(57)【要約】  本明細書では、疾患または状態を治療するための標的治療薬を作製する方法およびキットが提供される。本治療薬は、患者に特異的な疾患マーカーを標的とすることができる。これらの方法の１つでは、本方法は、疾患もしくは状態を有する患者、または疾患もしくは状態を発現する危険性がある患者から生体試料を得ることを含む。この特定の方法では、試料は、疾患細胞の集団を含み、前記疾患細胞に結合するｍＲＮＡ−タンパク質対を同定するために、それらの同族ｍＲＮＡに連結されたタンパク質を含むライブラリーをスクリーニングし、１つまたは複数のタンパク質を、前記同定されたｍＲＮＡ−タンパク質対から分離し、前記分離したタンパク質（複数可）を治療薬に結合させる。本方法の一部は、さらにその同族ｍＲＮＡに連結したタンパク質を有するライブラリーを作製することを含む。これらの方法の一部では、前記ライブラリーの作製は、各々の前記ｍＲＮＡ分子が架橋剤を含む少なくとも２つの候補ｍＲＮＡ分子を提供すること、少なくとも１つの翻訳されたタンパク質を生成するために、前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも２つを翻訳すること、および前記候補ｍＲＮＡ分子の少なくとも１つを、少なくとも１つの同族対を形成する前記架橋剤を介して、その対応する翻訳されたタンパク質に連結することを含む。
2008526973.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患または状態を治療するための標的治療薬を作製する方法であって、
疾患もしくは状態を有する患者、または疾患もしくは状態を発現する危険性がある患者から生体試料を得るステップであって、前記試料が疾患細胞の集団を含むステップと、
前記疾患細胞に結合するｍＲＮＡ−タンパク質対を同定するために、同族ｍＲＮＡと連結させたタンパク質を含むライブラリーをスクリーニングするステップと、
前記同定したｍＲＮＡ−タンパク質対から、１つまたは複数のタンパク質を分離するステップと、
前記分離したタンパク質（複数可）を治療薬に結合するステップであって、前記治療薬が前記疾患細胞に対して治療有効性を有するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
第１の亜集団細胞を前記試料から分離するステップであって、前記第１の亜集団が、非疾患細胞を実質的に含まない疾患細胞を含むステップと、
第２の亜集団細胞を前記試料から分離するステップであって、前記第２の集団が、疾患細胞を実質的に含まない非疾患細胞を含み、前記非疾患細胞よりも前記疾患細胞と実質的に高親和性で結合するｍＲＮＡ−タンパク質対を同定するために、前記ライブラリーをスクリーニングするステップと、
をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記疾患または状態が癌であり、前記疾患細胞が悪性細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記疾患または状態が血液癌であり、前記悪性細胞がリンパ球を含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記悪性細胞がＢ細胞である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記悪性細胞がＴ細胞である請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記疾患または状態が病原体の感染であり、前記疾患細胞が病原体で感染した細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記病原体がウイルスである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ウイルスがＨＩＶである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記治療薬が細胞毒性薬剤である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記治療薬が前記患者で免疫応答を引き起こしうる請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記治療薬がアジュバントである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記疾患または状態が移植拒絶反応であり、前記疾患細胞が移植された細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記治療薬が前記患者で免疫応答を抑制できる請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記疾患または状態が移植拒絶反応であり、前記疾患細胞が移植された細胞に結合するリンパ球である請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記治療薬が前記患者で免疫応答を引き起こしうる請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記治療薬が補体媒介免疫応答を刺激する請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記治療薬がＣ３転換酵素である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記分離ステップが、前記同定されたｍＲＮＡ−タンパク質対の前記ｍＲＮＡに対応するオリゴヌクレオチドをクローニングすること、および前記オリゴヌクレオチドからタンパク質を発現することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
同族のｍＲＮＡに連結したタンパク質を含むライブラリーを作製するステップであって、
少なくとも２つの候補ｍＲＮＡ分子を提供することであって、前記ｍＲＮＡ分子のそれぞれが架橋剤を含むこと、
前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも２つを翻訳して、少なくとも１つの翻訳されたタンパク質を生成すること、および
前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つを、架橋剤を介してその対応する翻訳されたタンパク質と連結して、少なくとも１つの同族対を形成すること
を含むステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記架橋剤がコドン上に配置される請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
前記架橋剤が疑似ストップコドン上に配置される請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記架橋剤がソラレン架橋剤を含み、連結には前記ｍＲＮＡをＵＶ光に曝露することを含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記翻訳がｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記候補ｍＲＮＡ分子の少なくとも１つおよび前記翻訳されたタンパク質の少なくとも１つが、ｔＲＮＡ、修飾されたｔＲＮＡ、およびｔＲＮＡ類似体からなる群から選択されるｔＲＮＡ分子によって連結される請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記疾患または状態が癌であり、前記疾患細胞が悪性細胞である請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記疾患または状態が血液癌であり、前記悪性細胞がリンパ球を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記疾患または状態が病原体の感染であり、前記疾患細胞が病原体で感染した細胞である請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
前記疾患または状態が移植拒絶反応であり、前記疾患細胞が移植された細胞である請求項１８に記載の方法。
【請求項３０】
前記治療薬が前記患者で免疫応答を抑制できる請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記疾患または状態が移植拒絶反応であり、前記疾患細胞が移植された細胞に結合するリンパ球である請求項１８に記載の方法。
【請求項３２】
前記治療薬が前記患者で免疫応答を引き起こしうる請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記治療薬が細胞毒性薬剤である請求項１８に記載の方法。
【請求項３４】
前記治療薬が前記患者で免疫応答を引き起こしうる請求項１８に記載の方法。
【請求項３５】
疾患または状態を治療するための標的治療薬を作製する方法であって、
疾患もしくは状態を有する患者、または疾患もしくは状態を発現する危険性がある患者から試料を得るステップと、
１つまたは複数のタンパク質を前記試料から分離するステップであって、前記タンパク質が、非疾患細胞と比べて疾患細胞上で発現の異なるマーカーを含むステップと、
前記マーカーに対して実質的に親和性を有するｍＲＮＡ−タンパク質対を同定するために、同族のｍＲＮＡと連結されたタンパク質を含むライブラリーをスクリーニングするステップと、
１つまたは複数のタンパク質を、前記同定されたｍＲＮＡ−タンパク質対から分離するステップと、
前記分離したタンパク質を治療薬に結合するステップであって、前記治療薬が前記疾患細胞に対して治療有効性を有するステップと、
を含む方法。
【請求項３６】
同族のｍＲＮＡに連結されたタンパク質を含むライブラリーを作製するステップであって、
少なくとも２つの候補ｍＲＮＡ分子を提供することであって、前記ｍＲＮＡ分子のそれぞれが架橋剤を含むこと、
前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも２つを翻訳して、少なくとも１つの翻訳されたタンパク質を生成すること、
および前記候補ｍＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つを、前記架橋剤を介してその対応する翻訳されたタンパク質と連結して、少なくとも１つの同族対を形成すること、
を含むステップをさらに含む請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記マーカーがＭＨＣを含む１つまたは複数のタンパク質である請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記治療薬が免疫応答を抑制する請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記疾患または状態が移植拒絶反応である請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記マーカーが、ＭＨＣに結合するリンパ球のイディオタイプを含む１つまたは複数のタンパク質である請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記治療薬が免疫応答を増強する請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記疾患または状態が移植拒絶反応である請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
請求項１８から請求項４２のいずれか１項に記載の前記方法を実施するためのキットであって、
同族のｍＲＮＡに連結されたタンパク質を含む前記ライブラリーを発現する手段と、
生体試料の１つまたは複数の成分に結合するｍＲＮＡ−タンパク質対を同定するために、前記ライブラリーをスクリーニングする手段であって、前記試料を疾患もしくは状態を有する患者、または疾患もしくは状態を発現する危険性がある患者から採取する手段と、
前記同定されたｍＲＮＡ−タンパク質対から、前記タンパク質を分離する手段と、
前記分離したタンパク質を前記治療薬に結合する手段であって、前記治療薬が前記疾患または状態に対して治療有効性を有する手段と、
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、個々の患者または患者の亜集団に合わせて調整した治療薬を作製する方法、またこのような治療薬を用いて、悪性疾患、病原体感染および他の状態を治療する方法、ならびに移植拒絶反応を減少させるかまたは阻止する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来技術の説明
多くの悪性細胞は、悪性疾患のタイプに特異的であるばかりでなく、個々の患者にも特異的であるエピトープを示す。ある態様では、本発明は悪性リンパ球上に示されるエピトープのような患者特異的なエピトープを標的にできる治療薬に関する。
【０００３】
リンパ球は、脊椎動物の免疫系に重要である。リンパ球は、胸腺、脾臓および骨髄（成体）で産生され、ヒト（成体）の循環系に存在する全白血球の約３０％を占める。リンパ球の２つの主要な亜集団、すなわちＴ細胞およびＢ細胞が存在する。Ｔ細胞は、細胞性免疫を担い、一方Ｂ細胞は、抗体産生（液性免疫）を担っている。典型的な免疫応答では、Ｔ細胞レセプターが、抗原提示細胞の表面で主要組織適合複合体（「ＭＨＣ」）糖タンパク質に結合した抗原フラグメントに結合すると、Ｔ細胞が活性化される。このような活性化が生物学的伝達物質（「インターロイキン」）の放出を生じ、そしてこの伝達物質が本質的には、Ｂ細胞を刺激して分化させ、抗原に対する抗体（「免疫グロブリン」）を産生させる。
【０００４】
リンパ腫、白血病および多発性骨髄腫などの血液癌の病因は、異なるかまたは知られていない。疑われる原因は、ウイルスおよび化学物質への暴露から家系性傾向の範囲に及ぶ。しかしこれらの癌の共通性は、これらの癌は全て分裂して、これらの癌がその表面に発現する免疫グロブリンタンパク質上に同じＦａｂイディオタイプを発現する細胞のクローンを生ずる悪性に形質転換したＢ細胞またはＴ細胞で始まることである。これらの癌を治療する困難性の１つは、それぞれの癌が特有なイディオタイプ発現することである。したがって、効果的かつ選択的に全てのありうるイディオタイプを治療する治療処置の開発についてはよく分かっていない。
【０００５】
血液癌のための従来の治療は、骨髄中の悪性クローンを含む全ての血液産生細胞を破壊した後、血液産生系を再構築するために、骨髄を患者または適合するドナーの骨髄から分離した幹細胞で置換する方法を一般的に含む。これらの治療は侵襲性が高く、治効はわずかである。１つの方法は、同定の「マーカー」として利用する細胞表面タンパク質を認識するモノクロナール抗体ワクチンを用いる治療を含む。この方法を採用する治療薬には、Ｃｏｍｐａｔｈ−Ｈ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、ＨＬＬ２（Ｅｐａｒｔｕｚｕｍａｂ）、ＨｕｌＤ１０およびＲｉｔｕｘｉｍａｂ、（例えば、米国特許第６，４５５，０４３号）が含まれる。しかし、これらのモノクロナール抗体に基づく治療薬についての深刻な限界は、標的細胞表面抗原が正常および悪性腫瘍細胞両方上にしばしば見出されることである。さらに、ヒトモノクロナール抗体の生成が困難であるため、モノクロナール抗体ワクチンは、通常は「キメラ」抗体、すなわち２つ以上の異なる種（例えば、マウスおよびヒト）由来の一部を含む抗体を利用する。このような外来抗体の注射を繰り返すと、有害な過敏性反応を招く免疫反応の誘導を引き起こす。マウスに基づくモノクロナール抗体に関して、この免疫反応は、ヒト抗マウス抗体応答（「ＨＡＭＡ」応答）としばしば呼ばれる。患者が、ヒト抗キメラ抗体応答（「ＨＡＣＡ」応答）も発症することもある。ＨＡＭＡおよびＨＡＣＡは、「外来の」抗体を攻撃することができ、その結果抗体の標的部位（複数可）に到達前に、それらの抗体は実質的に中和される。さらに、モノクロナール抗体ワクチンの他の欠点は、モノクロナール抗体を生成するため要する時間および費用である。標的エピトープ、例えばＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ５２ｗおよび抗クラスＩＩ  ＨＬＡが容易に突然変異して、以前の治療薬に抵抗性の新たな腫瘍を生ずることができることを考慮すると、これは特に問題である（例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５：６１１〜６１５、１９９９を参照）。したがって本技術分野において、良性の細胞に対して個々の癌細胞を選択的に標的にする悪性疾患を治療する効果的で低コストの治療薬に対する必要性が存在する。
【０００６】
悪性細胞のように移植組織および移植臓器の細胞は、生来の細胞と比べて移植された細胞で発現の異なる細胞表面エピトープを示す。ある態様では、本発明はこのような変異するエピトープを認識することにより、移植組織または臓器の細胞を標的にすることができる治療薬に関する。個々の患者（ドナーを含む）にとって特異的なタンパク質であり、したがってレシピエントにより異種であると認識される移植された細胞上の同種抗原に対する免疫応答により、移植拒絶反応が生じる。移植拒絶反応に含まれる最も一般的な同種抗原は、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）分子であり、移植された細胞表面で発現し、個体間で高度に多型性である。異種ＭＨＣ分子は、レシピエントの免疫系により認識され、移植の拒絶反応を招く免疫応答を生じる。
【０００７】
免疫系が移植組織に拒絶反応を示す１つの経路は、補体媒介性免疫であり、これは移植された細胞上のＭＨＣ抗原およびＭＨＣ抗原に対するレシピエントの自然抗体からなる、免疫複合体へのＣ１（第１の補体成分）の結合により活性化することができる。経路の活性化により、補体成分Ｃ３を分解してＣ３ａおよびＣ３ｂを生ずるＣ３転換酵素と呼ばれている酵素の集合体が得られる。そして、Ｃ３ｂ分子の一部がＣ３転換酵素に結合して、Ｃ５をＣ５ａとＣ５ｂに分解する。次いで補体系の生物活性が、Ｃ３とＣ５の分解産物から誘導される。別の補体系の亜成分であるＣ１ｑが、補体活性化の最初のステップに含まれる。現在まで補体媒介性免疫を調節することにより移植拒絶反応を治療する方法は、例えば異種分子から保護する免疫系の能力の重要な成分を排除する治療薬による、全ての補体媒介性免疫応答の抑制に起因する非選択性と関連した副作用を被っていた。
【０００８】
したがって本技術分野において、外来の病原体からの防御を保持しながら、移植された細胞に対する体の免疫応答を選択的に阻害することにより、および／またはより大きな免疫応答を刺激する特定の細胞型を選択的に破壊することにより、移植拒絶反応を減少させるかまたは予防する効果的で低コストの治療薬に対する必要性が存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
発明の開示
様々な態様において、細胞表面マーカー（例えばエピトープ、イディオタイプなど）、または悪性腫瘍細胞、病原体、移植された細胞、および／または治療の標的にされる他の物により、あるいはその極めて近傍で発現の異なる他の分子を標的にすることにより、広範な状態の治療に有効な、標的治療薬を開発するための方法が本明細書において提供される。また本明細書に記載する方法により生成される治療薬を投与することにより、疾患または状態を治療する方法も提供する。
【００１０】
いくつかの好ましい実施形態では、本明細書で提供される方法は、タンパク質をその対応するｍＲＮＡに連結し、タンパク質ｍＲＮＡ複合体を１つまたは複数の病因決定因子と関連した分子標的への結合についてスクリーニングする新規の技術を利用する。様々な好ましい実施形態では、本明細書で提供される治療法は、治療を望む個々の患者、または特定の株または疾患もしくは状態の亜型を有すると診断された患者のような患者の亜集団で、発現の異なる分子標的を認識するように設計されている。対象の標的に対して高親和性を有するタンパク質を好ましくは分離し、治療している疾患に対して有効な１つまたは複数の治療薬（例えば、細胞毒性薬剤）に連結して、種々の標的治療薬を生成する。都合の良いことに、対象の標的を認識できるタンパク質の迅速かつ効率的な同定、分離および生成が、患者および／または疾患に特異的な治療薬の生成のための効果的かつ低コストの方法を提供する。様々な実施形態で、本明細書において提供される方法は、従来の保健医療予算および資源分配状況の範囲内で、広範な疾患および状態を調整治療薬を用いて治療できる利点がある。
【００１１】
様々な態様において、癌および他の状態を治療するための調整治療薬を生成する方法が、本明細書で提供され、調整治療薬は治療のために選択される疾患または状態と関連した分子標的に結合する「標的領域」、および前記疾患または状態を治療するかまたは予防できる「治療薬」を含む。いくつかの好ましい実施形態では、標的領域が、特定の患者または患者の亜集団で発現の異なる標的を認識するように調整されるが、これらおよび／または他の実施形態では、本治療薬は個々の患者または患者の亜集団に対して実質的な調整を必要としない。標的領域を含む投与可能な治療薬の小部分だけの調整による、個別化した治療薬の作製のために、この「モジュラー」構造は有利であり、次いでこの治療薬を種々の既存のまたは容易に調製できる治療薬の有効性を増強するために用いることができる。
【００１２】
いくつかの好ましい実施形態では、治療を望む患者で、標的領域は選択的にエピトープと結合するように調整されるか、または非癌性細胞に比べ癌細胞で優先的に発現され、治療薬は抗体または患者で免疫応答を促進できる他の分子（以下「免疫エフェクター」と呼ぶ）である。いくつかの好ましい実施形態では、標的エピトープは非癌性細胞には実質上存在せず、治療薬は別の方法で非癌性細胞に実質上結合しない。いくつかの好ましい実施形態では、癌はイディオタイプでありうる患者特異的なエピトープを発現する癌性および／または悪性細胞であるリンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫）、白血病、または多発性骨髄腫のような血液癌である。
【００１３】
様々な実施形態で、治療薬は標的領域に直接的にまたは間接的に連結、融合、または誘導体化されて、モジュラー治療薬を形成する。いくつかの実施形態では、免疫エフェクターは、標的結合領域に共有結合しているが、他の実施形態では、免疫エフェクターは非共有結合している。いくつかの実施形態では、標的結合領域は、免疫エフェクターと結合する第２の領域に融合した標的結合領域を含む二官能性タンパク質の一部である。免疫エフェクター結合領域は、抗体の可変領域、またはＦｃ領域などの抗体の他の領域と結合する分子によって認識されるエピトープを含むことができる。免疫エフェクター結合領域は、免疫エフェクター（例えば図９を参照）と強固に結合するように設計されたペプチド配列も含むことができる。二官能性タンパク質は、融合タンパク質を含むことができるか、または２つのドメインは、共有結合または非共有結合することができる。標的結合領域および免疫エフェクター結合領域は、直接的に連結できるかまたは間接的に、例えば可動性のリンカーペプチドを介して連結できる。
【００１４】
他の態様では、本発明は、ｍＲＮＡ発現ライブラリーから、発現したｍＲＮＡ分子およびそれらの新生ポリペプチドの複合体を分離すること、タンパク質ｍＲＮＡ複合体を、癌細胞で示されるエピトープのような病因決定因子と関連した分子標的への結合についてスクリーニングすること、標的エピトープと結合するタンパク質をコードするｍＲＮＡを分離して発現させること、および標的エピトープ結合タンパク質（または誘導体、フラグメント、もしくはこれらのサブユニット）を、治療薬、例えば標的に対して免疫応答を誘発できる抗体に誘導体化することを含む癌治療の治療薬を調製するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本治療薬の調製は、以下にさらに詳細に説明するように、標的結合領域をコードする分離したｍＲＮＡに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化、選択的な突然変異誘発、および／または標的エピトープに対しより強いかまたはより効果的な結合を示すｍＲＮＡを同定して分離する当該技術分野で周知の他の方法を受けさせることをさらに含む。
【００１５】
さらに他の態様では、本発明は治療を要する患者で、治療標的にした状態の病因決定因子上で、あるいはその極めて近傍で特異的にもしくは優先的に発現する、標的エピトープまたは他の分子を同定すること、標的と結合するが、非標的には実質的に結合しないタンパク質を分離すること、標的結合タンパク質（または誘導体、誘導体のフラグメントもしくはサブユニット）を、治療薬、例えば所望の対象で免疫応答を誘発できる抗体に連結すること、ならびに患者に治療薬を、治療の標的にされた状態を治療するために十分な分量および回数で投与することを含む癌のような疾患または状態を治療するための方法を提供する。
【００１６】
なおさらなる態様では、本発明はｍＲＮＡ発現ライブラリーから、発現したｍＲＮＡ分子およびそれらの新生ポリペプチドの複合体を分離すること、癌細胞により示される標的エピトープに対する結合についてタンパク質ｍＲＮＡ複合体をスクリーニングすること、標的エピトープと結合するタンパク質をコードするｍＲＮＡを分離して発現させること、および標的エピトープ結合タンパク質（または誘導体、誘導体のフラグメントもしくはサブユニット）を、免疫応答を誘発できる抗体に誘導体化することを含む、癌細胞の標的エピトープまたは他の病因決定因子と結合するタンパク質を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は標的エピトープ結合タンパク質をコードする分離したｍＲＮＡに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化、選択的な突然変異誘発、または標的エピトープに対しより強いかもしくはより効果的な結合を示すｍＲＮＡを同定して分離する当該技術分野で周知の他の方法を受けさせることをさらに含む。
【００１７】
さらに別の態様では、本発明は、個別化した治療薬を開発するための、疾患および／または患者特異的な病因決定因子の発現により特徴付けられる疾患または状態の治療用のキットを提供する。いくつかの好ましい実施形態では、治療薬は癌性および／または悪性細胞表面で発現の異なる特有な細胞表面エピトープを標的にする固形腫瘍および血液癌を含む癌治療のための、患者特異的な治療薬を開発するキットが提供される。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、移植拒絶反応を減少させるか、または予防するための治療薬および方法を提供する。いくつかの実施形態では、標的結合タンパク質は、移植された細胞により表示されるＭＨＣ抗原のような細胞表面抗原に結合し、治療薬（例えば、免疫エフェクター）は、免疫応答についての１つまたは複数の分子決定因子に結合して阻害するタンパク質または他の分子を含む。いくつかの好ましい実施形態では、免疫エフェクターは、補体系のＣ１ｑまたはＣ３成分と結合し、それにより補体媒介免疫の活性化を阻害する。他の実施形態においては、免疫エフェクターは、免疫応答を刺激して「外来の」ＭＨＣまたは他の抗原を持つ移植された細胞を排除する。さらなる実施形態では、特異的なエピトープ、例えばＭＨＣ抗原を認識するエピトープを発現するリンパ球亜集団のクローン増殖を、治療薬は除去するかまたは妨げる。
【００１９】
本発明は、さらに悪性疾患治療に関して前記したものと本質的には同様の、移植拒絶反応を抑制する方法およびキットを提供する。
【００２０】
本発明のさらなる態様では、前記したものと本質的には同様の、標的結合領域が、病原性病原体により発現される１つまたは複数の変異するエピトープ、または病原性病原体が感染した１つまたは複数の細胞と結合するように選択され、かつ治療薬が、抗生物質または他の細胞毒性薬剤などの抗病原薬剤を含む治療薬、方法およびキットを提供する。いくつかの実施形態では、病原体は、ＨＩＶのようなウイルスである。
【００２１】
様々な態様において、本明細書で提供される方法は、迅速でかつ費用効率が高い個別化した治療薬の作製を可能にする。以下の詳細な記述は、態様の特定の用途に関連する本発明の様々な態様を説明する。しかし、この説明は悪性疾患の治療、病原体の減少と除去、移植拒絶反応の低減および／または予防、ならびに全体的に、非標的細胞または非標的分子と比べて、差次的な結合特性を示す治療薬標的を含むあらゆる状態の治療を含むがこれらに限定されない治療薬の開発および使用ならびに様々な状態の治療方法に等しく適用される。
【００２２】
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の発明の詳細な説明を添付の図面と共に読むとさらに充分に明らかとなる。
図面の簡単な説明
図１、標的エピトープ結合タンパク質および免疫エフェクター抗体を含む複合体は、細胞表面上に発現したＦａｂイディオタイプを介して悪性細胞と反応した。
【００２３】
図２は、小さなヒトタンパク質（Ｅｂｂｄ）に対する既知のヒト抗体（Ａｂ）を示す。このタンパク質は、抗体（Ａｂ）を治療薬に連結するエピトープとして機能できる。Ａｂの役割は、最終的に免疫応答を誘発する免疫エフェクターとして作用することである。
【００２４】
図３は、治療薬の二官能性タンパク質成分をコードするオリゴヌクレオチド配列の作製における、ライゲーションの目的のための免疫エフェクター結合タンパク質（Ｅｂｂｄ）をコードするｍＲＮＡの拡大生成を示す。
【００２５】
図４は、特定の癌細胞表面で発現したエピトープと選択的に結合するタンパク質改良用のＰｒｏｔｅｏＮｏｖａシステム。このシステムは、それぞれのタンパク質が、その同族のｍＲＮＡと連結したままであるタンパク質ライブラリーをもたらすｍＲＮＡライブラリーのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの翻訳を含む。選択は、癌エピトープと選択的に結合するが、正常細胞で発現するエピトープには結合しないタンパク質を同定するステップを含む。用いられる選択法は、用いられるエピトープ分離および表示方法に依存する。このシステムは、迅速な指向性進化法（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）、選択および標的特性を有するタンパク質（複数可）の大量な生成も含む。
【００２６】
図５は、悪性細胞上のイディオタイプまたは標的エピトープと結合するｍＲＮＡをタンパク質から分離する過程。図ではネガティブ選択を除外する。
【００２７】
図６は、オリゴヌクレオチド配列から翻訳される二官能性タンパク質が、標的エピトープ結合タンパク質およびヒト抗体が結合するヒトタンパク質（免疫エフェクター結合領域（Ｅｂｂｄ））をコードするｍＲＮＡのライゲーションにより作製されることを示す。
【００２８】
図７は、免疫エフェクターＡｂ（抗Ｅｂｂｄ抗体）およびＦａｂイディオタイプまたは標的エピトープに対するエピトープを有する、二官能性タンパク質を含む複合体形成により調製された、個別化した癌治療薬を示す。
【００２９】
図８は、イディオタイプもしくは標的エピトープとイディオタイプもしくは標的エピトープと結合するタンパク質との結合を介して、治療薬により標識された悪性細胞の図を示す。露出したヒト抗体は、治癒的免疫応答を誘発する。
【００３０】
図９は、標的エピトープに結合するように改良された第１のペプチド（標的エピトープ結合領域）、および安定なＣ３転換酵素（免疫エフェクター）と結合するように改良された第２のペプチド（免疫エフェクター結合領域）を含む治療薬を示す。標的エピトープへの治療薬の結合が、結合部位で補体媒介免疫応答を誘発する。
【００３１】
図１０は、標的エピトープに結合するように改良された第１のペプチド（標的エピトープ結合領域）、および補体系のＣ１成分と結合するように改良された第２のペプチド（免疫エフェクター）を含む治療薬を示す。標的エピトープへの治療薬の結合が、エフェクターへの内在のＣ１の結合を誘発し、結合部位で補体媒介免疫応答の開始を誘発する。
【００３２】
図１１は、修飾されたｔＲＮＡまたは類似体により連結されたとき、ｍＲＮＡおよびそのタンパク質生成物により形成される複合体の１つの例を、図式的に説明する。図のように、ｍＲＮＡのコドンは修飾されたｔＲＮＡのアンチコドン塩基対を形成し、ＵＶ照射によってソラレンモノ付加体、または非ソラレン架橋剤もしくはアリールアジドと共有結合的に架橋結合する。翻訳されたポリペプチドは、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼを介して修飾されたｔＲＮＡに連結される。いずれの連結も、ｍＲＮＡおよび新生タンパク質がリボソームによって適所に保持されている間に起こる。
【００３３】
図１２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの選択および進化過程の１例を示す模式図であり、開始核酸およびそのタンパク質生成物は連結されており（例えば図１参照）、タンパク質によって示される特定の特徴によって選択される。特定の特徴を示さないタンパク質は廃棄され、特徴を有するタンパク質は変異を有して増幅する、好ましくは変異を有するｍＲＮＡの増幅を介して増幅して新しい集団を形成する。様々な実施形態では、結合していないタンパク質が選択される。新しい集団は翻訳され、修飾されたｔＲＮＡまたは類似体を介して連結され、選択過程が繰り返される。タンパク質生成物を最適化するために、所望するだけの回数の選択および増幅／突然変異を行うことができる。
【００３４】
図１３は、本発明のｔＲＮＡ分子を構築する１方法を例示する図である。この実施形態では、ｔＲＮＡの５’末端と、アンチコドンループをコードし、ｍＲＮＡに安定して連結することができる分子（本例で用いるソラレンなど）を有する核酸と、末端ピューロマイシン分子で修飾されたｔＲＮＡの３’末端とをライゲーションして、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化の方法で用いる完全な修飾されたｔＲＮＡを形成する。他の実施形態にはピューロマイシンは含まれない。
【００３５】
図１４は、本発明の方法において、ｍＲＮＡをｔＲＮＡに連結することができるように架橋結合分子であるソラレンを配置することができる２つの代替実施形態について記載した図である。第１の実施形態には架橋剤（例えばソラレンモノ付加体）をｍＲＮＡに連結させることが含まれ、第２の実施形態には架橋剤をｔＲＮＡ分子のアンチコドンに連結させることが含まれる。架橋剤は、知られているもしくは部分的に知られているメッセージの読み枠のアンチコドンまたは３’末端コドンのどちらかとのモノ付加体とすることができる。これは翻訳とは別の手順、例えば翻訳が起こる前に行うことができる。
【００３６】
図１５は、ウリジンおよびプソイドウリジンの化学構造を示す図である。プソイドウリジンは、ウリジンと同じように水素結合を形成するが、ソラレンの標的である５−６二重結合を欠くｔＲＮＡ中に見つかる天然に生じる塩基である。
【００３７】
図１６は、本発明のいくつかの実施形態を示す図である。特定の実施形態におけるＳＡＴＡ、連結ｔＲＮＡ類似体およびナンセンスサプレッサー類似体を示す。
好ましい実施形態の詳細な説明
本明細書中で用いられる用語「Ｔリンパ球」および「Ｔ細胞」は、Ｔ細胞前駆体から成熟Ｔ細胞までの、Ｔリンパ球系列内のあらゆる細胞を包含する。
【００３８】
用語「Ｂリンパ球」および「Ｂ細胞」は、プレＢ細胞のようなＢ細胞前駆体から、成熟Ｂ細胞および形質細胞にまでのＢ細胞系列内のあらゆる細胞を包含する。
【００３９】
免疫グロブリン分子は、重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖から構成され、それらのアミノ末端で高度に特異的な可変領域を含む。Ｈ（ＶH）およびＬ（ＶL）鎖の可変（Ｖ）領域が組み合わさって、特有な抗原認識または免疫グロブリン（Ｉｇ）タンパク質の抗原結合部位を形成する。Ｉｇ分子の可変領域は、抗原またはイディオタイプとして認識されうる決定基（すなわち分子形態）を含む。
【００４０】
用語「エピトープ」は、免疫グロブリンＶ領域の抗原決定基またはエピトープ決定基（すなわちイディオトープ）のセット（すなわち相補性決定領域、ＶHおよびＶL領域の会合により形成される抗原結合部位を表す。）を表す。
【００４１】
用語「イディオトープ」は、免疫グロブリン分子のＶ領域の一部に沿って位置する単一のイディオタイプのエピトープを表す。
【００４２】
用語「免疫エフェクター」は、治療している対象で、免疫応答を促進できる分子、または分子の誘導体、フラグメント、もしくはサブユニットを表し、抗体、または抗体の誘導体、フラグメント、もしくはサブユニット、または非抗体分子を含むことができる。
【００４３】
「アジュバント」は、１つまたは複数の抗原（複数可）と共に投与した場合、免疫応答を増強するか、または刺激する化合物である。
【００４４】
「悪性細胞」は、未治療で放置した場合、癌を生じる細胞を表す。
【００４５】
本明細書中で定義する用語「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」とは、任意の型のアミノ酸（例えばペプチド結合を介して重合することができるＤもしくはＬアミノ酸、合成または修飾されたアミノ酸など）を含む２つ以上の単位の高分子を意味し、これらの用語は本明細書中で互換性があるように使用してもよい。
【００４６】
本明細書で提供するのは、特定の疾患もしくは状態を病む、特定の患者または患者の亜集団に合わせて調整した治療薬を生成する方法である。様々な実施形態で、治療薬は、１つまたは複数の患者マーカーおよび／または疾患特定マーカーと結合するように、小タンパク質領域の調整を可能にし、かつ治療標的にした状態に効果的である様々な既存のまたは容易に生成される治療薬を指示する調整された領域の使用を可能にする「モジュラー」構造で構成される。標的にされた疾患マーカーは、タンパク質、核酸、脂質、化学物質、ポリマー、および金属、ならびに生物構造、例えば細胞膜、細胞骨格要素、レセプター、およびさらに全細胞を含むがこれに限定されないあらゆるタイプの分子、またはこれら分子の部分もしくは誘導体、または分子の複合体を含むことができる。好都合にも、治療標的にした状態の病因決定因子上で、あるいはその極めて近傍でマーカーは発現し、治療薬の活性を病原性細胞、病原体、タンパク質、および／または治療状態の他の決定因子に集中する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、モジュラー治療薬は血液癌治療用に調整され、悪性Ｂ細胞および／またはＴ細胞の表面の特有なＦａｂイディオタイプに結合するように設計される。例えばいくつかの好ましい実施形態では、全ての癌性細胞が単一の悪性Ｂ細胞に由来する「クローン」Ｂ細胞疾患である非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の治療のために、治療薬が提供される。その結果、本明細書で提供されるモジュラー治療薬の標的結合部分により標的にされうるそれぞれの患者に特有である共通のイディオタイプ（表面で発現されたＩｇＭ分子の可変領域を含む）を、全てのＮＨＬ細胞が発現する。当該技術分野で周知の方法を用いて、Ｂ細胞はリンパ節または末梢血から分離できる。例えばいくつかの実施形態では、赤血球および／または顆粒球は、分離する細胞群間の中間密度を有する液体中で、遠心分離によりＢ細胞から分離できる。Ｔリンパ球を得る方法、例えば患者末梢血からの分離、および大きさおよび／または密度に基づく分離も、当該技術分野で周知の技術でもある。Ｂ細胞および／またはＴ細胞からのタンパク質の抽出は、当該技術分野で周知の多くの方法のいずれかにより実施できる。例えば、細胞は界面活性剤により、または機械的な方法により溶解できる。必要に応じて、酵素消化により、またはストレプトマイシンのような薬剤を使った沈殿により、核酸を細胞標品から除去できる。このような方法は当該技術分野で周知の技術である。
【００４８】
本明細書で記載される方法に従って作製した、血液癌を治療するためのモジュラー治療薬の作用機序を図１に示す。投与された治療薬は、悪性Ｂ細胞および／またはＴ細胞の表面の特有なＦａｂイディオタイプに結合し、イディオタイプが関連する血液癌の病因決定因子は、標的イディオタイプを発現する悪性および／または癌性細胞を含む。イディオタイプへの標的領域の結合は、悪性細胞を破壊する免疫応答を生じる。標的結合タンパク質は、単独で免疫応答を誘発するにはあまりに小さく、したがって標的イディオタイプへの結合がない場合は、結合した免疫エフェクターはＩＲを生じない。標的結合タンパク質が、悪性細胞の表面のＦａｂイディオタイプに結合するとき、悪性細胞は標的エピトープ結合タンパク質に免疫原性を与えるキャリアとして作用し、免疫エフェクターに悪性腫瘍細胞を標的にするＩＲを生じさせる。さらなる実施形態では、本発明の治療薬および方法は、非血液癌を特徴付けるエピトープを標的にするために用いることもできる。
【００４９】
様々な好ましい実施形態では、標的マーカーは、（ｉ）同様の診断を有する他の患者と比べて個々の患者において、または限定された患者の亜群で、および／または（ｉｉ）状態と関連せず、好ましくは治療薬の影響を受けない細胞／分子と比べて、細胞または状態の病因と関連した他の分子標的に関連して発現が異なる。有利なことに、例えば健全な細胞に対する無調整治療薬の非選択的活性、および／または標的マーカー（複数可）に関して、既存の標的治療薬の患者間での差異を説明できないため、既存の無調整治療薬と比べて、調整治療薬の選択性が治療の有効性を増強する。例えば血液癌の場合、標的イディオタイプは、患者および悪性細胞の両方に特有のもので、治療薬（免疫応答をもたらす）の活性を非癌性細胞は免れて、標的細胞に選択的に向けるようにする。さらに、イディオタイプがそれぞれの患者に特有なので、無調整治療薬は非選択的またはより選択的でない治療的応答をもたらすであろう。
【００５０】
悪性細胞により発現の異なる細胞表面マーカーの例には、リンパ管腫に関しては、ＣＤ−２０およびＣＤ−２２などの安定な細胞表面抗原エピトープ、ならびに固形腫瘍に関しては、ｍＡｂと結合した際に内部に取り入れられるＣＤ−１９およびＣＤ−３３などの表面エピトープが挙げられるが、それらに限定されない。他の発現の異なる細胞表面マーカーは当該技術分野で周知であり、ＣＤ−５２ｗおよびクラスＩＩＨＬＡ抗原を含むがこれらに限定されない。いくつかの好ましい実施形態では、標的エピトープは、治療対象患者で変異する（例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５：６１１〜６１５、１９９９を参照）癌細胞特異的なエピトープである。好都合にも、それぞれの患者に特有な変異エピトープを標的にする個別化した治療薬の開発を可能にすることにより、本明細書で提供される方法が、癌のさらに効果的な治療を可能にする。
【００５１】
いくつかの好ましい実施形態では（例えば、図２に示すように）、モジュラー治療薬の標的結合領域は、標的（例えば、標的エピトープ結合領域（Ｔｅｂｄ））と結合する第１のサブドメイン、および治療薬（例えば、免疫エフェクター結合領域（Ｅｂｂｄ））と結合する第２のサブドメインを含む。いくつかの実施形態では、治療薬は、治療の標的である対象における免疫応答を促進できる薬剤、例えば抗体、または抗体の誘導体、フラグメント、もしくサブユニットであり、治療薬と結合する領域は、治療薬により認識される小タンパク質、例えば、治療薬抗体により認識されるエピトープである。当該技術分野で周知である、はっきりと特徴付けられた抗体−抗原の組合せも利用でき、市販で入手可能である。本発明で有用な抗体は、任意の哺乳動物から得られるか、または異なる哺乳動物の組合せから得られるキメラ抗体でありうる。哺乳動物は、例えばウサギ、マウス、ラット、ヤギまたはヒトであってもよい。抗体は、ヒト抗体であるのが好ましい。ウエスタンブロット、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、および適切なＦａｂイディオタイプフラグメント、ペプチド、イディオタイプ−発現細胞またはこれらの細胞抽出物を用いるＦＡＣＳ分析を含む多数の周知の方法により、標的抗原に対する抗体の反応性を確立できる。本抗体は、任意の抗体クラスおよび／またはサブクラスに属すことができる。抗体は、異なるクラスおよびサブクラスの抗体からのフラグメントも含み、それにより複合体を形成してもよい。
【００５２】
様々な実施形態で、所望の結合活性を有するヒトモノクロナール抗体は、当該技術分野で周知の方法（総説に関しては、Ｖａｕｇｈａｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：５３５〜５３９を参照のこと）を用いて、例えば、ＰａｒｍｌｅｙとＳｍｉｔｈ、Ｇｅｎｅ  ７３：３０５〜３１８（１９８８）、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：７９７８〜７９８２（１９９１）、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ  １３：３２４５〜３２６０（１９９４）、ＧｒｉｆｆｉｔｈｓとＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの免疫系の構築：ファージディスプレイライブラリー由来ヒト抗体（Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ：  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）、ヒトにおける予防的および治療的適用のための抗体分子のタンパク質工学（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍａｎ）中、Ｃｌａｒｋ，Ｍ．編、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  Ａｃａｄｅｍｉｃ、ページ４５〜６４（１９９３）、およびＢｕｒｔｏｎとＢａｒｂａｓ、組合せライブラリー由来ヒト抗体（Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）、（前掲）、ページ６５〜８２に記載される、ファージディスプレイライブラリーのスクリーニングにより生成され、これら全ては、参照として本明細書に組み込まれている。典型的には、所望の大きさの結合親和性を生じる抗体に対応するクローンを同定し、標準的な組換え発現方法を用いるＤＮＡを用いて、所望の抗体を生成する。
【００５３】
ＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／２４８９３、およびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ、１９９８、Ｅｘｐ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｒｕｇｓ  ７（４）：６０７〜６１４に記載されているような、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作したトランスジェニックマウスを用いて、完全ヒトモノクロナール抗体も生成でき、参照として本明細書に組み込まれている。この方法は、ファージディスプレイ技術で要求されるｉｎ  ｖｉｔｒｏの操作を回避し、高親和性真正ヒト抗体を効率的に生成する。
【００５４】
いくつかの実施形態では、免疫エフェクター結合領域のような、対象の抗原に対する抗体が、モジュラー治療薬を用いる治療に選択された患者で生成される。例えば、いくつかの実施形態では、Ｚｅｂｅｄｅｅら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：３１７５〜３１７９（１９９２）、Ｂｕｒｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：１０１３４〜１０１３７（１９９１）、およびＢａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１０１６４〜２０１６８（１９９１）に記載されているように、患者は対象の抗原を用いる「ワクチン接種」を受け、抗原に対する患者の抗体が、対象の抗原への結合により選択される。
【００５５】
いくつかの実施形態では、スクリーニングを追加実施して、最初に分離した抗体の親和性を増加させる。例えばいくつかの実施形態では、抗体の親和性は、超可変抗体領域が変異して多数の組合せを生じ、対応する抗体変異体をファージディスプレイによりスクリーニングして、抗原に対し所望の親和性を有する抗体を選択する、親和力成熟により増強される。さらなる実施形態では、小さなタンパク質エピトープは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化を行い、以下にさらに詳細に説明するように、抗体に対するそのエピトープの結合親和性を増加できる。有利なことに、いくつかの実施形態では、例えば、患者に「予防接種をする」ことにより抗体が産生される実施形態では、同様な方法が宿主免疫系により（例えば、クローン選択を介して）行われて、対象の抗原に対して特異的な高親和性抗体を生成する。
【００５６】
他の実施態様において、治療を受けている対象で免疫応答を促進できる免疫エフェクターには、非抗体分子を含む。例えば、ＦａｒｒｉｅｓとＨａｒｒｉｓｏｎに付与された米国特許第６，２６８，４８５号に記載されている免疫エフェクターは、Ｃ３転換酵素を含むことができ、これは参照として本明細書に組み込まれている。Ｃ３転換酵素は、Ｃ３タンパク質をＣ３ａとＣ３ｂにタンパク質分解性転換を触媒する酵素であり、転換は補体系応答の誘発における重要なステップを含む。Ｃ３ｂは生成部位近傍の細胞表面に結合し、そこでＣ３ｂは食作用および他の破壊性免疫応答を媒介する。いくつかの実施形態では、Ｃ３転換酵素は修飾または誘導体化されて、阻害剤に対する感受性の低下、タンパク分解性裂開に対する耐性、補助因子に対する親和性の増強、または補体媒介免疫応答の促進における酵素の効果を増強する他の修飾を賦与する。いくつかの実施形態では、免疫エフェクターは、Ｃ５転換酵素、マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）または補体媒介免疫を刺激する別の分子を含む。
【００５７】
Ｃ３転換酵素を本発明の治療薬に連結することは、標的エピトープ結合タンパク質の、標的にされた細胞表面上の変異するエピトープへの結合により、治療の標的にされた細胞、病原体、病原体−感染細胞、および／または他の細胞に向けられている補体媒介免疫応答を可能にする。免疫エフェクターとしてＣ３転換酵素を用いる治療薬を図９に示す。好ましい実施形態では、Ｃ３転換酵素（免疫エフェクター結合タンパク質）、および標的エピトープ（標的エピトープ結合タンパク質）と結合するタンパク質をコードするペプチド配列を同定し、分離し、必要に応じてｉｎ  ｖｉｔｒｏでの進化または他の技術により改良して、それらの標的リガンドに対するペプチド配列の親和性を増加させた。次いで、標的エピトープ結合領域、および免疫エフェクター結合領域（Ｅｂｂｄ）として転換酵素結合ペプチドを含む二官能性融合タンパク質を作製する。治療薬が治療を要する患者に投与され、標的エピトープ結合領域が、悪性細胞の表面または他の標的に結合し、Ｃ３転換酵素が、対象細胞の破壊を媒介する細胞膜傷害複合体の生成を含む補体媒介免疫応答を生じる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、治療薬は、標的エピトープ結合領域およびＣ３転換酵素結合領域を含む。投与されると同時にこのような治療薬は標的エピトープと結合し、内在性のＣ３転換酵素を集めて補体媒介免疫応答を誘導する。免疫エフェクターが、補体系のＣ１成分と結合する治療薬を示すこのような方法を図１０に示す。治療を要する患者に投与されると同時に治療薬は標的エピトープと結合し、内在性のＣ１を細胞表面に集めて、そこで補体媒介免疫応答を誘導する。
【００５９】
他の実施形態においては、治療薬の免疫エフェクター成分は、Ｃ１ｑ、Ｃ３、Ｃ５、および／または補体媒介免疫応答の誘発に含まれる他の分子、例えば米国特許第５，６５０，３８９号で記載されるタンパク質に結合して阻害する。治療を必要とする患者に投与されると同時に、このような治療薬は、標的エピトープに結合し、さもなければ結合部位またはその近傍に向けられる免疫応答を阻害する。例えば、いくつかの好ましい実施形態では、患者は移植された細胞（例えば、幹細胞、または移植臓器を含む細胞）のレシピエントであり、標的治療薬は、移植された細胞を認識し、このような細胞に対する免疫応答を阻害することができる。さらなる実施形態では、移植拒絶反応を阻害するための標的治療薬は移植された細胞を認識する１つまたは複数の免疫細胞のエピトープ、例えば移植された細胞表面上のＭＨＣ抗原と結合するエピトープを標的にする標的結合領域を含み、治療薬は患者において抗移植免疫細胞に対し免疫応答を促進できる免疫エフェクターである。
【００６０】
有利なことに、本明細書で提供される方法は、迅速かつ安価で個別化した治療薬の日常的な作製が十分に可能である。本発明に従う治療薬は、生検材料の受け取りから治療薬の完成まで、わずか数週間で、かつ数千ドルの経費で作製できるのが好ましい。
【００６１】
本発明に用いる二官能性融合タンパク質は、当業者には周知の標準的な組換えＤＮＡ技術に従って生成できる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９））。いくつかの実施形態では、精製した二官能性タンパク質は、免疫エフェクターと反応でき、図７に示しているような、治療薬を含む結合したエフェクター−二官能性タンパク質複合体を産生する。当該技術分野で周知の方法により、二官能性タンパク質を、免疫エフェクターに化学的に結合させることもできる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチル脂肪イミダートＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシニミヂルスベリン酸塩）、アルデヒド（例えばグルタレルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ））、ビスアジド化合物（例えばｂｉｓ（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えば、ｂｉｓ−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチル−エンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン  ２，６−ジイソシアネート）、またはビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）が、治療薬を含む２種以上のタンパク質成分を連結するために使用される。
【００６３】
いくつかの実施形態では、標的−エピトープ結合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド配列、またはその誘導体、フラグメントもしくはサブユニットを、キメラコード配列を作製するために免疫エフェクターと結合するエピトープまたは他のタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド配列に連結すること、キメラコード配列を発現ベクターにサブクローニングすること、発現ベクターを用いて細胞をトランスフェクションすること、およびトランスフェクション細胞により発現される融合タンパク質を精製することにより、組換え型の融合タンパク質を作製する。いくつかの実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、原核生物および／または真核生物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系で適切な翻訳開始配列、および／または選択可能なマーカーを含むことができる。
【００６４】
いくつかの実施形態では、両方のタンパク質をコードするｍＲＮＡ、およびいくつかの実施形態では、主要組織適合複合体Ｉおよび／またはＩＩをコードするｍＲＮＡを含むｍＲＮＡオリゴのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの翻訳により、二官能性タンパク質複合体を作製する。ｍＲＮＡ配列に対するｃＤＮＡは、合成または市販品として入手でき、図３に示すようにＰＣＲにより転写して充分なｍＲＮＡを得ることができる。様々な実施形態で、免疫エフェクター結合領域をコードしているｍＲＮＡと、標的エピトープ結合領域をコードしているｍＲＮＡをライゲーションすることにより、オリゴを形成する。ある場合にはこの融合は、図６に示すように親水性アミノ酸をコードするｍＲＮＡブリッジを介して連結できる。次いで、ｍＲＮＡは原核生物または真核生物の翻訳系を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳でき、得られた二官能性タンパク質は、ゲル電気泳動または当該技術分野で周知の任意の他の方法により精製できる。
【００６５】
本融合タンパク質は、キメラタンパク質の有用性を高める、１つまたは複数の多数から成る他の成分を含むこともできる。例えば、タンパク質は融合タンパク質の精製を容易にするのに役立つエピトープタグを含むように設計できる。例えばペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端で、２またはそれ以上の隣接したヒスチジン残基をコードするようにキメラコード配列を修飾できる。ヒスチジン残基挿入は、スプライスバイオーバーラップ（ｓｐｌｉｃｅ−ｂｙ−ｏｖｅｒｌａｐ）延長方法により、ヒスチジンをコードするＣＡＴおよびＣＡＣ三塩基コドンをコード配列の適切な位置でＰＣＲプライマー中に取り込むことにより容易に達成できる。当該技術分野で周知のニッケル−セファロースクロマトグラフィー法により、ヒスチジン−修飾タンパク質は、効率的かつ定量的に分離できる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される治療薬は、治療薬（例えば細胞毒性薬剤）のような第２の分子に結合されてもよい。例えば、治療薬は抗腫瘍剤、トキシン、放射性薬剤、サイトカイン、第２抗体または酵素を含むが、これらに限定されない。細胞毒性薬剤の例には、リシン、リシンＡ鎖、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシンＤ、ジフテリアトキシン、シュードモナスエキソトキシン（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アルブリン（ａｒｂｒｉｎ）Ａ鎖、モデッシンＡ鎖、アルファ−サルシン、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン、カリケアマイシン、サパオナリアオフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、マイタンシノイドス（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）、ならびにグルココルチコイドおよび他の化学療法剤、ならびに放射性同位元素、例えば212Ｂｉ、131Ｉ、90Ｙ、および186Ｒｅを含むが、これらに限定されない。適切な検出可能なマーカーには、これらに限定されるものではないが、放射性同位元素、蛍光性化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素が含まれる。本発明の治療薬は、プロドラッグをその活性型に変換できる抗癌プロドラッグ活性化酵素にも結合できる。例えば米国特許第４，９７５，２８７号を参照のこと。
【００６７】
いくつかの好ましい実施形態では、第２の治療薬は、第１の治療薬と相補的作用様式を有する。例えばいくつかの実施形態では、第１および第２の治療薬は、癌または他の疾患の病因に含まれるシグナル伝達系の異なる態様に対して作用し、第１および／または第２の治療薬のみを持つ調整治療薬と比べて、有効性の増強、副作用の減少、改善された治療指数、および／または他の利点を生じる。いくつかの実施形態では、第１の治療薬は、第２の治療薬を増強するかあるいはこの逆で増強するか、または１つまたは複数の治療の態様で、第１および第２治療薬は相乗的な増強を示す。相乗作用、増強作用、および他の組み合わせた薬理学的効果を評価する方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、ＣｈｏｕとＴａｌａｌａｙ、Ａｄｖ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇｕｌ、２２：２７〜５５（１９８４）に記載され、参照として本明細書に組み込まれる。
【００６８】
いくつかの実施形態では、治療薬は、治療薬の抗体免疫エフェクター成分に結合される。抗体に治療薬を結合するか、または接続する技術は周知である（例えば、Ａｒｎｏｎら、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら編、ページ２４３〜５６（Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．  １９８５）、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”、ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編、ページ６２３〜５３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．  １９８７）、Ｔｈｏｒｐｅ、“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”、ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら編、ページ４７５〜５０６（１９８５）、およびＴｈｏｒｐｅら、“Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．，６２：１１９〜５８（１９８２）を参照のこと）。
【００６９】
本発明の治療薬は、タンパク質薬剤に適切な当該技術分野で周知の任意の方法、例えば静脈内注射、筋肉内注射、局所投与、経口摂取、経直腸投与および吸入により投与できる。あるいは本発明の治療薬は、悪性疾患部位に直接供給できる。治療薬は、薬剤学的に許容し得る担体との混合物として投与してもよい。任意のそのような担体が、適合性の問題が生じない限り本方法に従って使用できる。本組換え型融合タンパク質の有効量を、患者に投与しなければならない。用語「有効量」とは、望ましい応答をもたらすために必要な融合タンパク質の量を意味する。
【００７０】
いくつかの好ましい実施形態では、本明細書で提供する方法に従って作製した治療薬は、増殖を阻害し、かつ／またはエピトープ結合タンパク質がスクリーニングされて、エピトープを持つ細胞のアポトーシスを誘導する。例えば、いくつかの実施形態では、本治療薬複合体のエピトープ結合部分が、悪性細胞表面で発現するエピトープまたは他の標的と結合できる。一旦結合すると、複合体のＩＲを誘発する抗体成分が免疫系を刺激して、図８に示すように正常な細胞を残しつつ標識された細胞を攻撃し排除する。
【００７１】
様々な実施形態で、タンパク質をその対応するｍＲＮＡに連結（「同族対」として）する新規の方法を使用して、患者および／または疾患特異的な標的に結合する本明細書で提供される個別化した治療薬の調整が可能になる。いくつかの好ましい実施形態では、多数の同族対を含むタンパク質ライブラリーを作製し、対象の標的、例えば本明細書に記載した個別化された標的に結合する同族対に関して、ライブラリーをスクリーニングする。
【００７２】
本発明の様々な態様では、修飾したｔＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡ分子を用いて、翻訳されたタンパク質生成物をｔＲＮＡリンカーを介してそれらの対応するｍＲＮＡに連結して「同族対」を形成する。いくつかの実施形態で、未知の配列を有するｍＲＮＡ、例えばｍＲＮＡライブラリーからのｍＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系で発現し、それらの対応するタンパク質を、１つまたは複数の所望の特性、例えば標的エピトープ結合領域への結合、または対象の別のリガンド、および／または１つまたは複数の新たなリガンド、例えば健全な細胞により表示されるエピトープに対する選択性に関してスクリーニングする。さらなる実施形態では、１回または複数回の選択で同定されたタンパク質およびタンパク質と連結した核酸を、例えば核酸進化（図４）を通じて修飾して、標的リガンドに対して増強された親和性をもつタンパク質を生成する。次いで、標的リガンドに対する高親和性のような所望の特性を有するタンパク質を、標準的なクローン技術を使用して、タンパク質−ｍＲＮＡ同族対から、それらの対応するｍＲＮＡを分離することにより多量に生成できる。
【００７３】
いくつかの好ましい実施形態では、同族対は、真核生物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系、例えばウサギ網状赤血球溶解物（ＲＬＬ）、コムギ胚芽、大腸菌、または酵母菌溶菌液系を用いて形成される。しかしｉｎ  ｓｉｔｕ系、ならびに異なる系の成分を組み合わせるハイブリッド系を含む任意のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系を用いることは、当業者により理解される。例えばいくつかの実施形態では、１つまたは複数の原核生物の因子、例えば翻訳サプレッサータンパク質が真核生物の翻訳系で使用される（全て参照として本明細書に組み込まれている、例えばＧｅｌｌｅｒとＲｉｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ  ２８３：４１（１９８０）、Ｅｄｗａｒｄｓら、ＰＮＡＳ  ８８：１１５３（１９９１）、ＨｏｕとＳｃｈｉｍｍｅｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２８：６８００（１９８９）を参照のこと）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のｔＲＮＡまたはｔＲＮＡ類似体を原核生物系中で荷担し、その後、確立された方法に従って、真核生物系で使用するために精製する（参照として本明細書に組み込まれているＬｕｃａｓ−ＬｅｎａｒｄとＨａｅｎｎｉ、ＰＮＡＳ  ６３：９３（１９６９）。
【００７４】
様々な実施形態で、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼの作用により、同族対を含むタンパク質を、ｔＲＮＡまたはｔＲＮＡ類似体に連結する。いくつかの実施形態では、タンパク質を安定なアミノアシルｔＲＮＡ類似体に連結させる（ＳＡＴＡ）。いくつかの実施形態では、ＳＡＴＡは天然の構造で対応する高エネルギーのエステル結合と比べて、安定な結合を介してｔＲＮＡの３’末端に結合したアミノ酸またはアミノ酸類似体を有するｔＲＮＡである。ＳＡＴＡが特定のコドンを、例えば水素結合を介して認識し、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼの作用により新生ペプチド鎖を受容する場合、安定なアミノアシル結合が、ペプチジルトランスフェラーゼによるポリペプチドからのｔＲＮＡの脱離を防ぎ、その後のステップの間ｔＲＮＡ−ポリペプチド構造も保つ。
【００７５】
いくつかの実施形態では、ＳＡＴＡは、参照として本明細書に組み込まれている、ＦｒａｓｅｒとＲｉｃｈ、ＰＮＡＳ、７０：２６７１（１９７３）において一般に説明された方法により作製され、ｔＲＮＡまたはｔＲＮＡ類似体を３’−アミノ−３’−デオキシｔＲＮＡへと変換することを含む。これは、天然のアデノシンを取り除いた後に、ｔＲＮＡヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて、天然ｔＲＮＡの末端に３’−アミノ−３’−デオキシアデノシン付加することにより達成され、次いでそれぞれのアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）によって、修飾されたｔＲＮＡにアミノ酸を荷担する。いくつかの実施形態では、ａａＲＳは、ｔＲＮＡの２’ヒドロキシルではなく３’ヒドロキシルに荷担して、通常の不安定な高エネルギーのエステル結合ではなく、安定なアミド結合によってｔＲＮＡにアミノ酸を連結する。したがってＳＡＴＡがリボソームのペプチジルトランスフェラーゼからペプチド受容した際、ペプチドは安定して保持されて別のアクセプターに供与することができなくなる。
【００７６】
特定の実施形態では、３’アミド結合を介してアミノアシル化されたｔＲＮＡは、Ａ部位への結合を補助する伸長因子ＥＦ−ＴＵと結合しない（例えば、参照として本明細書に組み込まれているＳｐｒｉｎｚｌとＣｒａｍｅｒ、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、２２：１（１９７９））。しかし、このような修飾されたｔＲＮＡはＡ部位に結合する。この３’修飾されたｔＲＮＡの結合は、Ｍｇ++濃度を変えることにより増加させることができる（参照として本明細書に組み込まれているＣｈｉｎａｌｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３：３００１（１９７４））。ＳＡＴＡおよびＭｇ2+の適切な濃度ならびに／またはモル比は経験的に決定することができる。例えば、ＳＡＴＡの濃度またはＡ部位結合力が高すぎる場合は、ＳＡＴＡは非同族コドンに関して、天然ｔＲＮＡと競合する可能性があり、翻訳を停止する可能性がある。あるいは、ＳＡＴＡの濃度またはＡ部位結合力が低すぎる場合は、ＳＡＴＡは放出因子と有効に競合しない可能性があり、ＳＡＴＡが新生ペプチドを安定に受容することを妨げる可能性がある。
【００７７】
伸長因子がコドン−アンチコドンの認識のプルーフリーディングを補助すると考えられているが、プルーフリーディングのこの供与源を欠くことが、本明細書で提供される方法を妨害することは予想されない。特定の作用機序に束縛されることなく、伸長因子および関連するＧＴＰ加水分解が存在しない場合における誤り率は、ヌクレオチド１つ離れたコドンの認識についてほぼ１００回に１回であると考えられる（参照として本明細書に組み込まれているＶｏｅｔとＶｏｅｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、ページ１０００〜１００２（１９９５）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）。いくつかの好ましい実施形態では、ＵＡＡが連結コドンとして用いられる。ＵＡＡは、アミノ酸１個が異なる７つの非ストップコドンを有し、非ストップコドンの７／６１または約１１．５％を含む。したがって、所定のコドンのミスコードの確率は、コドン１個あたり（０．０１）（０．１１５）＝１．１５×１０-3個のミスコード、または８７０コドンごとに約１個のミスコードで、本明細書に記載されている様々な方法のパフォーマンスを実質的には損なわない頻度であると推定できる。いくつかの新たな実施形態では、伸長因子媒介プルーフリーディングを欠くことによる実質的な障害なしに、ＵＡＧを連結コドンとして用いることができる。
【００７８】
いくつかの実施形態では、ＳＡＴＡは、アクセプター基部（ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｓｔｅｍ）または分子の別の領域に、１つまたは複数の修飾された塩基を有するｔＲＮＡまたはｔＲＮＡ類似体である。アクセプター基部修飾を有するｔＲＮＡを生成する様々な方法が当該技術分野で周知であり、例えば、参照として本明細書に組み込まれているＳｐｒｉｎｚｌとＣｒａｍｅｒ、Ｐｒｏｇ．  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、２２：１（１９７９）に記載されている。いくつかの実施形態では、ｔＲＮＡは、ｔＲＮＡがアミノアシル−Ｔｙｒ  ｔＲＮＡを模倣するように、ピューロマイシンで修飾され、新生ポリペプチドに取り込まれて翻訳を停止する。いくつかの実施形態では、アクセプター基部が修飾されたｔＲＮＡは、「転写ｔＲＮＡ」から形成され、転写後プロセシングではなく、ｔＲＮＡ自体の配列が非定型かつ修飾された塩基をもたらす。転写ｔＲＮＡはｔＲＮＡとして機能することができる（例えば、どちらも参照として本明細書に組み込まれているＤａｂｒｏｗｓｋｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  １４：４８７２、１９９５、およびＨａｒｒｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３２：７６１７、１９９３を参照のこと）。転写ｔＲＮＡは、転写のような当該技術分野で周知の方法により生成することができ、または市販されているＲＮＡ配列（例えば、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｂｏｕｌｄｅｒ、Ｃｏｌｏ．から）を図Ｘに記載のように１片ずつ連結して一緒にするか、もしくは確立された方法をいくつか併用することにより生成することができる。例えば図Ｘを参照して、５’リン酸と３’ピューロマイシンは、オリゴリボヌクレオチドと結合したものが市販されていて、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（例えば、参照として本明細書に組み込まれているＭｏｏｒｅとＳｈａｒｐ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：９９２、（１９９２）、またはＴ４  ＲＮＡリガーゼ（参照として本明細書に組み込まれているＲｏｍａｎｉｕｋとＵｈｌｅｎｂｅｃｋ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １００：５２（１９８３））を用いて結合することができる。
【００７９】
修飾されたｔＲＮＡを生成する他の方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｃｈｉｎａｌｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３：３００１（１９７４）およびＫｒａｙｅｖｓｋｙとＫｕｋｈａｎｏｖａ、Ｐｒｏｇ．  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  ２３：１（１９７９）に記載され、どちらも参照として本明細書に組み込まれている。
【００８０】
いくつかの実施形態では、ｔＲＮＡは、新生タンパク質がペプチジルトランスフェラーゼによりｔＲＮＡに結合する時に翻訳が停止するように、好ましくはコドン−アンチコドンの水素結合により、ストップコドンまたは疑似ストップコドンを認識する修飾されたｔＲＮＡもしくは修飾されていないｔＲＮＡ、またはｔＲＮＡ類似体を含むナンセンスサプレッサーｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ナンセンスサプレッサーｔＲＮＡはＹａｒｕｓの延長アンチコドン則に従う３’修飾および／または配列を有する（参照として本明細書に組み込まれているＹａｒｕｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１８：６４６〜６５２、１９８２）。本明細書で定義されるように「疑似ストップコドン」とは、天然にはナンセンスコドンではないが、メッセージがさらに翻訳されることを防ぐコドンを意味する。疑似ストップコドンは、本明細書に記載されるような、「安定なアミノアシルｔＲＮＡ類似体」もしくはＳＡＴＡにより認識されるコドン、または存在しないｔＲＮＡが要求されたとき、すなわち疑似ストップコドンで翻訳が停止するように、相補的アンチコドンを有するｔＲＮＡが実質的に枯渇するかあるいは存在しないコドンを含むことができる。当業者は、本明細書で定義されるように、疑似ストップコドンの作製方法が多数存在することを理解するであろう。
【００８１】
いくつかの好ましい実施形態では、ｔＲＮＡは、天然ペプチド結合を介して新生ポリペプチドに連結された天然ｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＳＡＴＡは、アンチコドンループおよび／または分子の他の領域に１つまたは複数の修飾を有するが、３’末端で修飾されていないｔＲＮＡである。様々な実施形態で、３’末端で修飾されていない天然ｔＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡの使用は、本明細書に記載されている様々な選択法の改善に結びつき、より速い、誤りの少ない、効率的な、費用効率のより高い、および／または高い収率の方法が得られる。特定の理論に束縛されるものではないが、特定の条件下においては、ピューロマイシン（および類似のリンカー）は、伸長因子（複数可）とｔＲＮＡとの相互作用を干渉することで低収率をもたらしうると考えられる。
【００８２】
本発明の１つの実施形態において、架橋剤は、２つの分子を化学的または力学的に一緒に連結する作用物質である。１つの実施形態では、架橋剤は活性化されることにより、ｔＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡと１つまたは複数の共有結合を形成することができる作用物質である。１つの実施形態では、架橋剤は硫黄で置換したヌクレオチドである。別の実施形態においては、架橋剤はハロゲンで置換したヌクレオチドである。架橋剤の例には、これらに限定されるものではないが、２−チオシトシン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−ヨードシトシン、５−ヨードウリジン、５−ブロモウリジンおよび２−クロロアデノシン、アリールアジド、ならびにそれらの修飾体または類似体が含まれる。１つの実施形態では、架橋剤はソラレンまたはソラレン類似体である。
【００８３】
いくつかの好ましい実施形態では、例えば、ソラレンで連結されたオリゴヌクレオチド（図３）を連結することにより、または天然もしくは修飾されたｔＲＮＡもしくはｔＲＮＡ類似体、好ましくアンチコドンもしくはポリペプチドとの連結とは異なる別の部位へのモノ付加（ｍｏｎｏａｄｄｕｃｔｉｏｎ）により（図４）、ソラレンをｔＲＮＡまたはｔＲＮＡ類似体（例えば、３’修飾されたＳＡＴＡ）とのモノ付加体とする。所望の波長のＵＶ光で照射を受けたとき、以下にさらに詳細に説明するように、共有結合のソラレン架橋結合が、ＳＡＴＡとｍＲＮＡの間に形成される。いくつかの実施形態では、ｔＲＮＡのアンチコドンまたは他の部分を、ｍＲＮＡと架橋結合を形成することができる非ソラレン部分、例えば２−チオシトシン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−ヨードシトシン、５−ヨードウリジン、５−ブロモウリジン、２−クロロアデノシン、アリールアジド、およびそれらの修飾体または類似体で誘導体化する。これらおよび他の架橋剤は、当分野で周知であり、例えばＡｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）、および他の周知の科学材料の製造者から購入可能である。
【００８４】
様々な実施形態で、ＳＡＴＡ−ポリペプチド複合体またはｔＲＮＡ−ポリペプチド複合体が、ｍＲＮＡ上および／またはｔＲＮＡ上に位置することができるリンカー部分を介して、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに連結される。いくつかの好ましい実施形態では、ｍＲＮＡは、好ましくは転写物の３’末端のストップコドンまたはその近隣で架橋剤を含み、ｍＲＮＡ−ｔＲＮＡ連結は、ｍＲＮＡに基づく架橋剤により完全に媒介される。さらなる実施形態では、ｔＲＮＡは、その３’末端で修飾されていない（例えば、ナンセンスサプレッサーｔＲＮＡ）。いくつかの好ましい実施形態では、ｍＲＮＡは、翻訳可能な読み枠の最後に位置する疑似ストップコドンを含む。疑似ストップコドンがｍＲＮＡの３’末端に位置する、翻訳系が疑似ストップコドンの３’側のコドン対応するｔＲＮＡを枯渇する、および／または疑似ストップコドンに対応する３’修飾されたｔＲＮＡが使用され、転写物を翻訳不可能にして放出因子の活性化ができないようにする読み枠の最後に、疑似ストップコドンを効果的に配置することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはｔＲＮＡストップアンチコドンに対応するストップコドンを含む。有利なことに、ストップコドン／アンチコドンの対は、完全長の転写物を選択する。当業者は、ストップコドンを有さないｍＲＮＡを用いてもよく、任意のコドンまたは核酸トリプレットを用いてもよいことを理解するであろう。
【００８５】
いくつかの方法では、ＳＡＴＡは、コドンとアンチコドンとの間でソラレン架橋結合によって翻訳されたメッセージに結合している。ソラレン架橋結合は、相補的５’ピリミジン−プリン３’配列、特にＵＡまたはＴＡ配列を含む配列間で優先的に生じる（参照として本明細書に組み込まれているＣｉｍｉｎｏら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５４：１１５１（１９８５））。ＳＡＴＡをコードするコドン、または連結コドンは、連結コドンにいくつかのコドンが用いられてもよいために、ＰＹＲ−ＰＵＲ−ＸまたはＸ−ＰＹＲ−ＰＵＲであることができる。便利なことに、ストップコドンまたはナンセンスコドンがこの立体配置を有する。アミノ酸をコードするコドンを用いることは遺伝暗号の微調整を必要とすることがあり、これは一部の用途を複雑にする可能性がある。したがって好ましい実施形態では、ストップコドンを連結コドンとして用い、ＳＡＴＡは連結コドンを認識するという意味でナンセンスサプレッサーとして機能する。しかし当業者は、系に適切な調整を加えることによって任意のコドンを用いることができることを理解するであろう。
【００８６】
いくつかの好ましい実施形態では、ＳＡＴＡまたはペプチジルｔＲＮＡは、例えばコドンとアンチコドン間でソラレン架橋結合によって、または２−チオシトシン、２−チオウリジン、４チオウリジン、５−ヨードシトシン、５−ヨードウリジン、５−ブロモウリジン、２−クロロアデノシン、およびアリールアジドから成る群から形成された架橋結合によって、翻訳されたｍＲＮＡに架橋結合する。いくつかの実施形態では、ソラレン架橋結合は、相補的５’ピリミジン−プリン３’配列、特にＵＡまたはＴＡ配列を含む配列間で優先的に生じる（参照として本明細書に組み込まれているＣｉｍｉｎｏら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５４：１１５１（１９８５））。いくつかの実施形態では、非ソラレン架橋剤またはアリールアジドが用いられ、特定の実施形態では、その要件においてストリンジェンシーがより低く、そのため可能なコドン−アンチコドン対が増加するので特に有利である。
【００８７】
様々な実施形態で、ペプチジルトランスフェラーゼにより、新生タンパク質がＳＡＴＡに結合された際に、および／または読み枠の最後に到達した際に翻訳が停止する。多数のリボソームがこの位置にあるとき、ＳＡＴＡおよびｍＲＮＡはＵＶ光の処理によって架橋結合される。好ましい方法では、ＵＶ光を、好ましく３２０ｎｍ〜４００ｎｍの範囲で照射した後に、ソラレン架橋結合を形成することにより、架橋結合がなされる。ソラレンはフラン側鎖およびピロン側鎖を含み、これらは二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの相補的塩基対の間に容易にインターカレートする（参照として本明細書に組み込まれているＣｉｍｉｎｏら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５４：１１５１（１９８５））。いくつかの好ましい実施形態では、ソラレン架橋結合は、以下により詳細に記述するピロン側鎖またはフラン側鎖のモノ付加体であるモノ付加体を形成する。さらに照射すると、フラン側鎖のモノ付加体を相補的塩基対に共有結合的に架橋結合することができるが、ピロン側鎖のモノ付加体はさらに架橋結合することができない。フラン側鎖のソラレンモノ付加体（ＭＡｆ）の形成は、確立された方法に従って達成される。さらに他の実施態様においては、ソラレンは、メッセージの読み枠の最後に結合することもできる。
【００８８】
精製したオリゴヌクレオチドのＭＡｆの大量生成方法は文献に記載されており（例えば、参照として本明細書に組み込まれているＳｐｅｉｌｍａｎｎら、ＰＮＡＳ  ８９：４５１４、１９９２）、また、より少ない資源しか必要としないが架橋結合不可能なピロン側鎖のソラレンモノ付加体の混入を一部含む方法も記載されている（例えば、いずれも参照として本明細書に組み込まれている米国特許第４，５９９，３０３号、Ｇａｍｐｅｒら、Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １９７：３４９（１９８７）、Ｇａｍｐｅｒら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．  ４０：２９（１９８４））。本発明のいくつかの実施形態では、どちらかの方法を用いてソラレンの標識化を行う。好ましい実施形態では、どちらも参照として本明細書に組み込まれている米国特許第５，４６２，７３３号およびＧａｓｐａｒｒｏら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．、５７：１００７（１９９３）に記載の方法に従って、可視光、好ましくは約４００ｎｍ〜４２０ｎｍの範囲の可視光を用いてフラン側鎖のモノ付加体を作製する。本発明の１態様では、ｍＲＮＡの３’末端に配置するための、フラン側鎖モノ付加体を有するＳＡＴＡ、またはモノ付加体化したオリゴヌクレオチド、および付加していないＳＡＴＡをキットの主成分として提供する。
【００８９】
１つの実施形態では、参照として本明細書に組み込まれているＢａｃｈｅｌｌｅｒｉｅら、（Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、９：２２０７（１９８１））の方法に従って、モノ付加体および架橋結合の形成および逆転を行う。好ましい実施形態では、どちらも参照として本明細書に組み込まれているＫｏｂｅｒｔｚとＥｓｓｉｇｍａｎｎ、Ｊ．Ａ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９７、１１９、５９６０〜５９６１およびＫｏｂｅｒｔｚとＥｓｓｉｇｍａｎｎ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９７、６２、２６３０〜２６３２の方法を用いることにより、高収率の最終生成物をもたらすモノ付加体の効率的な生成が達成される。
【００９０】
ｍＲＮＡをそのタンパク質に連結する他の方法、またファージディスプレイ方法が使用できる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、適切な濃度のＳＡＴＡおよびＭｇ++が、ｍＲＮＡ分子の存在下で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系で用いられ、リボソームが上記のようにＳＡＴＡにペプチド鎖を受容させるストップコドンまたは疑似ストップコドンに達した際に翻訳が停止される。短時間の後、かなりの割合のおよび／または多くのストップコドンまたは疑似ストップコドンが、リボソーム内のＳＡＴＡによって占有され、いくつかの実施形態では、その後、系にＵＶ光を照射して、ｔＲＮＡ−ポリペプチドとそれらの対応するｍＲＮＡ間に架橋結合を生成する。いくつかの実施形態で、ｍＲＮＡに架橋結合の後、好ましくは透析、希釈、またはキレート化によるＭｇ++の除去によって、リボソームを放出または変性させる。当業者は、それだけに限定されないが、イオン強度、ｐＨ、または溶媒系を変えることによる変性を含めた他の方法も、結合したリボソームおよび／または他の翻訳因子から同族対を放出するために使用できることを理解するであろう。
【００９２】
様々な実施形態で、１つまたは複数の所望の特性に基づき同族対が選択される。いくつかの実施形態では、同族対の選択は、これらに限定されるものではないが、アレイ、アフィニティーカラム、免疫沈降などを含む、様々な確立された方法のうちの任意のものにより測定されるように、標的細胞、タンパク質、および／または他の生体分子の結合に基づく。いくつかの好ましい実施形態では、ハイスループットスクリーニング手法を用いて、選択基準が測定される。様々な実施形態において、治療薬の所望の特性に従って、選択は陽性または陰性であることができる。いくつかの好ましい実施形態では、配列が未知のｍＲＮＡ（例えば、患者、組織、または所望の他の供与源からのｍＲＮＡライブラリーの形態で）を発現させ、本明細書に記載する方法を用いてそれらのコードされたポリペプチドに連結し、同族対を所望の特性に関し選択するためにスクリーニングする。例えば、いくつかの好ましい実施形態では、同族対を、所望のリガンド、例えば悪性細胞により表示されるＦａｂイディオタイプ、または標的細胞の他の表面的特徴への結合に関して分析する。所望の結合特性を示すタンパク質に対するｍＲＮＡが分離でき、当該技術分野で周知の標準的な分子クローン技術を用いて大量のタンパク質が生成できる。本明細書でさらに詳細に記載されるように、次に所望のタンパク質をモジュラー治療薬に組み込み、例えば作用物質を患者および／または疾患特異的標的に向けることができる。
【００９３】
様々な実施形態で、選択された同族対は、リガンドによく結合する同族対またはよく結合しない同族対であってもよい。例えば、タンパク質が熱力学的に有利な反応を加速するためには、例えばその反応の酵素として作用するためには、基質および遷移状態の類似体のどちらにも結合するべきである。しかし、遷移状態の類似体は基質よりもはるかに密に結合しているべきである。
これは、以下の式によって説明される。
【００９４】
【数１】
2008526973.tif 000003
【００９５】
［式中、酵素を用いた場合反応の速度（Ｋ酵素）の、酵素を用いない場合の速度（Ｋ酵素）に対する比は、酵素と遷移状態との結合（Ｋ遷移状態）の、基質の酵素との結合（Ｋ基質）に対する比に等しい（ＶｏｅｔとＶｏｅｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、ページ３８０、（１９９５）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ）。
【００９６】
いくつかの好ましい実施形態では、基質との結合に関して競合が不十分であるが遷移状態の類似体との結合に関して良好に競合するタンパク質を選択する。操作上では、これはマトリックスに基質または基質類似体が結合した状態でマトリックスから容易に溶出され、マトリックスに遷移状態の類似体が結合した状態のマトリックスから除去が最も困難であるタンパク質を選ぶことによって達成してもよい。この選択を連続して繰り返し、同族対の核酸の複製および翻訳によりタンパク質を再生産することにより、改良された酵素が進化するはずである。本発明のいくつかの実施形態では、同一選択過程において、１つの部分に対する親和性、および別の部分に対する親和性の欠如を用いる。いくつかのさらなる実施形態では、ｍＲＮＡ部分の１つまたは複数の特性に従って同族対が選択できる。
【００９７】
正常細胞および悪性細胞により発現されるエピトープを同定する、当該技術分野で周知の多くの方法がある。例えば、いくつかの実施形態では、例えばＡｉｎａらによる“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ６６：１８４〜１９９（２００２）の記載のように、組合せライブラリーからの細胞特異的なマーカーペプチドの分離に、ペプチドマイクロアレイが使用できる。いくつかの好ましい実施形態では、タンパク質ｍＲＮＡ複合体ライブラリーを悪性細胞の分離した集団と反応させ、正常細胞の集団に対して観察される結合と比較して、悪性腫瘍細胞エピトープに結合する程度を測定する。いくつかの実施形態では、悪性細胞に対してかなりの親和性を有し、正常細胞に対しては、かなり低いかまたは親和性を有さないタンパク質が選択される。例えば、いくつかの実施形態では、約１０μＭ未満、好ましくは約１μＭ未満、より好ましくは約０．１μＭ未満、そしてさらにより好ましくは約１０ｎＭ未満の親和性で、エピトープまたは所望の他の標的と結合するポリペプチドが同定される。いくつかの好ましい実施形態では、ポリペプチドは、エピトープまたは約１ｎＭ未満の他の標的に対する親和性を有する。スクリーニング法は、潜在的なリガンド（例えば、その同族ｍＲＮＡに連結されたタンパク質）およびいろいろな配向の標的（例えば、治療対象の細胞）を用いて実施することができる。例えば、いくつかの実施形態では、悪性細胞はガラススライドのような平坦な表面上にあり、ｍＲＮＡ−タンパク質同族対を含む溶液に曝露される。結合したタンパク質（同族対）は、当該技術分野で周知のいろいろな方法で検出できる。例えば、いくつかの実施形態では、好ましくはｍＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡリンカー上で、その後第２のリポータープローブを用いて、例えばアビジンでコーティングした磁気ビーズ用いて検出できるビオチン部分のような検出可能なプローブを用いて、同族対は誘導体化される。得られたイディオタイプ−（タンパク質：ｍＲＮＡ）−ビオチン−アビジン−磁気ビーズ複合体は、Ｖｅｎｔａｎａ  ３２０自動免疫組織化学システム（Ｖｅｎｔａｎａ  ３２０  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）、または例えばＤａｖｉｓら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５：６１１〜６１５、（１９９９）に記載されているような類似のシステムを用いて同定できる。
【００９８】
この方法は、複数の相異なる核酸−ポリペプチド複合体を提供すること、所望の結合特徴を有するリガンドを提供すること、複合体をリガンドと接触させること、結合していない複合体を取り除くこと、およびリガンドに結合した複合体を回収することをさらに含むことができる。
【００９９】
本発明のいくつかの方法は、核酸分子および／またはタンパク質の進化を含む。いくつかの実施形態では、例えば参照として本明細書に組み込まれているＣａｄｗｅｌｌら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．、２：２８（１９９２）に記載のように、試験管内組換え、例えば米国特許第５，６０５，７９３号に記載のように、突然変異誘発、例えば米国特許第５，８３０，７２１号に記載のように、「ＤＮＡシャッフリング」、例えばＣｏｃｏら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１９（４）：３５４〜９（２００１）に記載のように、および／または当該技術分野で周知の方法に記載のように、このような方法は回収された複合体の核酸成分（ＲＮＡまたは対応するｃＤＮＡとして）を増幅すること、および例えばエラープローンＰＣＲにより、変異を核酸の配列に導入することを含む。いくつかの好ましい実施形態では、タンパク質中のそれぞれの位置において少なくとも１つのアミノ酸置換が導入される。さらなる実施形態では、この方法は、増幅して変化した核酸からポリペプチドを翻訳すること、ｔＲＮＡを用いてそれらを一緒に連結すること、および、結合した複合体の別の新しい集団を選択するためにそれらをリガンドと接触させることをさらに含む。本発明のいくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化の過程で、特に選択されたｍＲＮＡが変異を持って複製され、翻訳され、選択のために再度同族タンパク質に結合される反復過程において、選択されたタンパク質ｍＲＮＡ複合体を用いる。
【０１００】
複製の閾値
効率的な進化のための複製の公称最小回数は、以下の式を用いて推定してもよい。
選択的改善が突然変異ｒ離れており、突然変異率ｐである長さｎ配列がある場合、複製において選択的改善が生じる確率は以下のように決定してもよい：
ｒ＝１では、適当な点での突然変異の確率（ｐ）×その突然変異が、開始点とは異なる３個のヌクレオチドの目的ものに変異する確率（１／３）×他のｎ−１部位が、変異しないままである確率（１−ｐ）(n-r)、または
【０１０１】
【数２】
2008526973.tif 000004
【０１０２】
式中、Ｐは、突然変異ｒ離れて所定の変化を達成する確率である。より一般的には、全てのｒ値において：
【０１０３】
【数３】
2008526973.tif 000005
【０１０４】
突然変異１つ離れた場所で利点を見つける確率と、突然変異３つ離れた場合の確率とを比較することは有用である。これはトリプレットの遺伝暗号を考慮すると、任意の１種のコドンは１つの突然変異において９種の他のコドンにしか変化できないからである。実際に、１つの突然変異で９種の他のアミノ酸コードに実際に変化できるコドンは存在しないことが判る。１つの突然変異でアクセスすることができるアミノ酸の最大数は７種のアミノ酸であり、これを行うことができるのは６４個のコドンのうち８個のみである。ほとんどのコドンでは、１つの突然変異で１９種の他のアミノ酸のうち５または６種となる。開始アミノ酸とは異なる１９種のアミノ酸全てに達するためには、一般に３つの突然変異が必要である。間に入る２つの変異は一般に選択的に有利とならないので、これら３つの突然変異は逐次的であることはできない。したがって、２０種のアミノ酸全てを用いるためには、大きさが少なくとも３つの突然変異（ｒ＝３）であるステップを用いる必要がある。
【０１０５】
「エラープローンＰＣＲ」に関して報告されている突然変異率である０．００６７では、１００個のアミノ酸の短いタンパク質を与える３００個のヌクレオチドのメッセージを用いると：
Ｐ3＝１．５１×１０-9
したがって、有利である次のアミノ酸に合理的に到達することを予測するためには、その突然変異率において：
【０１０６】
【数４】
2008526973.tif 000006
【０１０７】
回の複製の閾値が必要であると予測される。二項展開により、１／３回を超える試験（実際には約１／ｅ）でも選択的利点を有する所定の配列が含まれないことが示されるので、これは用いるべき複製ではない。
【０１０８】
所定のμについて大きなｎおよび小さなｐに対するポアソン近似を計算することができ、したがってｎが例えば１０9の桁数であり、ｐが１０-9の桁数の場合の一般項を算出することができる。近似の一般項は以下のとおりである：
【０１０９】
【数５】
2008526973.tif 000007
【０１１０】
約６／Ｐを超える増幅係数により、全てのアミノ酸の使用を伴って進化が進行することが保証される。これは、新規タンパク質の生成が既存のタンパク質の「シャッフリング」の使用を妨げる場合に有用である。
精製に対する制限
ＢおよびＣがＡに対して競合する可逆的結合において：
【０１１１】
【数６】
2008526973.tif 000008
【０１１２】
全濃度は以下のように表すことができる：
［Ｂ］T＝［Ｂ］＋［ＡＢ］（３）
［Ｃ］T＝［Ｃ］＋［ＡＣ］（４）
（３）を（４）で割り算し：
【０１１３】
【数７】
2008526973.tif 000009
【０１１４】
（１）および（２）を［Ｂ］および［Ｃ］に代入し：
【０１１５】
【数８】
2008526973.tif 000010
【０１１６】
方程式を再度整理し、以下の結果が得られる：
【０１１７】
【数９】
2008526973.tif 000011
【０１１８】
分子および分母の［Ａ］を約分し：
【０１１９】
【数１０】
2008526973.tif 000012
【０１２０】
最後に方程式を再度整理し、以下の方程式が得られる：
【０１２１】
【数１１】
2008526973.tif 000013
【０１２２】
上記係数は「濃縮係数」と呼ばれる。結合した成分の比、またはＣに対するＢの濃縮を計算するために、全成分の比にこの係数を掛け算する。最大濃縮係数は、［Ａ］がｋcまたはｋBよりも有意に小さい場合にｋc／ｋBである。［Ａ］がｋcまたはｋBよりも有意に大きな場合は、濃縮は１であり、すなわち、他方に対して一方の濃縮は存在しない。
【０１２３】
濃縮は結合定数の比によって制限される。その競合相手よりも１００倍強力に結合している乏しいタンパク質を濃縮するためには、３回の濃縮でその競合相手に対するこのタンパク質の比が百万上昇する。その競合相手よりも２倍強力にしか結合していないタンパク質を濃縮するためには、１０回の濃縮サイクルでも約１０００の濃縮しか得られない。
【０１２４】
まったく同様の方法によって、結合が最小のタンパク質を選択する濃縮係数を示すことができる：
以下の方程式において：
【０１２５】
【数１２】
2008526973.tif 000014
【０１２６】
ここでの濃縮は、［Ａ］＞ｋAまたはｋBで最大である。
【０１２７】
【数１３】
2008526973.tif 000015
【０１２８】
以下の実施例は本発明の様々な実施形態を例示し、いかなる様式でも本発明を限定することを意図しない。
【０１２９】
実施例１：ＳＡＴＡの生成
当業者は、いくつかの異なる方法でＳＡＴＡを生成することができることを理解するであろう。以下の実施例中に記載したプロトコルは、ｔＲＮＡ上にピューロマイシンおよび架橋剤の両方を有するＳＡＴＡ、またはｔＲＮＡ上にピューロマイシンを有しｍＲＮＡ上に架橋剤を有するＳＡＴＡに用いることができる。架橋剤がｍＲＮＡ上にあるものは、以下の実施例４に指針が提供されている。好ましい実施形態において、連結ｔＲＮＡ類似体もｔＲＮＡ上に架橋剤を有するという意味で、以下のプロトコルは連結ｔＲＮＡ類似体についても有用である。
【０１３０】
例えば、好ましい実施形態では、３つのフラグメント（図１）を商業的な供与源（例えばＤｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）から購入した。修飾された塩基、ならびにその３’末端上に事前付着されたピューロマイシンおよびその３’末端上にＰＯ４を有するフラグメント３が含まれ、これらの全てが市販されていた。３つのフラグメントは、モノ付加体の形成においてフラグメント２の操作を容易にするために用いた。
【０１３１】
酵母ｔＲＮＡ  Ａｌａまたは酵母ｔＲＮＡ  Ｐｈｅを用いた。しかし、配列は広く知られているｔＲＮＡから、またはｔＲＮＡ様の構造を形成する配列を選択することによって選択することができる。フラグメント２に対応する部分中に限定数のＵしか有さない配列を用いるのが好ましい。ソラレンは優先的に５’ＵＡ３’配列に結合するので、わずかなＵしか有さない配列を用いることは必須ではない（参照として本明細書に組み込まれているＴｈｏｍｐｓｏｎＪ．Ｆ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２１：１３６３）。しかし、そのような配列を用いれば、精製して除去する二重に付加した生成物を減らすことになるであろう。
【０１３２】
フラグメント２は、ソラレンのインタカレートを誘導するためにヘリカルコンホメーションで用いるのが好ましかった。したがって、相補鎖が必要であった。ＤＮＡまたはＲＮＡを用い、１つの配列、例えば一方または両方の末端にポリＣを添加して、モノ付加体形成の完了後の分離と除去を容易にした。
【０１３３】
フラグメント２およびｃＲＮＡを、緩衝５０ｍＭＮａＣｌ溶液中で結合した。Ｔｍは、ハイパークロミシティー変化により測定した。２つの分子を再アニールして、選択されたソラレンと共に、Ｔｍよりも約１０℃低い温度で１時間インキュベートした。ソラレンは用いた配列に基づいて選択した。より高い配列ストリンジェンシーを有するが補充する必要があるかもしれない、８ＭＯＰなどの比較的不溶性のソラレンを選択することが可能であった。ＡＭＴのような可溶性の高いソラレンは、ストリンジェンシーが低いが、ほとんどの部位を埋める。ＨＭＴを用いるのが好ましい。非標的のＵをより多く含むフラグメント２を選択した場合は、さらに高いストリンジェンシーが要求される。温度の低下、またはＭｇ++を加えることによるイオン強度の上昇も、ストリンジェンシーを高めるために用いた。好ましい実施形態では、ＭＧ++を省略し、約４００ｍＭのＮａＣｌ溶液を用いた。
【０１３４】
インキュベーション後、ソラレンを約４００ｎｍよりも高い波長で照射した。照射は選択した波長および用いたソラレンに依存する。例えば、ＨＭＴには約４１９ｎｍ、２０〜１５０Ｊ／ｃｍ２を用いるのが好ましかった。この処理は、ほぼ全部がフラン側鎖のモノ付加体をもたらす。
モノ付加体の精製
次いで、参照として本明細書に組み込まれているＳａｓｔｒｙら、Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．Ｂ  Ｂｉｏｌ．、１４：６５〜７９に記載のＨＰＬＣによってモノ付加体を精製した。一般に２５量体以上のモノ付加体の精製は困難なので、フラグメント２がフラグメント３から分離されたことで、精製ステップが容易になった（参照として本明細書に組み込まれているＳｐｉｅｌｍａｎｎら、ＰＮＡＳ、８９：４５１４〜４５１８）。
フラグメント２および３のライゲーション
Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを用いて、フラグメント２を  フラグメント３にライゲーションした。３’末端のピューロマイシンは保護基として役割を果たした。これは参照として本明細書に組み込まれているＲｏｍａｎｉｕｋとＵｈｌｅｎｂｅｃｋ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１００：５２〜５９（１９８３）により実施する。フラグメント２＋３とフラグメント１の３’末端との結合は、参照として本明細書に組み込まれているＵｈｌｅｎｂｅｃｋ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２４：２７０５〜２７１２（１９８５）に記載の方法に従って実施した。フラグメント２＋３をポリヌクレオチドキナーゼによって５’リン酸化し、２つの半分子をアニールした。
【０１３５】
代替方法では、フラン側鎖のモノ付加体としたＵの相当量を、ポリＵＡをそれ自体にハイブリダイズさせて、上記のように照射することにより形成した。次いでポリＵＡを酵素消化して保護されているフラン側鎖のＵを得て、ヌクレオシドホスホラミダイト法によりｔＲＮＡ類似体内に組み込んだ。ソラレンモノ付加体を形成する他の方法には、全て参照として本明細書に組み込まれているＧａｍｐｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９７：３４９（１９８７）、Ｇａｍｐｅｒら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．、４０：２９、１９８４、Ｓａｓｔｒｙら、Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．Ｂ  Ｂｉｏｌ．、１４：６５〜７９、Ｓｐｉｅｌｍａｎｎら、ＰＮＡＳ、８９：４５１４〜４５１８、米国特許第４，５９９，３０３号に記載の方法が含まれる。
【０１３６】
上記の方法によって生成したＳＡＴＡはＵＡＧ（アンチコドンＣＵＡ）を読み取った。
さらに、ＵＡＡまたはＵＧＡも用いた。様々な実施形態では、「連結コドン」として選択されたストップコドンを有する任意のメッセージを用いた。
実施例２：ソラレン化したフラン側鎖のモノ付加体の生成
ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＵＶ光露光
いずれも５０ｍＭのＮａＣｌを含む、等容積の３ｎｇ／ｍｌのＲＮＡ：ｃＲＮＡハイブリッドセグメントおよび１０μｇ／ｍｌのＨＭＴを、新しい１．５ｍｌのキャップ付ポリプロピレンマイクロ遠心チューブに移し、３７℃で３０分間、暗所でインキュベートした。次いで、これを新しい清浄な培養皿に移した。これを、照射量が約６．５ｍＷ／ｃｍ2であるように約１２．５ｃｍの距離で光化学反応器（４１９ｎｍのピーク、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  Ｃｏ．）内に配置し、６０〜１２０分間照射した。
【０１３７】
低分子量の原産物（Ｐｒｏｔｏｐｒｏｄｕｃｔ）の除去
１００μｌのクロロホルム−イソアミルアルコール（２４：１）をピペットで注ぎ、ボルテックスによって混合した。混合物をマイクロ遠心チューブ中で、５分間、１５０００×ｇで遠心分離した。クロロホルム−イソアミルアルコール層をマイクロピペットで除去した。クロロホルム−イソアミルアルコールによる抽出を再度繰り返した。透明なＲＮＡが溶液から沈殿した。
【０１３８】
アルコール沈殿
２倍量（約１０００μｌ）の氷冷無水エタノールを混合物に加えた。チューブを１５分間、１５，０００×ｇで、マイクロ遠心機で遠心分離した。上清をデカンテーションして廃棄し、沈殿したＲＮＡを１００μｌのＤＥＰＣ処理水に再溶解し、その後、再度ＲＮＡ＋８−ＭＯＰに曝した。
【０１３９】
ＨＰＬＣを用いたソラレン化したＲＮＡフラグメントの分離
全ての成分、ガラス器具および試薬は、ＲＮＡａｓｅフリーのように調製した。ＨＰＬＣはＤｉｏｎｅｘ  ＤＮＡＰＡ−１００パッケージカラムを用いてセットアップした。ソラレン化したＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを４℃まで暖めた。ソラレン化したＲＮＡをＨＰＬＣにかけ、次いで「ＨＰＬＣによるオリゴヌクレオチド解析」という表題の以下のセクションに記載のように、オリゴヌクレオチド解析を行った。採取された分画は以下を表した：
・５’ＣＵＡＧＡΨＣＵＧＧＡＧＧ３’、ここで、Ψはプソイドウリジンである（配列番号１）
・フラン側鎖の５’ＣＵＰソラレンＡＧＡΨＣＵＧＧＡＧＧ３’モノ付加体（配列番号：２）
【０１４０】
【化１】
2008526973.tif 000016
【０１４１】
分画を新しい、ＲＮＡａｓｅフリーのスナップ付マイクロ遠心チューブ中に４℃で保存し、４週間を超える保存が必要な場合は−２０℃で保存した。
【０１４２】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いた、ＨＰＬＣによって採取された各ピーク分画に示されたＲＮＡフラグメントの同定
電気泳動ユニットを４℃の冷蔵庫内にセットアップした。２ｍｍのスペーサーを有するゲルを選択した。各ＨＰＬＣ分画の５μｌをローディング緩衝液で１０μｌまで希釈した。１０μｌの各希釈した分画を適切に標識した試料ウェルに入れた。追跡用色素を別のレーンに載せ、「ソラレン化したＲＮＡフラグメントのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）」という表題の以下のセクションに記載のように電気泳動を行った。電気泳動の実行が完了したあと、追跡用色素がゲルの端に達した時に電気泳動を停止した。装置を解体した。ゲル−ガラスパネルユニットをＵＶ光ボックス上に置いた。ＵＶ光を点けた。ＲＮＡのバンドを同定した。バンドはＵＶ光の条件下でより濃い影として現れた。
【０１４３】
ゲルからのＲＮＡの抽出
各バンドを滅菌して、ＲＮＡａｓｅフリーの新しいメスの刃を用いて切り出し、新しい１．５ｍｌのスナップキャップ付マイクロ遠心チューブに移した。メスの刃の側面を用いて、各ゲルをマイクロ遠心チューブの壁でつぶした。各試料に新しい刃を用いた。１．０ｍｌの０．３Ｍ酢酸ナトリウムを各チューブに加え、少なくとも２４時間、４℃で溶出させた。マイクロピペットを用いて溶出液を新しい０．５ｍｌのスナップキャップ付ポリプロピレンマイクロ遠心チューブに移した。各チューブに新しいＲＮＡａｓｅフリーのピペットチップを用い、ＲＮＡをエタノールで沈殿させた。
【０１４４】
エタノール沈殿
２倍容量の氷冷エタノールを各溶出液に加え、マイクロ遠心機で、１５，０００×ｇで１５分間遠心分離した。上清を排出し、沈殿したＲＮＡを再度１００μｌのＤＥＰＣ処理脱イオン水に溶かした。ＲＮＡは必要時まで４℃でマイクロ遠心チューブに保存した。保存が２週間を超える場合、チューブを−２０℃で保存した。以下が、各フラグメントの移動速度の順（速いものから遅いものの順）であった：
【０１４５】
【化２】
2008526973.tif 000017
【０１４６】
・フラン側鎖の５’ＣＵＰソラレンＡＧＡΨＣＵＧＧＡＧＧ３’モノ付加体（配列番号：２）
【０１４７】
【化３】
2008526973.tif 000018
【０１４８】
各分画の残りを含むチューブを標識し、−２０℃で保存した。
エタノール沈殿
ＲＮＡオリゴヌクレオチドフラグメントを沈殿させ、ＲＮａｓｅの痕跡を全て取り除くために、全てのガラス器具を「装置上、消耗品上、および溶液中のＲＮａｓｅｓの不活化」という表題の以下のセクションに記載のように洗浄した。全ての溶液はＲＮＡａｓｅフリーのガラス器具中で保存し、ヌクレアーゼの導入を防いだ。無水エタノールは使用時まで０℃で保存した。マイクロピペットを用いて、２倍容量の氷冷エタノールをマイクロ遠心チューブ内で沈殿させる核酸に加えた。キャップ付マイクロ遠心チューブをマイクロ遠心器内に入れ、１５，０００×ｇで１５分間遠心分離した。上清を捨て、沈殿したＲＮＡを再度ＤＥＰＣ処理脱イオン水に溶かした。ＲＮＡは使用の準備ができるまで、マイクロ遠心チューブ中に４℃で保存した。
ＲＮＡフラグメント２および３のライゲーション
ＲＮａｓｅの痕跡を全て取り除くために、全てのガラス器具を「装置上、消耗品上、および溶液中のＲＮａｓｅの不活化」という表題の以下のセクションに記載のように洗浄した。１００〜１０００μｌのピペットを用いて以下を新しい１．５ｍｌのポリプロピレンスナップキャップ付マイクロ遠心チューブに加え、各溶液に新しい滅菌したピペットチップを用いた：
フラグメント２（３．０ｎＭ）            １２５．０μｌ
フラグメント３（３．０ｎＭ）            １２５．０μ１
反応緩衝液                              ２５０．０μ１
ＲＮＡ  Ｔ４リガーゼ（９〜１２Ｕ／ｍｌ）      ４２μｌ
反応緩衝液
ＲＮａｓｅを含まない脱イオン水          ９０．００ｍｌ
トリス−ＨＣｌ（５０ｍＭ）                  ０．７９ｇ
ＭｇＣｌ2（１０ｍＭ）                      ０．２０ｇ
ＤＴＴ（５ｍＭ）                          ０．０７８ｇ
ＡＴＰ（１ｍＭ）                            ０．５５ｇ
ＨＣｌを用いてｐＨは７．８
ＲＮａｓｅを含まない脱イオン水で１００．００ｍｌに調整
混合物を穏やかに混合し、混合物を温度制御した冷蔵庫内で、１６℃で１時間インキュベートしてＲＮＡを溶解した。インキュベーション完了後直ちに、ＲＮＡを溶液から沈殿させた。
【０１４９】
アルコール沈殿
２倍容量（約１０００μｌ）の氷冷無水エタノールを反応混合物に加えた。マイクロ遠心チューブを１５，０００×ｇで１５分間マイクロ遠心機内に置いた。上清をデカントして捨て、沈殿したＲＮＡを１００μｌのＤＥＰＣ処理水に再溶解した。混合物を「ソラレン化したＲＮＡフラグメントのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）」という表題の以下のセクションに記載のように電気泳動した。以下が、各フラグメントの移動速度の順（速いものから遅いものの順）であった：
ａ）  フラグメント２
【０１５０】
【化４】
2008526973.tif 000019
【０１５１】
ｂ）  フラグメント３
【０１５２】
【化５】
2008526973.tif 000020
【０１５３】
ｃ）  フラグメント２＋３
【０１５４】
【化６】
2008526973.tif 000021
【０１５５】
各分画をＵＶシャドーイングにより分離し、バンドを切り出し、ＲＮＡをゲルから溶出させ、ＲＮＡ溶出液を「ソラレン化したＲＮＡフラグメントのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）」という表題の以下のセクションに記載のように沈殿させた。残留のライゲーションしていないフラグメント２および３の分画全てを用いてライゲーション手順を繰り返した。ライゲーションした画分２および３をプールし、少量のＲＮａｓｅを含まない脱イオン水に４℃で保存した。
ＲＮＡフラグメント１とフラグメント２＋３とのライゲーション
ＲＮａｓｅの痕跡を全て取り除くために、全てのガラス器具を「装置上、消耗品上、および溶液中のＲＮａｓｅの不活化」という表題の以下のセクションに記載のように洗浄した。以下を新しい１．５ｍｌのポリプロピレンスナップキャップ付マイクロ遠心チューブに加えた。各溶液に１００〜１０００μｌのピペットおよび新しいチップを用いた：
フラグメント２＋３（３．０ｎＭ）                １２５．０μｌ
反応緩衝液                                      ２５０．０μｌ
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（５〜１０Ｕ／ｍｌ）    １．７μｌ
反応緩衝液
ＲＮａｓｅを含まない脱イオン水                  ９０．００ｍｌ
トリス−ＨＣｌ（４０ｍＭ）                          ０．６３ｇ
ＭｇＣｌ2（１０ｍＭ）                              ０．２０ｇ
ＤＴＴ（５ｍＭ）                                    ０．０８ｇ
ＡＴＰ（１ｍＭ）                                  ０．００６ｇ
ＨＣｌを用いてｐＨは７．８
ＲＮａｓｅ含まない脱イオン水で１００．００ｍｌに調整
ＲＮＡを穏やかに混合し、その後、加熱ブロック内で、混合物を７０℃まで５分間加熱し、融解した。混合物を２時間かけて室温まで冷却し、ＲＮＡをｔＲＮＡの立体配置でアニールさせた。ＲＮＡを溶液から沈殿させた。
【０１５６】
アルコール沈殿
２倍容量（約１０００μｌ）の氷冷無水エタノールを反応混合物に加えた。マイクロ遠心チューブを１５，０００×ｇで１５分間マイクロ遠心機内に置いた。上清をデカントして捨て、沈殿したＲＮＡを１００μｌのＤＥＰＣ処理水に再溶解した。混合物を「ソラレン化したＲＮＡフラグメントのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）」という表題の以下のセクションに記載のように電気泳動した。以下が、各フラグメントの移動速度の順（速いものから遅いものの順）であった：
ａ）  フラグメント１
【０１５７】
【化７】
2008526973.tif 000022
【０１５８】
ｂ）フラグメント２＋３
【０１５９】
【化８】
2008526973.tif 000023
【０１６０】
ｂ）フラグメント１＋２＋３
【０１６１】
【化９】
2008526973.tif 000024
【０１６２】
各画分をＵＶシャドーイングにより分離し、バンドを切り出し、ＲＮＡをゲルから溶出させ、ＲＮＡ溶出液を「ソラレン化したＲＮＡフラグメントのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）」という表題の以下のセクションに記載のように沈殿させた。ライゲーションしていないフラグメント１および２＋３分画を用いて、ライゲーション手順を繰り返した。ライゲーションした分画２＋３をプールし、少量のＲＮａｓｅを含まない脱イオン水中に４℃で保存した。
【０１６３】
最終ＲＮＡライゲーション
以下を新しい１．５ｍｌのポリプロピレンスナップキャップ付マイクロ遠心チューブに加えた。各溶液に１００〜１０００μｌのピペットおよび新しいチップを用いた：
フラグメント１＋２＋３（３．０ｎＭ）      ２５０μｌ
反応緩衝液                                ２５０μｌ
ＲＮＡ  Ｔ４リガーゼ（４４μｇ／ｍｌ）      ２２μｇ
混合物を温度制御した冷蔵庫内で、１７℃で４．７時間インキュベートした。インキュベーションの直後、上記ステップ６．２に記載のようにｔＲＮＡを沈殿させ、「ソラレン化したＲＮＡフラグメントのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）」という表題の以下のセクションに記載したように電気泳動によりｔＲＮＡを分離した。ｔＲＮＡを少量のＲＮａｓｅを含まない水にプールし、２週間までは４℃で、または２週間を超える長い期間は−２０℃で保存した。
ソラレン化したＲＮＡフラグメントのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）
アクリルアミドゲルの調製
全ての試薬およびガラス器具は、「装置上、消耗品上、および溶液中のＲＮａｓｅの不活化」という表題の以下のセクションに記載のようにＲＮＡａｓｅフリーのようにした。ゲル装置を組み立てて厚さが４ｍｍで２０ｃｍ×４２ｃｍの四角いゲルを作製した。ＲＮＡａｓｅフリーの厚肉エルレンマイヤーフラスコ内で、適量のアクリルアミド溶液を用いて、２９部のアクリルアミドと１部のアンモニウム架橋剤を室温で混合した。
【０１６４】
アクリルアミド溶液
尿素（７Ｍ）        ４２０．４２ｇ
ＴＢＥ（１×）      １Ｌに調整
（５×ＴＢＥ）
０．４５５Ｍ  トリスＨＣｌ                ５３．９ｇ
１０ｍＭ  ＥＤＴＡ                        ０．５Ｍを２０ｍｌ
ＲＮＡａｓｅフリーの脱イオン水            ９００ｍｌ
ホウ酸を用いて                            ｐＨ９
ＲＮＡａｓｅフリーの脱イオン水を用いて    １Ｌに調整
混合物を１分間真空圧で脱気した。適量のＴＥＭＥＤを加え、穏やかに混合し、その後、ゲル混合物をガラスプレートの間に上部から０．５ｃｍ以内まで注いだ。すぐにガラスシートの間のゲル混合物内に櫛を挿入した。ＲＮＡａｓｅフリーのゲル用櫛を用いた。櫛で５ｍｍ幅の色素レーンおよび１３５ｍｍの試料レーン用のウェルを作製した。ゲルを約３０〜４０分間重合させ、その後、注意しながら櫛を取り外した。新しいピペットチップを備えたマイクロピペットを用いて試料ウェルを泳動緩衝液ですすいだ。その後、ウェルに泳動緩衝液を満たした。
【０１６５】
試料の調製
試料のアリコートをスナップキャップ付マイクロ遠心チューブ中のローディング緩衝液に懸濁させ、ボルテックスした。指示色素は試料に加えなかった。
【０１６６】
ローディング緩衝液
尿素（７Ｍ）                            ４２０．４２ｇ
トリスＨＣｌ（５０ｍＭ）                ７．８５ｇ
ＲＮＡａｓｅフリーの蒸留水を用いて      １Ｌに調整
電気泳動の実行
最大量のＲＮＡ／ローディング緩衝液溶液を１３５ｍｍの試料ウェルにセットし、適量の追跡用色素を５ｍｍの追跡用レーンに載せた。試料を５℃の冷蔵庫で電気泳動した。追跡用色素がゲルの端に達したら電気泳動を停止した。装置を解体した。ガラスパネルはゲルから取り外さなかった。ゲル−ガラスパネルユニットをＵＶ光ボックス上に置いた。ＵＶフィルタリングゴーグルを装着してＵＶ光を点けた。ＲＮＡのバンドを同定した。バンドはＵＶ光条件下でより濃い影として現れた。ＲＮＡをゲルから抽出した。各バンドを滅菌したＲＮＡａｓｅフリーの新しいメスの刃を用いて切り出し、各バンドを新しい１．５ｍｌのスナップキャップ付マイクロ遠心チューブに移した。メスの刃の側面を用いて、各ゲルをマイクロ遠心チューブの壁でつぶした。各試料に新しい刃を用いた。１．０ｍｌの０．３Ｍ酢酸ナトリウムを各チューブに加え、少なくとも２４時間、４℃で溶出した。各チューブにＲＮＡａｓｅフリーの新しいピペットチップを備えたマイクロピペットを用いて、溶出液を新しい０．５ｍｌのスナップキャップ付ポリプロピレンマイクロ遠心チューブに移した。２倍容量の氷冷エタノールを各溶出液に加え、次いでマイクロ遠心機で、１５，０００×ｇで１５分間遠心分離した。上清を捨て、沈殿したＲＮＡを１００μｌのＤＥＰＣ処理脱イオン水に再溶解した。ＲＮＡは必要時まで４℃でマイクロ遠心チューブに保存した。
ＨＰＬＣによるオリゴヌクレオチド解析
ＲＮＡオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ精製は陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて最も良好に達成される。２’−保護または２’−脱保護の型のいずれもククロマトグラフィーによって分離できる。２’−保護の型は、二次構造効果を最小限に抑える利点を提供し、ヌクレアーゼに対して耐性を与える。ＲＮＡが完全に脱保護されている場合は、精製中は無菌的な条件が必要である。
【０１６７】
２’−オルソエステル保護ＲＮＡの脱保護
チューブを１５，０００×ｇで、３０秒間またはＲＮＡペレットが底部に存在するまで遠心分離する。４００μｌのｐＨ３．８脱保護緩衝液を、ＲＮＡの各チューブに添加する。
【０１６８】
脱保護緩衝液
酢酸（１００ｍＭ）を、テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を用いてｐＨ３．８に調整する。ピペットで吸入と排出とを行って、ペレットを緩衝液中に完全に溶解する。チューブを１０秒間ボルテックスし、１５，０００×ｇで遠心分離する。チューブを、６０℃の水浴で３０分間インキュベートする。試料は、使用前に凍結乾燥する。
【０１６９】
ＨＰＬＣカラムの条件
２６０ｎｍで４０吸光度単位（ＯＤＵ）のキャパシティを有するＤｉｏｎｅｘ（８００）−ＤＩＯＮＥＸ−０（３４６−６３９０）で充填された４×２５０  ｍｍカラム（ＤＮＡＰＡＣ  ＰＡ、Ｎｏ．０４３０１０）を設置する。カラム温度は、５４℃にセットする。注入量を、５μｌが約０．２０ＯＤＵをもたらすように調整する。
溶出緩衝液
【０１７０】
【表１】
2008526973.tif 000025
【０１７１】
ＨＰＬＣの勾配
オリゴ１７〜３２塩基対長に対して、緩衝液Ｂの３０％〜６０％の勾配が用意される：
【０１７２】
【表２】
2008526973.tif 000026
【０１７３】
勾配の選択
勾配は、以下のとおり塩基数に基づき選択される：
【０１７４】
【表３】
2008526973.tif 000027
【０１７５】
ＨＰＬＣの後、目標の試料を採取し、分光光度計を用いて２６０ｎｍでＲＮＡ濃度を決定する。試料は−７０℃で保存する。
装置上、消耗品上、および溶液中のＲＮａｓｅｓの不活化
ガラス器具は、１８０℃で少なくとも８時間ベーキングすることにより処理した。プラスチック器具は、クロロホルムですすぐことにより処理した。あるいは、全てのものを０．１％のＤＥＰＣに浸した。
【０１７６】
０．１％のＤＥＰＣを用いた処理
０．１％のＤＥＰＣを調製した。脱イオン水を０．２μＭの膜フィルターで濾過した。水を１５ｐｓｉで１５分間、液体サイクルでオートクレーブした。１．０ｇ（ｗｔ／ｖ）のＤＥＰＣ／リットルの無菌的な濾過水を加えた。
【０１７７】
ガラスおよびプラスチック器具
全てのガラスとプラスチック器具を、０．１％ＤＥＰＣに３７℃で２時間浸した。
ガラス器具を少なくとも５回、殺菌した脱イオン水ですすいだ。ガラス器具は、１５分間１００℃までに加熱するか、または１５ｐｓｉで１５分間、液体サイクルでオートクレーブした。
【０１７８】
ＲＮＡの電気泳動に用いる電気泳動槽
泳動槽を洗剤で洗浄し、水、次いでエタノールですすぎ、空気乾燥した。泳動槽に３％（ｖ／ｖ）の過酸化水素（３０ｍｌ／Ｌ）を満たし、１０分間室温で放置した。泳動槽をＤＥＰＣ処理水で少なくとも５回すすいだ。
【０１７９】
溶液
全ての溶液は、Ｒｎａｓｅを含まないガラス器具、プラスチック器具、オートクレーブした水、ＲＮＡを用いる作業のための化学薬品、およびＲＮａｓｅを含まないスパーテルを用いて作製した。使い捨ての手袋を用いた。可能な場合は、溶液を０．１％のＤＥＰＣで少なくとも１２時間、３７℃で処理し、その後、１００℃までに１５分間加熱するか、または１５分間１５ｐｓｉで、液体サイクルでオートクレーブした。
ＲＮＡの翻訳
２０μｌ／ｍｌの濃度の腸阻害ペプチド（ＧＩＰ）ｍＲＮＡ、２μｌを、２５０μｌのスナップキャップポリプロピレンマイクロ遠心チューブに入れた。３５μｌのウサギ網状赤血球溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａから購入可能）を加えた。メチオニンを含まないアミノ酸混合物（Ｐｒｏｍｅｇａから購入可能）を１μｌ加えた。35Ｓ  メチオニンまたは非標識のメチオニンを１μｌ加えた。35Ｓ  ＧＩＰｍＲＮＡまたは非標識のＧＩＰｍＲＮＡを２μｌ加えた。任意選択で、対照として役割を果たすために２ｍｌのルシフェラーゼを一部のチューブに加えてもよい。好ましい実施形態では、ＧＩＰｍＲＮＡの代わりにルシフェラーゼを用いた。当業者は、実際に適切な配列を含む任意のｍＲＮＡフラグメントを用い得ることを理解するであろう。
【０１８０】
ＳＡＴＡを実験チューブに加えた。ＳＡＴＡを含まない対照チューブも調製した。用いたＳＡＴＡの量は、約０．１μｇ〜５００μｇ、好ましくは０．５μｇ〜５０μｇであった。４０単位／ｍｌのＲｎａｓｉｎを１μｌ加えた。ヌクレアーゼを含まない水を加えて全容量を５０μｌとした。
【０１８１】
約１５０個を超えるアミノ酸のタンパク質では、ｔＲＮＡの量を補充する必要があり得る。例えば、約１０〜２００μｇのｔＲＮＡを加えてもよい。一般にＳＡＴＡの量は、ストップコドンまたは疑似ストップコドンを有効に抑制するのに十分に多量であるべきである。天然ｔＲＮＡの量は、伸長因子の作用下で動的なプルーフリーディングを受けないＳＡＴＡとの競合に勝つために十分多くなければならない。
【０１８２】
各チューブは、すぐにキャップを締め、パラフィルム処理し、翻訳反応のために３０℃で９０分間インキュベートした。各反応チューブの内容物を毛管作用によって５０μｌの石英の毛細管に移した。Ｇａｓｐａｒｒｏら（Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．、５７：１００７（１９９３）、参照として本明細書に組み込まれている）の記載に従って、各チューブの内容物に２〜１０Ｊ／ｃｍ２、約３５０ｎｍの波長の光を照射して、ＳＡＴＡをｍＲＮＡと架橋結合した。光架橋結合の後、各チューブの内容物を新しいスナップキャップマイクロ遠心チューブに移した。２μｌの１０ｍＭ  ＥＤＴＡを各チューブに加えてカルシウム陽イオンをキレートして、リボソームを解離させた。各ステップの間で、各成分を加えた際にピペットチップで攪拌して各チューブを穏やかに混合した。
【０１８３】
最終的な実験を行う前に翻訳に最適なＲＮＡを決定した。ｍＲＮＡの最適濃度を見つけるためには、５〜２０μｇ／ｍｌの段階希釈を要してもよい。
【０１８４】
上記のように、各試料でＳＤＳ−Ｐａｇｅ電気泳動を行った。参照として本明細書に組み込まれているＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載のように、ゲルのオートラジオグラフィーを実施した。
【０１８５】
上記実施例は、ＳＡＴＡ（例えばｔＲＮＡ上のピューロマイシン＋ｔＲＮＡ上の架橋剤）の生成および使用、ならびに連結ｔＲＮＡ類似体（例えばピューロマイシンを有さないがｔＲＮＡ上に架橋剤を有する）の生成および使用を教示している。
【０１８６】
別の実施例では、ウリジンをプソイドウリジンで置き換えた以外は上記方法と同様の方法によってＳＡＴＡを生成した。プソイドウリジンによる置換は、架橋剤モノ付加体形成（例えばソラレンモノ付加体の形成）の形成を容易にするので、連結ｔＲＮＡ類似体にも用いることができる。この技術は以下の実施例２で説明する。
実施例３：プソイドウリジンを用いたＳＡＴＡの生成
上記のように、当業者は、ＳＡＴＡ、連結ｔＲＮＡ類似体およびナンセンスサプレッサーｔＲＮＡを、多くの異なる方法により生成することができることを理解するであろう。図５はウリジンおよびプソイドウリジンの化学構造を示す。プソイドウリジンは、ウリジンと同じように水素結合を形成するが、ソラレンの標的である５−６二重結合を欠くｔＲＮＡにおいて見出される天然の塩基である。本明細書中で用いるプソイドウリジンには、天然に存在する塩基および任意の合成類似体または修飾体が含まれる。好ましい実施形態では、プソイドウリジンを用いてＳＡＴＡを生成した。連結ｔＲＮＡ類似体もプソイドウリジンを用いて生成することができる。具体的には、好ましい実施形態では、３つのフラグメント（図１）を商業的な供与源（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）から購入した。それぞれの３’末端にピューロマイシンおよびＰＯ4を事前に結合させた、修飾された塩基およびフラグメント３（「フラグメント３」）が含まれ、これらは全て市販されている。３つのフラグメントは、モノ付加体の形成においてフラグメント２（「フラグメント２」）の操作を容易にするために用いた。いくつかの実施形態によれば、３つのフラグメントの配列は以下のとおりである（各フラグメントにつき２つの配列例を提供する）：
フラグメント１
【０１８７】
【化１０】
2008526973.tif 000028
【０１８８】
フラグメント２
【０１８９】
【化１１】
2008526973.tif 000029
【０１９０】
フラグメント３
【０１９１】
【化１２】
2008526973.tif 000030
【０１９２】
フラグメント３に挙げた上記配列はＳＡＴＡに適用可能である。連結ｔＲＮＡ類似体では、ピューロマイシンがアデノシンで置き換えられる以外は配列は類似している。
【０１９３】
修飾された酵母ｔＲＮＡ  Ａｌａまたは酵母ｔＲＮＡ  Ｐｈｅを本発明の１つの実施形態に従って用いた。しかし当業者は、配列は既知のｔＲＮＡから、またはｔＲＮＡ様の構造を形成する配列を選択することにより、広く選択することができることを理解するであろう。いくつかの実施形態においてプソイドウリジンを用いる利点の１つは、フラグメント２中にプソイドウリジンがあることで、対象外のＵのソラレン標識化が回避されることである。ウリジンの代わりにプソイドウリジンを用いることにより、ｔＲＮＡ類似体に対するリボソームのＡ部位の結合力が減少するが、末端ウリジンとソラレンとの相互作用が排除される。Ｙａｒｕｓの「延長アンチコドン」の指針を用いることによりＡ部位の結合が増加する（参照として本明細書に組み込まれているＹａｒｕｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１８：６４６〜６５２、１９８２）。
【０１９４】
１つの実施形態では、ソラレンのインタカレートを誘導するために、フラグメント２をヘリカルコンホメーションで用いる。当業者は、本発明のいくつかの実施形態に従って他のコンホメーションも用いることができることを理解するであろう。相補鎖も用いた。ＤＮＡまたはＲＮＡを用い、Ｃがソラレンの一方または両方の末端に対して相互作用する場合には、ポリＧまたはポリＣなどの配列を付加して、モノ付加体形成の完成後の分離と除去を容易にした。相補体中でウリジンの代わりにプソイドウリジンを用いることにより、生成物の架橋結合を気にせずに約３６５ｎｍのような高効率の波長を用いることが可能となった。照射は約３００〜４５０ｎｍの範囲が好ましく、約３２０〜４００ｎｍの範囲がより好ましく、約３６５ｎｍが最も好ましい。さらに、Ｍａｆが架橋結合形成の主な第１のステップであるので、プソイドウリジンを使用することによりフラン側鎖のモノ付加体がフラグメント２上の適所に配置された。
【０１９５】
プソイドウリジンを有する以下のｃＲＮＡ配列を本発明の好ましい実施形態に従って用いた。当業者は、これらの配列および本明細書中に記載の他の配列の置換体ならびに修飾体も、本発明のいくつかの実施形態に従って用いることができることを理解するであろう。例えば以下に記載の配列番号１９では、配列は以下のものであることもできる。
【０１９６】
【化１３】
2008526973.tif 000031
【０１９７】
ステップ１：フラグメント２へのソラレンのフラン側鎖のモノ付加体
フラグメント２の標的ウリジンを用いたフラン側鎖のソラレンモノ付加体の形成を以下のように行った。
【０１９８】
反応緩衝液を以下のように調製した：
トリスＨＣＬ      ２５ｍＭ
ＮａＣｌ          １００ｍＭ
ＥＤＴＡ          ０．３２ｍＭ
ｐＨ              ７．０
次いで、４’ヒドロキシメチル−４，５’，８’−トリエチルソラレン（ＨＭＴ）を最終濃度０．３２ｍＭまで加え、等モル量のフラグメント２およびｃＲＮＡをフラグメント２：ｃＲＮＡ：ソラレンの最終モル比＝１：１：１０００まで加えた。１００μｌの全容量を一度に照射した。
【０１９９】
相補的オリゴ、ＨＭＴ、ソラレンの混合物を以下のように処理した：
１）ＰＣＲサーモサイクラーを用いて、８５℃まで６０秒間加熱し、次いで４℃まで１５分間かけて冷却した。
【０２００】
２）エッペンドルフＵＶｅｔｔｅプラスチックキュベット内で、上部をパラフィルムで覆い、ＵＶランプ（１ｍＷ／ｃｍ2多波長ＵＶランプ（λ＞３００ｎｍ）（ＵＶ  Ｌ２１モデルλ３６５ｎｍ）の上に置いて４℃で２０分間照射した。
【０２０１】
ＨＭＴを再度インタカレートし、照射するために、上記ステップ１および２を４回繰り返した。２回目の照射後、さらに１０μｌの１．６ｍＭ  ＨＭＴを、合計１００μｌの反応容積に加えた。４サイクルの照射後、遊離ソラレンをクロロホルムで抽出し、全てのオリゴ（標識したものおよび未標識のもの）をエタノールで一夜沈殿させた（沈殿ステップを参照）。少量のアリコートをゲルの同定用に保存した。
ステップ２：ＨＰＬＣによるＨＭＴとコンジュゲートしたフラグメント２（２ＭＡ）オリゴの精製
１）反応混合物を高速真空（ｓｐｅｅｄ  ｖａｃｕｕｍ）で１０分間乾燥させ、その後、２μｌの０．１ＭのＴＥＡＡ、ｐＨ７．０の緩衝液に溶解した。
【０２０２】
０．１Ｍ  ＴＥＡＡ、ｐＨ７．０の緩衝液
酢酸                                ５．６ｍｌ
トリエチルアミン                    １３．８６ｍｌ
Ｈ2Ｏ（ＲＮＡａｓｅフリーの）      ９５０ｍｌ
酢酸を用いてｐＨを７．０に調整し、水を加えて１Ｌにする
２）試料を、緩衝液Ａ（０．１ＭのＴＥＡＡ、ｐＨ７．０中５％ｗｔ／ｗｔのアセトニトリル）で事前に平衡化したＷａｔｅｒｓ  Ｘｔｅｒｒａ  ＭＳ  Ｃ１８、２．５μｍ、４．５×５０ｍｍの逆相カラムに載せた。試料を、緩衝液Ａに対して０〜５５％の緩衝液Ｂ（０．１ＭのＴＥＡＡ、ｐＨ７．０中１５％ｗｔ／ｗｔのアセトニトリル）の勾配で、３５分間の時間フレームをかけて、１ｍｌ／分の流速で溶出した。カラム温度は６０℃であり、狭帯域フィルターによって設定した検出波長は３４０ｎｍであった。フラン側鎖のソラレンモノ付加体は３４０ｎｍで吸収するが、ＲＮＡおよび任意のピロン側鎖のモノ付加体は吸収しない。緩衝溶液は使用前に濾過し脱気した。
【０２０３】
２ＭＡは約２５〜２８分で、緩衝液Ｂの濃度４０％により溶出された。採取した分画のその後のゲル電気泳動分析に基づくと、ソラレン化していないフラグメント２は８分間より前に溶出された。
【０２０４】
カラムを１００％アセトニトリルで５分間洗浄し、緩衝液Ａで１５分間、再度平衡化した。全ての分画を高速真空で一夜乾燥させた。
【０２０５】
２ＭＡを含む分画は、２６０ｎｍ（ＲＮＡ）および３３０ｎｍ（フラン側鎖のソラレンモノ付加体としたＲＮＡ）での吸光レベルによって同定した。これは、乾燥した分画を再度１２０μｌのＲｎａｓｅを含まない蒸留水に溶かし、分光光度計を用いて２６０ｎｍおよび３３０ｎｍの吸光度を測定することによって行った。両方の波長で吸光度の高い分画をプールし、次いで高速真空で乾燥させた。各分画からの少量のアリコートをゲル分析用に保存した。
【０２０６】
架橋結合した生成物を変性２０％ＴＢＥ−尿素ゲルで分析し、ゲルの銀染色によって可視化した。
ステップ３：ＨＰＬＣによるＨＭＴとコンジュゲートした、ｃＲＮＡからのフラグメント２オリゴの精製
乾燥した試料をプールし、その後、０．５×ＴＥ緩衝液に溶かした。約０．４吸光単位の試料を、緩衝液Ｃ（２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で事前に平衡化したＤｉｏｎｅｘ  ＤＮＡＰａｃ  ＰＡ−１００（４×２５０ｍｍ）カラムに載せた。カラム温度は８５℃であった（陰イオン交換ＨＰＬＣ）。
【０２０７】
オリゴを１ｍｌ／分の流速で、４％〜５５％の緩衝液Ｄの凹型（ｃｏｎｃａｖｅ）勾配で１５分間、次いで次の１５分間は５５％〜８０％の緩衝液Ｄの凸型（ｃｏｎｖｅｘ）勾配で溶出させた。オリゴを１００％の緩衝液Ｄで５分間および１００％の緩衝液Ｃでさらに５分間、１．５ｍｌ／分の流速で洗浄した。２６０ｎｍの光を吸収した分画を採取した。２ＭＡの保持時間（ＲＴ）は１６．２分であり、５７％の緩衝液Ｄによって溶出され、遊離フラグメント２のＲＴは１６．６分未満であり、５５％の緩衝液Ｄによって溶出され、遊離ｃＲＮＡのＲＴは１９．２分を超えていた。２５４または２６０ｎｍで吸光した分画を採取した。採取した分画を高速真空で一夜乾燥させた。全ての溶液は使用前に濾過し脱気した。
【０２０８】
用いた溶液は以下を含んでいた：
Ｃ：２５ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、
Ｄ：２５ｍＭのトリス、ｐＨ８．０の緩衝液中２５０ｍＭのＮａＣｌＯ４、
ＴＥ：１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０
ステップ４：精製した２ＭＡオリゴの脱塩、沈殿および採取
乾燥した分画を１００μｌのＲｎａｓｅを含まない蒸留水に再溶解した。０．５Ｍの（ＮＨ４）２ＣＯ３を含む５００μｌの１００％冷エタノールを加え、混合物を短時間ボルテックスした。その後、混合物を６０分間ドライアイス上で凍結させるか、または−２０℃で一夜保存した。
【０２０９】
その後、試料を４℃にし、マイクロ遠心機で、最大速度で１５分間遠心分離した。ペレットの位置に注意し、上清をデカントするか、またはピペットで取り除いた。ペレットを乱さないように注意した。ペレットがまだ塩を含んでいた場合は、このステップを繰り返した。その後、ペレットを７０％の事前に冷やしたエタノールを用いて２回で洗浄した。湿ったペレットを高速真空で１５分間乾燥させた。尿素ＰＡＧＥゲルにより、次のステップ用の適切な分画を同定した。
ステップ５：２ＭＡオリゴのフラグメント３オリゴへのライゲーション
以下のステップを実施した。
【０２１０】
Ａ．以下の試薬および器具を用いた：
ヌクレアーゼを含まない水（Ｐｒｏｍｅｇａ）
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００、Ｓｉｇｍａ）４０％（水中のｗｔ／ｗｔ）
ＲＮａｓｉｎ（登録商標）リボヌクレアーゼ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）
フェノール：クロロホルム
滅菌１．５ｍｌマイクロ遠心チューブ
１００％エタノール
７０％エタノール
ドライアイスまたは−２０℃の冷凍庫
室温および＋４℃のマイクロ遠心機
ＰＣＲサーモサイクラーまたは水浴
Ｂ．以下の反応条件を用いた：
５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、
１０ｍＭ  ＤＴＴ
１ｍＭ  ＡＴＰ
１８〜２０％のＰＥＧ
Ｃ．以下の反応混合物を無菌的なマイクロ遠心チューブ内で構築した：
フラグメント３（ドナー）１μｌ（６μｇ）（必要な場合は、ドナーとして用いる前に精製した）
２ＭＡ（アクセプター）１μｌ（１．５μｇ）。
【０２１１】
８μｌのＲｎａｓｅを含まないｄＨ２Ｏを８μｌ加えたあと、オリゴ二次構造を緩めるために反応物を８５℃で１分間インキュベートし、その後、ＰＣＲ装置のサーモサイクラーを用いて４℃までゆっくりと冷やした。事前に加熱したチューブを氷上に置いて冷たい状態に保ち、短時間遠心分離し、その後、以下のものを加えた：
１０×リガーゼ緩衝液                                ４μｌ
１０ｍＭのＡＴＰ                                    ４μｌ
Ｒｎａｓｅ  ＯｕｔまたはＲｎａｓｉｎ（４０単位／μｌ）Ｐｒｏｍｅｇａ                                                    ０．５μｌ
ＰＥＧ、４０％（Ｓｉｇｍａ）                      ２０μｌ
Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ（１０単位／μｌ）（ＮＥＢ）      １μｌ
ヌクレアーゼを含まない水を加えて全容積を４０μｌとした。混合物を１６℃で一夜（１６時間）インキュベートした。混合物を短時間遠心分離し、次いで氷上に置いた。
【０２１２】
Ｄ．オリゴヌクレオチドの沈殿：
６０μｌのＤＥＰＣ  ＲＮａｓｅを含まない蒸留水を混合物に加え、次いで１５０μｌのフェノール／クロロホルムを加えた。混合物を３０秒間激しくボルテックスした。その後マイクロ遠心分離機で、室温で５分間、最大速度で遠心分離して沈殿物を除去した。水相を新しいマイクロ遠心チューブに移した（＞９５μｌ）。
【０２１３】
これに、３μｌの５ｍｇ／ｍｌのグリコーゲン、および５００μｌの事前に冷やした０．５Ｍの（ＮＨ４）２ＣＯ３を含む１００％エタノールを加え、混合物を短時間ボルテックスし、次いで６０分間ドライアイス上で凍結した。この時点で、これを一夜−２０℃で保存してもよい。乾燥した分画を１００μｌのＲｎａｓｅを含まない蒸留水に再溶解し、０．５Ｍの（ＮＨ４）２ＣＯ３を含む５００μｌの１００％冷エタノールを加え、混合物を短時間ボルテックスした。その後、これを６０分間ドライアイス上で凍結させるか、または−２０℃で一夜保存した。その後、試料を４℃にし、マイクロ遠心機で、最大速度で１５分間遠心分離し、上清をピペットで取り除いた。ペレットを乱さないように注意した。ペレットがまだ塩を含んでいた場合は、このステップを１回繰り返した。その後、ペレットを７０％の事前に冷やしたエタノールで数回洗浄した。次いで、これをマイクロ遠心機で、４℃で５分間、最大速度で遠心分離した。ピペットを用いてエタノールを慎重に取り除いた。遠心分離を再度繰り返して  残留するタノールを集め、これを慎重に取り除いた。湿ったペレットを高速真空で１０分間乾燥した。少量のアリコートをゲル分析用に採取した。長期間の保存には、ＲＮＡをエタノール中に−２０℃で保存した。ＲＮＡをＤＥＰＣ水中で保存しないように注意した。
ステップ６：ライゲーションしたフラグメント３オリゴ複合体の精製
乾燥した試料を０．５×ＴＥ緩衝液に再溶解し、緩衝液Ｃで平衡化したＤＮＡＰａｃ  ＰＡ−１００カラムに載せた。カラム温度は８５℃であり、検出器をＲＮＡを有する分画の同定には２５４ｎｍで作動させ、２ＭａＦを有する分画の同定には３４０ｎｍで作動させた。オリゴは、最初の２０分間は３０％〜７０％の緩衝液Ｄの凸型勾配で、０．８ｍｌ／分の流速で溶出させ、次いでさらに２０分間、７０％の〜９８％のＤの直線勾配で、同じ流速で溶出させた。溶出は、１００％のＤで７分間および１００％のＣでさらに１０分間、１．０ｍｌ／分の流速で洗浄することによって完了した。分画は２５４または２６０ｎｍの波長の光を用いて検出した。ライゲーションしたオリゴ（２ＭＡ−フラグメント３）は３４分より後に、９０％を超える緩衝液Ｂで溶出された。２５４ｎｍでの吸光度を有する分画（Ａ２５４ｎｍ＞０．０１）を採取し、高速真空で一夜乾燥させた。
ステップ７：精製した２ＭＡ−フラグメント３の脱塩および沈殿
乾燥した分画を１００μｌのＲｎａｓｅを含まない蒸留水に再溶解し、５００μｌの０．５Ｍの（ＮＨ４）２ＣＯ３を含む１００％冷エタノールを加え、混合物を短時間ボルテックスした。次いで混合物を６０分間ドライアイス上で凍結させるか、または−２０℃で一夜保存した。
【０２１４】
試料を４℃にし、マイクロ遠心機で、最大速度で１５分間遠心分離した。ペレットの位置に注意し、上清をデカントするか、またはピペットで取り除いた。ペレットを乱さないように注意した。まだ塩を含んでいる場合は、このステップを繰り返した。その後、ペレットを７０％の事前に冷やしたエタノールを用いて２回で洗浄した。湿ったペレットを高速真空で１５分間乾燥させた。
【０２１５】
フラグメント１を２ＭＡ−フラグメント−３オリゴにライゲーションさせてＳＡＴＡリンカーを完成させる次のステップで用いる、ライゲーションした２ＭＡ−フラグメント−３を同定するために、尿素ＰＡＧＥを実施した。
ステップ８：ＳＡＴＡ（または他のｔＲＮＡ分子）の調製
Ａ．ＲＮＡオリゴの５’リン酸化
１．試薬および器具：
・ヌクレアーゼを含まない水（カタログ番号Ｐ１１９３、Ｐｒｏｍｅｇａ）
・ＲＮａｓｉｎ（登録商標）リボヌクレアーゼ阻害剤（カタログ番号Ｎ２５１１、Ｐｒｏｍｅｇａ）
・フェノール：クロロホルム
・無菌的なマイクロ遠心チューブ
・１００％のエタノール
・７０％のエタノール
・室温および４℃のマイクロ遠心機
・ＰＣＲサーマルサイクラーまたは水浴
２．以下の反応混合物を無菌的なマイクロ遠心チューブ内で構築する：
成分  ：                                    容積
・アクセプターＲＮＡ                  ＜２００ｎｇ
・Ｔ４リガーゼ１０×反応緩衝液*            ４μｌ
・ＲＮａｓｉｎ（登録商標）リボヌクレアーゼ阻害剤（４０単位／μｌ）                                                ２０単位
・Ｔ４キナーゼ（９〜１２単位／μｌ）        ２μｌ
・１０ｍＭ  ＡＴＰ                          ４μｌ
・ヌクレアーゼを含まない水で最終容量に    ４０μｌ
ＰＣＲサーモサイクラーまたは水浴中で、３７℃で３０分間インキュベートする。非放射性のリン酸化には、１×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ反応緩衝液、１ｍＭのＡＴＰおよび１０〜２０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含む３０〜４０μｌの反応で、３００ｐｍｏｌまでの５’末端を用いる。３７℃で３０分間インキュベートする。１×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液は１ｍＭのＡＴＰを含み、非放射性のリン酸化において置き換えることができる。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼはこの緩衝液中で１００％の活性を示す）。最適な活性には新しい緩衝液が必要である（古い緩衝液では、酸化によるＤＴＴの減少が活性を低下させる。
【０２１６】
Ｂ．フラグメント１および２ＭＡ−フラグメント３オリゴ複合体のアニーリング：
１．試薬および器具：
・ＰＣＲサーモサイクラー装置または水浴
・１００μｇ／ｍｌのヌクレアーゼを含まないアルブミン
・１００ｍＭのＭｇＣｌ２
２．以下の反応混合物を無菌的なマイクロ遠心チューブ内で構築する：
・アクセプターＲＮＡオリゴ（１Ｅ）                        ＜２００ｎｇ
・ドナーＲＮＡオリゴ（３Ｇ−２Ｇのライゲーションしたオリゴ）    ＜２００ｎｇ
・（ステップＡからの５’リン酸化されたオリゴ）
適切な比は以下のとおりで、フラグメント１の自己ライゲーションを回避するために、アクセプターオリゴ：ドナーオリゴ（フラグメント１：２ＭＡ−フラグメント３）のモル比が１：１．１であるべきである。ＭｇＣｌ2を、Ｔ４リガーゼ緩衝液（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ2−（ｐＨ７．８）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＤＴＴおよび１ｍＭ  ＡＴＰ）に、最終２０ｍＭの濃度で添加した。Ｒｎａｓｅを含まないアルブミンを最終的に５μｇ／ｍｌになるように添加する。最終容量は、１００μｌ以下とすべきである。溶液を５分間７０℃まで加熱し、次いで２時間にわたって７０℃から２６℃まで冷やし、４０分にわたって２６から０℃まで冷却した。ＰＣＲ器具を用いて、１６℃で１６〜１７時間インキュベートする。
【０２１７】
Ｃ．アニールしたオリゴのライゲーション
・アニールしたオリゴ                          ＜１５μｌ
・１０ｍＭ  ＡＴＰ                                ２μｌ
・４０％ＰＥＧ                                  １８μｌ
・Ｔ４リガーゼ  １０×緩衝液                      ２μｌ
・ＲＮａｓｉｎ（登録商標）リボヌクレアーゼ阻害剤（４０単位／μｌ）                                                    ０．５μｌ
・Ｔ４リガーゼ（９〜１２ｕ／μｌ）（ＮＥＢ）      １μｌ
・ヌクレアーゼを含まない水で            最終容量４０μｌ
Ｄ．ｔＲＮＡフラグメントの沈殿
ライゲーションの後、５０μｌのＤＥＰＣ水および１５０μｌのフェノール：クロロホルムを加え、３０秒間激しくボルテックスした。その後、これをマイクロ遠心機で、室温で最大速度で５分間遠心分離した。水相を新しいマイクロ遠心チューブ（約１００μｌ）に移した。これに、２μｌの１０ｍｇ／ｍｌのイガイグリコーゲン、１０μｌの３Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２を加えた。これをよく混合した。次いで２２０μｌの９５％のエタノールを加え、短時間ボルテックスした。その後、混合物を３０分間ドライアイス上で凍結させた。この時点で、混合物を一夜−２０℃で保存してもよいし、または先に進んでもよい。１つの実施形態では、ＲＮＡは好ましくはＤＥＰＣ水中に保存すべきでなく、エタノール中に−２０℃で保存すべきである。
【０２１８】
その後試料を４℃にし、マイクロ遠心機で、最大速度で１５分間遠心分離した。ペレットの位置に注意し、上清をデカントするか、またはピペットで取り除いた。ペレットを乱さないように注意した。次いでペレットを７０％の事前に冷やしたエタノールを用いて２回で洗浄した。エタノールを除去した後、湿ったペレットを高速真空で１５分間乾燥させた。乾燥したペレットは、次のステップまで−２０℃で保存した。
【０２１９】
ＲＮＡの翻訳
ＳＡＴＡのアンチコドンによって認識されるコドンに対応するストップコドン（この場合はＵＡＧ）を有するように修飾されたルシフェラーゼｍＲＮＡを、１μｌの濃度１μｇ／μｌを推奨する標準のＰｒｏｍｅｇａ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳キットで用いた。当業者は、実際、適切な配列を含む任意のｍＲＮＡフラグメントを用い得ることを理解するであろう。
【０２２０】
ＳＡＴＡを実験チューブに加えた。ＳＡＴＡを含まない対照チューブも調製した。用いたＳＡＴＡの量は、約０．１μｇ〜５００μｇ、好ましくは０．５μｇ〜５０μｇであった。４０単位／ｍｌのＲｎａｓｉｎを１μｌ加えた。ヌクレアーゼを含まない水を加えて全容量を５０μｌとした。
【０２２１】
約１５０個を超えるアミノ酸のタンパク質では、ｔＲＮＡの量を補充する必要があり得る。例えば、約１０〜２００μｇのｔＲＮＡを加えてもよい。一般に、ＳＡＴＡの量は、ストップコドンまたは疑似ストップコドンを有効に抑制するのに十分に多量であるべきである。天然ｔＲＮＡの量は、伸長因子の作用下で活発なプルーフリーディングを受けないＳＡＴＡとの競合に勝つために十分に多量でなければならない。
【０２２２】
各チューブは、直ちにキャップを締め、パラフィルムで覆い、翻訳反応のために３０℃で９０分間インキュベートした。各反応チューブの内容物を毛管作用によって５０μｌの石英の毛細管に移した。Ｇａｓｐａｒｒｏら（Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．、５７：１００７（１９９３）、参照として本明細書に組み込まれている）に従って、各チューブの内容物に２〜１０Ｊ／ｃｍ２、約３５０ｎｍの波長の光を照射することにより、ＳＡＴＡをｍＲＮＡと架橋結合させた。光架橋結合の後、各チューブの内容物を新しいスナップキャップマイクロ遠心チューブに移した。２μｌの１０ｍＭ  ＥＤＴＡを各チューブに加えることによってカルシウム陽イオンをキレートして、リボソームを解離させた。各ステップの間に、各成分を加えた際にピペットチップで攪拌することによって各チューブを穏やかに混合した。
【０２２３】
最終的な実験を行う前に翻訳に最適なＲＮＡを決定した。ｍＲＮＡの最適濃度を見つけるためには、５〜２０μｇ／ｍｌの段階希釈を要してもよい。
【０２２４】
上記のように、各試料でＳＤＳ−Ｐａｇｅ電気泳動を実施した。参照として本明細書に組み込まれているＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載のように、ゲルのオートラジオグラフィーを実施した。
【０２２５】
上記実施例は、ＳＡＴＡ（ｔＲＮＡ上のピューロマイシンおよびｔＲＮＡ上の架橋剤）の生成および使用、ならびに連結ｔＲＮＡ類似体（ピューロマイシンを有さず、ｔＲＮＡ上に架橋剤を有する）の生成および使用のために有用である。
実施例４：架橋剤を形成するよう修飾したリボヌクレオチドを用いたｔＲＮＡ類似体の生成：ソラレンおよび非ソラレン架橋剤の使用
上記のように、いくつかの実施形態では、所望しないモノ付加体および架橋結合の形成を最小限にするために、プソイドウリジンを用いることができる。１つの実施形態では、架橋剤で修飾されたモノヌクレオチドを形成して用いる。架橋剤で修飾されたモノヌクレオチドの１つの利点は、これが望ましくないモノ付加体および架橋結合の形成を最小限にすることである。
【０２２６】
上記のように、当業者は、ＳＡＴＡ、連結ｔＲＮＡ類似体およびナンセンスサプレッサー類似体を多くの異なる方法によって生成することができることを理解するであろう。好ましい実施形態では、ソラレン化したウリジン５’モノヌクレオチド、２−チオシトシン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−ヨードシトシン、５−ヨードウリジン、５−ブロモウリジンもしくは２−クロロアデノシンを生成または購入し、オリゴヌクレオチドに酵素的にライゲーションして、ｔＲＮＡ類似体内に組み込むことができる。アリールアジドおよびアリールアジドの類似体、ならびにその任意の修飾体も、いくつかの実施形態において連結部分または作用物質として用いることができる。以下のプロトコルをｔＲＮＡ上に位置する架橋剤に用いることができる。当業者は、このプロトコルはｍＲＮＡ上に位置する架橋剤にも用いることができることを理解するであろう。したがって、以下の実施例は、ＳＡＴＡ、連結ｔＲＮＡ類似体、およびナンセンスサプレッサー類似体の生成ならびに使用に関して有用である。
修飾されたヌクレオチドの生成
長さが８０塩基対までのカスタムヌクレオチドにすでに組み込まれている、ピューロマイシンを有するかまたは有さない４−チオＵ、５−ヨードおよび５−ブロモＵを購入できる（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ）。したがって、ＳＡＴＡ、およびこれらの架橋剤が既に適所に存在する連結ｔＲＮＡ類似体、ならびに類似の架橋剤を、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃから直接購入できる。ナンセンスサプレッサー類似体もＤｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃから購入できる。
【０２２７】
２−チオシトシン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−ヨードシトシン、５−ヨードウリジン、５−ブロモウリジンまたは２−クロロアデノシンは、ＲＮＡ内に組み込むためのＡｍｂｉｏｎＭＯＤＩｓｃｒｉｐｔキットで使用するために、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．から架橋用に全て購入できる。したがって、これらの架橋剤および類似の架橋剤を有するＳＡＴＡおよび連結ｔＲＮＡ類似体を、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃから直接購入できる。
【０２２８】
ＰＯ4Ｕソラレンは以下のように生成することができる：
【０２２９】
【化１４】
2008526973.tif 000032
【０２３０】
（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．から入手可能）
【０２３１】
【化１５】
2008526973.tif 000033
【０２３２】
（南カリフォルニア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のサービスから入手可能）。
【０２３３】
標的ウリジンを用いたフラン側鎖のソラレンモノ付加体の形成は、以下のように実施する：
反応緩衝液を調製する。ｐＨ７．０を有する反応緩衝液は、２５ｍＭ  トリスＨＣＬ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．３２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む。
【０２３４】
その後、４’ヒドロキシメチル−４，５’，８’−トリエチルソラレン（ＨＭＴ）を最終濃度０．３２ｍＭまで加え、等モル量の配列Ａ１および配列Ａ２を配列Ａ１：配列Ａ２：ソラレンの最終モル比＝１：１：１０００まで加える。１００μｌの全容量を一度に照射した。
【０２３５】
相補的オリゴ、ＨＭＴ、トリメチルソラレンの混合物を以下のように処理する：１）ＰＣＲサーモサイクラーを用いて、８５℃まで６０秒間加熱し、次いで４℃まで１５分間かけて冷却する、ならびに２）冷却ファンおよび４１９ｎｍの波長を備えたＲＰＲ−２００  Ｒａｙｏｎｅｔ  Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｒｅａｃｔｏｒ内で、上部をパラフィルムで覆ったエッペンドルフＵＶｅｔｔｅプラスチックキュベット内で２０〜６０分間４℃で照射する。これを、氷水浴上または−２０℃の冷凍庫内のどちらかに置く。
【０２３６】
ＨＭＴを再インタカレートおよび照射するために上記ステップ１および２を４回繰り返す。４サイクルの照射後、遊離ソラレンをクロロホルムで抽出し、全てのオリゴ（標識したものおよび未標識のもの）をエタノールで一夜沈殿する（沈殿ステップを参照）。少量のアリコートをゲルの同定用に保存する。
【０２３７】
非ソラレン架橋剤のＡｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃのキットを用いて同等の配列を生成することができる。
【０２３８】
ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖中のＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ消化
以下のステップを実施する：（１）高速真空内でオリゴを乾燥する、（２）ペレットを１０μＬの１×ハイブリッド混合物に再懸濁する、（３）６８℃で１０分間加熱する、（４）ゆっくりと３０℃まで冷却する。パルススピンダウン（Ｐｕｌｓｅ  ｓｐｉｎ  ｄｏｗｎ）する、（５）１０μＬの２×ＲＮａｓｅ  Ｈ緩衝液を加える。混合する。（６）３０℃で６０分間インキュベートする、（７）１３０μＬの停止混合液を加える。
【０２３９】
フェノール／クロロホルム抽出には、（１）１倍容量のフェノール／クロロホルムを加える、（２）よくボルテックスする、（３）室温のマイクロ遠心機で２分間遠心沈殿する、（４）上層を新しいチューブに取り出す。
【０２４０】
クロロホルム抽出には：（１）１倍容量のクロロホルムを加える、（２）よくボルテックスする、（３）室温のマイクロ遠心機で２分間遠心沈殿する、（４）上層を新しいチューブに取り出す。
【０２４１】
次いで、（１）３７５μＬの１００％エタノールを加える、（２）−８０℃で凍結する、（３）室温のマイクロ遠心機で１０分間遠心沈殿する、（４）ペレットを７０％エタノールで洗浄する、（５）１０μＬのローディング色素に再懸濁する、（６）載せる直前に１００℃で３分間加熱する。
【０２４２】
より長いｃＤＮＡおよびより長いＲＮＡフラグメントからのモノリボヌクレオチドヌクレオチドの精製は、陰イオン交換ＨＰＬＣを用いて行う。次いでソラレンモノ付加体としたモノヌクレオチド（ＰＯ4Ｕソラレン）を、逆相ＨＰＬＣによってモノ付加体化されなかったモノヌクレオチド（ＰＯ4ＵおよびＰＯ4Ａ）から分離する。
【０２４３】
以下に記載する類似の消化技法およびヌクレオチドの組み込みも、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃのキットを用いた非ソラレン架橋剤に用いることができる。
ｔＲＮＡ成分オリゴリボヌクレオチド内への光感受性ヌクレオチドの組み込み
ｐＵ架橋剤をＣＵＡストップアンチコドン内に組み込むために以下のプロトコルを用いることができる。しかし当業者は、本明細書中に記載の方法に従って、他のストップアンチコドンおよび疑似ストップアンチコドンを生成するために他のヌクレオチドも用いることができることを理解するであろう。
【０２４４】
一般に、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ用のプロトコルからから適用させた方法を用いるが、修飾されたヌクレオチドの３’ＯＨの保護が欠けているためにいくつかの変更を伴っている。
【０２４５】
５’ＯＨ  ＣＵＣ  ＯＨ３’オリゴリボヌクレオチド（配列Ｂ１）はＤｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．から購入することができ、ライゲーションにおいてアクセプターとすることができる。Ｂ１対ソラレン化したモノヌクレオチドのモル比は、修飾されたＵの数が大きく下回るように１０：１〜５０：１を保つのが好ましく、それによりＣＵＣ（Ｕ架橋剤）Nの形成を妨げる。これにより、好ましい反応の１つが行われる：
【０２４６】
【化１６】
2008526973.tif 000034
【０２４７】
１つの実施形態では、ソラレン化したＵおよびより長いソラレン化した７量体を確実に分離するために、連続した陰イオン交換および逆相ＨＰＬＣによって生成物を精製する。その後、ｐＡｐとライゲーションすることによって７量体を３’保護してＣＵＣＵ架橋剤Ａｐ（フラグメント２Ｂ）を得る。
【０２４８】
陰イオン交換ＨＰＬＣＦまたは次のライゲーションを用いて、これを再び精製する。
フラグメント２Ｂと１Ｂもしくは１Ｂ１との第１のライゲーション
この２Ｂフラグメントは、安定したアクセプターを有するｔＲＮＡ類似体または、天然のエステル化されたアクセプターを有するｔＲＮＡ類似体において用いることができる。１つの実施形態では、天然のＡＡ−ｔＲＮＡ合成酵素によって、天然の３’末端をアミノアシル化できることを保証するために、その類似体のバージョンにおいてアクセプター基部を修飾する。ＳＡＴＡのバージョンでは、１つの実施形態では、３’フラグメントは市販の調製されたピューロマイシンをアクセプターとして保守する。したがって、１つの実施形態では、異なる２つの５’末端において以下を用いる：
【０２４９】
【化１７】
2008526973.tif 000035
【０２５０】
（安定したピューロマイシンアクセプターを有するｔＲＮＡ類似体と共に用いる）および
【０２５１】
【化１８】
2008526973.tif 000036
【０２５２】
（天然のエステル化されたアクセプターと共に用いる）。
【０２５３】
Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを用いて再度ライゲーションを行い、長さによって精製する。配列１Ｂの式は以下のとおりである：
【０２５４】
【化１９】
2008526973.tif 000037
【０２５５】
ｔＲＮＡ類似体の２つの半分子のライゲーション
３’リン酸を除去して５’リン酸を付加するために、上記生成物を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて２つの個別のステップで処理する。
【０２５６】
その後、新しく調製した５’および３’の半分子末端を、一般に以前のプロトコルに従ってライゲーションする。それぞれの５’配列に対応する３’配列は以下のとおりである：
配列１Ｂ：（Ψ＝プソイドウリジン）
【０２５７】
【化２０】
2008526973.tif 000038
【０２５８】
３’の半分に対応：
【０２５９】
【化２１】
2008526973.tif 000039
【０２６０】
３Ｂおよび配列１Ｂ１、
【０２６１】
【化２２】
2008526973.tif 000040
【０２６２】
３’の半分に対応：
【０２６３】
【化２３】
2008526973.tif 000041
【０２６４】
後者は、大腸菌のアラニンに対するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素によって認識可能である。
【０２６５】
上記の実施例は、ＳＡＴＡ、連結ｔＲＮＡ、およびナンセンスサプレッサーｔＲＮＡを作製および使用するために用いることができる。
実施例５：ＳＡＴＡおよびナンセンスサプレッサーｔＲＮＡに対するｍＲＮＡ上への架橋剤の配置
いくつかの実施形態では、架橋剤（ソラレンまたは非ソラレン架橋剤など）はｔＲＮＡ上に配置されず、ｍＲＮＡ上に位置する。例えば、１つの実施形態では、ＳＡＴＡはｔＲＮＡ上に位置するピューロマイシンを含むが、架橋剤はｍＲＮＡ上にある。さらに別の実施形態では、ナンセンスサプレッサーｔＲＮＡを用い、これはピューロマイシンを有さないｔＲＮＡを含み、架橋剤はｍＲＮＡ上にある。架橋剤のメッセージ（ｍＲＮＡ）上への配置は、以下に示すように達成することができる。関連する配列は以下のとおりである：
【０２６６】
【化２４】
2008526973.tif 000042
【０２６７】
利便性だけを考えると、１つの実施形態では、多数の35Ｓ標識のためのメチオニンコドンを有する、コザック配列およびシャインダルガノ配列をどちらも有するメッセージを用いる。
【０２６８】
４−チオウリジン、５−ブロモウリジンおよび５−ヨードウリジンに関しては、完全に作製されたメッセージをＤｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃから購入できる。アリールアジドに関しては、参照として本明細書に組み込まれているＤｅｍｅｓｈｋｉｎａ，Ｎら、ＲＮＡ、６：１７２７〜１７３６、２０００に記載の方法を用いることができる。
【０２６９】
２−チオシトシン、２−チオウリジン、５−ヨードシトシン、または２−クロロアデノシンに関しては、修飾された塩基を５’モノリン酸ヌクレオチドとしてＡｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．から購入できる。ソラレンを架橋剤として用いる場合は、修飾された５’モノリン酸ヌクレオチドは上記のように作製する。
【０２７０】
精製を容易にするために、修飾された５’モノリン酸ヌクレオチドをまず六量体内に組み込む。架橋剤を含むウリジンの構築を示すが、いくつかの実施形態では、類似の技法を用いて他の塩基をストップコドンおよび疑似ストップコドンのどちらにも組み込むことができる：
【０２７１】
【化２５】
2008526973.tif 000043
【０２７２】
は、ｐＮ架橋剤の３’保護が存在しないことによるＡＵＧの優位点を用いたこと以外は上記のプロトコルと同様のプロトコルを用いて達成した。陰イオン交換ＨＰＬＣにより、生成物を過剰のＡＵＧから精製した。次いでＴ４  ＲＮＡリガーゼを用いて５’ｐＡＧビオチン３’を付加した。３’ビオチンは、単にＤｈａｒｍａｃｏｎから入手可能な便利な３’ブロッキング基であった。得られたＡＵＧＵ架橋剤ＡＧヒ゛オチンを再度精製し、次いで５’リン酸化し：
【０２７３】
【化２６】
2008526973.tif 000044
【０２７４】
にライゲーションして、
【０２７５】
【化２７】
2008526973.tif 000045
【０２７６】
を得た。
【０２７７】
収率は精製が不要となるほどに十分に高い。したがって、上記のプロトコルを用いて、本発明のいくつかの実施形態に従ってＳＡＴＡおよびナンセンスサプレッサーｔＲＮＡを作製および使用することができる。
実施例６：ピューロマイシンを必要としないｔＲＮＡ系の使用
本発明のいくつかの実施形態は、ピューロマイシン、ピューロマイシン類似体、または他のアミドリンカーを必要としない系および方法を提供する。１つの実施形態では、連結ｔＲＮＡ類似体およびナンセンスサプレッサーｔＲＮＡはピューロマイシンを必要とせず、以下の例に従って作製および使用することができる。
【０２７８】
ピューロマイシンを用いない系では、ｔＲＮＡをアミノアシル化するための翻訳系を用いることができる。他の実施形態では、化学的にアミノアシル化を達成できる。当業者は、どのようにｔＲＮＡを化学的にアミノアシル化するかを理解するであろう。翻訳系を用いる場合は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｓｉｔｕなどのアミノアシル化する任意の種類の翻訳系を用いることができる。１つの実施形態では、大腸菌翻訳系を用いる。大腸菌翻訳系は、ａａＲＳAlaによって認識されるように修飾したｔＲＮＡを用いる系で使用する。１つの実施形態では、これは安定したアクセプター（例えばピューロマイシン）を含まない系に好ましい。
【０２７９】
以下のｍＲＮＡの各３ｍｃｇを、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｓ３０大腸菌翻訳混合物の各４０マイクロリットル中で翻訳する：
【０２８０】
【化２８】
2008526973.tif 000046
【０２８１】
上記のように製作したアンバーサプレッサーｔＲＮＡの３ｍｃｇを、第１配列に加える。アンチコドン上に架橋剤を有するサプレッサーの３ｍｃｇを、第２配列に加える。３５Ｓ−メチオニンを両方に加えた後、混合物を３７℃で３０分間インキュベートする。その後、反応液を氷浴に入れることにより迅速に冷却し、平らなペトリ皿に移し、混合物が約３５０ｎｍ光源から１．５ｃｍだけ下方にあるように氷浴中に浮かべる。これらを約２０Ｊ／ｃｍで１５分間露光させる。
【０２８２】
照射後、混合物をフェノール抽出し、エタノール沈殿する。このようにして、連結ｔＲＮＡ類似体およびナンセンスサプレッサーｔＲＮＡなどの系をアミノアシル化し、本発明のいくつかの実施形態に従ってメッセージ（ｍＲＮＡ）をそのコードされたペプチドに結合させるために用いる。
実施例７：代替配列
好ましい実施形態では、上記の実施例１に記載したフラグメント１、２および３は、以下の代替配列を有する：
フラグメント１（配列番号１３）
【０２８３】
【化２９】
2008526973.tif 000047
【０２８４】
フラグメント２（配列番号１４）
【０２８５】
【化３０】
2008526973.tif 000048
【０２８６】
フラグメント３−先に記載した配列（配列番号６）から変化なし
【０２８７】
【化３１】
2008526973.tif 000049
【０２８８】
上記の方法を用いると、代替フラグメント１＋２＋３の配列は（配列番号１５）であった：
【０２８９】
【化３２】
2008526973.tif 000050
【０２９０】
ｔＲＮＡ類似体とナンセンスサプレッサーｔＲＮＡの連結に関して、アデノシンがピューロマイシンの置換に用いられていることを除いて、上記の配列は類似している。
【０２９１】
本発明の多くの好ましい実施形態およびその変形を詳述したが、当業者には他の改変および使用方法が容易に明らかであろう。上記の全ての実施形態において、方法のステップを逐次的に行う必要はない。したがって、本発明の精神または特許請求の範囲から逸脱せずに様々な応用、改変および置換を行い得ることを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２９２】
【図１】標的エピトープ結合タンパク質および免疫エフェクター抗体を含む複合体は、細胞表面上に発現したＦａｂイディオタイプを介して悪性細胞と反応した。
【図２】小さなヒトタンパク質（Ｅｂｂｄ）に対する既知のヒト抗体（Ａｂ）を示す図である。
【図３】ライゲーションの目的のための免疫エフェクター結合タンパク質（Ｅｂｂｄ）をコードするｍＲＮＡの拡大生成を示す図である。
【図４】特定の癌細胞表面で発現したエピトープと選択的に結合するタンパク質改良用のＰｒｏｔｅｏＮｏｖａシステムの概略図である。
【図５】悪性細胞上のイディオタイプまたは標的エピトープと結合するｍＲＮＡをタンパク質から分離する過程を示す図である。
【図６】二官能性タンパク質が、ヒトタンパク質（免疫エフェクター結合領域（Ｅｂｂｄ））をコードするｍＲＮＡのライゲーションにより作製されることを示す図である。
【図７】二官能性タンパク質を含む複合体形成により調製された、個別化した癌治療薬を示す図である。
【図８】治療薬により標識された悪性細胞の図を示す。
【図９】改良された第２のペプチド（免疫エフェクター結合領域）を含む治療薬を示す図である。
【図１０】改良された第２のペプチド（免疫エフェクター）を含む治療薬を示す図である。
【図１１】ｍＲＮＡおよびそのタンパク質生成物により形成される複合体の例を示す図である。
【図１２】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの選択および進化過程の１例を示す模式図である。
【図１３】本発明のｔＲＮＡ分子を構築する１方法を例示する図である。
【図１４】本発明の方法において、ｍＲＮＡをｔＲＮＡに連結することができるように架橋結合分子であるソラレンを配置することができる２つの代替実施形態について記載した図である。
【図１５】ウリジンおよびプソイドウリジンの化学構造を示す図である。
【図１６】本発明のいくつかの実施形態を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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