(57)【要約】捕捉試薬が第１のエピトープで分析物に結合され、そして検出試薬が第２のエピトープで結合され、そしてこの検出試薬が、標識された相補的オリゴヌクレオチドがハイブリダイスし得るオリゴヌクレオチドを含む、サンプル中の分析物の存在を決定する方法が提供される。本発明のシステムおよび方法は、サンドイッチアッセイにおいて分析物を検出するために用いられる抗体およびその他の特異的結合パートナーに直接付着する標識に付随する問題を克服する。これらの問題は、オリゴヌクレオチドを、従来の化学的標識の代わりに、抗体またはその他の特異的結合パートナーに付着すること、そして次に、このアッセイで分析物の存在を直接検出するために、標識された相補的オリゴヌクレオチドを上記結合体化されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることによって克服される。
2008545142.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析物がサンプル中に存在するか否かを決定する方法であって：
（ａ）該分析物を第１のエピトープで特異的に結合する捕捉試薬を提供する工程；
（ｂ）第１の検出体オリゴヌクレオチドを含む第１の検出試薬を提供する工程であって、ここで、第１の検出試薬が該分析物を第２のエピトープで特異的に結合する工程；
（ｃ）該第１の検出体オリゴヌクレオチドの第１のヌクレオチド配列に相補的な第１の標識オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、ここで、該第１の標識オリゴヌクレオチドが第１の標識を含む工程；
（ｄ）該捕捉試薬を固体支持体に付着する工程；
（ｅ）該サンプル、該第１の検出試薬、および該第１の標識オリゴヌクレオチドを、該捕捉試薬および固体支持体と接触させる工程；および
（ｆ）該固体支持体に結合した該第１の標識を検出する工程であって、それによって該分析物が該サンプル中に存在することを決定する工程、を包含する、方法。
【請求項２】
（ｆ）前記固体支持体に結合した前記第１の標識の量を決定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記捕捉試薬が、前記サンプルが該捕捉試薬と接触する前に前記固体支持体に付着される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルが、前記捕捉試薬が前記固体支持体に付着される前に該捕捉試薬と接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記捕捉試薬が付着オリゴヌクレオチドを含み、そして前記捕捉試薬を前記固体支持体に付着する工程が、該付着オリゴヌクレオチドを、該付着オリゴヌクレオチドに相補的である固体支持体に付着されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の標識オリゴヌクレオチドが、発光化合物、着色微小粒子、蛍光タンパク質、蛍光ナノ結晶、金属ゾル、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、スピン標識、キレート化合物、質量標識、および放射活性同位体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の検出体オリゴヌクレオチドを、第２の標識を含む第２の標識オリゴヌクレオチドと接触する工程をさらに包含し、ここで、該第２の標識オリゴヌクレオチドが、該第１の検出体オリゴヌクレオチドの第２のヌクレオチド配列に相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の標識および第２の標識がスペクトル的に別個である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ｆｏｅｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動相互作用が、前記第１の標識オリゴヌクレオチドと前記第２の標識オリゴヌクレオチドが前記第１の検出体オリゴヌクレオチドに結合されるとき、前記第１の標識と前記第２の標識との間で生じる得る、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の検出体オリゴヌクレオチドが第１の側鎖と第２の側鎖とを含む分岐オリゴヌクレオチドであり、そして前記第１の標識オリゴヌクレオチドが該第１の検出体オリゴヌクレオチドの第１の側鎖に相補的であり、そして前記２の標識オリゴヌクレオチドが該第１の検出体オリゴヌクレオチドの第２の側鎖に相補的である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記捕捉試薬および前記第１の検出試薬が抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記固体支持体が、平坦表面、ファイバー、キャピラリー、または粒子からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の検出試薬が前記分析物の第１のイソフォームに特異的に結合する請求項１に記載の方法であって、さらに：
（ｉ）第２の検出体オリゴヌクレオチドを含む第２の検出試薬を提供する工程であって、該第２の検出体オリゴヌクレオチドが第２のヌクレオチド配列を有し、ここで、該第２の検出試薬が、該分析物の第２のイソフォームに特異的に結合する工程；
（ｉｉ）該第２の検出体オリゴヌクレオチドの第２のヌクレオチド配列に相補的である第２の標識オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、該第２の標識オリゴヌクレオチドが第２の標識を含む工程；
（ｉｉｉ）該第２の検出試薬および該第２の標識オリゴヌクレオチドを前記サンプルと接触する工程；および
（ｉｖ）前記固体支持体に結合した第２の標識を検出する工程であって、それによって、該分析物の第２のイソフォームが該サンプル中に存在することを決定する工程、を包含する、方法。
【請求項１４】
前記工程（ｉｖ）中に、前記固体支持体に結合した第２の標識を決定することをさらに包含し、それによって、前記サンプル中の分析物の第２のイソフォームの量を決定する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１および第２の検出体オリゴヌクレオチドが共通のヌクレオチド配列を含み、さらに：
（ｖ）該共通のヌクレオチド配列に相補的な第３の標識オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、該第３の標識オリゴヌクレオチドが、第３の標識を含む工程；および
（ｖｉ）該第３の標識オリゴヌクレオチドを、前記第１の検出試薬および前記第２の検出試薬と接触する工程、を包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記固体支持体に結合した第３の標識の量を決定する工程をさらに包含し、それによって、前記サンプル中の分析物の第１のイソフォームおよび第２のイソフォームの合わせた量を決定する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
固体支持体上の分析物のアッセイを行うためのキットであって：
（ａ）該固体支持体への付着のための捕捉試薬であって、第１のエピトープで該分析物を特異的に結合する捕捉試薬；
（ｂ）第１の検出体オリゴヌクレオチドを含む第１の検出試薬であって、該第１の検出体オリゴヌクレオチドが第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を含み、第２のエピトープで該分析物を特異的に結合する第１の検出試薬；
（ｃ）該検出体オリゴヌクレオチドの第１のヌクレオチド配列に相補的な第１の標識オリゴヌクレオチドであって、第１の標識を含む第１の標識オリゴヌクレオチド；および
（ｄ）該検出体オリゴヌクレオチドの第２のヌクレオチド配列に相補的な第２の標識オリゴヌクレオチドであって、第２の標識を含む第２の標識オリゴヌクレオチドを含む、キット。
【請求項１８】
前記Ｆｏｅｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動相互作用が、前記第１の標識オリゴヌクレオチドと前記第２の標識オリゴヌクレオチドが前記第１の検出体オリゴヌクレオチドに結合されるとき、前記第１の標識と前記第２の標識との間で生じ得る、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記第１の標識および第２の標識が、スペクトル的に別個である、請求項１７に記載のキット。
【請求項２０】
固体支持体をさらに備え、前記捕捉試薬が該固体支持体に付着される、請求項１７に記載のキット。
【請求項２１】
前記固体支持体が、平坦表面、ファイバー、キャピラリー、または粒子からなる群から選択される、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記第１の検出体オリゴヌクレオチドが、分岐オリゴヌクレオチドである、請求項１７に記載のキット。
【請求項２３】
前記第１の検出試薬が、前記分析物のイソフォームを特異的に結合する、請求項１７に記載のキットであって、さらに：
（ｉ）第２の検出体オリゴヌクレオチドを含む第２の検出試薬であって、該第２の検出体オリゴヌクレオチドが第３のヌクレオチド配列を有し、前記捕捉試薬によって結合された分析物のエピトープとは異なるエピトープで該分析物の第２のイソフォームを特異的に結合する第２の検出試薬；および
（ｉｉ）該第２の検出体オリゴヌクレオチドの第３のヌクレオチド配列に相補的な第３の標識オリゴヌクレオチドであって、ここで、該第３の標識オリゴヌクレオチドが第３の標識を含む、キット。
【請求項２４】
前記第２の検出体オリゴヌクレオチドが、前記第２のヌクレオチド配列、前記第１の検出体オリゴヌクレオチドおよび第２の検出体オリゴヌクレオチドを含み、それによって、共通のヌクレオチド配列を含む、請求項２３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（背景）
イムノアッセイは、患者の医療状態についての情報を得るための重要な診断ツールである。共通のイムノアッセイフォーマットは、特定の分析物に特異的な抗体が固体支持体に付着されるサンドイッチアッセイである。分析物がこの抗体と接触されるとき、それは、固体支持体に結合されるようになる。この分析物にまた特異的である第２の標識された抗体が、次いで、この分析物の上記固体支持体への結合を検出するために用いられる。
【背景技術】
【０００２】
抗体に標識を付着するプロセスは、しかし、分析物に結合する抗体の能力を妨害する。例えば、標識を、抗体の結合部位内のアミノ酸側鎖に付着することは、分析物を結合する抗体の能力を妨害する可能性が高い。標識はまた、それをタンパク質に結合するプロセスで反対に影響され得る。多くの蛍光色素は、例えば、それらが抗体に結合体化されるとき、強力なクエンチングを受ける。タンパク質への色素付着のための別個の位置を選択する能力の欠如はまた、Ｓｔｏｋｅｓシフトを増加し、そしてアッセイ感度を改善するための蛍光色素間のエネルギー移動を用いる能力を顕著に制限する。
【０００３】
代替のアプローチは、抗体を、標識とよりはむしろオリゴヌクレオチドで結合体化する。Ｋｕｒｎによる特許文献１では、例えば、オリゴヌクレオチド−結合体化抗体は、抗体が分析物に結合するようになった後、オリゴヌクレオチドに相補的なＰＣＲプライマーと接触される。オリゴヌクレオチド配列が次いで増幅され、そしてこの増幅された配列が検出される。ＰＣＲ増幅は、しかし、サイクリング反応を実施するため、そしてこのオリゴヌクレオチド配列を増幅するために、標準的なサンドイッチイムノアッセイと比較してさらなる時間を必要とする。このＰＣＲ増幅ステップは、さらに、定量的ではなく、そしてアッセイ結果に所望されない変動を導入する。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／００２３２７１号明細書
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（要旨）
本発明のシステムおよび方法は、サンドイッチアッセイにおいて分析物を検出するために用いられる抗体およびその他の特異的結合パートナーに直接付着する標識に付随する問題を克服する。これらの問題は、オリゴヌクレオチドを、従来の化学的標識の代わりに、抗体またはその他の特異的結合パートナーに付着すること、そして次に、このアッセイで分析物の存在を直接検出するために、標識された相補的オリゴヌクレオチドを上記結合体化されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることによって克服される。このアッセイフォーマットは、サンドイッチアッセイで用いられるべき標識の選択に関してさらなる柔軟性を提供する。なぜなら、そうでなければ特定の検出試薬と適合しないかも知れない標識が、本発明のシステムでオリゴヌクレオチド中に取り込まれ得るからである。色素部分は、オリゴヌクレオチド配列内の別個の位置で容易に配置され得るので、この技法はまた、タンパク質標識として周知のエネルギー移動色素対の使用を顕著に単純にする。
【０００５】
分析物がサンプル中に存在するか否かを決定するための本発明の方法は：（ａ）この分析物を第１のエピトープで特異的に結合する捕捉試薬；（ｂ）第２のエピトープで上記分析物を特異的に結合し、そしてまた検出体オリゴヌクレオチドを含む検出試薬；（ｃ）この検出体オリゴヌクレオチドに相補的な第１の標識オリゴヌクレオチド；および（ｄ）固体支持体の使用を含む。これらの方法において、上記サンプル、検出試薬、および第１の標識オリゴヌクレオチドは、上記捕捉試薬および固体支持体と接触され、そしてこの捕捉試薬は、上記固体支持体に付着される。サンプル中の分析物の存在が、次いで、決定され得る。好ましくは、固体支持体に結合される第１の標識の量が、サンプル中の分析物の量の定量的測定に到達するために決定される。
【０００６】
１つの実施形態では、上記捕捉試薬は、サンプルがこの捕捉試薬と接触される前に固体支持体に付着される。あるいは、サンプルは、上記捕捉試薬が上記固体支持体に付着される前にこの捕捉試薬と接触され得る。捕捉試薬は、例えば、固体支持体に結合された相補的オリゴヌクレオチドに結合された捕捉試薬上のオリゴヌクレオチドを経由して固体支持体に付着され得、そしてこの固体支持体は、ポリプロピレン、セファロース、ニトロセルロース、ガラス、または合成ポリマー材料であり得る。上記捕捉試薬および検出試薬は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、リガンド、核酸、脂質、ステロイド、代謝物、治療薬物、過剰摂取の薬物、ウイルス抗原、細菌抗原、疾患マーカー、ホルモン、および発癌マーカーのような、任意の数の異なる分析物を特異的に結合するように適合され得る。好ましくは、捕捉試薬および検出試薬の両方は、抗体である。
【０００７】
本発明の方法で用いられる標識は、例えば、フィコビリプロテイン、フィコビリソーム、蛍光色素、着色微小粒子、金属ゾル、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、スピン標識、または放射活性同位体を含み得る。１つの実施形態では、１つ以上のオリゴヌクレオチドが検出体オリゴヌクレオチドに結合され得、この場合には、各オリゴヌクレオチドは、異なる標識を含む。これら異なる標識は、好ましくは、スペクトル的に別個であり、そして１つの実施形態では、蛍光共鳴エネルギー移動またはその他のＦｏｅｒｓｔｅｒタイプ共鳴エネルギー移動がこのような標識間で起こり得る。特定の検出体オリゴヌクレオチドの配列に相補的な同じオリゴヌクレオチドがまた、異なる標識とともに提供され得る。
【０００８】
上記検出体オリゴヌクレオチドは、好ましくは、非重複配列である複数の異なるヌレレオチド配列を含み得、それらの各々は、異なる標識オリゴヌクレオチドによって保持される配列に相補的である。１つの実施形態では、この検出体オリゴヌクレオチドは分岐オリゴヌクレオチドであり、そこでは、第１の標識を保持する第１のオリゴヌクレオチドが、上記検出体オリゴヌクレオチドの主鎖に結合され得、そして第２の標識を保持する第２のオリゴヌクレオチドが、上記検出体オリゴヌクレオチドの側鎖に結合され得る。
【０００９】
本発明の方法はまた、サンプル中の分析物のイソフォームを検出するために用いられ得る。この実施形態では、捕捉試薬は、２つ以上のイソフォームによって共有される分析物の共通のエピトープに特異的に結合し、そして検出試薬は、イソフォームに特異的なエピトープに結合する。各検出試薬は、特定のイソフォームに特異的な、すなわち、そのイソフォームに特異的な検出試薬によって保持されるヌクレオチド配列、および上記アッセイで検出される分析物の種々のイソフォームのためのすべての検出試薬に共通な別のヌクレオチド配列を有する検出体オリゴヌクレオチドを含む。検出体オリゴヌクレオチドの各イソフォームに特異的な配列に特異的であり、そして異なる標識を保持する標識オリゴヌクレオチドが、次いで、検出体オオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ、そして検出体オリゴヌクレオチドの共通のヌクレオチド配列に特異的なその他の標識オリゴヌクレオチドがまた、検出試薬にハイブリダイズされる。標識オリゴヌクレオチドを検出する前に、捕捉試薬が固体支持体に付着され、これは、この捕捉試薬をサンプルと接触する前後いずれかで生じ得る。検出体オリゴヌクレオチドのイソフォーム特異的および共通のヌクレオチド配列にハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドによって保持される標識は、次いで、分析物の任意のイソフォームがサンプル中に存在するか否かを決定するために検出される。サンプル中の各イソフォームの量、およびサンプル中の分析物の総量がまた、決定され得る。
【００１０】
さらなる局面では、分析物のアッセイを実施するためのキットが提供され得る。このようなキットは、第１のエピトープで分析物を特異的に結合する捕捉試薬；検出体オリゴヌクレオチドを含む検出試薬であって、第２のエピトープで分析物を特異的に結合する検出試薬；第１の標識オリゴヌクレオチド；および第２の標識オリゴヌクレオチドを含む。上記捕捉試薬は、平坦表面、ファイバー、キャピラリー、粒子、または当該技術分野で公知のその他の支持体であり得る個体支持体に結合されるように適合されている。分岐オリゴヌクレオチドであり得るこの検出体オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのヌクレオチド配列を含む。第１の標識オリゴヌクレオチドは検出体オリゴヌクレオチドの１つの配列に相補的であり、その一方、第２の標識オリゴヌクレオチドは検出体オリゴヌクレオチドの第２の（好ましくは、非重複）ヌクレオチド配列に相補的であり、そしてこれら２つの標識オリゴヌクレオチドは、異なる標識、すなわち、スペクトル的に別個の、またはそうでなければ区別可能である標識を含む。本明細書中に記載される任意の標識は、これら標識オリゴヌクレオチド中に取り込まれ得る。
【００１１】
分析物のイソフォームのアッセイを実施するためのその他のキットがまた提供される。このようなキットは、分析物の第１のイソフォームおよび第２のイソフォームの両方を、好ましくは両方のイソフォームに共通のエピトープで特異的に結合する捕捉試薬；分析物の第１のイソフォームを、捕捉試薬によって結合されるエピトープとは異なるそのイソフォームに特異的なエピトープで特異的に結合する第１の検出試薬であって、第１の検出体オリゴヌクレオチドを有する第１の検出試薬；捕捉試薬によって結合されるエピトープとは異なるそのイソフォームに特異的なエピトープで分析物の第２のイソフォームを特異的に結合する第２の検出試薬であって、第２の検出体オリゴヌクレオチドを有する第２の検出試薬；第１の検出体オリゴヌクレオチドに相補的な第１の標識オリゴヌクレオチド；および第２の検出体オリゴヌクレオチドに相補的な第２の標識オリゴヌクレオチドを含む。上記第１および第２の検出体オリゴヌクレオチドはまた、第１および第２の検出体オリゴヌクレオチドに共通のヌクレオチド配列を含み、そしてこの第１および第２の標識オリゴヌクレオチドによって保持されるそれとは異なる標識を保持する第３の標識オリゴヌクレオチドが、分析物のすべてのイソフォームを検出するために、本発明のキット中に含まれ得る。本発明のキットで検出され得るイソフォームは、例えば、ＰＳＡのイソフォームを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（説明）
（定義）
本明細書で用いられるとき、以下の用語およびその改変物は、異なる意味が、このような用語が用いられる文脈によって明確に意図されるのでなければ、以下で与えられる意味を有する。
【００１３】
「分析物」は、サンプル中の分子、化合物、またはその他の成分をいう。分析物は、制限されないで、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、有機分子、糖およびその他の炭水化物、および脂質を含む。例えば、分析物は、ビタミン、ホルモン、薬物、ウイルスまたは細菌であり得る。分析物はまた、別の分子の一部分を含む。
【００１４】
「抗体」は、分析物に特異的に結合する免疫グロブリンタンパク質あるいはそのフラグメントまたは誘導体をいう。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＭのような免疫グロブリンの種々のクラスおよびイソタイプを含む。抗体フラグメントは、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦａｂ’分子のような分子を含む。抗体誘導体は、キメラ抗体のような、付加または置換を有する抗体またはそのフラグメントを含む。抗体は、ヒトまたは動物供給源から、ハイブリドーマから、組換え方法により、または当該技術分野で公知の任意のその他の方法により得られ得る。
【００１５】
「アプタマー」は、一本鎖ポリヌクレオチド、またはポリペプチド特異的な結合パートナーをいう。アプタマーは、一般に、非常に特異的かつ選択的な結合活性を有する安定な三次元構造に折り畳まれる短いポリマー（例えば、２０〜１００マー）である。
【００１６】
「アレイ」は、固体支持体の表面上の分子の二次元配列をいう。この表面は、平坦または湾曲であり得る。
【００１７】
「捕捉試薬」は、固体支持体に付着されるか、または付着されるように適合される、分析物に対する特異的結合パートナーをいう。捕捉試薬は、検出試薬によって結合されるエピトープとは空間的に別個であるエピトープで分析物を特異的に結合し、その結果、捕捉試薬および検出試薬による分析物の結合が、アッセイを妨害し得る程度まで立体的に妨害しない。捕捉試薬は、可逆的または不可逆的いずれかで固体支持体に付着され得る。
【００１８】
ポリヌクレオチドに関して「相補的」は、本発明の方法に従って実施されるアッセイの条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズし得るポリヌクレオチド分子をいう。好ましくは、相補的ポリヌクレオチドの非特異的ハイブリダイゼーションは、約５％より少ない、そしてより好ましくは約０．１％より少ない頻度で生じる。非特異的ハイブリダイゼーションは、アデニンとチミンまたはウラシルとの間の、またはシトシンとグアニンとの間の相互作用以外のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対相互作用を含む。
【００１９】
「検出試薬」は、分析物に特異的な結合パートナーを含み、そして検出体オリゴヌクレオチドをさらに含む分子をいう。
【００２０】
「検出体オリゴヌクレオチド」は、検出試薬の特異的結合パートナーに付着、またはそうでなければ連結されるオリゴヌクレオチドをいう。
【００２１】
「エピトープ」は、捕捉試薬または検出試薬が結合する、分析物の表面の局在化領域（単数または複数）をいう。
【００２２】
「ハイブリダイズ」は、少なくとも２つの相補的ポリヌクレオチド間の二本鎖核酸構造の形成をいう。このような結合は、一般に、ワトソン−クリック塩基対相互作用のような水素結合相互作用を経由して生じる。
【００２３】
「イソフォーム」は、同じ核酸配列を有するか、または相同配列を有するポリヌクレオチド由来の異なるポリペプチド分子をいう。イソフォームは、代表的には、顕著なアミノ酸配列相同性を有し、そしてイソフォーム間の差異は、ポリヌクレオチドの選択的スプライシング、このようなポリヌクレオチド中の代替の開始コドンの存在、またはグリコシル化およびリン酸化のような翻訳後改変にしばしば起因する。例えば、トランスフォーミング因子β（ＴＧＦ−Ｂ）は、３つのイソフォーム、ＴＧＦ−Ｂ１、ＴＧＦ−Ｂ２、およびＴＧＦ−Ｂ３で存在する。遊離の前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）は同様に、ｆ−ＰＳＡ、ＰＳＡ−ＡＣＴ、ＰＳＡ−ＭＧ、ｐＰＳＡ、ＢＰＳＡおよびｉＰＳＡを含むいくつかのイソフォームがある。
【００２４】
「標識」は、直接的または間接的いずれかで、結合パートナー中に付着され得るか、またはその中に取り込まれ得る、検出可能な信号を提供する部分をいう。標識の例は、制限されないで、蛍光色素、着色微小粒子、蛍光タンパク質、蛍光ナノ結晶（量子ドット）、金属ゾル、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、スピン標識、および放射活性同位体を含む。標識は、代表的には、分析機器の一部であり得る検出器によって検出される。
【００２５】
「標識オリゴヌクレオチド」は、検出体オリゴヌクレオチドに相補的であり、そして標識を含むオリゴヌクレオチドをいう。
【００２６】
「核酸配列」は、ポリヌクレオチド分子中の連続的ヌクレオチドの鎖をいう。
【００２７】
「オリゴヌクレオチド」は、約５と２００との間のヌクレオチドを含む線状または分岐ポリヌクレオチド分子またはそのアナログをいう。
【００２８】
「ペプチド」は５０またはより少ないアミノ酸を含むアミノ酸配列をいい、その一方、「タンパク質」は、５０アミノ酸より大きいアミノ酸配列をいう。
【００２９】
「ポリヌクレオチド」は、２つ以上のヌクレオチドを含む分子、またはそのアナログをいい、そしてＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドアナログは、改変塩基および／または糖部分を有するか、または天然核酸の糖リン酸骨格が合成ペプチド骨格によって置換されているペプチド核酸のような、置換を含むヌクレオチドである。ポリヌクレオチドの核酸は、通常、ホスホジエステル結合によって連結されているが、ホスホロチオエート、ホスホルアニリデート、またはホルホルアミデート結合を経由してまた連結され得る。
【００３０】
「固体支持体」は、本発明の方法で用いられる試薬の存在下で不溶性（すなわち、容易に溶解しない）材料をいう。固体支持体は、粒子、ファイバー、および平坦表面を含み、そして、一般に、セファロース、ニトロセルロース、ガラス、および多くの合成ポリマーのような水中で乏しく可溶性であるに過ぎない材料から作製される。
【００３１】
分析物と特異的結合パートナーとの間の相互作用に関する「特異的結合」または「特異的に結合する」は、サンプル中のその他の成分にではなく、この分析物への特異的結合パートナーの付着をいう。特異的結合パートナーは、いくつかの場合には、特定の群または特定クラスの分子を結合し得、そしてなお、このような分子を特異的に結合するとみなされる。例えば、捕捉試薬は、１つのクラスの抗体のＦｃ領域に対して惹起され得、そしてそれによって、その特定のクラスの多くの異なる抗体を特異的に結合し得るか、または分析物の異なるイソフォームに結合し得る。特異的結合パートナーによる分析物の結合は可逆的であり得、すなわち、この分析物は、分析物および／または特異的結合パートナーを構造的に改変することなくこの特異的結合パートナーから離脱され得るか、または（ビオチンとアビジンとの間の結合のような）不可逆的であり得る。
【００３２】
「特異的結合パートナー」は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対相互作用による以外で、分析物を特異的に結合し得る分子をいう。特異的結合パートナーは、抗体またはその他のタンパク質、ペプチド、多糖、脂質、またはアプタマーを含む任意の多くの異なるタイプの分子であり得る。
【００３３】
複数の蛍光標識またはその他の光学的に検出される標識を参照して、「スペクトル的に別個」は、複数の標識の光学的吸収または発光バンドが十分にはっきりと識別できること、すなわち、個々の標識が付着される分子が、分光光度計または蛍光計のような光検出システムを用いて個々の標識によって発生される光学的信号を基にして区別され得るという十分に重複しないことを意味する。
【００３４】
本明細書で用いられるとき、用語「包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに「包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」のようなこの用語の改変は、その他の付加物、成分、整数または工程を排除することは意図されない。本明細書中で用いられる、用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「該または上記（ｔｈｅ）」ならびに類似の指示語は、文脈中のそれらの語法が他であることを示さなければ、単数および複数の両方を含むと解釈されるべきである。
【００３５】
（アッセイ成分）
（特異的結合パートナー）
多くの異なるタイプの特異的結合パートナーが、検出されるべき分析物に依存して、本発明のシステムおよび方法で用いられ得る。１つの実施形態では、この特異的結合パートナーは抗体である。特定の分析物を結合するために捕捉試薬または検出試薬として用いられる抗体は、好ましくは、モノクローナルであり、そしてそれ故、分析物の特定のエピトープに対して向けられる。モノクローナル抗体は、当該技術分野で公知の技法を用いて調製され得、そして代表的には、所望の結合特徴をもつ抗体を産生するＢ細胞株を用いるハイブリドーマの生成によって調製される。単一のエピトープに対して惹起された抗体はまた、組換え方法によるような、その他の方法で産生され得る。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ポリクローナル抗体が、本発明のシステムおよび方法における特異的結合パートナーとして用いられ得る。例えば、捕捉試薬は、分析物を検出するために用いられる検出試薬によって認識されるエピトープ（単数または複数）とは異なる分析物のエピトープに対して惹起されたポリクローナル抗体を含み得る。ポリクローナル抗体は、宿主を免疫化すること、およびこの宿主から血漿または血清を収集することによるような、当該技術分野で公知の方法で調製され得る。
【００３７】
それらの特異的結合特徴を保持する抗体フラグメントもまた、本発明のシステムおよび方法における特異的結合パートナーとして用いられ得、抗体のＦｃ部分を欠くフラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを含む。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、当該技術分野で公知の方法によって、例えば、モノクローナル抗体を、ハパインおよびペプシンのようなタンパク質分解酵素で切断することにより産生され得る。Ｆａｂ’フラグメントは、ジチオトレイトールまたはメルカプトエタノールのような試薬でのＦ（ａｂ’）２フラグメントの還元的切断によって産生され得る。抗体フラグメントは、あるいは、ファージディスプレイライブラリー［例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２：４３３〜４５５（１９９４）を参照のこと］のような組換え方法を用いて産生され得る。
【００３８】
一本鎖抗体またはそのフラグメントのような抗体誘導体もまた、用いられ得る。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体は、１つの単一ポリペプチド鎖中の完全な抗体結合領域を取り込む。このような抗体は、組換えによるか、またはインタクトの抗体の重鎖成分を連結するジスルフィド結合の還元的切断によるかのいずれかで得られる。用いられ得るその他の抗体誘導体は、ミニ抗体、二特異性抗体（ダイアボディ）、抗体のマルチマーもしくは抗体誘導体、および抗体結合領域から、例えば、好ましくは、ＣＤＲ３領域を含む、抗体の１つまたはいくつかのＣＤＲ（補体決定領域）からの配列を含むペプチドを含む。
【００３９】
抗体または抗体フラグメントもしくは誘導体以外の特異的結合パートナーがまた、本発明のシステムおよび方法で用いられ得る。例えば、アプタマーが、特異的結合パートナーとして用いられ得る。用いられ得る特異的結合パートナー対は、レセプター−リガンド、酵素−基質、酵素−阻害剤、および酵素−補因子対を含む。このような特異的結合パートナー対の特定の例は、炭水化物およびレシチン、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、葉酸および葉酸結合タンパク質、ビタミンＢ１２および内因性因子、プロテインＡおよび免疫グロブリン、ならびにプロテインＧおよび免疫グロブリンを含む。また含まれるのは、互いと共有結合を形成する特異的結合対である。
【００４０】
（検出のためのオリゴヌクレオチド）
オリゴヌクレオチドが、本発明のシステムおよび方法のいくつかの局面で用いられ得る。１つの局面では、オリゴヌクレオチドが、分析物に結合した検出試薬を標識するために用いられる。本発明のシステムの検出試薬は、オリゴヌクレオチド、検出体オリゴヌクレオチドを含み、そしてこの検出体オリゴヌクレオチドに相補的な標識されたオリゴヌクレオチドがハイブリダイズされるとき、標識されたオリゴヌクレオチドの標識成分は、検出体オリゴヌクレオチドと会合するようになる。検出試薬が次いで検出され、そして好ましくは適切な設備を用いて測定される。
【００４１】
上記検出および標識オリゴヌクレオチドは、直鎖または分岐いずかのオリゴヌクレオチドであり得る。好ましくは、このようなオリゴヌクレオチドは、約５〜１００ヌクレオチドの間の長さを有し、そしてより好ましくは、相補的オリゴヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを確実にするために少なくとも約２０〜３０ヌクレオチドを含む。一般に、オリゴヌクレオチド対は完全に相補的であること、すなわち、１つのオリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドが、アッセイの条件下で、それらの個々の配列の少なくとも一部分に亘り、他のオリゴヌクレオチドのヌクレオドに結合されることが好ましい。配列のこれらの相補的部分は、少なくとも約２０塩基、そしてより好ましくは少なくとも約３０塩基を含む。
【００４２】
１つの実施形態では、分岐オリゴヌクレオチドが、本発明のシステムで検出体オリゴヌクレオチドとして用いられ得る。分岐オリゴヌクレオチドは、側鎖として、内部ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド分子のその他の部分に付着した少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。例えば、図３に示されるように、検出体オリゴヌクレオチド３４０は、側鎖３４１および３４８を含み、これらは、それぞれ、標識オリゴヌクレオチド３５１および３５０に相補的である。このような分岐検出体オリゴヌクレオチドは、例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、別のオリゴヌクレオチドの５’端部に接続され得るオリゴヌクレオチド中に、内部３’ヒドロキシリボヌクレオチド残基を含めることにより構築され得る［例えば、Ｍｅｎｄｅｌ−Ｈａｒｔｖｉｇ、Ｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．３２、Ｎｏ．１、ｅ２（１９９４）を参照のこと］。あるいは、分岐検出体オリゴヌクレオチドは、ペンタエリトリトールリンカーを有する３’−３’−連結分岐オリゴヌクレオチドを含み得、そしてＤＮＡ合成機を用いて調製され得る。フォーク様構造を有する分岐オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに対して複数の結合部位を提示する。１００ヌクレオチドより長いポリヌクレオチド鎖には、分岐オリゴヌクレオチドの使用は、鎖がより低い誤り率で産生されることを可能にする。なぜなら、複数のより小さなオリゴヌクレオチドが、このような分岐構造で組み合わされ得るからである。
【００４３】
本発明のシステムおよび方法で検出試薬に標識オリゴヌクレオチドを結合する１つの利点は、これが、１つの抗体結合体（またはその他の検出試薬）が多くの異なる種類の標識によって容易に標識され得ることを可能にすることである。これは、検出体オリゴヌクレオチドの同じ配列に相補的であるオリゴヌクレオチド（すなわち、検出試薬に結合体化するオリゴヌクレオチド）を調製すること、および、次に、このような相補的オリゴヌクレオチドを異なる標識で標識することによって達成され得る。このように異なって標識される相補的オリゴヌクレオチドは、反応条件の同じセットを用いて検出試薬にハイブリダイズされ得、その結果、特定の検出試薬および特定の標識された相補的オリゴヌクレオチドについて最適化された反応条件のセットが、異なる標識オリゴヌクレオチドのために反応条件を最適化するための時間および資源を投資する必要性なくして異なる検出システムで用いられ得る。
【００４４】
本発明のシステムの別の利点は、タンパク質に直接付着されるとき強いクエンチングを示す色素（すなわち、シアニン色素）が、本発明のシステムおよび方法で用いられる標識は、オリゴヌクレオチドに付着されるので、標識するために用いられる得ることである。例えば、複数の色素が、標識オリゴヌクレオチドの規定された位置に付着され得、それによって、このような色素が抗体およびその他のタンパク質中に高レベルの置換で取り込まれるとき、通常見出されるクエンチングを最小にする。さらに、複数の色素が標識オリゴヌクレオチド上の特定部位で取り込まれ得、効率的なエネルギー移動複合体を形成し、アッセイバックグラウンドを効率的に低減する大きなＳｔｏｋｅシフトを提供する。さらに、水溶液中のタンパク質またはその他の分子への結合体化には通常疎水性すぎる色素が、有機相中の固相合成により、標識オリゴヌクレオチド中に取り込まれ得、そして遊離して可溶性の標識オリゴヌクレオチドが、次いで、本発明のシステムおよび方法で引き続き用いられ得る。
【００４５】
１つの好ましい実施形態では、複数の異なる標識が異なるオリゴヌクレオチド中に取り込まれる。例えば、特定の分析物のイソフォームをアッセイするとき、１つの特定の標識が分析物のすべてのイソフォームを検出するために用いられる標識オリゴヌクレオチド中に取り込まれ得、その結果、この標識が検出されるとき、この種のすべてのイソフォームの総量が算出され得る。イソフォームアッセイ中の標識オリゴヌクレオチドはまた、一般に、分析物の各々の個々のイソフォームに対する異なる標識および配列を含み、その結果、このアッセイは、分析物の異なるイソフォームの存在および／または量を区別し得る。複数の標識が、アッセイにおいて、同じ標識オリゴヌクレオチド中で用いられるか、またはそうでなければ、同じ検出試薬に結合されるとき、それらは、検出されるとき、それらが互いを妨害しないように選択されるべきである。
【００４６】
（捕捉のためのオリゴヌクレオチド）
本発明のシステムおよび方法の別の局面では、オリゴヌクレオチドは、捕捉試薬を固体支持体に付着するために用いられ得る（例えば、米国特許第５，６４８，２１３号を参照のこと）。本発明のこの局面では、オリゴヌクレオチドは捕捉試薬に付着され、そして相補的オリゴヌクレオチドが固体支持体に付着される。次いで、この捕捉試薬が、固体支持体−結合オリゴヌクレオチドと捕捉試薬オリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で固体支持体と接触されるとき、これらのオリゴヌクレオチドはハイブリダイズし得、そして捕捉試薬は、それによって、固体支持体に可逆的に結合される。
【００４７】
オリゴヌクレオチドは、当該技術分野で公知の方法で固体支持体に付着され得る。例えば、ポリプロピレンマイクロ滴定プレートが、米国特許第５，１１２，７３６号に記載のようにアミン基で誘導体化され得、そして次に、米国特許出願公開番号第２００３００９２０６２号に記載のように、オリゴヌクレオチドに、１，１’−カルボニルジトリアゾールを用いて連結される。
【００４８】
オリゴヌクレオチドを支持体に共有結合により付着する別の方法は、シラン化である。例えば、ガラス表面は、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）でシラン化され得、アミノ基を含む表面を生成する。シラン化表面上の末端アミノ基は、次いで、１，４−ジフェニレンジイソチオシアネート（ＤＰＣ）と反応され得、このアミノ基を、フェニレンイソチオシアネート基に変換する。これらは、順に、５’−アミノ改変オリゴヌクレオチドと反応され、表面結合オリゴヌクレオチドを生じる（例えば、米国特許第５，６２２，８２６号を参照のこと）。オリゴヌクレオチドはまた、それらを固体支持体に付着するためにカルボジイミドのようなその他の試薬で活性化され得る（例えば、米国特許第６，１４６，８３３号を参照のこと）。あるいは、５’−ビオチン化オリゴヌクレオチドを生成するために、例えばビオチンホルホルアミダイト（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡから入手可能）で、ビオチン化されたオリゴヌクレオチドが、このオリゴヌクレオチドを固体支持体に特異的に結合するためにこの支持体に付着されたアビジン部分と反応され得る。
【００４９】
（標識）
広範な種類の標識が、本発明のシステムで用いられ得る。標識は、本発明のシステムの検出体オリゴヌクレオチドに相補的である標識オリゴヌクレオチドに付着され、その中に取り込まれ、またはそうでなければそれと会合される。標識の例は、蛍光部分、リン光部分、化学発光部分、着色粒子、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、放射活性同位体、色原体、色素、金属ゾル、キレート化合物、質量標識（ｍａｓｓ  ｌａｂｅｌ）、およびスピン標識を含む。標識は、蛍光、発光、放射活性、酵素活性、またはその他の性質を含む。
【００５０】
標識として用いられる発光化合物は、蛍光色素、蛍光タンパク質、および蛍光ナノ結晶のような蛍光標識を含む。蛍光色素は、例えば、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、およびそれらの誘導体（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手可能）ならびにＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲから入手可能）を含む。蛍光タンパク質は、（アロフィコシアニン、フィコシアニン、およびフィコエリトリンのような）フィコビリプロテイン、フィコビリソーム、グリーン蛍光タンパク質、レッド蛍光タンパク質、およびこのようなタンパク質の種々の誘導体を含む。標識として用いられ得るその他の蛍光化合物は、量子ドットともまた称されるナノ結晶を含む。
【００５１】
１つの実施形態では、蛍光標識は、Ｆｏｅｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を経由して相互作用する分子のアクセプター−ドナー対を含み得る。例えば、このようなＦＲＥＴ対の１つのメンバーが検出体オリゴヌクレオチド中に取り込まれ得、そして他方のメンバーが標識オリゴヌクレオチド中に取り込まれ得、その結果、標識オリゴヌクレオチドの検出体オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションが、検出可能なＦＲＥＴ相互作用を生じる。これは、ハイブリダイズしなかった標識オリゴヌクレオチド分子を除去するための洗浄ステップを行う必要性なくして、標識オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの検出を可能にする。この実施形態における分子のアクセプター−ドナー対は、例えば、両方が蛍光色素であり得る。あるいは、ＦＲＥＴ対の１つのメンバーが発光部分またはクエンチャーであり得る。別の実施形態では、単一の標識オリゴヌクレオチド配列が、効率的ＦＲＥＴのための別個の位置に位置決めされた２つ以上の蛍光部分を含み得、個々の色素から観察され得るより大きなＳｔｏｋｅｓシフトを生成する。
【００５２】
本発明のシステムにおける使用のための化学発光標識は、アクリジニウムエステル、ルミノールおよびその誘導体、ジオキセタン誘導体、エクオリンおよびルシフェリンを含む。
【００５３】
ルテニウムキレートおよびそれらの誘導体、または窒素酸化物部分を所有する試薬のような電気発光標識がまた、高い程度の感度が必要であるときに用いられ得る。光学的信号を生成するその他の標識は、例えば、ＯｐｔｉＢｉｎｄポリスチレンおよびＯｐｔｉＬｉｎｋカルボキシレート−改変微小粒子（Ｓｅｒａｄｙｎ  Ｉｎｃ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮから入手可能）のような、内部に色素を取り込む着色微小粒子を含む。
【００５４】
標識としての使用に適切な酵素は、制限されないで、ヒドロラーゼ、リアーゼ、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼを含む。特定の例は、ルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リパーゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびブタ肝臓エステラーゼを含む。酵素が標識として供される実施形態では、基質／酵素反応が、代表的には色の変化である検出可能な信号を生じる産物を形成し、その場合には、酵素の色原体基質が、本発明の方法において、反応混合物中に添加されなければならない。例えば、３，３’ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）は、光学的信号を生成するために西洋ワサビペルオキシダーゼと接触され得る。不溶性蛍光産物を生成する基質システム、例えば、アルカリホスファターゼのためのＥＬＦ基質システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）もまた利用可能である。化学発光信号もまた、ルシフェラーゼを用いてのように、酵素的に産生され得る。
【００５５】
スピン標識もまた、本発明のシステムおよび方法で標識として用いられ得る。スピン標識は、遷移金属イオンおよびフリーラジカルのような、電子スピン共鳴分光学によって検出され得る不対電子スピンを示す原子または原子の群を含む分子である。例えば、このスピン標識、１−オキシ−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−３−メチル）−メタンチオスルホネートであり得、これは、常磁性酸化窒素側鎖を含む。放射活性標識もまた、本発明のアッセイで用いられ得るが、これらは、このような標識を含む材料を配置する困難性および出費に起因してより好まれない。ヌクレオチドは、例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび３２Ｐγ−標識ＡＴＰを用いてそれらの５’末端上で標識され得る。
【００５６】
標識は、当該技術分野で公知の方法でオリゴヌクレオチドに付着され得る。例えば、一級アミンを取り込むオリゴヌクレオチドが、種々の標識に結合体化され得る。ＴＦＡ  Ａｍｉｎｏｌｉｎｋホスホルアミダイト（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡから入手可能）のような試薬が、核酸合成の間にオリゴヌクレオチドの５’−末端でこのようなアミノ基を確立し得る。標識はまた、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）の使用によるように、オリゴヌクレオチドの３’末端でオリゴヌクレオチド中に取り込まれ得る。あるいは、標識は、色素−ホスホルアミダイトを用いる合成の間にオリゴヌクレオチドの配列中に直接取り込まれ得る。これは、水溶液中で可溶性に乏しい標識が、標識オリゴヌクレオチド中に取り込まれることを可能にする利点を有する。本アッセイの感度を増加するために、１つ以上の標識部分が標識オリゴヌクレオチド中に取り込まれ得る。
【００５７】
標識は、マイクロウェルプレートリーダー、フローサイトメーター、分光光度計、蛍光計、および質量分光計のような検出器で検出され得る。用いられるべき特定の検出器は、当業者に公知のように、特定のアッセイで用いられる標識および固体支持体に依存する。
【００５８】
（固体支持体）
固体支持体は、捕捉試薬が結合し得、本発明の方法に従ってアッセイを行うことを妨害せず、そして本発明の方法で用いられる試薬の存在下で不溶性である任意の材料から作製され得る。適切な材料は、ニトロセルロース、ガラス、およびナイロン、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリグリシジルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリアミド、およびポリビニルクロライドを含む多くの合成ポリマーを含む。粒子支持体は、例えば、セファロースから作製され得る。
【００５９】
いくつかの実施形態では、固体支持体は、捕捉試薬がアレイで付着される平坦表面を備える。例えば、この固体支持体は、マイクロウェルプレート、ウェル、メンブレン、導波管、またはその他の比較的平坦な表面であり得る。１つの好ましい実施形態では、異なるオリゴヌクレオチドが、Ａ２プレート（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡから入手可能）のウェルの表面のような実質的に平坦な表面の異なる予め規定された領域に付着され、そして相補的オリゴヌクレオチドを含む捕捉試薬がそれらにハイブリダイズされ得、それによって、この表面に捕捉試薬を付着する。
【００６０】
その他の実施形態では、固体支持体は粒子を含む。粒子支持体は、約５０ｎｍ〜約５００μｍのサイズ範囲であり得、そしてＦｒａｃｔｏｇｅｌポリビニリデンメタクリレート粒子（Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能）、セファロース粒子（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから入手可能）、磁性粒子、常磁性粒子、およびラテックス粒子のような粒子を含み得る。
【００６１】
平面およびファイバーの光学的導波管がまた、固体支持体として用いられ得る。このような支持体は、内部反射によって光学的導波管内で光を伝搬し、一過性の波が、支持体を覆う水相中に波長の一部分を貫通させる。この一過性の波は、導波管表面に位置する蛍光部分のような分子と光学的に相互作用する。このような標識は、この一過性によって励起され得、そしてそれによって非結合標識オリゴヌクレオチドを洗浄する必要性なくして検出される。
【００６２】
（捕捉試薬および検出試薬）
特異的結合パートナーを含む、本発明のシステムおよび方法で用いられる捕獲試薬は、当該技術分野で公知の様式で固体支持体に付着され得る。１つの実施形態では、この捕捉試薬は、例えば、吸着、共有結合により、またはビオチン−アビジンもしくは類似の結合によって固体支持体に直接および不可逆的に付着され得る。好ましい実施形態では、この捕捉試薬は、固体支持体に可逆的に結合される。例えば、この捕捉試薬は、最初、オリゴヌクレオチドに結合体化され得、そして次に、支持体に付着されている相補的オリゴヌクレオチドを経由して固体支持体に結合され得る。このアプローチはいくつかの利点を有し、固体支持体上の特定の位置に捕捉試薬を特異的に結合する能力、および単一タイプの支持体を広範な種類の捕捉試薬と用いる能力を含む（例えば、米国特許第５，６４８，２１３号を参照のこと）。
【００６３】
オリゴヌクレオチドは、当該技術分野で公知の様式で捕捉試薬または検出試薬に付着され得る。例えば、誘導体化ＰＥＧポリマーまたはオリゴマーのような付着リンカーを有するオリゴヌクレオチドは、タンパク質または脂質特異的結合パートナーに結合体化され得る。本明細書における使用のためのヘテロ二官能性ＰＥＧオリゴマーは、１つの末端にＮＨＳエステルを有し、そして他方の末端に保護されたヒドラジドを有し得る。
【００６４】
捕捉試薬または検出試薬が、抗体またはその他のタンパク質もしくはペプチドであるとき、それは、ホモ二官能性試薬、すなわち、１，４−フェニレンジイソチオシアナート、およびジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）のような抗体およびオリゴヌクレオチドの両方に結合する試薬でオリゴヌクレオチドに結合され得る。例えば、このオリゴヌクレオチドは、カップリング段階で、試薬Ａｍｉｎｏｌｉｎｋ２（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡから入手可能）のような５’アミノヘキシルホスフェートリンカー、トリフルオロアセチル−保護アミノ側鎖を有するホスホルアミダイトカップリング試薬を採用することにより、末端一級脂肪族アミンとともに提供され得る。このオリゴヌクレオチドは、次に、アミン基のような、抗体上の反応性部分に連結され得る。
【００６５】
その他の実施形態では、捕捉試薬（および／または検出試薬）は、２ステッププロセスでオリゴヌクレオチドに結合され得、それによって、捕捉試薬およびオリゴヌクレオチドは別個に反応されるか、またはそうでなければ、互いへの付着のために調製される。例えば、アビジン部分がオリゴヌクレオチドに付着され得、そしてビオチン成分が捕捉試薬に付着され得る。このオリゴヌクレオチドは、次いで、これら２つの成分が接触されるとき、捕捉試薬に結合するようになる。
【００６６】
あるいは、オリゴヌクレオチドは、最初、オリゴヌクレオチドのアミノ基と反応する第１の基を含むヘテロ二官能性リンカーと反応され得、その後、リンカーの第２の基が、抗体のような捕捉または検出試薬を含むポリペプチドのチオール基と反応され得る（米国特許出願公開番号第２００３００９２９０１号に記載のように）。このリンカーは、例えば、ＳＭＣＣ（Ｎ−スクシンイミジル−４−（マレイミ−ドメチルシクロヘキサン）−１−カルボキシレート）、またはスルホ−ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬから入手可能）のようなより水溶性のアナログであり得る。これらの試薬は、１つの末端に、タンパク質捕捉試薬またはオリゴヌクレオチド上のアミンによって置換されるＮＨＳエステル基を、そして他方の端部にマレイミド基を含む。
【００６７】
１つの実施形態では、抗体上のアミン基が、ＳＭＣＣと反応され、マレイミド誘導体を生成する。オリゴヌクレオチド上の活性アミンは、２−アミノチオラン（Ｔｒａｕｔの試薬）と反応され、オリゴヌクレオチドに付着された末端チオール基を生成する。活性化抗体およびオリゴヌクレオチド成分の反応は、次いで、結合体を生成する。この手順の改変例では、チオール化試薬ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート）がいずれかの成分上で保護されたチオール官能性を生成するために用いられ得る。
【００６８】
（アッセイ方法）
本発明の方法は、特異的結合パートナーが分析物に結合され、そしてこの特異的結合パートナーに結合体化されたオリゴヌクレオチドが、相補的標識オリゴヌクレオチドによって直接検出されるサンドイッチタイプのアッセイに関する。本発明の方法の１つの実施形態は、図１に示される。図１は、固相１００に直接付着された抗体１１０を含む捕捉試薬を描写する。捕捉抗体１１０に結合されるのは、サンプルからの分析物１２０である。検出体オリゴヌクレオチド１４０と結合体化された第２の分析物−特異的抗体１３０（ともに検出試薬を形成する）は、分析物１２０の異なるエピトープに結合される。検出可能な標識１６０が相補的オリゴヌクレオチド１５０に付着され、これは、検出試薬の検出体オリゴヌクレオチド１４０にハイブリダイズされる。この実施形態では、捕捉抗体１１０は、サンプルが捕捉抗体１１０と接触される前に固体支持体１００に付着される。
【００６９】
図２に示されるように、捕捉抗体１１０がまた、オリゴヌクレオチド２１０および２２０を経由して固体支持体１００に結合され得る。この実施形態では、オリゴヌクレオチド２１０は、固体支持体１００に結合され、そして捕捉抗体１１０に結合された別のオリゴヌクレオチド２２０は、支持オリゴヌクレオチド２１０の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。この捕捉抗体１１０は、これら２つの成分が、オリゴヌクレオチド２１０と２２０とがハイブリダイズすることを可能にする条件下で接触されるとき、固体支持体１００に結合するようになる。
【００７０】
図２に示される実施形態では、本発明のアッセイは、すべてのアッセイ成分（例えば、サンプル、捕捉試薬、検出試薬、および相補的標識オリゴヌクレオチド）が、溶液相中に導入され得、分析物、捕捉試薬および検出試薬を含む複合体を形成する均一フォーマットを含み、すなわち、サンプルは、捕捉試薬が固体支持体に付着される前に捕捉試薬（および／または検出試薬）と接触される。捕捉試薬、検出試薬、相補的標識オリゴヌクレオチド、および溶液中の分析物間の均一反応を経由する複合体を形成する動力学は、溶液相材料と固体材料（例えば、図１に示されるような固体支持体に結合された捕捉試薬）との間の不均一反応での場合であろう場合より顕著により速い。溶液相複合体を含む反応混合物は、次いで、例えば、オリゴヌクレオチドが付着されている支持体と接触され得、その結果、この捕捉試薬に付着された相補的オリゴヌクレオチドは、支持オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、それによって、支持体上にこの複合体を効率的に回収する。この複合体に結合しない任意の材料は溶液相中に残り、そして上記複合体および固体支持体から容易に分離され得る。
【００７１】
サンプル中の分析物の存在を決定するため、またはサンプル中の分析物の量を決定するための本発明のシステムおよび方法で用いられる検出方法は、用いられる標識に依存する。例えば、この標識が、フルオレセインまたはローダミンのような蛍光色素であるとき、標識を検出する方法は、レーザー走査共焦点顕微鏡法（ＬＳＣＭ）、広視野蛍光顕微鏡法、またはＣＣＤカメラであり得る。３，３’ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）との西洋ワサビペルオキシダーゼのような、標識が酵素であり、そして信号が色原体基質で生成されるとき、分光光度計が、検出のために用いられ得る。その他の標識を検出するために当該技術分野で公知の方法が、同様に採用され得る。
【００７２】
（アッセイ条件）
本発明の方法では、複合体が、分析物、捕捉試薬、検出試薬、およびオリゴヌクレオチドの１つ以上のセット間で形成される。溶液中のこの複合体の形成は、用いられる分析物、捕捉試薬、検出試薬、およびオリゴヌクレオチドに依存して、広範な範囲の条件下で行われ得る。一般に、複合体形成は、所定の濃度の分析物について、より高い濃度の捕捉試薬および／または検出試薬でより迅速に起こる。過剰の捕捉試薬および検出試薬が好ましくは用いられ、そして好ましくは、少なくとも２倍過剰の捕捉および／または検出試薬が、サンプル中の分析物の量（または予期される量）に対して用いられる。
【００７３】
複合体形成は、捕捉試薬、検出試薬、および分析物の変性温度によって制限される、広範な範囲の温度に亘って生じ得る。好ましくは、この複合体形成は、約１５℃〜約７０℃の範囲の温度で、そして最も好ましくは（便利さの目的のために）室温で実施される。ｐＨもまた、反応体が変性されるようになるｐＨである制限因子をともない、広範な範囲に亘って変動され得る。このｐＨは、通常、約２〜約１１、好ましくは約４〜約１０、そして最も好ましくは７に近い範囲である。さらに、ウシ胎児血清タンパク質のような種々の材料が、非特異的相互作用を最小にするために用いられ得る。
【００７４】
本発明の方法では、捕捉試薬、検出試薬、および分析物を結合するために用いられる反応条件はまた、検出試薬に付着された検出体オリゴヌクレオチドの相補的標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを可能にするべきである。好ましくは、捕捉試薬はまた、上記で記載のように、相補的オリゴヌクレオチドを経由して固体支持体に付着される。このような相補的オリゴヌクレオチド間の二重鎖の形成のための適切な条件は、当業者によって決定され得る。本発明の方法を実施するための適切な温度もまた、当業者によって決定され得る。好ましくは、融点（Ｔｍ、一対の相補的オリゴヌクレオチドの５０％が二重鎖を形成する温度）未満の温度が用いられる。
【００７５】
本発明の方法のアッセイ条件は、好ましくは、検出体オリゴヌクレオチドが、その特異的相補的標識オリゴヌクレオチドのみにハイブリダイズするように選択される。この標識オリゴヌクレオチドは、本発明の方法では、比較的低い率でその他のオリゴヌクレオチドに非特異的にハイブリダイズし得るが、アッセイ条件は、好ましくは、このような交差ハイブリダイゼーションが、アッセイ結果の妨害を最小にするために、５％未満、より好ましくは約０．１％未満の率で、そしてなおより好ましくは約０．０１％未満の率で生じるように選択される。好ましいアッセイ条件は、約７のｐＨ、約５０ｍＭと５００ｍＭとの間のイオン強度、および約２℃と４５℃との間の温度を含む。２５％ｖ／ｖまでのグリセロールまたはホルムアミドのような有機化合物が、ハイブリダイゼーションの忠実度を改善するためにアッセイ溶液中に含められ得る。
【００７６】
捕捉試薬が相補的オリゴヌクレオチドによって固体支持体に付着される好ましい実施形態では、この捕捉試薬は固体支持体から放出され得、そしてこの支持体は、同じか、または異なる捕捉試薬とともに別のアッセイで用いられ得る。結合された捕捉試薬は、適切な解離条件を用いて支持体から放出され得る。脱イオン水または尿素の濃縮溶液（例えば、７Ｍ）またはホルムアミド（例えば、水中３０％〜６０％）が適切に用いられ得る。あるいは、捕捉試薬は、固体支持体上に保持され得、そして分析物および検出試薬が、支持体に付着された捕捉試薬を再使用するために除去され得る。
【００７７】
（イソフォーム検出）
サンプル中のイソフォームは、本発明の方法およびシステムで有利に検出され得る。サンプル中のイソフォームを検出するとき、これらイソフォームのすべてを特異的に結合し得る捕捉試薬が、各イソフォームに特異的な検出試薬とともに用いられ得る。このような検出試薬の各々は、異なるヌクレオチド配列を有する検出体オリゴヌクレオチドを含み、その結果、各検出試薬は、異なる標識を保持する標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし得る。
【００７８】
図３に示される１つの実施形態では、検出試薬の検出体オリゴヌクレオチドは、イソフォームを検出するとき、２つの異なる標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし得る。標識オリゴヌクレオチドの１つ３５０は、アッセイで用いられる検出体オリゴヌクレオチド３４０、３４２、３４４のすべてによって保持される配列３４８に相補的な配列を含み得、その結果、このような標識オリゴヌクレオチド３５０の標識３６０の検出は、サンプル中の特定の分析物のすべてのイソフォーム３２１、３２２、３２３の存在または量を示し得る。このアッセイで用いられる各検出抗体は特定のイソフォームに特異的であり、そして各抗体は、異なる配列を有するオリゴヌクレオチドを含み、その結果、抗体３３０、３３２、３３４に結合され、そしてオリゴヌクレオチド配列３４１、３４３、３４５にそれぞれ相補的である標識オリゴヌクレオチド３５１、３５３、および３５５は、サンプル中の分析物の特異的イソフォームの存在または量を決定するために検出され得る。これら標識オリゴヌクレオチド３５１、３５３、および３５５の各々は、それぞれ、異なる標識３６１、３６３、３６５を保持する。各イソフォームを同定するために用いられる標識は、互いとは異なるべきであり、そしてまた、サンプル中のすべてのイソフォームを同定するために用いられる標識とも異なる。
【００７９】
図３に示されるように、イソフォームは、非分岐構造がまた用いられ得るが、分岐オリゴヌクレオチドを含む検出体オリゴヌクレオチドの使用により検出され得る。分岐オリゴヌクレオチド３４０、３４２、３４４の各々の１つの分岐は、例えば、イソフォーム特異的検出抗体３３０、３３２、３３４のすべてによって保持される検出体オリゴヌクレオチド３５０に共通の配列３４８を含み得る。これら分岐オリゴヌクレオチド３４０、３４２、３４４の各々の別の分岐は、分析物の特定のイソフォーム３２１、３２２、３２３にそれぞれ特異的な配列３４１、３４３、または３４５の１つを含み得、そして相補的オリゴヌクレオチド３５１、３５３、または３５５は、それぞれ、サンプル中のそのイソフォームに対応する分析物の量を検出するためにその配列に結合され得る。
【００８０】
１つの実施例では、遊離の前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のイソフォームが、本発明のシステムおよび方法で検出され得る。ＰＳＡは、ｐＰＳＡ、ＢＰＳＡ、およびｉＰＳＡを含む、いくつかのイソフォームで存在し、そしてこれらイソフォームの相対的頻度を決定することは、前立腺癌から良性の前立腺肥大を区別することにおいて有用であり得る。本発明の方法は、特定のサンプルについて、合計の遊離ＰＳＡを定量することとともに、単一の試験領域内でこのような決定がなされることを許容する。複数のオリゴヌクレオチドがまた、本発明の方法を用いて、種々の異なる分析物のイソフォーム分布の同時特徴付けを許容するために、試験領域内の空間的に別個の領域でプリントされ得る。
【実施例】
【００８１】
（実施例１：オリゴヌクレオチド−結合プレートの調製）
ポリプロピレンプレートを、それらを、プラズマチャンバー中に配置し、そしてＰｌａｓｍａ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍｏｄｅｌ  ０１５０Ｅ  Ａｎｉｍａｔｏｒ（Ｐｌａｓｍａ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ａｉｒｃｏ  Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２７００  Ｍａｘｗｅｌｌ  Ｗａｙ、Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ、Ｃａｌｉｆ．９４５３３）を用いて、アンモニアガスでそれらをアミノ化することによりアミノ化した。これらプレートは、以下の条件に供した：
ステップＩ：アンモニア、０．２５６  Ｔｏｒｒ、４分
ステップＩＩ：アンモニア、０．３０６  Ｔｏｒｒ、プラズマ４０％出力（ＲＦ）、２分
ステップＩＩＩ：アンモニア、０．２５６  Ｔｏｒｒ、２分
ステップＩＶ：Ａｒ、０．２５６  Ｔｏｒｒ、１０分
活性化固体支持体を生成するために、アミノ化されたプレートを、次いで、アルゴン下のグローブボックス中、３〜５％の乾燥トリエチルアミンとともに無水ＡｃＣＮ中、１，１−カルボニルジトリアゾールの０．１Ｍ溶液と反応させた。これらプレートを３回洗浄し、そして風乾した。
【００８２】
この活性化固体支持体に付着された生物学的分子は、ＤＮＡ合成機ＡＢＩ３９４（Ａｐｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｅｍｅｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）に関する製造業者のプロトコールに従って、３’−Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ７  ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）上で合成された３’−アミノオリゴヌクレオチド−５’−Ｃｙ３分子であった。Ｃｙ３は、蛍光体であり、そしてＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４４９０１  Ｆａｌｃｏｎ  Ｐｌａｃｅ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡから購入され得るシアニン色素である。４％Ｎａ２ＳＯ４とともに、重炭酸緩衝液ｐＨ９．３中の３’−アミノオリゴヌクレオチド−５’−Ｃｙ３の２０ΦＭを、Ｂｉｏｍｅｋ２０００デバイス（Ｂｅｃｋａｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を用いて、閉鎖されたダストフリーで、かつ湿潤チャンバー中でプリントすることにより、３×３アレイの形態で、プレートのいくつかの部位上に、約１０ミクロンと約５００ミクロンとの間の直径を有する円形スポット内に、約５〜２５ナノリットルで堆積した。これらプリントされたプレートを、湿潤チャンバー中に一晩放置した。非反応活性基を、５０ｍＭの炭酸緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌのカゼインで一晩室温でクエンチし、そして次に、水で洗浄した。オリゴヌクレオチドはまた、同様の技法を用いて懸濁物の微小粒子に付着され得る。
【００８３】
（実施例２：表面に直接付着された抗体とのサンドイッチイムノアッセイ）
活性化固体支持体を備えたアミノ化ポリプロピレンマイクロウェルプレートは、実施例１におけるように調製される。ヒトサイトカインＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＬ−８に対する第１のセットの抗体を、適切な温和なアルカリプリンティング緩衝液中に１〜２ｍｇ／ｍＬで個々に希釈し、そして市販のアレイ整列器具を用いてこのプレートのウェル内の別個の位置上に分与する。ヒトサイトカインＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＬ−８に対する第２のセットの抗体を、米国特許出願公開番号第２００３／００９２９０１号に記載のように、特異的オリゴヌクレオチドと結合体化する。これらの抗体は、第１のセットの抗体と比較して、異なるエピトープに特異的である。この結合体化で用いれるオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドは、種々の末端蛍光基とともに商業的供給者から得られ得る。
【００８４】
反応を許容するための湿潤チャンバー中の一晩のインキュベーションの後、プリントされたプレートのウェルを、Ｔｒｉｓ／Ｔｗｅｅｎ−２０洗浄緩衝液ですすぎ、未反応抗体およびカゼインでブロックされた残存反応部位を除去する。ヒトサイトカインＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＬ−８を含むサンプルを、プリントされたマイクロウェルプレートのウェル中に分与し、そして室温で１時間インキュベートする。このマイクロウェルプレートを、Ｔｒｉｓ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液で数回洗浄し、ウェルからサンプル中の非結合分析物および可能な妨害物質を除去する。オリゴヌクレオチド結合体化抗体を、ウェルに、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロック緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬから入手可能）のような適切なブロック緩衝液中１〜５μｇ／ｍＬでウェルに添加し、そして室温で１時間インキュベートされる。マイクロウェルプレートを、Ｔｒｉｓ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液で数回洗浄し、未結合オリゴヌクレオチド−結合体化抗体を除去する。
【００８５】
上記の抗体結合体で用いられたオリゴヌクレオチドに相補的な蛍光で標識されたオリゴヌクレオチドを、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロック緩衝液のような適切な緩衝液中で希釈し、そしてウェルに添加される。ハイブリダイゼーションを、好ましくは、暗室中で、室温で１時間の間生じさせる。ハイブリダイゼーションの効率および忠実度を調節するために、当該分野で公知である塩または有機溶媒のような添加物をインキュベーション緩衝液中に含むことが必要であり得る。このマイクロウェルプレートを、Ｔｒｉｓ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液で数回洗浄し、ハイブリダイズしない蛍光オリゴヌクレオチドを除去する。
【００８６】
結果は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．のＡ２リーダーを含む種々の市販のプレートベースのマイクロアレイリーダーを用いて可視化され得る。プリントされた「捕捉」抗体の空間的分離は、すべてのオリゴヌクレオチドに対して同じ蛍光標識が用いられる場合にのみ必要である。スペクトル的に別個のオリゴヌクレオチド標識の使用は、試験領域中の捕捉抗体の混合物の使用を許容する。あるいは、微小粒子が固体支持体として利用される場合、これらの結果は、フロサイトメーターを用いて読み取られ得る。
【００８７】
（実施例３：オリゴヌクレオチドリンカーを用いるサンドイッチイムノアッセイ）
活性化固体支持体を備えたアミノ化ポリプロピレンマイクロウェルプレートは、実施例１におけるように調製される。異なる配列を有する４つのアミン末端オリゴヌクレオチド（Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺと称される）を、適切な温和なアルカリプリンティング緩衝液中に１０〜５０ＯＤ／ｍＬで個々に希釈し、そして市販のアレイ整列器具を用いてこのプレートのウェル内の別個の位置上に分与する。反応を許容するための湿潤チャンバー中の一晩のインキュベーションの後、プリントされたプレートのウェルを、Ｔｒｉｓ／Ｔｗｅｅｎ−２０洗浄緩衝液ですすぎ、未反応抗体およびカゼインでブロックされた残存反応部位を除去する。これらのプレートは乾燥され、そして使用の前に延長された期間の間貯蔵され得る。
【００８８】
ヒトサイトカインＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＬ−８に対する第１のセットの抗体は、各々、米国特許出願公開番号第２００３／００９２９０１号に開示される方法を用いて、オリゴヌクレオチドＷ、Ｘ、Ｙ、またはＺの１つに相補的な特異的オリゴヌクレオチドと結合体化され、その各タイプの抗体は、オリゴヌクレオチドＷ、Ｘ、Ｙ、またはＺの１つに相補的なオリゴヌクレオチドと結合体化される。これらの抗体複合体は、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロック緩衝液のような適切なブロック緩衝液中０．１〜５μｇ／ｍＬに希釈され、そして抗体アレイを生成するためにプリントされたプレートのウェルに添加される。これらは、室温で１時間ハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションの効率および忠実度を調節するために、当該分野で公知である塩または有機溶媒のような添加物をインキュベーション緩衝液中に含むことが必要であり得る。
【００８９】
このマイクロウェルプレートを、Ｔｒｉｓ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液で数回洗浄し、未結合オリゴヌクレオチド−結合体化抗体を除去する。ヒトサイトカインＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＬ−８を含むサンプルを、プリントされたマイクロウェルプレートのウェル中に分与し、そして室温で１時間インキュベートする。このマイクロウェルプレートを、Ｔｒｉｓ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液で数回洗浄し、ウェルからサンプル中の非結合分析物および潜在する妨害物質を除去する。
【００９０】
ヒトサイトカインＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＬ−８に対する第２のセットの抗体を、米国特許出願公開番号第２００３／００９２９０１号に記載のように、特異的オリゴヌクレオチド１、２、３、および４と結合体化する。これらの抗体は、第１のセットの抗体と比較して、異なるエピトープに特異的である。この結合体化で用いられるオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドは、種々の末端蛍光基とともに商業的供給者から得られ得る。これらのオリゴヌクレオチド−結合体化抗体は、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロック緩衝液のような適切なブロック緩衝液中１〜５μｇ／ｍＬでウェルに添加され、そして室温で１時間インキュベートされる。
【００９１】
マイクロウェルプレートを、Ｔｒｉｓ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液で数回洗浄し、未結合オリゴヌクレオチド−結合体化抗体を除去する。上記の抗体複合体中で用いられたオリゴヌクレオチドに相補的な蛍光標識されたオリゴヌクレオチドを、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロック緩衝液のような適切なブロック緩衝液中で希釈し、そしてウェルに添加される。ハイブリダイゼーションを、好ましくは、暗室中で、室温で１時間の間生じさせる。ハイブリダイゼーションの効率および忠実度を調節するために、当該分野で公知である塩または有機溶媒のような添加物をインキュベーション緩衝液中に含むことが必要であり得る。このマイクロウェルプレートを、Ｔｒｉｓ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液で数回洗浄し、ハイブリダイズしない蛍光オリゴヌクレオチドを除去する。
【００９２】
結果は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．のＡ２リーダーを含む種々の市販のプレートベースのマイクロアレイリーダーを用いて可視化され得る。プリントされたオリゴヌクレオチドの空間的分離は、すべての標識オリゴヌクレオチドに対して同じ蛍光「タグ」が用いられる場合にのみ必要である。スペクトル的に別個の蛍光タグの使用は、試験領域中の捕捉抗体の混合物の使用を許容する。あるいは、微小粒子が固体支持体として利用される場合、これらの結果は、フロサイトメーターを用いて読み取られ得る。
【００９３】
（実施例４：オリゴヌクレオチドリンカーを用いるイソフォーム−特異的アッセイ）
活性化固体支持体を備えたアミノ化ポリプロピレンマイクロウェルプレートは、実施例１におけるように調製される。アミノ末端オリゴヌクレオチドを、適切な温和なアルカリプリンティング緩衝液中に１０〜５０ＯＤ／ｍＬで希釈し、そして市販のアレイ整列器具を用いてこのプレートのウェル内の別個の位置上に分与する。
【００９４】
反応を許容するための湿潤チャンンバー中の一晩のインキュベーションの後、プリントされたプレートのウェルを、Ｔｒｉｓ／Ｔｗｅｅｎ−２０洗浄緩衝液ですすぎ、未反応オリゴヌクレオチドおよびカゼインでブロックされた残存反応部位を除去する。これらのプレートは乾燥され、そして使用の前に延長された期間の間貯蔵され得る。
【００９５】
多くの異なるイソフォームとして存在する前立腺特異的抗原に対する抗体は、米国特許出願公開番号第２００３／００９２９０１号に開示される方法を用いて、マイクロウェルプレート上に分与されたオリゴヌクレオチドに相補的な特異的オリゴヌクレオチドと結合体化される。これらの捕捉抗体は、ＰＳＡのすべてのイソフォームに共通であるエピトープに特異的である。
【００９６】
これら結合体化された抗体は、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロック緩衝液のような適切なブロック緩衝液中０．１〜５μｇ／ｍＬに希釈され、そして抗体アレイを生成するためにプリントされたプレートのウェルに添加される。これらは、室温で１時間ハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションの効率および忠実度を調節するために、当該分野で公知である塩または有機溶媒のような添加物をインキュベーション緩衝液中に含むことが必要であり得る。このマイクロウェルプレートを、Ｔｒｉｓ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液で数回洗浄し、未結合オリゴヌクレオチド−結合体化抗体を除去する。異なるイソフォームの混合物として分析物を含むサンプルを、プリントされたマイクロウェルプレートのウェル中に分与し、そして室温で１時間インキュベートする。このマイクロウェルプレートを、Ｔｒｉｓ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液で数回洗浄し、ウェルからサンプル中の非結合分析物および潜在の妨害物質を除去する。
【００９７】
ｆ−ＰＳＡ、ＰＳＡ−ＡＣＴ、およびＰＳＡ−ＭＧのイソフォーム特異的エピトープに対する検出抗体のセットの各メンバーを、米国特許出願公開番号第２００３／００９２９０１号に記載のように、特異的検出体オリゴヌクレオチドと結合体化する。このセット中のオリゴヌクレオチドは、２つの別個の領域、１つは特異的分析物に対するすべての標識抗体に共通の領域、および各イソフォーム特異的抗体に特有である第２を有する。これらの領域は、連続的線状ストランドまたは分岐配列いずれかとして提示され得る。これらの配列の両方の領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、種々の末端蛍光基とともに商業的供給者から得られ得るが、共通領域を標識するための蛍光体は、上記のイソフォーム特異的領域のために用いられるものとスペクトル的に別個であることが重要である。
【００９８】
これらのオリゴヌクレオチド−結合体化抗体は、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロック緩衝液のような適切なブロック緩衝液中１〜５μｇ／ｍＬでウェルに添加され、そして室温で１時間インキュベートされる。このマイクロウェルプレートを、Ｔｒｉｓ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液で数回洗浄し、未結合オリゴヌクレオチド−結合体化抗体を除去する。
【００９９】
上記の検出抗体に結合体化されたオリゴヌクレオチドの共通領域およびイソフォーム特異的領域に相補的な蛍光で標識されたオリゴヌクレオチドは、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロック緩衝液のような適切なブロック緩衝液中で希釈し、そしてウェルに添加される。ハイブリダイゼーションを、好ましくは、暗室中で、室温で１時間の間生じさせる。ハイブリダイゼーションの効率および忠実度を調節するために、当該分野で公知である塩または有機溶媒のような添加物をインキュベーション緩衝液中に含むことが必要であり得る。このマイクロウェルプレートを、次いで、Ｔｒｉｓ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液で数回洗浄し、ハイブリダイズしない蛍光オリゴヌクレオチドを除去する。
【０１００】
結果は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．のＡ２リーダーを含む種々の市販のプレートベースのマイクロアレイリーダーを用いて可視化され得る。標識オリゴヌクレオチドの共通領域に相補的な蛍光オリゴヌクレオチドからの放射は、総分析物を定量化するために用いられ得る。検出体オリゴヌクレオチドのイソフォーム特異的領域に相補的な標識オリゴヌクレオチドについての蛍光放射は、ＰＳＡ分析物の異なるイソフォームを同時に定量化するために用いられ得る。あるいは、微小粒子が固体支持体として利用される場合、これらの結果は、フロサイトメーターを用いて読み取られ得る。
【０１０１】
本発明を、特定の好ましい実施形態を参照して相当に詳細に論議されているが、その他の実施形態が可能である。それ故、添付の請求項の範囲は、本開示に含まれる好ましい実施形態の説明に制限されるべきではない。本明細書中に引用されるすべての参考文献は、それらの全体が参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
（図面）
本発明のこれらおよびその他の特徴、局面および利点は、上記の記載、添付の請求項、および添付の図面に関してより良好に理解されるようになり、ここで、
【図１】図１は、本発明のシステムおよび方法の１つの実施形態における分析物の結合の例示である。
【図２】図２は、本発明のシステムおよび方法の別の実施形態における分析物の結合の例示である。
【図３】図３は、検出体オリゴヌクレオチドが分岐オリゴヌクレオチドである、本発明のシステムおよび方法の別の実施形態における分析物のイソフォームの結合の例示である。
【０１０３】
本開示で特定されるすべての寸法は例示のみであって、そして制限的であることは意図されない。さらに、これらの図面で示される比は、必ずしもスケール通りではない。本開示を参照する当業者によって理解されるように、本開示に開示される任意のデバイスまたはデバイスの部分の実際の寸法は、それらの意図される使用によって決定される。
【図１】
2008545142.tif 000003
【図２】
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【図３】
2008545142.tif 000005
【国際調査報告】
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2008545142.tif 000007