭＩＣ値の広がりは、様々な３つのヌクレオチド塩基対の欠失突然変異がｂｌａ遺伝子に組み込まれ、ＴＥＭ−１のｉｎ  ｖｉｖｏ活性に対して大きな影響を与えたことを示す。
【００８６】
それぞれのアンピシリン濃度でのＭＩＣを示すいくつかのクローンを、プライマーＤＤＪｄｉ０１０及びＤＤＪｄｉ０１１並びにＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲに供した。シークエンシングプライマーとして、ＤＤＪｄｉ０１０及びＤＤＪｄｉ０１１を使用して、１０６７ｂｐのＰＣＲ生成物をシークエンシングすることにより、トリプレットヌクレオチドの欠失位置を確認した。
【００８７】
単一コドンに関するＭｕＤｅｌの挿入点により、欠失の性質が確定する。表１の第１列、第４列及び第５列に、３つの可能性が示される。全挿入の３分の１が、コドンの真の欠失を形成する。残りの３分の２においては、取り除かれる３つのヌクレオチド塩基対は２つのコドンと重複することになり、それにより二次的な点突然変異が引き起こされ得る。二次的な突然変異の性質は、周辺のＤＮＡ配列によって変わる。遺伝暗号の縮重のため、点突然変異のいくつかはサイレント突然変異になる一方で、それ以外は、アミノ酸の置換をもたらすことになろう。
【００８８】
【表１】
2008527987.tif 000003
【００８９】
特定のアンピシリンのＭＩＣを示すクローンからいくつかのｂｌａ遺伝子を単離し、シークエンシングすることによって、アミノ酸の欠失位置及び任意の二次突然変異が起こったか否かを確認した。表２は、ライブラリーＢＬＡDELの活性型ＴＥＭ−１変異体から単離した全ての異なる配列を示す。
【００９０】
【表２】
2008527987.tif 000004
【００９１】
２２個の可能な異なる突然変異の内の８個が、この選択基準において、ＴＥＭ−１により耐性になっていると同定された。８個のうちの２つ（Ｒ８３Δ及びＲ２７５Δ、Δは、欠失した残基を示す）は、真のコドンの欠失であった。３つの配列（Ｔ１１４Δ、Ｇ１９６Δ及びＡ２１７Δ）は、遺伝子レベルでは真の欠失を生成しなかったが、遺伝暗号の縮重のために、アミノ酸の置換は起こらなかった。３つの配列（Ｐ６２Δ−Ｅ６３Ｑ、Ｔ１１４Δ−Ｄ１１５Ｎ及びＥ１７７Δ−Ｒ１７８Ｄ）は、二次的な突然変異を含んでいた。単一のコドンに関するＭｕＤｅｌの挿入点は、予想通り均等に分配される（２：３：３）（表２）。任意のシークエンシングした変異体について、他の突然変異は観察されず、野生型のＴＥＭ−１は検出されなかった。
【００９２】
前記配列は、ＴＥＭ−１の一次構造の全長にわたって散在し、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性における種々の影響を伴っていた。２つの突然変異、Ｔ１１４Δ及びＴ１１４Δ−Ｄ１１５Ｎは、２つのヌクレオチド塩基対のトランスポゾン挿入位置によってのみ分離された（表２）。
【００９３】
前記配列とアンピシリンＭＩＣとの間には良好な相関関係があった（表３）。Ｐ６２Δ−Ｅ６３Ｑ、Ｒ８３Δ及びＥ１７７Δ−Ｒ１７６Ｄを含む変異体は、全て５００μｇ／ｍｌのＭＩＣを有していた。Ｔ１１４Δ変異体及びＴ１１４Δ−Ｄ１１５Ｎ変異体は、２５００μｇ／ｍｌ及び５０００μｇ／ｍｌの値両方にわたり、それぞれの濃度で複数のクローンが同定された。Ｒ２７５Δ変異体は、欠失がへリックス内で生じるにもかかわらず、アンピシリンに対する比較的高いＭＩＣを有している（５０００μｇ／ｍｌ）。Ａ２１７Δ及びＧ１９６Δの両者で、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性に対する影響はほとんどなく、Ｇ１９６Δは大腸菌に対して、１００００μｇ／ｍｌのアンピシリンに対する耐性を依然として付与することができる。Ｇ１９６Δ  ＴＥＭ−１変異体を有する１つのクローンは、実際に１００００μｇ／ｍｌのアンピシリンのＭＩＣを示したが、そのようになった理由は不明である。というのは、Ｇ１９６Δ変異体に関する一般的な傾向（シークエンシングした７個のうちの６個；表３）では、この変異体を有する細胞は１００００μｇ／ｍｌのアンピ
シリン濃度で成長できることが示されているからである。
【００９４】
【表３】
2008527987.tif 000005
【００９５】
＜実施例２＞
本実施例では、実施例１で概説されるトランスポゾンに基づく技術を用いて、対象の標的遺伝子のランダムな位置でのトリプレットヌクレオチドの挿入を含む変異体のライブラリーを形成する方法を例証する。本実施例は、改変ｍｉｎｉ−Ｍｕトランスポゾン及び新たに構築されたｐＮＯＭプラスミド、又はｐＮＯＭプラスミドの好適な誘導体を使用する。本実施例では、制限エンドヌクレアーゼＭｌｙＩはトリプレットヌクレオチドの挿入に必須であるが、当業者によって理解されるように、適当なステップが修正され、また必要に応じて追加のステップが加えられるならば、ＭｌｙＩのものと同様の特性を有する他の制限エンドヌクレアーゼを使用することができる。
【００９６】
本実施例は、実施例１及び図２で概説された手順に従う。図２では、本実施例に関しては、ギャップ及び灰色のブロックは挿入点を表す。主な違いは、ｍｉｎｉ−Ｍｕトランスポゾンに関する点である。ランダムなトリプレットヌクレオチドの挿入の形成を目的として、元のＭｕファージ由来のトランスポゾンであるｍｉｎｉ−Ｍｕ（ＣａｍR−３）を改変する。ここでは、改変されたＭｕトランスポゾン内の選択マーカーとして、ＣａｍR遺
伝子を使用する。正しい要素がトランスポゾンの末端に存在して転移を可能にするならば、このＣａｍR遺伝子を別の遺伝子と交換してもよい。そのような別の遺伝子は、大腸菌又は任意の他の生物の選択株に対して、特定の条件下において、その生物を生存可能にさせるか、又はその生物とトランスポゾン配列を含まない他の細胞とを差別化する特徴をその生物に示させる選択的利点を与える遺伝子である。
【００９７】
ＭｕＩｎｓとして知られる改変されたトランスポゾンはＭｌｙＩ制限部位を含むが、その位置はトランスポゾン挿入部位から４ヌクレオチド塩基対離れた位置にシフトした（図３Ａ）。トリプレットヌクレオチドの挿入に関するメカニズムは、実施例１のものと同様の経路に従い、図３Ｃで概説される。トランスポゾンの挿入は、大腸菌でのギャップ修復後に５ｂｐの重複をもたらす（トランスポゾンからの４ｂｐの突出部は取り除かれる）。ＭｌｙＩの切断部位は認識配列から５ｂｐ離れているため、標的遺伝子の両末端から１ｂｐが除去される結果になる。２つの末端のライゲーションによってこの遺伝子は再結合されるが、３つのヌクレオチド塩基対が付加される。挿入された３つのヌクレオチド塩基対は、図３Ｃにおいて太字で示される。単一コドンに関するＭｕＩｎｓの挿入点によって、挿入の性質が決定される。上記の表１の第１列、第２列、第３列で３つの可能性が示される。
【００９８】
ＭｕＤｅｌに関すると同じ様式でトランスポゾンが使用され、同様に取り扱われた。すなわち、標的遺伝子へのトランスポゾンの挿入、トランスポゾンが挿入された標的遺伝子の選択、制限消化によるトランスポゾンの除去、分子内ライゲーション、適当な生物への形質転換、トリプレットヌクレオチドの挿入を有する標的遺伝子変異体ライブラリーの選択又はスクリーニング、である。
【００９９】
＜実施例３＞
本実施例は、実施例１で概説されるトランスポゾンに基づく技術を使用して、対象の標的遺伝子のランダム位置でトリプレットヌクレオチドの置換を有する変異体のライブラリーを形成する方法を示している。本実施例は、ＭｕＤｅｌトランスポゾン（実施例１で概説される）及び新たに構築されたｐＮＯＭプラスミド、又はｐＮＯＭプラスミドの好適な誘導体を使用する。本実施例では、制限エンドヌクレアーゼＭｌｙＩはトリプレットヌクレオチドの置換に必須であるが、当業者によって理解されるように、適当なステップが改変され、また必要に応じて追加のステップが加えられるならば、ＭｌｙＩのものと同様の特性を有する他の制限エンドヌクレアーゼを使用することができる。
【０１００】
本実施例は、図６で概説される手順に従い、実施例１で概説される手順と同様である。ｐＮＯＭ及びＭｕＤｅｌの両者は実施例１で概説されると同様である。実施例１と同じ様式でＭｕＤｅｌが使用され、同様に取り扱われた。標的遺伝子へのトランスポゾンの挿入、トランスポゾンが挿入された標的遺伝子の選択、制限消化によるトランスポゾンの除去、である。図６で概説されるように、分子内ライゲーションが分子間ライゲーションに置き換えられるという点で、次の段階は実施例１とは異なる。ステップ３では、分子内ライゲーションが人工のＤＮＡ配列の分子間ライゲーションと置き換えられる（例えばＳｕｂＳｅｑ、図７参照）。人工のＤＮＡ配列内及び単離され、ＭｌｙＩで消化されたプラスミドＤＮＡ内に存在する選択マーカーを使用するために、人工のＤＮＡ配列を含む標的ＤＮＡ配列が選択される（図６のステップ４）。分子内ライゲーションは、３つのヌクレオチド塩基対が置換されたｂｌａ遺伝子の再形成をもたらす（ステップ５）。得られるライブラリーを選択又はスクリーニングして、必要な特性を有するこれらの変異体を選択する。
【０１０１】
図６において、斜線ブロックはトランスポゾン、黒色のブロックは標的遺伝子、斑のブロックは人工のＤＮＡ配列、灰色のブロックは置換点、そして太い点線は残りのプラスミド骨格を示す。図７Ａに示される特性を有するＤＮＡ要素を含むように、標準的なＤＮＡ
ライゲーション法を使用して、新たなＤＮＡ配列を挿入した。図７Ａでは、ＤＮＡ配列の２つの異なる末端をＴＥＲＭ−１及びＴＥＲＭ−２とした。ＴＥＲＭ−２の最後の３つのヌクレオチド塩基対は、決定されたトリプレット配列、又は、完全にランダムな（それぞれの位置が４つの可能性のあるヌクレオチドを有し得る）若しくは半分ランダムな（いくつかの位置では許容されるヌクレオチドに制限があってもよい）トリプレット配列であり得る。選択マーカーをコードする遺伝子がＴＥＲＭ−１とＴＥＲＭ−２との間に配置される。使用されるメカニズムを図７Ｂで概説する。ＭｕＤｅｌトランスポゾンの挿入が、大腸菌でのギャップ修復後の５ｂｐの重複をもたらす。ＭｌｙＩの切断部位は、認識配列から１ｂｐ離れており、標的遺伝子の両末端で４ｂｐの除去をもたらし、標的遺伝子から３つのヌクレオチド塩基対の同等物を欠失させる。ＳｕｂＳｅｑ  ＤＮＡを切断点で標的遺伝子にライゲーションし、形質転換後に、選択マーカーを使用して、挿入されたＳｕｂＳｅｑを有する標的遺伝子を選択する。ＳｕｂＳｅｑを挿入した標的遺伝子のＭｌｙＩによる消化によって、ＴＥＲＭ−２における最後の３つのヌクレオチド塩基対以外のＳｕｂＳｅｑ  ＤＮＡの除去がもたらされる。分子内ライゲーションによって、標的遺伝子の再形成がもたらされるが、３つのヌクレオチド塩基対が置き換えられる。置換された３つのヌクレオチド塩基対を太字で示す。
【０１０２】
ＳｕｂＳｅｑの作製
図７で示されるＤＮＡ要素（以降、ＳｕｂＳｅｑと称する）は、２つのＭｌｙＩ部位を含むが、当業者によって理解されるように、適当なステップが改変され、また必要に応じて追加のステップが加えられるならば、ＭｌｙＩのものと同様の特性を有する他の制限エンドヌクレアーゼを使用することができる。１つのＭｌｙＩ部位が（これ以降ＴＥＲＭ−１と称する）ＤＮＡ配列の１つの末端から５ｂｐに配置され、もう１つのＭｌｙＩ部位が（これ以降ＴＥＲＭ−２と称する）もう１つの末端から８ｂｐ離れて配置された。適切な選択マーカー遺伝子が２つのＭｌｙＩ部位を連結し、該選択マーカー遺伝子は、大腸菌又は任意の他の適当な生物の選択株に対して、特定の条件下において、その生物を生存可能にさせるか、又はその生物とＳｕｂＳｅｑ  ＤＮＡ要素を含まない他の細胞とを差別化する特徴をその生物に示させる選択的利点を与える。ＴＥＲＭ−２の最後の３つのヌクレオチド塩基対は、決定されたトリプレット配列、又は、完全にランダム（それぞれの位置が４つの可能性のあるヌクレオチドを有し得る）若しくは半分ランダム（いくつかの位置では許容されるヌクレオチドに制限があってもよい）であり得る。
【０１０３】
特に明記しない限り、Ｅｘｔｅｎｓｏｒ  Ｈｉ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｅｎｚｙｍｅミックスを用いて、上記のように全てのＰＣＲ反応を行った。鋳型として働く元のｍｉｎｉ−Ｍｕ（ＣａｍR−３）トランスポゾン０．１ｎｇと共に、オリゴヌクレオチドプライマーＤＤＪｄｉ０１７（５’Ｐｈｏｓ−ＣＧＡＣＣＧＡｃＴｃＡＡＴＡＣＣＴＧＴＧＡＣＧＧＡＡＧＡＴＣ３’（配列番号４７）；「Ｐｈｏｓ」は、リン酸化したヌクレオチドを示す）及びＤＤＪｄｉ０１８（５’Ｐｈｏｓ−ＮＮＮＡＡＣＴＧＧａＣＴＣＡＧＧＣＡＴＴＴＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＣ３’（配列番号４８）；「Ｐｈｏｓ」はリン酸化したヌクレオチドを示し、「Ｎ」は任意のヌクレオチドを示す）をフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用したＰＣＲによって、ＳｕｂＳｅｑ  ＤＮＡ要素を構築し、ＳｕｂＳｅｑを作製した。１０９５ｂｐのＰＣＲ産物を精製した。
【０１０４】
アミノ酸置換ライブラリーの作製及びシークエンシング
実施例１で作製されたものに基づく拡張ライブラリーを本実施例で使用した。この拡張ライブラリーは、ｂｌａ遺伝子内に挿入されたＭｕＤｅｌを有する最大１７６個のクローンを含んでいた。ｐＮＯＭのｂｌａ遺伝子内のＭｕＤｅｌを含むコロニーをプールし、実施例１で概説されるように、プラスミドＤＮＡを単離した。精製したプラスミドライブラリーをＭｌｙＩで切断し、実施例１で概説されるようにアガロースゲル電気泳動後にＭｕＤｅｌを除去した直鎖ｐＮＯＭプラスミドを単離精製した。プラスミドＤＮＡを、アガロ
ースゲル電気泳動に先立って、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ(NEBioLabs)を使用して脱リン酸化した。
【０１０５】
上記で概説されるように作製したＳｕｂＳｅｑ  ＤＮＡ配列（５０ｎｇ）をＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用して、ＭｌｙＩ消化ｐＮＯＭ（約３０ｎｇ）にライゲーションした。ライゲーションミックスを最大２μｌ使用して、エレクトロポレーションによって大腸菌ＤＨ５α細胞を形質転換した。この細胞を２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールＬＢ寒天プレートにプレーティングして、ｐＮＯＭのｂｌａ遺伝子内に挿入されたＳｕｂＳｅｑを含む細胞を選択した。クロラムフェニコールＬＢ寒天プレートからランダムに１９２個のコロニーを選択し、２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールＬＢブロスを含む９６ディープウェル培養プレートで成長させた。それぞれのウェルから等量を取り出し、共にプールした。
【０１０６】
実施例１で概説されるように、細胞からＳｕｂＳｅｑ含有ｐＮＯＭライブラリーを精製した。上記で概説されるように、約２μｇのライブラリーをＭｌｙＩで消化した。この消化によりＳｕｂＳｅｑが除去され、この手順のはじめにＭｕＤｅｌの除去の際に欠失した３ｂｐの野生型ｂｌａ遺伝子の置き換えをもたらした。アガロースゲル電気泳動後に直鎖ｐＮＯＭ（２１１５ｂｐ）に対応するバンドを単離精製した。
【０１０７】
直鎖ｐＮＯＭプラスミドのライブラリー（１０ｎｇ）は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを（上記のように）使用した分子内ライゲーションさせて、プラスミドの末端を再結合させ、ＢＬＡSUBライブラリーが構築された。ライゲーション混合物の１０分の１を使用し、ＤＨ５αを形質転換した。この細胞を１５μｇ／ｍｌのアンピシリンＬＢ寒天プレート上でプレーティングして、活性型ＴＥＭ−１β−ラクタマーゼ変異体を選択した。同プレート上で１０００個を超えるコロニーが成長した。
【０１０８】
実施例１で概説されるように、１５μｇ／ｍｌのアンピシリン上で成長することができるコロニーを幾つかランダムに選択して、プライマーＤＤＪｄｉ０１０及びＤＤＪｄｉ０１１を使用し、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用したＰＣＲを行った。予想通り、この生成物それぞれの大きさは１０７０ｂｐであった。プライマーとしてオリゴヌクレオチドＤＤＪｄｉ０１０を使用して、ＰＣＲによって生成されたＤＮＡを精製し、シークエンシングした。突然変異体の正確な性質を表４に示す。このデータは、このトランスポゾンに基づく技術を使用して、アミノ酸置換をタンパク質のランダムな位置に組み込むことができることを示している。
【０１０９】
【表４】
2008527987.tif 000006
【０１１０】
＜実施例４＞
本実施例は、実施例３の発展であり、ＳｕｂＳｅｑＤＮＡ配列内にさらなる特徴を組み込む。実施例４は、記載される違いを除いて、実施例３で概説されるものと同じステップに従う。主な違いは、ＳｕｂＳｅｑ  ＤＮＡ要素の性質である。
【０１１１】
実施例３に対するこの別形態においては、ＴＥＲＭ−１及び／又はＴＥＲＭ−２でのＭｌｙＩ部位をＳｕｂＳｅｑ配列内に移動させた。適当な位置にＭｌｙＩ配列を移動させることにより、
（ｉ）  別のトリプレットヌクレオチド又は複数のトリプレットヌクレオチドのさらなる欠失、
（ｉｉ）  トリプレット（３）ヌクレオチド配列の四重項（quadruplet）（４）ヌクレオチド配列による置換、及び
（ｉｉｉ）  別のトリプレットヌクレオチド又は複数のトリプレットヌクレオチドのさらなる挿入
が生じ得る。
【０１１２】
＜実施例５＞
本実施例は、実施例１で概説されるトランスポゾンに基づく技術を使用して、対象の標的タンパク質のランダムな位置へのアミノ酸配列（例えば、全タンパク質、タンパク質ドメイン又はタンパク質ドメインの（エピトープ等の）断片）の挿入を含む変異体のライブラリーを形成する方法を示している。本実施例は、ＭｕＤｅｌトランスポゾン（実施例１）及び新たに構築されたｐＮＯＭプラスミド、又はｐＮＯＭプラスミドの好適な誘導体を使用する。当業者に理解されるように、この処理に適当な改変を加えることにより、本明細書に記載される他のトランスポゾンもこの手順に使用することができる。本実施例では、制限エンドヌクレアーゼＭｌｙＩはドメイン挿入に必須であるが、当業者によって理解されるように、適当なステップが改変され、また必要に応じて追加のステップが加えられるならば、ＭｌｙＩのものと同様の特性を有する他の制限エンドヌクレアーゼを使用する
ことができる。
【０１１３】
本実施例は、図８で概説される手順に従い、実施例１で概説される手順と同様のものである。前述のように、この手順は４つの主なステップを含む。
ステップ１：ＭｕＤｅｌトランスポゾン（図８の斜線ブロック）を標的プラスミド又は標的遺伝子に挿入する。
ステップ２：選択マーカー遺伝子の特性を利用して、プラスミドに組み込まれたＭｕＤｅｌを含む細胞を選択する。プラスミドを単離し、プールして、ＭｌｙＩ消化によってトランスポゾンを取り除く。
ステップ３：ＤＮＡ配列（図８の白色ブロック）を標的遺伝子に挿入する。この場合、挿入されるＤＮＡは、タンパク質シトクロームｂ562をコードするｃｙｂＣ遺伝子（これ以降ｃｙｔ ｂと称する）である。
ステップ４：ライブラリーを所望の特性を有するキメラ遺伝子によってコードされるタンパク質を同定するに適切な選択又はスクリーニングステップに供する。
【０１１４】
ｐＮＯＭ及びＭｕＤｅｌの両者が、これまでの実施例に概説されるものと同一である。実施例１及び実施例３と同じ様式でＭｕＤｅｌを使用し、同様に取り扱った。すなわち、標的遺伝子へのトランスポゾンの挿入、トランスポゾンが挿入された標的遺伝子の選択、制限消化によるトランスポゾンの除去、である。
【０１１５】
本実施例で使用したｐＮＯＭのｂｌａ遺伝子内に挿入されたＭｕＤｅｌのライブラリーは、実施例３で使用したものと同一である。ＭｕＤｅｌを除いた直鎖脱リン酸化ｐＮＯＭの生成は、実施例３で概説されるものと全く同じである。
【０１１６】
Ｃｙｔ  ｂ挿入の構築
ｃｙｔ  ｂをコードするｃｙｂＣ遺伝子の３つの異なるバージョンを作製した。実施例１で概説されるように、トランスポゾンを１つのコドンに対して３つの異なる位置に挿入することができる。トランスポゾン除去後に導入される単一の切断点が、単一のコドンに対して３つの異なる位置に生じ得るので、ｃｙｂＣ遺伝子挿入に対して、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のみを使用した場合、フレームシフトによってライブラリーの３分の２は重複することになろう。したがって、全ての３つのＯＲＦのサンプリングを可能にするため、さらなる塩基を両末端に加えたｃｙｂＣの２つのさらなるバージョンを使用した。これらは、３つの別々のライブラリーを構築した。さらに、ＴＥＭ−１をｃｙｔ
ｂの挿入に対して耐性とするために、一方又は両方の結合点には短いリンカーが必要かもしれない。したがって、ｃｙｂＣのＯＲＦの各々のバージョンは、遺伝子の一方の末端又は両方の末端で、以下に列挙されるプライマーオリゴヌクレオチドでコードされたリンカーを有するｃｙｔ  ｂあるいはリンカー配列を有さないｃｙｔ  ｂのいずれかをコードする４つの異なる配列から構成されていた。
【０１１７】
特に明記しない限り、Ｅｘｔｅｎｓｏｒ  Ｈｉ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ酵素ミックス及び供給される緩衝液を用いて、上記で概説されるように全てのＰＣＲ反応を行った。以下のように、鋳型としてｃｙｂＣ遺伝子を使用したＰＣＲを使用して、ｃｙｂＣ遺伝子（ＯＲＦＩ、ＯＲＦＩＩ及びＯＲＦＩＩＩ）のＯＲＦライブラリーそれぞれを構築した。ＯＲＦＩ：フォワードプライマーＤＤＪｌａｃＢ００５（５’ＧＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴＧＧＡ３’、配列番号６９）、ＤＤＪｄｉ０２３（５’ｇｇｃｇｇｔａｇｃＧＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴＧＧＡ（配列番号７０）、小文字は結合領域をコードするヌクレオチドを示す）、並びにリバースプライマーＤＤＪｌａｃＢ００６（５’ＣＣＴＡＴＡＣＴＴＣＴＧＧＴＧＡＴＡＧＧＣＧＴ、配列番号７１）及びＤＤＪｄｉ０２４（５’ｇｃｔｇｃｃａｃｃＣＣＴＡＴＡＣＴＴＣＴＧＧＴＧＡＴＡＧＧＣＧＴ（配列番号７２）、小文字は結合領域をコードするヌクレオチドを示す）。
ＯＲＦＩＩ：フォワードプライマーＤＤＪｄｉ０１９（５’ＣＧＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴＧＧＡ３’（配列番号７３）、下線を付したヌクレオチドはＯＲＦを維持するために使用される追加のヌクレオチドである）及びＤＤＪｄｉ０２５（５’ＣｇｇｃｇｇｔａｇｃＧＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴＧＧＡ３’（配列番号７４）、下線のヌクレオチドはＯＲＦを維持するのに使用される追加のヌクレオチドであり、小文字は結合領域をコードするヌクレオチドを示す）、並びにリバースプライマーＤＤＪｄｉ０２０（５’ＣＴＡＴＡＣＴＴＣＴＧＧＴＧＡＴＡＧＧＣＧＴ３’、配列番号７５）及びＤＤＪｄｉ０２６（５’ｃｔｇｃｃａｃｃＣＣＴＡＴＡＣＴＴＣＴＧＧＴＧＡＴＡＧＧＣＧＴ３’（配列番号７６）、小文字は結合領域をコードするヌクレオチドを示す）；
ＯＲＦＩＩＩ：フォワードプライマーＤＤＪｄｉ０２１（５’ＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴＧＧＡ３’（配列番号７７）、下線のヌクレオチドはＯＲＦを維持するのに使用される追加のヌクレオチドである）及びＤＤＪｄｉ０２７（５’ＣＴｇｇｃｇｇｔａｇｃＧＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴＧＧＡ３’（配列番号７８）、下線を付したヌクレオチドはＯＲＦを維持するために使用される追加のヌクレオチドであり、小文字は結合領域をコードするヌクレオチドを示す）、並びにリバースプライマーＤＤＪｄｉ０２２（５’ＴＡＴＡＣＴＴＣＴＧＧＴＧＡＴＡＧＧＣＧＴ３’、配列番号７９）及びＤＤＪｄｉ０２８（５’ｔｇｃｃａｃｃＣＣＴＡＴＡＣＴＴＣＴＧＧＴＧＡＴＡＧＧＣＧＴ３’（配列番号８０）、小文字は結合領域をコードするヌクレオチドを示す）。
【０１１８】
３１８〜３３６ｂｐの生成物を精製し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ(NE Biolabs)反応緩衝液中で２０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して、ＰＣＲ産物に５’リン酸基を付加した。
【０１１９】
ｃｙｂＣ挿入ライブラリーの作製及びシークエンシング
次の段階は実施例１とは異なり、図８で概説されるように、分子内ライゲーションが分子間ライゲーションに置き換えられるという点で、実施例３により密接に従う。ＳｕｂＳｅｑがｂｌａ遺伝子のランダムな位置に挿入される代わりに、実施例３と同様に、ｃｙｂＣのＯＲＦライブラリーが挿入される。ここではｃｙｂＣが挿入されるが、全遺伝子、タンパク質ドメインと同等の遺伝子断片、全タンパク質の部分的アミノ酸配列と同等の遺伝子断片、若しくはタンパク質のドメインのいずれかをコードする任意のＤＮＡ要素（例えばエピトープ）、又は任意の他のアミノ酸配列を使用してもよい。
【０１２０】
実施例１で作製されたものに基づく、実施例３で使用された拡張ライブラリーもまた本実施例で使用された。この拡張ライブラリーは、ｂｌａ遺伝子内に挿入されたＭｕＤｅｌを有する最大１７６個のクローンを含んでいた。ｐＮＯＭのｂｌａ遺伝子内にＭｕＤｅｌを含むコロニーをプールし、実施例１で概説されるように、プラスミドＤＮＡを単離した。精製したプラスミドライブラリーをＭｌｙＩで切断し、実施例１で概説されるようなアガロースゲル電気泳動後に、ＭｕＤｅｌが除かれた直鎖ｐＮＯＭプラスミドを単離精製した。アガロースゲル電気泳動に先立って、仔ウシ腸アルカリホスファターゼを使用して、プラスミドＤＮＡを脱リン酸化した。
【０１２１】
上記で作製したｃｙｂＣの３つのＯＲＦライブラリー（５０ｎｇ）をＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用して、ＭｌｙＩ消化ｐＮＯＭ（約３０ｎｇ）に別々にライゲーションした。最大２μｌのそれぞれの反応物のライゲーションミックスを使用して、エレクトロポレーションによって大腸菌ＤＨ５α細胞を形質転換した。この細胞を１５μｇ／ｍｌのアンピシリンＬＢ寒天プレート上にプレーティングし、活性型キメラｃｙｔ  ｂ−ＴＥＭ−１タンパク質を含む細胞を選択した。対照プレート上で成長したのは８個のコロニーのみであったが（ＯＲＦライブラリー挿入物を含まないライゲーションで形質転換された細胞）、その一方で、４５個、１３０個及び１５０個のコロニーがそれぞれＯＲＦＩ、ＯＲＦＩＩ及びＯＲＦＩＩＩのｃｙｂＣライブラリーを意味するプレート上で成長した。
【０１２２】
実施例１で概説されるように、プライマーＤＤＪｄｉ０１０及びＤＤＪｄｉ０１１を使用して、それぞれＯＲＦＩ、ＯＲＦＩＩ及びＯＲＦＩＩＩを意味するプレートからの１０個、１５個及び１０個のランダムに選択されたコロニーについて、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用したＰＣＲを行った。生成物の大きさは１３００ｂｐ〜１６００ｂｐの範囲であった。ＰＣＲによって生成されたＤＮＡを精製し、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＤＤＪｄｉ０１０を使用してシークエンシングした。突然変異体の正確な性質を表５に示す。いくつかのキメラは、ｂｌａ遺伝子の同じ位置に直列に挿入された２つのｃｙｂＣ遺伝子を含んでいた。このデータは、このトランスポゾンに基づく技術を使用して、ドメイン挿入物をタンパク質のランダムな位置に組み込むことができることを示している。
【０１２３】
【表５】
2008527987.tif 000007
【０１２４】
本実施例で概説される方法が、上記の「背景技術」のセクションで概説されるような分子スイッチを生成するようにドメイン挿入物を作製するためのツールとして利用できることを、当業者は理解するだろう。
【０１２５】
＜実施例６＞
本実施例は、前述の実施例に記載されたＭｕＩｎｓトランスポゾンの代替物を記載している。ＭｕＩｎｓを含むこれまでのそれぞれの実施例において、スキームにおけるＭｕＩｎｓを以下に記載される新たなトランスポゾン配列によって置き換えるとともに、転移を生じさせる手順を適切に改変する。
【０１２６】
第１の例において、Devine及びBoeke(Nucleic Acid Res.(1994) 22 3765-3772)によって記載されるＡＴ−２トランスポゾンを図９Ａに示すように改変した。ＡＴ−２トランスポゾンは、ｍｉｎｉ−Ｍｕと同様の特徴を示し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで効率的な転移を行うことができる。主な違いは、トランスポザーゼ認識部位が、末端の４つのヌクレオチド塩基対のみから構成されるということである。この配列の後に直接ＭｌｙＩ認識部位を配置することにより、転移の効率を低下させることなく、図９Ｂで概説されるメカニズムにより、挿入突然変異を進行させることが可能である（挿入したヌクレオチドを太字で示す）。選択マーカーは、図９Ａで示されるように２つの末端の間のトランスポゾン内に存在する。Ｔｙ１インテグラーゼによって同定されるＵ３配列を示す。選択マーカーをコードする遺伝子は、２つの末端のＵ３配列及びＭｌｙＩ認識配列の間に存在するであろう。選択マーカーは、大腸菌又は任意の他の適当な生物の選択株に対して、特定の条件下で、その生物を生存可能にさせるか、又はその生物とトランスポゾン配列を含まない他の細胞とを差別化する特徴をその生物に示させる、選択的利点を与える遺伝子である。
【０１２７】
第２の例においては、図１０Ａに示されるように、Goryshin及びReznikoff(J. Biol. Chem. (1998) 273 7367-7374）に記載されるＴｎ５トランスポゾンを改変してＭｕＩｎｓトランスポゾンを置き換えた。Ｔｎ５ＩｎｓＯＥはＯＥ（外部末端）要素を含み、Ｔｎ５ＩｎｓＭＥはＭＥ（モザイク末端）要素を含む。これらの要素は、これらの間に位置するＤＮＡ配列の転移を促進することができる。それぞれの場合において、選択マーカー遺伝子は、２つのＯＥ又はＭＥ要素の間に位置している。選択マーカーは、大腸菌又は任意の他の好適な生物の選択株に対し、特定の条件下で、その生物を生存可能にさせるか、又はその生物とトランスポゾン配列を含まない他の細胞とを差別化する特徴をその生物に示させる、選択的利点を与える遺伝子である。ヌクレオチド配列の改変を含むＯＥ又はＭＥ要素の任意の修正版を利用することができるが、その配列が必要な位置にＭｌｙＩ配列を依然として含み、そのＤＮＡが依然トランスポゾンとして働くことができることが条件となる。
【０１２８】
Ｔｎ５ＩｎｓＯＥ又はＴｎ５ＩｎｓＭＥを使用する場合の、トリプレットヌクレオチドの挿入が起こるメカニズムを図１０Ｂに示す。挿入されたヌクレオチドを太字で示す。Ｍｕ及びＡＴ−２とは異なり、Ｔｎ５転移は、９つのヌクレオチドの互い違いの切断を介して生じる。ＭｌｙＩ認識配列は、各末端から２ヌクレオチド塩基対離れて配置され、ＭｌｙＩ消化後の分子内ライゲーションの際に３つのヌクレオチド塩基対の正確な挿入を可能にする。
【０１２９】
＜実施例７＞
本実施例は、図１０で示されるように、Ｔｎ５トランスポゾンに基づく改変された認識部位を含む改変されたトランスポゾンを利用するトランスポゾンに基づく技術を使用して、ｂｌａ遺伝子のランダムな位置におけるトリプレットヌクレオチドの付加を含む変異体のライブラリーを作製する方法を示している。クロラムフェニコール耐性遺伝子が、選択マーカーとして挙げられる。本実施例は、Ｔｎ５ＩｎｓＯＥ及びＴｎ５ＩｎｓＭＥと名付けられた２つの新規のトランスポゾン及びｐＮＯＭプラスミドを使用するが、ｐＮＯＭの他の好適な誘導体を使用してもよい。本実施例では、制限エンドヌクレアーゼＭｌｙＩは、トリプレットヌクレオチドの挿入に必須であるが、当業者によって理解されるように、適当なステップを改変し、また必要に応じて追加のステップが加えられれば、ＭｌｙＩのものと同様の特性を有する制限エンドヌクレアーゼを使用することができる。
【０１３０】
本実施例は、実施例１及び図２で概説される手順に従う。主な違いは、使用されるトランスポゾンに関するものである。要約すると、この手順は、４つの主なステップから成る。
ステップ１：Ｔｎ５ＩｎｓＯＥ又はＴｎ５ＩｎｓＭＥトランスポゾンを標的プラスミド又は標的遺伝子に挿入する。
ステップ２：プラスミドに組み込まれたＴｎ５ＩｎｓＯＥ又はＴｎ５ＩｎｓＭＥを含む細胞はＣａｍR遺伝子を含み、従ってクロラムフェニコールの存在下で成長することができる。プラスミドを単離し、プールして、ＭｌｙＩ消化によってトランスポゾンを取り除く。
ステップ３：分子内ライゲーションにより、ヌクレオチド塩基対が追加された標的遺伝子の再形成がもたらされる。
ステップ４：得られたライブラリーを選択又はスクリーニングして、必要な特性を有する変異体を選択する。
【０１３１】
図２においては、斜線ブロックはトランスポゾンを示し、黒色のブロックはｂｌａ遺伝子を示し、間隙及び灰色のブロックは挿入点を示し、太い点線は残りのプラスミド骨格を示す。
【０１３２】
この処理をｂｌａ遺伝子以外の標的遺伝子に適用することもできるが、その際の条件は、
１．標的遺伝子によってコードされるタンパク質に適した図２のステップ４の選択又はスクリーニングのステップに対して適切な改変が為されること、及び
２．好ましくない制限部位が全く存在しないか、又は標的遺伝子から取り除かれること、である。
【０１３３】
新たに構築したｐＮＯＭプラスミド（実施例１を参照）と共に、Ｔｎ５由来の配列を含む修飾したｍｉｎｉ−Ｍｕトランスポゾンを使用する本実施例を、これより詳細に記載する。得られたトランスポゾンＤＮＡは、Ｔｎ５由来の転移反応に要求される配列（例えばトランスポザーゼ酵素によって認識されるＯＥ又はＭＥ配列）以外はｍｉｎｉ−Ｍｕに由来する。本実施例では、制限エンドヌクレアーゼＭｌｙＩはトリプレットヌクレオチドの挿入に必須であるが、当業者によって理解されるように、適当なステップが改変され、また必要に応じて追加のステップが加えられる場合、ＭｌｙＩのものと同様の特性を有する他の制限エンドヌクレアーゼを使用することができる。同様に、ＯＥ又はＭＥ配列の間のＤＮＡ配列が適切な選択マーカーに対する配列を含んでいることを条件に、このＯＥ又はＭＥ配列の間のＤＮＡ配列を変えることができる。
【０１３４】
Ｔｎ５ＩｎｓＯＥ及びＴｎ５ＩｎｓＭＥの構築
ランダムなトリプレットヌクレオチドの付加の作製に使用するため、元のＭｕファージ由来のトランスポゾンであるｍｉｎｉ−Ｍｕ（ＣａｍR）を改変した。ここでは、トランスポゾン内の選択マーカーとして、ＣａｍR遺伝子を使用する。このＣａｍR遺伝子は、大腸菌又は任意の他の適当な生物の選択株に対して、特定の条件下で、その生物を生存可能にさせるか、又はその生物とトランスポゾン配列を含まない他の細胞とを差別化する特徴をその生物に示させる、選択的利点を与える別の遺伝子と交換することができる。
【０１３５】
トリプレットヌクレオチドを重複させる能力は、図１０で概説されるように、トランスポゾンの挿入メカニズム及び２つの導入された制限部位の位置に依存する。特定の制限部位を標的遺伝子に挿入するための媒体として機能するように、ｍｉｎｉ−Ｍｕトランスポゾンを改変した（図３Ａ）。選択された制限エンドヌクレアーゼは、その認識配列の外側の５ｂｐを切断し、平滑末端を形成するＩＩＳ型酵素であるＭｌｙＩであった（切断プロファイル５’ＧＡＧＴＣ（Ｎ5）↓３’）。Ｔｎ５トランスポゾン由来の外側の末端（ＯＥ）又はモザイク末端（ＭＥ）配列に基づく配列によって、ｍｉｎｉ−Ｍｕの２つの末端に向かうヌクレオチド配列を置き換えた。次に、この新たなヌクレオチド配列を標的ＤＮＡに挿入するためにＴｎ５トランスポザーゼが必要になる。Ｔｎ５Ｉｎｓの転移は、標的
ＤＮＡにおける９ｂｐの互い違いの切断を介して生じ、大腸菌でのギャップの修復に続いて、これらの９ｂｐの重複がもたらされる（図１０Ｂ）。ＭｌｙＩによるＤＮＡの消化は、標的遺伝子の両末端の３つの付加的ヌクレオチド塩基対と共にトランスポゾンを除去する。２つの平滑末端の分子内ライゲーションは、標的遺伝子由来の３つのヌクレオチドのインフレームでの重複をもたらす（図１０Ｂ）。
【０１３６】
特に明記しない限り、Ｅｘｔｅｎｓｏｒ  Ｈｉ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ酵素ミックスを用いて、上記のように全てのＰＣＲ反応を行った。Ｔｎ５Ｉｎｓトランスポゾンは、フォワードプライマー及びリバースプライマーの両者として、オリゴヌクレオチドプライマーＡＳ１（５’ＣＴＧＡＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＡＧＴＣＧＣＧＡＡＡＧＣＧＴＴＴＣＡＣＧＡＴＡ３’、配列番号８９）又はＡＳ２（５’ＣＴＧＡＧＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴＣＧＣＧＡＡＡＧＣＧＴＴＴＣＡＣＧＡＴＡ３’、配列番号９０）を使用したＰＣＲによって、鋳型として働く元のｍｉｎｉ−Ｍｕ（ＣａｍR−３）トランスポゾン０．１ｎｇを用いて構築され、それぞれトランスポゾンＴｎ５ＩｎｓＯＥ及びＴｎ５ＩｎｓＭＥを生成した。いつでも転移反応に使用できるように１３０２ｂｐの生成物を精製した。
【０１３７】
転移反応及び大腸菌細胞への形質転換
Ｔｎ５ＩｎｓＯＥ及びＴｎ５ＩｎｓＭＥを用いた転移を３７℃で２時間行った後に、７０℃で１０分間過熱して不活性化させた。反応混合物は、全量１０μｌの１０×反応緩衝液（５００ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．５）、１．５Ｍの酢酸カリウム、１００ｍＭの酢酸マグネシウム、４０ｍＭのスペルミジン）１μｌ、２００ｎｇのｐＮＯＭ、０．２３２ｐｍｏｌのＴｎ５Ｉｎｓ及び１単位のＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ(Epicentre, Madison USA)で構成されていた。７０℃で１０分間のインキュベーションに先立って１μｌの停止溶液（１％のＳＤＳ）を添加し、反応を停止させた。
【０１３８】
１μｌ又は２μｌの反応混合物を使用して、エレクトロポレーションにより大腸菌ＤＨ５α細胞を形質転換した。この細胞を２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天上にプレーティングして、ＣａｍR遺伝子、したがってＴｎ５Ｉｎｓ遺伝子を含む細胞を選択した。
【０１３９】
上記のように、標的遺伝子内のランダムな位置でトリプレットヌクレオチドの挿入を作製する方法の一般的な概要を図２に示す。前述のように、ＴＥＭ−１  β−ラクタマーゼをコードするｂｌａ遺伝子を標的として選択した。ｂｌａ遺伝子の供給源として、新規のベクターであるｐＮＯＭを使用し、その結果Ｔｎ５Ｉｎｓ挿入に関する標的ＤＮＡとして働く。
【０１４０】
上記の記述の代案として、ｐＮＯＭとは無関係の対象遺伝子をトランスポゾン挿入の標的として使用することができる。必要に応じて、トランスポゾンの挿入後に標準的な技法を使用して、対象遺伝子をｐＮＯＭ又は別の好適なベクターにクローン化することができる。あるいは、対象遺伝子へのトランスポゾン挿入後に、通常は生物中で修復される転移反応の結果として形成されたＤＮＡ鎖に存在するギャップを、適切なギャップ修復及びライゲーション法を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで修復してもよい。
【０１４１】
ｐＮＯＭへのＴｎ５ＩｎｓＯＥ又はＴｎ５ＩｎｓＭＥの挿入場所は、プラスミド全体にわたって均等に分配されるはずなので、ｂｌａ遺伝子領域に挿入されたトランスポゾンを含む細胞を選択する方法が要求される。プラスミドＤＮＡへのトランスポゾンの転移は、大腸菌に対してクロラムフェニコールに対する耐性を与え、Ｔｎ５ＩｎｓＯＥあるいはＴｎ５ＩｎｓＭＥが挿入されたｐＮＯＭを含む細胞の選択を可能にする。Ｔｎ５ＩｎｓＯＥ又はＴｎ５ＩｎｓＭＥがｂｌａ遺伝子領域内に挿入されたこれらのコロニーは、ＴＥＭ−１発現が低下し、したがってアンピシリンの存在下で成長させる細胞の能力に影響を与え
ることになる。
【０１４２】
トランスポゾンにより破壊されたｂｌａ遺伝子を有するコロニーの選択
転移反応物１μｌを用いた大腸菌ＤＨ５αの形質転換、及び２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール上への形質転換混合物の２分の１のプレーティング後、Ｔｎ５ＩｎｓＭＥを使用した場合には２００個を超えるコロニーが観察され、Ｔｎ５ＩｎｓＯＥを使用した場合には２０個のコロニーが観察された。これ以降は、Ｔｎ５ＩｎｓＭＥを用いて作製されたライブラリーを利用した。ｂｌａ遺伝子に関して挿入されたＴｎ５ＩｎｓＭＥトランスポゾンを選択するために、２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール上で成長する９６個のコロニーを選択し、それらを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールＬＢ寒天プレートの両者に再びプレーティングした。９６個のコロニーのうち、６６個はクロラムフェニコール上でのみ成長し、この領域におけるトランスポゾン挿入によってｂｌａ遺伝子が破壊されていると思われた。
【０１４３】
ｂｌａ遺伝子内に挿入されたＴＮ５ＩｎｓＭＥを有するｐＮＯＭプラスミドを、６６個のコロニーのうち１０個から別々に精製した。それぞれのプラスミドをＭｌｙＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動を行った。アガロースゲル電気泳動後、Ｔｎ５ＩｎｓＭＥを除去した直鎖ｐＮＯＭに対応するバンドを単離精製した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ及び約１０ｎｇの直鎖ＤＮＡを使用して、分子内ライゲーションを行った。最大２μｌのライゲーションミックスを使用して、エレクトロポレーションにより大腸菌ＤＨ５α細胞を形質転換し、この細胞を１５μｇ／ｍｌのアンピシリンＬＢ寒天プレート上にプレーティングして、活性型ＴＥＭ−１  β−ラクタマーゼを含む細胞を選択した。プライマーＤＤＪｄｉ０１０を使用し、個々のプラスミドそれぞれにおけるｂｌａ遺伝子のシークエンシングも行い、挿入の性質を確定した。これらの配列を以下の表６に示す。アミノ酸の重複は、ＴＥＭ−１全体にわたって存在することが見出された。１つの配列のみは、１以上のクローンにおいて２回表れた。このことにより、対象標的遺伝子にアミノ酸の挿入を組み込むための、トランスポゾンに基づく方法の利用法が成功裏に実証される。
【０１４４】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】ｐＮＯＭのＤＮＡ配列（配列番号１００）を示す図である。
【図２】トリプレットヌクレオチドの欠失−挿入突然変異導入法の概要を示す図である。
【図３】Ａは、改変されたＭｕＤｅｌ及びＭｕＩｎｓトランスポゾンの末端の配列を示す。Ｂは、３つのヌクレオチド塩基対の欠失の導入に関するメカニズムを示し、Ｃは３つのヌクレオチド塩基対の挿入の導入に関するメカニズムを示す。
【図４】トランスポゾン挿入のランダム性を決定するためのＭｌｙＩを用いたライブラリーＢＬＡDELの分析を示す図である。（Ａ）は制限分析の手順を図解し、（Ｂ）は２２個のＢＬＡDELライブラリー成員の内の１５個の制限分析を示す（アスタリスクを付されたバンドはトランスポゾンに対応する）。（Ｃ）は、ＤＮＡシークエンシングによって測定された、ＢＬＡDELライブラリーの２２個の成員におけるトランスポゾン挿入点の位置を示す。
【図５】ＢＬＡDELライブラリーのそれぞれ選択された成員に関するアンピシリンのＭＩＣ値の測定を示す図である。
【図６】トリプレットヌクレオチドの置換突然変異導入法の概要を示す図である。
【図７】Ａは、置換突然変異導入に用いられるＳｕｂＳｅｑ  ＤＮＡ要素の基本的特徴を示す。Ｂは、３つのヌクレオチド塩基対の置換の導入に関するメカニズムを示す。
【図８】全タンパク質、タンパク質ドメイン、又はタンパク質ドメインの断片（エピトープ等）の挿入を含む変異体のライブラリーの作製の概要を示す図である。
【図９】Ａは、ＭｕＩｎｓの代替として適したＡＴ−２系のトランスポゾンの特徴を示す。Ｂは、トリプレットヌクレオチドの挿入を有する標的遺伝子のライブラリーを作製するために、改変されたＡＴ−２トランスポゾンを使用することができるメカニズムを示す。
【図１０】Ａは、ＭｕＩｎｓの代替として適したＴｎ５ＩｎｓＯＥ及びＴｎ５ＩｎｓＭＥトランスポゾンの特徴を示す。Ｂは、トリプレットヌクレオチドの挿入を有する標的遺伝子のライブラリーを作製するために、Ｔｎ５ＩｎｓＯＥ及びＴｎ５ＩｎｓＭＥトランスポゾンを使用することができるメカニズムを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
2008527987000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年11月8日(2007.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
トランスポゾンは、標的部位の選択性が低いことが好ましい。トランスポゾンは、ｍｉｎｉ−Ｍｕ、ＡＴ−２又はＴｎ５の内の１つに由来してもよい。トランスポゾンは、トランスポゾンを含まない細胞と比較して選択可能な特徴を、トランスポゾンを含む宿主細胞に与える遺伝子を含むことが好ましい。より好ましくは、トランスポゾンは、５’末端として５’−ＮＧＡＣＴＣ−３’（配列番号１）及び３’末端として５’−ＧＡＧＴＣＮ−３’（配列番号２）（好ましくは、５’末端として５’−ＴＧＡＣＴＣＧＧＣＧＣＡ−３’（配列番号３）及び３’末端として５’−ＴＧＣＧＣＣＧＡＧＴＣＡ−３’（配列番号４））のＤＮＡ配列を含むか、あるいは、５’末端として５’−ＮＮＮＮＧＡＣＴＣ−３’（配列番号５）及び３’末端として５’−ＧＡＧＴＣＮＮＮＮ−３’（配列番号６）（好ましくは、５’末端として５’−ＴＧＡＡＧＡＣＴＣＧＣＡ−３’（配列番号７）及び３’末端として５’−ＴＧＣＧＡＧＴＣＴＴＣＡ−３’（配列番号８））のＤＮＡ配列を含む。ここで、Ｎは任意のヌクレオチドである。別の方法においては、トランスポゾンは、５’末端として５’−ＴＧＴＴＧＡＣＴＣ−３’（配列番号９）及び３’末端として５’−ＧＡＧＴＣＡＡＣＡ−３’（配列番号１０）のＤＮＡ配列を含むか、又はさらに別の方法では、５’末端として５’−ＣＴＧＡＣＴＣ−３’（配列番号１１）及び３’末端として５’−ＧＡＧＴＣＡＧ−３’（配列番号１２）のＤＮＡ配列を含む。
【国際調査報告】
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