(57)【要約】【課題】ファクターＸＩＩａ（“接触活性化系”の成分）及び新規なファクターＸＩＩａの分子量フォームを提供する。【解決手段】本発明は、ファクターＸＩＩａの５３Ｋｄ新規フォーム及び核酸分子、モノクローナル及びポリクローナル抗体並びにハイブリドーマ細胞株を含む関連生成物に関するものである。また、本発明は、ファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームのための分析及び診断における前記分析の使用及び、例えば、心筋梗塞後の生存の予測における予測方法に関するものである。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォーム。
【請求項２】
ヒトファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームである、請求項１記載のファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォーム。
【請求項３】
図１及び図２にそれぞれ示された実質的なアミノ酸配列を持つペプチドを有する、請求項２記載のファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォーム。
【請求項４】
請求項１ないし３の何れか一項に記載されたファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームのペプチドの一方又は双方をエンコードしている単離された核酸分子。
【請求項５】
単離されたＤＮＡ分子である、請求項４記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
請求項１ないし３の何れか一項に記載されたファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームのエピトープの一つ又はそれより多くに結合しているモノクローナル又はポリクローナル抗体或いは前記抗体のエピトープ結合フラグメント又は誘導体であって、前記抗体が、１０％又はそれ未満の、ファクターαＸＩＩａ及びファクターβＸＩＩａの一つ又は双方との補正された交差反応性を有することを特徴とする抗体、フラグメント又は誘導体。
【請求項７】
固体支持体上に固定された請求項６記載の抗体、フラグメント又は誘導体。
【請求項８】
検出可能な標識が付けられている請求項６記載の抗体、フラグメント又は誘導体。
【請求項９】
請求項６において定義されたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株。
【請求項１０】
請求項６において定義されたモノクローナル抗体を産生する方法であって、該抗体を産生することが可能なハイブリドーマ細胞株を成長培地中で培養し、そして該成長培地から該抗体を得ることを含む方法。
【請求項１１】
請求項６において定義されたポリクローナル抗体を産生する方法であって、ファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームの抗原を哺乳類に接種し、そして前記哺乳類の血清からの抗体を精製することを含む方法。
【請求項１２】
請求項９記載のハイブリドーマ細胞株を産生する方法であって、抗原を哺乳類に投与し、前記哺乳類から抗体産生性細胞を得、得られた抗体産生性細胞を骨髄腫と融合させるか、或いは、前記細胞を不死化し、そして得られたハイブリドーマをモノクローナル抗体の産生のために選別することを含む方法。
【請求項１３】
抗原とそれに結合する抗体との間の相互作用、及び所定量の抗原を使用して得られた結果を参照して流体試料中に存在する抗原の量を決定することを含む、該試料中の抗原に対するイムノアッセイを行う方法であって、前記抗体が請求項６ないし８の何れか一項に記載された抗体であり、そして前記抗原がファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームであることを特徴とする方法。
【請求項１４】
抗原と抗体との間の相互作用並びにあらゆる得られた抗体−抗原コンプレックスの検出及び／又は決定を含む定性又は定量イムノアッセイに試料を付すことを含む、該試料中のファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームを検出及び／又は決定する方法であって、前記抗体が請求項６ないし８の何れか一項に記載された抗体であることを特徴とする方法。
【請求項１５】
試料中のファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームを検出又は決定する方法であって、ファクターＸＩＩａの選択された５３ＫｄフォームをファクターＸＩＩａの他のフォームに対して優先的に検出又は決定することが可能な手順を行うことを含む方法。
【請求項１６】
ファクターＸＩＩａの前記５３ＫｄフォームをファクターＸＩＩａの他のフォームに対して優先的に決定することが可能な分析によりファクターＸＩＩａの前記５３Ｋｄフォームを検出又は決定ことを含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ファクターＸＩＩａの前記５３ＫｄフォームをファクターＸＩＩａの他のフォームから分離し、そしてファクターＸＩＩａの前記５３Ｋｄフォームを検出又は決定することを含む、請求項１５又は請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ファクターＸＩＩａの前記５３Ｋｄフォームの検出又は決定が請求項１６において定義された分析によるものである、請求項１６又は請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記試料を、ファクターＸＩＩａの前記５３Ｋｄフォームに結合可能であり且つ所望により更にファクターＸＩＩａの他の分子量フォームに結合可能な標識化された抗体と接触させ、調査中のファクターＸＩＩａの前記５３ＫｄフォームをファクターＸＩＩａの他のフォームから分離し、そしてファクターＸＩＩａの前記５３Ｋｄフォームを検出又は決定することを含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
調査中のファクターＸＩＩａのフォームがファクターＸＩＩａの他のフォームから、その物理的、化学的又は免疫学的な性質に基づいて分離される、請求項１７ないし請求項１９の何れか一項記載の方法。
【請求項２１】
ファクターＸＩＩａの前記５３Ｋｄフォームが、クロマトグラフ的、フローサイトメトリー的又は超遠心分離手順を使用してファクターＸＩＩａの他のフォームから分離され、所望によりその後、分離された物質の酵素活性又は免疫学的性質を評価する、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ファクターＸＩＩａの前記５３Ｋｄフォームが、ファクターＸＩＩａの前記５３Ｋｄフォームに結合可能な抗体を使用してイムノアフィニティ・クロマトグラフィーにより分離され、所望によりその後、分離された物質の酵素活性又は免疫学的性質を評価する、請求項２０記載び方法。
【請求項２３】
分離工程が、ファクターＸＩＩａの前記５３Ｋｄフォームが分解されないような条件下で行われる、請求項２１又は請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ファクターＸＩＩａの前記他のフォームがファクターＸＩＩａの非５３Ｋｄフォームである、請求項１５ないし２３の何れか一項記載の方法。
【請求項２５】
前記試料が体液又は体組織である、請求項１３ないし２４の何れか一項記載の方法。
【請求項２６】
前記体液が血液、血漿又は血清である、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記体液が尿、脳脊髄液、唾液又は涙である、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
調査中のファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームが細胞５３ＫｄファクターＸＩＩａである、請求項１３ないし２７の何れか一項記載の方法。
【請求項２９】
ファクターＸＩＩａの前記５３Ｋｄフォームが細胞５３ＫｄファクターＸＩＩａであ
り、該細胞５３ＫｄファクターＸＩＩａは、体液の液相から又は組織から細胞、細胞断片及び／又は細胞物質を分離することにより、ファクターＸＩＩａの他の結合フォームから分離される、請求項１７ないし２７の何れか一項記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞、細胞断片及び／又は細胞物質が遠心分離により分離される、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
５３ＫｄファクターＸＩＩａの検出又は決定前に、細胞５３ＫｄファクターＸＩＩａが５３ＫｄファクターＸＩＩａの他のフォームから分離される、請求項２８ないし３０の何れか一項記載の方法。
【請求項３２】
調査中のファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームが、脂質が結合した５３ＫｄファクターＸＩＩａである、請求項１５ないし２７の何れか一項記載の方法。
【請求項３３】
ファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームが、脂質が結合した５３ＫｄファクターＸＩＩａであり、該脂質が結合した５３ＫｄファクターＸＩＩａは、前記体液又は体組織から脂質フラクションを単離することにより、脂質が結合していない５３ＫｄファクターＸＩＩａから分離される、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記脂質フラクションがリポプロテイン及び／又はその断片を含む、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記脂質フラクションがリポプロテイン沈澱剤を使用して沈澱される、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記脂質が結合した５３ＫｄファクターＸＩＩａがファクターＸＩＩａの他のフォームから分離される前に、該脂質が結合した５３ＫｄファクターＸＩＩａが標識化された抗体と接触させられる、請求項３２ないし３５の何れか一項記載の方法。
【請求項３７】
ファクターＸＩＩａの前記他のフォームが、ファクターＸＩＩの非５３Ｋｄフォームである、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
ファクターＸＩＩａの前記５３Ｋｄフォームが、５３ＫｄファクターＸＩＩａ、低親和性の結合性パートナーと接続している５３ＫｄファクターＸＩＩａ及び高親和性の結合性パートナーと接続している５３ＫｄファクターＸＩＩａの二個又はそれより多くの分子を含む一種又はそれより多くのコンプレックスである、請求項１５ないし２７の何れか一項記載の方法。
【請求項３９】
前記検出又は決定が、ファクターＸＩＩａの前記５３Ｋｄフォームが分解しない条件下で行われる、請求項１５ないし３８の何れか一項記載の方法。
【請求項４０】
分離段階が、ファクターＸＩＩａの前記５３Ｋｄフォームが分解しない条件下で行われる、請求項１５ないし３９の何れか一項記載の方法。
【請求項４１】
ファクターＸＩＩａの前記５３Ｋｄフォームがイムノアッセイを使用して検出又は決定される、請求項１５ないし４０の何れか一項記載の方法。
【請求項４２】
前記イムノアッセイが、ファクターＸＩＩａの前記５３ＫｄフォームをファクターＸＩ
Ｉａの他のフォームに対して優先的に検出又は決定可能なイムノアッセイである、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記イムノアッセイが、ファクターＸＩＩａの前記５３Ｋｄフォームに結合可能な抗体の使用を含む、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
前記抗体が直接又は間接的に検出可能な標識を用いて標識化されている、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
前記抗体が放射性標識化されている、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
得られた抗原−抗体コンプレックスが直接検出又は決定される、請求項４１ないし４５の何れか一項記載の方法。
【請求項４７】
得られた抗原−抗体コンプレックスが間接的に検出又は決定される、請求項４１ないし４５の何れか一項記載の方法。
【請求項４８】
得られた抗原−抗体コンプレックスがフローサイトメトリー、表面プラズモン共鳴、表面弾性波法又は水晶振動子マイクロバランス法により検出される、請求項４１ないし４５の何れか一項記載の方法。
【請求項４９】
前記試料が組織試料であり、そしてファクターＸＩＩａの前記５３Ｋｄフォームが免疫組織学により検出又は決定される、請求項４１ないし４８の何れか一項記載の方法。
【請求項５０】
ファクターＸＩＩａの前記他のフォームがファクターＸＩＩａの非５３Ｋｄフォームである、請求項４０ないし４９の何れか一項記載の方法。
【請求項５１】
前記抗体がｍＡｂ２／２１５又はその類似体、ｍＡｂ２０１／９又はその類似体である、請求項４０ないし４９の何れか一項記載の方法。
【請求項５２】
前記抗体が請求項６に記載された抗体である、請求項４０ないし５０の何れか一項記載の方法。
【請求項５３】
前記検出又は決定のための手順が界面活性剤の不存在下で行われる、請求項１５ないし５２の何れか一項記載の方法。
【請求項５４】
前記検出又は決定のための手順が界面活性剤の存在下で行われる、請求項１５ないし５２の何れか一項記載の方法。
【請求項５５】
前記手順が、低親和性の結合パートナーに結合した５３ＫｄファクターＸＩＩａの優先的な検出又は決定を可能にする、請求項１５ないし５４の何れか一項記載の方法。
【請求項５６】
前記手順が、高親和性の結合パートナーに結合した５３ＫｄファクターＸＩＩａの優先的な検出又は決定を可能にする、請求項１５ないし５４の何れか一項記載の方法。
【請求項５７】
前記手順が、二個又はそれより多くのファクターＸＩＩａ分子であって、その少なくとも一個が５３ＫｄフォームであるファクターＸＩＩａ分子を取り込んでいる分子状コンプレックスの優先的な検出又は決定を可能にする、請求項１５ないし５４の何れか一項記載の方法。
【請求項５８】
前記手順が、細胞又は細胞から誘導された物質に結合した５３ＫｄファクターＸＩＩａの優先的な検出又は決定を可能にする、請求項１５ないし５４の何れか一項記載の方法。
【請求項５９】
前記手順が、脂質、リポプロテイン又はそれらの断片に結合した５３ＫｄファクターＸＩＩａの優先的な検出又は決定を可能にする、請求項１５ないし５４の何れか一項記載の方法。
【請求項６０】
ファクターＸＩＩａの前記５３Ｋｄフォームがクロマトグラフィー分析を使用して検出又は決定される、請求項１５ないし５４の何れか一項記載の方法。
【請求項６１】
前記試料が、病気又は疾患を有する、病気又は疾患が進行している、或いは病気又は疾患を有していた又は病気又は疾患が治療された被検者から得られている、請求項１５ないし６０の何れか一項記載の方法。
【請求項６２】
前記病気又は疾患が凝固系を伴う、請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
前記病気又は疾患が、血液凝固系、線維素溶解、キニン生成（ｋｉｎｉｎｏｇｅｎｓｉｓ）、補体活性化又は血管形成、血管完全性及び血圧を維持すること、血管内腔の構造的抗凝血性を維持すること、或いは組織防御及び修復を伴う、請求項６１記載の方法。
【請求項６４】
前記病気又は疾患が、急性又は慢性炎症、敗血症性ショックを含む何れかの原因によるショック、糖尿病、アレルギー、血栓−出血性障害、敗血症、自然流産又は腫瘍疾患であるか又はこれらを伴う、請求項６１記載の方法。
【請求項６５】
前記病気又は疾患が、血管内血液凝固又は血栓塞栓症、心筋梗塞、急性冠症候群又は狭心症であるか又はこれらを伴う、請求項６１記載の方法。
【請求項６６】
前記病気又は疾患が、血栓症又は狭窄であるか又はこれらを伴う、請求項６１記載の方法。
【請求項６７】
前記病気又は疾患が、疑似心筋梗塞又は急性冠不全症候群であるか又はこれらを伴う、請求項６１記載の方法。
【請求項６８】
前記病気又は疾患が、敗血症であるか又はこれを伴う、請求項６１記載の方法。
【請求項６９】
前記治療が治療剤の投与を伴う及び／又は外科手術を伴う、請求項６１記載の方法。
【請求項７０】
前記治療が冠状動脈血管造影又は血栓溶解である、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
被検者から得られた一連の試料が検査される、請求項１５ないし７０の何れか一項記載の方法。
【請求項７２】
試料が病気又は疾患の進行の間に得られる、請求項６９記載の方法。
【請求項７３】
前記試料が病気又は疾患の治療の間に、治療が開始される前に及び／又は治療が終了した後に得られる、請求項７１又は請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
病気又は疾患を有するか又は疑われる被検者における、前記病気又は疾患に対する感受性、前記病気又は疾患の進行、或いは前記病気又は疾患の転帰、或いは、前記病気又は疾患の治療の転帰を診断、モニター又は予測する方法であって、
前記被検者から得られた試料におけるファクターＸＩＩａの５３ＫｄフォームをファクターＸＩＩａの他のフォームに対して優先的に検出又は決定し、そして該被検者から得られた結果を、
（ｉ）前記病気又は疾患を有する被検者、
（ｉｉ）前記病気又は疾患の進行及び／又は転帰についてモニターされていた、前記病気又は疾患を有する被検者、
（ｉｉｉ）前記病気又は疾患を有し、そして治療中の被検者、
（ｉｖ）前記病気又は疾患の進行及び／又は転帰に対する治療についてモニターされていた、前記病気又は疾患を有し、そして治療中の被検者、
（ｖ）前記病気又は疾患を有しない被検者、
（ｖｉ）前記病気又は疾患の発症前、或いは前記病気又は疾患の治療の開始前の同一被検者、並びに
（ｖｉｉ）前記病気又は疾患の或いは前記病気又は疾患の治療の初期又は後期段階にあるか、或いは前記病気又は疾患の発症前の同一被検者
の少なくとも何れか一つ又はそれより多くから得られた試料に対する同様の分析を使用して得られた結果と比較することを含む方法。
【請求項７５】
請求項１５ないし６０の何れか一項に記載された方法を使用して、ファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームが検出又は決定される、請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
前記病気又は疾患が請求項６２ないし６８の何れか一項において定義されたものである、請求項７４又は請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
前記治療が請求項６９又は請求項７０において定義されたものである、請求項６６又は請求項６７記載の方法。
【請求項７８】
前記試料が請求項７１ないし７３の何れか一項において定義されたものである、請求項７４ないし７７の何れか一項記載の方法。
【請求項７９】
前記試料が、心筋梗塞の疑いでの被検者の病院への入院直後又は入院の後に得られ、５３ＫｄファクターＸＩＩａの特定フォームの低濃度が二次的トロポニン陽性発症のリスクの増加に結び付く、請求項７５又は請求項７６記載の方法。
【請求項８０】
前記試料が、心筋梗塞の疑いでの被検者の病院への入院直後又は入院の後に得られ、５３ＫｄファクターＸＩＩａの特定フォームの高濃度が二次的トロポニン陽性発症のリスクの増加に結び付く、請求項７５又は請求項７６記載の方法。
【請求項８１】
前記試料が、心筋梗塞の疑いでの被検者の病院への入院直後又は入院の後に得られ、５３ＫｄファクターＸＩＩａの特定フォームの低濃度が死亡のリスクの増加に結び付く、請求項７５又は請求項７６記載の方法。
【請求項８２】
前記試料が、心筋梗塞の疑いでの被検者の病院への入院直後又は入院の後に得られ、５３ＫｄファクターＸＩＩａの特定フォームの高濃度が死亡のリスクの増加に結び付く、請求項７５又は請求項７６記載の方法。
【請求項８３】
前記試料が、急性冠症候群の疑いでの被検者の病院への入院直後又は入院の後に得られ、５３ＫｄファクターＸＩＩａの特定フォームの高濃度が死亡のリスクの増加に結び付く、請求項７５又は請求項７６記載の方法。
【請求項８４】
前記試料が、０．０５ｎｇ／ｍＬを越えるトロポニンＴ（ＴｎＴ）濃度を有する被検者
の病院への入院直後又は入院の後に得られ、５３ＫｄファクターＸＩＩａの特定フォームの高濃度が死亡のリスクの増加に結び付く、請求項７５又は請求項７６記載の方法。
【請求項８５】
前記試料が、心筋梗塞の疑いでの被検者の病院への入院直後又は入院の後に得られ、５３ＫｄファクターＸＩＩａの特定フォームの高濃度が二次的心筋梗塞のリスクの増加に結び付く、請求項７５又は請求項７６記載の方法。
【請求項８６】
５３ＫｄファクターＸＩＩａの特定フォームの高濃度が敗血症に結び付く、請求項７５又は請求項７６記載の方法。
【請求項８７】
病気又は疾患を有するか又は病気又は疾患を治療中の被検者から得られた試料に対して、５３ＫｄファクターＸＩＩａについての一連の分析を行い、そして前記病気又は疾患或いは前記治療に関連する５３ＫｄファクターＸＩＩａ濃度に対する情報を提供する分析を選択することを含む方法。
【請求項８８】
病気又は疾患を有するか又は疑われる被検者における前記病気又は疾患に対する感受性、前記病気又は疾患の進行、或いは前記病気又は疾患の転帰、或いは、前記病気又は疾患の治療の転帰を診断、モニター又は予測するための情報を提供するのに適する、５３ＫｄファクターＸＩＩａについての分析を提供する方法であって、
前記病気又は疾患を有するか又は前記病気又は疾患を治療中の被検者から得られた試料に対して、５３ＫｄファクターＸＩＩａについての一連の分析を行い、そしてどの分析が前記病気又は疾患に対する感受性、前記病気又は疾患の進行、或いは前記病気又は疾患の転帰、或いは、前記病気又は疾患の治療の転帰を診断、モニター又は予測することに関連する５３ＫｄファクターＸＩＩａ濃度に対する情報を提供するかを決定することを含む方法。
【請求項８９】
請求項８８記載の方法であって、前記病気又は疾患を有するか或いはその治療中である被検者から得られた試料における５３ＫｄファクターＸＩＩａについて得られた結果を、（ｉ）前記病気又は疾患を有する被検者、
（ｉｉ）前記病気又は疾患の進行及び／又は転帰についてモニターされていた、前記病気又は疾患を有する被検者、
（ｉｉｉ）前記病気又は疾患を有し、そして治療中の被検者、
（ｉｖ）前記病気又は疾患の進行及び／又は転帰に対する治療についてモニターされていた、前記病気又は疾患を有し、そして治療中の被検者、
（ｖ）前記病気又は疾患を有しない被検者、
（ｖｉ）前記病気又は疾患の発症前、或いは前記病気又は疾患の治療の開始前の同一被検者、並びに
（ｖｉｉ）前記病気又は疾患或いは病気又は疾患の治療の初期又は後期段階にあるか、或いは前記病気又は疾患の発症前の同一被検者
の少なくとも何れか一つ又はそれより多くから得られた試料に対する同様の分析を使用して得られた結果と比較することを含む方法。
【請求項９０】
前記分析が請求項１５ないし６７の何れか一項において定義された方法である、請求項８７ないし８９の何れか一項記載の方法。
【請求項９１】
前記病気又は疾患が請求項６２ないし６８の何れか一項において定義されたものである、請求項８７ないし９０の何れか一項記載の方法。
【請求項９２】
前記治療が請求項６９又は請求項７０において定義されたものである、請求項８７ないし９１の何れか一項記載の方法。
【請求項９３】
前記試料が請求項７１ないし７３の何れか一項において定義されたものである、請求項８７ないし９２の何れか一項記載の方法。
【請求項９４】
前記得られた結果がデータベースに集められる、請求項８７ないし９３の何れか一項記載の方法。
【請求項９５】
請求項８７ないし９４の何れか一項記載の方法に従って得られた結果を含むデータベース。
【請求項９６】
被検者からの試料中の５３ＫｄファクターＸＩＩａをファクターＸＩＩａの他の分子量のフォームに対して優先的に検出又は決定することを含む方法であって、前記試料が尿試料であることを特徴とする方法。
【請求項９７】
病気又は疾患を診断又はモニターする、或いは該病気又は疾患の治療を診断又はモニターする方法であって、該病気又は疾患を有するか又は該病気又は疾患を有する疑いがある被検者の尿中のファクター５３ＫｄＸＩＩａをファクターＸＩＩａの他の分子量フォームに対して優先的に検出又は決定することを含む方法。
【請求項９８】
前記病気が腎機能不全、腎臓病又は腎障害であるか又はこれらを伴う、請求項９７記載の方法。
【請求項９９】
請求項９６ないし９８の何れか一項記載の方法であって、前記被検者について得られた結果を、
（ｉ）前記病気又は疾患、例えば、腎機能不全、腎臓病又は腎障害を有する被検者、
（ｉｉ）前記病気又は疾患、例えば、腎機能不全、腎臓病又は腎障害の進行及び／又は転帰についてモニターされていた、前記病気又は疾患、例えば、腎機能不全、腎臓病又は腎障害を有する被検者、
（ｉｉｉ）前記病気又は疾患、例えば、腎機能不全、腎臓病又は腎障害を有し、そしてそれに対して治療中の被検者、
（ｉｖ）前記病気又は疾患、例えば、腎機能不全、腎臓病又は腎障害の治療について、進行について及び／又は転帰についてモニターされていた、前記病気又は疾患、例えば、腎機能不全、腎臓病又は腎障害を有し、そして治療中である被検者、
（ｖ）前記病気又は疾患、例えば、腎機能不全、腎臓病又は腎障害を有しない被検者、
（ｖｉ）前記病気又は疾患、例えば、腎機能不全、腎臓病又は腎障害の発症前、或いは前記病気又は疾患、例えば、腎機能不全、腎臓病又は腎障害の治療の開始前の同一被検者、並びに
（ｖｉｉ）前記病気又は疾患、例えば、腎機能不全、腎臓病又は腎障害の或いは前記病気又は疾患の治療の初期又は後期段階にあるか、或いは前記病気又は疾患、例えば、腎機能不全、腎臓病又は腎障害の発症前の同一被検者
の少なくとも何れか一つ又はそれより多くから得られた試料に対する同様の分析を使用して得られた結果と比較することを含む方法。
【請求項１００】
前記分析が請求項１５ないし６７の何れか一項において定義されたものであり、前記試料が尿である請求項９７ないし９９の何れか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ファクターＸＩＩａ（“接触活性化系”の成分）及びファクターＸＩＩａの新規な分子量フォームに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ファクターＸＩＩは通常の血液中に存在する不活性酵素原である。それは生体内で、カリクレイン、高分子量キニノゲン及び負に帯電した表面の存在下で、酵素として活性であるフォーム、ファクターＸＩＩａに容易に転換する。生体内における、ファクターＸＩＩａの二つのフォームが、従来、報告されている。セリン・プロテイナーゼの８０Ｋｄフォーム（しばしばファクターαファクターＸＩＩａと呼ばれる。）は、２８Ｋｄの軽鎖に対してジスルフィド結合により結合した５２Ｋｄの重鎖を有している。このファクターのタンパク質分解は、前記重鎖からペプチドを放出して、生成物であるファクターβＸＩＩａを生じさせ、該ファクターβＸＩＩａはセリン・プロテアーゼ活性を維持するが、しかし、前記ファクターにおいては、ファクターαファクターＸＩＩａの２８Ｋｄ鎖は、先の５２Ｋｄ重鎖から誘導された小さいペプチドフラグメントにジスルフィド結合している。多くの場合において、前記小さいペプチドフラグメントは約１０００ｄの分子量を有するが、しかし、異なる寸法のフラグメントが生体内で観察された。
【０００３】
国際特許出願公開第９０／０８８３５号パンフレット（特許文献１）はファクターＸＩＩａに対するイムノアッセイを開示しており、国際特許出願公開第９０／０８８３５号パンフレットはまた、モノクローナル抗体２／２１５及び２０１／９（これらは、ファクターＸＩＩａの全ての既知分子量フォームに結合している。）及びそれらの産生方法を開示している。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）２／２１５は、１９９０年１月１６日に、英国、サリスバリー  エスピー４０ジェイジー（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ  ＳＰ４０ＪＧ）、ポートン  ダウン（Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ）、ピーエイチエルエス  センター  フォー  アプライド  ミクロバイオロジー  アンド  リサーチ（ＰＨＬＳ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅｒｃｈ）、ディビジョナル  オブ  バイオロジクス（Ｄｉｖｉｓｉｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）のヨーロピアン  コレクション  オブ  アニマル  セル  カルチャーズ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＥＣＡＣＣとして知られている。）に、寄託番号第９００１１６０６号の下に寄託され、そして、２００４年６月１４日にＥＣＡＣＣに、寄託番号第０４０６１４０３号の下に再寄託されたハイブリドーマ２／２１５により産生される。モノクローナル抗体２０１／９を産生するハイブリドーマ２０１／９は、１９９０年１月１８日にＥＣＡＣＣに、寄託番号第９００１１８９３号の下に寄託され、そして２００４年６月１４日にＥＣＡＣＣに、寄託番号第０４０６１４０２号の下に再寄託された。
【０００４】
ファクターＸＩＩａは、生体内の血液凝集の接触系に関わることが従来知られていた。より最近の研究は、ファクターＸＩＩａはまた、線維素溶解、キニン生成及び更に補体活性化及び血管形成を含む他の系に関わることを指摘している。多くの臨床及び実験データが蓄積され、前記接触系が血液凝固以外にも拡張していること及び、それは血管完全性及び血圧を維持する役割を有すること、それは内皮細胞の種々の機能に影響を及ぼすこと及び、それは線維素溶解の制御及び血管内腔の持続的抗凝固性の維持に関与することを示唆している。別の臨床的及び実験的研究は、前記接触系が急性又は慢性炎症、異なる原因によるショック、糖尿病、アレルギー、播種性血管内血液凝固を含む血栓−出血性障害、並びに腫瘍疾患に関与することを示している。このような症状は、敗血症、自然流産及び血栓塞栓症を含む。加えてファクターＸＩＩａは、組織防御及び修復に関与し得る。ヤロヴ
ァヤ等［ヤロヴァヤ，ジー．エイ．（Ｙａｒｏｖａｙａ  Ｇ．Ａ．）、ブロクヒナティー．ビー．（Ｂｌｏｋｈｉｎａ  Ｔ．Ｂ，）及びネシュコヴァ  イー，エイ．（Ｎｅｓｈｋｏｖａ  Ｅ．Ａ．）、「接触系。活性化機構及び生物学的調整機構についての新概念。（Ｃｏｎｔａｃｔ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｎｅｗ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｏｎ  ａｃｉｖｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｒｅｇｕｌａｔａｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，）］、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｕｔｒｙ）（モスクワ）、２００２年１月、第６７巻（第１号）：第１３〜２４頁（非特許文献１）は前記接触系及び活性化機構及び生物学的調整機構についての新概念の最近の概説である。
【０００５】
国際特許出願公開第０４／０５７３４３号パンフレット（特許文献２）は、ファクターＸＩＩａが体内に種々のフォームで存在し、そしてこれらの異なるフォームの濃度の測定が種々の臨床病態に対する有意義な情報を提供することを開示している。
【特許文献１】国際特許出願公開第９０／０８８３５号パンフレット
【非特許文献１】ヤロヴァヤ等［ヤロヴァヤ，ジー．エイ．（Ｙａｒｏｖａｙａ  Ｇ．Ａ．）、ブロクヒナティー．ビー．（Ｂｌｏｋｈｉｎａ  Ｔ．Ｂ，）及びネシュコヴァ  イー，エイ．（Ｎｅｓｈｋｏｖａ  Ｅ．Ａ．）、「接触系。活性化機構及び生物学的調整機構についての新概念。（Ｃｏｎｔａｃｔ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｎｅｗ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｏｎ  ａｃｉｖｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｒｅｇｕｌａｔａｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，）］、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｕｔｒｙ）（モスクワ）、２００２年１月、第６７巻（第１号）：第１３〜２４頁
【特許文献２】国際特許出願公開第０４／０５７３４３号パンフレット
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、高性能液体クロマトグラフィー及び質量分析法により測定された５３Ｋｄの分子量を有するファクターＸＩＩａの新規フォームを提供する。好ましくは、前記ファクターＸＩＩａの新規フォームはヒトのものであり、そして図１及び図２にそれぞれ示された実質的なアミノ酸配列を有するものである。ファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームは、ジスルフィドブリッジにより一緒に保持された二つのペプチド鎖を有している。図１は、“重鎖”と表記される、第一ペプチドのアミノ酸配列を示す。図１は、“軽鎖”と表記される、第二ペプチドのアミノ酸配列を示す。好ましくは、前記配列の少なくとも一方、より好ましくは双方は、図１及び図２の配列と、１０％を越えないで、またより好ましくは８％を越えないで、より好ましくは６％を越えないで、またより好ましくは４％を越えないで、またより好ましくは２％を越えないで、異なっている。好ましくは、重鎖及び軽鎖は、図１及び図２に示されるものと実質的に同一の長さのものである。本発明はまた、ファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームのペプチドの一方又は双方をエンコードしている単離された核酸分子を提供する。
【０００７】
本発明は、ファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームのエピトープの一つ又はそれより多くに結合している抗体を提供し、そしてまた前記抗体のエピトープ結合フラグメント又は誘導体、例えばＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2 フラグメント、又はＦａｂ発現ライブラリー、或いは、ファクターαＸＩＩａ及びファクターβＸＩＩａの一つ又はそれより多くとの１０％又はそれ未満、好ましくは５％又はそれ未満、更により好ましくは２％又はそれ未満、更により好ましくは１％又はそれ未満、更により好ましくは０．５％又はそれ未満、更により好ましくは０．１％又はそれ未満の補正された交差反応性を有する抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体により製造されたフラグメント生成物を提供する。本発明の抗体は、固体支持体上に固定され得るか、又は検出可能な標識が付けられ得る。本発明の抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってよい。
【０００８】
本発明はまた、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株及び、本
発明のハイブリドーマ細胞株を成長培地中で培養し、そして該成長培地から抗体を得ることを含む、このようなモノクローナル抗体を産生する方法を提供する。
【０００９】
本発明はまた、ファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォーム又はその抗原性フラグメント中に存在する抗原を哺乳類に接種し、そして前記哺乳類の血漿からの抗体血清を精製することを含む、ポリクローナル抗体血清を産生する方法を提供する。
【００１０】
本発明はまた、ファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォーム中に存在する抗原を哺乳類に投与し、前記哺乳類から抗体産生性細胞を得、得られた抗体産生性細胞を骨髄腫と融合させるか、或いは、前記細胞を不死化し、そして得られたハイブリドーマをモノクローナル抗体の産生のために選別することを含む、本発明のハイブリドーマ細胞株を産生する方法を提供する。
【００１１】
抗原とそれに結合する抗体との間の相互作用、及び所定量の抗原を使用して得られた結果を参照した流体試料中に存在する抗原の量の決定を含む、該流体試料中の抗原に対するイムノアッセイを行う方法であって、抗体が本発明の抗体であり、そして抗原がファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームであることを特徴とする方法を提供する。
【００１２】
抗原と抗体との間の相互作用並びにあらゆる得られた抗体−抗原コンプレックスの検出及び／又は決定を含む定性又は定量イムノアッセイに試料を付すことを含む、該試料中のファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームを検出及び／又は決定する方法であって、抗体が本発明の抗体であり、そして抗原がファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームであることを特徴とする方法を提供する。
【００１３】
試料中のファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームを検出又は決定する方法であって、ファクターＸＩＩａの５３ＫｄフォームをファクターＸＩＩａの他のフォーム（前記ファクターＸＩＩａの他のフォームは、好ましくは、ファクターＸＩＩａの非５３Ｋｄフォームである。）に対して優先的に検出又は決定することが可能な方法を行うことを含む方法を提供する。
【００１４】
一実施態様において、本発明の方法は、調査中のファクターＸＩＩａの５３ＫｄフォームをファクターＸＩＩａの他のフォームに対して優先的に決定することが可能な分析により、前記調査中のファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームを検出又は決定することを含む。
【００１５】
他の実施態様において、本発明の方法は、調査中のファクターＸＩＩａの５３ＫｄフォームをファクターＸＩＩａの他のフォーム（前記ファクターＸＩＩａの他のフォームは、好ましくは、ファクターＸＩＩａの非５３Ｋｄフォームである。）から分離し、そして分離されたファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームを検出又は決定することを含む。
【００１６】
分離されたファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームを検出又は決定は、調査中のファクターＸＩＩａの５３ＫｄフォームをファクターＸＩＩａの他のフォーム（前記ファクターＸＩＩａの他のフォームは、好ましくは、ファクターＸＩＩａの非５３Ｋｄフォームである。）に対して優先的に決定することが可能な分析手段によってでよい。
【００１７】
別の実施態様において、本発明の方法は、試料を、調査中のファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームに結合可能であり且つ所望により更にファクターＸＩＩａの他の分子量フォームに結合可能な標識化された抗体と接触させ、前記調査中のファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームを他のフォーム（前記ファクターＸＩＩａの他のフォームは、好ましくは、ファクターＸＩＩａの非５３Ｋｄフォームである。）から分離し、そしてファクターＸＩ
Ｉａの５３Ｋｄフォームを検出又は決定することを含む。
【００１８】
本発明はまた、病気又は疾患を有するか又は疑われる被検者における前記病気又は疾患に対する感受性、前記病気又は疾患の進行、或いは前記病気又は疾患の転帰、或いは、前記病気又は疾患の治療の転帰を診断、モニター又は予測する方法であって、
前記被検者から得られた試料におけるファクターＸＩＩａの５３ＫｄフォームをファクターＸＩＩａの他の、好ましくは５３Ｋｄではないフォームに対して優先的に検出又は決定し、そして該被検者から得られた結果を、
（ｉ）前記病気又は疾患を有する被検者、
（ｉｉ）前記病気又は疾患の進行及び／又は転帰についてモニターされていた、前記病気又は疾患を有する被検者、
（ｉｉｉ）前記病気又は疾患を有し、そして治療中の被検者、
（ｉｖ）前記病気又は疾患の進行及び／又は転帰に対する治療についてモニターされていた、前記病気又は疾患を有し、そして治療中の被検者、
（ｖ）前記病気又は疾患を有しない被検者、
（ｖｉ）前記病気又は疾患の発症前、或いは前記病気又は疾患の治療の開始前の同一被検者、並びに
（ｖｉｉ）前記病気又は疾患の或いは前記病気又は疾患の治療の初期又は後期段階にあるか、或いは前記病気又は疾患の発症前の同一被検者
の少なくとも何れか一つ又はそれより多くから得られた試料に対する同様の分析を使用して得られた結果と比較することを含む方法を提供する。
【００１９】
本発明は更に、病気又は疾患を有するか又は病気又は疾患を治療中の被検者から得られた試料に対して、５３ＫｄファクターＸＩＩａについての一連の分析を行い、そして前記病気又は疾患或いは前記治療に関連する５３ＫｄファクターＸＩＩａ濃度に対する情報を提供する分析を選択することを含む方法を提供する。
【００２０】
病気又は疾患を有するか又は疑われる被検者における前記病気又は疾患に対する感受性、前記病気又は疾患の進行、或いは前記病気又は疾患の転帰、或いは、病気又は疾患の治療の転帰を診断、モニター又は予測するための情報を提供するのに適する、ファクターＸＩＩａの５３Ｋｄについての分析を提供する方法であって、
前記病気又は疾患を有するか又は前記病気又は疾患を治療中の被検者から得られた試料に対して、５３ＫｄファクターＸＩＩａについての一連の分析を行い、そしてどの分析が前記病気又は疾患に対する感受性、前記病気又は疾患の進行、或いは前記病気又は疾患の転帰、或いは、前記病気又は疾患の治療の転帰を診断、モニター又は予測することに関連する５３ＫｄファクターＸＩＩａ濃度に対する情報を提供するかを決定することを含む方法を提供する。
【００２１】
前記方法は好ましくは、前記病気又は疾患を有するか或いはその治療中である被検者から得られた試料における５３ＫｄファクターＸＩＩａについて得られた結果を、
（ｉ）前記病気又は疾患を有する被検者、
（ｉｉ）前記病気又は疾患の進行及び／又は転帰についてモニターされていた、前記病気又は疾患を有する被検者、
（ｉｉｉ）前記病気又は疾患を有し、そして治療中の被検者、
（ｉｖ）前記病気又は疾患の進行及び／又は転帰に対する治療についてモニターされていた、前記病気又は疾患を有し、そして治療中の被検者、
（ｖ）前記病気又は疾患を有しない被検者、
（ｖｉ）前記病気又は疾患の発症前、或いは前記病気又は疾患の治療の開始前の同一被検者、並びに
（ｖｉｉ）前記病気又は疾患或いは前記病気又は疾患の治療の初期又は後期段階にあるか
、或いは前記病気又は疾患の発症前の同一被検者
の少なくとも何れか一つ又はそれより多くから得られた試料に対する同様の分析を使用して得られた結果と比較することを含む。
【００２２】
図１及び図２は、５３ＫｄファクターＸＩＩａを構成する二つのペプチド鎖のアミノ酸配列を示す。図１は“重鎖”の配列を示し、そして図１は“軽鎖”の配列を示す。
【００２３】
図３は、図形フォームにおけるファクターＸＩＩ酵素原を示す。太い暗線はペプチド鎖を示し、ジスルフィドブリッジは細く且つ短い線により示されている。アミノ末端は“Ｎ”で標識されており、そしてカルボキシル末端は“Ｃ”で標識されている。
【００２４】
図４は、図３と同じ図形表現を使用した、図形フォームにおけるファクターαＸＩＩａを示す。ファクターＸＩＩと比較して、ペプチド鎖の短い領域が欠けているのが見出され得る。この欠けている領域は、残りのペプチドを、ジスルフィドブリッジにより一緒に保持されたままの二つの鎖に切断する。
【００２５】
図５は、図３及び図４と同じ図形表現を使用した、図形フォームにおけるファクターβＸＩＩａを示す。ファクターＸＩＩと比較して、ファクターαＸＩＩａにおいて欠けているペプチド鎖の短い領域がファクターβＸＩＩａにおいても欠けているのが見出され得る。更に、ファクターαＸＩＩａの重鎖のアミノ末端の大きい部分が欠けている。
【００２６】
図６は、図３ないし図５と同じ図形表現を使用した、図形フォームにおける５３ＫｄファクターＸＩＩａを示す。ファクターβＸＩＩａの場合よりもファクターαＸＩＩａのより多くの重鎖が残っているが、しかし、ファクターαＸＩＩａの重鎖のアミノ末端の短いプロテインが欠けているのが見出され得る。
【００２７】
図７は、放射性標識化されたモノクローナル抗体２／２１５Ｆａｂに結合したファクターＸＩＩａの異なるフォームのＨＰＬＣ分離から得られたトレースを示す。図７ａは、分子量標準（６７０、１５８、４４、１７、１．３５ｋＤ）に対するトレースを示す。図７ｂは、放射性標識化されたモノクローナル抗体２／２１５Ｆａｂに対するトレースを示す。図７ｃは、βＸＩＩａ及び放射性標識化されたモノクローナル抗体２／２１５Ｆａｂに対するトレースを示す。図７ｄは、αＸＩＩａ及び放射性標識化されたモノクローナル抗体２／２１５Ｆａｂに対するトレースを示す。図７ｅは、典型的な血漿及び放射性標識化されたモノクローナル抗体２／２１５Ｆａｂに対するトレースを示す。
【００２８】
図８は、実施例２に記載された質量分析実験の結果を示す。低分子質量における多くのピーク（２０１／９プロットにおいて星印が付されている。）は、主５３ｋＤピークの多数のイオン化種である。
【００２９】
図９は、実施例３に記載された５３Ｋｄのトリプシン消化の後の、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析の結果を示す。このプロットにおけるピークは、得られたペプチド配列の分子質量を示す。
【００３０】
図１０ないし図１２は、実施例４に記載された実験から得られたデータを示す。
【００３１】
図１０は、胸痛で入院した患者に対するカプラン・マイヤー生存プロットを示す。前記患者は、５３ｋＤＸＩＩａ濃度に基づいて四つに分けられている。
【００３２】
図１１は、胸痛及び０．０５ｎｇ／ｍＬを越えるトロポニンＴ（ＴｎＴ）で入院した患者に対するカプラン・マイヤー生存プロットを示す。前記患者は、５３ｋＤＸＩＩａ濃度
に基づいて四つに分けられている。
【００３３】
図１２は、胸痛及び０．０５ｎｇ／ｍＬ未満又はそれに等しいトロポニンＴ（ＴｎＴ）で入院した患者に対するカプラン・マイヤー生存プロットを示す。前記患者は、５３ｋＤＸＩＩａ濃度に基づいて四つに分けられている。
【００３４】
図１３及び図１４は、実施例５に記載された実験から得られたデータを示す。
【００３５】
図１３は、心筋梗塞で病院に入院した後四日間にわたる、患者におけるＸＩＩａの５３ｋＤフォーム（ｐＭと表わされている。）の濃度変化を示す。
【００３６】
図１４は、心筋梗塞で病院に入院した後四日間にわたる、患者におけるＸＩＩａの５３ｋＤフォームの濃度変化（入院時の値からの％変化で表わされている。）を示す。
【００３７】
＜定義＞
抗体は、抗原に結合することが可能などのような抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）2 フラグメントも含み、並びにまた、組み換え抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体抗体をも含む。
【００３８】
抗体複合体、また検出抗体は、直接又は間接的に分析可能な標識を用いて標識化された抗体を示す。
【００３９】
捕捉抗体は、イムノアッセイにおいて使用するために固体相上に固定されている抗体を示す。
【００４０】
捕捉分析は、固体相上に固定された捕捉抗体を試料と接触させるイムノアッセイを示す。前記試料が固定された抗体に結合可能な抗原を含み、そして反応条件が適切である場合は、前記抗原は、固定された抗体との抗原−抗体コンプレックスを形成し得、そしてこの場合、前記固体相上に“捕捉”され、そしてその後検出又は決定され得る。
【００４１】
細胞は、特記しない限り、無傷細胞、細胞断片及び細胞物質を示す。
【００４２】
細胞ファクターＸＩＩａ及び細胞ファクターＸＩＩは、細胞の表面に存在する、或いは、細胞、細胞断片又は細胞物質に結合したファクターＸＩＩａ及びファクターＸＩＩをそれぞれ示す。
【００４３】
検出は、定性検査を示す。
【００４４】
検出及び／又は決定は、定量又は半定量検査を示す。
【００４５】
ファクターＸＩＩａ、またいわゆる活性化されたファクターＸＩＩは、酵素原（ファクターＸＩＩ）のどのような酵素活性化フォーム又はフラグメントをも示す。
【００４６】
高親和性の結合性パートナーは、ファクターＸＩＩａとコンプレックス（このコンプレックスは、単純な方法により、例えば、洗剤の添加により又は他の種との競合により、分解され得ない。）を形成する分子を示す。
【００４７】
脂質が結合したファクターＸＩＩａは、脂質物質が結合した、例えば、脂質、とりわけリポプロテイン及びその断片が結合したファクターＸＩＩａを示す。
【００４８】
低親和性の結合性パートナーは、ファクターＸＩＩａとコンプレックス（このコンプレックスは、単純な方法により、例えば、界面活性剤の添加により又は他の種との競合により、容易に分解され得る。）を形成する分子を示す。
【００４９】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）２／２１５、またいわゆる抗体２／２１５は、１９９０年１月１６日に、英国、サリスバリー  エスピー４０ジェイジー、ポートン  ダウン、ピーエイチエルエス  センター  フォー  アプライド  ミクロバイオロジー  アンド  リサーチ、ディビジョナル  オブ  バイオロジクスのヨーロピアン  コレクション  オブ  アニマル  セル  カルチャーズ（ＥＣＡＣＣとして知られている。）に、寄託番号第９００１１６０６号の下に寄託され、そして、２００４年６月１４日にＥＣＡＣＣに、寄託番号第０４０６１４０３号の下に再寄託されたハイブリドーマ２／２１５により産生された抗体である。
【００５０】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）２／２１５類似体は、ｍＡｂ２／２１５抗体のものと実質的に同一のファクターＸＩＩａ結合性を有する抗体を示す。
【００５１】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）２０１／９、またいわゆる抗体２０１／９は、１９９０年１月１８日にＥＣＡＣＣに、寄託番号第９００１２５１２号の下に寄託され、そして２００４年６月１４日にＥＣＡＣＣに、寄託番号第０４０３１４０２号の下に再寄託されたハイブリドーマ２０１／９により産生された抗体である。
【００５２】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）２０１／９類似体は、ｍＡｂ２０１／９抗体のものと実質的に同一のファクターＸＩＩａ結合性を有する抗体を示す。
【００５３】
細胞を含む試料は、細胞を含む体液の試料及び単離された細胞の試料の双方を示す。
【００５４】
種及びフォームは、ファクターＸＩＩａに関して互換可能に使用される用語である。それらは、本明細書において“分子量変異体”又は“分子量フォーム”の如く表現される、異なるペプチド長さのものであるファクターＸＩＩａのフォームを相互に区別するために使用され、そしてまた、異なる結合性フォームで存在するファクターＸＩＩａのフォームを相互に区別するために使用される。ファクターＸＩＩａの既知の分子量フォームはファクターαＸＩＩａ、ファクターβＸＩＩａ、ファクターγＸＩＩａ及び５３ＫｄファクターＸＩＩａである。５３ＫｄファクターＸＩＩａは、本明細書において最初に開示されている。ファクターＸＩＩａの結合性フォームの例は、細胞ファクターＸＩＩａ、脂質が結合したファクターＸＩＩａ及び尿ファクターＸＩＩａを含む。“ファクターＸＩＩａのフォーム”の例は、前記表現が更なる限定条件なく使用される場合は、下記の具体的フォーム：細胞ファクターαＸＩＩａ及び尿５３ＫｄファクターＸＩＩａを含む。ファクターＸＩＩａの既知の非５３Ｋｄ分子量フォームは、ファクターαＸＩＩａ、ファクターβＸＩＩａ及びファクターγＸＩＩａである。
【００５５】
ｕｇ及びｕＬは、マイクログラム及びマイクロリットルをそれぞれ示す。
【００５６】
尿ファクターＸＩＩａは、尿中に存在するファクターＸＩＩａを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５７】
ファクターＸＩＩａの分子量変異体
本発明は、生体内において、ファクターＸＩＩａ（活性化されたファクターＸＩＩ）が約５３Ｋｄの分子量を持つ種として主に存在し、それ故、この５３Ｋｄ種の測定が種々の臨床病態に関連する情報を提供する可能性があるという、我々の驚くべき観察に基づいている。このような情報は、ファクターＸＩＩａの５３ＫｄフォームとファクターＸＩＩａ
の他の分子量フォームとを相互に区別することができない、ファクターＸＩＩａを測定する方法から得られた情報よりもより正確であろう。本発明が基づくファクターＸＩＩａの新規５３Ｋｄフォームは、都合上“ファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォーム”又は短く“５３ＫｄＸＩＩａ”と表現されるが、この表現はその範囲内に、５３ＫｄＸＩＩａと実質的に同じ長さのペプチド鎖を有するが、しかし、選択的リン酸化反応、グリコシル化又は他の誘導体化のせいで５３Ｋｄと異なる分子量を有するファクターＸＩＩａの変異体を含み、そしてまた、他の化合物とコンプレックス化しているか又は他の化合物に結合しているために、測定された場合に非５３Ｋｄ分子量を有することが認められる５３ＫｄＸＩＩａのフォームを含む。それ故、表現“ファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォーム”は、ファクターＸＩＩａのこのようなフォームに対する言及は、例えば、細胞成分にまだコンプレックス化している間に測定した場合に、実質的に５３Ｋｄを越える分子量を有し得る細胞５３ＫｄＸＩＩａに対する言及を含むという事実に係わらず、ファクターＸＩＩａの典型的な５３Ｋｄフォームと同様のペプチド鎖を有するファクターＸＩＩａペプチドを含むファクターＸＩＩａのフォームを示すために使用される。“ファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォーム”又は“５３ＫｄＸＩＩａ”は、ファクターＸＩＩａの新規５３Ｋｄ分子量変異体、例えば尿５３ＫｄＸＩＩａ及び細胞５３ＫｄＸＩＩａを含むファクターＸＩＩａのどのようなフォームをも示す。好ましくは、５３ＫｄＸＩＩａのアミノ酸配列は、図１及び図２に開示されたものと同様である。しかしながら、前記表現は、母集団の健康個体中に存在するが、しかし、自然に生じる対立遺伝子多様性が原因で配列が変化している変異体及びまたペプチドの酵素活性又は抗原性に物質的に影響を及ぼさないアミノ酸置換、とりわけ保存アミノ酸置換を行うことにより造られた人工的に生じた配列変異体をも包含する。
【００５８】
ファクターＸＩＩａのフォーム
ファクターＸＩＩａペプチドの分子量変異体の図形表現を図３ないし図６に示す。不活性な酵素原ファクターＸＩＩの進行性分解の結果のファクターＸＩＩａの分子量及びペプチド鎖配列を反映しているファクターＸＩＩａのフォームにおける変異が図３に示される。ファクターＸＩＩは切断されて、ファクターαＸＩＩａと呼ばれそして図４に“アルファＸＩＩａ”として記載されている８０Ｋｄ活性セリン・プロテイナーゼを生じ、これはジスルフィド結合により２８Ｋｄ軽鎖に結合した５２Ｋｄ重鎖を含む。前記ファクターのタンパク質分解は前記重鎖からペプチドを放出し、そしてファクターβＸＩＩａと呼ばれそして図５に“ベータＸＩＩａ”として記載されている生成物を生じさせ、該生成物はセリン・プロテアーゼ活性を保持するが、しかし該生成物においては、αＸＩＩａの２８Ｋｄ鎖は、前者の５２Ｋｄ重鎖から誘導される小さいペプチドフラグメントにジスルフィド結合している。ファクターβＸＩＩａは更なるタンパク質分解的切断を起こし得、約１５Ｋｄの分子量を持つフラグメントを生じさせ、これはファクターγＸＩＩａ（図３ないし図６に示されていない。）と呼ばれている。図６は、“５３ＫＤＸＩＩａ”と名付けられた、ファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームを示す。図から分かるように、５３ＫｄＸＩＩａは、ファクターαＸＩＩａの軽鎖を共有する。前記鎖は、ファクターαＸＩＩａ中に見出されるものよりも長さが短いが、しかし、ファクターβＸＩＩａ中に見出されるものよりも長さが長い第二鎖に結合している。５３ＫｄＸＩＩａのペプチドのアミノ酸配列を図１及び図２に示す。混乱を避けるために、ファクターαＸＩＩａ（図４）中に見出されるペプチド鎖の相当寸法から誘導される用語“重鎖”及び“軽鎖”は、ファクターＸＩＩａの他の分子量フォーム中におけるペプチド鎖を記載するために使用する場合に、本明細書を通じて維持されることを特記すべきである。それ故、ファクターαＸＩＩａの軽鎖に相当する鎖は、ファクターβＸＩＩａ及び５３ＫｄファクターＸＩＩａ中に存在する場合に、“重鎖”と記載される他の鎖が実際には前記プロテインにおいてより短い鎖であるという事実にも係わらず、“軽鎖”と継続して記載される。
【００５９】
５３ＫｄファクターＸＩＩａプロテイン
５３ＫｄファクターＸＩＩａプロテイン及びそれらの構成要素ペプチド鎖は、本発明の範囲に含まれる。このようなプロテイン及びペプチドは、種々の用途のために製造され得る。これらの用途は、抗体の産生、診断分析における試薬としての使用並びに、医学的疾患又は病気の治療のために医薬として使用し得る化合物を分別するための分析における試薬としての使用を含むが、しかし、それらに限定されるものではない。本発明の５３Ｋｄファクタープロテイン配列は、図１及び図２中に存在する配列並びにそれらの類似物及び誘導物を含む。更に、他の種からの対応する相同物は、本発明に含まれる。本発明はまた、５３ＫｄファクターＸＩＩａに機能的に等しいプロテインを含み、このようなプロテインは、一つ又は二つのペプチドのアミノ酸配列内のアミノ酸残部の置換を含むものを含むが、しかし、それらに限定されるものではない。アミノ酸置換は、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は含まれる残部の両親媒性における類似性に基づいて行われ得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンを含み；極性の中性アミノ酸はグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンを含み；正に帯電した（塩基性）アミノ酸はアルギニン、リジン及びヒスチジンを含み；並びに負に帯電した（酸性）アミノ酸はアスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。
【００６０】
種々の宿主発現ベクター系が、本発明のプロテイン及びペプチドを発現するために使用され得る。適する発現系及び、前記発現系からのプロテイン及びペプチドの精製又は富化方法は、例えば国際特許出願公開第０２／００７２０号パンプレット（これは、参照として、本明細書中に取り込まれている。）中に見出され得る。
【００６１】
５３ＫｄＸＩＩａをエンコードしている核酸
本発明は、本発明のプロテイン又はペプチドをエンコードし得るどのような核酸をも含む。前記アミノ酸の相補体もまた、本発明に含まれる。本発明の核酸は、適する核酸ライブラリーから単離され得、遺伝子バンク記録ＮＰ＿０００４９６におけるファクターＸＩＩの開示された配列を利用して設計された適するプライマーを使用するＰＣＲにより単離され得るか、或いは、公知でありそして、例えば、国際特許出願公開第０２／００７２０号パンプレット及びそれに含まれる文献に記載された標準法により合成され得る。好ましくは、本発明の核酸は、５３ＫｄファクターＸＩＩａのペプチドを単独でエンコードする。好ましくは、本発明の核酸は、５３ＫｄファクターＸＩＩａのペプチドに存在しないアミノ酸配列をエンコードする配列を含まない。好ましくは、本発明の核酸は、５３ＫｄファクターＸＩＩａのペプチドに存在しないが、しかし、ファクターＸＩＩａの一つ、それより多く又は全ての非５３Ｋｄフォームのペプチド内に存在する配列を含まない。
【００６２】
本発明の核酸を含む生成物
本発明はまた、ＤＮＡベクター、とりわけ本発明の一つ又はそれより多くの核酸を含むＤＮＡ発現ベクター；本発明の一つ又はそれより多くの核酸或いはＤＮＡベクターを含む遺伝子操作された宿主細胞；並びに非ヒト遺伝子組み換え動物、例えば本発明のプロテイン又はペプチドを遺伝子組み換え的に発現するマウス、ラット、豚、山羊、雌牛又は鶏を包含する。
【００６３】
ファクターＸＩＩａの別の結合フォーム
例えば、ファクターαＸＩＩａ、βＸＩＩａ、γＸＩＩａ又は５３ＫｄＸＩＩａのような、その異なる分子量フォームの何れか一つにおけるファクターＸＩＩａは、高親和性の結合性パートナー、例えば、阻害剤、例えばＣｌエステラーゼ阻害剤、及び他の結合性プロテイン、例えば、低親和性の結合性パートナーを含む他の分子種と結合し得る。ファクターＸＩＩａと、このような他の結合性プロテイン、例えば、低親和性の結合性パートナーとの結合は、可逆的であり得、そして阻害プロテインに結合することを阻止し得、そしてそれ故、ファクターＸＩＩａ活性の阻害を低下又は妨げると主張されている。
【００６４】
例えば、ファクターαＸＩＩａ、βＸＩＩａ、γＸＩＩａ又は５３ＫｄＸＩＩａのような、その異なる分子量フォームの何れか一つにおけるファクターＸＩＩａは、脂質、例えば、粒子及び／又は粒子の断片の形態であってよいリポプロテインと結合しそしてこれらから解離し得る。例えば、ファクターαＸＩＩａ、βＸＩＩａ、γＸＩＩａ又は５３ＫｄＸＩＩａのような、その異なる分子量フォームの何れか一つにおけるファクターＸＩＩａは、どのような細胞及び細胞フラグメントとも結合しそしてこれらから解離し得る。特に、細胞、細胞フラグメント、リポプロテイン及びリポプロテイン断片と結合したファクターＸＩＩａの場合には、ファクターＸＩＩａの一つの分子量フォームの幾つかの分子が、個々の粒子上に存在し得る。更に、ファクターＸＩＩａの幾つかの分子が、同一の分子量フォームであっても又は異なる分子量フォームであっても、ファクターＸＩＩａ分子のコンプレックスとして存在し得る。
【００６５】
国際特許出願公開第０４／０５７３４３号パンプレットにおいて主張され、そして前記特許出願の図１に説明されたように、ファクターＸＩＩａの異なる結合性フォームの間の相互変換の動力学的系が生体内に存在すると考えられる。ファクターＸＩＩａの異なる結合性フォーム及びファクターＸＩＩａの異なる分子量フォームは生理学及び病理学において異なる役割を有し、そして、ファクターＸＩＩａの特定のフォームの優先的測定は、ファクターＸＩＩａの定義されないフォームを測定することと比較して、病気及び疾患及びそれらの治療の診断、予測及びモニターにおいて改善された臨床的用途を与えることもまた主張された。
【００６６】
細胞ファクターＸＩＩａ
ファクターＸＩＩａへのファクターＸＩＩの活性化が細胞表面で起こり得、そして前記仮説を支持するデータを提供することを多数の著者が示唆した。特に、著者において、ファクターＸＩＩの活性化は、高分子量キニノゲン、プレカリクレイン及びファクターＸＩを含む複合分子集合体の構成を通して、細胞、特に内皮細胞上で起こることを示唆した。これらのモデルは、ファクターＸＩＩａは活性化された後、前記集合体から解離し、そして長期間、細胞表面上に残らないことを示している［例えば、ヤロヴァヤ（Ｙａｖａｙａ）等の文献を参照］。
【００６７】
国際特許出願公開第０４／０５７３４３号パンプレットは、ファクターＸＩＩａは種々の結合性フォームで存在し、その一つは、血液中を循環している細胞及びその断片及びそれらから誘導される細胞物質の表面上に存在するファクターＸＩＩａであるという観察を開示している。ファクターＸＩＩａの前記フォームは、“細胞ファクターＸＩＩａ”と呼ばれた。
【００６８】
別の観察は、ファクターＸＩＩａが細胞性である場合、ファクターＸＩＩａエピトープの全てが、ファクターＸＩＩａが細胞性でない場合ほどにはアクセスし易い訳ではないことであった。例えば、モノクローナル抗体２／２１５は細胞ファクターＸＩＩａ及び非細胞ファクターＸＩＩａに効果的に結合することが可能である。しかしながら、モノクローナル抗体２０１／９及びファクターβＸＩＩａに対して生じた羊ポリクローナル抗体は、非細胞ファクターＸＩＩａに対する場合と同様には、細胞ファクターＸＩＩａに効果的に結合することが可能であるとは認められない。
【００６９】
血液中で、ファクターＸＩＩａは特に、顆粒球、とりわけフローサイトメトリーにおいて、他の顆粒球よりも僅かに高い分散を示し、それが、他の亜母集団とは異なる形態を示している、顆粒球の亜母集団に存在し得るようである。これらの観察は、臨床的な意義を有し得る。
【００７０】
脂質が結合したファクターＸＩＩａ
幾つかのファクターＸＩＩａが脂質、例えば、血液中のリポプロテイン及びその断片と結合しており、そして前記脂質が結合したファクターＸＩＩａの測定は、種々の臨床病態に関係する情報を提供することもまた国際特許出願公開第０４／０５７３４３号パンプレットから知られている。
【００７１】
尿ファクターＸＩＩａ
国際特許出願公開第０４／０５７３４３号パンプレットはまた、ファクターＸＩＩａは尿中に存在すること、及び尿ファクターＸＩＩａの測定は種々の臨床病態に対する情報を提供することを開示した。
【００７２】
ファクターＸＩＩａと他の分子種との分子コンプレックス及び結合
二つ又はそれより多くのファクターＸＩＩａ分子は、コンプレックスの形態で互いに結合し得、またファクターＸＩＩａは、一つ又はそれより多くの他の分子種、例えば、高親和性の結合性プロテイン、例えば阻害分子、又は低親和性の結合性プロテインと結合し得る。ファクターＸＩＩａの分子コンプレックス及びファクターＸＩＩａと低親和性の結合性パートナーとの結合体を分解するが高親和性の結合性パートナーとの結合体を分解しないと予期させる界面活性剤の存在下及び非存在下でイムノアッセイを行った場合に得られた結果も、また、分子コンプレックス及び結合性パートナーとの結合体の存在を示す。
【００７３】
ファクターＸＩＩａの異なるフォームに対する抗体
ｍＡｂ２／２１５及びｍＡｂ２０１／９により例示される先行技術の抗体は、ファクターＸＩＩと結合しないが、しかし、本発明の新規５３Ｋｄフォームを含むファクターＸＩＩａの全ての公知フォームと結合する。従ってそれらは、抗体の結合の前又は後に、それらがファクターＸＩＩａの分子量フォームを区別する技術と組み合わせて使用されない限りは、ファクターＸＩＩａの異なる分子量フォームを相互に区別するために使用することができない。ファクターＸＩＩａの分子量フォームを区別するための適する技術は、クロマトグラフィー技術、例えばゲル電気泳動を含む。先行技術の抗体を使用し得る、５３ＫｄＸＩＩａに対する特別な分析の例は、試料からファクターＸＩＩａ一般を免疫沈降させるために先行技術の抗体が使用され、そしてその結果得られたファクターＸＩＩａを、その後、ファクターＸＩＩａの異なる分子量フォームを分離するためにゲル上に流すものであった分析である。プロテインは、その後、一般的なプロテイン染色を用いるか又は、先行技術の抗体の一つを用いる染色により、ゲル上で視認化され得、そして、ゲル上の５３Ｋｄバンドの染色強度を観察することにより、５３ＫｄファクターＸＩＩａの濃度が測定され得る。
【００７４】
上記の分析は行うことが比較的容易であるけれども、分子量分別に対する必要性を除くことにより、それをまた更に簡略にすることが望ましい。このような改良は一工程分析をもたらし、それ故、利点が有る。５３ＫｄファクターＸＩＩａと、一つ又はそれより多くのファクターＸＩＩａの非５３Ｋｄフォームとを区別することが可能な本発明の抗体の産生を以下に記載する。
【００７５】
５３ＫｄファクターＸＩＩａ−特異的抗体の産生
抗体の産生のために、適する抗原を注射することにより、種々の宿主動物が免疫化され得る（以下の、抗原選択の詳細を参照）。このような宿主動物は、豚、兎、マウス、山羊、馬及びラットを含み得るが、しかし、それらに限定されるものではない。宿主に依存する免疫応答を増加させるために、フロインドアジュバント（完全及び不完全）、鉱物塩例えば水酸化アルミニウム又は燐酸アルミニウム、界面活性物質例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、多価アニオン、ペプチド、油性乳剤、及び潜在的に有用なヒトアジュバント例えばＢＣＧ［バシル  カルメット−ゲリン（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔ
ｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）］及びコリネバクテリウム  パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）を含むが、しかし、それらに限定されない種々の助剤が使用され得る。
【００７６】
或いはまた、免疫応答は、応答強化剤、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、オボアルブミン、コレラ毒素又はそれらのフラグメントと組み合わせる及び／又は結合させることにより、増加され得る。
【００７７】
ポリクローナル抗体は、免疫化動物の血清から誘導される抗体分子の不均質な集団である。
【００７８】
特定の抗原に対する抗体の均質な集団であるモノクローナル抗体は、培養液中での連続継代細胞系による抗体分子の産生を提供する如何なる技術によっても得ることができる。
【００７９】
これらは、コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）及びミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）［１９７５年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６、４９５〜４９７、及び米国特許第４，３７６，１１０号明細書］のハイブリドーマ技術、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術［コスボー（Ｋｏｓｂｏｒ）他、１９８３年、今日の免疫学（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ）４、７２；コール（Ｃｏｌｅ）他、１９８３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、８０、２０２６〜２０３０］並びに、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術［コール（Ｃｏｌｅ）他、１９８５年、モノクローナル抗体及び癌治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、アラン  アール．  リス  インコーポレーテッド（Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．）、第７７９６頁、を含むが、しかし、それらに限定されるものではない。
【００８０】
ｍＡｂを産生する本発明のハイブリドーマは生体内又は生体外で培養され得、そして、得られたｍＡｂは慣用技術により精製される。生体内における高力価のｍＡｂの産生は、これを好ましい産生方法になし得る。しかしながら、動物の使用に関する法的、商業的又は倫理的制約が生体内での産生を望ましくないものにする場合には、生体外の産生が好ましいことであり得る。
【００８１】
加えて、適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子と一体に接続することにより、“キメラ抗体”［モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）他、１９８４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８１、６８５１〜６８５５；ノイベルガー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ）他、１９８４年、ネイチャー、３１２、６０４〜６０８；タケダ（Ｔａｋｅｄａ）他、１９８５年、ネイチャー、３１４、４５２〜４５４］の産生のために開発された技術を使用することができる。キメラ抗体は、ネズミｍＡｂ及びヒトイムノグロブリン定常領域から誘導される可変領域を有するもののような、異なる部分が異なる動物種から誘導される分子である。このような技術は、米国特許第６，０７５，１８１号明細書及び同第５，８７７，３９７号明細書並びにそれらの個別の開示（これらは、その全体にわたり、参照として本明細書中に取り込まれている。）に記載されている。本発明により更に包含されるのは、米国特許第６，１５０，５８４号明細書（これは、その全体にわたり、参照として本明細書中に取り込まれている。）に記載されたような、完全ヒト化モノクローナル抗体の使用である。ヒト又はヒト化動物ｍＡｂは、ヒトにおける治療用途のために好ましいものであり得る。
【００８２】
或いはまた、一本鎖抗体の産生のための記載された技術［米国特許第４，９４６，７７８号明細書；バード（Ｂｉｒｄ）、１９８８年、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４２、４２３〜４２６；ヒューストン（Ｈｕｓｔｏｎ）他、１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、米国、８５、５８７９〜５８８３；及びウォード（Ｗａｒｄ）他
、１９８９年、ネイチャー、３４１、５４４〜５４６］が、一本鎖抗体の産生のために採用され得る。一本鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントとをアミノ酸ブリッジを介して結合させ、一本鎖ポリペプチドを得ることにより形成される。
【００８３】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知技術により製造され得る。例えば、このようなフラグメントは、抗体分子のペプシン分解により産生され得るＦ（ａｂ’）2 フラグメント及び、Ｆ（ａｂ’）2 フラグメントのジスルフィドブリッジを還元することにより製造され得るＦａｂフラグメントを含むが、しかし、それらに限定されるものではない。或いはまた、望ましい特異性を持つモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速且つ容易な同定を可能にするために、Ｆａｂ発現ライブラリーが構築され得る［ヒュース（Ｈｕｓｅ）他、１９８９年、サイエンス、２４６、１２７５〜１２８１］。
【００８４】
本発明の５３ＫｄファクターＸＩＩａに対する抗体は、当業者に知られている技術［例えば、グリーンスパン（Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ）及びボナ（Ｂｏｎａ）、１９９３年、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７（５）、４３７〜４４４；及びニシノフ（Ｎｉｓｓｉｎｏｆｆ）、１９９１年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）、２４２９〜２４３８を参照］を使用して、５３ＫｄファクターＸＩＩａを“模倣する”抗イディオタイプ抗体を製造するために使用され得る。
【００８５】
本発明の抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びこれらのどのような亜類をも含むどのような免疫グロブリン類のものであってもよい。
【００８６】
抗体の産生のために適する抗原の選択及び製造
抗原の選択
本発明の抗原は、ファクターαＸＩＩａ及びファクターβＸＩＩａの少なくとも一つに優先して５３ＫｄファクターＸＩＩａに結合することが要求される。それ故それらは、５３ＫｄＸＩＩａに存在し且つアクセス可能であるが、しかし、ファクターαＸＩＩａ及びファクターβＸＩＩａの少なくとも一つに存在しないか又はアクセス不可能であるエピトープを認識する。抗原の選択に対する一つの研究手法は、それ故、５３ＫｄファクターＸＩＩａに存在するが、しかし、ファクターβＸＩＩａに存在しないアミノ酸配列を有するペプチド抗原を選択することである。このような配列は、ファクターβＸＩＩａに存在しない５３ＫｄファクターＸＩＩａの重鎖の一部に見出され得る。抗原の選択に対するまた別の研究手法は、５３ＫｄファクターＸＩＩａの重鎖Ｎ−末端（この末端は、５３Ｋｄファクターにおいてのみ露出している。）を取り込むエピトープに対する抗体応答を引き上げる目的で、実質的に５３ＫｄファクターＸＩＩａ全体又はそのペプチド鎖又はその何れかのフラグメントを使用することである。抗原の選択に対するまた別の研究手法は、抗原として、ファクターαＸＩＩａ及び／又はファクターβＸＩＩａに存在するが、しかし、５３ＫｄファクターＸＩＩａにおいてのみ露出している配列を有するペプチドを選択することである。
【００８７】
抗原の製造
プロテイン抗原の寸法、凝集の程度及び相対的天然性、即ち、相対的欠損又は変性は全て、産生された抗体の品質及び量に劇的な影響を及ぼし得る。小さいポリペプチド（＜１０Ｋｄａ）及び非プロテイン抗原は、一般的に、免疫性を増加させ且つＴ細胞エピトープを産生するために、より大きい、免疫学的、キャリアプロテインと結合又は交差結合することが必要である。可溶性の、凝集していないプロテインの注射は、十分な抗体応答よりもむしろ耐性を生じさせ得る。それ故、前記抗原をより大きいプロテイン、例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と結合させることが望ましいことであり得る。ポリ−Ｌ−リジンもまた、小さい抗原ペプチドのための骨核として成功裏に使用されている。
【００８８】
抗原の天然性の程度もまた、考慮する必要があり得る。天然プロテインから生じた抗体は、天然プロテインと最も良く反応し、そして、変性プロテインに対する抗体は、変性プロテインと最も良く反応する。変性プロテインを検出するために抗体を使用することを意図する場合には、抗体は好ましくは変性抗原に対して生じさせるべきである。他方、診断用途の場合に一般的であるように、天然プロテインを検出するために抗体を使用する場合には、抗体は好ましくは、天然又は実質的に天然の抗原に対して生じさせるべきである。適切なアジュバントの選択は、抗原の天然性を変更するために使用され得る。一般的に、予め形成された水中油乳化アジュバント中に吸収されたプロテイン抗原は、油中水乳剤中のものよりもより多くの天然プロテイン構造を維持している。
【００８９】
抗原は常に、それらが微生物汚染を有しないことを保証する技術を使用して製造されるべきである。抗原組成物は、０．２２μｍフィルターを通すことにより滅菌され得る。
【００９０】
ポリクローナル抗体の精製
ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、公知技術、例えば、プロテイン−Ａ又はプロテイン−Ｇ親和性クロマトグラフィーカラムを使用して、非免疫グロブリン汚染物から精製され得る。本発明のポリクローナル抗体は、交差反応性を除去又は低減するために、更なる精製を必要とし得る。ファクターＸＩＩａの非５３Ｋｄフォームとの交差反応性を除去するために、親和性精製法により、ポリクローナル血清から前記抗体種を除去することが必要であり得る。フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）他、１９８８年、セル（Ｃｅｌｌ）、５４、８１３〜８２２（この開示は、参照として本明細書中に取り込まれている。）は、ポリクローナル抗体の親和性精製のために適するプロトコルの詳細を与える。要するに、このような精製技術は、前記抗原或いは交差反応性の問題を引き起こしている抗原を、固体基材、例えば実験室のプラスチックウェア物品の壁又はクロマトグラフィーカラム内に充填された固体ビーズに固定すること、及び、ポリクローナル血清を前記固体基材の中又は上を通過させることを含み、その結果、交差反応性を示す抗体種が保持されそして交差反応性を示さない抗体種が液相中に保持される。本発明のポリクローナル抗体の産生のための親和性精製技術の使用例として、ポリクローナル抗体応答は、動物に５３ＫｄファクターＸＩＩａを接種することにより該動物中に生じさせ得、ここで得られたポリクローナル血清は、その後、固定されたファクターαＸＩＩａを含むクロマトグラフィーカラムを通過させることにより、親和性精製され得る。ファクターαＸＩＩａとの交差反応性を示す抗体種はカラム中に保持され、そして、５３ＫｄファクターＸＩＩａに結合し得るがしかしファクターαＸＩＩａに結合し得ない抗体種は液相中に残り、そしてカラム溶出液に含まれる。
【００９１】
ファクターＸＩＩａの異なるフォームの検出及び／又は決定
本発明は、ファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォーム、例えば試料中の細胞５３ＫｄＸＩＩａ、循環５３ＫｄＸＩＩａ又は尿５３ＫｄＸＩＩａを検出及び／又は決定する方法であって、調査中のファクターＸＩＩａの５３ＫｄフォームをファクターＸＩＩａの他の分子量フォームに対して優先的に検出又は決定することが可能な手順を行うことを含む方法を提供する。
【００９２】
一実施態様において、本発明の方法は、調査中のファクターＸＩＩａの５３ＫｄフォームをファクターＸＩＩａの他のフォーム（前記ファクターＸＩＩａの他のフォームは、好ましくは、ファクターＸＩＩａの非５３Ｋｄフォームである。）に対して優先的に決定することが可能な分析により、調査中のファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームを検出又は決定することを含む。
【００９３】
他の実施態様において、本発明の方法は、ファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームをフ
ァクターＸＩＩａの他のフォーム（前記ファクターＸＩＩａの他のフォームは、好ましくは、ファクターＸＩＩａの非５３Ｋｄフォームである。）から分離し、そして分離されたファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームを検出又は決定することを含む。
【００９４】
分離されたファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームを検出又は決定は、ファクターＸＩＩａの５３ＫｄフォームをファクターＸＩＩａの他のフォーム（前記ファクターＸＩＩａの他のフォームは、好ましくは、ファクターＸＩＩａの非５３Ｋｄフォームである。）に対して優先的に決定することが可能な分析によってよい。
【００９５】
別の実施態様において、本発明の方法は、試料を、ファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームに結合可能であり且つ所望により更にファクターＸＩＩａの他のフォームに結合可能な標識化された抗体と接触させ、ファクターＸＩＩａの５３ＫｄフォームをファクターＸＩＩａの他のフォーム（前記ファクターＸＩＩａの他のフォームは、好ましくは、ファクターＸＩＩａの非５３Ｋｄフォームである。）から分離し、そしてファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームを検出又は決定することを含む。
【００９６】
それ故、本発明により、ファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームは、最初に、ファクターＸＩＩａの他のフォーム、好ましくはファクターＸＩＩａの他の分子量フォームから分離され得、次いでファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームが決定され得る。ファクターＸＩＩａのための一般的な分析、即ち、ファクターＸＩＩａのどのような特定フォームに対しても特異的ではない分析を使用し得るが、しかし、ファクターＸＩＩａの５３ＫｄフォームをファクターＸＩＩａの他のフォーム（前記ファクターＸＩＩａの他のフォームは、好ましくは、ファクターＸＩＩａの非５３Ｋｄフォームである。）に対して優先的に決定可能な分析を使用することが利点があり得る。このような分析の例を以下に与える。このような手順は、例えば、細胞５３ＫｄＸＩＩａ、５３ＫｄＸＩＩａと他の分子種との分子コンプレックス及び結合体を検出又は決定するために使用され得る。
【００９７】
或いはまた、調査中のファクターＸＩＩａの５３ＫｄフォームをファクターＸＩＩａの他のフォーム、好ましくはファクターＸＩＩａの他の非５３Ｋｄフォームに対して優先的に決定可能である分析は、ファクターＸＩＩａの異なるフォームを予め分離することなく、試料に対して直接行い得る。このような分析の例を以下に与える。このような分析は試料に対して直接行い得る。このような手順は、例えば、ファクターＸＩＩａと他の分子種との分子コンプレックス及び結合体を検出又は決定するために使用され得る。
【００９８】
別の方法として、ファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームを含む試料が標識化された抗体と接触され、次いで調査中のファクターＸＩＩａの分子量フォームの分離が、分離されたフォームの検出又は決定と共に行われ得る。このような手順は、例えば、脂質が結合した５３ＫｄファクターＸＩＩａを検出又は決定するために使用され得る。
【００９９】
ファクターＸＩＩａのフォームの分離
ファクターＸＩＩａのフォームは、それらの物理的、化学的又は免疫学的性質に基づいて分離され得る。このような分離の何れも、調査中のファクターＸＩＩａのフォームが変化せずに維持されるような条件下で一般的に行われるべきであり、例えば、前記条件は一般的に、どのようなコンプレックス又は分子結合体も分解されず、そして他の物質、例えば細胞又は脂質物質に結合したどのようなファクターＸＩＩａのフォームも前記物質から放出されないようにすべきである。しかしながら、幾つかの環境においては、ファクターＸＩＩａをそれが結合している結合体から又は材料から放出することが望ましいことであり得る。
【０１００】
物理的性質に基づく分離
ファクターＸＩＩａの異なる分子量フォームは、例えば、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のようなクロマトグラフィー技術、フローサイトメトリー技術又は超遠心分離技術を使用して、分子量に基づいて分離し、その後、分離した物質を評価し得る。
【０１０１】
評価は、複数の方法、例えば分離されたフォームに対してイムノアッセイを使用することにより又は酵素分析を使用することにより、例えばＳ２３０２［英国、アクスブリッジのカビ  ダイアグノスティクス（Ｋａｂｉ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）社製］のような発色性基質を使用することにより行うことができる。ファクターＸＩＩａに対する抗体は、ＨＰＬＣと組み合わせて使用され得る。例えば、標識化された抗体を試料と反応させ、そして得られた混合物をＨＰＬＣ分離に付し得る。抗体とファクターＸＩＩａの特定の分子量フォームとのコンプレックスを、その後、抗体を標識化するために使用された材料に対する適する検出システムを使用して測定することができる。
【０１０２】
物理的性質に基づく、ファクターＸＩＩａと結合性パートナーとの分子コンプレックス及び結合体の分離
このような方法は、とりわけ、ファクターＸＩＩａの二つ又はそれより多くの分子を含む分子コンプレックスをファクターＸＩＩａの他のフォームからを分離するために、また高親和性又は低親和性の結合性パートナーと結合したファクターＸＩＩａのフォームを分離するために有用である。
【０１０３】
ファクターＸＩＩａコンプレックスが分解されず、そしてファクターＸＩＩａが結合性パートナーから解離されないような条件下でこのような分離を行うことが一般的に好ましい。例えば、コンプレックス及び幾つかの分子結合体を分解する傾向がある界面活性剤が存在しないようにすることが一般的に好ましい。しかしながら、幾つかの環境において、分解が起こるのが望ましいことであり得る。例えば、低親和性の結合性パートナーからファクターＸＩＩａを開放することが、又は、低親和性の結合性パートナーと結合したファクターＸＩＩａを高親和性の結合性パートナーと結合したファクターＸＩＩａから分離することが望ましい場合には、適切な条件、例えば界面活性剤が使用され得、低親和性の結合性パートナーからのファクターＸＩＩａの解離を生じさせるが、しかし、高親和性の結合性パートナーからの解離は生じさせない。
【０１０４】
物理的又は化学的性質に基づく、細胞ファクターＸＩＩａと脂質が結合したファクターＸＩＩａとの分離
細胞及び脂質が結合したファクターＸＩＩａは、物理的又は化学的方法により、又はその組み合わせにより、ファクターＸＩＩａの他のフォームから分離され得る。例えば、細胞ファクターＸＩＩａは、遠心分離又はフローサイトメトリーにより分離され得る。脂質が結合したファクターＸＩＩａは、例えば、リポプロテイン沈降剤及び、一般的に遠心分離により、或いは密度層超遠心分離により、分離され得る。
【０１０５】
ファクターＸＩＩａが細胞又は脂質物質から解離しないような条件下で分離を行うことが一般的に好ましい。例えば、界面活性剤が存在しないようにすることが一般的に好ましい。しかしながら、幾つかの環境において、分解が起こるのが望ましいことであり得る。ファクターＸＩＩａをそれに結合している物質から分離することが望ましい場合には、適切な条件が使用され得る。
【０１０６】
免疫学的分離
調査中のファクターＸＩＩａのフォームは、該調査中のファクターＸＩＩａのフォームに対して優先的結合性を示す抗体を使用する免疫学的方法により、他のフォームから分離され得る。例えば、抗体が適切な固体支持体上に固定されているイムノアフィニティークロマトグラフィーを行い得る。結合した又は結合していないフラクションにおける酵素活
性の測定は、クロマトグラフィーの後に行い得る。好ましい抗体は、ファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームの一つ又はそれより多くのエピトープを認識し、そして０．１％又はそれ未満の、ファクターαＸＩＩａ及びファクターβＸＩＩａの一方又は双方との補正された交差反応性を有するものである。そのような抗体の産生は、本明細書の別の場所に記載されている。
【０１０７】
物理的又は化学的性質に基づく分離について上に記載されたように、イムノアフィニティークロマトグラフィーによる分離は、ファクターＸＩＩａのフォームが変化せずに維持される、例えば、コンプレックス及び結合体が分解されず、そして結合した分子が放出されないような条件下で一般的に行うべきである。しかしながら、分解が望ましい環境が存在し得る。そのような場合には、適切な条件が使用され得る。イムノアフィニティークロマトグラフィーは好ましくは、ファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームの一つ又はそれより多くのエピトープを認識するが、しかし、１０％又はそれ未満、より好ましくは５％又はそれ未満、更により好ましくは２％又はそれ未満、更により好ましくは１％又はそれ未満、更により好ましくは０．５％又はそれ未満の、ファクターαＸＩＩａ及びファクターβＸＩＩａの一方又は双方との補正された交差反応性を有する抗体を使用して行われる。このような抗体の産生は、本明細書の他の場所に記載されている。
【０１０８】
分析の適合性の測定
分子量フォームに関して識別することなくファクターＸＩＩａを検出又は決定する方法は知られており、そして発色性分析、例えば、アミド分解分析及び種々のタイプのイムノアッセイ、例えば、先行技術の抗体を使用するイムノアッセイを含む。
【０１０９】
調査中のファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームが、 分析が行われる前に、ファクターＸＩＩａの他の分子量フォームから分離されている場合には、ファクターＸＩＩａの異なる分子量フォームを相互に識別しない分析、即ち、“一般的な”ファクターＸＩＩａ分析が使用され得る。しかしながら、先の分離手順の後でさえも、調査中のファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームを他の分子量フォームに対して優先的に検出又は決定することが可能な分析を使用することは利点があり得る。
【０１１０】
分離手順が行われない場合には、使用される分析は、調査中のファクターＸＩＩａの５３ＫｄフォームをファクターＸＩＩａの他の非５３Ｋｄフォームから検出又は決定することが可能でなければならない。ファクターＸＩＩａを検出又は決定するために適することが知られている分析は、試料中の５３ＫｄファクターＸＩＩａの望ましいフォームを検出又は決定するための能力を試験され得る。
【０１１１】
例えば、細胞５３ＫｄファクターＸＩＩａを含むことが知られている試料を使用して、調査中の分析により得られる結果は、細胞５３ＫｄファクターＸＩＩａを検出するために適することが知られている分析を使用して得られる結果と比較される。モノクローナル抗体２／２１５は、細胞５３ＫｄファクターＸＩＩａに効果的に結合することが可能である。ｍＡｂ２／２１５又はその類似体を含むイムノアッセイは、比較分析として使用され得る。同様の考え方を５３ＫｄファクターＸＩＩａの他のフォームにも当てはまる。
【０１１２】
もう一つの方法は、５３ＫｄファクターＸＩＩａの望ましいフォーム、例えば、細胞５３ＫｄファクターＸＩＩａを含むことが知られている試料の一部について、調査中の分析を行うことである。この場合には、前記試料は非細胞５３ＫｄファクターＸＩＩａを含むべきではない。細胞から５３ＫｄファクターＸＩＩａを放出させるために前記試料の他の部分を処理し、処理された細胞を単離し、前記分析を繰り返し、そして二つの分析の結果を比較する。細胞５３ＫｄファクターＸＩＩａを含む試料に対する分析において得られた結果が、細胞５３ＫｄファクターＸＩＩａを除くために処理された試料から得られた結果
よりも高い場合には、これは、前記分析は細胞５３ＫｄファクターＸＩＩａを検出又は決定するために適していることを示す。同様の考え方を５３ＫｄファクターＸＩＩａの他のフォームにも当てはまる。
【０１１３】
ファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くのフォームに対する分析の特異性
分析の、ファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くのフォームへのの他のフォームに対するよりの特異性は、分析の設計により達成又は改良され得る。分析のパラメーターは、調査中のファクターＸＩＩａの前記フォームがファクターＸＩＩａの他のフォームに対して優先的に検出又は決定されるように調節され得る。
【０１１４】
分析のこのような最適化は従来技術における常識であり、そして適する技術は周知である［例えば、「イムノアッセイの原理及び実施（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）」、著者：プライス  シーピー（Ｐｒｉｃｅ  ＣＰ）及びニューマン  ディージェイ（Ｎｅｗｍａｎ  ＤＪ）、ストックトン出版（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９１年を参照］。
【０１１５】
イムノアッセイの場合において、望ましい特異性を達成するために調節することができるパラメーターは、使用する抗体又は抗体の組み合わせの一つ又はそれより多くの選択；界面活性剤の存在、不在及び選択；及び、固体相上にコートされた抗体を含む、抗原捕捉分析の場合におけるプレートコーティングのために使用される条件を含み得る。
【０１１６】
例えば、マイクロ滴定プレートイムノアッセイの場合には、ファクターＸＩＩａの特定のフォームを他のフォームに対して優先的に測定するために変更され得る多数のパラメーターが存在する。
【０１１７】
捕捉抗体を用いて固体相をコートするために使用される溶液の組成もまた、ファクターＸＩＩａの異なるフォームの優先的な測定に影響を及ぼし、例えば、組成物に含まれる抗体の濃度並びに緩衝液のｐＨ及び条件は重要である。
【０１１８】
どのフォームが優先的に測定されるかに影響を及ぼす別のパラメーターは、抗体を用いる培養の間の試料中の界面活性剤、例えばトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）の存在、不在及び選択である。界面活性剤の存在は、コンプレックス、例えば、ファクターＸＩＩａ分子のコンプレックスを分解し得、及び／又は、細胞及び／又は脂質に予め結合しているファクターＸＩＩａを放出し得ると仮定される。界面活性剤の性質及び／又は量もまた、分析に影響を及ぼす。
【０１１９】
ファクターＸＩＩａの特定のフォームの優先的な測定に影響を及ぼすために操作することができるパラメーターの別の例は、抗原−抗体コンプレックスを検出するために使用される複合体を形成するために標識化される抗体の選択である。
【０１２０】
分析パラメーターの間の複雑な相互作用が存在することを特記すべきであり、例えば、分析中に界面活性剤を配合することの影響は、捕捉抗体の組み合わせ、コーティング抗体濃度、コーティング緩衝液及び、使用される複合抗体に依存する。ファクターＸＩＩａの望ましいフォームを検出又は決定するための最適条件は、従来技術で慣用の方法に基づいて、種々のパラメーターの適切な操作により決定され得る。
【０１２１】
ファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームに特異的に存在するエピトープを認識する抗体を使用することにより、分析が、ファクターＸＩＩａの５３ＫｄフォームとファクターＸＩＩａの非５３Ｋｄフォームとを識別することを意図する場合には、興味のあるエピトープの整合性が抗体を結合させるために利用可能であることを保証するために分析条件の設
定に注意が払われるべきである。特定のエピトープは、５３ＫｄファクターＸＩＩａが非変性である場合にのみ、利用可能であり得る。他のエピトープは、解明のために、ファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くのフォームの変性を必要とし得る。分析条件の選択は、プロテイン変性の程度に影響を及ぼし得る。例えば、界面活性剤又は高いイオン濃度の使用は、一般的に、増加した度合の変性を生じさせ得る。還元性条件下（例えば、メルカプトエタノールのような還元剤の存在下）での実施及び分析及び／又は試料沈澱段階は、ファクターＸＩＩａの重鎖及び軽鎖の分離を生じさせ得る。分析に使用されるエピトープに応じて、これは、エピトープの分解、或いはまた、これまで隠されていたエピトープの暴露を導き得る。
【０１２２】
試料及び試料調製
試料
５３ＫｄファクターＸＩＩａの異なるフォームの測定は、体液、例えば全血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液又は涙の試料、或いは、体液から単離された細胞、即ち、生体内においてそれらが存在する液体相を実質的に含まない細胞、或いは、組織又は組織試料から得られた細胞を含む試料について行われ得る。
【０１２３】
試料調製
試料は、慣用の方法に従って得られ且つ調製され得る［ヤング  ディー．エス．（Ｙｏｕｎｇ  Ｄ．Ｓ．）及びバーメス  イー．ダブリュ．（Ｂｅｒｍｅｓ  Ｅ．Ｗ．）、“  被検体の捕集及び加工（Ｓｐｅｃｉｍｅｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）”、臨床化学のティーズテキストブック（Ｔｉｅｔｚ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２版、著者：バーティス  シー．エイ．（Ｂｕｒｔｉｓ  Ｃ．Ａ．）及びアシュウッド  イー．アール．（Ａｓｈｗｏｏｄ  Ｅ．Ｒ．）、サウンダーズ（Ｓａｕｎｄｅｒｓ）（１９９４年）、更に、酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、エイチ．ヴァン  ヴナキス（Ｈ．Ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ）及びジェイ．ジェイ．ランゴン（Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ）（著者）、１９８１年、７２（Ｂ）；酵素イムノアッセイの実施及び理論（Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）、ピー．チゼン（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ）、生化学及び分子生物学における実験室技術（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、アール．ジェイ．バーデン（Ｒ．Ｊ．Ｂｕｒｄｅｎ）及びピー．エイチ．ヴァン  クニッペンゲルグ（Ｐ．Ｈ．Ｖａｎ  Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ）（著者）、エルズヴィアー（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、１９８５年；ラジオイムノアッセイ及び関連技術の紹介（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、ティー．チャード（Ｔ．Ｃｈａｒｄ）、同前、第３版、１９８７年；並びに酵素学における方法、エイチ．ヴァン  ヴナキス及びジェイ．ジェイ．ランゴン（著者）、１９８１年、７４（Ｃ）を参照］。
【０１２４】
体液
本発明により、体液の試料中のファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くの５３Ｋｄフォームが検出又は決定され得る。体液の例は、全血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液及び涙である。体液の試料は、例えば上記参考文献に記載された慣用の方法により得られ且つ調製され得る。
【０１２５】
ファクターＸＩＩａの特定フォームの他のフォームに対する選択的測定は、以下の分析に関する章に記載の如く達成され得る。
【０１２６】
細胞ファクターＸＩＩａ
一実施態様において、本発明は、哺乳類の検体、一般的にはヒトから得られた細胞、特
に血液又は他の体液中を循環している細胞を含む試料中の５３ＫｄファクターＸＩＩａを検出又は決定することからなる方法を提供する。
【０１２７】
細胞ファクターＸＩＩａの測定は、体液の試料、或いは、細胞ファクターＸＩＩａの測定のための分析の前に単離され得る細胞、即ち、生体内においてそれらが存在する液体相を実質的に含まないようにして、体液、例えば全血液又は血漿の試料から単離され得る細胞について行われ得る。或いはまた、細胞は組織試料から得られ得る。
【０１２８】
使用される分析が細胞及び非細胞ファクターＸＩＩａの双方を検出又は決定することが可能である場合には、細胞を含む試料について分析を行うことで、細胞結合検体及び非細胞検体の双方が検出又は決定される。しかしながら、分析が単離された細胞の試料について行われる場合には、結果は細胞検体のみに対してである。用語“細胞を含む試料”は、細胞を含む体液の試料と単離された細胞の試料の双方を示して、本明細書において使用される。
【０１２９】
細胞残渣及び細胞物質を含む細胞は、例えば、上記“ファクターＸＩＩａのフォームに分離”に記載された通りに単離され得る。例えば、細胞は、遠心分離及び洗浄により単離され得る。好ましくは、細胞は遠心分離され、そして少なくとも１回、好ましくは２回又は複数回洗浄される。遠心分離は一般的に、細胞に、浮遊物から分離され得る分離ペレットを形成させるのに十分な高ｇ下で行われるべきである。前記ペレットは、細胞ファクターＸＩＩａに影響を及ぼさない、例えば、細胞ファクターＸＩＩａを細胞から分離しない適する媒体中で洗浄され得る。例えば、燐酸塩で緩衝化された生理食塩水ｐＨ７．４は、洗浄のため、そして細胞ファクターＸＩＩａの検出又は検出及び／又は決定のための懸濁に使用され得る。フローサイトメトリーは、細胞を単離するために使用され得る。
【０１３０】
分析が行われる前に、細胞ファクターＸＩＩａがファクターＸＩＩａの他の結合フォームから分離されている場合には、細胞ファクターＸＩＩａとファクターＸＩＩａの他の結合フォームとを識別しない分析、即ち、“一般的な”ファクターＸＩＩａ分析が使用され得る。しかしながら、先の分離手順の後でさえも、細胞ファクターＸＩＩａを、他のフォームに対して優先的に検出又は決定することが可能な分析を使用することは利点があり得る。
【０１３１】
分離手順が行われない場合には、使用される分析は、調査中の細胞ファクターＸＩＩａを検出又は決定することが可能であるべきである。
【０１３２】
組織試料中の細胞ファクターＸＩＩａの存在は、免疫組織学的技術を使用して検出され得る。例えば、適切な標識、例えば蛍光標識を用いて標識化されている以下に記載されたモノクローナル抗体が使用され得る。
【０１３３】
脂質が結合したファクターＸＩＩａ
本発明は、組織又は、とりわけ、哺乳類の検体、一般的にはヒトから得られた体液を含む試料中の脂質が結合した５３ＫｄファクターＸＩＩａを検出又は決定することからなる方法を提供する。
【０１３４】
脂質が結合した５３ＫｄファクターＸＩＩａの測定は、体液、例えば全血液又は血漿の試料について行い得る。或いはまた、体液又は組織から脂質フラクションを単離し、そして前記脂質フラクションのファクターＸＩＩａ含有量を決定することができる。脂質フラクションは、上記“ファクターＸＩＩａのフォームの分離”に記載された通りに単離され得る。例えば、リポプロテインは、組織又は体液から、例えば血漿から、例えば沈澱により単離され得る。リポプロテインを沈澱させるために適する試薬は公知であり、そして例
えば、塩化ナトリウム、塩化マンガン及びヘパリンを含む試薬並びにホスホタングステート試薬を含む。種々の試薬及び方法が、デマッカー  ピー．エヌ．エム．（Ｄｅｍａｃｋｅｒ  Ｐ．Ｎ．Ｍ．）他、臨床化学（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第４３巻、Ｎｏ．４、１９９７年、第６６３〜６６８頁、及びシャーマ  エイ．（Ｓｈａｒｍａ
Ａ．）、臨床化学、第３６巻、Ｎｏ．３、１９９０年、第５２９〜５３２頁に記載されている。
【０１３５】
試料、例えば血漿は、例えば、中速又は高速で、例えば、１２０００ｇないし１６０００ｇで、細胞成分を除去するために遠心分離され得る。リポプロテインは、公知リポプロテイン沈澱剤、例えば、塩化ナトリウム、塩化マンガン及びヘパリン、例えば、約５００ｍＮ塩化ナトリウム、約２１５ｍＭ二塩化マンガン及び約５００Ｕ／ｍＬヘパリンを含む試薬を使用して、或いは、ホスホタングステート沈澱剤、例えば、約５０ｍＭホスホタングステート及び一般的に塩化マンガンを含む試薬を使用して沈澱され得る。
【０１３６】
得られた沈澱剤は、例えば、遠心分離により単離され得る。所望により、沈澱物は沈澱剤中に再懸濁され、そして再度、単離される。この手順は、所望により、例えば２回又は３回、繰り返される。
【０１３７】
分析が行われる前に、脂質が結合したファクターＸＩＩａがファクターＸＩＩａの他の結合フォームから分離されている場合には、ファクターＸＩＩａの異なるフォームを相互に識別しない分析、即ち、“一般的な”ファクターＸＩＩａ分析が使用され得る。しかしながら、先の分離手順の後でさえも、脂質が結合したファクターＸＩＩａを、他のフォームに対して優先的に検出又は決定することが可能な分析を使用することは利点があり得る。
【０１３８】
分離手順が行われない場合には、使用される分析は、脂質が結合したファクターＸＩＩａを検出又は決定することが可能であるべきである。
【０１３９】
イムノアッセイの場合には、試料が抗体と接触する前後に、リポプロテインフラクションが単離され得る。抗体との接触後に、リポプロテインフラクションを単離するのが利点があり得る。
【０１４０】
ファクターＸＩＩａと他の分子種との分子コンプレックス及び結合体
ファクターＸＩＩａと他の分子種との分子コンプレックス及び結合体を含む試料、一般的には体液の試料は、慣用の方法に基づく分析のために調製され得る（上記を参照）。
【０１４１】
所望により、ファクターＸＩＩａの二つ又はそれより多くの分子、或いは、低又は高親和性の結合性パートナーと結合したファクターＸＩＩａのフォームを含む分子コンプレックスは、ファクターＸＩＩａに対する分析を行う前に、上記“ファクターＸＩＩａのフォームの分離”に記載した通りに単離され得る。例えば、低親和性の結合性パートナーと結合したファクターαＸＩＩａ、低親和性の結合性パートナーと結合したファクターβＸＩＩａ、低親和性の結合性パートナーと結合した５３ＫｄファクターＸＩＩａ、高親和性の結合性パートナーと結合したファクターαＸＩＩａ、高親和性の結合性パートナーと結合したファクターβＸＩＩａ及び高親和性の結合性パートナーと結合した５３ＫｄファクターＸＩＩａが分離され得る。
【０１４２】
分析が行われる前に、ファクターＸＩＩａの二つ又はそれより多くの分子或いは、低又は高親和性の結合性パートナーと結合したファクターＸＩＩａのフォームを含む分子コンプレックスがファクターＸＩＩａの他のフォームから分離されている場合には、ファクターＸＩＩａのこのようなフォームとファクターＸＩＩａの他のフォームとを相互に識別し
ない分析、即ち、“一般的な”ファクターＸＩＩａ分析が使用され得る。しかしながら、先の分離手順の後でさえも、ファクターＸＩＩａのこのようなフォームを、他のフォームに対して優先的に検出又は決定することが可能な分析を使用することは利点があり得る。
【０１４３】
調査中のファクターＸＩＩａのフォームを他のフォームに対して優先的に検出又は決定することが可能な分析は、該調査中のファクターＸＩＩａのフォームを予め分離することなく使用され得る。
【０１４４】
適する分析、特にイムノアッセイを以下に記載する。
【０１４５】
イムノアッセイ
イムノアッセイは、５３ＫｄファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くのフォームを他のフォーム（前記ファクターＸＩＩａの他のフォームは、好ましくはファクターＸＩＩａの非５３Ｋｄフォームである。）に対して優先的に検出又は決定するために、本発明に基づいて使用され得る。イムノアッセイは、本発明に従うどのような試料に対しても、使用され得る。
【０１４６】
一般的なイムノアッセイ技術
イムノアッセイを行う方法は周知である［臨床化学のティーズテキストブック第２版、著者：バーティス  シー．エイ．及びアシュウッド  イー．アール．、サウンダーズ（１９９４年）；酵素学における方法、エイチ．ヴァン  ヴナキス及びジェイ．ジェイ．ランゴン（著者）、１９８１年、７２（Ｂ）；酵素イムノアッセイの実施及び理論、ピー．チゼン、生化学及び分子生物学における実験室技術、アール．ジェイ．バーデン及びピー．エイチ．ヴァン  クニッペンゲルグ（著者）、エルズヴィアー、１９８５年；ラジオイムノアッセイ及び関連技術の紹介、ティー．チャード、同前、第３版、１９８７年；並びに酵素学における方法、エイチ．ヴァン  ヴナキス及びジェイ．ジェイ．ランゴン（著者）、１９８１年、７４（Ｃ）を参照］。
【０１４７】
定性的及び定量的の双方のイムノアッセイ技術は、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定吸着法）、ウエスタンブロット法、液相沈澱分析、被覆粒子分析、競合分析、サンドイッチ分析（前方、後方及び同時サンドイッチ分析を含む。）及び固体相ラジオイムノアッセイ（ＳＰＲＩＡ）を含む。
【０１４８】
抗原−抗体コンプレックスは、例えば、以下に記載された技術により、又は標識化された抗体を用いて、直接検出され得る。
【０１４９】
二重抗体サンドイッチ分析
本発明に基づいて使用され得るＥＬＩＳＡ形式の例は、いわゆる“二重抗体サンドイッチ”分析であり、ここで、抗体は、とりわけモノクローナル抗体であり、これは、５３ＫｄファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くのフォームに結合可能であり、固体相支持体、例えばプラスチック又は他のポリマー状物質上、例えばプラスチックマイクロ滴定プレートのウェル上に、或いはビーズ又は粒子上に、例えば専売特許のシステム、例えば米国、イリノイ、アボットパークのアボット  ラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のＩＭx システムにおいて使用されているものに固定される。この抗体は、“捕捉抗体”と呼ばれる。試料は、固定された捕捉抗体と接触してインキュベートされる。固定された抗体に結合可能な５３ＫｄファクターＸＩＩａのどのようなフォームも、固定された抗体により“捕捉”され、それ故、それ自体、固体相上に固定される。固体相上に捕捉された５３ＫｄファクターＸＩＩａは、５３ＫｄファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くのフォームに結合可能な標識化された抗体を使用して検出される。この標識化された抗体は、しばしば、“結合体”と呼ばれる。抗体及び／又は他の分析条件の注
意深い選択により、分析が５３ＫｄファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くの特定フォームをファクターＸＩＩａの他のフォーム（前記ファクターＸＩＩａの他のフォームは、好ましくは、ファクターＸＩＩａの非５３Ｋｄフォームである。）に対して優先的に測定、検出及び／又は決定するように分析を最適化することが可能である。
【０１５０】
標識化された抗体
標的抗原の検出或いは検出及び／又は決定のために使用される標識化された抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであってよい。抗ヒト抗体、例えば抗ヒトポリクローナル抗体はしばしば、臨床用途のための標識化された抗体としての使用のために都合が良い。或いはまた、調査中のファクターＸＩＩａのフォームに結合する抗体が使用され得る。このような抗体は、例えば、５３ＫｄファクターＸＩＩａの重鎖に結合し得る。
【０１５１】
前記標識は、直接又は間接的に検出可能であり得る。適切なラジオアイソトープ、例えばβ−放出体又はγ−放出体、例えば 125Ｉ、 131Ｉ、 3Ｈ及び14Ｃは、直接検出可能な標識として使用され得る。商業的用途のためには、非放射性の標識、一般的には酵素標識が好ましい。酵素標識は間接的に検出可能である。酵素標識は、例えば、アルカリ性ホスファターゼ又はペルオキシダーゼ、例えばワサビペルオキシダーゼである。選択された酵素のための適切な基質は、例えば、検出可能な光学又は蛍光変化を引き起こす基質、例えば、フェノールフタレインモノホスフェート又は蛍光基質、例えば、４−メチルムベリフェリルが使用される。或いはまた、電気化学的方法をその後使用することができる酵素反応が使用され得る。
【０１５２】
標識化された抗体は、例えばＥＬＩＳＡにおいて抗原−抗体コンプレックスを検出するために使用され得るか、又は、抗原とコンプレックスを形成し得、このコンプレックスはその後検出され得る。フローサイトメトリーは、検出のために使用され得る。
【０１５３】
競合分析
標識化、例えば、放射性標識化又は酵素標識化されたファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くの５３Ｋｄフォームが、５３ＫｄファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くのフォームを測定するための競合分析において使用され得る。
【０１５４】
別のイムノアッセイ技術
抗原を検出又は決定するための別のイムノアッセイ技術は、得られる抗体−抗原コンプレックスの直接検出を用いる。このような技術の例は、表面プラズモン共鳴、表面音響波及び水晶マイクロバランス法である［スズキ  エム．（Ｓｕｚｕｋｉ  Ｍ，）、オザワ  エフ．（Ｏｚａｗａ  Ｆ．）、スギモト  ダブリュ．（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  Ｗ．）、アソー  エス．（Ａｓｏ  Ｓ．）、Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ、３７２、３０１〜４、２００２；ピアソン  ジェイイー（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＪＥ）、カン  ジェイダブリュ（Ｋａｎｅ  ＪＷ）、ペトラキ−カリオチ  アイ（Ｐｅｔｒａｋｉ−Ｋａｌｌｉｏｔｉ  Ｉ、ギル  エイ（Ｇｉｌｌ  Ａ）、ヴァガマ  ピー．（Ｖａｄｇａｍａ  Ｐ，）、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ；２２１、８７〜９４、１９９８  ；ワイシュ  ダブリュ（Ｗｅｉｓｃｈ  Ｗ）、クライン  シー（Ｋｌｅｉｎ  Ｃ）、ヴォン  シックフス  エム（ｖｏｎ  Ｓｃｈｉｃｋｆｕｓ  Ｍ）、フンクリンガー  エス（Ｈｕｎｋｌｉｎｇｅｒ  Ｓ）、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ、１９９６  ６８、２０００〜４、１９９６；チョウ  エスエフ（Ｃｈｏｕ  ＳＦ）、スー  ダブリュエル（Ｈｓｕ  ＷＬ）、ワン  ジェイエム（Ｈｗａｎｇ  ＪＭ）、チェン  シーワイ（Ｃｈｅｎ  ＣＹ）、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、４８、９１３〜８、２００２］。
【０１５５】
標識化された抗体が抗原とコンプレックスを形成する場合には、前記コンプレックスはフローサイトメトリーにより検出又は決定され得る。
【０１５６】
標準及び対照
イムノアッセイは一般的に、基準点として“標準”を使用する。
【０１５７】
５３ＫｄファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くのフォームを検出或いは検出及び／又は決定するための分析のために適する標準は、典型的には、５３ＫｄファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くの適切なフォームの既知量を含む溶液を含み得る。或いはまた、標準は、固体相のような支持物質に結合した５３ＫｄファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くの適切なフォームを含み得る。或いはまた、５３ｋｄファクターＸＩＩａとの交差反応性を示すファクターＸＩＩａの非５３ｄｋフォームが標準として使用され得る。ファクターαＸＩＩａのための多くの公知分析は、標準としてファクターβＸＩＩａを使用し、それ故、５３ｋｄファクターＸＩＩａ分析のための標準としてファクターβＸＩＩａを使用することは、標準としてのファクターβＸＩＩａの使用が熟知されていることに起因する利点をもたらす。
【０１５８】
標準及び対照として使用する物質は、使用する分析に応じて種々の形態を取り得る。幾つかの分析形式においては、適する物質は水溶液であってよい。
【０１５９】
脂質が結合した５３ＫｄファクターＸＩＩａの検出或いは検出及び／又は決定のための分析のために適する標準は、典型的には、脂質が結合した５３ＫｄファクターＸＩＩａの既知量を含む溶液を含む。或いはまた、標準は、非脂質支持物質、例えば固体相に結合した５３ＫｄファクターＸＩＩａを含み得るか、又は、５３ＫｄファクターＸＩＩａの水溶液が標準として使用され得る。
【０１６０】
尿５３ＫｄファクターＸＩＩａの検出或いは検出及び／又は決定のための分析のために適する標準は、典型的には、５３ＫｄファクターＸＩＩａの既知量を含む溶液を含む。
【０１６１】
免疫組織学
組織試料中における５３ＫｄファクターＸＩＩａのフォーム（群）の存在は、免疫組織学的技術を使用して検出され得る。例えば、適切な標識、例えば蛍光標識を用いて標識化された上記のようなモノクローナル抗体が使用され得る。典型的には、標識化された抗体は組織試料と接触されそしてインキュベートされ、試薬は続いて、形成したどのような抗体−抗原コンプレックスをも分解しない条件下で洗浄され、そしてそのようなコンプレックスの何れも検出される。
【０１６２】
発色分析
ファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くの５３Ｋｄフォームの検出又は決定は、発色性基質、例えば、ヴィナッザー  エイチ．（Ｖｉｎａｚｚａｅｒ）、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ．、１４、１５５〜６６、１９７９に記載されたものを使用してその酵素活性を測定することにより行われ得る。
【０１６３】
この分析は、５３ＫｄファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くのフォームが他のフォームから単離される手順を含み得る（上を参照）。
【０１６４】
細胞５３ＫｄファクターＸＩＩａのためのイムノアッセイ
細胞は体液から、例えば、血液又は血漿から、例えば、遠心分離及び好ましくは少なくとも一回、そしてとりわけ二回又はそれより多くの洗浄により、例えば、細胞５３ＫｄファクターＸＩＩａに影響を及ぼさない、例えば、５３ＫｄファクターＸＩＩａを細胞から分離しない適する媒体中で単離され得る。適する液体は、一般的に緩衝液、例えば、ｐＨ７．４の、燐酸塩で緩衝化された生理食塩水（ＰＢＳ）である。
【０１６５】
細胞を含む体液の試料は、洗浄され、高速で遠心分離され得、次いで、適する液体に懸濁されて“洗浄された細胞”を与える。高速遠心分離の例は、１６０００ｇで１０分間である。適する洗浄及び懸濁液の例は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）である。一回又はそれより多く、例えば、二回又は三回、或いはそれより多くの遠心分離が行われ得る。
【０１６６】
細胞富化血漿は、例えば、血液の低速遠心分離により、例えば、クエン酸血液を１０００ｇで１０分間遠心分離することにより得られ得る。別の遠心分離、例えば、細胞富化血漿の高速遠心分離、例えば、１６０００ｇで１０分間の遠心分離は、細胞除去血漿と呼ばれる浮遊物を与える。
【０１６７】
脂質が結合した５３ＫｄファクターＸＩＩａのためのイムノアッセイ
イムノアッセイは、ｍＡｂ２／２１５又はその類似体又はフラグメント、例えばＦａｂフラグメントを使用して行われ得る。捕捉分析の場合には、捕捉抗体としてｍＡｂ２／２１５又はその類似体を使用するのが好ましい。或いはまた、本発明の５３ＫｄファクターＸＩＩａ−特異性抗体が使用され得る。異なる抗体、例えば異なるポリクローナル抗体又は異なるモノクローナル抗体、或いは同一の抗体が検出のために使用され得る。
【０１６８】
直接的イムノアッセイ、例えばラジオイムノアッセイが使用され得る。このような場合には、本発明のモノクローナル抗体又はその類似体或いはそのフラグメント、例えばＦａｂフラグメントを使用するのが好ましい。適する標識の例は、上に与えられている。
【０１６９】
リポプロテインフラクションは、試料が抗体と接触される前後に単離され得る。抗体との接触後にリポプロテインフラクションを単離することは利点があり得る。リポプロテインフラクションは、“試料の沈澱”の章において上記した如く単離され得る。
【０１７０】
イムノアッセイの代替として、脂質が結合した５３ＫｄファクターＸＩＩａの検出及び／又は決定は、発色性基質、例えば、ヴィナッザー  エイチ．、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ．、１４、１５５〜６６、１９７９に記載されたものを使用して酵素活性を測定することにより行われ得る。これは、一つ又はそれより多くの種が他の種から単離される手順を含み得る（上を参照）。
【０１７１】
５３ＫｄファクターＸＩＩａと他の分子種との分子コンプレックス及び結合体のためのイムノアッセイ
イムノアッセイは、５３ＫｄファクターＸＩＩａと、ファクターＸＩＩａの他のフォームからの他の分子種との分子コンプレックス及び結合体の分離の後に、或いはこのような分離を行わない試料に対して行われ得る。例えば、所望により、５３ＫｄファクターＸＩＩａの二つ又はそれより多くの分子或いは低又は高親和性の結合性パートナーと結合したファクターＸＩＩａのフォームを含む分子コンプレックスは、５３ＫｄファクターＸＩＩａに対する分析を行う前に、“ファクターＸＩＩａのフォームの分離”で上記したように分離され得る。例えば、低親和性の結合性パートナーと結合したファクターαＸＩＩａ、低親和性の結合性パートナーと結合したファクターβＸＩＩａ、低親和性の結合性パートナーと結合した５３ＫｄファクターＸＩＩａ、高親和性の結合性パートナーと結合したファクターαＸＩＩａ、高親和性の結合性パートナーと結合したファクターβＸＩＩａ及び高親和性の結合性パートナーと結合した５３ＫｄファクターＸＩＩａが分離され得る。
【０１７２】
ファクターＸＩＩａと他の分子種との分子コンプレックス及び結合体を決定するために、上記のどのようなイムノアッセイも使用され得る。上記の如く、抗体としてｍＡｂ２／２１５又はその類似体を、或いは、特に捕捉イムノアッセイにおける捕捉抗体として、本発明の５３ＫｄファクターＸＩＩａ−特異性抗体を使用するのが好ましいことであり得る
。検出のために使用される標識化された抗体は、ファクターＸＩＩａの捕捉されたフォームに結合可能であるべきである。例えば、標識化された抗体は、ファクターαＸＩＩａの重鎖に、ファクターβＸＩＩａに、又は５３ＫｄファクターＸＩＩａに結合し得る。
【０１７３】
尿５３ＫｄファクターＸＩＩａに対するイムノアッセイ及び他の分析
上記のどのようなイムノアッセイも、尿中の５３ＫｄファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くのフォームを他の分子量フォームに対して優先的に決定するために使用され得る。上記の如く、ｍＡｂ２／２１５を、抗体又は本発明の５３ＫｄファクターＸＩＩａ−特異性抗体又はその類似物として、特に捕捉イムノアッセイにおける捕捉抗体として、使用するのが好ましいことであり得る。
【０１７４】
キット
本発明は更に、
（ｉ）５３ＫｄファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くのフォームに結合可能なモノクローナル抗体、及び
（ｉｉ）５３ＫｄファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くのフォームが（ｉ）において定義されたモノクローナル抗体に結合している場合に、５３ＫｄファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くのフォームに結合可能な標識化された抗体
を、各々別の容器に、或いは区画された形で含む、本発明のイムノアッセイを行うためのキットであって、
前記双方の抗体は、それらが、１０％又はそれ未満、より好ましくは５％又はそれ未満、更により好ましくは２％又はそれ未満、更により好ましくは１％又はそれ未満、更により好ましくは０．５％又はそれ未満、更により好ましくは０．１％又はそれ未満の、ファクターαＸＩＩａ及びファクターβＸＩＩａの一方又は双方との補正された交差反応性を有することを特徴とするキットを提供する。
【０１７５】
前記キットは、例えば、上記のような、イムノアッセイを行うための別の成分を含み得る。モノクローナル抗体は、固体支持体上に固定され得る。
【０１７６】
本発明のキットは、例えば、
（ａ）５３ＫｄファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くのフォームに結合可能なモノクローナル抗体、
（ｂ）ファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くのフォームの既知量を含む溶液から典型的になる標準、
（ｃ）５３ＫｄファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くのフォームが（ｉ）において定義されたモノクローナル抗体に結合している場合に、５３ＫｄファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くのフォームと反応可能な標識化された抗体
を含み得る。
【０１７７】
標準及び対照として機能する使用する物質は、使用する分析に応じて種々の形態を取り得る。幾つかの分析形式においては、適する物質は水溶液であってよい。他の分析形式、例えば、ＥＬＩＳＡにおいて同一の抗体が捕捉及び検出（結合体）抗体として使用される場合においては、例えば、５３ＫｄファクターＸＩＩａをビーズ、例えばポリカーボネートビーズ（例えば直径３μＭ）の表面に結合させることにより、ファクターＸＩＩａの種々のフォームを含む複合ファクターＸＩＩ分子又はそのフラグメントを含む構成物を作り出すことが望ましいことであり得る。
【０１７８】
標準の別の例は上に与えられている。
或いはまた、キットは、競合分析における使用のために、ファクターＸＩＩａの標識化されたフォーム、とりわけ、５３ＫｄファクターＸＩＩａの標識化されたフォームを含み
得る。
【０１７９】
キットは、別々の容器内にそれぞれ、別の成分、例えば希釈剤、界面活性剤溶液及び基質溶液をも含み得る。
【０１８０】
分析機器
本発明はまた、本発明の分析を行うために適する分析機器を提供する。用語“分析機器”は、イムノアッセイを行うための手段を表わすために本明細書中で使用され、固体相、一般的に層状固体相、例えば、メンブレイン、シート、ストリップ、コーティング、フィルム又は他の層状手段を含み、その上に、適切な捕捉抗体が固定される。固定された抗体は好ましくは、本明細書中で“抗原捕捉領域”と呼ばれる、定義された領域中に存在する。  
【０１８１】
分析機器は、硬い支持体又はハウジング内に固体相を含み得、また、分析を行うために必要とされる幾つかの又は全ての試薬を含み得る。試料は一般的に、予め決定された試料適用領域において、例えば、前記領域に試料を注入又は滴下することにより、或いは、前記機器の関連部分を前記試料中に浸漬することにより、分析機器に適用される。試料適用領域が抗体捕捉領域とは異なる部位である場合には、機器の配置は一般的に、試料中の抗原が抗体捕捉領域に移行するようなものである。必要とされる試薬が次いで、指定された適用領域（これは、試料適用領域と同一又は同一でなくてもよい。）において、適切な順序で適用される。再び、前記の又は何れであれ試薬適用領域が抗体捕捉領域とは異なる部位である場合には、機器の配置は一般的に、試薬が抗体捕捉領域（ここで、形成されたどのような抗原−抗体コンプレックスも検出される。）に移行するようなものである。イムノアッセイのために必要とされる全ての又は幾つかの試薬は、液体で又は乾燥形態で、機器内に含まれ得る。そうである場合には、機器は一般的に、機器の異なる部分の間の相互作用（この相互作用は、機器の操作中に自動的に起こり得るか、又は、機器の使用者によりもたらされ得る。）が、種々の試薬に、行われるイムノアッセイのための正しい順序での互いの接触をもたらすように配列される。
【０１８２】
広範な分析機器がイムノアッセイの文献に記載されている。メンブレイン機器の例は、米国特許第４６２３４６１号明細書及び同第４６９３９８４号明細書に記載されている。それらの設計及びそれらの作動速度に応じて、幾つかの分析機器は“ディップスティック”と呼ばれ、そして幾つかの分析機器は“迅速分析”機器と呼ばれる。“迅速分析”機器は一般的に、試料適用の１０分以内の結果を提供する。［典型的なマイクロ滴定プレート又はビーズ分析はインキュベーション手順を必要とし、そして一般的に、結果を提供するために少なくとも１時間を要する。］従って、分析機器は一般的にマイクロ滴定又はビーズ形式分析よりもより高価であるけれども、それらは、臨床検査において、例えば、結果が迅速に要求される場合に、例えば、救急治療の場合に、特別な用途を有する。
【０１８３】
分析機器は、それらが高度な実験設備を必要とすることなく又はどのような実験設備に対する要求をも必要とすることなく使用され得るという、特別な利点を有する。それらは、それ故、例えば、救急室における、医者の手術室における、薬局における、家庭試験のための特定の場合における“ポイント  オブ  ケア（Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ）”試験のために使用され得る。それらは、実験設備が僅かであり且つ互いに離れている場合に特に有用である。
【０１８４】
抗体交差反応性
本発明の抗体は、１０％又はそれ未満、より好ましくは５％又はそれ未満、更により好ましくは２％又はそれ未満、更により好ましくは１％又はそれ未満、更により好ましくは０．５％又はそれ未満、更により好ましくは０．１％又はそれ未満の、ファクターαＸＩＩａ及びファクターβＸＩＩａの一方又は双方との補正された交差反応性を有する。好ま
しくは、前記抗体は、例えば０．５％又はそれ未満、より好ましくは０．１％又はそれ未満の、ファクターＸＩＩとの低い交差反応性を有する。本発明の抗体と、ファクターαＸＩＩａ、ファクターβＸＩＩａ及びファクターＸＩＩとの交差反応性を評価する際に考慮すべきファクターは、このようなプロテインの“純粋”製剤でさえも、少量の５３ＫｄファクターＸＩＩで殆ど不可避的に汚染されているということである。シルバーベルグ（Ｓｉｌｖｅｒｂｅｒｇ）及びカプラン（Ｋａｐｌａｎ）、血液（Ｂｌｏｏｄ）、６０、１９８２、６４〜７０に説明されているように、ファクターＸＩＩ製剤はファクターＸＩＩａで不可避的に汚染されている。国際特許出願公開第９０／０８８３５号パンフレットは、ファクターＸＩＩとの交差反応性を評価する方法の詳細を与え、このような方法は、ファクターαＸＩＩａ及びファクターβＸＩＩａとの交差反応性を評価するために適用可能である。特記しない限り、用語“交差反応性”は、補正された交差反応性を意味するために本明細書中で使用される。
【０１８５】
モノクローナル抗体を産生するために使用される方法は周知である［例えば、酵素学における方法、エイチ．ヴァン  ヴナキス及びジェイ．ジェイ．ランゴン（著者）、１９８１、７２（Ｂ）及び同１９８３、９２（Ｅ）を参照］。モノクローナル抗体は、例えば、コーラー及びミルシュタインの方法の変法により産生され得る［ジー．コーラー及びシー．ミルシュタイン、ネイチャー、１９７５、２５６、４９５］。
【０１８６】
国際特許出願公開第９０／０８８３５号パンフレット（これは、参考文献として本明細書中に取り込まれている。）は、ファクターαＸＩＩａ及びファクターβＸＩＩａに結合し、そして０．１％又はそれ未満の、ファクターＸＩＩとの補正された交差反応性を示す抗体をどのようにして産生するかを一般的な表現で記載しており、そしてｍＡｂ２／２１５及びｍＡｂ２０１／９の産生の具体的な詳細を与える。その中に記載された一般的及び特定の方法は、本発明の使用のために適するモノクローナル抗体、例えば、５３ＫｄファクターＸＩＩａと結合するが、しかし、ファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くの非５３Ｋｄフォームと結合しないモノクローナル抗体を産生するために使用され得る。
国際特許出願公開第９０／０８８３５号パンフレットの開示に基づく、本発明の使用のために適するモノクローナル抗体を産生するための一般的な手順は、国際特許出願公開第０４／０５７３４３号パンフレット（これは、参考文献として本明細書中に取り込まれている。）の実施例２２に与えられている。
【０１８７】
モノクローナル抗体を産生するために使用される方法は周知である［例えば、酵素学における方法、エイチ．ヴァン  ヴナキス及びジェイ．ジェイ．ランゴン（著者）、１９８１、７２（Ｂ）及び同１９８３、９２（Ｅ）を参照］。モノクローナル抗体は、例えば、コーラー及びミルシュタインの方法の変法により産生され得る［ジー．コーラー及びシー．ミルシュタイン、ネイチャー、１９７５、２５６、４９５］。モノクローナル抗体の産生の際に使用される抗原は、ファクターαＸＩＩａ又は５３ＫｄファクターＸＩＩａであってよい。得られたモノクローナル抗体は、ファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くの非５３Ｋｄフォームとの有意な結合性を示さないもの、例えば、０．１％又はそれ未満の、ファクターαＸＩＩａ又はβＸＩＩａとの補正された交差反応性を有するものについて選別され得る。
【０１８８】
得られたモノクローナル抗体は、結合体が望ましい５３ＫｄファクターＸＩＩａのフォーム、例えば、細胞５３ＫｄファクターＸＩＩａ、脂質が結合した５３ＫｄファクターＸＩＩａ、或いは、５３ＫｄファクターＸＩＩａと他のファクターＸＩＩａ分子との、或いは、高又は低結合性の親和性パートナーとのコンプレックスに対する結合性について選別され得る。
【０１８９】
５３ＫｄファクターＸＩＩａの特定の結合性フォームに結合する抗体を選別する際の対
照抗体として、モノクローナル抗体２／２１５又は２０１／９をそれぞれ使用することは利点があり得る。選択された抗体は、ｍＡｂ２／２１５又は２０１／９の抗体とそれぞれ同一又は類似又は異なっている５３ＫｄファクターＸＩＩａの選択されたフォームに対する結合特性を有し得る。
【０１９０】
本発明はネズミ又は一部ネズミ起源のハイブリドーマに限定されない。双方の融合パートナー（脾臓細胞及び骨髄腫）は、どのような適する動物からも得られ得る。組み換え抗体が産生され得る。抗体は、所望により、キメラ又はヒト化フォームにされ得る。ハイブリドーマは好ましくは、生体内で培養される。
【０１９１】
ポリクローナル抗体
本発明はまた、５３ＫｄファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くのフォームに選択的に反応可能である、ポリクローナル抗血漿とも呼ばれるポリクローナル抗体を提供する。このような抗体は標識化され、そしてＥＬＩＳＡにおいて、５３ＫｄファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くの捕捉されたフォームの検出のために使用され得る。
【０１９２】
本発明はまた、このようなポリクローナル抗血漿の産生のための方法であって、ファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォーム中に存在する抗原を動物に投与し、該動物から血清を得、５３ＫｄファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くのフォームに結合するための血清を選別することからなる方法を提供する。幾つかの場合において、ファクターＸＩＩａ又はファクターＸＩＩａの非５３Ｋｄフォームを抗原として使用することができる。
【０１９３】
尿検査
本発明はまた、検体から得られた尿を含む試料中の５３ＫｄファクターＸＩＩａを検出又は決定するからなる方法を含む。本発明の前記実施態様において、５３ＫｄファクターＸＩＩａの何れか一つ又はそれより多くの結合性フォームをファクターＸＩＩａの他の結合性フォームに対して優先的に検出又は決定することは不必要であり得る。結合性フォームを相互に識別しない分析が使用され得る。このような分析は、例えば、クロモメリック（ｃｈｒｏｍｏｍｅｒｉｃ）アッセイ又はイムノアッセイであり得る。
【０１９４】
ファクターＸＩＩａの異なる分子量フォームを相互に識別することができる分析手段による尿中の５３ＫｄファクターＸＩＩａの分析は、特に、激しいタンパク尿が存在しない条件において、尿中のファクターＸＩＩａ濃度が腎機能、腎臓病及び腎障害の敏感なマーカーであるので、腎機能、腎臓病及び腎障害に対する有用な情報を提供する。例えば健常検体に対する、検体の尿中のファクターＸＩＩａの高められた濃度は、腎機能不全、腎臓病及び腎障害の何れか一つを示す。尿ファクターＸＩＩａの濃度変化は、例えば、治療に対する応答における臨床病態の変化、例えば、症状の再燃又は改善を示し得る。
【０１９５】
臨床的及び他の用途
本発明、とりわけ上記イムノアッセイは、大規模用途のための自動化装置において容易に使用することができる５３ＫｄファクターＸＩＩａの異なるフォームの検出及び／又は決定方法を提供する。
【０１９６】
ファクターＸＩＩａ及びその主な活性化フォーム５３ＫｄファクターＸＩＩａは、血液凝集系及び、また接触相系、例えば、線維素溶解、補体カスケード、炎症及び血管拡張としても知られた他の接触系に関与すると考えられている［ジャコブセン  エス．（Ｌａｃｏｂｓｅｎ  Ｓ．）及びクリズ  エム．（Ｋｒｉｚ  Ｍ．）、Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２９、２５〜３６、１９６７；クラチ  ケイ（Ｋｕｒａｃｈｉ  Ｋ）他、生物化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９、１３３０〜８、１９８０；ラドクリフ  アール（Ｒａｄｃｌｉｆｆｅ  Ｒ）他、血液、５０、６１１〜７、１９７７；ゲブレヒウェト  
ビー（Ｇｈｅｂｒｅｈｉｗｅｔ  Ｂ）他、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、７１、１４５０〜６、１９８３；ゼット  トゥーシ（Ｚ  Ｔｏｏｓｓｉ）他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８９、１１９６９〜７２、１９９２；ワヒトフォーゲル  ワイティー（Ｗａｃｈｔｆｏｇｅｌ  ＹＴ）他、血液、６７、１７３１〜７、１９８６；ワヒトフォーゲル  ワイティー他、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ、８０、６８６〜９１、１９８８；並びにシュライバー（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ）他ＡＤ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、５２、１４０２〜９、１９７３を参照］。
【０１９７】
ファクターＸＩＩ及びその主な活性化フォーム５３ＫｄファクターＸＩＩａは凝血に関与し、そして血管完全性及び血圧を維持する役割を有し、内皮細胞の種々の機能に影響を及ぼすことに、線維素溶解の制御に及び血管内腔の構造的抗凝固特性の維持に関与しているので、５３ＫｄファクターＸＩＩａの特異性フォームの測定は、例えば、線維素溶解、補体カスケード及び血管拡張を含む前記系の検査の際に、また血栓症及び狭窄に対する検査の際に有用である。
【０１９８】
臨床的及び実験的研究は、５３ＫｄファクターＸＩＩａを含む接触系は急性及び慢性炎症、敗血症性ショックを含む異なる原因によるショック、糖尿病、アレルギー、播種性血管内血液凝固を含む血栓−出血性障害、腫瘍疾患、心臓血管調整、例えば、心筋梗塞症、狭心症及び急性冠症候群、血管形成、敗血症、自然流産及び血栓塞栓症に関与することを示す。
【０１９９】
血液凝固への、血管完全性及び血圧の維持への、線維素溶解の制御への、そして血管内腔の構造的抗凝固特性の維持への、５３ＫｄファクターＸＩＩａの関与は、播種性血管内血液凝固を含む血栓−出血性障害、腫瘍疾患、心臓血管調整、例えば、心筋梗塞症、狭心症及び急性冠症候群、血管形成及び血栓塞栓症において５３ＫｄファクターＸＩＩａが関与するという臨床的及び実験的観察を支持する。
【０２００】
ファクターＸＩＩａ（その主な５３ＫｄフォームにあるファクターＸＩＩａを含む。）は、炎症過程において活性化され／関与する顆粒球上に存在する。この観察は、炎症、例えば、急性及び慢性炎症、敗血症性ショックを含む異なる原因によるショック、アレルギー、腫瘍疾患及び敗血症を含む種々の症状におけるファクターＸＩＩａに関連する臨床的及び実験的研究を支持する。
【０２０１】
５３ＫｄファクターＸＩＩａの特定のフォームの検出及び／又は決定は、それ故、病気又は疾患を有するか又は有することが疑われる被験者についての、接触系が関与し得る病気及び疾患の臨床的及び科学的検査であって、このような病気又は疾患に対する感受性、該病気又は疾患の進行、或いはこのような病気又は疾患の転帰、或いは病気又は疾患の治療の転帰を含む検査において有用である可能性がある。このような病気及び疾患は、急性及び慢性炎症、異なる原因によるショック、糖尿病、アレルギー、播種性血管内血液凝固及び血栓塞栓症を含む血栓−出血性障害、血栓症及び狭窄、腫瘍疾患、心臓血管症状、例えば、心筋梗塞症、狭心症、急性冠症候群、血管形成、敗血症及び自然流産を含む。
【０２０２】
５３ＫｄファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くのフォームの検出又は決定は、それ故、病気又は疾患を有するか又は疑われる被検者における前記病気又は疾患に対する感受性、前記病気又は疾患の進行、或いは前記病気又は疾患の転帰、或いは、前記病気又は疾患の治療の転帰を診断、モニター又は予測するための補助として有用であり、前記病気又は疾患において、５３ＫｄファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くのフォームの量は、健常者におけるものと異なる。５３ＫｄファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くのフォームの濃度変化は、上記病気又は疾患の何れかであることを示し得る。患者における経時的な濃度変化は、治療に対する応答における症状の変化、例えば、症状の再燃又は
改善を示し得る。“診断、予測及びモニター”と呼ぶ、病気又は疾患に対する感受性、前記病気又は疾患の進行、或いは前記病気又は疾患の転帰、或いは、前記病気又は疾患の治療の転帰の診断、予測及びモニターのこのような方法は、本発明の一部である。
【０２０３】
加えて、尿中のファクターＸＩＩａは腎機能、腎臓病及び腎障害の敏感なマーカーであることが知られており、それ故、尿中の５３ＫｄファクターＸＩＩａの検出又は決定は、腎機能、腎臓病及び腎障害についての有用な情報を提供し得る可能性がある。
【０２０４】
診断、予測及びモニター
本発明は、病気又は疾患を有するか又は疑われる被検者における、前記病気又は疾患に対する感受性、前記病気又は疾患の進行、或いは前記病気又は疾患の転帰、或いは、前記病気又は疾患の治療の転帰を診断、モニター又は予測する方法であって、
前記被検者から得られた試料における５３ＫｄファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くのフォームをファクターＸＩＩａの他のフォーム（前記ファクターＸＩＩａの他のフォームは、好ましくは、ファクターＸＩＩａの非５３Ｋｄフォームである。）に対して優先的に検出又は決定し、そして該被検者から得られた結果を、
（ｉ）前記病気又は疾患を有する被検者、
（ｉｉ）前記病気又は疾患の進行及び／又は転帰についてモニターされていた、前記病気又は疾患を有する被検者、
（ｉｉｉ）前記病気又は疾患を有し、そして治療中の被検者、
（ｉｖ）前記病気又は疾患の進行及び／又は転帰に対する治療についてモニターされていた、前記病気又は疾患を有し、そして治療中の被検者、
（ｖ）前記病気又は疾患を有しない被検者、
（ｖｉ）前記病気又は疾患の発症前、或いは前記病気又は疾患の治療の開始前の同一被検者、並びに
（ｖｉｉ）前記病気又は疾患或いは病気又は疾患の治療の初期又は後期段階にあるか、或いは前記病気又は疾患の発症前の同一被検者
の少なくとも何れか一つ又はそれより多くから得られた試料に対する同様の分析を使用して得られた結果と比較することを含む方法を提供する。
【０２０５】
試料は、上記のどのようなものであってもよい。例えば、試料は、体液、例えば、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液又は涙の試料であってよい。
【０２０６】
前記分析は、ファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くの５３Ｋｄフォーム、例えば、何れか一つ又はそれより多くの選択されたフォーム、例えば、何れか一つ又はそれより多くの細胞５３ＫｄファクターＸＩＩａ、脂質が結合した５３ＫｄファクターＸＩＩａ及び尿ファクター５３ＫｄＸＩＩａを検出及び／又は検出及び／又は決定のためのものであり得る。
【０２０７】
分析の、５３ＫｄファクターＸＩＩの一つ又はそれより多くのフォームへの他の、好ましくはファクターＸＩＩａの非５３Ｋｄフォームに対するよりの特異性は、上記のように、分析の設計により達成又は改良され得る。イムノアッセイの場合には、このような設計は、使用する抗体又は抗体の組み合わせの多くの選択；界面活性剤の存在、不在及び選択；及び、固体相上にコートされた抗体を含む、抗原捕捉分析の場合におけるプレートコーティングのために使用される条件の一つ以上を含み得る。
【０２０８】
５３ＫｄファクターＸＩＩａのための分析は、調査中の５３ＫｄファクターＸＩＩａのフォームに結合可能な抗体の使用を含むイムノアッセイであり得る。このような分析において、調査中の５３ＫｄファクターＸＩＩａのフォームに結合可能な抗体は、捕捉抗体として、固体相上に固定される。
【０２０９】
或いは、又は加えて、調査中の５３ＫｄファクターＸＩＩａのフォームに結合可能な抗体は、直接又は間接的に検出可能な標識を用いて標識化されている。
【０２１０】
イムノアッセイにおいて、調査中の５３ＫｄファクターＸＩＩａのフォームに結合可能な抗体はｍＡｂ２／２１５又はその類似体、ｍＡｂ２０１／９又はその類似体、或いは、５３ＫｄファクターＸＩＩａに結合可能なポリクローナル抗体であり得る。しかしながら、５３ＫｄファクターＸＩＩａとファクターＸＩＩａの非５３Ｋｄフォームとを相互に識別することが不可能なｍＡｂ２／２１５のような抗体が使用される場合には、ファクターＸＩＩａの異なる分子量フォームを分離又は識別する方法と組み合わせて前記分析を使用することが必要になる。
【０２１１】
ｍＡｂ２／２１５又はその類似体、ｍＡｂ２０１／９又はその類似体、或いは、５３ＫｄファクターＸＩＩａに結合可能なポリクローナル抗体が使用されるイムノアッセイにおいて、前記抗体は、直接又は間接的に検出可能な標識を用いて標識化されていてよいか、及び／又は、捕捉抗体として、固体相上に固定されていてよい。
【０２１２】
定義された抗体により捕捉された５３ＫｄファクターＸＩＩａは、例えば、上記において定義された、標識化された抗体を使用して検出又は決定され得る。
【０２１３】
調査中の病気又は疾患は、“臨床的用途”の章における上記のどのようなものであってもよく、例えば、凝集系の病気又は疾患；血液凝固、繊維素溶解、キニン生成、補体活性化又は血管形成、血管完全性及び血圧を維持すること、血管内腔の構造的抗凝固特性を維持すること、或いは、組織防御及び修復、を含む症状の；急性及び慢性炎症、何れかの原因によるショック、糖尿病、アレルギー、血栓−出血性障害、敗血症、自然流産又は腫瘍疾患を含む症状の、並びに、血管内腔血液凝固又は血栓塞栓症、血栓症又は狭窄、心筋梗塞症、急性冠症候群又は狭心症を含む症状であり得る。
【０２１４】
臨床的又は病理学的症状の治療は、治療剤の投与を含み得るか、及び／又は、外科的手順を含み得る。例えば、血栓症又は狭窄の治療は、冠状動脈血管造影及び／又は血栓溶解を含み得る。
【０２１５】
被検者から得られた一連の試料、例えば、病気又は疾患の進行中に得られた試料及び／又は病気又は疾患の治療中及び／又は治療の開始前に得られた試料を検査することは利点があり得る。
【０２１６】
病気又は疾患は血栓症又は狭窄であり得るか又はそれらを含み得、及び／又は、治療は冠状動脈血管造影又は血栓溶解を含み得る。
【０２１７】
上記の如く、尿中のファクターＸＩＩａは腎機能、腎臓病及び腎障害の敏感なマーカーである。
本発明は、５３ＫｄファクターＸＩＩａ、特に病気又は疾患を有する被検者の尿中の５３ＫｄファクターＸＩＩａの濃度が、健常な被検者における場合と異なる、病気又は疾患を診断又はモニターする方法に関するものである。
【０２１８】
本発明は、５３ＫｄファクターＸＩＩａ、特に病気又は疾患を有するか又は該病気又は疾患を有することが疑われる被検者の尿中の５３ＫｄファクターＸＩＩａの濃度を検出又は決定することからなる、該病気又は疾患を診断又はモニターする、或いは、該病気又は疾患の治療をモニターする方法を提供する。                                        
【０２１９】
例えば、本発明は、腎不全、腎臓病又は腎障害を有するか又は有することが疑われる被検者から得られた試料中の５３ＫｄファクターＸＩＩａを検出又は決定することからなる、該被検者における腎機能、腎臓病又は腎障害を診断又はモニターする、或いは、腎機能不全、腎臓病又は腎障害の治療をモニターする方法を提供する。
【０２２０】
一般的に、前記被検者について得られた結果を、
（ｉ）前記病気又は疾患、例えば、腎機能不全、腎臓病又は腎障害を有する被検者、
（ｉｉ）前記病気又は疾患、例えば、腎機能不全、腎臓病又は腎障害の進行及び／又は転帰についてモニターされていた、前記病気又は疾患、例えば、腎機能不全、腎臓病又は腎障害を有する被検者、
（ｉｉｉ）前記病気又は疾患、例えば、腎機能不全、腎臓病又は腎障害を有し、そしてそれに対して治療中の被検者、
（ｉｖ）前記病気又は疾患、例えば、腎機能不全、腎臓病又は腎障害の治療について、進行について及び／又は転帰についてモニターされていた、前記病気又は疾患、例えば、腎機能不全、腎臓病又は腎障害を有し、そして治療中である被検者、
（ｖ）前記病気又は疾患、例えば、腎機能不全、腎臓病又は腎障害を有しない被検者、
（ｖｉ）前記病気又は疾患、例えば、腎機能不全、腎臓病又は腎障害の発症前、或いは前記病気又は疾患、例えば、腎機能不全、腎臓病又は腎障害の治療の開始前の同一被検者、並びに
（ｖｉｉ）前記病気又は疾患、例えば、腎機能不全、腎臓病又は腎障害の或いは前記病気又は疾患の治療の初期又は後期段階にあるか、或いは前記病気又は疾患、例えば、腎機能不全、腎臓病又は腎障害の発症前の同一被検者
の少なくとも何れか一つ又はそれより多くから得られた試料に対する同様の分析を使用して得られた結果と比較する。
【０２２１】
５３ＫｄファクターＸＩＩａは、５３ＫｄファクターＸＩＩａの一つ又はそれより多くのフォームをファクターＸＩＩａの他のフォーム（前記ファクターＸＩＩａの他のフォームは、好ましくは、ファクターＸＩＩａの非５３Ｋｄフォームである。）に対して優先的に検出又は決定することが可能である分析により、検出又は決定され得る。
【０２２２】
下記の非限定的実施例により、本発明を説明する。
【実施例】
【０２２３】
実施例
実施例１
本実施例において、放射性トレーサー（沃素１２５）を用いて標識化された抗体フラグメントに結合させ、そして、得られたコンプレックスを、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して分子量に基づいて分離することにより、血漿中の活性化されたファクターＸＩＩの５３Ｋｄ種の存在が示された。
【０２２４】
抗体２／２１５のＦａｂ抗体フラグメントは、“イムノピュアＦａｂ調製キット（Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ  Ｆａｂ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）”［ピース（Ｐｉｅｒｃｅ）、３７４７エヌ  メリジアン  ロード（Ｍｅｒｉｄｉａｎ  Ｒｏａｄ）、私書箱１１７、ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、イリノイ、米国］を製造者の使用説明書に従って使用して調製された。Ｆａｂフラグメントは次いで、アマシャム  ファルマシア  バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）［ポラーズ  ウッド（Ｐｏｌｌａｒｄｓ  Ｗｏｏｄ）、ナイチンゲールズ  レイン（Ｎｉｇｈｔｉｎｇａｌｅｓ  Ｌａｎｅ）、チャルフォント  セント  ゲイルズ（Ｃｈａｌｆｏｎｔ  Ｓｔ  Ｇｉｌｅｓ）、エイチピー８  ４エスピー、英国］による沃素１２５を用いて放射性標識化された。
【０２２５】
放射性標識化された抗体１μＬを、多数の健常ヒトボランティアの各々からの血漿１ｍＬに添加した。４時間インキュベートした後、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、血漿の成分を分離した。使用したＨＰＬＣシステムは、米国、カリホルニア、サンタ  クララ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ）のアジレント  テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社から得られたアジレント１１００システムであった。
【０２２６】
ＨＰＬＣのために使用した移動相は、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、０．４％（重量／容量）クエン酸３ナトリウム、ｐＨ７，５であった。固定相は、直列の２×３０ｃｍバイオセプ（ＢｉｏＳｅｐ）−ＳＥＣ−Ｓ３０００カラム［フェノメネックス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、クインーズ  アべニュー（Ｑｕｅｅｎｓ  Ａｖｅｎｕｅ）、ハーズフィールド  インダストリアル  エステート（Ｈｕｒｄｓｆｉｅｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｅｓｔａｔｅ）、チェシャー（Ｃｈｅｓｈｉｒｅ）、エスケイ１０
２ビーエヌ、英国］を含んでいた。流速は０．７ｍＬ／分であり、そして、注入容量は１００μＬであった。
【０２２７】
２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、そして、フロー−カウント  ラジオクロマトグラフィー検出器（Ｆｌｏｗ−Ｃｏｕｎｔ  Ｒａｄｉｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）［ラブロジック（ＬａｂＬｏｇｉｃ）、シェフィールド（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ）、英国］を使用して放射能をモニターすることにより、ＨＰＬＣ溶出液をモニターした。
【０２２８】
時間に対する放射能のプロットの例は図７に示されており、ここで、抗体フラグメントと血漿中の種との結合に起因する最大ピークは約８３Ｋｄの分子量を有し、３０Ｋｄ放射標識化Ｆａｂと約５３Ｋｄの血漿種との結合を示すことが判る。
【０２２９】
実施例２
サイパージェン  サーフェス  エンハンスト  レーザー  デソープション  アンド  アイオニゼーション−タイム  オブ  フライト（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ）（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）システム［サイパージェン  バイオシステムズ  インコーポレーテッド（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、フレモント（Ｆｒｅｍｏｎｔ）、カリホルニア、米国］を使用して質量分析を行った。
【０２３０】
アレイの各スポットに対して、抗体溶液（ＰＢＳ中、０．２ｍｇ／ｍＬ）２μＬ及び５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ3 （ｐＨ８．２）３μＬを添加することにより、活性化されたファクターＸＩＩに対して生じたモノクローナル抗体２／２１５及び２０１／９、並びに、対照として機能する非特異性ネズミモノクローナル抗体を、予め活性化したＲＳ−１００ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦチップ（サイパージェン）に結合させ、そして、湿潤チャンバー内で、室温で１時間インキュベートした。インキュベートした後、この抗体溶液を取り出し、そして、ブロッキング溶液（ＰＢＳ中、ウシ血清アルブミン２ｍｇ／ｍＬ）４μＬを各スポットに対して添加し、そして、湿潤チャンバー内で、室温で２０分間インキュベートした。ブロッキング溶液を除去した後、各アレイを、５分間に１５ｍＬＰＢＳで２回洗浄した。
【０２３１】
血漿１００μＬ及びＰＢＳ２００μＬを、９６ウェル  バイオプロセッサー（サイパージェン）を使用してプロテイン  チップ  アレイ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｉｐ  Ａｒｒａｙ）上の各スポットに適用した。この試料を次いで、プラットフォーム振震器上で５０分間、室温でインキュベートした。前記アレイを次いで、０．０５％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳ（スポット当たり２００μＬ）をそれぞれ用いて、５分間の洗浄３回を行った
。各スポットを次いで、スポット当たりＰＢＳ２００μＬを用いて更に２回、５分間洗浄した。各アレイを次いで５秒間、蒸溜水１５ｍＬ中で濯いだ。空気乾燥後、５００ｍＬ／Ｌアセトニトリル中の飽和ＥＡＭＩ（サイパージェン）０．５ｍＬ、トリフルオロ酢酸５ｍＬ／Ｌを、各スポットに２回適用した。ＲＳ１００プロテイン  チップ  アレイに固定された抗体に結合したプロテインを、プロテイン  チップ  リーダー（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｉｐ  Ｒｅａｄｅｒ）を使用して検出した。図８は、活性化されたファクターＸＩＩに対して生じた抗体（２／２１５及び２０１／９、“Ａｂ２１５”及び“Ａｂ２０１９”とそれぞれ、標識化されている。）は約５３Ｋｄの血漿成分と反応するが、しかし、この種は、対照抗体との相互作用が観察されない（図８）ことを示している。
【０２３２】
実施例３
８０ｕｌインターアクション  ディスカバリー  ビーズ（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｂｅａｄｓ）（サイパージェン）を、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）５００μＬを用いて３回洗浄した。このビーズを次いで、４本のエッペンドルフ管に均等に分配し、そして、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）１．５ｍＬ中の抗体４０μｇを各管に添加し、そして振震器上で、４℃で一晩インキュベートした。浮遊物（抗体溶液）を除去した後、このビーズを、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）１０００μＬを用いて一回洗浄した。このビーズを次いで、ブロッキング溶液（ＰＢＳ中、ＢＳＡ２ｍｇ／ｍＬ）１０００μＬを用いて、ボルテックスミキサーで、室温で２０分間インキュベートし、そして、ＰＢＳ（０．０２％トリトンＸ−１００を含む。）１０００μＬを用いて２回、そして１ＸＰＢＳ５００μＬを用いて１回洗浄した。
【０２３３】
血漿３００μＬに加えてＰＢＳ（０．０２％トリトンＸ−１００を含む。）６００μＬを前記ビーズに添加し、そして、ボルテックスミキサーで、室温で１時間インキュベートした。このビーズを次いで、ＰＢＳ（０．０２％トリトンＸ−１００を含む。）１０００μＬを用いて１５分間で２回、そしてＰＢＳ１０００μＬを用いて１５分間で２回、そして水１０００μＬを用いて１５秒間で１回洗浄した。プロテインを溶出するために、試料緩衝液４０μＬを添加した。
【０２３４】
溶出液をゲル電気泳動に付し、そして、約５３Ｋｄにおいて活動しているバンドを切除し、そしてトリプシン消化に付した［フェンセラー  シー．（Ｆｅｎｓｅｌａｕ  Ｃ．）、１９９７、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ及びプロテイン分析のための方法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ  ａｎｄ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６６１Ａ〜６６５Ａ；ジャングブルート  ピー．（Ｊｕｎｇｂｌｕｔ  Ｐ．）、及びチード  ビー．（Ｔｈｉｅｄｅ  Ｂ．）、１９９７、ＭＡＬＤＩ質量分析法による２−ＤＥゲルからのプロテイン同定（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｆｒｏｍ  ２−ＤＥ  ｇｅｌ  ｂｙ  ＭＡＬＤＩ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｒｅｖ．１６、１４５〜１６３；パターソン  エス．ディー．（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  Ｓ．Ｄ．）及びエバーソルド  アール．（Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ  Ｒ．）、１９９５、ゲル−分離されたプロテインの同定のための質量分析法による研究（Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｌ−ｓｅｐａｒａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、電気泳動（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、１６、１７９１〜１８１４）］。消化物を次いで、サイパージェン  プロテイン  チップ  リーダーを使用するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ［マトリックス  アシステッド  レーザー  デソープション  アイオニゼーション−タイム  オブ  フライト  マス  スペクトロメトリー（Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ  Ｏｆ
Ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）］分析に付した。得られたペプチドパターンの一部を図９に示す。得られたペプチドパターンと公知プロテインのデーターベースにおけるペプチドパターンとの比較は、５３ＫｄプロテインがファクターＸＩＩ
から誘導されるが、しかし、約１１５のアミノ末端残基を失っていることを示した。
【０２３５】
実施例４
本実施例は、ファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームの測定が、心筋梗塞及び／又は急性冠症候群が疑われて入院した患者の死亡を引き起こす全ての危険性の予測を提供することを示す。
【０２３６】
入院した８７１人の患者についてデータが得られた。各患者は、ファクターＸＩＩａの５３ｋｄフォームを優先的に測定する分析を使用して測定されたファクターＸＩＩａを有していた。これらの分析からのデータは、それが、あらゆる原因による死亡の第一次の臨床的エンドポイントの予測を提供するかどうかを解明するために研究された。
【０２３７】
前記分析の予測的有用性は、５３ｋｄファクターＸＩＩａ値を段階付け（最低から最高まで）し、次いで、被検者数を四分割する、即ち、最低の５３ｋｄファクターＸＩＩａ濃度を持つ２５％の個人は四分割の一番目であり、そして最高の５３ｋｄファクターＸＩＩａ濃度を持つ２５％の個人は四分割の四番目であるとすることにより決定された。
【０２３８】
試料を沃素−１２５で標識化された抗体と反応させた後に、ＸＩＩａの５３Ｋｄフォームは高性能液体クロマトグラフィーを使用して測定された。
【０２３９】
抗体２／２１５のＦａｂ抗体フラグメントは、“イムノピュアＦａｂ調製キット”［ピアース、３７４７エヌ  メリジアン  ロード、私書箱１１７、ロックフォード、イリノイ、米国］を製造者の使用説明書に従って使用して調製された。Ｆａｂフラグメントは次いで、アマシャム  ファルマシア  バイオテク［ポラーズ  ウッド、ナイチンゲールズ  レイン、チャルフォント  セント  ゲイルズ、エイチピー８  ４エスピー、英国］による沃素１２５を用いて放射性標識化された。
【０２４０】
放射性標識化された抗体１μＬを、多数の健常ヒトボランティアの各々からの血漿１ｍＬに添加した。４時間インキュベートした後、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、血漿の成分を分離した。ＨＰＬＣシステムはアジレント１１００システムであった。
【０２４１】
ＨＰＬＣのために使用した移動相は、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、０．４％（重量／容量）クエン酸３ナトリウム、ｐＨ７，５であった。固定相は、直列の２×３０ｃｍバイオセプ−ＳＥＣ−Ｓ３０００カラム［フェノメネックス、クインーズ  アべニュー、ハーズフィールド  インダストリアル  エステート、チェシャー、エスケイ１０  ２ビーエヌ、英国］を含んでいた。流速は０．７ｍＬ／分であり、そして、注入容量は１００μＬであった。
【０２４２】
２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、そして、フロー−カウント  ラジオクロマトグラフィー検出器［ラブロジック、シェフィールド、英国］を使用して放射能をモニターすることにより、ＨＰＬＣ溶出液をモニターした。
【０２４３】
分子量標準を流し、そしてこれらと比較することから、５３ｋＤＸＩＩａピークを同定することができた。このピーク（放射能活性シグナル）の下の面積の積算は、ＸＩＩａの５３ｋＤフォームの定量的測定を提供した。定量化のキャリブレーションは、ＸＩＩａの３０ｋＤフォーム（βＸＩＩａ）の既知量を持つ標準を流すことにより得られた。
【０２４４】
表Ｉは、異なる追跡調査時点におけるＸＩＩａの５３ｋＤフォームと関連付けられる、あらゆる原因による死亡の相対的危険性を示す。全ての場合において、最高の５３ｋＤＸ
ＩＩａ濃度を持つ前記患者は、統計的に有意に増加した死の危険性があった。これは全ての患者［心筋梗塞（０．０５ｎｇ／ｍＬより大きい入院時トロポニンＴ（ＴｎＴ）として定義された。）で入院した患者、しかし特別には、トロポニン陰性（０．０５ｎｇ／ｍＬより小さいか又は等しいＴｎＴ）の胸痛で入院した患者］に当てはまった。図１０ないし図１２は、全ての患者［それぞれ、０．０５ｎｇ／ｍＬより大きい入院時ＴｎＴを有する患者、及び、０．０５ｎｇ／ｍＬより小さいか又は等しい入院時ＴｎＴを有する患者］に対するカプラン・マイヤー生存プロットを示す。
【０２４５】
表Ｉ．５３ｋＤＸＩＩａ濃度に関するあらゆる原因による死亡のオッズ比（５３ｋＤＸＩＩａ四分割）
【表１】
2008526937.tif 000003
*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１
【０２４６】
実施例５
本実施例は、ファクターＸＩＩａの５３Ｋｄフォームの濃度変化の測定が、心筋梗塞で入院した患者における第二次の心筋梗塞の危険性の予測を提供することを示す。
【０２４７】
入院した３１５人の患者についてデータが得られた。血液試料は入院時及び入院４日後に得られた。各患者は、ファクターＸＩＩａの５３ｋＤフォームを優先的に測定する分析を使用して測定されたファクターＸＩＩａを有していた。これらの分析からのデータは、ファクターＸＩＩａの５３ｋＤフォームの濃度変化が、入院３０日以内の第二次の心筋梗塞の第一次の臨床的エンドポイントの予測を提供するかどうかを解明するために研究された。追跡調査３０日の時点で、２４人の患者が第二次の心筋梗塞を発症した。
【０２４８】
試料を沃素−１２５で標識化された抗体と反応させた後に、ＸＩＩａの５３Ｋｄフォームは高性能液体クロマトグラフィーを使用して測定された。
【０２４９】
抗体２／２１５のＦａｂ抗体フラグメントは、“イムノピュアＦａｂ調製キット”［ピース、３７４７エヌ  メリジアン  ロード、私書箱１１７、ロックフォード、イリノイ、米国］を製造者の使用説明書に従って使用して調製された。これらのＦａｂフラグメントは次いで、アマシャム  ファルマシア  バイオテク［ポラーズ  ウッド、ナイチンゲールズ  レイン、チャルフォント  セント  ゲイルズ、エイチピー８  ４エスピー、英国］による沃素１２５を用いて放射性標識化された。
【０２５０】
放射性標識化された抗体１μＬを、多数の健常ヒトボランティアの各々からの血漿１ｍＬに添加した。４時間インキュベートした後、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、血漿の成分を分離した。ＨＰＬＣシステムはアジレント１１００システムであった。
【０２５１】
ＨＰＬＣのために使用した移動相は、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、０．４％（重量／容量）クエン酸３ナトリウム、ｐＨ７，５であった。固定相は、直列の２×３０ｃｍバイオセプ−ＳＥＣ−Ｓ３０００カラム［フェノメネックス、クインーズ  アべニュー、ハーズフィールド  インダストリアル  エステート、チェシャー、エスケイ１０  ２ビーエヌ、英国］を含んでいた。流速は０．７ｍＬ／分であり、そして、注入容量は１００μＬであった。
【０２５２】
２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、そして、フロー−カウント  ラジオクロマトグラフィー検出器［ラブロジック、シェフィールド、英国］を使用して放射能をモニターすることにより、ＨＰＬＣ溶出液をモニターした。
【０２５３】
分子量標準を流し、そしてこれらと比較することから、５３ｋＤＸＩＩａピークを同定することができた。このピーク（放射能活性シグナル）の下の面積の積算は、ＸＩＩａの５３ｋＤフォームの定量的測定を提供した。定量化のキャリブレーションは、ＸＩＩａの３０ｋＤフォーム（βＸＩＩａ）の既知量を持つ標準を流すことにより得られた。
【０２５４】
前記分析の予測的有用性は、５３ｋＤファクターＸＩＩａ値の変化を段階付け（最低から最高まで）し、次いで、被検者数を四分割する、即ち、入院時と４日後との間に５３ｋＤファクターＸＩＩａ濃度における減少が最も大きかった２５％の個人は四分割の一番目であり、そして濃度における増加が最も大きかった２５％の個人は四分割の四番目であるとすることにより決定された。
【０２５５】
ＸＩＩａの５３ｋＤフォームの濃度変化の分布（ｐＭと表現する。）を図１３に示し、そして、ＸＩＩａの５３ｋＤフォームの相対的な濃度変化（入院時の値に対する％変化として表現する。）を図１４に示す。
【０２５６】
５３ｋＤＸＩＩａ濃度における変化に基づく発症率を表ＩＩに与える。５３ｋＤＸＩＩａ濃度における絶対及び相対変化（入院からの％変化）共に、危険性に強く関連していた。ＸＩＩａ濃度における変化をＱ１と比較した場合、Ｑ４における再発ＴｎＴ陽性発症についてのオッズ比は、入院時の値に対して、絶対変化で１５．３６（ｐ＝０．００４６）であり、そして％変化で１３．９７（ｐ＝０．００６２）であった。それ故、心筋梗塞での入院時から４日後までＸＩＩａの５３ｋＤフォーム濃度における変化は、３０日間の追跡調査の間の心筋梗塞を強く予測すると結論される。
【０２５７】
表ＩＩ．心筋梗塞による入院４日後の５３ｋＤＸＩＩａにおける変化に関する、心筋梗塞に対する入院後３０日以内のＴｎＴ陽性心臓発作の発症
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【０２５８】
【図１】図１は、５３ＫｄファクターＸＩＩａを構成するペプチド鎖における“重鎖”のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】図２は、５３ＫｄファクターＸＩＩａを構成するペプチド鎖における“軽鎖”のアミノ酸配列を示す図である。
【図３】図３は、図形フォームにおけるファクターＸＩＩ酵素原を示す図である。
【図４】図４は、図形フォームにおけるファクターαＸＩＩａを示す図である。
【図５】図５は、図形フォームにおけるファクターβＸＩＩａを示す図である。
【図６】図６は、図形フォームにおける５３ＫｄファクターＸＩＩａを示す図である。
【図７】図７は、放射性標識化されたモノクローナル抗体２／２１５Ｆａｂに結合したファクターＸＩＩａの異なるフォームのＨＰＬＣ分離から得られたトレースを示す図である。
【図８】図８は、実施例２に記載された質量分析実験の結果を示す図である。
【図９】図９は、実施例３に記載された５３Ｋｄのトリプシン消化の後の、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析の結果を示す図である。
【図１０】図１０は、実施例４に記載された実験から得られたデータを示す図である。
【図１１】図１１は、実施例４に記載された実験から得られたデータを示す別の図である。
【図１２】図１２は、実施例４に記載された実験から得られたデータを示す更に別の図である。
【図１３】図１３は、実施例５に記載された実験から得られたデータを示す図である。
【図１４】図１４は、実施例５に記載された実験から得られたデータを示す別の図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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