(57)【要約】  本発明は、核酸配列の検出用の組成物および方法に関する。本発明はさらに、核酸配列の検出用の前記組成物のキットフォーマットに関する。本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸配列の不在下でヘアピン構造を形成するために任意選択のリンカーにより結合された、標的結合配列およびそれに少なくとも部分的に相補的である配列を含む。本発明のプローブは、プローブが標的配列とハイブリダイズする場合に検出可能なシグナルを生じる対部分を含む。
2008529528.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸配列に結合できるプローブであって、前記プローブが、
（ａ）前記標的配列に少なくとも部分的に相補的である第１の配列；
（ｂ）前記第１の配列に少なくとも部分的に相補的である第２の配列；
（ｃ）前記第１の配列に作動的に結合している第１の部分；および
（ｄ）前記第２の配列に作動的に結合している第２の部分を含み；
ここで、前記第１の配列の３’末端が前記第２の配列の５’末端に結合しているか、または前記第１の配列の５’末端が前記第２の配列の３’末端に結合しており；
ここで、前記プローブが標的配列とハイブリダイズしていない場合、前記第１の配列および前記第２の配列が、互いにハイブリダイズでき；そして
ここで、前記プローブと標的配列とのハイブリダイゼーションにより、前記第１の部分または前記第２の部分のいずれかが検出可能なシグナルを生じるプローブ。
【請求項２】
前記第１の配列と前記第２の配列との間のリンカー配列であって、前記標的配列、前記第１の配列、または前記第２の配列のいずれともハイブリダイズしないリンカー配列をさらに含む請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
前記第１の配列と前記第２の配列との間のリンカー配列であって、前記リンカー配列の５つ以下の連続ヌクレオチドが、前記標的配列に相補的であるリンカー配列をさらに含む請求項１に記載のプローブ。
【請求項４】
前記第１の配列の３’末端が前記第２の配列の５’末端にホスホジエステル結合を介して直接結合しているか、または前記第１の配列の５’末端が前記第２の配列の３’末端にホスホジエステル結合を介して直接結合している請求項１に記載のプローブ。
【請求項５】
前記第１の部分および前記第２の部分が前記プローブの反対側末端に結合している請求項１に記載のプローブ。
【請求項６】
前記第１の配列が少なくとも５ヌクレオチド長である請求項１に記載のプローブ。
【請求項７】
前記第１の配列が約１０から約１５ヌクレオチド長である請求項６に記載のプローブ。
【請求項８】
前記標的配列とハイブリダイズしたプローブのＴｍを増加させる少なくとも１つの修飾ヌクレオチド塩基を含む請求項７に記載のプローブ。
【請求項９】
前記第１の配列が約１５から約６０ヌクレオチド長である請求項６に記載のプローブ。
【請求項１０】
前記第１の配列が約１５から約３０ヌクレオチド長である請求項６に記載のプローブ。
【請求項１１】
前記第２の配列が少なくとも５ヌクレオチド長である請求項１に記載のプローブ。
【請求項１２】
前記第２の配列が前記第１の配列と同じ長さである請求項１に記載のプローブ。
【請求項１３】
前記リンカー配列が約１から約１００ヌクレオチド長である請求項２に記載のプローブ。
【請求項１４】
前記リンカー配列が約４から約１０ヌクレオチド長である請求項１３に記載のプローブ。
【請求項１５】
前記リンカー配列が５ヌクレオチド長である請求項１４に記載のプローブ。
【請求項１６】
前記第１の配列が、その全長にわたって前記標的配列に完全に相補的である請求項１に記載のプローブ。
【請求項１７】
前記第１の配列が、その全長にわたって前記第２の配列に完全に相補的である請求項１に記載のプローブ。
【請求項１８】
前記第２の配列が、前記標的配列と同一である請求項１に記載のプローブ。
【請求項１９】
前記第１の配列と前記第２の配列との間に少なくとも１つのミスマッチを含む請求項１に記載のプローブ。
【請求項２０】
約３つから約６つのミスマッチを含む請求項１９に記載のプローブ。
【請求項２１】
約２つから約８つのミスマッチを含む請求項１９に記載のプローブ。
【請求項２２】
ミスマッチ数が、前記第１の配列の長さの約１０％から約３０％に相当する請求項１９に記載のプローブ。
【請求項２３】
ステム構造のＴｍが、前記標的配列とハイブリダイズされたプローブのＴｍ未満である請求項１に記載のプローブ。
【請求項２４】
前記標的配列に対する第１の配列の親和性が、前記第２の配列に対する前記第１の配列の親和性よりも大きい請求項１に記載のプローブ。
【請求項２５】
前記第１の部分または前記第２の部分が蛍光体であり、もう一方の部分がクエンチャーである請求項１に記載のプローブ。
【請求項２６】
前記検出可能なシグナルが、蛍光強度の増加である請求項１に記載のプローブ。
【請求項２７】
標的配列に結合すると５’フラップを生じる請求項１に記載のプローブ。
【請求項２８】
検出可能なシグナルが、フラップエンドヌクレアーゼによる侵襲的切断の際に生じる請求項２７に記載のプローブ。
【請求項２９】
検出可能なシグナルが、フラップエンドヌクレアーゼによる非侵襲的切断の際に生じる請求項２７に記載のプローブ。
【請求項３０】
標的配列に結合すると３’フラップを生じる請求項１に記載のプローブ。
【請求項３１】
標的核酸配列を検出する方法であって、
（１）前記標的配列を、標的核酸配列に結合できるプローブと共にインキュベートするステップであって、前記プローブが、（ａ）前記標的配列に少なくとも部分的に相補的である第１の配列；（ｂ）前記第１の配列に少なくとも部分的に相補的である第２の配列；（ｃ）前記第１の配列に作動的に結合している第１の部分；および（ｄ）前記第２の配列に作動的に結合している第２の部分を含み；
ここで、前記第１の配列の３’末端が前記第２の配列の５’末端に結合しているか、または前記第１の配列の５’末端が前記第２の配列の３’末端に結合しており；
ここで、前記プローブが標的配列とハイブリダイズしていない場合、前記第１の配列および前記第２の配列が、互いにハイブリダイズでき；そして
ここで、前記プローブと標的配列とのハイブリダイゼーションにより、前記第１の部分または前記第２の部分のいずれかが検出可能なシグナルを生じるステップと；
（２）前記第１の部分または前記第２の部分からのシグナルを検出するステップ
とを含む方法。
【請求項３２】
前記第１の配列の５’末端が前記第２の配列の３’末端に結合している請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記インキュベートするステップを、ヌクレアーゼの存在下で実施する請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記ヌクレアーゼが、フラップエンドヌクレアーゼである請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記フラップエンドヌクレアーゼが侵襲的切断を行うと、検出可能なシグナルが生じる請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記フラップエンドヌクレアーゼが非侵襲的切断を行うと、検出可能なシグナルが生じる請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
標的核酸配列を検出する方法であって、
（１）前記標的配列に結合できるプローブの存在下、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて標的配列を増幅させるステップであって、前記プローブが、（ａ）前記標的配列に少なくとも部分的に相補的であり、ステム部分およびループ部分からなる第１の配列；（ｂ）前記第１の配列よりも短く、前記第１の配列のステム部分に少なくとも部分的に相補的である第２の配列；および（ｃ）第１の部分および第２の部分を含み；
ここで、前記第１の配列の３’末端が前記第２の配列の５’末端に結合しており；
ここで、前記プローブが標的配列とハイブリダイズしていない場合、前記第１の配列および前記第２の配列が、互いにハイブリダイズでき；そして
ここで、前記プローブと標的配列とのハイブリダイゼーションにより、前記第１の部分または前記第２の部分のいずれかが検出可能なシグナルを生じるステップと；
（２）前記第１の部分または前記第２の部分からのシグナルを検出するステップ
とを含む方法。
【請求項３８】
前記第１の配列の５’末端が前記第２の配列の３’末端に結合している請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記インキュベートするステップを、ヌクレアーゼの存在下で実施する請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記ヌクレアーゼが、フラップエンドヌクレアーゼである請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記フラップエンドヌクレアーゼが侵襲的切断を行うと、検出可能なシグナルが生じる請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記フラップエンドヌクレアーゼが非侵襲的切断を行うと、検出可能なシグナルが生じる請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その各々が参照としてその全体が本明細書に組み込まれている、２００５年２月９日出願の米国仮特許出願第６０／６５１，３１０号、２００５年３月２５日出願の米国仮特許出願第６０／６６５，４００号、２００５年６月９日出願の米国仮特許出願第６０／６８８，７９８号、および２００５年１２月７日出願の米国仮特許出願第６０／７４８，２６７号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、核酸配列の検出用のプローブに関する。
【背景技術】
【０００３】
ポリヌクレオチドの検出のための技法は、基礎研究、診断、および法医学において幅広く使用されている。ポリヌクレオチドの検出は、多くの方法により達成することができる。大抵の方法は、標的ＤＮＡ量を増幅させるためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用に頼っている。
【０００４】
ＴａｑＭａｎ（商標）アッセイは、ポリヌクレオチドを検出するためのホモジニアスアッセイである（米国特許第５，７２３，５９１号を参照）。本アッセイにおいて、２つのＰＣＲプライマーが、中央のプローブオリゴヌクレオチドの両端に位置する。プローブオリゴヌクレオチドは、蛍光体およびクエンチャーを含有する。ＰＣＲプロセスの重合化ステップの間、ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性により、プローブオリゴヌクレオチドが切断され、蛍光体部分がクエンチャーから物理的に分離して蛍光発光が増大する。より多くのＰＣＲ産物が生成されるので、新たな波長の発光強度が増大する。しかしながら、この方法では、プローブオリゴヌクレオチドにおいて蛍光体およびクエンチャーの分離が必要なため、バックグラウンド発光がかなり高くなる可能性がある。
【０００５】
ポリヌクレオチドの検出のために、分子ビーコンは、ＴａｑＭａｎに対する代替法である（米国特許第６，２７７，６０７号；米国特許第６，１５０，０９７号；および米国特許第６，０３７，１３０号を参照）。分子ビーコンは、完全にマッチしたテンプレートに結合する際に立体配置的な変化を受けるオリゴヌクレオチドのヘアピンである。オリゴヌクレオチドの立体配置的な変化により、オリゴヌクレオチド上に存在する蛍光体部分とクエンチャー部分との間の物理的距離を増加させる。この物理的距離の増加により、クエンチャーの効果を減少させ、したがって蛍光体に由来するシグナルが増加する。
【０００６】
隣接プローブ法は、標的配列の隣接領域とハイブリダイズする２つの核酸プローブの存在下、ポリメラーゼ連鎖反応により標的配列を増幅させるものであり、プローブの１つは受容体蛍光体により標識され、他のプローブは蛍光エネルギー移動対の供与体蛍光体により標識されている。２つのプローブと標的配列とのハイブリダイゼーションの際に、供与体蛍光体は受容体蛍光体と相互作用して、検出可能なシグナルを発生させる。次いでサンプルは、供与体蛍光体により吸収される波長で光により励起され、蛍光エネルギー移動対からの蛍光発光が、その標的量の測定のために検出される。米国特許第６，１７４，６７０号（Ｂ１）はこのような方法を開示している。
【０００７】
サンライズプライマーは、分子ビーコンと類似しているが、プライマーとして役立つ標的結合配列に結合したヘアピン構造を利用する。プライマーの相補鎖が合成されると、ヘアピン構造が破壊され、それによってクエンチングを阻止する。これらのプライマーは、増幅産物を検出し、５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの使用を必要としない。サンライズプライマーは、Ｎａｚａｒｅｎｋｏら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：２５１６〜２１（１９９７））および米国特許第５，８６６，３３６号に記載されている。
【０００８】
スコーピオンプローブでは、サンライズプライマーと同様に、プライマーと付加されたヘアピン構造とが組み合わされている。しかしながら、スコーピオンプローブのヘアピン構造は、相補鎖の合成によって開かず、ヘアピン構造の一部と、プライマーとハイブリダイズする部分の下流にある標的の一部とのハイブリダイゼーションによって開く。
【０００９】
ＤｚｙＮＡ−ＰＣＲは、ＤＮＡザイムのアンチセンス配列を含有するプライマー、特定のＲＮＡホスホジエステル結合を切断できるオリゴヌクレオチドを含む。該プライマーは、標的配列に結合し、活性なＤＮＡザイムを含有するアンプリコンを生成させる増幅反応を駆動する。次に活性なＤＮＡザイムは、反応混合物中の一般的なレポーター基質を切断する。レポーター基質は、蛍光体−クエンチャー対を含有し、基質の切断により、標的配列の増幅により増加する蛍光シグナルを生じる。Ｄｚｙ−ＰＣＲは、Ｔｏｄｄら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４６：６２５〜３０（２０００）および米国特許第６，１４０，０５５号に記載されている。
【００１０】
核酸配列を検出し、特にリアルタイムでの増幅反応をモニターする新規なプローブおよび方法に関する技術が求められている。また、感度、シグナル対ノイズ比、特異性、対立遺伝子識別能、およびこのようなプローブおよび検出方法の設計の容易さを改善することも求められている。
【００１１】
（発明の概要）
本発明は、核酸検出用の新規な組成物および方法に関する。
【００１２】
本発明は、標的核酸の配列を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブを提供する。該プローブは、標的配列に少なくとも部分的に相補的である第１の配列および第１の配列に少なくとも部分的に相補的である第２の配列を含む。該プローブはさらに、第１の配列に作動的に結合している第１の部分および第２の配列に作動的に結合している第２の部分を含む。第１の配列の３’末端が、第２の配列の５’末端に結合しているか、あるいは第１の配列の５’末端が、第２の配列の３’末端に結合している。該プローブが標的配列とハイブリダイズしていない場合、第１の配列および第２の配列は、互いにハイブリダイズすることができる。該プローブと標的配列とのハイブリダイゼーションにより、第１の部分または第２の部分のいずれかに検出可能なシグナルが生じる。いくつかの実施形態において、該プローブと標的配列とのハイブリダイゼーションにより、３’フラップまたは５’フラップが形成される。該プローブの５’末端に第１の配列を有するプローブは、標的核酸に結合すると３’フラップを形成でき、該プローブの３’末端に第１の配列を有するプローブは、標的核酸に結合すると５’フラップを形成できる。
【００１３】
好ましい実施形態において、該プローブは、第１の配列および第２の配列に共有結合したリンカー配列をさらに含む。リンカー配列は、標的配列、第１の配列または第２の配列に完全に相補的ではないが、リンカーのいくつかのヌクレオチドが、これらの領域とハイブリダイズし得る。しかしながら、他の実施形態においては、リンカー配列を使用せずに、第１の配列の３’末端が第２の配列の５’末端に直接結合しているか、または第１の配列の５’末端が第２の配列の３’末端に直接結合している。存在する場合、該リンカー配列は、約１から約１００ヌクレオチド長であるか、または約４から約１０ヌクレオチド長であるか、または約５ヌクレオチド長である。任意選択のリンカー配列の５つ以下の連続ヌクレオチドが、標的配列に相補的である。ある実施形態においては、リンカーの４、３、または２以下の連続ヌクレオチドが、標的配列に相補的である。リンカーを含むいくつかの実施形態において、標的配列が第１の配列との最適の相補性を有して配置される場合、リンカーのどこかにおける５、４、３、２以下のヌクレオチドは標的配列に相補的である。
【００１４】
本発明のプローブは、標的配列に結合の際に蛍光発光の増大などの検出可能なシグナルを生じる。標的と標的結合配列（第１の配列）とのハイブリダイゼーションの際に、第１および第２の部分が物理的に分離される場合に検出可能なシグナルが生じる。第１および第２の部分は、第１および第２の配列にそれぞれ作動的に結合している。第１および第２の部分は、該プローブがステム構造またはヘアピン構造を形成する際に近接してくる該プローブの反対末端に、またはその近辺に結合できる。第１および第２の部分は、該プローブに共有結合されることが好ましい。いくつかの実施形態において、該部分は、該プローブの５’末端および３’末端に、またはその近辺に結合している。ある実施形態において、該部分の１つは、該プローブの３’末端に結合しており、それによってポリメラーゼによるプローブの伸長を妨げる。好ましい実施形態において、第１および第２の部分は、該プローブが標的配列に結合していない場合（すなわち、ステムまたはヘアピン立体配置の状態）にクエンチングをもたらすが、該プローブが標的とハイブリダイズする場合はクエンチングがない（すなわち、蛍光）ように該プローブ上に配置された蛍光体／クエンチャー対である。ある実施形態において、核酸配列内のヌクレオチドの多型性を認識するように設計された一連のプローブは、ヌクレオチドの各々可能な多型性に対して各々が、２つ以上の標的配列の同時検出または定量化を可能にする互いに異なるシグナルを提供する異なる部分を有することができる。
【００１５】
該プローブの標的結合配列（第１の配列）は、少なくとも５ヌクレオチド長である。好ましい実施形態において、該標的結合配列は、約１５から約６０ヌクレオチド長である。より好ましい実施形態において、該標的結合配列は、約１５から約３０ヌクレオチド長である。ある実施形態において、該標的結合配列は、約１０から約１５ヌクレオチド長であり、場合によっては、該標的とハイブリダイズする際に該プローブのＴｍを増加させる少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。
【００１６】
該プローブの第２の配列は、第１の配列に少なくとも部分的に相補的であり、第１の配列が標的配列とハイブリダイズしていない場合、第１の配列とハイブリダイズできる。例えば、第２の配列は、該プローブが標的配列に結合していない場合、ヘアピン構造のステム部分を形成し得る。第２の配列は、少なくとも５つのヌクレチドの長さである。第２の配列は、長さが第１の配列と同様であることが好ましい。第２の配列は、第１の配列と完全に相補的であり得る。しかしながら、好ましい実施形態において、第１の配列と第２の配列との間に少なくとも１つのミスマッチがある。第１の配列と第２の配列との間に約２つから約８つ、または約３つから約６つのミスマッチがあることが好ましい。ある実施形態において、第１の配列と第２の配列との間のミスマッチ数は、第１の配列の長さの約１０％から約３０％に相当する。
【００１７】
好ましい実施形態において、標的配列の不在下、第１の配列と第２の配列とにより形成されたステム構造のＴｍは、ＰＣＲサイクルまたはハイブリダイゼーションアッセイのアニーリング温度にほぼ等しいか、またはアニーリング温度よりも最大５〜２０℃高い。アニーリング温度よりも２０℃を超えて高いＴｍを有するプローブは、アンフォールディングが困難であるか、またはＰＣＲ時あるいはハイブリダイゼーション分析時にアンフォールディングすることができないであろう。プローブのＴｍは、プローブのステム部分の長さ、およびプローブのステム部分のミスマッチ数によって影響を受ける。一般にさらに、ステム領域にミスマッチが加えられるごとに、さらにＴｍが減少するであろう。したがって、ミスマッチ数を調整して所望のＴｍを得ることができる。ミスマッチは、群となってまたは分離して、プローブのステム部分内、末端または中間の任意の位置に配置し得る。さらにＴｍは、例えば、副溝バインダー（ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｅｒ）および固定核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）を含む、修飾ヌクレオチドの導入を介して改変できる。このような修飾ヌクレオチドの導入は、標的配列に対する親和性を増大させるために、標的結合配列の長さを減じるために、または所望のＴｍに必要とされるミスマッチ数を減少させるために使用することができる。
【００１８】
本発明はまた、標的核酸配列の検出用のプローブを含む組成物を提供する。該プローブは、標的配列に少なくとも部分的に相補的である第１の配列および第１の配列に少なくとも部分的に相補的である第２の配列を含む。該プローブはさらに、第１の配列に作動的に結合している第１の部分および第２の配列に作動的に結合している第２の部分を含む。第１の配列の３’末端が、第２の配列の５’末端に結合しているか、あるいは第１の配列の５’末端が、第２の配列の３’末端に結合している。例えば、該プローブが標的配列とハイブリダイズしていない場合、ステム構造またはヘアピン構造を形成するように、第１の配列および第２の配列は、互いにハイブリダイズできる。該プローブと標的配列とのハイブリダイゼーションにより、第１の部分または第２の部分に検出可能なシグナルが生じる。いくつかの実施形態において、該組成物は、プローブおよび標的核酸配列の増幅のための１つまたは複数のプライマーを含む。ある実施形態において、該組成物は、例えば、複数の標的配列を検出し同時に増幅するマルチプレックスＰＣＲを実施するために使用できる複数のプローブおよび複数のプライマーまたはプライマー対を含む。他の実施形態において、該組成物は、プローブおよび核酸ポリメラーゼを含む。さらに他の実施形態において、該組成物は、プローブ、標的配列の増幅用の１つまたは複数のプライマー、および核酸ポリメラーゼを含む。さらに他の実施形態において、該組成物は、複数のプローブ、複数のプローブにより検出される標的配列増幅用の複数のプライマーまたはプライマー対、および核酸ポリメラーゼを含む。他の実施形態において、該組成物は、プローブ、およびヌクレアーゼなどの切断剤を含む。該組成物のさらに他の実施形態は、プローブ、切断剤、および１つまたは複数の核酸ポリメラーゼを含む。
【００１９】
ある実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、蛍光体およびクエンチャーまたはＦＲＥＴ対を含む相互作用対の標識として役立つ第１の部分および第２の部分を含む。蛍光体またはクエンチャーは、プローブの３’ヌクレオチドに結合でき、蛍光体／クエンチャー対のもう一方は、プローブの５’ヌクレオチドに結合できる。標識の相互作用対は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、またはそれ以上のヌクレオチドまで分離でき、さらにそれらは、ヘアピン立体配置においてより近接する。蛍光体は、例えば、ＦＡＭ、Ｒ１１０、ＴＡＭＲＡ、Ｒ６Ｇ、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｇｏｌｄ  ５４０、またはＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｏｒａｎｇｅ  ５６０であり得、クエンチャーは、例えば、ＤＡＢＣＹＬ、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、またはＢＨＱ−３であり得る。いくつかの実施形態において、検出可能なシグナルは、標的配列へのハイブリダイゼーションの際に少なくとも２倍まで増加する。
【００２０】
オリゴヌクレオチドプローブは、サンプルとオリゴヌクレオチドプローブとを接触させること、およびサンプル中の標的核酸の存在を判定することにより、サンプル中の標的核酸を検出するために使用することができる。シグナル強度の変化により、標的核酸の存在を示している。
【００２１】
本発明の一実施形態は、オリゴヌクレオチドプローブ、核酸ポリメラーゼ、および１対のプライマーを含むＰＣＲ混合物を提供することによりサンプル中の標的核酸を検出する方法をさらに提供する。ＰＣＲ混合物は、サンプルと接触させてＰＣＲサンプル混合物を生じ、ＰＣＲサンプル混合物をインキュベートして標的核酸の増幅を可能にする。検出可能なシグナルの発生により、サンプル中の標的核酸の存在を示している。
【００２２】
本発明の追加の態様において、該プローブは、サンプル中の標的核酸配列の存在を示すシグナルを発生するキットの一部である。キットは、プローブ、核酸ポリメラーゼ、ＰＣＲ緩衝液、１種または複数種のプライマー、およびそれらのためのパッケージング材料を含むことができる。
【００２３】
本発明はまた、サンプル中の標的核酸配列を検出する方法を提供する。該方法は、（１）標的配列を含有する疑いのあるサンプルを、標的核酸配列に結合できるプローブと共にインキュベートするステップと、（２）標的配列に結合しているプローブに特徴的である検出可能なシグナルが生じるかどうかを判定するステップとを含み、その場合、標的配列は、サンプル中に検出される。該プローブは、（ａ）標的配列に少なくとも部分的に相補的である第１の配列；（ｂ）第１の配列に少なくとも部分的に相補的である第２の配列；（ｃ）前記第１の配列に作動的に結合している第１の部分；および（ｄ）前記第２の配列に作動的に結合している第２の部分を含む。第１の配列の３’末端が第２の配列の５’末端に結合しているか、または、第１の配列の５’末端が第２の配列の３’末端に結合している。該プローブが標的配列とハイブリダイズしていない場合、第１の配列および第２の配列は、互いにハイブリダイズでき、ステム構造を形成できる。該プローブと標的配列とのハイブリダイゼーションにより、第１の部分または第２の部分のいずれかが検出可能なシグナルを生じる。この方法のいくつかの実施形態において、例えば、「リアルタイム」のＰＣＲを実施することによって、ポリメラーゼ連鎖反応などの増幅方法を用いてサンプルからの標的配列を含む核酸を同時に増幅しながら、インキュベートするステップおよび判定するステップを実施する。
【００２４】
本発明はさらに、サンプル中の標的配列を定量化する方法を提供する。該方法は、（１）前述の段落で記載された方法によりサンプル中の標的核酸配列を検出するステップと、（２）サンプル中の標的配列量を得るために検量線とシグナルとを比較するステップとを含む。本法のいくつかの実施形態において、例えば、「リアルタイム」のＰＣＲを実施することによって、ポリメラーゼ連鎖反応などの増幅方法を用いてサンプルからの標的配列を含む核酸を同時に増幅しながら、検出ステップを実施する。
【００２５】
本発明はまた、標的配列が、多型性部位で１つまたは複数のヌクレオチドだけ異なる場合、サンプル中の第１の核酸標的配列と第２の核酸標的配列とを識別する方法を提供する。該方法は、（１）第１の標的配列に完全に相補的である標的結合配列を有する第１のプローブを用いる上記の方法により、サンプル中の第１の標的核酸配列を検出するステップと；（２）第２の標的配列に完全に相補的である標的結合配列を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを用いる上記の方法により、サンプル中の第２の標的核酸配列を検出するステップと；（３）前記第１のプローブまたは前記第２のプローブが検出可能なシグナルを生じるかどうかを測定し、それによって第１または第２の標的配列、あるいは双方の混合物の存在を検出するステップとを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、異なる形態の配列（例えば、２つ以上の対立遺伝子、野生型および変異など）がサンプル中に存在することを測定するために定量的に使用できる。例えば、第１のプローブおよび第２のプローブのシグナルを検量線と比較して、サンプル中の第１および第２の標的配列量を得ることができる。
【００２６】
第１または第２の核酸標的配列がサンプル中に存在するかどうかを判定する上記の方法の変型では、それぞれの標的配列に対するハイブリダイゼーションの際に識別可能なシグナルを生じる第１のプローブおよび第２のプローブを利用する。例えば、該プローブで、各々が特徴的発光波長を有する２つの異なる蛍光体を使用できる。この方法において、多型性の座における２つ以上の変異体を、同時に検出または定量化できる。
【００２７】
本発明のさらなる特徴および利点ならびにさらなる実施形態は、以下に記載の実施形態およびそれらの図面、ならびに請求項から、より十分に明らかとなろう。
【００２８】
（発明の詳細な説明）
定義
本明細書に用いられる「ポリヌクレオチド」とは、１つのヌクレオチドのペントースの３’位が、次のヌクレオチドのペントースの５’位へのホスホジエステル結合により結合している、ヌクレオチド（すなわち、ＲＮＡではリボヌクレオチドおよびＤＮＡではデオキシリボヌクレオチド）の共有結合配列を言う。用語の「ポリヌクレオチド」は、１本鎖および２本鎖ポリヌクレオチドを含む。本明細書に使用される用語の「ポリヌクレオチド」は、ポリヌクレオチドの化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、オリゴヌクレオチドとしばしば称される短いポリヌクレオチド（例えば、プライマーまたはプローブ）を包含する。ポリヌクレオチドホスホジエステル結合は、置換体モノヌクレオチドのペントース環の５’炭素と３’炭素との間に生じるため、ポリヌクレオチドは「５’末端」および「３’末端」を有する。新たな結合が５’炭素にあり得るポリヌクレオチドの末端は、ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドである。新たな結合が３’炭素にあり得るポリヌクレオチドの末端は、ポリヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドである。本明細書に用いられる「末端ヌクレオチド」は、３’末端または５’末端の末端位でのヌクレオチドである。本明細書に用いられるポリヌクレオチド配列はまた、より大きなポリヌクレオチドに内在していても（例えば、ポリヌクレオチド内の配列領域）、５’末端および３’末端を有すると言うことができる。
【００２９】
本発明によるポリヌクレオチド類は、固定核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などを含む、修飾ポリヌクレオチド類を含有できる。ＰＮＡは、ポリアミドタイプのＤＮＡ類似体であり、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンに関するモノマー単位は、市販されている（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティー、カリフォルニア州）。リン、酸化リン、またはデオキシリボース誘導体などのＤＮＡのある一定の成分は、ＰＮＡ類中に存在しない。ＮｉｅｌｓｅｎらによるＳｃｉｅｎｃｅ  ２５４、１４９７（１９９１）およびＥｇｈｏｌｍらによるＮａｔｕｒｅ  ３６５、６６６（１９９３）に開示されているように、ＰＮＡ類は、相補的ＤＮＡ鎖に特異的かつ堅固に結合し、ヌクレアーゼ類により分解されない。ＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖よりも広範囲のストリンジェンシー条件下で結合し、多重ハイブリゼーションの実施をより容易にする。より小型のプローブは、強力な結合のために、ＤＮＡとよりも使用することができる。ＰＮＡ／ＤＮＡの１５単量体単位における単一のミスマッチは、対応するＤＮＡ／ＤＮＡの１５単量体単位の二重鎖に対して８〜２０℃対４〜１６℃だけ融点（Ｔｍ）を低下させる。ＰＮＡには荷電基が不在であるため、ハイブリダイゼーションを低イオン強度下で実施することができる。ＬＮＡ類の合成および性質は、Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５４、３６０７〜３６３０（１９９８）ならびにＷｅｎｇｅｌの米国特許第６，７９４，４９９号に記載されている。ＬＮＡ含有オリゴヌクレオチド類は、例えば、Ｐｒｏｌｉｇｏ、ＬＬＰ（ボールダー、コロラド州）から商品として入手できる。
【００３０】
さらに、本発明のポリヌクレオチド類は、限定はしないが、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロキシウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、８−アザグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウィブトキソシン（wybutoxosine）、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、および２，６−ジアミノプリンを含む群から選択された１つまたは複数の修飾塩基を含むことができる。
【００３１】
本明細書に用いられる用語の「オリゴヌクレオチド」とは、典型的には１５０ヌクレオチド長以下（例えば、長さが５と１５０との間、好ましくは１０と１００との間、より好ましくは、１５と５０との間のヌクレオチド）の短いポリヌクレオチドを言う。しかしながら、本明細書に使用される該用語は、より長いかまたはより短いポリヌクレオチド鎖を包含することも意図されている。「オリゴヌクレオチド」は、他のポリヌクレオチド類とハイブリダイズでき、したがってポリヌクレオチド検出のためのプローブ、またはポリヌクレオチド鎖伸長のためのプライマーとして役立つ。
【００３２】
本明細書に用いられる用語の「相補的」とは、２本のポリヌクレオチド鎖の領域間または同じポリヌクレオチド鎖の２つの領域間での配列相補性の概念を言う。第１のポリヌクレオチド領域のアデニン塩基は、塩基がチミンまたはウラシルである場合、第１の領域に逆平行である第２のポリヌクレオチド領域の塩基と、特定の水素結合（「塩基対合」）を形成できることが知られている。同様に、第１のポリヌクレオチド鎖のシトシン塩基は、塩基がグアニンである場合、第１の鎖に逆平行である第２のポリヌクレオチド鎖の塩基と塩基対合できることが知られている。ポリヌクレオチドの第１の領域は、２つの領域が逆平行様式で整列されている場合、第１の領域の少なくとも１つのヌクレオチドが第２の領域の塩基と塩基対合できるならば、同じかまたは異なるポリヌクレオチドの第２の領域に対して相補的である。したがって、２つの相補的なポリヌクレオチドが、ヌクレオチドのすべての位置で塩基対合することは必要ではない。「相補的」は、別のポリヌクレオチドに対して、１００％または「十分に」相補的であり、したがって、すべてのヌクレオチドの位置で塩基対を形成するポリヌクレオチドを称することができる。「相補的」はまた、１つまたは複数のヌクレオチド位置においてミスマッチヌクレオチドを含有する別のポリヌクレオチドに対して１００％相補的というわけではない（例えば、すなわち９０％、８０％、７０％またはそれ以下の相補性）ポリヌクレオチドを称することができる。本明細書に用いられる「少なくとも部分的に相補的」とは、１つのポリヌクレオチドの１００％未満（例えば、９９％、９０％、７５％、５０％、２５％など）のヌクレオチドが、別のポリヌクレオチドのヌクレオチドと塩基対を形成できることを意味する。オリゴヌクレオチドが「部分的に相補的」である場合、相補的ヌクレオチドの領域は、連続的ヌクレオチドであっても、そうでなくてもよい。
【００３３】
本明細書に用いられる用語の「ハイブリダイゼーション」または「結合」は、相補的（部分的に相補的であることを含む）ポリヌクレオチド鎖の対合を記載するために使用される。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、ポリヌクレオチド鎖間の結合強度）は、ポリヌクレオチド間の相補性度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）、他の成分の存在（例えば、ポリエチレングリコールの有無）、ハイブリダイズ鎖のモル濃度、およびポリヌクレオチド鎖のＧ：Ｃ含量など、当技術分野によく知られた多くの因子により影響を受ける。
【００３４】
本明細書に用いられるように、１つのポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドと「ハイブリダイズする」と言われる場合、２つのポリヌクレオチド間に何らかの相補性があるか、または２つのポリヌクレオチドが、高いストリンジェンシー条件下でハイブリッドを形成することを意味する。１つのポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドと「ハイブリダイズしない」と言われる場合、２つのポリヌクレオチド間に本質的に配列相補性がないか、または高いストリンジェンシー条件下で、２つのポリヌクレオチド間でハイブリッドが形成されないことを意味する。一実施形態において、２つの相補的なポリヌクレオチドは、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリダイズできる。ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションは、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で膜のハイブリダイゼーション（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション）を実施することにより典型的に確立され、５×ＳＳＣ、５×デンハート液、１％ＳＤＳ中、６５℃で放射標識プローブとのインキュベーションとして規定される。膜のハイブリダイゼーションに関するストリンジェント洗浄は以下のとおり実施される：膜を、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中室温で、および０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中６５℃で、１洗浄当り１０分で洗浄し、フィルムに露光する。
【００３５】
本明細書に用いられる「プライマー」とは、上記に定義された「オリゴヌクレオチド」の長さ限定を有するかまたは含み、オリゴヌクレオチドプライマーにヌクレオチドを取り込む延長（伸長）反応を開始させるために、塩基対合を介して標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズする標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を有するか、または含有するオリゴヌクレオチドのタイプを言う。開始および伸長のための条件は、好適な緩衝液（「緩衝液」は、補因子である置換基、またはｐＨ、イオン強度などに影響を及ぼす置換基を含む）中、好適な温度で、４種の異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸およびＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素などの重合化誘導剤の存在を含む。プライマーは、増幅の最大効率のために一本鎖であることが好ましい。本発明に有用な「プライマー」は一般に、約１０から１０００ヌクレオチド長、好ましくは、約１４から５０ヌクレオチド長、最も好ましくは、約１７から４５ヌクレオチド長である。「増幅プライマー」は、プライマー伸長により標的配列の増幅を行うためのプライマーである。増幅反応を駆動するために特殊な配列または構造を必要としないので、ＰＣＲ用の増幅プライマーは、標的結合配列のみから構成できる。「プライマー領域」は、ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドプライマーに取り込む延長反応を開始させるために、塩基対合を介して標的核酸とハイブリダイズする「オリゴヌクレオチドプローブ」または「架橋オリゴヌクレオチドプローブ」上の領域である。
【００３６】
本明細書に用いられる場合、サンプルから「単離された」ポリヌクレオチドは、その正常な細胞環境から取り出された該サンプル内の天然ポリヌクレオチド配列である。したがって、「単離された」ポリヌクレオチドは、無細胞液内にあっても、異なる細胞環境下にあってもよい。
【００３７】
本明細書に用いられる用語の「量」とは、例えば、μｇ、μｍｏｌまたはコピー数で測定されたサンプル中の標的ポリヌクレオチドの量を言う。本発明のポリヌクレオチドの存在量は、参照ポリヌクレオチド、すなわち、既知量を有するポリヌクレオチドにより放出された蛍光強度と比較して、このようなポリヌクレオチドにより放出された蛍光強度により測定される。
【００３８】
本明細書に用いられる用語の「相同性」とは、アルゴリズムのコンピュータ導入により実施できる、配列（ヌクレオチドまたはアミノ酸）の最適アラインメントを言う。ポリヌクレオチドに関する「相同性」は、例えば、デフォルトパラメータを用いてＢＬＡＳＴＮ２．０版による解析によって判定できる。「別のポリヌクレオチドとの相同性を共有しないプローブ」とは、デフォルトパラメータを用いてＢＬＡＳＴＮ２．０版により測定されたポリヌクレオチドに対する相同性が、２０以上のヌクレオチドの連続領域において５５％以下、例えば、５０％未満、または４５％未満、または４０％未満、または３５％未満であるプローブを称する。
【００３９】
本明細書に用いられる「ヘアピン構造」は、任意にループ配列により一端で分離された、二本鎖「ステム」領域を形成できる２つの自己相補的配列を含む。二本鎖ステム領域を含むオリゴヌクレオチドの２つの領域は、互いに実質的に相補的であり、自己ハイブリダイゼーションが生じる。しかしながら、ステムは、１つまたは複数のミスマッチ、挿入または欠失を含むことができる。本明細書に用いられる「ヘアピン構造」は、二本鎖ステム部分から伸長する一本鎖領域をさらに含むことができる。
【００４０】
本明細書に用いられる「Ｔｍ」および「融解温度」は互換性の用語であり、二本鎖ポリヌクレオチド分子の集団の５０％を一本鎖に解離させる温度である。ポリヌクレオチドのＴｍを算出する式は、当技術分野によく知られている。例えば、Ｔｍは以下の式により算出できる：Ｔｍ＝６９．３＋０．４１×（Ｇ＋Ｃ）％−６５０／Ｌ、式中Ｌは、ヌクレオチド中のプローブの長さである。ハイブリッドポリヌクレオチドのＴｍは、１Ｍの塩中、ハイブリダイゼーションアッセイから採用された式を用いても算出でき、一般にＰＣＲプライマーに関するＴｍを算出するために使用できる：［（Ａ＋Ｔの数）×２℃＋（Ｇ＋Ｃの数）×４℃］、例えば、Ｃ．Ｒ．Ｎｅｗｔｏｎら、ＰＣＲ、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（ニューヨーク：１９９７年）、２４ページを参照。Ｔｍの算出のために構造ならびに配列特性を考慮に入れる他のより精巧な計算が当技術分野に存在している。算出されたＴｍは、所与のハイブリダイゼーションステップまたは解離ステップに関して適切な温度を予測するために使用できる単なる推定値である：最適温度は、一般に経験的に判定される。
【００４１】
本明細書に用いられる「ヌクレオチド類似体」とは、ペントース糖および／または１つまたは複数のリン酸エステルが、それぞれの類似体により置換されているヌクレオチドを言う。代表的なペントース糖類似体は、ヌクレオシド類似体と関連して上記に記載されているものである。代表的なリン酸エステル類似体としては、限定はしないが、アルキルホスホナート、メチルホスホナート、ホスホルアミデート、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホルアミデート、ボロノホスフェートなどが挙げられ、存在する場合には任意の関連するカウンターイオンを含む。また、ＤＮＡ／ＲＮＡホスフェートエステルおよび／または糖ホスフェートエステル主鎖が、異なるタイプの結合により置換されているポリヌクレオチド類似体に重合化できる核酸塩基は、「ヌクレオチド類似体」の定義内に含まれる。ヌクレオチド類似体は、ＬＮＡまたはＰＮＡでもあり得る（上記を参照）。
【００４２】
本明細書に用いられる用語の「サンプル」とは、天然の環境から単離され、ポリヌクレオチドを含有する生体材料を言う。本発明による「サンプル」は、精製または単離されたポリヌクレオチドからなり得るか、またはポリヌクレオチドを含む組織サンプル、生体液サンプル、または細胞サンプルなどの生体サンプルを含むことができる。生体液は、例えば、血液、血漿、痰、尿、脳脊髄液、洗浄液、および白血球泳動サンプルであり得る。本発明のサンプルは、標的ポリヌクレオチドを含有する植物、動物、細菌またはウイルス材料であり得る。本発明の有用なサンプルは、例えば、限定はしないが、種々の個体、同じかまたは異なる個体の種々の発達段階、種々の疾患状態の個体、正常な個体、同じかまたは異なる個体の種々の疾患段階、種々の疾患治療を受けている個体、種々の環境因子にさらされた個体、病状に対する素因を有する個体、感染症（例えば、ＨＩＶ）への曝露個体からなど、種々の供給源から得ることができる。有用なサンプルは、インビトロ培養組織、細胞、その他のポリヌクレオチドを含有する供給源からも得ることができる。培養サンプルは、限定はしないが、種々の培地および条件（例えば、ｐＨ、圧、または温度）で培養された培養物（例えば、組織または細胞）、種々の長さの期間で培養された培養物（例えば、組織または細胞）、種々の因子または薬剤（例えば、薬物候補物質、またはモジュレーター）で処理された培養物（例えば、組織または細胞）、または種々のタイプの組織または細胞の培養物などの供給源から採取できる。
【００４３】
本明細書に用いられる「核酸ポリメラーゼ」とは、ヌクレオチドの重合化を触媒する酵素を言う。一般に、この酵素は、核酸テンプレート配列にアニールされたプライマーの３’末端で合成を開始し、テンプレート鎖の５’末端に向けて進行させる。「ＤＮＡポリメラーゼ」は、デオキシリボヌクレオチドの重合化を触媒する。既知のＤＮＡポリメラーゼ類としては、例えば、パイロコッカス属フリオサス（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、１９９１、Ｇｅｎｅ、１０８：１）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（ＬｅｃｏｍｔｅおよびＤｏｕｂｌｅｄａｙ、１９８３、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：７５０５）、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍら、１９８１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１１２）、サームス属サーモフィラス（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＭｙｅｒｓおよびＧｅｌｆａｎｄ  １９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：７６６１）、バシラス属ステアロサーモフィラスＤＮＡポリメラーゼ（ＳｔｅｎｅｓｈおよびＭｃＧｏｗａｎ、１９７７、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ４７５：３２）、サーモコッカス属リトラリス（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼとも称される、Ｃａｒｉｅｌｌｏら、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１９：４１９３）、９°Ｎｍ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓからの製造中止製品）、サーモトガ属マリチマ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＤｉａｚおよびＳａｂｉｎｏ、１９９８  Ｂｒａｚ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．、３１：１２３９）、サームス属アクワチカス（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈｉｅｎら、１９７６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｏｒｉｏｌ、１２７：１５５０）、パイロコッカス属コダカラエンシス  ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｇｉら、１９９７、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４５０４）、ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ（特許出願ＷＯ  ０１３２８８７）、およびパイロコッカス属ＧＢ−Ｄ（ＰＧＢ−Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｊｕｎｃｏｓａ−Ｇｉｎｅｓｔａら、１９９４、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１６：８２０）が挙げられる。任意の上記酵素のポリメラーゼ活性は、当技術分野によく知られた手段により測定できる。本発明によるＤＮＡポリメラーゼ活性の１単位は、最適温度（例えば、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼに関して７２℃）で３０分間の、１０  ｎｍｏｌの全ｄＮＴＰのポリマー形態への取込みを触媒する酵素量として定義される。
【００４４】
「プライマー伸長反応」または「プライマー伸長の合成」とは、取り込まれたヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドに対して相補的であるように、プライマーの３’末端へのヌクレオチドの付加をもたらす標的プライマーハイブリッドとヌクレオチドとの間の反応を意味する。プライマー伸長化剤としては、典型的に（ｉ）ポリメラーゼ酵素、（ｉｉ）緩衝液、および（ｉｉｉ）１つまたは複数の伸長可能なヌクレオチドが挙げられる。
【００４５】
本明細書に用いられる「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」とは、特定のポリヌクレオチドテンプレート配列を増幅させるインビトロ法を言う。ＰＣＲ反応は、一連の反復温度サイクルを含み、典型的に５０〜１００  μｌの容量で実施される。この反応混合物には、ｄＮＴＰ（４種のデオキシリボヌクレオチド、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの各々）、プライマー、緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ、およびポリヌクレオチドテンプレートを含む。１つのＰＣＲ反応は、ポリヌクレオチド分子の変性および合成の５回から１００回の「サイクル」からなり得る。ＰＣＲ法は、米国特許第４，６８３，１９５号および米国特許第４，６８３，２０２号に記載され、それらの開示は、参照として本明細書に組み込まれている。
【００４６】
本明細書に用いられる「ヌクレアーゼ」または「切断剤」とは、本発明による「切断構造」に特異的である、すなわちそれを切断する酵素、標的核酸とハイブリダイズしないプローブまたはプライマー、あるいはプローブまたはプライマーとハイブリダイズしない標的核酸を実質的に切断しない酵素を言う。用語の「ヌクレアーゼ」は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩ、サームス属アクワチカス（Ｔａｑ）、サームス属サーモフィラス（Ｔｔｈ）、パイロコッカス属フリオサス（Ｐｆｕ）およびサームス属フレーバス（Ｔｆｌ）からのＤＮＡポリメラーゼなどの、５’エンドヌクレオチド鎖切断活性を有する酵素を含む。用語の「ヌクレアーゼ」はまた、ＦＥＮヌクレアーゼを含む。
【００４７】
本明細書に用いられる「フラップ」とは、二本鎖核酸分子から伸長する一本鎖ＤＮＡの領域を言う。本発明によるフラップの長さは、好ましくは、その範囲が約１から約５００ヌクレオチド、より好ましくは、約５から約２５ヌクレオチド、最も好ましくは、約１０から約２０ヌクレオチドである。
【００４８】
本明細書に用いられる「切断構造」とは、フラップ、ループ、一本鎖バブル、Ｄループ、ニックまたはギャップを含む一本鎖領域を有する少なくとも二重鎖核酸を含むポリヌクレオチド構造を言う。したがって本発明による切断構造は、５’一本鎖ヌクレオチドフラップがその構造の二本鎖部分への接合部付近の位置から伸長する分枝状ＤＮＡのフラップ鎖を含むポリヌクレオチド構造を含み、フラップは検出可能な標識で標識されることが好ましい。本発明による切断構造のフラップは、フラップ鎖のエルボー部の１ヌクレオチド近位および／または１ヌクレオチド遠位に配置される位置で切断されることが好ましい。いくつかの実施形態において、切断構造のフラップは、標的核酸配列とハイブリダイズしない。
【００４９】
本発明の一実施形態による切断構造は、標的核酸配列を含むことが好ましく、また、標的核酸に少なくとも部分的に相補的である１つまたは複数の領域を介して標的核酸配列とハイブリダイズした本発明によるオリゴヌクレオチドプローブ、およびハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブから伸長するフラップを含む。
【００５０】
ＦＥＮ−１は、５’一本鎖フラップ鎖の主鎖を特異的に認識し、二重鎖ＤＮＡの二本鎖が一本鎖アームに隣接する接合部に配置されている切断部位へとこのアームを追跡する、およそ４０ｋＤａの二価金属イオン依存のエキソ-およびエンドヌクレアーゼである。エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ双方の活性は、フラップまたはニックにおいて多くの５’位の塩基に感受性が殆どないことを示している。ＦＥＮ−１エンド-およびエキソヌクレオチド鎖切断基質の結合および切断の双方は、上流のオリゴヌクレオチド（フラップ隣接鎖またはプライマー）により促進される。これは、大腸菌ｐｏｌ  Ｉの場合にもある。酵素のエンドヌクレアーゼ活性は、５’フラップ長に依存せず、１つのヌクレオチドのような小型の５’フラップを切断する。エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼの活性は、基質の化学的性質に対して非感受性であり、ＤＮＡおよびＲＮＡの双方を切断する。
【００５１】
本発明に有用なＦＥＮ−１酵素をコードするｆｅｎ−１遺伝子としては、マウスｆｅｎ−１、ヒトｆｅｎ−１、ラットｆｅｎ−１、アフリカツメガエルｆｅｎ−１、および４種の古細菌アルカエグロブス属フルギダス、メタノコックス属ジャンナシー、パイロコッカス属フリオサスおよびパイロコッカス属ホリコシーに由来するｆｅｎ−１遺伝子が挙げられる。ＦＥＮ−１酵素をコードするｃＤＮＡクローンは、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００４，１１１およびＬ３７，３７４）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｌ２６，３２０）、ラット（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡ８１９，７９３）、アフリカツメガエル（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｕ６８，１４１およびＵ６４，５６３）、およびパイロコッカス属フリオサス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ０１３，４９７）から単離されている。パイロコッカス属ホリコシーフラップエンドヌクレアーゼに関する完全ヌクレオチド配列もまた、決定されている（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＢ００５，２１５）。ＦＥＮ−１ファミリーとしてはまた、サッカロマイセス属セレビシエＲＡＤ２７遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｚ２８，１１３  Ｙ１３，１３７）およびサッカロマイセス属ポンベＲＡＤ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｘ７７，０４１）が挙げられる。メタノバクテリウム属サーマウトロフィクルムの古細菌ゲノムもまた配列決定されている。ＦＥＮ−１と原核生物とウイルス５’｛キャラクタプルアウト（ｃｈａｒａｃｔｅｒ  ｐｕｌｌｏｕｔ）｝３’エキソヌクレアーゼとの間に配列類似性は低いが、真核生物界内のＦＥＮ−１類は、アミノ酸レベルで高度に保存されており、ヒトおよびサッカロマイセス属セレビシエのタンパク質は６０％同一性および７８％類似性がある。３種の古細菌ＦＥＮ−１タンパク質はまた、真核生物のＦＥＮ−１酵素に高度に相同的である（Ｍａｔｓｕｉら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１８，２９７、Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、１９９８ｂ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２７，１５４、およびＬｉｅｂｅｒ、１９９７、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ、１９：２３３に概説されている）。
【００５２】
本発明によるＦＥＮヌクレアーゼは、耐熱性であることが好ましい。耐熱性ＦＥＮヌクレアーゼは単離されており、４種の古細胞を含む種々の耐熱性生物から特性化されている。パイロコッカス属フリオサスフラップエンドヌクレアーゼに関するｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ０１３，４９７）およびアミノ酸配列（Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、１９９８ａ、上記文献、およびＨｏｓｆｉｅｌｄら、１９９８ｂ）は決定されている。パイロコッカス属ホリコシーフラップエンドヌクレアーゼに関する完全ヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＢ００５，２１５）およびアミノ酸配列（Ｍａｔｓｕｉら、上記文献）もまた決定されている。メタノコックス属ジャンナシー（Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、１９９８ｂ、およびＭａｔｓｕｉら、１９９９、上記文献）およびアスペルギラス属フルギダス（Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、１９９８ｂ）のフラップエンドヌクレアーゼに関するアミノ酸配列もまた決定されている。
【００５３】
本明細書に用いられる「５’から３’のエンドヌクレアーゼ活性」または「５’→３’のエキソヌクレアーゼ活性」は、テンプレート特異的核酸ポリメラーゼの活性、例えば、いくつかのＤＮＡポリメラーゼと慣例上関連する５’→３’のエキソヌクレアーゼ活性を言い、それによってモノヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが連続様式でポリヌクレオチドの５’末端から取り出されるか（すなわち、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩはこの活性を有するが、一方、Ｋｌｅｎｏｗ（Ｋｌｅｎｏｗら、１９７０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６５：１６８）断片は有さず（Ｋｌｅｎｏｗら、１９７１、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２２：３７１））、またはポリヌクレオチドは５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性に本来的に存在し得るエンドヌクレアーゼ活性により５’末端から取り出される。
【００５４】
本明細書に用いられる語句の「５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する」または「５’→３’のエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する」とは、野生型酵素の活性の１０％未満、５％、１％、０．５％、または０．１％を有することを意味する。語句の「５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性を欠如すること」または「５’→３’のエキソヌクレアーゼ活性を欠如すること」とは、検出不能の５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性を有するか、野生型酵素の５’から３’のエンドヌクレアーゼ活性の約１％、０．５％、または０．１％未満を有することを意味する。５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性は、適切な緩衝液（例えば、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン）の存在下、６０℃で３０分間ニック基質を切断するステップと、１０ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍｇ／ｍｌのブロモフェノールブルーを含有する９５％ホルムアミドの添加により切断反応を終了するステップと、ニック産物またはニックされない産物を検出するステップとを含むエキソヌクレアーゼアッセイにより測定することができる。
【００５５】
本発明の一定の実施形態に有用である核酸ポリメラーゼは、３’から５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠如し、限定はしないが、エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（３’から５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠如するＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼの変異体形態、Ｃｌｉｎｅら、１９９６、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４：３５４６；米国特許第５，５５６，７７２号；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから市販、ラジョラ、カリフォルニア州、カタログ番号６００１６３）、エキソ−Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ（３’から５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠如するＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼの変異体形態）、エキソ−Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ（３’から５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠如するＴｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼの変異体形態、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、（カタログ番号２５７））、エキソ−大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（３’から５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠如する大腸菌ＤＮＡポリメラーゼの変異体形態）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのエキソ−Ｋｌｅｎｏｗ断片（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号６０００６９）、エキソ−Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（３’から５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠如するＴ７  ＤＮＡポリメラーゼの変異体形態）、エキソ−ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（３’から５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠如するＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼの変異体形態）、エキソ−ＪＤＦ−３−ＤＮＡポリメラーゼ（３’から５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠如するＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼの変異体形態）、エキソ−ＰＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（３’から５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠如するＰＧＢ−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼの変異体形態、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号２５９）、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、カタログ番号６００１３１、６００１３２、６００１３９、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ＵｌＴｍａ（Ｎ−トランケートされた）サーマトガマルチマ（Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ  ｍａｒｔｉｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ；ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片、９°Ｎｍ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓからの製造中止製品、ビバリー、マサチューセッツ州）、「３’〜５’エキソ減少」変異体（Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ９３：５，２８１）、およびセクナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）（ＵＳＢ、クリーブランド、オハイオ州）が挙げられる。上記酵素のいずれのポリメラーゼ活性は、当技術分野によく知られた手段により規定することができる。本発明によるＤＮＡポリメラーゼ活性の１単位は、最適温度で３０分間、１０  ｎｍｏｌの全ｄＮＴＰのポリマー形態への取込みを触媒する酵素量として定義される。
【００５６】
本明細書に用いられる「増幅」とは、ポリメラーゼの使用により核酸テンプレート配列のコピー数を増加させる任意のインビトロ法を言う。核酸増幅は、核酸（例えば、ＤＮＡ）分子またはプライマーへのヌクレオチドの取込みをもたらし、それによって核酸テンプレートに相補的な新規な核酸分子を形成する。形成された核酸分子およびそのテンプレートは、さらに核酸分子を合成するためのテンプレートとして使用することができる。本明細書に用いられる１つの増幅反応は、多くのラウンドの核酸合成からなり得る。増幅反応としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；ＭｕｌｌｉｓおよびＦａｌｏｏｎａ、１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５５：３３５）が挙げられる。１つのＰＣＲ反応は、核酸分子の変性および合成についての５回から１００回の「サイクル」からなり得る。エキソ−ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ増幅は、本来的に変異増幅産物を生じる結果となる。
【００５７】
本明細書に用いられる「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、特定の核酸テンプレート配列を増幅するインビトロ法を言う。ＰＣＲ反応は、一連の反復温度サイクルを含み、典型的には、５０〜１００μｌの容量で実施される。この反応混合物には、ｄＮＴＰ（４種のデオキシリボヌクレオチド、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの各々）、プライマー、緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ、および核酸テンプレートを含む。ＰＣＲ反応は、第１のプライマーが、核酸テンプレート配列の１つの鎖内の領域に相補的な配列を含有し、相補的なＤＮＡ鎖の合成を開始し、第２のプライマーが、標的核酸配列の第２の鎖内の領域に相補的な配列を含有し、相補的なＤＮＡ鎖の合成を開始する一組のオリゴヌクレオチドプライマーを提供すること、および（ｉ）増幅に必要なプライマーをテンプレート配列内に含まれる標的核酸配列にアニーリングさせ、（ｉｉ）プライマーを伸長させ、核酸ポリメラーゼがプライマー伸長産物を合成するＰＣＲサイクリングステップに許容される条件下で核酸ポリメラーゼをテンプレート依存重合化剤として使用して、核酸テンプレート配列を増幅させることを含む。「一組のオリゴヌクレオチドプライマー」または「一組のＰＣＲプライマー」は、２つ、３つ、４つまたはそれ以上のプライマーを含むことができる。一実施形態において、エキソ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ反応において核酸テンプレートを増幅させるために用いられる。
【００５８】
本明細書に用いられる用語の「ＰＣＲプライマー」とは、核酸テンプレートとハイブリダイズでき、第２の核酸鎖の酵素的合成を開始することができる一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を言う。本発明による有用なプライマーは、１０から１００ヌクレオチド長、好ましくは１７から５０ヌクレオチド長、より好ましくは１７から４５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、本発明のプライマーは、検出に有用である二次的シグナルを生じるタグまたは標識を含む。タグは、例えば、二次的シグナルを生じる二次的配列により結合し得るさらなる核酸配列であり得る。
【００５９】
本明細書に用いられる「ＰＣＲ反応用緩衝液」または「反応用緩衝液」とは、核酸ポリメラーゼによる核酸テンプレートのＰＣＲ増幅を可能にする単一の緩衝液組成物を言う。緩衝液は、ＰＣＲ反応用の緩衝液に用いられる任意の知られた化学物質を含有できる。緩衝液は、トリスまたはトリシンから選択される緩衝組成物を含有することが好ましい。緩衝組成物は、７．５から９．５までのｐＨ範囲を有することが好ましい。ＰＣＲ反応用緩衝液は、１〜１０  ｍＭの範囲でＭｇ２＋（例えば、ＭｇＣｌ２またはＭｇＳＯ４）を含有することが好ましい。本発明による緩衝液はまた、０から２０  ｍＭまでの範囲でＫ＋（例えば、ＫＣｌ）を含有し得る。いくつかの実施形態において、緩衝液は、ＰＣＲ収率を増加させる成分（例えば、０から２０  ｍＭまでの範囲の（ＮＨ４）２ＳＯ４）を含有する。他の実施形態において、緩衝液は、１種または複数種の非イオン性界面活性剤（例えば、０から１％までの範囲でトリトンＸ−１００、ツイーン２０、またはＮＰ４０）を含有する。緩衝液はまた、１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌまでの範囲でＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含有できる。本発明の好ましい実施形態において、ＰＣＲ反応用緩衝液は、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．８）、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％トリトンＸ−１００、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する。別の好ましい実施形態において、緩衝液は、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ９．２）、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％トリトンＸ−１００、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する。
【００６０】
本明細書に用いられる用語の「等量」とは、等モル濃度を有するＰＣＲ用緩衝液中の成分（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ）を言う。
【００６１】
本明細書に用いられる「増幅産物」とは、ＰＣＲ増幅反応の終末における二本鎖核酸集団を言う。増幅産物は、元の核酸テンプレートおよびＰＣＲ反応時に核酸テンプレートを用いてＤＮＡポリメラーゼにより合成された核酸を含有する。本発明による増幅産物は、ＰＣＲ反応におけるエラープローンＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ミュータザイム（Ｍｕｔａｚｙｍｅ）およびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの使用のために、元の核酸テンプレート配列に対する変異を含有する。
【００６２】
本明細書に用いられる用語の「１つまたは複数の追加の引き続くＰＣＲ増幅反応を反復すること」とは、核酸テンプレートの増幅を可能にする条件下で、核酸テンプレート、少なくとも２つのＰＣＲプライマー、エラープローンＤＮＡポリメラーゼをインキュベートすることを含む１つまたは複数の追加のＰＣＲ増幅反応の引き続く作業を言う。引き続くＰＣＲ反応は、先行するＰＣＲ増幅のＰＣＲ増幅産物をテンプレートとして用いる前記インキュベートするステップを含む。先行するＰＣＲ増幅反応の増幅産物は、当技術分野に知られた手段、例えば、フェノール抽出／エタノール沈殿またはカラム精製により、引き続くＰＣＲ反応用のテンプレートとして使用される前に精製してもよい。引き続くＰＣＲ増幅反応用のテンプレートは、先行するＰＣＲ増幅の増幅産物の一部または全部であり得る。引き続くＰＣＲ増幅の各々に関して、新鮮な試薬（例えば、反応用緩衝液、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー）を反応混合物に加える。先行するＰＣＲ増幅の増幅産物の一部が使用される場合、引き続くＰＣＲ反応の容量は、先行するＰＣＲ反応と同じであり得る。先行するＰＣＲ反応の全増幅産物がテンプレートとして使用される場合、引き続くＰＣＲ反応は、先行するＰＣＲ反応よりも大きな容量を有することとなる。
【００６３】
本明細書に用いられる「核酸テンプレート」または「標的核酸テンプレート」とは、増幅領域を含有する核酸を言う。本明細書に用いられる「増幅領域」は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により合成または増幅できる核酸領域である。例えば、核酸テンプレートの増幅領域は、２つのＰＣＲプライマーが相補的である２つの配列間に存在する。
【００６４】
（説明）
例えば、リアルタイムのＰＣＲ分析において、標的核酸配列の検出のために容易に設計されるが非常に有効なオリゴヌクレオチドプローブが、ステム部分、場合によってはループ部分を含むヘアピン構造を形成するために、場合によっては、リンカーオリゴヌクレオチド配列を介して、相補的配列（第２の配列）に結合した標的結合オリゴヌクレオチド（第１の配列）から形成できることを、本発明者らは発見している。ループ部分は、任意選択のリンカー配列、または第１の配列および第２の配列の末端に結合する適切な共有結合を含有する。ループ構造を形成するリンカー配列は、標的配列とハイブリダイズしてもよいし、しなくてもよい。任意選択のリンカー配列の５以下の連続ヌクレオチドは、標的配列に相補的である。リンカーを含むいくつかの実施形態において、標的配列が第１の配列に対して最適相補性のために位置合わせされる場合、リンカー内のどこかにある５以下のヌクレオチドは標的配列に対して相補的である。ステム部分は場合によっては、第１の配列と第２の配列との間の１つまたは複数のミスマッチを含有し；ミスマッチ数は、プローブの融解温度を調整するために使用することができる。ステム部分はまた、修飾ヌクレオチド、例えば、標的配列に関するプローブの親和性を変えることができ、融解温度を調整するためにも使用できる、副溝バインダーまたはＬＮＡを含有できる。本発明のプローブはまた、検出可能なシグナル、例えば蛍光体の蛍光発光の増加が、プローブが標的配列とハイブリダイズする場合に生じるように、プローブの末端またはその近辺に相互作用的標識対、例えば蛍光体／クエンチャー対を含有する。該プローブは、「キープローブ」と呼ばれる。
【００６５】
驚くべきことに、キープローブは、以前に設計されたオリゴヌクレオチドプローブと比較して、単一ヌクレオチドのみ、例えば、変異、置換、対立遺伝子、または一塩基多型（ＳＮＰ）により異なる配列間を識別する強力な能力を有する。本発明を、いずれの特定の機序にも限定はしないが、第１の配列（標的結合配列）に少なくとも部分的に相補的である第２の配列の包含により、線状プローブまたは標的結合配列がプローブ中の対応する相補的配列に伴わないプローブよりも、キープローブが、単一の塩基ミスマッチ間をより良好に識別できるようにする。キープローブにより得られたデータにより、例えば、完全マッチ標的配列を容易に検出でき、ＤＮＡサンプルの１％だけで存在する場合に定量化できるが、一方、単一のヌクレオチド相違性のみを有する殆ど同一の標的配列からなる残りの９９％は検出可能なシグナルを生じないことを示す。したがって、キープローブは、密に関連する別の形態を含有する核酸混合物中の特定の変異、対立遺伝子、または多型性を検出し、定量化する優れた能力を有する。
【００６６】
（プライマーおよびプローブの調製）
オリゴヌクレオチドのプローブおよびプライマーは、下記の任意の方法および当技術分野に知られた他の方法により合成できる。プローブおよびプライマーは、生物学的または化学的合成により典型的に調製されるが、それらはまた、生物学的精製または分解、例えば、エンドヌクレアーゼ消化によっても調製できる。本発明に用いられるプローブおよびプライマーなどの短い配列に対しては、生物学的合成と比較して、しばしば化学合成がより経済的である。より長い配列については、Ｍｅｓｓｉｎｇにより、１９８３、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：２０〜７８に記載されている一本鎖ＤＮＡに対するＭ１３の使用など、分子生物学に使用される標準的複製法を使用することができる。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド合成の化学的方法としては、ホスホトリエステル法およびホスホジエステル法（Ｎａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９７９）６８：９０）および支持体上の合成（Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．（１９８１）２２：１８５９〜１８６２）ならびにホスホルアミデート法、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８８）１５４：２８７〜３１４（１９８８）、および「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ」、Ｓ．Ａ．Ｎａｒａｎｇ編集者、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８７に記載されている他の方法が挙げられ、それに引用文献が含まれている。本発明のプローブは、二次的構造、典型的にはヘアピンまたは類似の構造を採る一本鎖から形成することができるか、または、ヘアピンまたは類似の構造を形成するために、例えば相補的塩基のハイブリダイゼーションにより結合する２つ以上の一本鎖から形成することができる。プローブの標的結合配列が標的配列とハイブリダイズする場合に検出可能なシグナルが生じるという条件で、標識部分を任意の鎖上の任意の位置に結合することができる。
【００６７】
本発明によれば、オリゴヌクレオチドプローブには、天然、非天然ヌクレオチドおよび類似体を含むことができる。該プローブは、核酸および２−アミノエチルグリシンなどの核酸類似体モノマー単位を含む核酸類似体またはキメラであり得る。例えば、該プローブの一部またはすべては、ＰＮＡまたはＰＮＡ／ＤＮＡキメラであり得る。副溝バインダー（ＭＧＢ）、固定核酸（ＬＮＡ）および他の修飾ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド類を使用することができる。合成ヌクレオチドを用いるこれらのオリゴヌクレオチド類は、高い融解温度を維持しながら、長さを短縮できるという利点を有することができる。
【００６８】
（プローブ設計）
本発明のプローブは、理想的には、長さが１５０未満のヌクレオチド、典型的には長さが１００未満のヌクレオチド、例えば、長さが８０、７０、６０、または５０未満のヌクレオチドである。本発明のプローブは、好ましくは、ヌクレオチドの長さが１０と６０との間、または２０と４０との間、より好ましくは、長さが３０と６０との間である。該プローブの所望の長さは、プローブの意図された使用に依る。例えば、より長いプローブは、標的核酸が検出前に増幅されないハイブリダイゼーションアッセイに対して好ましいものであり得る。
【００６９】
該プローブの第１の配列（標的結合配列）は、標的ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションがハイブリダイゼーションアッセイまたはＰＣＲのアニーリング／伸長温度で生じるように設計される。したがって、該プローブの第１の配列は、標的ＤＮＡとの相同性を共有するが、一方、リンカーが存在する場合、標的配列に対する相同性を共有してもよいし、共有しなくてもよい。リンカー配列が存在し、標的配列が第１の配列に対して最適相補性のために位置合わせする場合、標的配列に相補的である５以下の連続ヌクレオチドを有する必要がある。第１の配列に対して少なくとも部分的に相補的である標的核酸の領域は、ＰＣＲと関連して使用される場合、理想的には、プライマー結合部位の２００のヌクレオチド下流内（すなわち、プライマー結合部位の３’に）、典型的には、プライマー結合部位の１５０、１２５、または１００のヌクレオチド内に配置される。いくつかの実施形態において、第１の配列は、標的配列に対してその全体の長さにわたって十分に相補的である。いくつかの実施形態において、第１の配列は、第２の配列に対してその全体の長さにわたって十分に相補的である。
【００７０】
該プローブの第１の配列は、長さが少なくとも５のヌクレオチドである。好ましい実施形態において、第１の配列は、長さが約１５から約６０のヌクレオチドである。より好ましい実施形態において、第１の配列は、長さが約１５から約３０のヌクレオチドである。一定の実施形態において、第１の配列は、長さが約１０から約１５のヌクレオチドであり、場合によっては、標的とハイブリダイズされる場合、プローブのＴｍを増加させる少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。
【００７１】
該プローブの第２の配列は、第１の配列に少なくとも部分的に相補的であり、該プローブが標的配列に結合しない場合にヘアピン構造のステム部分を形成する。第２の配列は、長さが少なくとも５つのヌクレオチドである。第２の配列は、長さが第１の配列と同様であることが好ましい。いくつかの実施形態において、第１の配列および第２の配列は、同じ長さである。第２の配列は、第１の配列に十分相補的であり得る。しかしながら、好ましい実施形態において、第１の配列と第２の配列との間に少なくとも１つのミスマッチがある。好ましくは、第１の配列と第２の配列との間に約２つから約８つのミスマッチ、または約３つから約６つのミスマッチがある。一定の実施形態において、第１の配列と第２の配列との間のミスマッチ数は、第１の配列の長さの約１０％から約３０％に相当する。いくつかの実施形態において、第２の配列は、標的配列と同一である。
【００７２】
一本鎖「リンカー」配列は、存在する場合、２つのステム形成領域間に介在し、１から１０塩基長、典型的には２から１０塩基長、３から１０塩基長、４から１０塩基長、４塩基長、または５塩基長と変わり得る。リンカーの配列は、任意の配列であり得る；しかしながら、リンカー配列の５つ以下の連続ヌクレオチドは、標的配列に相補的である。一定の実施形態において、リンカーの４つ、３つ、または２つ以下の連続ヌクレオチドは、標的配列に相補的である。いくつかの実施形態において、標的配列が第１の配列に対して最適相補性のために位置合わせする場合、リンカーのいずれかにおける５つ、４つ、３つ、または２つ以下の連続ヌクレオチドは、標的配列に相補的である。いくつかの実施形態において、ループ配列は、標的ＤＮＡ配列と、またはプローブの他の領域との相同性を殆ど共有しないか、または共有しない。リンカー配列としては、限定はしないが、ｎが３と６との間の整数であるＡｎおよびＴｎが挙げられる。
【００７３】
プローブが標的核酸に結合すると、５’フラップまたは３’フラップが形成されることが多い。例えば、標的核酸とハイブリダイズしない第２の配列により、フラップを形成することができる。フラップは、第２の配列およびループ配列（存在する場合）の組合わせからも形成することができる。フラップは、第１の配列と付加された標識との間の５’末端または３’末端に挿入された追加の配列によっても形成することができる。第１の配列が、プローブの５’末端またはその近辺にある場合、３’フラップは、第２の配列により形成することができ、場合によってはフラップは、ループ配列またはその一部を含むことができる。第１の配列が、プローブの３’末端またはその近辺にある場合、５’フラップは、第２の配列により形成することができ、場合によってはフラップは、ループ配列またはその一部を含むことができる。標的核酸に結合する際に蛍光シグナルの増強のために、例えばＦＥＮ−１などの５’ヌクレアーゼを含む方法にプローブが使用される場合、該プローブは、標的に結合すると５’フラップを形成することが好ましい。５’ヌクレアーゼを使用するような実施形態において、第２の配列は、プローブの５’末端またはその近辺にあることが好ましい。
【００７４】
ヘアピン構造は、高温、イオン濃度の減少、および／またはホルムアミドまたはＤＭＳＯなどの破壊的（ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ）化学薬品の存在を含む、適切な条件で変性を受ける。本発明のプローブは、典型的に５５〜６５℃の範囲であるアニーリング／伸長温度でヘアピン構造を形成することが好ましい。したがって、アニーリング／伸長温度よりも高いヘアピン構造のＴｍを有するプローブが好ましい。例えば、プローブのヘアピン構造は、Ｔｍ≧５５℃、≧６０℃、≧６２℃、または≧６５℃を有し得る。しかしながら、Ｔｍは一般に、アニーリング／伸長温度よりも約１５℃超高くしてはならない。いくつかの実施形態において、プローブは、およそアニーリング／伸長温度からおよそアニーリング／伸長温度の約５〜１５℃超までの範囲のＴｍをもつヘアピン構造を有する。ヘアピン構造の安定性および融解温度は、例えば、ｍｆｏｌｄ（Ｚｕｋｅｒ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４、４８〜５２）またはＯｌｉｇｏ５．０（ＲｙｃｈｌｉｋおよびＲｈｏａｄｓ（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７、８５４３〜５１）などのプログラムを用いて算出できる。プローブのヘアピン構造が、目的のアニーリング／伸長温度（例えば、６０℃のアニーリングおよび伸長温度に対して＞６０℃）に好適な融解温度を有するように、ステムの適切な配列と長さが選択される。
【００７５】
標的に結合される場合、プローブの標的結合配列のＴｍは、ヘアピン構造のＴｍと同様の範囲であるが、ヘアピン構造のＴｍよりも高くても、また低くてもよい。いくつかの実施形態において、ヘアピン構造のＴｍは、標的配列に結合された標的結合配列のＴｍ未満である。しかしながら、他の実施形態において、ヘアピン構造のＴｍは、標的配列に結合された標的結合配列のＴｍよりも高い。例えば、いくつかの実施形態において、ヘアピン構造のＴｍは、標的配列とハイブリダイズされた標的結合配列のＴｍよりも約３℃から７℃高い。
【００７６】
好ましい実施形態において、標的配列の不在下で第１および第２の配列により形成されたステム構造のＴｍは、ＰＣＲサイクルまたはハイブリダイゼーションアッセイのアニーリング温度にほぼ等しいか、またはアニーリング温度よりも５〜２０℃高い。アニーリング温度よりも２０℃超高いＴｍを有するプローブは、アンフォールディングが困難であるか、またはＰＣＲまたはハイブリダイゼーション分析時にアンフォールディングできないであろう。プローブのＴｍは、プローブのステム部分の長さおよびプローブのステム部分におけるミスマッチ数による影響を受ける。一般に、ステム領域に付加された付加ミスマッチの各々は、Ｔｍをさらに低下させる。したがって、ミスマッチ数は、所望のＴｍを得るために調整できる。ミスマッチは、末端または中央で、寄せ集めまたは分離された状態でプローブのステム部分内の任意の位置で配置することができる。さらに、Ｔｍは、例えば副溝バインダーおよび固定核酸（ＬＮＡ）を含む、修飾ヌクレオチドの導入により修飾することができる。このような修飾ヌクレオチドの導入は、標的配列に対する親和性を増加させるために、標的結合配列の長さを減じるために、または所望のＴｍに必要なミスマッチ数を減じるために用いることができる。
【００７７】
（検出部分）
本明細書に用いられる語句「相互作用対の標識」ならびに語句「相互作用標識対」ならびに語句「第１および第２の部分」とは、物理的、光学的、あるいは検出可能なシグナルによりそれらの近接の検出を可能にするような様式で相互作用する分子対を言う。「相互作用標識対」の例としては、限定はしないが、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７、８１９〜８４６、１９７８）、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）（ＨａｒｔおよびＧｒｅｅｎｗａｌｄ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６：２６５〜２６７、１９７９；米国特許第４，６５８，６４９号）、発光共鳴エネルギー移動（ＬＲＥＴ）（Ｍａｔｈｉｓ，Ｇ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４１、１３９１〜１３９７、１９９５）、直接的クエンチング（Ｔｙａｇｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６、４９〜５３、１９９８）、化学発光エネルギー移動（ＣＲＥＴ）（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ａ．Ｋ．およびＰａｔｅｌ，Ａ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２１６、１８５〜１９４、１９８３）、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）（Ｘｕ，Ｙ．、Ｐｉｓｔｏｎ  Ｄ．Ｗ．、Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ．、９６、１５１〜１５６、１９９９）、またはエキシマ形成（Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｊ．Ｒ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９９）の使用に好適な標識が挙げられる。
【００７８】
第１および第２の部分は、プローブのそれぞれ第１および第２の配列に「作動的に結合」する。このことは、その操作と一致する任意の様式、すなわち、標的配列に対しプローブの第１の配列が結合する際に検出可能なシグナルの提供と一致する任意の様式で、各部分がそのそれぞれの配列に結合することを意味する。例えば、対の部分は、本発明のオリゴヌクレオチドプローブに共有結合または非共有結合で結合し得る。第１または第２の部分が本発明のプローブに作動的に結合するのに使用できる任意の非共有結合の例としては、ハイブリダイゼーション、水素結合、イオン結合、疎水的相互作用、ファンデルワールス相互作用、およびタンパク質核酸間相互作用を介する結合が挙げられる。部分は、プローブの５’および３’末端またはそれらの近辺に共有結合するのが好ましい。
【００７９】
本明細書に用いられる「蛍光」または「蛍光基」または「蛍光体」に対する参照としては、それぞれ発光および発光基が挙げられる。
【００８０】
本明細書に用いられる「蛍光の増加」とは、蛍光体により放出された検出可能な蛍光の増加を言う。例えば蛍光体とクエンチャーとの間の距離が増加する際に、例えば、プローブ内のハイブリダイゼーションの阻止によりクエンチングが減じるために、蛍光の増加が生じ得る。蛍光体により放出された蛍光が少なくとも２倍、例えば２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、１０倍、またはそれ以上増加する場合に「蛍光の増加」がある。
【００８１】
一定の実施形態において、蛍光の増加または他の検出可能なシグナルは、その標的配列へのプローブのハイブリダイゼーションによるのみならず、ヌクレアーゼを用いるプローブの切断によってさらに駆動され得る。例えば、５’−フラップエンドヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮ−１）または別のヌクレアーゼまたはポリメラーゼによる切断は、第１および第２の部分をさらに分離するために、したがって標的に対する結合によって生じるシグナルを増強するために使用することができる。５’ヌクレアーゼとの使用目的のキープローブは、プローブの３’末端またはその近辺に第１の配列（標的結合配列）を有し、標的へのハイブリダイゼーションの際に５’フラップを生成するように５’末端またはその近辺に第２の配列を有する。例えば、５’ヌクレアーゼによる使用目的のプローブは、第１の配列の５’末端が、場合によっては第２の配列の３’末端に対するリンカーを介して結合される場合、テンプレートに結合される際に５’フラップを生成することができる。第２の配列は、標的に対して相補的でないので、プローブの５’末端にフラップを形成する。標的に結合すると、５’フラップではなくて３’フラップを生成するプローブは、５’ヌクレアーゼによってそのフラップが切断されず、５’ヌクレアーゼの使用によるシグナル増強を受けないこととなる。
【００８２】
（蛍光体）
本発明に有用な相互作用標識対は、ＦＲＥＴ適合色素対、またはクエンチャー色素対を含み得る。一実施形態において、この対は蛍光体−クエンチャー対を含む。
【００８３】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、蛍光による増幅反応のモニタリングを可能にする。オリゴヌクレオチドプローブは、無処置のプローブ中の蛍光体により放出された蛍光が実質的にクエンチされるような様式で、蛍光体およびクエンチャーにより標識することができるが、一方、切断または標的のハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプローブ中の蛍光はクエンチされないことにより、プローブ切断または標的ハイブリダイゼーションの際に総合的に蛍光増加をもたらす。さらに、増幅産物のリアルタイム検出中における蛍光シグナルの発生は、サンプル中の初発の標的配列数の正確な定量を可能にする。
【００８４】
広範囲の種々の蛍光体としては、限定はしないが、５−ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセインとも呼ばれ；Ｓｐｉｒｏ（イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−（９Ｈ）キサンテン）−５−カルボン酸、３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−６−カルボキシフルオレセインとも呼ばれる）；５−ヘキサクロロ−フルオレセイン（［４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロ−（３’，６’−ジピバロイル−フルオレセイニル）−６−カルボン酸］）；６−ヘキサクロロ−フルオレセイン（［４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロ−（３’，６’−ジピバロイルフルオレセイニル）−５−カルボン酸］）；５−テトラクロロ−フルオレセイン（［４，７，２’，７’−テトラ−クロロ−（３’，６’−ジピバロイルフルオレセイニル）−５−カルボン酸］）；６−テトラクロロ−フルオレセイン（［４，７，２’，７’−テトラクロロ−（３’，６’−ジピバロイルフルオレセイニル）−６−カルボン酸］）；５−ＴＡＭＲＡ（５−カルボキシテトラメチルローダミン；キサンチリウム、９−（２，４−ジカルボキシフェニル）−３，６−ビス（ジメチル−アミノ））；６−ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン；キサンチリウム、９−（２，５−ジカルボキシフェニル）−３，６−ビス（ジメチル−アミノ））；ＥＤＡＮＳ（５−（（２−アミノエチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸）；１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ（５−（（（（２−ヨードアセチル）アミノ）エチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸）；ＤＡＢＣＹＬ（４−（（４−（ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸）；Ｃｙ５（インドジカルボシアニン−５）；Ｃｙ３（インド−ジカルボシアニン−３）；およびＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（２，６−ジブロモ−４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロプリオン酸）、Ｑｕａｓａｒ−６７０（Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣａｌＯｒａｎｇｅ（Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｒｏｘ、ならびにそれらの好適な誘導体などを使用することができる。
【００８５】
（クエンチャー）
本明細書に用いられる用語の「クエンチャー」とは、ドナーにまたはその近くに結合すると、蛍光ドナーからの放出を減少させることができる化合物の発色分子またはその一部を言う。クエンチングは、蛍光共鳴エネルギー移動、光誘導電子移動、項間交差の常磁性増強、Ｄｅｘｔｅｒ交換カップリング、および暗複合体形成などのエキシトンカップリングを含む、任意のいくつかの機序により生じ得る。蛍光体により放出された蛍光が少なくとも１０％、例えば、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％。９０％、９５％、９８％、９９％、９９．９％またはそれ以上まで、クエンチャーの不在下における蛍光と比較して減少する場合に、蛍光が「クエンチ」される。
【００８６】
クエンチャーは、アッセイに用いられる励起蛍光体からの少なくとも１つの蛍光放出をクエンチできる任意の材料であり得る。以下の引用文献により例示されるように、特定のプローブに関して適切なレポーター−クエンチャー対を選択するために文献上利用できる重要な処置の実用的なガイダンスがある：Ｃｌｅｇｇ（１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０：２９９４〜２９９８）；Ｗｕら（１９９４、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１８：１〜１３）；Ｐｅｓｃｅら編集、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（１９７１、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ニューヨーク）；Ｗｈｉｔｅら、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９７０、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ニューヨーク）など。これらの文献はまた、蛍光および色素生成分子ならびにレポーター−クエンチャー対を選択するための関連する光学性に関する徹底的なリストを提供する引用文献を含み、例えば、Ｂｅｒｌｍａｎ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒａ  ｏｆ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、第２版（１９７１、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、Ｃｏｌｏｕｒ  ａｎｄ  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（１９７６、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク）；Ｂｉｓｈｏｐ編集、Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ（１９７２、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード）；Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（１９９２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ）；Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（１９４９、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ニューヨーク）があり、これらのすべては参照として本明細書に組み込まれている。さらに、以下の引用文献により例示されるように、オリゴヌクレオチドに付加できる通常の反応性基を介する共有結合に関してレポーターおよびクエンチャー分子を誘導化するために文献上広範なガイダンスがあり、例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ（上記引用）；Ｕｌｌｍａｎら、米国特許第３，９９６，３４５号；Ｋｈａｎｎａら、米国特許第４，３５１，７６０号を参照されたく、これらのすべては参照として本明細書に組み込まれている。
【００８７】
当技術分野に知られている多くの市販のクエンチャーは、限定はしないが、ＤＡＢＣＹＬ、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、およびＢＨＱ−３が挙げられる。ＢＨＱ（「ブラックホールクエンチャー」）クエンチャーは、ハイブリダイゼーション事象が生じるまで蛍光を防止する新規クラスの暗クエンチャーである。さらに、これらの新規クエンチャーは固有の蛍光を有さず、他のクエンチャーに見られるバックグラウンド問題を事実上排除する。ＢＨＱクエンチャーは、殆どすべてのレポーター色素をクエンチするために使用することができ、例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（ノバト、カリフォルニア州）から市販されている。
【００８８】
（蛍光体およびクエンチャーの結合）
本発明の一実施形態において、蛍光体またはクエンチャーを、プローブの３’ヌクレオチドに結合させる。本発明の別の実施形態において、蛍光体またはクエンチャーを、５’ヌクレオチドに結合させる。さらに別の実施形態において、蛍光体またはクエンチャーを、オリゴヌクレオチドプローブに内部的に結合させる。いくつかの実施形態において、蛍光体またはクエンチャーのいずれかを、プローブの５’ヌクレオチドに結合させ、前記蛍光体またはクエンチャーのもう一方を、プローブの３’ヌクレオチドに結合させる。直接結合を介して結合を成し得るか、あるいは例えば、長さが約１個から約５個の原子のスペーサー分子を用いて結合を成し得る。
【００８９】
蛍光体またはクエンチャーの内部結合に関して、当技術分野に知られた任意の手段を用いて結合を成すことができる。オリゴヌクレオチドへの多数の色素の結合に関する適切な結合の方法論は、多数の引用文献、例えば、Ｍａｒｓｈａｌｌ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊ．、７：２９９〜３０３（１９７５）；Ｍｅｎｃｈｅｎら、米国特許第５，１８８，９３４号；Ｍｅｎｃｈｅｎら、欧州特許出願第８７，３１０，２５６．０号；およびＢｅｒｇｏｔら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９０／０５５６５号に記載されている。すべては参照として本明細書に組み込まれている。
【００９０】
プローブが標的配列に結合されない場合、すなわちプローブがヘアピン構造を採っている場合、蛍光体／クエンチャー対の各メンバーは、好ましくは、十分な量のクエンチングが生じるように対のもう一方から離れて、プローブ内のどこかに結合することができる。
【００９１】
オリゴヌクレオチドプローブがヘアピン構造を採っている場合、蛍光体／クエンチャー対の部分は、近接したクエンチング関係にある。最大クエンチングのために、２つの部分は、理想的には互いに近接している。いくつかの実施形態において、クエンチャーおよび蛍光体は、互いから３０またはそれ以下のヌクレオチドの位置に配置されている。
【００９２】
一実施形態において、本発明は、蛍光体／クエンチャー対により二重標識されるキープローブの使用を企図している。標識プローブがＦＥＮヌクレアーゼ（または本明細書に記載された他のヌクレアーゼ）により切断されると、蛍光体およびクエンチャーは分離され、残りの断片は蛍光を発する。下流プローブ上の蛍光体およびクエンチャーの配置は、標的に相補的でないプローブ部分の侵襲的切断と非侵襲的切断とを識別するために特異的に選択され得ることが企図されている。蛍光体／クエンチャー対の文脈に記載されるが、レポーター分子の配置のために以下の開示は、その特定のレポーター系に限定されないことが当業者により認識されるであろう。下記のレポーター分子の配置はまた、例えば、挿入色素などの他のレポーター系に適用でき、特定部位におけるプローブの切断により色素シグナルのクエンチングを生じるであろう。下記の配置スキームは、ＦＲＥＴ対などのようなレポーター分子の相互作用を含む任意のレポーター系にも使用することができ、分子の相互作用を下流プローブの非相補的部分の切断により遮断できる。
【００９３】
本明細書に記載されたキープローブは、例えば、２００５年６月１０に出願の米国特許出願第１１／１５０，７７５号に記載されているものと同様の標的検出アッセイに使用することができ、それらの内容はそれらの全体が本明細書に組み込まれている。このようなアッセイの文脈において、Ｐｆｕ  ＦＥＮは、上流オリゴヌクレオチドの３’末端に関連して主として単一の位置でキープローブのオリゴヌクレオチドを切断する。例えば、標的とハイブリダイズするキープローブのヌクレオチドが＋１から＋Ｘのヌクレオチドであると規定される場合、＋１は、プローブの標的のハイブリダイズされた領域の５’部分の末端にあり、＋Ｘは、プローブの標的のハイブリダイズされた領域の３’部分の末端にある（Ｘは、下流プローブにおけるハイブリダイズされた残基数に等しい）。上流オリゴヌクレオチドが、キープローブの標的のハイブリダイズされた領域と重ならないが、２つのオリゴヌクレオチド間にニックのみがあるようにキープローブと隣接する場合、ＦＥＮは、キープローブの標的のハイブリダイズされた領域の＋１位と＋２位との間を切断すると予想される。上流オリゴヌクレオチドが、キープローブの標的のハイブリダイズされた領域の５’末端と重なる単一３’塩基を有し、その３’塩基位置において標的とハイブリダイズする場合、プローブの切断は、キープローブのハイブリダイズされた領域の＋２位と＋３位との間に生じる。したがって、上流オリゴヌクレオチドの３’末端が、Ｎヌクレオチドによりキープローブのハイブリダイズされた領域と重なり、上流オリゴヌクレオチドの３’末端の重なり領域が、その領域の標的にハイブリダイズする場合、キープローブの標的のハイブリダイズされた領域の＋（Ｎ＋１）位と＋（Ｎ＋２）位との間で切断が生じる。
【００９４】
したがって、キープローブが予め形成された非ハイブリダイジング５’末端（例えば、５’フラップ）を有する場合に、上流オリゴヌクレオチドがキープローブの標的のハイブリダイズされた領域に隣接する（および重ならない）という条件で、プローブの標的のハイブリダイズされた領域の＋（Ｎ＋１）位と＋（Ｎ＋２）位との間で切断が生じる。２つのオリゴヌクレオチド間にニックのみを残して、下流オリゴヌクレオチドのハイブリダイズされた領域の＋１位と＋２位との間で切断が生じ、プローブの５’フラップの放出を生じ；５’フラップは、キープローブのハイブリダイズされた領域の５’末端に由来するその３’末端に１つのヌクレオチドを有するであろう。上流オリゴヌクレオチドがキープローブの標的のハイブリダイズされた領域と重なるその３’末端に１つの塩基を含有する場合、プローブの＋２位と＋３位との間で切断が生じ、プローブの５’フラップの放出を生じて、ここでプローブの最初の２つの標的のハイブリダイズされた塩基に由来するその３’末端に２つの塩基を有する。
【００９５】
したがって、蛍光体のようなレポーター基がキープローブの標的のハイブリダイズされた領域の＋２塩基に結合され、クエンチャーが５’フラップの塩基に結合される場合、＋２位の切断下流はクエンチャーおよび同じ核酸分子に依然として結合されたレポーター基を残すであろう。しかしながら、プローブの＋２位の上流（すなわち、＋１位と＋２位との間）に切断が生じる場合、＋２塩基上に配置されたレポーターは、フラップ上に配置されたクエンチャーから分離されることになる。また次に、＋２位の切断上流がある場合、上流プローブは、キープローブの標的のハイブリダイズされた領域との重なりを有することができない。したがって、上流オリゴヌクレオチドが標的に相補的であって下流オリゴヌクレオチドの相補的な部分と重なる３’部分を有する侵襲的切断構造は、＋２位の切断下流を生じ、したがって、＋２位に配置されたレポーター基および５’フラップに配置されたクエンチャーの物理的分離を生じないであろう。侵襲的切断構造から生じる切断事象は検出されないが、一方、非侵襲的切断構造から生じる切断事象は検出可能となるであろう。したがって、キープローブの標的のハイブリダイズされた／相補的部分の＋２位におけるレポーター分子（蛍光体など）の配置は、侵襲的切断と非侵襲的切断との間の識別を可能にする。したがって、本発明の一実施形態では、キープローブの標的の相補的領域の＋２位におけるレポーター分子（例えば、蛍光体）の配置が企図されている。蛍光体が５’フラップ上にあり、クエンチャーが下流プローブの相補的領域の＋２位に配置されるように、蛍光体／クエンチャー対の位置付けを逆にすることができることも企図されている。
【００９６】
本発明はまた、キープローブの＋３位または＋９位におけるレポーター分子（限定はしないが、ＦＡＭ（フルオレセイン）などの蛍光体など）の配置が、それぞれプローブの＋３位と＋４位との間、またはプローブの＋９位と＋１０位との間で切断を生じ得ないという発見に一部基づいている。よって、＋２位に蛍光体（例えば、ＦＡＭ）を有するキープローブは＋２位と＋３位との間で切断され得ず、したがって、単一の３’重なり塩基を有する上流オリゴヌクレオチドは、＋２位と＋３位との間でプローブの切断を引き起こすことができず、一方、重なり領域のない上流オリゴヌクレオチド、ニックは、＋１位と＋２位との間で切断を引き起こし、５’フラップ上に存在するクエンチャーからレポーター基を分離することになる。したがって、プローブのハイブリダイズ領域の＋２塩基に結合されたＦＡＭを有するキープローブの切断によって生じたシグナルは、侵襲的切断構造からではなく、非侵襲的切断構造からのみ生じる。さらに、相補的領域の＋２位に結合された蛍光体（例えば、ＦＡＭ）を有するプローブからの５’フラップの切断により、フラップの３’末端に結合された相補的領域の５’末端から１つの３’塩基、または３つの３’塩基を有する切断フラップを生じるであろう。５’フラップに結合されたままである２つの３’塩基を生じると思われる切断構造が、キープローブの＋２塩基上の蛍光体によりＦＥＮによる遮断のために切断し得ないので、このようなフラップは、その３’末端に結合されたちょうど２つの付加塩基を有することができない。
【００９７】
したがって、本発明は、侵襲的切断構造からではなく、非侵襲的切断構造からのみシグナルを発生させるために、＋２塩基上の蛍光体基（限定はしないが、ＦＡＭ基など）および＋１位のクエンチャー上流（５’プライム）を有するキープローブの使用を企図している。
【００９８】
（標的核酸の増幅）
いくつかの実施形態において、本発明のプローブは、核酸増幅反応における標的核酸の存在をモニターするか、または検出するために用いられる。このような実施形態において、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に関する典型的な反応条件を用いてこの方法を実施することができる。１サイクルにつき２つの温度で達成される：１つは、典型的に１秒から３０秒続く高温の変性ステップ（一般に９０℃〜９６℃の範囲で）、および通常１秒から９０秒の間での連結されたアニーリング／伸長ステップ（典型的に、その反応のために選択されたプローブおよびプライマーならびにポリメラーゼのアニーリング温度に依って、５０℃〜６５℃の範囲で）。「ＰＣＲ混合物」とも称される反応混合物は、核酸、上記の核酸ポリメラーゼ、本発明のオリゴヌクレオチドプローブ、好適な緩衝液、および塩類を含有する。該反応は、ＰＣＲ用に通常使用される任意のサーモサイクラー中で実施できる。しかしながら、Ｔａｑ  Ｍａｎ  ７７００ＡＢ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティー、カリフォルニア州）、Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ  ２０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、シドニー、オーストラリア）、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、インディアナポリス、インディアナ州）、ｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ヘルクレス、カリフォルニア州）およびＭｘ４０００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラジョラ、カリフォルニア州）を含む、定量蛍光測定機能を有するサイクラーが好ましい。
【００９９】
例えばＰＣＲによる標的ポリヌクレオチドの増幅と一般的に関連する標識プローブの使用は、例えば、Ｉｎｎｉｓら編集、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８９）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク、１９８９）など多くの引用文献に記載されており、それらのすべては参照として本明細書に組み込まれている。好ましい実施形態において、プローブの結合部位は、標的ポリヌクレオチドを増幅させるために用いられるＰＣＲプライマー間に配置されている。ＰＣＲは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼまたは当量の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施されることが好ましく、ＰＣＲのアニーリング温度は、使用されるオリゴヌクレオチドプローブの融解温度より約５℃〜１０℃低い。
【０１００】
（キット）
本発明は、本明細書に記載される増幅および／または検出に関する新規な組成物および方法を提供することが意図されている。本明細書中の本発明は、本発明の組成物の１つまたは複数の容器を有するパッケージ単位を含み、いくつかの実施形態においてＰＣＲにおける合成などのポリヌクレオチド合成に使用される種々の試薬の容器を含むキットフォーマットもまた企図している。キットはまた、１つまたは複数の以下の項目を含むことができる：重合化用酵素（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼ、特に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼなどの１つまたは複数の核酸ポリメラーゼ）、ポリヌクレオチド前駆体（例えば、ヌクレオシドトリホスフェート）、プライマー、緩衝液、取扱説明書、および対照。キットは、本発明による方法を実施するための好適な割合で一緒に混合された試薬の容器を含むことができる。試薬用容器には、本発明の方法を実施する際に計量ステップを不要にする単位量で試薬を含むことが好ましい。本発明による１つのキットにはまた、染色されたゲルからのＰＣＲ産物の収量の定量化用ＤＮＡ収量標品を含む。
【０１０１】
（実施例）
下記の実施例は非限定であり、本発明の種々の態様および特徴を単に代表するものである。
【０１０２】
（実施例１）
グループＢの連鎖球菌属ＤＮＡを定量化するためのキープローブの使用
連鎖球菌属アガラクシア（ＧＢＳ）からの精製ゲノムＤＮＡ（５×１０５、５×１０４、５，０００、５００、５０、または１０のコピー）を、３’−ＦＡＭで標識し、５’−ＢＨＱ−２でクエンチし、４００ｎＭのＧＢＳ特異的プライマーおよび３００ｎＭのＧＢＳ特異的キープローブを含有するＦｕｌｌ  Ｖｅｌｏｃｉｔｙ（商標）ＰＣＲ反応液に滴定した。ＧＢＳ特異的キープローブは図１に示され、その配列は配列番号：１に示される。ＧＢＳ特異的プライマーは、
【化１】
2008529528.tif 000003
【０１０３】
および
【化２】
2008529528.tif 000004
【０１０４】
であった。実験は、以下のサイクリングパラメータ：９５℃で２分、次いで９５℃で１秒および６０℃で１８秒の４０サイクルによりＭｘ３０００ｐ定量ＰＣＲ装置（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で実施した。データは、各反応における３０ｎＭのＲＯＸ参照色素の包含により正規化し、サイクル数に関してｄＲｎ（参照色素に対して正規化されたＦＡＭ蛍光での変化）として表される。正規化されたデータが図２Ａに示される。図２Ｂに示された蛍光生データは、キープローブのバックグラウンドシグナル（１０，０００と１２，０００との間の生の蛍光単位）を示す。ＧＢＳ  ＤＮＡを欠くテンプレートなしのサンプルは、陰性対照として入れた。各反応は、二連で実施した。Ｆｕｌｌ  Ｖｅｌｏｃｉｔｙ（商標）ＱＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅのカタログ番号６００５６１であり、米国特許第６，５２８，２５４号および米国特許第６，５４８，２５０号（各々は、参照としてその全体が本明細書に組み込まれている）にさらに記載されている。
【０１０５】
データから作成された検量線を図３に示す。データは、Ｃｔ対インプットＤＮＡコピー数として示される。Ｃｔ（閾値サイクル）は、蛍光シグナルが、選択閾値レベルを超えるサイクル数であり；この場合、閾値レベル（図２Ａの下部付近の実線）は、Ｍｘ３０００ｐソフトウェアにより決定した。データポイントは、線形回帰解析によりラインに適合している。これらのデータの線形適合に関するＲ２値は０．９９９であり、増幅の算出効率（最良適合ラインのスロープから作成）は９９．５％である。これらのデータにより、各サイクルによる標的ＤＮＡのほぼ完全なダブリング、および初発のＧＢＳ  ＤＮＡコピー数に関するＰＣＲシグナルのほぼ完全な濃度依存を示唆する。
【０１０６】
（実施例２）
キープローブ対と３’フラップとを用いる対立遺伝子の識別
ＰＣＲ反応は、ｅＮＯＳ（内皮型一酸化窒素シンターゼ）キープローブ対を用いて実施した。野生型プローブ（３’ＦＡＭ標識、５’ＢＨＱ−２クエンチャーを有する）は、図４Ａに示され、その配列は、配列番号：４に示される。マッチング変異体プローブ（３’クエーサー６７０標識、５’ＢＨＱ−２クエンチャーを有する）は図４Ｂに示され、その配列は配列番号：５に示される。テンプレートは、野生型または変異型ＤＮＡを用いて得られた精製ＰＣＲ産物であった。ｅＮＯＳ野生型テンプレートは以下の配列を有した。
【化３】
2008529528.tif 000005
【０１０７】
ｅＮＯＳ変異型テンプレートは以下の配列を有した。
【化４】
2008529528.tif 000006
【０１０８】
両テンプレートは、以下のプライマー対を用いて得られた。
【化５】
2008529528.tif 000007
【０１０９】
および
【化６】
2008529528.tif 000008
【０１１０】
Ｆｕｌｌ  Ｖｅｌｏｃｉｔｙ（商標）ＰＣＲ反応は、マッチング野生型テンプレート（Ｇ対立遺伝子、円）、ミスマッチ変異型テンプレート（Ｔ対立遺伝子、四角）を有するか、または陰性対照としてＤＮＡのない（三角）ｅＮＯＳ野生型キープローブを用いて実施された。テンプレートは、野生型または変異型ＤＮＡからの精製ＰＣＲ産物であり、１反応当り１００ｆｇで存在した。フォワードＰＣＲプライマー（ｅＮＯＳ−ｋ−Ｆｗｄ）は５００ｎＭで存在し、リバースＰＣＲプライマー（ｅＮＯＳ−ｋ−Ｒｅｖ）は１００ｎＭで存在し、ｅＮＯＳ野生型キープローブは４００ｎＭで存在した。データは、各反応において３０ｎＭのＲＯＸ参照色素の包含により正規化された。実験は、以下のサイクリングパラメータ：９５℃で２分、次いで９５℃１０秒および６０℃３０秒の５０サイクルでＭｘ３０００ｐのリアルタイムＰＣＲ装置により実施された。データは、サイクル数に関してｄＲｎ（参照色素に対して正規化されたＦＡＭ蛍光での変化）として表される。結果は、図５Ａに示される。
【０１１１】
Ｆｕｌｌ  Ｖｅｌｏｃｉｔｙ（商標）ＰＣＲ反応は、マッチング変異型テンプレート（Ｔ対立遺伝子、円）、ミスマッチ野生型テンプレート（Ｇ対立遺伝子、四角）を有するか、または陰性対照としてＤＮＡのない（三角）ｅＮＯＳ変異型キープローブを用いて実施された。フォワードＰＣＲプライマー（ｅＮＯＳ−ｋ−Ｆｗｄ）は５００ｎＭで存在し、リバースＰＣＲプライマー（ｅＮＯＳ−ｋ−Ｒｅｖ）は１００ｎＭで存在し、ｅＮＯＳ変異型キープローブは４００ｎＭで存在した。サイクルパラメータおよびデータの正規化は、上記の野生型キープローブ反応と同じであった。クエーサー６７０は、ＣＹ５の直接的置換であり、したがって、ＣＹ５チャンネルに報告されていることに注目されたい。結果は、図５Ｂに示している。
【０１１２】
Ｆｕｌｌ  Ｖｅｌｏｃｉｔｙ（商標）ＰＣＲ反応は、同じ反応において野生型（ＦＡＭ標識）および変異型（クエーサー６７０標識）キープローブの双方を用いて実施された。野生型プローブ（ＦＡＭチャンネル）から生じたシグナルは、図６Ａに示される。テンプレートの全濃度は１００ｆｇ／反応であるが、野生型（Ｇ対立遺伝子）対変異型（Ｔ対立遺伝子）のＰＣＲ産物の比率は以下のとおり変化した：野生型または変異型テンプレート単独が１００ｆｇ、各テンプレートが５０ｆｇ、または１つのテンプレートが９０ｆｇおよび他のテンプレートが１０ｆｇ。フォワードＰＣＲプライマー（ｅＮＯＳ−ｋ−Ｆｗｄ）は５００ｎＭで存在し、リバースＰＣＲプライマー（ｅＮＯＳ−ｋ−Ｒｅｖ）は１００ｎＭで存在し、ｅＮＯＳキープローブは４００ｎＭで存在した。サイクルパラメータおよびデータの正規化は、上記と同じであった。データは、サイクル数に関してｄＲｎ（参照色素に対して正規化されたＦＡＭ蛍光での変化）として表される。
【０１１３】
Ｆｕｌｌ  Ｖｅｌｏｃｉｔｙ（商標）ＰＣＲ反応は、同じ反応において野生型（ＦＡＭ標識）および変異型（クエーサー６７０標識）キープローブの双方を用いて実施された。変異型プローブ（ＣＹ５チャンネルに示されたクエーサー６７０蛍光）から生じたシグナルは、図６Ｂに示される。テンプレートの全濃度は、１００ｆｇ／反応であるが、野生型（Ｇ対立遺伝子）対変異型（Ｔ対立遺伝子）のＰＣＲ産物の比率は以下のとおり変化した：野生型または変異型テンプレート単独が１００ｆｇ、各テンプレートが５０ｆｇ、または１つのテンプレートが９０ｆｇおよび他のテンプレートが１０ｆｇ。フォワードＰＣＲプライマー（ｅＮＯＳ−ｋ−Ｆｗｄ）は５００ｎＭで存在し、リバースＰＣＲプライマー（ｅＮＯＳ−ｋ−Ｒｅｖ）は１００ｎＭで存在し、ｅＮＯＳキープローブは４００ｎＭで存在した。サイクルパラメータおよびデータの正規化は、上記と同じであった。データは、サイクル数に関してｄＲｎ（参照色素に対して正規化されたクエーサー６７０蛍光での変化）として表される。
【０１１４】
（実施例３）
キープローブ対と５’フラップとを用いる対立遺伝子の識別
ＰＣＲ反応は、図７Ａと図７Ｂとに示されたｅＮＯＳキープローブ対を用いて実施された。野生型プローブの配列は、配列番号：１０に示され、マッチング変異型プローブの配列は、配列番号：１１に示される。野生型プローブは、３’ＦＡＭおよび５’ＢＨＱ−２クエンチャーにより標識された。変異型プローブは、３’クエーサー６７０および５’ＢＨＱ−２クエンチャーにより標識された。テンプレートは、野生型または変異型ＤＮＡを用いて得られた精製ＰＣＲ産物であり、実施例２に記載されたものと同じテンプレートであった。
【０１１５】
Ｆｕｌｌ  Ｖｅｌｏｃｉｔｙ（商標）ＰＣＲ反応は、図７Ａおよび図７ＢのｅＮＯＳ野生型キープローブの双方と、野生型テンプレート（結果は図８に示されている）または変異型テンプレート（結果は図９に示されている）とを用いて実施された。テンプレートは、野生型または変異型ＤＮＡからの精製ＰＣＲ産物であり、１反応当り１００ｆｇで存在した。フォワードＰＣＲプライマー（実施例２と同じ）は４００ｎＭで存在し、リバースＰＣＲプライマー（実施例２と同じ）は４００ｎＭで存在し、ｅＮＯＳ野生型キープローブはそれぞれ４００ｎＭで存在した。データは、各反応において３０ｎＭのＲＯＸ参照色素の包含により正規化された。実験は、以下のサイクリングパラメータ：９５℃で２分、次いで９５℃１０秒および６０℃３０秒の５０サイクルでＭｘ３０００ｐのリアルタイムＰＣＲ装置により実施された。データは、サイクル数に関してｄＲｎ（参照色素に対して正規化されたＦＡＭまたはＢＨＱ蛍光での変化）として表される。
【０１１６】
（実施例４）
この実施例は、特異的非侵襲切断後の最良シグナルを達成するために（このような標的検出および切断検出に対するアッセイは、例えば、２００５年６月１０日に出願の米国特許出願第１１／１５０，７７５号に教示され、その内容は参照としてそれらの全体が本明細書に組み込まれている）、蛍光体／クエンチャー対の最適置換を判定するために使用できるキープローブの変化を示している。図１０〜１３は、キープローブと、キープローブの標的相補的領域の５’末端の＋２位における蛍光体（例えば、ＦＡＭ）の特定の位置付けとを組み合わせる本発明の方法の例を示す。
【０１１７】
図１０は、標的アンプリコン配列（配列番号：１２）の例を示す。キープローブに相補的である標的配列の部分は太字で示され、上流の３’ブロックのプローブに相補的である標的配列の部分はイタリックで示される。図１１および図１２は、本発明により使用できるキープローブの種々の実施形態を示す。図１１Ａは対照プローブを示し；すなわち、蛍光体およびクエンチャー部分は、プローブ配列（配列番号：１３）のそれぞれ３’末端および５’末端に配置され、切断されるこのプローブの非標的相補的部分の能力は、蛍光体の位置付けに依存すべきでない（上記の実施形態とは異なり、蛍光体は＋２位に特異的に配置される）。図１１Ｂは、図１１Ａのプローブと同じヌクレオチド配列（配列番号：１３）に基づくキープローブの例を示し、ここでＦＡＭ分子は、キープローブの相補的領域の５’末端の＋２位に配置される。このプローブはまた、−８位におけるクエンチャーＢＨＱ２の位置付けを示す（すなわち、相補的領域の５’末端の８残基５’の位置）。本実施例において、−７位をチミン（Ｔ）に変更することなく−７位にクエンチャーを配置できず、標準的なキープローブ構造は、このような変換により有害な影響を及ぼし得ることが予想される。図１２ＡおよびＢは、＋２位にＦＡＭ部分、ならびに−３位および−１位にそれぞれ配置されたＢＨＱ２クエンチャーを有するキープローブを示す。プローブ配列は、図１１Ａおよび図１１Ｂ（配列番号：１３）のものと同じである。＋２位における蛍光体と比較したクエンチャー部分の特定の位置付けは、キープローブの非標的相補的領域の切断後のクエンチングおよび／または蛍光の効率および十分性に影響があり得ることが予想される。
【０１１８】
図１３は、キープローブの相補的領域の３’末端と５’末端とで重なりの０〜３つのヌクレオチドを有する上流３’のブロックされたオリゴヌクレオチドプローブの例を示す。重なりが０ｎｔの配列は、配列番号：１４であり；重なりが１ｎｔの配列は、配列番号：１５であり；重なりが２ｎｔの配列は、配列番号：１６であり；重なりが３ｎｔの配列は、配列番号：１７である。合成アンプリコン鎖は、配列番号：１８である。＋２位にＦＡＭを有するキープローブは切断されて蛍光シグナルを生じさせるのみであり、ブロックされたオリゴヌクレオチドプローブと下流のキープローブの５’末端との重なりがないことが予想される。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】図１は、分類Ｂの連鎖球菌配列に特異的なキープローブの配列および二次的構造を例示する図である。
【図２】図２は、ＧＢＳ特異的キープローブを用いた分類Ｂの連鎖球菌（ＧＢＳ）ＤＮＡの滴定を示す図である。図１のプローブは、１アッセイ当り１０から５００，０００のコピーの範囲でＧＢＳ  ＤＮＡ量を定量化するために使用された。正規化データは図２Ａに示され、蛍光生データは図２Ｂに示される。詳細については実施例１を参照されたい。
【図３】図３は、図２Ａに示されたデータから作成された検量線を示す図である。
【図４】図４は、ｅＮＯＳ（内皮型一酸化窒素シンターゼ）をコードするＤＮＡの一塩基多型（ＳＮＰ）で２つの対立遺伝子間を識別でき、３’フラップを生じるマッチした対のキープローブの配列および二次的構造を例示する図である。一方のプローブは野生型に特異的であり（図４Ａ）、もう一方は変異型（ＳＮＰ）に特異的である（図４Ｂ）。ＳＮＰを認識するプローブ位置は矩形により示される。図４Ａおよび４Ｂにおけるプローブは、双方とも５’末端において標的結合配列（配列１）を有し、したがって、標的配列を含有する核酸とハイブリダイズしている場合には３’フラップを生じる。
【図５】図５は、図４Ａの野生型ｅＮＯＳ特異的キープローブを用いた対立遺伝子の識別アッセイ結果（図５Ａ）および図４Ｂの変異型ｅＮＯＳ特異的キープローブを用いた対立遺伝子の識別アッセイ結果（図５Ｂ）を示す図である。図５Ａでは、完全にマッチした野生型ｅＮＯＳ  ＤＮＡ（円）、変異型（すなわち、ミスマッチ）ｅＮＯＳ  ＤＮＡ（四角）を含有するテンプレート、およびｅＮＯＳ  ＤＮＡテンプレートなしで実施された対照反応（三角）に関する結果を示す。図５Ｂでは、完全にマッチした変異型ｅＮＯＳ  ＤＮＡ（円）、野生型（すなわち、ミスマッチ）ｅＮＯＳ  ＤＮＡ（四角）を含有するテンプレート、およびｅＮＯＳ  ＤＮＡテンプレートなしで実施された対照反応（三角）に関する結果を示す。詳細は実施例２を参照されたい。
【図６】図６は、対立遺伝子特異的ｅＮＯＳキープローブのテンプレート特異性を示す図である。示されるように、野生型および変異型テンプレートの種々の混合物の存在下、野生型特異的および変異型特異的双方のｅＮＯＳキープローブを用いて反応を実施した。図６Ａでは、野生型特異的キープローブのシグナルを示す。図６Ｂでは、変異型特異的キープローブのシグナルを示す。詳細は実施例２を参照されたい。
【図７】図７は、ｅＮＯＳ（内皮型一酸化窒素シンターゼ）をコードするＤＮＡの一塩基多型（ＳＮＰ）で２つの対立遺伝子間を識別でき、ｅＮＯＳをコードするＤＮＡに結合すると５’フラップを生じるマッチした対のキープローブの配列および二次的構造を例示する図である。一方のプローブは、野生型に特異的であり（図７Ａ）、もう一方は変異型（ＳＮＰ）に特異的である（図７Ｂ）。ＳＮＰを認識するプローブ位置は矢印により示される。図７Ａ及び７Ｂにおけるプローブは、双方とも３’末端において標的結合配列（配列１）を有し、したがって、ｅＮＯＳ標的配列を含有する核酸とハイブリダイズしている場合には５’フラップを生じる。
【図８】図８は、野生型配列を有する標的核酸配列を検出するために、図７Ａの野生型ｅＮＯＳ特異的キープローブ（円）および図７Ｂの変異型ｅＮＯＳ特異的キープローブ（四角）を用いた対立遺伝子の識別アッセイ結果を示す図である。詳細は実施例３を参照されたい。
【図９】図９は、変異型ｅＮＯＳ配列を有する標的核酸配列を検出するために、図７Ａの野生型ｅＮＯＳ特異的キープローブ（＊）および図７Ｂの変異型ｅＮＯＳ特異的キープローブ（四角）を用いた対立遺伝子の識別アッセイ結果を示す図である。詳細は実施例３を参照されたい。
【図１０】図１０は、標的の存在を示すシグナルを発生させる能力について種々のキープローブを試験するために用いられる代表的な標的アンプリコンを示す図である。
【図１１】図１１は、対照キープローブの例（図１１Ａ）および試験キープローブの例（図１１Ｂ）を示す。
【図１２】図１２ＡおよびＢは、キープローブの例を示す図である。
【図１３】図１３は、下流のキープローブの相補的領域の５’末端との０から３残基の重なりを有する上流の３’ブロック化プローブの例を示す図である。
【図１】
2008529528.tif 000009
【図２Ａ】
2008529528.tif 000010
【図２Ｂ】
2008529528.tif 000011
【図３】
2008529528.tif 000012
【図４】
2008529528.tif 000013
【図５Ａ】
2008529528.tif 000014
【図５Ｂ】
2008529528.tif 000015
【図６Ａ】
2008529528.tif 000016
【図６Ｂ】
2008529528.tif 000017
【図７】
2008529528.tif 000018
【図８】
2008529528.tif 000019
【図９】
2008529528.tif 000020
【図１０】
2008529528.tif 000021
【図１１】
2008529528.tif 000022
【図１２】
2008529528.tif 000023
【図１３】
2008529528.tif 000024
【配列表】
2008529528000001.xml
【国際調査報告】
2008529528.tif 000029
2008529528.tif 000030