(57)【要約】本発明は、植物に、サリチル酸、ジャスモン酸、およびブラシノステロイドからなる群の一つまたは複数の全身性シグナル化合物に対する受容体をコードするDNA配列を含む遺伝子構築物を提供する工程による、植物における抵抗性を増強するための方法を提供する。抵抗性は、該植物を該シグナル化合物と接触させる工程によって誘導できる。好ましくは、受容体は、RKS受容体、サリチル酸受容体、またはジャスモン酸受容体である。組み合わせおよび/またはキメラ受容体もまた適用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物に、サリチル酸、ジャスモン酸、およびブラシノステロイドからなる群の一つまたは複数の全身性シグナル化合物に対する受容体をコードするDNA配列を含む遺伝子構築物を提供する工程による、植物における病原体抵抗性を増強するための方法。
【請求項２】
受容体が、ジャスモン酸受容体（JAI-1遺伝子によってコードされる可能性がある）、サリチル酸受容体（植物COX2相同遺伝子によってコードされる可能性がある）およびRKS受容体からなる群より選択されることを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項３】
細胞1個あたりの受容体分子の数を増加させる工程による、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
受容体をコードするDNA配列が、組織特異的もしくは発生特異的受容体または調節性（誘導性）プロモーターの制御下にある、請求項1または2記載の方法。
【請求項５】
受容体が、好ましくはRKS1、RKS4、RKS7、およびRKS14からなる群より選択されるRKS受容体である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
受容体が、該受容体のリガンド結合部分がジャスモン酸受容体（JAI-1遺伝子によってコードされる可能性がある）、サリチル酸受容体（植物COX2ホモログ遺伝子によってコードされる可能性がある）、RKS受容体、ステロイド受容体、PAMP（病原体関連分子パターン）分子に対する受容体、および他の拡散性分子に対する受容体からなる群より選択される別の受容体のリガンド結合部分によって置換されるような様式でキメラである、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
RKS受容体のリガンド結合部分が他の受容体のリガンド結合部分によって置換される、請求項6記載の方法。
【請求項８】
植物に、2つまたはそれ以上の受容体をコードする構築物が提供される、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
DNA配列がRKS受容体のN末端部分（細胞外ドメイン）をコードする、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
N末端部分が、切断型（truncated）受容体によってまたは細胞外プロテアーゼを（内因性または外部からの適用のいずれかによって）適用する工程によって産生される、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
細胞外プロテアーゼがスブチリシンである、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
請求項6〜9のいずれか一項記載の方法によって産生された植物。
【請求項１３】
誘導抵抗性に対する増加した感受性を依然として含有する、請求項9記載の植物の子孫から産生された同系交配植物品種。
【請求項１４】
ジャスモン酸受容体（JAI-1遺伝子によってコードされる可能性がある）、サリチル酸受容体（植物COX2ホモログ遺伝子によってコードされる可能性がある）、およびRKS受容体、もしくはそれらのキメラ受容体からなる群より選択されるシグナリング化合物に対する受容体が提供されている植物に、該受容体に結合できるシグナリング化合物をスプレーする工程による、病原体抵抗性を誘導するための方法。
【請求項１５】
PR-1、At2g14560、ZAT7（At3g46090）およびAt2g32200のような抵抗性マーカー遺伝子のレベルをモニタリングする工程による、請求項14記載の方法を適用する最善の時期を決定するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物病害の分野、より具体的には病原体に対する植物の抵抗性を向上させること、より具体的には誘導された抵抗性機構を増大させることに関する。
【背景技術】
【０００２】
緒言
植物が病原体に遭遇すると、感染を防止し、病害からの回復を支援し、そして将来の感染さえ防止することのできる抵抗性機構が活性化される。抵抗性の一般的特徴は、抵抗性が病原体との最初の遭遇もしくは病原体による攻撃に反応して誘導されることである。
【０００３】
近年、植物の抵抗性タンパク質は、病原体由来エリシター分子との相互作用によって活性化されるとシグナル伝達経路を誘導できることが明らかになってきた。一部の相互作用は、少なくとも部分的に共通経路を使用することが確定されている（Science, 1997, 278, 1963-1965）。この刊行物では、NDR1遺伝子座が病原菌であるトマト斑葉細菌病菌（Pseudomonas syringae pv. tomato）に対する抵抗性のために必要とされ、真菌性病原体ペロノスポラ・パラスチカ（Peronospora parasitica）によって誘導されることが証明される。同様に、Parker, J.E. et al. （The Plant Cell, 1996, 8, 2033-2046）は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）におけるEDS1遺伝子座によってコードされた産物もまた、ペロノスポラ・パラスチカによる感染後のシグナル伝達経路において重要な機能を有するが、ダイズ斑点細菌病（Pseudomonas syringae pv. glycinae）による感染後には重要な機能を有していないことを証明する。
【０００４】
多数の様々な研究グループが、これらの病原体感染に対して抵抗性である形質転換植物を作製するために、そのようなエリシターセンサーもしくは受容体分子をコードする遺伝子を植物内へ導入してきた。一般に、これらのエリシター受容体は、1つの病原体しか、あるいは1病原体種のまさに1つの毒性の強い菌株しか認識できない。さらに、病原体は、植物が病原体を認識できないようにするために十分であることが証明されているこの形の淘汰圧およびエリシター分子の小さな修飾に向けて迅速かつ容易に適応できる。可能性のあるセンサー分子は極めて多数存在するが、シグナル伝達に関係する遺伝子の数は極めて少なく、進化的に保存されたタンパク質からなる。
【０００５】
はるかに広範囲のレベルの感知（perception）および広域スペクトル病害抵抗性応答が、極めて多種多様な病原体内で保存されている病原体分子の感知によって媒介される。これらの病原体関連分子パターン（PAMP）は、フラジェリンペプチド受容体FLS2（Mol Cell., 2000, 5, 1003-1011）、または伸長因子Tuに対する受容体（The Plant Cell, 2004, 16, 3496-3507）のような植物受容体によって認識される。
【０００６】
エリシター受容体によって伝達される細胞内警告シグナルは、基礎抵抗性操作にとって適切な標的を提供する（Trends in Genetics, 2000, 16, 449-450）。一次侵襲の部位でのシグナリングカスケードは、大多数の植物種において類似であり、保存される。トランスジェニック植物における基礎シグナリングの高レベルへの調節（WO99/45129参照）により、誘導基礎抵抗性レベルが生じた。
【０００７】
このため一次防御シグナルの持続的活性化は、第1防御障壁での抵抗性を増加させるために最適な戦略であると思われる。しかし、このレベルの抵抗性の絶え間ない過剰刺激は、関係する適応度が犠牲となるために望ましくない（Trends in Plant Science, 2002, 7, 61-67）。
【０００８】
二次抵抗性障壁は、全植物を通して誘導抵抗性（IR）応答のプロセスによって提供される。この防御障壁は、病原体に対する戦いにおいて不可欠である。これは大まかには2種のプロセスに分けることができる：
（a）一次感染部位からの警告シグナルの放出およびその植物全体へのシグナルの全身性拡延；
（b）様々な器官におけるこれらのシグナルの感知および誘導抵抗性（IR）の活性化。
【０００９】
活性化抵抗性を生じさせる警告シグナルの感知および下流プロセッシングは、様々な警告シグナル間で相違する可能性があるプロセスである。
【００１０】
サリチル酸（SA）は、長年にわたり主要警告シグナルの1つであると認識されてきた。サリチル酸は、老化および熱産生のような植物の発生プロセスに関係するホルモンとしても作用している（Plant Physiol., 1992, 99, 799-803；Science, 1987, 237, 1601-1602；PNAS, 1989, 86, 2214-2218）。獣医学分野では、サリチル酸（およびその誘導体）は、長年にわたり炎症誘導性発熱に対して使用されてきた。ヒトの身体における体温上昇は、シクロオキシゲナーゼの1種であるCOX2を通してその作用を媒介するサリチル酸を適用することによって下げることができる。動物系（Journal of Endocrinology, 2003, 178, 1-4）および植物系のどちらにおいても、炎症や疾患における抵抗性のつながりは、COX2の活性によって媒介される。COX2は、煙草におけるPiox（The Plant Cell, 1998, 10, 1523-1537）、またはコショウ由来のpCa-COX1と同様に、植物界において明白な相同物を有し、その発現パターンは病原体により侵襲されると強力かつ迅速に誘導される（J. Exp. Botany, 2002, 53, 383-385）。本明細書において本発明者らは、これらのシクロオキシゲナーゼ相同物の植物相同物をサリチル酸の感知分子（受容体）であると規定する。SAがシクロオキシゲナーゼへ結合すると、その酵素活性の修飾が生じ、最終的には植物内のSA媒介性抵抗性誘導を生じさせる細胞内（脂質）プロセスの変化が生じる。
【００１１】
植物における抵抗性に向けてのSA応答を媒介することに関係しているまた別の分子は、SABP2である。SABP2は、高親和性でサリチル酸に結合する（PNAS, 2003, 100, 16101-16106）。それによってSABP2ヒドロラーゼ酵素活性が修飾され、最終的には植物抵抗性のSA媒介性誘導を生じさせる細胞内脂質プロセスの変化を生じさせる。近年、SABP2は、MeSAをSA活性化SARへ修飾するメチルエステラーゼであること、そしてSAはフィードバックループ内でこの反応を阻害することが知られてきた（PNAS, 2005, 102, 1773-1778）。このため、この分子はおそらく間違って受容体であると規定される。
【００１２】
ブラシノステロイド受容体BRI1（BRassinosteroid Insensitive 1）は、膜貫通型受容体キナーゼを含有するLRR（ロイシンリッチリピート）である（Cell, 1997, 90, 929-938）。これは、BRI1（At4g39400）；BRLl（At1g55610）、BRL2（At2g01950）およびBRL3（At3g13380）を含むシロイヌナズナ内の小さなファミリーに属する（Development, 2004, 131, 5341-5351）。BRI1および相同物は、ステロイド感知に直接的に関係しているだけではなく（Nature 2005, 433, 167-171）、抵抗性応答の全身性シグナリングに関係するペプチドホルモンであるシステミン（シロイヌナズナ由来のプロシステミン相同物：At2g22940）に高親和性で結合する（PNAS, 2002, 99, 9090-9092）。植物のステロイドシグナリングのための下流細胞内経路については記載されている（Bioassays, 2001, 23, 1028-1036；Trends in Plant Science, 2004, 9, 91-95）。
【００１３】
ブラシノステロイド感知に関係するまた別の受容体ファミリーは、RKS（受容体キナーゼ型SERK；Development, 1997, 124, 2049-2062）遺伝子産物によって規定されている（WO04/007712）。これらのRKS遺伝子産物は、植物におけるブラシノステロイドシグナリングを媒介することにも関係し、BRI1様受容体との複合体を形成すると思われる（The Plant Cell, 2004, 16, 3216-3229；Cell, 2002, 110, 213-222；Cell, 2002, 110, 203-212）。それらは、14種のシロイヌナズナRKS遺伝子産物へ直接的に結合すると仮定されている14種のシロイヌナズナGASA（Gibberelic Acid Stimulated Arabidopsis；Plant Mol Biol., 1995, 27, 743-752）遺伝子産物のような候補ペプチドリガンドによって代表される細胞外ペプチドリガンドに結合することにも関係している（WO04/007712）。GASAタンパク質は、高親和性でブラシノステロイドに結合することに関係すると仮定されているそれらの構造内にポケットを含有する。GASAペプチドリガンドは、それによってRKS/BRI二量体とブラシノステロイド分子との媒介物として機能する。RKSとBRI1のような他の受容体との二量化複合体は、様々なファミリーメンバーが二量化パートナーとして参加することのできる動的原形質膜複合体である（図1参照）。
【００１４】
これらのクラスの受容体キナーゼの活性の変調は、ペプチドリガンドおよびステロイドホルモンの両方によって調節される。植物ブラシノステロイドは、様々な形で入手可能である（J. Exp. Botany, 1999, 50, 275-282；The Plant Cell, 2002, S97-S110；Plant Physiol, 2003, 131, 287-297に記載されている）。これらとは別に、これらの受容体活性を調節するために、多数の合成アゴニストまたはアンタゴニストを使用できる（Trends in Plant Science, 1999, 4, 348-353）。
【００１５】
上述のタンパク質受容体複合体中では、ELSタンパク質（WO04/007712）もまたブラシノステロイドの感知およびシグナルの伝達に、したがって植物全体に及ぶ抵抗性応答の媒介に関係する。シロイヌナズナELS遺伝子産物のトマトホモログであるLRPは、病害発生過程中に特異的に誘導され、驚くべきことにタンパク質分解的にプロセッシングされる（Mol. Gen. Genet., 1994, 243, 47-53；Plant J., 1996, 10, 315-330）。このため、ELSタンパク質産物は、明らかに抵抗性応答に関係し、抵抗性のブラシノステロイド調節の変調において何らかの役割を果たすと思われる。
【００１６】
ジャスモン酸（JA）および多数の誘導体分子によって媒介されるジャスモン酸塩のシグナリングは、植物抵抗性ならびに果物の成熟、老化、および胚発生や花粉発生のような発生プロセスにおいて重要な役割を果たすことも公知である（The Plant Cell, 2002, 14, S153-S164）。JAは、COI1のようなF-Boxタンパク質の作用を通して、ユビキチン化経路を媒介することに関係する。JAの感知は、JAI-1遺伝子座（PNAS, 2002, 99, 6416-6422）またはまだ同定されていない受容体によってコードされるような遺伝子産物によって媒介される可能性がある。
【００１７】
植物は、全植物を通して全身性免疫機構を活性化する洗練されたプロセスを発達させてきた。多数の局面では、この二次防御障壁は、ヒトにおけるワクチン接種反応に匹敵し、重複する要素は、類似の遺伝子産物ならびに植物および動物の進化中に保存され続けたシグナリング経路に依存する（EMBO reports, 2005, 6, 504-507）。植物における全身抵抗性応答は、大きくは全身獲得抵抗性（systemic acquired resistance；SAR）と誘導全身抵抗性（induced systemic resistance；ISR）とに分けることができる（Curr Opin Plant Biol., 2004, 7, 456-464）。これらの様々な抵抗性の様式は各々が広範囲の病原体に対して有効ではあるが、それらの応答は現段階では様々なクラスの病原体に対して多かれ少なかれ特異的である（Mol Plant Microbe Interact., 2002, 15, 27-34）。細菌またはウイルスを標的とする広域スペクトル抵抗性応答は、必ずしも例えば線虫類またはアブラムシに対する誘導レベルの抵抗性を生じさせない。さらに様々なシグナリング分子の組み合わせによって、各シグナリングカスケードが誘導かつ伝達される（Trends in Genetics, 2000, 16, 449-455）。
【００１８】
通常は、これらの植物産生シグナルの全身性輸送は、長期間の広範囲にわたる抵抗性の全身性誘導を生じさせる。しかし、植物シグナルの特異的組み合わせは、結果として生じる長時間持続性全身性応答の特異的性質を一緒に決定付ける。一部の応答は、既に1つのシグナリング化学物質の存在によって誘発される。他の応答は、様々な化学物質全体に対する重複する要件を有する。シグナル化合物の例は、サリチル酸、ジャスモン酸、エチレン（Nature Biotechn., 2000, 18, 779-783）、およびブラシノステロイド（WO04/007712）である。システミンおよびGASAなどのペプチド因子は、上記で考察したように、ブラシノステロイドシグナルの感知を妨害することが公知である。例えばこれらの特異的シグナリング分子をスプレーすることによる植物への外部からの人工的適用は、植物内の望ましい誘導抵抗性応答を活性化することができる。スプレー溶液中の様々な全身性植物シグナルの濃度および組成の変調は、全身抵抗性の獲得の変調を可能にする。
【００１９】
これらの全身性シグナルは、感染プロセスに直接的には関係していない植物の各部分内の細胞および器官によって感知される。この感知は、これらの全身性シグナル分子の各々について特異的受容体によって遂行される。
【００２０】
フィールド条件下での作物植物の（単一）栽培における病害抵抗性のレベルを制御することは、生産農業従事者と様々な天然病原体との間の絶え間ない闘争である。植物自体がしばしば高い収穫高レベルを得るために繁殖させたクローン品種からなるが、そのゲノム構成は、概して最適な病害抵抗性のために最適化されてはいない。成育中の植物の保護または収穫された作物のその後の保護のために利用できる主要なツールは、殺真菌剤、殺菌剤および殺虫剤などの殺生物剤の適用からなる。これらの化学物質に関連する環境問題についての現在の理解は、病害を管理するために利用できる代替策を農業従事者に与えないまま、現在利用できる化学物質の多くの禁止をもたらしてきた。病害抵抗性を目的として現在進行中の伝統的な品種改良戦略の多くは、新規な貴重な交配種および市販適用するための品種を産生できるようになるには何年も要する。しかし、この数十年の間に、遺伝子組み換えによって、例えば高感受性応答の成分およびシグナル分子の媒介物を用いて植物を形質転換させることによって抵抗性を増加させるための無数の試みがなされてきた（Transgenic Res., 2002, 11, 599-613）。これらのトランスジェニック代替品のほとんどは、とにかく現時点では、市場には到達していない。
【００２１】
農業従事者が植物の天然防御機構を利用する1つの方法は、サリチル酸などのシグナリング化合物の投与によって防御応答を誘発する方法である。これらのシグナリング化合物は、環境内で適用できる（土壌添加物、スプレー、散粉など）。しかしこのアプローチの欠点は、シグナリング化合物が、スプレーによる損失および植物によって取り込まれる間の損失を補填するために高用量で、少なくともISRを誘導するために使用されなければならない濃度で投与される必要があり、一部には毒性および/または環境に不都合である点である。植物自体の機構の使用は、植物自体によるシグナリング化合物の内因性生成の上昇による代替法を提供する。これにより、活性のシグナリング化合物（例、SA、ブラシノステロイドなど）のレベルを調節する遺伝子が、誘導性/組織特異的もしくは時期特異的プロモーターの制御下でトランスジェニック植物自体内で発現させられる。これらの遺伝子産物の定常状態レベルの変調は、順に活性シグナリング化合物のレベルを調節する。そのような遺伝子産物の例は、プロシステミンペプチドの開裂に関係しているプロテアーゼ、またはDWARF4遺伝子産物である（Plant Journal 26 2001 573-582）。この後者のアプローチの特別の短所は、植物全体が誘導されることにあり、これは必要ではないことが多く、植物の全体的適応度（および収穫高）を減少させる。そこで、植物の適応度および収穫高の特性をできる限り妨害せずに、植物における病害抵抗性を増強させるためのまた別の戦略に対する必要が依然として存在する。
【発明の開示】
【００２２】
発明の概要
ここで、本発明は、全身性シグナル化合物に対する受容体をコードするDNA配列を含む遺伝子構築物を植物に提供する工程による、植物における病原体抵抗性を増強するための方法を提供する。このような全身性シグナル化合物は、サリチル酸、ジャスモン酸、およびブラシノステロイドからなる群の一つまたは複数である。より具体的には、この受容体は、ジャスモン酸受容体、サリチル酸受容体、およびRKS受容体の中から選択される。
【００２３】
誘導抵抗性に対する植物の感受性の増強は、細胞/器官1つ当たりの一つまたは複数の上述の受容体に対応する受容体分子の数を増加させることによって達成される。
【００２４】
感知の増加は、警告シグナル受容体の量を増加させるだけではなく、これらの警告シグナル自体の（局所的）濃度を増加させることによっても遂行できる。これは、SAまたはブラシノステロイドなどのこれらのシグナルの投与または（局所的）内因性生成によって実施できる。
【００２５】
具体的な態様は、その受容体をコードするDNA配列が組織特異的プロモーター（具体的には、果実、種子、もしくは花において発現するプロモーターなど）または病原体誘導性プロモーター、界面活性剤誘導性プロモーター（TWEEN20；Hunzicker, G.M., et al. （2004） Proceedings for the 4th International Crop Science Congress, Brisbane, Australia, 26 September-1 October 2004）、熱ショック誘導性プロモーター（Biochem Biophys Res Commun., 200, 321, 364-369）、ステロイド誘導性プロモーター（動物ステロイド（例えば、Plant J., 2005, 41, 899-918）もしくは植物ステロイド（例、At2g14560のプロモーター）、テトラサイクリン抑制因子をベースとするプロモーター系（Plant J., 2000, 21, 579-588）などの誘導性プロモーターの制御下に置かれる方法によって形成される。
【００２６】
また別の具体的な態様は、受容体をコードするDNA配列がキメラである方法によって形成されるが、キメラは、上述の受容体の一部を認識するリガンドが、上述の選択からの相違するシグナル化合物認識受容体、ステロイド受容体、PAMP、ステロール、ペプチドに対する受容体、または全身抵抗性応答を媒介することに関係する他の拡散性分子に対する受容体などのまた別の受容体の一部を認識するリガンドによって置換されていることを意味する。
【００２７】
本発明による方法によって産生される植物もまた本発明の一部である。そのような植物の具体的な態様は、キメラであってもなくてもよい2種またはそれ以上の受容体が導入されている植物である。本発明のまた別の一部は、該植物の子孫から産生された同系交配植物品種であるが、該品種は依然として誘導抵抗性に対する増加した感受性を含有する。同様の結果は、転写因子のような下流標的分子をコードする構築物と組み合わせた受容体をコードする構築物のような、同一経路に関係している相違する過剰発現構築物を組み合わせることによって入手できる。
【００２８】
本発明のまた別の態様は、本発明による植物もしくは品種における抵抗性を誘導する方法であって、該植物もしくは品種に提供される異種もしくはキメラ受容体に結合して刺激することのできるリガンド分子を該植物もしくは品種に適用する工程を含む方法である。該適用は、好ましくは該分子をスプレーする工程を含む。
【００２９】
発明の詳細な態様
本発明の基本は、誘導抵抗性に対する植物の感受性を増加させることである。緒言において考察してきたように、誘導抵抗性は病原体による攻撃に対する植物の初期応答によって誘発され、その攻撃は引き続いてサリチル酸、ジャスモン酸およびブラシノステロイドなどの全身性シグナル化合物の分散を生じさせる。これらの化合物は、植物細胞内の特異的受容体によって感知される。現在では、本発明者らによって、これらのシグナル化合物に対する受容体の量が抵抗性経路における限定因子であることが見いだされる。そこで、細胞もしくは組織1つ当たりの受容体の数を増加させると、循環全身性シグナル化合物および/または外部から適用されたシグナル化合物に対するより強度の応答が可能になる。この増加は、好ましくは、そのような受容体分子に対するコーディング配列を含むヌクレオチド構築物を用いて植物細胞を形質転換させることによって遂行される。
【００３０】
BRI/RKS二量体化膜貫通タンパク質複合体（図1参照）は、発生プロセス（The Plant Cell, 2004, 16, 3216-3229；Cell, 2002, 110, 213-222；Cell, 2002, 110, 203-212）、ならびにブラシノステロイドの感知を通しての抵抗性の調節（Plant Journal, 2003, 33, 887-898；および本発明者らによって入手されたデータ、例えば図2および図5）に関係する。拡散性システミンペプチドの感知およびもしかするとGASAリガンドもまた、この膜関連タンパク質複合体を通しての抵抗性応答を媒介することに関係する。このため、この複合体内のヘテロ二量体化タンパク質パートナー（図1）は、抵抗性、増殖および花器官の発生のような多種多様な一連のプロセスを媒介する。
【００３１】
驚くべきことに、本発明者らによって、BRI1受容体は植物の病原体抵抗性を増強しないが、他方RKS受容体の過剰発現は顕著な作用を及ぼすことが確証されている（実験の部参照）。これは、病原体抵抗性経路への関与に関する限り、RKS受容体が限定因子であると思われることを示唆する。
【００３２】
これがRKS受容体を、本発明において使用するために極めて適合する重要な受容体群にする。これらの受容体の感知機構は、ステロイドによって制御される動物系における炎症反応の感知機構に似ている。その場合には、グルココルチコイドの適用は、病原体侵襲に向かう一次応答を低下させる。このプロセスは、炎症反応にとって重要な数種の調節因子、例えばCOX2のmRNA安定性の低下によって変調させられる。さらに、これらのステロイドは、IL-1などの数種の膜貫通型TOLL様受容体複合体の活性を調節する（J. Endocrinology, 2003, 178, 1-4）。植物におけるTOLL様受容体のホモログは、植物ステロイドシグナル伝達にともに関係している、特にBRI1およびRKSホモログを含有するLRR受容体キナーゼの1つのサブグループによって表される。植物ステロイドシグナリングによって変調される経路の1つは、動物系においてグルココルチコイドを阻害するための標的である（Curr Opin Pharmacol., 2003, 3, 404-11）細胞内MAPキナーゼ経路である（FEBS Lett., 2001, 2, 346-50）。これらのデータは、植物ステロイドシグナリングおよびSAシグナリングは相互に広範囲のクロストークを示し、それらは動物系におけるような類似の経路および遺伝子産物を使用することによってこの相互作用を媒介するという仮説を導いた。これらのシグナリング化合物の各々は、部分的に重複する細胞内プロセスをそのために使用する抵抗性応答を単独で調節することができる。
【００３３】
現在では、そのような受容体の過剰発現が植物におけるより高レベルの病原体抵抗性を誘導することが確定される。実際に、受容体を刺激することができ、上述のカスケードの進行を設定し、次に（低）レベルの誘導抵抗性を導く内因性（低）レベルのシグナリング化合物がすでに存在すると思われるので、より高レベルである。これは特に、すでにシグナリング化合物を追加して適用する必要を伴わずにあるレベルの抵抗性を提供するので有益である。さらにこれには、抵抗性のレベルを増加させるために下流カスケードの化合物を刺激できるリガンドの使用を可能にする下流カスケードの増加した感受性が付随する。これらのリガンドは、特に、SPL、At4g14400、At4g23130、NPR1、At2914610、At2g14560および下流カスケードの一部であるその他のタンパク質からなる群より選択できる。ブラシノステロイド抗病原体カスケードと例えばSA病原体抵抗性カスケードとの間にはクロストークが存在することが明らかとなってきてから、GASAまたはシステミンもしくはこれらのペプチドのフラグメントのようなシグナリング機能を備える植物ステロイド、病原体もしくはそのフラグメント由来のエリシター、SA、JAおよび細胞外ペプチドなどの他の因子の適用をさらにまた使用すると活性化カスケードを高めることが可能である。したがって、下流カスケードに作用を及ぼすリガンドによって所定条件下で使用することが（例えば、毒性、環境問題などのために）望ましい可能性があるシグナル分子を取り替えることが可能である。
【００３４】
さらに、抵抗性を増強するための受容体の過剰発現は最適条件に結び付いていることも見いだされている。明らかに、過剰の受容体は下流カスケードの過剰刺激を発生させることがあり、これは阻害機構によって自動調節されることを示唆している（図4および7参照）。そこで、植物へシグナリング化合物に対する受容体をコードする遺伝子構築物が提供される場合には、最高発現因子を選択せず、むしろ最適抵抗性パラメーターについて試験するように注意を払わなければならない。以下では、当業者には容易に実行可能であるそのような試験について記載する。基本的には、1）ATTAアッセイ（Cell, 1996, 87, 1307-1316）などの抵抗性アッセイを実行する方法；および2）PR-1もしくはAt2g14560（SAおよびブラシノステロイドの適用によって強力に誘導されたNPR1の直接転写制御下の遺伝子（Plant Physiology 2005, 137, 1147-1159；Science 2005, 308, 1036-1040））またはAt3946090（ZAT7）もしくはAt2932200（図9および10も参照）のようなマーカー遺伝子の量を決定する方法などの最高抵抗性を決定するための数種の方法がある。マーカーとしてRKS4もしくは他のRKS受容体の植物中での過剰発現後に修飾された発現を備える遺伝子を使用する可能性は、スプレー法を通してトランスジェニックもしくは非トランスジェニック植物のプライミングを最適化するための遺伝子組み換えアッセイへの可能性を提供する。
【００３５】
RKS受容体、中でもRKS1、RKS4、RKS7、RKS11およびRKS14受容体は、最も好ましい受容体である（例えば、WO04/007712参照）。これらの受容体の大多数およびそれらの各コーディング配列は、白イヌナズナから単離される。しかし、他の植物由来のオルソロガス受容体およびまだ単離されていないこれらの受容体に対するコーディング配列もまた、同様に使用できる。これらのコーディング配列は、上述の参考文献に開示された配列と相同であると考えられる。そこで原則としては、該配列と相同であり、少なくとも全身性シグナル化合物受容体として機能するタンパク質をコードする任意の配列は有用である。これらのヌクレオチド配列はオルソロガス受容体を発現する植物から単離することができ、これらのヌクレオチド配列はさらにまたすでに公知の受容体のムテインをコードする現在あるヌクレオチド配列を修飾することによって作製することができる。
【００３６】
本発明の受容体のムテインは、全身性シグナリング化合物に対する受容体としてのそれらの機能を依然として維持しながら、一つまたは複数のアミノ酸を置換する、付加する、および/または欠失させることによってすでに公知の受容体から入手されるタンパク質である。そのようなムテインは、タンパク質遺伝子工学によって、タンパク質をコードできるオープンリーディングフレームを、例えばそれによってアミノ酸配列が影響を受けるように変化させる工程によって容易に作製できる。アミノ酸配列における変化がタンパク質の活性を一緒に無効にしない限り、そのようなムテインは本発明に含まれる。さらに、ムテインは生物活性を保持しながら公知の受容体から誘導可能である、すなわちムテインと配列表に表示したタンパク質との間の媒介物の全部、または大きな部分は全身性シグナリング化合物によって誘導できるはずであると理解されたい。大きな部分とは、媒介物の30％以上、好ましくは40％以上、より好ましくは50％以上、より好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは99％以上を意味する。
【００３７】
そこで、本発明の一部は、公知のタンパク質に少なくとも70％同一である、しかしより好ましくは上述の公知の受容体と80％より多く同一である、より好ましくは90％より多く同一である、および最も好ましくは95％より多く同一である受容体である。同一性のパーセンテージを計算するためには、デフォルトパラメーターを用いてBLASTアルゴリズム（Nucl. Acids Res., 1997, 25, 3389-3402）、またはデフォルトパラメーターを用いてGAPアルゴリズム（J. Mol. Biol., 1970, 48, 443-453）を使用できるが、それらはどちらもWisconsin Geneticsソフトウエアパッケージ、Genetics Computer Group（GCG）, 575 Science, Madison, Wisconsin, USAの中に含まれる。BLAST調査は、タンパク質をランダム配列としてモデリングできることを想定する。しかし、多数の実質タンパク質は、ホモポリマートラクト、短期反復、または一つまたは複数のアミノ酸のリッチな領域であってよい非ランダム配列の領域を含む。そのような低複雑性領域は、たとえタンパク質の他の領域が完全に異なっていても非関連タンパク質間で整列化してよい。多数の低複雑性フィルタープログラムを使用すると、そのような低複雑性アラインメントを減少させることができる。例えば、SEG（Comput. Chem., 1993, 17, 149-163）およびXNU（Comput. Chem., 1993, 17, 191-201）低複雑性フィルターは、単独で、または結び付けて使用することができる。
【００３８】
本明細書において使用する2つのタンパク質配列（またはヌクレオチド配列）の状況における「配列同一性」または「同一性」または「相同性」は、規定の比較ウインドウにわたり最高一致について整列化したときに同一である2つの配列内への残基についての言及を含む。配列同一性のパーセンテージがタンパク質に関連して使用される場合は、同一ではない残基位置はしばしば保存的アミノ酸置換によって相違することが認識されており、アミノ酸は類似の化学的特性（例、電荷もしくは疎水性）を備える他のアミノ酸残基と置換されるので、このため分子の機能的特性を変化させない。配列が保存的置換において相違する場合は、配列同一性のパーセンテージは置換の保存的性質について補正するために上流へ調整されてよい。そのような保存的置換によって相違する配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。これらの調整を行うための手段は、当業者には周知である。典型的には、これは保存的置換を完全ミスマッチではなくむしろ部分ミスマッチとしてスコア付けし、それにより配列同一性のパーセンテージを増加させる工程を含む。そこで、例えば、同一アミノ酸に1のスコアが与えられ、非保存的置換に0のスコアが与えられる場合は、保存的置換には0〜1の間のスコアが与えられる。保存的置換のスコア付けは、例えばMeyersおよびMillerのアルゴリズムによって計算される（Computer Applic. Biol. Sci., 1998, 4, 11-17）。
【００３９】
本明細書において使用する「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウインドウにわたる2つの最適に整列化した配列を比較する工程によって決定される数値を意味するが、比較ウインドウにおけるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の部分は、2つの配列の最適なアラインメントのための参照配列と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでいてよい。パーセンテージは、同一アミノ酸もしくは核酸塩基残基が両方の配列内で発生してマッチした位置の数を生成する位置の数を決定し、マッチした位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数で割り、そして結果に100を掛けて配列同一性のパーセンテージを与えることによって計算される。
【００４０】
一般に、タンパク質の全アミノ酸およびヌクレオチド配列の全ヌクレオチドが同等に良好に交換可能なのではない。大多数の場合に、タンパク質は、機能にとって重要または決定的である一つまたは複数の領域を有する。本発明のRKS受容体については、配列（WO04/007712の中に見いだすことができる）を整列化し、いわゆるコンセンサス配列、すなわち同一機能を備える相同配列間で良好に保存されているタンパク質の部分を決定することによって、低可変性領域を決定することは容易である。RKS受容体の変異体（またはムテイン）を設計しようとする場合は、これらのコンセンサス配列は、好ましくは無傷で維持されなければならないが、他の領域はもっと変動してもよい。RKS受容体群内では、最も好ましいのはRKS1、RKS4、RKS7、RKS11およびRKS14である。このサブグループは、特異的コンセンサス配列を共有する。
【００４１】
部分受容体、例えば細胞外ドメイン（の部分）だけ、または細胞内ドメインもしくはそのフラグメントだけしかヘテロ二量体受容体タンパク質複合体内の構成的活性化合物として作用できないことを言及するのは極めて重要である。本発明者らの試験結果は、RKS4のN末端部分（細胞外ドメイン）が抵抗性（図5）およびもしかすると器官のサイズおよび新鮮重量（図7および8）における増加によって例示されるような植物適応度に関してブラシノステロイド応答の構成的活性化因子として機能する可能性を示す。
【００４２】
本発明においてRKS受容体のN末端部分が言及される場合は、該RKS受容体の細胞外ドメインを意味する。当業者は、受容体のどの部分が細胞外ドメインによって意味されるかについて理解する。さらに、WO04/007712では、RKS受容体の細胞外ドメインが指示される。
【００４３】
本発明のまた別の態様はキメラ受容体によって形成されるが、上述の受容体のリガンド結合部分は、受容体、または例えばステロイド受容体を認識する相違するシグナル化合物などのまた別の受容体のリガンド結合部分によって置換される。この方法で、上述のように、相違する受容体、1つおよび同一のシグナル分子もしくはリガンドによって誘発される相違するIR経路を誘導することが可能である。これはさらに、IR応答を誘導するために、より安価およびより容易に入手できる化合物の使用を可能にする。1つの例は、例えばRKS受容体のリガンド結合部分をサリチル酸受容体のSA結合部分と置換することである。天然サリチル酸受容体およびキメラRKS受容体の両方を用いた植物の形質転換後には、サリチル酸の適用はサリチル酸誘導性応答およびブラシノステロイド誘導性応答の両方を誘発する。しかし、病原体抵抗性に関係していない受容体およびリガンドのリガンド結合部分を使用することもまた可能である。例えば、上述の受容体のいずれかのリガンド結合部分をERECTAのようなまた別の非関連性LRR受容体キナーゼのリガンド結合部分で置換することも可能である（Plant Cell, 1996, 8, 735-746）。
【００４４】
ヌクレオチド配列は、それらがその中へ形質転換される植物内で発現させることが必要である。このためには、発現可能なヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物（発現カセット）が必要とされる。ヌクレオチド配列の発現は、プロモーター、ターミネーター、およびエンハンサーエレメントなどの構築物中に含有される機能的エレメントに左右される。
【００４５】
用語「プロモーター」は、プロモーターが機能的に結合しているDNAの転写前に、RNAポリメラーゼおよび/または他の転写開始因子が結合する短鎖DNAを意味し、転写の発生を可能にすることを意図する。プロモーターは、通常はコーディング配列の上流（5'）に位置する。広い範囲では、用語「プロモーター」は、転写開始部位から、ときにはいっそう遠く離れて、RNAポリメラーゼ結合部位ならびに数百個の塩基対内に位置する調節配列エレメントを含む。そのような調節配列は、例えば生理的条件に反応して転写開始の有効性を制御するタンパク質因子の結合に関係している配列である。プロモーター領域は、宿主細胞内で機能的でなければならず、好ましくは受容体タンパク質の天然プロモーター領域に対応する。しかし、発現が望ましい場合にそれが宿主細胞内で機能的である限り、任意の異種プロモーター領域を使用できる。異種プロモーターは、構成的、組織もしくは発生特異的または調節性のいずれかであってよい。全部が当業者に周知のCaMV 35SプロモーターもしくはT-DNAプロモーターなどの構成的プロモーターは、実質的に誘導もしくは抑制などの調節を供さないが、転写が発生するための他の要件が満たされることを前提に、生体の全部もしくは大多数の活性細胞内で機能的に結合しているDNA配列の安定した、そして実質的に変化しない転写を可能にするプロモーターである。組織特異的プロモーターは、植物の限定された部分、すなわち特殊な組織および/または特殊な細胞タイプへのコーディング配列の発現を制限するプロモーターである。しばしば使用される組織特異的プロモーターは、Rubiscoプロモーター（植物の緑色部分に対して特異的である）である。調節性もしくは誘導性プロモーターは、その機能が内部に存在する、もしくは外部から加えられるのいずれかである一つまたは複数の因子によって調節されるプロモーターである（Trends in biotechnology 2005, 23, 283-290）。インデューサーの不在下では、DNA配列は転写されない、またはインデューサーの存在下での転写レベルと比較して減少したレベルで転写されるのいずれかである。所定の例では、ある因子は転写を活性化するために誘導性プロモーターへ特異的に結合することができ、該因子は不活性形で存在して、インデューサーによって（直接的もしくは間接的のいずれかで）活性形へ転換可能である。インデューサーは、タンパク質、代謝産物（糖、アルコールなど）、成長調節因子、除草剤、またはフェノール化合物などの化学的/生化学的物質であってよい。または、インデューサーは直接的に課された生理学的ストレス（例えば、熱、塩、創傷、毒性要素など）または間接的に課された生理学的ストレス（例えば、ウイルスなどの病原体もしくは病原物質の作用）である可能性がある。誘導性プロモーターを含有する植物細胞は、スプレー、散水、加熱、または類似の方法によるなどの細胞への該インデューサーの外部からの適用によってインデューサーへ曝露させることができる。誘導性プロモーターの例には、ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）の70kD熱ショックプロモーター（Ann. Rev. Genet., 1985, 19, 297-323）およびエタノールによって誘導されるアルコール脱水素酵素プロモーター（Nagao, R.T. et al., in： Miflin, B.J. （ed.） Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biology, Vol. 3., pp. 384-438, Oxford Univ. Press, 1986）が含まれる。単純な化学物質による誘導性であるプロモーターの例は、GurrおよびRushton（Trends in biotechnology 2005, 23, 283-290）、WO90/08826、WO93/21334、WO93/031294、ならびにWO96/37609に記載される。
【００４６】
ターミネーターは、DNAからRNAへの転写を終了するように機能するDNAの短い断片であり、好ましくは、当業者に公知の植物転写ターミネーター配列、細菌転写ターミネーター配列および植物ウイルスターミネーター配列からなる群より選択される。
【００４７】
エンハンサーエレメント（35Sエンハンサーなど）およびスカフォールド付着領域（SAR）のような他のエレメントを使用すると、本発明の遺伝子の発現を増加させることができる。さらに、オープンリーディングフレーム内にイントロン（例、Adhイントロン）を導入する工程によって発現を高めること、またはウイルスエンハンサー配列を使用することも可能である。
【００４８】
用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖を産生することに関係する、そしてコーディング領域（5'上流および3'下流配列）の前後の領域ならびに個別コーディングセグメント（いわゆるエクソン）間もしくは5'上流もしくは3'下流領域内に配置されているいわゆるイントロンである介在配列を含むDNA配列を指すのに使用される。5'上流領域は、遺伝子の発現を制御する制御配列、典型的にはプロモーターを含んでいてよい。3'下流領域は、遺伝子の転写の終了に関係している配列ならびに任意で転写および3'非翻訳領域のポリアデニル化の原因となる配列を含んでいてよい。
【００４９】
真核細胞では、発現カセットは通常はさらに、一次転写産物の転写を終結させてポリアデニル化を発生させる、オープンリーディングフレームの下流に位置する転写終結領域を含む。さらに、コドン使用は最適な宿主の容認されたコドン使用に適応させることができる。選択された宿主細胞内でのDNA構築物の発現を支配する原理は当業者には一般に理解されており、発現可能なDNA構築物の構築は、それが原核細胞であっても真核細胞であっても、宿主細胞のいずれの種類についても現在ではルーチンの作業である。
【００５０】
オープンリーディングフレームを宿主細胞内で維持するためには、オープンリーディングフレームは、通常は選択された宿主細胞によって認識かつ複製されるDNAに連結した本発明による該オープンリーディングフレームを含むレプリコンの形状で提供される。したがって、レプリコンの選択は、ほとんどが最適の宿主細胞によって決定される。特定の選択された宿主のために適合するレプリコンの選択を決定する原理は、当業者の範囲内に明確に含まれている。
【００５１】
特殊タイプのレプリコンは、それ自体、もしくはその一部を植物細胞などの別の宿主細胞に移入し、それによって本発明によるオープンリーディングフレームの該植物細胞へ同時移入することのできるレプリコンである。そのような能力を備えるレプリコンは、本明細書においてベクターと呼ぶ。そのようなベクターの1つの例は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）などの適合する宿主中に存在する場合にそれ自体の一部、いわゆるT領域を植物細胞へ移入することができるTiプラスミドベクターである。様々なタイプのTiプラスミドベクター（参照：EP0116718B1）は、現在はDNA配列を植物細胞、もしくはゲノム内に安定に該DNAを組み込んだ新規植物を産生できるプロトプラストへ移入するためにルーチン的に使用される。Tiプラスミドベクターの特に好ましい形態は、いわゆるバイナリーベクター（EP0120516B1および米国特許第4,940,838号において主張されている）である。本発明によるDNAを植物宿主内へ導入するために使用できる他の適合するベクターは、ウイルスベクター、例えば二本鎖植物ウイルス（例、CaMV）および一本鎖ウイルス、Geminiウイルスなどから誘導できるような例えば非統合的植物ウイルスベクターから選択することができる。そのようなベクターの使用は、特に植物宿主を安定に形質転換することが困難である場合は有益なことがある。そのようなことは、木本種、特に樹木およびつる植物に当てはまる可能性がある。
【００５２】
「ゲノム内に本発明によるDNA配列を組み込んでいる宿主細胞」という表現は、該DNAを安定にゲノム内に組み込み、それによってDNAを維持する、および好ましくはそれが有糸分裂もしくは減数分裂を通してであっても、そのようなDNAのコピーを子孫細胞へ伝達する細胞、ならびにそのような細胞を含む、またはそのような細胞から本質的になる多細胞生物を含むことを意味する。本発明の好ましい態様によると、本質的に該DNAの一つまたは複数のコピーをゲノム内に組み込む細胞からなり、そして好ましくはメンデルの法則に従ったスタイル（Mendelian fashion）で、コピーを子孫へ伝達することのできる植物が提供される。本発明によるDNAの転写および翻訳によって、植物細胞の一部または全部において、全身性シグナリング化合物に対する受容体を産生できるそれらの細胞は病原体感染に対する増強した抵抗性を示す。
【００５３】
植物種の形質転換は、双子葉植物ならびに単子葉植物の両方を含む、極めて多数の植物種にとって現在ではルーチン作業である。原理的には、細胞を植物全体として再生できる限り、本発明によるキメラDNAを適合する祖先細胞内へ導入するための任意の形質転換法を使用できる。方法は、プロトプラストのためのカルシウム/ポリエチレングリコール法（Nature, 1982, 296, 72-74；Plant Mol. Biol., 1987, 8, 363-373）、プロトプラストのエレクトロポレーション（Bio/Technol., 1985, 3, 1099-1102）、植物物質へのマイクロインジェクション（Mol. Gen. Genet., 1986, 202, 179-185）、様々な植物物質の（DNAもしくはRNA被覆）微粒子衝撃法（Nature, 1987, 327, 70）、（非組込）ウイルスによる感染などから適切に選択することができる。本発明による好ましい方法は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性DNA移入を含む。特に好ましいのは、EPA120516および米国特許第4,940,838号に開示されたいわゆるバイナリーベクターテクノロジーの使用である。
【００５４】
形質転換は、形質転換植物もしくは植物細胞と非形質転換植物もしくは植物細胞とを識別するための選択可能もしくはスクリーニング可能なマーカーの使用によって促進できる。しかし、もしかすると例えばWO01/29240に記載されたようないわゆるマーカーフリー形質転換プロトコールを使用できる。
【００５５】
一般に、形質転換後に植物細胞もしくは細胞群が本発明による核酸配列で同時移入された植物発現性遺伝子によってコードされる一つまたは複数のマーカーの存在について選択され、その後に形質転換された物質が植物全体に再生される。マーカー遺伝子として使用できる遺伝子は、大まかには、nptII（カナマイシンに対する抵抗性を与える）およびhpt（ホスホノトリシンに対する抵抗性を与える）などの抗生物質抵抗性マーカー遺伝子と、ならびにトレハラーゼ遺伝子、マンノース遺伝子（どちらも代謝マーカー）およびIPT遺伝子もしくはRKS受容体キナーゼ遺伝子（発生マーカー）などの発生もしくは代謝選択マーカー遺伝子とに分けることができる。マーカーフリー形質転換のためには、再生遺伝子産物の一過性活性（WO9743427）、または誘導性再生遺伝子産物の安定性組み込みに基づいて以前に記載されたT/R系を使用することが可能である。
【００５６】
単子葉植物は、遺伝子形質転換に向けては相当に扱いにくいと考察されてきたが、形質転換に適用可能であり、繁殖力のあるトランスジェニック植物は形質転換細胞もしくは胚、または他の植物物質から再生することができる。現在、単子葉植物を形質転換させるために好ましい方法は、胚、外植片もしくは懸濁細胞の微粒子弾丸衝撃、および直接DNA取り込みもしくはエレクトロポレーション（Shimamoto, et al, 1989, Nature 338, 274-276）である。トランスジェニックトウモロコシ植物は、除草剤（ホスフィノスリシン・アセチルトランスフェラーゼ（ホスフィノスリシンを不活化する酵素）をコードするストレプトミセス・ヒグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）バー遺伝子を微粒子弾丸衝撃によってトウモロコシ懸濁培養の胚形成細胞内へ導入することによって得られている（Plant Cell, 1990, 2, 603-618）。コムギおよびオオムギなどの他の単子葉作物のアリューロン・プロトプラスト内への遺伝物質の導入は報告されている（Plant Mol. Biol., 1989, 13, 21-30）。コムギ植物は、胚形成懸濁培養を確立するために熟成緻密性および結節性胚形成性カルス組織だけを選択することによって胚形成懸濁培養から再生されている（Bio/Technol., 1990, 8, 429-434）。これらの作物のための形質転換系との組み合わせは、単子葉植物への本発明の適用を可能にする。
【００５７】
イネおよびトウモロコシなどの商業的に重要な作物を含む単子葉植物は、アグロバクテリウム菌株によるDNA移入にも適応する（WO94/00977；EP0159418Bl；Plant. Physiol., 1991, 95, 426-434；The Plant J., 1994, 6, 271-282参照）。
【００５８】
DNA移入および再生に続いて、形質転換されたと推定される植物は、例えばサザン分析を用いて、本発明によるDNAの存在、コピー数および/またはゲノム構成について評価することができる。初期分析後に、本発明により新しく導入されたDNAの所望のコピー数および発現レベルを示している形質転換植物を病原体に対する抵抗性レベルについて試験することができる。
【００５９】
その他の評価には、フィールド条件下での病原体抵抗性の試験、繁殖能力、収量、およびその他の特徴のチェックを含むことができる。そのような試験は、現在では当業者によってルーチン作業として実施される。
【００６０】
そのような評価に続いて、形質転換植物は直接的に増殖させることができるが、しかし通常は、それらは新規な（同系交配）品種の繁殖またはハイブリッドの作製などにおける親系として使用できる。
【００６１】
病原体に対する向上した抵抗性を備える植物品種を含むこれらの植物は、田畑、温室、または自宅もしくは他の場所で成長させることができる。植物もしくはその食用部分は、動物用飼料もしくはヒトが消費するために使用することができ、または農業もしくは工業の任意の形状で食品、飼料もしくはその他の目的に加工処理することができる。農業は、園芸、樹木栽培、草花栽培などを含むことを意味する。本発明による植物物質から利益を得られる工業には、製薬工業、製紙およびパルプ製造工業、製糖工業、飼料および食品工業、酵素製造業者などが含まれるがそれらに限定されない。
【００６２】
本発明による植物、もしくはその一部の長所は、殺虫剤処置の必要が減少することであり、したがって産物の材料コスト、労力、および環境汚染は低下し、またはそのような植物の産物（例、果実、種子など）の寿命は延長する。本発明のための植物は、光合成が可能であり、かつ一部の形態の病原体誘導性病害の対象である多細胞生物を意味する。それらは、少なくとも被子植物ならびに裸子植物、単子葉植物ならびに双子葉植物を含む。
【００６３】
本発明の目標の1つは、植物の適応度および収量を維持しながら、増強した病原体抵抗性を提供することである。植物におけるRKS受容体の導入が表現型変化を誘導することは証明されている（例えば、WO04/007712参照）。しかし、RKS受容体分子の過剰発現によって誘導される変化は適応度および収量を低下させないと思われ、むしろそれらは適応度および収量を増強させると思われる。そこで、シグナリング化合物へ応答する受容体をコードする遺伝子産物を植物に提供することによって増強した病原体抵抗性を誘導することの追加の長所は、そのような受容体の過剰発現が植物の収量および/または全適応度を増加させることである。
【００６４】
さらに、そのような作用があまり望ましくない場合は、植物の最適適応度を維持するために、受容体分子組織を特異的に、すなわち病原体感染に（最も）感受性である組織においてのみ発現させることが好ましいことがある。当然ながら、組織の選択は防御が求められている病原体にも依存する：一部の病原体は、例えば植物の根にしか感染しないが、他方では他の病原体は緑色部分もしくは葉もしくは葉柄に対してのみ特異的である。植物の限定された部分のみでの受容体の発現は、植物の適応度を大きくは傷つけないであろうこと、そして同時に病害に対する増強した抵抗性を植物に与えるために十分であることは理解できる。
【００６５】
トランスジェニック植物は、それ自体が基礎レベルもしくは病原体攻撃後には大量にそれらの同一植物によって全身性で生成される全身性シグナル化合物に対して増加した感受性を示すが、受容体によって認識される全身性シグナル化合物またはトランスジェニック植物のキメラ受容体によって認識されるリガンドを適用することによって増強した誘導抵抗性を誘導することは本発明の一部である。好ましくは、全身性シグナル化合物はスプレー法によって適用される。大多数の作物植物について、それは、それらが病原体感染に対して最も脆弱である場合、またはそのような植物を宿主として使用する病原体が最も病原性である場合に公知である。疾患に対してこれらの植物を最適に保護するためには、これらの植物に、病原体の攻撃が予測される前に誘導抵抗性が構築されることを可能にする時点でスプレーするのが賢明である。
【００６６】
新規な植物種が実際に全身性シグナリング化合物のスプレー後に増強した抵抗性を産生できるかどうかについての迅速かつ単純な試験を提供するために、当業者は、ATTA（アグロバクテリウム・ツメファシエンス一過性発現アッセイ）の名称の下で公知の迅速な一過性発現試験を実施することができる。このアッセイ（その詳細な説明は、Van den Ackerveken, G., et al. （Cell, 1996, 87, 1307-1316）の中に見いだすことができる）では、最適な受容体をコードするヌクレオチド配列が植物構成的プロモーターの制御下に置かれ、安定性形質転換のためのプロトコールにおいても使用されるアグロバクテリウム菌株内に導入される。アセトシリンゴンもしくはアグロバクテリウムT-DNA移入を増強することが公知の任意の他のフェノール化合物と細菌とをインキュベーションした後に、1mLのアグロバクテリウム培養を注入によってインサイチューで植物内へ浸潤させ、その後に植物を温室内に入れる。2〜5日後、葉にはシグナリング化合物をスプレーすることができる。その翌日、葉に病原体を直接的に適用するか、または周知の切断葉アッセイ（detached leaf assay）に葉を使用するかのどちらかによって、それらを病原体抵抗性について試験できる。シグナリング化合物を積極的にスプレーするのではなく、直接には影響を受けない植物部分の増加した抵抗性について試験するために植物自体のシグナリング系を使用することも可能である。
【００６７】
抵抗性のレベルを検出するためのまた別の試験は、抵抗性マーカー、すなわち病原体に対する増加した抵抗性を指示する分子をアッセイすることによる試験である。これに関連して使用できるマーカーは、サリチル酸導入についてのマーカーであるPR-1、ならびにブラシノステロイドおよびサリチル酸導入についてのマーカーであるがオーキシン導入についてのマーカーではない、そしてNPR1の直接転写制御下にあるAt2g14560である（Plant Physiology 2005, 137, 1147-1159；Science 2005, 308, 1036-1040）。ジンクフィンガータンパク質ZAT7（At3g46090）および細胞外ペプチドシグナリング分子をコードするAt2g32200は、SAR媒介性抵抗性応答についての他のマーカーを表している（図6、9および10参照）。RKS4の過剰発現後に修飾された発現を備える他の遺伝子もまたマーカーとして使用することができる。野生型対照と比較した場合にこれらのマーカーが豊富であれば、植物内の増強した病原体抵抗性を示す。
【００６８】
これらのマーカーの細胞内含量は、当業者に周知の標準アッセイ法を用いて容易に決定することができる（実験の部も参照）。
【００６９】
スプレー法のために適用可能であるリガンド分子またはシグナル化合物は、当業者には公知である。サリチル酸、ジャスモン酸、およびブラシノステロイドは、大量に生成され、容易に入手できる化合物である。RKS受容体の活性を修飾するペプチド作用性GASAシグナル化合物は記載されており、合成的に、または当業者に周知の組み換えDNA技術によって、のいずれかで作製することができる。適用される化合物の濃度は、化合物自体の特性、処置される植物組織中に存在する内因性およびトランスジェニック受容体の密度ならびにその化合物が適用される方法（例えば、スプレー法によって、栄養分もしくは水の取り込みなどを通して）に依存する。例えば、最適化された機能を備える特別に設計されたブラシノステロイド、および活性ブラシノステロイドの正常結合をシグナルし、妨害するブラシノステロイドのアンタゴニストは、ブラシノステロイドアゴニストおよびアンタゴニストに対する細胞内応答を定量的および定性的に検出することに基づく分子受容体系に基づいてさらに最適化することができる。増強された抵抗性応答の最適化された検出は、モデル植物の様々な遺伝的バックグラウンドにおいて、または所定のシグナリング経路のために突然変異させた植物において決定することができる。
【００７０】
GASAもしくはシステミンペプチドリガンドの活性化は、プロタンパク質配列のN末端部分を取り除くことによって可能である。活性ペプチド産物には、活性GASAおよび/またはシステミンタンパク質をスプレーする、細胞外プロテアーゼによるプロタンパク質を活性化する、または活性ペプチドリガンド配列へ直接的に融合した誘導性/組織もしくは時期特異的プロモーター構築物を植物に提供する、のいずれかによって提供することができる。
【００７１】
シグナリング化合物に対する大量の受容体分子を植物に提供する作用を増強することを考察しなければならない場合は、そのようなプロセッサーの一つまたは複数の下流媒介物をコードする第2構築物は抵抗性増強作用を拡大することができる。このアプローチのために適する化合物は、受容体から下流のシグナリングカスケードを伝達する遺伝子産物、または受容体活性化後に活性化される遺伝子産物のどちらかによって代表される。直接シグナル伝達の例は、ツーハイブリッドタンパク質パートナーとしてRKSタンパク質と直接的に相互作用することが証明されているNHLおよびSPL遺伝子産物によって提供される。このシグナリングカスケードによって転写レベルで制御される遺伝子の例は、以前に記載されたAt2g14560、またはAt4g14400（様々な細胞内タンパク質を一緒にさせることに関係するアンキリンリピートタンパク質）およびAt4g23130（膜貫通型受容体キナーゼ）のような、抵抗性始動を誘導することに関係する遺伝子産物によって示される。
【００７２】
実施例
実施例1
クローニング戦略
受容体の産生および発現は、例えば（http：//www.psb.rug.ac.be/gateway/）に規定されたゲートウェイクローニング系を通して遂行される。過剰発現構築物は、SALK、RIKENもしくはシロイヌナズマ遺伝子マッピングツール（http：//signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress）によって指示されるような別の所から入手された全長cDNAクローンのクローニング、例えばベクター配列（M13フォーワードおよびリバースプライマーまたはT7およびSP6/T3プライマー）を用いた組み換えクローニングおよび例えばそれらをゲートウェイクローニングテクノロジーにおいて使用されるようなB1およびB2組み換え部位へ融合させることによって作製される。異所性バイナリー発現ベクター内への組み合えは、例えばゲートウェイ組み換えによって遂行される。発現カセット単独のPCR増幅およびその後の例えばT/Rマーカーフリー形質転換テクノロジー（WO01/29240）を用いた微粒子衝撃法が、所望の遺伝子産物を用いた植物種の慣例的な形質転換のために遂行できる。発現のための特定の誘導系は、例えばシロイヌナズナ由来のTween 20誘導性1200bp OPR1プロモーター（Plant Mol Biol. 2001 Nov；47（5）：595-605）のような誘導性プロモーターまたは例えば初期老化2000bp CDPK1（At1g18890）プロモーター（Mol Gen Genet., 1994, 244, 331-340）のような組織もしくは時期誘導性プロモーターが使用される同一ゲートウェイクローニングベクター内で実施することができる。
【００７３】
キメラ受容体は、様々な受容体ドメインのRT-PCR産生を用いて構築することができる。結果として生じたキメラ受容体のその後のクローニング（Science, 2000, 288, 2360-2363に記載のように）および発現は、再びゲートウェイクローニングおよび発現系を用いて実施することができる。
【００７４】
実施例2
植物における抵抗性を誘導するブラシノステロイドの適用
実験には2つのシロイヌナズナ系；Ws-0およびCol-0を使用した。9日齢の実生に模擬液のSilwet L-77（0.01％）またはブラシノステロイド（＋0.01％ Silwet L-77）をスプレーした。乾燥させた後、植物を長日植物グロースチャンバ内でインキュベートした（MPMI 2005, 18, 583-592）。2日後、植物の半分の葉にペロノスポラ・パラスチカの1菌株であるWaco9（50芽胞/μL）をスプレーした（MPMI 2005, 18, 583-592）。接種7日後に、植物（1系統当たり40本の実生）を芽胞形成についてスコア付けした。模擬液を対照として使用した。実験的感染および分析は、以前に記載されたように実施した（MPMI 2005, 18, 583-592）。
【００７５】
試験結果（図2および表1参照）は、模擬液およびブラシノステロイドミックスをスプレーした2日後に、ブラシノステロイドをスプレーした植物は伸長したが、6日後にはそれらは模擬液の0.01％ Silwett-L77水溶液で処置した植物（ほんのわずかに伸長した）とほとんど同じに見えることを証明した。さらに一部の子葉は逆向きに回転していた。ブラシノステロイドをスプレーしたCol-0およびWs-0植物は、模擬液対照と比較してWaco9のより少ない芽胞形成を示し、したがってブラシノステロイドの適用による抵抗性の誘導を示していた。
【００７６】
（表Ｉ）芽胞形成結果
2008507969.tif 000002
【００７７】
実施例3
ブラシノステロイドの感知を媒介するRKS受容体
RKS遺伝子の過剰発現は、根応答バイオアッセイにおいて様々な濃度のブラシノステロイドに向かう修飾された応答を生じさせる（Cell 2002, 110 203-112 ＆ 213-222）。図3は、RKS10-OXおよびRKS4-OX系の両方が様々な濃度のブラシノステロイドに増加した感受性を示すことを証明する。根内では、中心柱の一次分裂組織および前形成層組織において特異的に発現する遺伝子であるRKS4のノックアウト系は、他方では高濃度でのより長い根によって例示されるようなブラシノステロイド感受性における強度の減少を示す。これは、RKS4が根成長中の重要な調節分子であるだけではなく、さらにブラシノステロイドシグナリングを通して作用することを示す。RKS4は、数種の植物器官における細胞の伸長および細胞分裂速度の両方を制御する（図8参照）。分裂細胞内でのその限定された発現は、受容体およびホルモン濃度に依存する、増殖におけるRKS4遺伝子産物の重要な機能を示唆する。
【００７８】
RKS4の機能を詳細に試験するために、機能獲得および機能消失アプローチにしたがった。RKS4全長cDNAは、CaMV 35Sプロモーターの制御下でシロイヌナズナWs-0植物中で異所性に発現したので、本発明者らはSALKコレクションにおけるT-DNA挿入系を探索した（Alonso et al., 2003、NASC欧州シロイヌナズナ種子貯蔵センター（the European Arabidopsis seed-stock center）から入手できる）。2つの挿入系、各々がrks4-1およびrks4-2に改名されたSALK＿066568およびSALK＿071166を各々過剰発現系（RKS4-OX）と一緒に試験した。RKS4定常状態mRNAレベルにおける変化は、RKS4遺伝子が実際にRKS4-OX植物中で過剰発現すること、そしてその全長メッセンジャーが2つのT-DNA挿入系のいずれにおいてももはや検出できないことを証明した12日齢実生におけるRT-PCRによって検証した（図4）。それでも、RKS4 mRNAの5'末端（T-DNA挿入の上流）は依然としてrks4-1およびrks4-2 KO系の両方において転写される。rks4-1では、産生された切断型（truncated）メッセンジャーのレベルは他の全サンプル中におけるより高かった。このフラグメントは、RKS4受容体の細胞外ドメインに一致する。図4からのデータは、rks4-1ノックアウト系が、RKS4遺伝子産物の野生型レベルと比較して5'mRNAの強度に上昇した定常状態レベルを示すことを示す。ノックアウト系は、どちらも全長RKS4 mRNAをもはや発現しない。図5における結果ならびにレポーターPR-1およびAt2g14560からのQ-PCRデータ（図9および10）は、このフラグメントがシュードモナス属に対する病害抵抗性および抵抗性レポーター遺伝子産物のmRNAレベルにプラスの作用を有することを証明する。
【００７９】
類似のN末端タンパク質産物であるトマトLRPタンパク質（RKS細胞外ドメインに極めて類似するELS遺伝子産物と相同）は、ウィロイド感染に関連していると以前に記載される。このLRPタンパク質は、スブチリシンによって病害発生中に処理される（Plant Journal 1996, 10, 315-330）。これらの特異的エンドプロテイナーゼは、細胞壁内での調節遺伝子産物の特異的修飾による病原体侵襲に向けての植物の応答を変調することに関係する。上述の抵抗性において結果として生じた変化は、以下で説明する植物内での誘導抵抗性の活性化においてRKS様遺伝子産物のN末端ドメインが果たす役割を示す。
【００８０】
多数のRKS遺伝子産物は、広域スペクトルのジェミニウイルスに対する抵抗性を媒介することでウイルス抵抗性に関係していることが証明されている（Genes and Development 2004, 18, 2545-2556）。本明細書において、RKS7、14および1の内因性機能は、それらがウイルス感染に及ぼす作用について試験される。植物感染に成功するかどうかは、ウイルス毒性因子NSPによるこれらのRKS受容体の抑制に依存することが証明された。NSP毒性因子タンパク質は、RKSタンパク質と直接的に相互作用し、抗ウイルス応答の抑制を生じさせる（Virology 2004, 318, 24-31）。
【００８１】
本発明者らのデータは、それに対してRKS4発現が変調させられている植物は増加したレベルの抵抗性を示すので、このサブクラスのRKS受容体の役割と一致する。シロイヌナズナにおけるRKS4の異所性発現は、実際にシュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）感染のほぼ50％減少を生じさせる（図5）。興味深いことに、このレベルの抵抗性は、メッセンジャーの5'端の発現レベルが増加する（図4）rks4-1 KO系においてはさらに増加する（図5）。これは、タンパク質分解酵素による受容体の活性化を示唆している。これらの植物は、さらにペロノスポラ・パラスチカに対しても抵抗性であり（図5B）、これは様々な病原体に対する抵抗性を媒介する際に少なくともこのサブグループのRKS遺伝子産物に対して一般的な役割を果たすことを示唆する。
【００８２】
実施例4
様々な抵抗性マーカー遺伝子を調節するRKS遺伝子
RKS4を過剰発現する植物では、ブラシノステロイド誘導のマーカーであるがオーキシン誘導に対するマーカーではないAt2g14560遺伝子産物がアップレギュレートされる（図9および10参照）。マーカーAt2g14560はNPR1の直接転写制御下にあり、SA適用によって強力に誘導される（Plant Physiology 2005, 137, 1147-1159；Science 2005, 308, 1036-1040）。これらの所見は、PR-1が、他の抵抗性マーカーと一緒に、対照植物と比較して修飾されたレベルのRKS4を備える植物中では強力にアップレギュレートされるという観察所見と完全に一致している（図6、9および10参照）。
【００８３】
本発明者らは、これらの結果から、RKS4によって媒介されたブラシノステロイドシグナリングが、PR-1の強力なアップレギュレーションによって可視化されるように植物内でのSAシグナリング応答を誘導すると結論する。転写調節遺伝子産物（At3g46090）であるC2H2/ZAT7（図6参照）または抵抗性関連遺伝子At2g32200などの他の高度に誘導された抵抗性マーカー遺伝子は、異所性RKS4発現性植物内で各々160倍および100倍で誘導された。
【００８４】
実施例5
RKSが誘導した表現型変化
RKS4を過剰発現する植物の観察は広範囲の形態学的変化を明らかにした。花において見られた最も劇的な作用は、そのサイズがRKS4-OX1（図7a）においては激しく上昇することであったが、RKS4-OX2およびKO植物では影響受けないままであった（データは示していない）。本発明者らは全花器官についての定量的分析は実施しなかったが、このサイズ変化は少なくとも増加した花弁サイズに関連付けることができる。実際的な問題として、RKS4-OX1における花弁表面積は野生型と比較して60％増加すると思われた（図7b）。細胞サイズの測定は、これが細胞サイズ（37.6％）および数（16.3％）における両方の増加によって引き起こされることを明白に証明した。しかしRKS4-OX2（図7b、p値＝0.09）またはrks4ノックアウト植物（データは示していない）において有意差は観察されなかった。後者は、RKS4遺伝子が花弁では発現しないために驚くことではない。しかし、2つの過剰発現系間で観察された差はより不可解であり、これは所定レベルを越えるRKS4の発現はその状況を野生型へ逆転させる傾向を示唆する。RKS4の変化した発現は、種子のサイズ（すでに上記で言及した）および重量（図7f）とは反対に、長角果の形状およびサイズ（データは示していない）には影響を及ぼさなかった。その長さによって決定される種子のサイズは、実際にKO系では有意に減少したが、rks4-1および-2については各々5.2％および3.5％しか減少しなかった。過剰発現系では反対のことが観察され、花におけるように、RKS4-OX1（27.6％）における強力な長さの増加を示し、RKS4-OX2（14.9％）では有意ではあるが弱い増加を示した。種子重量に関しては、RKS4-OX1および-OX2について差は同一傾向を示すが、種子が各々81.9％および33.7％重くなり差がいっそう極度になる。他方、KO系は有意差を示さなかった。注目すべきことに、種子のサイズ/重量の変化は種子の発芽に影響を及ぼさなかった（データは示していない）。胚のサイズまたは内胚乳含量における変化は調査しなかったが、子葉のサイズは発芽後に測定した（図7e）。驚くべきことに、子葉はKO系（rks4-1については30.1％およびrks4-2については15.8％）ならびに過剰発現系（RKS4-OX1および-OX2については、各々61.7％および36.9％）のどちらにおいても明白に大きかった。子葉が大きいほど、大きな胚、したがってRKS4-OX1および-OX2において観察されるように種子の重量およびサイズの増加の原因となる。しかしこれは、野生型より小さいrks4-1および-2の種子とは一致していない。より緻密に観察すれば、この不一致を説明することができる。実際問題として、子葉は、主として細胞分割の増加に起因してKO系における方が大きい（rks4-1については15％およびrks4-2については10.7％）。過剰発現系では、他方では細胞分割は実際的に15.5％（RKS4-OX1）および4.9％（RKS4-OX2）減少するので、このためより大きな子葉は細胞伸長における極度の増加だけの結果である（各々91.3％および43.9％プラス）。興味深いことに、rks4-1（13.1％）では細胞伸長が同様に増加し、同様に子葉サイズ変化の原因となるが、rks4-2（p値＝0.38）における子葉サイズ変化の原因とはならないが、これは、種子におけるように表現型強度の差を示す。RKS4-OX1の子葉において観察された大きなサイズの増加は、特に極度に頑丈なロゼットにより丸みを帯びて幅の広い葉を与える短日条件下で、そのロゼット葉のサイズおよび形状において後に視認することができた（図7c〜d）。しかし、花弁におけるように、これは有意差を示さなかったRKS4-OX2またはKO植物については当てはまらなかった（データは示していない）。その発現パターンから予測されるように、RKS4発現レベルを変化させることは根の発生にも影響を及ぼした。垂直板上で増殖した実生の根を測定すると、実際に、子葉におけると同様に、根のサイズ/長さはKOおよび過剰発現系のどちらにおいても有意に増加することを明らかにした（図7g）。この状況は、増加の程度が関係する限りにおいて一様に同一であり（図5eおよびgを比較する）、rks4-1はrks4-2より強力な増加を示し（74％対65.9％）、RKS4-OX1は52.7％という同様にあまり極度ではないRKS4-OX2を含めて全部の最大増加（83.7％）を示す。この増加の性質を調査するために、本発明者らは、RKS4-OX系（図7h）で交配されたColon-Carmona et al.（1999）によって記載された有糸分裂活性マーカーを利用した。根端におけるGUS陽性細胞の数についての定量的分析は、細胞分割速度がRKS4-OX1においては劇的に減少するが、RKS4-OX2（図7i）内では有意に変化しないことを証明し、これは子葉サイズ（図8e）において観察された限定された減少（4.9％）と多少は一致する。RKS4-OX1において観察された細胞分割における3分の1の減少にもかかわらず、根の長さはそれでも84％増加し、これは子葉におけるように根におけるサイズの増加は細胞伸長における劇的な増加によって引き起こされることを示唆する。しかし本発明者らは、KO系では、この状況が子葉において観察された、すなわちより長い根の原因である細胞の伸長および分割の両方における増加にも一致するかどうかを調査することはできていない。
【００８５】
これらの観察所見を要約すると、RKS4プロモーター活性にしたがっており、RKS4受容体がその中で発現する器官のサイズを維持することに関係することを示唆する。発現の増加および減少がどちらもより大きな器官（種子を除く）をもたらすという事実は、器官のサイズを一定に維持する最適状態にするにはRKS4受容体を特定レベルに保つ必要があることを示唆する。受容体の機能消失はその過剰発現ほど劇的に表現型を誘発しなかったので、RKS4ノックアウトでは、細胞分割が少なくとも子葉中ならびにおそらく根においても刺激されるが、過剰発現植物の同一器官では反対のことが観察されるのは明白であり、細胞分割がRKS4によって所定レベル以下で抑制/維持され得ることを確証する。これは、他方ではRKS4の過剰発現が細胞分割ならびに伸長を刺激した花弁では観察されなかった。しかし、RKS4は通常は花弁では発現しないので、受容体の内因性機能を表していないと思われる異所性相互作用に起因する多面的作用であると見ることができる。興味深いことに、RKS4のより強力な発現を示すRKS4-OX2系では、観察された表現型は花弁におけるように他の過剰発現系におけるより軽度または不在でさえある。これはおそらく、より弱い作用を引き起こす産生した受容体の数が飽和レベルに到達していることを示す。
【００８６】
植物の成長中に観察された表現型に光条件が及ぼす影響および光形態形成の変調におけるブラシノステロイドの公知の関係は、ブラシノステロイド（BR）シグナリングにおけるRKS10（BAK1/AtSERK3）に関する文献と一致して、本明細書において上述の根の成長アッセイによっても例示されるようなRKS4の役割と一致する。
【００８７】
結論として、RKS遺伝子産物はブラシノステロイドの感知に関係する。これらの受容体の変調は、シュードモナス属細菌およびウイルスのような様々な病原体に対する上昇したレベルの抵抗性を生じさせる。修飾されたレベルのRKSを備える植物は、広域スペクトル病害抵抗性を示すだけではなく、誘導適応度特性も示す。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】病害抵抗性に関するBRI/RKS媒介性シグナリングについて提案されたモデル。RKS受容体と相互作用するタンパク質は濃い灰色で示される。BRLは、BRI1様およびRKSとヘテロ二量体化できる他のRLK（受容体型キナーゼ）を表している。NHL（NDR1/HINl様）およびSPL（鱗結合タンパク質様）は、RKSと相互作用するこれら2つのファミリーのメンバーに対応する。上流および下流成分は薄い灰色で表示される。
【図２】ブラシノステロイドはペロノスポラ・パラスチカに対する抵抗性を増加させる。9日齢のシロイヌナズナ実生の生態型Columbia（Col-0）もしくはWassilewskija（WS-0）に模擬液のSilwet L-77（0.01％）（MQ＝水＋Silwet）または0.05mMのブラシノステロイド（＋0.01％ Silwet L-77＝Bras）をスプレーした。乾燥させた後、植物を長日植物グロースチャンバ内でインキュベートした（MPMI 2005, 18, 583-592）。2日後、植物の半分の葉にWaco9をスプレーした（50芽胞/μL；European journal of Plant Pathology, 2001, 107, 63-68）。植物（1系統当たり40本の実生）を接種7日後に芽胞形成についてスコア付けした。模擬液を対照として使用した。実験的感染および分析は、以前に記載されたように実施した（MPMI 2005, 18, 583-592）。これにより模擬液およびブラシノステロイドミックスをスプレーした2日後には、ブラシノステロイドをスプレーした植物は伸長したが、6日後にはそれらは模擬液の0.01％ Silwett-L77水溶液で処置した植物（ほんのわずかに伸長した）とほとんど同じに見えることを証明した。さらに一部の子葉は逆向きに回転していた。ブラシノステロイドをスプレーしたCol-0およびWs-0植物は、模擬液対照と比較してWaco9のより少ない芽胞形成を示した。
【図３】RKS4受容体はブラシノステロイドの感知に関係する。A. 垂直板上での9日後のWs-0（WT）、RKS4-OX1およびRKS10（BAK1, Cell, 2002, 110, 213-222）過剰発現（RKS10-OX）実生について測定した、根の成長に24-エピブラシノリド（EBL）濃度が及ぼす作用。B. 0.1nM EBLを使用した場合の根の長さ。各四角形は1cm2である。C. RKS4 KO（ノックアウト）系の根の成長に高EBL濃度が及ぼす作用（詳細については図4A参照）。D. 10nM EBLを使用した場合の根の長さ。各四角形は1cm2である。
【図４】ノックアウトおよび過剰発現実生におけるRKS4 mRNAレベル。A. RKS4遺伝子上のT-DNA挿入部位。B. 野生型（Ws-0およびCol-0）、過剰発現系（RKS4-OX）ならびに2種のT-DNA挿入系（rks4-1およびrks4-2）由来の10日齢実生内のRKS4全長メッセンジャーについてのRT-PCR分析。鋳型対照は含めず、等量のcDNA鋳型を構成的ユビキチン遺伝子（Ubi）上で評価した。RT-PCR反応内で使用した様々なオリゴヌクレオチドの位置は、様々なT-DNA組み込み部位と比較して表示される。
【図５】RKS4はトマト斑葉細菌病菌DC3000およびペロノスポラ・パラスチカに対する抵抗性を変調する。A. RKS4の過剰発現（RKS4-OX1）は、病原体であるトマト斑葉細菌病菌に対する抵抗性の誘導レベルを示す。これは、Y軸上の病害指数によって表される。入手できるデータの外挿は、RKS4のノックアウト系もまた抵抗性応答の媒介に関係していることを示唆する。抵抗性アッセイは、以前に記載されたとおりに実施した（Plant Cell 1996, 8, 1225-1237；Plant Cell 1998, 10, 1571-1580）。B. RKS4のKO（rks4-1；N末端の誘導発現、図4参照）もまたペロノスポラ・パラスチカに対する抵抗性を増加させるが、β-アミノ酪酸（BABA）を用いて誘導された陽性対照より低かった。植物を任意の尺度I〜IVによりスコア付けしたが、このときIは正常から極めてわずかまでの症状を意味し、IVは重度の症状から死亡までを意味する。C. カロース沈着が同一植物中で検証されたが、これはBABAを用いた処置後に、カロース沈着がrks4-1植物中では増加することを明らかにし、変化したレベルのRKS4によって媒介された増加した抵抗性が増強されたカロース沈着を含むことを示唆する。どちらの試験も（Plant Cell., 2005, 17, 987-999）に記載される。
【図６】RKS4過剰発現バックグラウンドにおける病害抵抗性マーカー遺伝子の発現解析。これは、Ws-0、35S::RKS4および35S::RKS10からの10日齢実生から単離したRNA上でのシロイヌナズナ病原体誘導性遺伝子（SIGMA）についてのプライマーライブラリーを用いて定量的RT-PCR（qRT-PCR）によって実施した。誘導倍率は、標準物質として野生型を用いて、アクチン（このライブラリーの対照プライマー）を用いた標準化後の発現変化における3回の反復実験の平均値（2-ΔΔCt値）に一致する。エラーバーは、反復実験間の標準偏差に相当する。A. RLK1＝At5g60900、WAK1＝At1g21250、HEL（hevein様タンパク質）＝PR4＝At3g04720およびWRKY70＝At3g56400。B. ZAT7（C2H2ジンクフィンガータンパク質）＝At3g46090であり、このペプチドはAt2g32200によってコードされる。これは、RKS4過剰発現が特異的防御関連遺伝子の発現を誘導することを証明し、それが病害抵抗性に関係することを確証する。
【図７】RKS4の変化した発現によって誘導される形態学的表現型。パネル（b）、（e）、（f）および（g）に示したヒストグラムは、RKS4により変化した発現を備える植物について実施された測定値に基づいており、対応する野生型（rks4-1および-2に対してはCol-0；RKS4-OX1および2に対してはWs-0）に関連付けたパーセンテージでの変化を示す。観察された差の統計的有意性は、t検定によって分析した。＊は、測定された差が統計的有意ではないことを示している（すなわち、p値＞0.05）。（a）RKS4過剰発現（RKS4-OX1）に起因する、野生型Ws-0（WT）と比較して増加した花のサイズ（スケールバー＝1mm）。（b）RKS4過剰発現が花弁および花弁表皮の細胞サイズに及ぼす影響。細胞/花弁の数は、花弁表面積の平均値を細胞表面積の平均値で割ることにより得た。（c）RKS4-OX1植物のロゼットにおける変化した葉の形状（スケールバー：1cm）。（d）RKS4-OX1およびWT植物におけるロゼットの形状およびサイズの概観（スケールバー：1cm）。（e）子葉およびそれらの柵状葉肉細胞の表面積の測定値に基づく、RKS4の変化した発現が子葉サイズに及ぼす影響。子葉1枚当たりの細胞数は、子葉の平均表面積を葉肉細胞の平均表面積で割ることにより得た。（f）種子の長さおよび重量の測定によって決定した、RKS4の変化した発現が種子収量に及ぼす影響。（g）垂直板上で成長させた9日齢の実生について測定した、RKS4の変化した発現が根の長さに及ぼす影響。（h〜i）RKS4の過剰発現によって誘発された根端の有糸分裂活性における変化。（h）左から右へ：pCDG構築物を含有する7日齢の実生の根端におけるGUS陽性/分化細胞（Colon-Carmona, A., You, R., Haimovitch-Gal, T. and Peter Doerner, O.（1999） Spatio-temporal analysis of mitotic activity with a labile cyclin-GUS fusion protein. Plant J. 20, 503-508）単独；RKS4-OX1とpCDGとの交配由来の7日齢のF1実生の根端内の減少した分化細胞数；RKS4-OX2とpCDGとの交配由来の7日齢のF1実生の根端（スケールバー＝50um）。（i）主根内の根端1つ当たりのGUS陽性細胞の平均数のヒストグラム（標準偏差はエラーバーによって表示した）。
【図８】RKS4の変化した発現は新鮮重量を増加させる。Ws-0、Col-0、pGREEN 4K（空ベクター対照）および35S::RKS10を対照として使用した。グラフは、新鮮重量が過剰発現系およびKO系において同様に増加することを示し、これは図7のデータと一致する。そこで、RKS4レベルの変調は、病害抵抗性の次に、植物適応度（成長）特性も増強する。
【図９】変化したRKS4の発現レベルがAt2g14560およびPR1マーカー遺伝子の発現に及ぼす影響。A. レポーター遺伝子At2g14560（ブラシノステロイド誘導およびNPR-1媒介性抵抗性活性化の両方のためのマーカー）のqRT-PCR分析。RKS4-OX1（RKS4S 6）およびrks4-1（ko566568）は、どちらもこのレポーターのmRNAレベルの増加を示したので、これはRKS4シグナリング媒介性遺伝子発現の調節におけるRKS4のN末端フラグメント（図4に見ることができる）の機能を示す。RKS4-OX2（RKS4S 22）、RKS4のノックダウン（RKS4a 12）およびRKS4のノックアウト（rks4-2＝ko571166）は、全部がこのマーカー遺伝子の減少したレベルを生じさせた。B. レポーター遺伝子PR-1＝At2g14610（SAR誘導およびNPR-1媒介性抵抗性活性化のためのマーカー）のqRT-PCR分析。At2g14560およびPR-1はシロイヌナズナゲノム上で相互に近位に位置し、これらやAt2g14620、キシログルカン：キシログルコシルトランスフェラーゼのようなこの遺伝子座内の他の遺伝子は、抵抗性変調転写活性化によって直接的に制御される。rks4-1（ko566568）は、PR-1レポーターのmRNAレベルの強力な増加を示し、これは、図4から明らかなように、RKS4シグナリング媒介性遺伝子発現の調節におけるRKS4のN末端フラグメントの機能を示す。RKS4-OX2（RKS4S 22）およびRKS4のノックダウン（RKS4a 12）は、このレポーターマーカー遺伝子産物の減少したレベルを生じさせる。これらのデータは、レポーターmRNAのレベルが下流標的遺伝子産物の応答を決定することを証明する。
【図１０】ブラシノステロイド処置がRKS4の過剰発現と結び付いてAt2g14560マーカー遺伝子の発現に及ぼす影響。At2g14560 mRNAは、Silwett L-77（最終濃度：0.01％）または0.01％Silwett L-77の模擬溶液と混合したブラシノミックス（0.05もしくは0.01mMのブラシノステロイドの希釈ストック（各、1：1000もしくは1：5000で希釈）のスプレー後にqRT-PCRによって検出された。これは、野生型WS対照と比較して、RKS4-OX1系（RKS4S 6）におけるブラシノステロイド応答の振幅における極めて強度の増加を示す。この増加は、ブラシノステロイドをスプレーしてから既に3時間後に検出される。この時間は、間接的活性化応答にしては短すぎる。このため、RKS媒介性シグナリングは、このブラシノステロイドおよびNPR-1活性化レポーター遺伝子による転写活性化に直接的作用を及ぼしている。野生型および形質転換植物におけるスプレー直前である時点t＝0におけるAt2g14560のmRNAレベルをこの図におけるベースラインとして使用する。各実験のために3種の植物を処置し、採取した。mRNA単離のために物質を混合した。Q-PCR実験は3回ずつ実施し、標準誤差を表示した。興味深いことに、RKS4-OX1植物中の最適なブラシノステロイド濃度は最も希釈された濃度（0.01mM）であり、これは、過剰のブラシノステロイドがそれ以上の刺激作用を有していないことを確証する。このため、受容体レベルおよびブラシノステロイドレベルの両方が一緒になって植物の最終応答を決定する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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