(57)【要約】  ハイドロホビン、特に一般構造式（Ｉ）  Ｘn−Ｃ1−Ｘ1-50−Ｃ2−Ｘ0-5−Ｃ3−Ｘ1-100−Ｃ4−Ｘ1-100−Ｃ5−Ｘ1-50−Ｃ6−Ｘ0-5−Ｃ7−Ｘ1-50−Ｃ8−Ｘm      （Ｉ）（但し、  Ｘが、２０種の天然由来のアミノ酸の何れか、  ｎとｍが０〜５００の範囲の数、  Ｃがスチレン、  である。）  のプロテインを含む被膜を有する、膨張可能な、又は膨張した、熱可塑性ポリマー粒子、及び静電防止剤としてのその使用方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイドロホビンを含む被膜を有する、膨張可能な又は膨張した熱可塑性ポリマー粒子。
【請求項２】
前記被膜が、ハイドロホビンを、前記熱可塑性ポリマーに対して、１〜５０００ｐｐｍ含むことを特徴とする請求項１に記載の膨張可能な又は膨張した熱可塑性ポリマー粒子。
【請求項３】
前記熱可塑性ポリマーが、ポリスチレン又はポリオレフィンから成ることを特徴とする請求項１に記載の膨張可能な又は膨張した熱可塑性ポリマー粒子。
【請求項４】
平均粒子径が０．０５〜５ｍｍの範囲であることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の膨張可能な又は膨張した熱可塑性ポリマー粒子。
【請求項５】
前記被膜が、一般式（ＩＩ）
Ｘn−Ｃ1−Ｘ3-25−Ｃ2−Ｘ0-2−Ｃ3−Ｘ5-50−Ｃ4−Ｘ2-35−Ｃ5−Ｘ2-15−Ｃ6−Ｘ0-2−Ｃ7−Ｘ3-35−Ｃ8−Ｘm      （ＩＩ）
（但し、
Ｘが、２０種の天然由来のアミノ酸の何れか、
ｎとｍが０〜５００の範囲の数、
Ｃがシステイン、
である。）
のハイドロホビンを含むことを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の膨張可能な又は膨張した熱可塑性ポリマー粒子。
【請求項６】
前記被膜が、一般式（ＩＩＩ）
Ｘn−Ｃ1−Ｘ5-9−Ｃ2−Ｃ3−Ｘ11-39−Ｃ4−Ｘ2-23−Ｃ5−Ｘ5-9−Ｃ6−Ｃ7−Ｘ6-18−Ｃ8−Ｘm      （ＩＩＩ）
のハイドロホビンを含むことを特徴とする請求項４に記載の膨張可能な又は膨張した熱可塑性ポリマー粒子。
【請求項７】
前記被膜が、ｄｅｗＡ、ｒｏｄＡ、ｈｊｙｐＡ、ｈｙｐＢ、ｓｃ３、ｂａｓｆ１又はｂａｓｆ２タイプのハイドロホビンを含むことを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の膨張可能な又は膨張した熱可塑性ポリマー粒子。
【請求項８】
ポリマー粒子の表面が、ハイドロホビンを含む溶液と接触されることを特徴とする、膨張可能な又は膨張した熱可塑性ポリマー粒子を被覆する方法。
【請求項９】
使用される、ハイドロホビンを含んだ溶液が、水溶液であり、且つハイドロホビンの濃度が１〜１００ｇ／ｌで、及びｐＨが５〜９の範囲であることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記表面が、０℃〜１４０℃の範囲の温度で、前記ハイドロホビンを含んだ溶液と接触されることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイドロホビンを含んだ被膜を有する膨張可能な又は膨張した熱可塑性ポリマー粒子に関し、及びこれらを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
膨張可能なポリスチレンを、問題が発生しない方法で輸送可能とするために、及び予備発泡（前発泡）したポリスチレンフォーム粒子の静電気的電荷（帯電）を低減するために、このＥＳＰ粒子は、通常、静電気防止剤（帯電防止剤）で被覆される。被覆剤が磨耗し、又は粒子表面から洗い流されることに起因して、静電防止特性（帯電防止特性）は、しばしば不十分なものとなる。このことは、この静電防止性被覆について、粒子の塊状化(caking)と流動性が低下するという結果をもたらす。
【０００３】
特許文献１（ＥＰ−Ａ４７０４５５）には、ビード状の静電防止性（帯電防止性）、膨張性スチレンポリマーが記載されており、このスチレンポリマーは、第４級アンモニウム塩及び微細に粉砕されたシリカを含む被膜を有しており、そして、良好な流動性を有していることで区別される。
【０００４】
ハイドロホビンは、約１００〜１５０個のアミノ酸を有する小さなプロテイン(small protein)であり、糸状菌(filamentous fungi)例えば、シゾフィラムコムネ(Schizophyllum commune)に特有のものである。通常、これらは８個のシステイン単位を有している。
【０００５】
ハイドロホビンは、境界表面に顕著な親和性(affinity)を有しており、そして従って、表面の被覆に適切である。従って、例えば、疎水性の表面を得るために、ハイドロホビンを使用して、テフロン（登録商標）を被覆することが可能である。
【０００６】
ハイドロホビンは、天然物質から分離（単離）して良い。本出願人による特許文献２（ＤＥ１０２００５００７４８０．４）は、ハイドロホビンを製造する方法が開示されている。
【０００７】
従来技術には、ハイドロホビンの種々の使用方法が提案されている。
【０００８】
特許文献３（ＷＯ９６／４１８８２）は、ハイドロホビン性表面を疎水化するために、疎水性表面の耐水性を改良するために、水中オイル（oil in water）乳濁液又はオイル中水（water in oil）乳濁液を製造するために、ハイドロホビンを、乳化剤、シックナー、界面活性剤として使用する方法を提案している。軟膏又はクリームの製造等の薬学（製薬）的適用、及び、スキン保護又はヘアシャンプー又はヘアリンス等の化粧品的適用も提案されている。
【０００９】
特許文献４（ＷＯ０１／５７５２８）は、窓ガラス、コンタクトレンズ、バイオセンサー、医療機器、試験資材の運搬用又は保存用容器、船体、固体粒子、又は車体（シャシー）又は旅客車の車体を、３０〜８０℃の温度において、ハイドロホビン含有溶液で被覆することを開示している。
【００１０】
特許文献５（ＷＯ０３／５３３８３）は、化粧分野において、ケラチン（角質）を処理するために、ハイドロホビンを使用することを開示している。
【００１１】
特許文献６（ＷＯ０３／１０３３１）には、ハイドロホビンで被覆されたセンサー、例えば測定電極（このセンサーには、別の非共有結合物質、例えば電気活性(electroactive)物質、抗体又は酵素が付加されている。）が開示されている。
【００１２】
【特許文献１】ＥＰ−Ａ４７０４５５
【特許文献２】ＤＥ１０２００５００７４８０．４
【特許文献３】ＷＯ９６／４１８８２
【特許文献４】ＷＯ０１／５７５２８
【特許文献５】ＷＯ０３／５３３８３
【特許文献６】ＷＯ０３／１０３３１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、本発明の目的は、上述した不利な点を除去し、そして、膨張可能な又は膨張した熱可塑性ポリマー粒子のための、密度を低下させる予備発泡又は発泡の間、粒子が塊状化する傾向を低減させる、静電気防止性（帯電防止性）被覆を見出すことにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
従って、上述した膨張可能な又は膨張した熱可塑性ポリマー粒子が見出された。
【００１５】
この被覆（被覆物）は、熱可塑性ポリマーに対して、１〜５０００ｐｐｍ、特に１０〜１０００ｐｐｍのハイドロホビン（ヒドロホビン:hydrophobin）を含むことが好ましい。被覆は、更に、静電防止剤及び／又は被覆助剤を含んでも良く、又、異なる被覆剤を含む別の被覆が施されても良い。ハイドロホビン又はハイドロホビン混合物のみから成り、そして膨張可能な又は膨張した熱可塑性ポリマー粒子上に単分子層(monomolecular layer)を形成する被覆が特に好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
膨張可能な又は膨張した熱可塑性ポリマー粒子のために、ポリスチレン（ＥＰＳ）等のスチレンポリマー又はポリエチレン（ＥＰＥ）又はポリプロピレン（ＥＰＰ）等のポリオレフィンを使用することが好ましい。
【００１７】
膨張可能な熱可塑性ポリマー粒子は、膨張された熱可塑性ポリマー粒子を得るために、例えば、ホットエア又は熱風（ホットストリーム）により、発泡（フォーム化）可能なものである。これらは、通常、化学的又は物理的発泡剤を、熱可塑性ポリマーに対して２〜１０質量％、好ましくは３〜７質量％の量で含む。
【００１８】
好ましい物理的発泡剤は、窒素又は二酸化炭素、又は２〜７個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素、アルコール、ケトン、エーテル又はハロゲン化炭化水素等のガスである。イソブタン、ｎ−ブタン、イソペンタン、ｎ−ペンタン、ネオペンタン、ヘキサン又はこれらの混合物を使用することが特に好ましい。
【００１９】
膨張可能な、及び膨張した熱可塑性ポリマー粒子は、更に、染料、顔料等の通常の助剤、充填剤、カーボンブラック等のＩＲ吸収剤、アルミニウム又はグラファイト、安定剤、ヘキサブロモシクロドデカン（ＨＢＣＤ）等の難燃剤（frame retardants）、ジクミル(dicumyl)又は過酸化ジクミル(dicumyl preoxide)等の合成難燃剤、核生成剤（nucleating agent）又はグリダント(glidant)を有効な量だけ含んでも良い。
【００２０】
製造方法に依存して、本発明に従う膨張可能な熱可塑性ポリマー粒子は、球状、ビード状又はシリンダー状であって良く、そして通常、平均粒径が、０．０５〜５ｍｍの範囲、特に０．３〜２．５ｍｍの範囲であって良く、そして適切であれば、スクリーニング（選別）により、個々の部分けしても良い。
【００２１】
膨張した熱可塑性ポリマー粒子は、平均粒子が、１〜１０ｍｍの範囲、特に２〜６ｍｍの範囲であり、そして膨張の程度に対応して、密度が、１０〜２００ｋｇ／ｍ3の範囲である。
【００２２】
膨張可能な熱可塑性ポリマー粒子は、例えば、以下の方法で得ることができる。すなわち、（例えば、）熱可塑性ポリマーを、タンク中において、発泡剤で、圧力含浸(pressure impregnation)させることにより、発泡剤の存在下に懸濁重合させることにより、又は押出し成形機又は静的攪拌器内で溶融含浸させ、その後に、水の使用下に圧力造粒(pressure granulation)することにより得ることができる。
【００２３】
膨張した熱可塑性ポリマー粒子は、膨張可能な熱可塑性ポリマー粒子を発泡させることにより得られて良く、これは、例えば、予備発泡器（prefoamer）中のホットエアー又は熱風を使用して、又は熱可塑性粒子をタンク中の発泡剤で圧力含浸させ、後に減圧することにより、又は発泡剤を含んだ溶融物を発泡させながら溶融押出し、そして次に造粒することにより行われて良い。
【００２４】
本発明に従い使用される「ハイドロホビン」という用語は、以降、一般構造式（Ｉ）、
Ｘn−Ｃ1−Ｘ1-50−Ｃ2−Ｘ0-5−Ｃ3−Ｘ1-100−Ｃ4−Ｘ1-100−Ｃ5−Ｘ1-50−Ｃ6−Ｘ0-5−Ｃ7−Ｘ1-50−Ｃ8−Ｘm      （Ｉ）
（但し、Ｘは、２０種の天然由来のアミノ酸（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ）の何れかであって良い。）のプロテイン(protein)を意味する。Ｘは、同一であって良く、異なっていても良い。Ｘに続く指数(indice)は、各場合においてアミノ酸の数を表し、Ｃは、システインを表し、そして、指数ｎ及びｍは、独立して０〜５００の範囲の自然数、好ましくは１５〜３００の範囲の自然数である。
【００２５】
式（Ｉ）に従うポリペプチドは、ガラス表面に被覆した後、水滴の接触角度が、少なくとも２０°、好ましくは２５°、及び特に好ましくは３０°増加する（各場合、室温で測定）という特性によって更に特徴づけられる（但し、上記接触角度の増加は、同一の大きさの水滴と、被覆を行なっていないガラス表面との接触角度と比較してのものである。）。
【００２６】
Ｃ1〜Ｃ8で表されたシステインは、還元された状態で存在して良く、又は相互間で二硫化ブリッジを形成して存在して良い。Ｃ−Ｃブリッジを分子間で形成することが特に好ましく、特に少なくとも１個、好ましくは２個、特に好ましくは３個の分子間形成であり、及び極めて好ましくは４個の分子間二硫化ブリッジである。
【００２７】
本発明を行うために、一般式（ＩＩ）、
Ｘn−Ｃ1−Ｘ3-25−Ｃ2−Ｘ0-2−Ｃ3−Ｘ5-50−Ｃ4−Ｘ2-35−Ｃ5−Ｘ2-15−Ｃ6−Ｘ0-2−Ｃ7−Ｘ3-35−Ｃ8−Ｘm      （ＩＩ）
（但し、Ｘ、Ｃ及びＸとＣに続く指数は、上記に定義したものであり、しかし、指数ｎとｍは、０〜３００の範囲の数を表す。）のヒドロホビンを使用することが好ましく、そしてこのプロテインは、更に上述した接触角の変化で区別可能である。
【００２８】
一般式（ＩＩＩ）、
Ｘn−Ｃ1−Ｘ5-9−Ｃ2−Ｃ3−Ｘ11-39−Ｃ4−Ｘ2-23−Ｃ5−Ｘ5-9−Ｃ6−Ｃ7−Ｘ6-18−Ｃ8−Ｘm      （ＩＩＩ）
（但し、Ｘ、Ｃ及びＸとＣに続く指数は、上記に定義したものであり、指数ｎとｍは、０〜２００の範囲の数を表す。）のヒドロホビンを使用することが特に好ましく、そしてこのプロテインは、更に上述した接触角の変化で区別可能なものである。
【００２９】
残基(残留物：residue)Ｘn及びＸmは、ペプチド配列であって良く、このペプチド配列は、ハイドロホビンに自然に結合していても良い。しかしながら、残基ＸnとＸmの何れか、又は両方がハイドロホビンと自然には結合しないペプチド配列であっても良い。ここで、これには、ハイドロホビン中に自然に発生（存在）するペプチド配列が、ハイドロホビン中には自然には存在しないペプチド配列によって延長（増量）されている、残基Ｘn及び／又はＸmも含まれる。
【００３０】
Ｘn及び／又はＸmが、ハイドロホビンと自然には結合しないペプチド配列である場合、このような配列（シーケンス）は通常、少なくとも２０アミノ酸の長さであり、この長さは、少なくとも３５アミノ酸であることが好ましく、少なくとも５０アミノ酸であることがより好ましく、そして、少なくとも１００アミノ酸であることが極めて好ましい。ハイドロホビンと自然には結合しないこの種の残基は、以降、融合相手部分(fusion partner portion)とも称される。このことは、本発明に従い使用されるプロテインは、少なくとも１種のハイドロホビン部分(hidorohobin portion)と、融合相手部分（これらは、この状態では自然には一緒に発生しない。）とから構成されて良いことを説明することを意図している。
【００３１】
この融合相手部分は、多種のプロテインから選ばれて良い。複数の融合相手部分が１個のハイドロホビン部分、例えば、上述したハイドロホビン部分のアミノ末端基（アミノ末端部分）（Ｘn）、又はカルボキシル末端基（Ｘm）と結合することも可能である。しかし、例えば、２個の融合相手部分が、本発明のプロテインの１箇所（Ｘn又はＸm）と結合することも可能である。
【００３２】
特に適切な融合相手部分は、微生物(microorganismus)、特にＥ．コイル又はバチルスサブチリス中に自然に発生するプロテインである。このような融合相手部分の例は、配列ｙａａｄ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５及び１６）、ｙａａｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７及び１８）及びチオレドキシン（thioredoxin）である。上述した配列の１部分のみ、好ましくは上述した配列の７０％〜９９％及び、より好ましくは８０〜９８％を含む、上述した配列の断片（fragment）又は誘導体も適切であり、又、上述した配列に対して、個々のアミノ酸又はヌクレオチドが取替えられているものも適切である（なお、百分率は、全てアミノ酸の数に対してである）。
【００３３】
本発明に従い使用されるプロテインのポリペプチド配列は、例えば、グリコシル化、アセチル化によって、又は他に、例えばグルタルアルデヒドでの化学的な架橋によって、追加的に修飾（改変:modify）されていても良い。
【００３４】
本発明に従い使用されるプロテインの特性の一つには、表面(surface)がこのプロテインで被覆された場合には、表面特性が変化することが挙げられる。表面特性の変化は、表面をプロテインで被覆する前と後で、水の滴の接触角を測定し、そしてこの２つの測定値の差を測定（計算）することにより、実験的に確かめることができる。
【００３５】
接触角の測定は、この技術分野の当業者にとって公知である。接触角の測定は、室温及び５μｌの水に基づいている。例えば、適切な接触角の測定方法の正確な実験条件は、実施例部分に記載されている。実施例で記載した条件下で、本発明に従い使用されるプロテインは、接触角度を、少なくとも２０°、好ましくは少なくとも２５°、及び特に好ましくは少なくとも３０°増加させる（但し、上記接触角度の増加は、同一の大きさの水滴と、被覆を行なっていないガラス表面との接触角度と比較してのものである。）。
【００３６】
今日までに知られているハイドロホビンのハイドロホビン部分には、極性及び非極性アミノ酸の部分（箇所：position）が含まれて（保存されて）おり、これは、特徴的なハイドロホビンプロット(hydrophobicity plot)を提供する。生物物理的特長及び疎水性(hudrophobicity)の差異により、今日までに知られているハイドロホビンは、クラスＩとＩＩ（Ｗａｓｓｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９４，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．，３２，４１３−４３７）の２種類に分けられる。
【００３７】
クラスＩのハイドロホビンの（集められた）被膜は、広い範囲で不溶性であり（例えば、高温度下のナトリウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）の１質量％の水溶液にも不溶性である。）、そして、濃縮トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）又は蟻酸でのみ解離可能である。これに対して、クラスＩＩのハイドロホビンの（集められた）型は、より不安定である（安定性に劣る）。これらは、６０％濃度（strength）のエタノールの又は１％ＳＤＳ（室温における。）に溶解可能である。
【００３８】
アミノ酸配列を比較した場合、システインＣ3とシステインＣ4との間の領域の長さは、クラスＩのハイドロホビンよりも、クラスＩＩのハイドロホビンの方が明らかに短いことがわかる。更に、クラスＩＩのハイドロホビンは、クラスＩのハイドロホビンよりも、より荷電された(charged)アミノ酸を有している。
【００３９】
本発明を実施するための、特に好ましいハイドロホビンは、タイプｄｅｗＡ、ｒｏｄＡ、ｈｙｐＡ、ｈｙｐＢ、ｓｃ３、ｂａｓｆ１、ｂａｓｆ２のもので、これらは以下に列挙する配列に構造的な特徴を有している。これら（上記好ましいハイドロホビン）は上述したタイプの一部分のみ、又はこれらの誘導体であって良い。ハイドロホビン部分の複数、好ましくは２又は３個の同一又は異なる構造物を互いに結合させて良く、及び対応する適切なポリペプチド配列（このポリペプチド配列は、自然にはハイドロホビンと結合しないものである。）に結合させて良い。
【００４０】
本発明を行うために特に適切なものは、更に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０，２２，２４中に示されたポリペルチド配列を有する融合プロテイン(fusion protein)、及びそのためにコードする核酸配列(nucleic acid sequence)を有する融合プロテインであり、これは、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９，２１，２３に従う配列である。特に好ましい実施の形態として、更に、プロテインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２，２２又は２４中に示されたポリペプチド配列から出発して、全てのアミノ酸の、少なくとも１から１０以下、好ましくは５以下、特に好ましくは５％を、変換（置換）、挿入（差込：insertion）又は削除(deletion)することにより得られ、且つ出発プロテインの生物学的特性を少なくとも５０％有しているプロテインも含む。ここで、プロテインの生物学的特性は、上述した接触角度の増加量が、少なくとも２０°であることを意味している。
【００４１】
本発明に従い使用されるプロテインは、ペプチド合成の通常の技術（例えば、メリフィールド（Merrifield）固相合成）によって化学的に製造可能である。
【００４２】
自然に発生するハイドロホビンは、適切な方法を使用して、天然原料から分離することができる。例えば、Ｗｏｓｔｅｎ  ｅｔ．  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．６３，１２２−１２９（１９９４）又はＷＯ９６／４１８８２が参照可能である。
【００４３】
融合プロテインは、遺伝子工学法によって製造可能であることが好ましく、この遺伝子工学法では、融合相手のため、及びハイドロホビン部分のためにコードする核酸配列、特にＤＮＡ配列が（互いに）組合され、そして、ホスト有機体（宿主有機体：host organism）中で、組合された核酸配列の遺伝子発現（expression）により、所望のプロテインが形成されるものである。このような製造方法は、本願の出願人による、先願のＤＥ１０２００５００７４８０．４に開示されている。
【００４４】
上述した製造方法のために適切なホスト有機体（生成有機体）は、原核生物（prokaryotes）（始原（Archaea）を含む）又は真核生物（eukaryotes）であって良く、特にハロバクテリア含有バクテリア及びｍｅｔａｎｏｃｏｃｃｉ、フンギ（菌）、インセクトセル（昆虫細胞）、植物細胞、及び哺乳類細胞、より好ましくはＥｓｃｅｒｉｃｈｉａコイル、バチルスサブチリス、バチルスメガテリウム（megaterium）、アスペルギルスオリジア（Aspergillus oryzea）、アスペルギルスニドランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルスニガー（Aspergillus niger）、ピキアパトリス（Pichia pastoris）、シュードモナス（Pseudomonas）種（spec．）、ラクトバシリ（Lactobaclli）、ハンセヌラポリモルファ（Hansenula polymorpha）、トリコデルマレーゼイ（Trichoderma reesei）、ＳＦ９（又は関連する細胞）等であって良い。
【００４５】
更に、本発明は、遺伝子発現構築体(expression construct)の使用方法に関し、ここで、この遺伝子発現構築体は、調節核酸配列の遺伝子的な制御下に、本発明に従い使用されるポリペプチドのためにコードする核酸配列、及びこれら発現構築体を少なくとも１種含むベクターを含むものである。
【００４６】
使用する構築体（遺伝子発現構築体）は、好ましくは、所定のコード配列（暗号配列:coding sequence）の５’−上流側に、（１つの）プロモーター（promoter）を含み、及び（それぞれコード配列の）３’−下流側に、末端配列（ターミネーター配列）を含み、及び所望により、通常の別の調節エレメント(regulatory element)を含み、そして、各場合において、コード配列と、実質的に（操作的に）結合している。
【００４７】
上記「実質的に（操作的に）結合」は、プロモーター、コード配列、ターミネーター、及び所望により別の調節エレメントの次のような配列的な配置、すなわち、各調節エレメントが、コード配列の遺伝子発現において必要とされる機能を発揮し得るような配置を意味する。
【００４８】
実質的に（操作上）結合可能な配列の例は、標的（targeting）配列、及びエンハンサー(enhancer)、ポリアデニル化シグナル等である。更なる調節エレメントは、選択性（selectable）マーカー、増幅（amplification）シグナル、複製の原点（origin）等である。適切な調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ（１９９０）に記載されている。
【００４９】
これらの調節配列(regulatory sequence)に加え、これら配列の自然の調節（regulation）が、実際の構造遺伝子の上流(upstream)に存在しても良く、及び適切であれば、自然調節が排除（スイッチオフ）され、そして遺伝子の発現が増加するように遺伝子上、代え(alter)られて良い。
【００５０】
好ましい核酸構築体は、上述したエンハンサーの配列を１種以上含むことが有利であっても良い。ここで、このエンハンサーの配列は、プロモーターと機能的に結合しており、そして、核酸配列の発現を高めることができるものである。また、ＤＮＡ配列の３’エンドに、更に、調節エレメント又はターミネータ等の有利な配列が挿入されても良い。
【００５１】
核酸は、１個以上のコピーの状態で構築体中に含まれても良い。構築体(construct)は、更に、場合により、抗生物質耐性（antibiotic resistance）又は栄養要求性相補遺伝子（auxotrophy−complemeting gene）等の付加的なマーカーを（構築体上で選択するために）含んでも良い。
【００５２】
この方法のために有利な調節配列は、例えば、ｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｌａｃｌｑ−Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ｒｈａＰ（ｒｈａＰBAD）ＳＰ６、ｌａｍｂｄａ−ＰＲ又はｉｍｌａｍｂｄａ−Ｐプロモーター等のプロモーター中に存在する（ここで、プロモーターは、グラム陰性（Gram−negative）バクテリア中に使用することが有利である）。更に、有利な調節配列は、例えば、グラム陽性（Gram−positive）プロモーターのａｍｙ及びＳＰ０２中に、イースト（yeast）又は菌（fungal）プロモーターＡＤＣ１、ＭＦａｌｐｈａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８、ＡＤＨ中に存在する。
【００５３】
調節のために、人工的なプロモーターを使用することも可能である。
【００５４】
ホスト有機体（宿主有機体）中で発現するために、核酸構築体は、ベクター中に有利に装入される。ここで、このベクターは、例えば、プラスミド又はファージ（phage）等のものであり、これらは、ホスト（宿主：host）中に遺伝子の最適な発現を可能にするものである。ベクターは、プラスミド（plasmid）及びファージの他に、更に、当業者に公知のベクターをも意味する。この公知のベクターは、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ等のウィルス、バキョロウィルス（baculovirus）及びアデノウィルス（adenovirus）、トランスポゾン（transposons）、ＩＳ要素、ファスミド（phasmids）、コスミド（cosmids）、及び直線状又は環式ＤＮＡ、及び又、アグロバクテリウム（Agrobacterium）系である。
【００５５】
これらのベクターは、ホスト有機体内で、内因的に再現（複製）されて良く、又は染色体的に再現されて良い。これらベクターは、本発明の別の形態を構成する。適切なプラスミド（plasmid）の例は、Ｅコイル、ｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐｌＮ−ＩＩＩ”３−Ｂ１、ｔｇｔ１１又はｐＢｄＣｌ中のもの、ストレプトミセス（Streptomyces）、ｐｌＪ１０１、ｐｌＪ３６４、ｐｌＪ７０２、又はｐｌＪ３６１中のもの、バチルス（Bacillus）  ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、又はｐＢＤ２１４中のもの、コリネバクテリウム（Corynebacterium）  ｐＳＡ７７又はｐＡＪ６６７中のもの、菌（フンギ）ｐＡＬＳ１、ｐｌＬ２又はｐＢＢ１１６中のもの、イースト（yeasts）２アルファ、ｐＡＧ−１、ＹＥｐ６、ＹＥｐ１３、又はｐＥＭＢＬＹｅ２３中のもの、又は植物ｐＬＧＶ２３、ｐＧＨｌａｃ＋、ｐＢＩＮ１９、ｐＡＫ２００４又はｐＤＨ５１中のものである。上述したプラスミドは、可能なプラスミドの小部分を選択して示したものである。更なるプラスミドは、それ自身公知であり、そして、例えば、ｂｏｏｋ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｅｄｓ．Ｐｏｕｗｅｌｓ  Ｐ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ、１９８５、ＩＳＢＮ  ０４４４９０４０１８）に見出される。
【００５６】
存在する他の遺伝子を発現させるために、核酸構築体は、更に、３’−及び／又は５’−ターミナル調節配列も含み、ホスト又は遺伝子（遺伝子は複数種類の場合を含む）の選択に従い、最適の発現のために選択された発現を高める（増加させる）ことが有利である。
【００５７】
これら調節配列は、目標とする遺伝子の発現とプロテイン発現を可能にすることを意図している。ホスト有機体に依存して、このことは、例えば遺伝子が、誘導(induction)の後にのみ発現又は過剰発現(overexpress)されて良いことを意味して良く、又は直ちに発現又は過剰発現されて良いことを意味して良い。
【００５８】
これに関連して、調節配列或いはファクター（因子：factor）は、好ましくは、導入された遺伝子発現に積極的な影響を及ぼすことが可能であり、そしてこれにより、この遺伝子発現を高める（増加させる）ことができる。従って、強い転写シグナル、例えばプロモーター及び／又はエンハンサーを使用することにより、調節エレメントの強化（増加）を転写領域(transcription level)上で有利に行うことができる。しかしながら、これに加え、例えば、ｍＲＮＡの安定性を改良することにより、翻訳を高めることも可能である。
【００５９】
ベクターの他の実施の形態では、本発明の核酸構築体又は核酸を含むベクターは、直線状（直鎖状）ＤＮＡの状態で、微生物中に有利に導入されても良く、そしてヘテローグ(異種又は相異：heterologous)又はホモローグ(同種又は相同：homologous)の組換えを介して、ホスト有機体のゲノムに統合されても良い。この直線状ＤＮＡは、プラスミド等の直線化ベクターで構成されて良く、又は核酸構築体又は核酸のみよって構成されても良い。
【００６０】
ヘテローグ遺伝子の、有機体中での最適の発現のために、有機体中で使用される特定の「コドン（codon）使用」に従い、核酸配列を改変(alter)することが有利である。「コドン使用」は、対象となる有機体の、他の既に知られている遺伝子をコンピュータ解析することにより容易に決定（測定）することができる。
【００６１】
発現カセットは、適切なプロモーターを適切なコード核酸配列(coding nucleotide sequenve)及びターミネータシグナル又はポリアデニル化シグナルに融合させることにより製造される。例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ（１９８９）に、及びまた、Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）中に、及びＡｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．ｅｔａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）中に記載された、通常の組換え及びクローン技術がこの目的のために使用される。
【００６２】
適切なホスト有機体内で発現を達成するために、組換え核酸構築体又は遺伝子構築体が、ホスト中で遺伝子の最適の発現を提供するホスト特殊ベクター(host-specific vector)に有利に挿入される。ベクターは、当業者にとって公知であり、そして例えば、「Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」（Ｐｏｕｗｅｌｓ  Ｐ．Ｈ．  ｅｔａｌ．，Ｅｄｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）から得ることができる。
【００６３】
例えば、少なくとも１種のベクターで形質転換(transform)され、そして、本発明に従い使用されるプロテインを製造するために使用されて良い組換え微生物を、ベクターの補助下に製造することができる。有利なことに、上述した本発明の組換え構築体は、適切なホストシステム（宿主系）に導入され、そして発現される。これに関連して、特定の発現系中に発現するべき核酸を発生させるために、当業者にとって公知の、通常のクローン化法及びトランスフェクション法、例えば、共析出(coprecipitation)、プロトプラスト融合、エレクトロポーレイション、レトロウィルストランスフェクション等の方法を使用することが好ましい。適切な系(system)は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、  Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９７又はＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載されている。
【００６４】
ホモローグに組換えられた微生物を製造することも可能である。この目的のために、本発明に従い使用される遺伝子の少なくとも１切片（区分：section）又は、コード配列の１切片を含むベクターが、このために製造される。ここで、適切であれば、この配列を修飾（改変）、例えば機能的に分解（disrupt）するために（ノックアウトベクター）、少なくとも１種のアミノ酸−削除、−付加、又は−置換が導入される。導入された配列は、例えば、関連する微生物からのホモローグ（ホモログ変換）であっても良く、又、哺乳類、イースト、又はインセクトのソース（供給源）から誘導されても良い。この代わりに、ホモローグ性組換えのために使用されるベクターは、以下のように設計されて良い。すなわち、ホモローグ性組換えの場合、内生的な遺伝子が、変異(mutate)するか、又は他に、代えられるが、しかし機能プロテインをなおエンコード(encode)するように設計されて良い（例えば、上流の調節領域が、これにより内生的なプロテインの発現が代えられるように、代えられていても良い。）。本発明に従い使用される遺伝子の、代えられた切片は、ホモローグ性組換えベクター中に存在する。ホモローグ性組換えのために適切なベクターの構成は、例えば、Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．及びＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８７）Ｃｅｌｌ５１：５０３に記載されている。
【００６５】
本発明に従い使用される核酸、又は核酸構築体のために適切な組換えホスト有機体は、原則として、何れの原核性又は真核性有機体であっても良い。有利なことに、バクテリア、菌（フンギ）、又はイースト等の微生物が、ホスト有機体として使用される。グラム陽性又はグラム陰性バクテリア、好ましくは、科（ファミリー）、腸内細菌（Enterobacteriaceae）、シュードモナス（Pseudomonadaceae）、リゾビアセー（Rhizobiaceae）、ストレプミセトアセー（Streptomycetaceae）又はノカルジセアエ（Nocardiceae）、特に好ましくは、類(genera)エシェキアノ（大腸菌：Escherichia）、シュードモナス（Pseudomonas）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、ノルカルディア（Nocardia）、バークホルディア（Burkholderia）、サルモネラ（Salmonella）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）又はロドコッカス（Rhdococcus）が有利に使用される。
【００６６】
融合プロテインの製造方法に使用される有機体は、ホスト有機体に依存して、当業者にとって公知の方法で栽培（飼育）又は培養される。微生物は、通常、炭素供給源（通常は砂糖の状態）、窒素供給源（通常は、イースト抽出物、又は硫化アンモニウムの塩等の有機窒素供給源の状態）、鉄塩、マンガン塩等の少量の要素（元素）、及び適切な場合には、ビタミンを含む液体媒体中で、０℃〜１００℃の温度、好ましくは１０℃〜６０℃の温度で、酸素の供給下に栽培（飼育）される。これに関連し、栄養液体のｐＨは、一定の値に維持されても、維持されなくても良く、すなわち、培養の間調節しても、調節しなくても良い。培養は、非連続的（バッチ式：batchwise）、準バッチ式、又は連続的に行って良い。栄養剤は、発酵の初期に導入して良く、又、後に、準連続的又は連続的な方法で導入して良い。酵素は、実施例に記載した方法で有機体から分離して良く、又粗製抽出物として反応に使用して良い。
【００６７】
本発明に従い使用されるプロテイン又はこの、機能的(functional)、生物学的に活性な部分は、組換え製造方法によって製造されても良く、ここで、この製造方法では、プロテインを製造する微生物が培養され、適切であれば、プロテインの発現が誘導され、そして上述したプロテインが培養から分離される。このプロテインは、所望する場合には、この方法により工業規模で製造されて良い。組換え微生物は、公知の方法で培養され、そして、発酵されて良い。バクテリアは、例えば、ＴＢ媒体又はＬＢ媒体中で、及び２０℃〜４０℃の温度で、及び６〜９のｐＨで繁殖させて良い。適切な培養条件は、例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ（１９８９）に詳細に記載されている。
【００６８】
本発明に従い使用されるプロテインが、培養媒体に分泌(secrete)されない場合、細胞は分解（崩壊）され、そして、公知のプロテイン分離法により、生成物がリゼイド（溶解質：lysate）から得られる。細胞は、所望するように分解して良く、この分解は、高周波超音波を使用して、高圧を使用して、例えば、Ｆｒｅｎｃｈ圧力セル中で、ｏｓｍｏｌｙｓｉｓを使用して、洗浄剤(detergent)、溶菌（lytic）酵素又は有機溶媒の作用で、同質器（ホモナイザー）を使用して、又は上述した方法の２種以上を組合わせて行われる。
【００６９】
本発明に従い使用されるプロテインは、分子篩クロマトグラフィ（ゲル濾過）、例えばＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、及び疎水性クロマトグラフィ等の公知のクロマトグラフィ法、及びウルトラ濾過、結晶化、塩化分離(salting-out)、透析(dialysis)及び自然ゲル電気泳動等の他の通常の方法を使用して精製して良い。適切な方法は、例えば、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｆ．Ｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｃｈｅ  Ａｒｂｅｉｔｓｍｅｔｈｏｄｅｎ，  Ｖｅｒｌａｇ  Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ，  Ｂｅｒｌｉｎ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに、又はＳｃｏｐｅｓ、Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，  Ｂｅｒｌｉｎに記載されている。
【００７０】
ベクター系(vector system)又はオリゴヌクレオチドを使用して組換えプロテインを分離（単離）することが有利であって良く、オリゴヌクレオチドは、（所定のヌクレオチド配列分）ｃＤＮＡを延長させる。そして、延長したｃＤＮＡで、変えられたポリペプチド又は融合プロテインをコードするもので、これは、例えば精製の簡素化に役立つ。この種の適切な修飾（modification）の例は、アンカーとして機能する、いわゆる「ｔａｇｓ」（例えば、ヘキサ−ヒスチジンアンカーとして公知の修飾）、又は、抗体の抗原として識別されているエピトピ（epitopes）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ，  Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（Ｎ．Ｙ．）  Ｐｒｅｓｓに記載されている。）を含む。他の適切なｔａｇは、例えば、ＨＡ、ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ＢＤ、ＧＳＴ、ＭＢＤ；ｃｈｉｔｉｎ−ＢＤ、ｓｔｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＢＤ−ａｖｉ−ｔａｇ、Ｆｌａｇ−ｔａｇ、Ｔ７等である。これらのアンカーは、プロテインを、例えば、ポリマーマトリックス（ポリマーマトリックスは、例えば、クロマトグラフィカラムに詰め込まれても良い。）等の固定の基体(support)に留めるために使用されて良く、又は、微小滴定（microtiter）プレート又は他の基体に留めるために使用されても良い。対応する精製施行例（プロトコール）は、市販の類似するｔａｇの提供者から得られる。
【００７１】
上述のように製造されるプロテインは、融合プロテインとして直接的に使用して良く、又は切断（cleaving off）し、及び融合相手部分を除去した後、「純粋」なハイドロホビンとして使用しても良い。
【００７２】
融合相手部分の除去が意図される場合、可能な切断部位(cleavage site)（プロテアーゼ（タンパク質分解酵素）のための、特定の認識部位）を、融合プロテイン中、ハイドロホビン部分と、融合相手部分との間に挿入する（移入する）ことが有利である。適切な切断部位は、特に、他の場合では、ハイドロホビン部分中にも、融合相手部分中にも発生しないペプチド配列である。このことは、生命情報学機器を使用して容易に調査（確認）可能である。特に好ましくは、例えば、メチオニン上のＢｒＣＮ切断、又はファクター（因子）Ｘａを有するプロテアーゼ媒介（protease−mediated）切断、エンテロキナーゼ（enterokonase）切断、トロンビン（thrombin）、ＴＥＶ−切断（ｔａｂａｃｃｏ  ｅｔｃｈ  ウィルスプロテアーゼ）である。
【００７３】
膨張可能な、又は膨張した熱可塑性ポリマー粒子は、発泡の前又は後に、ドラム内でハイドロホビンを施すことにより、Ｌｏｄｉｇｅ  パドルミキサーを使用して、又は浸漬又はスプレーがけにより上述したポリマー粒子をハイドロホビンを含んだ溶液と接触させることにより、被覆して良い。発泡剤を含んだ溶融物を押出し成形することによる製造は、水を使用したペレタイザーの水流サーキットにハイドロホビンを加えることを含んでも良い。
【００７４】
膨張可能な、又は膨張した熱可塑性ポリマー粒子は、ハイドロホビンの濃度が１〜１００ｇ／ｌ、及びｐＨ範囲が５〜９の水溶液を使用して、被覆されることが好ましい。このハイドロホビンを含んだ溶液は、通常、０〜１４０℃の温度範囲、好ましくは３０〜８０℃の温度範囲で施される。
【００７５】
本発明に従う膨張可能な、及び膨張した熱可塑性ポリマー粒子は、静電防止性（帯電防止性）であり、発泡の間、塊状化(caking)する傾向が少なく、しかし、発泡（forming）して成形物を形成する時に、良好な融合性（溶接性）を示す。
【実施例】
【００７６】
実施例１
ｙａａｄ−Ｈｉｓ6／ｙａａＥ−Ｈｉｓ6のクローニングのための予備処理（前）処理
オリゴヌクレオチド  Ｈａｌ５７０及びＨａｌ５７１（Ｈａｌ５７２／Ｈａｌ５７３）の補助下に、ポリメラーゼ鎖反応を行った。使用したテンプレートＤＮＡは、バクテリアバチルスサブチリスのゲノムのＤＮＡであった。得られたＰＣＲ断片（フラグメント）は、バチルスサブチルスの遺伝子ｙａａＤ／ｙａａＥのコード配列を含み、及び末端に、（各場合に）Ｎｃｏｌ及びＢｇＩＩＩ制限切断部位(restriction cleavage site)を含んでいた。このＰＣＲ部分を精製し、そして制限酵素Ｎｃｏｌ及びＢｇｌｌｌでカット(cut)した。このＤＮＡ部分は、「挿入(insert)」として使用され、そして、制限酵素Ｎｃｏｌ及びＢｇＩＩＩで、事前に直線化（直鎖化）されたベクターｐＱＥ６０（Ｑｉａｇｅｎ社より）内でクローン化された。このように得られたベクターｐＱＥ６０ＹＡＡＤ＃２／ｐＱＥ６０ＹａａＥ＃５は、プロテイン（このプロテインは、ＹＡＡＤ：：ＨＩＳ6及びＹＡＡＥ：：ＨＩＳ6で構成されている。）の発現に使用された。
【００７７】
Ｈａｌ５７０：ｇｃｇｃｇｃｃｃａｔｇｇｃｔｃａａａｃａｇｇｔａｃｔｇａ
Ｈａｌ５７１：ｇｃａｇａｔｃｔｃｃａｇｃｃｇｃｇｔｔｃｔｔｇｃａｔａｃ
Ｈａｌ５７２：ｇｇｃｃａｔｇｇｇａｔｔａａｃａａｔａｇｇｔｇｔａｃｔａｇｇ
Ｈａｌ５７３：ｇｃａｇａｔｃｔｔａｃａａｇｔｇｃｃｔｔｔｔｇｃｔｔａｔａｔｔｃｃ
【００７８】
実施例２
ｙａａｄハイドロホビンＤｅｗＡ−Ｈｉｓ6のクローン化
オリゴヌクレオチドＫａＭ４１６及びＫａＭ４１７でポリメラーゼ連鎖反応(chain reaction)を行った。使用したテンプレートＤＮＡは、（糸状菌）アスペルギルスニドランス（Aspergilus nidulans）のゲノムのＤＮＡであった。得られたＰＣＲフラグメント（断片）は、ハイドロホビン遺伝子ｄｅｗＡのコード配列、及びＮ−末端ファクターＸａプロテイナーゼ切断部位を含んでいた。このＰＣＲフラグメントを精製し、そして制限エンドヌクレアーザ（endonucleases）ＢａｍＨｌでカットした。このＤＮＡフラグメントは、「挿入」として使用され、そして、制限エンドヌクレアーザＢｇＩＩＩで、事前に直線化（直鎖化）されたベクターｐＱＥ６０ＹＡＡＤ＃２内でクローン化された。
【００７９】
このように得られたベクター＃５０８は、融合プロテイン（この融合プロテインは、ＹＡＡＤ：：Ｘａ：：ｄｅｗＡ：：ＨＩＳ６で構成されている。）の発現に使用された。
【００８０】
ＫａＭ４１６：ＧＣＡＧＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＡＴＣＣＣＴＣＡＧＣＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＧＣ
ＫａＭ４１７：ＣＣＣＧＴＡＧＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＣＧＴＣＴＣＣＧＣ
【００８１】
実施例３
ｙａａｄハイドロホビンＲｏｄＡ−Ｈｉｓ6のクローン化（クローニング）
プラスミド＃５１３を、オリゴヌクレオチドＫａＭ４３４及びＫａＭ４３５を使用して、プラスミド＃５０８に類似してクローン化した。
【００８２】
ＫａＭ４３４：ＧＣＴＡＡＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＣＡＴＴＧＣＴＧＣ
ＫａＭ４３５：ＣＣＡＡＴＧＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＣＣＡＡＧＧＧ
【００８３】
実施例４
ｙａａｄハイドロホビンＢＡＳＦ１−Ｈｉｓ6のクローン化
プラスミド＃５０７を、オリゴヌクレオチドＫａＭ４１７及びＫａＭ４１８を使用して、プラスミド＃５０８に類似してクローン化した。テンプレートＤＮＡは、人工的に合成したＤＮＡ配列ハイドロホビンＢＡＳＦ１であった（アッペンディックス参照）。
【００８４】
ＫａＭ４１７：
ＣＣＣＧＴＡＧＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＣＧＴＣＴＣＣＧＣ
ＫａＭ４１８：ＣＴＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＡＣＡＧ
【００８５】
実施例５
ｙａａｄハイドロホビンＢＡＳＦ２−Ｈｉｓ6のクローン化
プラスミド＃５０６を、オリゴヌクレオチドＫａＭ４１７及びＫａＭ４１８を使用して、プラスミド＃５０８に類似してクローン化した。テンプレートＤＮＡは、人工的に合成したＤＮＡ配列ハイドロホビンＢＡＳＦ２であった（アッペンディックス参照）。
【００８６】
ＫａＭ４１７：
ＣＣＣＧＴＡＧＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＣＧＴＣＴＣＣＧＣ
ＫａＭ４１８：ＣＴＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＡＣＡＧ
【００８７】
実施例６
ｙａａｄハイドロホビンＳＣ３−Ｈｉｓ6のクローン化
プラスミド＃５２６を、オリゴヌクレオチドＫａＭ４６４及びＫａＭ４６５を使用して、プラスミド＃５０８に類似してクローン化した。使用したテンプレートＤＮＡは、Ｓｃｈｙｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ  ｃＤＮＡであった（アッペンディックス参照）。
【００８８】
ＫａＭ４６４：ＣＧＴＴＡＡＧＧＡＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣ
ＫａＭ４６５：ＧＣＴＡＡＣＡＧＡＴＣＴＡＴＧＴＴＣＧＣＣＣＧＴＣＴＣＣＣＣＧＴＣＧＴ
【００８９】
実施例７
組換えＥ．ｃｏｉｌ菌株ｙａａｄハイドロホビンＤｅｗＡ−Ｈｉｓ6の発酵
１５ｍｌＧｒｅｉｎｅｒチューブにおける、ｙａａｄハイドロホビンＤｅｗＡ−Ｈｉｓ6発現Ｅｃｏｉｌ菌株を使用した、３ｍｌのＬＢ液体媒体の接種（植え付け）。２００ｒｐｍ、３７℃で、シェーカー上で８時間にわたり培養。各場合、バッフル（baffle）が設けられた２１ｌ（２１リットル）のＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコを使用し、そして、２５０ｍｌのＬＢ媒体（＋１００μ／ｍｌ  アンピシリン（ampicillin））に、１ｍｌの前培養（preculture）を接種し、そして、シェーカー上において、１８０ｒｐｍ、３７℃で９時間培養した。２０ｌの発酵器（fermenter）において、１３．５ｌのＬＭ媒体（＋１００μｇ／ｍｌ  アンピシリン（ampicillin））に、０．５ｌの前培養（ＯＤ600nm１：１０、Ｈ2Ｏに対して測定）で接種した。〜３．５のＯＤ60nmで、１４０ｍｌの１００ｍＭ  ＩＰＴＧを付加した。３時間後、発酵器を１０℃にまで冷却し、そして、遠心分離により、発酵器のブロース（培養液）を除去した。
【００９０】
実施例８
組換えハイドロホビン融合プロテインの精製（Ｃ末端Ｈｉｓ６ｔａｇを有する、ハイドロホビン融合プロテインの精製）
１００ｇのセルペレット（１００〜５００ｍｇのハイドロホビン）を、５０ｍＭナトリウムホスフェート緩衝液（バッファー）、ｐＨ７．５で、合計体積が２００ｍｌとし、そして、懸濁させた。懸濁を、Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ  ｔｙｐｅ  Ｔ２５（Ｊａｎｋｅ  ａｎｄ  Ｋｕｎｋｅｌ；ＩＫＡ−Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ）で１０分間処理し、そして、次に、核酸を分解(degrade)するために、５００単位のベンゾナーゼ（benzonase）（Ｍｅｒｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ；ｏｒｄｅｒ  Ｎｏ．１．０１６９７．０００１）で、室温で１時間培養した。セル破壊の前に、ガラスカートリッジ（Ｐ１）を使用して、濾過を行った。セルの破壊と残っているゲノムＤＮＡのせん断を目的として、１５００バールでホモナイザー器（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ  Ｍ−１１０ＥＨ；Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．）を２回作動させた。ホモジェネートを遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ−５Ｂ，ＧＳＡ  Ｒｏｔｏｒ、２５０ｍｌ遠心ブレーカー、６０分、４℃、１２０００ｒｐｍ、２３０００ｇ）し、上澄液（supernatant）を氷上に置き、そして、ペレットを１００ｍｌのナトリウムホスフェート緩衝液、ｐＨ７．５中に懸濁させた。遠心分離と懸濁を３回繰り返し、ここで、ナトリウムホスフェート環緩衝液は、３回目の繰り返し時に、１％ＳＤＳを含んでいた。再懸濁の後、この溶液を１時間攪拌させ、次に最終的な遠心分離を行った（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ−５Ｂ，ＧＳＡ  Ｒｏｔｏｒ，２５０ｍｌ遠心分離ブレーカー、６０分、４℃、１２０００ｒｐｍ、２３０００ｇ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に従い、ハイドロホビンは、最終的な遠心分離の後、上澄液中に存在した（図１）。実験から、ハイドロホビンは、おそらく、対応するＥ．ｃｏｉｌ中に、封入体（inclusion body）の状態で存在していると考えられる。５０ｍｌのハイドロホビン含有上澄液を、５０ｍｌのｎｉｃｋｅｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  １７−５２６８−０２カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に導入し、これを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液、ｐＨ８．０と平衡させた。カラムを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液、ｐＨ８．０で洗浄し、そして次に、ハイドロホビンを、２００ｍＭのイミダゾールを含む、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液、ｐＨ８．０で溶出（elute）した。イミダゾールを除去するために、この溶液を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液、ｐＨ８．０に対して透析した。
【００９１】
図１は、このように製造されたハイドロホビンＨＰ１の精製を示している。
【００９２】
レーン１：  ニッケル−セファロース（nickel−Sepharose）カラム（１：１０希釈）に供給した溶液
レーン２：  流通＝洗浄工程の溶出
レーン３〜５：  溶出（elution）部分のＯＤ２８０ピーク
図１に示したハイドロホビンは、分子量が約５３ｋＤである。小さなバンドが、ハイドロホビンの分解生成物（減生生成物）を、部分的に示している。
【００９３】
実施例９
技術試験；ガラス上での水滴の接触角度を変化させることによるハイドロホビンの特徴付
基体(substrate)
ガラス（ウィンドウガラス、南ドイツガラス、マンハイム、ドイツ）：
ハイドロホビン濃度：１００μｇ／ｍＬ
５０ｍＭナトリウムアセテート（ｐＨ４）＋０．１％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノロレート（sorbitan monolaurate）（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）中で、一晩（温度８０℃）、ガラス板について培養、
次に、被覆、蒸留水での洗浄、
次に、培養：１０分／８０℃／１質量％の水性ナトリウム−ドデシルスルフェート（ＳＤＳ）溶液（蒸留水中）、
蒸留水での洗浄。
【００９４】
試料は、空気乾燥（室温）されて、そして室温で、５μｌの水滴の接触角（度）の測定に付された。
【００９５】
接触角度の測定は、Ｄａｔａｐｈｙｓｉｃｓ  Ｃｏｎｔａｃｔ  Ａｎｇｌｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＯＣＡ１５＋，Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＳＣＡ２０．２．０．（２００２年１１月）で行った。測定は、製造者の指導に従い行われた。
【００９６】
未処理のガラスは、接触角度が３０±５°であり；実施例８の機能性(官能性：functional)ハイドロホビン（ｙａａｄ−ｄｅｗＡ−ｈｉｓ6）での被覆では、接触角度が６７±５°であった。
【００９７】
実施例１０及び１１
ｐＱＥ６０＋ＹａａＤ＋Ｘａ＋ｄｅｗＡ＋ＨＩＳ６を使用してのＥＰＳビーズの被覆
被覆剤：
実施例８（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５、ハイドロホビンの濃度：６．０８ｇ／ｌ）に従い予備処理されたハイドロホビンｐＱＥ６０＋ＹａａＤ＋Ｘａ＋ｄｅｗＡ＋ＨＩＳ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）の水溶液。
【００９８】
懸濁重合（Ｓｔｙｒｏｐｏｒ（登録商標）Ｆ３１５／Ｎ）を使用して製造された、ビーズ径が０．７〜１．０ｍｍの範囲の、被覆されていない、膨張可能なポリスチレン（ＥＰＳ）ビーズを乾燥させ、そして以下のように被覆した：
スクリューカップを使用して、５０ｇのＥＰＳビーズを５００ｍｌのグラスに計量導入し、それぞれ、１０ｍｌ及び２０ｍｌのハイドロホビン溶液と混合し、そして、室温で２４時間、ローラーミキサー上で攪拌した。次に、ハイドロホビンで被覆されたＥＰＳビードをフィルターペーパー上に置き、そして、室温で５時間乾燥させた。
【００９９】
比較試験Ｖ１
ハイドロホビン溶液の代わりに、１０ｍｌの蒸留水を使用した点が異なること以外は、実施例１０を繰り返した。
【０１００】
実施例１０及び１１及び、比較試験の被覆ＥＳＰを、それぞれ、予備膨張器（Ｒａｕｓｃｈｅｒ）内で、１００℃で、２分間、予備発泡させ、これにより、ポリスチレンフォームビーズを得、そして、３日間の保管の後、融合（溶接）して成形物とした。この成形物（molding）は、２日間の保管の後、半分に割って、融合の品質を評価した。
【０１０１】
予備発泡(prefoam)され、そして乾燥されたポリスチレンフォームビードの表面抵抗(surface resistance)を測定して、静電防止特性（帯電防止特性）を評価した。
【０１０２】
【表１】
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【０１０３】
配列ネームのＤＮＡへの割当及び配列リスト中のポリペプチド配列
【０１０４】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】ハイドロホビンＨＰ１の精製を示した図である。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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