(57)【要約】いくつかの型の癌細胞は、１つまたはそれより多くのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を発現する。これらのＴＬＲが処置の標的である。本発明は、ＴＬＲを発現する腫瘍細胞を選択し、そしてその細胞を治療的に有効な量のＴＬＲリガンドと接触させることによって、Ｔｏｌｌ様受容体を発現する癌および腫瘍細胞を処置するための方法に関連する。本発明は特に、ＴＬＲ３アゴニストを用いて、ＴＬＲ３を発現する癌および腫瘍細胞を処置する方法に関連する。
2008507530.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を処置するための方法であって、
ａ）ＴＬＲを発現する癌を有する患者を選択する工程、および
ｂ）該患者に治療的に有効な量のＴＬＲリガンドを投与する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記リガンドがアゴニストまたはアンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するための方法であって、
ａ）ＴＬＲを発現する腫瘍細胞を選択する工程、および
ｂ）該細胞を、該細胞においてアポトーシスを誘導するのに有効な量のＴＬＲリガンドと接触させる工程
を包含する、方法。
【請求項４】
前記リガンドがアゴニストまたはアンタゴニストである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
癌を処置するための方法であって、
ａ）ＴＬＲ３を発現する癌を有する患者を選択する工程；および
ｂ）該患者に治療的に有効な量のＴＬＲ３リガンドを投与する工程
を包含する、方法。
【請求項６】
前記リガンドがアゴニストまたはアンタゴニストである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記アゴニストがポリＩＣである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記アゴニストがポリＡＵである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記アンタゴニストが抗体またはその断片である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＴＬＲ３を発現する癌が乳癌である、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＴＬＲ３を発現する癌が大腸癌である、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が、前記患者に化学療法剤または癌処置を投与する工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が、ＴＬＲ３リガンドの投与前に、前記患者に低用量のＩ型ＩＦＮを投与する工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するための方法であって、
ａ）ＴＬＲ３を発現する腫瘍細胞を選択する工程；および
ｂ）該細胞を、該細胞においてアポトーシスを誘導するのに有効な量でＴＬＲ３リガンドと接触させる工程
を包含する、方法。
【請求項１５】
前記リガンドがアゴニストまたはアンタゴニストである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アゴニストがポリＩＣである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アゴニストがポリＡＵである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記アンタゴニストが抗体またはその断片である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＴＬＲ３を発現する腫瘍細胞が乳癌細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＴＬＲ３を発現する腫瘍細胞が大腸癌細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法が、前記細胞を化学療法剤または癌処置に接触させる工程をさらに包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法が、ＴＬＲ３リガンドの投与前に、前記細胞を低用量のＩ型ＩＦＮと接触させる工程をさらに包含する、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、米国出願第６０／５８９，６１６号に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、ＴＬＲを発現する腫瘍細胞を選択し、そしてその細胞を治療的に有効な量のＴＬＲリガンドと接触させることによって、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を発現する癌および腫瘍細胞を処置するための方法に関連する。本発明は特に、ＴＬＲ３アゴニストを用いて、ＴＬＲ３を発現する癌および腫瘍細胞を処置するための方法に関連する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
癌は、世界中で主な死因の１つである。従って、我々がこの致命的な疾患を処置する新規な方法を開発することが必須である。多くの現在の癌治療は、急速に分裂する細胞に影響を与える。これらの治療は、癌細胞のみでなく、胃腸管および毛包の細胞のような、全ての急速に分裂する細胞に影響を与えるので、破壊的な副作用を有する。従って、そのような破壊的な副作用を有さない、新規の処置方法が必要である。本出願は、Ｔｏｌｌ様受容体３を、癌処置における処置標的として同定する。
【０００４】
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｔｏｌｌタンパク質は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ胚において、背側−腹側パターン形成を制御し、そして太古からの宿主防御メカニズムを表すとも考えられる。
【０００５】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）と呼ばれる、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｔｏｌｌのヒト相同体も同定された。ヒトのＴｏｌｌタンパク質とＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＴｏｌｌタンパク質との配列の整列は、このタンパク質鎖の全長にわたって相同性が存在することを示す。よって、ＴＬＲはヒトの先天免疫の重要な構成要素であると考えられる。
【０００６】
ヒトＴｏｌｌ様受容体のファミリーは、１０個の高度に保存された受容体タンパク質であるＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０から構成される。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｔｏｌｌと同様に、ヒトＴＬＲは、病原体関連分子パターン（ｐａｔｈｏｇｅｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎｓ；ＰＡＭＰ）を認識するロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ドメインからなる細胞外ドメイン、およびヒトインターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体の細胞質ドメインと相同的な細胞質ドメインを有するＩ型膜貫通タンパク質である。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｔｏｌｌおよびＩＬ−１受容体の両方のシグナル伝達経路と同様に、ヒトＴｏｌｌ様受容体はＮＦ−κＢ経路を介してシグナル伝達する。
【０００７】
哺乳類ＴＬＲは多くの特徴およびシグナル伝達メカニズムを共有するが、その生物学的機能は非常に異なる。これは、部分的には、４つの異なるアダプター分子（ＭｙＤ８８、ＴＩＲＡＰ、ＴＲＩＦ、およびＴＲＡＦ）が、ＴＬＲと様々な組み合わせで会合し、そして異なるシグナル伝達経路を媒介するという事実による。それに加えて、１つのＴＬＲに対する異なるリガンドが、異なるシグナル伝達経路を優先的に活性化し得る。さらに、ＴＬＲは、様々な造血系細胞および非造血系細胞において、識別的に発現される。よって、ＴＬＲリガンドに対する応答は、ＴＬＲによって活性化されるシグナル伝達経路だけでなく、個々のＴＬＲを発現する細胞の性質にも依存する。
【０００８】
いくつかのＴＬＲのリガンドはまだ同定されていないが、多くのＴＬＲ特異的リガンドが既に報告されている。例えば、ポリＩＣおよびポリＡＵは、どちらもＴＬＲ３アゴニストである。
【０００９】
ポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ポリＩＣ）は、大きさが不均一な、高分子量合成２本鎖ＲＮＡである。ポリＩＣはＴＬＲ３アゴニストであるが、抗ウイルス応答および遺伝子の転写後調節に関与する普遍的な酵素であるＰＫＲの強力な活性化因子でもある。
【００１０】
ポリアデニル酸−ポリウリジル酸（ポリＡＵ）は、合成ポリリボヌクレオチドの２本鎖複合体である。ポリＡＵは、ＴＬＲ３アゴニストである。ポリＡＵは、体液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方の修飾因子であり、そしてインターフェロンの誘導因子でもある。
【００１１】
ポリＩＣおよびポリＡＵはどちらも、乳房、膀胱、腎臓、および胃の癌のような、異なる型の癌でのアジュバント治療としていくつかの臨床試験において使用されたが、これらの薬剤は、本明細書中で開示される新規方法において以前に使用されたことはない。
【００１２】
先に述べたように、本出願は、Ｔｏｌｌ様受容体３を、癌の処置における処置標的として同定する。以下の発表された研究は、ＴＬＲとアポトーシスとの間の関係に関連する。
【００１３】
非特許文献１（Ａｌｉｐｒａｎｔｉｓら）は、ヒトＴｏｌｌ様受容体２（ｈＴＬＲ２）を発現する単球細胞株におけるアポトーシスの誘導に対する細菌リポタンパク質（ＢＬＰ）の影響を調査する実験について報告する。非特許文献１を参照のこと。
【００１４】
Ａｌｉｐｒａｎｔｉｓらによる別の参考文献（非特許文献２）は、ＦＡＤＤの補充によるカスパーゼ８の活性化の誘発におけるＴＬＲ２の役割に関連する。非特許文献２を参照のこと。
【００１５】
非特許文献３（Ｓａｂｒｏｅら）は、好中球の生存におけるＴＬＲ２の役割に関連する。非特許文献３を参照のこと。
【００１６】
非特許文献４（ＢａｎｎｅｒｍａｎおよびＧｏｌｄｂｌｕｍ）は、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）受容体としてＴＬＲ４およびＴＬＲ２を示す研究に関連する。非特許文献４を参照のこと。
【００１７】
非特許文献５（Ｍｅｙｅｒら）は、ヒト上皮細胞株（ＨｅＬａＳ３）、ケラチノサイト（ＨａＣａＴおよびＡ４３１細胞）、およびマウス線維芽細胞（ＭｃＣｏｙ細胞）におけるＴＬＲ７アゴニストによるアポトーシスの誘導についての研究に関連する。非特許文献５を参照のこと。
【００１８】
非特許文献６（Ｗｅｎら）は、糖尿病が、先天免疫受容体であるＴＬＲ３の発現を介した、膵島によるウイルス様刺激の直接認識の組み合わせによって部分的に誘導されることを示唆する。Ｗｅｎらはまた、ポリＩＣによるアポトーシスの誘導がおそらくＴＬＲ３によって媒介されることを推測する。非特許文献６を参照のこと。
【００１９】
最後に、非特許文献７（Ｈａｎら）は、ＴＲＩＦを過剰発現する２９３細胞におけるアポトーシスの誘導に関連する。非特許文献７はまた、ＴＬＲ３によって活性化される、ＴＲＩＦ誘導細胞内シグナル伝達経路（ＩＳＲＥ／ＩＦＮβ、ＮＦκＢおよびアポトーシス）の提案されたモデルに言及する。非特許文献７を参照のこと。
【非特許文献１】Ａｌｉｐｒａｎｔｉｓら、「Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２８５巻、７３６−７３９頁（１９９９年７月３０日）
【非特許文献２】Ａｌｉｐｒａｎｔｉｓら、「Ｔｈｅ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２」、Ｅｍｂｏ  Ｊ．，第１９（１３）巻、３３２５−３３３６頁（２０００）
【非特許文献３】Ｓａｂｒｏｅら、「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＬＲ）２  ａｎｄ  ＴＬＲ４  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｐａｎ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１７０巻、５２６８−５２７５頁（２００３）
【非特許文献４】ＢａｎｎｅｒｍａｎおよびＧｏｌｄｂｌｕｍ、「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ」、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、第２８４巻、Ｌ８９９−Ｌ９１４頁（２００３）
【非特許文献５】Ｍｅｙｅｒら、「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−７  ａｇｏｎｉｓｔ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ」、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ、第１４９巻（ｓｕｐｐ．６６）、９−１３頁（２００３）
【非特許文献６】Ｗｅｎら、「Ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｉｎｎａｔｅ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｏｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｏｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｉｓｌｅｔｓ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１７２巻、３１７３−３１８０頁（２００４）
【非特許文献７】Ｈａｎら、「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＴＲＩＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ＮＦ−κＢ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｐａｔｈｗａｙｓ」、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２７９巻、第１５号、１５６５２−１５６６１頁（２００４）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
（発明の要旨）
本発明の実施態様は、ａ）ＴＬＲを発現する癌を有する患者を選択する工程、およびｂ）その患者に、治療的に有効な量のＴＬＲリガンドを投与する工程を包含する、癌を処置するための方法を提供する。好ましくは、そのリガンドはアゴニストまたはアンタゴニストである。
【００２１】
本発明の別の実施態様は、ａ）ＴＬＲを発現する腫瘍細胞を選択する工程、およびｂ）その細胞を、その細胞においてアポトーシスを誘導するために有効な量のＴＬＲリガンドと接触させる工程を包含する、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するための方法を提供する。好ましくは、そのリガンドはアゴニストまたはアンタゴニストである。
【００２２】
本発明の別の実施態様は、ａ）ＴＬＲ３を発現する癌を有する患者を選択する工程、およびｂ）その患者に、治療的に有効な量のＴＬＲ３リガンドを投与する工程を包含する、癌を処置するための方法を提供する。好ましくは、そのリガンドはアゴニストまたはアンタゴニストである。より好ましくは、そのアゴニストはポリＡＵである。最も好ましくは、そのアゴニストはポリＩＣである。あるいは、そのアンタゴニストは抗体またはその断片である。好ましくは、ＴＬＲ３を発現する癌は大腸癌である。最も好ましくは、ＴＬＲ３を発現する癌は乳癌である。その方法はさらに、患者に化学療法剤または癌処置を投与することを含み得る。その方法はまたさらに、ＴＬＲ３リガンドの投与前に、患者に低用量のＩ型ＩＦＮを投与することを含み得る。
【００２３】
本発明の別の実施態様は、ａ）ＴＬＲ３を発現する腫瘍細胞を選択する工程、およびｂ）その細胞を、その細胞においてアポトーシスを誘導するために有効な量のＴＬＲ３リガンドと接触させる工程を包含する、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するための方法を提供する。好ましくは、そのリガンドはアゴニストまたはアンタゴニストである。より好ましくは、そのアゴニストはポリＡＵである。最も好ましくは、そのアゴニストはポリＩＣである。あるいは、そのアンタゴニストは抗体またはその断片である。好ましくは、ＴＬＲ３を発現する腫瘍細胞は大腸癌細胞である。最も好ましくは、ＴＬＲ３を発現する腫瘍細胞は乳癌細胞である。その方法はさらに、その細胞を化学療法剤または癌処置と接触させることを含み得る。その方法はまたさらに、ＴＬＲ３リガンドの投与前に、細胞を低用量のＩ型ＩＦＮと接触させることを含み得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明の前述および他の特徴は、以下の発明の詳細な説明および図面の簡単な説明からより容易に明らかである。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で引用された全ての刊行物は、その全体が参考として援用される。
【００２６】
（定義）
「アポトーシス」という用語は、プログラム細胞死を意味する。
【００２７】
「アゴニスト」という用語は、受容体に結合し、そして活性化し得るリガンドを意味する。
【００２８】
「アンタゴニスト」という用語は、受容体に結合し、そして受容体をブロックまたは不活性化し得るリガンドを意味する。あるいは、「アンタゴニスト」は、アゴニストが受容体に結合するのを防止するように、アゴニストに結合し、そしてアゴニストをブロックまたは不活性化し得る。
【００２９】
「抗体」という用語は、免疫グロブリン全体、すなわちＦｃ断片に結合した２つのＦａｂ断片を含むものを意味する。「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体を包含する。「抗体」という用語は、免疫グロブリンの５つの主要なクラス（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）および免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＡ２）のいずれか１つを含む。
【００３０】
「抗体断片」という用語は、Ｆａｂ断片、Ｆｃ断片、Ｆ（ａｂ）２断片およびＦｖ断片のような、免疫グロブリン全体の任意の断片または断片の組み合わせを意味する。
【００３１】
「癌」という用語は、代表的に未制御の細胞増殖によって特徴付けられる生理学的状態を記述する。癌の例は、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病を含むがこれらに限定されない。より具体的な例は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、大腸癌、直腸結腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌腫、腎臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌腫、および様々な型の頭部および頸部癌を含む。
【００３２】
「化学療法剤」という用語は、癌の処置に有用な化学的化合物を意味する。
【００３３】
「処置」という用語は、任意の臨床的に望ましいまたは有用な効果を引き起こす、疾患または異常の処置的、予防的または抑制的な手段を意味し、１つまたはそれより多くの症状の緩和、疾患または障害の進行の後退、遅延、または休止を含むがこれらに限定されない。
【００３４】
「ｓｉＲＮＡ」という用語は、短い干渉ＲＮＡを意味する。
【００３５】
「ＴＬＲ」という用語は、Ｔｏｌｌ様受容体を意味する。ＴＬＲは、Ｔｏｌｌ様受容体の任意の種であり得る。好ましくは、その用語は、ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０の１つのような、ヒトＴｏｌｌ様受容体（ｈＴＬＲ）を指す。
【００３６】
「ＴＬＲを発現する癌」という用語は、Ｔｏｌｌ様受容体を発現する細胞を含む腫瘍を意味する。
【００３７】
「ＴＬＲを発現する腫瘍細胞」という用語は、Ｔｏｌｌ様受容体を発現する腫瘍細胞を意味する。
【００３８】
「発現する（ｅｘｐｒｅｓｓ）」、「発現する（ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ）」、「発現」、および「発現している」という用語は全て、ポリペプチドを産生するための核酸の転写および翻訳を意味する。細胞において、これはそのポリペプチドが分泌されるか、細胞質にとどまるか、または少なくとも部分的に細胞膜に存在するかのいずれかであることを意味する。
【００３９】
「リガンド」という用語は、受容体のような、別の分子に特異的に結合し得る任意の分子を意味する。「リガンド」という用語は、アゴニストおよびアンタゴニストの両方を含む。「リガンド」は例えば、低分子（有機分子）、抗体または抗体断片、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、ポリペプチド、ＤＮＡおよびＲＮＡであり得る。
【００４０】
「ＴＬＲリガンド」という用語は、Ｔｏｌｌ様受容体、特にヒトＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０に特異的に結合し得る任意の分子を意味する。「ＴＬＲリガンド」という用語は、ＴＬＲのアゴニストおよびアンタゴニストの両方を含む。「ＴＬＲリガンド」は例えば、低分子（有機分子）、抗体または抗体断片、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、ポリペプチド、ＤＮＡおよびＲＮＡであり得る。
【００４１】
「対応するＴＬＲリガンド」という用語は、特定のＴＬＲに結合するリガンドを意味する。例えば、ＴＬＲ１リガンドは、ＴＬＲ１の対応するＴＬＲリガンドである。同様に、ＴＬＲ２リガンドは、ＴＬＲ２の対応するＴＬＲリガンドである。この同じ原理がＴＬＲ３〜ＴＬＲ１０にもあてはまる。
【００４２】
「患者」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物の両方を意味する。
【００４３】
「ポリＩＣ」という用語は、ポリイノシン酸−ポリシチジル酸を意味する。
【００４４】
「ポリＡＵ」という用語は、ポリアデニル酸−ポリウリジル酸を意味する。
【００４５】
「治療的に有効な量」という用語は、癌のような、ＴＬＲによって引き起こされる、または媒介される医学的状態を特徴付ける１つまたはそれより多くのパラメーターを緩和する、ＴＬＲリガンドのような組成物の量を意味する。
【００４６】
「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」および「有効な量（ａｍｏｕｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」という用語は、細胞におけるアポトーシスの誘導のような、ある効果を引き起こす、ＴＬＲリガンドのような医薬品組成物の量を意味する。
【００４７】
「低用量」という用語は、処置的効果のようなある効果を達成するために普通であると考えられるより低い物質の量を意味する。
【００４８】
（Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の特徴付け）
ヒトＴｏｌｌ様受容体（ｈＴＬＲ）のファミリーは、１０個のメンバーｈＴＬＲ１〜ｈＴＬＲ１０から構成される。ｈＴＬＲ１〜ｈＴＬＲ１０のそれぞれの完全なオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列は、当該分野で公知である。例えば、ｈＴＬＲ１〜ｈＴＬＲ１０の配列はＰＣＴ公開第ＷＯ０１／９０１５１において開示されるが、その配列は公の命名法と異なって番号が付けられている。ｈＴＬＲ１〜ｈＴＬＲ１０のそれぞれのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列はまた、下記の表１において示すように、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースにおいても見出され得る。
【００４９】
【表１】
2008507530.tif 000003
当業者は、任意のＴＬＲの核酸配列およびアミノ酸配列を考慮して、標準的な分子生物学の技術を用いて、任意のＴＬＲタンパク質またはその断片、そのタンパク質または断片に対する抗体、核酸またはその断片、核酸プローブ、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ等を産生し得る。これらの分子を次いでＴＬＲを発現する癌または腫瘍細胞を選択するために使用し得る。
【００５０】
下記の表２で示すように、いくつかのＴＬＲリガンドが同定された。当業者は、下記のリガンドのいずれも単離または産生し得る。あるいは、そのリガンドを市販の供給源から購入し得る。
【００５１】
【表２】
2008507530.tif 000004
ＴＬＲは、免疫応答のメディエーターとして機能する。従って、ＴＬＲの処置的適用は、腫瘍学、感染性疾患、自己免疫、アレルギー、喘息、ＣＯＰＤおよび心臓病学の分野に存在する。
【００５２】
本発明は、部分的には、ある型の腫瘍細胞はＴｏｌｌ様受容体を発現すること、およびこれらのＴＬＲへのリガンド結合は、腫瘍に対する免疫応答の確立を助け、そしてその有効性を改善するという知見に基づく。
【００５３】
（ＴＬＲを発現する癌または腫瘍細胞の選択）
本発明の方法の工程は、ＴＬＲを発現する癌を有する患者を選択すること、またはＴＬＲを発現する腫瘍細胞を選択することを含む。
【００５４】
「選択すること」という用語は、目的の何かを同定することを意味する。本適用の文脈において、「患者を選択すること」という語句は、ＴＬＲを発現する癌のような、特定の特徴を有する患者を同定することを意味する。「ＴＬＲを発現する腫瘍細胞を選択すること」という語句は、Ｔｏｌｌ様受容体を発現する腫瘍細胞を同定することを意味する。
【００５５】
当該分野において公知であるように、ＴＬＲを発現する癌を有する患者を選択する、またはＴＬＲを発現する腫瘍細胞を選択する多くの方法が存在する。例えば、ＴＬＲを発現する腫瘍細胞に結合し、そしてそれを同定するために、抗体または抗体断片を使用し得る。好ましくは、ＴＬＲ３を発現する腫瘍細胞に結合し、そしてそれを同定するためにＴＬＲ３抗体を使用する。抗体またはその断片を、医薬品組成物においてインビボで、またはインビトロで投与し得る。好ましくは、患者に対して生検を実施し、そして腫瘍細胞をインビトロで選択する。そうでなければＴＬＲリガンド処置のプロトコールに含まれない患者を補充する潜在的な手段として、生検の前にＴＬＲの発現を増加させることも可能である。ＴＬＲ３の場合、低用量のＩ型ＩＦＮまたはＴＬＲ３リガンド自身を、生検前、または他のあらゆる診断的手順（穿刺吸引または医学的映像）の前に、数日間投与し得る。あるいは、この出願の表２において同定されたＴＬＲリガンドのいずれか１つ、または他の低分子を、ＴＬＲを発現する腫瘍細胞に結合し、そしてそれを同定するために使用し得る。好ましくは、ＴＬＲ３を発現する細胞に結合し、そしてそれを同定するためにＴＬＲ３リガンドを使用する。再び、選択工程を好ましくはインビトロで行う。さらに、腫瘍細胞を溶解して、その細胞が増加したレベルの特定のＴＬＲタンパク質（ウェスタンブロットによって）、または特定のＴＬＲ  ＲＮＡ（ノーザンブロットによって）を示すかどうかを決定し得る。
【００５６】
選択過程は、検出可能な標識の使用を含み得る。例えば、上記の抗体、抗体断片、低分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および他のリガンドを、検出するために標識する必要があり得る。検出は視覚的に、またはデバイスの使用によって達成され得る。当該分野で通常使用される検出可能な標識は、例えば放射性標識、蛍光標識、および酵素的標識を含むが、任意の検出可能な標識を使用し得る。
【００５７】
ＴＬＲを発現する腫瘍細胞を同定することに加えて、選択工程はおそらく特定の腫瘍細胞がどのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０）を発現しているかを同定する。これは、ＴＬＲを発現する腫瘍細胞を選択するために使用される多くの抗体、抗体断片、ＤＮＡ、ＲＮＡ、低分子、または他のリガンドが、ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０のうちの個々のＴＬＲに特異的に結合するという事実による。
【００５８】
ＴＬＲを発現する癌を有する患者を選択する、またはＴＬＲを発現する腫瘍細胞を選択する工程を、間接的な様式でも実施し得る。例えば、癌による特定のＴＬＲの発現を、特定の病因を有する癌の特定のサブタイプと関連させ得る。ウイルスのような、この特定の病因の任意のマーカーは、所定のＴＬＲの発現を示し得、そして対応するＴＬＲリガンドの使用を導く有用なマーカーであり得る。
【００５９】
（患者へのＴＬＲリガンドの投与）
本発明の方法の別の工程は、患者に、治療的に有効な量のＴＬＲリガンドを投与することを含む。この工程は、ＴＬＲリガンドを医薬品組成物中で投与することを含む。例えば、医薬品組成物は、錠剤の形式であり得、その結果、リガンドが血流中に吸収される。次いで循環系によってＴＬＲリガンドがＴＬＲを発現する癌へと送達され得、その結果、リガンドと癌とがお互いに接触し得る。この接触工程が、リガンドが癌のＴｏｌｌ様受容体に結合し、そして癌における増殖阻害およびアポトーシスを誘導することを可能にする。あるいは、黒色腫の処置のためのように、医薬品組成物を局所的（ｌｏｃａｌｌｙ）または表面（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）に投与し得る。
【００６０】
上記で述べたように、選択工程はおそらく、その癌が発現している特定のＴＬＲを同定する。好ましくは、投与工程は、Ｔｏｌｌ様受容体を発現する癌を有する患者に、対応するリガンドを投与することを含む。例えば、癌がＴＬＲ１を発現しているなら、好ましくは患者に有効な量のＴＬＲ１リガンドを投与する。同様に、癌がＴＬＲ２を発現しているなら、好ましくは患者に有効な量のＴＬＲ２リガンドを投与する。同じ原理がＴＬＲ３〜ＴＬＲ１０にもあてはまる。
【００６１】
好ましくは、本発明の方法は、ＴＬＲ３を発現する癌を有する患者に、有効な量のＴＬＲ３リガンドを投与することを含む。好ましくは、ＴＬＲ３リガンドはアゴニストである。より好ましくは、ＴＬＲ３リガンドはポリＡＵである。最も好ましくは、ＴＬＲ３リガンドはポリＩＣである。好ましくは、癌は大腸癌細胞または乳癌である。
【００６２】
好ましくは、本発明の方法はさらに、患者に化学療法剤または癌処置を投与することを含む。
【００６３】
好ましくは、本発明の方法はさらに、患者に低用量のＩ型ＩＦＮまたはＴＬＲ３リガンドを投与することを含む。例えば、低用量のＩ型ＩＦＮは１〜３ＭＵの範囲であり、そして好ましくは２ＭＵである。より好ましくは、低用量のＩ型ＩＦＮは１ＭＵより少ない。
【００６４】
（ＴＬＲを発現する腫瘍細胞とＴＬＲリガンドとの接触）
あるいは、本発明の方法の工程は、ＴＬＲを発現する腫瘍細胞を、有効な量のＴＬＲリガンドと接触させることを含む。インビボにおいて、接触工程は、ＴＬＲリガンドを医薬品組成物中で患者に投与することを含む。インビトロにおいて、接触工程は、ＴＬＲを発現する腫瘍細胞およびＴＬＲリガンドを、リガンドと細胞とがお互いに接触し得るように、物理的に近づけることを含む。この接触工程は、リガンドが細胞のＴｏｌｌ様受容体に結合し、そして腫瘍細胞において増殖阻害およびアポトーシスを誘導することを可能にする。
【００６５】
上記で述べたように、選択工程はおそらく、その腫瘍細胞が発現している特定のＴＬＲを同定する。好ましくは、接触工程は、Ｔｏｌｌ様受容体を発現する細胞を、対応するリガンドと接触させることを含む。例えば、腫瘍細胞がＴＬＲ１を発現しているなら、好ましくは細胞を有効な量のＴＬＲ１リガンドと接触させる。同様に、腫瘍細胞がＴＬＲ２を発現しているなら、好ましくは細胞を有効な量のＴＬＲ２リガンドと接触させる。同じ原理がＴＬＲ３〜ＴＬＲ１０にもあてはまる。
【００６６】
好ましくは、本発明の方法は、ＴＬＲ３を発現する腫瘍細胞を、有効な量のＴＬＲ３リガンドと接触させることを含む。好ましくは、ＴＬＲ３リガンドはアゴニストである。より好ましくは、ＴＬＲ３リガンドはポリＡＵである。最も好ましくは、ＴＬＲ３リガンドはポリＩＣである。好ましくは、細胞は大腸癌細胞または乳癌細胞である。
【００６７】
好ましくは、本発明の方法はさらに、細胞を化学療法剤または癌処置と接触させることを含む。
【００６８】
好ましくは、本発明の方法はさらに、細胞を低用量のＩ型ＩＦＮまたはＴＬＲ３リガンドと接触させることを含む。例えば、低用量のＩ型ＩＦＮは１〜３ＭＵの範囲であり、そして好ましくは２ＭＵである。より好ましくは、低用量のＩ型ＩＦＮは１ＭＵより少ない。
【００６９】
（ポリペプチド）
抗体、抗体断片またはリポペプチドのようなポリペプチドを、本発明の方法において、ＴＬＲを発現する癌または細胞を選択するために選択工程において、ＴＬＲリガンドを患者に送達するために投与工程において、またはＴＬＲ発現細胞において増殖阻害およびアポトーシスを誘導するために接触工程において使用し得る。それに加えて、ＴＬＲに結合する（抗体のような）リガンドを同定または産生するために、ＴＬＲポリペプチドまたはその断片を産生し得る。
【００７０】
本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド」または「ペプチド」という用語は、例えば完全なタンパク質の残基の全数までおよびそれを含んで、少なくとも８個、好ましくは少なくとも１２個、より好ましくは少なくとも２０個、そして最も好ましくは少なくとも３０個またはそれより多くの連続的なアミノ酸残基を含むポリペプチドの断片または部分を意味する。「ポリペプチド」という用語はまた、欠失体、付加体、修飾体、置換体、アナログ、変異体、および糖鎖付加ポリペプチドまたは非糖鎖付加ポリペプチドを含む。
【００７１】
置換は、保存的置換および非保存的置換の両方を含む。
【００７２】
アミノ酸残基の修飾は、カルボキシル末端またはカルボキシル側鎖を含む残基の脂肪族エステルまたはアミド、ヒドロキシル基を含む残基のＯ−アシル誘導体、およびアミノ末端アミノ酸またはアミノ基を含む残基、例えばリジンまたはアルギニンのＮ−アシル誘導体を含み得るがこれに限らない。
【００７３】
アナログは、非天然（ｕｎｎａｔｕｒａｌ）アミノ酸残基、またはホスホチロシン残基、ホスホセリン残基、もしくはホスホスレオニン残基のようなリン酸化アミノ酸残基の組み込みのような修飾を含むポリペプチドである。他の可能性のある修飾は、スルホン化、ビオチン化、または他の部分、特にリン酸基と類似の分子形状を有するものの付加を含む。
【００７４】
ポリペプチドの合成の技術は、例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９（１９６３）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３４１（１９８６）；およびＡｔｈｅｒｔｏｎら、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、１９８９、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄにおいて記載されている。
【００７５】
ポリペプチドのアナログを、化学的合成によって、または部位特異的変異誘導［Ｇｉｌｌｍａｎら、Ｇｅｎｅ  ８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：７３１（１９８７）またはＩｎｎｉｓ（編）、１９９０、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ］、または完全な受容体をコードする核酸を修飾するために、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：２４７１（１９９１）］によって例示されたように、ポリメラーゼ連鎖反応法［ＰＣＲ；Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７（１９８８）］を用いることによって調製し得る。組み換え産物の精製または検出のために、エピトープタグを加えることを想定する。
【００７６】
（核酸）
ＴＬＲを発現する癌を有する患者を選択するために、またはＴＬＲを発現する腫瘍細胞を選択するために、核酸を使用し得る。患者を選択するために、好ましくは患者の腫瘍の生検を行う。次いで、その腫瘍細胞を、インビトロでＴＬＲ核酸の発現に関して分析し得る。
【００７７】
この出願の表１において示すように、ｈＴＬＲ１〜ｈＴＬＲ１０のそれぞれの核酸配列およびアミノ酸配列は、当該分野で公知である。当業者は、特定の腫瘍細胞がＴＬＲ核酸を発現しているかどうかを決定するためのハイブリダイゼーションアッセイを行うために、公知の配列またはその断片を使用し得る。例えば、特定のＴＬＲの公知の配列を使用して、当業者は、腫瘍細胞がその特定のＴＬＲを発現しているかどうかを決定するためにノーザンブロット分析を行い得る。
【００７８】
それに加えて、特定のＴＬＲまたはその断片をコードする核酸を使用して、ＴＬＲポリペプチドを産生し得る。次いでそのＴＬＲポリペプチドを使用して、特定のＴＬＲに対する抗体を産生し得る。
【００７９】
核酸「断片」は、本明細書中で、少なくとも１７、一般的に少なくとも２５、好ましくは少なくとも３５、より好ましくは少なくとも４５、そして最も好ましくは少なくとも５５またはそれより多くの連続的なヌクレオチドを含むヌクレオチド配列として定義される。
【００８０】
核酸の操作および発現の一般的な技術が、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）、１９８９、第１−３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにおいて一般的に記載されている。
【００８１】
（抗体産生）
ＴＬＲに特異的な抗体およびその断片を、本発明の方法の、ＴＬＲ発現細胞を選択するために選択工程において、ＴＬＲリガンドを患者に送達するために投与工程において、またはＴＬＲ発現細胞において増殖阻害およびアポトーシスを誘導するために接触工程において使用し得る。
【００８２】
個々のＴＬＲの抗原性（すなわち免疫原性）断片を産生し得る。それらがＴＬＲリガンドに結合するかどうかに関わらず、そのような断片は、完全な受容体と同様、完全な受容体に結合し得る抗体を調製するための抗原として有用である。より短い断片をキャリアに連結または結合し得る。エピトープは一般的に少なくとも５つ、好ましくは少なくとも８個のアミノ酸残基を含むことが当該分野で周知であるので［Ｏｈｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：２９４５（１９８５）］、抗体の産生に使用される断片は、一般的に少なくともそのサイズである。好ましくは、それらは、上記で記載したように、さらにより多くの残基を含む。所定の断片が免疫原性かどうかを、慣用的な実験によって容易に決定し得る。
【００８３】
免疫学的にコンピテントな宿主において抗体産生を誘導するために完全なＴＬＲを抗原として使用する場合には一般的に必要でないが、より小さい抗原性断片は、好ましくは免疫原性キャリア分子（すなわち、宿主動物において独立に免疫学的応答を惹起する性質を有する高分子）への架橋または連結によって、または結合によって、最初により免疫原性にする。小さいポリペプチド断片は、ハプテン（抗体に特異的に結合し得るが、抗体産生を誘導できない分子、すなわち、それらは免疫原性ではない）として作用することがあるので、キャリア分子への架橋または結合が必要であり得る。そのような断片の免疫原性キャリア分子への結合は、「キャリア効果」として通常公知であるものによって、それらをより免疫原性にする。
【００８４】
適切なキャリア分子としては、例えばタンパク質およびポリペプチド、多糖類、リポ多糖類等のような、天然または合成のポリマー化合物が挙げられる。キーホールリンペットヘモシアニン、ならびにヒトまたはウシのガンマグロブリン、ヒト、ウシ、またはウサギの血清アルブミン、またはそのようなタンパク質のメチル化または他の誘導体のような、哺乳類血清タンパク質を含むがこれらに限定されない、タンパク質キャリア分子が特に好ましい。他のタンパク質キャリアは、当業者に明らかである。好ましくは、そのタンパク質キャリアは、断片に対する抗体が惹起される宿主動物に対して外来性であるが、その必要はない。
【００８５】
キャリア分子に対する共有結合を、当該分野で周知の方法を用いて達成し得、その正確な選択は、使用されるキャリア分子の性質によって指示される。免疫原性キャリア分子がタンパク質である場合、本発明の断片を、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドのような、水溶性カルボジイミドまたはグルタルアルデヒドを用いて結合し得る。
【００８６】
これらのような結合薬剤を、別のキャリア分子を用いることなく、断片をそれ自身に架橋するためにも使用し得る。そのような凝集物への架橋も、免疫原性を増加させ得る。単独で、または結合もしくは凝集と組み合わせて、公知のアジュバントを使用することによっても、免疫原性を増加させ得る。
【００８７】
動物をワクチン接種するために適切なアジュバントとしては、アジュバント６５（ピーナッツオイル、マンナイドモノオレエート、およびモノステアリン酸アルミニウムを含む）；フロイント完全または不完全アジュバント；水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびミョウバンのようなミネラルゲル；ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リゾレシチン、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシメチル）プロパンジアミン、メトキシヘキサデシルグリセロールおよびプルロニックポリオールのような界面活性剤；ピラン、硫酸デキストラン、ポリＩＣ、ポリアクリル酸およびカルボポールのようなポリアニオン；ムラミルジペプチド、ジメチルグリシンおよびタフトシンのようなペプチド；およびオイルエマルションが挙げられるがこれらに限定されない。ポリペプチドも、リポソームまたは他のマイクロキャリアへ組み込んだ後、投与し得る。
【００８８】
アジュバントおよびイムノアッセイの様々な局面に関する情報が、例えば、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、第３版、１９８７、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋによるシリーズにおいて開示されている。ポリクローナル抗血清を調製する方法を含む他の有用な参考文献は、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９６９、Ｈｏｅｂｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｈａｒｐｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｗ；Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ、Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、１９６２、Ｄｏｖｅｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、およびＷｉｌｌｉａｍｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１巻、１９６７、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを含む。
【００８９】
標準的な方法を用いて免疫された動物からの血清を直接使用し得る、またはＩｇＧ画分を、血漿分離交換法または固定化プロテインＡのようなＩｇＧ特異的吸着剤を用いた吸着クロマトグラフィーのような、標準的な方法を用いて血清から分離し得る。あるいは、モノクローナル抗体を調製し得る。
【００９０】
ＴＬＲまたはその抗原性断片に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、周知の技術によって産生する。通常、その過程は、不死化細胞株と、望ましい抗体を産生するＢリンパ球との融合を含む。あるいは、不死の抗体産生細胞株を産生する、非融合技術、例えばウイルスにより誘導されたトランスフォーメーション［Ｃａｓａｌｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：４７６（１９８６）］を使用し得る。不死化細胞株は、通常トランスフォーメーションされた哺乳類細胞、特にげっ歯類、ウシ、およびヒト起源の骨髄腫細胞である。最も多くの場合、利便性および入手可能性の問題として、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株を採用する。
【００９１】
抗原を注射した哺乳類から抗体産生リンパ球を得る技術は周知である。一般的に、ヒト起源の細胞を採用するなら、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を使用する、または非ヒト哺乳類の供給源からは脾臓またはリンパ節細胞を使用する。宿主動物に、精製抗原の反復投与量を注射し（ヒト細胞をインビトロで感作する）、そして動物に望ましい抗体産生細胞を産生させてから、それらを不死化細胞株と融合するために回収する。融合の技術も当該分野で周知であり、そして一般的に細胞をポリエチレングリコールのような融合剤と混合することを含む。
【００９２】
ＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）選択のような、標準的な手順によってハイブリドーマを選択する。望ましい抗体を分泌するものを、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）等のような、標準的なイムノアッセイを用いて選択する。抗体を、標準的なタンパク質精製技術を用いて培地から回収する［Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９８５）］。
【００９３】
上記の技術を適用する指針を提供するために、多くの参考文献が入手可能である［Ｋｏｈｌｅｒら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｃｏｌｄ  ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８０）；Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９８５）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９８４）；Ｈｕｒｒｅｌｌ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ、１９８２）］。モノクローナル抗体はまた、周知のファージライブラリーシステムを用いても産生され得る。例えば、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５（１９８９）；Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４（１９８９）を参照のこと。
【００９４】
ポリクローナルまたはモノクローナルに関わらず、そのように産生された抗体を、例えば免疫親和性クロマトグラフィーによって受容体を精製するために、周知の方法によって固体支持体に結合した固定化形式で使用され得る。
【００９５】
未標識または標準的な方法によって標識された、抗原性断片に対する抗体も、ＴＬＲのイムノアッセイの基礎として使用し得る。使用される特定の標識は、イムノアッセイの型に依存する。使用し得る標識の例としては、３２Ｐ、１２５Ｉ、３Ｈ、および１４Ｃのような放射性標識；フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシルおよびウンベリフェロンのような蛍光標識；ルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタラジンジオンのような化学発光剤；および西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リゾチーム、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼのような酵素が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９６】
抗体を、公知の方法によって、そのような標識でタグ化し得る。例えば、アルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、イミデート、スクシンイミド、ビスジアゾ化ベンジジン等のような結合剤を使用して、抗体を蛍光標識、化学発光標識または酵素標識でタグ化し得る。関与する一般的な方法は、当該分野で周知であり、そして例えばＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ、１９８７、Ｃｈａｎ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｏｒｌａｎｄｏ、ＦＬにおいて記載される。そのようなイムノアッセイを、例えば受容体の精製の間に得られた画分に対して実施し得る。
【００９７】
本発明の抗体をまた、発現クローニングシステムにおいて、ＴＬＲを発現する特定のｃＤＮＡクローンを同定するために使用し得る。
【００９８】
受容体のリガンド結合部位に特異的な中和抗体も、リガンド結合をブロックするためのアンタゴニスト（阻害剤）として使用され得る。そのような中和抗体を、慣用実験によって、例えば下記で記載する放射性リガンド結合アッセイを用いることによって、容易に同定し得る。ＴＬＲ活性の拮抗作用を、完全な抗体分子、またはＦａｂ断片、Ｆｃ断片、Ｆ（ａｂ）２断片およびＦｖ断片のような周知の抗原結合断片を用いて達成し得る。
【００９９】
そのような断片の定義を、例えば、Ｋｌｅｉｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８２）；Ｗｅｉｒ編、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４版（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８６）のＰａｒｈａｍ、第１４章において見出し得る。抗体断片、例えばＦａｂ断片［Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９８５）］、Ｆｖ断片［Ｈｏｃｈｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：１１３０（１９７３）；Ｓｈａｒｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １５：１５９１（１９７６）；Ｅｈｒｌｉｃｈら、米国特許第４，３５５，０２３号］および抗体半分子（ｈａｌｆ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）（Ａｕｄｉｔｏｒｅ−Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ、米国特許第４，４７０，９２５号）の使用および産生もまた、記載された。公知の抗体重鎖および軽鎖可変領域配列に基づいて組み換えＦｖ断片を作成する方法が、例えばＭｏｏｒｅら（米国特許第４，６４２，３３４号）によって、およびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ［Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：５４５（１９９１）］によって、さらに記載された。あるいは、それらを標準的な方法によって化学的に合成し得る。
【０１００】
ポリクローナルおよびモノクローナルの両方の抗イディオタイプ抗体も、抗原としての受容体に対して惹起された抗体を用いて産生され得る。そのような抗体は、受容体を模倣し得るので有用であり得る。
【０１０１】
（医薬品組成物）
ＴＬＲアゴニストおよびアンタゴニストを、治療的に使用して、ＴＬＲの活性を刺激またはブロックし、そしてそれによってＴＬＲによって引き起こされる、または媒介される任意の医学的状態を処置し得る。処置的適用に関わる投与レジメは、処置物質の作用を改変し得る様々な因子、例えば患者の状態、体重、性別および食事、投与時間、および他の臨床的因子を考慮して、担当医師によって決定される。
【０１０２】
そのような物質の治療的投与のための代表的なプロトコールは、当該分野で周知である。医薬品組成物の投与は、代表的には非経口、腹腔内、静脈内、皮下もしくは筋肉内での注射による、または注入による、または任意の他の受容可能な全身性の方法による。多くの場合、処置投与量は、安全性および有効性を最適化するために、低いレベルから上へ向かってタイトレーションされる。一般的に、１日投与量は体重１キログラムあたり約０．０１から２０ｍｇのタンパク質の範囲に入る。代表的には、投与量範囲は、体重１キログラムあたり約０．１から５ｍｇまでである。
【０１０３】
より小さな分子サイズおよびおそらく減少した投与後の半減期（クリアランス時間）を考慮して、投与量を調整する。しかし、ＴＬＲアンタゴニストは、本発明の方法を用いて同定し得る、有機低分子および阻害性リガンドアナログを含む他の型の阻害剤に加えて、中和抗体またはその結合断片を含むことが、当業者によって認識される。
【０１０４】
医薬品組成物を単純な溶液中で投与し得るが、より代表的には、キャリア、好ましくは医薬品キャリアのような他の材料と組み合わせて使用される。有用な医薬品キャリアは、医薬品組成物を患者に送達するために適切な、任意の適合性の無毒性物質であり得る。滅菌水、アルコール、脂肪、ワックス、および不活性固体が、キャリアに含まれ得る。薬学的に受容可能な佐剤（緩衝剤、分散剤）も、医薬品組成物に含まれ得る。一般的に、そのような薬物の非経口投与に有用な組成物は周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１７版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０））。あるいは、医薬品組成物を、移植可能な薬物送達システムによって、患者の体内に導入し得る［Ｕｒｑｕｈａｒｔら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２４：１９９（１９８４）］。
【０１０５】
多くの従来の投与処方物において、治療用処方物を投与し得る。処方物は、代表的には、１つまたはそれより多くの薬学的に受容可能なキャリアと共に、少なくとも１つの活性成分を含む。処方物としては、経口、直腸内、経鼻、または非経口（皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む）投与に適切なものが挙げられ得る。
【０１０６】
処方物は、簡便に単位投与形式で提示され得、そして薬学の分野で周知の任意の方法によって調製され得る。例えば、Ｇｉｌｍａｎら（編）（１９９０）、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第８版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前出、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎ；Ａｖｉｓら（編）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：  Ｔａｂｌｅｔｓ、Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＬｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：  Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。
【０１０７】
（組み合わせ治療）
癌の予防または処置におけるＴＬＲリガンドの有効性を、リガンドを、この同じ目的のために有効な、別の薬剤または処置と組み合わせて投与することによって改善し得る。例えば、ＴＬＲリガンドを、化学療法剤または癌処置と組み合わせて投与され得る。好ましくは、ＴＬＲリガンドはＴＬＲ３アゴニストである。
【０１０８】
「化学療法剤」は、癌の処置に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例としては、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮＴＭ）のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファンのようなアルキルスルホネート；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）のようなアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、およびトリメチロールメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミンおよびメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎｏｎｅ））；カンプトテシン（合成アナログトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシン合成アナログを含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ−２１８９およびＣＢＩ−ＴＭＩを含む）；エレウテロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）；パンクラチスタチン；サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミン酸化物、メルファラン、ノベムビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロホスファミド、およびウラシルマスタードのようなナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンのようなニトロソウレア；エネジイン（ｅｎｅｄｉｙｎｅ）抗生物質（例えばカリチェアミシン、特にカリチェアミシンガンマ１ｌおよびカリチェアミシンｐｈｉｌ１、例えばＡｇｎｅｗ、Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：１８３−１８６（１９９４）を参照のこと）のような抗生物質；ダイネマイシンＡを含むダイネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）；クロドロネートのようなビスホスホネート；エスパラマイシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）；ならびにネオカルチノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エネジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎ）、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（アドリアマイシンＴＭ）（モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビ���ン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、チューバーシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン、およびゾルビシン；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のような代謝拮抗剤；ドネプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキサート、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）およびトリメトレキセートのような葉酸アナログ；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）およびチオグアニンのようなプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、およびフロクスウリジンのようなピリミジンアナログ；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、およびテストラクトンのようなアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトーテン、およびトリロスタンのような抗副腎（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）のような葉酸補充剤；アセグラトン、アルドホスファミド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）グリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン；エダトレキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デホホラミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン；エルホルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）；エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；マイタンシンおよびアンサマイトシンのようなマイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）；ミトグアゾン；ミトザントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン：フェナメト（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキザントロン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅ）（特にＴ−２毒素、バラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎ）Ａおよびアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕ��ｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）およびドキセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン（ＧｅｍｚａｒＴＭ）；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンのような白金アナログ；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトザントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン（ＮａｖｅｌｂｉｎｅＴＴＭ）；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸のようなレチノイド；カペシタビン；および上記のいずれかの薬学的に受容可能な塩、酸、または誘導体を含む。例えば、タモキシフェン（ＮｏｌｖａｄｅｘＴＭを含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（ＦａｒｅｓｔｏｎＴＭ）を含め、抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体調節物質（ＳＥＲＭ）のような、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するよう作用する抗ホルモン剤；例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール（ＭｅｇａｃｅＴＭ）、エキセメスタン、フォルメスタン、ファドロゾール、ボロゾール（ＲｉｖｉｓｏｒＴＭ）、レトロゾール（ＦｅｍａｒａＴＭ）、およびアナストロゾール（ＡｒｉｍｉｄｅｘＴＭ）のような、副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドおよびゴセレリンのような抗アンドロゲン；および上記のいずれかの薬学的に受容可能な塩、酸、または誘導体も、この定義に含まれる。
【０１０９】
癌の「処置」は、癌を除去するための手術、および癌または腫瘍を減少させるかまたは破壊するための放射線処置を含む。癌の予防または処置におけるＴＬＲリガンドの有効性を、低用量のＩ型ＩＦＮと組み合わせてリガンドを投与することによっても改善し得る。例えば、低用量のＩ型ＩＦＮは、１〜３ＭＵの範囲、そして好ましくは２ＭＵである。より好ましくは、低用量のＩ型ＩＦＮは１ＭＵより少ない。好ましくは、ＴＬＲリガンドはＴＬＲ３アゴニストである。
【０１１０】
上記で述べたように、組み合わせ処置に関与する投与レジメンは、担当医師によって決定される。
【実施例】
【０１１１】
本発明の例示として提供される、以下の制限しない実施例を参照することによって、本発明をより良く理解し得る。以下の実施例は、本発明をより完全に説明するために提供され、そして決して本発明の広い範囲を制限すると解釈されるべきでない。他に示さなければ、固体混合物中の固体、液体中の液体、および液体中の固体に関して下記で与えられるパーセンテージは、それぞれｗｔ／ｗｔ、ｖｏｌ／ｖｏｌ、およびｗｔ／ｖｏｌベースである。細胞培養中は一般的に滅菌条件が維持された。
【０１１２】
（材料および一般的な方法）
例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、１９８２、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）、第１−３巻、１９８９、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｂｒｏｏｋｌｙｎ、ＮＹ；またはＡｕｓｕｂｅｌら（１９８７および増刊）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ／Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｉｎｎｉｓら（編）、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９０、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．において記載されるような、標準的な方法を使用した。
【０１１３】
（細胞株および試薬）
ヒト乳房腫瘍細胞株である、Ｃａｍａ−１、ＳＷ５２７、ＢＴ−４８３およびＭＣＦ−７を、ＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から得て、そして２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｉｓｌｅｙ  Ｐａｒｋ、ＧＢ）、１０％のウシ胎仔血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１６０μｇ／ｍＬのゲンタリン（ｇｅｎｔａｌｌｉｎｅ）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ＮＪ）、２．５ｍｇ／ｍＬの炭酸水素ナトリウム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を補充した４．５ｇ／ｍＬのグルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含むＤＭＥＭ  Ｆ１２中で培養した（完全培地と呼ばれる）。ポリイノシン酸−ポリシチジン酸（ポリＩＣ）を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から得た。ペプチドグリカン（ＰＧＮ）およびリポ多糖（ＬＰＳ）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。Ｉ型ＩＦＮ受容体をブロックするｍＡｂを、ＰＢＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から購入し、そしてＴＮＦ−α中和ｍＡｂを、Ｇｅｎｚｙｍｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から購入した。Ｓｔａｔ１に対する抗体、リン酸化Ｓｔａｔ１（チロシン７０１）に対する抗体およびＰＫＲに対する抗体を、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から購入した。ヒトＩＦＮ−βに対する抗体を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＩＮ）から購入した。ＮＦ−κＢ  ｐ６５サブユニット、ＴＲＡＦ６およびβ−チューブリンに対する抗体を、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）から購入した。一般的なカスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋを、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。シクロヘキシミド（ＣＨＸ）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【０１１４】
ヒト原発性乳房腫瘍サンプルを、病院の生命倫理プロトコールに従ってＣｅｎｔｒｅ  Ｌｅ’ｏｎ  Ｂｅ’ｒａｒｄ（Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）から得た。単一の細胞懸濁液を、コラゲナーゼＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）による消化、ならびに洗浄および製造会社の指示に従ってＨＥＡマイクロビーズ（Ｍｙｌｔｅｎｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてヒト上皮抗原（ＨＥＡ）陽性細胞を濃縮した後に得た。最終的な単一細胞懸濁液は、８０％より多くのＨＥＡ陽性細胞、および２％より少ないＣＤ４＋造血系の混入物を含んでいた。
【０１１５】
（アポトーシス分析）
ＴＬＲリガンドによる処置後の細胞回復を、クリスタルバイオレット染色（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によって測定した。細胞を９６穴プレートに、１０４細胞／ウェルでプレーティングした。ＴＬＲリガンド有りまたは無しのいずれかで７２時間培養した後、細胞をＰＢＳで洗浄し、６％のホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で２０分間固定し、２回洗浄し、そして次いで０．１％のクリスタルバイオレットで１０分間染色した。洗浄および１％のＳＤＳ中で１時間インキュベートした後、Ｖｍａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）において、６０５ｎｍで吸光度を読み取った。アネキシンＶ染色を、アネキシン−ＦＩＴＣアポトーシス検出キット（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で、製造会社の指示に従って行った。７０％のエタノール中で一晩透過処理した後、３μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で染色することによって、二倍体未満（ｓｕｂ−ｄｉｐｌｏｉｄ）の細胞を検出した。二重線識別モジュールを備えたＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）で、そしてＣｅｌｌｑｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、フローサイトメトリーによって蛍光を分析した。
【０１１６】
（生化学）
Ｃａｍａ−１細胞を、１％のＮｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０を含む緩衝液中で溶解した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、１レーンあたり２０μｇの全タンパク質をローディングした。上記で記載した抗体を用いて、標準的な技術によってウェスタンブロット（ＷＢ）を行った。抗ＩＲＡＫ−４モノクローナル抗体を、Ｆｏｓｓｉｅｚら、「Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第１８３（６）巻、２５９３−２６０３（１９９６）において記載されたプロトコールに従って、研究室で作製した。
【０１１７】
（サイトカイン分泌）
ＩＬ−６の分泌を、ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を製造会社の指示に従って用いた標準的な酵素結合アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、培養上清中で測定した。
【０１１８】
（ｓｉＲＮＡ実験）
Ｃａｍａ−１細胞を、６穴プレートに１ウェルあたり３×１０５細胞でプレーティングした。一晩接着させた後、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションを、３μｇ／ｍＬのリポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１００ｎＭのｓｉＲＮＡを含むＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で５時間行った。次いでポリＩＣによる処理およびアポトーシス分析の前に、細胞を洗浄し、そして完全培地中で７２時間培養した。ＴＬＲ３に特異的なｓｉＲＮＡ二重鎖、ＰＫＲに特異的なｓｉＲＮＡ二重鎖、ＩＲＡＫ−４に特異的なｓｉＲＮＡ二重鎖、ＴＲＡＦ６に特異的なｓｉＲＮＡ二重鎖およびｐ６５に特異的なｓｉＲＮＡ二重鎖を、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）からＳＭＡＲＴ−Ｐｏｏｌｓとして購入した。ＴＲＩＦ  ｓｉＲＮＡを、同じ供給会社から単一のオリゴ二重鎖（５’−ＧＣＵＣＵＵＧＵＡＵＣＵＧＡＡＧＣＡＣ−３’）（配列番号２３）として購入した。ＴＬＲ３およびＴＲＩＦの発現を、以下のプライマーを用いて、ＴａｑＰＣＲ  ＲｅａｄｙＭｉｘ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によるＰＣＲ（３５サイクル：１分９４℃、１分５５℃、２分７２℃）によって評価した：ＴＬＲ３に関して５’−ＡＡＣＧＡＴＴＣＣＴＴＴＧＣＴＴＧＧＣＴＴＣ−３’（前方向）（配列番号２４）／５’−ＧＣＴＴＡＧＡＴＣＣＡＧＡＡＴＧＧＴＣＡＡＧ−３’（逆方向）（配列番号２５）、およびＴＲＩＦに関して５’−ＡＣＴＴＣＣＴＡＧＣＧＣＣＴＴＣＧＡＣＡ−３’（前方向）（配列番号２６）／５’−ＡＴＣＴＴＣＴＡＣＡＧＡＡＡＧＴＴＧＧＡ−３’（逆方向）（配列番号２７）。ＰＫＲ、ＩＲＡＫ−４、ＴＲＡＦ６およびｐ６５の発現を、上記で記載したようにＷＢによって評価した。
【０１１９】
（実施例１）
これらの実験のセットにおいて、ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０のそれぞれに関するＴＬＲの発現を、６つのヒト結腸直腸腺癌細胞株において、ＲＴ−ＰＣＲによって検出した。分析した６つの細胞株は、Ｃａｃｏ２、ＬｏＶｏ、Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ、ＳＮＵ−Ｃ１、Ｔ８４およびＣｏｌｏ２０５であった。同量のｍＲＮＡを、各細胞株から抽出した。続いてｍＲＮＡを、ｈＴＬＲ特異的プライマーを用いて、ＰＣＲによって３５サイクル（９４℃で３０秒、６０℃で４５秒、７２℃で９０秒）増幅した。以下のプライマーを使用した：
【０１２０】
【化１】
2008507530.tif 000005
次いでＰＣＲ産物を、エチジウムブロミドで染色したアガロースゲル上で分析した。
【０１２１】
これらの実験の結果は、Ｃａｃｏ２細胞株はＴＬＲ２、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７およびＴＬＲ９を発現していたことを示す。ＬｏＶｏ細胞株は、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５およびＴＬＲ６を発現していた。Ｃｏｌｏ３２０  ＤＭ細胞株はＴＬＲ５およびＴＬＲ６を発現していた。ＳＮＵ−Ｃ１細胞株は、ＴＬＲ４を発現していた。Ｔ８４細胞株はＴＬＲ４、ＴＬＲ５、およびＴＬＲ６を発現していた。Ｃｏｌｏ２０５細胞株は、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、およびＴＬＲ６を発現していた。
【０１２２】
同様の分析を、８つのヒト肺細胞株（ＮＣＩ−Ｈ５２６、ＳＨＰ−７７、ＮＣＩ−Ｎ４１７、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ３５８、Ａ４２７、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＮＣＩ−Ｈ１８７）および４つのヒト乳癌細胞株（ＳＷ５２７、Ｃａｍａ−１、ＢＴ４８３、ＭＣＦ−７）に対して行った。これらの実験の結果は、ＮＣＩ−Ｈ５２６細胞株（小細胞肺癌）は、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ５およびＴＬＲ９を発現していたことを示す。ＳＨＰ−７７細胞株（ＳＣＬＣの大細胞改変体）は、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９およびＴＬＲ１０を発現していた。ＮＣＩ−Ｎ４１７細胞株（小細胞肺癌）は、ＴＬＲ５を発現していた。Ａ５４９細胞株（肺癌）は、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ１０を発現していた。ＮＣＩ−Ｈ３５８細胞株（細気管支肺胞上皮癌）は、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７およびＴＬＲ１０を発現していた。Ａ４２７細胞株（肺癌）は、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ５およびＴＬＲ６を発現していた。ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞株（類表皮肺癌）は、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６およびＴＬＲ１０を発現していた。ＮＣＩ−Ｈ１８７細胞株（小細胞肺癌）は、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、およびＴＬＲ１０を発現していた。ＳＷ５２７細胞株（乳房腺癌）は、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６およびＴＬＲ１０を発現していた。Ｃａｍａ−１細胞株（乳房腺癌）は、ＴＬＲ２、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６およびＴＬＲ１０を発現していた。ＢＴ４８３細胞株（乳房腺癌）は、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９およびＴＬＲ１０を発現していた。ＭＣＦ−７細胞株（乳房腺癌）は、ＴＬＲ２、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６およびＴＬＲ９を発現していた。
【０１２３】
大腸、乳房および肺由来の、試験したヒト腫瘍系統の全ては、多くのＴＬＲ転写物を発現することが明らかである。しかし、各細胞株においてどのＴＬＲが発現するかおよびその発現レベルに関して、実質的な不均一性が存在する。
【０１２４】
（実施例２）
４つのヒト乳房腫瘍細胞株である、Ｃａｍａ−１、ＳＷ５２７、ＢＴ４８３、およびＭＣＦ−７を、ポリＩＣに応答した細胞死に関して分析した。細胞を５μｇ／ｍｌのＰＧＮ、５０μｇ／ｍｌのポリＩＣまたは１０μｇ／ｍｌのＬＰＳと７２時間インキュベートした。コントロール細胞を、ＰＢＳとともに培養した。クリスタルバイオレット染色によって細胞傷害性を評価し、そしてコントロールのパーセントとして表した。
【０１２５】
平均して、コントロール細胞は１００％の細胞回復率を示した。ＰＧＮ細胞は、平均９５％の細胞回復率を示した。ＬＰＳ処理細胞は、平均して９５％の回復率を示した。平均して、ポリＩＣで処理した細胞は６７．５％の細胞回復率を示した。具体的には、Ｃａｍａ−１、ＳＷ５２７、ＢＴ４８３およびＭＣＦ−７細胞株は、それぞれ３３％、７５％、６７％、および１００％の細胞回復率を示した。
【０１２６】
そのデータは、ポリＩＣが、試験した細胞株のうち３つ、Ｃａｍａ−１、ＢＴ４８３およびＳＷ５２７において、細胞回復率の減少を引き起こしたことを示す。データからわかるように、Ｃａｍａ−１細胞株は、一貫して最も劇的な減少を示した。しかし、ポリＩＣはＭＣＦ−７細胞においては細胞回復率の減少を引き起こさなかった。
【０１２７】
さらに、さらなるＴＬＲリガンドを試験して、細胞傷害性に対するあらゆる可能性のある影響を決定した。試験したリガンドは、ＰＧＮ、ＬＰＳ、フラジェリン、Ｒ８４８およびＣｐＧであった。細胞を、５μｇ／ｍｌのＰＧＮ、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳ、５０ｎｇ／ｍｌのフラジェリン、６μｇ／ｍｌのＲ８４８、１０μｇ／ｍｌのＣｐＧ  ＯＤＮと、またはコントロールとしてＰＢＳと、７２時間培養した。クリスタルバイオレット染色によって細胞回復率を評価し、そしてコントロールのパーセントとして表した。それらのリガンドのうちどれも、４つの乳癌細胞株（Ｃａｍａ−１、ＢＴ４８３、ＳＷ５２７およびＭＣＦ−７）のいずれの細胞回復率も有意に減少させなかった。ＰＧＮは細胞回復率には影響を与えなかったが、それはある細胞株においてＩＬ−８の分泌を誘導し、従って細胞傷害性の欠如は、ＴＬＲ誘発が存在しないためではないことが確立された。
【０１２８】
（実施例３）
Ｃａｍａ−１細胞を、ポリＩＣに反応したＴＬＲ３  ｍＲＮＡの発現に関して分析した。Ｃａｍａ−１細胞を、完全培地（４．５ｇ／ｍＬのグルコースを含み、そして２ｍＭのＬ−グルタミン、１０％のウシ胎仔血清、１６０μｇ／ｍＬのゲンタリン、２．５ｍｇ／ｍＬの炭酸水素ナトリウムを補足したＤＭＥＭ  Ｆ１２）中で、単独で、またはＬＰＳ（５μｇ／ｍｌ）および／もしくはポリＩＣ（５μｇ／ｍｌ）と共に、４８時間培養した。各グループの細胞からｍＲＮＡを抽出した。次いでｍＲＮＡを逆転写し、そしてｈＴＬＲ３特異的プライマー（ＴＬＲ３Ｆ：ａａｃｇａｔｔｃｃｔｔｔｇｃｔｔｇｇｃｔｔｃ（配列番号５）およびＴＬＲ３Ｒ：ｇｃｔｔａｇａｔｃｃａｇａａｔｇｇｔｃａａｇ（配列番号６））を用いて３５サイクル（上記の実施例１におけるように）ＰＣＲ増幅した。ＴＬＲ３  ｍＲＮＡは、休止Ｃａｍａ−１細胞からは増幅できなかった。
【０１２９】
ｈＴＬＲ３特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ由来の増幅ＤＮＡを、ゲルに流した。このゲルは、ポジティブコントロール（プラスミドＴＬＲ３）、ポリＩＣで処理した細胞、およびポリＩＣおよびＬＰＳの両方で処理した細胞において、ＴＬＲ３の発現を示した。ゲルは、ＬＰＳで処理した、または何も処理していない（ネガティブコントロール）細胞において、ＴＬＲ３の発現を示さなかった。
【０１３０】
そのデータは、ヒト乳癌Ｃａｍａ−１細胞において、ＴＬＲ３  ｍＲＮＡの発現が、ポリＩＣによって誘導されることを示す。従って、ポリＩＣ処理は、特定の腫瘍細胞株において、その認識された受容体であるＴＬＲ３の発現をアップレギュレートする。他方、ＬＰＳによる処理は、Ｃａｍａ−１細胞におけるＴＬＲ３  ｍＲＮＡの発現に影響を与えなかった。
【０１３１】
（実施例４）
２つの細胞株である、大腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔおよび乳癌細胞株Ｃａｍａ−１を、死および細胞周期の変化に関して分析した。細胞を、ポリＩＣ（５μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下のいずれかで４８時間培養した。１μｇ／ｍｌのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の３０分のパルスの後、細胞を７０％エタノール中で４℃にて一晩固定した後、ＦＩＴＣ結合抗ＢｒｄＵモノクローナル抗体および３μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムで染色した。細胞死および細胞周期を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって分析した。ＢｒｄＵの組み込みは増殖の尺度であり、一方、ヨウ化プロピジウム染色はＤＮＡ含有量、特にアポトーシスを起こしている二倍体未満の細胞集団の定量を可能にする。
【０１３２】
そのデータは、ＢｒｄＵを組み込んだＬＳ１７４Ｔ細胞のパーセンテージが、処理前の２７％から、ポリＩＣの存在下での４８時間培養後に９％になったことを示す。逆に、二倍体未満のＤＮＡ含有量を有するＬＳ１７４Ｔ細胞のパーセンテージは、処理前の３％から、ポリＩＣの存在下で４８時間培養後には２３％になり、ポリＩＣの強力な細胞傷害性を示す。
【０１３３】
そのデータはまた、ＢｒｄＵを組み込んだＣａｍａ−１細胞のパーセンテージは、処理前の１５％から、ポリＩＣの存在下での４８時間培養後に２％になったことを示す。逆に、二倍体未満のＤＮＡ含有量を有するＣａｍａ−１細胞のパーセンテージは、処理前の４％から、ポリＩＣの存在下での４８時間培養後に１７％になり、これは、ポリＩＣによって引き起こされたアポトーシスを示す。
【０１３４】
これらのデータは、ポリＩＣによる４８時間の処理で、ＬＳ１７４ＴおよびＣａｍａ−１細胞株の両方が、分裂を停止し、そしてアポトーシスを起こすことを示す。
【０１３５】
（実施例５）
乳房腫瘍細胞株に対するポリＩＣ処置の効果をさらに調査するために、アネキシンＶ染色によって、Ｃａｍａ−１細胞において細胞死を分析した。細胞を、５μｇ／ｍｌのポリＩＣ有りまたは無しのいずれかで、２４時間培養した。アポトーシスを、アネキシンＶ染色およびフローサイトメトリーによって測定した。そのデータは、７０％を超えるＣａｍａ−１細胞がアネキシンＶによって染色されたことを示し、ポリＩＣによって誘導されたアポトーシスをさらに示す。
【０１３６】
本発明者らはまた、ポリＩＣ誘導アポトーシスの動態を決定することを試みた。Ｃａｍａ−１細胞を、５μｇ／ｍｌまたは５０ｎｇ／ｍｌのポリＩＣ有りまたは無しのいずれかで培養した。培養中のアポトーシス（アネキシン陽性）細胞のパーセンテージを、続く３０時間の間測定した。そのデータは、未処理の細胞が３０時間後に１５％の自然発生的なアポトーシスを示したことを示す。しかし、ポリＩＣで処理した細胞の８０％は細胞死を示した。具体的には、ポリＩＣは、ポリＩＣの添加から９時間後に始まるＣａｍａ−１細胞におけるアポトーシスを引き起こし、そして処理の３０時間後には８０％までのアポトーシス細胞に達した。
【０１３７】
本発明者らは次いで、ヒト初代乳房腫瘍細胞に対してポリＩＣが有する効果を決定することを試みた。新規に回復した腫瘍単一細胞懸濁液を、ＰＢＳまたはポリＩＣ（５０μｇ／ｍｌ）のいずれかと共に４８時間インキュベートした。アポトーシスをＰＩ染色によって測定した。そのパーセンテージは、低いＤＮＡ含有量の細胞（サブＧ０／Ｇ１細胞）、すなわちアポトーシス細胞の割合を表す。そのデータは、ＰＢＳで処理した細胞の１９．５％が低いＤＮＡ含有量を有し、一方ポリＩＣで処理した細胞の３８．６％が低いＤＮＡ含有量を有していたことを示す。従って、ポリＩＣの同様の細胞傷害性効果が、ヒト乳房初代腫瘍細胞において観察された。
【０１３８】
（実施例６）
ＴＬＲ３を、ポリＩＣ誘導アポトーシスにおけるその役割に関して分析した。Ｃａｍａ−１細胞を、無関係な配列（Ｓｃｒ  ＲＮＡ；配列：ＡＣＵＡＧＵＵＣＡＣＧＡＧＵＣＡＣＣＵｔｔ）（配列番号２１）、またはｈＴＬＲ３（配列：ＣＡＧＵＧＵＵＧＡＡＣＣＵＵＡＣＣＣＡｔｔ）（配列番号２２）のいずれかに対応するｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡトランスフェクションを、３μｇ／ｍＬのリポフェクトアミン２０００および１００ｎＭのｓｉＲＮＡを含む、１ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭＴＭ培地中で、５時間行った。次いで細胞をリン酸緩衝化生理食塩水溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、完全培地中で７２時間培養し、その後、５μｇ／ｍＬのポリＩＣによって４８時間処理した。次いで細胞周期を、実施例３で記載されたように、エチジウムブロミドによって染色した後ＦＡＣＳによって分析した。
【０１３９】
これらの実験の結果を図１に示す。そのデータは、ポリＩＣの存在下で、無関係なスクランブルＲＮＡでトランスフェクトしたＣａｍａ−１細胞の４８時間のインキュベーションは、二倍体未満の細胞のパーセンテージを２％から４５％へと増加させたことを示す。しかし、ポリＩＣの存在下でｈＴＬＲ３  ｓｉＲＮＡによりトランスフェクトしたＣａｍａ−１細胞の４８時間のインキュベーションは、二倍体未満の細胞のパーセンテージを増加させず、これは、３％で変化しないままであった。
【０１４０】
これらのデータは、ポリＩＣによってＣａｍａ−１細胞に伝達されるアポトーシスシグナルは、ＴＬＲ３の発現を必要とすることを示す。
【０１４１】
（実施例７）
ポリＡＵを、そのアポトーシスに対する効果に関して分析した。Ｃａｍａ−１細胞を、ＰＢＳまたは５ｎｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌまでの範囲の漸増濃度のポリＡＵのいずれかと共に４８時間培養した。アポトーシスを、アネキシンＶ陽性細胞のパーセンテージを測定することによって分析した。そのデータは、ポリＩＣと同様、ポリＡＵはアポトーシスを引き起こすことを示す。
【０１４２】
（実施例８）
本発明者らは、インビボでポリＩＣ誘導アポトーシスに対するＩＦＮの効果を分析した。ＴＲＰ−Ｔａｇマウスは、網膜色素上皮にＳＶ４０のＴ抗原を発現し、そして代表的には生後数週間以内に完全な貫通を有する眼の腫瘍を発生させる。
【０１４３】
これらの実験において、１実験あたり１４〜１６匹のＴＲＰ−Ｔａｇ／ＩＦＮαβγＲ−／−マウス（これらは、Ｉ型インターフェロンの受容体（ＩＦＮαβＲ）およびＩＩ型インターフェロンの受容体（ＩＦＮγＲ）を同時に欠損したマウスと交雑させたＴＲＰ−Ｔａｇマウスである）を、ポリＩＣ（１００μｇ／用量）またはＰＢＳのいずれかの静脈内注射によって、２１、２３、２５、２７および２９日目に処置した。目に見える眼の腫瘍の発生の動態を、１週間に２〜３回モニターした。
【０１４４】
眼腫瘍の出現は、ＰＢＳで処置したマウスと比較して、ポリＩＣで処置したマウスにおいて、２１日間まで遅延した。これらの実験に使用したマウスは、機能的なインターフェロン応答システムを有していないので、そのデータは、ポリＩＣ誘導腫瘍増殖阻害は、インビボにおいてＩ型およびＩＩ型インターフェロンと独立であることを示す。
【０１４５】
（実施例９）
ポリＩＣ誘導Ｃａｍａ−１細胞傷害性の経路を決定するために、ＲＮＡ干渉を使用してＴＲＩＦおよびＰＫＲの発現を効率的にダウンレギュレートした。Ｃａｍａ−１細胞を、６穴プレートに１ウェルあたり３×１０５細胞でプレーティングした。一晩接着させた後、ｓｉＲＮＡトランスフェクションを、３μｇ／ｍＬのリポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）および１００ｎＭのｓｉＲＮＡを含むＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で５時間行った。細胞を、ＭＯＣＫ（水）、コントロールスクランブル二重鎖（ｓｃｒ）ｓｉＲＮＡ、ＴＲＩＦ  ｓｉＲＮＡまたはＰＫＲ  ｓｉＲＮＡのいずれかでトランスフェクトした。
【０１４６】
ＰＫＲに特異的なｓｉＲＮＡ二重鎖を、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）からＳＭＡＲＴ−Ｐｏｏｌｓとして購入した。ＴＲＩＦ  ｓｉＲＮＡを、同じ供給会社から単一のオリゴ二重鎖５’−ＧＣＵＣＵＵＧＵＡＵＣＵＧＡＡＧＣＡＣ−３’（配列番号２３）として購入した。ＴＬＲ３およびＴＲＩＦ発現を、以下のプライマーを用いて、ＴａｑＰＣＲ  ＲｅａｄｙＭｉｘ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いたＰＣＲ（３５サイクル：９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で２分）によって評価した：ＴＬＲ３に関して５’−ＡＡＣＧＡＴＴＣＣＴＴＴＧＣＴＴＧＧＣＴＴＣ−３’（配列番号２４）（前方向）／５’−ＧＣＴＴＡＧＡＴＣＣＡＧＡＡＴＧＧＴＣＡＡＧ−３’（配列番号２５）（逆方向）、およびＴＲＩＦに関して５’−ＡＣＴＴＣＣＴＡＧＣＧＣＣＴＴＣＧＡＣＡ−３’（配列番号２６）（前方向）／５’−ＡＴＣＴＴＣＴＡＣＡＧＡＡＡＧＴＴＧＧＡ−３’（配列番号２７）（逆方向）。ＰＫＲの発現を、ウェスタンブロットによって評価した。ＴＲＩＦ  ｍＲＮＡに関して、５μｇ／ｍｌのポリＩＣ有りまたは無しのいずれかでさらに２４時間培養した後にＰＣＲを行った。
【０１４７】
そのデータは、ＲＮＡ干渉を使用してＴＲＩＦおよびＰＫＲの発現を効率的にダウンレギュレートしたことを示す。
【０１４８】
ｓｉＲＮＡトランスフェクションの７２時間後、Ｃａｍａ−１細胞を、５μｇ／ｍｌのポリＩＣ有りまたは無しのいずれかでさらに２４時間培養した。アポトーシスを、アネキシンＶ染色によって測定し、そして培養中のアポトーシス細胞のパーセンテージとして表した。平均して、未処理のコントロール細胞（ＭＯＣＫおよびｓｃｒ）の１０％が、アポトーシスを起こした。対照的に、ポリＩＣで処理したコントロール細胞（ＭＯＣＫおよびｓｃｒ）の約７５％が、アポトーシスを起こした。ＴＲＩＦ  ｓｉＲＮＡグループにおいて、未処理の細胞は１０％のアポトーシス細胞を示し、一方、ＴＲＩＦ  ｓｉＲＮＡで処理した細胞は２０％のアポトーシス細胞を示した。最後に、ＰＫＲ  ｓｉＲＮＡグループにおいて、未処理細胞は１０％のアポトーシス細胞を示し、一方、ＰＫＲ  ｓｉＲＮＡで処理した細胞は８０％のアポトーシス細胞を示した。
【０１４９】
従って、ＴＲＩＦに対するｓｉＲＮＡによる処理は、ポリＩＣ誘導アポトーシスを実質的に抑止し、一方ＰＫＲ発現の非存在下において細胞死は正常に起こった。
【０１５０】
これらのデータは、Ｃａｍａ−１細胞におけるポリＩＣ誘導アポトーシスは、ＴＬＲ３およびＴＲＩＦの両方によって媒介され、そしてＰＫＲ非依存性であることを明らかに示す。
【０１５１】
（実施例１０）
ＴＬＲ３によって媒介される細胞傷害性をさらに調査するために、どちらもＴＬＲシグナル伝達の下流メディエーターであるシグナル伝達分子ＩＲＡＫ−４およびＴＲＡＦ６の関与を評価した。Ｃａｍａ−１細胞を６穴プレートに１ウェルあたり３×１０５細胞でプレーティングした。一晩接着させた後、ｓｉＲＮＡトランスフェクションを、３μｇ／ｍＬのリポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）および１００ｎＭのｓｉＲＮＡを含むＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で５時間行った。細胞を、コントロールスクランブル二重鎖（ｓｃｒ）ｓｉＲＮＡ、ＩＲＡＫ−４  ｓｉＲＮＡまたはＴＲＡＦ−６  ｓｉＲＮＡのいずれかでトランスフェクトした。次いで細胞を洗浄し、そしてポリＩＣによる処理およびアポトーシス分析の前に、完全培地中で７２時間培養した。ＩＲＡＫ−４およびＴＲＡＦ６に特異的なｓｉＲＮＡ二重鎖を、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）からＳＭＡＲＴ−Ｐｏｏｌｓとして購入した。
【０１５２】
ＩＲＡＫ−４およびＴＲＡＦ６の発現を、ウェスタンブロットによって分析した。ウェスタンブロットは、ＩＲＡＫ−４およびＴＡＲＦ６  ｓｉＲＮＡが、対応するタンパク質の発現を消滅させることを示す。
【０１５３】
ｓｉＲＮＡトランスフェクションの７２時間後、Ｃａｍａ−１細胞を、５μｇ／ｍｌのポリＩＣ有りまたは無しのいずれかでさらに２４時間培養した。アポトーシスを、アネキシンＶ染色によって測定し、そして培養中のアポトーシス細胞のパーセンテージとして表した。平均して、未処理のコントロール細胞（ｓｃｒ）の１０％が、アポトーシスを起こした。対照的に、ポリＩＣで処理したコントロール細胞（ｓｃｒ）の約７５％が、アポトーシスを起こした。ＩＲＡＫ−４  ｓｉＲＮＡグループにおいて、培養物は２０％のアポトーシス細胞しか示さなかったが、一方、ＴＲＡＦ６  ｓｉＲＮＡグループにおいては、７５％の細胞が培養の最後にはアポトーシス性であった。ＴＲＡＦ６  ｓｉＲＮＡグループにおいて、未処理細胞は１５％のアポトーシス細胞を示し、一方、ＴＲＡＦ６  ｓｉＲＮＡによって処理した細胞は、７５％のアポトーシス細胞を示した。
【０１５４】
そのデータは、ＩＲＡＫ−４発現の阻害が、ＴＬＲ３によって媒介される細胞傷害性の阻害を引き起こしたことを示す。しかし、ＴＲＡＦ６発現の阻害は、ＴＬＲ３によって媒介される細胞傷害性の阻害を引き起こさなかった。ＴＲＡＦ６は、ＴＬＲシグナル伝達経路においてＩＲＡＫ−４の下流に位置すると考えられたので、この知見は予期されていなかった。従って、これは、ＴＬＲ３がＩＲＡＫ−４を介してシグナル伝達をして、ＴＲＡＦ６非依存性のアポトーシス経路を活性化し得たことを示唆する。
【０１５５】
並行して、５μｇ／ｍｌのポリＩＣ有りまたは無しのいずれかで２４時間培養した、ｓｉＲＮＡトランスフェクトＣａｍａ−１細胞の上清におけるＩＬ−６濃度を、ＥＬＩＳＡによって決定した。そのデータは、ｓｃｒグループに関して、未処理細胞および処理細胞が、それぞれ１０および１１０のＩＬ−６濃度（ｐｇ／ｍｌ／１０６細胞）を有していたことを示す。ｓｉＲＮＡ  ＩＲＡＫ−４グループにおいて、未処理細胞および処理細胞は、それぞれ１０および４０のＩＬ−６濃度（ｐｇ／ｍｌ／１０６細胞）を有していた。ｓｉＲＮＡ  ＴＲＡＦ６グループにおいて、未処理細胞および処理細胞は、それぞれ１０および２０のＩＬ−６濃度（ｐｇ／ｍｌ／１０６細胞）を有していた。これらのデータは、ＩＲＡＫ−４およびＴＲＡＦ６がどちらも、サイトカイン産生に必要であったことを示す。
【０１５６】
（実施例１１）
ＴＬＲ３によって媒介されるアポトーシスにおける１型インターフェロンの関与を評価した。Ｃａｍａ−１細胞を、５μｇ／ｍｌのポリＩＣとともに、０時間、１時間、６時間、１８時間または２４時間のいずれかでインキュベートした。細胞溶解産物におけるＩＦＮ−β、リン酸化Ｓｔａｔ１（チロシン７０１）（Ｐ−Ｓｔａｔ−１）および総Ｓｔａｔ−１の存在を、ウェスタンブロットによって分析した。
【０１５７】
そのデータは、ポリＩＣ処理時にＩＦＮ−β産生が強力に誘導されたことを示す。また、Ｓｔａｔ１のリン酸化が観察された。これらの観察は、Ｃａｍａ−１細胞において、Ｉ型ＩＦＮのシグナル伝達が、ポリＩＣによって引き起こされたことを示す。興味深いことに、Ｓｔａｔ１のリン酸化は、ポリＩＣ処理の６時間後に最大であり、その時ＩＦＮ−βの産生はまだほとんど検出できなかった。
【０１５８】
別の実験において、Ｃａｍａ−１細胞を、２０μｇ／ｍｌの中和ＩＦＮ  Ｉ型受容体ｍＡｂ（抗ＩＦＮ  Ｒ１）またはアイソタイプコントロール（マウスＩｇＧ１）のいずれかとともに１時間プレインキュベートした。次いで細胞を５μｇ／ｍｌのポリＩＣ有りまたは無しで、またはそれぞれ１０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βの混合物と、２４時間培養した。アポトーシスを、アネキシンＶ染色によって測定し、そして培養中のアポトーシス細胞のパーセンテージとして表した。
【０１５９】
抗体の非存在下で、未処理細胞、ポリＩＣ処理細胞およびＩＦＮα／β処理細胞は、それぞれ１０％、７０％および２０％のアポトーシス細胞を示した。ｍＩｇＧ１グループにおいて、未処理細胞、ポリＩＣ処理細胞およびＩＦＮα／β処理細胞は、それぞれ１０％、７０％および２０％のアポトーシス細胞を示した。抗ＩＦＮ  Ｒ１グループにおいて、未処理細胞、ポリＩＣ細胞およびＩＦＮα／β処理細胞は、それぞれ１０％、３０％および１５％のアポトーシス細胞を示した。
【０１６０】
そのデータは、特異的モノクローナル抗体によるＩ型ＩＦＮ受容体の中和が、ポリＩＣ誘導アポトーシスを有意に減少させたことを示す。これは、Ｉ型ＩＦＮがＴＬＲ３によって媒介されるアポトーシスに必要であることを示す。
【０１６１】
ＩＦＮαとＩＦＮβとの混合物によるＣａｍａ−１細胞の処理は、有意なアポトーシスを誘導することができなかった。これは、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達はＴＬＲ３によって引き起こされる細胞傷害性に必要であったが、単独で細胞死を誘導するのに十分でないことを示す。
【０１６２】
（実施例１２）
本発明者らは、ＴＮＦ−αがＴＬＲ３によって媒介されるアポトーシスにおいて役割を果たしているかどうか決定することを試みた。Ｃａｍａ−１細胞を、２０μｇ／ｍｌの中和抗ＴＮＦ−α  ｍＡｂまたは１０μｇ／ｍｌのＣＨＸ有りまたは無しのいずれかでプレインキュベートした。次いで細胞を、５μｇ／ｍｌのポリＩＣまたは２５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α有りまたは無しのいずれかで培養した。アポトーシスを、アネキシンＶ染色によって測定し、そして培養中のアポトーシス細胞のパーセンテージとして表した。
【０１６３】
抗体の非存在下で、未処理細胞、ポリＩＣ処理細胞およびＴＮＦ−α処理細胞は、それぞれ１０％、７０％、および４０％のアポトーシス細胞を示した。抗ＴＮＦ−αｍＡｂグループにおいて、未処理細胞、ポリＩＣ処理細胞およびＴＮＦ−α処理細胞は、それぞれ１０％、６５％および１０％のアポトーシス細胞を示した。ＣＨＸグループにおいて、未処理細胞、ポリＩＣ処理細胞およびＴＮＦ−α処理細胞は、それぞれ１５％、４０％および７０％のアポトーシス細胞を示した。
【０１６４】
そのデータは、Ｃａｍａ−１細胞をＴＮＦ−α誘導アポトーシスから保護した中和抗ＴＮＦ−α抗体は、ポリＩＣによって引き起こされる細胞死に影響を与えなかったことを示す。従って、ＴＮＦ−αはＴＬＲ３によって媒介されるアポトーシスにおいて役割を果たしていない。
【０１６５】
上記で述べたように、ＮＦκＢが制御する生存プログラムをブロックすることによって細胞をＴＮＦ−α誘導性アポトーシスに感受性にすることが公知である一般的な転写阻害剤ＣＨＸによってＣａｍａ−１細胞を前処理した。
【０１６６】
そのデータは、ＣＨＸは有意にＣａｍａ−１細胞をＴＮＦ−α誘導性アポトーシスに感受性にしたことを示す。対照的に、ＣＨＸはポリＩＣ誘導性アポトーシスから細胞を部分的に保護した。これは、これら２つのアポトーシス促進性刺激によって、異なるメカニズムが引き起こされることを確認する。
【０１６７】
次いでＲＮＡ干渉を使用して、ＴＬＲ３によって媒介されるアポトーシスにおけるＮＦκＢの関与を評価した。７２時間前にｐ６５に対するｓｉＲＮＡまたはスクランブルコントロール二重鎖（ｓｃｒ）でトランスフェクトしたＣａｍａ−１細胞を、５０ｎｇ／ｍｌまたは５μｇ／ｍｌのポリＩＣ有りまたは無しのいずれかで２４時間培養した。ポリＩＣ処理の前のｐ６５タンパク質発現の消滅を、ウェスタンブロットによって評価した。アポトーシスをアネキシンＶ染色によって測定した。結果を、培養中のアポトーシス細胞のパーセントとして表した。
【０１６８】
ｓｃｒグループにおいて、未処理細胞、ポリＩＣ（５０ｎｇ／ｍｌ）処理細胞およびポリＩＣ（５μｇ／ｍｌ）処理細胞は、それぞれ１０％、２０％および７０％のアポトーシス細胞を示した。ｓｉＲＮＡ  ｐ６５グループにおいて、未処理細胞、ポリＩＣ（５０ｎｇ／ｍｌ）処理細胞およびポリＩＣ（５μｇ／ｍｌ）処理細胞は、それぞれ１０％、１０％および２０％のアポトーシス細胞を示した。
【０１６９】
そのデータは、ｓｉＲＮＡによるＮＦκＢ  ｐ６５発現の阻害は、ポリＩＣ誘導細胞傷害性に対する有意な保護を引き起こしたことを示す。これは、ポリＩＣによって引き起こされるアポトーシスにおける、ＮＦκＢのアポトーシス促進の役割を確認する。
【０１７０】
まとめると、これらの結果は、ＴＮＦ−αの分泌がポリＩＣ誘導性アポトーシスの原因ではないことを示す。それに加えて、これらの結果は、ＴＬＲ３によって媒介されるアポトーシスにおけるＮＦκＢのアポトーシス促進の役割を示し、それはＴＮＦ処理時の抗アポトーシス効果と対照的である。
【０１７１】
（実施例１３）
本発明者らは、次にアポトーシスにおけるカスパーゼの役割に取り組んだ。Ｃａｍａ−１細胞を２５μＭの一般的なカスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋまたはＤＭＳＯと共に１時間プレインキュベートし、その後、５μｇ／ｍｌのポリＩＣまたは２５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（ポジティブコントロールとして使用した）有りまたは無しで２４時間培養した。アポトーシスをアネキシンＶ染色によって測定し、そして培養中のアポトーシス細胞のパーセンテージとして表した。
【０１７２】
ＤＭＳＯグループにおいて、未処理細胞、ポリＩＣ処理細胞およびＴＮＦ−α処理細胞は、それぞれ１０％、７０％および４０％のアポトーシス細胞を示した。ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋグループにおいて、未処理細胞、ポリＩＣ処理およびＴＮＦ−α処理細胞は、それぞれ１０％、３０％および１０％のアポトーシス細胞を示した。
【０１７３】
そのデータは、広いカスパーゼ阻害剤であるｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによるカスパーゼ活性の阻害は、ポリＩＣ誘導性アポトーシスを大きく抑制したことを示す。これは、ＴＬＲ３によって引き起こされる細胞傷害性におけるカスパーゼの主な役割を示唆する。
【０１７４】
別の実験において、上記で得られた細胞由来の溶解産物を、ＰＡＲＰの切断、カスパーゼ３およびカスパーゼ８に関してウェスタンブロットによって分析した。
【０１７５】
そのデータは、カスパーゼ依存性アポトーシスの特徴であるＰＡＲＰの切断が、ポリＩＣ処理時にＣａｍａ−１細胞において起こったことを示す。これは、ＴＬＲ３によって媒介されるアポトーシスにおけるカスパーゼの関与を確認する。実際、ウェスタンブロット分析によって証明されるように、カスパーゼ３はポリＩＣ処理時に活性化された。
【０１７６】
（実施例１４）
本発明者らは、ＴＬＲ３リガンドとＩ型インターフェロンとの間に何らかの相乗作用が存在するかどうかをさらに調査しようと試みた。初代乳癌細胞ＳＫＢｒ３を、６穴プレートに１ウェルあたり３×１０５細胞でプレーティングした。一晩接着させた後、ｓｉＲＮＡトランスフェクションを、３μｇ／ｍＬのリポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）および１００ｎＭのｓｉＲＮＡを含むＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で５時間行った。細胞を、ＭＯＣＫ（水）、ＴＬＲ３  ｓｉＲＮＡまたはＰＫＲ  ｓｉＲＮＡのいずれかでトランスフェクトした。次いで細胞を洗浄し、完全培地中で７２時間培養し、その後、５０μｇ／ｍｌのポリＩＣにより２４時間処理し、そしてアポトーシス分析を行った。
【０１７７】
ＭＯＣＫグループにおいて、未処理細胞およびポリＩＣ（５０μｇ／ｍｌ）処理細胞は、それぞれ１０％および２２％のアポトーシス細胞を示した。ＴＬＲ３  ｓｉＲＮＡグループにおいて、未処理細胞およびポリＩＣ（５０μｇ／ｍｌ）処理細胞は、それぞれ８％および１３％のアポトーシス細胞を示した。ＰＫＲ  ｓｉＲＮＡグループにおいて、未処理細胞およびポリＩＣ（５０μｇ／ｍｌ）処理細胞は、それぞれ１２％および２２％のアポトーシス細胞を示した。
【０１７８】
そのデータは、乳房腺癌細胞株ＳＫＢｒ３は、ポリＩＣで処理した場合に部分的なアポトーシスを起こしたことを示す。それに加えて、そのデータは、ＴＬＲ３  ｓｉＲＮＡによる細胞の前処理がアポトーシスを無効にし、一方、ＰＫＲ  ｓｉＲＮＡが保護効果を有さなかったことを示す。
【０１７９】
別の実験において、本発明者らは、ＩＦＮおよびポリＩＣが、アポトーシスを誘導するために相乗的に作用するかどうかを決定することを試みた。ＳＫＢｒ３細胞を、未処理としたか、または１０Ｕ／ｍｌもしくは１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−αもしくはＩＦＮ−βの低用量混合物のいずれかで処理した。ポリＩＣを以下の投与量で投与した：０、０．５、５および５０μｇ／ｍｌで４８時間。
【０１８０】
そのデータは、未処理ポリＩＣグループにおいて、未処理細胞、ＩＦＮ−α／β（１０Ｕ／ｍｌ）処理細胞およびＩＦＮ−α／β（１００Ｕ／ｍｌ）処理細胞は、それぞれ１０％、１４％および２２％のアポトーシス細胞を示したことを示す。０．５μｇ／ｍｌポリＩＣグループにおいて、未処理細胞、ＩＦＮ−α／β（１０Ｕ／ｍｌ）細胞およびＩＦＮ−α／β（１００Ｕ／ｍｌ）処理細胞は、それぞれ１５％、４５％および５５％のアポトーシス細胞を示した。５μｇ／ｍｌポリＩＣグループにおいて、未処理細胞、ＩＦＮ−α／β（１０Ｕ／ｍｌ）細胞およびＩＦＮ−α／β（１００Ｕ／ｍｌ）処理細胞は、それぞれ２０％、５５％および６０％のアポトーシス細胞を示した。５０μｇ／ｍｌポリＩＣグループにおいて、未処理細胞、ＩＦＮ−α／β（１０Ｕ／ｍｌ）細胞およびＩＦＮ−α／β（１００Ｕ／ｍｌ）処理細胞は、それぞれ２０％、５５％および６０％のアポトーシス細胞を示した。
【０１８１】
従って、ＩＦＮは、アポトーシスを誘導するためにポリＩＣと相乗的に作用し得た。この相乗作用は、２つの徴候を有していた：１）前処理した場合、ＳＫＢｒ３細胞は、非前処理細胞より１００倍低い濃度で、ポリＩＣ誘導性アポトーシスに対して感受性になった；および２）ポリＩＣによってアポトーシスに誘導されたＳＫＢｒ３細胞のパーセンテージは、Ｉ型ＩＦＮ前処理の後、２２％から６６％へと増加した。
【０１８２】
結論として、Ｉ型ＩＦＮ前処理は、ＴＬＲ３によって媒介されるポリＩＣ誘導性アポトーシスに対してＳＫＢｒ３乳房腺癌細胞を感受性にした。従って、乳癌患者の低用量Ｉ型ＩＦＮによる前処置は、ポリＩＣ処置の効力を高めるだけでなく、そうでなければポリＩＣから利益を得られない患者の補充を可能にする。患者を手術の前に低用量のＩ型ＩＦＮで処置して、生検に対する免疫組織学によって陽性と評価される、およびＴＬＲ３リガンドに反応性となる腫瘍のパーセンテージを増加させることもできる。それに加えて、低用量のＩ型ＩＦＮと低用量のポリＩＣとの組み合わせは、より高い投与量のポリＩＣ単独よりも有効であり得る。この組み合わせはまた、副作用のリスクを減少させ得る。
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】図１は、ポリＩＣとともに４８時間インキュベーションした後の、Ｃａｍａ−１細胞のアポトーシスに対する、ＴＬＲ３のｓｉＲＮＡサイレンシングの効果を示すグラフのセットである。
【図１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年6月22日(2007.6.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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