(57)【要約】本発明は、医薬品または薬学的組成物としての、髄膜炎菌によって発現されるペニシリン結合タンパク質、またはその断片、変異体、もしくは変異体の断片、あるいはこれらをコードする核酸、あるいはこれらに対する抗体または抗体断片に関するものである。また本発明は、髄膜炎菌による感染、および／または、髄膜炎菌ペニシリン結合タンパク質の変異体を発現する細菌株による感染に対する、哺乳動物、好ましくはヒトの予防的かつ／または治療的な免疫療法を目的とする、髄膜炎菌によって発現されるペニシリン結合タンパク質、またはそれらをコードする核酸、またはそれらに対する抗体の使用にも関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬品としての、髄膜炎菌によって発現されるペニシリン結合タンパク質、またはその断片、変異体もしくは変異体の断片。
【請求項２】
医薬品としての、髄膜炎菌によって発現される少なくとも一つのペニシリン結合タンパク質、またはその断片、変異体、もしくは変異体の断片をコードする核酸。
【請求項３】
医薬品としての、髄膜炎菌によって発現されるペニシリン結合タンパク質、またはその変異体、断片、もしくは変異体の断片に対する抗体または抗体断片。
【請求項４】
前記ペニシリン結合タンパク質が髄膜炎菌ＰＢＰ２である、請求項１〜請求項３のいずれか一つに記載の医薬品。
【請求項５】
前記ペニシリン結合タンパク質の断片が、Ｎ末端の膜貫通領域を欠いた髄膜炎菌ＰＢＰ２の断片である、請求項４に記載の医薬品。
【請求項６】
Ｎ末端の膜貫通領域を欠いた髄膜炎菌ＰＢＰ２の前記断片が、番号Ｉ−３４２２として２００５年５月３日にＣＮＣＭに寄託されたクローンＤＨ５ｐＡＡ２から精製される、請求項５に記載の医薬品。
【請求項７】
前記変異体が、淋菌または肺炎連鎖球菌によって発現される髄膜炎菌ＰＢＰの変異体である、請求項１〜請求項３のいずれか一つに記載の医薬品。
【請求項８】
前記変異体が淋菌ＰＢＰ２または肺炎連鎖球菌ＰＢＰ２Ｘである、請求項７に記載の医薬品。
【請求項９】
請求項１〜請求項８のいずれか一つに記載の、少なくとも一つのペニシリン結合タンパク質、またはその断片、変異体もしくは変異体の断片、あるいは、少なくとも一つの核酸、あるいは、少なくとも一つの抗体または抗体断片と、薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む、薬学的組成物。
【請求項１０】
髄膜炎菌ＰＢＰタンパク質またはその変異体を発現する細菌株による感染に対する、哺乳動物、好ましくはヒトのワクチン接種を目的とした薬学的組成物の調製のための、請求項１または請求項４〜請求項８のいずれか一つに記載の、少なくとも一つのペニシリン結合タンパク質、またはその断片、変異体もしくは変異体の断片の使用方法。
【請求項１１】
髄膜炎菌ＰＢＰタンパク質またはその変異体を発現する細菌株による感染に対する、哺乳動物、好ましくはヒトのワクチン接種を目的とした薬学的組成物の調製のための、請求項２または請求項４〜請求項８のいずれか一つに記載の、少なくとも一つの核酸の使用方法。
【請求項１２】
髄膜炎菌ＰＢＰタンパク質またはその変異体を発現する細菌株による感染に対する、哺乳動物、好ましくはヒトの防御を目的とした薬学的組成物の調製のための、請求項３〜請求項８のいずれか一つに記載の、少なくとも一つの抗体または抗体断片の使用方法。
【請求項１３】
前記感染性細菌株が髄膜炎菌である、請求項１０〜請求項１２のいずれか一つに記載の使用方法。
【請求項１４】
前記薬学的組成物が、すべての髄膜炎菌の血清群による感染に対し、前記哺乳動物にワクチン接種し、該哺乳動物を防御する、請求項１３に記載の使用方法。
【請求項１５】
前記感染性細菌株が淋菌または肺炎連鎖球菌である、請求項１０〜請求項１２のいずれか一つに記載の使用方法。
【請求項１６】
前記薬学的組成物がさらに、髄膜炎菌ＰＢＰタンパク質の変異体を発現する別の種または属の細菌株による感染に対し、前記哺乳動物にワクチン接種し、該哺乳動物を防御する、請求項１３または請求項１４に記載の使用方法。
【請求項１７】
髄膜炎菌ＰＢＰタンパク質の変異体を発現する、別の種または属の前記細菌株が、淋菌または肺炎連鎖球菌である、請求項１６に記載の使用方法。
【請求項１８】
抗生物質と組み合わせる、請求項１０〜請求項１２のいずれか一つに記載の使用方法。
【請求項１９】
前記抗生物質がβ−ラクタム系抗生物質である、請求項１６に記載の使用方法。
【請求項２０】
哺乳動物、好ましくはヒトにおける髄膜炎菌に対する抗体を検出するための、請求項１または請求項４〜請求項８のいずれか一つに記載の、少なくとも一つのペニシリン結合タンパク質、またはその断片、変異体もしくは変異体の断片の使用方法。
【請求項２１】
哺乳動物、好ましくはヒトの生体サンプルから髄膜炎菌感染に対する抗体を検出するためのインビトロでの方法であり、
−前記生体サンプルを、請求項１または請求項４〜請求項８のいずれか一つに記載の、少なくとも一つの髄膜炎菌ペニシリン結合タンパク質、またはその断片、変異体もしくは変異体の断片に接触させること、および
−前記少なくとも一つの髄膜炎菌ペニシリン結合タンパク質、またはその断片、変異体もしくは変異体の断片と、前記生体サンプルの抗体との間の複合体の存在を検出すること、
を含む方法。
【請求項２２】
哺乳動物、好ましくはヒトの生体サンプルから、髄膜炎菌感染をインビトロで診断するための、請求項３〜請求項８のいずれか一つに記載の少なくとも一つの抗体または抗体断片の使用方法。
【請求項２３】
哺乳動物、好ましくはヒトの生体サンプルから、髄膜炎菌感染を診断するためのインビトロでの方法であり、
−前記生体サンプルを、請求項３〜請求項８のいずれか一つに記載の少なくとも一つの抗体または抗体断片に接触させること、および
−前記少なくとも一つの抗体または抗体断片と、前記生体サンプルの髄膜炎菌ペニシリン結合タンパク質またはその断片との間の複合体の存在を検出すること、
を含む方法。
【請求項２４】
番号Ｉ−３６０９、Ｉ−３６１０およびＩ−３６１１として２００６年５月２２日にＣＮＣＭにそれぞれ寄託された、ハイブリドーマＤ２．４、Ｄ１３．６およびＩ４．３７から産生されるモノクローナル抗体で構成される群から選択される、髄膜炎菌ＰＢＰ２タンパク質に対するモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品または薬学的組成物としての、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）によって発現されるペニシリン結合タンパク質、またはその断片、変異体、もしくは変異体の断片、またはこれらをコードする核酸、またはこれらに対する抗体もしくは抗体断片に関するものである。また、本発明は、髄膜炎菌による感染、および／または髄膜炎菌のペニシリン結合タンパク質の変異体を発現する細菌株による感染に対する、哺乳類、好ましくはヒトの予防的かつ／または治療的免疫療法のための、髄膜炎菌によって発現されるペニシリン結合タンパク質、またはこれをコードする核酸、またはこれに対する抗体の使用にも関するものである。
【背景技術】
【０００２】
二つの補完的な治療方法が細菌感染に抵抗する能力を大きく高めてきた。すなわち、抗生物質の使用と、感染した個体の予防的または治療的なワクチン接種である。しかし、これら二つの方法の組み合わせによっていくつかの細菌性疾患はほぼ根絶することができたが、その他の感染症に関しては困難が生じた。他方、最も一般的な抗生物質に対して耐性を示すようになった細菌株の数が増え、新しい抗生物質の考案と、これらの新しい抗生物質に対する細菌の適応との間で、際限のない競争が起こっている。また、一部の細菌に対するワクチンの開発は、効率の良いワクチンの標的を見出す困難性と、タンパク質標的と考えられるものの遺伝的変異性とに直面することになった。
【０００３】
特に、髄膜炎菌性感染症の管理には、その感染者に対する即時の抗生物質治療、また、二次感染および流行を防ぐために、家族の接触に対する化学的予防およびワクチン接種（利用可能なとき）が必要となる。ペニシリンＧは髄膜炎菌性疾患に対する最良の抗生物質であるが（Ｑｕａｇｌｉａｒｅｌｌｏ，Ｖ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｗ．Ｍ．Ｓｃｈｅｌｄ．１９９７．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３６：７０８−１６）、感受性の減退した髄膜炎菌株が徐々に認められてきている（Ａｎｔｉｇｎａｃ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ３７：９１２−２０；Ｓａｅｚ  Ｎｉｅｔｏ，  ｅｔ  ａｌ．１９９０．Ｌａｎｃｅｔ  ３３６：５４）。
【０００４】
髄膜炎菌に対する現状のワクチンは莢膜多糖類に基づいたものであり、血清群Ａ、Ｃ、ＹおよびＷ１３５に属する株に対してのみ使用でき、血清群Ｂの株に対しては使用できない。血清群Ｂの株に対するワクチンを開発するために、主要な外膜のポーリン（ＰｏｒＡ）およびトランスフェリン結合タンパク質Ｂ（ＴｂｐＢ）といったタンパク質候補が研究されてきている（Ｃｌａａｓｓｅｎ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｖａｃｃｉｎｅ  １４：１００１−８；Ｒｏｋｂｉ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６５：５５−６３）。外膜小胞に基づくワクチンも開発されている（Ｆｒｅｄｒｉｋｓｅｎ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．１９９１．ＮＩＰＨ  Ａｎｎ  １４：６７−８０；Ｈｏｌｓｔ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１：７３４−７；Ｓｉｅｒｒａ，Ｇ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．１９９１．ＮＩＰＨ  Ａｎｎ  １４：１９５−２１０）。しかしこの方法では、遺伝子座の構造の変化という結果をもたらす、株間の水平的なＤＮＡ交換に起因する髄膜炎菌の高度な変異性が妨げとなる（Ｍａｉｄｅｎ，Ｍ．Ｃ．１９９３．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １１２：２４３−５０）。
【非特許文献１】Ｇｏｆｆｉｎ，Ｃ．ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．Ｇｈｕｙｓｅｎ．１９９８．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．６４（４）：１０７９−９３
【非特許文献２】Ｇｏｆｆｉｎ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．Ｇｈｕｙｓｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．６２（４）：１０７９−９３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、細菌の感染、特に髄膜炎菌の感染に対する新しいワクチン候補が必要となっている。理想的なワクチン候補の分子は、特定の細菌種のすべての株に存在していなければならず、また、防御抗体の標的とすることができる保存領域を有していなければならない。
【０００６】
ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）は、細菌の細胞壁ペプチドグリカンの合成と代謝に関与する保存されたタンパク質である（Ｇｏｆｆｉｎ，Ｃ．ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．Ｇｈｕｙｓｅｎ．１９９８．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．６２（４）：１０７９−９３）。ＰＢＰは二つの機能的モジュールで構成されており、一方のアシルセリントランスフェラーゼのペニシリン結合（ＰＢ）モジュールが、保存された融合部位を介して、もう一方の非ペニシリン結合（ｎ−ＰＢ）モジュールのカルボキシ末端に結合している。この二つのモジュールは一本のポリペプチド鎖を形成し、該ポリペプチド鎖は、原形質膜の外側で折り畳まり、膜貫通スパナ（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｐａｎｎｅｒ）によって固定される。ＰＢＰは二つのクラスＡおよびＢをなしている。各クラスにおいて、いくつかの保存されたアミノ酸パターンがＰＢモジュールとｎ−ＰＢモジュールの両方に存在している（図１）。これらの保存されたアミノ酸パターンの外側では、髄膜炎菌および肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のようないくつかの種の株の間で大きな変異が見られる。
【０００７】
また、ＰＢＰは、ペニシリンのβ−ラクタムのアミド結合の切断と、ほとんど不活性であるためペプチドグリカンの生合成に介入することはできない、セリンエステルに結合したペニシロイル酵素の形成とを触媒する能力により、ペニシリンの抗菌作用のメカニズムに関係するものである。しかし、β−ラクタム系抗生物質の使用の結果、重要な病原菌において、薬剤に対する親和性が低いまたは低下したＰＢＰが出現し、増加した。このペニシリンに対する親和性の減少は、ＰＢモジュールにおける遺伝的改変に起因している（Ｇｏｆｆｉｎ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．Ｇｈｕｙｓｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．６２（４）：１０７９−９３）。
【０００８】
β−ラクタム系抗生物質に対する耐性へのＰＢＰの関与は十分に調査されているが、それらのワクチン候補としての考えられる役割は現時点では体系的に分析されておらず、特に髄膜炎菌においては、その役割は示唆すらもされていない。三つのＰＢＰ（ＰＢＰ１、ＰＢＰ２およびＰＢＰ３）が髄膜炎菌では報告されているが（Ｂａｒｂｏｕｒ，Ａ．Ｇ．１９８１．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  １９：３１６−２２）、その他のＰＢＰもゲノム配列に基づいて同定されている（Ｐａｒｋｈｉｌｌ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｎａｔｕｒｅ  ４０４：５０２−６；Ｔｅｔｔｅｌｉｎ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１８０９−１５）。ｐｅｎＡ遺伝子によってコードされているＰＢＰ２は６０ｋＤａのタンパク質であり、該タンパク質は高分子量のクラスＢのＰＢＰと相同であり、髄膜炎菌の細胞壁におけるペプチドグリカンの架橋結合に必要なペプチド転移反応を最も触媒すると考えられる。関連性の高いｐｅｎＡＳ対立遺伝子および異なるｐｅｎＡＩ対立遺伝子はそれぞれ、感受性のある株（ＰｅｎＳ）とペニシリンＧに対する感受性が低下した株（ＰｅｎＩ）に存在する（Ａｎｔｉｇｎａｃ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４７：２８５−９６）。ｐｅｎＡの５’側の半分が高度に保存されているのに対し、該遺伝子の３’側の半分における改変はペニシリンＧに対する感受性の低下の原因であり、ＤＮＡの形質転換を通して起こる（Ｓｐｒａｔｔ，Ｂ．Ｇ．１９９４．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：３８８−９３）。活性セリン残基Ｓｘ２Ｋ、ＳｘＮおよびＫｘＧ（通常はＫＴＧ）モチーフは、すべて３’のトランスペプチダーゼをコードする領域に位置しており、通常は保存されているが、高度な多型が周辺の配列に見られる（Ａｎｔｉｇｎａｃ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３１５２９−３５；Ａｎｔｉｇｎａｃ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４７：２８５−９６）。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
髄膜炎菌ＰＢＰ２の保存された活性セリン残基Ｓｘ２Ｋ、ＳｘＮおよびＫｘＧ（通常はＫＴＧ）モチーフの周辺の配列において高度な多型が見られるにもかかわらず、本発明者は驚くべきことに、髄膜炎菌のヒトへの感染が生じている際にこのタンパク質が免疫原性であること、そしてＰＢＰ２断片によるマウスの免疫付与が抗ＰＢＰ２抗体を誘発することを発見した。
【００１０】
また、特定の髄膜炎菌株のＰＢＰ２タンパク質の断片に対する抗体は、異なる血清群の株および／または抗生物質に対する感受性のレベルが異なる株を含む他の髄膜炎菌株のＰＢＰ２タンパク質を結合することができる。
【００１１】
最後に、本発明者はまた、ワクチン接種したマウスにおいて、ＰＢＰ２断片によるマウスの免疫付与が防御免疫を誘発すること、そして特定の髄膜炎菌株のＰＢＰ２タンパク質の断片に対する抗体が、同一の髄膜炎菌株の感染、または改変したＰＢＰ２タンパク質を発現する前記株の変異体の感染からマウスを防御することができることも証明した。
【００１２】
このように、本発明は、医薬品としての、髄膜炎菌によって発現されるペニシリン結合タンパク質、またはその断片、変異体もしくは変異体の断片に関するものである。
【００１３】
「ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）」とは、保存された融合部位を介して非ペニシリン結合（ｎ−ＰＢ）モジュールのカルボキシ末端に結合したアシルセリントランスフェラーゼのペニシリン結合（ＰＢ）モジュールと、膜への固定を可能にする膜貫通スパナとを有する、ペニシロイルセリントランスフェラーゼファミリーのタンパク質を指すものである。三つのＰＢＰタンパク質（ＰＢＰ１、ＰＢＰ２およびＰＢＰ３）が髄膜炎菌で報告されている（Ｂａｒｂｏｕｒ，Ａ．Ｇ．１９８１．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  １９：３１６−２２）。さらに、二つの髄膜炎菌株のゲノム配列の分析は、髄膜炎菌におけるさらなる二つのＰＢＰタンパク質の存在を示唆している（Ｐａｒｋｈｉｌｌ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｎａｔｕｒｅ  ４０４（６７７７）：５０２−６、Ｔｅｔｔｅｌｉｎ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７（５４５９）：１８０９−１５、該文書はここで引用することにより本発明に含まれるものとする）。これらＰＢＰタンパク質のすべてが本発明の範囲に含まれる。特定の髄膜炎菌株によって発現される髄膜炎菌ＰＢＰタンパク質のアミノ酸配列の参照を以下の表１に示す。これらの配列はとりわけ本発明の範囲に含まれるが、その他のあらゆる髄膜炎菌株の変異体によって発現される髄膜炎菌ＰＢＰタンパク質も本発明の範囲に含まれるため、本発明を限定するものとして見なすべきではない。
【００１４】
【表１】
2008545383.tif 000002
【００１５】
髄膜炎菌のペニシリン結合タンパク質の「断片」とは、この断片で免疫付与すると、髄膜炎菌の感染に対する、あるいは、この断片を含むＰＢＰタンパク質またはその変異体を発現する細菌の感染に対する防御免疫、好ましくは防御抗体を生じさせることができる、部分的なペニシリン結合タンパク質を意味する。したがって、本発明によるＰＢＰ断片は少なくともＴ細胞エピトープまたはＢ細胞エピトープを含み、好ましくはＢ細胞エピトープを含んでおり、したがって、好ましくは少なくとも６個、少なくとも８個、少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも７５個、少なくとも１００個のアミノ酸長である。いくつかの実施態様では、前記断片は、前記ＰＢＰタンパク質のＰＢモジュールの３つの保存されたアミノ酸モチーフ（Ｓｘ２Ｋ、ＳｘＮおよびＫｘＧ）の少なくとも一つを含み、好ましくはＰＢモジュールの保存されたアミノ酸モチーフの２つまたは３つを含む。前記断片は前記ペニシリン結合タンパク質の完全なＰＢモジュールを含んでいてもよい。特に、断片は、Ｎ末端の膜貫通領域を欠いている、髄膜炎菌の部分的なペニシリン結合タンパク質であってよく、特に、Ｎ末端の膜貫通領域を欠いている、髄膜炎菌の部分的なＰＢＰ２タンパク質であってよい。
【００１６】
髄膜炎菌によって発現されるペニシリン結合タンパク質の「変異体」という用語は、一つまたは複数のアミノ酸位置に変化を有するペニシリン結合タンパク質であって、
（ｉ）具体的に説明された髄膜炎菌タンパク質のＰＢモジュールと、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もっとも好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％の同一性を有すること、
（ｉｉ）保存されたモチーフ（Ｓｘ２Ｋ、ＳｘＮおよびＫｘＧ）が、具体的に説明された髄膜炎菌タンパク質の保存されたアミノ酸モチーフ（Ｓｘ２Ｋ、ＳｘＮおよびＫｘＧ）と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％の同一性を有すること、
という特徴を有しているペニシリン結合タンパク質を指す。
【００１７】
本発明によると、髄膜炎菌ＰＢＰタンパク質の変異体は、この変異体で免疫付与すると、髄膜炎菌の感染に対する、あるいは、この変異体を発現する細菌株の感染に対する防御免疫、好ましくは防御抗体を生じさせることができるものである。また、このような変異体は、この変異体で免疫付与すると、前記髄膜炎菌ＰＢＰタンパク質の別の変異体を発現する細菌株の感染に対する防御免疫、好ましくは防御抗体を生じさせることもできるものである。
【００１８】
ほとんどの細菌性ペニシリン結合タンパク質の保存されたモチーフは十分に明らかにされている（アミノ酸位置および寄託番号についてはＧｏｆｆｉｎ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．Ｇｈｕｙｓｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．６２（４）：１０７９−９３を参照）。推定ペニシリン結合タンパク質の場合、保存されたモチーフは、Ｓｘ２ＫモチーフとＳｘＮモチーフが少なくとも４５個のアミノ酸によって隔てられ、ＳｘＮモチーフとＫｘＧモチーフ（通常はＫＴＧ）が少なくとも１００個のアミノ酸によって隔てられていると明らかにされているものが好ましい。
【００１９】
好ましくは、具体的に説明された髄膜炎菌タンパク質のＰＢモジュールと５０％未満の同一性を有している、上記で定義したような変異体は、さらに、具体的に説明された髄膜炎菌タンパク質の三次元（３Ｄ）空間構造に類似した三次元（３Ｄ）の空間構造を有している。
【００２０】
「配列同一性のパーセンテージ」は比較ウィンドウで最適にアラインされた二つの配列を比較することで判定され、ここで、二つの配列の最適なアラインメントに際して、比較ウィンドウにおけるペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の部分は、参照配列（付加も欠失も有さない）と比較して付加または欠失（すなわちギャップ）を含むことがある。パーセンテージは、同一のアミノ酸残基または核酸塩基が両方の配列で見られる位置の数を判定して、合致した位置の数を得、合致した位置の数を比較ウィンドウ内の全位置数で割り、結果に１００をかけることで計算され、その結果、配列同一性のパーセンテージが得られる。
【００２１】
上述した配列同一性の定義は、当業者が用いると考えられる定義である。定義自体はいかなるアルゴリズムの助けも必要とせず、このようなアルゴリズムは、配列同一性の計算よりも、配列の最適なアラインメントを得るためのみに有効である。上述の定義により、二つの比較される配列間の配列同一性についての十分に定義されたただ一つの値が存在することとなり、その値は最良あるいは最適なアラインメントで得られる値に対応している。
【００２２】
２つのアミノ酸配列の間における配列同一性のパーセンテージは、デフォルトのパラメータで、国立バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／、Ｔａｔｕｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｂｌａｓｔ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  −  ａ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０）によって提供されているＢｌａｓｔｐ２．０プログラムを用いて判定することができ、該プログラムは、二つの配列間の同一性を比較し判定するために、本発明者が日常的に用いているものであり、当業者が通常用いているものである。
【００２３】
髄膜炎菌ＰＢＰタンパク質と推定変異体との間における「三次元（３Ｄ）構造の類似性」は、二つのポリペプチド間の合致の程度にしたがって評価することができる。合致の程度は、たとえば根平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）を含む、当該技術で既知の様々なパラメータによって表すことができる。構造間のＲＭＳＤが低い方が、構造間のＲＭＳＤが高い場合よりも、合致の程度が高い（たとえば、Ｄｏｕｃｅｔ  ａｎｄ  Ｗｅｂｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９６）参照）。類似の三次元（３Ｄ）構造を有するポリペプチドは、ポリペプチドの骨格についてのＲＭＳＤの平均値を比較することによって同定することができる。好ましくは、髄膜炎菌ＰＢＰタンパク質とその変異体は、互いに比較して、およそ５Ａより小さい、またはおよそ３Ａより小さい、骨格のＲＭＳＤの平均値を有することができる。
【００２４】
特に本発明の範囲に含まれる髄膜炎菌ＰＢＰタンパク質の変異体の特定の例、ならびに、特定の細菌株におけるこれらの変異体のアミノ酸配列の参照を以下の表２に示す。ここでも、これらの配列は特に本発明の範囲に含まれるが、上記で定義したような髄膜炎菌ＰＢＰタンパク質のその他のあらゆる変異体も本発明の範囲に含まれるため、本発明を限定するものとして見なすべきではない。
【００２５】
【表２】
2008545383.tif 000003
【００２６】
本発明によると、髄膜炎菌ＰＢＰタンパク質の「変異体の断片」は、上記で定義した変異体の、上記で定義した断片であり、さらに、対応する髄膜炎菌ＰＢＰタンパク質の断片と、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、もっとも好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％の同一性を有している。
【００２７】
本発明によると、髄膜炎菌によって発現されるこのようなペニシリン結合タンパク質またはその変異体は、β−ラクタム系抗生物質への耐性に関与する場合もしない場合もある。新しい、または、変異したペニシリン結合タンパク質の発現に起因して細菌株が耐性となることのあるβ−ラクタム系抗生物質の例には、ペニシリンＧ、アモキシシリン、アンピシリン、およびセファロスポリンが含まれる。
【００２８】
本発明によると、髄膜炎菌によって発現されるＰＢＰタンパク質、またはその断片、変異体もしくは変異体の断片は、天然由来のもの、または、ペプチド合成または慣習的な組換え技術による人工のものとすることができる。特に、これらは、糖鎖付加パターンのような、天然由来の髄膜炎菌ＰＢＰタンパク質、またはその断片、変異体もしくは変異体の断片によって見られるあらゆる翻訳後修飾を有していてもいなくてもよい。本発明によると、髄膜炎菌ＰＢＰタンパク質、または断片、変異体もしくは変異体の断片はしたがって、髄膜炎菌ＰＢＰタンパク質、またはその断片、変異体もしくは変異体の断片のアミノ酸配列を有するあらゆるポリペプチドを含む。
【００２９】
さらに、これらは、その産生、精製を容易にするために、または、医薬品としての安定性、生物学的利用能または効率性を向上させるために、修飾することができる。たとえば、これらは、炭水化物、脂質部分に結合することができ、あるいは、その他の方法で修飾すること、たとえば、リン酸化または水酸化することができる。特に、これらはグリコシル化することができ、結合した炭水化物部分は天然分子において２０〜３０ｋＤの分子量を有している。前記髄膜炎菌ＰＢＰ、または断片、変異体、もしくは変異体の断片による、一つまたは複数の部分への結合は、たとえば、ポリペプチドを産生する生物によって行われるポリペプチドの翻訳後修飾、または、化学合成の結果生じる修飾によるものであってよい。
【００３０】
髄膜炎菌によって発現される前記ＰＢＰ、または断片、変異体、もしくは変異体の断片はまた、別のポリペプチド配列に融合することができ、該ポリペプチド配列は、生物内で発現するとタンパク質の発現増加をもたらすもの、あるいは、前記生物からの融合タンパク質の精製および回収、すなわちより簡易で経済的な回収を容易にするか改善するもの、あるいは、前記髄膜炎菌ＰＢＰ、またはその断片、変異体、もしくは変異体の断片の免疫原性または薬物動態を改善するものであってよい。
【００３１】
ある場合には、融合タンパク質を切断して、実質的に前記髄膜炎菌ＰＢＰ、または断片、変異体、もしくは変異体の断片だけを含むポリペプチドを得ることが好適な場合がある。この場合、前記髄膜炎菌ＰＢＰ、またはその断片、変異体、もしくは変異体の断片は、好ましくは、切断物質、たとえば臭化シアン、ヒドロキシルアミンおよび２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸のような化学物質、または、たとえばトリプシン、クロストリパイン、およびブドウ球菌プロテアーゼまたはＸａ因子のような、ペプチダーゼ、プロテイナーゼまたはプロテアーゼのような酵素によって特異的に認識され得るポリペプチド配列に融合している。
【００３２】
本発明はまた、医薬品としての、髄膜炎菌によって発現される少なくとも一つのペニシリン結合タンパク質、またはその断片、変異体、もしくは変異体の断片をコードする核酸に関するものである。
【００３３】
本発明によると、髄膜炎菌によって発現される少なくとも一つのペニシリン結合タンパク質、またはその断片、変異体、もしくは変異体の断片をコードする核酸は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを含む、あらゆる種類の核酸であってよい。好ましい実施態様では、核酸は二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡのいずれかである。別の実施態様では、核酸はアンチセンスＲＮＡである。
【００３４】
このような核酸は、髄膜炎菌によって発現される単一のＰＢＰタンパク質、またはその断片、変異体、もしくは変異体の断片、あるいは髄膜炎菌によって発現される複数の異なったＰＢＰタンパク質、またはその断片、変異体もしくは変異体の断片をコードすることができる。該核酸はさらに、その他のポリペプチドもコードすることができる。核酸において、少なくとも一つのコードされた髄膜炎菌ＰＢＰまたはその変異体は、他のあらゆるポリペプチドと融合することができる。
【００３５】
ＤＮＡの場合、前記核酸は機能的に結合した開始コドンおよび終止コドン、プロモーター領域およびターミネーター領域、そして任意にエンハンサーのようなその他の調節配列を備えることができる。プロモーターおよび任意にはエンハンサーによって、原核細胞または真核細胞であってよい標的宿主細胞において、ＰＢＰ、またはその断片、変異体もしくは変異体の断片をコードする配列の発現が可能となる。一つの好ましい実施態様では、ＤＮＡ核酸は、所定の細胞においてのみＤＮＡの十分な転写を可能にする細胞特異的プロモーターを含んでいる。ＤＮＡ核酸を、宿主細胞のゲノムに組み込まないように操作してもよい。
【００３６】
このようなＤＮＡ核酸は、部分的に細菌由来のプラスミドであって、細菌の複製起点およびその選択を可能にする遺伝子、たとえば抗生物質に対する耐性のための遺伝子をとりわけ有するプラスミドに挿入することができる。また、このプラスミドは、該プラスミドがその宿主の標的細胞内において複製することを可能とする複製起点、たとえば、筋細胞の場合にはウシパピローマウイルスの複製起点を有することもできる。このようなプラスミドの多くが当業者には知られており、多くが市販で入手可能である。
【００３７】
本発明による核酸は裸とすること、または、当業者に知られた運搬システムに挿入することができる。たとえば、運搬システムにはウイルスベクター、細菌ベクター、または化学的ベクターが含まれる。適切なウイルスベクターの例には、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターまたはアルファウイルスベクター、および、レンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスを含むレトロウイルスが含まれる。好ましくは、これらのベクターは複製欠損ウイルスベクターである。
【００３８】
化学的ベクターの例はリポゾーム、すなわち水中油型エマルジョンである。あるいは、本発明による核酸は少なくとも一つのキャリアー分子に付着させることができる。このようなキャリアー分子は、特定の細胞タイプ、特に、膜受容体のリガンドまたは膜受容体に対する抗体のような、標的細胞の表面に結合することのできるリガンドに対する、核酸のターゲッティングを容易にする分子とすることができる。
【００３９】
あるいは、本発明によるキャリアー分子は、好ましくは核酸をヌクレアーゼ酵素から保護することのできる核内結合分子とすることができる。たとえば、核内結合分子は、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミン、もしくはポリアミンのようなポリカチオン性ポリマーとすることができるか、ヒストンタンパク質、プロタミン、オルニチン、プトレシン、スペルミジン、スペルミン、転写因子またはホメオボックスタンパク質のような核内結合タンパク質とすることができる。
【００４０】
さらに別のキャリアー分子のタイプは、宿主細胞における核酸の細胞内局在化を方向付けることのできるポリペプチドとすることができる。たとえば、核酸を真核細胞である宿主細胞の核へ向けるシグナルポリペプチドであってよい。
【００４１】
また、本発明は、医薬品としての、髄膜炎菌によって発現されるペニシリン結合タンパク質、またはその断片、変異体もしくは変異体の断片に対する抗体または抗体断片にも関するものである。
【００４２】
「抗体」という用語は、抗原またはエピトープに特異的に結合する能力をもち、Ｂリンパ球またはＢリンパ球由来のクローンによって発現される、一つの免疫グロブリン遺伝子または複数の免疫グロブリン遺伝子によってコードされるポリペプチドを含む。「抗体」という用語は、最も広い意味で用いられる。したがって、「抗体」は天然由来のもの、または、ペプチド合成、もしくは慣習的なハイブリドーマ技術によるモノクローナル抗体の産生による、人工のものとすることができる。
【００４３】
「抗体断片」は、免疫グロブリン分子の、その標的に結合する可変領域すなわち抗原結合領域の、少なくとも一部として定義される。よく知られた「抗体断片」には
（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨＩ領域で構成される一価の断片である、Ｆａｂ断片、
（ｉｉ）ジスルフィド結合によってヒンジ領域で結合している二つのＦａｂ断片を含む二価の断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片、
（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨＩ領域で構成されるＦｄ断片、
（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨ領域で構成されるＦｖ断片、
（ｖ）ＶＨ領域からなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）、および、
（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）
が含まれる。
一本鎖抗体も、参照することにより「抗体断片」という用語に含まれる。
【００４４】
免疫付与の方法、抗体（ポリクローナルおよびモノクローナル）の産生と単離の方法は当業者に知られており、科学文献および特許文書に記載されている。抗体は、動物を用いる従来のインビボでの方法に加え、たとえばファージディスプレイライブラリーを発現する組換え抗体結合部位を用いて、インビトロでも生成することができる。
【００４５】
前記抗体または抗体断片は、ＩｇＭ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＥ抗体またはＩｇＡ抗体のようなあらゆるクラスの抗体、ならびに、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のようなすべてのサブクラスに属するものであってよい。
【００４６】
前記抗体または抗体断片はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、キメラ抗体あるいはヒト化抗体であってよい。
【００４７】
本明細書では、抗体または抗体断片に用いられる「キメラ」という用語は、前記抗体または抗体断片の二つまたはそれ以上のセグメントあるいは部分が、異なる動物種に由来することを意味する。キメラ抗体の特定のケースが「ヒト化」抗体であり、該抗体は、ヒトのフレームワーク領域と、別の種の相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含んでいる。ヒトではない種に由来する抗体をヒト化するための技術は当業者にはよく知られている。
【００４８】
本発明によるペニシリン結合タンパク質またはその断片、変異体もしくは変異体の断片、または核酸、または抗体もしくは抗体断片で構成される医薬品の好ましい実施態様では、前記ペニシリン結合タンパク質は髄膜炎菌ＰＢＰ２である。
【００４９】
特定の実施態様では、前記ペニシリン結合タンパク質の断片はＮ末端の膜貫通領域を欠いた髄膜炎菌ＰＢＰ２の断片である。さらに特定の実施態様では、Ｎ末端の膜貫通領域を欠いた髄膜炎菌ＰＢＰ２の前記断片は、番号Ｉ−３４２２でＣＮＣＭ（２５−２８，ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｒ  Ｒｏｕｘ．７５０１５  Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）に２００５年５月３日に寄託されたクローンＤＨ５ｐＡＡ２から精製される。クローンＤＨ５ｐＡＡ２は、最初の４１個のアミノ酸をコードする最初のヌクレオチドが欠失した髄膜炎菌のＬＮＰ８０１３株のｐｅｎＡ遺伝子を、ｐＥＴ２８ｂベクターのＮｄｅＩ部位とＸｈｏＩ部位の間でクローニングすることで得られたものである（Ａｎｔｉｇｎａｃ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７８（３４）：３１５２１−８）。
【００５０】
本発明によるペニシリン結合タンパク質、またはその断片、変異体もしくは変異体の断片、または核酸、または抗体もしくは抗体断片で構成される医薬品の別の好ましい実施態様において、前記変異体は淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）または肺炎連鎖球菌によって発現される髄膜炎菌ＰＢＰの変異体である。淋菌または肺炎連鎖球菌によって発現される髄膜炎菌ＰＢＰのこのような変異体には、淋菌のＰＢＰ１およびＰＢＰ２、ならびに肺炎連鎖球菌のＰＢＰ１ｂ、ＰＢＰ２ａおよびＰＢＰ２Ｘが含まれる。好ましくは、前記変異体は淋菌のＰＢＰ２または肺炎連鎖球菌のＰＢＰ２Ｘである。
【００５１】
本発明による抗体または抗体断片の医薬品は単独で使うこともでき、また他の薬剤と組み合わせて使うこともできる。たとえば、該医薬品は抗生物質と組み合わせて使うことができ、前記抗生物質は、好ましくはβ−ラクタム系抗生物質群、特にペニシリンＧ、アモキシシリン、アンピシリンおよびセファロスポリンから選択される。
【００５２】
さらに、本発明による、ペニシリン結合タンパク質、またはその断片、変異体もしくは変異体の断片、またはそれらをコードする核酸で構成される医薬品は、単独で、または他の薬剤と組み合わせて使用することができる。特に、該医薬品は抗生物質と組み合わせて使用することができる。適切な抗生物質の例には、リファンピシン、スピラマイシン、キノロンおよび、第三世代セファロスポリン、特にセフォタキシムが含まれる。
【００５３】
さらに本発明は、本発明による、少なくとも一つのペニシリン結合タンパク質、またはその断片、変異体、もしくは変異体の断片、または核酸、または抗体もしくは抗体断片を薬学的に許容できる担体または賦形剤と共に含む薬学的組成物に関するものである。該薬学的組成物において、ペニシリン結合タンパク質、またはその断片、変異体もしくは変異体の断片、または核酸、または抗体もしくは抗体断片は、本発明による医薬品としてのペニシリン結合タンパク質もしくは核酸または抗体について上で説明したあらゆる特徴を有することができる。
【００５４】
「薬学的に許容できる」とは、ヒトまたはその他の哺乳動物と生理学的に適合する、非毒性で不活性の組成物を指す。
【００５５】
薬学的に許容できる担体または賦形剤には、分散剤、懸濁剤、希釈剤、充填剤、ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張化剤、湿潤剤、保存剤などが含まれる。
【００５６】
さらに、本発明による薬学的組成物はアジュバントを含むことができる。「アジュバント」という用語はワクチン技術の分野における通常の意味をもち、つまり、１）それ自体でワクチンの免疫原に対する特異的免疫応答をもたらすことはないが、２）免疫原に対する免疫応答を強化することができる、物質または組成物である。多くのアジュバントおよび推定アジュバント（ある種のサイトカインなど）が共通して免疫応答を強化することができる。アジュバントとして用いられる適切なサイトカインは、通常、ワクチン組成物においてアジュバントとしても機能するもの、たとえば、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、および、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である。少なくとも一つのＰＢＰタンパク質、またはその断片、変異体もしくは変異体の断片をコードする少なくとも一つの核酸を含んだ医薬品または薬学的組成物の場合、前記サイトカインはまた、核酸によりコードさせることもできる。あるいは、アジュバントはリステリオリシン（ＬＬＯ）、リピドＡおよび易熱性エンテロトキシンのような毒素であってよい。また、ＭＤＰ（ムラミルジペプチド）、ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）、トレハロースジエステルＴＤＭおよびＴＤＥのような、多くのマイコバクテリアの誘導体が、有益な可能性を有する。ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ＨＳＣ７０、ＧＲＰ９４およびカルレティキュリン（ＣＲＴ）のような熱ショックタンパク質もアジュバントとして使用することができる。少なくとも一つのＰＢＰタンパク質、またはその断片、変異体もしくは変異体の断片をコードする少なくとも一つの核酸を含んだ医薬品または薬学的組成物の場合、前記熱ショックタンパク質も核酸によりコードさせることができる。
【００５７】
上述した薬学的組成物または医薬品は、非制限的ではあるが、経口、皮下、静脈内、経鼻、経皮、腹腔内、筋肉内、肺内、膣内、直腸を含む、あらゆる経路、または他のあらゆる許容可能な方法で投与することができる。
【００５８】
上述した薬学的組成物または医薬品は多様な形状、たとえば、液体、ゲル、凍結乾燥、または圧縮した固体として製剤することができる。好ましい形状は、治療される特定の適応症に応じるものであり、当業者には明らかとなるものである。いずれの場合にも、投与される活性成分または活性成分の組み合わせは、分解、特に酵素による分解から活性成分を保護するように製剤しなければならない。
【００５９】
上述した薬学的組成物または医薬品は、一つまたは複数の他の治療剤と併用投与、同時投与および／または連続投与することができる。
【００６０】
上述した薬学的組成物または医薬品は、治療効果のある用量の活性成分（すなわち、少なくとも一つのＰＢＰ、またはその断片、変異体もしくは変異体の断片、あるいは、少なくとも一つのＰＢＰ、またはその断片、変異体もしくは変異体の断片をコードする少なくとも一つの核酸、あるいは、少なくとも一つのＰＢＰ、またはその断片、変異体もしくは変異体の断片に対する少なくとも一つの抗体もしくは抗体断片）を含んでいる。ここでの「治療効果のある用量」とは、投与対象の症状についての所望の効果を生み出すのに十分な用量を意味する。的確な用量は状況（病気、投与スケジュール、薬学的組成物または医薬品が単独で投与されるのか他の治療剤とともに投与されるのか、薬学的組成物または医薬品の血漿中半減期、および患者の全体的な健康状態）に依存するものであり、既知の技術を用いて当業者が確認することができるものである。
【００６１】
本発明はさらに、髄膜炎菌ＰＢＰタンパク質またはその変異体を発現する細菌株による感染に対する、哺乳動物、好ましくはヒトのワクチン接種を目的とする薬学的組成物を調製するための、本発明による少なくとも一つのペニシリン結合タンパク質、またはその断片、変異体もしくは変異体の断片の使用にも関するものである。このような使用において、ペニシリン結合タンパク質、またはその断片、変異体もしくは変異体の断片は、本発明による医薬品としてのペニシリン結合タンパク質、またはその断片、変異体もしくは変異体の断片について上で説明したあらゆる特徴を有することができる。
【００６２】
また、本発明は、髄膜炎菌ＰＢＰタンパク質またはその変異体を発現する細菌株による感染に対する、哺乳動物、好ましくはヒトのワクチン接種を目的とする薬学的組成物を調製するための、本発明による少なくとも一つの核酸の使用にも関するものである。このような使用において、前記核酸は、本発明による医薬品としての核酸について上で説明したあらゆる特徴を有することができる。
【００６３】
細菌株による感染に対する哺乳動物の「ワクチン接種」とは、前記細菌株に対する防御免疫を誘発する前記哺乳動物の免疫付与を意味する。「免疫付与」とは、補体系、樹状細胞、マクロファージ、好中球、好酸球のような先天性免疫系、および／または、Ｔリンパ球およびＢリンパ球のような適応性免疫系の刺激を含む、前記哺乳動物の免疫系の刺激を意味する。細胞株による感染に対する「防御免疫」の誘発とは、免疫付与によって誘発された免疫系の刺激により、前記感染性細菌株に対する免疫抵抗の状態が生じることを意味する。感染性細菌株に対する前記免疫抵抗の状態は免疫付与の数日後に現れ、そして長期間持続する。したがって、防御免疫の誘発は、既に感染した個体において感染の進行を抑えるために有効であり、あるいは、健康な個体が続いて感染する可能性を防ぐために有効である。
【００６４】
「免疫抵抗の状態」とは、前記薬学的組成物を投与されていないコントロールの哺乳動物と比較したときに、感染の程度が顕著に低下していることを意味する。細菌感染の程度は、感染したと推定される器官において、感染後いくつかの時点で、良く知られた技術によって菌血症を測定する（ｃｆｕ計数）ことで判定することができる。好ましくは、「免疫抵抗の状態」という用語は、前記薬学的組成物を投与されていないコントロールの哺乳動物と比較したときに、細菌感染の程度が顕著に低下しているときに用いられる。好ましくは、感染の３〜５時間後の細菌感染の程度は、前記薬学的組成物を投与されていないコントロールの哺乳動物と比較したときに、少なくとも２００〜３００個の因子が減少している。このような免疫抵抗の状態は、たとえば、ワクチン接種が髄膜炎菌によって発現される少なくとも一つのペニシリン結合タンパク質またはその変異体に対する抗体を誘発するときに引き起こされうるものである。このような抗体には、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＡ抗体のようなあらゆるクラスの抗体、ならびに、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のようなあらゆるサブクラスが含まれる。
【００６５】
本明細書の全体において、「哺乳動物」という用語は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマおよびヒトを含む、ほ乳類として分類されるあらゆる生物を指す。本発明の一つの実施態様において、哺乳動物はマウスである。本発明の別の実施態様において、哺乳動物はヒトである。
【００６６】
また、本発明は、髄膜炎菌ＰＢＰタンパク質またはその変異体を発現する細菌株による感染に対して、哺乳動物、好ましくはヒトを防御することを目的とした薬学的組成物の調製のための、本発明による少なくとも一つの抗体または抗体断片の使用にも関するものである。このような使用において、前記抗体または抗体断片は、本発明による医薬品としての抗体または抗体断片について上で説明したあらゆる特徴を有することができる。
【００６７】
「防御」とは、一つまたは複数の抗体または抗体断片を含んだ前記薬学的組成物の使用によって、前記薬学的組成物を投与されていないコントロールの哺乳動物と比較したときに、細菌感染の程度が顕著に低下することを意味する。好ましくは、「防御」という用語は、前記薬学的組成物を投与されていないコントロールの哺乳動物と比較したときに、細菌感染の程度が顕著に低下するときに用いられる。好ましくは、前記薬学的組成物を投与されていないコントロールの哺乳動物と比較したとき、感染後３〜５時間の細菌感染の程度は、少なくとも２００〜３００個の因子が減少している。
【００６８】
本発明による使用の好ましい実施態様において、前記感染性細菌株は髄膜炎菌である。この場合、前記使用される薬学的組成物は、好ましくは、すべての髄膜炎菌の血清群による感染に対して前記哺乳動物にワクチン接種するか、または該哺乳動物を防御する。
【００６９】
「血清群」とは、その抗原の構成によって区別される関連した微生物の群を意味する。より詳細には、髄膜炎菌の血清群は莢膜抗原の構成にしたがって決定され、該構成は莢膜抗原に対する抗体を用いて判定される。髄膜炎菌の株は五つの主要な血清群、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ、およびＷ１３５に分けられる。髄膜炎菌に対する現状のワクチンは莢膜多糖類に基づくものであり、血清群Ａ、Ｃ、ＹおよびＷ１３５に属する株に対してのみ使用可能で、血清群Ｂの株には使用することができない。逆に、本発明による使用によると、すべての髄膜炎菌の血清群に対して哺乳動物にワクチン接種するか、または該哺乳動物を防御することが可能である。
【００７０】
本発明による使用の別の好ましい実施態様において、前記感染性細菌株は、淋菌や肺炎連鎖球菌のような、髄膜炎菌ＰＢＰタンパク質の変異体を発現する株である。
【００７１】
別の好ましい実施態様において、感染性細菌株が髄膜炎菌であるとき、前記薬学的組成物はさらに、髄膜炎菌ＰＢＰタンパク質の変異体を発現する別の種または属の細菌株による感染に対し、前記哺乳動物にワクチン接種するか、または該哺乳動物を防御するものである。
【００７２】
好ましくは、髄膜炎菌ＰＢＰタンパク質の変異体を発現する、別の種または属のこのような細菌株は、淋菌または肺炎連鎖球菌である。
【００７３】
特定の実施態様において、髄膜炎菌のＰＢＰタンパク質またはその変異体を発現する細菌株による感染に対する、哺乳動物、好ましくはヒトのワクチン接種を目的とする薬学的組成物を調製するための、本発明による少なくとも一つのペニシリン結合タンパク質、またはその断片、変異体、もしくは変異体の断片、または少なくとも一つの核酸の上述した使用は、抗生物質との組み合わせで実施される。適切な抗生物質の例には、リファンピシン、スピラマイシン、キノロンおよび第三世代セファロスポリン、特にセフォタキシムが含まれる。髄膜炎菌ＰＢＰタンパク質またはその変異体を発現する前記細菌株の特徴は、上述したあらゆる特定の特徴に応じて変化しうるものである。
【００７４】
別の特定の実施態様において、髄膜炎菌のＰＢＰタンパク質またはその変異体を発現する細菌株による感染に対する、哺乳動物、好ましくはヒトの防御を目的とする薬学的組成物を調製するための、少なくとも一つの抗体または抗体断片の上述した使用は、抗生物質、好ましくはβ−ラクタム系抗生物質との組み合わせで実施される。適切なβ−ラクタム系抗生物質の例には、ペニシリンＧ、アモキシシリン、アンピシリン、およびセファロスポリンが含まれる。髄膜炎菌のＰＢＰタンパク質またはその変異体を発現する前記細菌株の特徴は、上述したあらゆる特定の特徴に応じて変化しうるものである。
【００７５】
また、本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける髄膜炎菌に対する抗体を検出するための、本発明による少なくとも一つのペニシリン結合タンパク質、またはその断片、変異体もしくは変異体の断片の使用にも関するものである。このような使用において、前記ペニシリン結合タンパク質は、本発明による医薬品としてのペニシリン結合タンパク質について上で説明したあらゆる特徴を有することができる。髄膜炎菌に対する抗体のこのような検出は、たとえば、ワクチン接種をしていない哺乳動物において髄膜炎菌感染をインビトロで診断するため、または、ワクチン接種した哺乳動物においてワクチン接種の効果を評価するために有効である。
【００７６】
検出は、たとえばＥＬＩＳＡ法のような、血清中の特異的抗体をそれらの精製した特異的抗原を用いて検出するための当該分野で知られた多くの方法のいずれを用いても行うことができる。本発明による少なくとも一つのペニシリン結合タンパク質、またはその断片、変異体もしくは変異体の断片の使用の利点は、該使用によって、あらゆる血清群の髄膜炎菌株に対する抗体のインビトロでの検出が可能になることである。
【００７７】
また、本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトの生体サンプルから、髄膜炎菌感染に対する抗体をインビトロで検出する方法にも関するものであり、該方法は、
−前記生体サンプルを、上述した少なくとも一つの髄膜炎菌ペニシリン結合タンパク質、またはその断片、変異体もしくは変異体の断片に接触させること、および
−前記少なくとも一つの髄膜炎菌ペニシリン結合タンパク質、またはその断片、変異体もしくは変異体の断片と、前記生体サンプルの抗体との間の複合体の存在を検出すること
を含んでいる。
【００７８】
好ましくは、前記生体サンプルは、血液サンプル、血清サンプルまたは血漿サンプルである。上述したように、検出過程は、たとえばＥＬＩＳＡ法のような、特異的抗体とそれらの精製した特異的抗原との間の複合体を検出するための、当該分野で知られている多くの方法のいずれを用いても実施することができる。
【００７９】
さらに、本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトの生体サンプルに基づく、髄膜炎菌感染のインビトロでの診断のための、本発明による少なくとも一つの抗体または抗体断片の使用にも関するものである。このような使用において、前記抗体または抗体断片は、本発明による医薬品としての抗体または抗体断片について上で説明したあらゆる特徴を有することができる。
【００８０】
診断は、たとえばＥＬＩＳＡ法のような、血清中の特異的抗原をその抗原に特異的な抗体または抗体断片を用いて検出するための、当該分野で知られた多くの方法のいずれを用いても実施することができる。本発明による少なくとも一つの抗体または抗体断片の使用の利点は、該使用によって、あらゆる血清群の髄膜炎菌株による感染のインビトロでの診断が可能となることである。
【００８１】
また、本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトの生体サンプルに基づく、髄膜炎菌感染のインビトロでの診断方法にも関するものであり、該方法は、
−前記生体サンプルを、上述した、本発明による、髄膜炎菌によって発現されるペニシリン結合タンパク質、またはその変異体、断片もしくは変異体の断片に対する少なくとも一つの抗体または抗体断片と接触させること、および
−前記少なくとも一つの抗体または抗体断片と、前記生体サンプルの髄膜炎菌ペニシリン結合タンパク質またはその断片との間の複合体の存在を検出すること
を含んでいる。
【００８２】
好ましくは、前記生体サンプルは血液サンプル、血清サンプルまたは血漿サンプルである。上述したように、検出過程は、たとえばＥＬＩＳＡ法のような、特異的抗体とその精製された特異的抗原との間の複合体を検出するための、当該分野で知られた多くの方法のいずれを用いても実施することができる。
【００８３】
また、本発明は、髄膜炎菌によって発現される少なくとも一つのペニシリン結合タンパク質またはその変異体に対し、哺乳動物にワクチン接種することを含む、髄膜炎菌の感染、および／または、髄膜炎菌ＰＢＰの変異体を発現する細菌株による感染に対する、哺乳動物、好ましくはヒトの治療方法にも関するものである。
【００８４】
ワクチン接種は、当該分野で知られたあらゆる方法によって、特に、上述した、髄膜炎菌によって発現される少なくとも一つのペニシリン結合タンパク質、またはその断片、変異体もしくは変異体の断片、またはそれらをコードする核酸を含んだ薬学的組成物を用いて実施することができる。
【００８５】
また、本発明は、上述した、髄膜炎菌によって発現される少なくとも一つのペニシリン結合タンパク質、またはその断片、変異体もしくは変異体の断片に対する少なくとも一つの抗体または抗体断片を含んだ、効果的な量の医薬品または薬学的組成物を哺乳動物に注射することを含む、髄膜炎菌感染、および／または、髄膜炎菌ＰＢＰの変異体を発現する細菌株による感染に対する、哺乳動物、好ましくはヒトの治療方法にも関するものである。
【００８６】
さらに、本発明は、２００６年５月２２日にＣＮＣＭにそれぞれＩ−３６０９、Ｉ−３６１０およびＩ−３６１１という番号で寄託されたハイブリドーマＤ２．４、Ｄ１３．６およびＩ４．３７から産生されるモノクローナル抗体から構成される群から選択される髄膜炎菌ＰＢＰ２タンパク質に対するモノクローナル抗体にも関するものである。このようなモノクローナル抗体は、上述した医薬品として、または、上述したあらゆる治療的使用のために用いることができる。あるいは、このようなモノクローナル抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトの生体サンプルに基づく、髄膜炎菌感染のインビトロでの診断のために用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８７】
全体的に本発明を説明してきたが、本発明の特徴および利点は、例示としてのみ示し、明記しない限り限定するものではないいくつかの特徴的な実施例および図面を参照することでさらに理解することができるものである。
【００８８】
図１：クラスＡ（大腸菌のＰＢＰ１ａ、淋菌および髄膜炎菌のＰＢＰ１）およびクラスＢ（大腸菌のＰＢＰ３、淋菌および髄膜炎菌のＰＢＰ２）の、高分子量のＰＢＰの分子組成。保存されたモチーフ（クラスＡのＰＢＰの番号１〜９、クラスＢのＰＢＰの番号１〜７）ならびにモチーフ間の距離（アミノ酸の数）を示している（Ｇｏｆｆｉｎ  ａｎｄ  Ｇｈｕｙｓｅｎ，１９９８．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．Ｄｅｃ；６２（４）：１０７９−９３）。
【００８９】
図２：髄膜炎菌のＬＮＰ８０１３株のＰＢＰ２で免疫付与したウサギの血清の特異性。
【００９０】
図２Ａ：大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ由来の細胞全体の可溶化物と、髄膜炎菌のＬＮＰ８０１３株の精製したＨｉｓ６−ｔａｇ−ＰＢＰ２タンパク質を含む溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。可溶化した細胞は、発現ベクターのみ（レーン１）、ＩＰＴＧによる誘発のないｐｅｎＡ遺伝子を有する組換えプラスミド（レーン２）、およびＩＰＴＧによる誘発後のｐｅｎＡ遺伝子を有する組換えプラスミド（レーン３）を有する大腸菌  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに由来する。矢印は、Ｎ末端の膜貫通領域（１２１個のアミノ酸）を欠いた、過剰発現した組換えＰＢＰ２に対応するバンドを示している。レーン４はニッケルカラムを通した可溶性画分に対応し、レーン５からレーン１１は精製されたＰＢＰ２を含む溶出画分を示している。ＭＭは分子量マーカーである。
【００９１】
図２Ｂ：髄膜炎菌ＬＮＰ８０１３株のＰＢＰ２タンパク質で免疫付与した後に得たウサギ血清の結合を示すウェスタンブロット。ウサギ血清は、髄膜炎菌のＬＮＰ８０１３株、ＬＮＰ１７７２３株、ＬＮＰ１６４５４株、ＬＮＰ１８４２５株およびＬＮＰ１７０４１株に対応する精製したＨｉｓ６−ｔａｇ−タンパク質（ＰＰ）、ならびに、二つの血清群Ｗ１３５の単離株（ＬＮＰ１７５９２株およびＬＮＰ１６６３５株）に由来する細菌細胞膜の抽出物（ＢＭＥ）について試験した。ＮｍＣは血清群Ｃの髄膜炎菌である。ＮｍＢは血清群Ｂの髄膜炎菌である。ＮｍＷ１３５は血清群Ｗ１３５の髄膜炎菌である。ＰｅｎＳはペニシリンＧに対する感受性のある株である。ＰｅｎＩはペニシリンＧに対する中程度の感受性をもった株である。
【００９２】
図３：自然の髄膜炎菌感染が生じている際のＰＢＰ２の免疫原性
【００９３】
図３Ａ：入院する時点（急性期血清）と７〜２０日後（回復期血清）に得た、患者（Ｐ１〜Ｐ３）の二種の血清における髄膜炎菌の細胞全体に対するＩｇＧ免疫応答（中塗りの記号）。患者Ｐ１は、血清群Ｃの髄膜炎菌による髄膜炎菌感染が確認された患者である。患者Ｐ２は、血清群Ｂの髄膜炎菌による髄膜炎菌感染が確認された患者である。患者Ｐ３は、髄膜炎菌感染がない患者である。白塗りの記号は大腸菌の細胞全体に対する各患者の二種の血清の活性を示している。
【００９４】
図３Ｂ：異なる血清群および遺伝系統に属する髄膜炎菌単離株ＰｅｎＳ（ＰＢＰ２Ｓ）およびＰｅｎＩ（ＰＢＰ２Ｉ）に対応する精製した組換えＨｉｓ６−ｔａｇ−ＰＢＰ２に対する、患者Ｐ１の二種の血清（急性期および回復期）とコントロールのＰ３の血清（回復期）について実施したドットブロット分析。四つの異なる血清希釈物を試験した（１：５００から１：５０００）。１００ｎｇと５０ｎｇを用いたＬＮＰ８０１３株由来のＰＢＰ２を除き、各タンパク質について、二つの濃度（３００ｎｇおよび１５０ｎｇ）をスポットした。髄膜炎菌のピリンを上述したように精製した（１１）。
【００９５】
図４：腹腔内へチャレンジしたマウスにおける髄膜炎菌性菌血症に対する受動的防御の研究。抗ＰＢＰ２  ＩｇＧの防御的役割を、野生型のｐｅｎＡＳ対立遺伝子ならびに三つのｐｅｎＡＩの同質遺伝子変異体であるＴＲ−ＴＨ４１、ＴＲ１６４５４、およびＴＲ１６５０４を有する髄膜炎菌ＬＮＰ８０１３株で腹腔内チャレンジした後に評価した。ＰＢＰ２またはＣｒｇＡに対する精製したウサギのＩｇＧを用いた。用いた株／ＩｇＧの組み合わせは各曲線の上に示している。中塗りの記号および白抜きの記号は、それぞれ、コントロールの未処理マウス（ＰＢＳ）と、３０μｇのＩｇＧで処理したマウスの結果を示している。データは、二つの独立した実験の各時点における三頭のマウスからなる群の平均±ＳＤである。未処理マウスの群と処理マウスの群との間のＣＦＵの数（ｌｏｇ１０）を比較するためにスチューデントｔ検定を用いた。＊は、ｐ≦０．０５である。
【００９６】
図５：ペニシリンに感受性のある髄膜炎菌の血清群ＣのＬＮＰ８０１３株のＰＢＰ２タンパク質で免疫付与したマウスにおいて得られた抗髄膜炎菌性防御。ワクチン接種したマウス（ｎ＝５）およびコントロールマウス（ｎ＝４）を、ペニシリンに感受性のある５×１０５ｃｆｕの髄膜炎菌ＬＮＰ８０１３株で腹腔内感染によってチャレンジした。三時間後、ＧＣＢプレート上に血液の連続希釈物を置いて、血液中のｃｆｕの計数を行った。結果は最初の血液に従って標準化した。個々のワクチン接種したマウス（黒の菱形）とコントロールマウス（黒の丸）が示されている。両マウス群間の差の有意性（Ｐ＜０．０５）を判定するためにスチューデントｔ検定を利用した。
【００９７】
図６：マウスにおける髄膜炎菌性菌血症に対する受動的防御の特異性。Ａ：抗ＰＢＰ２  ＩｇＧの防御的役割を、野生型ｐｅｎＡＳを有する髄膜炎菌ＬＮＰ８０１３株で腹腔内にチャレンジした後評価した。精製した抗ＰＢＰ２  ＩｇＧ（３０μｇ）を単独で、または、ペニシリンに感受性のある血清群ＣのＬＮＰ８０１３株に由来する、Ｎ末端の膜貫通領域を欠いた精製した組換えＨｉｓ６−ｔａｇ−ＰＢＰ２（２０μｇ）とともに、細菌によるチャンレジの前に注射した。二時間後、０．５ｍＬのＰＢＳ中の３×１０６ｃｆｕの細菌懸濁液でマウスを腹腔内でチャレンジした。細菌によるチャレンジの４時間後、四頭のマウスの血液のｃｆｕ計数を行った。データは、二つの独立した実験の各時点における４頭のマウスからなる群の平均±ＳＤである。Ｂ：Ａで用いた、ペニシリンに感受性のある血清群ＣのＬＮＰ８０１３株の調製物に由来する、Ｎ末端の膜貫通領域を欠いた精製した組換えＨｉｓ６−ｔａｇ−ＰＢＰ２に対する、精製した抗ＰＢＰ２  ＩｇＧを用いたウェスタンブロット分析。
【００９８】
図７：抗ＰＢＰ２モノクローナル抗体（Ｄ２．４、Ｄ１３．６およびＩ４．３７）の結合能力をウェスタンブロットにより試験した。三つのモノクローナル抗体のすべてが、血清群Ｂ、ＣまたはＷ１３５に属しペニシリンに対するさまざまなレベルの感受性を有する複数の異なる髄膜炎菌株に由来する、精製した組換えＰＢＰ２を認識した。
【実施例１】
【００９９】
Ｎ末端の膜貫通領域を欠いた組換え髄膜炎菌ＰＢＰ２断片の産生
【０１００】
いくつかの髄膜炎菌ＰｅｎＳ単離株およびＰｅｎＩ単離株に由来するＰＢＰ２のＮ末端の膜貫通領域をコードする配列を欠いた、変化したｐｅｎＡ遺伝子を、ｐＥＴ２８ｂ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、ノッティンガム、イギリス）にクローニングした。
【０１０１】
つぎに、大腸菌ＢＬ２１  ｐＬｙｓＳ  ＤＥ３株を組換えプラスミドで形質転換し、Ｈｉｓ６−ｔａｇ−ＰＢＰ２をＴ７バクテリオファージのプロモーターの制御下で過剰発現させた。
【０１０２】
組換えタンパク質の精製を、過去に報告されているように（Ａｎｔｉｇｎａｃ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３１５２９−３５）、ニッケルニトリロ三酢酸−アガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ、デューレン、ドイツ）を用いて行った。
【０１０３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の後、精製したＰＢＰ２を含有する画分をプールし、リン酸緩衝生理食塩水で透析し、２０％グリセロールとなるように調整し（ｖ＼ｖ）、そして−２０℃で保存した。
【０１０４】
Ｎ末端の膜貫通領域を欠いた組換え髄膜炎菌ＰＢＰ２断片が産生されたすべての髄膜炎菌株の特徴を以下の表３に示す。
【０１０５】
【表３】
2008545383.tif 000004
【０１０６】
図２Ａは、ペニシリンに感受性のある髄膜炎菌の血清群ＣのＬＮＰ８０１３株の、Ｎ末端の膜貫通領域を欠いた組換え髄膜炎菌ＰＢＰ２断片を精製するさまざまな過程の分析を示している。
【実施例２】
【０１０７】
Ｎ末端の膜貫通領域を欠いた組換え髄膜炎菌ＰＢＰ２で免疫付与した後に得られたウサギ抗ＰＢＰ２血清の結合能力
【０１０８】
ペニシリンに感受性のある血清群ＣのＬＮＰ８０１３株に由来する、Ｎ末端の膜貫通領域を欠いた精製した組換えＨｉｓ６−ｔａｇ−ＰＢＰ２でウサギを免疫付与した後、抗ＰＢＰ２血清を得た（図２Ａ）。
【０１０９】
ＰＢＰ２による免疫付与のために、二頭の３ｋｇの雌のウサギに、０日目に完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ、ＭＡ）を加えた３μｇの精製ＰＢＰ２を、７日目および２１日目に不完全フロイントアジュバントを加えた３μｇの精製ＰＢＰ２を皮下注射した。免疫付与前である０日目に免疫前血清を得、２８日目に免疫血清を採取した。
【０１１０】
ウサギの抗ＰＢＰ２血清の特異性を試験するため、ｐｅｎＡＳおよびｐｅｎＡＩでコードされた、さまざまな血清群および遺伝系統に属する髄膜炎菌のＰＢＰ２に対してウェスタンブロットを実施した。血清の５０００倍希釈によって、免疫血清のみによる特異的な認識を示すことが可能となった。
【０１１１】
ウサギの抗ＰＢＰ２血清の特異性を、実施例１で説明したペニシリンのＮ末端の膜貫通領域を欠いている、精製した組換え髄膜炎菌ＰＢＰ２断片、ならびに、血清群Ｗ１３５に属する他の二つの髄膜炎菌株（ＬＮＰ１７５９２株およびＬＮＰ１６６３５株）の細菌細胞膜の抽出物について試験した。
【０１１２】
結果は、試験したウサギの抗ＰＢＰ２血清が、さまざまな株のペニシリン感受性レベルとは無関係に、血清群Ｂ、ＣまたはＷ１３５に属する複数の異なる髄膜炎菌の単離株に由来するＰＢＰ２を認識することを示している（図２Ｂ）。
【０１１３】
このことは、精製したＰＢＰ２タンパク質がウサギにおいて免疫原性であることと、抗ＰＢＰ２抗体が、複数の異なる髄膜炎菌の単離株に由来するＰＢＰ２を認識することを裏付けるものであり、該抗体が、血清群Ｂの株を含む多くのさまざまな髄膜炎菌株による髄膜炎菌感染が生じている際の感染した対象に注射されると、防御効果を有する可能性があることを示唆している。
【実施例３】
【０１１４】
自然の髄膜炎菌性感染が生じている際のＰＢＰ２の免疫原性
【０１１５】
異なる遺伝系統、異なる血清群（ＢおよびＣ）に属し、そしてペニシリンＧに対する多様な感受性を有する髄膜炎菌の単離株に対応する精製した組換えＰＢＰ２をニトロセルロース膜にスポットし、髄膜炎菌感染が確認された患者（Ｐ１）の二種の血清を用いて免疫検出した（血清群Ｃの髄膜炎菌については陽性培養）。二種の血清は、入院時に得た急性期血清と、１０日後に得た回復期血清である。血清の連続希釈物を試験し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＣＡＬＴＡＧ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンゲーム、カリフォルニア州）を用いてＩｇＧの応答を検出した。ｐｅｎＡＳおよびｐｅｎＡＩでコードした、試験したすべてのＰＢＰ２に対して、回復期血清を用いたときだけＩｇＧシグナルが検出された（図３Ｂ）。
【０１１６】
血清群Ｂの髄膜炎菌感染が確認された別の患者（Ｐ２）から得た二種の血清でＰＢＰ２を免疫検出したところ、同様の結果が得られた。無関係のタンパク質（大腸菌のマルトース結合タンパク質、ＭａｌＥ）に対しては両方の血清でシグナルが検出されなかったのに対し、髄膜炎菌の主要な免疫原性タンパク質（ピリン）に対しては回復期血清で陽性シグナルが観察された（図３Ｂ）。
【０１１７】
抗ＰＢＰ２の免疫ブロット法におけるこの増加は、髄膜炎菌の細胞全体に対してＥＬＩＳＡで試験した患者の血清（１：１０００の希釈）の免疫応答と類似している（図３Ａ）。
【０１１８】
髄膜炎菌に感染していない患者（Ｐ３）から得たコントロールの二種の血清では、シグナルの強化が観察されなかった（図３Ａ）。これらのデータは、自然の髄膜炎菌感染が生じている際のＰＢＰ２に対する免疫応答の特異性を裏付けるものであり、髄膜炎菌ＰＢＰ２が、髄膜炎菌感染が生じている際の防御抗体の相応しい標的であることを示唆している。
【実施例４】
【０１１９】
腹腔内へチャレンジしたマウスにおける髄膜炎菌性菌血症に対する受動的防御の研究
【０１２０】
４．１  ポリクローナル抗ＰＢＰ２  ＩｇＧを用いた受動的防御
【０１２１】
次に、マウスの腹腔内（ｉｐ）感染モデルにおいて、髄膜炎菌菌血症に対する受動的防御を付与するウサギ抗ＰＢＰ２  ＩｇＧの能力を試験した。
【０１２２】
ペニシリンに感受性のある血清群ＣのＬＮＰ８０１３株に由来する、Ｎ末端の膜貫通領域を欠いた精製した組換えＨｉｓ６−ｔａｇ−ＰＢＰ２による免疫付与の後、一頭のウサギの免疫血清から全ＩｇＧを精製することで、抗ＰＢＰ２  ＩｇＧを得た。全ＩｇＧはまず３３％の（ＮＨ４）２ＳＯ４で沈殿させ、１７．５ｍＭ、ｐＨ６．３のリン酸緩衝生理食塩水で透析した。この画分を、ｐＥＴ２８Ｂ発現ベクターを有するＢＬ２１  ｐＬｙｓＳ  ＤＥ３大腸菌の細菌抽出物で事前にコーティングした、臭化シアンで活性化したセファロース４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）に吸着させた。溶出した画分中のタンパク質濃度を２８０ｎｍの吸光度で判定した。
【０１２３】
受動的防御の実験については、すべての試験した髄膜炎菌株は病原性を維持するようマウスで継代し、３０％のグリセロールを含むＧＣ液体培地内で−７０℃で保存した。これらを、５％ＣＯ２の雰囲気下において３７℃でＧＣＢ寒天プレート上で一晩培養し、ついでＢＨＩ液体培地に入れた。細菌は対数期に達するまで４時間培養し、１０６ｃｆｕ／ｍｌに調節した。
【０１２４】
５週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ、フランス）を時点０において、３０μｇ、３μｇそして０．３μｇの精製したウサギの抗ＰＢＰ２  ＩｇＧを静脈内投与して処理した。これらの用量は、マウスにおける特異的ＩｇＧの濃度（０．３μｇ／ｍｌ〜３０μｇ／ｍｌ）をヒトにおいて期待される濃度（全ＩｇＧの約０．３〜０．５％）とほぼ同様とするように計算されている。各実験について、コントロールマウスには、ＰＢＳまたは髄膜炎菌の細胞質性の（したがって抗体にアクセスできない）調節タンパク質ＣｒｇＡ（Ｄｅｇｈｍａｎｅ，Ａ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｍ．Ｋ．Ｔａｈａ．２００３．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４７：１３５−４３）に対する精製したウサギＩｇＧを注射した。
【０１２５】
二時間後、０．５ｍｌ（５×１０５ｃｆｕ）の、野生型ｐｅｎＡＳ対立遺伝子を有するペニシリンに感受性のある株である、血清群Ｃの髄膜炎菌ＬＮＰ８０１３株でマウスを腹腔内でチャレンジした。二つの独立した実験における３頭のマウスの血液のｃｆｕ計数を、細菌チャレンジの１時間、２時間、３時間および４時間後に行った。チャレンジの１時間および２時間後ではマウス間における菌血症のレベルに有意差はなかった（図４）。しかし、ウサギの抗ＰＢＰ２  ＩｇＧを注射したマウスは、３時間および４時間後に、コントロールと比較して菌血症の減少を示し、この減少は用いた三つの用量（３０μｇ、３μｇおよび０．３μｇ）について用量依存性であった（図４）。ネガティブコントロール、つまりＰＢＳまたは髄膜炎菌の細胞質性の調節タンパク質ＣｒｇＡ（Ｄｅｇｈｍａｎｅ，Ａ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｍ．Ｋ．Ｔａｈａ．２００３．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４７：１３５−４３）に対する精製したウサギＩｇＧを注射したマウスでは、防御が観察されなかった（図３）。
【０１２６】
次に、ペニシリンに対する感受性の低い三つのＬＮＰ８０１３の同質遺伝子変異体を用いた腹腔内チャレンジに対する、抗ＰＢＰ２  ＩｇＧの受動的防御の能力を分析した。これらの株すべてが、ｐｅｎＡ遺伝子の３’にあるトランスペプチダーセをコードする領域に改変を有している。ＴＲ−ＴＨ４１、ＴＲ１６４５４およびＴＲ１６５０４の株が、三つの異なる髄膜炎菌株（それぞれＴＨ−４１、ＬＮＰ１６４５４およびＬＮＰ１６５０４）（Ａｎｔｉｇｎａｃ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３１５２９−３５）のＰＣＲ増幅したｐｅｎＡ対立遺伝子でＬＮＰ８０１３を形質転換することで得られた。図４で見られるように、抗ＰＢＰ２  ＩｇＧは、三つのｐｅｎＡ変異体のすべてのチャレンジの後、それらが発現するＰＢＰ２タンパク質における改変にもかかわらず、菌血症を減少させた。
【０１２７】
これらの結果は、特定の髄膜炎菌株のＰＢＰ２タンパク質を結合する抗体を注射することが、この特定の株だけでなく、変異した髄膜炎菌株によって感染したマウスの防御を誘発するために十分であることを実証している。したがって、特定の髄膜炎菌株のＰＢＰ２タンパク質を結合する抗体の注射が、他の血清群の髄膜炎菌株を含む、多くの異なる髄膜炎菌株による感染に対する防御を誘発するために十分であることが示唆される。
【０１２８】
４．２  ポリクローナル抗ＰＢＰ２  ＩｇＧを用いた受動的防御の特異性
【０１２９】
精製した抗ＰＢＰ２  ＩｇＧを用いて観察される受動的防御の特異性をさらに確認するために一連の実験を行い、該実験において、細菌によるチャレンジは、精製した抗ＰＢＰ２  ＩｇＧを単独で、または、抗ＰＢＰ２  ＩｇＧの産生に用いられるＮ末端の膜貫通領域を欠いている、精製した組換えＰＢＰ２断片とともに注射した２時間後に行った。
【０１３０】
より詳細には、５週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ、フランス）に、３０μｇの精製したウサギ抗ＰＢＰ２  ＩｇＧのみを含んだ溶液、または、ペニシリンに感受性のある血清群ＣのＬＮＰ８０１３株に由来する、Ｎ末端の膜貫通領域を欠いた２０μｇの精製した組換えＨｉｓ６−ｔａｇ−ＰＢＰ２とともに含んだ溶液を、時点０で注射した。二時間後、マウスを、０．５ｍｌのＰＢＳ中の３×１０６ｃｆｕの細菌懸濁液で腹腔内チャレンジした。二つの独立した実験において、４頭のマウスの血液のｃｆｕ計数を細菌チャレンジの４時間後に行った。
【０１３１】
精製した抗ＰＢＰ２  ＩｇＧ単独で処理したマウスに比べ、精製した抗ＰＢＰ２  ＩｇＧと、Ｎ末端の膜貫通領域を欠いた精製したＰＢＰ２組換え断片との両方で処理したマウスにおいて、有意に高いレベルの菌血症が観察された（Ｐ＝０．０００１２）（図６Ａ参照）。さらに、抗ＰＢＰ２  ＩｇＧは、精製した組換えＰＢＰ２断片の調製物では一つのバンドのみを認識した（図６Ｂ）。要するに、これらの結果は、ポリクローナル抗ＰＢＰ２  ＩｇＧによって付与される受動的防御が髄膜炎菌ＰＢＰ２の特異的認識および該髄膜炎菌ＰＢＰ２への特異的結合に起因することを強く示唆している。
【実施例５】
【０１３２】
髄膜炎菌ＰＢＰ２タンパク質の断片によるマウスのワクチン接種
【０１３３】
方法
６週齢の５頭の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、ペニシリンに感受性のある血清群ＣのＬＮＰ８０１３株（ＰＢＰ２ＣＳ）に由来する、Ｎ末端の膜貫通領域を欠いた１２μｇの精製した組換えＨｉｓ６−ｔａｇ−ＰＢＰ２で免疫付与した。４頭のコントロールマウスに生理食塩水を注射した。注射は、０日目、７日目および１４日目に皮下に行い、一回目の投与については完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ、デトロイト、ミシガン州、アメリカ）を用い、二度目の投与については不完全フロイントアジュバントを用いた。２８日目にマウスを採血し、ＰＢＰ２ＣＳでコーティングした９６ウェルプレートを用いて、ＥＬＩＳＡによって、１μｇの精製ＰＢＰ２で免疫応答を試験した。その後、５×１０５ｃｆｕのＬＮＰ８０１３株（ＰｅｎＳ）による腹腔内（ｉｐ）チャレンジを行った。血液のコロニー形成単位（ｃｆｕ）の計数は、細菌チャレンジの３時間後にＧＣＢプレート上で行った。
【０１３４】
結果
コントロールマウスと比較し、高いレベルの抗ＰＢＰ２抗体力価がＥＬＩＳＡで見られた。ワクチン接種したマウスの間では、抗体力価の差は観察されなかった。
【０１３５】
ワクチン接種したマウスは、コントロールマウスと比較して有意に低い血液中のｃｆｕ値を示した（Ｐ＝０．０３０４）（図５）。これらの結果は、ペニシリンに感受性のある血清群ＣのＬＮＰ８０１３株（ＰＢＰ２ＣＳ）に由来する、Ｎ末端の膜貫通領域を欠いた精製した組換えＨｉｓ６−ｔａｇ−ＰＢＰ２が免疫原性であり、髄膜炎菌に対する防御反応を誘発することができることを示唆している。
【０１３６】
全体として、前記実施例で説明した結果は、髄膜炎菌ＰＢＰ２タンパク質が通常のヒトの髄膜炎菌感染が生じている際に免疫原性であること、そしてＰＢＰ２断片によるマウスの免疫付与によって抗ＰＢＰ２抗体が誘発されることを明らかに示している。
【０１３７】
さらに、このような免疫付与はワクチン接種したマウスにおいて防御免疫を誘発する。
【０１３８】
とりわけ、髄膜炎菌ＰＢＰ２タンパク質の高度な遺伝的多様性にもかかわらず、結果は、特定の髄膜炎菌ＰＢＰ２タンパク質に対する抗体が、他の異なる髄膜炎菌株の髄膜炎菌ＰＢＰ２タンパク質を結合することができること、そして、このような抗体が、髄膜炎菌の感染が生じている際に注射されると防御を付与することを示している。
【０１３９】
特定の髄膜炎菌ＰＢＰ２タンパク質に対する抗体が、他の異なる髄膜炎菌株の髄膜炎菌ＰＢＰ２タンパク質を結合する能力は、ＰＢモジュールにおける保存されたアミノ酸モチーフ（Ｓｘ２Ｋ、ＳｘＮおよびＫＴＧ）の存在と関係している可能性がある。これらのモチーフは、ＰＢＰタンパク質間、特定のＰＢＰタンパク質の変異体間、あるいは異なる細菌群間においてでさえ高度に保存されているため、この方法は、髄膜炎菌ＰＢＰタンパク質の変異体を発現する別の種の細菌株による感染に対し、哺乳動物にワクチン接種するために応用することも可能である。
【０１４０】
このように、髄膜炎菌によって発現されるＰＢＰタンパク質は、髄膜炎菌、および／または髄膜炎菌ＰＢＰタンパク質の変異体を発現する別の種の細菌株に対するワクチン接種に用いることができる。髄膜炎菌ＰＢＰタンパク質に対する抗体は、髄膜炎菌、および／または、髄膜炎菌ＰＢＰタンパク質の変異体を発現する別の種の細菌株に感染した個体の治療に用いることができる。ＰＢＰタンパク質または抗体の投与の防御効果を高めるため、いくつかのＰＢＰタンパク質または抗体の組み合わせを用いてもよい。
【実施例６】
【０１４１】
髄膜炎菌ＰＢＰ２タンパク質に対するモノクローナル抗体の調製
【０１４２】
方法
ペニシリンに感受性のある血清群ＣのＬＮＰ８０１３株に由来する、Ｎ末端の膜貫通領域を欠いた精製した組換えＨｉｓ６−ｔａｇ−ＰＢＰ２（番号Ｉ−３４２２として２００５年５月３日にＣＮＣＭに寄託されたクローンＤＨ５ｐＡＡ２から精製された）を、特異的モノクローナル抗体の産生に用いた。
【０１４３】
Ｓｗｉｓｓマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ）に、０日目、７日目および２１日目にＰＢＰ２を注射した。次に、精製ＰＢＰ２ＣＳに対する応答を確認した。応答したマウスを四ヶ月間、さらなる免疫付与をせずに維持した。ブースター注射を、同用量のＰＢＰ２組換え断片で、融合の３日前に行った。
【０１４４】
最も高い抗体力価を示したマウスを屠殺し、その脾臓を回収した。免疫付与したマウスの脾臓細胞とマウスの骨髄腫細胞Ｐ３Ｕ１を４：１の割合で混合し、ペレットにし、そして０．８ｍｌの４５％ポリエチレングリコール１０００を添加して融合させた。
【０１４５】
得られた融合細胞を２４ウェルプレート上で、５％の二酸化炭素雰囲気下で３７℃で培養した。安定した雑種細胞株を、ヒポキサンチン−アザセリン培地を用いて選別した。
【０１４６】
融合の二週間後、上清中のハイブリドーマを、ＥＬＩＳＡによって特異的抗ＰＢＰ２抗体の存在についてスクリーニングした。陽性のウェルの細胞を限界希釈法によってクローニングした。
【０１４７】
選別されたモノクローナル抗体のクラスおよびサブクラスは、さまざまなサブクラスに特異的なペルオキシダーゼ標識免疫グロブリンを用いてＥＬＩＳＡによって判定した。
【０１４８】
ハイブリドーマ細胞を増殖させ、５×１０６個の細胞をヌードマウス（ＮＭＲＩ−ｎｕ、Ｊａｎｖｉｅｒ）の腹腔内に注射することで腹水を生成させた。
【０１４９】
結果
上述した手順を用いることで、髄膜炎菌ＰＢＰ２タンパク質に対するモノクローナル抗体を産生する三つのハイブリドーマが得られた。
【０１５０】
これら３つのハイブリドーマは、Ｄ２．４、Ｄ１３．６およびＩ４．３７と名付けられ、それぞれ、番号Ｉ−３６０９、Ｉ−３６１０およびＩ−３６１１として２００６年５月２２日にＣＮＣＭ（２５−２８  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｒ  Ｒｏｕｘ．７５０１５  Ｐａｒｉｓ．Ｆｒａｎｃｅ）に寄託された。
【０１５１】
前記ハイブリドーマから産生される三つのモノクローナル抗体のすべてがＩｇＧ抗体である。
【０１５２】
前記三つの抗ＰＢＰ２モノクローナル抗体（Ｄ２．４、Ｄ１３．６およびＩ４．３７）の結合能力をウェスタンブロットで試験した。三つのモノクローナル抗体のすべてが、血清群Ｂ、Ｃ、またはＷ１３５に属し、ペニシリンに対するさまざまなレベルの感受性を有する、複数の異なる髄膜炎菌株の精製した組換えＰＢＰ２を認識した（図７参照）。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】クラスＡ（大腸菌のＰＢＰ１ａ、淋菌および髄膜炎菌のＰＢＰ１）およびクラスＢ（大腸菌のＰＢＰ３、淋菌および髄膜炎菌のＰＢＰ２）の、高分子量のＰＢＰｓの分子組成を示す図。
【図２】髄膜炎菌のＬＮＰ８０１３株のＰＢＰ２で免疫付与したウサギの血清の特異性を示す図であり、図２中のＡは大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ由来の細胞全体の可溶化物と、髄膜炎菌のＬＮＰ８０１３株の精製したＨｉｓ６−ｔａｇ−ＰＢＰ２タンパク質を含む溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図であり、図２中のＢは髄膜炎菌ＬＮＰ８０１３株のＰＢＰ２タンパク質で免疫付与した後に得たウサギ血清の結合を示すウェスタンブロットの結果を示す図。
【図３】自然の髄膜炎菌感染が生じている際のＰＢＰ２の免疫原性示す図であり、図３中のＡは入院する時点（急性期血清）と７〜２０日後（回復期血清）に得た、患者（Ｐ１〜Ｐ３）の二種の血清における髄膜炎菌の細胞全体に対するＩｇＧ免疫応答（中塗りの記号）を示す図であり、図３中のＢは異なる血清群および遺伝系統に属する髄膜炎菌単離株ＰｅｎＳ（ＰＢＰ２Ｓ）およびＰｅｎＩ（ＰＢＰ２Ｉ）に対応する精製した組換えＨｉｓ６−ｔａｇ−ＰＢＰ２に対する、患者Ｐ１の二種の血清（急性期および回復期）とコントロールのＰ３の血清（回復期）について実施したドットブロット分析の結果を示す図。
【図４】腹腔内へチャレンジしたマウスにおける髄膜炎菌性菌血症に対する受動的防御の研究の結果を示す図。
【図５】髄膜炎菌の血清群ＣのＬＮＰ８０１３株に感受性のあるペニシリンのＰＢＰ２タンパク質で免疫付与したマウスにおいて得られた抗髄膜炎菌性防御を示す図。
【図６】マウスにおける髄膜炎菌性菌血症に対する受動的防御の特異性を示す図であり、図６中のＡは抗ＰＢＰ２  ＩｇＧの防御的役割の、野生型ｐｅｎＡＳを有する髄膜炎菌ＬＮＰ８０１３株で腹腔内にチャレンジした後の評価を示す図であり、図６中のＢはＡで用いた、ペニシリンに感受性のある血清群ＣのＬＮＰ８０１３株の調製物に由来する、Ｎ末端の膜貫通領域を欠いた精製した組換えＨｉｓ６−ｔａｇ−ＰＢＰ２に対する、精製した抗ＰＢＰ２  ＩｇＧを用いたウェスタンブロット分析の結果を示す図。
【図７】抗ＰＢＰ２モノクローナル抗体（Ｄ２．４、Ｄ１３．６およびＩ４．３７）の結合能力のウェスタンブロットによる試験の結果を示す図。
【図１】
2008545383.tif 000005
【図２】
2008545383.tif 000006
【図３】
2008545383.tif 000007
【図４】
2008545383.tif 000008
【図５】
2008545383.tif 000009
【図６】
2008545383.tif 000010
【図７】
2008545383.tif 000011
【配列表】
2008545383000001.app
【国際調査報告】
2008545383.tif 000012
2008545383.tif 000013
2008545383.tif 000014
2008545383.tif 000015
2008545383.tif 000016