(57)【要約】本発明は、ＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド−１）ならびにエキセンディン−３及び（又は）エキセンディン−４から誘導されるペプチドであって、ＧＬＰ−１受容体に結合し、ＧＬＰ−１受容体発現が関与する良性疾患および悪性疾患を診断および治療するための手段の製造に、標識して、または標識せずに、使用することができるペプチドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミンによるＣ末端での修飾およびＧＬＰ−１受容体へのＮ末端の結合を特徴とする、ＧＬＰ−１、エキセンディン−３およびエキセンディン−４のペプチド誘導体。
【請求項２】
ペプチドＧＬＰ−１（１−３７）：
H-His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13  14  15  16  17  18
Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-OH
19  20  21  22  23  24  25  26  27  28  29  30  31  32  33  34  35  36  37
およびエキセンディン−３：
H-His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13  14  15  16  17  18
Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-
19  20  21  22  23  24  25  26  27  28  29  30  31  32  33  34  35  36  37
Pro-Ser-NH2
38  39 
またはエキセンディン−４：
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13  14  15  16  17  18
Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-
19  20  21  22  23  24  25  26  27  28  29  30  31  32  33  34  35  36  37
Pro-Ser-NH2
38  39 
のアミノ酸配列を完全にまたは部分的に有する、請求項１に記載の、ＧＬＰ−１、エキセンディン−３およびエキセンディン−４のペプチド誘導体。
【請求項３】
ＧＬＰ−１（ｘ−ｙ）Ａ１−３７、またはエキセンディン−３（ｚ−ｋ）Ａ１−４０、またはエキセンディン−４（ｚ−ｋ）Ａ１−４０
［式中、
ｘは、ＧＬＰ−１アミノ酸配列のアミノ酸１〜３６を表し、
ｙは、ＧＬＰ−１アミノ酸配列のアミノ酸２〜３７を表し、
ｚは、エキセンディン−３またはエキセンディン−４アミノ酸配列のアミノ酸１〜３８を表し、
ｋは、エキセンディン−３またはエキセンディン−４アミノ酸配列のアミノ酸２〜３９を表し、
そしてＡは、シグナル分子としての、またはシグナル分子を結合するための、またはそれらを安定化するための、一種以上のアミノ酸またはその誘導体からなる付加基であって、指数部は、その付加基を見いだすことができるアミノ酸配列内の位置を示す］
に由来する、請求項１に記載の、ＧＬＰ−１、エキセンディン−３およびエキセンディン−４のペプチド誘導体。
【請求項４】
付加基Ａが好ましくはＣ末端に位置して、アミンを表す、請求項３に記載の、ＧＬＰ−１、エキセンディン−３およびエキセンディン−４のペプチド誘導体。
【請求項５】
付加基Ａが好ましくはリジンである、請求項３又は４に記載の、ＧＬＰ−１、エキセンディン−３およびエキセンディン−４のペプチド誘導体。
【請求項６】
付加基Ａが遊離アミンを持つアミノ酸、たとえばオルニチン、または遊離アミンを持つ有機基である、請求項３〜５のいずれか１つに記載の、ＧＬＰ−１、エキセンディン−３およびエキセンディン−４のペプチド誘導体。
【請求項７】
放射性核種もしくはＭＲＩ造影剤、蛍光色素または化学療法剤による標識化のために、キレーターが付加基Ａに結合される、請求項３〜６のいずれか１つに記載の、ＧＬＰ−１、エキセンディン−３およびエキセンディン−４のペプチド誘導体。
【請求項８】
キレーターが、Ｎ，Ｎ−ビス（２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］−エチルグリシン）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）、ＨＹＮＩＣ（６−ヒドラジノピリジン−３−カルボン酸）、ＭＡＧ３（メルカプトアセチル−グリシルグリシルグリシン）、Ｎ４（１，４，８，１１−テトラアザウンデカン）、および全ての公知の誘導体、好ましくはＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）である、上記請求項のいずれか１つに記載の、ＧＬＰ−１、エキセンディン−３およびエキセンディン−４のペプチド誘導体。
【請求項９】
標識化が放射性核種、ＭＲＩ造影剤、蛍光色素及び（又は）化学療法剤の結合である、上記請求項のいずれか１つに記載の、ＧＬＰ−１、エキセンディン−３およびエキセンディン−４のペプチド誘導体。
【請求項１０】
蛍光色素が、特に、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、ＢＯＤＩＰＹ、ピレン（カスケードブルー）、ルシファーイエロー、フィコビリタンパク質、シアニン、アレクサフルオロ、オレゴングリーン、テキサスレッド、クマリンおよびそれらの誘導体より成る群から選ばれる、上記請求項のいずれか１つに記載の、ＧＬＰ−１、エキセンディン−３およびエキセンディン−４のペプチド誘導体。
【請求項１１】
放射性核種が、特に、Ｆ−１８、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｙ−８６、Ｙ−９０、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２４、Ｉ−１３１、Ｌｕ−１７７、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｐｔ−１９３ｍ、Ｐｔ−１９５ｍ、Ａｃ−２２５、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１３、Ｓｍ−１５３またはＥｒ−１６９より成る群から選ばれる、上記請求項のいずれか１つに記載の、ＧＬＰ−１、エキセンディン−３およびエキセンディン−４のペプチド誘導体。
【請求項１２】
ＭＲＩ造影剤が、ガドリニウム、マンガン、鉄、ユーロピウム、銅、ニッケル、クロム、プラセオジム、ジスプロシウムもしくはホルミウム、またはそれらの化合物であるか、あるいはペルフルオロカーボン、またはＦ−１９、Ｈ−１、Ｐ−３１、Ｎａ−１９である、上記請求項のいずれか１つに記載の、ＧＬＰ−１、エキセンディン−３およびエキセンディン−４のペプチド誘導体。
【請求項１３】
化学療法剤が、特に、アルキルスルホネート、エチルイミン、ニトロソ尿素類、ナイトロジェンマスタード誘導体、葉酸類似体、プリン類似体、ピリミジン類似体、ポドフィリン誘導体、タキサン、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、他の細胞増殖抑制性抗生物質、白金化合物、カンプトテシン誘導体、ホルモン、成長因子、インターフェロンもしくはインターロイキン、または細胞増殖抑制性物質もしくは細胞毒性物質より成る群から選ばれる、上記請求項のいずれか１つに記載の、ＧＬＰ−１、エキセンディン−３およびエキセンディン−４のペプチド誘導体。
【請求項１４】
インビトロ用途のための放射性核種の結合による標識化が、ｎａｔＩｎＣＬ３による結合部位の飽和によって行なわれる、上記請求項のいずれか１つに記載の、ＧＬＰ−１、エキセンディン−３およびエキセンディン−４のペプチド誘導体。
【請求項１５】
ＧＬＰ−１およびエキセンディン（このエキセンディンはエキセンディン−３またはエキセンディン−４から選択される）のキメラペプチドであって、
ペプチドＧＬＰ−１（１−３７）：
H-His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13  14  15  16  17  18
Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-OH
19  20  21  22  23  24  25  26  27  28  29  30  31  32  33  34  35  36  37
およびエキセンディン−３：
H-His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13  14  15  16  17  18
Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-
19  20  21  22  23  24  25  26  27  28  29  30  31  32  33  34  35  36  37
Pro-Ser-NH2
38  39 
またはエキセンディン−４：
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13  14  15  16  17  18
Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-
19  20  21  22  23  24  25  26  27  28  29  30  31  32  33  34  35  36  37
Pro-Ser-NH2
38  39 
のアミノ酸配列を完全にまたは部分的に有することを特徴とする、キメラペプチド。
【請求項１６】
ＧＬＰ−１（ｘ−ｙ）エキセンディン−３（ｚ−ｋ）、ＧＬＰ−１（ｘ−ｙ）エキセンディン−４（ｚ−ｋ）、エキセンディン−３（ｚ−ｋ）ＧＬＰ−１（ｘ−ｙ）またはエキセンディン−４（ｚ−ｋ）ＧＬＰ−１（ｘ−ｙ）
［式中、
ｘは、ＧＬＰ−１アミノ酸配列のアミノ酸１〜３６を表し、
ｙは、ＧＬＰ−１アミノ酸配列のアミノ酸２〜３７を表し、
ｚは、エキセンディン−３またはエキセンディン−４アミノ酸配列のアミノ酸１〜３８を表し、
ｋは、エキセンディン−３またはエキセンディン−４アミノ酸配列のアミノ酸２〜３９を表す］
に由来する、請求項１５に記載の、ＧＬＰ−１およびエキセンディンのキメラペプチド。
【請求項１７】
ＧＬＰ−１（ｘ−ｙ）エキセンディン−３（ｚ−ｋ）Ａ１−７５、ＧＬＰ−１（ｘ−ｙ）エキセンディン−４（ｚ−ｋ）Ａ１−７５、エキセンディン−３（ｚ−ｋ）ＧＬＰ−１（ｘ−ｙ）Ａ１−７５またはエキセンディン−４（ｚ−ｋ）ＧＬＰ−１（ｘ−ｙ）Ａ１−７５
［式中、
ｘは、ＧＬＰ−１アミノ酸配列のアミノ酸１〜３６を表し、
ｙは、ＧＬＰ−１アミノ酸配列のアミノ酸２〜３７を表し、
ｚは、エキセンディン−３またはエキセンディン−４アミノ酸配列のアミノ酸１〜３８を表し、
ｋは、エキセンディン−３またはエキセンディン−４アミノ酸配列のアミノ酸２〜３９を表し、
そしてＡは、シグナル分子としての、またはシグナル分子を結合するための、またはそれらを安定化するための、一種以上のアミノ酸またはその誘導体からなる付加基であって、指数部は、その付加基を見いだすことができるアミノ酸配列内の位置を示す］
に由来する、請求項１５に記載の、ＧＬＰ−１およびエキセンディンのキメラペプチド。
【請求項１８】
付加基Ａが好ましくはＣ末端に位置して、アミンを表す、請求項１７に記載の、ＧＬＰ−１およびエキセンディンのキメラペプチド。
【請求項１９】
付加基Ａが好ましくはリジンである、請求項１７に記載の、ＧＬＰ−１およびエキセンディンのキメラペプチド。
【請求項２０】
付加基Ａが、好ましくは、遊離アミンを持つアミノ酸、例えばオルニチン、または遊離アミンを持つ有機基である、請求項１７に記載の、ＧＬＰ−１およびエキセンディンのキメラペプチド。
【請求項２１】
放射性核種もしくはＭＲＩ造影剤、蛍光色素または化学療法剤による標識化のために、キレーターが付加基Ａに結合される、請求項１７〜２０のいずれか１つに記載の、ＧＬＰ−１およびエキセンディンのキメラペプチド。
【請求項２２】
キレーターが、Ｎ，Ｎ−ビス（２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］−エチルグリシン）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）、ＨＹＮＩＣ（６−ヒドラジノピリジン−３−カルボン酸）、ＭＡＧ３（メルカプトアセチル−グリシルグリシルグリシン）、Ｎ４（１，４，８，１１−テトラアザウンデカン）、および全ての公知の誘導体、好ましくはＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）である、請求項１７〜２１のいずれか１つに記載の、ＧＬＰ−１およびエキセンディンのキメラペプチド。
【請求項２３】
標識化が放射性核種、ＭＲＩ造影剤、蛍光色素及び（又は）化学療法剤の結合である、請求項１７〜２２のいずれか１つに記載の、ＧＬＰ−１およびエキセンディンのキメラペプチド。
【請求項２４】
蛍光色素が、特に、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、ＢＯＤＩＰＹ、ピレン（カスケードブルー）、ルシファーイエロー、フィコビリタンパク質、シアニン、アレクサフルオロ、オレゴングリーン、テキサスレッド、クマリンおよびそれらの誘導体より成る群から選ばれる、請求項１７〜２３のいずれか１つに記載の、ＧＬＰ−１およびエキセンディンのキメラペプチド。
【請求項２５】
放射性核種が、特に、Ｆ−１８、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｙ−８６、Ｙ−９０、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２４、Ｉ−１３１、Ｌｕ−１７７、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｐｔ−１９３ｍ、Ｐｔ−１９５ｍ、Ａｃ−２２５、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１３、Ｓｍ−１５３またはＥｒ−１６９より成る群から選ばれる、請求項１７〜２４のいずれか１つに記載の、ＧＬＰ−１およびエキセンディンのキメラペプチド。
【請求項２６】
ＭＲＩ造影剤が、ガドリニウム、マンガン、鉄、ユーロピウム、銅、ニッケル、クロム、プラセオジム、ジスプロシウムもしくはホルミウム、またはそれらの化合物であるか、あるいはペルフルオロカーボン、またはＦ−１９、Ｈ−１、Ｐ−３１、Ｎａ−１９である、請求項１７〜２５のいずれか１つに記載の、ＧＬＰ−１およびエキセンディンのキメラペプチド。
【請求項２７】
化学療法剤が、特に、アルキルスルホネート、エチルイミン、ニトロソ尿素類、ナイトロジェンマスタード誘導体、葉酸類似体、プリン類似体、ピリミジン類似体、ポドフィリン誘導体、タキサン、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、他の細胞増殖抑制性抗生物質、白金化合物、カンプトテシン誘導体、ホルモン、成長因子、インターフェロンもしくはインターロイキン、または細胞増殖抑制性物質もしくは細胞毒性物質より成る群から選ばれる、請求項１７〜２６のいずれか１つに記載の、ＧＬＰ−１およびエキセンディンのキメラペプチド。
【請求項２８】
インビトロ用途のための放射性核種の結合による標識化が、ｎａｔＩｎＣＬ３による結合部位の飽和によって行なわれる、請求項１７〜２７のいずれか１つに記載の、ＧＬＰ−１およびエキセンディンのキメラペプチド。
【請求項２９】
ＧＬＰ−１受容体発現が関与する良性疾患および悪性疾患の診断剤および治療剤を製造するための、請求項１７〜２８のいずれか１つに記載の、ＧＬＰ−１、エキセンディン−３およびエキセンディン−４のペプチド誘導体、ならびにＧＬＰ−１、エキセンディン−３またはエキセンディン−４のキメラペプチドの使用。
【請求項３０】
組織中のインスリン産生細胞の密度を決定するための、請求項１〜２８のいずれか１つに記載の、ＧＬＰ−１、エキセンディン−３およびエキセンディン−４のペプチド誘導体、ならびにＧＬＰ−１、エキセンディン−３またはエキセンディン−４のキメラペプチドの使用。
【請求項３１】
ＧＬＰ−１受容体の発現またはそれらの密度を決定するための、請求項１〜２８のいずれか１つに記載の、ＧＬＰ−１、エキセンディン−３およびエキセンディン−４のペプチド誘導体、ならびにＧＬＰ−１、エキセンディン−３またはエキセンディン−４のキメラペプチドの使用。
【請求項３２】
請求項１および１７のいずれか１つに記載の、ＧＬＰ−１、エキセンディン−３およびエキセンディン−４の標識ペプチド誘導体、またはＧＬＰ−１、エキセンディン−３もしくはエキセンディン−４の標識キメラペプチドを有する、ＧＬＰ−１受容体発現が関与する良性疾患および悪性疾患を診断および治療するための薬剤。
【請求項３３】
請求項１および１６に記載の、ＧＬＰ−１、エキセンディン−３およびエキセンディン−４の非標識ペプチド誘導体、またはＧＬＰ−１、エキセンディン−３もしくはエキセンディン−４の非標識キメラペプチドを有する、ＧＬＰ−１受容体発現が関与する良性疾患および悪性疾患を診断および治療するための薬剤。
【請求項３４】
標識化が放射性核種、ＭＲＩ造影剤、蛍光色素及び（又は）化学療法剤の結合を有する、請求項３２に記載の薬剤。
【請求項３５】
ＧＬＰ−１受容体発現が関与する良性疾患および悪性疾患を診断および治療するための、請求項３２又は３３に記載の薬剤の使用。
【請求項３６】
神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）、特にインスリノーマおよび小細胞気管支癌を診断および治療するための、請求項３２又は３３に記載の薬剤の使用。
【請求項３７】
シンチグラフィ、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、ＭＲＩ、光診断、受容体媒介型の化学療法、受容体媒介型の細胞増殖抑制療法または細胞毒療法、および放射性ペプチド療法における、請求項３２に記載の薬剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
胃腸膵神経内分泌腫瘍の局在診断において、ソマトスタチン受容体シンチグラフィ（ＳＲＳ）は、超音波に次いで、最も重要な診断方法である。その原理は、腫瘍細胞によって吸収される放射性標識ペプチドの助けを借りた、腫瘍の特異的描写である。次に、ガンマカメラの助けを借りて、腫瘍組織における放射能の蓄積を視覚的に検証することができる。ある腫瘍タイプがＳＲＳに必要な受容体の一つ（例えばソマトスタチン類似体オクトレオチド（登録商標）の受容体）を持っている場合、それらの腫瘍の検証は問題なく行なうことができる。しかし、対応する受容体が発現されない場合、それらはシンチグラフィによる検証をすり抜けてしまう。放射性標識ペプチドは、局在診断だけでなく、腫瘍を処置する方法にも対応する。この方法では、オクトレオチド（登録商標）などのソマトスタチン類似体を適当な放射性核種（α放射体またはβ放射体）で標識することにより、特異的受容体を指向する放射性ペプチド治療を実施することができる。対応する放射性核種が、ペプチドにより（例えばそのペプチドに予め結合しておいた金属キレーターとの錯化を介して）、それらが確かに腫瘍細胞に吸収されはするが、もはや排泄されることはできないような形で、化学的に結合されるという事実は、結果として、腫瘍組織における高度な特異的蓄積をもたらす。
【０００２】
しかし、インスリノーマおよび小細胞気管支癌などの神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）はいずれも、ソマトスタチン類似体オクトレオチド（登録商標）を使ったＳＲＳまたは放射性ペプチド療法にとって欠かすことのできない必要なサブタイプのソマトスタチン受容体を発現させない。特にインスリノーマは、かなりのパーセンテージが、シンチグラフィ診断では検出できない。小細胞気管支癌でもＳＲＳは適当な方法にはならない。なぜなら、原発腫瘍は見えることも多いが、転移では受容体発現が失われるため、転移を明らかにすることはできないからである。したがってこれらは、興味深い追加治療または代替治療法である放射性ペプチド療法には、利用し難い。それゆえに、上述の腫瘍によって吸収されるであろう適当なペプチドが、必要とされている。
【０００３】
インクレチンホルモンであるグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）ならびにその類似体エキセンディン−３およびエキセンディン−４（アメリカドクトカゲＨｅｌｏｄｅｒｍａ ｈｏｒｒｉｄｕｍおよびＨｅｌｏｄｅｒｍａ ｓｕｓｐｅｃｔｕｍの唾液に由来する）は、他の多くの種類の腫瘍と共に、インスリノーマおよび小細胞気管支癌でも、その受容体が発現されるペプチドである。インスリノーマは、ＧＬＰ−１ならびにエキセンディン−３およびエキセンディン−４が食後インスリン分泌を誘発している膵臓のランゲルハンス島内のインスリン産生β細胞に起源を持つ。
【背景技術】
【０００４】
グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）をシンチグラフィに利用するには、そのペプチドを標識する必要がある。その方法および放射性核種によるタンパク質の標識方法は当業者に知られており、数多くの特許出願（例えば独国特許第６９０  １８  ２２６  Ｔ２号）および科学刊行物に詳述されている。そこに記載されている、画像診断法に応用するためのペプチド、および病理組織における治療有効分子の交換のためのペプチドは、通常、ペプチド中のアミンを介して、Ｎ末端で挿入される。ペプチドは、それと同時に、安定化に関して、さらに修飾されなければならない。
【０００５】
例えば、米国特許第２００３／０２３２７６１  Ａ１号で使用されるＧＬＰ−１およびその誘導体ＧＬＰ−１（７−３７）は、一つのアミンにより、そのＮ末端で修飾される。したがってＧＬＰ−１のＮ末端は、もはやＧＬＰ−１受容体を結合するためには使用することができず、それゆえに、受容体結合も、内部移行も、これらのペプチドでは不十分になる。したがって後者は、インスリノーマおよび小細胞気管支癌の放射性ペプチド療法での利用には不適当である。経験が示すように、突然変異、例えばＧＬＰ−１およびエクセンディン３またはエクセンディン４のペプチド配列内でのアミノ酸の置換、および治療分子またはシグナル生成分子によるそれらの考えうる修飾は、ほとんどの場合、受容体へのさらなる結合を妨害するようなペプチド構造の損傷を引き起こす。
【０００６】
Ｎ末端に影響を及ぼさない、他のＧＬＰ−１修飾方法は、現在、知られていない。さらにまた、インスリノーマおよび小細胞気管支癌の放射線療法での使用に適した、標識または非標識ＧＬＰ−１誘導体も知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の課題は、現在の技術水準が持つ欠陥を取り除くこと、そして標識することができるペプチドであって、その標識化を行なってもなおＧＬＰ−１受容体を結合することができ、ＧＬＰ−１受容体の発現が関与する疾患を診断および治療するための薬剤の製造に利用することができるペプチドを、入手可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によれば、この課題は、本願請求項により、アミンによってＣ末端で修飾され、かつ、Ｎ末端を介してＧＬＰ−１受容体に結合する、ＧＬＰ−１、エキセンディン−３およびエキセンディン−４のペプチド誘導体、ならびにＧＬＰ−１とエキセンディン−３またはエキセンディン−４とのキメラペプチドによって解決される。これらのペプチド誘導体およびキメラペプチドは、ＧＬＰ−１受容体発現が関与する良性疾患もしくは悪性疾患の診断剤および治療剤の製造に利用するために、非標識であるか、または標識される。
【０００９】
ＧＬＰ−１、エキセンディン−３およびエキセンディン−４のこれらペプチド誘導体、ならびにＧＬＰ−１、エキセンディン−３またはエキセンディン−４のキメラペプチドにより、ＮＥＴ（特にインスリノーマによるもの）および小細胞気管支癌を含むＧＬＰ−１受容体発現腫瘍の診断および治療に利用されるシンチグラフィ用手段の製造が行なわれる。これが可能になったのは初めてのことである。なぜなら、本発明に基づくペプチド誘導体はアミンによってＣ末端で修飾され、そのおかげでＮ末端をＧＬＰ−１受容体への結合に利用することができるからである。
【００１０】
ＧＬＰ−１、エキセンディン−３およびエキセンディン−４の、本発明に基づく（例えば放射性標識）ペプチド誘導体、ならびにキメラペプチドが、ＧＬＰ−１受容体に結合することにより、ＧＬＰ−１受容体発現腫瘍の表示が可能になり、それによって、患者の医療をかなり改善することが可能になる。ＮＥＴは、とりわけ、現在のところ十分な感度を持つ非侵襲的方法を利用することができないインスリノーマなどの胃腸膵ＮＥＴ、または肺の領域に局在した小細胞気管支癌のもの（この場合は、炎症過程と腫瘍または転移との特異的弁別が、非侵襲的方法ではどちらも不可能である）である。
【００１１】
さらにまた、本発明によるペプチド誘導体およびキメラペプチドを使用することにより、膵臓におけるインスリン産生細胞の密度およびＧＬＰ−１受容体の発現が、インビボおよびインビトロで可視化される。これは、例えばＧＬＰ−１受容体発現細胞の表示（糖尿病の場合はインビボ表示）においてなされる。なぜなら、これらはインスリンも分泌する細胞だからである。膵臓におけるＧＬＰ−１受容体密度の表示は、医薬品による治療中および医薬品による治療後の糖尿病患者の場合は、特に重要である。また、悪性組織および良性組織におけるＧＬＰ−１受容体の分布も表示される。ここで関連づけられる疑問は、臨床的性質を持つと共に、科学的性質も持つ。なぜなら、ヒトにおけるＧＬＰ−１受容体の配置に関して利用できる包括的データは、まだ無いからである。
【００１２】
したがって本発明の利点は、ＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド−１）、エキセンディン−３およびエキセンディン−４のペプチド誘導体、ならびにＧＬＰ−１、エキセンディン−３またはエキセンディン−４のキメラペプチドが、薬剤の製造に、特に受容体指向の特異的表示および治療、特にＮＥＴの治療、この例では特にインスリノーマおよび小細胞気管支癌の治療のための薬剤の製造に、利用されることである。
【００１３】
ＧＬＰ−１受容体シンチグラフィは、小細胞気管支癌の診断には特に適当であり、リンパ節内の転移の特異的検出（炎症によって変化したリンパ節と転移によって攻撃されたリンパ節との対比）を初めて可能にする。本発明によるＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド−１）、エキセンディン−３およびエキセンディン−４のペプチド誘導体、ならびにＧＬＰ−１、エキセンディン−３またはエキセンディン−４のキメラペプチドは、ＧＬＰ−１受容体発現が関与する全ての悪性疾患および良性疾患の診断剤および治療剤として、特に以下に挙げる用途にも応用される：磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）における造影剤；シンチグラフィ（ＳＰＥＣＴ，単光子放射型コンピュータ断層撮影）および放射性ペプチド療法における放射性薬剤；ＰＥＴ（陽電子放射断層撮影）；受容体媒介型の化学療法；ならびに光診断。本明細書において光診断とは、特定波長による蛍光分子の刺激を意味し、これは続いて、異なる波長の光放射を誘発する。検出されるのはその放射波長である。当業者は、ＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド−１）、エキセンディン−３およびエキセンディン−４のペプチド誘導体、ならびにＧＬＰ−１、エキセンディン−３またはエキセンディン−４のキメラペプチドのＣ末端における標識の種類を、希望する用途に応じて、例えばシンチグラフィまたは放射線療法には放射性核種から、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）における造影剤にはガドリニウムから、そして内視鏡検査または科学的検査には蛍光色素から、容易に選択することができる。
【００１４】
本発明によれば、悪性疾患とは、患部組織が健常組織と比較したその分化レベルの変化、侵襲的成長、または血流もしくはリンパ系へのその組織の伝播を示す疾患である。全ての神経内分泌腫瘍、特に、胃腸路のもの、とりわけインスリノーマ、気管支癌、膵癌、およびＧＬＰ−１受容体の過剰発現に結び付けられる他の全ての悪性疾患は、このカテゴリーに属する。
【００１５】
本発明によれば、良性疾患とは、患部組織がその分化レベルを有意に失わず、侵襲的成長を示さず、血流またはリンパ系への組織転移を持たないことを特徴とする疾患である。これには例えば糖尿病が含まれるが、摂食障害または精神障害も含まれる。
ペプチド誘導体およびキメラペプチドの特徴づけ
驚いたことに、アミンを介してＣ末端で修飾されているＧＬＰ−１、エキセンディン−３およびエキセンディン−４のペプチド誘導体、ならびにＧＬＰ−１、エキセンディン−３またはエキセンディン−４のキメラペプチドは、そのＮ末端でＧＬＰ−１受容体に結合することがわかった。さらにこれらは、天然ペプチドと同じように、ＧＬＰ−１受容体に対して高い親和度を示す。腫瘍保有ヘアレスマウスを使って実験では、陽性腫瘍組織のＧＬＰ−１受容体における特異的取り込みが示される。
【００１６】
本発明のペプチド誘導体およびキメラペプチドは、ＧＬＰ−１受容体発現が関与する良性疾患および悪性疾患の診断および治療に応用するための薬剤として、標識されていないか、またはキレーターによりＣ末端アミンで標識される。この場合、標識のタイプは、主に放射性金属、ＭＲＩ造影剤、蛍光発色団または化学療法剤からなる。
【００１７】
標識の手順および方法は、当業者にはよく知られており（例：ＤＥ  ６９０  １８  ２２６  Ｔ２）、例えば放射性核種、非磁性金属および他のＭＲＩ造影剤または蛍光色素の結合などによって行なわれる。これは、本発明のペプチド誘導体およびキメラペプチドの受容体結合または内部移行が損なわれず、ＧＬＰ−１受容体結合性Ｎ末端は遊離（非連結）のままであることを意味する。
【００１８】
元のペプチドのアミノ酸配列：
GLP-1:
H-His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13  14  15  16  17  18
Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-OH
19  20  21  22  23  24  25  26  27  28  29  30  31  32  33  34  35  36  37
エキセンディン−３：
H-His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13  14  15  16  17  18
Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-
19  20  21  22  23  24  25  26  27  28  29  30  31  32  33  34  35  36  37
Pro-Ser-NH2
38  39 
エキセンディン−４：
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  11  12  13  14  15  16  17  18
Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-
19  20  21  22  23  24  25  26  27  28  29  30  31  32  33  34  35  36  37
Pro-Ser-NH2
38  39 
本発明によれば、ＧＬＰ−１（１−３７）、エキセンディン−３およびエキセンディン−４の以下のペプチド誘導体が製造される：
ＧＬＰ−１（ｘ−ｙ）Ａ１−３７
エキセンディン−３（ｚ−ｋ）Ａ１−４０
エキセンディン−４（ｚ−ｋ）Ａ１−４０。
式中、
ｘ＝ＧＬＰ−１アミノ酸配列のアミノ酸１〜３６
ｙ＝ＧＬＰ−１アミノ酸配列のアミノ酸２〜３７
ｚ＝エキセンディン−３またはエキセンディン−４アミノ酸配列のアミノ酸１〜３８
ｋ＝エキセンディン−３またはエキセンディン−４アミノ酸配列のアミノ酸２〜３９
Ａ＝シグナル分子としての、またはシグナル分子を結合するための、またはそれらを安定化するための、一種以上のアミノ酸またはその誘導体からなる付加基。Ａは、Ｃ末端に位置することが好ましく、そのアミンは、好ましくはリジンであるか、あるいは遊離アミンを持つ他のアミノ酸、例えばオルニチン、または遊離アミンを持つ有機基であって、そこに、放射性核種もしくはＭＲＩ造影剤、蛍光色素または化学療法剤による標識化のためにキレーターが結合される。
【００１９】
使用することができるキレーターには、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、あるいはＮ，Ｎ−ビス（２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］−エチルグリシン）、あるいはＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）、ＨＹＮＩＣ（６−ヒドラジノピリジン−３−カルボン酸）、ＭＡＧ３（メルカプトアセチル−グリシルグリシルグリシン）、Ｎ４（１，４，８，１１−テトラアザウンデカン）、および上記キレーターの全ての公知の誘導体が含まれる。指数部は、付加基を択一的に見いだすことができるアミノ酸配列内の位置を示す。
ＧＬＰ−１（ｘ−ｙ）Ａ１−３７
ここには、長さの異なるＧＬＰ−１誘導体が含まれ、ｘには、２〜３７の数字が割り当てられるｙよりも小さい１〜３６の数字を割り当てることができる。Ａは付加基であり、どの位置にあってもよいが、好ましくはＣ末端にあって、ｙよりも１大きい。付加基は、好ましくは、アミン・リジンである。
エキセンディン−３（ｚ−ｋ）Ａ１−４０
ここには、長さの異なるエキセンディン−３誘導体が含まれ、ｚには、２〜３９の数字が割り当てられるｋよりも小さい１〜３８の数字を割り当てることができる。Ａは付加基であり、どの位置にあってもよいが、好ましくはＣ末端にあって、ｙよりも１大きい。付加基は、好ましくは、アミン・リジンである。
エキセンディン−４（ｚ−ｋ）Ａ１−４０
ここには、長さの異なるエキセンディン−４誘導体が含まれ、ｚには、２〜３９の数字が割り当てられるｋよりも小さい１〜３８の数字を割り当てることができる。Ａは付加基であり、どの位置にあってもよいが、好ましくはＣ末端にあって、ｙよりも１大きい。付加基は、好ましくは、アミン・リジンである。
【００２０】
以下のペプチド誘導体は特に好ましい：
１．ＭＣ１０：（ＤＴＰＡ−Ｌｙｓ３７）ＧＬＰ１（７−３６）アミド
２．ＭＣ１３：（ＤＴＰＡ−Ｌｙｓ４０）エキセンディン−３アミド
３．ＭＣ１１：（ＤＴＰＡ−Ｌｙｓ４０）エキセンディン−４アミド。
【００２１】
合成は、例えばＰｅｐｔｉｄｅ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ社において、メリフィールド法に従って行なわれ、ＨＰＬＣで精製される。
【００２２】
ＭＣ１０  （ＤＴＰＡ−Ｌｙｓ３７）ＧＬＰ１（７−３６）アミドは、Ｃ末端に遊離アミンを持つアミノ酸として、好ましくは３７位のリジンと、キレーターＤＴＰＡとを保有する、ＧＬＰ−１のアミノ酸７〜３６からなる。
【００２３】
ＭＣ１３  （ＤＴＰＡ−Ｌｙｓ４０）エキセンディン−３アミドは、Ｃ末端に遊離アミンを持つアミノ酸として、好ましくは４０位のリジンと、キレーターＤＴＰＡとを保有する、エキセンディン−３の全アミノ酸配列からなる。
【００２４】
ＭＣ１１  （ＤＴＰＡ−Ｌｙｓ４０）エキセンディン−４アミドは、Ｃ末端に遊離アミンを持つアミノ酸として、好ましくは３９位のリジンと、キレーターＤＴＰＡとを保有する、エキセンディン−４の全アミノ酸配列からなる。
【００２５】
本発明によれば、ＧＬＰ−１（１−３７）およびエキセンディン−３またはエキセンディン−４から、以下のキメラペプチドが製造される：
ＧＬＰ−１（ｘ−ｙ）エキセンディン−３（ｚ−ｋ）Ａ１−７５
ＧＬＰ−１（ｘ−ｙ）エキセンディン−４（ｚ−ｋ）Ａ１−７５
エキセンディン−３（ｚ−ｋ）ＧＬＰ−１（ｘ−ｙ）Ａ１−７５
エキセンディン−４（ｚ−ｋ）ＧＬＰ−１（ｘ−ｙ）Ａ１−７５。
【００２６】
ここでは以下の定義が適用される。
ｘ＝ＧＬＰ−１アミノ酸配列のアミノ酸１〜３６
ｙ＝ＧＬＰ−１アミノ酸配列のアミノ酸２〜３７
ｚ＝エキセンディン−３またはエキセンディン−４アミノ酸配列のアミノ酸１〜３８
ｋ＝エキセンディン−３またはエキセンディン−４アミノ酸配列のアミノ酸２〜３９
Ａ＝シグナル分子としての、またはシグナル分子を結合するための、またはそれらを安定化するための、一種以上のアミノ酸またはその誘導体からなる付加基。ＡはＣ末端に位置することが好ましく、アミンは、好ましくはリジンであるか、あるいは遊離アミンを持つ他のアミノ酸、例えばオルニチン、または遊離アミンを持つ有機基であって、そこに、放射性核種もしくはＭＲＩ造影剤、蛍光色素または化学療法剤による標識化のためにキレーターが結合される。使用することができるキレーターには、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、あるいはＮ，Ｎ−ビス（２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］−エチルグリシン）、あるいはＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）、ＨＹＮＩＣ（６−ヒドラジノピリジン−３−カルボン酸）、ＭＡＧ３（メルカプトアセチル−グリシルグリシルグリシン）、Ｎ４（１，４，８，１１−テトラアザウンデカン）、および上記キレーターの全ての公知の誘導体が含まれる。
【００２７】
指数部は、付加基を択一的に見いだすことができるアミノ酸配列内の位置を示す。
ＧＬＰ−１（ｘ−ｙ）エキセンディン−３（ｚ−ｋ）Ａ１−７５
ここには、ＧＬＰ−１およびエキセンディン−３のキメラペプチドが含まれ、このキメラペプチドでは、ＧＬＰ−１のアミノ酸１〜３６の後に、エキセンディン−３のアミノ酸１〜３９が続く。Ａは、付加基であり、どの位置にあってもよいが、好ましくはＣ末端にあって、ＧＬＰ−１およびエキセンディン−３のアミノ酸数よりも１大きく、好ましくはアミノ・リジンである。
ＧＬＰ−１（ｘ−ｙ）エキセンディン−４（ｚ−ｋ）Ａ１−７５
ここには、ＧＬＰ−１およびエキセンディン−４のキメラペプチドが含まれ、このキメラペプチドでは、ＧＬＰ−１のアミノ酸１〜３６の後に、エキセンディン−４のアミノ酸１〜３９が続く。Ａは付加基であり、どの位置にあってもよいが、好ましくはＣ末端にあって、ＧＬＰ−１およびエキセンディン−４のアミノ酸数よりも１大きく、好ましくはアミン・リジンである。
エキセンディン−３（ｚ−ｋ）ＧＬＰ−１（ｘ−ｙ）Ａ１−７５
ここには、エキセンディン−３およびＧＬＰ−１のキメラペプチドが含まれ、この場合、ｚには、１〜３８の数字を割り当てることができるが、ｚは、２〜３９の数字を割り当てることができるｋより小さい。Ａは付加基であり、どの位置にあってもよいが、好ましくはＣ末端にあって、ｙよりも１大きい。付加基は、好ましくは、アミン・リジンである。
エキセンディン−４（ｚ−ｋ）ＧＬＰ−１（ｘ−ｙ）Ａ１−７５
ここには、エキセンディン−４およびＧＬＰ−１のキメラペプチドが含まれ、この場合、ｚには、１〜３８の数字を割り当てることができるが、ｚは、２〜３９の数字を割り当てることができるｋより小さい。Ａは付加基であり、どの位置にあってもよいが、好ましくはＣ末端にあって、ｙよりも１大きい。付加基は、好ましくは、アミン・リジンである。
【００２８】
キメラＧＬＰ−１（ｘ−ｙ）エキセンディン−３（ｚ−ｋ）Ａ１−７５またはＧＬＰ−１（ｘ−ｙ）エキセンディン−４（ｚ−ｋ）Ａ１−７５ペプチドの典型例は、ＧＬＰ−１（７−３６）エキセンディン（３３−３９）ＬｙｓアミドからなるＭＣ１２である（合成は、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ社において、メリフィールド法に従って行なわれ、ＨＰＬＣで精製される）。
ＭＣ１２：（Ｓｅｒ３７，  Ｇｌｙ３８，  Ａｌａ３９，  Ｐｒｏ４０，  Ｐｒｏ４１，  Ｐｒｏ４２，  Ｓｅｒ４３，  ＤＴＰＡ−Ｌｙｓ４４アミド）  ＧＬＰ１（７−３６）
ＭＣ１２は、Ｃ末端にアミン、好ましくは４４位のリジンと、キレーターＤＴＰＡ、ならびにエキセンディン（３３−３９）Ｌｙｓアミドの７アミノ酸の鎖を保有する、ＧＬＰ−１（７−３６）の全アミノ酸配列からなる。したがってキメラペプチドＧＬＰ−１（７−３６）エキセンディン（３３−３９）Ｌｙｓアミドになる。
【００２９】
ここで、ＧＬＰ−１、エキセンディン−３およびエキセンディン−４の、長さの異なるペプチド誘導体、ならびにＧＬＰ−１、エキセンディン−３またはエキセンディン−４の、長さの異なるキメラペプチドであって、それらの基礎となるＧＬＰ−１、エキセンディン−３およびエキセンディン−４のアミノ酸配列のさまざまな組み合わせを含有するものが存在することは、当業者には明らかである。
【００３０】
本発明に基づく、ＧＬＰ−１、エキセンディン−３およびエキセンディン−４のペプチド誘導体、ならびにＧＬＰ−１、エキセンディン−３またはエキセンディン−４のキメラペプチドであって、アミンによりＣ末端で修飾され、ＧＬＰ−１受容体ではそのＮ末端を介して結合するものには、上述したペプチドＧＬＰ−１、エキセンディン−３およびエキセンディン−４とは一箇所以上の位置で識別することができ、かつそれらの配列に対して高い相同性を持つ分子も、含まれる。この場合、相同性とは、少なくとも４０％の配列一致度、特に６０％の一致度、好ましくは８０％を超える一致度、とりわけ好ましくは９０％を超える一致度を意味する。上述したアミノ酸配列からの逸脱は、欠失、置換及び（又は）挿入によって生じうる。
【００３１】
さらにまた、本発明によるＧＬＰ−１、エキセンディン−３またはエキセンディン−４のキメラペプチドであって、Ｃ末端が修飾されていないものも、製造される。それらは特に糖尿病治療剤の製造に使用される。
ＧＬＰ−１（ｘ−ｙ）エキセンディン−３（ｚ−ｋ）
ＧＬＰ−１（ｘ−ｙ）エキセンディン−４（ｚ−ｋ）
エキセンディン−３（ｚ−ｋ）ＧＬＰ−１（ｘ−ｙ）
エキセンディン−４（ｚ−ｋ）ＧＬＰ−１（ｘ−ｙ）
ＭＣ２０：（Ｓｅｒ３３，  Ｇｌｙ３４，  Ａｌａ３５，  Ｐｒｏ３６，  Ｐｒｏ３７，  Ｐｒｏ３８，  Ｓｅｒ３９）エキセンディンＧＬＰ１（７−３６）
ＭＣ２０は、Ｃ末端にエキセンディン（３３−３９）の７アミノ酸の鎖を保有する、ＧＬＰ−１（７−３６）の全アミノ酸配列からなる。したがって無修飾キメラペプチドＧＬＰ−１（７−３６）エキセンディン（３３−３９）になる。
ペプチド誘導体およびキメラペプチドの標識化  
本発明のペプチド誘導体およびキメラペプチドを、適切な安定化緩衝液に、例えば金属を安定化する目的で、好ましくは０．５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．４）に、約１０−３Ｍの濃度で溶解する。あるいは、蛍光色素の安定化には酢酸アンモニウムの緩衝液が好ましく、化学療法剤および造影剤の安定化には生理緩衝液が好ましい。標識化は、付加基Ａにおいて、放射性核種、ＭＲＩ造影剤、蛍光色素または化学療法剤の結合によって行なわれる。用途がインビトロであるかインビボであるかに応じて、異なる方法が適用される。
【００３２】
以下の元素が、放射性核種として、共有結合または錯体結合に使用される。
【００３３】
【表１】
2008511557.tif 000002
例えば以下に挙げる蛍光色素／発色団を使用した：フルオレセイン、ローダミン、クマリン、ＢＯＤＩＰＹ、ピレン（カスケードブルー）、ルシファーイエロー、フィコビリタンパク質、シアニン、アレクサフルオロ（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒｏ）、オレゴングリーン、テキサスレッド、クマリンおよびそれらの誘導体。
【００３４】
使用することができるキレーターには、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、あるいはＮ，Ｎ−ビス（２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］−エチルグリシン）、あるいはＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）、ＨＹＮＩＣ（６−ヒドラジノピリジン−３−カルボン酸）、ＭＡＧ３（メルカプトアセチル−グリシルグリシルグリシン）、Ｎ４（１，４，８，１１−テトラアザウンデカン）、および上記キレーターの全ての公知の誘導体が含まれる。
【００３５】
使用することができるＭＲＩ造影剤には、ガドリニウム、マンガン、鉄、ユーロピウム、銅、ニッケル、クロム、プラセオジム、ジスプロシウムもしくはホルミウムまたはそれらの化合物が含まれ、さらに、ペルフルオロカーボンなどの陰性ＭＲＩ造影剤、ならびにＦ−１９、Ｈ−１、Ｐ−３１、Ｎａ−１９などのＭＲＩ分光法用同位体も含まれる。本発明にいう陰性ＭＲＩ造影剤とは、ＭＲＩシグナルを消失させるか、著しく減弱する（すなわち増幅しない）ものである。
【００３６】
使用することができる化学療法剤には、アルキル化剤、インターカレーター、代謝拮抗物質、酵素阻害剤および酵素遮断剤、ならびに紡錘体毒（例えばアルキルスルホネート、エチルイミン、ニトロソ尿素類、ナイトロジェンマスタード誘導体、葉酸類似体、プリン類似体、ピリミジン類似体、ポドフィリン誘導体、タキサン、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、他の細胞増殖抑制性抗生物質、白金化合物、カンプトテシン誘導体、種々のホルモン、成長因子、インターフェロンまたはインターロイキン）、その他、Ｐｒｅｉｓｓ，Ｄｏｒｎｈｏｆｆ，Ｈａｇｍａｎｎ，Ｓｃｈｍｉｅｄｅｒ著「Ｏｎｋｏｌｏｇｉｅ  ２００４／０５」（Ｚｕｃｋｓｃｈｗｅｒｄｔｖｅｒｌａｇ発行）の２３０〜２８７頁に記載されている化学療法剤、ならびに他の全ての細胞増殖抑制物質または細胞毒性物質が含まれる。
【００３７】
本発明のタンパク質誘導体およびキメラタンパク質を使用する用途のタイプに応じて、そしてまた、上述のタンパク質を使って製造される、ＧＬＰ−１受容体発現が関与する良性疾患および悪性疾患を診断および治療するための薬剤のタイプに応じて、標識化反応は、２種類の方法で行なわれることになる。
【００３８】
放射線療法におけるインビトロ用途のための標識化
適切な安定化緩衝液、好ましくは０．５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．４）に、約１０−３Ｍの濃度で溶解しておいた本発明のペプチド誘導体またはキメラペプチド３μＬを、標識化のために、０．５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．４）５００μＬに加える。ｐＨ値は３〜６である。次に、０．１Ｍ  ＨＣｌ  ５００μＬ中の１１１ＩｎＣｌ３（Ｔｙｃｏ，オランダ・ペッテン）１８５ＭＢｑを加え、３７℃で３０分間インキュベートする。最後に、全ての結合部位を飽和させるために、ｎａｔＩｎＣｌ３の１０−３Ｍ溶液３μＬを加えた後、さらに３０分間インキュベートする。品質管理はＨＰＬＣカラムで行なう。
カラム：ＣＣ  ２５０／４．６  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  １２０−５  Ｃ１８（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ，スイス・エンジンゲン）
勾配：０→５分  １００％  ０．０５Ｍ  ＮＨ４ＯＯＣＣＨ３，ｐＨ５．４（緩衝液Ａ）；５→２５分  １００％緩衝液Ａ→５０％緩衝液Ａ／５０％アセトニトリル）。
インビトロ用途のための品質管理は、９８％を超える標識化収率で満たされる。このようにして、ＧＬＰ−１受容体発現が関与する良性疾患および悪性疾患を診断および治療するために、例えば膵臓細胞の細胞培養物および組織培養物中で使用することができる、放射性標識薬剤を入手することができる。
【００３９】
放射線療法におけるインビボ用途のための標識化
適切な安定化緩衝液、好ましくは０．５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．４）に、約１０−３Ｍの濃度で溶解しておいた本発明のペプチド誘導体またはキメラペプチド３μＬを、標識化のために、０．５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．４）５００μＬに加える。最後に、０．１Ｍ  ＨＣｌ  ５００μＬ中の１１１ＩｎＣｌ３（Ｔｙｃｏ，オランダ・ペッテン）１８５ＭＢｑを加え、３７℃で３０分間インキュベートする。品質管理はＨＰＬＣカラムで行なう。
カラム：ＣＣ  ２５０／４．６  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  １２０−５  Ｃ１８（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ，スイス・エンジンゲン）
勾配：０→５分  １００％  ０．０５Ｍ  ＮＨ４ＯＯＣＣＨ３，ｐＨ５．４（緩衝液Ａ）；５→２５分  １００％緩衝液Ａ→５０％緩衝液Ａ／５０％アセトニトリル）。
インビボ用途のための品質管理は、９８％を超える標識化収率で満たされる。
【００４０】
このようにして、ＧＬＰ−１受容体発現が関与する良性疾患および悪性疾患を診断および治療するために、例えば患者内の腫瘍を検出するために使用することができる、放射性標識薬剤を入手することができる。
【００４１】
「患者」という用語はヒトおよび脊椎動物を等しく意味する。したがって本薬剤はヒト医学にも獣医学にも応用することができる。本発明に基づく治療的および診断的に有効な薬剤は、許容できる薬学的組成物の一部として、以下のいずれかの形態で患者に与えられる：経口、直腸、非経口、静脈内／動脈内、筋肉内、皮下、髄腔内、槽内、頭蓋内、腟内，
腹腔内、脈管内、局所（散剤、軟膏または点滴剤）または噴霧（エアロゾル）。必要な用量は、ＧＬＰ−１受容体発現が関与する良性疾患および悪性疾患の個々の診断例および治療例ごとに、医師によって決定されることになる。
【００４２】
内部移行研究
内部移行研究により、本発明のペプチド誘導体およびキメラタンパク質（どちらもインビトロ放射性標識されたもの）の細胞内への輸送を、典型的に示す。
【００４３】
６穴プレートに１００，０００個のＧＬＰ−１受容体トランスフェクトＣＨＯ細胞を播種する。細胞を、それらがコンフルエントになるまで成長させる。次に四つの群を形成させる。
【００４４】
第１群：全結合、ＰＢＳで洗浄
１００，０００ｃｐｍの１１１Ｉｎ（１０−１５Ｍｏｌ）標識ペプチドを培地２ｍＬに加え、３７℃で１時間インキュベートする。次に、それをＰＢＳで３回洗浄し、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（３−モルホリノプロパンスルホン酸）＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（ｐＨ７．４）で、細胞を分離する。細胞内への取り込みをγ線計数器で測定する。ブラッドフォード法に基づくＢｉｏ−Ｒａｄ（ドイツ・ミュンヘン）製のタンパク質アッセイキットを使って、タンパク質含量により、細胞数を測定する。結果をｃｐｍ／μｇ−タンパク質の形で表す。
【００４５】
第２群：非特異的結合、ＰＢＳで洗浄
２０μＬの１０−３Ｍ  ＧＬＰ−１溶液および１００，０００ｃｐｍの１１１Ｉｎ標識ペプチドを培地２ｍＬに加え、３７℃で１時間インキュベートする。次に、それをＰＢＳで３回洗浄し、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（３−モルホリノプロパンスルホン酸）＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（ｐＨ７．４）で、細胞を分離する。細胞内への取り込みをγ線計数器で測定する。ブラッドフォード法に基づくＢｉｏ−Ｒａｄ（ドイツ・ミュンヘン）製のタンパク質アッセイキットを使って、タンパク質含量により、細胞数を測定する。結果をｃｐｍ／μｇ−タンパク質の形で表す。
【００４６】
第３群：全結合、酸で洗浄
２０μＬの１０−３Ｍ  ＧＬＰ−１溶液および１００，０００ｃｐｍの１１１Ｉｎ標識ペプチドを培地２ｍＬに加え、３７℃で１時間インキュベートする。次に、それを０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４）で１回、ＰＢＳで２回洗浄し、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（３−モルホリノプロパンスルホン酸）＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（ｐＨ７．４）で、細胞を分離する。細胞内への取り込みをγ線計数器で測定する。ブラッドフォード法に基づくＢｉｏ−Ｒａｄ（ドイツ・ミュンヘン）製のタンパク質アッセイキットを使って、タンパク質含量により、細胞数を測定する。結果をｃｐｍ／μｇ−タンパク質の形で表す。
【００４７】
第４群：非特異的結合、酸で洗浄
２０μＬの１０−4Ｍ  ＧＬＰ−１溶液および１００，０００ｃｐｍの１１１Ｉｎ標識ペプチドを培地２ｍＬに加え、３７℃で１時間インキュベートする。次に、それを０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４）で１回、ＰＢＳで２回洗浄し、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（３−モルホリノプロパンスルホン酸）＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（ｐＨ７．４）で、細胞を分離する。細胞内への取り込みをγ線計数器で測定する。ブラッドフォード法に基づくＢｉｏ−Ｒａｄ（ドイツ・ミュンヘン）製のタンパク質アッセイキットを使って、タンパク質含量により、細胞数を測定する。結果をｃｐｍ／μｇ−タンパク質の形で表す。
評価：
【００４８】
【数１】
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【００４９】
【表２】
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これらの結果は細胞内への良好な輸送が起こっていることを示す。
結合研究
結合研究により、本発明のインビボ標識性放射性標識ペプチド誘導体およびキメラタンパク質によって起こるＧＬＰ−１受容体への特異的結合を示す。６穴プレートに１００，０００個のＧＬＰ−１受容体トランスフェクトＣＨＯ細胞を播種する。細胞を、それらがコンフルエントになるまで成長させる。次に１００，０００ｃｐｍの１１１Ｉｎ標識ペプチド２ｍＬを加える。結合を調べるために、次にそれを１０−３Ｍ ＧＬＰ−１溶液２０μＬで遮断する。
【００５０】
【表３】
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例えばヘアレスマウスなどの齧歯類でインビボ生体内分布を示すことができる。そのために、ＧＬＰ−１トランスフェクトＣＨＯ細胞をヘアレスマウスに注射する。約３〜５週間後に、腫瘍は約３００ｍｇの大きさに成長していた。次に、本発明の１１１Ｉｎ標識ペプチド３７ＭＢｑをマウスに注射し、４時間後にγカメラで測定する。この手法の過程で、腎臓による迅速なクリアランスおよび腎臓における取り込みがあった。ＧＬＰ−１受容体陽性腫瘍における高度な取り込みもあったが、ＧＬＰ−１受容体陰性腫瘍は取り込みをほとんど示さなかった。膵臓でもわずかな取り込みがあったが、他の臓器は目に見える取り込みを示さなかった。
【００５１】
エクスビボ生体内分布研究を、各群４匹のマウスからなる群で行なう。ここでは５５５ｋＢｑのＩｎ−１１１標識ＭＣ１０を尾静脈に注射する。注射の１、４および２４時間後に、全てのマウスを屠殺し、その臓器を摘出する。
【００５２】
放射能の取り込みを測定し、臓器を重さを測定する。臓器重量１ｇあたりの注射した用量の％を計算する。結果は以下のとおりである。
【００５３】
【表４】
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【国際調査報告】
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