(57)【要約】  本発明は、低分子量ヘパリンおよび超低分子量ヘパリンを構成するオリゴ糖を血漿から分析するための方法に関連する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の２つの段階：
ａ．サンプルを処理すること、次いで
ｂ．高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってアッセイすること
を行うことを特徴とする、オリゴ糖を血漿から分析するための方法。
【請求項２】
血漿サンプルがろ過によって処理されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
３０ｋＤａよりも大きい分子量を有する分子が濃縮物に保持されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
コントロールのオリゴ糖がろ過前に血漿に加えられることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
濃縮物が塩溶液で少なくとも１回洗浄されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
塩溶液が塩化カリウム溶液であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
濃縮物の添加の後での塩溶液の濃度が１Ｍ以上であることを特徴とする、請求項５または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
濃縮物の添加の後での塩溶液の濃度が２Ｍ以上であることを特徴とする、請求項５または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
濃縮物が塩溶液で少なくとも１回洗浄され、次いで、水により洗浄されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
ろ液および適する場合には洗浄液の全体が注入され、ＨＰＬＣによって分析されることを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
クロマトグラフィーがアニオン交換クロマトグラフィーであることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
クロマトグラフィーが、第四級アンモニウムが共有結合による結合によってグラフト化されているアニオン交換カラムでのアニオン交換クロマトグラフィーであることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
２００ｎｍまで透明である移動相が使用されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
移動相が、過塩素酸ナトリウムの、メタンスルホン酸塩のまたはリン酸塩の溶液であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
移動相が過塩素酸ナトリウムの溶液であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
アセチル化糖を選択的に検出することを可能にする検出方法を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
アセチル化糖を選択的に検出するための方法が、非アセチル化糖類の吸収性が相殺されるような方式で選ばれた２つの波長における吸収の違いをシグナルとして処理することによって行われることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アセチル化糖を選択的に検出するための方法が、２０２ｎｍから２３０ｎｍおよび２３４ｎｍにおける吸収を測定することによって行われることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
アセチル化糖を選択的に検出するための方法が、２０２ｎｍから２３０ｎｍ、２３４ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸収を測定することによって行われることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
β−不飽和オリゴ糖をアッセイすることにおける請求項１に記載の方法の使用。
【請求項２１】
エノキサパリン、オクタパリン（ｏｃｔａｐａｒｉｎ）、ベミパリン（ｂｅｍｉｐａｒｉｎ）またはチンザパリン（ｔｉｎｚａｐａｒｉｎ）をアッセイすることにおける請求項１に記載の方法の使用。
【請求項２２】
下記の八糖：
【化１】
2008527390.tif 000009
の１つ以上をアッセイすることにおける請求項１に記載の方法の使用。
【請求項２３】
下記のオリゴ糖：
【化２】
2008527390.tif 000010
の１つ以上をアッセイすることにおける請求項１に記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、低分子量ヘパリンおよび超低分子量ヘパリンを構成するオリゴ糖を血漿から分析するための方法である。
【背景技術】
【０００２】
ヘパリンは、特に有用な抗凝固特性を有するグリコサミノグリカンファミリーの生物学的に活性な因子である。低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）および超低分子量ヘパリン（ＶＬＭＷＨ）が、ヘパリンの長い多糖鎖を切断して、低分子量のより短い鎖を与えることによって調製される。
【０００３】
ＬＭＷＨおよびＶＬＭＷＨを構成するオリゴ糖は通常、巨視的パラメーター（例えば、これらの平均分子量など）または生物学的活性（例えば、ａＸａ活性（ＩＵ／ｍｇ）など）によって特徴づけられる。後者は、アンチトロンビンＩＩＩとの相互作用を測定するものであり、最も一般に使用されている。
【０００４】
しかしながら、これらの巨視的パラメーターの測定、または、これらの生物学的活性の測定では、いくつかの非常に重要な問題に答えることができない。具体的には、ＬＭＷＨおよびＶＬＭＷＨを構成する様々なオリゴ糖の薬物動態学的プロフィルの分析をこれらの基準に基づいて行うことが不可能である。例えば、ａＸａ活性では、ＡＴ  ＩＩＩに対する親和性を有する実体のみ（すなわち、混合物の約２０％のみ）が考慮に入れられるだけであり、その結果、オリゴ糖の８０％の挙動を測定することができない。さらに、このような親和性混合物を構成する各実体の寄与を明らかにすることができない。
【０００５】
従って、各オリゴ糖の血漿中濃度、および、より大きな理由によるが、このａＸａ活性を単に測定することによるこの薬物動態学的プロフィルを正確に明らかにすることが不可能である。実際、これらのプロフィルにより、ＬＭＷＨおよびＶＬＭＷＨに基づく医薬品の投薬量を改善するための非常に有益な情報が提供される。
【０００６】
血漿中のＬＭＷＨまたはＶＬＭＷＨを構成する様々なオリゴ糖の挙動を分析することが可能であるためには、これらのオリゴ糖を血漿のその他の構成成分（特に、タンパク質）から完全および再現性良く分離できることが必要である。先行技術において記載される方法では、強力なプロテアーゼ処理（Ｖｏｌｐｉら、、１９９５、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１２４３（１）、４９−５８）が伴う。
【０００７】
クロマトグラフィーまたは電気泳動による方法はＬＭＷＨの様々な構成成分の分析を可能にしている。例えば、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）がヘパリンオリゴ糖の分離のために使用される（Ｇｕｅｒｒｉｎｉら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００２、１２、７１３−７１９；Ｌｉｎｈａｒｄｔら、ＢｉｏＭｅｔｈｏｄｓ、１９９７、９、１８３−１９７）。しかしながら、ＣＥの選択性は、液体クロマトグラフィーと比較してかなり低い。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法をヘパリンオリゴ糖の分析のために使用することもまた一部の場合には可能であり、しかし、この方法は、この大きなコストは言うまでもないことではあるが、複雑な混合物には適用することができない。
【０００８】
このような理由から、硫酸化オリゴ糖（例えば、ＬＭＷＨおよびＶＬＭＷＨを構成する硫酸化オリゴ糖など）の分析が特に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって行われる。酵素的解重合、これに続く還元（適する場合）からなり、および、ＨＰＬＣアッセイすることによるＬＭＷＨの分析方法が最近では記載されている（ＷＯ２００４／０２７０８７）。最近の欧州特許出願（ＥＰ０４２９０７８９．９）には、ＬＭＷＨおよびＶＬＭＷＨを構成するオリゴ糖をＣＴＡ−ＳＡＸアニオン交換クロマトグラフィーによってアッセイするための方法が開示される。この方法では、逆相シリカカラムに動的に吸収され、および、２から１２のｐＨ範囲で明瞭および一定の正電荷を維持する第四級アンモニウム塩（具体的には、セチルメチルアンモニウム）に対して行われるアニオン交換クロマトグラフィーが伴う。この方法では、予備的な処理、すなわち、解重合、または、排除クロマトグラフィーによる分離が、ＣＴＡ−ＳＡＸカラムでのＨＰＬＣによるＬＭＷＨおよびＶＬＭＷＨの分析の前に伴うことがある。
【発明の開示】
【０００９】
本発明の主題は、下記の２つの段階：
ａ．血漿のサンプルを処理すること、
ｂ．ＨＰＬＣによってアッセイすること
を行うことを特徴とする、血漿からのオリゴ糖の分析方法である。
【００１０】
この方法では、血漿のサンプルに存在するオリゴ糖の酵素的解重合または排除クロマトグラフィーによる分画化のいずれもが、ＨＰＬＣによるアッセイを行う前に伴わない。他方で、この方法によれば、血漿のサンプルが、ろ液において再び一緒にされるオリゴ糖を、濃縮物に留まる血漿混入物（具体的には、タンパク質）から分離するようにろ過によって処理される。
【００１１】
従って、本発明の主題は、より具体的には、血漿のサンプルがろ過によって処理される上記で定義されるような方法である。本発明の非常に具体的な主題は、３０ｋＤａを超える分子量を有する分子が濃縮物に保持されることを特徴とする上記で定義されるような方法である。
【００１２】
血漿のサンプルの処理方法の定量化を可能にするために、また、サンプル毎のこの処理の再現性を確認するために、内部標準物質が、適する場合にはサンプルに加えられる。この標準物質は、可能であるならば、アッセイ生成物に構造的に近いオリゴ糖でなければならず、これはろ過直前に血漿と混合される。
【００１３】
従って、本発明の別の主題は、コントロールのオリゴ糖がろ過直前に血漿サンプルに加えられることを特徴とする上記で定義されるような方法である。
【００１４】
オリゴ糖の大部分がろ過によってタンパク質から分離されるが、一部が濃縮物との静電的相互作用によって捕捉されたままである可能性がある。この場合、塩溶液での濃縮物に対する１回以上の洗浄操作を行うことが必要である。
【００１５】
従って、本発明の別の主題は、濃縮物が塩溶液で少なくとも１回洗浄されることを特徴とする上記で定義されるような方法である。
【００１６】
本発明によれば、塩溶液は、好ましくは、塩化カリウム溶液である。
【００１７】
本発明の主題は、より具体的には、濃縮物への添加の後での塩溶液の濃度が１Ｍ以上であることを特徴とする上記で定義されるような方法であり、非常に具体的には、塩濃度が２Ｍ以上であるこのような方法である。
【００１８】
塩溶液による１回以上の洗浄操作の後、濃縮物は、適するならば、水により洗浄される。従って、本発明の主題は、塩溶液での濃縮物に対する少なくとも１回の洗浄操作の後、水により洗浄する段階を含む上記で定義されるような方法である。
【００１９】
最初のろ液は、洗浄操作に由来するろ液と一緒にされ、一緒にされた生成物は水で５倍希釈される。この希釈により、過度に高い塩濃度によって引き起こされるピークの何らかの広幅化を防止しながら、オリゴ糖のすべてをクロマトグラフィーカラムへの注入の後で再濃縮することが可能になる。注入直前に、溶液のｐＨが１ＮのＨＣｌの添加によって３に調節される。
【００２０】
本発明による方法によれば、ろ液および適する場合には洗浄液の全体が直接に注入され、ＨＰＬＣによって分析される。
【００２１】
アニオン交換ＨＰＬＣが、このような複雑な混合物に最も良く適した分離方法である。具体的には、ＨＰＬＣのために、第四級アンモニウムが共有結合による結合によってグラフト化されているアニオン交換カラムが使用される。このタイプのカラムは、過塩素酸塩を移動相として使用することができるという利点を提供する。このことは、過塩素酸塩とＣＴＡとの間での強い複合体化のためにＣＴＡ−ＳＡＸカラムに関しては不可能である。
【００２２】
従って、本発明の別の主題は、オリゴ糖がアニオン交換ＨＰＬＣによってアッセイされる上記で定義されるような方法である。本発明のより具体的な主題は、オリゴ糖が、第四級アンモニウムが共有結合による結合によってグラフト化されているアニオン交換カラムでのＨＰＬＣによってアッセイされる上記で定義されるような方法である。
【００２３】
ＩｏｎＰＡｃ  ＡＳ１１タイプのカラム（Ｄｉｏｎｅｘ）（粒子サイズが９μｍから１３μｍであり、長さが２５ｃｍである）を使用することができる。１ｍｍから４．６ｍｍの間の従来型カラムの直径のすべてを使用することができ、しかし、直径が２ｍｍであるカラムが好ましくは使用される。より一般的には、より小さい直径（例えば、１ｍｍ）を有するカラムを使用することができ、このようなカラムでは、実際にはより少量の血漿が必要とされ、および、分析の感度における増大もまた可能になる。
【００２４】
使用される装置は、ＵＶ検出器を伴う、溶出グラジエントの形成を可能にするクロマトグラフ装置であり得る。好ましくは、構成成分のＵＶスペクトルをもたらすこと、および、２つの異なる波長における吸収の差から生じ、および、血漿起源の化合物の中のアセチル化されたオリゴ糖の検出を可能にする複雑なシグナルを記録することを可能にする、ダイオードアレイを備える検出器が使用される。２００ｎｍまで透明である移動相の使用により、構成成分の識別を容易にすることが可能になる。この場合に使用される移動相は、好ましくは、過塩素酸ナトリウムの溶液であり、しかし、メタンスルホン酸塩またはリン酸塩もまた使用することができる。
【００２５】
従って、本発明の主題は、２００ｎｍまで透明である移動相が使用されることを特徴とする上記で定義されるような方法である。具体的には、本発明の主題は、移動相が、過塩素酸ナトリウムの溶液、メタンスルホン酸塩の溶液またはリン酸塩の溶液であることを特徴とする上記で定義されるような方法である。本発明の非常に具体的な主題は、移動相が過塩素酸ナトリウムの溶液であることを特徴とする上記で定義されるような方法である。
【００２６】
分離のために推奨されるｐＨは２から６．５の間である。好ましくは、３の領域でのｐＨが使用される。このｐＨは、過塩素酸塩の緩衝化力よりも良好な緩衝化力をｐＨ＝３において有する塩（例えば、リン酸塩など）の添加によって得られる。
【００２７】
クロマトグラフィー分離のための標準的な条件が例として下記に示される。
・溶媒Ａ：ＮａＨ２ＰＯ４（２．５ｍＭ）、これはＨ３ＰＯ４の添加によってｐＨ２．９にされる
・溶媒Ｂ：ＮａＣｌＯ４（１Ｎ）、ＮａＨ２ＰＯ４（２．５ｍＭ）、これはＨ３ＰＯ４の添加によってｐＨ３．０にされる。
溶出グラジエントは下記の通りにすることができる。
Ｔ＝０分：％Ｂ＝３；Ｔ＝４０分：％Ｂ＝６０；Ｔ＝６０分：％Ｂ＝８０
直径が２ｍｍであるカラムについては、選ばれる流速は、例えば、０．２２ｍｌ／分であり、カラム温度が４０℃である。
【００２８】
ろ過された血漿サンプルに存在するオリゴ糖がＵＶによって検出される。アセチル化されていない多糖はすべてが、所与のｐＨにおいて、事実上同一のＵＶスペクトルを有するので、アセチル化糖を、非アセチル化糖類の吸収性（ａｂｓｏｒｐｔｉｖｉｔｙ）が相殺されるような方式で選ばれた２つの波長における吸収の差をシグナルとして利用することによって選択的に検出することが可能である。
【００２９】
下記の場合には、２０２ｎｍおよび２３０ｎｍが参照波長として選ばれ、２０２ｎｍから２３０ｎｍのシグナルが記録される。数ｎｍの調節が、前記条件の最適な状態であるために必要である可能性があるので、波長の選択は移動相のｐＨに依存することは当業者には明らかである。この技術のための最も好適な検出器は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得られるＤＡＤ検出器である。この場合、二重検出が、一方が２３４ｎｍにおいて、他方が２０２ｎｍから２３０ｎｍにおいて、それぞれのサンプルに対して行われる。三重検出もまた、シグナルがタンパク質残渣によって汚染されていないことを確認することを可能にする２８０ｎｍにおけるそれぞれのサンプルの吸収をさらに測定することによって行うことができる。
【００３０】
従って、本発明の主題は、検出方法が、アセチル化糖を選択的に検出することを可能にすることを特徴とする上記で定義されるような方法である。
【００３１】
本発明の別の主題は、アセチル化糖を選択的に検出するための方法が、非アセチル化糖類の吸収性が相殺されるような方式で選ばれた２つの波長における吸収の違いをシグナルとして処理することによって行われることを特徴とする上記で定義されるような方法である。
【００３２】
従って、本発明の主題は、非常に具体的には、アセチル化糖を選択的に検出するための方法が、２０２ｎｍから２３０ｎｍおよび２３４ｎｍにおける吸収を測定することによって行われることを特徴とする上記で定義されるような方法である。
【００３３】
従って、本発明の主題は、非常に具体的には、アセチル化糖を選択的に検出するための方法が、２０２ｎｍから２３０ｎｍ、２３４ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸収を測定することによって行われることを特徴とする上記で定義されるような方法である。
【００３４】
上記で定義された方法は、より具体的には、すべてのβ−不飽和オリゴ糖を分析することを可能にする。より具体的には、上記で定義された方法は、エノキサパリン、オクタパリン、ベミパリンおよびチンザパリンを構成するオリゴ糖に対して適用される。
【００３５】
実験例
手順
血漿の処理
体積が１００μｌから１０００μｌの間である血漿サンプルを採血し、適する場合には内部標準物質を後者に加える。
【００３６】
ホモジネーション後、得られた溶液を、１００００回転／分での５分間の遠心分離によって２５０μｌの水により事前に洗浄された３０ｋＤのＵｌｔｒａｆｒｅｅ  ０５限外ろ過カートリッジ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に導入する。
【００３７】
血漿を、一度に、または、ろ過すべき量が５００μｌを超えるならば２回に分けて、カートリッジの上部部分に導入する。
【００３８】
カートリッジを、１時間から２時間の間、１００００回転／分で遠心分離し、その後、ろ液を抜き取る。適する場合には、ろ過すべき血漿の第２の部分をカートリッジの上部部分に導入し、後者を再び遠心分離する。
【００３９】
導入された血漿の正確な量が重量測定されている。カートリッジを、カートリッジの上部部分におけるタンパク質残渣が最初の部分の最大でも約１０％になるまで遠心分離する。
【００４０】
ろ液を抜き取り、ろ過された血漿の１ｍｌあたり２１０μｌの３Ｍ  ＫＣｌを濃縮物に加える。
【００４１】
ホモジネーション後、カートリッジを、１時間から４時間の間、１００００回転／分で遠心分離する。カートリッジを、カートリッジの上部部分におけるタンパク質残渣が最初の部分の最大でも約１０％になるまで遠心分離する。
【００４２】
２回目のろ液を抜き取り、ろ過された血漿の１ｍｌあたり２１０μｌの３Ｍ  ＫＣｌを濃縮物に再び加える。
【００４３】
ホモジネーション後、カートリッジを、１時間から４時間の間、１００００回転／分で遠心分離する。カートリッジを、カートリッジの上部部分におけるタンパク質残渣が最初の部分の最大でも約１０％になるまで遠心分離する。
【００４４】
３回目のろ液を抜き取り、ろ過された血漿の１ｍｌあたり２５０μｌの水を濃縮物に加える。
【００４５】
ホモジネーション後、カートリッジを、１時間から４時間の間、１００００回転／分で遠心分離する。カートリッジを、カートリッジの上部部分におけるタンパク質残渣が最初の部分の最大でも約１０％になるまで遠心分離する。
【００４６】
これらのろ液を一緒にし、水で５倍希釈し、全体をアニオン交換ＨＰＬＣに直接に注入する。注入直前に、注入溶液のｐＨを１Ｎ  ＨＣｌの添加によって３に調節する。
【００４７】
ＨＰＬＣ方法
ろ過された血漿をアニオン交換ＨＰＬＣによって分析する。使用されたカラムは、長さが２５ｃｍで、内径が２ｍｍのＩｏｎＰＡｃ  Ａｓ１１カラム（Ｄｉｏｎｅｘ）である。使用された検出器は、ダイオードアレイを備えるＵＶ分光光度計である。
【００４８】
ｐＨの全体を、ｐＨを  Ｎ  ＨＣｌの添加により３に調節した後で注入する。選ばれた流速は０．２２ｍｌ／分であり、カラム温度は４０℃である。
【００４９】
溶出をグラジエントモードで行う。使用された２つの溶液は、
溶媒Ａ：ＮａＨ２ＰＯ４（２．５ｍＭ）（これはＨ３ＰＯ４の添加によってｐＨ２．９にされる）
溶媒Ｂ：ＮａＣｌＯ４（１Ｎ）、ＮａＨ２ＰＯ４（２．５ｍＭ）（これはＨ３ＰＯ４の添加によってｐＨ３．０にされる）
である。
【００５０】
溶出グラジエントは下記の通りである。
Ｔ＝０分：％Ｂ＝３；Ｔ＝４０分：％Ｂ＝６０；Ｔ＝６０分：％Ｂ＝８０
【実施例１】
【００５１】
ビーグル血統の雄イヌの血液における３つの八糖の混合物の変化がモニターされる。これら３つの八糖（これらは、ΔＩＩａＩＩｓＩｓＩｓ、ΔＩｓＩＩａＩＩｓＩｓおよびΔＩＩａＩＩｓＩｓＩｓ１，６−ａｎｈｙｄｒｏと記号化される）はＬｏｖｅｎｏｘ（登録商標）の八糖分画物の主要な親和性の八糖である。これらは、ＡＴＩＩＩに対する大きな親和性を有し、その結果として抗トロンビン活性を有する。
【００５２】
【化３】
2008527390.tif 000002
【００５３】
混合物をこれら３つの構成成分のそれぞれに関して０．５ｍｇ／ｋｇの目標用量でビーグル血統の３匹の雄イヌに皮下投与する。投与溶液は０．５ｍｇ／ｍｌの目標濃度でのこれら３つの八糖の混合物の０．９％ＮａＣｌ溶液である。
【００５４】
５ｍｌの血液サンプルを、投与後の０ｈ、０．２５ｈ、０．５ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈ、８ｈ、２４ｈ、３０ｈおよび４８ｈの時間で採血する。採血された血液サンプルを、４００μｌのＣＴＡＤ（クエン酸塩、テオフィリン、アデノシン、ジピリダモール）混合物を含有するチューブに集める。ホモジネーション後、溶液を３０００ｇにおいて１５℃で１５分間遠心分離する。血漿上清を回収し、使用まで−２０℃で保存する。
【００５５】
血漿をＨＰＬＣ注入前に処理するために、約１ｍｌの血漿を抜き取り、重量測定し、これに、約０．０２ｇ／ｌの濃度での内部標準物質の溶液の５０μｌを加える。
【００５６】
内部標準物質は、分析される生成物に対してできる限り構造的に近いように選ばれる。この構造を下記に示す。
【００５７】
【化４】
2008527390.tif 000003
【００５８】
使用されたこの四糖により、抽出収率における変動の潜在的な影響を補正することが可能になる。
【００５９】
血漿を処理し、ＨＰＬＣによって分析する。
【００６０】
得られた結果を表１に表す。対応するクロマトグラムが図１に表される。
【００６１】
【表１】
2008527390.tif 000004
【００６２】
【表２】
2008527390.tif 000005
【００６３】
【表３】
2008527390.tif 000006
【実施例２】
【００６４】
平均分子量が２５００ＤａのＶＬＭＷＨを１．４ｍｇ／ｋｇの目標用量でヒト志願者に投与する。血液サンプルを、投与後の０ｈ、０．２５ｈ、０．５ｈ、０．７５ｈ、１ｈ、１．２５ｈ、１．５ｈ、２ｈ、２．５ｈ、３ｈ、３．５ｈ、４ｈ、４．５ｈ、５ｈ、６ｈ、７ｈ、８ｈ、９ｈ、１０ｈ、１２ｈ、１４ｈおよび２４ｈの時間で採血する。
【００６５】
使用されたＶＬＭＷＨはオリゴ糖の複雑な混合物であるので、この研究は、この混合物から選ばれたいくつかの成分に限定された。
【００６６】
さらに、混合物の構成成分の１つとクロマトグラフィーレベルで妨害しない内部標準物質が見出されていないので、アッセイを、親和性の八糖に関して実施例１で得られたモル応答係数をモル応答係数として採用することによって行った。
【００６７】
【化５】
2008527390.tif 000007
【００６８】
結果から、挙動における非常に大きな違いが、研究された低分子量ヘパリンを構成するオリゴ糖の間で明らかにされる。ａＸａ活性を有するオリゴ糖は、これ以外の硫酸化オリゴ糖よりもはるかに遅い脱離速度を有しており、ａＸａ活性をモニターすることからは検出することができない。
【００６９】
得られた結果を表２に表す。対応するクロマトグラムが図２に表される。
【００７０】
【表４】
2008527390.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】イヌ１についての３つの八糖の薬物動態学のクロマトグラフィーによるモニタリングを示す。
【図２】投与後の時間を関数とする、超低分子量ヘパリンを構成する主なオリゴ糖のクロマトグラフィーによるモニタリングを示す。
【図１】
2008527390.tif 000011
【図２】
2008527390.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成18年10月27日(2006.10.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の２つの段階：
ａ．ろ過によってサンプルを処理すること、次いで
ｂ．高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってアッセイすること
を行うことを特徴とする、オリゴ糖を血漿から分析するための方法。
【請求項２】
３０ｋＤａよりも大きい分子量を有する分子が濃縮物に保持されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
コントロールのオリゴ糖がろ過前に血漿に加えられることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
濃縮物が塩溶液で少なくとも１回洗浄されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
塩溶液が塩化カリウム溶液であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
濃縮物の添加の後での塩溶液の濃度が１Ｍ以上であることを特徴とする、請求項４または５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
濃縮物の添加の後での塩溶液の濃度が２Ｍ以上であることを特徴とする、請求項４または５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
濃縮物が塩溶液で少なくとも１回洗浄され、次いで、水により洗浄されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ろ液および適する場合には洗浄液の全体が注入され、ＨＰＬＣによって分析されることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
クロマトグラフィーがアニオン交換クロマトグラフィーであることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
クロマトグラフィーが、第四級アンモニウムが共有結合による結合によってグラフト化されているアニオン交換カラムでのアニオン交換クロマトグラフィーであることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
２００ｎｍまで透明である移動相が使用されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
移動相が、過塩素酸ナトリウムの、メタンスルホン酸塩のまたはリン酸塩の溶液であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
移動相が過塩素酸ナトリウムの溶液であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
アセチル化糖を選択的に検出することを可能にする検出方法を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
アセチル化糖を選択的に検出するための方法が、非アセチル化糖類の吸収性が相殺されるような方式で選ばれた２つの波長における吸収の違いをシグナルとして処理することによって行われることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
アセチル化糖を選択的に検出するための方法が、２０２ｎｍから２３０ｎｍおよび２３４ｎｍにおける吸収を測定することによって行われることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アセチル化糖を選択的に検出するための方法が、２０２ｎｍから２３０ｎｍ、２３４ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸収を測定することによって行われることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項１９】
β−不飽和オリゴ糖をアッセイすることにおける請求項１に記載の方法の使用。
【請求項２０】
エノキサパリン、オクタパリン（ｏｃｔａｐａｒｉｎ）、ベミパリン（ｂｅｍｉｐａｒｉｎ）またはチンザパリン（ｔｉｎｚａｐａｒｉｎ）をアッセイすることにおける請求項１に記載の方法の使用。
【請求項２１】
下記の八糖：
【化１】
2008527390.tif 000013
の１つ以上をアッセイすることにおける請求項１に記載の方法の使用。
【請求項２２】
下記のオリゴ糖：
【化２】
2008527390.tif 000014
の１つ以上をアッセイすることにおける請求項１に記載の方法の使用。
【国際調査報告】
2008527390.tif 000015
2008527390.tif 000016