(57)【要約】  本発明は、親水性表面コーティングを含むナノ粒子、その製造方法、および生物学的、分子生物学的、生化学的、および医学的用途におけるその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均粒径が1nm〜500nmで、少なくとも1つのポリマーを含む親水性表面コーティングを有する無機ナノ粒子であって、該ナノ粒子が、具体的にはプラズモン共鳴励起によって増強される形で、発光性または磁性であるか、若しくは電磁放射線を散乱または吸収し、該表面コーティングが0.5nm〜7nmの小さい厚みを有することを特徴とする無機ナノ粒子。
【請求項２】
その結晶格子が外来イオンでドーピングされていることを特徴とする請求項1に記載の親水性表面を有する無機ナノ粒子。
【請求項３】
蛍光共鳴エネルギー移動のためのドナー特性またはアクセプタ特性を有することを特徴とする請求項1または2に記載の親水性表面を有する無機ナノ粒子。
【請求項４】
シェル内に存在するポリマーの少なくとも1つが、ポリアクリル酸またはポリメタクリル酸の系列、および／またはその塩またはコポリマー由来であることを特徴とする請求項1〜3に記載の親水性表面を有する無機ナノ粒子。
【請求項５】
少なくとも1つの機能性分子または生体分子が化学または物理的反応によって親水性表面シェルに結合していることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の親水性表面を有する無機ナノ粒子。
【請求項６】
親水性表面シェルが化学または物理的反応によって架橋されていることを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の親水性表面を有する無機ナノ粒子。
【請求項７】
疎水性ナノ粒子を少なくとも1つの水混和性高沸点溶媒中で加熱し、同じ溶媒または少なくとも1つの他の水混和性溶媒中で少なくとも1つの親水性ポリマーの溶液と反応させることを特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載の親水性表面を有する無機ナノ粒子の製造方法。
【請求項８】
ヘテロジニアスまたはホモジニアスバイオアッセイ、特に免疫アッセイにおける生体標識としての、生体分子の定性的または定量的検出、特に定量PCRのための、請求項1〜6のいずれかに記載の親水性表面を有する無機ナノ粒子の使用。
【請求項９】
分子生物学および／または細胞生物学における、医療診断または治療におけるマーカーまたは標識としての、請求項1〜6のいずれかに記載の親水性表面を有する無機ナノ粒子の使用。
【請求項１０】
ポリマーにおける充填剤または添加剤、有機塗料または無機塗料または塗料系における添加剤、および／またはインクにおける添加剤としての、請求項1〜6のいずれかに記載の親水性表面を有する無機ナノ粒子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親水性表面コーティングを有するナノ粒子、その製造方法、並びに生物学的、分子生物学的、生化学的および医学的用途におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インビボ診断またはインビトロ診断、治療、発生学、および一般に多くの分子生物学的または生化学的な用途、更に、薬剤スクリーニングにおけるナノ粒子の使用は、近年、ますます重要性を増している。この目的のために、多くの用途で、生物学的環境、すなわち水性環境中に粒子を分散させることができるように、親水性表面を有するナノ粒子が必要とされる。上記のナノ粒子は、第一に望ましくない沈降を防止し、および／または第二に生化学的または生体分子的な過程や挙動の力学や動力学にできるだけ影響を与えないように、理想的には単粒子の形態であるか単分散した形態にある、すなわち非凝集の形態にある。加えて、上記のナノ粒子は理想的には、機能性分子の該粒子への結合を可能にする官能性の反応性化学基を有する。機能性分子は、例えば生体高分子、例えばオリゴヌクレオチド（例えばDNAやRNA）またはポリペプチド（例えばタンパク質または抗体）、生体カップリング分子、例えばビオチンまたはストレプトアビジン、若しくは他の有機分子であってよい。
【０００３】
蛍光性無機ナノ粒子は、しばしば有機溶媒中で調製され、疎水性の最終生成物をもたらす。最も一般的に使用される蛍光性無機ナノ粒子は、II-VIまたはIII-V半導体から成る半導体ナノ粒子であり、これは通常、コア−シェル構造を有する。U.S. 6,322,901、U.S. 6,576,291およびU.S. 6,423,551は、無機コアの大きさが10nm未満で「量子ドット」とも呼ばれるそのような粒子を記載している。その製法に起因して、これらの粒子はトリオクチルホスフィンから成る有機シェルを有することが多い。
【０００４】
別の種類の蛍光性無機ナノ粒子は、非導電性材料から成り、希土類および／または遷移族元素のイオンでドーピングされた蛍光体ナノ粒子である。
【０００５】
これらはナノ蛍光体とも呼ばれ、WO 04/046035 Al、WO 02/020695 Al、K. Koempe; H. Borchert; J. Storz; A. Arun; S. Adam; T. Moeller; M. Haase; Angewandte Chemie, International Edition (2003), 42(44), 5513-5516は、発光波長が励起波長よりも長い「ダウンコンバートナノ蛍光体」を記載しており、また、S. Heer; O. Lehmann; M. Haase; H. Guedel; Angewandte Chemie, International Edition (2003), 42(27), 3179-3182は、発光波長が励起波長よりも短い「アップコンバート蛍光体」を記載している。
【０００６】
WO 01/86299 Al、WO 03/040024 Alは、このようなナノ蛍光体のさらに生体標識としての使用も記載している。
【０００７】
WO 02/020695 Alは、CePO4:Tbから成るナノ蛍光体、および例えばトリス-エチルへキシルホスフェート（TEHP）中での、蛍光体表面に付着するTEHPを含む粒子を生成する、その製法を記載している。TEHPではなく、トリブチルホスフェートや、ホスフェートの他の疎水性誘導体を使用することも可能である。このようにして生成されたナノ粒子を水中に分散させることはできないが、それらは有機溶媒中に分散させることができ、すなわち、単粒子の懸濁液に変換することができる。
【０００８】
しかしながら、ナノ蛍光体の親水性表面は、生体系において意図された用途のために絶対的な要件である。疎水性表面を有するナノ粒子の親水化は、WO 02/055186（Quantum Dot Corp.）に記載されているように、原理上は既知である。そこでは、疎水性ナノ粒子の親水化は、例えば、ポリアクリル酸をオクチルアミンと部分的に反応させることによって調製される両親媒性分散剤を用いて行われる。
【０００９】
水相において、疎水性のオクチルアミド側鎖がナノ粒子の疎水性表面と相互作用し、一方、両親媒性分散剤の遊離アクリル酸基が、水相に向けて配向する。このように配向したアクリル酸残基に対して、さらなる分子、例えばタンパク質や他の生体高分子を、共有結合によって結合し得る。ここで、両親媒性分散剤は、リンカーとしての役割を果たす。
【００１０】
この方法の欠点は、両親媒性分散剤として用いられる疎水化されたポリアクリル酸誘導体を再現可能な品質で調製することが比較的複雑であること、および、ナノ粒子の疎水性表面が両親媒性ポリマー分散剤のオクチルアミド基と疎水性相互作用するために比較的大きなスペースが必要になることである。このようにして修飾されたナノ粒子は、単粒子の分散液の場合でさえ、非修飾の一次粒子と比較して大きく増大した平均粒径を有する。この体積の増大は、例えば、標識分子が生体膜（例えば細胞壁）を透過したりチャネルタンパク質を通って拡散したりすることが意図されるさまざまな生物学的用途について不利である。体積の増大は、空間的に近接している(F)RETパートナーへの（蛍光）共鳴エネルギー移動、すなわち(F)RETが光学的評価に関わっているホモジニアスアッセイにおける使用には、特に不利である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記の先行技術に基づいて、親水性表面を有し、平均粒径が大きく増大することのない無機ナノ粒子であって、好ましくは該ナノ粒子が官能性の反応性化学基を有し、それにより機能性分子の該粒子への結合を可能にし、生物学的、分子生物学的、生化学的、および医学的、例えば診断および治療用途、特に共鳴エネルギー移動過程に基づくホモジニアスバイオアッセイのために使用することができると同時に、安価で調製の容易な無機ナノ粒子を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この目的は、本発明のナノ粒子を提供することによって達成される。本発明のナノ粒子は、平均粒径が1nm〜500nm、好ましくは1nm〜100nm、特に好ましくは1nm〜40nm、格別に特に好ましくは1nm〜20nm未満の無機ナノ粒子である。このナノ粒子は、特にはプラズモン共鳴励起によって増強される形で発光性または磁性であるか、若しくは電磁放射線を散乱または吸収する。本発明のナノ粒子は、少なくとも1つのポリマーを含む親水性表面コーティングを備えており、上記の表面コーティングが0.5nm〜7nm、好ましくは0.5〜4nm、特に好ましくは0.5〜2nmの小さい厚みを有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
これらのポリマー分散剤がWO 02/055186 A1に記載されているものと比較して決定的に相違している点は、疎水性相互作用によってナノ蛍光体を被包する疎水性側鎖を有しないことである。その結果、本発明のポリマーで修飾された本発明のナノ粒子の平均粒径は、WO 02/055186に言及された「疎水性被包（enveloping）法」によって得られる粒子よりも明らかに小さく、このことは多くの用途について有利である。そのような用途としては、例えば、ナノ粒子が（蛍光）共鳴エネルギー移動のためのパートナーとして機能する用途、および／またはナノ粒子が輸送過程を経る用途が挙げられる。その薄いシェルの外、本発明のナノ粒子は、温度、塩、およびpHからの影響に対して高い安定性を有するというさらなる利点を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明においてナノ粒子に好適な材料は、無機コアから成るものであり、その結晶格子（母材）は外来イオンでドーピングされている。これらは、例えばUllmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, WILEY-VCH, 7th edition, 2004 Electronic Release, Chapter "Luminescent Materials: 1. Inorganic Phosphors"に記載されているように、特に、例えば蛍光スクリーン（例えば電子線管用の）における「蛍光体」として、または蛍光灯（ガス放電灯用の）における塗料として使用されているあらゆる材料および材料の種類を含む。吸収するエネルギーよりも低いエネルギーの光を発するダウンコンバート蛍光体だけでなく、吸収するエネルギーよりも高いエネルギーの光を発するアップコンバート蛍光体も使用することができる。これらすべての材料において、外来イオンは、紫外線、可視光または赤外線、X線またはγ線または電子線による励起の後に蛍光を発するための活性化因子として機能する。いくつかの材料においては、第一に発光活性化因子を発生させ、第二に粒子系の励起をより効率的にするために、または所定の励起光源の波長に移行させることによって吸光波長を調節するために、複数の種類の外来イオンもまたホスト格子に組み込まれる（「増感剤」）。複数の種類の外来イオンを組み込むことは、ナノ粒子が発する蛍光帯の特定の組み合わせを具体的に設定する役割をも果たし得る。
【００１５】
本発明においてナノ粒子に適した材料は、好適な材料の層状構造（1つ以上のシェルを有するコア−シェル構造）を有する材料でもある。これには、外来イオンが少なくとも一部、すなわちコアまたは少なくとも1つのシェルでホスト格子に組み込まれていることが必要である。本発明のナノ粒子の基礎となるladナノ粒子の母材は、好ましくはXY型の化合物から成る。ここで、Xは、周期表の主族1a、2a、3a、4a、遷移族2b、3b、4b、5b、6b、7b、またはランタニドの元素の陽イオンである。場合によっては、Xは上記の元素の組み合わせまたは混合物であってもよい。Yは、主族3a、4a、5a、遷移族3b、4b、5b、6b、7b、および／または8bの1つ以上の元素、および主族6aおよび／または7aの複数の元素の、複数の原子から成る陰イオンであってよい。しかし、Yはまた、周期表の主族5a、6a、または7aの単一原子の陰イオンであってもよい。本発明のナノ粒子の基礎となるladナノ粒子の母材はまた、周期表の主族4aの元素から成ってもよい。主族1a、2aの元素、またはAl、Cr、Tl、Mn、Ag、Cu、As、Nb、Nd、Ni、Ti、In、Sb、Ga、Si、Pb、Bi、Zn、Coから成る群の元素、および／またはランタニドの元素を、ドーピングに用いてよい。これらの元素の2つ以上を互いに異なる相対濃度で組み合わせたものも、ドーピング材料として使用できる。ホスト格子中でのドーピング材料の濃度は、10-5mol%〜50mol%、好ましくは0.01mol%〜30mol%、特に好ましくは0.1mol%〜20mol%である。ドーピング材料は、それによって誘起される蛍光が長い減衰期間（＞100ns）を有するように選択される。
【００１６】
ナノ粒子のホスト材料として、硫化物、セレン化物、硫セレン化物、オキシ硫化物、ホウ化物、アルミン酸塩、没食子酸塩、ケイ酸塩、ゲルマン酸塩、リン酸塩、ハロリン酸塩、酸化物、ヒ酸塩、バナジウム酸塩、ニオブ酸塩、タンタル酸塩、硫酸塩、タングステン酸塩、モリブデン酸塩、アルカリハライド、フッ化物、および他のハロゲン化物または窒化物を使用することが好ましい。上記の材料の種類の組み合わせから成る混合格子を用いることが好ましい。これらの材料の種類の例を、対応するドーピングとともに、以下の一覧に示す（B:Aタイプの材料、B=ホスト材料、およびA=ドーピング材料、ここで、Aは示した材料の混合物であってもよい）：
【００１７】
LiI:Eu；NaI:Tl；CsI:Tl；CsI:Na；LiF:Mg；LiF:Mg,Ti；LiF:Mg,Na；KMgF3:Mn；Al2O3:Eu；BaFCl:Eu；BaFCl:Sm；BaFBr:Eu；BaFCl0,5Br0,5:Sm；BaY2F8:A（A=Pr、Tm、Er、Ce）；BaSi2O5:Pb；BaMg2Al16O27:Eu；BaMgAl14O23:Eu；BaMgAl10O17:Eu；BaMgAl2O3:Eu；Ba2P2O7:Ti；(Ba,Zn,Mg)3Si2O7:Pb；Ce(Mg,Ba)Al11O19；Ce0,65Tb0,35MgAl11O19:Ce,Tb；MgAl11O19:Ce,Tb；MgF2:Mn；MgS:Eu；MgS:Ce；MgS:Sm；MgS:(Sm,Ce)；(Mg,Ca)S:Eu；MgSiO3:Mn；3.5MgO・0.5MgF2・GeO2:Mn；MgWO4:Sm；MgWO4:Pb；6MgO・As2O5:Mn；(Zn,Mg)F2:Mn；(Zn4Be)SO4:Mn；Zn2SiO4:Mn；Zn2SiO4:Mn,As；ZnO:Zn；ZnO:Zn,Si,Ga；Zn3(PO4)2:Mn；ZnS:A（A=Ag、Al、Cu）；(Zn,Cd)S:A（A=Cu、Al、Ag、Ni）；CdBO4:Mn；CaF2:Mn；CaF2:Dy；CaS:A（A=ランタニド、Bi）；(Ca,Sr)S:Bi；CaWO4:Pb；CaWO4:Sm；CaSO4:A（A=Mn、ランタニド）；3Ca3(PO4)2・Ca(F,Cl)2:Sb,Mn；CaSiO3:Mn,Pb；Ca2Al2Si2O7:Ce；(Ca,Mg)SiO3:Ce；(Ca,Mg)SiO3:Ti；2SrO・6(B2O3)・SrF2:Eu；3Sr3(PO4)2・CaCl2:Eu；A3(PO4)2・ACl2:Eu（A=Sr、Ca、Ba）；(Sr,Mg)2P2O7:Eu；(Sr,Mg)3(PO4)2:Sn；SrS:Ce；SrS:Sm,Ce；SrS:Sm；SrS:Eu；SrS:Eu,Sm；SrS:Cu,Ag；Sr2P2O7:Sn；Sr2P2O7:Eu；Sr4Al14O25:Eu；SrGa2S4:A（A=ランタニド、Pb）；SrGa2S4:Pb；Sr3Gd2Si6O18:Pb,Mn；YF3:Yb,Er；YF3:Ln（Ln=ランタニド）；YLiF4:Ln（Ln=ランタニド）；Y3Al5O12:Ln（Ln=ランタニド）；YAl3(BO4)3:Nd,Yb；(Y,Ga)BO3:Eu；(Y,Gd)BO3:Eu；Y2Al3Ga2O12:Tb；Y2SiO5:Ln（Ln=ランタニド）；Y2O3:Ln（Ln=ランタニド）；Y2O2S:Ln（Ln=ランタニド）；YVO4:A（A=ランタニド、In）；YVO4:A, Bi（A=ランタニド、In）；Y(PxVl-x)O4:Eu（0≦x≦1）；Y(PxVl-x)O4:Eu, Bi（0≦x≦1）；YTaO4:Nb；YAlO3:A（A=Pr、Tm、Er、Ce）；YOCl:Yb,Er；Ln1PO4:Ln2（Ln1、Ln2=ランタニド、またはランタニドの混合物）；Ax(PO4)y:Ln（A=アルカリ土類元素、Ln=ランタニド）LuVO4:Eu；GdVO4:Eu；Gd2O2S:Tb；GdMgB5O10:Ce,Tb；LaOBr:Tb；La2O2S:Tb；LaF3:Nd,Ce；BaYb2F8:Eu；NaYF4:A（A=Yb、Er、Tm、Ho）；NaGdF4:Yb,Er；NaLaF4:Yb,Er；LaF3:Yb,Er,Tm；BaYF5:Yb,Er；Ga2O3:Dy；GaN:A（A=Pr、Eu、Er、Tm）；Bi4Ge3O12；LiNbO3:Nd,Yb；LiNbO3:Er；LiCaAlF6:Ce；LiSrAlF6:Ce；LiLuF4:A（A=Pr、Tm、Er、Ce）；Li2B4O7:Mn、SiOx:Er,Al（0≦x≦2）。
【００１８】
特に好ましいのは、以下の材料の使用である：LaxCeyTbzPO4（x+y+z=1）；LaxEul-xPO4、LaxSml-xPO4、LaxDyl-xPO4、LaxNdl-xPO4（0≦x<1）；LaxCeyLnzPO4、（Ln=ランタニド、x+y+z=1）；MVO4:Ln（M=Y、Gd；Ln=ランタニド）；MVO4:Bi,Ln（M=Y、Gd；Ln=ランタニド）；MPO4:Ln（M=Y、Gd；Ln=ランタニド）；YxGdl-xVyPy-lO4:Ln（0≦x≦1；0≦y≦1；Ln=ランタニド）；YxGdl-xVyPy-lO4:Bi,Ln（0≦x≦1；0≦y≦1；Ln=ランタニド）；MSO4:Eu（M=Ca、Sr、Ba）；MSO4:Eu,Mn（M=Ca、Sr、Ba）；NaYF4:A（A=Yb、Er、Tm、Ho）；ZnS:Tb、ZnS:TbF3、ZnS:Eu、ZnS:EuF3、Y2O3:Eu、Y2O2S:Eu、Y2SiO5:Eu、SiO2:Dy、SiO2:Al、Y2O3:Tb、CdS:Mn、ZnS:Tb、ZnS:Ag、ZnS:Cu。特に好ましい材料のうち、特にホスト格子の立方格子構造を有する材料が選択される。なぜなら、これらの材料では、結果的に個々の蛍光帯の数が最少になるからである。これらの例としては、MgF2:Mn；ZnS:Mn、ZnS:Ag、ZnS:Cu、CaSiO3:Ln、CaS:Ln、CaO:Ln、ZnS:Ln、Y2O3:Ln、またはMgF2:Ln（Ln=ランタニド）が挙げられる。
【００１９】
本発明においてナノ粒子に適した材料は、未ドープ半導体材料から成るものでもある。これらは好ましくは、第4主族のもの（例えばSi）および二元化合物AB（ここで、Aは周期表の第2遷移族の元素であり、Bは第6主族の元素（例えば、ZnS、CdS、またはCdSe）である）を含む。これらはまた、好ましくは、Aが周期表の第3主族の元素であり、Bが第5主族の元素（例えば、InAs、InP、GaAs、GaP、またはGaN）である二元化合物ABを含む。
【００２０】
本発明のナノ粒子に適した無機ナノコアの大きさは、1nm〜500nmの範囲であり、好ましくは1nm〜100nm、特に好ましくは1nm〜40nm、格別に特に好ましくは1〜20nm未満である。
【００２１】
無機ナノコアは、特定の用途に要求される特定の特性、例えば、発光性の電磁放射線を散乱または吸収する特性を有していてもよく、その利用目的に応じて、プラズモン共鳴励起による上記の散乱や吸収、磁性（原子核や電子殻に起因する）、機械的特性または他の特性を増強することが可能である。また、これらは、例えば"Principles of Fluorescence Spectroscopy"；J. R. Lakowicz, 2nd edition, Kluwer Academic, New York 1999, 367〜442頁に記載されているような共鳴エネルギー移動過程（FRET=fluorescence resonance energy transfer（蛍光共鳴エネルギー移動）またはFoerster移動）におけるパートナーとして使用することもできる。
【００２２】
本発明のナノ粒子の被包中に存在する親水性ポリマーは、好ましくは、該ポリマーに結合する生体分子の官能基に対する共有結合や吸着結合、例えば静電結合やイオン結合を可能にする、アミノ、カルボキシルまたはその塩、ヒドロキシル、チオール、酸無水物、酸塩化物および／またはイソシアネート基などの官能基を有する親水性の直鎖状または分岐状のホモまたはコポリマーである。
【００２３】
ここで、例えばポリアクリル酸および／またはその塩、ポリメタクリル酸および／またはその塩、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリマレイン酸および／またはその塩、ポリアスパラギン酸および／またはその塩、ポリマレイン酸無水物、ポリエチレンイミン、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（PHEMA）、ポリジメチルアミノエチルメタクリレートおよび／またはその塩、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、またはポリビニルエーテルまたはポリエーテルの場合のように、対応するポリマーの官能性の、おそらくは吸着的でもある反応性の基は、ポリ酸、ポリ酸無水物、多価アルコール、ポリチオール、またはポリアミンまたはポリ複素環などの繰り返し単位に存在してもよい。
【００２４】
ホモポリマーまたはコポリマーに適したアミン系（aminic）ポリマーの例としては、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、直鎖状または分岐状のポリエチレンイミン、ポリリシン、ポリマー含有キトサミンおよびポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド、および／またはポリビニルピリジンまたはその酸付加物が挙げられる。
【００２５】
言及したすべてのポリマーを、ホモポリマーあるいはコポリマーとして、相互に、および他のモノマーとともに本発明のナノ粒子の調製に使用することができる。同様に考えられるのは、アクリル酸とビニルピロリドン、マレイン酸無水物とメチルビニルエーテル、ビニルピロリドンとジメチルアミノエチルメタクリレート、ビニルイミダゾールとビニルピロリドン、およびメタクリル酸とビニルピロリドンとのコポリマーである。
【００２６】
他の好適なポリマーは、その官能基が末端基に位置するものであり、例えば、その末端基がアミノ／カルボキシ／チオ／イソシアネートなどで官能化されているポリエーテルの場合には、例えばアミノ官能性オリゴ-またはポリエチレングリコール（Jeffamine）またはOH終端のポリエチレンオキシドに位置するものである。
【００２７】
繰り返し単位に官能基を有するポリマーが好ましく、ポリ酸が特に好ましく、ここで、ポリアクリル酸またはポリメタクリル酸および／またはその塩が格別に特に好ましい。
【００２８】
別の態様では、ポリマレイン酸無水物やポリスクシンイミドなどの反応性ポリマーの使用も可能である。これらは、さらに処理する過程で、反応して上記の高分子電解質、すなわち、それぞれポリアクリル酸およびポリアスパラギン酸を生成する。
【００２９】
本発明のナノ粒子の好ましい態様においては、そのシェルは、ポリメタクリル酸、ポリアスパラギン酸（PASP）、ポリマレイン酸、アクリル酸の、例えばマレイン酸とのコポリマー（BASFからSokalane（登録商標）の製品名で販売されている）、および／またはアクリル酸とマレイン酸およびビニルエーテルとのコポリマー（SKW PolymersからMelpers（登録商標）の名で販売されている）、および／またはその塩、好ましくはそのナトリウム塩から成る。
【００３０】
本発明のナノ粒子のシェルにポリアクリル酸ナトリウムが存在することが特に好ましい。
【００３１】
「被包ポリマー（enveloping polymer）」の分子量（Mw）は異なり得、好ましくは1000〜100000gmol-1、より好ましくは1000〜25000gmol-1、特に好ましくは5000〜12000gmol-1、格別に特に好ましくは7000〜10000gmol-1である。
【００３２】
こうして、分子量Mwが約8000gmol-1のポリアクリル酸ナトリウムは、例えば、分子量が50000gmol-1の対応するこれより高分子量の類似物よりも良好な結果を生じることがわかった。
【００３３】
本発明のナノ粒子の親水性表面シェルは、その利用目的に応じて、例えば、蛍光特性、電磁放射線を散乱または吸収する特性、磁性（原子核や電子殻に起因する）、または他の特性など、無機ナノコアの特性を補う、特定の用途に要求される特定の特性を有していてもよい。これらは、共鳴エネルギー移動過程（Foerster移動）におけるパートナーとして使用することもできる。
【００３４】
無機ナノコアとしてCePO4:Tbを含み、ポリアクリル酸のナトリウム塩を含む親水性表面被包を有する本発明のナノ粒子が特に好ましい。上記のナノ粒子は、比較的高い電解質濃度に対する高い安定性によって特徴づけられる。したがって、例えば、2モル濃度のNaCl溶液中においてさえ、充分な懸濁安定性が観察された。しかしながら、MgCl2のように、一価イオンが1モル、多価イオンが0.5モルの濃度を超えないことが好ましい。
【００３５】
さらに、本発明のナノ粒子懸濁液は、高い温度安定性を有している。したがって、ポリアクリル酸のナトリウム塩で被包されたCePO4:Tbナノ粒子懸濁液を、懸濁安定性を損なわずに半日間にわたって熱湯で処理することができた。好ましくは、本発明のナノ粒子懸濁液は、実質的な損失なしに3〜5時間にわたって1回または数回、95℃の温水で処理してもよい。これは、例えばqPCR検出法の基本条件を満たしている。
【００３６】
レーザー光散乱、または好ましくは分析超遠心（AUC）の使用は、本発明のナノ粒子の粒径を測定し、単分散性を検出するのに適している。AUCは、例えばH. G. MuellerがColloid & Polymer Science 267:1113-1116に記載しているように、当業者には既知である。
【００３７】
表面電荷を測定する実績のある方法は、特に、その基本原理が例えばR. Westermeierによって"Electrophoresis in Practice" Wiley-VCHに記載されたゲル電気泳動である。
【００３８】
表面特性解析の別の方法は、例えば、HiemenzおよびRajagopalanによりPrinciples of Colloid and Surface Chemistry, 3rd Edition, New York: Dekker 1997に記載されているゼータ電位測定である。
【００３９】
ポリマーシェル層の厚みは、透過電子顕微鏡法、X線電子分光法（ESCA）、および熱重量分析（TGA）の組み合わせ適用によって測定することができ、0.5nm〜7nm、好ましくは0.5〜4nm、特に好ましくは0.5〜2nmである。
【００４０】
ポリマーシェル層の厚みは、透過電子顕微鏡法を用いた場合、直接観察することができるが、当業者には知られている透過電子顕微鏡法に典型的な試料調製上のアーティファクトの問題のために、最初の表示（first indication）を与えることができるにすぎない。ESCAは被包されたナノ粒子の無機コアのシグナルをまだ検出できるかどうかを確定するために用いることができ、約5nm未満の層厚を示す。TGAを用いれば、ポリマーシェルをナノ粒子から熱脱着することができ、その絶対質量およびナノ粒子に対する質量を測定することができる。透過電子顕微鏡法によって測定できるナノ粒子の無機部分の大きさ、その密度、およびポリマーの密度がわかっていれば、こうして平均ポリマーシェルを計算することができる。例えば、無機粒径が7nm、密度が5.2g/cm3のCePO4:Tbナノ粒子が、TGA中に20%の相対重量損失が起こるように密度が1.1g/cm3のポリアクリル酸の層で被包されている場合、シェル厚み1.0nmが観察される。
【００４１】
本発明は、本発明のナノ粒子の製造方法に関する。その製法に起因して、例えば疎水性溶媒中でのその合成の故に、多くの種類のナノ粒子は疎水性の表面を有する。疎水性のナノ粒子の凝集体から出発して単分散の水分散液を調製する本発明の方法は、高沸点の水混和性溶媒中で加熱することによって疎水性の出発物質を少なくとも部分的に脱アルキル化し、続いて、上記のように加熱されたナノ粒子を、水混和性溶媒中で任意に可溶化剤を使用して、好ましくは官能性の反応性基を有する好適なポリマーと反応させることによって親水性ポリマーで被包することを含む。
【００４２】
上記の親水性ポリマー分散剤の、親水化しようとする疎水性ナノ粒子に対する親和性を与えるためには、後者を完全に、または少なくとも部分的に脱疎水化（dehydrophobicized）しなくてはならない。
【００４３】
驚くべきことに、例えば、トリス-エチルへキシルホスフェート（TEHP）またはトリブチルホスフェートで修飾されたナノ蛍光体の脱疎水化または部分的脱疎水化は、少なくとも1つの高沸点の、好ましくは水混和性の溶媒、例えば、N-メチルピロリドン（NMP）、ジメチルホルムアミド（DMF）、ジメチルアセトアミド（DMAc）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、トリエチルホスフェートまたは亜リン酸ジエチル、またはこれらの溶媒の混合物、好ましくは純粋なNMP中で、単に加熱することによって達成できることがわかった。
【００４４】
脱疎水化は、沸点近く、好ましくは180〜250℃、特に好ましくは200℃まで、数時間、好ましくは2〜3時間にわたって加熱することによって行われる。
【００４５】
脱疎水化に続くポリマーの被包は、原則的にはいかなる溶媒中でも行うことができ、好ましくは同じ溶媒（脱疎水化溶媒）中で行うことができる。
【００４６】
上記の溶媒は、好ましくは、数wt%から同量までの「可溶化剤」、例えばエチレングリコール、グリセロールまたは低分子量オリゴエチレングリコールまたはそれらのモノメチルエーテル、好ましくは低分子量エチレングリコール、格別に特に好ましくはエチレングリコールで処理されてもよい。特に好ましい溶媒系は、実施例2に記載のとおり、等割合のNMPとエチレングリコールとを含む。
【００４７】
上記の脱疎水化は高温で行うことができるが、ポリマーの被包は、室温で数時間にわたって攪拌または回転させることによって行うことができる。
【００４８】
実施例2に記載のとおり、脱疎水化溶液は、ほぼ等量のエチレングリコールおよび被包しようとするポリマーの約1%濃度の水溶液と混合され、好ましくは一晩攪拌され、またはローラーベンチ上で連続的にかき混ぜられる。
【００４９】
本発明の方法は同様に、反応生成物の処理にも関する。被包されたナノ粒子は、超遠心分離法または膜処理、好ましくは限外濾過法（UF）によって、その副生物から分離することができる。例えば、カットオフが100000Daのポリエーテルスルホンの膜は、本発明で製造されるCePO4:Tbナノ粒子の単離に適している。この場合、ナノ粒子は保持されるが、一方、ポリマーや有機溶媒などの過剰な副生物は透過する。膜のカットオフの好適な大きさは異なり得、被覆されるナノ粒子の大きさや、使用されるポリマーの分子量に依存する。しかし、当業者であれば、上記の大きさの範囲を容易に限定することができる。
【００５０】
本発明は、本発明のナノ粒子の誘導体にも関し、これらは、化学反応、例えば機能性分子の親水性表面コーティングへの結合、および／または物理的過程によって、表面コーティングの上および／または中に得ることができる。
【００５１】
したがって、本発明のナノ粒子の親水性表面被包に、例えばCePO4:Tbに、例えばフルオレセインまたはローダミン（例えば、Sigma-Aldrich、タウフキルヒェン、ドイツ）、Bodipy、Alexa 546（Molecular Probes、ユージーン、米国）、Cy3（Amersham Bioscience, General Electric HealthCare）、Atto 532、Atto 550（Atto-Tec GmbH、ジーゲン、ドイツ）などの染料や、当業者に既知の他の蛍光染料を付着させることができる。蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を利用するためには、理想的には、アクセプタとして使用された場合に、染料の吸収プロフィールと、エミッタとして使用されるナノ粒子の発光帯との間が非常に高度に重複している染料が使用される。しかし、好適なアクセプタ分子はまた、それ自体が蛍光発光することなくドナーの蛍光をクエンチする分子、例えば、Black Hole Quencher BHQ-1（BIOSEARCH Technologies、ノバト、米国）でもある。この場合も、クエンチャー分子の吸収プロフィールと、エミッタとして使用されるナノ粒子の発光帯との間が非常に大きく重複しているクエンチャー分子が使用される。上記の重複に関して、ナノ粒子の蛍光帯の少なくとも1つの発光ピークの波長が、好ましくは染料の主吸収の範囲内にあり、主吸収の波長単位が吸収ピークの37%値によって定義される。染料の発光波長がナノ粒子の吸収帯と重複する場合には、ナノ粒子はアクセプタとして、染料はドナーとして機能する。FRETをできるだけ効果的に達成するために、吸収帯および発光帯の位置に関する情報は、上記と同様である。
【００５２】
したがって、このようにして修飾された本発明のナノ粒子を活用すれば、無機ナノコアと染料との間の距離をさらに確定することができ、よって、共鳴エネルギー移動（Foerster移動）を活用して、無機ナノコアから染料までのポリマー含有親水性表面被包の厚みを間接的に確定することができる（実施例3）。
【００５３】
エネルギー移動は、第一には、ナノ粒子によって増感された染料の蛍光によって測定できる。この目的のために、ナノ粒子を数マイクロ秒以下の光を発生する閃光で励起し、一方で励起光パルスが消失した時から少し遅れて発光スペクトルを測定する。遅れの長さは、本質的には励起する閃光の照明時間に依存し、通常は20〜50マイクロ秒である。この測定原理の故に、直接的に励起された染料、または生じる可能性のあるバックグラウンド蛍光の発光は、実質的に完全に排除される。このようなスペクトルにおいて、エネルギー移動によって減少したドナーの蛍光は、アクセプタの増感された蛍光によってオーバーレイされているとみなすことができる。別の測定原理を用いると、エネルギー移動は、染料が結合している無機ナノコアと、結合している染料なしの無機ナノコアの蛍光寿命を比較することによって決定することができる。当業者であれば、寿命の割合から、およびナノ粒子の測定可能な大きさを考慮して（したがってエミッタイオンの空間分布を考慮して）、エネルギー移動の効率を容易に決定することができ、それにより、ナノ粒子の周囲のポリマー層の厚みを推定することができる。結合した染料分子の数の関数として決定される蛍光寿命の90%までの短縮は、実施例に記載する系の高いエネルギー移動効率を示す。これは、無機ナノコアと染料との間の距離が、エネルギー移動の臨界距離（「Foersterの半径」）、すなわち約5nmよりも明らかに短い場合にのみ可能である。この結果もまた、本発明のナノ粒子のポリマー含有表面被包層の厚みが小さいことを明確に示している。
【００５４】
加えて、本発明は、少なくとも1つの機能性分子、例えば、一般的な有機分子または生体高分子、例えば、抗体他のタンパク質、ペプチド、酵素、オリゴヌクレオチド若しくは他の核酸分子または核酸様分子（例えば、PNAやモルホリノ）、オリゴ糖類または多糖類、ハプテン（例えば、ビオチンやジゴキシン）、若しくは低分子量の合成抗原、天然抗原またはエピトープ、またはカップリング分子（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、またはニュートラビジン）をさらに結合することによって得られるナノ粒子に関する。
【００５５】
本発明のナノ粒子について、カップリングオリゴヌクレオチド（実施例4）、ビオチン、アビジン、および／またはストレプトアビジン（実施例5および6）が好ましい。
【００５６】
親水性表面コーティングにおける物理的過程は、好適なイオン、例えば常磁性イオン（例えば鉄）の錯体形成によるカップリングであり得、これによりさらなる分析法が可能になる。分子間錯体形成による物理的架橋、およびそれによる親水性ポリマー含有表面被包の安定化も可能である。
【００５７】
本発明の別の態様において、被包ポリマーの官能基は、二官能またはそれ以上の官能性の低分子量分子、例えば、二官能、三官能、四官能、五官能、または多官能の試薬（例えばリシン、エチレンジアミン二酢酸（EDDA））により架橋されていてもよい。例えば、無機ナノコアに位置するポリアクリレート被包ポリマーは、二官能の試薬であるリシンと反応させることによって架橋された（実施例7）。ここで、粒子間架橋を少しだけ発生させることも可能である。これは、出発物質の平均粒径よりも大きな平均粒径に基づいて観察される。
【００５８】
特に好ましいのは、リシンで架橋され、フルオレセインで修飾された、親水性表面被包中にポリアクリル酸ナトリウムを有するCePO4:Tbナノ粒子である。このナノ粒子は、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）に関して、特に強いドナーおよびアクセプタ特性を示す。
【００５９】
本発明のナノ粒子の表面被包の誘導体化に用いられる化学反応および／または上記の表面被包における物理的過程は、当業者に既知であり、有機化学または生化学の標準的な書籍に記載されている。
【００６０】
本発明は同様に、例えば、検出しようとする生体高分子（例えば、抗体他のタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド他の核酸分子や核酸様分子（例えば、PNAやモルホリノ）、オリゴ糖類や多糖類、ハプテン）の存在を定量的および／または定性的に示すための、ヘテロジニアスおよびホモジニアスバイオアッセイにおける生体標識としての、本発明のナノ粒子および／またはその誘導体の使用に関する。このようなアッセイは、例えば、当該分野において当業者に既知の形態における免疫アッセイ、あるいは同様に当業者に既知の形態における定量PCRアッセイ（例えば、Molecular Beacon, Taqman, Dual HybridizationまたはScorpions Format）であってよい。目的とする分子がナノ粒子の誘起凝集および吸収の強度または波長の乱れまたは変化、光散乱、若しくは蛍光によって認識されるアッセイ形態も、本発明のナノ粒子を使用して実施することができる。ここで、ナノ粒子を、一光子法あるいは多光子法によって励起してよい。
【００６１】
本発明のナノ粒子を、分子生物学および／または細胞生物学、並びに医療診断または治療法におけるマーカーまたは標識として使用することも可能である。ここで、分析物の存在または非存在を測定し、細胞の断片を染色し、または、本発明のナノ粒子で標識された生体分子または生体活性分子をインビボまたはインビトロで監視することができる。
【００６２】
さらに、本発明のナノ粒子はまた、ポリマーにおける充填剤または添加剤として、特に有機塗料または無機塗料または塗料系における添加剤として、またはインクにおける添加剤として使用することができる。
【００６３】
本発明を、実施例に基づいて以下にさらに詳細に説明するが、これに限定されることはない。
【実施例】
【００６４】
疎水性ナノ粒子懸濁液の調製：
1.9gの疎水性CePO4:Tbナノ粒子を、19.0gのNMP（N-メチルピロリドン）中に懸濁させた。この懸濁液を、磁気攪拌器と還流冷却器を備えたガラスフラスコ中で、200℃まで2時間にわたって攪拌しながら加熱した。褐色の透明なナノ粒子懸濁液が生成した（9.1%濃度の懸濁液20.9g）。分析超遠心（AUC）により、このNMP／ナノ粒子懸濁液の平均粒度分布は5.4nm（d50値）と測定された。NMPを加えて、以下のポリマー被包のための1%濃度懸濁液を調製した。
【００６５】
ポリアクリル酸のナトリウム塩（PASNa）の疎水性懸濁液による被包：
1%濃度の疎水性NMPナノ粒子懸濁液10.0mlを、50mlのFalconチューブ（PP製、ねじぶた付き）内で10.0mlのエチレングリコール（EG）と混合した。これに、20.0gのPASNa／EG混合物（10.0gの1%濃度PASNa溶液、MW：8000D、Aldrichおよび10.0gのEG）を加えた。このナノ粒子懸濁液を、Falconチューブを回転させて、一晩混合した。反応混合物を、カットオフが100000Daのポリエーテルスルホン（PES）の膜を備えた50mlのMillipore攪拌式セル内で、約3barで限外濾過法（UF）によって処理した。約850mlの総透過容積で連続的に水で浸透して、溶媒を交換した。対応する濃縮物（保持物）は、以下の特性を有する0.75%濃度の無色透明のナノ粒子懸濁液15mlから成っていた：
【００６６】
・pH：7.0；
・粒度分布（AUCによって測定）：d50：5.9nm；
・ゲル電気泳動（GEP）：ゲル電気泳動（トリス酢酸EDTA緩衝液中のアガロースゲル）において、PASNa被包ナノ粒子は陰極に移動するが、被包されていない水不溶性の出発物質は電気泳動移動性を有さなかった。
・分光研究：280nmでの励起によって、テルビウムイオンの発光の典型的な蛍光ピークが487nm、542nm（主ピーク）、583nmおよび620nmに生じた。これらの発光ピークの半減期は、1.35msであった。
・食塩負荷に対する安定性：PASNa被包ナノ蛍光体は、塩分濃度に対して非常に安定であることがわかった。NaClの濃度2000mmol+/lまで、およびMgC12の濃度5mmol/lまで、全く凝集物が生成しなかった。
・pH変化に対する安定性：PASNa被包ナノ蛍光体は、pH4から少なくともpH9までの範囲のpH変化に対して非常に安定であることがわかった。
・温度安定性：PASNa被包ナノ蛍光体は、高温に対して非常に安定であることがわかった。分散液は、粒度分布や光学特性における実質的な変化なしに、6時間を超える時間にわたって90℃を超える温度で保持することができた。
【００６７】
PASNa被包ナノ蛍光体へのフルオレセインのカップリング：
この反応は、15mlのFalconチューブ（PP）内で行われた。上記のポリアクリル酸-Na被包ナノ蛍光体1.5mlを、ピペット操作によって、1.5mlのリン酸緩衝液（0.1m、pH：6.0）に溶解した70mgのEDC（1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩、Aldrich）と混合した。渦動後に、反応混合物を室温で30分間、ローラーベンチ上で回転させると、pH6.5となった。この反応混合物に、7.5mlのホウ酸緩衝液（0.1m、pH：8.3）に溶解した5mgのフルオレセインアミン（Fluka）を加えた。渦動後、反応混合物を暗中で一晩回転させると、黄色の反応媒質中のpHが8.3となった。
【００６８】
水を透過液として、限外濾過法（PES膜  100000D、約3bar）によって処理を行った。350mlの透過容積の後、最初は黄色の透過物の後に、完全に無色の透過物が得られた。濃縮物（生成物）は、以下の特性を有する鮮黄色の透明なナノ粒子懸濁液であった：
【００６９】
・容積：2.2ml
・ナノ粒子濃度：0.5wt%
・粒度分布（AUC）：d50：8.4nm
・分光研究（Jobin Yvon、燐光オプションを備えたFluorolog FL3-22）：この目的のために、粒子分散液を0.002wt%の濃度まで希釈し、Xe閃光で280nmで励起した。エネルギー移動を、まずCePO4:Tbナノ蛍光体で増感したフルオレセインで測定した。この目的のために、直接的に励起された染料、または生じる可能性のあるバックグラウンド蛍光の発光を実質的に完全に排除するために、励起光パルスの後40マイクロ秒遅れて蛍光スペクトルを記録した。テルビウムイオンの発光に典型的な蛍光ピークが487nm、542nm（主ピーク）、583nmおよび620nmに現れ、広範囲のバックグラウンドピークの中心は523nmであり、これは、増感されたフルオレセイン蛍光を示している。次に、波長542nmで、フルオレセインが結合しているCePO4:Tbナノ蛍光体と、結合しているフルオレセインなしのナノ蛍光体の蛍光寿命を比較することによって、エネルギー移動を測定した。これにより、寿命は90%まで短縮した。いくつかのフルオレセイン分子が結合したことを考慮に入れても、この結果は、ナノ蛍光体と染料との間の距離がFRETの臨界距離（「Foersterの半径」）、すなわち約5nmよりも明らかに短い場合にのみ可能である、系の高いFRET効率が存在することを示している。
【００７０】
フルオレセイン分子をナノ蛍光体に結合させずに加えた対照実験においては、523nmにおけるフルオレセインの遅延発光は観察されなかった。同様に、ポリアクリル酸-Na被包ナノ蛍光体が単独で存在していた測定と比較して、半減期は変化しなかった。
【００７１】
PASNa被包ナノ蛍光体へのオリゴヌクレオチドのカップリング：
実施例2に記載のナノ蛍光体／PASNa粒子懸濁液0.8mlに、0.5mのリン酸緩衝液（pH：6.0）に溶解した65mgのEDCを加えた。これに続いて、室温（RT）で1時間混合し、それによりpHは6.2となった。
【００７２】
このようにして活性化したナノ蛍光体を、0.2m、pH：9のホウ酸緩衝液0.4mlに溶解した以下のNH-オリゴ配列（Thermo Electron、ウルム）1.9mgと混合した：5 GGC AGC AAC GCG ACG CGC ACC-3（5 aminolink C6/MMT）。
【００７３】
室温で4時間攪拌しながらインキュベートした後、混合物を4℃で一晩保管し、その後、Vivaspinセル（VivaScience、PES膜  MWCO  50000D）を用いて限外濾過法によって精製した。
【００７４】
最終生成物（0.8ml）は、1.2%濃度の透明なナノ粒子懸濁液であった。
【００７５】
この最終生成物を5倍に希釈し、6倍のモル濃度の相補配列5 GGT GCG CGT CGC GTT GCT GCC 3‘（3‘ TAMRA；TAMRA=ローダミン誘導体、Thermo Electron、ウルム）で、1.5mMのMgCl2と一緒にインキュベートした。波長542nmにおけるナノ蛍光体の発光の蛍光寿命を、続いて、実施例3と同様に測定した。結果は、70%の寿命の短縮で、これはナノ蛍光体からのTAMRA染料へのFRETに起因していた。
【００７６】
PASNa被包ナノ蛍光体へのビオチンのカップリング（HIE 13 024）：
24mgのEDCを、pH6.0の0.5mリン酸緩衝液0.04mlに溶解し、PASNa被包ナノ蛍光体（実施例2の生成物）0.09mlに加えた。室温で1時間インキュベートした後、0.05mlの0.2mホウ酸緩衝液（pH9.2）に溶解した3.745mgのビオチン-(PEO)3-アミン（Bioscience 00215）を加えた。攪拌を伴った6時間の反応時間の後、混合物を4℃で一晩保管し、その後、限外濾過法（Vivaspin  MWCO  50000  PES膜）によって精製した。
【００７７】
ビオチンのカップリングは、分散液をpH8のPBS緩衝液中で800μg/lに希釈し、それをストレプトアビジンで被包された磁性ポリマービーズ（Sera-Mag（登録商標）  Strepatavidin、Serva、ハイデルベルク）を含む分散液（800μg/l）に加えることによって検出された。ポリマービーズを、続いて、永久棒磁石を用いて10分間除去し、上澄みの蛍光を測定した。蛍光は視認できなかったが、ポリマービーズの添加前にナノ蛍光体の明らかな蛍光が検出された。この実験は、ビオチンのナノ蛍光体への良好なカップリングを示している。
【００７８】
PASNa被包ナノ蛍光体へのストレプトアビジンのカップリング
6%濃度のPASNa修飾ナノ蛍光体懸濁液（実施例2の生成物）0.3mlに、0.5mのリン酸緩衝液（pH6.0）に溶解した40mgのEDCおよび30mgのSulfoNHS（N-ヒドロキシスクシンイミド）を加えた。室温で、混合を伴うインキュベーションを1時間にわたって行った。続いて、限外濾過法（PES膜  MWCO：100000D）によって、活性化したナノ蛍光体を単離した。得られた保持物は、pH5.7の少し不透明な懸濁液であった。
【００７９】
この粒子懸濁液1mlに、0.2mのホウ酸緩衝液（pH9.2）に溶解した5.0mgのストレプトアビジン（Sigma S4762）を加えた。4時間インキュベートし4℃で一晩保管した後、最終生成物を限外濾過法（PES膜  MWCO  100000D）によって精製したところ、保持物としてpH8.3の1.3%濃度の透明な溶液を得た。ストレプトアビジンとビオチンの位置を交換した以外は、実施例5のビオチン結合の検出と同様に、ストレプトアビジン結合を検出した。
【００８０】
PASNa被包ナノ蛍光体のリシンによる架橋：
実施例2に記載のPASNa被包ナノ蛍光体（1.1%濃度の懸濁液）5mlに、5mlの0.1mリン酸緩衝液（pH6.0）に溶解した170mgのEDCを加えた。この混合物をローラーベンチ上で混合しながら、室温で30分間インキュベートした。
【００８１】
これに続いて、2.5mlの0.2mホウ酸緩衝液（pH9.0）に溶解した4.34mgのL-リシンを加えた。
【００８２】
室温での24時間のインキュベーション後に、混合物を4℃で一晩保管し、その後、限外濾過法（PES膜  100000  MWCO）によって精製した。
【００８３】
赤外分光法によって、アミド基に基づいて、粒子間架橋が検出された。
【国際調査報告】
2008545980.tif 000002
2008545980.tif 000003
2008545980.tif 000004
2008545980.tif 000005
2008545980.tif 000006
2008545980.tif 000007