(57)【要約】  本発明は、生存細胞、組織および生物体中の転写および翻訳のリアルタイム検出のための組成物、方法およびキットを包含する。本発明はさらに、慣習的配列決定技術若しくは反応を使用することを伴わない核酸の迅速な配列決定方法を提供する。
2008545394.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出体分子、および検出体分子に特異的に結合する検出体結合ドメインを含んでなるキメラＲＮＡポリメラーゼ分子と細胞を接触させることを含んでなる、ＤＮＡ分子の転写の検出方法であって；
該検出体分子が
ａ）該検出体結合ドメインに結合することが可能なキメラＲＮＡポリメラーゼ結合ドメイン（ＣＲＰＢＤ）、
ｂ）ＲＮＡ分子の一部分に相補的なペプチド核酸（ＰＮＡ）；および
ｃ）シグナリング部分
を含んでなり、
かつ、該キメラＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡを転写して新生ＲＮＡ分子を産生する場合に、該ＰＮＡが新生ＲＮＡ分子に結合し、そしてシグナルが検出体分子により発せられてそれによりＤＮＡ分子の転写を検出する、上記方法。
【請求項２】
検出体分子が細胞透過性ペプチドをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
検出体結合ドメインが、ＳＨ３ドメインおよびロイシンジッパーよりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＣＲＰＢＤが、α−ＰＡＫドメインおよびロイシンジッパーよりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細胞透過性ペプチドが、トランスポータンペプチド（ＴＰ）、ＴＰ１０ペプチド、ｐＶＥＣペプチド、ペネトラチンペプチド、ｔａｔフラグメントペプチド、シグナル配列をベースとするペプチドおよび両親媒性モデルペプチドよりなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
シグナリング部分が蛍光分子を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
蛍光分子が、ＲｅＡｓＨ、ビス−（（Ｎ−ヨードアセチル）ピペラジニル）スルホンローダミン（ＢＳＲ）、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）およびフルオレセインよりなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＰＮＡが、新生ＲＮＡ分子の二ヌクレオチド若しくは三ヌクレオチドに相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＰＮＡが新生ＲＮＡ分子の三ヌクレオチドに相補的である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
三ヌクレオチドが核酸配列ＣＡＣを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
キメラＲＮＡポリメラーゼがキメラＲＮＡポリメラーゼＩＩである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
キメラＲＮＡポリメラーゼがキメラＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
シグナルが、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）シグナル若しくは極性変化シグナルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
新生ＲＮＡ分子が細胞中にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
細胞が真核生物細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
細胞が動物中にある、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
動物が哺乳動物である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
細胞が生物学的サンプルである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
ａ）検出体結合ドメインを含んでなるキメラＲＮＡポリメラーゼ；ならびに
ｂ）シグナリング部分を含んでなる検出体分子、ＲＮＡ分子の一部分に相補的なＰＮＡ、および検出体結合ドメインに結合することが可能なＣＲＰＢＤ
を含んでなり、
ＣＲＰＢＤはキメラＲＮＡポリメラーゼの検出体結合ドメインに特異的に結合する、
単離されたヌクレオペプチドコンジュゲート複合体。
【請求項２０】
検出体結合ドメインが、ＳＨ３ドメインおよびロイシンジッパーよりなる群から選択される、請求項１９に記載のヌクレオペプチドコンジュゲート複合体。
【請求項２１】
ＣＲＰＢＤが、α−ＰＡＫドメインおよびロイシンジッパーよりなる群から選択される、請求項１９に記載のヌクレオペプチドコンジュゲート複合体。
【請求項２２】
シグナリング部分が蛍光分子を含んでなる、請求項１９に記載のヌクレオペプチドコンジュゲート複合体。
【請求項２３】
蛍光分子が、ＲｅＡｓＨ、ビス−（（Ｎ−ヨードアセチル）ピペラジニル）スルホンローダミン（ＢＳＲ）、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５、ＴＡＭＲＡおよびフルオレセインよりなる群から選択される、請求項２２に記載のヌクレオペプチドコンジュゲート複合体。
【請求項２４】
ＰＮＡがＲＮＡ分子の二ヌクレオチド若しくは三ヌクレオチドに相補的である、請求項１９に記載のヌクレオペプチドコンジュゲート複合体。
【請求項２５】
ＰＮＡがＲＮＡ分子の三ヌクレオチドに相補的である、請求項２４に記載のヌクレオペプチドコンジュゲート複合体。
【請求項２６】
三ヌクレオチドがＣＡＣの核酸配列を有する、請求項２５に記載のヌクレオチペプチドコンジュゲート複合体。
【請求項２７】
複合体が細胞透過性ペプチドをさらに含んでなる、請求項１９に記載のヌクレオチペプチドコンジュゲート複合体。
【請求項２８】
細胞透過性ペプチドが、トランスポータンペプチド（ＴＰ）、ＴＰ１０ペプチド、ｐＶＥＣペプチド、ペネトラチンペプチド、ｔａｔフラグメントペプチド、シグナル配列をベースとするペプチドおよび両親媒性モデルペプチドよりなる群から選択される、請求項２７に記載のヌクレオチペプチドコンジュゲート複合体。
【請求項２９】
キメラＲＮＡポリメラーゼがキメラＲＮＡポリメラーゼＩＩである、請求項１９に記載のヌクレオチペプチドコンジュゲート複合体。
【請求項３０】
キメラＲＮＡポリメラーゼがキメラＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１９に記載のヌクレオペプチドコンジュゲート複合体。
【請求項３１】
キメラＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡポリメラーゼおよび検出体結合ドメインを含んでなる、キメラＲＮＡポリメラーゼをコードする単離された核酸。
【請求項３２】
配列番号１および配列番号２を含んでなり、かつ、配列番号１が、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４よりなる群から選択される配列を有する単離された核酸により配列番号２から分離されている、キメラＲＮＡポリメラーゼをコードする単離された核酸。
【請求項３３】
配列番号１が配列番号２に共有結合している、請求項３２に記載の単離された核酸。
【請求項３４】
共有結合した標識ポリペプチドをコードする核酸をさらに含んでなる、請求項３１に記載の単離された核酸。
【請求項３５】
コードされているキメラＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列が配列番号３および配列番号４を含んでなり、かつ、配列番号３が、０から４個までのプロリンを有するペプチドにより配列番号４から分離されている、キメラＲＮＡポリメラーゼをコードする単離された核酸。
【請求項３６】
標識ポリペプチドが、ｍｙｃ標識ポリペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ標識ポリペプチド、緑色蛍光タンパク質標識ポリペプチド、ｍｙｃ−ピルビン酸キナーゼ標識ポリペプチド、Ｈｉｓ６標識ポリペプチド、インフルエンザウイルスヘマグルチニン標識ポリペプチド、ｆｌａｇ標識ポリペプチドおよびマルトース結合タンパク質標識ポリペプチドよりなる群から選択される、請求項３４に記載の単離された核酸。
【請求項３７】
作動可能に連結されたプロモーター／制御配列を指定する核酸をさらに含んでなる、請求項３１に記載の単離された核酸。
【請求項３８】
請求項３１、３２若しくは３５のいずれか１つに記載の単離された核酸を含んでなるベクター。
【請求項３９】
作動可能に連結されたプロモーター／制御配列を指定する核酸をさらに含んでなる、請求項３８に記載のベクター。
【請求項４０】
請求項３１に記載の単離された核酸を含んでなる組換え細胞。
【請求項４１】
請求項３１、３２、３３、３４、３５、３６若しくは３７のいずれか１つに記載の単離された核酸を含んでなる組換え細胞。
【請求項４２】
請求項３７に記載のベクターを含んでなる組換え細胞。
【請求項４３】
細胞が真核生物細胞若しくは原核生物細胞である、請求項４２に記載の組換え細胞。
【請求項４４】
キメラＲＮＡポリメラーゼがキメラＲＮＡポリメラーゼＩＩである、請求項３１に記載の単離された核酸。
【請求項４５】
キメラＲＮＡポリメラーゼがＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項３１に記載の単離された核酸。
【請求項４６】
キメラＲＮＡポリメラーゼを含んでなる単離されたポリペプチド。
【請求項４７】
キメラＲＮＡポリメラーゼが配列番号３および配列番号４を含んでなり、配列番号３が、０から４個までのプロリンを有するポリペプチドにより配列番号４から分離されている、キメラＲＮＡポリメラーゼを含んでなる単離されたポリペプチド。
【請求項４８】
請求項４６に記載の単離されたポリペプチドを特異的に結合する抗体。
【請求項４９】
ＣＲＰＢＤ、ＰＮＡおよびシグナリング部分を含んでなる単離された検出体分子。
【請求項５０】
ＣＲＰＢＤが検出体結合ドメインに結合することが可能である、請求項４９に記載の検出体分子。
【請求項５１】
ＣＲＰＢＤが配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する７５％同一性を有する、請求項５０に記載の検出体分子。
【請求項５２】
ＰＮＡが二ヌクレオチド若しくは三ヌクレオチドに相補的である、請求項４９に記載の検出体分子。
【請求項５３】
ＰＮＡが三ヌクレオチドに相補的である、請求項５２に記載の検出体分子。
【請求項５４】
三ヌクレオチドが核酸配列ＣＡＣを有する、請求項５３に記載の検出体分子。
【請求項５５】
シグナリング部分が蛍光分子を含んでなる、請求項４９に記載の検出体分子。
【請求項５６】
蛍光分子が、ＲｅＡｓＨ、ビス−（（Ｎ−ヨードアセチル）ピペラジニル）スルホンローダミン（ＢＳＲ）、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５、ＴＡＭＲＡおよびフルオレセインよりなる群から選択される、請求項５５に記載の検出体分子。
【請求項５７】
細胞透過性ペプチドをさらに含んでなる、請求項４９に記載の検出体分子。
【請求項５８】
細胞透過性ペプチドが、ＴＰペプチド、ＴＰ１０ペプチド、ｐＶＥＣペプチド、ペネトラチンペプチド、ｔａｔフラグメントペプチド、シグナル配列をベースとするペプチド、トランスポータンペプチドおよび両親媒性モデルペプチドよりなる群から選択される、請求項５７に記載の検出体分子。
【請求項５９】
請求項４９に記載の検出体分子を特異的に結合する抗体。
【請求項６０】
キメラＲＮＡポリメラーゼ、検出体分子、およびその使用のための取扱説明書を含んでなる、ＲＮＡ分子の転写を検出するためのキット。
【請求項６１】
検出体分子が細胞透過性ペプチドをさらに含んでなる、請求項６０に記載のキット。
【請求項６２】
キメラＲＮＡポリメラーゼが、ＳＨ３ドメインおよびロイシンジッパーよりなる群から選択される検出体結合ドメインを含んでなる、請求項６０に記載のキット。
【請求項６３】
検出体分子が、検出体結合ドメインに結合することが可能なＣＲＰＢＤを含んでなるがα−ＰＡＫドメインおよびロイシンジッパーよりなる群から選択される、請求項６０に記載のキット。
【請求項６４】
細胞透過性ペプチドが、トランスポータンペプチド（ＴＰ）、ＴＰ１０ペプチド、ｐＶＥＣペプチド、ペネトラチンペプチド、ｔａｔフラグメントペプチド、シグナル配列をベースとするペプチドおよび両親媒性モデルペプチドよりなる群から選択される、請求項６１に記載のキット。
【請求項６５】
検出体分子がシグナリング部分を含んでなる、請求項６０に記載のキット。
【請求項６６】
シグナリング部分が蛍光分子を含んでなる、請求項６５に記載のキット。
【請求項６７】
蛍光分子が、ＲｅＡｓＨ、ビス−（（Ｎ−ヨードアセチル）ピペラジニル）スルホンローダミン（ＢＳＲ）、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５、ＴＡＭＲＡおよびフルオレセインよりなる群から選択される、請求項６６に記載のキット。
【請求項６８】
検出体分子が、ＲＮＡ分子の一部分に相補的なＰＮＡを含んでなる、請求項６０に記載のキット。
【請求項６９】
ＰＮＡが、ＲＮＡ分子の二ヌクレオチド若しくは三ヌクレオチドに相補的である、請求項６８に記載のキット。
【請求項７０】
ＰＮＡが三ヌクレオチドに相補的である、請求項６９に記載のキット。
【請求項７１】
三ヌクレオチドが核酸配列ＣＡＣを有する、請求項７０に記載のキット。
【請求項７２】
キメラＲＮＡポリメラーゼがキメラＲＮＡポリメラーゼＩＩである、請求項６０に記載のキット。
【請求項７３】
キメラＲＮＡポリメラーゼがキメラＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項６０に記載のキット。
【請求項７４】
キメラＲＮＡポリメラーゼをコードする単離された核酸、検出体分子、およびその使用のための取扱説明書を含んでなる、ＲＮＡ分子の転写を検出するためのキット。
【請求項７５】
検出体分子が細胞透過性ペプチドをさらに含んでなる、請求項７４に記載のキット。
【請求項７６】
単離された核酸が、配列番号１に示される核酸配列を含んでなる、請求項７４に記載のキット。
【請求項７７】
検出体分子が、α−ＰＡＫドメインおよびロイシンジッパーよりなる群から選択される検出体結合ドメインに結合することが可能なＣＲＰＢＤを含んでなる、請求項７６に記載のキット。
【請求項７８】
細胞透過性ペプチドが、トランスポータンペプチド（ＴＰ）、ＴＰ１０ペプチド、ｐＶＥＣペプチド、ペネトラチンペプチド、ｔａｔフラグメントペプチド、シグナル配列をベースとするペプチドおよび両親媒性モデルペプチドよりなる群から選択される、請求項７５に記載のキット。
【請求項７９】
検出体分子がシグナリング部分を含んでなる、請求項７４に記載のキット。
【請求項８０】
シグナリング部分が蛍光分子を含んでなる、請求項７９に記載のキット。
【請求項８１】
蛍光分子が、ＲｅＡｓＨ、ビス−（（Ｎ−ヨードアセチル）ピペラジニル）スルホンローダミン（ＢＳＲ）、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５、ＴＡＭＲＡおよびフルオレセインよりなる群から選択される、請求項８０に記載のキット。
【請求項８２】
検出体分子が、ＲＮＡ分子の一部分に相補的なＰＮＡを含んでなる、請求項７４に記載のキット。
【請求項８３】
ＰＮＡがＲＮＡ分子の二ヌクレオチド若しくは三ヌクレオチドに相補的である、請求項８２に記載のキット。
【請求項８４】
ＰＮＡが三ヌクレオチドに相補的である、請求項８３に記載のキット。
【請求項８５】
三ヌクレオチドが核酸配列ＣＡＣを有する、請求項８４に記載のキット。
【請求項８６】
キメラＲＮＡポリメラーゼがキメラＲＮＡポリメラーゼＩＩである、請求項７４に記載のキット。
【請求項８７】
キメラＲＮＡポリメラーゼがキメラＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項７４に記載のキット。
【請求項８８】
単離されたＤＮＡ分子をプロモーター／制御配列に連結して、連結されたＤＮＡ分子を形成すること、ならびに
該連結されたＤＮＡ分子を、検出体分子に結合されたキメラＲＮＡポリメラーゼと接触させることであって、該キメラＲＮＡポリメラーゼは検出体結合ドメインを含んでなり、かつ、該検出体分子は
ａ）検出体結合ドメインに結合することが可能なＣＲＰＢＤ、
ｂ）連結されたＤＮＡ分子の一部分に相補的なＰＮＡ、および；
ｃ）シグナリング部分
を含んでなり、
キメラＲＮＡポリメラーゼが該連結されたＤＮＡ分子をｍＲＮＡ分子に転写する場合に、ＰＮＡがｍＲＮＡ分子に結合し、そしてシグナルが検出体分子により発せられてそれによりＤＮＡ分子を配列決定する、
を含んでなる、単離されたＤＮＡ分子の配列決定方法。
【請求項８９】
単離されたＤＮＡ分子が二本鎖ｃＤＮＡを含んでなる、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
プロモーター／制御配列がＴ７プロモーターである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
検出体結合ドメインが、ＳＨ３ドメインおよびロイシンジッパーよりなる群から選択される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９２】
ＣＲＰＢＤが、α−ＰＡＫドメインおよびロイシンジッパーよりなる群から選択される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９３】
シグナリング部分が蛍光分子を含んでなる、請求項８８に記載の方法。
【請求項９４】
蛍光分子が、ＲｅＡｓＨ、ビス−（（Ｎ−ヨードアセチル）ピペラジニル）スルホンローダミン（ＢＳＲ）、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５、ＴＡＭＲＡおよびフルオレセインよりなる群から選択される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
ＰＮＡが、連結されたＤＮＡ分子の二ヌクレオチド若しくは三ヌクレオチド部分に相補的である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９６】
ＰＮＡが、連結されたＤＮＡ分子の三ヌクレオチド部分に相補的である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
キメラＲＮＡポリメラーゼがキメラＲＮＡポリメラーゼＩＩである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９８】
キメラＲＮＡポリメラーゼがキメラＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９９】
シグナルが、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）シグナル若しくは極性変化シグナルである、請求項８８に記載の方法。
【請求項１００】
三ヌクレオチドが核酸配列ＧＴＧを有する、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０１】
プロモーター／制御配列が支持体に結合されている、請求項８８に記載の方法。
【請求項１０２】
該方法が最低１回反復され、かつ、各反復における検出体分子が、連結されたＤＮＡ分子の異なる一部分に相補的である異なるＰＮＡを含んでなる、請求項８８ないし９９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０３】
検出体分子、および該検出体分子に特異的に結合する検出体結合ドメインを含んでなるキメラリボソームサブユニットを有するキメラリボソーム分子と細胞を接触させることを含んでなり、該検出体分子が、
ａ）検出体結合ドメインに結合することが可能なキメラリボソーム結合ドメイン（ＣＲＢＤ）、
ｂ）ＲＮＡ分子の一部分に相補的なＰＮＡ；および
ｃ）シグナル伝達分子
を含んでなり、
該キメラリボソーム分子がＲＮＡ分子を翻訳する場合に、ＰＮＡが、キメラリボソームのＲＮＡ出口孔を出るＲＮＡ分子に結合し、そしてシグナルが検出体分子により発せられてそれによりＲＮＡ分子の翻訳を検出する、
ＲＮＡ分子の翻訳の検出方法。
【請求項１０４】
検出体分子が細胞透過性ペプチドをさらに含んでなる、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
検出体結合ドメインが、ＳＨ３ドメインおよびロイシンジッパーよりなる群から選択される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
ＣＲＢＤが、α−ＰＡＫドメインおよびロイシンジッパーよりなる群から選択される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０７】
細胞透過性ペプチドが、トランスポータンペプチド（ＴＰ）、ＴＰ１０ペプチド、ｐＶＥＣペプチド、ペネトラチンペプチド、ｔａｔフラグメントペプチド、シグナル配列をベースとするペプチドおよび両親媒性モデルペプチドよりなる群から選択される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０８】
シグナリング部分が蛍光分子を含んでなる、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０９】
蛍光分子が、ＲｅＡｓＨ、ビス−（（Ｎ−ヨードアセチル）ピペラジニル）スルホンローダミン（ＢＳＲ）、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５、ＴＡＭＲＡおよびフルオレセインよりなる群から選択される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
ＰＮＡがＲＮＡ分子の二ヌクレオチド若しくは三ヌクレオチド部分に相補的である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１１１】
ＰＮＡがＲＮＡ分子の三ヌクレオチド部分に相補的である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
三ヌクレオチドが核酸配列ＣＡＣを有する、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
キメラリボソーム分子がキメラの原核生物リボソーム分子である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１１４】
キメラリボソームサブユニットがキメラ５０ｓサブユニットである、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１１５】
シグナルが、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）シグナル若しくは極性変化シグナルである、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１１６】
ＲＮＡ分子が細胞中にある、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１１７】
細胞が真核生物細胞である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
細胞が動物中にある、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１９】
動物が哺乳動物である、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
細胞が生物学的サンプルである、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２１】
キメラリボソームサブユニット成分をコードする単離された核酸であって、該キメラリボソームサブユニット成分が検出体結合ドメインを含んでなる、上記核酸。
【請求項１２２】
キメラリボソームサブユニット成分をコードする単離された核酸であって、該単離された核酸が配列番号６および配列番号２を含んでなり、配列番号６が、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４よりなる群から選択される配列を有する単離された核酸により配列番号２から分離されている、上記核酸。
【請求項１２３】
配列番号６が配列番号２に共有結合されている、請求項１２２に記載の単離された核酸。
【請求項１２４】
共有結合された標識ポリペプチドをコードする核酸をさらに含んでなる、請求項１２１に記載の単離された核酸。
【請求項１２５】
キメラリボソームサブユニット成分をコードする単離された核酸であって、該キメラリボソームサブユニット成分のアミノ酸配列が、配列番号７および配列番号４に示されるアミノ酸配列を含んでなり、配列番号７が０から４個までのプロリンを有するペプチドによ
り配列番号４から分離されている、上記核酸。
【請求項１２６】
標識ポリペプチドが、ｍｙｃ標識ポリペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ標識ポリペプチド、緑色蛍光タンパク質標識ポリペプチド、ｍｙｃ−ピルビン酸キナーゼ標識ポリペプチド、Ｈｉｓ６標識ポリペプチド、インフルエンザウイルスヘマグルチニン標識ポリペプチド、ｆｌａｇ標識ポリペプチドおよびマルトース結合タンパク質標識ポリペプチドよりなる群から選択される、請求項１２４に記載の単離された核酸。
【請求項１２７】
作動可能に連結されたプロモーター／制御配列を指定する核酸をさらに含んでなる、請求項１２１に記載の単離された核酸。
【請求項１２８】
請求項１２１、１２２若しくは１２５のいずれか１つに記載の単離された核酸を含んでなるベクター。
【請求項１２９】
作動可能に連結されたプロモーター／制御配列を指定する核酸をさらに含んでなる、請求項１２８に記載のベクター。
【請求項１３０】
請求項１２１に記載の単離された核酸を含んでなる組換え細胞。
【請求項１３１】
請求項１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６若しくは１２７のいずれか１つに記載の単離された核酸を含んでなる組換え細胞。
【請求項１３２】
請求項１２８に記載のベクターを含んでなる組換え細胞。
【請求項１３３】
細胞が真核生物細胞若しくは原核生物細胞である、請求項１３２に記載の組換え細胞。
【請求項１３４】
キメラリボソームサブユニット成分がキメラの原核生物リボソームサブユニットである、請求項１２１に記載の単離された核酸。
【請求項１３５】
キメラの原核生物リボソームサブユニットが５０ｓサブユニットの一成分である、請求項１３４に記載の単離された核酸。
【請求項１３６】
キメラリボソームサブユニット成分を含んでなる単離されたポリペプチド。
【請求項１３７】
キメラリボソームサブユニット成分を含んでなる単離されたポリペプチドであって、該キメラリボソームサブユニット成分が配列番号７および配列番号４に示されるアミノ酸配列を含んでなり、配列番号７は０から４個までのプロリンを有するポリペプチドにより配列番号４から分離されている、上記ポリペプチド。
【請求項１３８】
請求項１３６に記載の単離されたポリペプチドを特異的に結合する抗体。
【請求項１３９】
検出体分子、および核酸分子を転写するキメラ酵素と細胞を接触させることであって、該キメラ酵素は該検出体分子を特異的に結合する検出体結合ドメインを含んでなり、該検出体分子は：
ａ）該検出体結合ドメインに結合することが可能なキメラ酵素結合ドメイン（ＣＥＢＤ）、
ｂ）核酸分子の一部分に相補的なＰＮＡ；および
ｃ）シグナリング部分
を含んでなり、
かつ、該キメラ酵素が核酸を転写する場合に、ＰＮＡが、該酵素から発生する新生核酸分
子に結合し、そしてシグナルが検出体分子により発せられ、ならびに
該シグナルを検出してそれにより核酸分子の転写を検出すること
を含んでなる、核酸分子の転写の検出方法。
【請求項１４０】
検出体分子が細胞透過性ペプチドをさらに含んでなる、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
検出体結合ドメインが、ＳＨ３ドメインおよびロイシンジッパーよりなる群から選択される、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４２】
ＣＥＢＤが、α−ＰＡＫドメインおよびロイシンジッパーよりなる群から選択される、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４３】
細胞透過性ペプチドが、トランスポータンペプチド（ＴＰ）、ＴＰ１０ペプチド、ｐＶＥＣペプチド、ペネトラチンペプチド、ｔａｔフラグメントペプチド、シグナル配列をベースとするペプチドおよび両親媒性モデルペプチドよりなる群から選択される、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４４】
シグナリング部分が蛍光分子を含んでなる、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４５】
蛍光分子が、ＲｅＡｓＨ、ビス−（（Ｎ−ヨードアセチル）ピペラジニル）スルホンローダミン（ＢＳＲ）、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５、ＴＡＭＲＡおよびフルオレセインよりなる群から選択される、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
ＰＮＡが核酸分子の二ヌクレオチド若しくは三ヌクレオチド部分に相補的である、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４７】
ＰＮＡが核酸分子の三ヌクレオチド部分に相補的である、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
該三ヌクレオチドが核酸配列ＣＡＣを有する、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１４９】
核酸分子を転写するキメラ酵素がキメラＲＮＡポリメラーゼＩＩである、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１５０】
キメラＲＮＡポリメラーゼがキメラＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
シグナルが、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）シグナル若しくは極性変化シグナルである、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１５２】
核酸分子が細胞中にある、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１５３】
細胞が真核生物細胞である、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
細胞が動物中にある、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５５】
動物が哺乳動物である、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
細胞が生物学的サンプルである、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５７】
検出体分子、および核酸分子を翻訳するキメラ酵素と細胞を接触させることであって、
該キメラ酵素は検出体分子を特異的に結合する検出体結合ドメインを含んでなり、該検出体分子は；
ａ）検出体結合ドメインに結合することが可能なキメラ酵素結合ドメイン（ＣＥＢＤ）、ｂ）核酸分子の一部分に相補的なＰＮＡ；および
ｃ）シグナリング部分
を含んでなり、
かつ、該キメラ酵素が核酸を転写する場合、ＰＮＡがキメラ酵素から発生するＲＮＡ分子に結合し、そしてシグナルが検出体分子により発せられ、ならびに
該シグナルを検出してそれにより核酸分子の翻訳を検出すること
を含んでなる、核酸分子の翻訳の検出方法。
【請求項１５８】
検出体分子が細胞透過性ペプチドをさらに含んでなる、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
検出体結合ドメインが、ＳＨ３ドメインおよびロイシンジッパーよりなる群から選択される、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６０】
ＣＥＢＤが、α−ＰＡＫドメインおよびロイシンジッパーよりなる群から選択される、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６１】
細胞透過性ペプチドが、トランスポータンペプチド（ＴＰ）、ＴＰ１０ペプチド、ｐＶＥＣペプチド、ペネトラチンペプチド、ｔａｔフラグメントペプチド、シグナル配列をベースとするペプチドおよび両親媒性モデルペプチドよりなる群から選択される、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６２】
シグナリング部分が蛍光分子を含んでなる、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６３】
蛍光分子が、ＲｅＡｓＨ、ビス−（（Ｎ−ヨードアセチル）ピペラジニル）スルホンローダミン（ＢＳＲ）、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５、ＴＡＭＲＡおよびフルオレセインよりなる群から選択される、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６４】
ＰＮＡが、ＲＮＡ分子の二ヌクレオチド若しくは三ヌクレオチド部分に相補的である、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６５】
ＰＮＡがＲＮＡ分子の三ヌクレオチド部分に相補的である、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
三ヌクレオチドが核酸配列ＣＡＣを有する、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６７】
キメラ酵素がキメラリボソームである、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６８】
キメラリボソームがキメラの原核生物リボソームである、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１６９】
シグナルが、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）シグナル若しくは極性変化シグナルである、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１７０】
核酸が細胞中にある、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１７１】
細胞が真核生物細胞である、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
細胞が動物中にある、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７３】
動物が哺乳動物である、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７４】
細胞が生物学的サンプルである、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７５】
検出体分子、および核酸分子を転写するキメラ酵素と細胞を接触させることであって、該キメラ酵素は該検出体分子を特異的に結合する検出体結合ドメインを含んでなり、該検出体分子は：
ａ）検出体結合ドメインに結合することが可能なキメラ酵素結合ドメイン（ＣＥＢＤ）、ｂ）核酸分子の一部分に相補的なＰＮＡ；および
ｃ）シグナリング部分
を含んでなり、
かつ、キメラ酵素が核酸を転写する場合、ＰＮＡは該酵素から発生する新生核酸分子に結合し、そしてシグナルが検出体分子により発せられ、
該シグナルを検出すること、ならびに
検出されたシグナルを特定の配列と関連するシグナルのライブラリーに適合させるための拘束局所動的時間伸縮アルゴリズム（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ｌｏｃａｌ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｔｉｍｅ  ｗａｒｐ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を使用して、転写された核酸分子を同定し、それにより転写される核酸を同定すること
を含んでなる、転写される核酸の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ヒトおよび病原性微生物を包含する多彩かつ重要な生物体からの増大する数のゲノムが配列決定されたか若しくは配列決定されつつある。各新たなゲノム配列の核酸配列が解明される際に、各遺伝子の発現プロファイルおよび機能の決定方法に対する必要性はかつてないほど緊急になっている。
【０００２】
転写機構は酵母からヒトまでの範囲にわたる多様な種の間で大部分は保存されており、そして転写過程の基礎的性質を反映する。事実、転写過程に関与することが既知の１００を超えるタンパク質の良好な配列の保存が存在する。ｍＲＮＡを合成するタンパク質はＲＮＡポリメラーゼＩＩとして知られている。ＲＮＡポリメラーゼＩＩは複数のサブユニットから構成される大型タンパク質複合体である、このタンパク質はあるＤＮＡ配列（該ＤＮＡ配列の直鎖状配置および転写の開始へのその近接によりＴＡＴＡボックスとして知られる）に結合する。しかしながら、ＲＮＡポリメラーゼＩＩは、転写因子ＴＦＩＩＤ、ＴＦＩＩＡおよび他者を包含する数種の他のタンパク質のこのＤＮＡ領域との事前の会合を伴わずにＴＡＴＡボックスに結合しない。これらのタンパク質は相互と相互作用して、ＲＮＡポリメラーゼＩＩが結合し得る複合体を形成する。ＴＡＴＡボックスでのタンパク質相互作用のこの足場構造が転写装置を形成する。この基礎的転写複合体は生物体の全細胞中の全遺伝子について非常に類似であるが、それでもなお、選択された遺伝子の転写は、異なる細胞型でオン若しくはオフされ、ならびに差別的に調節されて、異なる量のｍＲＮＡを生じ得ることが明らかである。
【０００３】
転写調節のこの過程は多面的であり、そして転写複合体との特定の配置の数種の付加的なタンパク質の会合を必要とする。転写因子ともまた呼ばれる転写アクセサリータンパク質の配置および同一性は、個々の遺伝子に独特であり得る。
【０００４】
２つの方法が遺伝子の機能を決定するのに主に使用されている。配列のアプローチは、核酸結合ドメインのような構造要素をコードする配列モチーフを同定し、それらの構造要素はこれらのモチーフを有する遺伝子の機能を仮定するのに使用し得る。この方法の欠点は、モチーフの機能の事前に知識なしには配列のアプローチが有用でないことである。従って、新たな遺伝子が発見されるがしかし既知のモチーフを含有しない場合、配列のアプローチはその遺伝子の機能に関していかなる手掛かりも提供することに失敗する。
【０００５】
第二の方法は特定の一遺伝子の発現のパターンを探求する。発現のパターンは、その遺伝子の発現が、該発現に影響を及ぼした刺激と比較される場合に、該遺伝子の機能を解明し得る。蓄積された発現データがその後、該遺伝子およびそれがコードするポリペプチドの機能に関する洞察を提供し得る。
【０００６】
ノーザンブロット（非特許文献１）、ディファレンシャルディスプレイ（非特許文献２）、Ｓ１ヌクレアーゼ保護（非特許文献３）、ｃＤＮＡライブラリーを配列決定すること（非特許文献４；非特許文献５）、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）（非特許文献６）、ｃＤＮＡアレイおよびオリゴヌクレオチドアレイ（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）のような、遺伝子発現レベルを検出かつ定量するための多数の方法が考案された。これらの多様な遺伝子発現分析方法の間の共通の主題は、相補核酸の高度に感受性かつ高度に特異的な相互作用である。大部分の遺伝子発現の応用は、単一の標識オリゴヌクレオチドおよび細胞若しくは組織由来ＲＮＡ種の混合物を使用する。標識プローブと未知の標的ＲＮＡの間の核酸ハイブリダイゼーションの精巧な選択性は、標的の各プール中の特定の一ＲＮＡの豊富さに関する情報を提供する。これらから遺伝子発現データを得ることができる。
【０００７】
ｃＤＮＡマイクロアレイはこれらの方法を上回る大きな改良を表す。マイクロアレイは、ＲＮＡ転写物由来の多くの遺伝子特異的ポリヌクレオチドが支持体上に固定されかつその後試験細胞若しくは組織の全ＲＮＡプール由来のなおより多数の蛍光若しくは放射標識ｃＤＮＡに曝露されるために、特異的ヌクレオチド−ヌクレオチド相互作用が大スケールで起こることを可能にするからである。固定されたプローブと標識した標的の間のハイブリダイゼーションにより生成されるシグナルは、マイクロアレイ上およびｃＤＮＡプール中に存在する転写物の相対量の決定を可能にし、そして、細胞若しくは組織に対する刺激の影響の結果が、試験細胞若しくは組織と対照細胞若しくは組織の間の比較により決定される。
【０００８】
遺伝子発現の分析方法、およびとりわけマイクロアレイは、遺伝子機能の分析で強力なツールであることが判明した。同一始原細胞由来の２種の相違する組織間の遺伝子発現の相違、細胞若しくは組織に対する毒性化学物質の影響、健康な組織と疾患により苦しめられている組織の間の遺伝子発現の差違、腫瘍原性の分子的基礎、酵母での嫌気性呼吸から好気性呼吸への代謝シフト、ならびに同一種の非病原性および病原性株の間の毒性の基礎は、全部、とりわけ遺伝子発現分析およびマイクロアレイを使用して検討された。しかしながら、現在の遺伝子発現分析方法は、全部、細胞若しくは組織の溶解、ＲＮＡの単離、ならびに転写および翻訳事象のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出を必要とする。生物学的現象はガラス製マイクロアレイチップの無菌環境で正確に表されないが、しかしむしろ遺伝子発現およびタンパク質翻訳に影響する細胞内環境で正確に表される。さらに、現在使用される遺伝子発現分析方法は、リアルタイムよりはむしろ生物学的系の実際の活動を正確に反応しないかもしれない一連の時点を通して転写および翻訳事象の検出が起こることを必要とする。従って、マイクロアレイは実際の遺伝子発現の近似のみを提供する。それらは、実際の生物学的事象に対応することがありそうにない自由裁量の時間枠の間、一定の間隔を空けられたｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出を必要とするからである。
【０００９】
遺伝子の発現および機能のｉｎ  ｖｉｖｏのリアルタイム検出および分析を提供することの長年にわたる切実な必要性が存在する。本発明はこの必要性を満たす。
【非特許文献１】Ａｌｗｉｎｅら、１９７７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５３５０−５３５４
【非特許文献２】ＬｉａｎｇとＰａｒｄｅｅ、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：９６７−９７１
【非特許文献３】ＢｅｒｋとＳｈａｒｐ、１９７７、Ｃｅｌｌ  １２：７２１−７３２
【非特許文献４】Ａｄａｍｓら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１６５１−１６５６
【非特許文献５】Ｏｋｕｂｏら、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２：１７３−１７９
【非特許文献６】Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４８４−４８７
【非特許文献７】Ｓｃｈｅｎａら、１９９５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４６７−４７０
【非特許文献８】Ｓｃｈｅｎａら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１０６１４−１０６１９
【非特許文献９】Ｌｏｃｋｈａｒｔら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１６７５−１６８０
【発明の開示】
【００１０】
［発明の要約］
一局面において、本発明はＤＮＡ分子の転写の検出方法を包含し、該方法は、検出体分子（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、および検出体分子を特異的に結合する検出体結合ドメインを含んでなるキメラＲＮＡポリメラーゼ分子と細胞を接触させることを含んでなり；該検出体分子は：該検出体結合ドメインに結合することが可能なキメラＲＮＡポリメラーゼ結合ドメイン（ＣＲＰＢＤ）、ＲＮＡ分子の一部分に相補的なペプチド核酸（ＰＮＡ）；およびシグナリング部分（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）を含んでなり、さらに、該ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡを転写して新生ＲＮＡ分子を産生する場合に、該ＰＮＡが新生ＲＮＡ分子に結合し、そしてシグナルが検出体分子により発せられて、それによりＤＮＡ分子の転写を検出する。
【００１１】
一局面において、検出体分子は細胞透過性ペプチドをさらに含んでなる。
【００１２】
別の局面において、検出体結合ドメインはＳＨ３ドメインおよびロイシンジッパーよりなる群から選択される。
【００１３】
なお別の局面において、ＣＲＰＢＤはα−ＰＡＫドメインおよびロイシンジッパーよりなる群から選択される。
【００１４】
一局面において、細胞透過性ペプチドは、トランスポータンペプチド（ＴＰ）、ＴＰ１０ペプチド、ｐＶＥＣペプチド、ペネトラチンペプチド、ｔａｔフラグメントペプチド、シグナル配列をベースとするペプチドおよび両親媒性モデルペプチドよりなる群から選択される。
【００１５】
別の局面において、シグナリング部分は蛍光分子を含んでなる。
【００１６】
なお別の局面において、蛍光分子は、ＲｅＡｓＨ、ビス−（（Ｎ−ヨードアセチル）ピペラジニル）スルホンローダミン（ＢＳＲ）、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）およびフルオレセインよりなる群から選択される。
【００１７】
一局面において、ＰＮＡは新生ＲＮＡ分子の二ヌクレオチド若しくは三ヌクレオチドに相補的である。
【００１８】
別の局面において、ＰＮＡは新生ＲＮＡ分子の三ヌクレオチドに相補的である。
【００１９】
なお別の局面において、三ヌクレオチドは核酸配列ＣＡＣを有する。
【００２０】
一局面において、キメラＲＮＡポリメラーゼはキメラＲＮＡポリメラーゼＩＩである。
【００２１】
別の局面において、キメラＲＮＡポリメラーゼはキメラＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである。
【００２２】
なお別の局面において、シグナルは蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）シグナル若しくは極性変化シグナルである。
【００２３】
別の局面において、新生ＲＮＡ分子は細胞中にある。
【００２４】
一局面において、細胞は真核生物細胞である。
【００２５】
なお別の局面において、細胞は動物中にある。
【００２６】
別の局面において、動物は哺乳動物である。
【００２７】
なお別の局面において、細胞は生物学的サンプルである。
【００２８】
一局面において、本発明は；
ａ）検出体結合ドメインを含んでなるキメラＲＮＡポリメラーゼ；ならびに
ｂ）シグナリング部分を含んでなる検出体分子、ＲＮＡ分子の一部分に相補的なＰＮＡ、および検出体結合ドメインに結合することが可能なＣＲＰＢＤ
を含んでなる、単離されたヌクレオペプチドコンジュゲート複合体（ｎｕｃｌｅｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ）を包含し、
ＣＲＰＢＤはキメラＲＮＡポリメラーゼの検出体結合ドメインに特異的に結合する。
【００２９】
一局面において、検出体結合ドメインはＳＨ３ドメインおよびロイシンジッパーよりなる群から選択される。
【００３０】
なお別の局面において、ＣＲＰＢＤはα−ＰＡＫドメインおよびロイシンジッパーよりなる群から選択される。
【００３１】
なお別の局面において、シグナリング部分は蛍光分子を含んでなる。
【００３２】
別の局面において、蛍光分子は、ＲｅＡｓＨ、ビス−（（Ｎ−ヨードアセチル）ピペラジニル）スルホンローダミン（ＢＳＲ）、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５、ＴＡＭＲＡおよびフルオレセインよりなる群から選択される。
【００３３】
一局面において、ＰＮＡはＲＮＡ分子の二ヌクレオチド若しくは三ヌクレオチドに相補的である。
【００３４】
なお別の局面において、ＰＮＡはＲＮＡ分子の三ヌクレオチドに相補的である。
【００３５】
なお別の局面において、三ヌクレオチドはＣＡＣの核酸配列を有する。
【００３６】
一局面において、複合体は細胞透過性ペプチドをさらに含んでなる。
【００３７】
別の局面において、細胞透過性ペプチドは、トランスポータンペプチド（ＴＰ）、ＴＰ１０ペプチド、ｐＶＥＣペプチド、ペネトラチンペプチド、ｔａｔフラグメントペプチド、シグナル配列をベースとするペプチド（ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）および両親媒性モデルペプチドよりなる群から選択される。
【００３８】
なお別の局面において、ＲＮＡポリメラーゼはＲＮＡポリメラーゼＩＩである。
【００３９】
一局面において、ＲＮＡポリメラーゼはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである。
【００４０】
一局面において、本発明は、キメラＲＮＡポリメラーゼをコードする単離された核酸を包含し、該キメラＲＮＡポリメラーゼはＲＮＡポリメラーゼおよび検出体結合ドメインを含んでなる。
【００４１】
一局面において、本発明は、キメラＲＮＡポリメラーゼをコードする単離された核酸を包含し、該単離された核酸は配列番号１および配列番号２を含んでなり、配列番号１は、
配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４から選択される群に示される配列を有する単離された核酸により配列番号２から分離されている。
【００４２】
なお別の局面において、単離された核酸は配列番号１および２に示される核酸配列を含んでなり、配列番号１は配列番号２に共有結合されている。
【００４３】
一局面において、核酸はそれに共有結合された標識ポリペプチドをコードする核酸をさらに含んでなる。
【００４４】
一局面において、本発明は、キメラＲＮＡポリメラーゼをコードする単離された核酸を包含し、キメラＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は配列番号３および配列番号４に示されるアミノ酸配列を含んでなり、配列番号３は０から４個までのプロリンを有するペプチドにより配列番号４から分離されている。
【００４５】
別の局面において、標識ポリペプチドは、ｍｙｃ標識ポリペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ標識ポリペプチド、緑色蛍光タンパク質標識ポリペプチド、ｍｙｃ−ピルビン酸キナーゼ標識ポリペプチド、Ｈｉｓ６標識ポリペプチド、インフルエンザウイルスヘマグルチニン標識ポリペプチド、ｆｌａｇ標識ポリペプチドおよびマルトース結合タンパク質標識ポリペプチドよりなる群から選択される。
【００４６】
一局面において、核酸は、それに作動可能に連結されたプロモーター／制御配列を指定する核酸をさらに含んでなる。
【００４７】
一局面において、本発明は、キメラＲＮＡポリメラーゼをコードする単離された核酸を含んでなるベクターを包含する。
【００４８】
なお別の局面において、該ベクターはそれに作動可能に連結されたプロモーター／制御配列を指定する核酸をさらに含んでなる。
【００４９】
一局面において、本発明は、キメラＲＮＡポリメラーゼをコードする本発明の単離された核酸を含んでなる組換え細胞を包含する。
【００５０】
一局面において、本発明は、キメラＲＮＡポリメラーゼをコードする単離された核酸を含んでなる本発明のベクターを含んでなる組換え細胞を包含する。
【００５１】
一局面において、細胞は真核生物細胞若しくは原核生物細胞である。
【００５２】
別の局面において、ＲＮＡポリメラーゼはＲＮＡポリメラーゼＩＩである。
【００５３】
なお別の局面において、ＲＮＡポリメラーゼはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである。
【００５４】
一局面において、本発明はキメラＲＮＡポリメラーゼを含んでなる単離されたポリペプチドを包含する。
【００５５】
一局面において、本発明はキメラＲＮＡポリメラーゼを含んでなる単離されたポリペプチドを包含し、該キメラＲＮＡポリメラーゼは配列番号３および配列番号４に示されるアミノ酸配列を含んでなり、さらに、配列番号３は、０から４個までのプロリンを有するポリペプチドにより配列番号４から分離されている。一局面において、本発明は、キメラＲＮＡポリメラーゼを含んでなる単離されたポリペプチドを特異的に結合する抗体を包含する。
【００５６】
一局面において、本発明は、ＣＲＰＢＤ、ＰＮＡおよびシグナリング部分を含んでなる単離された検出体分子を包含する。
【００５７】
一局面において、ＣＲＰＢＤは検出体結合ドメインに結合することが可能である。
【００５８】
なお別の局面において、ＣＲＰＢＤは配列番号５に示されるアミノ酸配列に７５％同一性を有する。
【００５９】
なお別の局面において、ＰＮＡは二ヌクレオチド若しくは三ヌクレオチドに相補的である。
【００６０】
一局面において、ＰＮＡは三ヌクレオチドに相補的である。
【００６１】
別の局面において、三ヌクレオチドは核酸配列ＣＡＣを有する。
【００６２】
なお別の局面において、シグナリング部分は蛍光分子を含んでなる。
【００６３】
一局面において、蛍光分子は、ＲｅＡｓＨ、ビス−（（Ｎ−ヨードアセチル）ピペラジニル）スルホンローダミン（ＢＳＲ）、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５、ＴＡＭＲＡおよびフルオレセインよりなる群から選択される。
【００６４】
なお別の局面において、検出体分子は細胞透過性ペプチドをさらに含んでなる。
【００６５】
一局面において、細胞透過性ペプチドは、トランスポータンペプチド（ＴＰ）、ＴＰ１０ペプチド、ｐＶＥＣペプチド、ペネトラチンペプチド、ｔａｔフラグメントペプチド、シグナル配列をベースとするペプチドおよび両親媒性モデルペプチドよりなる群から選択される。
【００６６】
一局面において、本発明は、本発明の検出体分子を特異的に結合する抗体を包含する。
【００６７】
一局面において、本発明は、ＲＮＡ分子の転写を検出するためのキットを包含し、該キットは、キメラＲＮＡポリメラーゼ、検出体分子、およびその使用のための取扱説明書を含んでなる。
【００６８】
一局面において、キット中の検出体分子は細胞透過性ペプチドをさらに含んでなる。一局面において、細胞透過性ペプチドは、トランスポータンペプチド（ＴＰ）、ＴＰ１０ペプチド、ｐＶＥＣペプチド、ペネトラチンペプチド、ｔａｔフラグメントペプチド、シグナル配列をベースとするペプチド、トランスポータンペプチドおよび両親媒性モデルペプチドよりなる群から選択される。
【００６９】
なお別の局面において、キット中のキメラＲＮＡポリメラーゼは、ＳＨ３ドメインおよびロイシンジッパーよりなる群から選択される検出体結合ドメインを含んでなる。
【００７０】
別の局面において、キット中の検出体分子は、α−ＰＡＫドメインおよびロイシンジッパーよりなる群から選択される検出体結合ドメインに結合することが可能なＣＲＰＢＤを含んでなる。
【００７１】
別の局面において、キット中の検出体分子はシグナリング部分を含んでなる。なお別の局面において、シグナリング部分は蛍光分子を含んでなる。なお別の局面において、蛍光
分子は、ＲｅＡｓＨ、ビス−（（Ｎ−ヨードアセチル）ピペラジニル）スルホンローダミン（ＢＳＲ）、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５、ＴＡＭＲＡおよびフルオレセインよりなる群から選択される。
【００７２】
一局面において、キット中の検出体分子は、ＲＮＡ分子の一部分に相補的なＰＮＡを含んでなる。別の局面において、ＰＮＡはＲＮＡ分子の二ヌクレオチド若しくは三ヌクレオチドに相補的である。一局面において、ＰＮＡは三ヌクレオチドに相補的である。なお別の局面において、三ヌクレオチドは核酸配列ＣＡＣを有する。
【００７３】
なお別の局面において、キット中のキメラＲＮＡポリメラーゼはＲＮＡポリメラーゼＩＩである。一局面において、キメラＲＮＡポリメラーゼはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである。
【００７４】
一局面において、本発明はＲＮＡ分子の転写を検出するためのキットを包含し、該キットは、キメラＲＮＡポリメラーゼをコードする単離された核酸、検出体分子、およびその使用のための取扱説明書を含んでなる。
【００７５】
別の局面において、該キットの検出体分子は細胞透過性ペプチドをさらに含んでなる。別の局面において、細胞透過性ペプチドは、トランスポータンペプチド（ＴＰ）、ＴＰ１０ペプチド、ｐＶＥＣペプチド、ペネトラチンペプチド、ｔａｔフラグメントペプチド、シグナル配列をベースとするペプチドおよび両親媒性モデルペプチドよりなる群から選択される。
【００７６】
なお別の局面において、該キットの単離された核酸は配列番号１に示される核酸配列を含んでなる。
【００７７】
一局面において、該キットの検出体分子は、α−ＰＡＫドメインおよびロイシンジッパーよりなる群から選択される検出体結合ドメインに結合することが可能なＣＲＰＢＤを含んでなる。
【００７８】
一局面において、該キットの検出体分子はシグナリング部分を含んでなる。なお別の局面において、シグナリング部分は蛍光分子を含んでなる。別の局面において、蛍光分子は、ＲｅＡｓＨ、ビス−（（Ｎ−ヨードアセチル）ピペラジニル）スルホンローダミン（ＢＳＲ）、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５、ＴＡＭＲＡおよびフルオレセインよりなる群から選択される。
【００７９】
一局面において、該キットの検出体分子はＲＮＡ分子の一部分に相補的なＰＮＡを含んでなる。なお別の局面において、ＰＮＡはＲＮＡ分子の二ヌクレオチド若しくは三ヌクレオチドに相補的である。なお別の局面において、ＰＮＡは三ヌクレオチドに相補的である。なお別の局面において、三ヌクレオチドは核酸配列ＣＡＣを有する。
【００８０】
別の局面において、該キットのキメラＲＮＡポリメラーゼはＲＮＡポリメラーゼＩＩである。一局面において、キメラＲＮＡポリメラーゼはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである。
【００８１】
一局面において、本発明は単離されたＤＮＡ分子の配列決定方法を包含し、該方法は、単離されたＤＮＡ分子をプロモーター／制御配列に連結して連結されたＤＮＡ分子を形成すること、単離された核酸を、検出体分子に結合されたキメラＲＮＡポリメラーゼと接触させることを含んでなり、該キメラＲＮＡポリメラーゼは検出体結合ドメインを含んでなり、かつ、該検出体分子は、検出体結合ドメインに結合することが可能なＣＲＰＢＤ、単離された核酸の一部分に相補的なＰＮＡ、およびシグナリング部分を含んでなり、キメラ
ＲＮＡポリメラーゼが該単離された核酸をｍＲＮＡ分子に転写する場合に、ＰＮＡがそのように転写されたｍＲＮＡ分子に結合し、そしてシグナルが検出体分子から発せられて、それによりＤＮＡ分子を配列決定する。
【００８２】
一局面において、単離されたＤＮＡ分子は二本鎖ｃＤＮＡを含んでなる。
【００８３】
別の局面において、プロモーター／制御配列はＴ７プロモーターである。
【００８４】
なお別の局面において、検出体結合ドメインはＳＨ３ドメインおよびロイシンジッパーよりなる群から選択される。
【００８５】
一局面において、ＣＲＰＢＤはα−ＰＡＫドメインおよびロイシンジッパーよりなる群から選択される。
【００８６】
なお別の局面において、シグナリング部分は蛍光分子を含んでなる。別の局面において、蛍光分子は、ＲｅＡｓＨ、ビス−（（Ｎ−ヨードアセチル）ピペラジニル）スルホンローダミン（ＢＳＲ）、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５、ＴＡＭＲＡおよびフルオレセインよりなる群から選択される。
【００８７】
なお別の局面において、ＰＮＡは、連結されたＤＮＡ分子の二ヌクレオチド若しくは三ヌクレオチド部分に相補的である。なお別の局面において、ＰＮＡは連結されたＤＮＡ分子の三ヌクレオチド部分に相補的である。
【００８８】
一局面において、ＲＮＡポリメラーゼはＲＮＡポリメラーゼＩＩである。なお別の局面において、ＲＮＡポリメラーゼはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである。
【００８９】
別の局面において、シグナルは蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）シグナル若しくは極性変化シグナルである。
【００９０】
なお別の局面において、三ヌクレオチドは核酸配列ＧＴＧを有する。
【００９１】
なお別の局面において、プロモーター／制御配列は支持体に結合されている。
【００９２】
一局面において、該方法は最低１回反復され、かつ、各反復での検出体分子は、連結されたＤＮＡ分子の異なる一部分に相補的である異なるＰＮＡを含んでなる。
【００９３】
一局面において、本発明はＲＮＡ分子の翻訳の検出方法を包含し、該方法は、検出体分子、および検出体分子を特異的に結合する検出体結合ドメインを含んでなるキメラリボソームサブユニットを有するキメラリボソーム分子と細胞を接触させることを含んでなり、該検出体分子は、検出体結合ドメインに結合することが可能なキメラリボソーム結合ドメイン（ＣＲＢＤ）、ＲＮＡ分子の一部分に相補的なＰＮＡ；およびシグナル伝達分子を含んでなり、リボソームがＲＮＡを翻訳する場合に、ＰＮＡがキメラリボソームのＲＮＡ出口孔（ｅｘｉｔ  ｐｏｒｅ）を出るＲＮＡに結合し、そしてシグナルが検出体分子から発せられて、それによりＲＮＡ分子の翻訳を検出する。
【００９４】
別の局面において、検出体分子は細胞透過性ペプチドをさらに含んでなる。一局面において、細胞透過性ペプチドは、トランスポータンペプチド（ＴＰ）、ＴＰ１０ペプチド、ｐＶＥＣペプチド、ペネトラチンペプチド、ｔａｔフラグメントペプチド、シグナル配列をベースとするペプチドおよび両親媒性モデルペプチドよりなる群から選択される。
【００９５】
一局面において、検出体結合ドメインはＳＨ３ドメインおよびロイシンジッパーよりなる群から選択される。
【００９６】
なお別の局面において、ＣＲＢＤはα−ＰＡＫドメインおよびロイシンジッパーよりなる群から選択される。
【００９７】
別の局面において、シグナリング部分は蛍光分子を含んでなる。なお別の局面において、蛍光分子は、ＲｅＡｓＨ、ビス−（（Ｎ−ヨードアセチル）ピペラジニル）スルホンローダミン（ＢＳＲ）、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５、ＴＡＭＲＡおよびフルオレセインよりなる群から選択される。
【００９８】
一局面において、ＰＮＡはＲＮＡ分子の二ヌクレオチド若しくは三ヌクレオチド部分に相補的である。別の局面において、ＰＮＡはＲＮＡ分子の三ヌクレオチド部分に相補的である。なお別の局面において、三ヌクレオチドは核酸配列ＣＡＣを有する。
【００９９】
なお別の局面において、リボソームは原核生物リボソームである。
【０１００】
一局面において、リボソームはリボソームの５０ｓサブユニットである。
【０１０１】
なお別の局面において、シグナルは蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）シグナル若しくは極性変化シグナルである。
【０１０２】
別の局面において、ＲＮＡ分子は細胞中にある。
【０１０３】
なお別の局面において、細胞は真核生物細胞である。
【０１０４】
一局面において、細胞は動物中にある。
【０１０５】
なお別の局面において、動物は哺乳動物である。
【０１０６】
別の局面において、細胞は生物学的サンプルである。
【０１０７】
一局面において、本発明はキメラリボソームサブユニット成分をコードする単離された核酸を含んでなり、該キメラリボソームサブユニット成分はリボソームサブユニット成分および検出体結合ドメインを含んでなる。
【０１０８】
一局面において、本発明はキメラリボソームサブユニット成分をコードする単離された核酸を包含し、該単離された核酸は配列番号６および配列番号２を含んでなり、配列番号６は、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４から選択される群に示される配列を有する単離された核酸により配列番号２から分離されている。
【０１０９】
別の局面において、単離された核酸は配列番号６および配列番号２に示される核酸配列を含んでなり、配列番号６は配列番号２に共有結合されている。
【０１１０】
一局面において、該核酸は、それに共有結合された標識ポリペプチドをコードする核酸をさらに含んでなる。
【０１１１】
一局面において、本発明は、キメラリボソームサブユニット成分をコードする単離された核酸を包含し、該キメラリボソームサブユニット成分のアミノ酸配列は、配列番号７および配列番号４に示されるアミノ酸配列を含んでなり、配列番号７は０から４個までのプ
ロリンを有するペプチドにより配列番号４から分離されている。
【０１１２】
なお別の局面において、標識ポリペプチドは、ｍｙｃ標識ポリペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ標識ポリペプチド、緑色蛍光タンパク質標識ポリペプチド、ｍｙｃ−ピルビン酸キナーゼ標識ポリペプチド、Ｈｉｓ６標識ポリペプチド、インフルエンザウイルスヘマグルチニン標識ポリペプチド、ｆｌａｇ標識ポリペプチドおよびマルトース結合タンパク質標識ポリペプチドよりなる群から選択される。
【０１１３】
別の局面において、該核酸は、それに作動可能に連結されたプロモーター／制御配列を指定する核酸をさらに含んでなる。
【０１１４】
一局面において、本発明は、キメラリボソームサブユニット成分をコードする単離された核酸を含んでなるベクターを包含する。
【０１１５】
一局面において、該ベクターは、それに作動可能に連結されたプロモーター／制御配列を指定する核酸をさらに含んでなる。一局面において、組換え細胞は該ベクターを含んでなる。
【０１１６】
一局面において、本発明は、キメラリボソームサブユニット成分１をコードする単離された核酸を含んでなる組換え細胞を包含する。
【０１１７】
なお別の局面において、細胞は真核生物細胞若しくは原核生物細胞である。
【０１１８】
一局面において、リボソームサブユニット成分は原核生物リボソームサブユニットである。
【０１１９】
別の局面において、リボソームサブユニットは５０ｓサブユニットの一成分である。
【０１２０】
一局面において、本発明は、キメラリボソームサブユニット成分を含んでなる単離されたポリペプチドを包含する。
【０１２１】
一局面において、本発明は、キメラリボソームサブユニット成分を含んでなる単離されたポリペプチドを包含し、該キメラリボソームサブユニット成分は配列番号７および配列番号４に示されるアミノ酸配列を含んでなり、配列番号７は０から４個までのプロリンを有するポリペプチドにより配列番号４から分離されている。一局面において、本発明は、キメラリボソームサブユニット成分を含んでなる単離されたポリペプチドを特異的に結合する抗体を包含する。
【０１２２】
一局面において、本発明は核酸分子の転写の検出方法を包含し、該方法は、検出体分子、および核酸分子を転写するキメラ酵素と細胞を接触させることを含んでなり、該キメラ酵素は該検出体分子を特異的に結合する検出体結合ドメインを含んでなり、該検出体分子は；該検出体結合ドメインに結合することが可能なキメラ酵素結合ドメイン（ＣＥＢＤ）、核酸分子の一部分に相補的なＰＮＡ；およびシグナリング部分を含んでなり、該キメラ酵素が核酸を転写する場合に、ＰＮＡは該酵素から発生するＲＮＡ分子に結合し、そしてシグナルが検出体分子から発せられ、さらに、前記方法は、シグナルを検出してそれにより核酸分子の転写を検出するための手段をさらに含んでなる。
【０１２３】
一局面において、検出体分子は細胞透過性ペプチドをさらに含んでなる。
【０１２４】
なお別の局面において、検出体結合ドメインはＳＨ３ドメインおよびロイシンジッパー
よりなる群から選択される。
【０１２５】
別の局面において、ＣＥＢＤはα−ＰＡＫドメインおよびロイシンジッパーよりなる群から選択される。
【０１２６】
一局面において、細胞透過性ペプチドは、トランスポータンペプチド（ＴＰ）、ＴＰ１０ペプチド、ｐＶＥＣペプチド、ペネトラチンペプチド、ｔａｔフラグメントペプチド、シグナル配列をベースとするペプチドおよび両親媒性モデルペプチドよりなる群から選択される。
【０１２７】
別の局面において、シグナリング部分は蛍光分子を含んでなる。
【０１２８】
なお別の局面において、蛍光分子は、ＲｅＡｓＨ、ビス−（（Ｎ−ヨードアセチル）ピペラジニル）スルホンローダミン（ＢＳＲ）、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５、ＴＡＭＲＡおよびフルオレセインよりなる群から選択される。
【０１２９】
一局面において、ＰＮＡは核酸分子の二ヌクレオチド若しくは三ヌクレオチド部分に相補的である。
【０１３０】
別の局面において、ＰＮＡは核酸分子の三ヌクレオチド部分に相補的である。
【０１３１】
なお別の局面において、三ヌクレオチドは核酸配列ＣＡＣを有する。
【０１３２】
一局面において、核酸分子を転写するキメラ酵素はＲＮＡポリメラーゼＩＩである。
【０１３３】
なお別の局面において、ＲＮＡポリメラーゼはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである。
【０１３４】
なお別の局面において、シグナルは蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）シグナル若しくは極性変化シグナルである。
【０１３５】
別の局面において、核酸分子は細胞中にある。
【０１３６】
一局面において、細胞は真核生物細胞である。
【０１３７】
なお別の局面において、細胞は動物中にある。
【０１３８】
なお別の局面において、動物は哺乳動物である。
【０１３９】
一局面において、細胞は生物学的サンプルである。
【０１４０】
一局面において、本発明は核酸分子の翻訳の検出方法を包含し、該方法は、検出体分子、および核酸分子を転写するキメラ酵素と細胞を接触させることを含んでなり、該キメラ酵素は、検出体分子を特異的に結合する検出体結合ドメインを含んでなり、該検出体分子は：検出体結合ドメインに結合することが可能なキメラ酵素結合ドメイン（ＣＥＢＤ）、核酸分子の一部分に相補的なＰＮＡ；およびシグナリング部分を含んでなり、該キメラ酵素が核酸を転写する場合、ＰＮＡが該酵素から発生するＲＮＡ分子に結合し、そしてシグナルが検出体分子から発せられ、さらに、前記方法は、シグナルを検出してそれにより核酸分子の翻訳を検出するための手段をさらに含んでなる。
【０１４１】
一局面において、検出体分子は細胞透過性ペプチドをさらに含んでなる。なお別の局面
において、細胞透過性ペプチドは、トランスポータンペプチド（ＴＰ）、ＴＰ１０ペプチド、ｐＶＥＣペプチド、ペネトラチンペプチド、ｔａｔフラグメントペプチド、シグナル配列をベースとするペプチドおよび両親媒性モデルペプチドよりなる群から選択される。
【０１４２】
別の局面において、検出体結合ドメインはＳＨ３ドメインおよびロイシンジッパーよりなる群から選択される。
【０１４３】
一局面において、ＣＥＢＤはα−ＰＡＫドメインおよびロイシンジッパーよりなる群から選択される。
【０１４４】
なお別の局面において、シグナリング部分は蛍光分子を含んでなる。一局面において、蛍光分子は、ＲｅＡｓＨ、ビス−（（Ｎ−ヨードアセチル）ピペラジニル）スルホンローダミン（ＢＳＲ）、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５、ＴＡＭＲＡおよびフルオレセインよりなる群から選択される。
【０１４５】
別の局面において、ＰＮＡはＲＮＡ分子の二ヌクレオチド若しくは三ヌクレオチド部分に相補的である。一局面において、ＰＮＡはＲＮＡ分子の三ヌクレオチド部分に相補的である。一局面において、三ヌクレオチドは核酸配列ＣＡＣを有する。
【０１４６】
別の局面において、キメラ酵素はリボソームである。
【０１４７】
なお別の局面において、リボソームは原核生物リボソームである。
【０１４８】
一局面において、シグナルは蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）シグナル若しくは極性変化シグナルである。
【０１４９】
なお別の局面において、核酸は細胞中にある。
【０１５０】
一局面において、細胞は真核生物細胞である。
【０１５１】
なお別の局面において、細胞は動物中にある。
【０１５２】
一局面において、動物は哺乳動物である。
【０１５３】
別の局面において、細胞は生物学的サンプルである。
【０１５４】
一局面において、本発明は転写される核酸の同定方法を包含し、該方法は、検出体分子、および核酸分子を転写するキメラ酵素と細胞を接触させること（該キメラ酵素は該検出体分子を特異的に結合する検出体結合ドメインを含んでなり、該検出体分子は：ａ）検出体結合ドメインに結合することが可能なキメラ酵素結合ドメイン（ＣＥＢＤ）、ｂ）核酸分子の一部分に相補的なＰＮＡ；およびｃ）シグナリング部分を含んでなり、かつ、キメラ酵素が核酸を転写する場合、ＰＮＡは該酵素から発生する新生核酸分子に結合し、そしてシグナルが検出体分子により発せられ）；シグナルを検出すること；ならびに、検出されたシグナルを特定の配列と関連するシグナルのライブラリーに適合させるための拘束局所動的時間伸縮アルゴリズム（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ｌｏｃａｌ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｔｉｍｅ  ｗａｒｐ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を使用して、転写された核酸分子を同定し、それにより転写される核酸を同定することを含んでなる。
【０１５５】
［発明の詳細な記述］
ｉｎ  ｖｉｖｏでの核酸の転写および翻訳を迅速かつ正確に検出する能力は、細胞の実
際の作用を知る手段、および従って生物学の全レベルのより大きな理解を見込む。加えて、細胞、組織、器官若しくは動物に対する治療薬、毒素、汚染物質、ホルモンおよび細胞と細胞の相互作用の影響を、組成物の作用機序をその最も基本的なレベルで解明するために核酸レベルでモニターし得る。
【０１５６】
本発明は、部分的に、タンパク質のＮ末端がＲＮＡ出口孔に緊密に近接しているようなＤＮＡにＲＮＡポリメラーゼが結合する場合にそれがコンホメーション変化を受けるという観察結果に基づく。
【０１５７】
本発明は、ＲＮＡポリメラーゼのＮ末端に工作され、従ってキメラＲＮＡポリメラーゼを創製する小捕捉ペプチド（検出体結合ドメイン）を包含する。本発明はさらに、ＲＮＡポリメラーゼ中に工作された検出体結合ドメインに結合する一領域（キメラＲＮＡポリメラーゼ結合ドメイン；ＣＲＰＢＤ）を包含する複数のドメインを含有する合成検出体分子を包含する。検出体分子中の別のドメインは、ペプチドスペーサー領域により分離されかつシグナリング部分を含んでなる、１個若しくはそれ以上、好ましくは２個の部分を含有する。検出体分子中の別のドメインは、新生ＲＮＡ上の相補ヌクレオチドを特異的に結合しかつ長さが最低約２、好ましくは３ヌクレオチドに同等であるペプチド核酸（ＰＮＡ）である。キメラＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡ鋳型に沿って動くように検出体分子がそれに結合される場合、ＰＮＡは発生するＲＮＡ中のその対応する配列に結合し、そしてこうした結合により、シグナリング部分が動き、その結果蛍光エネルギー転移シグナルおよび極性変化が生じる。検出体分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでマイクロアレイ上で若しくはｉｎ  ｖｉｖｏで生存細胞中でそれが作用するように合成され得る。後者について、検出体分子は輸送ベクター（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｖｅｃｔｏｒ）、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）にコンジュゲートされる。
【０１５８】
本発明はキメラリボソーム分子をさらに包含する。キメラリボソーム分子は、その中に検出体結合ドメインが工作されるサブユニット成分を有するキメラリボソームサブユニットを含んでなる。キメラリボソーム分子はＲＮＡ分子の翻訳の検出方法で有用であり、検出体分子を使用してシグナルを生じさせる。
【０１５９】
本発明は、核酸の転写および翻訳の検出ならびに核酸の迅速な配列決定のための新規組成物、方法およびキットを包含する。
【０１６０】
定義
本明細書で使用されるところの以下の用語のそれぞれは、本節のそれと関連する意味を有する。
【０１６１】
冠詞「ａ」および「ａｎ」（ある）は、該冠詞の文法上の目的の１若しくは１以上（すなわち最低１）を指すのに本明細書で使用する。例として、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ（ある要素）」は１要素若しくは１以上の要素を意味している。
【０１６２】
「増幅」は、例えば逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応およびリガーゼ連鎖反応によりポリヌクレオチド配列をコピーしかつ従ってより多数のポリヌクレオチド分子に増やす、いかなる手段も指す。
【０１６３】
本明細書で使用されるところの「抗体」という用語は、ある抗原上の特定の１エピトープに特異的に結合することが可能である免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然の供給源若しくは組換え供給源由来の無傷の免疫グロブリンであり得、また、無傷の免疫グロブリンの免疫反応性部分であり得る。抗体は典型的には免疫グロブリン分子の四量体である。本発明の抗体は、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２、ならびに一本鎖抗体およびヒト化抗体を包含する多様な形態で存在しうる（Ｈａｒｌｏｗら、１９９９、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｏｔｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク；Ｈａｒｌｏｗら、１９８９、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー；Ｈｏｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）。
【０１６４】
本明細書で使用されるところの「合成抗体」という用語により、例えば本明細書に記述されるところのバクテリオファージにより発現される抗体のような組換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体を意味している。該用語は、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成により生成されかつそのＤＮＡ分子が抗体タンパク質若しくは抗体を指定するアミノ酸配列を発現する抗体を意味するともまた解釈されるべきであり、該ＤＮＡ若しくはアミノ酸配列は、当該技術分野で使用可能かつ公知である合成ＤＮＡ若しくはアミノ酸配列技術を使用して得られている。
【０１６５】
「アンチセンス」は、とりわけ、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の非コーディング鎖の核酸配列、若しくは非コーディング鎖に実質的に相同である配列を指す。本明細書で定義されるところのアンチセンス配列は、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の配列に相補的である。アンチセンス配列がＤＮＡ分子のコーディング鎖のコーディング部分にのみ相補的であることは必要でない。アンチセンス配列は、タンパク質をコードするＤＮＡ分子のコーディング鎖上で指定される制御配列に相補的であることができ、その制御配列は該コーディング配列の発現を制御する。
【０１６６】
該用語が本明細書で使用されるところの「アプリケーター」という用語により、本発明のいずれかの方法の実務で有用な、限定されるものでないが皮下シリンジ、ピペット、微小遠心管などを挙げることができるいかなる装置若しくは器具も意味している。
【０１６７】
「結合」は特異的結合を意味するのに本明細書で使用する。
【０１６８】
該用語が本明細書で使用されるところの「生物学的サンプル」は、核酸の発現のレベル、存在するタンパク質のレベル、若しくは双方を評価するのに使用し得る、哺乳動物から得られた若しくはそれ中のサンプルを意味している。こうしたサンプルは、限定されるものでないが細胞、血液サンプル、神経組織サンプル、脳サンプルおよび脳脊髄液サンプルを挙げることができる。
【０１６９】
「細胞透過性ペプチド」は、ポリペプチドと会合したいかなる分子とも一緒の前記ポリペプチドの１種若しくはそれ以上の膜を横断して細胞の内側への進入を容易にするポリペプチドを指す。本明細書で使用されるところの細胞透過性ペプチドは、限定されるものでないが、ＴＰ１０、ＴＰ、ｐＶＥＣ、ペネトラチン、Ｔａｔフラグメント、シグナル配列をベースとするペプチド、トランスポータンおよび両親媒性モデルペプチドを挙げることができる。
【０１７０】
本明細書で使用されるところの「相補的」および「アンチセンス」という用語は完全に同義でない。「アンチセンス」は、とりわけ、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の非コーディング鎖の核酸配列、若しくは該非コーディング鎖に実質的に相同である配列を指す。
【０１７１】
本明細書で使用されるところの「相補的」は、２種の核酸、例えば２種のＤＮＡ分子の
間のサブユニット配列相補性の広範な概念を指す。該分子の双方中のあるヌクレオチド位置が、相互と塩基対形成することが通常可能なヌクレオチドにより占有される場合には、該核酸はこの位置で相互に相補的であるとみなされる。従って、２種の核酸は、分子のそれぞれ中の対応する位置の実質的な数（最低５０％）が、相互と通常塩基対形成する（例えばＡ：ＴおよびＧ：Ｃヌクレオチド対）ヌクレオチドにより占有されている場合は、相互に相補的である。本明細書で定義されるところのアンチセンス配列は、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の配列に相補的である。アンチセンス配列はＤＮＡ分子のコーディング鎖のコーディング部分にのみ相補的であることは必要でない。アンチセンス配列は、タンパク質をコードするＤＮＡ分子のコーディング鎖上で指定される制御配列に相補的であることができ、その制御配列は該コーディング配列の発現を制御する。
【０１７２】
遺伝子の「コーディング領域」は、遺伝子の転写により産生されるｍＲＮＡ分子のコーディング領域にそれぞれ相同若しくは相補的である遺伝子のコーディング鎖のヌクレオチド残基および遺伝子の非コーディング鎖のヌクレオチドよりなる。
【０１７３】
ｍＲＮＡ分子の「コーディング領域」はまた、ｍＲＮＡ分子の翻訳の間に転移ＲＮＡ分子のアンチコドン領域と適合するか若しくは終止コドンをコードするｍＲＮＡ分子のヌクレオチド残基よりもなる。コーディング領域は、従って、該ｍＲＮＡ分子によりコードされる成熟タンパク質中に存在しないアミノ酸残基（例えばタンパク質輸出シグナル配列中のアミノ酸残基）に対応するヌクレオチド残基を包含しうる。
【０１７４】
「検出体結合ドメイン」は、別のポリペプチドの一部分に特異的に結合するポリペプチドの一部分、若しくは別のポリペプチド以外の分子を特異的に結合するポリペプチド以外の分子を指すのに本明細書で使用する。別の非ポリペプチドに特異的に結合する非ポリペプチドの制限しない一例は、アビジン若しくはストレプトアビジンへのビオチンの結合である。
【０１７５】
「検出体分子」は、ポリペプチド、１個若しくはそれ以上のシグナリング部分、１種若しくはそれ以上のペプチド核酸（ＰＮＡ）、および検出体結合ドメインに結合する部分を含んでなる組成物を指すのに本明細書で使用する。
【０１７６】
「二ヌクレオチド」は共有結合を共有する２ヌクレオチドを指すのに本明細書で使用する。
【０１７７】
「コードすること」は、ヌクレオチド（すなわちｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）の定義された配列若しくはアミノ酸の定義された配列のいずれかおよびそれらから生じる生物学的特性を有する、生物学的過程で他のポリマーおよび巨大分子の合成のための鋳型としてはたらく、遺伝子、ｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡのようなポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。従って、遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞若しくは他の生物学的系でタンパク質を産生する場合に、タンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列に同一でありかつ通常配列表に提供されるコーディング鎖、および遺伝子若しくはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コーディング鎖の双方を、その遺伝子若しくはｃＤＮＡのタンパク質若しくは他の産物をコードすると称し得る。
【０１７８】
オリゴヌクレオチドの第一の領域は、２領域が相互に隣接している場合、若しくは２領域が約１０００を超えないヌクレオチド残基、および好ましくは約１００を超えないヌクレオチド残基により分離されている場合に、該オリゴヌクレオチドの第二の領域に「隣接する」。
【０１７９】
本明細書で使用されるところの「相同な」は、２種のポリマー分子間、例えば２種の核酸分子、例えば２種のＤＮＡ分子若しくは２種のＲＮＡ分子間、または２種のポリペプチド分子間のサブユニット配列類似性を指す。２分子の双方中のあるサブユニット位置が同一の単量体サブユニットにより占有される場合、例えば２種のＤＮＡ分子のそれぞれ中の１位置がアデニンにより占有される場合には、それらはその位置で相同である。２配列間の相同性は、適合する若しくは相同な位置の数の直接の関数であり、例えば、２種の化合物の配列中の位置の半分（例えば長さ１０サブユニットのポリマー中の５位置）が相同である場合には、該２配列は５０％相同であり、１０位置のうち９が適合しているか若しくは相同である場合、該２配列は９０％相同性を共有する。例として、ＤＮＡ配列３’ＡＴＴＧＣＣ５’および３’ＴＡＴＧＧＣ５’は５０％相同性を共有する。
【０１８０】
本明細書で使用されるところの「相同性」は「同一性」と同義に使用する。
【０１８１】
２種のヌクレオチド若しくはアミノ酸配列間の同一性パーセントの決定は数学的アルゴリズムを使用して達成し得る。例えば、２配列を比較するのに有用な数学的アルゴリズムは、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７）でのとおり改変されたＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８）である。このアルゴリズムはＡｌｔｓｃｈｕｌらのＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれ（１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）、そして、例えば国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏａｎｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）のワールドワイドウェブサイトでアクセスし得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本明細書に記述される核酸に相同なヌクレオチド配列を得るために、以下のパラメータ、すなわち、ギャップペナルティ（ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝５；ギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝２；ミスマッチペナルティ（ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝３；マッチリウォード（ｍａｔｃｈ  ｒｅｗａｒｄ）＝１；期待値（ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ）１０．０；およびワードサイズ（ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ）＝１１を使用するＮＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩウェブサイトで“ｂｌａｓｔｎ”と呼称される）を用いて実施し得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本明細書に記述されるタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、以下のパラメータ、すなわち、期待値（ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ）１０．０、ＢＬＯＵＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用してＸＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩウェブサイトで“ｂｌａｓｔｎ”と呼称される）若しくはＮＣＢＩ“ｂｌａｓｔｐ”プログラムを用いて実施し得る。比較の目的上、ギャップを付けられたアライメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴをＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）に記述されるとおり利用し得る。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔ若しくはＰＨＩ−Ｂｌａｓｔを、分子間の距離関係（同上）、および共通パターンを共有する分子間の関係を検出する繰り返し検索を実施するのに使用し得る。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢｌａｓｔおよびＰＨＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメータを使用し得る。
【０１８２】
２配列間の同一性パーセントは、ギャップを許容することを伴う若しくは伴わない上述されたものに類似の技術を使用して決定し得る。同一性パーセントの算出において、典型的には正確な一致を計数する。
【０１８３】
本明細書で使用されるところの「説明資料」は、その指定される使用についての本発明の組成物の有用性を伝えるのに使用し得る刊行物、録画・録音、図、若しくはいかなる他の表現媒体も包含する。本発明のキットの説明資料は、例えば組成物を含有する容器に添
付しうるか、若しくは組成物を含有する容器と一緒に発送しうる。あるいは、説明資料は、該説明資料および組成物が受領者により協同して使用されるという意図を伴い、容器と別個に発送しうる。
【０１８４】
「単離された核酸」は、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から分離された核酸セグメント若しくはフラグメント、例えば、該フラグメントに通常隣接している配列、例えば該フラグメントが天然に存在するゲノム中で該フラグメントに隣接する配列から取り出されたＤＮＡフラグメントを指す。該用語は、細胞中で該核酸に天然に付随する他成分、例えばＲＮＡ若しくはＤＮＡまたはタンパク質から実質的に精製された核酸にもまた当てはまる。該用語は、従って、例えば、ベクター、自律複製プラスミド若しくはウイルス、または原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組込まれているか、あるいは他の配列と独立に個別の分子として（例えばｃＤＮＡ、またはＰＣＲ若しくは制限酵素消化により生じられたゲノム若しくはｃＤＮＡフラグメントとして）存在する組換えＤＮＡを包含する。それはまた、付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも包含する。
【０１８５】
対象に適用されるところの「天然に存在する」は、該対象が天然に見出され得るという事実を指す。例えば、天然の供給源から単離し得る生物体（ウイルスを包含する）中に存在しかつ人により意図的に改変されていないポリペプチド若しくはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【０１８６】
「ヌクレオペプチドコンジュゲート複合体」は、最低１種のポリペプチド、最低１種のＰＮＡおよびシグナリング部分を含んでなる分子を指すのに本明細書で使用する。
【０１８７】
本発明の情況において、一般に存在する核酸塩基の以下の略語を使用する。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシチジンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、そして「Ｕ」はウリジンを指す。
【０１８８】
別の方法で明記されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、相互の縮重バージョンでありかつ同一アミノ酸配列をコードする全ヌクレオチド配列を包含する。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はイントロンを包含しうる。
【０１８９】
２種のポリヌクレオチドを「作動可能に連結される」として記述することにより、一本鎖若しくは二本鎖核酸部分が、それが他者に対し特徴とする生理学的影響を該２種のポリヌクレオチドの少なくとも１種が発揮することが可能であるような様式で核酸部分内に配置された該２種のポリヌクレオチドを含んでなることを意味している。例として、遺伝子のコーディング領域に作動可能に連結されるプロモーターは、該コーディング領域の転写を促進することが可能である。
【０１９０】
「ポリヌクレオチド」は核酸の一本鎖若しくは平行および反平行鎖を意味している。従って、ポリヌクレオチドは一本鎖若しくは二本鎖いずれの核酸でもありうる。
【０１９１】
「核酸」という用語は、典型的には大型ポリヌクレオチドを指す。
【０１９２】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、一般に約５０ヌクレオチドより大きくない短いポリヌクレオチドを典型的に指す。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわちＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）により表される場合、これは「Ｕ」が「Ｔ」を置き換えるＲＮＡ配列（すなわちＡ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）もまた包含することが理解されるであろう。
【０１９３】
ポリヌクレオチド配列を記述するのに慣習的表記法を本明細書で使用する。すなわち、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端が５’端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側の方向が５’方向と称される。
【０１９４】
新生ＲＮＡ転写物へのヌクレオチドの５’から３’の付加の方向が転写の方向と称される。ｍＲＮＡと同一配列を有するＤＮＡ鎖は「コーディング鎖」と称され；ＤＮＡの参照点に対し５’に位置するＤＮＡ鎖上の配列は「上流配列」と称され；ＤＮＡの参照点に対し３’であるＤＮＡ鎖上の配列は「下流配列」と称される。
【０１９５】
「キメラＲＮＡポリメラーゼ結合ドメイン（ＣＲＰＢＤ）」は、検出体結合ドメインに特異的に結合する検出体分子中のポリペプチド若しくは分子を指すのに本明細書で使用する。
【０１９６】
「キメラリボソーム結合ドメイン（ＣＲＢＤ）」は、リボソーム中の検出体結合ドメインに特異的に結合する検出体分子中のポリペプチド若しくは分子を指すのに本明細書で使用する。
【０１９７】
「キメラ酵素結合ドメイン（ＣＥＢＤ）」は、酵素中の検出体結合ドメインに特異的に結合する検出体分子中のポリペプチド若しくは分子を指すのに本明細書で使用する。
【０１９８】
ポリヌクレオチドの「部分」は、該ポリヌクレオチドの最低約２０の連続するヌクレオチド残基を意味している。ポリヌクレオチドの一部分は該ポリヌクレオチドのすべてのヌクレオチド残基を包含しうることが理解される。
【０１９９】
「プライマー」は、指定されるポリヌクレオチド鋳型に特異的にハイブリダイズしかつ相補ポリヌクレオチドの合成の開始点を提供することが可能であるポリヌクレオチドを指す。こうした合成は、合成が誘導される条件下、すなわちヌクレオチド、相補ポリヌクレオチド鋳型、およびＤＮＡポリメラーゼのような重合のための剤の存在下にポリヌクレオチドプライマーが置かれる場合に発生する。プライマーは典型的に一本鎖であるが、しかし二本鎖でありうる。プライマーは典型的にデオキシリボ核酸であるが、しかし多様な合成および天然に存在するプライマーが多くの応用に有用である。プライマーは、それがハイブリダイズして合成の開始のための部位としてはたらくように設計されている鋳型に相補的であるが、しかし該鋳型の正確な配列を反映する必要はない。こうした場合、鋳型へのプライマーの特異的ハイブリダイゼーションはハイブリダイゼーション条件の緊縮性に依存する。プライマーは、例えば色素生産性、放射活性若しくは蛍光部分で標識し得、そして検出可能な部分として使用し得る。
【０２００】
「プローブ」は、別のポリヌクレオチドの指定される配列に特異的にハイブリダイズすることが可能であるポリヌクレオチドを指す。プローブは標的の相補ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするが、しかし該鋳型の正確な相補配列を反映する必要はない。こうした場合、標的へのプローブの特異的ハイブリダイゼーションはハイブリダイゼーション条件の緊縮性に依存する。プローブは、例えば色素生産性、放射活性若しくは蛍光部分で標識し得、そして検出可能な部分として使用し得る。
【０２０１】
「組換えポリヌクレオチド」は、天然に一緒に結合されていない配列を有するポリヌクレオチドを指す。増幅若しくは集成された組換えポリヌクレオチドを適するベクターに包含することができ、そして該ベクターを使用して適する宿主細胞を形質転換し得る。組換えポリヌクレオチドは、コーディング以外の機能（例えばプロモーター、複製起点、リボソーム結合部位など）ならびにコーディング機能を供しうる。
【０２０２】
組換えポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞は「組換え宿主細胞」と称される。遺伝子が組み換えポリヌクレオチドを含んでなる組換え宿主細胞中で発現される遺伝子は「組換えポリペプチド」を産生する。
【０２０３】
「組換えポリペプチド」は組換えポリヌクレオチドの発現に際して産生されるものである。
【０２０４】
「ポリペプチド」は、アミノ酸残基、関連する天然に存在する構造バリアント、およびペプチド結合を介して連結されたそれらの合成の天然に存在しないアナログから構成されるポリマーを指す。合成ポリペプチドは、例えば自動ポリペプチド合成機を使用して合成し得る。
【０２０５】
「タンパク質」という用語は典型的に大型ポリペプチドを指す。
【０２０６】
「ペプチド」という用語は典型的に短いポリペプチドを指す。
【０２０７】
ポリペプチド配列を表現するのに慣習的表記法を本明細書で使用する。すなわち、ポリペプチド配列の左側はアミノ末端であり；ポリペプチド配列の右側はカルボキシル末端である。
【０２０８】
本明細書で使用されるところの「プロモーター／制御配列」という用語は、該プロモーター／制御配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列を意味している。いくつかの例において、この配列はコアプロモーター配列であることができ、また、他の例において、この配列は、エンハンサー配列、および遺伝子産物の発現に必要とされる他の調節エレメントもまた包含しうる。プロモーター／制御配列は、例えば、組織特異的様式で遺伝子産物を発現するものでありうる。
【０２０９】
「キメラＲＮＡポリメラーゼ」は、ＲＮＡポリメラーゼ中に天然に存在しないペプチドを含んでなるＲＮＡポリメラーゼ分子を指すのに本明細書で使用する。
【０２１０】
本明細書で使用されるところの「ＲＮＡポリメラーゼ分子」若しくは「ＲＮＡポリメラーゼ」は、ヌクレオシド三リン酸前駆体からのＤＮＡ鋳型上でのＲＮＡ分子の合成を触媒する酵素を意味している。
【０２１１】
「シグナリング部分」は、刺激されるか若しくは動かされる場合にシグナルを発し、該シグナルが機械若しくはヒトにより検出可能である、１個若しくはそれ以上の分子を指すのに本明細書で使用する。
【０２１２】
本明細書で使用されるところの「特異的に結合する」という用語により、あるドメイン、例えばＳＨ３ドメイン若しくはα−ＰＡＫドメインを認識かつ結合するがしかしサンプル中の他の分子を実質的に認識若しくは結合しないエピトープ若しくはタンパク質を認識かつ結合する抗体を意味している。
【０２１３】
「治療的」処置は、病理の徴候を減少若しくは排除する目的上それらの徴候を表す被験体に投与される処置である。
【０２１４】
化合物の「治療的有効量」は、該化合物を投与する被験体に有益な効果を提供するのに十分である化合物の量である。
【０２１５】
本明細書で使用されるところの「導入遺伝子」は、あるアミノ酸配列をコードする核酸
に作動可能に連結されたプロモーター／制御配列をコードする核酸を含んでなる外因性核酸配列を意味しており、その外因性核酸は動物若しくは細胞によりコードされる。
【０２１６】
「三ヌクレオチド」は２個の共有結合を共有する３ヌクレオチドを指すのに本明細書で使用する。
【０２１７】
「ベクター」は、単離された核酸を含んでなりかつ細胞の内側に該単離された核酸を送達するのに使用し得る組成物である。限定されるものでないが、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性若しくは両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを挙げることができる多数のベクターが当該技術分野で既知である。従って、「ベクター」という用語は自律複製プラスミド若しくはウイルスを包含する。該用語は、例えばポリリシン化合物、リポソームなどのような、核酸の細胞中への移入を容易にするプラスミド以外およびウイルス以外の化合物を包含するともまた解釈されるべきである。ウイルスベクターの例は、限定されるものでないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどを挙げることができる。
【０２１８】
「発現ベクター」は、発現されるべきヌクレオチド配列に効果的に連結された発現制御配列を含んでなる組換えポリヌクレオチドを含んでなるベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用性エレメントを含んでなり；発現のための他のエレメントは宿主細胞により、若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系で供給され得る。発現ベクターは、組換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド（例えば裸の若しくはリポソームに含有される）およびウイルスのような当該技術分野で既知の全部のものを包含する。
【０２１９】
記述
Ｉ．単離された核酸
本発明は、キメラＲＮＡポリメラーゼをコードする単離された核酸若しくはそのフラグメントを包含し、該キメラＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ、検出体結合ドメイン、ならびに、場合によっては、ＲＮＡポリメラーゼと検出体結合ドメインの間に約１から約３個までのプロリンを含んでなる可変スペーサーペプチドを含んでなる。
【０２２０】
ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸は、配列番号１の配列を有する核酸と最低約５０％の同一性を共有する。好ましくは、該核酸は配列番号１に約６０％同一であり、より好ましくは、該核酸は約６５％同一である。好ましくは、該核酸は配列番号１に約７０％同一であり、より好ましくは、該核酸は約７５％同一である。好ましくは、該核酸は配列番号１に約８０％同一であり、より好ましくは、該核酸は約８５％同一である。好ましくは、該核酸は配列番号１に約９０％同一であり、より好ましくは、該核酸は約９５％同一である。好ましくは、該核酸は配列番号１に約９７％同一であり、より好ましくは、該核酸は約９８％同一である。好ましくは、該核酸は配列番号１に約９９％同一であり、より好ましくは、該核酸は約９９．９％同一である。なおより好ましくは、該核酸は配列番号１に同一であり、該核酸はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする。
【０２２１】
キメラＲＮＡポリメラーゼの検出体結合ドメインをコードする核酸は、配列番号２の配列を有する核酸と最低約５０％の同一性を共有する。好ましくは、該核酸は配列番号２に約６０％同一であり、より好ましくは、該核酸は約６５％同一である。好ましくは、該核酸は配列番号２に約７０％同一であり、より好ましくは、該核酸は約７５％同一である。好ましくは、該核酸は配列番号２に約８０％同一であり、より好ましくは、該核酸は約８５％同一である。好ましくは、該核酸は配列番号２に約９０％同一であり、より好ましくは、該核酸は約９５％同一である。好ましくは、該核酸は配列番号２に約９７％同一であり、より好ましくは、該核酸は約９８％同一である。好ましくは、該核酸は配列番号２に約９９％同一であり、より好ましくは、該核酸は約９９．９％同一である。なおより好ましくは、該核酸は配列番号２であり、該核酸はα−ＰＡＫを結合するラットβ−ｐｉｘ  ＳＨ３ドメインをコードする。
【０２２２】
本発明のキメラＲＮＡポリメラーゼは、検出体結合ドメインに直接融合されたＲＮＡポリメラーゼを含み得る。あるいは、キメラＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼと検出体結合ドメインの間に可変スペーサーペプチドを含み得る。可変スペーサーペプチドは１個若しくはそれ以上のアミノ酸を含んでなるポリペプチドを含み得る。好ましくは、可変スペーサーペプチドは約１ないし約１０の間のアミノ酸、好ましくは約２から約９アミノ酸まで、なおより好ましくは約３から約８アミノ酸まで、なおより好ましくは約４から約７アミノ酸まで、なおより好ましくは約５から約６アミノ酸までを含んでなる。最も好ましくは、スペーサーペプチドは約１ないし約３アミノ酸を含んでなる。なおより好ましくは、スペーサーペプチド中のアミノ酸はプロリンである。一例として、検出体結合ドメインとＲＮＡポリメラーゼの間のスペーサーペプチド中にプロリンを含まないキメラＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸は、配列番号２１（ＧＧＣＧＡＴＡＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＡＴＣＧＧＣＴＴＴ  ＧＧＣ）を含み得る。検出体結合ドメインとＲＮＡポリメラーゼの間のリンカー中に１個のプロリンを含んでなるキメラＲＮＡポリメラーゼは、配列番号２２（ＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＡＧＧＣＡＴＧＴＧＴＧＧＣＧＧＣ）を含んでなる核酸によりコードされ得る。検出体結合ドメインとＲＮＡポリメラーゼの間のリンカー中に２個のプロリンを含んでなるキメラＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸は、配列番号２３（ＧＧＣＣＣＡＧＡＴＧＡＴＡＣＴＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＣＧＧＣ）を含み得る。検出体結合ドメインとＲＮＡポリメラーゼの間のリンカー中に３個のプロリンを含んでなるキメラＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸は、配列番号２４（ＧＧＣＣＣＡＣＣＡＧＡＴＡＣＴＣＣＡＴＡＣＧＣＣＧＡＴＧＧＣ）を含み得る。当業者により認識されるであろうとおり、本発明はスペーサー領域ペプチド中のプロリンに限定されないが、しかしむしろ本明細書の別の場所に示されるものを包含するいかなるアミノ酸も含み得る。こうしたアミノ酸をコードするコドン、および核酸配列中へのコドンの組み込み方法は当該技術分野で公知であり、かつ、本明細書の別の場所に記述される。
【０２２３】
本発明はまた、キメラリボソームサブユニット成分をコードする単離された核酸若しくはそのフラグメントも包含し、該キメラリボソームサブユニット成分は、リボソームサブユニットの１成分、検出体結合ドメイン、ならびに、場合によっては、リボソームサブユニットおよび検出体結合ドメインのキメラ成分の間に約１から約３個までのプロリンを含んでなる可変スペーサーペプチドを含んでなる。好ましくは、リボソームサブユニットはＬ１サブユニットである。キメラリボソームサブユニット成分はキメラリボソーム分子の一部である。好ましくは、リボソームは原核生物リボソームである。別の態様において、リボソームは、哺乳動物リボソーム、酵母リボソーム、植物リボソームなどのような真核生物リボソームである。一態様において、リボソームサブユニット成分は３０ｓサブユニットの１成分（すなわち３０ｓサブユニット中の約２１種のタンパク質の１種）であり、別の態様において、キメラリボソームサブユニット成分は５０ｓサブユニットの１成分（すなわち５０ｓサブユニット中の約３４種のタンパク質の１種、好ましくはＬ１サブユニット）である。別の態様において、リボソームサブユニット成分は６０ｓの大サブユニットの１成分若しくは４０ｓの小サブユニットの１成分である。
【０２２４】
リボソームサブユニット成分をコードする核酸は、配列番号６の配列を有する核酸と最低約５０％の同一性を共有する。好ましくは、該核酸は配列番号６に約６０％同一であり、より好ましくは、該核酸は約６５％同一である。好ましくは、該核酸は配列番号６に約７０％同一であり、より好ましくは、該核酸は約７５％同一である。好ましくは、該核酸は配列番号６に約８０％同一であり、より好ましくは、該核酸は約８５％同一である。好ましくは、該核酸は配列番号６に約９０％同一であり、より好ましくは、該核酸は約９５％同一である。好ましくは、該核酸は配列番号６に約９７％同一であり、より好ましくは、該核酸は約９８％同一である。好ましくは、該核酸は配列番号６に約９９％同一であり、より好ましくは、該核酸は約９９．９％同一である。なおより好ましくは、該核酸は配列番号６に同一であり、該核酸は細菌の５０ｓサブユニットのＬ１成分をコードする。
【０２２５】
キメラリボソームサブユニット成分中の検出体結合ドメインをコードする核酸は、配列番号２の配列を有する核酸と最低約５０％の同一性を共有する。好ましくは、該核酸は配列番号２に約６０％同一であり、より好ましくは、該核酸は約６５％同一である。好ましくは、該核酸は配列番号２に約７０％同一であり、より好ましくは、該核酸は約７５％同一である。好ましくは、該核酸は配列番号２に約８０％同一であり、より好ましくは、該核酸は約８５％同一である。好ましくは、該核酸は配列番号２に約９０％同一であり、より好ましくは、該核酸は約９５％同一である。好ましくは、該核酸は配列番号２に約９７％同一であり、より好ましくは、該核酸は９８％同一である、好ましくは、該核酸は配列番号２に約９９％同一であり、より好ましくは、該核酸は約９９．９％同一である。なおより好ましくは、該核酸は配列番号２であり、該核酸はα−ＰＡＫを結合するラットβ−ｐｉｘ  ＳＨ３ドメインをコードする。
【０２２６】
本発明のキメラリボソームサブユニット成分は、検出体結合ドメインに直接融合されたリボソームを含み得る。あるいは、キメラリボソームサブユニット成分は、リボソームサブユニット成分と検出体結合ドメインの間にスペーサーペプチドを含み得る。該スペーサー領域ペプチドは１個若しくはそれ以上のアミノ酸を含み得る。好ましくは、スペーサー領域ペプチドは、約１ないし約１０アミノ酸の間、好ましくは約２から約９アミノ酸まで、なおより好ましくは約３から約８アミノ酸まで、なおより好ましくは約４から約７アミノ酸まで、なおより好ましくは約５から約６アミノ酸までを含んでなる。最も好ましくは、スペーサーペプチドは約１ないし約３アミノ酸を含んでなる。
【０２２７】
本発明の単離された核酸は、本発明のキメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分をコードするＲＮＡ若しくはＤＮＡ配列、およびそれが細胞を含まない場合若しくはそれが細胞と会合される場合にヌクレオチド配列をより安定にするＤＮＡ若しくはＲＮＡの化学修飾を包含するそれらのいかなる修飾された形態も包含すると解釈されるべきである。ヌクレオチドの化学修飾は、ヌクレオチド配列が細胞により取り込まれる効率若しくはそれが細胞中で発現される効率を高めるのにもまた使用しうる。該ヌクレオチド配列の修飾のいかなるおよび全部の組み合わせを本発明で企図している。
【０２２８】
本発明は、本明細書に開示される核酸およびアミノ酸配列にのみ制限されると解釈されるべきでない。本発明を一旦備えれば、キメラＲＮＡポリメラーゼ、キメラリボソームサブユニット成分、ＲＮＡポリメラーゼ、検出体結合ドメイン若しくはスペーサーペプチドをコードする他の核酸を、本明細書に開示されるところのキメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分をコードする他の単離された核酸の生成のための本明細書で実験の詳細の節に記述される手順（例えば部位特異的突然変異誘発、フレームシフト突然変異など）、および当該技術分野で公知であるか若しくは開発されるはずである手順に従うことにより得ることができることが、当業者に容易に明らかである。一例として、本発明は、ロイシンジッパーモチーフの一方のヘリックスを含んでなる検出体結合ドメイン、およびロイシンジッパーモチーフの他方のヘリックスを含んでなるＣＲＰＢＤを含み得る。
【０２２９】
さらに、いずれかの他の数の手順を、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ  ＆  Ｗｉｌｅｙ、ニューヨーク）に記述され
るもののような当該技術分野で公知の組換えＤＮＡの方法論を使用するキメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分の誘導体若しくはバリアントの形態の生成に使用しうる。
【０２３０】
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を変更することによるタンパク質若しくはポリペプチド中のアミノ酸変化の導入手順は当該技術分野で公知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１、上記）；Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９７、上記）にもまた記述されている。
【０２３１】
本発明はまた、それに共有結合された標識ポリペプチドをコードする核酸をさらに含んでなる、キメラＲＮＡポリメラーゼ、キメラリボソームサブユニット成分、ＲＮＡポリメラーゼ、検出体結合ドメイン若しくはスペーサーペプチドをコードする核酸も包含する。すなわち、本発明は、標識ポリペプチドをコードする核酸配列がキメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分をコードする核酸に共有結合されているキメラ核酸を包含する。こうした標識ポリペプチドは当該技術分野で公知であり、そして、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍｙｃ、ｍｙｃ−ピルビン酸キナーゼ（ｍｙｃ−ＰＫ）、Ｈｉｓ６、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、インフルエンザウイルスヘマグルチニン標識ポリペプチド、ｆｌａｇ標識ポリペプチド（ＦＬＡＧ）およびグルタチン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）標識ポリペプチドを包含する。しかしながら、本発明は、上に列挙される標識ポリペプチドをコードする核酸に制限されると決して解釈されるべきでない。むしろ、これらの標識ポリペプチドに実質的に類似の様式で機能しうるポリペプチドをコードするいかなる核酸配列も、本発明に包含されると解釈されるべきである。
【０２３２】
標識ポリペプチドをコードする核酸を含んでなる核酸は、キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分を細胞、組織および／若しくは全生物体（例えば哺乳動物細胞）内で位置推定し、キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分を細胞の核内で検出し、キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分をガラス製スライドガラス若しくは他の支持体上で検出し、かつ／または細胞中のキメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分の役割（１種若しくは複数）を研究するのに使用し得る。さらに、標識ポリペプチドの付加は、本発明のタンパク質が容易に産生かつ精製され得るような「標識された」タンパク質の単離および精製を容易にする。
【０２３３】
ＩＩ．単離されたポリペプチド
本発明は、キメラＲＮＡポリメラーゼを含んでなる単離されたポリペプチド若しくはそのフラグメントを包含し、該キメラＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ、検出体結合ドメイン、ならびに、場合によっては、ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドと検出体結合ドメインポリペプチドの間に約１から約３個までのプロリンを含んでなる可変スペーサーペプチドを含んでなる。好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド若しくはそのフラグメントに最低約５０％同一である。好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドは、配列番号３若しくはその何らかのフラグメントに約５５％同一、より好ましくは約６０％同一、より好ましくは約６５％同一である。なおより好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドは、配列番号３若しくはその何らかのフラグメントに約７０％同一、より好ましくは約７５％同一、より好ましくは約８０％同一である。より好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドは、配列番号３若しくはその何らかのフラグメントに約８５％同一、より好ましくは約９０％同一、より好ましくは約９５％同一である。なおより好ましくは、単離されたＲＮＡポリメラーゼポリペプチドは、配列番号３若しくはその何らかのフラグメントに約９６％同一、より好ましくは約９７％同一、より好ましくは約９８％同一、およびなおより好ましくは約９９％同一である。最も好ましくは、キメラＲＮＡポリメラーゼ中のＲＮＡポリメラーゼポリペプチドは、配列番号３すなわちＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列である。
【０２３４】
キメラＲＮＡポリメラーゼを含んでなる単離されたポリペプチドは検出体結合ドメインをさらに含んでなる。好ましくは、検出体結合ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチド若しくはそのフラグメントに最低約５０％同一である。好ましくは、検出体結合ドメインポリペプチドは、配列番号４若しくはその何らかのフラグメントに約５５％同一、より好ましくは約６０％同一、より好ましくは約６５％同一である。なおより好ましくは、検出体結合ドメインポリペプチドは、配列番号４若しくはその何らかのフラグメントに約７０％同一、より好ましくは約７５％同一、より好ましくは約８０％同一である。より好ましくは、検出体結合ドメインポリペプチドは、配列番号４若しくはその何らかのフラグメントに約８５％同一、より好ましくは約９０％同一、より好ましくは約９５％同一である。なおより好ましくは、検出体結合ドメインポリペプチドは、配列番号４若しくはその何らかのフラグメントに約９６％同一、より好ましくは約９７％同一、より好ましくは約９８％同一、およびなおより好ましくは約９９％同一である。最も好ましくは、検出体結合ドメインを含んでなる単離されたポリペプチドの部分は、配列番号４、すなわちα−ＰＡＫを結合するラットβ−ＰＩＸからのＳＨ３ドメインのアミノ酸配列である。
【０２３５】
本発明のキメラＲＮＡポリメラーゼは、検出体結合ドメインに直接融合されたＲＮＡポリメラーゼを含み得るか、若しくは、あるいは、それは、ＲＮＡポリメラーゼポリペプチドと検出体結合ドメインポリペプチドの間にスペーサーペプチドを含み得る。スペーサーペプチドは１個若しくはそれ以上のアミノ酸を含み得る。好ましくは、スペーサーペプチドは、約１ないし約１０アミノ酸の間、好ましくは約２から約９アミノ酸まで、なおより好ましくは約３から約８アミノ酸まで、なおより好ましくは約４から約７アミノ酸まで、なおより好ましくは約５から約６アミノ酸までを含んでなる。最も好ましくは、スペーサーペプチドは約１ないし約３アミノ酸を含んでなる。好ましくは、スペーサーペプチドは１個のプロリンを含んでなる。
【０２３６】
本発明はまた、キメラリボソームサブユニット成分を含んでなる単離されたポリペプチド若しくはそのフラグメントも包含し、該キメラリボソームサブユニット成分は、リボソームサブユニット成分、検出体結合ドメイン、およびリボソームサブユニット成分と検出体結合ドメインの間の約１から約３個までのプロリンを含んでなる可変リンカー領域を含んでなる。好ましくは、リボソームサブユニット成分を含んでなる単離されたポリペプチドは原核生物リボソーム由来である。より好ましくは、リボソームサブユニット成分は原核生物リボソームの５０ｓサブユニットの１成分である。好ましくは、リボソームサブユニット成分は、配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチド若しくはそのフラグメントに最低約５０％同一である。好ましくは、リボソームサブユニット成分は、配列番号７若しくはその何らかのフラグメントに約５５％同一、より好ましくは約６０％同一、より好ましくは約６５％同一である。なおより好ましくは、リボソームサブユニット成分は、配列番号７若しくはその何らかのフラグメントに約７０％同一、より好ましくは約７５％同一、より好ましくは約８０％同一である。より好ましくは、リボソームサブユニット成分は、配列番号７若しくはその何らかのフラグメントに約８５％同一、より好ましくは約９０％同一、より好ましくは約９５％同一である。なおより好ましくは、ｉリボソームサブユニット成分は、配列番号７若しくはその何らかのフラグメントに約９６％同一、より好ましくは約９７％同一、より好ましくは約９８％同一、およびなおより好ましくは約９９％同一である。最も好ましくは、リボソームサブユニット成分は、配列番号７、すなわち原核生物リボソームの５０ｓサブユニットのＬ１成分のアミノ酸配列である。
【０２３７】
キメラリボソームサブユニット成分を含んでなる単離されたポリペプチドは、検出体結
合ドメインをさらに含んでなる。好ましくは、検出体結合ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチド若しくはそのフラグメントに最低約５０％同一である。好ましくは、検出体結合ドメインポリペプチドは、配列番号４若しくはその何らかのフラグメントに約５５％同一、より好ましくは約６０％同一、より好ましくは約６５％同一である。なおより好ましくは、検出体結合ドメインポリペプチドは、配列番号４若しくはその何らかのフラグメントに約７０％同一、より好ましくは約７５％同一、より好ましくは約８０％同一である。より好ましくは、検出体結合ドメインポリペプチドは、配列番号４若しくはその何らかのフラグメントに約８５％同一、より好ましくは約９０％同一、より好ましくは約９５％同一である。なおより好ましくは、検出体結合ドメインポリペプチドは、配列番号４若しくはその何らかのフラグメントに約９６％同一、より好ましくは約９７％同一、より好ましくは約９８％同一、およびなおより好ましくは約９９％同一である。最も好ましくは、検出体結合ドメインを含んでなるキメラリボソームサブユニット成分ポリペプチドの該部分は、配列番号４、すなわちα−ＰＡＫを結合するラットβ−ＰＩＸ  ＳＨ３ドメインのアミノ酸配列である。
【０２３８】
本発明のキメラリボソームはキメラリボソームサブユニット成分を含んでなる。キメラリボソームサブユニット成分は、検出体結合ドメインに直接融合されたリボソームサブユニット成分を含み得るか、若しくは、あるいは、キメラリボソームサブユニット成分は、リボソームと検出体結合ドメインポリペプチドの間にスペーサーペプチドを含み得る。スペーサーペプチドは１個若しくはそれ以上のアミノ酸を含み得る。好ましくは、スペーサーペプチドは、約１と約１０アミノ酸の間、好ましくは約２から約９アミノ酸まで、なおより好ましくは約３から約８アミノ酸まで、なおより好ましくは約４から約７アミノ酸まで、なおより好ましくは約５から約６アミノ酸までを含んでなる。最も好ましくは、スペーサーペプチドは約１ないし約３アミノ酸を含んでなる。好ましくは、スペーサーペプチドは１個のプロリンを含んでなる。
【０２３９】
本発明は、核酸を転写するキメラ酵素を含んでなる単離されたポリペプチド若しくはそのフラグメントを包含し、該キメラ酵素は、核酸を転写する酵素、検出体結合ドメイン、および、場合によっては、酵素と検出体結合ドメインポリペプチドの間に約１から約３個までのプロリンを含んでなる可変スペーサーペプチドを含んでなる。一態様において、核酸を転写する酵素はＤＮＡポリメラーゼである。
【０２４０】
ＩＩＩ．単離されたポリペプチドのコンジュゲート
本発明は、単離されたポリペプチドおよびペプチド以外の分子を含んでなる単離されたポリペプチドのコンジュゲートをさらに包含する。本発明の単離されたポリペプチドのコンジュゲートは検出体分子を包含する。一態様において、検出体分子は、キメラＲＮＡポリメラーゼの検出体結合ドメインに特異的に結合するＣＲＰＢＤ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、および相互に共有若しくは別の方法で化学的に結合されたシグナリング部分を含んでなる。一態様において、検出体分子は、キメラリボソームの検出体結合ドメインに特異的に結合するＣＲＢＤ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、および相互に共有若しくは別の方法で化学的に結合されたシグナリング部分を含んでなる。なお別の態様において、検出体分子は、キメラ酵素の検出体結合ドメインに特異的に結合するＣＥＢＤ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、および相互に共有若しくは別の方法で化学的に結合されたシグナリング部分を含んでなる。加えて、検出体分子は、また検出体分子の残部に共有若しくは別の方法で化学的に結合されうる細胞透過性ペプチドを含み得る。
【０２４１】
検出体分子は、本明細書の別の場所に記述されるキメラＲＮＡポリメラーゼのような別のポリペプチド中の検出体結合ドメインに特異的に結合するＣＲＰＢＤ、ＣＲＢＤ若しくはＣＥＢＤを含んでなる。好ましくは、ＣＲＰＢＤ、ＣＲＢＤ若しくはＣＥＢＤは、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチド若しくはそのフラグメントに最低約７５％同
一である。好ましくは、ＣＲＰＢＤ、ＣＲＢＤ若しくはＣＥＢＤは、配列番号５若しくはその何らかのフラグメントに約８０％同一、より好ましくは約８５％同一、より好ましくは約９０％同一である。なおより好ましくは、ＣＲＰＢＤ、ＣＲＢＤ若しくはＣＥＢＤは、配列番号５若しくはその何らかのフラグメントに約９５％同一、より好ましくは約９６％同一、より好ましくは約９７％同一である。より好ましくは、検出体分子のＣＲＰＢＤ、ＣＲＢＤ若しくはＣＥＢＤは、配列番号５若しくはその何らかのフラグメントに約９８％同一、より好ましくは約９９％同一である。最も好ましくは、検出体分子のＣＲＰＢＤ、ＣＲＢＤ若しくはＣＥＢＤは配列番号５である。当業者は、本開示および本明細書に開示される方法を備える場合に、ＣＲＰＢＤ、ＣＲＢＤ若しくはＣＥＢＤが、配列番号５若しくはそのフラグメントおよび相同なバリアントに制限されないが、しかしむしろいかなるポリペプチド（そのポリペプチドは、キメラＲＮＡポリメラーゼの一部であり得る別のポリペプチドを特異的に結合する）も包含することを容易に認識するとみられる。
【０２４２】
検出体分子は、シグナリング部分のリンカー若しくは結合点としてはたらくための付加的なペプチド配列をさらに含み得る。検出体分子のＣＲＰＢＤ、ＣＲＢＤ若しくはＣＥＢＤは、キメラＲＮＡポリメラーゼの検出体結合ドメインに特異的に結合しないがしかしむしろＲＮＡポリメラーゼを特異的に結合する抗体若しくはそのフラグメントの結合点としてはたらくペプチド配列をさらに含み得る。従って、本発明は、抗体若しくはそのフラグメントに結合されたＣＲＰＢＤをさらに包含する。
【０２４３】
本発明の結合体分子は、本発明の方法で新生ＲＮＡ若しくはＤＮＡに結合するペプチド核酸（ＰＮＡ）をさらに含んでなる。ＰＮＡは単量体、二量体、三量体若しくはより高次のポリマーであり得る。好ましくは、検出体分子に結合されたＰＮＡは二ヌクレオチド若しくは三ヌクレオチドを特異的に結合する。ＰＮＡ単量体は、ＤＮＡで見出される４種の塩基（アデニン、グアニン、チミンおよびシトシン）の１種へのメチレンカルボニル結合により連結された２−アミノエチルグリシンである。アミノ酸と同様、ＰＮＡ単量体はアミノおよびカルボキシル末端を有する。ヌクレオチドと異なり、ＰＮＡ単量体は五炭糖リン酸基を欠く。ＰＮＡのＮ末端は相補一本鎖ＤＮＡの５’端にハイブリダイズする（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４、１４９７；Ｅｇｈｏｍら、１９９２、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４、１８９５；ｌｌａｎｖｅｙら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８、１４８１）。
【０２４４】
検出体分子のＰＮＡは、Ａ，Ｔ、ＣおよびＧの普遍的塩基を使用するいかなる配列でもあり得る。従って、ＰＮＡは、ＡＡ、ＡＴ、ＡＣ、ＡＧ、ＴＡ、ＴＴ、ＴＣ、ＴＧ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＧ、ＧＡ、ＧＴ、ＧＣ若しくはＧＧのような二ヌクレオチドを結合し得る。当業者は、上のおよび本明細書の別の場所に開示される例を考えれば、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧの多様な順列から作成される配列を有する三ヌクレオチドを結合するＰＮＡを容易に製造し得、そして従ってこうした配列はここで再現される必要はない。好ましくは、ＰＮＡは新生ＲＮＡの三ヌクレオチドを結合する。
【０２４５】
本発明の検出体分子は、シグナリング部分として集合的に作動する２種若しくはそれ以上の分子をさらに含んでなる。シグナリング部分の１分子は、ＲｅＡｓＨ分子、ビス−（（Ｎ−ヨードアセチル）ピペラジニル）スルホンローダミン（ＢＳＲ）分子、Ｃｙ３Ｂ分子、Ｃｙ５分子若しくはフルオレセイン分子のような蛍光分子である。第二の分子は、ＲｅＡｓＨ分子、ビス−（（Ｎ−ヨードアセチル）ピペラジニル）スルホンローダミン（ＢＳＲ）分子、Ｃｙ３Ｂ分子、Ｃｙ５分子若しくはフルオレセイン分子のような蛍光分子である。第三のおよび付加的な分子は、ＲｅＡｓＨ分子、ビス−（（Ｎ−ヨードアセチル）ピペラジニル）スルホンローダミン（ＢＳＲ）分子、Ｃｙ３Ｂ分子、Ｃｙ５分子若しくはフルオレセイン分子であり得る。好ましくは、シグナリング部分は、フルオレセイン分子およびＢＳＲ分子、若しくはフルオレセイン分子およびＣｙ３Ｂ分子のような２種の蛍光分子を含んでなる。従って、本開示により示されるとおり、本発明の検出体分子は、本明細書の別の場所に開示されかつ当該技術分野で既知の方法の１つにより検出可能な蛍光若しくは極性シグナルを生成することが可能である分子のいかなる組み合わせも含み得る。加えて、本発明は、検出可能な蛍光若しくは極性分子を増幅することが可能である付加的な蛍光若しくは極性生成分子で補足される検出可能な蛍光若しくは極性シグナルを生成する２種若しくはそれ以上の分子の使用を含み得る。
【０２４６】
シグナリング部分は、１個の蛍光分子が検出体分子のＣＲＰＢＤ若しくは検出体分子のＣＲＰＢＤに結合されたポリペプチドに結合されるような検出体分子に共有若しくは別の方法で化学的に結合される。第二の蛍光分子は、ＰＮＡおよび１個若しくはそれ以上のアミノ酸がシグナリング部分を含んでなる第一および第二の蛍光分子の間にあるようなＰＮＡにより検出体分子の残部から分離されたアミノ酸上で、検出体分子に共有若しくは別の方法で化学的に結合される。
【０２４７】
検出体分子は、検出体分子に共有若しくは別の方法で化学的に結合された細胞透過性ペプチドをさらに含み得る。好ましくは、細胞透過性ペプチドは２個のシステイン間のジスルフィド結合を介して検出体分子に結合される。細胞透過性ペプチドは、限定されるものでないが、トランスポータンペプチド（ＴＰ）、ＴＰ１０ペプチド、ｐＶＥＣペプチド、ペネトラチンペプチド、ｔａｔフラグメントペプチド、シグナル配列をベースとするペプチド、両親媒性モデルペプチドなどを挙げることができる、当該技術分野で既知のいかなる細胞透過性ペプチドでもあり得る。細胞透過性ペプチドの配列は当該技術分野で公知であり、そして本明細書の別の場所に開示される。一例として、細胞透過性ペプチドＴＰ、ＴＰ１０およびｐＶＥＣの配列は、例えば、Ｅｉｒiｋｓｄoｔｔｉｒら（２００４、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１：１６１−１７３）および表１に開示される。
【０２４８】
【表１】
2008545394.tif 000003
【０２４９】
検出体分子は、細胞上に存在する細胞受容体を結合するリガンドのような細胞内到達性ドメインもまた含み得る。こうした細胞内到達性ドメインは、限定されるものでないが、細胞上の葉酸受容体を結合する検出体分子に結合された葉酸などを挙げることができる。
【０２５０】
本発明の検出体分子およびキメラＲＮＡポリメラーゼは核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含み得る。ＮＬＳは当該技術分野で公知であり、そして例えばＮａｉｒら（２００３、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：３９７−３９９）に記述される。ＳＶ４０ラージＴ抗原由来のＮＬＳの一例はＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３３）である。
【０２５１】
本発明は、ＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラＲＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラＲＮＡポリメラーゼに結合された検出体分子を含んでなるヌクレオペプチドコンジュゲート複合体をさらに含んでなる。検出体分子および組換え分子は、検出体分子のＣＲＰＢＤおよびキメラＲＮＡポリメラーゼの検出体結合ドメインにより結合される。検出体分子のＣＲＰＢＤは、本明細書の別の場所に記述される特異的タンパク質−タンパク質親和性を介して、キメラＲＮＡポリメラーゼの検出体結合ドメインに特異的に結合する。こうした特異的タンパク質−タンパク質結合は、本明細書の別の場所に開示される本発明の方法で有用である、キメラＲＮＡポリメラーゼおよび検出体分子を含んでなるヌクレオペプチドコンジュゲート複合体を形成する。
【０２５２】
あるいは、検出体分子は、該検出体分子に共有結合されている抗体若しくはそのフラグメントを介してＲＮＡポリメラーゼに結合される。好ましくは、該抗体は検出体分子に結合され、そして、本発明の方法に有用である様式で該検出体分子がＲＮＡポリメラーゼに結合されるようなＲＮＡポリメラーゼを特異的に結合する。
【０２５３】
本発明のヌクレオペプチドコンジュゲート複合体は、キメラＲＮＡポリメラーゼ、ならびに検出体結合ドメイン、ＣＲＰＢＤ、蛍光分子を含んでなるシグナル伝達分子、ＰＮＡおよび細胞透過性ペプチドを包含する検出体分子の多様な成分を含んでなる。検出体分子は、キメラＲＮＡポリメラーゼの検出体結合ドメインを選択的に結合する検出体分子のＣＲＰＢＤによりキメラＲＮＡポリメラーゼに特異的に結合する。
【０２５４】
本発明はまた、本明細書に開示されるところのキメラＲＮＡポリメラーゼ若しくは検出体分子を含んでなるタンパク質若しくはペプチドのアナログも提供する。アナログは、保存的アミノ酸配列の差違、若しくは配列に影響を及ぼさない修飾、または双方により、天然に存在するタンパク質若しくはペプチドと異なりうる。例えば、それらが該タンパク質若しくはペプチドの一次配列を変えるとは言えその機能を通常は変えない保存的アミノ酸変化を作成しうる。保存的アミノ酸置換は、典型的に、以下の群、すなわち
グリシン、アラニン；
バリン、イソロイシン、ロイシン；
アスパラギン酸、グルタミン酸；
アスパラギン、グルタミン；
セリン、トレオニン；
リシン、アルギニン；
フェニルアラニン、チロシン
内の置換を包含する。
【０２５５】
修飾（通常は一次配列を変えない）は、ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏの化学的誘導体化、例えばアセチル化若しくはカルボキシル化を包含する。グリコシル化の改変、例えば、その合成およびプロセシングの間若しくはさらなるプロセシング段階でのポリペプチドのグリコシル化パターンを変えることにより；例えば、グリコシル化に影響を及ぼす酵素、例えば哺乳動物のグリコシル化若しくは脱グリコシル化酵素にポリペプチドを曝露することにより作成されるものもまた包含される。リン酸化されたアミノ酸残基、例えばホスホチロシン、ホスホセリン若しくはホスホトレオニンを有する配列もまた包含される。
【０２５６】
タンパク質分解性の分解に対するそれらの耐性を改良する、若しくは溶解性の特性を至適化する、またはそれらを治療薬としてより適するようにするように、通常の分子生物学技術を使用して改変されたポリペプチドもまた包含される。こうしたポリペプチドのアナログは、天然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基、例えばＤ−アミノ酸若しくは天然に存
在しない合成アミノ酸を含有するものを包含する。本発明のペプチドは、本明細書に列挙される特定の例示的方法のいずれかの産物に制限されない。
【０２５７】
本発明は、本発明のペプチド（若しくはそれをコードするＤＮＡ）の「誘導体」および「バリアント」を包含するともまた解釈されるべきであり、その誘導体およびバリアントは、生じるペプチド（若しくはＤＮＡ）が本明細書に列挙される配列に同一でないがしかし該ペプチドが本発明のキメラＲＮＡポリメラーゼ若しくは検出体分子の生物学的／生化学的特性を有するために本明細書に開示されるペプチドと同一の生物学的特性を有するような１個若しくはそれ以上のアミノ酸で変えられている（または、それをコードするヌクレオチド配列を指す場合は、１個若しくはそれ以上の塩基対で変えられている）キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくは検出体分子である。こうした特性、生物学的／生化学的特性は、限定されるものでないが、検出体分子ドメインへのＣＲＰＢＤの結合、シグナリング部分、標的相互作用ドメイン、およびＮＬＳのような細胞内ターゲッティングドメインを挙げることができる。
【０２５８】
本明細書で使用されるところのアミノ酸は、以下の表に示されるところのそれらの完全な名称、それらに対応する三文字記号、若しくはそれらに対応する一文字記号により表される。
【０２５９】
【表２】
2008545394.tif 000004
【０２６０】
本発明のペプチドは、Ｓｔｅｗａｒｔら（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、１９８４、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、イリノイ州ロックフォード）により記述されるところの、およびＢｏｄａｎｓｚｋｙとＢｏｄａｎｓｚｋｙ（Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、１９８４、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク）により記述されるところの、標準的な、十分に確立された固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により容易に製造しうる。最初に、適して保護したアミノ酸残基を、架橋ポリスチレン若しくはポリアミド樹脂のような誘導体化した不溶性ポリマー支持体にそのカルボキシル基により結合する。「適して保護した」は、アミノ酸のα−アミノ基およびいずれかの側鎖官能基双方での保護基の存在を指す。側鎖保護基は、一般に、合成を通じて使用される溶媒、試薬および反応条件に対し安定であり、そして最終ペプチド生成物に影響を及ぼさないことができる条件下で除去可能である。オリゴペプチドの段階的合成は、最初のアミノ酸からのＮ−保護基の除去、および所望のペプチドの配列中の次のアミノ酸のカルボキシル端のそれへの結合により実施する。このアミノ酸もまた適して保護されている。カルボジイミド、対称酸無水物、またはヒドロキシベンゾトリアゾール若しくはペンタフルオロフェニルエステルのような「活性エステル」基への形成のような反応性基への形成により、支持体に結合したアミノ酸のＮ末端と反応するように、入ってくるアミノ酸のカルボキシルを活性化し得る。
【０２６１】
固相ペプチド合成法の例は、α−アミノ保護基としてｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルを利用するｔ−Ｂｏｃ法、およびアミノ酸残基のα−アミノを保護するために９−フルオレニルメチルオクスカルボニルを利用するＦｍｏｃ法を包含し、それらの双方の方法は当業者により公知である。
【０２６２】
Ｎおよび／若しくはＣ保護基の組み込みは、固相ペプチド合成法に慣習的なプロトコルを使用してもまた達成し得る。例えば、Ｃ末端保護基の組み込みのため、所望のペプチドの合成は、典型的に、樹脂からの切断が所望のＣ末端保護基を有するペプチドをもたらすように化学修飾されている支持樹脂を固相として使用して実施する。例えば、Ｃ末端が一級アミノ保護基を担持するペプチドを提供するために、ペプチド合成が完了する場合にフッ化水素酸での処理が所望のＣ末端アミド化されたペプチドを遊離するように、ｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂を使用して合成を実施する。同様に、Ｃ末端でのＮ−メチルアミン保護基の組み込みは、ＨＦ（フッ化水素酸）処理に際してＮ−メチルアミド化されたＣ末端を担持するペプチドを遊離するＮ−メチルアミノエチル誘導体化ＤＶＢ樹脂を使用して達成される。エステル化によるＣ末端の封鎖もまた慣習的手順を使用して達成し得る。これは、エステル官能基を形成するための所望のアルコールとのその後の反応を見込むための、樹脂からの側鎖ペプチドの遊離を可能にする樹脂／保護基の組合せの使用を必要とする。メトキシアルコキシベンジルアルコール若しくは同等なリンカーで誘導体化したＤＶＢ樹脂と組み合わせのＦｍｏｃ保護基をこの目的上使用し得、支持体からの切断はジクロロメタン中ＴＦＡにより遂げられる。例えばＤＣＣを用いて適して活性化したカルボキシル官能基のエステル化をその後、所望のアルコールの添加により進行させ得、次いで脱保護し、そしてエステル化されたペプチド生成物を単離する。
【０２６３】
Ｎ末端保護基の組み込みは、合成されたペプチドが樹脂になお結合されている間に、例えば適する無水物およびニトリルでの処理により達成し得る。例えばアセチル保護基をＮ末端に組み込むため、樹脂に結合したペプチドをアセトニトリル中２０％無水酢酸で処理し得る。Ｎ保護したペプチド生成物をその後樹脂から切断し、脱保護しかつその後単離し得る。
【０２６４】
化学的若しくは生物学的いずれかの合成技術から得られるペプチドが所望のペプチドであることを確認するために、ペプチド組成の分析を実施すべきである。こうしたアミノ酸組成分析は、ペプチドの分子量を決定するための高分解能質量分析を使用して実施しうる
。あるいは、若しくは付加的に、ペプチドのアミノ酸含量を、水性酸中でペプチドを加水分解すること、ならびに、ＨＰＬＣ若しくはアミノ酸分析機を使用して混合物の成分を分離、同定かつ定量することにより確認し得る。ペプチドを連続して分解しかつアミノ酸を順番に同定するペプチドシークェンサーもまた、ペプチドの配列を明確に決定するのに使用しうる。
【０２６５】
その使用前に、ペプチドを精製して汚染物質を除去する。この点に関して、ペプチドを適切な規制当局により設定される基準に合致するように、若しくは特定の用途のために精製することができることが認識されるであろう。例えば、Ｃ４−、Ｃ８−若しくはＣ１８−シリカのようなアルキル化シリカカラムを使用する逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を包含する、多数の慣習的精製手順のいずれか１つを使用して、必要とされるレベルの純度を達成しうる。増大する有機含量の勾配移動相、例えば、通常は少量のトリフルオロ酢酸を含有する水性緩衝液中のアセトニトリルを使用して精製を達成する。イオン交換クロマトグラフィーもまた、それらの電荷に基づきペプチドを分離するのに使用し得る。
【０２６６】
本発明のポリペプチドおよびペプチドは、例えば天然の化学的連結（ｎａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）（ＮＣＬ）を使用してもまた製造し得る。ＮＣＬは水性溶液中の未保護ペプチドの非酵素的カップリングである。ＮＣＬは、連結の部位で天然のペプチド結合を生じるために、Ｃ末端チオエステルとＮ末端システイン残基の間での化学選択的反応を必要とする。図１０に図解で描かれるとおり、第一段階は、最初の共有生成物としてチオエステルに連結した中間体を生じるための未保護合成ペプチドチオエステルのＮ末端システイン（Ｃｙｓ）残基を含有する別の未保護ペプチドセグメントとの化学選択的反応である。この中間体が自発的な迅速な分子内反応を受けて、連結部位に天然のペプチド結合を形成する。該反応速度は、チオフェノールを添加物として使用する場合にもまた増大させ得る。
【０２６７】
ＩＶ．ベクター
他の関係する局面において、本発明は、キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分をコードする単離された核酸が、好ましくは該核酸によりコードされるタンパク質の発現を指図することが可能であるようなプロモーター／制御配列を含んでなる核酸に作動可能に連結されている、キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分をコードする単離された核酸を包含する。従って、本発明は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク）に記述されるもののような、発現ベクター、および細胞中での外因性ＤＮＡの付随する発現を伴う細胞中への外因性ＤＮＡの導入方法を包含する。
【０２６８】
細胞中での単独での若しくは検出可能な標識ポリペプチドに融合されたのいずれかのキラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分の発現は、ベクターが導入される細胞中で標識を伴う若しくは伴わないタンパク質の発現を駆動するようはたらくプロモーター／制御配列に作動可能に連結された所望の核酸を含んでなるプラスミド、ウイルス、若しくは他の型のベクターを生成することにより達成し得る。遺伝子の構成的発現を駆動するのに有用な多くのプロモーター／制御配列が当該技術分野で利用可能であり、そして、限定されるものでないが、例えば、サイトメガロウイルス前初期プロモーターエンハンサー配列、ＳＶ４０初期プロモーター、ならびにラウス肉腫ウイルスプロモーターなどを挙げることができる。さらに、キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分をコードする核酸の誘導可能なおよび組織特異的発現は、標識を伴う若しくは伴わないキメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分をコードする核酸を、誘導可能な若しくは組織特異的プロモーター／制御配列の制御下に置くことにより達成しうる。この目的上有用である組織特異的若しくは誘導可能なプロモーター／制御配列の例は、限定されるものでないが、ＭＭＴＶ  ＬＴＲの誘導可能なプロモーターおよびＳＶ４０後期エンハンサー／プロモーターを挙げることができる。加えて、金属、グルココルチコイド、ホルモンなどのような誘導剤に応答して誘導される、当該技術分野で公知であるプロモーターもまた本発明で企図している。従って、本発明は、既知若しくは未知いずれかでありかつそれに作動可能に連結された所望のタンパク質の発現を駆動することが可能であるいかなるプロモーター／制御配列の使用も包含することが認識されるであろう。
【０２６９】
ベクターを使用してキメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分を発現することは、大量の組換え産生されるタンパク質の単離を可能にする。さらに、プロモーター／制御配列により駆動されるキメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分の発現は、多様な細胞および組織型でのキメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分の発現を可能にし得る。従って、本発明は、本発明の方法での使用のためのキメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分の製造方法を包含するのみならず、しかしまた、真核生物細胞、原核生物細胞、真核生物からの組織サンプルなどを包含する当該技術分野で既知のいずれの細胞若しくは組織型でのキメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分の発現方法も包含する。
【０２７０】
いずれかの特定のプラスミドベクター若しくは他のＤＮＡベクターの選択は本発明で制限因子でなく、そして多様なベクターが当該技術分野で公知である。さらに、特定のプロモーター／制御配列を選びかつ所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列にそれらのプロモーター／制御配列を作動可能に連結することは、十分に当業者の熟練内にある。こうした技術は当該技術分野で公知であり、そして例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク）に記述されている。
【０２７１】
本発明は、従って、キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分をコードする単離された核酸を含んでなるベクターを包含する。ベクターへの所望の核酸の組み込みおよびベクターの選択は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク）に記述されるとおり、当該技術分野で公知である。
【０２７２】
本発明はこうしたベクターを含有する細胞、ウイルス、プロウイルスなどもまた包含する。ベクターおよび／若しくは外因性核酸を含んでなる細胞の製造方法は当該技術分野で公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク）中を参照されたい。
【０２７３】
キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分をコードする核酸は多様なプラスミドベクターにクローン化しうる。しかしながら、本発明はプラスミド若しくはいずれかの特定のベクターに制限されると解釈されるべきでない。代わりに、本発明は、容易に利用可能でありかつ／若しくは当該技術分野で公知である多量のベクターを包含すると解釈されるべきである。
【０２７４】
Ｖ．組換え細胞
本発明は、とりわけ、キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分をコードする単離された核酸、ＲＮＡポリメラーゼを特異的に結合する抗体をコードする核酸などを含んでなる組換え細胞を包含する。一局面において、組換え細胞は、キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分をコードする核酸の一部分をコードするプラスミドで一過性にトランスフェクトし得る。該核酸は細胞ゲノムに組込まれる必要はなく、それは細胞中で発現される必要もない。さらに、該細胞は原核生物若しくは真核生物細胞であることができ、そして、本発明は、いずれかの特定の細胞株若しくは細胞型に制限されると解釈されるべきでない。こうした細胞は、限定されるものでないが、ニューロン、幹細胞、線維芽細胞、星状細胞、リンパ球、上皮細胞、植物細胞、細菌細胞などを挙げることができる。
【０２７５】
さらに、導入遺伝子を含んでなる、すなわち組換え細胞の目的は、単離されたキメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分の生成に制限されると解釈されるべきでないことに注目することが重要である。むしろ、本発明は、キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分をコードする単離された核酸を含んでなる原核生物細胞若しくは真核生物細胞を制限なしに包含する、キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分をコードする核酸が導入されるいかなる細胞型も包含すると解釈されるべきである。
【０２７６】
本発明は、本発明の導入遺伝子が該細胞中で以前に存在もしくは発現されなかったか、または該導入遺伝子が導入される前と異なるレベル若しくは環境で今やそれが発現される、その中に本発明の導入遺伝子を導入し、そして該所望の遺伝子によりコードされるタンパク質がそれから発現される場合に利益が得られる、真核生物細胞を包含する。こうした利益は、所望の遺伝子の発現を使用して、細胞中若しくは該細胞が存する哺乳動物中で別の遺伝子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現を研究し得る系、導入された遺伝子を含んでなる細胞を研究ツールとして使用し得る系、および生物体若しくは細胞中での選択された生物学的（とりわけ核酸の転写および翻訳）のための新たな研究ツールの開発に有用である哺乳動物モデルが生成される系が提供されたという事実を包含しうる。
【０２７７】
キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分をコードする単離された核酸を発現する細胞を使用して、キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分の発現が核酸の転写若しくは翻訳の検出のためのキメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分の産生をもたらす細胞、組織若しくは全動物にキメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分を提供し得る。キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分をコードする単離された核酸を発現する細胞を、配列決定反応および本明細書の別の場所に記述される他の方法での使用のためのキメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分を製造するのにさらに使用し得る。従って、本発明は、キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分の製造のため、ならびに限定されるものでないが核酸の転写および翻訳を挙げることができる生物学的および生化学的現象の検出のための、キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分を発現する細胞を包含する。
【０２７８】
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、本発明の「ノックイン」若しくは「ノックアウト」ベクターが、それぞれ置換若しくは欠失されるべきである核酸の２部分に相同な最低２種の配列を含んでなることを認識するとみられる。該２配列は、該遺伝子に隣接する配列と相同であり；すなわち、一方の配列は、ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸のコーディング配列の５’部分若しくはその近くの領域と相同であり、そして、他方の配列は第一のものからさらに下流である。当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、本発明がいずれかの特定の隣接核酸配列に制限されないことを認識するとみられる。代わりに、ターゲッティングベクターは、それぞれ、哺乳動物ゲノムから例えばＲＮＡポリメラーゼの若干若しくは全部を除去する（すなわち「ノックアウト」ベクター）か、あるいはそれ中にキメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分をコードする核酸またはそのフラグメントをコードする核酸を挿入する（すなわち「ノックイン」ベクター）２種の配列を含みうる。ターゲッティングベクターの重要な特徴は、それが、ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸の全部若しくは一部分が哺乳動物染色体上の１位置から欠失されているような相同的組換えによる欠失／挿入が発生することを可能にするように、「ノックアウト」ベクターの場合にはＲＮＡポリメラーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の相対するすなわち５’および３’端に向かって配置された２種の配列の十分な部分を含んでなることである。
【０２７９】
導入遺伝子ならびにノックインおよびノックアウトターゲッティングベクターの設計は当該技術分野で公知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク）などのような標準的論文に記述されている。ターゲッティングベクター中で使用されるべきＲＮＡポリメラーゼのコーディング領域に隣接する上流および下流部分またはそれ内の部分は、既知の方法に基づき、ならびに、ＲＮＡポリメラーゼおよびキメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分の核酸およびアミノ酸配列を包含する本明細書に開示される教示に従って、容易に選択しうる。これらの配列を備えれば、当業者は、本発明の導入遺伝子およびノックアウトベクターを構築することが可能であるとみられる。
【０２８０】
培養物、初代細胞培養物若しくはスライス培養物中で哺乳動物細胞を維持するのに有用な方法および組成物は当該技術分野で公知であり、該哺乳動物細胞は、限定されるものでないがマウス、ラット、ヒトおよび他の哺乳動物から得られる細胞を挙げることができる哺乳動物、ならびにゼブラフィッシュ、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエルなどのような哺乳動物以外の真核生物から得られる。
【０２８１】
ＶＩ．抗体
本発明はさらに、本発明のＲＮＡポリメラーゼ、キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分を特異的に結合する抗体、そのタンパク質核酸コンジュゲート若しくはフラグメントを包含する。
【０２８２】
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、ＲＮＡポリメラーゼ、キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分、タンパク質核酸コンジュゲートまたはそれらのフラグメントを特異的に結合する抗体が、とりわけ、細胞、組織若しくは器官中のこうした分子の検出に有用であることを理解するとみられる。さらに、ＲＮＡポリメラーゼに特異的に結合する抗体を、検出体分子が複合された抗体を介してＲＮＡポリメラーゼに特異的に結合し得るような検出体分子に複合若しくは別の方法で結合し得る。
【０２８３】
ポリクローナル抗体の生成は、例えばＨａｒｌｏｗら（１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー中）に記述されるもののような標準的抗体製造方法を使用して、抗原を所望の動物に接種すること、および該抗原を特異的に結合する抗体をそれから単離することにより達成する。こうした技術は、マルトース結合タンパク質若しくはグルタチオン（ＧＳＨ）標識ポリペプチド部分、および／または、ＲＮＡポリメラーゼ、検出体分子、キメラリボソームサブユニット成分若しくはキメラＲＮＡポリメラーゼ部分が免疫原性にされるような部分のような別のタンパク質の一部分を含んでなるキメラタンパク質（例えば、キーホール林ペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と複合したＲＮＡポリメラーゼ）で動物を免疫することを包含する。キメラタンパク質は、例えば検出体分子、キメラリボソームサブユニット成分若しくはキメラＲＮＡポリメラーゼをコードする適切な核酸（例えば配列番号１および配列番号２）を、限定されるものでないがｐＭＡＬ−２若しくはｐＣＭＸを挙げることができるこの目的上適するプラスミドベクターにクローン化することにより製造する。あるいは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに対する抗体は、例えばＡｂｃａｍ，Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ケンブリッジ）から商業的に入手可能である。
【０２８４】
しかしながら、本発明は、キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分、ＲＮＡポリメラーゼまたは検出体分子を結合するポリクローナル抗体にのみ制限されると解釈されるべきでない。むしろ、本発明は、キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分、ＲＮＡポリメラ―ゼまたは検出体分子、あるいはそれらの部分に対する、その用語が本明細書の別の場所で定義されるところの他の抗体を包含すると解釈されるべきである。さらに、本発明は、とりわけキメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分、ＲＮＡポリメラ―ゼまたは検出体分子に結合し、かつ、ウエスタンブロット上、細胞中および組織の免疫組織化学染色中に存在する場合にこれらの分子を結合して、それにより組織中で、およびキメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分の少なくとも一部分をコードする核酸で一過性に若しくは安定にトランスフェクトした細胞の免疫蛍光顕微鏡検査で、ならびにキメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分と接触される細胞若しくは組織にこうした分子を位置推定することが可能である抗体を包含すると解釈されるべきである。
【０２８５】
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、該抗体が該タンパク質のいずれかの部分と特異的に結合し得、そして完全長のタンパク質を使用してそれに特異的な抗体を生成し得ることを認識するとみられる。しかしながら、本発明は免疫原として完全長のタンパク質を使用することに制限されない。むしろ、本発明は、キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分、ＲＮＡポリメラーゼまたは検出体分子と特異的に結合する抗体を製造するために該タンパク質の免疫原性部分を使用することを包含する。すなわち、本発明は、キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分、ＲＮＡポリメラ―ゼまたは検出体分子の免疫原性の部分すなわち抗原決定子、例えばリンカー領域を含んでなる１エピトープ、検出体結合ドメイン、若しくは該分子上のいずれかの他の抗原部位を使用して動物を免疫することを包含する。
【０２８６】
抗体は、限定されるものでないがウサギ若しくはマウスを挙げることができる動物を、キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分、ＲＮＡポリメラーゼまたは検出体分子あるいはそれらの一部分で免疫することにより、あるいは、キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分、ＲＮＡポリメラーゼまたは検出体分子の少なくとも一部分を含んでなるタンパク質、あるいは、適切なキメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分、ＲＮＡポリメラ―ゼまたは検出体分子のアミノ酸残基を含んでなる一部分と共有結合された例えばマルトース結合タンパク質標識ポリペプチド部分を含んでなる標識ポリペプチド部分を包含する融合タンパク質を使用して動物を免疫することにより製造し得る。当業者は、これらのタンパク質のより小さいフラグメントを、キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分、ＲＮＡポリメラ―ゼまたは検出体分子を特異的に結合する抗体を製造するのにもまた使用し得る。
【０２８７】
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、単離されたキメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分、ＲＮＡポリメラーゼまたは検出体分子の多様な部分を、リンカー領域、検出体結合ドメイン若しくは該分子上のいずれかの他の抗原部位を含んでなるエピトープ、またはこれらの分子の１種の別の場所に存在するエピトープに対する抗体を生成するのに使用し得ることを認識するとみられる。キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分、ＲＮＡポリメラ―ゼまたは検出体分子の配列を一旦備えれば、当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、当該技術分野で公知の若しくは開発されるべき方法を使用して、キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分、ＲＮＡポリメラ―ゼまたは検出体分子ポリペプチドの多様な部分に特異的な抗体を得る方法を理解するとみられる。
【０２８８】
従って、当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、本発明がキメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分、ＲＮＡポリメラーゼまたは検出体分子を特異的に結合する抗体を包含することを認識するとみられる。
【０２８９】
本発明は、本明細書に開示される抗体、若しくは本発明のタンパク質のいずれかの特定の免疫原性部分にのみ制限されると解釈されるべきでない。むしろ、本発明は、キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分、ＲＮＡポリメラ―ゼまたは検出体分子あるいはそれらの部分、あるいは、キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分、ＲＮＡポリメラ―ゼまたは検出体分子と何らかの相同性を共有するタンパク質に対する、その用語が本明細書の別の場所で定義されるところの他の抗体を包含すると解釈されるべきである。
【０２９０】
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、こうした抗体を、細胞中の関連するタンパク質の位置を推定しかつ多様な生化学的および生物学的過程でそれにより認識されるポリペプチドの役割（１種若しくは複数）を研究するのに使用し得ることを認識するとみられる。さらに、該抗体を、限定されるものでないがウエスタンブロッティングおよび酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を挙げることができる公知の方法を使用して、生物学的サンプル中に存在するタンパク質を検出かつ／若しくはその量を測定するのに使用し得る。さらに、該抗体は、当該技術分野で公知の方法を使用してそれらの同族の抗原を免疫沈降しかつ／若しくは免疫親和性精製するのに使用し得る。加えて、該抗体は、本明細書の別の場所に開示される本発明の方法を実施するために、検出体分子がキメラＲＮＡポリメラーゼ、キメラリボソームサブユニット成分若しくはＲＮＡポリメラーゼに特異的に結合するように、検出体分子に複合若しくは別の方法で結合し得る。
【０２９１】
本発明は、ポリクローナル、モノクローナル、合成の抗体などを包含する。当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、本発明の抗体の重要な特徴が、該抗体がキメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分、ＲＮＡポリメラ―ゼまたは検出体分子と特異的に結合することであることを理解するとみられる。すなわち、本発明の抗体は、ウエスタンブロット上、細胞の免疫染色中のキメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソ―ムサブユニット成分、ＲＮＡポリメラ―ゼまたは検出体分子、あるいはそれらのフラグメント（例えばそれらの免疫原性部分すなわち抗原決定子）を認識し、そして当該技術分野で公知の標準的方法を使用して、キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分、ＲＮＡポリメラ―ゼまたは検出体分子を免疫沈降する。
【０２９２】
完全長のタンパク質若しくはペプチドまたはそれらのペプチドフラグメントに向けられるモノクローナル抗体は、例えばＨａｒｌｏｗら（１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー中）およびＴｕｓｚｙｎｓｋｉら（１９８８、Ｂｌｏｏｄ、７２：１０９−１１５）に記述されるもののようないずれかの公知のモノクローナル抗体製造手順を使用して製造しうる。所望のペプチドの量は化学合成技術を使用してもまた合成しうる。あるいは、所望のペプチドをコードするＤＮＡをクローン化しかつ大量のペプチドの生成に適する細胞中で適切なプロモーター配列から発現させうる。該ペプチドに向けられるモノクローナル抗体は、本明細書で参照されるところの標準的手順を使用して該ペプチドで免疫したマウスから生成する。
【０２９３】
本明細書に記述される手順を使用して得られるモノクローナル抗体をコードする核酸を、当該技術分野で利用可能でありかつ例えばＷｒｉｇｈｔら（１９９２、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１２５−１６８）およびその中に引用される参考文献に記述される技術を使用してクローン化かつ配列決定しうる。
【０２９４】
さらに、本発明の抗体は、例えばＷｒｉｇｈｔら（１９９２、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１２５−１６８）およびその中に引用される参考文献、ならびにＧｕら（１９９７、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍａｔｏｃｙｓｔ  ７７：７５５−７５９）に記述される技術を使用して「ヒト化」しうる。本発明は、キメラＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ若しくは検出体分子のエピトープと特異的に反応性のヒト化抗体の使用もまた包含する。こうした抗体は、キメラＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ若しくは検出体分子またはそれらのフラグメントを特異的に結合することが可能である。本発明のヒト化抗体は、ヒト枠組みを有し、かつ、キメラＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ若しくは検出体分子またはそれらのフラグメントと特異的に反応性の限定されるものでないがマウス抗体を挙げることができる抗体からの１個若しくはそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。
【０２９５】
本発明で使用される抗体をヒト化する場合、該抗体は、Ｑｕｅｅｎら（米国特許第６，１８０，３７０号明細書）、Ｗｒｉｇｈｔら（１９９２、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１２５−１６８）およびその中に引用される参考文献、若しくはＧｕら（１９９７、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍａｔｏｃｙｓｔ  ７７（４）：７５５−７５９）に記述されるとおり生成しうる。Ｑｕｅｅｎらに開示される方法は、アクセプターヒト枠組み領域をコードするＤＮＡセグメントに結合された、キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分、ＲＮＡポリメラ―ゼまたは検出体分子のような、所望の抗原に結合することが可能なドナー免疫グロブリンからのＨおよびＬ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする組換えＤＮＡセグメントを発現させることにより産生されるヒト化免疫グロブリンを設計することに部分的に向けられる。一般的に言って、Ｑｕｅｅｎの特許の発明は実質的にいかなるヒト化免疫グロブリンの設計にも対する応用性を有する。Ｑｕｅｅｎは、該ＤＮＡセグメントは、天然に会合する若しくは異種のプロモーター領域を包含する、ヒト化免疫グロブリンコーディング配列に作動可能に連結された発現制御ＤＮＡ配列を典型的に包含することができることを説明する。該発現制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換若しくはトランスフェクトすることが可能なベクター中の真核生物プロモーター系であり得るか、または、該発現制御配列は、原核生物宿主細胞を形質転換若しくはトランスフェクトすることが可能なベクター中の原核生物プロモーター系であり得る。該ベクターが適切な宿主に一旦組み込まれれば、導入されたヌクレオチド配列の高レベル発現に適する条件下で該宿主を維持し、そして所望のとおり、ヒト化Ｌ鎖、Ｈ鎖、Ｌ／Ｈ鎖二量体若しくは無傷の抗体、結合フラグメントまたは他の免疫グロブリンの形態の収集および精製が後に続きうる（Ｂｅｙｃｈｏｋ、Ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓ
ｓ、ニューヨーク（１９７９）（引用することにより本明細書に組込まれる））。
【０２９６】
多様なヒト細胞からのヒト定常領域（ＣＤＲ）ＤＮＡ配列を公知の手順に従って単離し得る。好ましくは、ヒト定常領域ＤＮＡ配列は、第ＷＯ  ８７／０２６７１号明細書（引用することにより本明細書に組込まれる）に記述されるところの不死化Ｂ細胞から単離する。本発明の抗体の製造において有用なＣＤＲは、キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分、ＲＮＡポリメラ―ゼまたは検出体分子に結合することが可能なモノクローナル抗体をコードするＤＮＡに同様に由来しうる。こうしたヒト化抗体は、限定されるものでないがマウス、ラット、ウサギ若しくは他の脊椎動物を挙げることができる、抗体を産生することが可能ないずれかの便宜的哺乳動物供給源で公知の方法を使用して生成しうる。定常領域および枠組みＤＮＡ配列に適する細胞、ならびに抗体を発現かつ分泌する宿主細胞は、多数の供給源、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、バージニア州マナサスから得ることができる。
【０２９７】
上で論考されたヒト化抗体に加え、天然の抗体配列に対する他の改変は、当業者に公知の多様な組換えＤＮＡ技術を利用して容易に設計かつ製造し得る。さらに、多様な異なるヒト枠組み領域を、キメラＲＮＡポリメラーゼ若しくはキメラリボソームサブユニット成分、ＲＮＡポリメラ―ゼまたは検出体分子に向けられる抗体をヒト化するための基礎として単独で若しくは組合せで使用しうる。一般に、遺伝子の改変は、部位特異的突然変異誘発（ＧｉｌｌｍａｎとＳｍｉｔｈ、Ｇｅｎｅ、８：８１−９７（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ、３２８：７３１−７３４）のような多様な公知の技術を使用して容易に達成しうる。
【０２９８】
あるいは、ファージ抗体ライブラリーを生成しうる。ファージ抗体ライブラリーを生成するために、ｃＤＮＡライブラリーを、ファージ表面で発現されるべき所望のタンパク質、例えば所望の抗体を発現する細胞、例えばハイブリドーマから単離されるｍＲＮＡから最初に得る。該ｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーを逆転写酵素を使用して製造する。免疫グロブリンフラグメントを指定するｃＤＮＡをＰＣＲにより得、そして、生じるＤＮＡを適するバクテリオファージベクターにクローン化して、免疫グロブリン遺伝子を指定するＤＮＡを含んでなるバクテリオファージＤＮＡライブラリーを生成する。異種ＤＮＡを含んでなるバクテリオファージライブラリーの作成手順は当該技術分野で公知であり、そして例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク）に記述されている。
【０２９９】
その対応する結合タンパク質、例えば該抗体が向けられる抗原への結合に該タンパク質が利用可能であるような様式で、それがその表面に表示されるような、所望の抗体をコードするバクテリオファージを工作しうる。従って、特異的抗体を発現するバクテリオファージを、対応する抗原を発現する細胞の存在下でインキュベートする場合、該バクテリオファージは細胞に結合することができる。抗体を発現しないバクテリオファージは細胞に結合しないことができる。こうしたパニング技術は当該技術分野で公知であり、そして例えばＷｒｉｇｈｔら（９９２、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１２５−１６８）に記述されている。
【０３００】
上述されたもののような方法は、Ｍ１３バクテリオファージディスプレイを使用するヒト抗体の製造のため開発された（Ｂｕｒｔｏｎら、１９９４、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７：１９１−２８０）。本質的に、ｃＤＮＡライブラリーは抗体産生細胞の一集団から得られるｍＲＮＡから生成する。該ｍＲＮＡは再配列された免疫グロブリン遺伝子をコードし、そして従って該ｃＤＮＡはそれをコードする。増幅されたｃＤＮＡをＭ１３発現ベクターにクローン化して、それらの表面にヒトＦａｂフラグメントを発現するファージのライブラリーを創製する。目的の抗体を表示するファージを抗原結合により選択し、そして細菌中で増殖させて可溶性ヒトＦａｂ免疫グロブリンを製造する。従って、慣習的モノクローナル抗体合成と対照的に、この手順は、ヒト免疫グロブリンを発現する細胞よりむしろヒト免疫グロブリンをコードするＤＮＡを不死化する。
【０３０１】
たった今提示された手順は、抗体分子のＦａｂ部分をコードするファージの生成を記述する。しかしながら、本発明は、Ｆａｂ抗体をコードするファージの生成にのみ制限されると解釈されるべきでない。むしろ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ／ファージ抗体ライブラリー）をコードするファージもまた本発明に包含される。Ｆａｂ分子はＩｇ  Ｌ鎖全体を含んでなる、すなわちそれらはＬ鎖の可変および定常双方の領域を含んでなるが、しかし、Ｈ鎖の可変領域および第一の定常領域ドメイン（ＣＨ１）のみを包含する。一本鎖抗体分子はＩｇ  Ｆｖフラグメントを含んでなるタンパク質の一本鎖を含んでなる。Ｉｇ  Ｆｖフラグメントは抗体のＨおよびＬ鎖の可変領域のみを包含し、その中に定常領域を含有させない。ｓｃＦｖ  ＤＮＡを含んでなるファージライブラリーはＭａｒｋｓら（１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７）に記述される手順に従って生成しうる。所望の抗体の単離のためのそのように生成されたファージのパニングは、Ｆａｂ  ＤＮＡを含んでなるファージライブラリーについて記述されたものに類似の様式で実施する。
【０３０２】
本発明は、それらがほぼ全部の可能な特異性を包含するような、ＨおよびＬ鎖可変領域を合成しうる合成ファージディスプレイライブラリーを包含するようにもまた解釈されるべきである（Ｂａｒｂａｓ、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １：８３７−８３９；ｄｅ  Ｋｒｕｉｆら、１９９５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：９７−１０５）。
【０３０３】
ＶＩＩ．方法
本発明は、多くの転写分析がｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイに頼るが、しかしこれらのアッセイは実時間で生存細胞中で発生する広範な転写を包括しないという事実に部分的に基づく。本明細書に開示される方法および組成物は、数分の時間経過にわたる生存細胞中の転写のリアルタイム検出を可能にする。本方法はまた単離されたＲＮＡ集団の迅速な発現プロファイリングにも有用である。本明細書の別の場所で開示されるとおり、細胞核中のＲＮＡのリアルタイム産生をモニターすることは、ｉｎ  ｖｉｖｏ転写を可視化するための最も直接的な方法である。
【０３０４】
ＲＮＡポリメラーゼは、細胞ＤＮＡに結合しかつ該ＤＮＡ鋳型をＲＮＡにコピーする酵素である。機械的には、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡに結合する場合、該タンパク質は、新たに合成されたＲＮＡがＲＮＡポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体を出る、タンパク質のＮ末端近くのＲＮＡ出口孔を生じるコンホメーション変化を受ける。ＲＮＡ出口孔近くに配置される検出体分子が、ＲＮＡが複合体を離れる際にそれを検出し得る。転写されている各遺伝子は独特な配列のＲＮＡを生じる。
【０３０５】
本明細書に開示される方法および組成物は、新たに合成されたＲＮＡがポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体を出る際にそれの配列特異的検出を可能にする。本明細書に開示される検出体分子は、ＲＮＡが出る際にＲＮＡ上の相補配列へのＰＮＡのアニーリングを容易にするための細胞進入および核局在化を可能にする多様な配列を含有するよう工作されているＰＮＡを含んでなるハイブリッドペプチドである。ＲＮＡ配列とのＰＮＡのアニーリングは、検出体分子中に工作されかつ好ましくはＰＮＡ配列に隣接する最低２個の蛍光分子の相互作用により検出される。蛍光分子の相互作用の差違はＦＲＥＴの変化若しくは蛍光極性の測定により検出可能である。本発明の検出体分子は、キメラＲＮＡポリメラーゼのＲＮＡ出口孔に緊密に近接して結合するよう設計される。これを達成するため、キメラＲＮＡポリメラーゼの検出体結合ドメインへのその結合を可能にすることができるターゲッティング配列、例えばＣＲＰＢＤが検出体分子中に工作されている。さらに、検出体結合ドメインは、ＲＮＡ出口孔を形成するポリメラーゼの領域近くのＲＮＡポリメラーゼ中に工作されている。生存細胞への検出体分子の添加に際して、検出体分子は細胞膜を横断し、核中に移動し、そして転写されるはずである遺伝子に結合されているＲＮＡポリメラーゼに結合する。検出体分子のシグナリング部分は、相補ＲＮＡ配列とのＰＮＡの相互作用に際して、検出体分子のシグナリング部分、好ましくは蛍光分子のＦＲＥＴ若しくは蛍光極性の移動により検出可能なシグナルを生成する。キメラＲＮＡポリメラーゼに結合した検出体分子のＰＮＡが新生ＲＮＡ中の相補配列に遭遇するたびに、蛍光シグナルの変化（明滅）が起こる。これらの明滅の間の時間はＲＮＡ上のアニーリング配列間の距離と相関する。３〜４回の明滅の回復（ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）に際して、時間の差違を、公的核酸データベースに寄託されたヌクレオチド配列とアルゴリズム的に比較する。従って個々の遺伝子の転写が評価される。該遺伝子がゲノム中で不動であり、そして結果としていずれの特定の遺伝子の明滅もゲノム中の限局的な点で起こるため、個々の遺伝子シグナルが検出可能である。これらの明滅は、蛍光および極性の共焦点顕微鏡検査（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｏｌａｒｉｔｙ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）により、ならびに本明細書の別の場所に開示されかつ当該技術分野で既知の他の方法により検出かつ定量し得る。
【０３０６】
本明細書の別の場所に開示されるとおり、検出体分子はＣＲＰＢＤによりキメラＲＮＡポリメラーゼに特異的に結合することができる。ＣＲＰＢＤは、本明細書に記述されるところのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼの特定の領域に工作されたβ−ＰＩＸのＳＨ３ドメインのようなＲＮＡポリメラーゼ中の特定の１エピトープでキメラＲＮＡポリメラーゼに結合することができる。ＳＨ３ドメインは、真核生物細胞中の多様なシグナル伝達経路でタンパク質−タンパク質相互作用を媒介する。ＳＨ３ドメインはポリプロリンモチーフに結合する。例えば、β−ＰＩＸのＳＨ３ドメインは、α−ＰＡＫと命名されるタンパク質からの２４アミノ酸の小さなプロリン豊富な領域（配列番号１６）と相互作用する。検出体分子は、限定されるものでないがフルオレセイン（ドナー）およびテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ；アクセプター）若しくはそれらのアナログを挙げることができる最低２個の蛍光部分のシグナル部分、およびｇｔｇのようなＰＮＡ三量体をさらに含んでなる。蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）若しくは蛍光極性の連合が蛍光分子の間で起こるように蛍光分子が配置される。
【０３０７】
検出体分子は、ＰＮＡ三量体が出口孔近くに配置されるような様式でキメラＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのＳＨ３ドメインに結合する。ＲＮＡが孔を出る場合に、ＰＮＡはそれらの相補塩基と塩基対形成する。この塩基対形成の間に、会合された蛍光分子が離れていき、そしてＦＲＥＴシグナル、すなわちドナーフルオロフォアのフルオレセインからの増大する蛍光を創製する。ＲＮＡ鎖が成長する際に、ＰＮＡがそれらの相補物を認識する場合にのみＦＲＥＴの差違が発生する。これはフルオレセインからの増大する蛍光およびＴＡＭＲＡからの減少する蛍光を伴う明滅を引き起こし、それらは本明細書の別の場所に開示される極性および光学的方法論を用いて検出し得る。明滅間の時間距離の差違は、各ｍＲＮＡ配列のヌクレオチド配列の特徴に変換し得る。データベースをその後、合成されているＲＮＡの同一性を解明するために検索する。
【０３０８】
従って、本発明は、ＤＮＡの転写およびＲＮＡの翻訳を生存細胞若しくは組織中で実時間で検出かつモニターし得るという新規発見に部分的に基づく。本明細書に開示されるとおり、検出体分子を、新生ＲＮＡ分子の配列をモニターしかつ特徴付けするのに使用し得、それをその後、遺伝子発現が起こる速度および条件を決定するのに使用し得る。
【０３０９】
本発明はまた、キメラＲＮＡポリメラーゼおよび検出体分子を使用して、慣習的配列決定反応および技術の使用を伴わずに支持体に結合された核酸分子を迅速に配列決定し得る
という新規発見にも部分的に基づく。
【０３１０】
Ａ．ＲＮＡ分子の転写の検出方法
本発明は、ＤＮＡ分子が細胞、組織若しくは生物体中でＲＮＡ分子に転写される際のその転写の実時間での検出方法を包含する。該方法は、検出体結合ドメインを含んでなるキメラＲＮＡポリメラーゼと細胞を接触させることを含んでなる。該方法はさらに、検出体分子のＣＲＰＢＤを介してキメラＲＮＡポリメラーゼの検出体結合ドメインに結合することが可能である検出体分子と細胞を接触させることを含んでなる。検出体分子は、ＣＲＰＢＤ、シグナリング部分、およびＲＮＡポリメラーゼの出口孔を介してキメラＲＮＡポリメラーゼから発生するＲＮＡ分子の一部分に相補的なＰＮＡを含んでなる。本方法は、さらに、シグナリング部分中の別の蛍光分子に関しての検出体分子上の蛍光分子の転置により生じられるシグナリング部分により生成されるシグナルを検出する段階を含んでなる。蛍光分子の転置は、検出体分子のＰＮＡの新生ＲＮＡ分子の一部分への結合により引き起こされる。新生ＲＮＡのＰＮＡへの結合は蛍光分子の転置を引き起こして、検出可能な極性若しくは蛍光エネルギー共鳴転移（ＦＲＥＴ）シグナルをもたらす。該シグナルは、顕微鏡検査、共焦点顕微鏡検査、感光膜への曝露、若しくは蛍光および極性変化を検出し得る装置、例えばＰＯＬＡＲＳＴＡＲ  ＯＰＴＩＭＡ若しくはＦＬＵＯＲＯＳＴＡＲ（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ、ノースカロライナ州ダラム）の使用を包含する当該技術分野で公知の方法を使用して検出する。
【０３１１】
細胞を、細胞を含む溶液中にキメラＲＮＡポリメラーゼを置くことにより、キメラＲＮＡポリメラーゼと接触させる。キメラＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ上に存在する内因性のＲＮＡポリメラーゼ核局在化シグナル（ＮＬＳ）を介して細胞の核に局在化する。核局在化シグナルは当該技術分野で公知であり、そしてポリメラーゼを包含する核タンパク質に組み込まれている。さらに、キメラポリメラーゼ中に工作されたか若しくはキメラポリメラーゼに別の方法で複合された細胞透過性ペプチドによって、キメラポリメラーゼは細胞膜を横断し得る。あるいは、本発明の別の態様において、電気穿孔法、光穿孔法、コレステロール修飾キメラポリメラーゼ若しくは脂質媒介性移入のような当該技術分野で既知の方法を、キメラポリメラーゼを細胞に導入するのに使用する。
【０３１２】
キメラＲＮＡポリメラーゼは、本明細書の別の場所に開示される方法を使用して、キメラＲＮＡポリメラーゼをコードする単離された核酸を発現するように組換え細胞を誘導することにより、細胞若しくは組織中でさらに発現させ得る。制限しない一例として、ベクターを含んでなる組換え細胞（その中で該ベクターは組換えの単離された核酸をコードする）を、キメラＲＮＡポリメラーゼを発現するように誘導し得る。細胞は、キメラＲＮＡポリメラーゼを一旦発現すれば、その後、本発明の方法を実施するために検出体分子と接触させ得る。
【０３１３】
検出体分子は、キメラＲＮＡポリメラーゼの検出体結合ドメインと検出体分子のＣＲＰＢＤの間の特異的結合を介してキメラＲＮＡポリメラーゼに結合する。検出体結合ドメインおよびＣＲＰＢＤは、相互を特異的に結合するいずれか２種のポリペプチド、好ましくはＳＨ３ドメイン、α−ＰＡＫドメイン、ロイシンジッパーの成分などであり得る。さらに、本明細書の別の場所に開示されるとおり、検出体結合ドメインおよびＣＲＰＢＤは、限定されるものでないがビオチン、アビジンおよびストレプトアビジンを挙げることができる、相互を特異的に結合するペプチド以外の分子を含み得る。
【０３１４】
本明細書の別の場所に開示されるとおり、検出体分子は、ＲＮＡポリメラーゼの出口孔から発生するＲＮＡ分子の一部分に相補的なＰＮＡを含んでなる。ＰＮＡは検出体分子に共有結合されており、そして新生ＲＮＡに結合する。好ましくは、ＰＮＡは、約１から約１０ＲＮＡ塩基まで、なおより好ましくは約１から約５ＲＮＡ塩基まで、なおより好まし
くは約２ないし約３ＲＮＡ塩基を結合する。好ましくは、ＰＮＡは３ＲＮＡ塩基を結合する。
【０３１５】
本明細書に開示される検出体分子は、検出体分子に結合されたシグナリング部分をさらに含んでなる。より具体的には、シグナリング部分の最低１個の蛍光分子が検出体分子のＣＲＰＢＤに結合され、また、シグナリング部分の最低１個の第二の蛍光分子が直接若しくは間接的にのいずれかでＰＮＡに結合されている。なおより具体的には、シグナリング部分を含んでなる蛍光分子は、少なくとも該ＰＮＡにより相互から分離されている。
【０３１６】
検出体分子は、トランスポータント［ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎｔ（ＴＰ）］ペプチド、ＴＰ１０ペプチド、ｐＶＥＣペプチド、ペネトラチンペプチド、ｔａｔフラグメントペプチド、シグナル配列をベースとするペプチド、両親媒性モデルペプチドなどのような細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）をさらに含み得る。ＣＰＰは、本発明の方法を実施し得るようなキメラＲＮＡポリメラーゼ分子を選択的に結合するために、検出体分子を細胞の内側に向けるのに使用し得る。
【０３１７】
新生ＲＮＡがキメラＲＮＡポリメラーゼの出口孔から発生する場合に、ＰＮＡは相補塩基対間の水素結合を介して新生ＲＮＡの一部分に結合する。新生ＲＮＡのＰＮＡへの結合は、シグナリング部分中の第二の蛍光分子の転置をもたらす。蛍光分子の転置は第一の蛍光分子の位置に関し、検出可能なシグナルの生成をもたらす。かように検出される該検出可能なシグナルは、検出体分子に結合されたＰＮＡに相補的な配列を有するＲＮＡ分子がキメラＲＮＡポリメラーゼの出口孔から発生したことを示す。本方法の使用者に既知である、検出体分子に結合されたＰＮＡの配列をその後、キメラＲＮＡポリメラーゼの出口孔から発生する新生ＲＮＡの配列を決定するのに使用する。新生ＲＮＡと相補ＰＮＡの間の相補結合事象の数および頻度を既知の配列と比較し、また、特異的遺伝子の転写を検出して、従ってＤＮＡ分子の転写を検出する。
【０３１８】
当業者は、本開示および本明細書に開示される方法を備える場合に、細胞が本発明の分子と一旦接触されれば、ＤＮＡ分子の転写を、当該技術分野で既知の存在するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法と対照的に細胞中で実時間で検討し得ることを理解するであろう。加えて、当業者は、細胞、組織若しくは生物体がさらされる条件を、該細胞、組織若しくは生物体中での遺伝子の転写に対するこれらの条件の影響を決定するために変動し得ることを容易に理解するであろう。
【０３１９】
加えて、本発明は、ポリメラーゼ／検出体分子複合体が細胞と接触される前に、キメラＲＮＡポリメラーゼ分子の検出体結合ドメインおよび検出体分子のＣＲＰＢＤを介して相互に結合されている組換えＲＮＡ分子および検出体分子と細胞を接触させることを含んでなる、ＤＮＡ分子の転写の検出方法をさらに含んでなる。すなわち、本発明は、選択的結合により結合されたキメラＲＮＡポリメラーゼおよび検出体分子を含んでなる１個の大型分子（ヌクレオペプチドコンジュゲート複合体）と細胞を接触させることを含んでなる、ＤＮＡ分子の転写の検出方法を含んでなる。
【０３２０】
本方法は、キメラＲＮＡポリメラーゼおよび検出体分子が、それらが細胞と接触される前に相互と選択的に結合されることを除き、本質的に本明細書の別の場所に開示されるとおり実施される。
【０３２１】
本発明は、ＲＮＡポリメラーゼが、例えば核局在化シグナルによって、電気穿孔法、化学的形質転換などにより、発現されるか若しくは細胞の内側に進入することを別の方法で可能にされる方法をさらに包含する。検出体分子は、ＤＮＡ転写の経過の間にＲＮＡポリメラーゼを結合するサブユニットに選択的に結合される。本発明で企図しているＲＮＡポ
リメラーゼは、限定されるものでないが、真核生物ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７ポリメラーゼのα、β、β’およびσサブユニットを挙げることができる。検出体分子は、本明細書の別の場所に記述されるところの２タンパク質間の選択的結合事象を介して１サブユニットに結合し得るか、若しくは、検出体分子は、本明細書の別の場所に開示されるとおり、ＲＮＡポリメラーゼサブユニットへの抗体の選択的結合によりＲＮＡポリメラーゼサブユニットに結合し得る。検出体分子／ＲＮＡポリメラーゼサブユニット複合体をその後、本明細書の別の場所に記述されるとおり細胞と接触させる。該サブユニットは、ＲＮＡポリメラーゼとの結合に際して、該検出体分子を、本明細書に記述されるところのＤＮＡ分子の転写を検出するための位置に置く。従って、本発明は、限定されるものでないがＲＮＡポリメラーゼおよび／若しくはＴ７ポリメラーゼのα、β、β’およびσサブユニットを挙げることができる１個のＲＮＡポリメラーゼサブユニットをさらに含んでなる検出体分子を含んでなる。
【０３２２】
Ｂ．ＲＮＡ分子の翻訳の検出方法
本発明はさらに、ＲＮＡ分子のペプチドへの翻訳の検出方法を含んでなる。すなわち、本発明は、ｍＲＮＡ分子の翻訳の頻度ならびに生じるペプチドの配列の実時間かつ生存細胞中での決定方法を包含する。
【０３２３】
本発明の方法は、キメラリボソームサブユニット成分を含んでなるキメラリボソームと細胞を接触させることを含んでなる。該方法は、検出体分子のＣＲＢＤ（キメラリボソーム結合タンパク質）を介してキメラリボソームの検出体結合ドメインに結合することが可能である検出体分子と細胞を接触させることをさらに含んでなる。検出体分子は、ＣＲＢＤ、シグナリング部分、およびリボソームの３０ｓサブユニットの出口孔を介してキメラリボソームから発生するＲＮＡ分子の一部分に相補的なＰＮＡを含んでなる。本方法は、さらに、シグナリング部分の別の蛍光分子に関しての検出体分子上の蛍光分子の転置により生じられる、シグナリング部分により生成されるシグナルを検出する段階を含んでなる。蛍光分子の転置は検出体分子のＰＮＡへの発生するＲＮＡヌクレオチドの結合により引き起こされる。発生するｍＲＮＡのＰＮＡへの結合は蛍光分子の転置を引き起こして、検出可能な極性若しくは蛍光エネルギー共鳴転移（ＦＲＥＴ）シグナルをもたらす。該シグナルは、顕微鏡検査、共焦点顕微鏡検査、感光膜への曝露、若しくは蛍光および極性の変化を検出し得る装置、例えばＰＯＬＡＲＳＴＡＲ  ＯＰＴＩＭＡ若しくはＦＬＵＯＲＯＳＴＡＲ（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ、ノースカロライナ州ダラム）の使用を包含する当該技術分野で公知の方法を使用して検出される。
【０３２４】
加えて、本発明は、現在開示される方法により検出可能な蛍光および／若しくは極性移動を検出するための、蛍光の発射体、およびフルオレセインのような蛍光分子または本明細書に記述されるか若しくは当該技術分野で既知の他の蛍光分子としての量子ドットの使用を包含する。量子ドットは、光退色をほとんど伴わない蛍光を生じ、そして例えば米国特許第６，３２２，９０１号；同第６，５７６，２９１号；同第６，４２３，５５１号；同第６，２５１，３０３号；同第６，３１９，４２６号；同第６，４２６，５１３号および同第６，４４４，１４３号明細書に記述され、そして商業的に入手可能である（Ｑｕａｎｔｏｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州ヘイワード）。
【０３２５】
細胞を含む溶液中にキメラリボソームを置くことにより細胞をキメラリボソームと接触させる。キメラリボソームは細胞の細胞質に局在化する。さらに、キメラリボソーム中に工作されたか若しくはキメラリボソームに別の方法で複合されたＣＰＰによって、キメラリボソームは細胞膜を横断し得る。あるいは、本発明の別の態様において、電気穿孔法、光穿孔法、コレステロール修飾キメラポリメラーゼ若しくは脂質媒介性移入のような当該技術分野で既知の方法を、キメラリボソームを細胞に導入するのに使用する。
【０３２６】
キメラリボソームは、本明細書の別の場所に開示される方法を使用して、キメラリボソームサブユニット成分をコードする単離された核酸を発現するように組換え細胞を誘導することにより、細胞若しくは組織中でさらに発現させ得る。制限しない一例として、ベクターを含んでなる組換え細胞（その中で該ベクターは組換えの単離された核酸をコードする）を、キメラリボソーム若しくはキメラリボソームサブユニット成分を発現するように誘導し得る。細胞は、キメラリボソーム若しくはキメラリボソームサブユニット成分を一旦発現すれば、その後、本発明の方法を実施するために検出体分子と接触させ得る。
【０３２７】
検出体分子は、キメラリボソームの検出体結合ドメインと検出体分子のＣＲＢＤの間の特異的結合を介してキメラリボソームに結合する。検出体結合ドメインおよびＣＲＢＤは、相互を特異的に結合するいずれか２種のポリペプチド、好ましくはＳＨ３ドメインおよびα−ＰＡＫドメイン、若しくはロイシンジッパーの成分であり得る。さらに、検出体分子およびＣＲＢＤは、限定されるものでないがビオチン、アビジンおよびストレプトアビジンを挙げることができる相互に特異的に結合するペプチド以外の分子を含み得る。
【０３２８】
検出体結合ドメインおよびＣＲＢＤ（またはＣＲＰＢＤ若しくはＣＥＢＤ）は、好ましくは相互を特異的に結合する２種のタンパク質の相互作用により相互に結合する。しかしながら、本発明は相互を特異的に結合するタンパク質に制限されず、しかしまた、ビオチンおよびアビジン若しくはビオチンおよびストレプトアビジンのような相互に結合するタンパク質以外の分子も包含する。加えて、抗体、若しくはファージディスプレイライブラリーで生じられるＦｖフラグメントのような抗体フラグメントの使用が本発明に包含される。加えて、検出体結合ドメインまたはＣＲＢＤ若しくはＣＲＰＢＤ若しくはＣＥＢＤは、二価若しくは三価のイオンのような金属分子を含み得、そしてコンジュゲート結合パートナーは金属イオンを特異的に結合するキレート剤を含み得る。
【０３２９】
本明細書の別の場所に開示されるとおり、検出体分子は、リボソームの出口孔から発生するＲＮＡ分子の一部分に相補的なＰＮＡを含んでなる。ＰＮＡは、検出体分子に共有結合され、そして発生するｍＲＮＡに結合する一連のヌクレオチドを含んでなる。好ましくは、ＰＮＡは約１から１０ヌクレオチドまで、なおより好ましくは約１から約５ヌクレオチドまで、なおより好ましくは約２ないし約３ヌクレオチドを結合する。好ましくはＰＮＡは三ヌクレオチドを結合する。
【０３３０】
本明細書に開示される方法は、シグナリング部分が検出体分子に結合され、より具体的にはシグナリング部分の最低１種の蛍光分子が検出体分子のＣＲＢＤに結合され、そしてシグナリング部分の最低１種の第二の蛍光分子が直接若しくは間接的にのいずれかでＰＮＡに結合されている、シグナリング部分をさらに含んでなる。なおより具体的には、シグナリング部分を含んでなる蛍光分子は、少なくともＰＮＡにより相互から分離されている。
【０３３１】
検出体分子は、ＴＰペプチド、ＴＰ１０ペプチド、ｐＶＥＣペプチド、ペネトラチンペプチド、ｔａｔフラグメントペプチド、シグナル配列をベースとするペプチド、両親媒性モデルペプチドなどのようなＣＰＰをさらに含み得る。ＣＰＰは、本発明の方法が実施され得るようなキメラＲＮＡポリメラーゼ分子を選択的に結合するために検出体分子を細胞の内側に挿入するのに使用し得る。
【０３３２】
翻訳されたｍＲＮＡがキメラリボソームの出口孔から発生する場合に、ＰＮＡは、相補塩基対間の結合を介して発生するｍＲＮＡを結合する。ｍＲＮＡのＰＮＡへの結合はシグナリング部分の第二の蛍光分子の転置をもたらす。蛍光分子の転置は第一の蛍光分子の位置に関し、検出可能なシグナルの発射をもたらす。かように検出される検出可能なシグナルは、検出体分子に結合されたＰＮＡに相補的な配列を有するＲＮＡ分子がキメラリボソ
ームの出口孔から発生したことを示す。本方法の使用者に既知である、検出体分子に結合されたＰＮＡの配列をその後、キメラリボソームの出口孔から発生するＲＮＡ分子の配列を決定するのに使用する。ＲＮＡと相補ＰＮＡの間の相補結合事象の数および頻度を既知の配列と比較し、また、特定の遺伝子の翻訳を検出して、従ってＲＮＡ分子の翻訳を検出する。
【０３３３】
当業者は、本開示および本明細書に開示される方法を備える場合に、細胞が本発明の分子と一旦接触されれば、ＲＮＡ分子の翻訳を、当該技術分野で既知の存在するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法と対照的に細胞中で実時間で検討し得ることを理解するであろう。加えて、当業者は、細胞、組織若しくは生物体がさらされる条件を、細胞、組織若しくは生物体中でのｍＲＮＡの翻訳に対するこれらの条件の影響を決定するために変動し得ることを容易に理解するであろう。
【０３３４】
加えて、本発明はさらに、キメラリボソーム／検出体分子複合体が細胞と接触される前に、キメラリボソーム分子の検出体結合ドメインおよび検出体分子のＣＲＢＤを介して相互に結合されるキメラリボソームおよび検出体分子と細胞を接触させることを含んでなる、ＲＮＡ分子の翻訳の検出方法を含んでなる。すなわち、本発明は、特異的結合により結合されたキメラリボソームおよび検出体分子を含んでなる１個の大型分子と細胞を接触させることを含んでなる、ＲＮＡ分子の翻訳の検出方法を含んでなる。
【０３３５】
本方法は、キメラリボソームサブユニット成分および検出体分子が、それらが細胞と接触される前に相互と選択的に結合されることを除き、本質的に本明細書の別の場所に開示されるとおり実施される。
【０３３６】
本発明はさらに、リボソームが、例えばリポソームによって、電気穿孔法、化学的形質転換などにより、発現されるか若しくは細胞の内側に進入することを別の方法で可能にされる方法を包含する。検出体分子は、ＲＮＡ翻訳の経過の間に、３０ｓサブユニット若しくは５０ｓサブユニットのようなリボソームの１サブユニットに選択的に結合される。検出体分子は、本明細書の別の場所に記述されるところの２種のタンパク質間の選択的結合事象を介してサブユニットに結合され得るか、若しくは、検出体分子は、本明細書の別の場所に開示されるところのリボソームサブユニットへの抗体の選択的結合によりリボソームサブユニットに結合され得る。検出体分子／リボソームサブユニット複合体をその後、本明細書の別の場所に記述されるとおり細胞と接触させる。サブユニットは、他のリボソームサブユニットとの結合に際して、検出体分子を、本明細書に記述されるところのＲＮＡ分子の翻訳を検出するための位置に置く。従って、本発明は、限定されるものでないが原核生物リボソームの５０ｓおよび３０ｓサブユニットを挙げることができるリボソームサブユニットをさらに含んでなる検出体分子を含んでなる。
【０３３７】
Ｃ．核酸の配列決定方法
本発明は、さらに、伝統的な配列決定反応若しくは技術を使用することを伴わない核酸の迅速なｉｎ  ｖｉｔｒｏ配列決定方法を含んでなる。本発明は核酸の迅速配列決定に有用である。加えて、本発明は、核酸を患者若しくは生物学的サンプルから単離し、本発明の方法を使用して配列決定し、そしてある細胞型の既知配列と比較する、患者若しくは生物学的サンプルからの単離された核酸の同定に有用である。制限しない一例として、腫瘍細胞を含んでなる生物学的サンプルを患者から単離し得、そして該生物学的サンプルからの核酸を配列決定し得、そして該腫瘍細胞の同一性若しくは腫瘍細胞の核酸発現を決定するために腫瘍細胞の核酸の既知配列と比較し得る。加えて、本発明は、核酸の既知のライブラリーからの核酸の発現に刺激を適用する場合の細胞若しくは組織中の同一核酸の発現の比較において有用であり得る。
【０３３８】
該方法は、プロモーター／制御配列を含んでなる二本鎖オリゴヌクレオチドを支持体に結合することを含んでなる。該支持体は、ガラス製スライドガラス、プラスチック製スライドガラス若しくは皿、ナイロン若しくはセルロースメンブレン、ならびに化学および生物学的反応を実施するために当該技術分野で公知の他のこうした支持体であり得る。プロモーター／制御配列は、グルタルアルデヒドを介する共有架橋のように直接若しくはビオチン分子のような媒介によりのいずれかで支持体に結合する。ビオチン分子の場合、支持体をストレプトアビジンのような対応する結合パートナーで被覆する。当該技術分野で公知の他の分子を、プロモーター／制御配列を支持体に結合するのに使用し得、そして、本発明は、グルタルアルデヒド架橋若しくはビオチン／ストレプトアビジン複合に制限されると解釈されるべきでない。
【０３３９】
一例として、本発明の一態様において、アミン修飾プロモーター／制御配列を、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル反応基を含有する疎水性ポリマー（ＣｏｄｅＬｉｎｋ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を含んでなる活性化したスライドガラスを使用してスライドガラスに結合する。加えて、プロモーター／制御配列は、ＵＶ架橋、化学的架橋を可能にするシリコーン処理石英製スライドガラス、アガロース若しくは磁性ビーズなどを使用して、スライドガラスに結合する。
【０３４０】
プロモーター／制御配列を含んでなるオリゴヌクレオチドは、支持体に直接若しくは間接的のいずれかで結合されている端と反対の端で、制限酵素でさらに消化する。プロモーター／制御配列を含んでなるオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で既知のいずれかの制限酵素で消化して、付着端若しくは平滑端をもつオリゴヌクレオチドを残す。さらに、プロモーター／制御配列は、当該技術分野でいずれかの既知のもの、好ましくはＲＮＡポリメラーゼＩＩのプロモーター／制御配列、なおより好ましくはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター／制御配列（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ：配列番号２５）であり得る。
【０３４１】
一態様において、プロモーター／制御配列は、相補付着端へのライゲーションを可能にする付着端を含んでなる２種の相補オリゴヌクレオチドとして合成する。オリゴヌクレオチドの合成は当該技術分野で公知である。
【０３４２】
目的の核酸は、ＴＲＩＺＯＬに基づくＲＮＡ単離などのような当該技術分野で公知の方法を使用して細胞、動物若しくは組織から単離する。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ  ＆  Ｗｉｌｅｙ、ニューヨーク）を参照されたい。目的の核酸をその後、逆転写酵素を用いる転写のような当該技術分野で公知の方法を使用して二本鎖ｃＤＮＡ分子に転写する。該二本鎖ｃＤＮＡをその後、目的の核酸がプロモーター／制御配列に対する対応する付着端若しくは平滑端を有するような、プロモーター／制御配列を含んでなるオリゴヌクレオチドを消化するのに使用した制限酵素で消化する。プロモーター／制御配列および消化した二本鎖ｃＤＮＡをその後、当該技術分野で公知の方法を使用して一緒に連結する。
【０３４３】
目的の二本鎖ｃＤＮＡに融合したプロモーター／制御配列を、検出体分子を含んでなるキメラＲＮＡポリメラーゼと接触させる。キメラＲＮＡポリメラーゼはプロモーター／制御配列に結合し、そして目的の二本鎖ｃＤＮＡを転写することを開始する。検出体分子のＰＮＡが、キメラＲＮＡポリメラーゼから発生する新生ｍＲＮＡを結合し、そして本明細書の別の場所に記述されるとおりシグナルを発する。該シグナルは、限定されるものでないが、顕微鏡検査、共焦点顕微鏡検査、多光子顕微鏡検査、感光膜への曝露、または蛍光
および極性の変化を検出し得る装置、例えばＰＯＬＡＲＳＴＡＲ  ＯＰＴＩＭＡ若しくはＦＬＵＯＲＯＳＴＡＲ（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ、ノースカロライナ州ダラム）の使用を挙げることができる検出手段により検出する。
【０３４４】
かように検出されるシグナルは、検出体分子および新生ＲＮＡに結合したＰＮＡの相補結合によりシグナリング部分の位置が変えられる場合に発せられる蛍光若しくは極性シグナルの消光および蛍光発光により生成される。本明細書の別の場所に記述されるとおり、ＰＮＡは好ましくは新生ＲＮＡ上の三ヌクレオチド相補物を結合しかつシグナルを発せさせる。従って、目的の核酸を配列決定するために、本発明の配列決定法を実質的に本明細書に記述されるとおり実施し、そしてその後、新生ＲＮＡの異なる配列を結合する異なるＰＮＡを用いて反復する。従って、プロモーター／制御配列および目的の核酸を、例えばＣＡＣを結合するＰＮＡを含む検出体分子を使用して配列決定する場合は、第二の反応を、検出体分子を含んでなるキメラＲＮＡポリメラーゼ（ここで該検出体分子はＣＡＣを結合しない配列を有するＰＮＡを含んでなる）を使用して実施する。該シグナルが、本明細書の別の場所に記述されるところのシグナルの検出手段により検出され、そして第一の反応および第二の反応の結果を、目的の核酸の配列若しくは配列の緊密な近似を決定するために比較かつ解析する。
【０３４５】
ＶＩＩＩ．キット
本発明は、ＲＮＡ分子の転写を検出するための多様なキットを包含し、該キットは、キメラＲＮＡポリメラーゼ、検出体分子、および本発明の方法を実施するための該キットの使用を記述する説明資料を含んでなる。これらの説明書は本明細書に提供される方法および例を単純に例示する。モデルキットを下述するとは言え、他の有用なキットの内容は本開示に照らして当業者に明らかであろう。これらのキットのそれぞれを本発明内で企図している。キットは本発明の各態様について予見される。
【０３４６】
本キットの検出体分子は、本質的に、本明細書の別の場所に開示される要素を包含する。検出体分子は、細胞透過性ペプチド、キメラＲＮＡポリメラーゼの検出体結合ドメインを特異的に結合するＣＲＰＢＤ、蛍光分子を含んでなるシグナリング部分、およびＲＮＡ分子の一部分に相補的なＰＮＡを含み得る。好ましくは、ＰＮＡは二ヌクレオチド若しくは三ヌクレオチド、より好ましくは三ヌクレオチドを結合する。好ましくは、蛍光分子は、ＲｅＡｓＨ分子、ＢＳＲ分子、Ｃｙ３Ｂ分子、Ｃｙ５分子、フルオレセイン分子、若しくは本明細書の別の場所に開示される別の蛍光分子である。
【０３４７】
本発明のキットに包含されるキメラＲＮＡポリメラーゼは、本明細書の別の場所に記述されるところの単離されたポリペプチドであり得るか、若しくは、本明細書の別の場所に開示されるところの単離された核酸から発現され得る。
【０３４８】
本発明の一態様において、キットは単離されたキメラＲＮＡポリメラーゼポリペプチドを含んでなる。該単離されたＲＮＡポリメラーゼポリペプチドは、とりわけ、本明細書の別の場所に記述される検出体分子のＣＲＰＢＤを特異的に結合する検出体結合ドメインを含んでなる。
【０３４９】
本発明の別の態様において、キットはキメラＲＮＡポリメラーゼをコードする単離された核酸を含んでなる。本発明の単離された核酸によりコードされるキメラＲＮＡポリメラーゼは、とりわけ、本明細書の別の場所に記述される検出体分子のＣＲＰＢＤを特異的に結合する検出体結合ドメインを含んでなる。
【０３５０】
本発明のなお別の態様において、キットは、ＲＮＡのタンパク質への翻訳を検出するためのキメラリボソームを含んでなる。該キットは、検出体結合ドメインおよび可変リンカ
ー領域をさらに含んでなるキメラリボソームサブユニット若しくはそのフラグメントを含んでなる。該キットは、さらに、ＣＲＢＤを含んでなる検出体分子、およびＲｅＡｓＨ分子、ＢＳＲ分子、Ｃｙ３Ｂ分子、Ｃｙ５分子、フルオレセイン分子、若しくは本明細書の別の場所に開示される別の蛍光分子を包含する蛍光分子のようなシグナリング部分を含んでなる。
【０３５１】
本発明のキットに包含されるキメラリボソームは、本明細書の別の場所に記述されるところの単離されたポリペプチドであり得るか、若しくは本明細書の別の場所に開示されるところの単離された核酸から発現され得る。
【０３５２】
本発明の一態様において、キットは単離されたキメラリボソームポリペプチドを含んでなる。単離されたキメラリボソームポリペプチドは、とりわけ、本明細書の別の場所に記述される検出体分子のＣＲＢＤを特異的に結合する検出体結合ドメインを含んでなる。
【０３５３】
本発明の別の態様において、キットは、キメラリボソームをコードする単離された核酸を含んでなる。本発明の単離された核酸によりコードされるキメラリボソームは、とりわけ、本明細書の別の場所に記述される検出体分子のＣＲＢＤを特異的に結合する検出体結合ドメインを含んでなる。
【０３５４】
本発明のキットは、本発明の方法で使用されるプレートおよび皿、緩衝剤、溶液などのような本明細書に開示される付加的な試薬、ならびに本発明の方法を実施するためのアプリケーター若しくは他の器具をさらに含み得る。本発明のキットは説明資料をさらに含んでなる。
【０３５５】
［実施例］
実験実施例
本発明は今や以下の実施例に関して記述する。これらの実施例は具体的説明の目的上のみ提供され、そして、本発明は、これらの実施例に制限されると決して解釈されるべきでなく、しかしむしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかとなるいかなるおよび全部の変形物を包含すると解釈されるべきである。
【実施例１】
【０３５６】
キメラＲＮＡポリメラーゼ−ＳＨ３−Ｔ７融合構築物
キメラＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡ鋳型からＲＮＡを合成する際に該ポリメラーゼの検出体結合ドメインと検出体分子が会合し得るような本発明のキメラＲＮＡポリメラーゼを工作する。α−ＰＡＫドメインおよびβ−ＰＩＸのＳＨ３ドメインはｉｎ  ｖｉｖｏで会合しかつ高い相互作用親和性を有することが以前に示されている。従って、β−ＰＩＸ  ＳＨ３ドメインを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのＮ末端領域に工作した。
【０３５７】
ラットβ−ＰｉｘからのＳＨ３ドメイン（ＡＦ０４４６７３；ｇｉ２８６５５９５、ｎｔ１−１８９；配列番号２）をＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＣ＿００１６０４、ｎｔ３１７１−５８２２；配列番号１）のアミノ末端にクローン化する５種の構築物を創製した。構築物１（Ｃ１）では、ＳＨ３ドメインの最後のアミノ酸にすぐＴ７のアミノ酸配列が続き、構築物２〜５（Ｃ２〜Ｃ５）では、それぞれ０ないし３個のプロリンを含有する１０アミノ酸のスペーサーペプチドをこれら２ドメインの間に挿入した。該スペーサーペプチドは、増大する数のプロリンで該２ドメインを相互からわずかに離して配置して、スペーサーペプチド中でより多い曲がりを提供する。
【０３５８】
これらのプロリンは、ＳＨ３ドメイン（検出体結合ドメイン）をスペーサーペプチドのα−ヘリックスの周囲の等距離に配置する。キメラＲＮＡポリメラーゼ構築物中に工作さ
れたスペーサーペプチドは、０個のプロリン−ＧＤＫＶＱＬＩＧＦＧ（配列番号１７）；１個のプロリン−ＧＥＧＬＰＧＭＣＧＧ（配列番号１８）；２個のプロリン−ＧＰＤＤＴＰＷＤＧＧ（配列番号１９）；および３個のプロリン−ＧＰＰＤＴＰＹＡＤＧ（配列番号２０）である。これらのスペーサーペプチドは、キメラＲＮＡポリメラーゼに結合された検出体分子のより大きな柔軟性を可能にし、その結果検出体分子は新生ＲＮＡとより良好に相互作用し得る。スペーサーペプチドのα−ヘリックスの性質は、ＲＮＡ出口孔からの特定の距離にＳＨ３ドメインを配置する。
【０３５９】
細菌からのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの精製は、サイズ排除およびイオン交換カラムのような標準的プロトコルを使用する十分に確立された手順である（Ｄａｖａｎｌｏｏら、１９８４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８１：２０３５−２０３９；Ｇｒｏｄｂｅｒｇら、１９８８、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：１２４５−１２５３；Ｚａｗａｄｓｋｉら、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９：１９４８；Ｌｉら、１９９９、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１６：３５５−３５８）。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、例えばＢＬ２１−ＴＩＲ細菌から得ることができ、そして、キメラＲＮＡポリメラーゼを発現するよう工作されたＢＬ２１−ＴＩＲ細菌の１００ｍｌ培養物からの数ミリグラムのタンパク質の収量が容易に可能である。
【０３６０】
ＲＮＡポリメラーゼ構築物を、異なる実験系間の往復が容易であるように、ＧＡＴＥＷＡＹ（Ｒ）ベクター系（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州ラホヤ）にクローン化した。５種の異なる細菌で発現されたキメラＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを作成し、そして同一の５構築物を哺乳動物細胞で発現させる。これらの構築物は最初の実験のための適切な選択である一方、本明細書の別の場所に開示されるとおり、検出可能なシグナルを最大化するようにＲＮＡポリメラーゼの他の領域に捕捉ペプチドを配置することが必要でありうる。これは、当該技術分野で公知であるとおり、ＲＮＡ出口孔の周囲の多様な部位で挿入突然変異誘発を実施することにより達成することができる。
【０３６１】
Ｃ１の段階的構築を後に続くとおり実施した。ＳＨ３ドメインおよびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを、一緒に連結されるはずであった端の５’リン酸化したプライマー（ＳＨ３について配列番号８および配列番号９；Ｔ７について配列番号１０および配列番号１５）を使用する別個の反応でＰＣＲにより増幅した（ＳＨ３  ３’端およびＴ７  ５’端）。ＳＨ３およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのＰＣＲ産物を一緒に連結した。ＳＨ３−Ｔ７連結分子を、該連結反応を鋳型として使用するＰＣＲにより増幅した。正しい大きさのＰＣＲ産物をアガロースゲルから抽出した。ＳＨ３−Ｔ７  ＰＣＲ産物をｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯエントリーベクターにクローン化し、そしてＧＡＴＥＷＡＹ（Ｒ）組換え系を使用して発現ベクターに移入した。構築物２〜５は、Ｔ７−５’Ｌの代わりにプライマー０Ｐ／１Ｐ／２Ｐ／３Ｐ−Ｔ７−５’Ｌを含有する５’リン酸化したリンカーを使用する同一の戦略に従って創製した。［Ｊｉｍ：配列番号１１、１３および１４のスペーサー部分はアミノ酸配列、配列番号１７、１９および２０に対応しない。プライマー若しくはアミノ酸配列のどちらの配列が正しいか？］
【０３６２】
【表３】
2008545394.tif 000005
【０３６３】
ＢＬ２１細菌を、構築物Ｃ１〜Ｃ５のそれぞれを含んでなる発現ベクターで形質転換した。各キメラＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ構築物から発現されるタンパク質を、変性タンパク質ゲルで分析した（図２９）。タンパク質のレベルはＢＳＡタンパク質負荷曲線と比較して推定し得る。
【０３６４】
キメラＴ７  ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡを合成することがなお可能であったかどうかを評価するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ転写アッセイを実施した。キメラＲＮＡポリメラーゼ（３０ｎｇ）を、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有するプラスミド鋳型およびＰ３２放射標識ヌクレオチドを含有するＲＮＡ転写反応に添加した。放射標識ヌクレオチドが新生ＲＮＡに取り込まれた。クローン化したＲＮＡポリメラーゼのそれぞれのＲＮＡ合成能力についての０および３０分の時間点を図２９の右側の図に示す。キメラＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのそれぞれがＲＮＡ合成活性を表した。従って、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのＮ末端での検出体結合ドメインおよびスペーサーペプチドの挿入は該酵素を不活性化しない。これらの改変ＲＮＡポリメラーゼをその後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現プロファイリングのための予備実験で使用した。
【実施例２】
【０３６５】
検出体分子の合成
本実施例は、本発明の方法を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ研究のための多様な検出体分子の合成を記述する。ｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）戦略を使用する固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して、検出体分子を生成するのに使用されるペプチドを合成した。具体的には、ＳＰＰＳを使用して、Ｃ末端チオエステル、リンカー、ＰＮＡ三量体およびフルオレセインを含有するペプチド（Ｌ６０４）；α−ＰＡＫ配列およびＴＡＭＲＡを含有するペプチド（Ｌ６０５）；Ｃ末端チオエステル、リンカー、ＰＮＡ三量体およびフルオレセインを含有するペプチド（Ｌ５６４）；ならびにα−ＰＡＫ配列、ＴＡＭＲＡおよびＮ末端Ｃｙｓを含有するペプチド（Ｌ５７５）を合成した。該ペプチドの全部をＨＰＬＣにより精製し、そしてその後ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により分析した。
【０３６６】
３種の異なるＰＮＡ−リンカーペプチドをα−Ｐａｋドメイン含有ペプチドに連結して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究のための検出体分子を生成した（図１２に描かれる上３種の分子）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ応用に企図している２種の他の検出体分子もまた図１２に描く（下２種の分子）。
【０３６７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ研究のため、４種の異なるＰＮＡ−リンカーペプチドをα−Ｐａｋドメイン含有ペプチドに連結した。これらの２種はリンカーの一部としてＮＬＳを含有した（図１３Ａの上２種の分子）。他２種はＰＮＡに結合されたＮＬＳを含有した（図１３Ａの下２種の分子）。これらのそれぞれを、Ｎｐｙｓ活性化したＣｙｓを含有する細胞透過性ペプチドＴＰ１０にジスルフィド架橋を介してさらに結合し、（図１１）検出体分子を製造した。１種のｉｎ  ｖｉｖｏ検出体分子を試験し、そしてＮＬＳが該検出体分子を細胞核に成功裏にターゲッティングした。図１３Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏ応用に企図している４種の他の検出体分子を描く。
【０３６８】
検出体分子の２種（Ｌ６０６およびＬ６０２）ならびにＴＰ１０配列は後に続くとおり合成した。チオエステルペプチドＬ６０４およびＬ５６４の合成を容易にするために、Ｂｏｃ化学−ＳＰＰＳのためのチオエステルペプチドを生じる樹脂リンカーを使用した。ＨＦ不安定性ＭＢＨＡ樹脂で開始して、ロイシン、次いでＳ−トリチルメルカプトプロピオン酸を、標準的ＳＰＰＳ条件を使用することによりカップリングした。生じる樹脂を、ＤＣＭ／ＴＦＡ／ＴＩＳによるトリチル保護基の除去後にポリペプチド鎖集成のための出発樹脂として使用した。所望のチオエステル結合を、残存するアミノ酸を標準的カップリング条件下でカップリングすることにより樹脂上で直接生成し得た。ＨＦ切断、ＨＰＬＣ精製およびその後の質量分析後に、Ｃ末端チオエステルペプチドをＮＣＬで直接使用した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析データを正反射（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）モードで記録した。粗チオエステルペプチドＬ６０４およびＬ５６４のＨＰＬＣスペクトルを図１４および１６に見ることができ、また、正しい画分の質量スペクトルをそれぞれ図１５および１７に見ることができる。
【０３６９】
ペプチドＬ６０５およびＬ５７５を、ＳＰＰＳのｔ−Ｂｏｃ戦略を使用して、ペプチド合成機（モデル４３１Ａ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国マサチューセッツ州フラミンガム）で０．１ミリモルスケールで段階的様式で合成した。ｔ−Ｂｏｃアミノ酸をヒドロキシベンゾトリアゾールエステルとしてｐ−メチルベンジルヒドリルアミン樹脂（Ｂａｃｈｅｍ、スイス・ブーベンドルフ）にカップリングして、Ｃ末端アミド化したペプチドを得た。該ペプチドをＤＭＦ中２０％ピペリジンで処理してＬｙｓ２側鎖上のＦｍｏｃ基を切断分離した。ＴＡＭＲＡを２等量のＤＩＥＡと一緒にＤＭＳＯ／ＤＭＦ（１：１）に溶解し、そしてＬｙｓ２側鎖に一夜カップリングした。ペプチドＬ６０５のＨＰＬＣおよび質量スペクトルは図１８および１９に見ることができ、また、Ｌ５７５の質量スペクトルは図２０に見ることができる。
【０３７０】
ペプチドＬ６０６をもたらす、ペプチドＬ６０４とＬ６０５の間の天然の化学的連結（ＮＣＬ）を、ｐＨ７．２のリン酸緩衝液、塩酸グアニジンおよびチオフェノール中で実施した。混合物を一夜反応させ、そして１２時間で完了した。ＮＣＬのＨＰＬＣスペクトルは図２１に見ることができ、また、正しい画分の質量スペクトルは図２２に見ることができる。Ｌ６０２をもたらす、Ｌ５６４とＬ５７５の間のＮＣＬ反応を、Ｌ６０４およびＬ６０５についてと同様に実施した。
【０３７１】
本明細書に記述される方法により合成した検出体分子は、合成および機能双方に関して至適化し得る。一例として、蛍光分子間の距離を、最良のシグナルを生じかつ受領するように至適化し得る。ＣＰＰおよび／若しくは核局在化シグナルを、ｉｎ  ｖｉｖｏ転写検出のため改変し得る。
【実施例３】
【０３７２】
発現プロファイリングおよび配列決定
発現プロファイリングおよび配列決定は、マイクロアレイ上に固定されている短い二本鎖オリゴヌクレオチドＤＮＡにｃＤＮＡ集団を連結することによりマイクロアレイ上で起こる（図２３）。これらの短いＤＮＡオリゴヌクレオチドを、本発明の方法を使用する検出体分子による検出を容易にするように改変する。ＤＮＡは、二本鎖オリゴヌクレオチドの結合鎖の５’端上の１２炭素伸長上に５’活性化可能なアミンを伴い合成する。該オリゴヌクレオチドは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位、スペーサー領域、および例えばＥｃｏＲ１部位のような連結可能な制限酵素部位もまたコードする。相補オリゴヌクレオチドは、５’活性化可能なアミンを含まない相補配列を含有するが、しかし５’リン酸を含有する。このオリゴヌクレオチドの配列はスポット間で不変である。二本鎖オリゴヌクレオチドを、ＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅｓ  ＯｍｎｉＧｒｉｄアレイヤー（ａｒｒａｙｅｒ）（ミシガン州アナーバー）を使用してアミン結合（ａｍｉｎｅ−ｌｉｎｋ）ガラス製スライドガラスにスポットする。これらのスポットの印刷密度は変動し、各スポットは、隣接スポットの中心間の２００ミクロンの距離を伴い直径約１５０ミクロンである。
【０３７３】
検出は個々のＤＮＡが識別可能でなければならないことを必要とし、従って、ＤＮＡ密度はスポットあたり約１０，０００分子ないしスポットあたり約２５０，０００分子の間で変動することができる。これらの密度は複数の個々の分子が所定の視野内で見えるように異なる。スポットの各行は、各行の始めに配置される蛍光分子により仕切られる。
【０３７４】
ガラス製スライドガラス上での二本鎖オリゴヌクレオチドの結合後に、ｃＤＮＡ集団を、固定したオリゴヌクレオチドに直接連結する。ｃＤＮＡライブラリーを、ｃＤＮＡ合成を開始するためのオリゴｄＴおよびランダムプライマーの混合物を使用するｍＲＮＡのｃＤＮＡへの転化により生成する（図２３）。双方のプライマーは、合成されたｃＤＮＡ中でＲＮＡの３’端（オリゴｄＴでプライミングされる）およびＲＮＡの５’端により近い配列（ランダムプライミングされる）の双方が表されるように使用する。ｃＤＮＡが一旦合成されれば、それを二本鎖にしかつＥｃｏＲＩで消化する。消化されたＤＮＡを、マイクロアレイに固定したオリゴヌクレオチドに直接連結する。連結反応に依存して、各固定されたオリゴヌクレオチド上の多様なｃＤＮＡの鎖状体が生じ得る。多様なｃＤＮＡの鎖状体が異なるＲＮＡの認識において困難を引き起こす場合には、自己連結が起こり得ないように、ＥｃｏＲ１で消化したｃＤＮＡを脱リン酸化し、従って、ライゲーション反応を、固定したオリゴヌクレオチドでのライゲーションに偏向させる。
【０３７５】
ライゲーション後に、カバーガラスの２端が開放であり室を創製するようなカバーガラスでアレイを覆い、その結果溶液が該室を通り流れ得る。室のあるマイクロアレイを、蛍光刺激およびＦＲＥＴ検出の可能な顕微鏡の載物台に置く。あるいは、スライドガラスを、本明細書の別の場所に記述されるもののような自動蛍光検出器の反応／検出室に入れる。キメラＲＮＡポリメラーゼがＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに結合し、検出体分子がＲＮＡポリメラーゼに結合し、そして、ＲＮＡが合成される際に、ＲＮＡがＲＮＡ出口孔を出る際に新たに合成されたＲＮＡの相補配列にＰＮＡが結合する場合にフルオレセインおよびＴＡＭＲＡ蛍光分子が相互に関して動くように、キメラＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出体分子およびＮＴＰを、透析するか、若しくはマイクロアレイの室に微小ポンプで送る（図２３）。
【０３７６】
マイクロアレイを、上述されたところのＣｏｄｅｌｉｎｋスライドガラス上で、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位を含有するアミノ修飾した二本鎖ＤＮＡ鋳型を固定することにより作成した。２種のＤＮＡ鋳型を製造した。コーディング配列に作動可能に
連結されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターをそのそれぞれが有したアクチンｃＤＮＡおよびｐＧＥＭクローニングベクターを、１６炭素リンカーアームに一級アミンを含有するよう改変した５’ＰＣＲプライマーを使用して増幅した。この一級アミン基をＣｏｄｅｌｉｎｋスライドガラスに連結し、それにより、二本鎖ＤＮＡ鋳型の転写が該ＤＮＡ鋳型の結合された領域から該鋳型の自由端まで起こるとみられるようなＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの方向を定めた。
【０３７７】
ｇｔｇ  ＰＮＡを含んでなる３種のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出体分子（図１２の上３種の分子）の混合物を、全５種のキメラＲＮＡポリメラーゼの混合物と混合し、マイクロアレイに添加しかつ転写緩衝液中でインキュベートして、繋ぎ止められたＤＮＡ鋳型分子をＲＮＡに転写した。スポットしたアレイの拡大像に示されるとおり、検出可能な蛍光シグナルがＲＮＡ転写の間に発せられる。スポットを、蛍光強度の変化が検出かつ定量され得るような時間にわたり画像化し、従って時間および配列依存性のＢｌｉｎｋｅｒシグナルを生じさせる。
【０３７８】
蛍光分子の明滅を数分の経過にわたり評価し、明滅間の時間を測定する。各ＲＮＡが合成されている際のそれと関連する明滅時間を、明滅間の時間を核酸の配列と相関させる、Ｊｕｎｈｙｏｎｇ  Ｋｉｍ博士により開発された、本明細書の別の場所で論考される拘束局所動的時間伸縮（ＣＬ−ＤＴＷ）アルゴリズムに当てはめる。これらのデータを使用して、配列が明滅パターンに一致するＲＮＡについてラット、マウスおよびヒトのデータベースに問い合わせる。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは１秒あたり約８０塩基の速度でＲＮＡを合成し、そして、結果として１２マイクロ秒の分解能が単一ヌクレオチドの分離に必要とされる。本明細書に記述される方法はＰＮＡ三ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションにより最低約３個の隣接ヌクレオチドを評価するため、この三ヌクレオチド配列の検出のための時間分解能は、１２ミリ秒より有意により少なく緊縮性である。８０塩基／秒により除算される３個の特定の隣接する塩基を見出すことの頻度（４３＝１／６４）は、明滅間の時間である８００ミリ秒に等しい。この時間枠は、当該技術分野で既知の利用可能な検出器で容易に認識可能である。
【０３７９】
単一分子検出は本明細書に記述される標準的検出系で評価されるが、しかし、単一分子解像度を高める、倒立顕微鏡に一体化された背面照射型増倍ゲイン（ｂａｃｋ−ｔｈｉｎｎｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｖｅ  ｇａｉｎ）カメラを使用してもまた評価し得る。ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成の速度を考えれば、たった数分間の画像化が、連結されたｃＤＮＡを明白に同定するのに十分である。
【０３８０】
ＦＲＥＴシグナル生成ならびに蛍光極性測定に最適である多様な検出体分子の合成は本明細書の別の場所に記述される。ＦＲＥＴのための蛍光分子間の距離は至適には１０〜２０アミノ酸である一方、極性測定については、１０アミノ酸未満の分離が好ましい。従って、検出は、本発明の検出体分子に依存して、ＦＲＥＴ若しくは蛍光検出を使用して補足若しくは置換し得る。
【０３８１】
検出体分子上の三ヌクレオチドのＰＮＡ配列の選択を、核酸を伴うＰＮＡにより表される比較的高いアニーリングエネルギーにより行った。事実、２１塩基のＰＮＡは約９０℃のＴｍを有し得る。３塩基ｇｔｇのＰＮＡは、それが既存のＲＮＡに近づきかつ離れ得るように３７℃で一過性にアニーリングする。本明細書に記述されるこの３塩基配列は、長さ最低約４若しくは５若しくは６塩基に伸長もまたし得る。４、５若しくは６塩基のＰＮＡの配列は、ＲＮＡの集団との相互作用の数を最大化するように生物情報科学的に決定される。これは、既知のコドンの好み、ヒト、マウス若しくはラットのようなある種に特定のＧ：Ｔ比、および当該技術分野で公知の核酸の他の特徴を使用して決定し得る。
【０３８２】
検出可能な明滅シグナルは、連結されたｃＤＮＡを明白に同定することができる。同一ＲＮＡについて検出可能な明滅シグナルを表示する多様なオリゴヌクレオチドの数が、初期ＲＮＡ集団中のその特定のＲＮＡの豊富さの分析を可能にする。連結されたｃＤＮＡの配列決定は、検出体分子中の複数の三ヌクレオチドのＰＮＡ配列の組合せを使用してもまた可能である（Ｋｏｒｎら、２００３、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、３１：８９）。従って、三ヌクレオチドの全６４種の異なる組合せを使用することは、完全な配列情報がいずれのｃＤＮＡについても得られることを可能にする。これは、繰り返し様式でロボット的になされ、１検出体分子を使用し、シグナルを生成させ、そしてその後洗い流し、そして、異なるＰＮＡ配列検出体を伴う別の検出体分子が続く。検出体分子のシグナルが生成される方法により、６４種の組合せの完全な相補物がいずれかの所定のｃＤＮＡの配列を決定するのに必要とされないであろうことが高度にありそうである。三ヌクレオチドのような変動するオリゴヌクレオチド配列を伴う検出体分子は、本明細書の別の場所に開示される方法を使用して合成し得る。
【０３８３】
本発明の方法および組成物を使用して新規ＲＮＡを同定する場合に、該ＲＮＡの同一性を独立に確認し得る。マイクロアレイの明滅シグナルに対応するＲＮＡの同一性の確認はＰＣＲにより決定される。同定されたＲＮＡの配列を使用して、マイクロアレイ上のＤＮＡスポットから配列をＰＣＲ増幅するためのＰＣＲプライマーを生成する。このＰＣＲ反応は低密度の固定されたＤＮＡを用いて実施する。検出可能な明滅シグナルを生じさせるマイクロアレイに固定されたＤＮＡにＲＮＡが連結されていることの確認は、連結されたｃＤＮＡに対し５’である固定されたＤＮＡからであるＰＣＲ反応プライマーの１種により提供される。さらなる標準的ＲＮＡ増幅およびマイクロアレイ分析を、検出可能な明滅シグナルにより観察されるところの多様な転写物の同一の相対比が、（より時間がかかるとは言え）標準的技術で見られるものに平行であることを確認するために実施し得る。
【実施例４】
【０３８４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏＢｌｉｎｋｅｒシグナルの生物情報科学分析
Ｂｌｉｎｋｅｒシグナルのシグナル処理および標的適合：画像の取り込みおよび解析からの最初のシグナル定量後に、測定したＢｌｉｎｋｅｒシグナルを転写物配列に変換する。該アプローチは候補配列のライブラリーの生成で開始する。各ライブラリー配列を、ＰＮＡ：：ＲＮＡ二重鎖形成および検出器応答のコンピュータモデルを使用して、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  Ｂｌｉｎｋｅｒシグナルに変換する。計算機上で（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）標的シグナルのライブラリーへのプローブのＢｌｉｎｋｅｒシグナルの適合の程度を定量化する。その後、最良の適合および適合の信頼性を統計学的に評価する。
【０３８５】
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  Ｂｌｉｎｋｅｒシグナルのライブラリーの生成：Ｂｌｉｎｋｅｒ技術は、ＦＲＥＴによるＰＮＡ：ＲＮＡのｋ−ｍｅｒ二重鎖中の配置の変化を検出することに依存する。ｋ−ｍｅｒのＰＮＡ配列を考えれば、標的配列中の相補ｋ−ｍｅｒの存在／非存在をコンピュータ計算することは簡単である。しかしながら、該ｋ−ｍｅｒはＦＲＥＴ応答の差別的調節を誘導する部分的二重鎖を形成しうるため、Ｂｌｉｎｋｅｒシグナルには単純な相補適合より多くの情報が存在する。これは、測定したＢｌｉｎｋｅｒシグナルが応答ピークの混合した様式を有し、より小さいピークが潜在的に部分適合に対応している、図３０のグラフで見ることができる。従って、候補配列のＢｌｉｎｋｅｒシグナルのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデルを、最初に、二重鎖配置の生物物理学的モデルを結合自由エネルギーに基づきコンピュータ計算することにより構築する。候補標的の集合物を、実験的プローブシグナルとの比較のためにｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  Ｂｌｉｎｋｅｒシグナルのライブラリーを生成するのに使用し得る。
【０３８６】
プローブのｋ−ｍｅｒのＰＮＡ配列および標的転写物のｋ−ｍｅｒの枠を考えれば、ＰＮＡおよびＲＮＡは、合計２ｋの配置について、完全に解離しうる、第一の位置のみで結
合されうる、第二の位置でのみ結合されうる、などである。二重鎖配置の相対自由エネルギーを、各可能な対に結合エネルギーを割り当てる予め決定されたパラメータの組、［ΔＥｉｊ｜ｉ，ｊ＝｛Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｕ｝］を使用して、ｋ個の位置の対結合自由エネルギー値を（結合された位置のサブセットについて）総和することによりコンピュータ計算する。予備データでは、相互作用は一過性でありかつ二重鎖らせんのスタッキングエネルギーにより強く支配されないと仮定した。従って、−３ｋｃａｌ、−２ｋｃａｌおよび−１ｋｃａｌがそれぞれＣ：Ｇ：、Ａ：ＵおよびＧ：Ｕ対に、ならびにゼロが全部の他の対に割り当てられた。潜在的配置の確率は、ｉ番目の配置について、量
【０３８７】
【数１】
2008545394.tif 000006
【０３８８】
を使用してコンピュータ計算され；該総和はｉ番目の配置のｋのポジショナル二重鎖状態（ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｄｕｐｌｅｘ  ｓｔａｔｅ）にわたり、そしてＴは温度パラメータである。その場合、ｉ番目の配置の確率は
【０３８９】
【数２】
2008545394.tif 000007
【０３９０】
である。
【０３９１】
各二重鎖配置は、結合された蛍光分子間のある相互作用距離を意味している。例えば、二重鎖が全部のｋ位置で完全に結合される場合、蛍光分子は、Ｆｏｅｒｓｔｅｒ距離（５０％至適の共鳴転移の距離）に関して何らかの相対距離ｄにあると仮定される。各ｉ番目の配置はｄ（ｉ）相対距離を誘導すると期待する。ＦＲＥＴ出力の調節は、標準的な６次応答、Ｅ＝１／（１＋ｄ（ｉ）６）としてモデル化される。従って、標的配列の特定の１ｋ−ｍｅｒ枠での期待されるＢｌｉｎｋｅｒシグナルは、
【０３９２】
【数３】
2008545394.tif 000008
【０３９３】
すなわち、ＰＮＡ：：ＲＮＡ二重鎖配置の確率を上回る期待されるＦＲＥＴエネルギーとしてコンピュータ計算される。該モデルのパラメータは実際のデータの測定値への当てはめにより推定し得る。該パラメータは、ピーク分布およびピーク遷移時間の最小二乗当てはめにより数値的に至適化することができる（予備データはピーク分布への当てはめを用いて生成した）。
【０３９４】
標的配列の潜在的実験測定値は、ＦＲＥＴシグナル、ポリメラーゼによる標的配列を横断する動きおよび検出装置の関数である。とりわけ、重要なパラメータは、検出装置の時間応答、および標的配列を横断する動き（ポリメラーゼの処理能力により支配される）に関するサンプリング間隔である。光電子増倍管（ＰＭＴ）のような迅速な時間応答を伴う
光収集装置は、サンプリング点での実際の値に近いシャッター閉鎖時タイムスライス（ｓｈｕｔｔｅｒｅｄ  ｔｉｍｅ−ｓｌｉｃｅ）シグナルを生じることができ；一方、収集した光をサンプリングまで積分する装置（例えばＣＣＤ）は、間隔全体の総和である異なる値を生成することができる（図３１）。一般に、シグナルを積分する装置は、時間領域のエラー（ジッター）に対しより少なく感受性であることができる。Ｂｌｉｎｋｅｒシグナルは、積分モデルおよびタイムスライスモデル双方を組み込むことによりモデル化することができる。Ｐｅｒｌ／Ｃ＋＋プログラムの総合ソフトウェアが、ＦＲＥＴシグナルおよび検出器応答モデル双方を伴い既に実装されている。
【０３９５】
プローブＢｌｉｎｋｅｒシグナルの標的Ｂｌｉｎｋｅｒシグナルへのマッチング：実験測定からのプローブＢｌｉｎｋｅｒシグナルは、異なる時間間隔（サンプリング時間）でのＦＲＥＴ出力に対応する数のベクトルよりなる。標的配列のライブラリーからのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  Ｂｌｉｎｋｅｒシグナルもまた数のベクトルよりなる。解析の次段階は、プローブおよび標的のベクトルの間の適合の尺度をコンピュータ計算しかつ最良のマッチング標的を決定することである。適合のコンピュータ計算は、Ｂｌｉｎｋｅｒシグナル産生での固有のエラーおよび偏りのため、単純なベクトル対ベクトルの相関として実施し得ない。プローブのシグナルは３種の型の潜在的エラー、すなわち、ＦＲＥＴ振幅のエラー（例えば二重鎖の変動による）、時間領域のエラー（「ジッター」と呼ばれ、ポリメラーゼの処理能力による）、および壊滅的なエラー（例えば塵埃、酵素の不足など）を有する。Ｂｌｉｎｋｅｒシグナルの偏りは、測定された値がプローブ配列の未知の枠に対応しかつ各転写事象が出力シグナル中に明瞭な境界なく転写のその後の回に潜在的に突入し；Ｂｌｉｎｋｅｒシグナルが未知の相にあり、そして再度未知の相でシグナルの付加的なコピーと潜在的に連結するという事実から生じる。従って、マッチングアルゴリズムは、全部のエラーの型、ならびに移相／連結の問題に対しエラー強さがなければならない。
【０３９６】
上の問題を解決するため、拘束局所動的時間伸縮（ＣＬ−ＤＴＷ）アルゴリズムがシグナルマッチングのため開発された。動的時間伸縮（ＤＴＷ）は、遺伝子発現の時系列分析にもまた使用されている、音声信号処理で開発されたアルゴリズムである。標準的配列アライメントアルゴリズムと同様、ＤＴＷアルゴリズムの目標は、２組の時系列間の最良の適合するアライメントを見出すことである。ＤＴＷアライメントでの挿入および欠失は、該２時系列のいずれかの時間領域のジッターと解釈し得る（図３２）。Ｂｌｉｎｋｅｒシグナルの大多数は、大きなピーク逸脱を伴い散在されたバックグラウンドの低振幅変動よりなる（図３０を参照されたい）。従って、タイムアライメントに関する情報密度は配列の大部分で低く、外的な規則性の制約（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｒｉｔｙ  ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ）の追加を必要とする。予備データでは、時間領域のジッターが最大Ｑ時間段階に制限された場合に単純な制約を実施し、ここでＱはユーザー定義済みパラメータである（予備データでＱ＝２）。ローカルパスの連続性の制約（ｌｏｃａｌ  ｐａｔｈ
ｃｏｎｔｉｎｕｉｔｙ  ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ）のような他の制約もまた実施することができる。該形態の制約は交換条件を課す。強い制約が適用される場合、擬陽性の適合は、大量のジッター若しくは壊滅的なエラーをもつシグナル間の真の適合が見失われること（擬陽性）の危険が低下される。該アルゴリズムは、十分に定義された実験データの収集物から調整されることができる。
【０３９７】
上述された相／連結の問題により、包括的アライメントは、プローブと標的の間の適合を見出すための情報を与えることが期待されない。局所ＤＴＷアルゴリズムを、配列アライメントのためのＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムと同様、コンピュータ計算した値が臨界値（シグナルを定数に適合させることからコンピュータ計算される）より下に下落する場合は常に動的プログラミング表の値をゼロに設定することにより実行した。
【０３９８】
Ｂｌｉｎｋｅｒシグナルの適合の統計学的評価：プローブシグナルおよび標的シグナルを、ＣＬ−ＤＴＷ手順を使用して一旦整列すれば、スコアを適合の質についてコンピュータ計算しなければならない。多くの可能な評価スキームが存在する。１つの可能性は、アライメント手順の評価スキームを直接使用することである。これはしばしば至適であることがありそうではなく；該アライメント手順の重要な目標は時間領域適合を得ることであり、そして同一の配列の基礎を有する２種のＢｌｉｎｋｅｒシグナルの見込みを評価することでない。予備試行で、異なるスコア、とりわけ対角和（ｓｕｍ−ｏｆ−ｄｉａｇｏｎａｌ）スコア、χ２加重スコア、およびフレームサイズにより除算される適合の数の使用を検討した。制限された組の実験データ内で、合理的性能が、局所アライメントの対角に沿ったχ２加重距離値を必要とする評価スキームで見出された。該評価スキームは、付加的なＢｌｉｎｋｅｒデータが多様な配列から一旦入手可能であれば、調整されることを継続することができる。
【０３９９】
最終出力について評価されるべき２種の付加的な統計学的手順が存在する。第一に、Ｂｌｉｎｋｅｒシグナルの複数の測定値を、典型的に、同一プローブについて通常は異なる画像領域から得；従って、複製シグナルのそれぞれからのスコアを総適合スコアに集約しなければならない。正しい集約（ｓｕｍｍａｒｙ）を見出すことの問題は、マイクロアレイ実験（例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプラットフォーム）での複数のプローブからの発現レベル値を集約することに類似である。単順な一手段は、壊滅的なエラーおよび相／連結の問題の潜在性により、合理的であることがありそうではない。中央値、百分位数若しくはトリム平均のような確固たる推定量が必要とされる。予備データでは分布正規化値の９５百分位数を使用した。より経験的なデータで、集約手順をさらに微調整することができる。第二に、標的のライブラリーを考えれば、「プローブＸが確率Ｐで標的Ｙに適合する」という形態で結果を述べることができるような各適合スコアに信頼性値を割り当てることが望ましいことができる。これは適合スコアの確率モデルを必要とする。一般に、こうした確率モデルの分析的逸脱は可能でないことができる。経験的分布を、参照ヌル集団からの適合スコアのサンプリング（若しくは再サンプリング）に基づき生成することができる。予備データで、スコア値を、会合していない転写物の無作為収集物と比較した。潜在的に合理的なヌル分布は、標的生物体ゲノム（例えばラットゲノム）中の転写物の対を無作為にサンプリングすること、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデルを使用してＢｌｉｎｋｅｒシグナルを生成すること、および適合スコアをコンピュータ計算することにより生成し得る。
【０４００】
これらのアルゴリズムを使用する予備ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｂｌｉｎｋｅｒデータ解析：予備Ｂｌｉｎｋｅｒシグナルを２種の鋳型、ＡＣＴ（アクチン）およびＰＧＥＭ（ｐ−ＧＥＭベクター配列）から生成した。記述されるコンピュータモデルを使用して、該鋳型配列の双方のＢｌｉｎｋｅｒシグナルのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデルを導出した。ヌル比較群（今後ＮＵＬＬと呼ばれる）を生成するため、マウスゲノムからの７５種の転写物を無作為に選び、そしてこれらの転写物のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏＢｌｉｎｋｅｒ配列のライブラリーを生成した。
【０４０１】
ＡＣＴ若しくはＰＧＥＭプローブの実験的Ｂｌｉｎｋｅｒシグナルを、それぞれ独特の走査ｉｄにより示される多様な異なる条件下で生成させた（図３３）。図３３中でペプチド１、２および３と示される使用した検出体分子は、図１２に描かれるそれぞれ上３種の検出体分子に対応する。全５種のキメラＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの混合物を使用した。各走査内で２５種の異なる目的領域（ＲＯＩ）を選択し、各走査について２５の複製測定値を生じた。走査内の各ＲＯＩを合計１０分間、１００の時間間隔についてサンプリングした。１走査内の２５のＲＯＩデータのそれぞれを、記述された拘束局所動的時間伸縮（ＣＬ−ＤＴＷ）アルゴリズムを使用して、ＡＣＴ、ＰＧＥＭおよびＮＵＬＬのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  Ｂｌｉｎｋｅｒシグナルに適合させた。（各ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏシグナルを多様な相で生成させ、そして、実験的に測定したポリメラーゼ処理能力から時間間隔を較正した。）
【０４０２】
各実験シグナルについて、ＡＣＴおよびＰＧＥＭに対する適合スコアをＮＵＬＬ適合スコアに比較し、そして該スコアがＮＵＬＬ適合スコアの上９５％内にあった場合にのみ維持した。ＡＣＴおよびＰＧＥＭの適合スコアの相対比を、合計２５（まで）の複製ｌｏｇ（ＡＣＴ／ＰＧＥＭ）値についてｌｏｇ（ＡＣＴ／ＰＧＥＭ）としてコンピュータ計算した。（大部分の走査は、スコアがヌル分布への比較を失敗したため実質的により少ない複製値を有した。）複製スコアを、ＡＣＴ帰属に好都合な最良の値（正の値）およびＰＧＥＭ帰属に好都合な最良の値（負の値）について検査した。該２種の最良値間の差違が臨界値を超えた（すなわち、一方若しくは他方の帰属の十分な裏付けが存在した）場合、該最良値を使用して、ＡＣＴ若しくはＰＧＥＭを適合させるように実験走査を呼び出した。臨界値が超えなかった場合、若しくは複製物のいずれもヌルの９５％より良好な適合スコアを生じなかった場合、帰属を与えなかった。
【０４０３】
図３３は、１２の決定および２の決定なし（走査５および１８）を生じる１４の走査についてのこの手順の結果を示す。１２の決定について、９の正しい結果（走査１、２、６、１０、１３、１４、２５、２６および３０）ならびに３の正しくない結果（走査１７、２２および２９）が得られた。二項分布および正しい呼び出しの５０％の確率を想定すれば、１２回の試行で偶然９若しくはそれ以上の正しい呼び出しを得ることの確率は０．０１９であり、実験的プローブ値を統計学的有意性を伴い正しい鋳型に帰属し得ることを示唆する。現在の結果は、同一データセットでの検出アルゴリズムのパラメータを微調整することにより得られ、従ってｐ値は注意を伴い解釈されなければならない。新たな実験が、訓練および試験のための独立のデータセットを使用して該アルゴリズムを調整するであろう。
【実施例５】
【０４０４】
差別的に刺激したニューロンにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ  ＲＮＡプロファイリング
本発明のｉｎ  ｖｉｖｏ検出体分子は、ＣＰＰ、α−ＰＡＫ配列（Ｍａｎｓｅｒら、１９９８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １：１８３−１９２）、核局在化配列、リンカーおよびＰＮＡを含んでなる。核局在化配列は検出体分子を核に向けるのに必要である。検出体分子の細胞および核に進入する能力は、多様な形態学的部位の転写パターンを評価し得るように刺激されるニューロンおよび当該技術分野で既知の他の細胞中の核転写のｉｎ  ｖｉｖｏ検出を可能にする（図２４）。
【０４０５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ転写の検出は、生存細胞中への検出体分子の導入を必要とする。これは細胞透過性ペプチドを使用して達成される。ＣＰＰを含んでなるペプチドの分類は当該技術分野で公知である（Ｈａｌｌｂｒｉｎｋら、２００１、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１５１５：１０１−１０９；Ｊａｒｖｅｒ、２００４、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ  ９：３９５−４０２；Ｐｏｏｇａら、２００１  Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  １：２３１−２３９；Ｐｏｏｇａら、２００１、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１５：１４５１−１４５３；Ｐｏｏｇａら、１９９８、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１２：６７−７７）。ＣＰＰは細胞膜を横断し、そして神経細胞の細胞体および樹状突起中に集中する。これらのデータは、ＣＰＰが生存ニューロンに輸送することができることを示す最初のものであり、かつ、ＣＰＰを結合した検出体分子が本発明での使用のため細胞に浸透し得ることを示す。
【０４０６】
細胞への検出体分子の導入は、ＣＰＰの固有の特性を使用して達成し得るか、若しくは、あるいは、外因性のｍＲＮＡ、タンパク質若しくはＤＮＡが選択された細胞中に拡散し得るように一緒に細胞膜に一過性の孔を形成するためのレーザーパルスを使用して細胞に導入し得る。中核技術は、ｍＲＮＡ、または生存細胞の機能を改変するための他の遺伝物質若しくは遺伝子以外物質の適用と一緒に細胞膜に一過性の孔を導入するための高エネルギーパルスレーザーの使用よりなる。予備実験は、該アッセイが、ＲＮＡ翻訳により観察されるとおり細胞中への一過性ＲＮＡ導入で１００％効率的であることを示す。
【０４０７】
とりわけ、２種の独立のレーザー（一方は光穿孔のため、他方は画像化のため）を使用し、そしてそれらのビームを共通の顕微鏡ヘッドにより組合せる。これは細胞野の可視化および光穿孔の領域の選択を可能にする。光穿孔の間、細胞外色素若しくは標識がｍＲＮＡとともに包含され、光穿孔の成功について即時のフィードバックを可能にする。
【０４０８】
ＤＮＡ若しくはＲＮＡをニューロンに導入することは特徴上極めて困難である。光穿孔をｍＲＮＡ適用と組み合わせる場合、コードされるタンパク質の慣例の発現が可能である。一例として、ＧＰＦ  ｍＲＮＡを、培養海馬ニューロンの生理的食塩水浴（ｂａｔｈｉｎｇ  ｓａｌｉｎｅ）に導入する。細胞を、２光子画像化と一緒の細胞外造影剤Ａｌｅｘａ  ５６８の存在を使用して画像化する。選択すべき細胞を同定した後に、光穿孔パルスを、細胞外色素およびｍＲＮＡを細胞に進入させるための細胞の孔形成に短時間に至る別個のレーザー（７２０ｎｍ）から送達する。細胞はＡｌｅｘａ色素で即座に標識され、そして後の時間で該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質を発現する。この光穿孔のアプローチは反復して成功裏と判明しており、そして細胞に検出体分子を送達するのに使用し得る。
【０４０９】
レーザー励起のエネルギー、励起時間および検出体分子の濃度を変動させることは、検出体分子の細胞内進入を可能にすることができる。光穿孔はマイクロ秒で起こるため、検出体分子上の蛍光部分の光退色は一因子となるはずはない。
【０４１０】
リアルタイムｉｎ  ｖｉｖｏ転写分析が起こるはずである細胞若しくは組織を、細胞若しくは組織中でキメラＲＮＡポリメラーゼを発現するようにトランスフェクトし得る。Ｇａｔｅｗａｙクローニング系にクローン化したキメラＲＮＡポリメラーゼを、ＣＭＶ哺乳動物プロモーターを含有する哺乳動物発現ベクターに往復させる（ｓｈｕｔｔｌｅｄ）。これはその制御下で導入遺伝子の高レベルの発現を生じさせる強力なプロモーターである。内因性ＲＮＡポリメラーゼに対するキメラＲＮＡポリメラーゼの相対比は、核転写を検出する能力に対する影響を有することができる。多すぎる内因性ポリメラーゼが存在する場合には、キメラＲＮＡポリメラーゼは活性化された遺伝子に結合しないかも知れない一方、内因性ＲＮＡポリメラーゼに関して多すぎるキメラＲＮＡポリメラーゼが存在する場合、単一遺伝子にシグナルが分散していてもよく（１遺伝子に複数のＲＮＡポリメラーゼ）、解釈不可能な明滅シグナルを生じる。生物情報科学分析は特異的シグナルの同定において補助することができる。加えて、トランスフェクトされた細胞中で作成されたキメラＲＮＡポリメラーゼの量は、本明細書に開示される他のプロモーターを使用することにより、若しくは、限定されるものでないがＴｅｔ−ｏｎプロモーター系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）のようなテトラサイクリン／ドキシサイクリンで誘導可能なプロモーターを挙げることができる誘導可能なプロモーターを使用することにより、滴定し得る。
【０４１１】
検出体分子が細胞により一旦取り込まれれば、サンプルを画像化し得る前に転写明滅シグナルが生成されうる。結果、明滅が協調した様式で起こり得るように、転写過程を遅らせることが必要でありうる。これが必要である場合には、培養物を３７℃から２℃の増分だけより低い温度に冷却して、転写を検出する能力と、細胞を生理学的に生存可能かつ刺激に応答性に保つのに必要な温度の間の適正な均衡を決定する。
【０４１２】
細胞核内の検出可能な明滅シグナルの画像化は、焦点面の迅速な操作を必要とすることがあり、これは、高度に感受性の背面照射型増倍ゲインカメラ（Ｃａｓｃａｄｅ  ５１２
Ｂカメラ、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ、アリゾナ州トゥーソン）の使用で補助し得る。
【０４１３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ検出体分子からのＦＲＥＴシグナルは、蛍光部分間のスペーサー領域の長さに依存し得る。直鎖状α−ヘリックスでは、１０〜２０アミノ酸の距離がＦＲＥＴが起こるのに理想的であるようである。より短いスペーサー領域は、ＦＲＥＴを可能にしつつ、蛍光極性の差違を検出する能力を増大する。ＦＲＥＴ検出に加えて、本発明の検出体分子は、蛍光分極の差違の検出を可能にする（Ｂｅｌｌｅｔら  ２００２、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．８３：１０５０−１０７３；Ｈａｕｓｔｅｉｎら、２００４、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１４：５３１−５４０、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｅｉｄｅら、２０００  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．、７８：２１３８−２１５０）。蛍光極性は、２個の蛍光分子が本質的にそれらの共鳴性環構造の平面的相互作用により相互作用する場合に検出可能である。単一共有結合の周囲を自由に回転する２個の蛍光部分は、スタッキングエネルギーを増大させるようにそれら自身の方向を定めることができ、そして、これが混乱される場合に分極の変化が観察される。蛍光分子の一方に対しより大きい安定性が存在する場合、分極シグナルが増大されかつノイズが低減される。本発明の検出体分子、とりわけｉｎ  ｖｉｖｏ応用で使用される検出体分子は、本明細書の別の場所に開示されるところの２個の連結によりペプチドに共有結合された蛍光分子を含み得る。この蛍光化合物は、例えば、細胞骨格タンパク質の動きにより蛍光極性で誘導される変化を評価するために当該技術分野で広範に使用されているビス−（Ｎ−ヨードアセチル（ピペラジニル）スルホンローダミンであり得る。
【０４１４】
本明細書で引用されるそれぞれおよびすべての特許、特許出願および刊行物の開示は、ここにそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる。
【０４１５】
本発明は特定の態様に関して開示された一方、本発明の他の態様および変形物が、本発明の真の技術思想および範囲から離れることなく当業者により考案されうることが明らかである。付随する請求の範囲は、全部のこうした態様および同等の変形物を包含すると解釈されることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【０４１６】
本発明を具体的に説明する目的上、本発明のある態様を図面に描く。しかしながら、本発明は、図面に描かれる態様の正確な配置および手段に制限されない。
【図１】図１Ａおよび１Ｂを含んでなり、多様な検出体分子のアミノ酸配列およびペプチド核酸（ＰＮＡ）配列を描く像である。図１Ａにおいて、下線を付けた部分は、上から下へそれぞれ配列番号４５、５２、５３および５４である。二重下線を付けた部分は核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含有する配列番号５５である。図１Ｂにおいて、下線を付けた部分は、上から下へ配列番号３４〜３７である。Ｆｌｕｏ＝フルオレセイン。ｇｔｇ＝ペプチド核酸（ＰＮＡ）。ＢＳＲ＝ビス−（（Ｎ−ヨードアセチル）ピペラジニル）スルホンローダミン。ＣＰＰ＝細胞透過性ペプチド。
【図２】図２Ａおよび２Ｂを含んでなり、多様な検出体分子のアミノ酸配列およびＰＮＡ配列を描く像である。図２Ａにおいて、下線を付けた部分は、上から下へ配列番号５５、５６、５７および５８である。二重下線を付けた部分はＮＬＳを含有する配列番号５５である。そのＮ末端にシステインを付加させたＴＰ１０は、下線を付けた配列中のシステインにジスルフィド結合されている。図２Ｂにおいて、下線を付けた部分は、上から下へ配列番号３８および３９である。Ｆｌｕｏ＝フルオレセイン。ｇｔｇ＝ペプチド核酸（ＰＮＡ）。ＣＰＰ＝細胞透過性ペプチド。
【図３】シグナリング部分（五角形および正方形により表される）、検出体結合ドメインに結合されたキメラＲＮＡポリメラーゼ結合ドメイン（ＣＲＰＢＤ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ；楕円）および細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を包含する検出体分子の図解である。
【図４】キメラＲＮＡポリメラーゼの検出体結合ドメイン（薄灰色長方形）に結合されかつＤＮＡ分子（細長い垂直の長方形）の転写を検出する検出体分子の図解を描く像である。一連の楕円は産生された新生ＲＮＡ分子を表す。
【図５】検出体分子の相補ＰＮＡに結合する新生ＲＮＡ分子およびＤＮＡの転写を検出するシグナルを発する検出体分子の図解を描く一連の像である。黒十字は、検出体分子のＰＡＮが新生ＲＮＡ分子の一部分に結合する場合に発生する明滅を示す。
【図６】検出体分子の相補ＰＮＡに結合する新生ＲＮＡ分子の非存在下での検出体分子中の消光されたシグナル部分（囲みおよび楕円）の図解を描く像である。
【図７】検出体分子の相補ＰＮＡに結合する新生ＲＮＡ分子の存在下でシグナルを発するシグナル部分の図解を描く像である。
【図８】検出体分子を特異的に結合するキメラＲＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ分子の転写の検出の図解を描く像である。検出体分子に結合されたＰＮＡは新生ＲＮＡ分子に相補的であり、かつ、新生の転写されたＲＮＡ分子を結合して、検出されるシグナリング部分からシグナルを発し、それによりＤＮＡ分子の転写を検出する。
【図９】キメラＲＮＡポリメラーゼと相互作用する検出体分子の図解を描く像である。下線を付けたアミノ酸は、キメラＲＮＡポリメラーゼ中のＳＨ３ドメインに結合する検出体分子中のα−ＰＡＫドメインである。ＰＮＡ（ｇｔｇ）はＧＴＧオリゴヌクレオチドがすると同一の相補配列を結合し、そして従って新生ＲＮＡ中のＣＡＣ配列に結合する。検出体分子は配列番号４０を含んでなる。ＴＡＭＲＡ＝テトラメチルローダミン。Ｆｌｕｏ＝フルオレセイン。
【図１０】ペプチドＬ６０６をもたらす、ペプチドＬ６０４とＬ６０５の間の天然の化学的連結（ＮＣＬ）を描く像である。ペプチドＬ６０４は配列番号４１を含んでなり、Ｌ６０５は配列番号４２を含んでなり、そしてＬ６０６は配列番号４０を含んでなる。Ｆｌｕｏ＝フルオレセイン。ＴＡＭＲＡ＝テトラメチルローダミン。
【図１１】ペプチドと、そのＮ末端に３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル（Ｎｐｙｓ）活性化されたシステインを含有する細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）ＴＰ１０の間のジスルフィド形成を描く像である。
【図１２】明滅するシグナル伝達のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出のための複数連結された検出体分子を描く像である。下線を付けた部分は、上から下へ、それぞれ配列番号４３、４０、４４、４５および４６である。Ｆｌｕｏ＝フルオレセイン。ｇｔｇ＝ペプチド核酸（ＰＮＡ）。ＴＡＭＲＡ＝テトラメチルローダミン。上３種の検出体分子を合成した（実施例２を参照されたい）。
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂを含んでなり、明滅するシグナル伝達のｉｎ  ｖｉｖｏ検出のための複数連結された検出体分子を描く像である。図１３Ａにおいて、下線を付けた部分は、上から下へ配列番号５９、６０、４０および４４である。二重下線を付けた部分は、ＮＬＳを含有する配列番号５５である。そのＮ末端にシステインを付加させたＴＰ１０は、下線を付けた配列中のシステインにジスルフィド結合する。図１３Ｂにおいて、下線を付けた部分は、上から下へそれぞれ配列番号４７〜５０である。ＴＰ１０に付加された追加のＮ末端システインが図１３Ｂで検出体分子中に描かれる。Ｆｌｕｏ＝フルオレセイン。ＴＡＭＲＡ＝テトラメチルローダミン。ＢＳＲ＝ビス−（（Ｎ−ヨードアセチル）ピペラジニル）スルホンローダミン。ｇｔｇ＝ペプチド核酸（ＰＮＡ）。
【図１４】粗ペプチドＬ６０４の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）スペクトルの像である。
【図１５】ペプチドＬ６０４の正しいＨＰＬＣ画分のマトリックス支援レーザー脱離飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量スペクトルの像である。
【図１６】粗ペプチドＬ５６４のＨＰＬＣスペクトルの像である。
【図１７】ペプチドＬ５６４を含有するＨＰＬＣ画分のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルの像である。ｍ／ｚ  ２２８２．７および２３０３．７のピークはそれぞれペプチドＬ５６４およびナトリウムを伴うＬ５６４に対応する。
【図１８】粗ペプチドＬ６０５のＨＰＬＣスペクトルの像である。
【図１９】ペプチドＬ６０５を含有する画分のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルの像である。
【図２０】粗ペプチドＬ５７５のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルの像である。
【図２１】ペプチドＬ６０６を生じる、ペプチドＬ６０４とＬ６０５の間のＮＣＬのＨＰＬＣスペクトルの像である。
【図２２】ペプチドＬ６０６を含有するＨＰＬＣ画分のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルの像である。ｍ／ｚ  ４８３８．５および２４１９．７のピークはそれぞれ単一および二重に荷電したペプチドＬ６０６に対応する。
【図２３】マイクロアレイ支持体上でのｍＲＮＡの検出を描く図である。マイクロアレイ結合部分（濃い楕円）、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位（濃い長方形）および制限酵素部位を含んでなるオリゴヌクレオチドをアレイに結合し、そして制限酵素で消化したｃＤＮＡに連結する。キメラＲＮＡポリメラーゼおよび検出体分子の複合体を添加する。
【図２４】検出体分子およびキメラＲＮＡポリメラーゼによる転写のｉｎ  ｖｉｖｏ検出を描く図である。
【図２５】ＳＨ３ドメイン配列番号の核酸（配列番号２）およびアミノ酸配列（配列番号４）の像である。
【図２６】Ｔ７ポリメラーゼの核酸配列（配列番号１）の像である。
【図２７】Ｔ７ポリメラーゼのアミノ酸配列（配列番号３）の像である。
【図２８】α−ＰＡＫドメインのアミノ酸配列（配列番号５）の像である。
【図２９】一連の２像である。左の像は、多様なキメラＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ構築物から発現されたタンパク質のサンプルの変性タンパク質ゲルを描く。ＮＬ＝スペーサーペプチドなし。０Ｐ＝１個のプロリンを含むスペーサーペプチド。１Ｐ＝２個のプロリンを含むスペーサー。３Ｐ＝３個のプロリンを含むスペーサーペプチド。ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン。ＦＬＡＧ−ＣＴＣ＝ＦＬＡＧエピトープ標識対照（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼなし）。ｐＡＲ  １２１９＝検出体結合ドメインを伴わないＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する発現ベクター。ＭＷマーカーの分子量をゲルの像の隣に示す。右の像は、キメラＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用する転写アッセイの０分および３０分の結果を描く。ＥＰＩ＝未改変Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（Ｒ）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ウィスコンシン州マディソン）。「０」と標識された一番上の行は、転写反応にＲＮＡポリメラーゼが添加されておらず、そしてバックグラウンド対照としてはたらく。
【図３０】Ｂｌｉｎｋｅｒ検出体分子をスポットしたマイクロアレイおよび検出されたシグナルの代表的グラフを描く一連の像である。左の像はマイクロアレイのものである。６個の大きな白色円は蛍光方向マーカーである。マイクロアレイ上の円で囲まれた領域の拡大像を右上に描く。１スポットからの蛍光Ｂｌｉｎｋｅｒ強度シグナルを、右下のグラフで時間の関数として描く。
【図３１】Ｂｌｉｎｋｅｒシグナル（実線）、および元のシグナルを異なるサンプリング間隔（縦の点線により示す）内で積分した場合の期待されるシグナル（破線）のモデルを描く。白丸は積分したシグナルから得た値を示し、そして黒丸は元のシグナルから得た値を示す。積分したシグナルは、移相の問題に対しより少なく感受性であると期待される。ＰＭＴ＝光電子増倍管。ＣＣＤ＝電荷結合デバイス。
【図３２】変動する程度の時間拡張を見込む、２つの時系列（破線）間の拘束局所動的時間伸縮アルゴリズムによる代表的アライメントを描く。
【図３３】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｂｌｉｎｋｅｒシグナルの解析に基づくＤＮＡ同一性の予測の結果を描く。「ｓｃａｎ」は走査したＢｌｉｎｋｅｒスポットを指す。「ｐｅｐｔｉｄｅ」は、シグナル部分のフルオロフォア間の距離により変動する、使用した３種の異なるＢｌｉｎｋｅｒ検出体分子の１種である。「ｌｉｎｋｉｎｇ」はＤＮＡの固定のためのスライドガラス上のコーティングの種類である。「ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ」は蛍光励起エネルギーである。「ＤＮＡ」はマイクロアレイにスポットしたＤＮＡの同一性である。「Ｄａｔａ  Ｃａｌｌ」はＢｌｉｎｋｅｒ分析後にＤＮＡに帰属されるＩＤである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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