(57)【要約】  本発明は、混合物からの標的種（例えば標的核酸種）の単離方法に関する。本発明の方法において、混合物を、可逆的および選択的に標的種を結合するものの一つである多官能基を含む表面を有する固相担体と組み合わせる。特定の態様において、混合物を、可逆的に核酸を結合する第一の官能基ならびに選択的および可逆的に標的核酸種を結合する第二の官能基を有する固相担体と組み合わせて、それにより第一の組み合わせを生じる。核酸の第一の官能基への結合、および標的核酸種の第二の官能基への結合に適した条件下で、第一の組み合わせを維持する。固相担体を第一の組み合わせから分離し、固相担体の第一の官能基から核酸、または第二の官能基から標的核酸種のいずれかを、選択的に除去する（例えば溶出する）薬剤（例えばバッファ）と組み合わせて、それにより複数の核酸種を含む混合物から標的核酸種を単離する。
2008510456.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)  核酸を結合する第一の官能基および核酸の標的種を選択的に結合する第二の官能基を含む表面を有する固相担体と混合物とを組み合わせて、それにより第一の組み合わせを生じる工程；
b)  核酸の第一の官能基への結合に適した条件下で、第一の組み合わせを維持する工程；
c)  第一の組み合わせから固相担体を分離する工程；
d)  固相担体の第一の官能基から核酸を除去し、固相担体の第二の官能基に核酸の標的種を結合させる、少なくとも一つの薬剤と固相担体とを組み合わせて、それにより第二の組み合わせを生じる工程；ならびに
e)  第二の組み合わせから固相担体を分離する工程、
それにより核酸を含む混合物中に存在する核酸の標的種を単離する工程
を含む、混合物中に存在する核酸分子の標的種の選択的な単離方法。
【請求項２】
工程d) において、固相担体の第一の官能基から核酸を除去する第一の薬剤、および核酸の標的種が固相担体の第二の官能基に結合することを可能にする第二の薬剤と固相担体とを組み合わせて、それにより第二の組み合わせを生じる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
核酸の標的種がDNA、RNAおよびPNAからなる群より選択される核酸種である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
第一の薬剤がTris、TE、ホルムアミドまたはその組み合わせを含むバッファである、請求項２記載の方法。
【請求項５】
バッファが、DNaseおよびRnaseからなる群より選択される酵素をさらに含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
バッファが溶解剤をさらに含む、請求項４記載の方法。
【請求項７】
固相担体が磁性微粒子である、請求項２記載の方法。
【請求項８】
第一の官能基がCOOHであり、第二の官能基が核酸の標的種に相補的である核酸配列である、請求項２記載の方法。
【請求項９】
a)  核酸を結合する第一の官能基およびmRNAを選択的に結合する第二の官能基を含む表面を有する固相担体と混合物とを組み合わせて、それにより第一の組み合わせを生じる工程；
b)  核酸の第一の官能基への結合に適した条件下で、第一の組み合わせを維持する工程；
c)  第一の組み合わせから固相担体を分離する工程；
d)  固相担体の第一の官能基から核酸を除去し、固相担体の第二の官能基にmRNAを結合させる、少なくとも一つの薬剤と固相担体とを組み合わせて、それにより第二の組み合わせを生じる工程；ならびに
e)  第二の組み合わせから固相担体を分離する工程、
それにより核酸を含む混合物中に存在するmRNAを単離する工程
を含む、核酸を含む混合物中に存在するmRNAの単離方法。
【請求項１０】
工程d) において、固相担体の第一の官能基から核酸を除去する第一の薬剤、およびmRNAが固相担体の第二の官能基に結合することを可能にする第二の薬剤と固相担体とを組み合わせて、それにより第二の組み合わせを生じる、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
混合物が生物学的試料である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
生物学的試料が、全細胞、組織、溶解物および血液からなる群より選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
固相担体が磁性微粒子である、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
第一の官能基がCOOHであり、第二の官能基がオリゴdT、修飾オリゴdTおよびその組み合わせからなる群より選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
固相担体の第一の官能基から核酸を溶出するバッファが水を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
磁場を印加する方法、真空を利用する方法および遠心分離を利用する方法からなる群より選択される方法を用いて、固相担体が除去される、請求項１０記載の方法。
【請求項１７】
第一の官能基から核酸を溶出する前に、汚染物を除去するために固相担体と洗浄バッファとを接触させる工程をさらに含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１８】
固相担体の第一の官能基から核酸を溶出する前に、固相担体とDNAを消化する薬剤とを接触させる工程をさらに含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１９】
該薬剤がDNaseである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
固相担体の第二の官能基からmRNAを溶出する工程をさらに含む、請求項１０記載の方法。
【請求項２１】
mRNAが水、Tris、TEおよびホルムアミドからなる群より選択されるバッファ中に溶出される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
a)  核酸を結合する第一の官能基およびグロビンRNAを選択的に結合する第二の官能基を含む表面を有する固相担体と混合物とを組み合わせて、それにより第一の組み合わせを生じる工程；
b)  核酸の第一の官能基への結合に適した条件下で、第一の組み合わせを維持する工程；
c)  第一の組み合わせから固相担体を分離する工程；
d)  固相担体の第一の官能基から核酸を除去し、固相担体の第二の官能基にグロビンRNAを結合させる、少なくとも一つの薬剤と固相担体とを組み合わせて、それにより第二の組み合わせを生じる工程；ならびに
e)  第二の組み合わせから固相担体を分離する工程、
それにより核酸を含む混合物中に存在するグロビンRNAを分離する工程
を含む、混合物中に存在する核酸からのグロビンRNAの分離方法。
【請求項２３】
工程d) において、固相担体の第一の官能基から核酸を除去する第一の薬剤、およびグロビンRNAが固相担体の第二の官能基に結合することを可能にする第二の薬剤と固相担体とを組み合わせて、それにより第二の組み合わせを生じる、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
固相担体が磁性微粒子である、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
第一の官能基がCOOHであり、第二の官能基がβグロビンRNA配列に相補的である配列を含む、オリゴヌクレオチドである、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
a)  混合物中に存在するグロビンRNA配列に相補的である配列を含む、ビオチン標識されたオリゴヌクレオチドと混合物とを組み合わせて、それにより第一の組み合わせを生じる工程；
b)  オリゴヌクレオチドとグロビンRNAの間でハイブリダイゼーションが起こる条件下で、第一の組み合わせを維持する工程；
c)  核酸を結合する第一の官能基、およびビオチンを選択的に結合する第二の官能基を有する固相担体と第一の組み合わせとを組み合わせて、それにより第二の組み合わせを生じる工程；
d)  核酸が第一の官能基に結合し、グロビンRNAにハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドが固相担体の第二の官能基に結合する条件下で、第二の組み合わせを維持する工程；
e)  第二の組み合わせから固相担体を分離する工程；
f)  第一の官能基から核酸を溶出する試薬と固相担体とを組み合わせる工程、
それにより混合物中に存在する核酸からグロビンRNAを分離する工程
を含む、混合物中に存在する核酸からのグロビンRNAの分離方法。
【請求項２７】
グロビンRNAがβグロビンRNAである、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
a)  核酸を結合する第一の官能基およびエンドトキシンを選択的に結合する第二の官能基を含む表面を有する固相担体と混合物とを組み合わせて、それにより第一の組み合わせを生じる工程；
b)  核酸の第一の官能基への結合、およびエンドトキシンの第二の官能基への結合に適した条件下で、第一の組み合わせを維持する工程；
c)  第一の組み合わせから固相担体を分離する工程；
d)  固相担体の第一の官能基から核酸を除去する少なくとも一つの薬剤と固相担体とを組み合わせて、それにより第二の組み合わせを生じる工程；および
e)  第二の組み合わせから固相担体を分離する工程、
それにより混合物中に存在する核酸からエンドトキシンを分離する工程
を含む、混合物中の核酸からのエンドトキシンの分離方法。
【請求項２９】
固相担体が磁性微粒子である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
第一の官能基がCOOHであり、第二の官能基がポリミキシンB、ネイティブリムルス抗LPS因子（LALF）および組換えLALFからなる群より選択される、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
a)  核酸を結合する第一の官能基およびエンドトキシンを選択的に結合する第二の官能基を含む表面を有する固相担体と混合物とを組み合わせて、それにより第一の組み合わせを生じる工程；
b)  エンドトキシンの第二の官能基への結合に適した条件下で、第一の組み合わせを維持する工程；
c)  第一の組み合わせから固相担体を分離する工程；
d)  核酸を結合する官能基を含む表面を有する固相担体と第一の組み合わせとを組み合わせて、それにより第二の組み合わせを生じる工程；
e)  工程d) の固相担体の官能基への核酸の結合に適した条件下で、第二の組み合わせを維持する工程；
e)  第二の組み合わせから固相担体を分離する工程、
それにより混合物中に存在する核酸からエンドトキシンを分離する工程
を含む、混合物中の核酸からのエンドトキシンの分離方法。
【請求項３２】
工程e) の固相担体から核酸を溶出する工程をさらに含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
第一の官能基がCOOHであり、第二の官能基がポリミキシンB、ネイティブリムルス抗LPS因子（LALF）および組換えLALFからなる群より選択される、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
a)  生物体を結合する第一の官能基および核酸を結合する第二の官能基を含む表面を有する固相担体と生物体とを組み合わせて、それにより第一の組み合わせを生じる工程；
b)  生物体が第一の官能基に結合する条件下で第一の組み合わせを維持する工程；
c)  第一の組み合わせから固相担体を分離する工程；
d)  生物体を溶解し、生物体の核酸を第二の官能基に結合させる薬剤と固相担体とを組み合わせて、それにより第二の組み合わせを生じる工程；
e)  生物体が溶解され、生物体の核酸が第二の官能基に結合する条件下で、第二の組み合わせを維持する工程、
それにより生物体の核酸を単離する工程
を含む、生物体の核酸の単離方法。
【請求項３５】
工程e) の固相担体から核酸を溶出する工程をさらに含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
第一の官能基がCOOHであり、第二の官能基がポリエチレンイミンである、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
a)  順方向伸長産物および逆方向伸長産物を含むシークエンス反応混合物と、順方向伸長産物を選択的に結合する第一の官能基および核酸を結合する第二の官能基を含む表面を有する固相担体とを組み合わせて、それにより第一の組み合わせを生じる工程；
b)  順方向伸長産物の第一の官能基への結合および逆方向伸長産物の第二の官能基への結合に適した条件下で、第一の組み合わせを維持する工程；
c)  第一の組み合わせから固相担体を分離する工程；
d)  固相担体の第二の官能基から逆方向伸長産物を選択的に溶出するバッファと固相担体とを組み合わせて、それにより第二の組み合わせを生じる工程；ならびに
e)  第二の組み合わせから固相担体を分離する工程、
それによりシークエンス反応の順方向伸長産物および逆方向伸長産物を分離する工程
を含む、シークエンス反応の順方向伸長産物および逆方向伸長産物の分離方法。
【請求項３８】
第一の官能基がストレプトアビジンであり、第二の官能基がCOOHである、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
順方向伸長産物がビオチン化される、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
固相担体が磁性微粒子である、請求項３７記載の方法。
【請求項４１】
磁場を印加する方法、真空を利用する方法および遠心分離を利用する方法からなる群より選択される方法を用いて、固相担体が除去される、請求項３７記載の方法。
【請求項４２】
第二の官能基から逆方向伸長産物を溶出する前に、汚染物を除去するために固相担体と洗浄バッファとを接触させる工程をさらに含む、請求項３７記載の方法。
【請求項４３】
固相担体の第二の官能基から逆方向伸長産物を選択的に溶出するバッファが水である、請求項３７記載の方法。
【請求項４４】
工程e) の固相担体から順方向伸長産物を溶出する工程をさらに含む、請求項３７記載の方法。
【請求項４５】
逆方向伸長産物および順方向伸長産物をシークエンスする工程をさらに含む、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
a)  順方向伸長産物および逆方向伸長産物を含むシークエンス反応混合物と、順方向伸長産物を選択的に結合する第一の官能基および核酸を結合する第二の官能基を含む表面を有する固相担体とを組み合わせて、それにより第一の組み合わせを生じる工程； 
b)  順方向伸長産物の第一の官能基への結合に適した条件下で、第一の組み合わせを維持する工程；
c)  第一の組み合わせから固相担体を分離し、それにより逆方向伸長産物を含む第二の混合物を生じる工程；
d)  固相担体の第一の官能基から順方向伸長産物を選択的に溶出するバッファと固相担体とを組み合わせて、それにより第二の組み合わせを生じる工程；
e)  第二の組み合わせから固相担体を分離する工程；
f)  固相担体とc) の第二の混合物とを組み合わせて、それにより第三の組み合わせを生じる工程；
g)  逆方向伸長産物の第二の官能基への結合に適した条件下で、第三の組み合わせを維持する工程；
h)  第三の組み合わせから固相担体を分離する工程；ならびに
g)  固相担体の第二の官能基から逆方向伸長産物を選択的に溶出するバッファと固相担体とを組み合わせる工程、
それによりシークエンス反応の順方向伸長産物および逆方向伸長産物を分離する工程
を含む、シークエンス反応の順方向伸長産物および逆方向伸長産物の分離方法。
【請求項４７】
ヘテロ二官能性ビーズおよび細胞溶解バッファを含むキット。
【請求項４８】
COOH官能基およびオリゴdT官能基を含むヘテロ二官能性磁性微粒子、ならびに細胞溶解バッファを含むキット。
【請求項４９】
COOH官能基、およびβグロビンRNA配列に相補的であるオリゴヌクレオチドを含む官能基を含むヘテロ二官能性磁性微粒子、ならびに細胞溶解バッファを含むキット。
【請求項５０】
COOH官能基およびストレプトアビジン基を含むヘテロ二官能性磁性微粒子、ならびに結合および／または洗浄バッファを含むキット。
【請求項５１】
COOH官能基およびポリミキシンB官能基を含む、ヘテロ二官能性磁性微粒子を含むキット。
【請求項５２】
COOH官能基およびリムルス抗LPS因子官能基を含む、ヘテロ二官能性磁性微粒子を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、2004年7月30日に出願された米国仮特許出願第60/592,917号の利益を主張する。上記出願の全体の教示は、参照により本明細書に援用される。
【０００２】
（発明の背景）
キャピラリー電気泳動法、ヌクレオチドシークエンス、逆転写クローニング、および哺乳類細胞のトランスフェクション、形質導入またはマイクロインジェクションを企図する遺伝子治療プロトコール等の多くの分子生物学的応用が、高品質な核酸調製物およびペプチド調製物の単離を必要とする。かかる高品質な核酸調製物およびペプチド調製物を産生する方法への必要性がある。
【０００３】
（発明の概要）
本発明は、核酸を結合する第一官能基および核酸の標的種を選択的に結合する第二官能基を含む表面を有する固相担体と混合物を組み合わせることにより、第一の組み合わせを生じる工程を含む、混合物中に存在する核酸分子の標的種を選択的に単離する方法に関する。第一の組み合わせを、核酸が第一官能基に結合するのに適当な条件下で維持する。固相担体を第一の組み合わせから除去し、固相担体の第一官能基から核酸を除去（溶出）し、固相担体の第二官能基への核酸の標的種の結合を促進する（可能にする、引き起こす）薬剤と組み合わせることにより、第二の組み合わせを生じる。固相担体を第二の組み合わせから分離することにより、核酸を含む混合物中に存在する核酸の標的種を単離する。
【０００４】
本発明はまた、核酸を結合する第一官能基および核酸の標的種を選択的に結合する第二官能基を含む表面を有する固相担体と混合物を組み合わせることにより、第一の組み合わせを生じる工程を含む、核酸を含む混合物中に存在する核酸分子の標的種を選択的に単離する方法に関する。第一の組み合わせを、核酸が第一官能基に結合するのに適当な条件下で維持する。固相担体を第一の組み合わせから除去し、固相担体の第一官能基から核酸を除去する第一の薬剤、および固相担体の第二官能基への核酸の標的種の結合を可能にする第二の薬剤と組み合わせることにより、第二の組み合わせを生じる。固相担体を第二の組み合わせから分離することにより、核酸を含む混合物中に存在する核酸の標的種を単離する。
【０００５】
ある態様において本発明は、核酸を結合する第一官能基およびmRNAを選択的に結合する第二官能基を含む表面を有する固相担体と混合物を組み合わせることにより、第一の組み合わせを生じる工程を含む、核酸を含む混合物中に存在するmRNAを単離する方法に関する。第一の組み合わせを、核酸が第一官能基に結合するのに適当な条件下で維持する。固相担体を第一の組み合わせから分離し、固相担体の第一官能基から核酸を除去し、固相担体の第二官能基へmRNAを結合する薬剤と組み合わせることにより、第二の組み合わせを生じる。固相担体を第二の組み合わせから除去することにより、核酸を含む混合物中に存在するmRNAを単離する。
【０００６】
本発明はまた、核酸を結合する第一官能基およびmRNAを選択的に結合する第二官能基を含む表面を有する固相担体と混合物を組み合わせることにより、第一の組み合わせを生じる工程を含む、核酸を含む混合物中に存在するmRNAを単離する方法に関する。第一の組み合わせを、核酸が第一官能基に結合するのに適当な条件下で維持する。固相担体を第一の組み合わせから除去し、固相担体の第一官能基から核酸を除去する第一の薬剤、および固相担体の第二官能基へのmRNAの結合を可能にする第二の薬剤と組み合わせることにより、第二の組み合わせを生じる。第一および第二の薬剤は、同時または順次に加えられ得る。固相担体を第二の組み合わせから分離することにより、核酸を含む混合物中に存在するmRNAを単離する。
【０００７】
混合物中に存在する核酸からグロビンRNAを分離する方法はまた、本発明により包含される。該方法は、核酸を結合する第一官能基およびグロビンRNAを選択的に結合する第二官能基を含む表面を有する固相担体と混合物を組み合わせることにより、第一の組み合わせを生じる工程を含む。第一の組み合わせを、核酸が第一官能基に結合するのに適当な条件下で維持する。固相担体を第一の組み合わせから分離し、固相担体の第一官能基から核酸を除去し、固相担体の第二官能基へグロビンRNAを結合する少なくとも一つの薬剤と組み合わせることにより、第二の組み合わせを生じる。固相担体を第二の組み合わせから分離することにより、核酸を含む混合物中に存在するグロビンRNAを単離する。特定の態様において、固相担体が、固相担体の第一官能基から核酸を除去する第一の薬剤、および固相担体の第二官能基へのグロビンRNAの結合を可能にする第二の薬剤と組み合わせることにより、第二の組み合わせを生じる。第一および第二の薬剤は、同時または順次に加えられ得る。別の態様において、第一官能基はCOOHであり、第二官能基はグロビンRNA配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドである。
【０００８】
特定の態様において本発明は、混合物中に存在するグロビンRNA配列に相補的な配列を含む、ビオチン標識されたオリゴヌクレオチドと混合物を組み合わせることにより、第一の組み合わせを生じる工程を含む、混合物中に存在する核酸からグロビンRNAを分離する方法に関する。第一の組み合わせを、ハイブリダイゼーションがオリゴヌクレオチドとグロビンRNAの間で起こるような条件下で維持し、核酸を結合する第一官能基および選択的にビオチンを結合する第二官能基を有する固相担体と組み合わせることにより、第二の組み合わせを生じる。第二の組み合わせを、核酸が第一官能基に結合し、グロビンRNAにハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドが固相担体の第二官能基に結合するような条件下で維持する。固相担体を第二の組み合わせから分離し、第一官能基から核酸を溶出する薬剤と組み合わせることにより、混合物中に存在する核酸からグロビンRNAを分離する。
【０００９】
本発明はまた、核酸を結合する第一官能基およびエンドトキシンを選択的に結合する第二官能基を含む表面を有する固相担体と混合物を組み合わせることにより、第一の組み合わせを生じる工程を含む、混合物中の核酸からエンドトキシンを分離する方法に関する。第一の組み合わせを、核酸が第一官能基に結合し、エンドトキシンが第二官能基に結合するのに適当な条件下で維持する。固相担体を第一の組み合わせから分離し、固相担体の第一官能基から核酸を除去する少なくとも一つの薬剤と組み合わせることにより、第二の組み合わせを生じる。エンドトキシンが依然として結合する固相担体を、第二の組み合わせから分離することにより、混合物中に存在する核酸からエンドトキシンを分離する。特定の態様において、第一官能基はCOOHであり、第二官能基は、ポリミキシンＢ、ネイティブリムルス抗LPS因子（LALF）および組み換えLALFからなる群より選ばれる。
【００１０】
特定の態様において本発明は、核酸を結合する第一官能基およびエンドトキシンを選択的に結合する第二官能基を含む表面を有する固相担体と混合物を組み合わせることにより、第一の組み合わせを生じる工程を含む、混合物中の核酸からエンドトキシンを分離する方法に関する。第一の組み合わせを、エンドトキシンの第二官能基への結合に適当な条件下で維持する。固相担体を第一の組み合わせから分離し、核酸をと結合する官能基を含む表面を有する固相担体と第一の組み合わせを組み合わせることにより、第二の組み合わせを生じる。第二の組み合わせを固相担体の官能基への核酸の結合に適当な条件下で維持し、固相担体を第二の組み合わせから分離することにより、混合物中に存在する核酸からエンドトキシンを分離する。
【００１１】
本発明はまた、生物体を結合する第一官能基および核酸を結合する第二官能基を含む表面を有する固相担体と生物体を組み合わせることにより、第一の組み合わせを生じる工程を含む、生物体の核酸を単離する方法に関する。第一の組み合わせを、生物体が第一官能基に結合するような条件下で維持する。固相担体を第一の組み合わせから分離し、生物体を溶解し、生物体の核酸を第二官能基に結合する薬剤と組み合わせることにより、第二の組み合わせを生じる。生物体が溶解し生物体の核酸が第二官能基に結合するような条件下で、第二の組み合わせを維持することにより、生物体の核酸を単離する。
【００１２】
本発明はまた、順方向伸長産物を選択的に結合する第一官能基および核酸を結合する第二官能基を含む表面を有する固相担体と、順方向伸長産物および逆方向伸長産物を含むシークエンス反応混合物を組み合わせることにより、第一の組み合わせを生じる工程を含む、シークエンス反応の順方向伸長産物および逆方向伸長産物を分離する方法に関する。第一の組み合わせを、順方向伸長産物の第一官能基への結合および逆方向伸長産物の第二官能基への結合に適切な条件下で維持する。固相担体を第一の組み合わせから分離し、固相担体の第二官能基から逆方向伸長産物を選択的に溶出するバッファと組み合わせることにより、第二の組み合わせを生じる。固相担体を第二の組み合わせから分離することにより、シークエンス反応の順方向伸長産物および逆方向伸長産物を分離する。
【００１３】
本発明はまた、核酸を結合する第一官能基および順方向伸長産物を選択的に結合する第二官能基を含む表面を有する固相担体と、順方向伸長産物および逆方向伸長産物を含むシークエンス反応混合物を組み合わせることにより、第一の組み合わせを生じる工程を含む、シークエンス反応の順方向伸長産物および逆方向伸長産物を分離する方法に関する。第一の組み合わせを、順方向伸長産物の第二官能基への結合および逆方向伸長産物の第一官能基への結合に適切な条件下で維持する。固相担体を第一の組み合わせから分離し、固相担体の第一官能基から逆方向伸長産物を選択的に溶出するバッファと組み合わせることにより、第二の組み合わせを生じる。固相担体を第二の組み合わせから分離することにより、シークエンス反応の順方向伸長産物および逆方向伸長産物を分離する。
【００１４】
特定の態様において本発明は、順方向伸長産物を選択的に結合する第一官能基および核酸を結合する第二官能基を含む表面を有する固相担体と、順方向伸長産物および逆方向伸長産物を含むシークエンス反応混合物を組み合わせることにより、第一の組み合わせを生じる工程を含む、シークエンス反応の順方向伸長産物および逆方向伸長産物を分離する方法に関する。第一の組み合わせを、順方向伸長産物の第一官能基への結合に適切な条件下で維持する。固相担体を第一の組み合わせから分離することにより、逆方向伸長産物を含む第二の混合物を生じる。固相担体が、固相担体の第一官能基から順方向伸長産物を選択的に溶出するバッファと組み合わせることにより、第二の組み合わせを生じる。固相担体を第二の組み合わせから分離し、第二の混合物と組み合わせることにより、第三の組み合わせを生じる。第三の組み合わせを、逆方向伸長産物の第二官能基への結合に適切な条件下で維持し、固相担体の第二官能基から逆方向伸長産物を選択的に溶出するバッファと組み合わせることにより、シークエンス反応の順方向伸長産物および逆方向伸長産物を分離する。
【００１５】
本発明はまた、本発明の方法で用いるキットに関する。ある態様において、キットは二官能性ビーズおよび細胞溶解バッファを含む。特定の態様において、キットはCOOH基およびオリゴdT基を含む二官能性磁性微粒子ならびに細胞溶解バッファを含む。別の態様において、キットはCOOH基およびストレプトアビジン基を含む二官能性磁性微粒子ならびに結合バッファおよび／または洗浄バッファ等のバッファを含む。別の態様において、キットはCOOH官能基およびポリミキシンＢ官能基を含むヘテロ二官能性磁性微粒子を含む。さらに別の態様において、キットはCOOH官能基およびLALF官能基を含むヘテロ二官能性磁性微粒子を含む。本発明のキットはさらに洗浄バッファおよび溶出バッファ等のさらなるバッファを含み得る。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、少なくとも２つの異なる（異種の）官能基（多官能基）を含む表面を有する固相担体を用いて、混合物中に存在する少なくとも２つの分子が分離され得るという発見に一部基づく。各分子が固相担体上に存在する異なる官能基に結合することにより、分子の分離をもたらす２つの異なる結合事象が起こる。固相担体上で起こる結合事象は、同時（一段階で）または順次に（一段階より多くで）起こり得る。
【００１７】
よって本発明は、少なくとも２つの異なる（異種の）官能基（多官能基）を含む表面を有する固相担体を用いて、種の混合物に存在する（一つまたはそれ以上の）標的種を分離または単離する方法に関し、ここで標的種は官能基の一つに結合し、標的種が分離されている種は、標的種が結合した基とは異なる別の官能基に結合する。本発明の方法を用いて単離され得る混合物中に存在する標的種の例としては、核酸（例えば、DNA、RNA）、ペプチド（例えば、ポリペプチド、タンパク質）、糖類（例えば、多糖類、リポ多糖類）、生物全体（例えば、ウイルス）および汚染物が挙げられる。本発明の方法で用いるための標的種（例えば、標的核酸種）を含む適切な混合物または出発物質の例としては、生物試料（例えば、血液、組織、組織溶解物、細胞、細胞溶解物）および分子診断、発現プロファイリング、遺伝子型決定およびトランスフェクションに用いる核酸操作産物（例えば、シークエンス反応物）が挙げられる。
【００１８】
該方法は、少なくとも２つの異なる官能基を含む表面を有する固相担体を用いて、混合物中の標的核酸種を混合物中に存在する他の種もしくは成分から分離または単離するのに特に適し、ここで標的核酸種は官能基の一つに結合し、標的種が分離されている一つまたはそれ以上の成分が、標的核酸種が結合した官能基とは異なる別の官能基に結合する。標的核酸種が分離され得る混合物中の他の成分としては、他の核酸種、ペプチド、糖類、生物全体および汚染物等の成分が挙げられる。
【００１９】
本発明の多官能性固相担体は、複数の核酸種およびペプチド種を含む混合物中に存在する核酸種およびペプチド種を分離または単離するのに用いられ得る。ある態様において、本発明は複数の核酸種およびペプチド種を含む混合物から標的核酸種を単離する方法に関する。別の態様において、本発明は複数の核酸種を含む混合物から標的核酸種を単離する方法に関する。混合物は、核酸およびペプチドを可逆的に結合する複数の官能基を含む表面を有する固相担体と組み合わされる。
【００２０】
特定の態様において、本発明は、混合物中の１つの（１つ以上の）核酸種を混合物中の１つの（１つ以上の）ペプチド種から分離する方法に関する。混合物は、核酸を可逆的に結合する第１の官能基およびペプチド種を可逆的に結合する第２の官能基を有する固相担体と組み合わされ、それによって第１の組み合わせを生じる。第１の組み合わせは、核酸の第１の官能基への結合およびペプチド種の第２の官能基への結合に適切な条件下で維持される。固相担体は、第１の組み合わせから分離され、固相担体の第１の官能基から核酸または固相担体の第２の官能基からペプチド種のいずれかを選択的に除去（例えば溶出）する薬剤（例えばバッファ）と組み合わせられ、それによって混合物中の核酸種を混合物中の１つ以上のペプチド種から分離する。
【００２１】
別の態様において、本発明は、複数の核酸種を含む混合物から標的核酸種を単離する方法に関する。混合物は、核酸を可逆的に結合する第１の官能基および標的核酸種を選択的かつ可逆的に結合する第２の官能基を有する固相担体と組み合わせられ、それによって第１の組み合わせを生じる。第１の組み合わせは、核酸の第１の官能基への結合および標的核酸種の第２の官能基への結合に適切な条件下で維持される。特定の態様において、第２の官能基は、第１の官能基より標的核酸種に対して高い親和性を有しており、従って、標的核酸種は、好ましくは第２の官能基に結合する。固相担体は第１の組み合わせから分離され、固相担体の第１の官能基から核酸または固相担体の第２の官能基から標的核酸種のいずれかを選択的に除去（例えば溶出）する薬剤（例えばバッファ）と組み合わせられ、それによって標的核酸種を複数の核酸種を含む混合物から単離する。
【００２２】
固相担体は第１の組み合わせから分離され得、固相担体の第２の官能基から標的核酸種を選択的に除去（例えば溶出）する薬剤（例えばバッファ）と組み合わせられ、それによって標的核酸種を複数の核酸種を含む混合物から単離する。すなわち、固相担体を薬剤と組み合わせることによって、標的核酸種の第２の官能基からの除去が生じるが、第１の官能基に結合される核酸の除去は生じない。薬剤の存在下で、核酸は、固相担体の第１の官能基に結合されたままでいる。
【００２３】
あるいは、固相担体は第１の組み合わせから分離され得、固相担体の第１の官能基から核酸種を選択的に除去する薬剤と組み合わせられ、その一方で、標的核酸は固相担体上の第２の官能基に結合されたままでいる。すなわち、固相担体を薬剤と組み合わせることによって、第１の官能基からの核酸の除去が生じるが第２の官能基に結合された標的核酸種の除去は生じない。薬剤（例えばバッファ；酵素）は、例えば第１の官能基に結合される核酸の溶出または分解のいずれかを生じ得る。次いで、標的核酸種が結合される固相担体は除去され、それによって標的核酸種を複数の核酸種を含む混合物から単離する。標的核酸種は、固相担体上の第２の官能基から溶出され得る。
【００２４】
特定の態様において、本発明は、核酸を含む混合物中に存在する標的核酸種を単離する方法に関する。混合物は、核酸を可逆的に結合する第１の官能基および核酸の標的種を選択的かつ可逆的に結合する第２の官能基を含む表面を有する固相担体と組み合わせられ、それによって第１の組み合わせを生じる。第１の組み合わせは、核酸の第１の官能基への結合に適切な条件下で維持される。この態様において、標的核酸種を含む試料中の核酸は、第１の官能基に結合する。固相担体は第１の組み合わせから分離され、固相担体の第１の官能基から核酸を除去し、固相担体上の第２の官能基への標的核酸種の結合（選択的結合）を促進（可能に）する薬剤と組み合わせられ得、それによって第２の組み合わせを生じる。第２の組み合わせにおいて、標的種核酸は、第２の官能基に結合され、その一方で、他の核酸は、溶液中に残る。あるいは、第１の組み合わせから分離された固相担体は、核酸を第１の官能基から除去する薬剤と組み合わせられ得、固相担体の第２の官能基への核酸の標的種の選択的結合を促進する（引き起こす）第２の薬剤が添加され、それによって、第２の組み合わせを生じる。固相担体は第２の組み合わせから分離され、それによって核酸を含む混合物中に存在する核酸の標的種を単離する。
【００２５】
本明細書中に記載される多官能性固相担体はまた、細胞または細胞溶解物のような混合物からRNAを精製するために使用され得る。例えば、ｍRNAおよび／またはグロビンRNAは、本明細書中に記載の方法を使用して混合物から単離または分離され得る。
【００２６】
１つの態様において、細胞または細胞溶解物中に存在する全核酸は、遊離COOH基および第２の官能基としてオリゴｄT基が共有結合されるCOOH基を含む固相担体に結合され、それによって、混合物中の核酸は単離される。核酸単離の後、固相担体は、全核酸の溶出を促進し、その後の固相担体上のオリゴ−ｄT官能基へのｍRNAのポリAの結合を促進するバッファ（例えば低イオン強度バッファ）と組み合わされる。固相担体は除去され得、ｍRNAは、固相担体から溶出され得、それによってｍRNAを単離する。ｍRNAの溶出の前に、固相担体は、適切な洗浄バッファを用いて洗浄され得る。
【００２７】
１つの態様において、本発明は、核酸を含む混合物中に存在するｍRNAを単離する方法に関する。混合物は、核酸を結合する第１の官能基およびｍRNAを選択的に結合する第２の官能基を含む表面を有する固相担体と組み合わせられ、それによって第１の組み合わせが生じる。第１の組み合わせは、核酸の第１の官能基への結合に適切な条件下で維持される。固相担体は、第１の組み合わせから分離され、固相担体の第１の官能基から核酸を除去し、固相担体の第２の官能基へのｍRNAの結合を可能にする少なくとも１つの薬剤と組み合わせられ、それによって第２の組み合わせを生じる。固相担体は第２の組み合わせから除去され、それによって核酸を含む混合物中に存在するｍRNAを単離する。次いで、ｍRNAは、固相担体から適切な溶出バッファ中に溶出され得る。特定の態様において、固相担体は、固相担体の第１の官能基から核酸を除去する第１の薬剤および固相担体の第２の官能基へのｍRNAの結合を可能にする第２の薬剤と組み合わせられ、それによって第２の組み合わせを生じる。
【００２８】
本明細書中に記載される多官能性固相担体はまた、混合物中に存在する核酸からグロビンRNAを分離するために使用され得る。本明細書中に記載される方法を使用して単離され得るグロビンRNAの例としては、α、β、δ、γ、ε、θおよびζグロビンRNAが挙げられる。
【００２９】
１つの態様において、本発明は、核酸を結合する第１の官能基およびグロビン特異的配列を含む核酸を選択的に結合する第２の官能基を有する固相担体と混合物を組み合わせ、それによって第１の組み合わせを生じる工程を包含する、核酸の混合物中に存在するグロビン核酸配列を除去する方法に関する。第１の組み合わせは、核酸の第１の官能基への結合に適切な条件下で維持される。固相担体は、第１の組み合わせから分離され、固相担体の第１の官能基から核酸を除去し、固相担体の第２の官能基へのグロビン含有配列の結合を促進（可能に）する少なくとも１つの薬剤と組み合わされ、それによって第２の組み合わせを生じる。固相担体は、第２の組み合わせから除去され、それによって第２の組み合わせからグロビン特異的配列を除去する。
【００３０】
別の態様において、核酸の混合物中に存在するグロビン核酸配列を除去する方法は、核酸を結合する第１の官能基およびグロビン特異的配列を含む核酸を選択的に結合する第２の官能基を有する固相担体と混合物を組み合わせ、それによって第１の組み合わせを生じる工程を包含する。第１の組み合わせは、第１の官能基への核酸の結合に適切な条件下で維持される。固相担体は、第１の組み合わせから分離され、固相担体の第１の官能基から核酸を除去する第１の薬剤と組み合わせられる。固相担体の第２の官能基へのグロビン含有配列の選択的な結合を可能にする第２の薬剤が添加され、それによって第２の組み合わせが生じる。固相担体が第２の組み合わせから除去され、それによって第２の組み合わせから単数または複数のグロビン特異的核酸配列を除去する。
【００３１】
別の態様において、核酸配列の混合物中に存在するグロビン核酸配列を除去する方法は、グロビン配列に配列上相補的なビオチン標識されたオリゴヌクレオチドと核酸配列の混合物を、ビオチン標識されたオリゴヌクレオチドとグロビン配列との間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で組み合わせ、それによって第１の組み合わせを生じる工程を包含する。第１の組み合わせは、核酸を結合する第１の官能基およびビオチンを選択的に結合する第２の官能基を有する固相担体と組み合わせられ、第２の組み合わせを生じる。この第２の組み合わせは、ビオチン標識されたオリゴヌクレオチドとグロビン配列との間で形成されるハイブリッドの結合に適切な条件下で維持される。残存核酸の第１の官能基への結合を促進する薬剤が添加され、それによって第３の組み合わせが生じる。固相担体は、第３の組み合わせから除去され、洗浄され、第１の官能基に結合された核酸を溶出する薬剤と組み合わせられ、それによって核酸混合物からグロビン配列を分離する。
【００３２】
本明細書中に記載される多官能性固相担体はまた、混合物または試料中の核酸から汚染物を分離するために使用され得る。ハイスループットDNA調製法の導入によって大規模シークエンス活動の発展が活気付けられ、ゲノム配列および発現された遺伝子配列の広大な収集が生成される。これらの配列のインビトロでのさらなる特徴づけは、発現された遺伝子のハイスループット分析を使用して哺乳動物細胞の機能の評価のために応用され得る(Ziauddin, J., et al., Nature, 411:107-110 (2001))。さらに、プラスミドおよびBAC DNAを使用するインビボでの遺伝子療法研究は、疾患状態の特徴づけおよび潜在的な治療介入の評価の両方のために動物モデルにおいて広く応用されてきた(Nabel, G.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:11307-11311 (1993))。裸のDNAワクチンを使用する遺伝的免疫の理解の増加はまた、新規の治療送達可能なものとして大きく約束する(Lewis, P.J., et al., Adv. Virus Res., 54:129-188 (1999); Liu, M., J. Intern. Med., 253:402-410 (2003))。不幸なことに、かかる応用および療法は、核酸調製物中に典型的に存在する汚染物に非常に感受性である。アルカリ溶解、高圧（フレンチプレス）煮沸を含む細菌からプラスミドDNAを単離する標準的な方法およびリゾチームまたは界面活性剤の使用は、プラスミドDNAと一緒に細菌の外膜からリポ多糖類（LPS）またはエンドトキシンの放出を誘導する。次いで、LPSは、プラスミドDNAと類似した物理的特性（密度、大きさ、および電荷分布）を有するミセルを形成し、その結果、プラスミドDNAと一緒に精製工程を切り抜ける。DNA分子を調製するために典型的に使用される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主由来のエンドトキシンの汚染は、インビトロでの哺乳動物細胞の培養の間にアポトーシス(Kuwabara, T., Apoptosis, 9:467-474 (2004))ならびに中毒性ショック、敗血症および種々のインビボで関連する臨床的合併症(DiPiro, J.T., Am. J. Hosp. Pharm., 47:S6-10 (1990)) を誘導することが示された。HeLa、Huh7、COS7およびLNHのような哺乳動物細胞におけるエンドトキシン含有DNAのトランスフェクション効率は、エンドトキシンを含まないDNAに比べて有意に低下する(Weber, M., et al., BioTechniques, 19:930-940 (1995))。
【００３３】
エンドトキシンは、外膜の組織化および安定性に寄与するグラム陰性細菌の外膜の構成要素である。R. Pfeiffer (1858-1945) によって最初に名づけられたエンドトキシンは、以来、構造的および化学的の両方で十分に特徴付けられてきたリポ多糖類（LPS） の１つのクラスを特徴付ける(Rietschel, et al., 1994)。全てのエンドトキシンの一般的な構造は、非極性部分（脂質A）に共有結合される極性ヘテロポリ多糖類鎖である。主要な細菌膜構造として、エンドトキシンは、細菌細胞のその周囲との相互作用に参加する。エンドトキシンは、細胞または器官に対して直接作用しないが、免疫系の活性化によって作用する(Anspach 2001)。グラム陰性細菌が哺乳動物宿主に接近する場合、エンドトキシンの存在は、宿主の免疫系を活性化し、宿主における炎症の病因および敗血症ショックに関与することが示された。少量のエンドトキシンは、種々の細胞型(Gould et al. 1984)、特に単核細胞、内皮細胞、平滑筋細胞ならびに多形核顆粒球および単球(Galanos and Freudenberg 1993; Galanos et al. 1992)の表現型を変更することが示された。これらの細胞型は、生体活性脂質、活性酸素種および種々のペプチド炎症性メディエータを産生することによってエンドトキシンの存在に応答する(Rietschel et al., 1994)。それは、動物に導入された場合、高熱、血管拡張、下痢および極端な場合、致死的ショック（fatal shock）を含む顕著な病態生理学的反応をエンドトキシンに生じさせるこの型の細胞応答である(Morrison, D.C., Ann. Rev. Med., 38:417-432 (1987))。
【００３４】
グラム陰性細菌のインビボ導入由来の、細胞に対する毒性効果に加えて、エンドトキシンは、インビトロで哺乳動物細胞に対して毒性を発揮することが示された。エンドトキシン汚染DNAのトランスフェクション効率は、HeLa、Huh7、COS7およびLNHのような哺乳動物細胞に対するエンドトキシンの毒性効果に起因して妨げられる(Weber, M., et al., Biotechniques, 19:930-939, 1995)。この毒性は、アデノウイルス、グリセロールまたはカチオン性脂質のいずれかをベースとしたトランスフェクションを使用してDNAを導入する場合に見られ、エンドトキシンの脂質A成分に原因がある。脂質Aそれ自体は取るに足りないが、トランスフェクションの間の細胞の小胞系、細胞質または核へのエンドトキシンの導入は、アポトーシス経路へ導く(Cotton and Saltik, 1997)。予想され得るように、エンドトキシンはまた、マイクロインジェクションおよび遺伝子治療研究のようなプロセスにおけるインビボでのDNAの導入の間、毒性を発揮する(Weber et al., 1995; Vukajlovich, S.W. et al., 1987; Schleef, M. 1999)。有害な反応は、薬物、注入可能物ならびに他の生物学的および薬学的生成物からならびにプラスミドDNA調製物からエンドトキシンを除去することを避けられなくする。かかる生成物をヒトに対して使用する研究によって、任意の治療応用のために使用される核酸は300 EU/mgまたは300 IU/mg未満を有することが要求される、FDAによる厳しい指針が得られた(米国特許6,297,371)。
【００３５】
多くのペプチド、タンパク質およびレセプターモチーフは、エンドトキシンと強く相互作用し、従って、本発明の方法において使用され得る。これらのいくつかとしては、リポ多糖類結合タンパク質(LBP)、殺菌性／透過亢進タンパク質(BPI) (Beamer, L.J., Protein Sci., 7:906-914 (1998))、ポリミキシンおよびポリミキシン類似物(Jacobs, D.M., et al., J. Immunol., 118:21-27 (1997))、アミロイドP成分(de Haas, C.J., et al.,Infect. Immun., 67:2790-2796 (1999))、カチオニン（cationin）タンパク質１８(de Haas, C.J., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 252:492- 496 (1998))、MD-2およびToll-様レセプター(TLR)(Shimazu, R., et al., J. Exp. Med., 189:1777-1782 (1999))、TLR2(Sabroe, I., et al., J. Immunol., 168:4701-4710 (2002))、CD14(Soler-Rodriguez, A.M., et al., J. Immunol., 164:2674-2683 (2000))、Bac7(About, S., et al., Cancer epidemiology, biomarkers and prevention, 11:1130- 1133 (2002), Liu, M.A., J, Intern. Med.,253:402-410 (2003))、ウシ好中球中に見出されるタンパク質由来の合成ペプチド(Ghiselli, R., et al., Shock, 19:577-581 (2003))、リムルス因子−CおよびそのSushi3ドメイン由来の合成ペプチド(Li. C., et al., Protein Eng., 116:629-635 (2003))ならびにエンドトキシンの脂質A成分に対して惹起された抗体(Helmerhorst, E.M., et al., Infect. Immun., 66:870873 (1998); Holy, R.A., et al., Science, 298:129-149 (2002)) が挙げられる。
【００３６】
エンドトキシン吸収剤として広く使用されてきた１つの分子は、ポリミキシンB（PMXB）、環状カチオン性ポリペプチド抗生物質である。PMXBは、主に疎水性相互作用によってエンドトキシン分子の脂質A部分に化学量論的に結合する(Srimal, S., et al., Biochem. J., 315:679-686 (1996))。具体的には、PMXBおよびエンドトキシンは、ペプチドおよびエンドトキシンの脂質A成分の１つの側面の疎水性パッチの相互作用に主に起因して結合する(Srimal, et al. 1996)。
【００３７】
本発明の方法において使用され得る別の特定の分子は、アメリカカブトガニ（リムルスポリフェマス（Limulus polyphemus））から単離されたリムルス抗−LPS因子(LALF)である。これは、エンドトキシンレベルを決定するためにLALアッセイにおいて使用されるタンパク質である。本発明の方法において、LALFネイティブタンパク質および組換えタンパク質（例えば、ピキアパストリス（Pichia pastoris）において発現されたLALF;サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）において発現されたLALF）が使用され得る。
【００３８】
エンドトキシンを結合するタンパク質または分子は、電荷相互作用および疎水性相互作用によってカルボキシ含有固相担体上に吸着され得る。PMXBは、ｐH１０未満で正味の正電荷を保持し、MESバッファおよび固相担体溶液（１％固体）の存在下で２４時間の、分子の単純なインキュベーションによって、カルボキシ固相担体と容易に結合する。
【００３９】
特定の態様において、共有結合が使用される。エンドトキシンを結合する分子（例えばPMXB分子）の固相担体上のカルボキシ基への共有結合によって、各々が異なる生化学的分子を標的化するように設計された固相担体表面上の２つの異なる官能基（例えばCOOHおよびPMXB）を含むヘテロ二官能性固相担体が可能になる。例えば、PMXBをカルボキシル化された固相担体に共有結合させることによって、低塩条件下で固相担体上のPMXB官能基にエンドトキシンを押しやり、その後異なる条件下で同じ固相担体上のCOOH官能基に核酸を押しやることが可能である。一旦、固相担体が混合物から分離され、上清が除去されると、エンドトキシンが固相担体上のPMXB官能基に結合されたままの条件下で同じ固相担体上のCOOH官能基からDNAが溶出され得る。
【００４０】
１つの態様において、本発明は、PMXBまたはLALFタンパク質のようなエンドトキシン結合基およびカルボキシル基のような核酸結合基を含む二官能性固相担体に核酸およびエンドトキシンを同時に結合することによって、核酸溶液からエンドトキシン汚染物を除去する方法に関する。固相担体は、カルボキシル官能基への核酸の結合およびエンドトキシン結合官能基へのエンドトキシンの結合が生じる条件（例えばバッファ条件）下で、細菌清澄化溶解物のようなエンドトキシンおよび核酸を含む溶液に添加される。固相担体は、溶液から除去され、固相担体から核酸の選択的な溶出を引き起こすバッファ（例えば低イオン強度のバッファ）と接触される。まだエンドトキシンが結合される固相担体は、精製された（実質的に純粋な）核酸の溶液を残して除去される。
【００４１】
別の態様において、本発明は、PMXBまたはLALFタンパク質のようなエンドトキシン結合官能基およびカルボキシル基のような核酸結合官能基を含む二官能性固相担体に核酸およびエンドトキシンを同時に結合することによって、核酸溶液からエンドトキシン汚染物を除去する方法に関する。二官能性固相担体は、エンドトキシン結合官能基へのエンドトキシンの結合を引き起こす第１の混合物を生成するバッファ条件において、細菌清澄化溶解物のようなエンドトキシンおよび核酸を含む溶液に添加される。第１の混合物中のバッファ条件は、核酸が核酸結合官能基に結合し、エンドトキシンがエンドトキシン結合官能基に結合したままでいる条件を提供するように調節される。固相担体は、溶液から除去され、固相担体から核酸の選択的溶出を引き起こすバッファ（例えば低イオン強度のバッファ）と混合される。エンドトキシンが結合されたままでいる固相担体は、精製された核酸の溶液を残して除去される。
【００４２】
さらに別の態様において、本発明は、PMXBまたはLALFタンパク質のようなエンドトキシン結合官能基およびカルボキシル基のような核酸結合官能基を含む二官能性固相担体を細菌溶解物のような核酸およびエンドトキシンの溶液に添加し、エンドトキシンがエンドトキシン結合官能基によって固相担体に結合される第１の混合物を生成することによって核酸溶液からエンドトキシン汚染物を除去する方法に関する。固相担体は、溶液から除去され、エンドトキシンから本質的に精製された核酸の第２の混合物を残す。二官能性固相担体は、カルボキシ官能基への核酸の結合を引き起こす条件下で第２の混合物に添加され、第３の混合物を作り出す。あるいは、カルボキシ基を含む固相担体が添加され、第３の混合物を作り出す。固相担体は、第３の混合物から除去され、固相担体から、精製された核酸を溶出するために低イオン強度のバッファと混合される。
【００４３】
本明細書中に記載される方法はまた、溶液からウイルスを濃縮し、その後ウイルス核酸を単離するために使用され得る。ポリマーポリエチレンイミン（PEI）またはポリ−L-リシン（PLL）のようなポリカチオン性ポリマーは、カルボキシル官能基を含む固相担体に共有結合される。カルボキシル基はカルボジイミド１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（EDAC）によってまず活性化され、次いで、ポリマー上の遊離アミノ基と反応される。このことによって、２つの官能基、ウイルス結合のためのポリカチオンポリマーおよび核酸結合のためのカルボキシル基を有する固相担体が生成される。ポリマー修飾二官能性固相担体は、ある体積のウイルス含有血清または溶解物に添加され、よく混合され、血清中のウイルス粒子がポリマーとの相互作用を介して固相担体の表面に濃縮される第１の混合物を作り出す。固相担体は分離され、血清上清が除去される。固相担体に、例えば、20 mM Tris pH 7.0、1% Triton-X-100、2 % SLS、10 mM DTT、イソプロパノールおよびRNase阻害剤を含む溶解バッファが添加される。これは、ウイルスが溶解される第２の混合物を生じ、溶解の際に、ウイルス核酸は、カルボキシル基との相互作用を介して固相担体に結合されるようになる。固相担体は分離され、洗浄バッファおよび／または７０％エタノール中で洗浄され得る。固相担体は乾燥され得、精製されたウイルス核酸は、低イオン強度バッファ中に溶出される。
【００４４】
１つの態様において、本発明は、核酸を結合する第１の官能基および生物体を選択的に結合する第２の官能基を含む表面を有する固相担体と生物体を組み合わせ、それによって第１の組み合わせを生じる工程を包含する、生物体（例えばウイルス、細菌、真菌、寄生虫のような病原体）の核酸を単離する方法に関する。第１の組み合わせは、第２の官能基への生物体の結合に適切な条件下で維持され；固相担体は、第１の組み合わせから分離される。固相担体は生物体を溶解する薬剤と組み合わせられ、溶解の際、生物体の核酸は放出され、固相担体の第１の官能基と結合されるようになる。固相担体は分離され、次いで生物体の核酸は、固相担体から溶出され得、それによって生物体の核酸を単離する。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、用語「単離する」は、問題の物質が天然に存在する環境とは異なる物理的環境に存在し、かつ／または他の核酸分子から完全にもしくは部分的に分離、単離もしくは精製されていることを意味することが意図される。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸」および「核酸分子」は、用語ポリヌクレオチドと同義語的に使用され、DNA（例えば、単鎖、二本鎖、コバレントリークローズド（covalently closed）形態、リラックスドサーキュラー（relaxed circular）形態、ゲノムDNA、ｃDNA、プラスミドDNA）、RNA（例えば、単鎖および二本鎖、ｍRNA）、ｃRNA、アンチセンスRNA、ミクロRNA、RNA/DNAハイブリッドおよびポリアミド核酸（PNA）を包含することが意味される。
【００４７】
「固相担体」は、標的種を可逆的に結合する官能基（１つ以上）を有するまたはそれを付加され得る実体である。固相担体は、標的種が固相担体上に沈殿し得る（それに結合し得る）条件下で本質的に不溶性である。本発明の方法における使用のための適切な固相担体は、担体上の単数または複数の官能基への標的種の効率的な結合を可能にする十分な表面積を有し、標的種を可逆的に結合し得る表面を有することによってさらに特徴付けられる。適切な固相担体としては、核酸のような標的種に対して親和性を有し、形態が規則的または不規則的のいずれかである種々の形状を具体化し得、固相の表面積を最大にし、かつ微小規模の操作に影響を受けやすい担体を具体化する形状を好ましくは有する、微粒子（例えばビーズ）、線維および支持体が挙げられるがこれらに限定されない。１つの態様において、固相担体は、磁性微粒子（例えば常磁性（磁気応答性）微粒子）である。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、「常磁性微粒子」は、外部磁場（例えば埋め込まれた希土（例えばネオジム）磁石を有するプラスチックチューブまたはマイクロタイタープレートホルダー）に応答するが、磁場が除去されると消磁する微粒子をいう。従って、常磁性微粒子は、磁石を使用して溶液から効率的に分離されるが、磁気的に誘導される凝集が起こることなしに容易に再懸濁され得る。特定の常磁性微粒子は、純粋なポリマー殻によってカプセル化された磁鉄鉱富化核を含む。１つの態様において、適切な常磁性微粒子は、約２０〜３５％の磁鉄鉱／カプセル化比を含む。例えば、約２３％、２５％、２８％、３０％、３２％または３４％の磁鉄鉱／カプセル化比を含む磁性粒子は、本発明における使用のために適切である。約２０％未満の比を含む磁性粒子は、磁気分離を達成するために使用される磁石にわずかに弱く引き付けられる。本発明の方法において使用される混合物の性質に依存して、より高いパーセンテージの磁鉄鉱を含む常磁性微粒子が考慮されるべきである。表面に露出された鉄またはFe3O4を有さないカプセル化された常磁性微粒子の使用によって、単離された核酸の特定の下流の操作においてポリメラーゼ機能に鉄が干渉する可能性が排除される。しかし、磁鉄鉱の核が大きければ大きいほど、カプセル化漏出の機会（例えば酸化鉄の放出）はより大きくなる。
【００４９】
適切な常磁性微粒子は、例えば磁気的手段またはろ過による溶液からの分離が困難でない大きさであるべきである。さらに、好ましい常磁性微粒子は、それほど大きくないため、表面積が最小であるかまたは微小規模の操作に適切でないものである。適切な大きさは、約０．１μ平均直径〜約１００μ平均直径の範囲である。好ましい大きさは、約１．０μ平均直径である。本発明における使用のための適切な磁性微粒子は、例えば、Agencourt Biosciences, Polysciences, Bioclone, Seradyne, Bangs Laboratories Inc., FishersおよびIN (例えばエスタポール（登録商標） カルボキシレート修飾カプセル化磁性ミクロスフィア)から得られ得る。
【００５０】
１つの態様において、混合物中の標的種は、固相担体上の少なくとも１つの官能基に非特異的に結合する。「非特異的結合」は、種々の標的種分子の構造（例えば核酸配列）または大きさの違いに関わらず、固相担体上の官能基にほぼ類似した親和性でもって異なる標的種分子（例えば、大きさの異なる核酸のような異なる種の核酸）が結合することをいう。結合は、例えば、容易化された吸着によって生じ得る。本明細書中で使用される場合、「容易化された吸着」は、沈殿試薬（例えば、ポリアルキレングリコール、エタノール、イソプロパノール）が、最初混合物中に存在したある種のDNA分子の固相担体の表面への沈殿、その後の吸着を促進するために使用されるプロセスをいう。
【００５１】
別の態様において、混合物中の標的種は、固相担体上の少なくとも１つの官能基に特異的（選択的）に結合する。「特異的結合」または「選択的結合」は、混合物中の他の核酸種を除外するほどに、固相担体上の１つ以上の官能基に例えば特定の核酸分子（例えば標的核酸分子種）が結合することをいう。この態様において、官能基は、固相担体上の他の官能基より、特定の核酸分子（例えば標的核酸種）に対してより大きな親和性を有する。かかる可逆的相互作用は、２つの結合パートナーの間の相互作用を含む。例えば、相互作用は、組成または配列に基づいて特定の生体分子を単離する目的のために従来使用される２つの結合パートナー（例えば、ストレプトアビジン／ビオチン、抗体/抗原、リガンドレセプターまたは相補的配列のハイブリダイゼーションのような配列特異的相互作用）の間に存在し得る。
【００５２】
本発明の方法において使用される固相担体は、官能基コート化表面を有する。特に本発明の方法における使用のための固相担体の表面は、複数（少なくとも２つ）の異なる官能基を含む。本明細書中で使用される場合、用語「官能基コート化表面」は、核酸（例えばDNA、RNAまたはポリアミド核酸（PNA））、ペプチド、糖類、全生物体、および汚染物のような混合物中に存在する標的分子を、直接的（官能基が核酸またはペプチドを結合する）または間接的（官能基（例えばストレプトアビジン）が核酸（例えばビオチン）またはペプチドに連結された基を結合する）のいずれかで可逆的に結合する官能基または部分でコートされた固相担体の表面をいう。
【００５３】
官能基で固相担体を直接的または間接的のいずれかでコーティングする方法は、当該分野で公知である。例えば、官能基（例えば、COOH）は、固相担体の形成の間に固相担体をコートし得る。例えば、参照によって本明細書中に援用される米国特許5,648,124を参照。さらに、固相担体は、官能基（１つ以上）を固相担体上のCOOH基（１つ以上）に共有結合することによって官能基でコートされ得る。官能基コート化表面の特定の例は、微粒子のアミノシランのアミノ基に結合される遊離官能基を各々が有する部分でコートされた表面である；その結果として、微粒子の表面は官能基含有部分でコートされる。官能基は、沈殿核酸（例えばポリアルキレングリコール沈殿DNA）またはペプチドに対するバイオアフィニティー吸着体として作用する。
【００５４】
１つの態様において、少なくとも１つの官能基は、カルボン酸（COOH）である。遊離カルボン酸官能基を有する適切な部分は、カルボン酸基の１つがアミド結合を介してアミノシランのアミンに結合され、第２のカルボン酸が結合されず、固相担体の表面に付着またはつなぎ留められる遊離カルボン酸基を生じるコハク酸部分である。カルボン酸コート化磁性粒子は、例えばPolysciences, Inc.から市販される。カルボキシ基は、固相担体からの核酸の効果的な溶出において主要な役割を果たす。カルボキシ基は、４．７のｐKaを有するので、中性ｐHでは負に帯電している。DNAのような核酸は負に帯電しており、任意のクラウディング（crowding）試薬または塩の非存在下で核酸は中性ｐHで微粒子からそれ自身を反発する。
【００５５】
可逆的に核酸分子を結合する官能基コート化表面を有する適切な固相担体は、例えば、非限定的にアミノコート化常磁性微粒子、カルボキシルコート化常磁性微粒子およびカプセル化カルボキシル基コート化常磁性微粒子のような官能基コート化表面を有する磁気応答性固相担体である。
【００５６】
特定の態様において、他の官能基は、固相担体の表面（sruface）上のカルボキシ基に結合するカルボキシイミド（carboxyiimide）を介して固相担体に結合され得る。表面上に高密度のカルボキシル基を有する固相担体は、カルボジイミド結合を介して、いくつかであって全てではないカルボキシ基に結合する別の官能基（例えばオリゴ−ｄT）と接触され得る。（例えば核酸を結合するために使用され得る）十分なカルボキシ官能基は、カルボイミド（carboiimide）が二官能性を有する固相担体を生じる別個の官能基に結合した後も残っており、ここで核酸のカルボキシ基への結合および異なる部分の第２の官能基への結合が生じ得る。従って、固相担体は、別の標的分子を除去または保持するために使用され得る。
【００５７】
核酸およびペプチドのような標的分子を結合する官能基は、当該分野において周知である(例えば、本明細書中に参照によって援用されるHermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, CA (1996)を参照)。核酸およびペプチドを直接結合する官能基としては、例えば、金属イオン、アミン基、カルボキシル基、カプセル化カルボキシル基、シリカ（SiOH）、ジエチルアミノエチル（DEAE）、および混合物中で核酸配列にハイブリダイズする基が挙げられる。
【００５８】
核酸配列にハイブリダイズする官能基は、混合物中の核酸の全てまたは一部に相補的である（例えば、単離されるべき標的核酸配列の核酸配列の全てまたは一部に相補的である）核酸配列であり得る。特定の態様において、相補的である核酸配列は、単離されるべき核酸種に特異的（に特有）である配列であり、その結果、相補的配列を結合する混合物中の実質的に全ての核酸（核酸種の大部分）は、標的核酸種を含み、その一方で、混合物中に存在する他の核酸配列は、相補的配列を結合しない。例えば、基はデオキシリボチミジンのポリマーであるオリゴデオキシチミジン（オリゴｄT）基であり得、ｍRNAに特有の配列であるメッセンジャーRNA（ｍRNA）の３’末端のアデニンヌクレオチドポリマー（ポリアデニレート（ポリA）テール）に相補的である。オリゴｄT基は、約３〜約１００チミジン、約５〜約７５チミジン、約８〜約６０チミジン、約１０〜約５０チミジン、約１５〜約４０チミジン、または約２０〜約３０チミジンのポリマーであり得る。修飾されたオリゴｄT基はまた、本発明の方法において使用され得る。例えば、最後の２つの３’ヌクレオチドがNであるオリゴｄTまたは最後の２つの３’ヌクレオチドがVNであるオリゴｄTであって、「N」はアデニン（A）、シトシン（C）、チミジン（T）またはグアニジン（G）であり、「V」はA、CまたはGであるものが使用され得る。混合物中に存在する核酸からグロビンRNAを単離または分離する方法において、官能基は、単離されるβグロビンの配列の全てまたは一部（βグロビン配列として配列を区別する一部）に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであり得る。
【００５９】
１つの態様において、官能基は、ペプチド（タンパク質）を直接結合する１つの（１つ以上の）遷移金属イオンである。例えば、Porath et. al. (Nature, 258:598-599) によって記載された固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（IMAC）は、アミノ酸側鎖と固定化遷移金属イオンとの間の親和性に基づいてタンパク質を分離するために使用される周知技術である。固定化遷移金属は、タンパク質の表面上の電子供与基と可逆的配位複合体を形成し得る。特に、ヒスチジン、システインおよびトリプトファンの側鎖は、Cu、Zn、CoおよびNiを含む遷移金属に対して親和性を示す。金属イオンは、アガロース、ポリアクリルイミドおよびシリカのような固定化表面に化学的結合される金属キレーターによって固定化される。共通のキレーターとしては、イミノ二酢酸（IDA）、ニトリロ酢酸（NTA）、カルボキシメチルアスパラギン酸（CM-Aｓｐ）およびトリカルボキシメチルエチレンジアミン（trsicarboxymethyl ethylene diamine）（TED）が挙げられる。多くの他のものが記載される(例えば、参照によって本明細書中に援用される米国特許5,047,513およびUS 6,623,655;ならびに米国公開公報2002/0019496 Alを参照)。複合体は、可逆的な結合の性質に起因して非変性または変性条件を使用して溶出され得るタンパク質を効果的に分離するために使用され得る。IMACは金属複合体に対する異なる親和性に基づいてネイティブタンパク質を分離するために使用され得るが、最高の商業的使用は、組換えタンパク質へのポリヒスチジン融合タグの導入ならびに固定化Ni複合体、一般的にはアガロースに結合されたIDAおよびNTAを介する部分配列の精製による(米国特許5,284,933およびSchmitt et. al. Molecular Biology Reports, vol. 18, pp. 223-230, 1998、これらの両方は、参照によって本明細書中に援用される)。さらに金属キレート複合体のミクロスフィア(Lauer SA and Nolan JP. Cytometry 48:136-145, 2002)および水可溶性ポリマーへの結合はまた記載される(参照によって本明細書中に援用される米国特許6,703,498)。
【００６０】
混合物中に存在する核酸からエンドトキシンを分離する方法において、官能基は、PMXB、LALF、リポ多糖類結合タンパク質(LBP)、殺菌性／透過亢進タンパク質(BPI)、ポリミキシンおよびポリミキシン類似物、アミロイドP成分、カチオニンタンパク質、MD-2およびToll-様レセプター(TLR)、CD14、Bac7、ウシ好中球中に見出されるタンパク質由来の合成ペプチド、リムルス因子−CおよびそのSushi3ドメイン由来の合成ペプチドならびにエンドトキシンの脂質A成分に対して惹起された抗体であり得る。
【００６１】
核酸またはペプチドのような標的種を結合する基は、核酸またはペプチドに結合される、標識またはタグのような部分に間接的に結合する。従って、固相担体上の官能基に結合し得るタグを含む核酸またはペプチドは、本発明の方法を使用して単離され得る。かかる基は、例えば、結合パートナーと相互作用する基を含む。例えば、官能基は、組成または配列に基づいて特定の生体分子を単離するために従来使用される結合パートナーであり得る。本発明の方法における使用のためのかかる官能基の例としては、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、抗体、抗原、配列特異的相互作用（ハイブリダイゼーション可能なタグ）、DNA特異的結合タンパク質（例えば、フィンガードメイン、転写因子）およびこれらの誘導体が挙げられる。
【００６２】
特定の態様において、官能基は、ビオチンまたはビオチンを含む分子である。水溶性ビタミンであるビオチンは、高分子検出、精製および単離を含む多様な目的のための生化学および分子生物学において、ならびに細胞化学染色において、広範に用いられる（例えば、U.S. Patent No. 5,948,624参照；その全教示は参照によって本明細書中に援用される）。ビオチンはまた、臨床診断アッセイ、腫瘍の画像化および薬剤送達の分野の医薬において重要な応用を有し、細胞、細胞内構造およびタンパク質の選択的標識のための親和性細胞化学の分野で広範に用いられる。ビオチンの有用性は、卵白および鳥類、爬虫類および両生類の組織に見出される、４量体タンパク質アビジンまたはアビジンよりもわずかにビオチン特異的である、アビジンの化学相同物であるストレプトアビジンに強く結合する能力から生じる。ビオチンのアビジンとの相互作用は、公知の非共有親和性の中で、最も強く、約1.3×10-15Mの解離定数を示す（Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, CA(1996), p.570）。他の態様において、官能基は、ビオシチンおよび／またはビオチンアナログ（例えば、ビオチンアミドカプロン酸−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ビオチン−ＰＥＯ4−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ビオチン4−アミド安息香酸、ビオチンアミドカプロイルヒドラジド）ならびにビオチン誘導体（例えば、ビオチン−デキストラン、ビオチン−ジスルフィド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ビオチン−６アミドキノリン、ビオチンヒドラジド、ｄ−ビオチン−Ｎ ヒドロキシスクシンイミドエステル、ビオチンマレイミド、ｄ−ビオチン ｐ−ニトロフェニルエステル、ビオチン化ヌクレオチド、Ｎ.エプシロン.−ビオチニル−ｌ−リシン等のビオチン化アミノ酸）である（例えば、U.S. Patent No. 5,948,624参照）。
【００６３】
別の態様において、官能基は、アビジンまたはアビジンを含む分子（アビジン化）である。アビジンは、卵白に見出される４つの同一のサブユニットを含む糖タンパク質であり、それぞれがビオチンに対する結合部位を有する（Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, CA(1996), p.570）。ストレプトアビジンおよび他のアビジンアナログはまた、本発明の方法に用いられ得る。かかるアビジンアナログとしては、例えば、アビジン結合体、ストレプトアビジン結合体、アビジンもしくはストレプトアビジンの高純度および／または画分された種類、アビジンもしくはストレプトアビジンの非部分的または部分的アミノ酸バリアント（例えば、アビジンアナログの高親和性、多価性または一価性のビオチンへの結合をなお可能にするアミノ酸または化学置換を有する組換えまたは化学合成アビジンアナログ）が挙げられる。ストレプトアビジンは、Streptomyces avidiniiから単離された別のビオチン結合タンパク質である（Hermanson,上掲）。
【００６４】
官能基はまた、抗体であり得る。本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を包含する（例えば、IgG, IgM, IgA, IgDおよびIgE抗体）。用語ポリクローナルおよびモノクローナルとは、抗体調製物の均一性の程度のことをいい、特定の産生方法に限定されることを意図しない。任意の抗体または抗原結合断片が、本発明の方法において使用され得る。例えば、単鎖抗体、キメラ抗体、哺乳動物（例えば、ヒト）抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ移植抗体（例えば、霊長類化抗体）、ベニア化抗体（veneered）、多価抗体（例えば、二価）および二特異的抗体が、本発明および用語「抗体」に包含される。異なる種由来の部分を含むキメラ、ＣＤＲ移植またはベニア化単鎖抗体はまた、本発明および用語「抗体」に包含される。これらの抗体の種々の部分が、従来技術で化学的に繋ぎ合わされ得るか、あるいは遺伝子工学技術を用いた連続的なタンパク質として調製され得る。例えば、キメラ鎖またはヒト化鎖をコードする核酸は、連続的なタンパク質を産生するために発現され得る。例えば、Cabilly et al., U.S. Patent No. 4,816,567; Cabilly et al., European Patent No.0,125,023 B1; Boss et al., U.S. Patent No. 4,816,397; Boss et al., European Patent No.0,120,694 B1; Neuberger, M.S. et al., WO 86/01533; Neuberger, M.S. et al., European Patent No.0,194,276 B1; Winter, U.S. Patent No. 5,225,539; Winter European Patent No.0,239,400 B1; Queen et al., European Paternt No. 0 451 216 B1; およびPadlan, E.A. et al., EP 0 519 596 A1参照。また、霊長類化抗体に関してNewman, R. et al., BioTechnology, 10: 1455-1460 (1992)、並びに単鎖抗体に関してLadner et al., U.S. Patent No. 4,946,778およびBird, R.E. et al., Science, 242: 423-426 (1988)参照。
【００６５】
あるいは、官能基は抗原であり得る。本明細書で使用される場合、用語「抗原」、「免疫原」、または「エピトープ」（例えば、T細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ）とは、抗体または抗原結合断片が結合特異性を有する物質のことをいう。本発明の方法の使用のための抗体および抗原結合断片は、種々の免疫原（例えば、ポリペプチド）に対する結合特異性を有する。
【００６６】
任意の数のヘテロ（別の）官能基（例えば、ヘテロ二官能性、ヘテロ三官能性、ヘテロ多官能性）が、官能基の存在によって標的種の可逆結合を（例えば、化学的、立体的に）阻害しない限りは、固相粒子の表面上に存在し得る。本発明の方法において、少なくとも２つの別の官能基が固相担体上に存在する。１つの態様において、約２Ａ２毎で約２００Ａ２までの官能基があり得る。特定の態様において、固相担体上で50.5Ａ２毎に官能基がある。別の態様において、固相担体上で１３．８Ａ２毎に官能基がある。
【００６７】
当業者は、本発明の使用のためのヘテロ多官能性ビーズ上に任意の数の基を想像し得る。固相担体上の異なる官能基の数は、約２〜約１００の別の基であり得る。特定の態様において、固相担体は２つの異なる官能基を有する（二官能性磁性微粒子のような、二官能性固相担体）。別の態様において、固相担体は、1つが混合物中に存在する核酸と結合し、もう１つが混合物中に存在する１つ以上の非核酸構成物または部分（例えば、エンドトキシン、生物体）と結合する２つの基を有する。さらに別の態様において、固相担体は、１つが混合物中に存在する全ての核酸と結合し、もう１つが混合物中に存在する特定の標的核酸種（例えば、mRNA）と結合する２つの基を有する。
【００６８】
特定の態様において、少なくとも１つの官能基は、ストレプトアビジン基またはその誘導体である。
【００６９】
他の態様において、固相担体は、２つの別の官能基を含み、第一の官能基はＣＯＯＨ基であり、第二の官能基はストレプトアビジン基またはその誘導体であり；ここで第一の官能基はＣＯＯＨ基であり、第二の官能基はオリゴdT基またはその誘導体であり；第一の官能基はＣＯＯＨ基であり、第二の官能基はＰＭＸＢ基またはその誘導体であり；第一の官能基はＣＯＯＨ基であり、第二の官能基はＬＡＬＦ基またはその誘導体であり；第一の官能基はＣＯＯＨ基であり、第二の官能基はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）基またはその誘導体であり；第一の官能基はＣＯＯＨ基であり、第二の官能基はポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）基またはその誘導体である。
【００７０】
本発明の方法において、標的種および固相担体を含む混合物の組み合わせは、標的種が担体上の官能基に結合するための適切な条件下で維持される。本明細書に記載の方法および薬剤（試薬）は、核酸が固相担体へ結合することを含む、種々の精製技術（例えば、核酸および／またはペプチド精製技術）と共に使用され得、U.S. Pat. Nos. 5,705,628 (Hawkins); 5,898,071 (Hawkins); 6,534,262 (McKernan et al.), PCT Published Application No. WO 99/58664, U.S. Published Application No. 20020094519 A1, US Patent Nos. 5,047,513, US 6,623,655およびUS Patent No. 5,284,933に記載されるものを含み、その内容は、本明細書中に参照によって援用される。
【００７１】
本明細書に記載される場合、１つ以上の薬剤（例えば、バッファ、酵素）が、固相担体からの標的種を結合または除去するために使用される。固相担体からの標的種を結合および／または除去するために必要とされる薬剤の構成物は、１つの薬剤または複数の薬剤（例えば、第一の薬剤、第二の薬剤、第三の薬剤等）中に存在し得る。従って、１つより多くの薬剤が本発明の方法で使用される場合、薬剤は、同時または連続的に使用され得る。本明細書中に記載される方法を使用する目的に依存して、当業者は、本発明の方法で使用される薬剤の数および順序を決定し得る。
【００７２】
１つの態様において、薬剤は本発明の方法で用いられ、混合物中の標的種を沈殿させるか、あるいは固相担体（核酸沈殿剤）の表面上の官能基に吸着させる。１つの態様において、核酸またはペプチド沈殿剤は、十分な濃度で使用され、固相担体上に混合物の核酸を沈殿させる。
【００７３】
「核酸沈殿試薬」または「核酸沈殿剤」は、細胞の核酸を溶液へ放出させる組成物である。適切な沈殿剤としては、アルコール（例えば、エタノールまたはイソプロパノール等の短鎖アルコール）およびポリ−ＯＨ化合物（例えば、ポリアルキレングリコール）が挙げられる。核酸沈殿試薬は、1つ以上のこれらの薬剤を含み得る。核酸沈殿試薬は、固相担体に細胞の核酸を非特異的および可逆的に結合させる十分な濃度で存在する。かかる核酸沈殿剤は、例えば、使用される濃度に依存して、核酸を非特異的にまたは標的核酸種を特異的に、官能基としてのＣＯＯＨを含む固相担体に結合させるために使用され得る。
【００７４】
１つの態様において、アルコール、グリコール（例えば、アルキレン、ポリアルキレングリコール、エチレン、ポリエチレングリコール）およびポリビニルピロリジノン−40のような種々の核酸沈殿試薬（クラウディング試薬）を用いた核酸のカルボキシルコート固相担体（例えば、磁性微粒子）への結合を含む、カルボキシを基にした磁性ビーズを用いる。これらのクラウディング試薬の分子量は、実質的な沈殿力を有する低粘度溶液を製造するために最適化され得る。サイズ特異的な核酸単離は、クラウディング試薬の濃度、クラウディング試薬の分子量を調節するか、または溶液の塩、ｐＨ、極性もしくは疎水性の調節のいずれかによって実施され得る。大きな核酸分子は、低濃度の塩の溶液およびクラウディング試薬に押し出される一方で、より小さなサイズの種は、より高濃度のクラウディング試薬を必要とする。例えば、U.S.Patent No.5,705,628; U.S. Patent No. 5,898,071; U.S. Patent No. 6,534,262 およびU.S. Published Application No. 2002/0106686を参照、その全ては本明細書中に参照によって援用される。
【００７５】
適切な「ペプチド沈殿試薬」または「ペプチド沈殿剤」は、任意の適切な親和結合バッファを含む（例えば、US Patent Nos. 5,047,513; 6,623,655; 5,284,933;およびUS Published Application No. 2002/0019496, その全ては本明細書中に参照によって援用される）。
【００７６】
本発明の方法の使用のための適切なアルコール（例えば、エタノール、イソプロパノール）濃度（最終濃度）は、約５％〜約１００％；約４０％〜約６０％；約４５％〜約５５％；および約５０％〜約５４％である。
【００７７】
適切なポリアルキレングリコールとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリプロピレングリコールが挙げられる。適切なＰＥＧは、Sigma（Sigma Chemical Co., St. Louis MO., Molecular weight 8000, DnaseおよびRnase fee, Catalog number 25322-68-3）から入手可能である。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の分子量は、約250〜約10,000、約1000〜約10,000、約2500〜約10,000、約6000〜約10,000、約6000〜約8000、約7000〜約9000、約8000〜約10,000の範囲であり得る。特定の態様において、約8000の分子量を有するＰＥＧが用いられる。一般に、ＰＥＧの存在は、溶液から親水性核酸分子を追い出す疎水性溶液を提供する。１つの態様において、ＰＥＧ濃度は、約５％〜約２０％である。他の態様において、ＰＥＧ濃度は、約７％〜約１８％；約９％〜約１６％；および約１０％〜約１５％の範囲である。
【００７８】
任意に、混合物中の核酸および／またはペプチドの固相担体上への沈殿をおこすために、塩が試薬に添加され得る。単離の標的核酸分子の磁性反応微粒子への吸着を容易にするために有用な、適切な塩としては、塩化ナトリウム（NaCl）、塩化リチウム（LiCl）、塩化バリウム（BaCl2）、カリウム（KCl）、塩化カルシウム（CaCl2）、塩化マグネシウム（MgCl2）および塩化セシウム（CsCl）が挙げられる。１つの態様において、塩化ナトリウムが用いられる。一般に、塩の存在は、核酸分子の負電荷の反発を最小化するために機能する。該方法の使用に適切な広範囲の塩によって、多くの他の塩もまた、使用され得、適切な濃度が当業者によって経験的に決定され得るということを示す。塩濃度は、約０．００５Ｍ〜約５Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．５Ｍ；約０．１５Ｍ〜約０．４Ｍ；および約２Ｍ〜約４Ｍであり得る。
【００７９】
さらなる構成物が試薬に添加され得る。１つの態様において、RNAseが、核酸沈殿剤に添加される。
【００８０】
官能基が相補的な配列であり、そのために混合物中で核酸種にハイブリダイズする態様において、ハイブリダイズバッファが結合のために使用され得る。かかる方法の使用のための適切なバッファは、当業者に公知である。適切なバッファの例は、NaCl（例えば、約０１．Ｍ〜約０．５Ｍ）、Tris-HCl（例えば、１０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（例えば、０．５ｍＭ）、クエン酸ナトリウム塩化ナトリウム（ＳＳＣ）およびその組み合わせを含むバッファである。
【００８１】
使用される官能基（例えば、ビオチン標識またはタグを含む核酸と結合するために使用されるストレプトアビジン官能基）に依存して、当業者は、核酸および／もしくはペプチドを固相担体上の官能基に結合させるか、または固相担体上の官能基から核酸および／もしくはペプチドを溶出するかのいずれかに使用される薬剤を決定し得る。
【００８２】
本発明の方法において、複数の核酸および／またはペプチド種を含む混合物が固相担体と組み合わせられる。複数の核酸および／またはペプチドを含む任意の混合物が、該方法で使用され得る。適切な開始物質の例としては、血液、組織、組織溶解物、細胞（口内細胞のようなインタクトまたは全体の細胞）および細胞溶解物（増殖または培養培地の細胞）のような生物学的試料が挙げられる。さらなる適切な開始物質としては核酸を含むアッセイ試料が挙げられる。適切な開始物質としてはまた、哺乳動物（例えば、ヒト、霊長類、ウマ科動物、イヌ科動物、ネコ科動物、ウシ、ネズミ）組織か、あるいは体液およびかかる細胞から調製された溶解物のいずれかから得られた細胞を含む。本発明の方法の使用のための細胞の例は、限定されないが、哺乳動物細胞（例えば、全血細胞のような血液細胞）、細菌細胞（例えば、DH5α、DH10B、DH12S、C600又はXL-1 Blueのような大腸菌）、酵母細胞、植物細胞、組織細胞（例えば、線虫、マウス尾部、ヒト生検由来の細胞）ならびに外来性核酸（例えば、組換えＤＮＡ、細菌ＤＮＡまたは複製型ＤＮＡ）および／または宿主細胞染色体ＤＮＡおよび他の宿主細胞生体分子から単離のために標的となるペプチドを含む宿主細胞が挙げられる。あるいは、開始物質は、かかる細胞から調製された溶解物であり得る。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」は外来核酸および／またはペプチドが導入され得、それによって宿主細胞核酸およびペプチドに加えて、外来性核酸および／またはペプチドを含む宿主細胞を生じる任意の細胞である。本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞核酸」、「内在性核酸」、「宿主細胞ペプチド」、および「内在性ペプチド」とは、核酸種（例えば、ゲノムまたは染色体核酸）および細胞が得られる場合の宿主細胞に存在するペプチド種のことをいう。本明細書で使用される場合、用語「外来性」とは、宿主細胞核酸（例えば、プラスミド）およびペプチド以外の核酸およびペプチドのことをいい；外来性核酸およびペプチドは、宿主細胞に導入されるか、あるいは宿主細胞の祖先に導入されるかの結果として、宿主細胞中に存在し得る。このように、例えば、非内在性である核酸種（ペプチド種）は、得られたままの宿主細胞または宿主細胞の祖先には存在しない。適切な宿主細胞としては、限定されないが、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞および哺乳動物細胞が挙げられる。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「溶解物」は、任意の手段によって細胞膜が破壊され、その結果その核酸を含む細胞の含有物が溶液中に存在する溶液である。「清澄化溶解物」は、染色体またはゲノム核酸、タンパク質および細胞膜が、溶解物の化学処理または遠心分離によるなどして除去された溶解物である。細胞は公知の方法を用いて解離され、それによって本発明の方法での使用に適切な混合物を調製する。例えば、細胞は化学手段（例えば、アルカリまたはアルカリおよび陰イオン洗浄剤処理、非イオン洗浄剤（例えば、Triton X））、陽性洗浄剤、等張ショック、または物理的破壊（例えば、均質化）を用いて溶解され得る。
【００８５】
本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞溶解懸濁物」は、何らかの手段（例えば、アルカリもしくはアルカリおよび陰イオン洗浄剤処理、非イオン洗浄剤、陽性洗浄剤、等張性ショック等の化学的、またはホモジネートによる物理的破壊）により膜が破壊された宿主細胞を含む懸濁物について言い；かかる懸濁物は宿主細胞生体分子、細胞内容物および破壊された膜残屑の混合物である。一つの態様において、本発明での使用に適した宿主細胞溶解懸濁物は、宿主細胞とアルカリおよび陰イオン洗浄剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム（SDS））溶液（例えば0.2N NaOH、1% SDS）とを接触させることにより調製される。随意に、リゾチームは溶解バッファに含まれ得る。溶解溶液中の陰イオン洗浄剤の存在は、タンパク質の有効な電荷を中和することによる抗タンパク質環境を作り出すために機能し、それにより官能基でコートされた常磁性微粒子の表面へのタンパク質の誘引を最小にする。一つの態様において、宿主細胞溶解懸濁物は非中和性である。
【００８６】
一つの態様において、本発明の方法に従って細胞を固相担体および試薬と組み合わせるが、ここで該試薬により、細胞の核酸が非特異的および可逆的に固相担体に結合するようになる。上述のように、開始物質が細胞である態様において、本発明の方法に使用される（一つまたは複数の）薬剤は、細胞の溶解を生じさせるように調製され得る。種々の溶解液成分を用いて膜の破壊がなされ得る（アルカリ、アルカリおよび陰イオン洗浄剤処理、または等張性ショック等）。一つの態様において、試薬の溶解液成分はアルカリ（NaOH）および／または陰イオン洗浄剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム（SDS））溶液である（例えば、細胞に加える際に終濃度0.2N NaOH、1% SDS）。随意に、リゾチームは第一の試薬の溶解液成分に含まれ得る。溶解液成分中の陰イオン洗浄剤の存在は、タンパク質の有効な電荷を中和することによる抗タンパク質環境を作り出すために機能し、それにより固相担体（例えば官能基でコートされた常磁性微粒子）の表面へのタンパク質の誘引を最小にする。一つの態様において、RNA溶解バッファが使用される。特定の態様において、RNA溶解バッファは、pH4.5の20mMクエン酸バッファ、2％ラウリルサルコシンナトリウム、10mM EDTA、1mMオーリントリカルボン酸、1% triton-x-100、1M LiCl、30% イソプロパノール、0.05% アジ化ナトリウムである）。別の態様において、RNA溶解バッファは、pH7.0の50mMクエン酸バッファ、2% ラウリルサルコシンナトリウム、10mM EDTA、1mMオーリントリカルボン酸、1% triton-x-100、1M LiCl、30% イソプロパノール、0.05% アジ化ナトリウムである。
【００８７】
本発明の方法に従って、混合物中の標的種の単離は、核酸でコートされた固相担体を組み合わせから除去することによりなされる。例えば吸引濾過、遠心分離によるか、または固相担体（例えば常磁性微粒子）を引きおろすために磁場を利用することにより、第一の組み合わせから固相担体（例えば常磁性微粒子）を回収し得る。好ましくは、常磁性微粒子は、少なくとも1000ガウスの磁場を利用するなど、磁力による手段を用いて溶液から分離される。しかしながら、上清から磁性微粒子を除去するために当業者に公知の他の方法が用いられ得る（例えば吸引濾過または遠心分離）。次いで残りの溶液が除去され得、表面に吸着された細胞の核酸を有する固相担体が残る。
【００８８】
本明細書に記載されるように、固相担体から核酸および／またはペプチド等の標的種を除去するために使用され得る薬剤には、溶出バッファ等のバッファが含まれる。本発明の方法の使用に適切な「溶出バッファ」は、固相担体の（一つまたは複数の）官能基から、核酸および／またはペプチド等の標的種を（例えば選択的に）溶出するバッファである。一つの態様において、本発明での使用に適切な溶出バッファは、水または任意の水溶液であり得る。例えば有用なバッファとしては、TRIS-HCl（例えば10mM, pH7.5）、Trisアセテート、ショ糖（20％）、EDTAおよびホルムアミド（100％）溶液が挙げられるが、これに限定されない。一つの態様において、溶出バッファは、ナトリウム、リチウム、カリウムおよび／またはアンモニウム等の一価の（一つ以上の）陽イオンを含む緩衝化塩溶液である（例えば約0.1M〜約0.5M）。適切な低イオン強度溶出バッファが使用される場合、固相担体からの核酸またはペプチドの溶出は迅速に起こり得る（例えば30秒以下）。結合した標的核酸種および／またはペプチド種が一旦溶出されると、非標的の核酸種および／またはペプチド種が結合した固相担体は溶出バッファから分離される。
【００８９】
随意に、該薬剤は、核酸（例えば酵素）またはペプチド（例えばプロテイナーゼK等のプロテイナーゼ）を分解する成分を含み得る。例えば、DNase（例えばDNaseI）はDNA（例えば宿主細胞DNA）を分解するために添加され得、それによりDNAを有さないか、または本質的にDNAを有さない固相担体にRNAが結合することが可能となる。あるいは、RNAseはRNA（例えば宿主細胞のRNA）を分解するために添加され得、それによりRNAを有さないか、または本質的にRNAを有さない固相担体にDNAが結合することが可能となる。あるいは、RNAse（例えば1.75ng/μl RNAse/ddH2O）は宿主細胞のRNAを分解するために、溶解液成分に添加され得、それによりRNAを有さないか、または本質的にRNAを有さない固相担体にDNAが結合することが可能となる。RNAse工程を含むことの必要性は、実行される特定の核酸沈殿において単離の標的とされる核酸種の大きさによって主に決定される。例えば、単離のために選択される条件が少なくとも4000塩基対を含む核酸の単離に適切である場合、RNA種が相当の汚染物であり得ることは起こりそうもない。
【００９０】
また、固相担体に結合した標的種を固相担体から分離する前に、結合した標的種で固相担体を洗浄することで（例えば固相担体と適切な洗浄バッファ溶液とを接触させることで）、固相担体から不純物（例えば宿主細胞成分、タンパク質、代謝物、化学物質または細胞残屑）を除去し得る。本明細書で使用される場合、「洗浄バッファ」は、微粒子に直接結合するかまたは吸着された核酸に結合するかいずれかの不純物を溶解または除去するが、固相に吸着された標的種を溶解しない組成物である。pHならびに洗浄バッファの溶質組成物および濃度は、存在すると予想される不純物の型に従って変化し得る。例えば、エタノール（例えば70％）は、余分なPEGおよび塩を除去するために有用な好ましい洗浄バッファの例である。一つの態様において、洗浄バッファには、NaCl（例えば0.1M）、Tris（例えば10mM）およびEDTA（例えば0.5mM）が含まれる。核酸および／またはペプチドを結合している固相担体はまた、一つより多い洗浄バッファ溶液で洗浄され得る。固相担体は、所望の不純物を除去するために、必要があるたびに洗浄され得る（例えば3〜5回）。しかしながら、結合した標的種の収量の損失を最小にするために、好ましくは洗浄の回数は限られる。適切な洗浄バッファ溶液はいくつかの特性を有する。まず、洗浄バッファ溶液は、固相担体に結合した核酸および／またはペプチドが固相担体から溶出しないが、微粒子に結合したままである、十分に高い塩濃度（十分に高いイオン強度）を有さなければならない。適切な塩濃度は約0.1Mよりも高く、好ましくは約0.5Mである。第二に、バッファ溶液は、核酸または微粒子に結合した不純物が解離するように選択される。pHならびにバッファ溶液の溶質組成物および濃度は、存在すると予想される不純物の型に従って変化し得る。適切な洗浄溶液としては以下のもの：0.5 x 5 SSC；100mM硫酸アンモニウム、400mM Tris pH 9、25mM MgCl2および1% ウシ血清アルブミン（BSA）；1〜4Mグアニジン塩酸（例えば40% イソプロパノールおよび1% Triton X100を含む1MグアニジンHCL）；ならびに0.5M NaClが挙げられる。一つの態様において、洗浄バッファ溶液には、25mM Trisアセテート（pH7.8）、100mMカリウムアセテート（KOAc）、10mMマグネシウムアセテート（Mg2OAc）、および1mMジチオトレイトール（dithiothreital（DTT））が含まれる。別の態様において、洗浄溶液には、2% SDS、10% Tweenおよび／または10% Tritonが含まれる。
【００９１】
本発明の方法に使用される薬剤の成分は、単一の薬剤（試薬）中、または別々の成分として包含され得る。（一つまたは複数の）薬剤の別々の成分が使用される態様において、該成分は同時にまたは続いて混合物と組み合わされ得る。特定の態様に従って、組み合わせの要素が組み合わされる順序は必ずしも決定的ではあり得ない。試薬に含まれる成分の性質および量は、上述の方法中に記載されたとおりである。本明細書の方法に記載された機能および／または濃度を取得するために希釈が必要であるように、該試薬は濃縮された形態で調製され得る。
【００９２】
本明細書に記載の方法はまた、二重シークエンス反応物をそれぞれの順方向および逆方向サンガー伸長産物に分離するために用いられ得る。二重シークエンス反応により完全なリードペアが保証され、サーマルサイクラーの要求物が半分に削減される。例えば、ストレプトアビジンおよびカルボキシ官能基を含む二官能性磁性粒子を用いて、ビオチン付加順方向リードは、反応容器中でビオチン-ストレプトアビジン相互作用を介して磁性粒子に結合し得るが、一方（同時にまたは続いて）逆方向リードはカルボキシ官能化ビーズに結合する（図１参照）。特定の態様において、ビオチン付加順方向リードは第二の反応容器中でビオチン-ストレプトアビジン相互作用を介して磁性粒子に結合し得るが、一方で逆方向リードは続いてカルボキシ官能化ビーズに結合する。この態様において、ある標準的なストレプトアビジン精製を行い、シークエンスのためにホルムアミドで溶出されるほとんどの順方向産物を捕捉し得る。次いで上清を新しい容器に移し、二官能性ストレプトアビジン/カルボキシビーズを添加し、二工程の結合反応を続ける。ストレプトアビジン/ビオチン相互作用は水のみでは解離され得ないので、残りのビオチン標識された順方向産物はビーズ混合物上に残るが、一方で標識されない逆方向産物はカルボキシ基から溶出され、キャピラリーシークエンスのために新しいプレートに移される。
【００９３】
別の態様において、本発明は、ビオチン付加順方向プライマー、および逆方向プライマーを用いた同一反応容器中の鋳型DNAの同時にまたは続いて起こる増幅およびシークエンス、ならびに順方向および逆方向伸長産物の分離の方法に関する。鋳型DNA、ビオチン付加順方向プライマー、逆方向プライマーおよび非プルーフリーディングDNAポリメラーゼが、アンプリコンの大きさに依存するデオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP）（例えば2〜10x濃度）および標識されたジデオキシヌクレオチド三リン酸（ddNTP）ターミネーターを含むポリメラーゼ連鎖反応（PCR）中に存在する。特定の態様において、PCRの初めの数サイクル中に鋳型の指数関数的な増幅が起こる。一定のレベルのdNTPが消費された後、順方向および逆方向伸長産物を生じる混合物中で、dNTPおよび標識ddNTPの両方を消費する線形のシークエンス（linear sequencing）が優勢な反応である。ストレプトアビジンおよびカルボキシ官能基を含む二官能性磁性粒子を用いて、ビオチン付加順方向リードは、反応容器中でビオチン-ストレプトアビジン相互作用を介して磁性粒子に結合し得るが、一方で（同時にまたは続いて）逆方向リードはカルボキシ官能化ビーズに結合する。特定の態様において、ビオチン付加順方向リードは、第二の反応容器中でビオチン-ストレプトアビジン相互作用を介して磁性粒子に結合し得るが、一方で逆方向リードは、続いてカルボキシ官能化ビーズに結合する。ストレプトアビジン精製を行い、シークエンスのためにホルムアミドで溶出されたほとんどの順方向産物を捕捉し得る。次いで上清を新しい容器に移し、二官能性ストレプトアビジン/カルボキシビーズを添加し、二工程の結合反応を続ける。ストレプトアビジン/ビオチン相互作用は水のみでは解離され得ないので、残りのビオチン標識順方向産物はビーズ混合物上に残るが、一方で標識されない逆方向産物はカルボキシ基から溶出される。
【００９４】
従って、本発明は、シークエンス反応の順方向伸長産物および逆方向伸長産物の分離方法に関する。該方法は、順方向伸長産物および逆方向伸長産物を含むシークエンス反応混合物と順方向伸長産物を選択的に結合する第一の官能基および核酸を結合する第二の官能基を含む表面を有する固相担体とを組み合わせて、それにより第一の組み合わせを生じる工程を含む。順方向伸長産物の第一の官能基への結合および逆方向伸長産物の第二の官能基への結合に適した条件下で、第一の組み合わせは維持される。固相担体を第一の組み合わせから除去し、固相担体の第二の官能基から逆方向伸長産物を選択的に溶出するバッファと組み合わせて、それにより第二の組み合わせを生じる。固相担体を第二の組み合わせから除去し、それによりシークエンス反応の順方向伸長産物および逆方向伸長産物を分離する。
【００９５】
シークエンス反応の順方向伸長産物および逆方向伸長産物の分離の一つの態様において、該方法は、ビオチン付加順方向伸長産物、および逆方向伸長産物を含むシークエンス反応混合物と順方向伸長産物を選択的に結合する（一つ以上の）ストレプトアビジン官能基、および核酸を結合する（一つ以上の）COOH官能基を含む表面を有する固相担体とを組み合わせて、それにより第一の組み合わせを生じる工程を含む。ビオチン付加順方向物のストレプトアビジン官能基への結合を促進する薬剤（例えば塩）、および核酸のCOOH基への結合を促進する薬剤（例えば、エタノール、ポリエチレングリコール）と第一の組み合わせとを接触させる。
【００９６】
ビオチン付加順方向物のストレプトアビジン官能基への結合を促進し、核酸のCOOH基への結合を促進する薬剤と第一の組み合わせを接触させることは、一つ以上の薬剤（例えば一薬剤、二薬剤、三薬剤等）を用いて、一つ以上の工程（例えば一工程、二工程、三工程等）で行われ得る。一つの態様において、第一の組み合わせを、ビオチン付加順方向物のストレプトアビジン官能基への結合を促進する第一の薬剤（例えば塩）と接触させ、次いで核酸のCOOH基への結合を促進する第二の薬剤（例えばエタノール、ポリエチレングリコール）と接触させる。別の態様において、第一の組み合わせを、核酸のCOOH基への結合を促進する第一の薬剤（例えばエタノール、ポリエチレングリコール）と接触させ、次いでビオチン付加順方向物のストレプトアビジン官能基への結合を促進する第二の薬剤（例えば塩）と接触させる。
【００９７】
固相担体を第一の組み合わせから除去し、固相担体のCOOH官能基から逆方向伸長産物を選択的に溶出するバッファ（例えば水）と組み合わせて、それにより第二の組み合わせを生じる。あるいは、固相担体をストレプトアビジン基から順方向伸長産物を選択的に溶出するバッファと組み合わせて、それにより第二の組み合わせを生じ得る。固相担体を第二の組み合わせから除去し、それによりシークエンス反応の順方向伸長産物および逆方向伸長産物を分離する。本方法は、順方向伸長産物よりもむしろ逆方向伸長産物がビオチン付加されて行なわれ得る。
【００９８】
シークエンス反応の順方向伸長産物および逆方向伸長産物を分離する別の態様において、該方法は、ビオチン付加順方向伸長産物、および逆方向伸長産物を含むシークエンス反応混合物と、順方向伸長産物を選択的に結合する（一つ以上の）ストレプトアビジン官能基および核酸を結合する（一つ以上の）COOH官能基を含む表面を有する固相担体とを組み合わせて、それにより第一の組み合わせを生じる工程を含む。ビオチン付加順方向物のストレプトアビジン官能基への結合を促進する薬剤（例えば塩）、および核酸のCOOH基への結合を促進する薬剤（例えばエタノール、ポリエチレングリコール）と第一の組み合わせとを接触させる。この工程は一つ以上の薬剤（例えば一薬剤、二薬剤）を用いて、一つ以上の工程（例えば一工程、二工程）で行われ得る。固相担体を第一の組み合わせから除去して、固相担体のCOOH官能基から逆方向伸長産物を選択的に溶出するバッファ（例えば水）と組み合わせて、それにより第二の組み合わせを生じる。あるいは、固相担体をストレプトアビジン基から順方向伸長産物を選択的に溶出するバッファと組み合わせて、それにより第二の組み合わせを生じ得る。固相担体を第二の組み合わせから除去し、それによりシークエンス反応の順方向伸長産物および逆方向伸長産物を分離する。本方法は、順方向伸長産物よりも、むしろ逆方向伸長産物がビオチン付加されて行なわれ得る。
【００９９】
特定の態様において、本発明はシークエンス反応の順方向伸長産物および逆方向伸長産物の分離方法に関する。この態様において、該方法は、順方向伸長産物および逆方向伸長産物を含むシークエンス反応混合物と、順方向伸長産物を選択的に結合する第一の官能基および核酸を結合する第二の官能基を含む表面を有する固相担体とを組み合わせて、それにより第一の組み合わせを生じる工程を含んだ。順方向伸長産物の第一の官能基への結合に適した条件下で、第一の組み合わせを維持する。固相担体を第一の組み合わせから除去し、それにより逆方向伸長産物を含む第二の混合物を生じる。固相担体を、固相担体の第一の官能基から順方向伸長産物を選択的に溶出するバッファ（例えばホルムアミド）と組み合わせて、それにより第二の組み合わせを生じる。固相担体を第二の組み合わせから分離し、第二の混合物と組み合わせて、それにより第三の組み合わせを生じる。逆方向伸長産物の第二の官能基への結合に適した条件下で、第三の組み合わせを維持する。固相担体を第三の組み合わせから除去し、固相担体の第二の官能基から逆方向伸長産物を選択的に溶出するバッファと組み合わせて、それによりシークエンス反応の順方向伸長産物および逆方向伸長産物を分離する。
【０１００】
別の態様において、本明細書に記載の方法を用いて、核酸種およびペプチド種の分離もし得る。例えば、カルボキシおよび固定金属イオン官能基（immobilized metal functional group）を含む二官能性磁性ビーズを用いて、DNAまたはRNAはカルボキシ基との相互作用を介して該粒子に結合され得るが、一方で同時にまたは続いて、ペプチドは固定金属イオン複合体との相互作用を介して該粒子に結合し得る。一つの特定の態様において、ポリヒスチジン融合タンパク質を組換え的に発現する細胞は溶解され得、組換えタンパク質、および組換えタンパク質を発現する組換えDNA種の両方は二官能性微粒子により結合され、単離され得る。かかる技術は、タンパク質、および直接進化の反復的な過程においてまたはcDNAライブラリー由来の発現コンストラクトのスクリーニングにおいてタンパク質を発現する組換えDNAクローンを単離するために有用である。別の態様において、mRNAおよびタンパク質は、mRNAを結合するためのカルボキシまたはオリゴdT官能基、およびタンパク質を結合するための固定金属イオン官能基を含む二官能性ビーズによって単離され得る。かかる技術は、タンパク質的応用のための遺伝子の転写および翻訳発現レベルの定量的な共評価のための、タンパク質およびmRNAの共精製に有用である。
【０１０１】
本発明の方法において、単離された標的種は、シークエンス解析等（例えばポリアクリルアミドゲルまたはキャピラリー電気泳動）のさらなる分析にかけられ得る。開示された方法によって単離された核酸は、高品質核酸を必要とする分子生物学的応用（例えば、DNAシークエンスの鋳型の調製；哺乳動物細胞のマイクロインジェクション、トランスフェクションまたはトランスフォーメーション；RNAプローブのインビトロ合成；逆転写クローニング；cDNAライブラリーの構築；PCR増幅；または遺伝子治療研究；さらにはトランスフォーメーション；制限エンドヌクレアーゼまたはマイクロアレイ解析；選択的RNA沈殿；インビトロトランスポジション（in vitro transposition）；複数PCR増幅産物の分離；インビトロsiRNA；RNAiヘアピン；DNAプローブおよびプライマーの調製ならびに脱テンプレートプロトコール（detemplating protocol）が挙げられるが、これに限定されない、よりストリンジェントではない品質の要求の他の応用）に用いられ得る。
【０１０２】
多様な構成および複雑性の開始溶液からの高品質核酸調製物の単離は、分子生物学の基本技術である。従って本明細書に記載された発明（work）の結果としての、新規で容易であり、自動化可能な核酸分子の分離方法は現在利用可能である。一つの態様において、複数試料の移動装置により細胞に試薬が添加される。別の態様において、第一の試薬は複数の試料、例えば少なくとも6、12、24、96、384または1536の試料に、各試料が一つ以上の細胞に接触するように同時に添加される。別の態様において、第一の試料は複数の試料（例えば少なくとも6、12、24、96、384または1536の試料）に、各試料が、例えば一つ以上の細胞に接触するように連続的に送達される。本発明は複数の核酸試料の分析方法を包含する。該方法は、本明細書に記載された方法により単離された複数の核酸試料の提供工程、および例えば試料のシークエンス解析を行なう等の試料の分析工程を包含する。
【０１０３】
本発明はまた、本発明の方法で用いるキットにも関する。ある態様において、該キットはヘテロ多官能性（ヘテロ二官能性）固相担体および細胞溶解バッファを含む。本発明のキットは、さらなるバッファ（例えば溶解バッファ、洗浄バッファおよび溶出バッファ）、核酸の分解のための酵素および使用説明書をさらに含み得る。特定の態様において、キットは、COOH基およびオリゴdT基、ならびに任意に細胞溶解バッファを含む二官能性磁性微粒子；COOH基およびストレプトアビジン基を含む二官能性磁性微粒子；COOH基およびオリゴdT基またはその誘導体を含む二官能性磁性微粒子；COOH基およびPMXB基またはその誘導体を含む二官能性磁性微粒子；COOH基およびLALF基またはその誘導体を含む二官能性磁性微粒子；COOH基およびポリエチレンイミン（PEI）基またはその誘導体を含む二官能性磁性微粒子；ならびにはCOOH基およびポリ-L-リシン（PLL）基またはその誘導体を含む二官能性磁性微粒子を含む。
【０１０４】
（実施例）
実施例１  磁気ビーズ上の二つの官能基を用いた二重シークエンス反応物の分離
方法／材料
以下の試薬および反応当りの量を含有する混合物を作成した。
【０１０５】
【表１】
2008510456.tif 000003
【０１０６】
混合物を96ウェルサーモサイクリングプレート中の混合物に配列し、以下のパラメータを用いてサイクルシークエンスにかけられた：
工程1.  95℃、10秒
工程2.  5O℃、5秒
工程3.  6O℃、150秒
工程4.  工程1〜3を40回繰り返す
工程5.  4℃維持
【０１０７】
手順A.  ストレプトアビジン磁気ビーズの洗浄（順方向配列）
1.  5μLシークエンス反応物に、2.5μL磁気ストレプトアビジンビーズおよび7.5μLの5M NaClを添加し、反応液をよく混合した。
2.  結合ビオチン-順方向配列フラグメントを含有する磁気ビーズを、磁性プレート上に5分間置くことで溶液から分離した。
3.  逆方向配列フラグメントを含有する上清を吸い、逆方向配列洗浄のための新しいウェルに分配した（手順B）。
4.  各洗浄の間にビーズを再懸濁して40μL ddH2Oでストレプトアビジン（strepavidin）ビーズを2回洗浄した。
5.  ビーズを20μL Hi-Dyeホルムアミドに再懸濁、スピンダウンし、90℃で10分間インキュベートして順方向配列フラグメントを溶出した。
【０１０８】
手順B.  上清のカルボキシルビーズの洗浄（逆方向配列）
1.  手順A. 工程3からの上清試料に5μLの希釈済みのカルボキシルコートした磁気ビーズおよび23μL 85％のエタノールをウェルごとに加え、よく混合した。
2.  結合逆方向配列フラグメントを含有する磁気ビーズを、磁性プレート上に5分間置くことで溶液から分離した。
3.  上清を吸い、廃棄した。
4.  40μLの85％のエタノールでビーズを2回洗浄した。
5.  20μL ddH2Oにビーズを再懸濁して逆方向配列フラグメントを溶出した。
ABI 3700で、順方向および逆方向配列フラグメントを別々に解析した。
【０１０９】
結果／議論：
二つのフラグメント集団の好結果の分離およびシークエンスは、二つの異なる官能基を有する磁気ビーズを用いることで立証される。図１参照。順方向および逆方向の両方のシークエンス反応の解析が図２に示される。同一の反応からの順方向および逆方向の配列フラグメントの効果的な分離は、Phred 20品質スコア（P20）で示されるきれいなシグナルにより立証される。
【０１１０】
実施例２  二官能性オリゴdT／カルボキシルビーズを用いた全RNAの単離
全RNAのSPRI精製を行なう能力についてオリゴdT修飾カルボキシルビーズを試験するため。
【０１１１】
手順
15mLの円錐管中にペレット化した1.75 x 10e7 293T細胞で開始した。15ml円錐管中で、二つのペレットを3ml RNA溶解バッファ（pH4.5の20mMクエン酸バッファ、2%ラウリルサルコシンナトリウム、10mM EDTA、1mM オーリントリカルボン酸、1% triton-x-100、1M LiCl、30%イソプロパノール、0.05% アジ化ナトリウム、0.03% 磁気カルボキシルまたはオリゴdT磁気ビーズ）に再懸濁した。磁石上に15分間置いた。5mlの4Mグアニジン-HCL/40％イソプロパノールバッファに再懸濁することでビーズを洗浄し、その後磁石の上に置いた。第二および第三の洗浄は1mLの90％エタノールを用いた。ビーズを1.5mLエッペンドルフチューブに移した。洗浄4および5も1mLの90％エタノールを用いた。ビーズを乾燥させ、100μL DEPC水で溶出した。微小遠心分離でペレットにして45μLを回収した。
【０１１２】
結果
二官能性オリゴdT/カルボキシルビーズは、標準カルボキシルビーズにより行なわれる同一の単離との比較により示されるように、ゲノムDNAおよび全RNAの両方を単離するためにSPRIプロセス中で機能し得る。図３のゲルは、全RNA、28、18、5.8/5SリボソームバンドおよびゲノムDNAバンドを示す。試料のRibogreen分析で測定されるように、標準カルボキシルビーズおよび二官能性オリゴdT/カルボキシルビーズの両方により、およそ同等収量のRNAが得られる。
【０１１３】
RiboGreenでの定量
【表２】
2008510456.tif 000004
【０１１４】
実施例３  細胞からの直接mRNA単離
二官能性オリゴdT/カルボキシルビーズを用いた1x106個の3638C細胞からのmRNAの直接単離。
【０１１５】
手順
1.  1.1x107個の3638C細胞を-80℃で凍結させた。融解し、全量10mlの100mM NaCl、10mM Trisに再懸濁し、約1x106細胞/mlにした。
2.  epiチューブ中1mlの細胞を14K x g、RTで2回ペレットにした。
3.  0.03% 二官能性オリゴ-dTビーズまたは標準カルボキシルビーズのいずれかを有するpH7.0の0.5ml RNA溶解バッファにペレットを再懸濁した。
4.  RTで5分間インキュベートした。
5.  磁石上で5分間インキュベートした。
6.  各ペレットを、pH7.3の0.5ml洗浄バッファ（1M G-HCl、1% TX-100、25mMクエン酸Na、30% iso）に再懸濁した。
7.  磁石上に5分間置いた。
8.  70％エタノール、各500μLで30秒、ペレットを4回洗浄した。5分間乾燥させた。この時点で、ビーズはそれらに結合した全核酸を有する。
9.  mRNAを選択的に単離するために、65℃の160μL 1Xハイブリダイゼーションバッファ（0.5M NaCl、pH7.5の1OmM Tris-HCl、0.5mM EDTA）にビーズを再懸濁した。室温で5分間冷却して、磁石上に2分間置き、次いで65 Cの160μL 1X Hybバッファでの再懸濁を繰り返し、室温で5分間冷却した。磁石上に2分間置いた。
10.  160μLのハイブリダイゼーションバッファにビーズを再懸濁し、磁石上に2分間置いた。
11.  80μLの洗浄バッファ（0.1M NaCl、pH7.5の1OmM Tris-HCl、0.5 mM EDTA）にビーズを再懸濁し、新しいチューブに移して磁石上に2分間置いた。
12.  RNAseの存在しない65 Cの2OμL DEPC水にビーズを再懸濁し、磁石上に2分間置き、その後新しいチューブに移した。-20℃で保存した。
【０１１６】
結果
Pico RNAチップを用いて、1μLをBioanalyer 2100にかけた（run）。図４の上部の電気泳動図はRNAラダーを示す。図４の下部の電気泳動図は、二官能性オリゴdT/カルボキシルビーズを用いた、mRNAの好結果の単離を示す広域なピークとなって表れたmRNAサイズフラグメントの範囲を有する典型的なmRNAプロファイルを示す。
【０１１７】
実施例４  細胞からの直接mRNA単離
目的
二官能性オリゴdT/カルボキシルビーズおよび標準カルボキシルビーズを用いた5x105個の3638C細胞からのmRNAの直接単離。
【０１１８】
手順
1.  9.9xlO6個の3638C細胞を-80℃で凍結させた。融解し、全量10mlの100mM NaCl、10mM Trisに再懸濁し、約1x106細胞/mlにした。
2.  エッペンドルフチューブ中0.5mlの細胞を14K x g、RTで2回ペレットにした。
3.  0.03% 二官能性オリゴ-dT/カルボキシルビーズまたは標準カルボキシルビーズのいずれかを有するpH7.0の0.5ml RNA溶解バッファにペレットを再懸濁した。
4.  RTで5分間インキュベートした。
5.  磁石上で5分間インキュベートした。
6.  上清を除去して、各ペレットをpH 7.3の0.5ml洗浄バッファ（1M G-HCl、1% TX-100、25mMクエン酸Na、30% iso）に再懸濁した。
7.  磁石上に5分間置いた。
8.  70％エタノール、各500μLで30秒、ペレットを4回洗浄した。5分間乾燥させた。この時点で、ビーズはそれらに結合した全核酸を有する。
9.  mRNAを選択的に単離するために、65℃の80μL 1Xハイブリダイゼーションバッファ（0.5M NaCl、pH7.5の1OmM Tris-HCl、0.5mM EDTA）にビーズを再懸濁した。室温で5分間冷却させ、磁石上に2分間置き、次いで65℃の80μLハイブリダイゼーションバッファでの再懸濁を繰り返した。室温で5分間冷却し、磁石上に2分間置いた。
10.  ビーズを40μLの洗浄バッファ（0.1M NaCl、1OmM Tris-HCl、pH7.5、0.5 mM EDTA）に再懸濁し、新しいチューブに移して磁石上に2分間置いた。
11.  65℃の10μL水にビーズを再懸濁し、磁石上に2分間置き、その後新しいチューブに移した。-20℃で保存した。
【０１１９】
結果
Pico RNAチップを用いて、1μLをBioanalyer 2100にかけた。図５の上部の電気泳動図はRNAラダーを示す。中央は、幅広いピークで示される、オリゴdT/カルボキシルビーズを用いた、好結果のmRNAの単離を示す。下部の電気泳動図は、標準カルボキシルビーズがmRNAピークの非存在によって示されるように、mRNAを単離しないことを示す。
【０１２０】
実施例５  ポリミキシンBのカルボキシルビーズへの吸着
PXMBはpH10未満で正味の正の電荷を有するので、カルボキシビーズと容易に結合するはずである。次の実験において、エンドトキシン除去試薬の調製のためにカルボキシビーズへのPMXBの吸着を調査した。
【０１２１】
手順：標準的な手法（Seradyn Microparticle Reagent Optimization Manual）を用いて、pH6.1でMESバッファの存在下で、タンパク質はカルボキシビーズに容易に吸着され得る。結合は、電荷および疎水性相互作用の両方に起因する。カルボキシビーズに装填できるタンパク質の量は、各タンパク質に関して経験的に決定される。PMXBの吸着の最大レベルを決定するために、さらなる量のPMXBを、pH6.1の25mM MESバッファ中で1％カルボキシビーズ溶液に添加し、回転台で24時間穏やかに混合した。結合および非結合タンパク質の量を上述のBCAアッセイで決定した。必要なカルボキシビーズの最適量を決定するために、種々の濃度のカルボキシビーズで同様の滴定実験を行なった。
【０１２２】
結果：1％カルボキシビーズの0.1ml溶液を飽和させるのに、10μgのPMXBで十分であり、タンパク質の残りが上清（SN）中に見られた（図９）。
【０１２３】
実施例６  二官能性ビーズを用いたエンドトキシンの除去
ポリミキシンBの磁気ビーズへの吸着により作製した、二官能性ビーズでのエンドトキシンの存在しないDNA調製。
【０１２４】
カルボキシ修飾（CM）ビーズに吸着されるポリミキシンB（PMXB）を含むエンドトキシン除去試薬（ERR）は、以下のように調製された：0.1mg/ml PMXBを25mM MESバッファ（pH6.1）に溶解し、CMビーズ（最終1％）と混合した。溶液を最低24時間、4 Cで、回転台で平衡化した。プラスミド調製物からエンドトキシンを除去する能力について、図１０で図示されるAgencourtのCosMcPrep DNA精製キットと共に、ERR試薬を試験した。簡潔に、各240μLの清澄化溶解液（図１０、工程４）に、100μLのERRを添加した（10μgのPMXBを含有する）。インキュベーションおよびERRビーズの磁性除去に続き、上清中のプラスミドDNAをSPRIで精製した（図１０、工程７〜１０）。
【０１２５】
プラスミドDNA調製物中のエンドトキシンの量を、BioWhittakerの光度計リムルス試験（LAL）アッセイで測定した。本アッセイは、医薬および医療器具に関するエンドトキシン制限を設けるため、ならびに最終産物エンドトキシン試験としてLALの使用を検証するために、米国食品医薬品局公開ガイドラインに従う。
【０１２６】
図１０は、エンドトキシン除去工程を含むように修正された、CosMcPrep（Agencourt）DNA精製キットを示す。
【０１２７】
清澄化溶解液からのエンドトキシンの除去について、ERR試薬の他にいくつかの試薬を試験した。該試薬には、Magnesilシリカ磁気ビーズ（Promega）、CMビーズ、PMXBアガロース（Pharmacia）、PMXBと混合したCMビーズ（PMXB＋CMビーズ非吸着)、PMXBが吸着したCMビーズ（PMXB/CMビーズ、ERR試薬としても知られる）が含まれた。プラスミドDNAのSPRI精製を進める前の1時間、種々のビーズ試薬が清澄化溶解液と混合された。LALアッセイにより、エンドトキシンレベルが測定された。全ての結果を、未処理対照中に見られるミリグラムDNA当りのエンドトキシンの量について標準化した。
【０１２８】
結果
図１１には、CMビーズに吸着したPMXBがプラスミドDNA調製物からのエンドトキシンの除去に効果的な試薬であり、この実験においてプラスミドDNA中に残るエンドトキシンの量が、対照と比較すると1％未満の量であることが見出されることが示される。シリカコートした磁気ビーズは効果において中位のものであったが、CMビーズ単独またはPMXBアガロースビーズはそれよりずっと効果が低かった。PMXBを添加したが吸着しなかったCMビーズが、エンドトキシン除去に効果的でなかったので、エンドトキシン除去はPMXBのCMビーズへの吸着に依存することが分かった。図１２に要約されるように、エンドトキシン除去もまた、PMXB/CMビーズへの曝露時間に比例した。この実験において、清澄化溶解液とERR溶液とのインキュベーションの30分後、プラスミドDNA中に存在したエンドトキシンの量は、治療的な使用に必要とされる300 EU/mg DNAより有意に少なかった。図１０には、吸着性PMXB/CMビーズでのエンドトキシン除去が示される。図１２には、時間の関数として、PMXB/CMビーズでのエンドトキシン除去が示される。
【０１２９】
【表３】
2008510456.tif 000005
【０１３０】
実施例７  リムルス抗LPS因子の磁気ビーズへの吸着により作製された二官能性ビーズによるエンドトキシンが存在しないDNA調製物。
PMXBは、低価格で大量に入手可能であることを含むいくつかの利点を有するが、他のエンドトキシン結合タンパク質も同様に、該方法に使用され得る。
【０１３１】
手順：アメリカカブトガニ（リムルスポリフェムス（Limulus polyphemus））から単離された、リムルス抗LPS因子（LALF）の三つの調製物をこの目的のために試験した。この三つの調製物には、LALF天然タンパク質単離物（Lp）、ピキアパストリス（Pichia pastoris）（Pp）中で発現された組換えLALF、およびサッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）（Sc）中で発現された組換えLALFが含まれる。インビトロアッセイにおいて、三つのタンパク質はエンドトキシンを中和する能力において異なる（Sc＞Pp＞Lp）。該タンパク質は、PMXBに関して記載したようにCMビーズに吸着され、プラスミドDNAのSPRI精製の前に清澄化溶解液との６０分のインキュベーションを用いてエンドトキシンを除去するために修正されたAgencourt CosMcPrepプロトコール（図１）において試験された。該実験においてもまた、対照としてMagnesilシリカビーズおよび吸着PMXB/CMビーズが含まれた。
【０１３２】
結果
組換えLALFは、未処理対照と比較したところ、プラスミドDNAから95％より多くのエンドトキシンを除去し、本実験のPMXB/CMビーズよりもわずかに良好であった（図１３）。三つ全てが300 IU/mg未満のプラスミドDNAを含むDNAを生成した。図１３にはLALFが結合したCMビーズを用いたエンドトキシン除去が示される。
【０１３３】
【表４】
2008510456.tif 000006
【０１３４】
実施例８  CMビーズへのPMXBの共有結合
発明者らのエンドトキシン除去計画を用いてPMXB汚染を防ぐために、PMXBをCMビーズに共有結合させる。
【０１３５】
直接結合のために、ビーズの表面上のカルボキシル基を、まずカルボジイミド1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド（EDAC）により活性化させ、次いでタンパク質上の遊離アミノ基と反応させる。表面に結合するタンパク質の量を最適にするために、結合反応中にPMXBを滴定する。結合タンパク質の量を銅還元／ビシンコニン酸反応（BCA）により測定した。実際の共有結合したタンパク質と単に表面に吸着したタンパク質とを区別するために、非共有結合したタンパク質を、任意の吸着タンパク質を完全に除去する工程である塩基および洗浄剤を組み合わせた処理により前もって溶出させる。次いでBCAタンパク質アッセイを用いて、ビーズ上および溶液中に残ったタンパク質の量を測定する。図１４には、さらなる量のPMX-Bを用いた異なる結合反応の結果が示される。図１５は、該ビーズの概略図である。図１４には、共有結合PMX-B磁気ビーズの調製が示される。図１５は、二官能性PMXB-CMの概略図である。
【０１３６】
実施例９  二官能性PMX-B/CMビーズを用いたエンドトキシン除去
図１０に図解されるように、AgencourtのCosMcPrep DNA精製キットと共に、プラスミド調製物からエンドトキシンを除去する能力に関して、実施例８からの二官能性PMX-Bビーズを試験した。簡潔に、各240μLの清澄化溶解液（図１０、工程４）に、100μLのPMXB-CMビーズを添加した（異なる量のPMXBを含有する）。インキュベーションおよび二官能性ビーズの磁性除去に続いて、上清中のプラスミドDNAをSPRIにより精製した（図１０、工程７〜１０）。プラスミドDNA調製物中のエンドトキシンの量を、BioWhittakerの光度計リムルス試験（LAL）アッセイにより測定した。PMXB-CMビーズは、DNA調製物から97％より多くの関連のあるエンドトキシンを除去する（図１６）。図１６には、二官能性PMXB-CMを有するプラスミドDNAからのエンドトキシンの除去が示される。
【０１３７】
【表５】
2008510456.tif 000007
【０１３８】
実施例１０  二官能性ビーズで調製したエンドトキシンを有さないDNAのトランスフェクション
PMX-B二官能性ビーズで精製した1μgのpEGFP発現プラスミドを、製造業者の指示書に従って、Effectene試薬およびLipofectamine試薬をそれぞれ用い、エンドトキシン無感受性293T細胞またはエンドトキシン感受性Huh-7細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、GFP蛍光をAgilent Bioanalyzer 2100細胞チップで測定した。予想通り、比較的容易にトランスフェクトされた293は、ほとんどの調製物中で高い発現を示す（図１７A）。トランスフェクトが困難なHuh-7細胞はより低い発現を示す（図１７B）。しかし両方の場合において、PMXB-CMビーズは、該研究において標準（Gold Standard）であると見なされるQiagen maxiprepもしくはQiagen Endofree maxiprepと同様、またはそれよりも良好にトランスフェクトするDNAを生成しする。
【０１３９】
図１８はリポ多糖類（LPS）の構造を示し；図１９はポリミキシンB（PMXB）の構造を示す。
【０１４０】
実施例１１  ウイルス精製のための二官能性ビーズの応用
別の態様において、本明細書中に記載の方法はまた、溶液由来のウイルスの濃縮および次いでウイルス核酸の単離に使用され得る。ポリマーポリエチレンイミン（PEI）またはポリ-L-リシン（PLL）等のポリカチオンポリマーは、カルボキシル官能基を含有する磁気ビーズに共有結合する。カルボキシル基まずカルボジイミドl-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド（EDAC）により活性化し、次いでポリマー上の遊離アミノ基と反応させる。これにより、ウイルス結合のためのポリカチオンポリマー、および核酸結合のためのカルボキシル基の二つの官能基を有するビーズが生成される。ポリマー修飾二官能性ビーズを、血清または溶解物を含有する多量のウイルスに添加し、よく混合し、血清中のウイルス粒子がポリマーとの相互作用を介してビーズの表面に濃縮されるような第一の混合物を生成する。ビーズを磁力により磁石上に分離し、血清上清を除去する。例えばpH 7.0の20mM Tris、1% Triton-X-100、2% SLS、10mM DTT、イソプロパノールおよびRNaseインヒビターを含有する溶解バッファをビーズに添加する。これにより、ウイルスが溶解されウイルス核酸がカルボキシル基との相互作用を介してビーズに結合するようになる第二の混合物が生じる。磁石によりビーズを分離し、洗浄バッファおよび／または70％エタノールで三回洗浄する。ビーズを乾燥させ精製したウイルス核酸を低イオン強度バッファに溶出する。
【０１４１】
実施例１２  PEIを基礎としたビーズのウイルス抽出
PEIカルボキシ二官能性ビーズを用いるウイルス核酸を濃縮および単離するための手順
1.  エッペンドルフチューブ中の50〜10,000 HBVコピーを含有する1mlの血漿に、50μlのPEIカルボキシビーズ（1％固体）を添加した。混合して室温で10分間インキュベートした。磁石によりビーズを捕捉し、上清を廃棄した。ビーズを200μlの水に再懸濁した。
2.  全試料に、400μlのウイルス溶解液（2 M GITC、pH 7.0の10mM Tris、1% NP-40、10mM DTTおよび5μgのポリA）を添加した。よく混合した。
3.  20mg/ml中0.5μg/μlのプロテイナーゼK（17.9mgタンパク質/ml；907単位/ml：Sigma P4850）を添加した。混合し、簡単に遠心分離して（〜2秒）、チューブの底の内容物を回収した。55 Cで20分間インキュベートする。2分間氷中に保持した。
4.  8μlの30％最終イソプロパノールを添加した。試料を混合して、5分間インキュベートした。簡単に遠心分離（〜2秒）して、チューブ内容物を回収した。
5.  磁力によりビーズを捕捉し、上清を廃棄した。
6.  400μlの洗浄バッファ（14% PEG、1M NaCl、6M尿素）で、ビーズを2回洗浄した。
7.  400μlの70％エタノールでビーズを3回洗浄し、ビーズを室温で10分間乾燥させた。
8.  25μlの水にウイルス核酸を溶出した。前の工程のように、磁力によりビーズを捕捉し、ウイルス核酸を含有する上清をヌクレアーゼの存在しない容器に移した。
9.  遺伝子特異的プライマーを用いて、ネステッドPCRにより核酸を増幅した。
【０１４２】
結果
図２０に示されるように、該手順はml当り50コピーのHBVまで検出可能なほどに感度が良かった。
【０１４３】
実施例１３  グロビンサブトラクションの二官能性の例
二官能性ビーズによる、ヒト全血からの全RNAの単離およびβグロビン特異的転写産物の除去
【０１４４】
4M GITC、2mM DTT、2% Triton-X-100および0.4Mクエン酸ナトリウムを含有する1/3量の溶解バッファを全血に添加してよく混合する。二官能性磁気ビーズおよびイソプロパノールを含む等量の結合バッファを混合物に添加する。二官能性ビーズは、ヒトβグロビンmRNA転写産物に相補的な配列の、ビオチン化された三つのオリゴの混合物がビオチン-ストレプトアビジン相互作用を介して結合するストレプトアビジンおよびカルボキシル官能基を含む。磁石によってビーズを分離し、上清を除去する。2M GITC、1mM DTT、1% Triton-X-100および0.2Mクエン酸ナトリウムおよび30%イソプロパノールを含む第一の洗浄バッファでビーズを洗浄し、次いで70％エタノールを含む第二の洗浄バッファで3回洗浄する。ビーズを乾燥させ、次いで全RNAを低イオン強度バッファに溶出する。図２１は、このプロトコールを用いて0.3mlのヒト血液から単離された全RNAの電気泳動図を示す。本発明の方法により、全RNAが、PaxGeneコレクションチューブに回収された2.5mlのヒト血液から単離された。
【０１４５】
グロビン配列を除去するために、ビーズを有する溶出バッファを0.5 M LiCl、10mM Tris、1mM EDTA、pH7.4、0.1% LDSの最終濃度に調整して、相補的なβグロビンRNA転写産物へのオリゴヌクレオチド配列の結合を促進する。混合物を5分間、65 Cに加熱して、その後氷中で冷却する。室温で30分間ハイブリダイゼーションを行なう。グロビン転写産物が減少した全体の血液RNAを含有する上清を取り除き、貯蔵する。抗βグロビンビーズハイブリダイゼーションおよび抗グロビンオリゴを含有していない対照ビーズハイブリダイゼーションからの上清に関して、定量的RT-PCRを行なうことでグロビン減少の程度を検査した。
【０１４６】
【表６】
2008510456.tif 000008
【０１４７】
この実験において、アンチセンスβグロビンプライマーの最適化されていない混合物を用いて、62％のβ配列を除去することが可能であった。
【０１４８】
実施例１４  グロビン除去
0.5M LiCl、10mM Tris、1mM EDTA pH7.4、0.1% LDS中の20μgの全RNAを、αおよびβグロビンに相補的な10pmolのビオチン標識されたオリゴヌクレオチドと組み合わせて、最終量を50μLとした。混合物を50 Cで30分間インキュベートした。カルボキシおよびストレプトアビジン基を含有する二官能性ビーズ100μgを混合物に添加し、室温で30分間インキュベートした。イソプロパノールを添加して、最終濃度30％とした。ビーズを70％エタノールで3回洗浄し、磁石上に置いて上清を除去した。グロビン配列がないRNAを20mM LiClで溶出した。グロビン特異的な定量的RT-PCRアッセイを用いて、内部βアクチン対照RNAと比較して、αおよびβグロビンの減少量を測定した。
【０１４９】
結果
qRT-PCRの結果により、このプロトコールを用いて大部分のαグロビンおよびβグロビンの両転写産物が除去されたことが立証される。
【０１５０】
【表７】
2008510456.tif 000009
【０１５１】
本発明は特に、その好ましい態様に対する参照によって示され、記載されるが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を逸脱することなく、本明細書において形態および詳細における種々の変化がなされることが当業者によって理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
本特許または本出願書類は、カラーで作成された少なくとも一つの図面を含む。カラーの図面（一つまたは複数）を有する本特許または本特許出願公開の複写は、要請および必要な手数料の支払いにより、官庁によって提供されるであろう。
【図１】図１は、二重シークエンス反応をその順方向プライマーおよび逆方向プライマーそれぞれに分離する、磁気ビーズ上の２つの官能基を用いる固相ベースの精製手順の概略図である。
【図２】図２は、固体ベースの精製手順を用いた二重シークエンス反応のシークエンス結果を示す。
【図３】図３は、カルボキシルビーズおよび二官能性オリゴ-dTカルボキシルビーズの両者が、固相可逆的固定化（SPRI）技術によりゲノムDNAおよび全RNAを単離できることを示すゲルである。
【図４】図４は、細胞からのmRNA単離を図解する実験データのグラフを示す。
【図５】図５は、細胞からのmRNA単離を図解する実験データの３つのグラフを示す。
【図６】図６は、標準カルボキシルビーズおよびオリゴ-dTビーズの概略である。
【図７】図７は、オリゴ-dTビーズにハイブリダイズされるポリ-A RNAを示す概略図である。
【図８】図８は、直接的なmRNA調製の概略図である。
【図９】図９は、ビーズに結合したPMX-Bに対する、溶液に添加したPMX-Bを示すグラフである。
【図１０】図１０は、プラスミド調製物からのエンドトキシン除去の概略図である。
【図１１】図１１は、吸着PMXB/CMビーズによるエンドトキシン除去を示す棒グラフである。
【図１２】図１２は、時間の関数としてのPMXB/CMビーズによるエンドトキシン除去を示す棒グラフである。
【図１３】図１３は、LALF結合CMビーズを用いるエンドトキシン除去を示す棒グラフである。
【図１４】図１４は、PMX-B共有結合磁気ビーズの調製を示す棒グラフである。
【図１５】図１５は、二官能性PMXB-CMビーズの概略図である。
【図１６】図１６は、二官能性PMXB-CMビーズを用いたプラスミドDNAからのエンドトキシン除去を示す棒グラフである。
【図１７】図１７Ａおよび１７Ｂは、二官能性ビーズで調製されたエンドトキシンのないDNAのトランスフェクションを示す棒グラフである。
【図１８】図１８は、リポ多糖類（LPS）の構造を示す。
【図１９】図１９は、ポリミキシンＢ（PMXB）の構造を示す。
【図２０】図２０は、二官能性固相担体を用いるウイルスの単離を示すゲルである。
【図２１】図２１は、このプロトコールを用いて0.3mlのヒト血液から単離された全RNAの電気泳動図(electropheregram)を示す。
【図２２】図２２は、ヘテロ多官能性固相担体の概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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