(57)【要約】本発明は、合成培養培地において真核生物細胞によって組換タンパク質を生産する方法であって、前記真核生物細胞は、ポリヒドロキシル化ポリアルキレンミンをベースとする合成の遺伝子導入剤を含む組成物により遺伝子導入される方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成培養培地において真核生物細胞によって組換タンパク質を生産する方法であって、前記真核生物細胞は、ポリヒドロキシル化ポリアルキレンイミンをベースとする合成遺伝子導入剤を含む組成物により遺伝子導入される、方法。
【請求項２】
前記ポリアルキレンイミン誘導体は、分枝状または線状（linear）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリアルキレンイミン基は、任意のヒドロキシル化誘導体と、例えば、アミン、エステルまたはアミドリンカーを介して連結する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリアルキレンイミンは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ポリヒドロキシル化構造は、炭水化物、例えば、単糖、二糖またはオリゴ糖を含む、請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
炭水化物構造は、糖、例えば、グルコース、マンノース、ガラクトースまたはフコース残基を含む、請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
炭水化物構造は、グルクロン酸のエステルまたはアミドのオリゴマーに対応する、請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
ポリヒドロキシル化構造は、ヒドロキシル化アルキルモチーフ、例えば、エトキシ基を含む、請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
遺伝子導入組成物は、１以上の中性ポリマーをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
ポリアルキレンイミンの分子量は、１〜１０００ｋＤａである、請求項１〜９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
ポリアルキレンイミンの窒素残基のポリヒドロキシル化の程度は、０．１％超である、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、合成培養培地における真核生物細胞による組換タンパク質の生産に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、組換タンパク質の大量スケールでの工業的生産のために真核生物細胞系が用いられる。HEK-293およびCHO細胞、およびそれらに由来するクローンは、最も一般的に用いられる細胞系であり、懸濁液中または粘着形態下に培養される。規制要件を満たすために、生産系は、現在、動物起源のあらゆる化合物を欠いていなければならない。その後、HEK-293およびCHOの培養を可能にする無血清培養培地が開発された。しかしながら、依然として、増殖因子としてタンパク質が加えられた。全体的な合成培養培地の組成が全体的に規定されている、すなわち、全ての化合物が知られており、それらのいずれもが動物起源のものでないものが、有利に用いられる。
【０００３】
特異的な遺伝子導入剤が開発された。例えば、合成培地、例えば、FreeStyle（Invitrogen）においてHEK-293細胞を特異的に遺伝子導入する293-Fectin（登録商標）である。しかしながら、この剤は、それらが開発された対象の培養培地のためにのみ効果的である。
【０００４】
より広いスペクトルを有する遺伝子導入剤が、大いに用いられた。すなわち、ポリエチレンイミンについてのＰＥＩである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、ここで、ＰＥＩの誘導体が、あらゆる合成培地における真核生物細胞による組換タンパク質の生産のための遺伝子導入剤として特に効果的であることを見出した。同様の結果はまた、他のポリアルキレンイミン誘導体、特に、ポリプロピレンイミン誘導体により得られた。
【０００６】
それ故に、本発明は、このような誘導体の使用を包含する組換タンパク質の生産のための新しい方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明による方法は、ポリヒドロキシル化ポリアルキレンイミン誘導体をベースとする合成遺伝子導入試薬を含む組成物による真核生物細胞の遺伝子導入を包含する。
【０００８】
本発明による方法は、高親水性ポリアルキレンイミン誘導体をベースとする遺伝子導入の組成物を含む。
【０００９】
前記ポリアルキレンイミン誘導体は分枝状または線状（linear）である。前記ポリアルキレンミン基は、あらゆるヒドロキシル化誘導体と、例えば、アミン、エステル、アミドリンカーを介して連結されている。
【００１０】
好ましいポリアルキレンイミンは、ポリエチレンイミン（短くはＰＥＩ）またはポリプロピレンイミン（短くはＰＰＩ）である。
【００１１】
有利には、ポリヒドロキシル化構造は、炭水化物、例えば、単糖、二糖またはオリゴ糖を含む。
【００１２】
炭水化物構造は、より特定的には、糖、例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、フコース残基を含む。
【００１３】
炭水化物構造はまた、グルクロン酸のエステルまたはアミドのオリゴマーに対応してもよい。
【００１４】
ポリヒドロキシル化構造は、ヒドロキシル化されたアルキルモチーフ（motif）、例えば、エトキシ基を含んでもよい。
【００１５】
好ましい遺伝子導入組成物は、１以上の中性ポリマーをさらに含む。
【００１６】
ポリアルキレンイミンの分子量（ＭＷ）は、好ましくは、約１〜１０００ｋＤａである。
【００１７】
ポリアルキレンイミンに移植されるグリコシド鎖は１〜２０の配糖体（osidic）単位を含む。
【００１８】
好ましい遺伝子導入組成物において、ポリアルキレンイミンの窒素残基のヒドロキシル化の程度は０．１％超である。ヒドロキシル化の程度は、例えば、エトキシまたはプロポキシ改変ポリマーにより８０％以上に達してもよい。
【００１９】
本発明の方法は、特に、組換タンパク質生産に適している合成培地における非粘着性または粘着性の細胞生育の効率的かつ一時的なの遺伝子導入に有用である。
【００２０】
本発明の他の特徴および利点は、以降において、遺伝子導入剤：グリコシル化ＰＥＩを含む遺伝子導入組成物の使用によって与えられ、かつ、例示されることになる。
【００２１】
この剤は、以降においては「ＴＡ」によって示されることになる。
【００２２】
前記実施例において、図１〜５が参照されることになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（グリコシル化された線状のＰＥＩ接合体の合成）
ＰＥＩは、Erbacher Pら，1999；1:210-222 Transfection and physical properties of various saccharides,poly(ethylene glycol),and antibody derivatized polyethylenimines(PEI)，S Gene Medによって既に記載されるようにシアノボロ水素化ナトリウムの存在下の還元的アミノ化手順によってグリコシル化された。線状のテトラグルコース（Ｇｌｃα４−Ｇｌｃα４−Ｇｌｃα６−Ｇｌｃ，Sigma）または線状のテトラガラクトース（Ｇａｌα３−Ｇａｌβ４−Ｇａｌα６−Ｇａｌ，Dextra Laboratories Ltd）またはラクトース（Glcα4-Gal，Sigma）（５μｍｏｌ）およびシアノボロ水素化ナトリウム（２５μｍｏｌ，Aldrich）が、０．９ｍｌのホウ酸バッファー０．２Ｍ（ｐＨ８．２）中の線状のＰＥＩ（１００μｍｏｌのモノマー，jetPEI（登録商標），polyplus-Transfection SAS）に加えられ、９６時間にわたって室温で一定の攪拌下に放置された。低分子量化合物が、Sephadex-G25微細（fine）カラム（１２．５×４５０ｍｍ，Fluka）上で０．１５ＭのＮａＣｌにおいて取り除かれた。ＰＥＩ分子当たりの種々のグリコシル構造の移植範囲（窒素当たりのグリコシルモチーフの百分率として表される）は、レゾルシノール／硫酸微量法（micromethod）を用いることによって決定され、３〜５％であった。
【００２４】
（懸濁細胞の一過性の遺伝子導入）
１．  懸濁培養生育条件
・合成培地への細胞の適合
HEK-293またはCHO細胞は、４ｍＭのグルタミン、１％のPLURONIC（登録商標）F-68（１０％溶液）を含有する合成培地において、ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質を伴ってまたは伴わないで生育させられる。５０ｍＬの合成培地における細胞の適応のために、細胞は、５０ｍＬの合成培地当たり５０００００細胞で、２５０ｍＬのポリカーボネートエルレンアマイヤーまたは振とうフラスコ中で播種され、３〜５日間にわたって３７℃で８％のＣＯ２を有する湿気のある雰囲気中、１２５ｒｐｍの軌道を描く一定の振とう下にインキュベートされる。
【００２５】
・遺伝子導入のための細胞の調製
遺伝子導入の前に、細胞は、新鮮な合成培地により一度洗浄され、遠沈され、カウントされる。細胞は、容積（ｍＬ）当たり１００万で、FreeStyle（登録商標）（Invitrogen）培地中に播種され、３７℃で、８％のＣＯ２中、一定の振とう下に、３ｍＬの全容積においてインキュベートされる。
【００２６】
２．ＴＡ／プラスミドＤＮＡ複合体の調製および遺伝子導入手順
用いられる合成培養培地によれば、遺伝子導入剤とプラスミドＤＮＡとの間の比は、ＤＮＡの重量（μｇ）当たり１〜３μＬで変動し得る。通常推奨されるのは、最適条件を決定するために２つの異なる量のプラスミドＤＮＡを試験することである。遺伝子導入試薬の量対HEK-293およびCHO細胞についてのプラスミドＤＮＡの量は、いくつかの市販の合成培養培地に対して最適化された。これらの最適化条件は、表１に要約される。異なるＤＮＡ／遺伝子導入剤比による遺伝子導入については表２を参照のこと。
【００２７】
【表１】
2008529544.tif 000002
【００２８】
２．１．  １ｍＬの細胞培養のための遺伝子導入手順
１ｍＬの合成培地中１×１０６個の懸濁細胞の遺伝子導入のための条件は、与えられる。大容積の培地（１〜１０ｍＬ）において遺伝子導入を行うために、播種する総細胞数並びに遺伝子導入試薬およびプラスミドＤＮＡの量は、比例して変化させられなければならない。
【００２９】
（細胞培養の容積（ｍＬ）当たり２μｇのＤＮＡの遺伝子導入のためのプロトコル）
・５０μＬの合成培地（PLURONIC（登録商標）F-68および抗生物質を有しない）中に２μｇのプラスミドＤＮＡを希釈する。１０秒間にわたり振とうし、室温で１５分間にわたりインキュベートする。
【００３０】
・５０μＬの合成培地（PLURONIC（登録商標）F-68および抗生物質を有しない）中に２μＬのＴＡ試薬を希釈する。１０秒間にわたり振とうし、室温で１５分間にわたりインキュベートする。
【００３１】
・５０μＬのＴＡ溶液を、５０μＬのプラスミドＤＮＡ溶液に迅速に全てを一度で加える。
【００３２】
・１０秒間にわたり振とうする。
【００３３】
・複合体形成を可能にするために３０分間にわたって室温でインキュベートする。
【００３４】
・１００μＬのＴＡ／プラスミドＤＮＡ複合体溶液を、１ｍＬの細胞懸濁液（密度：１×１０６細胞／ｍｌ）に加え、３７℃で、８％のＣＯ２を有する湿った雰囲気中、１２５ｒｐｍの軌道を描く一定の振とう下にインキュベートする（細胞培養容器のフォーマットを、最終の遺伝子導入容積に適合させる。１〜２ｍＬのために１０ｍＬのポリカーボネート丸底管を使用し、３〜１０ｍＬのために５０ｍＬのポリカーボネート円錐管を使用する）。
【００３５】
・最大のタンパク質産生が、通常、遺伝子導入４８時間後に観察される。
【００３６】
２．２．  ５０ｍＬの細胞培養のための遺伝子導入手順
推奨されるのは、最適化のためにプラスミドＤＮＡの２つの異なる量：５０および１００μｇ（表２）を試験することである。以下のプロトコルは、１００μｇのＤＮＡおよび１００μＬのＴＡによる、５０ｍＬの合成培地において生育する５０×１０６の懸濁細胞（１×１０６細胞／ｍＬ）の遺伝子導入に適している。
【００３７】
・１００μｇのプラスミドＤＮＡを２．５ｍＬの合成培地（PLURONIC（登録商標）F-68および抗生物質を有しない）中に希釈する。１０秒間にわたり振とうし、室温で１５分間にわたり放置した。
【００３８】
・１００μＬのＴＡを２．４ｍＬの合成培地（PLURONIC（登録商標）F-68および抗生物質を有しない）中に希釈する。１０秒間にわたり振とうし、室温で１５分間にわたりインキュベートする。
【００３９】
・２．５ｍＬのＴＡ溶液を２．５ｍＬのプラスミドＤＮＡ溶液に迅速に全部一度に加える。
【００４０】
・直ぐに、１０秒間にわたって振とうしながら混合する。
【００４１】
・複合体の形成を可能にするために３０分間にわたって室温でインキュベートする。
【００４２】
・５ｍＬのＴＡ／プラスミドＤＮＡ複合体溶液を、２５０ｍＬの振とうフラスコ（ポリカーボネートエルレンマイヤーフラスコ）中の５０ｍＬの細胞懸濁液（密度：１×１０６細胞／ｍＬ）に加え、３７℃で、８％のＣＯ２を有する湿った雰囲気中、１２５ｒｐｍの軌道を描く一定の振とう下にインキュベートする。
【００４３】
・最大のタンパク質産生が、通常、遺伝子転移の４８時間後に見出される。
【００４４】
大容積の培地において遺伝子導入を行うために、播種する総細胞数並びに遺伝子導入試薬およびプラスミドＤＮＡの量は、比例して変更されなければならない。
【００４５】
【表２】
2008529544.tif 000003
【００４６】
（粘着細胞の一時的な遺伝子導入）
１．  細胞の播種
ＴＡによる最適な遺伝子導入条件のために、細胞は、５０〜６０％の融合性（confluent）であるべきである。典型的には、２４ウェルプレートにおける遺伝子導入のために、遺伝子導入２４時間前にウェル当たり５００００細胞が播種される。他の培養フォーマットのために、遺伝子導入前の日に播種する細胞の推奨される数についての表３を参照する。
【００４７】
表３は、種々の細胞培養フォーマットのための複合体調製を与える。
【００４８】
【表３】
2008529544.tif 000004
【００４９】
２．  ＴＡ／ＤＮＡ複合体の調製および遺伝子導入手順
２．１  １ｍＬの細胞培養のための遺伝子導入手順
以下のプロトコルは、２４ウェル組織プレートにおける遺伝子導入のために与えられ、他の培養フォーマットにおける遺伝子導入のために表３を参照する。条件は、１ｍＬの合成培地中の５００００細胞の遺伝子導入のために与えられる。最適化の間、本発明者らは、プラスミドＤＮＡの２つの異なる量；２μｇおよび１μｇを試験することを推奨した。以下のプロトコルは、２μｇのＤＮＡの遺伝子導入のために準備される。
【００５０】
・２μｇのプラスミドＤＮＡを５０μＬの合成培地（PLURONIC（登録商標）F-68および抗生物質を有しない）中に希釈する。１０秒間にわたり振とうし、室温で１５分間にわたって放置する。
【００５１】
・２μＬのＴＡを５０μＬの合成培地（PLURONIC（登録商標）F-68および抗生物質を有しない）中に希釈する。１０秒間にわたって振とうし、室温で１５分間にわたってインキュベートする。
【００５２】
・５０μＬのＴＡ溶液を５０μＬのプラスミドＤＮＡ溶液に迅速に全て一度に加える。
【００５３】
・すぐに１０秒間にわたって振とうしながら混合する。
【００５４】
・複合体形成を可能にするために３０分間にわたって室温でインキュベートする。
【００５５】
・１００μＬのＴＡ／プラスミドＤＮＡ複合体溶液を、一滴ずつ、各ウェル中に加え、プレートを穏やかに旋回させることによって混合物をホモジナイズする。
【００５６】
・３７℃、５または８％のＣＯ２を有する湿った雰囲気中でインキュベートする。
【００５７】
・遺伝子導入実験は、通常、２４〜４８時間後に停止させられ、タンパク質発現が評価される。
【００５８】
（合成培地における懸濁非粘着性HEK-293細胞の遺伝子導入）
細胞は、FreeStyle（登録商標）（Invitrogen）培地における容積（１ｍＬ）当たり１００万で播種され、３７℃で、８％ＣＯ２存在下、一定の振とう下に、３ｍＬの総容積でインキュベートされる。細胞は、６μｇのプラスミドＤＮＡ（pCMVLuc）および６μＬのPEI-GLc4（線状のテトラグルコシルＰＥＩ誘導体）により遺伝子導入された。293Fectin（登録商標）（Invitrogenから）およびjetPEI（登録商標）（線状のポリエチレンイミン，Polyplus-Transfectionから）が、製造業者の推奨に従って用いられた。ルシフェラーゼタンパク質含有量（ルシフェラーゼのｎｇ）は、遺伝子導入の２４時間後に定量される。各遺伝子導入は、３回なされた。
【００５９】
結果は、図１上に与えられる。
【００６０】
PEI-Glc4により得られるルシフェラーゼレベルは、未改変の線状ポリエチレンイミン（jetPEI（登録商標））により得られるレベルより高いことはほとんどなく、このタンパク質産生用途のために特別に設計された293-Fectin（登録商標）により得られるレベルに好適に匹敵していた。
【００６１】
（種々の合成培地における懸濁非粘着CHO細胞の遺伝子導入）
細胞は、CD-CHO（Invitrogen）、ProCHO（登録商標）−４（Cambrex）またはCHOExpress（PAA Laboratories）培地のいずれかの容積（１ｍＬ）当たり１００万で播種され、３７℃で、８％ＣＯ２中、一定の振とう下、３ｍＬの総容積においてインキュベートされた。細胞は、６μｇのpCMVluc DNAおよび１８μＬのPEI-Glc4または３０μＬのLipoFectAmine2000（LipoFect，Invitrogen）により遺伝子導入された。ルシフェラーゼ発現（ＲＬＵ）は、遺伝子導入の２４時間後にアッセイされた。各実験は、３回なされた。
【００６２】
結果は、図２に与えられ、LipofectAmine2000と比較してPEI-Glc4が遺伝子導入においてより効果的であることを示す。
【００６３】
細胞は、ProCHO（登録商標）−４（Cambrex）培地の容積（１ｍＬ）当たり１００万で、５０ｍＬの総容積で播種され、３７℃で、８％ＣＯ２中、一定の振とう下にインキュベートされた。細胞は、ＤＮＡの重量（μｇ）当たり２μｇ／ｍＬのpCMVhVEGF165DNA（ヒト血管増殖因子（vascular growth factor）をコードする）および３μＬのPEI-Glc4により遺伝子導入された。産生されたＶＥＧＦタンパク質の量は、遺伝子導入後の種々の時間においてＥＬＩＳＡによって定量された。各定量化は３通りなされる。
【００６４】
結果は、図３上に与えられる。分泌されたＶＥＧＦの定量化は、多くの日にわたって持続した産生を示し、これは、治療的興味のタンパク質生産のためのPEI-Glc4適用の有効性を裏付ける。
【００６５】
他の実験において、
細胞は、ProCHO（登録商標）−４（Cambrex）培地中の容積（１ｍＬ）当たり１００万で、３または５０ｍＬまたは５００ｍＬの種々の総容積で播種され、３７℃で、８％ＣＯ２中、一定の振とう下にインキュベートされた。細胞は、ＤＮＡの重量（μｇ）当たり２μｇ／ｍＬのpCMVhVEGF165DNA（ヒト血管増殖因子をコードする）および３μＬのPEI-Glc4により遺伝子導入された。産生されたＶＥＧＦタンパク質の量は、ＥＬＩＳＡによって、遺伝子導入後の種々の時間に定量された。各定量化は３回なされる。
【００６６】
結果は、図４上に与えられ、PEI-Glc4が、その遺伝子導入特性に影響を及ぼすことなくバイオリアクターの種々の容積においてタンパク質生産のスケールアップによく適合させられることを示す。
【００６７】
さらに他の実験において、
細胞は、ProCHO（登録商標）−４（Cambrex）培地中の容積（１ｍＬ）当たり１００万で、５０ｍＬの総容積において播種され、３７℃で、８％ＣＯ２中、一定の振とう化にインキュベートされた。細胞は、ＤＮＡの重量（μｇ）当たり２μｇ／ｍＬのpCMVhVEGF165DNA（ヒト血管増殖因子をコードする）および３μＬのPEI-Glc4またはjetPEI（登録商標）により遺伝子導入された。産生されるＶＥＧＦタンパク質の量は、ＥＬＩＳＡによって遺伝子導入５日後に定量された。各定量化は３回なされた。
【００６８】
結果は、図５において与えられる。比較は、PEI-Glc4誘導体および線状ＰＥＩ（jetPEI（登録商標））により遺伝子導入された合成ProCHO（登録商標）−４培地中の非粘着ＣＨＯ細胞の間で提示される。結果は、PEI-Glc4により得られるレベルと比較して未改変線状ＰＥＩによる遺伝子導入後に非常に低いレベルのＶＥＧＦ産生を示す。
【００６９】
表４は、３ｍＬの合成培地における非粘着ＣＨＯ細胞の遺伝子導入２日後のＶＥＧＦ産生についての細胞密度の効果を与える。遺伝子導入は、各遺伝子導入剤について２μｇ／ｍＬのpCMVLucプラスミドおよび３μＬ／μｇのＤＮＡにより行われた。ＶＥＧＦ量は、ＥＬＩＳＡによって決定された。各実験は、３回なされる。
【００７０】
【表４】
2008529544.tif 000005
【００７１】
表４は、ＴＡが用いられる場合の非粘着ＣＨＯ細胞の遺伝子導入条件の最適化の例を提示する。結果は、通常組換タンパク質産生方法に適用される高密度細胞培養（＞５０００００細胞／ｍＬ）に適した遺伝子導入条件を示す。
【００７２】
表５は、３ｍＬのProCHO-4培地中の非粘着ＣＨＯ細胞の遺伝子導入の有効性についての線状ＰＥＩに移植されたグリコシルモチーフの効果を与える。遺伝子導入は、各遺伝子導入試薬について２μｇ／ｍＬのpCMVLucプラスミドおよび３μＬ／μｇのＤＮＡにより行われた。ルシフェラーゼ活性は、遺伝子導入の４８時間後に決定された。各実験は、３回なされる。
【００７３】
【表５】
2008529544.tif 000006
【００７４】
表５は、線状ＰＥＩの種々のグリコシル化誘導体を用いる、pCMVLucプラスミドの一過性の遺伝子導入後のProCHO（登録商標）−４培地中の非粘着ＣＨＯ細胞において産生されたルシフェラーゼタンパク質の活性レベルを提示する。線状ＰＥＩ上に移植されたグリコシルモチーフの構造は、タンパク質産生の全体的レベルに大きくは影響を及ぼすことなく異なり得る。グリコシルモチーフ、例えば、グルコシル、ガラクトシル残基を識別する配糖体の性質は、遺伝子導入によって産生された組換タンパク質レベルについて主要な効果を有しない。実際に、線状ＰＥＩの全てのグリコシル誘導体は、未改変線状ＰＥＩより効果的である。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】合成培地における懸濁HEK-293細胞の遺伝子導入
【図２】種々の合成培地における懸濁CHO細胞の遺伝子導入
【図３】懸濁CHO細胞におけるＶＥＧＦ生産
【図４】懸濁CHO細胞におけるＶＥＧＦ生産
【図５】懸濁CHO細胞におけるＶＥＧＦ生産
【図１】
2008529544.tif 000007
【図２】
2008529544.tif 000008
【図３】
2008529544.tif 000009
【図４】
2008529544.tif 000010
【図５】
2008529544.tif 000011
【国際調査報告】
2008529544.tif 000012
2008529544.tif 000013
2008529544.tif 000014