(57)【要約】本発明は、胚または胚由来細胞からの多能性幹細胞の作製および導出のための方法および組成物ならびにそれらに関する治療的使用に関する。特に、本発明は、機能的な幹細胞または幹細胞様細胞を作製するための方法であって、胚または胚由来細胞を脱メチル化剤の存在下で培養する段階、および機能的な多能性細胞を単離する段階を含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能的な幹細胞または幹細胞様細胞を作製するための方法であって、胚または胚由来細胞を脱メチル化剤の存在下で培養する段階、および機能的な多能性細胞を単離する段階を含む方法。
【請求項２】
幹細胞または幹細胞様細胞を作製するための方法であって、
(i)胚または胚由来細胞を細胞のフィーダー層の上で培養する段階；
(ii)該培養物に少なくとも1つの脱メチル化剤を導入する段階；および
(iii)多能性細胞を単離する段階
を含む方法。
【請求項３】
胚または胚由来細胞を培養する段階が、合成卵管液(SOF)、改変イーグル培地(MEM)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、RPMI 1640、F-12、IMDM、α-MEMおよびマッコイ培地からなる群より選択される培地を用いる、請求項1または請求項2記載の方法。
【請求項４】
培地がα-MEMである、請求項3記載の方法。
【請求項５】
脱メチル化剤が5-アザシチジン、5-アザ-2'-デオキシシチジンまたはエチオニンである、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
胚が押しつぶされてフィーダー層の中に押し込まれている、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
胚が、カモノハシ、ハリモグラ、カンガルー、ワラビー、トガリネズミ、モグラ、ハリネズミ、ツパイ、ハネジネズミ、コウモリ、霊長動物(チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、ヒトを含む)、貧歯類の動物、ナマケモノ、アルマジロ、アリクイ、センザンコウ、ウサギ、ナキウサギ(pica)、齧歯動物、クジラ、イルカ、ネズミイルカ、食肉目の動物、ツチブタ、ゾウ、ハイラックス、ジュゴン、マナティー、ウマ、サイ、バク、レイヨウ、キリン、雌ウシまたは雄ウシ、バイソン、バッファロー、ヒツジ、オオツノヒツジ、ウマ、ポニー、ロバ、ラバ、シカ、ヘラジカ、カリブー、ヤギ、スイギュウ、ラクダ、ラマ、アルパカ、ブタおよびカバからなる群より選択される哺乳動物から得られる、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
胚が、家畜または野生のウシ科動物、ヒツジ科動物(ovid)、シカ科動物、イノシシ科動物、ウマ科動物およびラクダ科動物からなる群より選択される有蹄動物から得られる、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
有蹄動物が、ウシ(Bos taurus)、コブウシ(Bos indicus)、またはバッファロー(Bos buffalo)である雌ウシまたは雄ウシのいずれかである、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
胚がヒト対象から得られる、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
請求項1〜10記載の方法によって得られる、単離された幹細胞または幹細胞様細胞。
【請求項１２】
正常な非ヒト動物を作出するための方法であって、
(a)胚または胚由来細胞を脱メチル化剤の存在下で培養する段階；
(b)多能性細胞を単離する段階；
(c)該多能性細胞を胚盤胞に導入する段階；
(d)(c)の胚盤胞を代理母に移植する段階；および
(e)子孫を発育させて出産させる段階
を含む方法。
【請求項１３】
動物がキメラ性である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
多能性細胞の集団および培地を含む組成物であって、多能性細胞が胚または胚様細胞を脱メチル化剤の存在下で培養することによって得られた、組成物。
【請求項１５】
請求項14記載の多能性細胞の完全または部分的に精製された子孫の集団を含む組成物。
【請求項１６】
子孫がさらに分化する能力を有する、請求項15記載の組成物。
【請求項１７】
多能性細胞の単離および増殖のための方法であって、
(a)胚または胚様細胞を哺乳動物から入手する段階；
(b)該胚または胚様細胞を少なくとも1つの脱メチル化剤の存在下で培養する段階；
(c)該多能性細胞を回収する段階；および
(d)増大した(expanded)細胞集団を作製するために、該多能性細胞を増大条件下で培養する段階
を含む方法。
【請求項１８】
請求項17記載の方法によって得られる、増大した細胞集団。
【請求項１９】
多能性細胞をエクスビボで分化させるための方法であって、
(a)胚または胚様細胞を哺乳動物から入手する段階；
(b)該胚または胚様細胞を少なくとも1つの脱メチル化剤の存在下で培養する段階；
(c)該多能性細胞を回収する段階；
(d)増大した細胞集団を作製するために、該多能性細胞を増大条件下で培養する段階；および
(e)増大した細胞集団を所望の分化因子の存在下で培養する段階
を含む方法。
【請求項２０】
分化因子が、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)；血管内皮増殖因子(VEGF)；ジメチルスルホキシド(DMSO)およびイソプロテレノール；ならびに線維芽細胞増殖因子4(FGF4)および肝細胞増殖因子(HGF)からなる群より選択される、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
多能性細胞をインビボで分化させるための方法であって、
(a)胚または胚様細胞を哺乳動物から入手する段階；
(b)該胚または胚様細胞を少なくとも1つの脱メチル化剤の存在下で培養する段階；
(c)該多能性細胞を回収する段階；
(d)増大した細胞集団を作製するために、該多能性細胞を培養する段階；および
(e)増大した細胞集団を哺乳動物宿主に投与する段階であって、損傷、遺伝病、後天性疾患または医原性処置に起因する欠陥のある細胞または臓器の機能が初めて増強、再構成または提供されるように、該細胞集団が生着してインビボで組織特異的細胞へと分化する段階
を含む方法。
【請求項２２】
組織特異的細胞が、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、骨髄間質細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、眼細胞、内皮細胞、上皮細胞、肝細胞、膵細胞、造血細胞、グリア細胞、神経細胞またはオリゴデンドロサイトである細胞種のものである、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
疾患が、癌、心血管疾患、代謝性疾患、肝疾患、糖尿病、肝炎、血友病、変性性または外傷性の神経学的状態、自己免疫疾患、遺伝子欠損症、結合組織疾患、貧血、感染症、および移植拒絶反応からなる群より選択される、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
多能性細胞および薬学的に許容される担体を含む治療用組成物であって、多能性細胞が骨髄、血液、脾臓、肝臓、肺、腸管、眼、脳、免疫系、骨、結合組織、筋肉、心臓、血管、膵臓、中枢神経系、腎臓、膀胱、皮膚、上皮付属器、乳房-乳腺、脂肪組織、ならびに口腔食道、膣および肛門を含む粘膜表面からなる群より選択される組織を生じるのに有効な量で存在し、該多能性細胞が胚または胚由来細胞を少なくとも1つの脱メチル化剤の存在下で培養することによって作製される、組成物。
【請求項２５】
臓器、組織または細胞の機能をそれを必要とする哺乳動物に対して回復させるための治療的方法であって、
(a)胚または胚様細胞を哺乳動物から入手する段階；
(b)該胚または胚様細胞を少なくとも1つの脱メチル化剤の存在下で培養する段階；
(c)該多能性細胞を回収する段階；および
(d)多能性細胞を哺乳動物に投与する段階であって、臓器、組織または細胞の機能が回復される段階
を含む方法。
【請求項２６】
胚もしくは胚由来細胞を少なくとも1つの脱メチル化剤の存在下で培養することによって得られた多能性細胞またはそれから単離された核を除核卵母細胞に移入する段階を含む、核移入の方法。
【請求項２７】
遺伝的に操作された、またはトランスジェニック性の非ヒト哺乳動物を作製するための方法であって、
(i)胚もしくは胚由来細胞を少なくとも1つの脱メチル化剤の存在下で培養することによって得られた多能性細胞またはそれから単離された核に対して、所望の遺伝子の挿入、除去または改変を行う段階；および
(ii)その多能性細胞または核を除核卵母細胞に移入する段階
を含む方法。
【請求項２８】
非ヒト哺乳動物のクローニングのための方法であって、
(i)胚もしくは胚由来細胞を少なくとも1つの脱メチル化剤の存在下で培養することによって得られた多能性細胞またはそれから単離された核を、除核された哺乳動物卵母細胞に、再構成された細胞の形成のために適した条件下で挿入する段階；
(ii)胚を形成させるために、再構成された細胞を活性化する段階；
(iii)該胚を二細胞期を上回る発生段階まで培養する段階；および
(iv)胚が胎児へと発生するように、該培養胚を宿主哺乳動物に移入する段階
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本発明は、胚または胚由来細胞からの多能性幹細胞の作製および導出のための方法および組成物に関する。特に、本発明は、脱メチル化剤を用いて幹細胞または幹細胞様細胞を作製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
幹細胞が生物学、医学/獣医学的治療および畜産学に大変革をもたらす能力を有することに関しては、ほぼ普遍的な認識がある。例えば、細胞の機能障害または特定の組織の破壊の結果である数多くの疾患を細胞療法で治療しうる可能性がある。移植後に新たな組織を作り出すかそれに寄与するような特殊化した細胞へと発達するように、幹細胞を誘導させることも可能と考えられる。このような細胞移植片は、伝統的に移植されてきた組織よりも組織拒絶を来すことが少ないと多くの者が考えている。このため、アルツハイマー病、パーキンソン病、糖尿病などのヒト変性疾患のすべてを幹細胞を用いて治療しうる可能性がある。
【０００３】
しかし、現在に至るまで、研究に着手し、それによって商業的に存立しうる手順を提供することを可能にするのに十分な幹細胞を入手することは難題となっている。現在、幹細胞などの多能性細胞は以下の3種の供給源から得られている：
1)．胚性幹細胞(ES細胞)を生じる、胚の内部細胞塊。例えば、Thomson et al., 1998, Science, 282: p1145(非特許文献1)；Reubinoff et al., 2000, Nature Biotechnology 18(4):399-404(非特許文献2)；米国特許第6,875,607号(特許文献1)を参照のこと。
2)．胚性生殖細胞(EG細胞(例えば、Shamblott et al., 1998, P.N.A.S. USA, 95: p13726-13731(非特許文献3)；Gearhart, 1999、Science, 282: p1061-1062(非特許文献4)；米国特許第6,090,622号(特許文献2)を参照)を生じる、胎児組織；および
3)．臍帯血。例えば、Erices et al., 2000, British Journal of Haematology, 109(1): 235-242(非特許文献5)；Mareschi et al., Haematologica, 86(10): 1099-1100(非特許文献6))を参照のこと。
【０００４】
残念ながら、上記の組織、特に胚および胎児組織の入手可能性は極めて限られており、当面はそのままであり続ける可能性が高い。より重要なことには、たとえこれらの組織を自由に入手しうるようになったとしても、マウスまたはヒト以外の種から幹細胞を単離するための現在の培養手法は、商業的に存立しうる量を作製することができない。マウスにおいてすら、それぞれの培養マウス胚盤胞から回収しうる幹細胞のパーセンテージは、全細胞数の5％未満である(Markert & Petters, 1978, Science, 202: 491-498(非特許文献7))。他の種に関してはこの数字は異なりうる。
【０００５】
このため、数多くの研究者が、幹細胞を導き出すために他の組織を用いることを提唱している。例えば、卵母細胞に対する核移入を介した体細胞核の再プログラミングによって、ヒト多能性幹細胞を導き出しうることが提唱されている(Munsie et al, 2000, Curr Biol, 10: p989(非特許文献8))。治療的クローニングと呼ばれるそのようなアプローチは、患者に由来する多能性幹細胞を自己移植療法に用いることを可能にすると考えられる(例えば、米国特許第5,945,577号(特許文献3)および第6,235,970号(特許文献4)を参照)。しかし、これらの手法は技術的には実行可能であるものの、核移入(NT)によって体細胞からクローニングされた分化体細胞および胚は、インビボで生じた配偶子および初期胚よりもDNAメチル化のレベルおよび擾乱が高度であることが見いだされている。これらの技術的難点は、SCNTクローンにおける早期老化および病状発症という、文書により十分に立証された問題につながっている(例えば、Hill et al., 1999, Theriogenology, 51 (8):1451-1465(非特許文献9)を参照)。
【０００６】
これらの問題を克服しようとする企ての中で、研究者らは、NTの前にDNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤(5-アザ-2'-デオキシシチジン；5-アザ-dC)などの化学物質でドナー細胞を処理することによって、それらにおけるDNAメチル化を減少させることを試みた。しかし、現在に至るまで、NT胚のクローニング効率の劇的な改善はみられていない(例えば、Jones et al., 2001, Molecular Reproduction and Development, 60: 208-213(非特許文献10)を参照)。その上、これらの胚は、標準的な培養法よりも多くの数の幹細胞を提供することができていない。DNAメチル化などの問題を被らない、より多くの数の多能性細胞を作製することのできるインビトロ手法を開発することには需要がある。
【０００７】
【特許文献１】米国特許第6,875,607号
【特許文献２】米国特許第6,090,622号
【特許文献３】米国特許第5,945,577号
【特許文献４】米国特許第6,235,970号
【非特許文献１】Thomson et al., 1998, Science, 282: p1145
【非特許文献２】Reubinoff et al., 2000, Nature Biotechnology 18(4):399-404
【非特許文献３】Shamblott et al., 1998, P.N.A.S. USA, 95: p13726-13731
【非特許文献４】Gearhart, 1999、Science, 282: p1061-1062
【非特許文献５】Erices et al., 2000, British Journal of Haematology, 109(1): 235-242
【非特許文献６】Mareschi et al., Haematologica, 86(10): 1099-1100
【非特許文献７】Markert & Petters, 1978, Science, 202: 491-498
【非特許文献８】Munsie et al, 2000, Curr Biol, 10: p989
【非特許文献９】Hill et al., 1999, Theriogenology, 51 (8):1451-1465
【非特許文献１０】Jones et al., 2001, Molecular Reproduction and Development, 60: 208-213
【発明の開示】
【０００８】
概要
本発明者らは、驚いたことに、全胚または胚由来細胞からの幹細胞の作製のための、信頼性のある選択的なプロセスを見いだした。
【０００９】
したがって、第1の局面において、本発明は、機能的な幹細胞または幹細胞様細胞を作製するための方法であって、胚または胚由来細胞を脱メチル化剤の存在下で培養する段階、および機能的な多能性細胞を単離する段階を含む方法を提供する。
【００１０】
胚または胚由来細胞を培養する段階は、そのような細胞を培養するための当技術分野で公知の方法を利用することができる。好ましくは、培地はES細胞培地である。より好ましくは、培地は、合成卵管液(SOF)、改変イーグル培地(MEM)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、RPMI 1640、F-12、IMDM、α-MEMおよびマッコイ培地からなる群より選択される。最も好ましくは、培地はα-MEMである。
【００１１】
脱メチル化剤は、DNAを脱メチル化することが知られた任意の薬剤であってよいが、それは好ましくは5-アザシチジン、5-アザ-2'-デオキシシチジンまたはエチオニンである。5-アザシチジンが最も好ましい。
【００１２】
脱メチル化剤の量が、用いられる具体的な薬剤に依存することを、当業者は認識しているであろう。好ましくは、胚または胚由来細胞を、全体的なゲノムの脱メチル化を誘導するために、約5μMの5-シチジンの存在下で約10日間にわたってインキュベートする。これらの細胞を、ヒストンのアセチル化を促進するために、脱アセチル化阻害剤またはアセチル化促進剤、好ましくは100ng/mlまたは1μMのトリコスタチンAにより、約24時間にわたって処理してもよい。また、これらの細胞を、DNAからの転写リプレッサーの除去を助長するために、核シャペロンまたは他のクロマチンリモデリング酵素、好ましくはヌクレオプラスミンまたはtat-ヌクレオプラスミンを含む、一定量のポリペプチドによって処理してもよい。
【００１３】
もう1つの態様においては、幹細胞または幹細胞様細胞を、幹細胞を維持するためには最適ではないが、リモデリングされた細胞が分化することは許容する条件下で直接培養する。一般に、このような培養条件は、血清を含まず、フィーダー細胞を含まず、高密度の細胞を含む、またはレチノイン酸もしくは神経成長因子といった、さまざまな形態形成性の増殖因子もしくは分化因子のうち1つもしくは複数を含むと思われる。
【００１４】
培地中の血清は、同種血清(すなわち、同じ動物種からではあるが、同じ動物個体からではない)、自己血清(すなわち、同じ動物個体から)または異種血清(すなわち、異なる動物種から)のいずれでもよい。好ましくは、種にとって適切である熱非働化血清が用いられると考えられる(例えば、ヒト―自己血清、ウシ―同種血清、マウス―異種血清)。
【００１５】
培地は単に、血清が追加されたDMEMのような市販の培地でもよいが、他の追加物を含めてもよいことは認識されている。例えば、増殖因子、補助因子、塩および抗生物質を含めることができる。
【００１６】
第2の局面において、本発明は、幹細胞または幹細胞様細胞を作製するための方法であって、
(i)胚または胚由来細胞を細胞のフィーダー層の上で培養する段階；
(ii)前記培養物に少なくとも1つの脱メチル化剤を導入する段階；および
(iii)多能性細胞を単離する段階
を含む方法を提供する。
【００１７】
胚は押しつぶされてフィーダー層の中に押し込まれていることが好ましい。いくつかの態様において、フィーダー細胞層は培養された自己細胞を含む。
【００１８】
第3の局面において、本発明は、第1または第2の局面による方法によって得られる、単離された幹細胞または幹細胞様細胞を提供する。
【００１９】
胚または胚由来細胞は、ヒトを含む、任意の動物から得ることができる。好ましくは、動物は、哺乳動物目の1つからの哺乳動物である。哺乳動物目には、単孔目(Monotremata)、有袋目(Metatheria)、オポッサム目(Dideiphimorphia)、ケノレステス目(Paucituberculata)、ミクロビオテリウム目(Microbiotheria)、フクロネコ目(Dasyuromorphia)、バンディクート目(Peraamelemorphia)、フクロモグラ目(Notoryctemorphia)、カンガルー目(Diprotodontia)、食虫目(Insectivora)、ハネジネズミ目(Macroscelidea)、ツパイ目(Scandentia)、ヒヨケザル目(Dermoptera)、翼手目(Chiroptera)、霊長目(Primates)、貧歯目(Xenarthra)、有鱗目(Pholidota)、ウサギ目(Lagomorpha)、齧歯目(Rodentia)、クジラ目(Cetacea)、食肉目(Carnivora)、ツチブタ目(Tubulidentata)、長鼻目(Proboscidea)、イワダヌキ目(Hyracoidea)、海牛目(Sirenia)、奇蹄目(Perissodactyla)および偶蹄目(Artiodactyla)が含まれる。
【００２０】
好ましくは、哺乳動物は、カモノハシ、ハリモグラ、カンガルー、ワラビー、トガリネズミ、モグラ、ハリネズミ、ツパイ、ハネジネズミ、コウモリ、霊長動物(チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、ヒトを含む)、貧歯類の動物、ナマケモノ、アルマジロ、アリクイ、センザンコウ、ウサギ、ナキウサギ(pica)、齧歯動物、クジラ、イルカ、ネズミイルカ、食肉目の動物、ツチブタ、ゾウ、ハイラックス、ジュゴン、マナティー、ウマ、サイ、バク、レイヨウ、キリン、雌ウシまたは雄ウシ、バイソン、バッファロー、ヒツジ、オオツノヒツジ、ウマ、ポニー、ロバ、ラバ、シカ、ヘラジカ、カリブー、ヤギ、スイギュウ、ラクダ、ラマ、アルパカ、ブタおよびカバからなる群より選択される。
【００２１】
いくつかの態様において、胚または胚由来細胞は、家畜または野生のウシ科動物、ヒツジ科動物(ovid)、シカ科動物、イノシシ科動物、ウマ科動物およびラクダ科動物からなる群より選択される有蹄動物から単離される。
【００２２】
特に好ましい有蹄動物は、ウシ(Bos taurus)、コブウシ(Bos indicus)およびバッファロー(Bos buffalo)である雌ウシまたは雄ウシである。
【００２３】
他の態様において、胚または胚由来細胞は、ヒト対象から単離される。
【００２４】
ひとたび単離されれば、本発明の幹細胞または幹細胞様細胞を、幹細胞を用いる任意の手法に用いることができる。例えば、それらを、正常な非ヒト動物を作出する方法；または、細胞、組織もしくは臓器を入手するために幹細胞もしくは幹細胞様細胞をエクスビボで分化させるための方法、または疾患を治療する方法；または、非ヒト動物のクローニングの方法、に用いることができる。または、それらを、胚を作り出すために用いうる配偶子に分化させることもできる。
【００２５】
したがって、第4の局面において、本発明は、正常な非ヒト動物を作出するための方法であって、
(a)胚または胚由来細胞を脱メチル化剤の存在下で培養する段階；
(b)多能性細胞を単離する段階；
(c)前記多能性細胞を胚盤胞に導入する段階；
(d)(c)の胚盤胞を代理母に移植する段階；および
(e)子孫を発育させて出産させる段階
を含む方法を提供する。
【００２６】
好ましくは、動物はキメラ性である。
【００２７】
第5の局面において、本発明は、多能性細胞の集団および培地を含む組成物であって、多能性細胞が胚または胚様細胞を脱メチル化剤の存在下で培養することによって得られる組成物を提供する。
【００２８】
第6の局面において、本発明は、第6の局面による多能性細胞の完全または部分的に精製された子孫の集団を含む組成物を提供する。
【００２９】
好ましくは、子孫はさらに分化する能力を有する。より好ましくは、子孫は、終末分化を行う能力を有する。最も好ましくは、子孫は、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、骨髄間質細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、眼細胞、内皮細胞、上皮細胞、肝細胞、膵細胞、造血細胞、グリア細胞、神経細胞またはオリゴデンドロサイトである細胞種のものである。
【００３０】
第7の局面において、本発明は、多能性細胞の単離および増殖のための方法であって、
(a)胚または胚様細胞を哺乳動物から入手する段階；
(b)前記胚または胚様細胞を少なくとも1つの脱メチル化剤の存在下で培養する段階；
(c)前記多能性細胞を回収する段階；および
(d)増大した(expanded)細胞集団を作製するために、前記多能性細胞を増大条件下で培養する段階
を含む方法を提供する。
【００３１】
第8の局面において、本発明は、第7の局面の方法によって得られる、増大した細胞集団を提供する。
【００３２】
第9の局面において、本発明は、多能性細胞をエクスビボで分化させるための方法であって、
(a)胚または胚様細胞を哺乳動物から入手する段階；
(b)前記胚または胚様細胞を少なくとも1つの脱メチル化剤の存在下で培養する段階；
(c)前記多能性細胞を回収する段階；
(d)増大した細胞集団を作製するために、前記多能性細胞を増大条件下で培養する段階；および
(e)増大した細胞集団を所望の分化因子の存在下で培養する段階
を含む方法を提供する。
【００３３】
好ましくは、分化因子は、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)；血管内皮増殖因子(VEGF)；ジメチルスルホキシド(DMSO)およびイソプロテレノール；ならびに線維芽細胞増殖因子4(FGF4)および肝細胞増殖因子(HGF)からなる群より選択される。
【００３４】
好ましくは、局面9の方法によって得られる分化した細胞は、外胚葉、中胚葉または内胚葉である。より好ましくは、分化した細胞は、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、骨髄間質細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、眼細胞、内皮細胞、上皮細胞、肝細胞、膵細胞、造血細胞、グリア細胞、神経細胞またはオリゴデンドロサイトである細胞種のものである。
【００３５】
第10の局面において、本発明は、多能性細胞をインビボで分化させるための方法であって、
(a)胚または胚様細胞を哺乳動物から入手する段階；
(b)前記胚または胚様細胞を少なくとも1つの脱メチル化剤の存在下で培養する段階；
(c)前記多能性細胞を回収する段階；
(d)増大した細胞集団を作製するために、前記多能性細胞を培養する段階；および
(e)増大した細胞集団を哺乳動物宿主に投与する段階であって、損傷、遺伝病、後天性疾患または医原性処置に起因する欠陥のある細胞または臓器の機能が初めて増強、再構成または提供されるように、前記細胞集団が生着してインビボで組織特異的細胞に分化するようにさせる段階
を含む方法を提供する。
【００３６】
好ましくは、組織特異的細胞は、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、骨髄間質細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、眼細胞、内皮細胞、上皮細胞、肝細胞、膵細胞、造血細胞、グリア細胞、神経細胞またはオリゴデンドロサイトである細胞種のものである。
【００３７】
好ましくは、疾患は、癌、心血管疾患、代謝性疾患、肝疾患、糖尿病、肝炎、血友病、変性性または外傷性の神経学的状態、自己免疫疾患、遺伝子欠損症、結合組織疾患、貧血、感染症および移植拒絶反応からなる群より選択される。
【００３８】
第11の局面において、本発明は、多能性細胞および薬学的に許容される担体を含む治療用組成物であって、多能性細胞が骨髄、血液、脾臓、肝臓、肺、腸管、眼、脳、免疫系、骨、結合組織、筋肉、心臓、血管、膵臓、中枢神経系、腎臓、膀胱、皮膚、上皮付属器、乳房-乳腺、脂肪組織、ならびに口腔食道、膣および肛門を含む粘膜表面からなる群より選択される組織を生じるのに有効な量で存在し、前記多能性細胞が胚または胚由来細胞を少なくとも1つの脱メチル化剤の存在下で培養することによって作製される組成物を提供する。
【００３９】
第12の局面において、本発明は、臓器、組織または細胞の機能をそれを必要とする哺乳動物に対して回復させるための治療的方法であって、
(a)胚または胚様細胞を哺乳動物から入手する段階；
(b)前記胚または胚様細胞を少なくとも1つの脱メチル化剤の存在下で培養する段階；
(c)前記多能性細胞を回収する段階；および
(d)多能性細胞を哺乳動物に投与する段階であって、臓器、組織または細胞の機能が回復される段階
を含む方法を提供する。
【００４０】
第13の局面は、胚または胚由来細胞を少なくとも1つの脱メチル化剤の存在下で培養することによって得られた多能性細胞またはそれから単離された核を除核卵母細胞に移入する段階を含む、核移入の方法を提供する。
【００４１】
第14の局面は、遺伝的に操作された、またはトランスジェニック性の非ヒト哺乳動物を作製するための方法であって、
(i)胚もしくは胚由来細胞を少なくとも1つの脱メチル化剤の存在下で培養することによって得られた多能性細胞またはそれから単離された核に対して、所望の遺伝子の挿入、除去または改変を行う段階；および
(ii)その多能性細胞または核を除核卵母細胞に移入する段階
を含む方法を提供する。
【００４２】
第15の局面は、非ヒト哺乳動物のクローニングのための方法であって、
(i)胚もしくは胚由来細胞を少なくとも1つの脱メチル化剤の存在下で培養することによって得られた多能性細胞またはそれから単離された核を、除核された哺乳動物卵母細胞に、再構成された細胞の形成のために適した条件下で挿入する段階；
(ii)胚を形成させるために、再構成された細胞を活性化する段階；
(iii)前記胚を二細胞期を上回る発生段階まで培養する段階；および
(iv)胚が胎児へと発生するように、前記培養胚を宿主哺乳動物に移入する段階
を含む方法を提供する。
【００４３】
卵母細胞は、公知の手順によって、任意の非ヒト哺乳動物から単離することができる。例えば、当技術分野で周知であって本明細書に記載されている卵管回収手順または経腟的卵母細胞回収手順によって、卵母細胞を生きている動物の卵管および/または卵巣から単離することができる。さらに、卵母細胞を、死亡した動物から単離することもできる。例えば、卵巣を屠殺場から入手し、卵母細胞をこれらの卵巣から吸引することができる。また、卵母細胞を最近屠殺された動物の卵巣から、または卵巣が凍結および/もしくは解凍された時に単離することもできる。好ましくは、卵母細胞は卵管から新たに単離される。
【００４４】
同じく本発明によって提供されるのは、以上の方法に従って得られる非ヒト哺乳動物、およびそのような哺乳動物の子孫である。
【００４５】
第16の局面において、本発明は、ワクチン、RNAiベクター、導入遺伝子、DNAベクターを特定の部位に対して異所性に送達するための、本発明の細胞の使用法を提供する。
【００４６】
遺伝子治療の用途のための本発明の細胞の使用法も想定されている。
【００４７】
好ましい態様の詳細な説明
本発明を詳細に記載する前に、本発明が、具体的に例示される細胞培養手法、血清、培地または方法には限定されず、それらは当然ながら異なってもよいことが理解される必要がある。また、本明細書で用いる専門用語は、本発明の特定の態様のみを記述することが目的であり、限定することは意図しておらず、それは添付した特許請求の範囲のみによって限定されることも理解される必要がある。
【００４８】
本明細書中に引用したすべての刊行物、特許および特許出願は、上記または下記のいずれであるかを問わず、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。しかし、本明細書中に言及した刊行物は、その刊行物中に報告されていて、本発明と関連して用いられる可能性のあるプロトコール、試薬およびベクターを記載および開示する目的で引用されている。本明細書中のいかなるものも、本発明が先行発明によるこのような開示に先行する権利を持たないことを認めたものとみなされるべきではない。
【００４９】
本発明の実施には、別に指示する場合を除き、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNAおよび免疫学の従来の手法が用いられると考えられ、これらは当技術分野の技能の範囲に含まれる。このような手法は文献中に記載されている。例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989)；DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984)；Mullis et al. 米国特許第4,683,195号；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)；Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)；Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986)；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)；the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987)；Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986)；Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)を参照のこと。
【００５０】
本明細書および添付した特許請求の範囲において用いる場合、単数形の「1つの(a)」「1つの(an)」および「その(the)」は、その文脈で明らかに別の指示がなされない限り、複数のものに関する言及も含むことに留意されたい。したがって、例えば、「1つの細胞」に対する言及は複数のそのような細胞を含み、「1つの卵母細胞」に対する言及は1つまたは複数の卵母細胞に対する言及であり、その他も同様である。別に定義する場合を除き、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者が一般に理解しているものと同じ意味を持つ。本発明の実施または検査のために本明細書に記載したものと同様または同等の材料および方法を用いることができるが、好ましい材料および方法についてはこれから述べる。
【００５１】
本発明は、無傷の胚または胚由来細胞から、機能的な幹細胞または幹細胞様細胞を作製する方法に関する。本明細書で用いる場合、「胚」または「胚性」という用語は、母体宿主の子宮膜に移植されていない細胞塊を発育させることを指す。このため、本明細書で用いる「胚」という用語は、最大で受胎8週後までの、受精後の任意の段階と定義される。それは細胞の反復分裂によって発育し、前胚盤胞期、胚盤胞期、および/または母体宿主の子宮膜への移植の前に進展する任意の他の細胞塊発育段階を含む。「胚盤胞期」の胚は、外部の栄養外胚葉および内部細胞塊(ICM)を含む。「胚由来細胞」という用語は、胚から単離された、および/または生じた、任意の細胞または細胞群を含む。いくつかの態様において、「胚由来細胞」という用語は、栄養外胚葉細胞を含む、胚に付随する任意のさまざまな細胞を含む。
【００５２】
胚は細胞発育のさまざまな段階にあってよい。例えば、一細胞の胚は接合子と呼ぶことができ、分割した胚に起因する細胞の充実性球状塊は桑実胚と呼ぶことができ、胞胚腔を有する胚は胚盤胞と呼ぶことができる。
【００５３】
胚または胚由来細胞は、幹細胞または幹細胞様細胞の検討を必要とする、任意の動物から採取することができる。適した哺乳動物には、霊長目、齧歯目、ウサギ目、クジラ目、食肉目、奇蹄目および偶蹄目のメンバーが含まれる。奇蹄目および偶蹄目のメンバーは、それらの生物学的な類似性および経済的重要性のため、特に好ましい。
【００５４】
例えば、偶蹄目は、9つの科に分布している約150種類の現存種を含む：ブタ(イノシシ科(Suidae))、ペッカリー(ペッカリー科(Tayassuidae))、カバ(カバ科(Hippopotamidae))、ラクダ(ラクダ科(Camelidae))、マメジカ(マメジカ科(Tragulidae))、キリンおよびオカピ(キリン科(Giraffidae))、シカ(シカ科(Cervidae))、プロングホーン(プロングホーン科(Antilocapridae))、ならびにウシ、ヒツジ、ヤギおよびレイヨウ(ウシ科(Bovidae))。これらの動物の大部分は、さまざまな国で食用動物として用いられる。本発明に関連してより重要なことに、ヤギ、ヒツジ、ウシおよびブタなどの経済的に重要な動物の多くは、生物学的に極めて類似しており、高度のゲノム相同性を有する。
【００５５】
奇蹄目はウマおよびロバを含み、それらはどちらも経済的に重要である上、互いに近縁関係にある。実際に、ウマとロバは異種交配することが周知である。
【００５６】
いくつかの態様において、胚または胚由来細胞は、有蹄動物、特にウシ科動物、ヒツジ科動物(ovid)、シカ科動物、イノシシ科動物、ウマ科動物およびラクダ科動物から得られると考えられる。そのようなものを代表するものの例には、雌ウシまたは雄ウシ、バイソン、バッファロー、ヒツジ、オオツノヒツジ、ウマ、ポニー、ロバ、ラバ、シカ、ヘラジカ、カリブー、ヤギ、スイギュウ、ラクダ、ラマ、アルパカおよびブタがある。特に好ましいウシ種は、ウシ、コブウシおよびバッファローである雌ウシまたは雄ウシである。
【００５７】
他の態様において、胚または胚由来細胞は、霊長動物、特にヒトから得られると考えられる。
【００５８】
ひとたび胚または胚由来細胞が得られれば、続いてそれらを培養する。培養の一般的な目的は、胚または胚由来細胞の中に存在する機能的な幹細胞または幹細胞様細胞を「単離する」、「増殖させる」または「選択的に増大させる」ことである。本明細書で用いる「単離する」、「増殖させる」または「選択的に増大させる」という用語は、幹細胞または幹細胞様細胞の数を、胚または胚由来細胞の中に存在する他の細胞に比して増加させる培養プロセスのことを指す。
【００５９】
「前駆細胞」は「幹細胞」と同義に用いられる。どちらの用語も、増殖して、分化したまたは分化しうる娘細胞を続いて生じうる多数の母細胞を生成する能力を有するより多くの前駆細胞を生じることのできる、未分化細胞のことを指す。好ましい態様において、前駆細胞または幹細胞という用語は、胚性幹細胞または幹細胞様細胞(ES細胞)のことを指す。ES細胞の特性には、接触阻止の欠如、足場非依存性増殖、アルカリホスファターゼのデノボ発現、および生殖細胞系に特異的なOct4プロモーターの活性化がある。したがって、本明細書で用いる「機能的」という用語は、胚から単離された本発明の幹細胞が、以下の活性のうち少なくとも1つを示す能力のことを指す：SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA 1-60、TRA 1-81、GCTM-2、アルカリホスファターゼ、Oct-4、Rex1、Nanongを発現する；平坦コロニー、単層コロニー、または明瞭な細胞境界を有する細胞の塊として成長するコロニーとして成長する；胚の3種のすべての胚葉の派生物へと分化する；および、白血病抑制因子(LIF)に対して非応答性である(例えば、Pera et al., 1989, Differentiation, 42: p10-23を参照)。
【００６０】
「培養」、「培養された」および「培養すること」という用語は、胚および/または胚由来細胞がインビトロで成長するプロセスを指すために本明細書中で互換的に用いられる。
【００６１】
胚を、細胞層を解離させることのできる物理的および/または化学的な解離手段にかけてもよい。胚の内部の細胞層を解離させるための方法は当技術分野で周知である。例えば、解離手段が物理的または化学的な破壊手段であってもよい。物理的解離手段には、例えば、胚を小刀で解体すること、胚を細かく刻むこと、胚を物理的に切り裂くこと、または胚に酵素を灌流させることが含まれるであろう。化学的解離手段には、例えば、トリプシン、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、トリプシン-EDTA、サーモリシン、プロナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、パパインおよびパンクレアチンなどの酵素による消化が含まれるであろう。胚の解離のための非酵素性溶液を用いることもできる。
【００６２】
胚の解離は、胚の中の細胞層を解離させるのに十分な量のトリプシンを含む予熱した酵素溶液中に胚を置くことによって成し遂げることができる。本方法に用いられる酵素溶液はカルシウムおよびマグネシウムを含まないことが好ましい。
【００６３】
本発明に用いられるであろうトリプシンの量は、好ましくは、溶液の容積比でトリプシン約5〜0.1％の間である。望ましくは溶液のトリプシン濃度は約2.5〜0.25％であり、約0.5％トリプシンが最も好ましい。
【００６４】
胚をトリプシン溶液にさらさせる期間は、胚のサイズに応じてさまざまでありうる。胚の細胞間の粘着結合を弱めるのに十分な時間にわたって胚をトリプシン溶液の存在下に置くことが好ましい。例えば、胚をトリプシン中に5〜60分間置いてもよい。いくつかの態様においては、胚をトリプシン溶液中に10〜30分間浸漬させるが、15〜20分間がほとんどの胚にとっては最適である。
【００６５】
しかし、いくつかの好ましい態様においては、胚を無傷のままとし、そのまま組織培地中に導入する。「培地」、「組織培地」または「組織培地」という用語は、当技術分野で認識されており、一般的には、生細胞のの培養のために用いられる任意の物質または調製物のことを指す。動物からの組織を培養するために存在する組織培地は数多くある。これらの中には複雑なものもあれば単純なものもある。本発明において有用と考えられる培地の例には、改変イーグル培地(MEM)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、RPMI 1640、F-12、IMDM、α-MEMおよびマッコイ培地が含まれる。最も好ましくは、培地はα-MEMである。
【００６６】
しかし、いくつかの好ましい態様においては、無傷の胚が、先端の細いガラス製マイクロピペットまたは超微細針インスリン用シリンジを用いて、培養皿の上で押しつぶされてフィーダー層の中に押し込まれる。いかなる理論にも仮説にも拘束されることは望まないが、本発明者らは、ES細胞を胚から単離する、過去に用いられてきたすべての方法は、胚の他の細胞からのICMまたはICM派生物の機械的、免疫手術的または酵素的な単離を伴うと考えている。これに対して、本発明の方法は全胚の使用を可能にし、その際、移植前胚のすべての細胞が多能性状態に変換される。
【００６７】
いくつかの態様においは、胚または胚由来細胞を、2mMグルタマックス、1％非必須アミノ酸、0.1mMメルカプトエタノール、100U/mlペニシリンおよび100mg/mlストレプトマイシン、1.25μg/mlアンホテリシンB、5ng/ml bFGF、5ng/ml hEGF、1×ITS溶液、5ng/ml hLIF(すべてInvitrogen社より)が加えられたα-MEM中に導入する。
【００６８】
幹細胞または幹細胞様細胞が増殖するように促すためには、血清を組織培地に添加する。培地中の血清は、(すなわち、同じ動物種からではあるが、同じ動物個体からではない)、自己血清(すなわち、同じ動物個体から)または異種血清(すなわち、異なる動物種から)のいずれでもよい。いくつかの態様においては、熱非働化血清が用いられる。
【００６９】
胚または胚由来細胞を最初に培養する場合には、用いる血清の量は典型的には約20％である。培地中に用いる血清の量を記載するために本明細書で用いる「約」という用語は、ある種の状況においては、用いる血清の量が明記した量よりも幾分多い(約10％多い)または幾分少ない(約10％少ない)ことを示している。例えば、約10％血清は、少ない方では18％血清、または最大では22％血清を用いてもよいことを意味すると考えられる。
【００７０】
幹細胞または幹細胞様細胞を含む胚または胚由来細胞は、加湿された95％空気/5％CO2の雰囲気下でインキュベートされる。インキュベーションの温度は、種々の動物に対して適切な条件にある。例えば、マウスおよびヒトに対してはインキュベーションの温度は37℃である；ウシに対してはインキュベーションの温度は39℃である。
【００７１】
培地にはまた、少なくとも1つの脱メチル化剤も加えられる。本明細書で用いる「脱メチル化剤」という用語は、DNAメチルトランスフェラーゼの阻害剤、またはヒストンデアセチラーゼの阻害剤、またはリプレッサー複合体の阻害剤を含む。
【００７２】
現時点で好ましい脱メチル化剤には、5-アザシチジン、5-アザ-2'-デオキシシチジン、2-アミノ-4-(エチルチオ)酪酸、プロカインアミド、プロカイン、Ara-C、デシタビン、ファザラビン、DHACのうち少なくとも1つが含まれる。
【００７３】
いかなる理論にも仮説にも拘束されることは望まないが、本発明者らは、脱メチル化剤の存在が、胚または胚由来細胞からの幹細胞または幹細胞様細胞の単離の助けになると考えている。実際に、いくつかの態様において、本発明の方法によって単離された幹細胞は、培養物中に存在する細胞の90％超を含む。
【００７４】
脱メチル化剤の量は、用いる薬剤の種類、細胞の体積、培地の種類および/または胚の数に依存すると考えられる。いくつかの態様において、脱メチル化剤は、濃度が30μM未満、より好ましくは0.01〜20μM、最も好ましくは約5μMの5-アザシチジンである。
【００７５】
いくつかの態様においては、本発明の胚または胚由来細胞をフィーダー層の上で培養する。フィーダー層の例は当業者に周知であり、インビトロで培養される数多くのさまざまな細胞から生じさせることができる。例えば、後述の例示的な態様、ならびにStrelchenko, 1996, Theriogenology 45: 130-141；Piedrahita et al., 1990, Theriogenology 34: 879-901；Piedrahita et al., 1998, Biol. Reprod. 58: 1321-1329；およびShim et al., 1997, Theriogenology 47: 245を参照されたいが、そのそれぞれはすべての図、表および図面を含め、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００７６】
幹細胞または幹細胞様細胞が増殖するに伴って、それらは、種にもよるが一般的には、扁平な外観(ヒト)、単層コロニーの外観(ウシ)、細胞塊コロニーの外観(マウス)を伴うコロニーを生じる。ひとたびコロニーが直径約0.5cmに達すると、それらを機械的に切り分けていくつかの小片にすることができ、5-アザシチジンなどの脱メチル化剤を有する新たな培地中にある新たなフィーダー層の上に手作業で再びプレーティングすることができる。
【００７７】
ひとたび幹細胞および/または幹細胞様細胞が単離または増殖されれば、続いてそれらを、例えば、直接的な移植のために、または移植のためにインビトロで分化した細胞を作製するために、または核移入の手法に用いることができる。本発明はしたがって、例えば、多くの他の、より分化した細胞種の供給源として役立ちうる幹細胞を提供する。
【００７８】
1つの態様は、幹細胞および/または幹細胞様細胞の子孫、例えば、最初の胚の細胞に由来するような細胞に関する。このような子孫には、幹細胞および/または幹細胞様細胞のその後の世代、ならびに幹細胞および/または幹細胞様細胞の分化をそれらの胚からの単離後に誘導することによって、例えばインビトロで誘導されて、作製された系列拘束細胞が含まれうる。
【００７９】
もう1つの態様は、幹細胞および/または幹細胞様細胞またはその子孫が富化された細胞組成物に関する。ある特定の態様において、細胞は、医薬製剤、例えば、望ましくないウイルス、細菌および他の病原体が存在しない無菌組成物、ならびに発熱物質を含まない製剤の一部として提供されると考えられる。すなわち、動物への投与のためには、幹細胞および/または幹細胞様細胞は、FDAの生物製剤部(Office of Biologics)の基準によって求められている無菌性、発熱原性、一般的安全性および純度の基準を満たすべきである。
【００８０】
ある特定の態様においては、そのような細胞組成物を、動物、好ましくは哺乳動物、さらにより好ましくはヒトへの移植のために用いることができる。幹細胞および/または幹細胞様細胞は、移植宿主に対して自己性、同種性または異種性のいずれでもありうる。
【００８１】
本発明のさらにもう1つの局面は、細胞成分として、幹細胞および/または幹細胞様細胞またはその子孫の実質的に純粋な調製物を含む、細胞組成物に関する。本発明の細胞組成物は、幹細胞および/または幹細胞様細胞の実質的に純粋な集団を含むのみならず、細胞培養成分、例えばアミノ酸、金属、補酵素因子を含む培地、ならびに幹細胞または幹細胞様細胞でない細胞の小集団、例えば、その一部が本発明の単離された幹細胞および/または幹細胞様細胞のその後の分化によって生じているようなものも含みうる。さらに、その他の非細胞成分には、細胞成分を、例えば移植、例えば連続培養といった特定の状況下で支援のために適切なものにするようなものが含まれる。
【００８２】
本明細書中に詳述されている、本発明の幹細胞および/または幹細胞様細胞を動物、特にヒトに対して投与する一般的な方法としては、動物の標的部位への幹細胞および/または幹細胞様細胞の注入または移植が含まれ、本発明の細胞は、動物への細胞の注入または移植による導入を容易にする送達デバイス内に挿入することができる。このような送達デバイスには、細胞および流体をレシピエント動物の体内に注入するためのチューブ、例えばカテーテルが含まれる。1つの好ましい態様において、チューブはさらに、それを通して本発明の細胞を動物の所望の位置に導入するための針、例えばシリンジを有する。本発明の幹細胞および/または幹細胞様細胞は、さまざまな形態で、このような送達デバイス、例えばシリンジ内に挿入することができる。例えば、細胞を溶液中に懸濁させること、またはこのような送達デバイス内に含まれるならば支持マトリックス中に包埋することができる。本明細書で用いる場合、「溶液」という用語には、その中で本発明の細胞が生きたままでいる、薬学的に許容される担体または希釈剤が含まれる。薬学的に許容される担体および希釈剤には、食塩液、水性緩衝液、溶媒および/または分散媒が含まれる。このような担体および希釈剤の使用は当技術分野で周知である。溶液は無菌性であって、容易な注入可能性が存在する程度に流動性であることが好ましい。溶液は製造および貯蔵の条件下で安定であって、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの使用によって細菌および真菌などの微生物の汚染作用に抗して保存されることが好ましい。本発明の溶液は、本明細書に記載の幹細胞および/または幹細胞様細胞を、薬学的に許容される担体または希釈剤中に、必要に応じて、上に列挙した他の成分とともに組み入れ、その後に濾過滅菌を行うことによって調製することができる。
【００８３】
幹細胞および/または幹細胞様細胞を内部に組み入れること、または包埋させることができる支持マトリックスには、レシピエント適合性があり、レシピエントにとって有害でない産物へと分解されるマトリックスが含まれる。天然および/または合成性の生分解性マトリックスは、そのようなマトリックスの例である。天然の生分解性マトリックスには、血漿凝塊、例えば哺乳動物由来のもの、およびコラーゲンマトリックスが含まれる。合成性の生分解性マトリックスには、ポリアンヒドリド、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの合成ポリマーが含まれる。合成ポリマーのその他の例、および細胞をこれらのマトリックス中に組み入れる、または包埋するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第4,298,002号および第5,308,701号を参照のこと。これらのマトリックスは、脆弱な前駆細胞に対してインビボでの支持および防御を提供し、このため、幹細胞および/または幹細胞様細胞をレシピエント動物に導入するのに好ましい形態である。
【００８４】
本発明はまた、さまざまな疾患の治療のために治療的に用いることができる、実質的に純粋な幹細胞および/または幹細胞様細胞も提供する。
【００８５】
例えば、本発明の幹細胞および/または幹細胞様細胞は、さまざまな障害の治療または予防に用いることができる。例えば、幹細胞および/または幹細胞様細胞を、例えば膵組織、心組織、神経などのような損傷組織の修復用の分化細胞の集団を作製するために用いることができる。同様に、このような細胞集団を、膵組織崩壊、例えば膵炎などの膵組織破壊、心疾患またはニューロパチーのために失われた膵組織、心組織または神経を再生または置換するために用いることもできる。
【００８６】
さらにもう1つの態様は、さまざまな化合物を、幹細胞および/または幹細胞様細胞の成長、増殖または分化を調節する能力に関してスクリーニングするための方法を提供する。1つの例示的な態様においては、本幹細胞および/または幹細胞様細胞およびそれらの子孫を、さまざまな化合物または天然物のスクリーニングのために用いることができる。このような外植体を、最小培地中で長期間(例えば、7〜21日またはそれ以上)にわたって維持し、何らかの化合物、例えば低分子または天然物、例えば増殖因子と接触させて、幹細胞および/または幹細胞様細胞の細胞成長、増殖または分化のうち1つに対するそのような化合物の効果を判定することができる。所与の化合物に反応してのこれらの細胞の成長、増殖または分化の検出および定量は、成長、増殖または分化のうち1つを誘導することに関しての化合物の有効性を判定するための手段を提供する。細胞増殖を測定する方法は当技術分野で周知であり、最も一般的には、細胞複製に特徴的なDNA合成を決定することが含まれる。DNA合成の測定のためには当技術分野に数多くの方法があり、その任意のものを本発明に従って用いてよい。本発明の1つの態様において、DNA合成は、放射性標識(3H-チミジン)、または免疫蛍光による検出用の標識ヌクレオチド類似体(BrdU)を用いて決定されている。化合物の有効性は、種々の濃度の化合物を用いて得られたデータから用量反応曲線を作成することによって評価することができる。比較用のベースラインを得るために対照アッセイを行うこともできる。所与の被験物質に反応して増幅された前駆細胞集団の同定は、上記のような表現型判定によって従って行うことができる。
【００８７】
いくつかの態様において、幹細胞および/または幹細胞様細胞は、核移入または核移植による哺乳動物のクローニングのために用いられる。本出願において、「核移入」または「核移植」という用語は互換的に用いられる；しかし、これらの用語は、本明細書で用いる場合、核DNAの全量を1つの細胞から除核細胞へと導入することを指す。
【００８８】
好ましい方法における第1の段階は、適した動物からのレシピエント卵母細胞の単離を伴う。この点に関して、卵母細胞は、任意の動物を源として任意の成熟段階で入手することができる。卵母細胞の単離のための方法は当技術分野で周知である。例えば、卵母細胞は、当技術分野で周知の卵管回収手順または経腟的な卵母細胞回収手順によって、生きている動物の卵管および/または卵巣から単離することができる。例えば、Pieterse et al., 1988, "Aspiration of bovine oocytes during transvaginal ultrasound scanning of the ovaries," Theriogenology 30: 751-762を参照のこと。さらに、卵母細胞を、死んだ動物の卵巣または卵管から単離することもできる。例えば、卵巣を屠殺場から入手し、卵母細胞をこれらの卵巣から吸引することができる。また、卵母細胞を最近屠殺された動物の卵巣から、または卵巣が凍結および/もしくは解凍された時に単離することもできる。
【００８９】
手短に述べると、1つの好ましい態様においては、未熟な(分裂前期Iの)卵母細胞を哺乳動物卵巣から吸引によって採取する。遺伝子操作、核移入およびクローニングなどの手法を首尾良く用いるためには、ひとたびこれらの卵母細胞を採取したところで、これらの細胞を核移入のためのレシピエント細胞として用いる前に、それらを一般的にはインビトロで成熟させなければならない。
【００９０】
除核および核移入に際しての卵母細胞の成熟の段階は、核移入方法の成功のために重要であることが報告されている(例えば、Prather et al., 1991, Differentiation, 48, 1-8を参照)。一般に、哺乳動物胚クローニングを首尾良く施行するには、分裂中期IIの卵母細胞をレシピエント卵母細胞として用いるが、これはこの段階では、卵母細胞が導入された核を受精した精子と同じように処理するようにそれが活性化されうる、または十分に活性化されると考えられているためである。
【００９１】
卵母細胞のインビトロ成熟は通常、卵母細胞が第一極体を放出するまで、または卵母細胞が分裂中期IIに達するまで、成熟培地中で行われる。家畜動物、特にウシでは、卵母細胞の成熟期間は一般に、吸引後の約16〜52時間、好ましくは約28〜42時間であり、より好ましくは約18〜24時間である。本発明の目的において、この期間は「成熟期間」として知られている。
【００９２】
卵母細胞は、当業者に公知である、さまざまなやり方で、さまざまな培地を用いて成熟させることができる。例えば、米国特許第5,057,420号；ウシ個体に関するSaito et al., 1992, Roux's Arch. Dev. Biol. 201: 134-141、ヒツジ個体に関するWells et al., 1997, Biol. Repr. 57: 385-393、および「Unactivated Oocytes as Cytoplast Recipients for Nuclear Transfer」と題するWO97/07668号を参照されたいが、それらはすべて、すべての図、表および図面を含め、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００９３】
卵母細胞の収集および成熟のために用いられる最も一般的な培地の一つは、TCM-199に、FCS、新生仔血清、発情期雌ウシ血清、仔ヒツジ血清または去勢雄ウシ血清を含む1〜20％の血清が加えられたものである。卵母細胞は、5％CO2を含む39℃の環境内で、この種の培地中で首尾良く成熟させることができる。
【００９４】
新たに単離して成熟させた卵母細胞が好ましいことは当業者には認識されているであろうが、卵母細胞を採取後または成熟後に凍結保存することが可能であることも認識されているであろう。したがって、本明細書で用いる「凍結保存すること」という用語は、本発明の卵母細胞、細胞、胚または動物を凍結することを指すことができる。本発明の卵母細胞、細胞、胚または動物部分は、好ましくは0℃以下、より好ましくは-80℃以下の温度で、最も好ましくは-196℃以下の温度で凍結される。本発明における卵母細胞、細胞および胚は、無期限の時間にわたって凍結保存することができる。生体材料は50年以上にわたって凍結保存しうることが知られている。例えば、50年以上にわたって凍結保存された精液を、雌ウシ個体に人工授精するために用いることができる。凍結保存のための方法およびツールは当業者に周知である。例えば、「Cryopreservation Process for Direct Transfer of Embryos」と題する米国特許第5,160,312号を参照のこと。
【００９５】
凍結保存した卵母細胞を利用する場合には、卵母細胞を成熟培地中に置く前にこれらをまず解凍しなければならない。凍結保存された材料を、解凍工程の後もそれらが活性を有するように解凍する方法は、当業者に周知である。
【００９６】
1つのさらに好ましい態様においては、インビボで成熟した成熟(分裂中期IIの)卵母細胞を採取して、本明細書で開示する核移入方法に用いる。本質的には、成熟した分裂中期IIの卵母細胞を、過排卵させないか過排卵させた雌ウシまたは若い雌ウシのいずれかから、発情現象の発生またはヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(hCG)もしくは類似のホルモンの注射から35〜48時間後に外科的に収集する。
【００９７】
卵母細胞をインビトロで培養した場合には、除核のためにより適した成熟段階にある卵母細胞を得るために、蓄積している可能性のある卵丘細胞を除去してもよい。卵丘細胞は、例えば、0.5％ヒアルロニダーゼの存在下で、ピペット操作またはボルテックス処理によって除去することができる。
【００９８】
上記の成熟期間の後に、所望であれば、卵母細胞から透明帯を除去してもよい。透明帯除去の利点は、PCT/AU02/00491号に記載されており、それはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。卵母細胞からの透明帯の除去は、物理的操作(機械的開放)、化学処理または酵素消化を含む、当技術分野で公知の任意の方法によって行うことができる(Wells & Powell, 2000)。物理的操作にはマイクロピペットまたは顕微鏡下手術用ブレードの使用が含まれうる。酵素消化を用いることが好ましい。
【００９９】
1つの特に好ましい態様において、透明帯は、プロテアーゼまたはプロナーゼの存在下での酵素消化によって除去される。手短に述べると、成熟卵母細胞を、合計濃度が0.1％〜5％の範囲、より好ましくは0.25％〜2％、最も好ましくは約0.5％であるプロテアーゼ、プロナーゼまたはそれぞれの組み合わせを含む溶液に入れる。続いて、成熟卵母細胞を30℃〜約45℃の間、好ましくは約39℃で、1〜30分間にわたってインキュベートする。卵母細胞を酵素に対して約5分間曝露させることが好ましい。プロナーゼは卵母細胞の膜に対して有害な可能性があるが、FCSまたは雌ウシ血清などの血清の添加によってこの影響を最小限に抑えることができる。プロナーゼによる透明帯除去の特有の利点は、個別的な処理が必要でなく、手順を100個単位の量の卵母細胞に行えることにある。ひとたび透明帯が除去されれば、透明帯を含まない成熟卵母細胞を、20％FCSおよび10μg/mlのサイトカラシンBを加えた4mlのHEPES緩衝TCM-199培地ですすぎ洗いし、続いて除核を行う。
【０１００】
「除核」、「除核」および「除核卵母細胞」という用語は、本明細書中で互換的に用いられ、その内容物の一部が除去された卵母細胞のことを指す。
【０１０１】
卵母細胞の除核は、核、前核もしくは中期板(卵母細胞に依存)の実際の除去によって物理的に、または紫外線照射もしくは別の除核性影響力の適用などによって機能的に、成し遂げることができる。これらの方法はすべて当業者に周知である。例えば、物理的手段には吸引(Smith & Wilmut, 1989, Biol. Reprod., 40: 1027-1035)が含まれる；機能的手段には、DNA特異的蛍光色素(例えば、Tsunoda et al., 1988, J. Reprod. Fertil. 82: 173を参照)および紫外線の照射(例えば、Gurdon, 1960, J. Microsc. Soc., 101: 299-311を参照)が含まれる。また、除核を、当技術分野で公知の任意の他の方法によって行うこともできる。例えば、米国特許第4,994,384号；米国特許第5,057,420号；およびWilladsen, 1986, Nature, 320: 63-65を参照されたいが、これらは参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０２】
好ましくは、卵母細胞は手作業による二分割によって除核される。卵母細胞の二分割は、当業者に公知の任意の方法によって行うことができる。1つの好ましい態様において、二分割は、参照により本明細書に組み入れられる国際特許出願第WO98/29532号に記載されたように、顕微鏡下手術用ブレードを用いて行われる。手短に述べると、卵母細胞を、極めて鋭利な切離用ブレード(AB Technology, Pullman, WA, USA)を用いて、卵母細胞の全体積の約30％および70％に相当する断片に非対称的に分割する。続いて、首尾良く除核されたものを同定するために卵母細胞をスクリーニングする。このスクリーニングは、20％FCSを加えたTCM-199培地中に溶解した1μg/mlのHoechst蛍光色素33342で卵母細胞を染色し、続いて卵母細胞を10秒未満の紫外線照射下で倒置顕微鏡によって観察することによって行うことができる。首尾良く除核された卵母細胞(デミ卵母細胞(demi-oocyte))を、続いて、適した培地、例えば20％FCSを加えたTCM-199培地中に入れる。
【０１０３】
本発明において、レシピエント卵母細胞は、好ましくはインビトロ成熟の開始から約10時間〜約40時間後、より好ましくはインビトロ成熟の開始から約16時間〜約24時間後、最も好ましくはインビトロ成熟の開始から約16〜18時間後の範囲にわたる時点で除核される。
【０１０４】
本明細書に記載した二分割手法は、他の除核方法よりも時間および技能をはるかにわずかしか必要とせず、染色によるその後の選択によって高い精度がもたらされる。その結果として、クローニング技術の大規模適用のためには、本二分割手法は他の手法よりも効率的である可能性がある。
【０１０５】
続いて、除核卵母細胞と同じ種のものである本発明の単一の幹細胞または幹細胞様細胞を融合によって除核卵母細胞に移入し、それによって再構成細胞を作製することができる。
【０１０６】
細胞周期の段階の分析は、Kubota et al., PNAS 97: 990-995 (2000)に記載されたようにして行うことができる。手短に述べると、さまざまな継代時点の細胞培養物を集密化するまで成長させる。トリプシン処理後に、細胞をTCM-199＋10％FCSによって洗浄し、グルコース(6.1mM)を含む4℃の1ml PBS中に5×105個/mlの濃度で再懸濁させる。3mlの氷冷エタノールを添加することによって細胞を一晩にわたり固定する。核染色のためには、続いて細胞をペレット化し、PBSで洗浄した上で、30μg/mlのヨウ化プロピジウムおよび0.3mg/mlのRNアーゼAを含むPBS中に再懸濁させる。細胞を暗所にて室温で1時間インキュベートし、その後に30μmメッシュを通して濾過する。続いて細胞を分析する。
【０１０７】
さまざまな継代時点での幹細胞および/または幹細胞様細胞の倍数性を調べるためには、分裂中期スプレッドの標準的調製物を用いて、培養のさまざまな継代時点での染色体数を決定することができる(例えば、Kubota et al., 2000, PNAS, 97: 990-995を参照)。
【０１０８】
また、培養した幹細胞および/または幹細胞様細胞を、当業者に周知のトランスジェニック方法によって遺伝的に改変することもできる。例えば、Molecular Cloning a Laboratory Manual, 2nd Ed., 1989, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press；米国特許第5,612,205号；米国特許第5,633,067号；「Transgenic Animals Secreting Desired Proteins Into Milk」と題するEPO 264 166号；「Isolation of Components of Interest From Milk」と題するW094/19935号；「Method for Identifying Transgenic Pre-implantation Embryos」と題するW093/22432号；および「Transgenic Production of Antibodies in Milk」と題するW095/175085号を参照されたいが、これらはすべて、すべての図、表および図面を含め、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。哺乳動物細胞からの所望の遺伝子の挿入、除去または改変のための任意の公知の方法を、核ドナーとして用いようとする幹細胞および/または幹細胞様細胞を改変するために用いることができる。これらの手順は遺伝子の全体または一部を除去することができ、遺伝子は異種性であってもよい。含められるものには、細胞ゲノム中の特定の1つまたは複数の部位での1つまたは複数の遺伝子の挿入、除去または改変を可能にする、相同組換えの手法もある。
【０１０９】
除去、挿入および/または変異によって標的DNAゲノムを改変することに関する例には、レトロウイルス挿入、人工染色体法、遺伝子挿入、組織特異的プロモーターによるランダム挿入、遺伝子ターゲティング、転移因子、および/または外来性DNAを導入するため、改変されたDNA/改変された核DNAを作製するための任意の他の方法がある。他の改変手法には、DNA配列をゲノムから除去すること、および/または核DNA配列を改変することが含まれる。核DNA配列を、例えば、位置指定突然変異誘発法によって改変することもできる。
【０１１０】
本発明はしたがって、所望の所望の遺伝子型を有する成体哺乳動物を提供するために用いることができる。トランスジェニック動物または遺伝子組換え動物およびキメラ動物を含め、遺伝的優越性または他の望ましい形質が証明されている成体有蹄動物の数を増やすことは特に有用である。さらに、トランスジェニック性および/またはキメラ性の胎仔を含む、核移入胎仔からの細胞および組織を、細胞、組織および臓器の移植に用いることもできる。
【０１１１】
トランスジェニック細胞を作製するための方法には、典型的には、(1)特定のDNA配列を幹細胞および/または幹細胞様細胞の核ゲノム中に挿入するために有用な適したDNA構築物を組み立てる段階；(2)DNA構築物を幹細胞および/または幹細胞様細胞にトランスフェクトする段階；(3)ランダム挿入および/または相同組換えを行わせる段階、を含む。この工程の結果として起こる改変は、標的ゲノム中への適したDNA構築物の挿入；標的ゲノムからのDNAの除去；および/または標的ゲノムの突然変異であると考えられる。
【０１１２】
DNA構築物は、関心対象の遺伝子のほかに、調節性プロモーター、インスレーター、エンハンサーおよびリプレッサーを含む種々のエレメント、ならびにDNA構築物から転写されたRNAに対するリボソーム結合のためのエレメントを含みうる。
【０１１３】
また、DNA構築物が、本明細書において以前に特定されている、リボザイムおよびアンチセンスDNAおよび/またはPNAをコードすることもできる。これらの例は当業者に周知であり、限定的ではないものとする。
【０１１４】
利用しうる有効な組換えDNA手法と、データベースおよび商業部門において容易に入手しうる調節性エレメントおよび遺伝子のDNA配列とを組み合わせることで、当業者は、本明細書に記載の材料および方法を用いてトランスジェニック細胞を樹立するために適したDNA構築物を容易に作製することができる。
【０１１５】
トランスフェクション手法は当業者に周知であり、細胞へのDNA構築物のトランスフェクションを行うための材料および方法は商業的に入手可能である。細胞にDNA構築物をトランスフェクトするために典型的に用いられる材料には、例えばリポフェクチン(Lipofectin)(商標)などの親油性化合物がある。特定の親油性化合物は、細胞へのDNA構築物のトランスフェクションを媒介するためのリポソームを形成するように誘導することができる。
【０１１６】
DNA構築物の合理的設計により、DNA構築物からの標的配列を核ゲノムの特定領域に挿入することができる。これらの設計手法および方法は当業者に周知である。例えば、米国特許第5,633,067号；米国特許第5,612,205号およびPCT広報第W093/22432号を参照されたいが、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。ひとたび所望のDNA配列が核ゲノム中に挿入されれば、挿入領域の位置ならびに所望のDNA配列が核ゲノム中に挿入された頻度を当業者に周知の方法によって同定することができる。
【０１１７】
ひとたび導入遺伝子がドナー幹細胞および/または幹細胞様細胞の核ゲノム中に挿入されれば、その細胞を、本発明の他の幹細胞および/または幹細胞様細胞と同様に、核移入方法における核ドナーとして用いることができる。幹細胞および/または幹細胞様細胞の核を除核卵母細胞に移入する手段は、好ましくは、再構成細胞を形成させるための細胞融合を含む。
【０１１８】
融合は典型的には、接触/融合面と交差するDC電気パルスの印加によって誘導されるが、ドナー細胞およびレシピエント細胞の整列化を補助するために、さらなるAC電流を用いてもよい。電気融合法は、原形質膜の一過性破壊を引き起こすのに十分であって、かつ膜が直ちに再形成されるほどに十分に短い電気パルスを生じさせる。すなわち、2つの隣接した膜が破壊するように誘導すると再形成後に脂質二重層が混ざり合い、2つの細胞の間に小さなチャンネルが開口すると考えられる。このような小さな開口部の熱力学的不安定性のために、それは2つの細胞が1つになるまで拡大する。このプロセスのさらなる考察については、Pratherらによる米国特許第4,997,384号(これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる)を参照されたい。例えばスクロース、マンニトール、ソルビトールの溶液およびリン酸緩衝液を含む、さまざまな電気融合用媒質を用いることができる。
【０１１９】
また、融合を、融合誘導因子としてのセンダイウイルスを用いて成し遂げることもできる(Graham, 1969, Wister Inot. Symp. Monogr., 9, 19)。融合を、ポリエチレングリコールなどの融合促進性化学物質に対する細胞の曝露によって誘導することもできる。
【０１２０】
好ましくは、ドナー幹細胞および/または幹細胞様細胞および除核卵母細胞を500μmの融合チャンバーに入れ、26℃〜27℃の4mlの融合媒質(0.3Mマンニトール、0.1mM MgSO4、0.05mM CaCl2)で覆う。続いて、約15μsにわたる70〜100Vの直流(DC)電気パルスを2回、1秒間隔で印加することにより、細胞を電気融合させる。融合後に、結果として生じた融合再構成細胞を、活性化するまで適した培地中、例えばTCM-199培地中に置く。
【０１２１】
細胞融合の1つの好ましい方法においては、ドナー組織特異的前駆細胞、幹細胞様細胞またはMCTをまず除核卵母細胞と付着させる。例えば、ドナー細胞と除核卵母細胞の膜の融合が可能となるように、前駆細胞、幹細胞様細胞またはMCTを除核卵母細胞と付着させるための化合物を選択する。化合物は、細胞を凝集させうる任意の化合物であってよい。化合物が、糖質を結合または凝集させうるタンパク質または糖タンパク質であってもよい。より好ましくは、化合物はレクチンである。レクチンは、コンカナバリンA、カナバリンA、リシン、大豆レクチン、蓮実レクチンおよびフィトヘマグルチニン(PHA)を含む群から選択しうる。好ましくは、化合物はPHAである。
【０１２２】
1つの好ましい態様において、上記の電気融合の方法はさらにもう1つの融合段階を含む、または上記の融合段階は、1つのドナー前駆細胞、幹細胞様細胞またはMCTと、2つまたはそれ以上の除核卵母細胞とを含む。この二重融合方法には、再構成細胞の細胞質体積が増すという有利な効果がある。
【０１２３】
再構成細胞は典型的には、核ドナーとレシピエント卵母細胞との融合の前、最中および/または後に、電気的および/または非電気的な手段によって活性化される(例えば、Susko-Parrish et al., 米国特許第5,496,720号を参照)。活性化方法は以下を含む：
1).  電気パルス；
2).  化学的に誘導されたショック；
3).  精子による貫入；
4).  例えばイオノフォアの形態で、例えばマグネシウム、ストロンチウム、バリウムまたはカルシウムなどの二価陽イオンを卵母細胞の細胞質に導入することによって、卵母細胞内の二価陽イオンのレベルを高めること。二価陽イオンのレベルを高めるための他の方法には、電気ショックの使用、エタノールによる処理およびケージドキレート剤による処理が含まれる；ならびに
5)．公知の方法によって、例えば、キナーゼ阻害剤、例えば、6-ジメチル-アミノプリン、スタウロスポリン、2-アミノプリンおよびスフィンゴシンなどのセリン-トレオニンキナーゼ阻害剤の添加によって、卵母細胞内の細胞タンパク質のリン酸化を低下させること。または、ホスファターゼ、例えばホスファターゼ2Aおよびホスファターゼ2Bの卵母細胞への導入によって、細胞タンパク質のリン酸化を阻害することもできる。
【０１２４】
活性化された再構成細胞または胚は、典型的には、当業者に周知の培地中で培養され、これにはTCM-199＋10％FSC、タイロード-アルブミン-乳酸-ピルビン酸(TALP)、ハムF-10＋10％FCS、合成卵管液(「SOF」)、B2、CR1aa、中および高カリウムシンプレックス培地(「KSOM」)が非限定的に含まれる。
【０１２５】
再構成細胞を公知の方法によって活性化することもできる。このような方法には、例えば、再構成細胞を生理的温度以下で培養することが含まれ、これは本質的には再構成細胞に対して寒冷ショック、または実際には低温ショックを適用することによる。これは、再構成細胞を、胚が通常曝露される生理的温度条件よりも低温である室温で培養することによって最も簡便に行うことができる。適した卵母細胞活性化法は、Susko-Parrishらに対する米国特許第5,496,720号の主題であり、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１２６】
活性化された再構成細胞は続いて、細胞および細胞コロニーが生じるまで適したインビトロ培地中で培養することができる。胚の培養および成熟のために適した培地は当技術分野で周知である。ウシ胚の培養および維持のために用いうる公知の培地の例には、ハムF-10＋10％FCS、TCM-199＋10％FCS、タイロード-アルブミン-乳酸-ピルビン酸(TALP)、ダルベッコリン酸緩衝食塩液(PBS)、イーグル培地およびホイッテン培地が含まれる。卵母細胞の収集および成熟のために用いられる最も一般的な培地は、TCM-199に、ウシ胎仔血清、新生仔血清、発情期雌ウシ血清、仔ヒツジ血清または去勢雄ウシ血清を含む1〜20％の血清が加えられたものである。好ましい維持培地には、TCM-199にアール塩、10％FSC、0.2mMピルビン酸ナトリウムおよび50μg/mlの硫酸ゲンタマイシンを加えたものが含まれる。上記の任意のものが、顆粒膜細胞、卵管細胞、BRL細胞および子宮細胞およびSTO細胞などのさまざまな細胞種との共培養を伴ってもよい。
【０１２７】
その後に、培養した再構成細胞または胚を、好ましくは洗浄した上で、好ましくは適した集密化フィーダー層を含むウェルプレート内に含めた適した培地、例えば、10％FCSを含むTCM-199培地中に入れる。適したフィーダー層には、例えば、有蹄動物に由来する線維芽細胞および子宮上皮細胞、ニワトリ線維芽細胞、ネズミ科動物(例えば、マウスまたはラット)線維芽細胞、STOおよびSI-m220フィーダー細胞系ならびにBRL細胞などのような線維芽細胞および上皮細胞が含まれる。
【０１２８】
いくつかの態様において、フィーダー細胞はマウス胚性線維芽細胞を含む。適した線維芽細胞フィーダー層の調製は当技術分野で周知である。
【０１２９】
再構成細胞が、レシピエント雌に移入するのに、または細胞もしくは細胞コロニーを生じさせるために用いうる細胞を入手するのに適したサイズに達するまで、再構成細胞をフィーダー層の上で培養する。好ましくは、これらの再構成細胞を、少なくとも約2〜400個の細胞、より好ましくは約4〜128個の細胞、最も好ましくは少なくとも約50個の細胞となるまで培養する。培養は、適した条件下で、すなわち、約39℃および5％CO2で、成長を最適化するために培地を典型的には約2〜5日毎、好ましくは約3日毎に交換しながら行われると考えられる。
【０１３０】
本発明における胚の移入およびレシピエント動物の管理のための方法は、胚移入産業で用いられる標準的な手順である。本発明の成功のためには、同期的移入、すなわち核移入胚の段階をレシピエント雌の発情周期と同期させることが重要である。この利点およびレシピエントをいかにして維持するかは、Siedel, G. E., Jr.("Critical review of embryo transfer procedures with cattle" in Fertilization and Embryonic Development in vitro (1981) L. Mastroianni, Jr. and J. D. Biggers, ed., Plenum Press, New York, N.Y., page 323)に総説があり、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１３１】
手短に述べると、胚盤胞を、同期させたレシピエントの子宮に非手術的または手術的に移入する。当業者に周知の手法および培地を用いて、他の培地を用いてもよい。1つの手順では、クローニングした胚を新たなKSOMで3回洗浄し、5％CO2、5％O2および90％N2、39℃にて、0.1％BSAを含むKSOM中で4日間培養し、その後に1％BSAとしてさらに3日間培養する。胚の発育の検査および等級化は当技術分野で公知の標準的な方法によって行う。分割率を第2日に記録し、分割胚をさらに7日間培養する。第7日に胚盤胞の発育を記録し、胚および/または動物の入手可能性に応じて1つまたは2つの胚を、同期させたそれぞれの養母の子宮に非手術的に移入する。
【０１３２】
好ましくは、養母を直腸診または超音波検査よって妊娠に関して定期的に、例えば妊娠第40日、60日、90日、120日に検査する。妊娠のさまざまな段階での胚喪失について評価するために、注意深い観察および連続的な超音波モニタリング(毎月)を、妊娠期間全体を通じて行うことが好ましい。流産した胎仔は、クローンの状態を確かめるためのDNA型判定およびルーチン的な病態検査のために、できれば採取すべきである。
【０１３３】
このような方法の緒段階で作製された再構成細胞、活性化された再構成細胞、胎仔および動物、ならびにそれらから採取しうる細胞、核および他の細胞成分も、本発明の態様として主張される。作製された動物という用語は、生きている動物であることが特に好ましい。
【０１３４】
本発明をまた、例えば細胞、組織および臓器の移植に用いうる、胚、胎仔または子孫を作製するために用いることもできる。胎仔細胞または成体細胞を動物から採取して、それをクローニング手順に用いることにより、クローニングした胎仔から、それらが器官形成を経て発育するに伴って、さまざまな細胞、組織および可能性としては臓器を入手することができる。細胞、組織および臓器を、クローニングした子孫から単離することもできる。この工程は、細胞療法および遺伝子治療を含む、数多くの医学的および獣医学的な治療法のための「材料」の源を提供することができる。細胞を、その細胞の由来である動物に戻して移入するならば、免疫拒絶反応は避けられる。また、多くの細胞種をこれらのクローンから単離することができるため、同じ種の動物間での免疫拒絶反応を回避するために造血系キメラ化などの他の方法を用いることもできる。
【０１３５】
「含む(comprising)」とは、「含む」という言葉の後に続くものを非限定的に含むことを意味する。したがって、「含む」という用語の使用は、列挙した要素が必要または必須であるが、他の要素は選択的であり、存在してもしなくてもよいことを意味する。「からなる(consisting of)」とは、「からなる」という語句の後に続くものを限定的に含むことを意味する。したがって、「からなる」という語句は、列挙した要素が必要または必須であり、他の要素は存在しないと考えられることを示す。「本質的に……からなる(consisting essentially of)」とは、語句の後に列挙した要素を含むほかは、列挙した要素の開示において特定される活性または作用に干渉または寄与しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「本質的には……からなる」という語句は、列挙した要素が必要または必須であるが、他の要素は選択的であって、それらが列挙した要素の活性または作用に影響を及ぼすか否かに応じて存在しても存在しなくてもよいことを示す。
【０１３６】
ここで、以下の非制限的な実施例のみを参照することにより、本発明をさらに説明する。しかし、以下の実施例は例示的なものに過ぎないことが理解される必要があり、いかなる形でも上記の本発明の一般性を限定するものとみなされるべきではない。特に、本発明はウシおよびネズミ科動物の胚の使用に関して詳細に記述されているが、本明細書における知見がこれらの胚には限定されず、ヒトを含む任意の動物の胚から幹細胞または幹細胞様細胞を成長させることにも有用であると考えられることは明らかに理解されるであろう。
【０１３７】
実施例1  無傷の胚からのウシ幹細胞の作製
胚盤胞期にあるウシのD7.5胚を、先端の細いガラス製マイクロピペットまたは超微細針インスリン用シリンジを用いて押しつぶしてマウス胚フィーダー(MEF)層の中に押し込み、α-MEM培地中にてbFGF、hEGF、ITS、hrLIF、2-β-ME、グルタマックス、NEAAおよび20％FCSの存在下で培養した。その同日または翌日に、培地を、5μMの5'-アザシチジンを含む(処理群)または含まない新たな培地(非処理群)と交換した。各群において培地を3日毎に交換した。図1に見られるように、非処理物(パネルA)および処理物(パネルB)の外観は培養開始時点ではどちらも極めて類似している。
【０１３８】
7〜9日後に、処理していない、および処理した「押しつぶされた」全胚は、形態的に識別しうる初代胚増殖物を生じた。
【０１３９】
図2に見られるように、非処理胚は、多能性細胞(PC)、栄養膜細胞、原始内胚葉細胞、およびおそらくは原始中胚葉からなる増殖物(対照増殖物、CO)を形成した(パネルA)。一方、処理胚は、増殖物(処理増殖物、TRO)は、ウシES様細胞に特徴的な形態を有する細胞のみからなっていた(パネルB)。増殖物のサイズは直径0.6〜0.8cmに達した。
【０１４０】
図3に見られるように、CO増殖物のうち、Oct4、Rex1およびSSEA-1などの多能性のマーカーを発現したのはPC部分のみであった(パネルA、B)。TRO増殖物ではすべての細胞がこれらのマーカーを発現した(パネルC、D)。続く9〜12日の間に、TRO増殖物は形態の変化を伴うことなく直径約2cmに達した(器官培養皿のウェルの中央部を満たしている。BD、カタログ番号353001)。増殖物は多能性マーカーOct4を発現し続けた(図4)。
【０１４１】
CO増殖物のPCを機械的に切り刻んでいくつかの小片にし、新たなフィーダー層の上で継代して、5'-アザシチジンを含まない培地中で培養したところ、それらは正常な初代培養物と同じ様式で振る舞った：すなわち、それらは前述したさまざまな細胞種の細胞からなるコロニーを生じた。さらに、これらのコロニーのPC構成要素のみが多能性マーカーを発現した。
【０１４２】
5'-アザシチジンの存在下で14〜21日間培養した初代TRO増殖物を幅約600〜800μmの小片に機械的に分割し、新たなフィーダー層の上で継代して、5'-アザシチジンの存在下で培養したところ、それらはウシES様細胞に特徴的な、均一な形態を有する細胞のコロニーを形成することができた(図5、6および7)。これらの細胞コロニーは、培養皿に入れた小片の数に応じて、14〜21日間で集密状態に達した。集密化した単層へと発育した成長性コロニーは、Oct4などの多能性マーカーを発現した。
【０１４３】
5'-アザシチジンの濃度を2.5μM未満に低下させた場合には、初代培養物および継代培養物に対する5'-アザシチジンの同じ効果は観察されなかった。
【０１４４】
これらのデータは以下のことを示唆する：
1)．全胚外植体からESCを単離することができる。初代胚盤胞外植体のインビトロの胚からES様初代増殖物を単離する効率の上昇をもたらす、新規な押しつぶし手法は、ウシ胚盤胞の多能性構成要素を増加させることができる。
2)．5'-アザシチジン処理は、細胞のより多くを、多能性であり続けるように誘導することができ、これらの細胞の均一な多能性集団としての増殖を誘導することができる。
3)．5'-アザシチジン中での初代増殖物の継続培養は、細胞の多能性状態での維持をもたらす。
【０１４５】
実施例2  実施例1で単離されたウシES細胞のインビボ発育能力
ウシES細胞のインビボ発育能力を調べ、それらの多能性を検討するために、5μM 5'-アザシチジンの存在下で単離および維持されているウシES細胞を、第3継代の時点で微細ガラス製ピペットを用いて切り刻んで小片にした。これらの小片は150〜300個の細胞からなっており、続いてこれらをSCIDマウスの精巣に注入した。注入8週後に、精巣から部分的に排出された奇形種が同定された。組織化学分析により、発育した奇形種の中には3種類の胚葉すべての派生物の存在が確かめられた(図8のパネルA、BおよびDを参照)。
【０１４６】
実施例3  無傷の胚からのマウス幹細胞の作製
マウス胚からES細胞を単離するために、実施例1に記載したウシ幹細胞に対して開発された手法を利用した。
【０１４７】
前成熟期(5〜6週齡)の129sv雌を、ルーチン的なプロトコール(1IUのPMSGおよびHCGを48時間間隔で腹腔内注射)を用いて過排卵させた後に、OG2雄と交配させた。129sv系統を選択した理由は、ES細胞の単離が容易になることが文献中で明らかにされていたためである。交配のための繁殖相手として用いたOG2雄は、C57/B16系統であり、Oct4-EGFP構築物に関してトランスジェニック性であった。これらのマウスからのすべての多能性細胞がGFPを発現したことから、本研究ではこの性質を利用し、GFPを、ESCが導き出された後にその同定を容易にするための蛍光マーカーとして用いた。人道的に屠殺した雌性マウスの卵管から接合子を収集した。KSOM培地(Chemicon)中でのヒアルロニダーゼ(300IU/ml)による処理によって、接合子から卵丘細胞を除去した。ヒアルロニダーゼを除去するために接合子を注意深く洗浄し、培養液の入った新たな培養皿に移して37℃インキュベーターに入れ、桑実胚/胚盤胞期まで発育させた。
【０１４８】
1μMの5-アザ-シチジンによる桑実胚/胚盤胞の処理．桑実胚/胚盤胞を、1μMの5-アザ-シチジンを加えたKSOM培養液の中で24時間にわたって培養した。
【０１４９】
F1(CBA/C57)MEFを、胚の付着ならびにその後のESCの単離および支持を促すためのフィーダー層として用いた。MEFは37℃インキュベーター内でのマイトマイシンC(10μg/ml)による2.5時間にわたる処理によって失活させ、6cm培養皿当たり細胞3×105個/mlの割合でプレーティングした。
【０１５０】
0.1％のAcid Tyrode溶液(pH2.8)に対する短時間の曝露後に胚から透明帯を除去し、続いて培地(KSOM)中で3回洗浄した。その後に、それらを、29G針(0.33mm×12.7mm)を用いてフィーダーに対して押しつけた。培地を改変ESC培地、すなわち1000×2-β-ME、100×NEAA、100×グルタマックス、20％Hyclone血清、10ng/mlマウスLIF、10ng/ml bFGFおよび10ng/ml hEGFを加えたDMEMと交換し、10ng/mlのアクチビンA、10ng/mlのNodalおよび0.1μMの5-アザ-シチジンを使用直前に新たに添加した。続いて培養皿を37℃のインキュベーターに戻した。
【０１５１】
培地は24時間間隔で毎日交換した。培地を交換する直前に培養物を観察し、形態(明視野/位相差)およびGFP発現を記録するために、以下のものを備えたOlympus 1X71蛍光顕微鏡を用いて写真を撮影した：(1)位相差、(2)U-MNUA-2(UV励起)---360-370(励起フィルター)420-460(発光フィルター)、(3)U-MIGA 2(緑色励起)-540-550(発光フィルター)575-625(発光フィルター)および(4)写真用付属品。GFPを発現するコロニーを、試料が自己蛍光を呈するか否かを判定するためにUV2Aの下で観察した。GFPを発現し、かつUV2A下で自己蛍光を発しない試料はGFP陽性であるとして確かめられた。
【０１５２】
図9：以上の方法に記載した通りに処理したOG2 F1胚を、形態を記録するために明視野、GFPおよびUV2A蛍光顕微鏡検査によって観察して写真を撮影した。GFP蛍光を、自己蛍光の存在(またはその欠如)を検出するために利用した。この点に関して、自己蛍光は被験試料のいずれにも観察されなかったことを指摘しておく(非提示データ)。
【０１５３】
(パネル9A)D0：5'アザシチジンによる処理の前に観察した培養液中の胚(上が桑実胚、下が胚盤胞)。GFP発現が、稠密な桑実胚の全体および胚盤胞の主として内部細胞塊(ICM)に認められる。
【０１５４】
(パネル9B)D1：1μMの5-アザシチジンを含むKSOM培地中での24時間の処理の後(処理)、透明体の除去およびMEFフィーダー層上へのプレーティングの前の胚盤胞。
【０１５５】
(パネル9C)D2：改変ESC培地中のフィーダー層上へのプレーティングから24時間後の処理した胚盤胞。
【０１５６】
(パネル9D)D4：D4までに、GFP発現が胚盤胞外植体に明瞭に認められるようになった。
【０１５７】
(パネル9E)D9：第9日までに、胚構造の完全性は崩壊し、ESCコロニーが観察されるようになった。ここには、GFPを発現するそのような1つのコロニーが提示されている。
【０１５８】
脱メチル化剤(5-アザ-シチジン)によるマウス移植前胚の24時間にわたる前処理の後に、透明帯を除去し、フィーダー層の上に無傷の胚を押し込むことにより、胚外植体の増大がもたらされた。短期間の培養(8〜10日間)の後に、ESCに似た細胞のコロニーが観察された。このESCと推定されるものは、多能性遺伝子Oct4の調節制御下にあるGFP導入遺伝子を発現した。
【０１５９】
以上をまとめると、本発明者らは、ウシおよびマウスにおけるES様細胞の集団を、培養下で、単離および樹立するための新規な方法を記載してきた。用いた化学物質の作用の方法は種特異的ではないため、本発明者らは、本発明がヒトを含むすべての脊椎哺乳動物において用途を有すると考えている。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】胚が押しつぶされてフィーダー層の中に押し込まれたものを示している。対照胚(パネルA)および5-アザシチジン処理を受けることになる被験胚(パネルB)の外観は極めて類似している。
【図２】(パネルA)は、以下のいくつかの種類の細胞からなる、7〜9日間のインビトロ培養後の対照増殖物(CO)を示している：ウシES細胞に特徴的な形態を有する多能性細胞(PC)；栄養膜細胞；原始内胚葉細胞。パネルBは、処理された胚が、ウシES細胞に特徴的な形態を有する細胞のみからなる増殖物(処理された増殖物、TRO)を生じることを示している。
【図３】COの多能性細胞が、多能性のマーカー：ウシOct4、ウシRex1およびウシSSEA-1を発現することを示している(パネルA)。COの他の細胞はこれらのマーカーを発現しない(パネルB)。TROの任意に選択された領域の細胞は、Oct4、Rex1(パネルC)およびSSEA-1(パネルD)を発現する。
【図４】21日間の培養後に、集密化したTROがOct4を発現することを示している。
【図５】単に継代したTROを示している。
【図６】5-アザシチジンの存在下における2日間の培養後の、継代したTROを示している。
【図７】5-アザシチジンの存在下における7日間の培養後の、継代したTROを示している。
【図８】(パネルA)は、拡張した上皮腺(腺上皮)に、立方状ないし円柱状の上皮の単層が一列に並んでいる様子を示しており、後者はエオジン好性で薄紅色で尖状の細胞質および基底に位置する均一なサイズの卵形の核を有する。写真の右上の辺縁には、赤血球が充満した血管がある。パネルBは、外胚葉派生物が小さな暗色の神経芽細胞(神経分化)によって提示されることを示している。パネルCは、無定形でエオジン好性でタンパク質性の分泌物を含む、エオジン好性の薄紅色の細胞質および均一なサイズの卵形の核を有する立方状細胞からなる上皮腺を示している(内胚葉)。腺は、疎に詰まったコラーゲン繊維によって囲まれている(中胚葉)。
【図９−１】パネルA〜Cは、さまざまな条件下で培養したマウス胚を示している。
【図９−２】パネルD〜Eは、さまざまな条件下で培養したマウス胚を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【国際調査報告】
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