(57)【要約】  本発明は質量分析法で特定試料に含まれているポリペプチドの同定方法に関するものである。さらに詳しく、本発明はプロテオミック分析のための試料の製造法に関するものである:特定開裂規則（Ｎ-末端、またはＣ-末端のアスパラギン酸での開裂）で蛋白質をペプチドに断片化する方法を提供し、前記ペプチドは質量分析器で分析するのに適している。【選択図】          図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリフルオロ酢酸、燐酸、プロピオン酸、ＨＣｌ、ｏ-ヨード安息香酸、氷酢酸、及びｐＨ２付近の緩衝力を有する酸からなる群より選択される少なくとも１種の酸成分;及び
水を含むことを特徴とするポリペプチド加水分解用組成物
【請求項２】
前記組成物は水と混合可能な有機溶媒及び還元剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記酸成分はトリフルオロ酢酸、燐酸、プロピオン酸、ＨＣｌ及びｏ-ヨード安息香酸の混合物であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
反応の時に前記ポリペプチド加水分解用組成物のｐＨが１．５乃至２．５であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ポリペプチド加水分解用組成物が少なくとも２乃至３０（ｖ/ｖ）％であることを特徴とする、請求項１に記載の氷酢酸を含む組成物。
【請求項６】
前記ポリペプチド加水分解用組成物はｐＨ２の氷酢酸を１５（ｖ/ｖ）％で含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記水と混合可能な有機溶媒はアセトニトリル、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）またはアルコールであることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
前記アルコールはメタノールまたはエタノールであることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記水と混合可能な有機溶媒はアセトニトリルであることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項１０】
前記水と混合可能な有機溶媒は少なくとも５-７０（ｖ/ｖ）％のアセトニトリルであることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項１１】
前記水と混合可能な有機溶媒は３０（ｖ/ｖ）％のアセトニトリルであることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項１２】
前記還元剤はＴＣＥＰ（トリス（２-カルボキシエチル）ホスフィン）、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、またはベータ-メルカプトエタノールであることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項１３】
前記還元剤はＴＣＥＰのようなｐＨ１，５乃至２．５の酸性ｐＨ範囲を有するホスフィン化合物であることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記還元剤は少なくとも１ｍＭ乃至１ＭのＴＣＥＰ（トリス（２-カルボキシエチル）ホスフィン）またはＤＴＴ（ジチオトレイトール）であることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記還元剤は少なくとも１０ｍＭのＴＣＥＰ（トリス（２-カルボキシエチル）ホスフィン）またはＤＴＴ（ジチオトレイトール）であることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物は組成物の全量を基準に酢酸２-３０（ｖ/ｖ）％、アセトニトリル、５-７０（ｖ/ｖ）％及び約１ｍＭ-１ＭのＴＣＥＰを含むことを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物は組成物の全量を基準に酢酸１５（ｖ/ｖ）％、アセトニトリル５-７０（ｖ/ｖ）％及び約１ｍＭ-１ＭのＴＣＥＰを含むことを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物は組成物の全量を基準に酢酸１５（ｖ/ｖ）％、アセトニトリル３０（ｖ/ｖ）％及び約１ｍＭ-１ＭのＴＣＥＰを含むことを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物は組成物の全量を基準に酢酸１５（ｖ/ｖ）％、アセトニトリル３０（ｖ/ｖ）％及び１０ｍＭのＴＣＥＰを含むことを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物は界面活性剤を追加的に含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項２１】
前記界面活性剤はＯＢＧ（オクチル-ベータ-グルコピラノシド）またはＳＤＳ（ソジウムドデシルスルフェート）であることを特徴とする、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
請求項１乃至１９のいずれかによる加水分解用組成物をポリペプチドと接触させてＣ-末端またはＮ-末端にアスパラギン酸残基を有するポリペプチド切片を得て、
選択的に、前記ポリペプチド切片のアミノ酸序列を分析する段階を含むアスパラギン酸残基でポリペプチドを加水分解する方法。
【請求項２３】
請求項２０に記載の加水分解用組成物をポリペプチドと接触させてＣ-末端またはＮ-末端にアスパラギン酸残基を有するポリペプチド切片を得て、
選択的に、前記ポリペプチド切片のアミノ酸序列を分析する段階を含むアスパラギン酸残基でポリペプチドを加水分解する方法。
【請求項２４】
（ｉ）請求項１乃至１９のいずれかによる加水分解用組成物をポリペプチドと接触させてＣ-末端またはＮ-末端にアスパラギン酸残基を有するポリペプチド切片を得て、
（ｉｉ）前記得られたポリペプチド切片のアミノ酸序列を決め、
（ｉｉｉ）前記ポリペプチド切片のアミノ酸序列を合わせて連結して前記ポリペプチドの全アミノ酸序列を得る段階を含むポリペプチドのアミノ酸序列を決定する方法。
【請求項２５】
（ｉ）請求項２０による加水分解用組成物をポリペプチドと接触させてＣ-末端またはＮ-末端にアスパラギン酸残基を有するポリペプチド切片を得て、
（ｉｉ）前記得られたポリペプチド切片のアミノ酸序列を決め、
（ｉｉｉ）前記ポリペプチド切片のアミノ酸序列を合わせて連結して前記ポリペプチドの全アミノ酸序列を得る段階を含むポリペプチドのアミノ酸序列を決める方法。
【請求項２６】
前記ポリペプチド切片のアミノ酸序列を質量分析法で決めることを特徴とする、請求項２２乃至２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記水を重水素、三重水素、１７Ｏまたは１８Ｏで標識したことを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリペプチドの加水分解は約７５乃至１５０°Ｃの反応温度で加熱して行うことを特徴とする、請求項２２乃至２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記加熱法はマイクロ波または超音波で行うことを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ポリペプチドの加水分解は重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）装置で約９５乃至１０５°Ｃ反応温度で行うことを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ポリペプチドの加水分解は前記加水分解用組成物とポリペプチドを含む水槽及びＰＣＲ装置のキャップをを約９５乃至１０５°Ｃ温度で加熱して行うことを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記加水分解反応容器の材質はプラスチックであることを特徴とする、請求項２５乃至２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記プラスチックはポリエチレン、ポリプロピレン、高密度ポリエチレン、または低密度ポリエチレンであることを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記方法はＮ-末端、Ｃ-末端、またはＮ-末端とＣ-末端全てにアスパラギン酸残基を有するポリペプチド断片を含む変形された開裂規則を使用したデータベース検索でポリペプチドの序列を決定することを追加的に含むことを特徴とする、請求項２５乃至２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記データベース検索はＮ-末端、Ｃ-末端、またはＮ-末端とＣ-末端全てにアスパラギン酸残基を有するポリペプチド切片を含む開裂規則と変形規則を有するＰＣＡデータベースメニューで行われることを特徴とする、請求項２５乃至２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
（ｉ）ポリペプチドをプロテアーゼで加水分解してポリペプチド切片を得て、
（ｉｉ）前記段階（ｉ）の結果物を請求項１乃至１９のいずれかによる加水分解組成物で加水分解し、切片のＮ-末端またはＣ-末端にアスパラギン酸残基を有するポリペプチド切片を得て、
（ｉｉｉ）前記得られたポリペプチド切片のアミノ酸序列を決め、
（ｉｖ）前記ポリペプチド切片のアミノ酸序列を合わせて連結し、ポリペプチドのアミノ酸序列を決定することによってポリペプチドの全アミノ酸序列を得ることを特徴とするポリペプチドのアミノ酸序列を決定する方法。
【請求項３７】
（ｉ）プロテアーゼを加水分解してポリペプチド切片を得て、
（ｉｉ）前記段階（ｉ）の結果物を請求項２０による加水分解組成物で加水分解し、切片のＮ-末端またはＣ-末端にアスパラギン酸残基を有するポリペプチド切片を得て、
（ｉｉｉ）前記得られたポリペプチド切片のアミノ酸序列を決め、
（ｉｖ）前記ポリペプチド切片のアミノ酸序列を合わせて連結し、ポリペプチドのアミノ酸序列を決めることによってポリペプチドの全アミノ酸序列を得ることを特徴とするポリペプチドのアミノ酸序列を決定する方法。
【請求項３８】
前記方法はＮ-末端、Ｃ-末端、またはＮ-末端とＣ-末端全てにアスパラギン酸残基を有するポリペプチド断片を含む変形された開裂規則を使用したデータベース検索でポリペプチドの序列を決めることを追加的に含むことを特徴とする、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記データベース検索はＮ-末端、Ｃ-末端またはＮ-末端とＣ-末端全てにアスパラギン酸残基を有するポリペプチド切片を含む開裂規則と変形規則を有するＰＣＡデータベースメニューで行われることを特徴とする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
（ｉ）酸容液と水を含有する第１容器;そして（ｉｉ）水と混合可能な有機溶媒を含む第２容器を含み、
前記酸容液はトリフルオロ酢酸、燐酸、プロピオン酸、ＨＣｌ、ｏ-ヨード安息香酸、氷酢酸及びｐＨ２付近の緩衝力を有する酸からなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とするポリペプチド加水分解用キット。
【請求項４１】
前記第２容器は還元剤を追加的に含むことを特徴とする、請求項４０に記載のポリペプチド加水分解用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は蛋白質の同定及び定量化のための蛋白質加工法に関するものである。さらに詳しく、本発明は化学試薬を使用して蛋白質をペプチドに加工する方法及びキットに関するものと、前記加工法及びキットを広範囲のプロテオミクス研究に利用する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
特定生物種において遺伝子の予測のための有用な情報を完全なゲノム序列分析法が提供してはいるが、前記ゲノム序列のみでは生物学的及び病理学的過程の底辺にある機作を説明することはできない。その理由は、翻訳された蛋白質産物の具体的な定量的または分子的情報、例えば、構造、機能的活性、翻訳後変形状態などに対しては正確に予測できないためである。プロテオミクス（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）の新たな分野は分子的水準の生化学的情報を解決することを目標とする。したがって、与えられた状況でプロテオム（ｐｒｏｔｅｏｍ）の理解は細胞または生命体の生理的状態を評価するのに必須である。
現在、質量精度を高める方法、例えば、質量分析法（Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）により、蛋白質をさらに速く正確に同定するために、増加する需要に応じて、多くの技術が開発されてきた。プロテオミック分析に使用されるプラットホームは、試料に含まれる各種蛋白質の分離と同定を含む２種類の広範囲な実務過程の統合を含む。質量分析法を適用する前に、１種類か複数種類の２−ＤＥ（２次元ゲル電気泳動：Ｔｗｏ-ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）または液体クロマトグラフィ（ＬＣ）を使用して蛋白質を分離する。２-ＤＥでは、前記蛋白質はゲル中にあって、主に分子量と等電点に依存して移動するので、特徴的なゲルパターンを形成する。質量分析法が一般に蛋白質同定に使用される。質量分析法では、蛋白質またはペプチドがイオン化され、イオン化された種は真空中で電磁界の影響を受けやすい。これらの分子量はイオンの移動経路から推測できる。蛋白質やペプチドの同定は、質量分析（ＭＳ）またはタンデム質量分析（ＭＳ/ＭＳ）により、ペプチド指紋追跡（ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ）法またはデノボ序列分析（ｄｅ ｎｏｖｏ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）で明らかにできる。
【０００３】
プロテオミクス研究で幅広く使用する試料準備法において、少なくともいくつかの蛋白質が十分にイオン化されて特定範囲の質量を分析する一般的な質量分析器にも適用可能なペプチドを生成することによって探知の可能性を向上させるために、ＭＳ分析を行う前に蛋白質を酵素開裂して構成ペプチドにする。蛋白質の酵素消化後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行って蛋白質を分離し、前記分離された蛋白質のペプチド質量マッピングを行うことは蛋白質特性分析で一般に行われる手続きである。最もよく使用されるプロテアーゼはトリプシンであり、その理由としてはトリプシンを処理して得られたペプチドはよく調査された特異性と正確な大きさを持っていて質量分析法に有用であるためである。市販のいくつかの他のプロテアーゼとしてはある気質に対してはＬｙｓ-Ｃ、Ｇｌｕ-Ｃ及びＡｓｐ-Ｎを区別する。トリプシン消化は複数の分解活性の強い地点があるために疎水性蛋白質または塩基性の非常に高い蛋白質に対しては適用することが難しい。また、プロテアーゼ自家消化産物（例えば、トリプシンの場合には、２６１．１４、５１４．３２、８４１．５０、９０５．５０、１００５．４８、１０４４．５６、１４６８．７２、１７３５．８４、１７６７．７９、２１５７．０２、２２１０．１０、２２８２．１７、３０１２．３２、４４７４．０９、４４８８．１１Ｄａ）が度々スペクトル解釈に妨害になる。さらに、効率的で特異な蛋白質消化過程のために必要ないくつかの緩衝液は化学的ノイズを生成することもあって、質量分析を行う前に追加的な精製過程が必要である。
【０００４】
酵素消化の代案として、酸加水分解を使用する新たな蛋白質分析法が最近開発された。蛋白質を効果的に開裂するための他の多様な進め方が報告されている。バーク（Ｂａｒｋ）等はサーモリシン（ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ）を利用する高温蛋白質消化法を開発した。ゴボム（Ｇｏｂｏｍ）等はペンタフルオロプロピオン酸（ＰＦＰＡ）を使用して気相酸化加水分解法を提案した。しかし、序列はしご（ｌａｄｄｅｒ）を含む３つの異なる開裂類型が観察され、これはスペクトル複雑性増加という新たな短所を招いた。アイクンリ（ＡｉｑｕｎＬｉ）などは２（ｖ/ｖ）％蟻酸を使用してアスパラギン酸の位置で蛋白質を化学的に開裂する方法を提案したが、予測しなかったホルミル化断片が生じ、これによってペプチド-質量指紋追跡法（ＰＭＦ）を使用して蛋白質を同定することが難しい問題であった。追加的に、前記蟻酸を利用する方法は序列分析データが明確な開裂規則を示さなかった。
【０００５】
また、他の観点で、蛋白質の相対的な定量分析を行うために、ボトム-アップ（ｂｏｔｔｏｍ-ｕｐ）プロテオミクスと安定な同位元素標識を使用する多様な分析法が報告された。このような方法は次のように大別することができる:（１）蛋白質合成過程に同位元素標識が含まれる代謝的方法（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ）、（２）安定な同位元素標識がＩＣＡＴTM法である場合、システインのような特異のアミノ酸を含有するペプチドにのみ適用されるアミノ酸特異な方法（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ-ｓｐｅｃｉｆｉｃ）及び（３）プロテオムのすべてのペプチドに同位元素標識を付けるグローバル標識法。本明細書において、“同位元素タグ”（ｉｓｏｔｏｐｅ ｔａｇ）は同位元素を挿入するのに適した化学的性質を有する化学的残基で、２種類のサンプルで異なって標識されたポリペプチドを生成させる。前記同位元素タグは安定な同位元素が１つ以上の原子に併合可能にする適した組成物を含む。特に、有用で安定な同位元素対は水素と重水素であり、これらは質量分析法で容易に区別することができ、例えば、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏまたは３４Ｓである。ＩＣＡＴTMのようなアミノ酸特異的方法はサンプル複雑性を減少させるという長所はあるが、少ない数のシステインに対して区別する短所がある。また、蛋白質をトリプシン性ペプチドのＣ-末端で同位元素で標識することもできる。グローバル標識法は酵素でアミド骨格を開裂する過程で水分子を経由してペプチドで同位元素標識を挿入させる。キモトリプシンとＡｓｐ-Ｎは１つの１８Ｏ原子のみを併合させ、トリプシン、Ｇｌｕ-ＣまたはＬｙｓ-Ｃは得られたペプチドのＣ-末端に２つの１８Ｏ原子を挿入させる。
【０００６】
さらに、ペプチドとアミノ酸のカルボン酸基に存在する１８Ｏ標識は逆交換に抵抗性を有する。したがって、液体クロマトグラフィ、電気噴霧イオン化（ＥＳＩ）及びマトリックス支援レーザー脱着／イオン化（ｍａｔｒｉｘ-ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ/ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、ＭＡＬＤＩ）を行う一般的な条件下で、Ｃ-末端でのカルボン酸基と酸素原子間の共有結合は安定である。高い同位元素標識に対する好ましい方法として知られたいくつかの適用例１８Ｏ-標識方法はますます注目されており、そのいくつかの適用例が公開されている。プロテオームの定量的分析用として各断片の最大標識化を達成するために、できるだけ最大に濃縮されたＨ２１８Ｏを使用することが有利である。
【０００７】
本発明は米国特許庁に２００４年９月１５日付で出願された仮出願第６０/６１０，３０６号を優先権として主張して出願し、前記仮出願明細書全体を参考文献として本明細書に併合する。
【０００８】
【非特許文献１】Aiqun Li et al. Anal Chem. 2001, 73, 5395-5402, Chemical Cleavage at Aspartyl Residues for Protein Identification
【非特許文献２】Peter Roepstorff et al. Anal Chem. 1999, 71, 919-927, Use of Vapor-Phase Acid Hydrolysis for Mass Spectrometric Peptide Mapping and Protein Identification
【非特許文献３】Zee-Yong Park et al. Anal Chem. 2000, 72, 2667-2670, Thermal Denaturation: A useful Technique in Peptide Mass Mapping
【非特許文献４】Steven L. Cohen et al. Anal. Chem. 1996, 68, 31-37, Influence of Matrix Solution Conditions on the MALDI-MS Analysis of Peptides and Proteins
【非特許文献５】Bart A. van Montfort et al. J. Mass Spectrom. 2002, 37, 322-330, Improved in-gel approaches to generate peptide maps of integral membrane proteins with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of fanlight mass spectrometry
【非特許文献６】J.otte et al, J. Agric. Food Chem. 2000, 48, 2443-2447, Identification of Peptides in Aggregates Formed during Hydrolysis of b-Lactoglobulin B with a Glu and Asp Specific Microbial Protease
【非特許文献７】Adrianne Kishiyama et al, Anal. Chem. 2000, 5431-5436, Cleavage and identification of Proteins: A Modified Aspartyl-Prolyl Cleavage
【非特許文献８】Cornelia Koy et al. Proteomics 2003, 3, 851-858, Matrix-assisted laser desorption/ionization-quadrupole ion trap-time of flight mass spectrometry sequencing resolves structures of unidentified peptides obtained by in-gel tryptic digestion of haptoglobin deribatives from human plasma proteomes.
【非特許文献９】Melanie Lin et al. Rapid Commun. Mass Spectrum. 2003, 17, 1809-1814, Intact protein analysis by matrix-assisted laser desorption/ionization tandem time-of-flight mass spectrometry.
【非特許文献１０】Xudong Yao et al. Anal. Chem. 2001, 73, 2836-2842, Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Model Studies with Two Serotypes of Adenovirus
【非特許文献１１】Marcus Bantscheff et al, Rapid Commun. Mass Spectrum. 2004, 18, 869-876, Femtomol sensitivity post-digest 18O labeling for relative quantification of differential protein complex composition.
【非特許文献１２】Kenneth L. Johnson et al. J Am Soc Mass Spectrom 2004, 15, 437-445, A Method for Calculating 16O/18O Peptide Ion Ratios for the Relative Quantification of Proteomes.
【非特許文献１３】Y.Karen Wang et al, Anal. Chem. 2001, 73, 3742-3750, Inverse 18O Labeling Mass Spectrometry for the Rapid Identification of Marker/Target Proteins.
【非特許文献１４】Schnolze,M.;Jedrzejewski,P.;Lehmann,W.D. Electrophoresis 1996, 17, 945-953,
【非特許文献１５】Methods in ENZYMOLOGY Vol 91, Enzyme Structure Part 1, 324-332, Cleavage at Aspartic Acid
【非特許文献１６】Methods in ENZYMOLOGY Vol 4, Enzyme Structure, 255-263, Cleavage at Aspartic Acid
【非特許文献１７】Gargi Choudhary et al. Jounal of Proteome Research 2003, 2, 59-67
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的はペプチドの予想できない変形を起こさず、アスパルチル残基で開裂する厳しい特異性を示す蛋白質酸加水分解法、キット及び装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は蛋白質の同定及び定量分析のために、蛋白質の酸加水分解（本明細書でアスパラギン酸残基で蛋白質開裂（ＰＣＡ））のための最適組成の化学試薬を提供する。本発明による切片化方法を適用して生成されたペプチドをデノボ序列分析または質量分析結果のペプチド-質量指紋追跡法で試料に含まれる蛋白質の同定を行うことができる。
【００１１】
本発明は水槽だけでなく、キャップを同一な温度で加熱することによって蒸気圧の損失を最少化し、９５°Ｃ以上で溶液を反応させるために開発されたＰＣＡ装置を提供する。本発明による方法は質量分析の前に、単に数時間試料の準備と反応を行うことを含む便利で簡単な蛋白質加工法を提供する。さらに、ＰＣＡはトリプシン消化と組み合わせて、 蛋白質の詳しい構造的分析を行うのに十分な程度にタンデム質量分析に適したペプチドを得ることができる。
【００１２】
また、本発明は比較プロテオミクスのために加水分解過程でＨ２１８Ｏを使用して蛋白質の１８Ｏ-標識概念を採択した蛋白質の定量分析方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は酸成分、水と混合可能な有機溶媒及び還元剤を含むポリペプチド加水分解用組成物に関するものである。前記酸成分はトリフルオロ酢酸、燐酸、プロピオン酸、ＨＣｌ、ｏ-ヨード安息香酸、氷酢酸またはｐＨ２付近の緩衝力を有する酸である。好ましくは、前記酸成分はトリフルオロ酢酸、燐酸、プロピオン酸、ＨＣｌ及びｏ-ヨード安息香酸の混合物であってもよい。
【００１４】
反応過程で加水分解溶液のｐＨは１．５ないし２．５である。前記加水分解溶液は少なくとも２乃至３０（ｖ/ｖ）％の氷酢酸を含む。前記加水分解溶液は１５（ｖ/ｖ）％の氷酢酸（ｐＨ２．０）を含む。
【００１５】
前記水と混合可能な有機溶媒はアセトニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）またはアルコールである。例えば、前記水と混合可能な有機溶媒は少なくとも５-７０（ｖ/ｖ）％のアセトニトリル、好ましくは３０（ｖ/ｖ）％のアセトニトリルであってもよい。
【００１６】
前記還元剤はトリス（２-カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、またはベータ-メルカプトエタノールである。前記還元剤はＴＣＥＰのようなｐＨ１．５乃至２．５の酸性ｐＨ範囲を有するホスフィン化合物であってもよい。前記還元剤は少なくとも１ｍＭ乃至１ＭのＴＣＥＰまたはＤＴＴであってもよい。前記還元剤は少なくとも１０ｍＭのＴＣＥＰまたはＤＴＴであってもよい。
【００１７】
例えば、前記組成物は組成物の全量を基準に酢酸２-３０（ｖ/ｖ）％、アセトニトリル、５-７０（ｖ/ｖ）％及び約１ｍＭ-１ＭのＴＣＥＰを含む組成物であってもよい。前記組成物は組成物の全量を基準に酢酸１５（ｖ/ｖ）％、アセトニトリル５-７０（ｖ/ｖ）％及び約１ｍＭ-１ＭのＴＣＥＰを含む組成物であってもよい。前記組成物は組成物の全量を基準に酢酸１５（ｖ/ｖ）％、アセトニトリル３０（ｖ/ｖ）％及び約１ｍＭ-１ＭのＴＣＥＰを含む組成物であってもよい。前記組成物は組成物の全量を基準に酢酸１５（ｖ/ｖ）％、アセトニトリル３０（ｖ/ｖ）％及び１０ｍＭのＴＣＥＰを含む組成物であってもよい。
【００１８】
前記組成物は水と混合可能な有機溶媒及び還元剤を含まなくてもよい。
【００１９】
本発明による組成物は界面活性剤を追加的に含むことができ、前記界面活性剤はオクチル-β-グルコピラノシド（ＯＢＧ）または硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）であってもよい。
【００２０】
追加的に、本発明は前記加水分解用組成物とポリペプチドと接触させてＣ-末端またはＮ-末端にアスパラギン酸残基を有するポリペプチド切片を得て、選択的に前記ポリペプチド切片のアミノ酸序列を決める段階を含むアスパラギン酸残基でポリペプチドを加水分解する方法を提供する。
【００２１】
本発明の具体的一例で、前記ポリペプチドのアミノ酸序列を決める方法は下記の段階を含む:
（ｉ）前記加水分解用組成物をポリペプチドと接触させてＣ-末端またはＮ-末端にアスパラギン酸残基を有するポリペプチド切片を得て、
（ｉｉ）前記得られたポリペプチド切片のアミノ酸序列を決め、
（ｉｉｉ）前記ポリペプチド切片のアミノ酸序列を合わせて連結して前記ポリペプチドの全アミノ酸序列を得る段階。
【００２２】
前記ポリペプチド切片のアミノ酸序列は質量分析法で決めることができる。水を重水素または三重水素で示したり、或いは１７Ｏまたは１８Ｏで表示することができる。前記ポリペプチドの加水分解は約７５乃至１５０°Ｃの反応温度で加熱して行ううことができる。前記加水分解反応容器の材質はプラスチックであってもよく、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、高密度ポリエチレンまたは低密度ポリエチレンであってもよい。前記反応熱加熱法はマイクロ波または超音波であってもよい。
【００２３】
前記Ｎ-末端、Ｃ-末端またはＮ-末端とＣ-末端全てにアスパラギン酸残基を有するポリペプチド断片を含む変形された開裂規則を使用したデータベース検索でポリペプチドの序列を決めることができる。前記データベース検索はＮ-末端、Ｃ-末端またはＮ-末端とＣ-末端全てにアスパラギン酸残基を有するポリペプチド断片を含む開裂規則と変形規則を有するＰＣＡデータベースメニューで行うことができる。
【００２４】
本発明の具体的な例で、本発明は下記の段階を含むポリペプチドのアミノ酸序列を決める方法を提供する:
（ｉ）ポリペプチドをプロテアーゼで加水分解してポリペプチド切片を得て、
（ｉｉ）前記段階（ｉ）の結果物を前記加水分解組成物で加水分解して切片のＮ-末端またはＣ-末端にアスパラギン酸残基を有するポリペプチド切片を得て、
（ｉｉｉ）前記得られたポリペプチド切片のアミノ酸序列を決め、
（ｉｖ）前記ポリペプチド切片のアミノ酸序列を合わせて連結してポリペプチドのアミノ酸序列を決めることによってポリペプチドの全アミノ酸序列を得る段階。
【００２５】
前記方法はＮ-末端、Ｃ-末端またはＮ-末端とＣ-末端全てにアスパラギン酸残基を有するポリペプチド断片を含む変形された開裂規則を使用したデータベース検索でポリペプチドの序列を決めることができる。データベース検索はＮ-末端、Ｃ-末端またはＮ-末端とＣ-末端全てにアスパラギン酸残基を有するポリペプチド切片を含む開裂規則と変形規則を有するＰＣＡデータベースメニューで行うことができる。
【００２６】
本発明の具体的な例で、本発明は（ｉ）酸容液と水を含有する第１容器;そして（ｉｉ）物と混合可能な有機溶媒を含む第２容器を含むポリペプチド加水分解キットを提供する。前記第２容器は還元剤を追加的に含むことができる。
【００２７】
本発明は下記の実施例を参照してさらに詳しく説明するが、下記の実施例は本発明の保護範囲を制限する意図で解釈されない。
【実施例１】
【００２８】
１．化学試薬を使用したアスパラギン酸残基（ＰＣＡ）で蛋白質消化
本発明は従来の他の分解法に比べて優れたプロテオム分析法を提供する。図１に示したように、ＰＣＡ溶液を使用して溶液またはゲルに含まれる蛋白質は効果的に開裂されてペプチドを生成し、前記得られたペプチドの質量パターン及びアミノ酸序列を質量分析器で分析することができる。ＰＣＡ溶液の存在の下で溶媒またはゲルに存在する蛋白質を９５°Ｃ（９９．９°Ｃで反応することがさらに好ましい）以上の温度で１０分以上反応させた。
【００２９】
１-１．ＰＣＡ溶液の組成
１．酸成分:トリフルオロ酢酸、燐酸、プロピオン酸、ＨＣｌ、ｏ-ヨード安息香酸、氷酢酸、蟻酸
（酢酸のような酸はｐＨ２近くの緩衝力を有し、反応する間に予測できない変形を招かないことが好ましい）
２．水と混合可能な有機溶媒:アセトニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）またはメタノールまたはエタノールのような全ての種類のアルコール
（アセトニトリルの含量は３０（ｖ/ｖ）％が好ましい。）
３．二硫化結合の還元剤:ＴＣＥＰ、ＤＴＴ
（酸性ｐＨ条件で作用するＴＣＥＰのような還元剤が好ましい）
収率、効率及び特異性面で反応は１５％酢酸（２．６２ｍＭ）、３０（ｖ/ｖ）％アセトニトリル及びＴＣＥＰ（１０ｍＭ）を含むことがアスパラギン酸残基で蛋白質開裂及び蛋白質の二硫化結合の還元に最適であり得る。
【００３０】
その後、前記試料を室温に冷却させて迅速な真空乾燥のために反応溶液を新たなチューブに移動させず、同一な反応チューブで乾燥した。前記乾燥されたペプチド抽出物を適切な容量の０．１（ｖ/ｖ）％ＴＦＡで希薄にさせた。ＴＣＥＰオキシド（ＴＣＥＰＯ）及び質量分析に妨害になり得る他の塩を除去するための脱塩過程をμ-Ｃ１８ＺｉｐＴｉｐに通過させて行った。前記得られたペプチドを質量分析器で分析した。
【００３１】
１-２．ＢＳＡ及びユビキチンを利用したサンプルテスト
１-２-１．ＢＳＡ
牛胎児血清（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ、ＢＳＡ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．１２６６０９）を使用して試料製造のためのＰＣＡ法の有用性を検証した。１５（ｖ/ｖ）％酢酸（ｐＨ２．０）、３０（ｖ/ｖ）％のアセトニトリル及び１０ｍＭのＴＣＥＰを含むＰＣＡ溶液で９９．９°Ｃ温度で２時間反応した。得られた質量分析結果でｐｙｒｏ-ｇｌｕＥ（Ｎ-末端）及びｐｙｒｏ-ｇｌｕＱ（Ｎ-末端）を除いてはいかなる任意的変形も観察されなかった。これら任意の変形はＭＡＳＣＯＴＴＭによる蛋白質同定を妨害しない。前記反応過程で、ノイズ-対信号を満足する５７個ピークを観察し、これはアスパルチル残基でＢＳＡが開裂されることによって生成された予想された産物である。ＢＳＡ序列の中で、ＰＣＡ法の適用で４３％を直接回収した（図２）。システインをさらに多く含むペプチドをＰＣＡ溶液の中でＤＴＴの代わりに還元剤としてＴＣＥＰを含んで回収する。ＤＴＴを還元させるための最適のｐＨは弱塩基性であるので、酸加水分解条件でペプチド間二硫化結合を開裂するためには多量のＤＴＴが必要である。ＴＣＥＰは蛋白質の酸加水分解に最適ｐＨ範囲で作用できる還元剤として選択される。
【００３２】
１-２-２．ユビキチン
ＰＣＡ法の適用の可能性を検証するために、小さい大きさの蛋白質の例としてユビキチン（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．Ｕ６２５３）を使用した。１５（ｖ/ｖ）％酢酸（ｐＨ２．０）、３０（ｖ/ｖ）％のアセトニトリル及び１０ｍＭのＴＣＥＰを含むＰＣＡ溶液で９９．９°Ｃ温度で２時間反応させた。ユビキチンに対して実験する場合に、ユビキチンは二硫化結合が存在しないためにＴＣＥＰを反応混合液に含めなかった。ＰＣＡ法でユビキチンを開裂して１００％完全な結果が得られた（図３）。トリプシン消化ではユビキチンの約８２％アミノ酸序列のみが分かり、ユビキチンの他の変形体をＭＡＳＣＯＴＴＭで分析した。
【実施例２】
【００３３】
２．ＰＣＡと酵素消化の併行遂行
酵素分解とＰＣＡ法を併行して随行することができるかどうかについて調べた。トリプシンは蛋白質消化で幅広く使用される酵素である。アスパルチル残基（Ｄ）で起こる開裂は酵素蛋白質消化に対する接近性が良くないかアミノ酸開裂が殆どない試料を取り扱う場合に有用である。
【００３４】
２-１．多様な分解のためのＢＳＡを利用するサンプルテスト
ＢＳＡ（１０ｐｍｏｌｅ）を５０ｍＭの重炭酸アムモニウム溶液に溶解して１-５μＭ濃度の溶液を製造した。蛋白質溶液を等分して、９０°Ｃで２０分間暖めて熱変成させた。次いで、変成過程を終了するために前記蛋白質を氷水水槽に移動させた。熱変性された蛋白質試料を序列分析用等級の変性トリプシンで３７°Ｃで１２時間反応させて酵素的に分解させた。５０ｍＭの重炭酸アムモニウム溶液中に分解された試料を反応チューブに移動させた後、９９．９°Ｃで３０分間加熱して重炭酸アムモニウムを蒸発させて除去した。加熱した後、ＰＣＡ溶液に溶解された乾燥試料を１５（ｖ/ｖ）％酢酸（ｐＨ２．０）、３０（ｖ/ｖ）％のアセトニトリル及び１０ｍＭのＴＣＥＰを含むＰＣＡ溶液で９９．９°Ｃで２時間加熱した。前記試料を室温に冷却させて反応溶液を同一な反応チューブで９９．９°Ｃで乾燥した。前記乾燥ペプチド抽出物を５μＬの０．１（ｖ/ｖ）％ＴＦＡで希釈し、μ-Ｃ１８ＺｉｐＴｉｐｓを使用して脱塩処理を行った。ＺｉｐＴｉｐに結合されたペプチドを０．１（ｖ/ｖ）％のＨＡｃ（酢酸）溶液または５０（ｖ/ｖ）％ＡＣＮ/０．１（ｖ/ｖ）％ＨＡｃに溶解された５μＬそれぞれ２０（ｖ/ｖ）％、５０（ｖ/ｖ）％及び８０（ｖ/ｖ）％ＣＡＮを使用して段階的に溶出させた。前記得られたペプチド溶液を乾燥して体積を約５μＬに減少させ、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦのためにマトリックス溶液を添加した。ＺｉｐＴｉｐ使用の目的はＭＳ分析を行う前に塩を除去することである。このような進め方はＢＳＡのような蛋白質の特性分析に適用され、その結果、ＰＣＡ法及びトリプシン消化法によって得られた４０％及び３２％に比べて高い水準の同定率（８７％）を得ることができる。図４参照。
【００３５】
２-２．化学的及び酵素的方法で膜蛋白質を順次に分解
膜蛋白質のプロテオミック分析は多様な信号ネットワークの理解と特定疾患に対する標的発見のために必須で魅力的な主題である。大部分の研究者は酵素分解及び質量分析を行う前に蛋白質の分離のために二次元電気泳動からなる伝統的なプロテオミック方法に依存し、僅か数個の研究だけでゲル-フリーＬＣ-ＭＳ/ＭＳに対して好意的に報告された。しかし、ゲル-フリーＬＣ-ＭＳ/ＭＳ技術が膜断片から膜貫通蛋白質を分離するために界面活性剤またはカオトロピック試薬に依存的であった。本発明者らは膜蛋白質を分析するために新たなゲル-フリー界面活性剤も不要なショットガンプロテオミック法（ｓｈｏｔｇｕｎ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｍｅｔｈｏｄ）を開発した。本発明による技術によって（ＣＣＰＡ法、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｔ Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）、マウスの脂質ラフト蛋白質の脱脂質化（ｄｅ-ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）結合体を成功的にペプチドで開裂した。
【００３６】
２-２-１．マウス脳から脂質ラフトの準備
脂質ラフトに存在する蛋白質の組成を糾明するための多様なプロテオミック研究が行われてきたので、化学的開裂の有用性を立証するために脂質ラフトを選択した。プロテオミクス２００４、４、３５３６-３５４８に記載された方法によって脂質ラフトを準備した。（１（ｖ/ｖ）％ＴｒｉｔｏｎＸ-１００、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ及びプロテアーゼカクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）を含む分解緩衝液でタイトドンスホモゲナイゼ（ｔｉｇｈｔ Ｄｏｕｎｃｅ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（Ｋｏｎｔｅｓ、Ｖｉｎｅｌ及びＮＪ、ＵＳＡ））を使用してマウス脳を２０回均質化し、４℃で２０分間反応させた。前記抽出物を２．５Ｍのサッカロース溶液と混合し、ＳＷ４１遠心分離チューブに移動させて２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．５及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する３０（ｗ/ｖ）％のサッカロース溶液及び５（ｗ/ｖ）％のサッカロース溶液で覆った。不連続的なサッカロース濃度勾配で４℃、ＳＷ４１ローターで３９０００ｒｐｍで１８時間遠心分離した。前記濃度勾配は底から 上端まで１２分画に区分した。脂質ラフト画分を洗浄緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ）を使用して超遠心分離（２００００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ、４７Ｃ）を行って洗浄し、５０ｍＭの重炭酸ナトリウムに懸濁させた。アセトン処理及び後続的な洗浄段階を行うことによって膜蛋白質の沈殿物を得た。得られた蛋白質沈殿物を乾燥させた。
【００３７】
２-２-２．脱脂質化された膜蛋白質のＰＣＡ反応
１５（ｖ/ｖ）％の酢酸（ｐＨ２．０）、３０（ｖ/ｖ）％アセトニトリル及びＴＣＥＰ（１０ｍＭ）を含有するＰＣＡ溶液に前記建造物質を溶解し、ＰＣＲ装置で９９°Ｃで４時間反応させた。図５に示したように、膜蛋白質を開裂して得られたペプチドをトリス-トリシン（Ｔｒｉｓ-Ｔｒｉｃｉｎｅ）電気泳動に次いで蛋白質またはペプチド可視化方法を行って確認した。
【００３８】
２-２-３．ＰＣＡ-開裂された膜蛋白質の分離
図６に示したように、化学的に分解された膜蛋白質を逆相カラムクロマトグラフ（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ-Ｃ１８、Ｍｅｒｃｋ）を行って分離した。カラムで得られた分画は約９種類分画で、それぞれ分離して乾燥させた。
【００３９】
２-２-４．ＰＣＡ-開裂された膜蛋白質のトリプシン消化
前記９個の乾燥分画物を、５０ｍＭの重炭酸アムモニウムの中で１/５０のトリプシンと共に３７℃で１２時間暖めた。これで得られたペプチドをＬＣ-ＭＳ/ＭＳで分析した。
【実施例３】
【００４０】
３．ＰＣＡ-ＤＭＴ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｍａｓｓ Ｔａｇｇｉｎｇ）
試料の定量的分析のために１６Ｏまたは１８Ｏを含む水で化学的に同一であるが、放射線同位元素に区別されるように２種類の試料を標識した。反応過程中で１つまたは２つの酸素原子交換が起こることがあり、これによって質量分析法で区別される程度の２または４Ｄａの分子量の差をもたらす。ＰＣＡ-ＤＭＴ方法で、１８Ｏ-水を含むＰＣＡ溶液の場合に得られる値に比べて、１６Ｏ-水を含むＰＣＡ溶液で行った化学的開裂で得られた単一放射線同位元素の質量信号の強度を比較することで蛋白質の相対的定量分析を行う。
【００４１】
３-１．ユビキチンを使用するサンプルテスト
１５（ｖ/ｖ）％の酢酸（ｐＨ２．０）、３０（ｖ/ｖ）％アセトニトリル及びＴＣＥＰ（１０ｍＭ）を含有するＰＣＡ溶液の存在下で水に溶解されたまたは乾燥したゲルバンドにある蛋白質を９９．９°Ｃで２時間加熱した。差分質量タグを行うために、１６Ｏ-水を１８Ｏ-水で置換した。その後、前記試料を室温に冷却させ、反応溶液を反応チューブで９９．９°Ｃで乾燥し、５μＬの０．１（ｖ/ｖ）％ＴＦＡに溶解させ、μ-Ｃ１８ＺｉｐＴｉｐｓを使用して脱塩過程を行った。ＺｉｐＴｉｐに結合されたペプチドを０．１（ｖ/ｖ）％のＨＡｃ（酢酸）溶液または５０（ｖ/ｖ）％ＡＣＮ/０．１（ｖ/ｖ）％ＨＡｃに溶解された５μＬそれぞれ２０（ｖ/ｖ）％、５０（ｖ/ｖ）％及び８０（ｖ/ｖ）％ＣＡＮを使用して段階的に溶出させた。前記得られたペプチド溶液を乾燥して体積を約５μＬに減少させ、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦのためにマトリックス溶液を添加した。前記実験例のうちの１つは図７に示した。前記ペプチドに対して単一放射線同位元素ピークの正確な質量測定を行ってＱＱＲＬＩＦＡＧＫＱＬＥＤ（Ｐｙｒｏ-ｇｌｕ（Ｎ-末端））で示し、２または４Ｄａの分子量変化もまた観察され、Ｃ-末端のカルボン酸基で１つまたは２つの１８Ｏ原子が含まれたことを示す。ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ（ＡＢＩ４７００ａｎａｌｙｚｅｒTM）を使用して１０ｐｐｍの質量正確度で質量スペクトルを得た。
【００４２】
ｍ/ｚ値（質量スペクトルのｘ-軸に記載された数値）をＭ０で記載し、一連の放射線同位元素質量を分子量差による昇順としてＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４で示した。ｍ/ｚの信号大きさ（質量スペクトルのｙ-軸に記載された数値）はＳ１６（Ｍ０）、Ｓ１６（Ｍ１）、Ｓ１６（Ｍ２）、Ｓ１６（Ｍ３）及びＳ１６（Ｍ４）で示した。ここで、数字１６は化学的開裂に使用された水の酸素原子の質量を示す。したがって、１８Ｏ-水を用いた場合には、化学的開裂を通じて単一放射線同位元素質量の信号大きさはＳ１８（Ｍ０）で示し、それぞれ１６Ｏ-水または１８Ｏ-水の存在下で行われた個別的な化学的開裂反応で得られた産物を混合して得られた信号強さはＳ１６+１８（Ｍ０）で示す。Ｋ１は１８Ｏ-水の存在下で行われた化学的開裂反応で酸素原子１つが含まれる場合の係数であり、Ｋ２は酸素原子２つが含まれる場合の係数である。Ｋ１及びＫ２の合計を計算することによって２種類の異なる試料に存在する蛋白質量の相対的な比較が可能である。数学的意味で、Ｋ１及びＫ２は下記式から得られる。
【００４３】
Ｓ１６+１８（Ｍｘ）=Ｓ１６（Ｍｘ）+Ｋ１*Ｓ１６（Ｍｘ-２）+Ｋ２*Ｓ１６（Ｍｘ-４）
[ｍ/ｚ数値は０以上]
Ｓ１６+１８（Ｍ２）=Ｓ１６（Ｍ２）+Ｋ１*Ｓ１６（Ｍ０）+Ｋ２*Ｓ１６（Ｍ-２）=Ｓ１６（Ｍ２）+Ｋ１*Ｓ１６（Ｍ０）
Ｋ１=（Ｓ１６+１８（Ｍ２）-Ｓ１６（Ｍ２））/Ｓ１６（Ｍ０）
Ｓ１６+１８（Ｍ４）=Ｓ１６（Ｍ４）+Ｋ１*Ｓ１６（Ｍ２）+Ｋ２*Ｓ１６（Ｍ０）
Ｋ２=（Ｓ１６+１８（Ｍ４）-Ｓ１６（Ｍ４）-Ｋ１*Ｓ１６（Ｍ２））/Ｓ１６（Ｍ０）
図７に示した質量スペクトルから、１６Ｏ-水及び１８Ｏ-水が存在する場合に、ユビキチンの化学的開裂で得られたペプチドの混合比率は上記式から計算することができる。
【００４４】
Ｋ１=（５９６３．０９−０．４９３８９*８２５１．５６）/８２５１．５６=０．２２８７
Ｋ２=（４９６６．４９-（０．０６４７２*８２５１．５６+０．４９３８９*１８８７．７３））/８２５１．５６=０．４２４２
Ｋ１+Ｋ２=０．６５２９
１６Ｏ-水及び１８Ｏ-水が存在する場合に、ユビキチンの化学的開裂で得られたペプチドの混合比率は１:０．６５である。理論的に計算された数値との差は５％の１６Ｏ-水を含む１８Ｏ-水を使用したためであり、ＴＣＥＰ及び試料（ユビキチン）のような他の試薬に存在する１６Ｏ-水の汚染可能性、そして反応過程で空気から１６Ｏ-水の混入可能性のためである。
【実施例４】
【００４５】
４．ＭＡＬＤＩ ＭＳ分析用サンプル準備
５μＬの０．１（ｖ/ｖ）％ＴＦＡに前記乾燥ペプチド抽出物を溶解し、μ-Ｃ１８ＺｉｐＴｉｐｓを使用して脱塩処理した。ＺｉｐＴｉｐに結合されたペプチドを０．１（ｖ/ｖ）％のＨＡｃ（酢酸）溶液または５０（ｖ/ｖ）％のＡＣＮ/０．１（ｖ/ｖ）％のＨＡｃに溶解された５μＬそれぞれ２０（ｖ/ｖ）％、５０（ｖ/ｖ）％及び８０（ｖ/ｖ）％ＣＡＮを使用して段階的に溶出させた。前記得られたペプチド溶液を乾燥して体積を約５μＬに減少させ、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦのためにマトリックス溶液を添加した。ＺｉｐＴｉｐを使用する目的はＭＳ分析を行う前に試料から塩を除去するためであるが、非イオン性界面活性剤のｎ-ＯＧを完全に除去することはできない。マトリックスとしてα-ＣＨＣＡを使用する２層サンプル蒸着法（ｔｗｏ-ｌａｙｅｒ ｓａｍｐｌｅ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）をＭＡＬＤＩ-ＭＳ分析法で使用した。最初の層は２０（ｖ/ｖ）％メタノール/アセトンα-ＣＨＣＡに溶解された２０ｍｇ/ｍＬのα-ＣＨＣＡ溶液とし、第２層は３０（ｖ/ｖ）％のメタノール/水に溶解されたマトリックス飽和溶液とした。第２層をＺｉｐ-Ｔｉｐｐｅｄペプチド混合物に添加して分析対象物に対するマトリックスの比率が４:１にし、ボルテックスで混合した。０．５μＬの最初層を前記サンプルプローブに置き、乾燥して０．５μＬの第２層を前記最初層の上端に置き、乾燥して１μＬの水で２回洗浄した。
【実施例５】
【００４６】
５．ＭＡＬＤＩ-質量分析法
質量スペクトルを得るためにＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量分析、４７００Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ＡｎａｌｙｚｅｒTM（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。マトリックス溶液は水と５０（ｖ/ｖ）％のアセトニトリルに溶解された１０ｍｇのα-ＣＨＣＡであった。前記ペプチド混合物０．５μＬの一定割合として及び０．５μＬマトリックス溶液をサンプルプレート上で混合して分析する前に空気で乾燥した。
【実施例６】
【００４７】
６．ＭＡＬＤＩタンデム質量分析法（ＭＳ/ＭＳ）
ＴＯＦ/ＴＯＦ（４７００Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ＡｎａｌｙｚｅｒＴＭ）を利用し製造者の指示によって基本１ｋｖのＭＳ/ＭＳを使用して全てのＭＳ/ＭＳデータを得た。ＰｒｏｂｏｔTMで点滴したＬＣ溶出液のあるプレート（ＬＣ-ＭＡＬＤＩプレート）からＭＳ/ＭＳデータを得ることは４段階で行われる。第一に、６個目盛り点それぞれからＭＳスペクトルを記録し、装置の基本目盛り変数とプレートモデルの適したモデルを更新する。第二に、前記プレート上の全ての１４４個試料点に対してＭＳスペクトルを記録する。最近更新した目盛り調整を使用して７５０レーザーシュートからデータを蓄積して各スペクトルを得る。第三に、前記装置に供給されたピークピッカーソフトウェア（Ｐｅａｋ Ｐｉｃｋｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を利用して１４４ＭＳスペクトルを分析する。臨界基準を満足して除外リストに現れないスペクトルｌピークが実験のＭＳ/ＭＳ部分に対する結果リストに含まれる。前記臨界基準は次のように合わせる:質量範囲:６５０乃至４０００Ｄａ;最小クラスタ領域:５００;最小信号-対-ノイズ（Ｓ/Ｎ）:１０;ピーク/スポット:３０;最大前駆体ギャップ:２００ｐｐｍ;最大分画ギャップ:４．マトリックスクラスタイオンを排除する質量フィルターが適用された。ＭＳ/ＭＳに対する前駆体質量のリスト及びこれらの対応スポット数値を含むＸＭＬファイルを得た。最後に、前記リストを４７００Ｅｘｐｌｏｒｅｒ ｓｏｆｔ ｗａｒｅ ｂａｔｃｈ ｅｄｉｔｏｒに出力して１ｋＶの衝突エネルギーを有する衝突ガスとして空気を使用してＭＳ/ＭＳスペクトルを記録した。ＭＳ/ＭＳデータを得る過程で、終了条件のある方法を使用した。このような方法で、最小７５０シュート（それぞれ１２５レーザーシュートから得られた６サブ-スペクトル）及び最大２０００シュートを各スペクトルに許容した。前駆体質量がｍ/ｚ４００乃至９０％の範囲で、１０以上のＳ/Ｎを有する１０以上のイオンが蓄積されたＭＳ/ＭＳスペクトルに存在する場合には、追加的なレーザーシュートの蓄積を中断させた。
【実施例７】
【００４８】
７．二重で分解された脂質ラフトプロテオムのＬＣ-ＭＳ/ＭＳ分析
ＰＣＡ/トリプシンで分解されたペプチドをナノＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ１１００）から溶出し、イオンをＱＳＴＡＲ-ＸＬ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ＴＯＦ ｈｙｂｒｉｄ ＭＳ（ＰＥ-Ｓｃｉｅｘ、Ｔｈｏｒｎｈｉｌｌ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）のオリフィスに直接噴射した。マウス脳の脂質ラフトをＰＣＡ/トリプシンで順次分解して得られた加水分解物に対するＬＣ-ＭＳ/ＭＳ実験結果を図８に示した。ＭＡＳＣＯＴ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌｏｎｄｏｎ）を使用する国際人間蛋白質指数データベース（Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｄｅｘ ｄａｔａｂａｓｅ、ｆｔｐ://ｆｔｐ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ/ｐｕｂ/ｄａｔａｂａｓｅｓ/ＩＰＩ/ｃｕｒｒｅｎｔ/ＭＯＵＳＥ）に対して検索して多重電荷を帯びたペプチドに対して断片スペクトルの情報-依存した方式でＬＣ/ＭＳ/ＭＳを使用して蛋白質を同定した。次のような検索変数を全てのＭＡＳＣＯＴ検索で使用した:最大ＣＣＰＡ-トリプシン開裂（ｔｗｏ ｍｉｓｓｅｄ ＣＣＰＡ-ｔｒｙｐｓｉｎ ｃｌｅａｓｖａｇｅ）、システインカーバミドメチレイション、メチオニン酸化及びＭＳで最大０．２-Ｄａ誤差範囲及びＭＳ/ＭＳデータで０．１-Ｄａ誤差範囲、最高ＭＯＷＳＥ点数を有する有意のマッチ（ｍａｔｃｈ）を可能な同定と見なした。四重極-ＴＯＦ混成ＭＳ（ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ-ＴＯＦ ｈｙｂｒｉｄ ＭＳ）でペプチド断片化に対して受容される規則を利用して他のマッチは手動で検証した。マウス脳の脂質ラフトの選択したサブセットを図１１に羅列した。得られたペプチドのＬＣ-ＭＳ/ＭＳ分析で複数の膜蛋白質、例えばＧ-蛋白質、付着分子、チャンネル/移送者（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、信号蛋白質（ＣＡＭ-キナーゼ及びフォスフォジエステラーゼ）及びフロチリン（一種のラフトマーカ蛋白質）を同定した。
【実施例８】
【００４９】
８．質量分析の解釈及びデータベース検索
蛋白質からペプチドが生成する規則はＭＡＳＣＯＴＴＭの使用者マニュアルに従う指示で変形し、その結果Ａｓｐ-Ｘ及びＸ-Ａｓｐ２つの残基でＰＣＡ開裂規則はＭＡＳＣＯＴＴＭプログラムに反映された。トリプシン消化過程で生じるペプチド変形、例えばメチオニンの酸化、Ｐｙｒｏ-ｇｌｕＥ（Ｎ-末端）、Ｐｙｒｏ-ｇｌｕＱ（Ｎ-末端）がデータ検索で考慮された。本発明で開発されたアルゴリズムは質量分析用として開発された全ての種類のプログラムに適用することができる。
【実施例９】
【００５０】
９．ＰＣＡプロテオミクスキット
ＰＣＡキットは溶液（溶液Ａ及び溶液Ｂ）と、化学開裂過程で最適熱伝達及び試料損失を最少化するように設計された容器で構成された１つのセットで提供することができる。ＰＣＲ反応のための薄い壁チューブが好ましく薦められる。前記反応は効果的なＰＣＡ法を行うためにＰＣＲ装置のように同一な温度で同時に容器とキャップを共に加熱することによって蒸気圧損失を最少化できるように考案された加熱装置で行われるのが好ましい。
【００５１】
全反応混合物（１５０μＬ）;溶液Ａ（４５μＬ）+溶液Ｂ（１０５μＬ）
Ａ．溶液Ａ;アセトンに溶解された１０ｍＭのＴＣＥＰ
Ｂ．溶液Ｂ;水に溶解された２１．４（ｖ/ｖ）％氷酢酸
ペプチド混合物を内部質量標準で使用することができる。差分質量タグには、１８Ｏ-水に溶解された２１．４（ｖ/ｖ）％酢酸を使用することができる。
【００５２】
本明細書に記述された方法は基本的な知識を理解する専門家が多様な方法で変更することができる。したがって、本発明は前記実施例に限られるわけではない。データベース検索アルゴリズムに基づいて特異な開裂規則と変形規則を有する蛋白質及びペプチドの同定及び定量に他の類型の質量分析器を使用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１はアスパラギン酸位置での蛋白質開裂（ＰＣＡ）法を使うプロテオミック分析による蛋白質同定のフローチャートである。
【図２ａ】図２ａは、ＰＣＡ法による、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）のMALDI-MS分析の結果（質量範囲800-4300 Da）を示している。スペクトルはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ＡｎａｌｙｚｅｒTMを用いて得られた。
【図２ｂ】図２ｂは、ＰＣＡ法による牛血清アルブミン（ＢＳＡ）について、ＭＡＳＣＯＴＴＭを用いて行ったPMFによるデータベース検索の結果を示している。
【図２ｃ】図２ｃは、ＰＣＡ法による牛血清アルブミン（ＢＳＡ）について、単一同位元素ピークを有する1723.86 DaのMS/MS（MALDI-TOF/TOF）分析を行った結果を示している。スペクトルは、衝突ガスとして機能する空気を用いて、１ｋＶの衝突エネルギーで連続5000回のレーザーショットの蓄積によって得られた。
【図３ａ】図３ａは、ＰＣＡ法による、ユビキチンをMALDI-MS分析した結果（質量範囲：400-4300 Da）を示している。スペクトルはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ＡｎａｌｙｚｅｒTMを用いて得られた。
【図３ｂ】図３ｂは、ＰＣＡ法によるユビキチンについて、ＭＡＳＣＯＴＴＭを用いて行ったPMF（ペプチドフィンガープリント）によるデータベース検索の結果を示している。
【図４ａ】図４ａは、（BSA）牛血清アルブミンを蛋白試料としてＭＡＳＣＯＴＴＭを用いて行ったデータベース検索の結果を示しており、PCA法によって消化されたBSAのMALDI-TOF質量リスト（S/Nが10より大きいもの）についてのデータベース検索結果である序列適用範囲：40％）。
【図４ｂ】図４ｂは、（BSA）牛血清アルブミンを蛋白試料としてＭＡＳＣＯＴＴＭを用いて行ったデータベース検索の結果を示しており、トリプシンよって消化されたBSAのMALDI-TOF質量リスト（S/Nが10より大きいもの）についてのデータベース検索結果である（序列適用範囲：32％）。
【図４ｃ】図４ｃは、（BSA）牛血清アルブミンを蛋白試料としてＭＡＳＣＯＴＴＭを用いて行ったデータベース検索の結果を示しており、PCA法とトリプシン消化法とを併用して得られたMALDI-TOF質量リスト（S/Nが10より大きいもの）についてのデータベース検索結果である。PCA/トリプシン法のデータベース検索結果は高い序列適用範囲を示す（87％）。
【図５】図５は界面活性剤及びカオトロピック試薬のない条件で膜蛋白質を化学的に消化したものを示す。マウス脳脂質ラフトから得られた脂質を除去した（Ｄｅ-ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）膜蛋白質結合体は、酢酸（ｐＨ２．０）１５（ｖ/ｖ）％、アセトニトリル３０（ｖ/ｖ）％、及びＴＣＥＰ（１０ｍＭ）を含むＰＣＡ溶液で消化され、９９°Ｃに暖めて４時間、ＰＣＲ装置で反応させた。化学的に消化された膜蛋白質をＳＤＳ-ＰＡＧＥで分析し、ＣＢＢ-染色法で可視化した。
【図６】図６は脂質が除去された膜蛋白質結合体のＰＣＡ反応液から得られた加水分解物の逆相ＨＰＬＣ分離のＵＶクロマトグラフィを示す。約１ｍｇの蛋白質加水分解物を注入した。分離された分率を円文字で示した。
【図７ａ】図７ａはPCA法で分解されたユビキチンのペプチド断片をMALDI-TOF/TOFで分析した結果であり、PCA法で処理したユビキチンの質量分析スペクトルを示している。
【図７ｂ】図７ｂはPCA法で分解されたユビキチンのペプチド断片をMALDI-TOF/TOFで分析した結果であり、PCA-DMT（差分質量タグ、Differential Mass Tagging）法で得られたユビキチンの質量分析スペクトルを示している。
【図７ｃ】図７ｃはPCA法で分解されたユビキチンのペプチド断片をMALDI-TOF/TOFで分析した結果であり、PCA/PCA-DMTの１：１混合物で開裂したユビキチンの質量分析スペクトルである。図７ＤはPCA法で分解されたユビキチンのペプチド断片をMALDI-TOF/TOFで分析した結果であり、PCA/PCA-DMTの１：２混合物で開裂したユビキチンの質量分析スペクトルである。
【図８】図８はマウス脳の脂質ラフト蛋白質をＰＣＡとトリプシンが連続的に消化して得られた加水分解物をＬＣ-ＭＳ/ＭＳで分析した実験結果を示す:パネルＡ;図４の各断片のトリプシン加水分解物を全イオンクロマトグラフィを行った結果であり、各断片は円文字で示した;パネルＢ;パネルＡに示した時間に行った抽出イオンクロマトグラフィを行った結果;パネルＣ;パネルＢで円形に示したイオンのタンデムＭＳ/ＭＳ結果。
【図９】図９はＰＣＡ法で得られたユビキチンのペプチド断片の質量を示す[序列分析適用範囲１００％]。
【図１０ａ】図１０ａはPCA法で処理されたBSAのペプチド断片の質量を示し、前記MALDI-TOFで得られたペプチド質量リストと、いくつかのペプチドの同定とが、タンデム質量分析によるデノボ配列によって確認された。
【図１０ｂ】図１０ｂはPCA法で処理されたBSAのペプチド断片の質量を示し、前記MALDI-TOFで得られたペプチド質量リストと、いくつかのペプチドの同定とが、タンデム質量分析によるデノボ配列によって確認された。
【図１１ａ】図１１ａはPCAとトリプシンとによる連続消化から得られた加水分解物をLC-MS/MSで分析したマウス脳の脂質ラフト蛋白質を選択したリストである。
【図１１ｂ】図１１ｂはPCAとトリプシンとによる連続消化から得られた加水分解物をLC-MS/MSで分析したマウス脳の脂質ラフト蛋白質を選択したリストである。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【国際調査報告】
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