(57)【要約】皮膚充填剤および注射可能コラーゲン物質を滅菌する方法であって、これらの物質に悪影響を及ぼすことなく（すなわち、皮膚充填剤および注射可能コラーゲン物質が、最終滅菌の前後で同じ特性を保持する）活性な生物的汚染物質または病原体のレベルを低減させる方法が開発された。一実施形態において、放射線に感受性を有する皮膚充填剤または注射可能コラーゲン物質を滅菌するための方法は、上記充填剤および物質を放射線から保護する工程、ならびに上記充填剤または注射可能物質を滅菌するのに有効な時間および速度で適切な放射線量の放射線で、上記充填剤または物質を照射する工程を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン物質または皮膚充填剤を滅菌するための方法であって：
ａ）該コラーゲン物質または皮膚充填剤を凍結する工程、および
ｂ）該コラーゲン物質または皮膚充填剤を、有効量のγ放射線または電子ビーム放射線で照射して、該コラーゲン物質または皮膚充填剤の顕著な劣化を生ずることなく該コラーゲン物質または皮膚充填剤を滅菌する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記コラーゲン物質がコラーゲンである、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記コラーゲンが、組換えヒトコラーゲン、組織工学的に作製されたヒトベースコラーゲン、ブタコラーゲン、ヒト胎盤コラーゲン、ウシコラーゲン、自己コラーゲン、コラーゲン繊維およびヒト組織コラーゲンマトリックスからなる群より選択される、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、注射可能コラーゲン物質が、組換えヒトコラーゲンＩ型、組換えヒトコラーゲンＩＩ型または組換えヒトコラーゲンＩＩＩ型、単離ヒトベースコラーゲンＩ型調製物、単離ヒトベースコラーゲンＩＩＩ型、ブタコラーゲンＩ型、ブタコラーゲンＩＩＩ型、ヒトＩ型胎盤コラーゲン、ヒトＩＩ型胎盤コラーゲン、ヒトＩＩＩ型胎盤コラーゲンまたはヒトＩＶ型胎盤コラーゲン、ウシコラーゲンを含む可溶化エラスチンペプチド、グルタルアルデヒドで架橋したウシ皮膚コラーゲン、コラーゲン繊維、死体皮膚由来のヒト組織コラーゲンマトリックス、凍結乾燥し微粉化した無細胞ヒト死体皮膚、グロビン（ヘモグロビンのタンパク質部分）および培養自己繊維芽細胞からなる群より選択される、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記皮膚充填剤が、重合および架橋に応じて固体、ゲルまたは液体の形態の、ポリメチルメタクリレートの微小球懸濁液、デキストランビーズ懸濁液、ポリ乳酸、シリコーンポリマー、発砲ポリテトラフルオロエチレン、酢酸セルロース、エチレンビニルアルコール共重合体ポリアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アクリレート、アクリレート共重合体、およびポリアルキルアルカクリレートからなる群より選択され、該アルキルおよびアルキル基が６個以下の炭素原子を含む、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記コラーゲン物質または皮膚充填剤が、マンニトール、マンノース、アスコルビン酸、ヒアルロン酸、糖、多糖、ヒアルロン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸ナトリウムからなる群より選択される安定剤を更に含む、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記放射線が、電子ビーム照射である、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記放射線が、γ照射である、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記放射線の放射線量が、５ｋＧｙと１２ｋＧｙとの間である、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、前記凍結温度が、−８０℃である、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、生物的汚染物質または病原体を除去する工程を更に包含する、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、前記コラーゲン物質または皮膚充填剤が、照射後に１０−６ＳＡＬの無菌性保証レベル（ＳＡＬ）を達成する、方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２に記載のいずれかの方法による生成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００５年５月１９日に米国特許商標庁において出願された、米国特許出願第６０／６８２，５０７号の優先権を主張している。
【背景技術】
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、注射可能コラーゲン物質および皮膚充填剤を滅菌するための方法に関する。
【０００３】
（発明の背景）
活性化合物の化学的特性、物理的特性または生理学的特性が、しばしば化合物を取り囲む環境中の変化により著しく変更されるため、生物学的に活性な化合物を滅菌することがしばしば困難となっている。例えば、ｐＨ、イオン強度または温度の変化が、化合物の性質の可逆的または不可逆的変化をもたらし得る。
【０００４】
放射線滅菌は、高い浸透能力、比較的低い化学反応性、および温度、圧力、真空度または湿度を制御する必要性のない瞬時効果の利点を有する。放射線滅菌は、種々の製品に対し、工業において広く使用されており、線量レベルも放射線滅菌の生物学的効果もともに周知である。一般的に、電子ビーム滅菌およびγ滅菌は、微生物を殺すことに関して同様に有効であると認められている。放射線は、微生物を効果的に殺すには申し分ないが、一般的に、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の構造を変更し、生物学的に不活性にする。したがって、生物学的に活性な化合物の化学的特性、物理的特性または生理学的特性に有害な影響を及ぼすことなく、生物学的に活性な化合物を効果的かつ安全に滅菌するための簡単な方法に対する重大な必要性が依然として存在する。
【０００５】
ヒト用の多くの注射可能コラーゲン物質は、無菌プロセスにより調製され、最終滅菌を受けることができない。したがって、それらの注射可能コラーゲン物質は、好ましくない、潜在的に危険な生物的汚染物質または病原体（例えば、ウイルス、細菌（細胞間および細胞内細菌（例えば、マイコプラズマ、ウレアプラズマ、ナノバクテリア、クラミジア、リケッチア）を含む）、酵母菌、糸状菌、真菌、単細胞または多細胞寄生生物、および／または単独でまたは組み合わせて有害反応を引き起こし得る同様な病原体を含み得る。したがって、注射可能コラーゲン物質中の生物的汚染物質はいずれも、その生成物を使用する前に不活性化されることが最も重要である。この不活性化は、上記物質が患者に直接的に投与される場合に特に重要である。
【０００６】
注射可能コラーゲン物質を生成するための大抵の手順が、１種以上の特定の生物的汚染物質または病原体について出発物質をスクリーニングまたは試験する方法を含んでいた。生物的汚染物質または病原体の検査で陽性反応を示す物質は捨てられる。スクリーニング手順の例としては、出発物質（例えば、ヒト胎盤）中の特定のウイルスについての試験が挙げられる。その場合、製造プロセスは、初期原料からの汚染物質および／または病原体の除去もしくは不活性化の工程を包含しなければならない。
【０００７】
市販されているほとんどの注射可能コラーゲン生成物は、初期コラーゲン溶液の濾過などの手段により最初に滅菌し、次いで、完全な無菌条件下で加工される物質から作製される。このプロセスを用いて１０−６ＳＡＬの無菌性保証レベル（ＳＡＬ（ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  ａｓｓｕｒａｎｃｅ  ｌｅｖｅｌ））を達成するのは非常に困難である。γ線照射または電子ビーム（ｅ−ｂｅａｍ）照射を用いた結果ははるかに良くなるが、これらの方法を用いると、コラーゲン物質がしばしば害される。
【０００８】
上記で検討した困難を考慮すると、注射可能コラーゲン物質の望ましい性質に悪影響を及ぼすことなくこの物質を最終滅菌する方法に対する必要性が依然として存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の目的は、注射可能コラーゲン物質に悪影響を及ぼすことなく活性な生物的汚染物質または病原体のレベルを低減させることにより、この物質を滅菌する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の概要）
皮膚充填剤および注射可能コラーゲン物質を滅菌する方法であって、この物質に悪影響を及ぼすことなく（すなわち、皮膚充填剤および注射可能コラーゲン物質が、最終滅菌の前後で同じ特性を保持する）活性な生物的汚染物質または病原体のレベルを低減させる方法が開発された。一実施形態において、放射線に感受性を有する皮膚充填剤または注射可能コラーゲン物質を滅菌するための方法は、上記充填剤または物質を放射線から保護する工程、ならびに上記充填剤または注射可能物質を滅菌するのに有効な時間および速度で適切な放射線量の放射線で上記充填剤または物質に照射する工程を包含する。好ましい実施形態において、放射線に感受性を有する皮膚充填剤または注射可能コラーゲン物質を滅菌するための方法は、ａ）上記充填剤または物質をその凍結温度以下（一般的には０℃以下）の温度で凍結する工程、およびｂ）上記充填剤または物質を滅菌するのに有効な時間の間、有効な速度で適切な放射線量の放射線で上記充填剤または物質に照射する工程を包含する。この放射線曝露は、上記充填剤または物質の密度に応じて異なるが、好ましくは、５ｋＧｙと１２ｋＧｙとの間であり、より好ましくは、６ｋＧｙと８ｋＧｙとの間である。これらの放射線量は、上記充填剤または物質に対して１０−６ＳＡＬの無菌性保証レベル（ＳＡＬ）をもたらす。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（発明の詳細な説明）
（皮膚充填剤および注射可能コラーゲン）
本明細書中で一般的に使用される場合、「注射可能コラーゲン」としては、均質または不均質なコラーゲンのペースト、ゲル、溶液または懸濁液であって、注射器、チューブ、または細針またはノズルを通じてコラーゲンを押し出すように設計され、適切なプランジャーまたはシステムを備えた他の容器に含まれるものが挙げられるが、これらに限定されない。この注射可能コラーゲンは、注射、トロカールを通じた外科的適用、または創面上への直接的適用に向けて設計されている。
【００１２】
代表的なコラーゲン物質としては、組み換えヒトコラーゲン、組織工学的に作製されたヒトベースコラーゲン（ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｈｕｍａｎ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ）、ブタコラーゲン、ヒト胎盤コラーゲン、ウシコラーゲン、自己コラーゲン、コラーゲン繊維およびヒト組織コラーゲンマトリックスが挙げられる。適切な種類の皮膚充填剤および注射可能コラーゲン物質としては、組み換えヒトコラーゲンＩ型、組み換えヒトコラーゲンＩＩＩ型、組織工学的に作製されたヒトベースコラーゲンＩ型、ブタコラーゲンＩ型、ブタコラーゲンＩＩＩ型、ヒトＩ型胎盤コラーゲン、ヒトＩＩ型胎盤コラーゲン、ヒトＩＩＩ型胎盤コラーゲンまたはヒトＩＶ型胎盤コラーゲンであって、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）中２％濃度で中性ｐＨのもの、ウシコラーゲンを含む可溶化エラスチンペプチド、ならびにコラーゲンインプラントであるＺｙｄｅｒｍ（登録商標）Ｉ、Ｚｙｄｅｒｍ（登録商標）ＩＩ、およびＺｙｐｌａｓｔ（登録商標）を含むウシコラーゲンが挙げられるが、これらに限定されない。Ｚｙｄｅｒｍ  Ｉは、９５％〜９８％のＩ型コラーゲンを含み、その残りとしてＩＩＩ型コラーゲンを含む。Ｚｙｄｅｒｍ  Ｉはまた、０．３％のリドカインを含む。Ｚｙｄｅｒｍ  Ｉは、生理的リン酸緩衝塩化ナトリウム溶液に懸濁させた３．５重量％のウシ皮膚コラーゲンである。Ｚｙｄｅｒｍ  ＩＩは、６．５重量％のウシ皮膚コラーゲンであることを除き、Ｚｙｄｅｒｍ  Ｉと同一である。Ｚｙｐｌａｓｔは、格子およびより粘度の高い化合物を形成するためにグルタルアルデヒドで架橋させた３．５％のウシ皮膚コラーゲンである。
【００１３】
他の皮膚充填剤および注射可能コラーゲン物質としては、ウシコラーゲン中に懸濁させたポリメチルメタクリレートの微小球、患者の組織から調製されたコラーゲン繊維、マトリックスタンパク質（例えば、エラスチンおよび基質成分）を含有する中性ｐＨ緩衝剤中に懸濁させた死体皮膚由来のヒト組織コラーゲンマトリックス、凍結乾燥して微粉化した無細胞ヒト死体皮膚、グロビン（ヘモグロビンのタンパク質部分）および培養自己繊維芽細胞が挙げられる。非動物由来の物質としては、非動物由来のｈｙｌａｎ  ｇｅｌ中に懸濁させたデキストランビーズ、ポリ乳酸、重合および架橋に応じて固体、ゲルまたは液体の形態の人工ポリマーでできたシリコーン、顔面形成外科および顔面再建手術用のシート形態、細長片（ｓｔｒｉｐ）形態およびチューブ形態の拡張ポリテトラフルオロエチレン（ｅ−ＰＴＦＥ）が挙げられる。皮膚充填剤としては、Ｇｒｅｆｆ，ｅｔ  ａｌ．による米国特許第６，２３１，６１３号に開示された軟組織増大のための組成物も挙げられ、これらは、約１５％未満の平衡含水量を有するポリマーである。例示的なポリマーとしては、酢酸セルロース、エチレンビニルアルコール共重合体ポリアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）アクリレート、アクリレート共重合体、およびポリアルキルアルカクリレート（ｐｏｌｙａｌｋｙｌ  ａｌｋａｃｒｙｌａｔｅ）であって、アルキルおよびアルキル基が６個以下の炭素原子を含むものが挙げられる。
【００１４】
（コラーゲン物質の滅菌のための方法）
皮膚充填剤および注射可能コラーゲン物質を、この物質に悪影響を及ぼすことなく活性生物的汚染物質または病原体のレベルを低減させることにより滅菌する方法が開発された。皮膚充填剤および注射可能コラーゲン物質を、γ放射線または電子ビーム放射線を用いて、コラーゲンの生理学的特性に顕著な影響を及ぼすことなく除染または滅菌し得る。この混合物は、混合物内に存在する病原であるあらゆる微生物、ウイルスおよびそれらのポリヌクレオチドフラグメント、ＤＮＡまたはＲＮＡ（一本鎖であるか二本鎖であるかに関わらない）を不活性化する条件下で照射される。
【００１５】
γ線または電子ビーム放射線は、充填剤または物質の密度により異なるが、少なくとも５ｋＧｙであることが好ましい。１２ｋＧｙを超える照射は、充填剤または物質が害され得るため好ましくない。最も好ましい曝露は、約６ｋＧｙと８ｋＧｙとの間である。
【００１６】
放射線に感受性を有する皮膚充填剤または注射可能コラーゲン物質を、放射線から保護するために処理し、次いで、充填剤または注射可能物質を滅菌するのに有効な時間および速度で照射する。好ましい実施形態において、放射線に感受性を有する皮膚充填剤または注射可能コラーゲン物質は、まず、凍結温度以下の温度（一般的には０℃以下）で凍結され、上記充填剤またはコラーゲン物質を滅菌するのに有効な時間の間、有効な速度で適切な放射線で照射される。代替的な実施形態において、凍結防止剤および／またはマンニトール、マンノース、アスコルビン酸、ヒアルロン酸、または他の糖もしくは多糖といった安定剤が、凍結する前の初期のコラーゲン物質に加えられる。これらの保護剤は、凍結しない場合に十分であるということも、照射からの顕著な保護を得るのに必要であるということもないが、好都合であり得る。
【００１７】
照射された皮膚充填剤またはコラーゲン物質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動および／または示差走査熱量測定により分析されて、最適な照射条件を選択し得、コラーゲン分子の保存された特性を証明し得る。本明細書中で使用される場合、顕著な被害がないということは、２５％未満、より好ましくは１５％以下のコラーゲン物質または皮膚充填剤しか、悪化または劣化されないことを意味する。
【００１８】
適切な注射可能コラーゲン生成物は、均質または不均質なコラーゲンのペースト、ゲル、溶液または懸濁液であって、細針またはノズルを通じてコラーゲン内容物を押し出すように設計され、注射器、チューブ、または適切なプランジャーまたはシステムを備えた他の容器に含まれているものが挙げられるが、これらに限定されない。この注射可能コラーゲンは、注射、トロカールを通じた外科的適用、または創面上への直接的適用に向けて設計されている。本明細書中に記載される方法に従えば、コラーゲンのペースト、ゲル、溶液または懸濁液は、最終滅菌の前後で同じ流動性を保つ。
【００１９】
上記皮膚充填剤およびコラーゲン物質は、一旦滅菌されると、治療奉仕者により使用されるまで無菌環境中に維持される。例示的な容器としては、小瓶、皿、小袋、広口瓶、注射器などが挙げられる。この容器は、γ線と電子ビームとの両方に対して透明であることが好ましい。
【００２０】
上記の方法は、以下の非限定的な実施例を参照して、さらに理解される。
【実施例】
【００２１】
（実施例１．２５ｋＧｙでの照射に曝露した注射可能コラーゲン生成物のＨｕｍａｌｌａｇｅｎ）
（材料および方法）
０．３％〜０．５％のヒトＩ＋ＩＩＩ型コラーゲン溶液を、ｐＨ３（５未満）にて調製し、０．４５μｍの多孔膜に通して濾過し、次いで、クラス１０００の清潔な部屋において層流フード下で処理した。濾過した溶液中に、バクテリアを検出し得なかった。２０ｍＭのリン酸ナトリウムの添加により、室温にてｐＨ７．２で、コラーゲンを沈殿させた。密閉した無菌のバケツに入れ、遠心分離によりコラーゲンペーストを得た。次いで、この６％の濃縮コラーゲンペーストを洗浄し、無菌のリン酸緩衝生理溶液（ＰＢＳ）で３．５％に希釈した。無菌の１ｍｌ注射器を、最終コラーゲンペーストで満たした。＋４℃での１週間の保管後、ドライアイス中で約−８０℃に凍結する前に、各注射器を最後の小袋に詰め、密封した。ポリスチレン製の断熱された箱に入れ、注射器の各層を１インチ厚のドライアイス層で覆った。最終包装の全高は、１５インチ未満であり、γ照射まで−２０℃にて、またはドライアイス内で保管した。γ照射を２４時間未満の間、室温にて実施した。照射線量は、＞２５ｋＧｒａｙであった。照射後に、一部のドライアイスは依然として包装内に存在しており、注射器は依然として凍結していた。解凍後、注射器を調べた。注射器は害されておらず、試験される前の１週間の間、これらの注射器を室温にて保管した。当業者に周知の硫酸ドデシルナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）手順を用いてコラーゲンペーストを試験した。
【００２２】
（結果および考察）
コラーゲンペーストを含む注射器の照射後、ガラス製注射器の色が淡褐色に変化した。注射器の中身は、水相とコラーゲンの塊との間に顕著な相分離はなく、均質に見えた。この中身を細い規格針を通じて押し出し得た。
【００２３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により決定されるように、コラーゲン分子を２５ｋＧｙでのγ線照射の間、凍結状態により顕著に保護されている。物質全体の約１５％であるごく少量の物質が劣化した。
【００２４】
ＤＳＣ（示差走査熱量測定法）を用いてコラーゲン物質を評価した。再構成された繊維性コラーゲン調製物は、不均質な繊維集団を含み、非繊維性状態の分子を含む可能性がある。繊維性クラスは、充填順序（ｐａｃｋｉｎｇ  ｏｒｄｅｒ）、コラーゲン濃度、繊維幅および架橋レベルが互いに異なる３種類以上の区分された種および区分されていない種を代表し得る。繊維性コラーゲン生成物の多様な融解吸熱は、各々異なる融解温度を有する分子クラスおよび繊維クラスを順次融解することによるものである。３６℃以下におけるピークは、変性したコラーゲンが存在すること示す。３６℃〜４０℃における小さな肩（ｓｈｏｕｌｄｅｒ）は、縮んだかまたは傷ついたコラーゲンの螺旋構造、劣化しているが変性していないコラーゲン分子を示している可能性が高い。非繊維性コラーゲンまたは細かいコラーゲン繊維物質は、４０℃〜４５℃にて融解し、大きい繊維性コラーゲンクラスは、４５℃より高い温度で融解する。
【００２５】
【表１】
2008545461.tif 000002
表１は、非照射の注射可能コラーゲン（Ｈｕｍａｌｌａｇｅｎ）およびドライアイス中にて２５ｋＧｙで照射した注射可能コラーゲン（Ｈｕｍａｌｌａｇｅｎ）の両方について、３６℃以下におけるピークが存在しないことを示している。このことは、非照射サンプル中には変性した物質が存在しないことを示している。表１はまた、照射プロセス中に生じた変性物質がないことを示している。非照射の注射可能コラーゲン（Ｈｕｍａｌｌａｇｅｎ）と比較すると、３６℃〜４０℃において、わずかに大きな肩が、照射した注射可能コラーゲン（Ｈｕｍａｌｌａｇｅｎ）について存在した。このことは、顕著な量の劣化物質は、照射中に生じなかったことを示している。非照射の注射可能コラーゲン（Ｈｕｍａｌｌａｇｅｎ）と比較すると、４０℃〜４５℃において、わずかに大きな面積が、照射した注射可能コラーゲン（Ｈｕｍａｌｌａｇｅｎ）について存在した。このことは、照射した注射可能コラーゲン中に、顕著な量の非繊維性コラーゲンまたは細かいコラーゲン繊維物質が存在しないことを示している。非照射の注射可能コラーゲン（Ｈｕｍａｌｌａｇｅｎ）の主要融解温度５１．３７３℃と照射した注射可能コラーゲン（Ｈｕｍａｌｌａｇｅｎ）の主要融解温度４６．４７３℃との間に差異がある。このことは、コラーゲン繊維クラスの移動があることを示している。生成物の効力に対するこの移動の影響は不明であるが、この融解温度の移動は、ドライアイス中にて２５ｋＧｙの放射線量での照射後のこの物質の性質に関する顕著な変化を明示している。このデータは、２５ｋＧｙの放射線量での照射により最適な注射可能コラーゲン生成物（Ｈｕｍａｌｌａｇｅｎ）が得られないことを明示している。
【００２６】
（実施例２．６ｋＧｙおよび１２ｋＧｙでの照射により滅菌される注射可能コラーゲン生成物のＨｕｍａｌｌａｇｅｎ）
（材料および方法）
第１の実施例と同様に、３ｍｇ／ｍｌのコラーゲン溶液から開始し、０．４５μｍのフィルターに通して濾過し、注射可能コラーゲン物質に再構成し、更に安定剤を含む注射可能コラーゲン生成物または安定剤を含まない注射可能コラーゲン生成物の小バッチを作成した。１％のヒアルロン酸ナトリウム、１０ｍＭのマンノースまたは１０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを安定剤として含む生成物を別々に調製した。これらの材料を１ｃｃのガラス製注射器内に充填し、次いで、実施例１と同様にドライアイス中において、６ｋＧｙ、１２ｋＧｙおよび３０ｋＧｙで照射した。コラーゲン分子を照射被害から保護するための凍結の具体的な有益な効果を示すために、凍結を除いた平行実験を、全ての同じサンプルについて実施した。実施例１に記載される方法と同じ方法を使用した。
【００２７】
（結果および検討）
実施例１と同様に、ガラス製注射器の色が、全照射線量において淡褐色に変化した。注射器の中身は、全照射線量における全サンプルについて、水相とコラーゲンの塊との間に顕著な相分離はなく、均質に見えた。全サンプルの中身を、細い規格針を通じて押し出し得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥデータは、３０ｋＧｙにおけるγ線照射の間、コラーゲン分子が凍結状態により顕著に保護されたことを明らかにした。全コラーゲン物質のうちの約１５％のみが劣化した。最適な結果が、５ｋＧｙまたは１２ｋＧｙの放射線量において示された。これらの放射線量でのサンプルの劣化は、照射していないコントロールサンプルと同等であった。安定剤の添加は、いくらかの更なる保護を与えるが、顕著なものではなかった。
【００２８】
【表２】
2008545461.tif 000003
このコラーゲンサンプルのＤＳＣ分析は、コントロールおよび処理サンプルの両方について、３６℃以下におけるピークが存在しないことを見出した。このことは、照射プロセスの間に変性した物質が生じないことを明示している。コントロールサンプルと比較すると、処理サンプルについて、３６℃〜４０℃において僅かに大きな肩が観察された。このことは、全ての放射線量において、照射の間、いくらかの劣化した物質が生じたことを示している。コントロールサンプルと比較すると、処理サンプルについて、４０℃〜４５℃において僅かに大きな面積が観察された。このことは、いくらかの非繊維性コラーゲンまたは細かい繊維物質が、照射したサンプル全てに存在することを示している。処理した群に関し、ドライアイス中において６ｋＧｙで照射した注射可能コラーゲン物質、ドライアイス中において６ｋＧｙで照射した１％のヒアルロン酸ナトリウムを含む注射可能コラーゲン、およびドライアイス中において６ｋＧｙで照射した１０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを含む注射可能コラーゲンが、この物質の全ての所望の特性を保持する無菌コラーゲン物質をもたらした。これらのサンプルの主要ピークは、コントロールサンプルの主要ピークと同様に＞５０℃である。このことは、これらのサンプルにおいて、顕著なコラーゲン繊維クラスの移動がないことを示している。このデータは、ドライアイス中において６ｋＧｙで照射された注射可能コラーゲン、ドライアイス中において６ｋＧｙで照射された１％のヒアルロン酸ナトリウムを含む注射可能コラーゲン、およびドライアイス中において６ｋＧｙで照射された１０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを含む注射可能コラーゲンが注射可能コラーゲン生成物（例えば、Ｈｕｍａｌｌａｇｅｎ）を滅菌するのに望ましい条件であることを明示している。ドライアイス中において１２ｋＧｙで照射された注射可能コラーゲンは、４７．１８０℃の融解温度の主要ピークを有する。この融解温度は、コントロールサンプルの融解温度の主要ピーク５０．６４９℃より３．４６９℃低く、融解温度として受容可能な範囲の限界である。
【００２９】
凍結がない場合、３種の放射線量で照射した全てのサンプルが、顕著に害された。全ての注射器内で２相がはっきりと分離した。コラーゲンゲルは縮み、水層の流体により取り囲まれた。大型の針を用いても、注射器からこのコラーゲンゲルを押し出すことは不可能であった。ＳＤＳ電気泳動法およびＤＳＣデータは、コラーゲン分子の顕著な変化を明示している。
【００３０】
（実施例３．６ｋＧｙおよび８ｋＧｙでの照射により滅菌される注射可能コラーゲン生成物のＨｕｍａｌｌａｇｅｎ）
注射可能コラーゲン生成物（Ｈｕｍａｌｌａｇｅｎ）を、ドライアイス中において６ｋＧｙおよび８ｋＧｙで照射した。非凍結で非照射のサンプルを、コントロールとして使用した。実施例１に記載される方法と同じ方法が使用された。
【００３１】
実施例１および２と同様に、照射後に、ガラス製注射器の色が淡褐色に変化した。注射器の中身は、全サンプルについて、水相とコラーゲンの塊との間に顕著な相分離はなく、均質に見えた。この中身を３０ｇの針を通じて押し出し得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により判定される通り、コラーゲン分子は、γ照射の間、凍結状態により顕著に保護された。このデータは、６ｋＧｙ〜８ｋＧｙの照射により劣化した物質が、コラーゲンサンプル中に生じないことを明示している。
【００３２】
【表３】
2008545461.tif 000004
ＤＳＣデータは、コントロールサンプルおよび処理サンプルの両方について、３６℃以下におけるピークが存在しないことを示している。このことは、照射プロセスの間に変性した物質が生じなかったことを示している。コントロールサンプルと比較すると、全ての処理サンプルについて、３６℃〜４０℃において僅かに大きな肩が観察された。このことは、照射の間にいくらかの変性した物質が生じたことを示している。コントロールサンプルと比較すると、処理サンプルについて、４０℃〜４５℃において僅かに大きな面積が観察された。このことは、いくらかの非繊維性コラーゲンまたは細かい繊維物質が、照射した全てのサンプル中に存在することを示している。６ｋＧｙで照射されたサンプルの主要なピークは４９．３０７℃であり、コントロールの５０．４６２℃よりも、僅かに１．１５５℃低い。これは顕著ではない。ドライアイス中において８ｋＧｙで照射した注射可能コラーゲン（Ｈｕｍａｌｌａｇｅｎ）についての主要ピークは、４８．７８０℃であり、コントロールの５０．４６２℃よりも僅かに１．６８２℃低い。これは顕著ではない。このデータは、両方の照射したサンプルにおいて、顕著なコラーゲン繊維クラスの移動がないことを示している。したがって、ドライアイス中における６ｋＧｙまたは８ｋＧｙでの照射は、悪影響なく、注射可能コラーゲン生成物の滅菌をもたらす。
【国際調査報告】
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