(57)【要約】式(I)の化合物が記載され、式中、R1 基は明細書に定義の通りであり、カンプトテシン分子の7位にてRGD配列を含むシクロペプチドとの縮合を含む。 該化合物は、インテグリン受容体αvβ3およびαvβ5に対する高親和性およびマイクロモル濃度でのヒト腫瘍細胞株に対する選択的細胞毒性活性の両方を有する。2008504235.tif 000017（I)
2008504235.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I)の化合物、そのN1-オキシド、ラセミ混合物、その単一エナンチオマー、その単一ジアステレオアイソマー、形態EおよびZ、その混合物、医薬上許容される塩：
【化１】
2008504235.tif 000013
(I)
［式中: 
iは、0または1;
R1は、基 -CH=N-(O)m-R2-Z-X-Y; 
ここで、 mは、0または1; 
R2 は以下からなる群から選択される： 直鎖状または分枝状 C1-C7 アルキレン、直鎖状または分枝状 C2-C7 アルケニレン、C3-C10 シクロアルキレン、C3-C10 シクロアルケニレン、C6-C14 アリーレン、アリーレン (C6-C14)-アルキレン (C1-C6)、アルキレン (C1-C6)-アリーレン (C6-C14)、O、N、Sからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含む芳香族または非芳香族複素環 (C3-C14)、ヘテロシクロアルキレン (O、N、Sからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含むC3-C10)-アルキレン (C1-C6)、アルキレン (C1-C6)-ヘテロシクロアルキレン (O、N、Sからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含むC3-C10); 下記式の基：-(CH2)m1-NR8-(CH2)n1-NR9-(CH2-CH2-CH2-NR9)p1-H ポリアミノアルキル、ここでm1およびn1は、同一であっても異なっていてもよく、2〜6の整数であり、p1は0〜3の整数である;
R8およびR9は、同一であっても異なっていてもよく、以下からなる群から選択される： H、直鎖状または分枝状 C1-C6 アルキル、Boc、Cbz; 単糖類、例えば、 6-D-ガラクトシル、または 6-D-グルコシル;上記の基はそれぞれ以下からなる群から選択される１以上の基によって置換されていてもよい ：CN、NO2、NH2、OH、SH、COOH、COO-(アルキル)(C1-C5)、CONH-(アルキル)(C1-C5)、SO3H、SO3-(アルキル)(C1-C5)、ここでアルキル 基は直鎖状または分枝状; ハロゲン原子; 
Zは、非存在、または-NH-、-CO-、-O-から選択される;
Xは、非存在、または以下からなる群から選択される： -COCHR3NH-、-COCHR6(CH2)n2R4-、-R4-CH2(OCH2CH2)n3OCH2R4-、-R4(Q)R4-、-R5[Arg-NH(CH2)n1CO]n4R5-、-R5-[N-グアニジノプロピル-Gly]n3R5-、-CON[CH2)n4NHR7]CH2-、ここでn1は2〜6の整数、n2は0〜5の整数、n3は0〜50の整数、n4は2〜7の整数; 
R3は、Hまたは-COOH、-CONH2、-NH2 または-OHによって置換されていてもよい直鎖状または分枝状 C1-C4 アルキル; C6-C14 アリール; 
R4 は、以下からなる群から選択される：-NH-、-CO-、-CONH-、-NHCO-;
R5は、非存在または-R4(Q)R4-;
R6は、水素原子、または、-NH2;
R7は、水素原子または直鎖状または分枝状 (C1-C4) アルキル;
Q は以下からなる群から選択される： 直鎖状または分枝状 C1-C6 アルキレン; 直鎖状または分枝状 C3-C10 シクロアルキレン; 直鎖状または分枝状 C2-C6 アルケニレン; 直鎖状または分枝状 C3-C10 シクロ-アルケニレン; C6-C14 アリーレン; アリーレン (C6-C14)-アルキレン; (C1-C6),アルキレン (C1-C6)-アリーレン (C6-C14); O、N、Sからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含む 芳香族または非芳香族 ヘテロサイクリル (C3-C14); 
Yは、
式 c(Arg-Gly-Asp-AA1-AA2)、
ここで:
cは、環状を意味する; 
AA1 は、以下からなる群から選択される：(D)-Phe、(D)-Trp、(D)-Tyr、(D)-2-ナフチルAla、(D)-4-terブチル-Phe、(D)-4,4'-ビフェニル-Ala、(D)-4-CF3-Phe、(D)-4-アセチルアミン-Phe; 
AA2 は、以下からなる群から選択される：NW-CH[(CH2)n7-CO]-CO、NW-CH[(CH2)n5-NH]-CO、NW-[4-(CH2)n5-CO]-Phe、NW-[4-(CH2)n5-NH]-Phe、[NW]-Gly、NW-Val、ここでWは、H、直鎖状または分枝状 C1-C6 アルキル、-(CH2)n5-COOHから選択され、ここでn7は0〜5の整数、4-カルボキシベンジル、4-アミノメチルベンジル］。 
【請求項２】
mが1である、請求項1の化合物。
【請求項３】
R2がアルキレンであり、ZおよびXが非存在である、請求項2の化合物。
【請求項４】
X = R4CH2(OCH2CH2)n3OCH2R4]である、請求項2の化合物。
【請求項５】
下記式を有する請求項 3の化合物、そのN1-オキシド、ラセミ混合物、その単一エナンチオマー、その単一ジアステレオアイソマー、形態EおよびZ、その混合物、医薬上許容される塩。
【化２】
2008504235.tif 000014
【請求項６】
下記式を有する請求項 3の化合物、そのN1-オキシド、ラセミ混合物、その単一エナンチオマー、その単一ジアステレオアイソマー、形態EおよびZ、その混合物、医薬上許容される塩。
【化３】
2008504235.tif 000015
【請求項７】
下記式を有する請求項 4の化合物、そのN1-オキシド、ラセミ混合物、その単一エナンチオマー、その単一ジアステレオアイソマー、形態EおよびZ、その混合物、医薬上許容される塩。
【化４】
2008504235.tif 000016
【請求項８】
以下のように行われる請求項1-7の化合物の調製方法:
7-CP-CH=N-(O)m-R2-Z1-X1 + Y1
ここで、7-CPは、7-置換カンプトテシンの多環構造を表し、Z1、X1およびY1はそれぞれ最終的に適宜に官能化および/または保護される式Iで定義した基Z、XおよびYを表す。
【請求項９】
活性成分として、請求項1-7の少なくとも１つの化合物を、少なくとも１つの医薬上許容される賦形剤 および/または媒体と混合して含む医薬組成物。
【請求項１０】
医薬の調製のための請求項1-7の化合物の使用。
【請求項１１】
トポイソメラーゼ1阻害活性を有する医薬の調製のための請求項1-7の化合物の使用。
【請求項１２】
抗癌活性を有する医薬の調製のための請求項11の使用。
【請求項１３】
該医薬が、非小細胞および小細胞肺癌、結腸直腸腫瘍、前立腺癌、神経膠芽腫および神経芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、消化器癌、肝臓癌、カポジ肉腫、腎臓癌、肉腫および骨肉腫、精巣癌、乳癌、膵臓癌、黒色腫、膀胱癌および頭頸部癌の治療に有用である、請求項12の使用。
【請求項１４】
転移形態の予防または治療に有用な医薬の調製のための請求項1-7の化合物の使用。
【請求項１５】
抗寄生虫活性を有する医薬の調製のための請求項11の使用。
【請求項１６】
抗ウイルス活性を有する医薬の調製のための請求項11の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、RGD 配列を含むシクロペプチドおよびカンプトテシン誘導体からなる、細胞毒性活性を有する化合物、その調製方法、その医薬としての使用およびそれを含む組成物に関する。
【０００２】
特に、本発明に記載する化合物は、インテグリンαvβ3およびαvβ5に対する高親和性と、マイクロモル濃度でのヒト細胞株に対する選択的細胞毒性活性との両方を備えている。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
化学療法用抗癌薬は、治療濃度域が非常に制限された薬剤である。実際、それらの細胞毒性活性は非選択的であるため、それらはそれらが接触した体の細胞のすべてに無差別に損傷を与え得る。
【０００４】
現在、薬剤の活性を健康な周囲組織の細胞には損傷を与えずに発揮させ、あるいは少なくとも可能な限り損傷を制限する、選択的に腫瘍細胞に向かわせる細胞毒性薬の問題が存在している。
【０００５】
文献によると、選択的シクロペプチドの使用により（その参照化合物はシクロペンタペプチド c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val)とされている）(JACS 1997、119、1328-35; 国際特許出願 WO 97/06791)、あるいはモノクローナル抗体の使用により(Cell、1994、79、1157-64)、インテグリンαvβ3およびαvβ5をブロックすることにより、血管新生が抑止され、腫瘍増殖が低減されることが報告されている。さらに、抗転移作用も観察されている(J. Clin. Invest.、1995、96、1815)。Brooks et al.(Science、1994、264、569-71)は、腫瘍脈管構造の内皮細胞および腫瘍細胞自体が、正常組織の静止状態の細胞と比較してインテグリン αvβ3を優先的に発現することを報告している。臨床開発の発展段階にある化合物のなかで、本発明者らは、c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-MeVal)、またはEMD121974またはシレンギチド(cilengitide)に言及しうる。
【０００６】
Ruoslatiおよびその同僚ら(Current Opinion in Oncology、1998、10、560-5)は、腫瘍内皮に結合するRGD アナログは、細胞毒性薬であるドキソルビシンと一度接合すると、ドキソルビシンのみよりもより有効かつ低毒性の化合物を形成することを示した。かかる著者らは、結合が遊離のペプチド自体によりアンタゴナイズされるため、合理的疑いの余地無く、その効果はRGDとの接合に起因することを示した (Arap、Pasqualini and Ruoslati、Science、1998、279、377-380)。後に、同著者らはアポトーシス促進性ペプチド配列のRGD アナログへの化学的結合についての別の実験を行い、その新規化合物が血管新生内皮細胞に対して選択的に毒性であり、マウスにおいて抗癌活性を有することを示した (Ruoslati、Nature Medicine、1999、5、1032-8)。
【０００７】
Marcus et al.は国際特許出願 WO 01/17563において、１以上のアミノ酸からなるスペーサーによって、インテグリンαvβ3およびαvβ5.の非ペプチド性阻害剤アンタゴニストに接合したカンプトテシンなどの細胞毒性薬についての特異的抗癌活性について記載している。
【０００８】
Aoki et al.は、Cancer Gene Therapy、2001、8、783-787において、RGD 配列に接合したヒスチジル化(histidylated)オリゴリシンの特異的抗癌活性について記載しており、マウスにおける腫瘍に対するホーミング(homing)効果を明らかにした。
【０００９】
インテグリンにより媒介される細胞表面での結合の概念は遺伝子輸送に関して提案されている (Hart、et al.、J. Biol. Chem.、1994、269、12468-12474)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このたび、任意に好適なスペーサーによって、RGD 配列を含むシクロペプチド誘導体に接合した7-イミノメチルまたは7-オキシメチル カンプトテシン誘導体が、強い選択的な抗癌活性を有しており、腫瘍の治療のための医薬の調製に有利なことに使用できることが見いだされた。
【００１１】
腫瘍細胞に対する選択的細胞毒性活性のため、本発明による化合物により、副作用が少ないか、あるいは重篤ではない医薬が提供される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の説明
本発明の目的は、RGD配列を含むシクロペプチド誘導体に接合したカンプトテシン誘導体である。その結果得られる分子は、元のカンプトテシンの細胞毒性と、非接合シクロペプチドについて観察されるものと匹敵する親和性を有するインテグリン結合特性の、両方を変化させずに保持している。この組合せの結果は、αvβ3 および αvβ5 型のインテグリンを大量に発現する細胞における細胞毒性薬の集中に有利である(ホーミング(homing))。この細胞毒性薬は酵素または加水分解作用を介して接合形態および/または遊離形態においてその細胞内活性を発揮する。
【００１３】
本発明の目的は式(I)の化合物、そのN1-オキシド、ラセミ混合物、その単一エナンチオマー、その単一ジアステレオアイソマー、EおよびZ形態、それらの混合物、医薬上許容される塩である: 
【化１】
2008504235.tif 000003
(I)
［式中: 
iは、0または1;
R1は、基 -CH=N-(O)m-R2-Z-X-Y; 
ここで、mは、0または1; 
R2は、以下からなる群から選択される： 直鎖状または分枝状 C1-C7 アルキレン、直鎖状または分枝状 C2-C7 アルケニレン、C3-C10 シクロアルキレン、C3-C10 シクロアルケニレン、C6-C14 アリーレン、アリーレン (C6-C14)-アルキレン (C1-C6)、アルキレン (C1-C6)-アリーレン (C6-C14)、O、N、Sからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含む芳香族または非芳香族複素環 (C3-C14)、ヘテロシクロアルキレン (O、N、Sからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含むC3-C10)-アルキレン (C1-C6)、アルキレン (C1-C6)-ヘテロシクロアルキレン (O、N、Sからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含むC3-C10); 式-(CH2)m1-NR8-(CH2)n1-NR9-(CH2-CH2-CH2-NR9)p1-Hのポリアミノアルキル基、ここで、m1およびn1は、同一であっても異なっていてもよく、0〜6の整数である; 
R8およびR9は、同一であっても異なっていてもよく、以下からなる群から選択される：H、直鎖状または分枝状 C1-C6 アルキル、Boc、Cbz; 単糖類、例えば、6-D-ガラクトシル、または6-D-グルコシル; 上記基はそれぞれ以下からなる群から選択される１以上の基によって置換されていてもよい：CN、NO2、NH2、OH、SH、COOH、COO-(アルキル)(C1-C5)、CONH-(アルキル)(C1-C5)、SO3H、SO3-(アルキル)(C1-C5)、ここでアルキル基は直鎖状または分枝状;ハロゲン原子; 
Zは、非存在、または-NH-、-CO-、-O-から選択される;
X は、非存在、または以下からなる群から選択される： -COCHR3NH-、-COCHR6(CH2)n2R4-、-R4-CH2(OCH2CH2)n3OCH2R4-、-R4(Q)R4-、-R5[Arg-NH(CH2)n1CO]n4R5-、-R5-[N-グアニジノプロピル-Gly]n3R5-、-CON[CH2)n4NHR7]CH2-、ここで、n1は、2〜6の整数、n2は、0〜5の整数、n3 は、0〜50の整数、n4は、2〜7の整数; 
R3は、Hまたは-COOH、-CONH2、-NH2または-OHによって置換されていてもよい直鎖状または分枝状 C1-C4 アルキル; C6-C14 アリール; 
R4は、以下からなる群から選択される： -NH-、-CO-、-CONH-、-NHCO-;
R5は、非存在または-R4(Q)R4-;
R6は、水素原子または、-NH2;
R7は、水素原子または直鎖状または分枝状 (C1-C4) アルキル;
Q は以下からなる群から選択される: 直鎖状または分枝状 C1-C6 アルキレン; 直鎖状または分枝状 C3-C10 シクロアルキレン; 直鎖状または分枝状 C2-C6 アルケニレン; 直鎖状または分枝状 C3-C10 シクロ-アルケニレン; C6-C14 アリーレン; アリーレン (C6-C14)-アルキレン; (C1-C6),アルキレン (C1-C6)-アリーレン (C6-C14); O、N、Sからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含む芳香族または非芳香族ヘテロサイクリル (C3-C14);
Yは、式 c(Arg-Gly-Asp-AA1-AA2)、ここで:
cは環状を意味する; 
AA1 は、以下からなる群から選択される：(D)-Phe、(D)-Trp、(D)-Tyr、(D)-2-ナフチルAla、(D)-4-terブチル-Phe、(D)-4,4'-ビフェニル-Ala、(D)-4-CF3-Phe、(D)-4-アセチルアミノ-Phe; 
AA2 は、以下からなる群から選択される：NW-CH[(CH2)n7-CO]-CO、NW-CH[(CH2)n5-NH]-CO、NW-[4-(CH2)n5-CO]-Phe、NW-[4-(CH2)n5-NH]-Phe、[NW]-Gly、NW-Val、ここでWはH、直鎖状または分枝状 C1-C6 アルキル、-(CH2)n5-COOHから選択され、ここでn7は0〜5の整数、4-カルボキシベンジル、4-アミノメチルベンジル］。
【００１４】
本発明はまた、上記式(I)の化合物の調製方法を提供する。
【００１５】
本発明は、医薬、特にトポイソメラーゼI阻害剤として有用な医薬のための活性成分としての上記一般式(I)の化合物の使用を含む。トポイソメラーゼI阻害に起因する治療用途のなかでも、本発明者らは腫瘍および寄生虫またはウイルス感染に言及する。
【００１６】
特定の薬理学的特性があるため、式(I)の化合物はまた、腫瘍およびその転移形態の治療用医薬の調製に有用である。
【００１７】
本発明はまた、少なくとも１つの 医薬上許容される媒体および/または賦形剤と混合して、活性成分として式(I)の化合物を含む医薬組成物も含む。
【００１８】
本発明による化合物は、7位にて官能化された、カンプトテシン分子と、Arg-Gly-Asp配列を含むシクロペプチドとの縮合の結果得られる。この構造的組合せは、αvβ3 および αvβ5 型のインテグリンを高発現する細胞に細胞毒性薬 (カンプトテシン)を集中させやすいという利点を有する。細胞毒性薬はその活性を、酵素または加水分解作用を介して接合形態および/または 遊離形態において発揮する。
【００１９】
上記式(I)に示される様々な官能基および残基の定義、ならびに医薬上許容される塩の定義は、化学分野の当業者の周知技術の範囲内であり、特定の定義は必要ではない。しかしながら、かかる基への言及は、例えば本出願人名義で出願した国際特許出願WO 00/53607(抗腫瘍活性を有するカンプトテシン誘導体)、WO 03/101995(修飾ラクトン環を有するカンプトテシン; i=1)およびWO 03/101996(カンプトテシンの20位におけるエステル)などの技術および特許文献においてみることが出来る。
【００２０】
好ましい化合物の第一の群は、m = 1である式(I)の化合物からなる。
【００２１】
この第一の群において、R2は好ましくはアルキレンであり、より好ましくはメチレンまたはエチレンであり、Xは非存在である。
【００２２】
好ましい化合物の別の群は、X = R4CH2(OCH2CH2)n3OCH2R4]である式(I)の化合物からなる。
【００２３】
本発明によるもっとも好ましい化合物は以下のものである:
【化２】
2008504235.tif 000004
以下、ST2686と称する; 
【化３】
2008504235.tif 000005
以下、ST2724と称する；
【化４】
2008504235.tif 000006
以下、ST2742と称する。
【００２４】
式(I)の化合物は、本発明による好ましい化合物について以下に記載され、例証されている方法によって調製することが出来る。この方法は本発明のさらなる目的を構成する。
【００２５】
基本的に、本発明の目的である式(I)の化合物は、その五環系構造を簡略して本明細書においては略語CPによって示す、7位にて好適に官能化されたカンプトテシンと、シクロペプチド誘導体 Y1との、縮合によって調製することが出来る。
【００２６】
縮合反応は以下のスキームによって行うことが出来る:
7-CP-CH=N-(O)m-R2-Z1-X1 + Y1
ここで、7-CPは7-置換カンプトテシンの多環構造 を表し、Z1、X1およびY1はそれぞれ、式Iの接合化合物が得られるように、最終的に適当に官能化および/または保護されている、式Iにおいて定義した基Z、XおよびYを表す。
【００２７】
7-CP 誘導体は公知のアプローチ、例えば、 EP1044977、またはJ. Med. Chem. 2001、44、3264-3274、S.Dallavalle et alに記載のアプローチを用いて得られ、縮合反応は常套方法、例えば、Journal of Controlled Release 2003、91、61-73; S.S. Dharap et al.; Journal of Medicinal Chem. 2003、46、190-3、R.Bhattに記載の方法を用いて実施できる。
【００２８】
シクロペプチド Y1 は実施例1〜6に記載のように常套のペプチド合成技術にしたがって調製することが出来る。 
【００２９】
所望のシクロペプチドが得られると、それは保護形態において縮合反応に用いられ、保護基は最終化合物が得られた後に除去する。脱保護は、公知方法、例えば、純粋なトリフルオロ酢酸の使用による酸性条件または塩素化有機溶媒の存在下で行われる。
【００３０】
カンプトテシン誘導体 7-CP-CH=N-(O)m-R2-Z1-X1は、当業者にとって技術常識である方法を用いて得られる。
【００３１】
重要な中間体はアミノ(アルコキシ)-イミノメチル-カンプトテシンであり、その調製方法はWO 03/101995および WO 03/101996に記載されており、上記特許EP 1 044 977に記載の反応と類似の反応により7-ホルミルカンプトテシンから出発する
【００３２】
7-ホルミルカンプトテシンは公知の化合物であり、その調製は特許出願 WO 00/53607およびそれに引用される文献に記載されており、特に、N1-オキシドの調製も記載されている。
【００３３】
Dallavalle S.、et al.、Bioorg. Med. Chem. Lett.、2001、11(3): 291-4; Dallavalle S.、et al.、J.Med.Chem.、2000、43(21): 3963-9も参照されたい。
【００３４】
Y(-COOH) 化合物は新規であり、特に式(I)の化合物の調製のための中間体として、本発明のさらなる目的を構成する。
【００３５】
本発明に記載される化合物は、トポイソメラーゼI阻害剤であり、それゆえ医薬、特に該トポイソメラーゼの阻害により恩恵を受ける疾患の治療用医薬として有用である。特に、本発明による化合物は抗増殖活性を示し、それゆえその治療特性のために使用され、そして医薬組成物における製剤のために好適なものとする物理化学的特性を有する。
【００３６】
医薬組成物は、例えば、有意な治療効果をもたらす量の少なくとも１つの 式(I)の化合物を活性成分として含む。本発明による組成物は完全に常套のものであり、医薬業界において慣行である方法を用いて得られる。選択した投与経路に応じて、組成物は経口、非経口または静脈内投与に好適な固体または液体形態であろう。本発明による組成物は、活性成分とともに、少なくとも１つの医薬上許容される媒体または賦形剤を含む。特に有用なものは、製剤補助剤、例えば、可溶化剤、分散剤、懸濁剤または乳化剤であり得る。 
【００３７】
式(I)の化合物は、例えば抗癌薬または抗寄生虫または抗ウイルス活性を有するその他の薬物といったその他の活性成分と組み合わせて、別々の形態および単一用量形態のいずれにおいても用いることが出来る。
【００３８】
本発明による化合物は例えば以下において、抗癌活性を有する医薬として有用である：非小細胞癌(non-microcytoma)および小細胞肺癌、または結腸直腸癌または 前立腺癌、神経膠芽腫および神経芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、消化器癌、肝臓癌、カポジ肉腫、腎臓癌、肉腫および骨肉腫、精巣癌、乳癌、膵臓癌、黒色腫、膀胱癌および頭頸部癌。本発明による化合物により得られる利益の１つは、分子のカンプトテシン部分に固有の抗トポイソメラーゼ活性と、分子のシクロペプチド部分によって提供されるインテグリン阻害活性の組合せである。その結果、本発明による化合物により可能な組合せ作用は、腫瘍学分野における当業者に有益であると認識される。実際、Arg-Gly-Asp 配列を含むシクロペプチド部分は、分子をインテグリンを発現する腫瘍に向かわせるだけでなく、いったん標的に到達すると、分子の細胞毒性部分のインターナリゼーションからインテグリン阻害活性に及ぶ多様な機能を発揮することが出来、その結果、特に腫瘍血管新生の阻害に関する利益がもたらされる。シクロペプチド部分も、いったんカンプトテシン部分と離れると、腫瘍部位から離れた部位にて作用を発揮することが出来、それゆえ本発明による化合物は、転移形態の予防または治療において有用である。
【００３９】
本発明の目的である医薬はまた、寄生虫疾患の治療においても有用であり得る。
【００４０】
以下の実施例により本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００４１】
使用した略語は以下の通りである: 
Aad (アミノアジピン酸); 
Amb (アミノメチルベンジル); 
Amp (アミノメチルフェニルアラニン); 
Boc (ter-ブトキシカルボニル); 
CSA (カンファースルホン酸); 
CTH (触媒的移動水素化); 
DCC (ジシクロヘキシルカルボジイミド); 
DCM (ジクロロメタン); 
DIEA (ジイソプロピルエチルアミン); 
DMF (ジメチルホルムアミド); 
Fmoc (9-フルオレニルメチルオキシカルボニル); 
HOBT (ヒドロキシベンゾトリアゾール); 
NMP (N-メチル-ピロリドン); 
Pht (フタロイル); 
Pmc (ペンタメチルクロマン-6-スルホニル); 
ST1968 (2-アミノエトキシイミノメチル-カンプトテシン)
TBTU(テトラフルオロボラート-O-ベンゾトリアゾール-1-イル-テトラメチルウロニウム);
TFA (トリフルオロ酢酸)。
【００４２】
実施例 1
c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Amp) (保護された ST2581) の合成
1.587 mmolの Fmoc-Gly-Res (Res = Sasrin 樹脂（登録商標）、Bachem)を30 分間撹拌しながら75 mlの DMFに懸濁し、その後 18 mlの ピペリジンを添加しさらに30 分間撹拌を続けた。ろ過し、DMFで洗浄した樹脂を、50 mlの NMP (N-メチル-ピロリドン)に15 分間懸濁した。その後 Fmoc-Arg(Pmc)-OH、HOBT、TBTU および DIEAを添加した(各3.174 mmol); 2 時間の撹拌の後、懸濁液をろ過し、DMFで洗浄した。ピペリジンによる脱保護の後、連続してそれぞれ上記のように行う次のアミノ酸とのカップリングを繰り返した。即ち: Fmoc-Amp(Cbz)-OH、Fmoc-D-Phe-OH、および Fmoc-Asp(OtBu)-OH。Fmoc-N-末端の最後の脱保護の後、直鎖状ペンタペプチドをDCM中の45 mlの 1％ TFAを用いて樹脂から遊離させた。これをおよそ1 lのCH3CNに溶解し、4.761 mmolの HOBT および TBTU および 10 mlの DIEAを添加した;溶液を30 分間撹拌しながら維持し、溶媒を蒸発させて少容量とし、生成物の沈降を水を用いて完了した。ろ過した粗生成物を27 mlの MeOH および DMFの1:1混合物に溶解した; 5 mmolのアンモニウムホルミエート および 0.55 gの10％ Pd/Cを添加し、室温で30 分間撹拌しながら放置した。懸濁液をセライトでろ過し、乾燥させた。 残渣を分取 RP-HPLC (カラム: Alltima（登録商標）C-18、Alltech; 移動相水中50％ CH3CN + 0.1％ TFA; 保持時間 (Rt) = 9.13 分間)により精製した。483 mgの白色粉末を得た。
【００４３】
1H-NMR (DMSO-d6) δ8.3、8.07、8.04、7.90、7.80、7.33、7.15、7.07、4.62、4.50、4.35、4.12、4.01、3.15、3.03、2.96-2.65、2.58、2.48、2.32、2.02、1.75、1.50、1.35、1.23
【００４４】
分子量 (Maldi-Tof): 973
【００４５】
実施例 2
c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Aad)  (保護された ST2650) の合成
0.69 mmolの Fmoc-Gly-Resを実施例 1に記載のようにして処理し、ただしこの場合、第３および第４アミノ酸をジペプチド Fmoc-D-Phe-Aad(OBzl)-OH の形態で添加した。CTHによる脱保護、および粗生成物の分取 RP-HPLC (移動相: 水中 66％ CH3CN + 0.1％ TFA; Rt = 17.29 分間)による精製の後、187 mgの 純粋なペプチドを得た。
【００４６】
1H-NMR (DMSO-d6) δ 7.23、4.58、4.20-3.90、3.28、3.05、2.99、2.85、2.74-2.35、2.15、2.05、1.85-1.25.
【００４７】
分子量 (Maldi-Tof): 940
【００４８】
実施例 3
c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-N-Me-Amp)  (保護された ST2700) の合成
還流している無水トルエン中のFmoc-Phe(4-Pht-N-CH2)-COOHの懸濁液に、2 当量のCSAおよび20 当量のパラホルムアルデヒドを添加し、15 分の間隔で4 部に分けた。混合物を放置して冷却し、120 mlの トルエンで希釈し、5％ NaHCO3 および水で洗浄した。溶媒の蒸発後、残渣を15 mlの CHCl3 + 15 mlの TFA + 700 μlの Et3SiHに溶解した; 混合物を暗所で42 時間放置して撹拌した。溶媒の蒸発後、残渣をシリカゲルでのろ過により精製した。総収率: 90％
【００４９】
直鎖状ペプチドを実施例 1に記載のように固相で合成し、上記のように調製した第３ アミノ酸としてのFmoc-N-Me-Phe-(4-Pht-N-CH2)-COOHを挿入した。この場合は樹脂でのN-Fmoc-末端の脱保護をDMF中の溶液中の30％ ジイソプロピルアミン (300 当量) を用いて行った(フタルイミドが存在したため)。閉環後、500 mgのペプチドを10 mlの熱い無水 EtOHに溶解し、それに、エタノール中の0.9 mlのNH2-NH2・H2O 1 M溶液を添加した。還流しながら2 時間加熱した後、溶媒を蒸発させ、残渣を10 mlの DCM + 10 mlの Na2CO3 溶液で激しく撹拌しながら処理した。粗最終生成物を有機相から回収し、蒸発後、分取 RP-HPLC (移動相: 水中52％CH3CN + 0.1％ TFA; Rt = 10 分間)により精製した。
【００５０】
1H-NMR (CDCl3) δ 8.29-7.66、7.38-7.07、4.95-4.77、4.09、3.41、3.05-2.81、2.51、2.05、1.74、1.40、1.26
【００５１】
分子量 (Maldi-Tof): 987
【００５２】
実施例 4
c[Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Amp(CO-(CH2)2 -COOH)] (保護された ST2649)の合成
120 mgのシクロペプチド c[Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Amp]・TFA (実施例 1に記載のように調製)を3.6 mlの DCM-DMFの2:1混合物に、化学量論の TEA および 無水コハク酸とともに溶解した。1 時間後、反応混合物を30 mlの DCMで希釈し、水で洗浄した。有機相を、乾燥させ濃縮し、100 mgの 純粋な生成物の残渣を得た。
【００５３】
分析 RP-HPLC: カラム: Purosphere STAR（登録商標）、Merck; 移動相: 水中 45％ CH3CN + 0.1％ TFA; Rt = 13.17 分間
【００５４】
1H-NMR(DMSO-d6) δ 8.20-7.75、7.19-7.02、4.58、4.45、4.36、4.30、4.20、4.05、3.00、2.97-2.57、1.83、1.62、1.32
【００５５】
分子量 (Maldi-Tof): 1073
【００５６】
実施例 5
c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-N-Amb-Gly)  (保護された ST2701) の合成
6 mlの THF中の1-22 mmolの Boc-一保護 p-キシリレンジアミンの溶液に、1.83 mmolの TEAを添加し、2 mlの THF中の1.22 mmolの ベンジル ブロモアセテートの溶液を滴下した。混合物を撹拌しながら一晩放置し、その後、溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュカラム (CHCl3-EtOAc、9:1)で精製した。0.69 mmolの N-(4-Boc-NH-CH2-ベンジル)-グリシン ベンジルエステルを得た。
【００５７】
250 mgの Fmoc-D-Phe-OHを27 mlの DCMに溶解し、40 μlの ジホスゲン および 230 μlの sym-コリジンを添加した; 15 分後、190 mgの先に調製したエステルを添加し、3 mlの DCMに溶解した。3 時間後、80 μlの N-Me-ピペラジンを反応混合物に添加し、10 分間撹拌し、その後混合物を10 mlの DCMで希釈し、抽出を水、HCl 0.5N、水、5％ NaHCO3 および 水により行った。溶媒の蒸発後、残渣をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー (DCM-EtOAc、9:1)により精製した。収率: 80％
【００５８】
こうして得た6 mlの MeOHに溶解した100 mgの生成物に、76 μlの AcOH および 42 mgの HCOONH4を添加し、混合物を0℃に冷却し、50 mgの 10％ Pd/Cを添加した。30 分後、反応混合物をセライトでろ過した。ろ液を乾燥させ、フラッシュカラム (CHCl3-MeOH 9:1) で精製した。収率:90％
【００５９】
こうして得た190 mgの生成物を1.2 mlの TFAに溶解し、乾燥させた (Bocの脱保護); 残渣を9 mlの 10％ Na2CO3 + 6 mlの ジオキサンに再溶解し、0℃に冷却し、3 mlの ジオキサンで希釈した120 μlの ベンジルオキシカルボニルクロリド溶液を滴下した。室温で1 時間撹拌後、減圧下で蒸発を行い、少容量とし、その後混合物を水で希釈し、pHをHClにより1に下げ、抽出をEtOAcにより行った。溶媒の蒸発後、残渣をシリカゲルでのろ過により精製し、CHCl3-MeOH (8:2)で洗浄した。純粋なジペプチド収率: 82％
【００６０】
0.69 mmolの Fmoc-Gly-Resを実施例 1に記載のように処理し、Argの後、先に調製した ジペプチド Fmoc-D-Phe-N(4-Cbz-NH-CH2-ベンジル)-Glを順に添加した。CTHによるCbzの脱保護の後、粗生成物 c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-N-Amp-Gly) を分取 RP-HPLC (移動相: 水中50％ CH3CN + 0.1％ TFA; Rt = 10.5 分間)により精製した。
【００６１】
1H-NMR (DMSO-d6) δ 8.29-7.66、7.44-6.90、5.15、4.72-4.18、4.20、4.05-3.32、3.15、3.06、2.70、2.51、2.49、2.01、1.80-1.35、1.49、1.35、1.23
【００６２】
分子量 (Maldi-Tof): 973 
【００６３】
実施例 6
c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Amp(CO-CH2-(OCH2CH2)n-O-CH2-COOH)) の合成
4 mlの 3:1 DCM-DMF 混合物中の200 mgの c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Amp)・TFA (実施例 1に記載のように得た)の溶液に、実質的に過剰のグリコールジ酸を添加した。DIEA (3 当量) および DCC (2 当量)を同溶液に添加した。混合物を一晩撹拌しながら放置し、その後DCMで希釈し、水で洗浄した。
【００６４】
粗生成物を有機相の蒸発により回収し、フラッシュクロマトグラフィー (移動相: CHCl3-MeOH 7:3 + 1％ AcOH) により精製した; 生成物を含むフラクションをプールし、水で洗浄し、脱水し、乾燥させ、157 mgの純粋な生成物の残渣を得た。
【００６５】
分析 RP-HPLC: (カラム: Purosphere STAR（登録商標）、Merck; 移動相: 水中50％ CH3CN 50％ + 0.1％ TFA; Rt = 10.96)
1H-NMR (DMSO-d6) δ 8.35-7.92、7.20-7.00、4.65、4.50、3.94、3.60-3.45、3.00-2.60、2.55、2.45、2.30、2.00、1.70、1.50、1.30、1.20.
【００６６】
分子量 (Maldi-Tof): 様々な分子量の様々な使用したグリコール類に対応
【００６７】
接合誘導体の合成
実施例 7
ST2686の合成
【化５】
2008504235.tif 000007
【００６８】
ST1968と保護されたST2650との縮合
15 mg (0.016 mmol)の保護されたST2650 を1 mlの 無水 DMFに溶解し、溶液を0℃にした; 3.6 mg (0.027 mmol)のHOBtおよび4 mg (0.019 mmol)のEDC を添加し、混合物を0℃で30分間放置して反応させた。
【００６９】
6 mgの 2-アミノエトキシイミノメチルカンプトテシン (0.0131 mmol)および8μlの DIEA (0.046 mmol) を次いで添加し、混合物を室温でおよそ60時間放置して反応させた。反応はTLCによりモニターした (CH2Cl2:CH3OH = 9:1)。
【００７０】
反応混合物をH2O (およそ 10 ml)で希釈し、CH2Cl2で３回抽出を行った;有機相を塩水で洗浄し、Na2SO4で脱水し、ろ過して乾燥させた。40 mgの 粗生成物を得た。
【００７１】
クロマトグラフィー: 溶出液 CH2Cl2:CH3OH = 94:6 → 92:8。11 mgの 生成物を得た。
【００７２】
収率 = 61%
【００７３】
保護基の遊離
9 mgの 保護生成物を4 mlのCH2Cl2:CF3COOH 1:1 溶液に溶解し、室温で24時間放置して反応させた。
【００７４】
反応はTLCによりモニターした (CH2Cl2:CH3OH = 94:6)。
【００７５】
反応溶液を乾燥させ、固体を得、それをEt2Oで3回洗浄し、遊離反応の副生成物を除いた。
【００７６】
5 mgの 生成物をトリフルオロアセテートの形態にて得た。 
【００７７】
収率 = 66%
【００７８】
分析データ:
Rf = 0.24 、 CH3OH:H2O = 7:3中 (TLC RP)
【００７９】
HPLC 分析: カラム: Dynamax（登録商標） RP C18、サンプルはメタノールに溶解; 流速: 1ml/分; 溶出混合液: アセトニトリル:水 (0.1% TFA) = 55:45; グラジエント: 10 分〜 55% 水 (TFA 0.1%): 45% アセトニトリル、10分〜10% 水 (TFA 0.1%)、10分、10% 水 (TFA 0.1%)、5分〜 開始条件。λ = 360 nm 8.323 (25.8%); 10.969 (74.2%)、λ= 254 nm 8.325 (29.4%); 10.975 (70.6%)
【００８０】
実施例 8
ST2724の合成 
【化６】
2008504235.tif 000008
ST1968と保護されたST2649との縮合
25 mg (0.023 mmol)の保護されたST2649 を2 mlの 無水 DMFに溶解し、溶液を0℃にし、その後 5 mg (0.039 mmol)のHOBtおよび5 mg (0.027 mmol)の EDCを添加し、混合物を0℃で30分間放置して反応させた。
【００８１】
8 mgの ST1968 (0.019 mmol)および12 μlの DIEA (0.070 mmol) を添加し、混合物を室温でおよそ39 時間放置して反応させた。反応 はTLCによりモニターした (CH2Cl2:CH3OH = 9:1 開始を確認)。
【００８２】
DMF を蒸発させ、混合物をH2O (およそ 10 ml)で希釈し、CH2Cl2で3回抽出を行った。有機相を塩水で洗浄し、Na2SO4で脱水し、ろ過して乾燥させた。29 mgの 粗生成物を得た。
【００８３】
クロマトグラフィー: 溶出液 CH2Cl2:CH3OH = 94:6 → 9:1. 22 mgの 7位にて結合したCH=NO 基の２つのsinおよびanti異性体からなる生成物 (lom184)。 
【００８４】
収率 = 78 %
HPLC-MS 分析: カラム: 対称 C18 (3.5 μm、4.6 x 75 mm); 移動相: アセトニトリル (TFA 0.1%): 水 (TFA 0.1%) = 55:45; グラジエント: 10 分、55% 水 (TFA 0.1%): 45% アセトニトリル、10 分〜10% 水 (TFA 0.1%)、10分、10% 水 (TFA 0.1%)、5分〜 開始条件。λ = 254 nm: tr = 5.20 (42%); tr = 5.97 (52%)
【００８５】
MS: (ESI) m/z = 1492 、［MH］+に対応
【００８６】
保護基の除去
22 mgの 保護されたST2724を4 mlのCH2Cl2:CF3COOH 1:1 溶液に溶解し、室温で26 時間放置して反応させた。反応 はTLCによりモニターした (溶出液: CH2Cl2:CH3OH = 95:5 開始を確認; H2O:CH3OH = 3:7、生成物)。
【００８７】
保護されたST2724の消失をt = 0、t = 2 時間、t = 26 時間にて以下のグラジエント条件にて得たサンプルを注入するHPLCによりモニターした: 10 分、55% 水 (TFA 0.1%): 45% CH3CN、10 分〜10% 水 (TFA 0.1%)、10分、10% 水 (TFA 0.1%)、5分〜開始条件; Tr 保護されたST2724 = 17.3; 18.1
【００８８】
カラム: Alltima RP C18 (150 mm、DI 4.6 mm、5 μ). サンプルは溶出混合液に溶解
【００８９】
反応溶液を乾燥させ、3回洗浄した; 得られた固体を3回Et2Oで洗浄した。
【００９０】
10 mgの トリフルオロアセテート 生成物を得た。
【００９１】
収率 = 53%
Rf = 0.52 、CH3OH:H2O = 7:3中 (TLC RP)
【００９２】
融点:分解温度( dec. T) > 160℃
【００９３】
HPLC 分析: カラム: Alltima RP C18 (150 mm、DI 4.6 mm、5 μ)、 サンプルは溶出混合液に溶解; 移動相: アセトニトリル (0.1% TFA): 水 (TFA 0.1%) = 35:65; 流速 = 1 ml/分、アイソクラティック 分析、λ = 254 nm 3.204 (15.0%); 3.982 (79.1%)、λ = 360 nm 3.204 (12.8%); 3.984 (83.9%)
【００９４】
実施例 9
ST2742の合成
【化７】
2008504235.tif 000009
ST1968と保護されたST2661との縮合
110 mg (0.093 mmol)の保護されたST2661を4 mlの 無水 DMFに溶解し、溶液を0℃にし、その後 21 mg (0.158 mmol)のHOBtおよび22 mg (0.112 mmol)の EDC を添加し、混合物を0℃で30分間放置して反応させた。
【００９５】
33 mgの ST1578 (0.077 mmol)、47μlの DIEA (0.270 mmol) を添加し、混合物を室温で24時間放置して反応させた。反応 はTLCによりモニターした (CH2Cl2:CH3OH = 9:1 開始を確認)
【００９６】
処理(processing): DMF を蒸発させ、混合物をH2O (およそ 15 ml)で希釈し、CH2Cl2で3回抽出を行った。有機相を塩水で処理し、Na2SO4で脱水し、ろ過して乾燥させた。166 mgの 粗生成物を得た。
【００９７】
クロマトグラフィー: 溶出液 CH2Cl2:CH3OH = 95:5 → 8:2. 63 mgの 生成物 (保護されたST2742)を得た。収率 = 52%
【００９８】
HPLC 分析: カラム: Alltima RP C18 (150 mm、DI 4.6 mm、5 μ)、サンプルは溶出混合液に溶解; 移動相: アセトニトリル (TFA 0.1%): 水 (TFA 0.1%) = 35:65; 流速 = 1 ml/分; グラジエント: 10 分〜55% 水 (TFA 0.1%) : 45% アセトニトリル、10分〜10% 水 (TFA 0.1%)、10分、10% 水 (TFA 0.1%)、5分〜開始条件、λ = 254 nm 15.17 (12.7%); 15.88 (80.2%)、λ= 360 nm 15.17 (17.5%); 15.88 (79.0%)
【００９９】
保護基の除去 
30 mgの 保護されたST2742を4 mlのCH2Cl2:CF3COOH 1:1 溶液に溶解し、室温で25 時間放置して反応させた。保護生成物の消失は、上記分析条件にてt = 0、t = 1 時間、t = 2 時間およびt =  24時間にて得たサンプルを注入するHPLCによりモニターした。
【０１００】
7位にて結合するCH=NO 基の２つのsinおよびanti異性体からなる19 mgの 生成物を得た。
【０１０１】
収率 = 73%; m.p. 160℃ (dec); MS (MALDI) m/z: 1272,4
【０１０２】
Rf = 0.44、 CH3OH:H2O = 7:3中(TLC RP-18)
【０１０３】
HPLC 分析: カラム: Alltima RP C18 (150 mm、DI 4.6 mm、5 μ)、サンプルは溶出混合液に溶解; 移動相: アセトニトリル (TFA 0.1%): 水 (TFA 0.1%) = 35:65; 流速 = 1 ml/分; グラジエント: 85% 水 (TFA 0.1%) : 15% アセトニトリル、20'〜10% 水 (TFA 0.1%)、10'、10% 水 (TFA 0.1%)、5' 〜 開始条件
【０１０４】
λ= 254 nm 9.65 (28.4%); 10.24 (62.4%)
【０１０５】
実施例 10
生物学的結果
インテグリン αvβ3 受容体への結合
精製した αvβ3 受容体 (Chemicon、カタログ番号CC1020)をバッファー (20 mM Tris、pH 7.4、150 mM NaCl、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、1 mM MnCl2)に希釈して濃度0.5μg/mlとした。100 μlのアリコットを96-ウェルプレートに添加し、一晩＋4℃でインキュベートした。プレートを１回バッファー (50 mM Tris、pH 7,4、100 mM NaCl、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、1 mM MnCl2、1% ウシ血清アルブミン)で洗浄し、次いでさらに2 時間室温でインキュベートした。プレートを同じバッファーで２回洗浄し、3 時間 室温で放射性リガンド [125I]エキスタチン0.05 nM(Amersham Pharmacia Biotech)とともに競合リガンドの存在下でインキュベートした。インキュベーションの最後に、ウェルを洗浄し、放射能をガンマカウンター (Packard)を用いて測定した。リガンドの非特異的結合は過剰の非放射性エキスタチン(1 μM)の存在下で測定した。
【０１０６】
インテグリン αvβ5 受容体への結合
精製した αvβ5 受容体 (Chemicon、カタログ番号CC1020)をバッファー (20 mM Tris、pH 7.4、150 mM NaCl、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、1 mM MnCl2)に希釈して濃度1 μg/mlとした。100 μlのアリコットを96-ウェルプレートに添加し、一晩+4℃でインキュベートした。プレートを１回バッファー  (50 mM Tris、pH 7.4、100 mM NaCl、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、1 mM MnCl2、1% ウシ血清アルブミン) で洗浄し、次いでさらに2 時間 室温でインキュベートした。プレートを同じバッファーで２回洗浄し、 3 時間室温で放射性リガンド [125I]エキスタチン0.15 nM (Amersham Pharmacia Biotech) とともに競合リガンドの存在下でインキュベートした。インキュベーションの最後に、ウェルを洗浄し、放射能をガンマカウンター (Packard) を用いて測定した。非特異的リガンド結合は過剰の非放射性エキスタチン(1 μM) の存在下で測定した。
【０１０７】
IC50 パラメーターの評価
ビトロネクチン受容体に対する生成物の親和性を、IC50 値 ±SD、即ち、特異的放射性リガンド-受容体結合の50%を阻害することが出来る濃度として表した。IC50 パラメーターは「ALLFIT」 ソフトウェアを用いて算出した。
【０１０８】
結果
接合体ST2686はIC50 値として算出した結合が低かったため、ST2724およびST2742と比較してインテグリン受容体に対する親和性がもっとも興味深かった(表 1参照)。インテグリン αvβ3 受容体について放射性リガンドと競合するST2686の能力は遊離RGD ペプチド ST2650により示されるよりも高く、αvβ5 受容体に対するST2650の能力に匹敵していた (表 2)。ST2724もまた、遊離ペプチド ST2649と比較してインテグリン受容体に対する強い親和性を示したが(表 2)、ST2742は、両方のインテグリン受容体に対する強力な親和性ではあるが、RGD 遊離ペプチド ST2661と比較して弱い親和性を示した。
【０１０９】
その他のRGD ペプチド(ST2581、ST2700、ST2701)もまた、インテグリン受容体に対する強力な相互作用を示した (表 2)。
【０１１０】
表 1 
カンプトテシン-RGD 接合体のビトロネクチン αvβ3 およびαvβ５受容体に対する親和性
【表１】
2008504235.tif 000010
表 2
RGD ペプチドのビトロネクチンαvβ3 およびαvβ５受容体に対する親和性
【表２】
2008504235.tif 000011
【０１１１】
様々な腫瘍細胞株に対する接合体の細胞毒性
化合物の生存細胞に対する効果を評価するために、スルホローダミン B試験を用いた。PC3 ヒト前立腺癌、A498 ヒト腎臓癌、A2780 ヒト 卵巣癌細胞を用いた。A2780、およびPC3 腫瘍細胞は10% 胎児ウシ血清 (GIBCO)を含むRPMI 1640で培養し、A498 腫瘍細胞は10% 胎児ウシ血清 (GIBCO)を含むEMEMで培養した。
【０１１２】
腫瘍細胞を96-ウェル組織培養プレート(Corning)におよそ 10% 集密にて播種し、少なくとも 24時間付着させ、回復させた。８種類の濃度の被験薬物の効果を分析してそのIC50 値 (細胞生存を50%阻害する濃度))を算出した。プレートを72時間37℃でインキュベートした。処理の最後に、プレートを上清の除去とPBS の添加を3回行うことによって洗浄した。200μlのPBSと50 μlの冷80%TCA を添加した。プレートを氷上で少なくとも 1時間インキュベートした。TCAを除去し、プレートを蒸留水に3回浸漬させて洗浄し、紙で40℃で5分間乾燥させた。次いで1% 酢酸中の200 μlの 0.4%スルホローダミン Bを添加した。プレートを室温でさらに30分間インキュベートした。スルホローダミン Bを除去し、プレートを1% 酢酸に3回浸漬させて洗浄し、紙で40℃で5分間乾燥させた。次いで200 μlのTris 10 mM を添加し、プレートを撹拌下に 20分間維持した。生存細胞をMultiskan 蛍光光度計で540 nmの吸光度として測定した。死滅した細胞の量を対照培養と比較してのスルホローダミン B結合のパーセンテージ低下として算出した。IC50値は「ALLFIT」プログラムを用いて算出した。
【０１１３】
報告するように、接合体はA2780 卵巣腫瘍細胞に対してIC50 値が 0.16〜0.4μMであり、もっとも強力な細胞毒性活性を示した。A498 腫瘍細胞に対しては、ST2742はIC50 値 0.74μM、次いでST2686および ST2724 (それぞれIC50=3.2および4.3 μM) (表 3)の順に活性が高かった。
【０１１４】
表 3
PC3 前立腺癌、A498 腎臓癌、A2780 卵巣癌細胞に対する接合体の細胞毒性
【表３】
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【国際調査報告】
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