(57)【要約】本発明は、急性期血清アミロイドタンパク質Ａ（Ａ−ＳＡＡ）が肥満症及び特定の異常状態のバイオマーカーであることの発見に関する。従って、本発明は、被験者の肥満症又は異常状態を診断する方法を提供する。また、本発明は、被験者の肥満症又は異常状態の進行度を監視する方法も提供する。本発明は、肥満度又は異常状態の治療であって、それを必要とする患者の活性ＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２のレベルを減少させることを含む治療にも関する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
肥満症を診断する方法であって、
ａ）血清アミロイドＡ１（ＳＡＡ１）及び血清アミロイドＡ２（ＳＡＡ２）からなる群から選択される少なくとも１種類のバイオマーカーのサンプル中のレベルを測定することと、
ｂ）前記少なくとも１種類のバイオマーカーの測定レベルと前記少なくとも１種類のバイオマーカーの正常レベルとを比較することと、
ｃ）前記少なくとも１種類のバイオマーカーの測定レベルと前記少なくとも１種類のバイオマーカーの正常レベルとの差を求めることと、を含み、
前記少なくとも１種類のバイオマーカーの測定レベルと前記少なくとも１種類のバイオマーカーの正常レベルとの差が、肥満症を示す方法。
【請求項２】
前記少なくとも１種類のバイオマーカーがＳＡＡ１である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１種類のバイオマーカーがＳＡＡ２である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＳＡＡ１及びＳＡＡ２の双方が測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルが、全血、プラズマ、血清、大網脂肪組織、皮下脂肪組織、及び肝組織からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが血清である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＳＡＡ１及びＳＡＡ２を測定することは、核酸を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＳＡＡ１及びＳＡＡ２を測定することは、ポリペプチドを測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＳＡＡ１及びＳＡＡ２を測定することは、タンパク質活性を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記肥満症が、炎症性又は非炎症性のいずれかの肥満症である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
異常状態を診断する方法であって、
ａ）被験者からの血清アミロイドＡ１（ＳＡＡ１）及び血清アミロイドＡ２（ＳＡＡ２）からなる群から選択される少なくとも１種類のバイオマーカーのレベルを測定することと、
ｂ）前記少なくとも１種類のバイオマーカーの測定レベルと前記少なくとも１種類のバイオマーカーの正常レベルとを比較することと、
ｃ）前記少なくとも１種類のバイオマーカーの測定レベルと前記少なくとも１種類のバイオマーカーの正常レベルとの差を求めることと、を含み、
前記少なくとも１種類のバイオマーカーの測定レベルと前記少なくとも１種類のバイオマーカーの正常レベルとの差が、異常状態の存在を示す方法。
【請求項１２】
前記異常状態が、糖尿病、高血圧、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症炎症、及び感染症からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１種類のバイオマーカーがＳＡＡ１である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１種類のバイオマーカーがＳＡＡ２である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
ＳＡＡ１及びＳＡＡ２の双方が測定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記サンプルが、全血、プラズマ、血清、大網脂肪組織、皮下脂肪組織、及び肝組織からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルが血清である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＳＡＡ１及びＳＡＡ２を測定することは、核酸を測定することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＳＡＡ１及びＳＡＡ２を測定することは、ポリペプチドを測定することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＳＡＡ１及びＳＡＡ２を測定することは、タンパク質活性を測定することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
病状の進行度を監視する方法であって、
ａ）血清アミロイドＡ１（ＳＡＡ１）及び血清アミロイドＡ２（ＳＡＡ２）からなる群から選択される少なくとも１種類のバイオマーカーのレベルを第１の時点及び第２の時点において測定することと、
ｂ）前記少なくとも１種類のバイオマーカーの前記第１の時点の測定レベルと前記少なくとも１種類のバイオマーカーの前記第２の時点の測定レベルとを比較することと、
ｃ）前記少なくとも１種類のバイオマーカーの前記第１の時点の測定レベルと前記第２の時点の測定レベルとの差を求めることと、を含み、
前記少なくとも１種類のバイオマーカーの前記第１の時点の測定レベルと前記第２の時点の測定レベルとの差が、異常状態の進行度を示す方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１種類のバイオマーカーがＳＡＡ１である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１種類のバイオマーカーがＳＡＡ２である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
ＳＡＡ１及びＳＡＡ２の双方が測定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記サンプルが、全血、プラズマ、血清、大網脂肪組織、皮下脂肪組織、及び肝組織からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記サンプルが血清である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＳＡＡ１及びＳＡＡ２を測定することは、核酸を測定することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＳＡＡ１及びＳＡＡ２を測定することは、ポリペプチドを測定することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＳＡＡ１及びＳＡＡ２を測定することは、タンパク質活性を測定することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
肥満症の治療を必要とする患者の前記肥満症を治療する方法であって、血清アミロイドＡ１（ＳＡＡ１）及び血清アミロイドＡ２（ＳＡＡ２）からなる群から選択される少なくとも１種類のポリペプチドの前記患者における活性レベルを減少させることを含む方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１種類のバイオマーカーがＳＡＡ１である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１種類のバイオマーカーがＳＡＡ２である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ＳＡＡ１及びＳＡＡ２の双方の活性レベルが減少する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
異常状態の治療を必要とする患者の前記異常状態を治療する方法であって、血清アミロイドＡ１（ＳＡＡ１）及び血清アミロイドＡ２（ＳＡＡ２）からなる群から選択される少なくとも１種類のポリペプチドの前記患者における活性レベルを減少させることを含む方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１種類のバイオマーカーがＳＡＡ１である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも１種類のバイオマーカーがＳＡＡ２である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
ＳＡＡ１及びＳＡＡ２の双方の活性レベルが減少する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記異常状態が、糖尿病、高血圧、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、及び高コレステロール血症炎症からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
異常状態を治療されている被験者の前記異常状態を治療するための治療計画の効果を評価する方法であって、
ａ）血清アミロイドＡ１（ＳＡＡ１）及び血清アミロイドＡ２（ＳＡＡ２）からなる群から選択される少なくとも１種類のバイオマーカーのレベルを第１の時点及び第２の時点において測定することと、
ｂ）前記少なくとも１種類のバイオマーカーの前記第１の時点の測定レベルと前記少なくとも１種類のバイオマーカーの前記第２の時点の測定レベルとを比較することと、
ｃ）前記少なくとも１種類のバイオマーカーの前記第１の時点の測定レベルと前記第２の時点の測定レベルとの差を求めることと、を含み、
前記少なくとも１種類のバイオマーカーの前記第１の時点の測定レベルと前記第２の時点の測定レベルとの差が、前記治療の効果を示す方法。
【請求項４０】
前記異常状態が、糖尿病、高血圧、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、及び高コレステロール血症炎症からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
肥満症の段階を判定する方法であって、
ａ）血清アミロイドＡ１（ＳＡＡ１）及び血清アミロイドＡ２（ＳＡＡ２）からなる群から選択される少なくとも１種類のバイオマーカーのサンプル中のレベルを測定することと、
ｂ）前記少なくとも１種類のバイオマーカーの測定レベルが属する前記少なくとも１種類のバイオマーカーの予め段階判定されたレベルを判定することと、を含み、
前記バイオマーカーの予め段階判定されたレベルが、肥満症の段階を分類するために用いられる方法。
【請求項４２】
前記肥満症の段階が、炎症性又は非炎症性のいずれかの肥満症である、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
米国国立衛生研究所から助成された米国政府国債（助成金番号、ＨＬ／ＤＫ６２０９３及びＨＬ／ＤＫ５７８３５）を有用して本発明の開発中において実施された研究の一部である。米国政府は、本発明の特定の権利を所有する。本発明は、急性期血清アミロイドタンパク質Ａ（Ａ−ＳＡＡ）が肥満症及び特定の異常状態のバイオマーカーであることの発見に関連する。
【０００２】
従って、本発明は、被験者の肥満症又は異常状態を診断する方法であって、血清アミロイドＡタンパク質１（ＳＡＡ１）及び／又は血清アミロイドＡタンパク質２（ＳＡＡ２）のレベルを測定することと、これらの測定されたレベルとＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２の許容される正常レベルとを各々比較することと、を含み、被験者の測定レベルと正常レベルとの差は、被験者の肥満症又は肥満状態の存在を示す方法を提供する。また、本発明は、被験者の肥満症又は異常状態の進行度を監視する方法であって、異なる２時点において被験者の血清アミロイドＡタンパク質１（ＳＡＡ１）及び／又は血清アミロイドＡタンパク質２（ＳＡＡ２）のレベルを測定することと、これら２時点の測定レベルを比較して、ＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２の経時レベルの差を求めることと、を含み、経時レベルの差は、患者の肥満症又は肥満状態の進行度又は退行度を示す方法を提供する。本発明は、肥満度又は異常状態を治療することに関連し、それを必要とする患者の活性ＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２のレベルを減少させることを含む。
【背景技術】
【０００３】
現在、１０億人を超えるアメリカ人が過体重又は肥満として分類され、米国だけでも年間少なくとも３００，０００人が肥満により死亡している。肥満症は、遺伝的要素が強い慢性疾患と考えられる。更に、肥満症は、限定されるものではないが、高血圧、２型糖尿病、心疾患、脳卒中、胆嚢疾患及び数種の癌等の症状を発症するリスクを高めるおそれがある。
【０００４】
低悪性度の慢性炎症が肥満症に関連している多くの証拠が存在し、この慢性炎症状態には、肥満症、２型糖尿病、異脂肪血症、及びアテローム性動脈硬化症等を含むメタボリック症候群の重要な媒介因子であり得る（Ｘｕ  Ｈら，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１２：１８２１−１８３０  （２００３）；Ｗｅｉｓｂｅｒｇ  ＳＰら、Ｊ  ＣＩｍ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１２：１７９６−１８０８  （２００３）；Ｌｅｈｒｋｅ  Ｍら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １０：１２６−１２７  （２００４）；Ｒｅａｖｅｎ  Ｐ，  Ｊ  Ｉｎｓｕｒ  Ｍｅｄ  ３６：１３２−１４２  （２００４）；Ｙｕｄｋｉｎ  ＪＳ，  ＩｎｔＪＯｂｅｓ  ＲｅｌａｔＭｅｔａｂ  Ｄｉｓｏｒｄｌｌ  Ｓｕｐｐｌ  ３：  Ｓ２５−２８  （２００３）；Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＭＩら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  ４１：１１２０−１１３０  （２００３）、全て引用することにより本願明細書の一部とする）。実際、肥満症における機能不全に陥った大量の脂肪組織は、従来、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）及び単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）を含む炎症性因子、並びに易血栓性因子プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤−１（ＰＡＩ−１）とみなされるいくつかの因子の供給源である。
【０００５】
他方、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、α−１アンチトリプシン、α１−アンチキモトリプシン、α１−アンチマクログロブリン、フィブリノーゲン、プロトロンビン、因子ＶＩＩＩ、フォン・ウィルブランド因子、プラスミノーゲン及び血清アミロイドＡタンパク質（ＳＡＡ）等の急性期タンパク質は、急性炎症及び外傷に応答して血清中で劇増加するが、慢性炎症はこれら急性期反応物の多くの血中レベルにおいて軽度の増加しか示さない。しかしながら、集団研究では、これらいくつかの急性期反応物の血中レベルは心血管リスクの指標となる。
【０００６】
急性期タンパク質のうち、ＳＡＡは、慢性炎症及び急性炎症に実質的に関連し、主要な脊椎動物において保存されている４つの遺伝子（ＳＡＡ１〜４）からなる多重遺伝子タンパク質ファミリーである（Ｓｅｌｌａｒ  ＧＣら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １９：２２１−２２７  （１９９４）参照）。ヒトでは、これら４つの遺伝子のうち３つ（ＳＡＡ１、２及び４）だけが発現する（Ｋｌｕｖｅ−Ｂｅｃｋｅｒｍａｎ  Ｂら、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０：６５１−６６１  （１９９１）参照）。急性炎症の刺激に応答し、血漿中のＳＡＡ１及びＳＡＡ２のレベルは、約５〜６時間の間に約１０００倍もの増殖を示すことがあるが（Ｃａｂａｎａ  ＶＧら、Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ３０：３９−４９  （１９８９））、ＳＡＡ４はわずかに調節されるのみである（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  ＡＳら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７：３８６２−３８６７  （１９９２））。従って、ＳＡＡ１及びＳＡＡ２は、急性期ＳＡＡ（Ａ−ＳＡＡ）と総称され、ＳＡＡ４は構造ＳＡＡ（Ｃ−ＳＡＡ）と呼ばれる。
【０００７】
ＳＡＡは炎症に関与し、リポ多糖類（ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−６及びＩＬ−８等の多くの炎症性の刺激によって生じる（Ｈａｇｉｈａｒａ  Ｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３１４：３６３−３６９  （２００４）；Ｂｏｐｓｔ  Ｍら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８：４１３０−４１３７  （１９９８）参照）。更に、ＳＡＡは、好中球におけるＴＮＦα、ＩＬ−６及びＩＬ−８の遺伝子の発現又は放出を刺激するタンパク質である（Ｆｕｒｌａｎｅｔｏ  ＣＪら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２６８：４０５−４０８  （２０００）；Ｈａｔａｎａｋａ  Ｅら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ９１：３３−３７  （２００４）；Ｒｉｂｅｉｒｏ  ＦＰら、Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  Ｉｎｆｌａｍｍ  １２：１７３−１７８  （２００３）参照）。
【０００８】
従って、本発明は、肥満症の被験者及びそれに関連する異常状態を診断、監視、及び治療するためのＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２のレベルに焦点を合わせる方法及び組成物を提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、急性期血清アミロイドタンパク質Ａ（Ａ−ＳＡＡ）が肥満症及び特定の異常状態のバイオマーカーであることの発見に関連する。従って、本発明は、被験者の肥満症を診断する方法であって、血清アミロイドＡタンパク質１（ＳＡＡ１）及び／又は血清アミロイドＡタンパク質２（ＳＡＡ２）のレベルを測定することと、これらの測定されたレベルとＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２の許容される正常レベルとを各々比較することと、を含み、被験者の測定レベルと正常レベルとの差は、被験者の肥満症を示す方法を提供する。
【００１０】
また、本発明は、被験者の異常状態を診断する方法であって、血清アミロイドＡタンパク質１（ＳＡＡ１）及び／又は血清アミロイドＡタンパク質２（ＳＡＡ２）のレベルを測定することと、これらの測定されたレベルとＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２の許容される正常レベルとを各々比較することと、を含み、被験者の測定レベルと正常レベルとの差は、被験者の異常状態の存在を示す方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、被験者の肥満症又は異常状態の進行度を監視する方法であって、異なる２時点において被験者の血清アミロイドＡタンパク質１（ＳＡＡ１）及び／又は血清アミロイドＡタンパク質２（ＳＡＡ２）のレベルを測定することと、これら２時点の測定レベルを比較して、ＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２の経時レベルの差を求めることと、を含み、経時レベルの差は、患者の肥満症又は肥満状態の進行度又は退行度を示す方法を提供する。
【００１２】
本発明は、肥満度及び／又は異常状態を治療することに関連し、それを必要とする患者の活性ＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２のレベルを減少させることを含む。
【００１３】
また、本発明は、様々な診断及び本願明細書に記載される治療方法に使用できる抗体等の組成物に関連する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
血清アミロイドＡ（ＳＡＡは、急性期タンパク質の一種であり、血清中のレベルは、急性炎症及び急性外傷に応答して激増する。肝臓は、過剰肝臓発現が報告されているが、ＳＡＡ産生の主要源である。本願において、発明者らは、ヒトの急性期ＳＡＡ（Ａ−ＳＡＡ）、つまりＳＡＡ１及びＳＡＡ２は、脂肪組織中で主に発現することを開示及び教示している。ヒトの脂肪組織特異的発現は、Ａ−ＳＡＡが肝臓で主に発現するマウスと極めて異なる。更に、本願明細書で記述されるような相対的に極めて豊富なヒト脂肪組織中のＡ−ＳＡＡ  ｍＲＮＡは、脂肪細胞が、肝臓、筋肉、免疫系の細胞、及び血管系への全身的な影響を与える炎症要因の重要源であるのみならず、局所的な脂肪代謝への重要な影響であるという進化概念を支持している。
【００１５】
従って、本発明は、被験者の肥満症を診断する方法であって、血清アミロイドＡタンパク質１（ＳＡＡ１）及び／又は血清アミロイドＡタンパク質２（ＳＡＡ２）のレベルを測定することと、これらの測定されたレベルとＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２の許容される正常レベルとを各々比較することと、を含み、被験者の測定レベルと正常レベルとの差は、被験者の肥満症の存在を示す方法を提供する。本願明細書で用いられる「急性期血清アミロイドＡタンパク質（Ａ−ＳＡＡ）」という用語は、ＳＡＡ１及びＳＡＡ２の組合せを意味する。例えば、Ａ−ＳＡＡに結合する抗体とは、ＳＡＡ１及びＳＡＡ２の双方に結合し、その２種類のタンパク質を区別しないことを指す。本願明細書で用いられる「患者」及び「被験者」という用語は同義である。特に、被験者は、哺乳類、例えば、限定されるものではないが、マウス、ラット、イヌ、ウマ、又はネコであってよい。具体的に、被験者はヒト又は非ヒト霊長類である。
【００１６】
本願明細書において「診断」とは、他の試験の結果、又は単に被験者が肥満症等の異常状態に罹患している可能性の有無を確認することを意味する。他方、用いられる「試験」は、患者又は医療従事者が、患者が異常状態に実質的に罹患していることを示さない場合のスクリーニング方法を指し、今後患者が疾病又は症状を発症する可能性又は確率の評価も意味する。従って、本発明の方法は、診断又はスクリーニングに用いてもよい。診断及び試験はいずれも、患者の肥満状態又は肥満症の「段階を判定する」ために用いることができる。本願明細書において用いられる「段階を判定する」とは、異常状態又は肥満症が、様々な重症度に、任意又は合理的に分類可能であることを指す。この分類は、限定されるものではないが、体重、ＢＭＩ、血圧、例えばＡ−ＳＡＡ、インスリン等のバイオマーカーの数値といった分離可能な定量特性に基づくものであってもよいし、或いは分離可能な定性特性に基づいてもよい。「段階を判定する」とは、疾病の進行を含んでも含まなくてもよい。
【００１７】
上記のように、本発明は、被験者の肥満症を診断又は試験する方法に関し、本願明細書において用いられる「肥満症」は、被験者が過体重又は肥満であること、又は、被験者のＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２が正常レベルよりも高いことを意味する。つまり、ある個体は、過体重及び肥満症の診断に用いられる体格指数（ＢＭＩ）の評価による過体重に分類される。ＢＭＩは、各個体の体重（キログラム）を各個の身長（メートル）の二乗で除算して求められる。ＢＭＩを用い、米国立心臓・肺・血液研究所（ＮＨＬＢＩ）は６つの体重分類を開発しているが、これを下表１に示す。明確にするため、本願明細書における「肥満症」は、限定されるものではないが、ＢＭＩの評価によって過体重及び肥満クラス１〜３体重分類に属する被験者を含む。肥満症は炎症性肥満症又は非炎症性肥満症であり得る。
【表１】
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【００１８】
診断及びスクリーニング方法は、ＳＡＡ１及びＳＡＡ２からなる群から選択される少なくとも１種類のバイオマーカーのレベルを測定することを含む。本発明の特定の一実施形態では、少なくともＳＡＡ１が測定される。本発明の別の特定の実施形態では、少なくともＳＡＡ２が測定される。更に別の特定の実施形態では、少なくともＡ−ＳＡＡ（ＳＡＡ１及びＳＡＡ２）が測定される。出願者らは、ＳＡＡ１及びＳＡＡ２は、肥満症、限定されるものではないが、糖尿病、高血圧症、高脂血症、高コレステロール血症、炎症及びアテローム性動脈硬化症を含む疾病又はメタボリック症のマーカーであることを見出した。本願明細書において用いられる「異常状態」は、健康な個体には通常存在しない、被験者の疾病、メタボリック症又は症状を意味する。また、本願明細書において用いられる異常状態のバイオマーカーは、検出可能なレベルと正常個体に相関している、又は相関している可能性のある化合物、分子、イオン又は他の化学的な存在を指す。個体レベルでの異常状態の他、バイオマーカーはまた、器官、組織又は細胞の改変状態を判定するためにも使用することができる。異常状態の例としては、限定されるものではないが、関節リウマチ（ＲＡ）、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、感染（急性又は慢性敗血症）、進行癌、糖尿病性腎症、クローン病、潰瘍性大腸炎、膵炎、喘息、アレルギー性鼻炎等の炎症状態が挙げられる。
【００１９】
所与のバイオマーカーの「正常レベル」は、後にスクリーニング又は診断される被験者と同じ被験者を含む、既知の健康被験者においてバイオマーカーのレベルを測定することによって評価することができる。また、正常レベルは集団サンプルで評価してもよく、この場合、集団サンプルは一人の患者からの複数のサンプル又は複数の被験者からの少なくとも１種類のサンプルを平均化することを意図する。集団サンプルに関して、バイオマーカーの正常レベルは、限定されるものではないが、性別、年齢、体重、ＢＭＩ、人種、地理的立地、空腹状態、妊娠状態又は妊娠後、月経周期、患者の健康状態、アルコール又は薬剤の摂取、カフェイン又はニコチンの摂取及び日内周期を含む、集団の特性に従って分類しても、しなくてもよい。
【００２０】
被験者を診断又はスクリーニングするためには、所与のサンプル中のＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２のレベルを測定する。本願明細書において、サンプルは、対象とするバイオマーカーを含有すると疑われるいずれの環境であってもよい。従って、サンプルは、限定されるものではないが、溶液、細胞、体液、組織又はその一部、及び器官又はその一部を含む。動物細胞の例としては、限定されるものではないが、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ヒト及び非ヒト霊長類等の哺乳類細胞が挙げられる。本発明の範囲はアッセイされる細胞種によって限定されない。アッセイされるサンプル又は体液の例としては、限定されるものではないが、血液、血漿、血清、尿、唾液、乳汁、精液血漿、滑液、間質液、脳脊髄液、リンパ液、胆汁、羊水、脂肪組織及び肝臓組織が挙げられる。特定の一実施形態では、アッセイされるサンプルは血清である。本発明の方法の範囲はアッセイされるサンプル種によって限定されない。
【００２１】
サンプルはそれらの天然環境から除去されてもされなくてもよい。従って、アッセイされるサンプルの一部は、サンプルの残りの部分から、又はサンプルを含有し得る被験者から分離する又は取り出す必要はない。例えば、被験者の血液を、患者から血液を取り出さずに、ＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２に関してアッセイしてもよい。勿論、サンプルは、その天然環境から除去してもよい。例えば、サンプルは、免疫組織化学（ＩＨＣ）的技術で使用できる組織切片であってよく、また、本発明の抗体を標準的なＩＨＣ技術において使用してもよく、この場合、抗体をサンプルと接触させ、バイオマーカーと抗体の結合を、標準的な免疫組織化学技術を用いて検出する。更に、サンプルをアッセイ前に処理してもよい。例えば、サンプルを希釈又は濃縮してもよい。サンプルを精製してもよいし、かつ／又はサンプルに内部標準等の少なくとも１種類の化合物を加えてもよい。サンプルはまた、本発明の方法の前に、又は本発明の方法と組み合わせて物理的に改変させるか（例えば、遠心分離、アフィニティー分離）、又は化学的に改変させてもよい（例えば、酸、塩基又はバッファーの添加、加熱）。処理はまた、アッセイ前にサンプルを凍結させる、かつ／又は保存することも含む。
【００２２】
本発明の範囲は、所与のバイオマーカーのレベルを測定する方法によって限定されない。例えば、ＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２の「レベル」は、限定されるものではないが、タンパク質レベル、核酸レベル、例えば、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡレベル、受容体結合及びタンパク質活性が挙げられる。タンパク質を測定してＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２レベルを評価する場合、これらのタンパク質は無傷なタンパク質でも変性タンパク質でも、又は更には部分的に消化されたタンパク質であってもよい。タンパク質レベルは、限定されるものではないが、いくつか例を挙げると、分光法及びＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法及び他のイムノアッセイ等の当技術分野で周知の標準的技術を用いてアッセイすることができる。使用可能なイムノアッセイとしては、限定されるものではないが、ラジオイムノアッセイ、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散法沈降素反応、免疫拡散法アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光イムノアッセイ、Ａタンパク質イムノアッセイ等の技術を用いた競合的アッセイ系及び非競合的アッセイ系が含まれる。このようなアッセイは当技術分野で周知のものであり、タンパク質レベルをアッセイするには慣例である（引用することにより本願明細書の一部とされ、Ａｕｓｕｂｅｌら編，  １９９４，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。
【００２３】
ＥＬＩＳＡでは、最初にバイオマーカーと結合する捕捉分子は標識とコンジュゲートさせる必要はなく、実際には、標識された、その後の検出分子（捕捉分子を認識できる）をウェル中に加えてもよい。当業者ならば、検出されるシグナルを増強するように改変されたパラメーター並びに当技術分野で周知のＥＬＩＳＡの他の変形形態について知識を有すると考えられる。本願明細書において用いられる「捕捉分子」は、限定されるものではないが、バイオマーカーと特異的に結合することによりバイオマーカーを固定する抗体又は受容体等の分子を意味する。更に、バイオマーカーは、そのバイオマーカー又はバイオマーカー−捕捉分子複合体がサンプルの残りの部分から分離する、又は分離できる場合に「固定」される。捕捉分子がウェル又は他の表面に被覆される場合、対象とするバイオマーカーをウェルに加えた後に検出分子を加えればよい。本願明細書において用いられる検出分子は、標識を含む、抗体又は受容体等の分子を意味する。特定の実施形態では、本発明の方法は、捕捉抗体及びＳＡＡ１若しくはＳＡＡ２を検出するための検出抗体の使用を含む。
【００２４】
捕捉されたＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２タンパク質、すなわちタンパク質レベルを、標識捕捉分子又は標識検出分子の使用によって検出することができる。本願明細書において、標識は、検出可能なシグナルを有する、或いは有するようになる、又は生成し得る化学的な化合物又はイオンを意味するものとする。本発明の標識は、捕捉分子若しくは検出分子、対象とするバイオマーカー、又は標識及び／又は捕捉分子若しくは検出分子が結合される表面とコンジュゲートさせることもできる。標識の例としては、限定されるものではないが、例えば、３Ｈ及び３２Ｐ等、放射線計量装置で測定可能な放射性標識；目視可能又は分光光度計で測定可能な顔料、色素又は他の色素体；スピン標識アナライザーで測定可能なスピン標識；及び、出力シグナルが適切な分子付加物の励起によって生成される場合、光による励起によって可視化されるか、又は蛍光計若しくは画像システムで測定可能である蛍光標識（蛍光プローブ）が挙げられる。標識の更なる例としては、限定されるものではないが、リン光色素、タンデム色素及び粒子が挙げられる。標識は、シグナル化合物の化学修飾によって出力シグナルが生成される場合の化学発光物質；金属含有物質；又は無色の基質からの有色生成物の形成等、シグナルの酵素依存的二次生成が起こる場合の酵素であり得る。また、「標識」という用語は、コンジュゲート分子が、基質と共加えた場合に検出可能なシグナルを生成するように、コンジュゲートした分子と特異的に結合することができる「タグ」又はハプテンも含む。例えば、ビオチンを標識として用い、このビオチン標識と結合させるためにセイヨウワサビペルオキシターゼ（ＨＲＰ）のアビジン又はストレプトアビジンコンジュゲートを使用することができ、次に、比色定量基質（例えば、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ））、又はＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．）等の蛍光基質を用いてＨＲＰの存在を検出することができる。多くの標識が当業者に周知であり、限定されるものではないが、粒子、蛍光プローブ、ハプテン、酵素及びそれらの比色定量基質、蛍光基質及び化学発光基質、並びに引用することにより本願明細書の一部とされる、ＲＩＣＨＡＲＤ  Ｐ．  ＨＡＵＧＬＡＮＤ，  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＢＥＳ及びＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ  第９版，  ＣＤ−ＲＯＭ，  （Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００２）に記載されている他の標識が挙げられる。
【００２５】
本発明の蛍光プローブは、２８０ｎｍを超える領域に吸収極大を示し、標識試薬と共有結合させてもそのスペクトル特性を保持する化学部分である。本発明の蛍光プローブとしては、限定されるものではないが、
ピレン（引用することにより本願明細書の一部とされる、米国特許第５，１３２，４３２号明細書に開示されている対応する誘導体化合物を含む）、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドール又はベンズインドール、オキサゾール又はベンズオキサゾール、チアゾール又はベンゾチアゾール、Ａ−アミノ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）、シアニン（引用することにより本願明細書の一部とされる、米国特許出願第０９／９６８，４０１号明細書及び同第０９／９６９，８５３号明細書の対応する化合物を含む）、カルボシアニン（引用することにより本願明細書の一部とされる、米国特許出願第０９／５５７，２７５号明細書；同第０９／９６９，８５３号明細書及び同第０９／９６８，４０１号明細書；米国特許第４，９８１，９７７号明細書；同第５，２６８，４８６号明細書；同第５，５６９，５８７号明細書；同第５，５６９，７６６号明細書；同第５，４８６，６１６号明細書；同第５，６２７，０２７号明細書；同第５，８０８，０４４号明細書；同第５，８７７，３１０号明細書；同第６，００２，００３号明細書；同第６，００４，５３６号明細書；同第６，００８，３７３号明細書；同第６，０４３，０２５号明細書；同第６，１２７，１３４号明細書；同第６，１３０，０９４号明細書；同第６，１３３，４４５号明細書；及び国際公開第０２／２６８９１号パンフレット、同第９７／４０１０４号パンフレット、同第９９／５１７０２号パンフレット、同第０１／２１６２４号パンフレット；欧州特許第１０６５２５０号パフレットの対応する化合物を含む）、カルボスチリル、ポルフィリン、サリチル酸塩、アントラニル酸塩、アズレン、ペリレン、ピリジン、キノリン、ボラポリアザインダセン（引用することにより本願明細書の一部とされる、米国特許第４，７７４，３３９号明細書；同第５，１８７，２８８号明細書；同第５，２４８，７８２号明細書；同第５，２７４，１１３号明細書；及び同第５，４３３，８９６号明細書に開示されている対応する化合物を含む）、キサンテン（引用することにより本願明細書の一部とされる、米国特許第６，１６２，９３１号明細書；同第６，１３０，１０１号明細書；同第６，２２９，０５５号明細書；同第６，３３９，３９２号明細書；同第５，４５１，３４３号明細書及び米国特許出願第０９／９２２，３３３号明細書に開示されている対応する化合物を含む）、オキサジン（引用することにより本願明細書の一部とされる、米国特許第４，７１４，７６３号明細書に開示されている対応する化合物を含む）、又はベンズオキサジン、カルバジン（引用することにより本願明細書の一部とされる、米国特許第４，８１０，６３６号明細書に開示されている対応する化合物を含む）、フェナレノン、クマリン（引用することにより本願明細書の一部とされる、米国特許第５，６９６，１５７号明細書；同第５，４５９，２７６号明細書；同第５，５０１，９８０号明細書及び同第５，８３０，９１２号明細書に開示されている対応する化合物を含む）、ベンゾフラン（引用することにより本願明細書の一部とされる、米国特許第４，６０３，２０９号明細書及び同第４，８４９，３６２号明細書に開示されている対応する化合物を含む）、並びにベンズフェナレノン（引用することにより本願明細書の一部とされる、米国特許第４，８１２，４０９号明細書に開示されている対応する化合物を含む）及びその誘導体が挙げられる。本願明細書において、オキサジンとしては、レゾルフィン（引用することにより本願明細書の一部とされる、米国特許第５，２４２，８０５号明細書に開示されている対応する化合物を含む）、アミノオキサジノン、ジアミノオキサジン、及びそれらのベンゾ置換類似体が挙げられる。
【００２６】
蛍光プローブがキサンテンである場合、蛍光プローブは所望により、フルオレセイン、ロードール（引用することにより本願明細書の一部とされる、米国特許第５，２２７，４８７号明細書及び同第５，４４２，０４５号明細書に開示されている対応する化合物を含む）、又はローダミン（引用することにより本願明細書の一部とされる、米国特許第５，７９８，２７６号明細書；同第５，８４６，７３７号明細書；米国特許出願第０９／１２９，０１５号明細書に開示されている対応する化合物を含む）であってもよい。本願明細書において、フルオレセインとしては、ベンゾ又はジベンゾフルオレセイン、セミナフトフルオレセイン、又はナフトフルオレセインが挙げられる。同様に、本願明細書において、ロードールとしては、セミナフトローダフルオル（引用することにより本願明細書の一部とされる、米国特許第４，９４５，１７１号明細書に開示されている対応する化合物を含む）が挙げられる。或いは、蛍光プローブは、キサンテンの９位における共有単結合である結合を介して結合したキサンテンである。特定のキサンテンとしては、９位に結合した３Ｈ−キサンテン−６−オール−３−オンの誘導体、９位に結合した６−アミノ−３Ｈ−キサンテン−３−オンの誘導体、又は９位に結合した６−アミノ−３Ｈ−キサンテン−３−イミン誘導体の誘導体が挙げられる。
【００２７】
本発明の特定の蛍光プローブとしては、キサンテン（ロードール、ローダミン、フルオレセイン及びその誘導体）、クマリン、シアニン、ピレン、オキサジン及びボラポリアザインダセンが挙げられる。蛍光プローブの更に特定の例としては、限定されるものではないが、スルホン化キサンテン、フッ素化キサンテン、スルホン化クマリン、フッ素化クマリン及びスルホン化シアニンが挙げられる。標識試薬と結合された蛍光プローブの選択により、標識試薬及び免役標識された複合体の吸収及び蛍光放射特性が決定される。蛍光プローブ標識の物理的特性としては、スペクトル特性（吸収、放射及びストークスシフト）、蛍光強度、寿命、偏光及び光退色速度が挙げられ、これらは全て各蛍光プローブを識別するために使用することができる。
【００２８】
一般に、蛍光プローブは、限定されるものではないがハロゲン、ニトロ、シアノ、アルキル、ペルフルオロアルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールアルキル、アシル、アリール又はヘテロアリール環系、ベンゾ、又は当技術分野で周知の蛍光プローブ上に一般に存在する他の置換基を含む、様々な置換基によって任意に１回又は複数回置換されていてもよい、１又は複数の芳香族又は複素芳香環を含む。
【００２９】
本発明の一態様では、蛍光プローブは４８０ｎｍを超える領域に吸収極大を有する。特に有用な実施形態では、蛍光プローブは４８８ｎｍ〜５１４ｎｍ又はその付近（アルゴンイオンレーザー励起源の出力による励起に特に適する）又は５４６ｎｍ付近（水銀アーク灯による励起に特に適する）で吸収される。
【００３０】
また、多くの蛍光プローブが発色団としても働き得るので、記載されている蛍光プローブは本発明の好ましい発色団でもある。
【００３１】
蛍光プローブの他、酵素も標識として使用することができる。酵素は、検出可能なシグナルの増幅が得られ、アッセイによる感受性が高いことから望ましい標識である。酵素自体は検出可能なシグナルを生成しないが、例えば、基質を変換して、蛍光シグナル、比色定量シグナル又は発光シグナル等の検出可能なシグナルを生成することにより、シグナルを生成することができる。標識試薬上の酵素は、検出可能なシグナルへ変換される複数の基質をもたらすので、酵素は検出可能なシグナルを増幅する。サンプル中に存在する標的量が少ない場合、又は酵素に匹敵する、若しくは酵素よりも強いシグナルが得られる蛍光プローブがない場合には酵素が有利である。酵素基質は、好ましい測定可能な生成物、例えば、比色定量物、蛍光又は化学発光を生じるように選択する。このような基質は当技術分野で広く用いられており、その多くがＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ  ＨＡＮＤＢＯＯＫに記載されている。
【００３２】
特定の実施形態では、比色定量基質又は蛍光基質と酵素の組合せとして、セイヨウワサビペルオキシダーゼ等のオキシドレダクターゼと特徴的な色を生じる３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）及び３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）（それぞれ褐色及び赤色）等の基質を用いる。検出可能な生成物を生じる他の比色定量オキシドレダクターゼ基質としては、限定されるものではないが、２，２−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ｏ−ジアニシジン、５−アミノサリチル酸、４−クロロ−１−ナフトールが挙げられる。蛍光基質としては、限定されるものではないが、ホモバニリン酸又は４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル酢酸、還元フェノキサジン及び還元ベンゾチアジンアジン（ａｎプレックス（登録商標）レッド試薬及びその変異体（米国特許第４，３８４，０４２号明細書）を含む）及び還元ジヒドロキサンテン（ジヒドロフルオレセイン（引用することにより本願明細書の一部とされる米国特許第６，１６２，９３１号明細書）を含む）及びジヒドロローダミン（ジヒドロローダミン１２３を含む）が挙げられる。チラミド（引用することにより本願明細書の一部とされる、米国特許第５，１９６，３０６号明細書；同第５，５８３，００１号明細書及び同第５，７３１，１５８号明細書）であるペルオキシダーゼ基質は、酵素作用の前に本質的に検出可能であるが、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）として記載されているプロセスにおけるペルオキシダーゼの作用によって「適切な位置に固定される」という点で、ユニークなペルオキシダーゼ基質種であると言える。これらの基質は、次に行われる顕微鏡、フローサイトメトリー、光学走査及び蛍光測定法による基質検出のために、細胞、組織又はアレイであるサンプル中の標的を標識するために広く用いられている。
【００３３】
別の比色定量（場合によっては蛍光）基質と酵素の組合せとしては、酸性ホスファターゼ、アルカリ性ホスファターゼ又はこのようなホスファターゼの組換え体等のホスファターゼ酵素を、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、６−クロロ−３−インドリルホスフェート、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリルホスフェート、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、又はｏ−ニトロフェニルホスフェート等の比色定量基質と、或いは４−メチルウンベリフェリルホスフェート、６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリニルホスフェート（ＤｉＦＭＵＰ、引用することにより本願明細書の一部とされる米国特許第５，８３０，９１２号明細書）、フルオレセインジホスフェート、３−Ｏ−メチルフルオレセインホスフェート、レゾルフィンホスフェート、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）ホスフェート（ＤＤＡＯホスフェート）、又はＥＬＦ  ９７、ＥＬＦ  ３９若しくは関連のホスフェート（引用することにより本願明細書の一部とされる米国特許第５，３１６，９０６号明細書及び同第５，４４３，９８６号明細書）等の蛍光基質と組み合わせて用いる。
【００３４】
グリコシダーゼ、特にβ−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ及びβ−グルコシダーゼが更に好適な酵素である。適当な比色定量基質としては、限定されるものではないが、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）及び類似のインドリルガラクトシド、グルコシド、及びグルクロニド、ｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）及びｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドが挙げられる。好ましい蛍光基質としては、レゾルフィン（ｒｅｓｏｒｕｆｍ）β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）、フルオレセインジグルクロニド及びそれらの構造変異体（引用することにより本願明細書の一部とされる、米国特許第５，２０８，１４８号明細書；同第５，２４２，８０５号明細書；同第５，３６２，６２８号明細書；同第５，５７６，４２４号明細書及び同第５，７７３，２３６号明細書）、Ａ−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、カルボキシウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド及びフッ素化クマリンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（引用することにより本願明細書の一部とされる米国特許第５，８３０，９１２号明細書）が挙げられる。
【００３５】
更なる酵素としては、限定されるものではないが、コリンエステラーゼ及びペプチダーゼ等のヒドロラーゼ、グルコースオキシダーゼ及びシトクロムオキシダーゼ等のオキシダーゼ、並びに好適な基質が既知であるレダクターゼが挙げられる。
【００３６】
本発明の特定の実施形態は、限定されるものではないが、天然型及び組換え型のルシフェラーゼとエクオリン等、化学発光シグナルを生成するための酵素とそれらの好適な基質を含む。更に、好適なジオキセタン、ルミノール、イソルミノール及びアクリジニウムを含有するもの等、ホスファターゼ、グリコシダーゼ及びオキシダーゼに対する化学発光生成基質が有用である。
【００３７】
更なる実施形態は、ビオチン等のハプテンを含む。ビオチンは酵素系に作用して検出可能なシグナルを更に増幅することができ、かつ、単離するためのアフィニティークロマトグラフィーで使用されるタグとしても機能可能であることから有用である。検出目的では、ビオチンに対して親和性を有するアビジン−ＨＲＰ等の酵素コンジュゲートが用いられる。その後、ペルオキシダーゼ基質を加えて検出可能なシグナルを生成させる。
【００３８】
またハプテンには、ホルモン、天然及び合成薬物、汚染物質、アレルゲン、エフェクター分子、増殖因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、アミノ酸、ペプチド、化学中間体、ヌクレオチド等も含まれる。
【００３９】
蛍光タンパク質はまた、本発明の標識試薬の標識としても使用される。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びフィコビリタンパク質及びその誘導体が挙げられる。これらの蛍光タンパク質、特にフィコビリタンパク質は、タンデム色素で標識された標識試薬を作出するのに特に有用である。これらのタンデム色素は、蛍光タンパク質と、放射スペクトルが蛍光タンパク質の吸収スペクトルの波長からさらにシフトされる大きなストークスシフトを得るための蛍光プローブとを含む。これらのタンデム色素は、放射蛍光光が最大限に至適化された場合、言い換えれば、放射光が蛍光タンパク質によってほとんど又は全く再吸収されない場合に、サンプル中の少量の標的を検出するのに特に有意である。機能させるためには、蛍光タンパク質と蛍光プローブがエネルギー移動対として働き、蛍光タンパク質が、蛍光プローブが吸収する波長で放射し、蛍光プローブが、蛍光タンパク質単独で得られることができた波長よりも蛍光タンパク質から遠波長で放射する。特に有用な組合せは、引用することにより本願明細書の一部とされる米国特許第４，５２０，１１０号明細書；同第４，８５９，５８２号明細書；同第５，０５５，５５６号明細書で開示されているフィコビリタンパク質と、米国特許第５，７９８，２７６号明細書に開示されているスルホローダミン蛍光プローブ、又は引用することにより本願明細書の一部とされる米国特許出願第０９／９６８／４０１号明細書及び同第０９／９６９／８５３号明細書に開示されているスルホン化シアニン、
又は引用することにより本願明細書の一部とされる米国特許第６，１３０，１０１号明細書に開示されているスルホン化キサンテン誘導体、及び引用することにより本願明細書の一部とされる米国特許第４，５４２，１０４号明細書に開示されている組合せである。或いは、蛍光プローブはエネルギー供与体として作用し、蛍光タンパク質はエネルギー受容体である。
【００４０】
一実施形態において、標識は、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、５−ＴＭＲＩＡ（テトラメチルローダミン−５−ヨードアセトアミド）、（９−（２（又は４）−（Ｎ−（２−マレイミジルエチル）−スルホンアミドイル）−４（又は２）−スルホフェニル）−２，３，６，７，１２，１３，１６，１７−オクタヒドロ−（１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ−キサンテノ、（２，３，４−ｉｊ：５，６，７−ｉ’ｊ’）ジキノリジン−１８−イウム塩）（テキサス州Ｒｅｄ（登録商標））、２−（５−（ｌ−（６−（Ｎ−（２−マレイミジルエチル）−アミノ）−６−オキソヘキシル）−１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−５−スルホ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）−１，３−プロピルジエニル）−１−エチル−３，３−ジメチル−５−スルホ−３Ｈ−インドールイウム塩（Ｃｙ（商標）３）、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−Ｎ−（ヨードアセチル）−Ｎ’−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）エチレンジアミン（ＩＡＮＢＤアミド）、６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン（アクリロダン）ピレン、６−アミノ−２，３−ジヒドロ−２−（２−（（ヨードアセチル）アミノ）エチル）−１，３−ジオキソ−１Ｈ−ベンズ（デ）イソキノリン−５，８−ジスルホン酸塩（ルシファーイエロー）、２−（５−（１−（６−（Ｎ−（２−マレイミジルエチル）−アミノ）−６−オキソヘキシル）−１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−５−スルホ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）−１，３−ペンタジエニル）−１−エチル−３，３−ジメチル−５−スルホ−３Ｈ−インドールイウム塩（Ｃｙ（商標）５））、４−（５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル）フェニル−Ｎ−（２−ブロモアセトアミドエチル）スルホンアミド（Ｄａｐｏｘｙｌ（登録商標）（２−ブロモアセトアミドエチル）スルホンアミド））、（Ｎ−（４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−イル）ヨードアセトアミド（ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５０７／５４５  ＩＡ）、（Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−Ｎ’−ヨードアセチルエチレンジアミン（ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０  ＩＡ）、５−（（（（２−ヨードアセチル）アミノ）エチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸（１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ）、及びカルボキシ−Ｘ−ローダミン、５／６−ヨードアセトアミド（ＸＲＩＡ  ５，６）からなる群から選択される蛍光プローブである。標識の別の例は、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ヒドラジドである。他の発光標識には、通常、フェナントロリン等のジイミン配位子を有する錯体のルテニウム［Ｒｕ（ＩＩ）］、レニウム［Ｒｅ（Ｉ）］、又はオスミウム［Ｏｓ（ＩＩ）］のみならず、ユウロピウム（Ｅｕ３＋）及びテルビウム（Ｔｂ３＋）等のランタニドの金属配位錯体が含まれる。
【００４１】
免疫沈降プロトコールは一般に、タンパク質ホスファターゼ及び／又はプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジウム酸ナトリウム）を添加したＲＩＰＡバッファー（１％ＮＰ−４０又はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．２、１％Ｔｒａｓｙｌｏｌ）等の溶解バッファー中で細胞集団を溶解すること、その細胞溶解液に対象抗体を加えること、４℃で一定期間（例えば、１〜４時間）インキュベートすること、その細胞溶解液にＡタンパク質及び／又はＧタンパク質セファロースビーズを加えること、４℃で約１時間又はそれ以上インキュベートすること、それらのビーズを溶解バッファー中で洗浄すること、及びそれらのビーズをＳＤＳ／サンプルバッファー中に再懸濁させることを含む。対象抗体の、特定の抗原を免疫沈降させる能力は、例えば、ウエスタンブロット解析によりアッセイすることができる。当業者ならば、抗体とバイオマーカーとの結合を増強する、及び、バックグラウンド結合を引き下げるように改変できるパラメーターについて知識があると考えられる。
【００４２】
ウエスタンブロット解析は一般に、タンパク質サンプルを調製すること、ポリアクリルアミドゲル（例えば、バイオマーカーの分子量に応じて８％〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中でタンパク質サンプルの電気泳動を行うこと、そのタンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲルから、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ又はナイロン等のメンブランに移すこと、メンブランをブロッキングバッファー、例えば３％ＢＳＡ又は脱脂乳を含むＰＢＳ中でブロッキングすること、メンブランを洗浄バッファー（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０）中で洗浄すること、メンブランをブロッキングバッファーで希釈した一次抗体でブロッキングすること、メンブランを洗浄バッファー中で洗浄すること、メンブランを、ブロッキングバッファーで希釈した、酵素基質、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ若しくはアルカリ性ホスファターゼ又は放射性分子（例えば、３２Ｐ又は１２５Ｉ）とコンジュゲートした二次抗体（一次抗体、例えば、抗ヒト抗体を認識する）でブロッキングすること、メンブランを洗浄バッファー中で洗浄すること、及び抗原の存在を検出することを含む。当業者ならば、検出されるシグナルを増強する、及び、バックグラウンドノイズを引き下げるように改変可能なパラメーターについて知識があると考えられる。
【００４３】
次に、捕捉分子とバイオマーカーとの結合を検出するための検出分子の使用は、限定されるものではないが、本願明細書に記載されているように、放射性同位元素、及びセイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリ性ホスファターゼ等の酵素を含んでもよい。更に、例えば捕捉分子がビーズ又は粒子に結合されている場合には、結合したバイオマーカーを検出及び測定する方法として、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）もまた含んでもよい。
【００４４】
また、ＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２のレベルは、限定されるものではないが、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット法、サザンブロット法及びアレイ等の当技術分野で周知の標準的技術を用いて関連する核酸のレベルを測定することによりアッセイしてもよい。このようなブロット法及びアレイ技術は当技術分野で周知であり、一般に、標識される相補的核酸とハイブリダイズさせる対象核酸、又はその逆を含む。核酸の標識としては、限定されるものではないが、放射性同位元素及び本願明細書に記載されている他の標識が挙げられる。
【００４５】
タンパク質活性は当技術分野で用いられている通りに用いられ、タンパク質の添加又は除去に対する下流応答を直接的又は間接的に示す。従って、タンパク質活性は、限定されるものではないが、例えば、ＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２等のバイオマーカーによって、又はバイオマーカーの受容体への結合によって引き起こされる細胞応答又は生理応答、並びに更なる下流の作用を含む。ホルミルペプチド受容体様１／リポキシンＡ４受容体（ＦＰＲＬ  １／ＬＸＡ４Ｒ）は、好中球における、ＳＡＡに媒介されるＩＬ−８産生に必要であると考えられる（引用することにより本願明細書の一部とされる、Ｈｅ  Ｒら、Ｂｌｏｏｄ  １０１：１５７２−１５８１  （２００３））。更に、ＳＡＡは核因子κＢ（ＮＦＫＢ）及びマイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼＥＲＫ１／２及びｐ３８（両者とも炎症情報伝達経路において重要な分子である）を活性化する。更に、Ａ−ＳＡＡは分泌性ホスホリパーゼＡ２（ｓＰＬＡ２）の活性を増強する（また、Ｐｒｕｚａｎｓｋｉ  Ｗら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  １９９５  ＪｕＩ  １５；３０９  （Ｐｔ  ２）：  ４６１−４も参照）。従って、ＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２レベルの測定は、限定されるものではないが、例えば、リパーゼ、キナーゼ、炎症性サイトカイン等の酵素のレベル又は活性、並びに例えば、ＳＡＡ１及び／若しくはＳＡＡ２によって活性化又は不活性化されることが知られている、或いはＳＡＡ１／ＳＡＡ２受容体経路に関与することが知られているＮＦＫＢのような活性化された核転写因子等の他のエフェクター分子のレベルの測定を含む。
【００４６】
ＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２のレベルが測定されれば、これらの測定レベルをＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２の正常レベルと比較して、ＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２の測定レベルと正常レベルとの差を求める。ＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２の正常レベルと測定レベルとの差は、その被験者が肥満であるか、又は健常な被験者よりも肥満になる確率が高い（又は低い）ことを示すと考えられる。更にまた、ＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２の測定レベルと正常レベルとの差は、肥満症の程度、又は健常な被験者と比較した場合の、肥満となる確率値を示すと考えられる。
【００４７】
同様に、ＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２の正常レベルと測定レベルのと差は、その被験者がある特定の異常状態を有するか、又は健常な被験者よりも異常状態を生じる確率が高い（又は低い）ことを示し得る。更にまた、ＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２の測定レベルと正常レベルとの差は、異常の程度、又は健常な被験者と比較した場合の、異常状態を生じる確率値を示し得る。
【００４８】
ＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２の測定レベルと正常レベルとの差は、相対量であっても絶対量であってもよい。当然ながら、この差はゼロに相当する場合もあり、その場合には患者が正常であること、又はバイオマーカーのレベルが過去のアッセイから変化していないことを示す。この差は、更なる測定又は操作を行わない、単に、例えば、測定蛍光値、放射線測定レベル、測定密度、質量値等であってもよい。或いは、この差は、限定されるものではないが、標品を含む別の化合物の測定レベルに対する抗原の測定レベルの百分率又は比率として表してもよい。この差は負の値である場合もあり、その場合には測定されたバイオマーカーの量が正常レベルよりも低いか、又は過去の測定から低下していることを示す。また、この差は正の値である場合もあり、その場合には測定された抗原の量が正常レベルよりも高いか、又は過去の測定から増加していることを示す。この差はまた、異なる時点において測定された抗原に対するそれ自体の差又は比率として表してもよい。この差はまた、生データが操作されるアルゴリズムに用いて測定してもよい。
【００４９】
更に、Ａ−ＳＡＡはまた、血管内皮細胞及び単球における炎症性サイトカインの産生を直接刺激することから、Ａ−ＳＡＡがヒト好中球においてインターロイキン８（ＩＬ−８）及びＴＮＦαの産生を誘発するという報告を拡大適用して、ＳＡＡが炎症性アジポサイトカインであることが確認される。従って、本発明はまた、特定の病態の指標ともなるＡ−ＳＡＡ及び更なるバイオマーカーのレベルを測定することを含む診断又はスクリーニング法も提供する。一実施形態において、例えば、本発明は、ＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２のレベルを測定すること、また、限定されるものではないが、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＴＮＦα及びＲＡＮＴＥＳを含む更なるバイオマーカーのレベルを測定することを含む、肥満症又は関連の異常状態に関して被験者を診断又はスクリーニングする方法を提供する。
【００５０】
興味深いところでは、肥満症は、ＳＡＡが一成分であるＨＤＬが低いことに関連性があるという点が注目される
（Ｃｈａｎ  ＤＣら、Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｄｒｕｇｓ  ４：２２７−２４６  （２００４）；Ａｖｅｎｅｌｌ  Ａら、Ｊ  Ｈｕｍ  Ｎｕｔｒ  Ｄｉｅｔ  １７：２９３−３１６  （２００４）；Ｗａｇｈ  Ａら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｔｈｅｒ  ２：２１３−２２８  （２００４）、全て引用することにより本願明細書の一部とされる）。ＳＡＡとＨＤＬとの相互作用はＨＤＬの分解を促進するので、本発明は、肥満症における脂肪由来Ａ−ＳＡＡの増加が、肥満症と低ＨＤＬと高い心血管疾患リスクとの間の機械的連結子であり得ることを教示する。
【００５１】
Ａ−ＳＡＡは血管内皮細胞及び単球由来細胞からの数種のサイトカインの産生を刺激するが、このことはＡ−ＳＡＡが炎症性応答の媒介因子であることを示す。血管内皮細胞及び単球に対するＡ−ＳＡＡの炎症作用により、Ａ−ＳＡＡが肥満症と心血管疾患の間の連結子であることが確認される。マウスでは、アテローム性動脈硬化症の亢進は、血漿リポタンパク質に依存しない高脂肪・高コレステロール食によって誘発される血清Ａ−ＳＡＡレベルに関連しているが、このことはＳＡＡがアテローム性動脈硬化症を直接誘発し得るということを示す（引用することにより本願明細書の一部とされる、Ｌｅｗｉｓ  ＫＥら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１０：５４０−５４５  （２００４））。女性虚血症候群評価（ＷＩＳＥ）の研究において、Ｊｏｈｎｓｏｎらは、Ａ−ＳＡＡは、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）に比べ、血管造影的冠動脈疾患に独立して関連し、３年心血管事象を高く予測することを見出している（引用することにより本願明細書の一部とされる、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＢＤら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０９：７２６−７３２  （２００４））。
【００５２】
従って、本発明は、被験者の異常状態を診断又は検査する方法であって、血清アミロイドＡタンパク質１（ＳＡＡ１）及び／又は血清アミロイドＡタンパク質２（ＳＡＡ２）のレベルを測定することと、これらの測定されたレベルとＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２の許容される正常レベルとを各々比較することと、を含み、被験者の測定レベルと正常レベルとの差は、被験者の肥満症又は異常状態の存在を示す方法を提供する。
【００５３】
診断又はスクリーニングされる異常状態は、必ずというわけではないが、多くの場合、被験者の肥満症と関連している。従って、診断又はスクリーニングされる異常状態は、必ずというわけではないが、肥満の被験者に存在する可能性がある。本発明の方法を用いて診断又はスクリーニングすることができる異常状態の例としては、限定されるものではないが、糖尿病、高血圧症、異脂肪血症、高コレステロール血症、炎症及びアテローム性動脈硬化症が挙げられる。（Ｈａｓｌａｍ  ＤＷら．  Ｌａｎｃｅｔ．  ３６６（９４９２）：  １１９７−２０９  （２００５）及びＳｈａｗ  ＤＩら．  Ｐｒｏｃ  Ｎｕｔｒ  Ｓｏｃ．  ６４（３）：  ３４９−５７  （２００５）参照。）
他の異常状態としては、限定されるものではないが、関節リウマチ（ＲＡ）、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、感染（急性又は慢性敗血症）、進行癌、糖尿病性腎症、クローン病、潰瘍性大腸炎、膵炎、喘息、アレルギー性鼻炎等の炎症状態が挙げられる。スクリーニング、診断又は処置可能な他の異常状態としては、肥満症に関連する症状である「メタボリック症候群」がある。（引用することにより本願明細書の一部とされる、Ｄａｎｄｏｎａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  １１１（１１）：  １４４８−５４  （２００５）参照。）
【００５４】
異常状態を診断又はスクリーニングする特定の一実施形態では、少なくともＳＡＡ１が測定される。異常状態を診断又はスクリーニングする別の特定の実施形態では、少なくともＳＡＡ２が測定される。異常状態を診断又はスクリーニングする更に別の特定の実施形態では、少なくともＡ−ＳＡＡ（ＳＡＡ１及びＳＡＡ２）が測定される。
【００５５】
また、本発明は、被験者の肥満症又は異常状態の進行度を監視する方法であって、異なる２時点において被験者の血清アミロイドＡタンパク質１（ＳＡＡ１）及び／又は血清アミロイドＡタンパク質２（ＳＡＡ２）のレベルを測定することと、これら２時点の測定レベルを比較して、ＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２の経時レベルの差を求めることと、を含み、経時レベルの差は、患者の肥満症又は肥満状態の進行度又は退行度を示す方法を提供する。本願明細書で用いられる「進行度を監視する」という語句は、被験者の異常状態を定期的に検査し、本発明の方法を用いて被験者のＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２のレベルを分析して個体の異常状態が進行（悪化）している、退化（改善）している、又は無変化状態（変化を検出できない）のままかどうかを判定することを意味する。監視する方法は、異常状態の治療と共に用いて治療効果を監視してもよい。従って、「進行度を監視する」は、ＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２のレベルを定期的に測定し、被験者のＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２の経時レベルの差と、異常状態の進行、退行、又は無変化状態とを相互に関連付けることによって、治療計画の効果を評価することを指す。監視は、サンプルが採取された２時点又はそれ以上の時点において行ってもよく、所与の被験者のある特定の時点においてのＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２のレベルを、１又は複数の時点においての同一被験者のＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２のレベルと各々比較してもよい。
【００５６】
また、本発明は、肥満症又は肥満症に関連する異常状態を治療する方法を提供する。本願明細書で用いられる「治療」という用語は、計画された処置によって、被験者の肥満症又は異常状態の１又は複数の原因、症状、又は有害作用が改善することを意味する。更に、「治療する」という用語は、治療を行うことを指すのに用いられる。治療とは、被験者を治療することができるがその必要はなく、つまり、被験者の異常状態の原因を除去、或いは症状及び／又は有害作用を完全に除去することである。従って、治療は、被験者を治療して、症状、例えば、限定されるものではないが、高血圧、疲労感、頭痛、視覚障害、悪心、吐き気、動脈疾患、及び不整脈等を改善することを含んでもよい。また、本発明は、肥満症に関連する異常状態の進行度を予防する方法を提供する。
【００５７】
また、本発明は、肥満症及び／又は異常状態を治療することに関連し、それを必要とする患者にＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２のレベルを減少させることができる化合物を被験者に投与することを含む。ＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２に関連して用いられる活性レベルは、ＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２の活性中のＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２レベルの量を指す。従って、ＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２の活性レベルを減少させる方法は、限定されるものではないが、ＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２の量を除去或いは減少させる、又は分子が受容体と結合できない、或いは被験者の生化学的経路を活性化できないようにＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２と結合させることを含む。また、活性レベルの低下は、ＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２受容体を、ＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２をそれらの受容体と結合させない化合物と結合させることを含む。一実施形態において、その方法は、被験者のＳＡＡ１の活性レベルを減少させることを含む。別の実施形態において、その方法は、被験者のＳＡＡ２の活性レベルを減少させることを含む。更なる別の実施形態において、その方法は、被験者のＡ−ＳＡＡの活性レベルを減少させることを含む。特定の一実施形態において、投与される化合物は、ＰＰＡＲγアゴニスト、例えば、限定されるものではないが、ロジグリタゾンである。本願明細書で用いられる「投与する」及び「投与すること」という用語は、少なくとも１種類の化合物を被験者に導入することを意味する。投与とは、治療が目的である場合、治療される肥満症の発現、診断、或いは異常状態の診断時又は診断後に、物質が与えられることである。この物質を治療目的で投与することによって、任意の症状を改善、又は発症による更なる症状の予防を改善する。異常状態の発症を予防する目的で投与（「予防投与」）が行われる場合、可視或いは検出可能な症状、又は異常状態を示す前に、物質は与えられる。物質の予防投与によって、後に発症する症状を改善、又は、危険性がある或いはないと考えられる被験者において症状を全く発症させないように予防する。組成物の投与経路は、限定されるものではないが、局所、経皮、鼻腔、膣、直腸、経口、皮下静脈内、動脈内、筋肉内、骨内、腹腔内、硬膜外、及び髄腔内を含む。
【００５８】
更に、肥満症又は異常状態を治療又は予防する方法は、ＳＡＡｌ及び／又はＳＡＡ２のレベルを減少させる化合物に加えて１又は複数の物質を併用することにも関連する。「併用投与する」という用語は、少なくとも２種類の化合物の生物活性又は効果を示す期間が重複する時間枠において、それらの化合物が投与されることを指す。従って、この用語は、本発明の化合物の同一時間にわたる投与のみならず連続投与も含む。更に、化合物の投与と同様、１種類以上の物質の併用投与を、治療及び又は予防目的で行うことができる。１種類以上の物質が併用投与される場合、２種類以上の投与経路が同一である必要はない。本発明の範囲は、併用投与される可能性のある物質の同定によって限定されない。例えば、ロジグリタゾンを、別の薬理学的な活性物質、例えば、限定されるものではないが、交感神経遮断薬又は他のαアドレナリンアゴニスト、αアドレナリン受容体アンタゴニスト、β１及びβ２アドレナリンアンタゴニスト（ベータ受容体遮断薬）ＡＣＥ阻害剤（アンギオテンシン変換酵素阻害剤）、血管拡張剤、カルシウムチャンネル遮断薬、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、及びインスリン等と併用投与してもよい。併用してもよい更なる薬剤は、限定されるものではないが、抗生物質を含む。
【００５９】
また、本発明は、ＳＡＡ１、ＳＡＡ２、及び／又はＡ−ＳＡＡに対して特異的である抗体を提供する。抗原としてＫＬＨにコンジュゲートされるＳＡＡ１−特異性ペプチドＮ’−ＡＩＳＤＡＲＥＮＩＱＲＦＦＧ−Ｃ’及びＳＡＡ２−特異性ペプチドＮ’−ＶＩＳＮＡＲＥＮＩＱＲＬＴＧ−３’を使用して、本発明者らは、ＳＡＡ１及びＳＡＡ２−特異性ペプチドポリクローナル抗体を作製した。イソフォーム特異性抗原は、ＳＡＡ１又はＳＡＡ２のいずれかを検知するが、双方を検知しない。本願明細書で用いられる「抗体」という用語は、フラグメント源又はフラグメントの作製方法に関わらず、免疫グロブリン分子及びその機能性フラグメントを意味する。本願明細書で用いられる免疫グロブリンの「機能性フラグメント」は、結合標的に特異的に結合する免疫グロブリン分子の部分である。従って、本願明細書で用いられる「抗体」という用語は、限定されるものではないが、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びＩｇＹを含む、イソ型の抗体等の抗体を全て包含する。全ての抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであってよく、ヒト化又はキメラ化であってよい。本願明細書で用いられる「モノクローナル抗体」という用語は、限定されるものではないが、ハイブリドーマ技術によって作製される抗体である。更に、「モノクローナル抗体」という用語は、任意の成熟核、原核、又はファージクローンを含む単一クローンに由来する抗体を意味し、その作製方法は言及されない。また、「抗体」という用語は、免疫グロブリンの機能性フラグメントを包含し、限定されるものではないが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、及びＦｄフラグメントを含む。また、抗体は、単鎖抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合されたＦｖ等のＶＬ及び又はＶＨの少なくとも一部を含む免疫グロブリンのフラグメントを包含する。
【００６０】
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、又は更にそれを超える多重特異性であってもよい。更に、これらの抗体は、一価、二価、三価、又は更にそれらを超える多価であってもよい。更に、本発明の抗体は、限定されるものではないが、鳥類及び哺乳類を含む動物由来のものであってもよい。特定の実施形態では、抗体はヒト、ネズミ、ラット、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ウマ、又はニワトリの抗体である。本願明細書において「ヒト」抗体としては、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、また、引用することにより本願明細書の一部とされる米国特許第５，９３９，５９８号明細書に記載されているように、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、又は１又は複数のヒト免疫グロブリンに対してトランスジェニックで、かつ、内因性の免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体を含む。
【００６１】
本発明の抗体は、それらが認識する、又は特異的に結合するポリペプチドのエピトープ又は部分に関して記載又は明示することができる。或いは、抗体は、抗原自体がＳＡＡ受容体等の別の分子と結合している場合、抗原のコンフォメーション、例えばＳＡＡ１又はＳＡＡ２等の抗原の特定のコンフォメーションと結合する能力に基づいて記載することもできる。
【００６２】
また、本発明の抗体を、抗原との結合親和性のみならず交差反応性に関して説明又は特定してもよい。本発明における結合親和性の具体例には、限定されるものではないが、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ未満の解離定数が挙げられる。
【００６３】
また、本発明の抗体としては例えば、いずれかの分子種を抗体と共有結合させることによって（ただし、共有結合は、抗体が抗イディオタイプ応答を生じるのを妨げないように）改変されている誘導体も含む。抗体修飾の例としては、限定されるものではないが、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンド又は他のタンパク質との結合等が挙げられる。多くの化学修飾はいずれも、限定されるものではないが、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等を含む既知の技術によって行うことができる。更に、誘導体は１又は複数の非天然アミノ酸を含み得る。
【００６４】
本発明の一実施形態では、抗体はＳＡＡ１に対して特異的である。更に特定の実施形態では、ＳＡＡ１に対して特異性を有する抗体は、ＳＡＡ２に対しては検出可能な結合親和性を持たない。逆に、本発明はまた、ＳＡＡ２に対して特異的な抗体も提供する。更に特定の実施形態では、ＳＡＡ２に対して特異性を有する抗体は、ＳＡＡ１に対しては検出可能な結合親和性を持たない。最後に、本発明は、Ａ−ＳＡＡに対して特異性を有する抗体を提供する。
【００６５】
本発明の抗体は、当技術分野で周知の好適ないずれの方法によって作製してもよい。ＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２に対するポリクローナル抗体を、当技術分野で周知の様々な手法によって作製することができる。例えば、ＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２は、限定されるものではないが、ウサギ、マウス、ラットを含む様々な宿主動物に投与して、抗原に特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘発することができる。宿主種に応じ、様々なアジュバントを用いて免疫応答を増強することができ、限定されるものではないが、フロイントの（完全及び不完全）アジュバント、水酸化アルミニウム等の無機ゲル、リゾレシチン等の界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、並びにＢＣＧ（カルメットゲラン菌）及びジフテリア菌等の潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられる。このようなアジュバントも当技術分野で周知である。
【００６６】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え体及びファージディスプレー技術、又はその組合せを含む、当技術分野で周知の多様な技術を用いて作製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野で周知であり、例えば、（Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  第２版，  １９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、ｉｎ：  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１  （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８１）（双方とも、引用することにより本願明細書の一部とされる）で教示されているものを含むハイブリドーマ法を用いて作製することができる。  
【００６７】
ハイブリドーマ法を用いて特定の抗体を作製及びスクリーニングする方法は当技術分野で慣例かつ周知である。非限定的な例では、マウスを、ＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２を含む融合タンパク質で免疫化する。免疫応答を検出したら、マウス脾臓を採取し、脾細胞を単離する。次に、これらの脾細胞を周知の技術によって好適な骨髄腫細胞、例えば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞系統ＳＰ２０由来の細胞と融合させる。ハイブリドーマは制限希釈によって選択及びクローニングする。次に、これらのハイブリドーマクローンを当技術分野で周知の方法により、本発明のバイオマーカーと結合できる抗体を分泌する細胞に関してアッセイすることができる。一般に高レベルの抗体を含む腹水は、マウスを陽性ハイブリドーマクローンで免疫化することにより作製することができる。
【００６８】
本発明の抗体はまた、当技術分野で周知の様々なファージディスプレーを用いて作製することができる。ファージディスプレー法では、機能性抗体ドメインを、コードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面に提示する。特定の実施形態では、このようなファージを用いて、レパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリーから発現した抗原結合ドメインを提示する。対象抗原と結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、標識抗原、又は固相表面若しくはビーズに結合又は捕捉された抗原を用いる等して、対象抗原を用いて選択又は同定することができる。これらの方法に用いられるファージは、一般に、限定されるものではないが、ファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかと組換え融合されたＦａｂ、Ｆｖ又はジスルフィド結合で安定化されたＦｖ抗体ドメインを有するファージから発現したｆｄ及びＭ１３結合ドメインを含む、繊維状ファージである。本発明の抗体を作製するために使用可能なファージディスプレー法の例としては、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０  （１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６  （１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８  （１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ  １８７  ９−１８  （１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０  （１９９４）；国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号パンフレット；国際公開第９０／０２８０９号パンフレット；同第９１／１０７３７号パンフレット；同第９２／０１０４７号パンフレット；同第９２／１８６１９号パンフレット；同第９３／１１２３６号パンフレット；同第９５／１５９８２号パンフレット；同第９５／２０４０１号パンフレット；及び米国特許第５，６９８，４２６号明細書；同第５，２２３，４０９号明細書；同第５，４０３，４８４号明細書；同第５，５８０，７１７号明細書；同第５，４２７，９０８号明細書；同第５，７５０，７５３号明細書；同第５，８２１，０４７号明細書；同第５，５７１，６９８号明細書；同第５，４２７，９０８号明細書；同第５，５１６，６３７号明細書；同第５，７８０，２２５号明細書；同第５，６５８，７２７号明細書；同第５，７３３，７４３号明細書及び同第５，９６９，１０８号明細書（全て、引用することにより本願明細書の一部とされる）に開示されているものが挙げられる。
【００６９】
特定のエピトープ、例えば、ＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２を認識する抗体フラグメントは周知の技術により作製することができる。例えば、本発明のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントは、パパイン（Ｆａｂフラグメントの作製のため）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの作製のため）等の酵素を用いた免疫グロブリン分子のタンパク質分解切断によって作製することができる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可変領域と軽鎖定常領域と重鎖ＣＨ１ドメインを含む。
【００７０】
組換え技術等の他の方法を用いてＦａｂ’及びＦ（ａｂ’）２フラグメントを作製することもでき、このような方法は国際公開第９２／２２３２４号パンフレット；  
Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：  ８６４−８６９  （１９９２）；Ｓａｗａｉら、ＡＪＲＩ  ３４：２６−３４  （１９９５）；及びＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：  １０４１−１０４３  （１９８８）（これらは引用することにより本願明細書の一部とされる）に開示されている。ファージの選択後、例えば、そのファージ由来の抗体コード領域を単離し、これを用いてヒト抗体を含む完全抗体、又は他の所望の抗原結合フラグメントを作製し、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母及び細菌を含む所望の宿主で発現させることができる。
【００７１】
ｓｃＦｖ等の多種のフラグメントを作製するために使用可能な技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号明細書及び同第５，２５８，４９８号明細書；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８  （１９９１）；Ｓｈｕら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ  （ＵＳＡ）  ９０：７９９５−７９９９  （１９９３）；並びにＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０  （１９８８）（全て、引用することにより本願明細書の一部とされる）に開示されているものが挙げられる。ヒトの抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ使用及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出アッセイを含むいくつかの使用では、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を用いるのが好ましい場合がある。キメラ抗体は、ネズミモノクローナル抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有する抗体等、種々の抗体部分が異なる動物種に由来している分子である。キメラ抗体を作製する方法は当技術分野で周知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２  （１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４  （１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−  ２０２（１９８９）；米国特許第５，８０７，７１５号明細書；同第４，８１６，５６７号明細書；及び同第４，８１６，３９７号明細書（全て、引用することにより本願明細書の一部とされる）参照。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域とを有する、所望の抗原と結合する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。多くの場合、ヒトフレームワーク領域内のフレームワーク残基は、抗原結合を改変、好ましくは改善するためにＣＤＲ供与抗体由来の対応する残基で置換される。これらのフレームワーク置換は、例えば、抗原結合にとって重要なフレームワーク残基を同定するためにＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用のモデリングを行う、及び特定の位置において異常なフレームワーク残基を同定するために配列比較を行う等、当技術分野で周知の方法によって同定される（米国特許第５，５８５，０８９号明細書；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３  （１９８８）（双方とも、引用することにより本願明細書の一部とされる）参照。）。抗体は、例えば、ＣＤＲグラフト（欧州特許第２３９，４００号明細書；国際公開第９１／０９９６７号パンフレット；米国特許第５，２２５，５３９号明細書；同第５，５３０，１０１号明細書；及び同第５，５８５，０８９号明細書）、ベニヤリング又はリサーフェイジング（欧州特許第５９２，１０６号明細書；欧州特許第５１９，５９６号明細書；Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：  ４８９−４９８  （１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：  ８０５−８１４  （１９９４）；  Ｒｏｇｕｓｋａ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  ＳｃＬ  ９１：９６９−９１３  （１９９４））、並びにチェーンシャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号明細書）（全て、引用することに��り本願明細書の一部とされる）を含む、当技術分野で周知の様々な技術を用いてヒト化することができる。
【００７２】
完全なヒト抗体がヒト患者の治療的処置又は診断に特に望ましい場合もある。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いた上記のファージディスプレー法を含む当技術分野で周知の様々な方法によって作製することができる。米国特許第４，４４４，８８７号明細書及び同第４，７１６，１１１号明細書；並びに国際公開第９８／４６６４５号パンフレット、同第９８／５０４３３号パンフレット、同第９８／２４８９３号パンフレット、同第９８／１６６５４号パンフレット、同第９６／３４０９６号パンフレット、同第９６／３３７３５号パンフレット、及び同第９１／１０７４１号パンフレット（各々、引用することにより本願明細書の一部とされる）も参照。
【００７３】
また、ヒト抗体は、機能的な内因性免疫グロブリンは発現できないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを用いて作製することもできる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体をマウス胚幹細胞に無作為に導入するか、又は相同組換えにより導入することができる。或いは、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域及び多様性領域をマウス胚幹細胞に導入してもよい。マウス重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別に、又は同時に非機能的にすることができる。特に、ＪＨ領域の同形接合欠如は内因性の抗体産生を妨げる。これらの改変された胚幹細胞を増殖させ、胚盤胞のマイクロインジェクションを行い、キメラマウスを作出する。次に、これらのキメラマウスを交配させ、ヒト抗体を発現する同形接合性の後代を作出する。これらのトランスジェニックマウスを常法にて、ＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２等の選択した抗原で免疫化する。抗原に対するモノクローナル抗体は、免疫化されたトランスジェニックマウスから通常のハイブリドーマ法を用いて得ることができる。トランスジェニックが保持するヒト免疫グロブリン導入遺伝子はＢ細胞の分化時に再配列を起こし、続いて、クラススイッチングと体細胞突然変異が起こる。従って、このような技術を用いると、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＥ抗体を作製することができる。ヒト抗体を作製するためのこの技術の総説としては、引用することにより本願明細書の一部とされる、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，  Ｉｎｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３  （１９９５）を参照。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を作製するためのこの技術、並びにこのような抗体を作製するプロトコールに関する詳述としては、例えば、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット；同第９２／０１０４７号パンフレット；同第９６／３４０９６号パンフレット；同第９６／３３７３５号パンフレット；欧州特許第０５９８８７７号明細書；米国特許第５，４１３，９２３号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６６１，０１６号明細書；同第５，５４５，８０６号明細書；同第５，８１４，３１８号明細書；同第５，８８５，７９３号明細書；同第５，９１６，７７１号明細書；及び同第５，９３９，５９８号明細書（引用することにより本願明細書の一部とされる）を参照。
【００７４】
ヒト抗体を作製するための更に別のアプローチでは、ガイデッド・セレクション（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）と呼ばれる技術を用いる。ガイデッド・セレクションでは、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を用い、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を導く。（引用することにより本願明細書の一部とされる、Ｊｅｓｐｅｒｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３  （１９８８））
【００７５】
また、本発明は、本願明細書に記載される方法を実施するためのキットを提供する。本発明のキットは、本発明の実施に有用である１又は複数の試薬を含有する１又は複数の容器を含んでもよい。本発明のキットは、本発明の方法を実施するのに有用な１又は複数のバッファー又はバッファー塩を含有する容器を含んでもよい。本発明のキットは、酵素基質を含有する容器を含んでもよい。例えば、本発明のキットは、酵素活性、つまり、ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼを検知するのに有用な１又は複数の基質を含んでもよい。
【００７６】
本発明のキットは、周知の濃度の抗原ストックを含有する容器を含んでもよい。例えば、周知の濃度のストックを使用して、検量線を作成してもよい。次いで、検量線を使用して、サンプル中の抗原の量を測定してもよい。
【００７７】
本発明のキットは、本発明の方法を実施するのに使用できる１又は複数のコンピュータプログラムを含んでもよい。例えば、対象とするバイオマーカーに結合する抗体の検出レベルの結果からサンプル中のＳＡＡ１及び／又はＳＡＡ２の濃度を計算するコンピュータプログラムを提供してもよい。このようなコンピュータプログラムは、市販の機器、例えば、市販のマイクロプレートリーダーと互換性があってよい。サンプル中の抗原濃度を測定する場合、周知の標準濃度のストックを、様々に希釈して、マイクロプレートの様々なウェルにアプライしてもよい。本発明のプログラムは、マイクロプレートリーダーから出力値を読み込み、ウェルで観察される光学密度から検量線を作成し、レベルの読み込み値と抗原の周知の量を含有するウェルの光学密度の読み込み値とを比較し、サンプル中に存在する抗原の量を測定することができる。
【実施例】
【００７８】
ヒト被験者
ヒトでの研究は全て、各施設の治験審査委員会によって認可されたものであり、各参加者からは参加意志のインフォームド・コンセントを書面で得た。全員から一晩絶食後の血液サンプルを採取し、血清を使用するまで約−８００℃で保存した。被験者は全て、プロトコールに特に記載がない限り、病歴、健康診断及び臨床検査によれば健康であった。急性炎症の臨床的又は試験的証拠を示した被験者はいなかった。
【００７９】
統計分析
結果は平均値±ＳＥＭで示す。図面の凡例に示されているように、必要に応じてスチューデントの片側又は両側ｔ検定を行った。差は、ｐ＜０．０５で有意であるとみなされた。アーミッシュ被験者の近縁性を制御するために、ＳＯＬＡＲ（引用することにより本願明細書の一部とされる、Ａｌｍａｓｙ  Ｌら、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６２：  １１９８−１２１１  （１９９８））において実施されるような分散成分分析を用いて、アーミッシュ１３４名という大きなセットにおけるＢＭＩ値とＳＡＡレベルの間の相関を評価した。
【００８０】
方法
【００８１】
体格指数（ＢＭＩ）と血清ＳＡＡレベルの試験
本試験に用いたヒト被験者は、引用することにより本願明細書の一部とされる、Ｈｓｕｅｈ  ＷＣら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２３：５９５−６０１  （２０００）及びＰｏｌｌｉｎ  ＴＩら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  １７３：８９−９６  （２００４）に従前に記載されているようなアーミッシュ家系糖尿病研究の一環であった。まず、ＢＭＩの差が少なくとも３ｋｇ／ｍ２である、性別及び年齢（５歳以内）が合致する非糖尿病の兄弟姉妹ペア（３８名）からの血漿サンプルでＳＡＡレベルを測定した。次に、これら３８名を、ＢＭＩが１７．０〜４１．８ｋｇ／ｍ２の範囲である１３４名の非糖尿病者からなる拡張セットに含めた。一晩絶食後、血液サンプルを前腕前部の静脈から採血した。ＢＭＩは、体重（ｋｇ）を身長（ｍ）の二乗で除算して求めた。
【００８２】
体重減少試験
２４名の定着した過体重又は肥満（ＢＭＩ３３±２ｋｇ／ｍ２、平均値±ＳＥＭ）の、閉経後（５７±１歳）の女性について５か月の食事療法減量プログラムの前後で試験を行った。介入としては、外来患者低カロリー食プログラム（３５０ｋｃａｌ／日減）と有酸素運動トレーニングの組合せからなった。脂肪量は、二重Ｘ線吸収骨塩定量（モデルＤＰＸ−Ｌ；  Ｌｕｎａｒ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）により、１．３ｚ  ＤＰＸ−Ｌ拡張分析プログラムを用いて測定した。血清ＳＡＡの空腹時レベルを、０時点と５か月の減量プログラム後に測定した。
【００８３】
ロジグリタゾン試験
８名の非糖尿病健常被験者（４４．７±３．２歳、ＢＭＩ３０．８±１．１ｋｇ／ｍ２、平均値±ＳＥＭ）を動員し、ロジグリタゾン（４ｍｇ／日）で４週間処置した後、８ｍｇ／日で８週間処置した。介入中毎週、空腹時血液を採取した。血清ＳＡＡのレベルを、０時点と１２週間のロジグリタゾン処置後に測定した。同時点に、本願明細書の他所に記載されているＳＡＡ分泌のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験のため、局所麻酔下で腹部皮下脂肪生検を採取した。
【００８４】
ＲＮＡ分析
マイクロアレイ分析のため、メリーランド大学で治験審査委員会（ＩＲＢ）により認可されたプロトコールにて、ＢＭＩ２５、２８、３３及び４４の４名の被験者から、ヒト大網脂肪及び皮下脂肪を外科的に得た。約４％アルブミンと約２００ｎＭアデノシンを含有するＫｒｅｂ  Ｒｉｎｇｅｒ重炭酸バッファー（ＫＲＢ−Ａ）中にて、引用することにより本願明細書の一部とされるＨｏｎｎｏｒ  ＲＣら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６０：１５１２２−１５１２９  （１９８５）に記載されるようなコラゲナーゼ消化によって、単離脂肪細胞及び間質細胞を得た。約２００ｘｇで１〜２分遠心分離した後、浮遊している脂肪細胞の下の媒体（間質血管細胞（ＳＶＣ）を含有する）を取り出し、約８００ｘｇで約５分遠心分離した。ペレットとなった細胞をＫＲＢ−Ａに再懸濁させ、同じ手順を用いて３回洗浄した。浮遊脂肪細胞を浮上分離により数回洗浄した。引用することにより本願明細書の一部とされるＦｒｉｅｄ  ＳＫら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９２：２１９１−  ２１９８  （１９９３）に従前に記載されているようなＣｈｏｍｚｃｚｙｎｓｋｉ及びＳａｃｃｈｉの方法を用いて脂肪細胞及びＳＶＣ画分からＲＮＡを抽出した。ノーザン分析のため、ヒト脂肪組織及び肝臓検体をＮａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ  （Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ）から購入し、トリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を製造業者の使用説明書に従って用い、全ＲＮＡを調製した。他のＲＮＡは全てＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）から購入した。
【００８５】
ＲＴ−ＰＣＲ試験
半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析のため、Ａｄｖａｎｔａｇｅキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）を用い、約１μｇの全ＲＮＡ、ポリＴプライマー及びＭＭＬＶ逆転写酵素を含有する反応液中で逆転写を行った。ＰＣＲは、一般に、約９４℃で約３０秒、約５５℃で約３０秒、及び約７２℃で約１分の約２８サイクルからなる条件下で行った。分画した脂肪細胞におけるヒトＡ−ＳＡＡの発現を検出するため、プライマー５’−ＧＡＧＡＧＡＡＧＣＣ  ＡＡＴＴＡＣ  ＡＴＣＧＧＣ−３’及び５’−ＡＧＴＡＴＴＴＣＴＣＡＧＧＣＡＧＧＣＣＡＧＣ−Ｓ’を用いた。対照として、ヒトβ−アクチンを、プライマー５’−ＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣＣ−３’及び５’−ＡＧＡＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣＣＣＡＧＣＣＡ−３’を用いて増幅した（引用することにより本願明細書の一部とされる、Ｘｕ  Ｈら、ＪＣｌｉｎ  ｌｎｖｅｓｔ  １１２：１８２１−１８３０  （２００３）参照）。ＲＴ−ＰＣＲ産物を約１％アガロースゲル上で電泳動にかけ、臭化エチジウムで染色し、  ＵＶ透視法により可視化した。
【００８６】
ノーザンブロット法
ノーザン分析のため、全ＲＮＡ約１５μｇを各レーンに流した。Ｃ５７ＢＬマウスのＲＮＡからマウス・マルチティッシュブロットを作製した（引用することにより本願明細書の一部とされる、Ｙａｎｇ  ＲＺら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３１０：９２７−９３５  （２００３）参照）。  
ＢＣ０２０７９５のヌクレオチド１〜５３６に相当するヒトＳＡＡ２  ｃＤＮＡ及びＵ６０４３８のヌクレオチド１〜５６５に相当するネズミＳＡＡ２  ｃＤＮＡを、ノーザン分析用のプローブとして用いた。これらのプローブはＳＡＡ１配列と約９７％（ヒト）及び約９５％（マウス）同一であったことから、用いたハイブリダイゼーション及び洗浄条件下でＳＡＡ１及びＳＡＡ２の双方とハイブリダイズした。これらのプローブを３２Ｐ−ｄＣＴＰでランダム標識し、約６５℃にてＲａｐｉｄ−ｈｙｂバッファー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）中でハイブリダイゼーションを行った。ブロットを約６５℃、約０．５×ＳＳＣ／１％ＳＤＳで２回洗浄した（ストリンジェント洗浄）。
【００８７】
脂肪器官培養からのＳＡＡの分泌
脂肪器官培養は、引用することにより本願明細書の一部とされるＦｒｉｅｄ  ＳＫら、Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ３０：１９１７−１９２３  （１９８９）に従前に記載されている手順に従った。無菌フード内で、組織を約５〜１０ｍｇ片に細断し、温生理食塩水で洗浄した。ロジグリタゾンで処置したヒトからの脂肪生検の急性研究では、引用することにより本願明細書の一部とされるＲｕｓｓｅｌｌ  ＣＤら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７５：  Ｅ５０７−５１５  （１９９８）に従前に記載されているように、脂肪片をＭ１９９〜１％ＢＳＡ（約１００ｍｇ／ｍｌ）中で約３時間インキュベートし、培養培地を回収し、分析まで約−８０℃で保存した。脂肪ＳＡＡの産生に対するロジグリタゾンの直接的作用に関する研究では、約５％ＣＯ２雰囲気下、約３７℃、ゲンタマイシン（約１０ｍｇ／Ｌ）を含むＭ１９９〜ｌ％ＢＳＡ（約３００〜５００ｍｇ組織／１５ｍｌ培地）中、ホルモンの不在下、約２５ｎＭデキサメタゾン（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，  Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇ，  ＩＬ）及び約７ｎＭインスリン（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ，  Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，  ＮＪ）又はこれらのホルモンとロジグリタゾン（１μＭ，  ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ）の組合せにて脂肪組織片を培養した。培養培地を毎日交換し、２日目の細胞馴化培地でＳＡＡをアッセイした。
【００８８】
細胞培養条件
一次ヒト冠動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）をＣａｍｂｒｅｘ  （Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）から購入し、ＥＧＭ−２  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔを添加した内皮細胞基本培地−２（ＥＢＭ−２）で培養した。試験は継代培養３回〜５回の間で行った。ＲＡＷ２６４細胞（ＡＴＣＣ５  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）を、約１０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ培地で増殖させた。これらの細胞を６ウェル組織培養プレートに集密度約７５％で播種し、集密度約９０〜９５％まで増殖させた。増殖培地を、添加物を含まない培地（ＨＣＡＥＣにはＥＢＭ−２基本培地、また、ＲＡＷ２６４にはＲＰＭＩ１６４０）に置き換えた。培地交換から約１時間後、細胞を組換えヒトＳＡＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，  Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，  ＮＪ）で処理した。この市販の調製物の内毒素レベルはタンパク質１μｇにつき約０．１ｎｇ未満である。この細胞馴化培地をＳＡＡ処理から約８時間後に、約２，０００ｘｇで約５分の遠心分離により回収し、サイトカイン分析に使用するまで冷凍した。
【００８９】
サイトカイン分析
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）キットを製造業者の使用説明書に従って用いて、ヒトＳＡＡ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，  ＣＡ）及びＰＡＩ−１（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，  Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，  ＣＴ）を２回測定した。このＳＡＡ  ＥＬＩＳＡキットは、Ａ−ＳＡＡ（ＳＡＡ１及びＳＡＡ２）のみを検出し、ＳＡＡ４は検出しない。アッセイ内変動係数及びアッセイ間変動係数は、それぞれ約５％及び約８％である。ヒトＭＣＰ−１、ＩＬ−６、及びＩＬ−８と、マウスＴＮＦα、ＩＬ−６、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＣＰ１は、メリーランド大学サイトカイン研究室で、サイトカイン・マルチプレックス試薬（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．，  Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，  ＮＹ）を用い、Ｌｕｍｉｎｅｘ  １００  （Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ａｕｓｔｉｎ，  ＴＸ．）を用いて分析した。全てのサンプルを２回測定した。
【００９０】
本発明をその特定の実施形態に関して記載してきたが、さらなる改変が可能であると理解され、本願は下記の本発明の変形形態、使用及び変更のいずれをも包含するものとする。一般に、本発明の原理は、本発明が属する技術分野で周知の又は通例の実施に含まれるような、また、以上に示される本質的な特徴に当てはまり得るような、また、添付の特許請求の範囲に従うような本開示からの逸脱も含む。
【００９１】
結果
【００９２】
急性期ＳＡＡはヒト脂肪組織で選択的に発現される。脂肪細胞で優先的に発現される遺伝子を同定するため、ヒト脂肪組織を脂肪細胞画分と間質血管細胞（ＳＶＣ）画分に分画し、約２９，０００種の遺伝子転写物を含むヒトＵ１３３Ａ遺伝子チップにてマイクロアレイ分析（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を行った。予備的なデータ分析では、約８００の遺伝子がＳＶＣよりも脂肪細胞で優先的に発現された（３倍超）。これらのうち、急性期ＳＡＡ（Ａ−ＳＡＡ）は、脂肪細胞において最も豊富な１０の遺伝子の１種であった。ＲＴ−ＰＣＲ分析により、ヒト脂肪細胞においてはＡ−ＳＡＡの高い発現が確認されたが、ＳＶＣでは確認されず、皮下脂肪層と大網脂肪層の間では発現に有意な差はなかった（図１Ａ）。ヒトＳＡＡ１とＳＡＡ２はｃＤＮＡレベルで約９７％同一であることから、ＳＡＡ２をノーザン分析によるＡ−ＳＡＡ（ＳＡＡ１及びＳＡＡ２）遺伝子発現のプローブとして用いた。図１Ｂ（左上のパネル）は、Ａ−ＳＡＡがヒト脂肪組織で選択的かつ豊富に発現するが、肝臓では発現がはるかに低いことを示す。肝臓組織よりも脂肪でＡ−ＳＡＡ発現が高い点（約１５倍）は、脂肪組織と肝臓組織の更なる検体を含む、独立したノーザンブロットでも確認された（図１Ｂ、右上のパネル）。これに対してマウスでは、マウスＳＡＡ１  ｃＤＮＡと約９５％同一であるマウスＳＡＡ２  ｃＤＮＡプローブを用いたノーザンブロット分析が示したところでは、Ａ−ＳＡＡは主として肝臓で発現し、脂肪組織では発現しない。更に、イソ型特異的ＰＣＲプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ分析では、ヒト脂肪組織においてＳＡＡ１とＳＡＡ２はほぼ同等の発現を示すことが明らかになった。これらの研究は、ヒトにおいてＡ−ＳＡＡが主として脂肪組織、より具体的には、脂肪細胞で発現することを示す。
【００９３】
ヒトにおいて、血清Ａ−ＳＡＡは体格指数（ＢＭＩ）と共に増加し、体重減少後に減少する。血清Ａ−ＳＡＡレベルと体脂肪量の直接的相関は、年齢及び性別が合致するが、ＢＭＩが異なる（３ｋｇ／ｍ２超）非糖尿病の兄弟姉妹１９組において血漿中のＡ−ＳＡＡレベルを測定することにより確認された。両側ｔ検定は、肥満兄弟姉妹において有意に高いＡ−ＳＡＡレベル（ｐ＝０．０４４）と、ＢＭＩとＳＡＡ差間の正のスペアマン相関を（ｒ＝０．５４、ｐ＝０．０１７）を示した。ＢＭＩが一定の範囲にわたる１３４名の非糖尿病男女の拡大セットにおいては、ＢＭＩは順変換ＳＡＡレベルの有意な予測因子であった（ｐ＝０．０２５、年齢、性別及び家族構成に関して調整）。被験者を低体重（ＢＭＩ＜２５ｋｇ／ｍ２）、過体重（２５ｋｇ／ｍ２＜ＢＭＩ＜３０ｋｇ／ｍ２）及び肥満（ＢＭＩ＞３０ｋｇ／ｍ２）に分類した場合、肥満群の血清ＳＡＡレベル（分析時は順変換、表示時は逆変換）は、低体重群より約４３％高かった（ｐ＝０．０１３、年齢、性別及び家族構成に関して調整）。低カロリー食と運動によって８．７±５．１ｋｇ（−１０±２％）体重減少し、ＢＭＩの低下が約４ｋｇ／ｍ２（３３．０＋４．１ｋｇ／ｍ２〜２９．０＋３．８ｋｇ／ｍ２（平均値＋Ｓ．Ｄ．）である別の２４名の女性群では、２４名の女性のうち１９名で血清Ａ−ＳＡＡの著しい減少が見られ、ＳＡＡは平均約２７％低下した（図３Ａ、ｐ＜０．０１）。更に、血清ＳＡＡ濃度の変化は体脂肪量の変化と相関しており（図３Ｂ、ｒ＝０．５５、ｐ＜０．０１）、及び脂肪を含まない体重の変化とは相関していなかった（ｒ＝０．２３、ｐ＝０．３）。
【００９４】
ロジグリタゾンは血清ＳＡＡを低下させ、脂肪のＳＡＡ産生を抑制する。ＰＰＡＲγアゴニストであるロジグリタゾンはＡ−ＳＡＡを調節することができた。１２週間の間、被験者の体重又は脂肪量には統計学的に有意な差は無かったが、血清Ａ−ＳＡＡレベルは、全ての被験者で処置後に大きく低下した（ｐ＜０．０５）（図４）。更に、ロジグリタゾンの投与を受けたこれらの同じ患者からのＡ−ＳＡＡの脂肪組織分泌は有意に低下した（図４）。従って、本発明は、必要とする被験者にロジグリタゾンを投与することを含む、血清Ａ−ＳＡＡレベルを低下させる方法を提供する。
【００９５】
ロジグリタゾンは脂肪組織と直接相互作用することによって脂肪のＡ−ＳＡＡ分泌を阻害することが示された。ロジグリタゾンで処置されていないヒト被験者から脂肪生検を採取し、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養し、培養培地においてＡ−ＳＡＡの低い基礎レベルが検出された。デキサメタゾン（２５ｎＭ）及びインスリン（７ｎＭ）を含有する培地で組織を培養すると、ホルモン非存在下で培養した場合に比べて高いＡ−ＳＡＡ産生が得られた（図５）。しかしながら、ロジグリタゾンを添加すると、この培地における、Ａ−ＳＡＡ分泌のインスリン／デキサメタゾン刺激は約７０％低下した。
【００９６】
ＳＡＡは炎症性サイトカインである。本明細書に記載の方法の結果、肥満症と炎症の間の関連性を示し、Ａ−ＳＡＡが、肥満症に関連する炎症に関与する炎症性メディエーターであることが確認される。一次ヒト冠動脈血管内皮細胞（ＨＣＶＥＣ）及びマウス単球細胞系統ＲＡＷ２６４をビヒクル（ＰＢＳ）、及び低濃度（０．４７μｇ／ｍｌ）又は高濃度（２．３μｇ／ｍｌ）のＳＡＡで約８時間処理し、その細胞馴化培地をサイトカイン産生に関してアッセイした。図６Ａに示されるように、培養培地にＡ−ＳＡＡを添加すると、ＨＣＶＥＣ細胞においてはＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、及びプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤−１（ＰＡＩ−１）の放出、また、ＲＡＷ２６４細胞においてはＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦα及びＲＡＮＴＥの放出が用量依存的に著しくに促進された。ヒト組換えＡ−ＳＡＡにＬＰＳの混入の有無を調べるため、組換えＡ−ＳＡＡにおいて可能性のある内毒素の最大混入量より約１５倍高い濃度である１ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを用いたところ、いずれの細胞培養においてもサイトカイン分泌は促進されなかった。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１Ａ】Ａ−ＳＡＡ  ｍＲＮＡの組織限定発現を示す。図１Ａは、ヒト大網（Ｏ）及び皮下（Ｓ）脂肪組織から分画された間質血管細胞（ＳＶＣ）及び脂肪細胞（ＦＣ）におけるＳＡＡ及びβ−アクチン遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を表す。図１Ｂ及び図１Ｃは、ヒト及びマウスそれぞれのマルチプルティッシュノーザンブロットの分析結果を表す。全てのノーザン分析について、示された組織の全ＲＮＡ約１５μｇをナイロンメンブランにブロットし、放射性標識ヒト（図１Ｂ）又はネズミ（図１Ｃ）ＳＡＡ２  ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ＲＮＡの存在は、臭化エチジウム染色によって可視化した。
【図１Ｂ】Ａ−ＳＡＡ  ｍＲＮＡの組織限定発現を示す。図１Ａは、ヒト大網（Ｏ）及び皮下（Ｓ）脂肪組織から分画された間質血管細胞（ＳＶＣ）及び脂肪細胞（ＦＣ）におけるＳＡＡ及びβ−アクチン遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を表す。図１Ｂ及び図１Ｃは、ヒト及びマウスそれぞれのマルチプルティッシュノーザンブロットの分析結果を表す。全てのノーザン分析について、示された組織の全ＲＮＡ約１５μｇをナイロンメンブランにブロットし、放射性標識ヒト（図１Ｂ）又はネズミ（図１Ｃ）ＳＡＡ２  ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ＲＮＡの存在は、臭化エチジウム染色によって可視化した。
【図１Ｃ】Ａ−ＳＡＡ  ｍＲＮＡの組織限定発現を示す。図１Ａは、ヒト大網（Ｏ）及び皮下（Ｓ）脂肪組織から分画された間質血管細胞（ＳＶＣ）及び脂肪細胞（ＦＣ）におけるＳＡＡ及びβ−アクチン遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を表す。図１Ｂ及び図１Ｃは、ヒト及びマウスそれぞれのマルチプルティッシュノーザンブロットの分析結果を表す。全てのノーザン分析について、示された組織の全ＲＮＡ約１５μｇをナイロンメンブランにブロットし、放射性標識ヒト（図１Ｂ）又はネズミ（図１Ｃ）ＳＡＡ２  ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ＲＮＡの存在は、臭化エチジウム染色によって可視化した。
【図２】急性−ＳＡＡは体格指数（ＢＭＩ）と正の相関があることを示す。低体重（ＢＭＩ＜２５ｋｇ／ｍ２、ｎ＝５４）、過体重（ＢＭＩ２５〜３０ｋｇ／ｍ２、ｎ＝４９）及び肥満（ＢＭＩ＞３０ｋｇ／ｍ２、ｎ＝３１）群に分類した健常なヒト被験者の血漿中のＳＡＡレベルを測定した。データは、年齢、性別及び家族構成に関して調整した平均値＋ＳＥＭ（分析時は順変換、表示時は逆変換）として表す。＊低体重群に対してｐ＝０．０１３
【図３Ａ】食事療法及び運動による体重減少に伴う血清Ａ−ＳＡＡの低下を示す。図３Ａは、食事療法及び運動による体重減少の前後での血清Ａ−ＳＡＡレベルを示す。データは、平均値＋ＳＥＭ、ｎ＝２４として表される。対数変換後、両側ｔ検定を行った。＊＊ｐ＜０．０１。図３Ｂは、体重減少前後の、血清Ａ−ＳＡＡレベルの変化と体脂肪量の変化の間の相関関係を表す。Ｒ＝０．５５、ｐ＜０．０１、ｎ＝２４。
【図３Ｂ】食事療法及び運動による体重減少に伴う血清Ａ−ＳＡＡの低下を示す。図３Ａは、食事療法及び運動による体重減少の前後での血清Ａ−ＳＡＡレベルを示す。データは、平均値＋ＳＥＭ、ｎ＝２４として表される。対数変換後、両側ｔ検定を行った。＊＊ｐ＜０．０１。図３Ｂは、体重減少前後の、血清Ａ−ＳＡＡレベルの変化と体脂肪量の変化の間の相関関係を表す。Ｒ＝０．５５、ｐ＜０．０１、ｎ＝２４。
【図４】ヒトの血清Ａ−ＳＡＡレベル及び脂肪Ａ−ＳＡＡ産生に対するロジグリタゾンの効果を示す。Ａ−ＳＡＡの血清Ａ−ＳＡＡ（ｎ＝８）及び脂肪分泌（ｎ＝７）は、非糖尿病ヒト被験者において、３か月のロジグリタゾン処置の前後にｅｘ  ｖｉｖｏで測定した。データをプロットし、各レベルを線でつなぐ。血清Ａ−ＳＡＡ及び各個体からのＳＡＡの脂肪分泌（各パネルの同じ記号は両試験の同じ個体を表す）は、ロジグリタゾンにより有意に低下した（対数変換後の両側ｔ検定（両比較ともＰ＜０．０１））。
【図５】ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける脂肪組織のＡ−ＳＡＡ産生を直接抑制することによるロジグリタゾンの効果を示す。脂肪組織は、細胞培養培地１９９（基本培地）又はインスリン（Ｉｎｓ、７ｎＭ）及びデキサメタゾン（Ｄｅｘ、５ｎＭ）を含む培地中、ロジグリタゾン（Ｒｏｓｉ、１μＭ）の存在又は不在下で約４８時間インキュベートした。ＳＡＡの産生を２４〜４８時間測定し、組織重に対して補正した。データは平均値＋ＳＥＭ、ｎ＝３で表す。＊＊Ｐ＜０．０１、対数変換後の片側ｔ検定。
【図６Ａ】炎症性サイトカインの媒介因子としてのＡ−ＳＡＡの効果を示す。ヒト冠動脈血管内皮細胞（ＨＣＶＥＣ）（図６Ａ）及びマウス単球ＲＡＷ２６４（図６Ｂ）を、血清フリー培地中で約８時間、ビヒクル（リン酸緩衝生理食塩水、白い棒）、低濃度のＳＡＡ（０．４７μｇ／ｍｌ、斜線の棒）又は高濃度のＳＡＡ（２．３４μｇ／ｍｌ、黒い棒）で処置した。細胞を含まない上清を、Ｌｕｍｉｎｅｘによりサイトカインに関してアッセイした。データは、３〜４回の独立した実験の平均値＋ＳＥＭとして表されている。ＳＡＡ処置群と対照の間には、統計学的に有意であること（＊ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１、片側ｔ検定）が観察された。
【図６Ｂ】炎症性サイトカインの媒介因子としてのＡ−ＳＡＡの効果を示す。ヒト冠動脈血管内皮細胞（ＨＣＶＥＣ）（図６Ａ）及びマウス単球ＲＡＷ２６４（図６Ｂ）を、血清フリー培地中で約８時間、ビヒクル（リン酸緩衝生理食塩水、白い棒）、低濃度のＳＡＡ（０．４７μｇ／ｍｌ、斜線の棒）又は高濃度のＳＡＡ（２．３４μｇ／ｍｌ、黒い棒）で処置した。細胞を含まない上清を、Ｌｕｍｉｎｅｘによりサイトカインに関してアッセイした。データは、３〜４回の独立した実験の平均値＋ＳＥＭとして表されている。ＳＡＡ処置群と対照の間には、統計学的に有意であること（＊ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１、片側ｔ検定）が観察された。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【国際調査報告】
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