(57)【要約】  一般構造式（I）: Xn-C1-X1-50-C2-X0-5-C3-X1-100-C4-X1-100-C5-X1-50-C6-X0-5-C7-X1-50-C8-Xmのポリペプチドならびにその製造および使用が開示される。
2008529484.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般構造式（I）：
Xn-C1-X1-50-C2-X0-5-C3-X1-100-C4-X1-100-C5-X1-50-C6-X0-5-C7-X1-50-C8-Xm（I）
［式中、Xは２０種類の天然アミノ酸のいずれかであり、
nおよびmは０〜５００の数であり、
Cはシステインである］
で示されるポリペプチドであって、但し、XnまたはXmとして略記したペプチド配列の少なくとも一方は、天然ではハイドロフォビンと連結されていない少なくとも２０アミノ酸長のペプチド配列であり、また該ポリペプチドはガラス表面の被覆後の接触角を少なくとも２０°変化させる、前記ポリペプチド。
【請求項２】
前記構造式（I）がクラスIハイドロフォビンを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記構造式（I）がdewA、rodA、sc3、hypA、hypB、basf1、basf2からなる群より選択されるハイドロフォビンを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記構造式（I）が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４より選択される配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
XnまたはXmが配列番号１６、１８より選択されるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
XnまたはXmが(His)4-10配列である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記構造式（I）が配列番号２０、２２、２４からなる群より選択されるポリペプチドを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸を宿主生物中で発現させ、このようにして得られたタンパク質を、適宜精製した後に、単離することによって、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドを製造する方法。
【請求項１０】
使用する宿主生物が大腸菌である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
表面の被覆のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のハイドロフォビンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規ハイドロフォビン融合タンパク質、ならびにその製造および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハイドロフォビンは、糸状菌に特有であり他の生物には見られない約１００個のアミノ酸からなる低分子タンパク質である。最近、「Chaplin」と呼ばれ、同様に高い界面活性特性を有するハイドロフォビン様タンパク質がストレプトマイセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）で見出された。Chaplinは水-空気界面で構築されて、アミロイド様線維を生じうる（Classenら2003 Genes Dev 1714-1726; Elliotら2003, Genes Dev. 17, 1727-1740）。
【０００３】
ハイドロフォビンは、様々な菌類の構造、例えば、気中菌糸、胞子、子実体などの表面上に水不溶性形態で分布している。ハイドロフォビンの遺伝子は、子嚢菌類、不完全菌類および担子菌類から単離された。いくつかの菌類、例えばシゾフィラム・コムネ（Schizophyllum commune）、コプリヌス・シネレウス（Coprinus cinereus）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）は、２以上のハイドロフォビン遺伝子を有する。明らかに、様々なハイドロフォビンは菌類の異なる発達段階に関与する。上記ハイドロフォビンはおそらく異なる機能を担っていると思われる（van Wetterら、2000, Mol. Microbiol., 36, 201-210; Kershawら1998, Fungal Genet. Biol, 1998, 23, 18-33）。
【０００４】
気中菌糸を生じるために水の表面張力を低下させることに加えて記載されるハイドロフォビンの生物学的機能はまた、胞子の疎水化である（Woestenら1999, Curr. Biol., 19, 1985-88; Bellら1992, Genes Dev., 6, 2382-2394）。更に、ハイドロフォビンは、地衣類の子実体においてガスチャネルを裏打ちするために、および菌類病原体により植物表面を識別するシステムにおける成分として、用いられる（Lugonesら1999, Mycol. Res., 103, 635-640; HamerおよびTalbot 1998, Curr. Opinion Microbiol., Volume 1, 693-697）。
【０００５】
相補性実験は、ハイドロフォビンが単一のクラス内である程度まで機能的に置換され得ることを実証した。
【０００６】
以前に開示されたハイドロフォビンは、通常のタンパク質化学的精製および単離方法を用いても中程度の収量および純度でしか調製できない。遺伝学的方法を用いてより大量のハイドロフォビンを供給する試みもまた、今まで成功していなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、新規ハイドロフォビンおよびその製造方法を提供することが目的であった。それはハイドロフォビンが経済的に製造され、様々な技術分野において使用されるようにすることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の説明
本発明は、一般構造式（I）：
Xn-C1-X1-50-C2-X0-5-C3-X1-100-C4-X1-100-C5-X1-50-C6-X0-5-C7-X1-50-C8-Xm（I）
［式中、Xは２０種類の天然アミノ酸（Phe、Leu、Ser、Tyr、Cys、Trp、Pro、His、Gln、Arg、Ile、Met、Thr、Asn、Lys、Val、Ala、Asp、Glu、Gly）のいずれかであってよく、Xの添字はアミノ酸の数を表し、添字nおよびmは０〜５００、好ましくは１５〜３００の数であり、Cはシステインである］
で示されるポリペプチドであって、但し、XnまたはXmとして略記したペプチド配列の少なくとも一方は、天然ではハイドロフォビンと連結されていない少なくとも２０アミノ酸長のペプチド配列であり、また該ポリペプチドはガラス表面の被覆後の接触角を少なくとも２０°変化させる前記ポリペプチドに関する。
【０００９】
C1〜C8で表されるシステインは、還元型であってもよく、または本発明のタンパク質において互いにジスルフィド架橋を形成していてもよい。分子内でのC-C架橋の形成、具体的には、以下の群、すなわちC1とC2、C3とC4、C5とC6、C7とC8から選択される少なくとも１つ、好ましくは２つ、特に好ましくは３つ、非常に好ましくは４つの分子内ジスルフィド架橋を有するものが特に好ましい。
【００１０】
システインがXで表される位置にも用いられる場合、一般式における個々のシステイン位置の番号はそれに応じて変化しうる。
【００１１】
特に有利なポリペプチドは一般式（II）：
Xn-C1-X3-25-C2-X0-2-C3-X5-50-C4-X2-35-C5-X2-15-C6-X0-2-C7-X3-35-C8-Xm（II）
［式中、Xは２０種類の天然アミノ酸（Phe、Leu、Ser、Tyr、Cys、Trp、Pro、His、Gln、Arg、Ile、Met、Thr、Asn、Lys、Val、Ala、Asp、Glu、Gly）のいずれかであってよく、Xの添字はアミノ酸の数を表し、添字のnおよびmは２〜３００の数であり、Cはシステインである］
で示されるポリペプチドであって、但し、XnまたはXmとして略記したペプチド配列の少なくとも一方は、天然ではハイドロフォビンと連結されていない少なくとも３５アミノ酸長のペプチド配列であり、また該ポリペプチドはガラス表面の被覆後の接触角を少なくとも２０°変化させる、前記ポリペプチドである。
【００１２】
非常に有利なものは、一般式（III）：
Xn-C1-X5-9-C2-C3-X11-39-C4-X2-23-C5-X5-9-C6-C7-X6-18-C8-Xm    （III）
［式中、Xは２０種類の天然アミノ酸（Phe、Leu、Ser、Tyr、Cys、Trp、Pro、His、Gln、Arg、Ile、Met、Thr、Asn、Lys、Val、Ala、Asp、Glu、Gly）のいずれかであってよく、Xの添字はアミノ酸の数を表し、添字のnおよびmは０〜２００の数であり、Cはシステインである］
で示されるポリペプチドであって、但し、XnまたはXmとして略記したペプチド配列の少なくとも一方は、天然ではハイドロフォビンと連結されていない少なくとも４０アミノ酸長のペプチド配列であり、また該ポリペプチドはガラス表面の被覆後の接触角を少なくとも２０°変化させる、前記ポリペプチドである。
【００１３】
記載される発明の好ましい実施形態は、一般構造式（I）、（II）または（III）を有するポリペプチドであり、この構造式は、少なくとも１つのクラスIハイドロフォビン、好ましくは少なくとも１つのdewA、rodA、hypA、hypB、sc3、basf1、basf2、ハイドロフォビン、またはその一部もしくは誘導体を含む。上記ハイドロフォビンは下記の配列表において構造的に特徴付けられている。複数の、好ましくは２個または３個の、構造的に同一または異なるハイドロフォビンを、互いに、そして天然ではハイドロフォビンと連結されていない対応する適切なポリペプチド配列に、連結させることもできる。
【００１４】
本発明の特に好ましい実施形態は、配列番号２０、２２、２４に示されるポリペプチド配列を有する新規タンパク質、およびそれをコードする核酸配列、特に配列番号１９、２１、２３に規定される配列である。特に好ましい実施形態はまた、配列番号２２、２２、または２４に示されるポリペプチド配列を出発物質として、少なくとも１、最大１０、好ましくは５、特に好ましくは全体の５％のアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によって生じるタンパク質であり、それは出発物質のタンパク質の生物学的特性の少なくとも５０％をなお有している。ここでのタンパク質の生物学的特性とは、実施例１０に記載されるような、接触角の変化を意味する。
【００１５】
本発明のタンパク質は、XnまたはXmとして略記される少なくとも１つの位置に、天然ではハイドロフォビンと連結されていない少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３５個、特に好ましくは少なくとも５０個、特に少なくとも１００個のアミノ酸を含むポリペプチド配列（以下では融合パートナーとも呼ばれる）を有する。これは、本発明のタンパク質が、天然ではこの形態で一緒になって生じることはないハイドロフォビン部分および融合パートナー部分からなるという事実を表すことを意図する。
【００１６】
融合パートナー部分は多様なタンパク質より選択されうる。１つのハイドロフォビン部分に複数の融合パートナー、例えば、ハイドロフォビン部分のアミノ末端（Xn）およびカルボキシ末端（Xm）にを連結することも可能である。しかし、例えば、本発明のタンパク質の１つの位置（XnまたはXm）に２つの融合パートナーを連結することも可能である。
【００１７】
特に好ましい融合パートナーは、本発明のタンパク質がガラス表面を被覆することを可能にし、タンパク質処理されたガラス表面が実施例（実施例１０）に詳細に記載されるような界面活性剤による処理（例えば、1% SDS/80℃/10 min）に対して耐性になるようにする、そのようなポリペプチド配列である。
【００１８】
特に適切な融合パートナーは、微生物、特に大腸菌またはバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）において天然に存在するポリペプチドである。このような融合パートナーの例は、yaad（配列番号１５および１６）、yaae（配列番号１７および１８）ならびにチオレドキシンの配列である。上記配列の一部のみ、好ましくは７０〜９９％、特に好ましくは８０〜９８％を含むか、または上記配列と比較して個々のアミノ酸もしくはヌクレオチドが変更されている、上記配列の断片または誘導体もまた非常に有用である。例えば、付加的なアミノ酸、特に２個の付加的なアミノ酸、好ましくはアミノ酸Arg、Serが、そのyaadおよびyaae配列のC末端に付加されうる。好ましくは、付加的なアミノ酸、例えば配列番号１７および１８におけるアミノ酸番号２（Gly）が、天然の配列と比較してyaae配列に挿入されていてもよい。
【００１９】
更に、２つの融合パートナーの連結部に、結果として核酸レベルで制限エンドヌクレアーゼの認識部位を新たに作製または不活性化する付加的なアミノ酸を挿入することも可能である。
【００２０】
更にまた、本発明のタンパク質のポリペプチド配列を、例えばグリコシル化、アセチル化によって、またはさもなければ、例えばグルタルジアルデヒドを用いた化学的架橋によって、修飾することが可能である。
【００２１】
本発明のタンパク質の１つの特性は、表面を上記タンパク質で被覆した際にその表面特性を変化させることである。表面特性の上記変化は、本発明のタンパク質による表面の被覆前後での水滴の接触角を測定し、その２つの測定結果の差異を決定することにより、実験的に測定され得る。
【００２２】
接触角の測定のための正確な実験条件は、実施例の実施例１０に記載されている。これらの条件下で、本発明のタンパク質は、接触角を少なくとも２０°、好ましくは２５°、特に好ましくは３０°増加させるという特性を有する。
【００２３】
以前に開示されたハイドロフォビンのハイドロフォビン部分中の極性および非極性アミノ酸の位置は保存されており、そのため特有の疎水性プロットを生じる。生物物理学的特性および疎水性における違いにより、以前に開示されたハイドロフォビンはIおよびIIの２つのクラスに分類された（Wesselsら1994, Ann. Rev. Phytopathol., 32, 413-437）。
【００２４】
クラスIハイドロフォビンの組織化膜は、（高温の1％SDSに対してでさえも）高度に不溶性であり、高濃度のトリフルオロ酢酸（TFA）またはギ酸によってのみ再解離させることができる。一方、クラスIIハイドロフォビンの組織化形態はより安定性が低い。それらは（室温で）６０％強度のエタノールまたは１％SDSによってでさえも再溶解されうる。
【００２５】
アミノ酸配列の比較は、システインC3とC4との間の領域の長さが、クラスIハイドロフォビンよりもクラスIIハイドロフォビンにおいて明らかに短いことを示す。
【００２６】
更に、クラスIIハイドロフォビンはクラスIより多くの荷電アミノ酸を有する。
【００２７】
本発明は更に、本発明のタンパク質を製造する方法に関する。これらのポリペプチドは、既知のペプチド合成方法、例えばMerrifieldの固相合成によって化学的に生成され得る。
【００２８】
しかし、融合パートナーおよびハイドロフォビン部分をそれぞれコードする２つの核酸配列、特にDNA配列を結合し、結合された核酸配列の遺伝子発現が宿主生物内で所望のタンパク質を生成するようにする遺伝学的方法が、特に有用である。
【００２９】
ここでの適切な宿主生物（産生生物）は、原核生物（古細菌を含む）または真核生物であってよく、特に、好塩菌およびメタノコッカスを含む細菌、菌類、昆虫細胞、植物細胞ならびに哺乳動物細胞、特に好ましくは大腸菌（Escherichia coli）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzea）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、シュードモナス属種（Pseudomonas spec.）、乳酸菌（Lactobacillen）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、SF9（または関連細胞）などでありうる。
【００３０】
本発明は更に、調節核酸配列の遺伝的制御下に本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現構築物、および少なくとも１つの上記発現構築物を含むベクターにも関する。
【００３１】
特定のコード配列の5’側上流にプロモーター、3’側下流にターミネーター配列、さらにまた、適切な場合には、更なる通常の調節エレメントを、それぞれ上記コード配列に機能しうる形で連結されて含む、本発明のそのような構築物が好ましい。
【００３２】
「機能しうる形で連結」とは、プロモーター、コード配列、ターミネーター、および適切な場合には、当該コード配列の発現と関連したその使用目的に従ってそれぞれの調節エレメントがその機能を発揮できるような更なる調節エレメントを連続的に配置したものを意味する。
【００３３】
機能しうる形で連結され得る配列の例は、標的配列、およびさらにエンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどである。更なる調節エレメントは、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などを含む。適切な調節配列の例は、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載される。
【００３４】
これらの調節配列に加えて、これらの配列の天然の調節が実際の構造遺伝子の上流にまだ存在していてもよく、さらに、適切な場合には、天然の調節がスイッチオフされて遺伝子の発現が増加するように遺伝的に改変されていてもよい。
【００３５】
好ましい核酸構築物は、有利には、機能しうる形でプロモーターに連結され、核酸配列の発現の増加を可能にする前述の１つ以上のエンハンサー配列をも含む。更なる調節エレメントまたはターミネーターなどの更なる有利な配列もまた、DNA配列の3’末端に挿入されうる。
【００３６】
本発明の核酸は、構築物中に１つ以上のコピー数で存在しうる。構築物は更に、適切な場合には、構築物の選択のためのなおさらなるマーカー、例えば抗生物質耐性遺伝子または栄養要求性を相補する遺伝子などを含みうる。
【００３７】
本発明の方法に有利な調節配列の例は、cos、tac、trp、tet、trp-tet、Ipp、lac、Ipp-lac、laclq-T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD) SP6、ラムダ-PRまたはラムダ-Pプロモーターなどのプロモーターの中に存在しており、それらはグラム陰性細菌において有利に使用される。有利な調節配列の更なる例は、グラム陽性プロモーターamyおよびSP02、酵母または菌類のプロモーターADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADHの中に存在する。
【００３８】
人工プロモーターを調節のために使用することも可能である。
【００３９】
宿主生物において発現させるために、核酸構築物は、例えば、プラスミドまたはファージなどのベクターに都合良く挿入され、それによって遺伝子が宿主内で最適に発現されるようにする。プラスミドおよびファージの他に、ベクターはまた、当業者に知られている他の任意のベクター、すなわち、例えば、SV40、CMV、バキュロウイルスおよびアデノウイルスなどのウイルス、トランスポゾン、ISエレメント、ファスミド、コスミド、ならびに線状または環状DNA、またアグロバクテリウムシステムを意味する。
【００４０】
これらのベクターは、宿主生物内で自律複製するか、または染色体上で複製されうる。これらのベクターは本発明のさらなる実施形態を構成する。適切なプラスミドの例は、大腸菌におけるpLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III''3-B1、tgt11もしくはpBdCl、ストレプトマイセス属におけるpIJ101、pIJ364、pIJ702もしくはpIJ361、バチルス属におけるpUB110、pC194もしくはpBD214、コリネバクテリウム属におけるpSA77もしくはpAJ667、菌類におけるpALS1、pIL2もしくはpBB116、酵母における2α、pAG-1、YEp6、YEp13もしくはpEMBLYe23、または植物におけるpLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004もしくはpDH51である。上記プラスミドは、可能性のあるプラスミドを小規模に選出したものである。更なるプラスミドは当業者によく知られており、例えば、Cloning Vectors (Pouwels P.H.ら編、Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018)という本において見いだすことができる。
【００４１】
有利には、核酸構築物は更に、存在している他の遺伝子の発現のため、発現を増加させるための3'および/または5'末端調節配列を含み、それは最適な発現のために、選択した宿主生物および遺伝子に応じて選択される。
【００４２】
これらの調節配列は、遺伝子およびタンパク質発現が特異的に発現できるようにすることを目的とする。これは、例えば、宿主生物に依存して、遺伝子が誘導後にのみ発現もしくは過剰発現すること、または直ちに発現および/もしくは過剰発現することを意味しうる。
【００４３】
これに関して、調節配列または調節因子は好ましくは、導入遺伝子の遺伝子発現に対して有益な影響を及ぼし、その結果それを増加させうる。従って、調節エレメントは有利には、プロモーターおよび/またはエンハンサーなどの強力な転写シグナルを用いることによって転写レベルを増加させ得る。しかし、その他に、例えばmRNAの安定性を改善することによって翻訳を促進することも可能である。
【００４４】
ベクターの別の実施形態では、本発明の核酸構築物または本発明の核酸を含むベクターはまた、有利には、線状DNAの形で微生物に導入され、宿主生物のゲノムに非相同もしくは相同組換えによって組み込まれうる。上記線状DNAは、プラスミドなどの線状化されたベクターからなるものでもよいし、または本発明の核酸構築物もしくは核酸のみからなるものでもよい。
【００４５】
異種遺伝子の生物内での最適な発現を達成するために、その生物で用いられる特有のコドン使用頻度に従って核酸配列を改変することは有利である。コドン使用頻度は、対象とする生物の他の既知の遺伝子のコンピューター解析に基づいて容易に決定され得る。
【００４６】
本発明の発現カセットは、適切なプロモーターを適切なコードヌクレオチド配列およびターミネーターシグナルまたはポリアデニル化シグナルと融合することによって作製される。このために、例えば、T. Maniatis, E.F.FritschおよびJ.Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)、また、T.J.Silhavy, M.L.BermanおよびL.W.Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)、ならびにAusubel, F.M.ら、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)に記載されるような、よく知られている組換えおよびクローニング技術が使用される。
【００４７】
適切な宿主生物での発現のために、組換え核酸構築物または遺伝子構築物は、遺伝子がその宿主内で最適に発現することを可能にする宿主特異的ベクターに有利に挿入される。ベクターは当業者によく知られており、例えば、「Cloning Vectors」(Pouwels P.H.ら編、Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)において見いだすことができる。
【００４８】
本発明のベクターは、組換え微生物を作製するために使用でき、その微生物は、例えば、少なくとも１つの本発明のベクターによって形質転換され、本発明のポリペプチドを産生するために使用されうる。有利には、上述の本発明の組換え構築物は、適切な宿主システムに導入され、発現される。ここでは、上記核酸を特定の発現系において発現させるために、当業者に知られている一般的なクローニング方法およびトランスフェクション方法、例えば、共沈法、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどを用いることが好ましい。適切なシステムは、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, F.Ausubelら編、Wiley Interscience, New York 1997、またはSambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されている。
【００４９】
本発明に従って相同組換えされた微生物を作製することも可能である。このために、本発明の遺伝子またはコード配列の少なくとも一部分を含むベクターが作製され、適切な場合、その中に、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加もしくは置換を導入して本発明の配列を改変、例えば機能的に破壊する（ノックアウトベクター）。導入される配列は、例えば、関連微生物由来のホモログでもよく、または哺乳動物、酵母もしくは昆虫起源に由来してもよい。相同組換えに使用されるベクターは、あるいは、内在性遺伝子が突然変異しているかまたは何か他の方法で相同組換えの際に改変されているが、まだ機能タンパク質をコードするように設計されうる（例えば、内在性タンパク質の発現を改変するように、上流の調節領域が改変されていてもよい）。本発明の遺伝子の改変部分は、相同組換えベクター中にある。相同組換えに適したベクターの構築は、例えば、Thomas, K.R.およびCapecchi, M.R. (1987) Cell 51: 503に記載されている。
【００５０】
任意の原核生物または真核生物は、原則として、本発明の核酸もしくは核酸構築物のための組換え宿主生物としての使用に適している。有利に使用される宿主生物は、細菌、菌類または酵母などの微生物である。グラム陽性またはグラム陰性細菌、好ましくはEnterobacteriaceae、Pseudomonadaceae、Rhizobiaceae、StreptomycetaceaeもしくはNocardiaceae科の細菌、特に好ましくはEscherichia、Pseudomonas、Streptomyces、Nocardia、Burkholderia、Salmonella、AgrobacteriumもしくはRhodococcus属の細菌が有利に使用される。
【００５１】
宿主生物に応じて、本発明の方法に使用される生物は、当業者に知られている方法で増殖または培養される。通常、微生物は、通常糖の形での炭素源、通常酵母抽出物などの有機窒素源の形での窒素源または硫酸アンモニウムなどの塩、また鉄、マンガン、マグネシウム塩などの微量元素、および、適切な場合にはビタミンを含有する液体培地中で、０〜１００℃、好ましくは１０〜６０℃の温度で、酸素ガス供給を受けながら、培養される。栄養液のpHは、ここでは固定値に維持され、すなわち、培養の際に調節されていてもよく、またそのようにされていなくてもよい。増殖は、バッチ式、半バッチ式または連続的に行われうる。栄養素は、まず発酵の開始時に導入してもよく、続けて半連続的または連続的に供給してもよい。酵素は、実施例に記載される方法を用いて生物から単離することができ、粗抽出物として反応に使用してもよい。
【００５２】
本発明は更に、本発明のポリペプチドまたは機能的な生物学的活性を有するその断片を組換え生産する方法に関し、その方法は、ポリペプチド産生微生物を培養し、適切な場合には、上記ポリペプチドの発現を誘導し、そして該培養物からそれらを単離することを含む。このような方法で、ポリペプチドはまた必要であれば工業規模で製造しうる。組換え微生物は既知の方法によって培養および発酵すればよい。例えば、細菌はTB培地またはLB培地中で２０〜４０℃の温度および６〜９のpHで増殖され得る。適切な培養条件は、例えば、T. Maniatis, E.F. FritschおよびJ. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)に詳細に記載されている。
【００５３】
ポリペプチドが培地中に分泌されない場合には、続いて細胞を破砕し、産物を溶解物から、タンパク質を単離する既知の方法によって単離する。細胞は任意に、高周波数超音波により、高圧により（例えばフレンチプレスで）、浸透圧溶解により、界面活性剤、溶菌酵素もしくは有機溶媒の作用により、ホモジナイザーの使用により、または記載されたいくつかの方法の組み合わせにより、破砕しうる。
【００５４】
ポリペプチドは、分子篩クロマトグラフィー（ゲルろ過）、例えばQセファロースクロマトグラフィーなど、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水クロマトグラフィーなどの既知のクロマトグラフ法を用いて、さらにまた、限外ろ過、結晶化、塩析、透析および非変性ゲル電気泳動などの他の通常の方法を用いて、精製されうる。適切な方法は、例えば、Cooper, F.G., Biochemische Arbeitsmethoden [original title: The tools of biochemistry], Verlag Water de Gruyter, Berlin, New YorkまたはScopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlinに記載される。
【００５５】
組換えタンパク質を単離するためには、特定のヌクレオチド配列によってcDNAを伸長し、その結果、例えば、精製を容易にする改変ポリヌクレオチドまたは融合タンパク質をコードする、ベクターシステムまたはオリゴヌクレオチドを使用することは、有利でありうる。このような適切な改変の例は、アンカーとして機能する「タグ」、例えばヘキサヒスチジンアンカーとして知られる改変、または抗原として抗体に認識され得るエピトープである（例えば、Harlow, E.およびLane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Pressに記載される）。更なる適切なタグは、例えば、HA、カルモジュリン-BD、GST、MBD; キチン-BD、ストレプトアビジン-BD-Aviタグ、Flagタグ、T7などである。これらのアンカーはタンパク質を固体支持体、例えば、クロマトグラフィーカラムに導入されていてもよい高分子マトリックスなど、またはマイクロタイタープレートもしくは他の任意の支持体に付着させるために使用されうる。対応する精製プロトコルは、市販のアフィニティータグの供給業者から入手できる。
【００５６】
ハイドロフォビンで被われた多くの菌類の表面（胞子、子実体、菌糸体）は、「小桿（rodlet）」と呼ばれる顕微鏡によって検出可能な特徴的構造を示す。約10 nmの厚さを有する類似小桿はまた、ハイドロフォビンで被われた疎水性表面（例えば、ガラス、雲母など）上で検出されうる（Woestenら、1993, Plant Cell, 5, 1567-1574）。
【００５７】
表面の被覆に関するハイドロフォビンの並外れた特性のため（例えば、１％強度のSDS溶液などの界面活性剤に耐性を示す）、これらのタンパク質は多数の工業的用途に対して大きな可能性を有する。様々な特許文献がこのような用途の例を記載し、ハイドロフォビンの用途に関して、本明細書ではそれらを参照する。
【表１】
2008529484.tif 000003
【００５８】
ハイドロフォビン、特にクラスIのハイドロフォビンの工業的利用は、効率的な製造および精製方法がないために、今まで成功してこなかった。天然起源物（胞子、菌類の菌糸体など）を出発物質とする、以前に記載された方法では、mg規模の量の物質しか製造されない（例えばWO 96/41882）。
【００５９】
様々な産生生物での組換え産生による方法も同様に、非常に複雑であまり満足のいくものではないことが判明した。
【００６０】
本発明のハイドロフォビンタンパク質は、それらの融合型、すなわち融合パートナー部分を伴うものと、単離型との両方で、ハイドロフォビンの望ましい特性を有する。従って、本発明のタンパク質を融合タンパク質として直接使用すること、また融合パートナーの切断および除去後に「純粋な」ハイドロフォビンとして使用することの両方が可能である。
【００６１】
融合パートナーを除去することを意図する場合、融合タンパク質のハイドロフォビン部分と融合パートナー部分との間に潜在的な切断部位（プロテアーゼの特異的認識部位）を組み込むことが推奨される。特に適切な切断部位は、ハイドロフォビン部分および融合パートナー部分の他の部分には出現しないペプチド配列であり、それはバイオインフォマティクスツールを用いて容易に決定することができる。特に有用であるのは、例えば、メチオニンでのBrCN切断、または、Xa因子、エンテロキナーゼ、トロンビン、TEV（タバコエッチウイルスプロテアーゼ）切断によるプロテアーゼ媒介切断である。
【実施例】
【００６２】
実施例１
yaad-His6/yaaE-His6クローニングのための準備作業
オリゴヌクレオチドHal570およびHal571（Hal 572/Hal 573）を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った。使用した鋳型DNAは細菌のバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）に由来するゲノムDNAであった。得られたPCR断片はバチルス・サブチリスyaaD/yaaE遺伝子のコード配列およびその両末端にNcoIまたはBglII制限切断部位を含んでいた。PCR断片を精製し、制限エンドヌクレアーゼNcoIおよびBglIIによって切断した。このDNA断片をインサートとして使用し、制限エンドヌクレアーゼNcoIおよびBglIIによって事前に線状化したQiagen pQE60ベクター中にクローニングした。このようにして得られたベクター、pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5は、それぞれYAAD::HIS6およびYAAE::HIS6からなるタンパク質の発現のために使用されうる。
【００６３】
Hal570: gcgcgcccatggctcaaacaggtactga
Hal571: gcagatctccagccgcgttcttgcatac
Hal572: ggccatgggattaacaataggtgtactagg
Hal573: gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc
【００６４】
実施例２
yaad-ハイドロフォビンDewA-His6のクローニング
オリゴヌクレオチドKaM 416およびKaM 417を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った。使用した鋳型DNAはのアスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)に由来するゲノムDNAであった。得られたPCR断片はハイドロフォビン遺伝子dewAのコード配列およびN末端Xa因子プロテイナーゼ切断部位を含んでいた。そのPCR断片を精製し、制限エンドヌクレアーゼBamHIによって切断した。このDNA断片をインサートとして使用し、制限エンドヌクレアーゼBglIIによって事前に線状化したpQE60YAAD#2ベクターにクローニングした。
【００６５】
このようにして得られたベクター#508はYAAD::Xa::dewA::HIS6からなる融合タンパク質の発現のために使用されうる。
【００６６】
KaM416:GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC
KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
【００６７】
実施例３
yaad-ハイドロフォビンRodA-His6のクローニング
オリゴヌクレオチドKaM 434およびKaM 435を用いてプラスミド#508と同様にしてプラスミド#513をクローニングした。
【００６８】
KaM434: GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC
KaM435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG
【００６９】
実施例４
yaad-ハイドロフォビンBASF1-His6のクローニング
オリゴヌクレオチドKaM 417およびKaM 418を用いてプラスミド#508と同様にしてプラスミド#507をクローニングした。
【００７０】
使用した鋳型DNAは人工的に合成されたDNA配列であるハイドロフォビンBASF1（添付書類参照）であった。
【００７１】
KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
KaM418:CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG
【００７２】
実施例５
yaad-ハイドロフォビンBASF2-His6のクローニング
オリゴヌクレオチドKaM 417およびKaM 418を用いてプラスミド#508と同様にしてプラスミド#506をクローニングした。
【００７３】
使用した鋳型DNAは人工的に合成されたDNA配列であるハイドロフォビンBASF2（添付書類参照）であった。
【００７４】
KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
KaM418:CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG
【００７５】
実施例６
yaad-ハイドロフォビンSC3-His6のクローニング
オリゴヌクレオチドKaM464およびKaM465を用いてプラスミド#508と同様にしてプラスミド#526をクローニングした。
【００７６】
使用した鋳型DNAはシゾフィラム・コムネ(Schyzophyllum commune) cDNA（添付書類参照）であった。
【００７７】
KaM464: CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC
KaM465: GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT
【００７８】
実施例７
yaad-ハイドロフォビンDewA-His6組換え大腸菌株の発酵
3 mlのLB液体培地をyaad-ハイドロフォビンDewA-His6を発現する大腸菌株とともに15 mlのグライナー管に植菌する。培養物を３７℃で８時間、振とう機で200 rpmにてインキュベートする。250 mlのLB培地（+100 μg/mlアンピシリン）をそれぞれ含有する2個の1 L バッフル底三角フラスコに、それぞれ1 mlの前培養物を植菌し、３７℃で９時間、振とう機で180 rpmにて培養する。
【００７９】
20 Lの発酵槽中の13.5 LのLB培地（+100 μg/mlアンピシリン）に0.5 lの前培養物（H2Oに対して測定されたOD600nm 1:10）を植菌する。OD60nmが約3.5の時に、140 mlの100 mM IPTGを添加する。３時間後、発酵槽を１０℃に冷却し、発酵培養液を遠心分離によって除去する。細胞ペレットを更なる精製に用いる。
【００８０】
実施例８
組換えハイドロフォビン融合タンパク質の精製（C末端His6タグを有するハイドロフォビン融合タンパク質の精製）
100 gの細胞ペレット（100〜500 mgのハイドロフォビン）を50 mMリン酸ナトリウムバッファー、pH 7.5と混合して全量200 mlとし、再懸濁する。懸濁液をUltraturrax type T25（Janke and Kunkel; IKA-Labortechnik）で１０分間処理し、その後、核酸を分解するために、室温で１時間、500ユニットのベンゾナーゼ（Merck, Darmstadt, Germany; 注文番号 1.01697.0001）を加えてインキュベートする。細胞破砕の前に、ガラスカートリッジを用いてろ過を行う（P1）。細胞破砕および残存するゲノムDNAの剪断のために、２つのホモジナイザーを1500 barで作動させる（M-110EH microfluidizer; Microfluidics Corp.）。ホモジネートを遠心分離し（Sorvall RC-5B, GSAローター、250 mlの遠心管、60分間、4℃、12000 rpm、23000 g）、その後、上清を氷上に静置し、ペレットを100 ml のリン酸ナトリウムバッファー、pH 7.5に再懸濁する。遠心分離と再懸濁を３回繰り返し、３回目には１％SDSを含有するリン酸ナトリウムバッファーを用いる。再懸濁後、混合物を１時間撹拌し、最後の遠心分離を行う（Sorvall RC-5B, GSAローター、250 mlの遠心管、60分間、4℃、12000 rpm、23000 g）。SDS PAGE分析は、ハイドロフォビンが最後の遠心分離後の上清に存在することを示す（図１）。実験は、ハイドロフォビンがおそらく、対応する大腸菌細胞中に封入体の形で存在することを示す。50 mlのハイドロフォビン含有上清を、50 mM Tris-Clバッファー、pH 8.0で平衡化した50 mlのニッケルセファロース高性能17-5268-02カラム（Amersham）にアプライする。そのカラムを50 mM Tris-Clバッファー、pH 8.0で洗浄し、その後、ハイドロフォビンを200 mMイミダゾールを含有する50 mM Tris-Clバッファー、pH 8.0で溶出する。該溶液を50 mM Tris-Clバッファー、pH 8.0に対して透析することにより、上記イミダゾールを除去する。
【００８１】
図１は、本発明のハイドロフォビンの精製を図示する。  
レーン１：ニッケルセファロースカラムにアプライされた溶液（1:10希釈）
レーン２：流出液＝洗浄ステップ溶出液
レーン３〜５：OD 280がピークの溶出画分
【００８２】
図１における本発明のハイドロフォビンは、約53 kDの分子量を有する。いくつかのより低分子のバンドは、上記ハイドロフォビンの分解産物を示す。
【００８３】
実施例９
ハイドロフォビンによる表面の被覆/評価
ハイドロフォビンまたはハイドロフォビン融合タンパク質の被覆特性は、好ましくは、親水性および疎水性表面のモデルとして、それぞれガラスおよびテフロン上で評価する。
【００８４】
標準的な被覆実験
ガラス：
-ハイドロフォビンの濃度：1〜100 μg/mL
-ガラス板を、50 mM酢酸ナトリウム（pH 4）＋0.1% Tween 20中で一晩（温度：８０℃）インキュベーション
-被覆後、蒸留水で洗浄
-その後、８０℃で1% SDSを加えて１０分間インキュベーション
-蒸留水で洗浄
【００８５】
テフロン：
-濃度：1〜100μg/mL
-テフロン板を、10 mM Tris、pH 8中で一晩（温度：８０℃）インキュベーション
-被覆後、蒸留水で洗浄
-８０℃で0.1% Tween 20を加えて１０分間インキュベーション
-蒸留水で洗浄
-その後、８０℃で1% SDSを加えて１０分間インキュベーション
-蒸留水で洗浄
【００８６】
サンプルを空気乾燥させ、5 μlの水滴の接触角（度数で）を測定し、これは例えば下記の値をもたらす。
【表２】
2008529484.tif 000004
【００８７】
ハイドロフォビンによる表面の被覆/評価
ガラス（窓ガラス、Sueddeutsche Glas, Mannheim, Germany）：
-ハイドロフォビンの濃度：100 μg/mL
-ガラス板を、50 mM酢酸ナトリウム（pH 4）＋0.1% Tween 20中で一晩（温度：８０℃）インキュベーション
-被覆後、蒸留水で洗浄
-その後、８０℃、蒸留水中1%のSDS溶液で１０分間インキュベーション
-蒸留水で洗浄
サンプルを空気乾燥させ、5 μlの水滴の接触角（度数で）を測定する。
【００８８】
Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, Software SCA 20.2.0. (2002年11月) 装置で接触角を測定した。製造業者の使用説明書に従って測定を実施した。
【００８９】
未処理ガラスは３０±５°の接触角を与えたが、実施例８に従った機能的ハイドロフォビン（yaad-dewA-his6）による被覆は７５±５°の接触角を与えた。
【表３】
2008529484.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１は、本発明のハイドロフォビンの精製を図示する。
【図１】
2008529484.tif 000006
【配列表】
2008529484000001.app
【国際調査報告】
2008529484.tif 000007
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