(57)【要約】  本発明は、水性二相系を用いた流体からのＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）の精製のための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性二相分配を用いた少なくとも１つの段階を含んで成る、流体からＩＬ−１８ＢＰを精製するための方法。
【請求項２】
水性二相系がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）相及び塩相を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＥＧが約２０００〜約１２０００の範囲の分子量を有する、請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
ＰＥＧが約１００００の分子量を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
塩相が（ＮＨ4）ＳＯ4を含んで成る、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
塩相がＫＨ2ＰＯ4を含んで成る、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項７】
塩相が（Ｎａ2）ＳＯ4を含んで成る、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
（Ｎａ2）ＳＯ4の初期濃度が、約２０％［ｗ／ｗ］又は約１４％［ｗ／ｗ］又は約１２％［ｗ／ｗ］又は約１０％［ｗ／ｗ］又は約８％［ｗ／ｗ］又は約６％［ｗ／ｗ］又は約４％［ｗ／ｗ］又は約２％［ｗ／ｗ］未満である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＰＥＧが、約３５％［ｗ／ｗ］又は約３０％［ｗ／ｗ］又は約２５％［ｗ／ｗ］又は約２０％［ｗ／ｗ］又は約１５％［ｗ／ｗ］又は約１２％［ｗ／ｗ］又は約１０％［ｗ／ｗ］又は約５％［ｗ／ｗ］未満の濃度で用いられる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
二相の濃度が以下の式により計算される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法：
ｙ＝−２．５１０８ｘ＋３５．１５９
｛式中、ｙ＝ＰＥＧ％［ｗ／ｗ］、ｘ＝（Ｎａ2）ＳＯ4％［ｗ／ｗ］｝。
【請求項１１】
二相の濃度が以下の式により計算される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法：
ｙ＝−２．５５７３ｘ＋３５．７５７
｛式中、ｙ＝ＰＥＧ％［ｗ／ｗ］、ｘ＝（Ｎａ2）ＳＯ4％［ｗ／ｗ］｝。
【請求項１２】
二相の濃度が以下の式により計算される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法：
ｙ＝−２．１１８２ｘ＋３５．３５５
｛式中、ｙ＝ＰＥＧ％［ｗ／ｗ］、ｘ＝（Ｎａ2）ＳＯ4％［ｗ／ｗ］｝。
【請求項１３】
ｐＨ４〜９の範囲のｐＨで実施される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ｐＨ５で実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ｐＨ７で実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
室温で実施される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
水性二相系を用いる段階が捕獲段階である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
１以上の追加の精製段階を更に含んで成る、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
追加の精製段階が、金属イオンアフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーから選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
１つ以上の限外ろ過段階を更に含んで成る、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
１つ以上のウイルス除去ろ過段階を更に含んで成る、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
流体が、細胞培養回収物、細胞溶解物、細胞抽出物、組織抽出物、血漿、血清、乳、尿、腹水、植物抽出物、又は初期のタンパク質精製段階に由来する画分から選択される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
細胞培養回収物が、未清澄化粗細胞培養回収物である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
細胞培養回収物が、清澄化粗細胞培養回収物である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
細胞培養回収物が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来である、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ＣＨＯ細胞が懸濁液中で培養される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＩＬ−１８ＢＰがヒト組み換えＩＬ−１８ＢＰである、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法により得られたＩＬ−１８ＢＰを含んで成るタンパク質調製物。
【請求項２９】
ＩＬ−１８ＢＰの精製のための水性二相系の使用。
【請求項３０】
流体からのＩＬ−１８ＢＰの捕獲のための水性二相系の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質精製の分野におけるものである。より具体的には、それは水性二相分配を用いた流体からのＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）の精製のための段階に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、一般的に「生物学的製剤」とも呼ばれている薬物として商業的に重要になってきた。商業規模でのタンパク質の精製のための費用効果的で費用効率の高い方法の開発は、最も大きなチャレンジの１つである。多くの方法がタンパク質のラージスケールの調製に利用可能であるが、粗生成物、例えば体液又は細胞回収物（ｈａｒｖｅｓｔ）は所望の生成物だけでなく不純物も含んでおり、不純物は所望の生成物から分離することが困難である。更に、タンパク質の生物源は、通常物質の複合混合物を含む。
【０００３】
所望のタンパク質産物を発現する細胞からの細胞培養調節培地などの生物源は、特に細胞が無血清培地中で培養される場合には、より少ない不純物を含み得る。しかし、保健機関は、ヒトへの投与を意図したタンパク質に関して高い水準の精製を要求する。更に、多くの精製方法は、所定のタンパク質の生物活性を損ない得る低い若しくは高いｐＨ，高い塩濃度又は他の極限条件の適用を必要とする段階を含み得る。従って、任意のタンパク質に関して、タンパク質の生物活性を保持しながら十分な精製を可能にする効率的な精製方法を確立することが課題である。
【０００４】
タンパク質精製は、一般的に少なくとも３つの局面又は段階を含んで成る。すなわち、捕獲段階（そこでは、所望のタンパク質がＤＮＡ又はＲＮＡなどの流体中に存在する他の成分から分離され、理想的には予備精製をもたらす）、中間体段階（そこでは、大きさ及び／又は物理的／化学的特性が類似した汚染物質からタンパク質が単離される）、及び例えばヒト又は動物における治療投与を意図したタンパク質から必要とされる高いレベルの精製をもたらす最終的な洗練段階である。
【０００５】
典型的に、タンパク質精製段階は、所定の流体中に存在する化合物のクロマトグラフィー分離に基づく。広く適用されるクロマトグラフィー法は、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー又は逆相クロマトグラフィーである。
【０００６】
水性二相系（Ａ２ＰＳ）は、伝統的なクロマトグラフィー方法に代わるものである。Ａ２ＰＳ方法は、タンパク質の精製に関する先行技術において用いられてきた（表１を参照）。
【０００７】
【表１】
2008504346.tif 000002
【０００８】
部分的に精製された血清を含む産生培地からのインターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−β）の精製は、３〜７．１０Ｅ１０6  ＩＵ／ｍｇの特異的活性を有する、３５０倍精製され且つ１０倍濃縮されたＩＦＮ試料をもたらした（Ｍｅｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。しかし、工業規模の治療用タンパク質の精製に関するＡ２ＰＳの適用は、未だ制限されている。
【０００９】
Ａ２ＰＳは、２つの不混和水性相の間の標的分子の区画に基づいている（例えば、ＰＥＧ／塩系）。この系は、双方の相の高い水分含量（７０〜８０％ｗ／ｗ）がタンパク質の分解を最小にする高い生物適合性及び低い界面張力を意味するので、タンパク質抽出に適合する。Ａ２ＰＳによるタンパク質精製の原理は、例えば米国特許第５，６９５，９５８号中のインスリン様成長因子ＩＧＦ−１の精製に関して例示されている。
【００１０】
適切な相系（ポリマー／ポリマー；ポリマー／塩．．．）の選択は、Ａ２ＰＳに基づいた精製方法における重要な段階である。この系は、相の間の標的タンパク質の高い選択的分配を示さなければならない。様々な生物源からのタンパク質のＡ２ＰＳ精製に用いられる組の例を、表２で説明する。
【００１１】
Ｈａｔｔｉ−Ｋａｕｌ，２０００から得た図５で説明するように、水性ポリマー二相系の組成は、通常相図の長方形形態において表される。垂直軸は、一般的に最上層において豊富である成分に関して用いられる。水のポリマー／塩  Ｘ，ポリマー／塩  Ｙ及びＳの量を混合する。１つの混合物の全体の組成は、相図上のポイントＡ１、Ａ２、又はＡ３の１つにより表される。混合物は２つの相に分離する。これらの二相の組成は、ポイントＴ及びＢにより表される。それらは交点（ｎｏｄｅ）と呼ばれ、双節線に位置する。双節曲線は、組成の２つのドメインを分離する線である：系が単一相であるところ（曲線の左下）及び相分離を観察することができるところ（曲線の右上）。共存する相の組成を表すポイントＢ及びＴをつなぐ線は、対応線と呼ばれている。共存する組成を特徴付ける交点Ｂ及びＴがこれらの混合物に由来するので、全体の混合物を表すポイントＡ１、Ａ２、又はＡ３は、同一の対応線上に位置しなければならない。
【００１２】
図５に示すように、同一の対応線上の異なるポイントにより表される異なる全体の組成の混合物は、同一の組成を有するが異なる体積の共存する相を有する二相系を生じさせる。２つの相の体積比は、セグメントＡＢ（上相）及びＡＴ（下相）の比によりグラフにより概算することができる。
【００１３】
表２：Ａ２ＰＳに基づいたタンパク質抽出の例
【表２】
2008504346.tif 000003
【表３】
2008504346.tif 000004
【表４】
2008504346.tif 000005
【００１４】
しかし、生物材料の区画を管理する機構は、未だ良く理解されていない。それは、以下の表３に記載した多くの因子に依存する。現在の実務で一般的に用いられる大部分は、相形成ポリマーの濃度及び分子量、塩のタイプ及び量、並びに添加物（通常無機塩）のタイプ及び濃度である。これらの因子は、より優れた分離を達成するためのタンパク質の分配を操作するのに最も重要なものとして一般的に考えられている。従って、治療用途を意図したタンパク質は構造（例えば、凝集、切断）及び機能の双方に関して完全に機能を保持しなければならないので、所定の起源から精製する所定のタンパク質のための適切なＡ２ＰＳ系を見出すのは極めて困難である。
【００１５】
表３：水性二相系における溶質の分配を導くことのできる因子
【表５】
2008504346.tif 000006
a水性の単一のポリマー−塩の系において、相形成塩のタイプ及び濃度は、２つのポリマー系における相形成ポリマーのものと等しい因子である。b溶質に対して特異的な親和性を有しない、低分子量の添加物、例えば無機塩、尿素など。c親和性リガンド、例えば薬物、トリアジン色素、有機形態、脂肪酸など。d溶質分子中の溶媒に接近可能な部分のトポグラフィーの除去、組み込み、又は改変をもたらす、化学的、酵素的処理などによる変化。
【００１６】
インターロイキン−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）は、尿からＩＬ−１８カラム上で初めにアフィニティー精製された天然の溶解性タンパク質である（Ｎｏｖｉｃｋ ｅｔ ａｌ．  １９９９）。ＩＬ−１８ＢＰは、インビトロでのＩＦＮ−γのＩＬ−１８誘導及びＮＦ−κＢのＩＬ−１８活性化を駄目にする。更に、ＩＬ−１８ＢＰはＬＰＳを注射したマウスにおいてＩＦＮ−γの誘導を阻害する。
【００１７】
ＩＬ−１８ＢＰ遺伝子はヒト第１１染色体に位置し、膜貫通ドメインをコードするエキソンは、ＩＬ−１８ＢＰ遺伝子を含んで成る８．３ｋｂのゲノム配列中に見出すことができない。これまでに、別のｍＲＮＡスプライシングにより生み出されるＩＬ−１８ＢＰの４つのイソフォームがヒトで同定された。それらは、ＩＬ−１８ＢＰ ａ、ｂ、ｃ、及びｄと指定され、全ては同一のＮ末端を共有するがＣ末端においては異なる（Ｎｏｖｉｃｋ ｅｔ ａｌ．  １９９９）。これらのアイソフォームは、ＩＬ−１８に結合する能力は様々である（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．２０００）。４つのヒトＩＬ−１８ＢＰ（ｈＩＬ−１８ＢＰ）アイソフォームのうち、アイソフォームａ及びｃは、ＩＬ−１８に対して中和容量を有することが知られている。最も豊富なＩＬ−１８ＢＰアイソフォームであるアイソフォームａは、速いオン−速度及び遅いオフ−速度を有して、ＩＬ−１８に対して高い親和性を示し、且つおよそ０．４ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を示す（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．２０００）。ＩＬ−１８ＢＰは脾臓中で構成的に発現し、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する。ＩＬ−１８のＩＬ−１８ＢＰとの相互作用に関連する残基は、コンピューターモデリングを用いて説明され（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．  ２０００）、そして類似のタンパク質であるＩＬ−１βのＩＬ−１ＲタイプＩとの間の相互作用に基づいて説明された（Ｖｉｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．  １９９７）。
【００１８】
ＩＬ−１８ＢＰは多くの細胞中で構成的に存在し（Ｐｕｒｅｎ ｅｔ ａｌ．  １９９９）、健康なヒトにおいて循環し（Ｕｒｕｓｈｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．  ２０００）、サイトカイン生物学において固有の現象を示す。ＩＬ−１８ＢＰのＩＬ−１８に対する高い親和性（Ｋｄ＝０．４ｎＭ）、並びに血液中に見出される高濃度のＩＬ−１８ＢＰ（ＩＬ−１８よりも２０倍のモル過剰）により、全てではないがほとんどの血液中のＩＬ−１８分子がＩＬ−１８ＢＰに結合することが推測された。従って、ＩＬ−１８に対する細胞表面の受容体と競合する循環ＩＬ−１８ＢＰは、抗炎症及び免疫抑制分子として作用し得る。
【００１９】
ＩＬ−１８ＢＰは、数多くの疾病及び疾患、例えば乾癬、クローン病、慢性関節リウマチ、乾癬関節炎、肝損傷、敗血症、アテローム性動脈硬化症、虚血性心疾患、アレルギーにおける治療タンパク質として提案されてきた。例えば、ＷＯ９９０９０６３、ＷＯ０１０７４８０、ＷＯ０１６２２８５、ＷＯ０１８５２０１、ＷＯ０２０６０４７９、ＷＯ０２０９６４５６、ＷＯ０３０８０１０４、ＷＯ０２０９２００８、ＷＯ０２１０１０４９、ＷＯ０３０１３５７７を参照のこと。
【００２０】
先行技術は、ＩＬ−１８ＢＰの精製方法について記載していない。
【発明の開示】
【００２１】
発明の概要
本発明は、水性二相分配に基づいたＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）に対する効率的な精製段階の開発に基づいている。
【００２２】
従って、第一の側面において、本発明は、水性二相系を含んで成る少なくとも１つの段階を含んで成る、流体からＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）の精製のための方法に関する。
【００２３】
本発明の第二の側面は、流体からＩＬ−１８ＢＰを精製するための水性二相系の使用に関する。
【００２４】
本発明の第三の側面は、本発明の方法により得られる精製されたＩＬ−１８ＢＰに関する。
【００２５】
本発明は、ＩＬ−１８ＢＰの精製方法のための段階の開発に基づいている。
【００２６】
本発明は、水性二相分配を用いた少なくとも１つの段階を含んで成る、流体からＩＬ−１８ＢＰを精製するための方法に関する。そのような水性二相系は、ＩＬ−１８ＢＰの精製の１つの段階として用いることができる。それは、他の精製方法に基づいて他の段階の中の１つの段階として用いることもできる。それは、更に精製方法の多段階において用いることができる。すなわち、２、３又はそれ以上の段階が、水性二相分配に基づいている。精製方法が水性二相系に基づいた１つ以上の段階を含んで成る場合、用いる個々の水性二相系は同一の系であるか、又は異なる系（例えば、異なるポリマー、塩など）に基づいていることができる。
【００２７】
本発明によると、水性二相系は、その相系が相間の標的タンパク質の高度に選択的な分配を提供する限り、２つの不混和相（例えばポリマー／ポリマー又はポリマー／塩の相）の任意の適切な相系であることができる。
【００２８】
ポリマーは、例えばデキストラン、ポリビニルアルコール、又はマルトデキストリンであることができる。好ましくは、水性二相系は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）相及び塩相を含んで成る。
【００２９】
本発明の精製により用いられるＰＥＧは、任意の適切な分子量を有することができる。好ましい実施態様において、ＰＥＧは、約２０００〜約１２０００の範囲の分子量を有し、それは約３０００、又は約４０００、又は約５０００、又は約６０００、又は約７０００、又は約８０００、又は約９０００、又は約１００００、又は約１１０００であることができる。ＰＥＧが約１００００の分子量を有することがより好ましい。
【００３０】
本発明の方法において用いることのできる適切な塩は、リン酸塩又は硫酸塩を含んで成る。塩相は、例えばＫＨ2ＰＯ4を含んで成ることができる。好ましくは、塩相は（ＮＨ4）ＳＯ4を含んで成る。或いは、塩相は（Ｎａ2）ＳＯ4を含んで成る。
【００３１】
ポリマー層中のポリマーの濃度は、様々であることができる。好ましい実施態様において、ポリマー、好ましくはＰＥＧの初期濃度は、約３５％［ｗ／ｗ］未満であり、約３０％［ｗ／ｗ］、２９％［ｗ／ｗ］、２８％［ｗ／ｗ］、２７％［ｗ／ｗ］、２６％［ｗ／ｗ］、２５％［ｗ／ｗ］、２４％［ｗ／ｗ］、％２３［ｗ／ｗ］、２２％［ｗ／ｗ］、２１％［ｗ／ｗ］、２０％［ｗ／ｗ］、１９％［ｗ／ｗ］、１８％［ｗ／ｗ］、１７％［ｗ／ｗ］、１６％［ｗ／ｗ］、１５％［ｗ／ｗ］、１４％［ｗ／ｗ］、１３％［ｗ／ｗ］、１２％［ｗ／ｗ］、１１％［ｗ／ｗ］、１０％［ｗ／ｗ］、９％［ｗ／ｗ］、８％［ｗ／ｗ］、７％［ｗ／ｗ］、６％［ｗ／ｗ］、５％［ｗ／ｗ］、４％［ｗ／ｗ］、３％［ｗ／ｗ］、２％［ｗ／ｗ］、又は１％［ｗ／ｗ］未満である。
【００３２】
塩相中の塩の濃度も、特にポリマー層に用いた濃度に依存して様々であることができる。好ましい実施態様において、Ｎａ2ＳＯ4は、約３０％［ｗ／ｗ］未満、２５％［ｗ／ｗ］、２０％［ｗ／ｗ］、１６％［ｗ／ｗ］、１５％［ｗ／ｗ］、１４％［ｗ／ｗ］、１３％［ｗ／ｗ］、１２％［ｗ／ｗ］、１１％［ｗ／ｗ］、１０％［ｗ／ｗ］、９％［ｗ／ｗ］、８％［ｗ／ｗ］、７％［ｗ／ｗ］、６％［ｗ／ｗ］、５％［ｗ／ｗ］、４％［ｗ／ｗ］、３％［ｗ／ｗ］、２％［ｗ／ｗ］、又は１％［ｗ／ｗ］である。
【００３３】
本発明の非常に好ましい実施態様においては、二相の濃度は以下の式に従って計算する：
ｙ＝−２．５１０８ｘ＋３５．１５９
｛式中、ｙ＝ＰＥＧ％［ｗ／ｗ］、ｘ＝（Ｎａ2）ＳＯ4％［ｗ／ｗ］｝。
【００３４】
本発明の更に非常に好ましい実施態様においては、二相の濃度は以下の式に従って計算する：
ｙ＝−２．５５７３ｘ＋３５．７５７
｛式中、ｙ＝ＰＥＧ％［ｗ／ｗ］、ｘ＝（Ｎａ2）ＳＯ4％［ｗ／ｗ］｝。
【００３５】
本発明のまた更に非常に好ましい実施態様においては、二相の濃度は以下の式に従って計算する：
ｙ＝−２．１１８２ｘ＋３５．３５５
｛式中、ｙ＝ＰＥＧ％［ｗ／ｗ］、ｘ＝（Ｎａ2）ＳＯ4％［ｗ／ｗ］｝。
【００３６】
本発明によると、本方法は、ｐＨ４〜ｐＨ９の範囲のｐＨで実施し、それは約ｐＨ４、ｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ７、ｐＨ８、又はｐＨ９で実施することができる。好ましくは、それは約ｐＨ５又は約ｐＨ７で実施する。
【００３７】
本発明の方法は、任意の適切な温度、例えば４℃、６．５℃、１３℃、１９．５℃、３０℃で実施することができ、好ましくはこの方法は室温で実施する。
【００３８】
好ましい実施態様において、本発明の水性二相系を用いた段階は捕獲段階である。すなわち、精製手順の初めの段階は、１つ以上の更なる段階を含んでなる。
【００３９】
本発明の精製段階は、粗物質中に存在する全ての汚染物質の＞１０％、＞２０％、＞３０％、＞４０％、＞５０％又は＞６０％又は更に＞７０％を除去することができる。本発明の精製段階により得られる収率は、＞５０％、＞６０％、＞７０％又は＞８０％又は更に＞９０％であることができる。
【００４０】
更に好ましい実施態様において、本発明の方法は、更に１つ以上の追加の精製段階を含んで成る。
【００４１】
好ましくは、追加の精製段階は、金属イオンアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及び逆相クロマトグラフィーから選択する。
【００４２】
疎水性電荷−誘導（ｃｈａｒｇｅ−ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）クロマトグラフィーは、好ましくは固定化リガンドとして４−メルカプトエチル−ピリジン（ＭＥＰ）を有する樹脂上で実施する。ＭＥＰ−Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（登録商標）は、本発明のフレームにおいて特に適した樹脂である。
【００４３】
イオン交換クロマトグラフィーは、好ましくはカルボキシメチル（ＣＭ）−樹脂を用いて実施する。
【００４４】
アフィニティークロマトグラフィーは、好ましくは固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーであり、キレートセファロースは、このクロマトグラフィー段階を実施するのに用いることのできる樹脂の例である。
【００４５】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、固定化リガンドとして、任意の既知のＨＩＣ樹脂、例えばアルキル−又はアリール−残基を有する樹脂上で実施することができる。ブチル−、オクチル−又はフェニル−セファロース（アガロース）は、そのようなＨＩＣ樹脂の例である。
【００４６】
逆相段階に有用な好ましい物質は、逆相Ｓｏｕｒｃｅ ３０ＲＰＣである。
【００４７】
非常に好ましい実施態様において、本発明の精製段階は以下の段階に続く：
ａ）流体を、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーにかける段階；
ｂ）金属イオンアフィニティークロマトグラフィーの溶出液を、疎水性荷電相互作用クロマトグラフィーにかける段階；
ｃ）疎水性荷電相互作用クロマトグラフィーの溶出液を、イオン交換クロマトグラフィーにかける段階；
ｄ）イオン交換クロマトグラフィーの貫流液（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を、疎水性相互作用クロマトグラフィーにかける段階；
ｅ）疎水性相互作用クロマトグラフィーの溶出液を、逆相クロマトグラフィーにかける段階。
【００４８】
好ましくは段階（ａ）の前に、流体を限外ろ過又はダフィルトレーション（ｄａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）にかける。
【００４９】
上記の段階（ａ）〜（ｅ）の順序が好ましいが、本発明の方法の段階は、精製タンパク質生成物を生じさせる任意の順序において実施することができる。
【００５０】
段階（ａ）は、キレートしたＺｎ2+イオンを有するキレートセファロースカラム、例えばキレートセファロース高速流カラム上で実施する。好ましくは、ＩＬ−１８ＢＰの結合は、ｐＨ８．５±０．１において、好ましくはこのｐＨを有する５０ｍＭの硫酸ナトリウム及び０．５ＭのＮａＣｌ中で実施する。溶出は、好ましくはｐＨ９．０±０．１において、例えばこのｐＨを有する０．０７５Ｍの酢酸アンモニウム中で実施する。
【００５１】
段階（ｂ）は、好ましくはＭＥＰ（４−メルカプトエチルピリジン誘導体）カラム、例えばＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ（登録商標）（ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）上で実施する。ＩＬ−１８ＢＰの結合は、好ましくはｐＨ６．１±０．１において、例えばこのｐＨを有するＰＢＳ １×＋１ ＮａＣｌ中で実施する。溶出は、好ましくはｐＨ８．４±０．１において、例えばｐＨ８．４±０．１を有する２０ｍＭのリン酸塩バッファー及び３５％のプロピレングリコール混合物中で実施する。
【００５２】
段階（ｃ）は、好ましくはカルボキシメチル−セファロース（ＣＭ）カラム上で実施する。これは、貫流液が更なる精製のために回収される段階である。この段階は、例えば塩及びｐＨ条件に関する具体的な状況において、不純物が樹脂に結合するがＩＬ−１８ＢＰは樹脂に結合しないという事実に基づいている。好ましくは、段階（ｃ）は、ｐＨ６．０±０．２において、例えば１ｍＭのＭＥＳ（Ｎ−モルホリノエタンスルホン酸）の存在下で実施する。
【００５３】
段階（ｄ）は、好ましくはフェニルセファロースカラム、例えばフェニル−セファロース高速流カラム上で実施する。好ましくは、ＩＬ−１８ＢＰの結合は、約ｐＨ９．１±０．２において、例えばこのｐＨを有する５０ｍＭのホウ酸ナトリウム及び０．９Ｍの硫酸アンモニウム中で実施する。フェニル−セファロースカラムからの溶出は、好ましくはｐＨ９．１±０．２で、高い塩濃度の存在下において、例えば５０ｍＭのホウ酸ナトリウム９．１±０．２、このｐＨを有する０．１５Ｍの硫酸アンモニウム中で実施する。
【００５４】
段階（ｅ）は、好ましくはＳｏｕｒｃｅ ３０ ＲＰＣカラム上で実施する。カラム物質に対するＩＬ−１８ＢＰの結合は、好ましくはｐＨ９．１±０．２において、例えば５０ｍＭのホウ酸ナトリウムバッファー中で実施する。溶出は、好ましくは勾配を用いて実施し、ＩＬ−１８ＢＰはアセトニトリル中の０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の約２８〜３２％が溶出する。
【００５５】
本発明の１つの段階、又は段階の（サブ）コンビネーションを実施する場合は、精製の段階（ａ）〜（ｅ）に関連した上記の条件を適用することもできることが理解される。
【００５６】
本精製方法の更に好ましい実施態様においては、１以上の限外ろ過段階を実施する。限外ろ過は、例えば標的タンパク質の濃縮、バッファー交換、又は前のクロマトグラフィー段階から得られる溶出液中の小さな分子量の成分の除去に有用である。この限外ろ過は、前の段階からの有機溶媒、ＴＦＡ及び塩の除去、バルクバッファー中のＩＬ−１８ＢＰの平衡化、及び所望の濃度への分子の濃縮を可能にする。このような限外ろ過は、例えば５ｋＤａ未満の分子量を有する成分を排除する限外ろ過媒体上で実施することができる。
【００５７】
好ましくは、限外ろ過は、段階（ｂ）及び（Ｃ）の間、及び／又は段階（ｅ）の後に実施する。より好ましくは、２つの限外ろ過の段階は、１つは段階（ｂ）及び（ｃ）の間に、１つは段階（ｅ）の後に実施する。
【００５８】
保管又は輸送を容易にするために、例えば本発明の物質を、本発明の任意の精製段階の前及び／又は後に凍結又は解凍することができる。
【００５９】
本発明の方法により精製したタンパク質がヒトへの投与を意図している場合、ウイルス除去の段階を更に含むことが有利である。好ましくは、ウイルス除去ろ過段階は、段階（ｄ）及び（ｅ）の間に実施する。ウイルス除去ろ過段階を段階（ｅ）の後に実施することが更に好ましい。より好ましくは、本方法は２つのウイルス除去段階を含んで成り、１つは段階（ｄ）及び（ｅ）の間に実施し、他方は段階（ｅ）の後に実施する。
【００６０】
ＩＬ−１８ＢＰが本発明により精製される流体は、好ましくは細胞培養回収物、細胞溶解物、細胞抽出物、組織抽出物、血漿、血清、乳、尿、腹水、植物抽出物、又は初期のタンパク質精製段階に由来する画分から選択される。
【００６１】
流体は、清澄化していない粗細胞培養回収物であるか又は清澄化した粗細胞培養回収物であることができ、そしてそれは、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来である。清澄化した粗細胞培養回収物は、例えば遠心分離又はろ過技術により細胞及び残がいが除去された細胞培養調節培地を指す。清澄化していない粗細胞培養回収物を出発物質として本発明の方法に用いる場合は、細胞及び残がいが存在する。以下の実施例に示す通り、本発明の精製段階は、前処理した清澄化していない細胞培養回収物からＩＬ−１８ＢＰを得ることが可能である。
【００６２】
ＩＬ−１８ＢＰを産生するＣＨＯ細胞は、懸濁液中で培養し、又は例えばマイクロキャリアなどの担体の表面に結合させることができる。好ましくは、細胞は懸濁液中で培養する。
【００６３】
本発明によると、精製すべきＩＬ−１８ＢＰは天然、すなわち天然に生じるＩＬ−１８ＢＰであることができる。従って、それは任意の天然源又は物質、例えば尿などの体液から精製することができる。
【００６４】
ＩＬ−１８ＢＰは、任意の動物又はヒト源から得ることもできる。好ましくは、精製すべきＩＬ−１８ＢＰはヒトであり、より好ましくは、それはＩＬ−１８ＢＰである。組み換えＩＬ−１８ＢＰは、原核生物発現系、例えばエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの細菌系において産生することができる。それは、真核生物発現系、例えば酵母、昆虫、又は哺乳動物細胞において産生することもできる。本発明によると、哺乳動物細胞、例えば動物細胞株、又はヒト細胞株においてＩＬ−１８ＢＰを発現することが好ましい。チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）は、ＩＬ−１８ＢＰの発現に特に適した細胞株の例である。
【００６５】
ＩＬ−１８ＢＰが溶解性の分泌タンパク質であるので、それはその天然のシグナルペプチドにより、又は異種のシグナルペプチド（すなわち用いる特定の発現系においてより効率的であり得る、別の分泌タンパク質から得られるペプチド）により、細胞培養上清に放出される。従って、ＩＬ−１８ＢＰが精製される流体は、好ましくは細胞培養上清、例えばＣＨＯ−細胞上清である。無血清培地（すなわち、ウシ胎仔又は他の動物源から得られる血清を含まない培地）中で培養した細胞の上清からタンパク質を精製することがより好ましい。
【００６６】
「ＩＬ−１８結合タンパク質」という用語は、本明細書中では「ＩＬ−１８ＢＰ」と同義的に用いられる。この用語は、ＷＯ９９／０９０６３又はＮｏｖｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９９で定義されたものなどのＩＬ−１８結合タンパク質に関する。ＩＬ−１８ＢＰという用語は、ＩＬ−１８結合タンパク質のスプライス変異体及び／又はアイソフォーム（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０００で定義されたもののような）、特にＩＬ−１８ＢＰのヒトアイソフォームａ及びｃを含む。本明細書中で用いる場合、「ＩＬ−１８ＢＰ」という用語は、ＷＯ９９／０９０６３で定義されているように、ＩＬ−１８ＢＰの突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ）、機能的誘導体、活性画分、融合タンパク質、循環的置換タンパク質及びスラット（ｓｌａｔ）を更に含む。
【００６７】
本発明の精製方法にかけるＩＬ−１８ＢＰは、グリコシル化又は非グリコシル化されていることができ、それは天然源、例えば尿素から得ることができ、或いは好ましくは組み換え技術により産生することができる。組み換え体発現は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような原核生物発現系、又は真核生物、好ましくは哺乳動物の発現系において実施することができる。
【００６８】
本明細書中で用いる場合、「突然変異タンパク質」という用語は、ＩＬ−１８ＢＰのアナログ、又はウイルス性ＩＬ−１８ＢＰのアナログを指す。それらにおいては、野生型ＩＬ−１８ＢＰ又はウイルス性ＩＬ−１８ＢＰと比較して得られる産物の活性が顕著に変化せずに、天然のＩＬ−１８ＢＰ又はウイルス性ＩＬ−１８ＢＰの１以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基により置換され、又は削除され、或いは１以上のアミノ酸残基がＩＬ−１８ＢＰ又はウイルス性ＩＬ−１８ＢＰの天然の配列に付加されている。これらの突然変異タンパク質は、既知の合成法及び／又は部位特異的突然変異誘発法、或いはそれらに適した任意の他の既知の技術により調製する。
【００６９】
本発明の突然変異タンパク質は、ストリンジェントな条件下でＩＬ−１８ＢＰ又はウイルス性ＩＬ−１８ＢＰ（ＷＯ９９０９０６３）をコードするＤＮＡ又はＲＮＡにハイブリダイズする、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸によりコードされるタンパク質を含む。「ストリンジェントな条件」という用語は、当業者が通常「ストリンジェントな」として意味する、ハイブリダイゼーション及びその後の洗浄条件を指す。Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｓｕｐｒａ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，§６．３及び６．４（１９８７，１９９２）を参照のこと。限定はせずに、ストリンジェントな条件の例としては、例えば５分間の２×ＳＳＣ及び０．５％のＳＤＳ、１５分間の２×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳ；３０〜６０分間の３７℃での０．１×ＳＳＣ及び０．５％のＳＤＳ、及びその後の３０〜６０分間の６８℃での０．１×ＳＳＣ及び０．５％のＳＤＳにおける試験下での、ハイブリッドの計算したＴｍより１２〜２０℃低い洗浄条件が挙げられる。当業者は、ストリンジェントな条件が、ＤＮＡ配列、オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、１０〜４０塩基）又は混合したオリゴヌクレオチドプローブの長さにも依存することを理解する。混合プローブを用いる場合、ＳＳＣの代わりに塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）を用いるのが好ましい。上記のＡｕｓｕｂｅｌを参照のこと。
【００７０】
同一性は、配列を比較することにより決定される、２つ以上のポリペプチド配列又は２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係を反映する。一般的に、同一性は、比較する長さの配列にわたって、２つのポリヌクレオチド又は２つのポリヌクレオチドそれぞれの、厳密なヌクレオチド対ヌクレオチド又はアミノ酸対アミノ酸の一致を指す。
【００７１】
厳密な一致が存在しない配列の場合、「同一性（％）」は決定することができない。一般的に、比較する２つの配列をアラインして、配列間の最大相関関係を得る。これは、アラインメントの程度を強化するために、１つ又は双方の配列における挿入「ギャップ」を含むことができる。同一性（％）は、比較するそれぞれの配列の全長にわたって決定することができ（いわゆる、グローバルアラインメント）、それは同一又は非常に似た長さ、又はより短い規定した長さの配列に特に適しており（いわゆる、局所的アラインメント）、それは等しくない長さの配列により適している。
【００７２】
２つ以上の配列の同一性及び相同性を比較するための方法は、当業界で周知である。従って例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，ｖｅｒｓｉｏｎ ９．１（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ Ｊ ｅｔ ａｌ．，１９８４）において利用可能なプログラム、例えばプログラムＢＥＳＴＦＩＴ及びＧＡＰを用いて、２つのポリヌクレオチド間の同一性（％）、並びに２つのポリペプチド配列間の同一性（％）及び相同性（％）を決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴはＳｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）の「局所的相同性」アルゴリズムを利用し、２つの配列間の類似性の最も優れた単一領域を見出す。配列間の同一性及び／又は類似性を決定するための他の方法は当業界で知られており、例えばプログラムのＢＬＡＳＴファミリー（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ Ｆ ｅｔ ａｌ，１９９０，Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ Ｆ ｅｔ ａｌ，１９９７，ＮＣＢＩのホームページｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからアクセス可能）及びＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ Ｗ Ｒ，１９９０）である。
【００７３】
好ましくは、任意のこのような突然変異タンパク質は、ＩＬ−１８ＢＰのアミノ酸配列、又はウイルス性ＩＬ−１８ＢＰのアミノ酸配列と十分に重複したアミノ酸の配列を有し、ＩＬ−１８ＢＰと実質的に類似の活性を有する。ＩＬ−１８ＢＰの１つの活性は、ＩＬ−１８に結合する能力である。突然変異タンパク質がＩＬ−１８への実質的な結合活性を有する限り、例えばアフィニティークロマトグラフィーによりＩＬ−１８の精製に用いることができ、それによりＩＬ−１８ＢＰと実質的に類似の活性を有すると考えることができる。従って、このような突然変異タンパク質を、例えば単純なサンドイッチ（ｓａｎｄｗｉｃｈ）競合アッセイにかけ、それが適切に標識したＩＬ−１８に結合するかどうかを判断（例えば、放射免疫測定又はＥＬＩＳＡアッセイ）することを含んで成る決まりきった実験により、任意の所定の突然変異タンパク質がＩＬ−１８ＢＰと実質的に同じ活性を有するかを判断することができる。
【００７４】
好ましい実施態様において、ＷＯ９９／０９０６３に規定されているように、任意のこのような突然変異タンパク質は、ＩＬ−１８ＢＰ又はウイルスによりコードされたＩＬ−１８ＢＰホモログの配列と少なくとも４０％の同一性又は相同性を有する。より好ましくは、それは、それに対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、或いは最も好ましくは少なくとも９０％の同一性又は相同性を有する。
【００７５】
本発明により用いることのできるＩＬ−１８ＢＰポリペプチドの突然変異タンパク質又はウイルス性ＩＬ−１８ＢＰの突然変異タンパク質、或いはそれらをコードする核酸は、本明細書中に示す教示及びガイダンスに基づいて、過度の実験をせずに当業者が通常得ることのできる置換ペプチド又はポリヌクレオチドとして、限定された一連の実質的に対応する配列を含む。
【００７６】
本発明の突然変異タンパク質の好ましい変化は、「保存的」置換として知られているものである。ＩＬ−１８ＢＰポリペプチド又はタンパク質又はウイルス性ＩＬ−１８ＢＰの保存的アミノ酸置換は、十分に類似の物理化学的特性を有する群の中の同義のアミノ酸を含み、その群のメンバーの間の置換は分子の生物学的機能を保存するだろう（Ｇｒａｎｔｈａｍ，１９７４）。上記の配列中において、それらの機能を変えずに、好ましくはアミノ酸の挿入又は削除が２、３のアミノ酸（例えば３０以下、好ましくは１０以下）のみを伴い、機能的構造に重要なアミノ酸、例えばシステイン残基を削除又は置換しない場合は、アミノ酸の挿入又は除去を行うこともできることが明らかである。このような削除及び／挿入により産生されるタンパク質及び突然変異タンパク質は、本発明の範囲内である。
【００７７】
好ましくは、同義アミノ酸群は、表４に規定するものである。より好ましくは、同義アミノ酸群は、表５に規定するものであり；そして最も好ましくは、同義アミノ酸群は、表６に規定するものである。
【００７８】
【表６】
2008504346.tif 000007
【００７９】
【表７】
2008504346.tif 000008
【００８０】
【表８】
2008504346.tif 000009
【００８１】
本発明における使用のための、ＩＬ−１８ＢＰポリペプチド又はタンパク質の突然変異タンパク質、或いはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰの突然変異タンパク質を得るのに用いることのできる、タンパク質中のアミノ酸置換の産生の例としては、任意の既知の方法段階、例えば米国特許第４，９５９，３１４号、４，５８８，５８５号及び４，７３７，４６２号（Ｍａｒｋ他）；５，１１６，９４３号（Ｋｏｔｈｓ他）、４，９６５，１９５号（Ｎａｍｅｎ他）；４，８７９，１１１号（Ｃｈｏｎｇ他）；及び５，０１７，６９１号（Ｌｅｅ他）；並びに米国特許第４，９０４，５８４号（Ｓｈａｗ他）に示されているリジン置換タンパク質を含む。
【００８２】
「融合タンパク質」という用語は、別のタンパク質と融合した、ＩＬ−１８ＢＰ、又はウイルス性ＩＬ−１８ＢＰ、或いはそれらの突然変異タンパク質又はフラグメントを含んで成るポリペプチドを指し、体液中で長期の滞留を有する。従って、ＩＬ−１８ＢＰ又はウイルス性ＩＬ−１８ＢＰを、別のタンパク質、ポリペプチドなど、例えば免疫グロブリン又はそれらのフラグメントと融合させることができる。
【００８３】
本明細書中で用いる場合、「機能的誘導体」は、当業界で知られている手段により、残基又はＮ−若しくはＣ−末端基上に側鎖として生じる官能基から調製することのできる、ＩＬ−１８ＢＰ又はウイルス性ＩＬ−１８ＢＰの誘導体、及びそれらの突然変異タンパク質及び融合タンパク質を対象とし、それらが医薬としての許容性を保持する限り（すなわち、それらが、ＩＬ−１８ＢＰ、又はウイルス性ＩＬ−１８ＢＰと実質的に類似の活性であり、それを含む組成物において毒性特性を与えない）、本発明に含まれる。
【００８４】
これらの誘導体は、例えば抗原部位をマスクし、体液中でのＩＬ−１８ＢＰ又はウイルス性ＩＬ−１８ＢＰの滞留を伸ばすことのできるポリエチレングリコール側鎖を含むことができる。他の誘導体としては、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニア又は１級若しくは２級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分（例えば、アルカノイル又は炭素環アロイル基）と形成したアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、或いはアシル部分と形成した遊離ヒドロキシル基（例えば、セリル又はトレオニル残基）のＯ−アシル誘導体が挙げられる。
【００８５】
ＩＬ−１８ＢＰ、又はウイルス性ＩＬ−１８ＢＰ、突然変異タンパク質及び融合タンパク質の「活性画分」として、本発明は、単独又は結合分子若しくはそれに結合した残基（例えば、糖又はリン酸残基）とのタンパク質分子、或いはタンパク質分子又は糖残基それら自身の凝集体のポリペプチド鎖の任意のフラグメント又は前駆体を対象とする。
【００８６】
本明細書中の「塩」という用語は、ＩＬ−１８インヒビター分子、又はその類似体のアミノ基のカルボキシル基の塩及び酸付加塩の双方を指す。カルボキシル基の塩は、当業界で知られた手段により形成することができ、無機塩、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄又は亜鉛の塩など、並びに例えばアミン、例えばトリエタノールアミン、アルギニン又はリジン、ピペリジン、プロカインなどと形成したもののような有機塩基との塩が挙げられる。酸付加塩としては、例えば鉱酸、例えば塩酸又は硫酸との塩、及び有機酸、例えば酢酸又はシュウ酸との塩が挙げられる。当然、任意のこのような塩は、ＩＬ−１８インヒビターの生物活性、例えば血球中のＩＦＮ−ガンマの誘導を保持していなければならない。
【００８７】
ＩＬ−１８ＢＰの配列及びそのスプライス変異／アイソフォームは、ＷＯ９９／０９０６３又はＮｏｖｉｃｋ他，１９９９、並びにＫｉｍ他，２０００から得ることができる。
【００８８】
ＩＬ−１８ＢＰの機能的誘導体をポリマーと結合させ、タンパク質の特性、例えば安定性、半減期、バイオアベイラビリティ、ヒトの体による耐性、又は免疫原性を改善することができる。この目標を達成するために、ＩＬ−１８ＢＰを、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合させることができる。ＰＥＧ化は、例えばＷＯ９２／１３０９５に記載の方法により実施することができる。
【００８９】
従って、好ましい実施態様において、機能的誘導体は、１以上の官能基に結合した少なくとも１つの部分を含んで成り、これはアミノ酸残基上で１つ以上の側鎖として生じる。その部分がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分である実施態様が、非常に好ましい。
【００９０】
本発明の更なる好ましい実施態様において、ＩＬ−１８ＢＰは免疫グロブリン融合を含んで成る。すなわち、ＩＬ−１８インヒビターは、免疫グロブリンの全て又は部分に融合した、ＩＬ−１８結合タンパク質の全て又は部分を含んで成る融合タンパク質である。免疫グロブリン融合タンパク質を作製する方法は、当業界で知られており、例えばＷＯ０１／０３７３７に記載されているものである。当業者は、得られる本発明の融合タンパク質がＩＬ−１８ＢＰの生物活性、特にＩＬ−１８への結合活性を保持することを理解するだろう。融合は直接的であるか、或いは１〜３アミノ酸残基長又はそれより長くてもよい（例えば、１３アミノ酸残基長）の短いリンカーペプチドによることができる。当該リンカーは、例えば配列Ｅ−Ｆ−Ｍ（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）のトリペプチドであるか、或いはＩＬ−１８ＢＰ配列と免疫グロブリン配列の間に導入されるＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔを含んで成る１３アミノ酸リンカー配列であることができる。得られる誘導タンパク質は、改善された特性、例えば体液中での延長さえれた滞留時間（半減期）、増大した特異的活性、増大した発現レベルを有し、或いは融合タンパク質の精製が容易になる。
【００９１】
好ましい実施態様において、ＩＬ−１８ＢＰは、Ｉｇ分子の定常領域に融合する。好ましくは、それは、例えばヒトＩｇＧ１のＣＨ２及びＣＨ３ドンメインのような重鎖領域に融合する。ＩＬ−１８ＢＰ及び免疫グロブリンの部分を含んで成る具体的な融合タンパク質の産生は、例えばＷＯ９９／０９０６３の実施例１１に記載されている。Ｉｇ分子の他のアイソフォームも、本発明の融合タンパク質の産生に適しており、例えばアイソフォームＩｇＧ２又はＩｇＧ４、又はＩｇ又はＩｇＡのような他のＩｇクラスである。融合タンパク質は、単量体又は多量体（ヘテロー又はホモ多量体）であることができる。
【００９２】
第三の側面において、本発明は、本発明の精製方法により得られるタンパク質調製物に関する。好ましくは、このようなタンパク質調製物は、＞５０％、より好ましくは＞６０％、最も好ましくは＞７０の純度でＩＬ−１８ＢＰを含む。好ましくは、このタンパク質調製物中に存在するＩＬ−１８ＢＰは、低含量の二量体及び凝集体を有し、好ましくは二量体及び凝集体を全く有しない。本発明のタンパク質調製物中に存在するＩＬ−１８ＢＰの切断の程度は、＜１０％であることが更に好ましい。それは、＜９％、＜８％、＜７％、＜６％であり、好ましくは＜５％、更に＜４％、＜３％、＜２％、又は＜１％であることができる。
【００９３】
更に好ましくは、本発明により精製したＩＬ−１８ＢＰは、例えばキャピラリーゾーン電気泳動法により測定した場合に、特異的なアイソフォームプロファイルを有する。ＩＬ−１８ＢＰは、５％未満の塩基性アイソフォーム、２５％未満の酸性アイソフォーム、４５％超の酸性アイソフォーム、１５％超の高度に酸性のアイソフォームを含むことが好ましい。アイソフォームの分類は、以下の実施例に記載する。
【００９４】
更なる精製段階を用いる場合、好ましくは上記の更なる段階を用いる場合、得られるＩＬ−１８ＢＰ調製物は、２０％未満の不純物、好ましくは約１５％、又は約１４％、又は約１３％、又は約１２％、又は約１１％未満の不純物を含み得る。好ましくは、それは、約１０％、又は約５％、３％、２％又は１％未満の不純物を含み、或いはそれは等質（すなわち基本的にタンパク質混入物質を含まない）まで精製することができる。
【００９５】
精製したＩＬ−１８ＢＰは、治療用途、例えば患者への投与を対象とすることができる。精製したＩＬ−１８ＢＰを患者に投与する場合、好ましくはそれを全身に、好ましくは皮下又は筋肉内、或いは局所的に、すなわち局所的に（ｌｏｃａｌｌｙ）投与する。精製ＩＬ−１８ＢＰの具体的使用に依存して、直腸又は髄腔内投与が適切でもあり得る。
【００９６】
この目的のために、精製ＩＬ−１８ＢＰは、医薬組成物として、すなわち、医薬として許容される担体、賦形剤などと共に製剤化することができる。
【００９７】
「医薬として許容される」の定義は、活性成分の生物活性の有効性を妨げずに、それが投与される宿主に対して毒性でない任意の担体を包含することが意図されている。例えば、非経口投与の場合、活性タンパク質は、ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）、例えば生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン及びリンガー溶液中で注射用に単位用量形態で製剤化することができる。
【００９８】
本発明の医薬組成物の活性成分は、様々な方法で個々に投与することができる。投与の経路としては、皮内、経皮（例えば、徐放製剤において)、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、頭蓋内、硬膜外、局所、直腸、及び鼻腔内経路が挙げられる。任意の他の治療上有効な投与経路を用いることができ、例えば上皮又は内皮組織を通した吸収、又は活性成分をインビボで発現し分泌させる、活性成分をコードするＤＮＡ分子が患者に投与される（例えば、ベクターにより）遺伝子治療である。さらに、本発明のタンパク質は、生物活性剤の他の成分、例えば医薬として許容される界面活性剤、賦形剤、担体、希釈剤及びビヒクルと共に投与することができる。
【００９９】
非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）投与の場合、活性タンパク質は、溶液、懸濁液、エマルジョン又は凍結乾燥粉末として、医薬として許容される非経口ビヒクル（例えば、水、生理食塩水、デキストロース溶液）及び等張性を保持する添加剤（例えば、マンニトール）又は化学的安定性を保持する添加剤（例えば、保存剤及びバッファー）と共に製剤化することができる。
【０１００】
本発明の活性タンパク質のバイオアベイラビリティは、ヒトの体内での分子の半減期を増大させる結合手順を用いることにより、例えばＰＣＴ国際特許出願ＷＯ９２／１３０９５に記載されているように、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に分子を結合させることにより、改善することもできる。
【０１０１】
治療有効量の活性タンパク質は、多くの変数、例えばアンタゴニストのタイプ、ＩＬ−１８に対するアンタゴニストの親和性、アンタゴニストにより示される任意の残余の細胞毒性活性、投与の経路、患者の臨床症状（例えば、非毒性レベルの内因性ＩＬ−１８活性を保持する望ましさ）の関数であるだろう。
【０１０２】
「治療有効量」は、投与した際に、ＩＬ−１８インヒビターがＩＬ−１８の生物活性の阻害をもたらす程度のものである。個々に投与する用量（単回又は複数回投与）は、様々な因子、例えばＩＬ−１８インヒビター薬物動態特性、投与の経路、患者の症状及び特徴（性別、年齢、体重、健康、大きさ）、症状の程度、並行処置、処置の頻度並びに所望される効果に依存して変わるだろう。確立された用量範囲の調節及び操作は、当業者の能力、並びに個々においてＩＬ−１８の阻害を決定するインビトロ及びインビボの方法の範囲内で良い。
【０１０３】
精製ＩＬ−１８ＢＰは、体重の約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ又は約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ、或いは体重の約０．１〜５ｍｇ／ｋｇ又は体重の約１〜３ｍｇ／ｋｇ又は体重の約２ｍｇ／ｋｇの量において用いることができる。
【０１０４】
更に好ましい実施態様において、精製ＩＬ−１８ＢＰは、毎日又は一日おき又は一週間に３回又は一週間に一回投与する。
【０１０５】
日用量は通常、所望の結果を得るのに効果的な、分割投与又は徐放形態において与えられる。第二の又は後の投与は、個々に投与した最初又は前の用量と同じか、それ未満か、又はそれを超えた用量で実施することができる。第二の又は後の投与は、疾患の発現の間又はその前に投与することができる。
【０１０６】
本発明によると、精製ＩＬ−１８ＢＰは、治療有効量において、他の治療法又は治療剤の前、又は同時、又は連続的に、個々に対して、予防的に又は治療として投与することができる。
【０１０７】
精製ＩＬ−１８ＢＰは、多くの疾病又は疾患の処置及び／又は予防のための薬剤の調製に用いることができる。好ましくは、このような疾病又は疾患は、ＩＬ−１８介在疾患である。特に、精製ＩＬ−１８ＢＰは、乾癬、乾癬性関節炎、クローン病、炎症性腸疾患、慢性関節リウマチ、肝損傷（例えば、アルコール性肝硬変）、敗血症、アテローム性動脈硬化症、虚血性心疾患、アレルギー、特に遅延型過敏症及び閉鎖性頭部外傷の処置及び／又は予防に用いることができる。
【０１０８】
第三の側面において、本発明は、ＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）の精製のための水性二相系の使用に関する。好ましくは、水性二相系は、流体からのＩＬ−１８の捕獲に用いる。
【０１０９】
本発明を完全に記載したので、本発明の精神及び範囲から逸脱せずに、そして過度の実験をせずに、広い範囲の同等のパラメーター、濃度及び条件の中で同じことを実施することができることが当業者により理解されるだろう。
【０１１０】
本発明はその具体的な実施態様との関連で記載したが、それは更なる変更が可能であることが理解されるだろう。本願は、一般的に本発明の原理に従い、そして本発明が関係する分野の範囲内の既知又は通常の実施の範囲内に入り、添付の特許請求の範囲の範囲内の通りに上記の本質的な特徴に適用することのできるような、本発明からの逸脱を含み、本発明の任意のバリエーション、用途又は適応を対象とすることが意図されている。
【０１１１】
本明細書中で引用する全ての引用文献、例えば学術論文又は要旨、発行された若しくは発行されていない米国若しくは外国の特許出願、発行された米国若しくは外国の特許又は任意の他の引用文献は、本明細書中で引用文献により、例えば引用された引用文献中の全てのデータ、表、図及び文書により全てが組み込まれる。更に、本明細書中で引用された引用文献の中で引用された引用文献の全ての内容も、引用文献によりその全てが組み込まれる。
【０１１２】
既知の方法段階、重大の方法段階、既知の方法又は従来の方法に対する引用文献は、本発明の任意の側面、記載又は実施態様が関連技術において開示、教示又は示唆されているということの全くの承認ではない。
【０１１３】
前記の具体的な実施態様は、他の人々が、当該分野の技術の範囲内の知識（例えば、本明細書中で引用する引用文献の内容）を適用することにより、過度の実験をせずに、そして本発明の一般概念から逸脱することなく、様々な適用のためにこのような具体的な実施態様を容易に変化させ及び／又は適合させることができる本発明の一般的性質を完全に明らかにするだろう。従って、このような適合及び変更は、本明細書中に示す教示及びガイダンスに基づいて、開示した実施態様の同等物の意図の範囲内であることが意図されている。本明細書中の語句又は専門用語は開示の目的であって制限の目的ではなく、当業者の知識と組み合わせて、本明細書の専門用語又は語句が本明細書に示す教示及びガイダンスの観点において当業者により解釈されるべきであることが理解されるべきである。
【実施例】
【０１１４】
無血清ＣＨＯ細胞回収物からの組み換えヒトＩＬ−１８ＢＰの精製
本実施例において、ＣＨＯ細胞回収物からのＩＬ−１８ＢＰの精製のための水性二相系に基づいた精製段階を開発した。この目的のために、以下の段階を実施した：
１．スクリーニングすべき相形成成分（一組）の選択
２．第一の要素設計実験。全ての単一の選択した一組に関して、タンパク質分配に影響する全ての主な因子を、広い実験スペースにわたってスクリーニングした。
３．第二の要素設計実験。標的タンパク質の分配に影響する唯一重要な因子を、減少した実験スペースにわたってスクリーニングした。
４．モデルにより予想したリード（ｌｅａｄ）を実験的に検証した。
５．リードを最適化し、微調整した。
６．リードを１リットルスケールにスケールアップした。
【０１１５】
成分を形成する二相系の選択
異なる因子を、成分を形成する相の選択に関して考慮した：（ｉ）工程の適合性；（ｉｉ）成分価格；（ｉｉｉ）成分の入手可能性；（ｉｖ）文献データ。工程の適合性、価格及び入手可能性に関して、一組のＰＥＧ／塩が適切であった。ＰＥＧ／（ＮＨ4）2ＳＯ4、ＰＥＧ／ＫＨ2ＰＯ4及びＰＥＧ／Ｎａ2ＳＯ4を選択した。
【０１１６】
従って、試験した３組は以下のものであった：
１．ＰＥＧ／（ＮＨ4）2ＳＯ4
２．ＰＥＧ／ＫＨ2ＰＯ4
３．ＰＥＧ／Ｎａ2ＳＯ4
【０１１７】
要素設計実験の第一のサイクル
要素設計実験のこのサイクルの目的は、極度のタンパク質分配を示す成分を形成する適切な相を選択することである。
【０１１８】
用いた実験は、２5-1の分別要素、１０スターポイント（ｓｔａｒ ｐｏｉｎｔ）及び２センターポイント（ｃｅｎｔｒｅ ｐｏｉｎｔ）を含む、中心の混合物設計であった。この設計は、全ての主な効果及び２成分相互作用並びに実験要素の全ての純粋な二次効果の評価を可能にした。表Ａは、考慮した実験的要素のタイプ及びレベルを要約する。それは、選択した一組当たりの２８の実験に対応する。
【０１１９】
【表９】
2008504346.tif 000010
用いた実験条件を、表Ｂ、Ｃ及びＤに記載した。
【０１２０】
【表１０】
2008504346.tif 000011
【０１２１】
【表１１】
2008504346.tif 000012
【０１２２】
【表１２】
2008504346.tif 000013
【０１２３】
この第一サイクル（３組×２８実験×二相）の間に生成された多くの試料により、精製ＩＬ−１８ＢＰを用いて、タンパク質濃度を２８０ｎｍでのＵＶ吸収により測定した。実験は、２ｍｌ−スケールで実施した。収集した応答は、以下に定義した分配係数Ｋであった：
【数１】
2008504346.tif 000014
【０１２４】
結果
生データを表Ｅに記載する。
【表１３】
2008504346.tif 000015
【０１２５】
３つの要素設計実験のために回収した分配係数値の範囲を、表Ｆに示す。
【表１４】
2008504346.tif 000016
【０１２６】
統計分析は、ＰＥＧ／Ｎａ2ＳＯ4又はＰＥＧ／ＫＨ2ＰＯ4を用いて、ＩＬ−１８ＢＰの分配に関して実施した。タンパク質分配において小さい影響を有する要素は、第一に統計分析から削除した。これは、数学的モデル（Ｅｑｕ２及びＥｑｕ３）（Ｋの値の予測）をもたらし、これは応答Ｋにおける顕著な効果を有することが見出された要素を考慮する。
【０１２７】
ＰＥＧ／Ｎａ2ＳＯ4を用いたＩＬ−１８ＢＰ分配の予測モデル
【数２】
2008504346.tif 000017
【０１２８】
ＰＥＧ／ＫＨ2ＰＯ4を用いたＩＬ−１８ＢＰ分配の予測モデル
【数３】
2008504346.tif 000018
【０１２９】
モデルから予測される最大分配係数Ｋ
【表１５】
2008504346.tif 000019
【０１３０】
要素設計実験の第二サイクル
要素設計実験のこのサイクルの目的は、極端なタンパク質分配及び優れた精製要素を示す適切な条件（ｐＨ、濃度など）を選択することである。このサイクルは、相形成構成要素としてＰＥＧ／Ｎａ2ＳＯ4を用いて実施した。
【０１３１】
実験設計は、中心複合（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）設計であった。この設計は、それぞれの実験設定での繰り返しを有する、完全な２つのレベルの要素、スターポイント、及びセンターポイントを含んでいた。表Ｈに示すように、それは５２の実験をもたらした。
【表１６】
2008504346.tif 000020
【０１３２】
要素設計実験の第一サイクルとは異なり、清澄化した粗回収物を出発物質として用いた。実験は、１０ｍｌスケールで実施した。２つの応答を収集した：方法の容量に関するＩＬ−１８ＢＰ分配係数Ｋ(IL-18BP)、及び方法の精製能力に関する全タンパク質分配係数Ｋ(tot prot)。
【０１３３】
結果
生データを表Ｉに示す。
【表１７】
2008504346.tif 000021
【０１３４】
要素設計実験に関して観察された分配係数値の範囲を、表Ｊに示す。
【表１８】
2008504346.tif 000022
【０１３５】
統計分析を、ＩＬ−１８ＢＰ及び総タンパク質の分配に関して実施した。実験の第一サイクルとは対照的に、表Ｋ及び表Ｌで報告したこの分析の結果は、多くの第二級（ｓｅｃｏｎｄ−ｄｅｇｒｅｅ）相互作用のように、試験した全ての４つの主な要素が重要であることが見出されたことを示す。
【表１９】
2008504346.tif 000023
【０１３６】
【表２０】
2008504346.tif 000024
【０１３７】
要素設計実験の第二サイクルの予想モデルは、２８の候補条件の選択を可能にし、それは予想収率＞７５％及びＡ２ＰＳ後の画分において５０％超の純度を示す。これらは、更なる発達に関して「リード」として考えられる。候補条件を表Ｍに記載する。
【表２１】
2008504346.tif 000025
【０１３８】
予想モデルにより予測されるリードの実験検証
これらの実験の目的は、統計分析により予測されるリードの性能を実験的に検証することである。清澄化した粗回収物を、出発物質として用いた。実験は、１０ｍｌ−スケールで実施した。２つの応答を収集した：ＩＬ−１８ＢＰ分配係数Ｋ(IL-18BP)、及び総タンパク質分配係数Ｋ(tot prot)。実験条件を上記の表Ｍに記載する。
【０１３９】
結果
結果を表Ｎに報告する。ＩＬ−１８ＢＰの濃度は、ＩＬ−１８ＢＰを検出する固定化モノクローナル抗体（指定された、Ｍａｂ  ５８２．１）を用いてＢＩＡｃｏｒｅにより測定した。ＩＬ−１８ＢＰ濃度は、以下の媒介変数を用いて、製造業者のプロトコルに従ってＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）により測定した：
【表２２】
2008504346.tif 000026
【０１４０】
【表２３】
2008504346.tif 000027
【０１４１】
３つのリードを、統計モデルから同定した。これらのリードに関するパラメーターを、以下の表Ｏに示す。キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を、以下のプロトコルに従って実施した。
【０１４２】
キャピラリーゾーン電気泳動に関する物質及び装置
【表２４】
2008504346.tif 000028
【０１４３】
装置
【表２５】
2008504346.tif 000029
【０１４４】
Ｓｅｐ−Ｐａｋ用の溶液
Ｓｅｐ−Ｐａｋコンディショニング：１００％のＣＨ3ＣＮ
Ｓｅｐ−Ｐａｋ平衡化／洗浄溶液：０．１％の水性ＴＦＡ中の２５％のＣＨ3ＣＮ
Ｓｅｐ−Ｐａｋ溶出溶液：０．１％水性ＴＦＡ中の３６％のＣＨ3ＣＮ（有効期限：４℃で２週間）
【０１４５】
ＣＺＥ用の溶液
５ｍＭのリン酸ＣＺＥ洗浄／ラン（ｒｕｎ）バッファー
５０ｍＭのリン酸ストック溶液ｐＨ７．０の１：１０の希釈により調製。０．２２μｍのフィルターによりろ過。新鮮なものを調製。
０．５ＭのＮａＯＨ（ＣＺＥ洗浄溶液）
水に２６．２μＬの５０％ＮａＯＨを添加する（１ｍＬの総体積）。新鮮なものを調製。
１ＭのＮａＯＨ（ＣＺＥ再生溶液）
水に５２．４μＬの５０％ＮａＯＨを添加する（１ｍＬの総体積）。
中性マーカー（希釈１：１００００）
水に１０μＬの中性マーカーストック溶液を添加する（１ｍＬの総体積）。
水に１０μＬのこの中性マーカー１：１００希釈物を添加する（１ｍＬの総体積）。
４℃で３ヶ月保存する。
【０１４６】
方法
ＣＺＥは高性能キャピラリー電気泳動法の形態である。キャピラリーは電解質バッファーで満たされており、試料分離はキャピラリーの電界により生じる。分離機構は、分析物の電気泳動移動度における相違に基づいている。電気泳動移動度は、所定の条件でのそれぞれの分析物の正味荷電及び流体力学的大きさの関数である。
【０１４７】
ＩＬ−１８ＢＰを含む試料のＣＺＥ分析は、５ｍＭのリン酸塩を含むバッファーで満たした溶融シリカキャピラリー（７５μｍのＩＤ及び５０ｃｍの効果的長さ）を有するＣＥ系を用いて実施する。
【０１４８】
ＣＺＥ分解を増大させるために、標準的基準及び各バルクを、ＣＺＥ分析の前にＣｅｎｔｒｉｃｏｎ１０により脱塩する。試料は、約２．５ｍｇ／ｍＬのＩＬ−１８ＢＰ濃度で充填する。キャピラリー中への注入は、５秒間の低圧力注入（〜０．５ｐｓｉ）を用いて実施する。分離は、２５℃で３０分間２５ＫＶの一定電圧で実施する。その実施を、２１４ｎｍでＵＶ吸収を用いて観察する。
【０１４９】
基準標準及びバルク試料の場合、手順は２つの段階から成る：試料脱塩及びＣＺＥ分析。
【０１５０】
粗回収物及び捕獲後の試料に関しては、高いマトリックス干渉が取り除かれ、ＩＬ−１８ＢＰ糖タンパク質プロファイルの観察を可能にする。この場合、手順は３つの段階から成る：高いマトリックス干渉を取り除くためのＳｅｐ−Ｐａｋ捕獲段階、試料脱塩、及び捕獲したＩＬ−１８ＢＰ画分のＣＺＥ分析。
【０１５１】
粗回収物及び捕獲後の試料のＣＺＥ分析のためのＳｅｐ−Ｐａｋ手順によるＩＬ−１８ＢＰの捕獲
５ｍＬのシリンジを用いてＳｅｐ−Ｐａｋカートリッジを集め、次いで以下の手順に従う：
【表２６】
2008504346.tif 000030
【０１５２】
段階６から回収した溶液（総体積３ｍＬ）をＳｐｅｅｄ−Ｖａｃ遠心分離機において濃縮し、ＣＨ3ＣＮを除去して≦２．０ｍＬの総体積まで減少させた。
【０１５３】
Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ１０限外ろ過による試料の脱塩
基準標準、又は前の段階から得られたバルク若しくはＳｐｅｅｄ−Ｖａｃ溶液をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ１０に移し、５０００×ｇ及び１０℃での限外ろ過により約１００μＬまで濃縮する。
【０１５４】
次いで、４つの１ｍＬのＨ2Ｏを用いて、５０００×ｇ、１０℃でそれぞれ４０分洗浄して脱塩を実施する。
【０１５５】
粗回収物を除いて、保持液を希釈し、２．５ｍｇ／ｍＬのＩＬ−１８ＢＰ濃度で等分する（３０μＬのアリコート）。
【０１５６】
粗回収試料は、４０〜５０μＬの最終体積において回収する。この量は、２つの独立のＣＺＥ試料を調製するのに十分である。この試料は、ＣＺＥ分析用に準備されている。
【０１５７】
ＣＺＥ分析まで−２０℃で全ての試料を保存する。
【０１５８】
ＣＺＥ分析
≧２０μＬの試料／基準を、１／１０体積の中性マーカー（３．３．４）を含むＰＣＲバイアル中に移し、リバースピペッティングにより混合し、泡の発生を回避する。
【０１５９】
推奨された電気泳動媒介変数：
以下の試薬を別々のバイアルホルダーに添加し、泡の発生を回避する。
【表２７】
2008504346.tif 000031
【０１６０】
ＣＺＥ分析時間表
【表２８】
2008504346.tif 000032
【０１６１】
ＣＺＥキャピラリー再生時間表
【表２９】
2008504346.tif 000033
【０１６２】
【表３０】
2008504346.tif 000034
【０１６３】
推奨された注入プロトコル
キャピラリーコンディショニングの目的での、標準的基準物質の少なくとも３回の注入。
標準的基準１（開始）
試料１の単回注入
試料２の単回注入
試料３の単回注入
試料４の単回注入
標準的基準２（終了）
【０１６４】
注意：再現性を増大させるために、同一のＣＺＥランニングバッファーを用いることにより、最大で４つの試料を、基準１及び基準２の間の１つの連続において分析することができる。或いは、２つのブラケット（ｂｒａｃｋｅｔｉｎｇ）基準は、下記のように各試料に対して用いることができる。
【０１６５】
キャピラリーコンディショニングの目的で、少なくとも３回の標準的基準物質の注入を行う。
標準的基準（開始１）
試料１の単回注入
標準的基準（終了１／開始２）
試料２の単回注入
標準的基準の繰り返し（終了２／開始３）
試料３の単回注入
標準的基準の繰り返し（終了３）
【０１６６】
データ分析
試料データの比較のために、標準的基準物質を用いる。
【０１６７】
試料及び基準標準（開始／終了）の双方の、重なりそして積層されたエレクトロフェログラムを印刷し、それらをファイル結果に保管する。
【０１６８】
泳動時間ＭＴ２及びＭＴ３の決定
基準標準（開始）の−３及び＋３のピークの左右の谷間での泳動時間ＭＴ２及びＭＴ３を決定する。０ピークは、基準の第一ピークである。
【０１６９】
アイソフォームの分類
ＩＬ−１８ＢＰ糖タンパク質のプロファイルの高い酸性度により、ＭＴ２及びＭＴ３の間のアイソフォームは、「酸性アイソフォーム」と名づける。ＭＴ３よりの高い泳動時間を有するアイソフォームは、「より高い酸性アイソフォーム」と名づける。ＭＴ２よりも低い泳動時間を有するアイソフォームは、「より低い酸性アイソフォーム」と名づける。
【０１７０】
ある環境においては、ＭＴ１よりも低い泳動時間を有するアイソフォームとして定義される「塩基性アイソフォーム」のクラスを添加することが必要であり得る。
【０１７１】
アイソフォームの存在量の測定
関数を用いることにより、基準及び各試料を分析する：ＭＴ１−Ｍ２、ＭＴ２−ＭＴ３及びＭＴ３−ＭＴ４の間のマニュアルピーク；５〜２８分のマニュアルベースライン並びに０〜ＭＴ１及びＭＴ４〜３０分の積分ＯＦＦ。関数Ｗｉｄｔｈａｎｄ  Ｔｒｅｓｈｏｌｄを手作業で変え、基準標準に関して上記で示したものと類似の、ＭＴ１−Ｍ２（より低い酸性アイソフォーム）、ＭＴ２−ＭＴ３（酸性アイソフォーム）及びＭＴ３−ＭＴ４（高い酸性アイソフォーム）の３つの群のピークの積分を得る。
【数４】
2008504346.tif 000035
【０１７２】
必要な場合は、ＭＴ１よりも低い泳動時間を有するアイソフォームとして定義される「塩基性アイソフォーム」に対応するピークの群を加え、それにより上記の式を修正する。
【０１７３】
ＣＺＥ分析の結果
ＣＺＥプロファイルは、酸性アイソフォームがＡ２ＰＳにより選択されるようであることを示した。アイソフォームプロファイルの結果を図１に表す。
【０１７４】
収率及び純度の計算
精製ＩＬ−１８ＢＰの収率及び純度を、以下のように計算した：
収率：
【数５】
2008504346.tif 000036
純度
【数６】
2008504346.tif 000037
Ｖ相：注目の相の体積
Ｃ相IL18BP：注目の相におけるＩＬ１８ＢＰの濃度
Ｃ相tot_prot.：注目の相における総タンパク質の濃度
Ｖ0：精製する出発物質の体積
Ｃ0IL18BP：精製する出発物質におけるＩＬ１８ＢＰの濃度。
【０１７５】
結果
３つのリードに関して測定した媒介変数を、表Ｏに要約する。タンパク質分配は再現可能であった（標準偏差値を参照のこと）。工程の間に凝集体は形成されなかった。
【表３１】
2008504346.tif 000038
【０１７６】
未清澄化回収物を用いたＡ２ＰＳ工程
このセクションにおいては、粗未清澄化回収物からのＩＬ−１８ＢＰの直接的精製を評価した。比較するために、細胞が工程性能に影響する場合は、細胞を用いて及び用いずに２つの工程条件を比較した（工程条件に関しては、表Ｎを参照のこと）。
【０１７７】
表Ｐに示すように、性能は細胞又は細胞残屑の存在により、比較的少ししか影響されない。相分離の後に、細胞及び細胞残屑のほとんどは厚い界面相に位置した。
【表３２】
2008504346.tif 000039
【０１７８】
これらの実験の目的は、前もって選択したリードの性能を最適化することである（表Ｏ）。対応線に基づいた抽出段階の収率、純度又は濃縮係数を最適化することは可能である。
【０１７９】
Ｎａ2ＳＯ4濃度
伝導度測定法は、Ａ２ＰＳ中の塩濃度の測定に一般的に用いられる。しかし、培地は分析に影響し得るある程度の塩を既に含む。従って、比色分析（キット：Ａｑｕａｎａｌ−ｐｌｕｓ  Ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＯ4）５０〜３３０ｍｇ／ｌ（Ｆｌｕｋａ  Ｎo  ３７４２９−１ＥＡ））が用いられ、この場合優れた結果を示す。
【０１８０】
ＰＥＧ濃度
ＰＥＧ濃度分析に関して屈折計法を用いることができる。しかし、多くの培地構成要素は分析を妨害する。従ってＰＥＧ濃度分析に関しては、サイズ排除クロマトグラフィーを表Ｑで報告した条件下で用いた。
【表３３】
2008504346.tif 000040
【０１８１】
上相及び下相におけるＰＥＧ及びＮａ2ＳＯ4を測定することにより、対応線を決定することができる（図４、５及び６を参照のこと）。Ｋ(IL-18BP)及びＫ(tot prot)は、同一の対応線上で一定である。従って、精製方法に対して選択された最適相比は、収率及び精製係数の間のバランスを提供するだろう。
【０１８２】
清澄化粗回収物を出発物質として用い、実験を１０ｍｌ−スケールで実施した。２つの応答を収集した：ＩＬ−１８ＢＰ分配係数Ｋ(IL-18BP)、及び総タンパク質分配係数Ｋ(tot prot)。
【０１８３】
結果
４つの最適化した実験条件を試験した。表Ｒは、分配の後に得られた実験工程性能を要約する。
【表３４】
2008504346.tif 000041
【０１８４】
下流の工程及び最終バルクの性質に依存して、図２、３及び４に示した対応線に基づいて、多くのより最適化した条件を選択することができる。対応線に基づいた収率、純度又は濃縮係数に関する柔軟性は、Ａ２ＰＳ技術の主な利点の一つである。
【表３５】
2008504346.tif 000042
【０１８５】
１−リットルスケールでのＩＬ−１８ＢＰの直接的捕獲
これらの実験の目的は、Ａ２ＰＳ技術に関連した主なスケールアップ問題を評価することであった。表Ｒ及び表Ｓからの２つの条件は、１００倍のスケールアップに対して選択された（ｖａｌ２−５；ｖａｌ２−２ ｏｐｔ２）。結果を表Ｔに示す。１００倍のスケールアップの後に、工程性能における大きな相違は観察することができない。
【表３６】
2008504346.tif 000043
【０１８６】
Ａ２ＰＳ技術を用いたＩＬ−１８ＢＰの直接的な捕獲が最終バルクの性質に影響を与えるかを評価するために、スケールアップ実験ｖａｌ−２．５からのＡ２ＰＳ捕獲後物質を、更なるクロマトグラフィー精製段階を用いて精製した。結果を表Ｕに示す。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＴＭＡＥ（トリメチルアミノエチルイオン交換クロマトグラフィー、Ｍｅｒｋから購入）上でのクロマトグラフィー捕獲により得られた薬剤物質との比較において、Ａ２ＰＳ捕獲から得たロット（７０７５−４１−０５  ＵＦ２）は、同等の性質の結果を示す。
【表３７】
2008504346.tif 000044
【０１８７】
結論
従来のクロマトグラフィー捕獲段階により得られた結果を要約する表Ｖは、Ａ２ＰＳ工程がより単純であり；より優れた純度、収率を提供し、そしてより速くあることができることを示す。
【表３８】
2008504346.tif 000045
【０１８８】
【表３９】
2008504346.tif 000046
【表４０】
2008504346.tif 000047
【表４１】
2008504346.tif 000048
【表４２】
2008504346.tif 000049
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１】図１は、統計モデルから同定されたリード（ｌｅａｄ）の、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）からの結果を示す。
【図２】条件Ｖａｌ２−１に対する対応線を示す。
【図３】条件Ｖａｌ２−２に対する対応線を示す。
【図４】条件Ｖａｌ２−５に対する対応線を示す。
【図５】水性二相系における対応線を確立する原理を示す（Ｈａｔｔｉ−Ｋａｕｌ，２０００から得た）。
【図１】
2008504346.tif 000050
【図２】
2008504346.tif 000051
【図３】
2008504346.tif 000052
【図４】
2008504346.tif 000053
【図５】
2008504346.tif 000054
【国際調査報告】
2008504346.tif 000055
2008504346.tif 000056
2008504346.tif 000057