(57)【要約】  本発明は、脂質および／またはリポ蛋白を検出するために使用される任意の方法のためのキャリブレーション法、および標準、キャリブレーションの検証、直線性および品質管理の物質に有用な材料に関する。本発明は、安定化量のＴＤＰＡを含んでなり、そしてさらにとりわけ総コレステロール（ＣＨＯＬ）、トリグリセリド（ＴＲＩＧ）、高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）、アポリポ蛋白Ａ（ＡＰＯ−Ａ）、アポリポ蛋白Ｂ（ＡＰＯ−Ｂ）、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、アポリポ蛋白ａＬｐ（ａ））およびサンプル中のそのような構成要素のレベルを評価するための計測器の使用に関連して、キャリブレーション、標準化、検証、品質管理等に有用な他のアポリポ蛋白部分を含め、目的の実質的に純粋な既知の量の構成要素をさらに含んでなる安定な脂質対照、標準および試薬を生産する方法およびそれにより生産される組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
既知の値の実質的に純粋な構成要素および安定化量の少なくとも１つの酸化防止剤を含んでなる安定な水性脂質参照標準組成物であって、該組成物のｐＨが約６．５〜８．０の範囲にある上記組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の参照組成物であって、検量線の作成、品質管理、検量線の検証および直線性の評価からなる群から選択される少なくとも１つの使用に有用であり、そしてさらに該組成物が約６．５〜９．０の範囲のｐＨで有用である、上記参照組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の参照組成物であって、上記使用が、上記構成要素を測定するための計測器を含んでなる手動、半自動化、および完全に自動化された方法を含んでなる、上記参照組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の参照組成物であって、上記酸化防止剤がモノチオグリセロール、フマル酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、Ｏｘｙｒａｓｅ（商標）、アスコルビン酸、フィチン酸ドデカナトリウム塩および３，３’−チオジプロピオン酸（ＴＤＰＡ）からなる群から選択される、上記参照組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の参照組成物であって、上記安定化量がリットルあたり約１．１グラム〜リットルあたり約１８．０グラムの範囲である、上記参照組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の参照組成物であって、上記構成要素が、総コレステロール（ＣＨＯＬ）、トリグリセリド（ＴＲＩＧ）、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）、アポリポ蛋白Ａ（ＡＰＯ−Ａ）、アポリポ蛋白Ｂ（ＡＰＯ−Ｂ）、アポリポ蛋白ａ（Ｌｐ（ａ））およびアポリポ蛋白の副成分からなる群から選択される少なくとも１つの構成要素の実質的な純粋な成分である、上記参照組成物。
【請求項７】
副成分が、ＡＩＩ、ＡＩＶ、Ｂ−４８、Ｂ−１００、ＣＩ、ＣＩＩ、ＣＩＩＩ、Ｄ、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｆ、Ｇ、ＨおよびＪからなる群から選択される少なくとも１つの副成分である、請求項６に記載の参照組成物。
【請求項８】
ＣＨＯＬの値が約０〜５０００ｍｇ／ｄＬの範囲である請求項６に記載の参照組成物。
【請求項９】
トリグリセリドの値が約０〜４０００ｍｇ／ｄＬの範囲である請求項６に記載の参照組成物。
【請求項１０】
ＬＤＬの値が約０〜５０００ｍｇ／ｄＬの範囲である請求項６に記載の参照組成物。
【請求項１１】
ＨＤＬの値が約０〜１０００ｍｇ／ｄＬの範囲である請求項６に記載の参照組成物。
【請求項１２】
ＡＰＯ−Ａの値が約０〜１０００ｍｇ／ｄＬの範囲である請求項６に記載の参照組成物。
【請求項１３】
ＡＰＯ−Ｂの値が約０〜１０００ｍｇ／ｄＬの範囲である請求項６に記載の参照組成物。
【請求項１４】
Ｌｐ（ａ）の値が約０〜１２００ｍｇ／ｄＬの範囲である請求項６に記載の参照組成物。
【請求項１５】
副成分の上記値が約０〜５００ｍｇ／ｄＬの範囲である請求項６に記載の参照組成物。
【請求項１６】
請求項６に記載の参照組成物であって、上記組成物のｐＨが約６．５〜８．０の範囲となるように、該組成物がＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を含んで成るバッファーをさらに含んでなる、上記参照組成物。
【請求項１７】
請求項６に記載の参照組成物であって、
上記組成物が：
上記組成物のｐＨが約６．８〜８．３の範囲になるように、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）を含んでなるバッファー；
上記組成物のｐＨが約６．８〜８．３の範囲になるように、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）を含んでなるバッファー；
上記組成物のｐＨが約６．８〜８．３の範囲になるように、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）を含んでなるバッファー；
上記組成物のｐＨが約６．８〜８．３の範囲になるように、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンスルホン酸（ＴＲＩＳ）を含んでなるバッファー；および
上記組成物のｐＨが約６．８〜８．３の範囲になるように、セーレンセンのリン酸バッファーを含んでなるバッファー
からなる群から選択されるバッファーをさらに含んでなる、上記参照組成物。
【請求項１８】
請求項６に記載の参照組成物であって、上記組成物が約０．０９（重量／容量）％未満の量のアジ化ナトリウムをさらに含んでなる、上記参照組成物。
【請求項１９】
請求項６に記載の参照組成物であって、上記組成物がＰｒｏＣｌｉｎ（商標）を百万分の約１０部（ｐｐｍ）から１００ｐｐｍの範囲の量でさらに含んでなる、上記参照組成物。
【請求項２０】
請求項６に記載の参照組成物であって、上記組成物がＯｘｙｒａｓｅ（商標）を約０．０５Ｕ／ｍＬ〜０．５Ｕ／ｍＬの範囲の量でさらに含んでなる、上記参照組成物。
【請求項２１】
安定化量の３，３’−チオジプロピオン酸を含んでなる安定な対照またはキャリブレーション標準組成物であって、該組成物が予め定めた含量の実質的に純粋な被検体をさらに含んでなる上記対照または検量標準組成物。
【請求項２２】
請求項１に記載の参照組成物の生産方法であって、水を含んでなる液体を既知の値の実質的に純粋な構成要素と混合して混合物を生成し、そしてさらに安定化量の３，３’−チオジプロピオン酸を該混合物に加えることを含んでなる、上記生産方法。
【請求項２３】
安定な対照または検量標準組成物の生産方法であって、水溶液を安定化量の３，３’−チオジプロピオン酸と混合し、そして予め定めた量の実質的に純粋な被検体を加えることをさらに含んでなる、上記生産方法。
【請求項２４】
水溶液が水、血漿、血清、ウシ血清アルブミンを含んでなる溶液、ヒト血清アルブミンを含んでなる溶液およびグッドのバッファーを含んでなる溶液からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項２３に記載の方法であって、上記混合物に有効量の抗微生物剤を加えることをさらに含んでなる、上記方法。
【請求項２６】
被検体が、総コレステロール（ＣＨＯＬ）、トリグリセリド（ＴＲＩＧ）、低密度リポ
蛋白（ＬＤＬ）、高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）、アポリポ蛋白Ａ（ＡＰＯ−Ａ）、アポリポ蛋白Ｂ（ＡＰＯ−Ｂ）、Ｌｐ（ａ）およびアポリポ蛋白の副成分からなる群から選択される少なくとも１つの被検体である請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
計測器の較正、品質管理、検量線の検証または直線性の評価方法であって、該計測器が試験溶液中の構成要素の量を測定するために適合されており、該方法が請求項１に記載の参照組成物を用いて該計測器を較正し、品質管理、検量線の検証または直線性の評価に供することを含んでなる上記方法。
【請求項２８】
測定が生きている個体の状態に関する情報を提供し、該状態が限定するわけではないが冠状動脈疾患、アテローム硬化症、糖尿病、種々の高脂血症（遺伝型または誘導型）、リポ蛋白代謝の遺伝子異常、閉塞性肝疾患、腎不全、甲状腺機能不全症の診断、処置および／または監視の支持における、コレステロールレベル、トリグリセリドレベル、ＨＤＬレベル、ＬＤＬレベルおよびＡｐｏＡレベルおよびＡｐｏＢレベル、Ｌｐ（ａ）レベルからなる群から選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
試験溶液中の被検体の量を測定するために適合された計測器の較正、品質管理、検量線の検証または直線性の評価方法であって、該方法が請求項１に記載の組成物を用いて該計測器を較正し、品質管理、検量線の検証または直線性の評価に供することを含んでなる上記方法。
【請求項３０】
測定が生きている個体の状態に関する情報を提供し、該状態が限定するわけではないが冠状動脈疾患、アテローム硬化症、糖尿病、種々の高脂血症（遺伝型または誘導型）、リポ蛋白代謝の遺伝子異常、閉塞性肝疾患、腎不全、甲状腺機能不全症の診断、処置および／または監視の支持における、コレステロールレベル、トリグリセリドレベル、ＨＤＬレベル、ＬＤＬレベルおよびＡｐｏＡレベルおよびＡｐｏＢレベル、Ｌｐ（ａ）レベルからなる群から選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
試験溶液中の構成要素の量を測定するために適合された計測器の較正、品質管理、検量線の検証または直線性の検証のためのキットであって、該キットが既知の量の該構成要素および安定化量の３，３’−チオジプロピオン酸を含んでなる組成物を含んでなり、該キットがさらに該キットを使用するためのアプリケーターおよび使用説明書を含んでなる、上記キット。
【請求項３２】
組成物が約４．０ｇ／ＬのＴＤＰＡ、約０．９ｇ／Ｌのアジ化ナトリウム、約４０ｐｐｍのＰｒｏＣｌｉｎ（商標）を含んでなり、そしてさらに約ｐＨ７．４のＨＥＰＥＳバッファーを含んでなり、ここで該組成物のｐＨが約ｐＨ７．２〜７．６の範囲である、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
請求項３１に記載のキットであって、
ａ）約１０ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約５ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約５ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約１５．６ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約３．３ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；
ｂ）約２００ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約３７．５ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約２５０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約１６２．５ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約１１７．２ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約１０６．９ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；
ｃ）約４００ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約１１５ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約５００ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約２８５ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約３５９．４ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約１８７．５ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；
ｄ）約６００ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約１７７．５ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約７５
０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約４２２．５ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約５５４．７ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約２８７．０ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；および
ｅ）約８００ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約２００ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約１０００ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約６００ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約６２５ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約３９４．７ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物
からなる群から選択される少なくとも１つの組成物を含んでなる、上記キット。
【請求項３４】
請求項３１に記載のキットであって、
ａ）約０ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約０ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約０ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約０ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約０ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；および
ｂ）約２００ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約６０ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約２５０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約１４０ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約１８８ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約９２ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；
からなる群から選択される少なくとも１つの組成物を含んでなる、上記キット。
【請求項３５】
請求項３１に記載のキットであって、
ａ）約１００ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約２０ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約９０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約８０ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約６３ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約５３ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；
ｂ）約２５０ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約５０ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約１５０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約２００ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約１５６ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約１３２ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；および
ｃ）約５００ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約１００ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約２５０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約４００ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約３１３ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約２６３ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；
からなる群から選択される少なくとも１つの組成物を含んでなる、上記キット。
【請求項３６】
請求項３１に記載のキットであって、
ａ）約１００ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約２５ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約５０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約７５ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約７８ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約４９ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；
ｂ）約２７５ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約４８．７５ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約２８７．５ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約２２６．２５ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約１５２．２５ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約１５０ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；
ｃ）約４５０ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約７２．５ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約５２５ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約３７７．５ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約２２６．５ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約２５１ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；
ｄ）約６２５ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約９６．２５ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約７６２．５ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約５２８．７５ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約３００．７５ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約３５２ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；および
ｅ）約８００ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約１２０ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約１０００ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約６８０ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約３７５ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約４５３ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物
からなる群から選択される少なくとも１つの組成物を含んでなる、上記キット。
【請求項３７】
請求項３１に記載のキットであって、
ａ）約０ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約０ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約０ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約０ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約０ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；および
ｂ）約２４０ｍｇ／ｄＬより高い総コレステロール、約３５ｍｇ／ｄＬ未満のＨＤＬ、約１００ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約１９０ｍｇ／ｄＬより高いＬＤＬ、約１２０ｍｇ／ｄＬより高いＡＰＯ−Ａ、および約１２０ｍｇ／ｄＬ未満のＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；
からなる群から選択される少なくとも１つの組成物を含んでなる、上記キット。
【請求項３８】
請求項３１に記載のキットであって、
ａ）約０ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約０ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約１００ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約０ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約０ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約０ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；および
ｂ）約２４０ｍｇ／ｄＬより高い総コレステロール、約４５ｍｇ／ｄＬ未満のＨＤＬ、約１００ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約１９０ｍｇ／ｄＬより高いＬＤＬ、約１２０ｍｇ／ｄＬより高いＡＰＯ−Ａ、および約１２０ｍｇ／ｄＬ未満のＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；
からなる群から選択される少なくとも１つの組成物を含んでなる、上記キット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
体液中の脂質レベルの測定、特に総称して「脂質」と呼ばれる総コレステロール、高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、トリグリセリド、アポリポ蛋白、リン脂質、スフィンゴ脂質およびコレステリルエステルレベルの測定は、最近の酵素的、免疫学的、電気泳動的および超遠心測定法の発展に伴い急速に広く使用されるようになった。その結果、これら脂質の臨床診断の分野における用途が増大し続けている。したがって脂質レベルの測定のための適切な標準溶液が必要である。
【０００２】
ほとんどのコレステロール分析は、色原体の作用試薬を、分析するサンプルと混合し、そして発色後に色の強度を比色計で観察することを含んでなる。作用試薬は一般に、コレステロールエステルを遊離のコレステロールに転換するためのコレステロールエステラーゼ、および遊離コレステロールを酸化してコレステノンを生じ、同時に過酸化水素を遊離するためのコレステロールオキシダーゼを含む。次いで存在するコレステロールの量が、ペルオキシダーゼ／フェノール／４−アミノアンチピリン系を使用して遊離した過酸化水素の量を測定することにより測定され、作用試薬中に存在するものも測定される。またこの分析は作用試薬を既知の濃度のコレステロールを含有する標準溶液に加えることにより調製されるキャリブレーター溶液でも行われるので、意味のある定量的情報を得ることができる。
【０００３】
ほとんどのＨＤＬコレステロール分析は、前処理または遠心工程を必要としない均一アッセイにより行われる。この方法はＨＤＬリポ蛋白粒子のみを可溶化し、そしてＨＤＬコレステロールを放出して上記の酵素的アッセイと反応して発色生成物を生じる独自な界面活性剤に依存している。また同じ界面活性剤がコレステロール酵素とＬＤＬ、超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）およびカイロミクロン（ｃｈｙｌｏｍｉｃｒｏｎ）リポ蛋白との反応をそれらの表面に吸着することにより阻害する。さらに試薬に含まれるポリアニオンは、ＬＤＬ、ＶＬＤＬおよびカイロミクロンタンパク質との複合体形成よりＨＤＬコレステロールに対する選択性を強める（非特許文献１を参照にされたい）。
【０００４】
またＨＤＬコレステロール分析は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−修飾化酵素およびデキストラン硫酸を使用した直接法を介して測定される。コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼ酵素がＰＥＧにより修飾される場合、それらはリポ蛋白画分に対する選択的な触媒活性を示し、反応性は以下の順序で増加する：ＬＤＬ＜ＶＬＤＬ＜カイロミクロン＜ＨＤＬ。マグネシウムイオンの存在下では、硫酸化α−シクロデキストリンが、リポ蛋白の凝集物の沈殿を必要とせずにコレステロールの、特にカイロミクロンおよびＶＬＤＬ中での反応性を下げる。（非特許文献２を参照にされたい）。これにより血清中のＨＤＬコレステロールの選択的測定が可能となる。
【０００５】
今日までＬＤＬコレステロールアッセイは、非イオン性界面活性剤によるＬＤＬ−コレステロールの選択型ミセル可溶化および糖化合物とリポ蛋白（ＶＬＤＬおよびカイロミクロン）との相互作用を利用して行われてきた。界面活性剤がコレステロール測定用の酵素的方法に含まれる場合、リポ蛋白画分のコレステロールの相対的反応性は以下の順序で増加する：ＨＤＬ＜カイロミクロン＜ＶＬＤＬ＜ＬＤＬ。マグネシウムカチオンの存在下では、糖化合物が、ＶＬＤＬおよびカイロミクロン中のコレステロール測定について酵素的反応を著しく下げる。糖化合物と界面活性剤との組み合わせは、血清中のＬＤＬコレステロールの選択的測定を可能とする（非特許文献３を参照にされたい）。またＬＤＬコレステロールは、とりわけジェンザイム社（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ベ
ックマン  コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）から入手可能な技術的ニュースレター等に記載されている手順を使用しても測定される。
【０００６】
ほとんどのトリグリセリドアッセイは、色原体の作用試薬を、分析するサンプルと混合し、そして発色後に色の強度を比色計で観察することを含んでなる。作用試薬は一般に、トリグリセリドをグリセロールおよび脂肪酸に転換するためのリパーゼを含み、続いてグリセロールキナーゼにより触媒されるグリセロールとＡＴＰの反応により、グリセロール−３−ホスフェートおよびＡＤＰを生じる。次いでグリセロール−３−ホスフェートはグリセロホスフェートオキシダーゼにより触媒されてジヒドロオキシアセトンホスフェートに加えて過酸化水素を形成する。存在するトリグリセリドの量は、４−アミノフェナゾンおよび４−クロロフェノールまたは４−アミノアンチピリンおよび３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホン酸のような色原体基質を転換して、光度計測定用の最終産物を形成するペルオキシダーゼの反応からの色の量を測定することにより決定される。またこの分析は作用試薬を既知の濃度のトリグリセリドを含有する標準溶液に加えることにより調製されるキャリブレーター溶液でも行われるので、意味のある定量的情報を得ることができる。
【０００７】
アポリポ蛋白Ａ−１（ＡＰＯ−Ａ１）は、サンプルがＴｒｉｓバッファーに加えられ、続いて抗−リポ蛋白Ａ−１抗体が加えられる免疫濁度アッセイ技法を使用して測定される。抗−リポ蛋白Ａ−１抗体はサンプル中の抗原と反応して抗原／抗体複合体を形成し、これは凝集後、濁度で測定される。（非特許文献４を参照にされたい）。
【０００８】
アポリポ蛋白Ｂ（ＡＰＯ  Ｂ）は、サンプルがＴｒｉｓバッファーに加えられ、続いて抗−リポ蛋白Ｂ抗体が加えられる免疫濁度アッセイ技法を使用して測定されることが多い。抗−リポ蛋白Ｂ抗体はサンプル中の抗原と反応して抗原／抗体複合体を形成し、これは凝集後、濁度で測定される。（非特許文献５を参照にされたい）。
【０００９】
これらの手順は酵素的、免疫学的または比濁的であってもすべて作用試薬、キャリブレーター、品質管理（ＱＣ）物質、および限定するわけではないが血清、血漿等のような水性基質（ａｑｕｅｏｕｓ  ｍａｔｒｉｘ）であるサンプルを要する。この特別な基質の必要性は、コレステロールそして一般に「脂質」と呼ばれる他のほとんどの成分が実質的に水に不溶性であるので、キャリブレーター溶液の調製に関して問題を呈する。例えばアルコール中に作成されたコレステロール標準溶液は、水性の作用試薬と合わせた場合、コレステロールの沈殿を生じる恐れがある。これにより許容できないキャリブレーター溶液を生じる。そのような沈殿は、キャリブレーター、ＱＣまたは検量線（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）の検証および／または直線性物質に不確実または不適合な発色を導く恐れがあり、そして一般に選択された検体を色の強度とコレステロール濃度との信頼性のある相関には無用なものとする。第２の例では、参照法を用いたトリグリセリドの測定は、アルコール基質中のトリオレインおよび／またはトリパルミチンで作成されたトリグリセリド標準を使用する。
【００１０】
脂質はそれらの疎水性により、一般に有機溶媒に溶解する。次いでこれらの溶液はコレステロール測定のためのアベール−ケンダール（Ａｂｅｌｌ−Ｋｅｎｄａｌｌ）参照法で使用され得る。この技法では、溶媒に可溶化されたコレステロールがアッセイ法に適合している。しかしこれらの標準溶液中の脂質は、血清に存在するものとは存在状態および流体特性が異なる。これにより標準溶液と体液（例えば血清）との間の反応性が異なり、測定値に誤差を生じる。
【００１１】
したがってヒトまたは動物に由来する血清または精製されたリポ蛋白コレステロールが標準溶液として使用されてきた。トリグリセリドは、人工的な水溶性グリセロール、水不
溶性の動物卵黄抽出物、内因性トリグリセリドまたは水不溶性の溶媒に基づく（アルコール）トリオレイン／トリパルミチン標準のような物質を使用して代替的に検量線の作成（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）ができる。トリグリセリドの検量線の作成に関しては、グリセロールの使用は遊離のグリセロールがサンプル中に存在し得る場合、これは反応スキームにおいてリパーゼがトリグリセリドをグリセロールへ転換する前に「グリセロールブランキングｂｌａｎｋｉｎｇ）」を必要とするので、好ましくない。ナショナル  インスティチュート  フォ  スタンダード  アンド  テクノロジー（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＮＩＳＴ）は、総コレステロール、総グリセリド、トリグリセリド、ＨＤＬ−コレステロールおよびＬＤＬ−コレステロールに利用することができる標準参照物質（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ：ＳＲＭ）を有する。これらのＳＲＭ（ＳＲＭ１９５１ａおよび１９５１ｂ）は、ロットに特異的な参照濃度値からなる。これらのＳＲＭの基質は、ドライアイス下で輸送され、そして−２０℃でわずか（１）週間、および−８０℃ではより長い期間安定な「凍結ヒト血清中の脂質」からなる。すべて高い経費、難しい輸送条件、受け取った時に−８０℃の保存冷蔵庫の必要性を提示するこれらの媒体は、測定値に影響を及ぼす可能性がある未知の不純物を含む恐れがあり、そして感染源の潜在的存在に関する技術的な困難を提示する。さらにリポ蛋白の精製法は技術的に複雑であり、そして膨大なサンプルの日常的分析を行うには経費がかかる。
【００１２】
結果として、脂質および／またはリポ蛋白および目的の他の構成要素は、表面活性剤を含有する水に溶解され、そして標準／参照溶液として使用されてきた。しかし水に脂質を可溶化するためには大量の表面活性剤が必要である。これは次いで溶液の粘度を上げ、これが時折、取り扱いを難しくする。さらに可溶化された脂質および／またはリポ蛋白を含んでなるサンプルは不安定であり、そして保存中に短い使用期限を示す。これらの課題を克服するために、可溶化された脂質溶液は凍結乾燥された。しかしこれらのサンプルの再構成後、その後の構成要素の活性には損失がある。
【００１３】
種々のアッセイに使用するための既知の標準の調製における困難にもかかわらず、検出可能なアッセイシグナルを定量的な結果（例えば構成要素の濃度）に転換するために、アッセイはまず最初に検量線の作成をしなければならない。検量線の作成は、使用するアッセイ法の製造元からの使用説明に従い、最初にアッセイを予め定めた濃度の一連のサンプルを用いて行う。これらのサンプルを「キャリブレーター」と呼ぶ。キャリブレーターからのシグナルを読むことにより得た結果を使用して、種々の曲線フィットモデルを使用することにより、全アッセイ範囲にわたる検量線が作成される。次いで検量線は、ＱＣの未知のサンプルの濃度、検量線の検証／直線性の評価、またはアッセイが生産するシグナルから未知のサンプルを測定するために使用することができる。キャリブレーターはしばしば、患者の血清または他の試験サンプルとは異なって応答するので、時間に伴うキャリブレーターの変化はキャリブレーターを非効率的とするか、または誤差または不正確な試験結果を引き起こすかもしれない。当該技術分野では、より安定な水性のキャリブレーターおよび検量線、ならびにアッセイの連続した正確性を評価するために品質管理および検量線の検証／直線性物質の必要性が存在する。本発明はこれらの必要性を満たす。
【参考文献】
【００１４】
【非特許文献１】ベックマン  シンクロン  ＣＸ  ケミストリー  インフォメーション  マニュアル（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｎｃｈｒｏｎ  ＣＸ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ）Ｎｏ．２４９５９５，２０００年５月
【非特許文献２】ロッシュ  ダイアグノスティックス社（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＧｍｂＨ）、２００２、Ｎｏ．０５４５３１０１，  マンハイム、ドイツ
【非特許文献３】ロッシュ  ダイアグノスティックス社、２００２、技術出版物（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）Ｎｏ．０５４５６５８０１、マンハイム、ドイツ
【非特許文献４】ロッシュ  ダイアグノスティックス社、２００２、技術出版物  Ｎｏ．０３０３２６１２、マンハイム、ドイツ
【非特許文献５】ロッシュ  ダイアグノスティックス社、２００２、技術出版物  Ｎｏ．０３０３２６３９、マンハイム、ドイツ
【発明の開示】
【００１５】
発明の要約
本発明は、既知の値の実質的に純粋な構成要素および安定化量の酸化防止剤を含んでなる安定な水性脂質参照標準組成物を含み、組成物のｐＨは約６．５〜８．０の範囲である。
【００１６】
１つの観点では、参照組成物は検量線の作成（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）、品質管理、検量線（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）の検証および直線性の評価からなる群から選択される少なくとも１つの使用に有用であり、そしてさらに組成物は約６．５〜９．０のｐＨ範囲で有用である。
【００１７】
別の観点では、使用は構成要素を測定するための計測器を含んでなる手動、半自動化、および完全に自動化された方法を含んでなる。
【００１８】
さらに別の観点では、酸化防止剤が３，３’−チオジプロピオン酸（ＴＤＰＡ）である。
【００１９】
さらなる観点では、安定量がリットルあたり約１．１グラム〜リットルあたり約１８．０グラムの範囲である。
【００２０】
別の観点では、構成要素が、総コレステロール（ＣＨＯＬ）、トリグリセリド（ＴＲＩＧ）、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）、アポリポ蛋白Ａ（ＡＰＯ−Ａ）、アポリポ蛋白Ｂ（ＡＰＯ−Ｂ）、アポリポ蛋白ａ（Ｌｐ（ａ））およびアポリポ蛋白の副成分からなる群から選択される少なくとも１つの構成要素の実質的な純粋な成分である。
【００２１】
別の観点では、副成分が、ＡＩＩ、ＡＩＶ、Ｂ−４８、Ｂ−１００、ＣＩ、ＣＩＩ、ＣＩＩＩ、Ｄ、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｆ、Ｇ、ＨおよびＪからなる群から選択される少なくとも１つの副成分である。
【００２２】
別の観点では、ＣＨＯＬの値が約０〜５０００ｍｇ／ｄＬの範囲である。
【００２３】
別の観点では、トリグリセリドの値が約０〜４０００ｍｇ／ｄＬの範囲である。
【００２４】
さらに別の観点では、ＬＤＬの値が約０〜５０００ｍｇ／ｄＬの範囲である。
【００２５】
さらに別の観点では、ＨＤＬの値が約０〜１０００ｍｇ／ｄＬの範囲である。
【００２６】
別の観点では、ＡＰＯ−Ａの値が約０〜１０００ｍｇ／ｄＬの範囲である。
【００２７】
さらに別の観点では、ＡＰＯ−Ｂの値が約０〜１０００ｍｇ／ｄＬの範囲である。
【００２８】
さらに別の観点では、Ｌｐ（ａ）の値が約０〜１２００ｍｇ／ｄＬの範囲である。
【００２９】
さらに別の観点では、副成分の値が約０〜５００ｍｇ／ｄＬの範囲である。
【００３０】
別の観点では、組成物は組成物のｐＨが約６．５〜８．０の範囲になるように、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を含んで成るバッファーをさらに含んでなる。
【００３１】
さらに別の観点では、組成物はさらに約０．０９（重量／容量）％未満の量のアジ化ナトリウムをさらに含んでなる。
【００３２】
別の観点では、組成物はＰｒｏＣｌｉｎ（商標）を百万分の約１０部（ｐｐｍ）から１００ｐｐｍの範囲の量でさらに含んでなる。
【００３３】
さらに別の観点では、組成物はＯｘｙｒａｓｅ（商標）を約０．０５Ｕ／ｍＬ〜０．５Ｕ／ｍＬの範囲の量でさらに含んでなる。
【００３４】
本発明は安定化量の３，３’−チオジプロピオン酸を含んでなる安定な対照またはキャリブレーション標準組成物を含み、組成物は予め定めた含量の実質的に純粋な被検体をさらに含んでなる。
【００３５】
また本発明は、既知の値の実質的に純粋な構成要素および安定化量の酸化防止剤を含んでなる安定な水性脂質参照標準組成物であり、約６．５〜８．０のｐＨ範囲の組成物を生産する方法も含む。この方法は、水を含んでなる液体を既知の値の実質的に純粋な構成要素とを混合して混合物を生産し、そしてさらに安定化量の３，３’−チオジプロピオン酸を混合物に加えることを含んでなる。
【００３６】
本発明は、安定な対照または検量標準組成物を生産する方法を含む。この方法は水溶液を安定化量の３，３’−チオジプロピオン酸と混合し、そして予め定めた含量の本質的に純粋な被検体をさらに加えることを含んでなる。
【００３７】
１つの観点では、水溶液は水、血漿、血清、ウシ血清アルブミンを含んでなる溶液、ヒト血清アルブミンを含んでなる溶液およびグッドのバッファー（Ｇｏｏｄ’ｓ  Ｂｕｆｆｅｒ）を含んでなる溶液からなる群から選択される。
【００３８】
別の観点では、方法はさらに混合物に有効量の抗微生物剤を加えることを含んでなる。
【００３９】
さらに別の観点では、被検体は総コレステロール（ＣＨＯＬ）、トリグリセリド（ＴＲＩＧ）、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）、アポリポ蛋白Ａ（ＡＰＯ−Ａ）、アポリポ蛋白Ｂ（ＡＰＯ−Ｂ）、アポリポ蛋白ａ（Ｌｐ（ａ））およびアポリポ蛋白の副成分からなる群から選択される少なくとも１つの被検体である。
【００４０】
本発明は計測器（ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）の検量線の作成、品質管理、検量線の検証または直線性の評価のための方法を含み、ここで計測器は試験溶液中の構成要素の量を測定するために適合されており、この方法は既知の値の実質的に純粋な構成要素および安定化量の酸化防止剤を含んでなり、組成物が約６．５〜８．０のｐＨ範囲である安定な水性脂質参照標準組成物を用いて、計測器を検量線の作成、品質管理、検量線の検証または直線性の評価に供することを含んでなる。
【００４１】
また本発明は、試験溶液中の被検体の量を測定するために適合された計測器の検量線の
作成、品質管理、検量線の検証または直線性の評価のための方法を含む。この方法は、既知の値の実質的に純粋な構成要素および安定化量の酸化防止剤を含んでなり、組成物が約６．５〜８．０のｐＨ範囲であり、ここで酸化防止剤がＴＤＰＡである安定な水性脂質参照標準組成物を用いて、計測器を検量線の作成、品質管理、検量線の検証または直線性の評価にかけることを含んでなる。
【００４２】
本発明は、試験溶液中の構成要素の量を測定するために適合された計測器の検量線の作成、品質管理、検量線の検証または直線性の検証のためのキットを含む。このキットは既知の量の構成要素および安定化量の３，３’−チオジプロピオン酸を含んでなる組成物を含んでなる。このキットはさらにキットを使用するためのアプリケーターおよび使用説明書を含んでなる。
【００４３】
１つの観点では、組成物は約４．０ｇ／ＬのＴＤＰＡ、約０．９ｇ／Ｌのアジ化ナトリウム、約４０ｐｐｍのＰｒｏＣｌｉｎ（商標）を含んでなり、そしてさらに約ｐＨ７．４のＨＥＰＥＳバッファーを含んでなり、ここで組成物のｐＨは約ｐＨ７．２〜７．６の範囲である。
【００４４】
別の観点では、キットは：
ａ）約１０ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約５ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約５ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約１５．６ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約３．３ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；
ｂ）約２００ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約３７．５ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約２５０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約１６２．５ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約１１７．２ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約１０６．９ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；
ｃ）約４００ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約１１５ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約５００ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約２８５ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約３５９．４ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約１８７．５ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；
ｄ）約６００ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約１７７．５ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約７５０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約４２２．５ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約５５４．７ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約２８７．０ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；および
ｅ）約８００ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約２００ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約１０００ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約６００ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約６２５ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約３９４．７ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物
からなる群から選択される少なくとも１つの組成物を含んでなる。
【００４５】
さらに別の観点では、キットは：
ａ）約０ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約０ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約０ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約０ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約０ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；および
ｂ）約２００ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約６０ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約２５０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約１４０ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約１８８ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約９２ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；
からなる群から選択される少なくとも１つの組成物を含んでなる。
【００４６】
さらに別の観点では、キットは：
ａ）約１００ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約２０ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約９０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約８０ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約６３ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約５３ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；
ｂ）約２５０ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約５０ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約１５０ｍｇ
／ｄＬのトリグリセリド、約２００ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約１５６ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約１３２ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；および
ｃ）約５００ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約１００ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約２５０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約４００ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約３１３ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約２６３ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；
からなる群から選択される少なくとも１つの組成物を含んでなる。
【００４７】
さらに別の観点では、キットは：
ａ）約１００ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約２５ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約５０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約７５ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約７８ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約４９ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；
ｂ）約２７５ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約４８．７５ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約２８７．５ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約２２６．２５ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約１５２．２５ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約１５０ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；
ｃ）約４５０ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約７２．５ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約５２５ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約３７７．５ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約２２６．５ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約２５１ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；
ｄ）約６２５ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約９６．２５ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約７６２．５ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約５２８．７５ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約３００．７５ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約３５２ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；および
ｅ）約８００ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約１２０ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約１０００ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約６８０ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約３７５ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約４５３ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物
からなる群から選択される少なくとも１つの組成物を含んでなる。
【００４８】
別の観点では、キットは：
ａ）約０ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約０ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約０ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約０ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約０ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；および
ｂ）約２４０ｍｇ／ｄＬより高い総コレステロール、約３５ｍｇ／ｄＬ未満のＨＤＬ、約１００ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約１９０ｍｇ／ｄＬより高いＬＤＬ、約１２０ｍｇ／ｄＬより高いＡＰＯ−Ａ、および約１２０ｍｇ／ｄＬ未満のＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；
からなる群から選択される少なくとも１つの組成物を含んでなる。
【００４９】
さらに別の観点では、キットは：
ａ）約０ｍｇ／ｄＬの総コレステロール、約０ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、約１００ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約０ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ、約０ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ａ、および約０ｍｇ／ｄＬのＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；および
ｂ）約２４０ｍｇ／ｄＬより高い総コレステロール、約４５ｍｇ／ｄＬ未満のＨＤＬ、約１００ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、約１９０ｍｇ／ｄＬより高いＬＤＬ、約１２０ｍｇ／ｄＬより高いＡＰＯ−Ａ、および約１２０ｍｇ／ｄＬ未満のＡＰＯ−Ｂを含んでなる組成物；
からなる群から選択される少なくとも１つの組成物を含んでなる。
【００５０】
発明の詳細な説明
本発明は３，３’−チオジプロピオン酸が、多数のアッセイのための検量線の作成、品質管理および検量線の検証／直線性物質に有用な水性、血清、血漿および他の基質脂質標
準を安定化するという知見に関する。すなわち本発明は、広範な沢山の技術的に認識されている脂質アッセイの中でも、とりわけキャリブレーション、品質管理に使用することができる安定な参照標準を生産するための新規組成物および方法に関する。また本発明は本発明の新規の安定な脂質標準を含んでなる新規の検量線の作成、品質管理、検量線の検証および直線性を評価する物質を提供する。
【００５１】
定義
本明細書で使用するように、以下の各用語は本章においてそれに関連する意味を有する。
冠詞“ａ”および“ａｎ”は本明細書では１もしくは１より多くの（すなわち少なくとも１つ）冠詞の文法上の対象となる物体を指すために使用する。例として「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は１つの要素、または１より多くの要素を指す。
【００５２】
本明細書において用語として使用する用語「アプリケーター」とは、限定するわけではないが本発明の化合物および組成物を投与するための皮下注射器、ピペット、自動サンプルプローブ等を含む任意のデバイスを意味する。
【００５３】
本明細書において用語として使用する「使用説明書」には、本明細書で言及する種々の疾患または障害に作用し（ｅｆｆｅｃｔ）、緩和し、または処置するためのキットにおいて、本発明の組成物および／または化合物の有用性を伝えるために使用することができる刊行物、記録、図表、プロダクトインサート、または他の任意の表現媒体を含む。場合により、あるいは代替として、使用説明書は本明細書のいたるところに開示するものを含め、細胞または組織または哺乳動物の疾患または障害を緩和する１もしくは複数の方法を記載することができる。
【００５４】
キットの使用説明書は、例えば本発明の化合物および／または組成物を含む容器に付けられるか、あるいは化合物および／または組成物を含む容器と一緒に輸送されてもよい。あるいは使用説明書は受け取り人が使用説明書および化合物を連携して使用することを意図して、容器とは別に輸送することもできる。あるいは使用説明書は使用者への電子化されたファイルの伝達に適する形式でインターネット上で得ることもできる。
【００５５】
本明細書で使用する用語「製薬学的に許容され得る担体」とは、有効成分と合わせることができ、しかも組み合わせた後に有効成分を個体に投与するために使用することができる化学的組成物を意味する。
【００５６】
本明細書で使用する用語「生理学的に許容され得る」エステルまたは塩とは、製薬学的組成物の任意の他の成分と適合性があり、しかも組成物が投与される個体に有害ではないエステルまたは塩形の有効成分を意味する。
【００５７】
本明細書で使用する「安定化量」とは、ある量の物質または化合物が水性または血清もしくは血漿参照組成物に加えられた時、物質または化合物が加えられていない同一の組成物の安定性と比較した場合に、参照組成物を検出可能に安定化する量を指す。すなわち、物質または化合物を含んでなる組成物中では組成物中に存在する構成要素の既知の値が、物質または化合物を加えていない他は同一の組成物中に存在する同一の構成要素の値よりも、時間または保存条件の関数としての変化が少ない。
【００５８】
本明細書で使用する「構成要素」は、一般に「被検体」と互換的であり、その存在または量が目的対象であり、そして当該技術分野で知られている任意の方法により評価することができる任意の物質を指す。好ましくは構成要素は限定するわけではないが、総コレステロール（ＣＨＯＬ）、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）、トリグリセリド、アポリポ蛋白Ａ（ＡＰＯ−Ａ、Ａ１およびＡ２を包含する）、アポリポ蛋白Ｂ
（ＡＰＯ−Ｂ）、アポリポ蛋白ａ（Ｌｐ（ａ））、それらの各副成分等に関連する任意の物質を指す。これらのおよび多くの他の目的とする構成要素は、他の技術的に認識されている学術論文、Ｒｉｆａｉ  ａｎｄ  Ｗａｒｎｉｃｋ（１９９４、脂質、リポ蛋白およびアポリポ蛋白の研究室での測定（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ），Ｒａｆａｉ  ａｎｄ  Ｗａｒｎｉｃｋ編集、ＡＡＣＣ出版、ワシントン、ＤＣ）、およびＲａｆａｉ，Ｗａｒｎｉｃｋ  ａｎｄ  Ｄｏｍｉｎｉｃｚａｋ（２０００，リポ蛋白試験のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ）、Ｒａｆａｉ，Ｗａｒｎｉｃｋ  ａｎｄ  Ｄｏｍｉｎｉｃｚａｋ編集、ＡＡＣＣ出版、ワシントン、ＤＣ）の中で検討されている。
【００５９】
本明細書で使用する用語「参照組成物」とは、サンプル中の目的構成要素のレベルおよび／または存在の分析に関する検量線の作成および／または品質管理および／または検量線の検証および／または直線性の評価に使用される任意の組成物を意味する。そのような参照組成物は、サンプル中の構成要素の存在および／またはレベルを評価するための任意の方法またはデバイスを用いて使用することができる。
【００６０】
本明細書で、とりわけ所定の構成要素に関して使用する用語「実質的に純粋」という用語は、構成要素が会合していたかもしれない（例えば生化学的または他の技術による生産過程において、あるいは天然の生物資源から精製する前に）細胞物質、ウイルス物質、血漿、血液、体液または培養基中のもののような他の化合物、生物学的もしくはその他を実質的に含まないことを意味する。例えば実質的に純粋な構成要素は、乾燥重量に基づき少なくとも７５％（例えば少なくとも８０、８５、９５または９９％）純粋である。純度は適切な標準的方法、例えば当該技術分野で十分に理解されているようなカラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ分析等により測定することができる。
【００６１】
説明
本発明は当該技術分野で知られているか、または将来開発される広い様々な計測器を使用して、種々の技術的に知られている脂質アッセイに関する検量線の作成、品質管理、検量線の検証および直線性物質に有用な新規の安定な脂質水性（例えば血清、血漿、他のタンパク質に基剤（ｂｓａｅ）等）基質標準の知見に関する。より詳細には、本発明は３，３’−チオジプロピオン酸の水性脂質参照標準への添加が標準の使用期限を大きく延ばすように標準を安定化するという驚くべき知見に関する。これらの結果はさらに安定な水性脂質標準の新規生産法、ならびに標準を使用した新規アッセイおよびそれらに関連するキットを提供する。
【００６２】
Ｉ．新規な参照標準を含んでなる組成物
本発明は安定な水性（例えば血清、血漿等）基質の脂質参照組成物を包含する。この組成物は実質的に純粋な既知の値の構成要素、および安定化量の３，３’−チオジプロピオン酸（ＴＤＰＡ；ＣＡＳ登録番号１１１−１７−１）（これは限定するわけではないが３，３’−チオビスプロパン酸、β，β’−チオジプロピオン酸、ジエチルスルフィド２，２’−ジカルボン酸、チオジヒドロアクリル酸、ＴｙｏｘＡ、４−チアヘプタイン二酸、ビス（２−カルボキシエチル）スルフィドを含むの他の種々の名前で知られている）を含んでなる。これは本明細書のいたるところに記載するデータが、ＴＤＰＡおよびアッセイされる少なくとも１つの構成要素（例えば総コレステロール、ＬＤＬ、ＨＤＬ、ＡＰＯ−Ａ、ＡＰＯ−Ｂ、トリグリセリド、Ｌｐ（ａ）等）を含んでなる水溶液が安定化され、ＴＤＰＡを加えない同一の溶液よりも長い使用期間をもたらすことができることを証明しているからである。
【００６３】
このように本発明は安定化量の３，３’−チオジプロピオン酸、および予め定めた含量
の被検体、すなわち限定するわけではないが生物学的サンプル（すなわち生きているか、または死んだ生物から得たサンプル）を含む試験サンプル中の特異的成分を含んでなる安定な対照またはキャリブレーション標準組成物を包含する。
【００６４】
当業者は本明細書に提供する開示に基づき、構成要素が試験サンプル中にアッセイされる目的の広範な多くの物質および化合物を含んでなると直ちに想定するだろう。すなわち参照組成物は、目的とする構成要素の量を評価するために使用する計測器を較正し、検量線を検証するために、かつ／または品質管理対照サンプルとして使用することができる。さらに詳細には、本明細書のいたるところで詳細に示すように、組成物を安定化するために十分な量のＴＤＰＡ、および既知の量の構成要素を含んでなる参照組成物は、試験サンプル中の構成要素の値が参照組成物中の既知の値の同じ構成要素に対して正確に測定されるように、検量線の作成のための標準として、および／またはアッセイに関する品質管理を行うために使用することができる。
【００６５】
当業者は本明細書に提供する開示に基づき、目的の構成要素の存在および／または量を検出するために試験サンプルが分析される場合、試験サンプルをアッセイした結果は、一般に試験サンプル中の構成要素の存在および／または量を評価するために標準に対して比較されると考える。すなわちアッセイに使用する任意の計測器に関する信頼性のある検量線を得るために、および／またはアッセイの正確性を監視するための品質管理および／または検量線の検証および直線性について、アッセイの検証用の正確な参照組成物の必要性が存在する。すなわち、参照標準は計測器の較正をするために、計測器が所望する許容範囲（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）内で未だ作動しているかを周期的に確認するために、またはその両方のために使用することができる。検量線の作成および品質管理の参照標準に関する検討は、例えばＢａｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．の欧州特許出願公開第９５２０１３３６．５号明細書（欧州特許第０６８４４７７Ａ２号として公開）、Ｇｉｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第４，２３９，６４９号明細書、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎへの米国特許第４，３６３，６３３号明細書、Ｈｏｓｋｉｎｓへの米国特許第４，６４３，９７６号明細書、Ｐｏｒｔｅｎｈｏｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第４，７０１，４１７号明細書、Ｒｅｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第４，７１６，１１９号明細書、Ｄｅｅｇ
ｅｔ  ａｌ．への米国特許第４，８６８，１３９号明細書およびＳａｍｓｏｏｄａｒへの米国特許第６，３７２，５０３号明細書に説明され、これらの各々は説明されている場合は全部、引用により本明細書に編入する。  
【００６６】
本明細書で示すように、安定化量のＴＤＰＡは、ＴＤＰＡを加えていない同一の参照組成物の安定性と比較した場合、参照組成物の安定性、例えばとりわけ使用期間に検出可能な上昇を媒介する量である。好ましくはこの量はリットルあたり約１．１〜１８グラムの範囲である。より好ましくはこの量は約２．６〜約１２．０の範囲、さらにより好ましくは約３．３〜１０．５、さらに一層好ましくは約３．６５〜９．７５、さらにより一層好ましくは約４．０〜９．０、そして最も好ましくはこの量はリットルあたり４．０グラム（ｇ／Ｌ）である。
【００６７】
本明細書のいたるところで詳細に記載するように、ＴＤＰＡは酸化防止剤として機能することができる。特にＴＤＰＡは本発明の組成物を安定化する目的のために酸化防止剤として機能することができる。本発明に有用な他の酸化防止剤には限定するわけではないが、モノチオグリセロール、フマル酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、Ｏｘｙｒａｓｅ（商標）、アスコルビン酸、フィチン酸ドデカナトリウム塩等を含む。当業者は本開示から着手する場合、本明細書に説明する教示に基づき、本発明に有用な酸化防止剤をどのように同定し、そして特性決定するかを理解している。
【００６８】
２以上の酸化防止剤を本発明に使用できることも理解されている。非限定的例として、Ｏｘｙｒａｓｅ（商標）およびＴＤＰＡを使用することができる。さらに本開示に基づき、種々の濃度の酸化防止剤を本発明に使用できることが理解されている。加えて、種々の濃度を酸化防止剤およびその組み合わせは、限定するわけではないがＨＤＬ、ＬＤＬ、ＡＰＯＡ、ＡＰＯＢ、ＣＨＯＬ、Ｌｐ（ａ）およびＴＲＩＧを含む種々の標準に関して本発明に包含され、そして任意のアッセイまたは反応条件を、本発明の組成物または方法の意図する使用および／または応用に基づき変動させることができると理解されている。
【００６９】
また本明細書に説明する本発明に基づき、特定の酸化防止剤は他の酸化防止剤と、他の酸化防止剤の組み合わせと、または特定の標準溶液（例えば中でも特定の脂質、特定のトリグリセリド）と適合性でなくてもよいと理解される。非限定的例として、そして実験的実施例１０で説明するように、アスコルビン酸のような特定の酸化防止剤は、ペルオキシダーゼ表示アッセイのようなアスコルビン酸を含有する標準溶液を用いて行われる１もしくは複数の下流アッセイを妨害するかもしれない。別の非限定的例として、モノチオグリセロールはＴＲＩＧ溶液中で酸化防止剤として使用する場合、表示反応においてグリセロールを誤って増加させることによりトリグリセリドヒドロラーゼ反応に貢献する可能性がある。
【００７０】
本発明は、参照組成物の実質的に純粋な構成要素成分の広範な値を包含する。すなわち当業者にはいったん本明細書に提供される教示から着手すれば理解されるように、本発明は目的の任意の構成要素に関して多数の値、およびその組み合わせを含んでなる参照組成物を包含する。特定の構成要素または構成要素の値に限定するわけではないが、本発明は限定するわけではないが総コレステロール（ＣＨＯＬ）、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）、トリグリセリド、アポリポ蛋白Ａ（ＡＰＯ−Ａ、Ａ１およびＡ２を包含する）、アポリポ蛋白Ｂ（ＡＰＯ−Ｂ）、アポリポ蛋白ａ（Ｌｐ（ａ））、それらの各副成分等のような多数の構成要素を包含する。これらおよび目的とする多くの他の構成要素は、他の学術論文の中でもとりわけＲｉｆａｉ  ａｎｄ  Ｗａｒｎｉｃｋ（１９９４、脂質、リポ蛋白およびアポリポ蛋白の研究室での測定，Ｒａｆａｉ  ａｎｄ  Ｗａｒｎｉｃｋ編集、ＡＡＣＣ出版、ワシントン、ＤＣ）、およびＲａｆａｉ，Ｗａｒｎｉｃｋ  ａｎｄ  Ｄｏｍｉｎｉｃｚａｋ（２０００，リポ蛋白試験のハンドブック、Ｒａｆａｉ，Ｗａｒｎｉｃｋ  ａｎｄ  Ｄｏｍｉｎｉｃｚａｋ編集、ＡＡＣＣ出版、ワシントン、ＤＣ）の中で検討されている。
【００７１】
当業者は本明細書に提供する開示に基づき、組成物は限定するわけではないがＩＤＬ、ＶＬＤＬ、カイロミクロンおよびＡＰＯ−Ｅのような脂質および／リポ蛋白サンプル中に存在すると当該技術分野で知られている種々の他の基質を包含することができると考えている。すなわち本発明は脂質および／リポ蛋白サンプル中に、またはそれらについて試験されるサンプル中に存在すると当該技術分野で知られている種々の成分および副成分を含んでなる組成物を包含する。
【００７２】
さらに本発明は参照組成物中に存在する任意の構成要素に関する特定の値に限定されないし、または構成要素の特定の組み合わせにも限定されない。例えば本発明の参照組成物は、実質的に純粋なＣＨＯＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬおよびトリグリセリド、あるいはＣＨＯＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ、トリグリセリド、ＡＰＯ−ＡおよびＡＰＯ−Ｂを含んでなることができる。構成要素のこれら幾つかの組み合わせ、およびそれに関する値は本明細書のいたるところで例示しているが、本発明はそれらに限定されることは全くなく、または他の構成要素の組み合わせまたはそれらに関する既知の値に限定されることもない。むしろ別個に、あるいは試験サンプル中でアッセイされる他の有用な構成要素と組み合わせて使用することができる種々の構成要素も本発明に包含され、そして本発明は任意の構成要素、構成要素の組み合わせ、またはそれらの特定の既知の値に決して限定されることはなく、そして本明細書のいたるところで開示する例示の参照組成物は、具体的説明を目的とし、そして本発明をどのようにも限定しない。
【００７３】
１つの態様では、実質的に純粋な構成要素は総コレステロールであり、そして好適な既知の値が約０．０〜５０００、より好ましくは約０．０〜４０００、さらにより好ましくは約０．０〜３０００、そしてさらにより一層好ましくは約０〜２０００ｍｇ／ｄＬの範囲である。より好ましくは本発明の参照組成物中のＣＨＯＬに関する既知の値は、約０〜１０００ｍｇ／ｄＬの範囲であり、そして最も好ましくはＣＨＯＬ範囲の値はアッセイについて特許請求した分析測定範囲、および／または当該技術分野で知られているように、アッセイされる構成要素の確立された臨床的に報告可能な範囲である。
【００７４】
別の態様では、実質的に純粋な構成要素はＬＤＬであり、そして好適な既知の値が約０〜５０００、より好ましくは約０〜４０００、さらにより好ましくは約０〜３０００、さらに一層好ましくは約０〜２０００、そしてさらにより一層好ましくは約０〜１０００ｍｇ／ｄＬの範囲である。より好ましくは本発明の参照組成物中のＬＤＬに関する既知の値は、約０〜５００ｍｇ／ｄＬの範囲であり、そして最も好ましくはＬＤＬ範囲の値はアッセイについて特許請求した分析測定範囲、および／または当該技術分野で知られているようなＬＤＬに関して確立された臨床的に報告可能な範囲である。
【００７５】
別の態様では、実質的に純粋な構成要素はトリグリセリドであり、そして好適な既知の値が約０〜４０００、より好ましくは約０〜３０００、さらにより好ましくは約０〜２０００、さらに一層好ましくは約０〜１０００、そしてさらにより一層好ましくは約０〜５００ｍｇ／ｄＬの範囲である。最も好ましくは本発明の参照組成物中のトリグリセリドの既知の値の範囲は、目的のアッセイについて特許請求した分析測定範囲、および／または当該技術分野で知られているようなトリグリセリドに関して確立された臨床的に報告可能な範囲である。
【００７６】
さらに別の態様では、実質的に純粋な構成要素はＨＤＬであり、そして好適な既知の値が約０〜１０００、より好ましくは約０〜９００、さらにより好ましくは約０〜８００、さらに一層好ましくは約０〜７００、そしてさらにより一層好ましくは約０〜６００ｍｇ／ｄＬの範囲である。より好ましくは参照組成物中のＨＤＬに関する既知の値は、約０〜５００ｍｇ／ｄＬの範囲である。最も好ましくは本発明の参照組成物中のＨＤＬに関する既知の値は、目的のアッセイについて特許請求した分析測定範囲、および／または当該技術分野で知られているようなＨＤＬに関して確立された臨床的に報告可能な範囲である。
【００７７】
既知の構成要素は実質的に純粋なＡＰＯ−Ａを含んでなり、そして好適な既知の値が約０〜１０００、より好ましくは約０〜９００、さらにより好ましくは約０〜８００、さらに一層好ましくは約０〜７００、そしてさらにより一層好ましくは約０〜６００ｍｇ／ｄＬの範囲である。より好ましくは本発明の参照組成物中のＡＰＯ−Ａに関する既知の値は、約０〜５００ｍｇ／ｄＬの範囲であり、そして最も好ましくはＡＰＯ−Ａの値の範囲は、特許請求した分析測定範囲、および／または当該技術分野で知られているようなＡＰＯ−Ａに関して確立された臨床的に報告可能な範囲である。
【００７８】
さらに実質的に純粋な構成要素はＡＰＯ−Ｂであり、そして好適な既知の値が約０〜１０００、より好ましくは約０〜９００、さらに好ましくは約０〜８００、さらに一層好ましくは約０〜７００、そしてさらにより一層好ましくは約０〜６００ｍｇ／ｄＬの範囲である。最も好ましくは本発明の参照組成物中のＡＰＯ−Ｂに関する既知の値は、約０〜５００ｍｇ／ｄＬの範囲であり、そして最も好ましくはＡＰＯ−Ｂの値の範囲は特許請求した分析測定範囲、および／または当該技術分野で知られているようなＡＰＯ−Ｂに関して確立された臨床的に報告可能な範囲である。
【００７９】
さらに実質的に純粋な構成要素はＬｐ（ａ）であり、そして好適な既知の値が約０〜１０００、より好ましくは約０〜９００、さらに好ましくは約０〜８００、さらに一層好ましくは約０〜７００の範囲である。最も好ましくは本発明の参照組成物中のＬｐ（ａ）に関する既知の値は、約０〜６４０ｍｇ／ｄＬの範囲であり、そして最も好ましくはＬｐ（ａ）の値の範囲は特許請求した分析測定範囲、および／または当該技術分野で知られているようなＬｐ（ａ）に関して確立された臨床的に報告可能な範囲である。
【００８０】
ＡＰＯ−ＡおよびＡＰＯ−Ｂの各副成分も含むことができる。これらの実質的に純粋な副成分は、限定するわけではないがとりわけＡＩＩ、ＡＩＶ、Ｂ−４８、Ｂ−１００、ＣＩ、ＣＩＩ、ＣＩＩＩ、Ｄ、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｆ、Ｇ、ＨおよびＪであることができる。これら副成分の最も好適な範囲は、約０〜５００ｍｇ／ｄＬである。
【００８１】
しかし当業者は本明細書に提供する開示に基づき、一連の組成物参照、すなわち少なくとも２つを使用して、連続する各サンプルが互いに既知の値の範囲を含んでなるような検量線を作成することができる。このように本発明は本発明の一連の参照組成物を包含し、これは２つの組成物の間のデルタ値が、異なる値の他の参照組成物に関する理論的値を較正（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）するために使用することができるように、既知の少なくとも２つの異なる値のレベルを含んでなる。したがって本発明は異なる既知の値の目的の構成要素の少なくとも２つの参照組成物を含んでなるキットを包含し、ここで２つの値の間のデルタは、較正または検量線の検証標準として知られている。さらに本発明は広範な多数の構成要素を含んでなる種々の連続するそのような参照組成物からなり、唯一の要件は構成要素の値が各参照組成物に関して知られていることであり、そしてそのような多くのレベルの検量線の検証および品質管理用の設定を本明細書に例示するが本発明はそれらに限定されず、他の特定の参照組成物の設定に限定されない。
【００８２】
同様に、ＨＥＰＥＳバッファー系を含んでなる参照組成物は約６．５〜８．０のｐＨ範囲であるが、本発明はこれに限定されず、また他のいかなるバッファー系、または実際にいかなるバッファーにも限定されない。すなわち当業者はいったん本明細書に提供する教示から着手すれば、限定するわけではないがＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、Ｔｒｉｓのようなグッドのバッファー、セーレンセン（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ）のリン酸バッファー、種々の生理学的バッファー系等のような広範な多数のバッファーを本発明に使用することができると考えるだろう。（Ｔｉｅｔｚ，２０００：臨床化学の基礎（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第５版、Ｂｕｒｔｉｓ＆Ａｃｈｗｏｏｄ編集で、エルセビアサイエンス出版（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨークを参照にされたい）。同様に、バッファー系は、生化学製品および試薬を包含する目的分野に列挙されている、より詳細にはバッファーエクスプローラー／バッファー参照のウェッブサイトの中心部に説明されているもののような、シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のウェッブサイトにも記載されている。
【００８３】
ＨＥＰＥＳバッファーは、約６．５〜９．０、さらにより好ましくは約６．８〜８．３、さらに一層好ましくは約７．０〜８．０の範囲の既知のｐＨ値のバッファーを含んでなる。最も好ましくは本発明の参照組成物中のＨＥＰＥＳバッファーに関する既知のｐＨ値は、約７．３〜７．５の範囲である。
【００８４】
ＢＥＳバッファーは、約６．５〜９．０、さらにより好ましくは約６．８〜８．３、さらにより一層好ましくは約７．０〜８．０の範囲の既知のｐＨ値を含んでなる。最も好ましくは本発明の参照組成物中のＢＥＳに関する既知のｐＨ値は、約７．３〜７．５の範囲である。
【００８５】
ＭＯＰＳバッファーは、約６．５〜９．０、さらにより好ましくは約６．８〜８．３、さらにより一層好ましくは約７．０〜８．０の範囲の既知のｐＨ値を含んでなる。最も好ましくは本発明の参照組成物中のＭＯＰＳに関する既知のｐＨ値は、約７．３〜７．５の範囲である。
【００８６】
ＴＥＳバッファーは、約６．５〜９．０、さらにより好ましくは約６．８〜８．３、さらにより一層好ましくは約７．０〜８．０の範囲の既知のｐＨ値を含んでなる。最も好ましくは本発明の参照組成物中のＴＥＳに関する既知のｐＨ値は、約７．３〜７．５の範囲である。
【００８７】
ＴＲＩＳバッファーは、約６．５〜９．０、さらにより好ましくは約６．８〜８．３、さらにより一層好ましくは約７．０〜８．０の範囲の既知のｐＨ値を含んでなる。最も好ましくは本発明の参照組成物中のＴＲＩＳに関する既知のｐＨ値は、約７．３〜７．５の範囲である。
【００８８】
セーレンセンのリン酸バッファーは、約６．５〜９．０、さらにより好ましくは約６．８〜８．３、さらにより一層好ましくは約７．０〜８．０の範囲の既知のｐＨ値を含んでなる。最も好ましくは本発明の参照組成物中のセーレンセンのホスフェートに関する既知のｐＨ値は、約７．３〜７．５の範囲である。
【００８９】
当業者には理解されているように、本発明の参照組成物は、抗微生物剤を含んでなることができるが、必ずしもその必要はない。そのような抗微生物剤の例には、限定するわけではないがアジ化ナトリウムおよびＰｒｏＣｌｉｎ（商標）がある。本発明はこれらに限定されないし、任意の他の抗微生物剤にも限定されない。むしろ既知の、もしくは将来開発されるであろう多数の抗微生物剤の両方、およびそれらが使用される有効量を本発明に使用することができる。限定するわけではないが米国特許第５，８９１，７３４号明細書に説明されているようなものを含む多くの抗微生物剤が当該技術分野では周知であり、したがって本明細書では列挙しない。
【００９０】
本発明の抗微生物剤はアジ化ナトリウムである。好ましくはアジ化ナトリウムの量は容量あたりの重量に基づき（重量／容量）、約０．０９％未満である。アジ化ナトリウムの好適な量は、約０．９ｇ／Ｌである。
【００９１】
あるいはＰｒｏＣｌｉｎ（商標）の量は、約１０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍ、さらにより好ましくは約２０ｐｐｍ約８０ｐｐｍの範囲であり、さらにより一層好ましくは約３０ｐｐｍ〜約６０ｐｐｍの範囲の量であり、そして最も好ましくはＰｒｏＣｌｉｎ（商標）の量は約４０ｐｐｍである。（例えばスペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）の技術的刊行物Ｎｏ．９００を参照されたい）。
【００９２】
参照組成物は、限定するわけではないがＯｘｙｒａｓｅ（商標）のような第２の酸化防止剤を含んでもよい。当業者には理解されるように、本明細書に提供する開示に基づき、Ｏｘｙｒａｓｅ（商標）はリットルあたり約９．０グラムより高いＴＤＰＡのレベルで参照組成物の安定性に影響を及ぼさない。いかなる理論にも拘束されことを望まないが、Ｏｘｙｒａｓｅ（商標）は酸素スカベンジャーとして機能するためにプロトンドナー（例えば乳酸等）を要するかもしれない。さらにＯｘｙｒａｓｅ（商標）を含んでなる組成物は、ＮａＣｌを含んでなることができるが、必ずしも必要ではない。ＴＤＰＡはＯｘｙｒａｓｅ（商標）の競合的インヒビターとしても作用することができ、これは高濃度ではその効力を下げるかもしれない。
【００９３】
好ましくはＯｘｙｒａｓｅ（商標）の量は、約０．０５Ｕ／ｍＬ〜約０．５Ｕ／ｍＬ、さらにより好ましくは約０．１Ｕ／ｍＬ約０．４Ｕ／ｍＬの範囲、さらにより一層好ましくは約０．１Ｕ／ｍＬ〜約０．３Ｕ／ｍＬの範囲の量である。最も好ましくはＯｘｙｒａｓｅ（商標）の量は０．１Ｕ／ｍＬである。（例えば米国特許第４，４７６，２２４号；同第４，９９６，０７３号；および同第５，２４０，８５１号明細書を参照にされたい）。
【００９４】
当業者は本明細書に提供する開示に基づき、本発明の参照組成物が好ましくは水溶液として提供され、これは既知の値の少なくとも１つの既知の構成要素に調整するために希釈することはできるが、希釈されない。すなわち組成物は、水溶液を生成するために再構成を必要とせず、これにより取り扱いの誤りおよび経費のかかる操作を減らし、これにより組成物が使用できるようになる前に液体を加えることを必要とする凍結乾燥および／または乾燥もしくは粉末状態で提供される参照組成物に対して有意な改善を提供する。したがって本発明は使用できるようになる前に再構成および／または任意の液体の添加を必要としなくても有意な期間、安定なままである安定な水性または血清／血漿基質の参照組成物を提供する。
【００９５】
ＩＩ．参照組成物の生産方法
本発明は、実質的に純粋な既知の値の構成要素および安定化量のＴＤＰＡを含んでなる参照組成物の生産方法を含む。この方法は、水性またはタンパク質基剤のバッファー基質を含んでなり、これに酸化防止剤および抗微生物剤が加えられる。溶解後、溶液は次いで十分な量とされ（ｑｓ）、次いで例えば０．２μｍのフィルターを通して濾過される。限定するわけではないがＣＨＯＬ、ＨＤＬ、ＬＤＬ等のような成分（すなわち被検体）が、その所望する目標量で加えられる。次いで溶液を再度、濾過する。参照組成物は目標濃度に確実に達成するように作られた適用可能な化学的分析器でアッセイされる。必要ならば、調整を行い、そしてサンプルを再度アッセイする。
【００９６】
本発明は安定な対照または検量標準組成物を生産するための方法を包含する。この方法は水性または血清／血漿基質溶液と安定化量の３，３’−チオジプロピオン酸および予め定めた量の実質的に純粋な被検体とを混合することを含んでなる。
【００９７】
当業者は本明細書に提供する開示に基づき、広範な多数の水溶液を使用して本発明の標準を生産することができると考えるだろう。そのような水溶液には限定するわけではないが、とりわけ水、ヒト血漿、ヒト血清、ウシ血清アルブミンを含んでなる溶液、およびヒト血清アルブミンを含んでなる溶液がある。そのような溶液は当該技術分野では周知であり、そして本明細書ではさらに検討しない。
【００９８】
ＩＩＩ．参照組成物の使用法
本発明はさらに試験溶液中の構成要素の量を測定するために適合された計測器の較正または品質管理法を含む。すなわち本明細書に開示するデータに示されるように、本発明はサンプル中の構成要素の量を評価するために使用する計測器について較正し、かつ／または検証し、かつ／または品質管理を提供するために、本発明の参照組成物の使用法を示す。
【００９９】
当業者は本明細書に提供される教示に基づき、本発明が任意の特定の計測器に限定されず、むしろ本発明は当該技術分野で知られているような、あるいは将来開発されるであろう広範な多数の計測器を包含すると考えるだろう。すなわちそのようなサンプル中の既知の目的構成要素の存在および／またはレベルをアッセイするための計測器には、限定するわけではないが例えばベックマンコールター（フラートン、カリフォルニア州）のＣＸモデルおよび／またはＬＸモデル、ロッシュダイアグノスティックス（マンハイム、ドイツ
）のＨｉｔａｃｈｉおよびＩｎｔｅｇｒａシステム、バイエルヘルスケア（Ｂａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（タリータウン、ニューヨーク）のＣｅｎｔａｕｒ  ＩＭＳおよびＡｄｉｖａシステム、アボットダイアグノスティックス（Ａｂｂｏｔｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）（アボットパーク、イリノイ州）のＡｅｒｏｓｅｔおよびＣｈｅｍ  ８０００システム、オルトＪ＆Ｊクリニカルダイアグノスティックス（Ｏｒｔｈｏ’ｓ  Ｊ＆Ｊ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）（ラリタン、ニュージャージー州）のＶｉｔｒｏｓおよびＤＴシステム、ダーデ  ベーリング（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）（ニューアーク、デラウエア州）およびダーデ  ベーリング社（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）（英国）のＤｉｍｅｎｓｉｏｎシリーズ、ポリメディコ（Ｐｏｌｙｍｅｄｃｏ）（コールトランド  マナー、ニューヨーク）のＰｏｌｙｃｈｅｍ、エランダイアグノスティックス（Ｅｌａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）（モリスタウン、ニュージャージー州およびダブリン、アイルランド）のＡＴＡＣ、および多くのその他のようなマルチチャンネル化学分析機を含む。このように当業者は、本明細書に提供する開示に基づき、本発明は本発明の参照組成物を用いてサンプルを調査するために使用される既知の、またはこれから開発されるいずれの特定の計測器に限定されないことを理解するだろう。血清分析器、手持ちのデバイス、１つの試験デバイス等を含むそのような計測器は当該技術分野では周知であり、そして本明細書ではさらに検討しない。
【０１００】
当業者は本明細書に説明する開示から着手する場合に理解するように、本発明の参照組成物が計測器および／またはアッセイを較正するために使用できる。すなわち本発明の参照組成物および方法は、他の用途の中でもとりわけ検量線の作成、検量線の検証、品質管理および直線性試験に有用である。
【０１０１】
当業者は本開示に基づき、本発明の組成物が特定の応用の必要性に基づき、修飾することができること知っている。非限定的例として、特定の酸化防止剤がアッセイを妨害する能力を有するか、または参照組成物の１もしくは複数の他の成分を妨害する場合、その酸化防止剤を参照組成物から排除することができる。同様に当業者は本開示に基づき、本発明の方法が特定の応用の必要性に基づき、修飾することができること知っている。非限定的例として、参照組成物は２点検量アッセイに使用することができる。本発明の別の態様では、参照組成物は５点検量アッセイに使用することができる。１つの観点では、参照組成物は有効な（ｖａｌｉｄ）および正確な参照曲線を確立するために必要であると定められる多数の、または少数の参照点を含むことができる。
【０１０２】
臨床研究室で使用される多くのキャリブレーションスキームが存在する。より古い方法はしばしば手動で行われ、アッセイ範囲全体にわたる幾つかの濃度レベルを使用し、そして典型的には患者の被検体値を計算するために回収対濃度をプロットするか、または線形回帰を使用する。これらの方法は今でも使用することができる。しかしコンピューター技術の使用および利用性が増すにつれ、今では直線性を示す方法は同じ結果を達成するために１もしくは２つのキャリブレーター点を使用することが多い。多くは１もしくは２つの設定点法は生理食塩水または蒸留水のブランクをさらなる設定点として加え、後者は計測器または試薬の製造元により指示されるように機能する。非線形化学については、従来の取り組みは通常、患者の結果の最終的な計算に使用する数学的モデルにより指示される非線形様式に設定される、５もしくは６レベルのキャリブレーターを提供する。非線形化学に関するより最近の傾向は、このアッセイで測定される高濃度の被検体を含有する１つのキャリブレーターを使用することである。この方法を使用して、系が被検体をキャリブレーションする場合、分析系は次いで飛んでいるこの高濃度の値の必要な希釈を行って、予め定めたキャリブレーションの設定点を作成するように向けられる。
【０１０３】
したがって本発明の１つの観点では、方法が参照曲線を作成するために多くのキャリブレーター点の使用を特徴とする。１つの態様では、方法は１より多くの点の使用を特徴と
する。別の態様では、多点の１つがゼロ点である。さらに別の態様では、ゼロ点は多点の１つとして含まれないが、参照曲線中に別個に含めてもよい。本発明の別の観点では、方法は本明細書のいたるところで詳細に記載するように、１つのキャリブレーション点の使用を特徴とする。１つの態様では、方法は１つのキャリブレーション点に加えてゼロ点の使用を特徴とする。
【０１０４】
一連の非限定的例として、本発明の方法は検量用の１つの濃度に基づく参照曲線を使用することができ、本発明の方法は１つの濃度に加えて検量用のゼロ濃度点に基づく参照曲線を使用することができ、本発明の方法は検量用の少なくとも２つの濃度に基づく参照曲線を使用することができ、そして本発明の方法は少なくとも２つの濃度に加えて検量用のゼロ濃度点に基づく参照曲線を使用することができる。本発明の１つの観点では、検量サンプルの濃度が分かっている。本発明の観点では、検量サンプルの濃度は未知である。本発明のさらに別の観点では、少なくとも２つの検量サンプルを含有する混合物中の少なくとも１つの検量サンプルの濃度が知られている。
【０１０５】
ＩＶ．キット
本発明は本発明の新規の安定な水性または血清／血漿基質の脂質標準、アプリケーター、および本発明の方法を行うためのキットの使用を説明する使用説明書を含んでなる種々のキットを含む。例示するキットを以下に記載するが、他の有用なキットの内容物は、本開示に照らして当業者には明白である。これらの各キットを本発明に含む。
【０１０６】
１つの観点では、本発明は試験溶液中の構成要素の量を測定するために適合された計測器のキャリブレーションまたは品質管理用のキットを含む。キットは、既知の量の構成要素および安定化量の３，３’−チオジプロピオン酸を含んでなる参照組成物を含んでなる。キットはさらに、アプリケーターおよびキットを使用するための使用説明書を含んでなる。
【０１０７】
キットは本発明に開示する方法に準じて使用される。簡単に説明すると、キットは検量線の作成を行い、検量線を検証し、および／または品質管理の目的に使用することができる。これは本明細書のいたるところでさらに完全に開示しているように、本明細書に開示するデータがＴＤＰＡの添加が水性の脂質参照組成物を検出可能に安定化することを証明し、そして中でもとりわけアッセイにおける検量線の作成および品質管理に、そして目的の構成要素の存在および／または濃度を評価するために使用することができる安定な組成物を提供するからである。
【０１０８】
キットはさらに関連するアッセイでの使用に安定な標準を投与するために有用なアプリケーターを含んでなる。キットに含まれる特定のアプリケーターは、例えば脂質をアッセイするために使用する方法、ならびに使用する特定の分析計測器に依存し、そしてそのようなアプリケーターは当該技術分野において周知であり、そして他の中でもとりわけピペット、シリンジ、ドロッパーボトル（ｄｒｏｐｐｅｒ  ｂｏｔｔｌｅ）等を含むことができる。さらにキットはキットを使用するための使用説明書を含んでなる。これらの使用説明書は単に本明細書で提供する開示を具現している。
【０１０９】
キットは本明細書をいたるところに開示しているような種々の構成要素の組み合わせを種々の既知の量で含んでなり、それらには限定するわけではないが１もしくは複数の酸化防止剤、および１もしくは複数の生物学的バッファーを含む。組成物は本明細書のいたるところで説明している適切な量で提供される。
【０１１０】
さらにキットは、２つの組成物の間のデルタまたは差異が知られているような既知の構成要素の異なる既知の値を含んでなる少なくとも２つの参照組成物の組み合わせを含む。
そのようなキットは品質管理の目的で計測器を標準化またはキャリブレーションするために、そして本明細書のいたるところで検討しているような計測器のためのキャリブレーション曲線を作成するために使用することができる。すなわち本発明は少なくとも２つの参照組成物を含んでなるキットを包含する。本発明は任意の特定の組に限定されないが、参照組成物の具体的な組み合わせを本明細書のいたるところに例示する。
【０１１１】
さらに本発明は３，３’−チオジプロピオン酸を含んでなるキットを包含し、キットが少なくとも１つの構成要素または被検体を含んでなる場合、その値は既知である。すなわちキットは本明細書に提供する開示に基づき、当業者には想定されるように、限定するわけではないが総コレステロール、ＬＤＬ、ＨＤＬ、トリグリセリド、ＡＰＯ−Ａ、ＡＰＯ−Ｂ、Ｌｐ（ａ）等、およびそれらの組み合わせを含む被検体をさらに含んでなる。
【０１１２】
本発明は以下の実験的実施例を参照することにより一層詳細に説明される。これらの実施例は、具体的説明の目的のみに提供され、そして他に特定されない限り限定することを意図していない。すなわち本発明は以下の実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ本明細書に提供する教示の結果として明らかになるありとあらゆる変更を包含すると解釈すべきである。
【実施例】
【０１１３】
実施例１：多点キャリブレーション設定
表１は、検量線の作成に多くの設定点を要する方法のために、多点キャリブレーションスキーム用の多くのレベルで本発明を使用する形態を示す。幾つかの市販されている方法は、関与する成分用の多点キャリブレーションを利用する。これらの設定点は、全分析測定範囲を網羅するように設計されている。
【０１１４】
【表１】
2008511839.tif 000002
【０１１５】
種々の組成物は以下のように調製した。簡単に説明すると、キャリブレーター設定用の１リットルの基質バッファーは以下のように生成する：２５ｇ（２．５重量／容量％）のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；セラケア（Ｓｅｒａｃａｒｅ）カタログＮｏ．ＨＳ４３０、２０ｇ（２．０重量／容量％）のヒトガンマグロブリン（ＨＧＧ：セラケア  カタログＮｏ．ＨＳ４７５または均等物）、３４．４２ｇのＨＥＰＥＳナトリウム（約０．１Ｍ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ）カタログＮｏ．Ｈ７００６または均等物）、６．４２８４ｇ（約８ｍＭ）の塩化ナトリウム（シグマ  カタログＮｏ．Ｓ９８８８または均等物）、４．０ｇ（約５０ｍＭ）ＴＤＰＡ（アルドリッチ  カタログＮｏ．Ｔ３０２０−１または均等物）、２．２４２ｇ（約１０ｍＭ）乳酸ナトリウム（シグマ  カタログＮｏ．Ｌ７０２２または均等物）、０．９０ｇ（約０．０１Ｍ）アジ化ナトリウム（シグマ  カタログＮｏ．Ｓ８０３２または均等物）、および１．３３ｍＬ  Ｐｒｏｃｌｉｎ（商標）３００（約４０ｐｐｍ）（スペルコ  カタログＮｏ．４−８１２７）。いったん溶解したら、ｐＨを７．３〜７．５、好ましくは約７．４に１Ｎ  ＨＣｌまたは３Ｎ  ＮａＯＨを使用して調整した。溶液は十分量作成した。次いで溶液は、Ｓａｒｔｏｂｒａｎ  Ｐ  Ｃａｐｓｕｌｅ（ザルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、ＰａｒｔＮｏ．５２３１３０７Ｈ５または均等物）を使用して０．２μｍで濾過した。
【０１１６】
設定点は個別に調製するか、またはレベル５の設定点の希釈から調製する。この場合、キャリブレーターの設定点間で直線関係が存在し、そして標準の濃度がアッセイの報告可能な範囲にわたり出現する従来のマニュアルによる化学アッセイを表す。またこの例は、非線形化学用に設計することもでき、その場合、レベル５の設定点を使用して上限または数値的境界を設定し、そして最適な曲線形および続いて数学的モデルが確立されて臨床的結果の計算が可能となるような濃度で、さらなる設定点をアッセイ範囲全体にわたり加える。
【０１１７】
実質的に純粋な脂質濃縮物（リー（Ｌｅｅ）カタログＮｏ．３６１−１０、３６０−１０または均等物）を方法の分析範囲に希釈し、そして適切な計測器でアッセイする。値は濃縮保存物に割り当てる。次いでＨＤＬおよびＬＤＬ保存物の適切な希釈を行って、所望する設定点値を得る。例えば総コレステロール濃縮保存物が４０００ｍｇ／ｄＬならば、１：５を基質バッファー中に作成して、設定点＃５を作成する。これは点が個別に調製される場合、各設定点について行う。
【０１１８】
ＡＰＯ−ＡはＨＤＬの副成分であるが、ＡＰＯ−ＢはＬＤＬの副成分である。故にこれらの構成要素について得た値は、ＨＤＬおよびＬＤＬの値に依存している。例えばレベル５の設定点は１１８．７ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ値を生成した。得られたＡＰＯ−Ａ値は３６９．３４ｍｇ／ｄＬであった。同じサンプルについて、５１０．２ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ値が作成されたが、その対応するＡＰＯ−Ｂ値は３３５．３ｍｇ／ｄＬであった。あるいはＡＰＯ−ＡおよびＡＰＯ−Ｂの目標は、目標とするアポリポ蛋白濃度に依存して、生じるＨＤＬおよびＬＤＬ値を用いて設定することができる。
【０１１９】
次いで各レベルをアッセイする。調整は目標濃度を確実に達成するために行う。この設定を再度アッセイし、そしていったん正しい濃度に達したら、種々のレベルを０．２μｍで濾過する。これらのキャリブレーターは、ＡＰＯ  Ａ−１用のＩＦＣＣ  ＳＰ１−０１参照調製物のような設計された参照法に対して行い、そして標準化して、例えばロッシュのプロダクトインサートＡＰＯ  Ａ−１バージョン２．０、２００２年２月に記載されているような参照値を確立することができる。いったん確立されれば、末端の使用者は臨床分析器をキャリブレーションするために設定点を使用することができる。組成物はＴＤＰＡを含まない他は同一の組成物と比べて、延長された安定性を示す。
【０１２０】
実施例２：２点キャリブレーション設定 
表２は、２つのレベルの設定点でキャリブレーションするように設計した方法のために、２点キャリブレーションスキーム用の２点を使用する形態を示す。しばしば所望する成分の「ゼロ」量を含有する１つの設定点用に、生理食塩水または他の適切なブランク物質が使用される。
【０１２１】
【表２】
2008511839.tif 000003
【０１２２】
表１に関連して前に説明したバッファーを使用して、実質的に純粋な脂質濃縮物を希釈し、そして適切な計測器でアッセイする。次いで値を濃縮保存物に割り当てる。次いで脂質保存物の適切な希釈を行って、所望する設定点値を得る。適切な量のトリグリセリド、ＨＤＬおよびＬＤＬ濃縮物を加え、そして溶解する。ここでもＡＰＯ−ＡおよびＡＰＯ−Ｂはこれら構成要素の副成分である。溶液をアッセイし、そして必要な調整を行って確実に設定点が合うようにする。次いでサンプルを再試験し、そして０．２μｍで濾過する。設定点は表１で説明した組成物に関して記載した内容と同様に、値の割り当てに関する参照方法を実施することができる。いったん確立すれば、次いで末端使用者は２設定点を使用して彼らの臨床的分析器をキャリブレーションすることができる。組成物はＴＤＰＡを含まない他は同一の組成物と比べて、延長された安定性を示す。
【０１２３】
実施例３：さらなる２点キャリブレーション実験
２点ＨＤＬモック（ｍｏｃｋ）キャリブレーターを作成して、ベックマンＣＸ７に関するベックマン脂質キャリブレーターを模倣した。キャリブレーターは、脂質生成物用の配合物を使用して作成し、ここで被検体は例えば実施例１で説明したようなものを含め、本明細書のいたるところで詳細に説明されているように所望の被検体濃度でバッファーに加えられた。被検体の濃度は２つの必要とされる設定点を満たすように調整された。４０名の患者サンプルを脂質分析用に得、そして改良したＥＰ９プロトコールに従い分析した。ＣＸ７はベックマン脂質キャリブレーターを使用してキャリブレーションした。患者のサンプルを１回あたり５〜６種のサンプル群で二連で分析した。キャリブレーション間の時間は約２時間であった。計測器はモックキャリブレーターを使用して再度キャリブレーションし、そして同じ患者のサンプルを二連で分析した。全部で４０種のサンプルを分析した。
【０１２４】
統計的なデータの調査で、キャリブレーターが同等であったかどうかを明らかにした。ｔ  Ｓｔａｔ＜ｔ  両側棄却（ｔ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｔｗｏ−ｔａｉｌ）（９５％）ならば、キャリブレーターは同等であることを表す。ＣＸ７でのＨＤＬの場合、同等であることが示された。
【０１２５】
このモックキャリブレーター実験では、計測器の製造元のキャリブレーションを使用して、モックキャリブレーター設定点の値を確立した。多くの市販されている製品については、設定点はナショナルスタンダードガイドライン（ｎａｔｉｏｎａｌ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ）に従い、ＮＩＳＴ参照物質を用いて決定される。
【０１２６】
さらなる実験では、１点のＣＨＯＬモックキャリブレーターを作成して、Ｉｎｔｅｇｒａ４０に関するロッシュのＣＦＡＳ（自動化システムのためのキャリブレーター）キャリブレーターを模倣した。キャリブレーターは本明細書のいたるところに記載する脂質生成物用の配合物を使用して作成し、そして必要な設定点を満たすように調整した。４０名の
患者サンプルを脂質分析用に得、そして改良したＥＰ９プロトコールに従い分析した。Ｉ４００はロッシュのＣＦＡＳキャリブレーターを使用してキャリブレーションした。患者のサンプルを１回あたり５〜６種のサンプル群で二連で分析した。キャリブレーション間に約２時間休んだ。計測器はモックキャリブレーターを使用して再度キャリブレーションし、そして同じ患者のサンプルを二連で分析した。全部で４０種のサンプルを分析した。
【０１２７】
統計的なデータの調査では、キャリブレーターが同等であったかどうかが明らかになった。結果は一部、スチューデントｔ検定を使用して等しい変動を持つ結果について分析した。ｔ  Ｓｔａｔ＜ｔ  両側棄却（９５％）ならば、キャリブレーターは同等であることを表す。Ｉ４００でのＣＨＯＬの場合、同等であることが示された。
【０１２８】
このモックキャリブレーター実験では、計測器の製造元のキャリブレーションを使用して、キャリブレーションで使用する設定点の値を確立した。多くの市販されている製品については、ナショナルスタンダードガイドラインに従い設定点はＮＩＳＴ参照物質を用いて決定される。
【０１２９】
【表３】
2008511839.tif 000004
【０１３０】
【表４】
2008511839.tif 000005
【０１３１】
【表５】
2008511839.tif 000006
【０１３２】
【表６】
2008511839.tif 000007
【０１３３】
【表７】
2008511839.tif 000008
【０１３４】
【表８】
2008511839.tif 000009
【０１３５】
実施例４：多構成要素の２点キャリブレーション
多構成要素のモックキャリブレーターは、Ｈｉｔａｃｈｉ９９１ではＨＤＬ、ＬＤＬおよびＴＲＩＧに関して、Ｉｎｔｅｇｒａ４００ではＡＰＯＡおよびＡＰＯＢに関するＣＦＡＳ脂質のロッシュキャリブレーターを模倣するために作成した。キャリブレーターは本明細書のいたるところに記載するような脂質生成物用の配合物を使用して作成し、そして目標を各分析器に必要な設定点に合うように調整した。４０名の患者サンプルを脂質分析用に得、そして改良したＥＰ９プロトコールに従い分析した。９１１およびＩ４００はロッシュのＣＦＡＳ脂質キャリブレーターを使用してキャリブレーションした。患者のサンプルは１回あたり５〜６種のサンプル群で二連で分析した。キャリブレーション間は約２時間あった。計測器はモックキャリブレーターを使用して再度キャリブレーションし、そして同じ患者のサンプルを二連で分析した。全部で４０種のサンプルを分析した。
【０１３６】
統計的なデータの調査では、キャリブレーターが同等であったかどうかが明らかになった。ｔ  Ｓｔａｔ＜ｔ  両側棄却（９５％）ならば、キャリブレーターは同等であることを表す。９１１でのＨＤＬ、ＬＤＬおよびＴＲＯＧの場合、同等であることが示された。Ｉ４００でのＡＰＯＡの場合、同等であることが示された。Ｉ４００でのＡＰＯＢの場合、同等であることは示されなかった。これは誤差が９９％信頼まで上昇すれば、同等に達することができることを示唆する。
【０１３７】
このモックキャリブレーター実験では、計測器の製造元のキャリブレーションを使用して、モックキャリブレーターの設定点の値を確立した。多くの市販されている製品については、設定点はＮＩＳＴ参照物質を用いて決定される。
【０１３８】
【表９】
2008511839.tif 000010
【０１３９】
【表１０】
2008511839.tif 000011
【０１４０】
【表１１】
2008511839.tif 000012
【０１４１】
【表１２】
2008511839.tif 000013
【０１４２】
【表１３】
2008511839.tif 000014
【０１４３】
【表１４】
2008511839.tif 000015
【０１４４】
【表１５】
2008511839.tif 000016
【０１４５】
【表１６】
2008511839.tif 000017
【０１４６】
【表１７】
2008511839.tif 000018
【０１４７】
【表１８】
2008511839.tif 000019
【０１４８】
【表１９】
2008511839.tif 000020
【０１４９】
【表２０】
2008511839.tif 000021
【０１５０】
【表２１】
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【０１５１】
【表２２】
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【０１５２】
【表２３】
2008511839.tif 000024
【０１５３】
実施例５：多レベルの品質管理設定
表７は臨床研究室で日常的なＯＣ試験に使用されるＱＣ製品の３つのレベルを開示する形態を示す。試験は使用者の必要性に依存してありとあらゆるレベルについて行うことができる。
【０１５４】
【表２４】
2008511839.tif 000025
【０１５５】
本明細書のいたるところで以前に開示した多点キャリブレーション設定と同様に、品質管理の設定を個別のレベルとして、または最高レベルの希釈から作成することができる。実質的に純粋な脂質濃縮物は、適切な計測器範囲に希釈した後に値を割り当て、そして試験する。表１に開示する組成物に関して説明したように調製したバッファーを使用して、必要量の成分を加えて、各レベルを個別に作成する。次いでレベルは０．２μｍで濾過し、そして試験する。
【０１５６】
設定点は割り当て値無しで使用することができる。そのような場合は、末端使用者は彼らの研究室からの臨床検体に基づき、彼ら独自の値を確立してもよい。しかしこれらの設定点は標準参照調製物および割り当てた値に対しても試験できる。分析器をキャリブレーションした後、末端使用者はこれらのレベルを試験してアッセイの性能を検証することができる。品質管理の設定点は問題解決に使用することもできる。組成物はＴＦＰＡを含まない他は同一の組成物と比較して、延長した安定性を示す。
【０１５７】
実施例６：多レベルの品質管理
上記の脂質生成物が品質管理に使用できることを具体的に説明するために、本明細書のいたるところに記載するような配合物からレベル２の溶液およびレベル３の溶液を４３日間、Ｉｎｔｅｇｒａ４００についての品質管理として使用した。データを集め、そしてＴＲＩＧおよびＣＨＯＬに関するロッシュのＰｒｅｃｉ対照およびＨＬＤ、ＬＤＬ、ＡＰＯＡおよびＡＰＯＢに関するロッシュの脂質対照を用いて現在得られる結果と比較した。それらの対照は、被検体に依存して５２〜８５日間分析した。各被検体に関するＳＤおよびＣＶの比較により、使用した物質が製造元の対照物質と同等か、それより良いことが示された。
【０１５８】
Ｉｎｔｅｇｒａでの対照実験に加えて、脂質生成物をレベル２および５の溶液でＬｐ（ａ）に関してベックマンのＩｍｍａｇｅで１０日間、単独（ｓｉｎｇｌｅｔ）で分析した。レベル２の濃度は参照範囲を表し、そしてレベル３の濃度は範囲の外であった。レベル２のデータは１２．７〜１５．９の範囲を具体的に説明し、平均１４．１ｍｇ／ｄＬであった。レベル３のデータは４９．５〜５９．８の範囲を具体的に説明し、平均５４．２ｍｇ／ｄＬであった。データは以下の表１９に含める。
【０１５９】
【表２５】
2008511839.tif 000026
【０１６０】
【表２６】
2008511839.tif 000027
【０１６１】
実施例７：キャリブレーションの検証および直線性のＱＣ設定
表２０は、試験した方法の報告可能な範囲を網羅するために、５つの等しく間隔を明けたレベルを使用してキャリブレーションの検証および直線性の試験設定に関する形態を説明する。試験は検証し、または直線性を確認するために必要な範囲を網羅するために、低、中および高い点を使用しなければならない。
【０１６２】
【表２７】
2008511839.tif 000028
【０１６３】
実質的に純粋な脂質濃縮物をアッセイし、そして本明細書のいたるところで前に説明した値を割り当てる。表１について前に記載したように調製したバッファーを使用して、レベル１および５は適切な量の脂質濃縮物を加えることにより作成する。レベル１および５をアッセイする。調整を行って各レベルが所望の濃度となるようにする。次いでレベルを再度試験し、そして０．２μｍで濾過する。組成物はＴＦＰＡを含まない外は同一の組成物と比較して、延長した安定性を示す。
【０１６４】
レベル１〜５は、直線性の試験に関するＮＣＣＬＳのＥＰ６ガイドラインにより利用される好適な「イコールデルタ（ｅｑｕａｌ  ｄｅｌｔａ）」法を使用して調製する。（ＮＣＣＬＳ、２００３、定量的な測定法の直線性の評価：統計的取り組み、認可されたガイドライン（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｉｎｅａｒｉｔｙ  ｏｆ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ：Ａ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ）、２３巻（Ｎｏ．１６）で、ウェイン、ペンシルバニア州）。レベル２は３部のレベル１と１部のレベル５を合わせることにより調製する。レベル３は等量の両レベル１および５を加えることにより作成する。レベル４は１部のレベル１および３部のレベル５を加えることにより作成する。次いで各レベルを試験して、確実に目標濃度を達成する。キャリブレーションの検証および直線性の設定は、値の割り当てに関する参照法に対して分析することができる。いったん確立したら、末端使用者はこれらの５レベルを患者のサンプルとして分析し、そして直線性の曲線（ｌｉｎｅａｒｉｔｙ  ｃｕｒｖｅ）を作成することができる。組成物はＴＤＰＡを含まない他は同一の組成物と比較して、延長した安定性を示す。
【０１６５】
実施例８：定性的カットオフ値
表２１はポイントオブケア検査（ＰＯＣＴ）系に関する形態を説明し、ここでは定性的な結果のみが報告される。物質を使用して低い、または高いカットオフ、または負および正の結果を確立する。
【０１６６】
この物質は、２点キャリブレーション設定に関して説明したような、本明細書のいたるところで前に記載したように生成する。負の参照は所望の成分を「ゼロ」量で含む適切なブランク物質であることができる。組成物はＴＦＰＡを含まない他は同一の組成物と比較して、延長した安定性を示す。
【０１６７】
【表２８】
2008511839.tif 000029
【０１６８】
実施例９：代表的組成物
ＴＦＰＡを含まない他は同一の組成物と比較して、延長した安定性を示すサンプル組成物は、以下の通りである：
ＨＥＰＥＳを含んでなるバッファー、約ｐＨ７．４（約７．２〜７．６のｐＨ範囲）に
４．０ｇ／Ｌ  ＴＤＰＡ
０．９ｇ／Ｌ  アジ化ナトリウム
４０ｐｐｍ  ＰｒｏＣｌｉｎ（商標）
Ｏｘｙｒａｓｅ（商標）を加えた。
【０１６９】
組成物の安定性：
本明細書のいたるところに前に記載した幾つかの配合物をアッセイして、当該技術分野で周知な方法を使用して組成物の安定性を評価した。今日までの分析は、６カ月間のリアルタイム試験にわたり、有意な１０％未満の分解が示されている。リアルタイム試験を、保存条件として冷蔵（例えば２〜８℃）および凍結温度（例えば−１０から−２０℃）の両方で行った。
【０１７０】
安定性試験を続け、そして試験した組成物は、ＴＦＰＡを含まない他は同一の組成物と比較して実質的に少ない分解を示した。市場で望まれる安定性は、約１２〜１５カ月である。本明細書に開示するデータは、本発明の組成物が市場で望まれる範囲まで、ずっと安定であることを示す。試験は、Ｏｘｙｒａｓｅ（商標）を含むか、または含まずに、４から９グラム／リットルの間のＴＤＰＡの配合物について行い、そして種々の配合物の安定性はおよそ等しい。
【０１７１】
実施例１０：標準溶液中での種々の酸化防止剤の使用
選択し、そして試験した酸化防止剤には、フィチン酸ドデカナトリウム塩、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、ＢＨＴ、アスコルビン酸、フマル酸、ＥＤＴＡ、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、ヒドロキノン、イソアスコルビン酸、フィチン酸二カリウム塩およびシステアミンＨＣＬを含んだ。
【０１７２】
【表２９】
2008511839.tif 000030
【０１７３】
【表３０】
2008511839.tif 000031
【０１７４】
【表３１】
2008511839.tif 000032
【０１７５】
溶液は、本明細書のいたるところに記載したような脂質生成物用の配合物を使用して、２２ｍＭ  ＴＤＰＡ、Ｏｘｙｒａｓｅ（商標）およびＨＥＰＥＳバッファーを使用して調製した。酸化防止剤を分類し（表２２〜２４）、そして各群から１つを選択した。続いてレベル５の溶液を、選択した酸化防止剤（ＴＤＰＡなし）をＴＤＰＡと同じ濃度で使用して調製した。溶液をアリコートとし、そして室温で、２〜８℃で、および−１０から−２０℃で保存した。周期的に保存したアリコートをＨＤＬ、ＬＤＬ、ＴＲＩＧ、ＣＨＯＬ、ＡＰＯＡおよびＡＰＯＢについて試験した。この試験の目標は、異なる温度で脂質生成物に及ぼす種々の酸化防止剤が有する保護効果を決定することであった。
【０１７６】
【表３２】
2008511839.tif 000033
【０１７７】
【表３３】
2008511839.tif 000034
【０１７８】
【表３４】
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【０１７９】
【表３５】
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【０１８０】
【表３６】
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【０１８１】
【表３７】
2008511839.tif 000038
【０１８２】
実施例１１：組み合わせた酸化防止剤バッファー中の脂質物質の分解に関する特性決定
ＨＤＬおよびＬＤＬ濃縮物は、Ｎ−アセチル−システインおよびフマル酸を含むバッファー中に調製した。レベル５溶液は、前に記載したように調製した。サンプルを凍結し、解凍し、そして以下の温度／範囲で保存した：２０℃（ＲＴ）、２〜８℃および−２０℃。試験は４週間にわたり４８時間毎に行った。
【０１８３】
以前の実験では、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインのみがＮ−アセチル−Ｌ−システインおよびフマル酸の組み合わせと同じ様式で回収したことを示す。フマル酸のみは以前の実験でＣＨＯＬおよびＴＲＩＧをより良く回収し、一方ＡＰＯＰは本配合物中で改善した。−２０℃でＮ−アセチル−Ｌ−システインおよびフマル酸の組み合わせは、ほとんどの試
験で十分に回収した。
【０１８４】
【表３８】
2008511839.tif 000039
【０１８５】
実施例１２：標準溶液の安定化に及ぼすバッファー組成物の効果
溶液は、本明細書のいたるところに記載するような脂質生成物に関する配合物を使用して、４ｇ／Ｌ  ＴＤＰＡ、Ｏｘｙｒａｓｅ（商標）およびＨＥＰＥＳを使用して調製した。引き続きレベル５溶液は、種々のバッファー（ＢＥＳ、ＭＯＰＳおよびＴＲＩＳ）を使用して、ＨＥＰＥＳと同じ濃度に調製した。溶液をアリコートとし、そして室温で、２〜８℃で、および−１０から−２０℃で保存した。周期的にアリコートをＨＤＬ、ＬＤＬ、ＴＲＩＧ、ＣＨＯＬ、ＡＰＯＡおよびＡＰＯＢについて試験した。この試験の目標は、異なる温度で脂質生成物に及ぼす種々のバッファーが有する保護効果を決定することであった。
【０１８６】
〜５２８時間後のデータは、ＨＥＰＥＳバッファーが最高の保護効果を提供したことを示した。試験したすべての他のバッファーは保護を提供したが、ＨＥＰＥＳバッファーと同じレベルではなかった。
【０１８７】
【表３９】
2008511839.tif 000040
【０１８８】
さらなる実験を行って、Ｏｘｙｒａｓｅ（商標）および４ｇ／Ｌ  ＴＤＰＡを含むリン
酸ナトリウムバッファー中の脂質原材料（ＨＤＬおよびＬＤＬ濃縮物）の分解について特性決定した。リン酸ナトリウムの添加を含む脂質バッファーを調製し、そして本明細書のいたるところに記載するようにレベル５を作成した。サンプルを凍結し、解凍し、そして以下の温度／範囲で保存した：２０℃（ＲＴ）、２〜８℃および−２０℃。試験は４週間にわたり４８時間毎に行った。
【０１８９】
６７２時間の試験後、以下の結果が観察された。ＨＥＰＥＳを含有するレベル５溶液に比べて、経時的に分解したリン酸ナトリウムバッファーを含むレベル５溶液中のＡＰＯ−ＡおよびＡＰＯ−Ｂは、本明細書のいたるところで説明するデータに示すように、上昇した。−２０℃でリン酸ナトリウムバッファー中のＡＰＯ−Ａは、６２４時間後に９５％回収され、一方、ＨＥＰＥＳバッファー中のＡＰＯ−Ａは６００時間後に１１３％回収された。−２０℃でリン酸ナトリウムバッファー中のＡＰＯ−Ｂは、６２４時間後に９７％回収され、一方、ＨＥＰＥＳバッファー中のＡＰＯ−Ｂは６００時間後に１１３％回収された。リン酸ナトリウムバッファーを含むレベル５溶液は、−２０℃で試験したすべてで十分に回収し（〜９８％）、２〜８℃が続いた（〜９３％）。
【０１９０】
本明細書に引用するすべての特許、特許出願および刊行物の開示は、それら全部を参照により本明細書に編入する。
【０１９１】
本発明を具体的な態様に関して開示してきたが、本発明の他の態様および変更は本発明の精神および範囲から逸脱せずに当業者により考案され得ることは明白である。添付する特許請求の範囲はすべてのそのような態様および均等な変更態様を含むと解釈されることを意図する。
【国際調査報告】
2008511839.tif 000041
2008511839.tif 000042
2008511839.tif 000043