(57)【要約】  ADHD患者がモノアミンオキシダーゼB型(MAO-B)阻害剤での治療に適するかどうかを決定する方法、およびADHDの治療用薬剤におけるMAO-B阻害剤の使用。ADHD患者でのMAO-B活性の決定に有用な核酸プローブおよびプライマーの配列。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ADHD患者がモノアミンオキシダーゼB型(MAO-B)阻害剤での治療に適するかどうかを決定する方法であって、
(a)ADHD患者におけるMAO-B活性のレベルをex vivoで決定するステップと、
(b)MAO-Bの前記活性が、正常集団内でのMAO-B活性の全域の30%低い百分位数の中にある場合、ADHDの不注意優勢型の症状について(DSM IVに従って)前記患者を試験するステップと、
(c)MAO-Bの前記活性が、正常集団内でのMAO-B活性の全域の30%低い百分位数の中にあり、前記患者の試験でADHDの不注意優勢型の症状があった場合、前記患者がMAO-B阻害剤での治療に適すると結論を下すステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
ADHD患者がMAO-B阻害剤での治療に適するかどうかを決定する方法であって、
(a)DSM IVに従ってADHDの不注意優勢型と診断された患者を選択するステップと、
(b)MAO-Bの活性についてステップ(a)に従って選択された患者をex vivoで試験するステップと、
(c)MAO-Bレベルが正常集団内でのMAO-B活性の全域の30%低い百分位数の中にある患者にMAO-B阻害剤での治療を受けさせるステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
正常集団内でのMAO-B活性の全域の30%低い百分位数が、30nmol/ml/時間/血小板数×10-6以下、または8nmol/分/血小板数1010以下、または3MAO-B単位/血小板数108以下と定義されることを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
血液、血小板、脳生検、脳脊髄液(CSF)、リンパ球、または肝試料中でMAO-B活性を決定するステップを含むことを特徴とする請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
放射測定、ガスクロマトグラフィー、質量分析または遺伝学的試験によりMAO-B活性を決定するステップを含むことを特徴とする請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
遺伝学的試験が、可変数タンデム反復配列(VNTR)および/または一塩基多型(SNP)検出用の1つまたは複数のプローブまたはプライマーの使用を含むことを特徴とする請求項5に記載の方法。
【請求項７】
GCTGCCAAGAAGAAGGTG、TGGATGGATGAA、ACCATCATC、CACACACATG、ATTTATTAACT、TGTATCAGCCATTTCCAAC、TTTTACAAAGTAATATTTG、ATTTGTTTTACAAATTTTTACAAAGTA、ATAGATAT、TTCAAAGCAAATGTTGAG、TGTTTATGAAACAAA、GATTTCATTCATAAGATACACおよびCTTGCTCAGTTACAAGAから選択される1つまたは複数のVNTRの検出を含むことを特徴とする請求項6に記載の方法。
【請求項８】
遺伝学的試験が、
(a)MAO-Bイントロン13におけるG対立遺伝子の存在を決定するステップ、
(b)AP-2β遺伝子での遺伝子型を評価するステップ、または
(c)c-Jun、Egr-1およびSp1遺伝子での遺伝子型またはその発現レベルを評価するステップ
を含むことを特徴とする請求項5または6に記載の方法。
【請求項９】
MAO-B阻害剤で患者を治療するステップをさらに含むことを特徴とする請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
MAO-B阻害剤での治療に適する患者を治療するための薬剤の製造におけるMAO-B阻害剤の使用であって、そのような治療に対する患者の適合性が、
(a)ADHD患者におけるMAO-B活性のレベルをex vivoで決定するステップと、
(b)MAO-Bの前記活性が、正常集団内でのMAO-B活性の全域の30%低い百分位数の中にある場合、ADHDの不注意優勢型の症状について(DSM IVに従って)前記患者を試験するステップと、
(c)MAO-Bの前記活性が、正常集団内でのMAO-B活性の全域の30%低い百分位数の中にあり、前記患者の試験でADHDの不注意優勢型の症状があった場合、前記患者がモノアミンオキシダーゼB型阻害剤での治療に適すると結論を下すステップと
によって決定されることを特徴とする使用。
【請求項１１】
MAO-B阻害剤が、セレギリン、ラサギリン、サフィンアミド、モフェギリンおよびラザベミド、SL-25.118、ミラセミド、LU-53439、SL-34.0026、EXP-631、M-2-PP、SL-25.1131、FA-87、RS-1636、NW-1048、ヒマンタン、興奮性アミノ酸、FA-73、ラドスチギル、CHF-3381、セレギリン類似体、ベフロキサトン、AIT-203およびAIT-297から選択されることを特徴とする請求項9に記載の方法または請求項10に記載の使用。
【請求項１２】
ADHDの患者を治療するための薬剤の製造におけるMAO-B阻害剤の使用であって、MAO-B阻害剤がセレギリン、パルギリンまたはラサギリン以外であることを特徴とする使用。
【請求項１３】
患者がADHDの不注意優勢型のサブタイプであり、かつ/または低MAO-B活性を有することを特徴とする請求項12に記載の使用。
【請求項１４】
MAO-B阻害剤が、SL-25.118、ラザベミド、サフィンアミド、モフェギリン、ミラセミド、LU-53439、SL-34.0026、EXP-631、M-2-PP、SL-25.1131、FA-87、RS-1636、NW-1048、ヒマンタン、興奮性アミノ酸、FA-73、ラドスチギル、CHF-3381、セレギリン類似体、ベフロキサトン、AIT-203およびAIT-297から選択されることを特徴とする請求項12または13に記載の使用。
【請求項１５】
薬剤が、口内、舌、舌下、鼻内または吸入投与用に製剤され、あるいは貼付製剤中にあることを特徴とする請求項10から14のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
MAO-B阻害剤が選択的阻害剤であることを特徴とする請求項9に記載の方法または請求項10から15のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
ADHD患者におけるMAO-B活性を予測する遺伝子型を評価する核酸プローブまたはプライマーを作製するためのVNTR配列モチーフの隣接配列の使用であって、VNTRモチーフが、GCTGCCAAGAAGAAGGTG、TGGATGGATGAA、ACCATCATC、CACACACATG、ATTTATTAACT、TGTATCAGCCATTTCCAAC、TTTTACAAAGTAATATTTG、ATTTGTTTTACAAATTTTTACAAAGTA、ATAGATAT、TTCAAAGCAAATGTTGAG、TGTTTATGAAACAAA、GATTTCATTCATAAGATACACおよびCTTGCTCAGTTACAAGAから選択され、隣接配列が、そのモチーフの上流または下流にある1〜250塩基の配列であることを特徴とする使用。
【請求項１８】
VNTRモチーフを検出するための核酸プローブまたはプライマーであって、
(a)VNTRモチーフの隣接配列の断片、または
(b)(a)と相補的な核酸配列
を含み、VNTRモチーフが、GCTGCCAAGAAGAAGGTG、TGGATGGATGAA、ACCATCATC、CACACACATG、ATTTATTAACT、TGTATCAGCCATTTCCAAC、TTTTACAAAGTAATATTTG、ATTTGTTTTACAAATTTTTACAAAGTA、ATAGATAT、TTCAAAGCAAATGTTGAG、TGTTTATGAAACAAA、GATTTCATTCATAAGATACACおよびCTTGCTCAGTTACAAGAから選択され、隣接配列が、そのモチーフの上流または下流にある1〜250塩基の配列であることを特徴とする核酸プローブまたはプライマー。
【請求項１９】
医薬品で使用するためのものであることを特徴とする、請求項17に従って作製される、または請求項18に記載のプローブまたはプライマー。
【請求項２０】
ADHD患者由来の試料におけるMAO-B活性を予測する遺伝子型をin vitroで決定するためのものであることを特徴とする、請求項17に従って作製される、または請求項18に記載のプローブまたはプライマーの使用。
【請求項２１】
請求項17に従って作製される、または請求項18に記載のプローブまたはプライマーを含むことを特徴とする、対象におけるADHDの診断および/または治療で使用するキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、注意欠陥多動性障害(ADHD)患者におけるモノアミンオキシダーゼB型酵素のレベルの意義について検討するものであり、ADHD患者の特定の部分集団の、モノアミンオキシダーゼB型阻害剤での治療に対する適合性を決定する方法を提示するものである。
【背景技術】
【０００２】
注意欠陥多動性障害
注意欠陥多動性障害(ADHD)は、最も一般的な小児期発症性行動障害であり、小児および青年の約5%が罹患している。小児は最終的にADHDから脱却すると以前は考えられていたが、後から考えて小児期の状態を診断する条件を満たしていた成人をADHDであると診断できることが現在認識されている。
【０００３】
その状態は高度に不均質であることが知られ、このことから、「Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders(DSM)IV」で詳細に説明されるように最近調整がなされた。DSM IVに従って、ADHDは、3つのサブタイプ:1)不注意型、2)多動性-衝動性型、および3)不注意と多動性-衝動性の混合型に分類することができ(Laheyら、Am.J.Psychiatry、1994年、151:1673頁)、後者は、前二者より2倍多く認められる(25%:25%:50%)(LeungおよびLemay、Adv.Ther.、2003年、20(6):305頁;Biedermanら、Am.J.Psychiatry、2002年、159:36頁;de Quirosら、J.Dev.Behav.Pediatr.、1994年、5:311頁)。
【０００４】
DSM IVによれば、3つのADHDサブタイプの診断で下記の診断基準を使用する:
(1)または(2):
(1)不注意を示す下記の症状のうち6個(またはそれ以上)が、不適応であり、発達レベルに合わない程度で少なくとも6カ月間持続している:
(a)学業、仕事、または他の活動において詳細に注意を払うことができず、不注意な誤りを起こすことが多い;
(b)課題または遊びの活動において注意の持続が困難であることが多い;
(c)直接話しかけられたときに聞いていないように見えることが多い;
(d)指示に最後まで従わず、学業、雑用、または職場での業務を終えることができないことが多い(反抗的な行動をとり、または指示を理解できないことに起因するものではない);
(e)課題および活動をまとめることが困難であることが多い;
(f)(学業や宿題などの)持続的な精神的努力を必要とする課題に従事することを避け、嫌い、またはそれに気が進まないことが多い;
(g)課題または活動に必要な物(例えば、おもちゃ、宿題、鉛筆、本、または道具)を失くすことが多い;
(h)外部からの刺激によって容易に気が散ることが多い;
(i)日常的活動を忘れがちであることが多い。
(2)多動性-衝動性を示す下記の症状のうち6個(またはそれ以上)が、不適応であり、発達レベルに合わない程度で少なくとも6カ月間持続している:
多動性
(a)手または足を動かしてそわそわし、あるいは座席でもじもじすることが多い;
(b)教室で、または座ったままでいることが要求される他の状況で席を離れることが多い;
(c)不適当な状況で過度に走り回りまたはよじ登ることが多い(青年または成人では、落ち着かないという主観的な感情に限定されることがある);
(d)静かに遊びまたは余暇活動を行うことが困難であることが多い;
(e)「動き回る」ことが多く、または「発動機で動く」ように活動することが多い;
(f)しゃべりすぎることが多い。
衝動性
(g)質問が終わる前に出し抜けに答えを口走ることが多い;
(h)順番を待つことが困難であることが多い;
(i)他に割り込みまたは他を邪魔する(例えば、会話またはゲームに入り込む)ことが多い;
ADHDの不注意優勢型:過去6カ月間で診断基準(1)を満たすが、診断基準(2)を満たさない場合。
ADHDの多動性-衝動性優勢型:過去6カ月間で診断基準(2)を満たすが、診断基準(1)を満たさない場合。
ADHDの混合型:過去6カ月間で診断基準(1)と(2)をどちらも満たす場合。
【０００５】
不注意優勢型のサブタイプの小児は、かなり大きな学習困難性があることが多く(American Academy of Pediatrics、Pediatrics、2000年、105(5):1158頁;AugustおよびGarfinkel、J.Am.Acad.Child Adolesc.Psychiatry、1989年、5:739頁)、その結果、深刻な学校での不成績が生じる。さらに、このサブタイプの患者は、現在利用可能な治療法で治療されないことが多い(Weissら、J.Attent.Disord.、2003年、7(1):1頁)。
【０００６】
具体的な疾患の機構はまだ解明されていないが、ADHDが家族内で集まって生じることが示されており、重要な遺伝成分が疾患の根底にあることが予想される(総説については、Biederman、1998年、J.Clin.Psychiatry、59(7):4頁を参照されたい)。候補遺伝子を使用した遺伝的関係の研究から、ドーパミン受容体および輸送体の遺伝子の関与が考えられることが示された(ZametkinおよびLiotta、J.Clin.Psychiatry、1998年、59(7):17頁;Huntら、Schiz.Bulletin、1982年、8:236頁;FaraoneおよびBiederman、J Atten Disord.、2002年;6(1):S7頁)。
【０００７】
Shekimら(Biolog.Psych.、18(6):707〜714頁(1983))は、学習障害におけるカテコールアミンのノルアドレナリンおよび/またはドーパミンの代謝の重要性について論じ、罹患した患者がこれらの生体アミンの代謝に障害を有する可能性があることを示唆している。この研究および他の研究を考慮して、ADHDのファーストライン治療は、現在メチルフェニデートやD-アンフェタミンなどの精神刺激薬となっている。1998年に利用可能なデータによれば(J.Clin.Psychiatry、59:7、31〜41頁(1998))、北米の学齢小児全体の2%〜2.5%が多動性について何らかの薬理学的介入を受け、90%を超える者が精神刺激薬のメチルフェニデートで治療されている。さらに、The Chronicle Online 2002(www.chronicle.duke.edu/vnews/display.v?TARGET=printable-&article id=3d817873efdfc)の記事において、Jodi Sarowitzによれば、メチルフェニデートの米国での処方数は1年当たり約1100万であり、アンフェタミンの処方はさらに600万である。
【０００８】
Zametkinら(Amer.J.Psychiat.(1984)141:9、1055〜1058頁)は、ADHDの小児にアンフェタミンを投与すると、尿中フェニルエチルアミン(PEA)の排泄が1600%増加することを示した。PEAは、モノアミンであり、ヒト脳から単離することができ、アンフェタミンとほぼ同一の化学構造を有する。
【０００９】
しかし、アンフェタミンおよびメタンフェタミンに基づく薬物は、中毒、睡眠の問題および食欲不振の可能性を含めたいくつかの重篤な副作用を起こす可能性がある。
【００１０】
モノアミンオキシダーゼA型(MAO-A)、ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼやカテコール-O-メチルトランスフェラーゼなどモノアミンの神経伝達の制御に関与する他の酵素も、疾患の病因に役割を果たす。
【００１１】
分子遺伝学的薬理学的研究から、ADHDにおけるドーパミンおよびノルアドレナリン作動性の神経伝達物質の系の関与が示唆される。Wenderら(Psychiatry Res.(1983)9:329〜336頁)は、注意欠陥障害(ADD)/ADHDが、ドーパミン作動系またはフェニルエチルアミン作動系の活動低下によって起こり、この活動低下がB型モノアミンオキシダーゼによるドーパミンまたはPEAの合成速度の低下または分解速度の上昇によって起こる可能性があることを示唆した。モノアミンオキシダーゼ(MAO)AおよびB遺伝子は、ドーパミン作動系およびノルアドレナリン作動系の神経伝達物質の代謝に関与する酵素をコードする。
【００１２】
PEAの分解を低下させその合成を増大させる手段として、特定のモノアミンオキシダーゼ阻害剤(MAOI)、具体的にはセレギリンおよびパルギリンの投与の効果を決定し、ADHDの症状に対するこの効果を決定する研究が行われている。
【００１３】
これに加えて、セレギリン(選択的MAO-B阻害剤)が1-アンフェタミンおよび1-メタンフェタミン刺激化合物に代謝され、したがって、ADHDの治療に有益であることがAkhondzadehらによって最近示された(Progress in Neuro-Psychopharmacol.& Biol.Psych.、27:841〜845頁(2003))。
【００１４】
WO97/17067は、ADHDを含めたいくつかの疾患および状態に対するセレギリンの治療上の適用に関するものである。
【００１５】
Shekimら(Am.J.Psychiatry、(1982)139:936〜938頁)は、低レベルのMAO-B酵素が精神病理に対する全身の脆弱性を反映するものであることを示唆し、MAO-AおよびMAO-Bのレベルと、ADHDを含めた様々な精神障害および人格特性との関係について調べた様々な研究が存在する。
【００１６】
モノアミンオキシダーゼB型(MAO-B)酵素
MAO-Bは、神経伝達物質のドーパミンならびに生体微量アミンのPEAを代謝する役割を果たす酵素である。ドーパミンは、いくつかの中枢神経系(CNS)の機能で重要であることでよく知られ、パーキンソン病、統合失調症、中毒および抑うつを含めたCNSのいくつかの疾患に関係している。PEAに対してなされた臨床研究は限られた量しか存在しないが、それは神経伝達物質の放出に役割を果たすと考えられ、中枢神経系の中に広く存在する。MAO-Bは主にミトコンドリア上に位置し、脳ならびに末梢臓器および血液の血小板中に認めることができる。MAO-Aアイソザイムは線維芽細胞および肝の中で主要な型であり、ノルアドレナリン、アドレナリンおよびセロトニンを主に分解するが、ドーパミンを代謝することもできる。
【００１７】
MAO-B活性の調節
MAO-B活性は、遺伝的調節下にあることが知られ(Weinshilboum、「Neurogenetics: Genetic Approaches to the Nervous System」、Breakefield編、Elsevier、1979年、257頁;Riceら、Am.J.Hum.Genet.、1984年、36:36頁)、加齢とともにわずかに上昇し、喫煙を含めた薬物によって影響を受ける可能性がある。一般に、血小板のMAO-B活性は、時間が経つにつれて安定となるように思われる。
【００１８】
MAO-B、ドーパミンおよびADHD
MAO-Bは、ヒト脳において、前頭皮質、側頭皮質、尾状核や被殻など強いドーパミン作動性の神経支配を受けることが知られている構造で広く発現している(Jossanら、Brain Res.、1991年、547:69頁;Sauraら、J.Neurosci.、1992年、12:1977頁)。ノルアドレナリン作動性の神経伝達に障害がある可能性に加えて、ドーパミン作動性の神経伝達の欠陥もADHDの病状の一部の根底にある可能性があるという仮説が広くとられている。
【００１９】
ADHDの神経化学的基礎
いくつかの報告が生化学的特徴と特定の患者の表現型または疾患のサブタイプとのつながりを強調していることは非常に興味深い。Shekimらによって発表された研究(Shekimら、Psychiatry Res.、1986年、18:179頁)は、血小板MAO-Bの低下と、多動性および不注意を測定する試験でのADHDの小児の成績の低下との相関を強調するものである。この研究では、多動性の小児および正常の小児の試料中での血小板MAO活性を試験した。多動性の小児が正常の小児より有意に低いMAO活性を有する結果が示された。
【００２０】
Shekimの試験の結果と対照的に、Stoffら(J.Am.Acad.Child Psychiatry(1989)28(5):754〜760頁)は、衝動性を必要とする実験的課題に対する成績が低い少年でMAO活性が上昇することを示唆するものであった。その著者らは、血小板MAOと衝動性との正の関係の知見が、MAOIで治療した多動性の小児における臨床的改善のいくつかの他の報告(例えば、Zametkinら、上記)と一致することを示唆した。
【００２１】
Jiangら(Am.J.Med.Gen.(Neuropsychiatric Genetics)(2001)105:783〜788頁)は、MAO遺伝子がADHDの感受性因子である可能性があることを提唱し、ADHDとMAO遺伝子との連鎖を調べることによりこの仮説について試験した。その結果、MAO-A遺伝子がADHDの感受性因子である可能性があることが示唆された。
【００２２】
ADHDの有効かつ安全な治療が必要であり、ADHDでない場合でMAO-AおよびBのアイソザイムが果たす役割について歴史的にいくらかの関心があったが、これらの酵素とADHDとの正確な関係が不明であることが上記から明らかである。さらに、限られた数の選択的MAO-B阻害剤(セレギリンおよびパルギリン)がADHDの治療で使用されているが、これらの化合物を使用する唯一の論理的根拠は、それらがアンフェタミン/メタンフェタミンに代謝されることにあり、それがADHDの第一線の治療を現在もたらしている。
【特許文献１】WO97/17067
【特許文献２】WO-09626720
【特許文献３】WO-09426218
【特許文献４】米国特許第05484608号
【特許文献５】EP-00436492
【特許文献６】DE-03530046
【特許文献７】DE-03010599
【特許文献８】WO-2004026825
【特許文献９】WO-2004026826
【特許文献１０】WO-2004026827
【特許文献１１】WO-2004014856
【特許文献１２】WO-2004007429
【特許文献１３】WO-03099763
【特許文献１４】WO-03091219
【特許文献１５】WO-03075906
【特許文献１６】WO-03072055
【特許文献１７】WO-03066596
【特許文献１８】WO-03039525
【特許文献１９】WO-02083656
【特許文献２０】WO-02068376
【特許文献２１】WO-00219964
【特許文献２２】WO-00215841
【特許文献２３】米国特許第06350876号
【特許文献２４】WO-00136407
【特許文献２５】WO-00134172
【特許文献２６】WO-00126656
【特許文献２７】WO-00112176
【特許文献２８】WO-00107033
【特許文献２９】WO-00071109
【特許文献３０】WO-09957119
【特許文献３１】WO-09936513
【特許文献３２】WO-09903458
【特許文献３３】米国特許第05840979号
【特許文献３４】EP-00878191
【特許文献３５】WO-09822110
【特許文献３６】WO-09733572
【特許文献３７】米国特許第05668154号
【特許文献３８】WO-09717346
【特許文献３９】WO-09637199
【特許文献４０】WO-09635425
【特許文献４１】WO-09624349
【特許文献４２】WO-09619981
【特許文献４３】WO-09612472
【特許文献４４】EP-00699680
【特許文献４５】EP-00670313
【特許文献４６】WO-09519960
【特許文献４７】EP-00655445
【特許文献４８】WO-09511016
【特許文献４９】WO-09508325
【特許文献５０】米国特許第05380755号
【特許文献５１】WO-09324120
【特許文献５２】WO-09312275
【特許文献５３】EP-00538134
【特許文献５４】EP-00529994
【特許文献５５】EP-00529995
【特許文献５６】WO-09221333
【特許文献５７】EP-00504574
【特許文献５８】WO-09215551
【特許文献５９】WO-09108201
【特許文献６０】米国特許第04971995号
【特許文献６１】EP-00385210
【特許文献６２】EP-00382533
【特許文献６３】米国特許第6,715,485号
【特許文献６４】WO-00/05409
【非特許文献１】「Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders(DSM)IV」
【非特許文献２】Laheyら、Am.J.Psychiatry、1994年、151:1673頁
【非特許文献３】LeungおよびLemay、Adv.Ther.、2003年、20(6):305頁
【非特許文献４】Biedermanら、Am.J.Psychiatry、2002年、159:36頁
【非特許文献５】de Quirosら、J.Dev.Behav.Pediatr.、1994年、5:311頁
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明は、患者の低MAO-B活性が、ADHDについての、より具体的にはADHDの不注意優勢型のサブタイプについてのリスクファクターである最初の証拠を提供するものである。したがって、本発明は、ADHDの患者がモノアミンオキシダーゼB阻害剤での治療に感受性であるかどうかを決定する方法に関し、それによって、MAO-B阻害剤での治療を介して得られた症状の改善が、アンフェタミン/メタンフェタミンへの代謝に対する作用ではなくMAO-B酵素に対する作用に起因すると考えられる。
【００２４】
選択的なMAO-B阻害剤がそのような患者の治療に適すると決定した後、本発明はまた、そのような患者でのADHDの治療についてこれまで知られていないMAO-B阻害剤の使用をも提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
したがって、本発明は、ADHD患者がモノアミンオキシダーゼB型(MAO-B)阻害剤での治療に適するかどうかを決定する方法を提供し、その方法は、
(a)ADHD患者におけるMAO-B活性のレベルをex vivoで決定するステップと、
(b)MAO-Bの前記活性が、正常集団内でのMAO-B活性の全域の30%低い百分位数の中にある場合、ADHDの不注意優勢型の症状について(DSM IVに従って)前記患者を試験するステップと、
(c)MAO-Bの前記活性が、正常集団内でのMAO-B活性の全域の30%低い百分位数の中にあり、前記患者の試験でADHDの不注意優勢型の症状があった場合、前記患者がMAO-B阻害剤での治療に適すると結論を下すステップと
を含む。
【００２６】
本発明はさらに、
ADHD患者がMAO-B阻害剤での治療に適するかどうかを決定する方法であって、
(a)DSM IVに従ってADHDの不注意優勢型と診断された患者を選択するステップと、
(b)MAO-Bの活性についてステップ(a)に従って選択された患者をex vivoで試験するステップと、
(c)MAO-Bレベルが正常集団内でのMAO-B活性の全域の30%低い百分位数の中にある患者にMAO-B阻害剤での治療を受けさせるステップと
を含む方法;
MAO-B阻害剤での治療に適する患者を治療するための薬剤の製造におけるMAO-B阻害剤の使用であって、そのような治療に対する患者の適合性が、
(a)ADHD患者におけるMAO-B活性のレベルをex vivoで決定するステップと、
(b)MAO-Bの前記活性が、正常集団内でのMAO-B活性の全域の30%低い百分位数の中にある場合、ADHDの不注意優勢型の症状について(DSM IVに従って)前記患者を試験するステップと、
(c)MAO-Bの前記活性が、正常集団内でのMAO-B活性の全域の30%低い百分位数の中にあり、前記患者の試験でADHDの不注意優勢型の症状があった場合、前記患者がモノアミンオキシダーゼB型阻害剤での治療に適すると結論を下すステップと
によって決定される使用;
ADHDの患者を治療するための薬剤の製造におけるMAO-B阻害剤の使用であって、MAO-B阻害剤がセレギリン、パルギリンまたはラサギリン以外である使用;
ADHD患者におけるMAO-B活性を予測する遺伝子型を評価する核酸プローブまたはプライマーを作製するためのVNTR配列モチーフの隣接配列の使用であって、VNTRモチーフが、GCTGCCAAGAAGAAGGTG、TGGATGGATGAA、ACCATCATC、CACACACATG、ATTTATTAACT、TGTATCAGCCATTTCCAAC、TTTTACAAAGTAATATTTG、ATTTGTTTTACAAATTTTTACAAAGTA、ATAGATAT、TTCAAAGCAAATGTTGAG、TGTTTATGAAACAAA、GATTTCATTCATAAGATACACおよびCTTGCTCAGTTACAAGAから選択され、隣接配列が、そのモチーフの上流または下流にある1〜250塩基の配列である使用;
VNTRモチーフを検出するための核酸プローブまたはプライマーであって、
(a)VNTRモチーフの隣接配列の断片、または
(b)(a)と相補的な核酸配列
を含み、VNTRモチーフが、GCTGCCAAGAAGAAGGTG、TGGATGGATGAA、ACCATCATC、CACACACATG、ATTTATTAACT、TGTATCAGCCATTTCCAAC、TTTTACAAAGTAATATTTG、ATTTGTTTTACAAATTTTTACAAAGTA、ATAGATAT、TTCAAAGCAAATGTTGAG、TGTTTATGAAACAAA、GATTTCATTCATAAGATACACおよびCTTGCTCAGTTACAAGAから選択され、隣接配列が、そのモチーフの上流または下流にある1〜250塩基の配列である核酸プローブまたはプライマー;
医薬品で使用する本発明のプローブまたはプライマー;
ADHD患者由来の試料におけるMAO-B活性を予測する遺伝子型をin vitroで決定する本発明のプローブまたはプライマーの使用;
本発明のプローブまたはプライマーを含む、対象におけるADHDの診断および/または治療で使用するキット
を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
その第1の態様では、本発明は、ADHD患者がモノアミンオキシダーゼB型(MAO-B)阻害剤での治療に適するかどうかを決定する方法を提供し、その方法は、
a)ADHD患者におけるMAO-B活性のレベルを決定するステップと、
b)MAO-Bの前記活性が、正常集団内でのMAO-B活性の全域の30%低い百分位数の中にある場合、ADHDの不注意優勢型の症状について(DSM IVに従って)前記患者を試験するステップと、
c)MAO-Bの前記活性が、正常集団内でのMAO-B活性の全域の30%低い百分位数の中にあり、前記患者の試験でADHDの不注意優勢型の症状があった場合、前記患者がMAO-B阻害剤での治療に適すると結論を下すステップと
を含む。
【００２８】
本発明のこの態様の診断方法は、MAO-B阻害剤で患者を治療する方法によって補足することができる。
【００２９】
あるいは、本発明は、MAO-B阻害剤での治療に適する患者を治療するための薬剤の製造におけるMAO-B阻害剤の使用を提供し、そのような治療に対する患者の適合性は、
a)ADHD患者におけるMAO-B活性のレベルを決定するステップと、
b)MAO-Bの前記活性が、正常集団内でのMAO-B活性の全域の30%低い百分位数の中にある場合、ADHDの不注意優勢型の症状について(DSM IVに従って)前記患者を試験するステップと、
c)MAO-Bの前記活性が、正常集団内でのMAO-B活性の全域の30%低い百分位数の中にあり、前記患者の試験でADHDの不注意優勢型の症状があった場合、前記患者がモノアミンオキシダーゼB型阻害剤での治療に適すると結論を下すステップと
によって決定される。
【００３０】
その第2の態様では、本発明は、ADHD患者がMAO-B阻害剤での治療に適するかどうかを決定する方法を提供し、その方法は、
a)DSM IVに従ってADHDの不注意優勢型と診断された患者を選択するステップと、
b)MAO-Bの活性についてステップ(a)に従って選択された患者を試験するステップと、
c)MAO-Bレベルが正常集団内でのMAO-B活性の全域の30%低い百分位数の中にある患者にMAO-B阻害剤での治療を受けさせるステップと
を含む。
【００３１】
本発明のこの態様の診断方法は、MAO-B阻害剤で患者を治療する方法によって補足することができる。
【００３２】
第3の態様では、本発明は、ADHDの患者を治療するための薬剤の製造におけるMAO-B阻害剤の使用を提供し、MAO-B阻害剤は、セレギリン、パルギリンまたはラサギリン以外である。
【００３３】
生物学的作用(例えば、タンパク質の活性)と、いくつかの中枢神経系の障害との間に新規な関係があるかどうかについてヒトの公的ドメインデータをスクリーニングすることにより、意外にも、低MAO-B活性がADHDのリスクファクターとなる可能性があることが明らかとなった。表1に、得られたデータを列挙する。ADHDでない10名のうち約1名のMAO-B活性が低いが、その結果は、ADHD患者ではるかに大きく優勢である。
【００３４】
【表１】
2008510480.tif 000002
【００３５】
したがって、低MAO-B活性、すなわち正常集団内でのMAO-B活性の全域の30%低い百分位数の中にある活性は、それが対照群より患者集団でより頻繁に現れるので、その疾患について考えられる生物学的リスクファクターとなる可能性がある。(同様に、アルツハイマー病の既知のリスクファクターであるAPOE-ε4対立遺伝子は、一般集団の13%で、患者の35%で現れる(Farrerら、JAMA、1997年、278:1349頁))。
【００３６】
したがって、低MAO-B活性を有する個人が、ADHDを発症する機会がより高い可能性があることが示唆される。しかし、多数の精神医学的状態と同様に、ADHDは、いくつかのリスクファクターによって起こる可能性が最も高く、低MAO-B活性はそのうちの1つである可能性がある。ADHDの他のリスクファクターが示唆されているが、確認されているものはない。これらには、ドーパミン受容体遺伝子、ドーパミン輸送体ならびにMAO-A酵素がある。
【００３７】
Shekimらによる生化学的研究に基づいて(Shekimら、Psychiatry Res.、1986年、18:179頁およびShekimら、Am.J.Psychiatry、1982年、139:485頁)、本発明者らは、異なる生化学的特徴が、異なるADHDサブタイプと関係する可能性があると考えた。
【００３８】
したがって、例えば、多動性型および混合型のサブタイプは、
低レベルのノルアドレナリン代謝物3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール(MHPG)
ノルアドレナリン作動性神経伝達の低下(MAO-Aによって媒介されると推定される)
ドーパミン代謝物ホモバニリン酸(HVA)のレベルの有意な変化なし
正常なドーパミン作動性神経伝達
を特徴とする可能性がある。
【００３９】
不注意型のサブタイプは、
低MAO-B活性、およびその結果生じる低HVAレベル
ドーパミン作動性神経伝達の低下
MHPGレベルの有意な変化なし
正常なノルアドレナリン作動性神経伝達
考えられるフェニルエチルアミン(およびその活性型代謝物であるフェニルエタノールアミン)の代謝回転の低下
を特徴とする可能性がある。
【００４０】
本発明者らは、不注意優勢型のサブタイプのADHD患者と低MAO-B活性との間に相関があると考える。不注意型のサブタイプは、より重篤な型の疾患として一般に認められ、患者の社会的機能および認識機能に大きな欠陥がある。本発明者らは、MAO-B活性の選択的な調節が、特に低MAO-B活性を有するADHD患者の有効かつ安全な治療となる可能性があると考える。
【００４１】
本明細書において、「不注意優勢型の症状」、または「ADHDの不注意優勢型」の患者とは、DSM IVで示され、上記で示した診断基準に従ってそのように診断された患者である。この分類は、多動性-衝動性優勢型または混合型の症状を有する患者を含まない。
【００４２】
本明細書において「患者」とは、小児の患者であれ、青年の患者であれ、あるいは成人の患者であれどんな年齢の患者をも包含するものとする。成人の診断は、小児期の間に患った症状を後から認めることによる可能性があるが、そのような成人は、依然としてADHDに罹患していると診断される可能性がある。
【００４３】
本発明の第1の態様の方法では、ADHDと診断された患者を試験してMAO-B活性を決定する。ADHDの診断は、患者である間いつでも行うことができ、ADHDのいずれか特定のサブタイプである必要はない。次いで、低MAO-B活性レベル、すなわち正常集団内でのMAO-B活性の全域の30%低い百分位数の中にある活性レベルを有する、ADHDと診断された任意のそのような患者を試験して、ADHDがDSM IVで示される症状に従った不注意優勢型であるかどうかを決定する。この後者の試験が陽性である場合、患者をMAO-B阻害剤で治療することができる。
【００４４】
本発明の第2の態様の方法では、ADHDと診断された患者を不注意優勢型の決定に従って選択し、次いでMAO-Bの活性について前記患者を試験する。MAO-Bの活性レベルが正常集団内でのMAO-B活性の全域の30%低い百分位数の中にある場合、前記患者にMAO-B阻害剤での治療を受けさせる。
【００４５】
本発明に従って、対象におけるMAO-B活性のレベルを例えばex vivoで決定することができる。例えば、対象から採取した試料に対して実施するものなどのin vitro試験を使用して活性を決定することができる。
【００４６】
MAO-B酵素活性の正確な大きさは、実験条件、データの読み取り、および酵素活性の決定で使用する分析に依存的である。しかし、正常集団の活性と相対的な患者の活性は、酵素活性を決定する方法に依存的ではない。
【００４７】
MAO-B活性は、下記の実施例で示す様々な方法で、血液、血小板、脳生検、脳脊髄液(CSF)、リンパ球、肝または他の組織試料中で直接測定することができる。
【００４８】
本発明の目的では、MAO-B活性の測定は、好ましくは血小板中で行う。
【００４９】
古典的に、MAO-B活性は、例えば、WurtmanおよびAxelrod(Biochem Pharmacol.(1963)12:1417〜1419頁)、Jackmanら(Clin Chim Acta.(1979)96(1〜2):15〜23頁)、Shekimら(1982年、1986年、上記、Shekimら、Psychiatry Res.(1984)11(2):99〜106頁)、Youngら(Arch Gen Psychiatry(1986)43(6):604〜609頁)、Hallmanら(Acta Psychiatr.Scand.(1987)76(3):225〜34頁)、Garpenstrandら(J Neural Transm.(2000)107(5):523〜530頁)、Whitfieldら(Psychol Med.(2000)30(2):443〜54頁)により記載のように血小板中で測定する。
【００５０】
本発明のこの態様に従って、MAO-B活性は、
(A)下記のものなどの直接的生化学試験:
1)血小板での放射測定
2)組織試料での放射測定
3)ガスクロマトグラフィー-質量分析(GC-MS)
4)分光測定
5)発光測定
6)高処理能蛍光アッセイ
7)高速液体クロマトグラフィー(HPLC)
8)ベルトロー反応
9)免疫ブロット法
10)放射標識
11)陽電子放出型断層撮影
(B)下記のものなどの間接的生化学試験:
1)GC-MSによる尿濃度
2)尿試料でのHVA濃度
3)PEAおよび関連物質の尿中濃度および血漿濃度
4)GC-MSによる血漿PEA濃度
5)GC-MSによるPEAおよび関連物質の尿中濃度
6)GCによるHVAの尿中濃度
7)GC-MSによる脳脊髄液(CSF)中のHVA、または
(C)例えば、下記で定義するG対立遺伝子など低MAO-B活性と関係する遺伝子型を有するADHD患者を選択するための測定を含む、血液および唾液を含めた任意の液体組織試料での遺伝学的試験
によって測定することができる。
【００５１】
MAO-B酵素活性を表す様々な方法を使用することができる。例えば、正常集団内でのMAO-B活性の全域の30%低い百分位数は、(Shekimら、1982年、1984年、1986年、上記による測定に従って)≦30nmol/ml/時間/血小板数×10-6、または(Garpenstrandら、上記のように)≦8nmol/分/血小板数1010、または(Youngら、上記のように)≦3MAO-B単位/血小板数108と定義することができる。
【００５２】
本発明では、MAO-Bレベルを(Shekimら、1982年、1984年、1986年、上記による測定に従って)30nmol/ml/時間/血小板数×10-6以下、または(Garpenstrandら、上記のように)8nmol/分/血小板数1010以下、または(Youngら、上記のように)3MAO-B単位/血小板数108と定義することが好ましい。
【００５３】
上記の方法のいずれかを使用してMAO-B活性を測定することができ、任意の他の方法が当技術分野から利用可能であるが、放射測定、例えば、血小板での放射測定により、またはガスクロマトグラフィー/質量分析により、または遺伝学的試験によりMAO-B活性を測定することが好ましい。
【００５４】
本発明の方法におけるMAO-B活性の評価で最も好ましい方法は、遺伝学的試験によるものである。
【００５５】
好ましい遺伝学的試験には、例えば、
可変数タンデム反復配列(VNTR)および/または一塩基多型(SNP)用の1つまたは複数のプローブ/プライマーの使用によるもの、
MAO-Bイントロン13におけるG対立遺伝子の存在によるもの、
AP-2β遺伝子での遺伝子型の評価によるもの、
c-Jun、Egr-lおよびSp1遺伝子での遺伝子型またはその発現レベルの評価によるもの、
タンパク質キナーゼCおよびMAPKのシグナル伝達経路上の遺伝子およびタンパク質の評価によるもの、ならびに/あるいは
ドーパミンおよびPEA代謝回転に関与する遺伝子またはタンパク質の評価によるもの
がある。最も好ましいそのような試験は、MAO-Bイントロン13におけるG対立遺伝子の存在の決定である。
【００５６】
MAO-B酵素活性は遺伝的調節下にあり、したがって、遺伝子型および/または遺伝子発現レベルの組合せを評価して、低MAO-B活性を有する患者を同定することができる。
【００５７】
MAO-B活性は、主として遺伝性であることが示され(Riceら、Am.J.Hum.Genet.(1984)36(1):36〜43頁、Pedersonら、1993年、Psychiatry Res.、46(3):239頁)、遺伝的に調節されていると考えられる(Weinshilboum、Neurogenetics:Genetic Approaches to the Nervous System、Breakefield編、Elsevier、1979年、257頁;Riceら、上記)。遺伝学的試験を使用して、低MAO-B活性が生じる遺伝子型および/または遺伝子発現パターンを有するADHD患者を選択することができる。MAO-B遺伝子は、染色体Xp11.3上に位置し、15個のエキソンを有し、519aaの産物をコードする。それは、MAO-A遺伝子に隣接して認められ、MAO-B遺伝子の発現は、MAO-A遺伝子と協調的に制御されている可能性がある。他の遺伝子がMAO-B遺伝子の発現および/または活性に影響を及ぼす可能性もある。
【００５８】
MAO-B遺伝子は、複数の可変数タンデム反復配列(VNTR)および一塩基多型(SNP)を有し、それらは単独でまたは組み合わせて使用し、低MAO-B活性を有するADHD部分集団および/または疾患の不注意優勢型サブタイプの同定に有用である。具体的には、MAO-Bのイントロン13における変動は、酵素の活性と相関することが示された(Garpenstrandら、J.Neural Transm.(2000)107(5):523〜530頁;Balciunieneら、2002年、Hum Genet.、110(1):1頁)。G対立遺伝子は、低MAO-B活性と関係することが明らかとなった。したがって、本試験は、G対立遺伝子を有するADHD患者をMAO-B阻害剤での治療に選択するそのような測定を含む。
【００５９】
MAO-B酵素の低活性と関係する可能性がある遺伝子型のさらなる可能性は、MAO-B酵素における変動だけでなく、おそらくMAO-A酵素にもあり、それは染色体で隣接して局在し、その発現は共通の経路によってつながっている可能性がある。
【００６０】
本発明の遺伝学的試験で使用することができる、この染色体の位置におけるVNTRおよびSNPの変動を同定した。プライマーおよび/またはプローブの設計で使用することができるVNTRモチーフおよび周辺配列を表3(図1)に示す。プライマーおよびプローブの組をSNPの周りで設計して、診断試験に最も有用なものを選択した(表4(図2)を参照)。「低活性型」の遺伝子に対応する、またはそれを予測する遺伝子型を同定する診断試験を設計する。表3および4(図1および2)に列挙したVNTRおよびSNPは、遺伝子発現またはタンパク質の活性に影響を及ぼすことができ、単独でまたは組み合わせてMAO-B酵素の低活性を起こすことができる。その試験はまた、遺伝子の発現に対して影響を及ぼす可能性があるその領域における遺伝マーカーのハプロタイプをも評価する。
【００６１】
したがって、上記によれば、本発明はまた、ADHD患者でのMAO-B活性の評価における、本明細書の表3(図1)に列挙したVNTRモチーフの使用をも提供する。
【００６２】
具体的には、この態様では、本発明は、ADHD患者におけるMAO-B活性を評価する、具体的にはMAO-B活性を予測する遺伝子型を評価するプローブおよび/またはプライマーの作製における、表3(図1)のVNTRモチーフまたは前記モチーフの周辺にある核酸の使用を提供する。モチーフの周辺にある配列は、隣接配列と呼ぶことができ、モチーフの1〜250塩基上流または下流まで拡張することができる。表3(図1)に、表中のVNTRモチーフの隣接配列を示す。
【００６３】
表3(図1)中のVNTRを使用して作製するプローブまたはプライマーは、個人が有する反復の数が測定されるように設計する。VNTRの周りの配列、または隣接配列(500bp、表3を参照)を使用して、選択的であり感度の高いプライマー/プローブを設計することができ、それを使用してモチーフを検出し反復の数を決定することができる。
【００６４】
表3中のVNTRモチーフを使用して作製した核酸プローブまたはプライマーは、一態様では、
(a)VNTRモチーフの隣接配列の断片、または
(b)(a)と相補的な核酸配列
を含み、または(本質的に)それからなるものでもよく、VNTRモチーフは表3に列挙したものであり、隣接配列はモチーフの1〜250塩基上流または下流にある配列である。
【００６５】
本発明のこれらの態様では、好ましいVNTRモチーフは、例えば、GCTGCCAAGAAGAAGGTG、TGGATGGATGAA、ACCATCATC、CACACACATG、ATTTATTAACT、TGTATCAGCCATTTCCAAC、TTTTACAAAGTAATATTTG、ATTTGTTTTACAAATTTTTACAAAGTA、ATAGATAT、TTCAAAGCAAATGTTGAG、TGTTTATGAAACAAA、GATTTCATTCATAAGATACACおよびCTTGCTCAGTTACAAGAなど、大きい反復単位サイズと多いコピー数の一方または両方を有するものである。
【００６６】
通常、プローブまたはプライマーは、20〜50、20〜40、15〜30や15〜40塩基など、長さ15〜60塩基である。例えば、プローブ/プライマーは、長さ15、16、17、18、19、20、22、25、27または30塩基でもよく、通常は20塩基である。
【００６７】
さらに、本発明は、ADHD患者でのMAO-B活性の評価、具体的にはMAO-B活性を予測する遺伝子型の評価における、本明細書の表4(図2)で特定されるプライマーまたはプローブの使用を提供する。
【００６８】
VNTRおよびプライマー/プローブの配列が未知である限り、本発明はまた、表3または4(図1および2)にそれぞれ列挙した配列を有するVNTRまたはプライマー/プローブをも提供する。
【００６９】
好ましくは、VNTRモチーフは、例えば、GCTGCCAAGAAGAAGGTG、TGGATGGATGAA、ACCATCATC、CACACACATG、ATTTATTAACT、TGTATCAGCCATTTCCAAC、TTTTACAAAGTAATATTTG、ATTTGTTTTACAAATTTTTACAAAGTA、ATAGATAT、TTCAAAGCAAATGTTGAG、TGTTTATGAAACAAA、GATTTCATTCATAAGATACACおよびCTTGCTCAGTTACAAGAなど、大きい反復単位サイズと多いコピー数の一方または両方を有するものから選択される。
【００７０】
本発明のプローブまたはプライマー、例えば、本明細書に記載のように作製したものおよび表4中にあるものは、ADHD患者でのMAO-B活性の決定で有用である。具体的には、プローブ/プライマーを使用して、MAO-B活性を予測する遺伝子型を決定することができる。したがって、本発明はまた、医薬品で使用する本発明の核酸プローブまたはプライマーをも提供する。ADHD患者由来の試料におけるMAO-B活性を予測する遺伝子型をin vitroで決定する本発明のプローブまたはプライマーの使用も提供される。
【００７１】
対象におけるADHDの診断および/または治療で使用するキットがさらに提供され、そのキットは、本発明のプローブまたはプライマーを含む。キットを使用して、例えば患者から採取した試料に対して実施する遺伝学的試験により、ADHD患者などの対象におけるMAO-B活性を評価することができる。通常、キットは、本明細書に記載した、ADHD患者がMAO-B阻害剤での治療に適するかどうかを決定する方法での使用に適する。そのようなキットは、適切な核酸標識および/または検出手段、反応緩衝液、適切な酵素ならびに/あるいは使用説明書をさらに含んでもよい。
【００７２】
MAO-B活性が、転写因子AP-2βの変異体(遺伝子型)によって影響を受けることも示されている(Dambergら、2000年、Neurosci Lett.291(3):204〜6頁)。したがって、この遺伝子、ならびにMAO-B遺伝子の転写およびMAO-B活性に影響を及ぼす他の因子の遺伝子型の評価を使用して、ADHD患者をMAO-B阻害剤での治療に選択することができる。これらの試験は、c-Jun、Egr-1やSp1などの転写因子の遺伝子型または発現レベルの評価を含んでもよい(Wongら、2002年、J.Biol.Chem.277(25):22222〜30頁を参照)。タンパク質キナーゼCおよびMAPKシグナル伝達経路上の遺伝子およびタンパク質もMAO-B遺伝子の発現(Wongら、上記)およびおそらくは活性に影響を及ぼすことが分かり、したがって、このことも患者選択試験で潜在的に役立つ。
【００７３】
ドーパミンおよびPEAの代謝回転に関与する遺伝子またはタンパク質がMAO-B活性に影響を及ぼす可能性もあり、したがってMAO-B阻害剤での治療についてのADHD患者の選択で役立つ可能性がある。これには、ドーパミン輸送体(DAT)、カテコール-O-メチルトランスフェラーゼおよびいくつかの他のドーパミン受容体(またはこれらのタンパク質をコードする遺伝子)が含まれる。
【００７４】
血小板を含めた血液、リンパ球、唾液、尿、皮膚、毛または他の身体組織から抽出したDNAを使用して、遺伝学的試験を実施することができる。遺伝子型の評価に使用することができる多数の方法がある。これらの大部分については、下記の刊行物に総説が記載されている:Mikkelら、2002年、Psych.Genetics、12(2):109〜117頁;Dalma-WeiszhauszおよびMurphy、2002年、Psych.Genetics、12(2):97〜107頁ならびにBreen、2002年、12(2):83〜88頁。
【００７５】
低MAO-B酵素活性を決定する遺伝子型決定試験について考えられるプライマーおよびプライマーの組合せの例を下記の表4(図2)に詳細に記載する。その上にさらなるプライマーおよびプライマーの組合せを設計することができるVNTRおよび周辺の配列も下記の表3(図1)に詳細に記載する。血小板を含めた血液、リンパ球、唾液、尿、皮膚、毛または他の身体組織から抽出したDNAを使用して、遺伝学的試験を実施することができる。同様に、下記に例示する通り、MAO-BメッセンジャーRNA発現のレベルを測定する遺伝子発現試験は、どんなヒト組織試料でも測定することができる。
【００７６】
PEAおよび/またはHVAを含めた基質(または基質の組合せ)の測定を介して、MAO-B活性を間接的に測定することもできる(McKennaら、Neurochem Res.、(1993)18(9):1023頁;Beckmanら、J Neural Transm.、(1983)57:103頁;Kennedyら、Neurochem Res.、(1993)18(12):1281頁)。
【００７７】
MAO-B阻害剤が、ADHD患者、具体的には、不注意優勢型の症状を示し、低MAO-B活性を有する患者の有効な治療となる可能性がある。本発明者らは、MAO-Bアイソザイムの活性の低下によって、HVAのレベルが低下し、細胞外のドーパミンおよびおそらくは細胞内のドーパミンのレベルが最初に上昇することを示唆した。低MAO-B酵素活性を有する個人は幼い頃からこれにさらされているので、低MAO-B活性を有する患者において負のフィードバック系(おそらくドーパミンシナプス前自己受容体による)が活性化されており、その結果ドーパミンの代謝回転(合成および代謝)が低下する(Cooperら、The Biochemical Basis of Neuropharmacology、Oxford University Press、第5版〜第8版、1986〜2002年)ことはあり得ないことではない。
【００７８】
したがって、本発明の診断方法は、MAO-B阻害剤で患者を治療する方法によって補足することができる。
【００７９】
あるいは、本発明は、MAO-B阻害剤での治療に適する患者を治療するための薬剤の製造におけるMAO-B阻害剤の使用を提供し、そのような治療に対する患者の適合性は、
a)ADHD患者におけるMAO-B活性のレベルを決定するステップと、
b)MAO-Bの前記活性が、正常集団内でのMAO-B活性の全域の30%低い百分位数の中にある場合、ADHDの不注意優勢型の症状について(DSM IVに従って)前記患者を試験するステップと、
c)MAO-Bの前記活性が、正常集団内でのMAO-B活性の全域の30%低い百分位数の中にあり、前記患者の試験でADHDの不注意優勢型の症状があった場合、前記患者がモノアミンオキシダーゼB型阻害剤での治療に適すると結論を下すステップと
によって決定される。
【００８０】
その第3の態様では、本発明は、患者のADHD治療用薬剤の製造におけるMAO-B阻害剤の使用を提供し、そのMAO-B阻害剤は、セレギリン、パルギリンまたはラサギリン以外である。
【００８１】
本発明のこれらの態様での使用に適するMAO-B阻害剤は、MAO-B酵素に対する活性を有する任意の化合物である。好ましくは、本発明のこれらの態様での使用に適するMAO-B阻害剤は選択的MAO-B阻害剤であり、すなわちこの化合物はMAO-B酵素には親和性を有するがMAO-A酵素には親和性が有意に低い。通常そのようなMAO-B阻害剤には、パーキンソン病などの神経変性障害を治療するために主に開発され使用されている、とりわけセレギリン、ラサギリン、サフィンアミド(safinamide)、モフェギリンやラザベミドなどの薬物がある。
【００８２】
本発明の第3の態様では、患者は、ADHDの不注意優勢型、ADHDの多動性-衝動性優勢型、またはADHDの混合型であるADHDの3つのサブタイプのいずれかと診断されていてもよい。しかし、患者がADHDの不注意優勢型と診断されていることがより好ましい。本発明のこの態様の好ましい実施形態では、ADHDの患者は低MAO-B活性をも有する。この点では、低MAO-B活性は、本発明の第1の態様に関して上記で定義した通りであり、すなわち、正常集団内でのMAO-B活性の全域の30%低い百分位数の中にある酵素活性レベルである。
【００８３】
本発明のこの態様によれば、MAO-B阻害剤は、セレギリン、パルギリンまたはラサギリン以外の、当技術分野で知られている任意のそのような阻害剤でもよい。通常そのような阻害剤は、SL-25.118、ラザベミド、モフェギリン、ミラセミド、LU-53439、SL-34.0026、EXP-631、M-2-PP、SL-25.1131、FA-87、RS-1636、NW-1048、ヒマンタン(himantane)、興奮性アミノ酸、FA-73、ラドスチギル(ladostigil)、CHF-3381、セレギリン類似体、ベフロキサトン、AIT-203またはAIT-297でもよい。
【００８４】
好ましくは、MAO-B阻害剤は、サフィンアミド(safinamide)、モフェギリン、ラザベミドまたはセレギリン類似体である。
【００８５】
患者が、ADHDの不注意優勢型と診断されており、低MAO-Bレベルを示すとき、MAO-B阻害剤は、あるいは、とりわけ、セレギリンでもよい。
【００８６】
セレギリン
不可逆性MAO-B阻害剤のセレギリン(L-デプレニール)を使用して、低MAO-B活性およびADHDの不注意優勢型のサブタイプを有するADHD患者を治療することができる。
【００８７】
【化１】
2008510480.tif 000003
【００８８】
ADHDにおけるセレギリンの使用を評価したいくつかの研究がある(Woodら、Psychopharmacol.Bull.、1983年、19:627頁;Wenderら、Psychopharmacol.Bull.、1985年、21:222頁;Rapoportら、Psychopharmacol.Bull.、1985年、21:232頁;Ernstら、Psychopharmacol.Bull.、1996年、32:327頁;Akhondzadehら、Prog.Neuropsycholpharmacol Biol.Psychiatry、2003年、27(5):841〜5頁)が、これらの大部分によって、セレギリンが精神刺激薬の治療より患者に有効でなかったことが示された。
【００８９】
セレギリンは、Eldepryl(被覆錠剤型製剤)、Zelapar(速溶Zydis製剤、WO-09626720)、Emsam(貼付型製剤、WO-09426218)、セレギリンXR(持続放出型製剤、米国特許第05484608号)として、いくつかの異なる製剤中に存在し、いずれも本発明の様々な実施形態に従って使用することができる。
【００９０】
2〜20mg/日(Eldeprylまたは他の製剤の生物学的に等価な投与量)の間で様々な投与量を治療に使用することができる。
【００９１】
ラサギリン
ラサギリン(EP-00436492)は、選択的かつ不可逆性のMAO-B阻害剤であり、それを使用して、低MAO-B活性およびADHDの不注意優勢型のサブタイプを有するADHD患者の部分集団を治療することができる。
【００９２】
【化２】
2008510480.tif 000004
【００９３】
1〜2mg/日の投与量を治療に使用することができる。
【００９４】
他のMAO-B阻害剤
MAO-B活性を阻害し、したがって本発明の実施形態で使用することができるさらなる化合物を表2に示す。
【００９５】
【表２】
2008510480.tif 000005
2008510480.tif 000006
2008510480.tif 000007
【００９６】
本発明によれば、セレギリンやラサギリンなどのMAO-B阻害剤は、任意の適当な製剤中にあるものでもよい。例えば、阻害剤は、経口吸入、鼻内、静脈内、口内、舌、舌下、経皮または筋内投与用に製剤することができる。経口製剤には、液体またはゲルカプセルがある。経皮製剤には、貼付製剤がある。
【００９７】
適切な吸入薬物送達技術の一例は、Staccato(商標)送達装置である。Staccato(商標)技術は、熱発生型濃縮エアロゾルを使用して薬物を肺深部へと迅速かつ確実に送達する携帯システムを含む。単回の吸入によって、金属基質上で純粋な(添加物を含まない)薬物の薄層の制御された迅速な加熱が生じる。熱により薬物が装置の気流中へと気化し、得られた気相の分子が濃縮して適当なサイズのエアロゾル粒子となり、それが肺深部へと送達され、全身循環へと吸収される。呼吸によって活性化して基質が加熱されてから、気道へと薬物が入るまでの時間は、1秒未満である。
【００９８】
適切な鼻内薬物送達技術の一例は、米国特許第6,715,485号に記載のものである。
【００９９】
製剤のさらなる例は、セレギリンに関して上記に記載されている。
【０１００】
本発明の使用では、MAO-B阻害剤は、有利には、適当な場合に他の薬剤と組み合わせて、すなわち順次または同時に投与することができる。本発明は、治療で別々に、順次または同時に使用する1つまたは複数のそのような薬剤と組み合わせたMAO-B阻害剤を含む製品を想定するものである。
【０１０１】
(実施例)
(実施例1)
低MAO-B活性を有するADHD患者を選択する直接的生化学的試験
MAO-B活性の直接的測定は、多数の様々な方法で行うことができる。これについて記載する刊行物には、とりわけ、WurtmanおよびAxelrod、上記、Jackmanら、上記、Yanら、2004年、Rapid Comm.Mass.Spectrom.、18(8):834頁;Harroら、2001年、Prog.Neuropsychopharmacol.Biol.Psychiatry,25:1497頁、Sacconeら、2002年、Alcohol Clin.Exp.Res.、26(5):603頁、Snellら、2002年、Alcohol Clin.Exp.Res.、26(7):1105頁、Ekblomら、1998年、Neuroscience Lett.、258:101頁、Shekimら、1982年、1984年、1986年、上記、Youngら、上記、Hallmanら、上記、Garpenstrandら、上記、Whitfieldら、上記、Reimherrら、1983年、sychiatry Res.、11:78頁がある。
【０１０２】
下記では、血液の血小板、リンパ球または組織でのin vitroアッセイ、あるいは走査を使用するin vivoアッセイのいくつかの例に従う。MAO-B活性の測定は下記に記載の方法から変化してもよい。
【０１０３】
放射測定によるもの(血小板で、Harroら、上記の方法):
基質として2-フェニルエチルアミン(β-PEA)を用いる放射測定アッセイによって血小板MAO活性を測定した。EDTAを含むVacutainer(登録商標)(Beckton Dickinson、米国ニュージャージー州Franklin Lakes)管中に血液試料(7ml)を採取し、低速遠心分離(200g、10分間)によって血小板に富む血漿を調製した。血小板濃度をThrombocounter-C(登録商標)(Coulter Electronics Ltd、英国Luton)で概算し、血小板に富む血漿を-80℃で貯蔵した。
【０１０４】
分析時に、血漿試料を解凍し、Branson Sonifier Cell Disruptor B 1(登録商標)(Branson Sonic Power Company、米国コネチカット州Danbury)で4×10秒間超音波処理した後酵素活性の概算を行い、それはHallmanら、上記に記載のように行った。簡潔に述べると、試料を[14C]-β-PEA(50μM、New England Nuclear、米国マサチューセッツ州Boston)とともに37℃で4分間インキュベートし、その後、酸性化によって反応を終結させた。形成した放射活性産物をトルエン:酢酸エチル(1:1、体積/体積)の使用により抽出し、その後Packard Tri-Carb Liquid Scintillation Analyzer model 1900 CA(登録商標)(Packard Instrument Company、米国イリノイ州Downers Grove)で定量した。酵素活性は、nmol/血小板数1010 /分として表すことができる。
【０１０５】
放射測定によるもの(組織試料で、Youngら、上記の方法):
切除時から10分以内に組織をドライアイス上で凍結させ、-80℃で貯蔵した。0.25Mスクロースを含む9倍の体積の氷冷5mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)中で凍結組織を15秒間ホモジナイズした。粗ホモジネートのアリコートを希釈し、それを使用してタンパク質含量およびMAO活性を測定した。粗ホモジネートを4℃、650gで10分間遠心分離して、細胞の破片を除去した。上清を4℃、10,000gで10分間遠心分離した。得られたペレットを再懸濁させ、氷冷5mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)中で2回洗浄し、希釈し、それを使用してタンパク質含量およびMAO活性のアッセイを行った。
【０１０６】
MAO活性は、WurtmanおよびAxelrod、上記の改変法によって測定した。モノアミン基質はPEAであった。ミトコンドリア単離からのアーチファクトまたはミトコンドリア数における個々の違いを回避するために、粗ホモジネートでもミトコンドリア分画でもMAO活性を測定した。インキュベート時間および酵素濃度に対する産物形成の直線性を、粗ホモジネートおよびミトコンドリア分画について明らかにした。アッセイはすべて、十分にこれらの直線範囲内にある条件下で行った。「盲検」は、ホモジネートを95℃で5分間予めインキュベートした試料であった。4N塩酸の添加によって反応を終結させた。反応産物を有機相中に抽出し、有機溶媒のアリコートをトルエン液体シンチレーション蛍光体に添加した。その放射活性を液体シンチレーション計数器で測定した。アッセイでは、80倍希釈した粗ホモジネートまたは40倍希釈したミトコンドリア分画を、20μMの[14C]-β-PEA(12.5mCi/mmol)の存在下で、37℃で6分間インキュベートした。反応産物をトルエン中に抽出した。抽出効率は100%であった。タンパク質1mg当たりの単位または組織重量1g当たりの単位として結果を表した。
【０１０７】
GC-MSによるもの(Zhouら、(2001)J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry 70:229頁の方法)
空腹時静脈血7mlを、抗凝固剤を含むプラスチック管中に採取した。200gで10分間穏やかに遠心分離することによって、MAO-B測定用の血小板に富む血漿を得、血小板に富む血漿中の血小板数を決定した。血漿および血小板に富む血漿をアッセイまで別々に-80℃で貯蔵した。GC-MS(GC-17 AおよびQP-5000質量分析計、Shimadzu、日本国京都)によって、血小板MAO-B活性を決定した。試料調製および試料のインキュベーションは、Husseiniら、(1995)J.Chromatogr.B.、672:138頁の方法にわずかに改変を加えたものに従って行った。簡潔に述べると、血小板ペレットを食塩水で再懸濁させて、1ml当たり血小板107個の濃度を得、次いでそれを10秒間超音波処理した。懸濁液50μlを100mMのKH2PO480μlとともに37℃で5分間予めインキュベーションを行った後、懸濁液を20μMのPEAおよび0.15単位のアルデヒドデヒドロゲナーゼとともに37℃で30分間インキュベートした。一方の試料は0℃でインキュベートした。他方には、盲検として0.24mMのMAO-B阻害剤パルギリンを添加した。DB-5で被覆した毛細管カラム(内径0.23mm、長さ30m、J and W Scientific Co、米国カリフォルニア州Folsom)を使用した。定量分析に使用した質量数は、フェニル酢酸(PAA)に対応するm/z268、およびメチルフェニル酢酸(mPAA)に対応するm/z282であった。ピーク面積の測定を使用して、イオン電流を概算した。検量線は、10〜500ng/mlの標準試料において高度に相関した(r=0.947)。0℃でインキュベートし、またはパルギリンを添加した試料中ではPAAは産生しなかった。PAAの産生から酵素活性を算出し、産物のpmol量/血小板107個/30分でそれを表した。
【０１０８】
分光測定によるもの(IvanovicおよびMajkic-Singh、1988年、J Clin Chem Clin Biochem.、26(7):447頁の方法)
ペルオキシダーゼを使用する2,2'-アジノ-ジ-(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)(ABTS)の酸化に基づいて組織モノアミンオキシダーゼを決定する、簡単であり継続されている分光測定法がすでに記載されている(IvanovicおよびMajkic-Singh(1986)Fresenius Z.Anal.Chem.324、307頁)。本研究では、その方法を血小板モノアミンオキシダーゼアッセイについて最適化する。
【０１０９】
発光測定によるもの(O'Brienら、(1993)Biochem Pharmacol.5:46(7):1301頁の方法)
この方法は、ペルオキシダーゼが触媒する、MAO反応で産生する過酸化水素による5-アミノ-2,3-ジヒドロ-1,4-フタラジンジオン(ルミノール)の半発光性酸化からの光発生の測定に基づいている。その手順は、広範なMAO基質での使用に適するが、5-ヒドロキシ-トリプタミン、アドレナリンおよびノルアドレナリンは過酸化水素によって容易に酸化されすぎて使用できない。この手順の特定の利点は、それがアルデヒドや遊離アンモニアなどの産物を産生しない基質の酸化に提供可能であることであり、このことは、基質に依存しないいくつかの代替アッセイ手順の基礎となる。ラット肝からの粗ミトコンドリア調製物または精製したウシ肝MAO-Bによるベンジルアミン、チラミンおよび2-n-ペンチルアミノアセトアミド(ミラセミド)の酸化のアッセイを行う手順の適用を示す。
【０１１０】
高処理能蛍光アッセイによるもの(Snellら、2002、Alcohol Clin.Exp.Res.26(7):1105頁の方法)
本明細書に記載のものなどの高処理能蛍光アッセイを使用することによって、血小板MAO-B活性のアッセイを行うことができる。
【０１１１】
高速液体クロマトグラフィー(Nissinen 1984年、J Chromatogr.309(1):156頁の方法)
本明細書に記載のものなどの高速液体クロマトグラフィー技術を使用して、MAO-B活性のアッセイを行うことができる。
【０１１２】
ベルトロー反応によるもの(Uzonovら、1978年、Acta Physiol Pharmacol Bulg.4(2):61頁の方法)
基質チラミンを用いたモノアミンオキシダーゼ(MAO)決定の手順を使用することができる。酸素での飽和、および基質からのアンモニアの分離は省略した。インキュベーション終了時に、エタノールで試料からタンパク質を除去し、連続して遠心分離を行った。Fenton(1962)の手順を使用して、新たに形成されたアンモニアを着色化合物インドフェノールに転換する。それぞれNH3であるインドフェノール濃度を625nmでの分光測定によって決定し、基準量のNH3の組との比較によって算出する。酵素活性は、タンパク質1mgによって1分間に形成されたアンモニアのnmol量として表す。
【０１１３】
免疫ブロット法によるMAO-B濃度の測定によるもの(Snellら、上記の方法)
本明細書に記載のものなど、MAOに選択的なポリクローナル抗体でプローブした免疫ブロットの分析によって、血小板MAO-Bタンパク質濃度を測定することができる。
【０１１４】
放射標識によるMAO-B濃度の測定によるもの(Snellら、上記の方法)
本明細書に記載のものなど、選択的MAO-B触媒部位アンタゴニスト[3H]Ro 19-6327によって、血小板MAOの親和性標識の定量的測定を使用することができる。
【０１１５】
陽電子放出型断層撮影によるもの(Fowlerら、(2003)Proc.Nat.Sciences Soc.100(20):11600頁)
(ガスクロマトグラフィーによる;Quest Diagnostics)血漿コチニン分析用の血液試料を、最初のPET走査前に採取し、一酸化炭素について呼気試料を分析した。12名すべての被験者が両方の走査を終了し、1名を除いたすべての被験者についてその心臓と腎臓をどちらも同じ走査中で視覚化した。以前に試験された非喫煙者8名のデータを比較に使用した(Fowlerら、(2002)J.Nucl.Med.43:1331頁)。
【０１１６】
走査する間の2〜3時間、Siemens/CTI(テネシー州Knoxville)HR+陽電子放出型断層撮影装置(視野の中心部での空間分解能≒半値全幅4.5mm)を3D動態取得モードにして、L-[11C]デプレニールおよびL-[11C]デプレニール-D2を比較するPET走査[平均線量はそれぞれ6.4±0.9および5.6±1.3mCi(1Ci=37GBq)であり、比活性は注射時に250mCi/μmolであった]を全身に行った。心臓と腎臓がどちらも15cmの軸の中にある視野内に入ることを目標にして被験者を配置した。腕を頭から上にして視野から外した。Fowlerら、上記に記載の採血および分析を使用した。簡潔に述べると、自動化採血機器(Ole Dich Instruments、デンマークHvidovre)を使用することによって最初の2.5分間は2.5秒毎に動脈血試料を回収し、次いで2〜6分では毎分、次いで8、10、15、20、30、45および 60分に手動操作で試料を採取した。各動脈血試料を遠心分離し、血漿をピペットで採取し、C-11を計数した。固相抽出法(Alexoffら、(1995)Nucl.Med.Biol.22:893頁)を使用することにより、L-[11C]デプレニール(またはL-[11C]デプレニール-D2)について1、5、10、20、30、45および 60分での血漿試料を分析した。これらの値を使用して、標識代謝物の存在に対して動脈血漿の時間活性曲線を補正した。
【０１１７】
動態PET走査に加えて、以前に動態走査プロトコールを受けた非喫煙者1名(7.66mCi)および喫煙者1名(7.42mCi)に対してL-[11C]デプレニールでの全身走査も行った。これらの全身走査は、動態走査を行った日とは異なる日に行い、脳を含めて、全臓器の半定量的画像を得た。トレーサーを注射してから25分後にPET走査を開始したが、これはトレーサーの最初の分配相が終了し、臓器蓄積がプラトーに達するときであり、そのことはトレーサーが酵素と結合したことを反映している。骨盤から脳にかけて各10分ベッドの位置8箇所を使用することにより、PETカメラの製造業者によって供給される標準的な臨床的全身プロトコールを使用した。分割透過減衰補正および反復再構成を使用することによってデータを処理し、直接比較することができるように画像を拡大縮小した。
【０１１８】
(実施例2)
低MAO-B活性を有するADHD患者を選択する間接的生化学試験
MAO-B酵素は、主にドーパミン(その結果HVAが生じる)およびβ-フェニルエチルアミン(その結果PAAが生じる)を代謝する。1つまたは複数の基質および/あるいは1つまたは複数の代謝物の相対レベルを評価する任意の方法によってMAO-B活性を決定することができる。下記の検出方法は、血液、尿またはCSFについて記載されているが、任意の体液試料をこれらの物質の検出に使用することができる。
【０１１９】
GC-MSによる尿濃度(Zametkinら、(1985)、Arch.Gen.Psychiatry、42(3):251頁の方法)
ノルアドレナリン、ドーパミンとそれらの代謝物であるMHPG、NMN、VMA、3,4-ジヒドロキシフェニル酢酸(DOPAC)およびホモバニリン酸(HVA)ならびにPEAの生化学的分析を、内部標準物質として重水素化異性体を使用するガスクロマトグラフィーおよび質量分析で実施した。クラス内相関は反復したアッセイについて0.95〜0.98であり、感度はpmolの範囲内であった。収集後、6Nの塩酸塩(合計体積の3%)で尿を酸性化し、-80℃で貯蔵し、1〜3カ月以内にそれを分析した。内因性非重水素化化合物のピークの高さを適当な重水素化内部標準物質のものと比較することによって定量を行った。アッセイ内での変動係数がセロトニンで4.7%であり5-HIAAで4.5%である電気化学的検出を使用する液体クロマトグラフィーでの抽出手順の後、24時間尿中セロトニンおよび5-HIAA産出物を測定した。アッセイ間での変動はそれぞれで約5%である。Hereの方法(Here、1950年、Proc.Soc.Exp.Biol.Med.、74:148頁)を使用してクレアチニンのアッセイを行って、尿収集の完全性を評価した。
【０１２０】
尿試料でのHVA濃度(Shekimら、Biol Psychiatry(1983)18(6):707〜14頁の方法)
本明細書に記載のものなど、Shekimらの方法に従って、尿試料からHVA濃度を決定することができる。
【０１２１】
PEAおよび関連物質の尿中濃度および血漿濃度(Bakerら、(1991)Biol.Psychiatry、29:15頁の方法)
Bakerら、上記およびWongら、(1988)J.Chromatogr.、428(1):140頁に記載のように、電子捕獲ガスクロマトグラフィーによって尿中PEA(遊離および総PEA)ならびに/または尿中および血漿PAAのレベルをそれぞれ分析した。Yeungら、1986年、J.Chromatogr.、378(2):293頁の手順を使用して、尿中および血漿のPheおよびP-チロシン(Tyr)を測定した。尿中の値はすべて、24時間試料中のクレアチニン1g当たりの量として表した。
【０１２２】
GC-MSによる血漿PEA濃度(Zhouら、上記の方法)
空腹時静脈血7mlを、抗凝固剤を含む2本のプラスチック管中に採取した。PEAを測定するために、血小板に富む血漿を3000gで10分間遠心分離した。血漿および血小板に富む血漿をアッセイまで別々に-80℃で貯蔵した。前記に記載のようにGC-MSによってPEAの決定を行い、それをpg/mlで表した(Yamadaら、1994年、Biogenic Amines、10:295頁)。
【０１２３】
GC-MSによるPEAおよび関連物質の尿中濃度(Zametkinら、上記の方法)
3%の6N塩酸で酸性化した後、他に記載のガスクロマトグラフィー-マスフラグメントグラフィー法を使用して尿試料をコード(code)し分析した(Karoumら、(1979)J.Neurochem.、33(1):201頁)。アッセイを行った化合物には、PEA、クレアチニン、フェニルアラニン、チロシンおよびフェニル酢酸(PAA)がある。
【０１２４】
GCによるHVAの尿中濃度(Shekimら、J.Child Neurol.(1987)2(1):50〜56頁の方法)
24時間尿収集物を得、尿中クレアチニンレベルによって尿収集物の完全性をモニターした。代謝物の保存剤としてメタ重亜硫酸ナトリウムを尿試料に添加し(尿1l当たり0.5g)、試料は排尿後直ちに冷蔵した。アリコートを凍結し、後にDziedzicら(Annal.Biochem.1972,47:595頁)の方法によってHVAについて分析した。
【０１２５】
GC-MSによる脳脊髄液(CSF)中のHVA(Reimherrら、上記の方法)
女性から11ccの、男性から15ccのCSF試料を得た。アスコルビン酸5mgを含む目盛り付き管中に試料を収集し、ドライアイス、エタノールおよびアセトンの槽中に直ちに入れ、-70℃の冷凍庫に移した。重水素化内部標準物質を使用するガスクロマトグラフィー、質量分析によってHVAのアッセイを実施した(Godfeら、1977年、Analytical Chem.、49:917頁、Gordonら、1974年、Biological Med.、11:32頁)。
【０１２６】
(実施例3)
低MAO-B活性が生じる遺伝子型および/または遺伝子発現パターンを有するADHD患者を選択する遺伝学的試験
遺伝子型判定実験(Bengraら、2002年、Clin Chem.48(12):2131〜40頁のもの)
DNA試料
血液試料からゲノムDNAを抽出および精製し、分析前は-20℃で貯蔵した。
【０１２７】
SNPの選択
対象とする遺伝子中の異なるSNPのPCR増幅用プライマーを設計した。
【０１２８】
PCRプライマーおよびDNA増幅
公開されている遺伝子配列から、Oligo(商標)第6.4版プライマー分析ソフトウェア(Molecular Biology Insights)を使用して、対立遺伝子特異的PCRプライマーおよびCOM(逆向き)プライマーを設計した。PCRプライマー配列は、Midland Certified Reagentsによって合成された。PCRプライマーは、各SNP座位を増幅するために、SNP毎に野生型(WT)および突然変異型(MUT)の2つの対立遺伝子特異的プライマーならびに反対側のCOMプライマーを含んでいた。対立遺伝子特異的プライマーは21ヌクレオチド(nt)の領域(各Universal Amplifluorプライマーの認識部位と同一;「尾部付き」)を含み、それは2つの標識プライマーの1つで異なる(緑または赤)。次いで、異なる配列の尾部を各対立遺伝子特異的プライマーの5'-末端に付加する。対立遺伝子特異的プライマー上の21ntの尾部は、対応するUniversal Amplifluorの21ntの3'-領域と同一である(緑または赤)。PCR試薬の終濃度は、20μL中で各デオキシヌクレオシド三リン酸が200μM、Taq DNAポリメラーゼ(Roche Biochemical)またはPlatinum(登録商標)Taq DNAポリメラーゼ(Life Technologies)が1反応当たり1.0U、Universal AmplifluorプライマーとCOM(逆向き)プライマーがどちらも250nM、両方の尾部付き対立遺伝子特異的プライマーが25nMであった。(1×)反応緩衝液は、1.8mM MgCl2、50mM KCl、および10mMトリス、pH 8.30であった。Amplifluor試薬システム(Serologicals Corp.)は、2つのUniversal Amplifluorプライマー[フルオレセイン(FAM)またはスルホローダミン(SR)で標識]、10×PCR緩衝液、およびデオキシヌクレオシド三リン酸を含む。PCR反応を設定し、光学的に透明なPCRマイクロプレート(VWR Scientific Products)中で実施し、それをPCRプレート密封粘着テープ(Robbins Scientific Corp.)で密封した。
【０１２９】
PTC-200勾配型サーマルサイクラー(MJ Research)中で、下記の条件で増幅を行った:94℃で5〜10秒間の偽ホットスタート、95℃で4分間の変性、次いで35サイクル(94℃で10秒、55℃で20秒、および72℃で40秒)、その後72℃で3分間の最終伸長。蛍光測定を実施することができるまで20℃でPCR反応物を保持した。いくつかの10×PCR緩衝液[緩衝液K:600mM トリス-HCl(pH9.5)、150mM(NH4)2S04、および25mM MgCl2;緩衝液N:600mM トリス-HCl(pH10.0)、150mM(NH4)2S04、および20mM MgCl2;ならびに緩衝液I:100mM トリス-HCl(pH8.3)、500mM KCl、および18mM MgCl2]でPCRを実施し、次いでゲル電気泳動により収量および特異性についてPCR産物を分析することによってSNPのPCR反応を最適化した。続いて、最大の単位複製配列収量および特異性が得られた緩衝液をすべてのSNPのPCRについて1つ選択した。温度勾配PCRも行って、アニール温度の関数としての(範囲、50〜70℃)PCRの単位複製配列収量および特異性に対するAmplifluorの潜在的な影響を調べた。PCR単位複製配列の最良の収量が得られる標的量とサイクル数の最適な組合せも決定した。
【０１３０】
蛍光測定およびデータ分析
標識Universal Amplifluorプライマーを含む単位複製配列の全蛍光(相対蛍光単位として)を、Victor(商標)1420蛍光マイクロプレートリーダー(Perkin-Elmer Wallac,Inc.)を使用して、開いたPCRマイクロプレートの各穴の上部を介して定量した。マイクロプレートリーダーは、FAM(励起、485nm;放出、535nm)およびSR(励起、585nm;放出、620nm)を定量する狭帯域フィルターを備えていた。蛍光の結果を、別々の分析用Excelワークシートに移し、下記の通りに各SNP座位について散布図を構築した。WT(通常FAM標識プライマー)対立遺伝子からのシグナルをx軸に沿ってプロットし、MUT(通常SR標識プライマー)対立遺伝子からのシグナルをy軸に沿ってプロットした。典型的な標識スキームでは、ホモ接合性WT遺伝子型を有する試料の蛍光はx軸に沿って蓄積するが、ホモ接合性MUT遺伝子型を有する試料のシグナルはy軸に沿って蓄積する。ヘテロ接合性遺伝子型のシグナルは、xおよびy軸の間の対角線に沿って集まる傾向がある。鋳型のない(盲検)PCRのシグナルは、x、yの原点の近くに出現する。
【０１３１】
遺伝子型の頻度をHardy-Weinbergの期待値と比較し、対立遺伝子の頻度を、RoussettおよびRaymond(1995年、Genetics 140(4):1413〜9頁)の方法により正常血圧群と高血圧群の間で比較した。
【０１３２】
snp単位複製配列の配列確認
配列に適した制限エンドヌクレアーゼを使用してPCR産物を消化することによって、SNP座位6つのうち5つでWTおよびMUT単位複製配列の配列確認を行った。蛍光定量の後、2×体積の無水エタノールを使用する沈殿によりPCR単位複製配列を通常精製し、次いでそれを脱イオン化IH2Oで再懸濁させ、1〜2単位の適当な制限エンドヌクレアーゼでそれを制限した。インキュベーション後に、1×トリス-酢酸-EDTA緩衝液中、4%アガロースゲル上でのゲル電気泳動によって反応混合物(体積、20μL)を分離し、その後エチジウムブロマイドで染色した。10bpサイズラダー(New England Biolabs)との比較によって、消化した単位複製配列のサイズを決定した。
【０１３３】
同様に、MAO-BメッセンジャーRNA発現のレベルを測定する遺伝子発現試験を、下記で例示するように任意のヒト組織試料で測定することができる。この技術には、マイクロアレイやABI-Taqman(商標)技術(WO-00/05409を参照)などによるRT-PCR関連方法が含まれる可能性がある。使用することができる組織にはリンパ球がある(Gladkevichら、2004年、Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry.28(3):559〜76頁を参照)。
【０１３４】
メッセンジャーRNAの発現
例えば、WO00/05409に記載の方法を使用して、メッセンジャーRNAの発現を行うことができる。
【０１３５】
RNA抽出
製造業者のプロトコールに従ってTrizolを使用して組織から全RNAを抽出する。吸光度比(A260/A280)>1.8であり、無傷の18および28SリボソームRNAを有する場合、そのRNAだけをcDNA合成に使用する。
【０１３６】
プライマー/プローブ設計
特定のGenBank配列が増幅されるようにプライマーおよびTaqManプローブを設計する。次いで、これらのプライマーおよびプローブをGenBankに対して相同性検索して、それらを設計した標的にそれらが特異的であることを確認する。RNAが無傷であるマーカーとして使用するグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)と標的遺伝子のPCR反応を重複して行う。標的プローブは蛍光体6-FAMで標識し、GAPDHのプローブは蛍光体VICで標識する。エキソン/エキソンの境界にまたがってプライマーおよびプローブを設計し、またはこれが不可能である場合、試料をDNアーゼIで処理する。これは、全RNAと同時に単離されたゲノムDNAの任意の増幅を回避するためである。
【０１３７】
cDNA合成
試験する各組織由来の全RNA50ngからこれを合成する。大容量cDNAアーカイブキット(high capacity cDNA archive kit)(Applied Biosystems 4322171)を使用して、ランダムプライマーを用いてcDNAを合成する。
【０１３８】
各試料の全RNA50ngに由来するcDNAを、単一の反応でPCR増幅にかけて、標的とGAPDHの転写物をどちらも同定する。標的およびGAPDH遺伝子のプライマーおよびプローブを、適当な緩衝液、ヌクレオチドおよびTaqポリメラーゼとともに反応混合物に添加する。PCR条件は、95℃で10分、その後95℃で15秒および60℃で45秒を45サイクルである。PCR増幅曲線を分析してCt値を得、この値を使用して、標的とGAPDH両方について既知の量のPCR産物から得られた標準曲線からの外挿により、標的とGAPDH遺伝子両方の開始時mRNAコピー数を決定する。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】表3-診断試験(の一部)として使用するプライマーおよびプローブの組の設計で有用な、MAO-BおよびMAO-A遺伝子のプロモーター領域中で同定された可変数タンデム反復配列(VNTR)モチーフおよびその周辺配列の一覧表である。
【図２】表4-診断試験の設計で使用することができる、MAO-B遺伝子中で同定された一塩基多型(SNP)のプライマー配列の一覧表である。
【図１】
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【図２】
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【図２】
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【図２】
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【図２】
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【図２】
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【図２】
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【図２】
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【図２】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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