(57)【要約】本発明は、植物および植物細胞におけるストレス耐性を増加させる方法に関し、限定されないが、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、ジノテフラン、ニテンピラム、アセタミプリドまたはチアクロプリドなどのネオニコチノイド化合物が、植物またはこれらの細胞をよりストレス耐性にするように修飾されたゲノムを含む植物またはこれらの細胞、即ち、ストレス耐性となるように工作された植物に適用される。特に、遺伝子改変されたストレス耐性植物またはこれらの細胞と組み合わせた効果的なストレス耐性共力剤は、例えば、イミダクロプリド、チアクロプリド、アセタミプリド、ニテンピラムおよび６−クロロニコチン酸（６−ＣＮＡ）のようなクロロピリジン側鎖を含むネオニコチノイド化合物である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の６−クロロニコチン酸または式（Ｉ）
【化１】
2008545421.tif 000013
（式中、
Ｈｅｔは、いずれの場合でも、フッ素、塩素、メチルまたはエチルによって場合により一置換または多置換される複素環を表し、この複素環は、次記の複素環の群：ピリド−３−イル、ピリド−５−イル、３−ピリジニオ、１−オキシド−５−ピリジニオ、１−オキシド−５−ピリジニオ、テトラ−ヒドロフラン−３−イル、チアゾール−５−イルから選択され、
Ａは、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、−Ｎ（Ｒ１）（Ｒ２）またはＳ（Ｒ２）を表わし、ここで、
Ｒ１は、水素、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、フェニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、Ｃ３−Ｃ６−シクロアルキル、Ｃ２−Ｃ６−アルケニルまたはＣ２−Ｃ６−アルキニルを表わし、および
Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ２−Ｃ６−アルケニル、Ｃ２−Ｃ６−アルキニル、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ３またはベンジルを表わし、
Ｒは、水素、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ２−Ｃ６−アルケニル、Ｃ２−Ｃ６−アルキニル、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ３もしくはベンジルを表わし、またはＲ２と一緒になって以下の基：−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−を表わし、および
Ｘは、Ｎ−ＮＯ２、Ｎ−ＣＮまたはＣＨ−ＮＯ２を表わす。）
で表わされる化合物を植物もしくはこの遺伝子座または前記植物の種子に適用することを含み、前記植物がストレス耐性となるように工作された植物であることを特徴とする、植物におけるストレス耐性を増加させる方法。
【請求項２】
前記ストレス耐性となるように工作された植物が、ストレス耐性を増加させる外因性遺伝子を含むトランスジェニック植物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記外因性遺伝子が、ＰＡＲＰ阻害性ＲＮＡ分子をコードする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記外因性遺伝子が、機能可能なように連結されている下記のＤＮＡ断片：
ａ．植物にて発現可能なプロモータ；
ｂ．配列番号１のヌクレオチド配列、配列番号２のヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド配列、配列番号４のヌクレオチド配列、配列番号５のヌクレオチド配列または配列番号６のヌクレオチド配列から選択される２０個の連続するヌクレオチドのうち少なくとも１９個を含むＰＡＲＰ阻害性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ領域；および
ｃ．転写終結およびポリアデニル化ＤＮＡ領域
を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記外因性遺伝子が、機能可能なように連結されている下記のＤＮＡ断片：
ａ．植物にて発現可能なプロモータ；
ｂ．配列番号１のヌクレオチド配列、配列番号２のヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド配列、配列番号４のヌクレオチド配列、配列番号５のヌクレオチド配列または配列番号６のヌクレオチド配列の相補体から選択される２０個の連続するヌクレオチドのうち少なくとも１９個を含むＰＡＲＰ阻害性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ領域；および
ｃ．転写終結およびポリアデニル化ＤＮＡ領域
を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記外因性遺伝子が、機能可能なように連結されている下記のＤＮＡ断片：
ａ．植物にて発現可能なプロモータ；
ｂ．ＰＡＲＰ阻害性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ領域（前記ＲＮＡ分子は、
ｉ．配列番号１のヌクレオチド配列、配列番号２のヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド配列、配列番号４のヌクレオチド配列、配列番号５のヌクレオチド配列または配列番号６のヌクレオチド配列から選択される２０個の連続するヌクレオチドのうち少なくとも１９個を含むセンスヌクレオチド配列；および
ｉｉ．前記センスヌクレオチド配列における前記少なくとも２０個の連続するヌクレオチドに相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンスヌクレオチド配列
を含み；
ｉｉｉ．前記センスおよびアンチセンスヌクレオチド配列は二本鎖ＲＮＡ領域を形成することができる。）；および
ｃ．転写終結およびポリアデニル化ＤＮＡ領域
を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記アンチセンスヌクレオチド配列が、前記センスヌクレオチド配列に約９５％の配列同一性を有するまたは前記センスヌクレオチド配列と同一である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記外因性遺伝子が、ＰａｒＧ阻害性ＲＮＡ分子をコードする、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記外因性遺伝子が、機能可能なように連結されている下記のＤＮＡ断片：
ａ．植物にて発現可能なプロモータ；
ｂ．配列番号７のヌクレオチド配列、配列番号８のヌクレオチド配列、配列番号９のヌクレオチド配列または配列番号１０のヌクレオチド配列から選択される２０個の連続するヌクレオチドのうち少なくとも１９個を含むＰＡＲＧ阻害性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ領域；および
ｃ．転写終結およびポリアデニル化ＤＮＡ領域
を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記外因性遺伝子が、機能可能なように連結されている下記のＤＮＡ断片：
ａ．植物にて発現可能なプロモータ；
ｂ．配列番号７のヌクレオチド配列、配列番号８のヌクレオチド配列、配列番号９のヌクレオチド配列または配列番号１０のヌクレオチド配列から選択される２０個の連続するヌクレオチドのうち少なくとも１９個を含むＰＡＲＧ阻害性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ領域；および
ｃ．転写終結およびポリアデニル化ＤＮＡ領域
を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記外因性遺伝子が、機能可能なように連結されている下記のＤＮＡ断片：
ａ．植物にて発現可能なプロモータ；
ｂ．ＰＡＲＧ阻害性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ領域（前記ＲＮＡ分子は、
ｉ．配列番号７のヌクレオチド配列、配列番号８のヌクレオチド配列、配列番号９のヌクレオチド配列または配列番号１０のヌクレオチド配列から選択される２０個の連続するヌクレオチドのうち少なくとも１９個を含むセンスヌクレオチド配列；および
ｉｉ．前記センスヌクレオチド配列における前記少なくとも２０個の連続するヌクレオチドに相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンスヌクレオチド配列
を含み；
ｉｉｉ．前記センスおよびアンチセンスヌクレオチド配列は二本鎖ＲＮＡ領域を形成することができる。）；および
ｃ．転写終結およびポリアデニル化ＤＮＡ領域
を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記アンチセンスヌクレオチド配列が、前記センスヌクレオチド配列に約９５％の配列同一性を有するまたは前記センスヌクレオチド配列と同一である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記外因性遺伝子が、ニコチンアミダーゼ、ニコチネートホスホリボシルトランスフェラーゼ、ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドシンテターゼから選択されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドサルベージ合成経路の植物機能酵素をコードする、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記外因性遺伝子が、配列番号１１のヌクレオチド配列、配列番号１２のヌクレオチド配列、配列番号１３のヌクレオチド配列、配列番号１４のヌクレオチド配列、配列番号１５のヌクレオチド配列、配列番号１６のヌクレオチド配列、配列番号１７のヌクレオチド配列、配列番号１８のヌクレオチド配列、配列番号１９のヌクレオチド配列、配列番号２０のヌクレオチド配列、配列番号２１のヌクレオチド配列または配列番号２２のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ネオニコチノイド類から選択される前記化合物がイミダクロプリドである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ネオニコチノイド類から選択される前記化合物がクロチアニジンである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ネオニコチノイド類から選択される前記化合物がチアクロプリドである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ネオニコチノイド類から選択される前記化合物がニテンピラムである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ネオニコチノイド類から選択される前記化合物がアセタミプリドである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物が６−クロロニコチン酸である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項２から１４のいずれか一項に記載の、ストレス耐性となるように工作された植物のストレス耐性を増加させるための、請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項２２】
請求項１に記載の化合物で処理された、請求項２から１４のいずれか一項に記載のストレス耐性となるように工作された植物の種子。
【請求項２３】
請求項２から１４のいずれか一項に記載のストレス耐性となるように工作された植物の種子が、６−クロロニコチン酸または請求項１に記載の式（Ｉ）で表わされる化合物の有効量とともに植えられる土壌を処理することを含む、植物におけるストレス耐性を増加させる方法。
【請求項２４】
前記植物が、前記トランスジェニックのストレス耐性双子葉植物もしくは単子葉植物、これらの植物細胞または種子である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記種子が、０．１ｇ／種子１００ｋｇから１０００ｇ／種子１００ｋｇの量の請求項１に記載の化合物で処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記植物が、１０ｇから１６００ｇ／ヘクタールの請求項１に記載の化合物で処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
ａ．請求項１に記載の化合物、および
ｂ．請求項２から１４のいずれか一項に記載の、ストレス耐性となるように工作された植物または前記植物の種子
を少なくとも含む容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
限定されないが、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、ジノテフラン、ニテンピラム、アセタミプリドまたはチアクロプリドなどのネオニコチノイド化合物が、植物またはこれらの細胞をよりストレス耐性にさせるために修飾されたゲノムを含む植物またはこれらの細胞（すなわち、ストレス耐性となるように工作された植物）に適用される、植物および植物種子におけるストレス耐性を増加させる方法が提供される。特に、遺伝子改変されたストレス耐性植物またはこれらの細胞と組み合わせる有効なストレス耐性共力剤は、例えば、イミダクロプリド、チアクロプリド、アセタミプリド、ニテンピラムおよび６−クロロニコチン酸（６−ＣＮＡ）のようなクロロピリジン側鎖を含むネオニコチノイド化合物である。
【背景技術】
【０００２】
ストレス耐性となるように工作された植物は、当分野において知られている。植物細胞および植物におけるストレス耐性は、例えば、ＷＯ００／０４１７３Ａ１およびＰＣＴ／ＥＰ２００４／００３９９５にそれぞれ記載されている内因性ポリ−ＡＤＰ−リボースポリメラーゼ（ＰａｒＰ）またはポリ（ＡＤＰ−リボース）グリコヒドロラーゼ（ＰａｒＧ）の活性またはレベルを低下させることによって達成することができる。このようにして、ストレス状態に晒されている植物細胞における致命的なＮＡＤおよびＡＴＰ枯渇は、外傷性の細胞死をもたらすものの、回避されまたは十分に先送りにされ、ストレスを受けた細胞が生存し、ストレス状態に順応することができると考えられている。
【０００３】
欧州特許出願第０４０７７６２４．７には、植物および植物細胞におけるストレス耐性は、例えば、植物に過剰発現させるために、ＮＡＤサルベージ合成経路および／またはＮＡＤデノボ合成経路に関与する酵素をコードするヌクレオチド配列を用いることによって達成されることが記載されている。
【０００４】
昆虫防除以外の目的で植物にネオニコチノイド類の化合物を適用することがまた、当分野で知られている（ＷＯ０１／２６４６８Ａ２、ＷＯ０３／０９６８１１Ａ１）。
【０００５】
ＷＯ０１／２６４６８Ａ２は、ネオニコチノイド類から選択される少なくとも１つの化合物を植物またはこの遺伝子座に適用することを含む植物の成長を改善する方法を開示している。
【０００６】
ＷＯ０３／０９６８１１Ａ１には、植物の種子をネオニコチノイド化合物で処理することによって、昆虫防除目的のために殺虫剤の使用の必要性を示すレベルより昆虫侵入レベルが下回る場所において、農業植物の収率および／または活力が増すかまたは改善することができることを記載している。この方法は、非トランスジェニック植物、および改変したバチラス・ツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）デルタ−内毒素タンパク質の生成物をコードする外来遺伝子を有する植物に有用であると考えられている。しかしながら、当技術は、従来技術に説明されるようなストレス耐性植物の健康および活力を増加させ、その上、化合物の適用によってストレス耐性となるようにすでに工作された植物のストレス耐性をさらに増加させる可能性については依然として沈黙したままである。
【発明の開示】
【０００７】
したがって、簡単に、本技術は、植物および／またはこの植物の生育地、植物細胞またはこのような植物が成長する種子をネオニコチノイド化合物で処理することを含む、ストレス耐性となるように組換えられている植物および植物細胞のストレス耐性を増加させる新規な方法に関する。
【０００８】
本発明はまた、植物および／または植物の生育地、植物細胞またはこのような植物が成長する種子をネオニコチノイド化合物で処理することを含む、ストレス耐性となるように組換えられている植物および植物細胞の健康および活力を増加させる新規な方法に関する。
【０００９】
本発明はまた、ストレス耐性植物が成長する、ネオニコチノイド化合物で処理されている新規な種子に関する。
【００１０】
詳細な説明
本明細書中で使用するとき、「ストレス耐性となるように工作された植物」または「ストレス耐性となるように工作された植物細胞」とは、外因性のストレス耐性増加遺伝子、またはこのような外因性のストレス耐性増加遺伝子に対応する内因性遺伝子の変異体を含む外来ＤＮＡを含有する植物またはこれらの細胞および種子を意味する。この変異体は植物細胞またはこのような変異体を内在させている植物に、より強いストレス耐性をもたらす。
【００１１】
本発明によれば、ストレス耐性となるように組換えられている植物のストレス耐性、健康および活力は、有効量のネオニコチノイド化合物で植物または植物の種子および／または植物の生育地を処理することによって増加できることが見い出された。驚くべきことに、このようなネオニコチノイド化合物は、それぞれの野生型植物よりすでにストレス耐性である植物のストレス耐性および健康の増加を引き起こす能力を有している。この効果は、ＷＯ０１／２６４６８Ａ２に説明されるような植物に適用される場合のネオニコチノイドの成長増加特性の付加された効果、および所与の植物の工作されたストレス耐性由来の効果に依存することのみから期待され得る効果をさらに超えている。この効果は、上述したネオニコチノイドの標的物である昆虫の存在とは無関係である。したがって、この効果は、植物もしくは植物細胞または成長する種子のストレス耐性の生化学的な改善と関連付けられる。この効果はこのような工作された植物および植物細胞の遺伝子工作されたストレス耐性を増加することが見い出された。
【００１２】
本明細書中で使用するとき、「ストレス耐性」とは、例えば、化合物（例えば、除草剤、防かび剤、殺虫剤、植物成長調節剤、アジュバント、肥料）の塗布、非生物的ストレス（例えば、干ばつ、強い光状態、極端な温度、オゾンおよび他の大気汚染物質、土壌塩分または重金属）への曝露、または生物的ストレス（例えば、真菌、ウイルス、細菌、昆虫、線虫、マイコプラズマおよびマイコプラズマ様微生物による感染を含む病原体または害虫感染）によって、ストレスが植物に適用される場合、組換えられていない植物と比較して、ストレスに対するより良好な耐性を意味する。
【００１３】
本発明の一実施形態では、ストレス耐性となるように組換えられている植物もしくは植物細胞、またはこのような植物が成長する種子のストレス耐性および健康を増加させるのに有用な方法が記載され、前記方法は、有効量の式（Ｉ）：
【００１４】
【化２】
2008545421.tif 000002
（式中、
Ｈｅｔは、いずれの場合でも、フッ素、塩素、メチルまたはエチルによって場合により一置換または多置換される複素環を表し、この複素環は、下記の複素環群：
ピリド−３−イル、ピリド−５−イル、３−ピリジニオ、１−オキシド−５−ピリジニオ、１−オキシド−５−ピリジニオ、テトラ−ヒドロフラン−３−イル、チアゾール−５−イルから選択され、
Ａは、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、−Ｎ（Ｒ１）（Ｒ２）またはＳ（Ｒ２）を表わし、ここで、
Ｒ１は、水素、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、フェニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、Ｃ３−Ｃ６−シクロアルキル、Ｃ２−Ｃ６−アルケニルまたはＣ２−Ｃ６−アルキニルを表わし、および
Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ２−Ｃ６−アルケニル、Ｃ２−Ｃ６−アルキニル、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ３またはベンジルを表わし；
Ｒは、水素、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ２−Ｃ６−アルケニル、Ｃ２−Ｃ６−アルキニル、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ３もしくはベンジルを表わし、またはＲ２と一緒になって以下の基：
−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−を表わし、および
Ｘは、Ｎ−ＮＯ２、Ｎ−ＣＮまたはＣＨ−ＮＯ２を表わす。）
で表わされるネオニコチノイド化合物を前記植物および／またはこの生育地、植物細胞または前記植物が成長する種子に適用することを含む。
【００１５】
アルキルまたはアルケニルなどの飽和または不飽和の炭化水素ラジカルは、いずれの場合でも、これが可能である限り、直鎖であるかまたは分岐であり得、ヘテロ原子と組み合わせて、例えばアルコキシを含む。
【００１６】
これらの化合物は、殺虫力を有することが知られている（例えば、ＥＰ−Ａ１−１９２  ６０６、ＥＰ−Ａ２−５８０  ５３３、ＥＰ−Ａ２−３７６  ２７９、ＥＰ−Ａ２−２３５  ７２５を参照されたい。）。
【００１７】
言及することができる式（Ｉ）の好ましい化合物は、「Ｔｈｅ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｍａｎｕａｌ」，１３ｔｈ，２００３（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ）に列挙されているネオニコチノイドである。
【００１８】
非常に特に好ましい化合物は、式：
【００１９】
【化３】
2008545421.tif 000003
で表わされるイミダクロプリドであり、例えば、ＥＰ  Ａ１  ０  １９２  ０６０により知られている。
【００２０】
さらに非常に特に好ましい化合物は、式：
【００２１】
【化４】
2008545421.tif 000004
で表わされるアセタミプリドであり、例えば、ＷＯ  Ａ１  ９１／０４９６５により知られている。
【００２２】
さらに非常に特に好ましい化合物は、式：
【００２３】
【化５】
2008545421.tif 000005
で表わされるチアクロプリドであり、例えば、ＥＰ  Ａ２  ０  ２３５  ７２５により知られている。
【００２４】
さらに非常に特に好ましい化合物は、式：
【００２５】
【化６】
2008545421.tif 000006
で表わされるニテンピラムであり、例えば、ＥＰ  Ａ２  ０  ３０２  ３８９により知られている。
【００２６】
さらに好ましい化合物は、式：
【００２７】
【化７】
2008545421.tif 000007
で表わされるクロチアニジンであり、例えば、ＥＰ  Ａ２  ０  ３７６  ２７９により知られている。
【００２８】
さらに好ましい化合物は、式：
【００２９】
【化８】
2008545421.tif 000008
で表わされるチアメトキサムであり、例えば、ＥＰ  Ａ２  ０  ５８０  ５５３により知られている。
【００３０】
さらに好ましい化合物は、式：
【００３１】
【化９】
2008545421.tif 000009
で表わされるジノテフランであり、例えば、ＥＰ  Ａ１  ０  ６４９  ８４５により知られている。
【００３２】
イミダクロプリドは、本発明による方法で使用するための特に好ましい化合物である。クロチアニジンはまた、本発明の明細書において好ましい化合物として言及されるべきである。
【００３３】
本発明の別の実施形態では、ストレス耐性となるように組換えられている植物もしくは植物細胞、またはこのような植物が成長する種子のストレス耐性および健康を増加させるのに有用である方法が記載され、式：
【００３４】
【化１０】
2008545421.tif 000010
で表わされる６−クロロニコチン酸（ナイアシン、ＣＡＳ  ＮＯ：５３２６−２３−８）の有効量を前記植物および／またはこの生育地、植物細胞または前記植物が成長する種子に適用することを含む。
【００３５】
６−クロロニコチン酸は、この基、例えば、イミダクロプリド、チアクロプリド、アセタミプリド、ニテンピラムを担持する上述したネオニコチノイドの分解過程に遊離され得る。例えば、イミダクロプリドは、段階的に、一次代謝物である６−クロロニコチン酸に分解され、結局は二酸化炭素に分解される。この代謝物はまた、ストレス耐性となるように工作された植物もしくは植物細胞またはこのような植物が成長する種子のストレス耐性および健康を増加させる。
【００３６】
上述した化合物は、外因性のストレス耐性増加遺伝子またはこのような外因性のストレス耐性増加遺伝子に対応する内因性遺伝子の変異体を含む外来性ＤＮＡを含有する植物またはこれらの細胞および種子のストレス耐性の増加を引き起こし、変異体はこのような変異体を内在させている植物細胞または植物に、より強いストレス耐性をもたらす。
【００３７】
一般に、ストレス耐性の増加は、ストレスを指示するパラメータの少なくとも有意な減少を意味し、このパラメータは、ストレスを受けた未処理の非トランスジェニックの参照植物またはこれらの細胞および種子と、処理されたトランスジェニック参照植物またはこれらの細胞および種子とを比較した場合の形態的、生理的または生化学的な差異のいずれかとして測定することができる。「健康」とは、本明細書中で言及されるように、害虫および疾病を有する植物、これらの細胞および種子の蔓延レベルが有意に低いことを意味し、例えば、存在している個々の害虫種数として、または肉眼で見える病徴発現（例えば、相対的な葉領域減少、葉領域浸漬、葉領域壊死）として計算するかまたは評価することができる。コルビー（Ｃｏｌｂｙ）の式を用いて有意性が明らかにされる。さらに、ストレス状態に対する耐性はまた、ＥＰ０４０７７６２４．７（参照により本明細書中に組み込まれる。）に記載されるストレス条件下で、ＮＡＤ（Ｈ）レベル（ストレスを受けた対照の植物よりもストレスを受けた耐性のある植物において依然として高い。）および活性酸素種（ストレスを受けた対照の植物よりもストレスを受けた耐性のある植物において低い。）を測定することによって評価することができる。
【００３８】
本発明の利点の１つには、本発明に係る化合物およびこの化合物を含む組成物の際立った浸透移行性が、ストレス耐性となるように工作された植物の種子をこれらの組成物で処理することによって、発芽植物および出芽後に現れた植物のストレス耐性が増加することを意味するということである。このように、播種時またはその後すぐに農作物の迅速な処理を省くことができる。
【００３９】
本発明の別の実施形態では、ストレス耐性となるように組換えられている植物もしくは植物細胞またはこのような植物が成長する種子でのストレス耐性および健康を増加させるのに有用である方法が記載され、前記方法は、有効量の式（Ｉ）の化合物を含む組成物を前記植物および／またはこの生育地、植物細胞または前記植物が成長する種子に適用することを含む。
【００４０】
したがって、本発明はまた、本発明に係る式（Ｉ）の化合物を含む組成物を使用するためのこのような組成物に関する。
【００４１】
式（Ｉ）の化合物は、他の活性化合物、例えば、殺虫剤、殺菌剤、ダニ駆除剤、防かび剤などの混合物中にて、商業的に有用な製剤の形態において、またはこのような製剤から調製した適用形態にて用いることができる。これを実施することにより、本発明に係る植物のストレス耐性および健康を改善することに加えて、現存する可能性のある害虫をも退治する組成物が得られる。使用することができる殺虫剤は、例えば、有機リン試薬、カルバメート試薬、カルボン酸塩型化学物質、塩素化炭化水素型化学物質、微生物によって産生される殺虫性物質である。
【００４２】
多くの場合、これは、相乗効果をもたらす。すなわち、混合物の活性は、個々の成分の活性を上回る。このような製剤および適用形態は、一般により少量の有効成分を用いることができるので、商業的および生態学的に特に有用である。しかしながら、共力剤は、活性化合物の作用を増加させる限りにおいて、それ自身必ずしも活性である必要はない。
【００４３】
除草剤などの他に公知の活性化合物との混合物、または毒性緩和剤、肥料および成長調節剤との混合物もまた可能である。
【００４４】
活性化合物による植物および植物部位の本発明に係る処理は、直接実行されるか、または慣用の処理法、例えば、浸水、噴霧、蒸発、雲霧、分散、塗布によって、繁殖原料である場合、特に種子の場合、同様に１以上の被覆剤を適用することによって、化合物がこれらの周囲、環境もしくは貯蔵スペースに作用できるようにさせることによって行われる。
【００４５】
活性化合物は、溶液、乳液、水和剤、懸濁液、粉末、粉塵、ペースト、溶剤、顆粒、懸濁液−乳液濃縮物、活性化合物で含浸された天然および合成材料、および重合物質のマイクロカプセルなどの慣用の製剤に変換することができる。
【００４６】
商業的に有用な製剤または適用形態での本発明の活性化合物の含有量は、広範囲で変化させることができる。商業的製剤から調製される使用形態の活性化合物含量は、広範囲で変化させることができる。
【００４７】
これらの製剤は、公知の方法、例えば、活性化合物を増量剤、換言すれば、液体溶媒および／または固体担体と混合することによって、場合により、界面活性剤、換言すれば、乳化剤および／または分散剤および／または発泡剤を使用して製造される。
【００４８】
使用される増量剤が水であれば、補助溶媒として、例えば有機溶媒を使用することも可能である。原則として、適する液体溶媒は、キシレン、トルエンまたはアルキルナフタレンなどの芳香族化合物、クロロベンゼン、クロロエチレンまたは塩化メチレンなどの塩素化芳香族化合物または塩素化脂肪族炭化水素、シクロヘキサンまたはパラフィンなどの脂肪族炭化水素、例えば石油留分、鉱油および植物油、ブタノールまたはグリコールなどのアルコール、これらのエーテルおよびエステル、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトンまたはシクロヘキサノンなどのケトン、ジメチルホルムアミドおよびジメチルスルホキシドなどの強い極性溶媒、および水である。
【００４９】
固体担体としては、例えば、アンモニウム塩、カオリン、粘土、タルク、チョーク、水晶、アタパルジャイト、モンモリロナイトまたは珪藻土などの地面の天然鉱物、および非常な分散シリカ、アルミナおよびケイ酸塩などの地面の合成鉱物が適している。顆粒用の固体担体としては、例えば、方解石、大理石、軽石、海泡石および白雲石などを砕いて分別した天然石、無機および有機ミールの合成顆粒、およびおがくず、ココナッツの殻、トウモロコシの穂軸およびタバコの茎などの有機材料の顆粒が適している。乳化剤および／または発泡剤としては、非イオン性およびアニオン性乳化剤［例えば、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル（例えばアルキルアリールポリグリコールエーテル）、アルキルスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、アリールスルホン酸塩］およびタンパク質加水分解物が適している。分散剤としては、例えば、リグニン亜硫酸塩排液およびメチルセルロースが適している。
【００５０】
製剤中に、カルボキシメチルセルロースなどの粘着性付与剤、および(粉末の形態、顆粒の形態またはラテックスの形態の)天然および合成高分子（例えばアラビアゴム、ポリビニルアルコールおよびポリ酢酸ビニル)が用いられ得、また、並びにケファリンおよびレシチンなどの天然リン脂質、および合成リン脂質が用いられ得る。他の添加剤は鉱油および植物油であってもよい。
【００５１】
無機色素（例えば酸化鉄、酸化チタンおよびプルシアンブルー）および有機色素（アリザリン色素、アゾ色素および金属フタロシアニン色素など）などの着色剤ならびに、微量栄養素（鉄塩、マンガン塩、ホウ素塩、銅塩、コバルト塩、モリブデン塩および亜鉛塩など）を用いることができる。
【００５２】
本製剤は、一般に、活性化合物の０．１から９８重量％、好ましくは０．１から９０重量％、特に好ましくは活性化合物の０．５から７０重量％を含む。
【００５３】
ネオニコチノイド化合物および６−ＣＮＡによるストレス耐性を増加する有利な効果は、ある適用率で特に強く現れる。しかしながら、活性化合物の適用率は、相対的に広範囲で変化させることができる。一般的に、適用率は、１ｇから１６００ｇ活性化合物／ヘクタール、好ましくは１０ｇから８００ｇ活性化合物／ヘクタール、特に好ましくは１０ｇから６００ｇ活性化合物／ヘクタールである。
【００５４】
前述した通り、本発明の一実施形態は、ストレス耐性となるように組換えられている植物のストレス耐性および健康を増加させるのに有用である方法であり、前記方法は、この植物が成長する種子を含む植物の繁殖原料に有効量の式（Ｉ）の化合物を含む組成物を適用することを含む。植物の繁殖原料は、植付け前に処理されてもよく、例えば、種子は、播種前に処理されてもよい。本発明に係る化合物はまた、種子の穀粒を液体製剤で含浸させるかまたはこれらを固体製剤で被覆させることによって、前記穀粒に適用することができる。この組成物はまた、繁殖原料が植付けられている場合、例えば播種期間中に、植付け部位に適用されてもよい。
【００５５】
したがって、本発明はまた、ストレス耐性となるように工作され、本発明に係る化合物で処理された植物の種子に関する。
【００５６】
種子などの植物の繁殖原料の処理と関連して、有益な適用率は、一般に、処理される材料１００ｋｇ当たり、ネオニコチノイド化合物の１つまたは６−ＣＮＡの０．１から１０００ｇ、特に１から８００ｇ、好ましくは１０から５００ｇである。
【００５７】
本方法に従って改良することができる農作物には、ストレス耐性となるように工作された任意の植物、双子葉種子および単子葉種子の両方、植物細胞、特にコットン、カノーラ、セイヨウアブラナ（ｏｉｌｓｅｅｄ  ｒａｐｅ）、小麦、トウモロコシまたはトウモロコシの実（ｍａｉｚｅ）、大麦、米、オートムギ、ライムギ、ソバ、ライ小麦、サトウキビ、大豆、ヒマワリ、アルファルファ、豆、亜麻、カラシナ、エンドウ、タバコ、ジャガイモ、サツマイモ、ビート、芝草、ソルガム、キビ、アブラナ科野菜、他の野菜（チョウセンアザミ、アスパラガス、ニンジン、セロリ、チコリー、キュウリ、ナス、ニラネギ、レタス、メロン、オクラ、タマネギ、コショウ、カボチャ、大根、ルタバガ、紅花、ホウレンソウ、スカッシュ、トマト、スイカ、ヤムイモ、ズッキーニを含む）、アーモンド、リンゴ、アプリコット、バナナ、ブラックベリー、ブルーベリー、カカオ、シトラス（グレープフルーツ、レモン、オレンジ、キンカン、ライム、マンダリン、タンジェリン、パメロおよびサツママンダリンを含む）、チェリー、ココナッツ、クランベリー、ナツメヤシ、グーズベリー、グレープ、グアバ、キウイ、マンゴー、ネクタリン、パパイヤ、パッションフルーツ、ピーチ、ピーナッツ、西洋ナシ、パイナップル、ペカン、ピスタチオ、プラム、ラズベリー、イチゴ、チャノキ、クルミを含み、また園芸、草花栽培または林業において用いられる植物を含む。
【００５８】
全ての植物および植物部位は、本発明に従って処理することができる。植物部位は、芽、葉、花および根などの植物の全ての地上および地下の部分および器官を意味すると理解されるべきであり、例としては、葉、針状葉、茎、幹、花、子実体、果実、種子、根、塊茎および地下茎であると言うことができる。植物部分はまた、収穫した原料、植物および発生の繁殖原料、例えば、裁断、塊茎、地下茎、子球および種子を含む。これらはまた、用いることができるかまたは本発明に従って植物細胞の形質転換に起因してもよい植物細胞を含む。例えば、植付けまたは播種前に、記載された効果を達成するために、例えば、植付け後の植物および処理された土壌に播種された種子から成長する出芽している植物のストレス耐性を増加させるために、土壌上または土壌中に前述の化合物を適用することもできる。
【００５９】
本発明で言及される植物、植物細胞および種子は、具体的な方法で前記植物のストレス耐性を増加させるように組換えられる。
【００６０】
本発明の一実施形態では、外因性のストレス耐性増加遺伝子は、ＷＯ００／０４１７３Ａ１またはＥＰ０４０７７９８４．５（参照により本明細書中に組み込まれる。）に記載される植物細胞または植物におけるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の発現および／または活性を低下させることができる。
【００６１】
ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）トランスフェラーゼ（ＡＤＰＲＴ）（ＥＣ２．４．２．３０）としても知られ、酵母を除く、脊椎動物、節足動物、軟体動物、粘菌変形菌、渦鞭毛虫、真菌および他の下等真核生物を含む大部分の真核動物に見出される核酵素である。酵素活性はまた、数多くの植物において明らかにされている（Ｐａｙｎｅら、１９７６；ＷｉｌｌｍｉｔｚｅｒおよびＷａｇｎｅｒ、１９８２；Ｃｈｅｎら、１９９４；Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ、１９９５）。
【００６２】
ＰＡＲＰは、標的タンパク質中の主にグルタミン酸残基のカルボキシル基にＮＡＤ＋由来のＡＤＰ−リボース部分を転移を、およびその後、ＡＤＰ−リボース重合を触媒する。主要な標的タンパク質は、ＰＡＲＰそれ自身であるが、またヒストン（高移動度群染色体タンパク質）でもあり、トポイソメラーゼ、エンドヌクレアーゼおよびＤＮＡポリメラーゼも、この修飾の対象であることが示されている。
【００６３】
特定の実施形態として、ストレス耐性増加遺伝子は、機能可能なように連結された下記のＤＮＡ断片：
ａ）植物にて発現可能なプロモータ；
ｂ）転写された場合に、植物の内因性のＰＡＲＰをコードする遺伝子の発現を低下させることができるＲＮＡ分子（ＰＡＲＰ阻害性ＲＮＡ分子）をもたらすＤＮＡ領域；
ｃ）転写終結およびポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域
を含み得る。
【００６４】
言及したＤＮＡ領域は、転写または転写後の形式で、標的植物または植物細胞においてＰＡＲＰをコードする遺伝子の発現を低下させるいわゆるアンチセンスＲＮＡ分子をもたらすことができ、植物細胞または植物に存在するＰＡＲＰをコードする遺伝子のヌクレオチド配列の相補体と少なくとも９５％から１００％の同一性を有する少なくとも２０または２１個の連続するヌクレオチドを含む。
【００６５】
言及したＤＮＡ領域はまた、転写または転写後の形式で、標的植物または植物細胞においてＰＡＲＰをコードする遺伝子の発現を低下させることを含むいわゆるセンスＲＮＡ分子をもたらすことができ、植物細胞または植物に存在するＰＡＲＰをコードする遺伝子のヌクレオチド配列と少なくとも９５％から１００％の同一性を有する少なくとも２０または２１個の連続するヌクレオチドを含む。
【００６６】
しかしながら、ＰＡＲＰをコードする領域の約２０ｎｔのアンチセンスまたはセンスＲＮＡ領域の最小のヌクレオチド配列は、より大きなＲＮＡ分子内に含まれていてもよく、大きさにして約２０ｎｔから標的遺伝子のサイズに等しい長さまで変化する。言及したアンチセンスまたはセンスヌクレオチド領域は、したがって、２１ｎｔ、４０ｎｔ、５０ｎｔ、１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、５００ｎｔ、１０００ｎｔ、２０００ｎｔまたはさらに約５０００ｎｔなどの約２１ｎｔから約５０００ｎｔの長さ、または５０００ｎｔより大きな長さであってよい。さらに、本発明の目的のためには、使用される阻害性ＰＡＲＰ  ＲＮＡ分子のヌクレオチド配列または外因性遺伝子のコーディング領域は、植物細胞においてその発現が低下させられることを目標とする内因性ＰＡＲＰ遺伝子に完全に同一であるかまたは完全に相補的である必要はない。配列が長くなると、全体の配列同一性に対する要求はより緩くなる。したがって、センスまたはアンチセンス領域は、内因性ＰＡＲＰ遺伝子のヌクレオチド配列またはこの相補体に対して約４０％または５０％または６０％または７０％または８０％または９０％または１００％の全体の配列同一性を有し得る。しかしながら、言及したように、アンチセンスまたはセンス領域は、内因性ＰＡＲＰ遺伝子のヌクレオチド配列に対して約１００％の配列同一性を有する２０個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含まなくてはならない。好ましくは、約１００％の配列同一性の範囲は、約５０、７５または１００ｎｔでなくてはならない。
【００６７】
本発明の趣旨において、２つの関連するヌクレオチド配列の「配列同一性」は、パーセントして表現され、同一の残基を有する２つの最適に整列した配列の位置の数（×１００）を比較される位置の数で割ったものを意味する。ギャップ、即ち、残基が１つの配列に存在するがその他の配列には存在しない整列における位置は、一致しない残基のある位置としてみなされる。２つの配列の整列は、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびヴンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、１９７０）によって実行される。コンピュータ支援配列整列は、ギャップ開始ペナルティ５０およびギャップ伸長ペナルティ３を有するデフォルトのスコアリングマトリックスを用いるウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）パッケージ  バージョン１０．１（ジェネティックス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、ウィスコンシン州マディソン、米国）の１つであるＧＡＰなどの標準的なソフトウェアプログラムを用いて都合良く行うことができる。
【００６８】
ＲＮＡ分子のヌクレオチド配列が、対応するＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を参照することにより定義されるときはいつでも、ヌクレオチド配列中のチミン（Ｔ）は、ウラシル（Ｕ）で置換されるべきであることは明確である。ＲＮＡまたはＤＮＡ分子のいずれかが参照されるかどうかは、出願の内容から明らかである。
【００６９】
内因性のＰＡＲＰ遺伝子の発現の低下における上述の外因性遺伝子の効率は、ポリアデニル化されていない異常なＰＡＲＰ阻害性ＲＮＡ分子の発現をもたらすＤＮＡエレメントを含ませることによってさらに高まり得る。この目的に適するこのようなＤＮＡエレメントの１つは、ＷＯ００／０１１３３Ａ１に記載されている自己スプライシングリボザイムをコードするＤＮＡ領域である。
【００７０】
植物細胞の内因性ＰＡＲＰ遺伝子発現の低下における上述した外因性遺伝子の効率はまた、本明細書中に記載されるアンチセンスＰＡＲＰ阻害性ＲＮＡ分子をコードする外因性遺伝子、および本明細書中に記載されるセンスＰＡＲＰ阻害性ＲＮＡ分子をコードする外因性遺伝子を同時に１つの植物細胞に含めることによってさらに上昇させることができる。ここで、前記アンチセンスおよびセンスＰＡＲＰ阻害性ＲＮＡ分子は、ＷＯ９９／５３０５０Ａ１に記載されているように、上述した少なくとも２０個の連続するヌクレオチド間の塩基対によって二本鎖ＲＮＡ領域を形成することができる。
【００７１】
ＷＯ９９／５３０５０Ａ１にさらに記載されているように、二本鎖ＲＮＡ領域を形成することができるセンスおよびアンチセンスＰＡＲＰ阻害性ＲＮＡ領域は、好ましくはスペーサー領域によって分別される１つのＲＮＡ分子中に存在していてよい。このスペーサー領域は、イントロン配列を含むことができる。このような外因性遺伝子は、単離されているかまたは同定されている内因性ＰＡＲＰ遺伝子からの少なくとも２０個のヌクレオチドを含み、その発現が低下されるように方向付けられているＤＮＡ断片を、逆方向反復中に、植物にて発現可能なプロモータならびに転写終結およびポリアデニル化に関係している３’末端形成領域に、機能可能なように連結して都合良く構築することができる。このような外因性遺伝子の構築を達成するために、ＷＯ０２／０５９２９４Ａ１に記載されているベクターを利用することができる。
【００７２】
現在の命名は、古典的なＺｎフィンガーを含有するポリメラーゼをＰＡＲＰ１タンパク質（および対応するｐａｒｐ１遺伝子）と呼び、これに対し、構造的な非古典的なＰＡＲＰタンパク質は、当面、ＰＡＲＰ２（および対応するｐａｒｐ２遺伝子）と呼びおよび本明細書中で使用されるＰＡＲＰをコードする遺伝子は、どちらのタイプについても使用し得る。
【００７３】
実験的に示された推定上のポリＡＤＰ−リボースポリメラーゼタンパク質配列、この部分または相同配列を同定する下記のデータベースの記載は（参照により本明細書中に組み込まれる。）は、本発明に従って使用することができる：ＢＡＤ５３８５５（オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ））；ＢＡＤ５２９２９（オリザ・サティバ）；ＸＰ  ４７７６７１（オリザ・サティバ）；ＢＡＣ８４１０４（オリザ・サティバ）；ＡＡＴ２５８５０（ゼア・マイズ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ））；ＡＡＴ２５８４９（ゼア・マイズ）；ＮＰ  １９７６３９（アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ））；ＮＰ  ８５０１６５（アラビドプシス・タリアナ）；ＮＰ  １８８１０７（アラビドプシス・タリアナ）；ＮＰ  ８５０５８６（アラビドプシス・タリアナ）；ＢＡＢ０９１１９（アラビドプシス・タリアナ）；ＡＡＤ２０６７７（アラビドプシス・タリアナ）；Ｑ１１２０７（アラビドプシス・タリアナ）；Ｃ８４７１９（アラビドプシス・タリアナ）；Ｔ５１３５３（アラビドプシス・タリアナ）；Ｔ０１３１１（アラビドプシス・タリアナ）；ＡＡＮ１２９０１（アラビドプシス・タリアナ）；ＡＡＭ１３８８２（アラビドプシス・タリアナ）；ＣＡＢ８０７３２（アラビドプシス・タリアナ）；ＣＡＡ１０４８２（アラビドプシス・タリアナ）；ＡＡＣ７９７０４（ゼア・マイズ）；ＡＡＣ１９２８３（アラビドプシス・タリアナ）；ＣＡＡ１０８８８（ゼア・マイズ）；ＣＡＡ１０８８９（ゼア・マイズ）；ＣＡＡ８８２８８（アラビドプシス・タリアナ）。
【００７４】
本発明の特定の実施形態として、ＰＡＲＰ遺伝子発現を低下させる遺伝子は、機能可能なように連結されている下記のＤＮＡ断片を含み得る。
ａ）植物にて発現可能なプロモータ、
ｂ）転写された場合、下記を含むＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域：
ａ．配列番号１（アラビドプシスｐａｒｐ１コーディング領域）、配列番号２（アラビドプシスｐａｒｐ２コーディング領域）、配列番号３（ゼア・マイズｐａｒｐ１コーディング領域）、配列番号４（別のゼア・マイズｐａｒｐ１コーディング領域）、配列番号５（ゼア・マイズｐａｒｐ２コーディング領域）もしくは配列番号６（コットンｐａｒｐ２部分ｃＤＮＡ）のヌクレオチド配列から選択されるまたは前述したヌクレオチド配列によってコードされる類似したもしくは同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列から選択される約２０個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列と約９６％の配列同一性を有する少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列。
ｂ．アンチセンスヌクレオチド配列に相補的である少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むセンスヌクレオチド配列。したがって、このセンスヌクレオチド配列は、配列番号１（アラビドプシスｐａｒｐ１コーディング領域）、配列番号２（アラビドプシスｐａｒｐ２コーディング領域）、配列番号３（ゼア・マイズｐａｒｐ１コーディング領域）、配列番号４（別のゼア・マイズｐａｒｐ１コーディング領域）、配列番号５（ゼア・マイズｐａｒｐ２コーディング領域）もしくは配列番号６（コットンｐａｒｐ２部分ｃＤＮＡ）のヌクレオチド配列から選択される、または言及したヌクレオチド配列によってコードされる類似したもしくは同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列から選択される約２０個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列と約９６％の配列同一性を有する少なくとも２０個の連続するヌクレオチドの配列を含み得る。
これによって、センスおよびアンチセンスヌクレオチド配列は、二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）を形成することができる；
ｃ）転写終結およびポリアデニル化のためのＤＮＡ領域。
【００７５】
しかしながら、ＷＯ００／０４１７３またはＥＰ０４０７７９８４．５に記載されている他のＰＡＲＰをコードする遺伝子を用いることができることは明らかである。
【００７６】
ストレス耐性を増加させる本発明の目的はまた、ゲノム中に変異体ＰＡＲＰをコードする遺伝子を含む植物または植物細胞に前記の化合物を適用することによって達成することができ、これによって、ＰＡＲＰ発現および／または活性が、類似植物のＰＡＲＰ発現および／または活性と比較した場合に低下され、これはまた、変異体ＰＡＲＰを有する植物のストレス耐性の増加をもたらそう。このような変異体ＰＡＲＰをコードする遺伝子は、例えば突然変異によって誘導することができ、またはＰＡＲＰをコードする遺伝子の天然に存在する、内在している植物のストレス耐性の増加と相関している対立遺伝子であってもよい。
【００７７】
本発明の別の実施形態において、言及した化合物は、ＷＯ２００４／０９０１４０（参照により本明細書中に組み込まれる。）に記載されているように、植物または植物細胞のＰａｒＧをコードする遺伝子の発現および／または活性を低下させることができる外因性のストレス耐性増加遺伝子を含む植物または植物細胞に適用される。
【００７８】
ＰＡＲＧ（ポリ（ＡＤＰ−リボース）グリコヒドロラーゼ；Ｅ．Ｃ．３．２．１．１４３）は、そのエキソグリコシダーゼ活性およびエンドグリコシダーゼ活性（ＰＡＲＧ）によってポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリマーを遊離ＡＤＰ−リボースに変換する。
【００７９】
植物において、ポリ（ＡＤＰ−リボース）グリコヒドロラーゼは、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）における遺伝子の時間制御転写においておよび植物成長から開花への光照射期に依存した移行において影響を受ける突然変異おいて不活性化された野生型遺伝子のマップに基づくクローニングによって同定されている（ｔｅｊ）。この遺伝子のヌクレオチド配列は、ヌクレオチドデータベースから受入番号ＡＦ３９４６９０により入手可能である（パンダ（Ｐａｎｄａ）ら、２００２年１２月、デベロップメンタル・セル（Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ）、３、５１−６１；配列番号７）。
【００８０】
植物由来の他の植物のＰＡＲＧをコードする遺伝子のヌクレオチド配列、例えば、ソラヌム・ツベロスム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｍ）（配列番号８）；オリザ・サティバ（配列番号９）またはゼア・マイズ（配列番号１０）由来のＰＡＲＧ遺伝子、並びに他の植物由来の更なるＰＡＲＧをコードする遺伝子およびこの変異体を単離する方法などは、ＷＯ２００４／０９０１４０Ａ２に見出すことができる。
【００８１】
したがって、一実施形態において、ストレス耐性となるように工作された植物または植物細胞は、機能可能なように連結されている下記のＤＮＡ断片を含み得る。
ａ）植物にて発現可能なプロモータ、
ｂ）転写された場合、阻害性ＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域［前記ＲＮＡ分子は、
ｉ．アンチセンスヌクレオチド領域（前記アンチセンスヌクレオチド領域は、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０のヌクレオチド配列などのまたは前述のヌクレオチド配列に類似のもしくは前述のヌクレオチド配列と同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列などの、植物ＰＡＲＧタンパク質をコードする塩基配列の相補体から選択される約２０個のヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも約９６％の配列同一性を有する少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含む。）、または
ｉｉ．センスヌクレオチド領域（前記センスヌクレオチド領域は、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０のヌクレオチド配列などのまたは前述のヌクレオチド配列に類似のもしくは前述のヌクレオチド配列に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列などの、植物ＰＡＲＧタンパク質をコードするヌクレオチド配列から選択される少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含む。）、または
ｉｉｉ．サブｉ）またはｉｉ）に記載のアンチセンスヌクレオチド配列およびセンスヌクレオチド配列（前記アンチセンスヌクレオチド配列および前記センスヌクレオチド配列は二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができる。）
を含む。］
ｃ）転写終結およびポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域。
【００８２】
当業者には、センスヌクレオチド配列およびアンチセンス塩基配列またはｄｓＲＮＡ分子の長さについての追加のパラメータは、ならびにＰａｒＧ阻害性ＲＮＡ分子についての配列同一性は、ＰＡＲＰ阻害性ＲＮＡ分子について上述したように用いることができることが直ちに明らかである。
【００８３】
本発明の更なる別の実施形態において、外因性のストレス耐性増加遺伝子は、ＥＰ０４０７７６２４．７（参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されているように、機能可能なように連結されている下記のＤＮＡ分子を含み得る。
ａ）植物にて発現可能なプロモータ、
ｂ）ニコチンアミダーゼ、ニコチネートホスホリボシルトランスフェラーゼ、ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドシンテターゼから選択されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドサルベージ合成経路の植物機能性酵素をコードするＤＮＡ領域；および
ｃ）転写終結およびポリアデニル化に関与する３’末端領域。
【００８４】
本明細書中で使用するとき、「ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドサルベージ合成経路の植物機能性酵素」は、植物に発現可能なプロモータおよびターミネータ領域などの適した調節エレメントに連結され、植物に導入された場合、転写および翻訳されて植物細胞にて機能するＮＡＤサルベージ合成経路の酵素を産生することができる酵素である。ＮＡＤサルベージ合成由来の酵素（およびコードしている遺伝子）が含まれ、これは、植物源から、また、酵母（サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅ））または他の酵母もしくは真菌から入手される。後者のタンパク質は、同様の植物由来酵素が受けるかもしれない酵素的フィードバック調節などを受ける可能性が低いので、本発明に係る方法にさらにより適している可能性があると考えられる。
【００８５】
ＮＡＤサルベージ合成経路に関係する酵素は下記を含む。
−ニコチンアミドのアミド基の加水分解を触媒し、これによってニコチン酸塩およびＮＨ３を放出するニコチンアミダーゼ（ＥＣ３．５．１．１９）。この酵素はまた、ニコチンアミドデアミナーゼ、ニコチンアミドアミダーゼ、ＹＮＤアーゼまたはニコチンアミドアミドヒドロラーゼとして知られている。
【００８６】
−ニコチネートホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．２．１１）。これは、ナイアシンリボヌクレオチダーゼ、ニコチン酸モノヌクレオチドグリコヒドラーゼ；ニコチン酸モノヌクレオチドピロホスホリラーゼ；ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼとしても知られており、下記の反応を触媒する。
ニコチネート−Ｄ−リボヌクレオチド＋二リン酸塩＝ニコチン酸塩＋５−ホスホ−α−Ｄ  リボース  １−ジホスフェート
【００８７】
−ニコチネート−ヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．７．７．１８）。これは、デアミド−ＮＡＤ＋ピロホスホリラーゼ；ニコチネートモノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ；デアミドニコチンアミドアデニンジヌクレオチドピロホスホリラーゼ；ＮａＭＴ−ＡＴａｓｅ；ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼとしても知られており、下記の反応を触媒する。
ＡＴＰ＋ニコチネートリボヌクレオチド＝二リン酸塩＋デアミド−ＮＡＤ＋
−ＮＡＤ−シンターゼ（ＥＣ  ６．３．１．５）。これは、ＮＡＤシンテターゼ；ＮＡＤ＋シンターゼ；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドシンテターゼ；ジホスホピリジンヌクレオチドシンテターゼとしても知られており、下記の反応を触媒する。
デアミド−ＮＡＤ＋＋ＡＴＰ＋ＮＨ３＝ＡＭＰ＋二リン酸塩＋ＮＡＤ＋
【００８８】
本発明の一実施形態において、ＮＡＤサルベージ経路の植物機能性酵素をコードするＤＮＡ領域は、配列番号１１、１２、１３、１４もしくは１５由来のヌクレオチド配列、または上述のヌクレオチド配列によってコードされているタンパク質に類似のもしくは上述のヌクレオチド配列と同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【００８９】
ハント（Ｈｕｎｔ）ら（２００４年）によって説明されているように、これらの酵素の植物相同性が決定され、これらのＤＮＡ配列は、類似の効果に使用することができる（Ｈｕｎｔら、２００４、Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ  １６３（１）：３１−４４）。決定されたＤＮＡ配列は、下記の受入番号：ニコチンアミダーゼに関しては、Ａｔ５ｇ２３２２０（配列番号１６）；Ａｔ５ｇ２３２３０（配列番号１７）およびＡｔ３ｇ１６１９０（配列番号１８）；ニコチネートホスホリボシルトランスフェラーゼに関しては、Ａｔ４ｇ３６９４０（配列番号１９）、Ａｔ２ｇ２３４２０（配列番号２０）；ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼに関しては、Ａｔ５ｇ５５８１０（配列番号２１）およびＮＡＤシンテターゼに関しては、Ａｔ１ｇ５５０９０（配列番号２２）を有する。
【００９０】
しかしながら、ストレス耐性となるように工作された植物はまた、挿入、欠失および置換を含むこれらのヌクレオチド配列の変異体を含み得ることが明確である。同様に、サッカロマイセス・セレビシエとは異なる種由来の前述のヌクレオチド配列に対する相同体を用いることができる。これらは、限定されないが、植物由来のヌクレオチド配列、同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、並びにこのようなヌクレオチド配列の変異体を含む。
【００９１】
記載されたヌクレオチド配列の変異体は、配列表に特定されているヌクレオチド配列などの、ＮＡＤサルベージ経路由来の酵素をコードする、特定されたヌクレオチド配列と好ましくは少なくとも約８０％または８５％または９０％または９５％の配列同一性を有する。好ましくは、これらの変異体は、ＮＡＤサルベージ経路由来の酵素と同じ酵素活性を有する機能性タンパク質をコードする。
【００９２】
本発明の方法は、様々な種類のストレスを誘導する条件（特に、浸水、強い光状態、強い紫外線レベル、過酸化水素レベルの増加、干ばつ状態、高温または低温、塩分状態の増加、除草剤、農薬、殺虫剤の塗布などを含む非生物的ストレス状態）に対する植物または植物細胞の耐性を増加させるために用いることができる。本発明の方法はまた、悪条件下、特に、浸水、強い光状態、強い紫外線レベル、過酸化水素レベルの増加、干ばつ状態、高温または低温、塩分状態の増加などを含む非生物学的ストレス条件下で成長している植物の細胞において、反応性酸素種（ＲＯＳ）レベルを低下させるまたはＮＡＤ＋、ＮＡＤＨ＋もしくはＡＴＰを増加させるために用いることができる。ＲＯＳレベルまたはＮＡＤＨレベルは、実施例に説明されている方法を含む当分野において公知の方法を用いて測定することができる。植物のストレス耐性の増加はまた、ＷＯ９７／０６２６７またはＷＯ０２／０６６９７２に記載されているミトコンドリアの電子流を測定するための方法を用いて分析することができる。
【００９３】
本発明を特定の作用様式に限定することは意図されないが、ネオニコチノイドの代謝物、特に、クロロピリジン側鎖を含むネオニコチノイド化合物の代謝物は、ＮＡＤサルベージ経路に送り込まれ、ＮＡＤレベルのより高産生をもたらすことが期待されている。この点において、ストレス耐性となるように工作された植物にこのような化合物を適用することによって、このような植物細胞におけるストレス条件でのＮＡＤレベルが、ストレス耐性となるように組換えられていない植物細胞の場合よりもすでに有意に高いため、何らかの効果があるとは期待されていなかった。
【００９４】
植物または植物細胞にネオニコチノイド化合物を適用することによってストレス耐性を増加させる本発明の方法は、ストレス耐性となるように工作されたいずれかの植物、双子葉および単子葉植物細胞、限定されないが、コットン、アブラナ科野菜、セイヨウアブラナ、小麦、トウモロコシまたはトウモロコシの実、大麦、ヒマワリ、米、オートムギ、サトウキビ、大豆、野菜（チコリー、レタス、トマトを含む）、タバコ、ジャガイモ、ビート、パパイヤ、パイナップル、マンゴー、アラビドプシス・タリアナ、また園芸、草花栽培または林業に用いられる植物、小麦、オートムギ、大麦、ライムギ、米、芝草、ソルガム、キビまたはサトウキビ植物を含む穀物用植物を含む植物に適していよう。本発明の方法はまた、限定されないが、コットン、タバコ、カノーラ、セイヨウアブラナ、大豆、野菜、ジャガイモ、レムナ（Ｌｅｍｎａ）属種、ニコチアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属種、サツマイモ、アラビドプシス、アルファルファ、大麦、豆、トウモロコシ、コットン、亜麻、エンドウ、セイヨウアブラナ（ｒａｐｅ）、米、ライムギ、紅花、ソルガム、大豆、ヒマワリ、タバコ、小麦、アスパラガス、ビート、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、キュウリ、ナス、レタス、タマネギ、セイヨウアブラナ、コショウ、ジャガイモ、カボチャ、ラディッシュ、ホウレンソウ、スカッシュ、トマト、ズッキーニ、アーモンド、リンゴ、アプリコット、バナナ、ブラックベリー、ブルーベリー、カカオ、チェリー、ココナッツ、クランベリー、ナツメヤシ、グレープ、グレープフルーツ、グアバ、キウイ、レモン、ライム、マンゴー、メロン、ネクタリン、オレンジ、パパイヤ、パッションフルーツ、ピーチ、ピーナッツ、エンドウ、パイナップル、ピスタチオ、プラム、ラズベリー、イチゴ、タンジェリン、クルミおよびスイカを含むいずれかの植物に適用することができる。
【００９５】
本明細書中で使用するとき、「含む」は、言及されている特徴、数値、工程または成分の存在を特定するものとして意図されるべきであり、１以上の特徴、数値、工程もしくは成分、またはこのグループの存在または追加を排除しない。したがって、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列を含む核酸またはタンパク質は、実際に引用されたものよりも多くのヌクレオチドまたはアミノ酸を含むことが可能であり、すなわち、より大きな核酸またはタンパク質に包含することができる。機能的または構造的に定義されているＤＮＡ領域を含む外因性遺伝子は、追加のＤＮＡ領域などを含むことができる。
【００９６】
実施例中で別に提示されない限り、全ての組換えＤＮＡ技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９４年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙの第１巻および第２巻、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ＵＳＡに記載されている標準的なプロトコールに従って行う。植物の分子作業のための標準的な材料および方法は、ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ（英国）およびＢｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、英国、によって共同して出版されたＲ．Ｄ．Ｄ．クロイ（Ｃｒｏｙ）によるＰｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｆａｘ（１９９３）に記載されている。標準的な分子生物学的技術のための他の文献は、サンブロックおよびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）（１９９８）の第Ｉ巻および第ＩＩ巻、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＬａｂＦａｘ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（英国）を含む。ポリメラーゼ連鎖反応のための標準的な材料および方法は、ディーフェンバッハ（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ）およびデヴェクスラー（Ｄｖｅｋｓｌｅｒ）（１９９５）Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、およびマックファーソン（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ）ら（２０００）ＰＣＲ−Ｂａｓｉｃｓ：Ｆｒｏｍ  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｇ  ｔｏ  Ｂｅｎｃｈ、初版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、ドイツに見出すことができる。
【００９７】
本説明および実施例の全体を通じて、下記の配列が参照される。
配列番号１：アラビドプシス・タリアナ由来のｐａｒｐ１をコードする領域。
配列番号２：アラビドプシス・タリアナ由来のｐａｒｐ２をコードする領域。
配列番号３：ゼア・マイズ由来のｐａｒｐ１をコードする領域１。
配列番号４：ゼア・マイズ由来のｐａｒｐ１をコードする領域２。
配列番号５：ゼア・マイズ由来のｐａｒｐ２をコードする領域。
配列番号６：コットン由来のｐａｒｐ２を部分的にコードする領域。
配列番号７：アラビドプシス・タリアナ由来のｐａｒＧをコードする領域。
配列番号８：ソラヌム・ツベロスム由来のｐａｒＧをコードする領域。
配列番号９：オリザ・サティバ由来のｐａｒＧをコードする領域。
配列番号１０：ゼア・マイズ由来のｐａｒＧをコードする領域。
配列番号１１：サッカロマイセス・セレビシエ由来のニコチンアミダーゼのヌクレオチド配列（ＰＮＣ１）。
配列番号１２：サッカロマイセス・セレビシエ由来のニコチネートホスホリボシルトランスフェラーゼのヌクレオチド配列（ＮＰＴ１）（相補体）。
配列番号１３：サッカロマイセス・セレビシエ由来のニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ１（ＮＭＡ１）のヌクレオチド配列。
配列番号１４：サッカロマイセス・セレビシエ由来のニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ２（ＮＭＡ２）のヌクレオチド配列。
配列番号１５：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＮＡＤシンテターゼ（ＱＮＳ１）のヌクレオチド配列。
配列番号１６：アラビドプシス・タリアナ由来のニコチンアミダーゼのヌクレオチド配列（アイソフォーム１）。
配列番号１７：アラビドプシス・タリアナ由来のニコチンアミダーゼのヌクレオチド配列（アイソフォーム２）。
配列番号１８：アラビドプシス・タリアナ由来のニコチンアミダーゼのヌクレオチド配列（アイソフォーム３）。
配列番号１９：アラビドプシス・タリアナ由来のニコチネートホスホリボシルトランスフェラーゼのヌクレオチド配列（アイソフォーム１）。
配列番号２０：アラビドプシス・タリアナ由来のニコチネートホスホリボシルトランスフェラーゼのヌクレオチド配列（アイソフォーム２）。
配列番号２１：アラビドプシス・タリアナ由来のニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼのヌクレオチド配列。
配列番号２２：アラビドプシス・タリアナ由来のＮＡＤシンテターゼのヌクレオチド配列。
【実施例１】
【００９８】
ＮＡＤＨ含有量およびスーパーオキシド含有量の測定プロトコール
水溶性テトラゾリウム塩を用いる細胞内ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ定量
【００９９】
【表１】
2008545421.tif 000011
【０１００】
植物材料
大部分の植物材料、例えば、インビトロで成長したアラビドプシスの芽１４から１８日齢を用いることができるが、セイヨウアブラナの開花および胚軸の外植体ではない。
【０１０１】
細胞計数キット−８（ＣＣＫ−８）
Ｓｏｐａｃｈｅｍ  ｎ．ｖ．／Ｂｅｌｇｉｕｍ、７２Ａ、ラールベークラーン通り（Ａｖｅｎｕｅ  ｄｕ  Ｌａａｒｂｅｅｋｌａａｎ）、１０９０  ブリュッセル、ベルギー。
【０１０２】
含有量
５ミリモル／Ｌ  ＷＳＴ−８（テトラゾリウム塩）、０．２ミリモル／Ｌ  １−メトキシＰＭＳ、１５０ミリモル／Ｌ  ＮａＣｌを含有する５ｍＬボトル；
反応液：１０ｍＬ、２５ｍＭ  Ｋ−リン酸緩衝液ｐＨ７．４；０．５ｍＬ  ＣＣＫ−８；０．１ｍＭ  １−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート（＝１−メトキシフェナジンメトサルフェート）：１μＬ／ｍＬ  １００ｍＭストック（ＭＷ＝３３６．４；２．９７３ｍＬ水中１００ｍｇ）；１滴のＴｗｅｅｎ２０／２５ｍＬ
【０１０３】
手順
植物材料を収穫し、２５ｍＭ  Ｋ−リン酸緩衝液ｐＨ７．４に入れる（例えば、１５０個のセイヨウアブラナの胚軸外植体または１グラムのアラビドプシスの芽（根を含まず））。緩衝液を反応液（１グラムのアラビドプシスの芽に対して１５ｍＬまたは１５０個のアブラナの胚軸外植体に対して１５ｍＬ）と置換する。暗闇で約３０分、２６℃で温置する（反応が続く）。反応液の吸光度を４５０ｎｍで測定する。
【０１０４】
ＸＴＴの還元を定量することによるスーパーオキシド産生の測定
【０１０５】
【表２】
2008545421.tif 000012
【０１０６】
Ａ．ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）
培地および反応緩衝液
播種培養液（培地２０１）：半濃縮ムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ）およびスクーグ（Ｓｋｏｏｇ）塩；２％スクロース、ｐＨ５．８；０．６％寒天（ディフコ・バクト寒天（Ｄｉｆｃｏ  Ｂａｃｔｏ  Ａｇａｒ））；２５０ｍｇ／ｌ  トリアシリン。
【０１０７】
カルス誘導培地Ａ２Ｓ３：ＭＳ培地、０．５ｇ／ｌ  Ｍｅｓ（ｐＨ５．８）、３％スクロース、４０ｍｇ／ｌアデニン−ＳＯ４、０．５％アガロース、１ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄ、０．２５ｍｇ／ｌ  ＮＡＡ、１ｍｇ／ｌ  ＢＡＰ、２５０ｍｇ／ｌトリアシリン。
【０１０８】
反応緩衝液：２５ｍＭ  Ｋ−リン酸緩衝液ｐＨ８；１ｍＭ  ナトリウム・３’｛１−［フェニルアミノ−カルボニル］−３，４−テトラゾリウム｝−ビス（４−メトキシ−６−ニトロ）＝ＸＴＴ（Ｂｉｏ  Ｖｅｃｔｒａ、カナダ）（ＭＷ６７４．５３）。注意深く溶液（±３７℃）を温めてＸＴＴを溶解する（使用前に室温まで冷却する。）。２５ｍｌ緩衝液に対してＴｗｅｅｎ２０を１滴。
【０１０９】
種子の滅菌−種子の予備発芽−種子の成長
種子を７０％エタノール中に２分間浸し、次に、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有する次亜臭素酸ナトリウム溶液（約６％活性塩素を含む。）中で１５分間表面殺菌する。最後に、種子を無菌水道水１ｌによりすすぐ。（発芽を阻害する可能性のある成分を種子から分散できるようにするために）無菌水道水中で少なくとも１時間、種子を温置する。５０ｍｌ無菌水道水（＋２５０ｍｇ／ｌトリアシリン）を含有する２５０ｍｌ三角フラスコに種子を入れる。約２０時間振とうする。幼根が飛び出した種子は、播種培地約１２５ｍｌ（種子１０個／容器、あまり多すぎて汚染によって種子を喪失させないようにする。）を含有するＤｕｃｈｅｆａからのビトロベント（Ｖｉｔｒｏ  Ｖｅｎｔ）コンテナーに入れる。日照時間を１６時間にして±２４℃で１０から３０μアインシュタインｓ−１ｍ−２で種子を発芽させる。切り取らなければならない種子の量の計算については、５胚軸部分／実ばえ。
【０１１０】
胚軸部分外植体の前培養およびストレス誘導
播種後１２から１４日で、胚軸を約７から１０ｍｍ切片に切断する。胚軸外植体（２５胚軸／オプチラックス・ペトリディッシュ（Ｏｐｔｉｌｕｘ  Ｐｅｔｒｉｄｉｓｈ）、Ｆａｌｃｏｎ  Ｓ１００５、デンマーク）を培地Ａ２Ｓ３上で５日間２５℃で培養する（１０から３０μアインシュタインｓ−１ｍ−２）。１条件当たり１５０個の胚軸外植体が用いられる。
【０１１１】
ストレス誘導
それぞれ０、２５および５０ｍｇ／ｌアセチルサリチル酸を含有するＡ２Ｓ３培地に胚軸外植体を移す。日照時間を１６時間にして２５℃、１０から３０μアインシュタインｓ−１ｍ−２で約２４時間インキュベートする。
【０１１２】
ＸＴＴ−アッセイ
１５０個の胚軸外植体を５０ｍｌファルコンチューブに移す。反応緩衝液（ＸＴＴ不含）で洗浄する。２０ｍＬ反応緩衝液＋ＸＴＴを添加する。外植体は浸水させなければならないが、減圧浸潤させない。暗闇中２６℃で温置する。反応培地の吸光度を４７０ｎｍで測定することによって反応を追跡する。
【０１１３】
Ｂ．アラビドプシス・タリアナ
培地および反応緩衝液
植物培地：半濃縮ムラシゲおよびスクーグ塩；ビタミンＢ５；１．５％スクロース；ｐＨ５．８；０．７％ディフコ寒天。
【０１１４】
温置培地：１／２濃縮ＭＳ塩；１％スクロース；０．５ｇ／Ｌ  ＭＥＳ  ｐＨ５．８；２５ｍｌ培地に対してＴｗｅｅｎ２０を１滴。
【０１１５】
反応緩衝液：２５ｍＭ  Ｋ−リン酸緩衝液ｐＨ８；１ｍＭナトリウム・３’−｛１−［フェニルアミノ−カルボニル］−３，４−テトラゾリウム｝−ビス（４−メトキシ−６−ニトロ）＝ＸＴＴ（Ｂｉｏ  Ｖｅｃｔｒａ、カナダ）（ＭＷ６７４．５３）。注意深く溶液（±３７℃）を温めてＸＴＴを溶解する（使用前に室温まで冷却する。）。２５ｍｌ緩衝液に対してＴｗｅｅｎ２０を１滴。
【０１１６】
アラビドプシス植物
アラビドプシス株：対照（試験される株が誘導される母株）；試験するための株。
【０１１７】
アラビドプシス種子の滅菌；２分。７０％エタノール；１０分漂白剤（６％活性塩素）＋２０ｍｌ溶液に対してＴｗｅｅｎ２０を１滴；滅菌水道水で５回洗浄；滅菌は、２ｍｌエッペンドルフチューブ中で行う。アラビドプシス種子は、チューブの底に沈め、１ｍｌ用ピペットマンを用いて液体を除去する。
【０１１８】
種子の予備発芽：１２ｍｌ滅菌水道水を含有する９ｃｍオプチラックス・ペトリディッシュ（ファルコン）中で２４時間まで一晩微光。
【０１１９】
アラビドプシス植物の成長：植物培地±１２５ｍｌを含有するファルコンのインターグリッド組織培養ディスク（３０２５番）に植え付ける：種子１個／グリッド。植物は、２４℃、３０μアインシュタインｓ−１ｍ−２、１６時間日照−８時間暗闇で、（薹立ち前）約１８日間成長させる。アッセイを行うために、植物材料（根を含まない芽）１ｇ／株／条件を必要とする。芽１ｇは４０から６０個の植物と一致する。
【０１２０】
ストレス誘導
パラコート：アラビドプシスの芽（根を含まない。）を収穫する。それぞれ０、５および１０μＭパラコートを含有する温置培地に芽１ｇを入れる（芽は浸水させなければならないが、減圧浸潤させない。）。温置培地：ファルコンのインターグリッド組織培養ディスク（３０２５番）中に±１５０ｍｌ。暗闇中２４℃で±２４時間および３０から５０μアインシュタインｓ−１ｍ−２で日照１６時間温置する。
【０１２１】
強い光：植物の半分を強い光（２５０μアインシュタインｓ−１ｍ−２）に移し、４から２０時間温置する。
【０１２２】
ＸＴＴ−アッセイ
寒天プレート（強い光のストレス）または液体温置培地（除草剤によるストレス）から芽（根を含まない。）を収穫し、反応緩衝液（ＸＴＴ不含）を含有する５０ｍｌファルコンチューブにこれらを入れる。反応緩衝液はＸＴＴ（１５ｍＬ／グラム）を含有する緩衝液と置換される。芽は浸水させなければならないが、減圧浸潤させない。暗闇中２６℃で温置する。反応培地の吸光度を４７０ｎｍで測定することによって反応を追跡する（約１時間）。
【実施例２】
【０１２３】
ストレス耐性を増加させるトランスジェニック遺伝子を含む植物にネオニコチノイド化合物を適用した後のストレス耐性の分析
ＷＯ００／０４１７３Ａ１（例えば、実施例８）に記載されているように、内因性ＰＡＲＰ遺伝子を減少させることができるｄｓＲＮＡ分子をコードするトランスジェニック遺伝子を含むアブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物を種々の濃度のイミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、アセタミプリド、ニテンピラム、ジノテフラン、６−クロロニコチン酸およびチアクロプリドにより処理し、様々なストレス条件、特に、高−低温、強い光の強度もしくは干ばつストレスまたはこれらの組合せに晒す。
【０１２４】
処理後、これら植物は、未処理のトランスジェニック対照植物、および同じ方法で上述の化合物で処理される非トランスジェニック同系植物と比較して生存および損傷に関して視覚的に記録される。活性酸素種、ＮＡＤおよびＡＴＰレベルを測定し、対照植物と比較する。
【０１２５】
化合物で処理されたトランスジェニックのアブラナ科植物は、未処理のトランスジェニック対照植物より良好にストレス条件を切り抜ける。ＲＯＳレベルは、未処理のトランスジェニックのアブラナ科植物よりも処理されたトランスジェニックのアブラナ科植物において低いが、ＮＡＤまたはＡＴＰレベルは高い。
【０１２６】
ＷＯ００／０４１７３Ａ１に記載されているように、内因性ＰＡＲＰ遺伝子を減少させることができるｄｓＲＮＡ分子をコードするトランスジェニック遺伝子を含むトウモロコシ植物を種々の濃度のイミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、アセタミプリド、ニテンピラム、ジノテフラン、６−クロロニコチン酸およびチアクロプリドで処理し、様々なストレス条件、特に、高−低温、強い光の強度もしくは干ばつストレスまたはこれらの組合せに晒す。
【０１２７】
処理後、これら植物は、未処理のトランスジェニック対照植物、および同じ方法で上述の化合物で処理された非トランスジェニック同系植物と比較して生存および損傷に関して視覚的に記録される。活性酸素種、ＮＡＤおよびＡＴＰレベルを測定し、対照植物と比較する。
【０１２８】
化合物で処理されたトランスジェニックのトウモロコシ植物は、未処理のトランスジェニック対照植物より良好にストレス条件を切り抜ける。ＲＯＳレベルは、未処理のトランスジェニックのトウモロコシ植物よりも処理されたトランスジェニックのトウモロコシ植物において低いが、ＮＡＤまたはＡＴＰレベルは高い。
【０１２９】
ＥＰ０４０７７９８４．５に記載されているように、内因性ＰＡＲＰ遺伝子を減少させることができるｄｓＲＮＡ分子をコードするトランスジェニック遺伝子を含む綿植物を種々の濃度のイミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、アセタミプリド、ニテンピラム、ジノテフラン、６−クロロニコチン酸およびチアクロプリドで処理し、様々なストレス条件、特に、高−低温、強い光の強度もしくは干ばつストレスまたはこれらの組合せに晒す。
【０１３０】
処理後、これら植物は、未処理のトランスジェニック対照植物、および同じ方法で上述の化合物で処理される非トランスジェニック同系植物と比較して生存および損傷に関して視覚的に記録される。活性酸素種、ＮＡＤおよびＡＴＰレベルを測定し、対照植物と比較する。
【０１３１】
化合物で処理されたトランスジェニックの綿植物は、未処理のトランスジェニック対照植物より良好にストレス条件を切り抜ける。ＲＯＳレベルは、未処理のトランスジェニックのコットン植物よりも処理されたトランスジェニックの綿植物において低いが、ＮＡＤまたはＡＴＰレベルは高い。
【０１３２】
ＷＯ２００４／０９０１４０に記載されるように、内因性ＰＡＲＧ遺伝子を減少させることができるｄｓＲＮＡ分子をコードするトランスジェニック遺伝子を含むアブラナ科植物または米の植物を種々の濃度のイミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、アセタミプリド、ニテンピラム、ジノテフラン、６−クロロニコチン酸およびチアクロプリドで処理し、様々なストレス条件、特に、高−低温、強い光の強度もしくは干ばつストレスまたはこれらの組合せに晒す。
【０１３３】
処理後、これら植物は、未処理のトランスジェニック対照植物、および同じ方法で上述の化合物で処理される非トランスジェニック同系植物と比較して生存および損傷に関して視覚的に記録される。活性酸素種、ＮＡＤおよびＡＴＰレベルを測定し、対照植物と比較する。
【０１３４】
化合物で処理されたトランスジェニックのアブラナ科植物または米の植物は、未処理のトランスジェニック対照植物より良好にストレス条件を切り抜ける。ＲＯＳレベルは、未処理のトランスジェニックのアブラナ科植物または米の植物よりも処理されたトランスジェニックのアブラナ科植物または米の植物において低いが、ＮＡＤまたはＡＴＰレベルは高い。
【０１３５】
ＥＰ０４７７６２４．７に記載されているように、ＮＡＤサルベージ経路に関係する植物機能酵素をコードするトランスジェニック遺伝子を含むアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物を種々の濃度のイミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、アセタミプリド、ニテンピラム、ジノテフラン、６−クロロニコチン酸およびチアクロプリドで処理し、様々なストレス条件、特に、高−低温、強い光の強度もしくは干ばつストレスまたはこれらの組合せに晒す。
【０１３６】
処理後、これら植物は、未処理のトランスジェニック対照植物、および同じ方法で上述の化合物で処理される非トランスジェニック同系植物と比較して生存および損傷に関して視覚的に記録される。活性酸素種、ＮＡＤおよびＡＴＰレベルを測定し、対照植物と比較する。
【０１３７】
化合物で処理されたトランスジェニックのアラビドプシス植物は、未処理のトランスジェニック対照植物より良好にストレス条件を切り抜ける。ＲＯＳレベルは、未処理のトランスジェニックのアラビドプシス植物よりも処理されたトランスジェニックのアラビドプシス植物において低いが、ＮＡＤまたはＡＴＰレベルは高い。
【配列表】
2008545421000001.app
【国際調査報告】
2008545421.tif 000014
2008545421.tif 000015
2008545421.tif 000016