(57)【要約】本発明は、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１レセプター（ＩＬ−２１Ｒ）のレベル（例えば、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒタンパク質および／またはｍＲＮＡの発現レベル、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの活性レベル、ＩＬ−２１とＩＬ−２１Ｒの相互作用のレベルなど）における変化を測定することによって、線維症および／または線維症に関連した状態を治療、改善または予防するのに有用な組成物をスクリーニングする方法を提供する。本発明は更に、線維症および／または線維症に関連した状態を治療するためのＩＬ−２１またはＩＬ−２１Ｒのアンタゴニストを提供する。本明細書においては更に、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベル（すなわち、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの活性レベル、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの発現レベル（例えば、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの遺伝子産物のレベル）、および／またはＩＬ−２１とＩＬ−２１Ｒの相互作用のレベル）を測定することによって、線維症および／または線維症に関連した状態の経過（例えば治療過程）を診断、予知およびモニタリングする方法が提供される。2008538553.tif 000008
2008538553.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体におけるＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを減少させる治療上有効量の薬剤を該被検体に投与する工程を含む、該被検体における線維症または線維症に関連した障害を治療、改善または予防する方法。
【請求項２】
前記薬剤が、抗ＩＬ−２１Ｒ抗体、抗ＩＬ−２１抗体、抗ＩＬ−２１Ｒ抗体の抗原結合性フラグメント、抗ＩＬ−２１抗体の抗原結合性フラグメント、およびＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントからなる群より選択されるＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記薬剤がＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントであり、該ＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントが、配列番号２の第１番目〜第５３８番目のアミノ酸、配列番号２の第２０番目〜第５３８番目のアミノ酸、配列番号２の第１番目〜第２３５番目のアミノ酸、配列番号２の第２０番目〜第２３５番目のアミノ酸、配列番号２の第１番目〜第２３６番目のアミノ酸、配列番号２の第２０番目〜第２３６番目のアミノ酸、配列番号５の第１番目〜第５２９番目のアミノ酸、配列番号５の第２０番目〜第５２９番目のアミノ酸、配列番号５の第１番目〜第２３６番目のアミノ酸および配列番号５の第２０番目〜第２３６番目のアミノ酸からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントが、ＩＬ−２１ポリペプチドに結合する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記薬剤がＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントであり、該ＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントが、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５または配列番号２７に示されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントのアミノ酸配列が、配列番号１１または配列番号１３に示されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記薬剤がＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントであり、該ＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントが、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４または配列番号２６に示される核酸配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントが、配列番号１２または配列番号１６に示される核酸配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列によってコードされる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記薬剤がＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントであり、該ＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントが、ＩＬ−２１Ｒの細胞外ドメインおよび免疫グロブリンＦｃフラグメントを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＩＬ−２１Ｒの細胞外ドメインのアミノ酸配列が、配列番号２の第１番目〜第２３５番目のアミノ酸または配列番号２の第２０番目〜第２３５番目のアミノ酸と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記免疫グロブリンＦｃフラグメントが機能変化（an altered function）を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記免疫グロブリンＦｃフラグメントが、配列番号１７の第２４４番目〜第４６７番目のアミノ酸のアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記線維症または線維症に関連した障害が、肝臓、表皮、内皮、筋肉、腱、軟骨、心臓、膵臓、肺、子宮、神経系、精巣、卵巣、副腎、動脈、静脈、結腸、小腸、胆管または胃に影響を与える、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記線維症または線維症に関連した障害が、肝臓、表皮、内皮または肺に影響を与える、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記線維症または線維症に関連した障害が、間質性肺線維症である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記線維症または線維症に関連した障害が、住血吸虫による感染の結果である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記線維症または線維症に関連した障害が、創傷治癒の結果である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記創傷治癒が外科的切開に起因する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つの追加の治療剤を前記被検体に投与する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの追加の治療剤が、サイトカイン阻害剤、成長因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤、細胞毒性薬剤および細胞増殖抑制剤からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの追加の治療剤が、ＴＮＦアンタゴニスト、抗ＴＮＦ剤、ＩＬ−１２アンタゴニスト、ＩＬ−１５アンタゴニスト、ＩＬ−１７アンタゴニスト、ＩＬ−１８アンタゴニスト、ＩＬ−２２アンタゴニスト、Ｔ細胞除去剤、Ｂ細胞除去剤、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ＣＣＩ−７７９、エタネルセプト、インフリキシマブ、リツキシマブ、アダリムマブ、プレドニゾロン、アザチオプリン、金、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、ミノサイクリン、アナキンラ、アバタセプト、メトトレキサート、レフルノミド、ラパマイシン、ラパマイシンの類似体、Ｃｏｘ−２阻害剤、ｃＰＬＡ２阻害剤、ＮＳＡＩＤ、ｐ３８阻害剤、およびＢ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＯＳＬ、ＩＣＯＳおよび／またはＣＤ２８のアンタゴニスト、ならびにＣＴＬＡ４のアゴニストからなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記被検体がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを測定する工程；（ｂ）該目的の細胞または試料を化合物と接触させる工程；および（ｃ）該化合物との接触の後に、該目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを測定する工程を含む、被検体における線維症または線維症に関連した障害を治療、改善または予防するための化合物を同定する方法であって、接触させなかった目的の細胞または試料におけるＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルと比較して、該接触させた目的の細胞または試料におけるＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルの方が低いことが、被検体における線維症または線維症に関連した状態を治療、改善または予防するのに有用な化合物として該化合物を同定するものである、前記方法。
【請求項２４】
（ａ）目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを測定する工程；（ｂ）該目的の細胞または試料を化合物と接触させる工程；（ｃ）該化合物との接触の後に、該目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを測定する工程；および（ｄ）該接触させた目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの基準レベルと比較する工程を含む、被検体における線維症または線維症に関連した障害を治療、改善または予防するための化合物を同定する方法であって、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの該基準レベルと比較して、該接触させた目的の細胞または試料におけるＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルの方が低いことが、被検体における線維症または線維症に関連した状態を治療、改善または予防するのに有用な化合物として該化合物を同定するものである、前記方法。
【請求項２５】
（ａ）第１時点において、被検体由来の目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを測定する工程；および（ｂ）第２時点において、該被検体由来の目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを測定する工程を含む、該被検体における線維症または線維症に関連した状態の経過をモニタリングする方法であって、該第１時点における該被検体由来の目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルと比較して、該第２時点における該被検体由来の目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルの方が低いことが、該線維症または線維症に関連した状態の重症度が減少したことを示すものである、前記方法。
【請求項２６】
（ａ）第１時点において、被検体由来の目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを測定する工程；および（ｂ）第２時点において、該被検体由来の目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを測定する工程を含む、該被検体における線維症または線維症に関連した状態を予知する方法であって、該第１時点における該被検体由来の目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルと比較して、該第２時点における該被検体由来の目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルの方が低いことが、該被検体が該線維症または線維症に関連した状態になり得る可能性が減少したこと、または、該被検体において該線維症または線維症に関連した状態が悪化し得る可能性が減少したことを示すものである、前記方法。
【請求項２７】
（ａ）被検体由来の目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを測定する工程；および（ｂ）該被検体由来の該目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの基準レベルと比較する工程を含む、該被検体における線維症または線維症に関連した状態を予知する方法であって、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの該基準レベルと比較して、該被検体由来の該目的の細胞または試料におけるＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルの方が低いことが、該被検体が該線維症または線維症に関連した状態になり得る可能性が減少したこと、または、該被検体において該線維症または線維症に関連した状態が悪化し得る可能性が減少したことを示すものである、前記方法。
【請求項２８】
（ａ）被検体由来の目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを測定する工程；および（ｂ）該被検体由来の該目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの基準レベルと比較する工程を含む、該被検体における線維症または線維症に関連した状態を診断する方法であって、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの該基準レベルと比較して、該被検体由来の該目的の細胞または試料におけるＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルの方が高いことが、該被検体において線維症または線維症に関連した状態が存在することを示すものである、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願においては、2005年4月14日に出願された米国仮出願第60/671,374号に対して優先権を主張し、その全体を引用することによって、本明細書の一部となす。
（発明の技術分野）
本発明は、線維症および線維症に関連した状態を治療および予防する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連する背景技術）
任意の器官の傷害は、一般的に、血小板に誘導された止血を伴う生理学的反応を引き起こし、続いて、炎症細胞および活性化された線維芽細胞の流入が起こる。これらの細胞型によって生成されたサイトカインは、新しい細胞外マトリックスおよび血管の形成を促進し、これらが集まって肉芽組織を形成する。線維組織の形成は、傷害の後の通常の有益な治癒の過程の一部である。しかし、線維症は、多様な組織の構造および機能を変えてしまう、傷害または炎症の後のコラーゲンマトリックスの異常な蓄積によって特徴づけられる状態である。腎臓、肝臓、肺、心臓、硬骨、骨髄および皮膚における進行性の線維症は、死亡の主な原因、または誘因となっている。
線維組織の増殖に関連した多くの病気が慢性的でしばしば衰弱させるものであり、例えば、強皮症などの皮膚疾患が含まれる。肺線維症を含めたいくつかは命にかかわるものであり得る。これは、現在の治療が重大な副作用を有し、一般的に線維症の進行を遅らせる、または食い止めるのに効果的ではないということも一因となっている。従って、新しい抗線維化薬剤への絶え間ないニーズがある。
【０００３】
ＩＬ−２１レセプター（ＩＬ−２１Ｒ）は、クラスＩサイトカインレセプターファミリーの中の新たに発見されたメンバーである（Parrish-Novakら、(2000) Nature 408:57-63；およびOzakiら、(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:11439-44参照）。ＩＬ−２１レセプターは、ＩＬ−４レセプターα鎖（ＩＬ−４Ｒα）との配列および構造における有意な相同性を示し、ヒトおよびマウスのゲノムにおいてＩＬ−４Ｒαに隣接する。一方、そのリガンドであるＩＬ−２１は、サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１５と有意な相同性を示す（Sivakumarら、(2004) Immunology 112:177-82；およびHabibら、（2003) J. Allergy Clin. Immunol. 112:1033-45参照）。このように、ＩＬ−２１およびＩＬ−２１Ｒは、ガンマ鎖（γｃ）の機能的シグナル伝達を必要とするサイトカインおよびレセプターとの相同性により、γｃに依存するサイトカインネットワークのメンバーとして新たに述べられているものである（VosshenrichおよびDi Santo (2001) Curr. Biol. 11:R175-77参照）。γｃネットワークのメンバー全てが、宿主免疫において重要で独特な役割を示していることから、インビボでの抗原に誘発された免疫反応中におけるＩＬ−２１Ｒの新しい機能を詳しく調べることへの関心が高まってきている。
【０００４】
ＩＬ−２１の機能を調べた初期研究は、ＩＬ−２１によって、ＮＫ細胞の膨張が中和される一方で、抗腫瘍免疫を含む抗原特異的なＴ細胞免疫が促進されることを示した（Maら、(2003) J. Immunol. 171:608-15；Kishidaら、(2003) Mol. Ther. 8:552-58；およびDi Carloら、(2004) J. Immunol. 172:1540-47参照）。研究の成果は、ＩＬ−２１が、先天性免疫反応と適応的免疫反応との間の橋渡し的な役割を果たすことを示唆するものである（Collinsら、(2003) Immunol. Res. 28:131-40参照）。ＩＬ−２１はまた、インビボでＢ細胞およびＣＤ８+Ｔ細胞の機能を調節する（Ozakiら、(2002) Science 298:1630-34；Sutoら、(2002) Blood 100:4565-73；Mehtaら、(2003) J. Immunol. 170:4111-18；Peneら、(2004) J. Immunol. 172:5154-57；Jinら、(2004) J. Immunol. 173:657-65；およびZengら、(2005) J. Exp. Med. 201:139-48参照）。更なる研究は、ＩＬ−２１が、ナイーブＴH細胞がＩＦＮ−γ−分泌ＴH１細胞に分化するのを阻害し得るＴH２サイトカインであることを示唆している（Wursterら、(2002) J. Exp. Med. 196:969-77参照）。実際に、ＩＬ−２１による外部処理は、他のＴH１／ＴH２に関連したサイトカインに影響を及ぼすことなくＩＦＮ−γの生成を強く阻害し、ＩＬ−２１によるＩＦＮ−γの抑制が非常に特異的であることを示唆した。このように、そのＴH１細胞の発達を抑制する能力により、ＩＬ−２１はＴH２反応を促進し得ると仮定された（Wursterら、既出）。にもかかわらず、ＴH２に依存するいかなる障害においても、ＴH２反応の発達へのＩＬ−２１Ｒシグナル伝達経路の関与についてはこれまで調査されなかった。
【０００５】
住血吸虫症において、ＴH２サイトカインは、病気の発症において不可欠の役割を果たす（Wynn (2004) Nat. Rev. Immunol. 4:583-594；PearceおよびMacDonald (2002) Nat. Rev. Immunol. 2:499-511参照）。実際、ＩＬ−４／ＩＬ−１３、ＩＬ−４ＲαおよびＳｔａｔ６が欠損したマウスすべてが、マンソン住血吸虫による感染後に、著しく障害のある肉芽腫の形成および肝線維症を示す（Chiaramonteら、(1999) J. Clin. Invest. 104:777-85；Kaplanら、(1998) J. Immunol. 160:1850-56；Jankovicら、(1999) J. Immunol. 163:337-42；およびFallonら、(2000) J. Immunol. 164:2585-91参照）。ＩＬ−２１をＴH２サイトカインとする最近の分類（Wursterら、(2002)、既出；およびMehtaら、(2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102:2016-21）、ＩＬ−４レセプターとＩＬ−２１レセプターの間の著しい類似性（Sivakumarら、既出；およびHabibら、既出）、そして、他のＴH２サイトカイン主導の炎症性疾患の場合と同様、この疾患においても関連するＩＬ−４Ｒα／Ｓｔａｔ６シグナル伝達経路が重大な役割を果たすこと（Wynn (2003) Annu. Rev. Immunol. 21:425-56）を考えると、これらの研究から出てきた重要な疑問点は、ＩＬ−２１Ｒのシグナル伝達が、ＴH２免疫の開始および／または維持において有意な役割を果たすかどうかということであった。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、線維症または線維症に関連した障害を治療、改善または予防する方法、およびそれらの方法において有用な化合物および組成物をスクリーニングする方法を提供する。本発明はまた、線維症および／または線維症に関連した状態の経過（例えば治療過程）を診断、予知およびモニタリングする方法を提供する。これらの方法は、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベル（すなわち、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの活性レベル、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの発現レベル（例えば、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの遺伝子産物のレベル）、および／またはＩＬ−２１とＩＬ−２１Ｒの相互作用のレベル）を測定および／または調節することに関連付けられる。本発明は更に、線維症および／または線維症に関連した状態を治療するためのＩＬ−２１またはＩＬ−２１Ｒのアンタゴニストを提供する。
【０００７】
一つの実施形態において、本発明は、被検体（例えばヒト）におけるＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを減少させる治療上有効量の薬剤を該被検体に投与する工程を含む、該被検体における線維症または線維症に関連した障害を治療、改善または予防する方法を提供する。更なる実施形態において、該薬剤は、抗ＩＬ−２１Ｒ抗体、抗ＩＬ−２１抗体、抗ＩＬ−２１Ｒ抗体の抗原結合性フラグメント、抗ＩＬ−２１抗体の抗原結合性フラグメント、およびＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントからなる群より選択されるＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニストである。別の更なる実施形態において、該薬剤は、ＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントであり、該ＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントは、配列番号２の第１番目〜第５３８番目のアミノ酸、配列番号２の第２０番目〜第５３８番目のアミノ酸、配列番号２の第１番目〜第２３５番目のアミノ酸、配列番号２の第２０番目〜第２３５番目のアミノ酸、配列番号２の第１番目〜第２３６番目のアミノ酸、配列番号２の第２０番目〜第２３６番目のアミノ酸、配列番号５の第１番目〜第５２９番目のアミノ酸、配列番号５の第２０番目〜第５２９番目のアミノ酸、配列番号５の第１番目〜第２３６番目のアミノ酸および配列番号５の第２０番目〜第２３６番目のアミノ酸からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、該ＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントは、ＩＬ−２１ポリペプチドに結合する。
【０００８】
別の実施形態において、該薬剤は、ＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントであり、該ＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントは、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５または配列番号２７に示されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、該ＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントのアミノ酸配列は、配列番号１１または配列番号１３に示されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、該薬剤は、ＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントであり、該ＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントは、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４または配列番号２６に示される核酸配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。別の実施形態において、該ＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントは、配列番号１２または配列番号１６に示される核酸配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。
【０００９】
別の実施形態において、該薬剤は、ＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントであり、該ＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントは、ＩＬ−２１Ｒの細胞外ドメインおよび免疫グロブリンＦｃフラグメントを含む。更なる実施形態において、該ＩＬ−２１Ｒの細胞外ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２の第１番目〜第２３５番目のアミノ酸または配列番号２の第２０番目〜第２３５番目のアミノ酸と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、該免疫グロブリンＦｃフラグメントは、機能変化（an altered function）を有する。別の更なる実施形態において、該免疫グロブリンＦｃフラグメントは、配列番号１７の第２４４番目〜第４６７番目のアミノ酸のアミノ酸配列を有する。
別の実施形態において、該線維症または線維症に関連した障害は、肝臓、表皮、内皮、筋肉、腱、軟骨、心臓、膵臓、肺、子宮、神経系、精巣、卵巣、副腎、動脈、静脈、結腸、小腸、胆管または胃に影響を与える。更なる実施形態において、該線維症または線維症に関連した障害は、間質性肺線維症である。別の実施形態において、該線維症または線維症に関連した障害は、住血吸虫による感染の結果である。別の実施形態において、該線維症または線維症に関連した障害は、創傷治癒の結果である。更なる実施形態において、該創傷治癒は、外科的切開に起因する。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの追加の治療剤を被検体に投与する工程を更に含む。別の実施形態において、該少なくとも１つの追加の治療剤は、サイトカイン阻害剤、成長因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤、細胞毒性薬剤および細胞増殖抑制剤からなる群より選択される。更なる実施形態において、該少なくとも１つの追加の治療剤は、ＴＮＦアンタゴニスト、抗ＴＮＦ剤、ＩＬ−１２アンタゴニスト、ＩＬ−１５アンタゴニスト、ＩＬ−１７アンタゴニスト、ＩＬ−１８アンタゴニスト、ＩＬ−２２アンタゴニスト、Ｔ細胞除去剤、Ｂ細胞除去剤、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ＣＣＩ−７７９、エタネルセプト、インフリキシマブ、リツキシマブ、アダリムマブ、プレドニゾロン、アザチオプリン、金、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、ミノサイクリン、アナキンラ、アバタセプト、メトトレキサート、レフルノミド、ラパマイシン、ラパマイシンの類似体、Ｃｏｘ−２阻害剤、ｃＰＬＡ２阻害剤、ＮＳＡＩＤ、ｐ３８阻害剤、およびＢ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＯＳＬ、ＩＣＯＳおよび／またはＣＤ２８のアンタゴニスト、ならびにＣＴＬＡ４のアゴニストからなる群より選択される。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、（ａ）目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを測定する工程；（ｂ）該目的の細胞または試料を化合物と接触させる工程；および（ｃ）該化合物との接触の後に、該目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを測定する工程を含む、被検体における線維症または線維症に関連した障害を治療、改善または予防するための化合物を同定する方法であって、接触させなかった目的の細胞または試料におけるＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルと比較して、接触させた該目的の細胞または試料におけるＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルの方が低いことが、被検体における線維症または線維症に関連した状態を治療、改善または予防するのに有用な化合物として該化合物を同定するものである、前記方法、を提供する。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、（ａ）目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを測定する工程；（ｂ）該目的の細胞または試料を化合物と接触させる工程；（ｃ）該化合物との接触の後に、該目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを測定する工程；および（ｄ）該接触させた目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの基準レベルと比較する工程を含む、被検体における線維症または線維症に関連した障害を治療、改善または予防するための化合物を同定する方法であって、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの該基準レベルと比較して、該接触させた目的の細胞または試料におけるＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルの方が低いことが、被検体における線維症または線維症に関連した状態を治療、改善または予防するのに有用な化合物として該化合物を同定するものである、前記方法、を提供する。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、（ａ）第１時点において、被検体由来の目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを測定する工程；および（ｂ）第２時点において、該被検体由来の目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを測定する工程を含む、該被検体における線維症または線維症に関連した状態の経過をモニタリングする方法であって、該第１時点における該被検体由来の目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルと比較して、該第２時点における該被検体由来の目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルの方が低いことが、該線維症または線維症に関連した状態の重症度が減少したことを示すものである、前記方法、を提供する。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、（ａ）第１時点において、被検体由来の目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを測定する工程；および（ｂ）第２時点において、該被検体由来の目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを測定する工程を含む、該被検体における線維症または線維症に関連した状態を予知する方法であって、該第１時点における該被検体由来の目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルと比較して、該第２時点における該被検体由来の目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルの方が低いことが、該被検体が該線維症または線維症に関連した状態になり得る可能性が減少したこと、または、該被検体において該線維症または線維症に関連した状態が悪化し得る可能性が減少したことを示すものである、前記方法、を提供する。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、（ａ）被検体由来の目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを測定する工程；および（ｂ）該被検体由来の該目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの基準レベルと比較する工程を含む、該被検体における線維症または線維症に関連した状態を予知する方法であって、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの該基準レベルと比較して、該被検体由来の該目的の細胞または試料におけるＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルの方が低いことが、該被検体が該線維症または線維症に関連した状態になり得る可能性が減少したこと、または、該被検体において該線維症または線維症に関連した状態が悪化し得る可能性が減少したことを示すものである、前記方法、を提供する。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、（ａ）被検体由来の目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを測定する工程；および（ｂ）該被検体由来の該目的の細胞または試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの基準レベルと比較する工程を含む、該被検体における線維症または線維症に関連した状態を診断する方法であって、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの該基準レベルと比較して、該被検体由来の該目的の細胞または試料におけるＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルの方が高いことが、該被検体において線維症または線維症に関連した状態が存在することを示すものである、前記方法、を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
線維症の発症におけるＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒシグナル伝達経路の役割を調べるために、肺および肝臓の炎症の多様なモデルを使用して、機能的ＩＬ−２１Ｒ（ＩＬ−２１Ｒ-/-）が欠損したマウスおよび野生型マウスにおいて、免疫反応を比較した。一つのモデルにおいて、肺における一次性および二次性肉芽腫性炎症を調べるために、未処理の動物または抗原感作した動物に、生きている住血吸虫卵を静脈注射で投与した。別のモデルにおいて、マンソン住血吸虫セルカリアを用いてマウスを経皮的に感染させ、卵に誘導された炎症および線維症の進行を肝臓において観察した。別のモデルにおいて、マウスをＮ・ブラシリエンシス（N. brasILiensis）に感染させた。これらのモデルを使用して、急性および慢性の病気状態におけるタイプ２サイトカイン主導の病変に対するＩＬ−２１Ｒの影響を調べた。結果は、インビボでの極性化されたタイプ２反応の産生、特にタイプ２サイトカインに媒介される炎症および線維症におけるＩＬ−２１Ｒの重要な役割を示している。
【００１８】
従って、本発明は、未処理のコントロール（例えば、線維症または線維症に関連した状態になっているコントロール被検体、線維症または線維症に関連した状態になっていないコントロール被検体）と比較して、または適切な基準レベルと比較して、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベル（例えば、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの発現レベル（例えば、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの遺伝子産物（すなわち、タンパク質および／またはｍＲＮＡ）のレベル）、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの活性レベル、ＩＬ−２１とＩＬ−２１Ｒの相互作用のレベル等）を減少させる薬剤を使用して、被検体（例えばヒト、例えばヒトの患者）における線維症または線維症に関連した障害を治療、改善または予防する方法を提供する。ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを減少させる薬剤を同定することに関連して、「ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベル」を測定することには、（１）ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの発現レベルを測定すること（例えば、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの遺伝子産物（例えばタンパク質および／またはそれに対応するｍＲＮＡ）のレベルを測定すること）；（２）ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの活性レベルを測定すること；および（３）ＩＬ−２１とＩＬ−２１Ｒの相互作用のレベルを測定すること（例えば被検体（例えばヒトの患者、コントロール被検体等）由来の、例えば目的の細胞または試料において）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書において更に詳しく述べられるように、線維症または線維症に関連した状態または障害を治療、改善および／または予防するのに有用な薬剤の例には、抗ＩＬ−２１Ｒ抗体、抗ＩＬ−２１Ｒ抗体の抗原結合性フラグメント、抗ＩＬ−２１抗体、抗ＩＬ−２１抗体の抗原結合性フラグメント、およびＩＬ−２１Ｒポリペプチドの可溶性フラグメントが含まれる。本発明は更に、線維症または線維症に関連した障害の治療過程をモニタリングし、それを診断および予知し、および線維症または線維症に関連した障害を治療するのに有用な化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【００１９】
本明細書において使用される「ＩＬ−２１」または「ＩＬ−２１Ｒ」とは、それぞれ、天然のＩＬ−２１またはＩＬ−２１Ｒレセプタータンパク質と実質的に同一である任意のポリペプチドを意味する。ヒトインターロイキン−２１（ＩＬ−２１）およびそのレセプター（ＩＬ−２１Ｒ）をコードするヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えば、国際公開第WO00/53761号；国際公開第WO01/85792号；Parrish-Novakら、(2000) Nature 408:57-63；およびOzakiら、(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:11439-44に記載されている。望ましくは、ＩＬ−２１ポリペプチドがＩＬ−２１Ｒを結合するか、またはＩＬ−２１ＲポリペプチドがＩＬ−２１を結合し、相互作用の際に、ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒ経路のシグナル伝達活性が、任意の標準方法による測定において、コントロールレベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％よりも高い比率で増加する。ＩＬ−２１Ｒは、「ＭＵ−１」、「ＮＩＬＲ」および「ｚａｌｐｈａｌ１」としても知られている。
【００２０】
ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを減少させる薬剤には、ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒ経路のシグナル伝達活性、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの活性レベル、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの発現レベル、および／またはＩＬ−２１とＩＬ−２１Ｒの相互作用のレベルを、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％減少させる任意の薬剤が包含される。必要に応じて、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルの減少は、線維症の減少のレベルを測定することによって評価される。ＩＬ−２１とＩＬ−２１Ｒとの相互作用のレベルを減少させる薬剤には、ＩＬ−２１とＩＬ−２１Ｒの相互作用を少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％減少させる任意の薬剤が包含される。ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの活性または発現のレベルを減少させる、および／またはＩＬ−２１とＩＬ−２１Ｒの相互作用のレベルを減少させるこれら前述の薬剤（すなわち、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを減少させる薬剤）は、本明細書において、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの「アンタゴニスト」と言われることがある。
「ＩＬ−２１遺伝子」または「ＩＬ−２１Ｒ遺伝子」は、それぞれ、ＩＬ−２１ポリペプチドまたはＩＬ−２１Ｒポリペプチドをコードする核酸として定義される。
【００２１】
「線維症」は、線維組織の過剰産生または異常産生の結果として生じる任意の病的状態として定義される。線維症は、例えば腎臓、肺、肝臓、皮膚、中枢神経系、硬骨、骨髄、心臓血管系、内分泌器官または胃腸系を含む任意の器官においておこり得る。「線維症に関連した状態」とは、線維症に関連している任意の状態を意味する。このように、線維症に関連した状態は、線維症によって引き起こされたり、線維症を伴ったり、または線維症を引き起こし得る。
ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの活性のレベルの減少とは、未処置のコントロールまたは基準の試料（例えば基準レベル）におけるＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルまたは生物活性と比較して、ＩＬ−２１のレベルまたは生物活性が減少することを指し得る。このようなレベルまたは活性は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％減少され得る。ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの活性の減少はまた、タイプ２（「Ｔｈ２」）サイトカインの発現および／または機能の減少と関連し得、これには、例えばＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＡＭＣａｓｅ、Ｙｍ１、およびＦｉｚｚ１／ＲＥＬＭαのレベルおよび活性における調節が含まれ得る。
【００２２】
ＩＬ−２１とＩＬ−２１Ｒとの相互作用のレベルの減少とは、未処理のコントロールまたは基準の試料におけるＩＬ−２１とＩＬ−２１Ｒとの相互作用のレベルと比較して、処理された細胞または試料における相互作用が減少することを指し得る。このような相互作用のレベルは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％減少され得る。相互作用のレベルは、例えばＥＬＩＺＡおよびウエスタンブロットなどのいくつかの周知の分子生物学の技術によって評価することができる。
ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの遺伝子産物のレベルの減少とは、未処理のコントロールまたは基準の試料におけるＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの遺伝子またはタンパク質発現レベルと比較して、処理された細胞または試料におけるｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現レベルが減少することを指す。このような発現は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％減少され得る。発現のレベルは、例えばノーザンブロットまたはウエスタンブロットなどの多数の周知の分子生物学の技術によって評価することができる。
【００２３】
「線維症を治療または改善する」とは、任意の標準方法による測定において、未処理のコントロールと比較して線維症のレベルが減少することを意味する。線維症の減少はまた、線維症または線維症に関連した状態に関連した任意の症状の減少によって測定され得る。本明細書に開示される実施例は、コントロールと比較して線維症のレベルが減少されたか否かを測定する方法の例を提供する。
「線維症に関連した状態（または障害）を治療または改善する」とは、このような状態がおこる前またはおこった後にそれを減少させることを意味する。相当する未処理のコントロールと比較して、任意の標準技術による測定において、このような減少または予防の程度は、少なくとも５％、１０％、２０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、９５％または１００％である。線維症に関連した状態の治療を受けている被検体とは、開業医が、そのような状態を有すると診断した者を言う。診断は、任意の適切な手段によって行うことができる。線維症に関連した状態の進行が予防されている被検体は、このような診断を受けていてもいなくとも良い。これらの被検体（例えば患者）は、線維症に関連した状態を診断するために標準試験にかけられていてもよく、または、試験をすることなく、１つ以上の危険因子の存在により高い危険にさらされているとして確認されていてもよいことを、当業者は理解するであろう。本明細書に開示された実施例は、コントロールと比較して線維症に関連した障害のレベルが減少されたか否かを測定する方法の例を提供する。
【００２４】
「予防する」とは、そのような状態が進行しそうな被検体において、線維症または線維症に関連した状態の発症を遅らせること、あるいは、線維症または線維症に関連した状態の発症を妨げることを言う。
「有効量」とは、哺乳動物において線維症または線維症に関連した状態を治療、改善、減少、または予防するのに必要な化合物（単独または組合せ）の量を意味する。活性化合物の有効量は、被検体における投与経路、年齢、体重、および総体的な健康によって異なる。最終的には、担当医または獣医が、適切な量および用法・用量を決定することになる。
タンパク質またはポリペプチドに関連して「実質的に同一の」とは、例えば配列番号２、配列番号５、および配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５および２７に示されるものなどの融合タンパク質などの基準のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％、または９９％までの同一性を有するタンパク質またはポリペプチドを意味する。タンパク質またはポリペプチドについて、比較配列の長さは、一般的に、少なくとも２０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも３０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも４０個のアミノ酸、最も好ましくは５０個のアミノ酸、あるいは、タンパク質またはポリペプチドの全長になるであろう。このような「実質的に同一の」タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸は、「実質的に同一の」核酸の例を構成する。遺伝子コードの冗長性のせいで、いくつかの核酸が所定のタンパク質またはポリペプチドをコードし得、このような核酸が、基準ポリペプチドに「実質的に同一の」ポリペプチドをコードするのであれば、本発明の範囲内にある、と認識される。
【００２５】
本発明に関連する核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得、全体または一部が合成であり得る。本明細書に示されるヌクレオチド配列への言及には、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、特定の配列（またはその相補体）を有するＤＮＡ分子が包含され、また、ＴがＵで置換された特定の配列を有するＲＮＡ分子が包含される。
本発明に関連する単離されたポリヌクレオチドは、開示されたポリヌクレオチドをコードする配列に同一の、または類似する配列を有する核酸を同定および単離するために、ハイブリダイゼーションのプローブおよびプライマーとして使用することができる。核酸を同定および単離するためのハイブリダイゼーションの方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、サザンハイブリダイゼーション、原位置ハイブリッド形成、およびノーザンハイブリダイゼーションが含まれ、これらは当業者にとって周知である。
【００２６】
ハイブリダイゼーション反応は、異なるストリンジェンシー条件下において実施され得る。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーには、任意の２つの核酸分子が互いにハイブリダイズする際の困難性が含まれる。好ましくは、ハイブリダイズする各ポリヌクレオチドは、その対応するポリヌクレオチドに、減少されたストリンジェントな条件下で、より好ましくはストリンジェントな条件下で、および最も好ましくは高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。ストリンジェンシー条件の例を、以下の表１に示す。高度にストリンジェントな条件とは、少なくとも、例えば条件Ａ−Ｆと同等にストリンジェントであるものである。ストリンジェントな条件とは、少なくとも、例えば条件Ｇ−Ｌと同等にストリンジェントであるものである。そして、減少されたストリンジェントな条件とは、少なくとも、例えば条件Ｍ−Ｒと同等にストリンジェントであるものである。
【００２７】
【表１】
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１：ハイブリッドの長さは、ハイブリダイズするポリヌクレオチドのハイブリダイズされた領域について予測されるものである。ポリヌクレオチドを、未知の配列の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合、ハイブリッドの長さは、ハイブリダイズするポリヌクレオチドの長さであると推測される。知られている配列のポリヌクレオチドがハイブリダイズされる場合、ハイブリッドの長さは、ポリヌクレオチドの配列を並べ、その領域または最適な配列相補性の領域を特定することによって決定することができる。
２：ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液として、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）の代わりに、ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡであり、ｐＨ７．４である）を使用し得る。洗浄は、ハイブリダイゼーション完了後に１５分間行われる。
ＴB*〜ＴR*：長さが５０塩基対よりも少ないと予測されるハイブリッドについてのハイブリダイゼーション温度は、該ハイブリッドの融解温度（Ｔm）よりも５〜１０℃低くするべきであって、ここで、Ｔmは、以下の方程式に従って決定される。長さが１８塩基対よりも少ないハイブリッド：Ｔm（℃）＝２（Ａ塩基＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ塩基＋Ｃ塩基の数）。長さが１８〜４９塩基対のハイブリッド：Ｔm（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ10Ｎａ+）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、ここで、Ｎはハイブリッド中の塩基の数であり、Ｎａ+は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣのＮａ+＝０．１６５Ｍ）。
ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションにおけるストリンジェンシー条件の更なる例は、Sambrook、J., E. F. FritschおよびT. Maniatis、1989、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、第9および11章；およびCurrent Protocols in Molecular Biology、1995、F. M. Ausubelら編、John WILey & Sons, Inc.、第2.10節および第6.3-6.4節に記載されており、引用することによって、本明細書の一部となす。
【００２８】
本発明に関連する単離されたポリヌクレオチドは、開示されたポリヌクレオチドの対立遺伝子多型をコードする配列を有するＤＮＡを同定および単離するために、ハイブリダイゼーションのプローブおよびプライマーとして使用することができる。対立遺伝子多型は、開示されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと同一の、または有意に類似性を有するポリペプチドをコードする、開示されたポリヌクレオチドの天然の代替形態である。好ましくは、対立遺伝子多型は、開示されたポリヌクレオチドと少なくとも９０％の配列同一性（より好ましくは、少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは、少なくとも９９％の同一性）を有する。あるいは、核酸のセグメントが、選択的なハイブリダイゼーション条件（例えば高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）下で開示されたポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合に、有意な類似性が存在する。
【００２９】
本発明に関連する単離されたポリヌクレオチドはまた、開示されたポリヌクレオチドに相同性を有するポリペプチドをコードする配列を有するＤＮＡを同定および単離するために、ハイブリダイゼーションのプローブおよびプライマーとして使用することができる。これらのホモログは、開示されたポリペプチドおよびポリヌクレオチドとは異なる種から単離されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドであるか、または、同種であるが、開示されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して有意な配列類似性を有するものである。好ましくは、ポリヌクレオチドのホモログは、開示されたポリヌクレオチドに対して少なくとも５０％の配列同一性（より好ましくは、少なくとも７５％の同一性、最も好ましくは、少なくとも９０％の同一性）を有し、一方でポリペプチドのホモログは、開示されたポリペプチドに対して少なくとも３０％の配列同一性（より好ましくは、少なくとも４５％の同一性、最も好ましくは、少なくとも６０％の同一性）を有する。好ましくは、開示されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドのホモログは、哺乳類種から単離されたものである。
【００３０】
二つの配列間の「相同性」または「配列同一性」の計算は、当業者に周知の手段によって行われる。例えば、配列同一性を計算するための一つの一般的な手段は、以下の通りである。配列は、最適な比較を行うためにアラインメントされる（例えば、最適なアラインメントのために、一番目および二番目のアミノ酸または核酸の配列の一方または両方において、ギャップが導入でき、比較の目的において、非相同の配列は無視することができる。好ましい実施形態において、比較目的でアラインメントされる参照配列の長さは、該参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、そして更により好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第一配列におけるある位置が、第二配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められている場合、分子はその位置において同一である。二つの配列間の同一率は、その二つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要のあるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れた、該配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
【００３１】
配列の比較および二つの配列間の配列同一率の決定は、数学アルゴリズムを使用して達成できる。好ましい実施形態において、二つのアミノ酸配列間の同一率は、Needleman-Wunschアルゴリズム（(1970) J. Mol. Biol. 48:444-53）を使用して決定され、これはＧＣＧソフトウエアパッケージ（www.gcg.comにて入手可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれており、Blossum 62マトリックスまたはPAM 250マトリックスが使用され、ギャップ重量は１６、１４、１２、１０、８、６または４、そして長さ重量は１、２、３、４、５または６が使用される。更に別の好ましい実施形態において、二つのヌクレオチド配列間の同一率は、ＧＣＧソフトウエアパッケージ（www.gcg.comにて入手可能）中のＧＡＰプログラムを使用して決定され、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重量および１、２、３、４、５または６の長さ重量が使用される。一つの好ましいパラメータのセットは、ギャップペナルティが１２、ギャップ延長ペナルティが４、そしてフレームシフトギャップペナルティが５のBlossum 62スコアリング・マトリックスである。二つのアミノ酸配列またはヌクレオチド間の同一率はまた、MeyersとMillerのアルゴリズム（(1989) CABIOS4:11-17）を使用しても決定され得、これはALIGNプログラム（バージョン２．０）に組み込まれており、PAM１２０荷重残基表を使用し、ギャップ長さペナルティが１２、ギャップペナルティが４である。
【００３２】
「実質的に純粋」は、例えば遺伝物質、関連タンパク質、膜、および細胞残屑などの天然に付随する成分から分離されている核酸、ポリペプチド、またはその他の分子として定義される。典型的には、天然に関連するタンパク質および天然の有機分子から、少なくとも６０ｗｔ％、７０ｗｔ％、８０ｗｔ％、９０ｗｔ％、９５ｗｔ％、または９９ｗｔ％まで遊離している場合、そのポリペプチドは実質的に純粋である。例えば、実質的に純粋なポリペプチドは、組み替え核酸を、通常はそのタンパク質を発現しない細胞中で発現させることにより、天然源から抽出することによって、または化学合成によって得られ得る。
用語「単離されたＤＮＡ」は、所定のＤＮＡが由来する生体の天然ゲノム内のＤＮＡの側方に位置する遺伝子およびその他のＤＮＡ配列から比較的、または実質的に遊離しているＤＮＡとして定義される。従って、用語「単離されたＤＮＡ」は、例えば、ｃＤＮＡ、クローニングされたゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡなどを包含する。
【００３３】
「ＩＬ−２１融合」ポリペプチドまたはタンパク質、または「ＩＬ−２１Ｒ融合」ポリペプチドまたはタンパク質は、第２の相同アミノ酸配列に結合される、例えば配列番号２の第１番目〜第２３５番目のアミノ酸由来のＩＬ−２１Ｒ細胞外フラグメントなどの、ＩＬ−２１またはＩＬ−２１Ｒアミノ酸配列の全部または一部として定義される。一つの実施形態において、第２の相同アミノ酸配列は、タグ配列である。一般的なタグ配列には、ｍｙｃタグ、ｈｉｓタグ、ｆｌａｇタグなどが含まれる。本発明の別の実施形態において、第２の相同アミノ酸配列は、例えばＦｃフラグメントなどの免疫グロブリン配列である。本明細書において更に詳しく述べられる、このような融合タンパク質および融合ポリペプチドは、「ＩＬ−２１融合遺伝子」または「ＩＬ−２１Ｒ融合遺伝子」と呼ばれる核酸配列によってコードされる。
スクリーニング方法において、「化合物」とは、天然のもの、または人工的なものにかかわらず、化学物質を指す。このような化合物には、例えば、ペプチド、ポリペプチド、合成有機分子、天然有機分子、核酸分子、ペプチド核酸分子、およびそれらの成分および誘導体が含まれ得る。例えば、本発明による有用な化合物は、ＩＬ−２１のＩＬ−２１Ｒへの結合を減少させる。
【００３４】
線維症または線維症に関連した状態を治療、改善または予防するのに使用するためのＩＬ−２１およびＩＬ−２１Ｒのアンタゴニストはまた、小分子より成り得る。用語「小分子」は、巨大分子ではない化合物を指す（例えば、Karp (2000) Bioinformatics Ontology 16:269-85；およびVerkman (2004) AJP-Cell Physiol. 286:465-74等参照）。このように、小分子はしばしば、例えば１０００ダルトンよりも少ない化合物と考えられる（例えば、VoetおよびVoet、Biochemistry、第2版、N. Rose, WILey and Sons編、New York、14(1995)参照）。例えば、Davisら、（2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:5981-86では、葉酸塩、メトトレキサートおよび神経ペプチドを示すために小分子のフレーズを使用している一方、HalpinおよびHarbury (2004) PLos Biology 2:1022-30では、例えばＤＮＡ、ＲＮＡおよびペプチドなどの小分子の遺伝子産物を示すためにフレーズを用いている。天然および合成の小分子の例には、コレステロール、神経伝達物質、ｓｉＲＮＡ、および、例えばＦＣＤ（Fine Chemicals Database）、ＳＭＩＤ（Small Molecule Interaction Database）、ＣｈＥＢＩ（Chemical Entities of Biological Interest）およびＣＳＤ（Cambridge Structural Database）などの多数の市販されている小分子データベース（例えばAlfaranoら、(2005) Nuc. Acids Res. Database Issue 33:D416-24参照）にリストアップされている多様な化学物質が含まれるが、これらに限定されない。
【００３５】
用語「医薬組成物」は、少なくとも１つの治療上または生物学的に活性の薬剤を含有し、被検体への投与に適切である、任意の組成物を意味する。これらの処方物のいずれもが、当技術分野において周知および受け入れられた方法によって調製され得る。例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy、第21版、（A.R.Gennaro編）、Lippincott WILliams & WILkins、Baltimore、MD(2005)参照。
本発明は、線維症に関連した状態の治療および予防のための標準的な療法に比べて有意な利点を提供する。本明細書に記載されるように、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの活性または発現のレベルを減少させる、またはＩＬ−２１とＩＬ−２１Ｒの相互作用を減少させる（すなわち、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの活性のレベルを減少させる）治療薬剤の投与の結果、線維症および線維症に関連した状態が改善、減少、または予防される。加えて、本発明が提供する化合物のスクリーニング方法によって、単に症状を和らげるよりもむしろ、損傷過程を変える新規の治療法を同定することが可能となる。
【００３６】
（線維性障害）
肉芽組織の産生は、注意深く組織された過程であって、その過程においては、プロテアーゼ阻害剤および細胞外マトリックスタンパク質の発現が調節されず、プロテアーゼの発現が減少し、細胞外マトリックスの蓄積に至る。しかし、繊維性材料の異常な蓄積は、最終的に臓器不全に至る場合がある（例えばBorderら、(1994) New Engl. J. Med. 331:1286-92参照）。誘導されたものか自然発生のものかにかかわらず、線維性の状態の進行は、少なくとも部分的には、線維芽細胞の活性の刺激によって引き起こされる。炎症細胞および活性化された線維芽細胞の損傷を受けた器官への流入は、これらの細胞型の、主としてコラーゲンを含有する間質マトリックスと相互に作用する能力に依存する。線維症に影響され得る組織の例には、腎臓、肺、肝臓、皮膚、中枢神経系、硬骨、骨髄、心臓血管系の組織、内分泌器官、および胃腸系の組織が含まれる。
【００３７】
本発明の方法および組成物は、例えば、内臓の線維症、皮膚または真皮の線維性障害、および眼における繊維性の状態などを含む、任意の組織に影響を与える、任意の線維症または線維症に関連した状態に対して有用である。内臓（例えば肝臓、肺、腎臓、心臓血管、胃腸管）の線維症は、肺線維症、特発性肺線維症、自己免疫線維症、骨髄線維症、肝硬変、肝内性肝静脈閉塞症、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、半月体形成性糸球体腎炎、糖尿病性ネフロパシー、腎間質線維症、シクロスポリンを受ける被検体における腎線維症、同種移植の拒絶反応、ＨＩＶに関連したネフロパシーなどの障害において起こる。その他の線維症に関連した障害には、全身性硬化症、好酸球増加・筋痛症候群、および眼球内の線維症などの線維症に関連したＣＮＳ障害が含まれる。皮膚の線維性障害には、例えば、強皮症、限局性強皮症、ケロイド、肥厚性瘢痕、家族性の皮膚の膠原腫、およびコラーゲンタイプの結合織母斑が含まれる。眼における繊維性の状態には、糖尿病性網膜症、手術後の瘢痕（例えば、緑内障のフィルタリング手術後、および斜視の手術後）、および増殖性硝子体網膜症などの状態が含まれる。本発明の方法によって治療され得る更なる繊維性の状態は、例えば、関節リウマチ、長期の関節痛および悪化した関節に関連した疾患、全身性進行性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、好酸球性筋膜炎、限局性強皮症、レイノー症候群、および鼻茸に起因し得る。本明細書に記載される通り、ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒ経路のアンタゴニストは、線維症および線維症に関連した障害を治療または予防するため、またはこれらの障害に関連した１つ以上の症状を改善するために投与され得る。
【００３８】
（ＩＬ−２１またはＩＬ−２１Ｒのアンタゴニスト（ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニスト））
本発明のＩＬ−２１アンタゴニストまたはＩＬ−２１Ｒアンタゴニストは、それぞれ、ＩＬ−２１またはＩＬ−２１Ｒ（例えばヒト、ウシ、ラット、マウス、馬、犬などの哺乳動物のＩＬ−２１またはＩＬ−２１Ｒ）と相互に作用し、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを減少させる（例えば、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒに関連した１つ以上の生物活性を減少させる）。この相互作用が直接の結合を伴う場合、アンタゴニストは、高い親和性をもってＩＬ−２１またはＩＬ−２１Ｒに結合する（例えば、親和定数が少なくとも約１０7Ｍ-1、好ましくは約１０8Ｍ-1、より好ましくは約１０9Ｍ-1〜１０10Ｍ-1またはそれ以上）。
ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルは、望ましくは１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％まで減少する。アンタゴニストは、例えば、ＩＬ−２１を中和することによってＩＬ−２１Ｒの活性を減少できる。アンタゴニストは、例えば配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５および２７に示される融合タンパク質などの、免疫グロブリンＦｃ領域などの非ＩＬ−２１Ｒフラグメントに融合されるＩＬ−２１Ｒのフラグメントを含む融合タンパク質であり得る。その他のアンタゴニストの例には、抗ＩＬ−２１抗体または抗ＩＬ−２１Ｒ抗体、それらの抗原結合性フラグメント、ＩＬ−２１Ｒの可溶性形態、ペプチド、抑制性のポリヌクレオチド（例えばｓｉＲＮＡ、ＳＮＰ、アプタマーなど）、および小分子が挙げられる。
【００３９】
一つの実施形態において、ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニストは、抗ＩＬ−２１Ｒ抗体または抗ＩＬ−２１抗体、あるいはそれらの抗原結合性フラグメントである。更なる実施形態において、抗体は中和抗体である。所望の場合、抗体は、ＩＬ−２１またはＩＬ−２１Ｒ、あるいはそれらの抗原結合性フラグメント（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖまたは単鎖のＦｖフラグメントなど）に結合するモノクローナル抗体または単一特異性抗体であり得る。抗体は、ＩＬ−２１ポリペプチドまたはＩＬ−２１Ｒポリペプチドに対するヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはインビトロで産生された抗体であり得る。
【００４０】
あるいは、ＩＬ−２１アンタゴニストまたはＩＬ−２１Ｒアンタゴニストは、ＩＬ−２１ポリペプチドまたはＩＬ−２１Ｒポリペプチドの全長（例えば変異配列）またはフラグメントであり得る（例えばヒト）。アンタゴニストの例には、例えば、ＩＬ−２１ポリペプチドの抑制性ＩＬ−２１レセプター結合ドメイン（例えばヒト）、あるいは、マウスまたはヒトＩＬ−２１Ｒの細胞外ドメインが含まれる。ＩＬ−２１アンタゴニストは、天然のＩＬ−２１Ｒ（例えば、配列番号２（ヒト）または配列番号５（マウス）など）またはそのフラグメントと実質的に同一の（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の配列同一性を有する）アミノ酸配列を有し得る（表２参照）。あるいは、アンタゴニストは、天然の哺乳動物のＩＬ−２１Ｒまたはそのフラグメント（例えば、配列番号１（ヒト）または配列番号４（マウス））と実質的に同一のヌクレオチド配列、または、ストリンジェントな条件、例えば高度にストリンジェントな条件下で前述のヌクレオチド配列の１つにハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有し得る（表１参照）。
【００４１】
【表２】
2008538553.tif 000004
【００４２】
必要に応じ、ＩＬ−２１Ｒポリペプチドは、膜の固着（membrane anchoring）が不可能な可溶性ポリペプチドであり得る。このような可溶性ポリペプチドには、例えば、膜貫通ドメインの十分な部分が無い、または膜貫通ドメインが非機能的であるように修飾されているＩＬ−２１Ｒポリペプチドが含まれる。例えば、ＩＬ−２１Ｒポリペプチドは、ＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメントであり得る（例えば、配列番号２（ヒト）のおよそ第１番目〜第２３５番目、第１番目〜第２３６番目、第２０番目〜第２３５番目、又は第２０番目〜第２３６番目のアミノ酸からのアミノ酸配列、または配列番号５（マウス）のおよそ第１番目〜第２３６番目、又は第２０番目〜第２３６番目のアミノ酸からのアミノ酸配列を含む、マウスまたはヒトＩＬ−２１Ｒの細胞外ドメインを含有するＩＬ−２１Ｒのフラグメントなど）。例となるＩＬ−２１アンタゴニストは、配列番号２の第２０番目〜第５３８番目のアミノ酸（成熟ヒトＩＬ−２１Ｒ）、配列番号２の第１番目〜第２３５番目のアミノ酸（ヒトＩＬ−２１Ｒの細胞外ドメイン）、配列番号２の第１番目〜第２３６番目のアミノ酸、配列番号２の第２０番目〜第２３５番目のアミノ酸、配列番号２の第２０番目〜第２３６番目のアミノ酸、配列番号５の第１番目〜第２３６番目のアミノ酸、または配列番号５の第２０番目〜第２３６番目のアミノ酸と実質的に同一のアミノ酸配列を有し得る。
【００４３】
本発明のＩＬ−２１アンタゴニストは、例えば表１に記載されたような高度にストリンジェントな条件下、配列番号１、配列番号４、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４または配列番号２６に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸によってコードされ得る。ＩＬ−２１Ｒタンパク質または融合タンパク質をコードする、しかし、遺伝子コードの縮重により配列番号１、４、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４または２６に示されるヌクレオチド配列と異なる単離されたポリヌクレオチドもまた、本発明に包含される。点突然変異または誘導された修飾によって引き起こされる、配列番号１、４、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４または２６に示されるヌクレオチド配列の変化物もまた、本発明に包含される。
【００４４】
所望であれば、可溶性のＩＬ−２１Ｒポリペプチドは、ポリペプチドなどの第２部分（例えば免疫グロブリン鎖、ＧＳＴ、Ｌｅｘ−ＡまたはＭＢＰのポリペプチド配列）を含み得るか、またはそれに融合され得る。例えば、融合タンパク質は、第２部分（例えば免疫グロブリン鎖、Ｆｃフラグメント、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥを含む多様な免疫グロブリンアイソタイプの重鎖定常領域など）に融合されるＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメント（例えば、配列番号２（ヒト）の第１番目〜第２３５番目、第１番目〜第２３６番目、第２０番目〜第２３５番目、もしくは第２０番目〜第２３６番目のアミノ酸、または配列番号５（マウス）の第１番目〜第２３６番目もしくは第２０番目〜第２３６番目のアミノ酸などの、マウスまたはヒトＩＬ−２１Ｒの細胞外ドメインを含有するフラグメント）などの、ＩＬ−２１を結合し得るＩＬ−２１Ｒポリペプチドのフラグメントを含み得る。
【００４５】
望ましくは、本発明のＩＬ−２１アンタゴニストは、例えば、ＩＬ−２１ポリペプチドと相互に作用する、またはそれに結合する能力、γｃまたはＪＡＫ１などのシグナル変換分子に関連する能力、リン酸化反応および／またはｓｔａｔタンパク質（例えばＳｔａｔ５および／またはＳｔａｔ３）の活性化を刺激する能力、および、増殖、分化、エフェクター細胞機能、細胞溶解活性、サイトカイン分泌、および／またはＴ細胞（Ｔｈ１およびＴｈ２細胞を含む、ＣＤ８+およびＣＤ４+Ｔ細胞）、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、および巨核球などの免疫細胞の生存を調節する（例えば刺激するまたは減少させる）能力を含む、天然のＩＬ−２１Ｒに関連した少なくとも１つの生物活性を減少させる。
【００４６】
本発明によれば、ＩＬ−２１ポリペプチドは、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１５に配列相同性を示すサイトカインである（Parrish-Novakら、(2000) Nature 408:57-63）。インターロイキンサイトカイン間での配列相同性が低いにもかかわらず、サイトカインは、共通の第２モチーフ、すなわち、ファミリーの典型である「４本ヘリックス束」構造を共有する。ＩＬ−２１は、主に活性化されたＣＤ４+Ｔ細胞中で発現され、ＮＫ細胞、Ｂ細胞およびＴ細胞に影響を与えることが報告されている（Parrish-Novakら、（2000）既出；およびKasaianら、(2002) Immunity 16:559-69参照）。IL-21は、ＩＬ−２１Ｒ（「ＭＵ−１」、「ＮＩＬＲ」および「ｚａｌｐｈａｌ１」とも呼ばれる）に結合する。ＩＬ−２１の結合の際、ＩＬ−２１Ｒの活性化により、Ｓｔａｔ５および／またはＳｔａｔ３のシグナル伝達が引き起こされる（Ozakiら、(2000)既出)。
ＩＬ−２１ポリペプチドのアミノ酸配列は公知である。例えば、ヒトＩＬ−２１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番ＮＭ＿０２１８０３で入手可能である。開示されているヒトＩＬ−２１ヌクレオチド配列が、以下に示される：
【化１】
2008538553.tif 000005
【００４７】
開示されているヒトＩＬ−２１ポリペプチドのアミノ酸配列が、以下に示される：
【化２】
2008538553.tif 000006
【００４８】
このように、ＩＬ−２１ポリペプチドとは、ＩＬ−２１Ｒと相互に作用可能な、またはそれに結合可能であって、以下の特性のうちの一つを有するタンパク質のことを言う：（i）天然の哺乳動物のＩＬ−２１またはそのフラグメント（例えば、配列番号８（ヒト））と実質的に同一のアミノ酸配列；（ii）天然の哺乳動物のＩＬ−２１ヌクレオチド配列またはそのフラグメント（例えば、配列番号７（ヒト）またはそのフラグメント）と実質的に同一のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列；（iii）例えば、配列番号７（ヒト）またはそのフラグメントなどの、天然のＩＬ−２１ヌクレオチド配列またはそのフラグメントに変性した（degenerate）ヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列；または（iv）ストリンジェントな条件下で、前述のヌクレオチド配列のうちの一つにハイブリダイズするヌクレオチド配列。
【００４９】
前述の本発明の局面全てにおいて、ＩＬ−２１ポリペプチドまたはＩＬ−２１Ｒポリペプチドは、それぞれＩＬ−２１ＲまたはＩＬ−２１に結合する、より高い親和性（突然変異のない配列に比較して）を有する結果となる天然のＩＬ−２１配列またはＩＬ−２１Ｒ配列（野生型）における突然変異を有する変異ポリペプチドとして提供され得る。このような突然変異は、例えばタンパク質分解耐性を高める（突然変異のない配列に比較して）のに有用であり得る。開示された配列のうちのいくつかのアミノ酸配列は、ＩＬ−２１またはＩＬ−２１Ｒの構造または機能を有意に変えることなく変化させることができる。一般的に、類似の機能を有する残基が使用されるのであれば、ＩＬ−２１タンパク質またはＩＬ−２１Ｒタンパク質の三次構造を形成する残基を置換することが可能である。他の場合において、重要でない領域において変更が起こるのであれば、残基の型は完全に無関係であり得る。このように、本発明は更に、実質的なＩＬ−２１型の生物活性を示すＩＬ−２１およびＩＬ−２１Ｒの改変体を含む。このような改変体には、欠失、挿入、逆位、繰り返し、およびタイプ置換（例えば、ある親水性残基を別のものに置換するが、強親水性残基から強疎水性残基へは置換しない）が含まれる。小さな変更または「ニュートラルな」アミノ酸置換は、タンパク質機能への影響が少ない場合が多い（Taylor (1986) J. Theor. Biol. 119:205-18参照）。同類置換には、脂肪族アミノ酸同士の置換、アミド残基同士の置換、塩基性残基同士の置換、および芳香族残基同士の置換が含まれ得るが、これらに限定されない。どのアミノ酸の変更が表現型的にサイレントである可能性が高いか（すなわち、機能に有意な影響を与える可能性が低い）についての更なるガイダンスは、Bowieら、(1990) Science 247:1306-10およびZvelebilら、(1987) J. Mol. Biol. 195:957-61において見ることが可能である。
【００５０】
必要に応じ、ＩＬ−２１またはＩＬ−２１Ｒアンタゴニストは、Ｆｃフラグメント等の免疫グロブリン鎖、ＧＳＴまたはｍｙｃ等のエピトープ（タグ）配列、および、Ｌｅｘ−ＡまたはＭＢＰポリペプチド配列等の更なる周知の配列などの第２部分に融合される、本明細書に記載されたＩＬ−２１またはＩＬ−２１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントを含有する融合タンパク質である。所望であれば、融合タンパク質には、第２部分（例えば、免疫グロブリン鎖、Ｆｃフラグメント、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥを含む多様なアイソタイプの重鎖定常領域など）に融合される、ＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメント（例えば、配列番号２（ヒト）のおよそ第１番目〜第２３５番目、第１番目〜第２３６番目、第２０番目〜第２３５番目、もしくは第２０番目〜第２３６番目のアミノ酸、または配列番号５（マウス）の第１番目〜第２３６番目もしくは第２０番目〜第２３６番目のアミノ酸由来のマウスまたはヒトＩＬ−２１Ｒの細胞外ドメインを含有するＩＬ−２１Ｒのフラグメント、または、配列番号１または４にコードされるポリペプチドに同一、または実質的に同一のフラグメント等）などの、ＩＬ−２１を結合可能なＩＬ−２１Ｒポリペプチドのフラグメントが含まれ得る。あるいは、Ｆｃレセプター結合を減少させるために、ヒトＦｃ配列は、天然の配列内において１つ以上のアミノ酸が突然変異されている（例えば、配列番号１６の第２５４番目及び第２５７番目の残基が突然変異されている）。その他の実施形態において、融合タンパク質は、マウス免疫グロブリンＦｃ鎖（例えばマウスＩｇＧ２ａ、またはマウスＩｇＧ２ａの突然変異形態等のマウスＩｇＧを含むがそれらに限定されない）に融合される、マウスＩＬ−２１Ｒの細胞外ドメイン（配列番号５（マウス）のおよそ第１番目〜第２３６番目又は第２０番目〜第２３５番目のアミノ酸由来）を含み得る。
【００５１】
本発明の方法において使用され得る拮抗的融合タンパク質の例を、図７−１５に示す。融合タンパク質は、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５または配列番号２７と実質的に同一のアミノ酸配列、または、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４または２６と実質的に同一のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列を含み得る。ある典型的な融合タンパク質は、Ｃ末端において、リンカー（配列番号１７の第２３６番目〜第２４３番目のアミノ酸に対応）によって、ヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）Ｆｃ変異配列（配列番号１７の第２４４番目〜第４６７番目のアミノ酸に対応）と融合した、ヒトＩＬ−２１Ｒ細胞外ドメイン（例えば、配列番号２の第１番目〜第２３５番目のアミノ酸）を含有する。ヒトＦｃ配列は、Ｆｃレセプター結合を減少させるために、野生型配列から第２５４番目及び第２５７番目の残基が突然変異されている。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号１６および配列番号１７として示されている。
【００５２】
第２のポリペプチドは、好ましくは可溶性である。必要に応じ、第２のポリペプチドは、結合されたポリペプチドの半減期（例えば血清の半減期）を改善する。所望であれば、第２のポリペプチドは、融合ポリペプチドの第２のＩＬ−２１ＲまたはＩＬ−２１ポリペプチドとの関連性を促進する配列を含む。第２のポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドの少なくともある領域を含み得る。免疫グロブリン融合ポリペプチドは当技術分野において知られており、例えば、米国特許第5,225,538号、第5,428,130号、第5,514,582号、第5,714,147号および第5,455,165号に記載されている。
必要に応じ、第２のポリペプチドは、全長免疫グロブリンポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ2、ＦｖまたはＦｃ等）である。
【００５３】
一つの例において、第２のポリペプチドは、野生型免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域のエフェクター機能よりも低いエフェクター機能を有する。Ｆｃエフェクター機能は、例えば、Ｆｃレセプター結合、補体結合、およびＴ細胞除去活性を含む（例えば米国特許第6,136,310号参照）。Ｔ細胞除去活性、Ｆｃエフェクター機能、および抗体安定性を検査する方法は、当技術分野において知られている。一つの実施形態において、第２のポリペプチドは、Ｆｃレセプターに対する親和性が低い、または親和性を有さない。別の実施形態において、第２のポリペプチドは、補体タンパク質Ｃ１ｑに対する親和性が低い、または親和性を有さない。
好ましい第２のポリペプチドの配列は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。この配列は、Ｆｃ領域を含む。下線が引かれたアミノ酸は、野生型免疫グロブリン配列の対応する位置に見られるアミノ酸とは異なるものである：
【化３】
2008538553.tif 000007
【００５４】
融合タンパク質は、第１部分を第２部分に結合させるリンカー配列を更に含み得る。例えば、融合タンパク質は、約４〜２０個のアミノ酸、より好ましくは５〜１０個のアミノ酸、そして最も好ましくは約８個のアミノ酸の長さからなるペプチドリンカーを含み得る。ペプチドリンカー内のアミノ酸は、例えばＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、ＴｈｒおよびＡｌａを含み得る。このように、ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒエレメントから成り得る。その他の実施形態において、融合タンパク質は、式（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）yを有するペプチドリンカーを含み、ここで、「ｙ」は１、２、３、４、５、６、７または８である。
その他の実施形態において、発現、検出および／または単離、または精製を促進するために、融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に、更にアミノ酸配列を追加し得る。例えば、ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒ融合タンパク質は、例えばＧＳＴ（すなわちグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、Ｈｉｓ、ＦＬＡＧまたはｍｙｃタグなどの１つ以上の更なる部分に結合され得る。例えば、融合タンパク質は、ＧＳＴペプチドを更に含み得、その場合において、融合タンパク質配列は、ＧＳＴ配列のＣ末端に融合されている。このような融合タンパク質は、ＩＬ−２１Ｒ／ＭＵ−１融合タンパク質の精製または同定を促進する。その他の実施形態において、発現、立体化学的柔軟性、検出および／または単離、または精製を促進するために、更なるアミノ酸配列は、融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に追加され得る。
【００５５】
融合タンパク質はまた、そのＮ末端において、非相同のシグナル配列をも含み得る。例えば、天然のＩＬ−２１Ｒシグナル配列は、除去され、別のタンパク質由来のシグナル配列に置換され得る。ある宿主細胞（例えば哺乳動物の宿主細胞）において、非相同のシグナル配列を使用して、ＩＬ−２１Ｒの発現および／または分泌が増加され得る。融合タンパク質に含有され得るシグナルペプチドは、ＭＰＬＬＬＬＬＬＬＬＰＳＰＬＨＰ（配列番号９）である。所望であれば、ＩＬ−２１Ｒ／ＭＵ−１部分を含む第１のポリペプチド部分と第２のポリペプチド部分との間に、１つ以上のアミノ酸が更に挿入され得る。
本明細書に記載されたＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニストは、誘導体化され得るか、または、例えば別のペプチドまたはタンパク質（例えばＦａｂ’フラグメント）などの別の機能分子に結合され得る。例えば、融合タンパク質または抗体、または抗原結合部分が、例えば、とりわけ抗体（例えば二重特異性抗体または多重特異性抗体）、毒素、放射性同位体、細胞毒性薬、細胞増殖抑制剤などの１つ以上のその他の分子的実体に、機能的に結合され得る（例えば、化学的結合、遺伝子融合、非共有結合性会合ないしは別の方法によって）。
【００５６】
本発明のキメラタンパク質または融合タンパク質は、標準的なＤＮＡ組み換え技術によって生成され得る。例えば、ライゲーションのための平滑末端または粘着末端、適切な末端を作り出すための制限酵素での消化、必要に応じた粘着末端の穴埋め、所望ではないライゲーションを避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素によるライゲーションなどを採用することにより、従来の技術に従って、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントをインフレームで結びつける。別の実施形態においては、融合遺伝子が、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来技術によって合成され得る。あるいは、キメラ遺伝子配列を産生するために後でアニールおよび再増幅され得る２つの連続した遺伝子フラグメント間の相補的なオーバーハングを引き起こすアンカープライマーを使用して、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅が行われ得る（例えば、Ausubelら（既出）参照）。更に、融合部分（例えば免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域）をコードする多数の発現ベクターが市販されている。融合部分が免疫グロブリンタンパク質にインフレームで結合されるように、ＩＬ−２１Ｒ／ＭＵ−１またはＩＬ−２１をコードする核酸が、このような発現ベクター内にクローニングされ得る。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２１Ｒ／ＭＵ−１またはＩＬ−２１融合ポリペプチドは、二量体または三量体などのオリゴマーとして存在する。当技術分野において知られている方法を使用して、ＩＬ−２１Ｒ／ＭＵ−１またはＩＬ−２１モノマー、および／またはＩＬ−２１Ｒ／ＭＵ−１またはＩＬ−２１をコードする核酸が構築され得る。
【００５７】
（核酸の生成）
ＩＬ−２１ＲまたはＩＬ−２１ポリペプチド（そのフラグメントおよび融合を含む）を遺伝子組み換え的に生成するために、本発明の単離されたポリヌクレオチドが、Kaufmanら、(1991) Nuc. Acids Res. 19:4485-90に開示されているｐＭＴ２またはｐＥＤ発現ベクターなどの発現調節配列に、作動可能に結合され得る。多数の適切な発現調節配列が、当技術分野において知られている。組み換えタンパク質を発現する一般的な方法もまた知られており、Kaufman (1990) Meth. Enzym. 185:537-66に例示されている。本明細書に定義される通り、「作動可能に結合され」とは、ＩＬ−２１ＲまたはＩＬ−２１ポリペプチドが、ライゲーションされたポリヌクレオチド／発現調節配列により形質転換（トランスフェクト）されている宿主細胞によって発現されるように、酵素的または化学的にライゲーションされて、本発明の単離されたポリヌクレオチドと発現調節配列との間に共有結合を形成することを意味する。
【００５８】
本明細書において使用される用語「ベクター」は、結合されている別の核酸を移送することが可能な核酸分子を指すことが意図される。ベクターの一つのタイプが「プラスミド」であり、これは、更なるＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る円形で二本鎖のＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターにはウイルスベクターがあり、ウイルスのゲノムに、更なるＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞における自己複製が可能である（例えば、細菌起源の複製を有する細菌ベクターおよび哺乳動物のエピソームベクターなど）。その他のベクター（例えば哺乳動物の非エピソームベクターなど）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノム内に統合され得、それによって宿主のゲノムと共に複製される。更に、ある種のベクターは、動作可能に結合された遺伝子の発現を指示することが可能である。このようなベクターは、本明細書において「組み換え発現ベクター」（または単純に「発現ベクター」）と称される。一般的に、ＤＮＡ組み換え技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態をとる場合が多い。本明細書において、「プラスミド」と「ベクター」は同じ意味で使用され得る。なぜならば、プラスミドは最も一般的に使用されるベクターの形態であるからである。しかし、本発明は、同等な機能を有するウイルスベクター（例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などの、その他の形態の発現ベクターをも含むことを意図する。
【００５９】
本発明の組み換え発現構成体は、調節配列（すなわち、複製起点、目的のポリペプチド（またはペプチド）をコードする核酸配列の転写などのベクターの複製、またはコードされたポリペプチドの発現を調節する配列）ヒスチジン等のタグ配列、および選択可能なマーカー遺伝子などの、更なる配列を有し得る。用語「調節配列」は、転写、複製または翻訳をコントロールするプロモーター、エンハンサー、およびその他の任意の発現調節エレメント（例えばポリアデニル化信号、転写スプライス部位）を含むことが意図される。このような調節配列は、例えば、Goeddel、Gene Expression Technology:Methods in Enzymology、Academic Press、San Diego、CA(1990)に記載されている。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、宿主細胞の選択および所望のタンパク質発現のレベルを含む多様な要因に依存するであろうことが、当業者によって理解されるであろう。哺乳動物の宿主細胞においてタンパク質を発現するための好ましい調節配列には、ＦＦ−１ａプロモーターおよびＢＧＨポリＡ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えばＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えばＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス（例えばアデノウイルスメジャーレイトプロモーター（ＡｄＭＬＰ））、およびポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの、高レベルのタンパク質発現を誘導するウイルスエレメントが含まれる。ウイルス性の調節エレメント、およびその配列は、例えば米国特許第5,168,062号、第4,510,245号および第4,968,615号に記載されている。
【００６０】
本発明の組み換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば複製起点および終了配列など）および選択マーカー遺伝子などの、更なる配列を含み得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する（例えば米国特許第4,399,216号、第4,634,665号および第5,179,017号（全てAxelら）参照）。例えば、選択マーカー遺伝子は典型的に、Ｇ４１８（ジェネティシン）、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの化合物に対する、選択マーカーでトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞の耐性を与える。好ましい選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサートの選択／増幅と共にｄｈｆｒ￣宿主細胞内で使用するため）、ｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）、および細菌に対するテトラサイクリンおよび／またはアンピシリン耐性を与える遺伝子が含まれる。
【００６１】
プロモーター配列、終了配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子およびその他の必要に応じた配列を含む適切な調節配列を含有する適切なベクターが、選択、あるいは構成され得る。ｐＴｅｔ−Ｏｎ（登録商標）およびｐＴｅｔ−Ｏｆｆ（登録商標）（クローンテック社、カリフォルニア州パロアルト）等テトラサイクリン誘導可能なベクターなどの、誘導可能なプロモーター配列を有するベクターを使用することによって達成されるタンパク質の誘導可能な発現もまた、開示された方法において使用することができる。発現ベクターに関する更なる詳細については、例えば既出のSambrookらを参照されたい。例えば、核酸構成体の調製、突然変異生成、シークエンシング、細胞内へのＤＮＡの導入、遺伝子発現、およびタンパク質の分析において核酸を操作するための多くの知られている技術およびプロトコルもまた、既出のSambrookらに詳しく記載されている。
【００６２】
多くのタイプの細胞が、ＩＬ−２１Ｒ／ＭＵ−１またはＩＬ−２１またはその融合タンパク質の発現に適切な宿主細胞として作用し得る。機能的ＩＬ−２１Ｒ／ＭＵ−１またはＩＬ−２１タンパク質またはその融合を発現可能な、任意の細胞タイプが使用され得る。適切な哺乳動物の宿主細胞には、例えば、サルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、その他の形質転換された霊長類の細胞株、正常２倍体細胞、一次組織のインビトロでの培養に由来する細胞株、初代外植片、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＬ−６０細胞、Ｕ９３７細胞、ＨａＫ細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、Ｒａｔ２細胞、ＢａＦ３細胞、３２Ｄ細胞、ＦＤＣＰ−１細胞、ＰＣ１２細胞、Ｍ１ｘ細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞が含まれる。
【００６３】
ＩＬ−２１ＲまたはＩＬ−２１ポリペプチドまたはその融合タンパク質はまた、１つ以上の昆虫発現ベクターにおいて、本発明の単離されたポリヌクレオチドを適切な制御配列に作動可能に結合し、昆虫の発現系を利用することによって生成することができる。バキュロウイルス／Ｓｆ９の発現系のための材料および方法は、キットの形態で市販されている（例えば、MAXBAC（登録商標）キット、インビトロジェン社、カリフォルニア州カールスバッド）。本明細書に記載されているポリペプチドの可溶性の形態もまた、上述のように適切な単離されたポリヌクレオチドを使用して、昆虫の細胞内で生成され得る。
【００６４】
あるいは、ＩＬ−２１ＲまたはＩＬ−２１ポリペプチドまたはその融合タンパク質は、酵母菌などの下等真核生物内で、または、細菌などの原核生物内で生成され得る。適切な酵母菌株には、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセスポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クリヴェロマイセス（Kluyveromyces）株、カンジダ菌、または、異種タンパク質を発現可能な任意の酵母菌株が含まれる。適切な細菌株には、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）、または、異種タンパク質を発現可能な任意の細菌株が含まれる。細菌内での発現の結果、組み換えタンパク質を組み込んだ封入体が形成され得る。このように、活性の、またはより活性の材料を生成するためには、組み換えタンパク質のリフォールディングが必要な場合がある。細菌の封入体由来の正しくリフォールディングされた異種タンパク質を得るためのいくつかの方法が、当技術分野において知られている。これらの方法は、一般的に、封入体由来のタンパク質を可溶化し、次にカオトロピック剤を使用してタンパク質を完全に変性させる工程を伴う。タンパク質の一次アミノ酸配列にシステイン残基が存在する場合、しばしば、ジスルフィド結合の正しい形成を可能にする環境（酸化還元系）において、リフォールディングを達成することが必要である。リフォールディングの一般的な方法は、Kohno (1990) Meth. Enzym. 185:187-95、欧州特許第0433225号および米国特許第5,399,677号において開示されている。
【００６５】
本発明のタンパク質（またはそのフラグメントまたは融合）はまた、例えば、トランスジェニックなウシ、ヤギ、ブタ、またはヒツジのミルクの成分として等、トランスジェニック動物の生成物として発現され得、これらは、例えば、ＩＬ−２１ＲまたはＩＬ−２１またはその融合タンパク質をコードする等、ポリヌクレオチド配列を含有する体細胞または胚細胞によって特徴づけられる。従って、タンパク質は、その所望のタンパク質を発現するために必要な培養条件下で、培養で形質転換された宿主細胞を育てることにより調製することができる。結果として得られた発現されたタンパク質は、次に、培地または細胞抽出物から精製することができる。タンパク質の可溶性の形態は、ならし培地から精製することができる。本発明のＩＬ−２１Ｒタンパク質の膜に結合された形態は、発現細胞から総膜画分を調製し、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（ＥＭＤバイオサイエンス社、カリフォルニア州サンディエゴ）等の非イオン系洗剤を使用して膜を抽出することにより精製することができる。
【００６６】
本明細書に記載されるポリペプチドは、当業者に知られている方法を使用して精製することができる。例えば、本発明のタンパク質は、ＡＭＩＣＯＮ（登録商標）またはＰＥＬＬＩＣＯＮ（登録商標）限外ろ過装置（ミリポア社、マサチューセッツ州ビレリカ）等、市販のタンパク質濃縮フィルターを使用して濃縮することができる。濃縮工程に続き、濃縮物は、ゲルろ過媒体等の精製マトリックスに適用することができる。あるいは、例えばペンダントしているジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）基を有するマトリックスまたは基質などの、陰イオン交換樹脂が利用できる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質の精製に一般的に利用されるその他のタイプであってよい。あるいは、陽イオン交換工程が利用できる。適切な陽イオン交換には、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む多様な不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が好ましい（例えばＳ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）カラム、シグマ・アルドリッチ社、ミズーリ州セントルイス）。培養上清からのＩＬ−２１Ｒ／ＭＵ−１タンパク質または融合タンパク質の精製はまた、コンカナバリンＡ−アガロース、ＡＦ−ＨＥＰＡＲＩＮ６５０、ヘパリン−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）またはチバクロンブルー３ＧＡ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）（トーソー・バイオサイエンス社、カリフォルニア州サンフランシスコ）等の親和性樹脂に対する；または、フェニルエーテル、ブチルエーテルまたはプロピルエーテル等の樹脂を使用した疎水性相互作用クロマトグラフィーによる；または免疫親和性クロマトグラフィーによる１つ以上のカラム工程を含む。最後に、ＩＬ−２１Ｒ／ＭＵ−１またはＩＬ−２１タンパク質を更に精製するために、例えばペンダントしているメチル基またはその他の脂肪族基を有するシリカゲル等の、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体を利用した、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）の１つ以上の工程が利用され得る。本発明のタンパク質に対する抗体を含む親和性カラムもまた、知られている方法に従って精製において使用され得る。実質的に精製された単離された組み換えタンパク質を提供するために、前述の精製工程のいくつか、または全てはまた、多様な組み合わせで、またはその他の知られている方法と共に利用され得る。好ましくは、単離されたタンパク質は、その他の哺乳動物のタンパク質から実質的に遊離されるように精製される。
【００６７】
（抗体の生成）
本発明のＩＬ−２１またはＩＬ−２１Ｒポリペプチドは、ＩＬ−２１またはＩＬ−２１Ｒと特異的に反応してＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの発現または活性を調節するか、またはＩＬ−２１とＩＬ−２１Ｒの相互作用のレベルを調節する、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を得るために、動物に免疫性を与えるために使用できる。このような抗体は、例えば、ＩＬ−２１Ｒ全体またはそのフラグメントを免疫原として使用して得ることができる。ペプチド免疫原は、カルボキシル末端にシステイン残基を更に含有し得、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等のハプテンに結合され得る。更なるペプチド免疫原が、チロシン残基を硫酸化チロシン残基で置換することにより産生され得る。このようなペプチドを合成する方法は、当技術分野において知られており、例えば、Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54およびKrstenanskyおよびMao (1987) FEBS Lett. 211:10-16に記載されている。
【００６８】
ＩＬ−２１またはＩＬ−２１Ｒに対するヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、マウス系よりもヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスを使用して産生され得る。ヒトタンパク質由来のエピトープに特異的な親和性を有するヒトｍＡｂｓを分泌するハイブリドーマを生成するために、目的の抗原で免疫性が与えられたこれらトランスジェニックマウス由来の脾細胞が使用される（例えば、国際公開第WO91/00906号、第WO91/10741号、第WO92/03918号および第WO92/03917号、Lonbergら、(1994) Nature 368:856-59；Green ら、(1994) Nat. Genet. 7:13-21、Morrisonら、(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-55；およびTuaillonら、(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:3720-24参照）。
【００６９】
モノクローナル抗体はまた、当業者に知られているＤＮＡ組み換え技術に関するその他の方法によって産生され得る。特別な抗原特異性を有する抗体フラグメントを同定および単離するために、「組合せ抗体ディスプレイ」方法と称される一つの典型的な方法が開発されており、モノクローナル抗体を生成するために利用され得る（組合せ抗体ディスプレイに関する記述については、例えばSastryら、(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:5728-32；Huseら、(1989) Science 246:1275-81；およびOrlandiら、(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:3833-37参照）。上述の通り免疫原で動物に免疫性を与えた後、得られたＢ細胞プールの抗体のレパートリーがクローニングされる。免疫グロブリン分子の異なる集団の可変領域のＤＮＡ配列は、オリゴマープライマーおよびＰＣＲの混合物を使用して得られ得る。例えば、５’リーダー（シグナルペプチド）配列および／またはフレームワーク１（ＦＲ１）配列、および保存３’定常領域プライマーに対するプライマーに対応する混合されたオリゴヌクレオチドプライマーが、多数のマウス抗体由来の重鎖および軽鎖の可変領域のＰＣＲ増幅に使用され得る（Larrickら、(1991) BioTechniques 11:152-56参照）。ヒト抗体由来のヒト重鎖および軽鎖可変領域を増幅するためにも、類似の戦略が使用され得る（Larrickら、(1991) Methods: Companion to Methods in Enzymology 2:106-10参照）。
【００７０】
キメラ免疫グロブリン鎖を含むキメラ抗体もまた、当技術分野において知られているＤＮＡ組み換え技術によって生成され得る。例えば、マウス（またはその他の種）のモノクローナル抗体分子のＦｃ定常領域をコードする遺伝子は、マウスＦｃをコードする領域を除去するために制限酵素を使用して切断され、ヒトＦｃ定常領域をコードする遺伝子の対応部分が置換される（PCT/US86/02269；欧州特許第184,187号；欧州特許第171,496号；欧州特許第173,494号；WO86/01533；米国特許第4,816,567号；欧州特許第125,023号；Betterら、（1988) Science 240:1041-43；Liuら、(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:3439-43；Liuら、(1987) J. Immunol. 139:3521-26；Sunら、(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:214-18；Nishimuraら、(1987) Canc. Res. 47:999-1005；Woodら、(1985) Nature 314:446-49；およびShawら、(1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-59参照）。
【００７１】
所望であれば、抗体または免疫グロブリン鎖は、当技術分野において知られている方法によってヒト化され得る。ヒト化された免疫グロブリン鎖を含むヒト化抗体は、抗原結合に直接に関与しないＦｖ可変領域の配列を、ヒトＦｖ可変領域由来の対応する配列で置換することによって産生され得る。ヒト化抗体を産生する一般的な方法は、Morrison (1985) Science 229:1202-07；Oiら、(1986) BioTechniques 4:214-21；および米国特許番号5,585,089、5,693,761および5,693,762によって提供され、これらの全てが、その全体を引用することにより本明細書の一部をなす。これらの方法には、重鎖または軽鎖のうちの少なくとも１つ由来の免疫グロブリンＦｖ可変領域の全部または一部をコードする核酸配列を単離、操作および発現する工程が含まれる。このような核酸のソースは当業者に周知であり、例えば、所定の標的に対する抗体を生成するハイブリドーマから得られ得る。ヒト化抗体またはそのフラグメントをコードする組み換えＤＮＡは、次に適切な発現ベクター内にクローニングされ得る。
【００７２】
ヒト化またはＣＤＲグラフト化抗体分子または免疫グロブリンは、ＣＤＲグラフト化またはＣＤＲ置換によって生成され得、ここで、免疫グロブリン鎖のうちの１つ、２つ、または全てのＣＤＲが置換され得る。例えば、米国特許番号5,225,539；Jonesら、(1986) Nature 321:552-25；Verhoeyanら、(1988) Science 239:1534-36；およびBeidlerら、(1988) J. Immunol. 141:4053-60参照。これらは全て、その全体を引用することによって、本明細書の一部となす。米国特許番号5,225,539には、本発明のヒト化抗体を調製するために使用され得るＣＤＲグラフト化方法が記載されている（英国特許公開第2188638号も参照されたい）。特定のヒト抗体のＣＤＲ全てが、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部で置換され得るか、またはＣＤＲのいくつかのみが非ヒトＣＤＲで置換され得る。ヒト化抗体を所定の抗原に結合させるのに必要なＣＤＲの数を置換しさえすればよい。
【００７３】
定常領域等、抗体のその他の部分を欠失、追加、または置換等することによって改変されているモノクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体もまた、本発明の範囲内にある。例えば、抗体は以下のようにして改変され得る：（i）定常領域を欠失させる；（ii）定常領域を別の定常領域、例えば、抗体の半減期、安定性および親和性を増加させることが意図される定常領域、または、別の種または別のクラスの抗体由来の定常領域などで置換する；または（iii）例えば、特に糖鎖付加部位の数、エフェクター細胞の機能、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）結合、補体結合を変えるために、定常領域内の１つ以上のアミノ酸を改変する。
【００７４】
抗体の定常領域を変える方法は、当技術分野において知られている。変えられた機能（例えば、細胞上のＦｃＲ等のエフェクターリガンド、または補体のＣ１成分に対する変えられた親和性）を有する抗体は、抗体の定常領域内の少なくとも１つ以上のアミノ酸残基を別の残基で置換することによって生成され得る（例えば、欧州特許公開第388,151号、米国特許第5,624,821号および第5,648,260号参照。これらは全て、その全体を引用することにより本明細書の一部をなす）。類似のタイプの変化が、マウス免疫グロブリンおよびその他の種由来の免疫グロブリンにも適用され得る。例えば、特定の残基を側鎖に適切な機能性を有する残基で置換することによって、または、グルタメートまたはアスパルテート等の荷電された官能基あるいは多分フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンまたはアラニン等の芳香族非極性残基を導入することによって、ＦｃＲ（例えばＦｃγＲ１）またはＣ１ｑ結合への抗体のＦｃ領域（例えばヒトＩｇＧ等のＩｇＧ）の親和性を変えることが可能である（例えば米国特許第5,624,821号参照）。
【００７５】
抗原によるチャレンジに応えて、その動物の内因性抗体よりもむしろ完全にヒト抗体を生成するように改変されたトランスジェニック非ヒト動物を使用して、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒに対するヒト抗体が、更に生成され得る。例えば国際公開第WO94/02602号参照。非ヒト宿主における免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードする内因性遺伝子は、機能しないようにされており、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードする活性の遺伝子座が、宿主のゲノムに挿入される。ヒト遺伝子は、例えば、必要なヒトＤＮＡセグメントを含有する酵母菌の人工染色体を使用して組み込まれる。そして、改変の全てよりも少ない種類の改変を含有する中間のトランスジェニック動物を異種交配することによって、所望の改変全てを提供する動物が、後代として得られる。このような非ヒト動物の一つの実施形態がマウスであり、XENOMOUSE（登録商標）と称され、国際公開第WO96/33735号および第WO96/34096号に開示されている。この動物は、完全にヒトの免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を生成する。抗体は、例えばポリクローナル抗体の調製としての目的の免疫原での免疫付与後に該動物から直接に得られるか、あるいは、モノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ等、該動物由来の不死化Ｂ細胞から直接に得られる。更に、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子が、抗体を直接得るために回収および発現され得、あるいは、例えば単鎖Ｆｖ分子等の抗体のアナログを得るために更に改変され得る。
【００７６】
ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの活性を調節するために、その他のタンパク質結合分子も利用することができる。このようなタンパク質結合分子には、小モジュラー免疫薬学的（small modular immunopharmaceutical、SMIP（登録商標））薬物（Trubion Pharmaceuticals社、ワシントン州シアトル）が含まれる。SMIPは、抗原やカウンターレセプター等の同種構造のための結合ドメイン；システイン残基を１つ有する、または有さないヒンジ領域のポリペプチド；および免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインから構成される単鎖ポリペプチドである（www.trubion.comも参照のこと）。SMIP、その使用および適用については、例えば米国特許出願公開第2003/0118592号、第2003/0133939号、第2004/0058445号、第2005/0136049号、第2005/0175614号、第2005/0180970号、第2005/0186216号、第2005/0202012号、第2005/0202023号、第2005/0202028号、第2005/0202534号、および第2005/0238646号、ならびにそれに関連するパテントファミリーメンバーに開示されており、それらは全て、その全体を引用することにより本明細書の一部をなす。
本明細書において述べられている通り、ＩＬ−２１ＲまたはＩＬ−２１またはその融合タンパク質に結合する中和抗体または非中和抗体（好ましくはモノクローナル抗体）は、線維症および線維症に関連した状態等の免疫状態の治療において有用であり得る。
従って、本発明は、ＩＬ−２１またはＩＬ−２１Ｒまたはその融合タンパク質と特異的に反応する抗体を含む組成物を更に提供する。
【００７７】
（スクリーニングアッセイ）
本発明のＩＬ−２１ＲまたはＩＬ−２１ポリペプチドまたは融合タンパク質はまた、ＩＬ−２１またはＩＬ−２１Ｒに結合可能で、例えばＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの活性レベル、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの発現レベル（例えばＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの遺伝子産物のレベル等）、および／またはＩＬ−２１とＩＬ−２１Ｒ間の相互作用のレベル等のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを調節可能な薬剤をスクリーニングするために使用され得る。支持体から離れていても固定されていても良い、本発明のタンパク質またはその結合パートナーを使用した結合アッセイは、当技術分野において周知である。本発明のＩＬ−２１ＲまたはＩＬ−２１ポリペプチドまたは融合タンパク質に対する結合パートナーおよび／またはリガンド（天然または合成、例えば試験化合物）を同定するために、精製された細胞ベースまたはタンパク質ベース（無細胞）のスクリーニングアッセイが使用され得る。例えば、ＩＬ−２１Ｒはキャリア上に精製された形態で固定され得、ＩＬ−２１Ｒに対する潜在的リガンドの結合が測定され得る。
【００７８】
（ＩＬ−２１に関連した、線維症および線維症に関連した障害の進行を診断、予知およびモニタリングする方法）
本発明は、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを検出および／または測定すること等により、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒに関連した障害、すなわち、線維症または線維症に関連した状態または障害の進行を診断、予知およびモニタリングする（例えば治療過程をモニタリングする）方法を提供する。ここで、「ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベル」のフレーズおよびそれに相当する語句は、（１）ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの遺伝子産物の発現レベル（例えば、目的の細胞または試料内におけるＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒタンパク質および／またはｍＲＮＡのレベル）；（２）ＩＬ−２１タンパク質および／またはＩＬ−２１Ｒタンパク質の活性レベル（例えば、Ｔｈ２サイトカイン発現および／または目的の細胞または試料内の機能）；および（３）ＩＬ−２１とＩＬ−２１Ｒの相互作用のレベル（例えば、目的の細胞または試料内において）を含むが、これらに限定されない。例えば、本発明は、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの遺伝子産物および／または活性の上方調節または下方調節の検出、および／またはＩＬ−２１のＩＬ−２１Ｒ等との相互作用の測定による診断、予知およびモニタリングの方法を提供する（ヒトの被検体におけるこのような方法の使用を含むが、これに限定されない）。ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの基準レベルを生成するまたは得るために、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルはまた、基準の目的の細胞または試料において測定され得る。または、このような基準レベルは、その他の方法を通じて入手され得るか、あるいは当業者に一般的に知られているものである。これらの方法は、例えば、臨床設定において便利に使用され得る、本明細書に記載されたＩＬ−２１またはＩＬ−２１Ｒポリヌクレオチド（またはそのフラグメント）；ＩＬ−２１またはＩＬ−２１Ｒポリペプチド（またはそのフラグメントおよび／または融合タンパク質）；ＩＬ−２１またはＩＬ−２１Ｒポリペプチドに対する抗体（またはその誘導体、またはその抗原結合性フラグメント）；またはＩＬ−２１またはＩＬ−２１Ｒポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドのモジュレータを含む群より少なくとも１つを含む、予めパッケージされた診断的キットを利用すること等によって実施され得る。
【００７９】
「診断的」または「診断」とは、病的状態が存在するかしないかを断定することを意味する。診断的方法には、被検体（ヒトまたは非ヒト哺乳動物）由来の生体試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの遺伝子産物（例えば、ＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはポリペプチド。そのフラグメントを含む）の試験量を測定することによって、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの活性を測定することによって、および／またはＩＬ−２１とＩＬ−２１Ｒの相互作用のレベルを測定することによって、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルの上方調節を検出し、試験量を、例えば正常量または正常範囲（例えば、ＩＬ−２１に関連した障害にかかっていないことがわかっている個体由来の量または範囲、あるいは、線維症または線維症に関連した状態にかかっていないことがわかっている個体由来の量または範囲）と比較することが含まれるが、これらに限定されない。特定の診断的方法は、ＩＬ−２１に関連した障害に関する確実な診断を提供しないかも知れないが、該方法が、診断に役立つ肯定的な兆しを提供するのであれば、十分である。
【００８０】
本発明はまた、例えば、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの遺伝子産物および／または活性の上方調節を検出すること、および／またはＩＬ−２１とＩＬ−２１Ｒの相互作用のレベルを測定すること等、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルの上方調節を検出することによって、このような障害を予知する方法を提供する。「予知的」または「予知」とは、病的状態の進行の可能性および／または重症度を予測することを意味する。予知的方法には、被検体由来の生体試料内のＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの遺伝子産物の試験量を測定し、その試験量を、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルの予知的量または範囲（すなわち、様々な重症度の障害、すなわち、例えばＩＬ−２１に関連した、線維症および／または線維症に関連した状態にかかっている個体由来の量または範囲）と比較することが含まれる。試験試料におけるＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルに関連した多様な量が、例えば、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒに関連した、線維症または線維症に関連した状態または障害等の障害に関するある予知と一致する。特定の予知的レベルにおけるＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒレベルの量の検出は、被検体に関する予知を提供する。
【００８１】
本発明はまた、例えば、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの遺伝子産物、活性、および／またはＩＬ−２１とＩＬ−２１Ｒの相互作用の上方調節を検出すること等、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルの上方調節を検出することによって、ＩＬ−２１に関連したこのような障害の進行または過程をモニタリングする方法を提供する。モニタリングの方法には、１回目および２回目に被検体から採取された生体試料におけるＩＬ−２１の遺伝子産物の試験量を測定し、それらの量を比較することが含まれる。１回目と２回目の間でのＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの遺伝子産物の量の変化は、ＩＬ−２１に関連した障害の過程における変化を示し、量の減少は、このような障害の寛解を、量の増加は、このような障害の進行を示す。このようなモニタリングアッセイはまた、線維症または線維症に関連した障害の治療を受けている患者における特定の治療的介入の有効性を評価するのにも有用である。
【００８２】
（ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルの測定）
本明細書において略述された本発明の方法（例えば、線維症または線維症に関連した状態を治療、改善または予防するための化合物をスクリーニングおよび／または同定する方法、線維症または線維症に関連した状態の進行を診断、予知および／またはモニタリングする方法、および、線維症または線維症に関連した状態を治療、改善または予防する方法等）におけるＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベル（例えば、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの遺伝子産物、活性および／または相互作用のレベル等）は、体液（例えば、全血、血漿および尿等）、細胞（例えば、全細胞、細胞分画および細胞抽出物等）、およびその他の組織を含む多様な生体試料内において測定され得る。生体試料にはまた、組織学的目的で採取された生検材料および凍結切片等の組織の切片が含まれる。好ましい生体試料には、血液、血漿、リンパ液、組織生検材料、尿、ＣＳＦ（脳脊髄液）、滑液、およびＢＡＬ（気管支肺胞洗浄）が含まれる。生体試料の分析において、必ずしも被検体から細胞または組織を取り出す必要はないことが理解されるであろう。例えば、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの遺伝子産物（例えば抗体や核酸等）に結合する適切に標識された薬剤が、被検体に投与され得、標準的な画像技術（例えばＣＡＴ、ＮＭＲ（ＭＲＩ）およびＰＥＴ）を使用して視覚化され得る（標的に結合された時）。
【００８３】
線維症または線維症に関連した障害を治療、改善または予防する方法において、被検体における線維症または線維症に関連した障害を治療、改善または予防するための化合物を同定する方法において、および、本発明の診断的、予知的、およびモニタリングアッセイおよび方法において、試験量を産生するために、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルが検出および測定される。試験量は次に、例えば正常量または正常範囲と比較される。例えば、正常量または正常範囲を超える量（例えばより高いレベル）は、ＩＬ−２１に関連した障害の診断における肯定的な徴候である。
ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの正常量またはベースライン値は、任意の特定の試料タイプおよび集団について測定され得る。一般的に、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのベースライン値（正常値）は、正常な（すなわち健康な）被検体由来の生体試料タイプ内においてＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのそれぞれのレベルを測定することにより決定される。あるいは、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの正常レベルは、病気の（または病気の可能性のある）試験細胞または試験組織が採取された同じ被検体から採取された健康な細胞または組織における量を測定することにより決定され得る。ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベル（正常量または試験量）は、細胞当たり、総タンパク質当たり、または容積当たりで測定または発現され得る。試料の細胞量を測定するために、構造的に発現された遺伝子産物、または生体試料が採取されたタイプの細胞において知られたレベルで発現されたその他の遺伝子産物のレベルが測定され得る。
【００８４】
本発明のアッセイ方法は、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルに関する絶対値の測定は、必ずしも必要ではないことが理解されるであろう。なぜならば、これらの方法の適用の多くにおいて、相対値で十分であるからである。また、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルの量または存在度に加え、変形した、または異常なＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベル、またはそれらの発現パターン（例えば、変異転写物、短縮ポリペプチド等）が、正常なレベルおよび発現パターンと比較することによって同定され得ることが理解されるであろう。
２つの試料における特定の遺伝子またはタンパク質のレベルが、それぞれ増加している（すなわち高まっている）か、または減少している（すなわち低くなっている）か（例えば、所定のレベルを有意に上回るか、または有意に下回るか）は、遺伝子そのものと、とりわけ、異なる個体または異なる試料間における発現、活性および／またはリガンドとの相互作用における変動性に依存する。試料間でＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルが有意に類似しているか、または異なっているかを決定することは、当技術分野における技術の範囲内である。２つの試料間でのＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルが増加しているか、または減少しているかを決定するために、個体、種、器官、組織、または細胞間での遺伝的多様性などの要因が考慮され得る（必要に応じて）。個体、種、器官、組織、または細胞間でのＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルにおける天然の不均質性の結果として、「有意に上回る」または「有意に下回る」等のフレーズは、正確なパーセンテージまたは値として定義され得ないが、むしろ、本発明を実施すれば、当業者によって確認され得る。ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの遺伝子産物、活性および相互作用を検出および測定する特定の方法が、本明細書に記載されている。
【００８５】
ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの遺伝子産物を測定するためのアッセイ
本発明の方法には、例えば、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの遺伝子産物のレベル、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの活性レベル、および／またはＩＬ−２１とＩＬ−２１Ｒの相互作用のレベル等、生体試料におけるＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒのレベルを検出および定量化することが含まれる。ＩＬ−２１およびＩＬ−２１Ｒの遺伝子産物には、ｍＲＮＡおよびポリペプチドが含まれ、どちらも、当業者に周知の方法を使用して測定され得る。
例えば、ｍＲＮＡは、ノーザンハイブリダイゼーション、インシトゥハイブリダイゼーション、ドットおよびスロットブロット、およびオリゴヌクレオチドアレイ等のハイブリダイゼーションをベースにしたアッセイを使用して、直接検出および定量化され得る。ハイブリダイゼーションをベースにしたアッセイとは、プローブ核酸が標的核酸にハイブリダイズされるアッセイのことを言う。いくつかのフォーマットにおいて、標的、プローブまたはその両方が固定される。固定された核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または別のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであってよく、天然または非天然のヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはバックボーンを含み得る。本発明において使用するための核酸プローブ配列を選択する方法（例えば、ＩＬ−２１の核酸配列に基づき）は、当技術分野において周知である。
【００８６】
あるいは、ｍＲＮＡは、検出および定量化前に増幅され得る。このような増幅をベースにしたアッセイは、当技術分野において周知であり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写式ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＰＣＲ−酵素免疫測定法（ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ）、およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を含む。増幅されたＩＬ−２１の遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ等）を生成および検出するためのプライマーおよびプローブは、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの核酸配列に基づき、当業者による過度の実験の必要なく、容易に設計および生成され得る。増幅されたＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの遺伝子産物は、例えば、ゲル電気泳動；プローブ核酸へのハイブリダイゼーション；配列決定；蛍光シグナル、リン光性シグナルまたは放射性シグナルの検出；または多様な周知の方法のうちのいずれか、によって直接分析され得る。加えて、標的核酸配列の増幅によって生成されるシグナルを増加させるものとして、方法は当業者に知られている。どの増幅法が使用されても、遺伝子産物の定量化が望まれる場合に、当技術分野において知られている多様な定量方法（たとえば定量ＰＣＲ）が使用され得ることを、当業者は認識するであろう。
【００８７】
ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒポリペプチド（またはそのフラグメント）は、当明細書に記載されるように産生され得る抗ＩＬ−２１抗体および／または抗ＩＬ−２１Ｒ抗体それぞれを利用する多様な周知の免疫アッセイを使用して検出され得る。免疫アッセイとは、例えばＩＬ−２１ポリペプチド（またはそのフラグメント）等に特異的に結合する抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ｓｃＦｖ抗体、および／またはそのフラグメント）を利用するアッセイのことを言う。本発明の実施に適切なこうした周知の免疫アッセイには、ＥＬＩＳＡ、放射免疫測定（ＲＩＡ）、免疫沈降、免疫蛍光、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）、およびウエスタンブロット法が含まれる。当業者であれば、ＩＬ−２１ポリペプチドが、標識されたＩＬ−２１Ｒポリペプチドを使用しても検出され得ることも認識するであろう。当業者であれば、前述の方法が、ＩＬ−２１に関連した障害、特に、線維症または線維症に関連した状態に適用され得ることを理解するであろう。
【００８８】
（ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの活性を測定するためのアッセイ）
ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒの活性（例えば、サイトカイン生成および細胞の増殖／分化のモジュレータとしてのＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニストに反応して）は、３２Ｄ、ＤＡ２、ＤＡ１Ｇ、Ｔ１０、Ｂ９、Ｂ９／１１、ＢａＦ３、ＭＣ９／Ｇ、Ｍ＋（ｐｒｅＢ  Ｍ＋）、２Ｅ８、ＲＢ５、ＤＡ１、１２３、Ｔ１１６５、ＨＴ２、ＣＴＬＬ２、ＴＦ−１、Ｍｏ７ｅおよびＣＭＫを含むがこれらに限定されない細胞株に関する多数のルーチンな因子依存性細胞増殖アッセイのうちの任意の一つを使用して試験され得る。
Ｔ細胞または胸腺細胞の増殖に関するアッセイは、例えば、Current Protocols in Immunology、Coliganら（編）、Greene Pub. Assoc. & WILey-Interscience、NY、NY(1991)(第3章「マウスのリンパ球の機能についてのインビトロアッセイ（In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function）」および第7章「ヒトにおける免疫学的研究（Immunologic studies in Humans）」）；Takaiら、(1986) J. Immunol. 137:3494-500；Bertagnolliら、(1990) J. Immunol. 145:1706-12；Bertagnolliら、(1991) Cell. Immunol. 133:327-41；Bertagnolliら、(1992) J. Immunol. 149:3778-83；Bowmanら、（1994) J. Immunol. 152:1756-61に記載されている。サイトカイン生成および／または脾臓細胞、リンパ節細胞または胸腺細胞の増殖に関するアッセイは、例えば、「ポリクローナルＴ細胞の刺激（Polyclonal T cell stimulation）」KruisbeekおよびShevach（Current Protocols in Immunology、Vol.1 Coliganら（編）、pp.3.12.1-14、John WILey and Sons、Toronto(1994））；および「マウスおよびヒトのインターフェロンガンマの測定（Measurement of mouse and human Interferon gamma）」Schreiber, R. D. (Current Protocols in Immunology、Vol. 1 Coliganら（編）、pp.6.8.1-8、John Wiley and Sons、Toronto (1994)）に記載されている。
【００８９】
造血細胞およびリンパ球産生細胞の増殖および分化に関するアッセイは、例えば、「ヒトおよびマウスのインターロイキン２およびインターロイキン４の測定（Measurement of Human and Murine Interleukin 2 and Interleukin 4）」Bottomlyら（Current Protocols in Immunology、Vol.1 Coliganら（編）pp.6.3.1-12、John Wiley and Sons、Toronto(1991））；de Vriesら、(1991) J. Exp. Med. 173:1205-11；Moreauら、(1988) Nature 336:690-92；Greenbergerら、(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2931-38；「マウスおよびヒトのインターロイキン６の測定（Measurement of mouse and human interleukin 6）」Nordan, R.（Current Protocols in Immunology、Vol.1 Coliganら（編）、pp.6.6.1-5、John Wiley and Sons、Toronto (1991））；Smithら、(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:1857-61；「ヒトのインターロイキン１１の測定（Measurement of human Interleukin 11）」Bennettら（Current Protocols in Immunology、Vol.1 Coliganら（編）、p.6.15.1、John Wiley and Sons、Toronto  (1991））；「マウスおよびヒトのインターロイキン９の測定（Measurement of mouse and human Interleukin 9）」Ciarlettaら（Current Protocols in Immunology、Vol.1.  Coliganら（編）、p.6.13.1、John Wiley and Sons、Toronto  (1991））に記載されている。
【００９０】
抗原に対するＴ細胞クローンの反応に関するアッセイ（とりわけ、増殖およびサイトカイン生成を測定することによる直接的なＴ細胞の影響と同様、ＡＰＣとＴ細胞の相互作用に影響を与えるタンパク質を同定するであろう）は、例えば、Current Protocols in Immunology、Coliganら（編）Greene Pub. Assoc．およびWiley-Interscience、NY、NY(1991）（第3章「マウスのリンパ球の機能についてのインビトロアッセイ（In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function）」；第6章「サイトカインおよびそれらの細胞受容体（Cytokines and their cellular receptors）」；および第７章「ヒトにおける免疫学的研究（Immunologic studies in Humans）」）；Weinbergerら、(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:6091-95；Weinbergerら、（1981) Eur. J. Immunol. 11:405-11；Takaiら、(1986) J. Immunol. 137:3494-500；Takaiら、(1988) J. Immunol. 140:508-12に記載されたものを含む。
【００９１】
（ＩＬ−２１とＩＬ−２１Ｒの相互作用の測定のためのアッセイ）
ＩＬ−２１とＩＬ−２１Ｒの相互作用のレベルを検出および／または測定する方法は、当技術分野において周知である。例えば、サイトカインとそのレセプター間でのこのような相互作用は、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法、免疫沈降、ビアコア（Biacore）による分析等の技術を使用して（ただしこれらに限定されない）検出および／または測定され得る。
【００９２】
（医薬組成物）
一つの局面において、本発明は、ＩＬ−２１に関連した障害、すなわち、線維症または線維症に関連した状態を治療、改善または予防する方法によって特徴づけられる。該方法は、例えばＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニスト等、被検体におけるＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒの活性レベルを減少させる薬剤（例えば、抗ＩＬ−２１Ｒ抗体、抗ＩＬ−２１抗体、抗ＩＬ−２１Ｒ抗体の抗原結合性フラグメント、抗ＩＬ−２１抗体の抗原結合性フラグメント、およびＩＬ−２１Ｒの可溶性フラグメント（例えば、配列番号２の第１番目〜第５３８番目のアミノ酸、配列番号２の第２０番目〜第５３８番目のアミノ酸、配列番号２の第１番目〜第２３５番目のアミノ酸、配列番号２の第２０番目〜第２３５番目のアミノ酸、配列番号２の第１番目〜第２３６番目のアミノ酸、配列番号２の第２０番目〜第２３６番目のアミノ酸、配列番号５の第１番目〜第５２９番目のアミノ酸、配列番号５の第２０番目〜第５２９番目のアミノ酸、配列番号５の第１番目〜第２３６番目のアミノ酸および配列番号５の第２０番目〜第２３６番目のアミノ酸からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列））を、細胞またはその集団におけるＩＬ−２１の活性を阻害するのに十分な量だけ、細胞の集団に接触させる（例えば、線維症または線維症に関連した障害にかかっている、またはその危険性のある検体に投与することによって）工程を含み得る。
【００９３】
線維症または線維症に関連した状態を治療するためのＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニストは、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わされた場合、医薬組成物として使用され得る。このような組成物は、ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニストおよびキャリアに加え、多様な希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、および当技術分野において周知のその他の材料を含有し得る。用語「薬学的に受容可能」とは、活性成分の生物活性の有効性を妨げない非毒性の材料を意味する。キャリアの特性は投与経路に依存し、一般的に当技術分野において周知である。
本発明の医薬組成物は、リポソームの形態であり得、この中において、ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニストは、他の薬学的に受容可能なキャリアに加え、脂質等の両親媒性薬剤と組み合わされ、これらは、水溶液内に存在するミセル、不溶性単分子層、液晶、またはラメラ層等の集合形態として存在する。リポソーム製剤用の適切な脂質には、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リソレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸等が含まれるが、これらに限定されない。このようなリポソーム製剤の調製は、当業者の実施レベルの範囲内にあり、例えば、米国特許番号4,235,871、4,501,728、4,837,028および4,737,323に開示されており、これらの全てが、その全体を引用することにより本明細書の一部をなす。
【００９４】
本明細書において使用される用語「治療上有効量」とは、例えば、このような状態に関する、症状の改善または減少、予防、治癒、または治癒の割合の増加等、重要な被検体の利益を示すのに十分な、医薬組成物または方法における各活性成分の総量を意味する。単独で投与される個々の活性成分に適用される場合、この用語は、その成分のみのことを言う。組合せに適用される場合、この用語は、併用、連続投与、同時投与の別を問わず、結果として治療効果を示すことになる、複数の活性成分の量を組み合わせたものを言う。
本発明の治療方法または使用を実施する際、治療上有効量のＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニストが、例えば哺乳動物（例えばヒト）等の被検体に投与される。ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニストは、本発明の方法のみに従って、または、本明細書により詳細に述べられるその他の治療法と組み合わせて投与され得る。１つ以上の薬剤と共に投与される場合、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２１Ｒアンタゴニストは、第２薬剤と同時に、または連続して投与され得る。連続投与の場合、ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニストをその他の薬剤と組み合わせて投与する際の適切な順番を、担当医が決定することとなる。
【００９５】
本発明の医薬組成物において使用されるＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニストの投与、または本発明の方法の実施は、例えば、経口摂取、吸入、あるいは、皮膚注射、皮下注射または静脈内注射等の多様な従来の方法によって行われ得る。被検体への静脈内投与が時には好ましい。治療上有効量のＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアゴニストまたはアンタゴニストが経口投与される場合、結合剤は、錠剤、カプセル、粉末、溶液またはエリキシル剤の形態をとる。錠剤の形態で投与される場合、本発明の医薬組成物は、ゼラチンまたはアジュバント等の固体キャリアを更に含有し得る。錠剤、カプセルおよび粉末は、約５〜９５％の結合剤、好ましくは約２５〜９０％の結合剤を含有する。液体の形態で投与される場合、水；石油；ピーナッツ油（但し集団におけるピーナッツアレルギーの頻度に留意）、鉱物油、大豆油、またはゴマ油等の動物または植物由来の油；または合成油などの液体キャリアが添加され得る。医薬組成物の液体形態は、生理食塩水、デキストロースまたはその他の糖類溶液、あるいはエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール等のグリコール類を更に含有し得る。液体形態で投与される場合、医薬組成物は、約０．５〜９０ｗｔ％の結合剤、好ましくは約１〜５０ｗｔ％の結合剤を含有する。
【００９６】
治療上有効量のＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニストが静脈内注射、皮膚注射または皮下注射によって投与される場合、結合剤は、ピロゲンのない、非経口的に受容可能な水溶液の形態をとるであろう。このような非経口的に受容可能なタンパク質溶液を、ｐＨ、等張性、安定性等に十分配慮しつつ調製することは、当分野の技術の範囲内である。静脈内注射、皮膚注射または皮下注射のための好ましい医薬組成物は、結合剤に加え、塩化ナトリウム注射液、リンガー液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、乳酸リンガー液、またはその他の当技術分野において知られているビヒクル等の等張性ビヒクルを含有するべきである。本発明の医薬組成物はまた、安定剤、防腐剤、緩衝液、酸化防止剤、または当業者に知られているその他の添加剤を含有し得る。
本発明の医薬組成物におけるＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニストの量は、治療される状態の性質および重症度、および被検体が受けた前治療の性質に依存するであろう。最終的に、個々の被検体を治療するために用いる結合剤の量は、担当医が決定することになる。はじめに、担当医は、少量の結合剤を投与し、被検体の反応を観察する。被検体にとって最適な治療効果が得られるまで、より多量の結合剤が投与され得、その時点で、用量は一般的にそれ以上増やされない。本発明の方法を実施するために使用される多様な医薬組成物は、体重１ｋｇ当たり約０．１μｇ〜約１００ｍｇのＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニストを含有するべきであると考えられる。
【００９７】
本発明の医薬組成物を使用する静脈内療法の期間は、治療される疾患の重症度、および、各被検体の状態および潜在的な特異的反応によって異なる。ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニストの各適用の期間については、１２〜２４時間の範囲の連続静脈内（i.v.）投与であり得ると考えられる。また、本発明の医薬組成物を使用する皮下（s.c.）注射療法も考えられる。これらの療法は、毎日、毎週、または、より好ましくは隔週または毎月投与され得る。また、ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニストが小分子である場合（例えば経口デリバリーのために）、これらの療法は毎日、１日に２回、１日に３回等の頻度で投与され得ると考えられる。最終的に、本発明の医薬組成物を使用する静脈内（i.v.）または皮下（s.c.）療法、あるいは小分子を用いた療法の適切な期間、および療法の投与のタイミングは、担当医が決定することになる。
本発明のポリヌクレオチドおよびタンパク質は、以下に同定される、１つ以上の使用または生物活性（本明細書に引用されたアッセイに関連するものを含む）を提示することが予期される。本発明のタンパク質、抗体またはポリヌクレオチドについて記載された使用または活性は、このようなタンパク質または抗体の投与または使用によって、あるいは、このようなタンパク質または抗体をコードするポリヌクレオチドの投与または使用によって提供され得る（例えば、ＤＮＡの導入に適した遺伝子療法またはベクターにおいて）。
【００９８】
（併用療法）
一つの実施形態において、少なくとも１つのＩＬ−２１Ｒ／ＩＬ−２１アンタゴニスト（例えばＩＬ−２１Ｒ／ＩＬ−２１抗体）と、少なくとも１つの治療薬剤と、を含む医薬組成物が、併用療法において投与される。このような療法は、例えば免疫および／または炎症性障害等の病的状態または障害を治療するために有用である。これに関し、用語「併用」とは、アンタゴニスト組成物および治療薬剤が、同時または連続であるを問わず、実質的に同時期に与えられることを意味する。連続して与えられる場合、２つの化合物のうちの第２化合物の投与開始時に、治療部位において、第１化合物がまだ有効濃度で検出可能であり得る。
例えば、併用療法は、少なくとも１つの更なる治療薬剤と共に処方され、および／または共に投与される少なくとも１つのＩＬ−２１Ｒ／ＩＬ−２１アンタゴニストを含み得る。更なる薬剤には、少なくとも１つのサイトカイン阻害剤、成長因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤、細胞毒性薬剤または細胞増殖抑制剤が含まれ得、以下により詳しく記載される。このような併用療法は、より少ない量の投与治療薬剤を有利に利用し得るので、多様な単剤療法に関連した毒性または合併症の可能性が避けられる。更に、本明細書に開示された治療薬剤は、ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒ経路と異なる経路に作用し得るので、ＩＬ−２１Ｒ／ＩＬ−２１アンタゴニストの効果を高める、および／または相乗作用を与えることが予期される。
【００９９】
ＩＬ−２１Ｒ／ＩＬ−２１アンタゴニストと組み合わせて使用される治療薬剤は、自己免疫およびその後の炎症反応における異なる段階において妨げる薬剤であり得る。一つの実施形態において、少なくとも１つの本明細書に記載されたＩＬ−２１Ｒ／ＩＬ−２１アンタゴニストが、少なくとも１つのサイトカインおよび／または成長因子アンタゴニストと共に処方され、および／または共に投与され得る。サイトカインおよび／または成長因子アンタゴニストは、可溶性レセプター、ペプチド阻害剤、小分子、リガンド融合、抗体（サイトカインまたは成長因子、またはそのレセプター、またはその他の細胞表面分子を結合する）および「抗炎症サイトカイン」、それらのアゴニストを含み得る。
【０１００】
本明細書に記載されたＩＬ−２１Ｒ／ＩＬ−２１アンタゴニストと組み合わせて使用され得る薬剤の限定されない例としては、少なくとも１つのインターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８おおびＩＬ−２２等）のアンタゴニスト；サイトカイン（例えば、ＴＮＦα、ＬＴ、ＥＭＡＰ−ＩＩおよびＧＭ−ＣＳＦ等）；または成長因子（例えば、ＦＧＦおよびＰＤＧＦ等）が含まれるが、これらに限定されない。薬剤はまた、インターロイキン、サイトカインおよび成長因子に対する少なくとも１つのレセプターのアンタゴニストも含み得るが、これらに限定されない。ＩＬ−２１Ｒ／ＩＬ−２１アンタゴニストはまた、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０（例えば、ＣＤ２０阻害剤のリツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）））、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ９０、またはＣＤ１５４（ｇｐ３９またはＣＤ４０Ｌ）を含むそれらのリガンド、あるいはＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１およびＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１等の細胞表面分子に対する抗体の阻害剤と組み合わせ得る（Yusuf-Makagiansarら、(2002) Med. Res. Rev. 22:146-67）。本明細書に記載されたＩＬ−２１Ｒ／ＩＬ−２１アンタゴニストと組み合わせて使用され得るその他の化合物は、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８およびＩＬ−２２のレセプターのアンタゴニストを含み得る。
【０１０１】
ＩＬ−２１Ｒ／ＩＬ−２１アンタゴニストとの併用療法において有用な薬剤の例は、ＩＬ−１２アンタゴニスト（ＩＬ−１２を結合する抗体等（例えば国際公開第WO00/56772号参照）；ＩＬ−１２レセプター阻害剤（ＩＬ−１２レセプターに対する抗体等）；および可溶性ＩＬ−１２レセプター、およびそれらのフラグメントを含む。ＩＬ−１５アンタゴニストの例は、ＩＬ−１５に対する抗体またはそのレセプター、ＩＬ−１５レセプターの可溶性フラグメント、およびＩＬ−１５結合タンパク質を含む。ＩＬ−１８アンタゴニストの例は、ＩＬ−１８に対する抗体、ＩＬ−１８レセプター可溶性フラグメント、およびＩＬ−１８結合タンパク質を含む（ＩＬ−１８ＢＰ、Mallatら、(2001) Circ. Res. 89:E41-45）。ＩＬ−１アンタゴニストの例は、インターロイキン−１変換酵素（ＩＣＥ）阻害剤（Ｖｘ７４０等）、ＩＬ−１アンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＡ（アナキンラ（ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標））等、アムジェン社）、ｓＩＬ−１ＲＩＩ（イムネックス社）、および抗ＩＬ−１レセプター抗体を含む。
【０１０２】
ＴＮＦアンタゴニストの例は、Ｄ２Ｅ７（ヒト抗ＴＮＦα抗体、米国特許番号6,258,562、ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）、アボット・ラボラトリーズ社）等のＴＮＦに対する抗体（ヒトＴＮＦα等）；ＣＤＰ−５７１／ＣＤＰ−８７０／ＢＡＹ−１０−３３５６（ヒト化抗ＴＮＦα抗体、セルテック社／ファルマシア社）；ｃＡ２（キメラ抗ＴＮＦα抗体、ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）、セントコア社）；および抗ＴＮＦ抗体フラグメント（ＣＰＤ８７０等）を含む。その他の例は、ｐ５５  ｋｄＴＮＦＲ−ＩｇＧ（５５ｋＤ  ＴＮＦレセプター−ＩｇＧ融合タンパク質、ＬＥＮＥＲＣＥＰＴ（登録商標））および７５  ｋｄＴＮＦＲ−ＩｇＧ（７５ｋＤ  ＴＮＦレセプター−ＩｇＧ融合タンパク質、ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）（エタネルセプト、イムネックス社））等の可溶性ＴＮＦレセプター（ヒトｐ５５またはｐ７５等）のフラグメントおよび誘導体を含む。例えば、van der Pollら、(1997) Blood. 89:3727-34；およびMoriら、（1996) J. Immunol. 157:3178-82参照。更なる例は、α−スルホニルヒドロキサム酸誘導体（国際公開第WO01/55112号）またはＮ−ヒドロキシホルムアミド阻害剤（ＧＷ３３３３、−００５または−０２２、グラクソ・スミスクライン社）およびＴＮＦ−ｂｐ／ｓ−ＴＮＦＲ（可溶性ＴＮＦ結合タンパク質、例えば、Lantzら、(1991) J Clin Invest. 88:2026-31；およびKapadiaら、(1995) Amer. J. Physiol. Heart Circ. Phys. 268:H517-25参照）等の酵素アンタゴニスト（ＴＮＦα変換酵素阻害剤（ＴＡＣＥ）等）を含む。ＴＮＦアンタゴニストは、７５ｋｄＴＮＦＲ−ＩｇＧおよびＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤等の可溶性ＴＮＦレセプター（例えばヒトｐ５５またはｐ７５等）のフラグメントおよび誘導体であり得る。
【０１０３】
その他の実施形態において、本明細書に記載されるＩＬ−２１Ｒ／ＩＬ−２１アンタゴニストは、以下のうちの少なくとも１つと組み合わせて投与され得る：可溶性ＩＬ−１３レセプターおよび／または抗ＩＬ−１３抗体等のＩＬ−１３アンタゴニスト；および、ＩＬ−２融合タンパク質（例えばSeragen社製のＤＡＢ４８６−ＩＬ−２および／またはＤＡＢ３８９−ＩＬ−２、Sewellら、(1993) Arthritis Rheum. 36:1223-33等参照）および抗ＩＬ−２Ｒ抗体（例えば抗Ｔａｃ（ヒト化抗体、プロテイン・デザイン・ラブ社、Junghansら、（1990) Cancer Res. 50:1495-502参照）等のＩＬ−２アンタゴニスト。別の組合せは、ＩＤＥＣ−ＣＥ９．１／ＳＢ２１０３９６（抗ＣＤ４抗体、グラクソ・スミスクライン社）等の非除去（nondepleting）抗ＣＤ４阻害剤とＩＬ−２１Ｒ／ＩＬ−２１アンタゴニストとの組合せを含む。更にその他の組合せは、ＩＬ−２１Ｒ／ＩＬ−２１アンタゴニストと、ＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）共刺激経路アンタゴニスト（抗体、可溶性レセプター、またはアンタゴニストリガンド等）；Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド（ＰＳＧＬ）およびＰＳＧＬ−１阻害剤（ＰＳＧＬおよび／またはＰＳＧＬ−１に対する抗体、および小分子阻害剤等）；Ｔ細胞およびＢ細胞除去剤（抗ＣＤ４または抗ＣＤ２２抗体等）、および抗炎症サイトカインおよびそのアゴニスト（抗体等）を含む。抗炎症サイトカインは、ＩＬ−４（例えばシェリング・プラウ  バイオファーマ）；ＩＬ−１０（例えばＳＣＨ５２０００、組み替えＩＬ−１０、シェリング・プラウ  バイオファーマ）；ＩＬ−１１；ＩＬ−１３；およびＴＧＦβまたはそのアゴニスト（例えばアゴニスト抗体）を含み得る。
【０１０４】
その他の実施形態において、少なくとも１つのＩＬ−２１Ｒ／ＩＬ−２１アンタゴニストが、少なくとも１つの抗炎症剤、免疫抑制剤、代謝阻害剤、および酵素阻害剤と共に処方、および／または共に投与され得る。本明細書に記載されるＩＬ−２１Ｒ／ＩＬ−２１アンタゴニストと組み合わせて使用され得る薬物または阻害剤の限定されない例は、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）（アスピリン、サルサレート、ジフルニサル、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナブメトン、ピロキシカム、ナプロキセン、ジクロフェナク、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、エトドラク、ケトロラック、オキサプロジン、テニダップ、メロキシカム、ピロキシカム、アセクロフェナク、トルメチン、チアプロフェン酸、ニメスリド等を含むが、これらに限定されない）；スルファサラジン；コルチコステロイド（プレドニゾロン等）；サイトカイン抑制性抗炎症薬（ＣＳＡＩＤ）；ヌクレオチド生合成の阻害剤（プリン生合成の阻害剤等（例えばメトトレキサート等の葉酸アンタゴニスト等））；および、例えばレフルノミド等のジヒドロオロト酸脱水素酵素（ＤＨＯＤＨ）阻害剤等のピリミジン生合成の阻害剤のうちの少なくとも１つを含むが、これらに限定されない（例えばKraanら、（2004) Ann. Rheum. Dis. 63:1056-61参照）。ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニストと組み合わせて使用するための治療薬剤は、１つ以上のＮＳＡＩＤ、ＣＳＡＩＤ、ＤＨＯＤＨ阻害剤（レフルノミド等）、および葉酸アンタゴニスト（メトトレキサート等）を含み得る。
【０１０５】
ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニストと組み合わせて使用され得る更なる薬剤の例は、コルチコステロイド（経口、吸入および局注）；免疫抑制剤（シクロスポリンおよびタクロリムス（ＦＫ−５０６）等）；ｍＴＯＲ阻害剤（例えばＣＣＩ−７７９等のエステルラパマイシン誘導体等、シロリムス（ラパマイシン）またはラパマイシンのアナログおよび／または誘導体等（Elit (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1249-53；およびHuangら、(2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:295-304等参照））；ＴＮＦαおよびＩＬ−１等の炎症性サイトカインのシグナル伝達を妨げる薬剤（例えばＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８またはＭＡＰキナーゼ阻害剤）；ＴＰＬ−２、Ｍｋ−２およびＮＦκｂ阻害剤；ＣＯＸ−２阻害剤（例えばセレコキシブ、ロフェコキシブ等、およびそれらの改変体等）；ホスホジエステラーゼ阻害剤（ロリプラム等）；ホスホリパーゼ阻害剤（例えばトリフルオロメチルケトンアナログ等、細胞質型ホスホリパーゼ２（ｃＰＬＡ２）の阻害剤等（米国特許番号6,350,892））；血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の阻害剤；ＶＥＧＦレセプターの阻害剤；血管形成の阻害剤；ＲＡＧＥおよび可溶性ＲＡＧＥ；エストロゲンレセプターβ（ＥＲＢ）アゴニスト、ＥＲＢ−ＮＦκｂアンタゴニスト；インターフェロンβ（例えばＩＦＮβ−１ａおよびＩＦＮβ−１ｂ）；コパクソン；およびコルチコステロイドのうちの少なくとも１つを含む。
【０１０６】
ＩＬ−２１Ｒ／ＩＬ−２１アンタゴニストと組み合わせ得るその他の有用な治療薬剤は、以下を含む：ブデノシド（budenoside）；上皮成長因子；アミノサリチル酸塩；６−メルカプトプリン；アザチオプリン；メトロニダゾール；リポキシゲナーゼ阻害剤；メサラミン；オルサラジン；バルサラジド；酸化防止剤；トロンボキサン阻害剤；成長因子；エラスターゼ阻害剤；ピリジニル−イミダゾール化合物；グルクロニドまたはデキストランが結合されたプレドニゾロンのプロドラッグ；デクサメタゾンまたはブデソニド；ＩＣＡＭ−１アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（ＩＳＩＳ２３０２；アイシス・ファーマシューティカルズ社）；可溶性補体レセプター１（ＴＰ１０；ティーセルサイエンス社）；徐放性メサラジン；血小板活性化因子（ＰＡＦ）のアンタゴニスト；シプロフロキサシン；リグノカイン；シクロスポリンＡ；ヒドロキシクロロキン（ＰＬＡＱＵＥＮＩＬ（登録商標））；ミノサイクリン（ＭＩＮＯＣＩＮ（登録商標））；およびアナキンラ（ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標））。
本発明のＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニストと組み合わせて投与するための特定の治療薬剤の選択は、特定の被検体、所望の標的、および選択された治療の長さ等の要因に大きく依存するであろう。このような決定は、十分に当業者の技術および知識の範囲内である。
【０１０７】
ＩＬ−２１Ｒ／ＩＬ−２１アンタゴニストと組み合わせ得る治療薬剤の更なる例は、以下のうちの１つ以上を含む：６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）；アザチオプリン；スルファサラジン；メサラジン；オルサラジン；クロロキン；ヒドロキシクロロキン（ＰＬＡＱＵＥＮＩＬ（登録商標））；ペンシルアミン（pencilamine）；オーロチオルナレート（aurothiornalate）（筋肉内および経口）；アザチオプリン；コルヒチン；β−２アドレナリンレセプターアゴニスト（サルブタモール、テルブタリン、サルメテロール）；キサンチン（テオフィリン、アミノフィリン）；クロモグリク酸；ネドクロミル；ケトチフェン；  イプラトロピウムおよびオキシトロピウム；ミコフェノール酸モフェチル；アデノシンアゴニスト；抗血栓剤；補体阻害剤；およびアドレナリン作動薬。
一つの実施形態において、ＩＬ−２１Ｒ／ＩＬ−２１アンタゴニストは、免疫反応の調節に関与する他の標的に向けられた１つ以上の抗体と組み合わせて使用され得る。本発明のＩＬ−２１Ｒ／ＩＬ−２１アンタゴニストと組み合わせ得る、免疫反応を治療または予防するための薬剤の限定されない例は、以下を含む：その他の細胞表面分子に対する抗体であって、ＣＤ２５（インターロイキン−２レセプター−ａ）、ＣＤ１１ａ（ＬＦＡ−１）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳＬ、ＩＣＯＳ、ＣＤ８０（Ｂ７．１）および／またはＣＤ８６（Ｂ７．２）を含むがこれらに限定されない。更に別の実施形態において、ＩＬ−２１Ｒ／ＩＬ−２１アンタゴニストは、シクロスポリンＡまたはＦＫ５０６等、１つ以上の一般的な免疫抑制剤と組み合わせて使用される。別の実施形態において、ＩＬ−２１／ＩＬ−２１Ｒアンタゴニストは、ＣＴＬＡ４アゴニスト（例えばＣＴＬＡ４  Ｉｇ−アバタセプト（ＯＲＥＮＣＩＡ（登録商標））等）と組み合わせて使用される。
【０１０８】
本出願全体を通じて引用されている全ての引例、特許、および公開された特許出願の内容全体は、引用することにより本明細書の一部をなす。
以下の実施例は、例示的な本発明の実施形態を提供し、決して本発明を限定するものではない。当業者であれば、本発明の範囲に、その他の多数の実施形態が包含されることを認識するであろう。
実施例
【実施例１】
【０１０９】
（材料および方法）
（実施例１．１：マウス、寄生虫病および抗原の調製）
メスまたはオスのＣ５７ＢＬ／６マウス、Ｃ５７ＢＬ／６／Ａｉ−ＩＬ−１０ＫＯ／ＩＬ−４ＫＯマウスおよびＣ５７ＢＬ／６Ａｉ−ＩＬ−１０ＫＯ／ＩＬ−１２ＫＯマウスが、タコニック社（ニューヨーク州ジャーマンタウン）から入手された（Hoffmannら、(1999) J. Immunol. 163:927-938）。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＩＬ−２１Ｒ-/-マウスのつがいが、ハーバード大学公衆衛生学部（マサチューセッツ州ボストン）で飼育されている繁殖コロニーから入手された（Kasaianら、(2002) Immunity 16:559-69）。全てのマウスは、国立衛生研究所における特定の無菌の状態下、実験動物管理認定協会に認可された施設内で飼育された。ＮＩＡＩＤ動物管理使用委員会は、全ての実験手順を認可した。先に述べた通り、マンソン住血吸虫卵を、感染したマウス（バイオ医療研究所、メリーランド州ロックビル）の肝臓から抽出した（Wynnら、(1995) Nature 376:594-96）。同期原発性肺肉芽腫の誘導のため、５０００個の卵をマウスに静脈内（i.v.）投与した。第二次肉芽腫の誘導のため、マウスを、腹腔内（i.p.）において５０００個の生きた卵で感作し、次に、静脈内（i.v.）において５０００個の生きた卵でチャレンジした（Wynnら、(1994) J. Exp. Med. 179:551-61)。感染実験において、感染したカタツムリ（Biomphalaria glabrata、バイオ医療研究所、メリーランド州ロックビル）から得られたマンソン住血吸虫（ＮＭＲＩ）のプエルトリコ株の２５〜３０匹のセルカリアを用いて、マウスを尾から経皮的に感染させた。先に述べた通り、可溶性の卵抗原（ＳＥＡ）および可溶性虫抗原性製剤（ＳＷＡＰ）は、マンソン住血吸虫卵および寄生成虫から精製および均質化されたものであった（Cheeverら、(1994) J. Immunol. 153:753-59）。他所に記載されるように（同上）、蠕虫および組織の卵の負担が測定できるように、全ての動物に、犠牲にされる際にかん流を適用した。先に述べられたように、腸管寄生線虫（Nippostrongylus brasiliensis）の幼虫（Ｌ３）が調製された（Katonaら、(1983) J. Immunol. 130:350-56）。マウスには、５００個のＬ３を皮下注射によって接種した。接種後７日目に、サイトカイン分析のために、肺の組織および縦隔リンパ節を回収した。
【０１１０】
（実施例１．２：組織病理および線維症）
ライト・ギムザ染色で染色した組織切片において、肺肉芽腫および肝肉芽腫の大きさを測定した（ヒストパス・オブ・アメリカ、メリーランド州クリントン）。全ての分析において、マウス１匹当たり約３０個の肉芽腫が含まれた。熟練の病理学者が、同じ切片における好酸球、肥満細胞およびその他のタイプの細胞のパーセンテージを評価した。ヒドロキシプロリンのレベルによって測定された、肝臓および消化管における住血吸虫卵の数、および肝臓におけるコラーゲンの含有量が、先に述べられたように測定された（Cheeverら、既出）。具体的には、５ｍｌの６Ｎ  ＨＣｌ内で２００ｍｇの肝臓の一部を１１０℃で１８時間加水分解した後に、Bergman & Loxley法の技術によって、ヒドロキシプロリンを基に肝臓のコラーゲンを測定した（BergmanおよびLoxley (1963)  Analytical Biochem. 35:1961-65）。肝臓のヒドロキシプロリンの増加は、全ての実験において卵の数と正の相関を示し、肝臓のコラーゲンは、正常な肝臓のコラーゲンよりも１０，０００個の卵当たりのミクロモル単位での増加として報告される：（感染した肝臓のコラーゲン−正常な肝臓のコラーゲン）／肝臓の卵×１０-4または蠕虫の対当たりのミクロモル単位。遅い慢性の時点において、線維症は、肝臓当たりの総肝臓コラーゲン量として報告される。同じ個体が、全ての組織学的特徴でスコアし、実験的設計の知識は有さなかった。
【０１１１】
（実施例１．３：ＦＡＣＳ分析）
肺全体を取り出し、ＲＰＭＩ内に配置した。７０ミクロンのナイロンメッシュ（ＢＤファルコン社、カリフォルニア州サンディエゴ）を通して引っ張ることにより、組織をバラバラにした。単一細胞懸濁液を洗浄し、ＲＢＣを、ＡＣＫ溶菌液で３分間インキュベートすることによって溶解した。肺のリンパ球を、ＦＡＣＳ緩衝液内で４℃で１５分間、ＰＥ−Ｃｙ５で標識した抗ＣＤ４およびＦｃ  Ｂｌｏｃｋを共に使用して標識した（どちらの抗体もＢＤファーミンゲン社製、カリフォルニア州サンディエゴ）。洗浄後、ＦＬＯＷＪＯ（登録商標）ソフトウエアを使用して、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒで細胞を分析した（ツリースター社、オレゴン州アッシュランド）。
【０１１２】
（実施例１．４：ｓＩＬ−２１Ｒ−Ｆｃを使用したＩＬ−２１ブロッキング実験）
３０〜３５匹のマンソン住血吸虫のセルカリアを用いて、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１０匹／グループ）を、尾から経皮的に感染させた。感染後６週目から、ｍＩＬ−２１Ｒ−Ｆｃ（ワイス・リサーチ）または抗コクシジウム（E.tenella）マウスＩｇＧ２ａ制御抗体（ワイス・リサーチ）を使用して、マウスを治療した。各マウスに、１回２００μｇの用量を、腹腔内注射により週３回、５週にわたって投与した。感染後１２週でマウスを犠牲にし、ヒドロキシプロリンアッセイにより、肝線維症を測定した。
【０１１３】
（実施例１．５：リンパ球の培養および酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いたサイトカイン検出）
脾臓および腸間膜のリンパ節（感染モデル）または肺関連リンパ節（肺のモデル）を無菌状態で除去し、先に述べた通りに単一細胞懸濁液を調製した（Hesseら、(2000) Am. J. Pathol. 157:945-55）。５％ＣＯ2の湿気のある環境において、培養物を３７℃でインキュベートした。ＳＥＡ（２０μｇ／ｍｌ）、ＳＷＡＰ（５０μｇ／ｍｌ）、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ；１μｇ／ｍｌ）、または培地のみを使用して、細胞を刺激した。７２時間で上清液を採取し、サイトカイン生成物のアッセイを行った。先に記載したように（同上）、対を成す抗体（ＢＤファーミンゲン社製、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５およびＩＬ−１０を測定した。組み換えマウスサイトカイン（ＢＤファーミンゲン社製、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して構築された標準曲線を用いて、サイトカインのレベルを算出した。製造業者のプロトコルに従い、マウスＩＬ−１３  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネソタ州ミネアポリス）を使用して、ＩＬ−１３のレベルを測定した。製造業者のプロトコルに従い、マウスＴＧＦ−β１  ＤＵＯＳＥＴ（登録商標）ＥＬＩＳＡディベロップメントシステム（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネソタ州ミネアポリス）を使用して、ＴＧＦ−β１のレベルを定量化した。ウシ由来のＴＧＦ−β１の混入を避けるため、細胞をＰＢＳ内で３回洗浄し、０．５％マウス血清を含有する培地内で培養した。
【０１１４】
（実施例１．６：ＲＮＡの単離および精製、およびリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応）
１ｍｌ  ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬（インビトロジェン社、カリフォルニア州カールスバッド）内に個々に配置された肺および肝臓の組織試料から、ＲＮＡ全部を抽出した。ティッシュポリトロン（tissue polytron、オムニインターナショナル社、ジョージア州マリエッタ）を使用して、試料を均質化し、製造業者の推奨に従ってＲＮＡ全部を抽出し、キアゲンのＲＮＥＡＳＹ（登録商標）ミニキット（キアゲンサイエンス社、メリーランド州ジャーマンタウン）を使用して更に精製した。個々の試料ＲＮＡ（１μｇ）を、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ＩＩ（登録商標）（インビトロジェン社、カリフォルニア州カールスバッド）、およびオリゴ（ｄＴ）とランダムプライマーの混合物を使用して逆転写した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００配列検出システム（アプライドバイオシステムズ社、カリフォルニア州フォスターシティ）で、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社、カリフォルニア州フォスターシティ）を使用し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００／７９００配列検出システム（アプライドバイオシステムズ社、カリフォルニア州フォスターシティ）に関してアプライドバイオシステムズ社が述べている相対閾値サイクル法によって、いくつかの遺伝子についてのｍＲＮＡの相対量を測定した。この方法において、各試料のｍＲＮＡレベルを、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼのｍＲＮＡレベルまで標準化し、次に、感染していないコントロールにおけるレベルと比較して、相対的に増加しているか減少しているかを表した。プライマーは、ＰＲＩＭＥＲ  ＥＸＰＲＥＳＳ（登録商標）ソフトウエア（アプライドバイオシステムズ社、カリフォルニア州フォスターシティ）を使用して設計した。ＩＬ−１３、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＨＰＲＴ（Hesseら、（2001) J. Immunol 167:6533-44)、ＩＬ−１３Ｒα２（Chiaramonteら、(2003) J. Exp. Med. 197:687-701）、Ｙｍ１、ＦＩＺＺ１および酸性キチナーゼ（ＡＭＣａｓｅ）（Sandlerら、既出）に対するプライマーは、以前に公開されており、以下を含む：
【０１１５】
ＩＬ−２１
5' GCCAG ATCGC CTCCT GATTA 3'（センス）（配列番号２８）；
5' CATGC TCACA GTGCC CCTTT 3'（アンチセンス）（配列番号２９）；
ＩＬ−２１Ｒ
5' CTCCC CCCTT GAACG TGACT 3'（センス）（配列番号３０）；
5' TTGCC CCTCA GCACG TAGTT 3'（アンチセンス）（配列番号３１）；
ＩＦＮ−γ
5' AGAGC CAGAT TATCT CTTTC TACCT CAG 3'（センス）（配列番号３２）；
5' CCTTT TTCGC CTTGC TGTTG 3'（アンチセンス）（配列番号３３）
【０１１６】
（実施例１．７：血清抗体イソタイプ分析および骨髄由来のマクロファージ）
製造業者のプロトコルに従って、ＢＤ  ＯＰＴＥＩＡ（登録商標）マウスＩｇＥ  ＥＬＩＳＡセット（BD Biosciences Pharmingen社製、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して総ＩｇＥを測定した。間接的なＥＬＩＳＡ方式により、ＳＥＡ特異的ＩｇＧｌおよびＩｇＧ２ｂアイソタイプ特異的抗体（Ａｂ）の力価を評価した。ＩＭＭＵＬＯＮ（登録商標）の４つのプレート（サーモ・ラブシステムズ社、マサチューセッツ州ビバリー）を、ＰＢＳ内で希釈した１０μｇ／ｍｌ  ＳＥＡ（１００μｌ／ウェル）でコートし、連続２倍希釈を使用して、血清試料を分析した。ビオチン−ウサギ抗マウスＩｇＧｌ（Zymed社、カリフォルニア州サンフランシスコ）は、１：１０００の希釈で使用した。続いて、ぺロキシダーゼで標識したストレプトアビジン（KPL社、メリーランド州ゲーサーズバーグ）の基質酵素を１：１０００の希釈で使用した。第２段階セイヨウワサビぺロキシダーゼが結合されたウサギ抗マウスＩｇＧ２ｂ（Zymed社、カリフォルニア州サンフランシスコ）Ａｂを、１：１０００の希釈で使用した。１００μｌ一成分ＡＢＴＳぺロキシダーゼ基質（KPL社、メリーランド州ゲーサーズバーグ）を添加後、ＶＭＡＸ（登録商標）カイネチックマイクロプレートリーダー（モレキュラー・ディバイシーズ社）を使用して、ウェル中の吸光度を４０５ｎｍで読み取った。
【０１１７】
メスのＣ５７ＢＬ／６マウスから骨髄を回収し、補充ＤＭＥＭ培地（Ｌ９２９で調節された培地）を含有するペトリ皿（１００×１５ｍｍ）で、６日間培養した。６日後、細胞を採取し、補充ＤＭＥＭ培地（１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン）を含有する２４ウェルプレート内に、０．５×ｌＯ6細胞／ウェルの濃度で植え付けた。細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＩＬ−２１（R&D社、ミネソタ州ミネアポリス）で２０時間刺激した。いくつかのアッセイにおいて、細胞をＩＬ−２１で前処理した。細胞を溶解し、ＲＮＥＡＳＹ（登録商標）キット（キアゲンサイエンス社、メリーランド州ジャーマンタウン）を用いたＲＮＡクリーンアップ手順を使用して、ＲＮＡを精製した。
【０１１８】
（実施例１．８：アルギナーゼ活性分析）
９６ウェル組織培養プレートにおいて、骨髄由来マクロファージをウェル当たり６×１０5個平板培養し、ＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＩＬ−２１の組合せで刺激した。ＩＬ−４またはＩＬ−１３による刺激の６時間前に、ＩＬ−２１を加えた。刺激に続き、細胞をＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼ阻害剤を含有する０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ロッシュ社、ニュージャージー州ナトリー）で溶解した。溶解物を９６ウェルＰＣＲプレートに移し、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ2および５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を用いてインキュベートし、５５℃で１０分間、酵素を活性化した。酵素活性化後、２５μｌの溶解物を除去し、新しいＰＣＲプレート内の２５μｌ  １Ｍ  アルギニン（ｐＨ９．７）に加え、３７℃で２０時間インキュベートした。５μｌの各試料を対で、５μｌの各標準液と共に、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに加え、１００ｍｇ／ｄＬでスタートして、同じアッセイ条件で希釈した。製造業者のプロトコルに従って、ＱＵＡＮＴＩＣＨＲＯＭ（登録商標）尿素アッセイキット（バイオアッセイ・システムズ社、カリフォルニア州ヘイワード）の尿素測定試薬を使用した。
【０１１９】
（実施例１．９：統計）
肝線維症（卵の数を調節）は、感染（蠕虫の対）の強度が高まると共に減少する。従って、共変量としての肝臓における卵の総数の対数、および卵当たりのヒドロキシプロリン含有量の対数を使用して、共分散分析によって、これらの変数を比較した。感染の強度によって変化しなかった変数は、ワンウェイＡＮＯＶＡまたはスチューデントのｔ検定によって比較した（Cheeverら、既出）。ＡＮＯＶＡを使用して、サイトカインｍＲＮＡ発現および肉芽腫の大きさの変化を評価した。p<0.05*、p<0.01**またはp<0.001***の場合に、差が有意なものであると考えた。
【実施例２】
【０１２０】
（タイプ１およびタイプ２の極性化反応中のＩＬ−２１およびＩＬ−２１Ｒの調節）
ＩＬ−２１レセプターの調節および機能をインビボで調べるために、線虫症の実験モデルに加え、肺および肝臓の炎症のモデルを含むＴH２に依存した炎症のいくつかの異なる実験系を調べた（Pearceら、既出；Wynnら、(1994)、既出）。各場合において、野生型（ＷＴ）動物の免疫反応を、ＩＬ−２１Ｒ欠損マウスと比較した（Hoffmanら、既出；Kasaianら、(2002)、既出）。
ＩＬ−２１に比べ（Wursterら、(2002)、既出；Mehtaら、(2004) Immunol. Rev. 202:84-95）、ＩＬ−２１レセプターの調節および機能はについてはほとんど知られていない。インビボでの病的ＴH２反応中に、ＩＬ−２１およびそのレセプターが調節されるかどうかを測定するために、肉芽腫形成のマンソン住血吸虫モデルを使用した。このモデルにおいて、ＴH２サイトカインが損傷形成において顕著な役割を果たすことが知られている（PearceおよびMacDonald、既出）。最初の研究は、ＩＬ−２１およびＩＬ−２１ＲのｍＲＮＡ発現が、インビボでの極性化ＴH２サイトカイン反応と関連するかどうかを測定するために設計された。マンソン住血吸虫卵に暴露した後に、非常に悪化したＴH１（ＩＬ−４-/-／ＩＬ−１０-/-）またはＴH２（ＩＬ−１２-/-／ＩＬ−１０-/-）サイトカイン反応が進行するマウスを使用して、この研究を達成した。ＩＬ−４-/-／ＩＬ−１０-/-「ＴH１」マウスについては、肺において、ＩＦＮ−γのｍＲＮＡ発現がチャレンジ後４日目でベースラインの７５倍増加し、バックグラウンドの約５０倍を１４日目まで維持した（図１６Ａ）。ＩＬ−１３のｍＲＮＡは、どの時点においてもこれらのマウスにおいて検出できなかった。このことは、高度に極性化されたＴH１炎症反応の確立を立証している。一方、ＩＬ−１２-/-／ＩＬ−１０-/-「ＴH２」マウスは、チャレンジ後すべての時点においてＩＬ−１３のｍＲＮＡの２００〜２５０倍の増加を示したが、ＩＦＮ−γについてはほとんど、あるいはまったく変化しなかった。高度に極性化されたパターンの発現を示したＴH１／ＴH２サイトカインとは対照的に、ＩＬ−２１は、極性化された表現型とは関連しなかった（図１６Ｂ）。両グループにおいて、住血吸虫卵によるチャレンジ後、ＩＬ−２１のｍＲＮＡレベルは、ベースラインの少なくとも５０倍増加したが、ＴH１極性化マウスにおいて観察された増加は、ＴH２極性化動物に比べて平均で３〜４倍であった（図１６Ｂ、下のパネル）。ＩＬ−２１Ｒも、ＴH１またはＴH２免疫反応と特に関連はしなかった。しかし、ＴH１非対称の動物においてより顕著であったＩＬ−２１とは対照的に、ＩＬ−２１Ｒへの最大の反応は、ＴH２極性化マウスにおいて観察された（図１６Ｂ、上のパネル）。
【実施例３】
【０１２１】
（住血吸虫卵に対する一次反応中、ＩＬ−２１Ｒ欠損マウスの肺において、タイプ２サイトカイン生成が減少した）
住血吸虫卵でチャレンジしたマウスにおけるＩＬ−２１Ｒ発現の有意な増加にかんがみ（図１６）、次の一連の実験では、ＩＬ−２１Ｒのシグナル伝達がＴH２反応の進行に影響を与えるかどうかを調べた。これらの実験において、未処理のＷＴマウスおよびＩＬ−２１Ｒ-/-マウスに、生きている住血吸虫卵を静脈注射し、その後１４日間にわたり、ＴH２サイトカインおよびＴH２が調節された遺伝子の生成を、肺、脾臓および排出するリンパ節においてモニターした。ＷＴマウスにおいては、卵への暴露後、ＩＬ−２１ＲのｍＲＮＡ発現が急速に増加し、１４日目まで増加をし続けた（図１７Ａ）。ＩＬ−２１は類似のプロフィールを示し、発現のピークが７日目に起こり、その後わずかに減少した。特に、ＩＬ−２１Ｒ-/-マウスは、７日目と１４日目にＩＬ−２１の発現の一貫して非常に有意な減少を示した。このことは、ＩＬ−２１Ｒが、自らのリガンドの発現に好ましい影響を与えていることを示唆している。以前の観察（Wynnら、(1993) J. Immunol. 151:1430-40；およびVellaおよびPearce (1992) J. Immunol. 148:2283-88）と一致して、ＴH２関連サイトカインＩＬ−４およびＩＬ−１３の発現は、ＷＴマウスの肉芽腫組織内において徐々に増加し、５〜１５倍の増加が１４日目まで検出可能であった。一方、ＩＬ−２１Ｒ-/-の組織においては、ＩＬ−４およびＩＬ−１３のｍＲＮＡ発現の顕著で有意な減少が見られた。ＷＴマウスにおいては、チャレンジ後４〜１４日目の間、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０のｍＲＮＡにおける変化はほとんど検出されなかったが、ＩＬ−２１Ｒ-/-動物においては、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０の生成もわずかに減少した。このように、ＩＬ−２１Ｒ-/-マウスにおいて観察されたＴH２反応の減少は、ＴH１サイトカイン生成の増加と関連しなかった。ＴH２サイトカインの減少も、肉芽腫組織に特異的なものであった。なぜならば、可溶性卵抗原（ＳＥＡ）またはマイトジェンによるインビトロでの刺激後、リンパ節および脾細胞の培養物において、有意なＴH２サイトカイン生成が観察されたからである（図１７Ｂ）。実際、ＳＥＡは、ＩＬ−２１Ｒ-/-マウスから調製されたリンパ節の培養物において、より強いＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３の反応を一貫して刺激した。しかし、肺におけるＴH２反応の減少と一致して、ＩＬ−２１Ｒ-/-動物において、肉芽腫形成のより迅速な分解が観察された（図１７Ｃ）。加えて、Ｓｔａｔ６活性化または「代わりに活性化されたマクロファージ」（ＡＡＭo）に関連するいくつかの遺伝子において、顕著な減少が見られた（Nairら、(2005) Infect. Immun. 73:385-94；Zhuら、（2004) Science 304:1678-82；Chiaramonteら、(2003)、既出；およびGordon, S. (2003) Nat. Rev. Immunol. 3:23-35）。これは、ＩＬ−２１Ｒ-/-マウスにおけるＴH２エフェクター反応の全体的な減少についての更なる証拠を提供している（図１７Ｄ）。
【実施例４】
【０１２２】
（Ｎ・ブラシリエンシス（N.brasiliensis）感染後、ＩＬ−２１Ｒ-/-マウスにおいてＴH２反応が減少した）
ＴH２エフェクター反応の減少が、マンソン住血吸虫による肺肉芽腫の形成に特異的なものであるかどうかを測定するために、ＷＴマウスおよびＩＬ−２１Ｒ-/-マウスを、腸内線虫、Ｎ・ブラシリエンシスで感染させた。３令幼虫（Ｌ３）を皮膚下に接種することにより、感染が確立した。それらは、成長した寄生虫として、接種部位から移動し、循環器系を経由して肺に入る。一旦肺の中に入ると、寄生虫は活発で高度に極性化されたＴH２反応を引き起こす（Urbanら、(1993) J. Immunol. 151:7086-94）。これは、肺（図１８Ａ）および肺に関連したリンパ節（図１８Ｂ）におけるいくつかのＴH２関連遺伝子の発現を分析することにより確認された。ＷＴマウスの肺およびリンパ節は、Ｎ・ブラシリエンシスによる感染後、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＡＭＣａｓｅ、ＦＩＺＺ１／ＲＥＬＭ１α、およびＹｍ１のｍＲＮＡ発現において顕著な増加を示した（図１８Ａおよび１８Ｂ）。しかし、肺肉芽腫モデルと一致して、ＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＡＭＣａｓｅの有意なレベルの減少が観察されると共に、ＩＬ−２１Ｒ-/-マウスの肺において、Ｙｍ１およびＦＩＺＺ１のｍＲＮＡのレベルはわずかに減少した（図１８Ａ）。排出するリンパ節は、類似の減少を示したが、Ｙｍ１およびＦＩＺＺ１における減少は、リンパ節においてより有意であった（図１８Ｂ）。２つの組織における唯一の他の主な相違点は、ＡＭＣａｓｅのｍＲＮＡの反応であり、これが肺に限定されたようであった。これらのデータは共に、インビボでのＴH２反応の進行におけるＩＬ−２１Ｒの重要な役割を立証するものである。しかし、顕著なことは、ＴH２反応が顕著に弱まったにもかかわらず、Ｎ・ブラシリエンシスに感染したＩＬ−２１Ｒ-/-マウスは、寄生虫の成虫の排出における有意な遅延を示さなかったことである（図示されず）。
【実施例５】
【０１２３】
（ＩＬ−２１Ｒ-/-マウスの肺においてタイプ２サイトカイン主導の炎症が減少する）
次の一連の実験は、ＩＬ−２１Ｒが、二次ＴH２反応の進行を調節するかどうかを測定するために設計された。これらの実験のために、ＷＴマウスおよびＩＬ−２１Ｒ-/-マウスをマンソン住血吸虫卵で感作し、２週間後に静脈内でチャレンジした。予期されたように、感作したマウスは、強固な肉芽腫性の反応を進行させ、それは一次チャレンジを行った動物（図１７Ｃ）に比べて４〜５倍であった（図１９Ｃ）。一次モデルにおいて観察されたように、卵への暴露後、肺においてＩＬ−２１およびＩＬ−２１ＲのｍＲＮＡが有意に増加したが、二次チャレンジ中においては、ＩＬ−２１の反応のピークはより早かった。ＩＬ−２１と比較した場合、ＩＬ−２１Ｒはやや増加したのみであったが、両時点において有意に増加し続けた。一方で、ＩＬ−２１のｍＲＮＡレベルは、４日目にピークに達した後で減少した（図１９Ａ）。このように、組織において、リガンドがより厳しく調節されるという証拠が見られた。また、ＩＬ−２１Ｒ-/-マウスにおいて、ＩＬ−２１の発現の顕著な減少が見られ、レセプターとそのリガンドの間における強力なフィードバックのメカニズムを立証している。ＴH２関連サイトカインの中で、ＩＬ−１３が最も強力な反応を示し、ＷＴマウスにおいて、ベースラインの５０〜１００倍の増加を示した。しかし、ＩＬ−２１Ｒ-/-マウスにおいては、バックグラウンドの１０〜２０倍まで減少した。このことは、二次ＴH２反応を最大限に進行させるためにはＩＬ−２１Ｒが必要であることを実証している。再び、ＩＬ−２１Ｒ-/-マウスにおけるＴH２サイトカイン発現の減少は、ＩＦＮ−γにおける有意な増加を伴わなかった。実際、ＩＬ−２１Ｒ-/-マウスの肺において、ＩＦＮ−γのｍＲＮＡ発現が減少した。しかし、ノックアウトマウスでは、リンパ節および脾臓において、ＩＦＮ−γ生成が控えめではあるが一貫して増加した。このことは、ＴH２サイトカイン全体のより強い阻害を示唆している（図１９Ｂ）。卵による一次チャレンジモデルに一致して、ＴH２およびＴH１サイトカイン生成の減少は、肉芽腫性組織においてより顕著に示されたが（図１９Ａ）、脾臓においては、ＳＥＡに誘導されるＴH２反応も部分的に減少した（図１９Ｂ）。二次肉芽腫性炎症の大幅な減少は、肺におけるより弱いＴH２反応の進行に一致していた（図１９Ｃ）。加えて、ＦＩＺＺ１、Ｙｍ１およびＡＭＣａｓｅの発現が顕著に減少した（図１９Ｄ）。このことは、ＩＬ−２１Ｒ-/-マウスにおける二次ＴH２エフェクター反応の有意な減少を更に立証している。
【実施例６】
【０１２４】
（感染したＩＬ−２１Ｒ欠損マウスにおいて、ＩｇＧ抗体、肉芽腫形成およびタイプ２サイトカインは実質的に減少する）
次に、慢性的なＴH２主導の反応を維持するためにＩＬ−２１のシグナル伝達が必要であるかどうかを測定するために、動物に対し、マンソン住血吸虫のセルカリアを経皮的に暴露し、感染後の急性の時点および慢性の時点両方における病的反応および免疫反応を分析した。肺肉芽腫の研究において観察されたように、感染したＷＴマウスの肝臓において、ＩＬ−２１ＲおよびＩＬ−２１のｍＲＮＡ発現における顕著な上方調節が見られた。一方、ＩＬ−２１Ｒ-/-マウスにおいては、慢性感染後であっても、ＩＬ−２１のｍＲＮＡはほとんど検出できなかった（図２０Ａ）。感染後の急性段階においては、ＩＬ−２１Ｒ-/-マウスもＴH２サイトカインのｍＲＮＡ発現において顕著な減少を示した（図２０Ａ）。しかし、やはり、変化は肉芽腫性組織に限定されていた。なぜならば、寄生虫の抗原を用いたインビトロでの刺激後、両グループにおいて、リンパ節および脾細胞の反応が類似していたからである（図２０Ｂ）。インビトロアッセイにおいて留意された唯一の一貫した相違点は、脾細胞の培養物において、ＩＬ−５およびＩＬ−１０の生成が２〜３倍減少したことである。ＩＬ−２１Ｒ-/-マウスも、感染後の急性段階において有意により小さな肉芽腫を形成し（図２０Ｃ）、これは、肝臓におけるＩＬ−４およびＩＬ−１３のｍＲＮＡ反応の減少と一貫していた（図２０Ａ）。しかしこれは、肉芽腫における好酸球のパーセンテージにおけるいかなる明白な変化をも伴わなかった（図２０Ｃ）。損傷のより詳しい顕微分析は、肉芽腫の組成物全体において、検出可能な変化はなかったことを立証した（図２１Ａ）。また、ＩＬ−２１Ｒ欠損が肉芽腫性組織へのＣＤ４+Ｔ細胞の漸増に特異的に影響を与えたかどうかを測定するためにも実験が行われた。この問題に取り組むに当たり、炎症細胞の漸増を同調させるために、肺肉芽腫モデルを使用した。しかし、肝臓の肉芽腫の微視的評価と一致して（図２１Ａ）、卵への暴露前、暴露後どちらにおいても、肺におけるＣＤ４+Ｔ細胞のパーセンテージは、ＷＴマウスとＩＬ−２１Ｒ-/-マウスで同様であった（図２１Ｂ）。このように、ＣＤ４+Ｔ細胞の漸増または展開における変化は、組織内で観察されたＴｈｌ／Ｔｈ２サイトカイン反応の減少の説明になっているとは考えられない。それよりはむしろ、全体的な炎症反応におけるより総体的な減少の結果であると思われる。重要なことに、両グループにおいて、感染後第１２週目までに肉芽腫性反応が効果的に下方調節された（PearceおよびMacDonald、既出）。その結果として、慢性的時点において、肉芽腫の大きさにおける有意な相違は無かった（図２０Ｃ）。慢性的に感染させたノックアウトマウスにおいて、ＴH２サイトカイン反応における最小限の弱まりが観察された（図２０Ａ）。急性段階に観察されたＦＩＺＺ１およびＹｍ１の顕著な減少も、慢性的に感染させたＩＬ−２１Ｒ-/-動物において減少していた（図２０Ｄ）。それにもかかわらず、ＡＭＣａｓｅの発現レベルは第１２週目において顕著な低さを維持した。このことは、慢性的に感染させたＩＬ−２１Ｒ-/-マウスにおいて、ＴH２主導の反応の少なくともサブセットが、減少を持続したことを示唆している。
【０１２５】
また、ＩＬ−２１Ｒ-/-マウスについて、血清抗体のレベルにおける変化を調べた（図２２）。抑制されたサイトカイン反応と一致して（図２０Ａ）、ＩＬ−２１Ｒ-/-マウスは、寄生虫に特異的なＩｇＧ1（ＴH２関連抗体）およびＩｇＧ2b（ＴH１関連抗体）の力価において顕著な減少を示し、これは、慢性的時点において維持された（図２２Ｂ）。しかし、興味深いことに、これにはＩｇＥにおけるいかなる有意な変化も伴わず（図２２Ｃ）、血清抗体アイソタイプのサブセットのみにおける選択的な弱まりを示唆している。外因性のＩＬ−２１は、ＩｇＥ生成を阻害することが示されてきており（Sutoら、(2002) Blood 100:4565-73）、これにより、慢性的に感染させたＩＬ−２１Ｒ-/-マウスにおけるＩｇＥの僅かな上昇の説明がつくかも知れない。重要なことに、ＩＬ−２１Ｒ-/-マウスにおけるタイプ２の反応性の全体的な減少は、寄生虫の負担における相違に起因しなかった。なぜならば、両グループの組織において、全ての時点で、類似の数の卵および対の寄生虫の成虫が見られたからである（図２２Ａ）。
【実施例７】
【０１２６】
（ＩＬ−２１Ｒ欠損が肝線維症の進行を遅らせる）
ＴH２サイトカインが組織の線維成長において主要な役割を果たすと考えられているので（Wynn (2004)、既出）、次に、マンソン住血吸虫で感染させたＩＬ−２１Ｒ-/-マウスにおける肝線維症の発生および進行を調べた。組織のコラーゲン含有量を直接的な測定として、様々な時点において、肝臓のヒドロキシプロリンのレベルをアッセイした。予期されたように、感染させたＷＴマウスにおいて、顕著な肝線維症が観察された（図２２Ｄ）。一方、ＩＬ−２１Ｒ-/-マウスは、急性時点、慢性時点の両方において有意により少ない線維症を示した。とりわけ、感染後第２９週目までに、ＩＬ−２１Ｒ-/-マウスは、肝臓コラーゲン総含有量がＷＴマウスに比較して５０％を超える減少を示した（図２２Ｅ）。このように、ＴH２に依存する線維症の進行における、ＩＬ−２１Ｒの重要で不可欠な役割が立証されている。
【０１２７】
ＩＬ−２１阻害剤が、感染させたＷＴマウスにおける線維症の進行を遅らせることができるかどうかを調べるために、実験が行われた。これらの実験のために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのグループが、全部で５週間の間ｓＩＬ−２１Ｒ−Ｆｃまたはコントロールタンパク質で処理され、卵が初めて肝臓で検出される頃である、感染後第６週目に開始した。両グループ共、寄生虫および卵の組織での負担が類似であったが（データは示されず）、ＩＬ−２１阻害剤を受けているマウスは、実験の終了において、肝線維症における５０％を超える減少を示した（図２２Ｆ）。ＩＬ−４およびＩＬ−１３のｍＲＮＡ発現も肝臓において減少し、肉芽腫の大きさは、約１５％減少した（データは示されず）。このように、これらのデータは、ＩＬ−２１Ｒ-/-マウスで行った実験を補足するものである。
【実施例８】
【０１２８】
（ＩＬ−２１シグナル伝達は、代わりに活性化されるマクロファージの発達を促進する）
Ａｒｇ−１、ＦＩＺＺ１およびＴＧＦ−β１が線維症の発達と関連しており、ＩＬ−２１Ｒ-/-マウスの病気の組織において、ＴH２／Ｓｔａｔ６に調節されたいくつかの遺伝子の発現が減少した（図１７−２０）（Gordonら、既出；およびNairら、既出も参照）ので、ＩＬ−２１での刺激に続き、Ａｒｇ−１、ＦＩＺＺ１およびＴＧＦ−β１がマクロファージ内において直接的に調節されたかどうかを測定するために、実験を行った。Ａｒｇ−１およびＦＩＺＺ１はまた、代わりに活性化されるマクロファージ（ＡＡＭo）の周知のマーカーである（Gordon、既出）。これらの研究のために、骨髄由来のマクロファージ培養物（ＢＭＭo）を産生し、次にＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＩＬ−２１の種々の組合せによって刺激した。予期されたように、ＩＬ−４およびＩＬ−１３の両方が、Ａｒｇ−１およびＦＩＺＺ１のｍＲＮＡ発現を増加させた上に、二つの刺激を組み合わせて使用した場合、付加的な効果が観察された（図２３Ａ）。しかし留意すべきは、ＩＬ−２１を単独で用いた場合には、ＩＬ−２１はどちらの遺伝子に対しても効果がなかったが、その後にＩＬ−４およびＩＬ−１３で刺激した場合、ＩＬ−２１で前処理した培養物は、Ａｒｇ−１およびＦＩＺＺ１のｍＲＮＡ発現における高度に有意な増加を示した（図２３Ａ）。同じ組合せはまた、細胞におけるアルギナーゼの機能を有意に増加させた（図２３Ｂ）。一方、ＩＬ−２１は、培養上清において、総ＴＧＦ−β１および活性ＴＧＦ−β１のレベルに影響を与えなかった（図２４）。予期しなかったことには、ＩＬ−２１処理のみで、ＩＬ−４ＲαおよびＩＬ−１３Ｒα１の発現が有意に増加した（図２３Ｃ）。一方、ＩＬ−４およびＩＬ−１３は、単独で用いた場合には効果がなく（図２３Ｃ）、３つの刺激が組み合わせて使用された場合にも、追加的な効果はなかった（示されず）。
【０１２９】
ＩＬ−１３Ｒα２は、ＩＬ−１３依存のシグナル伝達にも影響を与え得るので（Chiaramonteら、(2003)、既出；Mentink-Kaneら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:586-90；およびWoodら、（2003) J. Exp. Med. 197:703-09）、ＩＬ−２１がＩＬ−１３Ｒα２の生成を調節するのかどうかを調べるために、実験を行った。驚くことではないが、ＩＬ−１３Ｒα２は、主として線維芽細胞および平滑筋等の非造血細胞によって生成されるので（Chiaramonteら、(2003)、既出；Jakubzickら、(2003) Am. J. Pathol. 162:1475-86；Zhengら、(2003) J. Allergy Clin. Immunol. 111:720-28；Morimotoら、(2006) J. Immunol. 176:342-48）、ＢＭＭoの培養物においては、おとりレセプターが調節されるという証拠は無かった（データは示されず）。しかし、インビボでおとりレセプターの調節を調べると、ＩＬ−２１は、静脈内において卵でチャレンジしたマウスの肺におけるＩＬ−１３Ｒα２のｍＲＮＡ発現を下方調節し、血清における可溶性ＩＬ−１３Ｒα２のレベルを有意に減少させた（図２３Ｄ）。これらのデータをあわせて見ると、マクロファージにおいてタイプ２ＩＬ−４レセプター（シグナル伝達レセプター）を上方調節し、同時に、血清において可溶性ＩＬ−１３Ｒα２（おとりレセプター）のレベルを減少させることにより、ＩＬ−２１は、代わりに活性化されるマクロファージの発達に寄与するということを示唆する。恐らく両方のメカニズムが、ＩＬ−４／ＩＬ−１３で刺激されたマクロファージにおけるＡｒｇ−１およびＦＩＺＺ１の活性化の増加に寄与したものと考えられる。このように、蠕虫で感染させたＩＬ−２１Ｒ-/-マウスにおける弱められたＴH２反応およびＴH２依存線維症についての、更なる機構上の説明が提供される。
【実施例９】
【０１３０】
（考察）
最近、ＩＬ−２１は、ナイーブＴH細胞のＩＦＮ−γ生成ＴH１細胞への分化を阻害し得るＴH２サイトカインとして特徴付けられた（Wursterら、(2002)、既出）。住血吸虫症における免疫反応は、初期のＩＦＮ−γから、持続した優性のＴH２反応へと発展するので（PearceおよびMacDonald、既出）、蠕虫に誘導されたＴH２反応の発達に対するＩＬ−２１Ｒのシグナル伝達の影響を調べた。マンソン住血吸虫を用いてＷＴマウスを感染させたところ、肝臓におけるＩＬ−２１およびＩＬ−２１Ｒの発現が増加した。このことは、ＩＬ−２１のシグナル伝達が、蠕虫に誘導されたタイプ２の免疫性に関連することを立証している。しかし、肺においては、住血吸虫卵が、ＴH１極性化反応およびＴH２極性化反応の間、有意なＩＬ−２１発現を誘導した。実際、ＩＬ−２１の発現は、マウスがＴH１反応に極性化された時に最も増加した。これらのデータは、他のＴH２関連サイトカインに比べ、ＩＬ−２１の方がより制限されないパターンの発現を示すことを示唆した。ＩＬ−２１のレセプターもまた、ＴH１／ＴH２に特異的なパターンを示すことができなかった。しかし、ＴH１に極性化されたマウスの場合に比べ、ＴH２に極性化されたマウスの肺では、ほぼ４倍のＩＬ−２１レセプターが誘導された。このことは、ＩＬ−２１Ｒのシグナル伝達が、ＴH２媒介性の炎症の調節に関与するかも知れないことを初めて示すものの一つである。
【０１３１】
タイプ２エフェクターの反応が、ＩＬ−２１Ｒの不在において十分に発揮されなかった（compromised）かどうかを測定するために、ＴH２に極性化する条件下で好ましく誘導されるいくつかの遺伝子の発現を調べた。これらの遺伝子はＡＭＣａｓｅ、Ｙｍ１、およびＦｉｚｚ１を含み、これらの全てが、ＴH２媒介性の炎症の調節において、重要で非冗長の役割を果たすと考えられる（Zhuら、既出；Chiaramonteら、(2003)、既出；Nairら、既出；Mentink-Kaneら、既出；Guoら、(2000) J. Biol Chem. 275:8032-37)。一次免疫反応、二次免疫反応または慢性的な免疫反応の間にいくらかの変異が観察されたが、各場合において、ＩＬ−２１Ｒ-/-マウスは、そのＴH２関連遺伝子において高度に有意な減少を示した。Ｙｍ１およびＡＭＣａｓｅは、下等動物のキチナーゼとの相同性を共有するタンパク質ファミリーのメンバーである（Nairら、既出）。それらの宿主免疫反応における厳密な機能はまだ不確かなままではあるが、好酸球遊走、組織改造および線維症において重要な役割を果たすと考えられる。確かに、最近の研究は、ＡＭＣａｓｅの中和がアレルゲン主導の炎症および気道過敏性を改善できることを示し、ＴH２免疫性における哺乳動物のキチナーゼの関与を立証している（Zhuら、既出）。Ｆｉｚｚ１もまた、組織の線維成長に関連している（Mentink-Kaneら、既出；Liuら、（2004) J. Immunol. 173:3425-31）。このため、ＩＬ−２１Ｒの主な機能は、創傷治癒および線維症のメカニズムを調節することかも知れない。従って、蠕虫に誘導された免疫反応への関与に加え、ＩＬ−２１Ｒは、種々のＴH２に誘導された炎症性障害の調節に関与するかも知れない。
【０１３２】
住血吸虫症において、ＩＬ−２１Ｒの欠損は、病気の進行に対して大きな影響を与えた。感染の強度はＷＴマウスとＩＬ−２１Ｒ-/-マウスとで同じではあったが、ＩＬ−２１Ｒが無い場合に、卵に誘導された炎症性反応は有意に減少した。また、二次肉芽腫形成における顕著な減少および肺における一次肉芽腫のより早い分解も見られた。これらのデータをあわせると、肉芽腫性炎症におけるＩＬ−２１Ｒの不可欠な役割が示されている。以前の研究は、ＩＬ−４およびＩＬ−１３が損傷形成において必須であることを示した（PearceおよびMacDonald、既出）。このように、ＩＬ−２１Ｒは、これらサイトカインの活性に直接的または間接的に影響を与えると考えられている。これらの研究は、ＩＬ−４／ＩＬ−１０ダブルノックアウトマウスにおいて非常に高レベルのＩＬ−２１が観察されたので、ＩＬ−２１が単独では作用しないことを示唆したが、それでも、肉芽腫の形成は、これらのＴH２欠損動物においてほぼ完全に除かれた（Hoffmannら、(2000) J. Immunol. 164:6406-16；およびSandlerら、(2003) J. Immunol. 171:3655-67)。このように、ＩＬ−２１は、ＩＬ−４およびＩＬ−１３と共同して最大の反応を誘導するものと思われる。本明細書に開示されたデータは、ＩＬ−２１Ｒ-/-マウスの肉芽腫の細胞構成において検出可能な変化は見られず、また、ＣＤ４+Ｔ細胞の漸増における特異的な弱まりは見られなかったことを示している。これらの知見をあわせると、ＩＬ−２１Ｒは、ＴH２エフェクター反応の全体的な強度を調節することにより、寄生虫に誘導された病状の発達を調節することを示唆した。
【０１３３】
ＩＬ−２１Ｒは、ＩＬ−４に誘導されたＴH２細胞の分化を直接に調節するとは考えられていない（Sutoら、既出；Wursterら、(2002)、既出）。代わりに、最近の論文において、ＩＬ−２１が、ＩＦＮ−γ−生成ＴH１細胞の発現を下方調節することにより、ＴH２主導の反応を増幅すると仮定された（Wursterら、（２００２）、既出）。こうして、ＩＬ−２１レセプターが無い場合に、住血吸虫に感染させたマウスにおけるＩＦＮ−γ反応は増加するとの理論が立てられている。インビトロでは、肺関連リンパ節において少しの増加が観察されたが、ＩＦＮ−γの生成は、肉芽腫性組織において一貫して減少した。このように、これらの研究は、蠕虫による感染の間に、内因性ＩＬ−２１ＲがＩＦＮ−γ生成の阻害において実質的な役割を果たすということを示さなかった。しかし、ＩＬ−２１Ｒ-/-マウスは、組織内でより弱いＴH１およびＴH２サイトカイン反応を同時に生み出した。感染後全ての時点において、ＩｇＧ2b（ＴH１関連）およびＩｇＧ1（ＴH２関連）抗体の力価が有意に減少したことが、この結論を裏付けている。Ｔｈ２サイトカインも、Ｎ・ブラシリエンシスによる感染後に、肺およびリンパ節両方においてｍＲＮＡレベルで減少した。確かに、直接的な生体外のデータの全てが、影響を受けた組織内におけるＴH２サイトカインの発現および機能における顕著な減少を立証した。しかし、抗原による再刺激後、単離されたリンパ球によってＴH２サイトカインの生成が一貫して減少することはなかった。このことは、ＩＬ−２１Ｒ-/-マウスが、少なくともインビトロで、有意なＴH２反応を生み出すことができることを示唆している。このように、本明細書に開示されるデータは、ＩＬ−２１Ｒが、組織におけるＴH２反応を選択的に増加させることを示唆する。ＴH２反応を促進することに加え、ＩＬ−２１Ｒは、ＩＬ−２１の生成も増加させた。このように、ＩＬ−２１Ｒは、インビボでＴH２サイトカインの発現およびタイプ２のエフェクター機能を促進させるように、自己分泌の方法で作用すると思われる。
【０１３４】
関与するメカニズムを更に解明するに当たり、ＩＬ−２１がマクロファージの機能を直接的に調節するかどうかを測定するために実験を行った。なぜならば、インビボのデータは、「代わりに活性化された」表現型と関連しているいくつかの遺伝子において顕著な減少を示したからである（Gordon、既出；Mantovaniら、(2005) Immunity 23:344-46）。代わりに活性化された表現型を示すマクロファージおよび線維芽細胞は、住血吸虫性肉芽腫の主要な細胞構成要素であり、機能的研究は、病気の進行に決定的に関与することを示唆した（Hesseら、(2001)、既出）。確かに、Brombacherらによる重要な研究は、代わりに活性化されたマクロファージが完全に欠損するマウスにおいて、マンソン住血吸虫での感染後に、卵に誘導された致命的な病状が生じたことを示した（Herbertら、(2004) Immunity 20:623-35）。加えて、ＩＬ−１３に媒介される線維症のメカニズムにおいて、マクロファージ由来のＴＧＦ−β１が関っているので（Leeら、(2001) J. Exp. Med. 194:809-21；およびFichtner-Feiglら、(2006) Nat. Med. 12:99-106)、ＩＬ−２１がマクロファージにおいてＴＧＦ−β１の生成を調節するかどうかを測定するために実験を行った。これらの問題を調べるために、ＩＬ−２１、ＩＬ−４およびＩＬ−１３の種々の組合せによる刺激後、骨髄由来のマクロファージにおけるＡｒｇ−１およびＦＩＺＺ１のｍＲＮＡ、アルギナーゼ活性およびＴＧＦ−β１タンパク質の反応を測定した。Ａｒｇ−１およびＦＩＺＺ１は、ＩＬ−４Ｒα／Ｓｔａｔ６依存遺伝子である（Liuら、既出；Hesseら、(2001)、既出；Munderら、(1998) J. Immunol. 160:5347-54）。従ってそれらは、代替のマクロファージ活性化の機能的マーカーの役割を果たす。重要なことに、マクロファージは、ＩＬ−２１に暴露された時に、ＩＬ−４およびＩＬ−１３のＡｒｇ−１およびＦＩＺＺ１が誘導する活性に対してより感受性が高くなったことを、知見が示唆している。尿素の生成によって評価されたアルギナーゼ活性も有意に増加し、ＩＬ−２１が、高度に機能的な代わりに活性化されたマクロファージの発達に対する重要な刺激であることを立証した。一方、ＩＬ−２１は、マクロファージによるＴＧＦ−β１生成に対する効果を有さなかった。このように、前線維性（pro-fibrotic）サイトカインＴＧＦ−β１は確かに関与しているようであり、このことは、住血吸虫症におけるＴＧＦ−β１の役割を調べた以前の研究と一致する（Kaviratneら、(2004) J. Immunol. 173:4020-29）。代わりに、ＩＬ−２１は、ＢＭＭoにおけるＩＬ−４ＲαおよびＩＬ−１３Ｒα１の発現を有意に増加させ、インビボでの可溶性ＩＬ−１３おとりレセプター生成を減少させた。このことは、ＩＬ−４およびＩＬ−１３に対する感受性が高まったことの説明になると思われる。このように、これらのデータは、ＩＬ−２１Ｒ-/-マウスについてのインビボの研究を補足するものであり、ＩＬ−２１Ｒシグナル伝達の重要な機能は、線維症のメカニズムに関与しているＡＡＭoの発達を強めることであることを示唆する（Hesseら、(2001)、既出；Hesseら、(2000)、既出）。また、ＡＡＭoは、ＣＤ４+ＴH２細胞の分化を増幅することが示されているので（Bonecchiら、(1998) Blood 92:2668-71）、これらのデータは、ＩＬ−２１Ｒ-/-マウスにおける蠕虫に誘導されたＴH２活性の全体的な減少の説明にもなり得る。
【０１３５】
ヒトの住血吸虫症において、繊維性の肝臓の病状の発達は、慢性的な病的状態および死亡の主要な原因である（PearceおよびMacDonald、既出；Wynnら、（2004） Immunol. Rev. 201:156-67）。ＴH２サイトカイン反応は、コラーゲン沈着において重要な役割を果たすことが知られているので（Wynnら、(2004)、既出）、最終的な一連の実験において、ＩＬ−２１Ｒの肝線維症の進行に対する影響を調べた。留意すべきことに、ＩＬ−２１Ｒ-/-マウスにおいて、線維症の発達が有意に減少し、ノックアウト動物は、感染後２９週目までに、肝線維症の５０％を超える減少を示した。重要なことに、感染させたＷＴマウスをｓＩＬ−２１Ｒ−Ｆｃで処理した場合にも、類似の発見が得られた。このように、ＩＬ−２１レセプターは、抗線維性治療の潜在的な新しい標的として明らかになった。結論として、これらの研究は、ＴH２サイトカインに媒介される病気の進行におけるＩＬ−２１Ｒの必須の役割を例示している。そうであるから、ＩＬ−２１Ｒは、タイプ２の免疫性およびマクロファージの極性化を調節する重要なレセプターのリストに加えるべきである。
【実施例１０】
【０１３６】
（予測的治療）
予測的治療について、限定されない一連の例を以下に挙げる。
肝硬変と診断された被検体に、肝臓に線維性組織が蓄積するのを減らすために、ＩＬ−２１Ｒ融合タンパク質を投与する。ＩＬ−２１Ｒ融合タンパク質は、Ｃ末端において、リンカー（配列番号１７の第２３６番目〜第２４３番目のアミノ酸に対応）によって、ヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）Ｆｃ変異配列（配列番号１７の第２４４番目〜第４６７番目のアミノ酸に対応）と融合した、配列番号２の第１番目〜第２３５番目のアミノ酸を含む。
住血吸虫による感染と診断された被検体に、線維性組織が蓄積するのを減らすために、可溶性ＩＬ−２１Ｒフラグメントを投与する。フラグメントは、配列番号２の第２０番目〜第５３８番目のアミノ酸を含有する。
外科手術後に、創傷治癒の過程中に外科的切開が原因で線維症が蓄積するのを減らすために、被検体にＩＬ−２１Ｒ抗体を投与する。
肝硬変と診断された被検体に、肝臓に線維性組織が蓄積するのを減らすために、ＩＬ−２１抗体を投与する。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】図１は、マウスＩＬ−２１Ｒ／ＭＵ−１の全長ｃＤＮＡ配列を示す。ヌクレオチド配列は、配列番号４の第１番目〜第２６２８番目のヌクレオチドに対応する。
【図１−２】（図１の続き）
【図２Ａ】図２Ａおよび２Ｂは、マウスおよびヒトＩＬ−２１Ｒ／ＭＵ−１のアミノ酸配列を示す。図２Ａは、マウスＩＬ−２１Ｒ／ＭＵ−１のアミノ酸配列を示す（配列番号５の第１番目〜第５２９番目のアミノ酸に対応）。第１番目〜第１９番目のアミノ酸にリーダー配列（１０．１のスコアによるＳＰＳｃａｎによって予測）がある（ボールド体表示）。予測された膜貫通ドメイン（下線部）が、配列番号５の第２３７番目〜第２５３番目のアミノ酸に見られる。予測されたシグナル伝達モチーフは、第２６５番目〜第２７４番目のアミノ酸における「ボックス１」モチーフ、および第３１１番目〜第３２４番目のアミノ酸における「ボックス２」モチーフを含む（ボールド体および下線部分）。６つのチロシンが、配列番号５の第２８１番目、第３１９番目、第３６１番目、第３６８番目、第３９７番目及び第５１０番目のアミノ酸に位置する。ＷＳＸＷＳモチーフ（配列番号３）は、第２１４番目〜第２１８番目のアミノ酸残基に位置する（大文字、ボールド体で表示）。潜在的Ｓｔａｔドッキング部位は、配列番号５の第３９３番目〜第３９８番目のアミノ酸および第５１０番目〜第５１３番目のアミノ酸を含む。図２Ｂは、ヒトＩＬ−２１Ｒ／ＭＵ−１のアミノ酸配列を示す（配列番号２に対応）。予測されたシグナル配列（配列番号２のおよそ第１番目〜第１９番目のアミノ酸）；ＷＳＸＷＳモチーフ（配列番号２のおよそ第２１３番目〜第２１７番目のアミノ酸）；および膜貫通ドメイン（配列番号２のおよそ第２３６番目〜第２５２番目（又は第２３６番目〜第２５３番目、又は第２３６番目〜第２５４番目）のアミノ酸（下線部分））の位置が示されている。潜在的ＪＡＫ結合部位、ボックス１およびボックス２のシグナル伝達モチーフ、およびＳｔａｔドッキング部位が、ラベル付きの矢印で示されている。
【図２Ｂ】（図２Ａの説明を参照）
【０１３８】
【図３】図３は、ヒトおよびマウスＩＬ−２１Ｒ／ＭＵ−１のｃＤＮＡ配列（それぞれ配列番号１の第１番目〜第２６６５番目の核酸および配列番号４の第１番目〜第２６２８番目の核酸に対応）のＧＡＰ配列比較を示す。ｈｕＭＵ−１はヒトＩＬ−２１Ｒ／ＭＵ−１を、ｍｕＲＭＵ−１はマウスＩＬ−２１Ｒ／ＭＵ−１を表す。Ｇａｐパラメータ：Ｇａｐ重量＝５０；平均マッチ＝１０．０００；長さ重量＝３；平均ミスマッチ＝０．０００；同一性割合＝６６．１１６。
【図３−２】（図３の続き）
【図３−３】（図３の続き）
【図３−４】（図３の続き）
【図４】図４は、ヒトＩＬ−２１Ｒ／ＭＵ−１タンパク質（配列番号２のアミノ酸に対応）とマウスＩＬ−２１Ｒ／ＭＵ−１タンパク質（配列番号５のアミノ酸に対応）のＧＡＰ比較を示す。アラインメントは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸置換行列によって産生された（HenikoffおよびHenikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-19参照）。Ｇａｐパラメータ：Ｇａｐ重量＝８；平均マッチ＝２．９１２；長さ重量＝２；平均ミスマッチ＝２．００３；同一性割パーセント＝６５．２６７。
【図５】図５は、ヒトＩＬ−２１Ｒ／ＭＵ−１（配列番号２に対応）、マウスＩＬ−２１Ｒ／ＭＵ−１（配列番号５に対応）、およびヒトＩＬ−２ベータ鎖のアミノ酸（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号Ｍ２６０６２）の複数の配列アラインメントを示す。リーダー配列および膜貫通ドメインに下線が引かれている。保存されたサイトカインレセプターモジュールのモチーフがボールド体で表示されている。潜在的シグナル伝達領域が、下線およびボールド体で示されている。
【０１３９】
【図６】図６は、ＩＬ−２１Ｒ／ＭＵ−１経由のシグナル伝達を示す。ＩＬ−２１Ｒ／ＭＵ−１は、ＥＰＯで刺激されたクローンＥ７  ＥＰＯ  ＩＬ−２１Ｒ／ＭＵ−１キメラ発現細胞においてＳｔａｔ５をリン酸化する。コントロールまたはキメラＢＡＦ−３細胞をＩＬ−３で処理した結果、Ｓｔａｔ３がリン酸化されたが、Ｓｔａｔ１または５はリン酸化されなかった。
【図７Ａ】図７Ａおよび図７Ｂは、アミノ末端においてミツバチのリーダー配列およびＨｉｓ6およびＦｌａｇタグと融合した成熟ヒトＩＬ−２１Ｒのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のアラインメントを示す。図７Ａおよび図７Ｂに示される融合タンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０および配列番号１１に示される。融合タンパク質の成熟ヒトＩＬ−２１Ｒフラグメントおよびミツバチのリーダー配列／Ｈｉｓタグのフラグメントのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２の第２０番目〜第２３５番目のアミノ酸および配列番号１１の第１番目〜第４４番目のアミノ酸に対応する。
【図７Ｂ】（図７Ａの説明を参照）
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｃは、Ｃ末端において、リンカーによってヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）Ｆｃ配列と融合した、ヒトＩＬ−２１Ｒ細胞外ドメインのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のアラインメントを示す。図８Ａ〜８Ｃに示される融合タンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１２および配列番号１３に示される。ヒトＩＬ−２１Ｒ細胞外ドメイン、リンカー、およびヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）Ｆｃ配列のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２の第１番目〜第２３５番目のアミノ酸、配列番号１３の第２３６番目〜第２４３番目のアミノ酸、および配列番号１３の第２４４番目〜第４６７番目のアミノ酸に対応する。
【図８Ｂ】（図８Ａの説明を参照）
【図８Ｃ】（図８Ａの説明を参照）
【０１４０】
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｃは、Ｃ末端において、リンカーによってヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）Ｆｃ配列およびＨｉｓ６配列タグと融合した、ヒトＩＬ−２１Ｒ細胞外ドメインのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のアラインメントを示す。図９Ａ〜９Ｃに示される融合タンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１４および配列番号１５に示される。ヒトＩＬ−２１Ｒ細胞外ドメイン、リンカー、ヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）Ｆｃ配列およびＨｉｓ６配列タグのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２の第１番目〜第２３５番目のアミノ酸、配列番号１５の第２３６番目〜第２４３番目のアミノ酸、配列番号１５の第２４４番目〜第４６７番目のアミノ酸、および配列番号１５の第４６８番目〜第４９２番目のアミノ酸に対応する。
【図９Ｂ】（図９Ａの説明を参照）
【図９Ｃ】（図９Ａの説明を参照）
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｃは、Ｃ末端において、リンカーによってヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）Ｆｃ変異配列と融合した、ヒトＩＬ−２１Ｒ細胞外ドメインのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のアラインメントを示す。ヒトＦｃ配列は、Ｆｃ−レセプター結合を減少させるために野生型配列から第２５４番目及び第２５７番目の残基が変異されているものである。図１０Ａ〜１０Ｃに示される融合タンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１６および配列番号１７に示される。ヒトＩＬ−２１Ｒ細胞外ドメイン、リンカー、およびヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）Ｆｃ変異配列のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２の第１番目〜第２３５番目のアミノ酸、配列番号１７の第２３６番目〜第２４３番目のアミノ酸、および配列番号１７の第２４４番目〜第４６７番目のアミノ酸に対応する。
【図１０Ｂ】（図１０Ａの説明を参照）
【図１０Ｃ】（図１０Ａの説明を参照）
【０１４１】
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｂは、Ｃ末端において、ロドプシン配列タグと融合した、ヒトＩＬ−２１Ｒ細胞外ドメインのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のアラインメントを示す。この融合タンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１８および配列番号１９に示される。ヒトＩＬ−２１Ｒ細胞外ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２の第１番目〜第２３５番目のアミノ酸に対応する。
【図１１Ｂ】（図１１Ａの説明を参照）
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｃは、Ｃ末端において、ＥＫ切断部位および変異ＩｇＧ１  Ｆｃ領域と融合した、ヒトＩＬ−２１Ｒ細胞外ドメインのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のアラインメントを示す。図１２Ａ〜１２Ｃに示される融合タンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２０および配列番号２１に示される。ヒトＩＬ−２１Ｒ細胞外ドメイン、およびＥＫ切断部位／変異ＩｇＧ１  Ｆｃ領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２の第１番目〜第２３５番目のアミノ酸および配列番号２１の第２３６番目〜第４７０番目のアミノ酸に対応する。
【図１２Ｂ】（図１２Ａの説明を参照）
【図１２Ｃ】（図１２Ａの説明を参照）
【０１４２】
【図１３Ａ】図１３Ａ〜１３Ｂは、Ｃ末端において、マウス免疫グロブリンＧ２ａ（ＩｇＧ２ａ）と融合した、マウスＩＬ−２１Ｒ細胞外ドメインのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のアラインメントを示す。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２２および配列番号２３に示される。
【図１３Ｂ】（図１３Ａの説明を参照）
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｂは、Ｃ末端において、ＦｌａｇおよびＨｉｓ6配列タグと融合した、マウスＩＬ−２１Ｒ細胞外ドメインのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のアラインメントを示す。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２４および配列番号２５に示される。
【図１４Ｂ】（図１４Ａの説明を参照）
【図１５Ａ】図１５Ａ〜１５Ｂは、Ｎ末端において、ＦｌａｇおよびＨｉｓ6配列タグと融合した、（ミツバチのリーダー配列）マウスＩＬ−２１Ｒ細胞外ドメインのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のアラインメントを示す。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２６および配列番号２７に示される。
【図１５Ｂ】（図１５Ａの説明を参照）
【図１６】図１６は、高度に極性化されたタイプ１およびタイプ２の免疫応答中のＩＬ−２１およびＩＬ−２１Ｒの発現のプロフィールを示す。ＩＬ−１０／ＩＬ−４ＫＯ（ＴＨ１、Δ）およびＩＬ−１０／ＩＬ−１２ＫＯ（ＴＨ２、●）のグループの５匹のマウスを、マンソン住血吸虫卵を使用して腹腔内で感作し、１４日後に静脈内でチャレンジした。ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γ（図１６Ａ）、およびＩＬ−２１ＲおよびＩＬ−２１（図１６Ｂ）のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析のために、肺のＲＮＡ検体がそれぞれ調製された。遺伝子発現における平均±ＳＥＭは、ＨＰＲＴへの標準化後に、チャレンジしなかった野生型コントロールに比べて何倍増加したかとして表された。星印は、所定の時点におけるグループ間での有意差を示す。＊はｐ＜０．０５。
【０１４３】
【図１７Ａ】図１７は、住血吸虫卵でチャレンジしたＩＬ−２１Ｒ-/-マウスの肺において、タイプ２のサイトカイン生成が減少することを示す。未処理の野生型マウス（白い棒グラフ）およびＩＬ−２１Ｒ-/-マウス（黒い棒グラフ）のグループを、生きているマンソン住血吸虫卵を使用して静脈内でチャレンジし、チャレンジ後４、７および１４日で犠牲にした。（Ａ）肺の組織からＲＮＡを調製し、それぞれリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって分析した（グループ／時点当たりＮ＝５）。結果は、５つの数字を有する大まかなバーによる箱髭図に示されており、分布における中央値、四分位数、最小および最大のパーセンタイル値を示している。バーは（下から上に向かって）、それぞれ試験をした試料の１０、２５、５０、７５および９０パーセンタイルを示す。星印は、所定の時点における野生型の値との有意差を示し、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１である。（Ｂ）脾臓（Ｓｐｌ）および肺に関連するリンパ節（ＬＮ）をそれぞれプールし（２つの別個のグループ、グループ当たり３〜４匹のマウス）、Ｃｏｎ  Ａ（ＣＯＮ、１μｇ／ｍｌ）または可溶性卵抗原（ＳＥＡ、２０μｇ／ｍｌ）の存在下で７２時間インキュベーションした後、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γについて、単一細胞懸濁液のアッセイを行った。刺激を行わなかった培養物においては、サイトカインは検出レベルより低かった。（Ｃ）肉芽腫の大きさ（体積、ｍｍ3×１０-3）および肉芽腫における好酸球のパーセンテージを、顕微鏡によって定量化した。（Ｄ）肉芽腫性の肺の組織におけるＴH２に調節された炎症遺伝子のリアルタイムＰＣＲ分析。すべてのデータは、少なくとも２つの別個の実験を代表するものである。
【図１７Ｂ】（図１７Ａの説明を参照）
【図１７Ｃ】（図１７Ａの説明を参照）
【図１７Ｄ】（図１７Ａの説明を参照）
【０１４４】
【図１８Ａ】図１８は、Ｎ・ブラシリエンシスに感染させたＩＬ−２１Ｒ-/-マウスにおいて、タイプ２の反応が弱まることを示している。第７日に、Ｎ・ブラシリエンシスに感染させた、または未処理のＣ５７ＢＬ／６またはＩＬ−２１Ｒ-/-マウス（５匹／処理グループ）それぞれから、肺（Ａ）および肺に関連したリンパ節（ＬＡＬＮ）（Ｂ）を除去した。ＲＮＡを単離し、図１７について述べられている通りに、ｃＤＮＡを産生した。ＩＬ−１３、ＩＬ−４、ＡＭＣａｓｅ、Ｙｍ１およびＦＩＺＺ１それぞれについて、リアルタイム定量ＰＣＲによってｍＲＮＡを分析した。変化（倍）は、感染させたマウスと感染させなかったマウスとの比較に基づく。
【図１８Ｂ】（図１８Ａの説明を参照）
【図１９Ａ】図１９は、ＩＬ−２１Ｒ-/-マウスにおいて、タイプ２サイトカイン主導の炎症が減少することを示している。ＷＴマウス（白い棒グラフ）およびＩＬ−２１Ｒ-/-マウス（黒い棒グラフ）を、腹腔内において卵で感作し、２週間後に静脈内において生きているマンソン住血吸虫卵でチャレンジし、チャレンジ後第４日および第７日に犠牲にした。（Ａ）肺の組織からＲＮＡを調製し、図１７について述べられている通りに、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって個々に分析した（グループ／時点当たりＮ＝５）。（Ｂ）抗原（ＳＥＡ）またはマイトジェンによる刺激（ＣＯＮ）後に、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γについて、脾臓（Ｓｐｌ）および肺に関連したリンパ節（ＬＮ）のアッセイを行った。（Ｃ）ＷＴマウス（グループ当たり複数のマウス：Ｎ＝１０、第４日；Ｎ＝１５、第７日）およびＩＬ−２１Ｒ-/-マウス（Ｎ＝１１、第４日；Ｎ＝１６、第７日）について、肉芽腫の大きさ（ｍｍ3×１０-3）および肉芽腫における好酸球のパーセンテージを、顕微鏡によって定量化した。（Ｄ）肉芽腫性の肺の組織におけるＴH２炎症遺伝子のリアルタイムＰＣＲ分析（グループ／時点当たりＮ＝５）。星印は、所定の時点における野生型の値との有意差を示し、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１である。示されたデータは、３つの別個の実験の結果を総合したものである。
【図１９Ｂ】（図１９Ａの説明を参照）
【図１９Ｃ】（図１９Ａの説明を参照）
【図１９Ｄ】（図１９Ａの説明を参照）
【０１４５】
【図２０Ａ】図２０は、経皮的なマンソン住血吸虫への感染後に、ＩＬ−２１Ｒが存在しない場合、慢性的な肝疾患が減少することを示している。ＷＴマウス（白い棒グラフ）およびＩＬ−２１Ｒ-/-マウス（黒い棒グラフ）を、２５〜３０匹のマンソン住血吸虫セルカリアを用いて感染させた。全ての動物は、感染後第９週（急性）または第１２週（慢性）で犠牲にした。（Ａ）肝臓の組織からＲＮＡを単離し、図１７について述べられている通りに、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって個々に分析した（グループ／時点当たりＮ＝８〜１０）。（Ｂ）脾臓（Ｓｐｌ）および腸間膜リンパ節（ＬＮ）を、２〜４匹のマウスのグループ内でプールし、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γについて、単一細胞懸濁液のアッセイを行った。示されたデータは、３つの別個のプールされたグループの平均である。（Ｃ）ＷＴマウス（グループ当たり複数のマウス：第９週においてＮ＝３０、第１２週においてＮ＝１７）およびＩＬ−２１Ｒ-/-マウス（グループ当たり複数のマウス：第９週においてＮ＝２７、第１２週においてＮ＝１９）について、肉芽腫の大きさ（ｍｍ3×１０-3）および肉芽腫における好酸球のパーセンテージを、顕微鏡によって評価した。（Ｄ）肉芽腫性の肝臓の組織におけるＴH２炎症遺伝子のリアルタイムＰＣＲ分析（グループ／時点当たりＮ＝８〜１０）。示されたデータは、第９週に行われた１つの実験と、第１２週に行われた２つの実験、計３つの別個の実験結果を総合したものである。星印は、所定の時点における野生型の値との有意差を示し、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１である。
【図２０Ｂ】（図２０Ａの説明を参照）
【図２０Ｃ】（図２０Ａの説明を参照）
【図２０Ｄ】（図２０Ａの説明を参照）
【０１４６】
【図２１Ａ】図２１は、肉芽腫の細胞構成が、ＩＬ−２１Ｒの欠損によって変化しないことを示している。（Ａ）９週間感染させたＷＴ（Ｎ＝１０）マウスおよびＩＬ−２１Ｒ-/-（Ｎ＝９）マウスの肝臓における、肉芽腫の細胞構成が評価された。小リンパ球（Ｓｍ  Ｌｙｍ）、大リンパ球（Ｌｇ  Ｌｙｍ）、マクロファージ（Ｍａｃ）、線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏ）、好酸球（Ｅｏｓ）、および肥満細胞（Ｍｃ）の平均±ＳＥＭが示される。（Ｂ）未処理のＷＴマウスおよびＩＬ−２１Ｒ-/-マウスの潅流させた肺からリンパ球を単離し（上のパネル）、第７日に、マンソン住血吸虫の５０００個の卵を用いて静脈内でチャレンジを行った（下のパネル）。ヒストグラム中の数は、肺の総リンパ球数におけるＣＤ４-およびＣＤ４+Ｔ細胞のパーセンテージを示す。
【図２１Ｂ】（図２１Ａの説明を参照）
【図２２Ａ】図２２は、ＩＬ−２１Ｒの欠損が、ＴH２サイトカイン依存線維症の進行を有意に遅らせることを示す。ＷＴマウス（白い棒グラフ）およびＩＬ−２１Ｒ-/-マウス（黒い棒グラフ）を、マンソン住血吸虫のセルカリアを用いて感染させた。動物は、感染後第９週（急性）、第１２週（慢性）（パネルＡ〜Ｄ）、または第２９週（遅い慢性）（パネルＥ）に犠牲にした。（Ａ）各グループについて、千単位±ＳＥにおける平均的な蠕虫対数、総蠕虫数および蠕虫１対当たりの卵数が示されている。どの実験においても、感染強度の差は見られなかった（ｎ＝マウスの数）。（Ｂ）犠牲の際にマウスの血を抜き取り、ＳＥＡアイソタイプ特異的Ａｂの力価をＥＬＩＺＡによって測定した。（Ｃ）総血清ＩｇＥ量（μｇ／ｍｌ）。（Ｄ〜Ｆ）卵１０，０００個当たり（パネルＤ）、または肝臓全体当たり（パネルＥおよびＦ）の、肝臓において検出されたヒドロキシプロリンの量（単位：ミクロモル）によって、線維症を評価した。パネルＦにおいて、感染させたＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＩｇＧ２ａコントロール抗体（ｃＩｇ−白い棒グラフ）またはｓＩＬ−２１Ｒ−Ｆｃ（黒い棒グラフ）のどちらかで６週間処理した。星印は、所定の時点における野生型の値との有意差を示し、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１である。
【図２２Ｂ】（図２２Ａの説明を参照）
【図２２Ｃ】（図２２Ａの説明を参照）
【図２２Ｄ】（図２２Ａの説明を参照）
【図２２Ｅ】（図２２Ａの説明を参照）
【図２２Ｆ】（図２２Ａの説明を参照）
【０１４７】
【図２３Ａ】図２３は、ＩＬ−２１のシグナル伝達が、ＩＬ−１３レセプターの発現を調節することにより、代わりのマクロファージの活性化を促進することを示す。骨髄由来のマクロファージが、ＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１３（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−２１（２０ｎｇ／ｍｌ）の種々の組合せで一晩処理された。ＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＩＬ−２１で処理されたマクロファージを、ＩＬ−４およびＩＬ−１３を投与する前に、ＩＬ−２１で６時間前処理した。細胞を２０時間後に溶解し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってＲＮＡを個々に分析した。（Ａ）Ａｒｇ−１およびＦＩＺＺ１の遺伝子発現を測定することにより、ＩＬ−２１が代わりのマクロファージの活性化を促進する能力を評価した。（Ｂ）Ｌ−アルギニンから尿素への変換を測定することにより、細胞溶解物中のアルギナーゼ活性を定量化した（ｍｇ／ｄＬ±ＳＥＭ、３重測定）。（Ｃ）ＩＬ−４ＲαおよびＩＬ−１３Ｒα１のｍＲＮＡの発現を、リアルタイムＰＣＲによって評価した。全ての条件において、ＩＬ−１３Ｒα２のｍＲＮＡはほとんど検出不可能であった（示されず）。パネルＡ、ＢおよびＣに示されるデータは、３つの別個の実験を代表するものである。（Ｄ）５０００個の生きているマンソン住血吸虫卵を用いて、未処理のＣ５７ＢＬ／６マウスに静脈内でチャレンジし、第１日から第６日まで、一日おきにＰＢＳまたはｒＩＬ−２１（２μｇ／投与量）で処理した。動物（グループ当たり５匹）は第７日に犠牲にし、リアルタイムＰＣＲによって肺のＩＬ−１３Ｒα２  ｍＲＮＡのレベルのアッセイを行い、未処理のコントロール（白い棒グラフ）より何倍増加したかを示した。また、犠牲の際にマウスの血を抜き取り、ＥＬＩＳＡによって、個々の血清試料中のｓＩＬ−１３Ｒα２の量のアッセイを行った。星印は有意差を示し、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１である。
【図２３Ｂ】（図２３Ａの説明を参照）
【図２３Ｃ】（図２３Ａの説明を参照）
【図２３Ｄ】（図２３Ａの説明を参照）
【図２４】図２４は、代わりに活性化されたマクロファージが、有意な量の活性ＴＧＦ−β１を生成しないことを示す。右のパネルは、マクロファージ活性後の活性ＴＧＦ−β１を示し、左のパネルは、マクロファージ活性後の総ＴＧＦ−β１レベルを示す。骨髄由来のマクロファージを、ＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１３（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−２１（２０ｎｇ／ｍｌ）の種々の組合せで一晩処理した。ＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＩＬ−２１で処理されたマクロファージは、ＩＬ−４およびＩＬ−１３を投与する前に、ＩＬ−２１で６時間前処理された。活性化後２０時間で、ＥＬＩＺＡによって上清のアッセイを行い、総ＴＧＦ−β１および活性ＴＧＦ−β１を調べた。ＩＬ−２１のみで処理された細胞を除き（左のパネルの「ＩＬ−２１」と「未処理」とを比較のこと）、全てのグループにおいて高レベルの総ＴＧＦ−β１が検出された（例えば、左のパネルの「ＩＬ−４」と「未処理」とを比較のこと）。総ＴＧＦ−β１発現は高かったが、全てのグループにおいて活性ＴＧＦ−β１は最小限であった（右のパネル）。示されたデータは、類似の結果であった３つの別個の実験を代表するものである。
【図１】
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【図１−２】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
2008538553.tif 000046
【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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