(57)【要約】  結合試験中にマイクロアレイ基板に非特異的に結合する可能性があるタンパク質／タンパク質複合体のような標的、または他の標識を有する部分を効果的に除去するためにインキュベーション後処理を用いる。インキュベーションの後に、基板から非特異的に結合している標的またはそのような標的の少なくとも標識部分を除去するのに有効である消化剤、例えば、消化酵素（プロテアーゼ）またはリソソームを含む液体を用いて１段階洗浄を行う。プロテアーゼは、３−Ｄヒドロゲルマイクロスポットの多孔質表面に入ることが妨げられ、そのような多孔質ヒドロゲルマイクロスポット内で処理される標識標的−プローブ複合体に到達し、消化することができないようなサイズの巨大分子または固体粒子に結合または被覆されている。消化された標識を含むそのようなタンパク質のセグメント（または本質的にタンパク質全体）は、洗浄液中に運び去られ、したがって、イメージング時に存在してバックグラウンドノイズを発生させることはない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析するサンプル中の１つまたは複数の標的の存在を測定する方法であって、
上面を有する基板を準備する段階と、
前記面にヒドロゲルの複数の３次元多孔質マイクロスポットを付着させる段階と、
前記面上にマイクロアレイを形成させるために種々の前記複数のマイクロスポットの細孔内に種々の捕捉物質を供給する段階と、
前記マイクロアレイを、前記多孔質ヒドロゲルマイクロスポット内の前記捕捉物質との結合が可能なサイズの標的を含む溶液と接触させる段階と、
前記接触の後に、前記多孔質ヒドロゲルマイクロスポット内の捕捉物質に特異的に結合した標的に影響を及ぼすことなく、前記面から非特異的に結合した標的または少なくともその標識部分を除去する消化剤を含む液体を用いて前記マイクロアレイを洗浄する段階と、
前記標的が前記結合の時点に標識を含んでいない場合には、洗浄の前または後に前記標的に標識を結合させる段階と、
個々のマイクロスポット内に結合している標識標的からのシグナルを検出するために前記洗浄済みマイクロアレイを測定する段階と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記標的がタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的が抗体であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標的が抗原であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記消化剤がマイクロスフェアまたは微小固体粒子にコーティングとして結合することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記消化剤が、前記多孔質ヒドロゲル内への侵入を妨げるようなサイズのデンドリマーにコーティングとして結合することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記消化剤が、サイズが１ミクロンより大きいタンパク質複合体にコーティングとして結合することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記上面が固体表面であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記捕捉物質がタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記捕捉物質が抗体であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
結合物質を前記多孔性ヒドロゲルマイクロスポット内に固定化し、前記結合物質に付着するように水溶液中の前記種々の捕捉物質を前記多孔性ヒドロゲルマイクロスポット内に拡散させることによって前記捕捉物質を供給することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記結合物質がＮＦｋＢ転写因子であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
一次抗体を前記ＮＦｋＢに結合させ、その後、二次抗体を前記一次抗体に結合させることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
蛍光シグナルを発する標識が前記二次抗体に結合されていることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的が前記結合時に標識を含まない場合に、検出可能なシグナルを出す標識を前記洗浄段階の前または後に前記標的と結合させることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記消化剤がエキソペプチダーゼであることを特徴とする請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記消化剤がエンドペプチダーゼであることを特徴とする請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記消化剤がプロテイナーゼＫであることを特徴とする請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、未知サンプル中の標的を分析する方法に関し、より詳細には、処置を講じなければ、マイクロアレイ基板に対する非特異的標的その他の結合に起因し、かかるマイクロアレイからのシグナルの測定を妨害するようなバックグラウンドノイズを最小限にするための処置を講ずるマイクロアレイを用いて、標的、例えば、タンパク質または細胞溶解物を分析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質捕捉物質等を含むマイクロスポットを含むマイクロアレイに用いるガラスまたは他の基板に対するタンパク質、炭水化物、細胞溶解物等のバックグラウンド結合は、多年にわたり問題となっている。マイクロアレイ基板に対するタンパク質の非特異的結合は、マイクロアレイをイメージングするとき、あるいはマイクロスポット上で発生したシグナルを他の方法で読み取るときにバックグラウンドノイズを増加させる。そのようなバックグラウンドノイズは正確な読みを得ることを妨害し、妨げるため、このことが、特にシグナルが比較的弱い場合に特定のスポットに特異的に結合すべき標識から得られるシグナルを検出し、区別することを困難にする。
【０００３】
現在までのところ、この問題を軽減または緩和することを試みるのに用いられているより一般的な方法のうちの２つは、複数のマイクロスポットの各々の周囲の基板の表面の領域をブロックする方法を含むものである。そのようなブロッキングは、例えば、無水コハク酸を用いるような、例えば、ガラス表面がしばしば誘導体化されたアミノ基との化学反応を行わせることによって、基板の表面を化学的に被覆して行われている。第２の方法は、ガラス表面への小分子、例えば、ＢＳＡ、ｔＲＮＡ、スキムミルク固形物、カゼイン等の付着を用いるものであった。これらの様々なブロッキング法は、それ自体が、核酸プローブを用いる測定法におそらく有効であると思われる「スプレディングエンハンサー（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）溶液」の使用を提案している特許文献１に記載されている。特許文献２は、抗体を用いる分析に関するものであり、ｐＨ９以上に緩衝され、特定の陰イオン界面活性剤を含む水性洗浄液を用いて非複合タンパク質物質を除去することを提案している。特許文献３は、抗体を用いる分析に関するものであり、タンパク質の望ましくない結合を防止するためにガラス支持体をカルボキシル化デキストランからなる層で被覆することを開示している。特許文献４は、乳汁タンパク質と特定のパーセントの有機酸を用いることにより、基板への抗体等の非特異的吸収を阻止することを提案している。
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／００４４８２３号明細書
【特許文献２】米国特許第５２４８５９５号明細書
【特許文献３】米国特許第５６５６５０４号明細書
【特許文献４】米国特許第５０１７５５９号明細書
【特許文献５】米国特許第６１７４６８３号明細書
【特許文献６】国際公開第０２／０５９３７２号パンフレット
【特許文献７】米国特許第３９３９１２３号明細書
【特許文献８】米国特許第４１１０２８６号明細書
【特許文献９】米国特許第４０９８６４５号明細書
【特許文献１０】米国特許第５８４０８６７号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これらの様々な提案された問題の解決策はある程度の成功を収めているが、これらのうちのいずれもこの問題の完全な解決策として広く受入れられていない。したがって、マイクロアレイを読み取る際のバックグラウンドノイズを抑制するための、また特に３次元（３−Ｄ）ヒドロゲルマイクロスポットを用いる場合のよりよい解決策を求めて研究が継続されている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
結合試験中にマイクロアレイ基板に非特異的に結合する可能性があるタンパク質／タンパク質複合体、または他の標識を有する部分のような標的を効果的に除去するために特定のインキュベーション後処理を用いることができることが発見された。インキュベーションの後に、そのような標的が非特異的に結合するようになる可能性がある基板から標的の蛍光標識部分を除去かつ／または標的自体を除去することなどにより、そのような標識を除去するのに有効である消化剤、例えば、消化酵素（プロテアーゼ）またはリソソームを含む液体を用いて１段階洗浄を行う。これらのプロテアーゼは、３−Ｄヒドロゲルマイクロスポットの多孔質表面に入ることが妨げられるようなサイズの分子または固体粒子に結合または被覆されており、それにより、それらが多孔質ヒドロゲルマイクロスポット内で処理される標識標的−プローブ複合体に到達し、消化することを不可能にする。個々のアッセイの必要に応じて、１つまたは複数のプロテアーゼまたは他の消化剤を用いることができる。標識を含むタンパク質（または本質的にタンパク質全体）の特定のセグメントが切断されたならば、それはこの洗浄液中に運びさられる。例えば、アッセイが複数の抗体を用いるサンドイッチアッセイである場合、複数のプロテアーゼを用いるか、または異なるプロテアーゼを用いる複数の洗浄を行うことが望ましい。
【０００７】
１つの特定の態様において、本発明は、分析するサンプル中の１つまたは複数の標的の存在を測定する方法であって、上面を有する基板を準備する段階と、前記面にヒドロゲルの複数の３次元多孔質マイクロスポットを付着させる段階と、前記面上にマイクロアレイを形成させるために種々の前記複数のマイクロスポットの細孔内に種々の捕捉物質を供給する段階と、前記マイクロアレイを、前記多孔質ヒドロゲルマイクロスポット内の前記捕捉物質との結合が可能なサイズの標的を含む溶液と接触させる段階と、前記接触の後に、前記多孔質ヒドロゲルマイクロスポット内の捕捉物質に特異的に結合した標的に影響を及ぼすことなく、前記面から非特異的に結合した標的または少なくともその標識部分を除去する消化剤を含む液体を用いて前記マイクロアレイを洗浄する段階と、前記標的が前記結合の時点に標識を含んでいない場合には、洗浄の前または後に前記標的に標識を結合させる段階と、個々のマイクロスポット内に結合している標識標的からのシグナルを検出するために前記洗浄済みマイクロアレイを測定する段階とを含む方法を提供する。
【０００８】
他の特定の態様において、本発明は、分析するサンプル中の１つまたは複数の標的の存在を測定する方法であって、上面を有する固体基板を準備する段階と、前記面にイソシアネート官能性ヒドロゲルの複数の３次元多孔質マイクロスポットを付着させる段階と、前記多孔質ヒドロゲルマイクロスポット内の結合物質を固定化する段階と、種々のタンパク質性捕捉物質を、前記結合物質に付着するように、水溶液中のそのような捕捉物質を前記多孔質ヒドロゲルマイクロスポット中に拡散させることによって、種々の前記複数のマイクロスポットの細孔内に供給してマイクロアレイを形成させる段階と、前記マイクロアレイを、前記多孔質ヒドロゲルマイクロスポット内の前記捕捉物質との結合が可能なサイズの標的を含む溶液と接触させる段階と、前記接触の後に、前記多孔質ヒドロゲルマイクロスポット内の捕捉物質に特異的に結合した標的に影響を及ぼすことなく、前記面から非特異的に結合した標的または少なくともその標識部分を除去する消化剤を含む液体を用いて前記マイクロアレイを洗浄する段階と、個々のマイクロスポット内に結合している標識標的からのシグナルを検出するために前記洗浄済みマイクロアレイを測定する段階とを含む方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
医療診断分野における免疫学的測定法では、近年、未知サンプル中の特定のリガンドの存非を判定するために特定の分子に特異的なプローブまたは捕捉物質を担持するための固相基板、例えば、ガラス製の顕微鏡スライドおよびケイ素製のものなどのプレート、ならびにニトロセルロース膜等が用いられている。したがって、分析用のマイクロアレイを作製するために用いる基板としては、支持フィルムまたは多孔質膜、複数のマイクロウェルを有する、多孔性または不透過性であってよい平坦な固体プレートおよびプレートなどがあった。標準顕微鏡スライドのようなガラススライドは、そのようなマイクロアレイの基板として一般的に用いられており、そのようなガラス表面は、結合プローブまたはプローブが付着する物質を受入れる反応性を表面に与えるために、しばしばアミノシラン、アルデヒド、ポリリシン等で処理される。ガラススライドのアミノシラン処理は、そのような基板を得るというこの目的のためにしばしば用いられている。
【００１０】
本発明は、複数の３次元マイクロスポットを有するマイクロアレイの使用に関する。マイクロアレイは、時としてバイオチップと呼ばれる。そのようなバイオチップの例は、特許文献５および「３次元構成のバイオチップ」と題する特許文献６に記載されている。
【００１１】
そのような３次元アレイにおいて、プローブは、プレートのウェルの固体表面、またはガラススライドもしくは他のある種の平坦なプレート、または多孔質膜もしくはフィルムに結合されておらず、多孔質重合ヒドロゲルのマイクロスポット内の付着により３次元アレイとして存在する。このような配置は、プローブを固体基板から分離し、プローブの提示のための、また標識分子等の最終的な捕捉のための拡大された表面積を与える。複数のそのような３次元マイクロスポットが通常、各ガラススライド上、またはマイクロウェルプレートの各ウェル中等に存在する。
【００１２】
バイオチップ基板は、様々な材料製であってよく、通常、結合試験中の自動処理および個々のマイクロスポットに結合している標的分子の後の検出の助けとなる構成を有する。平坦な固体プレート、例えば、ガラススライドは、適切であり、用いることが好ましいが、個々のマイクロスポットを保持するためにそれらに形成されている陥凹またはウェルを有するプレートを用いることもできる。ニトロセルロースまたはナイロン膜のようなある種の微多孔膜は、非特異的結合が起る可能性がある表面に消化剤が到達できる限り、用いることができる。ガラスや透明ポリスチレンのような光学的に透明な物質は、マイクロスポットによる透過光の検出が可能となり、蛍光または光吸収を用いる検出方式に都合がよい。３次元ヒドロゲルマイクロスポットの結合能力は高いため、反射光学法も可能であり、不透明物質を用いることができる。硬質基板を使用することにより、バイオチップを用いる分析の検出段階における正確なアライメントが可能になるが、検出を容易にするために適切なアライメントがマイクロスポットに組み込まれている場合には、そのような必要はない可能性がある。例えば、テープ、多孔質膜またはフィラメントのような柔軟なものは、磁気テープの使用に類似した走査方式で正確に検出することができよう。光学的方法と適切な基板は、単純であるので、好ましいが、例えば、放射性標識の検出のような他の生化学的検出法を代わりになるべきものとして用いることができよう。一般的に、例えば、１〜１０，０００のあらゆる数のマイクロスポットをバイオチップ上に配置することができる。自動処理を容易にするために、しばしば９６の倍数を用いることができる。例えば、３８４個のマイクロスポットを３インチ（７．６ｃｍ）×５インチ（１２．７ｃｍ）のプレート上に配置することができる。
【００１３】
ヒドロゲルは、次の望ましい属性を有するゲルマトリックスを得ることができる種類のポリマーである：マトリックスを出入りする分子の拡散を可能にするのに十分な孔径および高い含水率、ガラスの表面、他の不透過性または多孔質表面に結合する能力、蛍光タグへの光学的妨害を最小限にするための十分な重合状態での光学的透明性、十分に重合したときの十分な構造上の完全性、通常の研究および臨床での使用に十分な貯蔵寿命。ヒドロゲルは、脱水状態ではガラス状であり、水の存在下で膨潤して弾性ゲルを形成する親水性網目ポリマーである。イソシアネート官能性ヒドロゲルは、核酸ハイブリッド形成プローブ、タンパク質、炭水化物、細胞等の捕捉物質の固定化を有利にするために用いることができる多数の特性を有する。イソシアネート官能性ヒドロゲルとは、所望のさらなる重合を行い、また、タンパク質等、または次にタンパク質に結合する中間体に共有結合する機能を果たすイソシアネート基でキャップされている有機ポリマーを意味する。例えば、当技術分野でよく知られており、ジイソシアネートとポリエーテルまたはポリエステルポリオールとの反応により生成させることができるポリウレタンポリマーは、この目的のための適切なヒドロゲルを提供することができる。
【００１４】
プレポリマーは、そのようなイソシアネート官能性ヒドロゲルを用いてバイオチップを形成させるための出発物質として一般的に用いられており、そのようなプレポリマーは、水和ポリウレタン、ポリ尿素−ウレタンおよび／またはポリ尿素ポリマーゲルを得るために調合することができる。ヒドロゲルポリマーは、一般的に、濃縮された形態のゲルである３次元ポリマー網目構造を有するわずかに架橋したプレポリマーが最初に生成するような条件下で水溶液中で親水性モノマーを重合して生成させる。ポリウレタンヒドロゲルは、尿素およびウレタン結合の形成によるイソシアネート末端キャッププレポリマーの重合により生成させることができる。
【００１５】
適切なイソシアネート官能性プレポリマーは、二官能または多官能性イソシアネート化合物と反応するポリオキシアルキレンジオールまたはポリオールからしばしば調製される。バイオチップ調製用の好ましいプレポリマーは、エチレンオキシド単位のホモポリマーまたはエチレンオキシド単位とプロピレンオキシドもしくはブチレンオキシド単位の混合物を含むブロックもしくはランダムコポリマーを含むポリオキシアルキレンジオールまたはポリオールから調製される。ブロックもしくはランダムコポリマーの場合、単位の少なくとも７５％がエチレンオキシド単位であることが好ましい。ポリプロピレンオキシドのホモポリマーを代わるべきものとして用いることができる。約１，０００〜１０，０００、より好ましくは約２，０００〜６，０００の分子量のポリオキシアルキレンジオールまたはポリオールを用いることが好ましい。適切なプレポリマーは、本質的にすべてのヒドロキシル基がポリイソシアネートでキャップされるように約１．２〜約２．２のイソシアネート対ヒドロキシル比で、選択されるポリオキシアルキレンジオールまたはポリオールとポリイソシアネートとを反応させることにより調製する。そのようなイソシアネート官能性プレポリマーは、約０．２ｍｅｑ／ｇ〜約０．８ｍｅｑ／ｇの量の活性イソシアネートを含むことが好ましい。プレポリマーは、マイクロスポットを形成する際に過度に急速に重合すべきではなく、この点に関して、比較的低いイソシアネート含量を含む高分子量プレポリマーが一般的に好ましい。
【００１６】
そのような高分子量プレポリマーは次の２つの一般的な方法のいずれかにより調製される。（１）少なくとも２，０００の分子量を有するポリオール（トリオールまたはより高級）をイソホロンジイソシアネートなどのポリイソシアネートと反応させる、または（２）少なくとも２，０００の分子量を有するジオールをポリイソシアネートおよびグリセロール、トリメチロールプロパン、トリメチロールエタン、トリエタノールアミンまたは有機トリアミンのような架橋剤と反応させる。
【００１７】
芳香族、脂肪族または環状脂肪族ポリイソシアネートを用いることができる。高分子量脂肪族イソシアネートでキャップされたプレポリマーは、一般的に約２０〜９０分で水和ポリマー状態にゲル化するが、芳香族ポリイソシアネートでキャップされたプレポリマーは、はるかに速やかにゲル化する。適切な二および多官能性イソシアネートの例は次のとおりである。トルエン−２，４−ジイソシアネート、トルエン−２，６−ジイソシアネート、イソホロンジイソシアネート、エチレンジイソシアネート、エチリデンジイソシアネート、プロピレン−１，２−ジイソシアネート、シクロヘキシレン−１，２−ジイソシアネート、シクロヘキシレン−１，４−ジイソシアネート、−フェニレンジイソシアネート、３，３”−ジフェニル−４，４”−ビフェニレンジイソシアネート、１，６−ヘキサメチレンジイソシアネート、１，４−テトラメチレンジイソシアネート、１，１０−デカメチレンジイソシアネート、クメン−２，４−ジイソシアネート、１，５−ナフタレンジイソシアネート、メチレンジシクロヘキシルジイソシアネート、１，４−シクロヘキシレンジイソシアネート、ｐ−テトラメチルキシリレンジイソシアネート、ｐ−フェニレンジイソシアネート、４−メトキシ−１，３−フェニレンジイソシアネート、４−クロロ−１，３−フェニレンジイソシアネート、４−ブロモ−１，３−フェニレンジイソシアネート、４−エトキシル−１，３−フェニレンジイソシアネート、２，４−ジメチル−１，３−フェニレンジイソシアネート、２，４−ジメチル−１，３−フェニレンジイソシアネート、５，６−ジメチル−１，３−フェニレンジイソシアネート、１，４−ジイソシアナトジフェニルエーテル、４，４’−ジイソシアナトジフェニルエーテル、ベンジジンジイソシアネート、４，６−ジメチル−１，３−フェニレンジイソシアネート、９，１０−アントラセンジイソシアネート、４，４’−ジイソシアナトジベンジル、３，３’−ジメチル−４，４’−ジイソシアナトジフェニルメタン、１，６−ジメチル−４，４’−ジイソシアナトジフェニル、２，４−ジイソシアナトスチベン、３，３’−ジメトキシ−４，４’−ジイソシアナトジフェニル、１，４−アントラセンジイソシアネート、２，５−フルオロンジイソシアネート、１，８−ナフタレンジイソシアネート、２，６−ジイソシアナトベンズルラン、２，４，６−トルエントリイソシアネート、ｐ，ｐ’，ｐ”−トリフェニルメタン−トリイソシアネート、イソホロンジイソシアネートの３官能三量体（イソシアヌレート）、ヘキサメチレンジイソシアネートの３官能性ビウレット、ヘキサメチレンジイソシアネートの３官能三量体（イソシアヌレート）、ポリマー状４，４’−ジフェニルメタンジイソシアネート、キシリレンジイソシアネートおよびｍ−テトラメチルキシリレンジイソシアネート。
【００１８】
プレポリマーを生成させるための選択されるジオールまたはポリオールのポリイソシアネートによるキャッピングは、化学量論量の反応物を用いて行うことができる。イソシアネートとヒドロキシル基との比は、当技術分野で知られているように変化させることができるが、約１．２〜約２．２であることが好ましい。キャッピング反応は、乾燥窒素中で約２時間から約１４日間、好ましくは触媒の非存在下で約６０℃〜１００℃のような適切な条件を用いて行う。反応は、イソシアネート濃度が理論値に近づくときに終了する。
【００１９】
好ましいプレポリマーとしては、トルエンジイソシアネートでエンドキャップされたポリエチレングリコール、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシド（場合によってトリメチロールプロパンを含む）およびトルエンジイソシアネートのコポリマー、トルエンジイソシアネート−ポリエチレングリコール−トリメチロールプロパン、メチレンジイソシアネート−メチレンホモポリマー、重合メチレンジイソシアネート−ポリエチレングリコール、エチレンオキシド−プロピレンオキシド−トリメチロールプロパンとイソホロンジイソシアネートのポリマー、ならびにポリエチレングリコールトリアセテートおよびトルエンジイソシアネートなどがある。上のタイプの適切なプレポリマーは、マサチューセッツ州のレキシントン（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ）のＨａｍｐｓｈｉｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．からＨＹＰＯＬ  ＰｒｅＭＡ（登録商標）Ｇ−５０、ＨＹＰＯＬ（登録商標）２０００、ＨＹＰＯＬ（登録商標）３０００、ＨＹＰＯＬ（登録商標）４０００およびＨＹＰＯＬ（登録商標）５０００として入手できる。これらの製剤は、約６，０００ダルトンの分子量を有するポリエチレンオキシドと微量のポリプロピレンオキシドとのコポリマーを一般的に含む。他の製造業者から入手可能な同等の製品が存在し、また、同等のプレポリマーを市販の原材料から調製することができる。
【００２０】
すべてのことを考慮すると、ヒドロゲルポリマーの主鎖は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーからなることが好ましい。ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールヒドロゲルの非イオン性親水性は、ヒドロゲルへの分析物の非特異的結合のレベルを低くし、また、その天然コンフォーメーションおよび生体反応性を維持するように固定化生体分子との適合性を良好にすると考えられる。イソシアネート官能性ヒドロゲルは、有利なことに大量の液体を速やかに、またゲル材料の全体の基本的形状が維持されるように比較的均一に吸収する。さらに、これらの材料により吸収される水分は、印加圧力下でさえも吸収材料に保持される。この一般的なタイプのポリウレタンベースのイソシアネート官能性ヒドロゲルは、特許文献７（Ｍａｔｈｅｗｓら）、特許文献８（Ｖａｎｄｅｇａｅｒら）および特許文献９（Ｈａｒｔｄｅｇａｎら）に記載されている。
【００２１】
好ましいバイオチップは、水活性ジイソシアネートでキャップされ、適切な架橋剤で場合によってわずかに架橋されていてよい、高分子量ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、またはポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドとのコポリマーのジオールまたはトリオールに基づくイソシアネート官能性ヒドロゲルを用いて調製することができる。プレポリマー中に存在する活性イソシアネートの量は、約０．８ｍｅｑ／ｇを超えないことが好ましい。一般的に好ましいジイソシアネートとしては、トルエンジイソシアネートまたはメチレンジフェニルイソシアネートのような芳香族ベースのジイソシアネートならびにイソホロンジイソシアネートのような脂肪族ジイソシアネートなどがある。好ましくは、捕捉物質を固定化するための部位を設けるために、ポリマー中約０．５％〜約１５％の反応性イソシアネートを用いる。水混和性有機溶媒中で前調合することがきるバイオチップ調製用のプレポリマーの重合は、水の単純な添加により発生する尿素結合の形成によって起り得る。
【００２２】
捕捉物質という用語は、１つまたは複数の標的分子と特異的に相互作用して、標的とハイブリッド形成するか、または別の仕方で相互作用し、ハイブリッド形成以外のメカニズムにより標的分子を物理的に封鎖することができる物質を指すために用いる。捕捉物質は、ハイブリッド形成により結合するＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡのような核酸、ならびにタンパク質、受容体、ペプチド、酵素、酵素阻害物質、酵素基質、免疫グロブリンを含むタンパク質、例えば、抗体、抗原、レクチン、修飾タンパク質、修飾ペプチド、二本鎖ＤＮＡ、生体アミンおよび複合炭水化物のような生物学的物質の形の非ハイブリッド形成物質などである。捕捉物質はまた、合成分子、例えば、この種の特異結合活性を有するように設計された薬物および合成リガンドなどであってよい。「修飾」タンパク質またはポリペプチドとは、新たな化学的部分の付加、既存の化学的部分の除去、または除去および付加の何らかの組合せにより変化した分子内に１つまたは複数のアミノ酸を有するタンパク質またはペプチドを意味する。この変化は、天然および合成修飾を含んでいてよい。天然修飾は、リン酸化、硫酸化、グリコシル化、ヌクレオチド付加および脂質化を含むが、これらに限定されない。合成修飾は、ヒドロゲルに対する結合を促進するための化学リンカー、および蛍光色素、マイクロ構造、ナノ構造、例えば、量子ドットまたは他の合成物質の付加を含むが、これらに限定されない。さらに、修飾は、既存の官能部分、例えば、ヒドロキシル、スルフヒドリルまたはフェニル基の除去、あるいは天然側鎖またはペプチドアミド骨格の除去または変化を含んでいてよい。複合炭水化物の例は、天然および合成線状および枝分れオリゴ糖、修飾多糖、例えば、糖脂質、ペプチドグリカン、グリコサミノグリカンまたはアセチル化種、ならびに異種オリゴ糖、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミンまたは硫酸化種を含むが、これらに限定されない。天然に存在する複合炭水化物の特定の例は、キチン、ヒアルロン酸、硫酸ケラタン、硫酸コンドロイタン、ヘパリン、セルロースならびにアルブミンおよびＩｇＧのような修飾タンパク質に認められる炭水化物部分などである。２つまたはそれ以上の捕捉物質の組合せをマイクロチップアレイ上のいくつかの位置に固定化することができ、該組合せは、２つの物質の混合物として加えることができ、あるいは連続的に加えることができる。
【００２３】
捕捉物質は、ヒドロゲル物質の重合の前、重合中または重合の後に各マイクロスポットに直接または間接的に固定化することができる。間接的固定化は、最初にヒドロゲルに結合させる中間物質と次にそれに結合させるおそらく第２の中間物質の使用を意図する。例えば、ヒドロゲルマトリックス内に封じ込められる第１のまたは一次中間物質は、カルモジュリンに対する抗体であってよい。カルモジュリンが抗体に結合したならば、カルモジュリンは、次に、カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼＩＩのようなカルモジュリン結合タンパク質を封鎖するのに利用されるとき第２の中間物質として働く。ヒドロゲルにＣａＭキナーゼＩＩ（一般的に言及されているように）を付着させるこのアプローチは、天然に存在する結合モチーフを介して、すなわち、カルモジュリンタンパク質を介してタンパク質を固定する緩やかな方法を提供する。ＣａＭキナーゼＩＩは、今や、例えば、ＣａＭキナーゼＩＩにおける調節事象（リン酸化、脱リン酸化）を検討する目的のため、または可能なドッキングタンパク質もしくは他の細胞内輸送タンパク質を探査するために分析物溶液を自由に探測することができる。
【００２４】
固定化捕捉物質と標的との間の封鎖または非ハイブリッド形成結合のような相互作用の記述において、２つまたはそれ以上の分子は一般的に共有結合または非共有結合（例えば、ファンデルワールス力および／またはイオン相互作用により）により特異的かつ選択的に互いに付着または結合することを意味する。特異的標的は、生物学的または合成物質の複合体混合物中に存在する可能性がある単純分子であってよい。封鎖または結合は、拡大された性質のもの、例えば、共有結合修飾または抗原抗体相互作用であってよく、あるいは、例えば、リン酸化事象中に起るような一過性であってよい。非ハイブリッド形成ＤＮＡ結合物質は、デオキシリボヌクレオチドの合成および天然二本鎖ポリマー、合成および天然ポリリボヌクレオチド、アプタマー、ならびに１つまたは複数の修飾または天然に存在しない化学物質を有する合成ポリヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。結合／封鎖剤としてのＤＮＡのこの代替使用は、標的ＤＮＡがハイブリッド形成するＤＮＡの一本鎖（オリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡ）を一般的に用いる従来のヌクレオチドハイブリッド形成アレイと対照的である。二本鎖ＤＮＡは、生体分子を結合または封鎖するように、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子のような適切な生体分子、例えば、エストロゲン受容体、あるいは合成薬物または分子と相互作用させる（ハイブリッド形成とは対照的に）ために用いることができよう。例として、ＴＢＰもしくはＳＰＩのような一般的転写因子、または核ホルモン受容体のような遺伝子特異的転写因子は、らせん状二本鎖ＤＮＡに誘引し、それにより封鎖することができる。アプタマーは、特許文献１０に記載され、モノクローナル抗体と非常に類似した機能を果たすことが示されている。
【００２５】
最初の捕捉物質、例えば、選択的抗体または他の選択的結合剤例えばアプタマーは、ゲルマトリックス内で共重合させることができる。１つまたは複数の異なる抗体をアレイの各マイクロスポット中に固定化することができる。その後にそのようなアレイに生物学的物質の複合体混合物を加えることにより、各マイクロスポット内の各固定化抗体の特有の結合属性を用いると、そのような複合体混合物が「自己選別」され、「自己アセンブル」する新たなアレイが作製されるはずである。新たなアレイは、最初の結合物質と相補的である。例えば、特異抗原に対する抗体を重合時に各ゲルマイクロスポット内に固定化することができる。その後、特異タンパク質またはペプチド抗原は、そのようなタンパク質またはペプチド抗原をそのようなアレイに曝露することにより同族抗体の各々に結合するようにすることができる。そのような中間抗体アレイの使用の１つの例は、各タンパク質の個別分離を必要とせずに、各細胞抽出物からのタンパク質の複合体混合物を自己選別することである。こうして形成されたこのようなアレイは、添加タンパク質キナーゼまたは他のタンパク質修飾部分への各曝露部位に対する効果はどのようなものかを評価するのに用いることができよう。この概念は、そのような修飾活性が薬物または他の添加化合物の影響を受けるかどうかを検討するために、拡大することができると思われる。
【００２６】
さらなる選択肢として、最初に固定化した中間物質を用いて、重合の後にバイオチップアレイのマイクロスポット内に他の捕捉物質を配置または固定することができる。例えば、プロテインＡのような適切な中間物質を重合時に固定化することができる。その後、所望の免疫グロブリン捕捉物質を、溶液中の免疫グロブリンへの曝露を制御することにより、固定化プロテインＡに結合させる。
【００２７】
最初に固定化した捕捉物質は、その後修飾してもよい。そのような修飾は、（ａ）生物学的修飾、例えば、リン酸化、グリコシル化、アセチル化、メチル化、ユビキチン化、脂質修飾およびＡＤＰ−リボシル化、非生物学的修飾、例えば、蛍光色素修飾、ビオチニル化、アルキル化および異常残基取り込み、ならびに他のタンパク質または酵素との共役によりアレイの最終形態の変化を生じさせることなどがある。さらに、二本鎖核酸オリゴヌクレオチド（またはポリマー）を重合時に固定化することができ、その後、所望のタンパク質をそのような核酸に核酸配列−特異的タンパク質相互作用により結合させて、自己アセンブルタンパク質−核酸複合アレイを製造することができる。
【００２８】
さらに、非プロトン性溶媒中で最初にプレポリマーを捕捉物質と反応させることが有利であると思われる。捕捉物質はプレポリマー上に効果的に固定化されるので、この手順は、その後、プレポリマーの均一な水溶液を得る助けとなり、また、重合段階における二酸化炭素の発生を遅くするのにも役立つ可能性がある。重合が高度に粘性の混合物中で非常に急激に起る場合、発生した二酸化炭素ガスは逃げることができず、ゲル中に捕捉された状態になり得る。そのような場合、不連続な泡マトリックスが生じ、連続体であるゲルマトリックスに対して問題となり、光学的透明性の妨害となる可能性がある。バイオチップの設計において、光学的透明性が大きいほど、標的への結合の成功を示唆する蛍光のようなシグナルの検出の正確度は大きくなる。
【００２９】
ゲルマトリックス内に固定化されている中間または一次捕捉物質と相互作用するために多孔質ヒドロゲルをとおしての予期される標的分子または他の二次結合物質の拡散のし易さは、用いられる溶液中のヒドロゲルプレポリマーの割合によってある程度決定される。ヒドロゲル小滴を調製するためにプレポリマーの５％溶液を用いることは核酸プローブを固定化するマイクロスポットを形成させるのに十分であるが、５％レベルで形成させた重合ヒドロゲル内へのタンパク質のようなより大きい分子の拡散は、所望よりも遅いと思われる。したがって、多孔質ヒドロゲル内へのより大きい生体分子の通過を促進するためには、より低いパーセントのプレポリマー、例えば、３．５％を用いることが一般的に好ましい。したがって、視覚化ツールとして抗体を用いるような多くの適用例においては、ポリマーの好ましい範囲は、約３％〜５％であってよい。一般的な抗体、例えば、ＩｇＧよりサイズが小さい分子を検査するような他の適用例および用途では、それぞれ溶液中より高いまたは低いパーセントのポリマーを用いることができる。本明細書で後に説明するように、特定のサイズのマイクロスフェアの侵入を防ぐために孔径を調節すべきである。
【００３０】
ヒドロゲルを、最初にタンパク質捕捉物質（または結合捕捉物質の中間体）で誘導体化し、次いで、その重合の開始の後であるが完了の前に、固体基板上に沈着させることはできるが、そのような手法は好ましくないことがある。一般的に、ヒドロゲルプレポリマーの微小滴の送達は、当技術分野でよく知られている都合のよい方法によって達成される。例えば、ゲルを沈着させてマイクロスポットのアレイを形成させる通常のマイクロスポッティング装置を用いることができる。そのようなゲルはある種の基板に本質的に非共有結合により付着しているが、基板へのゲルの強固な付着を保証するために、基板表面は一般的にヒドロゲルを加える前に誘導体化されている。例えば、ガラスを基板として用いる場合、重合性ヒドロゲルの沈着の前に、ガラスをアミンで誘導体化することができる。例えば、タンパク質により既に誘導体化された重合性ヒドロゲルは、誘導体化ガラス基板上に沈着させたとき、その残りの活性イソシアネート基の一部とガラスの表面上にあるアミンとの反応により基板に強く結合する。これは基板へのヒドロゲルマイクロスポットの共有結合による付着をもたらすが、プレポリマーに最初に存在する活性イソシアネート基の約５％以下がこの機能に用いられることが好ましい。
【００３１】
特定の実施形態において、有効な固定化を最大限にするために、捕捉物質の最初の部分的なブロックが好ましい。例えば、イソシアネートプレポリマーと、個々の捕捉物質が含む可能性がある化学的部分、例えば、第一級アミンとの反応性が捕捉物質とポリマーとの間の過度の架橋を生じさせる可能性があり、そのようなことは捕捉物質の変性をもたらしたり、その標的化合物に対するその結合親和力を低下させたりする可能性がある。そのようなことは、重合中にこれらの部分の少なくとも一部を保護することにより回避または制限することができよう。重合の後の脱保護によりアレイ内の捕捉物質の機能性と有用性を回復させることができよう。すなわち、重合の後のデブロッキングにより捕捉物質がその元のコンフォーメーションをとることができる。そのようなブロッキング／デブロッキングは、共有結合または非共有結合性手段により実現することができる。例えば、捕捉物質として抗体を用いる場合、プレポリマーと混合する前に、ポリマーに架橋した状態になり易い抗原認識部位を非架橋性ペプチド（または他のエピトープ模擬体）とともにインキュベートすることができる。そのようなペプチドまたはエピトープ模擬体は、重合過程中に抗原認識部位が反応性イソシアネート基に結合することを防ぐであろう。重合の後に、そのようなペプチドは、例えば、ｐＨ３．０の酸への短時間の曝露により抗体から放出され、それにより、抗体の抗原認識部位が再曝露されるであろう。同様なメカニズムを用いて捕捉物質上の選択されたスルフヒドリル部分またはアミンを保護することができる。これらは、重合過程中にこれらの機能性を保護するためのよく知られている可逆性化学誘導体化を用いるものであろう。
【００３２】
そのようなヒドロゲルポリマーは、合成分子、薬物、非ペプチド受容体リガンド、混合有機／無機種、例えば、金属ポルフィリンおよび無機物質、例えば、ゼオライトを含むが、これらに限定されない、上記以外の多種の捕捉物質を固定化するのに適している。例えば、そのような捕捉物質は、捕捉物質と分析化学種との間の特異的相互作用に基づき溶液からの化合物を封鎖するために用いることができる。
【００３３】
三座または四座金属キレート化剤、例えば、アミノ誘導体化Ｃ4−Ｃ8の適切なリンカーを有するイミノ二酢酸またはニトリロ三酢酸のような非生物学的化合物も重合の前または重合中に中間捕捉物質としてヒドロゲル内に固定化することができる。所望の捕捉物質、例えば、タンパク質は、例えば、タンパク質のテイルまたはヘッド上の末端として複数のヒスチジン含有配列を有するように合成または修飾することが好ましく、そのようなものは、次に、固定化キレート化剤に結合させることによりヒドロゲル内にタンパク質を物理的に固定化するためにそのような末端残基とのキレート化を可能にするようにＣｕ2+またはＦｅ3+のような２価または３価金属イオンとともに曝露させることにより、バイオチップの各マイクロスポットに固定化することができる。各マイクロスポットを個々の捕捉物質、例えば、異なるタンパク質捕捉物質に曝露させることにより、分析での使用で安定であるタンパク質チップを形成させる。そのようなポリマーマイクロスポットを調製する際に中間物質を用いる１つの利点は、最終的な捕捉物質であるタンパク質のコンフォーメーションとコンフィギュレーションが変化しないようにするために特に感受性が高いタンパク質の変性の可能性が回避されるという保証がより大きいことである。また、個々のタンパク質マイクロアレイにおける各マイクロスポットまたはセルを形成するために同じキレート化剤を用い、その後、それに捕捉物質を結合させることによって、製造を単純化することができる。
【００３４】
有利なことに、このシステムに必要なすべての反応、すなわち（１）タンパク質プローブまたは中間物質による直接的なヒドロゲルプレポリマーの誘導体化、（２）ヒドロゲルの重合および（３）基板表面への誘導体化ヒドロゲルの結合は、強い尿素またはウレタン（カルバメート）結合の形成を伴う。これらの結合は、マイクロスポットのアレイに機械的完全性を付与し、バイオチップの半減期を著しく延長させる。
【００３５】
一般的にヒドロゲルマイクロスポットの重合の後に捕捉物質をヒドロゲル内に加えることが好ましく、時折、単純拡散がこれを達成するための有効でない手段となることがある。速やかにヒドロゲル内に拡散する小分子は、後続の使用の過程においてヒドロゲルから拡散により容易に流出し、それによりこれらの結合物質の消失をもたらす。したがって、そのような容易に拡散できる物質、例えば、小分子およびペプチドの場合、そのような物質を、マトリックス内への拡散の後にポリマーマトリックスに共有結合により結合させることが好ましい場合がある。これを達成するための１つの好ましい手段は、架橋を行うのに適した部分、例えば、ポリマー内にその組成の一部として含まれている、またはポリマー内に拡散する小分子に結合している光活性化または化学的架橋試薬を用いることである。
【００３６】
これと対照的に、より大きい捕捉物質、例えば、タンパク質およびＤＮＡの大きいセグメントは、受動拡散によってヒドロゲルマトリックス内に効率よく移動しない可能性がある。より大きい化学種のマトリックス内への拡散を促進するために、タンパク質の等電点と異なるｐＨ値を有する溶液中の実効電荷を有する化学種、例えば、タンパク質の制御された移動を引き起こすように電界をかけることができる。この方法は、「電気泳動」と呼ばれている。ヒドロゲルマイクロスポットが荷電化学種の泳動路内にある場合、荷電化学種は、受動拡散力に加えて、印加した電界により加えられる追加の力を受け、それによりヒドロゲルマイクロスポット内へのその挿入が加速される。この電界促進拡散の利点は、これらのより大きい捕捉物質が後続の分析段階でヒドロゲルマトリックスから受動拡散により容易に出ないことである。
【００３７】
これまで、ヒドロゲルマイクロスポットにより占有されていない基板表面は、分析試薬、標的分子または他のそのような物質によるその後の非特異的で、望ましくない付着を減少させるために物質で処理されていた。そのようなことは、分析試薬が表面に非特異的に結合する可能性があり、それにより表面から観測されるバックラウンドシグナルの量を増加させ、それにより分析目的のためのヒドロゲルマイクロスポットの有効性を減少させる適用例において重要であると考えられた。そのような露出表面領域の処理は、活性化ポリエチレングリコールポリマー、ウシ血清アルブミンおよび他のそのようなブロッキング試薬の塗布などであった。本発明は、そのような段階の必要を不要にするものである。しかし、所望ならば、そのようなものを依然として用いることはできよう。
【００３８】
基板上での重合の後、まだ水和されているときのヒドロゲルマイクロスポットは、好ましくは少なくとも約２０μｍの厚さ、より好ましくは少なくとも約３０μｍの厚さ、最も好ましくは少なくとも約５０μｍ〜１００μｍの厚さである。脱水が徐々に起るので、すべての方向の収縮が起るが、再水和によって元の体積のほとんどが戻る。ヒドロゲルから形成されるマイクロスポットは、一部のシステムで以前に使用されていた矩形のゲルセルと異なり、しばしば一般的に楕円形である。そのような全体的なサイズがより大きいので、かなりの量の捕捉物質をゲルマイクロスポットに固定化することができ、それにより、バイオチップのより低い検出限界が低くなり、その使用が容易になる。ポリマー溶液の粘度を低下させ、バイオチップ基板上へのマイクロスポッティングのためにこれまでに用いられてきた分配メカニズムに適切な修正を加えることにより、より小さい個別のマイクロスポットを形成させることができ、非常に高密度のバイオチップアレイが可能になる。ウェルを有する基板を用いる場合、マイクロスポットをウェルの底部に沈着させる。
【００３９】
重合ヒドロゲルマイクロスポットの細孔内に種々の捕捉物質を固定化するために３Ｄマイクロスポット付着バイオチップの作製の後に、マイクロアレイを、溶液、通常、固定化捕捉物質と多孔質ヒドロゲル材料との結合を可能にするサイズの標的を含む水溶液と接触させる。分析物を含む溶液との接触を結合が起るための十分な時間、所望の温度で維持する。この期間は、インキュベーション期間と呼ぶことができる。問題の分析によって、試薬の多く、例えば、サンドイッチアッセイにおける二次抗体は「粘着性タンパク質変種」、すなわち、基板自体、例えばガラスに付着または結合する傾向を有するものであってよいことがわかる。そのようなことが起るならば、検出可能なシグナルがその後加えられるとき、例えば、Ｃｙ３で標識されたＴＳＡ（チラミドシグナル増幅）が導入されるとき、ＴＳＡは、多孔質ヒドロゲル中のプローブにより結合されていた標的に存在する二次抗体と結合するだけでなく、ガラスに付着していた二次抗体とも結合する。そのようなことが起る場合、マイクロアレイからのシグナルをレーザースキャナを用いて蛍光標識をイメージングすることにより測定するとき、ガラス上に高いバックグラウンドノイズの発生がある。分析物溶液が捕捉物質により封鎖されるが、ガラスまたは他の基板に非特異的に付着する傾向を同様に有する標識タンパク質を含む場合に、同様な状況が起り得る。
【００４０】
マイクロアレイを読み取ることを妨害するようなバックグラウンドノイズを発生するこのような傾向は、溶解および／または懸濁分析物を含む溶液とのインキュベーションの段階により分析手順が完了するまで、本質的に無視することができる。インキュベーションおよび／または標識後、読み取りの前に、マイクロアレイを、マイクロアレイの表面の個々のマイクロスポットの外にある非特異的に結合した標的を効果的に除去する、あるいはそのような標的の少なくとも標識部分を除去する適切な消化剤を含む１段階洗浄操作に供する。用いる消化剤は、多孔質ヒドロゲルマイクロスポット内の捕捉物質に特異的に結合している標識標的が影響を受けない状態に維持されるような方法で加える。
【００４１】
消化剤は、後により詳細に述べるように、多孔質ヒドロゲルマイクロスポット内に入ることを妨げるのに十分に大きいサイズのマイクロスフェアまたは微細固体粒子等にコーティングとして結合させることができる。用いる消化剤の選択は、分析液体中の物質の組成および、特に基板表面に非特異的に結合または付着する最も大きい傾向を有する成分に依存する。例えば、分析物がタンパク質である場合には、消化酵素、すなわちプロテアーゼを消化剤として用いることができ、分析物が細胞溶解物、すなわち細胞膜の断片である場合には、消化剤はリソソームであってよい。プロテアーゼは、パパインおよびペプシンのようなエンドペプチダーゼであってよく、あるいはカルボキシペプチダーゼのようなエキソペプチダーゼであってよい。
【００４２】
プロテアーゼを用いる場合には、一般的に次の２つの因子に基づいて選択する。すなわち、１）分析液中の抗体を消化するそれらの能力、および２）それらの最適作用温度およびｐＨ範囲。これに基づいて、次の３つのプロテアーゼが一般的に好ましい。すなわち、抗体の重鎖を切断し、あらゆる種類のタンパク質に特異的でないパパインおよびペプシン、ならびにペプチド結合を切断し、ペプチドアミドの加水分解を触媒するので、タンパク質の一般的な消化に用いられるプロテイナーゼＫである。これらのプロテアーゼの作用温度は約２５℃〜３７℃であり、最適ｐＨは約２〜８である。より具体的には、パパインは、ＲＴおよびｐＨ＝６；ペプシンは、ＲＴおよびｐＨ＝２；およびプロテイナーゼＫは、３７℃およびｐＨ＝７．５である。これらの温度およびｐＨ値は、非常に多くのタンパク質の使用環境に事実上適合し、それらを変性させない。
【００４３】
消化剤は、巨大分子または固体粒子に付着させる。サイズが多孔質ヒドロゲルマイクロスポット内に入ることを妨げるようなものである限り、例えば、金粒子、有機マイクロスフェア、デンドリマーまたは巨大タンパク質複合体を用いることができる。基板表面上に非特異的に結合した物質に対して消化剤を十分かつ効果的に提示するために、粒子はサイズが少なくとも１ミクロンであり、好ましくは粒子はサイズが約５０ミクロンより大きくないことが好ましい。このサイズ範囲のアガロース製のマイクロスフェアが市販されており、都合よく用いることができる。そのようなマイクロスフェアは、上記の３つの好ましいプロテアーゼであるパパインまたはペプシンまたはプロテイナーゼＫで被覆することができる。分析が、基板表面に非特異的に付着する可能性がある、または抗体および他のタンパク質の基板への結合をもたらす可能性がある根本的に異なる抗体が存在するようなものである場合には、異なる消化剤を用いる第２のフォローアップ洗浄を行うことができるが、単一の１段階洗浄で通常十分であると予想される。１つの選択肢として、異なるプロテアーゼで被覆したマイクロスフェアを同じ１段階洗浄の一部として用いることができよう。
【００４４】
洗浄は、プロテアーゼがタンパク質性物質に接触し、消化することを可能にする適切な時間にわたってある程度撹拌しながら行うことが好ましい。一般的に、洗浄は１分間から約９０分間までの時間にわたって行う。約３０分間の洗浄がしばしば用いられる。
【００４５】
洗浄の完了の後、マイクロアレイを場合によって洗浄緩衝液ですすいでもよい。しかし、多くの場合、そのようなすすぎは必要でない。消化されたタンパク質性物質を洗浄液で除去し、微細粒子も同様にマイクロアレイの表面から除去する。洗浄、および自由選択のすすぎの完了の後、タグが分析液中の潜在的標的上に存在していなかった場合、検出可能なシグナルを出すタグでマイクロアレイを標識する。
【００４６】
標識（または「タグ」）は、標的または分析物に結合させることができ、その検出および／または定量を可能にする置換基を指す。例としては、32Ｐ、33Ｐ、35Ｓのような放射性標識、蛍光、化学発光または着色化合物のような比色指示薬、ビオチンのようなリガンド、ならびに質量または他の分光学的特性により区別できる化学基などがある。より具体的な例または適切な標識としては、キサンチン色素、ローダミン色素、ナフチルアミン、ベンゾキサジアゾール、スチルベン、ピレン、アクリジン、シアニン３（Ｃｙ３）およびシアニン５などがある。標識またはタグは、分析物の一部として、例えば、プライマーの一部として直接的に核酸に取込むことにより導入するか、またはタンパク質または他の分析物との化学反応もしくは酵素反応により付加することができる。そのような標識は、検出可能なシグナルを含んでいてよく、あるいは検出可能なシグナルを出す物質がその後ハイブリッド形成またはアニールされる中間リガンドを含んでいてよい。検出可能なシグナルを出す物質のそのような付加は、洗浄段階の前または後に行うことができる。
【００４７】
洗浄後、および適切な緩衝剤含有溶液で場合によってすすいだ後、マイクロアレイを読み取りに供する。含まれる検出可能なシグナルが蛍光性である場合、マイクロアレイをレーザースキャナまたは何らかの同等な装置を用いた蛍光イメージングに供する。異なる種類の比色標識を用いる場合、または放射性標識もしくは他の何らかの既知のカテゴリーのものを用いる場合、適切なスキャナ／検出器をその代わりに用いてマイクロスポットからのシグナルを測定する。
【実施例】
【００４８】
以下の実施例は、本発明を実施するための発明者に現在知られている最良の態様を含むが、これらの実施例は例示のために示したものにすぎず、添付の請求の範囲により当然定義されている本発明の範囲を限定するものではない。
【００４９】
実施例１
バイオチップ上のタンパク質−ＤＮＡ相互作用
この実験では、一本鎖ＤＮＡを最初にヒドロゲルマイクロスポットに結合させた後、ハイブリッド形成させて、標的タンパク質を封鎖するのに有効である二本鎖捕捉物質を調製する。
【００５０】
５’アミノ修飾一本鎖細菌λリプレッサー結合配列ＯＲ２ＯＲ１（ｗｔ）および結合部位に単一塩基突然変異を有するその突然変異体（ｍｕｔ）を、３．７５％ＨＹＰＯＬ（商標）ＰｒｅＭＡ  Ｇ−５０ポリウレタンプレポリマー中１３０μＭでアミノシラン化スライド上にプリントする。本システムの除去の妥当性の確認を行うために、４種類のタンパク質系を、ガラス表面のフィブリノーゲン、細胞溶解物、ＩＬ−５およびＮＦｋＢ、４種類のタンパク質系の各々に対する対応する一次抗体および二次抗体に個別に結合させる。プリントしたスライドを個別ハイブリッド形成チャンバーに封入し、それらの対応する相補性配列と３ｘＳＳＣ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2中１μＭで、４５℃、１８時間にてハイブリッド形成させる。次いで、得られた二本鎖ＤＮＡを、水溶液中の結合緩衝剤（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、２．５μｇ／ｍｌポリ（ｄＡ−ｄＴ）、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭ  ＤＴＴ）中で１．５μｇ／ｍｌ  Ｃｙ３標識細菌ファージラムダリプレッサーλＣＩとともにインキュベートする。この場合、各種のタンパク質系をガラス表面のフィブリノーゲン、細胞溶解物、ＩＬ−５およびＮＦｋＢ、４種類のタンパク質系の各々に対する対応する一次抗体および二次抗体に個別に結合させることを含める。インキュベーションは、室温で２時間である。Ｃｙ３標識λＣＩをインキュベーションの終了時に除去し、各スライドのサンプルを、それぞれパパイン、ペプシンおよびプロテイナーゼＫで被覆した１ミクロンのアガロースマイクロスフェアを含む液体でそれぞれ洗浄する。洗浄は、約２７℃で約７のｐＨで３０分間行う。次いで、各スライドを結合緩衝液で、次いで脱イオン化Ｈ2Ｏで簡単にすすぐ。各スライドについて、存在する場合には二次抗体に結合するＴＳＡをＣｙ３で標識する。次いで、それをＧＳＩレーザースキャナによりイメージングする。別のスライドについて、二本鎖ＤＮＡを製造業者のプロトコールに従ってＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）で染色し、その総ＤＮＡ含量を得るためにＧＳＩレーザースキャナにより視覚化する。
【００５１】
Ｃｙ３標識λリプレッサーのその天然オペロンｄｓＤＮＡ配列に対する結合は、対応するマイクロスポットにおける蛍光シグナルの増加により示される。特定の突然変異体スポットにおける強い蛍光が存在しないことは、相互作用が配列特異的であることを示している。プリントスライドのＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（二本鎖ＤＮＡ染色）染色蛍光とλリプレッサーからのＣｙ３蛍光との比較により、それが野生型ＯＲ２ＯＲ１配列に関連するＣｙ３シグナルを生じさせる不均一にプリントされたＤＮＡに対するあらゆる非特異的タンパク質結合というよりも寧ろ、配列特異的λリプレッサー−λオペロン相互作用であることが確認される。突然変異体配列と比較して野生型配列に対する結合のシグナル強度に１００倍の差があることから、ヒドロゲルマトリックス内に固定化されていた二本鎖ＤＮＡに対する反応の特異性が確認される。マイクロスポットの周囲のスライドの領域からの有意なシグナルが存在しないことは、マイクロスポット内の複合体に影響を及ぼさずに非特異的に結合したタンパク質を除去するプロテアーゼ被覆マイクロスフェアの有効性を示している。
【００５２】
実施例２
抗原−バイオチップ
この実験では、捕捉物質としての抗原をアンカリングするためのマトリックスとしてヒドロゲルプラットフォームを用いる。抗原−抗体相互作用は、様々な生物学的測定法に日常的に用いられており、いずれかの成分（抗体または抗原）をアンカリングする能力は、望ましい特徴である。
【００５３】
実施例１で述べた方法を用いて、タンパク質抗原であるヒトトランスフェリン（０．２ｍｇ／ｍｌ）をアミン被覆ガラススライド上の５％トレハロース、２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む３．３％ヒドロゲルに種々の希釈度で直接固定化する。本発明を検定するために、ＩＬ−５をガラス表面に誘引することによりスライドに結合させる。スライドを、水溶液中の種々の濃度の抗ヒトトランスフェリンを含むマウス腹水とともに１時間インキュベートする。インキュベーションの後、スライドを最初に、パパインで被覆したアガロースマイクロスフェアを含む液体で２５℃、ｐＨ６で３０分間洗浄し、次いで、毎回ＰＢＳＴを用いて１０分間３回すすぐ。結合したマウス抗トランスフェリン抗体を、Ｃｙ３標識ロバ抗マウスＩｇＧおよびＩＬ−５に対するＣｙ３標識抗体とともにスライドをインキュベートした後、レーザースキャナイメージングにより視覚化する。３桁の希釈度、すなわち０．１〜０．００１にわたり線型用量反応が認められる。この用量−反応関係は、ヒドロゲルマトリックス内に固定された抗原の機能性、および測定法全体の一部としてのマトリックス内への抗体の逐次拡散を支持するヒドロゲルマトリックスの透過性を示している。マイクロスポットの周囲のスライドの領域からの有意なシグナルが存在しないことは、マイクロスポット内の複合体に影響を及ぼさずに非特異的に結合したタンパク質を除去するプロテアーゼ被覆マイクロスフェアの有効性を示している。
【００５４】
実施例３
抗体−バイオチップ
この実施例では、抗原を固定するのと対照的に、抗体をヒドロゲルマトリックス内に固定する。
【００５５】
実施例１の方法に従って、抗ヒトトランスフェリン、抗ＢＳＡおよび抗ＰＳＡ抗体（０．４〜０．８ｍｇ／ｍｌ）をアミノシラン化ガラススライド上の５％トレハロース、２ｍｇ／ｍｌウシＩｇＧおよび０．５％グリセロールの存在下で３．３％ヒドロゲル内に固定化した。スライドを水溶液中でフィブリノーゲンと接触させて、ガラス基板に非特異的に結合させ、次いで、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴ中１ｍｇ／ｍｌの濃度の個々のＣｙ標識抗原およびフィブリノーゲンに対するＣｙ３標識Ａｂｓとともに室温で一夜インキュベートする。最初に、パパインで被覆したアガロースマイクロスフェアを含む液体で２５℃、ｐＨ６で３０分間洗浄し、ＰＢＳＴですすいだ後に、レーザースキャナイメージングにより、結合したタンパク質を視覚化する。マイクロアレイ上の対応する抗体の部位における標識標的タンパク質の存在は、ヒドロゲルマトリックスにおける抗体の機能性の保持を示している。マイクロスポットの周囲のスライドの領域から有意なシグナルが存在しないことは、マイクロスポット内の複合体に影響を及ぼさずに非特異的に結合したタンパク質を除去するプロテアーゼ被覆マイクロスフェアの有効性を示している。
【００５６】
実施例４
多層ＥＬＩＳＡ検定法
より複雑な結合相互作用を支持する能力もヒドロゲルマトリックスの望ましい特徴であり、この実施例では、ヒドロゲルマイロスポットは、抗体を第１の結合物質としてアンカーする。その抗原のその後の特異的局在化に続いて、視覚化のためのさらなる結合事象が行われる。
【００５７】
アミノシラン化ガラススライド上にマイクロスポットを形成させるために、ＮＦｋＢモノクローナル捕捉抗体を５％トレハロース、２ｍｇ／ｍｌウシＩｇＧを含む３．３％ヒドロゲル内に直接固定化する。スライドを水溶液中、室温で適切に混合しながらＮＦｋＢに対するマウス抗体とともに１時間インキュベートする。１５分間のＰＢＳＴによるすすぎを２回行った後、スライドをビオチニル化ラットモノクローナル抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＤ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）とともに室温で１時間インキュベートする。１５分間のＰＢＳＴ洗浄により遊離の抗体を除去する。次いで、スライドを、ペプシンで被覆した１ミクロンのアガロースマイクロスフェアを含む液体で室温（ＲＴ）でｐＨ２で約３０分間洗浄した後、ＰＢＳＴで２回すすぐ。その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンをスライドに加えて室温でさらに１時間インキュベートする。推奨プロトコールに従ってストレプトアビジン−ＨＲＰを十分に洗浄した後に、ＴＳＡ試薬システムからのＣｙ３−トリアミド基質をスライドに加えてすべてのプリントスポットを完全に覆う。非反応基質を洗い落とした後、スライドをレーザースキャナイメージングにより分析する。蛍光シグナルの８倍の増加は、ヒドロゲル内のアンカリング抗体による結合抗原の存在を示す。マイクロスポットの周囲のスライドの領域からの有意なシグナルが存在しないことは、マイクロスポット内の複合体に影響を及ぼさずに非特異的に結合したタンパク質を除去するプロテアーゼ被覆マイクロスフェアの有効性を示している。
【００５８】
実施例５
多層小分子媒介（ＣａＭ／カルシニューリン）
以下の実施例は、小分子により媒介される複数のタンパク質相互作用の使用を示す。
【００５９】
実施例１の方法に従って、マウス抗ウシ脳カルシニューリンモノクローナル抗体（０．４ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）、ヒツジ抗ウシカルモジュリン抗体（０．２ｍｇ／ｍｌ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）および対照ウシＩｇＧ（０．４ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれアミン被覆ガラススライド上の５％トレハロース、２ｍｇ／ｍｌウシＩｇＧを含む３．３％ヒドロゲル内に直接固定化する。その後、スライドを水溶液中２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）、１３０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０μｇ／ｍｌポリグルタミン酸中０．１ｍｇ／ｍｌウシカルシニューリンとともに一夜インキュベートする。Ｃｙ３標識ニワトリカルモジュリンをＰＢＳＴ、１％ＢＳＡ中１ｍＭ  ＣａＣｌ2または５ｍＭ  ＥＤＴＡの存在下でカルシニューリン処理スライドに室温で１時間結合させる。次いで、スライドを、ペプシンで被覆した１ミクロンのアガロースマイクロスフェアを含む液体で室温（ＲＴ）でｐＨ２で約３０分間洗浄した後、ＰＢＳＴで２回すすぐ。結合したカルモジュリンをＣｙ３励起および発光波長でレーザースキャナイメージングにより視覚化する。カルシウムの非存在の場合と比較したシグナル強度の６倍の増加が、カルシウムの存在下での抗カルシニューリン抗体位置で示され、タンパク質と小分子に関する複雑な生体分子相互作用を支持するヒドロゲルマトリックスの能力を示し、そのようなことがプロテアーゼによるかかる処理による影響を受けないことをさらに示している。マイクロスポットの周囲のスライドの領域からの有意なシグナルが存在しないことは、マイクロスポット内の複合体に影響を及ぼさずに非特異的に結合したタンパク質を除去するプロテアーゼ被覆マイクロスフェアの有効性を示している。
【００６０】
実施例６
バイオチップ上のα−２−マクログロブリン−トリプシン相互作用
（電界を用いる負荷）
アルファ−２−マクログロブリンは、血液中に循環してプロテアーゼに特異的に結合し、中和する巨大血漿タンパク質（ｍｗ８００，０００）である。これは、過度のプロテアーゼ活性から身体を保護し、身体がそれ自体を「消化」することを本質的に妨げるメカニズムである。アルファ−２−マクログロブリンとトリプシンのようなプロテアーゼとの結合は非常に強く、アガロースビーズに固定化されたアルファ−２−マクログロブリンは、トリプシンおよび他のプロテアーゼをアフィニティ精製するのに用いられている。
【００６１】
３組のヒドロゲル微小滴をアミン誘導体化ガラス上にスポットする。この際、フルオレセイン標識タンパク質の将来の非特異的結合を阻害する努力は払わない。ヒドロゲルマイクロスポットはそれぞれイソシアネート官能性ＨＹＰＯＬ（商標）ＰｒｅＭＡ  Ｇ−５０ポリウレタンプレポリマーを含み、重合は水溶液を加えて開始し、重合速度をｐＨと温度により制御する。第１の組のそのようなヒドロゲルマイクロスポットに５ｍｇ／ｍＬ  ＰＢＳの濃度の５０μＬの水溶液を用いてα−２−マクログロブリンを加える。α−２−マクログロブリンの高分子量がヒドロゲルマイクロスポット内への速やかな拡散を制限し、小電極系により加えられるわずかな電流（２．５〜５ｍＶ）を用いて拡散速度を増加させる。α−２−マクログロブリンがヒドロゲルマイクロスポット内に一旦拡散すれば、その大きい分子量がその後のマイクロスポットからの有意な拡散を妨げる。トリプシンに結合しないことが知られているので、陰性対照タンパク質を得るためにフェリチンを用いる。同じ条件下で同じ電極系と小電流を用いて、フェリチンを第２の組のヒドロゲルマイクロスポット内に同様に拡散させる。第３の組の小滴にはタンパク質は加えずに、追加の陰性対照とする。
【００６２】
次いで、３組のマイクロスポットのすべてをＦＩＴＣ標識トリプシンに約１５分間曝露させ、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ、ｐＨ７．４で約５分間すすぐ。次いで、スライドを、ペプシンで被覆した１ミクロンのアガロースマイクロスフェアを含む液体で室温でｐＨ２で約３０分間洗浄した後、ＰＢＳＴで２回すすぐ。蛍光強度をＣＣＤカメラを用いて測定する。マイクロスポットの周囲のスライドの領域からの有意なシグナルが存在しないことは、マイクロスポット内の複合体に影響を及ぼさずに非特異的に結合したタンパク質を除去するプロテアーゼ被覆マイクロスフェアの有効性を示している。
【００６３】
結果は、ＦＩＴＣ標識トリプシンがヒドロゲルマイクロスポット内のその天然のリガンドであるα−２−マクログロブリンに特異的に結合し、陰性対照タンパク質であるフェリチン、ヒドロゲル自体、またはガラス基板に対する検出可能な結合活性がほとんどないことを示している。
【００６４】
本発明を発明者らが現在考える最良の態様を含む各種実施形態に関して記述したが、当業者に明らかであるような変更または修正は、本明細書に添付の請求の範囲に記載されている発明の範囲から逸脱することなく行うことができる。例えば、ＦＩＴＣおよびＣｙ３のような特定の発蛍光団を用いたが、他の発蛍光団または他のリポーターまたは検出可能なシグナルをほかの選択肢として用いることができる。異なる捕捉物質を含む複数のマイクロスポットを有するバイオチップの使用の利点はあるが、特定の状況では、１つの捕捉物質のみを含むバイオチップが適切である可能性がある。
【国際調査報告】
2008510167.tif 000002
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