(57)【要約】  修飾核酸は研究、診断及び治療プロトコルにおいて多くの目的のために使用される。しかし、このような分子の直接配列決定は通常、特別な条件を必要とすると考えられている。修飾核酸分子を用いてｃＤＮＡを調製し、修飾核酸分子の配列決定を行う方法を記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２’−修飾ヌクレオチドを含む修飾核酸のヌクレオチド配列を決定するための方法であって、
（ａ）多数の２’−修飾ヌクレオチドを含有する修飾核酸の試料を得ること；
（ｂ）逆転写酵素を用いて前記修飾核酸に相補的な第一のｃＤＮＡを合成すること；
（ｃ）２本鎖ｃＤＮＡを形成させるために、ＤＮＡポリメラーゼを用いて前記第一のｃＤＮＡに相補的な第二のｃＤＮＡを合成すること；
（ｄ）前記２本鎖ｃＤＮＡの複数の２本鎖コピーを生成させること；ならびに
（ｅ）前記２本鎖コピーの配列決定を行うこと；
を含み、前記修飾核酸は、多数の２’−フッ素化ヌクレオチド及び多数の２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドを含む方法。
【請求項２】
前記修飾核酸において、前記２’−フッ素化ヌクレオチドが、総ヌクレオチドの１０％から７０％を占める、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記修飾核酸において、前記２’−フッ素化ヌクレオチドが、総ヌクレオチドの少なくとも４０％を占める、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記修飾核酸において、前記２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドが、総ヌクレオチドの１０％から７０％を占める、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記修飾核酸において、前記２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドが総ヌクレオチドの少なくとも４０％を占める、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記修飾核酸において、前記２’−フッ素化ヌクレオチドが総ヌクレオチドの１０％から７０％を占め、ならびに前記修飾核酸において、前記２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドが総ヌクレオチドの１０％から７０％を占める、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記修飾核酸が、大きな親水性部分を含有する５’共有修飾をさらに含む、請求項１から請求項６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
５’又は３’の大きな親水性部分を含む修飾核酸のヌクレオチド配列を決定するための方法であって、
（ａ）５’又は３’の大きな親水性部分を含有する修飾核酸の試料を得ること；
（ｂ）逆転写酵素を用いて前記修飾核酸に相補的な第一のｃＤＮＡを合成すること；
（ｃ）２本鎖ｃＤＮＡを形成させるために、ＤＮＡポリメラーゼを用いて前記第一のｃＤＮＡに相補的な第二のｃＤＮＡを合成すること；
（ｄ）前記２本鎖ｃＤＮＡの複数の２本鎖コピーを生成させること；ならびに
（ｅ）前記２本鎖コピーの配列決定を行うこと；
を含む方法。
【請求項９】
前記大きな親水性部分が、分枝鎖もしくは直鎖、置換もしくは非置換の、アルキル、アルケニル、アリール又は複素環基の、ホモポリマーもしくはヘテロポリマーからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記大きな親水性部分が、ポリエチレングリコール部分である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記大きな親水性部分が、１０から５０ｋＤａのポリエチレングリコール部分である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記修飾核酸が、少なくとも１個の２’−フッ素化ヌクレオチド又は少なくとも１個の２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドをさらに含有する、請求項８から請求項１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
（ｉ）段階（ｂ）の後、前記第一のｃＤＮＡを精製すること；ならびに
（ｉｉ）段階（ｃ）の前に、前記第一のｃＤＮＡの３’末端をポリアデニル化すること
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
段階（ｄ）が、
（ｉ）クローニングベクターに前記２本鎖ｃＤＮＡをライゲーションすること；
（ｉｉ）前記クローニングベクターを用いて宿主細胞の形質転換を行うこと；
（ｉｉｉ）前記宿主細胞の子孫から前記クローニングベクターを単離すること；
（ｉｖ）前記宿主細胞から前記２本鎖コピーを単離することと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
段階（ｄ）が、オリジナルの鋳型分子として前記２本鎖ｃＤＮＡを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
修飾核酸に相補的なＤＮＡを合成する方法（該修飾核酸は、２’−修飾ヌクレオチドを含有する）方法であって、
（ａ）多数の２’−修飾ヌクレオチドを含む修飾核酸の試料を得ること；
（ｂ）逆転写酵素を用いて前記修飾核酸に相補的な第一のｃＤＮＡを合成すること；
を含み、前記修飾核酸は、多数の２’−フッ素化ヌクレオチド及び多数の２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドを含む方法。
【請求項１７】
前記修飾核酸が、大きな親水性部分を含有する５’共有修飾をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記大きな親水性部分が、分枝鎖もしくは直鎖、置換もしくは非置換の、アルキル、アルケニル、アリール又は複素環基の、ホモポリマーもしくはヘテロポリマーからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記大きな親水性部分が、ポリエチレングリコール部分である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記大きな親水性部分が、１０から５０ｋＤａのポリエチレングリコール部分である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
修飾核酸が、修飾３’末端をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国仮出願第６０／５９０，６０１号（２００４年７月２３日提出）の優先権を主張する。上記出願の全体的な教示を参照により本明細書中に組み込む。
【０００２】
本願は、分子生物学の分野に関する。具体的には、本発明は、修飾核酸の配列決定に関する。
【背景技術】
【０００３】
リボザイム、アプタマー及びｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）などの新規核酸分子には構造の必要条件を解明すること、診断用途及び治療法を含め、様々な用途がある。多くの場合、このような核酸分子は、核酸塩基、糖部分及び／又はヌクレオシド間結合の１以上の修飾を有する（Ｖｅｒｍａら、１９９８、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：９９−１３４）。多数の修飾オリゴヌクレオチド及びヌクレオシド三リン酸が知られており、利用可能である（例えば、ＴｒｉＬｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｌｅｅら、２００４、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３２：Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ  Ｄ９５−Ｄ１００）。しかし、修飾核酸の使用に伴う１つの問題は、このような分子の配列を確認することである。ある一定の修飾を含有する核酸分子が配列決定されてきたが、あるタイプの修飾を伴う核酸分子の配列決定は、一般的な方法を用いて行うのは困難であるか、又は不可能であると考えられている。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合されているものなど、修飾ＲＮＡ配列は、ある種の化学分解又はマススペクトロメトリー法を用いて配列決定できない。さらに、複数のタイプの修飾を含有する核酸分子の配列決定を行う場合困難に直面し、代替技術の開発が求められる（例えば、Ｇｒｏｓｊｅａｎら、２００４、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６５：３５７−９１を参照のこと。）。様々なポリメラーゼを用いた非天然ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドへの導入に対して制限があることが記載されている（Ｖｅｒｍａら、１９９８、前出；Ｋｉｓｓ及びＪａｄｙ、２００４、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２６５：３９３−４０８）。
【０００４】
例えば、診断法、スクリーニング法（例えば、医薬品を同定するために。）及び疾患の治療においてなど、修飾核酸分子の使用が益々増えている。例えば、アプタマーは、特異的にタンパク質リガンドに結合可能にする三次構造を有する核酸分子である（例えば、Ｏｓｂｏｒｎｅら、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：５−９；及びＰａｔｅｌ、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：３２−４６）。修飾塩基を含有する核酸のライブラリからこのような分子を選択することができる（例えば、試験管内人工進化法（ＳＥＬＥＸＴＭ）を用いて。）。ある場合において、アプタマーなどの選択された核酸は、選択後、化学的に修飾され（例えば、メチル化によって。）及び／又は、例えば、ＰＥＧ、脂質、リポタンパク質又はリポソームに結合させられる。オリジナル修飾核酸の配列が既知であり得るが、修飾後に核酸配列を確認することが望ましい。例えば、分子の核酸配列を製造プロトコルにおいて又は薬物承認プロセスのために確認することが望ましいか、又は必要とされ得る。しかし、ある一定のタイプの修飾は、修飾核酸分子の配列決定を妨げるということが当技術分野で実質的に明らかになっており、信じられている。
【０００５】
一般に、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸分子及びリボザイムなどの修飾核酸分子は、標準的な化学分解法を用いて配列決定されておらず、一方、配列決定の酵素法は、少なくともある種の修飾核酸に対して有効でないか、又は特別な条件が必要であると考えられている。特に、ＰＥＧに結合させられた（つまりＰＥＧ化）核酸分子の酵素的配列決定は通常行われていない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、修飾核酸分子に相補的なｃＤＮＡを合成することにより、修飾核酸を配列決定する方法に関する。メチル化又はペグ化などの１以上の修飾を含有するある種のクラスの修飾核酸分子を逆転写し、クローニングし、配列決定できることが分かった。ある場合において、核酸分子は２以上のタイプの修飾、例えば、２−フルオロ置換、２−Ｏ−メチル置換及びペグ化を含む。
【０００７】
したがって、ある態様において、本発明は、多数の２’−修飾ヌクレオチドを含有する修飾核酸のヌクレオチド配列を決定するための方法を提供する。これらの方法は、（ａ）修飾核酸の試料を得て；（ｂ）逆転写酵素を用いて修飾核酸に相補的な第一のｃＤＮＡを合成し；（ｃ）２本鎖ｃＤＮＡを形成させるために、ＤＮＡポリメラーゼを用いて第一のｃＤＮＡに相補的な第二のｃＤＮＡを合成し；（ｄ）２本鎖ｃＤＮＡの複数の２本鎖コピーを生成させ；（ｅ）２本鎖コピーの配列決定を行う；段階を含む。これらの方法において、修飾核酸は、多数の２’−フッ素化ヌクレオチド及び多数の２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドを含む。
【０００８】
ある実施形態において、修飾核酸中で、２’−フッ素化ヌクレオチドは、総ヌクレオチドの１０％から７０％を占める。ある実施形態において、修飾核酸中で、２’−フッ素化ヌクレオチドは、総ヌクレオチドの少なくとも４０％を占める。
【０００９】
ある実施形態において、修飾核酸中で、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドは、総ヌクレオチドの１０％から７０％を占める。ある実施形態において、修飾核酸中で、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドは、総ヌクレオチドの少なくとも４０％を占める。
【００１０】
ある実施形態において、修飾核酸中で、２’−フッ素化ヌクレオチドは、総ヌクレオチドの１０％から７０％を占め、修飾核酸中で、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドは、総ヌクレオチドの１０％から７０％を占める。
【００１１】
前述の実施形態のあるものにおいて、修飾核酸は、大きな親水性部分を含む５’共有修飾をさらに含む。
【００１２】
別の態様において、本発明は、５’又は３’の大きな親水性部分を含む修飾核酸のヌクレオチド配列を決定するための方法を提供する。これらの方法は、（ａ）修飾核酸の試料を得て；（ｂ）逆転写酵素を用いて修飾核酸に相補的な第一のｃＤＮＡを合成し；（ｃ）２本鎖ｃＤＮＡを形成させるために、ＤＮＡポリメラーゼを用いて第一のｃＤＮＡに相補的な第二のｃＤＮＡを合成し；（ｄ）２本鎖ｃＤＮＡの複数の２本鎖コピーを生成させ；（ｅ）２本鎖コピーの配列決定を行う；段階を含む。
【００１３】
ある実施形態において、大きな親水性部分は、分枝鎖もしくは直鎖、置換もしくは非置換の、アルキル、アルケニル、アリール又は複素環基の、ホモポリマーもしくはヘテロポリマーからなる群から選択される。ある実施形態において、大きな親水性部分は、１０から５０ｋＤａのポリエチレングリコール部分などのポリエチレングリコール部分である。
【００１４】
大きな親水性部分を含む前述の実施形態の何れかにおいて、修飾核酸は、少なくとも１個の２’−フッ素化ヌクレオチド又は少なくとも１個の２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドをさらに含み得る。
【００１５】
他の実施形態において、本発明は、多数の２’−修飾ヌクレオチドを含有する修飾核酸のヌクレオチド配列を決定するための方法を提供する。これらの方法は、（ａ）修飾核酸の試料を得て；（ｂ）逆転写酵素を用いて修飾核酸に相補的な第一のｃＤＮＡを合成し；（ｃ）第一のｃＤＮＡを精製し；（ｄ）第一のｃＤＮＡの３’−末端をポリアデニル化し；（ｅ）２本鎖ｃＤＮＡを形成させるために、ＤＮＡポリメラーゼを用いて第一のｃＤＮＡに相補的な第二のｃＤＮＡを合成し；（ｆ）２本鎖ｃＤＮＡの複数の２本鎖コピーを生成させ；（ｇ）２本鎖コピーの配列決定を行う；段階を含む。これらの方法において、修飾核酸は、多数の２’−フッ素化ヌクレオチド及び多数の２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドを含む。
【００１６】
前述の方法のある実施形態において、２本鎖ｃＤＮＡの多数の２本鎖コピーを生成させる段階は、（ｉ）クローニングベクターに２本鎖ｃＤＮＡをライゲーションし；（ｉｉ）前記クローニングベクターを用いて宿主細胞に対して形質転換を行い；（ｉｉｉ）前記宿主細胞の子孫からクローニングベクターを単離し；（ｉｖ）宿主細胞から２本鎖コピーを単離する段階を含む。
【００１７】
前述の方法の他の実施形態において、２本鎖ｃＤＮＡの多数の２本鎖コピーを生成させる段階は、オリジナルの鋳型分子として２本鎖ｃＤＮＡを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことを含む。
【００１８】
別の態様において、本発明は、多数の２’−修飾ヌクレオチドを含む修飾核酸に相補的なＤＮＡを合成する方法を提供する。これらの方法は、（ａ）修飾核酸の試料を得て；（ｂ）逆転写酵素を用いて前記修飾核酸に相補的な第一のｃＤＮＡを合成する段階を含む。これらの方法において、修飾核酸は、多数の２’−フッ素化ヌクレオチド及び多数の２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドを含む。
【００１９】
ある実施形態において、修飾核酸は、大きな親水性部分を含有する５’共有修飾をさらに含む。これらの実施形態のあるものにおいて、大きな親水性部分は、分枝鎖もしくは直鎖、置換もしくは非置換の、アルキル、アルケニル、アリール又は複素環基のホモポリマーもしくはヘテロポリマーから選択される。ある実施形態において、大きな親水性部分は、１０から５０ｋＤａのポリエチレングリコール部分などのポリエチレングリコール部分を含む。
【００２０】
前述の実施形態のいくつかにおいて、修飾核酸は、修飾された３’末端をさらに含む。
【００２１】
本明細書中で述べるものと同様又は同等の方法及び材料を本発明の実施及び試験において使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。さらに、材料、方法及び例は単に一例であり、制限することを意図するものではない。
【００２２】
本発明の他の特性及び長所が詳細な説明、図面及び特許請求の範囲から明らかになろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本明細書中で言及される、刊行物、特許出願、特許及びその他の参考文献は全て、参照によりそれらの全体を本明細書中に組み込む。
【００２４】
別段の定義がない限り、本明細書中で使用する全ての技術及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有するものとする。
【００２５】
本明細書中で使用する場合、他に具体的に指示されない限り、「又は」という単語は、「及び／又は」の包括的な意味で用いられ、「いずれか／又は」の排他的な意味ではない。
【００２６】
変数の数値範囲の列挙は、本明細書中で使用する場合、この範囲内の数値のいずれかに等しい変数で本発明を実施できることを伝えようとするものである。したがって、本質的に不連続である変数については、この変数は、この範囲の終点を含めて、この数値範囲内のあらゆる整数値に等しいものであり得る。同様に、本質的に連続的である変数については、この変数は、この範囲の終点を含めて、この数値範囲内のあらゆる実数値に等しいものであり得る。例として、以下に限定されないが、０から２の値を有するものと記載される変数は、本質的に不連続である変数については０、１又は２であり得、本質的に連続的である変数については０．０、０．１、０．０１、０．００１、又は≧０及び≦２であるあらゆる他の実数値であり得る。
【００２７】
修飾核酸（ＭＮＡ）は、（ａ）少なくとも１個のメチル化（例えば、２−Ｏ−メチル置換）及び少なくとも１個の２’−フルオロ置換（例えば、２−フルオロ−ピリミジン置換）又は（ｂ）大きな親水性部分での、少なくとも１個の５’もしくは３’修飾の何れかを含有する核酸分子である。ＭＮＡは、１以上のさらなるタイプの修飾又は置換を含み得る。
【００２８】
本明細書中で記載し、主張する方法は、ＭＮＡ配列に相補的なｃＤＮＡを生成させるのに有用であり、ＭＮＡ分子をクローニングし、配列決定するために有用である。
【００２９】
修飾核酸分子の逆転写
逆転写されるべきＭＮＡを最初に確認することにより、ＭＮＡの逆転写によるｃＤＮＡの合成を行う。例えば、ＭＮＡは、貯蔵期限又は、配列情報を必要とするその他のプロトコルの研究において、スケールアップ産生後に配列が確認されるべき分子であり得る。当然のことながら、本明細書中に記載するように、ＭＮＡから調製されたｃＤＮＡ配列は、ＭＮＡの修飾を含有しないが、ＭＮＡの修飾ヌクレオチドに対応する天然のヌクレオチドを含有する。本方法において、化学合成などの当技術分野で公知の方法を用いて、ＭＮＡの３’末端に相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーを調製する。一般に、３’配列がＭＮＡを含有する場合、プライマーが標的とするＭＮＡ配列の一部に最も近く対応する天然のヌクレオチドに相補的な天然のデオキシヌクレオチド三リン酸を用いてプライマーを調製する。ｃＤＮＡ合成を促進するために、ＭＮＡの３’末端にポリＡテールなどの合成配列を付加するか、又は既定の配列をＭＮＡの３’末端にライゲーションすることができる。ＭＮＡの最終的な３’ヌクレオチドが修飾される場合、このような方法は一般に使用されない。
【００３０】
プライマーは、決められた反応条件下で結果として十分に配列特異的にアニーリングが起こるあらゆる長さであり得る。通常、プライマーは、５から２０ヌクレオチド長であり、逆転写酵素はより短い配列（例えば、５から１０ヌクレオチド）であり、ＤＮＡポリメラーゼは、より長い配列（例えば、１２から１８ヌクレオチド）を利用する。一般に、長いプライマーであるほど、アニーリングの効率及び特異性が高くなる。ＭＮＡとともにプライマーをインキュベートし、逆転写酵素（ＲＴ）及びデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を用いてＭＮＡに相補的なｃＤＮＡを合成する。逆転写酵素は、あらゆるソース由来であり得、例えば、鳥類骨髄芽球症ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス又は、例えばＲＮＡｓｅ  Ｈ活性を欠く、もしくはその他の特性を有する、操作したＲＴであり得る（例えば、ＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ；ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ  ＩＩ  ＲＮａｓｅ  Ｈ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。逆転写酵素反応において使用されるｄＮＴＰは、標準的なｄＮＴＰ又は修飾ｄＮＴＰであり得る（例えば、Ｋｒａｙｅｖｓｋｙら、１９９８、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １７（７１：１１５３−６２：Ｔａｓａｒａら、２００３、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（１０）：２６３６−４６を参照のこと。）。一般に、ＭＮＡを配列決定する場合、ＲＴ反応に対して天然ｄＮＴＰ（ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＧＴＰ）を使用する。逆転写酵素反応のための試薬は、当技術分野で公知であり、市販のものを利用できる。本反応で使用される具体的なＲＴに適切な公知のプロトコルに従い、逆転写反応を行い得る。しかし、このようなプロトコルは、製造者により提案された、当業者にとって公知の、又は特定のＭＮＡ及びＲＴとともに使用するための通常の実験により得られた修飾を含み得る。
【００３１】
逆転写の最適化
逆転写反応のいくつかのパラメーターを操作して、ＭＮＡ鋳型を用いた場合に産生されるｃＤＮＡの忠実度及び量を向上させることができる。使用されるＭＮＡの量は、少なくとも反応体積あたり１０ｐｍｏｌ、２０ｐｍｏｌ、５０ｐｍｏｌ又は１００ｍｏｌであり得る。例えば使用されるＭＮＡの量は、反応体積あたり１から１００ｐｍｏｌ、１０から１００ｐｍｏｌ又は５０から１００ｐｍｏｌであり得る。鋳型の量は、反応体積あたり少なくとも１０ｐｍｏｌ、２０ｐｍｏｌ、５０ｐｍｏｌ又は１００ｐｍｏｌであり得る。例えば、使用される鋳型の量は、反応体積あたり約１から１００ｐｍｏｌ、１０から１００ｐｍｏｌ又は５０から１００ｐｍｏｌであり得る。使用されるプライマーの量は、反応体積あたり少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、２５０又は３００ｐｍｏｌであり得る。例えば、使用されるプライマー鋳型の量は、反応体積あたり約１０から３００ｐｍｏｌ、２５から３００ｐｍｏｌ、１２５から３００ｐｍｏｌ、１５０から３００ｐｍｏｌ又は２５０から３００ｐｍｏｌであり得る。反応体積は、利用できる出発材料の量及び所望する最終産物量に従い変化し得る。例えば、反応体積は、５から５０μＬ（例えば、プライマーアニーリングに対して１２μＬ及びＲＴ反応に対して２０μＬ）であり得る。通常、逆転写酵素反応において、各ＮＴＰ等量を使用する。ある場合において、反応中の各ｄＮＴＰの濃度は、約５００μＬ、６００μＬ、７００μＬ、７５０μＬ、１，０００μＬ、１，２５０μＬ又は２，５００μＬである。例えば、この濃度は、約５００μＬから２，５００μＬ、約５００μＬから１，０００μＬ又は約１，０００μＬから約２，５００μＬであり得る。ｃＤＮＡ産物を検出できるようにするために、ある種の逆転写酵素反応においてトレーサーを使用する。このような場合、α３２Ｐ−ｄＮＴＰを使用し得る（例えば、［α３２Ｐ］−ｄＣＴＰ）。Ｃｙ３−又はＣｙ５−標識ヌクレオチドなど、その他のタイプの標識を含むｄＮＴＰもまた使用できる。放射線標識の場合、標識ｄＮＴＰの量は、例えば、反応体積あたり、約１０μＣｉ、２０μＣｉ又は２５μＣｉであり得る。例えば、標識ｄＮＴＰの量は、反応体積あたり、約１０μＣｉから２５μＣｉ又は約１０μＣｉから２０μＣｉであり得る。
【００３２】
変化させることができるその他のパラメーターは、反応温度及び反応時間である。ＭＮＡを逆転写するために用いられる温度及び時間の例は、通常、４２℃で少なくとも５０分間又は４２℃で５５分間又は４２℃で６０分間の後、３７℃で１５分間及び、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＮａｓｅ  Ｈを用いる場合、酵素不活性化のために７０℃にて１０分間である。例えば、逆転写反応に対する温度は、約３７℃から５０℃（例えば、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭＩＩによるファーストストランド合成に対して４２℃）であり得る。本明細書中で使用する場合、逆転写反応のための時間は、例えば、約３０から６０分間、約４０から６０分間又は約５０から６０分間であり得る。具体的な逆転写酵素に対する製造者の推奨に従い、パラメーターを調整することもできる。選択されたＭＮＡに相補的なｃＤＮＡの合成に対する、逆転写プロトコルの一般的な非限定例は、以下のとおりである；水中でＭＮＡを懸濁し、加熱して変性させ（例えば、９０℃にて２分間）、試料を冷却し（例えば、氷上で２分間）、非標識ｄＮＴＰ、プライマー及び水を添加し、プライマーアニーリングのために適切な温度で加熱し（例えば、４２℃から７０℃）（例えば５分間）、冷却し、ファーストストランド緩衝液、ＤＴＴ、標識ｄＮＴＰ及び逆転写酵素を添加し、室温にて反応混合液をインキュベートし（例えば１０分間）、次いで高温で（例えば４２℃）４０から６０分間インキュベートし、その後、３７℃で１５分間、７０℃で１０分間インキュベートする。次に、例えば、ゲルローディング緩衝液をＲＴ反応混合液に添加し、電気泳動することにより、試料を分析する。ある場合において、変性ゲル条件を使用する。
【００３３】
処理及び配列決定
ファーストストランドＲＴ反応産物を検出し、さらなる処理及び配列決定のために単離することができる。例えば、ファーストストランドｃＤＮＡ単離後（例えば、フェノール／クロロホルム及びエタノールを用いた、抽出及び沈殿）、適切なプライマーを用いてｃＤＮＡのセカンドストランドを得ることができ、ＰＣＲを使用して２本鎖ｃＤＮＡを増幅することができる。ファーストストランドｃＤＮＡの３’配列が分からない場合、既知の配列をその３’末端にライゲーションし、その既知の配列に相補的なプライマーを利用することができる。あるいは、末端デオキシヌクレオチド転移酵素を用いてファーストストランドにポリＡテールを付加することができ、セカンドストランド合成にオリゴｄＴプライマーを使用することができる。クローニングのために、得られた２本鎖ＤＮＡをクローニングベクターにライゲーションすることができ、細菌に形質転換することができ、クローニングされた配列を含有する細菌を同定する。次に、ＰＣＲ又はクローニングにより増幅された配列を単離し、公知のプロトコルを用いて配列決定する。
【００３４】
修飾核酸分子
本明細書中に記載の方法を用いて配列決定することができるＭＮＡ分子としては、修飾ＲＮＡ、修飾ＤＮＡ、アプタマー、リボザイム及びｓｉＲＮＡ分子が挙げられる。このような分子は、合成核酸類似体又は天然及び合成核酸類似体の組み合わせを含有し得る。合成核酸類似体は、１以上の、骨格、塩基又は糖修飾を含有するものを含む。このような修飾は、当技術分野で公知である（例えば、Ｖｅｒｍａら（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）６７：９９−１３４）を参照のこと。）。特に、これらの方法を用いて配列決定できるＭＮＡ分子としては、２’−フルオロ置換（例えば、２’−フルオロ−ピリミジン又は２’−フルオロプリン）、２’−Ｏ−メチル置換、ペグ化（例えば、５’末端におけるＰＥＧの共有結合による。）、反転デオキシチミジンキャップ又は５’もしくは３’末端のその他の修飾などの修飾を含有する核酸分子が挙げられる。修飾核酸分子は、１以上の修飾を含有し得る。例えば、本分子は、２’−フルオロピリミジン及び２’−Ｏ−メチルプリン置換の両方を含有し得、場合によってはＰＥＧ部分を含有し得る。
【００３５】
ある場合において、ＭＮＡ分子は、アンチセンスリボ核酸である。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的なヌクレオチド配列である（例えば、２本鎖ｃＤＮＡ分子コード鎖、ｍＲＮＡ配列又は転写された非コード配列（例えば、遺伝子の５’及び３’非翻訳領域）に相補的なもの。）。アンチセンス核酸は、全体のコード鎖又はその一部にのみ相補的であり得る。アンチセンス分子のある非限定例はリボザイムであり、これは、触媒性核酸分子である。天然ヌクレオチド又は、分子の生物学的安定性を向上させるように、又はアンチセンスとセンス核酸との間で形成されるデュプレックスの物理的安定性を向上させるように設計された、様々に修飾されたヌクレオチドを用いて、アンチセンス分子及びその他の核酸分子を化学的に合成することができ、例えば、ホスホロチオアート誘導体とアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。本明細書中に記載の方法を使用して、このような修飾分子の配列決定を行うことができる。
【００３６】
本明細書中で記載のように、他のタイプの修飾を含有する核酸もまた逆転写し、クローニングし、配列決定することができる。例えば、全身投与の場合、選択された細胞表面で発現される受容体又は抗原にリボ核酸分子が特異的に結合するように、例えば、細胞表面受容体又は抗原に結合するペプチド又は抗体にリボ核酸分子を連結させることにより、リボ核酸分子を修飾し得る。ＭＮＡ分子のさらなる例には、１以上の２’−Ｏ−メチルヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１-６１４８）又はキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７-３３０）を含有するものが含まれる。検出可能な標識（例えば、蛍光、化学発光、放射性又は比色）を含有する核酸分子を、記載の方法を用いて、逆転写し、クローニングし、配列決定することができる。
【００３７】
ある場合において、ＭＮＡ分子は、大きな親水性部分を含む。一般に、このような部分は、核酸分子に共有結合される。大きな親水性部分としては、分枝鎖もしくは直鎖、置換もしくは非置換の、アルキル、アルケニル、アリール又は複素環基の、ホモポリマーもしくはヘテロポリマーが挙げられる。具体例としては、ポリエチレングリコール（例えば、１０から５０ｋＤａのＰＥＧ、２０-４０ｋＤａのＰＥＧ）及び、デキストラン、カルボキシメチルセルロース又はポリＨＥＭＡ（つまり、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）などのその他の非核酸分子が挙げられる。
【００３８】
核酸分子配列のあらゆる位置で、このような大きな親水性部分をＭＮＡに結合させることができる（例えば、米国出願第６０／５６１，６０１を参照のこと。その全体の開示を参照により本明細書中に組み込む。）。例えば、大きな親水性部分の結合は、ＭＮＡの５’末端、ＭＮＡの３’末端又は５’と３’末端との間のＭＮＡ配列に沿った何れかの位置を介し得る。例えば、修飾核酸配列の、塩基の環外アミノ基、ピリミジンヌクレオチドの５位、プリンヌクレオチドの８位、リン酸残基のヒドロキシル基又はリボース基のヒドロキシル基などの位置で、大きな親水性部分をＭＮＡに結合させることができる。これらの様々な位置で大きな親水性部分をＭＮＡ配列に化学的に連結するための手段は、当技術分野で公知であり、及び／又は下記で例示する。
【００３９】
大きな親水性部分の例としては、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）、ゲル形成化合物などが挙げられる。特に有用な大きな親水性部分の例としては、ポリエチレングリコール、多糖類、例えばグリコサミノグリカン、ヒアルロナン及びアルギン酸塩、ポリエステル、高分子量ポリオキシアルキレンエーテル（ＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭなど）、ポリアミド、ポリウレタン、ポリシロキサン、ポリアクリレート、ポリオール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ無水物、カルボキシメチルセルロース、その他のセルロース誘導体、キトサン、ポリアルデヒド又はポリエーテルが挙げられる。特に有用な大きな親水性部分は、約２０から約１００ｋＤａの分子量を有する。
【００４０】
さらに、ヌクレアーゼ耐性及び／又はその他の薬物動態学的特性を向上させるために非免疫原性の高分子量又は新油性化合物を５’末端に付加することも記載されており（例えば、米国特許第６，０１１，０２０号、同第６，１４７，０２４号、同第６，２２９，００２号、同第６，４２６，３３５号、同第６，４６５，１８８号及び同第６，５８２，９１８号）、このような基を大きな親水性部分として使用することができる。親油性基の例は、飽和又は不飽和炭化水素、例えばアルキル、アルケニル又はその他の脂質基である。ステロール（例えば、コレステロール）及びその他の医薬的に許容されるアジュバント（α−トコフェロールのような抗酸化剤を含む。）も含まれ得る。通常、このような「親油性化合物」は、実質的に親油性成分からなる構造を含む、誘電定数が低い、脂質及び／又はその他の物質もしくは相と会合する、又はそれらに分離する傾向を有する化合物である。親油性化合物は、脂質ならびに、脂質（及び／又は、誘電定数が低い、その他の物質もしくは相）と会合する傾向を有する化合物を含有する非脂質を含む。コレステロール、リン脂質及びグリセロ脂質、例えばジアルキルグリセロール及びジアシルグリセロール、及びグリセロアミド脂質は、このような親油性化合物のさらなる例である。
【００４１】
ある場合において、ＭＮＡは、ペプチドのなどの付加基（例えば、インビボで宿主細胞受容体を標的とするため）又は、細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８４：６４８-６５２；ＰＣＴ公開ＷＯ８８／０９８１０）もしくは血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ８９／１０１３４）を横切る輸送を促進する物質を含む。さらに、ハイブリダイゼーション誘発切断物質（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８、Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６を参照のこと。）又は挿入剤（例えば、Ｚｏｎ、１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９を参照のこと。）を用いて、オリゴヌクレオチドを修飾することができる。この目的に対して、オリゴヌクレオチドを別の分子に結合させることができる（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤又はハイブリダイゼーション誘発切断物質）。本明細書中に記載の方法を用いて配列決定され得るさらに別のタイプの修飾核酸は、分子指標オリゴヌクレオチドプライマー及び選択された核酸に相補的な少なくとも１個の領域を有するプローブ分子であり、分子指標が、試料中の選択された核酸の存在を定量するのに有用であるように、２つの相補的領域のうち１つは蛍光プローブを有し、１つは消光剤を有する。分子指標核酸は、例えば、Ｌｉｚａｒｄｉら、米国特許第５，８５４，０３３号；Ｎａｚａｒｅｎｋｏら、同第５，８６６，３３６号及びＬｉｖａｋら、同第５，８７６，９３０号に記載されている。
【００４２】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、血管新生に寄与し、いくつかのアイソフォームで存在する。ＶＥＧＦ１６５は、ヒトにおいて最も多いアイソフォームであり、異常な血管新生及び血管透過性及び糸球体内皮修復にも関与する血管新生サイトカインである（Ｏｓｔｅｎｄｏｒｆら、１９９９、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １０４：９１３−９２３）。アプタマー（ギリシャ語でＡｐｔｕｓ−英語で「ｆｉｔ（適合した）」の意；ｍｅｒｏｓ−部分又は領域）は、タンパク質などの標的分子と非常に高い特異性及び親和性で結合するオリゴヌクレオチドである。試験管内人工進化法（ＳＥＬＥＸＴＭ、Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、２'−フルオロピリミジンを含有し、ＶＥＧＦ１６５がＦＬＴ−１及びＫＤＲＶＥＧＦ受容体に結合するのを特異的にブロックする２８−ヌクレオチドアプタマーを調製し、同定した。２個のプリンヌクレオチド以外の全ての２’−Ｏ−メチル置換により、アプタマーの５’末端に結合された２個の分枝型２０ｋＤａＰＥＧ部分を付加することにより、及び３'−３’連結を介した３’末端へのデオキシチミジンの連結により、アプタマーをさらに修飾した（Ｒｕｃｋｍａｎら、１９９８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：２０５５６）。ヒト臨床試験において、この精巧な修飾アプタマー（ＮＸ１８３８又はペガプタニブと呼ばれる。）が使用されている。
【００４３】
逆転写及び配列決定に対してそうしなければ分子が不安定になると考えられ得る修飾を含有する分子の核酸配列を決定する方法を確認するために、様々な修飾を含有するペガプタニブを試験分子として使用した。実施例は、ｃＤＮＡ合成及びこのＭＮＡ分子のクローニングを説明する。
【００４４】
（実施例）
次の実施例により本発明をさらに説明する。この実施例は、説明のためにのみ与えるものである。これらは、本発明の範囲又は内容を制限するものとして解釈されるべきものではない。
【実施例１】
【００４５】
ＰＥＧ化アプタマーの塩基配列決定
次の手段を使用して、逆転写を介し（ｃＤＮＡ合成）、次いでクローニング及びＤＮＡ配列決定を行い、２’−フルオロピリミジン、２’−Ｏ−メチルプリン、５’ＰＥＧ化アプタマー（ペガプタニブ）の塩基配列を決定した。
【００４６】
ペガプタニブの合成は、Ｒｕｃｋｍａｎら、１９９８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２０５５６に記載されている。希釈ペガプタニブ試料の２６０ｎｍ（ＯＤ２６０）でのＵＶ吸収を測定するために分光光度計を使用して、次の式（Ｂｅｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ則）を用いて、ペガプタニブの濃度を求めた：
Ｃ（ｍｇ／ｍＬ）＝［Ａ／（ｅ  ｘ  ｂ）］ｘ（希釈因子）
Ｃ＝濃度；Ａ＝（ＯＤ２６０）；ｅ＝消光係数＝２７．２９；ｂ＝１
【００４７】
逆転写を介したファーストストランドｃＤＮＡ合成
修飾核酸ペガプタニブに対するｃＤＮＡの合成のために条件を決定した。通常、逆転写酵素を用いたｃＤＮＡ合成のために、プライマー（ＭＡＣＲＴ１と呼ばれる。）を使用した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．により、配列（５’から３’）ＣＧＧＡＴＧＴＡを有するプライマーを合成した。２００ユニットのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭＩＩ  ＲＮＡｓｅＨ−逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，カタログ番号１８０６４−０２２）、５ｘファーストストランド緩衝液及び０．１Ｍ  ＤＴＴ（ジチオスレイトール；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．，ＲＴ酵素とともに供給。）、各デオキシリボヌクレオチド１０ｍＭを含有するｄＮＴＰミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．，カタログ番号１８４２７−０８８）、［α３２Ｐ］−ｄＣＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，カタログ番号ＢＬＵ０１３Ｈ）、ヌクレアーゼフリー水（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，カタログ番号９９３７）及びＲＮＡｓｅ−ＤＮＡｓｅフリー微小遠心管（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，カタログ番号１２４５０）を用いて、ファーストストランドの合成を行った。
【００４８】
ＲＴ反応で用いるためのＭａｃｕｇｅｎ鋳型の適切な量を決定するために、様々な濃度のペガプタニブをＲＴ反応で用いた；１０ｐｍｏｌ、２０ｐｍｏｌ、５０ｐｍｏｌ及び１００ｐｍｏｌ。さらに、本反応において様々な濃度のプライマーを使用した；鋳型１０ｐｍｏｌとともにプライマー２５及び５０ｐｍｏｌ、鋳型２０ｐｍｏｌとともにプライマー５０ｐｍｏｌ及び６０ｐｍｏｌ；鋳型５０ｐｍｏｌとともにプライマー５０、１２５及び１５０ｐｍｏｌ；及び鋳型１００ｐｍｏｌとともにプライマー５０、２５０及び３００ｐｍｏｌ。反応は全て、２０から２５μＬの最終体積で行った。ＲＴ反応で使用するプライマーのモル当量は、５０ｐｍｏｌが２．５μＭ、６０ｐｍｏｌが３．０μＭ、１２５ｐｍｏｌが６．２５μＭ、１５０ｐｍｏｌが７．５μＭ、２５０ｐｍｏｌが１２．５μＭ、３００ｐｍｏｌが１５μＭであった。
【００４９】
ＭＮＡのＲＴ反応を特徴付けるように設計された反応の別の設定において、様々な濃度のｄＮＴＰを試験した。試験した濃度は、各ｄＮＴＰ５００μＭとともに１０ｐｍｏｌ鋳型；各ｄＮＴＰ５００μＭ又は５５０μＭとともに２０ｐｍｏｌ鋳型；各ｄＮＴＰ７００μＭ、７５０μＭ、１，０００μＭ又は１，２５０μＭとともに５０ｐｍｏｌ鋳型；各ｄＮＴＰ７５０μＭ、１，０００μＭ、１，２５０μＭ又は２，５００μＭとともに１００ｐｍｏｌ鋳型であった。
【００５０】
ＲＴ反応のための条件を評価するために設定した実験のさらなる設定において、様々な量の［α−３２Ｐ］−ｄＣＴＰ（例えば、１０μＣｉ、２０μＣｉ及び２５μＣｉ）をＲＴ反応において試験した。様々なプライマー及び鋳型量を試験する格子状のフォーマットでアッセイを行った。これらの実験の１つにおいて、ＭＮＡペガプタニブを用いたＲＴ反応に対する最適条件には、２０から２５μＬの反応体積において、１０ｐｍｏｌ鋳型及び５０ｐｍｏｌプライマーとともに、［α−３２Ｐ］−ｄＣＴＰ２０から２５μＣｉが含まれた。
【００５１】
上述の各実験に対して次の一般プロトコルを使用した。鋳型（ペガプタニブ）を水中で懸濁し、９０℃で２分間加熱し、次いで氷上で２分間冷却した。ｄＮＴＰ及びプライマーを鋳型に添加し、混合液を６５℃にて５分間加熱し、次いで氷上で２分間冷却し、その後、［α−３２Ｐ］−ｄＣＴＰを添加し、４２℃でさらに５分間インキュベートした。次に、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭＩＩ  ＲＮａｓｅＨ２００ユニットを反応混合液に添加し、次いでそれを室温にて１０分間、次に４２℃にて６０分間インキュベートした。この反応混合液を３７℃でさらに１５分間インキュベートし、ゲルローディング緩衝液を添加することにより反応停止させた。８Ｍ尿素を含有する１５％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動法により試料を分析した。１時間から５時間又は一晩、ゲルをフィルムに曝露させることにより、反応産物を検出した。
【００５２】
結果として正確なサイズのｃＤＮＡ産物が産生され、その他の試料と比較して［α−３２Ｐ］−ｄＣＴＰ取り込みが最大となる条件を確認することにより、条件を選択した。鋳型、プライマー、ｄＮＴＰ及び放射性核種の濃度が異なる幅広い種類の反応条件を試験した後、一貫性のある再現可能な結果が得られた条件を選択した。
【００５３】
ペガプタニブの逆転写のための条件
試験する条件を決定し、プライマー（ＭＡＣＲＴ１）５０ｐｍｏｌ、５００μＭ  ｄＮＴＰを含有する反応において、ペガプタニブの最適出発濃度は１０ｐｍｏｌであり、これを４２℃で６０分間インキュベートした。したがって、ＭＮＡ分子ペガプタニブに対するｃＤＮＡの合成のためのある有用なプロトコルは次の通りであることが分かった。９０℃で２分間ペガプタニブを加熱し、氷上で２分間冷却した。次いで、次の試薬を適切な反応容器に添加し、最初の反応混合液を調製した；総体積を１２μＬとする水の体積、ｄＮＴＰ（各ｄＮＴＰ５００μｍoｌ）、ＭＡＣＲＴ１プライマー（５０ｐｍｏｌ）及びペガプタニブ（１０ｐｍｏｌ）。次に、最初の反応混合液を６５℃で５分間インキュベートし、氷上で２分間冷却した。次に、５ｘファーストストランド緩衝液４μＬ、ＤＴＴ（０．１Ｍ）２μＬ及び２．５μＬ（２５μＣｉ）［α−３２Ｐ］−ｄＣＴＰを添加し、短時間遠心し、４２℃で２分間インキュベートし、次いで、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭＩＩ  ＲＮＡｓｅ  Ｈ−逆転写酵素１μＬを添加して最終反応混合液を調製した。最終反応混合液を２５℃で１０分間インキュベートし、次いで、４２℃で１時間、その後３７℃で１０分間インキュベートした。ゲルローディング緩衝液ＩＩ等体積を最終反応混合液に添加することにより、反応を停止させた。次に、今後使用するためにＲＴ  ｃＤＮＡ試料を凍結するか、又は電気泳動法による分析を行い、必要に応じて精製した。
【００５４】
ファーストストランドｃＤＮＡの精製
ペガプタニブから調製したｃＤＮＡの分析を行い、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いて精製した。ＲＴ産物のＰＡＧＥ分解のために次の試薬を用いた；４０％アクリルアミド／ビス（１９：１）溶液（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，カタログ番号９０２２）、１０ｘＴＢＥ緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，カタログ番号９８６３）、尿素（超高純度分子生物学グレード；Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，カタログ番号９９００）、過硫酸アンモニウム（水中１０％溶液、Ｓｉｇｍａ，Ｉｎｃ．，カタログ番号Ａ−３６７８）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）（Ｓｉｇｍａ，Ｉｎｃ．，カタログ番号Ｔ−８１３３）、ゲルローディング緩衝液ＩＩ（変性ＰＡＧＥ、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，カタログ番号７１４０）、ＲＮＡ  Ｄｅｃａｄｅ  Ｓｉｚｅ  Ｍａｒｋｅｒｓ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，カタログ番号７７７８）、１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，カタログ番号９８５５Ｇ）、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，カタログ番号９２６０Ｇ）、３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，カタログ番号９７４０）、Ｔｒｉｓ飽和フェノール  ｐＨ８．０（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，カタログ番号９７１０）及びクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）混合液（Ｓｉｇｍａ，Ｉｎｃ．，カタログ番号Ｃ−０５４９）。
【００５５】
簡潔に述べると、マーカーとしてγ３２Ｐ−ＡＴＰで放射線標識したＤｅｃａｄｅ  Ｍａｒｋｅｒｓ  Ｓｙｓｔｅｍとともに、８Ｍ尿素及び１ｘＴＢＥを含有する１５％ポリアクリルアミドゲルにＲＴ  ｃＤＮＡ試料の全て又は一部を載せた。ゲルを１２０ボルトで１時間走らせ、Ｘ線フィルムに曝露（−７０℃で４時間又は一晩の何れか。）し、ファーストストランドｃＤＮＡ産物の位置を調べた。所望の産物を含有するゲル片を切り出し、小片になるように切って、２００μＬ抽出緩衝液（１ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８）中で３７℃にて一晩振盪しながら溶出させた。第一の溶出物を回収し、ゲル片に抽出緩衝液２００μＬをさらに添加し、次いでそれを３７℃にて２時間インキュベートした。第二の溶出物を第一の溶出物と合わせ、最終濃度０．３Ｍとなるように酢酸ナトリウムを溶出物に添加した。Ｔｒｉｓ飽和フェノール：クロロホルム（イソアミルアルコール含有）（１：１）混合液の等体積を用いてｃＤＮＡを含有する溶出物を抽出し、次いでイソアミルアルコールを含有するクロロホルムで抽出し、１００μｇ／ｍＬの最終濃度になるようにグリコーゲンを添加した。ドライアイス上で２時間又は−８０℃で一晩の何れかで、エタノール３体積中でｃＤＮＡを沈殿させた。２０，０００ｘｇで１５分間遠心することにより、沈殿したｃＤＮＡを回収した。エタノールを除去し、ペレットを７０％エタノールで一度洗浄し、約１０分間風乾し、２０μＬ水中で再懸濁した。
【００５６】
精製ファーストストランドｃＤＮＡのポリＡテーリング
さらなる手段に対して精製ペガプタニブｃＤＮＡを調製するために、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）を用いてｃＤＮＡを３’ポリアデニル化した。一般的に、目的は、約１５から２５ヌクレオチドのポリＡテールをｃＤＮＡに付加することであった。この反応で使用する試薬には、末端転移酵素（ＴｄＴ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号６００１３７）、緩衝液（ＴｄＴ酵素とともに供給。）、ｄＡＴＰ（２５ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，カタログ番号１８４２７-０１３）及びＣｅｎｔｒｉ−ＳｐｉｎＴＭ−１０サイズ排除スピンカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，カタログ番号ＣＳ−１０１）が含まれた。簡潔に述べると、ｃＤＮＡ  ２ｐｍｏｌをポリアデニル化反応中で使用した（前述の再懸濁ｃＤＮＡ約１０μＬ）。１μＬ  ｄＡＴＰ（最終濃度０．５μＭ）、１０μＬ  ５ｘテーリング緩衝液及び０．５μＬ（１０ユニット）ＴｄＴをｃＤＮＡに添加した。反応物の最終体積は、５０μＬであった。ある実験において、ｄＡＴＰは、［α３２Ｐ］−ｄＡＴＰであった。次に、ポリアデニル化反応混合液を短時間遠心した。鋳型として１０ｐｍｏｌ、２０ｐｍｏｌ、５０ｐｍｏｌ又は１００ｐｍｏｌペガプタニブを用いて上述のように調製したｃＤＮＡ試料を用いて、ポリアデニル化反応に対する様々なインキュベート時間を試した：５、１０、１５及び２０分間。３７℃でインキュベートした後、７０℃で１０分間加熱処理を行い、ＴｄＴを不活性化した。次に、Ｃｅｎｔｒｉ−ＳｐｉｎＴＭ−１０排除スピンカラムを用いて全試料をカラム精製した。
【００５７】
クローニングし配列決定する試料の場合、ペガプタニブｃＤＮＡとのＴｄＴ反応に対してインキュベート時間を６分間とし、適切な長さのポリＡテールを得た。
【００５８】
セカンドストランドｃＤＮＡ合成
ペガプタニブｃＤＮＡから２本鎖核酸を調製するために、セカンドストランド合成を行い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて得られた２本鎖ＤＮＡを増幅させた。次の試薬を使用した；ＰｆｕＴｕｒｂｏ（Ｒ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，カタログ番号６００２５０）、１０ｘｐｆｕ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，ＰｆｕＴｕｒｂｏ（Ｒ）酵素とともに供給される。）、各デオキシリボヌクレオチド１０ｍＭを含有するｄＮＴＰミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，カタログ番号１８４２７−０８８）及びポリ−Ｔ（オリゴ−ｄＴ）プライマー（１６マー、Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｃ．，ロット番号Ｅ００７０５）。簡潔に述べると、鋳型としてポリＡテールを含有する、カラム精製した１本鎖ペガプタニブｃＤＮＡを用いて、セカンドストランド合成を行った。一般的に、１回のポリアデニル化反応からの全カラム精製産物を使用した（約５０μＬ、これは約１．２ｐｍｏｌ／５０μＬを含有する；ｃＤＮＡは約０．０２４ｐｍｏｌ／μＬで存在する。）。次に、試料５０μＬ：１μＬｄＮＴＰ、５μＬ  １０ｘ  ｐｆｕ緩衝液、０．５μＬ  オリゴ−ｄＴプライマー及び０．５５μＬ  ＰｆｕＴｕｒｂｏ（Ｒ）ＤＮＡポリメラーゼを添加した。１サイクルに対して、ＤＮＡＥｎｇｉｎｅ  Ｔｅｔｒａｄ  ＰＣＲ装置中で、このセカンドストランド合成反応物を９５℃にて１．１５分、４２℃にて１分間、次に７５℃にて１０分間、その後４℃にて５分間インキュベートした（ＰＴＣ−２２５  Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ，ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）。
【００５９】
２本鎖ｃＤＮＡの平滑末端化及び５’末端リン酸化反応
サブクローニングのために２本鎖ペガプタニブを調製するために、２本鎖ＤＮＡを平滑末端化し、平滑末端をリン酸化した。次の試薬を用いて平滑末端化を行った：Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，カタログ番号Ｍ０２０３Ｌ）、１０ｘＴ４ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ酵素とともに供給。）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、１０ｍｇ／ｍＬ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ酵素とともに供給。）及び各デオキシリボヌクレオチド１０ｍＭを含有するｄＮＴＰミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，カタログ番号１８４２７−０８８）。平滑末端化反応混合液は、ｄＮＴＰ  ０．５μＬ（各ｄＮＴＰ１０μＭ）、１００ｘＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）０．５μＬ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ用の１０ｘ緩衝液５．５μＬ及びＴ４ＤＮＡポリメラーゼ０．５μＬを含有していた。１２℃で２０分間、７５℃で１０分間、その後４℃で５分間、反応混合物をインキュベートした。
【００６０】
次いで、次の試薬を用いて平滑末端化２本鎖核酸の５’末端をリン酸化した：Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＴＫ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，カタログ番号Ｍ０２０１Ｌ）、１０ｘＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＰＮＴＫ酵素とともに供給。）及びＡＴＰ溶液１０ｍＭ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，カタログ番号８１１０Ｇ）。６μＬ  １０ｘＰＮＴＫ緩衝液、３μＬ  ＡＴＰ溶液及び１μＬ  ＰＮＴＫ酵素を添加することにより、平滑末端化反応に対して使用した容器と同じ容器中でリン酸化反応を行った。３７℃で６０分間、６５℃で２０分間、反応混合液をインキュベートし、次いで４０℃で保存するか、又はすぐにＤＮＡ抽出を行った。
【００６１】
ＤＮＡ抽出
上述のように調製した２本鎖ＤＮＡを抽出するために、リン酸化段階からの反応混合液の体積をヌクレアーゼフリー水で２００μＬにした。次に、３Ｍ酢酸ナトリウム溶液２０μＬを添加し、次に、１００μＬフェノール／Ｔｒｉｓ溶液を添加して激しく混合し、次いで１００μＬクロロホルムを添加し、激しく混合した。溶液を１０分間遠心し、相を分離し、水相を回収して、１００μＬクロロホルムを用いて再抽出し、次いで、１０分間遠心し、水相を回収し、次いで４μＬグリコーゲンを添加した（５ｍｇ／ｍＬ保存溶液）。次に、９５％エタノール３体積を添加し、−８０℃にて一晩又はドライアイス上で２時間の何れかでＤＮＡを沈殿させた。沈殿段階後、ｃＤＮＡを１５分間遠心し、エタノールを除去し、ペレットを７０％エタノールで１回洗浄した。ペレットを短時間風乾させ、ヌクレアーゼフリー水１０μＬ中で再懸濁した。
【００６２】
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔへのｃＤＮＡのライゲーション
次に、ＥｃｏＲＶで線状にし、アガロースゲル電気泳動で精製したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）に、上述のように調製した２本鎖ペガプタニブ由来核酸をクローニングした。ＥｃｏＲＶで線状化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターは、平滑末端を含有する２本鎖ｃＤＮＡでのライゲーションに適切な平滑末端を含有する。クローニングプロトコルのために使用する試薬は次の通りである：プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｒ）ＩＩ  ＳＫ（＋）（ＥｃｏＲＶ  Ｖ消化及び精製；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，カタログ番号２１２２０５）、Ｑｕｉｃｋ  ＬｉｇａｔｉｏｎＴＭキット（Ｔ４ＤＮＡリガーゼ及び１０ｘＱｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ緩衝液とともに供給。）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，カタログ番号Ｍ２２００Ｓ）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅエレクトロポレーションコンピーテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，カタログ番号２００２２８）、ＳＯＣ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，カタログ番号１５５４４−０３４）、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（Ｒ）キュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号１６５−２０８９）、Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ増殖培地（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｉｎｃ．，カタログ番号２３７５００）、アンピシリンナトリウム塩、０．１ｍｇ／ｍＬ（水中）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｉｎｃ．，カタログ番号１７１２５４）、Ｄｉｆｃｏ  ＬＢ寒天（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｉｎｃ．，カタログ番号２４０１１０）、制限エンドヌクレアーゼ、ＥｃｏＲＶ  Ｖ、ＸｂａＩ及びＸｈｏＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，それぞれカタログ番号Ｒ０１９５Ｓ、Ｒ０１４６Ｓ、Ｒ０１４５Ｓ）、ＱＩＡｐｒｅｐ（Ｒ）Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＤＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，カタログ番号２７１０４）、アガロース１０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，カタログ番号１０９７５−０３５）、５０ｘＴＡＥ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，カタログ番号２４７１０−０３０）及び臭化エチジウム溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，カタログ番号１５５８５−０１１）。調製した２本鎖ＤＮＡをクローニングするために、０．２５ｐｍｏｌ（２．５μＬ）ｃＤＮＡ（インサート）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターへのライゲーションに使用し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター０．０１７８８ｐｍｏｌを使用して、約１４：１のインサート対ベクター比にした。２０μＬの総反応体積中、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの１：５希釈（保存液８９．４ｎＭ）１．４μＬ、ｃＤＮＡ２．５μＬ、１０ｘＴ４Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ混合緩衝液１０μＬ、ヌクレアーゼフリー水６．１μＬ及びＴ４Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ酵素１μＬを微小遠心管に添加することにより、ライゲーション混合液を調製した。ライゲーション混合液を室温で１０分間インキュベートし、次いで約４℃で保存するか、又はすぐに使用した。
【００６３】
ＸＬ１−Ｂｌｕｅエレクトロポレーションコンピーテント細胞の形質転換
エレクトロポレーションを用いて細胞の形質転換を行った。簡潔に述べると、全試薬を氷上に維持し、エレクトロコンピーテント細胞を氷上で凍結融解した。微小遠心管中で、ライゲーション反応液（１．５μＬ）をエレクトロコンピーテント細胞４０μＬに添加し、混合液を０．１ｃｍ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に移した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒにおいて次の設定を用いて、形質転換を行った；１７００Ｖ、２００Ω及び２５μＦ。エレクトロポレーション後、細胞をＳＯＣ培地９６０μＬに移し、３７℃で１時間インキュベートした。次に、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を添加した、Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ寒天プレートに細胞をプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。
【００６４】
制限エンドヌクレアーゼ消化を介したプラスミドスクリーニング
クローニングしたペガプタニブ由来核酸配列を含有する細胞を同定するために、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を添加したＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ寒天プレートに無作為に拾った細菌コロニーをサブプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。個々のコロニーを拾い、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を添加した５ｍＬ  ＬＢブロス中に入れ、３７℃で一晩増殖させた。製造者の指示に従い、Ｑｉａｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＤＮＡカラムを用いて細菌培養物からプラスミドＤＮＡを抽出した。
【００６５】
ＸｈｏＩ及びＸｂａＩを用いてプラスミドＤＮＡ試料をエンドヌクレアーゼ消化し、２本鎖ｃＤＮＡインサートを含有するＤＮＡ試料（ポジティブクローン）を同定した。民間の配列決定機関により試料の配列決定を行った（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＤＮＡ  Ｃｏｒｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）。
【００６６】
その他の実施形態
本発明の詳細な説明と組み合わせて本発明を例示してきたが、前述の説明は例示を行うものであり、本発明の範囲を制限するものではなく、本発明の範囲は、添付の請求項の範囲によって定義されることを理解されたい。その他の態様、長所及び変更は次の請求項の範囲内にある。
【国際調査報告】
2008507277.tif 000002
2008507277.tif 000003
2008507277.tif 000004