(57)【要約】  配列３、配列６および配列９から成るグループから選択されたアミノ酸配列に少なくとも８５％のアミノ酸配列一致を有しているアミノ酸配列を含むブタ内因子をコードする単離ヌクレオチド配列またはそのフラグメント。本発明はまた、配列１、配列４および配列７から成るグループから選択されたヌクレオチド配列に少なくとも８５％のヌクレオチド配列一致を有しているヌクレオチド配列を含むかまたは相補的な単離核酸またはそのフラグメントを包含する。
2008529493.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列３、配列６および配列９から成るグループから選択されたアミノ酸配列に少なくとも８５％一致するアミノ酸配列を有しているブタ内因子をコードするヌクレオチド配列を含むかまたは相補的な単離核酸配列またはそのフラグメント。
【請求項２】
前記配列がＳｕｓ属から単離される請求項１に記載のヌクレオチド配列。
【請求項３】
前記Ｓｕｓ属の前記種がＳｕｓ  ｓｃｒｏｆａである請求項２に記載のヌクレオチド配列。
【請求項４】
請求項１に記載の前記ヌクレオチド配列によってコードされている精製ブタ内因子。
【請求項５】
（ａ）生物サンプルに請求項４に記載のブタ内因子でコートされた常磁性微粒子を混合する段階と、
（ｂ）前記サンプル中に存在するビタミンＢ１２を前記ブタ内因子でコートされた常磁性微粒子に結合させる段階と、
（ｃ）化学発光反応を生じ得るコンジュゲートを前記段階（ｂ）の混合物に添加する段階と、
（ｄ）前記化学発光反応を生じさせる段階と、
（ｅ）生じた化学発光反応を相対的光単位として測定して前記生物サンプル中のビタミンＢ１２の量を決定する段階と、
を含む生物サンプル中のビタミンＢ１２の定量方法。
【請求項６】
（ａ）生物サンプルを少なくとも１つの前処理試薬と混合する段階と、
（ｂ）前記段階（ａ）の前処理サンプルに請求項４に記載のブタ内因子でコートされた常磁性微粒子を混合する段階と、
（ｃ）前記サンプル中に存在するビタミンＢ１２を前記ブタ内因子でコートされた前記常磁性微粒子に結合させる段階と、
（ｄ）前記段階（ｃ）の混合物を洗浄する段階と、
（ｅ）化学発光反応を生じ得るコンジュゲートを前記段階（ｄ）の洗浄混合物に添加する段階と、
（ｆ）前記化学発光反応を生じさせるために前記段階（ｅ）の反応混合物にプレトリガ溶液およびトリガ溶液を添加する段階と、
（ｇ）生じた化学発光反応を相対的光単位として測定して前記生物サンプル中のビタミンＢ１２の量を決定する段階と、
を含む生物サンプル中のビタミンＢ１２の定量方法。
【請求項７】
（ａ）生物サンプルと請求項４に記載のブタ内因子でコートされた微粒子とを含む混合物を準備する段階と、
（ｂ）前記サンプル中に存在するビタミンＢ１２を前記内因子でコートされた前記微粒子に結合させてビタミンＢ１２とブタ内因子との第一複合体を形成する段階と、
（ｃ）蛍光生成物を形成し得るコンジュゲートを前記第一複合体に添加して第一複合体と蛍光生成物を形成し得るコンジュゲートとを含む第二複合体を形成する段階と、
（ｄ）第二複合体に蛍光原性材料を添加して蛍光生成物を生成させる段階と、
（ｅ）前記生物サンプル中のビタミンＢ１２の量を決定するために蛍光生成物を測定する段階と、
を含む生物サンプル中のビタミンＢ１２の定量方法。
【請求項８】
（ａ）生物サンプルを含む反応混合物を準備する段階と、
（ｂ）請求項４に記載のブタ内因子でコートされた微粒子を段階（ａ）の反応混合物に添加する段階と、
（ｃ）前記サンプル中に存在するビタミンＢ１２を前記内因子でコートされた前記微粒子に結合させてビタミンＢ１２とブタ内因子との第一複合体を形成する段階と、
（ｄ）段階（ｃ）の反応混合物の一部をマトリックスに転移させる段階と、
（ｅ）前記微粒子を前記マトリックスに不可逆的に結合させる段階と、
（ｆ）前記マトリックスを洗浄して前記微粒子に未結合の材料を除去する段階と、
（ｇ）蛍光生成物を形成し得るコンジュゲートをマトリックスに供給して第一複合体と蛍光生成物を形成し得るコンジュゲートとを含む第二複合体を形成する段階と、
（ｈ）マトリックスを洗浄して未結合のコンジュゲートを除去する段階と、
（ｉ）マトリックスに蛍光原性材料を添加して蛍光生成物を生成させる段階と、
（ｊ）前記生物サンプル中のビタミンＢ１２の量を決定するために蛍光生成物を測定する段階と、
を含む生物サンプル中のビタミンＢ１２の定量方法。
【請求項９】
配列１、配列４および配列７から成るグループから選択されたヌクレオチド配列に少なくとも８５％の一致を有しているヌクレオチド配列を含むかまたは相補的な単離核酸配列またはそのフラグメント。
【請求項１０】
前記配列がＳｕｓ属から単離される請求項９に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１１】
前記Ｓｕｓ属の前記種がＳｕｓ  ｓｃｒｏｆａである請求項１０に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１２】
請求項９に記載の前記ヌクレオチド配列によってコードされている精製ブタ内因子。
【請求項１３】
（ａ）生物サンプルに請求項１２に記載のブタ内因子でコートされた常磁性微粒子を混合する段階と、
（ｂ）前記サンプル中に存在するビタミンＢ１２を前記ブタ内因子でコートされた常磁性微粒子に結合させる段階と、
（ｃ）化学発光反応を生じ得るコンジュゲートを前記段階（ｂ）の混合物に添加する段階と、
（ｄ）前記化学発光反応を生じさせる段階と、
（ｅ）生じた化学発光反応を相対的光単位として測定して前記生物サンプル中のビタミンＢ１２の量を決定する段階と、
を含む生物サンプル中のビタミンＢ１２の定量方法。
【請求項１４】
（ａ）生物サンプルを少なくとも１つの前処理試薬と混合する段階と、
（ｂ）前記段階（ａ）の前処理サンプルに請求項１２に記載のブタ内因子でコートされた常磁性微粒子を混合する段階と、
（ｃ）前記サンプル中に存在するビタミンＢ１２を前記ブタ内因子でコートされた常磁性微粒子に結合させる段階と、
（ｄ）前記段階（ｃ）の混合物を洗浄する段階と、
（ｅ）化学発光反応を生じ得るコンジュゲートを前記段階（ｄ）の洗浄混合物に添加する段階と、
（ｆ）前記化学発光反応を生じさせるために前記段階（ｅ）の反応混合物にプレトリガ溶液およびトリガ溶液を添加する段階と、
（ｇ）生じた化学発光反応を相対的光単位として測定して前記生物サンプル中のビタミンＢ１２の量を決定する段階と、
を含む生物サンプル中のビタミンＢ１２の定量方法。
【請求項１５】
（ａ）生物サンプルと請求項１２に記載のブタ内因子でコートされた微粒子とを含む混合物を準備する段階と、
（ｂ）前記サンプル中に存在するビタミンＢ１２を前記内因子でコートされた前記微粒子に結合させてビタミンＢ１２とブタ内因子との第一複合体を形成する段階と、
（ｃ）蛍光生成物を形成し得るコンジュゲートを前記第一複合体に添加して第一複合体と蛍光生成物を形成し得るコンジュゲートとを含む第二複合体を形成する段階と、
（ｄ）第二複合体に蛍光原性材料を添加して蛍光生成物を生成させる段階と、
（ｅ）前記生物サンプル中のビタミンＢ１２の量を決定するために蛍光生成物を測定する段階と、
を含む生物サンプル中のビタミンＢ１２の定量方法。
【請求項１６】
（ａ）生物サンプルを含む反応混合物を準備する段階と、
（ｂ）請求項１２に記載のブタ内因子でコートされた微粒子を段階（ａ）の反応混合物に添加する段階と、
（ｃ）前記サンプル中に存在するビタミンＢ１２を前記内因子でコートされた前記微粒子に結合させてビタミンＢ１２とブタ内因子との第一複合体を形成する段階と、
（ｄ）段階（ｃ）の反応混合物の一部をマトリックスに転移させる段階と、
（ｅ）前記微粒子を前記マトリックスに不可逆的に結合させる段階と、
（ｆ）前記マトリックスを洗浄して前記微粒子に未結合の材料を除去する段階と、
（ｇ）蛍光生成物を形成し得るコンジュゲートをマトリックスに供給して第一複合体と蛍光生成物を形成し得るコンジュゲートとを含む第二複合体を形成する段階と、
（ｈ）マトリックスを洗浄して未結合のコンジュゲートを除去する段階と、
（ｉ）マトリックスに蛍光原性材料を添加して蛍光生成物を生成させる段階と、
（ｊ）前記生物サンプル中のビタミンＢ１２の量を決定するために蛍光生成物を測定する段階と、
を含む生物サンプル中のビタミンＢ１２の定量方法。
【請求項１７】
（ａ）（ｉ）配列３、配列６および配列９から成るグループから選択されたアミノ酸配列に少なくとも８５％の一致を有しているアミノ酸配列を含むブタ内因子をコードしている；または、
（ｉｉ）配列１、配列４および配列７から成るグループから選択されたヌクレオチド配列に少なくとも８５％の一致を有している；
ヌクレオチド配列を含むかまたは相補的な核酸配列を単離する段階と、
（ｂ）（ｉ）前記単離核酸配列と（ｉｉ）調節配列とを作動的に連結された形態で含むベクターを構築する段階と、
（ｃ）前記ブタ内因子の発現に十分な時間および条件下で前記ベクターを宿主細胞に導入する段階と、
を含むブタ内因子の産生方法。
【請求項１８】
（ａ）（ｉ）配列３、配列６および配列９から成るグループから選択されたアミノ酸配列に少なくとも８５％の一致を有しているアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている；、または、
（ｉｉ）配列１、配列４および配列７から成るグループから選択されたヌクレオチド配列に少なくとも８５％の一致を有している；
ヌクレオチド配列を含むかまたは相補的な核酸配列と、
（ｂ）調節配列と、
を作動的に連結された形態で含むベクター。
【請求項１９】
中または高ストリンジェンシー条件下で配列１、配列４および配列７から成るグループから選択された核酸配列にハイブリダイズする単離核酸配列またはそのフラグメント。
【請求項２０】
配列３、配列６および配列９から成るグループから選択されたアミノ酸配列に少なくとも８５％一致するアミノ酸配列をもつポリペプチドを含むブタ内因子をコードする単離核酸配列に中または高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする単離核酸またはそのフラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は診断試験用試薬、より特定的には全自動イムノアッセイ分析装置によって行われる診断試験用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
貧血は血清ビタミンＢ１２のレベル低下に関係のある重大な疾患である。平均赤血球容積（ＭＣＶ）の増加を特徴とする巨赤芽球性貧血（ＭＡ）の原因はビタミンＢ１２の欠乏であることが知見された。ＭＡ患者のある程度は正常なビタミンＢ１２レベルを有しており、逆にビタミンＢ１２欠乏でありながらＭＡに罹っていない個体も多いので、ビタミンＢ１２レベルとＭＡとの関係は必ずしも明らかでない。しかしながら、これらの複雑な要素はあるとしても、普通はＭＡ（例えば、ＭＣＶ増加）があるときには血清ビタミンＢ１２が欠乏している。ビタミンＢ１２欠乏の主な原因は悪性貧血である。この疾患の特徴はビタミンＢ１２の吸収が悪く、その結果として血清ビタミンＢ１２が正常値以下になることである。
【０００３】
鉄欠乏、正常妊娠の後期、菜食主義、胃の部分切除／回腸損傷、経口避妊、寄生虫競合、膵臓欠陥、癲癇治療、加齢などの多くの状態が、血清ビタミンＢ１２のレベル低下という兆候を示す。血清ビタミンＢ１２のレベル増加に付随する疾患は、腎不全、肝臓病、骨髄増殖性疾患などである。
【０００４】
内因子はビタミンＢ１２に結合する。この特性によって生物サンプル中のビタミンＢ１２の検出および定量に使用できる。慣用の内因子製造方法では、高価で緩慢で時間の掛かるプロセスを用いてブタ組織から内因子タンパク質を単離している。
【０００５】
逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応技術（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用するｃＤＮＡクローニングは当業界で公知である。この特定タンパク質について判明している他の種（ヒト、マウスおよびラットなど）との相同性に基づいてプライマーを設計し、ｃＤＮＡが得られる適正なＰＣＲ条件を選択するためには、ＰＣＲに基づくクローニング技術に加えてかなりの計画性および大量の知識が必要である。
【０００６】
米国特許Ｎｏ．３，５９１，６７８は、イオン交換樹脂を使用するバッチクロマトグラフィー法による内因子の精製方法を開示している。不純な内因子を、比較的低いｐＨおよびイオン強度のバッファ溶液に溶解し、得られた溶液をセルロース系交換樹脂に接触させる。樹脂を溶液から分離し、不純な内因子を溶解したバッファ溶液よりも高いｐＨおよびイオン強度のバッファ溶液で樹脂から精製内因子を溶出させる。
【０００７】
米国特許Ｎｏ．４，４４７，５２８は、自己阻止抗体、例えば、内因子とビタミンＢ１２との複合体形成を妨害する自己阻止抗体を検出するためのラジオアッセイ手順およびアッセイ試薬キットを開示している。受容体すなわち内因子を支持体に固定し、生物流体サンプルの存在下で該受容体に結合できるリガンドすなわちビタミンＢ１２を定量する。
【０００８】
米国特許Ｎｏ．５，２２７，３１１および５，４５９，２４２は、Ｒ−タンパク質を含有している内因子水溶液の精製方法を開示している。方法は、脂質エマルションを分散させる量のコロイドシリカ、溶液中のＲ−タンパク質の実質的に全部に結合するために十分な量のコビナミドおよび溶液中の内因子に結合するために十分な量の内因子親和性樹脂を内因子溶液に添加する段階と、結合したコビナミドおよびＲ−タンパク質を樹脂から洗浄する段階と、樹脂から内因子を溶出させる段階と、溶出した内因子を透析する段階とを含む。微粒子と精製内因子とのコンジュゲートを含むコバラミン用アッセイキットも開示されている。
【０００９】
米国特許Ｎｏ．５，３５０，６７４は、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した内因子を使用しヘテロ二官能架橋剤を介して結合させるビタミンＢ１２の非放射性競合アッセイを開示している。さらに、得られたコンジュゲートをＮ−エチルマレイミドで前処理することによって安定化する方法が開示されている。
【００１０】
ヒトの内因子（Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号Ｍ６３５１４）、マウスの内因子（Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号Ｌ２４１９１）、および、ラットの内因子（Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号Ｊ０３５７７）をそれぞれコードするｃＤＮＡ配列は過去の研究者らによって開示されている。しかしながら、ブタ内因子のｃＤＮＡ配列は未知である。従って、本発明よりも以前には組換えブタ内因子タンパク質を産生することはできなかった。
【００１１】
ブタ内因子は典型的にはブタ（たとえば、Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）の十二指腸組織から単離される。この単離は、緩慢で高価で時間の掛かる手順であり、しかも低収率である。また、現用の手順で単離された天然型内因子は純度の面でもイムノアッセイで示す性能の面でも恒常性に欠けている。従って、ブタ内因子を大量に産生し一段階アフィニティ単離法でブタ内因子を単離することが要望されている。このようにして産生された組換えタンパク質は、診断用イムノアッセイで恒常的な性能を示すであろう。
【発明の開示】
【００１２】
本発明は、ブタ内因子をコードする単離ヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む。ブタ内因子は配列３、配列６および配列９から成るグループから選択されたアミノ酸配列に少なくとも８５％のアミノ酸配列一致を有しているアミノ酸配列を含む。
【００１３】
本発明はさらに、配列１、配列４および配列７から成るグループから選択されたヌクレオチド配列に少なくとも８５％のヌクレオチド配列一致を有しているヌクレオチド配列を含むかまたは相補的な単離核酸配列またはそのフラグメントを含む。
【００１４】
上記のヌクレオチド配列はビタミンＢ１２に結合する機能的に活性のブタ内因子をコードしている。本発明はまた、上記に引用したヌクレオチド配列によってコードされた精製タンパク質およびそのフラグメントを含む。
【００１５】
さらに本発明は、配列３、配列６および配列９のアミノ酸配列に少なくとも８５％の一致を有しているアミノ酸配列を含むブタ内因子をコードするヌクレオチド配列を含むかまたは相補的なヌクレオチド配列を単離する段階；（ｉ）単離ヌクレオチド配列と（ｉｉ）プロモーターとを作動的に連結された形態で含むベクターを構築する段階；ブタ内因子の発現に十分な時間および条件下でベクターを宿主細胞に導入する段階；を含むブタ内因子の産生方法を含む。宿主細胞は例えば真核細胞または原核細胞である。より特定的に、原核細胞は例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓであろう。真核細胞は例えば、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞または真菌細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．またはＰｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．のような酵母細胞）であろう。Ｒｉｚｏｐｕｓ  ｓｐｐ．、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐおよびＭｕｃｏｒ  ｓｐｐのような他の真菌宿主も使用し得る。
【００１６】
さらに、本発明はまた、配列３、配列６および配列９から成るグループから選択されたアミノ酸配列に少なくとも８５％のアミノ酸一致を有するアミノ酸配列を有しているブタ内因子をコードしているヌクレオチド配列を含むかまたは相補的な単離ヌクレオチド配列を、調節配列（例えば、プロモーター）に作動的に連結された形態で含むベクターを包含する。本発明はまた、このベクターを内包する宿主細胞を含む。宿主細胞は例えば真核細胞または原核細胞であろう。適当な真核細胞および原核細胞は上記に提示した。
【００１７】
さらに、本発明は、配列１、配列４および配列７から成るグループから選択された核酸配列に中または高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする単離核酸配列またはそのフラグメントを含む。
【００１８】
本発明はまた、中または高ストリンジェンシー条件下でブタ内因子をコードする単離核酸配列にハイブリダイズする単離核酸またはそのフラグメントを含む。この場合、ブタ内因子のアミノ酸配列は配列３、配列６および配列９から成るグループから選択されたアミノ酸配列に少なくとも８５％の一致を有している。
【００１９】
本発明がさらに、配列１、配列４および配列７に少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％の一致を含む、対応する、同一であるまたは相補的である配列を有している単離ヌクレオチド配列（およびそれらにコードされた対応するタンパク質）を包含することに注目されたい。（パーセント一致に関しては７０％−１００％の範囲のすべての整数（およびそれらの部分）が本発明の範囲内であると考える。）このような配列は、天然資源からの単離、半合成経路による産生または新規合成などのいかなるソースに由来してもよい。より特定的に、このような配列は実施例に記載したソース以外のソース（例えば、細菌、真菌、藻類、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、マウスまたはヒト）から単離または誘導できる。
【００２０】
さらに、本発明はまた、本発明の核酸配列（すなわち、配列１、配列４および配列７）並びに上記の相補性、一致または対応を有している他のソースに由来の配列のフラグメントおよび誘導体を包含する。上記の全長配列およびフラグメントに機能的に等価の配列も本発明に包含される。
【００２１】
本発明方法は、ブタ内因子をコードしているｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ（逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応）によってクローニングする段階を含む。プライマーはヒト、マウスおよびラットの内因子ｃＤＮＡ配列間に存在する相同性に基づいて設計した。
【００２２】
当業界で常用の方法によって単離された内因子は、純度の面で、従ってアッセイ中の性能の面で恒常的な結果を与える。本発明の方法およびタンパク質を使用することによって、恒常的特性を有している組換え内因子を産生できる。本発明の方法はコストを節減し単離を容易にする。さらに、ブタ内因子を使用するアッセイ結果の恒常性が改善される。
【００２３】
本発明のために本文中で使用したヌクレオチド配列に関する“フラグメント”という用語は、特定したヌクレオチド配列の１領域に対応する少なくとも約６、好ましくは少なくとも約８、より好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド、いっそう好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチドの連続配列であると定義する。
【００２４】
本発明はさらに、上記ヌクレオチド配列によってコードされている上記タンパク質の配列３、配列６または配列９のアミノ酸配列に少なくとも約７０％のアミノ酸相似または一致、好ましくは少なくとも約８０％のアミノ酸相似または一致、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸相似または一致を有しておりビタミンＢ１２と結合する精製ポリペプチドを含む。
【００２５】
“一致”という用語は、特定の比較窓またはセグメントにおける個々のヌクレオチドに基づく２つの配列の相関を表す。すなわち、一致は、２つのＤＮＡセグメント（または２つのアミノ酸配列）の同じ鎖（センスまたはアンチセンス）間の同一、対応または等価の程度であると定義する。“配列一致のパーセンテージ”は、最適に位置合せした２つの配列を１つの特定領域で比較し、双方の配列に等しい塩基またはアミノ酸が存在する位置の数を測定して符合した位置の数を知り、このような位置の数を比較セグメントの位置の総数で除算し、結果に１００を乗算することによって計算する。配列の最適な位置合せは、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）のアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：２４４４（１９８８）の方法、および、適切なアルゴリズムを実行するコンピュータープログラム（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｍａｃａｗ  Ｐｉｌｅｕｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃｍｑｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｂｉｏｃｈｅｍ２１８／１１  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ．ｐｄｆ；Ｈｉｇｇｉｎｓら，ＣＡＢＩＯＳ．５Ｌ１５１−１５３（１９８９）），ＦＡＳＴＤＢ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ），ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５：３３８９−３４０２（１９９７）），ＰＩＬＥＵＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）またはＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ１，ＦＡＳＴＡ  ａｎｄ  ＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって行うことができる。（米国特許Ｎｏ．５，９１２，１２０参照）。
【００２６】
本発明のために“相補性”という用語は、２つのＤＮＡセグメント間の相関の程度であると定義する。相補性は、一方のＤＮＡセグメントのセンス鎖が他方のＤＮＡセグメントのアンチセンス鎖に適正条件下でハイブリダイズして二重螺旋を形成する能力を測定することによって決定する。“相補鎖（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）”という用語は、標準的塩基対合規則に基づいて所与の配列に対合する配列であると定義される。例えば、一方のヌクレオチド鎖の配列Ａ−Ｇ−Ｔは他方の鎖のＴ−Ｃ−Ａに“相補的”である。
【００２７】
二重螺旋中ではアデニンが一方の鎖、チミジンが他方に鎖に存在する。同様にして、一方の鎖にグアニンが見出されるときは他方の鎖にシトシンが見出される。２つのＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列間の相関が大きいほど、該２つのＤＮＡセグメントの鎖間のハイブリッド二重鎖形成能力が大きい。
【００２８】
２つのアミノ酸配列に関する“相似”という用語は、双方の配列に一連の等しい保存アミノ酸残基が存在することと定義する。２つのアミノ酸配列間の相似の程度が高いほど、２つの配列が高度に対応、相同または等価である。（２つのアミノ酸配列に関する“一致”という用語は、双方の配列に一連の全く同様のまたは不変のアミノ酸残基が存在することと定義する。）“相補”、“一致”および“相似”の定義は平均的な当業者に公知である。
【００２９】
“によってコードされた”という語句は、ポリペプチド配列またはその一部分が核酸配列によってコードされたポリペプチドの少なくとも３個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも８個のアミノ酸、いっそう好ましくは少なくとも１５個のアミノ酸を含むときのポリペプチド配列をコードしている核酸配列を表す。
【００３０】
本発明はまた、ブタ内因子をコードしており、上記のヌクレオチド配列（配列１、配列４および配列７参照）を含むかまたは相補的なヌクレオチド配列を有している核酸に中ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズ可能な単離ヌクレオチド配列を包含する。１つの核酸分子の一本鎖形態が他方の核酸分子に適当な温度およびイオン強度の条件下でアニールするとき、核酸分子は別の核酸分子に“ハイブリダイズ可能”である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）参照）。温度およびイオン強度の条件がハイブリダイゼーションの“ストリンジェンシー”を決定する。
【００３１】
本文中に使用した“ハイブリダイゼーション”という用語は一般的に、プローブ配列およびターゲット配列の種類次第で当業者に容易に明らかな適正ストリンジェンシー条件で行う核酸のハイブリダイゼーションを意味する。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は当業界で公知であり、所望のストリンジェンシー条件次第でインキュベーション時間、温度および／または溶液のイオン強度を変更することによって条件の調整を容易に行うことができる。例えば、参照によって本発明に含まれる上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９を参照するとよい。（また、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編、および、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ”（１９９３）も参照できる。双方の文献は参照によって本発明に含まれるものとする。）より詳細には、条件の選択は、ハイブリダイズする配列の長さ、特にプローブ配列の長さ、核酸の相対的ＧＣ含量、許容されるミスマッチの数によって指令される。低度に相補性の鎖間の部分的ハイブリダイゼーションが望まれる場合には低ストリンジェンシー条件が好ましい。完全なまたはほぼ完全な相補性が望まれるときは、高ストリンジェンシー条件が好ましい。典型的な高ストリンジェンシー条件では、ハイブリダイゼーション溶液が、６×Ｓ．Ｓ．Ｃ．、０．０１ＭのＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液および０．５％のＳＤＳを含有している。ハイブリダイゼーションは約６８℃でクローン化ＤＮＡのフラグメントの場合は約３−４時間、全真核細胞ＤＮＡの場合は約１２−約１６時間行う。中ストリンジェンシーでは３×塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、５０％ホルムアミド（このバッファの０．１Ｍ，ｐＨ７．５）および５×デンハルト溶液でフィルタープレハイブリダイズおよびハイブリダイズを行うとよい。この場合、３７℃で４時間プレハイブリダイズし、次いで３，０００，０００ｃｐｍに等しい量の標識プローブと共に３７℃で合計１６時間のハイブリダイゼーションを行い、次いで２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ溶液で洗浄する。室温で各１分の洗浄を４回、６０℃で各３０分の洗浄を４回行う。乾燥後にフィルムに露光する。低ストリンジェンシーの場合には、ハイブリダイゼーション温度を二重鎖の融解温度（Ｔｍ）よりも低温の約１２℃に下げる。ＴｍはＧＣ含量、二重鎖の鎖長および溶液のイオン強度の関数であることが知られている。
【００３２】
“ハイブリダイゼーション”には２つの核酸が相補的配列を含むことが必要である。しかしながら、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー次第では、塩基間のミスマッチが生じるであろう。上記で指摘したように、核酸のハイブリダイゼーションの適正なストリンジェンシーは核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。このような変数は当業界で公知である。より詳細には、２つの核酸配列間の相似または相同の程度が高いほどそれらの配列を有する核酸のハイブリッドのＴｍ値が高い。１００ヌクレオチドを上回る長さのハイブリッドについては、Ｔｍの計算式が得られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出参照）。より短い核酸のハイブリダイゼーションの場合、ミスマッチの位置はより重要であり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出参照）。
【００３３】
本文中に使用した“単離核酸フラグメントまたは配列”という語句は、合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を場合によっては含む一本鎖または二重鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを意味する。ＤＮＡポリマーの形態の単離核酸フラグメントは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つ以上のフラグメントから成り得る（特定したポリヌクレオチドに関する“フラグメント”という用語は、特定したヌクレオチド配列の１つの領域に一致的または相補的な少なくとも約６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド、いっそう好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約２５ヌクレオチドの連続配列を含むポリヌクレオチドを表す）。ヌクレオチド（通常は５’−モノホスフェート形態で見出される）は以下のような一文字記号によって表す：“Ａ”はアデニレートまたはデオキシアデニレート（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡの場合）、“Ｃ”はシチジレートまたはデオキシシチジレート、“Ｇ”はグアニレートまたはデオキシグアニレート、“Ｕ”はウリジレート、“Ｔ”はデオキシチミジレート、“Ｒ”はプリン（ＡまたはＧ）、“Ｙ”はピリミジン（ＣまたはＴ）、“Ｋ”はＧまたはＴ、“Ｈ”はＡまたはＣまたはＴ、“Ｉ”はイノシン、およひ、“Ｎ”は任意のヌクレオチド。
【００３４】
“機能的に等価であるフラグメントまたはサブフラグメント”または“機能的に等価のフラグメントまたはサブフラグメント”という語句は本文中で互換的に使用されている。これらの語句は、フラグメントまたはサブフラグメントが活性酵素をコードしているか否かにかかわりなく遺伝子発現を改変する能力またはある表現型を産生する能力を保持している単離核酸フラグメントの一部分またはサブ配列を表す。例えば、フラグメントまたはサブフラグメントは形質転換植物に所望の表現型を生じさせるキメラ構築物を設計するために使用できる。キメラ構築物は活性酵素をコードしているか否かにかかわりなく植物プロモーター配列に対して適正な配向で核酸フラグメントまたはそのサブフラグメントを連結することによって共抑制またはアンチセンスに使用するように設計できる。
【００３５】
“相同”、“相同的”、“実質的に相似の”および“実質的に対応する”という用語／語句は本文中で互換的に使用されている。これらは、１つ以上のヌクレオチド塩基の変化が遺伝子発現を介在するまたはある表現型を産生する核酸フラグメントの能力に影響を及ぼしていない核酸フラグメントを表す。これらの用語はまた、得られた核酸フラグメントの機能的特性を非修飾の初期フラグメントに比べて実質的に改変しない１つ以上のヌクレオチドの欠失または挿入のような本発明の核酸フラグメントの修飾を表す。従って、本発明が特定の例示配列よりも多くの配列を包含することは当業者に理解されよう。
【００３６】
“遺伝子”という用語は、コーディング配列に先行（５’非コーディング配列）および後続（３’非コーディング配列）する調節配列を含む特異的タンパク質を発現する核酸フラグメントを表す。
【００３７】
“天然型遺伝子”という語句は、天然にそれ自体の調節配列を伴って見出される遺伝子を表す。対照的に、“キメラ構築物”という語句は、組合せ形態では天然に普通に見出されない核酸フラグメントの組合せを表す。従ってキメラ構築物は、異なるソースに由来する調節配列とコーディング配列、または、同じソースに由来するが天然に普通に見出される編成とは異なる編成の調節配列とコーディング配列とを含む。（“単離”という用語は、配列が天然環境から切り離されたことを意味する）。
【００３８】
“外来遺伝子”という語句は、宿主微生物に普通に見出されないが遺伝子導入によって宿主生物に導入された遺伝子を表す。外来遺伝子は、非天然型生物またはキメラ構築物に挿入された天然型遺伝子を含み得る。“トランスジーン”という用語は、形質転換手順によってゲノムに導入された遺伝子を意味する。
【００３９】
“コーディング配列”という語句は、特異的アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を表す。“調節配列”という用語は、コーディング配列の上流（５’非コーディング配列）、内部、または下流（３’非コーディング配列）に局在し、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性または会合コーディング配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を表す。調節配列の非限定例は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロンおよびポリアデニル化認識配列である。
【００４０】
“プロモーター”という用語は、コーディング配列または機能的ＲＮＡの発現をコントロールできるＤＮＡ配列を表す。プロモーター配列は、近位およびより遠位の要素から成り、遠位の要素はしばしばエンハンサーと呼ばれる、従って、“エンハンサー”という用語は、プロモーター活性を刺激できるＤＮＡ配列を意味しており、プロモーターの先天的要素でもよくまたはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増進するために挿入された異種要素でもよい。プロモーター配列はまた、遺伝子の転写部分の内部および／または転写配列の下流に局在してもよい。プロモーターはそれらの完全体が天然型遺伝子に由来してもよく、または、天然に見出された種々のプロモーターに由来の種々の要素から構成されてもよく、または、合成ＤＮＡセグメントを含むものでもよい。異なる組織または細胞型の内部または異なる発達段階または異なる環境条件に応じて異なるプロモーターが遺伝子の発現を指令することは当業者に理解されよう。大抵の場合に大抵の宿主細胞型の内部で遺伝子を発現させるプロモーターは“構成的プロモーター”という通称で呼ばれている。また、大抵の場合、調節配列の正確な境界は完全に限定されてはいないので、多少は違っているＤＮＡフラグメントが等しいプロモーター活性を有し得ると認識されている。
【００４１】
“イントロン”という用語は、タンパク質配列の一部分をコードしていない遺伝子中の介在配列を意味する。従ってこのような配列はＲＮＡに転写されるがそれから切除され翻訳されない。この用語はまた、切除されたＲＮＡ配列を表すために使用される。“エキソン”という用語は、転写され、遺伝子由来の成熟メッセンジャーＲＮＡ中に見出されるが最終遺伝子産物をコードする配列の一部を必ずしも構成しない遺伝子配列の部分を意味する。
【００４２】
“翻訳リーダー配列”という語句は、遺伝子のプロモーター配列とコーディング配列との間に局在するＤＮＡ配列を表す。翻訳リーダー配列は翻訳開始配列の上流の完全にプロセシングされたｍＲＮＡ中に存在する。翻訳リーダー配列はｍＲＮＡの一次転写産物のプロセシング、ｍＲＮＡ安定性または翻訳効率を左右する。翻訳リーダー配列の例は文献に記載されている（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｒ．ａｎｄ  Ｆｏｓｔｅｒ，Ｇ．Ｄ．（１９９５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：２２５）。
【００４３】
“３’非コーディング配列”という語句は、コーディング配列の下流に局在し、ポリアデニル化認識配列、および、ｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現を左右できる調節シグナルをコードする他の配列を含むＤＮＡ配列を表す。ポリアデニル化シグナルの特徴は一般的にｍＲＮＡ前駆体の３’端へのポリアデニル酸トラクトの付加を左右することである。種々の３’非コーディング配列の使用がｌｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ：６７１−６８０（１９８９）に例示されている。
【００４４】
“ＲＮＡ転写産物”という語句は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写によって得られる産物を表す。ＲＮＡ転写産物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーであるとき、これは一次転写産物と呼ばれる。またはＲＮＡ転写産物は一次転写産物の転写後プロセシングに由来のＲＮＡ配列であり、これは成熟ＲＮＡと呼ばれる。“メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）”という語句は、イントロンがなく、細胞によってタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを表す。“ｃＤＮＡ”という用語は、ｍＲＮＡに相補的であり逆転写酵素を使用してｍＲＮＡ鋳型から合成されるＤＮＡを表す。ｃＤＮＡは一本鎖でもよく、または、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを使用して二重鎖形態に変換されてもよい。“センスＲＮＡ”という語句は、ｍＲＮＡを含んでおり細胞内部でまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでタンパク質に翻訳され得るＲＮＡ転写産物を表す。
【００４５】
“アンチセンスＲＮＡ”という語句は、ターゲット一次転写産物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的であり、ターゲット遺伝子の発現を阻止するＲＮＡ転写産物を表す（米国特許Ｎｏ．５，１０７，０６５）。アンチセンスＲＮＡは、特異的遺伝子転写産物のいずれかの部分、すなわち、５’非コーディング配列、３’非コーディング配列、イントロンまたはコーディング配列に相補的である。“機能的ＲＮＡ”という語句は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡまたは翻訳されないが細胞プロセスに効果をもつ他のＲＮＡを表す。ｍＲＮＡ転写産物に対する“相補鎖”という用語および“逆相補鎖”という語句は本文中で互換的に使用されており、メッセージのアンチセンスＲＮＡという定義を意味する。
【００４６】
“内在性ＲＮＡ”という語句は、天然産生であるかまたは天然非産生すなわち組換え手段、突然変異誘発などによって導入されたか否かにかかわりなく、本発明の組換え構築物によって形質転換する前の宿主のゲノムに存在する核酸配列によってコードされていたＲＮＡを表す。
【００４７】
“非天然産生”という語句は天然に普通に見出されるものと一致しない人工物を意味する。
【００４８】
“作動的に連結された”という語句は、一方の配列の機能が他方の配列によって調節されるように単一核酸フラグメントの複数の核酸配列が連結されていることを意味する。例えば、プロモーターがコーディング配列の発現を調節できるとき（すなわち、コーディング配列がプロモーターの転写コントロール下にあるとき）、プロモーターはコーディング配列に作動的に連結されている。コーディング配列はセンスまたはアンチセンスの配向で調節配列に作動的に連結され得る。別の例では、本発明の相補的ＲＮＡ領域は直接または間接にターゲットｍＲＮＡの５’、ターゲットｍＲＮＡの３’またはターゲットｍＲＮＡの内部に作動的に連結され得る。または、第一相補的領域が５’であり、その相補鎖がターゲットｍＲＮＡの３’である。“作動的に連結された”配列は、対象遺伝子に隣接の発現コントロール配列、および、対象遺伝子をコントロールするためにトランス位置または遠隔から作用する発現コントロール配列の双方を含む。本文中に使用した“発現コントロール配列”という語句は、それらに結合したコーディング配列の発現およびプロセシングを実行するために必要なポリヌクレオチド配列を表す。発現コントロール配列は、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルのような効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；適正な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；細胞質ｍＲＮＡを安定させる配列；翻訳効率を増進する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質安定性を強化する配列；および所望の場合にはタンパク質分泌を増進する配列を含む。このようなコントロール配列の特性は宿主生物次第で違っている。原核細胞中ではこのようなコントロール配列は一般にプロモーター、リボソーム結合部位および転写終結配列を含む。真核細胞中ではこのようなコントロール配列は一般にプロモーターおよび転写終結配列を含む。“コントロール配列”という語句は、その存在が発現およびプロセシングに必須である成分を意味しており、また、その存在が有利である追加成分、例えばリーダー配列や融合パートナー配列も含む。
【００４９】
本文中に使用した“発現”という用語は、機能的目的産物の産生を意味する。遺伝子の発現は、遺伝子の転写およびｍＲＮＡから前駆または成熟タンパク質への翻訳を含む。“アンチセンス阻害”はターゲットタンパク質の発現を抑制できるアンチセンスＲＮＡ転写産物の産生を意味する。“共抑制”という用語は、同一または実質的に相似の外来または内在性遺伝子の発現を抑制できるセンスＲＮＡ転写産物の産生を意味する（米国特許Ｎｏ．５，２３１，０２０）。
【００５０】
“成熟タンパク質”という語句は、翻訳後プロセシングされたポリペプチド、すなわち、一次転写産物中に存在するプレ−またはプロ−ペプチドが完全に除去されたポリペプチドを表す。“前駆”タンパク質という用語は、ｍＲＮＡの一次翻訳産物、すなわち、プレ−およびプロ−ペプチドがまだ存在しているものを表す。プレ−およびプロ−ペプチドの非限定例は細胞内局在化シグナルである。
【００５１】
本文中に示した“形質転換”という用語は、外因性ＤＮＡが宿主細胞に侵入するプロセスを意味する。形質転換は当業界で公知の様々な方法を使用して自然条件下または人工条件下で行うことができる。外来核酸配列を原核性または真核性の宿主細胞に挿入する公知方法のいずれかを形質転換に利用し得る。方法は、形質転換される宿主細胞に基づいて選択され、その非限定例は、ウイルス感染、電気穿孔、リポフェクション、粒子衝撃である。このような“形質転換”細胞は、挿入されたＤＮＡが自律複製プラスミドまたは宿主染色体の一部として複製できる安定に形質転換された細胞を含意する。また、挿入されたＤＮＡまたはＲＮＡが限定された時間的期間だけ一過性に発現する細胞を含意する。
【００５２】
“安定形質転換”という語句は、核酸フラグメントが宿主生物のゲノムに移入し、遺伝子的に安定な遺伝となることを意味する。対照的に“一過性形質転換”という語句は、核酸フラグメントが宿主生物の核またはＤＮＡ含有オルガネラに移入し、組込みや安定な遺伝のない遺伝子発現を意味する。形質転換した核酸フラグメントを含有する宿主生物は“トランスジェニック”生物と呼ばれる。イネ、トウモロコシおよび他の単子葉類の好ましい細胞形質転換方法は、粒子加速または“遺伝子ガン”形質転換テクノロジーの使用（Ｋｌｅｉｎら，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０−７３；米国特許Ｎｏ．４，９４５，０５０）、または、トランスジーン含有の適当なプラスミドを使用するアグロバクテリウム媒介法（Ｉｓｈｉｄａ  Ｙ．ら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：７４５−７５０）の使用である。本文中に使用した“形質転換”という用語は、安定形質転換および一過性形質転換の双方を表す。
【００５３】
本発明に使用した標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当業界で公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９（本文中では以後“Ｓａｍｂｒｏｏｋ”と表す）
に詳細に記載されている。
【００５４】
“組換え”という用語は、普通なら離れていた２つの配列セグメントの人工的組合せを表し、例えば、化学合成によって、または、核酸の単離セグメントを遺伝子工学技術で操作することによって得られる。
【００５５】
“ＰＣＲ”という用語および“ポリメラーゼ連鎖反応”という語句は、特異的ＤＮＡセグメントの大量合成技術を表し、一連の反復サイクルから成る（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）。典型的には、二重鎖ＤＮＡを熱変性し、ターゲットセグメントの３’境界に相補的な２つのプライマーを低温でアニーリングし、次いで中温で伸長させる。これらの３つの継続段階を１組として１サイクルと呼ぶ。
【００５６】
ポリメラーゼ連鎖反応（“ＰＣＲ”）は鋳型の反復的複製によって短時間でＤＮＡを何百万倍にも増幅するために使用される強力な技術である（Ｍｕｌｌｉｓら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３−２７３（１９８６）；Ｅｒｌｉｃｈら，欧州特許出願Ｎｏ．５０，４２４；欧州特許出願Ｎｏ．８４，７９６；欧州特許出願Ｎｏ．２５８，０１７；欧州特許出願Ｎｏ．２３７，３６２；Ｍｕｌｌｉｓ，欧州特許出願Ｎｏ．２０１，１８４；Ｍｕｌｌｉｓら，米国特許Ｎｏ．４，６８３，２０２；Ｅｒｌｉｃｈ，米国特許Ｎｏ．４，５８２，７８８；およびＳａｉｋｉら，米国特許Ｎｏ．４，６８３，１９４）。方法ではＤＮＡ合成をプライムするために特異的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成オリゴヌクレオチドセットを使用する。プライマーは解析が望まれるＤＮＡの配列に従って設計する。高温で鋳型を溶融しプライマーを鋳型内部の相補的配列にアニーリングし次いで鋳型をＤＮＡポリメラーゼで複製するサイクルを多数回（通常は２０−５０回）繰返すことによって方法を実行する。
【００５７】
ＰＣＲ反応産物をアガロースゲル分離次いで臭化エチジウム染色およびＵＶ透過照射による可視化によって分析する。あるいは、産物にラベルを組込むために放射性ｄＮＴＰをＰＣＲに加える。この場合、ＰＣＲ産物はゲルをｘ線フィルムに露光することによって可視化される。ＰＣＲ産物の放射性標識によって得られる追加の利点は個々の増幅産物のレベルを定量できることである。
【００５８】
“ＲＴ−ＰＣＲ”という用語は逆転写とＰＣＲとの組合せを意味する。逆転写は、ＲＮＡを出発材料として使用し逆転写酵素と呼ばれる酵素を用いてＤＮＡを作製するプロセスである。逆転写中に作製されるＤＮＡの第一鎖が以後のＰＣＲ反応の出発材料として使用される。
【００５９】
“組換え構築物”、“発現構築物”および“組換え発現構築物”という語句は本文中で互換的に使用されている。これらの語句は、当業者に公知の標準的方法論を使用して細胞のゲノムに挿入できる遺伝材料の機能的単位を表す。これらの構築物を単独で使用してもよくベクターと共に使用してもよい。ベクターを使用する場合、当業者に公知の宿主植物の形質転換に使用される方法に従ってベクターを選択する。例えばプラスミドベクターを使用できる。当業者は、本発明の単離核酸フラグメントのいずれかを含む宿主細胞の形質転換、選択および増殖を成功させるためにベクターに存在させるのが必要な遺伝要素を十分に知っている。当業者はまた、種々の独立した形質転換イベントが種々の発現レベルおよび発現パターンを生じること（Ｊｏｎｅｓら，（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２４１１−２４１８；Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａら，（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１８：７８−８６）、および、従って所望の発現レベルおよびパターンを示す系を得るために多数のイベントのスクリーニングが必要であることを認識している。このようなスクリーニングはＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のウェスタン分析、または、表現型分析によって行うことができる。
【００６０】
本文中に使用した“ポリペプチド”という用語は、アミノ酸の重合鎖を意味する。“ペプチド”および“タンパク質”という用語はポリペプチドという用語と互換的に使用されており、やはりアミノ酸の重合鎖を表す。“ポリペプチド”という用語は、天然型または人工のタンパク質、タンパク質フラグメントおよびタンパク質配列のポリペプチドアナローグを包含する。ポリペプチドは単量体でも重合体でもよい。
【００６１】
“単離タンパク質”および“単離ポリペプチド”という語句は、その起原または誘導ソースが原因で天然型状態でそれらに随伴している天然会合成分に会合していないタンパク質またはポリペプチド、同じ種に由来の他のタンパク質を実質的に含まないタンパク質またはポリペプチド、異なる種の細胞によって発現されているタンパク質またはポリペプチド、または、天然には生じないタンパク質またはポリペプチドを意味する。従って、化学合成された、または、天然の起原細胞とは異なる細胞系で合成されたポリペプチドは、天然会合成分から“単離”されているであろう。また、当業界で公知のタンパク質精製技術を使用し、単離によってタンパク質を実質的に天然会合成分非含有にすることもできる。
【００６２】
抗体、タンパク質またはペプチドと第二の化学種との相互作用に関して本文中で使用した“特異的結合”および“特異的に結合する”という語句は、相互作用が化学種の特定構造（例えば、抗原性決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味する。例えば、抗体はタンパク質一般でなく特定のタンパク質構造を認識して結合する。抗体がエピトープ“Ａ”に特異的であるならば、標識“Ａ”と抗体とを含有する反応物中のエピトープＡ（または遊離、非標識Ａ）を含有する分子の存在は、標識Ａの抗体結合量を減少させるであろう。
【００６３】
本文中に使用した“抗体”という用語は広義には、４つのポリペプチド鎖すなわち２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖から成る免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、または、Ｉｇ分子の必須エピトープ結合構造を保持しているその機能的フラグメント、突然変異体、変異体または誘導体のいずれかを意味する。このような突然変異体、変異体または誘導体の抗体フォーマットは当業界で公知であり、それらの非限定実施態様を以下に述べる。
【００６４】
全長抗体中でＨ鎖のおのおのはＨ鎖可変領域（本文中では以後ＨＣＶＲまたはＶＨと略記）とＨ鎖定常領域とから成る。Ｈ鎖定常領域は３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から成る。Ｌ鎖のおのおのはＬ鎖可変領域（本文中では以後ＬＣＶＲまたはＬＨと略記）とＬ鎖定常領域とから成る。Ｌ鎖定常領域は１つのドメインＣＬから成る。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに相補性決定部位（ＣＤＲ）と命名された超可変性領域と該領域間に散在する枠組み構造領域（ＦＲ）と命名されたより保存性の領域とから成る。ＶＨおよびＶＬのおのおのは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序で配列された３つのＣＤＲと４つのＦＲとから成る：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【００６５】
本文中で使用した抗体の“抗原結合部分”（または簡単に“抗体部分”）という語句は、抗原（例えばｈＩＬ−１８）に特異的に結合する能力を保持している抗体の１つ以上のフラグメントを表す。全長抗体のフラグメントが抗体の抗原結合機能を実行できることが判明した。このような抗体の実施態様にはまた、２つ以上の異なる抗原に特異的に結合する双特異性、二重特異性または多重特異性のフォーマットも存在するであろう。抗体の“抗原結合部分”という語句に包含される結合性フラグメントの実例は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、すなわち、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから成る一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、すなわち、ヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖフラグメント；（ｖ）単一可変ドメインを含むｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；および、（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、組換え方法を使用し、合成リンカーによってこれらを結合させると、ＶＬ領域とＶＨ領域とが対合して一価の分子を形成する単一タンパク質鎖を作製できる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えばＢｉｒｄら，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎら，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３参照）。このような単鎖抗体も抗体の“抗原結合部分”という語句に含意される。ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）のような単鎖抗体の別の形態も包含される。ジアボディはＶＨおよびＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖に発現される二価の二重特異性抗体であるが、同一鎖の２つのドメインが対合するには短すぎるリンカーを使用しこれによって当該ドメインを別の鎖の相補的ドメインに強制的に対合させ２つの抗原結合部位を創出している（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら，（１９９３）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ  Ｒ．Ｊ．ら，（１９９４）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３参照）。このような抗体結合部分は当業界で公知である（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ編、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００１）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．７９０  ｐｐ．（ＩＳＢＮ３−５４０−４１３５４−５参照）。
【００６６】
さらにまた、抗体またはその抗原結合部分は、抗体または抗体部分と１つ以上の別のタンパク質またはペプチドとの共有結合的または非共有結合的会合によって形成されたより大きい免疫付着分子の一部であってもよい。このような免疫付着分子の実例は、テトラマーｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．ら，（１９９５）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：９３−１０１）、および、二価のビオチニル化ｓｃＦｖ分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ−末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．ら，（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７−１０５８）を含む。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのような抗体部分は、完全抗体のパパイン消化またはペプシン消化のような慣用の技術を使用して完全抗体から作製できる。さらに、抗体、抗体部分、免疫付着分子は本文中に記載したような標準的組換えＤＮＡ技術を使用して得ることができる。
【００６７】
本文中に使用した“単離抗体”という語句は、異なる抗原特異性を有している他の抗体を実質的に含まない抗体を意味する（例えば、ｈＩＬ−１８に特異的に結合する単離抗体はｈＩＬ−１８以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ｈＩＬ−１８に特異的に結合する単離抗体は他の種のＩＬ−１８のような他の抗原に交差反応性を有し得る。なお、単離抗体は他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まない。
【００６８】
本文中に使用した“モノクローナル抗体”は、共通のＨ鎖および共通のＬ鎖を共有する抗体分子の調製物を意味する。対照的に“ポリクローナル”抗体調製物は種々の抗体の混合物を含有している。モノクローナル抗体は、ファージ、細菌、酵母またはリボソームディスプレイのようないくつかの新規なテクノロジーでも作成でき、また、ハイブリドーマ由来抗体（例えば、ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）のように、ハイブリドーマテクノロジーによって作製されたハイブリドーマによって分泌される抗体）を代表例とする従来方法によっても作製できる．従って、本発明の非ハイブリドーマ由来抗体も、従来方法で作製されてはいないがモノクローナル抗体と呼ぶ。
【００６９】
“組換え抗体”という語句は、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体、組換え組合せ抗体ライブラリイから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子にトランスジェニックな動物（例えばマウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：６２８７−６２９５参照）のような、組換え手段によって作製、発現、創出または単離された抗体、または、他のＤＮＡ配列への特定免疫グロブリン遺伝子配列（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列）のスプライシングを含む他の何らかの手段によって作製、発現、創出または単離された抗体を表す。組換え抗体の実例はキメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体およびヒト化抗体を含む。
【００７０】
本文中に使用した“ヒト抗体”という語句は、ヒト胚芽細胞系列免疫グロブリン配列に由来の可変および定常領域を有している抗体を意味する。本発明のヒト抗体はヒト胚芽細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基を例えばＣＤＲ特にＣＤＲ３に含み得る（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏランダムもしくは部位特異的突然変異誘発またはｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞突然変異によって導入された突然変異）。しかしながら、本文中に使用した“ヒト抗体”という用語は、マウスのような他の哺乳動物種の胚芽細胞系列に由来のＣＤＲ配列がヒト枠組み構造配列に移植された抗体を含意しない。
【００７１】
本文中に使用した“組換えヒト抗体”という語句は、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体、組換え組合せヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｈ．Ｒ．，（１９９７）  ＴＩＢ  Ｔｅｃｈ．１５：６２−７０；Ａｚｚａｚｙ  Ｈ．ａｎｄ  Ｈｉｇｈｓｍｉｔｈ  Ｗ．Ｅ．（２００２）Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：４２５−４４５；Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ  Ｊ．Ｖ．ａｎｄ  Ｌａｒｒｉｃｋ  Ｊ．Ｗ．（２００２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９：１２８−１４５；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｈ．ａｎｄ  Ｃｈａｍｅｓ  Ｐ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１−３７８）、ヒト免疫グロブリン遺伝子にトランスジェニックな動物（例えばマウス）から単離された抗体（例えばＴａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ら，（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ  Ｓ−Ａａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｌ．Ｌ．（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５９３−５９７；Ｌｉｔｔｌｅ  Ｍ．ら，（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ２１：３６４−３７０参照）のような組換え手段によって作製、発現、創生または単離されたすべての抗体、または、他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む他の何らかの手段によって作製、発現、創生または単離された抗体を含意する。このような組換えヒト抗体はヒト胚芽細胞系列免疫グロブリン配列に由来の可変および定常領域を有している。しかしながらいくつかの実施態様では、このような組換えヒト抗体がｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列にトランスジェニックな動物を使用するときは、ｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞突然変異誘発）で処理されてもよく、従って、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列はヒト胚芽細胞系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来しこれらの配列に近縁ではあるがｉｎ  ｖｉｖｏのヒト抗体胚芽細胞系列の目録に天然には存在しない配列である。
【００７２】
“キメラ抗体”という語句は、ヒト定常領域に連結されたネズミのＨ鎖およびＬ鎖の可変領域を有する抗体のような、１つの種のＨ鎖およびＬ鎖の可変領域と他の種の定常領域とを含む抗体を意味する。
【００７３】
“ＣＤＲ移植抗体”という語句は、１つの種に由来のＨ鎖およびＬ鎖の可変領域配列を含むがＶＨおよび／またはＶＬの１つ以上のＣＤＲ領域の配列が別の種のＣＤＲ配列によって置換されている抗体、例えば、ネズミのＨ鎖およびＬ鎖の可変領域を有するが１つ以上のネズミＣＤＲ（例えばＣＤＲ３）がヒトＣＤＲ配列によって置換されている抗体を表す。
【００７４】
“ヒト化抗体”という語句は、ヒト以外の種（例えばマウス）に由来のＨ鎖およびＬ鎖の可変領域配列を含むが、ＶＨおよび／またはＶＬ配列の少なくとも一部分がより“ヒトらしく”なるように、すなわち、ヒト胚芽細胞系列可変配列にいっそう近似するように改変されている抗体を意味する。ヒト化抗体の１つのタイプは、ヒトＣＤＲ配列をヒト以外のＶＨおよびＶＬ配列に導入し、対応するヒト以外のＣＤＲ配列に置換させたＣＤＲ移植抗体である。
【００７５】
“エピトープ”という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合できるポリペプチド決定基を含む。いくつかの実施態様ではエピトープ決定基がアミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニルのような分子の化学的活性表面基を含み、いくつかの実施態様では特異的三次元構造的特性および／または特異的電荷特性を有し得る。エピトープは抗体によって結合される抗原の領域である。いくつかの実施態様では、抗体がタンパク質および／または巨大分子の複合混合物中のターゲット抗原を優先的に認識するときに抗体が抗原に特異的に結合すると言われる。
【００７６】
本文中に使用した“結晶化結合タンパク質”という用語は、結晶の形態で存在するポリペプチドを表す。結晶は物質の固体状態の一形態であり、アモルファス固体状態または液晶状態のような他の形態から識別される。結晶は、原子、イオン、分子（例えば、抗体のようなタンパク質）または分子集合体（例えば、抗原／抗体複合体）の規則的な繰返し三次元アレイから構成されている。これらの三次元アレイは当該分野で十分に理解された特異的数学的関係に従って編成されている。結晶内部で繰返されている基本単位または構成単位を非対称単位と呼ぶ。所与の明確な結晶学的対称性に合致する編成の非対称単位の繰返しが結晶の“単位格子”を形成する。３つの次元全部で生じた規則的転位による単位格子の繰返しが結晶を形成する。Ｇｉｅｇｅ，Ｒ．ａｎｄ  Ｄｕｃｒｕｉｘ，Ａ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，２ｎｄ  ｅａ．，ｐｐ．２０  １−１６，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９９）参照。
【００７７】
本文中に使用した“ポリヌクレオチド”という用語は２つ以上のヌクレオチドの重合形態を意味しており、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドまたは双方の修飾形態を含む。この用語は一本鎖および二重鎖形態のＤＮＡを含むが二重鎖ＤＮＡが好ましい。
【００７８】
本文中に使用した“単離ポリヌクレオチド”という語句は、その起原によって天然に見出される“単離ポリヌクレオチド”に会合しているポリヌクレオチドの全部またはその一部分に会合していないポリヌクレオチド、天然には連結していないポリヌクレオチドに作動的に連結されているポリヌクレオチド、または、より大きい配列の一部として天然に生じることはないポリヌクレオチド（例えば、ゲノムＤＮＡ、合成起原またはそれらの何らかの組合せのポリヌクレオチド）を意味する。
【００７９】
本文中に使用した“ベクター”という用語は、結合した別の核酸分子を運搬し得る核酸分子を意味する。ベクターの一種が“プラスミド”であり、この用語は付加的ＤＮＡセグメントを結合できる環状二重鎖ＤＮＡループを表す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ここでは付加的ＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに結合されている。ある種のベクターはそれらが導入された宿主細胞中で自律複製できる（例えば、細菌性複製起点をもつ細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組込まれ宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクターは作動的に連結されたゲノムの発現を指令することができる。本文中ではこれらのベクターを“組換え発現ベクター”（または単に“発現ベクター”）と呼ぶ。一般的に組換えＤＮＡ技術に有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形態である。プラスミドは最頻用のベクター形態なので本明細書では“プラスミド”および“ベクター”という用語を互換的に使用する。しかしながら本発明は、等価の機能に役立つウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような他の形態の発現ベクターも含む。
【００８０】
本文中に使用した“組換え宿主細胞”（または単に“宿主細胞”）という語句は、外因性ＤＮＡが導入された細胞を意味する。この語句が特定の対象細胞だけでなくこのような細胞の後代をも含意することを理解されたい。継続する世代には突然変異または環境的影響によっていくつかの修飾が生じ得るので、このような後代は実際には親細胞に一致しないこともあろうがやはり本文中に使用した“宿主細胞”という語句の範囲に包含される。好ましくは宿主細胞が生命界のいずれかから選択された原核細胞および真核細胞を含む。好ましい真核細胞は原生生物、真菌類、植物および動物の細胞を含む。最も好ましくは真核細胞の非限定例が原核細胞系Ｅ．Ｃｏｌｉ；哺乳類細胞系ＣＨＯおよびＣＯＳ；昆虫細胞系Ｓｆ９；および真菌類細胞系Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
【００８１】
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養および形質転換には標準技術を使用し得る（例えば、電気穿孔、リポフェクション）。酵素反応および精製技術は製造業者の指示通りにまたは当業界で常用の手順でまたは本文中に記載の手順で行うとよい。上記の技術および手順は該して、当業界で公知であり本明細書で引用および検討した種々の概説的およびより特殊的な参考文献に記載された慣用の方法に従って行うことができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照するとよい。該文献は参照によって本発明に含まれるものとする。
【００８２】
“プライマー”という用語は、対象ＤＮＡ配列に結合し対象ＤＮＡから核酸を合成するための出発点として作用するオリゴヌクレオチドまたは短い一本鎖核酸分子を意味する。
【００８３】
本文中に使用した“サンプル”という用語は、最も広義に使用されている。本文中に使用した“生物サンプル”という用語は非限定的に、生命体または生命体であったものに由来する何らかの量の物質を含む。このような生命体の非限定例は、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ウサギおよびその他の動物である。このような物質の非限定例は、血液、血清、尿、滑液、細胞、器官、組織、骨髄、リンパ節および脾臓である。
【００８４】
本発明は、ブタ内因子タンパク質、ブタ内因子をコードする核酸分子、ブタ内因子に感作された抗体、および、ブタ内因子を調節する阻害性化合物に関する。本発明はまた、ブタ内因子タンパク質、ブタ内因子の核酸分子およびブタ内因子に対する抗体とこのような抗体の部分を同定し取得する方法を提供する。本発明はまた診断アッセイにおけるこのタンパク質の有用性を証明する。
【００８５】
本発明のブタ内因子の産生方法は以下の段階を含む：
（ａ）ブタ胃組織から全ＲＮＡを単離する；
（ｂ）ブタ内因子をコードしているｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲによってクローニングする；
（ｃ）ブタ内因子ｃＤＮＡを発現ベクターに挿入する；
（ｄ）組換え内因子タンパク質を、宿主細胞系中、タンパク質の発現に適した期間および条件下で発現させる；
（ｅ）内因子タンパク質を精製する。
【００８６】
本発明はまた、内因子のビタミンＢ１２結合活性の確認を含む。本発明はさらに、全自動イムノアッセイ分析装置における組換え内因子の使用適性試験を含む。
【００８７】
本発明の組換えブタ内因子は生物サンプル中のビタミンＢ１２レベルを検出する診断アッセイに使用できる。
【００８８】
ビタミンＢ１２診断アッセイは、すべてＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓから市販されている “ＩＭｘ”、“ＡｘＳＹＭ”および“ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ”などの商標をもつ診断用分析装置の基本メニューの一部である。アッセイの所期用途は、ヒトの血清および血漿中のビタミンＢ１２の定量的測定である。“ＩＭｘ”および“ＡｘＳＹＭ”分析装置のビタミンＢ１２アッセイは、微粒子エンザイムイムノアッセイ（ＭＥＩＡ）テクノロジーに基づく。“ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ”分析装置のビタミンＢ１２アッセイは化学発光性微粒子イムノアッセイ（ＣＭＩＡ）である。
【００８９】
内因子は胃で産生される。内因子は近位小腸でビタミンＢ１２に結合しこれによってビタミンＢ１２との複合体を形成する。この完全複合体が小腸内を移動して遠位回腸に到達する。ここで回腸吸収細胞（小腸上皮細胞）の内腔表面に局在する内因子特異的な高親和性受容体に結合する。内因子−ビタミンＢ１２複合体はこれらの表面受容体に速やかに結合し、これらの細胞に侵入し、最後に門脈循環に到達する。従って内因子は腸内のビタミンＢ１２の輸送および吸収を助ける。内因子のビタミンＢ１２特異的結合能力がＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓで開発された診断アッセイの根拠になっている。生物サンプル中のビタミンＢ１２のレベルは、内因子コート粒子に結合したビタミンＢ１２の量から決定できる。
【００９０】
ブタ内因子とヒト内因子とのヌクレオチド配列一致パーセントは８３％である（図４および５参照）。ブタ内因子とマウス内因子とのヌクレオチド配列一致パーセントは７９％である（図４および５参照）。ブタ内因子とラット内因子とのヌクレオチド配列一致パーセントは７９％である（図４および５参照）。ブタ内因子とヒト内因子とのアミノ配列一致パーセントは８１％である（図６および７参照）。ブタ内因子とマウス内因子とのアミノ配列一致パーセントは７３％である（図６および７参照）。ブタ内因子とラット内因子とのアミノ配列一致パーセントは７２％である（図６および７参照）。
【００９１】
組換えブタ内因子の産生
ブタ内因子をコードしている遺伝子を単離した後、ベクター構築物を使用して原核性または真核性宿主細胞に導入し得る。ベクター例えばバクテリオファージ、コスミドまたはプラスミドは、ブタ内因子をコードしているヌクレオチド配列と、宿主細胞中で機能的でありヌクレオチド配列によってコードされたブタ内因子の発現を誘導できる調節配列（例えば、プロモーター）とを含み得る。調節配列（例えば、プロモーター）はヌクレオチド配列に作動的に会合しているかまたは作動的に連結されている。（プロモーターがコーディング配列の転写または発現を左右するとき、プロモーターがコーディング配列に“作動的に連結された”と言う）。適当なプロモーターは例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、酸ホスファターゼ、Ｔ７、ＴＰＩ、ラクターゼ、メタロチオネイン、サイトメガロウイルス前初期遺伝子、乳清酸性タンパク質、グルコアミラーゼをコードする遺伝子に由来のプロモーター、および、ガラクトースの存在下で活性化されるプロモーター例えばＧＡＬ１およびＧＡＬ１０である。ベクターはさらに、他のタンパク質、オリゴ糖、脂質などをコードしているヌクレオチド配列や、ポリアデニル化シグナル（例えばＳＶ−４０Ｔ−抗原、オボアルブミンまたはウシ成長ホルモンのポリ−Ａシグナル）のような他の調節配列も含み得る。構築物中に存在する配列の選択は所望の発現産物や宿主細胞の性質に従う。
【００９２】
上述したように、ベクターを構築し、次いで、例えばトランスフェクション、形質転換および電気穿孔のような平均的な当業者に公知の方法によって好適な宿主細胞にベクターを導入する（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２版，Ｖｏｌ．１−３，Ｓａｍｂｒｏｏｋら編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）参照）。次に、所望のブタ内因子の産生に導く遺伝子の発現に適した条件下で宿主細胞を培養し、次いでブタ内因子を回収し精製する。
【００９３】
適当な原核性宿主細胞の例は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＣｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ例えばＳｐｉｒｕｌｉｎａ  ｓｐｐ．（すなわち、藍藻類）のような細菌である。適当な真核性宿主細胞の例は、哺乳類細胞、植物細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙ、Ｙａｒｒｏｗｉａ（Ｃａｎｄｉｄａ）ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのようなＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．またはＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐｐ．種のような酵母細胞、あるいは、糸状菌細胞ような真菌細胞例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、ＮｅｕｒｏｓｐｏｒａおよびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍである。好ましくは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（パン酵母）細胞を使用する。
【００９４】
宿主細胞中の発現は一過性発現または安定発現として得られる。一過性発現は、宿主細胞中で機能的な発現シグナルを含有しているが宿主細胞中で複製せず宿主細胞にめったに組込まれない構築物が導入されたとき、または、宿主細胞が増殖性でないときに生じる。一過性発現はまた、対象遺伝子に作動的に連結された調節プロモーターの活性が誘導されるがこのような誘導系がたいていは低い基底発現レベルを示すときに生じる。安定発現は宿主ゲノムに組込まれるかまたは宿主細胞中で自律複製する構築物の導入によって得られる。発現構築物に局在するかまたはトランスフェクトした選択可能マーカーを使用し、次いでマーカーを発現している細胞を選択することによって対象遺伝子の安定発現を選択できる。安定発現を組込みによって生じさせる場合には、構築物の組込み部位が宿主ゲノム内部でランダムに生じてもよく、または、宿主遺伝子座とのターゲット組換えを行うために十分な宿主ゲノムとの相同領域を有している構築物の使用によってターゲットさせてもよい。構築物を内在性遺伝子座にターゲットさせるとき、転写および翻訳の調節領域の全部または一部が内在遺伝子座によって提供されてもよい。
【００９５】
本発明の抗体を調製するためには、抗体の産生を誘導できる抗原（すなわち、ブタ内因子またはそのフラグメント）に対して抗体を感作させる。本発明は抗原に対して感作された１つ以上の単離抗体および抗体部分またはそのフラグメントを含む。さらに、本発明の抗体はモノクローナルおよび組換え抗体、それらの部分またはフラグメントを含む。様々な実施態様で、抗体またはその部分は、完全ヒト抗体または完全マウス抗体またはそれらの部分のような全体的に単一種に由来するアミノ酸配列を含み得る。別の実施態様で、抗体またはその部分は、キメラ抗体またはＣＤＲ移植抗体（ＣＤＲ、相補性決定領域）または他の形態のヒト化抗体であろう。
【００９６】
ＲＴ−ＰＣＲを使用して核酸分子を得る初期の試みは成功しなかったので本発明の核酸分子の単離は予想外であった。多くの試験（すなわち、合計で１０回の試験）を経て、このような核酸分子の単離に有用な特異的プライマーが発見された。組換え内因子タンパク質を産生するために使用できるブタ内因子のｃＤＮＡ配列がいまや判明した。この組換えタンパク質は患者の生物サンプル（血液、血漿）中のビタミンＢ１２のレベルを検出するために診断アッセイで使用できる。
【００９７】
以下の非限定実施例で本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例１】
【００９８】
ブタ内因子のクローニング
ブタの胃壁細胞にブタ内因子を産生させた。胃壁細胞は胃底領域に極めて集中しているので全ＲＮＡ単離のために胃底領域を使用した。“ＲＮＡ  Ｌａｔｅｒ”溶液（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓから購入）に保存した胃組織を“ＴＲＩｚｏｌ”試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから購入）でホモジナイズし、販売業者が薦めるプロトコルを使用して全ＲＮＡを単離した。ブタ胃から単離した全ＲＮＡを逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）反応の出発材料として使用した。ＲＴ−ＰＣＲのプライマーはヒト、マウスおよびラットの内因子間の既知の相同性に基づいて設計した。おのおのに異なる反応条件を用いた最初の６回のＲＴ−ＰＣＲ処理はブタ内因子ｃＤＮＡの産生に成功しなかった。追加のプライマー（すなわち、合計８プライマー）を作製し、７回目のＲＴ−ＰＣＲ処理の全ての可能な組合せに使用した。この７回目のＲＴ−ＰＣＲ処理では本文中で以後Ｐｏｒｃｉｎｅ  ＩＦ  ｃＤＮＡ２００−１２５４（長さ１０５４ｂｐ、配列１、逆相補鎖は配列２、そのアミノ酸配列は配列３）と呼ぶブタ内因子ｃＤＮＡフラグメントが順方向プライマーｈｕＩＦ２００Ｆｏｒ（配列１０）および逆方向プライマーｈｕＩＦ  Ｒｅｖｅｒｓｅ１（配列１１）を用いて得られた。ＲＴ−ＰＣＲプロフィルは以下のようにした。ＲＴ段階は温度４２℃で２５分間行った。この段階に続いて行ったＰＣＲ段階は、温度９４℃で３０秒間の初期変性段階を１回、次いで温度９４℃で３０秒、温度５７℃で３０秒、温度７２℃で１分という条件を４０サイクル、次いで温度７２℃で５分間の最終伸長段階を含んでいた。全長ブタ内因子ｃＤＮＡを得るために、追加プライマー（すなわち、合計９プライマー）を作製し、ＲＴ−ＰＣＲ処理を行った。おのおのに異なる反応条件を使用した最初の４回のＲＴ−ＰＣＲ処理はブタ内因子ｃＤＮＡの産生に成功しなかった。５回目のＲＴ−ＰＣＲ処理では本文中で以後Ｐｏｒｃｉｎｅ  ＩＦ  ｃＤＮＡ１４−１２４８と呼ぶブタ内因子ｃＤＮＡフラグメント（長さ１２３４ｂｐ）が順方向プライマーｈｕＩＦ−Ｆｏｒ１４（配列１２）および逆方向プライマーｈｕＩＦ  １２４８Ｒｅｖ（配列１３）を用いて得られた。ＲＴ−ＰＣＲプロフィルは以下のようにした。ＲＴ段階は温度４２℃で４０分間行った。この段階に続いて行ったＰＣＲ段階は、温度９９℃で４分間の初期変性段階を１回、次いで温度９５℃で３０秒、温度６１℃で３０秒、温度７２℃で１分という条件を４３サイクル、次いで温度７２℃で０．５分間の最終伸長段階を含んでいた。本文中でＰｏｒｃｉｎｅ  ＩＦ  ｃＤＮＡ１４−１２４８（配列４、その逆相補鎖は配列５、そのアミノ酸配列は配列６）と呼ぶこのｃＤＮＡフラグメント（長さ１２３４ｂｐ）をＴＡクローニングベクター（ｐＣＲ２．１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから購入）にクローニングし、“Ｔｏｐ１０”大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を形質転換させると、Ｐｏｒｃｉｎｅ  ＩＦ  ｃＤＮＡ１４−１２４８（配列５）が産生した。
【００９９】
Ｐｏｒｃｉｎｅ  ＩＦ  ｃＤＮＡ１４−１２４８（配列５）を鋳型として使用し、本文中でＰｏｒｃｉｎｅ  ＩＦ  ｃＤＮＡ５４−１２５４−Ｍａｔｕｒｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅと呼ぶブタ内因子成熟ペプチドをコードするｃＤＮＡ配列を作製した。Ｐｏｒｃｉｎｅ  ＩＦ  ｃＤＮＡ５４−１２５４−Ｍａｔｕｒｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ（長さ１２００ｂｐ）のコーディング鎖のヌクレオチド配列は配列７によって表され、その逆相補鎖は配列８によって表される。配列７の読取り枠の翻訳は、ブタ内因子成熟ペプチドが３９９アミノ酸を含むことを示唆しており、このアミノ酸配列は配列９によって表される。コードされた成熟ペプチドは予想分子量〜４４ｋＤａを有している。
【０１００】
Ｐｏｒｃｉｎｅ  ＩＦ  ｃＤＮＡ１４−１２４８（配列５）を鋳型とし、順方向プライマーｐＩＦＭＰ−Ｆｏｒ１（配列１４）と逆方向プライマーｐＩＦＭＰ−ＲｅｖＸｈｏ１（配列１５）とを使用して、Ｐｏｒｃｉｎｅ  ＩＦ  ｃＤＮＡ５４−１２５４−Ｍａｔｕｒｅ  ＰｅｐｔｉｄｅをコードしているＤＮＡをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲプロフィルは以下のようにした。温度９５℃で５分間の初期変性段階を１回、次いで温度９５℃で３０秒、温度５７℃で３０秒、温度７２℃で１分という条件を３３サイクル、次いで温度７２℃で５分間の最終伸長段階。このＰＣＲフラグメントをｐＧＥＭＥＸ−１発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎから購入）にサブクローニングした。発現されたタンパク質は不溶性で封入体を形成した。
【０１０１】
このタンパク質の可溶性形態を産生するために、Ｐｏｒｃｉｎｅ  ＩＦ  ｃＤＮＡ１４−１２４８（配列５）を鋳型とし、順方向プライマーｐＩＦ−ＰＩＣ−ＭＰ−Ｆｏｒ  ＥｃｏＲ１（配列１６）と逆方向プライマーｐＩＦ−ＭＰ−ｐＭＡＬ−Ｓａｌ１（配列１７）とを使用してＰｏｒｃｉｎｅ  ＩＦ  ｃＤＮＡ５４−１２５４−Ｍａｔｕｒｅ  ＰｅｐｔｉｄｅをコードしているｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ条件は以下のようにした。温度９５℃で５分間の初期変性段階を１回、次いで温度９５℃で３０秒、温度５６℃で３０秒、温度７２℃で１分という条件を３５サイクル、次いで温度７２℃で５分間の最終伸長段階。得られたＰＣＲをｐＭＡＬ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから購入）に導入してプラスミドｐＭＡＬ−ＩＦを作製した。このプラスミド（ｐＭＡＬ−ＩＦ）はマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ；分子量〜４３ｋＤａ）との融合タンパク質としてブタ内因子を産生する。ｐＭＡＬ−ＩＦ融合タンパク質の予想分子量は〜８７ｋＤａである。ＭＢＰ成分はブタ内因子タンパク質を部分可溶性にする。
【０１０２】
タンパク質の可溶性をさらに向上させ適切なタンパク質折り畳みを増進するために、Ｐｏｒｃｉｎｅ  ＩＦ  ｃＤＮＡ５４−１２５４−Ｍａｔｕｒｅ  ＰｅｐｔｉｄｅをコードしているｃＤＮＡインサートを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを用いてｐＭＡＬ−ＩＦから切出し、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化したｐＥＴ３２ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎから購入）に挿入した。このベクターはチオレドキシンタンパク質（ＴｒＸ；分子量〜１８ｋＤａ）との融合タンパク質としてブタ内因子を産生する。ｐＥＴ３２ａ−ＩＦ融合タンパク質の予想分子量は〜６２ｋＤａである。ＴｒＸ成分はブタ内因子タンパク質を部分可溶性にする。
【実施例２】
【０１０３】
大腸菌中の組換えブタ内因子の発現
ＩＰＴＧ（イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を使用するＴ７プロモーターの誘導によりｐＭＡＬ−ＩＦベクターおよびｐＥＴ３２ａ−ＩＦベクターからタンパク質を発現させることによって組換えブタ内因子を大腸菌中で産生した。１つの場合には誘導３時間後に細胞を採取し、もう１つの場合には誘導４時間後に細胞を採取した。採取した大腸菌細胞を溶解し、細胞溶解液を遠心によって清澄化した。清澄化した溶菌液を抗−内因子抗体アフィニティカラムに充填した。組換え内因子はアフィニティカラムに結合した。カラムをリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）バッファで洗浄して未結合タンパク質を完全に除去した。カラムに結合した内因子をグリシンバッファで溶出した。図１を参照すると、レーン１は分子量マーカーを含む（キロドルトンで記録）。レーン２および４は誘導０時間後に採取したサンプルを含む（０ＨＰＩ）。レーン３および５は４ＨＰＩおよび３ＨＰＩに採取したサンプルを含む。レーン６は細胞ペースト（濃縮および遠心後の細胞）を示す。レーン８は天然型ブタ内因子（ブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）腸から精製）を含む。
【実施例３】
【０１０４】
ブタ内因子の結合活性の証明
Ａ．コンジュゲートブロット中のビタミンＢ１２への結合
組換えブタ内因子がビタミンＢ１２に結合することはビタミンＢ１２−アルカリホスファターゼコンジュゲートブロットを使用して証明された。発現した組換えブタ内因子を含有する大腸菌溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）で処理し、ゲルをニトロセルロースにブロットした。このブロットをビタミンＢ１２−アルカリホスファターゼコンジュゲートでプローブし、適当な基質を使用して発色させた。組換え内因子タンパク質バンドは発色し、これによって内因子がビタミンＢ１２に結合したことを証明した。図２を参照すると、レーン１は分子量マーカーを含む（キロドルトンで記録）。レーン２、３、４および５は組換えブタ内因子を発現している種々のクローンに由来の細胞を表す。レーン６は天然型ブタ内因子（ブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）腸から精製）を含む。組換え内因子タンパク質バンドは発色し、これによって内因子がビタミンＢ１２に結合したことを証明した。
【０１０５】
Ｂ．ウェスタンブロットにおける抗−内因子抗体への結合
組換えブタ内因子の抗−内因子抗体への結合はウェスタンブロット法を使用して証明された。発現した組換えブタ内因子を含有する大腸菌溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）で処理し、ゲルをニトロセルロースにブロットした。このブロットを抗−内因子抗体でプローブし、適当な基質を使用して発色させた。組換え内因子タンパク質バンドは発色し、これによって組換え内因子が抗体によって認識されたことを証明した。図３を参照すると、レーン１は分子量マーカーを含む（キロドルトンで記録）。レーン２、３、４および５は組換えブタ内因子を発現している種々のクローンに由来の細胞を表す。レーン６は天然型ブタ内因子（ブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）腸から精製）を含む。組換え内因子タンパク質バンドは発色し、これによって組換え内因子が抗体によって認識されたことを証明した。
【０１０６】
Ｃ．“ＡｘＳＹＭ”および“ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ”ビタミンＢ１２診断アッセイにおける組換えブタ内因子の使用適性
組換えブタ内因子のビタミンＢ１２結合容量は“ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ”内因子結合容量アッセイを使用して測定した。このアッセイは被験サンプルの内因子と微粒子にコートした内因子とをビタミンＢ１２−アクリジニウムトレーサーに対して競合させる１段階競合アッセイである。従って、アッセイシグナルは被験サンプル中の内因子の濃度に反比例する。ビタミンＢ１２校正曲線から結果を読取り、等式を使用してビタミンＢ１２濃度の結果を結合容量に変換する。組換えブタ内因子の結合容量値は９４０ｎｇ／ｍｌと定量された。
【実施例４】
【０１０７】
“ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ” Ｂ１２アッセイは、変更自在なアッセイプロトコルをもつ化学発光性微粒子イムノアッセイ（ＣＭＩＡ）テクノロジーを使用してヒトの血清および血漿中のビタミンＢ１２の存在を測定する全自動サンプル前処理を伴う２段階アッセイである。“ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ”分析装置および“ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ”分析装置の使用方法は米国特許Ｎｏ．５，７９５，７８４に記載されており、該特許の記載内容全部が参照によって本発明に組み込まれるものとする。ビタミンＢ１２に関するアッセイは、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂ１２，ＬｉｓｔＮｏ．６Ｃ０９，６９−０６８９／Ｒ１，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９９８，Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓに記載されている。該文献の記載内容全部が参照によって本発明に組み込まれるものとする。サンプルと前処理試薬１、前処理試薬２および前処理試薬３を合せる。前処理したサンプルのアリコートを吸引し、新しい反応容器に移す。前処理したサンプルとアッセイ希釈剤と内因子でコートされた常磁性微粒子とを合せる。サンプル中に存在するビタミンＢ１２は内因子コート微粒子に結合する。洗浄後、第二段階でビタミンＢ１２−アクリジニウム標識コンジュゲートを加える。ビタミンＢ１２−アクリジニウム標識コンジュゲートは化学発光反応を生じ得る。次いで反応混合物にプレトリガ溶液およびトリガ溶液を加える。生じた化学発光反応を相対的光単位として測定する。サンプル中のビタミンＢ１２の量と“ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ”／光学系によって検出された相対的光単位との間に反比例関係が存在する。システムおよびアッセイテクノロジーのより詳細な記載は“ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ”／Ｓｙｓｔｅｍ  Ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ  Ｍａｎｕａｌに見出される。該文献の記載内容全部が参照によって本発明に組み込まれるものとする。アッセイ試薬を以下に記載する（量／ボトルは１００回の試験用）。
【０１０８】
タンパク質（ウシ）安定剤を含むホウ酸塩バッファ中のブタ内因子コート微粒子。保存剤：抗菌剤（１ボトル、６．６ｍＬ／ボトル）
ＭＥＳバッファ中のＢ１２アクリジニウム標識コンジュゲート。最小濃度：０．７ｎｇ／ｍＬ。保存剤：抗菌剤（１ボトル、５．９ｍＬ／ボトル）
ＥＤＴＡと共にホウ酸塩バッファを含有するＢ１２アッセイ希釈剤。保存剤：抗菌剤（１ボトル、１０ｍＬ／ボトル）
０．００５％シアン化ナトリウムと共に１．０Ｎ水酸化ナトリウムを含有するＢ１２前処理試薬１。（１ボトル、２７ｍＬ／ボトル）
アルファモノチオグリセロールおよびＥＤＴＡを含有するＢ１２前処理試薬２。（１ボトル、５．５ｍＬ／ボトル）
ホウ酸塩バッファ中にタンパク質（トリ）安定剤と共にコビナミドジシアニドを含有するＢ１２前処理試薬３。保存剤：ナトリウムアジド（１ボトル、５．５ｍＬ／ボトル）。
【０１０９】
リン酸塩緩衝生理的塩類溶液含有の“ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ”／マルチアッセイマニュアル希釈剤。保存剤：抗菌剤（１ボトル、１００ｍＬ／ボトル）
１．３２％（ｗ／ｖ）過酸化水素含有の“ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ”／プレトリガ溶液
０．３５Ｎ水酸化ナトリウム含有の“ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ”／トリガ溶液
リン酸塩緩衝生理的塩類溶液含有の“ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ”／洗浄バッファ。保存剤：抗菌剤。
【実施例５】
【０１１０】
“ＡｘＳＹＭ”Ｂ１２アッセイは微粒子エンザイムイムノアッセイ（ＭＥＩＡ）テクノロジーに基づく。“ＡｘＳＹＭ”分析装置および“ＡｘＳＹＭ”分析装置の使用方法は米国特許Ｎｏ．５，３５８，６９１に記載されている。該特許の記載内容全部が参照によって本発明に組み込まれるものとする。ビタミンＢ１２アッセイはＡｂｂｏｔｔ  ＡｘＳＹＭＲＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂ１２，Ｌｉｓｔ  Ｎｏ．３Ｃ７９，６９−０９１２／Ｒ２，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９９９，Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓに記載されている。該文献の記載内容全部が参照によって本発明に組み込まれるものとする。
【０１１１】
“ＡｘＳＹＭ”Ｂ１２試薬およびサンプルを以下の順序でピペット注入する。
【０１１２】
１回の試験に必要なサンプルおよび全種の“ＡｘＳＹＭ”Ｂ１２試薬をサンプリングプローブによって反応容器の種々のウェルにピペット注入する。抽出剤１および抽出剤２を反応容器の１つのウェルで合せる。サンプルと変性剤と部分量の混合抽出剤とを反応容器の別のウェルで合せる。反応容器を直ちに処理センターに移す。以後のピペット注入は処理センターで処理プローブによって行う。内因子コート微粒子を反応混合物に加える。サンプル中に存在するビタミンＢ１２が内因子コート微粒子に結合してビタミンＢ１２と内因子コート微粒子とを含有する複合体を形成する。反応混合物のアリコートをマトリックスセルに移す。微粒子はガラス繊維マトリックスに不可逆的に結合する。マトリックスセルを洗浄して微粒子に結合しなかった材料を除去する。ビタミンＢ１２−アルカリホスファターゼコンジュゲートをマトリックスセルに供給して、ビタミンＢ１２、内因子コート微粒子およびコンジュゲートを含有する複合体を形成する。ビタミンＢ１２−アルカリホスファターゼコンジュゲートは蛍光生成物を形成し得る。マトリックスセルを洗浄して未結合のコンジュゲートを除去する。基質４−メチルウンベリフェリルホスフェートをマトリックスセルに加えて蛍光生成物をＭＥＩＡ光学アセンブリによって測定する。基質４−メチルウンベリフェリルホスフェートは蛍光原性物質である。システムおよびアッセイテクノロジーのより詳細な記載は“ＡｘＳＹＭ”Ｓｙｓｔｅｍ  Ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ  Ｍａｎｕａｌに見出される。該文献の記載内容全部が参照によって本発明に組み込まれるものとする。アッセイ試薬を以下に記載する（試薬パックの項の量／ボトルは１００回の試験用である）。
【０１１３】
試薬パック
Ｂ１２変性剤
Ｂ１２変性剤：デュアルパックの別のボトルから供給された０．００５％のシアン化カリウムを含む０．８Ｎの水酸化ナトリウム（１ボトル、１３．０ｍＬ／ボトル）。
【０１１４】
試薬パックＡ
抽出剤１．タンパク質（トリ）安定剤を含むホウ酸塩バッファ中のコビナミドジシアニド。保存剤：ナトリウムアジド（１ボトル、８．７ｍＬ／ボトル）
抽出剤２．ＥＤＴＡ中のアルファモノチオグリセロール（１ボトル、３．８ｍＬ／ボトル）
タンパク質（ウシ）安定剤を含むホウ酸塩バッファ中のブタ内因子コート微粒子。保存剤：ナトリウムアジド（１ボトル、１４．１ｍＬ／ボトル）。
【０１１５】
試薬パックＢ
タンパク質（ウシ）安定剤を含むトリスバッファ中のＢ１２：アルカリホスファターゼ（ウシ）コンジュゲート。最小濃度：０．１μｇ／ｍＬ。保存剤：ナトリウムアジド（１ボトル、１２．５ｍＬ／ボトル）
Ｂ１２変性剤．０．００５％シアン化カリウムを含む０．８Ｎの水酸化ナトリウム（１ボトル、１３．０ｍＬ／ボトル）
タンパク質（ウシ）安定剤を含むホウ酸塩バッファ中のブタ内因子コート微粒子。保存剤：ナトリウムアジド（１ボトル、１４．１ｍＬ／ボトル）。
【０１１６】
他の試薬（試薬パックに含まれないもの）
溶液１（ＭＵＰ）はＡＭＰバッファ中に１．２ｍＭの４−メチルウンベリフェリルホスフェートを含む。保存剤：ナトリウムアジド（４ボトル、２３０ｍＬ／ボトル）
溶液３（マトリックスセル洗浄液）はトリスバッファ中に０．３Ｍの塩化ナトリウムを含む。保存剤：ナトリウムアジドおよび抗菌剤（４ボトル、１００ｍＬ／ボトル）
溶液４（系列希釈剤）は０．１Ｍのリン酸塩バッファを含む。保存剤：ナトリウムアジドおよび抗菌剤（１ボトル、１０Ｌ／ボトル）
ＡｘＳＹＭプローブ洗浄溶液は２％水酸化テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡＨ）を含む（２ボトル、２２０ｍＬ／ボトル）。
【０１１７】
ブタ内因子コート微粒子は典型的にはポリスチレンのような材料から製造され、約０．５μｍ−約１５μｍの範囲の粒径を有している。微粒子はその表面に例えばカルボキシル基またはアミノ基のような官能基を有しており、これらがタンパク質または他の分子への結合に使用される。この結合は受動的でもよく能動的でもよい。能動的結合では例えばＥＤＡＣのような活性化試薬を使用する。
【０１１８】
ブタ内因子コート微粒子を“ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ”Ｂ１２アッセイに使用する場合には、ＥＤＡＣ活性化方法を使用してブタ内因子をカルボキシル化微粒子に共有結合させる。ＥＤＡＣ（１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩）は微粒子のカルボキシル基を活性化するために使用される。これらの基はタンパク質（すなわちブタ内因子）のアミノ基と結合し得る。
【０１１９】
ブタ内因子コート微粒子を“ＡｘＳＹＭ”アッセイに使用する場合には、最初にＥＤＡＣを使用して抗−内因子抗体を微粒子に結合させる。次いでブタ内因子をこれらの微粒子に加える。ブタ内因子は微粒子にコートされた抗−内因子抗体に結合し、従って微粒子にブタ内因子がコートされる。
【０１２０】
微粒子に加えるブタ内因子の量はアッセイの設計者が決定する。平均的な当業者は適正な添加量を容易に決定できる。
【０１２１】
明細書中で言及したヌクレオチドおよびアミノ酸配列を以下の表にまとめる。
ブタ内因子ｃＤＮＡクローンのヌクレオチドおよびアミノ酸の配列表
【０１２２】
【表１】
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2008529493.tif 000004
2008529493.tif 000005
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【０１２３】
本発明の範囲および要旨を逸脱しない様々な修正および変更は当業者に明らかであろう。また、提示した代表的な実施態様に本発明が不当に限定されると理解してはならない。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】組換えブタ内因子の発現を示す。大腸菌細胞を溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動）を使用してタンパク質を分解した。レーン１は分子量マーカーを含む（キロドルトンで記入）。レーン２および４は誘導０時間後に採取したサンプルを含む（０ＨＰＩ）。レーン３および５は４ＨＰＩおよび３ＨＰＩに採取したサンプルを含む。レーン６は細胞ペースト（濃縮および遠心後の細胞）を表す。レーン８は天然型ブタ内因子（ブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）腸から精製）を含む。
【図２】組換えブタ内因子のビタミンＢ１２への結合を示す。大腸菌細胞を溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用してタンパク質を分解し、ニトロセルロース膜にブロットした。アルカリホスファターゼにコンジュゲートしたビタミンＢ１２で膜をプローブした。発色性アルカリホスファターゼ基質とのインキュベーションによってビタミンＢ１２に結合したタンパク質バンドを同定した。レーン１は分子量マーカーを含む（キロドルトンで記入）。レーン２、３、４および５は、組換えブタ内因子を発現する種々のクローンから得られた細胞を表す。レーン６は天然型ブタ内因子（ブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）腸から精製）を含む。組換え内因子タンパク質は発色し、これによって内因子がビタミンＢ１２に結合したことを証明する。
【図３】組換えブタ内因子の抗−内因子抗体への結合をウェスタンブロット法によって示す。大腸菌細胞を溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用してタンパク質を分解し、ニトロセルロース膜にブロットした。次に抗−内因子抗体で膜をプローブした。レーン１は分子量マーカーを含む（キロドルトンで記入）。レーン２、３、４および５は、組換えブタ内因子を発現する種々のクローンから得られた細胞を表す。レーン６は天然型ブタ内因子（ブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）腸から精製）を含む。組換え内因子タンパク質は発色し、これによって組換え内因子が抗体によって認識されたことを証明する。
【図４】ブタ内因子、ヒト内因子、ラット内因子およびマウス内因子のヌクレオチド配列の位置合せを示す。
【図４−１】ブタ内因子、ヒト内因子、ラット内因子およびマウス内因子のヌクレオチド配列の位置合せを示す。
【図４−２】ブタ内因子、ヒト内因子、ラット内因子およびマウス内因子のヌクレオチド配列の位置合せを示す。
【図４−３】ブタ内因子、ヒト内因子、ラット内因子およびマウス内因子のヌクレオチド配列の位置合せを示す。
【図４−４】ブタ内因子、ヒト内因子、ラット内因子およびマウス内因子のヌクレオチド配列の位置合せを示す。
【図５】ブタ内因子とヒト内因子とのヌクレオチド配列間、ブタ内因子とラット内因子とのヌクレオチド配列間、ブタ内因子とマウス内因子とのヌクレオチド配列間の一致パーセントを示す。
【図６】Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａによってコードされた内因子の推定アミノ酸配列とヒト、ラットおよびマウスの既知の内因子配列との位置合せを示す。
【図６−１】Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａによってコードされた内因子の推定アミノ酸配列とヒト、ラットおよびマウスの既知の内因子配列との位置合せを示す。
【図７】ブタ内因子とヒト内因子とのアミノ酸配列間、ブタ内因子とラット内因子とのアミノ酸配列間、ブタ内因子とマウス内因子とのアミノ酸配列間の一致パーセントを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５】
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【図６】
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【図６−１】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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