(57)【要約】ここでは、細胞、組織または動物において、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２または両方の発現を調整する化合物、組成物および方法を開示する。また、疾患および障害の治療のための医薬の調製における、開示された化合物および組成物の使用を提供する。本発明は、特定の表現型終点を達成するために、ＡＣＣ１またはＡＣＣ２をコードする核酸分子に標識され、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはＡＣＣ１およびＡＣＣ２の両方の発現を調整する化合物、特にアンチセンス化合物を使用する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物における状態の重篤度を改善または軽減する方法であって、前記状態がＡＣＣ１およびＡＣＣ２の発現を減少させることによって処置可能であり、前記動物を、ＡＣＣ１およびＡＣＣ２の発現を減少させるアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることを含む、方法。
【請求項２】
前記状態が、肥満、糖尿病、インシュリン耐性、インシュリン欠乏、コレステロール過剰血症、過血糖症、高トリグリセリド血症、高脂肪酸血症、肝臓脂肪症、代謝症候群または心血管疾患から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＡＣＣ１およびＡＣＣ２の発現の減少が、すい臓でもＣＮＳでも生じない、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ＡＣＣ１およびＡＣＣ２の発現の減少によって、過食もインシュリン分泌の抑制も生じない、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、修飾ヌクレオシド間結合、修飾核酸塩基または修飾糖から選択される修飾を含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項６】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、デオキシヌクレオチドを含む第一領域と、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）オリゴヌクレオチドを含む第二および第三領域とを含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項７】
動物における血中グルコース、血漿トリグリセリド、血漿コレステロールまたは肝臓トリグリセリド濃度を低下させる方法であって、ＡＣＣ１およびＡＣＣ２の発現を減少させるアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与するステップを含む、方法。
【請求項８】
動物におけるインシュリン感応性を改善する方法であって、ＡＣＣ１およびＡＣＣ２の発現を減少させるアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与するステップを含む、方法。
【請求項９】
動物における過脂肪蓄積を減少させる方法であって、ＡＣＣ１およびＡＣＣ２の発現を減少させるアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与するステップを含む、方法。
【請求項１０】
ＡＣＣ１およびＡＣＣ２の発現がＣＮＳでもすい臓でも減少されない、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
動物における状態の重篤度を改善または軽減する方法であって、前記状態がＡＣＣ１およびＡＣＣ２の発現を減少させることによって処置可能であり、前記動物を、ＡＣＣ１の発現を減少させるアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることを含む、方法。
【請求項１２】
前記状態が、肥満、糖尿病、インシュリン耐性、インシュリン欠乏、コレステロール過剰血症、過血糖症、高トリグリセリド血症、高脂肪酸血症、肝臓脂肪症、代謝症候群または心血管疾患から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記ＡＣＣ１の発現の減少が、すい臓でもＣＮＳでも生じない、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、修飾ヌクレオシド間結合、修飾核酸塩基または修飾糖から選択される修飾を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、デオキシヌクレオチドを含む第一領域と、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）オリゴヌクレオチドを含む第二および第三領域とを含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
動物において、血中グルコース、血漿トリグリセリド、血漿コレステロールまたは肝臓トリグリセリド濃度を低下させる方法であって、ＡＣＣ１の発現を減少させるアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与するステップを含む、方法。
【請求項１７】
動物におけるインシュリン感応性を改善する方法であって、ＡＣＣ１の発現を減少させるアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与するステップを含む、方法。
【請求項１８】
動物における過脂肪蓄積を減少させる方法であって、ＡＣＣ１の発現を減少させるアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与するステップを含む、方法。
【請求項１９】
前記ＡＣＣ１の発現の減少が、ＣＮＳでもすい臓でも生じない、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
動物における状態の重篤度を改善または軽減する方法であって、前記状態がＡＣＣ２の発現を減少させることによって処置可能であり、前記動物を、ＡＣＣ２の発現を減少させるアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることを含む、方法。
【請求項２１】
前記状態が、肥満、糖尿病、インシュリン耐性、インシュリン欠乏、コレステロール過剰血症、過血糖症、高トリグリセリド血症、高脂肪酸血症、肝臓脂肪症、代謝症候群または心血管疾患から選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記ＡＣＣ２の発現の減少が、ＣＮＳでもすい臓でも生じない、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、修飾ヌクレオシド間結合、修飾核酸塩基または修飾糖から選択される修飾を含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、デオキシヌクレオチドを含む第一領域と、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）オリゴヌクレオチドを含む第二および第三領域とを含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
動物において、血中グルコース、血漿トリグリセリド、血漿コレステロールまたは肝臓トリグリセリド濃度を低下させる方法であって、ＡＣＣ２の発現を減少させるアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与するステップを含む、方法。
【請求項２６】
動物におけるインシュリン感応性を改善する方法であって、ＡＣＣ２の発現を減少させるアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与するステップを含む、方法。
【請求項２７】
動物における過脂肪蓄積を減少させる方法であって、ＡＣＣ２の発現を減少させるアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与するステップを含む、方法。
【請求項２８】
前記ＡＣＣ２の発現の減少が、ＣＮＳでもすい臓でも生じない、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
ＡＣＣ１をコードする核酸分子に標的された、長さ１２〜３０核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
修飾ヌクレオシド間結合、修飾核酸塩基または修飾糖から選択される少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項２９記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
前記オリゴヌクレオチドが、デオキシヌクレオチドを含む第一領域と、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドを含む第二および第三領域とを有するキメラオリゴヌクレオチドである、請求項２９記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
少なくとも１個の修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項２９記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
少なくとも１個の５−メチルシトシンを含む、請求項２９記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
ＡＣＣ２をコードする核酸分子に標的された、長さ１２〜３０核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
修飾ヌクレオシド間結合、修飾核酸塩基または修飾糖から選択される少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項３４記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
前記オリゴヌクレオチドが、デオキシヌクレオチドを含む第一領域と、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドを含む第二および第三領域とを有するキメラオリゴヌクレオチドである、請求項３４記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
少なくとも１個の修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項３４記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
少なくとも１個の５−メチルシトシンを含む、請求項３４記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
ＡＣＣ１またはＡＣＣ２の発現に関連する状態の改善または処置のための医薬の調製における、請求項２９〜３９のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項４０】
肥満、糖尿病、インシュリン耐性、インシュリン欠乏、コレステロール過剰血症、過血糖症、高トリグリセリド血症、高脂肪酸血症、肝臓脂肪症、代謝症候群または心血管疾患から選択される状態の改善または処置のための医薬の調製における、請求項２９〜３９のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項４１】
ＡＣＣ１およびＡＣＣ２の両方の発現が減少される、請求項３９記載の使用。
【請求項４２】
ＡＣＣ１およびＡＣＣ２の発現の減少がＣＮＳでもすい臓でも生じない、請求項３９記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願番号６０／６６９，５３０（２００５年４月８日出願）に対する優先権を主張する。この仮特許出願の全体は、参考として本明細書に援用される。
【０００２】
配列表
参考のために、配列表のコピーおよび２００６年４月１０日に作成されたＢＩＯＬ００５８ＷＯＳＥＱと命名されるファイルを含む、フロッピー（登録商標）ディスクの該配列表のコンピュータ読み出し可能な形態を本明細書に組み込む。
【０００３】
発明の分野
本明細書は、細胞、組織または動物において、ＡＣＣ１またはＡＣＣ２の発現を調整するのに有用な化合物、組成物および方法を開示する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）活性は、脂肪酸合成における律速段階であるアセチルＣｏＡからマロニルＣｏＡへのＡＴＰ依存性カルボキシル化に関与する。この反応は、２つの半反応、すなわち、ビオチンカルボキシラーゼ反応およびカルボキシルトランスフェラーゼ反応で進んでいく。マロニルＣｏＡは、長鎖脂肪酸の合成および非常に長い鎖を持つ脂肪酸への伸長反応における炭素ドナーであり、また、長鎖脂肪酸のミトコンドリア酸化作用に関与するパルミトイルＣｏＡカルニチンシャトルシステムの調整剤でもある（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００５】
ＡＣＣ活性の生成物であるマロニルＣｏＡは、食事変化に応答する脂肪酸の酸化および合成コントロールの最も重要な代謝信号である。カルボキシラーゼは、食事制限、ホルモン類および他の生理的要因によって、大きく規制される。食物摂取は、ＡＣＣの合成を誘発し、ＡＣＣ活性を増加する。絶食または真性糖尿病は、遺伝子の発現を抑制し、酵素の活性を低下させる。インシュリンで治療されている糖尿病動物は、酵素の活性が増し、長期のインシュリン治療は、ＡＣＣタンパク質の合成を刺激する。
【０００６】
ＡＣＣは、２つの組織特異的同位酵素、すなわち、肝臓および脂肪のような脂肪生成組織中に存在するＡＣＣ１（アセチルＣｏＡカルボキシラーゼα、ＡＣＡＣ、ＡＣＡＣＡおよびｔｇｆとしても知られる）および肝臓、心臓、骨格筋のような酸化組織中に存在するＡＣＣ２（アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼβ、ＡＣＡＣＢ、ＡＣＣＢ、ＨＡＣＣ２７５およびアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２としても知られる）として存在する。ＡＣＣ１およびＡＣＣ２は異なる遺伝子によってコードされる（非特許文献１）。
【０００７】
治療のためにＡＣＣ１およびＡＣＣ２を減らすアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、中枢神経系およびすい臓におけるＡＣＣ濃度を減らさず、したがって、ＡＣＣ１およびＡＣＣ２の小分子抑制で観察される副作用を阻止する点から、小分子に関して有益である。
【非特許文献１】Ｈａｒｗｏｏｄ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ，２００４，５，２８３−２８９
【非特許文献２】ＭｃＧａｒｒｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈａｎ．，１９７８，２５３，８２９４−８３００
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要旨
本発明は、特定の表現型終点を達成するために、ＡＣＣ１またはＡＣＣ２をコードする核酸分子に標識され、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはＡＣＣ１およびＡＣＣ２の両方の発現を調整する化合物、特にアンチセンス化合物を使用する方法に関する。さらに、細胞、組織または動物中のＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはＡＣＣ１およびＡＣＣ２の両方を同時に減少させる方法であって、前記細胞、組織または動物を本発明の化合物または組成物の１個以上と接触させることを含む方法を提供する。
【０００９】
本発明は、そのような治療を必要とする対象において、前記対象に、ＡＣＣ１またはＡＣＣ２を減少させるアンチセンス化合物を投与することにより、血中グルコース、トリグリセリドまたはコレステロールを低下させる方法を提供する。好ましい実施形態では、アンチセンス化合物は、ＡＣＣ１およびＡＣＣ２の両方を減少させる。他の実施形態では、本発明は、過脂肪蓄積を低下させる方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、肝臓トリグリセリド濃度を低下させる方法を提供する。他の本発明の実施形態は、脂肪酸合成を抑制する方法である。別の実施形態として、そのような治療を必要とする対象において、前記対象に、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはＡＣＣ１およびＡＣＣ２の両方を減少させるアンチセンス化合物を投与することによって、脂肪酸酸化を刺激し、インシュリン感応性を改善し、肝グルコース産生を抑制する方法が挙げられる。
【００１０】
別の実施形態では、本発明は、動物における状態の重篤度を改善させるまたは軽減する方法であって、前記状態の１以上の身体的指数の測定値が前記状態の重篤度の軽減を示すように、前記動物を、有効量のＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはＡＣＣ１およびＡＣＣ２の両方を減少させるアンチセンス化合物に接触させる方法を提供する。１実施形態では、状態は肥満である。他の実施形態では、肥満は食事誘発性である。別の実施形態では、状態として、糖尿病、インシュリン耐性、インシュリン欠乏、コレステロール過剰血症、過血糖症、高トリグリセリド血症、高脂肪酸血症、代謝症候群および心血管疾患が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、状態は肝臓脂肪症である。他の実施形態では、肝臓脂肪症は脂肪性肝炎、非アルコール性肝臓脂肪症疾患（ＮＡＦＬＤ）または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である。また、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２または両方と関連する状態の改善または治療のための医薬の調製における本発明の化合物の使用も意図する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、アンチセンス化合物はＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはＡＣＣ１およびＡＣＣ２の両方を調整する。ここで意図され提供されるのは、長さ１３〜３０ヌクレオチドの配列を含むアンチセンス化合物である。また、本明細書では、修飾ヌクレオシド間結合、修飾核酸塩基または修飾糖から選択される少なくとも２個の修飾を持つアンチセンス化合物も提供する。本明細書では、少なくとも１個の２’−Ｏ−メトキシルエチルヌクレオチドを、５’および３’末端側のそれぞれに持つデオキシヌクレオチド領域を含むキメラオリゴヌクレオチドが提供される。さらに、１０個のデオキシヌクレオチドを含み、５個の２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチドを５’および３’両末端側に持つ、各ヌクレオシド間結合がチオリン酸エステルであるキメラオリゴヌクレオチドが提供される。さらなる実施形態では、本発明のアンチセンス化合物は、少なくとも１個の５−メチルシトシンを有してもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
概説
本明細書では、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはＡＣＣ１およびＡＣＣ２の両方を減少させる、アンチセンス化合物、ならびに前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス化合物を使用する方法を開示する。そのような方法は、ＡＣＣ１またはＡＣＣ２をコードする標的核酸分子の１種以上と相補的である、アンチセンス化合物を提供することによって行う。
【００１３】
本発明によれば、ＡＣＣ１（アセチルＣｏＡカルボキシラーゼα、ＡＣＡＣ、ＡＣＡＣＡおよびｔｇｆとしても知られる）またはＡＣＣ２（アセチル−補酵素Ａカルボキシラーゼβ、ＡＣＡＣＢ、ＡＣＣＢ、ＨＡＣＣ２７５およびアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２としても知られる）の発現を調整するための組成物および方法が提供される。表１に、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはＡＣＣ１およびＡＣＣ２に標的されるアンチセンス化合物の設計のために有用な配列のジェンバンク（登録商標）受託番号を挙げる。各ジェンバンク（登録商標）配列は参考によって本明細書に組み込まれる。もし指定されていれば、そのような配列の配列番号が表１に示されている。本発明のアンチセンス化合物として、表１に示される１以上の標的核酸分子を減少させる化合物、およびＡＣＣ１またはＡＣＣ２をコードする別の核酸分子を減少させるアンチセンス化合物が挙げられる。前記アンチセンス化合物は、ＡＣＣ１またはＡＣＣ２をコードする核酸分子の任意の領域、セグメントまたは部位を標的としてもよい。適切な標的領域を本明細書に記載する。
【００１４】
表１
遺伝子標的の名前および配列
【００１５】
【表１】
2008538355.tif 000002
本発明の実施形態には、長さ１２〜５０ヌクレオチドの配列を含むアンチセンス化合物が含まれる。長さ１２〜５０ヌクレオチの配列には、長さ１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９および５０ヌクレオチドの配列を包含すると理解される。長さ１３〜３０ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましい。また、長さ１２〜３０ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドも好ましい。当業者であれば、ヌクレオチド長さの範囲１２〜５０は、その範囲内および１２〜５０ヌクレオチドの境界内に入る任意の範囲のヌクレオチド長さの全てを含むことを容易に理解するであろう。
【００１６】
活性を失うことなく、アンチセンス化合物の長さを延ばすあるいは縮めることができ、および／またはミスマッチ塩基を導入することができることは、当業者によく知られている。たとえば、Ｗｏｏｌｆら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：７３０５−７３０９，１９９２，参照によって本明細書に組み込まれる）では、長さ１３〜２５核酸塩基の一連のＡＳＯが、卵母細胞注射モデルにおいて、標的ＲＮＡの開裂を誘発するそれらの能力に関し試験された。長さ２５核酸塩基の、末端近傍に８個または１１個のミスマッチ塩基を持つＡＳＯは、ミスマッチを含まないＡＳＯより少量であったにもかかわらず、標的ｍＲＮＡの特異的開裂を行うことができた。同様に、標的特異的開裂は、１個または３個のミスマッチを有するものを含む、１３核酸塩基ＡＳＯを使用することで達成された。ＭａｈｅｒおよびＤｏｌｎｉｃｋ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１６：３３４１−３３５８，１９８８，参照により本明細書に組み込まれる）は、一連の縦列型１４核酸塩基ＡＳＯ、およびそれぞれ２または３個の縦列型ＡＳＯの配列で構成される２８および４２核酸塩基ＡＳＯを、ウサギ網状赤血球アッセイにおけるヒトＤＨＦＲの翻訳を停止する能力に関して試験した。１４核酸塩基ＡＳＯのみの３個はそれぞれ、２８または４２核酸塩基ＡＳＯより中程度のレベルではあるが、翻訳を抑制することができた。
【００１７】
治療法
本発明の化合物は、ヒトのような動物において、ＡＣＣ１またはＡＣＣ２を調整するために使用することができる。限定ではない１実施形態において、前記方法は、前記動物に、有効量のＡＣＣ１またはＡＣＣ２、あるいは好ましくは両方の発現を減らすアンチセンス化合物を投与するステップを含む。１実施形態では、本発明のアンチセンス化合物は、ＡＣＣ１またはＡＣＣ２ＲＮＡの濃度または機能を効果的に減らす。ＡＣＣ１またはＡＣＣ２ｍＲＮＡの濃度減少は、同時に、発現のＡＣＣ１またはＡＣＣ２タンパク質産物の減少を導くので、そのような結果として得られた変化も測定することができる。発現ＡＣＣ１またはＡＣＣ２ＲＮＡ、あるいはタンパク質生成物の濃度または機能を効果的に減らす本発明のアンチセンス化合物は、活性アンチセンス化合物と認められる。１実施形態では、本発明のアンチセンス化合物は、標的ＲＮＡの減少を、少なくとも１０％まで、少なくとも２０％まで、少なくとも２５％まで、少なくとも３０％まで、少なくとも４０％まで、少なくとも５０％まで、少なくとも６０％まで、少なくとも７０％まで、少なくとも７５％まで、少なくとも８０％まで、少なくとも８５％まで、少なくとも９０％まで、少なくとも９５％まで、少なくとも９８％まで、少なくとも９９％まで、あるいは１００％までもたらすＡＣＣ１および／またはＡＣＣ２を標的する。本発明の化合物は、ＡＣＣ１ＲＮＡ、ＡＣＣ２ＲＮＡまたは両方の発現レベルをその程度まで減少させうると考えられる。
【００１８】
たとえば、ＡＣＣ１またはＡＣＣ２発現の減少は、動物の組織または器官で測定することができる。前記組織または器官として、骨格筋、肝臓、腎臓および脂肪（白色および褐色）が挙げられるが、これらに限定されない。組織または器官のサンプルは、生体組織検査によって、常法的に得ることができる。
【００１９】
前記分析される流体、組織または器官内に含まれる細胞は、ＡＣＣ１またはＡＣＣ２タンパク質をコードする核酸分子および／またはＡＣＣ１またはＡＣＣ２にコードされたタンパク質それ自身を含みうる。たとえば、動物から得た組織または器官は、標的ｍＲＮＡまたはタンパク質の濃度として評価することができる。ｍＲＮＡ濃度は、リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロット法、原位置ハイブリッド形成またはＤＮＡアレイ解析によって測定または評価することができる。タンパク質濃度は、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット法、定量的タンパク質アッセイ、タンパク質活性アッセイ（たとえば、カスパーゼ活性アッセイ）、免疫組織化学または免疫細胞学によって測定または評価することができる。さらに、治療の効果は、当分野で公知の常法的な臨床方法により、１種以上の本発明の化合物と接触させた動物から集めた、前記組織、器官または血液のような体液中で、標的遺伝子発現に伴うバイオマーカーを測定することによって評価することができる。これらのバイオマーカーとして、グルコース、コレステロール、リポタンパク質、トリグリセリド、遊離脂肪酸およびグルコースおよび脂質の代謝の別のマーカー；肝臓トランスアミナーゼ、ビリルビン、アルブミン、血中尿素窒素、クレアチン、および腎臓および肝臓機能の別のマーカーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
本発明の化合物は、有効量の化合物を、適切な医薬的に許容しうる希釈剤または担体に加えることによって、医薬組成物で利用することができる。１態様では、本発明の化合物は、ＡＣＣ１またはＡＣＣ２の発現を減らす。好ましい態様では、本発明の化合物は、ＡＣＣ１およびＡＣＣ２の両方の発現を減らす。また、本発明の化合物は、ＡＣＣ１またはＡＣＣ２の発現を減少させることによって治療しうる疾患および障害の治療のための医薬の調製において使用することもできる。
【００２１】
本発明の他の実施形態は、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはその両方の発現を減らすが、ＡＣＣ１およびＡＣＣ２の発現は、中枢神経系では減らされない方法である。本発明の他の実施形態は、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはその両方の発現を減らすが、ＡＣＣ１およびＡＣＣ２の発現は、すい臓では減らされない方法である。本発明の他の実施形態は、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはその両方の発現を減らすが、ＡＣＣ１およびＡＣＣ２の発現は、すい臓の島細胞では減らされない方法である。本発明の別の実施形態は、食物摂取量を増やすことなく、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはその両方の発現を減らすアンチセンス化合物を投与することによって、動物における状態の重篤度を改善するまたは軽減することを含む。本発明の別の実施形態は、食欲を増やすことなく、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはその両方の発現を減らすアンチセンス化合物を投与することによって、動物における状態の重篤度を改善するまたは軽減することを含む。好ましい実施形態では、ＡＣＣ１およびＡＣＣ２の両方の発現を減らす。ここでは、動物における状態の重篤度を改善するまたは軽減する医薬の調製において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することが意図され、前記状態は、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはその両方の発現を減少させることによって治療可能であるものを言う。
【００２２】
本発明の別の実施形態は、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはその両方の発現を減らすアンチセンス化合物を投与することによって、動物における血漿脂質濃度を低下させる方法である。血漿脂質として、脂肪酸、トリグリセリド、コレステロール、ＬＤＬおよびＶＬＤＬが挙げられるが、これらに限定されない。ここでは、動物中の血漿脂質濃度を低下させる医薬の調製において本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することが意図される。
【００２３】
本発明の他の実施形態は、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはＡＣＣ１およびＡＣＣ２の両方の発現を減らすアンチセンス化合物を投与することによって、動物中の肝臓トリグリセリド濃度を低下させる方法である。ここでは、動物中の肝臓トリグリセリド濃度を低下させる医薬の調製において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することが意図される。ＮＡＦＬＤは、肝細胞中での単純なトリグリセリド蓄積（肝臓脂肪症）から炎症を伴う肝臓脂肪症（脂肪性肝炎）、線維化および肝硬変におよぶ疾患領域を包含する。ＮＡＦＬＤはＮＡＳＨに達する可能性がある。したがって、本発明の別の実施形態は、ＡＣＣ１またはＡＣＣ２、あるいは好ましくはその両方の発現を減らすアンチセンス化合物を投与することにより、動物における肝臓脂肪症を改善することを含む。肝臓脂肪症は、ＮＡＦＬＤ、脂肪性肝炎またはＮＡＳＨであってもよい。ここでは、動物における肝臓脂肪症を治療する医薬の調製において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することが意図される。いくつかの実施形態では、脂肪症は、ＮＡＦＬＤ、脂肪性肝炎またはＮＡＳＨである。
【００２４】
本発明の他の実施形態は、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはその両方の発現を減らすアンチセンス化合物を投与することによる、その必要性のある動物における過脂肪蓄積を減少させる方法である。動物の過脂肪蓄積の減少の指示薬として、体脂肪を減らすものが挙げられるが、これに限定されない。本発明の他の実施形態は、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはその両方の発現を減らすアンチセンス化合物を投与することによる、動物における肥満の重篤度を改善するまたは軽減する方法である。本発明の他の実施形態は、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはその両方の発現を減らすアンチセンス化合物を投与することによる、動物における食事誘発性肥満の重篤度を改善するまたは軽減する方法である。ここでは、動物における肥満を治療する医薬の調製において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することが意図される。１実施形態では、前記医薬は、動物における体脂肪を減少させるために使用される。他の実施形態では、肥満は食事誘発性である。
【００２５】
本発明の別の実施形態として、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはその両方の発現を減らすアンチセンス化合物を投与することによる、動物中の血漿グルコースを低下させる方法および血漿トリグリセリド濃度を低下させる方法が挙げられるが、これらに限定されない。ここでは、動物中の血中グルコースまたは血漿トリグリセリドを低下させる医薬の調製において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することが提供される。別の実施形態として、ＡＣＣ１またはＡＣＣ２の発現を選択的にまたはＡＣＣ１およびＡＣＣ２の発現を同時に減らすアンチセンス化合物を投与することによる、動物におけるインシュリンまたはレプチン感受性の改善方法が挙げられるが、これに限定されない。ここでは、動物におけるインシュリンまたはレプチン感受性を改善する医薬の調製において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することが提供される。１実施形態では、インシュリン感応性の改善によって、必然的に、インシュリン濃度を減少させる結果となる。１実施形態では、インシュリン感応性の改善は、インシュリンの減少によって測定する。別の実施形態として、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはその両方の発現を減らすアンチセンス化合物を投与することによる、動物において、脂肪酸酸化を増やす方法、脂肪酸合成を減らす方法および肝グルコース産生を抑制する方法が挙げられるが、これらに限定されない。ここでは、脂肪酸酸化を増やす、脂肪酸合成を減らす、または肝グルコース産生を抑制する医薬の調製において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することが提供される。他の実施形態として、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはその両方の発現を減らすアンチセンス化合物を投与することによる、動物の肝臓マロニルＣｏＡ濃度を減少させる方法が挙げられる。他の実施形態として、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはその両方の発現を減らすアンチセンス化合物を投与することによる、動物の脂肪生成または酸化組織中のマロニルＣｏＡ濃度を減少させる方法が挙げられる。他の実施形態として、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはその両方の発現を減らすアンチセンス化合物を投与することによる、動物における肝臓インシュリン感応性の改善が挙げられる。ここでは、動物におけるインシュリン感応性を改善するための医薬の調製において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することが提供される。他の実施形態は、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはその両方の発現を減らすアンチセンス化合物を投与することによる、動物の血漿ケトン濃度を改善する方法である。血漿ケトンとして、３−ベータヒドロキシブタレート、アセトンおよびアセトアセテートが挙げられる。他の実施形態は、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはその両方の発現を減らすアンチセンス化合物を投与することによる、動物における肝臓脂肪酸化を増やす方法である。
【００２６】
本発明の別の実施形態は、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはその両方の発現を減らすアンチセンス化合物を投与することによる、ある状態の重篤度を改善するまたは軽減することを含む。前記状態として、代謝障害および循環器障害が挙げられるが、これらに限定されない。代謝障害として、肥満、食事誘発性肥満、糖尿病、インシュリン耐性、インシュリン欠乏、脂質異常症、コレステロール過剰血症、過血糖症、高トリグリセリド血症、高脂肪酸血症、肝臓脂肪症および代謝症候群が挙げられるが、これらに限定されない。循環器障害として、冠状心疾患が挙げられるが、これに限定されない。ここでは、代謝または循環器障害を阻止するまたは治療するための医薬の調製において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することが提供される。ここでは、肥満、糖尿病、インシュリン耐性、インシュリン欠乏、コレステロール過剰血症、過血糖症、高トリグリセリド血症、高脂肪酸血症、肝臓脂肪症、代謝症候群または心血管疾患から選択される状態の改善または治療のために本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することが意図される。
【００２７】
ここでは、肥満、糖尿病、インシュリン耐性、インシュリン欠乏、コレステロール過剰血症、過血糖症、高トリグリセリド血症、高脂肪酸血症、肝臓脂肪症、代謝症候群または心血管疾患から選択され、ＡＣＣ１およびＡＣＣ２の発現を減少させることによって治療可能な状態の改善または治療のために、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することが意図される。
【００２８】
標的
本明細書で使用される用語「標的核酸」および「ＡＣＣ１またはＡＣＣ２をコードする核酸分子」は、ＡＣＣ１またはＡＣＣ２をコードするＤＮＡから転写されたＲＮＡ（ｍＲＮＡ前駆体およびｍＲＮＡ、またはその一部を含む）、またそのようなＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡを包含するために、便宜上使用されてきた。
【００２９】
活性アンチセンス化合物が相補的である標的核酸上の位置を、以下、「有効な標的セグメント」と言う。本明細書で使用される用語「有効な標的セグメント」は、活性アンチセンス化合物が標的となる標的領域の少なくとも一部と定義される。いかなる理論にも縛られるつもりはないが、現在、これらの標的セグメントは、ハイブリダイゼーションに到達可能な標的核酸の位置を示すと考えられている。
【００３０】
領域、セグメントおよび部位
ターゲッティングプロセスは、普通、所望の効果、たとえば、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはその両方の発現の減少となるように、アンチセンス相互作用がおこる標的核酸の範囲内にある、少なくとも１つの標的領域、セグメントまたは部位の検出も含む。「領域」は、少なくとも１つの識別可能な構造、機能または特徴を持つ標的核酸の一部と定義する。セグメントは、標的核酸の領域内にある。「セグメント」は、標的核酸内の領域のより小さなあるいはサブの一部と定義する。本発明で使用される「部位」は、標的核酸内の特有な核酸塩基位置と定義する。
【００３１】
ひとたび、１以上の標的領域、セグメントまたは部位が識別されると、標的に十分に相補的となり、すなわち、十分な親和性および特性でハイブリダイゼーションされ、所望の効果を得るアンチセンス化合物が設計される。
【００３２】
標的セグメントは、有効な標的セグメントの５’−末端からの連続する核酸塩基の少なくとも一部を含むＤＮＡまたはＲＮＡ配列（残りの核酸塩基は、標的セグメントの５’−末端のすぐ上流から始まり、ＤＮＡまたはＲＮＡが所望の数の核酸塩基を含むまで続く、同じＤＮＡまたはＲＮＡの連続的ストレッチである）を含みうる。同様に、有効な標的セグメントは、有効な標的セグメントの３’−末端からの連続する核酸塩基の少なくとも一部を含むＤＮＡまたはＲＮＡ配列（残りの核酸塩基は、標的セグメントの３’−末端のすぐ下流から始まり、ＤＮＡまたはＲＮＡが所望の数の核酸塩基を含むまで続く、同じＤＮＡまたはＲＮＡの連続的ストレッチである）によって示される。有効なオリゴマー標的セグメントは、有効な標的セグメントの配列の内部の一部からの連続的核酸塩基の少なくとも一部を含み、オリゴヌクレオチドが所望の数の核酸塩基を含むまでどちらかのあるいは両方向に伸長することができるＤＮＡまたはＲＮＡ配列によって示すことができるとも理解される。あるいは、標的セグメントは、たとえば、有効な標的セグメントの５’または３’末端から、あるいは内部部位から数えて、有効な標的セグメントの少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９の連続核酸塩基を含みうる。したがって、本発明に包含されるオリゴヌクレオチドは、本明細書で例示したオリゴヌクレオチドの少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９の連続的核酸塩基を含んでもよい。例示したアンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１３核酸塩基部分を含むオリゴヌクレオチドが好ましい。例示したアンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも８核酸塩基部分を含むオリゴヌクレオチドも好ましい。
【００３３】
本明細書で識別された有効な標的セグメントは、ＡＣＣ１またはＡＣＣ２を調整する追加の化合物のスクリーンに使用することができる。前記スクリーニング方法は、ＡＣＣ１またはＡＣＣ２をコードする核酸分子の有効な標的セグメントを、１種以上の候補調整剤と接触させるステップと、ＡＣＣ１またはＡＣＣ２をコードする核酸分子の濃度を上げるまたは下げる１種以上の候補調整剤に選択するステップとを含む。ひとたび、候補調整剤または調整剤が、ＡＣＣ１またはＡＣＣ２をコードする核酸分子の濃度をあるレベルに変更することができることが示されれば、前記調整剤は、ＡＣＣ１またはＡＣＣ２の機能のさらなる調査研究に、あるいは調査、診断薬あるいは治療薬としての用途に使用することができる。
【００３４】
例示された化合物が抑制される標的領域を、本明細書では、標的核酸の最も５’位よりの部位を示すことによって記載する。例示された長さの化合物と結合した、例示した化合物の標的領域を記載する。たとえば、配列番号２１０のアンチセンス化合物は、ＡＣＣ２配列ＭＭ＿１３３９０４．１のヌクレオチド１９３２〜１９５１を標的する。本明細書の例示で示すように、前記オリゴヌクレオチドはＡＣＣ２を減少させ、したがって、ヌクレオチド１９３２〜１９５１は、ＮＭ＿１３３９０４．１の有効な標的セグメントである。本発明の化合物は、たとえば、長さ１３〜３０核酸塩基でもよく、たとえば、例示された配列の１３核酸塩基部分を含んでもよいので、本発明の範囲内の化合物は、ＮＭ＿１３３９０４．１のヌクレオチド１９１５〜１９６８のいかなる部分も標的してもよいことは、認められうる。さらなる例として、配列番号２１０の１３−核酸塩基部分を含む、ＮＭ＿１３３９０４．１の３０マー標的ヌクレオチド１９１５〜１９４４もここで記載する本発明の範囲内に包含される。
【００３５】
ｍＲＮＡ分子中の開始コドンと停止コドンおよびこれらの対応ＤＮＡ分子は、当業者には容易に識別可能である。本明細書で使用される「開始コドン領域」または「停止コドン領域」は、開始または停止コドンからいずれかの方向（すなわち、５’または３’）における、約２５から約５０までの連続ヌクレオチドを包含するｍＲＮＡまたは遺伝子の部分を言う。したがって、「開始コドン領域」または「停止コドン領域」は、本発明のアンチセンス化合物で効果的に標的される全領域を言う。
【００３６】
翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の領域を言うことが当該分野で公知の、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または「コード領域」は、効果的に標的される領域でもある。本発明の範囲内で、１つの領域は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始または終止コドンを包含する遺伝子内領域である。
【００３７】
別の標的領域として、「５’非翻訳領域」（５’ＵＴＲ）および「３’非翻訳領域」（３’ＵＴＲ）が挙げられる。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は、５’キャップ構造それ自身、およびキャップ部位に隣接する最初の５０ヌクレオチドを含むと考えられる。前記５’キャップ領域は標的でもある。
【００３８】
したがって、適切な標的領域として、５’ＵＴＲ、開始コドン、停止コドン、コード領域、３’ＵＴＲ、５’キャップ領域、イントロン、エキソン、イントロン−エキソン接合部、エキソン−イントロン接合部およびエキソン−エキソン接合部が挙げられるが、これらに限定されない。適切な標的領域は、接合部部位のどちらかの方向（すなわち、５’または３’）の約２５〜約５０ヌクレオチドを包含する。
【００３９】
変異体
また、当該分野では、選択的ＲＮＡ転写物を、ＤＮＡの同じ遺伝子領域から産生することができることも知られている。これらの選択的転写物は、一般的に、「変異体」として知られている。より具体的には、「ｍＲＮＡ前駆体変異体」は、同じ遺伝子ＤＮＡから産生された転写物であって、同じ遺伝子ＤＮＡから産生された別の転写物とは、それらの開始または停止位置のいずれかにおいて相違し、イントロン配列およびエキソン配列の両方を含む転写物である。
【００４０】
スプライシング中に１以上のエキソンまたはイントロン領域、あるいはその一部が切除されると、ｍＲＮＡ前駆体変異体はより小さな「ｍＲＮＡ変異体」を産生する。したがって、ｍＲＮＡ変異体は、加工ｍＲＮＡ前駆体変異体であり、特有のｍＲＮＡ前駆体変異体は、それぞれ、スプライシングの結果として、常に、特有のｍＲＮＡ変異体を産生するに違いない。また、これらのｍＲＮＡ変異体は、「選択的スプライス変異体」としても知られている。もしｍＲＮＡ前駆体変異体のスプライシングがおこらなければ、ｍＲＮＡ前駆体変異体は、ｍＲＮＡ変異体と同一である。
【００４１】
また、当該分野では、転写を開始または停止する選択シグナルを使用することによって、変異体を産生することができ、ｍＲＮＡ前駆体およびｍＲＮＡは、複数の開始コドンまたは停止コドンを持ちうることが知られている。ｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡを起源とし、選択的開始コドンを使用する変異体は、そのｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡの「選択的開始変異体」として知られている。選択的停止コドンを使用するそれらの転写物は、そのｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡの「選択的停止変異体」として知られている。選択的停止変異体の１つの具体的なタイプは、産生された複数の転写物が転写機構による「ポリＡ停止シグナル」の１つの別の選択に由来する「ポリＡ変異体」であり、それによって、特有のポリＡ部位で停止する転写物を産生する。したがって、本明細書に記載するタイプの変異体も、適切な標的核酸である。
【００４２】
標的発現の調整
「調整」は、機能の変動、たとえば、標的ＲＮＡの発現または濃度の増加（刺激または誘発）または削減（抑制または減少）を意味する。他の例として、発現の調整は、ｍＲＮＡ前駆体プロセシングのスプライス部位選択を変動することを含みうる。「発現」は、遺伝子のコードされた情報が現在の構造に変換され、細胞内で作動する機能全てを含む。これらの構造は、転写および翻訳の産生物を含む。「発現の調整」は、そのような機能の変動を意味する。「調整剤」は、ＡＣＣ１またはＡＣＣ２の発現を調整し、有効な標的セグメントに相補的なものの少なくとも一部を含む化合物を言う。
【００４３】
標的核酸の発現の調整は、核酸機能の任意の番号の変更によって達成することができる。調整すべきＲＮＡの機能として、転座機能を含むことができ、これには、ＲＮＡのタンパク質翻訳の部位への転座、ＲＮＡ合成の部位から離れた細胞内の部位へのＲＮＡの転座、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳が含まれるが、これらに限定されない。調整することができるＲＮＡプロセシング機能として、１以上のＲＮＡ種を得るためのＲＮＡのスプライシング、ＲＮＡのキャッピング、ＲＮＡの３’成熟およびＲＮＡと関連する触媒活性または錯体形成（ＲＮＡにかかわるものでもよいし、ＲＮＡによって促進されるものでもよい）が挙げられるが、これらに限定されない。発現の調整は、時間的なあるいは純定常状態レベルによる、１以上の核酸種の濃度の増加、あるいは１以上の核酸種の濃度の低下となる可能性がある。標的核酸機能によるそのような干渉の１つの結果が、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはＡＣＣ１およびＡＣＣ２の両方の発現の調整である。したがって、１実施形態では、発現の調整は、標的ＲＮＡまたはタンパク質濃度の増加または減少を意味することができる。他の実施形態では、発現の調整は、１以上のＲＮＡスプライス産生物の増加または減少、あるいは２種以上のスプライス産生物の比の変化を意味することができる。
【００４４】
ハイブリダイゼーションおよび相補性
「ハイブリダイゼーション」は、アンチセンス化合物の相補性鎖のペアリングを意味する。特定の機構に限定されないが、ペアリングの最も一般的な機構には水素結合が関与し、これは、アンチセンス化合物の鎖の相補ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基（核酸塩基）間のワトソン−クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合であるかもしれない。たとえば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成によって組み合わされる相補核酸塩基である。ハイブリダイゼーションは、種々の条件下でおこりうる。特異的結合が望まれる条件下、すなわち、インビボアッセイまたは治療処置の場合の生理学的条件下、およびアッセイがインビトロアッセイで行われる条件下で、アンチセンス化合物の非標的核酸配列への非特異的結合を避けるために、十分な程度の相補性がある場合、アンチセンス化合物は、「特異的にハイブリダイゼーションしうる」。
【００４５】
本明細書で使用される「相補性」は、１本または２本のアンチセンス化合物鎖上の２個の核酸塩基間での正確なペアリング能力を言う。たとえば、アンチセンス化合物のある位置の核酸塩基と標的核酸のある位置の核酸塩基との水素結合が可能であれば、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の水素結合の位置は、相補的な位置であると考えられる。各分子中の十分な数の相補的位置が互いに水素結合することができる核酸塩基によって占められている場合、アンチセンス化合物と別のＤＮＡまたはＲＮＡとは互いに相補的である。したがって、「特異的にハイブリダイゼーション可能な」と「相補的」は、安定で特異的な結合がアンチセンス化合物と標的核酸との間でおこり、化合物を機能化するように、十分な量の核酸塩基にわたって正確なペアリングまたは相補性の十分な程度を示すために使用される用語である。
【００４６】
当該分野では、特異的にハイブリダイゼーション可能であるため、あるいは本発明に包含されるために、アンチセンス化合物の配列がその標的核酸の配列に対して１００％相補的である必要はないことが理解されている。標的核酸またはそのような核酸内の有効な標的セグメントに対して１００％未満の相補性はミスマッチを有する化合物を提供し、したがってミスマッチを有する化合物が本発明の範囲内に入ることは、当業者によって認められるであろう。好ましいオリゴヌクレオチドは、約３未満のミスマッチを有する。
【００４７】
さらに、オリゴヌクレオチドは、介在または隣接セグメントがハイブリダイゼーション（たとえば、ループ構造、ミスマッチまたはヘアピン構造）に巻き込まれないように、複数のセグメントをハイブリダイゼーションしてもよい。本発明のアンチセンス化合物は、それらが標的とする標的核酸配列内の標的領域に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列相補性を含む。たとえば、アンチセンス化合物の２０個の核酸塩基のうちの１８個が標的領域に対して相補的で、したがって特異的にハイブリダイゼーションするアンチセンス化合物は、９０％相補性を示すであろう。この例では、残りの非相補的核酸塩基は、相補的核酸塩基でクラスターを形成してもよく、あるいは点在させられてもよく、互いに、あるいは相補的核酸塩基に接触している必要はない。このように、両側に標的核酸を持つ完全相補性の２つの領域が並ぶ、４個の非相補的核酸塩基を有する長さ１８核酸塩基であるアンチセンス化合物は、標的核酸に関して７７．８％の総相補性を持ち、したがって、本発明の範囲内に包含されるであろう。標的核酸の領域を持つアンチセンス化合物の％相補性は、当該分野で公知のＢＬＡＳＴプログラム（基本的な局所アラインメント検索ツール）とＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３−４１０；ＺｈａｎｇおよびＭａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９−６５６）を使用して常法的に測定することができる。％相同性、配列の同一性または相補性は、たとえば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを使用するデフォルト設定（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２−４８９）を使用して、Ｇａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）によって測定することができる。
【００４８】
ＡＣＣ１およびＡＣＣ２の両方に対して相補性のあるアンチセンス化合物は、本発明の範囲内であると考えられる。たとえば、ＡＣＣ１に対して１００％の相補性を持つが、ＡＣＣ２に対しては８５％の相補性または３ミスマッチ（したがって、標的部位に対して相補的である２０個のヌクレオチドのうち１７個を持つ）を持つオリゴヌクレオチドは、本発明で使用を意図するものである。同様に、ＡＣＣ１およびＡＣＣ２に両方に対して８５％の相補性を持つオリゴヌクレオチドも、使用が意図される。また、ＡＣＣ１およびＡＣＣ２の両方に対して１００％の相補性を持つオリゴヌクレオチドも使用が意図される。本発明の好ましい実施形態として、ＡＣＣ１およびＡＣＣ２に対して十分な相補性を持ち、ＡＣＣ１およびＡＣＣ２の両方における発現の減少をもたらすオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００４９】
ＡＣＣ１およびＡＣＣ２配列の通常のアラインメント（たとえば、ＢＬＡＳＴまたは別の簡単に入手しうるプログラムによって実施されるアラインメント）が、ＡＣＣ１およびＡＣＣ２を別々にあるいは同時に標的とするオリゴヌクレオチドの設計に適切な領域を示すことは、当業者によって認められるであろう。
【００５０】
アンチセンス機構および化合物
「アンチセンス機構」は、標的核酸を持つ化合物のハイブリダイゼーションに関与する全ての機構であり、ハイブリダイゼーションの結果または効果は、たとえば、転写またはスプライシングを含む細胞機構の共同失速を持つ標的分解または標的占有である。そのような機構は当該分野で認められ、たとえば、ＲＮアーゼＨおよびＲＮＡ干渉を基礎とする機構が挙げられる。
【００５１】
用語「アンチセンス化合物」は、核酸分子の領域にハイブリダイゼーションしうるポリマー構造体を言う。この用語として、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類縁体、オリゴヌクレオチド模倣物およびこれらのキメラ混合物が挙げられる。アンチセンス化合物は、通常、直線状に生成されるが、つなぎ合わせることも、あるいは環状に生成することもできる。さらに、分岐状構造は当該分野で公知である。「アンチセンス化合物」または「オリゴマーアンチセンス化合物」は、化合物がハイブリダイゼーションし、その発現を調整する（増やすまたは減らす）核酸分子の領域に対し少なくとも部分的に相補的であるアンチセンス化合物を言う。したがって、全てのアンチセンス化合物はオリゴマー化合物といってよいが、オリゴマー化合物は全てアンチセンス化合物ではない。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、核酸をベースとするオリゴマーであるアンチセンス化合物である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは化学的に修飾されうる。アンチセンス化合物の限定ではない例示として、プライマー、プローブ、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、選択的スプライサーおよびｓｉＲＮＡが挙げられる。このように、これらの化合物を、一本鎖、二本鎖、環状、分岐状、またはヘアピン状の形態に導くことができ、内部または末端が膨らんだまたはループ状のような構造要素を含むことができる。二本鎖化合物は、完全にまたは部分的に二本鎖化された化合物のハイブリダイゼーションおよび形成を可能にする、十分な自己相補性を有する二本鎖化合物または一本鎖を形成するための、２本のハイブリダイゼーションされたストランドで構成されうる。好ましい実施形態では、本発明の化合物は自己触媒体ではない。
【００５２】
本発明における「キメラ」アンチセンス化合物または「キメラ」は、オリゴヌクレオチドなどの一本鎖または二本鎖アンチセンス化合物であり、これは、２個以上の化学的に異なる領域を持ち、前記領域は、それぞれ、少なくとも１個の分子ユニット、すなわち、オリゴヌクレオチド化合物を含む場合、ヌクレオチドを含むものである。
【００５３】
「ギャップマー」は、両側に非デオキシオリゴヌクレオチドセグメントが並ぶ２‘−デオキシオリゴヌクレオチド領域を有する、アンチセンス化合物、一般的にオリゴヌクレオチドと定義する。中央領域を「ギャップ」と言う。傍らにあるセグメントを「ウィング」と言う。もしウィングの１つが非デオキシオリゴヌクレオチドモノマーを持たなければ、「ヘミマー」と記載する。
【００５４】
本発明の１実施形態では、二本鎖アンチセンス化合物は、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を包含する。本明細書で使用される用語「ｓｉＲＮＡ」は、第一鎖および第二鎖を有する二本鎖化合物と定義し、各鎖は、中央部と２個の独立した末端部とを持つ。第一鎖の中央部は、第二鎖の中央部に対して相補的であり、鎖のハイブリダイゼーションを可能にする。末端部は、独立して、場合によっては、相補鎖の対応末端部に相補的である。鎖の末端は、１以上の天然または修飾核酸塩基の付加によって修飾され、突出部を形成してもよい。限定ではない１例では、ｓｉＲＮＡの第一鎖は、標的核酸に対してアンチセンスであり、第二鎖は第一鎖に対して相補的である。ひとたびアンチセンス鎖を特定の核酸標的を標的するように設計すると、ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、アンチセンス鎖の相補体として設計し、合成することができ、どちらかの鎖は、修飾またはどちらかの末端への付加を含んでもよい。たとえば、１実施形態では、ｓｉＲＮＡ二重鎖の２本の鎖は、中央核酸塩基で相補的であり、それぞれ、１または両末端で突出部を持つ。二重鎖の一端をまっすぐに、他端を突出した核酸塩基を持つようにすることが可能である。１実施形態では、突出する核酸塩基の数は、二重鎖の各鎖の３’末端から１〜６個である。他の実施形態では、突出する核酸塩基の数は、二重鎖の１つの鎖の３’末端から１〜６個である。さらなる実施形態では、突出する核酸塩基の数は、１本または２本の二重鎖の５’末端から１〜６個である。他の実施形態では、突出する核酸塩基の数は０である。好ましい実施形態では、各鎖は、長さ１９核酸塩基で、相補鎖を持つ完全にハイブリッド可能な、突出部を含まないものである。
【００５５】
ｓｉＲＮＡ二重鎖の各鎖は、約１２〜約３５核酸塩基であってもよい。好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡ二重鎖の各鎖は、約１７〜約２５核酸塩基である。中央相補部分は、長さ約１２〜約３５核酸塩基であってもよい。好ましい実施形態では、中央相補部部分は、長さ約１７〜約２５核酸塩基である。ｓｉＲＮＡ二重鎖の各鎖および中央相補部分は、長さ約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５核酸塩基であってもよいことは理解される。末端部は、１〜６核酸塩基でありうる。末端部は、長さ１、２、３、４、５または６核酸塩基であることが理解される。ｓｉＲＮＡは、末端部を持たなくてもよい。ｓｉＲＮＡの２本の鎖は、内部で結合し、３’または５’末端をそのままにしておくことができ、あるいは結合し、連続するヘアピン構造またはループを形成することもある。ヘアピン構造は、５’または３’末端のどちらかで突出部を含み、１本鎖特性の延長を作ってもよい。
【００５６】
二本鎖化合物を、本明細書で検討するような化学修飾を含むように作ることができる。
【００５７】
化学修飾
本発明の実施形態として、修飾ヌクレオシド間結合、修飾核酸塩基または修飾糖から選択される少なくとも２個の修飾を含む化合物が挙げられる。１実施形態では、本発明のアンチセンス化合物はキメラオリゴヌクレオチドである。１実施形態では、本発明のアンチセンス化合物は、少なくとも１個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドが、それぞれ５’および３’末端側にあるデオキシヌクレオチド領域を含むキメラオリゴヌクレオチドである。他の実施形態では、本発明のアンチセンス化合物は、１０個のデオキシヌクレオチドを含み、５’および３’の両末端側に５個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドがあるキメラオリゴヌクレオチドである。さらなる実施形態では、本発明のアンチセンス化合物は、少なくとも１個の５−メチルシトシンを有してもよい。
【００５８】
当該分野で知られているように、ヌクレオシドは塩基−糖混合物である。ヌクレオシドの塩基部分は、普通、複素環塩基（「核酸塩基」または単位「塩基」とも言う）である。そのような複素環塩基の最も一般的な２つのクラスは、プリン類およびピリミジン類である。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合するリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むこれらのヌクレオシドに関し、リン酸基は、糖の２’、３’または５’ヒドロキシル部分に結合することができる。オリゴヌクレオチドの形成において、リン酸基は、それぞれ、隣接するヌクレオシドを共有結合し、直鎖ポリマー化合物を形成する。また、この直鎖ポリマー化合物のそれぞれの末端がさらに結合し、環状化合物を形成することができる。オリゴヌクレオチド内で、リン酸基は、一般的に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成すると言われている。ＲＮＡおよびＤＮＡの通常の結合または骨格は、３’〜５’リン酸ジエステル結合である。オリゴヌクレオチド中に化学修飾を含みその活性を変化させるのが好ましいことが多い。化学修飾は、たとえば、標的ＲＮＡに関するアンチセンスオリゴヌクレオチドの親和性を増加させることによって、ヌクレアーゼ耐性を増加させることによって、および／またはオリゴヌクレオチドの薬物動態を変えることによって、オリゴヌクレオチド活性を変えることができる。その標的のためのオリゴヌクレオチドの親和性を増やす化学特性の使用は、より短いオリゴヌクレオチド化合物の使用を可能にする。
【００５９】
本明細書で使用する用語「核酸塩基」または「複素環塩基部分」は、ヌクレオシドの複素環塩基部分を言う。一般的に、核酸塩基は、他の核酸の塩基に水素結合することができる原子または前記原子の基を１以上含む任意の基を言う。「非修飾」または「天然の」核酸塩基、たとえば、プリン核酸塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ピリミジン核酸塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）に加え、当該分野で公知の、多くの修飾核酸塩基または核酸塩基模倣物が、本発明に使用可能である。用語修飾核酸塩基および核酸塩基模倣物は重なりあうが、一般的に、修飾核酸塩基は、構造において、たとえば、７−デアザプリンまたは５−メチルシトシンのような親核酸塩基に非常に類似する核酸塩基を指すが、一方、核酸塩基模倣物は、たとえば、三環フェノキサジン核酸塩基模倣物のようなより複雑な構造を含む。前記修飾核酸塩基の製造方法は、当業者によく知られている。
【００６０】
また、本発明のアンチセンス化合物は、修飾糖部分を含む１以上のヌクレオシドを含んでもよい。ヌクレオシドのフラノシル糖環は、置換基の付加、２個の非ジェミナル原子の架橋による二環式核酸（ＢＮＡ）の形成、４’−位の環を形成する酸素に関し−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−または−Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）のような原子または基の置換（しかしこれらに限定されない）のような数多くの方法で修飾しうる。前記修飾糖部分はよく知られ、その標的および／または増加ヌクレアーゼ耐性に関するアンチセンス化合物の親和性を変更する、普通、増やすために使用することができる。好ましい修飾糖の代表的なリストには、ＬＮＡおよびＥＮＡ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−結合を含む）を含む二環式修飾糖（ＢＮＡの）；および置換糖、特に、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ２または２’−Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３置換基を含む、２’−置換糖が挙げられるが、これらに限定されない。また、糖類は、なかでも糖模倣物基に置換される。修飾糖の製造法は、当業者によく知られている。
【００６１】
本発明は、ヌクレオシドまたは別の修飾モノマーユニットとともに結合し、アンチセンス化合物を形成するヌクレオシド間結合基を含む。ヌクレオシド間結合基の２つの主なクラスは、リン原子の存在または不存在によって定義される。代表的なリン含有ヌクレオシド間結合として、リン酸ジエステル類、リン酸トリエステル類、メチルホスホネート類、亜リン酸エステル類およびチオリン酸エステル類が挙げられるが、これらに限定されない。リンを含有しない代表的なヌクレオシド間結合基として、メチレンメチルイミノ（−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−）、チオジエステル類（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｓ−）、チオノカルバメート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）（ＮＨ）−Ｓ−）；シロキサン（−Ｏ−Ｓｉ（Ｈ）２−Ｏ−）；およびＮ，Ｎ’−ジメチルヒドラジン（−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−）が挙げられるが、これらに限定されない。非リンヌクレオシド間結合基を含むアンチセンス化合物は、オリゴヌクレオシドと言われる。天然のリン酸ジエステル結合と比べて、修飾ヌクレオシド間結合は、アンチセンス化合物のヌクレアーゼ耐性を変化させる、普通、増やすために、使用することができる。キラル原子を有するヌクレオシド間結合は、ラセミ、キラルまたは混合物として製造することができる。代表的なキラルヌクレオシド間結合として、アルキルリンおよびチオリン酸エステル類が挙げられるが、これらに限定されない。リン含有およびリンを含有しない結合の製造法は、当業者によく知られている。
【００６２】
本明細書で使用する「模倣物」は、糖、核酸塩基および／またはヌクレオシド間結合に置換された基を言う。模倣物は、オリゴヌクレオチドの結合ヌクレオシドに、構造的には非常に異なる（単なる修飾ではない）が、機能的には類似する基である。一般的に、模倣物は、糖または糖−ヌクレオシド間結合の組み合わせの変わりに使用され、核酸塩基は、選択標的へのハイブリダイゼーションのために維持される。糖模倣物の代表的例示として、シクロヘキセニルまたはモルフォリノが挙げられるが、これらに限定されない。糖−ヌクレオシド間結合の組み合わせに関する模倣物の代表的な例示として、ペプチド核酸（ＰＮＡ）および非電荷アキラル結合によって結合するモルフォリノ基が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、模倣物は、核酸塩基の代わりに使用される。代表的な核酸塩基の模倣物は、当該分野でよく知られており、三環フェノキサジン類縁体および汎用塩基（Ｂｅｒｇｅｒら，Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２０００，２８：２９１１−１４，参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられるが、これらに限定されない。糖、ヌクレオシドおよび核酸塩基模倣物の合成方法は、当業者によく知られている。
【００６３】
本明細書で使用される、用語「ヌクレオシド」は、ヌクレオシド、無塩基ヌクレオシド、修飾ヌクレオシド、および模倣物塩基および／または糖類を持つヌクレオシドを含む。
【００６４】
本発明において、用語「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマーまたはポリマーであるアンチセンス化合物を言う。この用語は、天然起源のおよび非天然起源の核酸塩基、糖および共有ヌクレオシド間結合で構成され、可能であれば、さらに非核酸結合体を含むオリゴヌクレオチドを含む。
【００６５】
本発明は、たとえば、リン酸ジエステルおよびチオリン酸エステルヌクレオシド間結合を含むヌクレオシド間結合を形成するのに有用な反応性リン基を有する化合物を提供する。本発明の前駆体またはオリゴマー化合物の製造および／または精製方法は、本発明の組成物または方法の限定ではない。ＤＮＡ、ＲＮＡおよび本発明のアンチセンス化合物の合成および精製方法は、当業者によく知られている。
【００６６】
本明細書で使用される用語「キメラアンチセンス化合物」は、同じアンチセンス化合物内の別の糖、核酸塩基およびヌクレオシド間結合と比べて、示差的に修飾された、糖、核酸塩基および／またはヌクレオシド間結合を少なくとも１個有するアンチセンス化合物を言う。糖、核酸塩基およびヌクレオシド間結合の残りは、独立して、修飾されてもよく、非修飾であってもよいが、ただし、これらは、示差的に修飾された部分（複数を含む）から識別可能である。一般的に、キメラアンチセンス化合物は、孤立した位置にあってもよいし、特定のモチーフを規定する領域に一塊となってもよい修飾ヌクレオシドを持つ。修飾および／または模倣物基の任意の組み合わせは、本発明のキメラアンチセンス化合物を含みうる。
【００６７】
キメラアンチセンス化合物は、普通、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞摂取の増加および／または標的核酸に関する結合親和性の増加を与えるように修飾された領域を少なくとも１つ含む。アンチセンス化合物の付加的な領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを開裂しうる酵素のための基質として作用してもよい。一例として、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を開裂する細胞エンドヌクレア−ゼである。したがって、ＲＮアーゼＨの活性化は、ＲＮＡ標的の開裂の結果となり、それによって、遺伝子発現の抑制の効率を大きく促進する。その結果、キメラを用いた場合、より短いアンチセンス化合物データについて、たとえば、同じ標的領域にハイブリダイゼーションするチオリン酸エステルデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、匹敵する結果をしばしば得ることができる。ＲＮＡ標的の開裂は、ゲル電気泳動、もし必要なら、当該分野で公知の関連核酸ハイブリダイゼーション技術を使用して、日常的に測定することができる。
【００６８】
あるキメラおよび非キメラアンチセンス化合物は、特定のモチーフを持つものとして、さらに説明することができる。本発明で使用される用語「モチーフ」は、類似した、または示差的に修飾された、または修飾されていないヌクレオシドに関連して、アンチセンス化合物中の修飾糖部分および／または糖模倣物基の種類を言う。本発明で使用される用語「糖類」、「糖部分」および「糖模倣物基」は、相互互換的に使用される。そのようなモチーフとして、ギャップモチーフ、交互モチーフ、完全修飾モチーフ、ヘミマーモチーフ、ブロッカーモチーフおよび位置的に修飾されたモチーフが挙げられるが、これらに限定されない。核酸塩基の配列および構造ならびにヌクレオシド間結合のタイプは、アンチセンス化合物のモチーフの決定において要因ではない。
【００６９】
本発明の１態様では、アンチセンス化合物は、１以上の共役基によって共有結合によって修飾されている。共役基は、可逆性結合または付加逆性結合によって結合してもよい。共役基は直接アンチセンス化合物に結合してもよいし、またはリンカーを使用して結合してもよい。リンカーは、１官能性または２官能性リンカーであってもよい。そのような結合方法およびリンカーは当業者によく知られている。一般的に、共役基は、アンチセンス化合物に結合し、１以上の特性を変性する。そのような考えは、当業者によく知られている。
【００７０】
ＮＡＦＬＤおよび代謝症候群
用語「非アルコール性肝臓脂肪症疾患」（ＮＡＦＬＤ）は、肝細胞内での単純なトリグリセリド蓄積（肝臓脂肪症）から炎症を伴う肝臓脂肪症（脂肪性肝炎）、線維化および肝硬変までの範囲の疾患領域を包含する。非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、トリグリセリドの堆積が進み、ＮＡＦＬＤの進行を経ておこる。壊死、炎症および線維化を誘発しうる二次打撃は、ＮＡＳＨの発症を必要とする。二次打撃の対象は、広いカテゴリー（酸化ストレスの増加をもたらす要因および炎症性サイトカンの発現を促進する要因）に分類しうる。肝臓トリグリセリドの増加は、動物およびヒトの肝細胞中の酸化的ストレスの増加をもたらし、肝臓トリグリセリド蓄積、酸化的ストレスおよびＮＡＳＨへの肝臓脂肪症の進行との間の可能性のある因果関係を示していることが示唆されてきた（ＢｒｏｗｎｉｎｇおよびＨｏｒｔｏｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２００４，１１４，１４７−１５２）。高トリグリセリド血症および高脂肪酸血症は、周辺組織中にトリグリセリドの蓄積をもたらす可能性がある（Ｓｈｉｍａｍｕｒａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００４，３２２，１０８０−１０８５）。
【００７１】
「代謝症候群」は、代謝に由来する脂質および非脂質循環器リスク要因の集まりと定義される。インシュリン耐性として知られる、全身的な代謝障害と深くかかわる。全米コレステロール教育プログラム（ＮＣＥＰ）成人治療パネルＩＩＩ（ＡＴＰＩＩＩ）は、５つのリスク決定子のうち３つ以上が存在する場合、代謝症候群の診断用の基準を定めた。５つのリスク決定子は、男で１０２ｃｍを超え、女で８８ｃｍを超えるウエスト周りとして規定される腹部の肥満、１５０ｍｇ／ｄＬ以上のトリグリセリド濃度、男で４０ｍｇ／ｄＬ未満、女で５０ｍｇ／ｄＬ未満のＨＤＬコレステロールレベル、１３０／８５ｍｍＨｇ以上の血圧、および１１０ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時血糖値である。これらの決定子は臨床現場で容易に測定することができる（ＪＡＭＡ，２００１，２８５，２４８６−２４９７）。
【００７２】
組み合わせ
本発明の組成物は、２種以上のアンチセンス化合物を含むことができる。他の関連実施形態では、本発明の組成物は、１種以上のアンチセンス化合物、特に、第一核酸に標的されたオリゴヌクレオチドと、第二核酸標的に標的された付加的なアンチセンス化合物を１種以上とを含むことができる。あるいは、本発明の組成物は、同じ核酸標的の異なる領域に標的されたアンチセンス化合物を２種以上含むことができる。２種以上の組み合わされた化合物は一緒に使用してもよいし、連続的に使用してもよい。
【００７３】
併用治療
本発明の化合物は、状態の治療のために、付加的な効果を１種以上の本発明の化合物と１種以上の別の適切な治療／予防化合物とを投与することによって達成する併用治療において使用されてもよい。１種以上の治療／予防化合物を、ＡＣＣ１またはＡＣＣ２のアンチセンス抑制剤の１種以上と組み合わせて、付加的な治療効果を達成してもよい。
【００７４】
オリゴマー合成
修飾されたおよび修飾されていないヌクレオシドのオリゴマー化は、ＤＮＡ（Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ｅｄ．Ａｇｒａｗａｌ（１９９３），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）および／またはＲＮＡ（Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００１），２３，  ２０６−２１７．Ｇａｉｔら，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎ  ＲＮＡ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｅｄ．Ｓｍｉｔｈ（１９９８），１−３６．Ｇａｌｌｏら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２００１），５７，５７０７−５７１３）に関する文献記載の方法にしたがって日常的に行うことができる。
【００７５】
本発明のアンチセンス化合物は、固相合成の周知の技術によって都合よくおよび日常的に生成することができる。そのような合成のための設備は、数社の専門業者、たとえば、アプライドバイオシステムズ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって販売されている。当該分野で知られているそのような合成のための別の手段のいかなるものも、追加してあるいは代わりに使用してもよい。チオリン酸エステルおよびアルキル化誘導体のようなオリゴヌクレオチドを生成するための類似の技術を使用することはよく知られている。本発明は、オリゴマー合成の方法によって限定されない。
【００７６】
オリゴマー精製および分析
オリゴヌクレオチドの精製および分析の方法は、当業者に知られている。分析方法として、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）およびエレクトロスプレイ質量分光法が挙げられる。このような合成および分析方法は、マルチウェルプレート上で行うことができる。本発明の方法は、オリゴマー精製の方法によって限定されない。
【００７７】
限定ではない開示および参照による組み込み
本発明のある化合物、組成物および方法を、具体性をもって、ある実施形態に従って説明してきたが、本明細書の例示は、単に本発明の化合物を説明するためだけに挙げたもので、本発明はこれらに限定されるものではない。本願に列挙した参考文献、ジェンバンク（登録商標）受託番号などは、それぞれ、参照によってその全体が本明細書に組み込まれるものである。
【実施例】
【００７８】
実施例１  アッセイの調整
ＡＣＣ１またはＡＣＣ２の発現の調整は、当該分野で公知の種々の方法によってアッセイすることができる。ＡＣＣ１またはＡＣＣ２ｍＲＮＡの濃度は、たとえば、ノーザンブロット分析法、競合ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）またはリアルタイムＰＣＲによって定量することができる。ＲＮＡ分析は、全体の細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ上で、当該分野で公知の方法によって行うことができる。ＲＮＡの分離方法は、たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻，ｐ４．１．１〜４．２．９および４．５．１〜４．５．３，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９３で教示されている。
【００７９】
ノーザンブロット分析法は、当該分野では通常のものであり、たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻，ｐ４．２．１〜４．２．９，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９６で教示されている。リアルタイム定量法（ＰＣＲ）は、ＰＥ−アプライドバイオシステムズ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡから市販されているＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００配列検出システムを使用し、および製造業者の指示書に従って、簡単に達成することができる。
【００８０】
ＡＣＣ１またはＡＣＣ２によってコードされているタンパク質の濃度は、当該分野で周知の種々の方法、たとえば、免疫沈降法、ウェスタンブロット分析法（免疫ブロット法）、ＥＬＩＳＡまたは蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）を使用して定量することができる。ＡＣＣ１またはＡＣＣ２によってコードされたタンパク質に関する抗体は、抗体のＭＳＲＳカタログ（エリー社，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＭＩ）のような種々のソースから識別し入手することができ、あるいは従来の抗体生成法によって製造することができる。ポリクローナル抗血清を生成する方法は、たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻，ｐ１１．１２．１〜１１．１２．９，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７に教示されている。モノクローナル抗体の生成は、たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻，ｐ１１．４．１〜１１．１１．５，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７に教示されている。
【００８１】
免疫沈降法は、当該分野で標準的なものであり、たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻，ｐ１０．１６．１〜１０．１６．１１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９８．で見つかる。ウェスタンブロット（免疫ブロット）分析は、当該分野で標準的なものであり、たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻，ｐ１０．８．１〜１０．８．２１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７で見つかる。酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）は、当該分野で標準的なものであり、たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻，ｐ１１．２．１〜１１．２．２２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９１で見つかる。
【００８２】
本発明のアンチセンス化合物の標的核酸発現における効果は、標的核酸が測定可能な濃度で存在すれば、種々の細胞タイプのいかなるものでも試験することができる。本発明のアンチセンス化合物の標的核酸発現における効果は、たとえば、ＰＣＲまたはノーザンブロット分析法を使用して日常的に測定することができる。細胞ラインは、通常組織および細胞タイプの両方から、および種々の障害（たとえば、過剰増殖性障害）と関連する細胞から、誘導される。複数の組織および種から誘導される細胞ラインは、それぞれ、たとえば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、日本癌研究資源銀行（東京，日本）または応用微生物学研究センター（Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）から得られる。
【００８３】
第一細胞、動物から分離され、連続培養を受けていないこれらの細胞は、当該分野で公知の方法に従って生成することができ、あるいは種々の商業的供給者より得ることができる。さらに、第一細胞は、臨床設定におけるヒトドナー対象（すなわち、献血者、手術患者）から得られたものも含む。第一細胞は、当該分野で公知の方法により生成してもよく、または商業上の供給者、たとえば、ステムセルテクノロジーズ；ゼン−バイオ社（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，ＮＣ）；キャンブレックスバイオサイエンシーズ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）；インビトロテクノロジーズ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）；カスケードバイオロジーズ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）；アドバンスドビオテクノロジーズ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）から得ることもできる。
【００８４】
細胞のタイプ
アンチセンス化合物の標的核酸発現における効果を以下の細胞の種類で試験した。
ｂ．ＥＮＤ：
マウス脳内皮細胞ラインｂ．ＥＮＤを、マックスプランク研究所（Ｂａｄ  Ｎａｕｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＷｅｒｎｅｒ  Ｒｉｓａｕ博士から得た。ｂ．ＥＮＤ細胞を、ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清（インビトロジェンライフテクノロジーズ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を加えた高グルコース（インビトロジェンライフテクノロジーズ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で、常法で培養した。約９０％の集密度に達した時、細胞を、常法により、トリプシン処理および希釈によって継代させた。アンチセンス化合物トランスフェクション実験での使用のために、細胞を９６−ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ＃３５３８７２，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に、密度約３０００細胞／ウェルで接種した。
【００８５】
Ａ５４９：
ヒト肺がん細胞ラインＡ５４９を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得た。Ａ５４９細胞を、ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００マイクログラム／ｍｌのストレプトマイシン（インビトロジェンライフテクノロジーズ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を加えた高グルコース（インビトロジェンライフテクノロジーズ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中、常法で培養した。約９０％の集密度に達した時、細胞を、常法により、トリプシン処理および希釈によって継代させた。アンチセンス化合物トランスフェクション実験での使用のために、細胞を、９６−ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ＃３８７２）に、密度約５０００細胞／ウェルで接種した。
【００８６】
初代マウス肝細胞：
初代マウス肝細胞を、チャールスリバー研究所から購入したＣＤ−１マウスから、常法により、調製した。初代マウス肝細胞を、常法で、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／トレプトマイシン、１％抗生物質−抗有糸分裂薬（インビトロジェンライフテクノロジーズ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）および１０ｎＭのウシインシュリン（シグマ−アルドリッチ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加えた肝細胞添加培地中で培養した。アンチセンス化合物トランスフェクション実験での使用のために、細胞を、０．ｌｍｇ／ｍｌコラーゲンを塗布した９６−ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ＃３５３８７２，ＢＤバイトサイエンシーズ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に、密度約１０，０００細胞／ウェルで接種した。
【００８７】
アンチセンス化合物での処理
細胞が適正な密集度に達した時、これらを、記載したトランスフェクション方法を使用して、オリゴヌクレオチドで処理した。当該分野で公知の別の適切なトランスフェクション試薬として、ＬｌＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）およびＦＵＧＥＮＥ（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されない。当該分野で公知の別の適切なトランスフェクション方法として、電気穿孔法が挙げられるが、これに限定されない。
【００８８】
ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）
細胞が６５〜７５％の集密度に達した時、これらを、オリゴヌクレオチドで処理した。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）−１還元血清培地（インビトロジェンライフテクノロジーズ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で、オリゴヌクレオチドをＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（インビトロジェンライフテクノロジーズ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と混合し、１００ｎＭのオリゴヌクレオチド当たり、オリゴヌクレオチドの所望の濃度と、２．５または３μｇ／ｍＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）濃度を達成した。このトランスフェクション混合物を、室温で約０．５時間培養した。９６−ウェルプレート中で成長した細胞に関し、ウェルを１００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）−１で１回洗浄し、次いで、１３０μＬのトランスフェクション混合物で処理した。２４−ウェルプレートあるいは別の基準組織培養プレート中で成長した細胞を、適正な容量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して、同様に処理する。細胞を処理し、データを２通りまたは３通り得る。３７℃で約４〜７時間の処理の後、トランスフェクション混合物を含む培地を、新しい培養培地と入れ替えた。オリゴヌクレオチド処理から１６〜２４時間後、細胞を採取した。
【００８９】
ＣＹＴＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）
細胞が６５〜７５％の集密度に達した時、これらを、オリゴヌクレオチドで処理した。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）−１還元血清培地（インビトロジェンライフテクノロジーズ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で、オリゴヌクレオチドをＣＹＴＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（ジーンセラピーシステムス，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と混合し、１００ｎＭのオリゴヌクレオチド当たり、オリゴヌクレオチドの所望の濃度と、２または４μｇ／ｍＬのＣＹＴＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）濃度を達成した。このトランスフェクション混合物を室温で約０．５時間培養した。９６−ウェルプレートで成長した細胞に関し、ウェルを１００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）−１で１回洗浄し、次いで、１３０μＬのトランスフェクション混合物で処理した。２４−ウェルプレートあるいは別の基準組織培養プレート中で成長した細胞を、適正な用量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して、同様に処理する。細胞を処理し、データを２通りまたは３通り得る。３７℃で４〜７時間の処理の後、トランスフェクション混合物を含む培地を、新しい培養培地と入れ替えた。オリゴヌクレオチド処理から１６〜２４時間後、細胞を採取した。
【００９０】
コントロールオリゴヌクレオチド
コントロールオリゴヌクレオチドを、特定の細胞ラインに関する最適アンチセンス化合物濃度を測定するために使用する。さらに、本発明のアンチセンス化合物を、アンチセンス化合物スクリーニング実験または表現型アッセイで試験する場合、コントロールオリゴヌクレオチドを、本発明の化合物と並行して試験する。
【００９１】
使用されるオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞ラインにより様々である。特定の細胞ラインに関する最適オリゴヌクレオチド濃度を測定するために、細胞を、濃度の範囲で、陽性コントロールオリゴヌクレオチドで処理する。次いで、標的ｍＲＮＡの８０％抑制となる陽性コントロールオリゴヌクレオチドの濃度を、その細胞ラインの後続試験において、新しいオリゴヌクレオチドのスクリーニング濃度として利用する。８０％抑制が達成されなかった場合、標的ｍＲＮＡの６０％抑制となる陽性コントロールオリゴヌクレオチドの最低濃度を、その細胞ラインの後続試験において、オリゴヌクレオチドスクリーニング濃度として利用する。６０％抑制が達成されなかった場合、その特定の細胞ラインは、オリゴヌクレオチドトランスフェクション試験には不適切であると判断する。コントロールアンチセンスオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１８０７８（ＧＴＧＣＧＣＧＣＧＡＧＣＣＣＧＡＡＡＴＣ，配列番号１９として本明細書に組み込まれる）は、２’−デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャップ」領域で構成され、前記領域は、その両側（５’および３’）が「ウィング」で挟まれている、キメラオリゴヌクレオチドである。前記ウィングは、２’−ＭＯＥヌクレオチドとしても知られている、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで構成されている。ＩＳＩＳ１８０７８は、５’側に５−ヌクレオチドウィングが隣接し、３’側に６−ヌクレオチドが隣接する９−ヌクレオチドギャップ領域を有する。これは、ヒトＪｕｎのＮ−末端キナーゼ−２に標的され、発現の調整をアッセイする際、陽性または陰性コントロールとして使用してもよい。
【００９２】
実施例２
ＡＣＣ１またはＡＣＣ２のｍＲＮＡ濃度のリアルタイム定量的ＰＣＲ分析
ＡＣＣ１またはＡＣＣ２のｍＲＮＡ濃度の定量化は、リアルタイム定量的ＰＣＲにより、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７６００、７７００または７９００配列検出システム（ＰＥ−アプライドバイオシステムズ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用し、製造者の指示書に従って行った。
【００９３】
リアルタイムＰＣＲで用いるプローブおよびプライマーは、標的特異的配列をハイブリダイゼーションするように設計された。プライマーの方法およびプローブ設計は、当該分野で公知である。リアルタイムＰＣＲで使用されるプライマーおよびプローブの設計は、市販のソフトウェア、たとえば、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）、ＰＥアプライドバイオシステムズ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡを使用して、行うことができる。
【００９４】
定量的ＰＣＲ分析の前に、測定される標的遺伝子に特異的なプライマー−プローブセットを、その「多重化される」能力に関して、ＧＡＰＤＨ増幅反応で評価した。分離した後、ＲＮＡを、逐次逆転写酵素（ＲＴ）反応およびリアルタイムＰＣＲに供する。両試験とも同じウェル中で行う。ＲＴおよびＰＣＲ試薬は、インビトロジェンライフテクノロジーズ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から得た。ＲＴ、リアルタイムＰＣＲを、２０μＬのＰＣＲ混合物（２．５×ＰＣＲ緩衝−ＭｇＣｌ２、６．６ｍＭのＭｇＣｌ２、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰがそれぞれ３７５μＭ、フォワードプライマーおよびリバースプライマーがそれぞれ３７５ｎＭ、１２５ｎＭのプローブ、４単位のＲＮアーゼ抑制剤、１．２５単位のＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｔａｑ、５単位のＭｕＬＶ逆転写酵素および２．５×ＲＯＸ色素）を、３０μＬの総ＲＮＡ溶液（２０〜２００ｎｇ）を含む９６−ウェルプレートに添加することによって、同様に行った。ＲＴ反応を、４８℃で３０分培養することによって行った。９５℃で１０分培養し、ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｔａｑを活性化した後、２ステップＰＣＲプロトコルを、９５℃で１５秒（変性）次いで６０℃で１．５分（アニーリング／伸長）のサイクルで、４０サイクル行った。
【００９５】
ＲＴ、リアルタイムＰＣＲによって得られた遺伝子標的定量値は、ＧＡＰＤＨ、発現が一定の遺伝子の発現レベルを使用することによって、あるいはＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（モレキュラルプローブス社，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を使用して、総ＲＮＡを定量することによって、正規化した。ＧＡＰＤＨ発現は、ＲＴ、リアルタイムＰＣＲによって、標的と同時に走査し、多重化または分離してその定量化がおこなわれた。総ＲＮＡは、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ＲＮＡ定量試薬（モレキュラルプローブス社，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を使用して定量した。
【００９６】
１７０μＬのＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）作用試薬（１０ｍＭのトリスＨＣｌおよび１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）中、１：３５０に希釈されたＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）試薬）を、３０μＬの精製細胞ＲＮＡを含む９６−ウェルプレートにピペットで入れた。前記プレートをＣｙｔｏＦｌｕｏｒ４０００（ＰＥアプライドバイオシステムズ）を用い、励起４８５ｎｍおよび放射５３０ｎｍで読んだ。
【００９７】
ＧＡＰＤＨ  ＰＣＲプローブは、５’末端に共有結合するＪＯＥと、３’末端に共有結合するＴＡＭＲＡまたはＭＧＢを有する。ここで、ＪＯＥは、蛍光レポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）色素であり、ＴＡＭＲＡまたはＭＧＢはクエンチャー色素である。いくつかの細胞タイプでは、異なる種からのＧＡＰＤＨ配列に設計されたプライマーおよびプローブを、ＧＡＰＤＨ発現を測定するために使用する。たとえば、ヒトＧＡＰＤＨプライマーおよびプローブセットを、サル由来細胞および細胞ラインにおけるＧＡＰＤＨ発現を測定するために、使用してもよい。
【００９８】
実施例３
ヒトＡＣＣ１発現のアンチセンス減少
一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、表１に挙げた公開された配列を用い、ヒトＡＣＣ１の異なる領域を標的にするよう設計した。化合物を表２に示す。表２の全化合物は、１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャップ」領域で構成され、その両側（５’および３’）が５−ヌクレオチド「ウィング」で挟まれている、長さ２０ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウィングは、２’−ＭＯＥヌクレオチドとしても知られている、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで構成されている。ヌクレオシド（骨格）間結合は、オリゴヌクレオチド全域にわたりチオリン酸エステルである。全シチジン残基は、５−メチルシチジンである。化合物を、遺伝子標的ｍＲＮＡ濃度に関するそれらの効果に関して、本明細書の別の実施例で記載した定量リアルタイムＰＣＲにより、ヒトＡＣＣ１をハイブリダイゼーションするように設計された、以下のプライマー−プローブセットを使用して、分析した。
フォワードプライマー：ＧＧＡＴＧＧＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＧＴＡＡＴＡＧＡ（配列番号２０として本明細書に組み込まれる）
リバースプライマー：ＧＧＧＴＧＡＴＡＴＧＴＧＣＴＧＣＧＴＣＡＴ（配列番号２１として本明細書に組み込まれる）
および、ＰＣＲプローブは、ＦＡＭ−ＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＡＣＴＡＣＧＴＣＣＴＣＡＡＧＣＡＡＡＴＣ−ＴＡＭＲＡ（配列番号２２として本明細書に組み込まれる）である。ここで、ＦＡＭは蛍光色素であり、ＴＡＭＲＡはクエンチャー色素である。
【００９９】
Ａ５４９細胞を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）を使用し、７０ｎＭの開示されたアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した。発現の減少を表２に、％抑制として示す。「Ｎ．Ｄ．」とある場合は、これは測定できないことを示す。コントロールアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１９を使用した。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドが抑制性のある標的領域を、本明細書では、「有効な標的セグメント」と言う。
【０１００】
表２
２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを有するキメラオリゴヌクレオチドによるヒトＡＣＣ１ｍＲＮＡ濃度の減少
【０１０１】
【表２−１】
2008538355.tif 000003
【０１０２】
【表２−２】
2008538355.tif 000004
【０１０３】
【表２−３】
2008538355.tif 000005
好ましいオリゴヌクレオチドおよび標的領域は、ＡＣＣ１において少なくとも約５０％減少をもたらすために十分に活性であったものである。少なくとも約７０％までＡＣＣ１を減少させたオリゴヌクレオチドが特に好ましい。
【０１０４】
好ましい有効標的セグメントは、配列番号７のヌクレオチド２４８３２９〜２４８３４８、配列番号６のヌクレオチド５９９〜６１８および３３１３〜３３２２、ならびに配列番号４のヌクレオチド１０９〜１２８を含む。また、好ましい有効標的セグメントは、配列番号２のヌクレオチド１３６９〜１３８８、２００７〜２０２６、２２６６〜２２８５、２３６２〜２３８１、２３７２〜２３９１、２８３０〜２８４９、２８３５〜２８５４、３３７９〜３３９８、３３８４〜３４０３、３５７５〜３５９４、３９０８〜３９２７、３９６７〜３９８６、３９７２〜３９９１、３９７７〜３９９６、４１２９〜４１４８、４２６１〜４２８０、４４９２〜４５１１、４６９９〜４７１８、４７７７〜４７９６、５２１４〜５２３３、５３１７〜５３３６、５４２４〜５４４３、５９５３〜５９７２、６１０３〜６１２２、６１０８〜６１２７、６１３３〜６１５２、６３８５〜６４０４、６５８０〜６５９９、７０１４〜７０３３、７０１９〜７０３８および９９５８〜９９７７も含む。
【０１０５】
「活性標的セグメント」は、表中の活性があり有効な標的セグメントの任意の２つによって結合されうることが理解される。適切な標的領域は、配列番号２のヌクレオチド５２１４〜６１５２の領域である。この領域内で設計された７個のオリゴヌクレオチドは全て、少なくとも約７０％の減少をもたらした。また、５２１４〜６１５２標的領域の境界内に含まれる活性オリゴヌクレオチドによって規定される標的領域が適切である。
【０１０６】
実施例４
ヒトＡＣＣ２発現のアンチセンス減少
一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、表１に挙げた公開された配列を用い、ヒトＡＣＣ２の異なる領域を標的にするよう設計した。化合物を表３に示す。表３の全化合物は、１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャップ」領域で構成され、その両側（５’および３’）が５−ヌクレオチド「ウィング」で挟まれている、長さ２０ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウィングは、２’−ＭＯＥヌクレオチドとしても知られている、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで構成されている。ヌクレオシド（骨格）間結合は、オリゴヌクレオチド全域にわたりチオリン酸エステルである。全シチジン残基は、５−メチルシチジンである。化合物を、遺伝子標的ｍＲＮＡ濃度に関するそれらの効果に関して、本明細書の別の実施例で記載した定量リアルタイムＰＣＲにより、ヒトＡＣＣ２をハイブリダイゼーションするように設計された、以下のプライマー−プローブセットを使用して、分析した。
フォワードプライマー：ＣＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＡＣ（配列番号１０５として本明細書に組み入れられる）
リバースプライマー：ＧＡＡＧＧＣＴＡＣＣＡＴＧＧＣＴＣＣＣ（配列番号１０６として本明細書に組み入れられる）
およびＰＣＲプローブは、
ＦＡＭ−ＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＡＧＧＣＡＣＡＧＣＡ−ＴＡＭＲＡ（配列番号１０７として本明細書に組み入れられる）である。ここで、ＦＡＭは蛍光色素であり、ＴＡＭＲＡはクエンチャー色素である。
【０１０７】
Ａ５４９細胞を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）を使用し、７０ｎＭの開示されたアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した。「標的部位」は、アンチセンス化合物が設計されていることを示すＡＣＣ２標的配列上の最も５’位よりの部位を言う。発現の減少を表３に、％抑制として示す。「Ｎ．Ｄ．」とある場合は、これは測定できないことを示す。コントロールアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１９を使用した。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドが抑制性のある標的領域を、本明細書では、「有効な標的セグメント」と言う。
【０１０８】
表３
２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを持つキメラオリゴヌクレオチドによるヒトＡＣＣ２の減少
【０１０９】
【表３−１】
2008538355.tif 000006
【０１１０】
【表３−２】
2008538355.tif 000007
好ましいオリゴヌクレオチドおよび標的領域は、ＡＣＣ２において少なくとも約５０％減少をもたらすために十分に活性であったものである。少なくとも約６０％までまたはそれ以上ＡＣＣ２を減少させたオリゴヌクレオチドが特に好ましい。
【０１１１】
好ましい有効な標的セグメントは、配列番号９のヌクレオチド８４４〜８６３、２２２９〜２２４８、２４２３〜２４４２、２７８１〜２８００、２７８６〜２８０５、２８１８〜２８３７、３４２１〜３４４０、３５２９〜３５４８、３５３４〜３５５３、３５６５〜３５８４、４４８１〜４５００、４５３４〜４５５３、５１７２〜５１９１および５９１３〜５９３２を含む。また、好ましい有効な標的セグメントは、配列番号１２の３７７５〜３７９４、５０４６〜５０６５、５３３８〜５３５７、５３８５〜５４０４、５６１４〜５６３３も含む。
【０１１２】
「活性標的セグメント」は、表中の活性があり有効な標的セグメントの任意の２つによって結合されうることが理解される。配列番号９の適切な標的セグメントは、ヌクレオチド２２２９〜２４４２、ヌクレオチド２７８６〜２８３７、ヌクレオチド３５２９〜３５８４およびヌクレオチド４４８１〜４５５３を含む。また、配列番号１２のヌクレオチド５３８５〜５６３３の領域が適切である。
【０１１３】
実施例５
ＡＣＣ１およびＡＣＣ２の発現のアンチセンス減少：Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるインビボ試験
本発明のさらなる実施形態において、アンチセンス化合物は、公開された配列を使用して、マウスＡＣＣ１またはＡＣＣ２を標的にするよう設計され、本明細書で記載した方法を使用して、ｂ．ＥＮＤ細胞または初代マウス肝細胞中、インビトロでスクリーニングされた。使用したプライマー−プローブセットは、マウスＡＣＣ１またはＡＣＣ２にハイブリダイゼーションするように設計された。以下がマウスＡＣＣ２に関するプライマー−プローブセットである。
フォワードプライマー：ＡＧＧＴＧＣＴＣＡＴＣＧＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号２６９として本明細書に組込まれる）
リバースプライマー：ＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＡＴＧＧＡ（配列番号２７０として本明細書に組込まれる）
ＰＣＲプローブ：
ＦＡＭ−ＣＡＴＣＧＣＴＧＣＧＧＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＧＣＧ−ＴＡＭＲＡ（配列番号２７１として本明細書に組込まれる）、ここで、ＦＡＭは蛍光色素であり、ＴＡＭＲＡはクエンチャー色素である。
【０１１４】
以下が、マウスＡＣＣ２に関する他のプライマー−プローブである。
フォワードプライマー：ＧＧＧＣＴＣＣＣＴＧＧＡＴＧＡＣＡＡＣ（配列番号２７２として本明細書に組込まれる）
リバースプライマー：ＴＴＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＣＴＧＧＡ（配列番号２７３として本明細書に組込まれる）
ＰＣＲプローブ：
ＦＡＭ−ＣＴＣＴＧＡＴＧＡＧＧＡＣＣＣＴＡＧＴＧＣＣＧＧＣ−ＴＡＭＲＡ（配列番号２７４として本明細書に組込まれる）、
ここで、ＦＡＭは蛍光色素であり、ＴＡＭＲＡはクエンチャー色素である。
【０１１５】
以下が、マウスＡＣＣ１に関するプライマー−プローブである。
フォワードプライマー：ＣＴＧＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡＴＴＡＴＧＴＣＡ（配列番号２７５として本明細書に組込まれる）
リバースプライマー：ＧＧＧＴＴＧＴＣＣＡＧＴＴＧＣＡＴＴＴＴＧ（配列番号２７６として本明細書に組込まれる）
ＰＣＲプローブ：
ＦＡＭ−ＣＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＣＴＴＧＡＣＣＣＴＧＧＣ−ＴＡＭＲＡ（配列番号２７７として本明細書に組込まれる）、ここで、ＦＡＭは蛍光色素であり、ＴＡＭＲＡはクエンチャー色素である。
【０１１６】
数種の活性化合物がマウスにおけるさらなる検討のために選ばれた。
【０１１７】
雄Ｃ５７Ｂ１／６マウスに脂肪含有量が約４％の食餌を給餌し、表４に示すオリゴヌクレオチドを用量１００ｍｇ／ｋｇで１週間に１回の割合で２週間、皮下注射した。表４に、各オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列、標的とする核酸の配列番号、およびオリゴヌクレオチドが相補的である示された配列番号における、最も５’位よりの標的部位を示す。使用したオリゴヌクレオチドの配列を表４に示す。使用したアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャップ」領域から構成され、両側（５’および３’）が、５−ヌクレオチド「ウィング」で挟まれている、長さ２０ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウィングは、２’−ＭＯＥヌクレオチドとしても知られている、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで構成されている。ヌクレオシド（骨格）間結合は、オリゴヌクレオチド全域にわたりチオリン酸エステルである。全シチジン残基は、５−メチルシチジンである。
【０１１８】
表４
【０１１９】
【表４】
2008538355.tif 000008
生理食塩水を注射された動物を、コントロールとして使用する。各処置グループは５匹の動物で構成されていた。処置期間の後、マウスを殺処分し、肝臓および脂肪中の標的濃度を評価した。ＲＮＡ分離および標的ｍＲＮＡ発現レベル定量を、本明細書の別の実施例で記載したＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）を使用して行う。各処置グループの結果を、生理食塩水で処理したコントロールと比較した、標的（ＡＣＣ１またはＡＣＣ２）ｍＲＮＡの％抑制として表５に示す。
【０１２０】
表５
アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理されたマウスの組織内のＡＣＣ１またはＡＣＣ２の減少
【０１２１】
【表５】
2008538355.tif 000009
表５に示すように、配列番号１８６および１９０を有するオリゴヌクレオチドは、ＡＣＣ２濃度よりＡＣＣ１濃度においてより大きな減少をもたらした。配列番号１８９および１８８の配列を有するオリゴヌクレオチドは、ＡＣＣ１濃度よりＡＣＣ２濃度においてより大きな減少をもたらした。配列番号１９０および１９１は、ＡＣＣ１およびＡＣＣ２の両方の濃度において、減少をもたらし、一方、配列番号１９２は、脂肪において、ＡＣＣ１およびＡＣＣ２の両方の濃度で類似の減少をもたらした。
【０１２２】
グルコース代謝における標的抑制の効果を、本発明のアンチセンス化合物で処理したマウスについて評価した。血漿グルコースを、処置の開始時と、処置の２週間後に測定した。結果を、各処置グループに関し、平均血漿グルコース濃度として、表６に示す。グルコース濃度は、通常の臨床方法、たとえばＹＳＩグルコース分析器（ＹＳＩサイエンティフィック，Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＯＨ）を使用して測定した。
【０１２３】
表６
Ｃ５７ＢＬ／６マウス中の血漿グルコース濃度におけるＡＣＣ１またはＡＣＣ２減少の効果
【０１２４】
【表６】
2008538355.tif 000010
表６に示すように、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、血漿グルコース濃度を減少させた。本発明の他の実施形態は、本発明のアンチセンス化合物を投与することによって、動物の血漿グルコースを低下させる方法である。
【０１２５】
実施例６
ＡＣＣ２に標的されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果：正常マウスにおけるインビボ評価
一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、表１に挙げた公開された配列を用い、ＡＣＣ２の異なる領域を標的にするよう設計した。使用したオリゴヌクレオチドの配列を表７に示す。この実験で使用した全てのオリゴヌクレオチドは、１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャップ」領域で構成され、その両側（５’および３’）が５−ヌクレオチド「ウィング」で挟まれている、長さ２０ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウィングは、２’−ＭＯＥヌクレオチドとしても知られている、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで構成されている。ヌクレオシド（骨格）間結合は、オリゴヌクレオチド全域にわたりチオリン酸エステルである。全シチジン残基は、５−メチルシチジンである。化合物を、標準げっ歯類食餌で保たれたＣ５７Ｂ１／６マウスにおける遺伝子標的ｍＲＮＡ濃度に関するそれらの効果について分析した。
【０１２６】
Ｃ５７Ｂ１／６マウスに、表７に示す配列を有するオリゴヌクレオチドを用量１００ｍｇ／ｋｇ／週間で、３週間毎週皮下注射した。生理食塩水を注射した動物をコントロールとして用いた。各処置グループは５匹の動物で構成されていた。処置期間の後、マウスを殺処分し、肝臓中の標的濃度を評価した。ＲＮＡ分離および標的ｍＲＮＡ発現レベル定量を、本明細書の別の実施例で記載したように行う。各処置グループの結果を、生理食塩水で処理したコントロールに対する測定した標的（ＡＣＣ１またはＡＣＣ２）ｍＲＮＡの％抑制として表７に示す。「標的部位」は、アンチセンス化合物が設計された、示されたＡＣＣ２標的配列上の最も５’位よりの部位を言う。発現における減少を、％抑制として表７に示す。
【０１２７】
表７
２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを有するキメラオリゴヌクレオチドによるマウスＡＣＣ２またはマウスＡＣＣ１の減少−インビボスクリーニング
【０１２８】
【表７】
2008538355.tif 000011
表７に示されるように、ＡＣＣ１またはＡＣＣ２に標的されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＣＣ１、ＡＣＣ２またはＡＣＣ１およびＡＣＣ２の両方の発現を減少させることができる。標的ｍＲＮＡの抑制に起因する生理学的効果を評価するために、マウスを、処置期間の終了時に、血漿トリグリセリド、血漿コレステロールおよび血漿トランスアミナーゼ濃度に関してさらに評価した。トリグリセリド（ＴＲＩＧ）およびコレステロール（ＣＨＯＬ）を、実験の開始時（第０週）と試験終了時（第３週）に、通常の臨床分析装置（たとえば、Ｏｌｙｍｐｕｓ臨床アナライザー，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）によって測定した。グルコース濃度を、グルコースアナライザー、たとえば、ＹＳＩグルコースアナライザー（ＹＳＩサイエンティフィック，Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＯＨ）を使用して測定した。各処置グループに関し、平均血漿グルコース濃度を表８にｍｇ／ｄＬで示す。測定結果を表８に、処置グループごとに平均濃度として示す。コレステロールとトリグリセリド濃度をｍｇ／ｄＬで示す。
【０１２９】
表８
血漿トリグリセリド、コレステロールにおけるＡＣＣ２に標的されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果
【０１３０】
【表８−１】
2008538355.tif 000012
【０１３１】
【表８−２】
2008538355.tif 000013
体重を、試験の間中モニターした。試験の間の体重の増加に関して、アンチセンスオリゴヌクレオチドを受けた動物と生理食塩水で処理されたコントロール動物は同様であった。また、ひ臓、肝臓および脂肪組織の重さも試験の終了時にモニターした。生理食塩水で処理されたコントロール動物に関し、肝臓、脂肪およびひ臓の重さは、それぞれ、平均で、約１ｇ、約０．３ｇおよび約０．２ｇであった。ＡＣＣ２に標的されたアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された動物に関しては、肝臓、脂肪およびひ臓の重さは、それぞれ、約１〜３ｇ、約０．１〜０．４ｇおよび約０．１〜０．２ｇの範囲であった。
【０１３２】
実施例７
ＡＣＣ１およびＡＣＣ２の発現のアンチセンス抑制効果：食事誘発性肥満のマウスモデルにおけるインビボ試験
雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１２週間６０％脂肪食餌を与え、その後、表９に記載したオリゴヌクレオチドを、５０ｍｇ／ｋｇ／週の用量で、６週間毎週皮下注射した。高脂肪食を与え、生理食塩水を注射した、またはスクランブルコントロールオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１４１９２３（ＣＣＴＴＣＣＣＴＧＡＡＧＧＴＴＣＣＴＣＣ、配列番号２１２として本明細書に組込まれる）を注射した動物を、コントロールとして使用した。他のコントロールとして、通常の固形試料を与えられた動物に、同様に、生理食塩水を注射した。表９に示されたＩＳＩＳ１４１９２３およびオリゴヌクレオチドは、１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャップ」領域で構成され、その両側（５’および３’）が５−ヌクレオチド「ウィング」で挟まれている、長さ２０ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウィングは、２’−ＭＯＥヌクレオチドとしても知られている、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで構成されている。ヌクレオシド（骨格）間結合は、オリゴヌクレオチド全域にわたりチオリン酸エステルである。全シチジン残基は、５−メチルシチジンである。
【０１３３】
表９
【０１３４】
【表９】
2008538355.tif 000014
各処置グループは、７匹の動物で構成された。処置期間の後、マウスを殺処分し、肝臓の標的濃度を評価した。ＲＮＡ分離および標的ｍＫＮＡ発現レベル定量化は、本明細書の別の実施例で記載するように行う。表１０に、各処置グループの結果を、コントロール（高脂肪を与え、生理食塩水で処理したコントロールから測定した標的ＡＣＣ１またはＡＣＣ２ｍＲＮＡ）に対するパーセントとして示す。
【０１３５】
表１０
ＡＣＣ１またはＡＣＣ２に標的された、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された高脂肪供給マウスにおけるＡＣＣ１またはＡＣＣ２発現の減少
【０１３６】
【表１０】
2008538355.tif 000015
表１０に示されるように、ＡＣＣ１またはＡＣＣ２に標的されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、インビボで、標的発現レベルを減少させる。
【０１３７】
前記試験中、体重および餌消費量をモニターした。各処置グループの累積餌消費量は、生理食塩水で処理した、高脂肪供給マウスと類似していた。試験の開始時（第０週）および終了時（第６週）に測定した各処置グループの平均体重を表１１に示す。
【０１３８】
表１１
アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した動物の体重
【０１３９】
【表１１】
2008538355.tif 000016
また、試験終了時に、ひ臓、肝臓および精巣上体脂肪パッドの重さも測定した。脂肪パッドの重さは、生理食塩水で処理した高脂肪供給動物またはコントロールオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１４１９２３で処理した動物に比べて、ＡＣＣ１またはＡＣＣ２を標的するアンチセンス化合物で処理した動物において減少していた。総合すれば、これらの結果は、ＡＣＣ１またはＡＣＣ１およびＡＣＣ２の両方のアンチセンス抑制は、食事誘発性肥満の動物モデルにおいて、体重または餌消費量を変化させることなく、脂肪パッド重の減少を引きおこすことを示している。したがって、本発明の別の実施形態は、本発明のアンチセンス化合物を投与することによって、過脂肪蓄積を減少させる方法、肥満を治療する方法、および動物における食事誘発性肥満を治療する方法を含む。
【０１４０】
標的ｍＲＮＡの抑制に起因する生理的効果を評価するために、処置された食事誘発性肥満マウスの血漿トリグリセリド、血漿コレステロール、ならびに血漿ＨＤＬおよびＬＤＬを、試験の開始時（第０週）、処置の第３週の間（第３週）、および処置の第５週の間（第５週）、さらに、測定した。血漿トリグリセリドおよびコレステロールは、常法的な臨床分析装置（たとえば、Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）によって測定した。各処置グループに関し、平均血漿トリグリセリド（ＴＲＩＧ）、コレステロール（ＣＨＯＬ）、ＬＤＬおよびＨＤＬ濃度を、表１２にｍｇ／ｄＬで示す。
【０１４１】
表１２
高脂肪食餌を与えられたマウスにおける、血漿脂質濃度に関する、アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果
【０１４２】
【表１２】
2008538355.tif 000017
表１２に示されるように、配列番号１８６および２１０の配列を有するオリゴヌクレオチドは、試験の間中、血漿コレステロール濃度の減少をもたらした。したがって、本発明の他の実施形態は、本発明のアンチセンス化合物を投与することによって、動物のコレステロール濃度を低下させる方法である。配列番号１８６を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、試験の間中、ＬＤＬ濃度を減らす結果にもなった。したがって、本発明の他の実施形態は、本発明のアンチセンス化合物を投与することによって、動物のＬＤＬ濃度を低下させる方法である。
【０１４３】
組織のトリグリセリド濃度を、ロッシュダイグノスティックス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から入手したトリグリセリドＧＰＯアッセイを使用して測定した。肝臓トリグリセリド濃度は、評価する肝臓脂肪症または肝臓中の脂質の蓄積を評価するために使用する。生理食塩水で処置され高脂肪を供給されたコントロール動物で測定した肝臓トリグリセリド濃度に正常化した場合、コントロールＩＳＩＳ１４１９２３での処置は、肝臓トリグリセリドを３５％まで減少させ、通常の固形試料を与えられた、生理食塩水処置マウスは、肝臓トリグリセリドを高脂肪供給相当物より８２％低下させた。配列番号１８６、２１０または１９３を有するオリゴヌクレオチドで処置された高脂肪供給動物は、それぞれ、６７％、７０％および４６％の減少を示した。配列番号１９９、２０６または２０７での処置は、それぞれ、４４％、４６％または７１％の減少をもたらした。したがって、ＡＣＣ１およびＡＣＣ２を減少させるアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、肝臓トリグリセリド含有量を減らす。本発明の別の実施形態は、肝臓トリグリセリドを低下させる方法、および本発明のアンチセンス化合物を投与することによって、動物の肝臓脂肪症を改善させる方法を含む。
【０１４４】
また、グルコースおよびインシュリン代謝における標的抑制の効果も、本発明のアンチセンス化合物で処置された食事誘発性肥満マウスにおいて評価した。血漿グルコースを、処置の開始時、処置の２週間および５週間後に測定した。血漿インシュリンを、処置の開始時、処置の２週間後、５週間後に同様に測定した。
【０１４５】
グルコース負荷試験も行った。マウスに１ｇ／ｋｇのデキストロースの腹腔内注射し、血中グルコース濃度をグルコース投与前、および３０分の間隔で２時間測定した。グルコース濃度は、グルコースアナライザー、たとえば、ＹＳＩグルコースアナライザー（ＹＳＩサイエンティフィック，Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＯＨ）を使用して測定し、インシュリン濃度は、（Ｗｉｎｄｈａｍ，ＮＨ）から得たＡｌｐｃｏインシュリン−特異的ＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。グルコース代謝における変化を、血中グルコース濃度を各時間点でプロットし、作成した濃度曲線下面積と比較することによって、分析した。コントロールと比較して、処置グループに、濃度曲線下面積で実質的な違いは観察されず、すなわち、グルコース負荷は、ＡＣＣ１またはＡＣＣ２に標的されたアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置により、改善も悪化もしなかった。アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置された動物に関して、供給されたまたは絶食させたものの血中グルコース濃度に実質的な変化は観察されなかった。試験の間中、生理食塩水処置コントロール高脂肪供給マウスにおいて、供給されたインシュリン濃度は、約４から６ｎｇ／ｍＬに増加した。対照的に、配列番号１８６、２１０または１９３の配列番号の配列を持つアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置では、試験の間中、インシュリン濃度の約４から３ｎｇ／ｍＬへの減少がもたらされた。同様に、配列番号１９９または２０７を持つオリゴヌクレオチドによる処置では、インシュリン濃度の約３ｎｇ／ｍＬから約１ｎｇ／ｍＬへの減少がもたらされた。配列番号２０６の配列を持つオリゴヌクレオチドによる処置は、約５ｎｇ／ｍＬから約１ｎｇ／ｍＬへの減少をもたらした。したがって、本発明の他の実施形態は、本発明のアンチセンス化合物を投与することによって、血漿インシュリン濃度における減少として測定される、動物におけるインシュリン感応性を改善する方法である。
【０１４６】
身体組成を、試験の開始時（第０週）、治療の第３週の間（第３週）、および処置期間の終点（第６週）に、体脂肪量および脂肪なし重さのＤＥＸＡスキャン測定によって分析した。表１３に各処置グループに関し、平均体脂肪率として結果を示す。
【０１４７】
表１３
高脂肪食餌を与えられたマウスの身体組成
【０１４８】
【表１３】
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表１３に示されるように、ＡＣＣ１にＡＣＣ２標的されたオリゴヌクレオチドは、高脂肪供給において、体重を減少させる。本発明の他の実施形態は、本発明のアンチセンス化合物を投与することにより、動物の過脂肪蓄積または体脂肪を減少させる方法である。
【０１４９】
実施例８
ＡＣＣ１およびＡＣＣ２の発現のアンチセンス減少の効果：ｏｂ／ｏｂマウスにおけるインビボ試験
レプチンは、食欲を調整する脂肪により産生されるホルモンである。ヒトおよび非ヒト動物の両方において、このホルモンの欠乏は肥満を招くが、ｏｂ／ｏｂマウスは、肥満および過血糖症となるレプチン遺伝子において突然変異を有する。このように、これらのマウスは、肥満および糖尿病について検討するため、およびこれらの状態を治療するべく設計された処置について検討するために、有用なモデルである。本発明によれば、本発明のアンチセンス化合物を、肥満および糖尿病のｏｂ／ｏｂモデルにおいて試験する。
【０１５０】
雄Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ−Ｌｅｐ  ｏｂ／ｏｂマウス（ジャクソンラボラトリー，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、表１４に示す配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、５０ｍｇ／ｋｇ／週の用量で６週間、毎週皮下注射した。使用したオリゴヌクレオチドは、１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャップ」領域で構成され、その両側（５’および３’）が５−ヌクレオチド「ウィング」で挟まれている、長さ２０ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウィングは、２’−ＭＯＥヌクレオチドとしても知られている、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで構成されている。ヌクレオシド（骨格）間結合は、オリゴヌクレオチド全域にわたりチオリン酸エステルである。全シチジン残基は、５−メチルシチジンである。
【０１５１】
生理食塩水注射動物をコントロールとして使用した。各処置グループは６匹の動物で構成された。
【０１５２】
表１４
【０１５３】
【表１４】
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処置期間後、マウスを殺処分し、肝臓の標的濃度を評価した。ＫＮＡ分離および標的ｍＲＮＡ発現レベル定量化は、本明細書の別の実施例で記載されるように行う。表１５に、各処置グループの結果を、生理食塩水処置コントロールに対するパーセントとして示す。
【０１５４】
表１５
ＡＣＣ１またはＡＣＣ２に標的されたアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置されたｏｂ／ｏｂマウスにおけるＡＣＣ１またはＡＣＣ２発現の抑制
【０１５５】
【表１５】
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全処置グループに関して、本発明で記載したように測定した肝臓トリグリセリド濃度は、生理食塩水処置コントロール動物の濃度より低かった。配列番号１８６の核酸塩基配列を持つオリゴヌクレオチドによる処置は、生理食塩水処置コントロールと比べて、血漿コレステロールおよびＬＤＬ濃度を減少させた。したがって、本発明のアンチセンス化合物のこれらの効果は、レプチン信号伝達とは関係なく得られる。本発明の実施形態は、本発明のアンチセンス化合物を投与することによって、動物の肝臓トリグリセリドを低下させる方法、本発明のアンチセンス化合物を投与することによって、動物の肝臓脂肪症を改善する方法、および本発明のアンチセンス化合物を投与することによって、動物の血漿コレステロールまたはＬＤＬ濃度を低下させる方法を含む。
【０１５６】
実施例９
ヒトＡＣＣ１に設計された２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを持つキメラオリゴヌクレオチド
一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、表１に挙げた公開された配列を用いて、ヒトＡＣＣ１の異なる領域を標的にするよう設計した。前記オリゴヌクレオチドを表１６に示す。表１６の化合物は、全て、１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャップ」領域で構成され、その両側（５’および３’）が５−ヌクレオチド「ウィング」で挟まれている、長さ２０ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウィングは、２’−ＭＯＥヌクレオチドとしても知られている、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドで構成されている。ヌクレオシド（骨格）間結合は、オリゴヌクレオチド全域にわたりチオリン酸エステルである。全シチジン残基は、５−メチルシチジンである。
【０１５７】
表１６
ヒトＡＣＣ１に設計された、２’−ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを持つキメラオリゴヌクレオチド
【０１５８】
【表１６−１】
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【０１５９】
【表１６−２】
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表１６のオリゴヌクレオチドは、遺伝子標的ｍＲＮＡ濃度に関するそれらの効果に関し、ヒトＡＣＣ１にハイブリダイゼーションするように設計されたプライマー−プローブセットを用い、本明細書の別の実施例で記載したように、定量的リアルタイムＰＣＲによって分析してもよい。ＩＳＩＳ３８１７７９、ＩＳＩＳ３８１７８０、ＩＳＩＳ３８１７８１、ＩＳＩＳ３８１７８２、ＩＳＩＳ３８１７８３およびＩＳＩＳ３８１７８４は、配列番号２のヌクレオチド５２１４〜６１５２の適切な標的領域内に包含される。
【配列表】
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