(57)【要約】選択されたアミノ酸残基に置換を有している変異体ニューブラスチン（Ｎｅｕｂｌａｓｔｉｎ）ポリペプチドが開示される。１つ以上の選択されたアミノ酸残基での置換によっては、ヘパリンの結合が減少し、そして変異体ニューブラスチンポリペプチドの血清暴露が増大する。哺乳動物の疾患を処置し、ＲＥＴ受容体を活性化させるために変異体ニューブラスチンポリペプチドを使用する方法もまた開示される。１つの局面において、本発明は、配列番号１の１５位〜１１３位のアミノ酸に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の１５位〜１１３位のアミノ酸に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記アミノ酸配列には：
配列番号１の４８位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸；
配列番号１の４９位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸；および
配列番号１の５１位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸
からなる群より選択される、配列番号１と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換が含まれており、前記ポリペプチドは、二量体化すると、ＧＦＲα３とＲＥＴを含む複合体に結合する、ポリペプチド。
【請求項２】
前記アミノ酸配列に、配列番号１の４８位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸が含まれる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１の４８位のアルギニン残基が、非保存的アミノ酸残基で置換されている、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１の４８位のアルギニン残基が、グルタミン酸で置換されている、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記アミノ酸配列に、配列番号１の４９位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸が含まれる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号１の４９位のアルギニン残基が、非保存的アミノ酸残基で置換されている、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号１の４９位のアルギニン残基が、グルタミン酸で置換されている、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記アミノ酸配列に、配列番号１の５１位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸が含まれる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
配列番号１の５１位のアルギニン残基が、非保存的アミノ酸残基で置換されている、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号１の５１位のアルギニン残基が、グルタミン酸で置換されている、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記アミノ酸配列に、配列番号１の４８位と４９位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸が含まれる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号１の４８位のアルギニン残基と４９位のアルギニン残基が、非保存的アミノ酸残基で置換されている、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号１の４８位のアルギニン残基と４９位のアルギニン残基が、それぞれ、グルタミン酸で置換されている、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記アミノ酸配列が、配列番号１の１５位〜１１３位のアミノ酸に対して少なくとも９０％同一である、請求項１〜１３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記アミノ酸配列が、配列番号１の１５位〜１１３位のアミノ酸に対して少なくとも９５％同一である、請求項１〜１３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記アミノ酸配列が、配列番号１の１５位〜１１３位のアミノ酸に対して少なくとも９８％同一である、請求項１〜１３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号２の１５位〜１１３位のアミノ酸、配列番号３の１５位〜１１３位のアミノ酸、配列番号４の１５位〜１１３位のアミノ酸、配列番号５の１５位〜１１３位のアミノ酸、配列番号８の１５位〜１１３位のアミノ酸、または配列番号９の１５位〜１１３位のアミノ酸を含む、ポリペプチド。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、配列番号２の１０位〜１１３位のアミノ酸、配列番号３の１０位〜１１３位のアミノ酸、配列番号４の１０位〜１１３位のアミノ酸、配列番号５の１０位〜１１３位のアミノ酸、配列番号８の１０位〜１１３位のアミノ酸、または配列番号９の１０位〜１１３位のアミノ酸を含む、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記ポリペプチドが、配列番号２にアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸配列、配列番号５のアミノ酸配列、配列番号８のアミノ酸配列、または配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１から１９のいずれか１項に記載の２つのポリペプチドを含む、二量体。
【請求項２１】
自然界には存在しないポリマーに結合した請求項１から１９のいずれかに記載のポリペプチドを含む、結合体。
【請求項２２】
請求項１から１９のいずれかに記載のポリペプチドと異種アミノ酸配列を含む、融合タンパク質。
【請求項２３】
請求項１から１９のいずれかに記載のポリペプチド、請求項２０に記載の二量体、請求項２１に記載の結合体、または請求項２２に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項２４】
請求項１から１９のいずれかに記載のポリペプチドをコードする配列を含む、核酸。
【請求項２５】
請求項２４に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載の発現ベクターを含む、細胞。
【請求項２７】
ポリペプチドを作製する方法であって：
請求項２６に記載の細胞を提供する工程、および
核酸の発現が可能な条件下で前記細胞を培養する工程
を含む、方法。
【請求項２８】
哺乳動物の神経系の障害を処置または予防する方法であって、哺乳動物に治療有効量の請求項２３に記載の薬学的組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項２９】
哺乳動物の神経障害の痛みを処置する方法であって、哺乳動物に治療有効量の請求項２３に記載の薬学的組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項３０】
哺乳動物においてＲＥＴ受容体を活性化させる方法であって、哺乳動物に、有効量の請求項１から１９のいずれかに記載のポリペプチド、請求項２０に記載の二量体、請求項２１に記載の結合体、請求項２２に記載の融合タンパク質、または請求項２３に記載の薬学的組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項３１】
配列番号１の１５位〜１１３位のアミノ酸に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記アミノ酸配列には：
配列番号１の２０位に相当する位置にセリン以外のアミノ酸；
配列番号１の２１位に相当する位置にグルタミン以外のアミノ酸；
配列番号１の３２位に相当する位置にヒスチジン以外のアミノ酸；
配列番号１の３３位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸；
配列番号１の３９位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸；
配列番号１の４６位に相当する位置にセリン以外のアミノ酸；
配列番号１の６８位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸；
配列番号１の７２位に相当する位置にグリシン以外のアミノ酸；
配列番号１の７３位に相当する位置にセリン以外のアミノ酸；および
配列番号１の９４位に相当する位置にバリン以外のアミノ酸
からなる群より選択される、配列番号１と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換が含まれており、前記ポリペプチドは、二量体化すると、ＧＦＲα３とＲＥＴを含む複合体に結合する、ポリペプチド。
【請求項３２】
前記アミノ酸配列が、配列番号１の１５位〜１１３位のアミノ酸に対して少なくとも９０％同一である、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記アミノ酸配列が、配列番号１の１５位〜１１３位のアミノ酸に対して少なくとも９５％同一である、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
前記アミノ酸配列が、配列番号１の１５位〜１１３位のアミノ酸に対して少なくとも９８％同一である、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
配列番号１に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記アミノ酸配列には：
配列番号１の７位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸；
配列番号１の９位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸；および
配列番号１の１４位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸
からなる群より選択される、配列番号１と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換が含まれており、前記ポリペプチドは、二量体化すると、ＧＦＲα３とＲＥＴを含む複合体に結合する、ポリペプチド。
【請求項３６】
前記アミノ酸配列に、配列番号１の７位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸が含まれる、請求項３５に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
配列番号１の７位のアルギニン残基が、非保存的アミノ酸残基で置換されている、請求項３６に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
配列番号１の７位のアルギニン残基が、グルタミン酸で置換されている、請求項３６に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
前記アミノ酸配列に、配列番号１の９位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸が含まれる、請求項３５に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
配列番号１の９位のアルギニン残基が、非保存的アミノ酸残基で置換されている、請求項３９に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
配列番号１の９位のアルギニン残基が、グルタミン酸で置換されている、請求項３９に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
前記アミノ酸配列に、配列番号１の１４位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸が含まれる、請求項３５に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
配列番号１の１４位のアルギニン残基が、非保存的アミノ酸残基で置換されている、請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
配列番号１の１４位のアルギニン残基が、グルタミン酸で置換されている、請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
前記アミノ酸配列が、配列番号１に対して少なくとも９０％同一である、請求項３５〜４４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４６】
前記アミノ酸配列が、配列番号１に対して少なくとも９５％同一である、請求項３５〜４４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４７】
前記アミノ酸配列が、配列番号１の１５位〜１１３位のアミノ酸に対して少なくとも９８％同一である、請求項３５〜４４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４８】
請求項３１から４７のいずれか１項に記載の２つのポリペプチドを含む、二量体。
【請求項４９】
自然界には存在しないポリマーに結合した請求項３１から４７のいずれかに記載のポリペプチドを含む、結合体。
【請求項５０】
請求項３１から４７のいずれかに記載のポリペプチドと異種アミノ酸配列を含む、融合タンパク質。
【請求項５１】
請求項３１から４７のいずれかに記載のポリペプチド、請求項４８に記載の二量体、請求項４９に記載の結合体、または請求項５０に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項５２】
請求項３１から４７のいずれかに記載のポリペプチドをコードする配列を含む、核酸。
【請求項５３】
請求項５２に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項５４】
請求項５３に記載の発現ベクターを含む、細胞。
【請求項５５】
ポリペプチドを作製する方法であって：
請求項５４に記載の細胞を提供する工程、および
核酸の発現が可能な条件下で前記細胞を培養する工程
を含む、方法。
【請求項５６】
哺乳動物の神経系の障害を処置または予防する方法であって、哺乳動物に治療有効量の請求項５１に記載の薬学的組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項５７】
哺乳動物の神経障害の痛みを処置する方法であって、哺乳動物に治療有効量の請求項５１に記載の薬学的組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項５８】
哺乳動物においてＲＥＴ受容体を活性化させる方法であって、哺乳動物に、有効量の請求項３１から４７のいずれかに記載のポリペプチド、請求項４８に記載の二量体、請求項４９に記載の結合体、請求項５０に記載の融合タンパク質、または請求項５１に記載の薬学的組成物を投与する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００４年８月１９日に出願された仮特許出願番号６０／６０２，８２５および２００５年６月２４日に出願された各特許出願番号６０／６９４，０６７の優先権を主張する。これらの先行出願の各々の全内容は、その全体が本明細書に参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、タンパク質化学、分子生物学、および神経学に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
ニューブラスチン（Ｎｅｕｂｌａｓｔｉｎ）はアルテミン（Ａｒｔｅｍｉｎ）およびエノビン（Ｅｎｏｖｉｎ）としても知られており、２４ｋＤａのホモ二量体の分泌タンパク質である。これは、ドーパミン作用性ニューロンのような末梢神経系および中枢神経系のニューロンの生存性を促進する（非特許文献１；非特許文献２）。ニューブラスチンをコードする遺伝子はクローニングされ、配列決定されている（非特許文献３）。
【０００４】
ニューブラスチンは、グリア細胞株に由来する神経栄養因子（ＧＤＮＦ）リガンドファミリーのメンバーである。細胞レベルでは、ＧＤＮＦメンバーは、受容体チロシンキナーゼＲＥＴを活性化させる。ＲＥＴは、ＲＥＴのリガンド特異性を提供するグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合膜タンパク質であるコレセプター、ＧＮＤＦファミリー受容体α（ＧＦＲα）と会合する。４つのＧＦＲαが公知である（ＧＦＲα１〜４）。ニューブラスチンはＲＥＴとともにＧＦＲα３に結合して、３成分からなるシグナル伝達複合体を形成する（非特許文献３）。これは、侵害受容感覚ニューロンに主に局在化している（非特許文献４）。これらのニューロンは痛みと損傷を検出する。したがって、ニューブラスチンは、神経障害の通常の処置に、そしてより具体的には、神経障害の痛みの処置において臨床的に応用できる。
【０００５】
ニューブラスチンおよび他のＧＤＮＦファミリーのメンバーは、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーのメンバーであり、したがって、システインノットの構造を形成する同様の空間を有している７個の保存されているシステイン残基の存在を特徴とする（非特許文献５）。それぞれの単量体には２つのジスルフィド結合が含まれており、これらはきついノット構造を形成するように第３のジスルフィドを取り囲む閉環構造を形成する。個々の単量体形態の中に含まれる７個のシステインは分子間ジスルフィド結合を形成し、これによって、最終的な二量体産物を形成するように単量体が共有結合する。（非特許文献６）。
【０００６】
ＴＧＦβファミリーのメンバーはプレプロタンパク質として合成され、これは最終的には、シグナルペプチドおよびプロドメインの切断後に成熟ホモ二量体として分泌される（例えば、非特許文献６；非特許文献７）。シグナルペプチドとプロドメインの両方が、ＴＧＦβファミリーのメンバーの適切な分泌を媒介する（非特許文献６；非特許文献８）。
【非特許文献１】Ｂａｕｄｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０００、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２７：４３３５
【非特許文献２】Ｒｏｓｅｎｂｌａｄ  ２０００，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１５（２）：１９９；ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ１２０２７４
【非特許文献３】Ｂａｌｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，２１：１２９１
【非特許文献４】Ｏｒｏｚｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１３（１１）：２１７７
【非特許文献５】Ｓａａｒｍａ，１９９９，Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．，４５：２９２
【非特許文献６】Ｒａｔｔｅｎｈｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３０５：５２３
【非特許文献７】Ｆａｉｒｌｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２０）：１６９１１
【非特許文献８】Ｆａｉｒｌｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２０）：１６９１１
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（要旨）
本発明は、ニューブラスチンがヘパリン硫酸に結合すること、およびニューブラスチンポリペプチドの中の特定のアミノ酸残基がこの結合事象に寄与していることの発見に、少なくとも一部基づく。選択されたアミノ酸残基の置換は、変異体ニューブラスチンポリペプチドによるヘパリン結合を減少させ、そして変異体の生体活性および生体利用性を増大させることが明らかにされた。
【０００８】
１つの態様においては、本発明は、配列番号１の１５位〜１１３位のアミノ酸に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを特徴とする。ここでは、アミノ酸配列には、以下からなる群より選択される、配列番号１と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換が含まれる：（ｉ）配列番号１の４８位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸（例えば、アルギニンは、グルタミン酸のような非保存的アミノ酸残基で置換される）；（ｉｉ）配列番号１の４９位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸（例えば、アルギニンは、グルタミン酸のような非保存的アミノ酸残基で置換される）；および（ｉｉｉ）配列番号１の５１位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸（例えば、アルギニンは、グルタミン酸のような非保存的アミノ酸残基で置換される）。このポリペプチドは、二量体化すると、ＧＦＲα３とＲＥＴを含む複合体に結合する。
【０００９】
いくつかの実施例においては、アミノ酸配列には、配列番号１の４８位と４９位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸が含まれる。例えば、配列番号１の４８位のアルギニン残基と４９位のアルギニン残基は、非保存的アミノ酸残基（例えば、グルタミン酸）で置換することができる。
【００１０】
いくつかの実施形態においては、アミノ酸配列は、配列番号１の１５位〜１１３位のアミノ酸に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一である。
【００１１】
配列番号２の１５位〜１１３位のアミノ酸、配列番号３の１５位〜１１３位のアミノ酸、配列番号４の１５位〜１１３位のアミノ酸、配列番号５の１５位〜１１３位のアミノ酸、配列番号８の１５位〜１１３位のアミノ酸、または配列番号９の１５位〜１１３位のアミノ酸を含むポリペプチドも開示される。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドには、配列番号２の１０位〜１１３位のアミノ酸、配列番号３の１０位〜１１３位のアミノ酸、配列番号４の１０位〜１１３位のアミノ酸、配列番号５の１０位〜１１３位のアミノ酸、配列番号８の１０位〜１１３位のアミノ酸、または配列番号９の１０位〜１１３位のアミノ酸が含まれる。いくつかの実施例においては、ポリペプチドには、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸配列、配列番号５のアミノ酸配列、配列番号８のアミノ酸配列、または配列番号９のアミノ酸配列が含まれる。
【００１２】
配列番号１の１５位〜１１３位のアミノ酸に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドも開示される。ここでは、アミノ酸配列には、以下からなる群より選択される、配列番号１と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換が含まれる：（ｉ）配列番号１の２０位に相当する位置にセリン以外のアミノ酸（例えば、セリンは非保存的アミノ酸残基で置換される）；（ｉｉ）配列番号１の２１位に相当する位置にグルタミン以外のアミノ酸（例えば、グルタミンは非保存的アミノ酸残基で置換される）；（ｉｉｉ）配列番号１の３２位に相当する位置にヒスチジン以外のアミノ酸（例えば、ヒスチジンは非保存的アミノ酸残基で置換される）；（ｉｖ）配列番号１の３３位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸（例えば、アルギニンは非保存的アミノ酸残基で置換される）；（ｖ）配列番号１の３９位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸（例えば、アルギニンは非保存的アミノ酸残基で置換される）；（ｖｉ）配列番号１の４６位に相当する位置にセリン以外のアミノ酸（例えば、セリンは非保存的アミノ酸残基で置換される）；（ｖｉｉ）配列番号１の６８位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸（例えば、アルギニンは非保存的アミノ酸残基で置換される）；（ｖｉｉｉ）配列番号１の７２位に相当する位置にグリシン以外のアミノ酸（例えば、グリシンは非保存的アミノ酸残基で置換される）；（ｉｘ）配列番号１の７３位に相当する位置にセリン以外のアミノ酸（例えば、セリンは非保存的アミノ酸残基で置換される）；および（ｘ）配列番号１の９４位に相当する位置にバリン以外のアミノ酸（例えば、バリンは非保存的アミノ酸残基で置換される）。このポリペプチドは、二量体化すると、ＧＦＲα３とＲＥＴを含む複合体に結合する。いくつかの実施形態においては、アミノ酸配列は、配列番号１の１５位〜１１３位のアミノ酸に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一である。
【００１３】
配列番号１に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドも開示される。ここでは、アミノ酸配列には、以下からなる群より選択される、配列番号１と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換が含まれる：（ｉ）配列番号１の７位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸（例えば、アルギニンはグルタミン酸のような非保存的アミノ酸残基で置換される）；（ｉｉ）配列番号１の９位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸（例えば、アルギニンはグルタミン酸のような非保存的アミノ酸残基で置換される）；および（ｉｉｉ）配列番号１の１４位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸（例えば、アルギニンはグルタミン酸のような非保存的アミノ酸残基で置換される）。このポリペプチドは、二量体化すると、ＧＦＲα３とＲＥＴを含む複合体に結合する。いくつかの実施形態においては、アミノ酸配列は、配列番号１に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一である。
【００１４】
本発明はまた、自然界には存在しないポリマーに結合した本明細書中に記載されるポリペプチドを含む結合体を特徴とする。例示的なポリマーは、水溶性の合成ポリマー（例えば、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール））である。
【００１５】
本発明はまた、本明細書中に記載されるポリペプチドと異種アミノ酸配列を含む融合タンパク質を特徴とする。
【００１６】
本発明はまた、本明細書中に記載されるポリペプチド、結合体、または融合タンパク質の２つを含む二量体を特徴とする。
【００１７】
本発明はまた、本明細書中に記載されるポリペプチド、二量体、結合体、または融合タンパク質と、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む薬学的組成物を特徴とする。
【００１８】
本明細書中に記載されるポリペプチドをコードする配列を含む核酸、この核酸を含む発現ベクター、および発現ベクターを含む細胞もまた開示される。
【００１９】
ポリペプチドを作製する方法もまた開示される。この方法には：（ｉ）本明細書中に記載されるポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを含む細胞を提供する工程、および（ｉｉ）核酸の発現が可能な条件下で上記細胞を培養する工程が含まれる。
【００２０】
本発明はまた、哺乳動物の神経系の障害を処置または予防する方法を特徴とする。この方法は、哺乳動物に治療有効量の本明細書中に記載されるポリペプチド、二量体、結合体、融合タンパク質、または薬学的組成物を投与する工程による。
【００２１】
本発明はまた、哺乳動物の神経障害の痛みを処置する方法を特徴とする。この方法は、哺乳動物に治療有効量の本明細書中に記載されるポリペプチド、二量体、結合体、融合タンパク質、または薬学的組成物を投与する工程による。
【００２２】
本発明はまた、哺乳動物の中でＲＥＴ受容体を活性化させる方法を特徴とする。この方法は、哺乳動物に、有効量の本明細書中に記載されるポリペプチド、二量体、結合体、融合タンパク質、または薬学的組成物を投与する工程による。
【００２３】
本明細書中に記載される選択された変異体ニューブラスチンポリペプチドの利点は、これらが野生型ニューブラスチンと比較して低い結合能力を有していることである。ヘパリン結合の低下によって、変異体ポリペプチドのインビボでのクリアランスの減少が生じる。
【００２４】
４８位および４９位のアミノ酸位置に置換を有している変異体ニューブラスチンポリペプチドは、１変異アミノ酸変異体および／または野生型ニューブラスチンと比較して、大幅に低いヘパリン結合能力と、大幅に大きい効力および生体利用性を有していることが思いがけず見出された。例えば、二重変異体は、野生型ニューブラスチンと比較して、血清暴露においておよそ１８５倍の増大を示すことが見出された。加えて、この二重変異体は、野生型ニューブラスチンと比較してインビトロでの５倍以上の発現の増大を示し、それによって、タンパク質の大規模な生産が容易になることが見出された。
【００２５】
変異体ニューブラスチンポリペプチドの利点および予想以上の特性によって、より低用量のタンパク質を使用する被験体の処置が可能であり、そして／またはより長い投与間隔が可能である（野生型タンパク質での処置と比較して）。
【００２６】
他の場所で明記されていない限りは、本明細書中で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと同様または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、例示的な方法および材料が以下に記載される。本明細書中に言及される全ての刊行物、特許、および他の参考文献は、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。矛盾する場合、定義を含めて、本願が優先する。材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定するようには意図されない。
【００２７】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から、そして特許請求の範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明により、選択されたアミノ酸残基に置換を有している変異体ニューブラスチンポリペプチドが提供される。添付される実施例に開示されるように、野生型ニューブラスチンポリペプチドの中の特異的な残基は、ヘパリン結合に重要であることが明らかにされている。ヘパリン結合がインビボでのニューブラスチンのクリアランスに寄与していると考えられているので、これらの特異的残基の１つ以上での置換は、ヘパリン結合を減少させ、それによって変異体ポリペプチドの血清暴露が増大すると予想される。
【００２９】
変異体ニューブラスチンポリペプチド
成熟した野生型ヒトニューブラスチンは１１３アミノ酸の長さであり、以下のアミノ酸配列を有している：
【００３０】
【化１】
2008510468.tif 000002
ニューブラスチンポリペプチドの１つ以上の選択されたアミノ酸残基に置換を有しているポリペプチドが本明細書中に開示される。これらの残基の１つ以上での変異は、野生型ニューブラスチンと比較して、低いヘパリン結合能力を有しているかまたはヘパリン結合能力を有していない変異体ニューブラスチンを生じると予想される。変異体ニューブラスチンポリペプチドには、配列番号１と比較して、（ｉ）４８位、４９位、または５１位の１つ以上に相当するアルギニン残基、および／または（ｉｉ）Ｓｅｒ４６、Ｓｅｒ７３、Ｇｌｙ７２、Ａｒｇ３９、Ｇｌｎ２１、Ｓｅｒ２０、Ａｒｇ６８、Ａｒｇ３３、Ｈｉｓ３２、Ｖａｌ９４、Ａｒｇ７、Ａｒｇ９，もしくはＡｒｇ１４の１つ以上に、アミノ酸置換が含まれる。他の場所に明記されていなければ、位置番号によるニューブラスチンのアミノ酸残基についての本明細書中での全ての言及は、配列番号１に関する残基の番号を意味する。
【００３１】
置換について指名されたニューブラスチンのアミノ酸残基（例えば、４８位、４９位、および／または５１位のアルギニン残基）は、非保存的アミノ酸残基（例えば、グルタミン酸）または保存的アミノ酸残基で置換することができる。添付される実施例に詳細に記載されるように、Ａｒｇ４８、Ａｒｇ４９、および／またはＡｒｇ５１の非保存的アミノ酸での置換によっては、ヘパリン結合活性が低下しているが、ニューブラスチンの生物学的活性は維持している（または増強されている）変異体ニューブラスチンポリペプチドが生じ得る。本明細書中で同定されたアミノ酸残基（例えば、４８位、４９位、および／または５１位のアルギニン残基）を置換することができる例示的なアミノ酸としては、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびアラニンが挙げられる。
【００３２】
生物学的に活性な変異体ニューブラスチンポリペプチドは、二量体化すると、ＧＦＲα３とＲＥＴを含む３成分複合体に結合する。この複合体に対する結合を検出するための任意の方法を、変異体ニューブラスチンポリペプチドの生物学的活性を評価するために使用することができる。変異体ニューブラスチンポリペプチドの３成分複合体結合能力を検出するための例示的なアッセイは、ＷＯ００／０１８１５および実施例７に記載されている。
【００３３】
変異体ニューブラスチンポリペプチドはまた、ニューブラスチンによるシグナル伝達カスケードを誘発するその能力を評価するために評価することもできる。例えば、実施例６に記載されているキナーゼ受容体活性化（Ｋｉｎａｓｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）（ＫＩＲＡ）アッセイを、ＲＥＴの自己リン酸化を誘導する変異体ニューブラスチンポリペプチドの能力を評価するために使用することができる（例えば、Ｓａｄｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３５（２）：２０７もまた参照のこと）。
【００３４】
本明細書中で同定された特異的なアミノ酸置換に加えて、変異体ニューブラスチンポリペプチドにはまた、以下のセクションに詳細に記載されるように、他のアミノ酸位置での１つ以上の付加、置換、および／または欠失も含まれ得る。
【００３５】
変異体ニューブラスチンポリペプチドは、本明細書中に記載される１つ以上のアミノ酸置換に加えて、長さも異なる場合がある。成熟ヒトニューブラスチンポリペプチド（配列番号１）は、プレプロニューブラスチンのカルボキシ末端の１１３個のアミノ酸から構成されているが、１１３個のアミノ酸の全てがニューブラスチンの有用な生物学的活性を得るために必要であるわけではない。アミノ末端の短縮は許容される。したがって、変異体ニューブラスチンポリペプチドには、配列番号１のカルボキシ末端の９９個、１００個、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１１０個、１１１個、１１２個、または１１３個のアミノ酸の状況で（すなわち、その長さは、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、または１１３アミノ酸である）で、本明細書中に記載されるアミノ酸置換の１つ以上が含まれる場合がある。
【００３６】
変異体ニューブラスチンポリペプチドは、本明細書中に記載される１つ以上のアミノ酸置換（および、状況に応じて、本明細書中に記載される短縮を有している）に加えて、配列も異なる場合がある。具体的には、特定のアミノ酸置換を、ニューブラスチンの生物学的活性の感知できるほどの消失を伴うことなく、ニューブラスチン配列に導入することができる。例示的な実施形態においては、ポリペプチドは、（ｉ）本明細書中に記載されるアミノ酸置換の１つ以上を含み、そして、（ｉｉ）配列番号１に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である（あるいは、配列番号１の１５位〜１１３位のアミノ酸に対して、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である）。配列番号１とは配列が異なる（または、配列番号１の１５位〜１１３位のアミノ酸とは配列が異なる）変異体ニューブラスチンポリペプチドには、１つ以上の保存的アミノ酸置換、１つ以上の非保存的アミノ酸置換、および／または１つ以上の欠失もしくは挿入が含まれる場合がある。
【００３７】
図１は、野生型のヒト、マウス、およびラットのプレプロニューブラスチンポリペプチドのアラインメントである。図１の垂直の線は、それぞれ、ニューブラスチンの成熟形態の１１３アミノ酸（左の垂直の線）と１０４アミノ酸の形態（右の垂直の線）開始部位を示す。ＲＲＸＲヘパリン結合モチーフを四角で囲って示す。自然界に存在している生物学的に活性な形態のニューブラスチンのこのアラインメントは、生体活性を損なうことなく置換することができる特異的な例示的な残基（すなわち、ヒト、マウス、およびラットの形態の間で保存されていない残基）を示している。
【００３８】
アミノ酸配列の間での同一性の割合（％）は、ＢＬＡＳＴ  ２．０プログラムを使用して決定することができる。配列比較は、ギャップを含まないアラインメントを使用し、そしてデフォルトパラメーター（Ｂｌｏｓｓｏｍ  ６２マトリックス、１１のギャップ伸張コスト、１の残基あたりのギャップコスト、および０．８５のラムダ比）を使用して行うことができる。ＢＬＡＳＴプログラムにおいて使用される数学的アルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５：３３８９−３４０２に記載されている。
【００３９】
保存的置換は、１つのアミノ酸の類似する特性を有している別のアミノ酸での置換である。保存的置換としては、以下のグループの中での置換が含まれる：バリン、アラニン、およびグリシン；ロイシン、バリン、およびイソロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリン、システイン、およびスレオニン；リジンおよびアルギニン；ならびに、フェニルアラニンおよびチロシン。非極性の疎水性アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれる。極性の中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる。正電荷を有している（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれる。負電荷を有している（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。同じグループの別のメンバーによる上記の極性の塩基性または酸性のグループの１つのメンバーの任意の置換は保存的置換と考えることができる。
【００４０】
非保存的置換としては、以下が挙げられる：（ｉ）電気的陽性側鎖を有している残基（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓ）は、電気的陰性残基（例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐ）を置換する、またはそれらで置換される、（ｉｉ）親水性残基（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）は、疎水性残基（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、またはＶａｌ）を置換する、またはそれらで置換される、（ｉｉｉ）システインまたはプロリンは、任意の他の残基を置換する、またはそれらで置換される、あるいは、（ｉｖ）かさ高い疎水性または芳香族側鎖を有している残基（例えば、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、またはＴｒｐ）は、小さい側鎖を有している残基（例えば、Ａｌａ、Ｓｅｒ）または側鎖を有していない残基（例えば、Ｇｌｙ）を置換する、またはそれらで置換される。
【００４１】
例示的な変異体ニューブラスチンポリペプチドは表１に開示される。対応する野生型の位置と比較して変異している変異体ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸残基は太字で示し、下線が付けられている。加えて、置換のバックグラウンドとして使用されるニューブラスチンポリペプチド（１１３、９９、または１０４アミノ酸の長さ）が表１に示される。
【００４２】
【化２】
2008510468.tif 000003
変異体ニューブラスチンポリペプチドは、状況に応じて、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール部分のようなポリアルキレングリコール部分）に対して結合させることができる。いくつかの実施形態においては、ポリマーは、ニューブラスチンポリペプチド上のそのＮ末端である部位でポリペプチドに結合させられる。いくつかの実施形態においては、変異体ニューブラスチンポリペプチドには、配列番号１に対して（または配列番号１の１５位〜１１３位のアミノ酸に対して）少なくとも１つのアミノ酸置換が含まれる。これによって、ポリマーを結合させることができる内部ポリマー結合部位が提供される。いくつかの実施形態においては、ポリマーは、１４位、３９位、６８位、および９５位からなる群より選択される残基（配列番号１の配列にしたがって番号を付けた）で、変異体ニューブラスチンポリペプチドに対して結合させられる。内部ポリマー結合部位を提供する例示的なニューブラスチン変異体は、ＷＯ０２／０６０９２９およびＷＯ０４／０６９１７６（それらの内容は引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されている。
【００４３】
ポリペプチドには、状況に応じて、変異体ニューブラスチンポリペプチドに加えて異種アミノ酸配列が含まれ得る。「異種」は、アミノ酸配列について言う場合には、特定の宿主細胞に対して外来である供給源に由来する配列、または同じ宿主に由来する場合には、そのもとの形態から修飾された配列を意味する。例示的な異種配列としては、異種シグナル配列（例えば、自然界に存在しているラットのアルブミンシグナル配列、修飾されたラットのシグナル配列、またはヒト成長ホルモンシグナル配列）、あるいは、変異体ニューブラスチンポリペプチドの精製に使用される配列（例えば、ヒスチジンタグ）が挙げられる。
【００４４】
ニューブラスチンポリペプチドは、当該分野で公知の方法を使用して単離することができる。自然界に存在しているニューブラスチンポリペプチドは、標準的なタンパク質精製技術を使用して細胞または組織供給源から単離することができる。あるいは、変異したニューブラスチンポリペプチドを、標準的なペプチド合成技術を使用して化学的に合成することができる。短いアミノ酸配列の合成は、ペプチドの分野で十分に確立されている。例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ  ｅｄ．，１９８４）を参照のこと。
【００４５】
いくつかの実施形態においては、変異体ニューブラスチンポリペプチドは、組み換えＤＮＡ技術によって生産される。例えば、変異体ニューブラスチンポリペプチドをコードする核酸分子は、ベクター（例えば、発現ベクター）に挿入することができ、そして核酸を細胞に導入することができる。適切な細胞としては、例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞またはＣＨＯ細胞）、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および細菌細胞が挙げられる。組み換え体細胞の中で発現させられる場合には、細胞は変異体ニューブラスチンポリペプチドの発現が可能な条件下で培養されることが好ましい。変異体ニューブラスチンポリペプチドは、所望される場合には、細胞懸濁液から回収することができる。本明細書中で使用される場合は、「回収」は、変異したポリペプチドが回収プロセスの前にそれが存在している細胞または培養培地のそのような成分から取り出されることを意味する。回収プロセスには、１回以上の再折り畳みまたは精製工程が含まれる場合がある。
【００４６】
変異体ニューブラスチンポリペプチドは、当該分野で公知のいくつかの方法を使用して構築することができる。１つのこのような方法は部位特異的変異誘発であり、ここでは、１つの特異的なヌクレオチド（または所望される場合には、少数の特異的なヌクレオチド）が、コードされる変異体ニューブラスチンポリペプチドの中の１つのアミノ酸（または所望される場合には、少数の予め決定されたアミノ酸残基）を変化させるために変化させられる。多くの部位特異的突然変異誘発用のキットが市販されている。１つのこのようなキットは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から販売されている「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ」である。
【００４７】
薬学的組成物
変異体ニューブラスチンポリペプチドは、治療有効量のポリペプチドと１つ以上のアジュバント、賦形剤、担体、および／または希釈剤を含む薬学的組成物へと配合することができる。許容される希釈剤、担体、および賦形剤は、通常、レシピエントの恒常性（例えば、電解質のバランス）に有害な影響を及ぼさない。許容される担体としては、生体適合性の不活性な、もしくは生体内で吸収される塩、緩衝物質、オリゴ糖もしくは多糖、ポリマー、増粘剤、保存剤などが挙げられる。１つの例示的な担体は生理食塩水（０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０〜７．４）である。別の例示的な担体は５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウムである。薬学的組成物の処方および投与のための技術のさらなる詳細は、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）に見ることができる。
【００４８】
変異体ニューブラスチンポリペプチドを含む薬学的組成物の投与は、全身的に行うことも、また局所に行うこともできる。薬学的組成物は、それらが非経口投与および／または非経口ではない投与に適するように処方することができる。特異的な投与手法としては、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、髄腔内、経口、直腸、舌下、局所、鼻腔、眼、関節内、動脈内、くも膜下、気管支、リンパ管、膣、および子宮内への投与が挙げられる。
【００４９】
非経口投与に適している処方物には、通常、変異体ニューブラスチンポリペプチドの滅菌の水性調製物が含まれ、これは、好ましくは、レシピエントの血液と等張である（例えば、生理食塩溶液）。処方物は単位用量形態で提示される場合も、また、多用量形態で提示される場合もある。
【００５０】
例示的な処方物には、本明細書中に記載される変異体ニューブラスチンポリペプチドと、以下の緩衝成分が含まれる：コハク酸ナトリウム（例えば、１０ｍＭ）、；ＮａＣｌ（例えば、７５ｍＭ）；およびＬ−アルギニン（例えば、１００ｍＭ）。
【００５１】
経口投与に適している処方物は、カプセル剤、カシェ剤、錠剤、またはトローチ剤（それぞれが、予め決定された量の変異体ニューブラスチンポリペプチドを含む）のような物理的に分離している単位として；あるいは、シロップ剤、エリキシル剤、乳濁液、もしくはドラフトのような水性の液体または非水性の液体中の懸濁液として、提示される場合がある。
【００５２】
薬学的組成物の治療有効量を、当業者が確認することができる投与レジュメにおいて、それが必要な被験体に投与することがきる。例えば、組成物は、例えば、１回の投与について被験体の体重１ｋｇあたり０．０１μｇ／ｋｇから１０００μｇ／ｋｇまでの投与量で投与することができる。別の実施例においては、投与量は、１回の投与について、被験体の体重１ｋｇあたり１μｇ／ｋｇから１００μｇ／ｋｇ体重までである。別の実施例においては、投与量は、１回の投与について被験体の体重１ｋｇあたり１μｇ／ｋｇから３０μｇ／ｋｇまでであり、例えば、１回の投与について被験体の体重１ｋｇあたり３μｇ／ｋｇから１０μｇ／ｋｇまでである。
【００５３】
治療効率を最適にするために、変異体ニューブラスチンポリペプチドは、最初に異なる投与レジュメで投与される。単位用量およびレジュメは、例えば、哺乳動物の種類、その免疫状態、哺乳動物の体重を含む複数の要因に応じて変化する。通常、組織の中のタンパク質レベルは、例えば、所定の処置レジュメの効率を決定するために、臨床的な試験手順の一部としての適切なスクリーニングアッセイを使用してモニターされる。
【００５４】
変異体ニューブラスチンポリペプチドの投与頻度は、医師による技量および臨床的な判断の範囲である。通常、投与レジュメは、最適な投与パラメーターを確立することができる臨床試験によって確立される。しかし、開業医は、被験体の年齢、健康状態、体重、性別、および医学的状態にしたがってこのような投与レジュメを変えることができる。投与頻度もまた、神経障害についての急性期治療と長期治療との間で異なる場合がある。加えて、投与頻度は、処置が予防的であるか、また、治療的であるかによって異なる場合がある。
【００５５】
処置方法
変異体ニューブラスチンポリペプチドは、神経細胞またはニューロン細胞の代謝、増殖、分化、または生存を調節するために有用である。具体的には、変異体ニューブラスチンポリペプチドは、生存している動物（例えば、ヒト）の障害または疾患（これらの障害または疾患は、神経栄養因子の活性に反応する）を処置または緩和するために使用することができる。
【００５６】
本明細書中に開示される変異体ニューブラスチンポリペプチド（およびそれを含む薬学的組成物）は、感覚ニューロンまたは網膜神経節細胞（後根ガングリオンの中のニューロン、および以下の組織のいずれかの中にあるニューロンが含まれる：膝状関節、側頭骨錐体、および節上神経節；第８脳神経の内耳神経複合体；三叉神経節の上下顎葉の腹側両極；ならびに中脳三叉神経核）の損傷を特徴とする障害の処置のための方法において使用することができる。
【００５７】
いくつかの実施形態においては、感覚ニューロンおよび／または自律神経系ニューロンを処置することができる。具体的には、侵害および機械受容ニューロン、さらに具体的には、Ａ−δ線維、Ｃ−線維、およびＡ−β繊維ニューロンを処置することができる。加えて、自律神経系の交感神経ニューロンおよび副交感神経ニューロンも処置することができる。
【００５８】
いくつかの実施形態においては、運動ニューロン疾患（例えば、筋萎縮側索硬化症（「ＡＬＳ」）および脊髄性筋萎縮症）を処置することができる。他の実施形態においては、変異体ニューブラスチンポリペプチドは、外傷性損傷後の神経の回復を増強させるために使用することができる。あるいは、または加えて、ポリマー結合ニューブラスチンポリペプチド、または変異したニューブラスチンポリペプチドの融合体もしくは結合体を含むマトリックスを有している神経ガイドチャンネルを使用することができる。このような神経ガイドチャンネルは、例えば、米国特許第５，８３４，０２９号に開示されている。
【００５９】
いくつかの実施形態においては、変異体ニューブラスチンポリペプチド（およびそれを含む薬学的組成物）は、黄斑変性症、網膜色素変性症、緑内障、および同様の疾患に罹患している患者の網膜の中の光受容体の欠損を含む種々の眼疾患の処置に使用される。
【００６０】
いくつかの実施形態においては、変異体ニューブラスチンポリペプチド（およびそれを含む薬学的組成物）は、神経障害の痛みを処置するため、接触性アロディニアを処置するため、神経障害に伴う痛覚の欠如を軽減させるため、ウイルス感染およびウイルスが関係している神経障害を処置するため、痛みを伴う糖尿病性神経障害を処置するため、ならびに、神経系の障害を処置するために使用される。この方法は、以下のサブセクションで詳細に議論される。
【００６１】
１．神経障害の痛みの処置
本明細書中に開示される変異体ニューブラスチンポリペプチド（およびそれを含む薬学的組成物）は、被験体の神経障害の痛みを処置するための方法において使用することができる。この方法には、被験体に有効量の変異体ニューブラスチンポリペプチドを単独で投与する工程、または被験体に有効量の以下からなる群より選択される無痛覚症を誘導する化合物を投与する工程もまた、含まれる：オピオイド、不整脈治療剤、局所鎮痛薬、局所麻酔薬、抗痙攣剤、抗鬱剤、コルチコステロイド、および非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）。１つの実施形態においては、無痛覚症を誘導する化合物は抗痙攣剤である。別の実施形態においては、無痛覚症を誘導する化合物はガバペンチン（（１−アミノメチル）シクロヘキサン酢酸）またはプレガバリン（Ｓ−（＋）−４−アミノ−３−（２−メチルプロピル）ブタン酸）。である。
【００６２】
本明細書中に開示される変異体ニューブラスチンポリペプチド（およびそれを含む薬学的組成物）は、末梢神経障害に伴う痛みの処置に使用することができる。中でも、処置することができる末梢神経障害は、外傷によって誘導される神経障害（例えば、身体の損傷または疾患状態、脳の物理的損傷、脊髄の物理的損傷、脳損傷を伴う脳卒中、および神経変性が関係している神経学的障害によって引き起こされるもの）である。
【００６３】
本明細書中に開示される変異体ニューブラスチンポリペプチド（およびそれを含む薬学的組成物）は、以下を含む多数の抹消神経障害の処置に使用することができる：（ａ）外傷によって誘導される神経障害、（ｂ）化学療法によって誘導される神経障害、（ｃ）毒素によって誘導される神経障害（アルコール依存症、ビタミンＢ６中毒、ヘキサ炭素中毒（ｈｅｘａｃａｒｂｏｎ  ｉｎｔｏｘｉｃａｔｉｏｎ）、アミオダロン、クロラムフェニコール、ビスルファン、イソナイアジド、金、リチウム、メトロニダゾール、ミソニダゾール、ニトロフラントインによって誘導される神経障害が含まれるがこれらに限定はされない）、（ｄ）治療薬によって誘導される神経障害の痛みを含む薬剤によって誘導される神経障害（例えば、抗ガン剤、具体的には、タキソール、タキソテーレ、シスプラチン、ノコダゾール、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビンブラスチンからなる群より選択される抗ガン剤によって引き起こされるもの；ならびに、抗ウイルス剤、具体的には、ｄｄＩ、ＤＤＣ、ｄ４Ｔ、フォスカネット、ダプソーン、メトロニダゾール、およびイソナイアジドからなる群より選択される抗ウイルス剤によって引き起こされるもの）、（ｅ）ビタミン欠乏症によって誘導される神経障害（ビタミンＢ１２欠乏症、ビタミンＢ６欠乏症、およびビタミンＥ欠乏症が含まれるがこれらに限定はされない）、（ｆ）特発性神経障害、（ｇ）糖尿病性神経障害、（ｈ）病原体によって誘導される神経の損傷、（ｉ）炎症によって誘導される神経の損傷、（ｊ）神経変性、（ｋ）遺伝性神経障害（フリードライヒ失調症、家族性アミロイドニューロパシー、タンジアー病、ファブリー病が含まれるがこれらに限定はされない）、（ｌ）代謝疾患（腎不全および甲状腺機能低下症が含まれるがこれらに限定はされない）、（ｍ）感染性およびウイルス性神経障害（ハンセン病、ライム病に伴う神経障害の痛み、ウイルス、特に、ヘルペスウイルス（ヘルペス後の神経痛を引き起こし得る帯状疱疹）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびパピローマウイルスからなる群より選択されるウイルスによる感染に伴う神経障害の痛みが含まれるがこれらに限定されない）、（ｎ）自己免疫性神経障害（ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、決定されていない有意なものおよび多発性神経障害のモノクローナル免疫グロブリン異常症が含まれるがこれらに限定はされない）（ｏ）三叉神経の神経痛および絞扼性神経障害（Ｃａｒｐｅｌ−ｔｕｎｎｅｌ症候群が含まれるがこれに限定はされない）、ならびに（ｐ）他の神経障害の痛みの症候群（外傷後の神経痛、幻肢痛、多発性硬化症の痛み、複合性局所疼痛症候群（反射性交感神経性ジストロフィー、灼熱痛が含まれるがこれらに限定はされない）、新生組織形成に伴う痛み、脈菅／血管の神経障害、および坐骨神経痛）。神経障害の痛みは、異痛症、痛覚過敏症、突発性の痛みまたは幻想痛として症状を呈する場合もある。
【００６４】
２．接触性アロディニアの処置
本明細書中に開示される変異体ニューブラスチンポリペプチド（およびそれを含む薬学的組成物）は、被験体の接触性アロディニアの処置に使用することができる。用語「接触性アロディニア」は、通常、痛みが、正常であれば無害である皮膚の刺激（接触）によって引き起こされる被験体の症状をいう。
【００６５】
いくつかの実施形態においては、接触性アロディニアは、被験体に薬学的有効量の変異体ニューブラスチンポリペプチドを投与することによって処置される。関連する実施形態においては、接触性アロディニアは、被験体に有効量の変異体ニューブラスチンポリペプチドを単独で投与すること、または、被験体に有効量の変異体ニューブラスチンポリペプチドを、以下からなる群より選択される無痛覚症を誘導する有効量の化合物とともに投与することによってのいずれかで処置することができる：オピオイド、不整脈治療剤、局所鎮痛薬、局所麻酔薬、抗痙攣剤、抗鬱剤、コルチコステロイド、およびＮＳＡＩＤＳ。１つの実施形態においては、無痛覚症を誘導する化合物は抗痙攣剤である。別の実施形態においては、無痛覚症を誘導する化合物はガバペンチン（（１−アミノメチル）シクロヘキサン酢酸）またはプレガバリン（Ｓ−（＋）−４−アミノ−３−（２−メチルプロピル）ブタン酸）である。
【００６６】
いくつかの実施形態においては、変異体ニューブラスチンポリペプチドは、治療薬（抗ガン剤または抗ウイルス剤が含まれるがこれらに限定はされない）と組み合わせて投与される。抗ガン剤としては、タキソール、タキソテーレ、シスプラチン、ノコダゾール、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビンブラスチンが挙げられるがこれらに限定はされない。抗ウイルス剤としては、ｄｄＩ、ＤＤＣ、ｄ４Ｔ、フォスカネット、ダプソーン、メトロニダゾール、およびイソナイアジドが挙げられるがこれらに限定はされない。
【００６７】
３．痛覚の欠如の軽減のための処置
別の実施形態においては、本明細書中に開示される変異体ニューブラスチンポリペプチド（およびそれを含む薬学的組成物）は、神経障害に罹患している被験体の痛覚の欠如を軽減させるための方法において使用することができる。１つの実施形態においては、神経障害は糖尿病性神経障害である。いくつかの実施形態においては、痛覚の欠如は、熱痛覚の欠如である。この方法には、予防的処置と治療的処置の両方が含まれる。
【００６８】
予防的処置においては、変異体ニューブラスチンポリペプチドは、痛覚の欠如を生じるリスクがある被験体に投与される（このような被験体は、初期段階の神経障害を有している被験体と予想される）。このような状況下での変異体ニューブラスチンポリペプチドでの処置は、リスクのある患者を事前に処置するように作用する。
【００６９】
治療的処置においては、変異体ニューブラスチンポリペプチドは、神経障害の罹患の結果としての痛覚の欠如に悩まされている被験体に投与される（このような被験体は、後期段階の神経障害を有している被験体と予想される）。このような状況下での変異体ニューブラスチンポリペプチドでの処置は、被験体において適切な痛覚を回復させるように作用する。
【００７０】
４．ウイルス感染およびウイルス感染に伴う神経障害の処置
感染およびウイルスによる神経障害の予防的処置が想定される。予防的処置は、ウイルス感染の決定後であって、神経障害の痛みの発症の前に行われる。処置の間に、変異体ニューブラスチンポリペプチドが投与されて、神経障害の痛み（ハンセン病、ライム病に伴う神経障害の痛み、ウイルス、特に、ヘルペスウイルス（およびより具体的には、ヘルペス後の神経痛を引き起こし得る帯状疱疹ウイルス）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびパピローマウイルスからなる群より選択されるウイルスによる感染に伴う神経障害の痛みが含まれるがこれらに限定されない）の出現が防がれる。別の実施形態においては、変異体ニューブラスチンポリペプチドは、起こるであろう神経障害の痛みの重篤度を低下させるために投与される。
【００７１】
急性のウイルス感染の症状には、多くの場合に、発疹の出現が含まれる。他の症状としては、例えば、体の罹患した部分での持続的な痛みの発症が含まれ、これは、帯状疱疹感染（帯状疱疹）の一般的な合併症である。ヘルペス後の神経痛は、１ヶ月間またはそれ以上持続する場合があり、何らかの発疹のような症状が消えた数ヶ月後に現れる場合もある。
【００７２】
５．痛みを伴う糖尿病性神経障害の処置
痛みを伴う糖尿病性神経障害の予防的処置が想定される。糖尿病性神経障害の予防的処置は、糖尿病または糖尿病に伴う症状の最初の診断の決定後であって、神経障害の痛みの発症の前に、開始される。痛みを伴う糖尿病性神経障害の予防的処置はまた、被験体に糖尿病または糖尿病に伴う症状を発症するリスクがあることが決定されると開始される場合もある。処置の間に、変異体ニューブラスチンポリペプチドが投与されて、神経障害の痛みの出現が防がれる。別の実施形態においては、変異体ニューブラスチンポリペプチドは、すでに現れている神経障害の痛みの重篤度を低下させるために投与される。
【００７３】
６．神経系の障害の処置
本明細書中に開示される変異体ニューブラスチンポリペプチド（およびそれを含む薬学的組成物）は、被験体（例えば、ヒト）の神経系の障害の処置または予防において、その必要がある被験体に治療有効量の変異体ニューブラスチンポリペプチド、変異体ニューブラスチンポリペプチドを含む組成物、またはポリアルキレン部分（例えば、ＰＥＧ）に結合した安定な水溶性結合変異体ニューブラスチンポリペプチドを含む複合体を投与することによって使用することができる。
【００７４】
神経系の障害は、末梢神経系の疾患（例えば、末梢神経障害または神経障害の痛みの症候群）であり得る。ヒトが処置の好ましい被験体である。
【００７５】
変異体ニューブラスチンポリペプチドは、ニューロン（病変のニューロン、および損傷を受けたニューロンが含まれるがこれらに限定はされない）の中の欠損を処置するために有用である。外傷を受けた末梢神経としては、髄質の神経または脊髄の神経が挙げられるがこれらに限定はされない。変異体ニューブラスチンポリペプチドは、神経変性疾患（例えば、脳の虚血性神経損傷；神経障害（例えば、末梢神経障害、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮側索硬化症（ＡＬＳ））の処置に有用である。このような変異体ニューブラスチンポリペプチドは、記憶障害（例えば、認知症に伴う記憶障害）の処置に使用することができる。
【００７６】
以下は本発明の実施の例である。これらは、いかなる方法においても本発明の範囲の限定とは解釈されない。
【実施例】
【００７７】
実施例１：変異体ニューブラスチンポリペプチドの設計および合成
ヒトニューブラスチンを結晶化させ、互いに近い位置に接近している以下の４つのニューブラスチン残基：Ａｒｇ１４、Ａｒｇ４８、Ａｒｇ４９、およびＡｒｇ５１と相互作用する硫酸イオンの三者関係であるその構造を明らかにした。この三者構造の存在と、それらの相対的な互いの空間配置に基づいて、ニューブラスチンのこの領域がヘパリン硫酸結合ドメインである可能性があり得ると想定した。その後、先に解明されていたヘパリン硫酸構造を、硫酸塩の三者構造の部位でニューブラスチンに対してドッキングさせた（イン−シリコ）。ヘパリン硫酸はこの位置にきっちりとフィットし、このことは、ニューブラスチンの中のこの領域がヘパリン硫酸結合について可能性があることを示唆している。
【００７８】
ニューブラスチンの結晶化のデータによってまた、以下のアミノ酸残基によって硫酸イオンの三者構造、またはニューブラスチン：Ｓｅｒ４６、Ｓｅｒ７３、Ｇｌｙ７２、Ａｒｇ３９、Ｇｌｎ２１、Ｓｅｒ２０、Ａｒｇ６８、Ａｒｇ３３、Ｈｉｓ３２、およびＶａｌ９４と相互作用する３つの他の硫酸イオンの１つ以上との補助的な相互作用が提供されることも明らかになった。結晶構造によって明らかになった硫酸結合部位に加えて、ニューブラスチンには、そのＮ末端にある３位〜９位の残基にヘパリン硫酸結合部位コンセンサス配列（ＧＰＧＳＲＡＲ）が含まれる。この領域は、結晶構造に構造化されないが、グリコサミノグリカンの結合の際に秩序構造になる場合がある。この領域は結晶構造の中に観察される３つの硫酸クラスターに対して空間的におそらく近い（Ａｒｇ１４は、たいていの場合にタンパク質のヒンジ領域の中の中心にある、ヘパリン結合部位に寄与している）。
【００７９】
可能性のあるヘパリン硫酸結合ドメインの生物学的関連性を研究するために、３つの別々の１アミノ酸残基置換を、１１３アミノ酸の成熟ヒトニューブラスチン（配列番号１）の中に作製した。４８位（「Ａｒｇ４８Ｅ」と呼ばれる変異体、配列番号２）、４９位（「Ａｒｇ４９Ｅ」と呼ばれる変異体、配列番号３）、および５１位（「Ａｒｇ５１Ｅ」と呼ばれる変異体、配列番号４）のそれぞれのアルギニン残基を、硫酸塩を引き付けるものから硫酸塩を反発するものへ、そして周辺のアルギニン残基を潜在的に安定化させる残基変化へと変化させる意図で、グルタミン酸で置き換えた（すなわち、３種類の異なる１アミノ酸変異体構築物を調製した）。タンパク質を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）封入体によって折り畳ませ、これから精製した（ＷＯ０４／０６９１７６を参照のこと）。それぞれのニューブラスチン変異体を、構造の完全性を確認し、正確な残基の置換を確認するために分析した。全ての３つの変異体は、野生型ヒトニューブラスチンに構造的に似ていた。
【００８０】
実施例２：陽イオン性クロマトグラフィーおよびヘパリンセファロースクロマトグラフィー
変異体ニューブラスチンポリペプチドを、さらに生物学的分析を行い、ヘパリンの結合に対してそれぞれの変異が有している効果を決定した。ヘパリンセファロースと陽イオンクロマトグラフィーの両方を使用した。野生型のヒトニューブラスチンは、１１．３１の見かけのｐＩを有している塩基性タンパク質であるので、ニューブラスチンは陽イオン系の樹脂に効率よく結合する。アルギニンからグルタミン酸への１つの変換によって、見かけのｐＩは１０．８８に下がる。しかし、このｐＩの低下は、野生型の対照と比較して、陽イオン樹脂への結合を劇的に変化させることはなく、また、変異体の溶出プロフィールをもまた変化させることはないと予想された。
【００８１】
それぞれの変異体（野生型ニューブラスチンである対照とともに）について陽イオンクロマトグラフィーを行った。試料を、５ｍＭのリン酸塩（ｐＨ６．５）および１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む緩衝液中で樹脂上にロードし、その後、１５０ｍＭで始まり１Ｍで終わる塩化ナトリウムの直線的塩勾配で溶出させた。野生型ニューブラスチンは、約８００ｍＭの塩化ナトリウムで溶出し（図２Ａ；ピークＤ）、一方、３つの変異体のそれぞれは、およそ５００ｍＭの塩範囲で溶出した。したがってこれは、それらの低いｐＩを反映している。Ａｒｇ４９ＥとＡｒｇ５１Ｅ（図２Ａ；ピークＢおよびＣ）は、Ａｒｇ４８Ｅ（図２Ａ；ピークＡ）を溶出させるために必要であったよりもわずかに高い塩で溶出した（それぞれ、５２０ｍＭ対４９０ｍＭ）。この差は、Ａｒｇ４８がより表面に接近可能であり、他の２つの変異体よりも陽イオン結合により寄与していることを示唆している。
【００８２】
ＡｒｇからＧｌｕへの置換がヘパリン結合に対して効果があるかどうかを決定するために、３種類の変異体のそれぞれ（野生型のヒトニューブラスチンとともに）についてヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行った（図２Ｂ）。結合および溶出の条件は、陽イオンクロマトグラフィーに使用した結合および溶出の条件と同様とした。しかし、観察された溶出プロフィールは、陽イオン樹脂溶出プロフィールとは有意に異なっていた。野生型ニューブラスチンは、およそ７２０ｍＭの塩化ナトリウムで溶出し（図２Ｂ；ピークＨ）、一方、Ａｒｇ５１Ｅ、Ａｒｇ４９Ｅ、およびＡｒｇ４８Ｅは、それぞれ、５７０ｍＭ（図２Ｂ；ピークＧ）、５１０ｍＭ（図２Ｂ；ピークＦ）、および４５０ｍＭ（図２Ｂ；ピークＥ）の塩化ナトリウムで溶出した。Ａｒｇ４８Ｅは、ヘパリン結合に対して特に劇的な効果を有しているようであった。まとめると、これらのクロマトグラフィープロフィールは、それぞれの変異によって、ヘパリンに対するニューブラスチンの見かけの親和性が低下することを示唆している。
【００８３】
実施例３：陰イオンクロマトグラフィー
６．５の標準的なｐＨ条件、および１５０ｍＭの塩化ナトリウム濃度では、ニューブラスチンは陰イオン系樹脂には結合しない。対照的に、ヘパリン硫酸は、これらの同じ条件下で陰イオン系樹脂に結合する。
【００８４】
ニューブラスチンを、１６−ｋＤａのヘパリン硫酸と１：１のモル比であらかじめ混合し、そして上記の条件を使用して陰イオンマトリックスに載せると、ニューブラスチンは結合し、６００ｍＭの塩化ナトリウムで溶出した（図３Ｂ、「ＦＴ」と記したレーン）。これは、ニューブラスチンがヘパリン硫酸とのその相互作用を介して陰イオン系マトリックスに結合することを示唆している。ヘパリンが存在しない条件では、ニューブラスチンは陰イオン系樹脂には結合せず（図３Ａ，「ＦＴ」と記したレーン）、ニューブラスチンは６００ｍＭの塩化ナトリウムでは溶出しなかった（図３Ａ、「溶出」と記したレーン）。これらのデータは、ヘパリンに結合するニューブラスチンの能力のさらなる証拠を提供する。
【００８５】
実施例４：チャイニーズハムスター卵巣細胞結合実験
ニューブラスチンは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の表面に非特異的に結合することが以前に示されている。ニューブラスチンＣＨＯ細胞結合アッセイを、この相互作用が、細胞表面のヘパリン硫酸分子に対するニューブラスチンの結合によって少なくとも一部媒介されているかどうかを決定するために設定した。
【００８６】
野生型のヒトニューブラスチン（４０μｇ）またはＡｒｇ４８Ｅ変異体を、いずれの形態のニューブラスチンも漸増量の１６ｋＤａのヘパリン硫酸と完全に結合する細胞密度で、ＣＨＯ細胞（１０６細胞）と予め混合し、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を遠心分離によってペレット状にし、上清の中の残っている結合していないニューブラスチンについてＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析を行った。自動濃度測定によるそれぞれのタンパク質バンドの定量の後、得られた光学密度の値を、それぞれの試料中のヘパリン濃度に対してプロットした（図４）。
【００８７】
２つの低いヘパリン濃度では、野生型のニューブラスチンおよび変異体ニューブラスチンのいずれの形態も、上清の中で同定された等量のタンパク質を有していた。しかし、ヘパリン濃度が０．５μｇ／ｍｌおよびそれ以上に増大するにつれて、Ａｒｇ４８Ｅ変異体よりも多くの野生型のニューブラスチンが、上清の中で同定された。この観察は、ヘパリンが、野生型ニューブラスチンの結合について細胞表面に結合したヘパリンと競合することができることを示唆している（すなわち、野生型のニューブラスチンに対するヘパリンの結合によって細胞表面からのその除去が生じる）。一方、ヘパリンは、Ａｒｇ４８Ｅ変異体を容易に完全には除去することはできない。最も高いヘパリン濃度（５０μｇ／ｍｌ）では、Ａｒｇ４８Ｅ変異体は細胞表面を溶出させ始め、このことは、ヘパリンとＡｒｇ４８Ｅ変異体との間でのイオン性相互作用がこの観察に関係している可能性があることを示唆している。
【００８８】
実施例５：野生型ニューブラスチンおよび変異体ニューブラスチンポリペプチドのヘパリン結合
ニューブラスチンのヘパリン結合部位として同定されたアルギニンの三者構造の役割をさらに研究するために、ヘパリン結合ＥＬＩＳＡを設定した。簡単に説明すると、抗ニューブラスチンモノクローナル抗体を９６ウェルプレート上にコーティングし、その後、洗浄、およびニューブラスチンの１つの形態の添加を行った。その後、ビオチニル化ヘパリンをプレートに添加した。さらなる洗浄工程の後、ニューブラスチン／ヘパリン複合体を、化学発光基質を用いてストレプトアビジン−ＩＩＲＰ結合体を使用して同定した。このヘパリン結合ＥＬＩＳＡを使用して、野生型のヒトニューブラスチンの１１３アミノ酸の形態（配列番号１）と、１０４アミノ酸の形態（配列番号１の１０位から１３位のアミノ酸）の形態を、１アミノ酸置換（Ａｒｇ４８Ｅ、Ａｒｇ４９Ｅ、およびＡｒｇ５１Ｅ；配列番号２〜４）を含む変異体ニューブラスチンポリペプチド、さらには二重置換体（Ａｒｇ４８，４９Ｅ；配列番号５）に対して比較した。
【００８９】
野生型形態のニューブラスチンはいずれも、約１ｎｇ／ｍｌのヘパリンのＥＣ５０でヘパリンに結合した（図５）。Ａｒｇ４９ＥおよびＡｒｇ５１Ｅは低い効率で結合し、約１０ｎｇ／ｍｌの見かけのＥＣ５０を有していたが、最大結合は同じままであった（図５）。３種類の１点変異体のうち、Ａｒｇ４８Ｅがヘパリン結合に対して最も劇的な効果を有しており、約１００ｎｇ／ｍｌの見かけのＥＣ５０を有していたが、未修飾の形態のニューブラスチンと比較すると、同じ最大ヘパリン結合値がなおも得られた（図５）。Ａｒｇ４８Ｅ変異体は、したがって、未修飾のニューブラスチン形態と比較すると、ヘパリンへの結合においては１００倍効率が低く、他の１置換変異体と比較すると１０倍効率が低かった。Ａｒｇ４８およびＡｒｇ４９の両方をグルタミン酸で置換した場合には、ヘパリン結合はほぼ排除され、これによって、最大ヘパリン結合が７倍減少したが、ＥＣ５０は１点変異体の範囲の中に留まっていた。これらの結果は、Ａｒｇ４８が、推定されるヘパリン結合部位におけるその中心位置の理由からヘパリン結合において重要な役割を果たしていることを示唆している。
【００９０】
実施例６：野生型ニューブラスチンおよびヘパリン結合変異体のキナーゼ受容体活性化分析
ヘパリン結合部位変異体が細胞をベースとする生体アッセイにおいてニューブラスチン受容体によるシグナル伝達に対して効果を有しているかどうかを決定するために、変異体形態のニューブラスチンについて、野生型ニューブラスチンとともに、キナーゼ受容体活性化（ＫＩＲＡ）分析を行った。
【００９１】
ＡｒｇからＧｌｕへの１置換変異体のそれぞれは、ＫＩＲＡ活性に関して未修飾の対照と同じであるように見え、これは、これらの変異体が、野生型と構造的に類似しており、ニューブラスチン受容体およびシグナル伝達カスケードを活性化することができることを示唆している（図６）。さらに、これらのデータは、ニューブラスチンに対するヘパリン結合には、受容体の活性化は必要ない可能性があることを示唆している。
【００９２】
Ａｒｇ４８，４９Ｅ二重変異体（配列番号５；１１３アミノ酸の形態）についてＫＩＲＡ分析を行った場合には、その見かけのＥＣ５０は、野生型であるヒトニューブラスチンである対照と比較した場合には、その最大受容体活性化の増大に伴っておよそ１桁左にシフトした（図７Ａ）。同様に、Ａｒｇ４８，４９Ｅ二重変異体（配列番号７；１０４アミノ酸の形態）もまた、野生型ニューブラスチンと比較すると、高い効力を示した（図７Ｂ）。Ａｒｇ４８，５１ＥとＡｒｇ４９，５１Ｅ二重変異体（それぞれ、配列番号９および配列番号８；１１３アミノ酸の形態）はそれぞれ、ＫＩＲＡ活性に関して未修飾のニューブラスチンである対照と同様のようであった（図７Ｂ）。
【００９３】
実施例７：３成分複合体の分析
野生型のヒトニューブラスチンと個々のヘパリン変異体について、２つのわずかに異なるプロトコールを使用して３成分複合体分析を行った。第１のプロトコールでは、ニューブラスチンの受容体成分（ＧＦＲα３およびＲＥＴ）をプール中のニューブラスチンとともに混合し、その後、捕捉抗体でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに添加した（図８）。第２のプロトコールでは、これらの成分を、最初に添加したＧＦＲα３を含むＥＬＩＳＡプレートに対して連続して添加し、その後、ニューブラスチンを、そしてその後にＲＥＴを添加した（図９）。
【００９４】
これらの成分をプールとしてまとめて添加すると、最大結合は、Ａｒｇ４８ＥおよびＡｒｇ４８，４９Ｅのいずれを用いた場合にも得られ、このことは、これらのニューブラスチン形態がそれらの受容体に対して最も高い親和性を有していることを示唆している。野生型のニューブラスチンはＡｒｇ４９Ｅ変異体の親和性と同様の親和性で結合するようであり、一方、Ａｒｇ５１Ｅおよび三重変異体（Ａｒｇ４８、４９、および５１を全てグルタミン酸に置換した）は、最も弱い受容体結合を示した。
【００９５】
受容体成分を連続して添加した場合には、Ａｒｇ４８Ｅは最も高い受容体結合を示した。しかし、これらの条件下では、二重変異体は、その受容体に対して、Ａｒｇ５１Ｅ変異体と同様に見える親和性で弱く結合した。Ａｒｇ４９Ｅと野生型ニューブラスチンは、観察された最大結合と最小結合の間の中間の、受容体に対する親和性を有していた。三重変異体はこれらの条件下では結合しなかった。まとめると、これらのデータは、Ａｒｇ４８がその受容体に対するニューブラスチンの親和性に影響を与えることにおいて極めて重要な役割を担っていることを示唆している。
【００９６】
実施例８：近紫外光および遠紫外光ＣＤ分析
ニューブラスチンの二次構造および三次構造に対する二重変異の効果をさらに研究するために、Ａｒｇ４８，４９Ｅ二重変異体について、近紫外光および遠紫外光ＣＤ分析の両方を行った。微妙な差が二次構造と三次構造において検出されたが、二重変異体の立体構造は野生型ニューブラスチンの立体構造と極めてよく似ていた。
【００９７】
実施例９：ニューブラスチンＡｒｇ４８，４９Ｅ二重変異体の薬物動態分析
ヒトニューブラスチンは、ラットに静脈内（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）で投与した場合には乏しい薬物動態（ＰＫ）を示し、全体的な生体利用性は１％未満である。ヘパリンに基づくクリアランスは、この低い生体利用性の理由の１つであり得る。ヘパリンに基づくクリアランスがラットからのヒトニューブラスチンの迅速なクリアランスに関係しているかどうかを決定するために、Ａｒｇ４８，４９Ｅ二重変異体（野生型である対照とともに）についてＰＫ分析をおこなった。
【００９８】
いずれの形態も、７ｍｇ／ｋｇ  ＳＣでラットに別々に投与した。血清試料を、１時間で採取し始め、９６時間で終了し、ニューブラスチンについて分析した（図１０）。野生型ニューブラスチンについて観察された曲線下面積（ＡＵＣ）は約１０９であり、一方、二重変異体について観察されたＡＵＣは２０，１４５であった。これは、二重変異体のＡＵＣにおける１８５倍の増大（野生型ニューブラスチンと比較して）、血清暴露の有意な増加を示していた。
【００９９】
野生型ニューブラスチンおよび二重変異体ニューブラスチンの両方について、ＩＶ投与（１ｍｇ／ｋｇ）後にＰＫ分析をもまた行った。二重変異体の最初の血漿濃度は、注射の５分後には野生型対照（四角）よりもおよそ６倍高かった（菱形）が、これは１時間以内に迅速に野生型のレベルに近づいた（図１１）。これらのデータは、ニューブラスチンの中の二重変異が血清暴露の増大を助けるが、全体的なクリアランス速度には影響を及ぼさないことを示唆している。
【０１００】
ＳＣの観察をまとめると、ヘパリン結合は、ＳＣ投与後に特に関係があるようであるが、これによっておそらく、デポー様の効果が生じる。一旦、ニューブラスチンが循環に入ると、二重変異体分子および野生型分子がクリアランスされる速度はほぼ同じである。
【０１０１】
ニューブラスチンがラットの中の循環からクリアランスされる速度を調べるために、野生型の形態と二重変異体の形態のニューブラスチンの両方を、ＳＰＡをベースとするカップリング化学反応を使用して１０ｋＤａのＰＥＧでＰＥＧ化した。ニューブラスチンはホモ二量体であり、自然界に存在しているリジン残基を有していないので、１０ｋＤａ部分でそれぞれの単量体のアミノ酸末端を特異的に標識した。２×１０Ｋ  ＰＥＧ化ヒト二重変異体ニューブラスチンを均質になるように精製し、構造分析および生物学的分析、その後、ＰＫ分析を行った。
【０１０２】
２×１０Ｋ  ＰＥＧ  Ａｒｇ４８，４９Ｅ二重変異体を、ＩＶ（１ｍｇ／ｋｇ）またはＳＣ（７ｍｇ／ｋｇ）のいずれかでラットに注射し、分析のために種々の時点で血清を回収した。ＩＶ投与後、２×１０Ｋ  ＰＥＧ二重変異体は、１０μｇ／ｍｌの理論上のＣｍａｘに達し（菱形）、典型的なα期とβ期を有していた（図１２）。ＰＥＧ化した二重変異体のＳＣ投与は、２４時間の注射で４０ｎｇ／ｍｌのＣｍａｘを示した（図１２）。一旦、薬剤が循環に達すると、見かけのクリアランス速度はＩＶ用量のクリアランス速度と同等であった。この構築物の生体利用性は、非ＰＥＧ化またはＰＥＧ化した野生型ヒトニューブラスチンについての１％未満と比較して、およそ１０％であった。
【０１０３】
実施例１０：チャイニーズハムスター卵巣細胞の中でのニューブラスチンヘパリン結合変異体の発現
野生型ニューブラスチンをコードするプラスミド構築物と変異体ニューブラスチンをコードするプラスミド構築物をＣＨＯ細胞の中で発現させ、分泌された可溶性タンパク質の量をＥＬＩＳＡによって測定した。これらの実験で使用したプラスミド構築物は、（ｉ）野生型のヒトニューブラスチンのカルボキシ末端の１０４個のアミノ酸に対して、または（ｉｉ）Ａｒｇ４８，４９Ｅ二重変異体（１０４個のアミノ酸の形態）に対して融合させた、ヒト成長ホルモンシグナルペプチド（ＳｉｇＰｅｐ）（プラスミドの中に含まれるイントロンを含むもの、または含まないもの）を含む融合タンパク質をコードする。
【０１０４】
以下は、これらの実験で使用したニューブラスチン融合タンパク質のアミノ酸配列である。ニューブラスチン配列は大文字である。ヒト成長ホルモンシグナルペプチド配列は小文字である。シグナルペプチドとニューブラスチン配列の連結部分はカラット
【０１０５】
【化２−２】
2008510468.tif 000004
で示す。４８位および４９位のアミノ酸には下線を付けた。
【０１０６】
【化３】
2008510468.tif 000005
【０１０７】
【化４】
2008510468.tif 000006
ＣＨＯ細胞を上記の形態のニューブラスチンのそれぞれをコードするプラスミドでトランスフェクトし、３８４ウェルプレートの中で培養した。数週間後、増殖中の細胞を含むウェルを、新しい９６ウェル培養プレートに移した。馴化培地をＥＬＩＳＡによって分析して、可溶性ニューブラスチンの力価を測定した。試験したそれぞれのプラスミドについての累積吸光度のデータ（エラーバーとしての１標準偏差と共に平均値）を検出した。
【０１０８】
ＣＨＯ細胞の、Ａｒｇ４８，４９Ｅ二重変異体をコードするプラスミドでのトランスフェクションによって、野生型ニューブラスチンをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞と比較して、組み換え体タンパク質の高いレベルを示す細胞株の数の有意な増大が生じた（図１３）。
【０１０９】
個々のトランスフェクションによる主要な細胞株をさらに拡大させた。一定数の細胞を３日間培養し、そして、全細胞数、生存性、および力価を決定した。主要なＡｒｇ４８，４９Ｅ二重変異体細胞株から発現させられたニューブラスチンの力価は、主要な野生型ニューブラスチン細胞株のものよりもほぼ５倍高かった（図１４）。
【０１１０】
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と組み合わせて記載されているが、上記の記載は本発明を例示するように意図され、その範囲を限定するように意図されない。本発明は、添付の特許請求の範囲によって定義される。他の態様、利点、および変更は、以下の特許請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】図１は、野生型のヒトプレプロニューブラスチンポリペプチド（配列番号１０）、野生型のマウスプレプロニューブラスチンポリペプチド（配列番号１１）、および野生型のラットプレプロニューブラスチンポリペプチド（配列番号１２）のアラインメントである。左および右の垂直の線は、それぞれ、成熟形態の１１３アミノ酸と１０４アミノ酸の開始部位を示す。ＲＲＸＲヘパリン結合モチーフを四角で囲って示す。
【図２】図２Ａは、野生型ニューブラスチン（ピークＤ）と、３種類のＡｒｇからＧｌｕの１置換変異体（ピークＡ、Ｂ、およびＣ）の陽イオン溶出プロフィールを示す（傾斜した線は、カラムから溶出させられた任意の所定の容量について理論上の塩化ナトリウム濃度を示す）。データは、溶出した試料のＯＤ２８０値の表示である。図２Ｂは、野生型ニューブラスチン（ピークＨ）と、３種類のＡｒｇからＧｌｕの１置換変異体（ピークＥ、Ｆ、およびＧ）のヘパリンセファロース溶出プロフィールを示す（傾斜した線は、カラムから溶出させられた任意の所定の容量について理論上の塩化ナトリウム濃度を示す）。データは、溶出した試料のＯＤ２８０値の表示である。
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、ヘパリンの存在下（２Ａ）またはヘパリンが存在しない条件下（２Ｂ）での陰イオンクロマトグラフィーの後の野生型ニューブラスチンのＳＤＳ／ＰＡＧＥを示す写真である。
【図４】図４は、ニューブラスチンＣＨＯ細胞結合アッセイの結果を示すグラフである。ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよび濃度測定の後、野生型ニューブラスチンとＡｇｒ４８Ｅ変異体ニューブラスチンのバンドのＯＤ値を、それぞれの試料中のヘパリン濃度に対してプロットした。
【図５】図５は、野生型のヒトＮＢＮ１１３、野生型のヒトＮＢＮ１０４、Ａｒｇ４８Ｅ、Ａｒｇ４９Ｅ、Ａｒｇ５１Ｅ、およびＡｒｇ４８，４９Ｅを使用したヘパリン結合ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図６】図６は、野生型のラットＮＢＮ１１３、Ａｒｇ５１Ｅ、Ａｒｇ４８Ｅ、Ａｒｇ４９Ｅ、およびラットＮＢＮ１１３のＫＩＲＡ分析の結果を示すグラフである。
【図７】図７Ａは、野生型のヒトニューブラスチンとＡｒｇ４８，４９Ｅ変異体ヒトニューブラスチンのＫＩＲＡ分析の結果を示すグラフである。図７Ｂは、野生型のヒトニューブラスチン、Ａｒｇ４８，４９Ｅ変異体ヒトニューブラスチン（１０４アミノ酸の形態）、Ａｒｇ４８，５１Ｅヒトニューブラスチン（１１３アミノ酸の形態）、およびＡｒｇ４９，５１Ｅヒトニューブラスチン（１１３アミノ酸の形態）のＫＩＲＡ分析の結果を示すグラフである。
【図８】図８は、野生型ヒトニューブラスチン、Ａｒｇ４８Ｅ、Ａｒｇ４９Ｅ、Ａｒｇ５１Ｅ、Ａｒｇ４８，４９Ｅ、およびＡｒｇ４８，４９，５１Ｅニューブラスチンの形態の３成分複合体分析の結果を示すグラフである。
【図９】図９は、野生型ニューブラスチン、Ａｒｇ４８Ｅ、Ａｒｇ４９Ｅ、Ａｒｇ５１Ｅ、Ａｒｇ４８，４９Ｅ、およびＡｒｇ４８，４９，５１Ｅニューブラスチンの形態の３成分複合体分析の結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、１回のボーラスである７ｍｇ／ｋｇの皮下注射の後の、野生型ニューブラスチンと、Ａｒｇ４８，４９Ｅの薬物動態分析の結果を示すグラフである（ニューブラスチン血漿濃度は、ニューブラスチン検出ＥＬＩＳＡを使用して決定した）。
【図１１】図１１は、１回のボーラスである１ｍｇ／ｋｇの静脈内注射の後の、野生型ニューブラスチンと、Ａｒｇ４８，４９Ｅの薬物動態分析の結果を示すグラフである（ニューブラスチン血漿濃度は、ニューブラスチン検出ＥＬＩＳＡを使用して決定した）。
【図１２】図１２は、１回のボーラスである７ｍｇ／ｋｇの皮下注射（示されるデータは、１ｍｇ／ｋｇについて推定した）、および１ｍｇ／ｋｇを静脈内に投与した２×１０Ｋ  ＰＥＧ化Ａｒｇ４８，４９Ｅニューブラスチンの後の、２×１０Ｋ  ＰＥＧ化Ａｒｇ４８，４９Ｅニューブラスチンの薬物動態分析の結果を示すグラフである（ニューブラスチン血漿濃度は、ニューブラスチン検出ＥＬＩＳＡを使用して決定した）。
【図１３】図１３は、野生型ニューブラスチン、またはＡｒｇ４８，４９ＥをコードするプラスミドでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の中での相対的なニューブラスチンの発現レベルを示すグラフである。
【図１４】図１４は、Ａｒｇ４８，４９Ｅ二重変異体でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞株を導き、そして野生型ニューブラスチンでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を導くことにおける、相対的なニューブラスチンの発現レベルを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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