(57)【要約】  新規なＬ−リジン−誘導性プロモータ核酸分子を開示する。また、前記核酸分子を含むベクター、前記ベクターで形質転換された宿主細胞、および前記Ｌ−リジン−誘導性プロモータ核酸分子を用いて目的遺伝子の発現を誘導する方法を開示する。
2008526197.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１、２、３、４または５のヌクレオチド配列と、
（ｂ）前記（ａ）のヌクレオチド配列と７０％以上の相同性を有し、Ｌ−リジン−誘導性(L-lysine-inducible)プロモータとして使用できるヌクレオチド配列と、
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とを含むグループの中から選択されたＬ−リジン−誘導性(L-lysine-inducible)プロモータ核酸分子。
【請求項２】
請求項１に記載のＬ−リジン−誘導性プロモータ核酸分子を含むベクター。
【請求項３】
請求項２に記載のベクターで形質転換された原核宿主細胞。
【請求項４】
コリネ型細菌である請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項５】
請求項１に記載のＬ−リジン−誘導性プロモータ核酸分子を用いて目的遺伝子の発現を誘導する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、新規なＬ−リジン−誘導性(L-lysine-inducible)プロモータ核酸分子、この核酸分子を含むベクター、このベクターで形質転換された宿主細胞、およびこのＬ−リジン−誘導性プロモータ核酸分子を用いて目的遺伝子の発現を誘導する方法に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
コリネ型細菌は、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニンおよび各種核酸を含んだ飼料、医薬品、および食品などの分野で様々な用途を持つ化学物質を生産する産業用微生物である。このようなコリネ型細菌を遺伝工学的、代謝工学的技術を利用して高力価菌株として開発するには、コリネ型細菌内でいろんな代謝過程に関連した遺伝子の発現を選択的に調節することができなければならないが、このためには有用なプロモータ配列が必須的であるといえる。
【０００３】
コリネ型細菌で遺伝子を発現させるためには、一般に、自体遺伝子が元々持っていたプロモータを使用する(Vasicova, P., et al., J. Bacteriol. 181, 6188-6191, (1999)。一方、コリネ型細菌における遺伝子発現のためのプロモータ配列は、大腸菌や枯草菌などの他の産業用微生物とは異なり、一般な構造が知られていない。したがって、例えばクロラムフェニコール(Chloramphenicol)などの抗生剤耐性遺伝子のプロモータ部分を除去し、ここにコリネ型細菌から単離した染色体ＤＮＡを適切な制限酵素で切断して導入した後、これによりコリネ型細菌を形質転換させて得た菌株の抗生剤耐性を測定することにより、プロモータを開発してきている(Eikmanns, B.J., et al., Gene, 102, 93-98, (1991); Patek, M., et al., Microbiology, 142, 1297-1309, (1996))。ところが、開発された既存のプロモータ配列は、遺伝子発現の選択性や発現効率などの面で依然として改善の余地を抱えている。
【０００４】
プロモータを単離するための従来の方法には、（１）ゲノム性ＤＮＡ断片を、クローニングされた断片がプロモータ活性を含む場合にのみ発現されるレポーター遺伝子の前方に無作為にクローニングさせるプロモータプローブベクターの利用法、（２）遺伝子特異的プローブに基づいたハイブリッド化を用いて遺伝子ライブラリから遺伝子およびそのプロモータを単離する方法、（３）誘導性ｃＤＮＡプローブおよび非誘導性ｃＤＮＡプローブを用いた遺伝子バンクの差別ハイブリッド化法などがある。
【０００５】
最近、２次元電気泳動を用いたプロテオーム比較分析法によって、相異なる条件の下で発現率の異なるタンパク質を分析する方法が開発されており、発現に差異を示すタンパク質に基づいて、その発現を増大させることが可能な調節遺伝子を解明しようとする研究が行われている。
【０００６】
このような背景の下で、本発明者は、リジン添加条件で発現が誘導されたタンパク質を２次元電気泳動し、発現量に差異があるタンパク質をプロテオーム(proteome)比較分析法によって確認および同定し、同定されたタンパク質の予想プロモータ部分のポリヌクレオチドを重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅して、プロモータが欠乏したｌａｃＺ遺伝子の前部分に導入した後、リジン添加によるβ−ガラクトシダーゼ活性の顕著な増加を確認することにより、リジンによって発現を誘導することが可能な新規プロモータ核酸分子を提供することができ、本発明を完成するに至った。
【０００７】
〔発明の開示〕
本発明の目的は、新規なＬ−リジン−誘導性プロモータ核酸分子を提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、前記新規なプロモータ核酸分子を含むベクターを提供することにある。
【０００９】
本発明の別の目的は、前記ベクターで形質転換された宿主細胞を提供することにある。
【００１０】
本発明の別の目的は、前記新規なプロモータ核酸分子を用いて目的遺伝子の発現を誘導する方法を提供することにある。
【００１１】
〔図面の簡単な説明〕
本発明の前記および他の目的、特徴および利点は添付図面を参照する以降の詳細な説明からより明らかに理解可能である。
【００１２】
図１は２次元電気泳動法によって、リジン添加に応じて発現量が変化するタンパク質を比較したゲル写真である。変化したタンパク質スポットは矢印で表示した。
【００１３】
図２はプロモータ探索ベクターの製作方法を示す模式図である。プロモータの活性度を測定するためにβ−ガラクトシダーゼを使用した。
【００１４】
〔発明を実施するための最良の様態〕
一つの様態として、本発明は、新規なＬ−リジン−誘導性プロモータ核酸分子に関する。
【００１５】
具体的に、本発明のＬ−リジン−誘導性プロモータ核酸分子は、配列番号１、２、３、４または５のヌクレオチド配列を持つ。
【００１６】
本発明に係るプロモータ核酸分子のヌクレオチド配列は、最近のいろんな研究技法、例えば方向性進化(directed evolution)または部位特異突然変異技術(site-directed mutagenesis)などの方法によって一定の程度変形が可能である。本技術分野の当業者であれば、このような人為的な変形によって７０％以上の相同性が保たれる塩基配列が本明細書で目的とする遺伝子発現のためのプロモータ活性を保有する限りは、本発明の塩基配列から由来した、それと均等なものであることを容易に理解するであろう。
【００１７】
したがって、本発明のＬ−リジン−誘導性プロモータ核酸分子は、前述したヌクレオチド配列と７０％以上の相同性(homology)を有し、Ｌ−リジン−誘導性プロモータとして使用できるヌクレオチド配列を含む。
【００１８】
本発明で使用された用語「相同性」は、野性型核酸配列との類似な程度を示すためのものであって、本発明のＬ−リジン−誘導性プロモータの核酸配列とは好ましくは７５％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上同一でありうるＤＮＡ配列を含む。このような相同性の比較は、肉眼によって、または購入が容易な比較プログラムを用いて行うことができる。市販するコンピュータプログラムは２つ以上の配列間の相同性を百分率（％）で計算することができ、相同性（％）は隣接した配列に対して計算することができる。
【００１９】
また、本発明のＬ−リジン−誘導性プロモータ核酸分子は、前述したヌクレオチド配列に相補的な(complementary)ヌクレオチド配列を含むグループの中から選択されたＬ−リジン−誘導性(L-lysine-inducible)プロモータ核酸分子を含む。
【００２０】
本発明で使用された用語「相補的な」は、ヌクレオチドまたは核酸、例えば二重鎖ＤＮＡ分子の２つのストランド間、またはオリゴーヌクレオチドプライマーと配列分析または増幅されるべき単一ストランド核酸上のプライマー結合部位間のハイブリッド化または塩基対合を意味する。
【００２１】
また、本発明のＬ−リジン−誘導性プロモータ核酸分子は、前記Ｌ−リジン−誘導性(L-lysine-inducible)プロモータ核酸分子と機能的に同一の作用を行うその作用性等価物を含む。前述した機能性等価物には、作用性断片を含んで、一つ以上の核酸塩基が置換、欠失、挿入またはこれらの組み合わせによって変異された変異体を含むことができる。
【００２２】
本発明のＬ−リジン−誘導性プロモータ核酸分子は、コリネ型細菌(Corneform bacterium)由来のプロモータであって、好ましくは原核細菌、特に大腸菌およびコリネ型細菌における遺伝子発現のためのプロモータとして有用である。
【００２３】
本願で使用された用語「プロモータ」は、遺伝子の転写が開示されるためにＲＮＡポリメラーゼ(RNA polymerase)が結合するＤＮＡ部位であって、ｍＲＮＡ転写開示部位の５’側に位置する。本発明の目的上、本発明のプロモータは、外部シグナルであるＬ−リジンの添加によってプロモータ依存的遺伝子発現を可能にするＬ−リジン−誘導性プロモータをいう。
【００２４】
本発明のＬ−リジン−誘導性プロモータ核酸分子は、標準分子生物学技術を用いて単離または製造することができる。例えば、適切なプライマー配列を用いてＰＣＲによって単離することができる。また、自動化されたＤＮＡ合成器を用いる標準合成技術によって製造することもできる。
【００２５】
本願で使用された用語「コリネ型細菌」は、コリネバクテリウム(Corynebacterium)またはブレビバクテリウム(Brevibacterium)属の微生物を含む概念である。このようなコリネ型細菌は、コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ １３０３２の他に異なるコリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウムグルタミクム種の適当な菌株としては、公知の野性型菌株、コリネバクテリウムサーモアミノゲネス(thermoaminogenes)ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９、ブレビバクテリウムフラバム(Brevibacterium flavum)ＡＴＣＣ １４０６７、ブレビバクテリウムラクトフェルメンタム(lactofermentum)ＡＴＣＣ １３８６９、およびこれらから製造されたＬ−アミノ酸生産突然変異体または菌株、例えばコリネバクテリウムグルタミクムＫＦＣＣ １０８８１、コリネバクテリウムグルタミクムＫＦＣＣ １１００１などを含む。
【００２６】
別の様態として、本発明は、前記新規なＬ−リジン−誘導性プロモータ核酸分子を含むベクターに関する。
【００２７】
本願で使用された用語「ベクター」は、適切な宿主内でＤＮＡの発現を実施し得る適切な調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。そのような調節配列は、転写を行うためのプロモータ、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写および解読の終結を調節する配列を含む。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、または単に潜在的ゲノム挿入物でありうる。適切な宿主で形質転換されると、ベクターは、宿主ゲノムと関係なく複製し機能することができ、或いは一部の場合にはゲノムそれ自体に統合できる。
【００２８】
用語「作動可能に連結された」とは、発現が必要な遺伝子とその調節配列が互いに結合され、遺伝子の発現を可能にする方式で連結されることをいう。
【００２９】
本発明者は、２次元電気泳動の後、発現が増加したタンパク質をプロテオーム比較分析法で解明した後、このようなタンパク質からプロモータ配列を探すためにレポーター遺伝子を用いた。レポーター遺伝子は、その発現によってプロモータの作動有無を確認することが可能な遺伝子であって、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールトランスアセチラーゼ、蛍光タンパク質（たとえば、緑蛍光タンパク質、赤蛍光タンパク質、黄蛍光タンパク質、青蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質など）などを用いることができる。
【００３０】
本発明の具体的な実施では、本発明の新規プロモータ核酸分子のＬ−リジン−誘導性をＬａｃＺ遺伝子の発現によるβ−ガラクトシダーゼの活性によって確認し、この過程でプラスミドベクターｐＬＣＰを製作した。本発明の具体的な実施において本発明のＬ−リジン−誘導性プロモータ核酸分子を含むベクターｐＬＣＰの場合、２５０ｍＭのＬ−リジン添加によって、Ｌ−リジンを添加していない場合と比較して２倍以上の高いβ−ガラクトシダーゼ活性を示した。
【００３１】
Ｌ−リジン−誘導性プロモータ核酸分子を含む本発明のベクターは、目的遺伝子を組み換え的に生産するために多様なタンパク質をコードする遺伝子と作動的に連結される。本発明のベクターを用いて発現させるのに有利な目的遺伝子としては、ａｓｄ、ｄａｐＡ、ｄａｐＣ、ｄａｐＦ、ｆｂｐ、ｌｙｓＣ、ｐｙｃなどがあり、必ずしもこれらに制限されるものではない。前記目的遺伝子のうち、特にａｓｄ、ｄａｐＡ、ｌｙｓＣ、ｐｙｃなどが好ましい。
【００３２】
別の様態として、本発明は、前述したベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
【００３３】
前述したようなＬ−リジン−誘導性プロモータ核酸分子を含むベクターは、目的タンパク質の発現を誘導するために目的タンパク質をコードする遺伝子と作動可能に連結され、このように製作されたベクターは、目的タンパク質の発現のために宿主細胞、例えば原核細胞、好ましくは大腸菌およびコリネ型細菌、より好ましくはコリネ型細菌に形質転換させる。
【００３４】
本願で使用された用語「形質転換」は、ＤＮＡを宿主に導入してＤＮＡが染色体外の因子としてまたは染色体統合完成によって複製可能になることを意味する。
【００３５】
前述したような形質転換された宿主細胞（形質転換体）の培養は、当分野の通常の方法によって実施できる。これらの公知の培養方法は、文献［Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)); and Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))］に記述されている。
【００３６】
別の様態として、本発明は、前述したＬ−リジン−誘導性プロモータ核酸分子を用いて、目的遺伝子の発現を誘導する方法に関する。
【００３７】
本発明の新規なＬ−リジン−誘導性プロモータ核酸分子は、発酵培地中のＬ−リジン添加によって、これに作動可能に連結された目的遺伝子の高発現を誘導することができ、目的タンパク質の大量生産に有用である。
【００３８】
以下、本発明について下記実施例によってさらに具体的に説明する。ところが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３９】
＜実施例１：コリネバクテリウムグルタミクムにおいてＬ−リジンによって発現が誘導されるタンパク質の探索及び同定＞
（１）Ｌ−リジンの添加によるコリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ １３０３２の菌体由来タンパク質の調製
コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ １３０３２を、Ｌ−リジンがそれぞれ０ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ含まれた条件で培養した後、遠心分離によって菌体をそれぞれ回収した。これらの菌体を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で３回洗浄して洗浄菌体を得た。
【００４０】
前記洗浄菌体を破砕緩衝液（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％ＣＨＡＰＳ（３−［（３−クロアミドプロピル）ジメチル−アンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、０．４％ジチオスレイトール）に懸濁して超音波破砕装置を用いて冷却しながら菌体を破砕した後、１５分間遠心分離（１２，０００×ｇ、４℃）を行った。得られた破砕液に７００ｕｎｉｔ／ｍＬとなるようにエンドヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）を添加し、１Ｘプロテアーゼ抑制剤混合物（Ｒｏｃｈｅ社製）を添加した。前記タンパク質試料のタンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄのタンパク質定量法によって求めた。
【００４１】
（２）２次元電気泳動法によるタンパク質の単離
前記で得られたタンパク質試料５００μｇを、最終体積が５００μＬとなるように溶解促進溶液（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％ＣＨＡＰＳ（３−［（３−クロアミドプロピル）ジメチル−アンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、０．４％ジチオスレイトール、１％ブロモフェノールブルー）を加えた後、１５分間遠心分離（２０，０００×ｇ、４℃）を行った。上澄み液のみを取って０．５％となるようにＩＰＧ(immobiline pH gradient)緩衝溶液（ｐＨ４．５〜５．５両性担体、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を添加した後、ＩＰＧ乾燥ストリップ(immobiline pH gradient dry strip)再水和(rehydration)トレイに入れ、１８ｃｍのｐＨ４．５〜５．５の線形ＩＰＧ乾燥ストリップを溶液上に載せ、１２時間再水和させた。
【００４２】
再水和されたストリップを、マルチポアII（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）電気泳動装置で９０ＫＶｈｒの電気をかけて等電点電気泳動した。
【００４３】
等電点電気泳動の後、ＩＰＧストリップを取得し、平衡緩衝液（０．２Ｍトリブチルホスフィン、６Ｍ尿素、２％ＳＤＳ、３７５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、２０％グリセロールおよび２．５％アクリルアミド）に入れて１５分間攪拌しなら平衡化した。
【００４４】
平衡化の後、ＩＰＧストリップは１Ｘ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ展開緩衝液（１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ、２４．８ｍＭトリズマベース）で軽く濯ぎ、その後下記のように２次元電気泳動した。
【００４５】
すなわち、電気泳動装置にセットした８〜１６％の濃度勾配を持つポリアクリルアミドゲル上に前記ＩＰＧストリップを密着した後、ゲル当たり１５ｍＡで１６時間電気泳動してタンパク質を単離した。
【００４６】
（３）発現量が増加したタンパク質スポットの検出
前記タンパク質の単離が行われたゲルは、ゲル当たり２５０ｍＬの３次蒸留水で洗浄した後、固定溶液（４０％メタノール、５％リン酸）に１時間浸漬し、クマシーブリリアントＧ−２５０(Commassie brilliant G-250)（Ｓｉｇｍａ社製）で５時間染色した。過度な染色は、脱色溶液（１％酢酸）を用いて１２時間脱色した。
【００４７】
Ｌ−リジンがそれぞれ０ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ添加された条件から得られた２次元ゲルをＰＤＱｕｅｓｔプログラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で比較分析することにより、発現の増加した５つのタンパク質スポットを確認し、その結果を図１に示した。
【００４８】
＜実施例２：Ｌ−リジンによって発現が誘導されるタンパク質の同定＞
（１）タンパク質スポットからのペプチドの単離
図１に示したタンパク質スポットをゲルから切り出してマイクロチューブに移し、１２０μＬの脱染色溶液（２５ｍＭ重炭酸アンモニウムｐＨ７．８、５０％アセトニトリル）を入れて１５分間軽く攪拌した後、脱染色溶液を除去する過程を３回繰り返してゲル片の染色を除去した。脱染色を済ませた後、ゲル片は完全に乾燥させた。乾燥したゲル片に８μＬのタンパク質消化溶液（２５ｍＭ重炭酸アンモニウムｐＨ７．８、０．０１５μｇ／μLトリプシン）を入れて３７℃で１６時間反応させ、ゲル内にあるタンパク質がトリプシンで分解されるようにした。反応を済ませた後、この試料に８μＬのペプチド抽出溶液（５０％アセトニトリルと０．５％トリフルオロ酢酸の混合液）を添加して１０分間超音波処理してゲルを破砕した。破砕させた後、遠心分離して抽出されたペプチドを含む上澄み液を得、凍結乾燥機で５μＬ程度となるように濃縮させた。
【００４９】
（２）質量分析法によるタンパク質の同定
濃縮された試料から１μＬを取り出し、１μＬのマトリックス溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸、０．５％トリフルオロ酢酸、５０％アセトニトリル）と混ぜて質量分光計のマトリックス補助レーザー脱着イオン化時間（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometer、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）用プレートに載せた後、乾燥させて結晶化した。結晶化されたペプチドの質量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで測定した。獲得したペプチド質量値をＭＳ−Ｆｉｔ(http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml3.4/msfit.htm)またはＰｒｏＦｏｕｎｄ(http://prowl.rockefeller.edu/cgi-bin/ProFound)プログラムに入力してＮＣＢＩ等のタンパク質データベースを検索することにより、タンパク質スポットを同定した。このような方法で同定されたスポットａはＣｇｌ１９１０、スポットｂはＣｇｌ２１３４、スポットｃはＣｇｌ２７５４、スポットｄはＣｇｌ２８１８、スポットｅはＣｇｌ３０２９であった。その結果は表１に示した。
【００５０】
【表１】
2008526197.tif 000003
【００５１】
＜実施例３：プロモータ配列を含有する組み換えベクターの製作＞
（１）予想プロモータ部位のＤＮＡ断片の増幅
コリネバクテリウムグルタミクムゲノム遺伝子の塩基配列は、解明されており且つ公開されている。米国国立保健院ＧｅｎＢａｎｋ(NIH GenBank)から、表１に示したタンパク質の遺伝子情報（Ｃｇｌ１９１０、Ｃｇｌ２１３４、Ｃｇｌ２７５４、Ｃｇｌ２８１８、およびＣｇｌ３０２９）を確保した。各タンパク質ＯＲＦの前部分に位置した予想プロモータ（配列番号１：Ｃｇｌ１９１０のプロモータ、配列番号２：Ｃｇｌ２１３４、配列番号３：Ｃｇｌ２７５４、配列番号４：Ｃｇｌ２８１８、配列番号５：Ｃｇｌ３０２９）を増幅するために、報告された塩基配列に基づいて、下記表２に記載の制限酵素ＢａｍＨI切断部位を含むプライマーを合成し、コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ １３０３２菌株の染色体ＤＮＡを鋳型として重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ法）[Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories]（ＰＣＲ条件：Denaturing＝９４℃、１分／Annealing＝５８℃、１分／Polymerization＝６８℃、３０秒、２５回）によって５種類の遺伝子を増幅して確保した。
【００５２】
【表２】
2008526197.tif 000004
【００５３】
（２）プロモータ活性探索ベクターの製作
各予想プロモータの活性を探索するための組み換えベクターの製作は、図２に示した。
【００５４】
前記実施例３−（１）で得られたＤＮＡ断片を、図２に示したように、ｌａｃＺ遺伝子を含んだｐＲＳ４１５(Simons, R.W., et al., Gene, 53, 85-96 (1987))の制限要素ＢａｍＨIの切断部位にそれぞれクローニングした。クローニングされた組み換えベクターから制限酵素ＨｉｎｄIIIとＸｂａIを用いて、導入された予想プロモータの前部分とｌａｃＺ遺伝子部位の後部分を切断して電気泳動した後、アガロースゲルを切断して回収用キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）で回収した。
【００５５】
回収されたＤＮＡ断片をそれぞれｐＸＭＪ１９ベクター(Jakoby, M.J., et al., Biotechniques, 13, 437-441 (1999))にクローニングし、最終的にプロモータ活性探索ベクターであるｐＬＣＰ−１９１０、ｐＬＣＰ−２１３４、ｐＬＣＰ−２７５４、ｐＬＣＰ−２８１８、およびｐＬＣＰ−３０２９を製作した。これにより、ｌａｃＺ遺伝子の活性を測定することにより、それぞれのプロモータの活性を決定することが可能なプロモータ活性探索ベクターの製作が完結した。
【００５６】
こうして得られた組み換えベクターをそれぞれｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔなどの方法(Appl. Microbiol. Biotechnol. 52, 541-545, (1999))で形質転換可能に作ったコリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ １３０３２に導入させた。形質転換された菌株を、クロラムフェニコール１７ｍｇ／ｍＬ含有ＬＢ寒天培地（酵母抽出物０．５％、ＮａＣｌ１％、トリプトン１％、寒天１．５％）に塗抹して３０℃で培養しながら成長する菌株を選別した。
【００５７】
＜実施例４：コリネバクテリウムにおけるプロモータ配列の活性測定＞
（１）２５０ｍＭリジン添加有無によるプロモータ配列の活性測定
獲得された形質転換菌株は、プロモータ配列の活性測定のために下記の方法で培養した。
【００５８】
２５０ｍＭのＬ−リジンをそれぞれ含有している、または含有していない最小培地［ブドウ糖５ｇ、硫酸アンモニウム５ｇ、尿素２ｇ、ＮａＣｌ０．５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4１ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．５ｇ、ビオチン２００μｇ、チアミン塩酸塩１００μｇ、Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ １ｍＬ（蒸留水１リットル基準）、ｐＨ７．２］２５ｍＬが含まれた２５０ｍＬのコーナー−バッフルフラスコに、形質転換されたコリネバクテリウムグルタミクム菌株を２０分の１の割合でそれぞれ接種し、３０℃で培養中期（吸光度＝５）まで振とう培養（２００ｒｐｍ）した。培養終了の後、遠心分離によって菌体を回収して１００ｍＭの燐酸カリウムバッファ（ｐＨ７．０）に懸濁した後、超音波破砕法で細胞を破壊し、さらに高速遠心分離して上澄み液を得た。前記の方法で得られた上澄み液から２μＬずつを取り出してＲｅｓｅｎｔｈａｌの方法(Rosenthal, N., Methods Enzymol. 152, 704-720 (1987))によってβ−ガラクトシターゼの活性を測定した。その結果として、リジンが添加されていない条件で培養したときより、リジンが添加されている条件で培養したとき、β−ガラクトシダーゼの活性がＣｇｌ１９１０の場合には２．１倍、Ｃｇｌ２１３４の場合には２．１倍、Ｃｇｌ２７５４の場合には２．０倍、Ｃｇｌ２８１８の場合には３．４倍、Ｃｇｌ３０２９の場合には２．７倍と高かった（表３）。この結果より、各プロモータはリジン添加によってβ−ガラクトシダーゼの発現を誘導していることを確認した。
【００５９】
【表３】
2008526197.tif 000005
【００６０】
（２）２５０ｍＭ ＮａＣｌの添加有無によるプロモータ配列の活性の測定
リジンの代わりにＮａＣｌを使用する以外は実施例４−（１）の方法と同一の方法で培養した後、各プロモータの活性を測定した。表４に示したように、２５０ｍＭ ＮａＣｌの添加有無とは関係なくβ−ガラクトシダーゼの活性が類似であった。その結果は、リジン以外の因子による誘導発現可能性を排除することにより、各プロモータはリジンに特異的に反応して発現を誘導することを立証する。
【００６１】
【表４】
2008526197.tif 000006
【００６２】
〔産業上の利用可能性〕
本発明によってＬ−リジンに特異的に反応して発現を誘導するプロモータ核酸配列を提供することにより、目的タンパク質の遺伝子を高発現させる高力価菌株の開発に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】２次元電気泳動法によって、リジン添加に応じて発現量が変化するタンパク質を比較したゲル写真である。
【図２】図２はプロモータ探索ベクターの製作方法を示す模式図である。
【図１】
2008526197.tif 000007
【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2008526197.tif 000009
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