(57)【要約】本発明は、核酸を鋳型とする化学により、例えば、蛍光、化学発光および／または発色団シグナルを発生させることにより、生物学的標的（例えば、核酸およびタンパク質）を検出するための組成物および方法を提供する。そのような化合物、化学反応およびその他の組成物は、核酸およびタンパク質などの生物学的分子の検出において有用である。蛍光、化学発光および着色化合物を使用する本発明のアッセイは、インビトロ、インサイチュー、またはインビボで実施できる。
2008545416.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ヌクレオチド配列を検出するための方法であって：
（ａ）（１）第１ヌクレオチド配列（ｉ）および該第１オリゴヌクレオチド配列に連結した第１反応性基（ｉｉ）を含む第１プローブ、および（２）第２オリゴヌクレオチド配列（ｉ）および該第２オリゴヌクレオチド配列に連結した第２反応性基（ｉｉ）を含む第２プローブを提供する工程であって、このとき該第１オリゴヌクレオチド配列および第２オリゴヌクレオチド配列は該標的ヌクレオチドの２つの別個の領域に相補的である、工程と；
（ｂ）該第１プローブおよび該第２プローブを該標的ヌクレオチド配列の存在について試験されるサンプルと、該第１プローブおよび該第２プローブが該サンプル中に存在する場合は該標的ヌクレオチド配列のそれらの各相補的領域にハイブリダイズする条件下で結合させ、それにより該第１反応性基および該第２反応性基を反応近接性に持ち込む工程と；
（ｃ）該第１反応性基および該第２反応性基の間の反応を検出して、それにより該標的ヌクレオチド配列の存在を決定する工程と、を含む方法。
【請求項２】
前記第１反応性基および前記第２反応性基の反応生成物は蛍光もしくは発色団成分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１反応性基および前記第２反応性基の反応生成物は蛍光成分を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記蛍光成分は、シアニン色素、ヘミシアニン色素およびクマリン色素からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記蛍光成分はポリメチン色素である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記第１反応性基および前記第２反応性基の反応は、前記第１反応性基および前記第２反応性基を化学結合させる工程による、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記蛍光もしくは発色団成分は、前記第１プローブおよび第２プローブの一方または両方に共有結合している、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記蛍光もしくは発色団成分は、前記第１プローブにも前記第２プローブにも共有結合していない、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記第１反応性基および前記第２反応性基の反応は、酵素補因子の遊離を生じさせる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
標的ヌクレオチド配列を検出するための方法であって：
（ａ）各プローブ対が（１）第１オリゴヌクレオチド配列（ｉ）および該第１オリゴヌクレオチド配列に連結した第１反応性基（ｉｉ）を含む第１プローブ、および（２）第２オリゴヌクレオチド配列（ｉ）および該第２オリゴヌクレオチド配列に連結した。対応する第２反応性基（ｉｉ）を含む第２プローブを含む１セットのプローブ対を提供する工程であって、このとき該第１オリゴヌクレオチド配列および第２オリゴヌクレオチド配列は該標的ヌクレオチドの２つの別個の領域に相補的である工程と；
（ｂ）該セットのプローブ対を該標的ヌクレオチド配列の存在について試験されるサンプルと、該プローブ対の該第１プローブおよび第２プローブの各々が該サンプル中に存在する場合は該標的ヌクレオチド配列のその各相補的領域にハイブリダイズする条件下で結合させ、それにより該第１および第２反応性基の対応する対を反応近接性に持ち込む工程と；
（ｃ）該第１反応性基の対と該対応する第２反応性基の対との間の１つまたは複数の反応を検出して、それにより該標的ヌクレオチド配列の存在を決定する工程と、を含む方法。
【請求項１１】
プローブ対の数は、２〜１０，０００である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
プローブ対の数は、５〜５，０００である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
プローブ対の数は、１０〜１，０００である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１反応性基および前記対応する第２反応性基の間の反応は、前記プローブ対を通して同一である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１反応性基および前記対応する第２反応性基の間の反応は、前記プローブ対を通してすべてが同一とは限らない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記プローブ対の前記標的ヌクレオチド配列へのハイブリダイゼーションは、実質的に同一条件下で同時に発生する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
核酸を鋳型とする化学（nucleic acid-templated chemistry）を実施するための方法であって、一本鎖鋳型ヌクレオチド配列を鋳型とする、多重の核酸を鋳型とする化学反応を実施する工程を含む方法。
【請求項１８】
前記多重の核酸を鋳型とする化学反応は、実質的に類似の条件で行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記多重の核酸を鋳型とする化学反応は、実質的に同時に行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記多重の核酸を鋳型とする化学反応は、同一反応である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記多重の核酸を鋳型とする化学反応は、同一反応ではない、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
生物学的標的を検出するための方法であって：
（ａ）第１プローブを提供する工程であって、該第１プローブは（１）該生物学的標的に対する結合親和性を有する第１結合成分、（２）第１オリゴヌクレオチド配列、および（３）該第１オリゴヌクレオチド配列と結合している第１反応性基を含んでいる、工程と；
（ｂ）第２プローブを提供する工程であって、該第２プローブは（１）該生物学的標的に対する結合親和性を有する第２結合成分、（２）第２オリゴヌクレオチド配列、および（３）該第２オリゴヌクレオチド配列と結合している第２反応性基を含んでおり、このとき該第２オリゴヌクレオチドは、該第１オリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができ、該第２反応性基は相互に反応近接性に持ち込まれると該第１反応性基に対して反応性である工程と；
（ｃ）該第１および第２プローブを、該第１および該第２結合成分が該生物学的標的に結合する条件下で該生物学的標的の存在について試験されるサンプルと結合させる工程と；
（ｄ）該第１および該第２反応性基を反応近接性に持ち込むために該第２オリゴヌクレオチドを該第１オリゴヌクレオチドへハイブリダイズさせる工程と；
（ｅ）該第１および該第２反応性基の間の反応を検出し、それにより該生物学的標的の存在を決定する工程と、を含む方法。
【請求項２３】
前記第１プローブは、前記第１結合成分と前記第１オリゴヌクレオチド配列との間の第１リンカーをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第２プローブは、前記第２結合成分と前記第２オリゴヌクレオチド配列との間の第２リンカーをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記生物学的標的はタンパク質である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記生物学的標的は自己抗体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記生物学的標的は細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１および第２結合成分のうちの少なくとも１つは、前記生物学的標的に対する抗体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１および第２結合成分の両方は、前記生物学的標的に対する抗体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１および第２結合成分のうちの少なくとも１つは、前記生物学的標的に対する抗体ではない、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１および第２結合成分のうちの少なくとも１つは、前記生物学的標的に結合するアプタマーである、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１および第２結合成分の両方は、前記生物学的標的に結合するアプタマーである、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１および第２結合成分のうちの少なくとも１つは、小分子結合剤である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１および第２結合成分の両方は小分子結合剤である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１オリゴヌクレオチド配列および第２オリゴヌクレオチド配列は、６〜３０塩基の相補的領域を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１および第２反応性基の間の反応は、蛍光成分を生成する、請求項２２に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１および第２反応性基の間の反応は、化学発光もしくは発色団成分を生成する、請求項２２に記載の方法。
【請求項３８】
前記サンプル中の生物学的標的の不在下では、前記第１および第２反応性基の間で実質的に検出可能な反応が発生しない、請求項２２に記載の方法。
【請求項３９】
生物学的標的を検出するための方法であって：
（ａ）該生物学的標的と第１プローブとの結合複合体を提供する工程であって、該第１プローブは（１）該生物学的標的に対する結合親和性を有する第１結合成分、（２）第１オリゴヌクレオチド配列、および（３）該第１オリゴヌクレオチド配列と結合している第１反応性基を含む、工程と；
（ｂ）（ａ）の結合複合体と第２プローブとを接触させる工程であって、該第２プローブは（１）該生物学的標的に対する結合親和性を有する第２結合成分、（２）第２オリゴヌクレオチド配列、および（３）該第２オリゴヌクレオチド配列と結合している第２反応性基を含んでおり、このとき該第２オリゴヌクレオチドは、該第１オリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができ、該第２反応性基は相互に反応近接性に持ち込まれると該第１反応性基に対して反応性である、工程と；
（ｃ）該第１および第２反応性基を反応近接性に持ち込むために該第２オリゴヌクレオチドを該第１オリゴヌクレオチドへハイブリダイズさせる工程と；
（ｄ）該第１および第２反応性基の間の反応を検出し、それにより該生物学的標的の存在を決定する工程と、を含む方法。
【請求項４０】
生物学的標的の存在を検出するための方法であって：
（ａ）該生物学的標的に第１プローブおよび第２プローブを結合させる工程であって、ここで
（１）該第１プローブは（ｉ）該生物学的標的に対する結合親和性を有する第１結合成分、（ｉｉ）第１オリゴヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）該第１オリゴヌクレオチド配列と結合している第１反応性基を含み、そして
（２）該第２プローブは（ｉ）該生物学的標的に対する結合親和性を有する第２結合成分、（ｉｉ）第２オリゴヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）該第２オリゴヌクレオチド配列と結合している第２反応性基を含み、このとき該第２オリゴヌクレオチドは、該第１オリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができ、該第２反応性基は相互に反応近接性に持ち込まれると該第１反応性基に対して反応性である、工程と；
（ｂ）該第２オリゴヌクレオチドを該第１オリゴヌクレオチド配列へハイブリダイズさせ、それにより該第１および第２反応性基を反応近接性に持ち込む工程と；
（ｃ）該第１および第２反応性基の間の反応を検出し、それにより該生物学的標的の存在を決定する工程と、を含む方法。
【請求項４１】
前記第１プローブは、前記第１結合成分と前記第１オリゴヌクレオチド配列との間の第１リンカーをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記第２プローブは、前記第２結合成分と前記第２オリゴヌクレオチド配列との間の第２リンカーをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記生物学的標的はタンパク質である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記生物学的標的は自己抗体である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記生物学的標的は細胞である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記第１および第２結合成分のうちの少なくとも１つは、前記生物学的標的に対する抗体である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
前記第１および第２結合成分の両方は、前記生物学的標的に対する抗体である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
前記第１および第２結合成分のうちの少なくとも１つは、前記生物学的標的に対する抗体ではない、請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
前記第１および第２結合成分のうちの少なくとも１つは、前記生物学的標的に結合するアプタマーである、請求項４０に記載の方法。
【請求項５０】
前記第１および第２結合成分の両方は、前記生物学的標的に結合するアプタマーである、請求項４０に記載の方法。
【請求項５１】
前記第１および第２結合成分のうちの少なくとも１つは、小分子結合剤である、請求項４０に記載の方法。
【請求項５２】
前記第１および第２結合成分の両方は小分子結合剤である、請求項４０に記載の方法。
【請求項５３】
前記第１オリゴヌクレオチド配列および第２オリゴヌクレオチド配列は、６〜３０塩基の相補的領域を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項５４】
生物学的標的を検出するための方法であって：
（ａ）第１プローブを提供する工程であって、該第１プローブは（１）該生物学的標的に対して結合親和性を有する第１結合成分、および（２）第１オリゴヌクレオチドジップコード配列を含む工程と；
（ｂ）第２プローブを提供する工程であって、該第２プローブは（１）該生物学的標的に対して結合親和性を有する第２結合成分、および（２）第２オリゴヌクレオチドジップコード配列を含み、ここで
該第１プローブは、（１）該第１オリゴヌクレオチドジップコード配列に対して相補的であるオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列、（２）第１レポーターオリゴヌクレオチド、および（３）第１反応性基を含む第１レポータープローブへハイブリダイズされ；
該第２プローブは、（１）該第２オリゴヌクレオチドジップコード配列に対して相補的であるオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列、（２）第２レポーターオリゴヌクレオチド、および（３）第２反応性基を含む第２レポータープローブへハイブリダイズされ；
該第２レポーターオリゴヌクレオチドは、該第１レポーターオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができ、該第２反応性基は相互に反応近接性に持ち込まれると該第１反応性基に対して反応性である、工程と；
（ｃ）該第１および第２プローブを、該生物学的標的の存在について試験されるサンプルと接触させる工程と；
（ｄ）該第１および第２プローブを、該生物学的標的が該サンプル中に存在する場合に、該生物学的標的に結合させ、それにより該第２レポーターオリゴヌクレオチドが、該第１レポーターオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズし、該第１および第２反応性基を反応近接性に持ち込む工程と；
（ｅ）該第１および第２反応性基の間の反応を検出し、それにより該生物学的標的の存在を決定する工程と、を含む方法。
【請求項５５】
前記第１および第２結合成分は抗体である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記第１および第２結合成分はアプタマーである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記第１および第２結合成分は小分子結合剤である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記第１および第２反応性基の間のレポーター化学反応はポリメチンもしくはその誘導体を生成する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
前記第１および第２反応性基の間のレポーター化学反応はシアニンもしくはその誘導体を生成する、請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
前記第１および第２反応性基の間の反応はＷｉｔｔｉｇ反応である、請求項５４に記載の方法。
【請求項６１】
前記第１および第２反応性基の間の反応はアルドール縮合反応である、請求項５４に記載の方法。
【請求項６２】
前記第１および第２反応性基の間の反応は蛍光成分を生成する、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記第１および第２反応性基の間の反応は、化学発光もしくは発色団成分を生成する、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記第１および／または第２オリゴヌクレオチド配列の酵素的連結反応を含まない、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記第１および／または第２オリゴヌクレオチド配列の化学的連結反応を含まない、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
請求項１〜６５のいずれか一項に記載の方法の１つまたは複数のプローブを含むキット。
【請求項６７】
請求項１〜６５のいずれか一項に記載の方法の２つ以上のプローブを含むキット。
【請求項６８】
生物学的分析物を検出するために有用なキットであって：
（ａ）（１）該生物学的分析物に対する結合親和性を有する第１結合成分、（２）第１オリゴヌクレオチド配列、および（３）該第１オリゴヌクレオチド配列と結合している第１反応性基を含む第１プローブと；
（ｂ）（１）該生物学的分析物に対する結合親和性を有する第２結合成分、（２）第２オリゴヌクレオチド配列、および（３）該第２オリゴヌクレオチド配列と結合している第２反応性基を含む第２プローブとを含み、ここで
該第２オリゴヌクレオチドは、該第１オリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができ、該第２反応性基は相互に反応近接性に持ち込まれると該第１反応性基に対して反応性である、キット。
【請求項６９】
生物学的分析物を検出するために有用なキットであって：
（ａ）第１プローブであって、（１）該生物学的標的に対して結合親和性を有する第１結合成分、および（２）第１オリゴヌクレオチドジップコード配列を含む、第１プローブと；
（ｂ）第２プローブであって、（１）該生物学的標的に対して結合親和性を有する第２結合成分、および（２）第２オリゴヌクレオチドジップコード配列を含む、第２プローブと；を含み、ここで
該第１プローブは、（１）該第１オリゴヌクレオチドジップコード配列に対して相補的であるオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列、（２）第１レポーターオリゴヌクレオチド、および（３）第１反応性基を含む第１レポータープローブにハイブリダイズ可能であり；
該第２プローブは、（１）該第２オリゴヌクレオチドジップコード配列に対して相補的であるオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列、（２）第２レポーターオリゴヌクレオチド、および（３）第２反応性基を含む第２レポータープローブへハイブリダイズ可能であり；
該第２レポーターオリゴヌクレオチドは、該第１レポーターオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができ、該第２反応性基は相互に反応近接性に持ち込まれると該第１反応性基に対して反応性である、キット。
【請求項７０】
前記検出される生物学的分析物は融合タンパク質を含む、請求項６８または６９に記載のキット。
【請求項７１】
前記検出される生物学的分析物はタンパク質−タンパク質相互作用を含む、請求項６８または６９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００５年５月２６日に出願された米国特許出願第６０／６８５，０４７号、２００５年７月２１日に出願された同第６０／７０１，１６５号、２００５年８月３１日に出願された同第６０／７１３，０３８号、２００５年１０月７日に出願された同第６０／７２４，７４３号、２００６年１月１３日に出願された同第６０／７５８，８３７号、および２００６年３月２７日に出願された同第６０／７８６，２４７号の利益およびこれらに対する優先権を主張する。これらそれぞれの開示全体が、全ての目的のために参考として本明細書に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に生物学的検出および診断学におけるプローブならびにそれらの使用に関する。より詳細には、本発明は、生物学的検出および診断学（核酸およびタンパク質の検出）における核酸を鋳型とする化学（例えば、蛍光、化学発光および／または発色団化合物の合成）の組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
蛍光および着色化合物は、生体分子の存在、不在、状態、量、および組成を検出するために生物学的研究および医学の分野において使用されてきた。蛍光および着色化合物を使用するアッセイは、インビトロ（生体外）、インサイチュー（生体内の原位置）、またはインビボ（生体内）で実施できる。ＤＮＡおよびＲＮＡを検出するためのインビトロアッセイにおいて一般に使用される例は、リアルタイムおよびエンドポイントＰＣＲ、ＤＮＡシーケンシング、およびＤＮＡマイクロアレイテクノロジーである。
【０００４】
核酸の検出
ＤＮＡおよびＲＮＡ検出アッセイにおいて共通するのは、蛍光標識を有するＤＮＡプローブおよび／またはプライマーに対する要件である。これらは、典型的には酵素的および／または化学的合成によって作製される。インビトロ蛍光アッセイのその他の例には、抗体が蛍光体で標識されるＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。インサイチュー蛍光アッセイの例は、例えば、フローソーターを用いてそれらを検出する、イメージングする、および単離することができるように蛍光修飾された抗体を用いて全（生または死）細胞の標識化である。極めて最近には、蛍光を全動物において最小侵襲性検出テクノロジーとして利用する努力が重ねられてきた。本質的には、抗体もしくは一部の他の生物活性分子が近赤外線もしくは赤外線蛍光化合物で標識され、その後に動物に注射される；蛍光の所在位置は適正な照明およびイメージング装置を用いて検出される。この方法で、試験的手術の必要を伴わずに癌およびその他の疾患を見つけて監視することができる。上記は、生物学的検出のためのテクノロジーとして蛍光が普及していることを例示するほんの数例に過ぎない。
【０００５】
典型的には、これらのタイプのアッセイの大多数について、適正な信号対雑音比および感受性を達成するために洗浄工程によって未結合のプローブもしくは抗体を除去する必要がある。これは、アッセイ方法に工程を追加し、最終的には追加の時間や（試薬およびおそらく装備の）費用を生じさせる。ＲＴ−ＰＣＲなどのＤＮＡ／ＲＮＡ増幅アッセイについては、標的が増幅させられ、アッセイのために多量の分析物を提供しながらサンプルの複雑性を効果的に減少させるので、洗浄工程は必要とされない。だが、ＰＣＲでさえある程度の限界がある。例えば、単一アッセイで検出できる分析物の数は４つ以下に限定され、このアッセイは高額かつ消費電力が大きい装置を必要とするので、研究室、および特に現場で使用するための適用可能性を制限する。そこで、ＰＣＲと同程度の感受性かつ特異性があり、さらにいっそう頑丈かつ持ち運び化能であるアッセイテクノロジーがあれば有益であろう。インビボイメージングの場合には、生物活性化合物がその標的を見いだして、身体から過剰な試薬を除去できるように注入後のイメージング前にある期間が必要とされるので、「生物学的」洗浄工程が実施される。
【０００６】
タンパク質の検出
タンパク質は、基本的にはタンパク質に関係する分子間作用および様々な分子認識から構成される多数の生物学的反応において中心的役割を果たす。タンパク質の同定および定量的決定において使用される一般的方法は、二次元電気泳動法および質量分析法を使用する。また別の方法は、液体クロマトグラフィーおよび質量分析法を使用する。タンパク質の相互作用の検出および同定のためには、平面上にスポッティングされた多数の抗体が用意されている抗体チップもまた使用されてきた。電気泳動法を使用する従来型方法には、分解能および検出感受性に関して問題がある。
【０００７】
Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．による特許文献１は、検出対象の標的に結合する２つのプローブが、２つの結合プローブに付着している２つのオリゴヌクレオチドの両端へ酵素的に連結させられる近接連結反応アッセイについて記載している。結合したオリゴは、標的分子の存在を決定するために増幅させられる。Ｎａｄｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．による特許文献２は、アンプリコンを形成するという類似の原理について記載している。
【０００８】
Ｋｏｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．による特許文献３は、２つのオリゴヌクレオチドに連結した２つの結合パートナーが、標的に結合するとハイブリッドの、部分的に二本鎖のＤＮＡ構造を形成するという近接性に基づくアッセイについて記載している。部分的二本鎖構造は、次にＰＣＲによってさらに増幅させることのできる生成物を生成するためにＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長させることができる。
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／００６４７７９号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／０００９０５０号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５／００９５６２７号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、上述した生物学的検出方法に固有の多数の欠点を解決する新規な蛍光および比色テクノロジーに対する必要が存在する。現在ある多数の検出方法は、増幅を必要とする。そこで新規な蛍光化合物を発見する必要もまた存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の概要）
本発明は、一部には、核酸を鋳型とする化学を生物学的標的、例えば核酸、タンパク質、自己抗体、細胞などの検出に適用できるという発見に基づいている。本発明は、一部には、蛍光、化学発光および発色団化合物ならびに蛍光、化学発光および発色団シグナルを発生させる反応が核酸を鋳型とする化学によって合成できるという発見に基づいている。そのような化合物、化学反応およびその他の組成物は、核酸およびタンパク質などの生物学的分子の検出において有用である。蛍光、化学発光および着色化合物を使用する本発明のアッセイは、インビトロ、インサイチュー、またはインビボで実施できる。
【００１２】
１つの態様では、本発明は、標的ヌクレオチド配列を検出する方法に関する。本方法は、（ａ）（１）第１オリゴヌクレオチド配列（ｉ）および前記第１オリゴヌクレオチド配列に連結した第１反応性基（ｉｉ）を含む第１プローブ、および（２）第２オリゴヌクレオチド配列（ｉ）および前記第２オリゴヌクレオチド配列に連結した第２反応性基（ｉｉ）を含む第２プローブを提供する工程であって、このとき前記第１オリゴヌクレオチド配列および第２オリゴヌクレオチド配列は前記標的ヌクレオチドの２つの別個の領域に相補的である工程と；（ｂ）前記第１プローブおよび前記第２プローブを前記標的ヌクレオチド配列の存在について試験されるサンプルと、前記第１プローブおよび前記第２プローブが前記サンプル中に存在する場合は前記標的ヌクレオチド配列のそれらの各相補的領域にハイブリダイズする条件下で結合させ、それにより前記第１反応性基および前記第２反応性基を反応近接性に持ち込む工程と；および（ｃ）前記第１反応性基および前記第２反応性基の反応を検出して、それにより前記標的ヌクレオチド配列の存在を決定する工程と、を含んでいる。
【００１３】
また別の態様では、本発明は、標的ヌクレオチド配列を検出する方法に関する。本方法は、（ａ）各プローブ対が（１）第１オリゴヌクレオチド配列（ｉ）および前記第１オリゴヌクレオチド配列に連結した第１反応性基（ｉｉ）を含む第１プローブ、および（２）第２オリゴヌクレオチド配列（ｉ）および前記第２オリゴヌクレオチド配列に連結した第２反応性基（ｉｉ）を含む第２プローブを含む１セットのプローブ対を提供する工程であって、このとき前記第１オリゴヌクレオチド配列および第２オリゴヌクレオチド配列は前記標的ヌクレオチドの２つの別個の領域に相補的である工程と；（ｂ）前記セットのプローブ対を前記標的ヌクレオチド配列の存在について試験されるサンプルと、前記プローブ対の前記第１プローブおよび第２プローブの各々が前記サンプル中に存在する場合は前記標的ヌクレオチド配列のその各相補的領域にハイブリダイズする条件下で結合させ、それにより前記第１および第２反応性基を反応近接性に持ち込む工程と；および（ｃ）前記第１反応性基の対と前記第２反応性基の対との間の１つまたは複数の反応を検出して、それにより前記標的ヌクレオチド配列の存在を決定する工程と、を含んでいる。
【００１４】
さらにまた別の態様では、本発明は、核酸を鋳型とする化学を実施するための方法に関する。本方法は、例えば実質的に類似する条件下および／または実質的に同時に、単一鋳型ヌクレオチド配列によって鋳型作製される複数の核酸を鋳型とする化学反応を実施する工程を含んでいる。
【００１５】
さらにまた別の態様では、本発明は、生物学的標的を検出するための方法を提供する。本方法は、以下を含んでいる。第１プローブが提供される。第１プローブは、（１）生物学的標的に対する結合親和性を有する第１結合成分、（２）第１オリゴヌクレオチド配列、および（３）前記第１オリゴヌクレオチド配列と結合している第１反応性基を含んでいる。（１）生物学的標的に対する結合親和性を有する第２結合成分、（２）第２オリゴヌクレオチド配列、および（３）前記第２オリゴヌクレオチド配列と結合している第２反応性基を含んでいる第２プローブが提供される。前記第２オリゴヌクレオチドは、前記第１オリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる。前記第２反応性基は、相互に反応近接性に持ち込まれると前記第１反応性基に対して反応性である。前記第１および第２プローブは、前記生物学的標的の存在について試験されるサンプルと、前記第１および第２結合成分が前記生物学的標的に結合する条件下で結合させられる。前記第２オリゴヌクレオチドは、前記第１および第２反応性基を反応近接性に持ち込むために前記第１オリゴヌクレオチド配列へハイブリダイズさせられる。第１および第２反応性基の間の反応が検出され、それにより前記生物学的標的の存在が決定される。１つの実施形態では、第１および第２反応性基の間の反応は蛍光成分を生成する。また別の実施形態では、第１および第２反応性基の間の反応は化学発光および／または発色団成分を生成する。
【００１６】
さらにまた別の態様では、本発明は、生物学的標的を検出する方法を提供する。本方法は、以下を含んでいる。生物学的標的と第１プローブとの結合複合体が提供される。第１プローブは、（１）生物学的標的に対する結合親和性を有する第１結合成分、（２）第１オリゴヌクレオチド配列、および（３）前記第１オリゴヌクレオチド配列と結合している第１反応性基を含んでいる。前記結合複合体は、第２プローブと接触させられる。第２プローブは、（１）生物学的標的に対する結合親和性を有する第２結合成分、（２）第２オリゴヌクレオチド配列、および（３）前記第２オリゴヌクレオチド配列と結合している第２反応性基を含んでいる。前記第２オリゴヌクレオチドは、前記第１オリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができ、前記第２反応性基は相互に反応近接性に持ち込まれると前記第１反応性基に対して反応性である。前記第２オリゴヌクレオチドは、前記第１および第２反応性基を反応近接性に持ち込むために前記第１オリゴヌクレオチド配列へハイブリダイズさせられる。第１および第２反応性基の間の反応が検出され、それにより前記生物学的標的がサンプル中に存在するかどうかが決定される。
【００１７】
さらにまた別の態様では、本発明は、生物学的標的の存在を検出する方法を提供する。本方法は、以下を含んでいる。第１プローブおよび第２プローブは標的に結合させられる。第１プローブは、（１）生物学的標的に対する結合親和性を有する第１結合成分、（２）第１オリゴヌクレオチド配列、および（３）前記第１オリゴヌクレオチド配列と結合している第１反応性基を含んでいる。第２プローブは、（１）生物学的標的に対する結合親和性を有する第２結合成分、（２）第２オリゴヌクレオチド配列、および（３）前記第２オリゴヌクレオチド配列と結合している第２反応性基を含んでいる。前記第２オリゴヌクレオチドは、前記第１オリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる。前記第２反応性基は、相互に反応近接性に持ち込まれると前記第１反応性基に対して反応性である。前記第２オリゴヌクレオチドは、前記第１オリゴヌクレオチド配列へハイブリダイズさせられ、それにより前記第１および第２反応性基は反応近接性に持ち込まれる。前記第１および第２反応性基の間の反応は、前記生物学的標的がサンプル中に存在するかどうかを決定するために検出される。１つの実施形態では、第１および第２反応性基の間の反応は蛍光成分を生成する。また別の実施形態では、第１および第２反応性基の間の反応は化学発光および／または発色団成分を生成する。
【００１８】
さらにまた別の態様では、本発明は、生物学的標的の存在を検出する方法を提供する。本方法は、以下を含んでいる。（１）生物学的標的に対して結合親和性を有する第１結合成分、および（２）第１オリゴヌクレオチドジップコード配列を含む第１プローブが提供される。（１）生物学的標的に対して結合親和性を有する第２結合成分、および（２）第２オリゴヌクレオチドジップコード配列を含む第２プローブが提供される。前記第１プローブは、（１）前記第１オリゴヌクレオチドジップコード配列に対して相補的であるオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列、（２）第１レポーターオリゴヌクレオチド、および（３）前記第１反応性基を含む第１レポータープローブへハイブリダイズさせられる。前記第２プローブは、（１）前記第２オリゴヌクレオチドジップコード配列に対して相補的であるオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列、（２）第２レポーターオリゴヌクレオチド、および（３）前記第２反応性基を含む第２レポータープローブへハイブリダイズさせられる。第２レポーターオリゴヌクレオチドは、第１レポーターオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができ、前記第２反応性基は相互に反応近接性に持ち込まれると前記第１反応性基に対して反応性である。前記第１および第２プローブは、前記生物学的標的の存在について試験されるサンプルと接触させられる。前記第１および第２プローブは、サンプル中に存在する場合は生物学的標的に結合させられ、それにより前記第２レポーターオリゴヌクレオチドは、前記第１および第２反応性基を反応近接性に持ち込むために前記第１レポーターオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズする。第１および第２反応性基の間の反応は、それにより前記生物学的標的がサンプル中に存在するかどうかを決定するために検出される。
【００１９】
ここで本発明の方法は第１および／または第２オリゴヌクレオチド配列の酵素的または化学的連結反応を必要としないことを指摘しておきたい。
【００２０】
さらにまた別の態様では、本発明は、生物学的分析物を検出するために有用なキットを提供する。本キットは、（１）生物学的分析物に対する結合親和性を有する第１結合成分、（２）第１オリゴヌクレオチド配列、および（３）前記第１オリゴヌクレオチド配列に結合している第１反応性基を含む第１プローブ；ならびに（１）生物学的分析物に対する結合親和性を有する第２結合成分、（２）第２オリゴヌクレオチド配列、および（３）前記第２オリゴヌクレオチド配列に結合している第２反応性基を含む第２プローブを含んでいる。前記第２オリゴヌクレオチドは、前記第１オリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる。前記第２反応性基は、相互に反応近接性に持ち込まれると前記第１反応性基に対して反応性である。
【００２１】
さらにまた別の態様では、本発明は、生物学的分析物を検出するために有用なキットを提供する。本キットは、（１）生物学的標的に対する結合親和性を有する第１結合成分、および（２）第１オリゴヌクレオチドジップコード配列含む第１プローブ；ならびに（１）生物学的標的に対する結合親和性を有する第２結合成分、および（２）第２オリゴヌクレオチドジップコード配列を含む第２プローブを含んでいる。前記第１プローブは、（１）前記第１オリゴヌクレオチドジップコード配列に対して相補的であるオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列、（２）第１レポーターオリゴヌクレオチド、および（３）前記第１反応性基を含む第１レポータープローブへハイブリダイズすることができる。前記第２プローブは、（１）前記第２オリゴヌクレオチドジップコード配列に対して相補的であるオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列、（２）第２レポーターオリゴヌクレオチド、および（３）前記第２反応性基を含む第２レポータープローブへハイブリダイズすることができる。前記第２レポーターオリゴヌクレオチドは、前記第１レポーターオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができ、前記第２反応性基は相互に反応近接性に持ち込まれると前記第１反応性基に対して反応性である。
【００２２】
本発明は、本明細書に記載した１つ、２つまたはそれ以上のプローブを提供するキットを含んでいる。より詳細には、本発明は、生物学的標的、例えば１つまたは複数の核酸、１つまたは複数のタンパク質、１つまたは複数の自己抗体、および／または１つまたは複数の細胞の存在について検出するための方法として、検出可能なシグナルを発生させるために核酸を鋳型とする化学を利用する１つ、２つまたはそれ以上のプローブを提供するキットを含んでいる。
【００２３】
本発明の上記の態様および実施形態は、以下の図面、詳細な説明および特許請求の範囲を参照することでより十分に理解することができる。
用語の定義
本明細書で使用した用語「ＤＮＡプログラムされた化学」もしくは「ＤＰＣ」は、核酸を鋳型とする化学、例えば、特定生成物を産生させるために、（１）結合している反応性基を有する１つまたは複数の鋳型を提供する工程；（２）アンチコドン（例えば、１つまたは複数の鋳型を備える相補的配列）を有する１つまたは複数の導入基（試薬）と反応性基とを、鋳型にハイブリダイズさせるための条件下で接触させる工程と、および（３）生成物を産生するための反応性基の反応と、によって遂行される化学反応物質の配列特異的制御を意味する。例えば、シングルステップ核酸鋳型作製反応では、「鋳型」と「相補的」オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは反応性基とを結合させ、その後に所望の生成物を生じさせる化学反応が続く。反応物質と生成物の構造は、鋳型および導入基ヌクレオチドを含む核酸の構造と関連している必要はない。さらに、以下の全部が明示的に参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許公開第２００４／０１８０４１２Ａ１号（ＵＳＳＮ１０／６４３，７５２；２００３年８月１９日）およびＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．による２００３／０１１３７３８Ａ１（ＵＳＳＮ１０／１０１，０３０；２００２年３月１９日）；Ｇａｒｔｎｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ｖｏｌ．  ３０５，  ｐｐ．１６０１−１６０５；Ｄｏｙｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  ＪＡＣＳ，  ｖｏｌ．  １２５，  ｐｐ．１２３７２−１２３７３を参照されたい。例えば、２００６年５月３日に提出されたＣｏｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  による“Ｔｕｒｎ  Ｏｖｅｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ”と題するＰＣＴ国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０６／１６９９９も参照されたい。
【００２４】
本明細書で使用する用語「核酸」、「オリゴヌクレオチド」（時々は単純に「オリゴ」と呼ぶ）もしくは「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドの重合体を意味する。重合体には、制限なく、天然ヌクレオシド（すなわち、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）、ヌクレオシドアナログ（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および２−チオシチジン）、化学修飾された塩基、生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）、介在塩基、修飾された糖（例えば、２’−フルオロリボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）、または修飾されたホスフェート基（例えば、ホスホチオエート、ホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホルアミダイト連鎖）が含まれる。核酸およびオリゴヌクレオチドには、さらにまたロックされた核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）などの修飾された主鎖を有する塩基の他の重合体もまた含まれることがある。
【００２５】
本明細書を通して、組成物が特定の成分を「有する」、「含んでいる」、もしくは「含む」と記載されている場合、または本明細書に記載したプロセスが特定のプロセス工程を「有する」、「含んでいる」、もしくは「含む」と記載されている場合は、本発明の組成物は、言及した成分から本質的に構成される、もしくは構成される、そして本発明のプロセスは言及したプロセス工程から本質的に構成される、もしくは構成されることもまた企図されている。さらに、工程の順序または所定の作用を実施するための順序は、本発明が機能的のままである限り重要ではないことを理解されたい。その上、２つ以上の工程もしくは作用を同時に実施することもできる。
【００２６】
本発明は、以下の図面を見ることでより詳細に理解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
（発明の詳細な説明）
極めて単純に述べると、本発明は、核酸鋳型作製反応によって標的分析物、例えば核酸もしくはタンパク質の存在を指示する検出可能なシグナルを発生させる。より詳細には、本発明は、蛍光、化学発光もしくは発色団化合物およびシグナルを発生させるため、そしてそのようなテクノロジーを生物学的検出および／または診断用途に利用するための刺激的なアプローチを提供する。化学結合の形成もしくは開裂、または核酸を鋳型とする化学の直接的な結果としての官能基の化学変換に起因する着色、蛍光もしくは化学発光化合物もしくは前駆体の作製および検出は、バイオテロ物質の検出および疾患の診断を含む多数の領域に適用できる独創的テクノロジーを提供する。
【００２８】
そこで、プローブ間のハイブリダイゼーションイベントの後に、近接性作用に起因する化学反応速度を実質的に高め、様々な化学反応を媒介することができるＤＮＡ鋳型（オリゴヌクレオチド）によって媒介される化学反応が続く。このため、標的生体分子（例えば、核酸もしくはタンパク質）の存在は、検出可能な化学反応の発生を導く。結果として、本発明は、容易に使用することができ、高い信号対雑音比の生物学的標的検出を提供する。
【００２９】
核酸の検出
図１は、核酸検出の１つの実施形態を例示している。２つのオリゴヌクレオチドプローブは、ＤＮＡもしくはＲＮＡ標的（例えば、バイオテロ物質もしくはその他の感染性物質を含有すると考えられるサンプル中の分析物）に結合する。２つのプローブは、化学的反応種であるＸおよびＹで標識される。ハイブリダイゼーションさせると、ＸおよびＹは反応してシグナル発生化合物Ｚ（例えば、蛍光、化学発光もしくは着色化合物）を作製する。Ｚは２つのプローブに共有結合する場合も共有結合しない場合もあるが、共有結合しない場合は、Ｚはどちらかのプローブに結合することがある。Ｚは、形成されるとオリゴヌクレオチドから遊離できる。
【００３０】
蛍光体もしくは発色団が遊離すると、ハイブリダイゼーション複合体から分離されて独立して分析できる、または検出されると除去できるので、サンプルの追加のインテロゲーションラウンド（例えば、プローブの代謝回転）を実施できる。蛍光体もしくは発色団が遊離しない場合は、それは、例えばゲル電気泳動法によって分解できる二本鎖構造として移動する反応混合物の残りからさらに分離することができる。ＤＮＡもしくはＲＮＡ標的上のＤＮＡプローブに付着した蛍光体は、ビーズ、スライドガラス（マイクロアレイ）の表面などの固相に付着させることができる、または溶液中に存在してもよく、その場合には反応は均質アッセイを構成する。
【００３１】
そこで、１つの態様では、本発明は、標的ヌクレオチド配列を検出するための方法に関する。本方法は、（ａ）（１）第１オリゴヌクレオチド配列（ｉ）および前記第１オリゴヌクレオチド配列に連結した第１反応性基（ｉｉ）を含む第１プローブ、および（２）第２オリゴヌクレオチド配列（ｉ）および前記第２オリゴヌクレオチド配列に連結した第２反応性基（ｉｉ）を含む第２プローブを提供する工程であって、このとき前記第１オリゴヌクレオチド配列および第２オリゴヌクレオチド配列は前記標的ヌクレオチドの２つの別個の領域に相補的である工程と；（ｂ）前記第１プローブおよび前記第２プローブを前記標的ヌクレオチド配列の存在について試験されるサンプルと、前記第１プローブおよび前記第２プローブが前記サンプル中に存在する場合は前記標的ヌクレオチド配列のそれらの各相補的領域にハイブリダイズする条件下で結合させ、それにより前記第１反応性基および前記第２反応性基を反応近接性に持ち込む工程と；および（ｃ）前記第１反応性基および前記第２反応性基の反応を検出して、それにより前記標的ヌクレオチド配列の存在を決定する工程と、を含んでいる。
【００３２】
図２は、低コピー数の遺伝子の検出を可能にした核酸を鋳型とする化学による核酸配列の検出の実施例を示している。当該の遺伝子は、１セットのプローブ対（例えば、約４００／遺伝子）で「彩色」される。プローブ対の数は、例えば、２、５、１０および１，０００、５，０００または１０，０００の間であってよい。プローブ対（第１反応性基および対応する第２反応性基）間の化学反応は、プローブ対全体で同一であっても、相違していてもよい。相違する蛍光体を発生させる様々な群のプローブ対は、標的内の相違する配列にターゲティングすることができる。
【００３３】
図２に例示した実施形態は、生物学的検出以外の用途に適用することもできる。単一ＤＮＡ鋳型上で発生する複数の核酸鋳型作製反応の原理は、蛍光シグナルの発生に限定されない。
【００３４】
そこで、また別の態様では、本発明は、標的ヌクレオチド配列を検出する方法に関する。本方法は、（ａ）各プローブ対が（１）第１オリゴヌクレオチド配列（ｉ）および前記第１オリゴヌクレオチド配列に連結した第１反応性基（ｉｉ）を含む第１プローブ、および（２）第２オリゴヌクレオチド配列（ｉ）および前記第２オリゴヌクレオチド配列に連結した第２反応性基（ｉｉ）を含む第２プローブを含む１セットのプローブ対を提供する工程であって、このとき前記第１オリゴヌクレオチド配列および第２オリゴヌクレオチド配列は前記標的ヌクレオチドの２つの別個の領域に相補的である工程と；（ｂ）前記セットのプローブ対を前記標的ヌクレオチド配列の存在について試験されるサンプルと、前記プローブ対の前記第１プローブおよび第２プローブの各々が前記サンプル中に存在する場合は前記標的ヌクレオチド配列のその各相補的領域にハイブリダイズする条件下で結合させ、それにより前記第１および第２反応性基を反応近接性に持ち込む工程と；および（ｃ）前記第１反応性基の対と前記第２反応性基の対のと間の１つまたは複数の反応を検出して、それにより前記標的ヌクレオチド配列の存在を決定する工程と、を含んでいる。
【００３５】
図３は、間接的検出スキームが核酸鋳型作製反応とその後の補因子遊離および引き続いての検出可能な反応を含んでいる、また別の実施形態の例を示している。
【００３６】
タンパク質の検出
図４および図５は、タンパク質標的を検出するための本発明の１つの実施形態を示している。
【００３７】
図４は、本発明によるタンパク質標的を検出する実施形態を示している。２つのプローブは、標的結合成分、相補的オリゴヌクレオチド、ならびに各々化学的反応種ＸおよびＹを含有している。ハイブリダイゼーションさせると、ＸおよびＹは反応してシグナル発生（例えば、蛍光）化合物を作製するが、これは両方のプローブに共有結合する場合もしない場合もある。ＸおよびＹの反応生成物は、未結合の可溶性化合物として溶液中に放出されることもある。タンパク質標的は、ビーズ、スライドガラス（マイクロアレイ）などの固相に付着させることができる、または溶液中に存在してもよい。標的結合成分は、例えば、アプタマー、抗体、抗体フラグメント（すなわち、Ｆａｂ）、受容体タンパク質、または小分子であってよい。
【００３８】
図５により詳細に示したのは、各々が「前蛍光体（ｐｒｅｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）」前駆体（Ｆ１およびＦ２）を有しており、標的に対する結合成分および相互にアニールするように設計されているオリゴヌクレオチド配列を含有する２つのプローブを用いる二重プローブアプローチの例である。この実施形態では、検出は、前蛍光体オリゴが標的の不在下では相互にアニールしないような条件下で実施される。これらの条件は一般に、周囲温度が標的の不在下ではオリゴヌクレオチド対のＴｍより高いように（その結果としてオリゴ対は意図される標的分析物の不在下ではアニールしないであろう）選択される。しかし意図される標的の存在下では、局在する高濃度のオリゴはそれらの二本鎖複合体のＴｍを上向きに移動させるので、その結果としてハイブリダイゼーションが発生し、その後にシグナルを発生する核酸鋳型作製反応（Ｆ１とＦ２との間の反応）が続く。シグナルを発生する核酸鋳型作製反応は、局在する高濃度の前蛍光体のために促進されるが、さらにまた相互に向かう前蛍光体基の近接性および方向によっても促進される可能性がある。シグナル発生のこの構成は、様々な生体分子、細胞、表面を検出するため、およびインサイチューアッセイを設計するためのキットの作製を可能にする能力を有している。シグナル発生は酵素を必要とせず、そして均質なフォーマットはサンプル操作を必要としない。
【００３９】
図５には、２つのオリゴヌクレオチドが示されており、それらの各々は、この場合には図に示したように抗体であるが、アプタマーもしくは小分子などの他の結合剤であってよい結合剤を分離するために任意のスペーサーアームを通して結合されている。各抗体は、タンパク質などの一般標的分析物上の個別のエピトープを認識する。スペーサーアームは、オリゴと結合剤間の一方または両方のオリゴヌクレオチドに加えることができる。所定の場合には、このスペーサーアームは、所望の反応性を達成するための近接性要件を満たすために必要とされることがある。スペーサーアームは、原則的には任意の適切な基、例えば、直鎖状もしくは分枝状の脂肪族炭素鎖Ｃ３〜Ｃ５、Ｃ１０、Ｃ１５、Ｃ２０、Ｃ２５、Ｃ３０、Ｃ３５、Ｃ４０、もしくはＣ１００基、１０、１５、２０、３０、５０もしくは１００塩基長のＤＮＡ配列、または適切な長さのポリエチレングリコールオリゴマーであってよい。
【００４０】
前蛍光体は、一方はオリゴの５’端および他方は３’端に付着している「ヘリックスの末端」構成（図５の上方）に存在してよい（２つの前蛍光体を配列内に配置する、または部分ヘアピン構造（例えば、１００Å（オングストローム）長）にハイブリダイズする１つのオリゴを有することを含む他の構成を適用できる）。第１の例では、１つのオリゴヌクレオチドはスペーサーアームおよび標的結合剤の５’に付着しており、もう１つはスペーサーアームおよび別個の標的結合剤の３’に付着している。近接性要件を満たすためには、非相補的ＤＮＡ配列から構成されてよいスペーサーアーム、またはエチレングリコールのオリゴマーなどの合成スペーサーアームを加えることができる。そのようなスペーサーアームは、合成スペーサーを用いると発生する可能性がある結合への立体障害を克服するという長所を有する極めて柔軟性であってよい。適切に長いスペーサーアームの設計は、両方のオリゴヌクレオチドがそれらの結合剤の５’に結合する（図５の下方）、またはオリゴヌクレオチドがアンチパラレル構成でアニールできる限りは両方が３’に結合することを可能にし、反応性基を相互に反応させる。最適なスペーサーアーム長は、各標的に合わせて設計されてよい。過剰に長いスペーサーアームは、システム内の特異性を減少させる、または増加したＴｍ作用を減少させる可能性があるので回避すべきである。
【００４１】
オリゴヌクレオチド対を取り付けることによって与えられる近接性作用は、溶液中で自由な２つのオリゴヌクレオチドに比較して２つの相補的オリゴヌクレオチド配列のアニーリングの動態に影響を及ぼすことができる。より重要なことに、局在する高濃度は、自由複合体に比較して融解曲線を上方に移動させる、すなわち複合体のＴｍを上昇させる。バルク溶液中では、下記の方程式に示したように、Ｔｍが前オリゴヌクレオチド濃度に依存性を有することは知られている（Ｗｅｔｍｕｒ，  Ｃｒｉｔｉ．  Ｒｅｖ．  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ａｎｄ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ，  ２６，  ２２７−２５９（１９９１））。
【００４２】
【化１】
2008545416.tif 000003
式中、ΔＨおよびΔＳはヘリックス形成に対してエンタルピーおよびエントロピーであり、Ｒはモルガス定数であり、Ｃｔはオリゴマーの全濃度であり、そしてＮａ＋は溶液中のナトリウムイオンのモル濃度である。
【００４３】
図６は、０．１Ｍ塩中の短鎖オリゴヌクレオチドの範囲内でのＴｍ対濃度の勾配が、上記の方程式に基づくとオリゴヌクレオチド（図７に記載の配列）濃度の１０倍増加に付き約＋７℃の依存性を有することを示している。そこで例えば、局所濃度における１，０００倍の増加は、Ｔｍを約＋２１℃上昇させると予測されるであろう。
【００４４】
Ｆ１およびＦ２の反応生成物は、化学変換の結果としてハイブリダイゼーション複合体から遊離することがある。そこで、蛍光体もしくは発色団はハイブリダイゼーション複合体から分離されて独立して分析できる、または検出されると除去できるので、サンプルの追加のインテロゲーションラウンドを実施できる。Ｆ１とＦ２との間の反応は、生成物が形成されると２つのプローブに共有結合する、または共有結合しないことがある。
【００４５】
そこで、１つの態様では、本発明は、生物学的標的を検出する方法を提供する。本方法は、以下を含んでいる。第１プローブが提供される。第１プローブは、（１）生物学的標的に対する結合親和性を有する第１結合成分、（２）第１オリゴヌクレオチド配列、および（３）前記第１オリゴヌクレオチド配列と結合している第１反応性基を含んでいる。（１）生物学的標的に対する結合親和性を有する第２結合成分、（２）第２オリゴヌクレオチド配列、および（３）前記第２オリゴヌクレオチド配列と結合している第２反応性基を含んでいる第２プローブが提供される。前記第２オリゴヌクレオチドは、前記第１オリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる。前記第２反応性基は、相互に反応近接性に持ち込まれると前記第１反応性基に対して反応性である。前記第１および第２プローブは、前記生物学的標的の存在について試験されるサンプルと、前記第１および第２結合成分が前記生物学的標的に結合する条件下で結合させられる。前記第２オリゴヌクレオチドは、前記第１および第２反応性基を反応近接性に持ち込むために前記第１オリゴヌクレオチド配列へハイブリダイズさせられる。第１および第２反応性基の間の反応が検出され、それにより前記生物学的標的の存在が決定される。１つの実施形態では、第１および第２反応性基の間の反応は蛍光成分を生成する。また別の実施形態では、第１および第２反応性基の間の反応は化学発光および／または発色団成分を生成する。
【００４６】
また別の態様では、本発明は、生物学的標的を検出する方法を提供する。本方法は、以下を含んでいる。生物学的標的と第１プローブとの結合複合体が提供される。第１プローブは、（１）生物学的標的に対する結合親和性を有する第１結合成分、（２）第１オリゴヌクレオチド配列、および（３）前記第１オリゴヌクレオチド配列と結合している第１反応性基を含んでいる。前記結合複合体は、第２プローブと接触させられる。第２プローブは、（１）生物学的標的に対する結合親和性を有する第２結合成分、（２）第２オリゴヌクレオチド配列、および（３）前記第２オリゴヌクレオチド配列と結合している第２反応性基を含んでいる。前記第２オリゴヌクレオチドは、前記第１オリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができ、前記第２反応性基は相互に反応近接性に持ち込まれると前記第１反応性基に対して反応性である。前記第２オリゴヌクレオチドは、前記第１および第２反応性基を反応近接性に持ち込むために前記第１オリゴヌクレオチド配列へハイブリダイズさせられる。第１および第２反応性基の間の反応が検出され、それにより前記生物学的標的がサンプル中に存在するかどうかが決定される。
【００４７】
さらにまた別の態様では、本発明は、生物学的標的の存在を検出する方法を提供する。本方法は、以下を含んでいる。第１プローブおよび第２プローブは標的に結合させられる。第１プローブは、（１）生物学的標的に対する結合親和性を有する第１結合成分、（２）第１オリゴヌクレオチド配列、および（３）前記第１オリゴヌクレオチド配列と結合している第１反応性基を含んでいる。第２プローブは、（１）生物学的標的に対する結合親和性を有する第２結合成分、（２）第２オリゴヌクレオチド配列、および（３）前記第２オリゴヌクレオチド配列と結合している第２反応性基を含んでいる。前記第２オリゴヌクレオチドは、前記第１オリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる。前記第２反応性基は、相互に反応近接性に持ち込まれると前記第１反応性基に対して反応性である。前記第２オリゴヌクレオチドは、前記第１オリゴヌクレオチド配列へハイブリダイズさせられ、それにより前記第１および第２反応性基は反応近接性に持ち込まれる。第１および第２反応性基の間の反応は、前記生物学的標的がサンプル中に存在するかどうかを決定するために検出される。１つの実施形態では、第１および第２反応性基の間の反応は蛍光成分を生成する。また別の実施形態では、第１および第２反応性基の間の反応は化学発光および／または発色団成分を生成する。
【００４８】
図８は、核酸鋳型に基づく生物学的検出のために「ジップコード化」固定アーキテクチャーを使用する、本発明のまた別の実施形態を示している。本実施形態では、ハイブリダイズして核酸鋳型作製反応を開始させる相補的オリゴヌクレオチドへ直接的に連結（任意でスペーサー基を介して）している標的結合成分の代わりに、標的結合成分が「ジップコード」オリゴヌクレオチド配列へ連結させられる。対応するレポーターオリゴヌクレオチドの各々は、相補的な「アンチジップコード」配列（核酸鋳型作製反応を開始させる「レポーター」配列に加えて）を有する。核酸鋳型作製反応は、反応して検出可能なシグナルを発生する反応性基へ連結しているレポーターオリゴのハイブリダイゼーションによって開始される。プローブの各オリゴヌクレオチド配列がその意図されるハイブリダイゼーションパートナーにのみ相補的であり、検出系内の他のオリゴヌクレオチドには相補的ではないことが重要である。
【００４９】
このジップコード化アーキテクチャーは、アンチジップコード配列を通して相違する下流レポーターオリゴヌクレオチドと集合するであろう単一レポーター−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを作製することを支持する。固有のアンチジップコードへ連結した相違するレポーターのライブラリーは、化学量論的量の結合剤−ジップコードオリゴヌクレオチドコンジュゲートを備える各々をその相補的ジップコードと単純に混合する工程によって試験できる。
【００５０】
図９は、標的結合成分が２つのアプタマーである、ジップコード化固定アーキテクチャーアプローチの例である。例示的オリゴ配列およびレポーター化学（例えば、トリフェニルホスフィン（ＴＰＰ）および７−アジドクマリン（ＡｚＣ））を用いて血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を検出するための本実施例では、ＴＰＰレポーターオリゴヌクレオチドは、ＴＴＰレポーターオリゴヌクレオチド上の相補的アンチジップコード配列（Ｎ’Ｎ’Ｎ’  ．．．．．．）へのジップコード配列（ＮＮＮ．．．．．．）のハイブリダイゼーションを通してＰＤＧＦアプタマーオリゴヌクレオチドへ自己集合する。レポーターオリゴヌクレオチドは、代表的な１０塩基レポーター配列および５’−ＴＰＰ基で終了する。相違するジップコードおよびアンチジップコード（相互にペアワイズで相補的）を備える別個のオリゴヌクレオチド対もまた自己集合してＡｚＣレポーター配列および３’−ＡｚＣ基を提供する。ＡｚＣオリゴヌクレオチドはＴＰＰオリゴヌクレオチドと相補的かつアンチパラレルであるので、ＴＰＰおよびＡｚＣ基は、ＴＰＰおよびＡｚＣオリゴヌクレオチドが相互にアニールする場合は末端を接して終了する。
【００５１】
図１０は、例示的なオリゴ配列およびレポーター化学（ＴＰＰおよびＡｚＣ）を用いてＰＤＧＦを検出するためのジップコード化固定アーキテクチャーアプローチについて詳細に例示している。ＴＰＰ対は、最初に５’端上のＰＤＧＦ−アプタマー、Ｃ１８ポリエチレングリコールをベースとするスペーサー、および１８マーのジップコード配列を含んでいる。ＴＰＰレポーター配列は、その３’端上の相補的アンチジップコード配列、Ｃ１８  ＰＥＧスペーサー、および５’ＴＰＰ基で終了する１０塩基対のレポーター配列を含んでいる。オリゴヌクレオチドのＡｚＣ対は、別個のジップコードへＣ１８  ＰＥＧスペーサーを通して連結した３’−アプタマー、および５’アンチジップコードに連結した検出オリゴヌクレオチド、Ｃ１８  ＰＥＧスペーサー、および３’ＡｚＣ基で終了するレポーターオリゴヌクレオチド（ＴＰＰオリゴヌクレオチドに相補的）を含んでいる。
【００５２】
図１１は、標的結合成分としてのアプタマーの代わりに抗体が使用された場合の対応するアーキテクトの実施例を示している。
【００５３】
「ジップコード化」アプローチの１つの長所は、レポーターオリゴヌクレオチドを個別に作製する、そして結合剤および核酸鋳型活性化化学両方の活性を保持する条件下でそれらを結合剤と一緒に集合させる能力である。
【００５４】
ジップコード化系は、各対が固有のジップコードとアンチジップコードの対の塩基対合により一緒に保持されている、２対のオリゴヌクレオチドをベースにしている。「ジップコード」は、それらの相補的配列に特異的に結合する、そして好ましくはそれらが知られているゲノム配列（サンプルがゲノムＤＮＡを含有する可能性がある場合に重要）には相補的ではなく、類似のＴｍ値を有し、有意な二次構造が欠如しており、さらに検出系中の他のジップコードもしくはアンチジップコードへアニールしないように設計されているオリゴヌクレオチド配列である。
【００５５】
そこで、本発明のまた別の態様は、生物学的標的の存在を検出する方法を提供する。本方法は、以下を含んでいる。（１）生物学的標的に対して結合親和性を有する第１結合成分、および（２）第１オリゴヌクレオチドジップコード配列を含む第１プローブが提供される。（１）生物学的標的に対して結合親和性を有する第２結合成分、および（２）第２オリゴヌクレオチドジップコード配列を含む第２プローブが提供される。前記第１プローブは、（１）前記第１オリゴヌクレオチドジップコード配列に対して相補的であるオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列、（２）第１レポーターオリゴヌクレオチド、および（３）前記第１反応性基を含む第１レポータープローブへハイブリダイズさせられる。前記第２プローブは、（１）前記第２オリゴヌクレオチドジップコード配列に対して相補的であるオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列、（２）第２レポーターオリゴヌクレオチド、および（３）前記第２反応性基を含む第２レポータープローブへハイブリダイズさせられる。第２レポーターオリゴヌクレオチドは、第１レポーターオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができ、前記第２反応性基は相互に反応近接性に持ち込まれると前記第１反応性基に対して反応性である。前記第１および第２プローブは、前記生物学的標的の存在について試験されるサンプルと接触させられる。第１および第２プローブは、サンプル中に存在する場合は生物学的標的に結合させられ、それにより前記第２レポーターオリゴヌクレオチドは、前記第１および第２反応性基を反応近接性に持ち込むために前記第１レポーターオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズする。第１および第２反応性基の間の反応は、それにより前記生物学的標的がサンプル中に存在するかどうかを決定するために検出される。
【００５６】
ここで本発明の方法は第１および／または第２オリゴヌクレオチド配列の酵素的または化学的連結反応を必要としないことを指摘しておきたい。
【００５７】
ジップコード化アーキテクチャーの設計を最適化する際に考慮に入れることのできる要素には、（１）例えば、任意の立体化学障害を防止する目的でハイブリダイゼーションパートナーを相互に到達させるために、アプタマー／抗体とジップコードとの間のスペーサー基（例えば、オリゴヌクレオチドおよび／または非塩基基）（スペーサー１）；（２）複合体を形成するためにアンチジップコード配列への十分に安定性のアニーリングを生成するためのジップコード配列の長さ；および（３）例えば、何らかの化学障害を防止するために、アンチジップコードとレポーター配列との間のスペーサー基（スペーサー２）などが含まれる。
【００５８】
オリゴヌクレオチドに付着した結合剤（標的結合成分）は、標的分子に特異的に結合して本発明の設計を機能させる任意の化学成分であってよい。例には、（１）抗体：例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、Ｆａｂ’ｓ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｄａｂ、ＦｖもしくはＳｃＦｖフラグメント；（２）阻害剤、薬物、補因子などの小分子結合剤；（３）タンパク質検出のための受容体、およびその逆；（４）ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡアプタマー；（５）ＤＮＡ結合および調節タンパク質のためのＤＮＡ配列；（６）タンパク質結合モチーフを提示するペプチド；（７）ファージ提示、ランダム合成、突然変異誘発を通して発見されたペプチド；（８）天然型結合タンパク質対および複合体；（９）抗原（抗体検出のため）；および（１０）相違する特異性を備える２つの別個の結合剤として機能できる２つのオリゴヌクレオチドに別個に付着した単一ポリクローナル抗体などの広範囲の官能基が含まれる。
【００５９】
オリゴヌクレオチドに付着した標的結合成分は、同一標的内の相違する部位に対して向けられた異種タイプであってよい。例えば、２つの結合剤は、２つの相違する抗体、抗体および受容体、抗体および小分子結合剤、受容体およびペプチド、アプタマーおよび補因子、または任意の他の組み合わせであってよい。
【００６０】
標的分析物は、標的が２つ（もしくはそれ以上）の結合部位を支持することを前提に、任意のタイプであってよい。２つの結合部位は、同一であっても同一でなくてもよい。同一部位の場合には、２つの非同一結合剤を用いて入手される増加した特異性の利点が得られないであろう。モノマー形およびホモダイマーもしくはより高次の重合化層と平衡して存在する分子は、同一結合剤を含有するが相違する相補的ＤＮＡ配列を有する１対のプローブによって検出できる。適切な標的には、タンパク質、細胞表面、抗体、抗原、ウイルス、細菌、有機表面、膜、オルガネラ、固定細胞のインサイチュー分析、タンパク質複合体が含まれる。本発明は、融合タンパク質（例えば、ＢＣＲおよびＡＢＬの存在下におけるＢＣＲ−ＡＢＬ）のために特に適合する可能性がある。
【００６１】
図１２は、核酸鋳型活性化化学による蛍光体もしくは発色団の合成を用いるタンパク質もしくは小分子結合アッセイの報告方法の実施形態を示している。この実施例では、五角形によって表示されているアプタマー、抗体、もしくは小分子結合剤などのタンパク質結合剤が、その末端に反応性基Ｘを有するオリゴヌクレオチド（「鋳型」）へコンジュゲート化させられる。サンプルは結合剤鋳型と混合され、当該の分析物（丸によって表示されている）が存在する場合は、複合体が形成される。過剰の結合剤鋳型が取り除かれ、反応性基Ｙおよび上記の鋳型に相補的なオリゴヌクレオチドを有するプローブが加えられる。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、ＸとＹとの反応を開始させ、検出可能なシグナル分子（例えば、蛍光体もしくは発色団）を作製する。
【００６２】
シグナル分子（星印で表示されている）は、プローブ−鋳型ハイブリッドに付着したままになる、または複合体から遊離することがある。分析物は固相に付着させることができる、またはＹを有するプローブを添加する前に過剰の結合剤鋳型が除去される限り、溶液中に遊離していることがある。
【００６３】
鋳型およびプローブは、レポーターの合成を固有にコードし、そして多数の相違するレポーターを想定できるので、多重系を設計できる。例えば、２、３、４、５もしくはそれ以上の分析物を同時に検出することを可能にする、間隔をあけた（例えば、均等に間隔をあけた）発光を伴うある範囲の蛍光体を作製できる。さらに、着色および蛍光化合物の両方が同時に作製される系を設計できる。
【００６４】
プローブの設計では、１つの検討課題は反応性基を有する２つのレポーター配列のＴｍである。二本鎖のＴｍは標的の不在下では室温以下のはずであるので、この配列は、通常は例えば６〜１５塩基および／またはＡ−Ｔリッチのように短いはずである。１０塩基対の典型的なレポーター長は、低い塩濃度でほぼ３０℃のＴｍ有する可能性がある。このため、短鎖配列を用いた場合でさえ、温度をアッセイ温度よりいっそう低下させるため、またはアッセイ温度を上昇させるために、１０％〜４０％（ｖ／ｖ）のホルムアミドを加えることが必要になることが多い。極めて短いレポーターオリゴヌクレオチドは、特異性の欠如に悩まされ、（それらが使用される場合に）望ましくないジップコード配列への一部の結合を示すことがある。
【００６５】
プローブの設計におけるまた別の要素は、任意のジップコード配列を含む、結合成分とレポーター配列との間のオリゴヌクレオチドの長さである。これらは、レポーターオリゴヌクレオチドが相互に到達してアニールするために十分に長くなければならない。これらの配列は、柔軟性で任意の立体化学障害に対するさらなる保護を付与できるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを組み入れることができる。例えば、オリゴヌクレオチドの全長は約３５塩基長であってよい。０、１、もしくは２つのＣ１８  ＰＥＧスペーサー、またはホモポリマートラクトを含有するオリゴヌクレオチドもまた利用できる（すなわち、Ｃ１０）。
【００６６】
第３の検討課題は、ジップおよびアンチジップ配列が使用される場合（すなわち、図９および図３４）はこれらの長さである。各ジップコードがそのアンチジップコードにのみアニールして任意の他のジップコード、アンチジップコード、もしくはレポーター配列にはアニールしないという必要とは別に、重要なパラメーターは、ジップコードとアンチジップコードとの間の二本鎖のＴｍである。Ｔｍは、レポーターオリゴヌクレオチドが結合成分にしっかりと付着したままであるために、アッセイにおいて使用される最高温度より実質的に高くなければならない。実際に、レポーター配列の約２倍のジップコード（すなわち、１５〜３０塩基の全長）が望ましく、一般にこれらの基準を満たす。
【００６７】
シグナル発生に関しては、核酸鋳型活性化化学は、最適シグナルを作用させる標識を発生もしくは破壊する、例えば、蛍光、化学発光、または比色分子を発生もしくは破壊するために使用できる。さらに、検出反応は、検出可能な標識を直接的もしくは間接的に発生する生成物、例えば光学標識を発生する反応を触媒する；光学標識を発生する反応を阻害する；蛍光クエンチャーである；蛍光エネルギー転移分子である；Ｒａｍｅｎ標識を発生する；電気化学発光標識（すなわち、ｒｕｔｈｅｒｎｉｕｍビピリジル）を生成する；電子スピン標識分子を生成する生成物を発生もしくは破壊するように設計できる。
【００６８】
さらに、検出反応は、「無標識」検出を含むように設計できる。核酸鋳型活性化化学を使用すると、分子の固有の自然特性によって識別可能な分子、例えば、光散乱標識もしくは集団を作製する；マイクロ熱量測定法によって検出可能である；表面プラズモン共鳴（すなわち、固定された抗体への結合）によって検出可能である（例えば、エピトープ）；抗体によって認識されるエピトープの作製もしくは破壊（すなわち、ＥＬＩＳＡ）；質量分析法によって測定される識別可能な質量を用いて；光散乱、ゲル電気泳動法もしくはサイズ排除クロマトグラフィーによって識別可能な変化したサイズ；クロマトグラフィーによって識別される変化した疎水性もしくはイオン含量；親和性クロマトグラフィー分離への親和性の変化によって検出可能である生成物を作製もしくは破壊することができる。
【００６９】
本発明のまた別の態様は、生物学的分析物を検出するために有用なキットを提供する。本キットは、（１）生物学的分析物に対する結合親和性を有する第１結合成分、（２）第１オリゴヌクレオチド配列、および（３）前記第１オリゴヌクレオチド配列に結合している第１反応性基を含む第１プローブ；ならびに（１）生物学的分析物に対する結合親和性を有する第２結合成分、（２）第２オリゴヌクレオチド配列、および（３）前記第２オリゴヌクレオチド配列に結合している第２反応性基を含む第２プローブを含んでいる。前記第２オリゴヌクレオチドは、前記第１オリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる。前記第２反応性基は、相互に反応近接性に持ち込まれると前記第１反応性基に対して反応性である。
【００７０】
さらにまた別の態様では、本発明は、生物学的分析物を検出するために有用なキットを提供する。本キットは、（１）生物学的標的に対する結合親和性を有する第１結合成分、および（２）第１オリゴヌクレオチドジップコード配列含む第１プローブ；ならびに（１）生物学的標的に対する結合親和性を有する第２結合成分、および（２）第２オリゴヌクレオチドジップコード配列を含む第２プローブを含んでいる。前記第１プローブは、（１）前記第１オリゴヌクレオチドジップコード配列に対して相補的であるオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列、（２）第１レポーターオリゴヌクレオチド、および（３）前記第１反応性基を含む第１レポータープローブへハイブリダイズすることができる。前記第２プローブは、（１）前記第２オリゴヌクレオチドジップコード配列に対して相補的であるオリゴヌクレオチドのアンチジップコード配列、（２）第２レポーターオリゴヌクレオチド、および（３）前記第２反応性基を含む第２レポータープローブへハイブリダイズすることができる。前記第２レポーターオリゴヌクレオチドは、前記第１レポーターオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができ、前記第２反応性基は相互に反応近接性に持ち込まれると前記第１反応性基に対して反応性である。
【００７１】
本発明は、本明細書に記載した１つ、２つまたはそれ以上のプローブを提供するキットを含んでいる。より詳細には、本発明は、生物学的標的（例えば、核酸およびタンパク質）の存在について検出するための方法として、検出可能なシグナルを発生させるために核酸を鋳型とする化学を利用する１つ、２つまたはそれ以上のプローブを提供するキットを含んでいる。
【００７２】
レポーターの化学反応
クマリン
レポーター化学反応では、クマリン、特に７位で電子供与置換基を有するクマリンを使用できる。下記のスキームは、７−アジドクマリン（非蛍光性であることが知られている）から７−アミノ誘導体（蛍光性）への還元が核酸鋳型作製反応を用いてどのように遂行できるかを例示している。
【００７３】
【化２】
2008545416.tif 000004
フルオレスカミン
アジドをアミンに還元させるためにホスフィンを使用すると、生じたアミンを遊離（ＤＮＡに付着していない）試薬と反応させて蛍光アミン誘導体を生成することができる。最も重要な例は、本質的には非蛍光性であるが、１級もしくは２級アミンと反応すると青緑色の蛍光生成物を生成するフルオレサミンである。
【００７４】
【化３】
2008545416.tif 000005
イソインドール誘導体
誘導体化試薬と極めて近接している２つの官能基の反応もしくはトラッピングもまた利用できることがある。これら２つの官能基は２つの相違するオリゴ上にあってハイブリダイゼーションイベントによって一緒にされてよい、またはそれにより第２オリゴは誘導体化できる種への１つまたは複数の基を脱マスキングするもしくはトランスフォームさせるために使用されるように、それらはどちらも第１オリゴ上にあってもよい。これを以下で、アミン検出試薬として一般に使用されているｏ−ジアルデヒドおよびケトンからのイソインドールの形成について例示する。３−（４−カルボキシベンゾイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒド（ＣＢＱＣＡ）−誘導体化アミンについての検出限界は、アトモル範囲内にあると報告されている。
【００７５】
【化４】
2008545416.tif 000006
ポリメチン色素レポーターの化学反応
ポリメチン色素は、電子供与体およびそれらのポリエン鎖の反対側の末端で電子受容体を備えるメチン（−ＣＨ＝）基の鎖を特徴とする（図１３、Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ，  Ｃｏｌｏｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ，  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｄｙｅｓ  ａｎｄ  Ｐｉｇｍｅｎｔｓ，  ３ｎｄ  Ｅｄｎ．，  Ｖｅｒｌａｇ  Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，  Ｐｏｓｔｆａｃｈ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，  ２００３）。ポリメチン色素のための典型的なＡおよびＤ末端（図１３に示されている）には、チアゾール、ピロール、ピロリン、インドール、１，３，３−トリメチルインドリン、テトラゾール、ピリミジン、ピリジン、キノリン、および高次縮合Ｎ−複素環もしくは任意の置換ベンジル環が含まれる。末端がどちらもＮ−原子含有複素環である場合は、化合物はシアニンと指名される。一方のＮ−原子だけが環系の一部である場合は、化合物はヘミシアニンと指名される。ポリエン鎖内のビニル基の数を変化させることによって、ポリメチン色素の蛍光発光波長は近紫外線から近赤外線へ調整することができる。末端基は、さらにより繊細な調整を行うための手段を提供できる。
【００７６】
ポリメチン色素は、一般には、脱プロトン化に先行して、または脱プロトン化の後に求核および／または求電子置換によって合成される（Ｒａｕｅ，  Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ５ｔｈ  Ｅｄｎ．，  ＵＣＨ，  Ｗｅｉｎｈｅｉｍ  １９９０，  Ｖｏｌ．  Ａ１６，  ｐ４８７）。下記のスキーム１は、非対称性シアニン色素合成の実施例である。２−メチル複素環式４級塩は、１当量の求電子性結合試薬であるジフェニルホルムアミジンと反応してアミジンもしくはヘミシアニンを形成する。第２複素環式４級塩の段階的求核性添加は非対称性シアニン色素を導く。Ｎ−アシル化ヘミシアニンは、相当に穏和な条件下で固相上の第２複素環と反応できる（Ｍａｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ２００５，  ７０，  ２９３９−２９４９）。
【００７７】
【化５】
2008545416.tif 000007
アルドール縮合は、ヘミシアニン色素を合成するために頻回に使用されてきた（Ｈａｓｓｎｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  １９８４，  ４９，  ２５４６−２５５１；Ｊｅｄｒｚｅｊｅｗｓｋａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｙｅｓ  ａｎｄ  Ｐｉｇｍｅｎｔｓ  ２００３，  ５８，  ４７−５８；Ｓｃｚｅｐａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．  Ｓｃｉ．  ２００３，  ２，  １２６４−１２７１）。ここで活性水素成分は４級塩であるが、カルボニル成分は芳香環上に１つのアミノ置換基を有する。このタイプのアルドール縮合は、一般に触媒量の塩基を用いて無水アルコール中の還流条件下で実施されるが、しかし、水性条件はまた一部の活性アルデヒドについても試みられてきた（炭酸カリウム希釈液（ｐＨ８）、７０℃、２４時間；参考文献：Ｗａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｙｅｓ  ａｎｄ  Ｐｉｇｍｅｎｔｓ  ２００３，  ５９，  １６３−１７２）。
【００７８】
アルデヒドおよび最適化された化学的活性を備える活性水素を有する４級塩を選択することによって、アルドール縮合を使用して核酸鋳型作製反応条件下でポリメチン色素を合成することができる。ＤＮＡコンジュゲート化アルデヒドおよび活性水素を有する４級塩は、本発明の検出系において利用できる。本明細書に記載した一般的アプローチは、さらにまた糖、ペプチドおよびタンパク質などの他のバイオポリマーへこれらの前駆体を付着させるためにも使用できる。水性条件下でアルドール縮合によってポリメチンを合成するため、および核酸鋳型作製反応を通してポリメチン色素を生成するための一般的方法は、有用なレポーター化学反応である。
【００７９】
Ｗｉｔｔｉｇ反応は、アルデヒドもしくはケトンとホスホニウム塩から生成されたイリドとの反応によるアルケンの調製を可能にする。現在までの所、Ｗｉｔｔｉｇ反応を通してのヘミシアニンの合成に関する文献は少ない（Ｚｈｍｕｒｏｖａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｚｈｕｒｎａｌ  Ｏｒｇａｎｉｃｈｅｓｋｏｉ  Ｋｈｉｍｉｉ，  １９７５，  １１，  ２１６０−２１６２）。ここでは、アルデヒドおよびイリドは、ベンゼンを含有するナトリウムフェノレート中で９時間にわたり環流させた。
【００８０】
Ｗｉｔｔｉｇ試薬は核酸を鋳型とする化学反応により弱塩基性条件でアルデヒドと反応できることは知られているが（Ｇａｒｔｎｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２００２，  １２４，  １０３０４−１０３０６）、核酸鋳型作製Ｗｉｔｔｉｇ反応ならびに本明細書に記載したＷｉｔｔｉｇ試薬前駆体を合成するための方法によるポリメチン色素を合成する一般戦略は、有用なレポーター化学反応である。
【００８１】
（ｉ）水溶液中でのＷｉｔｔｉｇ反応によるポリメチン色素の合成
Ｗｉｔｔｉｇ反応条件を無水から水性媒体へ切り替えると、ポリメチン色素を合成するために迅速な反応および高収率を達成できる。下記のスキーム３および４は、水性条件下でのシアニンおよびヘミシアニンを合成するための２つの別個の実施例を提供する。
【００８２】
【化６】
2008545416.tif 000008
（ｉｉ）前駆体のＤＮＡへの付着
アルドールおよびＷｉｔｔｉｇ反応のための前駆体は、アミド結合形成を通してＤＮＡへ容易にコンジュゲート化させることができる。第１に、酸性複素環式もしくは芳香族前駆体が合成される。酸は、次にアミン官能基を有するＤＮＡと容易に反応する活性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドへ変換させられる。
【００８３】
（ｉｉｉ）アルドール縮合およびＷｉｔｔｉｇ反応のためのアルデヒド前駆体の合成
アルデヒド前駆体中の酸性官能基は、窒素含有複素環が関係する場合は４級化（スキーム５およびスキーム６）または例えばシアノ置換芳香族アルデヒドが関係する場合は過酸化水素によるシアノ基の加水分解のいずれかを通して導入される。ジシリル化ｔｅｒｔ−ブチルアセタルジミンもしくはＷｉｔｔｉｇ試薬は、広くコンジュゲート化したアルデヒドが必要な場合は対応するα，β−エナールへのアルデヒドの２炭素ホモログ化のために反復して使用できる（Ｂｅｌｌａｓｓｏｕｅｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  １９９３，  ５８，  ２５１７−２５２２）。
【００８４】
【化７】
2008545416.tif 000009
【００８５】
【化８】
2008545416.tif 000010
（ｉｖ）ＷｉｔｔｉｇもしくはＨｏｒｎｅｒ反応のための前駆体の合成
複素環式トリフェニルホスフィン前駆体は、フェニル基の１つを通してＤＮＡへ便宜的に連結させることができる。スキーム７は、ベンジル型のホスホラン（Ｗｉｔｔｉｇ試薬）を合成するための一般的方法を提供する。反応性ハロゲン化物は、最初は対応するベンジルアルコールから合成され、次に４−（ジフェニルホスフィノ）安息香酸と反応してホスホニウム塩を形成する。一部の特殊なアミノ置換芳香族ホスホニウム塩を合成するために、ハロゲン化物試薬を単離せずに便宜的なワンポット法を使用した（スキーム８、Ｐｏｒｒｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ２００３，  １０，  １５４１−１５４４）。しかしシアニンのためのＷｉｔｔｉｇ試薬を特別に合成するためには、いくつかの検討課題がある。第１に、複素環式ホスホニウム塩前駆体を入手するのは困難である。第２に、アルデヒドに対するこれらの試薬の反応性についてはほとんど何も知られていない。
【００８６】
スキーム９は、非４級複素環式ホスホランを合成するための一般的方法を記載している。ここでは、Ｈｏｒｎｅｒ反応のためのまた別のホスホン酸塩試薬もまた提案されている（スキーム１０）。
【００８７】
【化９】
2008545416.tif 000011
【００８８】
【化１０】
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（ｖ）アルドール縮合のための活性水素を有する複素環式前駆体の合成
メチル基などの活性水素を有する複素環式前駆体市販で入手できる。酸性官能基は、Ｎ−４級化を通してこれらの化合物へ容易に導入できる（スキーム１１）。
【００８９】
【化１１】
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（ｖｉ）核酸鋳型作製Ｗｉｔｔｉｇ反応を通してのポリメチンの生成
スキーム１２およびスキーム１３は、Ｗｉｔｔｉｇ反応およびアルドール縮合を含む核酸鋳型作製反応を通してポリメチン色素の合成を例示している。核酸鋳型作製Ｗｉｔｔｉｇ反応のためには、蛍光ポリメチン色素コンジュゲート化一本鎖ＤＮＡは他のＤＮＡ鎖にコンジュゲート化した非蛍光ホスフィンオキシドを用いて生成される。アルドール縮合のためには、ポリメチン色素は両方のＤＮＡ鎖に共有的に連結される。それらは有用なレポーター化学反応およびインビトロおよびインビボの両方で生物学的系の均質な蛍光アッセイのための方法を提供する。
【００９０】
【化１２】
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核酸鋳型作製反応によって様々な（近紫外線から近赤外線からの範囲に及ぶ）ポリメチン色素を生成できる。核酸を鋳型とする化学は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合に基づいているので、様々なポリメチン色素前駆体を用いて付着させた多重ＤＮＡプローブを用いることによって多重色素系を確立することができる。
【００９１】
核酸を鋳型とする化学を使用する生物学的検出において有用な化学反応
（ｉ）結合反応
反応性基は、例えば、求電子体（例えば、アセチル、アミド、酸塩化物、エステル、ニトリル、イミン）、求核基（例えば、アミン、ヒドロキシル基、チオール）、触媒（例えば、有機金属触媒）、または側鎖であってよい。
【００９２】
（ｉｉ）官能基の変換
核酸を鋳型とする化学は、（ｉ）結合反応において使用される官能基を曝露する、もしくは（ｉｉ）相互転換する、（ｉｉｉ）反応性基上に存在する官能基の相互転換官能基の変換を実行するために使用できる。
【００９３】
（ｉｉｉ）反応条件
核酸を鋳型とする化学は、水性もしくは非水性（すなわち、有機）溶液中、または１つまたは複数の水性および非水性溶液の混合液中で発生することができる。反応条件は、好ましくは、使用される反応性基、オリゴヌクレオチドの性質に適合する、およびサンプル検出条件に適合するように最適化される。
【００９４】
（ｉｖ）化学反応のクラス
知られている化学反応は、例えばＭａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ，  ｏｒｇａｎｉｃ  ｔｅｘｔ  ｂｏｏｋｓ，  ｊｏｕｒｎａｌｓ  ｓｕｃｈ  ａｓ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  ｅｔｃ．，  ａｎｄ  Ｃａｒｒｕｔｈｅｒ’ｓ  Ｓｏｍｅ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙに列挙されているような反応である核酸鋳型作製反応において使用するために考察できる。選択された反応は、ＤＮＡもしくはＲＮＡなどの核酸と適合しなければならない、または検出環境と適合しなければならない。
【００９５】
核酸鋳型作製反応において有用な反応には、例えば、置換反応、炭素−炭素結合形成反応、脱離反応、アシル化反応、および付加反応が含まれる。本発明において有用な脂肪族求核置換反応の例示的であるが包括的ではないリストには、例えば、ＳＮ２反応、ＳＮ１反応、ＳＮｉ反応、アリル転位、脂肪族三方炭素、およびビニル炭素での求核置換が含まれる。
【００９６】
酸素求核基との特定の脂肪族求核置換反応には、例えば、ハロゲン化アルキルの加水分解、ｇｅｎ−二ハロゲン化物の加水分解、１，１，１−三ハロゲン化物の加水分解、アルキルエステルもしくは無機酸の加水分解、ジアゾケトンの加水分解、アセタールおよびエノールエステルの加水分解、エポキシドの加水分解、ハロゲン化アシルの加水分解、無水物の加水分解、カルボン酸エステルの加水分解、アミドの加水分解、ハロゲン化アルキルを用いたアルキル化（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ反応）、エポキシド形成、無機エステルを用いたアルキル化、ジアゾ化合物を用いたアルキル化、アルコールの脱水、エーテル交換反応、エポキシドのアルコール分解、オニウム塩を用いたアルキル化、シランの水酸化、ハロゲン化アシルのアルコール分解、無水物のアルコール分解、カルボン酸のエステル化、カルボン酸エステルのアルコール分解（エステル交換反応）、アミドのアルコール分解、カルボン酸塩のアルキル化、酢酸無水物を用いたエーテルの開裂、ジアゾ化合物を用いたカルボン酸のアルキル化、ハロゲン化アシルを用いたカルボン酸のアシル化、カルボン酸を用いたカルボン酸のアシル化、オキソニウム塩の形成、過酸化物およびヒドロペルオキシドの調製、無機エステルの調製（例えば、亜硝酸塩、硝酸塩、スルホン酸塩）、アミンからのアルコールの調製、および混合有機−無機無水物の調製が含まれる。
【００９７】
それらの酸素アナログより良好な求核基である傾向がある硫黄求核基との特定の脂肪族求核置換反応には、例えば、チオール形成するためのアルキル炭素でのＳＨによる攻撃、チオエーテルを形成するためのアルキル炭素でのＳによる攻撃、アシル炭素でのＳＨもしくはＳＲによる攻撃、ジスルフィドの形成、ブンテ塩の形成、スルフィン酸塩のアルキル化、およびアルキルチオシアネートの形成が含まれる。
【００９８】
窒素求核基を用いた脂肪族求核置換反応には、例えば、アミンのアルキル化、アミンのＮ−アリール化、ヒドロキシのアミノ基による置換、アミノ基転移、アミド基転移、アミンのジアゾ化合物を用いたアルキル化、エポキシドのアミノ化、オキセタンのアミノ化、アジリジンのアミノ化、アルカンのアミノ化、イソシアニドの形成、ハロゲン化アシルによるアミンのアシル化、無水物によるアミンのアシル化、カルボン酸によるアミンのアシル化、カルボン酸エステルによるアミンのアシル化、アミドによるアミンのアシル化、他の酸誘導体によるアミンのアシル化、アミドおよびイミドのＮ−アルキル化もしくはＮ−アリール化、アシドおよびイミドのＮ−アシル化、エポキシドからのアジリジンの形成、ニトロ化合物の形成、アジドの形成、イソシアネートおよびイソチオシアネートの形成、ならびにアゾキシ化合物の形成が含まれる。
【００９９】
ハロゲン求核基を用いた脂肪族求核置換反応には、例えば、アルキル炭素での攻撃、ハロゲン化物交換、硫酸およびスルホン酸のエステルからのハロゲン化アルキルの形成、アルコールからのハロゲン化アルキルの形成、エーテルからのハロゲン化アルキルの形成、エポキシドからのハロヒドリンの形成、ヨウ化リチウムを用いたカルボン酸エーテルの開裂、ジアゾケトンからα−ハロケトンへの変換、アミンからハロゲン化物への変換、３級アミンからシアナミドへの変換（ｖｏｎ  Ｂｒａｕｎ反応）、カルボン酸からのハロゲン化アシルの形成、ならびに酸誘導体からのハロゲン化アシルの形成が含まれる。
【０１００】
求核基として水素を用いる脂肪族求核置換反応には、例えば、ハロゲン化アルキルの還元、トシレート、他のスルホン酸塩、および類似の化合物の還元、アルコールの水素添加分解、エステルの水素添加分解（Ｂａｒｔｏｎ−ＭｃＣｏｍｂｉｅ反応）、ニトリルの水素添加分解、水素によるアルコキシルの置換、エポキシドの還元、カルボン酸エステルの還元的開裂、Ｃ−Ｎ結合の還元、脱硫、ハロゲン化アシルの還元、カルボン酸、エステル、および無水物のアルデヒドへの還元、ならびにアミドのアルデヒドへの還元が含まれる。
【０１０１】
所定の炭素求核基は本発明の所定の実施形態において使用するには過度に求核性および／または塩基性である場合があるが、炭素求核基を用いる脂肪族求核置換反応には、例えば、シランとの結合、ハロゲン化アルキルの結合（Ｗｕｒｔｚ反応）、ハロゲン化アルキルおよびスルホン酸エステルとＩ属（ＩＡ）およびＩＩ属（ＩＩＡ）有機金属試薬との反応、ハロゲン化アルキルおよびスルホン酸エステルと有機銅酸化物との反応、ハロゲン化アルキルおよびスルホン酸エステルと他の有機金属試薬との反応、ハロゲン化物基質とのアリルおよびプロパルギル結合、有機金属試薬と硫酸およびスルホン酸のエステル、スルホキシド、およびスルホン酸塩との結合、アルコールを含む結合、有機金属試薬とカルボン酸エステルとの結合、有機金属試薬とエステル結合を含有する化合物との結合、有機金属試薬とエポキシドとの反応、有機金属とアジリジンとの反応、活性水素を有する炭素でのアルキル化、ケトン、ニトリル、およびカルボン酸エステルのアルキル化、カルボン酸塩のアルキル化、α位でのヘテロ原子へのアルキル化（１，３−ジチアンのアルキル化）、ジヒドロ−１，３−オキサジンのアルキル化（アルデヒド、ケトン、およびカルボン酸のＭｅｙｅｒｓ合成）、トリアルキルボランを用いたアルキル化、アルキニル炭素でのアルキル化、ニトリルの調製、ハロゲン化アルキルのアルデヒドおよびケトンへの直接変換、ハロゲン化アルキル、アルコール、もしくはアルカンのカルボン酸およびそれらの誘導体への変換、ハロゲン化アシルの有機金属化合物を用いたケトンへの変換、無水物、カルボン酸エステル、もしくはアミドの有機金属化合物を用いたケトンへの変換、ハロゲン化アシルの結合、活性水素を有する炭素でのアシル化、カルボン酸エステルのカルボン酸エステルによるアシル化（ＣｌａｉｓｅｎおよびＤｉｅｃｋｍａｎｎ縮合）、ケトンおよびニトリルのカルボン酸エステルを用いたアシル化、カルボン酸塩のアシル化、アシルシアニドの調製、ならびにジアゾケトンの調製、ケトンの脱カルボキシル化が含まれる。
【０１０２】
本発明においてはスルホニル硫黄原子での求核攻撃を含む反応もまた使用することができ、例えば、スルホン酸誘導体の加水分解（ＯＨによる攻撃）、スルホン酸エステルの加水分解（ＯＲによる攻撃）、スルホンアミドの形成（窒素による攻撃）、ハロゲン化スルホニルの形成（ハロゲン化物による攻撃）、塩化スルホニルの還元（水素による攻撃）、およびスルホンの調製（炭素による攻撃）が含まれる。
【０１０３】
芳香族求電子置換反応もまた核酸鋳型作製反応において使用できる。水素交換反応は、求電子基として水素を使用する芳香族求電子置換反応の例である。窒素求電子基を使用する芳香族求電子置換反応には、例えば、ニトロ化およびニトロ−脱水素化、ニトロソ−脱水素化のニトロソ化、ジアゾニウム結合、ジアゾニウム基の直接導入、ならびにアミノ化もしくはアミノ−脱水素化が含まれる。硫黄求電子基を用いるこのタイプの反応には、例えば、スルホン化、スルホ−脱水素化、ハロスルホン化、ハロスルホ−脱水素化、硫化、およびスルホニル化が含まれる。ハロゲン求電子基を用いる反応には、例えば、ハロゲン化、およびハロ−脱水素化が含まれる。炭素求電子基との芳香族求電子置換反応には、例えば、Ｆｒｉｅｄｅｌ−Ｃｒａｆｔｓアルキル化、アルキル化、アルキル−脱水素化、Ｆｒｉｅｄｅｌ−Ｃｒａｆｔｓアリール化（Ｓｃｈｏｌｌ反応）、Ｆｒｉｅｄｅｌ−Ｃｒａｆｔｓアシル化、二置換ホルムアミドを用いたホルミル化、シアン化亜鉛およびＨＣｌを用いたホルミル化（Ｇａｔｔｅｒｍａｎ反応）、クロロホルムを用いたホルミル化（Ｒｅｉｍｅｒ−Ｔｉｅｍａｎｎ反応）、その他のホルミル化、ホルミル−脱水素化、ハロゲン化カルボニルを用いたカルボキシル化、二酸化炭素を用いたカルボキシル化（Ｋｏｌｂｅ−Ｓｃｈｍｉｔｔ反応）、イソシアネートを用いたアミド化、Ｎ−アルキルカルバモイル−脱水素化、ヒドロキシアルキル化、ヒドロキシアルキル−脱水素化、アルデヒドおよびケトンの脱水環化、ハロアルキル化、ハロ−脱水素化、アミノアルキル化、アミドアルキル化、ジアルキルアミノアルキル化、ジアルキルアミノ−脱水素化、チオアルキル化、ニトリルを用いたアシル化（Ｈｏｅｓｃｈ反応）、シアン化、ならびにシアノ−脱水素化が含まれる。酸素求電子基を用いる反応には、例えば、ヒドロキシル化およびヒドロキシ−脱水素化が含まれる。
【０１０４】
転位反応には、例えば、Ｆｒｉｅｓ転位、ニトロ基の移動、ニトロソ基の移動（Ｆｉｓｃｈｅｒ−Ｈｅｐｐ転位）、アリールアゾ基の移動、ハロゲンの移動（Ｏｒｔｏｎ転位）、アルキル基の移動などが含まれる。芳香環上の他の反応には、Ｆｒｉｅｄｅｌ−Ｃｒａｆｔｓアルキル化の反転、芳香族アルデヒドの脱カルボキシル化、芳香族酸の脱カルボキシル化、Ｊａｃｏｂｓｅｎ反応、脱酸素化、脱スルホン化、ヒドロ−脱スルホン化、脱ハロゲン化、ヒドロ−脱ハロゲン化、および有機金属化合物の加水分解が含まれる。
【０１０５】
脂肪族求電子置換反応もまた有用である。本発明においては、ＳＥ１、ＳＥ２（前）、ＳＥ２（後）、ＳＥｉ、付加−脱離、および環状機構を用いる反応を使用できる。離脱基として水素を用いるこのタイプの反応には、例えば、水素交換（重水素−脱水素化、重水素化）、二重結合の移動、およびケト−エノール互変異性化が含まれる。ハロゲン求電子基を用いる反応には、例えば、アルデヒドおよびケトンのハロゲン化、カルボン酸およびハロゲン化アシルのハロゲン化、ならびにスルホキシドおよびスルホンのハロゲン化が含まれる。窒素求電子基を使用する反応には、例えば、脂肪族ジアゾニウム結合、活性水素を有する炭素でのニトロソ化、ジアゾ化合物の直接形成、アミドからα−アジドアミドへの変換、活性化位置での直接アミノ化、およびニトレンによる挿入が含まれる。硫黄もしくはセレニウム求電子基を使用する反応には、例えば、スルフェニル化、スルホン化、ならびにケトンおよびカルボン酸エステルのセレニル化が含まれる。炭素求電子基を用いる反応には、例えば、脂肪族炭素でのアシル化、アルデヒドのβ−ケトエステルもしくはケトンへの変換、シアン化、シアノ−脱水素化、アルカンのアルキル化、Ｓｔｏｒｋエナミン反応、およびカルベンによる挿入が含まれる。金属求電子基を用いる反応には、例えば、有機金属化合物を用いた金属化、金属および強塩基を用いた金属化、ならびにエノレートのシリルエノールエーテルへの変換が含まれる。離脱基として金属を用いる脂肪族求電子置換反応には、例えば、金属による水素の交換、有機金属試薬と酸素との間の反応、有機金属試薬と過酸化物との間の反応、トリアルキルボランのホウ酸塩への酸化、Ｇｒｉｇｎａｒｄ試薬の硫黄化合物への変換、ハロ−脱金属化、有機金属化合物のアミンへの変換、有機金属化合物からケトン、アルデヒド、カルボン酸エステルおよびアミドへの変換、シアノ−脱金属化、金属を用いた金属交換反応、ハロゲン化金属化を用いた金属交換反応、有機金属化合物を用いた金属交換反応、ハロゲン化アルキルの還元、金属−脱ハロゲン化、ハロゲンの有機金属化合物からの金属による交換、脂肪族酸の脱カルボキシル化、カルボキシル基のアシル基による交換、β−ケトエステルおよびβ−ジケトンの塩基性開裂、ハロホルム反応、エノール化不能ケトンの開裂、Ｈａｌｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ反応、アルカンの開裂、脱シアン化、ならびにヒドロ−脱シアン化が含まれる。窒素での求電子置換反応には、例えば、ジアゾ化、ヒドラジンのアジドへの変換、Ｎ−ニトロソ化、Ｎ−ニトロソ−脱水素化、アミンのアゾ化合物への変換、Ｎ−ハロゲン化、Ｎ−ハロ−脱水素化、アミンの一酸化炭素を用いた反応、ならびにアミンと二酸化炭素との反応が含まれる。
【０１０６】
本発明においては、芳香族求電子置換反応もまた使用できる。ＳΝＡｒ機構、ＳＮ１機構、ベンザイン機構、ＳＲΝ１機構、または他の機構によって進行する反応は、例えば、使用できる。酸素求核基を用いた芳香族求核置換反応には、例えば、ヒドロキシ−脱ハロゲン化、スルホン酸塩のアルカリ縮合、およびＯＲもしくはＯＡｒの交換が含まれる。硫黄求核基を用いた反応には、例えば、ＳＨもしくはＳＲによる交換が含まれる。窒素求核基を使用する反応には、例えば、ＮＨ２、ＮＨＲ、もしくはＮＲ２による交換、およびヒドロキシ基のアミノ基による交換が含まれる。ハロゲン求核基を用いた反応には、例えば、ハロゲンの導入が含まれる。求核基として水素を用いる芳香族求核置換反応には、例えば、フェノールとフェノールエステルおよびエーテルの還元、ならびにハロゲン化物およびニトロ化合物の還元が含まれる。炭素求核基を用いた反応には、例えば、Ｒｏｓｅｎｍｕｎｄ−ｖｏｎ  Ｂｒａｕｎ反応、有機金属化合物とハロゲン化アリールエーテル、およびカルボン酸エステルとの結合、活性水素を含有する炭素でのアリール化、アリール基質のカルボン酸、それらの誘導体、アルデヒド、およびケトンへの変換、ならびにＵｌｌｍａｎｎ反応が含まれる。離脱基として水素を用いる反応には、例えば、窒素複素環のアルキル化、アリール化、およびアミノ化が含まれる。離脱基としてＮ２＋を用いる反応には、例えばヒドロキシ−脱ジアゾ化、硫黄含有基による交換、ヨード−脱ジアゾ化、およびＳｃｈｉｅｍａｎｎ反応が含まれる。転位反応には、例えば、ｖｏｎ  Ｒｉｃｈｔｅｒ転位、Ｓｏｍｍｅｌｅｔ−Ｈａｕｓｅｒ転位、アリールヒドロキシルアミンの転位、およびＳｍｉｌｅｓ転位が含まれる。
【０１０７】
フリーラジカルを含む反応もまた使用できるが、ヌクレオチド鋳型作製反応に使用されるフリーラジカル反応は、ヌクレオチド鋳型の修飾もしくは開裂を回避するために注意深く選択しなければならない。その制限を含めて、本発明ではフリーラジカル置換反応を使用できる。特定のフリーラジカル置換反応には、例えば、ハロゲンによる置換、アルキル炭素でのハロゲン化、アリルハロゲン化、ベンジルハロゲン化、アルデヒドのハロゲン化、脂肪族炭素でのヒドロキシル化、芳香族炭素でのヒドロキシル化、アルデヒドのカルボン酸エステルへの酸化、環状エーテルの形成、ヒドロ過酸化物の形成、過酸化物の形成、アシルオキシル化、アシルオキシ−脱水素化、クロロスルホン化、アルカンのニトロ化、アルデヒドのアミドへの直接変換、アルキル炭素でのアミド化およびアミノ化、感受性位置での単純結合、アルキンの結合、ジアゾニウム塩による芳香族化合物のアリール化、ジアゾニウム塩による活性化アルケンのアリール化（Ｍｅｅｒｗｅｉｎアリール化）、有機パラジウム化合物によるアルケンのアリール化およびアルキル化（Ｈｅｃｋ反応）、ビニルスズ化合物によるアルケンのアリール化およびアルキル化（Ｓｔｉｌｌｅ反応）、芳香族化合物の過酸化物によるアルキル化およびアリール化、芳香族化合物の光化学アリール化、窒素複素環のアルキル化、アシル化、およびカルバルコキシル化が含まれる。Ｎ２＋が離脱基である特定の反応には、例えば、ジアゾニウム基の水素による交換、ジアゾニウム基の塩素もしくはホウ素による交換、ニトロ−脱ジアゾ化、ジアゾニウム基の硫黄含有基による交換、ジアゾニウム塩を用いるアリール二量化、ジアゾニウム塩のメチル化、ジアゾニウム塩のビニル化、ジアゾニウム塩のアリール化、ならびにジアゾニウム塩のアルデヒド、ケトン、もしくはカルボン酸への変換が含まれる。離脱基として金属を用いるフリーラジカル置換反応には、例えば、Ｇｒｉｇｎａｒｄ試薬の結合、ボランの結合、および他の有機金属試薬の結合が含まれる。離脱基としてハロゲンを用いる反応が含まれる。様々な離脱基を用いる他のフリーラジカル置換反応には、例えば、ラネーニッケルを用いる脱硫、スルフィドの有機リチウム化合物への変換、脱カルボキシル二量化（Ｋｏｌｂｅ反応）、Ｈｕｎｓｄｉｅｃｋｅｒ反応、脱カルボキシルアリル化、ならびにアルデヒドおよびハロゲン化アシルの脱カルボニル化が含まれる。
【０１０８】
ヌクレオチド鋳型作製反応においては、炭素−炭素多重結合への付加を含む反応もまた使用される。付加反応においては、例えば、求電子付加、求核付加、フリーラジカル付加、および環状機構を含む、任意の機構を使用できる。コンジュゲート化系への付加を含む反応もまた使用できる。シクロプロパン環への付加もまた利用できる。特定の反応には、例えば、異性化、ハロゲン化水素の付加、二重結合の水和、三重結合の水和、アルコールの付加、カルボン酸の付加、Ｈ２Ｓおよびチオールの付加、アンモニアおよびアミンの付加、アミドの付加、ヒドラゾン酸の付加、二重および三重結合の水素添加、二重および三重結合の他の還元、コンジュゲート化系の二重および三重結合の還元、芳香環の水素添加、シクロプロパンの還元開裂、ヒドロホウ素化、他のヒドロメタル化、アルカンの付加、アルケンおよび／またはアルキンのアルケンおよび／またはアルキンへの付加（例えば、ｐｉ−カチオン環化反応、ヒドロ−アルケニル−付加）、エン反応、Ｍｉｃｈａｅｌ反応、有機金属のカルボニルへコンジュゲート化していない二重および三重結合への付加、２つのアルキル基のアルキンへの付加、有機金属化合物の活性化二重結合への１，４−付加、ボランの活性化二重結合への付加、水素化スズおよび水銀の活性化二重結合への付加、活性化二重および三重結合のアシル化、アルコール、アミン、カルボン酸エステル、アルデヒドなどの付加、二重および三重結合のカルボニル化、ヒドロカルボキシル化、ヒドロホルミル化、アルデヒドの付加、ＨＣＮの付加、シランの付加、ラジカル付加、ラジカル環化、二重および三重結合のハロゲン化（ハロゲン、ハロゲンの付加）、ハロラクトン化、ハロラクタム化、次亜ハロゲン酸および次亜ハロゲン酸塩の付加（ハロゲン、酸素の付加）、硫黄化合物の付加（ハロゲン、硫黄の付加）、ハロゲンおよびアミノ基の付加（ハロゲン、窒素の付加）、ＮＯＸおよびＮＯ２Ｘの付加（ハロゲン、窒素の付加）、ＸＮ３の付加（ハロゲン、窒素の付加）、ハロゲン化アルキルの付加（ハロゲン、炭素の付加）、ハロゲン化アシルの付加（ハロゲン、炭素の付加）、ヒドロキシル化（酸素、酸素の付加）（例えば、ＯｓＯ４を用いた非対称性ジヒドロキシル化反応）、芳香環のジヒドロキシル化、エポキシド化（酸素、酸素の付加）、（例えば、Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ非対称性エポキシド化）、ジエンの光酸化（酸素、酸素の付加）、ヒドロキシスルフェニル化（酸素、硫黄の付加）、オキシアミノ化（酸素、窒素の付加）、脱アミノ化（窒素、窒素の付加）、アジリジンの形成（窒素の付加）、アミノスルフェニル化（窒素、硫黄の付加）、アシルアシルオキシル化およびアシルアミド化（酸素、炭素もしくは窒素、炭素の付加）、１，３−双極性付加（酸素、窒素、炭素の付加）、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応、ヘテロ原子Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応、全炭素３＋２環状付加、アルケンの二量化、カルベンおよびカルベノイドの二重および三重結合への付加、アルキンの三量化および四量化、ならびに他の環状付加反応が含まれる。
【０１０９】
炭素−炭素多重結合への付加を含む反応に加えて、ヌクレオチド鋳型作製反応においては炭素−ヘテロ多重結合への付加反応を使用できる。典型的な反応には、例えば、アルデヒドおよびケトンへの水の付加（水和物の形成）、炭素−窒素二重結合の加水分解、脂肪族ニトロ化合物の加水分解、ニトリルの加水分解、アルコールおよびチオールのアルデヒドおよびケトンへの付加、アルコールの還元アルキル化、アルコールのイソシアネートへの付加、ニトリルのアルコール分解、キサントゲン酸塩の形成、Ｈ２Ｓおよびチオールのカルボニル化合物への付加、重亜硫酸塩付加生成物の形成、アミンのアルデヒドおよびケトンへの付加、アミドのアルデヒドへの付加、アンモニアもしくはアミンの還元アルキル化、Ｍａｎｎｉｃｈ反応、アミンのイソシアネートへの付加、アンモニアもしくはアミンのニトリルへの付加、アミンの二硫化炭素および二酸化炭素への付加、ヒドラジン誘導体のカルボニル化合物への付加、オキシムの形成、アルデヒドのニトリルへの変換、アルデヒドおよびケトンからのｇｅｍ−二ハロゲン化物の形成、アルデヒドおよびケトンのアルコールへの還元、炭素−窒素二重結合の還元、ニトリルのアミンへの還元、ニトリルのアルデヒドへの還元、Ｇｒｉｇｎａｒｄ試薬および有機リチウム試薬のアルデヒドおよびケトンへの付加、他の有機金属のアルデヒドおよびケトンへの付加、トリアルキルアリルシランのアルデヒドおよびケトンへの付加、コンジュゲート化アルケンのアルデヒドへの付加（Ｂａｙｌｉｓ−Ｈｉｌｌｍａｎ反応）、Ｒｅｆｏｒｍａｔｓｋｙ反応、有機金属化合物を用いたカルボン酸塩のケトンへの変換、Ｇｒｉｇｎａｒｄ試薬の酸誘導体への付加、有機金属化合物のＣＯ２およびＣＳ２への付加、有機金属化合物のＣ＝Ｎ化合物の付加、カルベンおよびジアゾアルカンのＣ＝Ｎ化合物への付加、Ｇｒｉｇｎａｒｄ試薬のニトリルおよびイソシアネートへの付加、Ａｌｄｏｌ反応、Ｍｕｋａｉｙａｍａ  Ａｌｄｏｌおよび関連反応、カルボン酸エステルもしくはアミドとアルデヒドもしくはケトンとの間のＡｌｄｏｌ型の反応、Ｋｎｏｅｖｅｎａｇｅｌ反応（例えば、Ｎｅｆ反応、Ｆａｖｏｒｓｋｉｉ反応）、Ｐｅｔｅｒｓｏｎアルケニル化反応、活性水素化合物のＣＯ２およびＣＳ２への付加、Ｐｅｒｋｉｎ反応、Ｄａｒｚｅｎｓグリシド酸エステル縮合、Ｔｏｌｌｅｎｓ反応、Ｗｉｔｔｉｇ反応、Ｔｅｂｂｅアルケニル化、Ｐｅｔａｓｉｓアルケニル化、また別のアルケニル化、Ｔｈｏｒｐｅ反応、Ｔｈｏｒｐｅ−Ｚｉｅｇｌｅｒ反応、シランの付加、シアノヒドリンの付加、ＨＣＮのＣ＝ＮおよびＣ＝Ｎ結合への付加、Ｐｒｉｎｓ反応、ベンゾイン縮合、ラジカルのＣ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝Ｎ化合物への付加、Ｒｉｔｔｅｒ反応、アルデヒドおよびケトンのアシル化、アルデヒドのアルデヒドへの付加、イソシアネートのイソシアネートへの付加（カルボジイミドの付加）、カルボン酸塩のニトリルへの変換、エポキシドのアルデヒドおよびケトンからの形成、エピスルフィドおよびエピスルホンの形成、β−ラクトンおよびオキセタンの形成（例えば、Ｐａｔｅｒｎｏ−Ｂｕｅｃｈｉ反応）、β−ラクタムなどの形成が含まれる。イソシアニドへの付加を含む反応には、水のイソシアニドへの付加、Ｐａｓｓｅｒｉｎｉ反応、Ｕｇ反応、およびメタル化アルジミンが含まれる。
【０１１０】
α、β、およびγ脱離を含む脱離反応、ならびに抽出反応は、ヌクレオチド鋳型作製化学を用いて実施できるが、使用される試薬および条件の強度を考察しなければならない。好ましい脱離反応には、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ１ｃＢ、もしくはＥ２Ｃ機構によって進行する反応が含まれる。典型的な反応には、例えば、酸素が一方の側から除去される反応（例えば、アルコールの脱水、エーテルのアルケンへの開裂、Ｃｈｕｇａｅｖ反応、エステル分解、４級水酸化アンモニウムの開裂、強塩基を用いた４級アンモニウム塩の開裂、アミン酸化物の開裂、ケト−イリドの熱分解、トルエン−ｐ−スルホニルヒドラゾンの分解、スルホキシドの開裂、セレノキシドの開裂、スルホルン（ｓｕｌｆｏｒｎｅ）の開裂、ハロゲン化アルキルの脱ハロゲン化水素、ハロゲン化アシルの脱ハロゲン化水素、ハロゲン化スルホニルの脱ハロゲン化水素、ボランの脱離、アルケンからアルキンへの変換、ハロゲン化アシルの脱カルボニル化）、いずれの離脱原子も水素ではない反応（例えば、隣接ジオールの脱酸素化、環状チオノカルボン酸塩の開裂、エポキシドのエピスルフィドおよびアルケンへの変換、Ｒａｍｂｅｒｇ−Ｂａｅｃｋｌｕｎｄ反応、アジリジンのアルケンへの変換、隣接二ハロゲン化物の脱ハロゲン化、α−ハロハロゲン化アシルの脱ハロゲン化、ならびにハロゲンおよびヘテロ基の脱離）、破砕反応（すなわち、炭素が正の離脱基もしくはｅｌｅｃｔｒｏｆｕｇｅである反応、例えばγ−アミノおよびγ−ヒドロキシハロゲン化物の破砕、１，３−ジオールの破砕、β−ヒドロキシカルボン酸の脱カルボキシル化、β−ラクトンの脱カルボキシル化、α，β−エポキシヒドラゾンの破砕、架橋二環式化合物からのＣＯの脱離、および架橋二環式化合物からのＣＯ２の脱離）、Ｃ≡ＮもしくはＣ＝Ｎ結合が形成される反応（例えば、アルドキシムもしくは類似化合物の脱水、ケトキシムのニトリルへの変換、未置換アミドの脱水、およびＮ−アルキルホルムアミドのイソシアニドへの変換）、Ｃ＝Ｏ結合が形成される反応（例えば、β−ヒドロキシアルケンの熱分解）、ならびにＮ＝Ｎ結合が形成される反応（例えば、ジアゾアルケンを生じさせるための脱離）が含まれる。抽出反応には、例えば、Ｎ２のピラゾリンからの抽出、Ｎ２のピラゾールからの抽出、Ｎ２のトリアゾリンからの抽出、ＣＯの抽出、ＣＯ２の抽出、ＳＯ２の抽出、Ｓｔｏｒｙ合成、および二重抽出によるアルケン合成が含まれる。
【０１１１】
例えば、求核転位、求電子転位、プロトン向性転位、およびフリーラジカル転位を含む転位もまた、ヌクレオチド鋳型作製化学を用いて実施できる。１，２転位および非１，２転位の両方を実施できる。典型的な反応には、例えば、Ｒ、Ｈ、およびＡｒの炭素−炭素移動（例えば、Ｗａｇｎｅｒ−Ｍｅｅｒｗｅｉｎおよび関連反応、Ｐｉｎａｃｏｌ転位、環拡大反応、環収縮反応、アルデヒドおよびケトンの酸触媒転位、ジエノン−フェノール転位、Ｆａｖｏｒｓｋｉｉ転位、Ａｒｎｄｔ−Ｅｉｓｔｅｒｔ合成、アルデヒドのホモログ化、およびケトンのホモログ化）、他の基の炭素−炭素移動（例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノなどの移動；ホウ素の移動；およびＮｅｂｅｒ転位）、ＲおよびＡｒの炭素−窒素移動（例えば、Ｈｏｆｍａｎｎ転位、Ｃｕｒｔｉｕｓ転位、Ｌｏｓｓｅｎ転位、Ｓｃｈｍｉｄｔ反応、Ｂｅｃｋｍａｎ転位、Ｓｔｉｅｇｌｉｔｓ転位、および関連転位）、ＲおよびＡｒの炭素−酸素移動（例えば、Ｂａｅｙｅｒ−Ｖｉｌｌｉｇｅｒ転位およびヒドロ過酸化物の転位）、窒素−炭素、酸素−炭素、および硫黄−炭素の移動（例えば、Ｓｔｅｖｅｎｓ転位、およびＷｉｔｔｉｇ転位）、ホウ素−炭素移動（例えば、ボランからアルコール（１級もしくはその他）への変換、ボランからアルデヒドへの変換、ボランからカルボン酸への変換、ビニルボランからアルケンへの変換、アルキンのボランおよびアセチリドからの形成、アルケンのボランおよびアセチリドからの形成、ならびにケトンのボランおよびアセチリドからの形成）、環状電子転位（例えば、シクロブテンおよび１，３−シクロヘキサジエンの変換、もしくはスチルベンのフェナントレンへの変換）、シグマトロピー転位（例えば、（１，ｊ）水素のシグマトロピー転位、（１，ｊ）炭素のシグマトロピー移動、ビニルシクロプロパンのシクロペンテンへの変換、Ｃｏｐｅ転位、Ｃｌａｉｓｅｎ転位、Ｆｉｓｃｈｅｒインドール合成、（２，３）シグマトロピー転位、ならびにベンジジン転位）、その他の環状転位（例えば、アルケンのメタセシス、ジ−π−メタンおよび関連転位、ならびにＨｏｆｍａｎｎ−Ｌｏｅｆｆｌｅｒおよび関連反応）、非環状転位（例えば、水素化物の移動、Ｃｈａｐｍａｎ転位、Ｗａｌｌａｃｈ転位、および二向性転位）が含まれる。
【０１１２】
酸化および還元反応もまた核酸を鋳型とする化学を用いて実施できる。典型的な反応には、例えば、直接電子移行、水素化物移行、水素原子移行、エステル中間生成物の形成、置換機構、または付加−脱離機構を含んでいてよい。代表的な酸化には、例えば、水素の除去（例えば、６員環の芳香族化、炭素−炭素二重結合を産生する脱水素化、アルコールからアルデヒドおよびケトンへの酸化もしくは脱水素化、フェノールおよび芳香族アミンからキノンへの酸化、ケトンの酸化的開裂、アルデヒドの酸化的開裂、アルコールの酸化的開裂、オゾン分解、二重結合および芳香環の酸化的開裂、芳香族側鎖の酸化、酸化的脱カルボキシル化、およびビス脱カルボキシル化）、水素の酸素による交換を含む反応（例えば、メチレンからカルボニルへの酸化、メチレンからＯＨ、ＣＯ２Ｒ、もしくはＯＲへの酸化、アリールメタンの酸化、エーテルからカルボン酸エステルへの酸化および関連反応、芳香族炭化水素からキノンへの酸化、アミンもしくはニトロ化合物からアルデヒド、ケトン、もしくは二ハロゲン化物への酸化、１級アルコールからカルボン酸もしくはカルボン酸エステルへの酸化、アルケンからアルデヒドもしくはケトンへの酸化、アミンからニトロソ化合物およびヒドロキシルアミンへの酸化、１級アミン、オキシム、アジド、イソシアネート、もしくはｎｏｔｒｏｓｏ化合物からニトロ化合物への酸化、チオールおよび他の硫黄化合物からスルホン酸への酸化）、酸素が基質に加えられる反応（例えば、アルキンからα−ジケトンへの酸化、３級アミンから酸化アミンへの酸化、チオエステルからスルホキシドおよびスルホンへの酸化、ならびに酸化的結合反応（例えば、カルボン酸からペルオキシ酸への酸化）、ならびに酸化的結合反応（例えば、カルバノイン（ｃａｒｂａｎｏｉｎ）を含む結合、シリルエノーツエーテルもしくはリチウムエノレートの二量化、およびチオールからジスルフィドへの酸化）が含まれる。
【０１１３】
典型的な還元反応には、例えば、酸素の水素による交換を含む反応（例えば、アルデヒドおよびケトン中でのカルボニルのメチレンへの還元、カルボン酸のアルコールへの還元、アミドのアミンへの還元、カルボン酸エステルのエーテルへの還元、環状無水物からラクトンへの、および酸誘導体からアルコールへの還元、カルボン酸エステルのアルコールへの還元、カルボン酸およびエステルのアルカンへの還元、エポキシドの完全還元、ニトロ化合物のアミンへの還元、ニトロ化合物のヒドロキシルアミンへの還元、ニトロソ化合物およびヒドロキシルアミンのアミンへの還元、オキシムの１級アミンもしくはアジリジンへの還元、アジドの１級アミンへの還元、窒素化合物の還元、ならびにハロゲン化スルホニルおよびスルホン酸のチオールへの還元）、基質からの酸素の除去（例えば、酸化アミンおよびアゾキシ化合物の還元、スルホキシドおよびスルホンの還元、ヒドロ過酸化物および過酸化物の還元、ならびに脂肪族ニトロ化合物のオキシムもしくはニトリルへの還元）、開裂を含む還元（例えば、アミンおよびアミドの脱アルキル化、アゾ、アゾキシ、およびヒドラゾ化合物のアミンへの還元、ならびにジスルフィドのチオールへの還元）、還元カップリング反応（例えば、アルデヒドおよびケトンの１，２−ジオールへの生体分子還元、アルデヒドもしくはケトンのアルケンへの生体分子還元、アシロインエステル縮合、ニトロのアゾキシ化合物への還元、ならびにニトロのアゾ化合物への還元）、ならびに有機基質が酸化かつ還元される還元（例えば、Ｃａｎｎｉｚｚａｒｏ反応、Ｔｉｓｈｃｈｅｎｋｏ反応、Ｐｕｍｍｅｒｅｒ転位、およびＷｉｌｌｇｅｒｏｄｔ反応）が含まれる。
【０１１４】
以下では核酸を鋳型とする化学の多様な一般的態様について詳細に考察する。さらなる情報は、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許公開第２００４／０１８０４１２Ａ１号（ＵＳＳＮ１０／６４３，７５２）およびＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．による第２００３／０１１３７３８Ａ１号（ＵＳＳＮ１０／１０１，０３０）の中に見いだすことができる。
【０１１５】
本明細書に開示した本発明により含まれるシグナル作製方法には多数の長所がある。例えば、プローブに付け加えられる反応性成分は、ハイブリダイゼーションイベント（または非核酸標的の場合には、結合イベントに続くハイブリダイゼーションイベント）およびその後の反応が発生するまでは最初は検出可能な特性を有していないので、本発明によるプローブおよび化学的反応を使用するアッセイはバックグラウンドが低い、もしくは全く有しておらず、このために高い信号雑音比を有する。これは順に、高感受性および広いダイナミックレンジを有するアッセイの実質的な長所を提供する。そこで、より単純およびより低コストの検出機器を用いてそれを実施する可能性を伴ってより少量の分析物を検出できる。多数の相違するタイプのシグナル発生（蛍光発生、蛍光の放出、補因子の放出など）は、この機構を通して支持できる。
【０１１６】
さらなる重要な実質的な長所は、アッセイが均質であるように構築できることにある。均質なアッセイは、サンプルの調製を全くもしくはほとんど必要とせず、それらはさらに典型的には、異質なアッセイのために典型的に必要とされるような分析物を試薬除去、バックグラウンド現象、溶媒もしくはバッファー交換、および／または検出の目的で固体支持体上に固定することを必要としない。高Ｔｍの二本鎖ＤＮＡの形成は均質反応であるので、オリゴヌクレオチド上へ蛍光体前駆体を配置する工程は、標的に結合するために完全に均質な相アッセイを支持する。二本鎖構造自体の形成は、ほぼ瞬間的である。
【０１１７】
本発明のまた別の実質的な利点は、プローブおよび試薬をサンプルへ直接的に付加することができ、そして生じた溶液は、固体支持体への付着、洗浄などの任意の他の操作を必要とせずにシグナル発生について監視できることである。結果として、本発明は、高価もしくは煩わしい装置の必要を伴わずに非研究室環境において実施できる極めて単純なアッセイを提供する。
【０１１８】
高Ｔｍの二本鎖ＤＮＡを入手する工程はオリゴヌクレオチド上のスペーサーアームと適合する距離として配置された部位への２つの個別結合剤の使用を通常は必要とするので、極めて高特異性の結合を入手できる。
【０１１９】
さらに、それら自体がアニールされたＤＮＡを通して結び付けられる２つの結合剤の使用は増強された親和性（親和力）作用を生じさせるはずである。このため、２つの弱い結合剤は、増強された結合の親和力を示すはずである。両方が弱い可能性があるが相違する特異性（相違する部位への結合）を有する２つの結合剤は、増強された親和力および特異性を示すはずである。これは、弱い結合剤しか利用できない場合の低レベル検出にとって高度の長所である。
【０１２０】
以下の実施例は、その様々な実施形態およびそれらの同等物において本発明の実践に適応させることのできる、重要なさらなる情報、例証および案内を含有している。本発明の実践は、例示する目的でのみ本明細書に提示され、決して限定するものと見なすべきではないこれらの以下の実施例からより十分に理解されるであろう。
【実施例】
【０１２１】
実施例１．  ハイブリダイゼーション誘導性アジドクマリン還元による蛍光の発生
標準ホスホルアミダイト化学を用いて５つのオリゴヌクレオチドを調製した（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、米国バージニア州スターリング）。５’−アミノ基を有するオリゴヌクレオチド（オリゴ２およびオリゴ６）は５’−アミノ−モディファイヤー５を用いて調製し、３’−アミノ基を有するオリゴヌクレオチド（オリゴ４およびオリゴ５）は３’−アミノ−モディファイヤーＣ７  ＣＰＧを用いて調製した（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、米国バージニア州スターリング）。
【０１２２】
【化１３】
2008545416.tif 000015
オリゴ１、オリゴ４およびオリゴ５は、合成支持体から除去し、逆相ＨＰＬＣによって精製した。オリゴ２およびオリゴ６のアミノ基をそれらのトリフェニルホスフィン誘導体に樹脂結合している間に変換させ、各々オリゴ２−ＴＰＰおよびオリゴ−６−ＴＰＰを得るためにこれらを精製かつ単離した（Ｓａｋｕｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  （２００５）  Ｖｏｌ．１２７，  ｐｐ．１６６０−１６６７）。
【０１２３】
アミノ基を有するオリゴ４およびオリゴ５は、各オリゴと７−アジド−４−メチルクマリン−３−酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応によってそれらのアジドクマリン誘導体（各々、オリゴ４−ＡｚＣおよびオリゴ５−ＡｚＣ）へ変換させた（Ｔｈｅｖｅｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  （１９９２）  Ｖｏｌ．  ２０６，  ｐｐ．４７１−４７７）。この反応は、１μＬのトリフルオロサクサンを５μＬのＮ−メチルモルホリンへ加えてバッファーを調製し、これに６．６ｎＭのオリゴ４もしくはオリゴ５を含有する１０μＬの水を加え、さらにジメチルホルムアミド中のクマリンＮＨＳ−エステルの３０μＬの０．１６Ｍ溶液を添加することによって実施した。各反応は、室温で２時間にわたり進行させ、その後に５０μＬの０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム水溶液を加えた。この混合液をＮＡＰ−５脱塩カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）へ適用し、製造業者の取扱説明書にしたがって溶離させた。溶離液をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製すると、オリゴ４−ＡｚＣおよびオリゴ５−ＡｚＣが、各々７７％および７０％の収率で得られた。生成物同一性は、Ｍａｌｄｉ−ＴｏＦ質量分析法によって確証した。
【０１２４】
蛍光のハイブリダイゼーション特異的発生を証明するために、アジドクマリンおよびトリフェニルホスフィン成分を有する相補的および非相補的オリゴヌクレオチドの様々な組み合わせを、３０％ホルムアミド水溶液、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）からなるバッファー中において室温で反応させた。反応の進行は、３６０ｎｍでサンプルを励起し、４５５ｎｍでの発光を監視するために設定されたＶｉｃｔｏｒ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ蛍光計（ＥＧ＆Ｇ  Ｗａｌｌａｃｈ社、フィンランド国トゥルク）を用いて経時的に監視した。
【０１２５】
図１４は、オリゴ４−ＡｚＣおよびオリゴ２−ＴＰＰが最終濃度各々２００ｎＭおよび４００ｎＭへ結合された場合に、蛍光迅速な増加が観察されることを示している。この図では、００４はオリゴ４−ＡｚＣを示し、００２はオリゴ２−ＴＰＰを示し、そして００６はオリゴ６−ＴＰＰを示している。蛍光は、オリゴ６−ＴＰＰがオリゴ２−ＴＰＰと置換されると発生しない。オリゴ２−ＴＰＰはその塩基対合能力においてオリゴ４−ＡｚＣに対して完全に相補的であるが、オリゴ６−ＴＰＰは、それが３つのミスマッチヌクレオチドを含有するので相補的ではない。結果は、蛍光の発生はオリゴ２−ＴＰＰがオリゴ４−ＡｚＣへハイブリダイズして、結果として生じるハイブリッド内でのＴＰＰとアジドクマリン成分との間の反応を促進することに起因するという結論を支持している。オリゴ６−ＴＰＰとオリゴ４−ＡｚＣとの反応の場合におけるシグナルの欠如は、これら２つのオリゴヌクレオチドに二本鎖を生成する能力がなく、このために反応が促進されないことと一致している。任意の非特異的作用を除外するために、各一本鎖オリゴヌクレオチドを含有するコントロール反応を実施した。
【０１２６】
三元複合体を含むさらなる実験の結果は、図１５に示されている。これらの実験では、オリゴ１を、ハイブリダイゼーションによって２つの完全相補的なオリゴヌクレオチド（オリゴ５−ＡｚＣおよびオリゴ−２ＴＰＰ）を一緒にさせる能力対１つの完全相補的なオリゴヌクレオチド（オリゴ５−ＡｚＣ）と１つの部分的相補的オリゴヌクレオチド（オリゴ６−ＴＰＰ）とを一緒にさせる能力について試験した。オリゴ１およびオリゴ５−ＡｚＣは２００ｎＭの最終濃度にあったが、他方オリゴ２−ＴＰＰおよびオリゴ６−ＴＰＰは４００ｎＭの最終濃度で使用した。図１５では、００１はオリゴ１を示し、００２はオリゴ２−ＴＰＰを示し、００５はオリゴ５−ＡｚＣを示し、そして００６はオリゴ６−ＴＰＰを示している。結果は、蛍光が完全相補的オリゴヌクレオチドの組み合わせが存在する場合にのみ発生することを証明している（オリゴ１、オリゴ５−ＡｚＣおよびオリゴ２−ＴＰＰ）。
【０１２７】
実施例２．  遺伝子彩色法
遺伝子彩色法（Ｇｅｎｅ  Ｐａｉｎｔｉｎｇ）は、標的内の複数部位でシグナルを発生することに基づく配列検出法である。複数部位は、典型的にはその存在、不在または量を示したいと望む遺伝子配列内にある。例えば５，０００塩基配列のような相当に長い配列内では、その配列に固有である典型的には４０〜５０塩基の短い配列をターゲティングすることができる。これらは各々が典型的には１０〜２０塩基長であるオリゴヌクレオチドプローブの対によってターゲティングされる。プローブの長さが平均して約１２塩基である場合は、約４００対のプローブが５，０００塩基長配列を「彩色」することができる。これらのプローブ対各々は反応性対であり（図１に記載したように、核酸鋳型作製反応によって）、前蛍光体前駆体から蛍光体を発生する。発生した全蛍光は、全４００蛍光体の生成の合計である。例えば、コーンゲノムＤＮＡのサンプル中の５，０００塩基長の固有の遺伝子配列を検出するためには、単純にコーンＤＮＡのサンプルの調製ならびに適切なイオン強度、温度、およびホルムアミド濃度での４００オリゴヌクレオチド検出プローブの混合物へのその添加を必要とする。発生した全蛍光は、コーンＤＮＡ中のこの遺伝子配列の量に比例すると予想される。市販の蛍光機器の知られている感受性に基づく計算検出レベルは、核酸鋳型作製反応に基づく遺伝子彩色技術の予測された蛍光収率について計算された範囲内にある。
【０１２８】
アッセイデザインの実施例
本発明の１つの代表的な用途は、コーンなどの遺伝子組換え植物におけるトランスジェニック遺伝子のコピーを検出することである。標的遺伝子は、例えば、殺虫剤に対する耐性であってよい。遺伝子は、１ゲノム当たり単一コピーまたは複数コピーで存在する可能性がある。典型的な用途は、コーンの特定バッチがこの遺伝子を含有するかどうかを決定すること、そして１ゲノム当たりの平均遺伝子コピー数を定量することである。
【０１２９】
本発明によるこの遺伝子についてのアッセイの実施例は、まず最初にブレンダー内でコーンをホモジナイズする工程による約１００μｇ以上の全コーンＤＮＡの単離を含んでいる。コーンＤＮＡは、植物ＤＮＡを抽出および精製するための多数のキットの任意の１つを使用することによって単離できる。ＤＮＡは、例えば、一本鎖に変性するのをより容易にするためにｈｙｐｅｒｄｅｒｍｉｃ針に通して送り込むことによって小さな平均サイズへ剪断する。次にＤＮＡは、一本鎖にするために、短時間で１００℃へ加熱されて急速冷却する。次に、各々が標的遺伝子内のＤＮＡ配列に対して特異的であり、各対が２つのＤＰＣ−反応性前蛍光体を含有する、４００対のオリゴヌクレオチドプローブを含有する反応混合物を加える。インキュベーションすると、典型的には軽度に上昇した温度（３７℃）で、発生した蛍光を蛍光マイクロプレートリーダー内で測定する。発生した蛍光は、知られている量の標的遺伝子を備えるコーンＤＮＡの参照サンプルを用いてキャリブレーションする。本実施例で発生した蛍光体の予想量は約３０フェムトモルであり、これは市販で入手できるマイクロプレートリーダーの検出限界内に十分に含まれている。
【０１３０】
実施例３．  オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション、濃度および融解温度
１０塩基の相補的領域およびさらに６本の炭素スペーサーアームに連結された１０塩基の一本鎖スペーサーアームを備える２つの２０マーのオリゴヌクレオチドを含んでいるモデルシステムを調製した。これらのオリゴは、５’−ビオチン（６−炭素スペーサーアーム）を用いて、および用いずに合成した。下記に示すように、相補的領域には下線を付けている。第３オリゴは、（＋）鎖に対して４塩基ミスマッチ（イタリック形）を備える以外は（−）鎖のオリゴと同一であった。
【０１３１】
【化１４】
2008545416.tif 000016
１０塩基対のオリゴヌクレオチド対（オリゴ２６＋オリゴ２７）の融解曲線は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒ内で二本鎖ＤＮＡへ結合しているＳＹＢＲ色素の蛍光を測定することによって試験した（Ｌｉｐｓｋｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７［４］，  ６３５−４４．  ２００１）。結合曲線は、最大値が曲線内の変曲点（Ｔｍ、もしくは二本鎖部位の混合集団においては、「局所的」Ｔｍ）を表すように融解曲線の勾配の第１導関数として提示されている。結合曲線は、アビジンがこの温度以上までビオチン結合活性を維持するので少なくとも７０℃まで入手できる。
【０１３２】
この特定オリゴヌクレオチド対の濃度への依存性をチェックするために、５００〜２０ｎＭの範囲にわたって変化させたオリゴヌクレオチド対について融解曲線を生成した（図１６）（例えば、Ｌｉｐｓｋｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７［４］，  ６３５−４４．  ２００１を参照されたい）。観察されたＴｍは、図１６のグラフにおける予測に類似して、オリゴヌクレオチド対の濃度（ＲＦＵは相対蛍光単位を示す）における各１０倍減少に付き約１０℃の速度で低下した。融解曲線は、ビオチン化および非ビオチン化オリゴヌクレオチド対に対して本質的に同一であった。４つの塩基ミスマッチ対は、本質的に二本鎖構造を全く示さなかった。
【０１３３】
タンパク質標的への（＋）および（−）鎖の結合がＴｍにおける上昇を引き起こすかどうかを試験するために、これらのオリゴヌクレオチドのビオチン化バージョンをアビジンの存在下でインキュベートした。アビジンは、相当にすぐ側で間隔を空けていて、極めて緊密に（Ｋａ〜＜１０−１５Ｍ）そして非協調的にビオチンに結合する４つの同等結合部位を含有している。
【０１３４】
ビオチン化形にあるオリゴヌクレオチド＃２６および＃２７を等モル濃度で提示すると、ビオチン結合部位の約半分は相補的オリゴヌクレオチド対によって占められ、そして約半分は同一オリゴヌクレオチド（非相補的対）を備えると予測されるであろう。アビジンの存在下では、２つの融解曲線ピークが観察されるであろうと予想されている。１つのピークは、アビジンに結合していなかった（溶液中で遊離している）、またはアビジンに結合した２つのうちの１つのパートナーしか有していなかった任意のオリゴヌクレオチド対の結果であり、Ｔｍへの近接性作用を示さない。有意により高いＴｍの第２ピークは、アビジンにどちらも結合したビオチン化オリゴの対を表しており、近接性作用を示すはずである。
【０１３５】
そのような実験は、図１７に示したように実施した。オリゴヌクレオチドは、いわゆるホットスタートである６０℃に保持されたアビジンの存在下もしくは不在下で溶液に加えた。「ホットスタート」では、オリゴヌクレオチドは溶液中でそれらのＴｍをはるかに超える温度でビオチン結合部位へ結合するので、それらが一本鎖であることが保証される。この溶液を次に１０℃へ低下させ、温度を７０℃へ上昇させながら融解曲線分析を実施した。図１７に示したように、アビジンの存在下もしくは不在下で非ビオチン化オリゴ対の融解曲線は、３０〜３２℃のＴｍを示した（ＲＦＵは相対蛍光単位を示す）。しかしアビジンの存在下では、２つの明確に分離したＴｍピークは、３２℃および５２℃のＴｍ値で生成された。上昇した温度のピーク（Ｔｍはほぼ２０℃上昇した）は、アビジンの存在下で２つの相補的ビオチン化オリゴヌクレオチドの存在下でのみ観察された。Ｔｍ＋／−ビオチンにおける差は塩濃度が低くなると最大になり（図１８）、１０ｍＭ塩化マグネシウムの存在下ではわずかに高くなる（図１９）傾向を示した（ＲＦＵは相対蛍光単位を示す）。ビオチン化オリゴヌクレオチド対アビジンの最適モル比は、４つの同等結合部位を有するアビジンと一致して約３．５：１（オリゴ＋アビジンの総濃度＝０．７μＭ）であることが見いだされた（図２０）（ＲＦＵは相対蛍光単位を示す）。これは、Ｔｍ作用が発生するためにオリゴヌクレオチドが同一分子のアビジンに結合するという要件を具体化するので重要である。３’ビオチン化（−）鎖のオリゴの５’ビオチン化鎖のオリゴヌクレオチドとの置換は、両方のオリゴヌクレオチドが５’ビオチン化された以前の結果とＴｍ値における差をほとんど示さなかった（図２１）（ＲＦＵは相対蛍光単位を示す）。
【０１３６】
結果は、実験が等モル量の両方のオリゴヌクレオチドを室温で加え、６０℃へ上昇させ、次に融解曲線を入手することによって実施した場合は実質的に同一であった。本方法（ならびにホットスタート法）では、適切な融解曲線は所望であればアビジンに対して過剰モルの各オリゴを加えることによって生成できる（しかし、大きく過剰のオリゴ対は、予測されたように低Ｔｍピークのサイズを増加させる）。これは、オリゴ対はそれらが等モル量で一緒に加えられる限りビオチン結合部位に対して同等に競合したので、高ＴｍハイブリッドＤＮＡを形成する際には有害ではなかったからであった。オリゴが一度に１つ加えられた場合は、約２：１モル比の第１オリゴをアビジンに加え、次に２：１比の第２オリゴを加えることが重要であった。逐次添加を用いると、アビジンに比較した過剰モル量のいずれかのオリゴを加える工程は第１オリゴとのアビジンの全結合部位を占め、そして第２の相補的オリゴとともに隣接部位を占めて上昇したＴｍ作用を示すことを防止する。これらの観察は、上昇したＴｍピークを示すハイブリッドを入手するために隣接対の総的オリゴの２つの隣接ビオチン結合部位への結合である機構に一致している。
【０１３７】
実験は、全部がＡおよびＴから構成された１０塩基の自己相補的オリゴヌクレオチドを用いても実施した（オリゴ３１：５’−ビオチン−スペーサーアーム−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＡＡ）（配列番号２７）。このオリゴヌクレオチドは塩基組成において均質であり、完全にＡＴから構成されたので、このオリゴヌクレオチドは上述したモデルシステムより低いＴｍで融解し、相当に鋭い融解曲線を生成した。アビジンの存在下では、そのＴｍは３０．５℃から６１．５℃へ上昇した（図２２）（ＲＦＵは相対蛍光単位を示す）。このオリゴヌクレオチドは自己相補的であるので、全結合イベントは、イベントの１／２だけではなくむしろ相補的鎖を導いた。そこで、単一ピークの上昇したＴｍだけが観察された。
【０１３８】
これらの実験は、標的としてアビジンではなく抗ビオチン抗体を用いて繰り返した。抗ビオチン抗体は抗体のＦａｂ部分の末端近くに位置する２つのビオチン結合部位を含有しているが、結合部位はアビジン上のビオチン結合部位よりはるか遠くに離れている。
【０１３９】
実施例４．  タンパク質標的の検出−標的結合剤としてのアプタマー
ここで、アプタマー結合および２つの相補的ＤＮＡプローブのアニーリング後にタンパク質標的を検出するために核酸鋳型作製アジドクマリン（ＡｚＣ）−トリフェニルホスフィン（ＴＰＰ）化学を利用するために代表的な系を設計した。
【０１４０】
材料
ヒトＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＡＡは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（各々、２２０−ＢＢおよび２２０−ＡＡ）から入手した。抗ヒトＰＤＧＦ−Ｂサブユニットモノクローナル抗体は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社から入手した（ＭＡＢ２２０１）。バッファーは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）−１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２のＴｒｉｓ／Ｍｇバッファーを含有していた。使用したオリゴヌクレオチドは以下のとおりであった：
【０１４１】
【化１５】
2008545416.tif 000017
方法
ＤＰＣ反応の条件。上記を除いて、各１００μＬの反応液は、１００μＬの総量中に、１×Ｔｒｉｓ／Ｍｇバッファー、４０ｐＭ（ピコモル）のＴＰＰおよびＡｚＣ反応プローブ、４０ｐＭの標的オリゴヌクレオチドもしくは標的タンパク質、ならびに典型的には２５〜３０％（ｖ／ｖ）のホルムアミドを含有していた。サンプルは、２５℃のＷａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ  １４２０分光光度計内でインキュベートし、３５５ｎｍでの励起および４６０ｎｍでの発光を用いて蛍光の増加を監視した。
【０１４２】
結果：アプタマー−ＤＰＣプローブによるＰＤＧＦ−ＢＢの検出
図２３に例示したように、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）Ｂ−サブユニットに対して向けられたアプタマー配列を選択した（Ｆａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  ＢｉｏＣｈｅｍ．  ４，  ８２９−３４．  ２００３）。これは、ＰＤＧＦ  Ｂサブユニット（約１０−９Ｍ）に対する強度の親和性およびＰＤＧＦ  Ａサブユニットに対して約１０分の１に減少した親和性を備えるアプタマーの１ファミリーに属する（Ｇｒｅｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５，  １４４１３−２４．  １９９６）。各々が相補的１０マーのＤＮＡ配列、Ｃ１０スペーサー配列、および同一３５マーのアプタマー配列を含有するプローブ配列を合成した（オリゴ＃２０１、＃２０２）。各配列は、各々アプタマー連結３’もしくは５’を備える５’−ＴＰＰもしくは３’−ＡＺＣ基を含有していた。第２ＡｚＣプローブであるオリゴ＃２０３は、そのアニーリング配列がＴＰＰオリゴ（＃２０１）と完全にミスマッチであることを除いてオリゴ＃２０２と同一であった。
【０１４３】
図２４に示したように、３０％（容積）ホルムアミドの存在下では、ＴＰＰおよびＡｚＣプローブと相互との反応は、ＰＤＧＦ−ＢＢの存在およびプローブ上の相補的ＤＮＡ配列に完全に依存していた。この反応は、いずれかのプローブの不在下では失敗した。
【０１４４】
反応のＤＮＡ依存性は、アッセイ温度に比較してＤＮＡの融解温度に決定的に依存していた。０％ホルムアミド（計算および実測Ｔｍ＞Ｔａｓｓａｙ）の存在下では、反応は標的タンパク質ＰＤＧＦ−ＢＢの存在下もしくは不在下で発生した（図２５Ａ）。実際に、これらの条件下では、ＰＤＧＦ−ＢＢの添加は、反応速度を増加させず、約５０％減少させた。１０％ホルムアミド中では、ＰＤＧＦ−ＢＢは低阻害性であった（図２５Ｂ）。２０％ホルムアミド（図２６Ａ）中では、状況は完全に逆転された−今度は、ＰＤＧＦ−ＢＢの存在下を除いて反応速度は低かった。３０％ホルムアミド中では（図２６Ｂ）、反応はＰＤＧＦ−ＢＢの存在に完全に依存していた。４０％ホルムアミド中では、反応は任意セットの反応物を用いると極めて遅かった（図２７）。あらゆる場合に、ミスマッチプローブは反応をほとんど、または全く生成しなかった。
【０１４５】
ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを用いて監視した相補的配列を用いたＤＮＡ溶解実験は、ホルムアミドの不在下ではＴｒｉｓ／Ｍｇバッファー中の配列のＴｍが約３０℃であること、そしてホルムアミドの存在下では１０％増加する毎に約７℃低くなることを示した。検出アッセイのための最適ホルムアミド濃度である３０％でのＴｍは１０℃であった。
【０１４６】
０％ホルムアミド中では、オリゴヌクレオチドは、ＰＤＧＦ−ＢＢの不在下でさえ少なくとも部分二本鎖を形成できる（Ｔａｓｓａｙよりわずかに高いＴｍ）。２０％および３０％ホルムアミド中での反応のＤＮＡ標的依存性は、タンパク質標的の不在下でＴｍより高い温度で実施されるアッセイによって説明される。複合体のＴｍが２つのプローブのＰＤＧＦ−ＢＢ標的への結合によって上昇しない限り、反応は全く発生しない。４０％ホルムアミド中では、いずれのセットの反応を用いても反応は発生しない。これについて考えられる説明は、ＰＤＧＦ−ＢＢへの結合がＴａｓｓａｙを超えて上昇させられないほどＴｍが極めて緩徐に減少していた、またはホルムアミドがＰＤＧＦ−ＢＢのアプタマーへの結合を阻害したのいずれかである。より複雑な状態は、ホルムアミドの不在下でＰＤＧＦ−ＢＢの添加後に観察された反応速度の抑制である。ＰＤＧＦ−ＢＢによって形成された二本鎖の半分は非生産的であるので（５０％はホモ二本鎖であろう）、速度における減少はＰＤＧＦ−ＢＢ結合に起因してこれらのホモ二本鎖が解離するのを防止し、次にヘテロ二本鎖を形成するために相補的対を備える溶液中で再会合する可能性が高い。この状態は、ヘテロ二量体標的中の相違する結合部位に対して特異的に向けられたプローブ対を用いた場合は発生しない。
【０１４７】
アッセイの感受性（図２８）は、一連の希釈率のＰＤＧＦ−ＢＢ濃度から生成した反応速度を測定することによって計算した。Ｗａｌｌａｃ機器上の最低検出レベルは、アッセイのバックグラウンドノイズの標準偏差の３倍である計算値に基づいて、１００μＬアッセイ量中では０．８ｐＭであると推定された。
【０１４８】
アッセイ感受性は、さらに標的としてＰＤＧＦ−ＡＡを用いて決定した。アプタマーモノマーは、ＰＤＧＦ−ＡＡに対してＰＤＧＦ−ＢＢに比較して約１０分の１弱い親和性を有すると予想される。しかし、本アッセイはＰＤＧＦのいずれかのタイプへの２つのアプタマー−ダイマーの複合体を形成する工程を含むが、ダイマーの結合の親和力はモノマーの親和性より緊密であると予測され、その親和性は標的ＰＤＧＦの試験された濃度（約１ｎＭ（ナノモル）へ減少））より実質的に緊密（低Ｋｉ）のはずである。図２９に示したように、低もしくは高濃度（０、１．２５、２．５、５、１０、２０、および４０ｐＭのＰＤＧＦ−ＡＡ）でのアプタマーＤＰＣプローブのＰＤＧＦ−ＡＡへの反応速度は、ＰＤＧＦ−ＢＢを用いた場合の反応速度と実質的には相違しなかった。これは、ダイマーとしてのアプタマー対結合のモデルと一致しており、増加した親和力を示している。
【０１４９】
ＴＰＰ対ＡｚＣプローブの比。反応機構のモデルを確証するために（図４、ＴＰＰ対ＡｚＣプローブの最適比は１：１であると予想される）、図３０は、２つのプローブの全量が８００ｎＭのプローブ／反応で一定に維持されるが、２つのプローブの比は変化させられた実験であった。最高反応速度を生じさせる比は、予測された機構に一致してほぼ１：１であった。
【０１５０】
そこで、このモデル系では、アプタマーが結合し、２つのプローブ内の相補的配列が相互にアニールしない限り、蛍光は発生しなかった。
【０１５１】
実施例５．  アプタマー結合剤を用いた核酸を鋳型とする化学に基づく生物学的検出のためのジップコード化アーキテクチャー
図１０は、代表的なジップコード化アーキテクチャーをより詳細に例示している。ＴＰＰ対は、最初は５’端上のＰＤＧＦ−アプタマー、Ｃ１８ポリエチレングリコールをベースとするスペーサー、および１８マーのジップコード配列を含有していた。ＴＰＰレポーター配列は、その３’端上の相補的アンチジップコード配列、Ｃ１８  ＰＥＧスペーサー、および５’ＴＰＰ基で終了する１０塩基対のレポーター配列を含有していた。ＡｚＣ検出プローブを含むオリゴヌクレオチド対は、別個のジップコードへＣ１８  ＰＥＧスペーサーを通して連結した３’−アプタマー、および５’アンチジップコードに連結した検出オリゴヌクレオチド、Ｃ１８  ＰＥＧスペーサー、および３’ＡｚＣ基で終了するレポーターオリゴヌクレオチド（ＴＰＰオリゴヌクレオチドに相補的）を含有していた。
【０１５２】
２２℃での３５％ホルムアミド中の反応は、レポーターオリゴヌクレオチドの両方、アプタマーオリゴヌクレオチドの両方、および標的、ＰＤＧＦ−ＢＢの存在に依存していた（図３１）。２２℃でのホルムアミドの不在下では、反応は、ＰＤＧＦの存在とは無関係に進行した。これは、上述した「ワンピース」アーキテクチャーの挙動と一致しており、３５％ホルムアミド中での蛍光発生の機構がＰＤＧＦの添加後のホルムアミド中のレポーター配列二本鎖の増加した熱安定性に依存することを反映している。２２℃でのホルムアミドの不在下では、レポーターオリゴヌクレオチド二本鎖はＰＤＧＦの存在下および不在下のどちらにおいても安定性である。
【０１５３】
このモデルが正当であることの確証は、ＴＰＰおよびＡｚＣアプタマーオリゴの比率を変化させる実験を用いて得られた（図３２）。これらの実験は、アプタマーオリゴの最適比が１：１比（すなわち、全濃度のＰＤＧＦおよび０．４μＭのアプタマーオリゴを備える５０％のＴＰＰオリゴ）であると予想されることを示した。全レポーターオリゴヌクレオチド対全アプタマーオリゴの最適比もまた１：１であった。ＰＤＧＦ依存性反応は、レポーターもしくはアプタマーオリゴヌクレオチドのいずれか一方の完全不在下では発生しなかった。レポーターオリゴヌクレオチドの化学量論濃度より高い濃度では、ＰＤＧＦ非依存性シグナル（バックグラウンド）は増加したが、ＰＤＧＦ依存性シグナルはほぼ一定のままであった。これらの観察はどちらも、複合体がアプタマーオリゴの各々、レポーターオリゴの各々およびＰＤＧＦについて１：１：１の比率で集合するモデルと一致している。
【０１５４】
これらの実験は、各ジップコードおよびそのアンチジップコードが、アプタマー配列もしくはレポーター配列への干渉を最小限に抑えながら相互にアニールするように複合体が溶液中で自己集合できることを指示している。
【０１５５】
添加の順序、したがってアプタマーおよびレポータープローブの集合の順序もまた重要であるかどうかを決定するための実験もまた実施した。アプタマーオリゴヌクレオチドを最初にＰＤＧＦと一緒にインキュベートし、その後にレポーターオリゴヌクレオチドを添加すると、全プローブを混合物として一緒に添加した場合に比較してわずかに緩徐な反応速度が得られた。各対のアプタマーオリゴヌクレオチドおよびレポーターオリゴヌクレオチドを最初にインキュベートして相互と集合させ、その後に２セットを一緒に混合してＰＤＧＦと一緒にインキュベートすると、いくらか速い反応速度が得られた。この理由は、アプタマープローブがすでに標的に結合している場合は、アプタマープローブへのジップコード−アンチジップコードのアニーリングに立体障害が存在することにあろう。
【０１５６】
コントロールとして、ジップコード配列しか含有していない、およびジップコード−アンチジップコード配列を含有していない１セットのワンピースＴＴＰおよびＡｚＣプローブを比較した（図３３）。このワンピース系の反応速度は、ＰＤＧＦの添加に起因する増強が典型的にはツーピース系よりわずかに優れているということを除いて、ツーピース系の反応速度に類似していた。
【０１５７】
アプタマーを含有するＴＰＰおよびＡｚＣプローブの配列もまた、本設計上の任意の制約条件を決定するために系統的に変化させた。どちらも図１０に記載した配列と同一の配列を有するが、以下の変更を伴う、アプタマーを含有するＴＰＰおよびＡｚＣオリゴを合成した：（１）Ｃ１８−ＰＥＧスペーサーの削除（オリゴ１１９＆１２２）；（２）Ｃ１８−ＰＥＧスペーサーの配列Ｃ１０との交換（オリゴ１２０＆１２３）；（３）Ｃ１８−ＰＥＧスペーサーの配列Ｃ２０との交換（オリゴ１２１＆１２４）；（４）Ｃ１８−ＰＥＧスペーサーの削除およびジップコード領域内の３つの３’−塩基の削除（１５塩基長への減少）（オリゴ１２７＆１２９）；および（５）Ｃ１８−ＰＥＧスペーサーの削除およびジップコード領域内の６つの３’−塩基の削除（１２塩基長への減少）（オリゴ１２８＆１３０）。
【０１５８】
本実施例に使用したオリゴヌクレオチドは以下を含んでいた：
【０１５９】
【化１６】
2008545416.tif 000018
これらの変更は、系の性能において重大な相違を全く生じさせなかった。実験４）および５）もまたレポーターオリゴヌクレオチド内のＣ１８スペーサーのすぐ上流で３および６塩基の一本鎖（ジップコードへアニールしていない）構造を生じさせた。
【０１６０】
これらの実験の結果は、アプタマーに基づくＰＤＧＦ検出系が集合して結合およびＤＰＣ機能を２つの個別オリゴヌクレオチドへ分離できることを指示している。適切なジップコード配列の選択を通して、図９に記載した検出フォーマットは、単一ピースで合成されたオリゴヌクレオチドに類似して機能するであろうアニールしたオリゴヌクレオチド対に自己集合した。レポーターおよびアプタマーオリゴヌクレオチドは、標的を導入する前に個別に集合させられてよい、または全種がほぼ任意の順序で一緒に加えられてよい。このプロセスは、例えば複数の標的を検出するために、２対以上のアニールされた検出オリゴの液相集合へ拡大することができる。複数の標的の検出は、個別に識別できるシグナル（例えば、放射光の相違する波長）を発生する相違するレポーターオリゴヌクレオチドを用いることを必要とする場合がある。
【０１６１】
これらの結果は、ジップコード化報告アプローチが、例えば、アプタマー含有オリゴヌクレオチドを用いて効果的に設計できることを指示している。
【０１６２】
アプタマー系を用いた結果は、結合とレポーター配列との間の安定性複合体がジップコードおよびアンチジップコード領域を単純にアニールすることによって形成できることを示しているが、レポーター反応性基の活性を維持する高度の可能性を伴って、２つのオリゴヌクレオチドを一緒に共有的かつ不可逆的に連結するためのテクノロジーが存在することに留意されたい。例えば、オリゴヌクレオチドは、ジップコードおよびアンチジップコードがほとんど二本鎖であるが配列の残りは一本鎖である温度で、対（核酸を鋳型とする化学のための結合剤オリゴヌクレオチドおよび反応性オリゴヌクレオチド）でインキュベートすることができる。トリオキサレンなどの光活性可能なインターカレーション架橋剤を添加し、その後に紫外線照射を行うと、２本の鎖を不可逆的に架橋させることができる。同様に、紫外線照射は、アニールされた配列の個別鎖間にチミジンダイマーを導入できる。または、その後にＤＮＡリガーゼを用いてライゲートできる、隣接する３’および５’である短鎖標的（スプライス）ＤＮＡに相補的な配列を導入できる。またはスプライスオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡから構成されてよく、ＤＮＡにアニールしたＲＮＡを加水分解するＲＮａｓｅ  Ｈを用いた連結反応後に除去できる。これは、２つのオリゴヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡの単一ピースに変換させることを生じさせることができる。これらの方法は、特異的標的に対する検出キットにおける費用効果的なオリゴヌクレオチド試薬の産生を導くことができる。
【０１６３】
この実施例に関連する参考文献には、Ｃａｐａｌｄｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２８［７］，  ｅ２１．  ２０００；Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．  ２００４，  ７１６１−７２．  ２００４；Ｆａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ．  ４，  ８２９−３４．  ２００３；Ｇｅｒｒｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．  ２９２，  ２５１−６２．  １９９９が含まれる。
【０１６４】
実施例６．  抗体結合剤を用いたＤＰＣに基づく生物学的検出のためのジップコード化アーキテクチャー
また別の実施形態では、アプタマー配列を抗体などの非ＤＮＡ結合剤と交換する。ＰＤＧＦおよび他のタンパク質標的に対しては、アプタマー配列をアルデヒドなどの化学的活性基と交換し、そしてタンパク質標的に対する抗体もしくは受容体などの非ＤＮＡ結合剤配列と反応させる（図３４）。結合剤およびレポーターオリゴヌクレオチドについての最適設計は、結合剤のサイズおよび形状ならびに標的の結合部位のサイズおよび形状に関する熟考により達成できる。例えば、より長い、またはより短いスペーサーアームを使用すると、標的上の結合部位間の距離を最適に広げて、結合剤自体に起因する立体障害を回避することができる。
【０１６５】
図３４を参照すると、ＴＰＰレポーター分子へハイブリダイズするように設計された、５’−アミノ基を含有するジップコード化オリゴヌクレオチドが合成された。ＡｚＣレポーター分子へハイブリダイズするように設計されたジップコード化オリゴヌクレオチドは、３’−アミノ基を含有していた。オリゴヌクレオチドと抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体とのコンジュゲートの合成は、ＳｏｌｕＬｉｎｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（カリフォルニア州サンディエゴ）によって実施した。
【０１６６】
抗体およびオリゴヌクレオチドをコンジュゲート化させるためのＳｏｌｕＬｉｎｋテクノロジーは、まず最初に、抗体上にアセトンヒドラゾンを組み入れるためにスクシンイミジル２−ヒドラジノニコチネートアセトンヒドラゾンを用いて抗体の１級アミノ基を修飾することを必要とする。オリゴヌクレオチドの１級アミンは、スクシンイミジル４−ホルミルベンゾエートを用いて個別に活性化する。２つの活性化された分子を所望の比率（典型的には６：１）で混合し、安定性ヒドラゾン結合を形成するために弱酸性ｐＨで反応させる。この化学反応の詳細は、ｗｗｗ．ＳｏｌｕＬｉｎｋ．ｃｏｍから入手できる。２つのコンジュゲートを作製した：１つはＡｚＣ含有レポーターオリゴヌクレオチドへアニールするためのジップコードを含有しており、もう１つはＴＰＰ含有レポーターオリゴヌクレオチドへアニールするためのジップコードを含有している。
【０１６７】
ＳｏｌｕＬｉｎｋ社から受領した抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ＰＢＳバッファー（０．０１Ｍリン酸カリウム、（ｐＨ７．４）−０．１３８Ｍ塩化ナトリウム）中のＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ−２００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）の１．６×６０ｃｍカラム上でのゲルクロマトグラフィーによってさらに精製した。カラム容積の約０．６倍で溶離する主要抗体ピークを収集し、不純な非コンジュゲート化オリゴヌクレオチドの溶離ピークは廃棄した。抗体コンジュゲートは、Ｐｉｅｒｃｅ濃縮溶液を用いてＰｉｅｒｃｅ社（イリノイ州ロックフォード）製の３０Ｋ分子量カットオフスライド−Ａ−Ｌｙｚｅｒを使用する逆透析により濃縮した。タンパク質含量はＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ試薬キットを用いて決定し、オリゴヌクレオチド含量はＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡ結合色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社（オレゴン州ユージーン））を用いて決定した。コンジュゲートはどちらも、１タンパク質分子に付き平均して約３オリゴヌクレオチドを含有すると決定された。
【０１６８】
組換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（２２０−ＢＢ）およびマウスモノクローナル抗ＰＤＧＦ−ＢＢ（ＭＡＢ２２０）は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ミネソタ州ミネアポリス）から入手した。
【０１６９】
本試験に使用した配列は、以下を含んでいた（ＡｚＣはアジドクマリンを意味し、ＴＰＰはトリフェニルホスフィンを意味する）：
【０１７０】
【化１７】
2008545416.tif 000019
さらに、５’アミノモディファイアーＣ６は、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社から入手した（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製のホスホルアミダイト１１０−１９０６）。３’アミノモディファイアーＣ７は、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社から入手した（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製のホスホルアミダイト２０−２９５７）。Ｃ１８  ＰＥＧは、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社から入手した（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製のホスホルアミダイト１０−１９１８）。
【０１７１】
レポーターオリゴヌクレオチドを含む抗体−オリゴコンジュゲートの集合
それらのレポーターを含む２つの抗体−オリゴコンジュゲートは、最初は１０μＬの容量で個別に集合させた。各集合は、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８）−０．０１Ｍ塩化マグネシウム中に０．５μＭ（５ｐＭ）の抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートおよび０．１５μＭ（１５ｐＭ）の相補的レポーターオリゴヌクレオチドを含有していた。各々は検出反応混合液中で使用する前に４℃で少なくとも１５分間にわたりインキュベートした。
【０１７２】
抗ＰＤＧＦ−ＢＢ  ＤＰＣコンジュゲート／レポーターとＰＤＧＦ−ＢＢとの検出反応
検出反応を実施するためには、各反応液は５０μＬの容量中に：上述したように調製した１０μＬの各コンジュゲート集合体、および０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８）−０．０１  Ｍ塩化マグネシウム−４０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドのバッファー中の様々な量のＰＤＧＦ−ＢＢを含有していてよい。これらのコンジュゲートは反応混合液中に０．２μＭで存在する。サンプルは、２５℃のＷａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ照度計内の黒色９６ウエルマイクロプレートのウエル内でインキュベートする。蛍光は、３５５ｎｍでの励起および４６０ｎｍでの発光により時間に対して追跡できる。
【０１７３】
反応は、典型的には、２５℃で実施することができ、反応生成物である７−アミノクマリンの最適波長での蛍光発生を監視する。
【０１７４】
実施例７．  ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質アッセイの開発および臨床的有意性
複雑な生物学的環境においてタンパク質を特異的にインビトロおよびインビボ検出するための広範囲の適用を提供するモジュラー式アッセイプラットフォームを開発できる。このプラットフォームは、新規シグナル発生へのインサイチュータンパク質認識の結合を可能にする核酸を鋳型とする化学（もしくはＤＮＡプログラム化学反応、「ＤＰＣ」）を利用する。
【０１７５】
このアプローチは、癌患者の早期診断および治療監視のための有意な影響を及ぼすと予想されている。所定の用途のためには、このアプローチは、ポイント・オブ・アッセイ（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）の開発を促進するために単純な均質アッセイフォーマットを提供することによって有益である。他の用途のためには、このアプローチは、フローサイトメトリーと一緒に使用できる、またはインビボイメージングに適合させることができる。
【０１７６】
フローサイトメトリーに基づくアッセイは、ＣＭＬ患者における顕微鏡的遺残病変（ＭＲＤ）の原因となる細胞の亜集団を同定するために、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質に対して設定できる。同一腫瘍内の異質性は、薬理療法の成功にとって主要な挑戦課題であることが証明されている。例えば、原因が分子レベルで解明されており（Ｒｏｗｌｅｙ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２４３  ２９０−２９３（１９７３）；Ｌｕｇｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７  １０７９−１０８２（１９９０））、特異的ターゲティング（Ｄｒｕｋｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ，  ２，  ５６１−５６６（１９９６）；Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｌｏｏｄ，  １０５，  ２６４０−２６５３（２００５））が高い比率の寛解を生じさせている（Ｓａｗｙｅｒｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ，  ９９，  ３５３０−３５３９（２００２）；Ｋａｎｔａｒｊｉａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４６，  ６４５−６５２，（２００２）；Ｔａｌｐａｚ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ９９，  １９２８−１９３７（２００２））慢性骨髄性白血病ＣＭＬ（Ｇｏｌｄｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４９  １４５１−１４６４（２００３）；Ｓａｗｙｅｒｓ，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４０  １３３０−１３４０（１９９９））などの場合においてさえ、一次および二次耐性ならびに疾患持続の基礎となる様々な機構（Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ，  １０５，  ２６４０−２６５３（２００５）；Ｂｈａｔｉａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １０１，  ４７０１−４７０７（２００３）；Ｅｌｒｉｃｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １０５  １８６２−１８６６（２００５））は、これまでの所高い治癒率を妨害してきた。ＰＣＲに基づくアプローチはＭＲＤを検出することについては極めて高感受性であるが（Ｃｏｒｔｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １０２，  ８３−８６（２００３））、それらは単独では個々の患者におけるＭＲＤについての分子的基礎についての情報を提供しない。本明細書に記載したタンパク質に基づくアッセイは、個々の患者におけるＭＲＤを誘発する細胞プロファイル（例えば、流入および流出ポンプの状態（Ｃｒｏｓｓｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １０６，  １１３３−１１３４（２００５）；Ｔｈｏｍａｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ．１０４  ３７３９−３７４５（２００４）；Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ＿１０４  Ａｂｓｔｒａｃｔ  ７１６（ＡＳＨ）（２００４））、インテグリン（Ｂｕｅｎｏ−ｄａ−Ｓｉｌｖａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．  １０，  ５９２−５９８（２００３））およびサイトカイン受容体（Ｃｈｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １０３  ３１６７−３１７４（２００４））、アポトーシスモジュレーター（Ａｉｃｈｂｅｒｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １０６  Ａｂｓｔｒａｃｔ  １９８７（ＡＳＨ）（２００５）；Ａｉｃｈｂｅｒｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １０５，  ３３００３−３３１１（２００５））、ならびにシグナリング経路活性化（Ｊａｍｉｅｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ��５１，  ６５７−６６７（２００４））を規定するためにマルチパラメーター・フローサイトメトリー（Ｉｒｉｓｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １１８，  ２１７−２２８（２００４））を利用する特異的セルベースアプローチを可能にする。これらの情報があれば、最高度の情報を利用した臨床的決定が可能になり、新規の治療戦略を開発するための焦点を規定するのに役立つ。これらから類推すると、ＣＭＬに焦点を当てたこの特定の目的の結果は、ＡＬＬおよびＡＭＬ患者におけるＭＲＤの原因となる細胞の亜集団を同定するために拡大することができる。このタンパク質アッセイアプローチの固有のモジュール方式は、ＡＬＬおよびＡＭＬ各々に関連するＥ２Ａ−ＰＢＸ１、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＭＬＬ／ＡＦ４およびＰＭＬ／ＲＡＲａ、ＡＭＬ−ＥＴＯ融合タンパク質についてのフローサイトメトリーに基づくアッセイの開発を促進するはずである。
【０１７７】
それらの機能的関連性および／または（病理）生理学的状況におけるタンパク質の測定を含むためのスカラー測定を拡大するという目標の中で、このアプローチは、それらのモノマー対応物の存在下でシグナル伝達複合体全部の集合を指示するホモダイマー、ヘテロダイマー、およびタンパク質−タンパク質相互作用の特異的検出を可能にするように設計される。そこでこのアプローチは、特定タイプの癌の病理生理学に機械的に結合している新規の真正バイオマーカーの同定およびバリデーションのために極めて貴重である可能性がある。これは、臨床試験設計を改善して個々の患者にとって最善の治療を可能にできる。
【０１７８】
核酸を鋳型とする化学およびその固有の特異性の基本的原理を使用すると、複雑な生物学的環境において、標的分析物の構造的および機能的完全性が保存されている条件下での生物学的検出に使用できる。分析物認識エレメント（例えば、抗体、アプタマー、もしくは小分子）への反応性基の付着は、当該の分析物を含有するそれらの部位で化学反応が特異的に発生するように指令する。反応物が非蛍光性であり、反応生成物が蛍光性である場合は、極めて低い（「ゼロ」）非特異的バックグラウンドシグナルを入手できるので、特異性もしくは感受性を傷つけることなく複雑な環境における分析物の測定が可能になる。
【０１７９】
図４に示したように、プローブ対が使用される。対の各メンバーは、各々の非相互的に排他的認識エレメントを通してタンパク質へ独立して結合する。対の各メンバーは、アッセイに使用される濃度よりはるかに高い濃度でのみ相互にアニールするように設計された相補的デオキシオリゴヌクレオチド領域を含有している。しかし、両方のプローブがタンパク質へ同時に結合した場合は、それらの有効濃度は対のメンバー間のＤＮＡハイブリダイゼーションを可能にする近接性を通して上昇する。このタンパク質依存性ハイブリダイゼーションイベントは、付着した非蛍光性反応物に、蛍光生成物を生成する核酸鋳型作製反応を受けさせる。この方法で、２つの独立した結合イベントを含む分析物認識は、新規のシグナル発生を誘発する。プローブ対のメンバー間のタンパク質依存性ハイブリダイゼーションは、結果として生じる三元複合体における親和力の点として機能できる。各認識エレメント（例えば、抗体、アプタマー、または低分子量リガンド）の固有の特異性および親和性単独は、この二重認識アッセイフォーマットにおいて増強され、これによりそれらの効果的特異性および感受性が改善される。
【０１８０】
初期試験の１つは、分析物としてのＰＤＧＦのホモダイマーＢＢ系を使用し、相補的デオキシオリゴヌクレオチドへコンジュゲートしたタンパク質認識エレメントとしてアプタマーを使用した。これらは、順に、非蛍光性反応物であるトリフェニルホスフィン（５’−連結）および７−アジドクマリン（３’−連結）に付着している。厳密にＰＤＧＦの存在に依存する蛍光発生が観察された（図２８）。励起および発光スペクトルは、予測された生成物である７−アミノ−クマリンを示していた。アプタマーコンジュゲートが限定的ではなかった条件下でＰＤＧＦの濃度を上昇させると、蛍光シグナルの比例的増加が生じた。最高シグナルは、相補的コンジュゲートの比率が１：１である場合に発生した。さらに、蛍光発生は、相補的コンジュゲートの正確なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合に厳密に依存していた。単一塩基がミスマッチのデオキシオリゴヌクレオチドの導入は、ＰＤＧＦ依存性蛍光発生を導かなかった。
【０１８１】
これらのデータは、以下のモデルと一致している：コンジュゲートのアプタマー部分は、近接性を通して高効果的モル濃度を誘導するＰＤＧＦに結合する。これはコンジュゲートの相補的対間でＤＮＡ二本鎖の形成を導き、順に核酸を鋳型とする化学反応の生成物形成を支持する。これは、分析物認識に直接的に結合しているシグナルを発生するために、非蛍光前駆体が相互に反応することを可能にする。蛍光発生は、ＰＤＧＦ結合のためのアプタマー−デオキシオリゴヌクレオチドコンジュゲートと競合する非コンジュゲート化アプタマーを用いてブロックできる。シグナル発生を５０％減少させるためには、コンジュゲート化アプタマーと競合するために２５倍モル過剰の非コンジュゲート化アプタマーが必要とされた。
【０１８２】
顕微鏡的遺残病変を有するＣＭＬ患者においてＢＣＲ−ＡＢＬ陽性細胞集団を同定するためのアッセイ：新規シグナル発生を誘発する分析物の二重認識を特徴とする本発明を適用するタンパク質アッセイは、細胞の状況におけるＢＣＲ−ＡＢＬの測定のために使用できる。マルチパラメーター・フローサイトメトリーを使用すると、このアプローチは、ＭＲＤの原因となる細胞集団を同定できる。これは、個々の患者のための最善の治療結果をメカニズムに基づいて決定することを導く、ＭＲＤ誘発性細胞プロファイルを規定するために重要な工程であろう。
【０１８３】
抗ＢＣＲおよび抗ＡＢＬデオキシオリゴヌクレオチド抗体ＤＰＣコンジュゲートの調製。例えば（ｗｗｗ．ｓｏｌｕｌｉｎｋ．ｃｏｍ）などの公表されたプロトコールに基づいてヘテロ−二官能試薬であるスクシンイミジル６−ヒドラジノニコチネートアセトンヒドラゾン（ＳＡＮＨ）を用いて５’−もしくは３’−いずれかのアルデヒドデオキシオリゴヌクレオチドを抗体へコンジュゲート化するための一般的プロトコールが開発されている。コンジュゲートは、ゲル排除クロマトグラフィー、その後にアニオン交換クロマトグラフィーを用いて精製され、１抗体分子当たりのオリゴヌクレオチドコンジュゲート化度はＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ蛍光増強法を用いて定量されている。このアプローチは、市販で入手できるポリクローナルおよびモノクローナル抗ＢＣＲおよび抗ＡＢＬ抗体に適用できる。
【０１８４】
高品質モノクローナル抗体施設もまた、ＢＣＲおよびＡＢＬに対する新規抗体を生成するのに役立つことができる。分子モデリング能力は：１）２つの臨床的に重要な融合タンパク質サブタイプであるＢ３／Ａ２およびＢ２／Ａ２中に存在する、２）抗体対が好都合に結合することを可能にするようにトポロジー的に方向付けられる、３）融合タンパク質二量化、Ｇｌｅｅｖｅｃ結合、知られている耐性付与突然変異、およびおそらくは基質結合であるエピトープを予測するために適用できる。
【０１８５】
精製されたＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質の検出。生成したプローブ対を使用すると、上述したＰＤＧＦアッセイと類似方法でＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質についてのアッセイを開発することができる。プローブ対の１つのメンバーは、その認識エレメントとして抗ＢＣＲ抗体を有するであろうが、相補的メンバーはその認識エレメントとして抗ＡＢＬを利用するであろう。ＢＣＲ−ＡＢＬ（Ｂ３／Ａ２）融合タンパク質は、Ｋ５６２  ｃＤＮＡ由来のｂｃｒ−ａｂｌ接合フラグメントを用いてｂｃｒおよびａｂｌ  ｃＤＮＡを一緒にスプライシングし、それをｐＤＥＳＴ８内に配置することによって生成したｐ２１０（ｂｃｒ−ａｂｌ）バキュロウイルス発現構築物から発現させた。全長ＢＣＲおよびＡＢＬを使用すると、本アッセイが融合タンパク質に対して特異的であることを保証できる。検出限界は、精製Ｂ３／Ａ２融合タンパク質ならびにＢ２／Ａ２およびＢ３／Ａ２陽性細胞溶解液由来の融合タンパク質を用いて決定できる。ＢＣＲ−ＡＢＬ−陰性細胞溶解液由来の干渉の程度もまた決定できる。
【０１８６】
蛍光体生成のための反応。本明細書に記載したレポーター化学反応は、蛍光体の生成のために適用できる。好ましくは、この化学反応は、それら自体は認識可能な蛍光自体を有していない相当に安定性のＤＰＣをベースとする前駆体からの０．５より大きい量子収量とともに、＞５００ｎｍの励起極大、＞６００ｎｍの発光極大を備える蛍光体を産生するであろう。
【０１８７】
ＣＭＬ患者由来のＢＣＲ−ＡＢＬ陽性細胞集団を同定するためのフローサイトメトリーアッセイ。
【０１８８】
核酸鋳型作製反応化合物（反応物）の代わりに、連結したフローサイトメトリーのために使用する標準蛍光色素を有する抗ＢＣＲおよび抗ＡＢＬデオキシオリゴヌクレオチドを調製する。これらは、検出プローブ対の細胞内アクセスを保証かつ定量するための固定および透過化条件を最適化するための陽性コントロールとして使用できる。ヒト骨髄性患者由来細胞系を使用できる。初期条件は、活性化状態特異的キナーゼ抗体（Ｉｒｉｓｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １１８，  ２１７−２２８（２００４））を用いて細胞内シグナル伝導経路の活性化を試験するために実行されるプロトコール（Ｊａｍｉｅｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５１，  ６５７−６６７（２００４））に基づいてよい。これらの結果に基づいて、フローサイトメトリーのために最適化されたプローブ対を設計および調製する。
【０１８９】
プロトタイプＤＰＣに基づくフローサイトメトリーアッセイを開発できる。最初に、Ｋ５６２細胞を含む様々なＢ３／Ａ２およびＢ２／Ａ２陽性患者由来細胞系を使用できる。特異性および感受性は、ＢＣＲ−ＡＢＬ陰性細胞を用いてこれらの陽性細胞を希釈することによって決定できる。その目的は、１００万個のＢＣＲ−ＡＢＬ陰性細胞の存在下で１０〜３０個のＢＣＲ−ＡＢＬ陽性細胞を検出することである。この目的が達成されると、アッセイはさらにＣＭＬ患者および健常志願者由来のサンプルを用いて詳細にバリデーションできる。本アッセイの特異性および感受性は、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）（Ｓｃｈｏｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １６  ５３−５９（２００２））およびＤＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｅｌｒｉｃｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １０５  １８６２−１８６６（２００５））を利用するバリデーションされた方法と比較できる。このため、数例の患者由来のサンプル上で蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析を実施できる。
【０１９０】
ＣＭＬ患者におけるＧｌｅｅｖｅｃに対する一次および二次耐性ならびに疾患持続の原因となる一部の機構を示唆する重要な証拠が出現しつつある。さらに、ＢＣＲ−ＡＢＬのキナーゼドメイン、流入および流出ポンプ、インテグリンおよびサイトカイン受容体、アポトーシスモジュレーターにおける突然変異に加えて、ＭＰＡキナーゼおよびβ−カテニンを含むシグナリング経路も関係付けられてきた。これらの結果に誘導されると、マルチパラメーター・フローサイトメトリーフォーマットにおいて提案されたＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質アッセイを使用することによって個々の患者においてＭＲＤ誘発性細胞プロファイルを確定することが可能なはずである。このアプローチは、癌細胞において増強されたホスホタンパク質ネットワークの細胞プロファイリングに類似であろう。これらのＭＲＤ誘発性細胞の「バイオシグネチャー」は次に、様々な治療レジメンの前およびそれに応答した個々の患者間で比較することができよう。治癒を妨害する多種多様な潜在的機構を考えると、細胞プロファイリングは、各個別患者がもっとも適切な薬理療法を受けることを保証する際に極めて貴重であることが明らかであろう。Ｉｒｉｓｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １１８，  ２１７−２２８（２００４）；Ｃｒｏｓｓｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １０６，  １１３３−１１３４（２００５）；Ｔｈｏｍａｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １０４  ３７３９−３７４５（２００４）；Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １０４  Ａｂｓｔｒａｃｔ  ７１６（ＡＳＨ）（２００４）；Ｂｕｅｎｏ−ｄａ−Ｓｉｌｖａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．  １０，  ５９２−５９８（２００３）；Ｃｈｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １０３  ３１６７−３１７４（２００４）；Ａｉｃｈｂｅｒｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １０６  Ａｂｓｔｒａｃｔ  １９８７（ＡＳＨ）（２００５）；Ａｉｃｈｂｅｒｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １０５，  ３３００３−３３１１（２００５）；Ｊａｍｉｅｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５１，  ６５７−６６７（２００４）。
【０１９１】
以下では核酸鋳型作製反応の多様な一般的態様について詳細に考察する。さらなる情報は、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許公開第２００４／０１８０４１２Ａ１号（ＵＳＳＮ１０／６４３，７５２）およびＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．による第２００３／０１１３７３８Ａ１号（ＵＳＳＮ１０／１０１，０３０）の中に見いだすことができる。
【０１９２】
実施例８．  核酸鋳型作製による様々な色素の生成
標準ホスホルアミダイト化学を用いて３つのオリゴヌクレオチドを調製し、逆相Ｃ１８カラムによって精製した（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、米国バージニア州スターリング）。５’−アミノ基を有するオリゴヌクレオチド（ＥＤＣ２およびＥＤＣ３）は５’−アミノ−モディファイヤー５を用いて調製し、３’−アミノ基を有するオリゴヌクレオチド（ＥＤＣ１）は３’−アミノ−モディファイヤーＣ７  ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、米国バージニア州スターリング）を用いて調製した。ＤＮＡおよび複素環コンジュゲート化ＤＮＡの濃度は、２６０ｎｍでの紫外線吸光度によって決定した。複素環コンジュゲート化ＤＮＡ内の複素環部分からの２６０ｎｍでの紫外線吸光度の関与はわずかであったので、考慮に入れなかった。
【０１９３】
【化１８】
2008545416.tif 000020
アルドール縮合のためのＤＮＡコンジュゲート化複素環前駆体の合成。スキーム１４は、アルドール縮合のためのＤＮＡコンジュゲート化複素環前駆体の合成の２つの実施例を提供している。
【０１９４】
【化１９】
2008545416.tif 000021
化合物１の合成：５−ブロモ吉草酸（２．４３５ｇ、１３．４５ｍＭ）に２，３，３−トリメチルインドレニン（２．１４１ｇ、１３．４５ｍＭ）を加えた。この反応混合液を１１０℃で一晩、強力に攪拌しながら加熱した。入手した深紅色の粘性油をＧｒｅｇａｒ抽出器に移し、ＥｔＯＡｃを用いて一晩抽出した。淡紅色の固体が得られた。固体は３０ｍＬのＭｅＯＨ中に再溶解させた。減圧下でＭｅＯＨを除去し、残りの残留物を１０ｍＬのＥｔＯＡｃにより処理した。褐色がかった固体が沈殿したので濾過した。この固体を２×５０ｍＬのアセトンおよび２×１００ｍＬのＥｔＯＡｃで洗浄した。計１．５９０ｇの淡褐色がかった固体が得られた（収率３５％）。
【０１９５】
【化２０】
2008545416.tif 000022
化合物２の合成：化合物１（０．１ｇ、０．２９４ｍＭ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．０６８ｇ、０．５８８ｍＭ）およびＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（０．０８５ｇ、０．４１１ｍＭ）を１．５ｍＬのＤＭＦ中に溶解させた。反応混合物は、３７℃で１時間攪拌した。沈殿したジシクロヘキシルウレア（ＤＣＵ）を濾過により除去し、濾液を１５ｍＬのエーテルにより処理した。明るい橙色の固体を１０ｍＬのエーテルで３回洗浄し、真空下で数時間にわたり乾燥させた。入手した固体は、次の反応のために直接使用した。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（ポジティブモード）：３５７．１５９０。
【０１９６】
化合物３の合成：２０ｎＭのＤＮＡ（ＥＤＣ１）を含有する１．５ｍＬの遠心分離バイアルに４１．６μＬの０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ＮａＰｉ）（ｐＨ８．６）、ＮＭＰ（９６ｍＭ）中の４１．６μＬの化合物２および４１．６μＬのＮＭＰを加えた。バイアルをシェーカー内に配置し、３７℃で４時間振とうした。反応混合液はＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５を用いるゲル濾過によって脱塩し、次に逆相Ｃ１８カラムによって精製した。計８．８１ｎＭの所望の生成物が得られた（収率４４％）。ＬＣ−ＭＳ（ネガティブモード）：Ｃ１７２Ｈ２２１Ｎ６０Ｏ９６Ｐ１５についての計算値（モノイソトピック）：１０２４．４０７０［Ｍ−５Ｈ］−５；１２８０．７４７３［Ｍ−４Ｈ］−４  実測値：１０２４．３９８６［Ｍ−５Ｈ］５−；１２８０．７４７３［Ｍ−４Ｈ］４−。
【０１９７】
化合物４の合成（化合物１の合成方法に類似する）：４−メチルピリジン（１．２４５ｇ、１３．３７ｍＭ）および５−ブロモ吉草酸（２．４２０３ｇ、１３．３７ｍＭ）を１１０℃で一晩、強力に攪拌しながら加熱した。この粘性油に５０ｍＬのＥｔＯＡｃを加えた。入手した赤紫色の固体を崩壊させ、ＥｔＯＡｃおよびアセトンを用いてしっかりと洗浄した。固体を濾過し、真空下で乾燥させると、白色固体として１．８８６ｇの４が得られた（収率５１％）。
【０１９８】
【化２１】
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化合物５の合成：化合物５は化合物２と同一合成方法にしたがって合成し、エーテル沈降法を行わずにＤＮＡコンジュゲート化のために直接使用した。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（ポジティブモード）：２９１．１６０５。
【０１９９】
化合物６の合成：ＤＮＡ標識化の一般方法にしたがって、２０ｎＭのＤＮＡ（ＥＤＣ１）を化合物５と３７℃で一晩反応させると、９．０５ｎＭの純粋ピリジニウムコンジュゲート化ＤＮＡ６が得られた（収率４５％）。ＬＣ−ＭＳ（ネガティブモード）：Ｃ１６８Ｈ２１７Ｎ６０Ｏ９６Ｐ１５についての計算値（モノイソトピック）：１２６４．２３８５［Ｍ−４Ｈ］４−；１６８５．９８７２［Ｍ−３Ｈ］３−  実測値：１２６４．２３１３［Ｍ−４Ｈ］４−；１６８５．９８７１［Ｍ−３Ｈ］３−。
【０２００】
アルドール縮合およびＷｉｔｔｉｇ反応のためのＤＮＡコンジュゲート化アルデヒド前駆体の合成。スキーム１５およびスキーム１６は、Ｎ−４級化を通して酸性官能基を複素環に導入する２つの実施例を示している。スキーム１７は、ＤＮＡコンジュゲート化のためにシアノ基を酸性基に変換させる１つの実施例を提供する。
【０２０１】
【化２２】
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化合物７の合成：１（０．２５ｇ、０．７３５ｍＭ）および水酸化ナトリウム（０．０３９ｇ、０．９７０ｍＭ）の混合物を１．９ｍＬの水に溶解させ、室温で強力に攪拌した。３時間後、反応混合物を４．３ｇのＲｅｄｉＳｅｐ逆相Ｃ１８カラム上に直接装填した。カラムは過剰の塩を除去するために最初に水で洗浄し、次にアセトニトリルで洗浄して生成物を溶離させた。計０．１７８ｇの生成物が得られた（収率８６％）。
【０２０２】
【化２３】
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化合物８の合成：Ａｒ大気下でＰＴＦＥ／シリコーン隔膜を備える４ｍＬのガラスバイアル中に３００μＬの無水ＤＭＦを加えた。バイアルおよびその内容物を１０分間にわたり氷−塩浴中で冷却し、次に８４μＬのオキシ塩化リンを加えた。さらに１０分後、３００μＬのＤＭＦ中の化合物７の溶液（０．１５ｇ、０．５３３ｍＭ）を緩徐に加えた。この溶液は粘性になった。バイアルを３５℃に予熱したシェーカーへ移し、さらに４５分間振とうした。２００ｍｇの氷を注意深く攪拌しながらこの反応混合液に加え、続いて１．２ｍＬの水に入れた４５０ｍｇのＮａＯＨを加えた。生じた懸濁液を急速に沸点まで加熱し、室温へ冷却させた。生じた混合液は、最初はＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎクロマトグラフィーシステム（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  ＩＳＣＯ社）上の１２ｇのＲｅｄｉＳｅｐ逆相Ｃ１８カラム（アセトニトリル／水）によって、次に半分取薄層クロマトグラフィー（溶媒系：７０：２９：１  ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ）によって精製した。計２６ｍｇの純粋生成物が得られた（収率１６％）。
【０２０３】
【化２４】
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化合物９の合成：１．５ｍＬのＴＨＦ中のベンゾチアゾール−２−カルバルデヒド（１０２ｍｇ、０．６２３ｍＭ）およびＺｎＢｒ２（１４０ｍｇ、０．６２３ｍＭ）の溶液に、ＴＨＦ（０．３ｍＬ）中の（Ｅ）−Ｎ−（２，２−ｂｉｓ（トリメチルシリル）エチリデン）２−メチルプロパン−２−アミン（１６７ｍｇ、０．６８５ｍＭ）の溶液を室温で滴下した。２時間攪拌した後、生じた混合物はＺｎＣｌ２（２９７ｍｇ、２．２ｍＬの水中）およびエーテル（２．５６ｍＬ）の添加によって加水分解した（加水分解の程度はＨＰＬＣ分析によって監視した）。ＴＨＦは、Ａｒ流によって除去した。水相は、ＣＨ２Ｃｌ２を用いて抽出した。ＭｇＳＯ４の上方に通して乾燥させた後、粗生成物はＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎクロマトグラフィーシステム（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）上の１２ｇのＲｅｄｉＳｅｐシリカゲルカラムによって精製した。９７ｍｇの生成物が得られた（収率８２％）。
【０２０４】
【化２５】
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化合物１２の合成：Ｎ−メチル−Ｎ−シアノエチル−４−アミノベンズアルデヒド（１．０２４ｇ、５．４４ｍＭ）を含有する５０ｍＬの円形フラスコ中に２７．２ｍＬの５Ν  ＮａＯＨ溶液および６．８ｍＬの３０％  Ｈ２Ｏ２を加えた。反応混合液は２時間環流させた。冷却させた後、反応混合液は濃ＨＣｌ（３７重量％）の添加によって中和し、２×１００ｍＬのＥｔＯＡｃおよび１×１００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２を用いて抽出した。有機相を結合し、５０ｍＬの食塩液を用いて１回洗浄し、乾燥するまで濃縮させた。粗生成物はＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎクロマトグラフィーシステム（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ）上の４０ｇのＲｅｄｉＳｅｐシリカゲルカラムによって精製した。計０．７０２ｇの淡桃色がかった固体が得られた（収率６２％）。エレクトロスプレーＭＳ：Ｍ＋Ｈ  ２０８．０７３５．（Ｂｒａｄｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２００１，  ２７６，  １８８１２−１８８１８）。
【０２０５】
化合物１３の合成：化合物１３は化合物２と同一合成方法にしたがって合成し、エーテル沈降法を行わずにＤＮＡコンジュゲート化のために直接使用した。
【０２０６】
化合物１４の合成：ＤＮＡ標識化の一般方法にしたがって、２０ｎＭのＤＮＡ（ＥＤＣ２）を化合物１３と３７℃で一晩反応させると、８．８ｎＭの１４が得られた（収率４４％）。ＬＣ−ＭＳ：Ｃ１５８Ｈ２０４Ｎ５７Ｏ９１Ｐ１５についての計算値（モノイソトピック）：１２０３．９７１０［Ｍ−４Ｈ］４−；１６０５．６３０６［Ｍ−３Ｈ］３−  実測値：１２０３．９６６４［Ｍ−４Ｈ］４−；１６０５．６３０５［Ｍ−３Ｈ］３−。
【０２０７】
化合物１５の合成：ＤＮＡ標識化の一般方法にしたがって、２０ｎＭのＤＮＡ（ＥＤＣ３）を化合物１３と３７℃で一晩反応させると、９．７ｎＭの１５が得られた（収率４９％）。ＬＣ−ＭＳ：Ｃ１５９Ｈ２０４Ｎ５９Ｏ９１Ｐ１５についての計算値（モノイソトピック）：１２１３．９７２５［Ｍ−４Ｈ］４−；１６１８．９６６０［Ｍ−３Ｈ］３−  実測値：１２１３．９６２０［Ｍ−４Ｈ］４−；１６１８．９５９０［Ｍ−３Ｈ］３−。
【０２０８】
ＷｉｔｔｉｇもしくはＨｏｒｎｅｒ反応のための前駆体の合成。ここでは、ハロゲン化物試薬の単離を行わない便宜的なワンポット法を用いて、アミノ置換芳香族ホスホニウム塩を合成する実施例を提示した（スキーム１８）。
【０２０９】
【化２６】
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化合物１６の合成：８ｍＬのトルエン中のジュロリジン（０．９７ｇ、５．６０ｍＭ）、４−（ジフェニルホスフィノ）安息香酸（１．７１５ｇ、５．６０ｍＭ）およびパラホルムアルデヒド（０．１６８ｇ）の溶液に、ＮａＩ（０．８４ｇ、５．６０ｍＭ）、水（０．３９７ｍＬ）およびＨＯＡｃ（１．１３ｍＬ）を加えた。この混合液を一晩にわたり環流させた。１５ｍＬの水を加えた後、反応混合液はＣＨ２Ｃｌ２を用いて２回抽出した。結合ＣＨ２Ｃｌ２相を飽和ＮａＨＣＯ３で２回洗浄し、次に水で１回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４の上方に通して乾燥させた。溶媒を除去した後、残留物はＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎクロマトグラフィーシステム（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）上の４０ｇのＲｅｄｉＳｅｐシリカゲルカラムによって精製した。１．７７ｇの黄色固体が得られた（収率５１％）。
【０２１０】
【化２７】
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水性条件下でのアルドール縮合を通してのポリメチンの生成。以前の文献データのほとんどはアルドール縮合が厳しい条件（塩基性条件下でのエタノール環流）下でしか発生しないことを示しているが、本発明者らはここで、活性水素を有するＮ−４級複素環式前駆体が軽度の水性条件下でアルドール縮合に沈降する２つの実施例を示す。スキーム１９では、ほんの数分間にわたり水性バッファー中で化合物１および１２を混合した後に、濃紫色が観察された。質量分析は、アルドール縮合生成物が形成され（図３５）、希釈した反応混合物は特徴的なヘミシアニン色素蛍光を示している（図３６、励起：５４３ｎｍおよび発光：５８６ｎｍ）。スキーム２０は、生成されたヘミシアニン生成物が６１４ｎｍで蛍光を示す水性条件下でのアルドール縮合のまた別の実施例を例示している（５４０ｎｍでの励起、図３７）。
【０２１１】
【化２８】
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核酸鋳型作製Ｗｉｔｔｉｇ反応を通してのポリメチンの生成。スキーム２１は、化合物３および化合物１４の間の核酸鋳型作製アルドール縮合の実施例を例示している。３７℃で一晩インキュベーションした後、生成物のＬＣ−ＭＳ分析は、ポリメチン色素の生成を示している（図３８）。
【０２１２】
【化２９】
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参考文献の組み込み
本明細書で言及した刊行物および特許文書の各々の全開示は、各個別刊行物もしくは特許文書が個別に表示されているのと同程度に、あらゆる目的でそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１３】
同等物
本発明は、その精神もしくは不可欠の特徴から逸脱せずに他の特定の形状で具体化することができる。このため、上記の実施形態は、本明細書に記載した本発明を限定するのではなくあらゆる態様において例示であると見なすべきである。そこで本発明の範囲は、上記の説明ではなく添付の特許請求の範囲によって指示されるものであり、請求項の同等性の意味および範囲内に含まれるあらゆる変更はその中に含まれることが企図されている。
【図面の簡単な説明】
【０２１４】
【図１】図１は、本発明の１つの実施形態の下で核酸標的を検出するための方法を示した略図である。
【図２】図２は、遺伝子彩色法による低コピー数の遺伝子を検出する実施例を示した略図である。
【図３】図３は、補因子遊離アッセイにより核酸標的を検出する実施例を示した略図である。
【図４】図４は、本発明の１つの実施形態の下で生物学的標的を検出するための方法を示した略図である。
【図５】図５は、本発明の１つの実施形態の下で生物学的標的を検出するための方法を示した略図である。
【図６】図６は、濃度、温度、および単一塩基対ミスマッチの存在もしくは不在によって影響を受けるハイブリダイゼーションの実施例を示した図である。
【図７】図７は、所定の融解曲線実験において使用された代表的なオリゴヌクレオチドを示した図である。
【図８】図８は、本発明の１つの実施形態の下で生物学的標的を検出するための方法を示した略図である。
【図９】図９は、本発明の１つの実施形態の下で血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を検出するための方法を示した略図である。
【図１０】図１０は、標的結合成分としてアプタマーを用いた、固定されたジップコード化検出系の代表的な実施形態を示した図である。
【図１１】図１１は、標的結合成分として抗体を用いた、固定されたジップコード化検出系の代表的な実施形態を示した図である。
【図１２】図１２は、本発明の１つの実施形態の下でタンパク質標的を検出するための方法を示した略図である。
【図１３】図１３は、ポリメチン色素、シアニンおよびヘミシアニンの一般構造を示した図である。
【図１４】図１４は、トリフェニルホスフィン（ＴＰＰ）およびアジドクマリン（ＡｚＣ）レポーター化学による蛍光シグナル発生および生物学的標的検出の実施例を示した図である。
【図１５】図１５は、ＴＰＰおよびＡｚＣレポーター化学による蛍光シグナル発生および生物学的標的検出の実施例を示した図である。
【図１６】図１６は、オリゴヌクレオチド濃度がＴｍに及ぼす作用を例示している融解曲線の所定の例を示した図である。
【図１７】図１７は、アビジンを含む、および含まないビオチン化オリゴヌクレオチドのＤＮＡハイブリダイゼーション融解曲線を用いた所定の例を示した図である。
【図１８】図１８は、アビジンに結合した後の相補的ビオチン化オリゴのＴｍ変化の例を示した図である。
【図１９】図１９は、塩およびマグネシウムの濃度がオリゴヌクレオチド＋／−ビオチンのＴｍに及ぼす作用の所定の例を示した図である。
【図２０】図２０は、オリゴヌクレオチド対アビジンの様々な比率でのビオチン化オリゴヌクレオチドの融解温度挙動の所定の例を示した図である。
【図２１】図２１は、アビジンの不在下および存在下におけるビオチン−５’（＋）鎖オリゴと二本鎖化した５’および３’（−）ビオチン鎖オリゴの融解曲線の所定の例を示した図である。
【図２２】図２２は、アビジンを含む、および含まないＡＴリッチビオチン化オリゴダイマーの融解曲線の所定の例を示した図である。
【図２３】図２３は、本発明の１つの実施形態の下で生物学的標的を検出するための方法を示した略図である。
【図２４】図２４は、本発明の１つの実施形態の下で生物学的標的の検出についての実験結果の例を示した略図である。
【図２５】図２５Ａおよび２５Ｂは、本発明の１つの実施形態の下で生物学的標的の検出についての実験結果（反応混合物中でホルムアミドが及ぼす作用）の例を示した略図である。
【図２６】図２６Ａおよび２６Ｂは、本発明の１つの実施形態の下で生物学的標的の検出についての実験結果（反応混合物中でホルムアミドが及ぼす作用）の例を示した略図である。
【図２７】図２７は、本発明の１つの実施形態の下で生物学的標的の検出についての実験結果（反応混合物中でホルムアミドが及ぼす作用）の例を示した略図である。
【図２８】図２８は、本発明の１つの実施形態の下で生物学的標的の検出についての実験結果（反応混合物の時間経過）の例を示した略図である。
【図２９】図２９は、本発明の１つの実施形態の下で生物学的標的の検出についての実験結果（反応混合物の時間経過）の例を示した略図である。
【図３０】図３０は、本発明の１つの実施形態の下で生物学的標的の検出についての実験結果（プローブ比）の例を示した略図である。
【図３１】図３１は、ジップコード化検出系によるＰＤＧＦの検出の実施例を示した図である。
【図３２】図３２は、アプタマーおよびレポーターの比率についての実験を示した図である。
【図３３】図３３は、ＰＤＧＦを検出するための「ワンピース」検出系の実施形態を示した図である。
【図３４】図３４は、標的結合成分として抗体を備える、固定されたジップコード化検出系の代表的な実施形態を示した図である。
【図３５】図３５は、反応混合物のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示した図である。
【図３６】図３６は、反応混合物の吸収および蛍光発光スペクトルを示した図である。
【図３７】図３７は、精製ヘミシアニンの吸収および蛍光発光スペクトルを示した図である。
【図３８】図３８は、化合物のエレクトロスプレー質量分析データを示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年2月1日(2008.2.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008545416000001.app
【国際調査報告】
2008545416.tif 000070
2008545416.tif 000071
2008545416.tif 000072
2008545416.tif 000073
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