(57)【要約】  活性物質の均一かつ定義可能な輸送を確実にする生物分解可能なナノ粒子を利用可能とし、そして同時にこれらのナノ粒子の製造のための好適な方法を提供するために、ナノ粒子は本質的に水性のゼラチンゲルからなり、ここで、上記ナノ粒子の平均直径が３５０nm以下、上記ナノ粒子の多分散性指数が０．１５以下であり、ここで、上記製造方法のための出発物質としてゼラチンが使用され、分子量６５kDa未満のゼラチンの全ゼラチンに対する比率が４０重量％以下である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性ゼラチンゲルから本質的になるナノ粒子であって、ここで、該ナノ粒子の平均直径が３５０nm以下であり、かつ該ナノ粒子の多分散性指数が０．１５以下である、前記ナノ粒子。
【請求項２】
前記ナノ粒子の多分散性指数が０．１以下である、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記ナノ粒子の平均直径が２００nm以下である、請求項１又は２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
前記ナノ粒子の平均直径が１５０nm以下である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記ナノ粒子の直径の変動範囲が、前記平均直径よりも２０nm以下小さい又は大きい範囲である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項６】
前記ナノ粒子中に含まれる全ゼラチンに対する、６５kDa未満の分子量のゼラチンの比率が４０重量％以下である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項７】
前記ナノ粒子中に含まれる全ゼラチンに対する、６５kDa未満の分子量のゼラチンの比率が３０重量％以下である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項８】
前記ナノ粒子中に含まれる全ゼラチンに対する、６５kDa未満の分子量のゼラチンの比率が２０重量％以下である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項９】
前記ナノ粒子中に含まれるゼラチンが架橋されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
前記ゼラチンが、ホルムアルデヒド、ジアルデヒド、イソシアネート、ジイソシアネート、カルボジイミド又はアルキルジハライドによって架橋される、請求項９に記載のナノ粒子。
【請求項１１】
前記ゼラチンが酵素によって架橋される、請求項９に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
前記ゼラチンがトランスグルタミナーゼ又はラッカーゼによって架橋される、請求項１１に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
前記ナノ粒子の水分含量が、１５重量％以下である、請求項１〜１２のいずれか1項に記載のナノ粒子。
【請求項１４】
医薬が前記ナノ粒子の表面に結合される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１５】
前記医薬の結合が、前記ナノ粒子の表面の化学的修飾によりもたらされる、請求項１４に記載のナノ粒子。
【請求項１６】
前記医薬が吸着により結合される、請求項１４又は１５に記載のナノ粒子。
【請求項１７】
前記医薬が、共有結合される、請求項１４又は１５に記載のナノ粒子。
【請求項１８】
前記医薬が、イオン結合される、請求項１４又は１５に記載のナノ粒子。
【請求項１９】
前記医薬がスペーサーを介して結合される、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項２０】
薬物の製造のための生物分解可能な担体媒体としての、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のナノ粒子の使用。
【請求項２１】
前記ナノ粒子が、細胞内ドラッグデリバリーシステムの一部、特に核酸又はペプチドのための担体媒体である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記薬物が遺伝子治療のための薬物である、請求項２０又は２１に記載の使用。
【請求項２３】
水性ゼラチンゲルから本質的に成るナノ粒子の製造方法であって、以下のステップ：
（ａ）全ゼラチンに対する、分子量６５kDa未満のゼラチンの比率が、４０重量％以下である、水性ゼラチン溶液の製造；
（ｂ）前記ゼラチン溶液のｐＨ値の７．０未満の値への調節；
（ｃ）沈殿剤を添加した結果としての前記ゼラチンの沈殿；及び
（ｄ）遠心分離の結果としての前記ナノ粒子の分離。
を含む、前記方法。
【請求項２４】
前記ステップ（ａ）において、全ゼラチンに対する分子量６５kDa未満のゼラチンの比率が３０重量％以下である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ステップ（ａ）において、全ゼラチンに対する分子量６５kDa未満のゼラチンの比率が２０重量％以下である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記ステップ（ｂ）において、前記pH値が３．０以下の値に調節される、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ステップ（ｂ）において、前記pH値が１．５〜３．０の範囲の値に調節される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ステップ（ｃ）において、前記沈殿剤がアセトン、アルコール、又は該２つの混合物であり、水性溶液中で適用可能である、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
以下のステップ：
（ｃ’）前記ゼラチン溶液に架橋剤を添加する、
が前記ステップ（ｃ）及び（ｄ）の間に起こる、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記架橋剤が、ホルムアルデヒド、ジアルデヒド、イソシアネート、ジイソシアネート、カルボジイミド及びアルキルハライドから選ばれる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記架橋剤が酵素である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記架橋剤がラッカーゼ又はトランスグルタミナーゼである、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、ナノ粒子、薬物の製造のためのナノ粒子の使用およびナノ粒子の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤のための担体システムとしてのナノ粒子は、７０年代から知られている。それらは、体の所望の領域への活性物質の標的輸送を促進し、ここで、その放出は標的部位のみで起こる（所謂ドラッグデリバリーシステム）。同時に、未だ放出されていない活性物質は、体の代謝の影響に対して有効に保護される。その結果、活性物質の分子がそれらの実際の標的部位に圧倒的かつ選択的に到達し、かつ生物体全体に対する負荷がより少ないため、副作用が最小化されることができる。
【０００３】
ポリアクリレート、ポリアミド、ポリスチレンおよびシアノアクリレートなどの多数の合成出発物質がナノ粒子の製造についての文献中に記載される。しかし、これらの巨大分子の決定的な不利益は、それらの生物分解性が低いかまたはないことである。
【０００４】
なかでも、フィブロネクチン、多様なポリサッカライド、アルブミン、コラーゲンおよびゼラチンが、体内で分解可能な自然の担体材料として知られている。
【０００５】
知られたナノ粒子においては一部、均一な放出および輸送行動の目的に関して不利益である、広いサイズ分布におけるさらなる困難性がある。かかるナノ粒子のサイズ分布は、複雑な遠心分離および他の分離方法によってある程度狭められることができるが、満足のいく結果に導くものではない。
【発明の開示】
【０００６】
本出願の基礎をなす目的は、したがって、活性物質の均一かつ定義可能な輸送を確実にする生物分解性のナノ粒子を作製することである。同時に、これらのナノ粒子の好適な製造方法を特定することが目的である。
【０００７】
この目的は、冒頭に示されたタイプのナノ粒子の場合には、それらが水性ゼラチンゲルから本質的になることで達成され、ここで、該ナノ粒子の平均直径は、３５０nm以下であり、かつ該ナノ粒子の多分散性指数は０．１５以下である。
【０００８】
ゼラチンは、ナノ粒子のための出発物質として多くの利点を有する。それは、定義された組成および純度において利用可能であり、かつ比較的低い抗原としての能力を有する。さらに、ゼラチンは非経口的使用、なかでも血漿増補液として推奨される。
【０００９】
さらに、ゼラチンのアミノ酸側鎖は、ナノ粒子の表面を化学的に修飾する、ゼラチンを架橋させるかまたは活性物質の分子を該粒子に共有結合させるという単純な可能性を提供する。
【００１０】
「水性ゼラチンゲル」という用語は、本出願の意味の範囲内において、ナノ粒子中に含まれるゼラチンが水和形態、すなわちハイドロコロイドとして存在することを意味する。ナノ粒子がその製造および使用の間、常に水性溶液に取り囲まれているため、ナノ粒子のサイズおよび多分散性に関するすべての仕様はこの水和形態に関する。これらのパラメータの測定は、光子相関分光法（PCS）の標準的方法によって実施され、そして以下においてより詳細に記載される。
【００１１】
「本質的に成る」という言い回しは、本発明の意味の範囲内においては、ナノ粒子が９５重量％以上、好ましくは９７重量％以上、より好ましくは９８重量％以上、そして最も好ましくは９９重量％以上の水性ゼラチンゲルから成ると理解されるべきである。
【００１２】
多分散性指数は、ナノ粒子のサイズ分布について尺度であり、ここで、１（最大の分散）と０（すべての粒子が同じサイズ）の間の値が理論的に可能である。０．１５以下である本発明のナノ粒子の低い多分散性指数は、活性物質の制御可能な輸送、並びに特に体細胞によるナノ粒子の吸収の間の所望の標的部位における放出を確実にする。
【００１３】
０．１以下の多分散性指数を有するナノ粒子が特に好ましい。
【００１４】
ナノ粒子のサイズは、それらの有用性の決定因子であり、適用分野によって変動しうる。多くの場合、２００nm以下の平均直径のナノ粒子が好ましい。
【００１５】
本発明のさらなる実施態様は、１５０nm以下、好ましくは８０〜１５０nmの平均直径のナノ粒子に関する。これらは、所謂EPR効果（促進された透過性および保持）を引き出すことによって使用されてよい。特定のサイズ範囲のナノ粒子に関して、この効果は、健康な細胞よりもより大きな吸収率を有する腫瘍細胞の選択的な治療を促進する。
【００１６】
ナノ粒子のサイズ分布についてのさらなるパラメータは、平均値より最大でも２０nm大きいかまたは小さいことが好ましい直径の変動範囲である。この範囲も同様にPCS手段により測定されることができる。
【００１７】
本発明のナノ粒子の性質は、その中に含まれるゼラチンの分子量分布にも影響される。この関係において、ナノ粒子中に含まれる全ゼラチンに対する低分子量ゼラチンの比率、特に６５kDa未満の分子量のゼラチンの比率は、重要である。この比率は、好ましくは４０重量％未満である。３０重量％未満、好ましくは２０重量％以下、の比率が特に有利である。
【００１８】
技術水準において、（PCT国際特許出願公開第WO01/47501A1号中に記載されたようなコアセルベーション法により製造されたナノ粒子などの）さらなるポリマー構造を含むナノ粒子は、ゼラチンと関連して最も頻繁に記載される。純粋なゼラチンからここまで製造されたナノ粒子は、不安定であるかまたは活性物質の選択的な輸送のための粒子径およびサイズ分布に関する上記の有利なパラメータを有さない。
【００１９】
更に好ましい実施態様においては、ナノ粒子中に含まれるゼラチンは架橋されている。ナノ粒子の安定性は、架橋形成によって顕著に増加し、そしてさらに、ナノ粒子の分解挙動は、選択された架橋の程度の結果として選択的に調節されることができる。別々の適用分野は通常、ナノ粒子の定義された分解時間を要求するため、これは有利である。
【００２０】
特に、６５kDa未満の分子量のゼラチンの比率が２０重量％未満である場合の架橋については顕著である。
【００２１】
架橋していないナノ粒子は、体外の、特に室温などのゼラチンの融点未満で実施可能な診断的適用に適している。
【００２２】
これとは対照的に、上記の架橋ナノ粒子は特に治療的適用に好適である。
【００２３】
ゼラチンは、ホルムアルデヒド、ジアルデヒド、イソシアネート、ジイソシアネート、カルボジイミドまたはアルキルジハライドなどによって化学的に架橋されることができる。
【００２４】
或いは、トランスグルタミナーゼまたはラッカーゼなどによる酵素的架橋も行われることができる。
【００２５】
さらなる実施態様においては、本発明のナノ粒子は、好ましくは、１５重量％以下の水分含量となるまで乾燥される。
【００２６】
本発明のさらなる実施態様は、その表面に医薬が結合されるナノ粒子に関する。
【００２７】
好ましい実施態様においては、ナノ粒子の表面は、その結果として荷電した側鎖または新たな化学的官能基を有する側鎖が生じる、ゼラチンの遊離アミノ基またはカルボキシル基の反応によって、活性物質の結合の前に化学的に修飾される。
【００２８】
ナノ粒子または化学的に修飾されたナノ粒子への医薬の結合は、共有結合またはイオン結合による吸着力によってもたらされることができる。例えば、DNAまたはRNA断片は、対応する化学的修飾の結果、表面が陽性に荷電したナノ粒子にイオン結合されることができる。
【００２９】
さらなる実施態様においては、活性物質のナノ粒子への結合はスペーサーを介しておこる。
【００３０】
上記のナノ粒子は、それらが薬物の製造のために架橋される限りにおいて本発明にしたがって使用されることができる。
【００３１】
細胞内ドラッグデリバリーシステムのためのナノ粒子の使用は、特に核酸またはペプチドのための担体媒体として特に有益である。
【００３２】
本発明によるナノ粒子による薬物治療は、遺伝子治療において好ましく使用されることができる。
【００３３】
さらに、本発明は、冒頭で述べたタイプのナノ粒子の製造方法にも関する。
【００３４】
方法に関する本発明の基礎をなす目的は、全ゼラチンに対する分子量６５kDa未満のゼラチンの比率が４０重量％以下である、ゼラチンが製造方法の出発物質として使用される発明によって達成される。
【００３５】
かかるゼラチンを使用する結果、多分散性が低くかつ粒子直径の変動範囲の小さいナノ粒子、特に多分散性指数が０．１５以下の本発明のナノ粒子、が単純なやり方で製造されることができる。
【００３６】
本発明による方法の場合、かかるゼラチンからまず水性溶液が生成され、この溶液のpH値が次に７．０未満に調節される。この溶液に好適な沈殿剤を添加することにより、溶解されたゼラチンの脱溶媒和がナノ粒子の形態で起こり、これは次に単純な遠心分離によって溶液から分離される。密度勾配遠心法などによるナノ粒子の分画は必要でない、なぜなら、本発明による製造方法の結果としてそれらの多分散性は既に適切に低い範囲にあるからである。
【００３７】
水性ゼラチン溶液への補助剤、特に塩または洗剤などの界面活性剤の添加は、本発明の方法の枠組み内では必要でない。したがって、本発明のナノ粒子は、特定の添加剤を本質的に含まないことが好ましい。したがって、本発明による方法は、水性ゼラチンゲルのみから本質的に成るナノ粒子の製造を進にする。
【００３８】
上記の分子量分布を有するゼラチンを使用した結果、安定なナノ粒子の生成が確実となる。この方法の場合、低分子量の比率のより高いゼラチンは、多くの場合、より大きな凝集または不安的な粒子の生成をもたらす。
【００３９】
分子量６５kDa未満のゼラチンの比率は、３０重量％以下が好ましく、２０重量％以下であることが最も好ましい。
【００４０】
上記方法の好ましい実施態様においては、ゼラチンの調節されたpH値は、３．０以下であり、１．５〜３．０であることが好ましい。この範囲内では、pH値を介する影響は、部分的に平均粒子サイズに及び、ここで、より低いpH値はより小さなナノ粒子に導く傾向にある。
【００４１】
さらなる、好ましい実施態様においては、アセトン、エタノールなどのアルコールが沈殿剤として使用されるかまたはこれらの沈殿剤の混合物若しくはこれらの沈殿剤と水との混合物が使用され、ここで、アセトンが沈殿剤として好ましい。
【００４２】
かかる揮発性の沈殿剤を使用した結果、ナノ粒子中に取り込まれ及び／又はナノ粒子中に残存する沈殿剤の比率をかなりの程度回避し、そしてナノ粒子が水性ゼラチンゲルのみから本質的に成ることが可能である。
【００４３】
架橋されたナノ粒子の製造のためには、沈殿剤が添加された後でかつ遠心分離の前に架橋剤が添加される。この実施態様においては、架橋の間の粒子の凝集を妨げるためには、分子量６５kDa未満のゼラチンの比率が２０重量％以下であることが好ましい。この方法により、変動が±２０nm以下の範囲であり、かつ多分散性指数が０．１以下である、非常に均一なナノ粒子が製造されることができる。
【００４４】
分子量分布の測定
ゼラチンから製造されたナノ粒子の性質は、上記のように、このゼラチンの分子量分布を介する影響を受けることができる。分子量分布は、ゲル透過クロマトグラフィー（GPC）によって確認されることができる。
【００４５】
測定は、以下の成分を有するHPLCシステムを用いて実施される：
HPLCポンプ：  Pharmacia 2249
UV検出器：    LKW2151
分離カラム：    プレカラムを備えたTFK 400 SWXL（Tosoh Biosep GmbH社）
フロー剤：      １重量％のSDS、１００mmol／l Na2SO4、１０mmol/l 
NaH2PO4/NaOH  pH５．３
【００４６】
ゼラチンを３０分間膨潤させ、次に約６０℃で溶解させることによって、１重量％のゼラチン水溶液を生成する。０．２μlの使い捨てフィルターを通して濾過した後、３０μlのゼラチン溶液を６００μlのフロー剤及び３０μlの０．０１重量％の安息香酸溶液と混合する。この混合物２０μlを用いて、流速０．５ml/分及び２１４nmでのUV検出でGPCを実施する。
【００４７】
溶出体積と分子量の間の分配は、知られた分子量分布を有する標準的なゼラチンによるシステムのキャリブレーションによって行われる。それぞれの分子量範囲にあるゼラチンの比率は、クロマトグラムの定義された領域への再分割及びUV検出器シグナルの積分の結果として計算されることができる。
【００４８】
図１においては、２つの異なるゼラチンのゲル透過クロマトグラムが例として図示される。
【００４９】
図１Aは、ブルーム値（Bloom-Wert）１７５の市販の豚皮ゼラチン（ゼラチンタイプA）のGPCを示す。４５重量％を超える、分子量６５kDa未満のゼラチンの高い比率により、このゼラチンは本発明のナノ粒子の製造方法には適さず、かつ、多分散性の高すぎる粒子又は粒子の凝集に導く。
【００５０】
図１Bは、ブルーム値３１０及び約１５重量％の分子量６５kDa未満のゼラチンの比率を有する豚皮ゼラチンのGPCを示す。このゼラチンは、本発明による製造方法に非常によく適している。
【００５１】
平均粒子直径及び多分散性指数の測定
光子相関分光法は、ナノ粒子の平均粒子直径、多分散性指数及び平均値よりも上及び下の粒子直径の変動範囲の測定を可能とする。
【００５２】
測定は、BI-200ゴニオメーターバージョン２（Brookhaven Instruments Corp., Holtsville NY, USA）によって実施した。この目的のために、脱ミネラル水中の１０〜５０μg/mlの濃度のナノ粒子懸濁液を使用した。
【実施例】
【００５３】
実施例１
この実施例は、ゼラチンからなる架橋されたナノ粒子の製造を記載し、（分子量６５kDa未満のゼラチンの比率が約１５重量％である）該ナノ粒子のGPCを図１Bに図示する。
【００５４】
上記ゼラチン３００mgを５０℃の水に溶解する。塩酸でpH値を２．５に調節した後、４５mlのアセトンを滴下して加え、ゼラチンの脱溶媒和を実施する。１０分間攪拌後、４０μlの８％水性グルタルアルデヒド溶液を加え、そして続いてさらに３０分攪拌する。このようにして架橋されたナノ粒子を、１０，０００ｇでの１０分間の遠心分離により溶液から分離し、そしてアセトン／水（３０／７０）中に再分散させて３回すすぐ。最後の再分散に続いて、アセトンを５０℃で蒸発させる。
【００５５】
この単純な方法は、さらなる分離ステップなしに、約０．０８の多分散性指数における約１６０nmの平均直径が上記のPCS法によって確認された、本発明のナノ粒子に導く。サイズクラスによるナノ粒子の分布を図３に図示する。
【００５６】
架橋されないナノ粒子に対する比較試験は、出発物質中の比率にかなり対応する、生成されたナノ粒子中の低分子量ゼラチンの比率をもたらした。
【００５７】
実施例２
架橋されたナノ粒子を実施例１のとおりに製造し、ここで、その分子量６５kDa未満のゼラチンの比率が約１９重量％である、ブルーム値２７０の豚皮ゼラチンを出発物質として使用する。
【００５８】
本発明のナノ粒子について確認した約０．０８の多分散性指数における約１７３nmの平均直径を、上記のPCS法によってただちに得た。サイズ分布は、実施例１により製造したナノ粒子に匹敵した。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
以下において、本発明は図面を参照しながら実施例に基づいてより詳細に説明される。これらは、詳しくは：
【図１Ａ】（図１Aは）2つのゼラチンのうちの1つのゼラチンの分子量分布を示す、ゼラチンのゲル透過クロマトグラム。
【図１Ｂ】（図１Bは）2つのゼラチンのうちの1つのゼラチンの分子量分布を示す、ゼラチンのゲル透過クロマトグラム。
【図２】本発明によるナノ粒子の電子顕微鏡写真である。
【図３】本発明によって製造されたナノ粒子のサイズ分布。
【図１Ａ】
2008510688.tif 000002
【図１Ｂ】
2008510688.tif 000003
【図２】
2008510688.tif 000004
【図３】
2008510688.tif 000005
【国際調査報告】
2008510688.tif 000006
2008510688.tif 000007
2008510688.tif 000008
2008510688.tif 000009
2008510688.tif 000010
2008510688.tif 000011