(57)【要約】  本明細書は、ＰＡＲリガンドドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転移ドメイン及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含む修飾クロストリジウム毒素；ＰＡＲリガンドドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転移ドメイン及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含む修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子；及びＰＡＲリガンドドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転移ドメイン及びクロストリジウム毒素転移ドメインを含む修飾クロストリジウム毒素の産生方法を開示している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）  ＰＡＲリガンドドメイン；
ｂ）  クロストリジウム毒素酵素ドメイン；
ｃ）  クロストリジウム毒素転移ドメイン；及び
ｄ）  クロストリジウム毒素結合ドメイン、
を含む修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２】
ＰＡＲリガンドドメインが、クロストリジウム毒素酵素ドメインのアミノ末端に作動的に連結されている、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項３】
修飾クロストリジウム毒素が、ＰＡＲリガンドドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転移ドメイン及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含むアミノからカルボキシルまでの単一ポリペプチド線形順序を含む、請求項２に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項４】
修飾クロストリジウム毒素が、ＰＡＲリガンドドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素結合ドメイン及びクロストリジウム毒素転移ドメインを含むアミノからカルボキシルまでの単一ポリペプチド線形順序を含む、請求項２に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項５】
ＰＡＲリガンドドメインがクロストリジウム毒素転移ドメインのアミノ末端に対し作動的に連結されている、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項６】
修飾クロストリジウム毒素が、クロストリジウム毒素結合ドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、ＰＡＲリガンドドメイン及びクロストリジウム毒素転移ドメインを含むアミノからカルボキシルまでの単一ポリペプチド線形順序を含む、請求項５に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項７】
修飾クロストリジウム毒素が、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、ＰＡＲリガンドドメイン、クロストリジウム毒素転移ドメイン及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含むアミノからカルボキシルまでの単一ポリペプチド線形順序を含む、請求項５に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項８】
ＰＡＲリガンドドメインがクロストリジウム毒素結合ドメインのアミノ末端に作動的に連結されている、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項９】
修飾クロストリジウム毒素が、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、ＰＡＲリガンドドメイン、クロストリジウム毒素結合ドメイン及びクロストリジウム毒素転移ドメインを含むアミノからカルボキシルまでの単一ポリペプチド線形順序を含む、請求項８に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１０】
修飾クロストリジウム毒素が、プロテアーゼ切断部位をさらに含み；プロテアーゼ切断部位がＰＡＲリガンドドメインをアンマスクする、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１１】
ＰＡＲリガンドドメインがＰＡＲ１リガンドドメインを含む、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１２】
ＰＡＲ１リガンドドメインが配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号１３３を含む、請求項１１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１３】
ＰＡＲリガンドドメインがＰＡＲ２リガンドドメインを含む、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１４】
ＰＡＲ２リガンドドメインが配列番号２４又は配列番号２５を含む、請求項１３に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１５】
ＰＡＲリガンドドメインがＰＡＲ３リガンドドメインを含む、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１６】
ＰＡＲ３リガンドドメインが配列番号２６、配列番号２７又は配列番号１３４を含む、請求項１５に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１７】
ＰＡＲリガンドドメインがＰＡＲ４リガンドドメインを含む、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１８】
ＰＡＲ４リガンドドメインが配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号１３５又は配列番号１６０を含む、請求項１７に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１９】
修飾クロストリジウム毒素が、ＰＡＲリガンドドメイン、ボツリヌス毒素酵素ドメイン、ボツリヌス毒素転移ドメイン及びボツリヌス毒素結合ドメインを含む修飾ボツリヌス毒素である、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２０】
修飾ボツリヌス毒素がＰＡＲリガンドドメイン、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインを含む修飾ＢｏＮＴ／Ａである、請求項１９に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２１】
修飾ボツリヌス毒素が、ＰＡＲリガンドドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン、及びＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメインを含む修飾ＢｏＮＴ／Ｂである、請求項１９に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２２】
修飾ボツリヌス毒素が、ＰＡＲリガンドドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメインを含む修飾ＢｏＮＴ／Ｃ１である、請求項１９に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２３】
修飾ボツリヌス毒素が、ＰＡＲリガンドドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン、及びＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメインを含む修飾ＢｏＮＴ／Ｄである、請求項１９に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２４】
修飾ボツリヌス毒素が、ＰＡＲリガンドドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメインを含む修飾ＢｏＮＴ／Ｅである、請求項１９に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２５】
修飾ボツリヌス毒素が、ＰＡＲリガンドドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン、及びＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメインを含む修飾ＢｏＮＴ／Ｆである、請求項１９に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２６】
修飾ボツリヌス毒素が、ＰＡＲリガンドドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメインを含む修飾ＢｏＮＴ／Ｇである、請求項１９に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２７】
修飾ボツリヌス毒素が、ＰＡＲリガンドドメイン、破傷風毒素酵素ドメイン、破傷風毒素転移ドメイン及び破傷風毒素結合ドメインを含む修飾破傷風毒素である、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２８】
修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子であって、
ａ）  ＰＡＲリガンドドメインをコードするポリヌクレオチド分子；
ｂ）  クロストリジウム毒素酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；
ｃ）  クロストリジウム毒素転移ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；および
ｄ）  クロストリジウム毒素結合ドメインをコードするポリヌクレオチド分子、
を含むポリヌクレオチド分子。
【請求項２９】
ポリヌクレオチド分子が、クロストリジウム毒素酵素ドメインのアミノ末端に対して作動的に連結されたＰＡＲリガンドドメインを含むポリペプチドをコードする、請求項２８に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項３０】
ポリヌクレオチド分子が、ＰＡＲリガンドドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転移ドメイン及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含むアミノからカルボキシルまでの単一ポリペプチド線形順序を含む、修飾クロストリジウム毒素をコードする、請求項２９に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項３１】
ポリヌクレオチド分子が、ＰＡＲリガンドドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素結合ドメイン及びクロストリジウム毒素転移ドメインを含むアミノからカルボキシルまでの単一ポリペプチド線形順序を含む修飾クロストリジウム毒素をコードする、請求項２９に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項３２】
ポリヌクレオチド分子が、クロストリジウム毒素転移ドメインのアミノ末端に作動的に連結されたＰＡＲリガンドドメインを含むポリペプチドをコードする、請求項２８に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項３３】
ポリヌクレオチド分子が、クロストリジウム毒素結合ドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、ＰＡＲリガンドドメイン及びクロストリジウム毒素転移ドメインを含むアミノからカルボキシルまでの単一ポリペプチド線形順序を含む修飾クロストリジウム毒素をコードする、請求項３２に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項３４】
ポリヌクレオチド分子が、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、ＰＡＲリガンドドメイン、クロストリジウム毒素転移ドメイン及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含むアミノからカルボキシルまでの単一ポリペプチド線形順序を含む修飾クロストリジウム毒素をコードする、請求項３２に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項３５】
ポリヌクレオチド分子が、クロストリジウム毒素結合ドメインのアミノ末端に対し作動的に連結されたＰＡＲリガンドドメインを含むポリペプチドをコードする、請求項２８に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項３６】
ポリヌクレオチド分子が、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、ＰＡＲリガンドドメイン、クロストリジウム毒素結合ドメイン及びクロストリジウム毒素転移ドメインを含むアミノからカルボキシルまでの単一ポリペプチド線形順序を含む修飾クロストリジウム毒素をコードする、請求項３５に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項３７】
ポリヌクレオチド分子がさらにプロテアーゼ切断部位をコードし、プロテアーゼ切断部位の分割がＰＡＲリガンドドメインをアンマスクする、請求項２８に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項３８】
ＰＡＲリガンドドメインをコードするポリヌクレオチド分子がＰＡＲ１リガンドドメインを含む、請求項２８に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項３９】
ポリヌクレオチド分子が配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号１３３を含むＰＡＲ１リガンドドメインをコードする、請求項３８に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項４０】
ＰＡＲリガンドドメインをコードするポリヌクレオチド分子がＰＡＲ２リガンドドメインを含む、請求項２８に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項４１】
ポリヌクレオチド分子が、配列番号２４又は配列番号２５を含むＰＡＲ２リガンドドメインをコードする、請求項４０に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項４２】
ＰＡＲリガンドドメインをコードするポリヌクレオチド分子がＰＡＲ３リガンドドメインを含む、請求項２８に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項４３】
ポリヌクレオチド分子が、配列番号２６、配列番号２７又は配列番号１３４を含むＰＡＲ３リガンドドメインをコードする請求項４２に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項４４】
ＰＡＲリガンドドメインをコードするポリヌクレオチド分子がＰＡＲ４リガンドドメインを含む、請求項２８に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項４５】
ポリヌクレオチド分子が、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号１３５又は配列番号１６０を含むＰＡＲ４リガンドドメインをコードする、請求項４４に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項４６】
修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子が、ＰＡＲリガンドドメイン、ボツリヌス毒素酵素ドメイン、ボツリヌス毒素転移ドメイン及びボツリヌス毒素結合ドメインを含む修飾ボツリヌス毒素をコードするポリヌクレオチド分子を含む、請求項２８に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項４７】
修飾ボツリヌス毒素をコードするポリヌクレオチド分子が、ＰＡＲリガンドドメイン、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインを含む修飾ＢｏＮＴ／Ａをコードするポリヌクレオチド分子を含む、請求項４６に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項４８】
修飾ボツリヌス毒素をコードするポリヌクレオチド分子が、ＰＡＲリガンドドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメインを含む修飾ＢｏＮＴ／Ｂをコードするポリヌクレオチド分子を含む、請求項４６に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項４９】
修飾ボツリヌス毒素をコードするポリヌクレオチド分子が、ＰＡＲリガンドドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメインを含む修飾ＢｏＮＴ／Ｃ１をコードするポリヌクレオチド分子を含む、請求項４６に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項５０】
修飾ボツリヌス毒素をコードするポリヌクレオチド分子が、ＰＡＲリガンドドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメインを含む修飾ＢｏＮＴ／Ｄをコードするポリヌクレオチド分子を含む、請求項４６に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項５１】
修飾ボツリヌス毒素をコードするポリヌクレオチド分子が、ＰＡＲリガンドドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメインを含む修飾ＢｏＮＴ／Ｅをコードするポリヌクレオチド分子を含む、請求項４６に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項５２】
修飾ボツリヌス毒素をコードするポリヌクレオチド分子が、ＰＡＲリガンドドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメインを含む修飾ＢｏＮＴ／Ｆをコードするポリヌクレオチド分子を含む、請求項４６に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項５３】
修飾ボツリヌス毒素をコードするポリヌクレオチド分子が、ＰＡＲリガンドドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメインを含む修飾ＢｏＮＴ／Ｇをコードするポリヌクレオチド分子を含む、請求項４６に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項５４】
修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子が、ＰＡＲリガンドドメイン、破傷風毒素酵素ドメイン、破傷風毒素転移ドメイン及び破傷風毒素結合ドメインを含む修飾破傷風毒素をコードするポリヌクレオチド分子を含む、請求項２８に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項５５】
細胞内のポリヌクレオチド分子によりコードされた修飾クロストリジウム毒素を発現するステップを含む修飾クロストリジウム毒素の産生方法であって、修飾クロストリジウム毒素がＰＡＲリガンドドメイン、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転移ドメイン及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含む方法。
【請求項５６】
ａ．  ＰＡＲリガンドドメイン；クロストリジウム毒素酵素ドメイン；クロストリジウム毒素転移ドメイン；及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含む修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を細胞内に導入するステップ、及び
ｂ．  前記ポリヌクレオチド分子によりコードされる修飾クロストリジウム毒素を発現させるステップ、
を含む、修飾クロストリジウム毒素を産生する方法。
【請求項５７】
ａ）  ＰＡＲリガンドドメイン；
ｂ）  クロストリジウム毒素酵素ドメイン；
ｃ）  クロストリジウム毒素転移ドメイン；及び
ｄ）  非クロストリジウム毒素結合ドメイン、
を含む修飾クロストリジウム毒素。
【請求項５８】
非クロストリジウム毒素結合ドメインが、神経成長因子（ＮＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、多頭活性化ペプチド（ＨＨＡＰ）、形質転換成長因子１（ＴＧＦ−１）、形質転換成長因子２（ＴＧＦ−２）、形質転換成長因子３（ＴＧＦ−３）、表皮成長因子（ＥＧＦ）又は毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）からなる群から選択される、請求項５７に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項５９】
非クロストリジウム毒素結合ドメインが腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−）、インタロイキン−１（ＩＬ−１）、インタロイキン−１（ＩＬ−１）又はインタロイキン−８（ＩＬ−８）からなる群から選択される、請求項５７に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項６０】
非クロストリジウム毒素結合ドメインがブラジキニン、ダイノルフィン、β−エンドルフィン、エトルフィン、エンドモルフィン−１、エンドモルフィン−２、Leu−エンケファリン、Met−エンケファリン、ガラニン、ロフェンタニル又はノシセプチンからなる群から選択される、請求項５７に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項６１】
非クロストリジウム毒素結合ドメインが、後根神経節ニューロンの表面上に見出されるラクト系炭水化物エピトープに対する抗体（例えばモノクローナル抗体１Ｂ２及びＬＡ４）、上述の結合ドメインについてのレセプターのいずれかに対する抗体又は表面発現抗原Ｔｈｙ１に対する抗体（例えばモノクローナル抗体ＭＲＣＯＸ７）からなる群から選択される請求項５７に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全体が本明細書に参照として援用されている２００４年９月１日付けの米国特許出願第１０／９３１７１９号明細書から２００５年７月５日付けで変更された米国仮特許出願第６０／６５１４９４号明細書に対し、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．第１１９条（ｅ）に基づき優先権を請求するものである。
【０００２】
本出願に引用されている特許及び刊行物は全てその全体が本明細書に参照として援用されている。
【背景技術】
【０００３】
ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）類、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ及びＢｏＮＴ／Ｇ及び破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）といったようなクロストリジウム毒素の神経伝達阻害能力は、多種多様な治療用及び美顔用の利用分野において活用されている。例えば、非特許文献１を参照のこと。一例として、ＢＯＴＯＸ（登録商標）は、以下の適応症のために１カ国以上の国で現在承認されている：無弛緩症、成人痙性、裂肛、背痛、眼瞼けいれん、歯ぎしり、頭部ジストニア、本態性振戦、眉間のシワ又は多動な顔面のシワ、頭痛、片側顔面けいれん、過活動膀胱、多汗症、若年性脳性マヒ、多発性硬化症、間代性筋けいれん障害、鼻口唇シワ、けいれん性発声障害、斜視、及び第ＶＩＩ神経障害。さらにクロストリジウム毒素療法は、以下の障害を治療するために提案されている：神経筋肉障害、例えば特許文献１、特許文献２、特許文献３及び特許文献４参照；眼障害、例えば特許文献５、特許文献６及び特許文献７参照；疼痛、例えば特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３及び特許文献１４参照；筋障害、例えば特許文献１５参照；頭痛、例えば特許文献１６、特許文献１７、特許文献１８及び特許文献１９参照；心臓血管疾患、例えば特許文献２０；神経障害、例えば特許文献２１及び特許文献２２参照；神経精神障害、例えば特許文献２３及び特許文献２４参照；内分泌障害、例えば特許文献２５、特許文献２６、特許文献２７、特許文献２８、特許文献２９、特許文献３０、特許文献３１参照；癌、例えば特許文献３２、特許文献３３、特許文献３４及び特許文献３５参照；耳障害、例えば特許文献３６及び特許文献３７参照；自律神経障害、例えば特許文献３８参照；並びにその他の障害、例えば特許文献３９、特許文献４０、特許文献４１、特許文献４２、特許文献４３、特許文献４４、特許文献４５及び特許文献４６を参照のこと。さらに、ヒト及びその他の哺乳動物の治療及び美容整形術におけるＢｏＮＴ及びＴｅＮＴといったクロストリジウム毒素の期待されている用途は、これらの毒素の物性からの利益を享受できるつねに広がり続ける疾病及び軽い病気の範囲にまで拡張していくものと予想されている。
【０００４】
数多くの適応症のためにクロストリジウム毒素が使用され成功をおさめている。一般にクロストリジウム毒素の投与は充分に寛容されている。しかしながら、一部の利用分野での毒素の投与は、有益な効果を達成するのに必要とされる用量がより多いことから、挑戦的なものであり得る。用量が大きくなると、間質液及び循環系例えば体の心臓血管系及びリンパ系を通って毒素が移動しうる確率が増大しその結果、毒素処置の標的でない部域への毒素の望ましくない分散がもたらされる可能性がある。かかる分散は、例えば処置の標的でないニューロン内の神経伝達物質の放出の阻害又は処置の標的でない筋肉の麻痺といった望ましくない副作用を導く可能性がある。例えば、斜頸のために首の筋肉内への治療上有効な量のＢｏＮＴ／Ａ処置の投与を受けた患者は、中咽頭内への毒素の分散のため嚥下障害を発生させる可能性がある。かくして処置の部位において有効であるものの毒素処置の標的でない部域内では無視できる乃至は最小の影響しか及ぼさない改良型のクロストリジウム毒素に対するニーズがなおも存在している。
【０００５】
より大きな用量を必要とする療法におけるクロストリジウム毒素の臨床的、治療用及び美顔用の用途が増大しつつあることから、適用の標的部位においては有効であるものの望まれない場所に対する毒素の分散に付随する望ましくない副作用を削減又は防止する修飾クロストリジウム毒素を製薬業界が開発することが必要となっている。本発明は、非標的部域内への毒素の分散に付随する望ましくない副作用を削減又は防止する新規クロストリジウム毒素を提供している。これらの及び関係する利点は、例えば神経筋肉障害、神経病障害、眼障害、疼痛、筋障害、頭痛、心臓血管疾患、神経精神疾患、内分泌障害、ガン、耳障害及び多動な顔面のシワならびに哺乳動物に対するクロストリジウム毒素の投与が有益な効果を生成し得るその他の障害といったさまざまな臨床的、治療用及び美顔用の利用分野のために有用である。
【特許文献１】ケイ・ロジャー・アオキ（Ｋｅｉ  Ｒｏｇｅｒ  Ａｏｋｉ）ら、「Ａ及びＢ型ボツリヌス毒素を用いて神経筋障害及び身体条件を治療するための方法」、米国特許第６，８７２，３９７号明細書（２００５年３月２９日）；
【特許文献２】レット・Ｍ・シッフマン（Ｒｈｅｔｔ  Ｍ．Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ）、「子宮障害を治療するための方法」、米国特許公開第２００４／０１７５３９９号明細書（２００４年９月９日）；
【特許文献３】リチャード・Ｌ・バロン（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｌ．Ｂａｒｒｏｎ）、「潰瘍及び胃食道逆流症を治療するための方法」、米国特許公開第２００４／００８６５３１号明細書（２００４年５月７日）；
【特許文献４】ケイ・ロジャー・アオキら、「ボツリヌス毒素Ｃ〜Ｇを用いて筋失調症を治療するための方法」米国特許第６，３１９，５０５号明細書（２００１年１１月２０日）；
【特許文献５】エリック・Ｒ・ファースト（Ｅｒｉｃ  Ｒ．Ｆｉｒｓｔ）、「目の障害を治療するための方法及び組成物」、米国特許公開第２００４／０２３４５３２号明細書（２００４年１１月２５日）；
【特許文献６】ケイ・ロジャー・アオキら、「眼瞼けいれんのためのボツリヌス毒素治療」、米国特許公開第２００４／０１５１７４０号明細書（２００４年８月５日）；
【特許文献７】ケイ・ロジャー・アオキら、「斜視のためのボツリヌス毒素治療」、米国特許公開第２００４／０１２６３９６号明細書（２００４年７月１日）；
【特許文献８】ケイ・ロジャー・アオキら、「神経毒素の末梢投与による疼痛治療」、米国特許第６，８６９，６１０号明細書（２００５年３月２２日）；
【特許文献９】スティーヴン・ドノバン（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ）、「クロストリジウム毒素誘導体及び疼痛を治療するための方法」、米国特許第６，６４１，８２０号明細書（２００３年１１月４日）；
【特許文献１０】ケイ・ロジャー・アオキら、「神経毒素末梢投与により疼痛を治療するための方法」、米国特許第６，４６４，９８６号明細書（２００２年１０月１５日）；
【特許文献１１】ケイ・ロジャー・アオキ  及びミンライ・キュイ（Ｍｉｎｇｌｅｉ  Ｃｕｉ）、「疼痛を治療するための方法」、米国特許第６，１１３，９１５号明細書（２０００年９月５日）；
【特許文献１２】マルタン・Ａ・ヴォート（Ｍａｒｔｉｎ  Ａ．Ｖｏｅｔ）、「繊維筋痛症を治療するための方法」、米国特許第６，６２３，７４２号明細書（２００３年９月２３日）；
【特許文献１３】マルタン・Ａ・ヴォート、「繊維筋痛症のためのボツリヌス毒素療法」、米国特許公開第２００４／００６２７７６号明細書（２００４年４月１日）；
【特許文献１４】ケイ・ロジャー・アオキら、「腰痛のためのボツリヌス毒素療法」、米国特許公開第２００４／００３７８５２号明細書（２００４年２月２６日）；
【特許文献１５】グレゴリー・Ｆ・ブルックス（Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ｆ．Ｂｒｏｏｋｓ）、「筋肉損傷を治療するための方法」、米国特許第６，４２３，３１９号明細書（２００２年７月２３日）；
【特許文献１６】マルタン・ヴォート、「副鼻腔炎による頭痛を治療するための方法」、米国特許第６，８３８，４３４号明細書（２００５年１月４日）；
【特許文献１７】ケイ・ロジャー・アオキら、「緊張性頭痛を治療するための方法」、米国特許第６，７７６，９９２号明細書（２００４年８月１７日）；
【特許文献１８】ケイ・ロジャー・アオキら、「頭痛を治療するための方法」、米国特許第６，４５８，３６５号明細書（２００２年１０月１日）；
【特許文献１９】ウイリアム・Ｊ・バインダー（Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｊ．Ｂｉｎｄｅｒ）、「片頭痛を軽減するための方法」、米国特許第５，７１４，４６９号明細書（１９９８年２月３日）；
【特許文献２０】グレゴリー・Ｆ・ブルックス及び  スティーヴン・ドノバン、「ボツリヌス毒素を用いて心臓血管疾患を治療するための方法」、米国特許第６，７６７，５４４号明細書（２００４年７月２７日）；
【特許文献２１】スティーヴン・ドノバン、「パーキンソン病治療」、米国特許第６，６２０，４１５号明細書（２００３年９月１６日）；
【特許文献２２】スティーヴン・ドノバン、「ボツリヌス毒素を用いてパーキンソン病を治療するための方法」、米国特許第６，３０６，４０３号明細書（２００１年１０月２３日）；
【特許文献２３】スティーヴン・ドノバン、「神経精神障害のためのボツリヌス毒素療法」、米国特許公開第２００４／０１８００６１号明細書（２００４年９月１６日）；
【特許文献２４】スティーヴン・ドノバン、「神経精神障害のための治療上の処置」、米国特許公開第２００３／０２１１１２１号明細書（２００３年１１月１３日）；
【特許文献２５】スティーヴン・ドノバン、「内分泌障害を治療するための方法」、米国特許第６，８２７，９３１号明細書（２００４年１２月７日）；
【特許文献２６】スティーヴン・ドノバン、「ボツリヌス毒素を用いて甲状腺障害を治療するための方法」、米国特許第６７４０３２１号明細書（２００４年５月２５日）；
【特許文献２７】ケイ・ロジャー・アオキら、「コリン作動薬の影響を受けた汗腺を治療するための方法」、米国特許第６，６８３，０４９号明細書（２００４年１月２７日）；
【特許文献２８】スティーヴン・ドノバン、「糖尿病のための神経毒素療法」、米国特許第６，４１６，７６５号明細書（２００２年７月９日）；
【特許文献２９】スティーヴン・ドノバン、「糖尿病を治療するための方法」、米国特許第６，３３７，０７５号明細書（２００２年１月８日）；
【特許文献３０】スティーヴン・ドノバン、「神経毒素を用いて膵臓障害を治療するための方法」、米国特許第６，２６１，５７２号明細書（２００１年７月１７日）；
【特許文献３１】スティーヴン・ドノバン、「膵臓障害を治療するための方法」、米国特許第６，１４３，３０６号明細書（２０００年１１月７日）；
【特許文献３２】スティーヴン・ドノバン、「骨腫瘍を治療するための方法」、米国特許第６，５６５，８７０号明細書（２００３年５月２０日）；
【特許文献３３】スティーヴン・ドノバン、「患者の機能改善のために神経毒素を用いた癌の治療方法」、米国特許第６，３６８，６０５号明細書（２００２年４月９日）；
【特許文献３４】スティーヴン・ドノバン、「神経毒素を用いて癌を治療するための方法」、米国特許第６，１３９，８４５号明細書（２０００年１０月３１日）；
【特許文献３５】ミッチェル・Ｆ・ブリン（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｆ．Ｂｒｉｎ）及びスティーヴン・ドノバン、「種々の癌を治療するための方法」、米国特許公開第２００５／００３１６４８号明細書（２００５年２月１０日）；
【特許文献３６】スティーヴン・ドノバン、「内耳障害のための神経毒素療法」、米国特許第６３５８９２６号明細書（２００２年３月１９日）；
【特許文献３７】スティーヴン・ドノバン、「耳の障害を治療するための方法」、米国特許第６２６５３７９号明細書（２００１年７月２４日）；
【特許文献３８】パンカイ・Ｊ・パスリチャ（Ｐａｎｋａｉ  Ｊ．Ｐａｓｒｉｃｈａ）及びアンソニー・Ｎ・カルー（Ｎ．Ｋａｌｌｏｏ）、「胃腸筋肉障害及びその他の平滑筋機能不全を治療するための方法」、米国特許第５，４３７，２９１号明細書（１９９５年８月１日）；
【特許文献３９】ウイリアム・Ｊ・バインダー、「皮膚細胞増殖障害を随伴する皮膚病変の治療方法」、米国特許第  ５，６７０，４８４号明細書（１９９７年９月２３日）；
【特許文献４０】エリック・Ｒ・ファースト、「神経性炎症性障害の管理に対するボツリヌス毒素の応用」、米国特許第６，０６３，７６８号明細書（２０００年５月１６日）；
【特許文献４１】マーヴィン・シュワルツ（Ｍａｒｖｉｎ  Ｓｃｈｗａｒｔｚ）及びブライアン・Ｊ・フロイント（Ｂｒｉａｎ  Ｊ．Ｆｒｅｕｎｄ）、「毛髪の損失を削減し毛髪生長を刺激するための方法」、米国特許第６，２９９，８９３号明細書（２００１年１０月９日）；
【特許文献４２】ジャン・Ｄ・Ａ・カラザース（Ｊｅａｎ  Ｄ．Ａ．Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ）及びアラステア・カラザース（Ａｌａｓｔａｉｒ  Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ）、「下向きに曲がった口を治療するためのボツリヌス毒素の美容的利用」、米国特許第６，３５８，９１７号明細書（２００２年３月１９日）；
【特許文献４３】スティーヴン・ドノバン、「食欲を削減するためのクロストリジウム毒素の使用」、米国特許公開第２００４／４０２５３２７４号明細書（２００４年１２月１６日）；
【特許文献４４】ハワード・Ｉ・カッツ（Ｈｏｗａｒｄ  Ｉ．Ｋａｔｚ）及びアンドリュー・Ｍ・ブルメンフェルド（Ａｎｄｒｅｗ  Ｍ．Ｂｌｕｍｅｎｆｅｌｄ）、「ボツリヌス毒素の歯科療法及び手順」、米国特許公開第２００４／０１１５１３９号明細書（２００４年６月１７日）；
【特許文献４５】ケイ・ロジャー・アオキら、「異なるボツリヌス菌を用いた神経筋障害及び身体条件の治療」、米国特許公開第２００２／００１０１３８号明細書（２００２年１月２４日）；
【特許文献４６】ケイ・ロジャー・アオキら、「様々な障害及び身体条件並びに付随する疼痛を治療するためのボツリヌス毒素の使用」、米国特許公開第２００４／００１３６９２号明細書（２００４年１月２２日）。
【非特許文献１】ウイリアム・Ｊ・リップハム（Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｊ．Ｌｉｐｈａｍ）、「Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ」（スラック（Ｓｌａｃｋ，Ｉｎｃ．）、２００４年）。
【発明の開示】
【０００６】
このプロセスの全ての詳細は、まだ正確にわかっていないが、プロテアーゼで活性化されたＧ−タンパク質共役型レセプターー（ＰＡＲ）のシグナリングは、その他のＧＰＣＲのために確立された古典的パラダイムに従って応答を惹起する。出願人は、以下の記載により制限されることを望むものでは全くないが、シグナリング機序全体は少なくとも次の４つのステップを含むものとして記載することができる：すなわち、１）プロテアーゼアゴニストが、連結リガンドとして機能する新しいアミノ酸末端を生成するレセプターーの細胞外アミノ末端に位置設定された特定の部位を分割するレセプターー活性化ステップ；２）アンマスクされた連結リガンドが、レセプターーの第２の細胞外ループ内に位置設定されたリガンド結合ドメインに結合し、結果としてヘテロマーＧタンパク質との細胞内相互作用を促進する分割済みＰＡＲの立体配座変更がもたらされるリガンド結合ステップ；３）大部分のＧＰＣＲと共通して、ＰＡＲ−Ｇタンパク質複合体が、時間的及び空間的にさまざまなＧｑ−、Ｇｉ及びＧβγ−媒介型シグナリング経路を通してシグナリングするシグナル変換ステップ；及び４）レセプターー脱感作及びレセプターー分解が、活性化された複合体のシグナリングを停止させるシグナル終結ステップ（図１）、例えばホアン・トレホ（Ｊｏａｎｎ  Ｔｒｅｊｏ）、「Ｐｒｏｔｅａｓｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｎｅｗ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ」第３０７（２）号Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．４３７−４４２頁（２００３年）；及びヴァレリア・Ｓ・オソヴスカヤ（Ｖａｌｅｒｉａ  Ｓ．Ｏｓｓｏｖｓｋａｙａ）及びナイジェル・Ｗ・ベネット（Ｎｉｇｅｌ  Ｗ．Ｂｅｎｎｅｔｔ），「Ｐｒｏｔｅａｓｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、第８４（２）号、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．５７９−６２１頁（２００４年）を参照のこと。
【０００７】
レセプターー活性化の不可逆的機序にも関わらず、活性化されたＰＡＲにより開始されるシグナリングは急速かつ効率良く終結されるように思われる。シグナリング終結は、ＰＡＲ惹起された細胞応答の規模、持続時間及び忠実度を調節するために特に重要であり、次の２つのプロセスにより支配されると思われる。第１の機序は、Ｇ−タンパク質レセプターキナーゼ（ＧＲＫ）及びその他のキナーゼによる活性化されたＰＡＲの酵素リン酸化反応がその付随するＧ−タンパク質及びシグナリングエフェクタの脱共役する、レセプターの脱感作である。ＰＡＲ開始型シグナル終結の第２の機序は、原形質膜上の細胞表面プロテアーゼ及びリソソーム小胞内の細胞内プロテアーゼによる活性化されたＰＡＲのタンパク質分解分割が、活性化されたレセプターを破壊する、レセプター分解である。ＰＡＲ活性化が不可逆的な性質を有することから、活性化されたＰＡＲの内在化及びリソソームに対するそれらの後続選別は、シグナル終結にとって支配的なプロセスであると思われる。活性化されたＰＡＲの内在化は、Ｇタンパク質及びシグナリングエフェクタから活性化レセプターを除去すること又はタンパク質分解が活性化レセプターを有効に不活性化するリソソーム小胞まで活性化レセプターを導くことの両方によって、シグナル終結に貢献する。活性化レセプターのエンドサイトーシスに加え、ＰＡＲは又タンパク質分解活性化の不在下で構成性エンドサイトーシスをも受ける。従って、ＰＡＲ活性化の例外的で不可逆的な様式は、エンドサイトーシス及びリソソーム分解を用いて活性化ＰＡＲにより惹起されるシグナリング事象を終結させる非常に迅速で効率の良い手段を生み出した。
【０００８】
本発明は、活性化ＰＡＲシグナル終結に関与するプロセスを開発利用することにより循環系から急速に除去され得る修飾クロストリジウム毒素を開示している。ＰＡＲリガンドドメインを含有するクロストリジウム毒素は、ＰＡＲを結合することができ、かかる修飾毒素の内在化及び分解を開始させる。心臓血管系及びリンパ系の数多くの組織が、ＰＡＲを発現する細胞を含む。ＰＡＲリガンドドメインを含む修飾クロストリジウム毒素が循環系の中に拡散した状況下では、この修飾毒素はＰＡＲ発現細胞により有効に内在化され、リソソーム内部でプロテアーゼにより分解され得る（図２）。かくして、ＰＡＲにより惹起されたシグナル終結に関与するプロセスを利用することで、循環系からのクロストリジウム毒素は減少するか又は除去され、かくして望ましくない場所へのクロストリジウム毒素の拡散に付随する望ましくない副作用は削減又は防止されることになる。
【０００９】
本発明の態様は、ＰＡＲリガンドドメイン；クロストリジウム毒素酵素ドメイン；クロストリジウム毒素転移ドメイン及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含む修飾クロストリジウム毒素を提供している。本仕様書の修飾クロストリジウム毒素内のＰＡＲリガンドドメインの場所は、これに制限されないが、クロストリジウム毒素酵素ドメインのアミノ末端；クロストリジウム毒素転移ドメインのアミノ末端；及びクロストリジウム毒素結合ドメインのアミノ末端を含む、自由アミノ末端に位置設定されるものと予測されている。かくして、実施形態においては、修飾クロストリジウム毒素はＰＡＲリガンドドメイン；クロストリジウム毒素酵素ドメイン；クロストリジウム毒素転移ドメイン及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含み、ここでＰＡＲリガンドドメインはクロストリジウム毒素酵素ドメインのアミノ末端に位置設定されている。その他の実施形態においては、修飾クロストリジウム毒素はＰＡＲリガンドドメイン；クロストリジウム毒素酵素ドメイン；クロストリジウム毒素転移ドメイン及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含み、ＰＡＲリガンドドメインはクロストリジウム毒素転移ドメインのアミノ末端に位置設定されている。さらにその他の実施形態においては、修飾クロストリジウム毒素はＰＡＲリガンドドメイン；クロストリジウム毒素酵素ドメイン；クロストリジウム毒素転移ドメイン及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含み、ここでＰＡＲリガンドドメインはクロストリジウム毒素結合ドメインのアミノ末端に位置設定されている。
【００１０】
本発明のその他の実施形態は、ＰＡＲリガンドドメイン；クロストリジウム毒素酵素ドメイン；クロストリジウム毒素転移ドメイン及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含む修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書のポリヌクレオチド分子によりコードされる修飾クロストリジウム毒素のＰＡＲリガンドドメインの場所は、これに制限されないが、クロストリジウム毒素酵素ドメインのアミノ末端；クロストリジウム毒素転移ドメインのアミノ末端；及びクロストリジウム毒素結合ドメインのアミノ末端を含めた自由アミノ末端に位置設定されるものと予測されている。かくして、実施形態においては、該ポリヌクレオチド分子は、ＰＡＲリガンドドメイン；クロストリジウム毒素酵素ドメイン；クロストリジウム毒素転移ドメイン及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含み、ＰＡＲリガンドドメインがクロストリジウム毒素酵素ドメインのアミノ末端に位置設定されている修飾クロストリジウム毒素をコードした。その他の実施形態においては、該ポリヌクレオチド分子は、ＰＡＲリガンドドメイン；クロストリジウム毒素酵素ドメイン；クロストリジウム毒素転移ドメイン；及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含み、ＰＡＲリガンドドメインがクロストリジウム毒素転移ドメインのアミノ末端にある修飾クロストリジウム毒素をコードした。さらにその他の実施形態においては、該ポリヌクレオチド分子は、ＰＡＲリガンドドメイン；クロストリジウム毒素酵素ドメイン；クロストリジウム毒素転移ドメイン；及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含み、ＰＡＲリガンドドメインがクロストリジウム毒素結合ドメインのアミノ末端にある修飾クロストリジウム毒素をコードした。
【００１１】
本発明のその他の態様は、ＰＡＲリガンドドメイン；クロストリジウム毒素酵素ドメイン；クロストリジウム毒素転移ドメイン及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含む修飾クロストリジウム毒素を産生する方法において、ＰＡＲリガンドドメイン；クロストリジウム毒素酵素ドメイン；クロストリジウム毒素転移ドメイン及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含む修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を１つの細胞内で発現するステップを含む方法を提供している。本発明のその他の態様は、ＰＡＲリガンドドメイン；クロストリジウム毒素酵素ドメイン；クロストリジウム毒素転移ドメイン；及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含む修飾クロストリジウム毒素を１つの細胞内で産生する方法において、ＰＡＲリガンドドメイン；クロストリジウム毒素酵素ドメイン；クロストリジウム毒素転移ドメイン；及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含む修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を含む発現構成体を細胞内に導入するステップ及び該発現構成体を該細胞内で発現させるステップを含む方法を提供する。
【００１２】
本発明の態様は、一部には、クロストリジウム毒素を提供している。本書で使用されている「クロストリジウム毒素」という用語は、クロストリジウム毒素がニューロン内に入り神経伝達物質放出を抑制しかつ低又は高親和性レセプター複合体に対するクロストリジウム毒素の結合、毒素／レセプター複合体の内在化、細胞質内へのクロストリジウム毒素軽鎖の転移及びクロストリジウム毒素基質の酵素修飾を包含するようにする全体的細胞機序を実施できるあらゆるポリペプチドを意味する。Ｂ型ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、破傷風病菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、Ｆ型ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂａｒａｔｉｉ）及びＣ型ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）により産生されるクロストリジウム毒素が、人間及びその他の哺乳動物の治療的及び美顔的処置において最も広く用いられている。Ｃ．ボツリナムの菌株は、ヒト（ＢｏＮＴ／Ａ、／Ｂ、／Ｅ及び／Ｆ）、動物（ＢｏＮＴ／Ｃ１及び／Ｄ）におけるボツリヌス菌の発生を調査することによって同定されたか又は土壌から単離された（ＢｏＮＴ／Ｇ）、７つの抗原的に全く異なるタイプのボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ）を産生する。ＢｏＮＴは、互いに約３５％のアミノ酸同一性を有し、同じ機能的ドメインの組織及び全体的な構造的アーキテクチャを共有する。当業者は、クロストリジウム毒素の各々のタイプ内に、そのアミノ酸配列のみならずこれらのタンパク質をコードする核酸が幾分か異なっているサブタイプが存在し得る、ということを認めている。例えば、現在、ＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ３及びＢｏＮＴ／Ａ４の４つのＢｏＮＴ／Ａサブタイプが存在し、特定的サブタイプは、もう１つのＢｏＮＴ／Ａサブタイプに比べてほぼ８９％のアミノ酸同一性を示す。７つのＢｏＮＴ血清型は全て類似の構造及び薬理学的特性を有するものの、各々は同様に不均一な細菌学的特性も示している。これとは対照的に、破傷風毒素（ＴｅＮＴ）は、Ｃ．テタニの均一グループにより産生される。２つのその他のクロストリジウム種であるＣ．バラティ及びＣ．ブチリカムも同様にそれぞれＢｏＮＴ／Ｆ及びＢｏＮＴ／Ｅに類似した毒素を産生する。
【００１３】
クロストリジウム毒素は、例えば環境内で産生される天然に発生するプロテアーゼ又は内因性クロストリジウム毒素プロテアーゼといったような天然に発生するプロテアーゼによりジスルフィドグループ内部でタンパク質分解切断によりその後分割される約１５０ｋＤａの１本鎖ポリペプチドとして各々翻訳される。この翻訳後プロセッシングは、単一のジスルフィド結合及び非共有相互作用により併せて保持される約１００ｋＤａの重鎖（ＨＣ）及び約５０ｋＤａの軽鎖（ＬＣ）を含む２鎖分子を生成する。各々の成熟２鎖分子は、次の機能的に全く異なる３つのドメインを含む；１）神経伝達物質放出器官のコア構成要素を特定的にターゲティングする亜鉛依存性エンドペプチダーゼ活性を含有するメタロプロテアーゼ領域を含むＬＣ内に位置設定された酵素ドメイン（表１）；２）標的細胞の細胞質内への細胞内小胞からのＬＣの放出を容易にするＨＣ（ＨＮ）のアミノ末端半分内に含まれる転移ドメイン（表１）；及び３）標的細胞の表面に位置設定されたレセプター複合体に対する毒素の結合特異性及び結合活性を決定するＨＣ（Ｈｃ）のカルボニル末端半分内に見出される結合ドメイン（表１）。
【００１４】
これら３つの機能的ドメインの結合、転移及び酵素活性は全て毒性に必要なものである。このプロセスの全ての詳細はまだ正確にわかっていないが、クロストリジウム毒素がニューロン内に入り神経伝達物質の放出を抑制するようにする全体的細胞中毒機序は、タイプの如何に関わらず同様である。出願人は、以下の記載により制限されることを全く望んでいないが、該中毒機序は、少なくとも次の４つのステップを含むものとして記載することができる；１）レセプター結合、２）複合体内在化、３）軽鎖転移及び４）酵素標的修飾（図１参照）。該プロセスは、クロストリジウム毒素のＨｃドメインが標的細胞の原形質膜表面上に位置設定された毒素特異的レセプター複合体に結合する場合に開始される。レセプター複合体の結合特異性は、一部には、各々のクロストリジウム毒素レセプター複合体を区別して含むように思われるタンパク質レセプター及びガングリオシドの特異的組み合わせによって達成されるものと考えられている。ひとたび結合されると、毒素／レセプター複合体は、エンドサイトーシスにより内在化され、内在化された小胞は特異的細胞内経路へと選別される。転移ステップは、小胞区画の酸化性により誘発されるように思われる。このプロセスは、疎水性を増大させ毒素の２鎖形状の形成を促進する２つの重要なｐＨ依存性構造再配置を開始するものと思われる。ひとたび活性化されると、毒素の軽鎖エンドペプチターゼは、細胞内小胞から細胞質ゾル内に放出され、ここで、それは、神経伝達物質放出器官の３つの既知のコア構成要素の１つを特異的にターゲティングする。これらのコアタンパク質、小胞関連膜タンパク質（ＶＡＭＰ）／シナプトブレビン、２５ｋＤａのシナプトソーム関連タンパク質（ＳＮＡＰ−２５）及びシンタキシンは、神経末端でのシナプス小胞のドッキング及び融合に必要であり、可溶性Ｎ−エチルマレイミド−感受性因子−付着タンパク質−レセプター（ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ−ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＳＮＡＲＥ）ファミリーの成員を構成する。ＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｅは、カルボキシル末端領域においてＳＮＡＰ−２５を分割し、それぞれに９又は２６アミノ酸セグメントを放出し、かつＢｏＮＴ／Ｃｌは同様にカルボキシル末端近くのＳＮＡＰ−２５を分割する。ボツリヌス菌血清型ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｆ及びＢｏＮＴ／Ｇ及び破傷風毒素は、ＶＡＭＰの保存された中心部分に対して作用し、細胞質ゾル内にＶＡＭＰのアミノ末端部分を放出する。ＢｏＮＴ／Ｃ１は、細胞質ゾル膜表面近くの単一の部位でシンタキシンを分割する。シナプスＳＮＡＲＥの選択的タンパク質分解は、インビボでクロストリジウム毒素によりひき起こされる神経伝達物質放出の遮断を説明している。クロストリジウム毒素のＳＮＡＲＥタンパク質標的は、さまざまな非ニューロン型におけるエキソサイトーシスに共通である。これらの細胞においては、ニューロン内と同様、軽鎖ペプチダーゼ活性はエキソサイトーシスを阻害する。例えばヤン・ヒュモー（Ｙａｎｎ  Ｈｕｍｅａｕ）ら、「Ｈｏｗ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ａｎｄ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｎ��ｕｒｏｔｏｘｉｎｓ  Ｂｌｏｃｋ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  Ｒｅｌｅａｓｅ」、第８２（５）号、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、４２７−４４６頁（２０００年）；キャサリン・タートン（Ｋａｔｈｒｙｎ  Ｔｕｒｔｏｎ）ら、「Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ａｎｄ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｔｉｌｉｔｙ」、第２７（１１）号、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．５５２−５５８頁（２００２年）；ジョヴァンア・ラリ（Ｇｉｏｖａｎｎａ  Ｌａｌｌｉ）ら、「Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎｅｙ  ｏｆ  Ｔｅｔａｎｕｓ  ａｎｄ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｎｓ」、第１１（９）号、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３１−４３７頁（２００３年）を参照のこと。
【００１５】
【表１】
2008511338.tif 000002
【００１６】
クロストリジウム毒素は、これに制限されないが、クロストリジウム毒素イソ型及びクロストリジウム毒素サブタイプといったような天然に発生するクロストリジウム毒素変異体；例えば保存的クロストリジウム毒素変異体、非保存的クロストリジウム毒素変異体、クロストリジウム毒素キメラ変異体及びその活性クロストリジウム毒素フラグメントといったような非天然発生のクロストリジウム毒素変異体、又はそれらの組み合わせを含む。本書で記載されているように、「クロストリジウム毒素変異体」という用語は、天然発生又は非天然発生のいずれであれ、開示された基準配列の対応する領域からの少なくとも１つのアミノ酸変更を有し（表１参照）かつその基準配列の対応する領域に対する同一性百分率で描写できるクロストリジウム毒素を意味する。非制限的な例としては、配列番号１のアミノ酸１−１２９６を含むＢｏＮＴ／Ａ変異体が、配列番号１のアミノ酸領域１−１２９６に比べて例えば１つのアミノ酸置換、欠失又は付加といった少なくとも１つのアミノ酸の差を有することになり；配列番号２のアミノ酸１−１２９１を含むＢｏＮＴ／Ｂ変異体が、配列番号２のアミノ酸領域１−１２９１に比べて例えば１アミノ酸置換、欠失又は付加といった少なくとも１つのアミノ酸の差を有することになり；配列番号３のアミノ酸１−１２９１を含むＢｏＮＴ／Ｃ１変異体が、配列番号３のアミノ酸領域１−１２９１に比べて例えば１アミノ酸置換、欠失又は付加といったような少なくとも１つのアミノ酸の差を有することになり；配列番号４のアミノ酸１−１２７６を含むＢｏＮＴ／Ｄ変異体が、配列番号４のアミノ酸領域１−１２７６に比べて例えば１つのアミノ酸置換、欠失又は付加といった少なくとも１つのアミノ酸の差を有することになり；配列番号５のアミノ酸１−１２５２を含むＢｏＮＴ／Ｅ変異体が、配列番号５のアミノ酸領域１−１２５２に比べて例えば１アミノ酸置換、欠失又は付加といった少なくとも１つのアミノ酸の差を有することになり；配列番号６のアミノ酸１−１２７４を含むＢｏＮＴ／Ｆ変異体が、配列番号６のアミノ酸領域１−１２７４に比べて例えば１アミノ酸置換、欠失又は付加といったような少なくとも１つのアミノ酸の差を有することになり；配列番号７のアミノ酸１−１２９７を含む、ＢｏＮＴ／Ｇ変異体が、配列番号７のアミノ酸領域１−１２９７に比べて例えば１つのアミノ酸置換、欠失又は付加といった少なくとも１つのアミノ酸の差を有することになり；配列番号８のアミノ酸１−１３１５を含むＴｅＮＴ変異体が、配列番号８のアミノ酸領域１−１３１５に比べて例えば１アミノ酸置換、欠失又は付加といった少なくとも１つのアミノ酸の差を有することになる。
【００１７】
例えばセグメントアプローチ方法といったような包括的方法、局所的方法及びハイブリッド方法を含む（ただしこれらに制限されない）さまざまな配列整列方法のいずれかを用いて、同一性百分率を決定することができる。同一性百分率を決定するためのプロトコルは、本書中の教示に由来し当業者の技術範囲内に入る日常的手順である。
【００１８】
包括的方法は、分子の最初から終りまで配列を整列させ、個々の残基対の評点を加算し空隙ペナルティを課すことで、最高の整列を判定する。制限的意味のない方法としては、例えばＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ．［例えばジュリー・Ｄ・トンプソン（Ｊｕｌｉｅ  Ｄ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら、「ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ：Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，Ｐｏｓｉｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｃｈｏｉｃｅ」、第２２（２２）号、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４６７３−４６８０頁（１９９４年）を参照］；及び反復改良［例えば、オサム・ゴトー（Ｏｓａｍｕ  Ｇｏｔｏｈ）、「Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ａｃｃｕｒａｃｙ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｂｙ  Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  ａｓ  Ａｓｓｅｓｓｅｄ  ｂｙ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ」、第２６４（４）号、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８２３−８３８頁（１９９６年）を参照］が含まれる。
【００１９】
局所的方法は、入力配列の全てが共有する１つ以上の保存されたモチーフを同定することによって配列を整列させる。制限的意味のない方法としては、例えばＭａｔｃｈ−ｂｏｘ［例えばエリック・ドピエリュー（Ｅｒｉｃ  Ｄｅｐｉｅｒｅｕｘ）及びアーネスト・フェイトマン（Ｅｒｎｅｓｔ  Ｆｅｙｔｍａｎｓ）、「Ｍａｔｃｈ−Ｂｏｘ：  Ａ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｌｙ  Ｎｅｗ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｅｖｅｒａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、第８（５）号、ＣＡＢＩＯＳ  ５０１−５０９頁（１９９２年）を参照］；Ｇｉｂｂｓサンプリング［例えば、Ｃ・Ｅ・ローレンス（Ｌａｗｒｅｎｃｅ）ら、「Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｓｕｂｔｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｉｇｎａｌｓ：Ａ  Ｇｉｂｂｓ  Ｓａｍｐｌｉｎｇ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ」第２６２（５１３１）号、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０８−２１４頁（１９９３年）を参照］；Ａｌｉｇｎ−Ｍ［例えば、アイヴォ・ヴァン・ウェール（Ｉｖｏ  Ｖａｎ  Ｗａｌｌｅ）ら、「Ａｌｉｇｎ−Ｍ  −  Ａ  Ｎｅｗ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、第２０（９）号、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１４２８−１４３５頁（２００４年）を参照］が含まれる。
【００２０】
ハイブリッド方法は、包括的及び局所的の両方の整列方法の機能面を組合わせたものである。制限的意味の無い方法としては、セグメント対セグメント比較［例えば、ブルクハルト・モルゲンシュテルン（Ｂｕｒｋｈａｒｄ  Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ）ら、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｂａｓｅｄ  Ｏｎ  Ｓｅｇｍｅｎｔ−Ｔｏ−Ｓｅｇｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ、第９３（２２）号、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１２０９８−１２１０３頁（１９９６年）参照」；Ｔ−Ｃｏｆｆｅｅ［例えば、セドリック・ノートルダム（Ｃｅｄｒｉｃ  Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ）ら、「Ｔ−Ｃｏｆｆｅｅ：Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ」、第３０２（１）号、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０５−２１７頁（２０００年）参照］；ＭＵＳＣＬＥ［例えばロバート・Ｃ・エドガー（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｃ．  Ｅｄｇａｒ）、「ＭＵＳＣＬＥ：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｗｉｔｈ  Ｈｉｇｈ  Ｓｃｏｒｅ  Ａｃｃｕｒａｃｙ  ａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ」、第３２（５）号、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７９２−１７９７頁（２００４年）を参照］；並びに、ＤＩＡＬＩＧＮ−Ｔ［例えばアマレンドラン・Ｒ・サブラマニアン（Ａｍａｒｅｎｄｒａｎ  Ｒ  Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ）ら、「ＤＩＡＬＩＧＮ−Ｔ：Ａｎ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  Ｓｅｇｍｅｎｔ−Ｂａｓｅｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ」、第６（１）、ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、６６頁（２００５年）を参照］が含まれる。
【００２１】
本書で使用されるように「天然に発生するクロストリジウム毒素変異体」という用語は、これに制限されないが、選択的スプライシングによる写しから産生されたクロストリジウム毒素イソ型、自然突然変異により産生されるクロストリジウム毒素イソ型及びクロストリジウム毒素サブタイプを含めた、任意の人的操作の補助無しで産生されたあらゆるクロストリジウム毒素を意味する。クロストリジウム毒素イソ型の制限的意味のない例としては、例えばＢｏＮＴ／Ａイソ型、ＢｏＮＴ／Ｂイソ型、ＢｏＮＴ／Ｃ１イソ型、ＢｏＮＴ／Ｄイソ型、ＢｏＮＴ／Ｅイソ型、ＢｏＮＴ／Ｆイソ型、ＢｏＮＴ／Ｇイソ型及びＴｅＮＴイソ型が含まれる。クロストリジウム毒素サブタイプの制限的意味のない例としては、例えばＢｏＮＴ／ＡサブタイプＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ３及びＢｏＮＴ／Ａ４；ＢｏＮＴＢサブタイプＢｏＮＴ／Ｂ１、ＢｏＮＴ／Ｂ２、ＢｏＮＴ／Ｂ２価及びＢｏＮＴ／Ｂ非タンパク質分解；ＢｏＮＴ／Ｃ１サブタイプＢｏＮＴ／Ｃ１−１及びＢｏＮＴ／Ｃ１−２；ＢｏＮＴ／ＥサブタイプＢｏＮＴ／Ｅ１、ＢｏＮＴ／Ｅ２、及びＢｏＮＴ／Ｅ３；及びＢｏＮＴ／ＦサブタイプＢｏＮＴ／Ｆ１、ＢｏＮＴ／Ｆ２、ＢｏＮＴ／Ｆ３及びＢｏＮＴ／Ｆ４が含まれる。
【００２２】
本書で使用されている「非天然発生のクロストリジウム毒素変異体」という用語は、これに制限されないが、無作為突然変異誘発又は合理的設計を用いた遺伝子工学処理により産生されたクロストリジウム毒素及び化学的合成により産生されたクロストリジウム毒素を含め、人的操作を用いて産生されるあらゆるクロストリジウム毒素を意味する。非天然発生のクロストリジウム毒素変異体の制限的意味のない例としては、例えば保存的クロストリジウム毒素変異体、非保存的クロストリジウム毒素変異体、クロストリジウム毒素キメラ変異体及び活性クロストリジウム毒素フラグメントが含まれる。
【００２３】
本書で使用されている「保存的クロストリジウム毒素変異体」という用語は、基準クロストリジウム毒素配列（表１）からのもとのアミノ酸のものと類似した少なくとも１つの特性をもつアミノ酸類似体又はもう１つのアミノ酸により置換された少なくとも１つのアミノ酸を有するクロストリジウム毒素を意味する。特性の例としては、これに制限されないが、類似のサイズ、トポグラフィ、電荷、疎水性、親水性、親油性、共有結合能力、水素結合能力、物理化学的特性など、又はそれらの組み合わせが含まれる。保存的クロストリジウム毒素変異体は、その基礎となっている基準クロストリジウム毒素と実質的に同じ要領で機能することができ、本発明のいずれの態様においても、基準クロストリジウム毒素と置換され得る。保存的クロストリジウム毒素変異体は、その基礎となっている基準クロストリジウム毒素からの１個以上のアミノ酸、２個以上のアミノ酸、３個以上のアミノ酸、４個以上のアミノ酸、５個以上のアミノ酸、１０個以上のアミノ酸、２０個以上のアミノ酸、３０個以上のアミノ酸、４０個以上のアミノ酸、５０個以上のアミノ酸、１００個以上のアミノ酸、２００個以上のアミノ酸、３００個以上のアミノ酸、４００個以上のアミノ酸又は５００個以上のアミノ酸を置換し得る。保存的クロストリジウム毒素変異体は同様に、その基礎となっている基準クロストリジウム毒素と少なくとも５０％、６５％、７５％、８５％又は９５％のアミノ酸同一性を有する、該保存的クロストリジウム毒素変異体の基礎となっている基準クロストリジウム毒素から少なくとも１０個の隣接アミノ酸、少なくとも１５個の隣接アミノ酸、少なくとも２０個の隣接アミノ酸又は少なくとも２５個の隣接アミノ酸を置換することもできる。保存的クロストリジウム毒素変異体の制限的意味の無い例としては例えば、保存的ＢｏＮＴ／Ａ変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｂ変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｄ変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｅ変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｆ変異体、保存的ＢｏＮＴ／Ｇ変異体及び保存的ＴｅＮＴ変異体が含まれる。
【００２４】
本書で使用されている「非保存的クロストリジウム毒素変異体」という用語は、１）少なくとも１つのアミノ酸が、非保存的クロストリジウム毒素変異体の基礎となっている基準クロストリジウム毒素から欠失されているか；２）少なくとも１つのアミノ酸が非保存的クロストリジウム毒素変異体の基礎となっている基準クロストリジウム毒素に付加されているか、又は３）少なくとも１つのアミノ酸が、基準クロストリジウム毒素配列からのもとのアミノ酸のものに類似したいずれかの特性を共有しないアミノ酸類似体又はもう１つのアミノ酸により置換されているクロストリジウム毒素を意味する（表１）。非保存的クロストリジウム毒素変異体は、その基礎となっている基準クロストリジウム毒素と実質的に同じ要領で機能でき、又、本発明のいずれの態様においても基準クロストリジウム毒素と置換され得る。非保存的クロストリジウム毒素変異体は、その基礎となっている基準クロストリジウム毒素から１個以上のアミノ酸、２個以上のアミノ酸、３個以上のアミノ酸、４個以上のアミノ酸、５個以上のアミノ酸及び１０個以上のアミノ酸を欠失させることができる。非保存的クロストリジウム毒素変異体は、その基礎となっている基準クロストリジウム毒素に対して１個以上のアミノ酸、２個以上のアミノ酸、３個以上のアミノ酸、４個以上のアミノ酸、５個以上のアミノ酸及び１０個以上のアミノ酸を付加することができる。非保存的クロストリジウム毒素変異体は、その基礎となっている基準クロストリジウム毒素から１個以上のアミノ酸、２個以上のアミノ酸、３個以上のアミノ酸、４個以上のアミノ酸、５個以上のアミノ酸、１０個以上のアミノ酸、２０個以上のアミノ酸、３０個以上のアミノ酸、４０個以上のアミノ酸、５０個以上のアミノ酸、１００個以上のアミノ酸、２００個以上のアミノ酸、３００個以上のアミノ酸、４００個以上のアミノ酸又は５００個以上のアミノ酸を置換することができる。非保存的クロストリジウム毒素変異体は同様に、その基礎となっている基準クロストリジウム毒素に対する少なくとも５０％、６５％、７５％、８５％又は９５％のアミノ酸同一性を有するその基礎となっている基準クロストリジウム毒素から少なくとも１０個の隣接アミノ酸、少なくとも１５個、少なくとも２０個、又は少なくとも２５個の隣接アミノ酸を置換することもできる。非保存的クロストリジウム毒素変異体の制限的意味のない例としては、非保存的ＢｏＮＴ／Ａ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｂ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｄ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｅ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｆ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｇ変異体、及び非保存的ＴｅＮＴ変異体が含まれる。
【００２５】
本書で使用される「クロストリジウム毒素キメラ変異体」という用語は、表１の基準クロストリジウム毒素とは異なる特性を少なくとも１つ伴う毒素を形成するべく、クロストリジウム毒素の少なくとも一部分及び少なくとも１つのその他のタンパク質の少なくとも一部分を含む分子を意味する。かかるクロストリジウム毒素キメラ変異体は、例えばクリフォード・Ｃ・ショーン（Ｃｌｉｆｆｏｒｄ  Ｃ．Ｓｈｏｎｅ）ら、「組み換え型毒素フラグメント」、米国特許第６，４６１，６１７号明細書（２００２年１０月８日）；キース・Ａ・フォスター（Ｋｅｉｔｈ  Ａ．Ｆｏｓｔｅｒ）ら、「末梢感覚求心性機能を修正することのできるクリストリジュウム毒素誘導体、米国特許第６，３９５，５１３号明細書（２００２年５月２８日）；ウェイ・ジン・リン（Ｗｅｉ−Ｊｉｎ  Ｌｉｎ）ら、「増強された標的特異性を有する神経毒素」米国特許第２００２／０１３７８８６号明細書（２００２年９月２６日）；キース・Ａ・フォスターら、「非神経細胞からの分泌抑制」、米国特許第２００３／０１８０２８９号明細書（２００３年９月２５日）；Ｊ．オリバー・ドリー（Ｏｌｉｖｅｒ  Ｄｏｌｌｙ）ら、「活性化可能な組み換え型神経毒素」、国際公開第２００１／０１４５７０号パンフレット（２００１年３月１日）；クリフォード・Ｃ・ショーンら、「組み換え型毒素フラグメント」、国際公開第２００４／０２４９０９号パンフレット（２００４年３月２５日）；及びキース・Ａ・フォスターら、「再ターゲティングされた毒素共役体」、国際公開第２００５／０２３３０９号明細書（２００５年３月１７日）の中で記載されている。
【００２６】
毒素分子が、その毒素の天然の標的細胞でない細胞に再ターゲティングされ得るということは、充分に立証されている。このように再度ターゲティングされた場合、これらの毒素は、所望の標的細胞に結合する能力を有し、かつ、細胞質ゾル内への後続する転移の後、標的細胞に対するその効果を及ぼす能力をもつ。この点において、結合ドメインは、それが所望の標的細胞に結合し、その後標的細胞内で修飾クロストリジウム毒素からエンドソームへの移行を可能にするような形で選択される。これに制限されないが、非クロストリジウム結合ドメインが修飾クロストリジウム毒素のクロストリジウム結合ドメインにより使用されるもの以外の細胞表面レセプター系に結合することを条件として、リガンド、ホルモン、成長因子、サイトカイン、抗体、アンタゴニスト、アゴニスト及び逆アゴニストを含めあらゆる非クロストリジウム結合ドメインを使用することができるものと予測されている。非クロストリジウム結合ドメインの制限的意味のない例としては、成長因子、例えば神経成長因子（ＮＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、多頭活性化ペプチド（ＨＨＡＰ）、形質転換成長因子１（ＴＧＦ−１）、形質転換成長因子２（ＴＧＦ−２）、形質転換成長因子３（ＴＧＦ−３）、表皮成長因子（ＥＧＦ）又は毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；サイトカイン、例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−）、インタロイキン−１（ＩＬ−１）、インタロイキン−１（ＩＬ−１）及びインタロイキン−８（ＩＬ−８）；アゴニスト、例えば非クロストリジウム毒素結合ドメインがブラジキニン、ダイノルフィン、β−エンドルフィン、エトルフィン、エンドモルフィン−１、エンドモルフィン−２、Leu−エンケファリン、Met−エンケファリン、ガラニン、ロフェンタニル又はノシセプチン及びオピオイド；そして抗体、例えば後根神経節ニューロンの表面上に見出されるラクト系炭水化物エピトープ（lactoseries carbohydrate epitope）に対する抗体（例えばモノクローナル抗体１Ｂ２及びＬＡ４）、上述のリガンドについてのレセプターのいずれかに対する抗体及び表面発現抗原Ｔｈｙ１に対する抗体（例えばモノクローナル抗体ＭＲＣＯＸ７）が含まれる。クロストリジウム毒素キメラ変異体を作製し使用する方法は、結合ドメインが非クロストリジウム毒素結合ドメインを含む場合、本明細書中で開示されている修飾クロストリジウム毒素を含むことができ、これらの方法は、例えばクリフォード・Ｃ・ショーンら、上掲書（２００２年）；キース・Ａ・フォスターら、上掲書（２００２年）；ウェイ・ジン・リンら、上掲書（２００２年）；キース・Ａ・フォスターら、上掲書（２００３年）；Ｊ．オリバー・ドリーら、上掲書（２００１年）；クリフォード・Ｃ・ショーンら、上掲書（２００４年）；及びキース・Ａ・フォスターら、上掲書（２００５年）の中で記載されている。
【００２７】
かくして、一実施形態においては、クロストリジウム毒素キメラ変異体は、結合ドメインが非クロストリジウム毒素結合ドメインを含む場合、本明細書で開示されている修飾クロストリジウム毒素を含むことができる。この実施形態の態様においては、非クロストリジウム毒素結合ドメインは、例えば、リガンド、ホルモン、成長因子、サイトカイン、抗体、オピオイド、アンタゴニスト、アンタゴニスト又は逆アゴニストであり得る。この実施形態のその他の態様においては、前記非クロストリジウム毒素結合ドメインは、神経成長因子（ＮＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、多頭活性化ペプチド（ＨＨＡＰ）、形質転換成長因子１（ＴＧＦ−１）、形質転換成長因子２（ＴＧＦ−２）、形質転換成長因子３（ＴＧＦ−３）、表皮成長因子（ＥＧＦ）又は毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）である。さらに、本実施形態のその他の態様においては、前記非クロストリジウム毒素結合ドメインは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−）、インタロイキン−１（ＩＬ−１）、インタロイキン−１（ＩＬ−１）又はインタロイキン−８（ＩＬ−８）である。本実施形態のさらにもう1つの態様においては、非クロストリジウム毒素結合ドメインは、ブラジキニン、ダイノルフィン、β−エンドルフィン、エトルフィン、エンドモルフィン−１、エンドモルフィン−２、Leu−エンケファリン、Met−エンケファリン、ガラニン、ロフェンタニル又はノシセプチンである。本実施形態のさらにその他の形態においては、非クロストリジウム毒素結合ドメインは、後根神経節ニューロンの表面上に見出されるラクト系炭水化物エピトープに対する抗体（例えばモノクローナル抗体１Ｂ２及びＬＡ４）、上述の結合ドメインについてのレセプターのいずれかに対する抗体又は表面発現抗原Ｔｈｙ１に対する抗体（例えばモノクローナル抗体ＭＲＣＯＸ７）である。
【００２８】
クロストリジウム毒素が基質をタンパク質分解により分割させる全体的細胞機序をその活性フラグメントが実行できることを条件として、さまざまなクロストリジウム毒素フラグメントのうちの任意のものが本発明の態様において有用であり得るということも予測されている。かくしてこの実施形態の態様は、例えば少なくとも３００個のアミノ酸、少なくとも４００個のアミノ酸、少なくとも５００個のアミノ酸、少なくとも６００個のアミノ酸、少なくとも７００個のアミノ酸、少なくとも８００個のアミノ酸、少なくとも９００個のアミノ酸、少なくとも１０００個のアミノ酸、少なくとも１１００個のアミノ酸及び少なくとも１２００個のアミノ酸の長さをもつクロストリジウム毒素フラグメントを含むことができる。本実施形態のその他の態様は、例えば多くとも３００個のアミノ酸、多くとも４００個のアミノ酸、多くとも５００個のアミノ酸、多くとも６００個のアミノ酸、多くとも７００個のアミノ酸、多くとも８００個のアミノ酸、多くとも９００個のアミノ酸、多くとも１０００個のアミノ酸、多くとも１１００個のアミノ酸及び多くとも１２００個のアミノ酸の長さを有するクロストリジウム毒素フラグメントを含み得る。
【００２９】
同様に、その軽鎖フラグメントが神経伝達物質放出器官のコア構成要素を特異的にターゲティングしかくして、クロストリジウム毒素が基質をタンパク質分解により分割させる全体的細胞機序を実行するのに参加できることを条件として、軽鎖を含むさまざまなクロストリジウム毒素フラグメントのうちの任意のものが本発明の態様において有用であり得るということも予測されている。クロストリジウム毒素の軽鎖は長さがアミノ酸約４２０〜４６０個であり、酵素ドメインを含む（表１）。研究の結果、酵素ドメインの酵素活性にとってクロストリジウム毒素軽鎖の全長は必要でないことがわかった。制限的意味のない例として、酵素活性のためには、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖（配列番号１の残基１〜８）の最初の８個のアミノ酸は必要でない。もう１つの制限的意味のない例としては、ＴｅＮＴ軽鎖の最初の８個のアミノ酸（配列番号８の残基１〜８）は、酵素活性のために必要とされない。同様にして、軽鎖のカルボキシル末端は活性にとって必要ではない。制限的意味のない例として、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖の最後の３２個のアミノ酸（配列番号１の残基４１７〜４４８）は、酵素活性にとって必要ではない。もう１つの制限的意味のない例として、ＴｅＮＴ軽鎖の最後の３１個のアミノ酸（配列番号８の残基４２７〜４５７）は、酵素活性のために必要とされない。かくして、本実施形態の態様は、例えば少なくとも３５０個のアミノ酸、少なくとも３７５個のアミノ酸、少なくとも４００個のアミノ酸、少なくとも４２５個のアミノ酸及び少なくとも４５０個のアミノ酸の長さを有する酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素軽鎖を含み得る。本実施形態のその他の態様は、例えば多くとも３５０個のアミノ酸、多くとも３７５個のアミノ酸、多くとも４００個のアミノ酸、多くとも４２５個のアミノ酸及び多くとも４５０個のアミノ酸の長さをもつ酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素軽鎖を含むことができる。
【００３０】
同様に、その活性フラグメントが標的細胞の細胞質内への細胞内小胞からのＬＣの放出を容易にし、かくして、クロストリジウム毒素が基質をタンパク質分解により分割させる全体的細胞機序を実行するのに参加できることを条件として、転移ドメインを含むさまざまなクロストリジウム毒素ＨＮ領域のうちの任意のものが本発明の態様において有用であり得るということも予測されている。クロストリジウム毒素の重鎖からのＨＮ領域は、長さがアミノ酸約４１０〜４３０個であり、転移ドメインを含む（表１）。研究の結果、転移ドメインの転移活性にとって、クロストリジウム毒素重鎖からのＨＮ領域の全長は必要でないことがわかった。かくして、この実施形態の態様は、例えば少なくとも３５０個のアミノ酸、少なくとも３７５個のアミノ酸、少なくとも４００個のアミノ酸及び少なくとも４２５個のアミノ酸という長さをもつ転移ドメインを含むクロストリジウム毒素ＨＮ領域を含み得る。本実施形態のその他の態様は、例えば多くとも３５０個のアミノ酸、多くとも３７５個のアミノ酸、多くとも４００個のアミノ酸及び多くとも４２５個のアミノ酸の長さをもつ転移ドメインを含むクロストリジウム毒素ＨＮ領域を含み得る。
【００３１】
同様に、その活性フラグメントが標的細胞の表面にあるレセプター複合体に対する毒素の結合特異性及び結合活性を決定しかつ、クロストリジウム毒素が基質をタンパク質分解により分割させる全体的細胞機序を実行することができることを条件として、結合ドメインを含むさまざまなクロストリジウム毒素ＨＣ領域のうちの任意のものが本発明の態様において有用であり得るということも予測されている。クロストリジウム毒素の重鎖からのＨＣ領域は、長さがアミノ酸約４００〜４４０個であり、結合ドメインを含む（表１）。研究の結果、結合ドメインの結合活性にとって、クロストリジウム毒素重鎖からのＨＣ領域の全長は必要でないことがわかった。かくして、この実施形態の態様は、例えば少なくとも３５０個のアミノ酸、少なくとも３７５個のアミノ酸、少なくとも４００個のアミノ酸及び少なくとも４２５個のアミノ酸という長さをもつ結合ドメインを含むクロストリジウム毒素ＨＣ領域を含み得る。本実施形態のその他の態様は、例えば多くとも３５０個のアミノ酸、多くとも３７５個のアミノ酸、多くとも４００個のアミノ酸及び多くとも４２５個のアミノ酸の長さをもつ結合ドメインを含むクロストリジウム毒素ＨＣ領域を含み得る。
【００３２】
かくして、一実施形態においては、クロストリジウム毒素はクロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転移ドメイン及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含む。この実施形態の１態様においては、クロストリジウム毒素は、天然に発生するクロストリジウム毒素変異体、例えばクロストリジウム毒素イソ型又はクロストリジウム毒素サブタイプを含む。本実施形態のもう１つの態様においては、クロストリジウム毒素は例えば保存的クロストリジウム毒素変異体、非保存的クロストリジウム毒素変異体又は活性クロストリジウム毒素フラグメント又はそれらの任意の組み合わせといったような非天然発生のクロストリジウム毒素変異体を含む。本実施形態のもう１つの態様においては、クロストリジウム毒素は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン又はその活性フラグメント、クロストリジウム毒素転移ドメイン又はその活性フラグメント、クロストリジウム毒素結合ドメイン又はその活性フラグメント又はそれらの任意の組み合わせを含む。本実施形態のその他の態様においては、クロストリジウム毒素は、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ又はＴｅＮＴを含み得る。
【００３３】
もう１つの実施形態においては、クロストリジウム毒素はＢｏＮＴ／Ａを含む。この実施形態の１態様においては、ＢｏＮＴ／Ａは、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインを含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ａは配列番号１を含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ａは、例えばＢｏＮＴ／Ａイソ型又はＢｏＮＴ／Ａサブタイプといったような天然発生のＢｏＮＴ／Ａ変異体を含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ａは、例えば配列番号１のＢｏＮＴ／Ａイソ型又は配列番号１のＢｏＮＴ／Ａサブタイプといったような配列番号１の天然発生のＢｏＮＴ／Ａ変異体を含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ａは、例えば保存的ＢｏＮＴ／Ａ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ａ変異体又は活性ＢｏＮＴ／Ａフラグメント又はそれらの任意の組み合わせといったような非天然発生ＢｏＮＴ／Ａ変異体を含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ａは、例えば、配列番号１の保存的ＢｏＮＴ／Ａ変異体、配列番号１の非保存的ＢｏＮＴ／Ａ変異体又は配列番号１の活性ＢｏＮＴ／Ａフラグメント又はそれらの任意の組み合わせといった配列番号１の非天然発生ＢｏＮＴ／Ａ変異体を含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ａは、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン又はその活性フラグメント、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン又はその活性フラグメント、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン又はその活性フラグメント又はそれらの任意の組み合わせを含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ａは、配列番号１からのアミノ酸１〜４４８のＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号１からのアミノ酸４４９〜８７１のＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号１からのアミノ酸８７２〜１２９６のＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン又はその活性フラグメント、及びその任意の組み合わせを含む。
【００３４】
本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ａは、例えば配列番号１と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号１と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号１と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号１と少なくとも９０％のアミノ酸同一性又は配列番号１と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ａは、例えば配列番号１と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号１と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号１と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号１と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号１と多くとも９０％のアミノ酸同一性又は配列番号１と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００３５】
本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ａは、配列番号１との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ａは、配列番号１との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ａは、配列番号１との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ａは、配列番号１との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ａは、配列番号１との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ａは、配列番号１との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００３６】
本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ａは、配列番号１との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ａは、配列番号１との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ａは、配列番号１との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ａは、配列番号１との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ａは、配列番号１との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ａは、配列番号１との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００３７】
もう１つの実施形態においては、クロストリジウム毒素はＢｏＮＴ／Ｂを含む。この実施形態の１態様においては、ＢｏＮＴ／Ｂは、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメインを含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｂは配列番号２を含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｂは、例えばＢｏＮＴ／Ｂイソ型又はＢｏＮＴ／Ｂサブタイプといったような天然発生のＢｏＮＴ／Ｂ変異体を含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｂは、例えば配列番号２のＢｏＮＴ／Ｂイソ型又は配列番号２のＢｏＮＴ／Ｂサブタイプといったような配列番号２の天然発生のＢｏＮＴ／Ｂ変異体を含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｂは、例えば保存的ＢｏＮＴ／Ｂ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｂ変異体又は活性ＢｏＮＴ／Ｂフラグメント又はそれらの任意の組み合わせといったような非天然発生ＢｏＮＴ／Ｂ変異体を含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｂは、例えば、配列番号２の保存的ＢｏＮＴ／Ｂ変異体、配列番号２の非保存的ＢｏＮＴ／Ｂ変異体又は配列番号２の活性ＢｏＮＴ／Ｂフラグメント又はそれらの任意の組み合わせといった配列番号２の非天然発生ＢｏＮＴ／Ｂ変異体を含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｂは、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン又はその活性フラグメント、ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン又はその活性フラグメント、ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン又はその活性フラグメント又はそれらの任意の組み合わせを含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｂは、配列番号２からのアミノ酸１〜４４１のＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号２からのアミノ酸４４２〜８５８のＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号２からのアミノ酸８５９〜１２９１のＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン又はその活性フラグメント、及びその任意の組み合わせを含む。
【００３８】
本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｂは、例えば配列番号２と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号２と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号２と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号２と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号２と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号２と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｂは、例えば配列番号２と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号２と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号２と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号２と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号２と多くとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号２と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００３９】
本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｂは、配列番号２との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｂは、配列番号２との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｂは、配列番号２との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｂは、配列番号２との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｂは、配列番号２との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｂは、配列番号２との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００４０】
本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｂは、配列番号２との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｂは、配列番号２との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｂは、配列番号２との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｂは、配列番号２との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｂは、配列番号２との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｂは、配列番号２との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００４１】
もう１つの実施形態においては、クロストリジウム毒素はＢｏＮＴ／Ｃ１を含む。この実施形態の１態様においては、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメインを含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｃ１は配列番号３を含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、例えばＢｏＮＴ／Ｃ１イソ型又はＢｏＮＴ／Ｃ１サブタイプといったような天然発生のＢｏＮＴ／Ｃ１変異体を含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、例えば配列番号３のＢｏＮＴ／Ｃ１イソ型又は配列番号３のＢｏＮＴ／Ｃ１サブタイプといったような配列番号３の天然発生のＢｏＮＴ／Ｃ１変異体を含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、例えば保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１変異体又は活性ＢｏＮＴ／Ｃ１フラグメント又はそれらの任意の組み合わせといったような非天然発生ＢｏＮＴ／Ｃ１変異体を含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、例えば、配列番号３の保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１変異体、配列番号３の非保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１変異体又は配列番号３の活性ＢｏＮＴ／Ｃ１フラグメント又はそれらの任意の組み合わせといった配列番号３の非天然発生ＢｏＮＴ／Ｃ１変異体を含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン又はその活性フラグメント、ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン又はその活性フラグメント、ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン又はその活性フラグメント及びそれらの任意の組み合わせを含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、配列番号３からのアミノ酸１〜４４９のＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号３からのアミノ酸４５０〜８６６のＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号３からのアミノ酸８６７〜１２９１のＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン又はその活性フラグメント、及びその任意の組み合わせを含む。
【００４２】
本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、例えば配列番号３と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号３と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号３と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号３と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号３と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号３と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、例えば配列番号３と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号３と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号３と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号３と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号３と多くとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号３と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００４３】
本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、配列番号３との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、配列番号３との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、配列番号３との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、配列番号３との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、配列番号３との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、配列番号３との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００４４】
本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、配列番号３との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、配列番号３との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、配列番号３との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、配列番号３との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、配列番号３との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、配列番号３との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００４５】
もう１つの実施形態においては、クロストリジウム毒素はＢｏＮＴ／Ｄを含む。この実施形態の１態様においては、ＢｏＮＴ／Ｄは、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメインを含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｄは配列番号４を含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｄは、例えばＢｏＮＴ／Ｄイソ型又はＢｏＮＴ／Ｄサブタイプといったような天然発生のＢｏＮＴ／Ｄ変異体を含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｄは、例えば配列番号４のＢｏＮＴ／Ｄイソ型又は配列番号４のＢｏＮＴ／Ｄサブタイプといったような配列番号４の天然発生のＢｏＮＴ／Ｄ変異体を含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｄは、例えば保存的ＢｏＮＴ／Ｄ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｄ変異体又は活性ＢｏＮＴ／Ｄフラグメント又はそれらの任意の組み合わせといったような非天然発生ＢｏＮＴ／Ｄ変異体を含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｄは、例えば、配列番号４の保存的ＢｏＮＴ／Ｄ変異体、配列番号４の非保存的ＢｏＮＴ／Ｄ変異体又は配列番号４の活性ＢｏＮＴ／Ｄフラグメント又はそれらの任意の組み合わせといった配列番号４の非天然発生ＢｏＮＴ／Ｄ変異体を含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｄは、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン又はその活性フラグメント、ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン又はその活性フラグメント、ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン又はその活性フラグメント又はそれらの任意の組み合わせを含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｄは、配列番号４からのアミノ酸１〜４４５のＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号４からのアミノ酸４４６〜８６２のＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号４からのアミノ酸８６３〜１２７６のＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン又はその活性フラグメント、及びその任意の組み合わせを含む。
【００４６】
本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｄは、例えば配列番号４と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号４と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号４と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号４と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号４と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号４と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｄは、例えば配列番号４と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号４と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号４と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号４と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号４と多くとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号４と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００４７】
本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｄは、配列番号４との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｄは、配列番号４との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｄは、配列番号４との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｄは、配列番号４との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｄは、配列番号４との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｄは、配列番号４との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００４８】
本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｄは、配列番号４との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｄは、配列番号４との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｄは、配列番号４との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｄは、配列番号４との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｄは、配列番号４との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｄは、配列番号４との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００４９】
もう１つの実施形態においては、クロストリジウム毒素はＢｏＮＴ／Ｅを含む。この実施形態の１態様においては、ＢｏＮＴ／Ｅは、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメインを含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｅは配列番号５を含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｅは、例えばＢｏＮＴ／Ｅイソ型又はＢｏＮＴ／Ｅサブタイプといったような天然発生のＢｏＮＴ／Ｅ変異体を含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｅは、例えば配列番号５のＢｏＮＴ／Ｅイソ型又は配列番号５のＢｏＮＴ／Ｅサブタイプといったような配列番号５の天然発生のＢｏＮＴ／Ｅ変異体を含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｅは、例えば保存的ＢｏＮＴ／Ｅ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｅ変異体又は活性ＢｏＮＴ／Ｅフラグメント又はそれらの任意の組み合わせといったような非天然発生ＢｏＮＴ／Ｅ変異体を含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｅは、例えば、配列番号５の保存的ＢｏＮＴ／Ｅ変異体、配列番号５の非保存的ＢｏＮＴ／Ｅ変異体又は配列番号５の活性ＢｏＮＴ／Ｅフラグメント又はそれらの任意の組み合わせといった配列番号５の非天然発生ＢｏＮＴ／Ｅ変異体を含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｅは、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン又はその活性フラグメント、ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン又はその活性フラグメント、ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン又はその活性フラグメント及びそれらの任意の組み合わせを含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｅは、配列番号５からのアミノ酸１〜４２２のＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号５からのアミノ酸４２３〜８４５のＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号５からのアミノ酸８４６〜１２５２のＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン又はその活性フラグメント、及びその任意の組み合わせを含む。
【００５０】
本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｅは、例えば配列番号５と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号５と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号５と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号５と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号５と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号５と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｅは、例えば配列番号５と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号５と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号５と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号５と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号５と多くとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号５と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００５１】
本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｅは、配列番号５との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｅは、配列番号５との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｅは、配列番号５との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｅは、配列番号５との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｅは、配列番号５との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｅは、配列番号５との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００５２】
本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｅは、配列番号５との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｅは、配列番号５との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｅは、配列番号５との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｅは、配列番号５との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｅは、配列番号５との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｅは、配列番号５との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００５３】
もう１つの実施形態においては、クロストリジウム毒素はＢｏＮＴ／Ｆを含む。この実施形態の１態様においては、ＢｏＮＴ／Ｆは、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメインを含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｆは配列番号６を含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｆは、例えばＢｏＮＴ／Ｆイソ型又はＢｏＮＴ／Ｆサブタイプといったような天然発生のＢｏＮＴ／Ｆ変異体を含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｆは、例えば配列番号６のＢｏＮＴ／Ｆイソ型又は配列番号６のＢｏＮＴ／Ｆサブタイプといったような配列番号６の天然発生のＢｏＮＴ／Ｆ変異体を含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｆは、例えば保存的ＢｏＮＴ／Ｆ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｆ変異体又は活性ＢｏＮＴ／Ｆフラグメント又はそれらの任意の組み合わせといったような非天然発生ＢｏＮＴ／Ｆ変異体を含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｆは、例えば、配列番号６の保存的ＢｏＮＴ／Ｆ変異体、配列番号６の非保存的ＢｏＮＴ／Ｆ変異体又は配列番号６の活性ＢｏＮＴ／Ｆフラグメント又はそれらの任意の組み合わせといった配列番号６の非天然発生ＢｏＮＴ／Ｆ変異体を含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｆは、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン又はその活性フラグメント、ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン又はその活性フラグメント、ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン又はその活性フラグメント及びそれらの任意の組み合わせを含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｆは、配列番号６からのアミノ酸１〜４３９のＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号６からのアミノ酸４４０〜８６４のＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号６からのアミノ酸８６５〜１２７４のＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン又はその活性フラグメント、及びその任意の組み合わせを含む。
【００５４】
本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｆは、例えば配列番号６と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号６と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号６と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号６と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号６と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号６と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｆは、例えば配列番号６と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号６と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号６と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号６と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号６と多くとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号６と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００５５】
本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｆは、配列番号６との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｆは、配列番号６との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｆは、配列番号６との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｆは、配列番号６との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｆは、配列番号６との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｆは、配列番号６との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００５６】
本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｆは、配列番号６との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｆは、配列番号６との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｆは、配列番号６との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｆは、配列番号６との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｆは、配列番号６との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｆは、配列番号６との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００５７】
もう１つの実施形態においては、クロストリジウム毒素はＢｏＮＴ／Ｇを含む。この実施形態の１態様においては、ＢｏＮＴ／Ｇは、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメインを含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｇは配列番号７を含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｇは、例えばＢｏＮＴ／Ｇイソ型又はＢｏＮＴ／Ｇサブタイプといったような天然発生のＢｏＮＴ／Ｇ変異体を含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｇは、例えば配列番号７のＢｏＮＴ／Ｇイソ型又は配列番号７のＢｏＮＴ／Ｇサブタイプといったような配列番号７の天然発生のＢｏＮＴ／Ｇ変異体を含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｇは、例えば保存的ＢｏＮＴ／Ｇ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｇ変異体又は活性ＢｏＮＴ／Ｇフラグメント又はそれらの任意の組み合わせといったような非天然発生ＢｏＮＴ／Ｇ変異体を含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｄは、例えば、配列番号７の保存的ＢｏＮＴ／Ｇ変異体、配列番号７の非保存的ＢｏＮＴ／Ｇ変異体又は配列番号７の活性ＢｏＮＴ／Ｇフラグメント又はそれらの任意の組み合わせといった配列番号７の非天然発生ＢｏＮＴ／Ｇ変異体を含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｇは、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン又はその活性フラグメント、ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン又はその活性フラグメント、ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメイン又はその活性フラグメント又はそれらの任意の組み合わせを含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｇは、配列番号７からのアミノ酸１〜４４６のＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号７からのアミノ酸４４７〜８６３のＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号７からのアミノ酸８６４〜１２９７のＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメイン又はその活性フラグメント、及びその任意の組み合わせを含む。
【００５８】
本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｇは、例えば配列番号７と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号７と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号７と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号７と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号７と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号７と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｇは、例えば配列番号７と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号７と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号７と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号７と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号７と多くとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号７と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００５９】
本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｇは、配列番号７との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｇは、配列番号７との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｇは、配列番号７との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｇは、配列番号７との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｇは、配列番号７との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｇは、配列番号７との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００６０】
本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｇは、配列番号７との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｇは、配列番号７との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｇは、配列番号７との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｇは、配列番号７との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｇは、配列番号７との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この本実施形態のその他の態様においては、ＢｏＮＴ／Ｇは、配列番号７との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００６１】
もう１つの実施形態においては、クロストリジウム毒素はＴｅＮＴを含む。この実施形態の１態様においては、ＴｅＮＴは、ＴｅＮＴ酵素ドメイン、ＴｅＮＴ転移ドメイン及びＴｅＮＴ結合ドメインを含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＴｅＮＴは配列番号８を含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＴｅＮＴは、例えばＴｅＮＴイソ型又はＴｅＮＴサブタイプといったような天然発生のＴｅＮＴ変異体を含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＴｅＮＴは、例えば配列番号８のＴｅＮＴイソ型又は配列番号８のＴｅＮＴサブタイプといったような配列番号８の天然発生のＴｅＮＴ変異体を含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＴｅＮＴは、例えば保存的ＴｅＮＴ変異体、非保存的ＴｅＮＴ変異体又は活性ＴｅＮＴフラグメント又はそれらの任意の組み合わせといったような非天然発生ＴｅＮＴ変異体を含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＴｅＮＴは、例えば、配列番号８の保存的ＴｅＮＴ変異体、配列番号８の非保存的ＴｅＮＴ変異体又は配列番号８の活性ＴｅＮＴフラグメント又はそれらの任意の組み合わせといった配列番号８の非天然発生ＴｅＮＴ変異体を含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＴｅＮＴは、ＴｅＮＴ酵素ドメイン又はその活性フラグメント、ＴｅＮＴ転移ドメイン又はその活性フラグメント、ＴｅＮＴ結合ドメイン又はその活性フラグメント又はそれらの任意の組み合わせを含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＴｅＮＴは、配列番号８からのアミノ酸１〜４５７のＴｅＮＴ酵素ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号８からのアミノ酸４５８〜８７９のＴｅＮＴ転移ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号８からのアミノ酸８８０〜１３１５のＴｅＮＴ結合ドメイン又はその活性フラグメント、及びその任意の組み合わせを含む。
【００６２】
本実施形態のその他の態様においては、ＴｅＮＴは、例えば配列番号８と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号８と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号８と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号８と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号８と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号８と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＴｅＮＴは、例えば配列番号８と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号８と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号８と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号８と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号８と多くとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号８と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００６３】
本実施形態のその他の態様においては、ＴｅＮＴは、配列番号８との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＴｅＮＴは、配列番号８との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＴｅＮＴは、配列番号８との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＴｅＮＴは、配列番号８との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＴｅＮＴは、配列番号８との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この本実施形態のその他の態様においては、ＴｅＮＴは、配列番号８との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００６４】
本実施形態のその他の態様においては、ＴｅＮＴは、配列番号８との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＴｅＮＴは、配列番号８との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＴｅＮＴは、配列番号８との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＴｅＮＴは、配列番号８との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＴｅＮＴは、配列番号８との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。この本実施形態のその他の態様においては、ＴｅＮＴは、配列番号８との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。
【００６５】
本発明の態様は、一部にはＰＡＲリガンドドメインを提供する。本書で使用される「ＰＡＲリガンドドメイン」という用語は、「連結リガンド」及び「活性化用リガンド」と同義語であり、ＰＡＲリガンド結合ドメインに選択的に結合し活性化されたＰＡＲを細胞内に内在化させる全体的内在化機序を開始することのできるあらゆるポリペプチドを意味する。本書で使用されているように、「選択的に」という用語は、一方向のみで又は１つのものとのみ反応するか又は唯一の効果又は影響を有することを意味する。本書で使用されているように、「選択的に結合する」という用語は、ＰＡＲリガンドドメインが生理学的条件の下で又は生理的条件を実質的に近似するインビトロ条件内でその他の非標的リガンド結合ドメインに比べ統計的に著しく高いレベルまでその標的ＰＡＲリガンド結合ドメインを結合させることができる（つまりそれよりも小さいＫｄ又は解離定数を有する）ということを意味する。「Ｋｄ」は、ＰＡＲリガンドドメインによりＰＡＲリガンド結合ドメインの半分が結合されている、ＰＡＲリガンドドメインのモル濃度である。かくして指示された標的結合部位に対するＰＡＲリガンドドメインの差別的結合が存在する。
【００６６】
大部分のＧタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）は、リガンド結合時点で可逆的に活性化される。しかしながら、プロテアーゼ活性化されたＧタンパク質共役型レセプター（ＰＡＲ）の活性化は、拡散し得ない連結リガンドの生成を結果としてもたらす不可逆的タンパク質分解事象を通して発生する。基本的に、ＰＡＲは、部位特異的レセプター分割によりアンマスクされるまで未結合状態にとどまる独自のリガンドを担持するレセプターである。凝固剤プロテアーゼトロンビンは、ＰＡＲ１、ＰＡＲ３及びＰＡＲ４の生理学的活性化因子である。しかしながら、その他のプロテアーゼがこれらのレセプターを分割でき、インビボでその機能に貢献し得る（表２）。ＰＡＲ２は、トロンビンの上流側のトリプシン、トリプターゼ及び凝固プロテアーゼを含めた多数のトリプシン様セリンプロテアーゼ、第ＶＩＩａ因子及びＸａ因子によって活性化されるが、トロンビンによっては活性化されない（表２）。
【００６７】
現在、ヒトＰＡＲの４つのサブタイプが記載され、ＰＡＲ１（配列番号９）、ＰＡＲ２（配列番号１０）、ＰＡＲ３（配列番号１１）及びＰＡＲ４（配列番号１２）と呼称されている。さらに、少なくとも７０％のアミノ酸同一性及び少なくとも８０％のアミノ酸類似性を示すＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３及びＰＡＲ４オルソログが、例えばチンパンジーＰａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、マントヒヒＰａｐｉｏ  ｈａｍａｄｒｙａｓ、イヌＣａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ、マウスＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、ラットＲａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ及びニワトリＧａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓといったその他の哺乳動物において同定されてきている。分割の時点で連結リガンドをアンマスクするプロテアーゼ切断部位は、４つのレセプターすべてについて既知である（表２）。ヒトＰＡＲにおいては、Ｒ４１〜Ｓ４２でのＰＡＲ１の分割が、ヘキサペプチドＳＦＬＬＲＮで終了する新しいアミノ末端を露呈し、Ｒ３４〜Ｓ３５におけるＰＡＲ２の分割がヘキサペプチドＳＬＩＧＫＶで終了する新しいアミノ末端を露呈し、Ｋ３８−Ｔ３９におけるＰＡＲ３の分割がヘキサペプチドＴＦＲＧＡＰで終了する新しいアミノ末端を露呈し、一方Ｒ４７−Ｇ４８でのＰＡＲ４の分割がヘキサペプチドＧＹＰＧＱＶで終了する新しいアミノ末端を露呈する。プロテアーゼ切断部位の遠位にあるヒルジン様の部位が、ＰＡＲ１及びＰＡＲ３内で記載されてきた。この荷電ドメインは、ＰＡＲ１に対するトロンビンの結合を媒介する助けとなり、かくしてプロテアーゼ切断部位の分割を容易にする。
【００６８】
【表２】
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【００６９】
ＰＡＲの新たに形成されたアミノ末端連結リガンドを表わす合成ペプチドは、タンパク質分解の必要性なくレセプターのためのアゴニストとして作用でき、タンパク質分解により活性化されたＰＡＲにより惹起されるものと同じシグナリング応答の多くを開始することができる（表３）［例えばショーン・Ｒ・カウフリン（Ｓｈａｕｎ  Ｒ．Ｃｏｕｇｈｌｉｎ）及びマルク・カーン（Ｍａｒｋ  Ｋａｈｎ）、「血小板活性化の変調」、国際公開第０１／０７０７２号パンフレット（２００１年２月１日）；ショーン・Ｒ・カウフリン及びタチアナ・Ｒ・ファルキ（Ｔａｔｊａｎａ  Ｒ．Ｆａｒｕｑｉ）、「ペプチド変調プロテアーゼで活性化されたレセプター及びその使用方法」、国際公開第０１／９４４１１号パンフレット（２００１年１２月１３日）；スコット・Ｒ・マクファーレン（Ｓｃｏｔｔ  Ｒ．ＭａｃＦａｒｌａｎｅ）ら、「Ｐｒｏｔｅａｓｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ」、第５３（２）号、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．、２４５−２８２頁（２００１年）；及びロバート・Ｍ・スカボロー（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｍ．Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ）、「Ｐｒｏｔｅａｓｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ａｎｄ  Ａｇｏｎｉｓｔｓ」、第１（１）号、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ａｇｅｎｔｓ、７３−８２頁（２００３年）を参照のこと］。活性化ペプチド（ＡＰ）と呼ばれるこれらのペプチドは、上述のリガンドの結合、シグナル形質導入及びシグナル終結のステップをひき起こす。最初に記載されたＡＰは、ＰＡＲ１に対するアゴニストとして挙動する配列番号１３のアミノ酸４２−５５を含む１４残基のペプチドＳＦＬＬＲＮＰＤＫＹＥＰＦであった。その後の研究作業は、ヘキサペプチドＳＦＬＬＲＮのみならず、細胞応答を惹起するのに充分機能的ではないにせよ広範囲の変異体も同様に有効である、ということを示した（表３）。アラニンスキャニング及び部位特異的突然変異誘発を用いたＰＡＲＡＰの分析は、機能にとってきわめて重要な残基を同定した。例えばＦ２、Ｌ４及びＲ５は、ＰＡＲ１ＡＰヘキサペプチドＳＦＬＬＲＮにとって機能的に重要であるが、その他の位置での残基の置換を許容することが可能である。ＰＡＲ２ＡＰヘキサペプチドＳＬＩＧＫＶの類似のテストが、Ｌ２及びＲ５はＰＡＲ２ＡＰ活性にとって不可欠であり、一方Ｇ４又はＬ６の置換はＰＡＲ２活性化に対しわずかな効果しか及ぼさない、ということを示している。Ｓ１又は１３をアラニンで交換することも又活性を低減させる。数多くのＰＡＲ４変異体が機能的である（表３）ものの、Ｆでの交換がＰＡＲ１及びＰＡＲ４の両方のアゴニストを生成することから、ＰＡＲ４ＡＰの特異性にはＹ２が必要である。
【００７０】
【表３−１】
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【表３−２】
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【００７１】
不活性化されたＰＡＲを結合させ修飾クロストリジウム毒素−ＰＡＲ複合体の１細胞内への内在化を惹起する能力をもつ任意の及び全てのＰＡＲリガンドドメインが本発明の態様において有用であり得ることが予測されている。ＰＡＲリガンドドメインが不活性化ＰＡＲを結合させかつ修飾クロストリジウム毒素−ＰＡＲ複合体の１細胞内への内在化を惹起する能力をもつことを条件として、本発明の態様において、任意の及び全ての長さのＰＡＲリガンドドメインが有用であり得ると予測されている。かくして、この実施形態の態様においては、ＰＡＲリガンドドメインの長さは例えば少なくとも６個のアミノ酸、少なくとも７個のアミノ酸、少なくとも８個のアミノ酸、少なくとも９個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１５個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも２５個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも４０個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸又は少なくとも６０個のアミノ酸であり得る。本実施形態のその他の態様においては、ＰＡＲリガンドドメインの長さは例えば多くとも６個のアミノ酸、多くとも７個のアミノ酸、多くとも８個のアミノ酸、多くとも９個のアミノ酸、多くとも１０個のアミノ酸、多くとも１５個のアミノ酸、多くとも２０個のアミノ酸、多くとも２５個のアミノ酸、多くとも３０個のアミノ酸、多くとも４０個のアミノ酸、多くとも５０個のアミノ酸又は多くとも６０個のアミノ酸であり得る。制限的意味のない例としては、ＰＡＲ１リガンドドメインは、配列番号９のアミノ酸１〜６４、配列番号９のアミノ酸１〜５５、配列番号９のアミノ酸１〜４７、配列番号９のアミノ酸２９〜６４、配列番号９のアミノ酸４２〜５５又は配列番号９のアミノ酸４２〜４７を含み得る。もう１つの制限的意味のない例としては、ＰＡＲ２リガンドドメインは、配列番号１０のアミノ酸１〜５９を含み、配列番号１０のアミノ酸１〜４８を含み、配列番号１０のアミノ酸１〜４０を含み、配列番号１０のアミノ酸２４〜５９、配列番号１０のアミノ酸３５〜４８又は配列番号１０のアミノ酸３５〜４０を含み得る。さらにもう１つの制限的意味のない例としては、ＰＡＲ３リガンドドメインは配列番号１１のアミノ酸１〜６０を含み、配列番号１１のアミノ酸１〜５２を含み、配列番号１１のアミノ酸１〜４４を含み、配列番号１１のアミノ酸２６〜６０、配列番号１１のアミノ酸３９〜５２又は配列番号１１のアミノ酸３９〜４４を含み得る。さらにもう１つの制限的意味のない例としては、ＰＡＲ４リガンドドメインは配列番号１２のアミノ酸１〜７０を含み、配列番号１２のアミノ酸１〜６１を含み、配列番号１２のアミノ酸１〜５３、配列番号１２のアミノ酸３５〜７０、配列番号１２のアミノ酸４８〜６１又は配列番号１２のアミノ酸４８〜５３を含み得る。
【００７２】
該発明の態様において有用なＰＡＲリガンドドメインには、これに制限されないが、天然発生のＰＡＲリガンドドメイン、例えばＰＡＲ１連結リガンド、ＰＡＲ２連結リガンド、ＰＡＲ３連結リガンド又はＰＡＲ４連結リガンド；天然発生のＰＡＲリガンドドメイン変異体；及び非天然発生のＰＡＲリガンドドメイン変異体、例えば保存的ＰＡＲリガンドドメイン変異体、非保存的ＰＡＲリガンドドメイン変異体及びＰＡＲリガンドドメインペプチドミメティックスが含まれる。本書で使用されている通り、天然発生のものであれ非天然発生のものであれ「ＰＡＲリガンドドメイン変異体」という用語は、開示された基準配列の対応する領域からの少なくとも１つのアミノ酸の変更を有し、その基準配列の対応する領域に対する同一性百分率の形で記載できるＰＡＲリガンドドメインを意味する（表３）。これに制限されないが、包括的方法、局所的方法、及びハイブリッド方法例えばセグメントアプローチ方法を含め、さまざまな配列整列方法のいずれでも、同一性百分率を判定するために使用することができる。同一性百分率を決定するためのプロトコルは、当業者の技能範囲内に入る及び本書中の教示に基づく日常的手順である。
【００７３】
本書で使用されている「天然発生のＰＡＲリガンドドメイン変異体」という用語は、これに制限されないが選択的スプライスによる写しから産生されたＰＡＲリガンドドメインイソ型、自然突然変異により産生されたＰＡＲリガンドドメインイソ型及びＰＡＲリガンドドメインサブタイプを含め、いかなる人的操作の補助も無く産生された任意のＰＡＲリガンドドメインを意味する。
【００７４】
本書で使用される「非天然発生のＰＡＲリガンドドメイン変異体」という用語は、ランダム突然変異誘発又は合理的設計を用いた遺伝子工学処理により産生されたＰＡＲリガンドドメイン変異体及び化学的合成により産生されたＰＡＲリガンドドメイン変異体を含めた、人的操作を用いて産生されたあらゆるＰＡＲリガンドドメインを意味する。非天然発生のＰＡＲリガンドドメイン変異体の制限的意味のない例としては、例えば保存的ＰＡＲリガンドドメイン変異体、非保存的ＰＡＲリガンドドメイン変異体及びＰＡＲリガンドドメインペプチドミメティックスが含まれる。
【００７５】
本書で使用する「保存的ＰＡＲリガンドドメイン変異体」という用語は、基準ＰＡＲリガンドドメイン配列からのもとのアミノ酸のものと類似の特性を少なくとも１つ有するもう１つのアミノ酸又はアミノ酸類似体により少なくとも１つのアミノ酸が置換されているＰＡＲリガンドドメインを意味する（表３）。特性の例としては、これに制限されないが、類似のサイズ、トポグラフィ、電荷、疎水性、親水性、親油性、共有結合能力、水素結合能力、物理化学特性など又はそれらの任意の組み合わせが含まれる。保存的ＰＡＲリガンドドメイン変異体は、該保存的ＰＡＲリガンドドメイン変異体の基礎となっている基準ＰＡＲリガンドドメインと実質的に同じ要領で機能し得、本発明のいずれかの態様において基準ＰＡＲリガンドドメインに置換され得る。保存的ＰＡＲリガンドドメイン変異体は、その基礎となっている基準ＰＡＲリガンドドメインからの１個以上のアミノ酸、２個以上のアミノ酸、３個以上のアミノ酸、４個以上のアミノ酸又は５個以上アミノ酸を置換し得る。保存的ＰＡＲリガンドドメイン変異体は、その基礎となっている基準ＰＡＲリガンドドメインに対する少なくとも５０％、６５％、７５％、８５％又は９５％のアミノ酸同一性を有することもできる。保存的ＰＡＲリガンドドメイン変異体の制限的意味の無い例としては、例えば、保存的ＰＡＲ１リガンドドメイン変異体、保存的ＰＡＲ２リガンドドメイン変異体、保存的ＰＡＲ３リガンドドメイン変異体及び保存的ＰＡＲ４リガンドドメイン変異体が含まれる。
【００７６】
本書で使用されている「非保存的ＰＡＲリガンドドメイン変異体」という用語は、１）非保存的ＰＡＲリガンドドメイン変異体の基礎となっている基準ＰＡＲリガンドドメインから少なくとも１つのアミノ酸が欠失させられている；又は２）非保存的ＰＡＲリガンドドメイン変異体の基礎となっている基準ＰＡＲリガンドドメインに少なくとも１つのアミノ酸が付加されている；又は３）基準ＰＡＲリガンドドメイン配列からのもとのアミノ酸のものと類似した特性を全く共有しないもう１つのアミノ酸又はアミノ酸類似体により少なくとも１つのアミノ酸が置換されている、ＰＡＲリガンドドメインを意味する（表３）。非保存的ＰＡＲリガンドドメイン変異体は、その基礎となっている基準ＰＡＲリガンドドメインと同じ要領で機能でき、本発明の任意の態様において基準ＰＡＲリガンドドメインに置換され得る。非保存的ＰＡＲリガンドドメイン変異体は、その基礎となっている基準ＰＡＲリガンドドメインに対して１個以上のアミノ酸、２個以上のアミノ酸、３個以上のアミノ酸、４個以上のアミノ酸、５個以上のアミノ酸及び１０個以上のアミノ酸を添加できる。非保存的ＰＡＲリガンドドメインは、非保存的ＰＡＲリガンドドメイン変異体の基礎となっている基準ＰＡＲリガンドドメインからの１個以上のアミノ酸、２個以上のアミノ酸、３個以上のアミノ酸、４個以上のアミノ酸又は５個以上のアミノ酸を置換し得る。非保存的ＰＡＲリガンドドメイン変異体は同様に、その基礎となっている基準ＰＡＲリガンドドメインに対する少なくとも５０％、６５％、７５％、８５％又は９５％のアミノ酸同一性を有することもできる。非保存的ＰＡＲリガンドドメイン変異体の制限的意味のない例としては、例えば非保存的ＰＡＲ１リガンドドメイン変異体、非保存的ＰＡＲ２リガンドドメイン変異体、非保存的ＰＡＲ３リガンドドメイン変異体、及び非保存的ＰＡＲ４リガンドドメイン変異体が含まれる。
【００７７】
本書で使用される「ＰＡＲリガンドドメインペプチドミメティックス」という用語は、最初のアミノ酸のものと類似の少なくとも１つの特性を有する非天然オリゴマによって置換される少なくとも１つのアミノ酸をもつＰＡＲリガンドドメインを意味する。特性の例としては、これに制限されないが、ペプチド一次構造要素のトポロジー、ペプチド一次構造要素の機能性、ペプチド二次構造要素のトポロジー、ペプチド二次構造要素の機能性など又はその任意の組み合わせが含まれる。ＰＡＲリガンドドメインペプチドミメティックスは実質的に、該ＰＡＲリガンドドメインペプチドミメティックスの基礎となっている基準ＰＡＲリガンドドメインと実質的に同じ要領で機能し得、本発明の任意の態様において、基準ＰＡＲリガンドドメインと置換され得る。ＰＡＲリガンドドメインペプチドミメティックスは、その基礎となっている基準ＰＡＲリガンドドメインからの１個以上のアミノ酸、２個以上のアミノ酸、３個以上のアミノ酸、４個以上のアミノ酸又は５個以上のアミノ酸を置換し得る。ＰＡＲリガンドドメインペプチドミメティックスは、同様に、その基礎となっている基準ＰＡＲリガンドドメインに対し少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有することもできる。ペプチドミメティックス方法の例としては、アミー・Ｓ・リプカ（Ａｍｙ  Ｓ．Ｒｉｐｋａ）及びダニエル・Ｈ・リッチ（Ｄａｎｉｅｌ  Ｈ．Ｒｉｃｈ）、「Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｄｅｓｉｇｎ」、第２（４）号、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、４４１−４５２頁（１９９８年）；及びＭ．アンヘル・エストリアルテ（Ａｎｇｅｌｓ  Ｅｓｔｉａｒｔｅ）及びダニエル・Ｈ・リッチ、「Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ」、８０３−８６１頁（Ｂｕｒｇｅｒ’ｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｖｏｌ．１  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、ドナルド・Ｊ・アブラハム（Ｄｏｎａｌｄ  Ｊ．Ａｂｒａｈａｍ）編、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、第６版、２００３年）を参照のこと。ＰＡＲリガンドドメインペプチドミメティックスの制限的意味のない例としては、例えばＰＡＲ１リガンドドメインペプチドミメティックス、ＰＡＲ２リガンドドメインペプチドミメティックス、ＰＡＲ３リガンドドメインペプチドミメティックス及びＰＡＲ４リガンドドメインペプチドミメティックが含まれる。
【００７８】
かくして、一実施形態においては、ＰＡＲリガンドドメインは、例えばＰＡＲリガンドドメインイソ型又はＰＡＲリガンドドメインサブタイプといったような天然発生のＰＡＲリガンドドメイン変異体を含む。もう１つの実施形態においては、ＰＡＲリガンドドメインは、非天然発生ＰＡＲリガンドドメイン変異体例えば、保存的ＰＡＲリガンドドメイン変異体、非保存的ＰＡＲリガンドドメイン変異体、又はＰＡＲリガンドドメインペプチドミメティックス又はその任意の組み合わせを含む。
【００７９】
もう１つの実施形態においては、ＰＡＲリガンドドメインはＰＡＲ１リガンドドメインを含む。この実施形態の１態様においては、ＰＡＲ１リガンドドメインは配列番号１３を含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＰＡＲ１リガンドドメインは、例えばＰＡＲ１リガンドドメインイソ型又はＰＡＲ１リガンドドメインサブタイプといったような天然発生のＰＡＲ１リガンドドメイン変異体を含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＰＡＲ１リガンドドメインは、配列番号１３の天然発生のＰＡＲ１リガンドドメイン変異体例えば配列番号１３のＰＡＲ１リガンドドメインイソ型又は配列番号１３のＰＡＲ１リガンドドメインサブタイプを含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＰＡＲ１リガンドドメインは非天然発生のＰＡＲ１リガンドドメイン変異体例えば保存的ＰＡＲ１リガンドドメイン変異体、非保存的ＰＡＲ１リガンドドメイン変異体又はＰＡＲ１リガンドドメインペプチドミメティックス又はそれらの任意の組み合わせを含む。本実施形態のさらにもう１つの態様では、ＰＡＲ１リガンドドメインは、配列番号１３の非天然発生ＰＡＲ１リガンドドメイン変異体、例えば配列番号１３の保存的ＰＡＲ１リガンドドメイン変異体、配列番号１３の非保存的ＰＡＲ１リガンドドメイン変異体又は配列番号１３のＰＡＲ１リガンドドメインペプチドミメティックス、又はそれらの任意の組み合わせを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＰＡＲ１リガンドドメインは配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号１３３を含む。
【００８０】
本実施形態のその他の態様においては、ＰＡＲ１リガンドドメインは、例えば配列番号１３と少なくとも５０％のアミノ酸同一性、配列番号１３と少なくとも６７％のアミノ酸同一性又は配列番号１３と少なくとも８３％のアミノ酸同一性をもつポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＲ１リガンドドメインは、配列番号１３と多くとも５０％のアミノ酸同一性、配列番号１３と多くとも６７％のアミノ酸同一性、配列番号１３と多くとも８３％のアミノ酸同一性をもつポリペプチドを含む。
【００８１】
本実施形態のその他の態様においては、ＰＡＲ１リガンドドメインは、配列番号１３との関係において例えば多くとも１、２、３又は４個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＲ１リガンドドメインは、配列番号１３との関係において、例えば少なくとも１、２、３又は４個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＰＡＲ１リガンドドメインは、配列番号１３との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＲ１リガンドドメインは、配列番号１３との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の実施形態においては、ＰＡＲ１リガンドドメインは、配列番号１３との関係において例えば多くとも１、２又は３個の非隣接アミノ酸欠失をもつポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＲ１リガンドドメインは、配列番号１３との関係において例えば少なくとも１、２又は３個の非隣接アミノ酸欠失をもつポリペプチドを含む。
【００８２】
本実施形態のその他の態様においては、ＰＡＲ１リガンドドメインは、配列番号１３との関係において例えば多くとも２、３又は４個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＲ１リガンドドメインは、配列番号１３との関係において例えば少なくとも２、３又は４個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらなるその他の態様においては、ＰＡＲ１リガンドドメインは、配列番号１３との関係において例えば多くとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらなるその他の態様においては、ＰＡＲ１リガンドドメインは、配列番号１３との関係において少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＲ１リガンドドメインは、配列番号１３との関係において例えば多くとも２個又は３個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＲ１リガンドドメインは、配列番号１３との関係において例えば少なくとも２又は３個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。
【００８３】
もう１つの実施形態においては、ＰＡＲリガンドドメインはＰＡＲ２リガンドドメインを含む。この実施形態の１態様においては、ＰＡＲ２リガンドドメインは、配列番号２４を含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＰＡＲ２リガンドドメインは、天然発生のＰＡＲ２リガンドドメイン変異体、例えばＰＡＲ２リガンドドメインイソ型又はＰＡＲ２リガンドドメインサブタイプを含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＰＡＲ２リガンドドメインは、配列番号２４の天然発生のＰＡＲ２リガンドドメイン変異体、例えば配列番号２４のＰＡＲ２リガンドドメインイソ型又は配列番号２４のＰＡＲ２リガンドドメインサブタイプを含む。本実施形態にさらにもう１つの態様においては、ＰＡＲ２リガンドドメインは、非天然発生のＰＡＲ２リガンドドメイン変異体例えば保存的ＰＡＲ２リガンドドメイン変異体、非保存的ＰＡＲ２リガンドドメイン変異体又はＰＡＲ２リガンドドメインペプチドミメティックス又はそれらの任意の組み合わせを含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＰＡＲ２リガンドドメインは、配列番号２４の非天然発生のＰＡＲ２リガンドドメイン変異体、例えば配列番号２４の保存的ＰＡＲ２リガンドドメイン変異体、配列番号２４の非保存的ＰＡＲ２リガンドドメイン変異体又は配列番号２４のＰＡＲ２リガンドドメインペプチドミメティックス、又はそれらの任意の組み合わせを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＰＡＲ２リガンドドメインは配列番号２４又は配列番号２５を含む。
【００８４】
本実施形態のその他の態様においては、ＰＡＲ２リガンドドメインは、配列番号２４と例えば少なくとも５０％、配列番号２４と少なくとも６７％又は配列番号２４と少なくとも８３％のアミノ酸同一性をもつポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＲ２リガンドドメインは、配列番号２４と例えば多くとも５０％、配列番号２４と多くとも６７％、配列番号２４と多くとも８３％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００８５】
本実施形態のその他の態様においては、ＰＡＲ２リガンドドメインは、配列番号２４との関係において例えば多くとも１、２、３又は４個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＲ２リガンドドメインは、配列番号２４との関係において、例えば少なくとも１、２、３又は４個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＰＡＲ２リガンドドメインは、配列番号２４との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＲ２リガンドドメインは、配列番号２４との関係において、例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の実施形態においては、ＰＡＲ２リガンドドメインは、配列番号２４との関係において例えば多くとも１、２又は３個の非隣接アミノ酸欠失をもつポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＲ２リガンドドメインは、配列番号２４との関係において例えば少なくとも１、２又は３個の非隣接アミノ酸欠失をもつポリペプチドを含む。
【００８６】
本実施形態のその他の態様においては、ＰＡＲ２リガンドドメインは、配列番号２４との関係において例えば多くとも１、２、３又は４個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＲ２リガンドドメインは、配列番号２４との関係において例えば少なくとも２、３又は４個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらなるその他の態様においては、ＰＡＲ２リガンドドメインは、配列番号２４との関係において例えば多くとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらなるその他の態様においては、ＰＡＲ２リガンドドメインは、配列番号２４との関係において少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＲ２リガンドドメインは、配列番号２４との関係において例えば多くとも２個又は３個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＲ２リガンドドメインは、配列番号２４との関係において例えば少なくとも２又は３個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。
【００８７】
もう１つの実施形態においては、ＰＡＲリガンドドメインはＰＡＲ３リガンドドメインを含む。この実施形態の１態様においては、ＰＡＲ３リガンドドメインは、配列番号２６を含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＰＡＲ３リガンドドメインは、天然発生のＰＡＲ３リガンドドメイン変異体、例えばＰＡＲ３リガンドドメインイソ型又はＰＡＲ３リガンドドメインサブタイプを含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＰＡＲ３リガンドドメインは、配列番号２６の天然発生のＰＡＲ３リガンドドメイン変異体、例えば配列番号２６のＰＡＲ３リガンドドメインイソ型又は配列番号２６のＰＡＲ３リガンドドメインサブタイプを含む。本実施形態にさらにもう１つの態様においては、ＰＡＲ３リガンドドメインは、非天然発生のＰＡＲ３リガンドドメイン変異体例えば保存的ＰＡＲ３リガンドドメイン変異体、非保存的ＰＡＲ３リガンドドメイン変異体又はＰＡＲ３リガンドドメインペプチドミメティックス又はそれらの任意の組み合わせを含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＰＡＲ３リガンドドメインは、配列番号２６の非天然発生のＰＡＲ３リガンドドメイン変異体、例えば配列番号２６の保存的ＰＡＲ３リガンドドメイン変異体、配列番号２６の非保存的ＰＡＲ３リガンドドメイン変異体又は配列番号２６のＰＡＲ３リガンドドメインペプチドミメティックス、又はそれらの任意の組み合わせを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＰＡＲ３リガンドドメインは配列番号２６又は配列番号２７又は配列番号１３４を含む。
【００８８】
本実施形態のその他の態様においては、ＰＡＲ３リガンドドメインは、配列番号２６と例えば少なくとも５０％、配列番号２６と少なくとも６７％又は配列番号２６と少なくとも８３％のアミノ酸同一性をもつポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＲ３リガンドドメインは、配列番号２６と例えば多くとも５０％、配列番号２６と多くとも６７％、配列番号２６と多くとも８３％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００８９】
本実施形態のその他の態様においては、ＰＡＲ３リガンドドメインは、配列番号２６との関係において例えば多くとも１、２、３又は４個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＲ３リガンドドメインは、配列番号２６との関係において、例えば少なくとも１、２、３又は４個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＰＡＲ３リガンドドメインは、配列番号２６との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＲ３リガンドドメインは、配列番号２６との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の実施形態においては、ＰＡＲ３リガンドドメインは、配列番号２６との関係において例えば多くとも１、２又は３個の非隣接アミノ酸欠失をもつポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＲ３リガンドドメインは、配列番号２６との関係において例えば少なくとも１、２又は３個の非隣接アミノ酸欠失をもつポリペプチドを含む。
【００９０】
本実施形態のその他の態様においては、ＰＡＲ３リガンドドメインは、配列番号２６との関係において例えば多くとも２、３又は４個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＲ３リガンドドメインは、配列番号２６との関係において例えば少なくとも２、３又は４個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらなるその他の態様においては、ＰＡＲ３リガンドドメインは、配列番号２６との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらなるその他の態様においては、ＰＡＲ３リガンドドメインは、配列番号２６との関係において少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＲ３リガンドドメインは、配列番号２６との関係において例えば多くとも２個又は３個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＲ３リガンドドメインは、配列番号２６との関係において例えば少なくとも２又は３個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。
【００９１】
もう１つの実施形態においては、ＰＡＲリガンドドメインはＰＡＲ４リガンドドメインを含む。この実施形態の１態様においては、ＰＡＲ４リガンドドメインは、配列番号２８を含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＰＡＲ４リガンドドメインは、天然発生のＰＡＲ４リガンドドメイン変異体、例えばＰＡＲ４リガンドドメインイソ型又はＰＡＲ４リガンドドメインサブタイプを含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ＰＡＲ４リガンドドメインは、配列番号２８の天然発生のＰＡＲ４リガンドドメイン変異体、例えば配列番号２８のＰＡＲ４リガンドドメインイソ型又は配列番号２８のＰＡＲ４リガンドドメインサブタイプを含む。本実施形態にさらにもう１つの態様においては、ＰＡＲ４リガンドドメインは、非天然発生のＰＡＲ４リガンドドメイン変異体例えば保存的ＰＡＲ４リガンドドメイン変異体、非保存的ＰＡＲ４リガンドドメイン変異体又はＰＡＲ４リガンドドメインペプチドミメティックス又はそれらの任意の組み合わせを含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＰＡＲ４リガンドドメインは、配列番号２８の非天然発生のＰＡＲ４リガンドドメイン変異体、例えば配列番号２８の保存的ＰＡＲ４リガンドドメイン変異体、配列番号２８の非保存的ＰＡＲ４リガンドドメイン変異体又は配列番号２８のＰＡＲ４リガンドドメインペプチドミメティックス、又はそれらの任意の組み合わせを含む。本実施形態のその他の態様においては、ＰＡＲ４リガンドドメインは配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号１３５又は配列番号１６０を含む。
【００９２】
本実施形態のその他の態様においては、ＰＡＲ４リガンドドメインは、配列番号２８と例えば少なくとも５０％、配列番号２８と少なくとも６７％又は配列番号２８と少なくとも８３％のアミノ酸同一性をもつポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＲ４リガンドドメインは、配列番号２８と例えば多くとも５０％、配列番号２８と多くとも６７％、配列番号２８と多くとも８３％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【００９３】
本実施形態のその他の態様においては、ＰＡＲ４リガンドドメインは、配列番号２８との関係において例えば多くとも１、２、３又は４個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＲ４リガンドドメインは、配列番号２８との関係において、例えば少なくとも１、２、３又は４個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＰＡＲ４リガンドドメインは、配列番号２８との関係において多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＲ４リガンドドメインは、配列番号２８との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の実施形態においては、ＰＡＲ４リガンドドメインは、配列番号２８との関係において例えば少なくとも１、２又は３個の非隣接アミノ酸欠失をもつポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＲ４リガンドドメインは、配列番号２８との関係において例えば少なくとも１、２又は３個の非隣接アミノ酸欠失をもつポリペプチドを含む。
【００９４】
本実施形態のその他の態様においては、ＰＡＲ４リガンドドメインは、配列番号２８との関係において例えば多くとも２、３又は４個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。この実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＲ４リガンドドメインは、配列番号２８との関係において例えば少なくとも２、３又は４個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらなるその他の態様においては、ＰＡＲ４リガンドドメインは、配列番号２８との関係において例えば多くとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらなるその他の態様においては、ＰＡＲ４リガンドドメインは、配列番号２８との関係において少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＲ４リガンドドメインは、配列番号２８との関係において例えば多くとも２個又は３個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。本実施形態のさらにその他の態様においては、ＰＡＲ４リガンドドメインは、配列番号２８との関係において例えば少なくとも２又は３個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含む。
【００９５】
ＰＡＲプロテアーゼがＰＡＲの細胞外アミノ末端を分割する場合、連結リガンドとして機能する新しいアミノ酸末端が生成される。現在、連結リガンドのアミノ末端位置設定は、リガンド結合ドメインを含むレポータの第２の細胞外ループ領域に対してリガンドが有効に結合する上で決定的に重要な意味をもつと考えられている。２鎖分子の形成が結果としてＰＡＲリガンドドメインの自由アミノ酸末端をもたらすことを条件として、本明細書の修飾クロストリジウム毒素は任意のそして全ての場所でＰＡＲリガンドドメインを含むことができる、ということが予測されている。制限的意味のない例としては、クロストリジウム毒素酵素ドメインのアミノ末端にＰＡＲリガンドドメインを位置設定すること；クロストリジウム毒素転移ドメインのアミノ末端にＰＡＲリガンドドメインを位置設定すること；そしてクロストリジウム毒素結合ドメインのアミノ末端にＰＡＲリガンドドメインを位置設定することが含まれる（図４）。
【００９６】
かくして、一実施形態においては、修飾クロストリジウム毒素は、ＰＡＲリガンドドメイン；クロストリジウム毒素酵素ドメイン；クロストリジウム毒素転移ドメイン；及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含み、ここでＰＡＲリガンドドメインはクロストリジウム毒素酵素ドメインのアミノ末端に位置設定されている。この実施形態の１態様においては、クロストリジウム毒素１本鎖分子のアミノからカルボキシまでの線形組織が酵素ドメイン、転移ドメインそして結合ドメインである場合に、ＰＡＲリガンドドメインを酵素ドメインのアミノ末端に位置設定することができる。本実施形態のもう１つの態様においては、クロストリジウム毒素１本鎖分子のアミノからカルボキシまでの線形組織が酵素ドメイン、結合ドメインそして転移ドメインである場合に、ＰＡＲリガンドドメインを酵素ドメインのアミノ末端に位置設定することができる。
【００９７】
かくして、一実施形態においては、修飾クロストリジウム毒素は、ＰＡＲリガンドドメイン；クロストリジウム毒素酵素ドメイン；クロストリジウム毒素転移ドメイン；及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含み、ここでＰＡＲリガンドドメインはクロストリジウム毒素転移ドメインのアミノ末端に位置設定されている。この実施形態の１態様においては、クロストリジウム毒素１本鎖分子のアミノからカルボキシまでの線形組織が結合ドメイン、酵素ドメインそして転移ドメインである場合に、ＰＡＲリガンドドメインを同じく転移ドメインのアミノ末端に位置設定することもできる。本実施形態のもう１つの態様においては、クロストリジウム毒素１本鎖分子のアミノからカルボキシまでの線形組織が酵素ドメイン、転移ドメインそして結合ドメインである場合に、ＰＡＲリガンドドメインを転移ドメインのアミノ末端に位置設定することができる。
【００９８】
さらにもう１つの実施形態においては、修飾クロストリジウム毒素は、ＰＡＲリガンドドメイン；クロストリジウム毒素酵素ドメイン；クロストリジウム毒素転移ドメイン；及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含み、ここでＰＡＲリガンドドメインはクロストリジウム毒素結合ドメインのアミノ末端に位置設定されている。この実施形態の１態様においては、クロストリジウム毒素１本鎖分子のアミノからカルボキシまでの線形組織が酵素ドメイン、結合ドメインそして転移ドメインである場合に、ＰＡＲリガンドドメインを同じく結合ドメインのアミノ末端に位置設定することもできる。
【００９９】
【表４】
2008511338.tif 000006
【０１００】
さらにもう１つの実施形態においては、ＰＡＲリガンドドメインの場所は、修飾クロストリジウム毒素のアミノ末端に位置設定される。このような場所では、該ＰＡＲリガンドドメインはＰＡＲの結合ドメインに結合でき、ＰＡＲリガンドドメインをアンマスクするためにタンパク質分解分割は必要でない。本書で使用されている「アンマスク」という用語は、ＰＡＲリガンドドメインのアミノ末端が自由にＰＡＲのリガンド結合ドメインに結合できることを意味する。当該技術分野においては、開始メチオニンを含むもう１つのポリペプチドのアミノ末端に作動的に連結されているポリペプチドを添加する場合に、このメチオニン残基を欠失させることができるということがわかっている（表４）。これは、付加されたポリペプチドが新しい開始メチオニンを含むことになることそしてもとの開始メチオニンが融合タンパク質の最適な発現を低減し得ることに起因している。
【０１０１】
さらにもう１つの実施形態においては、ＰＡＲリガンドドメインの場所は、修飾クロストリジウム毒素のアミノ末端に位置設定される。このような場所では、該ＰＡＲリガンドドメインはＰＡＲの結合ドメインに結合できない。ＰＡＲリガンドドメインは、このドメインがＰＡＲのリガンド結合ドメインに結合できるようになるためにはＰＡＲリガンドドメインをアンマスクする必要があることから、マスクされているとみなされる。ここで使用する「マスクされた」という用語は、ＰＡＲリガンドドメインのアミノ末端がＰＡＲのリガンド結合ドメインに結合できないことを意味している。修飾クロストリジウム毒素のＰＡＲリガンドドメインをアンマスクするためには、適切なプロテアーゼでの分割時点で、マスクされたＰＡＲリガンドドメインがアンマスク状態となりいまやＰＡＲリガンド結合ドメインを結合する能力をもつことになるような形で、ＰＡＲリガンドドメインの前にプロテアーゼ切断部位を置くことができる。制限的意味無く、２鎖ループ内に見出されるクロストリジウム毒素プロテアーゼ切断部位、インビボで連結リガンドをアンマスクするのに使用されるプロテアーゼ切断部位及び外因性プロテアーゼ切断部位を含めて、ＰＡＲリガンドドメインをアンマスクする目的で本発明の中で開示されている修飾クロストリジウム毒素を分割し得る任意の及び全てのプロテアーゼを使用することが予測されている。
【０１０２】
上述のとおり、クロストリジウム毒素は単一ポリペプチド形態から２鎖分子へとタンパク質分解分割により転換される。プロテアーゼの同一性は現在未知であるものの、数多くのクロストリジウム毒素のための２鎖ループプロテアーゼ切断部位が判定されてきた。ＢｏＮＴにおいては、Ｋ４４８−Ａ４４９における分割がＢｏＮＴ／Ａの単一ポリペプチド形態を２鎖形態へと転換させる；Ｋ４４１−Ａ４４２での分割は、ＢｏＮＴ／Ｂの単一ポリペプチド形態を２鎖形態へと転換させる；Ｋ４４９〜Ｔ４５０での分割は、ＢｏＮＴ／Ｃ１の単一ポリペプチド形態を２鎖形態へと転換させる；Ｒ４４５〜Ｄ４４６での分割は、ＢｏＮＴ／Ｄの単一ポリペプチド形態を２鎖形態へと転換させる；Ｒ４２２−Ｋ４２３における分割は、ＢｏＮＴ／Ｅの単一ポリペプチド形態を２鎖形態へと転換させる；Ｋ４３９−Ａ４４０での分割は、ＢｏＮＴ／Ｆの単一ポリペプチド形態を２鎖形態へと転換させる。そしてＫ４４６〜Ｓ４４７での分割は、ＢｏＮＴ／Ｇの単一ポリペプチド形態を２鎖形態へと転換させる。Ａ４５７〜Ｓ４５８におけるＴｅＮＴの単一ポリペプチド形態のタンパク質分解分割は、２鎖形態を結果としてもたらす。かかる２鎖ループプロテアーゼ切断部位は、融合タンパク質として修飾クロストリジウム毒素に対して枠内で作動的に連結されている。しかしながら、同様に、２鎖の外観内部の付加的な分割部位が同じく分割されてその結果として失なわれつつある小さいペプチドフラグメントが生成されることになるように思われる、ということにも留意すべきである。制限的意味のない一例として、ＢｏＮＴ／Ａ一本鎖ポリペプチドの分割は究極的に、２鎖ループ内部のアミノ酸フラグメントの喪失を結果としてもたらす。
【０１０３】
かくして、一実施形態においては、ＰＡＲリガンドドメインをアンマスクするために内因性クロストリジウム毒素２鎖ループプロテアーゼ切断部位のタンパク質分解分割が使用される。本実施形態の１態様においては、ＰＡＲリガンドドメインは、例えばＢｏＮＴ／Ａ２鎖ループプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｂ２鎖ループプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｃ１２鎖ループプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｄ２鎖ループプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｅ２鎖ループプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｆ２鎖ループプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｇ２鎖ループプロテアーゼ切断部位又はＴｅＮＴ２鎖ループプロテアーゼ切断部位のタンパク質分解分割によりアンマスクされる。
【０１０４】
連結リガンドをアンマスクするような形でＰＡＲを分割するための多様な内因性ＰＡＲプロテアーゼが知られており、従ってＰＡＲリガンドドメインをアンマスクするのにこれを使用することも可能である。凝固剤プロテアーゼであるトロンビンは、ＰＡＲ１、ＰＡＲ３及びＰＡＲ４の生理学的活性化因子である。しかしながら、制限的意味無く、ＡＰＣ、カテプシンＧ、第ＶＩＩａ因子、第Ｘａ因子、グランザイムＡ、ジンジパイン−Ｒ、プラスミン及びトリプシンを含めたその他のＰＡＲプロテアーゼも同様に、タンパク質分解分割によりＰＡＲレセプターを活性化することができる（表２）。制限的意味無く、アクロシエン、ＤｅｒＰ１、ＤｅｒＰ３、ＤｅｒＰ９、第ＶＩＩａ因子、第Ｘａ因子、ジンジパイン−Ｒ、ＭＴ−ＳＰ１、プロティナーゼ−３、トリプシン及びトリプターゼを含めた数多くのプロテアーゼによりＰＡＲ２を活性化することもできる（表２）。特定のＰＡＲリガンドドメインと会合した状態で見出される両方の内因性プロテアーゼ切断部位ならびにその他のＰＡＲリガンドドメインからの外因性プロテアーゼ切断部位を用いて、ＰＡＲリガンド結合ドメインをアンマスクする目的で本明細書に開示されている修飾クロストリジウム毒素を分割可能であることが予測されている。かかるＰＡＲプロテアーゼ切断部位は、融合タンパク質として修飾クロストリジウム毒素に対し枠内で作動的に連結されている。制限的意味の無い例としては、インビボＰＡＲ１分子と会合したプロテアーゼ切断部位を用いてＰＡＲ１リガンドドメインをアンマスクすることができ、そうでなければ、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３又はＰＡＲ４と会合したプロテアーゼ切断部位を用いてＰＡＲ１リガンドドメインをアンマスクすることができる（表２）。もう１つの制限的意味の無い例としては、インビボＰＡＲ２分子と会合したプロテアーゼ切断部位を用いてＰＡＲ２リガンドドメインをアンマスクすることができ、そうでなければ、ＰＡＲ１、ＰＡＲ３又はＰＡＲ４と会合したプロテアーゼ切断部位を用いてＰＡＲ２リガンドドメインをアンマスクすることができる（表２）。さらにもう１つの制限的意味のない例として、インビボＰＡＲ３分子と会合したプロテアーゼ切断部位を用いてＰＡＲ３リガンドドメインをアンマスクすることができ、そうでなければ、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２又はＰＡＲ４と会合したプロテアーゼ切断部位を用いてＰＡＲ３リガンドドメインをアンマスクすることができる（表２）。さらにもう１つのプロテアーゼ切断部位のない例として、インビボＰＡＲ４分子と会合したプロテアーゼ切断部位を用いてＰＡＲ４リガンドドメインをアンマスクすることができ、そうでなければ、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２又はＰＡＲ３と会合したプロテアーゼ切断部位を用いて、ＰＡＲ４リガンドドメインをアンマスクすることができる（表２）。
【０１０５】
かくして、一実施形態においては、ＰＡＲリガンドドメインをアンマスクするために、内因性ＰＡＲ１プロテアーゼ切断部位のタンパク質分解分割が使用される。この実施形態の態様では、例えばＡＰＣプロテアーゼ切断部位、第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位、グランザイムＡプロテアーゼ切断部位、ジンジパイン−Ｒプロテアーゼ切断部位、トロンビンプロテアーゼ切断部位、又はトリプシンプロテアーゼ切断部位のタンパク質分解分割により、ＰＡＲリガンドドメインがアンマスクされる。本実施形態のその他の態様では、ＡＰＣプロテアーゼ、第Ｘａ因子プロテアーゼ、グランザイムＡプロテアーゼ、ジンジパイン−Ｒプロテアーゼ、トロンビンプロテアーゼ又はトリプシンプロテアーゼにより、ＰＡＲ１プロテアーゼ切断部位が分割される。
【０１０６】
もう１つの実施形態においては、内因性ＰＡＲ２プロテアーゼ切断部位のタンパク質分解分割を用いてＰＡＲリガンドドメインがアンマスクされる。本実施形態の態様では、例えばアクロシエンプロテアーゼ切断部位、ＤｅｒＤ１プロテアーゼ切断部位、ＤｅｒＰ３プロテアーゼ切断部位、ＤｅｒＰ９プロテアーゼ切断部位、第ＶＩＩａ因子プロテアーゼ切断部位、第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位、ジンジパイン−Ｒプロテアーゼ切断部位、ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼ切断部位、プロティナーゼ−３プロテアーゼ切断部位、トリプシンプロテアーゼ切断部位又はトリプターゼプロテアーゼ切断部位のタンパク質分解分割により、ＰＡＲリガンドドメインがアンマスクされる。この実施形態のその他の態様では、ＰＡＲ２プロテアーゼ切断部位が、例えばアクロシエンプロテアーゼ、ＤｅｒＰ１プロテアーゼ、ＤｅｒＰ３プロテアーゼ、ＤｅｒＰ９プロテアーゼ、第ＶＩＩａ因子プロテアーゼ、第Ｘａ因子プロテアーゼ、ジンジパイン−Ｒプロテアーゼ、ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼ、プロティナーゼ−３プロテアーゼ、トリプシンプロテアーゼ又はトリプターゼプロテアーゼにより分割される。
【０１０７】
もう１つの実施形態においては、ＰＡＲリガンドドメインをアンマスクするために、内因性ＰＡＲ３プロテアーゼ切断部位のタンパク質分解分割が用いられる。本実施形態の１態様においては、例えばトロンビンプロテアーゼ切断部位のタンパク質分解分割によってＰＡＲリガンドドメインがアンマスクされる。本実施形態のもう１つの態様では、例えばトロンビンプロテアーゼによりＰＡＲ３プロテアーゼ切断部位が分割される。
【０１０８】
もう１つの実施形態においては、ＰＡＲリガンドドメインをアンマスクするために内因性ＰＡＲ４プロテアーゼ切断部位のタンパク質分解分割が用いられる。この実施形態の態様においては、例えば、カテプシンＧプロテアーゼ切断部位、第ＶＩＩａ因子プロテアーゼ切断部位、第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位、ジンジパイン−Ｒプロテアーゼ切断部位、プラスミンプロテアーゼ切断部位、トロンビンプロテアーゼ切断部位又はトリプシンプロテアーゼ切断部位のタンパク質分解分割によりＰＡＲリガンドドメインがアンマスクされる。本実施形態のその他の態様においては、例えばカテプシンＧプロテアーゼ、第ＶＩＩａ因子プロテアーゼ、第Ｘａプロテアーゼ、ジンジパイン−Ｒプロテアーゼ、プラスミンプロテアーゼ、トロンビンプロテアーゼ又はトリプシンプロテアーゼにより、ＰＡＲ４プロテアーゼ切断部位が分割される。
【０１０９】
同様に、ＰＡＲリガンドドメインをアンマスクするために外因性プロテアーゼ切断部位を使用することができるということも予測されている。かかる外因性プロテアーゼ切断部位は、融合タンパク質として修飾クロストリジウム毒素に対し枠内で作動的に連結されている。プロテアーゼ切断部位の制限的意味の無い例としては、例えばエンテロキナーゼ分割部位（表５）；トロンビン分割部位（表５）；第Ｘａ因子分割因子（表５）；ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位（表４）；タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位（表５）；ジペプチジルアミノペプチダーゼ分割部位及び小ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ／ユビキチン様タンパク質−１（ＵＬＰ−１）プロテアーゼ切断部位例えばＭＡＤＳＥＶＮＱＥＡＫＰＥＶＫＰＥＶＫＰＥＴＨＩＮＬＫＶＳＤＧＳＳＥＩＦＦＫＩＫＫＴＴＰＬＲＲＬＭＥＡＦＡＫＲＱＧＫＥＭＤＳＬＲＦＬＹＤＧＩＲＩＱＡＤＱＴＰＥＤＬＤＭＥＤＮＤＩＩＥＡＨＲＥＱＩＧＧ（配列番号６７）が含まれる。制限的意味のない例として、ウシエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位、タバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位、ＳＵＭＯ／ＵＬＰ−１プロテアーゼ切断部位、トロンビンプロテアーゼ切断部位又は第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を用いて、ＰＡＲ１リガンドドメインをアンマスクすることが可能である（表５）。もう１つの制限的意味のない例としては、ウシエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位、タバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位、ＳＵＭＯ／ＵＬＰ−１プロテアーゼ切断部位、トロンビンプロテアーゼ切断部位又は第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を用いて、ＰＡＲ２リガンドドメインをアンマスクすることができる（表５）。さらにもう１つの制限的意味のない例としては、ウシエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位、タバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位、ＳＵＭＯ／ＵＬＰ−１プロテアーゼ切断部位、トロンビンプロテアーゼ切断部位又は第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を用いて、ＰＡＲ３リガンドドメインをアンマスクすることが可能である（表５）。さらにもう１つの制限的意味のない例としては、ウシエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位、タバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位、ＳＵＭＯ／ＵＬＰ−１プロテアーゼ切断部位、トロンビンプロテアーゼ切断部位又は第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を用いて、ＰＡＲ４リガンドドメインをアンマスクすることができる（表５）。
【０１１０】
かくして、一実施形態においては、ＰＡＲリガンドドメインをアンマスクするために外因性プロテアーゼ切断部位のタンパク質分解分割が使用される。本実施形態の態様においては、例えば、ウシエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位、タバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位、ＳＵＭＯ／ＵＬＰ−１プロテアーゼ切断部位、トロンビンプロテアーゼ切断部位又は第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位のタンパク質分解分割によってＰＡＲリガンドドメインをアンマスクすることが可能である。本実施形態のその他の態様においては、ウシエンテロキナーゼプロテアーゼ、タバコエッチウイルスプロテアーゼ、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、ＳＵＭＯ／ＵＬＰ−１プロテアーゼ、トロンビンプロテアーゼ又は第Ｘａ因子プロテアーゼによってＰＡＲプロテアーゼ切断部位が分割され、かくしてＰＡＲリガンドドメインがアンマスクされる。
【０１１１】
【表５】
2008511338.tif 000007
【０１１２】
もう１つの実施形態においては、ＰＡＲ１リガンドドメインをアンマスクするために外因性プロテアーゼ切断部位のタンパク質分解分割が使用される。本実施形態の態様においては、例えば、ウシエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位、タバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位、ＳＵＭＯ／ＵＬＰ−１プロテアーゼ切断部位、トロンビンプロテアーゼ切断部位又は第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位のタンパク質分解分割によってＰＡＲ１リガンドドメインをアンマスクすることが可能である。本実施形態のその他の態様においては、ウシエンテロキナーゼプロテアーゼ、タバコエッチウイルスプロテアーゼ、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、ＳＵＭＯ／ＵＬＰ−１プロテアーゼ、トロンビンプロテアーゼ又は第Ｘａ因子プロテアーゼによってＰＡＲ１プロテアーゼ切断部位が分割され、かくしてＰＡＲ１リガンドドメインがアンマスクされる。
【０１１３】
もう１つの実施形態においては、ＰＡＲ２リガンドドメインをアンマスクするために外因性プロテアーゼ切断部位のタンパク質分解分割が使用される。本実施形態の態様においては、例えば、ウシエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位、タバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位、ＳＵＭＯ／ＵＬＰ−１プロテアーゼ切断部位、トロンビンプロテアーゼ切断部位又は第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位のタンパク質分解分割によってＰＡＲ２リガンドドメインをアンマスクすることが可能である。本実施形態のその他の態様においては、ウシエンテロキナーゼプロテアーゼ、タバコエッチウイルスプロテアーゼ、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、ＳＵＭＯ／ＵＬＰ−１プロテアーゼ、トロンビンプロテアーゼ又は第Ｘａ因子プロテアーゼによってＰＡＲ２プロテアーゼ切断部位が分割され、かくしてＰＡＲ２リガンドドメインがアンマスクされる。
【０１１４】
さらにもう１つの実施形態においては、ＰＡＲ３リガンドドメインをアンマスクするために外因性プロテアーゼ切断部位のタンパク質分解分割が使用される。本実施形態の態様においては、例えば、ウシエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位、タバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位、ＳＵＭＯ／ＵＬＰ−１プロテアーゼ切断部位、トロンビンプロテアーゼ切断部位又は第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位のタンパク質分解分割によってＰＡＲ３リガンドドメインをアンマスクすることが可能である。本実施形態のその他の態様においては、ウシエンテロキナーゼプロテアーゼ、タバコエッチウイルスプロテアーゼ、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、ＳＵＭＯ／ＵＬＰ−１プロテアーゼ、トロンビンプロテアーゼ又は第Ｘａ因子プロテアーゼによってＰＡＲ３プロテアーゼ切断部位が分割され、かくしてＰＡＲ３リガンドドメインがアンマスクされる。
【０１１５】
もう１つの実施形態においては、ＰＡＲ４リガンドドメインをアンマスクするために外因性プロテアーゼ切断部位のタンパク質分解分割が使用される。本実施形態の態様においては、例えば、ウシエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位、タバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位、ＳＵＭＯ／ＵＬＰ−１プロテアーゼ切断部位、トロンビンプロテアーゼ切断部位又は第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位のタンパク質分解分割によってＰＡＲ４リガンドドメインをアンマスクすることが可能である。本実施形態のその他の態様においては、ウシエンテロキナーゼプロテアーゼ、タバコエッチウイルスプロテアーゼ、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、ＳＵＭＯ／ＵＬＰ−１プロテアーゼ、トロンビンプロテアーゼ又は第Ｘａ因子プロテアーゼによってＰＡＲ４プロテアーゼ切断部位が分割され、かくしてＰＡＲ４リガンドドメインがアンマスクされる。
【０１１６】
本明細書で開示されている修飾クロストリジウム毒素は、１つ以上の付加的な構成要素を任意に含み得るということがわかる。任意の構成要素の制限的意味のない例として、修飾クロストリジウム毒素はさらに、フレキシブルスペーサを含むフレキシブル領域を含むことができる。フレキシブルスペーサの制限的意味のない例としては、例えばＧ−スペーサＧＧＧＧＳ（配列番号４８）又はＡ−スペーサＥＡＡＡＫ（配列番号４９）が含まれる。フレキシブルスペーサを含むフレキシブル領域は、ポリペプチドの特性、属性又は物性を最適化する目的でポリペプチド領域の長さを調整するために使用可能である。かかるフレキシブル領域は、融合タンパク質として修飾クロストリジウム毒素に対し枠内で作動的に連結されている。制限的意味のない例として、プロテアーゼ切断部位をより良く露呈しかくしてプロテアーゼによるその部位の分割を容易にするべく、縦一列に１つ以上のフレキシブルスペーサを含むポリペプチド領域を用いることができる。もう１つの制限的意味の無い例としては、１つのリガンドドメインをより良く提示し、かくしてそのリガンドドメインのレセプター−上のその結合ドメインに対する結合を容易にするため、１つ以上のフレキシブルスペーサを含むポリペプチド領域を使用することができる。
【０１１７】
かくして一実施形態において、本明細書で開示された修飾クロストリジウム毒素はさらに、フレキシブルスペーサを含むフレキシブル領域を含むことができる。もう１つの実施形態においては、本明細書において開示されている修飾クロストリジウム毒素はさらに、縦一列に複数のフレキシブルスペーサを含むフレキシブル領域を含むことができる。本実施形態の態様においては、フレキシブル領域は、例えば少なくとも１個のＧ−スペーサ、少なくとも２個のＧ−スペーサ、少なくとも３個のＧ−スペーサ、少なくとも４個のＧ−スペーサ又は少なくとも５個のＧ−スペーサを縦一列に含むことができる。本実施形態のその他の態様においては、フレキシブル領域は、例えば多くとも１個のＧ−スペーサ、多くとも２個のＧ−スペーサ、多くとも３個のＧ−スペーサ、多くとも４個のＧ−スペーサ又は多くとも５個のＧ−スペーサを縦一列に含むことができる。本実施形態のさらにその他の態様においては、例えばフレキシブル領域は、少なくとも１個のＡ−スペーサ、少なくとも２個のＡ−スペーサ、少なくとも３個のＡ−スペーサ、少なくとも４個のＡ−スペーサ又は少なくとも５個のＡ−スペーサを縦一列に含むことができる。本実施形態のさらにその他の態様では、フレキシブル領域は、例えば多くとも１個のＡ−スペーサ、多くとも２個のＡ−スペーサ、多くとも３個のＡ−スペーサ、多くとも４個のＡ−スペーサ又は多くとも５個のＡ−スペーサを縦一列に含むことができる。本実施形態のもう１つの態様においては、修飾クロストリジウム毒素は、同じフレキシブルスペーサの１つ以上のコピー、異なるフレキシブルスペーサ領域の１つ以上のコピー又はその任意の組み合わせを含むフレキシブル領域を含むことができる。
【０１１８】
任意の構成要素のもう１つの制限的意味のない例として、修飾クロストリジウム毒素はさらにエピトープ結合領域を含み得る。エピトープ結合領域は、例えばタンパク質精製及びタンパク質視覚化が関与する様々な手順の中で使用可能である。かかるエピトープ結合領域は、融合タンパク質として修飾クロストリジウム毒素に対し枠内で作動的に連結されている。エピトープ結合領域の制限的意味のない例としては、例えばＦＬＡＧ、Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）、ヒトインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）、ヒトｐ６２Ｃ−ＭｙＣタンパク質（ｃ−ＭＹＣ）、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の糖タンパク質−Ｄ前駆体、Ｖ５及びＡＵ１；親和性結合領域例えばポリヒスチジン（ＨＩＳ）、ストレプトアビジン結合ペプチド（ｓｔｒｅｐ）及びビオチン又はビオチニル化配列；ペプチド結合領域、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのグルタジオン結合ドメイン、カルモジュリン結合タンパク質のカルモジュリン結合ドメイン及びマルトース結合タンパク質のマルトース結合ドメインが含まれる。適切な結合ペプチドを選択し、作製し使用するための特異的プロトコルの制限的意味のない例は、「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｔａｇｇｉｎｇ」１７．９０〜１７．９３頁（サンブルク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）及びラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）編、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第３巻、第３版、２００１年）；「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（エドワード・ハーロウ（Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ）及びダヴィッド・レーン（Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ）編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９９８年）；及び「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｎｏ．Ｉ」（エドワード・ハーロウ及びダヴィッド・レーン、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９８年）の中で記載されている。さらに結合ペプチドならびに充分に特徴づけされた試薬、条件及びプロトコルの制限的意味のない例は、制限的意味無くＢＤバイオサイエンシーズ・クローンテック（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、カリフォルニア州；  ＢＤバイオサイエンシーズ・ファーミゲン（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州；キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．）、Ｖａｌｅｎｃｉａ、カリフォルニア州；及びストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州を含めたサプライヤから容易に入手可能である。これらのプロトコルは、本書からの、当業者の技能範囲内に充分入るものである。
【０１１９】
かくして、一実施形態においては、本明細書で開示された修飾クロストリジウム毒素は、さらにエピトープ結合領域を含み得る。もう１つの実施形態においては、本明細書の中で開示されている修飾クロストリジウム毒素は、さらに複数のエピトープ結合領域を含み得る。本実施形態の態様においては、修飾クロストリジウム毒素は少なくとも１つのエピトープ結合領域、少なくとも２つのエピトープ結合領域、少なくとも３つのエピトープ結合領域、少なくとも４つのエピトープ結合領域又は少なくとも５つのエピトープ結合領域を含むことができる。本実施形態のその他の態様においては、修飾クロストリジウム毒素は例えば多くとも１つのエピトープ結合領域、多くとも２つのエピトープ結合領域、多くとも３つのエピトープ結合領域、多くとも４つのエピトープ結合領域又は多くとも５つのエピトープ結合領域を含み得る。本実施形態のもう１つの態様においては、修飾クロストリジウム毒素は、同じエピトープ結合領域の１つ以上のコピー、異なるエピトープ結合領域の１つ以上のコピー、又はその任意の組み合わせを含むことができる。エピトープ結合領域の場所は、これに制限されないが、修飾クロストリジウム毒素のアミノ末端、修飾クロストリジウム毒素内部又は修飾クロストリジウム毒素のカルボキシル末端を含め、さまざまな位置であり得る。
【０１２０】
任意の構成要素のさらにもう１つの制限的意味のない例として、修飾クロストリジウム毒素はさらに、外来性プロテアーゼ切断部位を含み得る。外因性プロテアーゼ切断部位は、例えばタンパク質分解分割によるエピトープ結合領域の除去、２鎖形態へのクロストリジウム毒素１本鎖ポリペプチドの転換又は上述のとおりのＰＡＲリガンドドメインのアンマスクが関与するさまざまな手順の中で使用可能である。かかる外因性プロテアーゼ切断部位は、融合タンパク質として作動的に修飾クロストリジウム毒素に対し枠内で作動的に連結される。プロテアーゼ切断部位の制限的意味のない例には、例えばエンテロキナーゼ分割部位（表５）；トロンビン分割部位（表５）；第Ｘａ因子分割部位（表５）；ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位（表４）；タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位（表５）；ジペプチジルアミノペプチターゼ分割部位及び小ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）／ユビキチン様タンパク質−１（ＵＬＰ−１）プロテアーゼ切断部位、例えばＭＡＤＳＥＶＮＱＥＡＫＰＥＶＫＰＥＶＫＰＥＴＨＩＮＬＫＶＳＤＧＳＳＥＩＦＦＫＩＫＫＴＴＰＬＲＲＬＭＥＡＦＡＫＲＱＧＫＥＭＤＳＬＲＦＬＹＤＧＩＲＩＱＡＤＱＴＰＥＤＬＤＭＥＤＮＤＩＩＥＡＨＲＥＱＩＧＧ（配列番号６７）が含まれる。
【０１２１】
かくして、一実施形態においては、本明細書で開示された修飾クロストリジウム毒素は、さらに外因性プロテアーゼ切断部位を含み得る。もう１つの実施形態においては、本明細書の中で開示されている修飾クロストリジウム毒素は、さらに複数の外因性プロテアーゼ切断部位を含み得る。本実施形態の態様においては、修飾クロストリジウム毒素は少なくとも１つの外因性プロテアーゼ切断部位、少なくとも２つの外因性プロテアーゼ切断部位、少なくとも３つの外因性プロテアーゼ切断部位、少なくとも４つの外因性プロテアーゼ切断部位又は少なくとも５つの外因性プロテアーゼ切断部位を含むことができる。本実施形態のその他の態様においては、修飾クロストリジウム毒素は、例えば多くとも１つの外因性プロテアーゼ切断部位、多くとも２つの外因性プロテアーゼ切断部位、多くとも３つの外因性プロテアーゼ切断部位、多くとも４つの外因性プロテアーゼ切断部位又は多くとも５つの外因性プロテアーゼ切断部位を含み得る。本実施形態のもう１つの態様においては、修飾クロストリジウム毒素は、同じ外因性プロテアーゼ切断部位の１つ以上のコピー、異なる外因性プロテアーゼ切断部位の１つ以上のコピー、又はその任意の組み合わせを含むことができる。
【０１２２】
外因性プロテアーゼ切断部位の場所は、制限的意味無く、エピトープ結合領域によるエピトープ結合領域の除去を容易にするべくエピトープ結合領域と修飾クロストリジウム毒素の間、又は毒素の１本鎖ポリペプチド形態から２鎖形態への転換を容易にするべく修飾クロストリジウム毒素の２鎖ループ内部を含めたさまざまな位置であり得る。
【０１２３】
エピトープ結合領域を除去するために外因性プロテアーゼ切断部位を使用できるということが予測されている。上述のとおり、タンパク質精製手順の中でエピトープ結合領域を使用することができ、タンパク質が精製された後にかかるエピトープ結合領域を除去することが往々にして望ましい。それを行なう一般的な１つの方法は、問題のタンパク質とエピトープ結合領域の間にプロテアーゼ切断部位を有し、かくしてプロテアーゼ切断部位のタンパク質分解分割が問題のタンパク質をエピトープ結合領域から分離するようにすることにある。エピトープ結合領域の除去のために用いられるプロテアーゼ切断部位の制限的意味のない例、ならびに充分に特徴づけ済みのプロテアーゼ、試薬、条件及びプロトコルは、制限的意味無くＢＤバイオサイエンシーズ・クローンテック、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、カリフォルニア州；ＢＤバイオサイエンシーズ・ファーミゲン、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニアシュウ；インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州；キアゲン、Ｖａｌｅｎｃｉａ、カリフォルニア州；及びストラタジーン、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州を含めたサプライヤから容易に入手可能である。適切なプロテアーゼ切断部位の選択、作製及び使用は、本書中の教示からの及び当業者の技能範囲内の日常的手順である。
【０１２４】
かくして、一実施形態においては、外因性プロテアーゼ切断部位が、エピトープ結合ペプチドと修飾クロストリジウム毒素の間に位置設定される。この実施形態のその他の態様では、ウシエンテロキナーゼ分割部位がエピトープ結合領域と修飾クロストリジウム毒素の間に位置設定されるか、タバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位がエピトープ結合領域と修飾クロストリジウム毒素の間に位置設定されているか、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位がエピトープ結合領域と修飾クロストリジウム毒素の間に位置設定されているか、ＳＵＭＯ／ＵＬＰ−１プロテアーゼ切断部位がエピトープ結合領域と修飾クロストリジウム毒素の間に位置設定されているか、トロンビンプロテアーゼ切断部位がエピトープ結合領域と修飾クロストリジウム毒素の間に位置設定されているか、又は凝固第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位がエピトープ結合領域と修飾クロストリジウム毒素の間に位置設定されている。該実施形態のその他の態様においては、エピトープ結合領域と修飾クロストリジウム毒素の間に位置設定されたウシエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位は、配列番号５０を含む。該実施形態のその他の態様においては、エピトープ結合領域と修飾クロストリジウム毒素の間に位置設定されたタバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位は、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９又は配列番号６０を含む。該実施形態のさらにその他の態様においては、エピトープ結合領域と修飾クロストリジウム毒素の間に位置設定されたヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位は、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５又は配列番号６６を含む。該実施形態のさらにその他の態様においては、エピトープ結合領域と修飾クロストリジウム毒素の間に位置設定されたＳＵＭＯ／ＵＬＰ−１プロテアーゼ切断部位は、配列番号６７を含む。該実施形態のさらにその他の態様においては、エピトープ結合領域と修飾クロストリジウム毒素の間に位置設定されたトロンビンプロテアーゼ切断部位は配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１又は配列番号８２を含む。該実施形態のその他の態様においては、エピトープ結合領域と修飾クロストリジウム毒素の間に位置設定された凝固第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位は、配列番号８３又は配列番号８４を含む。
【０１２５】
【表６】
2008511338.tif 000008
【０１２６】
本明細書内で開示されている修飾クロストリジウム毒素の１本鎖ポリペプチド形態を２鎖形態に転換するために外因性プロテアーゼ切断部位を使用できることが予測されている。上述の通り、クロストリジウム毒素は、天然発生のプロテアーゼによりジスルフィドループ内部でタンパク質分解切断により後に分割される約１５０ｋＤａの１本鎖ポリペプチドとして翻訳される。この翻訳後プロセッシングは、単一ジスルフィド結合及び非共有的相互作用により合わせて保持される約５０ｋＤａの軽鎖（ＬＣ）と約１００ｋＤａの重鎖（ＨＣ）を含む２鎖分子を生成する。天然発生のプロテアーゼは現在知られていないものの、分割は、ジスルフィド架橋を形成する２つのシスティン残基の間の２鎖ループ領域内で発生する（表６）。外因性プロテアーゼ切断部位での天然発生のプロテアーゼ切断部位の交換は、毒素の２鎖ループ領域を分割するために用いられる内因性クロストリジウムプロテアーゼを産生しない生体内で発現された時点で本明細書中で開示された修飾クロストリジウム毒素の分割を可能にすることになる。
【０１２７】
かくして、一実施形態においては、外因性プロテアーゼ切断部位は、修飾クロストリジウム毒素の２鎖ループ内部に位置設定されている。この実施形態の態様においては、ウシエンテロキナーゼ分割部位が修飾クロストリジウム毒素の２鎖ループ内部に位置設定されているか、タバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位が修飾クロストリジウム毒素の２鎖ループ内部に位置設定されているか、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位が修飾クロストリジウム毒素の２鎖ループ内部に位置設定されているか、ＳＵＭＯ／ＵＬＰ−１プロテアーゼ切断部位が修飾クロストリジウム毒素の２鎖ループ内部に位置設定されているか、トロンビンプロテアーゼ切断部位が修飾クロストリジウム毒素の２鎖ループ内部に位置設定されているか、又は凝固第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位が修飾クロストリジウム毒素の２鎖ループ内部に位置設定されている。該実施形態のその他の態様においては、修飾クロストリジウム毒素の２鎖ループ内部に位置設定されたウシエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位は、配列番号５０を含む。該実施形態のその他の態様においては、修飾クロストリジウム毒素の２鎖ループ内部に位置設定されたタバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位は配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９又は配列番号６０を含む。該実施形態のさらにその他の態様においては、修飾クロストリジウム毒素の２鎖ループ内部に位置設定されたヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位は、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５又は配列番号６６を含む。該実施形態のさらにその他の態様においては、修飾クロストリジウム毒素の２鎖ループ内部に位置設定されたＳＵＭＯ／ＵＬＰ−１プロテアーゼ切断部位は、配列番号６７を含む。該実施形態のさらなるその他の態様においては、修飾クロストリジウム毒素の２鎖ループ内部に位置設定されたトロンビンプロテアーゼ切断部位は、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１又は配列番号８２を含む。該実施形態のその他の態様においては、修飾クロストリジウム毒素の２鎖ループ内部に位置設定されている凝固第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位は、配列番号８３又は配列番号８４を含む。
【０１２８】
本発明の態様は一部には修飾クロストリジウム毒素を提供する。本明細書の中で開示されているクロストリジウム毒素修飾の制限的意味の無い例としては、例えば、ＰＡＲリガンドドメインの付加、プロテアーゼ切断部位の付加、酵素、転移及び結合ドメインの再配置、スペーサ領域の付加及びエピトープ結合領域の付加が含まれる。このような修飾全てが、細胞を中毒させるクロストリジウム毒素の能力に実質的に影響を及ぼすわけではないということが理解される。本書で使用する「実質的に影響を及ぼさない」という用語は、クロストリジウム毒素をニューロン内に入れ神経伝達物質の放出を阻害させる全体的細胞機序をクロストリジウム毒素がなお実行できることを意味し、低又は高親和性レセプター複合体に対するクロストリジウム毒素の結合、毒素／レセプター複合体の内在化、細胞質内へのクロストリジウム毒素軽鎖の転移及びクロストリジウム毒素基質の酵素的修飾を包含する。本実施形態の態様においては、修飾クロストリジウム毒素は例えば、天然に発生するクロストリジウム毒素の少なくとも１０％の毒性、天然に発生するクロストリジウム毒素の少なくとも２０％の毒性、天然に発生するクロストリジウム毒素の少なくとも３０％の毒性、天然に発生するクロストリジウム毒素の少なくとも４０％の毒性、天然に発生するクロストリジウム毒素の少なくとも５０％の毒性、天然に発生するクロストリジウム毒素の少なくとも６０％の毒性、天然に発生するクロストリジウム毒素の少なくとも７０％の毒性、天然に発生するクロストリジウム毒素の少なくとも８０％の毒性、天然に発生するクロストリジウム毒素の少なくとも９０％の毒性又は天然に発生するクロストリジウム毒素の少なくとも９５％の毒性を有する。本実施形態の態様においては、修飾クロストリジウム毒素は例えば、天然に発生するクロストリジウム毒素の多くとも１０％の毒性、天然に発生するクロストリジウム毒素の多くとも２０％の毒性、天然に発生するクロストリジウム毒素の多くとも３０％の毒性、天然に発生するクロストリジウム毒素の多くとも４０％の毒性、天然に発生するクロストリジウム毒素の多くとも５０％の毒性、天然に発生するクロストリジウム毒素の多くとも６０％の毒性、天然に発生するクロストリジウム毒素の多くとも７０％の毒性、天然に発生するクロストリジウム毒素の多くとも８０％の毒性、天然に発生するクロストリジウム毒素の多くとも９０％の毒性又は天然に発生するクロストリジウム毒素の多くとも９５％の毒性を有する。
【０１２９】
本発明の態様は、一部にはポリヌクレオチド分子を提供している。本書で使用される「ポリヌクレオチド分子」という用語は「核酸分子」と同義であり、例えば任意の長さのリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドといったようなヌクレオチドの重合体形態を意味する。制限的意味無く、天然発生及び非天然発生のＤＮＡ分子及び天然発生及び非天然発生のＲＮＡ分子を含めた、本明細書内で開示されている修飾クロストリジウム毒素をコードできる任意の及び全てのポリヌクレオチド分子が有用であり得るということが予測されている。天然発生及び非天然発生のＤＮＡ分子の制限的意味のない例としては、１本鎖ＤＮＡ分子、２本鎖ＤＮＡ分子、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、ベクター構成体例えばプラスミド構成体、ファージミド構成体、バクテリオファージ構成体、レトロウイルス構成体及び人工染色体構成体などが含まれる。天然発生及び非天然発生のＲＮＡ分子の制限的意味の無い例としては、１本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡ及びｍＲＮＡが含まれる。
【０１３０】
かくして、一実施形態においては、ポリヌクレオチド分子は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン、クロストリジウム毒素転移ドメイン及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含むクロストリジウム毒素をコードする。この実施形態の１態様においては、ポリヌクレオチド分子は、天然に発生するクロストリジウム毒素変異体、例えばクロストリジウム毒素イソ型又はＣＴサブタイプを含むクロストリジウム毒素をコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば保存的クロストリジウム毒素変異体、非保存的クロストリジウム毒素変異体又は活性クロストリジウム毒素フラグメント又はそれらの任意の組み合わせといったような非天然発生のクロストリジウム毒素変異体を含むクロストリジウム毒素をコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、クロストリジウム毒素酵素ドメイン又はその活性フラグメント、クロストリジウム毒素転移ドメイン又はその活性フラグメント、クロストリジウム毒素結合ドメイン又はその活性フラグメント又はそれらの任意の組み合わせを含むクロストリジウム毒素をコードする。本実施形態のその他の態様においては、クロストリジウム毒素は、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ又はＴｅＮＴを含む。
【０１３１】
もう１つの実施形態においては、ポリヌクレオチド分子は、クロストリジウム毒素はＢｏＮＴ／Ａを含むクロストリジウム毒素をコードする。この実施形態の１態様においては、ポリヌクレオチド分子は、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインを含むＢｏＮＴ／Ａをコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号１を含むＢｏＮＴ／Ａをコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えばＢｏＮＴ／Ａイソ型又はＢｏＮＴ／Ａサブタイプといったような天然発生のＢｏＮＴ／Ａ変異体を含むＢｏＮＴ／Ａをコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号１のＢｏＮＴ／Ａイソ型又は配列番号１のＢｏＮＴ／Ａサブタイプといったような配列番号１の天然発生のＢｏＮＴ／Ａ変異体を含むＢｏＮＴ／Ａをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば保存的ＢｏＮＴ／Ａ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ａ変異体又は活性ＢｏＮＴ／Ａフラグメント又はそれらの任意の組み合わせといったような非天然発生ＢｏＮＴ／Ａ変異体を含むＢｏＮＴ／Ａをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号１の保存的ＢｏＮＴ／Ａ変異体、配列番号１の非保存的ＢｏＮＴ／Ａ変異体又は配列番号１の活性ＢｏＮＴ／Ａフラグメント又はそれらの任意の組み合わせといった配列番号１の非天然発生ＢｏＮＴ／Ａ変異体を含むＢｏＮＴ／Ａをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン又はその活性フラグメント、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン又はその活性フラグメント、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン又はその活性フラグメント又はそれらの任意の組み合わせを含むＢｏＮＴ／Ａをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、配列番号１からのアミノ酸１〜４４８のＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号１からのアミノ酸４４９〜８６０のＢｏＮＴ／Ａ転移ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号１からのアミノ酸８６１〜１２９６のＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン又はその活性フラグメント、及びその任意の組み合わせを含むＢｏＮＴ／Ａ。
【０１３２】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号１と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号１と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号１と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号１と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号１と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ／Ａをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号１と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号１と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号１と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号１と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号１と多くとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号１と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ／Ａをコードする。
【０１３３】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号１との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ／Ａをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号１との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ／Ａをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号１との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ／Ａをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号１との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ／Ａをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号１との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ／Ａをコードする。この本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号１との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ／Ａをコードする。
【０１３４】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号１との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ／Ａをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号１との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ／Ａをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号１との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ／Ａをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号１との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ／Ａをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号１との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ／Ａをコードする。この本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号１との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ／Ａをコードする。
【０１３５】
もう１つの実施形態においては、ポリヌクレオチド分子は、ＢｏＮＴ／Ｂを含むクロストリジウム毒素をコードする。この実施形態の１態様においては、ポリヌクレオチド分子は、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメインを含むＢｏＮＴ/Ｂをコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２を含むＢｏＮＴ/Ｂをコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えばＢｏＮＴ／Ｂイソ型又はＢｏＮＴ／Ｂサブタイプといったような天然発生のＢｏＮＴ／Ｂ変異体を含むＢｏＮＴ/Ｂをコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号２のＢｏＮＴ／Ｂイソ型又は配列番号２のＢｏＮＴ／Ｂサブタイプといったような配列番号２の天然発生のＢｏＮＴ／Ｂ変異体を含むＢｏＮＴ/Ｂをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば保存的ＢｏＮＴ／Ｂ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｂ変異体又は活性ＢｏＮＴ／Ｂフラグメント又はそれらの任意の組み合わせといったような非天然発生ＢｏＮＴ／Ｂ変異体を含むＢｏＮＴ/Ｂをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号２の保存的ＢｏＮＴ／Ｂ変異体、配列番号２の非保存的ＢｏＮＴ／Ｂ変異体又は配列番号２の活性ＢｏＮＴ／Ｂフラグメント又はそれらの任意の組み合わせといった配列番号２の非天然発生ＢｏＮＴ／Ｂ変異体を含むＢｏＮＴ/Ｂをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン又はその活性フラグメント、ＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン又はその活性フラグメント、ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン又はその活性フラグメント又はそれらの任意の組み合わせを含むＢｏＮＴ/Ｂ。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、配列番号２からのアミノ酸１〜４４１のＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号２からのアミノ酸４４２〜８４７のＢｏＮＴ／Ｂ転移ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号２からのアミノ酸８４８〜１２９１のＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン又はその活性フラグメント、及びその任意の組み合わせを含むＢｏＮＴ/Ｂ。
【０１３６】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号２と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号２と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号２と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号２と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号２と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号２と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｂをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号２と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号２と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号２と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号２と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号２と多くとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号２と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｂをコードする。
【０１３７】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｂをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｂをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｂをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｂをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｂをコードする。この本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｂをコードする。
【０１３８】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｂをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｂをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｂをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｂをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｂをコードする。この本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｂをコードする。
【０１３９】
もう１つの実施形態においては、ポリヌクレオチド分子は、ＢｏＮＴ／Ｃ１を含むクロストリジウム毒素をコードする。この実施形態の１態様においては、ポリヌクレオチド分子は、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメインを含むＢｏＮＴ/Ｃ１をコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号３を含むＢｏＮＴ/Ｃ１をコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えばＢｏＮＴ／Ｃ１イソ型又はＢｏＮＴ／Ｃ１サブタイプといったような天然発生のＢｏＮＴ／Ｃ１変異体を含むＢｏＮＴ/Ｃ１をコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号３のＢｏＮＴ／Ｃ１イソ型又は配列番号３のＢｏＮＴ／Ｃ１サブタイプといったような配列番号３の天然発生のＢｏＮＴ／Ｃ１変異体を含むＢｏＮＴ/Ｃ１をコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１変異体又は活性ＢｏＮＴ／Ｃ１フラグメント又はそれらの任意の組み合わせといったような非天然発生ＢｏＮＴ／Ｃ１変異体を含むＢｏＮＴ/Ｃ１をコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号３の保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１変異体、配列番号３の非保存的ＢｏＮＴ／Ｃ１変異体又は配列番号３の活性ＢｏＮＴ／Ｃ１フラグメント又はそれらの任意の組み合わせといった配列番号３の非天然発生ＢｏＮＴ／Ｃ１変異体を含むＢｏＮＴ/Ｃ１をコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン又はその活性フラグメント、ＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン又はその活性フラグメント、ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン又はその活性フラグメント又はそれらの任意の組み合わせを含むＢｏＮＴ/Ｃ１をコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号３からのアミノ酸１〜４４９のＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号３からのアミノ酸４５０〜８５５のＢｏＮＴ／Ｃ１転移ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号３からのアミノ酸８５６〜１２９１のＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン又はその活性フラグメント、及びその任意の組み合わせを含むＢｏＮＴ/Ｃ１をコードする。
【０１４０】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号３と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号３と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号３と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号３と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号３と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号３と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｃ１をコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号３と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号３と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号３と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号３と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号３と多くとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号３と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｃ１をコードする。
【０１４１】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号３との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｃ１をコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号３との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｃ１をコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号３との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｃ１をコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号３との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｃ１をコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号３との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｃ１をコードする。この本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号３との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｃ１をコードする。
【０１４２】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号３との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｃ１をコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号３との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｃ１をコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号３との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｃ１をコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号３との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｃ１をコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号３との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｃ１をコードする。この本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号３との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｃ１をコードする。
【０１４３】
もう１つの実施形態においては、ポリヌクレオチド分子は、ＢｏＮＴ／Ｄを含むクロストリジウム毒素をコードする。この実施形態の１態様においては、ポリヌクレオチド分子は、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメインを含むＢｏＮＴ/Ｄをコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号４を含むＢｏＮＴ/Ｄをコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えばＢｏＮＴ／Ｄイソ型又はＢｏＮＴ／Ｄサブタイプといったような天然発生のＢｏＮＴ／Ｄ変異体を含むＢｏＮＴ/Ｄをコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号４のＢｏＮＴ／Ｄイソ型又は配列番号４のＢｏＮＴ／Ｄサブタイプといったような配列番号４の天然発生のＢｏＮＴ／Ｄ変異体を含むＢｏＮＴ/Ｄをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば保存的ＢｏＮＴ／Ｄ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｄ変異体又は活性ＢｏＮＴ／Ｄフラグメント又はそれらの任意の組み合わせといったような非天然発生ＢｏＮＴ／Ｄ変異体を含むＢｏＮＴ/Ｄをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号４の保存的ＢｏＮＴ／Ｄ変異体、配列番号４の非保存的ＢｏＮＴ／Ｄ変異体又は配列番号４の活性ＢｏＮＴ／Ｄフラグメント又はそれらの任意の組み合わせといった配列番号４の非天然発生ＢｏＮＴ／Ｄ変異体を含むＢｏＮＴ/Ｄをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン又はその活性フラグメント、ＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン又はその活性フラグメント、ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン又はその活性フラグメント又はそれらの任意の組み合わせを含むＢｏＮＴ/Ｄをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、配列番号４からのアミノ酸１〜４４２のＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号４からのアミノ酸４４３〜８５１のＢｏＮＴ／Ｄ転移ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号４からのアミノ酸８５２〜１２７６のＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン又はその活性フラグメント、及びその任意の組み合わせを含むＢｏＮＴ／Ｄ。
【０１４４】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号４と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号４と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号４と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号４と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号４と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号４と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｄをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号４と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号４と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号４と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号４と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号４と多くとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号４と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｄをコードする。
【０１４５】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号４との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｄをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号４との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｄをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号４との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｄをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号４との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｄをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号４との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｄをコードする。この本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号４との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｄをコードする。
【０１４６】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号４との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｄをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号４との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｄをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号４との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｄをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号４との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｄをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号４との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｄをコードする。この本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号４との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｄをコードする。
【０１４７】
もう１つの実施形態においては、ポリヌクレオチド分子は、ＢｏＮＴ／Ｅを含むクロストリジウム毒素をコードする。この実施形態の１態様においては、ポリヌクレオチド分子は、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメインを含むＢｏＮＴ/Ｅをコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号５を含むＢｏＮＴ/Ｅをコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えばＢｏＮＴ／Ｅイソ型又はＢｏＮＴ／Ｅサブタイプといったような天然発生のＢｏＮＴ／Ｅ変異体を含むＢｏＮＴ/Ｅをコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号５のＢｏＮＴ／Ｅイソ型又は配列番号５のＢｏＮＴ／Ｅサブタイプといったような配列番号５の天然発生のＢｏＮＴ／Ｅ変異体を含むＢｏＮＴ/Ｅをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば保存的ＢｏＮＴ／Ｅ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｅ変異体又は活性ＢｏＮＴ／Ｅフラグメント又はそれらの任意の組み合わせといったような非天然発生ＢｏＮＴ／Ｅ変異体を含むＢｏＮＴ/Ｅをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号５の保存的ＢｏＮＴ／Ｅ変異体、配列番号５の非保存的ＢｏＮＴ／Ｅ変異体又は配列番号５の活性ＢｏＮＴ／Ｅフラグメント又はそれらの任意の組み合わせといった配列番号５の非天然発生ＢｏＮＴ／Ｅ変異体を含むＢｏＮＴ/Ｅをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン又はその活性フラグメント、ＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン又はその活性フラグメント、ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン又はその活性フラグメント及びそれらの任意の組み合わせを含むＢｏＮＴ／Ｅ。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、配列番号５からのアミノ酸１〜４２２のＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号５からのアミノ酸４２３〜８３４のＢｏＮＴ／Ｅ転移ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号５からのアミノ酸８３５〜１２５２のＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン又はその活性フラグメント、及びその任意の組み合わせを含むＢｏＮＴ／Ｅ。
【０１４８】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号５と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号５と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号５と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号５と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号５と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号５と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｅをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号５と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号５と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号５と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号５と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号５と多くとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号５と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｅをコードする。
【０１４９】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号５との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｅをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号５との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｅをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号５との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｅをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号５との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｅをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号５との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｅをコードする。この本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号５との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｅをコードする。
【０１５０】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号５との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｅをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号５との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｅをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号５との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｅをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号５との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｅをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号５との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｅをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号５との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｅをコードする。
【０１５１】
もう１つの実施形態においては、ポリヌクレオチド分子は、ＢｏＮＴ／Ｆを含むクロストリジウム毒素をコードする。この実施形態の１態様においては、ポリヌクレオチド分子は、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメインを含むＢｏＮＴ/Ｆをコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号６を含むＢｏＮＴ/Ｆをコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ＢｏＮＴ／Ｆは、例えばＢｏＮＴ／Ｆイソ型又はＢｏＮＴ／Ｆサブタイプといったような天然発生のＢｏＮＴ／Ｆ変異体を含む。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号６のＢｏＮＴ／Ｆイソ型又は配列番号６のＢｏＮＴ／Ｆサブタイプといったような配列番号６の天然発生のＢｏＮＴ／Ｆ変異体を含むＢｏＮＴ/Ｆをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば保存的ＢｏＮＴ／Ｆ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｆ変異体又は活性ＢｏＮＴ／Ｆフラグメント又はそれらの任意の組み合わせといったような非天然発生ＢｏＮＴ／Ｆ変異体を含むＢｏＮＴ/Ｆをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号６の保存的ＢｏＮＴ／Ｆ変異体、配列番号６の非保存的ＢｏＮＴ／Ｆ変異体又は配列番号６の活性ＢｏＮＴ／Ｆフラグメント又はそれらの任意の組み合わせといった配列番号６の非天然発生ＢｏＮＴ／Ｆ変異体を含むＢｏＮＴ/Ｆをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン又はその活性フラグメント、ＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン又はその活性フラグメント、ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン又はその活性フラグメント及びそれらの任意の組み合わせを含むＢｏＮＴ/Ｆをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号６からのアミノ酸１〜４３６のＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号６からのアミノ酸４３７〜８５２のＢｏＮＴ／Ｆ転移ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号６からのアミノ酸８５３〜１２７４のＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン又はその活性フラグメント、及びその任意の組み合わせを含むＢｏＮＴ／Ｆをコードする。
【０１５２】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号６と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号６と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号６と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号６と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号６と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号６と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｆをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号６と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号６と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号６と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号６と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号６と多くとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号６と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｆをコードする。
【０１５３】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号６との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｆをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号６との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｆをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号６との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｆをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号６との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｆをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号６との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｆをコードする。この本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号６との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｆをコードする。
【０１５４】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号６との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｆをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号６との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｆをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号６との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｆをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号６との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｆをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号６との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｆをコードする。この本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号６との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｆをコードする。
【０１５５】
もう１つの実施形態においては、ポリヌクレオチド分子は、ＢｏＮＴ／Ｇを含むクロストリジウム毒素をコードする。この実施形態の１態様においては、ポリヌクレオチド分子は、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン及びＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメインを含むＢｏＮＴ/Ｇをコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号７を含むＢｏＮＴ/Ｇをコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えばＢｏＮＴ／Ｇイソ型又はＢｏＮＴ／Ｇサブタイプといったような天然発生のＢｏＮＴ／Ｇ変異体を含むＢｏＮＴ/Ｇをコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号７のＢｏＮＴ／Ｇイソ型又は配列番号７のＢｏＮＴ／Ｇサブタイプといったような配列番号７の天然発生のＢｏＮＴ／Ｇ変異体を含むＢｏＮＴ/Ｇをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば保存的ＢｏＮＴ／Ｇ変異体、非保存的ＢｏＮＴ／Ｇ変異体又は活性ＢｏＮＴ／Ｇフラグメント又はそれらの任意の組み合わせといったような非天然発生ＢｏＮＴ／Ｇ変異体を含むＢｏＮＴ/Ｇをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号７の保存的ＢｏＮＴ／Ｇ変異体、配列番号７の非保存的ＢｏＮＴ／Ｇ変異体又は配列番号７の活性ＢｏＮＴ／Ｇフラグメント又はそれらの任意の組み合わせといった配列番号７の非天然発生ＢｏＮＴ／Ｇ変異体を含むＢｏＮＴ/Ｇをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン又はその活性フラグメント、ＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン又はその活性フラグメント、ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメイン又はその活性フラグメント又はそれらの任意の組み合わせを含むＢｏＮＴ/Ｇをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、配列番号７からのアミノ酸１〜４４２のＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号７からのアミノ酸４４３〜８５２のＢｏＮＴ／Ｇ転移ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号７からのアミノ酸８５３〜１２９７のＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメイン又はその活性フラグメント、及びその任意の組み合わせを含むＢｏＮＴ／Ｇ。
【０１５６】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号７と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号７と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号７と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号７と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号７と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号７と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｇをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号７と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号７と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号７と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号７と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号７と多くとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号７と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｇをコードする。
【０１５７】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号７との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｇをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号７との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｇをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号７との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｇをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号７との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｇをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号７との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｇをコードする。この本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号７との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｇをコードする。
【０１５８】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号７との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｇをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号７との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｇをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号７との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｇをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号７との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｇをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号７との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｇをコードする。この本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号７との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＢｏＮＴ/Ｇをコードする。
【０１５９】
もう１つの実施形態においては、ポリヌクレオチド分子は、ＴｅＮＴを含むクロストリジウム毒素をコードする。この実施形態の１態様においては、ポリヌクレオチド分子は、ＴｅＮＴ酵素ドメイン、ＴｅＮＴ転移ドメイン及びＴｅＮＴ結合ドメインを含むＴｅＮＴをコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号８を含むＴｅＮＴをコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えばＴｅＮＴイソ型又はＴｅＮＴサブタイプといったような天然発生のＴｅＮＴ変異体を含むＴｅＮＴをコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号８のＴｅＮＴイソ型又は配列番号８のＴｅＮＴサブタイプといったような配列番号８の天然発生のＴｅＮＴ変異体を含むＴｅＮＴをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば保存的ＴｅＮＴ変異体、非保存的ＴｅＮＴ変異体又は活性ＴｅＮＴフラグメント又はそれらの任意の組み合わせといったような非天然発生ＴｅＮＴ変異体を含むＴｅＮＴをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば、配列番号８の保存的ＴｅＮＴ変異体、配列番号８の非保存的ＴｅＮＴ変異体又は配列番号８の活性ＴｅＮＴフラグメント又はそれらの任意の組み合わせといった配列番号８の非天然発生ＴｅＮＴ変異体を含むＴｅＮＴをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ＴｅＮＴ酵素ドメイン又はその活性フラグメント、ＴｅＮＴ転移ドメイン又はその活性フラグメント、ＴｅＮＴ結合ドメイン又はその活性フラグメント又はそれらの任意の組み合わせを含むＴｅＮＴ。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、配列番号８からのアミノ酸１〜４４１のＴｅＮＴ酵素ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号８からのアミノ酸４４２〜８７０のＴｅＮＴ転移ドメイン又はその活性フラグメント、配列番号８からのアミノ酸８７１〜１３１５のＴｅＮＴ結合ドメイン又はその活性フラグメント、及びその任意の組み合わせを含むＴｅＮＴ。
【０１６０】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号８と少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号８と少なくとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号８と少なくとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号８と少なくとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号８と少なくとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号８と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むＴｅＮＴをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号８と多くとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号８と多くとも７５％のアミノ酸同一性、配列番号８と多くとも８０％のアミノ酸同一性、配列番号８と多くとも８５％のアミノ酸同一性、配列番号８と多くとも９０％のアミノ酸同一性、配列番号８と多くとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むＴｅＮＴをコードする。
【０１６１】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号８との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＴｅＮＴをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号８との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＴｅＮＴをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号８との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＴｅＮＴをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号８との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＴｅＮＴをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号８との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＴｅＮＴをコードする。この本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号８との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＴｅＮＴをコードする。
【０１６２】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号８との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＴｅＮＴをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号８との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＴｅＮＴをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号８との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＴｅＮＴをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号８との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＴｅＮＴをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号８との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＴｅＮＴをコードする。この本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号８との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００又は５００個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＴｅＮＴをコードする。
【０１６３】
さらにもう１つの実施形態においては、ポリヌクレオチド分子は、例えばＰＡＲリガンドドメインイソ型又はＰＡＲリガンドドメインサブタイプといったような天然発生のＰＡＲリガンドドメイン変異体を含むＰＡＲリガンドドメインをコードする。もう１つの実施形態においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば保存的ＰＡＲリガンドドメイン変異体、非保存的ＰＡＲリガンドドメイン変異体又はＰＡＲリガンドドメインペプチドミメティックス又はその任意の組み合わせといった非天然発生ＰＡＲリガンドドメイン変異体を含むＰＡＲリガンドドメインをコードする。
【０１６４】
さらにもう１つの実施形態においては、ポリヌクレオチド分子は、ＰＡＲ１リガンドドメインを含むＰＡＲリガンドドメインをコードする。この実施形態の１態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号１３を含むＰＡＲ１リガンドドメインをコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えばＰＡＲ１リガンドドメインイソ型又はＰＡＲ１リガンドドメインサブタイプといった天然発生のＰＡＲ１リガンドドメイン変異体を含むＰＡＲ１リガンドドメインをコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号１３のＰＡＲ１リガンドドメインイソ型又は配列番号１３のＰＡＲ１リガンドドメインサブタイプといったような配列番号１３の天然発生のＰＡＲ１リガンドドメイン変異体を含むＰＡＲ１リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば保存的ＰＡＲ１リガンドドメイン変異体、非保存的ＰＡＲ１リガンドドメイン変異体又はＰＡＲ１リガンドドメインペプチドミメティックス又はその任意の組み合わせといったような非天然発生のＰＡＲ１リガンドドメイン変異体を含むＰＡＲ１リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号１３の保存的ＰＡＲ１リガンドドメイン変異体、配列番号１３の非保存的ＰＡＲ１リガンドドメイン変異体又は配列番号１３のＰＡＲ１リガンドドメインペプチドミメティックス又はその任意の組み合わせといったような配列番号１３の非天然発生のＰＡＲ１リガンドドメイン変異体を含むＰＡＲ１リガンドドメインをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２又は配列番号２３を含むＰＡＲ１リガンドドメインをコードする。
【０１６５】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号１３と少なくとも５０％のアミノ酸同一性、配列番号１３と少なくとも６７％のアミノ酸同一性又は配列番号１３と少なくとも８３％のアミノ酸同一性をもつポリペプチドを含むＰＡＲ１リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号１３と多くとも５０％のアミノ酸同一性、配列番号１３と多くとも６７％のアミノ酸同一性、配列番号１３と多くとも８３％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むＰＡＲ１リガンドドメインをコードする。
【０１６６】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号１３との関係において例えば多くとも１、２、３又は４個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＰＡＲ１リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号１３との関係において例えば少なくとも１、２、３又は４個の非隣接アミノ酸置換をもつポリペプチドを含むＰＡＲ１リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号１３との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＰＡＲ１リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号１３との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＰＡＲ１リガンドドメインをコードする。この実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号１３との関係において例えば多くとも１、２又は３個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＰＡＲ１リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号１３との関係において例えば少なくとも１、２又は３個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＰＡＲ１リガンドドメインをコードする。
【０１６７】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号１３との関係において例えば多くとも２、３又は４個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＰＡＲ１リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号１３との関係において例えば少なくとも２、３又は４個の隣接アミノ酸置換をもつポリペプチドを含むＰＡＲ１リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号１３との関係において例えば多くとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＰＡＲ１リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号１３との関係において例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＰＡＲ１リガンドドメインをコードする。この実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号１３との関係において例えば多くとも２又は３個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＰＡＲ１リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号１３との関係において例えば少なくとも２又は３個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＰＡＲ１リガンドドメインをコードする。
【０１６８】
さらにもう１つの実施形態においては、ポリヌクレオチド分子は、ＰＡＲ２リガンドドメインを含むＰＡＲリガンドドメインをコードする。この実施形態の１態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２４を含むＰＡＲ２リガンドドメインをコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えばＰＡＲ２リガンドドメインイソ型又はＰＡＲ２リガンドドメインサブタイプといった天然発生のＰＡＲ２リガンドドメイン変異体を含むＰＡＲ２リガンドドメインをコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号２４のＰＡＲ２リガンドドメインイソ型又は配列番号２４のＰＡＲ２リガンドドメインサブタイプといったような配列番号２４の天然発生のＰＡＲ２リガンドドメイン変異体を含むＰＡＲ２リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば保存的ＰＡＲ２リガンドドメイン変異体、非保存的ＰＡＲ２リガンドドメイン変異体又はＰＡＲ２リガンドドメインペプチドミメティックス又はその任意の組み合わせといったような非天然発生のＰＡＲ２リガンドドメイン変異体を含むＰＡＲ２リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号２４の保存的ＰＡＲ２リガンドドメイン変異体、配列番号２４の非保存的ＰＡＲ２リガンドドメイン変異体又は配列番号２４のＰＡＲ２リガンドドメインペプチドミメティックス又はその任意の組み合わせといったような配列番号２４の非天然発生のＰＡＲ２リガンドドメイン変異体を含むＰＡＲ２リガンドドメインをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は配列番号２４又は配列番号２５を含むＰＡＲ２リガンドドメインをコードする。
【０１６９】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号２４と少なくとも５０％のアミノ酸同一性、配列番号２４と少なくとも６７％のアミノ酸同一性又は配列番号２４と少なくとも８３％のアミノ酸同一性をもつポリペプチドを含むＰＡＲ２リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号２４と多くとも５０％のアミノ酸同一性、配列番号２４と多くとも６７％のアミノ酸同一性、配列番号２４と多くとも８３％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むＰＡＲ２リガンドドメインをコードする。
【０１７０】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２４との関係において例えば多くとも１、２、３、又は４個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＰＡＲ２リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２４との関係において例えば少なくとも１、２、３又は４個の非隣接アミノ酸置換をもつポリペプチドを含むＰＡＲ２リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２４との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＰＡＲ２リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２４との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＰＡＲ２リガンドドメインをコードする。この実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２４との関係において例えば多くとも１、２又は３個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＰＡＲ２リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２４との関係において例えば少なくとも１、２又は３個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＰＡＲ２リガンドドメインをコードする。
【０１７１】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２４との関係において例えば多くとも２、３、又は４個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＰＡＲ２リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２４との関係において例えば少なくとも２、３又は４個の隣接アミノ酸置換をもつポリペプチドを含むＰＡＲ２リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２４との関係において例えば多くとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＰＡＲ２リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２４との関係において例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＰＡＲ２リガンドドメインをコードする。この実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２４との関係において例えば多くとも２又は３個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＰＡＲ２リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２４との関係において例えば少なくとも２又は３個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＰＡＲ２リガンドドメインをコードする。
【０１７２】
さらにもう１つの実施形態においては、ポリヌクレオチド分子は、ＰＡＲ３リガンドドメインを含むＰＡＲリガンドドメインをコードする。この実施形態の１態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２６を含むＰＡＲ３リガンドドメインをコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えばＰＡＲ３リガンドドメインイソ型又はＰＡＲ３リガンドドメインサブタイプといった天然発生のＰＡＲ３リガンドドメイン変異体を含むＰＡＲ３リガンドドメインをコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号２６のＰＡＲ３リガンドドメインイソ型又は配列番号２６のＰＡＲ３リガンドドメインサブタイプといったような配列番号２６の天然発生のＰＡＲ３リガンドドメイン変異体を含むＰＡＲ３リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば保存的ＰＡＲ３リガンドドメイン変異体、非保存的ＰＡＲ３リガンドドメイン変異体又はＰＡＲ３リガンドドメインペプチドミメティックス又はその任意の組み合わせといったような非天然発生のＰＡＲ３リガンドドメイン変異体を含むＰＡＲ３リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号２６の保存的ＰＡＲ３リガンドドメイン変異体、配列番号２６の非保存的ＰＡＲ３リガンドドメイン変異体又は配列番号２６のＰＡＲ３リガンドドメインペプチドミメティックス又はその任意の組み合わせといったような配列番号２６の非天然発生のＰＡＲ３リガンドドメイン変異体を含むＰＡＲ３リガンドドメインをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は配列番号２６又は配列番号２７を含むＰＡＲ３リガンドドメインをコードする。
【０１７３】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号２６と少なくとも５０％のアミノ酸同一性、配列番号２６と少なくとも６７％のアミノ酸同一性又は配列番号２６と少なくとも８３％のアミノ酸同一性をもつポリペプチドを含むＰＡＲ３リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号２６と多くとも５０％のアミノ酸同一性、配列番号２６と多くとも６７％のアミノ酸同一性、配列番号２６と多くとも８３％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むＰＡＲ３リガンドドメインをコードする。
【０１７４】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２６との関係において例えば多くとも１、２、３、又は４個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＰＡＲ３リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２６との関係において例えば少なくとも１、２、３又は４個の非隣接アミノ酸置換をもつポリペプチドを含むＰＡＲ３リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２６との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＰＡＲ３リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２６との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＰＡＲ３リガンドドメインをコードする。この実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２６との関係において例えば多くとも１、２又は３個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＰＡＲ３リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２６との関係において例えば少なくとも１、２又は３個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＰＡＲ３リガンドドメインをコードする。
【０１７５】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２６との関係において例えば多くとも２、３、又は４個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＰＡＲ３リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２６との関係において例えば少なくとも２、３又は４個の隣接アミノ酸置換をもつポリペプチドを含むＰＡＲ３リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２６との関係において例えば多くとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＰＡＲ３リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２６との関係において例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＰＡＲ３リガンドドメインをコードする。この実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２６との関係において例えば多くとも２又は３個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＰＡＲ３リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２６との関係において例えば少なくとも２又は３個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＰＡＲ３リガンドドメインをコードする。
【０１７６】
さらにもう１つの実施形態においては、ポリヌクレオチド分子は、ＰＡＲ４リガンドドメインを含むＰＡＲリガンドドメインをコードする。この実施形態の１態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２８を含むＰＡＲ４リガンドドメインをコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えばＰＡＲ４リガンドドメインイソ型又はＰＡＲ４リガンドドメインサブタイプといった天然発生のＰＡＲ４リガンドドメイン変異体を含むＰＡＲ４リガンドドメインをコードする。本実施形態のもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号２８のＰＡＲ４リガンドドメインイソ型又は配列番号２８のＰＡＲ４リガンドドメインサブタイプといったような配列番号２８の天然発生のＰＡＲ４リガンドドメイン変異体を含むＰＡＲ４リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば保存的ＰＡＲ４リガンドドメイン変異体、非保存的ＰＡＲ４リガンドドメイン変異体又はＰＡＲ４リガンドドメインペプチドミメティックス又はその任意の組み合わせといったような非天然発生のＰＡＲ４リガンドドメイン変異体を含むＰＡＲ４リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにもう１つの態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号２８の保存的ＰＡＲ４リガンドドメイン変異体、配列番号２８の非保存的ＰＡＲ４リガンドドメイン変異体又は配列番号２８のＰＡＲ４リガンドドメインペプチドミメティックス又はその任意の組み合わせといったような配列番号２８の非天然発生のＰＡＲ４リガンドドメイン変異体を含むＰＡＲ４リガンドドメインをコードする。本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６又は配列番号４７を含むＰＡＲ４リガンドドメインをコードする。
【０１７７】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号２８と少なくとも５０％のアミノ酸同一性、配列番号２８と少なくとも６７％のアミノ酸同一性又は配列番号２８と少なくとも８３％のアミノ酸同一性をもつポリペプチドを含むＰＡＲ４リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、例えば配列番号２８と多くとも５０％のアミノ酸同一性、配列番号２８と多くとも６７％のアミノ酸同一性、配列番号２８と多くとも８３％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むＰＡＲ４リガンドドメインをコードする。
【０１７８】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２８との関係において例えば多くとも１、２、３、又は４個の非隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＰＡＲ４リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２８との関係において例えば少なくとも１、２、３又は４個の非隣接アミノ酸置換をもつポリペプチドを含むＰＡＲ４リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２８との関係において例えば多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＰＡＲ４リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２８との関係において例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の非隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＰＡＲ４リガンドドメインをコードする。この実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２８との関係において例えば多くとも１、２又は３個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＰＡＲ４リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２８との関係において例えば少なくとも１、２又は３個の非隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＰＡＲ４リガンドドメインをコードする。
【０１７９】
本実施形態のその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２８との関係において例えば多くとも２、３、又は４個の隣接アミノ酸置換を有するポリペプチドを含むＰＡＲ４リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２８との関係において例えば少なくとも２、３又は４個の隣接アミノ酸置換をもつポリペプチドを含むＰＡＲ４リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２８との関係において例えば多くとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＰＡＲ４リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２８との関係において例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の隣接アミノ酸付加を有するポリペプチドを含むＰＡＲ４リガンドドメインをコードする。この実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２８との関係において例えば多くとも２又は３個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＰＡＲ４リガンドドメインをコードする。本実施形態のさらにその他の態様においては、ポリヌクレオチド分子は、配列番号２８との関係において例えば少なくとも２又は３個の隣接アミノ酸欠失を有するポリペプチドを含むＰＡＲ４リガンドドメインをコードする。
【０１８０】
さらにもう１つの実施形態においては、本明細書中で開示されている修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子はさらに、フレキシブルスペーサを含むフレキシブル領域をコードするポリヌクレオチド分子を含むことができる。もう１つの実施形態においては、本明細書中で開示されている修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子はさらに、縦一列に複数のフレキシブルスペーサを含むフレキシブル領域をコードするポリヌクレオチド分子を含むことができる。本実施形態の態様では、フレキシブル領域をコードするポリヌクレオチド分子は、縦一列に例えば少なくとも１個のＧ−スペーサ、少なくとも２個のＧ−スペーサ、少なくとも３個のＧ−スペーサ、少なくとも４個のＧ−スペーサ又は少なくとも５個のＧ−スペーサを含み得る。本実施形態のその他の態様においては、フレキシブル領域をコードするポリヌクレオチド分子は、縦一列に、例えば多くとも１個のＧ−スペーサ、多くとも２個のＧ−スペーサ、多くとも３個のＧ−スペーサ、多くとも４個のＧ−スペーサ又は多くとも５個のＧ−スペーサを含み得る。本実施形態のさらにその他の態様においては、フレキシブル領域をコードするポリヌクレオチド分子は、縦一列に、例えば少なくとも１個のＡ−スペーサ、少なくとも２個のＡ−スペーサ、少なくとも３個のＡ−スペーサ、少なくとも４個のＡ−スペーサ又は少なくとも５個のＡ−スペーサを含み得る。本実施形態のさらにその他の態様では、フレキシブル領域をコードするポリヌクレオチド分子は、縦一列に、例えば多くとも１個のＡ−スペーサ、多くとも２個のＡ−スペーサ、多くとも３個のＡ−スペーサ、多くとも４個のＡ−スペーサ又は多くとも５個のＡ−スペーサを含み得る。本実施形態のもう１つの態様においては、修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子は、同じフレキシブルスペーサの１つ以上のコピー、異なるフレキシブルスペーサ領域の１つ以上のコピー又はその任意の組み合わせを含むフレキシブル領域をコードするポリヌクレオチド分子を含むことができる。
【０１８１】
さらにもう１つの実施形態においては、本明細書中で開示されている修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子はさらに、エピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子を含むことができる。もう１つの実施形態においては、本明細書中で開示されている修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子はさらに、複数のエピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子を含むことができる。本実施形態の態様では、修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子は、例えばエピトープ結合領域をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド分子、エピトープ結合領域をコードする少なくとも２つのポリヌクレオチド分子、エピトープ結合領域をコードする少なくとも３つのポリヌクレオチド分子、エピトープ結合領域をコードする少なくとも４つのポリヌクレオチド分子又はエピトープ結合領域をコードする少なくとも５つのポリヌクレオチド分子を含み得る。本実施形態のその他の態様においては修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子は、例えばエピトープ結合領域をコードする多くとも１つのポリヌクレオチド分子、エピトープ結合領域をコードする多くとも２つのポリヌクレオチド分子、エピトープ結合領域をコードする多くとも３つのポリヌクレオチド分子、エピトープ結合領域をコードする多くとも４つのポリヌクレオチド分子又はエピトープ結合領域をコードする多くとも５つのポリヌクレオチド分子を含み得る。本実施形態のもう１つの態様においては、修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子は、エピトープ結合領域をコードする同じポリヌクレオチド分子の１つ以上のコピー、エピトープ結合領域をコードする異なるポリヌクレオチド分子の１つ以上のコピー、又はその任意の組み合わせを含むことができる。エピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子の場所は、制限的意味無く、修飾クロストリジウム毒素のアミノ末端、修飾クロストリジウム毒素内部、又は修飾クロストリジウム毒素のカルボキシル末端を含めたさまざまな位置にあり得る。
【０１８２】
さらにもう１つの実施形態においては、本明細書中で開示されている修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子はさらに、外因性プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子を含むことができる。もう１つの実施形態においては、本明細書中で開示されている修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子はさらに、外因性プロテアーゼ切断部位をコードする複数のポリヌクレオチド分子を含むことができる。本実施形態の態様においては、修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子は、例えば外因性プロテアーゼ切断部位をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド分子、外因性プロテアーゼ切断部位をコードする少なくとも２つのポリヌクレオチド分子、外因性プロテアーゼ切断部位をコードする少なくとも３つのポリヌクレオチド分子、外因性プロテアーゼ切断部位をコードする少なくとも４つのポリヌクレオチド分子又は外因性プロテアーゼ切断部位をコードする少なくとも５つのポリヌクレオチド分子を含み得る。本実施形態のその他の態様においては、修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子は、例えば外因性プロテアーゼ切断部位をコードする多くとも１つのポリヌクレオチド分子、外因性プロテアーゼ切断部位をコードする多くとも２つのポリヌクレオチド分子、外因性プロテアーゼ切断部位をコードする多くとも３つのポリヌクレオチド分子、外因性プロテアーゼ切断部位をコードする多くとも４つのポリヌクレオチド分子又は外因性プロテアーゼ切断部位をコードする多くとも５つのポリヌクレオチド分子を含み得る。本実施形態のもう１つの態様においては、修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子は、同じ外因性プロテアーゼ切断部位の１つ以上のコピー、異なる外因性プロテアーゼ切断部位の１つ以上のコピー又はその任意の組み合わせを含むことができる。
【０１８３】
さらにもう１つの実施形態においては、外因性プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、エピトープ結合ペプチドをコードするポリヌクレオチド分子と修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子の間に位置設定される。本実施形態のその他の態様においては、ウシエンテロキナーゼ分割部位をコードするポリヌクレオチド分子が、エピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子と修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子の間に位置設定されるか、タバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、エピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子と修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子の間に位置設定されるか、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子がエピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子と修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子の間に位置設定されるか、ＳＵＭＯ／ＵＬＰ−１プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子がエピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子と修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子の間に位置設定されるか、トロンビンプロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子がエピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子と修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子の間に位置設定されるか、又は凝固第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子がエピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子と修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子の間に位置設定される。該実施形態のその他の態様においては、配列番号５０のウシエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、エピトープ結合領域をコードするポリヌクレオシチド分子と修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子の間に位置設定されている。該実施形態のその他の態様においては、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９又は配列番号６０のタバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、エピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子と修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子の間に位置設定される。該実施形態のさらにその他の態様においては、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５又は配列番号６６のヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子がエピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子と修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子の間に位置設定されている。該実施形態のさらにその他の形態においては、配列番号６７のＳＵＭＯ／ＵＬＰ−１プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、エピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子と修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子の間に位置設定されている。該実施形態のさらにその他の形態においては、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１又は配列番号８２のトロンビンプロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、エピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子と修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子の間に位置設定されている。該実施形態のその他の態様においては、配列番号８３又は配列番号８４の凝固第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、エピトープ結合領域をコードするポリヌクレオチド分子と修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子の間に位置設定されている。
【０１８４】
さらにもう１つの実施形態においては、外因性プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、修飾クロストリジウム毒素の２鎖ループをコードするポリヌクレオチド分子の内部に位置設定されている。本実施形態の態様においては、ウシエンテロキナーゼ分割部位をコードするポリヌクレオチド分子が、修飾クロストリジウム毒素の２鎖ループをコードするポリヌクレオチド分子の内部に位置設定されているか、タバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が修飾クロストリジウム毒素の２鎖ループをコードするポリヌクレオチド分子の内部に位置設定されているか、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が修飾クロストリジウム毒素の２鎖ループをコードするポリヌクレオチド分子の内部に位置設定されているか、ＳＵＭＯ／ＵＬＰ−１プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が修飾クロストリジウム毒素の２鎖ループをコードするポリヌクレオチド分子の内部に位置設定されているか、トロンビンプロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が修飾クロストリジウム毒素の２鎖ループをコードするポリヌクレオチド分子の内部に位置設定されているか、又は凝固第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が修飾クロストリジウム毒素の２鎖ループをコードするポリヌクレオチド分子の内部に位置設定されている。該実施形態のその他の態様においては、配列番号５０のウシエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、修飾クロストリジウム毒素の２鎖ループをコードするポリヌクレオチド分子の内部に位置設定されている。該実施形態のその他の態様においては、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９又は配列番号６０のタバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、修飾クロストリジウム毒素の２鎖ループをコードするポリヌクレオチド分子の内部に位置設定されている。該実施形態のさらにその他の形態においては、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５又は配列番号６６のヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、修飾クロストリジウム毒素の２鎖ループをコードするポリヌクレオチド分子の内部に位置設定されている。該実施形態のさらにその他の形態においては、配列番号６７のＳＵＭＯ／ＵＬＰ−１プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が、修飾クロストリジウム毒素の２鎖ループをコードするポリヌクレオチド分子の内部に位置設定されている。該実施形態のさらにその他の形態においては、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１又は配列番号８２のトロンビンプロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が修飾クロストリジウム毒素の２鎖ループをコードするポリヌクレオチド分子の内部に位置設定されている。本実施形態のその他の態様においては、配列番号８３又は配列番号８４の凝固第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子が修飾クロストリジウム毒素の２鎖ループをコードするポリヌクレオチド分子の内部に位置設定されている。
【０１８５】
本発明のもう１つの態様は、ＰＡＲリガンドドメイン；クロストリジウム毒素酵素ドメイン；クロストリジウム毒素転移ドメイン；及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含む修飾クロストリジウム毒素の産生方法において、細胞内で修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を発現させるステップを含む方法を提供している。本発明のもう１つの態様は、ＰＡＲリガンドドメイン；クロストリジウム毒素酵素ドメイン；クロストリジウム毒素転移ドメイン及びクロストリジウム毒素結合ドメインを含む修飾クロストリジウム毒素の産生方法において、細胞内に修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を含む発現構成体を導入し、その細胞内で発現構成体を発現させるステップを含む方法を提供している。
【０１８６】
本明細書中で開示されている方法には、一部、クロストリジウム毒素が含まれている。本明細書中に開示されている任意の及び全てのクロストリジウム毒素が、本明細書中に開示されている方法を用いて産生可能であるということが予測されている。かくして、この実施形態の態様は、これに制限されないが、天然発生のクロストリジウム毒素、例えばクロストリジウム毒素イソ型及びクロストリジウム毒素サブタイプ、といったような天然発生のクロストリジウム毒素変異体、例えば保存的クロストリジウム毒素変異体、非保存的クロストリジウム毒素変異体及びそのクロストリジウム毒素フラグメントといったような非天然発生のクロストリジウム毒素変異体、又はそれらの任意の組み合わせを産生するステップを含む。
【０１８７】
本明細書中で開示されている方法には、一部、ＰＡＲ結合ドメインが含まれている。本明細書中に開示されている任意の及び全てのＰＡＲ結合ドメインが、本明細書中に開示されている方法を用いて産生可能であるということが予測されている。かくして、この実施形態の態様は、これに制限されないが、天然発生のＰＡＲ結合ドメイン、例えばＰＡＲ結合ドメインイソ型及びＰＡＲ結合ドメインサブタイプ、といったような天然発生のＰＡＲ結合ドメイン変異体、例えば保存的ＰＡＲ結合ドメイン変異体、非保存的ＰＡＲ結合ドメイン変異体及びそのＰＡＲ結合ドメインフラグメントといったような非天然発生のＰＡＲ結合ドメイン変異体、又はそれらの任意の組み合わせを産生するステップを含む。
【０１８８】
本明細書中で開示されている方法は、一部には、ポリヌクレオチド分子を含む。本明細書中で開示されている任意の及び全てのポリヌクレオチド分子が使用可能であると予測される。かくして、本実施形態の態様は、これに制限されないが、天然発生のクロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子；クロストリジウム毒素イソ型及びクロストリジウム毒素サブタイプといったような天然発生のクロストリジウム毒素変異体をコードするポリヌクレオチド分子；例えば保存的クロストリジウム毒素変異体、非保存的クロストリジウム毒素変異体及びそれらのクロストリジウム毒素フラグメントといったような非天然発生のクロストリジウム毒素変異体をコードするポリヌクレオチド分子、又はそれらの組み合わせを含む。
【０１８９】
本明細書中で開示されている方法は、一部には発現構成体を含む。発現構成体は、細胞又は無細胞抽出物の中でそのポリヌクレオチド分子を発現させるために有用な発現ベクターに対して作動的に連結された本明細書中に開示されているポリヌクレオチド分子を含んでいる。制限的意味無く、ウイルス発現ベクター；原核生物発現ベクター；真核生物発現ベクター例えば酵母発現ベクター、昆虫発現ベクター及び哺乳動物発現ベクター；及び無細胞抽出物発現ベクターを含め、多様な発現ベクターを、修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を発現するために利用することができる。さらに、これらの方法の態様を実践するのに有用な発現ベクターが、構成性、組織特異的、細胞特異的又は誘発性プロモータ要素、エンハンサ要素又はその両方の制御下で修飾クロストリジウム毒素を発現するものを内含し得るということがさらに理解される。かかる発現ベクターからの発現構成体を作製し使用するための充分立証済みの試薬及び条件と併せて、発現ベクターの制限的意味のない例が、制限的意味無くＢＤバイオサイエンシーズ・クローンテック、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、カリフォルニア州；ＢＤバイオサイエンシーズ・ファーミゲン、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州；インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州；ＥＭＤバイオサイエンシーズ・ノバゲン（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州：キアゲン、Ｖａｌｅｎｃｉａ、カリフォルニア州；及びストラタジーン、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州を含むサプライヤから容易に入手可能である。適切な発現ベクターの選択、作製及び使用は、本書中の教示からのそして当業者の技能範囲内に充分入る日常的手順である。
【０１９０】
かくして、本実施形態の態様は、これに制限されないが、修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子に対し作動的に連結されたウイルス発現ベクター；修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子に対し作動的に連結された原核生物発現ベクター；修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子に対し作動的に連結された酵母発現ベクター；修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子に対し作動的に連結された昆虫発現ベクター；及び修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子に対し作動的に連結された哺乳動物発現ベクターを含む。本実施形態のその他の態様は、制限的意味無く、修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子に対し作動的に連結された無細胞抽出物発現ベクターを含む無細胞抽出物を用いて本明細書中で開示された修飾クロストリジウム毒素を発現するのに適した発現構成体を含んでいる。本実施形態のその他の態様は、制限的意味無く、配列番号１０９から配列番号１３２及び配列番号１３６から配列番号１５９までのいずれか１つを含むポリヌクレオチド分子を含む発現構成を含んでいる。本実施形態のその他の態様は、配列番号８５から配列番号１０８までのいずれか１つを含む修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を含む発現構成を含んでいる。
【０１９１】
本明細書に開示されている方法は、一部には細胞を含んでいる。任意の及び全ての細胞が使用可能であると予測される。かくして、本実施形態の態様は、制限的意味無く、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、リケニホルミス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クロトリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロトリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、カウロバクター・クレセンテス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、メタノール資化性菌（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、ナイセリア・メニンギラル（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｒｕｌｌｓ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）及びネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；から誘導されたものといったような好気性、微好気性、好二酸化炭素性（ｃａｐｎｏｐｈｉｌｉｃ）、通性、嫌気性、グラム陽性及びグラム陰性細菌細胞の菌株を制限的意味無く含む原核細胞；及び、例えばメタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、メチロトロフ酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びアルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）；から誘導されたものといった酵母菌株を制限的意味無く含む真核細胞；例えばヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）及びタバコスズメガ（Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ）；から誘導されたものといったような昆虫から誘導された昆虫細胞及び細胞系統；及び例えばマウス、ラット、ハムスター、ブタ、ウシ、ウマ、霊長類及びヒトから誘導されたものといった哺乳動物細胞から誘導された哺乳動物細胞及び細胞系統を含む。細胞系統は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（２００４年）、ＵＲＬアドレス、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ；欧州細胞培養コレクション（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（２２０４年）、ＵＲＬアドレスｗｗｗ．ｅｃａｃｃ．ｏｒｇ．ｕｋ；及びドイツ微生物及び細胞培養コレクション（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（２００４年）、ＵＲＬアドレスｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ．から入手可能である。適切な細胞系統を選択、作製及び使用するための特定のプロトコルの制限的意味のない例が、例えば「Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」（マテウス・Ｆ・Ａ・グーセン（Ｍａｔｔｈｅｕｓ  Ｆ．Ａ．Ｇｏｏｓｅｎ）ら編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、１９９３年）；「Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｓｐｅｃｔｓ」（Ｊ．Ｍ．ヴラク（Ｖｌａｋ）ら編、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９６年）；モーリーン・Ａ・ハリソン（Ｍａｕｒｅｅｎ  Ａ．  Ｈａｒｒｉｓｏｎ）及びイアン・Ｆ・レイ（Ｉａｎ  Ｆ．Ｒａｅ）、「Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７年）；「Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ」（アラン・ドイル（Ａｌａｎ  Ｄｏｙｌｅ）ら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９８年）；Ｒ．イアン・フレシネー（Ｉａｎ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）、「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、第４版、２０００年）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（ジョン・Ｒ・Ｗ・マスターズ（Ｊｏｈｎ  Ｒ．Ｗ．Ｍａｓｔｅｒｓ）編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、第３版、２０００年）；「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、上掲書、（２００１年）；「Ｂａｓｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（ジョン・Ｍ・デービス（Ｊｏｈｎ  Ｍ．Ｄａｖｉｓ）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、２００２年）；及び「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、上掲書、（２００４年）の中で記載されている。これらのプロトコルは、本書中の教示からの及び当業者の技能範囲内の日常的手順である。
【０１９２】
本明細書で開示されている方法は、一部には、ポリヌクレオチド分子を細胞内に導入するステップを含む。細胞中に導入されるポリヌクレオチド分子はその細胞により過渡的に又は安定した形で維持され得る。安定した形で維持されたポリヌクレオチド分子は、染色体外のもので、自己複製でき、そうでなければ、細胞の染色体材料内に組込まれ、非自己複製し得る。本明細書内で開示されているポリヌクレオチド分子を細胞内に導入するための任意の及び全ての方法が使用可能であると予測されている。細胞内に核酸分子を導入するために有用な方法には、制限的意味無く、例えば、リン酸カルシウム媒介型、ジエチル−アミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストラン媒介型、脂質媒介型、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介型、ポリリジン媒介型及びポリブレン媒介型といったような化学的媒介型トランスフェクション；例えば、バイオリスティック粒子送達、マイクロインジェクジョン、原形質融合及び電気穿孔といったような物理的媒介型トランスフェクション；及び例えばレトロウイルス媒介型トランスフェクションといったようなウイルス媒介型トランスフェクションが含まれる。例えば、「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎｔｏ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」、１６．１−１６．６２頁（サンブルック及びラッセル編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３巻、第３版、２００１年）を参照のこと。当業者であれば、細胞内に発現構成体を導入するための特異的方法の選択が一部には、その細胞が発現構成を過渡的に含有することになるのか又はその細胞が発現構成を安定した形で含有することになるのかによって左右されることになる。これらのプロトコルは、本書中の教示からの及び当業者の技能範囲内の日常的手順である。
【０１９３】
本実施形態の１態様においては、トランスフェクションと呼ばれる化学的媒介型方法が、細胞内に修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を導入するために使用される。トランスフェクションの化学的媒介型方法においては、化学的試薬は、細胞内へのその摂取を容易にする核酸と複合体を形成する。かかる化学的試薬としては、これに制限されないが、リン酸カルシウム媒介型（例えばマーチン・ジョーダン（Ｍａｒｔｉｎ  Ｊｏｒｄａｎ）及びフロリアン・ウォーム（Ｆｌｏｒｉａｎ  Ｗｏｒｍ）、「Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｈｅｒｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ」、第３３（２）号、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１３６−１４３頁、（２００４年）；を参照）；ジエチル−アミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストラン媒介型、脂質媒介型、カチオン重合体媒介型、例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介型及びポリリジン媒介型及びポリブレン媒介型（例えばチャン・ツァン（Ｃｈｕｎ  Ｚｈａｎｇ）ら、「Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ」、第３３（２）号、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１４４−１５０頁、（２００４年）を参照）が含まれる。かかる化学的媒介型送達系は、標準的方法によって調製され得、市販されている。例えばＣｅｌｌＰｈｅｃｔトランスフェクションキット（アマーシャム・バイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージ州）；哺乳動物トランスフェクションキット、リン酸カルシウム及びＤＥＡＥデキストラン、（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．）、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）；  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ(商標）トランスフェクション試薬（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）；  ＥｘＧｅｎ  ５００  トランスフェクションキット（フェルメンタス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．）、Ｈａｎｏｖｅｒ、メリーランド州）、及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔ及びＥｆｆｅｃｔｅｎｅ  トランスフェクションキット（キアゲン、Ｖａｌｅｎｃｉａ、カリフォルニア州）を参照のこと。
【０１９４】
本実施形態のもう１つの態様においては、修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を細胞内に導入するために、物理的媒介型方法が使用される。物理的技術には、これに制限されないが、電気穿孔法、バイオリスティック及びマイクロインジェクションが含まれる。バイオリスティック及びマイクロインジェクション技術は、細胞内に核酸分子を導入するために細胞壁に穴を開ける。例えばジェイク・Ｅ・ビウェンガ（Ｊｅｉｋｅ  Ｅ．Ｂｉｅｗｅｎｇａ）ら、「Ｐｌａｓｍｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、第７１（１）号、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、６７−７５頁、（１９９７年）；及びジョン・オーブリアン（Ｊｏｈｎ  Ｏ’Ｂｒｉｅｎ）及びサラ・Ｃ・Ｒ・ラミンズ）（Ｓａｒａｈ  Ｃ．Ｒ．Ｌｕｍｍｉｓ）、「Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｄｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ：  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｇｕｎ  ｔｏ  ｄｅｌｉｖｅｒ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｄｙｅｓ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ」、第３３（２）号、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１２１−１２５頁、（２００４年）を参照のこと。電気透過化とも呼ばれる電気穿孔法は、核酸分子が進入するのに通る過渡的気孔を膜内に作り出すべく短かい高圧電気パルスを用い、全ての細胞型の安定した及び過渡的なトランスフェクションのために有効に使用可能である。例えばＭ．ゴルジオ（Ｇｏｌｚｉｏ）ら、「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ、ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ、ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、第３３（２）号、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１２６−１３５頁、（２００４年）；及びオリビエ・グレッシュ（Ｏｌｉｖｅｒ  Ｇｒｅｓｃｈ）ら、「Ｎｅｗ  ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌｓ」、第３３（２）号、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１５１−１６３頁、（２００４年）を参照のこと。
【０１９５】
この実施形態のもう１つの態様においては、形質導入と呼ばれるウイルス媒介型方法が、修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子を細胞内に導入するのに使用される。過渡的形質導入のウイルス媒介型方法においては、ウイルス粒子が宿主細胞に感染しその中で複製するプロセスは、核酸分子を細胞内に導入するべくこの機序を用いる目的で操作されてきた。これに制限されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ピコルナウイルス、アルファウイルス及びバキュロウイルスを含めたさまざまなウイルスから、ウイルス媒介型方法が開発されてきた。例えばアルミン・ブレッシュ（Ａｒｍｉｎ  Ｂｌｅｓｃｈ）、「Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ＭＬＶ  ｂａｓｅｄ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ」、第３３（２）号、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１６４−１７２頁、（２００４年）；及びマウリッツィオ・フェデリコ（Ｍａｕｒｉｚｉｏ  Ｆｅｄｅｒｉｃｏ）、「Ｆｒｏｍ  ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｅｓ  ｔｏ  ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ」、第２２９号、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３−１５頁、（２００３年）；  Ｅ．Ｍ．ポシュラ（Ｐｏｅｓｃｈｌａ）、「Ｎｏｎ−ｐｒｉｍａｔｅ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ」、第５（５）号、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、５２９−５４０頁、（２００３年）；カリム・ベニホード（Ｋａｒｉｍ  Ｂｅｎｉｈｏｕｄ）ら、「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、第１０（５）号、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４４０−４４７頁、（１９９９年）；Ｈ．ビューラー（Ｂｕｅｌｅｒ）、「Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ」、第３８０（６）号、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、６１３−６２２頁、（１９９９年）；チョイ・Ｍ・ライ（Ｃｈｏｏｉ  Ｍ．Ｌａｉ）ら、「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ」、第２１（１２）号、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、８９５−９１３頁、（２００２年）；エドワード・Ａ・バートン（Ｅｄｗａｒｄ  Ａ．Ｂｕｒｔｏｎ）ら、「Ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ」、第２１（１２）号、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、９１５−９３６頁、（２００２年）；パオラ・グランディ（Ｐａｏｌａ  Ｇｒａｎｄｉ）ら、「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＨＳＶ  ａｍｐｌｉｃｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ」、第３３（２）号、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１７９−１８６頁、（２００４年）；イリヤ・フロロフ（Ｉｌｙａ  Ｆｒｏｌｏｖ）ら、「Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、第９３（２１）号、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１１３７１−１１３７７頁、（１９９６年）；マーカス・Ｕ・エイレングルバー（Ｍａｒｋｕｓ  Ｕ．Ｅｈｒｅｎｇｒｕｂｅｒ）、「Ａｌｐｈ��ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第５９（１）号、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．、１３−２２頁、（２００２年）；トーマス・Ａ・コスト（Ｔｈｏｍａｓ  Ａ．Ｋｏｓｔ）及びＪ・パトリック・コンドレイ（Ｐａｔｒｉｃｋ  Ｃｏｎｄｒｅａｙ）、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｅ−ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ」、第２０（４）号、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７３−１８０頁、（２００２年）；及びＡ・ハウザー（Ｈｕｓｅｒ）及びＣ・ホフマン（Ｈｏｆｍａｎｎ）、「Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ｎｏｖｅｌ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｅ−ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、第３（１）号、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ、５３−６３頁、（２００３年）を参照のこと。
【０１９６】
エンベロープをもたない２本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスは、約３６ｋｂの比較的大きなポリヌクレオチド分子を扱かい、高力価で産生されかつさまざまな分裂及び非分裂の両方の細胞に効率良く感染し得ることから、哺乳動物細胞形質導入のために選択されることが多い。例えば、ウィム（Ｗｉｍ）Ｔ．Ｊ．  Ｍ．Ｃ．ハーメンス（Ｈｅｒｍｅｎｓ）ら、「Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｎｄ  ｇｌｉａ：ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＣＮＳ  ａｎｄ  ＰＮＳ」、第７１（１）号、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、８５−９８頁、（１９９７年）；及び、ヒロユキ・ミズグチ（Ｈｉｒｏｙｕｋｉ  Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ）ら、「Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ」、第５２（３）号、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、１６５−１７６頁、（２００１年）を参照のこと。アデノウイルスベースの系を用いた形質導入は、核酸分子が宿主染色体内に組込まれるのではなくむしろ細胞核内のエピソームから運ばれることから、長時間のタンパク質発現を支援しない。アデノウイルスベクター系及びかかるベクターをいかに用いるかについての特定的なプロトコルは、例えばＶｉｒａＰｏｗｅｒ(商標）、アデノウイルス発現系（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）及びＶｉｒａＰｏｗｅｒ(商標）、アデノウイルス発現系取扱説明書、２５〜０５４３、バージョンＡ、インビトロジェン、（２００２年７月１５日）；及びＡｄＥａｓｙ(商標）、アデノウイルスベクター系（ストラタジーン、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）及びＡｄＥａｓｙ(商標）、アデノウイルスベクター系、取扱説明書０６４００４ｆ、ストラタジーン社の中で開示されている。
【０１９７】
核酸分子送達は同様に、例えばオンコレトロウイルス及びレンチウイルスといったような１本鎖ＲＮＡレトロウイルスをも使用することができる。レトロウイルス媒介型形質導入は往々にして１００％に近い形質導入効率を生み出し、多数の感染（ＭＯＩ）を変動させることによりプロウイルスコピー数を容易に制御でき、過渡的又は安定した形のいずれかで細胞を形質導入するために使用可能である。例えばティジアナ・トニーニ（Ｔｉｚｉａｎａ  Ｔｏｎｉｎｉ）ら、「Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ−  ａｎｄ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ−ｂａｓｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ」、第２８５号、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４１−１４８頁、（２００４年）；  アルミン・ブレッシュ（Ａｒｍｉｎ  Ｂｌｅｓｃｈ）、「Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ＭＬＶ  ｂａｓｅｄ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ」、第３３（２）号、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１６４−１７２頁（２００４年）；フェリックス・レシラス・タルガ（Ｆｅｌｉｘ  Ｒｅｃｉｌｌａｓ−Ｔａｒｇａ）、「Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ」、第２６７号、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４１７−４３３頁、（２００４年）；及びローランド・ウォルコヴィツ（Ｒｏｌａｎｄ  Ｗｏｌｋｏｗｉｃｚ）ら、「Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ」、第２４６号、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３９１−４１１頁、（２００４年）参照。レトロウイルス粒子は、脂質エンベロープにとり囲まれたタンパク質カプシドの中に詰め込まれたＲＮＡゲノムから成る。レトロウイルスは、逆転写酵素と共に細胞質内にそのＲＮＡを注入することにより宿主細胞を感染させる。ＲＮＡ鋳型はこのとき、宿主細胞ゲノム内へ組込むことで自らを複製する線状２本鎖ｃＤＮＡの中に逆転写される。ウイルス粒子は、垂直方向（プロウイルスを介して親細胞から娘細胞へ）ならびに水平方向（ビリオンを介して細胞から細胞へ）の両方向に拡がる。この複製戦略によると、問題の核酸分子が宿主細胞の染色体内に安定した形で組込まれかくしてタンパク質の長期発現が可能となることから、永続的な長期発現が可能になる。例えば、動物研究により、さまざまな組織内に注入されたレンチウイルスベクターが１年超の期間、持続的タンパク質発現を生み出すということが示されてきている。例えばルイジ・ナルジーニ（Ｌｕｉｇｉ  Ｎａｌｄｉｎｉ）ら、「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｄｉｖｉｄｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ」、第２７２（５２５９）号、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６３−２６７頁、（１９９６年）を参照のこと。例えばモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）といったようなオンコレトロウイルス由来のベクター系は広く使用され、数多くの異なる非分裂細胞を感染させる。分裂及び非分裂細胞を含め、レンチウイルスも又数多くの異なる細胞型を感染させることができ、きわめて特異的な細胞ターゲティングを可能にする複合外膜タンパク質を有する。
【０１９８】
レトロウイルスベクター及びかかるベクターをいかに使用するかについての特定的プロトコルは、例えば米国特許、マンフレッド・ゴッセン（Ｍａｎｆｒｅｄ  Ｇｏｓｓｅｎ）及びヘルマン・ブジャール（Ｈｅｒｍａｎｎ  Ｂｕｊａｒｄ）、「テトラサイクリン応答性プロモータによる真核細胞内遺伝子発現の厳格な管理」、米国特許第５，４６４，７５８号明細書（１９９５年１１月７日）並びにヘルマン・ブジャール及びマンフレッド・ゴッセン、「遺伝子発現を調節する方法」、米国特許第５，８１４，６１８号明細書（１９９８年９月２９日）デービッド・Ｓ・ホグネス（Ｄａｖｉｄ  Ｓ．Ｈｏｇｎｅｓｓ）、「昆虫ステロイドホルモンレセプターーポリペプチド及びそれによって形質転換された細胞をコードするポリヌクレオチド」、米国特許第５，５１４，５７８号明細書（１９９６年５月７日）及びデービッド・Ｓ・ホグネス、「昆虫エクジソンレセプターーをコードするポリペプチド」、米国特許第６，２４５，５３１号明細書（２００１年６月１２日）；エリザベッタ・ヴェジト（Ｅｌｉｓａｂｅｔｔａ  Ｖｅｇｅｔｏ）ら、「Ｃ末端ホルモン結合ドメイントランケーションを有するプロゲステロンレセプターー」、米国特許第５，３６４，７９１号明細書（１９９４年１１月１５日）、エリザベッタ・ヴェジトら、「突然変異型ステロイドホルモンレセプターー、その使用方法および遺伝子療法のための分子スイッチ」、米国特許第５，８７４，５３４号明細書（１９９９年２月２３日）及びエリザベッタ・ヴェジトら、「突然変異型ステロイドホルモンレセプターー、その使用方法および遺伝子療法のための分子スイッチ」、米国特許第５，９３５，９３４号明細書、（１９９９８月１０日）の中で開示されている。さらに、かかるウイルス送達系は、標準的方法により調製され、市販されている。例えばＢＤ（商標）Ｔｅｔ−Ｏｆｆ及びＴｅｔ−Ｏｎ遺伝子発現系（ＢＤバイオサイエンシーズ・クローンテック、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、カリフォルニア州）及びＢＤ（商標）Ｔｅｔ−Ｏｆｆ及びＴｅｔ−Ｏｎ遺伝子発現系利用の手引き、ＰＴ３００１−１、ＢＤバイオサイエンシーズ・クローンテック、（２００３年３月１４日）、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ（商標）システム（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）及びＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ（商標）システム、「哺乳動物細胞のためのミフェプリストン調節された発現系」バージョンＤ、２５−０３１３、インビトロジェン、（２００２年１１月４日）；ＶｉｒａＰｏｗｅｒ（商標）レンチウイルス発現系（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）及びＶｉｒａＰｏｗｅｒ（商標）レンチウイルス発現系取扱説明書２５−０５０１、バージョンＥ、インビトロジェン、（２００３年１２月８日）；及びＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（登録商標）、レトロウイルス誘発性哺乳動物発現系（ストラタジーン、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）及びＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（登録商標）レトロウイルス誘発性哺乳動物発現系取扱説明書、０６４００５ｅを参照のこと。
【０１９９】
本明細書で開示されている方法は、一部には、ポリヌクレオチド分子から修飾クロストリジウム毒素を発現させるステップを含む。これに制限されないが細胞ベースの系及び無細胞発現系を含め、本明細書中で開示されているポリヌクレオチド分子から修飾クロストリジウム毒素を発現するために、さまざまな発現系のうちの任意のものが有用であり得るということが予測されている。細胞ベースの系には、これに制限されないが、ウイルス発現系、原核生物発現系、酵母発現系、バキュロウイルス発現系、昆虫発現系及び哺乳動物発現系が含まれる。無細胞系統には、これに制限されないが、小麦麦芽抽出物、ウサギ網状赤血球抽出物及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抽出物が含まれ、これらは一般に本書中に開示されている方法と同等である。発現系を用いたポリヌクレオチド分子の発現は、これに制限されないが、誘発性発現、非誘発性発現、構成性発現、ウイルス媒介型発現、安定組込み型発現及び過渡的発現を含めた、さまざまな特徴のうちのいずれかを含み得る。充分に特徴づけされたベクター、試薬、条件、及び細胞を含む発現系は充分立証されており、これに制限されないがアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）Ａｕｓｔｉｎ、テキサス州；（ＢＤバイオサイエンシーズ・クローンテック、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、カリフォルニア州）；ＢＤバイオサイエンシーズ・ファーミゲン、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州；インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州；キアゲン、Ｖａｌｅｎｃｉａ、カリフォルニア州；  ロシュ・アプライド・サイエンス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、インディアナ州；及びストラタジーン、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州を含むサプライヤから容易に入手可能である。適切な異種発現系の選択及び使用についての制限的意味のない例は、例えば「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｓ・Ｊ・ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）及びＢ・デーヴィッド・ヘイムス（Ｄａｖｉｄ  Ｈａｍｅｓ）編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９年）；ジョセフ・Ｍ・フェルナンデス（Ｊｏｓｅｐｈ  Ｍ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ）及びジェームス・Ｐ・ホフラー（Ｊａｍｅｓ  Ｐ．Ｈｏｅｆｆｌｅｒ）、「ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＳＹＳＴＥＭＳ．Ｕｓｉｎｇ  Ｎａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｒｔ  ｏｆ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９年）；及びミーナ・ライ（Ｍｅｅｎａ  Ｒａｉ）及びハリッシュ・パッダ（Ｈａｒｉｓｈ  Ｐａｄｈ）、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、第８０（９）号、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１１２１−１１２８頁、（２００１年）の中で記載されている。これらのプロトコルは、本書中の教示からの及び当業者の技能範囲内に充分入る日常的手順である。
【０２００】
本明細書中で開示されているポリヌクレオチド分子によりコードされる修飾クロストリジウム毒素を発現するためには、さまざまな細胞ベースの発現手順が有用である。例として、これに制限されないが、ウイルス発現系、原核生物発現系、酵母発現系、バキュロウイルス発現系、昆虫発現系及び哺乳動物発現系が含まれていた。ウイルス発現系にはこれに制限されないがＶｉｒａＰｏｗｅｒ（商標）レンチウイルス（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、アデノウイルス発現系（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、ＡｄＥａｓｙ（商標）ＸＬアデノウイルスベクター系（ストラタジーン、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）及びＶｉｒａＰｏｒｔ（登録商標）レトロウイルス遺伝子発現系（ストラタジーン、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）が含まれる。原核生物発現系の制限的意味のない例としてはＣｈａｍｐｉｏｎ（商標）ｐＥＴ発現系（ＥＭＤバイオサイエンシーズ・ノバゲン、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）、ＴｒｉＥｘ（商標）細菌発現系（ＥＭＤバイオサイエンシーズ・ノバゲン、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）、ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）発現系（キアゲン）、及びＡｆｆｉｎｉｔｙ（登録商標）タンパク質発現及び精製システム（ストラタジーン、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）が含まれる。酵母発現系には、これに制限されないが、ＥａｓｙＳｅｌｅｃｔ（商標）ピキア発現キット（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、ＹＥＳ−Ｅｃｈｏ（商標）発現ベクターキット（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）及びＳｐＥＣＴＲＡ（商標）分裂酵母（ｓ．ｐｏｍｂｅ）発現系（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）が含まれる。バキュロウイルス発現系の制限的意味のない例としては、ＢａｃｕｌｏＤｉｒｅｃｔ（商標）（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、及びＢＤ  ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（商標）（ＢＤバイオサイエンシーズ・ファーミゲン、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州）が含まれる。昆虫発現系には、これに制限されないが、ショウジョウバエ発現系（ＤＥＳ（登録商標））（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、ＩｎｓｅｃｔＳｅｌｅｃｔ（商標）系（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）及びＩｎｓｅｃｔＤｉｒｅｃｔ（商標）系（ＥＭＤバイオサイエンシーズ・ノバゲン、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）が含まれる。哺乳動物発現系の制限的意味のない例としては、Ｔ−ＲＥｘ（商標）（テトラサイクリン調節発現）系（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−ＲＥｘ（商標）系（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、ｐｃＤＮＡ（商標）系（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、ｐＳｅｃＴａｇ２系（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）、Ｅｘｃｈａｎｇｅｒ（登録商標）系、ＩｎｔｅｒＰｌａｙ（商標）哺乳動物ＴＡＰ系��ストラタジーン、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（登録商標）誘発性哺乳動物発現系（ストラタジーン、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）及びＬａｃＳｗｉｔｃｈ（登録商標）ＩＩ誘発性哺乳動物発現系（ストラタジーン、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）が含まれる。
【０２０１】
本明細書中で開示されているポリヌクレオチド分子によりコードされた修飾クロストリジウム毒素を発現するもう１つの手順は、これに制限されないが原核生物抽出物及び真核生物抽出物といったような無細胞発現系を利用する。原核細胞抽出物の制限的意味のない例としては、ＲＴＳ  １００  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＹキット（ロシュ・アプライド・サイエンス、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、インディアナ州）、ＡｃｔｉｖｅＰｒｏインビトロ翻訳キット（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．）、Ａｕｓｔｉｎ、テキサス）、ＥｃｏＰｒｏ（商標）系（ＥＭＤバイオサイエンシーズ・ノバゲン、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）及びＥｘｐｒｅｓｓｗａｙ（商標）プラス発現系（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）が含まれる。真核細胞抽出物には、これに制限されないがＲＴＳ１００小麦胚芽ＣＥＣＦキット（ロシュ・アプライド・サイエンス、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、インディアナ州）、ＴｎＴ（登録商標）共役された小麦胚芽抽出物系（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）、小麦胚芽ＩＶＴ（商標）キット（アンビオン、Ａｕｓｔｉｎ、テキサス）、網状赤血球ライゼートＩＶＴ（商標）キット（アンビオン、Ａｕｓｔｉｎ、テキサス）、ＰＲＯＴＥＩＮｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ系（アンビオン、Ａｕｓｔｉｎ、テキサス）及びＴｎＴ（登録商標）共役された網状赤血球ライゼート系（プロメガ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）が含まれる。
【実施例】
【０２０２】
以下の制限的意味のない実施例は、開示されている実施形態のより完全な理解を容易にするためにあくまでも例示を目的として提供されているものであり、いかなる形であれ本明細書の中で開示されている実施形態のいずれかを制限するように意図されているわけではない。
【０２０３】
実施例１：ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂの構築
この例は、酵素ドメインを含む軽鎖のアミノ末端に位置設定されたＰＡＲ結合ドメインを含む修飾クロストリジウム毒素をいかに作製するかを例示するものである。
【０２０４】
ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂ（配列番号８５）に基づくポリヌクレオチド分子（配列番号１０９）は、標準的手順（（ＢｌｕｅＨｅｒｏｎ（登録商標）バイオテクノロジー社（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｂｏｔｈｅｌｌ、ワシントン州））を用いて合成される。長さ２０〜５０塩基のオリゴヌクレオチドが、標準的ホスホラミダイド合成を用いて合成される。これらのオリゴヌクレオチドは、全長ポリヌクレオチド分子を組立てるべく合わせてライゲートされる２本鎖２重鎖へとハイブリッド形成させられる。このポリヌクレオチド分子は、ｐＵＣＢＨＢ１ベクター内にＳｍａｌ部位で標準的分子生物学的方法によってクローニングされて、ｐＵＣＢＨＢ１／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂを生成する。合成されたポリヌクレオチド分子は、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）化学３．１（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）及びＡＢＩ３１００シーケンサー（アプライド・バイオシステムズ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）を用いて配列決定することによって確認される。
【０２０５】
必要に応じて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）菌株内の発現を改善するため、ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂ（配列番号８５）に基づいて発現最適化されたポリヌクレオチド分子（配列番号１３６）を合成することが可能である。１）大腸菌株の未変性ポリヌクレオチド分子内に標準的に存在する同義語コドンを含有するように；２）大腸菌株の中に見出される未変性ポリヌクレオチド分子の平均的Ｇ＋Ｃ含有量により密に一致するＧ＋Ｃ含有量を含むように；３）ポリヌクレオチド分子の内部に見出されるポリモノヌクレオチド領域を削減するように；及び／又は４）ポリヌクレオチド分子の内部に見出される内部の調節又は構造部位を除去するように、ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードするポリヌクレオチド分子を修飾することができる。例えばランス・Ｅ・スチュワード（Ｌａｎｃｅ  Ｅ．Ｓｔｅｗａｒｄ）ら、「活性ボツリヌス毒素タイプＥ発現の最適化」、ＰＣＴ特許出願番号第２００５／０２０５７８号明細書（２００５年６月９日）；ランス・Ｅ・スチュワードら、「活性ボツリヌス毒素タイプＡの発現の最適化」、ＰＣＴ特許出願番号第２００５／ＸＸＸＸＸＸ号明細書（２００５年８月３日）を参照のこと。ひとたび配列最適化が完了した時点で、長さ２０〜５０塩基のオリゴヌクレオチドが標準的なホスホラミダイド合成を用いて合成される。これらのオリゴヌクレオチドは、全長ポリヌクレオチド分子を組立てるため合わせてライゲートされる２本鎖２重鎖の形にハイブリッド形成される。このポリヌクレオチド分子は標準的な分子生物学的方法を用いて、Ｓｍａｌ部位でｐＵＣＢＨＢ１ベクターへとクローニングされて、ｐＵＣＢＨＢ１／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂを生成する。合成されたポリヌクレオチド分子は、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）化学３．１（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）及びＡＢＩ３１００シーケンサー（アプライド・バイオシステムズ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）を用いた配列決定により確認される。望まれる場合には、酵母菌株、昆虫細胞系統又は哺乳動物細胞といったような異なる生体に対する最適化を行なうことができる。例えばスチュワード、前掲書、ＰＣＴ特許出願番号第２００５／０２０５７８号明細書（２００５年６月９日）；及びスチュワード、前掲書、ＰＣＴ特許出願番号２００５／ＸＸＸＸＸＸ号明細書（２００５年８月３日）を参照のこと。
【０２０６】
配列番号８６のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｘａをコードする配列番号１１０又は配列番号１３７のポリヌクレオチド分子；配列番号８７のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ２Ｔｐをコードする配列番号１１１又は配列番号１３８のポリヌクレオチド分子；配列番号８８のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ２Ｘａをコードする配列番号１１２又は配列番号１３９のポリヌクレオチド分子；配列番号８９のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ３Ｔｂをコードする配列番号１１３又は配列番号１４０のポリヌクレオチド分子；配列番号９０のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ３Ｘａをコードする配列番号１１４又は配列番号１４１のポリヌクレオチド分子；配列番号９１のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ４Ｔｂをコードする配列番号１１５又は配列番号１４２のポリヌクレオチド分子；及び配列番号９２のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ４Ｘａをコードする配列番号１１６又は配列番号１４３のポリヌクレオチド分子を含むｐＵＣＢＨＢ１クローニング構成体を作るために類似のクローニング戦略が使用される。さらに、当業者であれば、例えばＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ及びＴｅＮＴといったようなクロストリジウム毒素を修飾して、これらの毒素が修飾ＢｏＮＴ／ＡのＰＡＲ属性を有するようにし、類似のクローニング戦略を用いてこれらを作製することができる。
【０２０７】
ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂを構築するためには、１）ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードする配列番号１３６の読取り枠を含むインサートを切除し；かつ２）ｐＥＴ２９ベクターに対しこのインサートを作動的に連結させることができるようにする制限エンドヌクレアーゼでｐＵＣＢＨＢ１／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂ構成体を消化させる（ＥＭＤバイオサイエンシーズ・ノバゲン（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｎｏｖａｇｅｎ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）。このインサートは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ手順を用いて、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化されるｐＥＴ２９ベクター内にサブクローニングされてｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂを生成する。ライゲーション混合物は、熱ショック方法を用いて化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）へと形質転換され、１．５％のルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）寒天平板（ｐＨ７．０）上に平板固定され、一晩成長させるために３７℃のインキュベータ内に置かれる。発現構成体を含有する細菌がカナマイシン耐性コロニーとして同定される。アルカリ溶菌プラスミド少量調製手順を用いて候補構成体を単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化物地図作成により分析してインサートの存在及び配向を判定する。このクローニング戦略により、カルボキシ末端ポリヒスチジン親和性結合ペプチドに対し作動的に連結された配列番号８５のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードする配列番号１３６のポリヌクレオチド分子を含むｐＥＴ２９発現構成体を生成した（図７）。
【０２０８】
配列番号８５のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードする配列番号１０９のポリヌクレオチド分子；配列番号８６のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｘａをコードする配列番号１１０又は配列番号１３７；配列番号８７のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ２Ｔｐをコードする配列番号１１１又は配列番号１３８のポリヌクレオチド分子；配列番号８８のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ２Ｘａをコードする配列番号１１２又は配列番号１３９のポリヌクレオチド分子；配列番号８９のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ３Ｔｂをコードする配列番号１１３又は配列番号１４０のポリヌクレオチド分子；配列番号９０のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ３Ｘａをコードする配列番号１１４又は配列番号１４１のポリヌクレオチド分子；配列番号９１のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ４Ｔｂをコードする配列番号１１５又は配列番号１４２のポリヌクレオチド分子；及び配列番号９２のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ４Ｘａをコードする配列番号１１６又は配列番号１４３のポリヌクレオチド分子を含むｐＥＴ２９発現構成体を作製するために類似のクローニング戦略が使用される。
【０２０９】
実施例２：ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ１Ｔｂの構築
この例は、転移ドメインを含む重鎖のアミノ末端に位置設定されたＰＡＲ結合ドメインを含む修飾クロストリジウム毒素をいかに作製するかを例示するものである。
【０２１０】
ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ１Ｔｂ（配列番号９３）に基づくポリヌクレオチド分子（配列番号１１７）は、標準的手順（（ＢｌｕｅＨｅｒｏｎ（登録商標）バイオテクノロジー、Ｂｏｔｈｅｌｌ、ワシントン州））を用いて合成される。長さ２０〜５０塩基のりオリゴヌクレオチドが、標準的ホスホラミダイド合成を用いて合成される。これらのオリゴヌクレオチドは、全長ポリヌクレオチド分子を組立てるべく合わせてライゲートされる２本鎖２重鎖へとハイブリッド形成させられる。このポリヌクレオチド分子は、ｐＵＣＢＨＢ１ベクター内にＳｍａｌ部位で標準的分子生物学的方法によってクローニングされて、ｐＵＣＢＨＢ１／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ１Ｔｂを生成する。合成されたポリヌクレオチド分子は、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）化学３．１（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）及びＡＢＩ３１００シーケンサー（アプライド・バイオシステムズ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）を用いて配列決定することによって確認される。
【０２１１】
必要に応じて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）菌株内の発現を改善するため、ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ１Ｔｂ（配列番号９３）に基づいて発現最適化されたポリヌクレオチド分子（配列番号１４４）を合成することが可能である。ポリヌクレオチド分子を含む読取り枠は大腸菌株内の発現を改善するために最適化される。１）大腸菌株の未変性ポリヌクレオチド分子内に標準的に存在する同義語コドンを含有するように；２）大腸菌株の中に見出される未変性ポリヌクレオチド分子の平均的Ｇ＋Ｃ含有量により密に一致するＧ＋Ｃ含有量を含むように；３）ポリヌクレオチド分子の内部に見出されるポリモノヌクレオチド領域を削減するように；及び／又は４）ポリヌクレオチド分子の内部に見出される内部の調節又は構造部位を除去するように、ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードするポリヌクレオチド分子を修飾することができる。例えばランス・Ｅ・スチュワードら、「活性ボツリヌス毒素タイプＥ発現の最適化」、ＰＣＴ特許出願番号第２００５／０２０５７８号明細書（２００５年６月９日）；ランス・Ｅ・スチュワードら、「活性ボツリヌス毒素タイプＡ発現の最適化」、ＰＣＴ特許出願番号第２００５／ＸＸＸＸＸＸ号明細書（２００５年８月３日）を参照のこと。ひとたび配列最適化が完了した時点で、長さ２０〜５０塩基のオリゴヌクレオチドが標準的なホスホラミダイド合成を用いて合成される。これらのオリゴヌクレオチドは、全長ポリヌクレオチド分子を組立てるため合わせてライゲートされる２本鎖２重鎖の形にハイブリッド形成される。このポリヌクレオチド分子は標準的な分子生物学的方法を用いて、Ｓｍａｌ部位でｐＵＣＢＨＢ１ベクターへとクローニングされて、ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ１Ｔｂを生成する。合成されたポリヌクレオチド分子は、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）化学３．１（アプライド・バイオシステムズ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）及びＡＢＩ３１００シーケンサー（アプライド・バイオシステムズ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）を用いた配列決定により確認される。望まれる場合にはＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードするポリヌクレオチド分子の最適化を実施する必要は無く、又は、酵母菌株、昆虫細胞系統又は哺乳動物細胞といったような異なる生体に対する最適化をその代わりに行なうことができる。例えばスチュワード、前掲書、ＰＣＴ特許出願番号第２００５／０２０５７８号明細書（２００５年６月９日）；及びスチュワード、前掲書、ＰＣＴ特許出願番号２００５／ＸＸＸＸＸＸ号明細書（２００５年８月３日）を参照のこと。
【０２１２】
配列番号９４のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ１Ｘａをコードする配列番号１１８又は配列番号１４５のポリヌクレオチド分子；配列番号９５のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ２Ｔｐをコードする配列番号１１９又は配列番号１４６のポリヌクレオチド分子；配列番号９６のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ２Ｘａをコードする配列番号１２０又は配列番号１４７のポリヌクレオチド分子；配列番号９７のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードする配列番号１２１又は配列番号１４８のポリヌクレオチド分子；配列番号９８のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ３Ｘａをコードする配列番号１２２又は配列番号１４９のポリヌクレオチド分子；配列番号９９のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ４Ｔｂをコードする配列番号１２３又は配列番号１５０のポリヌクレオチド分子；及び配列番号１００のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ４Ｘａをコードする配列番号１２４又は配列番号１５１のポリヌクレオチド分子を含むｐＵＣＢＨＢ１クローニング構成体を作るために類似のクローニング戦略が使用される。さらに、当業者であれば、例えばＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ及びＴｅＮＴといったようなクロストリジウム毒素を修飾して、これらの毒素が修飾ＢｏＮＴ／ＡのＰＡＲ属性を有するようにし、類似のクローニング戦略を用いてこれらを作製することができる。
【０２１３】
ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ１Ｔｂを構築するためには、１）ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードする配列番号１４４の読取り枠を含むインサートを切除し；かつ２）ｐＥＴ２９ベクターに対しこのインサートを作動的に連結させることができるようにする制限エンドヌクレアーゼでｐＵＣＢＨＢ１／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ１Ｔｂ構成体を消化させる（ＥＭＤバイオサイエンシーズ・ノバゲン、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）。このインサートは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ手順を用いて、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化されるｐＥＴ２９ベクター内にサブクローニングされてｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ１Ｔｂを生成する。ライゲーション混合物は、熱ショック方法を用いて化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）へと形質転換され、１．５％のルリア・ベルターニ寒天平板（ｐＨ７．０）上に平板固定され、一晩成長させるために３７℃のインキュベータ内に置かれる。発現構成体を含有する細菌がカナマイシン耐性コロニーとして同定される。アルカリ溶菌プラスミド少量調製手順を用いて候補構成体を単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化物地図作成により分析してインサートの存在及び配向を判定する。このクローニング戦略により、カルボキシ末端ポリヒスチジン親和性結合ペプチドに対し作動的に連結された配列番号９３のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードする配列番号１４４のポリヌクレオチド分子を含むｐＥＴ２９発現構成体を生成した（図８）。
【０２１４】
配列番号９３のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ１Ｘａをコードする配列番号１１７のポリヌクレオチド分子；配列番号９４のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ１Ｘａをコードする配列番号１１８又は配列番号１４５；配列番号９５のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ２Ｔｐをコードする配列番号１１９又は配列番号１４６のポリヌクレオチド分子；配列番号９６のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ２Ｘａをコードする配列番号１２０又は配列番号１４７のポリヌクレオチド分子；配列番号９７のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードする配列番号１２１又は配列番号１４８のポリヌクレオチド分子；配列番号９８のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ３Ｘａをコードする配列番号１２２又は配列番号１４９のポリヌクレオチド分子；配列番号９９のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ４Ｔｂをコードする配列番号１２３又は配列番号１５０のポリヌクレオチド分子；及び配列番号１００のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ４Ｘａをコードする配列番号１２４又は配列番号１５１のポリヌクレオチド分子を含むｐＥＴ２９発現構成体を作製するために類似のクローニング戦略が使用される。
【０２１５】
実施例３：ＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ１Ｔｂの構築
この例は、結合ドメインを含む重鎖のアミノ末端に位置設定されたＰＡＲ結合ドメインを含む修飾クロストリジウム毒素をいかに作製するかを例示するものである。
【０２１６】
ＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ１Ｔｂ（配列番号１０１）に基づくポリヌクレオチド分子（配列番号１２５）は、標準的手順（（ＢｌｕｅＨｅｒｏｎ（登録商標）バイオテクノロジー、Ｂｏｔｈｅｌｌ、ワシントン州））を用いて合成される。長さ２０〜５０塩基のオリゴヌクレオチドが、標準的ホスホラミダイド合成を用いて合成される。これらのオリゴヌクレオチドは、全長ポリヌクレオチド分子を組立てるべく合わせてライゲートされる２本鎖２重鎖へとハイブリッド形成させられる。このポリヌクレオチド分子は、ｐＵＣＢＨＢ１ベクター内にＳｍａｌ部位で標準的分子生物学的方法によってクローニングされて、ｐＵＣＢＨＢ１／ＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ１Ｔｂを生成する。合成されたポリヌクレオチド分子は、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）化学３．１（アプライド・バイオシステムズ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）及びＡＢＩ３１００シーケンサー（アプライド・バイオシステムズ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）を用いて配列決定することによって確認される。
【０２１７】
必要に応じて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）菌株内の発現を改善するため、ＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ１Ｔｂ（配列番号１０１）に基づいて発現最適化されたポリヌクレオチド分子（配列番号１５２）を合成することが可能である。ポリヌクレオチド分子を含む読取り枠は、大腸菌株内の発現を改善するために最適化される。１）大腸菌株の未変性ポリヌクレオチド分子内に標準的に存在する同義語コドンを含有するように；２）大腸菌株内に見出される未変性ポリヌクレオチド分子の平均的Ｇ＋Ｃ含有量により密に一致するＧ＋Ｃ含有量を含むように；３）ポリヌクレオチド分子の内部に見出されるポリモノヌクレオチド領域を削減するように；及び／又は４）ポリヌクレオチド分子の内部に見出される内部の調節又は構造部位を除去するように、ＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードするポリヌクレオチド分子を修飾することができる。例えばランス・Ｅ・スチュワードら、「活性ボツリヌス毒素タイプＥ発現の最適化」、ＰＣＴ特許出願番号第２００５／０２０５７８号明細書（２００５年６月９日）；ランス・Ｅ・スチュワードら、「活性ボツリヌス毒素タイプＡ発現の最適化」、ＰＣＴ特許出願番号第２００５／ＸＸＸＸＸＸ号明細書（２００５年８月３日）を参照のこと。ひとたび配列最適化が完了した時点で、長さ２０〜５０塩基のオリゴヌクレオチドが標準的なホスホラミダイド合成を用いて合成される。これらのオリゴヌクレオチドは、全長ポリヌクレオチド分子を組立てるため合わせてライゲートされる２本鎖２重鎖の形にハイブリッド形成される。このポリヌクレオチド分子は標準的な分子生物学的方法を用いて、Ｓｍａｌ部位でｐＵＣＢＨＢ１ベクターへとクローニングされて、ＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ１Ｔｂを生成する。合成されたポリヌクレオチド分子は、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）化学３．１（アプライド・バイオシステムズ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）及びＡＢＩ３１００シーケンサー（アプライド・バイオシステムズ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）を用いた配列決定により確認される。望まれる場合には、ＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードするポリヌクレオチド分子の最適化を実施する必要はなく、又は、酵母菌株、昆虫細胞系統又は哺乳動物細胞といったような異なる生体に対する最適化をその代わりに行なうことができる。例えばスチュワード、前掲書、ＰＣＴ特許出願番号第２００５／０２０５７８号明細書（２００５年６月９日）；及びスチュワード、前掲書、ＰＣＴ特許出願番号２００５／ＸＸＸＸＸＸ号明細書（２００５年８月３日）を参照のこと。
【０２１８】
配列番号１０２のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ１Ｘａをコードする配列番号１２６又は配列番号１５３のポリヌクレオチド分子；配列番号１０３のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ２Ｔｐをコードする配列番号１２７又は配列番号１５４のポリヌクレオチド分子；配列番号１０４のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ２Ｘａをコードする配列番号１２８又は配列番号１５５のポリヌクレオチド分子；配列番号１０５のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ３Ｔｂをコードする配列番号１２９又は配列番号１５６のポリヌクレオチド分子；配列番号１０６のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ３Ｘａをコードする配列番号１３０又は配列番号１５７のポリヌクレオチド分子；配列番号１０７のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ４Ｔｂをコードする配列番号１３１又は配列番号１５８のポリヌクレオチド分子；及び配列番号１０８のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ４Ｘａをコードする配列番号１３２又は配列番号１５９のポリヌクレオチド分子を含むｐＵＣＢＨＢ１クローニング構成体を作るために類似のクローニング戦略が使用される。さらに、当業者であれば、例えばＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ及びＴｅＮＴといったようなクロストリジウム毒素を修飾して、これらの毒素が修飾ＢｏＮＴ／ＡのＰＡＲ属性を有するようにし、類似のクローニング戦略を用いてこれらを作製することができる。
【０２１９】
ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ１Ｔｂを構築するためには、１）ＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードする配列番号１５２の読取り枠を含むインサートを切除し；かつ２）ｐＥＴ２９ベクターに対しこのインサートを作動的に連結させることができるようにする制限エンドヌクレアーゼでｐＵＣＢＨＢ１／ＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ１Ｔｂ構成体を消化させる（ＥＭＤバイオサイエンシーズ・ノバゲン、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）。このインサートは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ手順を用いて、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化されるｐＥＴ２９ベクター内にサブクローニングされてｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ１Ｔｂを生成する。ライゲーション混合物は、熱ショック方法を用いて化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）へと形質転換され、カナマイシン５０μｇ／ｍＬを含有する１．５％のＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ寒天平板（ｐＨ７．０）上に平板固定され、一晩成長させるために３７℃のインキュベータ内に置かれる。発現構成体を含有する細菌がカナマイシン耐性コロニーとして同定される。アルカリ溶菌プラスミド少量調製手順を用いて候補構成体を単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化物地図作成により分析してインサートの存在及び配向を判定する。このクローニング戦略により、カルボキシ末端ポリヒスチジン親和性結合ペプチドに対し作動的に連結された配列番号１０１のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードする配列番号１５２のポリヌクレオチド分子を含むｐＥＴ２９発現構成体を生成した（図９）。
【０２２０】
配列番号１０１のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードする配列番号１２５のポリヌクレオチド分子；配列番号１０２のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ１Ｘａをコードする配列番号１２６又は配列番号１５３；配列番号１０３のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ２Ｔｐをコードする配列番号１２７又は配列番号１５４のポリヌクレオチド分子；配列番号１０４のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ２Ｘａをコードする配列番号１２８又は配列番号１５５のポリヌクレオチド分子；配列番号１０５のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ３Ｔｂをコードする配列番号１２９又は配列番号１５６のポリヌクレオチド分子；配列番号１０６のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ３Ｘａをコードする配列番号１３０又は配列番号１５７のポリヌクレオチド分子；配列番号１０７のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ４Ｔｂをコードする配列番号１３１又は配列番号１５８のポリヌクレオチド分子；及び配列番号１０８のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ４Ｘａをコードする配列番号１３２又は配列番号１５９のポリヌクレオチド分子を含むｐＥＴ２９発現構成体を作製するために類似のクローニング戦略が使用される。
【０２２１】
実施例４：細菌細胞内のクロストリジウム毒素の発現
以下の実施例は、細菌細胞内で本明細書中に開示されている修飾クロストリジウム毒素のいずれかを発現するために有用な手順を例示している。
【０２２２】
例えばｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂ、ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ１Ｔｂ又はｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ１Ｔｂといったような発現構成体（例えば実施例１、２及び３を参照）を、熱ショック形質転換プロトコルを用いて、化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）の中に導入する。熱ショック反応を、カナマイシン５０μｇ／ｍＬを含有する１．５％のルリア・ベルターニ寒天平板（ｐＨ７．０）上に平板固定し、一晩成長させる目的で３７℃のインキュベータ内に置く。例えばｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂ、ｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ１Ｔｂ又はｐＥＴ２９／ＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ１Ｔｂといったような発現構成体を含有する形質転換された大腸菌のカナマイシン耐性コロニーを用いて、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する３．０ｍＬのＰＡ−０．５Ｇ培地の入ったバッフル付きフラスコに接種し、このフラスコを次に、一晩成長させるために２５０ｒｐｍで振盪する３７℃のインキュベータ内に入れる。今度は、結果として得た一晩スターター培養を用いて、１：１０００の希釈度で５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＺＹＰ−５０５２自己誘発性培地の入った３Ｌ入りのバッフル付きフラスコに接種する。培養体積は、約６００ｍＬ（フラスコ容積の２０％）から約７５０ｍＬ（フラスコ体積の２５％）の範囲内であった。これらの培養を約５．５時間２５０ｒｐｍで振盪する３７℃のインキュベータ内で成長させ、次に一晩発現させる目的で２５０ｒｐｍで振盪する１６℃のインキュベータに移す。細胞を遠心分離（２０〜３０分間４℃で４０００ｒｐｍ）により収獲し、直ちに使用するか又は必要となるまで−８０℃で乾燥状態にて保管する。
【０２２３】
実施例５：  修飾クロストリジウム毒素の精製及び定量化
以下の実施例は、本明細書中で開示されている任意の修飾クロストリジウム毒素の精製及び定量化にとって有用な方法を例示している。
【０２２４】
固定化金属親和性クロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）タンパク質精製のために、実施例４で記載されている通りの修飾クロストリジウム毒素を発現するのに使用されたＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞ペレットを、カラム結合緩衝液（２５ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、ｐＨ７．８；５００ｍＭの塩化ナトリウム；１０ｍＭのイミダゾール；２×プロテアーゼ阻害物質カクテルセットＩＩＩ（ＥＭＤバイオサイエンシーズ・カルビオケム（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州）；５単位／ｍＬのベンゾナーゼ（ＥＭＤバイオサイエンシーズ・ノバゲン、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）；０．１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ（登録商標）１００、４−オクチルフェノールポリエトキシラート；１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール）中に再懸濁させ、その後、低温オークリッジ遠心分離管に移す。細胞懸濁液を、氷上で超音波処理し（ブランソンデジタル超音波処理機上にて６０秒の冷却間隔で４０％の振幅で１０秒１０〜１２パルス）で細胞を溶解させ、次に遠心分離して（２０分間４℃で１６，０００ｒｐｍ）溶解物を清澄化させる。２．５〜５．０ｍＬのＴＡＬＯＮ（商標）Ｓｕｐｅｒ  Ｆｌｏｗ  ＣＯ２＋親和性樹脂（ＢＤバイオサイエンシーズ・クローンテック、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、カリフォルニア州）を詰めた２０ｍＬのＥｃｏｎｏ−Ｐａｃカラム支持体（バイオ・ラド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州）を用いて固定化金属親和性クロマトグラフィカラムを調製し、次にこれをまずは５カラム体積脱イオン化精製水そしてそれに続いて５カラム体積のカラム結合緩衝液で洗い流すことによって平衡化する。清澄化済みの溶解物を、重力流（約０．２５〜０．３ｍＬ／分）により平衡化済みカラムに対しゆっくりと適用する。次にカラムを、５カラム体積のカラム洗浄緩衝液（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、ｐＨ７．８；５００ｍＭの塩化ナトリウム；１０ｍＭのイミダゾール；０．１％（ｖ／ｖ）のＴｏｒｉｔｏｎ−Ｘ（登録商標）１００、４−オクチルフェノールポリエトキシラート；１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）で洗浄する。クロストリジウム毒素を、２０〜３０ｍＬのカラム溶離緩衝液（２５ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、ｐＨ７．８；５００ｍＭの塩化ナトリウム；５００ｍＭのイミダゾール；０．１％（ｖ／ｖ）のＴｏｒｉｔｏｎ−Ｘ（登録商標）１００、４−オクチルフェノールポリエトキシラート；１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）で溶離し、おおよそ１２の１ｍＬ画分の形で収集する。ブラッドフォード染料検定により、各溶離画分の中に含有されているクロストリジウム毒素の量を決定する。この手順において、各１．０ｍＬの画分の２０μｌアリコートを２００μＬのＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質試薬（バイオ・ラド・ラボラトリーズ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州）と組み合わせ、脱イオン化精製水で１対４に希釈し、次に比色シグナルの強度を分光光度計を用いて測定する。最も強度の高いシグナルをもつ５つの画分を溶離ピークとみなし、これらを組合わせる。標準としてウシガンマグロブリンを用いて、プールされたピーク溶離画分の合計タンパク質濃度を推定することにより、合計タンパク質収量を判定する（バイオ・ラド・ラボラトリーズ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州）。
【０２２５】
ＦＰＬＣ脱塩カラムを用いた修飾クロストリジウム毒素の精製のためには、８０ｍＬの４℃のカラム緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５）でＨｉＰｒｅｐ（商標）２６／１０サイズ排除カラム（アマーシャム・バイオサイエンシーズ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージ州）を予め平衡化する。カラムを平衡化した後、ＢｉｏＬｏｇｉｃ  ＤｕｏＦｌｏｗクロマトグラフィシステム（バイオ・ラド・ラボラトリーズ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州）を用いて１０ｍＬ／分の流速で４℃のカラム緩衝液の定組成移動相でサイズ排除カラムに対しクロストリジウム毒素試料を適用する。約７〜１２ｍＬの単一画分として脱塩した修飾クロストリジウム毒素試料を収集する。
【０２２６】
ＦＰＬＣイオン交換カラムを用いた修飾クロストリジウム毒素の精製のためには、ＩＭＡＣカラムからの溶離の後に脱塩されたクロストリジウム毒素試料を、ＢｉｏＬｏｇｉｃ  ＤｕｏＦｌｏｗクロマトグラフィシステム（バイオ・ラド・ラボラトリーズ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州）を用いて１ｍＬのＱ１（商標）アニオン交換カラム（バイオ・ラド・ラボラトリーズ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州）に適用する。４℃のカラム緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５）中でカラムに試料を適用し、以下の通りに、４℃の溶離緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ６．５）での線形勾配により溶離する。ステップ１、１ｍＬ／分の流速で５％の溶離緩衝液５．０ｍＬ；ステップ２、１ｍＬ／分の流速で５〜３０％の溶離緩衝液２０．０ｍＬ；ステップ３、１．０ｍＬ／分の流速で５０％の溶離緩衝液２．０ｍＬ；ステップ４、１．０ｍＬ／分の流速で１００％の溶離緩衝液４．０ｍＬ；及びステップ５、１．０ｍＬ／分の流速で０％の溶離緩衝液５．０ｍＬ。カラムからのクロストリジウム毒素の溶離を、２８０、２６０及び２１４ｎｍで監視し、２８０ｎｍで最低閾値（０．０１ａｕ）超を吸収するピークを収集する。大部分のクロストリジウム毒素は、約１００〜２００ｍＭの塩化ナトリウム濃度で溶離することになる。クロストリジウム毒素の平均合計収量がブラッドフォード検定によって判定されることになる。
【０２２７】
修飾クロストリジウム毒素の発現をポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分析する。以上で記載した手順を用いて精製された試料を、２×ＬＤＳ試料緩衝液（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）に添加し、変性、還元条件下でＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプレキャストポリアクリルアミドゲル（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）を用いてＭＯＰＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離する。ゲルをＳＹＰＲＯ（登録商標）ルビー（バイオ・ラド・ラボラトリーズ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州）で染色し、分離したポリペプチドを、クロストリジウム毒素発現レベルの定量化のためＦｌｕｏｒ−Ｓ  ＭＡＸ  ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ（バイオ・ラド・ラボラトリーズ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州）を用いて画像化する。クロストリジウム毒素のサイズ及び量をＭａｇｉｃ  Ｍａｒｋ（商標）タンパク質分子量標準（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）に対する比較により判定する（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）。
【０２２８】
修飾クロストリジウム毒素の発現は、ウェスタンブロット分析によっても分析される。上述の手順を用いて精製されたタンパク質試料を２×ＬＤＳの試料緩衝液（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）に添加し、変性、還元条件下でＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプレキャストポリアクリルアミドゲル（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）を用いてＭＯＰＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離する。Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標）ＳＤ半乾燥電気泳動転移細胞器具（バイオ・ラド・ラボラトリーズ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州）を用いたウェスタンブロット法によりフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）上へと、分離したポリペプチドをゲルから移す。２５ｍＭのトリス緩衝食塩水（２５ｍＭの２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ７．４）、１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．７ｍＭの塩化カリウム）、０．１％のＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート、２％のウシ血清アルブミン、５％の脱脂粉乳を含有する溶液中で、２時間、室温でインキュベートすることによって、ＰＶＤＦ膜を遮断する。遮断した膜を、プローブとして適切な一次抗体を含有するトリス緩衝食塩水ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（２５ｍＭのトリス緩衝食塩水、０．１％のＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレアート）の中で一晩４℃でインキュベートする。各回トリス緩衝食塩水ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）中で１５分間、一次抗体をプローブとしたブロットを３回洗浄する。二次抗体としてのホースラディッシュペルオキシダーゼに接合された適切な免疫グロブリンＧ抗体を含有するトリス緩衝食塩水ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）中で２時間室温で、洗浄済み膜をインキュベートする。二次抗体をプローブとしたブロットを、毎回トリス緩衝食塩水ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）中で１５分間、３回洗浄する。標識したクロストリジウム毒素のシグナル検出を、ＥＣＬＰｌｕｓ（商標）ウェスタンブロット検出システム（アマーシャム・バイオサイエンシーズ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージ州）を用いて視覚化し、修飾クロストリジウム毒素発現レベルの定量化のためＴｙｐｈｏｏｎ  ９４１０可変モード画像化装置（アマーシャム・バイオサイエンシーズ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージ州）で画像化する。
【０２２９】
実施例６：酵母細胞中での修飾クロストリジウム毒素の発現
以下の実施例は、酵母細胞中で本明細書中に開示された修飾クロストリジウム毒素のいずれかを発現するために有用な手順を例示している。
【０２３０】
修飾クロストリジウム毒素をコードする適切な酵母発現構成体を構築するためには、配列番号８５のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードする配列番号１３６のポリヌクレオチド分子の５’及び３’末端の中に、作動的に連結されたポリヌクレオチド分子をｐＰＩＣＡベクター（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）内にクローニングするのに適した制限エンドヌクレアーゼ部位を取り込む。このポリヌクレオチド分子を合成し、実施例１に記載された通りｐＵＣＢＨＢ１／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂ構成体を得る。１）ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードする配列番号１３６の読取り枠を含有するインサートを切除し；かつ２）このインサートがｐＰＩＣＡベクターに作動的に連結され得るようにする制限酵素で、この構成体を消化させる。ｐＰＩＣＡ／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂを生成するべく、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化されるｐＰＩＣＡベクター内にＴ４ＤＮＡリガーゼ手順を用いてこのインサートをサブクローニングする。熱ショック法を用いてライゲーション混合物を化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）へと形質転換し、２５μｇ／ｍＬのゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）（商標）を含有する１．５％の低温ルリア・ベルターニ寒天平板（ｐＨ７．５）上に平板固定し、一晩成長させるために３７℃のインキュベータ内に入れる。発現構成体を含む細菌を、ゼオシン（商標）耐性コロニーとして同定する。アルカリ溶菌プラスミド少量調製手順を用いて、候補構成体を単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化地図作成により分解してインサートの存在及び配向を判定する。このクローニング戦略は、カルボキシル末端ｃ−ｍｙｃ及びポリヒスチジン結合ペプチドに対して作動的に連結された配列番号８５のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードする配列番号１３６のポリヌクレオチド分子を含むｐＰＩＣＡ発現構成体を生成した（図９）。
【０２３１】
配列番号８５のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードする配列番号１０９のポリヌクレオチド分子；配列番号８６のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｘａをコードする配列番号１１０又は配列番号１３７；配列番号８７のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ２Ｔｐをコードする配列番号１１１又は配列番号１３８のポリヌクレオチド分子；配列番号８８のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ２Ｘａをコードする配列番号１１２又は配列番号１３９のポリヌクレオチド分子；配列番号８９のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ３Ｔｂをコードする配列番号１１３又は配列番号１４０のポリヌクレオチド分子；配列番号９０のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ３Ｘａをコードする配列番号１１４又は配列番号１４１のポリヌクレオチド分子；配列番号９１のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ４Ｔｂをコードする配列番号１１５又は配列番号１４２のポリヌクレオチド分子；及び配列番号９２のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ４Ｘａをコードする配列番号１１６又は配列番号１４３のポリヌクレオチド分子を含むｐＰＩＣＡ発現構成体を作製するために類似のクローニング戦略が使用される。
【０２３２】
配列番号９３のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ１Ｘａをコードする配列番号１１７のポリヌクレオチド分子；配列番号９４のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ１Ｘａをコードする配列番号１１８又は配列番号１４５；配列番号９５のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ２Ｔｐをコードする配列番号１１９又は配列番号１４６のポリヌクレオチド分子；配列番号９６のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ２Ｘａをコードする配列番号１２０又は配列番号１４７のポリヌクレオチド分子；配列番号９７のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードする配列番号１２１又は配列番号１４８のポリヌクレオチド分子；配列番号９８のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ３Ｘａをコードする配列番号１２２又は配列番号１４９のポリヌクレオチド分子；配列番号９９のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ４Ｔｂをコードする配列番号１２３又は配列番号１５０のポリヌクレオチド分子；及び配列番号９９のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ４Ｘｂをコードする配列番号１２３又は配列番号１５０のポリヌクレオチド分子；及び配列番号１００のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ４Ｘａをコードする配列番号１２４又は配列番号１５１のポリヌクレオチド分子を含むｐＰＩＣＡ発現構成体を作製するために類似のクローニング戦略が使用される。
【０２３３】
配列番号１０１のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードする配列番号１２５のポリヌクレオチド分子、配列番号１０２のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ１Ｘａをコードする配列番号１２６又は配列番号１５３のポリヌクレオチド分子；配列番号１０３のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ２Ｔｐをコードする配列番号１２７又は配列番号１５４のポリヌクレオチド分子；配列番号１０４のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ２Ｘａをコードする配列番号１２８又は配列番号１５５のポリヌクレオチド分子；配列番号１０５のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ３Ｔｂをコードする配列番号１２９又は配列番号１５６のポリヌクレオチド分子；配列番号１０６のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ３Ｘａをコードする配列番号１３０又は配列番号１５７のポリヌクレオチド分子；配列番号１０７のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ４Ｔｂをコードする配列番号１３１又は配列番号１５８のポリヌクレオチド分子；及び配列番号１０８のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ４Ｘａをコードする配列番号１３２又は配列番号１５９のポリヌクレオチド分子を含むｐＰＩＣＡ発現構成体を作るために類似のクローニング戦略が使用される。
【０２３４】
修飾クロストリジウム毒素を発現する酵母菌細胞系統を構築するため、適切な制限エンドヌクレアーゼ（すなわちＳａｃｌ、Ｐｍｅｌ又はＢｓｔＸＩ）でｐＰＩＣＺ  Ａ／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂを消化し、結果として得た線形化した発現構成体を、電気穿孔法を用いて適切なＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＭｕｔＳ菌株ＫＭ７１Ｈへと形質転換させる。形質転換混合物を、１００μｇ／ｍＬのゼオシン（商標）を含有する１．５％のＹＰＤＳ寒天平板（ｐＨ７．５）上に平板固定し、１〜３日間成長させるため２８〜３０℃のインキュベータ内に置く。５’ＡＯＸ１遺伝子座にｐＰＩＣＺ  Ａ／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂを組込む形質転換体の選択は、ゼオシン（商標）に対するコロニー耐性によって決定される。発現レベルについての対照として用いられる配列番号２を含むｐＰＩＣＺ  Ａ発現構成体を含有する細胞系統を作るために類似を戦略が用いられる。小規模発現試験を用いてＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂについて、ｐＰＩＣＺ  Ａ／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂ構成体を組込んだ細胞系統をテストする。組込まれたｐＰＩＣＺ  Ａ／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂを組込んだテスト細胞系統からの単離コロニーを用いて、１００ｍＬのＭＧＹＨ培地が入った１．０Ｌ入りのバッフル付きフラスコに接種し、培養がＯＤ６００＝２−６（約１６〜１８時間）に達するまで振盪インキュベータ（２５０ｒｐｍ）の中で約２８〜３０℃で成長させる。細胞を遠心分離により収獲する（５分間２２℃で３０００×ｇ）。発現を誘発するためには、細胞ペレットを１５ｍＬのＭＭＨ培地内で再懸濁させ、０．５％の最終濃度まで１００％のメタノールを添加する。培養を、振盪インキュベータ（２５０ｒｐｍ）内で約２８〜３０℃で成長させる。０．５％の最終濃度まで２４時間毎に培養に、さらなる１００％のメタノールを添加する。時間ゼロから出発し、１４４時間目に終了して、２４時間毎に培養から１．０ｍＬのテストアリコートを取り出す。細胞をペレット状にするべくマイクロ遠心分離法によりアリコートから細胞を収獲し、まずは５分間−８０℃次に５分間３７℃から成る３回の凍結−解凍ラウンドを用いてこれを溶解させる。溶解試料を、２倍のＬＤＳ試料緩衝液（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）に添加し、確立された細胞系統からの発現をウェスタンブロット分析（実施例５に記載した通り）により、抗−ＢｏＮＴ／Ａ、抗−ｍｙｃ又は抗−Ｈｉｓ抗体のいずれかを用いて測定し、ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂを発現する系統を同定する。市販の発酵手順を用いた大規模発現のために、最高のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂ発現レベルを示すＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＭｕｔＳＫＭ７１Ｈ細胞を選択する。大規模発現のための手順は、培養体積が５Ｌ入りＢｉｏ  Ｆｌｏ  ３０００発酵装置内で成長させられた約２．５ＬのＭＧＹＨ培地であり、全ての試薬の濃度がこの体積について比例的に増大されることになるという点を除いて、以上で概略的に示されている通りである。
【０２３５】
実施例５に記載されている通りに、ＩＭＡＣ手順を用いてＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂを精製する。一定量のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂが産生されたか否かを判定するべく、各培養からの発現をブラッドフォード染料検定、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法及びウェスタンブロット分析（実施例５で記載されている通り）によって評価する。
【０２３６】
実施例７：昆虫細胞中での修飾クロストリジウム毒素の発現
以下の実施例は、昆虫細胞中で本明細書中に開示された修飾クロストリジウム毒素のいずれかを発現するために有用な手順を例示している。
【０２３７】
修飾クロストリジウム毒素をコードする適切な昆虫発現構成体を構築するためには、配列番号８５のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードする配列番号１３６のポリヌクレオチド分子の５’及び３’末端の中に、作動的に連結されたポリヌクレオチド分子をｐＢＡＣｇｕｓベクター（ＥＭＤバイオサイエンシーズ・ノバゲン、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）内にクローニングするのに適した制限エンドヌクレアーゼ部位を取り込む。このポリヌクレオチド分子を合成し、実施例１に記載された通りｐＵＣＢＨＢ１／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂ構成体を得る。１）ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードする配列番号１３６の読取り枠を含有するインサートを切除し；かつ２）このインサートがｐＢＡＣｇｕｓ３ベクターに作動的に連結され得るようにする制限酵素で、この構成体を消化させる。ｐＢＡＣｇｕｓ３／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂを生成するべく、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化されるｐＢＡＣｇｕｓ３ベクター内にＴ４ＤＮＡリガーゼ手順を用いてこのインサートをサブクローニングする。熱ショック法を用いてライゲーション混合物を化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）へと形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する１．５％のＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ寒天平板（ｐＨ７．０）上に平板固定し、一晩成長させるために３７℃のインキュベータ内に入れる。発現構成体を含む細菌を、アンピシリン耐性コロニーとして同定する。アルカリ溶菌プラスミド少量調製手順を用いて、候補構成体を単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化地図作成により分解してインサートの存在及び配向を判定する。このクローニング戦略は、アミノ末端ｇｐ６４シグナルペプチド及びカルボキシル末端、トロンビン分割可能ポリヒスチジン結合ペプチドに対して作動的に連結された配列番号８５のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードする配列番号１３６のポリヌクレオチド分子を含むｐＢＡＣｇｕｓ３発現構成体を生成した（図１１）。
【０２３８】
配列番号８５のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードする配列番号１０９のポリヌクレオチド分子；配列番号８６のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｘａをコードする配列番号１１０又は配列番号１３７；配列番号８７のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ２Ｔｐをコードする配列番号１１１又は配列番号１３８のポリヌクレオチド分子；配列番号８８のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ２Ｘａをコードする配列番号１１２又は配列番号１３９のポリヌクレオチド分子；配列番号８９のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ３Ｔｂをコードする配列番号１１３又は配列番号１４０のポリヌクレオチド分子；配列番号９０のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ３Ｘａをコードする配列番号１１４又は配列番号１４１のポリヌクレオチド分子；配列番号９１のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ４Ｔｂをコードする配列番号１１５又は配列番号１４２のポリヌクレオチド分子；及び配列番号９２のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ４Ｘａをコードする配列番号１１６又は配列番号１４３のポリヌクレオチド分子を含むｐＢＡＣｇｕｓ３発現構成体を作製するために類似のクローニング戦略が使用される。
【０２３９】
配列番号９３のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ１Ｘａをコードする配列番号１１７のポリヌクレオチド分子；配列番号９４のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ１Ｘａをコードする配列番号１１８又は配列番号１４５；配列番号９５のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ２Ｔｐをコードする配列番号１１９又は配列番号１４６のポリヌクレオチド分子；配列番号９６のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ２Ｘａをコードする配列番号１２０又は配列番号１４７のポリヌクレオチド分子；配列番号９７のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードする配列番号１２１又は配列番号１４８のポリヌクレオチド分子；配列番号９８のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ３Ｘａをコードする配列番号１２２又は配列番号１４９のポリヌクレオチド分子；配列番号９９のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ４Ｔｂをコードする配列番号１２３又は配列番号１５０のポリヌクレオチド分子；及び配列番号１００のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ４Ｘａをコードする配列番号１２４又は配列番号１５１のポリヌクレオチド分子を含むｐＢＡＣｇｕｓ３発現構成体を作製するために類似のクローニング戦略が使用される。
【０２４０】
配列番号１０１のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードする配列番号１２５のポリヌクレオチド分子、配列番号１０２のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ１Ｘａをコードする配列番号１２６又は配列番号１５３のポリヌクレオチド分子；配列番号１０３のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ２Ｔｐをコードする配列番号１２７又は配列番号１５４のポリヌクレオチド分子；配列番号１０４のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ２Ｘａをコードする配列番号１２８又は配列番号１５５のポリヌクレオチド分子；配列番号１０５のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ３Ｔｂをコードする配列番号１２９又は配列番号１５６のポリヌクレオチド分子；配列番号１０６のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ３Ｘａをコードする配列番号１３０又は配列番号１５７のポリヌクレオチド分子；配列番号１０７のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ４Ｔｂをコードする配列番号１３１又は配列番号１５８のポリヌクレオチド分子；及び配列番号１０８のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ４Ｘａをコードする配列番号１３２又は配列番号１５９のポリヌクレオチド分子を含むｐＢＡＣｇｕｓ３発現構成体を作るために類似のクローニング戦略が使用される。
【０２４１】
バキュロウイルス発現系を用いて修飾クロストリジウム毒素を発現させるためには、２ｍＬのＢａｃ  Ｖｅｃｔｏｒ（登録商標）昆虫培地（ＥＭＤバイオサイエンシーズ・ノバゲン、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）が入った４枚の６０ｍｍの培養皿の中に、約２．５×１０６のＳｆ９細胞を平板固定し、２８℃のインキュベータの中で約２０分間インキュベートする。各トランスフェクションについて、例えばｐＢＡＣｇｕｓ３／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂといったような修飾クロストリジウム毒素をコードするｐＢＡＣｇｕｓ３構成体１００ｎｇ及び５００ｎｇのＴｌｏｗＥ転移プラスミドを含有する２５μＬのＢａｃＶｅｃｔｏｒ（登録商標）昆虫培地を、５μＬのＩｎｓｅｃｔ  ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（登録商標）（ＥＭＤバイオサイエンシーズ・ノバゲン、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）及びヌクレアーゼを含まない２０ｍＬの水を含有する２５μＬの希釈Ｉｎｓｅｃｔ  ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（登録商標）に添加することによって６ｍＬのポリスチレン管の中で５０μＬのトランスフェクション溶液を調製し、この溶液を約１５分間インキュベートする。１５分のインキュベーションの後、トランスフェクション溶液に対し４５０μＬのＢａｃＶｅｃｔｏｒ（登録商標）培地を添加し、穏やかに混合する。１／１０希釈物としてこのトランスフェクション原液を用いて、１／５０、１／２５０及び１／１２５０希釈の付加的なトランスフェクション溶液を作る。抗生物質も血清も含まないＢａｃＶｅｃｔｏｒ（登録商標）昆虫培地で２回洗浄した４枚の６０ｍｍの培養皿のうちの１枚からのＳｆ９細胞に対してトランスフェクション溶液１００μＬを添加し、２２℃でインキュベーションする。１時間後に、５％のウシ血清アルブミンを含有する１％のＢａｃＰｌａｑｕｅアガロース−ＢａｃＶｅｃｔｏｒ（登録商標）昆虫培地６ｍＬを添加する。アガロースを凝固させた後、トランスフェクションを受けた細胞に対し５％のウシ血清アルブミンを含有するＢａｃＶｅｃｔｏｒ（登録商標）昆虫培地を２ｍＬ加え、細胞を、溶菌斑が目に見えるまで３〜５日間２８℃のインキュベータに移す。トランスフェクションから３〜５日後に、２８℃のインキュベータ内で約２時間２０ｍｇ／ｍＬのＸ−Ｇｌｕｃ溶液（ＥＭＤバイオサイエンシーズ・ノバゲン、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）３０μＬを含有する２ｍＬのＢａｃＶｅｃｔｏｒ（登録商標）昆虫培地を用いて洗浄済み単分子層をインキュベートすることによってｐＢＡＣｇｕｓ３／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂを含有する組換え型ウイルス溶菌斑の存在についてテストするため、β−グルクロニダーゼリポータ遺伝子活性について単分子層中の溶菌斑を染色することになる。
【０２４２】
候補組換え型ウイルス溶菌斑を同定した後、いくつかの候補ウイルス溶菌斑を溶離させ、溶菌斑を精製する。組換え型ウイルスを溶離するためには、無菌のネジ蓋バイアル内で１ｍＬのＢａｃＶｅｃｔｏｒ（登録商標）昆虫培地（ＥＭＤバイオサイエンシーズ・ノバゲン、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）に対し無菌のパスツールピペットで、組換え型ウイルス溶菌を含むプラグを移す。２２℃で約２時間か又は４℃で約１６時間バイアルをインキュベートする。各々の組換え型ウイルス溶菌斑について、２ｍＬのＢａｃＶｅｃｔｏｒ（登録商標）昆虫培地（ＥＭＤバイオサイエンシーズ・ノバゲン、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）の入った３５ｍｍ入りの培養皿の中に２．５×１０５のＳｆ９細胞を平板固定し、２８℃のインキュベータ内で約２０分間インキュベーションする。培地を取り出し、２００μＬの溶離した組換え型ウイルスを添加する。１時間後に、５％のウシ血清アルブミンを含む１％のＢａｃＰｌａｑｕｅアガロース−ＢａｃＶｅｃｔｏｒ（登録商標）２ｍＬを加える。アガロースが凝固した後、５％のウシ血清アルブミンを含むＢａｃＶｅｃｔｏｒ（登録商標）１ｍＬをトランスフェクション済み細胞に添加し、溶菌斑が目に見えるまで３〜５日間２８℃のインキュベータに細胞を移す。トランスフェクションから３〜５日後に、２８℃のインキュベータ内で約２時間２０ｍｇ／ｍＬのＸ−Ｇｌｕｃ溶液（ＥＭＤバイオサイエンシーズ・ノバゲン、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）３０μＬを含有する２ｍＬのＢａｃＶｅｃｔｏｒ（登録商標）昆虫培地を用いて洗浄済み単分子層をインキュベートすることによってｐＢＡＣｇｕｓ３／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂを含有する組換え型ウイルス溶菌斑の存在についてテストするため、β−グルクロニダーゼリポータ遺伝子活性について単分子層中の溶菌斑を染色することになる。
【０２４３】
ウイルスの種子株を調製するためには、無菌のネジ蓋バイアル内でＢａｃＶｅｃｔｏｒ（登録商標）（ＥＭＤバイオサイエンシーズ・ノバゲン、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）１ｍＬに対して無菌のパスツールピペットで組換え型ウイルス溶菌斑を含有するプラグを移すことによって組換え型ウイルスを溶離する。４℃で約１６時間バイアルをインキュベーションする。５ｍＬのＢａｃＶｅｃｔｏｒ（登録商標）（ＥＭＤバイオサイエンシーズ・ノバゲン、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）の入ったＴ−２５フラスコ内で約５×１０５のＳｆ９細胞を平板固定し、２８℃のインキュベータ内で約２０分間インキュベーションする。培地をとり出し３００μＬの溶離済み組換え型ウイルスを添加する。１時間後、トランスフェクションを受けた細胞に対して５％のウシ血清アルブミンを含有する５ｍＬのＢａｃＶｅｃｔｏｒ（登録商標）を添加し、大部分の細胞が付着しなくなり不健全になるまで３〜５日間２８℃のインキュベータに細胞を移す。１５ｍＬのスナップ蓋管に培地を移し５分間１０００×ｇで管を遠心分離してデブリを除去することによってウイルスを収獲する。清澄化した上清を新鮮な１５ｍＬ入りスナップ蓋管に移し、４℃で保管する。
【０２４４】
高力価のウイルス株を調製するためには、１０ｍＬのＢａｃＶｅｃｔｏｒ（登録商標）（ＥＭＤバイオサイエンシーズ・ノバゲン、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）が入ったＴ−７５フラスコの中に約２×１０７個のＳｆ９細胞を平板固定し、２８℃のインキュベータ内で約２０分間インキュベーションする。培地を取り出し、５００μＬのウイルス種子株を添加する。１時間後に、トランスフェクションを受けた細胞に対して５％のウシ血清アルブミンを含有する１０ｍＬのＢａｃＶｅｃｔｏｒ（登録商標）を添加し、大部分の細胞が付着しなくなり不健全になるまで３〜５日間２８℃のインキュベータに細胞を移す。１５ｍＬのスナップ蓋管に培地を移し５分間１０００×ｇで管を遠心分離してデブリを除去することによってウイルスを収獲する。清澄化した上清を新鮮な１５ｍＬ入りスナップ蓋管に移し、４℃で保管する。高力価ウイルス株は、約２×１０８〜３×１０９ｐｆｕのバキュロウイルスを含有しているはずである。
【０２４５】
バキュロウイルス発現系を用いてｇｐ６４−ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂを発現するためには、２５０ｍＬのＢａｃＶｅｃｔｏｒ（登録商標）を含有する１Ｌ入りフラスコの中に約１．２５×１０８個のＳｆ９細胞を播種し、約５×１０８の細胞密度になるまで軌道振盪装置（１５０ｒｐｍ）内で成長させる。高力価株の組換え型バキュロウイルス約２．５×１０９を培養に接種し、２８℃の軌道振盪装置（１５０ｒｐｍ）内で約４８時間インキュベーションする。管に培地を移し、５分間５００×ｇで管を遠心分離してデブリを除去することにより培地を収獲する。２×ＬＤＳの試料緩衝液（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）に培地試料を添加し、抗ＢｏＮＴ／Ａ又は抗Ｈｉｓ抗体のいずれかを使用したウェスタンブロット分析（実施例５に記載されている通り）により発現を測定して、ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂを発現するバキュロウイルス株を同定する。
【０２４６】
実施例５に記載されている通りに、ＩＭＡＣ手順を用いてＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂを精製する。一定量のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂが産生されたか否かを判定するべく、各培養からの発現をブラッドフォード染料検定、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法及びウェスタンブロット分析（実施例５で記載されている通り）によって評価する。
【０２４７】
実施例８：哺乳動物細胞中での修飾クロストリジウム毒素の発現
以下の実施例は、哺乳動物細胞中で本明細書中に開示された修飾クロストリジウム毒素のいずれかを発現するために有用な手順を例示している。
【０２４８】
修飾クロストリジウム毒素をコードする適切な哺乳動物発現構成体を構築するためには、配列番号８５のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードする配列番号１３６のポリヌクレオチド分子の５’及び３’末端の中に、作動的に連結されたポリヌクレオチド分子をｐＳｅｃＴａｇ２ベクター（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）内にクローニングするのに適した制限エンドヌクレアーゼ部位を取り込む。このポリヌクレオチド分子を合成し、実施例１に記載された通りｐＵＣＢＨＢ１／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂ構成体を得る。１）ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードする配列番号１３６の読取り枠を含有するインサートを切除し；かつ２）このインサートがｐＳｅｃＴａｇ２ベクターに作動的に連結され得るようにする制限酵素で、この構成体を消化させる。ｐＳｅｃＴａｇ２／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂを生成するべく、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化されるｐＳｅｃＴａｇ２ベクター内にＴ４ＤＮＡリガーゼ手順を用いてこのインサートをサブクローニングする。熱ショック法を用いてライゲーション混合物を化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α細胞（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）へと形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（商標）を含有する１．５％のルリア・ベルターニ寒天平板（ｐＨ７．０）上に平板固定し、一晩成長させるために３７℃のインキュベータ内に入れる。発現構成体を含む細菌を、アンピシリン耐性コロニーとして同定する。アルカリ溶菌プラスミド少量調製手順を用いて、候補構成体を単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化地図作成により分解してインサートの存在及び配向を判定する。このクローニング戦略は、カルボキシル末端ｃ−ｍｙｃ及びポリヒスチジン結合ペプチドに対して作動的に連結された配列番号８５のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードする配列番号１３６のポリヌクレオチド分子を含むｐＳｅｃＴａｇ２発現構成体を生成した（図１２）。
【０２４９】
配列番号８５のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードする配列番号１０９のポリヌクレオチド分子；配列番号８６のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｘａをコードする配列番号１１０又は配列番号１３７；配列番号８７のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ２Ｔｐをコードする配列番号１１１又は配列番号１３８のポリヌクレオチド分子；配列番号８８のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ２Ｘａをコードする配列番号１１２又は配列番号１３９のポリヌクレオチド分子；配列番号８９のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ３Ｔｂをコードする配列番号１１３又は配列番号１４０のポリヌクレオチド分子；配列番号９０のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ３Ｘａをコードする配列番号１１４又は配列番号１４１のポリヌクレオチド分子；配列番号９１のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ４Ｔｂをコードする配列番号１１５又は配列番号１４２のポリヌクレオチド分子；及び配列番号９２のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ４Ｘａをコードする配列番号１１６又は配列番号１４３のポリヌクレオチド分子を含むｐＳｅｃＴａｇ２発現構成体を作製するために類似のクローニング戦略が使用される。
【０２５０】
配列番号９３のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ１Ｘａをコードする配列番号１１７のポリヌクレオチド分子；配列番号９４のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ１Ｘａをコードする配列番号１１８又は配列番号１４５；配列番号９５のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ２Ｔｐをコードする配列番号１１９又は配列番号１４６のポリヌクレオチド分子；配列番号９６のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ２Ｘａをコードする配列番号１２０又は配列番号１４７のポリヌクレオチド分子；配列番号９７のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードする配列番号１２１又は配列番号１４８のポリヌクレオチド分子；配列番号９８のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ３Ｘａをコードする配列番号１２２又は配列番号１４９のポリヌクレオチド分子；配列番号９９のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ４Ｔｂをコードする配列番号１２３又は配列番号１５０のポリヌクレオチド分子；及び配列番号９９のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ４Ｘｂをコードする配列番号１２３又は配列番号１５０のポリヌクレオチド分子；及び配列番号１００のＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ４Ｘａをコードする配列番号１２４又は配列番号１５１のポリヌクレオチド分子を含むｐＳｅｃＴａｇ２発現構成体を作製するために類似のクローニング戦略が使用される。
【０２５１】
配列番号１０１のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ１Ｔｂをコードする配列番号１２５のポリヌクレオチド分子、配列番号１０２のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ１Ｘａをコードする配列番号１２６又は配列番号１５３のポリヌクレオチド分子；配列番号１０３のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ２Ｔｐをコードする配列番号１２７又は配列番号１５４のポリヌクレオチド分子；配列番号１０４のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ２Ｘａをコードする配列番号１２８又は配列番号１５５のポリヌクレオチド分子；配列番号１０５のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ３Ｔｂをコードする配列番号１２９又は配列番号１５６のポリヌクレオチド分子；配列番号１０６のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ３Ｘａをコードする配列番号１３０又は配列番号１５７のポリヌクレオチド分子；配列番号１０７のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ４Ｔｂをコードする配列番号１３１又は配列番号１５８のポリヌクレオチド分子；及び配列番号１０８のＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ４Ｘａをコードする配列番号１３２又は配列番号１５９のポリヌクレオチド分子を含むｐＳｅｃＴａｇ２発現構成体を作るために類似のクローニング戦略が使用される。
【０２５２】
細胞系統内で修飾クロストリジウム毒素を過渡的に発現するためには、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１倍のペニシリン／ストレプトマイシン溶液（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）及び１倍のＭＥＭ可欠アミノ酸溶液（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）で補足された３ｍＬの完全ダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）が入った３５ｍｍの組織培養皿の中に、約１．５×１０５のＳＨＳＹ５Ｙ細胞を平板固定し、細胞が約５×１０５細胞／ｍｌの密度に達するまで５％の二酸化炭素下で３７℃のインキュベータ内で成長させる（６〜１６時間）。例えばｐＳｅｃＴａｇ２／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂといったような修飾クロストリジウム毒素をコードするｐＳｅｃＴａｇ２発現構成体を５μｇ含有する２５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ血清低減培地に対し、５分間室温でインキュベーションした１５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ  ２０００（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）を含有する２５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ血清低減培地を添加することにより、５００μＬのトランスフェクション溶液を調製する。このトランスフェクションを約２０分間室温でインキュベーションする。完全な補足済みＤＭＥＭ培地を２ｍＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ血清低減培地で交換し、５００μＬのトランスフェクション溶液をＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に添加し、細胞を約６〜１８時間、５％の二酸化炭素下で３７℃のインキュベータ内でインキュベーションする。トランスフェクション培地を３ｍＬの新鮮な完全な補足済みＤＭＥＭと交換し、細胞を４８時間５％の二酸化炭素下で３７℃のインキュベータ内でインキュベーションする。ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂの発現分析のため、培地と細胞の両方を収集する。１５ｍＬ入りのスナップ蓋管に培地を移し、５分間５００×ｇで管を遠心分離してデブリを除去することにより培地を収獲する。ｐＨ７．４の１００ｍＭのリン酸緩衝食塩水３．０ｍＬで一回細胞を洗い流し、６２．６ｍＭの２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１．３−プロパンジオール塩酸（トリス−ＨＣｌ）、ｐＨ６．３及び２％のラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有する緩衝液で細胞を溶解させることにより細胞を収獲する。２×ＬＤＳの試料緩衝液（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）に対して培地及び細胞試料の両方を添加し、ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂを発現するｐＳｅｃＴａｇ２構成体を同定するために、抗−ＢｏＮＴ／Ａ、抗−Ｃ−ｍｙｃ又は抗−Ｈｉｓ抗体のいずれかを用いたウェスタンブロット分析（実施例５に記載した通り）により発現を測定する。配列番号８６〜配列番号１０８の修飾クロストリジウム毒素のいずれかをコードするｐＳｅｃＴａｇ２構成体を過渡的に発現するために、類似の手順を使用することができる。
【０２５３】
修飾クロストリジウム毒素を発現する安定した形で組込まれた細胞系統を生成するためには、１０％のＦＢＳ、１倍のペニシリン／ストレプトマイシン溶液（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）及び１倍のＭＥＭ可欠アミノ酸溶液（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）で補足された３ｍＬＤＭＥＭが入った３５ｍｍの組織培養皿の中に、約１．５×１０５のＳＨＳＹ５Ｙ細胞を平板固定し、細胞が約５×１０５細胞／ｍｌの密度に達するまで５％の二酸化炭素下で３７℃のインキュベータ内で成長させる（６〜１６時間）。例えばｐＳｅｃＴａｇ２／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂといったような修飾クロストリジウム毒素をコードするｐＳｅｃＴａｇ２発現構成体を５μｇ含有する２５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ血清低減培地に対し、５分間室温でインキュベーションした１５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ  ２０００（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）を含有する２５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ血清低減培地を添加することにより、５００μＬのトランスフェクション溶液を調製する。このトランスフェクション溶液を約２０分間室温でインキュベーションする。完全な補足済みＤＭＥＭ培地を２ｍＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ血清低減培地で交換し、５００μＬのトランスフェクション溶液をＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に添加し、細胞を約６〜１８時間、５％の二酸化炭素下で３７℃のインキュベータ内でインキュベーションする。トランスフェクション培地を３ｍＬの新鮮な完全な補足済みＤＭＥＭと交換し、細胞を約４８時間５％の二酸化炭素下で３７℃のインキュベータ内でインキュベーションする。約５μｇ／ｍＬのゼオシン（商標）、１０％のＦＢＳ、１×ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）及び１×ＭＥＭ可欠アミノ酸溶液（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）を含有する新鮮な完全ＤＭＥＭで培地を交換する。４〜５日に１回古い培地を新鮮なゼオシン（商標）選択的完全補足済みＤＭＥＭで交換しながら、約３〜４週間５％の二酸化炭素下で３７℃のインキュベータ内で細胞をインキュベーションする。ひとたびゼオシン（商標）耐性コロニーが確立されたならば、耐性クローンを、細胞が６〜２０×１０５細胞／ｍＬの密度に達するまで、約５μｇ／ｍＬのゼオシン（商標）、１０％のＦＢＳ、１倍のペニシリン／ストレプトマイシン溶液（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）及び１倍のＭＥＭ可欠アミノ酸溶液（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）で補足された新鮮な完全ＤＭＥＭを含有する新しい３５ｍｍの培養平板に再度平板固体する。ｐＳｅｃＴａｇ２／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂを安定した形で組込んだＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞系統からのＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂの発現についてテストするためには、各細胞系統からの約１．５×１０５個のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、３ｍＬのゼオシン（商標）選択的な完全補足済みＤＭＥＭを含む３５ｍｍの組織培養皿内で平板固定し、細胞が約５×１０５細胞／ｍｌの密度に達するまで５％の二酸化炭素下で３７℃のインキュベータ内で成長させる���６〜１６時間）。培地を、ＤＭＥＭで補足された新鮮なゼオシン（商標）選択的な完全補足済みＤＭＥＭ３ｍＬで交換し、４８時間５％の二酸化炭素下で、３７℃のインキュベータ内で細胞をインキュベーションする。ＢｏＮＴ／Ａ−ｃ−ｍｙｃ−Ｈｉｓの発現分析のため、培地と細胞の両方を収集する。１５ｍＬ入りのスナップ蓋管に培地を移し、５分間５００×ｇで管を遠心分離してデブリを除去することにより培地を収獲する。ｐＨ７．４の１００ｍＭのリン酸緩衝食塩水３．０ｍＬで一回細胞を洗い流し、６２．６ｍＭの２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１．３−プロパンジオール塩酸（トリス−ＨＣｌ）、ｐＨ６．８及び２％のラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有する緩衝液で細胞を溶解させることにより細胞を収獲する。２×ＬＤＳの試料緩衝液（インビトロジェン、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）に対して培地及び細胞試料の両方を添加し、ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂを発現するＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞系統を同定するために、抗−ＢｏＮＴ／Ａ、抗−Ｃ−ｍｙｃ又は抗−Ｈｉｓ抗体のいずれかを用いたウェスタンブロット分析（実施例５に記載した通り）により発現を測定する。３Ｌ入りフラスコを用いて大規模発現のために最高のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂ発現レベルを示す確立されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を選択する。大規模発現のための手順は、出発体積が約８００〜１０００ｍＬの完全ＤＭＥＭであり、全ての試薬の濃度がこの体積について比例的に増大させられるという点を除いて以上で概略的に示された通りである。配列番号８６〜配列番号１０８の修飾クロストリジウム毒素のいずれかをコードするｐＳｅｃＴａｇ２構成体を安定した形で発現するために、類似の手順を使用することができる。
【０２５４】
実施例５に記載されている通りに、ＩＭＡＣ手順を用いてＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂを精製する。一定量のＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂが産生されたか否かを判定するべく、各培養からの発現をブラッドフォード染料検定、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法及びウェスタンブロット分析（実施例５で記載されている通り）によって評価する。
【０２５５】
本発明の態様について、開示された実施形態を参考にして記載してきたが、当業者であれば、開示された特定の実施例がこれらの態様をあくまでも例示するものにすぎず、いかなる形であれ本発明を制限するものではないということを容易に認識することだろう。本発明の精神から逸脱することなく、さまざまな修正を行なうことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０２５６】
【図１】活性化されたＰＡＲが分解のためリソソームに向かって主にターゲティングされていることを示している。ＰＡＲは不可逆的な機序により活性化され、ひとたび分割された時点で、大部分の活性化されたＰＡＲは、エンドサイトーシスを受け、細胞内トラフィッキング経路により、分解のためにリソソームへと導かれる。ステップ１は、連結リガンドをアンマスクするためのプロテアーゼによる不活性化ＰＡＲの分割を例示している（太線囲み）。ステップ２は、活性化ＰＡＲの連結リガンド結合及び立体配座変化を例示する。ステップ３は、活性化ＰＡＲのエンドサイトーシスを例示する。ステップ４は、リソソームに対するレセプターのトラフィッキングを結果としてもたらす内在化された活性化ＰＡＲの早期及び晩期エンドソーム選別を例示している。ステップ５は、リソソーム内部のプロテアーゼによる内在化された活性化ＰＡＲの分解を例示している。
【図２】連結リガンドを含む修飾クロストリジウム毒素が、分解のためにリソソームに向かってターゲティングされていることを示している。循環系内に拡散するこのような修飾毒素は、不活性ＰＡＲに結合することができ、こうしてエンドサイトーシスそして分解のためのリソソームに対する細胞内トラフィッキングによる内在化毒素の誘導が開始されることになる。ステップ１は、ＰＡＲに対する連結リガンドドメイン（太線囲み）を含む修飾クロストリジウム毒素の結合を例示している。ステップ２は、毒素−ＰＡＲ複合体のエンドサイトーシスを例示する。ステップ３は、リソソームに対する複合体のトラフィッキングを結果としてもたらす内在化毒素−ＰＡＲ複合体の早期及び晩期エンドソーム選別を例示している。ステップ５は、リソソーム内でのプロテアーゼによる内在化毒素−ＰＡＲ−複合体の分解を例示している。
【図３】中枢及び末梢ニューロンにおける神経伝達物質放出及びクロストリジウム毒素中毒の現行のパラダイムの概略図を示す。図３ａは、中枢及び末梢ニューロンの神経伝達物質放出の機序についての概略図を示す。放出プロセスは、次の２つのステップを含むものとして記載可能である；１）神経伝達物質分子を含有する小胞の小胞結合型ＳＮＡＲＥタンパク質が原形質膜にある膜結合型ＳＮＡＲＥタンパク質と会合する小胞ドッキングステップ；及び２）小胞が原形質膜と融合し、神経伝達物質分子がエキソサイトーシスを受ける、神経伝達物質の放出ステップ。図３ｂは、中枢及び末梢ニューロンにおける破傷風及びボツリヌス毒素活性についての中毒機序の概略図を示す。この中毒プロセスは、以下の４つのステップを含むものとして記載できる；１）クロストリジウム毒素がクロストリジウムレセプター系に結合し、中毒プロセスを開始させる、レセプター結合ステップ；２）毒素結合の後、毒素／レセプター系複合体を含有する小胞が細胞内にエンドサイトーシスされる、複合体内在化ステップ；３）例えば小胞の内部ｐＨの変化、クロストリジウム毒素重鎖のＨＮドメインを含むチャンネル孔の形成、重鎖からのクロストリジウム毒素軽鎖の分離及び活性軽鎖の放出を含めた、多数の事象が発生すると考えられている軽鎖転移ステップ、及び４）クロストリジウム毒素の活性化軽鎖がＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰ又はＳｙｎｔａｘｉｎといったようなその標的ＳＮＡＲＥ基質をタンパク質分解により分割し、かくして小胞ドッキング及び神経伝達物質の放出を防止するステップ。
【図４】酵素ドメインのアミノ末端にあるＰＡＲリガンドドメインを伴う修飾クロストリジウム毒素を示す。図４Ａは、２重ＳＳカッコにより描かれている２鎖ループ領域及び２鎖ループ分割後の結果として得られる２鎖形態と共に、ＰＡＲリガンドドメイン、酵素ドメイン、転移ドメイン及び結合ドメインを含むアミノからカルボキシルまでの線形組織をもつクロストリジウム毒素の単一ポリペプチド形態を描いている。この実施例では、マスクされたＰＡＲリガンドドメインが酵素ドメインのアミノ末端に位置設定され、タンパク質分解分割部位（Ｐ１）がＰＡＲリガンド結合ドメインの前に位置設定されている。Ｐ１プロテアーゼでのタンパク質分解分割の時点で、ＰＡＲリガンドドメインはアンマスクされた状態となる。Ｐ２は、毒素の１本鎖形態を２鎖形態に転換させるために使用されるプロテアーゼ切断部位である。Ｐ１もＰ２の両方共、ＰＡＲ内因性プロテアーゼ切断部位又は外因性プロテアーゼ切断部位であり得、同じプロテアーゼ又は異なるプロテアーゼにより分割され得る。図４Ｂは、２鎖ループ部域が２重ＳＳカッコで描かれている状態で、ＰＡＲリガンドドメイン、酵素ドメイン、結合ドメイン及び転移ドメインを含むアミノからカルボキシルまでの線形組織をもつクロストリジウム毒素の単一ポリペプチド形態を描いている。この実施例では、マスクされたＰＡＲリガンドドメインが酵素ドメインのアミノ末端に位置設定され、タンパク質分解分割部位（Ｐ１）が、ＰＡＲリガンド結合ドメインの前に位置設定されている。Ｐ１プロテアーゼでのタンパク質分解分割の時点で、ＰＡＲリガンドドメインはアンマスク状態になる。Ｐ２は、毒素の１本鎖形態から２鎖形態へと転換するために用いられるプロテアーゼ切断部位である。Ｐ１もＰ２も両方共、ＰＡＲ内因性プロテアーゼ切断部位又は外因性プロテアーゼ切断部位であり得、同じプロテアーゼ又は異なるプロテアーゼにより分割され得る。図４Ｃは、２鎖ループ領域が２重ＳＳカッコで描かれている状態で、ＰＡＲリガンドドメイン、酵素ドメイン、転移ドメイン及び結合ドメインを含むアミノからカルボキシルまでの線形組織をもつクロストリジウム毒素の単一ポリペプチド形態を描いている。この実施例では、アンマスクされたＰＡＲリガンドドメインが酵素ドメインのアミノ末端に位置設定されている。Ｐ２は、毒素の１本鎖形態から２鎖形態へと転換するために用いられるプロテアーゼ切断部位であり、ＰＡＲ内因性プロテアーゼ切断部位又は外因性プロテアーゼ切断部位であり得る。図４Ｄは、２鎖ループ領域が２重ＳＳカッコで描かれている状態で、ＰＡＲリガンドドメイン、酵素ドメイン、結合ドメイン及び転移ドメインを含むアミノからカルボキシルまでの線形組織をもつクロストリジウム毒素の単一ポリペプチド形態を描いている。この実施例では、アンマスクされたＰＡＲリガンドドメインが酵素ドメインのアミノ末端に位置設定されている。Ｐ２は、毒素の１本鎖形態から２鎖形態へと転換するために用いられるプロテアーゼ切断部位であり、ＰＡＲ内因性プロテアーゼ切断部位又は外因性プロテアーゼ切断部位であり得る。
【図５】転移ドメインのアミノ末端にあるＰＡＲリガンドドメインを伴う修飾クロストリジウム毒素を示す。図５Ａは、２重ＳＳカッコにより描かれている２鎖ループ領域及び２鎖ループ分割後の結果として得られる２鎖形態と共に、結合ドメイン、酵素ドメイン、ＰＡＲリガンドドメイン及び転移ドメインを含むアミノからカルボキシルまでの線形組織をもつクロストリジウム毒素の単一ポリペプチド形態を描いている。この実施例では、マスクされたＰＡＲリガンドドメインが酵素ドメインのアミノ末端に位置設定され、タンパク質分解分割部位（Ｐ１）がＰＡＲリガンド結合ドメインの前に位置設定されている。Ｐ１プロテアーゼでのタンパク質分解分割の時点で、ＰＡＲリガンドドメインはアンマスクされた状態となる。Ｐ１は、同様に、毒素の１本鎖形態を２鎖形態に転換させるために使用されるプロテアーゼ切断部位である。Ｐ１は、ＰＡＲ内因性プロテアーゼ切断部位又は外因性プロテアーゼ切断部位であり得る。図５Ｂは、２鎖ループ部域が２重ＳＳカッコで描かれている状態で、酵素ドメイン、ＰＡＲリガンドドメイン、転移ドメイン及び結合ドメインを含むアミノからカルボキシルまでの線形組織をもつクロストリジウム毒素の単一ポリペプチド形態を描いている。この実施例では、マスクされたＰＡＲリガンドドメインが転移ドメインのアミノ末端に位置設定され、タンパク質分解分割部位（Ｐ１）が、ＰＡＲリガンド結合ドメインの前に位置設定されている。Ｐ１プロテアーゼでのタンパク質分解分割の時点で、ＰＡＲリガンドドメインはアンマスク状態になる。Ｐ１は同様に毒素の１本鎖形態から２鎖形態へと転換するために用いられるプロテアーゼ切断部位である。Ｐ１は、ＰＡＲ内因性プロテアーゼ切断部位又は外因性プロテアーゼ切断部位であり得る。
【図６】結合ドメインのアミノ末端にあるＰＡＲリガンドドメインを伴う修飾クロストリジウム毒素を示す。図６は、２重ＳＳカッコにより描かれている２鎖ループ領域及び２鎖ループ分割後の結果として得られる２鎖形態と共に、酵素ドメイン、ＰＡＲリガンドドメイン、結合ドメイン及び転移ドメインを含むアミノからカルボキシルまでの線形組織をもつクロストリジウム毒素の単一ポリペプチド形態を描いている。この実施例では、マスクされたＰＡＲリガンドドメインが酵素ドメインのアミノ末端に位置設定され、タンパク質分解分割部位（Ｐ１）がＰＡＲリガンド結合ドメインの前に位置設定されている。Ｐ１プロテアーゼでのタンパク質分解分割の時点で、ＰＡＲリガンドドメインはアンマスクされた状態となる。Ｐ１は同様に、毒素の１本鎖形態を２鎖形態に転換させるために使用されるプロテアーゼ切断部位である。Ｐ１は、ＰＡＲ内因性プロテアーゼ切断部位又は外因性プロテアーゼ切断部位であり得る。
【図７】カルボキシル末端ポリヒスチジン結合ポリペプチドに作動的に連結された配列番号８５の修飾ＢｏＮＴ／Ａをコードする配列番号１３６ポリヌクレオチド分子を含む原核生物発現構成体ｐＥＴ２９ｂ／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂのプラスミド地図を示す。トリプシンプロテアーゼ切断部位が、ポリヒスチジン結合ポリペプチドと修飾ＢｏＮＴ／Ａの間で作動的に連結されている。略号は以下の通りである。すなわちＰＴ７、バクテリオファージＴ７プロモータ領域；トロンビン、ＰＡＲ１トロンビン分割部位をコードするポリヌクレオチド分子；ＰＡＲ１−ＬＤ、ＰＡＲ１リガンドドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＥＤ、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＴＤ、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＢＤ、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；トリプシン、トリプシン分割部位をコードするポリヌクレオチド分子；６×Ｈｉｓ、ポリヒスチジン結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；Ｔ７  ＴＴ、バクテリオファージＴ７転写終結領域；ｆ１  起点、バクテリオファージｆ１複製起点；カナマイシン、カナマイシン耐性を付与するアミノホスホトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド分子；ｐＢＲ３２２ｏｒｉ、プラスミド複製領域のｐＢＲ３２２起点；ｌａｃ1、ラクトースＩをコードするポリヌクレオチド分子。
【図８】カルボキシル末端ポリヒスチジン結合ポリペプチドに作動的に連結された配列番号９３の修飾ＢｏＮＴ／Ａをコードする配列番号１４４ポリヌクレオチド分子を含む原核生物発現構成体ｐＥＴ２９ｂ／ＢｏＮＴ／Ａ−ＴＤ−ＰＡＲ１Ｔｂのプラスミド地図を示す。トリプシンプロテアーゼ切断部位が、ポリヒスチジン結合ポリペプチドと修飾ＢｏＮＴ／Ａの間で作動的に連結されている。略号は以下の通りである。すなわちＰＴ７、バクテリオファージＴ７プロモータ領域；ＥＤ、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；トロンビン、ＰＡＲ１トロンビン分割部位をコードするポリヌクレオチド分子；ＰＡＲ１−ＬＤ、ＰＡＲ１リガンドドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＴＤ、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＢＤ、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；トリプシン、トリプシン分割部位をコードするポリヌクレオチド分子；６×Ｈｉｓ、ポリヒスチジン結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；Ｔ７  ＴＴ、バクテリオファージＴ７転写終結領域；ｆ１  起点、バクテリオファージｆ１複製起点；カナマイシン、カナマイシン耐性を付与するアミノホスホトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド分子；ｐＢＲ３２２ｏｒｉ、プラスミド複製領域のｐＢＲ３２２起点；Ｌａｃｌ、ラクトースＩをコードするポリヌクレオチド分子。
【図９】カルボキシル末端ポリヒスチジン結合ポリペプチドに作動的に連結された配列番号１０１の修飾ＢｏＮＴ／Ａをコードする配列番号１５２ポリヌクレオチド分子を含む原核生物発現構成体ｐＥＴ２９ｂ／ＢｏＮＴ／Ａ−ＢＤ−ＰＡＲ１Ｔｂのプラスミド地図を示す。トリプシンプロテアーゼ切断部位が、ポリヒスチジン結合ポリペプチドと修飾ＢｏＮＴ／Ａの間で作動的に連結されている。略号は以下の通りである。すなわちＰＴ７、バクテリオファージＴ７プロモータ領域；トロンビン、ＰＡＲ１トロンビン分割部位をコードするポリヌクレオチド分子；ＰＡＲ１−ＬＤ、ＰＡＲ１リガンドドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＥＤ、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＴＤ、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＢＤ、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；トリプシン、トリプシン分割部位をコードするポリヌクレオチド分子；６×Ｈｉｓ、ポリヒスチジン結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；Ｔ７  ＴＴ、バクテリオファージＴ７転写終結領域；ｆ１起点、バクテリオファージｆ１複製起点；カナマイシン、カナマイシン耐性を付与するアミノホスホトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド分子；ｐＢＲ３２２ｏｒｉ、プラスミド複製領域のｐＢＲ３２２起点；Ｌａｃｌ、ラクトースＩをコードするポリヌクレオチド分子。
【図１０】カルボキシル末端ｃ−ｍｙｃ及びポリヒスチジン結合ポリペプチドに作動的に連結された配列番号８５の修飾ＢｏＮＴ／Ａをコードする配列番号１３６ポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構成体ｐＰＩＣＺ  Ａ／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂのプラスミド地図を示す。略号は以下の通りである。すなわちＰＡＯＸ１、アルデヒドオキシダーゼ１プロモータ領域；トロンビン、ＰＡＲ１トロンビン分割部位をコードするポリヌクレオチド分子；ＰＡＲ１−ＬＤ、ＰＡＲ１リガンドドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＥＤ、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＴＤ、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＢＤ、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｃ結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；６×Ｈｉｓ、ポリヒスチジン結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；ＡＯＸ１ＴＴ、アルデヒドオキシダーゼ１転写終結領域；ゼオシン(商標)、ゼオシン（商標）耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；ｐＵＣ  ｏｒｉ、プラスミド複製領域のｐＵＣ３２２起点。
【図１１】カルボキシル末端ポリヒスチジン結合ポリペプチドに作動的に連結された配列番号８５の修飾ＢｏＮＴ／Ａをコードする配列番号１３６ポリヌクレオチド分子を含むバキュロウイルストランスファ構成体ｐＢＡＣｇｕｓ３／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂのプラスミド地図を示す。トロンビンプロテアーゼ切断部位が、修飾ＢｏＮＴ／Ａとポリヒスチジン結合ポリペプチドの間で作動的に連結されている。略号は以下の通りである。すなわちＰＰＨ、ポリヘドインプロモータ領域；ｇｐ６４、ｇｐ６４シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；トロンビン、ＰＡＲ１トロンビン分割部位をコードするポリヌクレオチド分子；ＰＡＲ１−ＬＤ、ＰＡＲ１リガンドドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＥＤ、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＴＤ、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＢＤ、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；Ｔｒｏｍｂｉｎ、トロンビンプロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド分子；６×Ｈｉｓ、ポリヒスチジン結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；ｐＵＣ  ｏｒｉ、プラスミド複製領域のｐＵＣ起点；アンピシリン、アンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼをコードするポリヌクレオチド分子；ｆ１ｏｒｉ、バクテリオファージｆ１複製起点；ｇｕｓ、β−グルクロニダーゼをコードするポリヌクレオチド分子。
【図１２】カルボキシル末端ｃ−ｍｙｃ及びポリヒスチジン結合ポリペプチドに作動的に連結された配列番号８５の修飾ＢｏＮＴ／Ａをコードする配列番号１３６ポリヌクレオチド分子を含む哺乳動物発現構成体ｐＳｅｃＴａｇ２／ＢｏＮＴ／Ａ−ＥＤ−ＰＡＲ１Ｔｂのプラスミド地図を示す。略号は以下の通りである。すなわちＰＣＭＶ、サイトメガロウイルスプロモータ領域；Ｉｇｋ、免疫グロブリンＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；トロンビン、ＰＡＲ１トロンビン分割部位をコードするポリヌクレオチド分子；ＰＡＲ１−ＬＤ、ＰＡＲ１リガンドドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＥＤ、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＴＤ、ＢｏＮＴ／Ａ転移ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ＢＤ、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド分子；ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｃ結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；６×Ｈｉｓ、ポリヒスチジン結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；ＢＧＨｐＡ、ウシ成長ホルモンポリアデニル化部位；ｆ１ｏｒｉ、バクテリオファージｆ１複製起点；ＰＳＶ４０、シミアンウイルス４０プロモータ領域；ゼオシン（商標）、ゼオシン（商標）耐性ポリペプチドをコードする領域；ｐＵＣ  ｏｒｉ、プラスミド複製領域のｐＵＣ起点；アンピシリン；アンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼをコードするポリヌクレオチド分子。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年4月27日(2007.4.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2008511338.tif 000217
2008511338.tif 000218
2008511338.tif 000219