(57)【要約】本発明は、植物の葉の寿命調節に関与する新規のタンパク質ＯＲＥ１５を開示する。また、前記タンパク質ＯＲＥ１５を暗号化する遺伝子を開示する。前記タンパク質および遺伝子は、老化遅延、成長促進、葉の重さおよび大きさの増加を含む、植物の葉の寿命調節に利用され得る。【選択図】図１
2008511314.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）よりなる群から選択されるポリペプチドを有する葉寿命調節タンパク質ＯＲＥ１５：
（ａ）配列番号２に示される全長のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド；および
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリペプチドと類似しているポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の前記タンパク質ＯＲＥ１５を暗号化する植物葉寿命調節遺伝子ＯＲＥ１５。
【請求項３】
前記植物葉寿命調節遺伝子ＯＲＥ１５は、配列番号１のヌクレオチド配列を有することを特徴とする、請求項２に記載の植物葉寿命調節遺伝子ＯＲＥ１５。
【請求項４】
請求項２に記載のＯＲＥ１５遺伝子を含む組み換えベクター。
【請求項５】
請求項２に記載の遺伝子を植物体に導入させる段階を含む植物の寿命調節方法。
【請求項６】
請求項２に記載の遺伝子を植物体に導入させる段階を含む植物の成長を増大させる方法。
【請求項７】
請求項２に記載の遺伝子を植物体に導入させる段階を含む植物の生産量を増大させる方法。
【請求項８】
請求項２に記載の遺伝子が導入された寿命延長特性を示す形質転換植物体。
【請求項９】
請求項２に記載の遺伝子が導入された増大した成長特性を示す形質転換植物体。
【請求項１０】
下記の段階を含む、植物の老化調節遺伝子をスクリーニングする方法：
（ａ）請求項２に記載のＯＲＥ１５遺伝子を植物細胞内で発現または活性化させる段階、および
（ｂ）前記植物細胞内で変化した発現量を示す遺伝子を検出する段階。
【請求項１１】
下記の段階を含む、植物の寿命調節に関与する物質をスクリーニングする方法：
（ａ）スクリーニング対象の物質を植物細胞に処理する段階、および
（ｂ）前記植物細胞で請求項２に記載のＯＲＥ１５遺伝子の発現量を調査する段階。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の葉の寿命調節に関与するタンパク質、それを暗号化する遺伝子、およびそれらの用途に関する。さらに詳しくは、本発明は、植物の葉の寿命を調節することが可能な新規のタンパク質ＯＲＥ１５、前記タンパク質を暗号化する新規の遺伝子ＯＲＥ１５、およびそれらの多様な用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の老化は、植物の発達過程中の最後段階で行われる一連の生化学的、生理学的現象を意味し、個体の寿命を制限する。植物老化の開始は細胞内に急激な変化を起す転換点であって、老化が進むにつれて、植物は益々合成能力が低下し、細胞内の構造物と巨大分子が順次分解して細胞の恒常性(homeostasis)を失うことにより、結局は細胞の死と帰結する(Matile P. et al., Elservier, 413-440, 1992; Nooden L.D. et al., Academic press, 1988; Thiman K.V. et al., CRC press, 85-115, 1980, Thomas H. et al., Annu. Rev. Plant Physiol. 123:193-219, 1993)。このような一連の過程は、単に手動的に植物組織の崩壊が起こるのではなく、遺伝的に計画されており、細胞、組織、器官の水準で非常に精巧且つ能動的に行われる過程である。
【０００３】
植物の老化は、生物学的重要性だけでなく、作物の生産性または収穫後の貯蔵効率における改良可能性のため、産業的に重要性が高い。これにより、植物の老化現象を解明するための遺伝学的、分子生物学的、生理学的および生化学的研究が盛んに行われている。ところが、植物ホルモンに関連した研究報告が主流を成しているだけであり、老化調節遺伝子を用いた老化調節誘導などの老化調節に関する研究については未だ足りない状態である。
【０００４】
逆遺伝的方法を通じて、これまでシロイヌナズナ、トマト、トウモロコシ、稲、タバコ、ジャガイモから、葉の老化の間に発現が増加する約１００枚余りの遺伝子が単離された(Buchanan-Wallaston, J. Exp. Bot. 48: 181-199, 1997; Quirini et al., Trends Plant Sci. 5: 278-282, 2000)。ところが、大部分の老化関連遺伝子の特性についてはよく知られておらず、極めて一部の老化関連遺伝子のみについてその機能が研究されている。最近では、シロイヌナズナの老化遅延を誘発する突然変異を単離し研究することにより、葉の老化を調節する遺伝子を探し出す方法が試みられている(Woo H.R. et al., Plant Cell 13: 1779-1790, 2001; Woo H.R. et al., Plant J. (in press))。ところが、老化促進突然変異から老化調節遺伝子を単離することは、実験上の困難さのため、殆ど行われなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、植物葉寿命調節タンパク質ＯＲＥ１５を提供することにある。
本発明の他の目的は、植物葉寿命調節タンパク質ＯＲＥ１５を暗号化する植物葉寿命調節遺伝子ＯＲＥ１５を提供することにある。  
本発明の別の目的は、ＯＲＥ１５遺伝子を含む組み換えベクターを提供することにある。
本発明の別の目的は、植物の寿命を調節する方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、植物の成長を増大させる方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、寿命延長特性を示す形質転換植物体を提供することにある。
本発明の別の目的は、増大した成長特性を示す形質転換植物体を提供することにある。
本発明の別の目的は、植物の老化調節遺伝子をスクリーニングする方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、植物の寿命調節に関与する物質をスクリーニングする方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一様態によれば、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含む植物葉寿命(leaf longevity)調節タンパク質ＯＲＥ１５を提供する。
【０００７】
本発明の他の様態によれば、本発明は、植物葉寿命調節タンパク質ＯＲＥ１５を暗号化する植物葉寿命調節遺伝子ＯＲＥ１５を提供する。
【０００８】
本発明は、植物の遺伝学的および分子生物学的研究のための材料として多く用いられるシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)を対象として、寿命の調節に関与する遺伝子を探索することを特徴とする。本発明者らは、既にＯＲＥ９という老化関与遺伝子を同定したことがある(Woo H.R. et al., Plant Cell 13:1779-1790, 2001)。本発明者らは、ＯＲＥ９の下流に存在する要素の突然変異体または新規の老化遅延突然変異体を探し出そうとし、このために、老化遅延変異体であるｏｒｅ９−１にアクティベーションタギング方法を適用して老化がｏｒｅ９−１よりさらに遅延する形質を示す突然変異体を選別した。その結果、本発明者らは、老化に関与する別の遺伝子を発掘し、これを「遺伝子ＯＲＥ１５」と命名した。
【０００９】
本明細書において、用語「寿命調節」および「老化調節」は、同義語であって、実質的な差異なしに互いに混用される。例えば、寿命を延長することは、老化を遅延するのと実質的に同一である。これと関連し、本発明の遺伝子またはタンパク質は、具体的には「寿命延長」もしくは「老化遅延」遺伝子またはタンパク質で表現できる。
【００１０】
また、本明細書において、本発明の遺伝子またはタンパク質と関連して使用される用語「葉の寿命」は、本発明の対象をより明確に表現するためのものであって、必ずしも葉に限定されて解釈されてはならない。すなわち、本発明の遺伝子またはタンパク質は、葉寿命調節遺伝子またはタンパク質で表現されるが、他の植物の器官、例えば根、種子、茎、花などの寿命の調節にも関与することができ、ひいては植物体自体の寿命を調節するのにも関与することができる。
【００１１】
本発明の植物葉寿命調節タンパク質ＯＲＥ１５では、（ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸と１００％一致するうえ、（ii）配列番号２に示されるアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド、および（i）または（ii）のポリペプチドと実質的に類似しているポリペプチドも本発明のＯＲＥ１５タンパク質の範囲に含まれるということは、当業界の技術水準を考慮して十分認識される。
【００１２】
本明細書において、「配列番号２に示されるアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド」は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較したとき、依然として葉の寿命延長（すなわち、老化遅延）機能を保有し、ジンクフィンガー(zinc finger)ドメインを成す配列番号２のアミノ酸配列の一部分を含むポリペプチドとして定義することができる。老化遅延機能を保有し且つジンクフィンガードメインを形成することができれば十分なので、前記ポリペプチドの長さおよびそのポリペプチドが有する活性の程度は特に問題となるものではない。すなわち、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに比べて活性が低くても、依然として寿命延長機能を保有するポリペプチドであれば、その長さを問わず、前記「配列番号２に示されるアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド」に含まれる。
【００１３】
通常の当業者であれば、すなわち本出願の時を基準として公知の関連先行技術を平均的に熟知している者であれば、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて一部分が欠失しても、そのようなポリペプチドは依然として寿命延長機能を持つものと期待するであろう。そのようなポリペプチドとしては、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいてＮ末端部分またはＣ末端部分が欠失したポリペプチドがある。一般に、Ｎ末端部分またはＣ末端部分が欠失しても、そのようなポリペプチドは本来のポリペプチドが有する機能を持つと当業界に公知になっている。また、Ｎ末端部分またはＣ末端部分だけでなく、それ以外の他の部分が欠失しても、本来のＯＲＥ１５タンパク質の有する機能を依然として持つことができる。
【００１４】
したがって、本発明において、前記「配列番号２に示されるアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド」は、前記定義のとおりに、本発明書の開示内容に基づいて当業者がその通常の能力範囲内で製造可能な葉寿命延長機能とジンクフィンガードメインを有する欠失した形態の全てのポリペプチドを含む意味で理解されるべきである。
【００１５】
一方、「（i）または（ii）のポリペプチドと実質的に類似しているポリペプチド」とは、一つ以上の置換されたアミノ酸を含むが、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドが有する機能、すなわち葉寿命延長機能を依然として保有し、ジンクフィンガードメインを持つポリペプチドをいう。一つ以上の置換されたアミノ酸を含むポリペプチドが葉寿命延長機能を依然として保有し、ジンクフィンガードメインを形成するだけすれば、そのようなポリペプチドが有する活性の程度またはアミノ酸が置換された割合は問題とならない。すなわち、一つ以上の置換されたアミノ酸を含むポリペプチドが配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに比べてその活性があまり低くても、かつ多数の置換されたアミノ酸を含んでいるとしても、そのようなポリペプチドが葉寿命延長機能を保有し、ジンクフィンガードメインを形成するだけすれば、本発明に含まれるのである。
【００１６】
一つ以上のアミノ酸が置換されても、置換される前のアミノ酸が置換されたアミノ酸と化学的に等価であれば、そのような置換されたアミノ酸を含むポリペプチドは依然として本来のポリペプチドの機能を保有する。例えば、疎水性アミノ酸であるアラニンが他の疎水性のアミノ酸、例えばグリシン、またはよりさらに疎水性のアミノ酸、例えばバリン、ロイシンまたはイソロイシンで置換されても、そのような置換されたアミノ酸を有するポリペプチドは、活性は低くても、本来のポリペプチドの機能を依然として保有する。同様に、陰に荷電されたアミノ酸、例えばグルタミン酸が他の陰に荷電されたアミノ酸、例えばアスパラギン酸で置換されても、そのような置換されたアミノ酸を持つポリペプチドも、活性は低くても、本来のポリペプチドの機能を依然として保有し、また、陽に荷電されたアミノ酸、例えばアルギニンが他の陽に荷電されたアミノ酸、例えばリジンで置換されても、そのような置換されたアミノ酸（ら）を持つポリペプチドも、活性は低くても、本来のポリペプチドの機能を依然として保有する。また、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端部分において置換されたアミノ酸（ら）を含むポリペプチドも、本来のポリペプチドの機能を依然として保有する。
【００１７】
当業界の技術水準を考慮すると、配列番号２のアミノ酸配列で前記一つ以上の置換されたアミノ酸を含みながらも寿命延長機能を依然として保有し、ジンクフィンガードメインを有するポリペプチドを容易に製造することができる。
【００１８】
上述したように、「前記（i）または（ii）のポリペプチドと実質的に類似しているポリペプチド」は、一つ以上の置換されたアミノ酸を含みながらも依然として寿命延長機能を有し、ジンクフィンガードメインを有する全てのポリペプチドを含む意味であるが、それにもかかわらず、活性の程度という観点から、前記ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列との配列相同性が高ければ高いほど好ましい。前記ポリペプチドは、配列相同性の下限において６０％以上の配列相同性を持つものが好ましいが、配列相同性の上限においては当然１００％の配列相同性を持つものが好ましい。
【００１９】
よりさらに具体的には、前記配列相同性は、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％の順序通りに高くなればなるほど好ましい。
【００２０】
本発明の植物葉寿命調節遺伝子ＯＲＥ１５は、上述した配列番号２のＯＲＥ１５タンパク質だけでなく、その変異体(variants)を暗号化する全てのポリヌクレオチド配列を含む。より詳しくは、本発明のＯＲＥ１５遺伝子は、上述した配列番号２のＯＲＥ１５タンパク質を暗号化するポリヌクレオチド配列だけでなく、その配列によって暗号化されるタンパク質が葉寿命延長活性を示し、ジンクフィンガードメインを有する限りは、本発明の範囲に属する。最も好ましくは、本発明のＯＲＥ１５遺伝子は、配列番号１に示される塩基配列を含む。
【００２１】
本発明の別の様態によれば、本発明は、上述したＯＲＥ１５遺伝子を含む組み換えベクターを提供する。
【００２２】
本発明の好適な具現例によれば、本発明のベクターは、（ａ）植物の寿命延長に関与するタンパク質ＯＲＥ１５を暗号化するヌクレオチド配列、および（ｂ）前記ヌクレオチドに作動的に連結された(operably linked)プロモータを含むベクターを提供する。
【００２３】
本明細書において、用語「作動的に連結された」とは、ヘキサン発現調節配列（例えば、プロモータ、シグナル配列、または転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列間の機能的な結合を意味し、これにより、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写および／またはトランスレイションを調節する。
【００２４】
本発明のベクターシステムは、当業界に公知になっている様々な方法によって構築でき、これに対する具体的な方法はSambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)に開示されており、その文献は本明細書に参照として組み込まれる。
【００２５】
本発明の遺伝子は、植物から単離され、植物体の寿命を延長する作用を行うことができるので、植物に対して最も好適な有用性を持つ。したがって、本発明のベクターは、（i）植物寿命延長タンパク質ＯＲＥ１５を暗号化するヌクレオチド配列；（ii）前記（i）のヌクレオチド配列に作動的に連結され、植物細胞で作用してＲＮＡ分子を形成させるプロモータ、および（iii）植物細胞で作用して前記ＲＮＡ分子の３’末端のポリアデニル化を引き起こす３’−非−解読化部位を含む植物発現用ベクターを提供する。
【００２６】
本発明の好適な具現例によれば、本発明に適したプロモータは、植物体の遺伝子導入のために、当業界で通常用いられるいずれのものも利用できる。例えば、トウモロコシのユビキチンプロモータ、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモータ、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）プロモータ、フィグウォットモザイクウィルス３５Ｓプロモータ、シュガーケーンバチルス状ウィルスプロモータ、コメリナイエローモトルウィルスプロモータ、リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼスモールサブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）の光誘導性プロモータ、稲サイトゾルトリオスホスフェートイソメラーゼ（ＴＰＩ）プロモータ、シロイヌナズナのアデニンホスホリボシールトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）プロモータ、およびオクトパインシンターゼプロモータを含む。
【００２７】
本発明の好適な具現例によれば、本発明に適したポリアデニル化を引き起こす３’−非−解読化部位は、アグロバクテリウムトゥメファシエンスのノパリンシンターゼ遺伝子に由来したもの（ｎｏｓ３’末端）(Bevan et al., Nucleic Acids Research, 11(2):369-385(1983))、アグロバクテリウムトゥメファシエンスのオクトパインシンターゼ遺伝子に由来したもの、トマトまたはジャガイモのプロテアーゼ抑制子IまたはII遺伝子の３’末端部分およびＣａＭＶ３５Ｓタミネータを含む。
【００２８】
選択的に、前記ベクターは、レポータ分子（例：ルシフェラーゼおよびβ−グルクロニダーゼ）を暗号化する遺伝子をさらに運搬する。また、本発明のベクターは、選択標識であって、抗生剤（例えば、ネオマイシン、カルベニシリン、カナマイシン、スペクチノマイシン、ハイグロマイシンなど）耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン、ホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔII）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）などを含む。
【００２９】
本発明の他の様態によれば、本発明は、上述したＯＲＥ１５遺伝子を植物体に導入させる段階を含む植物の寿命調節方法を提供する。
【００３０】
本発明の別の様態によれば、本発明は、ＯＲＥ１５遺伝子が導入された寿命延長特性を示す形質転換植物体を提供する。
【００３１】
本発明の別の様態によれば、本発明は、上述したＯＲＥ１５遺伝子を植物体に導入させる段階を含む植物の成長を増大させる方法を提供する。
【００３２】
本発明の別の様態によれば、本発明は、ＯＲＥ１５遺伝子が導入された増大した成長特性を示す形質転換植物体を提供する。
【００３３】
本発明の別の様態によれば、本発明は、上述したＯＲＥ１５遺伝子を植物体に導入させる段階を含む植物の生産量を増大させる方法を提供する。
【００３４】
このような形質転換によって植物の寿命が延長される特性を示すか、或いは成長／生産量が増大する特性を示す。このようにＯＲＥ１５遺伝子による形質転換によって得られた植物形質転換体は、植物の寿命が延長されたことを示す多様な指標（例えば、葉緑素含有量の減少遅延、光合成活性の減少遅延、老化関連遺伝子の発現）から確認可能であり、また成長が増大することを示す多様な指標（例えば、葉の重さおよび大きさ増加比率の増大）から確認可能である。
【００３５】
本発明の方法において、用語「植物（体）」は、成熟した植物だけでなく、成熟した植物に発育することが可能な植物細胞、植物組織、植物種子などを全て含む意味として理解される。
【００３６】
また、前記植物（体）には、具体的に、稲、小麦、麦、トウモロコシ、豆、ジャガイモ、小麦、小豆、オート麦、もろこしを含む食糧作物類、シロイヌナズナ、白菜、大根、唐辛子、イチゴ、トマト、スイカ、胡瓜、キャベツ、真桑瓜、カボチャ、ネギ、玉ねぎ、ニンジンを含む野菜作物類、朝鮮人参、タバコ、棉、ゴマ、砂糖黍、砂糖大根、荏胡麻、落花生、油菜を含む特用作物類、リンゴ、梨、茄、桃、キーウィ、葡萄、オレンジ、柿、スモモ、満州杏、バナナを含む果樹類、薔薇、グラジオラス、ガーベラ、カーネーション、菊、百合、チューリップを含む花卉類、ライグラス、ムラサキツメクサ、カモガヤ、ムラサキウマゴヤシ、ヒロハノウシノケグサ、多年生ライグラスなどを含む飼料作物類が含まれる、と理解される。
【００３７】
また、本発明の方法において、用語「生産量の増大」とは、バイオマス(biomass)の増加を意味し、好ましくは植物の葉、茎などの器官の重さおよび／または大きさの増加を含むと理解される。
【００３８】
一方、外来性ポリヌクレオチド、すなわちＯＲＥ１５遺伝子を植物体に導入させる方法は、当業界に一般に公知になっている方法（Methods of Enzymology, Vol. 153, 1987, Wu and Grossman Ed, Academic Press；その内容は本明細書に参照として組み込まれる）によって実施できる。外来性ポリヌクレオチドを運搬体、例えばプラスミドやウィルスなどのベクターに組み込んで植物を形質転換させることができ、アグロバクテリウムバクテリアを媒介体として使用することができ（Chilton et al., 1977, Cell 11:263:271；その内容は本明細書に参照として組み込まれる）、直接外来性ポリヌクレオチドを植物細胞内に導入させて植物を形質転換させることができる（Lorz et al., 1985, Mol. Genet. 199:178-182；その内容は本明細書に参照として組み込まれる）。例えば、Ｔ−ＤＮＡ部位を含まないベクターを利用する場合には、電気穿孔法(electroporation)、粒子衝撃法(microparticle bombardment)、ポリエチレングリコール沈殿法(polyethylene glycol-mediated uptake)を利用することができる。
【００３９】
一般に、植物を形質転換させるにおいて多く用いられる方法が、外来性ポリヌクレオチドで形質転換されたアグロバクテリウムトゥメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)を植物細胞や種子などにトランスフェクションする方法である（参照：米国特許第５，００４，８６３号、第５，３４９，１２４号および第５，４１６，０１１号）。当業者は、公知の適切な条件下でトランスフェクションされた植物細胞や種子を培養または栽培して植物に発育させることができる。
【００４０】
一方、前記形転換植物を作る段階は、老化遅延機能を持つＯＲＥ１５遺伝子を、調節ヌクレオチド配列を含む発現ベクターに組み込んで組み換え発現ベクターを製作する段階と、このような組み換えベクターを開花植物に導入して形質転換植物を作る段階とを含んでなることが好ましい。
【００４１】
さらに好ましくは、老化遅延機能を持つＯＲＥ１５遺伝子を、調節ヌクレオチド配列を含む発現ベクターに組み込んで組み換え発現ベクターを製作する段階と、このような組み換え発現ベクターでアグロバクテリウムバクテリアを形質転換させる段階と、このような形質転換されたアグロバクテリウムバクテリアを植物にトランスフェクションする段階とを含んでなることが好ましい。特に前記形質転換されたアグロバクテリウムバクテリアは、形質転換されたアグロバクテリウムトゥメファシエンスであることが好ましい。
【００４２】
前記「調節ヌクレオチド配列」とは、その存在がそれに連結された遺伝子の発現に影響を及ぼし得る全ての配列を含む意味として理解される。このような調節ヌクレオチド配列は、リーダー配列、エンハンサー配列、プロモータ配列を全て含むが、プロモータ配列が好ましい。プロモータの詳細な説明は前述した通りである。
【００４３】
形質転換された植物細胞の選別は、形質転換培養物を選択剤（例えば、代謝抑制剤、抗生剤および除草剤）に露出させて実施できる。形質転換されて選択剤に対する耐性を与える標識遺伝子を安定的に含んでいる植物細胞は、前述した培養物で成長し、分割する。例示的な標識は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、グリコホスフェート耐性遺伝子およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔII）システムを含むが、これに限定されるものではない。
【００４４】
植物の原形質または各種外植片から植物体の発達または再分化を行わせる方法は、当業界によく知られている。アグロバクテリウムによって導入された外来遺伝子を含む植物体の発達または再分化は、当業界に公知になっている方法によって達成できる（参照：米国特許第５，００４，８６３号、第５，３４９，１２４号および第５，４１６，０１１号）。
【００４５】
本発明の別の様態によれば、本発明は、（ａ）前記ＯＲＥ１５遺伝子を植物細胞内で発現または活性化させる段階と、（ｂ）前記植物細胞内で変化した発現量を示す遺伝子を検出する段階とを含む、植物の老化調節遺伝子をスクリーニングする方法を提供する。
【００４６】
本発明のＯＲＥ１５遺伝子は、老化関連遺伝子(senescence associated genes)の発現に影響を及ぼすものであって、本発明者らによって究明された（参照：実施例４）。すなわち、ＯＲＥ１５遺伝子が活性化、すなわち過発現される植物体の場合、野性型に比べて、老化を誘導する遺伝子の発現が増大した。
【００４７】
このような発見に基づき、ＯＲＥ１５遺伝子を植物細胞内で発現または活性化させる場合、変化した発現量のパターンを示す遺伝子を検出すると、老化調節遺伝子をスクリーニングし得ることが分かった。
【００４８】
変化した発現量のパターンを示す遺伝子を検出する技術は、当業界に公知となっている。例えば、アービトラリプライマーを用いて多数の転写体(transcript)を増幅することにより、変化した発現量のパターンを示す遺伝子をスクリーニングすることができる（参照：米国特許第５５９９６７２号）。この場合、ＯＲＥ１５遺伝子が非活性化、すなわち過発現されない対照群植物体のＲＴ−ＰＣＲ結果と比較する。
【００４９】
本発明の別の様態によれば、本発明は、（ａ）スクリーニング対象の物質を植物細胞に処理する段階と、（ｂ）前記植物細胞において前記ＯＲＥ１５遺伝子の発現量を調査する段階とを含む、植物寿命調節に関与する物質をスクリーニングする方法を提供する。
【００５０】
本発明の方法によれば、スクリーニング対象の飼料の処理によってＯＲＥ１５遺伝子の発現量が増加すると、植物の寿命を延長（老化遅延）することが可能な物質として分類する。
【００５１】
ＯＲＥ１５遺伝子の発現量の調査は、当業界に公知になっている様々な方法によって実施できる。大きくは、遺伝子水準における調査と、タンパク質水準における調査に区別される。遺伝子水準における調査は、本発明者によって究明されたＯＲＥ１５遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて製作されたプライマーを用いたＰＣＲまたはプローブを用いた混成化反応（この場合、ＤＮＡマイクロアレイを製作して使用すれば便利である）によって実施してもよく、ノーザンブロット技術（参照：Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRC press）を用いて実施してもよい。タンパク質水準における調査は、ＯＲＥ１５遺伝子によって暗号化されるタンパク質に対する抗体を用いて免疫分析（immunoassay、たとえば、放射能免疫分析方法、放射能免疫沈殿方法、酵素−結合免疫吸着方法（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイ、ウェスタンブロット、抑制または競合アッセイ、およびサンドイッチアッセイ）によって定量的にまたは定常的に実施できる（参照：Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; and Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984）。
【発明の効果】
【００５２】
以上述べたように、ｏｒｅ１５−Ｄ変異体の老化遅延表現型がＯＲＥ１５遺伝子の活性化によって現れたことを確認し、且つ、前記ＯＲＥ１５遺伝子を活性化させることにより、植物体における老化を遅延することができることを確認した。本発明の植物葉寿命調節遺伝子ＯＲＥ１５を用いて植物体を形質転換させることにより、植物の寿命を調節することができる。また、本発明のＯＲＥ１５遺伝子および前記遺伝子から発現するＯＲＥ１５タンパク質は、植物の老化機序研究や老化関連遺伝子または老化調節物質の探索などに有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。
但し、下記実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。
【実施例】
【００５４】
実施例１：シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)からの老化遅延突然変異体の選抜
まず、シロイヌナズナから突然変異を誘導するために、４つのＣａＭＶ ３５ＳエンハンサーがＴ−ＤＮＡの右縁(right border)付近に存在し、バスタ除草剤に対する抵抗性を与えるｂａｒ遺伝子(phosphinothricin acetyltransferase gene)を含むアクチベーションタギングベクターであるｐＳＫＩ０１５(Weigel et al., Plant Physiology 122:1003-1014, 2000)（米国Ｗｅｉｇｄ実験室から分譲を受けた）を、公知の電気穿孔法を用いてアグロバクテリウムトゥメファシエンスＡＢＩ菌株（米国Ａｍａｓｉｎｏ実験室から分譲を受けた)に導入させた後、カナマイシン(kanamycin)とカルベニシリン(carbenicillin)が含まれた培地から選抜した。その後、ｐＳＫＩ０１５ベクターが組み込まれた前記アグロバクテリウム菌株をフローラルディップ方法(Clough et al., Plant J., 16(6):735-743, 1998)によってシロイヌナズナの老化遅延突然変異体であるｏｒｅ９−１(Woo H.R. et al. Plant Cell 13:1779-1790, 2001)にトランスフェクションした。前記トランスフェクションされたシロイヌナズナの種子を受け取り、バスタ除草剤に抵抗性のある形質転換体を選別した。その後、約２３℃に温度が調節される温室で１０，０００個のＴ１ラインを成長させ、年齢依存的な植物老化による葉緑素の減少により葉が黄化する程度を肉眼で観察した。その後、ｏｒｅ９−１に比べて葉の黄化速度が遅い１個の変異体ラインを選抜し、前記変異体をｏｒｅ１５−Ｄと命名した。図１は、シロイヌナズナコロンビア野生型（Ｃｏｌ−Ｏ）とｏｒｅ１５−Ｄにおける時間による葉の老化様相を示す。図１から明確に確認できるように、本発明の変異体ｏｒｅ１５−Ｄは野生型に比べて老化が大きく遅延することが分かる。
【００５５】
実施例２：老化遅延突然変異体ｏｒｅ１５−Ｄの形質発現の調査
ｏｒｅ１５−Ｄ突然変異体の老化遅延形質を確認するために、ｏｒｅ１５−Ｄの葉の葉緑素含量と光合成活性の程度を測定して野生型（Ｃｏｌ−Ｄ）と比較した。
【００５６】
２−１）葉緑素含有量の測定
葉緑素含量の測定のために各試料の葉を８０℃の９５％エタノールで沸かして葉緑素を抽出した。葉緑素の含量は６４８ｎｍと６６４ｎｍの吸光度で測定し、葉の生体重(fresh weight)に対する葉緑素の濃度で表示した(Vermon et al., Anal. Chem. 32:1142-1150, 1960)。
その結果、図２に示すように、野性型（Ｃｏｌ−Ｏ）の場合、２４ＤＡＥ(days after emergence：葉が芽生えた日からの日数)に黄化現象が現われ始まり、２８ＤＡＥに５０％の葉緑素が維持されたが、ｏｒｅ１５−Ｄの場合、２８ＤＡＥまで１００％に維持され、３６ＤＡＥにも約２５％の葉緑素が維持された。
【００５７】
２−２）光合成の活性
光合成の活性を測定するために、Ｏｈ等の方法(Oh S.A. et al., Plant Mol. Biol. 30: 939, 1996)を用いた。まず、各ＤＡＥの葉を１５分間暗処理した後、植物効率分析器(Plant Efficiency Analyzer)（Ｈａｎｓａｔｅｃｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｏｒｆｏｌｋ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて葉緑素の蛍光を測定した。光合成の活性は、葉緑素の蛍光度特性を用いたＰＳII(photosystem II)の光化学的効率(photochemical efficiency)で表示したが、この効率は、蛍光度最大値(maximum value of fluorescence；Ｆｍ)に対する最大変形蛍光度(maximum variable fluorescence；Ｆｖ)の割合（Ｆｖ／Ｆｍ）で定められる。前記数値が高ければ高いほど、光合成効率に優れることを示す。
その結果、光合成活性の変化も葉緑素の含量と類似であり、野生型（Ｃｏｌ−Ｏ）の場合、２４ＤＡＥ以後に活性が急激に減少し始めたが、ｏｒｅ１５−Ｄの場合は、２８ＤＡＥ以後に徐々に低くなった（図３参照）。
以上の結果は、ｏｒｅ１５−Ｄ変異型においてＯＲＥ１５遺伝子変異によって野生型の老化の表現型が遅延することを示唆し、このような老化遅延の効果は、葉緑素の含量と光合成活性の維持などで表現される老化による生化学的変化が遅延してなされることから確認することができる。
【００５８】
実施例３：暗処理によるｏｒｅ１５−Ｄ変異体の葉寿命変化の調査
老化を促進する別の要因である暗処理によるｏｒｅ１５−Ｄ変異体の葉の寿命変化を、生合成の活性および葉緑素含量の変化の測定によって調査した。
野生型（Ｃｏｌ−Ｏ）とｏｒｅ１５−Ｄ変異体から単離した葉（１２ＤＡＥ）を３ｍＭ ２−［Ｎ−モルホリノ］−エタンスルホン酸緩衝液（2-[N-morpholino]-ethanesulfonic acid、ｐＨ５．８；以下「ＭＥＳ緩衝溶液」という）に浮遊させた後、光の入らない暗いボックスに入れて２２℃で放置しながら２日間隔で２４個の独立した葉に対して光合成の活性および葉緑素の含量を前記実施例２と同一の方法によって測定した。図４は、シロイヌナズナの野生型（Ｃｏｌ−Ｏ）とｏｒｅ１５−Ｄにおける暗処理後の時間による葉の老化を示す写真である。写真に明確に示されるように、本発明のｏｒｅ１５−Ｄ変異体は野生型と比較して老化が大きく遅延することが分かる。また、図５および図６に示すように、暗処理５日後に葉緑素および光合成の活性を比較したところ、葉緑素および光合成の活性が、野生型（Ｃｏｌ−Ｏ）の場合はそれぞれ７５％と７４％に減少したが、ｏｒｅ１５−Ｄの場合はそれぞれ９９．５％と９９％程度に減少した。
【００５９】
実施例４：ＯＲＥ１５遺伝子変異体における老化関連遺伝子の発現
ＯＲＥ１５遺伝子が老化関連遺伝子（senescence associated genes;ＳＡＧｓ）の発現にどんな影響を及ぼすかを確認するために、葉を暗処理する間に時間経過に伴う各ＳＡＧタンパク質の発現様相をノーザンブロット(northern blot)によって確認した。試料は０、２、４、６ＤＡＴ(days after dark treatment：暗処理後の日数)に全体ＲＮＡを抽出して調査した。各レーン別に１０μｇのＲＮＡをロードし、探針としてはＳＥＮ１（ＧｅｎＢａｎｋの受託番号ＮＭ１１９７４３）およびＳＥＮ４（ＧｅｎＢａｎｋの受託番号ＮＭ１１９１７３）遺伝子を使用した。
その結果、図７に示すように、老化関連遺伝子ＳＥＮ１とＳＥＮ４の発現は、Ｃｏｌ−Ｏでは８ＤＡＴに老化の進行に伴って確然に増加する。ところが、同一の時間の間に、ｏｒｅ１５−Ｄ変異型では前記老化関連遺伝子の発現が１２ＤＡＴになってやっと増加すると確認された。このような事実は、ＯＲＥ１５遺伝子変異が生理的現象だけでなく、分子水準においても寿命調節効果があることを意味する。
【００６０】
実施例５：ＯＲＥ１５遺伝子クローニングおよび配列分析
ｏｒｅ１５−Ｄ変異体から、エンハンサーによって活性化されたＴ−ＤＮＡ周辺の植物遺伝子を探索するために、プラスミドレスキュー方法(Weigel et al., Plant Physiology 122:1003-1014, 2000)によって遺伝子を単離した。図８にアクチベーションタギングベクターｐＳＫＩ０１５がｏｒｅ１５−Ｄ変異体ゲノム内に組み込まれた模式図を示した。ｏｒｅ１５−Ｄ変異体から全体ゲノムを単離した(Dellaporta et al., Plant Mol. Biol. Rep. 1:19-21, 1983)。その後、５μｇのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ制限酵素で切断し、エタノール沈殿(ethanol precipitation)をさせた後、乾燥させた。切断されたＤＮＡをセルフライゲーション(self-ligation)し、これを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換させた後、アンピシリンに抵抗性を持つコロニーを選抜した。
Ｔ−ＤＮＡ内に存在するＥ．ｃｏｌｉ複製起点と選別マーカー、そして右縁部位付近の７．０ｋｂ植物ゲノムＤＮＡ切片が含まれたプラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉは、選別培地でコロニーに成長する。したがって、このコロニーからプラスミドを単離した後、Ｔ−ＤＮＡ右縁面部位の塩基配列を決定した。前記選抜されたコロニーからプラスミドを単離してプラスミドレスキュー方法に使用したＥｃｏＲＩ部位の下流にある塩基配列を参照して製作したオリゴマーを用いて塩基配列を決定した。決定された塩基配列に基づいてシロイヌナズナゲノムデータベースを参照してエンハンサーと最も近い転写、解読フレームを探し出し、前記単離されたＯＲＥ１５遺伝子から発現されるタンパク質は、配列番号２および図９に示すように、２４３個のアミノ酸から構成されている。
その後、前記ＯＲＥ１５遺伝子を探針としてノーザンブロット分析を行った。野性型（Ｃｏｌ−Ｏ）とｏｒｅ１５−Ｄ変異体からＴＲＩ−試薬（Ｓｉｇｍａ）を用いてそれぞれ全体ＲＮＡを抽出した。各レーン別に１０μｇのＲＮＡを１．２％アガロース／ホルムアルデヒドゲルにロードして単離した後、ナイロン膜に移した。その後、２Ｘ ＳＳＣで５分間洗浄して余分のアガロースを除去した後、ＲＮＡをナイロン膜に固定させるために紫外線（２５４ｎｍ、０．１８Ｊ／Ｓｑ．ｃｍ2）を照射した。ナイロン膜に移されたブロットは、Ｐａｒｋ等の方法(Park et al., Plant Mol. Biol. 26:1725-1735, 1994)によって前混成化および混成化反応を行った。
その結果、図８に示すように、野性型（Ｃｏｌ−Ｏ）ではこのＯＲＥ１５遺伝子の発現が観察されなかったが、ｏｒｅ１５−Ｄ変異体では過多発現されていることが観察された。
【００６１】
実施例６：野生型（Ｃｏｌ−Ｏ）へのＯＲＥ１５遺伝子の導入
ｏｒｅ１５−Ｄ変異体で現れる老化遅延表現型がＯＲＥ１５遺伝子の活性化によるものかを最終確認するために、前記ＯＲＥ１５遺伝子を含む２．５ｋｂ ＤＮＡ断片を野生型（Ｃｏｌ−Ｏ）に過発現するように再び導入する実験を行った。このために、まず、全長のＯＲＥ１５ ｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって単離した。確保されたＯＲＥ１５遺伝子を含むＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）に組み込み、これをｐＯＲＥ１５／ＧＴＥと命名した。ｐＯＲＥ１５／ＧＴＥをＢｇｌIIとＢｓｔＥIIで切断してＯＲＥ１５遺伝子断片をさらにｐＣＡＭＢＩＡ３３０１ベクター（Ｃａｂｅｒｒａ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）に組み込み、これをｐＯＲＥ１５／３３０１と命名した。その後、ｐＯＲＥ１５／３３０１を用いてアグロバクテリウムトゥメファシエンスＡＧＬ１菌株(Agrobacterium tumefacience AGL1 strain)を形質転換した。前記形質転換されたアグロバクテリウムトゥメファシエンスＡＧＬ１菌株をｐＡＴ−ＯＲＥ１５と命名した。その後、フローラルディップ方法(Clough et al., Plant J., 16(6):735-743, 1998)によって前記ｐＡＴ−ＯＲＥ１５で野生型（Ｃｏｌ−Ｏ）を形質転換し、形質転換されたシロイヌナズナにおいて表現型が再現されることを確認することにより、前記ＯＲＥ１５がシロイヌナズナの葉の老化を調節する遺伝子であることが分かった。
【００６２】
実施例７：成長過程によるｏｒｅ１５−Ｄ変異体の葉の重さと大きさの変化調査
ｏｒｅ１５−Ｄ変異体の葉の寿命変化と共に現れる別の特徴である、野生型に比べて増加した葉の重さと大きさの変化を成長過程に従って測定によって調査した。
野生型（Ｃｏｌ−Ｏ）とｏｒｅ１５−Ｄ変異体から第３番の葉が生えた日（ＤＡＥ：days after emergence）を基準として４日間隔で葉の重さを測り、葉の大きさは葉をスキャンした後、ｓｃｉｏｎ ｉｍａｇｅ（ＮＩＨ、ＵＳＡ）というプログラムを用いて測定した。その結果、図１０に示すように、葉の重さが８ＤＡＥの後に野生型に比べてｏｒｅ１５−Ｄで著しく差異を示しながら増加していることを示す。しかも、図１１に示すように、葉のサイズを比較した結果、野生型（Ｃｏｌ−Ｏ）と８ＤＡＥ以後にやはり差異を示しながら増加することを示す。
このような表現型的差異を確認するために、野生型（Ｃｏｌ−Ｏ）、過発現変異体ｏｒｅ１５−Ｄ、およびノックアウト変異体ｏｒｅ１５−２ＫＯの１２ＤＡＥに対する表現型を調査した。その結果、葉のサイズにおいて野生型に比べてｏｒｅ１５−Ｄが著しく増加したことを観察することができ（図１２）、このような器官サイズの増加は、ｏｒｅ１５−Ｄ変異体の葉だけでなく、ほぼ全ての器官から確認することができた。このような器官サイズの変化が生体内のどの要因によって誘発されるかを確認するために、われわれは葉の縦断面に対する解剖学的観察（図１３）、そして第３番のロゼット葉(rosette leaf)に対する解剖学的分析（図１４）を行った。その結果、柵状組織の細胞の大きさが野生型に比べてｏｒｅ１５−Ｄがやや小さかったが、細胞の数は著しく増加することが分かった。一方、ノックアウト変異体であるｏｒｅ１５−２ＫＯは、過発現変異体であるｏｒｅ１５−Ｄと正反対の様相を示した。したがって、ｏｒｅ１５−Ｄの葉器官の大きさに対する表現型的特徴は、葉の柵状組織にある細胞の大きさではなく、細胞数の増加に起因すると提案することができる。このような事実は、植物体の細胞数の調節によって植物の老化を遅延させるのに重要な役割を担当する遺伝子がＯＲＥ１５遺伝子であるという新しい提案を誘導することができる。
【００６３】
このような現象が老化の調節に直接的な影響を及ぼす要素なのか間接的な効果なのかを解明するためにはさらに多くの実験が要求されるが、このような葉の大きさと重さの増加を各種作物に導入する場合、多くの生産性の増加をもたらすであろうと予想される。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】シロイヌナズナの野生型（Ｃｏｌ−Ｏ）と寿命延長変異体ｏｒｅ１５−Ｄにおける時間による葉の老化を示す写真（ａ）、葉緑素含量の変化（ｂ）、光合成活性の変化（ｃ）を示す。  ：Ｃｏｌ、■：ｏｒｅ１５−Ｄ  Ｆｖ：最大変形蛍光度(maximum variable fluorescence)  Ｆｍ：蛍光度最大値(maximum yield of fluorescence)
【図２】シロイヌナズナの野生型（Ｃｏｌ−Ｏ）と寿命延長変異体ｏｒｅ１５−Ｄにおける時間による葉の老化を示す写真（ａ）、葉緑素含量の変化（ｂ）、光合成活性の変化（ｃ）を示す。  ：Ｃｏｌ、■：ｏｒｅ１５−Ｄ  Ｆｖ：最大変形蛍光度(maximum variable fluorescence)  Ｆｍ：蛍光度最大値(maximum yield of fluorescence)
【図３】シロイヌナズナの野生型（Ｃｏｌ−Ｏ）と寿命延長変異体ｏｒｅ１５−Ｄにおける時間による葉の老化を示す写真（ａ）、葉緑素含量の変化（ｂ）、光合成活性の変化（ｃ）を示す。  ：Ｃｏｌ、■：ｏｒｅ１５−Ｄ  Ｆｖ：最大変形蛍光度(maximum variable fluorescence)  Ｆｍ：蛍光度最大値(maximum yield of fluorescence)
【図４】シロイヌナズナの野生型（Ｃｏｌ−Ｏ）とｏｒｅ１５−Ｄにおける暗処理後の時間による葉の老化を示す写真（ａ）、葉緑素含量の変化（ｂ）、光合成活性の変化（ｃ）、および老化関連遺伝子の発現様相を示すノーザンブロット分析の結果（ｄ）を示す。  ＳＥＮ１：老化遺伝子１(Senescence-associated gene 1)  ＳＥＮ４：老化遺伝子４(Senescence-associated gene 4)
【図５】シロイヌナズナの野生型（Ｃｏｌ−Ｏ）とｏｒｅ１５−Ｄにおける暗処理後の時間による葉の老化を示す写真（ａ）、葉緑素含量の変化（ｂ）、光合成活性の変化（ｃ）、および老化関連遺伝子の発現様相を示すノーザンブロット分析の結果（ｄ）を示す。  ＳＥＮ１：老化遺伝子１(Senescence-associated gene 1)  ＳＥＮ４：老化遺伝子４(Senescence-associated gene 4)
【図６】シロイヌナズナの野生型（Ｃｏｌ−Ｏ）とｏｒｅ１５−Ｄにおける暗処理後の時間による葉の老化を示す写真（ａ）、葉緑素含量の変化（ｂ）、光合成活性の変化（ｃ）、および老化関連遺伝子の発現様相を示すノーザンブロット分析の結果（ｄ）を示す。  ＳＥＮ１：老化遺伝子１(Senescence-associated gene 1)  ＳＥＮ４：老化遺伝子４(Senescence-associated gene 4)
【図７】シロイヌナズナの野生型（Ｃｏｌ−Ｏ）とｏｒｅ１５−Ｄにおける暗処理後の時間による葉の老化を示す写真（ａ）、葉緑素含量の変化（ｂ）、光合成活性の変化（ｃ）、および老化関連遺伝子の発現様相を示すノーザンブロット分析の結果（ｄ）を示す。  ＳＥＮ１：老化遺伝子１(Senescence-associated gene 1)  ＳＥＮ４：老化遺伝子４(Senescence-associated gene 4)
【図８】アクチベーションタギングベクターｐＳＫＩ０１５が老化変異体ｏｒｅ１５−Ｄのゲノム内に組み込まれた模式図、および野生型（Ｃｏｌ−Ｏ）とｏｒｅ１５−ＤにおけるＯＲＥ１５遺伝子の発現を示すノーザンブロット分析の結果を示す。  Ｅ：エンハンサー  ＢＡＲ：除草剤抵抗性遺伝子  ｐＢＳ：Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点(replication origin)とアンピシリン抵抗性遺伝子を持っている部位
【図９】ＯＲＥ１５タンパク質の予想アミノ酸配列を示す。
【図１０】野生型（Ｃｏｌ−Ｏ）とｏｒｅ１５−Ｄにおける葉の重さ(fresh weight)と葉の面積の変化を示す。
【図１１】野生型（Ｃｏｌ−Ｏ）とｏｒｅ１５−Ｄにおける葉の重さ(fresh weight)と葉の面積の変化を示す。
【図１２】シロイヌナズナの野生型（Ｃｏｌ−Ｏ）、過発現変異体ｏｒｅ１５−Ｄ、およびノックアウト変異体ｏｒｅ１２−２ＫＯの葉の大きさの差異を示す写真である。
【図１３】シロイヌナズナの野生型（Ｃｏｌ−Ｏ）、過発現変異体ｏｒｅ１５−Ｄ、およびノックアウト変異体ｏｒｅ１２−２ＫＯの葉の縦断面を示す解剖学的写真であり（棒の大きさは１００μｍを示す）。
【図１４】シロイヌナズンの野生型（Ｃｏｌ−Ｏ）と過発現変異体ｏｒｅ１５−Ｄ、およびノックアウト変異体ｏｒｅ１２−２ＫＯの柵状組織細胞の第１層における長さ方向と広さ方向の細胞数の平均値を図表したものである（括弧内の数字はＳＥである）。
【図９】
2008511314.tif 000003
【図１３】
2008511314.tif 000004
【図１】
2008511314.tif 000005
【図２】
2008511314.tif 000006
【図３】
2008511314.tif 000007
【図４】
2008511314.tif 000008
【図５】
2008511314.tif 000009
【図６】
2008511314.tif 000010
【図７】
2008511314.tif 000011
【図８】
2008511314.tif 000012
【図１０】
2008511314.tif 000013
【図１１】
2008511314.tif 000014
【図１２】
2008511314.tif 000015
【図１４】
2008511314.tif 000016
【配列表】
2008511314000001.app
【国際調査報告】
2008511314.tif 000017
2008511314.tif 000018