(57)【要約】  ラクタム化によるペプチドの側鎖環化のための新規な方法が手供される。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクタム化によりペプチドを環化する方法において：
ａ．ペプチドのNαにおける塩基に不安定な保護基を保持しながら、アリル型保護基からペプチドを脱保護する工程であって、該ペプチドは、そのNαにおいて塩基に不安定な保護基で保護され、且つ該ペプチドは更に、リジン側鎖またはリジン側鎖類似体の少なくとも一つのアリルオキシ-カルボニル保護されたアミノ官能基を含み、更に、グルタミル側鎖またはアスパルチル側鎖またはこれら側鎖類似体の少なくとも一つのアリル-エステル保護されたω-カルボキシ基を含んでなり、前記アリル保護基は置換もしくは非置換である工程と；
ｂ．前記脱保護された側鎖を弱塩基試薬の存在下でラクタム化することにより、前記ペプチドを環化する工程と；
ｃ．そのNαにおける塩基に不安定な保護基から前記ペプチドを脱保護する工程と
を具備する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、塩基に不安定な保護基で保護された前記Nαが、前記更なるアリル−エステルで保護されたカルボキシ基のNαであり、また好ましくは、前記アスパルチル残基はジペプチド配列Asp-Hisの一部であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、更なる最終工程ｄ．として、前記脱保護されたNαの連続的なペプチド合成またはペプチド切片カップリングにより、前記ペプチドを更に伸長させることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、環化の際に、前記アリル保護基は樹脂ハンドルとして作用しないことを条件として、前記ペプチドは固相に結合され、また工程ｄ．のペプチド伸長は連続した固相ペプチド合成であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１または２に記載の方法であって、前記環化反応工程ｂ．は、非プロトン性溶媒中の弱塩基試薬の存在下で、且つ更なるカップリング試薬の存在下で行われることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記環化反応は、カップリング剤としてHCTUもしくはTCTU、またはベンゾトリアゾールのホスホニウム塩を用いて行われることを特徴とする方法
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、前記ペプチドは、酸に不安定な結合により樹脂支持体に連結されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１〜５の何れか１項に記載の方法であって、前記ペプチドは、酸に不安定な結合を介してC末端で共有結合されることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記塩基に不安定な保護基がFMOC基であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１または７に記載の方法であって、アリルアクセプターの存在下において、好ましくはアリルアクセプターとしての過剰量のR1-PhnSiHmを使用して、アリルおよびalloc保護基がPd(0)触媒によって除去され、ここでのR1は芳香族核における置換基のアリール、アルキルまたはアラルキルであり、nは1または2であり、mは2または3であり、より好ましくは、前記アリルアクセプターがPhSiH3であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
塩基に不安定な保護基で保護されたNαを有する次式IIまたはIIIの環状ペプチド：
【化１】
2008513403.tif 000009
ここで、Yは塩基に不安定な保護基であり、n＝1〜10、好ましくはn＝1または2、最も好ましくはn＝1であり、更に、m＝1〜15、好ましくはm＝3〜6、最も好ましくはm＝3であり、更に、x＝1〜200およびq＝0〜200であり、R1およびR2は各々独立に、天然のアミノ側鎖またはその非天然の誘導体であり、該側鎖は更にアリルエーテルおよびアリルオキシカルボニル保護基以外の保護基を含んでよく、またAは樹脂または樹脂ハンドルであり、或いは任意に、R2は天然のアミノ側鎖またはその非天然の誘導体であってもよく、該側鎖はエーテル、チオエーテル、エステル、チオエステル、アミドまたは二級もしくは三級アミノ部分を介して樹脂もしくは樹脂ハンドルに結合される：但し、そのときに、AはOH、NH2、NR’1HまたはNR’1R’2からなる群から選択され、R’1およびR’2は独立にC1-C4アルキルである。
【請求項１２】
請求項１１に記載のペプチドであって、前記塩基に不安定な基がFMOCであることを特徴とするペプチド。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載のペプチドであって、該ペプチドが、n＝1または2、より好ましくはn＝1の式IIのものであるペプチド。
【請求項１４】
請求項１１〜１３の何れか１項に記載のペプチドであって、Aは、アリル-オキシカルボニル部分を含む樹脂ハンドルを除き、樹脂ハンドルまたは樹脂連結部分を含んでなることを特徴とするペプチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載のペプチドであって、前記樹脂または樹脂ハンドルが次式IVのものであることを特徴とするペプチド：
【化２】
2008513403.tif 000010
ここで、R’’’は樹脂であり、またR’’1、R’’2、R’’3は独立に水素、C1-C4アルキルまたはC1-C4 アルコキシであり、同じでも異なってもよいが、R’’1、R’’2の一方のみが水素であることを条件とし、Lは酸素、硫黄、窒素であるか、または次式Vのものである：
【化３】
2008513403.tif 000011
【請求項１６】
請求項１５に記載のペプチドであって、前記樹脂または樹脂ハンドルは次式VIのものであり、またLが酸素および窒素からなる群から選択されることを条件として、基R’’’、R’’1およびR’’2についての上記定義が適用される。
【化４】
2008513403.tif 000012
【請求項１７】
請求項１６に記載のペプチドであって、前記樹脂または樹脂ハンドルは次式VIIのものであり、またLが酸素および窒素からなる群から選択されることを条件として、基R’’’、R’’1およびR’’2についての上記定義が適用される：
【化５】
2008513403.tif 000013
【請求項１８】
請求項１７に記載のペプチドであって、R’’’、R’’1およびR’’2は、Lが酸素である場合はR’’1およびR’’2の一方のみが水素であり得ることを条件として、独立に水素、メチルまたはメトキシであり、Xが窒素である場合は、独立にメチルまたはメトキシであり、好ましくはメトキシであることを特徴とするペプチド。
【請求項１９】
請求項１８に記載のペプチドであって、Xは酸素であり、R’’1は水素であり、R’’2はメチルまたはメトキシであり、また好ましくは、Aは樹脂または樹脂ハンドルであることを特徴とするペプチド。
【請求項２０】
請求項１９に記載のペプチドであって、R’’2がメチルであるペプチド。
【請求項２１】
塩基に不安定な保護基で保護されたNαを有する次式IIまたはIIIの環状ペプチド：
【化６】
2008513403.tif 000014
ここで、Yは塩基に不安定な保護基であり、n＝1〜10、好ましくはn＝1または2、最も好ましくはn＝1であり、更に、m＝1〜15、好ましくはm＝3〜6、最も好ましくはm＝3であり、更に、x＝1〜200およびq＝0〜200であり、R1およびR2は各々独立に、天然のアミノ側鎖またはその非天然の誘導体であり、該側鎖は更にアリルエーテルおよびアリルオキシカルボニル保護基以外の保護基を含んでよく、またAは樹脂または樹脂ハンドルであり、或いは任意に、R2は天然のアミノ側鎖またはその非天然の誘導体であり、該側鎖はエーテル、チオエーテル、エステル、チオエステル、アミドまたは二級もしくは三級アミノ部分を介して樹脂もしくは樹脂ハンドルに結合される：但し、そのときに、AはOR’3であり、R’3はアリル基を除く保護基であり、好ましくは、R’3はtert-ブチルまたはペンタフルオロフェニルである。
【請求項２２】
Pd(P[ortho-トリル]3)2またはPd(P[2,4-キシロイル]3)2 錯体の使用であって、アリル保護されたカルボキシル基、またはアリルオキシカルボニル保護されたアミノおよび／またはヒドロキシ基の脱保護を触媒するための使用。
【請求項２３】
請求項２２に記載の使用であって、前記有機スルフィネートが、アリル基アクセプタまたはスカベンジャー試薬として使用されることを特徴とする使用。
【請求項２４】
請求項２１または２２に記載の使用であって、前記アリル保護またはアリルオキシカルボニル保護された基が、任意に更に保護されたペプチド、好ましくはFmoc保護されたペプチドの一部であり、該Fmoc基は前記ペプチドのNαに結合される使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、環状ペプチドの合成方法、即ち、一つのアミノ酸残基側鎖のカルボキシ基と第二のアミノ酸残基側鎖のアミノ基との閉環を含んでなる、環状ペプチドの製造方法に関する。
【０００２】
アミノ酸側鎖（典型的にはアスパルチル残基またはグルタミン残基）のω-カルボキシル基（即ち、炭素鎖長とは無関係に側鎖のカルボキシル基）と、アミノ酸側鎖（典型的にはリジン残基）のω-アミノ基の間のラクタム形成による樹脂上でのペプチドの環化が報告されている。
【０００３】
Rijkers et al.（An optimized solid phase strategy -- including on-resin lactamization- of Astressin, its retro-, inverso- and retro-inverso isomers, 2002, Biopolymers 63, 141-149）は、Rinkアミド樹脂に結合され、且つBoc-保護された41量体のラクタム化を記載している。アリル保護基およびalloc保護基のPd(0)に触媒された除去により、30位（Glu）および33位（Lys）が一段階で脱保護され、その後、N-メチルピロリドン中においてBOP/HOBtおよびHunig塩基の存在により環化される。該ペプチドは、Boc保護された最後の残基を除き、FMOCを用いる標準の直行保護スキームを使用して合成された。その後、N-末端のBoc保護基は酸であるTFA処理により除去され、同時に該ペプチドを樹脂から遊離された。
【０００４】
この方法の欠点は、ペプチド切片のその後の環化のために、全長ペプチド合成が予め完了することが必要なことである。従って、望ましくない副反応（ピログルタメート形成）または不完全なアリル／alloc脱保護によって、価値の高い全長ポリペプチドの収量ロスを被る。更に、樹脂上にある間に酸に不安定な保護基を使用することは、樹脂上でのペプチドのその後の更なる誘導体化（例えば、アセチル化によるN-末端ブロック）を妨げるので、常に望ましいわけではない。これは末端NαをキラルCαにおいてエピ化し易くするので、N-末端アセチル化の前には反応を行うことができない。
【０００５】
Kates et al.（A novel, convenient three dimensional orthogonal strategy for solid-phase synthesis of cyclic peptides, 1993, Tetrahedron Letters 34:1549-1552）は、C末端アスパルチル残基またはグルタミル残基の異なる樹脂ハンドルへの側鎖アンカリングによる、10両体ペプチドの頭部から尾部への環化を記載しており、前記残基はそのCαにおいてアリルエステル保護基により保護される。完全なペプチド鎖の線型固相FMOC合成の後、該アリルエステル部分はPd-触媒により除去され、続いて一連のNα-FMOC除去、およびその後のBOP/HOBt/DIEAに媒介された頭部から尾部への環化を受ける。興味深いことに、脱保護されたC-末端アスパルチル残基（PALハンドル樹脂へのFMOC-Aspのカップリングにより構成されたAsn8）を、FMOC保護基の不存在下でN-末端アスパルチル残基の脱保護されたNαにカップリングさせるストラテジーが、環状ペプチド配列に沿った合成開始点の置換によって得られる他の合成ストラテジーに比較して、最も良好に作用することが分かった。
【０００６】
この方法の一つの制限的な欠点は、救核試薬の存在に起因して、またそれが反応スキームに実際には影響しないため、主要なアリル脱保護工程の際の副反応として部分的なFMOC脱保護が生じることを、暗黙のうちに考慮に入れていることである。何れにしても、FMOC脱保護の更なる完結がその後に生じ、引き続く頭部から尾部へのペプチド結合を可能にすることが必要とされる。これとは対照的に、ペプチド側鎖官能基のみのラクタム化による環化は、Ｎαの完全な保護を維持することに厳密に依存する。
【０００７】
Blankemeyer et al.（1988, Tetrahedron Lett. 29, 5871-5874）は、固相に対するアリルハンドルとして4-(4’-メトキシトリチルオキシ)-ブタ-2-エニルオキシ-ヘキサン酸を含むセルロースディスク上において、更にFMOC化学を用いた幾つかの保護されたペプチド断片の合成を記載した。このアリルエステルリンカーの開裂は、乾燥THF中におけるPd(PPh3)4での処理と、その後のTHF中のHOBt溶液の添加によって達成された。
【発明の開示】
【０００８】
先行技術の欠点を回避し、且つアスパルチル側鎖を含むペプチドの環化に特に有用な、ペプチド側鎖環化のもう一つの方法が本発明に従って考案された。
【０００９】
本発明によれば、ペプチドのための環化方法は、下記の工程を含んでなるものである：
ａ．ペプチドのNαにおける塩基に不安定な保護基を保持しながら、アリル型保護基からペプチドを脱保護する工程であって、該ペプチドは、そのNαにおいて塩基に不安定な保護基で保護され、且つ該ペプチドは更にリジン側鎖またはリジン側鎖類似体のアリルオキシ-カルボニル保護されたアミノ官能基（即ち、ε-アミノ基）を含み、更に、アリル-エステル保護されたω-カルボキシ基であって少なくとも一つのグルタミル側鎖（即ち、β-カルボキシ基）またはアスパルチル側鎖（即ち、γ-カルボキシ基）またはこれら側鎖類似体のカルボキシ基を含んでなる工程；
ｂ．前記脱保護された側鎖を弱塩基試薬の存在下でラクタム化することにより、前記ペプチドを環化する工程；および
ｃ．そのNαにおける塩基に不安定な保護基から前記ペプチドを脱保護する工程；
但し、前記アリル保護基は非置換であってもよく、または更に、それ自身が非置換またはハロゲンもしくはアルコキシで更に置換されてもよいアルキルもしくはアラルキルで置換されてもよい。好ましいルーチンの実施形態では、ε-アミノ官能基の保護のために標準の非置換Alloc（即ち、アリルオキシ-カルボニルまたはプロパ-2-エニル-オキシ-カルボニル）保護基が用いられ、またγ-カルボキシ基はアリルオキシ（プロペン-2-オキシ）でエステル化することにより保護される。
【００１０】
本発明の文脈において、アミノ酸側鎖の「ω-カルボキシ基」とは、炭素鎖の長さとは無関係に、側鎖の末端カルボキシ基として理解され、またアミノ酸側鎖の「ω-アミノ基」とは、炭素鎖の長さとは無関係に、側鎖の末端アミノ基として理解される。その類似体、例えばその側鎖の異性体も同様である。例えば、リジンのγ-またはδ-アミノ異性体は、天然のリジンの適切な類似体である。本発明の文脈において、アミノ酸またはアミノ酸誘導体に関して「側鎖」の用語は、それぞれのIUPAC-IUB定義（International Union of Pure and Applied Chemistry and International Union of Biochemistry/ Joint Commission on Biochemical Nomenclature, "Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides", Pure Appl. Chem, 56, 595-624 (1984)）に従って使用される。
【００１１】
この反応経路は以前には記述されていない。予測に反して、特にアリル脱保護が固相に結合されたペプチド上で行われ、結果として環化も固相に結合した材料上で行われたときには、アリル脱保護の後にもFMOC基の完全性が殆ど保存されることが見出された。好ましくは、反応シーケンスの完了後にペプチド鎖の伸長が継続され、より好ましくは、先の環化工程が、分子間反応に対して分子内環化を優先するための限界希釈条件の適用を必要としなくなるとの利点を有するので、固相モードで継続される。従って、本発明の反応は、複数のグルタミル残基および／またはアスパルチル残基およびリジン残基、またはそれらの類似体（例えばノルリジンまたはホモリジン）が最終ペプチド鎖の中に存在する一方、最終的な完全サイズのペプチド鎖の最初の合成された部分上での環化についてはこれら残基の特定のペアリングのみが計画される場合に、特に有益である。この局部的ラクタム化のアプローチは、完全サイズのペプチドが、側鎖の環化により安定化されるべき生理活性ペプチドのための幾つかの二次的な副ドメイン構造またはペプチドループ構造を含んでいるときに特に有益であろう。ラクタム化は、天然に安定化されたジスルフィド架橋またはアミノ酸類似体を用いたその非天然の化学的類似体よりも、更に安定で、還元を受け難いオプションである。後者の官能基は、インビボにおいて通常は更に大きな免疫原性を与えるのに対して、本発明はより優れたオプションとして、天然アミノ酸類似体の使用を可能にする。
【００１２】
より好ましい実施形態において、当該ペプチドは、一つだけのアリル保護されたリジン残基、および一つだけのアリル保護されたアスパルチルもしくはグルタミル残基を含んでおり、従って、環化に際しては、一つで且つ唯一の結合オプションのみが存在し、均一な生成物を生じる。
【００１３】
先行技術の方法とは対照的に、本発明の方法によるペプチドは、任意に且つ好ましくは固相において、逐次的な段階的モードでのアミノ酸残基または他の基の付加または修飾、例えば、新たなN-保護されたアミノ酸の付加または、またはもう一つのペプチドとのN-末端縮合反応によって、更なるN-末端ペプチド伸長のために利用することができる。
【００１４】
特に好ましい更なる実施形態では、そのNα位において塩基に不安定な保護基を有する保護されたペプチドのN-末端残基が、前記少なくとも一つのアリルエステルで保護されたアスパルチル残基もしくはグルタミル残基またはその類似体である。このようなN-保護され、好ましくはFMOC保護され、同時に側鎖保護されたアミノ酸について殆ど認識されなかった問題は、それらがFMOC脱保護に際して塩基触媒による副反応を受け易く、アスパルチミド（aspartimide）またはグルタルイミド（glutarimide）を生じることである。それは、現在の標準的な固相鎖伸長合成の望ましくない欠点であり、通常はγ-カルボン酸基の保護によって回避されると思われている。しかし、γ-カルボキシ官能基のための異なる保護基について、Kates et al（Kates et al., Lett. Pept. Sci., 1995, 1, 213; Nicolas et al., Tetrahedron Lett. 1989, 30,497）等の報告に示されているように、これは真実ではない。FMOC脱保護のための標準の固相条件下での、FMOC保護されたN-末端アスパルチル残基のγ-カルボキシ官能基のアリルエステル保護に関する本発明者の知見に従っても、これと同じことが言える。その正確な定量的範囲は、処理時間および処理条件の僅かな変化にも敏感であり、生成物の収量に望ましくない変化を生じる。
【化７】
2008513403.tif 000002
【００１５】
従って、本発明の方法を用いれば、かかるN-末端のFMOC-保護およびアリルエステル-保護されたアスパルチルもしくはグルタミル残基の直接の側鎖環化による、この非生産的な副反応を回避することが可能である。ここでもFMOC保護は保存されて、アスパルチミドの形成は効果的に防止される。こうして、以前のラクタム化によるグルタルイミドまたはアスパルチミドの形成を伴わずに、引続くFMOC脱保護およびその後の更なる鎖伸長が可能である。
【００１６】
より好ましくは、前記N-末端アリルエステル-保護された酸性残基は、アスパルチル残基である。アスパルチミド形成は、グルタルイミド形成よりも高い反応速度を有し、通常はより優勢な副反応である。特に、それはジペプチド配列L-Asp-L-Xにおいて有利であり、ここでのXはGly、Ser、ThrまたはAsnであり、また我々が最初にここで報告したように、XはHisであり、容易に30〜40％以下のアスパルチミドを生じる。特に、この-Asp-Gly-ジペプチドは、アスパルチミド形成を非常に受け易い；これには通常、Packman et al., 1995, Tetrahedron Lett. 36, 7523に記載されたように、アスパルチミド形成の立体障害を与えるために、グリシン上の追加のHMB保護基の使用を必要とする。しかし、Gly(HMB)ジペプチドの使用は非常に高価であり、従って回避することが求められる。従って、これらの場合に、本発明は先行技術に対して更なる利点を提供するものである。
【００１７】
アリルおよび／またはalloc脱保護工程（以下ではアリル脱保護と略す）は、例えばBu3SnHを用いたハイドロスタンノリシス（hydrostannolysis）、またはアリル受容体としてのモルホリン、ジメドン、N-メチルアニリン、HOBt、ボロハイドライドもしくはN,N’-ジメチルバルビツール酸のような救核試薬の存在下での本質的な中性条件において、THF中のテトラキス-トリフェニルホスフィン・パラジウム(0) [Pd(PPh3)4]で処理する等のような、当該技術で既知の方法によって実施すればよい。異なるpHを用いる前記方法の変形も存在するが、当然ながら、樹脂連結基またはハンドル基のpH感受性、および保護基の塩基感受性を考慮して注意を払わなければならない。
【００１８】
このアリル脱保護は、好ましくはアリル基反応性のパラジウム錯体、好ましくはPd(0) 錯体を用いた触媒反応、好ましくはC1-C10トリアルキルホスファイト、C3-C10トリシクロアルキルホスファイト、またはトリアリールホスフィンもしくはトリヘテロアリールホスフィン配位子を有するパラジウム錯体を用いた触媒反応を利用し（ここでのアリールもしくはヘテロアリールは電子供与性置換基で更に置換されてもよく、または非置換であってもよい）、更に好ましくは、フェニルホスフィン配位子を有するパラジウム錯体を用いた触媒反応を利用する（ここでのフェニルは、トリルまたはキシロイル、より好ましくはフェニル、2,4-キシロイルまたはo-トリルである）。好ましくは、前記ホスフィン配位子はモノホスフィン配位子、より好ましくは非キレート性の一価配位子である。前記パラジウム錯体は好ましくはモノパラジウム錯体であるが、錯体の用語は、モノパラジウム錯体が好ましいとしても、ジパラジウム錯体またはより高次のパラジウム錯体をも含むものとして理解されるべきである。アリルアクセプターまたはスカベンジャーの存在下において、テトラキス(トリフェニルホスフィン)-パラジウム [Pd(PPh3)4]を使用すること、または対応のPd(P[ortho-トリル]3)2 もしくはPd(P[2,4-キシロイル]3)2 錯体、またはトリフェニルホスフィン配位子およびトリ-(o-トリル)ホスフィン配位子の両方を有し得る混合錯体を使用することが、本発明においては最も好ましい。トリフェニルホスフィンに比較して、メチルフェニルホスフィン配位子、特にトリ-o-トリルホスフィン配位子は触媒反応速度を改善し、更に、最適収量を維持しながら、使用される貴金属触媒の総量を低下させることを可能にする。Pd(0)触媒によるアリルおよびアリルオキシ脱保護に対する参照については、Jeffrey et al., J. Org. Chem. 1982, 47:587-590を比較されたい。Jeffreyに記載されたように、本発明の錯体を交換触媒としてインサイチューで構成すること、即ち、安定性の低い配意されたPd錯体に本発明の好ましい配位子を混合することによって構成することもまた、当該技術において実現可能であり、且つ完全に慣用的である。従って、極めて好ましいPd(PPh3)4とは別の適切な触媒錯体の例は、PdCl2(PPh3)2／PPh3、PdCl2(PPh3)2／P(oTol)3、Pd(DBA)2／P(oTol)3もしくはPd[P(oTol)3]2（Organometallics 1995, 14(6):3030-3039）、Pd(OAc)2／トリエチル-ホスファイト、Pd(OAc)2／PPh3、Pd(OAc)2／P(oTol)3である。最初に添加されるPd(0)錯体におけるアセテート、ベンゾイルまたはアミン（例えばHuenig塩基）のような配意性のより低い陰イオン塩基性配位子の存在は、PPh3またはP(oTol)3 [oTol＝オルト-トリル-]のような適切な遊離配位子の存在によって、好ましい錯体をインサイチューで構成することを可能にする。一般には、触媒との交換のために遊離リガンドを添加することは必須ではないが、特に高度に活性なアリールホスフィンパラジウム錯体を開始時から使用するときは、反応液に添加した余分なPPh3と共にJeffrey et al.(supra)によって最初に使用されたゼロ価のPd(PPh3)4の場合に、このオプションは注目に値する。アリルアクセプタの存在下でのPd触媒による脱保護の一般的機構は、当該技術において周知のアシル基転移反応（トランスアシレーション）である。アリルアクセプタ試薬またはスカベンジャーの選択は、望ましくな���副反応を回避しながら、温和な反応条件下で定量的な脱保護を達成するために同様に重要である。適切なスカベンジャーは何れかの救核試薬、例えばモルホリン、ジメドン、N,N-ジメチルバルビツール酸、メチルアニリンまたはチオサリチル酸である。
【００１９】
Pd(0)錯体の適切な触媒量は、好ましくは、遊離体と比較して0.005 eq〜0.5 eqの触媒量で使用され、より好ましくは0.01 eq〜0.1 eqの触媒量で使用され、最も好ましくは0.015 eq〜0.07 eqの触媒量で使用される。好ましくは、反応温度は10〜60℃、より好ましくは30〜50℃、最も好ましくは約40℃である。
【００２０】
本発明の一つの好ましい実施形態では、Gomez-Martin et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1(1999): 2871-2874（固相ペプチド合成におけるNα-Alloc一時的保護：アリル基スカベンジャーとしてのアミン-ボラン錯体の使用）に記載された救核性アリル基スカベンジャーとしてのアミン−ボラン錯体が、遊離体のアリル官能基当たり少なくとも1.5〜2倍過剰で用いられる。例えばt-Bu-NH2・BH3、Me2NH・BH3、またはNH3・BH3を用いた場合、該錯体におけるアミン部分の正確な組成に依存して、非常に短い反応時間と共に、高変換率を実現することができる。該アミンは、好ましくは一級もしくは二級アルキルアミン、またはアンモニアであり得るのに対して、四級アミンは今回の適切な錯体の定義からは除外される。一つの任意の更に好ましい実施形態において、前記Pd(0)に触媒されるアリル-脱保護は、Dessolin et al., Tetrahedron Lett. 1995, 36: 5741-5744（アリルカルバメートのパラジウム触媒によるトランスアシレーションのための新規なアリル基アクセプター）に本質的に記載されたように、例えばジクロロメタンのような非プロトン性極性有機溶媒中において、ハイドライド供与体であるフェニル-トリヒドロシランPhSiH3またはその官能基誘導体の存在下でのハイドロシリロリシス（hydrosilylolysis）として実施される。好ましくは、一般式R1-PhnSiHmのフェニル-ヒドロシラン試薬がアリルアクセプターとして通常は少なくとも1.5〜2 eq過剰で用いられ、ここでのR1は芳香族核における置換基のアリール、アルキルまたはアラルキルであり、n は1または2であり、mは2または3であり、最も好ましくは、前記アリルアクセプターはPhSiH3である。
【００２１】
フェニルシランおよび適切なアミン-ボラン錯体は、１時間未満、典型的には約20〜40分で迅速かつ完全な脱保護を可能にする。従って、それらは温和で且つ短時間の反応条件を可能にする。他のアリルスカベンジャーは著しく長い反応時間を必要とする。
【００２２】
技術的には完全に実施可能な試薬であるが、上記分類のアリルスカベンジャーは両者とも、環境的および作業的な安全性の観点からの問題を生じ得る有害な試薬である。工業規模の製造のために特に魅力的なもう一つの非常に好ましい実施形態では、アリル基アクセプター試薬として有機スルフィネートが使用される（Honda et al., Deprotection of allyl groups with sulfinic acids and palladium catalyst, J. Org. Chem. 1997, 62, 8932-8936）。驚くべきことに、本発明の反応においては、恐らくは形成された付加物の安定性および温和な反応条件に起因して、この反応は特に高い生成物収量を可能にする。その例は、4-クロロ-3-ニトロベンゼン-スルフィネート、2-チオフェンスルフィネート、ベンゼン-スルフィネート、p-トリルスルフィネート、またはヒドロキシメタンスルフィネート（そのナトリウム塩または亜鉛塩の形態でもRongalitＴＭとして知られており、このような塩の従来の慣用名はホルムアルデヒドスルホキシレートである）。この有機スルフィネートRi-SO2-（またはRi-S(O)O-）は、何れかのタイプの更なる置換有機残基、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、またはアラルキルを含んでもよい（Honda et al., supra参照）。それは、その塩または酸の形態で添加されてもよい。あまり好ましいものではないが、前記スルフィネートにおける競合性の救核部分の存在も可能である。最適な収量のためには、好ましくは、基Riは、任意に更に置換されたフェニル基、より好ましくは、アルキル-、アルキルオキシアルキル-もしくはアルキルオキシ-で単一もしくは多重置換されたフェニル基、最も好ましくはフェニル、キシロイルまたはトリル、特にp-トリルである。スルフィネートの使用はまた、より好ましいトリアリールホスフィン錯体に加えて、トリ-アルキルもしくはシクロアルキルホスファイト配位子錯体の使用を良好な収率で可能にする。
【００２３】
ラクタム化反応は、FMOCのような塩基に不安定なアミン保護基の存在下において、標準のペプチド鎖伸長反応に本質的に類似した方法で実施される。但し、この塩基に不安定な基は、鎖伸長反応におけるように更なるN-末端保護されたアミノ酸を加えるのではなく、同じペプチド上に担持される。勿論、環化および脱保護の後の任意の工程ｄにおいて、更なる鎖伸長のために引き続き同じ化学現象を用いてもよい。ラクタム化および鎖伸長の両者は、主要なカップリング試薬または助剤の種類に応じて、カップリング試薬、および最終的にはカップリング添加剤を必要とする。
【００２４】
ペプチド合成のためのカップリング試薬は、当該技術において周知である（Bodansky, M. , Principles of Peptide Synthesis, 2nd ed. Springer Verlag Berlin/Heidelberg, 1993; 並びにその中でのカップリング添加剤または助剤の役割の議論を参照されたい）。カップリング試薬は、混合無水物（例えば、T3P：プロパンホスホン酸無水物）、または他のアシル化試薬、例えば活性化されたエステルもしくは酸ハロゲン化物（例えばICBF、イソブチル-クロロホルメート）であってよく、或いは、それらはカルボジイミド（例えば、1-エチル-3-(3-diメチルアミノプロピル)-カルボジイミド)、活性化されたベンゾトリアジン-誘導体（DEPBT: 3-(ジエトキシホスホリルオキシ)-1,2,3-ベンゾトリアジン-4(3H)-オン）、またはベンゾトリアゾールのウロニウムもしくはホスホニウム塩誘導体であってよい。
【００２５】
最良の収率、短い反応時間および鎖伸長の際のラセミ化に対する保護の観点から、カップリング試薬は、遊離カルボン酸官能基を活性化できるベンゾトリアゾールのウロニウム塩およびホスホニウム塩からなる群から選択されるのが好ましく、ここでの反応は塩基の存在下で行われる。このようなウロニウムまたはホスホニウムカップリング塩の適切かつ同様に好ましい例は、例えば、HBTU（O-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート)、BOP (ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-tris-(ジメチルアミノ)-ホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェート、PyBOP（ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリピロリジノホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェート）、PyAOP、HCTU（O-(1H-6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート）、TCTU（O-1H-6-クロロベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム・テトラフルオロボレート）、HATU（O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート）、TATU（O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム・テトラフルオロボレート）、TOTU（O-[シアノ(エトキシカルボニル)メチレンアミノ]-N,N,N’,N’’-テトラメチルウロニウム・テトラフルオロボレート）、HAPyU（O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)オキシビス-(ピロリジノ)-ウロニウム・ヘキサフルオロホスフェートである。
【００２６】
好ましくは、ペプチドまたはアミノ酸もしくはアミノ酸誘導体のα-アミノ官能基を除き、前記塩基試薬は弱塩基であり、その共役酸はpKa 7.5〜15、より好ましくはpKa 7.5〜10のpKa値を有し、また前記塩基は、好ましくは三級の立体障害アミンである。このような更に好ましい例は、Hunig塩基（N,N-ジイソプロピルエチルアミン）、N,N’-ジアルキルアニリン、2,4,6-トリアルキルピリジン、2,6-トリアルキルピリジン、またはN-アルキル-モルホリン（ここでのアルキルは直鎖もしくは分岐鎖のC1-C4 アルキルである）であり、より好ましくは、それはN-メチルモルホリンまたはコリジン（2,4,6-トリメチルピリジン）であり、最も好ましくはコリジンである。
【００２７】
また、カップリング添加剤、特にベンゾトリアゾール型カップリング添加剤の使用も知られている（Bodansky, supra参照）。それらの使用は、高度に活性型のウロニウムまたはホスホニウム塩カップリング試薬を用いるときに特に好ましいものである。従って、カップリング試薬添加剤は、活性化されたエステルを形成できる救核性ヒドロキシ化合物、より好ましくは、酸性の救核性N-ヒドロキシ官能基を有するものであることが更に好ましく（ここでのNはイミドであるか、またはN-アシルもしくはN-アリール置換されたトリアゼノである）、最も好ましくは、該カップリング添加剤はN-ヒドロキシ-ベンゾトリアゾール誘導体（もしくは1-ヒドロキシ-ベンゾトリアゾール誘導体）であるか、またはN-ヒドロキシ-ベンゾトリアジン誘導体である。このようなカップリング添加剤のN-ヒドロキシ化合物は、WO 94/07910およびEP-410 182に記載されており、それぞれの開示を本明細書の一部として援用する。その例は、例えばN-ヒドロキシ-スクシンイミド、N-ヒドロキシ-3,4-ジヒドロ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアジン（HOOBt）、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール（HOAt）、およびN-ヒドロキシ-ベンゾトリアゾール（HOBt）である。N-ヒドロキシ-ベンゾトリアジン誘導体が特に好ましく、最も好ましい実施形態においては、該カップリング試薬添加剤はヒドロキシ-3,4-ジヒドロ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアジンである。カップリング添加剤のアンモニウム塩が知られており、カップリング化学現象におけるその使用が、例えばUS 4,806,641に記載されている。
【００２８】
更なる特に好ましい実施形態において、前記ウロニウムもしくはホスホニウム塩カップリング試薬は、ウロニウム塩試薬であり、好ましくはHCTU、TCTUまたはHBTUであり、更に好ましくは、N-ヒドロキシ-3,4-ジヒドロ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアジンまたはその塩と共に、当該反応において使用される。この実施形態は、主に、Nα-保護基の除去後のペプチド合成の鎖伸長工程において使用するために好ましいものであるが、側鎖環化の際のラクタム化反応のためにも使用されてよい。
【００２９】
本発明の内容において、HCTUおよびTCTUは、これらの化合物および可能な類似体が結晶構造解析によりウロニウム部分ではなくイソニトロソ部分を含み（O. Marder, Y. Shvo, and F. Albericio “HCTU and TCTU: New Coupling Reagents: Development and Industrial Applications”, Poster, Presentation Gordon Conference February 2002）、ヘテロ環コア上のN-アミジノ置換基が代わりにグアニジウム構造を生じることが示されているにもかかわらず、「ウロニウム塩試薬」の用語に包含されるように定義されることに留意すべきである。本発明の内容において、このような分類の化合物は、本発明によるウロニウム塩試薬の「グアニジウム型副分類」と称される。
【００３０】
更に、主としてラクタム化反応のために使用される特に好ましい実施形態において、前記カップリング試薬は、例えばBOP、PyBOPまたはPyAOPのようなベンゾトリアゾールのホスホニウム塩である。
【００３１】
塩基に不安定なNαの脱保護は、例えばN-メチルモルホリン中の20％ピペリジンを用いて、当該技術でルーチンに行われているように実施されてよい。
【００３２】
本発明の更なる目的は、塩基に不安定な保護基で保護されたNαを有する次式IIまたはIIIの環状ペプチドである。
【化８】
2008513403.tif 000003
【００３３】
ここで、Yは塩基に不安定な保護基であり、n＝1〜10、好ましくはn＝1または2、最も好ましくはn＝1であり、更に、m＝1〜15、好ましくはm＝3〜6、最も好ましくはm＝3であり、更に、x＝1〜200およびq＝0〜200であり、R1およびR2は各々独立に、天然のアミノ側鎖またはその非天然の誘導体であり、該側鎖は更にアリルエーテルおよびアリルオキシカルボニル保護基以外の保護基を含んでよく、またAは樹脂または樹脂ハンドルであり、或いは任意に、R2は天然のアミノ側鎖またはその非天然の誘導体であってもよく、該側鎖はエーテル、チオエーテル、エステル、チオエステル、アミドまたは二級もしくは三級アミノ部分を介して樹脂もしくは樹脂ハンドルに結合される：但し、そのときに、AはOH、NH2、NR’1HまたはNR’1R’2、OR’3からなる群から選択され、R’1およびR’2は独立にC1-C4アルキルであり、R’3はアリル基以外またはこれを除く保護基であり、好ましくは、R’3はtert-ブチルまたはペンタフルオロフェニルである。
【００３４】
例えばR1(x=1)のような側鎖基は、一つの型の任意に保護されたアミノ酸側鎖を意味するようには解釈されない；即ち、各残基R1(1)、R1(2)等は独特のものであってもよく、または少なくとも一つの他の残基と同じであってもよい。勿論、基R2(q=1)、R2(q=2)等についても同じことが言える。
【００３５】
樹脂または樹脂ハンドル複合体は、原理的には、例えばヒドロキシベンジル-フェニル必須リンカー部分と共にMerrifieldによって使用されたポリスチレン-ジビニルベンゼン樹脂、またはヒドロキシ-ベンジル-p-ベンジルオキシ部分（例えば、酸に不安定なリンカーが更にこれにグラフとされる部分）と共にWangによって使用された樹脂のような、合成に用いられる如何なる樹脂であってもよく、或いは、後者のリンカーは一体にまたは直接に樹脂に結合されてよい。原理的には、合成に使用するための固相樹脂は必ず、前記固相コア材料の一部である少なくとも一つの一体的なリンカーもしくはハンドルを含んでいる；このようなリンカーまたはハンドルは、固相化された保護基と看做してよい（Guillier et al., Chem.Rev.100,2091-2157, 2000）。その例は、例えば、Sieber樹脂、関連のキサンテニル型PALハンドル樹脂、Rinkアミド樹脂、Rink酸樹脂、より複雑なPEG-グラフト化ポリスチレン樹脂、例えば2'-クロロ-トリチルのような種々のハンドルをグラフト化された状態で入手可能なテンタゲル（tentagel）に基づくNovasyn TG（Novabiochem, Merck Biosciences, Germany）、またはシリカゲルのようなマトリックス材料上に官能基ハンドルをグラフト化することにより構成された樹脂である。好ましくは、前記樹脂がトリチル樹脂または樹脂ハンドルである場合、このような樹脂は、4-メトキシもしくは4,4'-ジメトキシ-トリチル樹脂である。本発明に用いられる樹脂は、約50〜500メッシュ、より好ましくは100〜400メッシュである標準メッシュサイズのものである。式IVに示した樹脂もしくは固相R’’’は、架橋されたポリマーマトリックス材料を含んでなるものとして解釈されるべきであり、該マトリックス材料は、R’’’ の一体的な部分と看做される何れかの種類の化学的に不活性なアルキル、アルキルオキシ、アリールオキシもしくはアルキルエステルスペーサもしくはリンカーを介して、式IV〜VIIで特定されたハンドル部分に結合されてよい。しかし、前記樹脂からの開裂条件に影響を与えることとは別に、該樹脂材料の化学的性質、特にハンドル基の化学的性質は、未だ少ししか分かっていない様式で、カップリング、特にラクタム化反応の合成効率にかなり影響することに留意すべきである。樹脂上の段階における成熟ペプチドの収率は、用いられる樹脂または樹脂ハンドルの種類に依存して異なる可能性がある。この理由で、本発明による好ましい実施形態では、特許請求の範囲に詳細に記載したように、樹脂または樹脂ハンドルは式IVのものであり、更に好ましくは式VIのもの、最も好ましくは、特許請求の範囲に詳細に記載したように式VIIのものである。このような樹脂または樹脂ハンドルの例は、ペプチド部分にO-もしくはN-結合した(4-メトキシフェニル)-メチル-および(4-メチルフェニル)-メチル-ポリスチレン（Atkinson et al., 2000, J. Org. Chem. 65, 5048）樹脂、並びにそれぞれのEPG-樹脂誘導体である。更なる例は、例えば、酸に不安定なHMPB-MBHAまたはHMPB-BHA樹脂（Sieber et al., 1987, tetrahedron Lett. 28, 6147)、酸に不安定なRinkアミド樹脂もしくはRin酸樹脂（Rink et al., 1987, tetrahedron Lett. 28,3787）である。「酸に不安定な」の用語は、ジクロロメタン中の2〜10％TFA中において周囲温度で少なくとも1時間の条件での、本質的に定量的な開裂を意味する。驚くべきことに、ジフェニ���-メチルの構造コアモチーフを有するこのような好ましい樹脂を使用することは、線型合成およびラクタム化の際に、より効率的なカップリング反応を可能にする；とりわけ、このような樹脂は、例えばトリチル樹脂上での効率的なカップリングに必要とされる標準の40℃に比較して、15〜25℃のより低い反応温度を可能にする。
【００３６】
好ましくは、基A（例えば式IIまたは式IIIに与えられたもの）は、アリルオキシカルボニル部分を含む樹脂ハンドル以外の、樹脂ハンドルまたは樹脂結合部分を含んでいる。より好ましくは、このような樹脂または樹脂ハンドルは次式IVのものである。
【化９】
2008513403.tif 000004
【００３７】
ここで、R’’’は樹脂であり、またR’’1、R’’2、R’’3は独立に水素、C1-C4アルキルまたはC1-C4 アルコキシであり、同じでも異なってもよいが、R’’1、R’’2の一方のみが水素であることを条件とし、Lは酸素、硫黄、窒素であるか、または次式Vのものである：
【化１０】
2008513403.tif 000005
【００３８】
ここでも、樹脂または樹脂ハンドルは次式VIのものであるのが更に好ましく、またLが酸素および窒素からなる群から選択されることを条件として、基R’’’、R’’1およびR’’2についての上記定義が適用される。
【化１１】
2008513403.tif 000006
【００３９】
ここでも、樹脂または樹脂ハンドルは式VIIのものであるのが更に好ましく、またLが酸素および窒素からなる群から選択されることを条件として、基R’’’、R’’1およびR’’2についての上記定義が適用される。
【化１２】
2008513403.tif 000007
【００４０】
更に好ましい実施形態においては、R’’’、R’’1およびR’’2は、Lが酸素である場合はR’’1およびR’’2の一方のみが水素であることを条件として、独立に水素、メチルまたはメトキシであり、Lが窒素である場合は、独立にメチルまたはメトキシであり、好ましくはメトキシである。更に好ましくは、Lは酸素であり、R’’1は水素であり、R’’2はメチルまたはメトキシであり、好ましくは、Aは樹脂または樹脂ハンドルである。最も好ましくは、R’’2はメチルである。
【００４１】
最も好ましくは、本発明によるペプチドは、樹脂または樹脂ハンドルに対してカルボキシ末端で結合される（式IVにおいてA＝樹脂または樹脂ハンドル）
好ましくは、本発明によるペプチドの配列は、
Ac-Nle-cyclo(Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys)、または
Nle-cyclo(Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys)
であり、ラクタム結合は、表１に示すように、Asp側鎖とLys側鎖の間に存在する。前記ペプチドは、医薬的に活性なメラノコルチン受容体特異的ペプチドであり、ヒトにおける男性勃起不全および女性性敵機能不全を含む、性的機能不全の治療のために有用である。
【００４２】
もう一つの好ましい実施形態において、本発明によるペプチドの配列は、少なくとも部分配列cyclo(Asp-His-Phe-Arg-Trp-Lys)からなるか、または該部分配列を含んでなり、ここでのPhe残基はまた、D-Phe、またはpF-Phe、Phe(4-Br)、Phe(4-CF3)、Phe(4-Cl)、Phe(2,4-diCl)、Phe(3,4-diCl)、Phe(3,4-diF)、Phe(4-I)、Phe(3,4-di-OMe)、 Phe(4-Me)もしくはPhe(4-NO2)のそれぞれD-もしくはL-異性体で置換されてよい。これらPheの非天然誘導体での修飾は、前記ペプチドの医薬活性を変調させる。同様に、上記配列において、Argもまた、D-Arg、またはArg(NO2)、Arg(Tos)、Arg(Pbf)、Arg(Mtr)、Arg(Me)もしくはArg(Pmc)のそれぞれのD-もしくはL-異性体で置換されてもよい。
【００４３】
該アルギニン側鎖は、好ましくは合成の際に、例えばトシル、ベンジルオキシカルボニル、ペンタメチレンクロマンスルホニル(Pmc)、ペンタメチルジヒドロベンゾフランスルホニル(Pbf)、4-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル(Mtr)およびその4-tbu-2,3,5,6-テトラメチル同族体(tart)、アダマンチルオキシカルボニル、またはBocで共有結合的に保護されてよい。Argを保護するためには、Pmc、Pbf、MtrまたはTartが非常に好ましく、最も好ましいのはPbfである。
【００４４】
Trpは、好ましくは、合成の際にBocで保護される。任意に、それはホルミル、sym-メシチレン-スルホニルで同様にN-保護されてよい。
【００４５】
Hisは、好ましくはN-トリチル保護基によって保護される。好ましくはないが、任意に、それはBoc、メチルトリチルまたはトシルで同様にN-保護されてよい。
【実施例】
【００４６】
ペプチドAc-Nle-cyclo(Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys)［その特性は、該ペプチドのみに向けられたWO 01/000224に記載された］の完全に保護されたFMOCバージョンを、異なる樹脂、例えば2-クロロトリチル-ポリスチレン樹脂上で新たに合成し、表１に示したように本発明に従って処理した。N-末端的には、表１に示した反応スキームの第一工程において、前記配列はFMOC-Asp(OAll)-His(Trt)-....である。Lys(Alloc)およびAsp(OAll)は５残基だけ離間しており、その間には、例えばArg(Pbf)のような嵩高い側鎖が突出している。この表において、Nleはノルロイシンである。
【表１】
2008513403.tif 000008
【００４７】
１．１：
2-CTC樹脂に結合されたモデルペプチドのアリル／alloc脱保護
0.1eqのPd(PPh3)4を、PhSiH3またはジアミノボラン（5 eq）の存在下に、DCM中に溶解させた。
【００４８】
この溶液を、1 eqのアリル／alloc保護された表１の出発ペプチドを担持したCTC-樹脂（0.44mmol/gで負荷された35gの樹脂）に添加した。定常的な窒素場部リングの元で、室温において最大15分の反応の後、該混合物を濾過し、回収された樹脂に更に３回の同じ処理を施し、その際に、1サイクル当たり常に同じ量の触媒およびスカベンジャーとして5 eqのフェニルシランを用いた。
【００４９】
洗浄工程：その後、下記を用いて樹脂を連続的に洗浄した
・N-メチル-ピロリドン（NMP）（3回）
・ジクロロ-メタン（DCM）（3回）
・DCM中の0.5% DIEA（Hunig塩基）（3回）
・NMP中のジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム三水和物0.02N
・NMP（5回）
１．２：
環化：側鎖のラクタム化
1 eqのPyBOPおよび1.8 EqのHOBtをNMP中に溶解し、4 EqのDIEAの存在下に、Asp／Lys-未保護FMOCペプチドに加えた。この反応を室温で2時間に亘って撹拌した。濾過およびNMPでの洗浄により、ラクタム化されたペプチドが回収された。 
CTC樹脂から2％TFAで放出された中間体ペプチドサンプルのHPLC逆相分析（C-18カラム、0.1％TFA、70％水／30％アセトニトリル中の約0.1g/mLの溶液の負荷、0.1％TFAアセトニトリル勾配での溶出）により、変換は殆ど完全であり、＞90％のラクタム化され且つ保護されたペプチドがFMOC部分を保持したことが示された。
【００５０】
１．３：
FMOC脱保護およびペプチド伸長
NMP中の20％ピペリジンを用いて、FMOC脱保護を行った。引き続き、DMF中において室温（40℃）で30分間、1 eqのHCTUおよび3 eqのHOOBt、3eqのDIEAの存在下に、FMOC-L-Nle（1 eq）を用いて1時間に亘り鎖伸長を行った。
【００５１】
樹脂に結合された生成物を濾別し、DMFで洗浄した後に、Nle上のFMOC部分をNMP中の20％ピペリジンで除去し、ピリジン中において約1.5 eqの無水酢酸と共に室温で1〜2時間インキュベートすることにより、N-末端アセチル基を組み込んだ。
【００５２】
該樹脂を濾別した後、濃ＴＦＡで野処理によりペプチドを解放し、且つ全体的に脱保護した。アセチル化され且つラクタム化されたペプチドの粗精製された生成物に基づく合計収率は、概ね〜60％であると決定された。
【００５３】
アシル化試薬を用いた樹脂上での更なる最後の誘導体化の必要性は、本発明、即ち、塩基に不安定なNα-保護基の存在下で且つこれを損なうことなくラクタム化を行うことの有用性を示している。Bocのような酸で開裂可能なN-保護基は、ここでは少なくとも樹脂上での処理について更なる問題を生じたであろう。
【００５４】
２．１：
ブロモ-(4-メチルフェニル)メチルポリスチレン樹脂結合されたモデルペプチド
の、アミノボランの存在下でのアリル／alloc脱保護
CTC樹脂をブロモ-(4-メチルフェニル)メチルポリスチレン（約200メッシュ、1.2〜2.2 mmol/g）（CBL Patras, Greece）に交換したことを除き、本質的には、(CH3)2NH・BH3をスカベンジャーとして使用して実験１．１を繰り返した。触媒をAcOH/DMF (approx. 4:1)中に溶解する一方、DMF（樹脂容積の5倍）中において40oCで30分間、脱保護反応を行った。工程２．２および工程２．３は、開裂を2％TISの存在下にジクロロメタン中の5％TFA中で行った点を除き、上記の工程１．２および工程１．３と同様にして行った。アセチル化された成熟ペプチドの収率は、72.8％（分析等級の純度）に達した。
【００５５】
３．１：
ブロモ-(4-メチルフェニル)メチルポリスチレン樹脂結合されたモデルペプチド
の、交換触媒Pd(Oac)2/P(oTol)3でのアリル／alloc脱保護
本質的には反応２．１を繰り返したが、以下の変更を伴った：0.1 eqのPd(PPh3)4の代わりに、0.05 eqのortho-トリルホスフィンの存在下で、0.05 eqのPd(Oac)2を使用した。更に、スカベンジャーとして2.2 eqのp-トリルスルフィン酸ナトリウムを加えた。2時間後でも、変換は痕跡量で生じたに過ぎなかった；温度を60℃に上昇させても変化はなかった。
【００５６】
４．１：
ブロモ-(4-メチルフェニル)メチルポリスチレン樹脂結合されたモデルペプチド
の、交換触媒Pd(P[oTol]3)2およびスルフィネートを用いたアリル／alloc脱保護
Paul et al., Organometallics (1995), 14(6), 3030-3039に記載されたようにして、触媒Pd(P[oTol]3)2を得た。Paul et alは更に、関連のPd(P[2,4-キシロイル]3)2を得ることを記載している。触媒を、AcOH/DMF(2:1)の中に溶解した。反応は、本質的に工程２．１に記載したとおりに行ったが、0.05 eqのPd(P[oTol]3)2を用いた。一定の窒素バブリングの下で、2.2 eqのp-トリルスルフィン酸ナトリウムをスカベンジャーとして加えた。反応は40℃において30分間生じた。該反応はスムースに進行し、開裂され且つアセチル化されたペプチドの分析的収率は、上記のセクション２の通りに行った工程４．２および４．３の後には82％に達した。アリル／alloc脱保護の反応時間を150分に延長しても、収率は顕著には増大しなかった（収率：84.5％）。触媒の量を約半分に低下させると、反応速度は顕著に遅延された。
【００５７】
５．１：
ブロモ-(4-メチルフェニル)メチルポリスチレン樹脂に結合されたモデルペプチド
の、交換触媒Pd(PPh3)4およびスルフィネートを用いたアリル／alloc脱保護
今回は、アリル/alloc脱保護のために0.1 eqのPd(PPh3)4を触媒として使用し、また30〜60分の反応時間を用いた点を除き、反応４．１を上記の通りに繰り返した。開裂されたアセチル化成熟ペプチドの収率は、82％に達した。
【００５８】
上記で述べた実施例は、先の実施例に使用したものについて、一般的または特定的に述べた本発明の反応物質および／または操作条件を置き換えることによって、同様の成功を伴って繰り返すことができる。
【００５９】
これら好ましい実施形態を特に参照して本発明を詳細に説明してきたが、他の実施形態も同じ結果を達成することができる。本発明の変形および修飾は当業者に明らかであり、本発明は変形例および均等物の全てをカバーするものである。上記で引用した全ての参照文献、特許出願、特許、および刊行物は、本明細書の一部としてここに組み込まれる。
【手続補正書】
【提出日】平成18年5月17日(2006.5.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクタム化によりペプチドを環化する方法において：
ａ．アリルアクセプタの存在下でのPd(0)触媒によって、ペプチドのNαにおける塩基に不安定な保護基を保持しながらアリル型保護基からペプチドを脱保護する工程であって、該ペプチドは、そのNαにおいて塩基に不安定な保護基で保護され、且つ該ペプチドは更に、リジン側鎖またはリジン側鎖類似体の少なくとも一つのアリルオキシ-カルボニル保護されたアミノ官能基を含み、更に、グルタミル側鎖またはアスパルチル側鎖またはこれら側鎖類似体の少なくとも一つのアリル-エステル保護されたω-カルボキシ基を含んでなり、前記アリル保護基は置換もしくは非置換である工程と；
ｂ．前記脱保護された側鎖を弱塩基試薬の存在下でラクタム化することにより、前記ペプチドを環化する工程と；
ｃ．そのNαにおける塩基に不安定な保護基から前記ペプチドを脱保護する工程と
を具備する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、塩基に不安定な保護基で保護された前記Nαが、前記更なるアリル−エステルで保護されたカルボキシ基のNαであり、また好ましくは、前記アスパルチル残基はジペプチド配列Asp-Hisの一部であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、更なる最終工程ｄ．として、前記脱保護されたNαの連続的なペプチド合成またはペプチド切片カップリングにより、前記ペプチドを更に伸長させることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、環化の際に、前記アリル保護基は樹脂ハンドルとして作用しないことを条件として、前記ペプチドは固相に結合され、また工程ｄ．のペプチド伸長は連続した固相ペプチド合成であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１または２に記載の方法であって、前記環化反応工程ｂ．は、非プロトン性溶媒中の弱塩基試薬の存在下で、且つ更なるカップリング試薬の存在下で行われることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記環化反応は、カップリング剤としてHCTUもしくはTCTU、またはベンゾトリアゾールのホスホニウム塩を用いて行われることを特徴とする方法
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、前記ペプチドは、酸に不安定な結合により樹脂支持体に連結されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１〜５の何れか１項に記載の方法であって、前記ペプチドは、酸に不安定な結合を介してC末端で共有結合されることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記塩基に不安定な保護基がFMOC基であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１または７に記載の方法であって、アリルアクセプターの存在下において、好ましくはアリルアクセプターとしての過剰量のR1-PhnSiHmを使用して、アリルおよびalloc保護基がPd(0)触媒によって除去され、ここでのR1は芳香族核における置換基のアリール、アルキルまたはアラルキルであり、nは1または2であり、mは2または3であり、より好ましくは、前記アリルアクセプターがPhSiH3であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
塩基に不安定な保護基で保護されたNαを有する次式IIまたはIIIの環状ペプチド：
【化１】
2008513403.tif 000015
ここで、Yは塩基に不安定な保護基であり、n＝1〜10、好ましくはn＝1または2、最も好ましくはn＝1であり、更に、m＝1〜15、好ましくはm＝3〜6、最も好ましくはm＝3であり、更に、x＝1〜200およびq＝0〜200であり、R1およびR2は各々独立に、天然のアミノ側鎖またはその非天然の誘導体であり、該側鎖は更にアリルエーテルおよびアリルオキシカルボニル保護基以外の保護基を含んでよく、またAは樹脂または樹脂ハンドルであり、或いは任意に、R2は天然のアミノ側鎖またはその非天然の誘導体であってもよく、該側鎖はエーテル、チオエーテル、エステル、チオエステル、アミドまたは二級もしくは三級アミノ部分を介して樹脂もしくは樹脂ハンドルに結合される：但し、そのときに、AはOH、NH2、NR’1HまたはNR’1R’2からなる群から選択され、R’1およびR’2は独立にC1-C4アルキルである。
【請求項１２】
請求項１１に記載のペプチドであって、前記塩基に不安定な基がFMOCであることを特徴とするペプチド。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載のペプチドであって、該ペプチドが、n＝1または2、より好ましくはn＝1の式IIのものであるペプチド。
【請求項１４】
請求項１１〜１３の何れか１項に記載のペプチドであって、Aは、アリル-オキシカルボニル部分を含む樹脂ハンドルを除き、樹脂ハンドルまたは樹脂連結部分を含んでなることを特徴とするペプチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載のペプチドであって、前記樹脂または樹脂ハンドルが次式IVのものであることを特徴とするペプチド：
【化２】
2008513403.tif 000016
ここで、R’’’は樹脂であり、またR’’1、R’’2、R’’3は独立に水素、C1-C4アルキルまたはC1-C4 アルコキシであり、同じでも異なってもよいが、R’’1、R’’2の一方のみが水素であることを条件とし、Lは酸素、硫黄、窒素であるか、または次式Vのものである：
【化３】
2008513403.tif 000017
【請求項１６】
請求項１５に記載のペプチドであって、前記樹脂または樹脂ハンドルは次式VIのものであり、またLが酸素および窒素からなる群から選択されることを条件として、基R’’’、R’’1およびR’’2の上記定義が適用される。
【化４】
2008513403.tif 000018
【請求項１７】
請求項１６に記載のペプチドであって、前記樹脂または樹脂ハンドルは次式VIIのものであり、またLが酸素および窒素からなる群から選択されることを条件として、基R’’’、R’’1およびR’’2の上記定義が適用される：
【化５】
2008513403.tif 000019
【請求項１８】
請求項１７に記載のペプチドであって、R’’’、R’’1およびR’’2は、Lが酸素である場合はR’’1およびR’’2の一方のみが水素であり得ることを条件として、独立に水素、メチルまたはメトキシであり、Lが窒素である場合は、独立にメチルまたはメトキシであり、好ましくはメトキシであることを特徴とするペプチド。
【請求項１９】
請求項１８に記載のペプチドであって、Lは酸素であり、R’’1は水素であり、R’’2はメチルまたはメトキシであり、また好ましくは、Aは樹脂または樹脂ハンドルであることを特徴とするペプチド。
【請求項２０】
請求項１９に記載のペプチドであって、R’’2がメチルであるペプチド。
【請求項２１】
塩基に不安定な保護基で保護されたNαを有する次式IIまたはIIIの環状ペプチド：
【化６】
2008513403.tif 000020
ここで、Yは塩基に不安定な保護基であり、n＝1〜10、好ましくはn＝1または2、最も好ましくはn＝1であり、更に、m＝1〜15、好ましくはm＝3〜6、最も好ましくはm＝3であり、更に、x＝1〜200およびq＝0〜200であり、R1およびR2は各々独立に、天然のアミノ側鎖またはその非天然の誘導体であり、該側鎖は更にアリルエーテルおよびアリルオキシカルボニル保護基以外の保護基を含んでよく、またAは樹脂または樹脂ハンドルであり、或いは任意に、R2は天然のアミノ側鎖またはその非天然の誘導体であり、該側鎖はエーテル、チオエーテル、エステル、チオエステル、アミドまたは二級もしくは三級アミノ部分を介して樹脂もしくは樹脂ハンドルに結合される：但し、そのときに、AはOR’3であり、R’3はアリル基を除く保護基であり、好ましくは、R’3はtert-ブチルまたはペンタフルオロフェニルである。
【請求項２２】
Pd(P[ortho-トリル]3)2またはPd(P[2,4-キシロイル]3)2 錯体の使用であって、アリル保護されたカルボキシル基、またはアリルオキシカルボニル保護されたアミノおよび／またはヒドロキシ基の脱保護を触媒するための使用。
【請求項２３】
請求項２２に記載の使用であって、前記有機スルフィネートが、アリル基アクセプタまたはスカベンジャー試薬として使用されることを特徴とする使用。
【請求項２４】
請求項２１または２２に記載の使用であって、前記アリル保護またはアリルオキシカルボニル保護された基が、任意に更に保護されたペプチド、好ましくはFmoc保護されたペプチドの一部であり、該Fmoc基は前記ペプチドのNαに結合される使用。
【請求項２５】
ラクタム化によってペプチドを環化する方法であって：
ａ．アリルアクセプタの存在下でのPd(0)触媒によって、ペプチドのNαにおける塩基に不安定な保護基を保持しながらアリル型保護基からペプチドを脱保護する工程であって、該ペプチドは、アリルエステルで保護されたω-カルボキシ基を有するアスパルチル残基のNαであるそのNαにおいて塩基に不安定な保護基で保護され、且つ該ペプチドは更に、リジン側鎖またはリジン側鎖類似体の少なくとも一つのアリルオキシ-カルボニル保護されたアミノ官能基を含んでなり、前記アリル保護基は置換もしくは非置換である工程と；
ｂ．前記脱保護された側鎖を弱塩基試薬の存在下でラクタム化することにより、前記ペプチドを環化する工程と；
ｃ．そのNαにおける塩基に不安定な保護基から前記ペプチドを脱保護する工程と
を具備する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
このアリル脱保護は、好ましくはアリル基反応性のパラジウム錯体、好ましくはPd(0) 錯体を用いた触媒反応、好ましくはC1-C10トリアルキルホスファイト、C3-C10トリシクロアルキルホスファイト、またはトリアリールホスフィンもしくはトリヘテロアリールホスフィン配位子を有するパラジウム錯体を用いた触媒反応を利用し（ここでのアリールもしくはヘテロアリールは電子供与性置換基で更に置換されてもよく、または非置換であってもよい）、更に好ましくは、フェニルホスフィン配位子を有するパラジウム錯体を用いた触媒反応を利用する（ここでのフェニルは、トリルまたはキシロイル、より好ましくはフェニル、2,4-キシロイルまたはo-トリルである）。好ましくは、前記ホスフィン配位子はモノホスフィン配位子、より好ましくは非キレート性の一価配位子である。前記パラジウム錯体は好ましくはモノパラジウム錯体であるが、錯体の用語は、モノパラジウム錯体が好ましいとしても、ジパラジウム錯体またはより高次のパラジウム錯体をも含むものとして理解されるべきである。アリルアクセプターまたはスカベンジャーの存在下において、テトラキス(トリフェニルホスフィン)-パラジウム [Pd(PPh3)4]を使用すること、または対応のPd(P[ortho-トリル]3)2 もしくはPd(P[2,4-キシロイル]3)2 錯体、またはトリフェニルホスフィン配位子およびトリ-(o-トリル)ホスフィン配位子の両方を有し得る混合錯体を使用することが、本発明においては最も好ましい。トリフェニルホスフィンに比較して、メチルフェニルホスフィン配位子、特にトリ-o-トリルホスフィン配位子は触媒反応速度を改善し、更に、最適収量を維持しながら、使用される貴金属触媒の総量を低下させることを可能にする。Pd(0)触媒によるアリルおよびアリルオキシ脱保護に対する参照については、Jeffrey et al., J. Org. Chem. 1982, 47:587-590を比較されたい。Jeffreyに記載されたように、本発明の錯体を交換触媒としてインサイチューで構成すること、即ち、安定性の低い配意されたPd錯体に本発明の好ましい配位子を混合することによって構成することもまた、当該技術において実現可能であり、且つ完全に慣用的である。従って、極めて好ましいPd(PPh3)4とは別の適切な触媒錯体の例は、PdCl2(PPh3)2／PPh3、Pd(DBA)2／P(oTol)3、Pd[P(oTol)3]2（Organometallics 1995, 14(6):3030-3039）、Pd(OAc)2／トリエチル-ホスファイト、Pd(OAc)2／PPh3である。
好ましくは、最初に添加されるPd(0)錯体は、PPh3またはP(oTol)3 [oTol＝オルト-トリル-]のような適切な遊離配位子の存在によって、好ましい錯体をインサイチューで構成することを可能にする。一般には、触媒との交換のために遊離リガンドを添加することは必須ではないが、特に高度に活性なアリールホスフィンパラジウム錯体を開始時から使用するときは、反応液に添加した余分なPPh3と共にJeffrey et al.(supra)によって最初に使用されたゼロ価のPd(PPh3)4の場合に、このオプションは注目に値する。アリルアクセプタの存在下でのPd触媒による脱保護の一般的機構は、当該技術において周知のアシル基転移反応（トランスアシレーション）である。アリルアクセプタ試薬またはスカベンジャーの選択は、望ましくない副反応を回避しながら、温和な反応条件下で定量的な脱保護を達成するために同様に重要である。適切なスカベンジャーは何れかの救核試薬、例えばモルホリン、ジメドン、N,N-ジメチルバルビツール酸、メチルアニリンまたはチオサリチル酸である。
【国際調査報告】
2008513403.tif 000021
2008513403.tif 000022
2008513403.tif 000023