(57)【要約】本発明は、核酸鋳型有機合成中に行われ得る化学反応の範囲を拡張するための方法および組成物を提供する。特に、核酸鋳型化学を用いて、オリゴヌクレオチドに結合した反応中間体を作製し、これを用いて、反応中間体および／または結果的に生じる反応生成物を同定し得る。次いで、反応中間体を遊離反応体（例えば、オリゴヌクレオチドとカップリングさせるのが困難または非実用的な反応体）と反応させ、反応生成物を生成させる。このアプローチは、核酸鋳型合成に有用な試薬の範囲を、オリゴヌクレオチドに係留する必要がないか、またはそれができない試薬に拡張する。しかしながら、この試薬は、オリゴヌクレオチドに結合した反応生成物の合成を依然として許容し、この反応生成物を特定するために使用され得る。
2008528000.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応生成物の合成方法であって、該方法は、
（ａ）第１の反応性単位および第２の反応性単位を含む混合物を、該第１の反応性単位と該第２の反応性単位との間での反応が誘導される条件下に提供し、反応中間体を生成させる工程；
（ｂ）該反応中間体に共有結合させた同定用配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する工程；ならびに
（ｃ）該反応中間体を、該反応中間体に対して選択的反応性である遊離反応体と合わせ、それにより、該同定用配列に連結された反応生成物を合成する工程であって、ここで、該遊離反応体は、出発混合物中の該反応性単位のうちの少なくとも一方に対してよりも該反応中間体に対しての方が反応性が高い、工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記同定用配列は、前記反応中間体を生成させる反応前に前記第１の反応性単位に結合され、該反応中間体に連結された状態で維持されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２の反応性単位を、前記同定用配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列に結合させる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）が、前記同定用配列を該同定用配列に相補的な配列とハイブリダイズさせ、それにより、前記第１の反応性単位と前記第２の反応性単位とを反応的に近接させることを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）が、前記反応中間体の形成後に、前記同定用配列を該反応中間体に酵素的に結合させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記遊離反応体が、出発混合物中の前記反応性単位のいずれかに対してよりも前記反応中間体に対しての方が少なくとも５倍反応性が高い、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記遊離反応体が、出発混合物中の前記反応性単位のうちの少なくとも一方に対してよりも前記反応中間体に対しての方が少なくとも５０倍反応性が高い、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記遊離反応体が、出発混合物中の前記反応性単位のうちの少なくとも一方に対してよりも前記反応中間体に対しての方が少なくとも１０００倍反応性が高い、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記反応生成物が５０％以上の収率で合成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記収率が７５％以上である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記収率が８５％以上である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記収率が９８％以上である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
核酸鋳型合成による反応生成物の合成方法であって、該方法は、
（ａ）（ｉ）コドン配列を含む第１のオリゴヌクレオチドに結合させた第１の反応性単位、および（ｉｉ）該コドン配列に相補的なアンチコドン配列を含む第２のオリゴヌクレオチドに結合させた第２の反応性単位、を含む混合物を提供する工程；
（ｂ）該第１のオリゴヌクレオチドのコドン配列を該第２のオリゴヌクレオチドのアンチコドン配列とアニーリングさせて、該第１の反応性単位と該第２の反応性単位との間での反応を誘導して、少なくとも該第１のオリゴヌクレオチドに結合した反応中間体を形成させる工程；ならびに
（ｃ）該反応中間体を、該反応中間体に対して選択的反応性である遊離反応体と合わせ、それにより、該第１のオリゴヌクレオチドに連結された反応生成物を合成する工程であって、ここで、該遊離反応体は、出発混合物中の該反応性単位のいずれかに対してよりも該反応中間体に対しての方が反応性が高い、工程
を包含する、方法。
【請求項１４】
前記遊離反応体が、出発混合物中の前記反応性単位のいずれかに対してよりも前記反応中間体に対しての方が少なくとも５倍反応性が高い、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記遊離反応体が、出発混合物中の前記反応性単位のうちの少なくとも一方に対してよりも前記反応中間体に対しての方が少なくとも５０倍反応性が高い、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記遊離反応体が、出発混合物中の前記反応性単位のうちの少なくとも一方に対してよりも前記反応中間体に対しての方が少なくとも１０００倍反応性が高い、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記反応生成物が５０％以上の収率で合成される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記収率が７５％以上である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記収率が８５％以上である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記収率が９８％以上である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
反応生成物の合成方法であって、該方法は、
（ａ）第１の反応性単位の集団と第２の反応性単位との混合物を、該第１の反応性単位のうちの少なくとも１種類と該第２の反応性単位との間での反応を誘導する条件下に提供し、それにより、該第１の反応性単位の集団と共存する反応中間体を形成させる工程；
（ｂ）該反応中間体に結合させた同定用配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する工程；
（ｃ）該第１の反応性単位と共存する該反応中間体を、該反応中間体と選択的に反応できる遊離反応体と合わせ、それにより、該同定用配列に結合した反応生成物を合成する工程であって、該反応生成物は、該第１の反応性単位の集団と共存し、ここで、該遊離反応体は、該出発混合物中の該反応性単位のうちの少なくとも１種類に対してよりも該反応中間体に対しての方が反応性が高い、工程
を包含する、方法。
【請求項２２】
前記同定用配列は、前記反応中間体を生成させる反応前および該反応中に前記第１の反応性単位のうちの少なくとも１種類に結合され、該反応中間体に連結された状態で維持されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第２の反応性単位を、前記同定用配列に相補的な配列に連結させる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
工程（ａ）が、前記同定用配列を該同定用配列に相補的な配列とハイブリダイズさせ、それにより、前記第１の反応性単位のうちの少なくとも１種類と前記第２の反応性単位とを反応的に近接させることを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ｂ）が、前記反応中間体の形成後に、前記同定用配列を該反応中間体に酵素的に結合させることを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記遊離反応体が、出発混合物中の前記反応性単位のうちの少なくとも一方に対してよりも前記反応中間体に対しての方が少なくとも５倍反応性が高い、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記遊離反応体が、出発混合物中の前記反応性単位のうちの少なくとも一方に対してよりも前記反応中間体に対しての方が少なくとも５０倍反応性が高い、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記遊離反応体が、出発混合物中の前記反応性単位のうちの少なくとも一方に対してよりも前記反応中間体に対しての方が少なくとも１０００倍反応性が高い、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記反応生成物が５０％以上の収率で合成される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記収率が７５％以上である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記収率が８５％以上である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記収率が９８％以上である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
核酸鋳型合成による反応生成物の合成方法であって、該方法は、
（ａ）コドン配列を含む第１のオリゴヌクレオチドに結合させた複数の第１の反応性単位を含む混合物を提供する工程であって、ここで、該オリゴヌクレオチド配列は、そこに結合された該第１の反応性単位を示す、工程；
（ｂ）少なくとも１つの第１の反応性単位のコドン配列に相補的なアンチコドン配列を含む第２のオリゴヌクレオチドに結合させた第２の反応性単位を提供する工程；
（ｃ）該第１のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つのコドン配列を、該第２のオリゴヌクレオチドのアンチコドン配列とアニーリングさせて、該第１の反応性単位と該第２の反応性単位との間での反応を誘導して、少なくとも第１のオリゴヌクレオチドに結合した第１の反応中間体を形成させる工程；ならびに
（ｄ）該第１の反応中間体を、該第１の反応中間体と選択的反応性である遊離反応体と合わせ、それにより、該第１のオリゴヌクレオチドに結合した第１の反応生成物を合成する工程であって、ここで、該遊離反応体は、該混合物中の該反応性単位のうちの少なくとも１つに対してよりも該第１の反応中間体に対しての方が反応性が高い、工程
を包含する、方法。
【請求項３４】
（ｅ）少なくとも１つの第１の反応性単位のコドン配列に相補的なアンチコドン配列を含む第３のオリゴヌクレオチドに結合させた第３の反応性単位を提供する工程；
（ｆ）該第１のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つのコドン配列を、前記第３のオリゴヌクレオチドのアンチコドン配列とアニーリングさせて、該第１の反応性単位と該第３の反応性単位との間での反応を誘導して、少なくとも第１のオリゴヌクレオチドに結合した第２の反応中間体を形成させる工程；ならびに
（ｇ）該第２の反応中間体を、該第２の反応中間体と選択的反応性である遊離反応体と合わせ、それにより、同定用配列に結合した第２の反応生成物を合成する工程であって、ここで、該遊離反応体は、該混合物中の該反応性単位のうちの少なくとも１つに対してよりも該第２の反応中間体に対しての方が反応性が高い、工程
をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
核酸鋳型合成をインビトロで行う方法であって、該方法は、
（ａ）（ｉ）コドン配列を規定する第１のオリゴヌクレオチドに共有結合させた第１の反応性単位を含む鋳型、および（ｉｉ）該鋳型のコドン配列に相補的なアンチコドン配列を規定する第２のオリゴヌクレオチドに共有結合させた第２の反応性単位を含む転移単位、を提供する工程；
（ｂ）該コドン配列と該アンチコドン配列とをアニーリングさせて、該第１の反応性単位と該第２の反応性単位とが互いに反応して反応中間体が生成されるように第１の反応性単位および第２の反応性単位を反応的に近接させる工程；ならびに
（ｃ）該反応中間体を、該反応中間体と化学的に反応して反応生成物を生成させる遊離反応体と接触させる工程であって、ここで、該第１のオリゴヌクレオチドは、該反応生成物に連結された状態で維持されている、工程
を包含する、方法。
【請求項３６】
前記第１の反応性単位が低分子骨格である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
工程（ｂ）において、前記第１の反応性単位の官能基が、前記反応中間体内の異なる化学的部分に変換される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記低分子骨格が保護された官能基を含有している、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
工程（ｂ）において、前記官能基を脱保護して反応中間体を生成させ、ここで、前記低分子骨格が、脱保護された官能基を含有している、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記反応生成物が核酸でない、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記反応生成物が、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体のいずれでもない、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
工程（ｂ）において、リボソームの補助なしで、前記第１の反応性単位と前記第２の反応性単位とが互いに反応して前記反応中間体を生成させる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
前記第１のオリゴヌクレオチドに結合した反応生成物を選択する工程をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】
前記第１のオリゴヌクレオチドを増幅させる工程をさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記反応生成物の正体または合成履歴を決定するために、前記反応生成物に結合した第１のオリゴヌクレオチドの配列を決定するさらなる工程を含む、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００５年１月２１日に出願された米国特許出願第６０／６４６，５８４号の利益およびその優先権を主張するものであり、その全開示は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（政府資金提供）
本願に記載された研究は、一部、米国海軍研究事務所によって契約番号Ｎ０００１４−０３−１−０７４９の下、およびＮＩＨ／ＮＩＧＭＳによって助成金Ｒ０１  ＧＭ０６５８６５の下に資金援助を受けた。米国政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、核酸鋳型合成を行うための方法および組成物に関する。より詳しくは、本発明は、反応中間体を作製するために核酸鋳型合成を行うための方法および組成物に関し、この反応中間体は次いで、この反応中間体と反応して反応生成物を生成させる遊離反応体を用いて、反応生成物に化学的に変換され得る。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
核酸鋳型有機合成により、従来の合成形式では可能でない制御反応様式が可能になり、これまでは生体高分子に対してのみ利用可能であった翻訳方法、選択方法および増幅方法を用いて合成分子を操作することが可能になる（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。核酸鋳型合成、特に、ＤＮＡ鋳型有機合成（すなわち、ＤＴＳ）によって得られ得る構造は、主に、２つの核酸連結反応体間のカップリング反応の生成物に限定されている。しかしながら、場合によっては、反応体をオリゴヌクレオチドに係留（ｔｅｔｈｅｒ）することが困難または不可能である。したがって、非オリゴヌクレオチド連結低分子試薬を、配列プログラム形式または配列記録化様式で反応させることを可能にするストラテジーの開発により、核酸鋳型合成の合成能力が有意に拡張される。
【非特許文献１】Ｇａｒｔｎｅｒら（２００１）Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ．１２３：６９６１−３
【非特許文献２】Ｇａｒｔｎｅｒら（２００２）ＡＮＧＥＷ．ＣＨＥＭ．，ＩＮＴ．ＥＤ．ＥＮＧＬ．１２３：６１７９６−１８００
【非特許文献３】Ｇａｒｔｎｅｒら（２００２）Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ．１２４：１０３０４−６
【非特許文献４】Ｃａｌｄｅｒｏｎｅら（２００２）ＡＮＧＥＷ．ＣＨＥＭ．，ＩＮＴ．ＥＤ．ＥＮＧＬ．４１：４１０４−８
【非特許文献５】Ｇａｒｔｎｅｒら（２００３）ＡＮＧＥＷ．ＣＨＥＭ．，ＩＮＴ．ＥＤ．ＥＮＧＬ．４２：１３７０−５
【非特許文献６】Ｌｉら（２００４）Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ．１２４：５０９０−２
【非特許文献７】Ｋａｎａｎら（２００４）ＮＡＴＵＲＥ  ４３１：５４５−９
【非特許文献８】Ｇａｒｔｎｅｒら（２００４）ＳＣＩＥＮＣＥ  ３０５：１６０１−５
【非特許文献９】Ｌｉら（２００４）ＡＮＧＥＷ．ＣＨＥＭ．ＩＮＴ．ＥＤ．４３：４８４８−７０
【非特許文献１０】Ｂｒｅｎｎｅｒら（１９９２）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ  ８９：５１８１
【非特許文献１１】Ｄｏｙｏｎら（２００３）Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ．１２５：１２３７２−３
【非特許文献１２】Ｈａｌｐｉｎら（２００４）ＰＬＯＳ  ＢＩＯＬ．２：ｅ１７４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、試薬をオリゴヌクレオチドに係留させる必要性に取り組むことによって核酸鋳型有機合成の範囲を拡張するための方法および組成物を提供する。試薬を核酸、例えばＤＮＡに連結させることが可能でも簡便でもない場合、それにもかかわらず、このような変換により、かかる試薬が、核酸配列と生成物の構造との対応性を保持したまま低分子合成に寄与することが可能になる。また、カップリング反応から核酸鋳型工程を切り離すこと（ｄｅｃｏｕｐｌｉｎｇ）によって、このアプローチにより、必ずしも核酸ハイブリダイゼーションが補助されない条件下で結合形成を行うことが可能になる。
【０００６】
一態様において、本発明は、反応生成物の合成方法を提供する。該方法は、（ａ）第１の反応性単位および第２の反応性単位を含む混合物を、第１の反応性単位と第２の反応性単位との間での反応により反応中間体が形成されるのを可能にする条件下に提供する工程；（ｂ）該反応中間体に結合させた同定用（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ）配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する工程；ならびに（ｃ）反応中間体を、該反応中間体と選択的反応性である遊離反応体と合わせ、それにより、同定用配列に連結された反応生成物を生成させる工程を含む。このアプローチにおいて、遊離反応体は、出発混合物中の反応性単位のいずれかに対してよりも反応中間体に対しての方が反応性が高い。
【０００７】
別の態様において、本発明は、例えば、米国特許出願第１０／６４３，７５２号（これは、米国特許出願公開第ＵＳ２００４／０１８０４１２号で公開されている）に記載されているような核酸鋳型合成による反応生成物の合成方法を提供する。該方法は、（ａ）（ｉ）コドン配列を含む第１のオリゴヌクレオチドに結合させた第１の反応性単位、および（ｉｉ）該コドン配列に相補的なアンチコドン配列を含む第２のオリゴヌクレオチドに結合させた第２の反応性単位、を含む混合物を提供する工程；（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドのコドン配列を第２のオリゴヌクレオチドのアンチコドン配列とアニーリングさせて、第１の反応性単位と第２の反応性単位との間での反応を誘導して、少なくとも第１のオリゴヌクレオチドに結合した反応中間体を形成させる工程；ならびに（ｃ）反応中間体を、該反応中間体と選択的反応性である遊離反応体と合わせ、それにより、第１のオリゴヌクレオチド配列に依然として結合した反応生成物を合成する工程を含む。遊離反応体は、好ましくは、該出発混合物中の反応性単位のうちの少なくとも一方に対してよりも反応中間体に対しての方が反応性が高い。
【０００８】
同様に、初期反応混合物中に多数の異なる第１の反応性単位（および必要に応じて、第２の反応性単位）が存在する程度まで、ある一定の反応条件下では、多数の異なる反応中間体を創製させ得ることが可能である。したがって、遊離反応体が、混合物中のただ１つの特定の型の反応中間体と選択的反応性であることは好都合であり得る。あるいはまた、遊離反応体が、反応中間体が特定の化学的官能性を有する官能基を有する反応中間体の集団または部分集団と選択的反応性であることは好都合であり得る。例えば、遊離反応体は、遊離アミンを欠く他の反応性中間体と比べ、遊離アミンを含有する反応性中間体と選択的反応性であり得る。
【０００９】
さらにまた、コドンおよび／またはアンチコドンの配列がわかることにより、どの第２の反応性単位が第１の反応性単位と反応して反応性中間体および／または反応生成物を生成させたのかを決定することが可能である。さらにまた、第１のオリゴヌクレオチドが、第１のオリゴヌクレオチドに結合させた第１の反応性単位の配列同定体（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）を提供する場合、どのような第１の反応単位が第２の反応性単位と反応して反応中間体および／または反応生成物を生成させたのかを決定することが可能である。反応条件、反応中間体を含有する反応混合物中に存在する反応体、およびある特定の遊離反応体が反応中間体を含有する混合物に添加された場合に関する情報に基づき、どのような遊離反応体が反応中間体と反応して具体的な反応生成物を創製させたかを決定することが可能であり得る。この情報を用い、反応生成物およびこれが作製された反応経路が特定され得る。
【００１０】
前述の本発明の態様および特徴は、以下の図面、詳細な説明、実施例および特許請求の範囲を参照することにより、さらに理解され得る。
【００１１】
（定義）
用語「コドン」および「アンチコドン」は、本明細書で用いる場合、それぞれ、鋳型および転移（ｔｒａｎｓｆｅｒ）単位内の相補オリゴヌクレオチド配列であって、核酸鋳型合成中、転移単位が鋳型にアニーリングするのを可能にする相補オリゴヌクレオチド配列をいう。
【００１２】
用語「遊離反応体（ｆｒｅｅ  ｒｅａｃｔａｎｔ）」は、本明細書で用いる場合、核酸鋳型合成に関与し得るオリゴヌクレオチドに連結されていない化学物質試薬または化学的部分をいう。これに対し、第１および第２の反応性単位ならびに転移単位は、核酸鋳型合成に関与し得るオリゴヌクレオチドに結合されている。
【００１３】
用語「オリゴヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書で用いる場合、ヌクレオチドのポリマーをいう。該ポリマーとしては、限定されないが、天然ヌクレオシド（すなわち、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシンおよびデオキシシチジン）、ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニンおよび２−チオシチジン）、化学的に修飾された塩基、生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化された塩基）、インターカレートされた塩基、修飾された糖類（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノースおよびヘキソース）、または修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホロアミダイト連結）が挙げられ得る。また、核酸およびオリゴヌクレオチドとしては、修飾されたバックボーンを有する塩基の他のポリマー（例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）など）、および増幅手法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、または非酵素系鋳型特異的複製（ｎｏｎ−ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ））を用いる増幅反応のための鋳型として供され得る任意の他のポリマーが挙げられ得る。
【００１４】
用語「反応性単位」は、本明細書で用いる場合、反応中間体および／または反応生成物を生成させるための別の化学物質試薬または化学的部分との化学反応に関与し得る化学物質試薬または化学的部分（例えば、限定されないが、ビルディングブロック、モノマー、モノマー単位、低分子骨格、または核酸鋳型化学合成に有用な他の反応体が挙げられる）をいう。
【００１５】
用語「反応中間体」は、本明細書で用いる場合、遊離反応体によって異なる試薬または化学的部分に化学的に変換され得る化学物質試薬または化学的部分をいう。
【００１６】
用語「低分子」は、本明細書で用いる場合、研究室で合成されたもの、または自然界に見られるもののいずれかであって、１０，０００グラム／モル未満、必要に応じて、５，０００グラム／モル未満、必要に応じて、２，０００グラム／モル未満の分子量を有する有機化合物をいう。
【００１７】
用語「低分子骨格」は、本明細書で用いる場合、官能性付与に適した少なくとも１つの部位または化学的部分を有する化合物をいう。低分子の骨格または分子の骨格は、官能性付与に適した部位または化学的部分を２、３、４、５またはそれより多く有し得る。このような官能性付与部位は、当業者には理解されるように、保護またはマスクされてもよい。該部位はまた、基礎となる環構造またはバックボーン上にも見られ得る。低分子骨格は、核酸、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体のいずれでもない。
【００１８】
用語「転移単位」は、本明細書で用いる場合、反応性単位（例えば、限定されないが、ビルディングブロック、モノマー、モノマー単位、低分子骨格、または核酸鋳型化学合成に有用な他の反応体が挙げられる）に結合させたアンチコドン配列を有するオリゴヌクレオチドを含む分子をいう。
【００１９】
用語「鋳型」は、本明細書で用いる場合、核酸鋳型化学合成に適した少なくとも１つのコドン配列を有するオリゴヌクレオチドを含む分子をいう。鋳型は、必要に応じて、、（ｉ）複数のコドン配列、（ｉｉ）増幅手段、例えば、ＰＣＲプライマー結合部位もしくはこれに相補的な配列、（ｉｉｉ）これと関連する反応性単位、（ｉｖ）（ｉ）と（ｉｉ）との組合せ、（ｖ）（ｉ）と（ｉｉｉ）との組合せ、（ｖｉ）（ｉｉ）と（ｉｉｉ）との組合せ、または（ｉ）と（ｉｉ）と（ｉｉｉ）との組合せを含み得る。
【００２０】
本明細書全体を通して、組成物がある特定成分を有する、含有するまたは含むものと記載される場合、またはプロセスがある特定のプロセス工程を有する、含有するまたは含むものと記載される場合、本発明の組成物は、記載した成分から本質的になるか、または記載した成分からなること、および本発明のプロセスは、記載したプロセス工程から本質的になるか、または記載したプロセス工程からなることもまた想定される。さらに、諸工程の順序またはある特定の諸作業（ａｃｔｉｏｎ）を行うための順序は、本発明が実施可能で維持される限り重要でないことを理解されたい。さらに、そうでないとの記載がない限り、２つ以上の工程または作業を同時に行ってもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（詳細な説明）
本発明は、分子（例えば低分子）のライブラリーの合成に有用である。本明細書に記載する官能基変換は、試薬をオリゴヌクレオチドに係留させる必要性に取り組むことにより核酸鋳型有機合成の範囲を拡張するのに特に有用である。オリゴヌクレオチドへの試薬の連結が可能でも簡便でもない場合、それにもかかわらず、このような変換により、かかる試薬が、オリゴヌクレオチド配列と得られる生成物の構造との対応性を保持したまま低分子合成に寄与することが可能になる。
【００２２】
一態様において、本発明は、反応生成物の合成方法を提供する。該方法は、（ａ）第１の反応性単位および第２の反応性単位を含む混合物を、第１の反応性単位と第２の反応性単位との間の反応により反応中間体が形成されるのを可能にする条件下に提供する工程；（ｂ）該反応中間体に結合させた同定用配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する工程；ならびに（ｃ）反応中間体を、該反応中間体と選択的反応性である遊離反応体と合わせ、それにより、同定用配列に連結された反応生成物を生成させる工程を含む。このアプローチにおいて、遊離反応体は、出発混合物中の反応性単位のいずれかに対してよりも反応中間体に対して反応性が高い。
【００２３】
このアプローチを図１に概略的に示す。簡単には、第１の反応性単位（ＦＲＵ）を、第２の異なる反応性単位（ＳＲＵ）と反応させ、反応中間体（ＲＩ）を生成させる。ＲＩを同定用配列（ＩＳ）に結合（好ましくは共有結合）させる。ＩＳは、オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはその誘導体、ＲＮＡまたはその誘導体）であり得る。次いで、ＲＩ−ＩＳ複合体を遊離反応体（ＦＲ）と、ＦＲがＲＩを反応生成物（ＲＰ）に化学的に変換させるのを可能にする条件下で合わせる。ＲＰは、依然としてＩＳに連結されており、ＲＰおよびＲＰの合成履歴を特定するのに使用され得る。
【００２４】
一つのアプローチにおいて、ＩＳ（例えば、ある特定のコドン配列またはアンチコドン配列を規定する核酸配列）を、ＲＩが生成される反応前にＦＲＵに連結させる。ＩＳは、ＲＩに連結されたＩＳが提供されるように、反応後、ＲＩに連結されたままである。ＲＰの創製後、ＩＳはＲＰに連結されたままであり、その結果、ＲＰおよびその合成履歴を特定することが可能である。ＳＲＵをＩＳに相補的な配列に連結させ得ることもまた想定される。その結果、工程（ａ）中、ＩＳはＩＳに相補的な配列にハイブリダイズし、その結果、ＦＲＵとＳＲＵとを反応的に近接させる。
【００２５】
別のアプローチにおいて、ＩＳ（例えば、ある特定のコドン配列またはアンチコドン配列を規定する核酸配列）をＲＩに、これがＦＲＵとＳＲＵとの間の反応によって形成された後に連結させる。次いで、ＲＩを、ＦＲを介してＲＰに化学的に変換させ得る。ＩＳは、ＲＰに連結されたままである。ＩＳはＲＩに、ＲＩの形成後に酵素的に（例えばポリメラーゼまたはリガーゼによって）連結させ得る。
【００２６】
一実施形態において、ＦＲは、出発混合物中の反応性単位または他の反応性中間体のうちの少なくとも１種類に対してよりも、必要に応じてすべてに対してよりも、ＲＩに対しての方が少なくとも５倍反応性が高い。さらにまた、反応体および反応条件に応じて、他の実施形態において、ＦＲは、出発混合物中の反応性単位または他の反応性中間体のうちの少なくとも１種類に対してよりも、必要に応じてすべてに対してよりも、ＲＩに対しての方が少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍または少なくとも１０００倍反応性が高い。さらに、反応体および反応条件に応じて、ＲＰは５０％以上、７５％以上、８５％以上または９８％以上の収率で合成される。
【００２７】
出発材料であるＦＲＵおよびＳＲＵと比べたＲＩに対するＦＲの反応性は、実験によって測定され得る。標準的な反応条件下でＦＲおよびＲＩを合わせることにより生成される生成物の量を測定してもよい。等モル量でＦＲをＦＲＵまたはＳＲＵのいずれかと同じ反応条件下で合わせることにより生成される生成物の量を測定してもよい。生成物の収率は、化学技術分野で標準的な手法によって測定され得る。各反応で生成される生成物の相対量に基づき、ＦＲがより反応性が高いか否かを決定することが可能であり、もし反応性がより高ければ、ＦＲＵまたはＳＲＵに対してよりもどれだけ反応性が高いかを決定することが可能である。同様のアプローチを用いて、遊離反応体が、ある１つの反応中間体に対しての方が、他の異なる反応性中間体に対してよりも反応性が高いか否かが決定され得る。
【００２８】
別の態様において、本発明は、例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００４／０１８０４１２号に記載された核酸鋳型合成を経由する反応生成物の合成方法を提供する。該方法は、（ａ）（ｉ）コドン配列を含む第１のオリゴヌクレオチドに結合させた第１の反応性単位、および（ｉｉ）コドン配列に相補的なアンチコドン配列を含む第２のオリゴヌクレオチドに結合させた第２の反応性単位（ここで、アンチコドン配列は第２の反応性単位を示す）、を含む混合物を提供する工程；（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドのコドン配列を第２のオリゴヌクレオチドのアンチコドン配列とアニーリングさせ、第１の反応性単位と第２の反応性単位との間での反応を誘導して、少なくとも第１のオリゴヌクレオチドに結合した反応中間体を形成させる工程；ならびに（ｃ）反応中間体を、該反応中間体と選択的反応性である遊離反応体と合わせ、それにより、第１のオリゴヌクレオチドに結合した反応生成物配列を合成する工程を含む。遊離反応体は、好ましくは、出発混合物中の反応性単位または他の反応中間体のうちの少なくとも１種類に対してよりも（必要に応じて、すべてに対してよりも）、反応中間体に対しての方が反応性が高い。
【００２９】
このアプローチを図２に概略的に示す。この場合、第１の反応性単位（ＦＲＵ）を、コドン配列を含む第１のオリゴヌクレオチド（ＣＳ）に結合（例えば共有結合）させる。第１の反応性単位とオリゴヌクレオチドとの組合せは、鋳型と称され得る。コドン配列により、例えばＩＳのようにＦＲＵが特定され得る。あるいはまた、ＣＳは、ＦＲＵを特定する別個の同定体配列（ＩＳ）をさらに含むものであり得る。後者のシナリオでは、ＣＳにより第２の反応性単位（ＳＲＵ）が特定され得、これがＦＲＵと反応して反応中間体（ＲＩ）を創製し、ＩＳによりＦＲＵが特定され得る。
【００３０】
このアプローチにおいて、ＳＲＵを、ＣＳに相補的なアンチコドン配列（ＡＣＳ）を含有する第２のオリゴヌクレオチドに結合（例えば共有結合）させる。第２の反応性単位とアンチコドン配列との組合せは、転移単位と称され得る。鋳型と転移単位とを適切な反応条件下で合わせると、ＣＳとＡＣＳとが互いにアニーリングし、ＦＲＵとＳＲＵとが反応的に近接する。次いで、ＦＲＵおよびＳＲＵは、例えば近接触媒作用によって互いに反応し、依然としてＣＳに連結されたＲＩを生成させる。遊離反応体（ＦＲ）と合わせると、ＲＩはＦＲによって、依然としてＣＳに連結された反応生成物（ＲＰ）に化学的に変換される。ＲＰに結合したオリゴヌクレオチドがＣＳを含有すると仮定すると、どのＳＲＵがＲＩおよび／またはＲＰの合成に関与したかを決定することが可能である。同様に、ＲＰに結合したオリゴヌクレオチドがＩＳを含有する場合、どのＦＲＵがＲＩおよび／またはＲＰの合成に関与したかを決定することが可能である。したがって、この情報を用い、ＲＩおよび／またはＲＰの正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）および合成履歴が決定され得る。
【００３１】
さらにまた、ＦＲＵは、核酸鋳型合成中に低分子を生成させるために使用され得る低分子骨格であり得ることが想定される。特に、低分子骨格は、これに該低分子の置換基を存在させるコアとして使用され得る。
【００３２】
一実施形態において、ＦＲは、出発混合物中の反応性単位または他の反応性中間体のうちの少なくとも１種類に対してよりも（必要に応じて、すべてに対してよりも）、ＲＩに対しての方が少なくとも５倍反応性が高い。さらにまた、反応体および反応条件に応じて、他の実施形態において、ＦＲは、出発混合物中の反応性単位または他の反応性中間体のうちの少なくとも１種類に対してよりも（必要に応じて、すべてに対してよりも）、ＲＩに対しての方が少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍または少なくとも１０００倍反応性が高い。さらに、反応体および反応条件に応じて、ＲＰは５０％以上、７５％以上、８５％以上または９８％以上の収率で合成される。
【００３３】
別の態様において、本発明は、反応生成物の合成方法を提供する。該方法は、（ａ）第１の反応性単位の集団と第２の反応性単位の混合物を、第１の反応性単位のうちの少なくとも１種類と第２の反応性単位との間での反応を誘導する条件下に提供し、それにより、該第１の反応性単位の集団と共存する反応中間体を形成させる工程；（ｂ）該反応中間体に結合させた同定用配列を提供する工程であって、ここで、該配列は、反応中間体を第１の反応性単位と識別する、工程；ならびに第１の反応性単位と共存する該反応中間体を、反応中間体と選択的に反応できる遊離反応体と合わせ、それにより、同定用配列に連結される反応生成物を合成する工程であって、該反応生成物は、該第１の反応性単位の集団と共存する、工程を含む。遊離反応体は、出発混合物中の反応性単位または他の反応性中間体のうちの少なくとも１種類に対してよりも反応中間体に対しての方が反応性が高い。
【００３４】
このアプローチを図３に概略的に示すが、これは、第１の反応単位が第１の反応性単位の混合物として存在すること以外は、図１に概略的に示すアプローチと同様である。簡単には、ＦＲＵ１、ＦＲＵ２、ＦＲＵ３およびＦＲＵ４で表される４種類の第１の反応性単位を含有する出発混合物を、ＳＲＵ１で表される第２の反応性単位と合わせる。適切な条件下で、ＦＲＵ１とＳＲＵ１とが互いに反応し、ＲＩ１で表される反応中間体が生成される。同定体配列（ＩＳ）をＲＩ１に結合させ、ＲＩ１が特定され得る。その後、遊離反応体（ＦＲ）を混合物と、ＲＩが、ＲＰ１で表される反応生成物に化学的に変換される条件下で合わせる。ＲＰ１は、依然としてＩＳに連結されており、これを用いて、ＲＰおよびＲＰの合成履歴が特定され得る。さらに、特に、ＦＲＵが低分子骨格である場合、ＲＰ１が、他の回（ｒｏｕｎｄ）の官能基変換に曝露されて、さらに修飾された生成物が生成され得ることが想定される。
【００３５】
別の態様において、本発明は、核酸鋳型合成を経由する反応生成物の合成方法を提供する。該方法は、（ａ）（ｉ）コドン配列を含む第１のオリゴヌクレオチドに各々連結された複数の異なる第１の反応性単位を含む混合物を提供する工程であって、ここで、各オリゴヌクレオチド配列はまた、これに結合された第１の反応性単位を示す、工程；（ｂ）少なくとも１つの第１の反応性単位のコドン配列に相補的なアンチコドン配列を含む第２のオリゴヌクレオチドに結合させた第２の反応性単位を提供する工程であって、ここで、アンチコドン配列は、第２の反応性単位を示す、工程；（ｃ）第１のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つのコドン配列を、第２のオリゴヌクレオチドのアンチコドン配列にアニーリングさせて、第１の反応性単位と第２の反応性単位との間での反応を誘導して、少なくとも第１のオリゴヌクレオチドに連結された第１の反応中間体を形成させる工程；ならびに（ｄ）第１の反応中間体を、該第１の反応中間体と選択的反応性である遊離反応体と合わせ、それにより、同定用配列に連結された第１の反応生成物を合成する工程であって、ここで、遊離反応体は、混合物中の反応性単位または他の反応性中間体のうちの少なくとも１種類に対してよりも（必要に応じて、すべてに対してよりも）、第１の反応中間体に対しての方が反応性が高い、工程を含む。
【００３６】
このアプローチを図４に概略的に示すが、これは、第１の反応性単位が第１の反応性単位の混合物として存在すること以外は、図２に概略的に示すアプローチと同様である。簡単には、初期反応物は、複数の鋳型を含有し、ここで、各鋳型は、それ自体のコドン特有（ｕｎｉｑｕｅ）配列（ＣＳ）を含有するそれ自体のそれぞれのオリゴヌクレオチドに結合（好ましくは共有結合）させた第１の反応性単位（ＦＲＵ１、ＦＲＵ２、ＦＲＵ３およびＦＲＵ４で表される）を含有する。オリゴヌクレオチドはまた、好ましくは、どの第１の反応性単位を鋳型のどのコドン配列に結合させるかを特定する同定体配列（ＩＳ）を含有する。コドン配列に相補的なアンチコドン配列を含有するオリゴヌクレオチドに結合（好ましくは共有結合）させた第２の反応性単位（ＳＲＵ）を含有する転移単位を、鋳型と合わせる。転移単位のＡＣＳを鋳型のＣＳとアニーリングさせて、ＦＲＵ１とＳＲＵとを反応的に近接させ、これによりＦＲＵ１とＳＲＵとが互いに反応し、ＣＳを含有するオリゴヌクレオチドに依然として結合したままである反応中間体（ＲＩ１）を生成させる。遊離反応体（ＦＲ）と合わせると、ＲＩはＦＲによって化学的に転移（ｔｒａｎｓｆｅｒ）され、依然としてＣＳに連結された反応生成物（ＲＰ）が生成される。ＲＰに結合したオリゴヌクレオチドがＣＳを含有すると仮定すると、どのＳＲＵがＲＩおよび／またはＲＰの合成に関与したかを決定することが可能である。同様に、ＲＰに結合したオリゴヌクレオチドがＩＳを含有する場合、どのＦＲＵがＲＩおよび／またはＲＰの合成に関与したかを決定することが可能である。したがって、この情報を用い、ＲＩおよび／またはＲＰの正体および合成履歴が決定され得る。記載のように、第１の反応性単位は、低分子ライブラリーの設計および合成に有用な低分子骨格であり得ることが想定される。
【００３７】
さらに、多数の異なる官能基変換を同時に同じ反応容器内で行い得ることが可能である。したがって、該方法はまた、以下のさらなる工程を含み得る：少なくとも１種類の異なる第１の反応性単位のコドン配列に相補的なアンチコドン配列を含有する第３のオリゴヌクレオチドに連結させた第３の異なる反応性単位を提供する工程であって、ここで、アンチコドン配列は、第３の反応性単位を示す、工程；第１のオリゴヌクレオチドのうちの異なる１種類のコドン配列を、第３のオリゴヌクレオチドのアンチコドン配列とアニーリングさせて、第１の反応性単位と第３の反応性単位との間での反応を誘導して、少なくとも第１の異なるオリゴヌクレオチドに結合した第２の反応中間体を形成させる工程；ならびに第２の反応中間体を、該第２の反応中間体と選択的反応性である遊離反応体と合わせ、それにより、同定用配列に結合した第２の反応生成物を合成する工程であって、ここで、遊離反応体は、混合物中の反応性単位または他の反応性中間体のうちの少なくとも１種類に対してよりも（必要に応じて、すべてに対してよりも）、第２の反応中間体に対しての方が反応性が高い、工程。
【００３８】
さらに、反応生成物が、他の回の官能基変換に曝露されて（例えば、ＦＲＵ１が低分子骨格である場合）、さらに修飾された生成物が生成され得ることが想定される。
【００３９】
当業者には理解されるように、本発明は、核酸鋳型化学合成の際に使用され得る化学反応の範囲を拡張するために使用され得る。鋳型、転移単位、反応条件、反応化学、選択手順の選択および使用に関する一般的な考慮事項は、当該技術分野で知られている。これらの考慮事項の一般的な論考は、以下の通りである。
【００４０】
（Ｉ．鋳型の考慮事項）
核酸鋳型は、相補オリゴヌクレオチドに連結された反応体を配列特異的に補充することにより、明白な構造的要件なしで、多種多様な化学反応を指図（ｄｉｒｅｃｔ）し得る。合成中、鋳型は、１つ以上の転移単位にハイブリダイズまたはアニーリングして反応中間体の合成を指図し、続いて該反応中間体が、遊離反応体によって反応生成物に変換され得る。次いで、反応生成物を、一定の基準（例えば、予め選択した標的分子に結合する能力など）に基づいて選択またはスクリーニングする。反応生成物が同定されたら、次いで、会合した鋳型を配列決定し、反応中間体および／または反応生成物の合成履歴をデコード（ｄｅｃｏｄｅ）し得る。
【００４１】
（ｉ）鋳型形式
鋳型の長さは、想定される核酸鋳型合成の型に応じて大きく異なり得る。例えば、ある特定の実施形態において、鋳型は、１０〜１０，０００ヌクレオチド長、２０〜１，０００ヌクレオチド長、２０〜４００ヌクレオチド長、４０〜１，０００ヌクレオチド長または４０〜４００ヌクレオチド長であり得る。鋳型の長さは、もちろん、例えば、コドンの長さ、ライブラリーの複雑さ、反応生成物の複雑さおよび／または大きさ、スペーサー配列の使用などに依存する。
【００４２】
鋳型は、転移単位と会合した１つ以上の反応性単位と相互作用し得る、反応性単位で終結するヘアピンループが一方の末端に組み込まれたものであり得る。例えば、ＤＮＡ鋳型は、５’−アミノ基で終結するヘアピンループを含むものであり得、５’−アミノ基は、保護されていても保護されていなくてもよい。このアミノ基は、非天然ポリマーまたは低分子の形成の開始点としての機能を果たし得る。
【００４３】
（ｉｉ）コドンの使用頻度
鋳型の配列は、多数の方法で設計され得ることが想定される。例えば、コドンの長さは決定されなければならず、コドン配列は設定されなければならない。２という長さのコドンが使用される場合、４種類の天然に存在する塩基を用いて１６通りだけの可能な組合せが、ライブラリーをコードする際の使用に利用可能である。コドンの長さを伸ばして３（自然界でタンパク質をコードする際に使用される数）にすると、可能な組合せの数は６４に増加する。コドンの長さを伸ばして４にすると、可能な組合せの数は２５６に増加する。コドンの長さの決定に考慮されるべき他の要素は、ミスマッチ、フレームシフト、ライブラリーの複雑さなどである。コドンの長さをある点まで増やすにつれて、ミスマッチの数は減少する。しかしながら、過度に長いコドンは、ミスマッチした塩基対にもかかわらずハイブリダイズする可能性がある。
【００４４】
コドンの長さは変化し得るが、コドンは、２〜５０ヌクレオチド、２〜４０ヌクレオチド、２〜３０ヌクレオチド、２〜２０ヌクレオチド、２〜１５ヌクレオチド、２〜１０ヌクレオチド、３〜５０ヌクレオチド、３〜４０ヌクレオチド、３〜３０ヌクレオチド、３〜２０ヌクレオチド、３〜１５ヌクレオチド、３〜１０ヌクレオチド、４〜５０ヌクレオチド、４〜４０ヌクレオチド、４〜３０ヌクレオチド、４〜２０ヌクレオチド、４〜１５ヌクレオチド、４〜１０ヌクレオチド、５〜５０ヌクレオチド、５〜４０ヌクレオチド、５〜３０ヌクレオチド、５〜２０ヌクレオチド、５〜１５ヌクレオチド、５〜１０ヌクレオチド、６〜５０ヌクレオチド、６〜４０ヌクレオチド、６〜３０ヌクレオチド、６〜２０ヌクレオチド、６〜１５ヌクレオチド、６〜１０ヌクレオチド、７〜５０ヌクレオチド、７〜４０ヌクレオチド、７〜３０ヌクレオチド、７〜２０ヌクレオチド、７〜１５ヌクレオチド、７〜１０ヌクレオチド、８〜５０ヌクレオチド、８〜４０ヌクレオチド、８〜３０ヌクレオチド、８〜２０ヌクレオチド、８〜１５ヌクレオチド、８〜１０ヌクレオチド、９〜５０ヌクレオチド、９〜４０ヌクレオチド、９〜３０ヌクレオチド、９〜２０ヌクレオチド、９〜１５ヌクレオチド、９〜１０ヌクレオチドの範囲であり得る。しかしながら、コドンは、好ましくは、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチド長である。
【００４５】
鋳型にコドンの組を用いることによって、好ましくは、該コドンの組内の任意の２つのコドン間のミスマッチの数が最大になり、転移単位の適正なアンチコドンのみが鋳型のコドン部位にアニーリングすることを確実にする。さらにまた、鋳型が、１つのコドンの組の全てのメンバーおよび異なるコドンの組の全てのコドンとの間でミスマッチを有し、アンチコドンが誤ったコドンの組に不慮に結合しないことを確実にすることは重要である。例示的なコドンの組の選択および機能性コドンの組を作出する方法は、例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００４／０１８０４１２号に記載されている。このアプローチおよび他のアプローチを用いて、異なる組のコドンを、コドンが繰り返されないように作製し得る。
【００４６】
核酸鋳型合成を用いてポリマーまたは低分子を作製する場合、フレームシフトを抑制するため、コドン間にスペーサー配列を配置してもよい。例えば、ポリマーサブユニットをコードする鋳型の塩基（該ポリマーの「遺伝暗号」）は、フレーム外アニーリングの可能性が最小限となるように選択され得る。このような遺伝暗号により、望ましくないフレームシフト核酸鋳型ポリマーの翻訳が低減され、予測される融解温度の範囲およびフレーム外アニーリングの際に生じるミスマッチの最小数が異なる。
【００４７】
（ｉｉｉ）鋳型の合成
鋳型は、当該技術分野で周知の方法論を用いて合成され得る。このような方法としては、インビボ方法およびインビトロ方法の両方、例えば、ＰＣＲ、プラスミド調製、エンドヌクレアーゼ消化、固相合成（例えば、自動合成装置を使用）、インビトロ転写、鎖の分離（ｓｔｒａｎｄ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）などが挙げられる。合成後、所望の場合は、鋳型を目的の反応性単位と、当該技術分野で公知の標準的なカップリング化学を用いて結合（例えば、共有または非共有結合）させ得る。
【００４８】
多種多様な鋳型を合成するための効率的な方法は、「スプリットプール」手法を使用することである。オリゴヌクレオチドは、標準的な３’から５’への化学反応を用いて合成される。最初に、定常３’末端を合成する。次いで、これをｎ個の異なる容器に分割する（ここで、ｎは、鋳型内の該位置に見られる異なるコドンの数である）。各容器について、ｎ個の異なるコドンのうちの１つを定常３’末端の（成長している）５’末端上に合成する。したがって、各容器は、５’から３’に、定常３’末端に結合した異なるコドンを含む。こうして、ｎ個の容器をプールし、その結果、単一の容器は、定常３’末端に結合したｎ個の異なるコドンを含む。コドンの５’末端に隣接する任意の定常塩基がこうして合成される。次いで、該プールをｍ個の異なる容器に分割し、ここで、ｍは、鋳型の次の（５’以降）の位置に出現する異なるコドンの数である。異なるコドンが、ｍ個の容器の各々において（成長しているオリゴヌクレオチドの５’末端において）合成される。得られたオリゴヌクレオチドを単一の容器内にプールする。分割、合成およびプールは、オリゴヌクレオチドにおいてすべてのコドンおよび定常領域が合成されるまで、必要に応じて繰り返される。
【００４９】
（ＩＩ．転移単位）
転移単位は、アンチコドン配列および反応性単位を含有するオリゴヌクレオチドを含む。アンチコドンは、鋳型内に存在するコドンに相補的となるように設計される。したがって、アンチコドンを設計する際は、鋳型に用いられる配列およびコドン長を考慮すべきである。鋳型に用いられるコドンに相補的な任意の分子、例えば、天然または非天然のヌクレオチドが使用され得る。ある特定の実施形態において、コドンは、自然界に見られる１個以上の塩基（すなわち、チミジン、ウラシル、グアニジン、シトシンおよびアデニン）を含む。したがって、アンチコドンとしては、通常自然界に見られ、塩基、糖および必要に応じたリン酸基を有する１個以上のヌクレオチドが挙げられ得る。
【００５０】
上記のように、アンチコドンは、特定の型の反応性単位と会合して転移単位を形成する。反応性単位は、別個の存在（ｅｎｔｉｔｙ）を表すものであってもよく、アンチコドン単位の機能性部の一部であってもよい。ある特定の他の実施形態において、ポリマーライブラリーではなく低分子のライブラリーを創製する場合、アンチコドンを、一般的に、低分子骨格を修飾するために用いられる反応性単位または反応体と会合させる。ある特定の実施形態において、反応体は、該反応体が低分子骨格と反応的に近接するのを可能にするのに充分長いリンカーを介してアンチコドンに連結される。リンカーは、好ましくは、分子内反応を許容するが分子間反応を最小限にする長さおよび組成を有する。反応体としては、広範囲の反応によって実証されている多様な試薬が挙げられ、これらは、核酸鋳型合成において利用され得、任意の化学基、触媒（例えば、有機金属化合物）、または化学の技術分野で公知の反応性部分（例えば、求電子剤、求核剤）であり得る。
【００５１】
ある特定の実施形態において、各アンチコドン配列は、１つのモノマー型と会合する。例えば、アンチコドン配列ＡＴＴＡＧは、イソブチル側鎖を有するカルバメート残基と会合し得、アンチコドン配列ＣＡＴＡＧは、フェニル側鎖を有するカルバメート残基と会合し得る。モノマー単位に対するアンチコドンのこの１対１マッピングによって、合成に使用された核酸鋳型を配列決定することにより、ライブラリーの任意のポリマーのデコードが可能になり、最初のポリマーの配列がわかることにより、同じポリマーまたは関連ポリマーの合成が可能になる。鋳型の配列を変更する（例えば、変異させる）ことにより、異なるモノマー単位が導入され得、それにより、関連ポリマーの合成が可能となり得、続いて、これを選択および進化させ得る。ある特定の好ましい実施形態において、自然界の場合のように、数種類のアンチコドンが１つのモノマー単位をコードし得る。
【００５２】
アンチコドンは反応体と、リンカー部分を介して会合し得る。この連結は、光、酸化、加水分解、酸への曝露、塩基への曝露、還元などによって切断可能であり得る。Ｆｒｕｃｈｔｅｌら（１９９６）ＡＮＧＥＷ．ＣＨＥＭ．ＩＮＴ．ＥＤ．ＥＮＧＬ．３５：１７には、本発明の実施に有用な多様な連結が記載されている。リンカーは、反応体と低分子骨格との接触を助長し、ある特定の実施形態においては、所望される反応に応じて、脱離基としてのＤＮＡの位置を占め（「自己切断可能な」ストラテジー）、または反応性基を鋳型に、「傷跡のない（ｓｃａｒｌｅｓｓ）」リンカーストラテジー（これは、化学的官能性を有するさらなる原子（１個または複数）が残らない生成物をもたらす）、もしくは「有用な傷跡（ｕｓｅｆｕｌ  ｓｃａｒ）」ストラテジー（リンカーの一部分が残り、リンカー切断後の後続の工程で官能性付与される）により連結させ得る。有用なリンカー、その設計および使用は、米国特許出願公開第ＵＳ２００４／０１８０４１２号に記載されている。
【００５３】
鋳型への転移単位の特異的アニーリングにより、多くの従来の有機合成で使用される濃度よりも低い濃度での転移単位の使用が可能になる。したがって、転移単位は、ミリモル未満の濃度（例えば、１００μＭ未満、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満または１０ｎＭ未満）で使用され得る。
【００５４】
（ＩＩＩ．化学反応）
多様な化合物および／またはライブラリーが、本明細書に記載の方法を用いて調製され得る。ある特定の実施形態において、核酸でもその類似体でもないか、またはこれらに似ていない化合物が、本発明の方法に従って合成される。ある特定の他の実施形態において、タンパク質、ペプチドまたはその類似体でなないか、またはこれらに似ていない化合物が、本発明の方法に従って合成される。
【００５５】
（ｉ）低分子の合成のためのカップリング反応
ある一部の実施形態では、本明細書に記載の方法を用いて低分子などの化合物を創製することが可能である。このような低分子は、非ポリマー系および／または非オリゴマー系の天然産物などであり得る。低分子における相当な関心は、一部は、多くの医薬調製物の活性成分としてのその使用のためであるが、これらはまた、例えば、触媒、材料または添加剤としても使用され得る。
【００５６】
本発明の方法を用いる低分子の合成において、進化可能な鋳型が使用され得る。鋳型は、低分子を構築するための低分子骨格を含むものであってもよく、または低分子骨格を鋳型に添加してもよい。低分子骨格は、官能性付与のための２つ以上の部位を有する任意の化合物であり得る。例えば、低分子骨格は、環構成原子とカップリングされた官能性付与可能な基を有する環系（例えば、コレステロール内に見られるＡＢＣＤステロイド環系）を含み得る。別の例において、低分子は、医薬用薬剤（例えば、モルヒネ、モルヒネならびにセファロスポリン抗生物質など）の基礎となる構造のものであり得る。低分子骨格上の官能性付与される部位または基は、当該技術分野で公知の方法および保護基を用いて保護されてもよい。低分子骨格に用いられる保護基は、保護基が一度に除去され得るように互いにオルソゴナルであってもよい。
【００５７】
このアプローチにおいて、転移単位は、修飾、低分子骨格への付加または該骨格からの除去における使用のための反応体またはビルディングブロックと会合したアンチコドンを含む。反応体またはビルディングブロックは、例えば、求電子剤（例えば、アセチル、アミド、酸塩化物、エステル、ニトリル、イミン）、求核剤（例えば、アミン、ヒドロキシル基、チオール）、触媒（例えば、有機金属触媒）、または側鎖であり得る。転移単位を鋳型と、ハイブリダイズ条件下で接触させる。オリゴヌクレオチドのアニーリングの結果、結合された反応体またはビルディングブロックは、低分子骨格上の１種類以上の反応中間体をもたらす部位との反応が可能になる。次いで、反応中間体を遊離反応体と反応させ、反応生成物が生成され得る。
【００５８】
反応条件、リンカー、反応体および官能性付与される部位は、分子間反応が回避され、分子内反応が加速されるように選択する。合成される具体的な化合物に応じて、鋳型と転移単位との逐次接触、または同時接触が使用され得る。
【００５９】
該骨格上の該部位を修飾した後、新たに合成された低分子は、その合成をコードした鋳型と会合したままである。鋳型配列のデコードにより、合成履歴、ひいては低分子の構造のデコンヴォルーション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）が可能になる。また、鋳型は、より多くの所望の低分子を創製するために増幅されてもよく、そして／または鋳型を進化（変異誘発）させて、関連低分子を創製してもよい。また、精製またはスクリーニングのために低分子を鋳型から切断してもよい。
【００６０】
（ｉｉ）ポリマー合成のためのカップリング反応
ある特定の実施形態において、ポリマー（特に、非天然ポリマー）が、本明細書に記載の手法を用いて調製され得る。例示的な非天然ポリマーとしては、限定されないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ポリマー、ポリカルバメート、ポリウレア、ポリエステル、ポリアクリレート、ポリアルキレン（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン）、ポリカーボネート、非天然の空間的配置を有するポリペプチド、非天然アミノ酸を有するポリペプチド、およびこれらの組合せが挙げられる。ある特定の実施形態において、該ポリマーは、少なくとも１０、２５、７５、１００、１２５、１５０個またはそれより多くのモノマー単位を含む。本明細書に記載の方法論を用いて合成される該ポリマーは、例えば、触媒、医薬品、金属キレート化剤、または触媒として使用され得る。
【００６１】
ある種の非天然ポリマーの調製では、アンチコドンに結合させたモノマー単位は、共に連結されてポリマーを形成することができる任意のモノマーまたはオリゴマーであり得る。モノマー単位は、例えば、カルバメート、Ｄ−アミノ酸、非天然アミノ酸、ＰＮＡ、ウレア、ヒドロキシ酸、エステル、カーボネート、アクリレートまたはエーテルであり得る。
【００６２】
（ｉｉｉ）反応条件
核酸鋳型反応（例えば、反応中間体を作製するための核酸鋳型反応）は、水性もしくは非水性（すなわち有機系）の溶液、または１種類以上の水性および非水性の溶液の混合物中で行われ得ることを理解されたい。水溶液中では、反応は、約２〜約１２、または好ましくは約２〜約１０、またはより好ましくは約４〜約１０のｐＨ範囲で行われ得る。ＤＮＡ鋳型化学反応に用いられる反応は、好ましくは、非常に塩基性の条件（例えば、ｐＨ＞１２、ｐＨ＞１０）または非常に酸性の条件（例えば、ｐＨ＜１、ｐＨ＜２、ｐＨ＜４）のいずれをも必要とすべきでない。これは、極端な条件により、核酸鋳型および／または合成される分子（例えば、ポリマーもしくは低分子）の分解または修飾がもたらされ得るからである。水溶液は、１種類以上の無機塩（例えば、限定されないが、ＮａＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４、ＫＣｌ、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２など）を種々の濃度で含有し得る。
【００６３】
核酸鋳型反応に適した有機溶媒としては、限定されないが、塩化メチレン、クロロホルム、ジメチルホルムアミド、ならびに有機アルコール（例えばメタノールおよびエタノール）が挙げられる。有機溶媒中の反応成分の定量的な溶解を可能にするため、第４級化アンモニウム塩（例えば、長鎖テトラアルキルアンモニウム塩）などを添加してもよい（Ｊｏｓｔら（１９８９）ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ  ＲＥＳ．１７：２１４３；Ｍｅｌ’ｎｉｋｏｖら（１９９９）ＬＡＮＧＭＵＩＲ  １５：１９２３−１９２８）。
【００６４】
核酸鋳型反応には、触媒（例えば、均一系触媒作用、不均一系触媒作用、相間移動触媒作用、および不斉触媒作用など）が必要とされ得る。実施形態によっては、触媒は必要とされない。核酸に連結されていないさらなる補助的試薬の存在は、ある一部の実施形態において好ましい。有用な補助的試薬としては、例えば、酸化剤（例えば、ＮａＩＯ４）；還元剤（例えば、ＮａＣＮＢＨ３）；活性化試薬（例えば、ＥＤＣ、ＮＨＳおよびスルホＮＨＳ）；遷移金属、例えば、ニッケル（例えば、Ｎｉ（ＮＯ３）２）、ロジウム（例えば、ＲｈＣｌ３）、ルテニウム（例えば、ＲｕＣｌ３）、銅（例えば、Ｃｕ（ＮＯ３）２）、コバルト（例えば、ＣｏＣｌ２）、鉄（例えば、Ｆｅ（ＮＯ３）３）、オスミウム（例えば、ＯｓＯ４）、チタン（例えば、ＴｉＣｌ４もしくはチタンテトライソプロポキシド）、パラジウム（例えば、ＮａＰｄＣｌ４）またはＬｎなど；遷移金属配位子（例えば、ホスフィン、アミンおよびハロゲン化物）；ルイス酸ならびにルイス塩基が挙げられ得る。
【００６５】
反応条件は、好ましくは、使用される反応性単位およびオリゴヌクレオチドの性質に適合するように最適化される。反応中間体を創製するため、および反応中間体を最終生成物に変換するために使用される試薬（例えば、遊離反応体）および反応条件の選択は、作製する具体的な化合物およびライブラリーに依存することを理解されたい。しかしながら、試薬および反応条件の選択は、当該技術分野における技術水準の範囲内であることが想定される。
【００６６】
（ｉｖ）化学反応の類型
反応中間体を創製するため、および／または反応中間体から反応生成物を創製するために、多種多様な化学反応が使用され得ることを理解されたい。ポリマー、低分子または他の分子を合成するための既知の化学反応が、核酸鋳型反応において使用され得る。したがって、Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ、有機化学の教科書、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎなどの雑誌、およびＣａｒｒｕｔｈｅｒ’ｓ  Ｓｏｍｅ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙなどに示された反応が使用され得る。選択される反応は、好ましくは、ＤＮＡもしくはＲＮＡなどの核酸と適合性であるか、または鋳型として使用する修飾された核酸と適合性である。
【００６７】
上記にかかわらず、本発明は、ある種の官能基変換、例えば、限定されないが、アジドからアミンへの変換、アジドからチオールへの変換、アジドからカルボン酸への変換、ヒドロキシルからアミンへの変換、ヒドロキシルからチオールへの変換、アセタールからアルデヒドへの変換、ケタールからケトンへの変換、カーボネートからヒドロキシル基への変換、カルバメートからアミンへの変換、チオカーボネートからチオールへの変換、ニトロ基からアミンへの変換、スルホンアミドからアミンへの変換、アルケンからエポキシドへの変換、α，β−不飽和ケトンからエポキシドへの変換、エポキシドからｌ，２−ジオールへの変換、エポキシドからｌ，２−ヒドロキシアミンへの変換、エポキシドからｌ，２−ヒドロキシスルフィドへの変換、アルケンからアジリジンへの変換、アジリジンからｌ，２−ジアミンへの変換、アジリジンからｌ，２−アミノスルフィドへの変換、リン酸エステルからリン酸への変換、イミドからアミンへの変換、およびニトリルからカルボン酸への変換を行う際に特に有用であることが想定される。他の例示的な変換は、例えば、Ｇｒｅｅｎｅら（編）（１９９９）ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  第３版，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，およびＫｏｃｉｅｎｓｋｉ（１９９４）ＰＲＯＴＥＣＴＩＮＧ  ＧＲＯＵＰＳ，Ｔｈｉｅｍｅに見出され得る。
【００６８】
（ＩＶ．生成物の選択、スクリーニングおよび同定）
（ｉ）選択およびスクリーニングアプローチ
所望の活性（触媒活性、結合親和性または活性アッセイにおける特定の効果など）を有する反応生成物の選択および／またはスクリーニングが、当該技術分野で知られ、使用されている方法論を用いて行われ得る。例えば、親和性選択は、ライブラリー系選択方法、例えば、ファージディスプレイ、ポリソームディスプレイ、およびｍＲＮＡ−融合タンパク質ディスプレイペプチドなどに使用される原理に従って行われ得る。触媒活性に関する選択は、遷移状態アナログアフィニティーカラムにおける親和性選択（Ｂａｃａら（１９９７）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ  ９４（１９）：１００６３−８）、または機能に基づく選択スキーム（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら（１９９８）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ  ９５（１８）：１０５２３−８）によって行われ得る。微量のＤＮＡ（約１０−２０ｍｏｌ）がＰＣＲによって増幅され得るため（Ｋｒａｍｅｒら（１９９９）ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．編）１５．１−１５．３，Ｗｉｌｅｙ）、このような選択は、現行の方法による反応解析に必要とされるものより１０桁以上小さい規模で行われ得、経済的かつ効率的で真に広い研究が行われ得る。
【００６９】
鋳型および反応生成物は、標的分子に対する結合に関して選択（スクリーニング）され得る。この状況において、選択または分配は、標的分子に結合したライブラリーメンバーが、標的分子に結合していないライブラリーメンバーと分離される任意のプロセスを意味する。選択は、当該技術分野で公知の種々の方法によってなされ得る。
【００７０】
本発明の鋳型は、直接的な選択および増幅のための内蔵機能を含む。ほとんどの適用において、標的分子に対する結合は好ましくは選択的であり、その結果、鋳型および得られる反応生成物が特定の標的分子と優先的に結合し、おそらく、特定の生物学的効果が抑制または誘導される。最終的に、本発明を用いて同定される結合分子は、治療用および／または診断用薬剤として有用であり得る。選択が完了したら、選択された鋳型を、必要に応じて、増幅および配列決定してもよい。選択された反応生成物は、充分な量で存在する場合、鋳型から分離され、（例えば、ＨＰＬＣ、カラムクロマトグラフィーまたは他のクロマトグラフィー法によって）精製され、さらに特徴付けられ得る。
【００７１】
選択ストラテジーは、ほぼあらゆる標的に対する選択を可能にするために行われ得る。重要なことには、選択ストラテジーは、標的分子に関する詳細な構造上の情報もライブラリー内の分子に関する詳細な構造上の情報も、なんら必要としない。プロセス全体は、所定の標的に対するライブラリー内の分子の特異的認識および結合に関与する結合親和性によって駆動される。
【００７２】
鋳型分子と反応生成物との連結により、種々の選択ストラテジーを用いる結合分子の速やかな同定が可能になる。核酸鋳型合成は、広く、任意の既知の標的分子に対する結合分子の同定を可能にする。さらに、新規な未知の標的が、未知抗原（エピトープ）に対する結合分子を単離すること、ならびに同定および確認のためにこのような結合分子を使用することによって見出され得る。
【００７３】
ライブラリーからの結合分子の選択は、最適な結合分子が同定される任意の形式で行われ得る。結合の選択は、典型的には、所望の標的分子の固定化、潜在的結合体のライブラリーの添加、および洗浄による非結合体の除去を伴う。固定化された標的に対して低親和性を示す分子を洗浄除去すると、一般的には、より強い親和性を有する分子が標的に結合されたままとなる。ストリンジェント洗浄後に標的に結合されたままである富化された集団を、好ましくは、例えば、酸、カオトロピック塩、加熱、既知リガンドとの競合的溶出によって、あるいは標的および／または鋳型分子のタンパク質分解性放出によって溶出させる。溶出される鋳型はＰＣＲに適しており、何桁もの増幅をもたらし、それにより本質的に、選択された各鋳型が、クローン化、配列決定および／またはさらなる富化もしくは誘導体化のために、非常に増加したコピー数で利用可能となる。
【００７４】
標的分子（ペプチド、タンパク質、ＤＮＡまたは他の抗原）を、固相支持体（例えば、容器壁、マイクロタイタープレートウェルの壁）上に固定化してもよい。ライブラリーは、好ましくは、水性結合バッファー中にワンポットで溶解し、固定化された標的分子の存在下で平衡化される。非結合体は、バッファーで洗い流される。それ自体の合成部分を介してではなく結合されたＤＮＡ鋳型を介して標的分子に結合し得る分子は、ＰＣＲプライマー結合部位を欠く官能性付与していない鋳型を有する結合したライブラリーを洗浄することにより排除され得る。次いで、残留する結合ライブラリーメンバーを、例えば変性によって溶出し得る。
【００７５】
あるいはまた、特に、標的分子が容器壁に充分に吸着されることが疑わしい場合（ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから溶出される折り畳まれていない（ｕｎｆｏｌｄｅｄ）標的の場合であり得る）、標的分子をビーズ上に固定化してもよい。次いで、誘導体化ビーズを用いて、高親和性ライブラリーメンバーを非結合体から、単に、ベンチトップ型遠心機内でビーズを沈降させることによって分離し得る。あるいはまた、ビーズを用いてアフィニティーカラムを作製し得る。このような場合では、結合を可能するために、ライブラリーをカラムに１回以上通過させる。次いで、カラムを洗浄して非結合ライブラリーメンバーを除去する。磁性ビーズは、本質的に、上記のものの改変物であり、標的を磁性ビーズに結合させ、次いで、これを選択に使用する。
【００７６】
標的分子に結合するライブラリーメンバーは、変性、酸またはカオトロピック塩によって放出され得る。あるいはまた、バックグラウンドを低減するため、および所望の特異性に関して選択するために、溶出条件をより特異的にし得る。溶出は、標的分子と固定化表面との間、または反応生成物と鋳型との間のリンカーを切断するタンパク質分解を用いて行われ得る。また、溶出は、標的分子に対する既知の競合的リガンドとの競合によって行われ得る。あるいはまた、ＰＣＲ反応は、選択手順の最後に、洗浄された標的分子の存在下で直接行われ得る。したがって、鋳型のみがさらなる増幅またはクローニングに必要とされ、反応生成物自体は必要とされないため、結合分子は、選択可能であるべき標的から溶出可能である必要はない。実際、一部の標的分子は、最もアビディティのある（ａｖｉｄ）リガンドに非常に強固に結合するため、溶出が困難である場合があり得る。
【００７７】
（ｉｉ）生成物の同定
一旦すべての回の選択が完了したら、選択された反応生成物に結合しているか、または以前は該反応生成物に結合していた鋳型を、好ましくは、鋳型の配列決定または他の後の操作を容易にする任意の適切な手法を用いて増幅させる。天然オリゴヌクレオチドは、任意の当該技術分野の技術水準の方法によって増幅させ得る。このような方法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；核酸配列に基づく増幅（例えば、Ｃｏｍｐｔｏｎ（１９９１）ＮＡＴＵＲＥ  ３５０：９１−９２を参照）、アンチセンスＲＮＡの増幅（例えば、ｖａｎ  Ｇｅｌｄｅｒら（１９８８）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ  ８５：７７６５２−７７６５６を参照）；自続型配列複製系（Ｇｎａｔｅｌｌｉら（１９９０）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−  １８７８）；ポリメラーゼ非依存的増幅（例えば、Ｓｃｈｍｉｄｔら（１９９７）ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ  ＲＥＳ．２５：４７９７−４８０２を参照）、およびクローン化されたＤＮＡ断片を保有するプラスミドのインビボ増幅が挙げられる。ＰＣＲ法の説明は、例えば、Ｓａｉｋｉら（１９８５）ＳＣＩＥＮＣＥ  ２３０：１３５０−１３５４；Ｓｃｈａｒｆら（１９８６）ＳＣＩＥＮＣＥ  ２３３：１０７６−１０７８；および米国特許第４，６８３，２０２号に見られる。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）などのリガーゼ媒介性増幅方法もまた使用され得る。一般に、選択した核酸配列の忠実で効率的な増幅を可能にする任意の手段が、本発明の方法において使用され得る。必要ではないが、増幅後の配列の比例的表示が、増幅前の混合物中の配列の相対的割合を反映することが好ましい。
【００７８】
非天然ヌクレオチドでは、効率的な増幅手順の選択肢がより少ない。非天然ヌクレオチドは、ある種の酵素（例えば、ポリメラーゼ）によって組み込まれ得るため、各伸長サイクル中にポリメラーゼを添加することにより、マニュアル型ポリメラーゼ連鎖反応を行うことが可能である。
【００７９】
一旦増幅されたら、目的の生成物をコードした鋳型の配列が決定され得る。例えば、配列決定は、標準的なジデオキシチェーンターミネーション法、または化学的配列決定（例えば、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定手順を使用）によって行われ得る。あるいはまた、鋳型の配列（または長鎖の鋳型を用いる場合は、その可変部分（１つまたは複数））は、ハイブリダイゼーション実験によって決定され得る。例えば、検出可能な部分（例えば、蛍光部分など）と会合する１本鎖鋳型分子を、既知配列の１本鎖核酸または核酸類似体の多数のクローン集団を担持するチップに曝露する。ここで、各クローン集団は、チップ上の特定のアドレス指定可能な位置に存在する。鋳型配列は、チップ上の配列へのアニーリングが許容される。次いで、チップ上の検出可能な部分の位置を決定する。検出可能な部分の位置および該位置に固定化された配列に基づいて鋳型の配列が測定され得る。多数のこのようなオリゴヌクレオチドが、チップまたは他の固相支持体上のアレイにおいて固定化され得ることが想定される。
【００８０】
ライブラリーは、例えば、エラープローンＰＣＲ（Ｃａｄｗｅｌｌら（１９９２）ＰＣＲ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＰＰＬ．２：２８）を用いて、またはＤＮＡをインビトロ相同組換えに供することにより（Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）ＮＡＴＵＲＥ  ３７０：３８９）、またはカセット変異誘発によって、ＤＮＡレベルで変異を誘導することにより進化させ得る。鋳型の進化および進化による合成は、例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００４／０１８０４１２号に記載されている。
【００８１】
以下の実施例は、本発明の種々の実施形態およびその均等物の実施に適用され得る、重要なさらなる情報、例示および手引きを含む。本発明の実施は、このような以下の実施例から、より充分に理解される。実施例は、本明細書において例示の目的のみのために提示されており、なんら限定するものと解釈されるべきでない。
【実施例】
【００８２】
以下の実施例に、配列プログラム化官能基変換の実行可能性を示す。実施例１および２に、３通りの配列プログラム化官能基変換、すなわち、アジドからアミン、アジドからチオール、およびアジドからカルボン酸への変換を記載し、変換の最終生成物は、ゲル電気泳動（実施例１）または質量分析法（実施例２）によって特徴付けられた。実施例３は、ＤＮＡに連結されていない低分子試薬（例えば、塩化スルホニル、クロロホルメート、イソシアネートおよびイソチオシアネート反応体）を用いて、アミン連結鋳型をスルホンアミド、カルバメート、尿素またはチオ尿素に変換することが可能であることを示す。実施例４は、単一溶液中で、有機アジドの混合物をアミン中間体に配列特異的に変換し、次いで、ＤＮＡに連結されていない遊離反応体（例えば、塩化スルホニル、クロロホルメート、イソシアネートおよびイソチオシアネート）を用いて、アミン中間体をスルホンアミド、カルバメート、尿素およびチオ尿素生成物に配列特異的に変換することが可能であることを示す。
【００８３】
（実施例１．第１級アミン、カルボン酸およびチオールへのアジドのＤＮＡ鋳型変換（ＰＡＧＥによる特徴付け））
この実施例では、アジドがアミン、チオールまたはカルボン酸に特異的に変換され得る配列プログラム化官能基変換を記載する。個々の反応スキームおよび結果としてもたらされた反応収率を、図５Ａおよび５Ｂに示す。
【００８４】
（Ｉ．材料および方法）
（ｉ）アジド酸の合成
図５Ｂに示す化合物１〜１２の合成のためのアジド基質を、対応するカルボン酸前駆物質から以下のようにして調製した：
アジド酢酸（図５Ｂの鋳型１を作製するために使用）。この試薬を、Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔら（２００１）ＯＲＧ  ＬＥＴＴ．３：７８１に記載のようにして作製した。生成物は、以下の特性を有することがわかった：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ３．９６（２Ｈ，ｓ）。
【００８５】
アジド−３−メチルペンタン酸（図５Ｂの鋳型２を作製するために使用）。この試薬は、Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔら（２００１）（前出）に記載のようにして作製した。生成物は、以下の特性を有することがわかった。
【００８６】
【化１】
2008528000.tif 000003
４−アジドメチル安息香酸（図５Ｂの鋳型３を調製するために使用）。ナトリウムアジド（１．３ｇ，２０ｍｍｏｌ）および１８−クラウン−６エーテル（０．２ｍＬ，１ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（４ｍＬ）中に溶解した。得られた溶液に、４−クロロメチル安息香酸（１．７１ｇ，１０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を２５℃にて１２時間攪拌した。反応物をＥｔＯＡｃ中で希釈し、０．１Ｎ  ＨＣｌで洗浄し（２×）、次いでブラインで洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して白色固形物（１．７５ｇ，定量的）を得た。得られた生成物は、以下の特性を有することがわかった：
【００８７】
【化２】
2008528000.tif 000004
１−アジドシクロへキシルカルボン酸（図５Ｂの鋳型５を調製するために使用）およびアジドイソグルタミン酸（図５Ｂの鋳型４を調製するために使用）を、アジド酸の合成について記載の方法に従って、Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔら（２００１）（前出）のジアゾ転移によって合成した。１−アジドシクロへキシルカルボン酸は、以下の特性を有することがわかった：
【００８８】
【化３】
2008528000.tif 000005
アジドイソグルタミン酸は、以下の特性を有することがわかった：
【００８９】
【化４】
2008528000.tif 000006
１−アジドメチル安息香酸（図５Ｂの鋳型６を作製するために使用）。この試薬を、Ｗａｄａら（２００１）ＴＥＴＲＡＨＥＤＲＯＮ  ＬＥＴＴ．４２：１０６９−７２、さらにＬｏｖｅら（２００１）．Ｊ．ＯＲＧ  ＣＨＥＭ．６６：６８１６５−７６に記載のようにして作製した。生成物は、以下の特性を有することがわかった：
【００９０】
【化５】
2008528000.tif 000007
４−アジド安息香酸（図５Ｂの鋳型７を作製するために使用）。この試薬をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。
【００９１】
４−アジドベンジル−シクロヘキシルジカルボン酸モノエステル（図５Ｂの鋳型８を調製するために使用）。トランス−シクロへキシルジカルボン酸（２００ｍｇ，１．１６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２２３ｍｇ，２．３２ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．４ｍＬ，２．３２ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）に溶解し、２５℃にて３０分間攪拌した。この混合物に、４−アジドベンジルアルコール（８６．６ｍｇ，０．５８ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を２５℃にて１２時間攪拌した。反応混合物を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（３０％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製した。所望のエステルが黄色固形物（１８．２ｍｇ，５％）として得られた。得られた生成物は、以下の特性を有することがわかった。
【００９２】
【化６】
2008528000.tif 000008
４−アジドベンジル−コハク酸モノエステル（図５Ｂの鋳型９を調製するために使用）。４−アジドベンジルアルコール（１００ｍｇ，０．６７ｍｍｏｌ）、無水コハク酸（１３４ｍｇ，１．３７ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（３．７ｍｇ，３０μｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解し、２５℃にて１２時間攪拌した。反応混合物を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（３０％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製した。所望のエステルが黄色固形物として得られた（７５．９ｍｇ，４５％）。得られた生成物は、以下の特性を有することがわかった：
【００９３】
【化７】
2008528000.tif 000009
４−アジドベンジル−ジフェン酸モノエステル（図５Ｂの鋳型１０を調製するために使用）。４−アジドベンジルアルコール（１１２ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）および無水ジフェン酸（７４．５ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）をピリジン（１ｍＬ）に溶解し、２５℃にて１２時間攪拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃ中で希釈し、リン酸バッファー（ｐＨ６．０、２×）で洗浄し、次いでブラインで洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、真空にて濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（２５％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製した。所望のエステルが黄色固形物として得られた（１９３ｍｇ，９９％）。得られた生成物は、以下の特性を有することがわかった：
【００９４】
【化８】
2008528000.tif 000010
１−アジドメチルベンゾイルチオ酢酸チオエステル（図５Ｂの鋳型１１を調製するために使用）。２−アジドメチルベンゾイル酸（４０ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）を、ＥＤＣ（６４．９ｍｇ，０．３４ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（３９．１ｍｇ，０．３４ｍｍｏｌ）（ＣＨ２Ｃｌ２中）と２５℃にて２時間混合した。反応混合物をＮａＨＣＯ３で洗浄し（２×）、次いでブラインで洗浄した。有機層を濃縮し、粗生成物を、さらに精製せずに次の工程で直接使用した。Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミジル２−アジドメチル安息香酸エステル（１６．４ｍｇ，４７μｍｏｌ）およびチオ酢酸（３．２μＬ）（ＤＭＦ中（２５０μＬ））を、２５℃で２４時間反応させた。反応混合物をＥｔＯＡｃ中で希釈し、ＮａＨＣＯ３で洗浄し（２×）、次いでブラインで洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、真空にて濃縮した。粗製混合物をフラッシュクロマトグラフィー（３０％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、チオエステル（９．８ｍｇ，８３％）を得た。得られた生成物は、以下の特性を有することがわかった：
【００９５】
【化９】
2008528000.tif 000011
２−アジドメチルベンゾイルチオプロピオン酸チオエステル（図５Ｂの鋳型１２を調製するために使用）。２−アジドメチルベンゾイルＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（ΝＨＳ）エステルを、等容量の１−アジドメチル安息香酸（図５Ｂの鋳型６を作製するために使用）（ＤＭＦ中９００ｍＭ）、ＥＤＣ（ＤＭＦ中９００ｍＭ）およびΝＨＳ（ＤＭＦ中９００ｍＭ）を２５℃で１時間混合することにより調製した。チオール基をＤΝＡオリゴヌクレオチドに、並行調製において結合させ、鋳型の形成時に鋳型内に組み込ませた（下記の５’２−アジドメチルベンゾイルチオプロピオン酸チオエステル連結ＤＮＡの調製を参照のこと）。
【００９６】
（ｉｉ）官能性付与したオリゴヌクレオチドの調製
この実施例および以下の実施例全体を通して、オリゴヌクレオチドは、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８０９０  ＤＮＡ合成装置で、標準的なホスホルアミダイトプロトコルを用いて合成し、分取スケール逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。自動化固相オリゴヌクレオチド合成のための試薬を、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入した。以下に記載するアミン末端ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびビオチン化ＤＮＡオリゴヌクレオチドでは、５’アミノ修飾体５（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて５’アミノ修飾オリゴヌクレオチドを調製し、３’アミノ修飾体Ｃ７  ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて３’アミノ修飾オリゴヌクレオチドを調製し、ビオチンＴＥＧ  ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、３’ビオチン標識オリゴヌクレオチドを調製した。官能性付与したＤＮＡオリゴヌクレオチドを、分析スケール逆相ＨＰＬＣによって精製した。
【００９７】
精製したオリゴヌクレオチドの溶液の濃度を、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ８４５３  ＵＶ−可視光分光測光器（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で測定した２６０ｎｍにおける吸光度に基づいて測定した。臭化エチジウムで染色したオリゴヌクレオチドを可視化し、ＵＶトランスイルミネーションおよびデンシトメトリー（Ｅａｇｌｅ  Ｅｙｅ  ＩＩ  デンシトメータ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用）によって定量した。
【００９８】
（ａ）鋳型オリゴヌクレオチド
５’アジド連結ＤＮＡオリゴヌクレオチド鋳型（図５Ｂの鋳型１〜１１を作製するために使用）。所望のアジド酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（ΝＨＳ）エステルを、等容量のそれぞれのアジド酸（ＤＭＦ中９００ｍＭ）、ＥＤＣ（ＤＭＦ中９００ｍＭ）およびΝＨＳ（ＤＭＦ中９００ｍＭ）を２５℃で１時間混合することにより調製した。粗製ΝＨＳエステルを２つに分けて（各５０μＬ）、５’アミノ修飾ＤΝＡオリゴヌクレオチド（５０μＬ、典型的には３００μＭ）を１００ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．２、３５０μＬ）中に含む溶液に添加した。これらの調製に用いた３０量体鋳型は、５’ＮＨ２（Ｃ２Ｈ４Ｏ）２−ＰＯ３Ｈ−ＧＧＴ  ＡＣＧ  ＡＡＴ  ＴＧＣ  ＡＣＴ  ＣＧＧ  ＧＡＡ  ＡＴＣ  ＣＡＣ  ＣＴＴ（配列番号１）であった。カップリング反応を２５℃で１時間行った。得られた反応混合物を、ＮＡＰ−５サイズ排除カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に直接ローディングし、有機溶媒、塩および過剰の低分子を除去し、アジド連結ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、分析スケール逆相ＨＰＬＣ（８〜３０％  ＭｅＣＮ／０．１Ｍ  ＴＥＡＡ勾配）によってさらに精製した。所望のオリゴヌクレオチド生成物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって特徴付けした。
【００９９】
５’２−アジドメチルベンゾイルチオプロピオン酸チオエステル連結ＤＮＡ（図５Ｂの鋳型１２を作製するために使用）。２，２’−ジチオジプロピオン酸をＤＭＦ（９００ｍＭ）中に含む溶液を、等容量のＥＤＣ（ＤＭＦ中９００ｍＭ）およびＮＨＳ（ＤＭＦ中９００ｍＭ）と２５℃で１時間混合した。粗製ＮＨＳエステル（５０μＬ）を、５’アミノ修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチド（５０μＬ、典型的には３００μＭ）を１００ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．２，３５０μＬ）中に含む溶液に添加した。カップリング反応を２５℃で１時間行った。反応混合物を、ＮＡＰ−５サイズ排除カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に直接ローディングし、分析スケール逆相ＨＰＬＣ（８〜３０％  ＭｅＣＮ／０．１Ｍ  ＴＥＡＡ勾配）によって精製した。ジスルフィド連結オリゴヌクレオチド生成物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって特徴付けした。２−チオプロピオン酸連結オリゴヌクレオチドを、上記のジスルフィド連結オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｌｅｏｔｉｄｅ）（典型的には、１０μＭ）を２０ｍＭ  ＤＴＴ含有１００ｍＭ  ＣＡＰＳバッファー（ｐＨ８）中で、２５℃にて０．５時間処理することにより調製した。反応混合物をゲル濾過カラムに通すことにより過剰のＤＴＴを除去した。パラレルで、２−アジドメチルベンゾイルＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（ΝＨＳ）エステルを、記載のようにして調製した（上記の２−アジドメチルベンゾイルチオプロピオン酸チオエステルの調製を参照）。粗製ΝＨＳエステル（１００μＬ）を、５’チオール連結オリゴヌクレオチド（１００μＬ）を１００ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．２、３００μＬ）中に含む溶液に添加した。カップリング反応を２５℃で１時間行った。反応混合物を、ΝＡＰ−５サイズ排除カラムに直接ローディングし、分析スケール逆相ＨＰＬＣ（８〜３０％  ＭｅＣＮ／０．１Ｍ  ＴＥＡＡ勾配）によって精製した。所望のオリゴヌクレオチド生成物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって特徴付けした。
【０１００】
（ｂ）転移単位
３’トリフェニルホスフィン連結ＤＮＡ。トリフェニルホスフィン基の結合は、ＣＰＧ樹脂に連結させた３’アミノ修飾オリゴヌクレオチド上に行った。鋳型に充分相補的な１０量体試薬は、５’ＡＡＴ  ＴＣＧ  ＴＡＣ  Ｃ−ＯＰＯ３Ｈ−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＣ６Ｈ４ＰＰｈ２（配列番号２）の構造を有した。鋳型と比べて３塩基ミスマッチを含む１０量体試薬は、以下の構造−５’ＡＡＴ  ＡＣＡ  ＴＣＣ  Ｃ−ＯＰＯ３Ｈ−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＣ６Ｈ４ＰＰｈ２（配列番号３）を有した。後者を、これらの実験の対照として使用した。
【０１０１】
３’ＦＭＯＣ−ＮＨ−オリゴヌクレオチド上のＦｍｏｃ基を、（ｉ）２０％ピペリジン含有ＤＭＦでの１０分間の処理；（ｉｉ）ＤＭＦでの洗浄；および（ｉｉｉ）ＭｅＣＮでの洗浄というサイクルを３回行うことによって除去した。樹脂を、窒素ガス流下で乾燥した。４−ジフェニルホスフィノ安息香酸（３０．６ｍｇ，１００μｍｏｌ）、ＥＤＣ（１９．１ｍｇ，１００μｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３６．８μＬ，２１１μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．６ｍＬ）中に含む溶液を該樹脂に添加し、混合物を３７℃で２時間インキュベートした。樹脂をＤＭＦ（２×）およびＭｅＣＮ（２×）で洗浄し、次いで、窒素下で乾燥した。誘導体化オリゴヌクレオチドをＣＰＧ樹脂から、塩酸トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ−ＨＣｌ，１  ｍｇ）を含む１：１水酸化アンモニウム：メチルアミン（ＡＭＡ）中での５５℃で４５分間のインキュベーションによって切断した。切断溶液を濾過し、分析スケール逆相ＨＰＬＣ（８〜３０％  ＭｅＣΝ／０．１Ｍ  ＴＥＡＡ勾配）によって精製した。所望のオリゴヌクレオチド生成物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって特徴付けした。
【０１０２】
（ｃ）捕捉試薬
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うため、反応生成物を、鋳型にアニーリングする２０量体二次試薬（捕捉試薬）を用いて捕捉した。
【０１０３】
アミノ修飾されたＤΝＡ（この試薬は、鋳型８〜１０の生成物を捕捉するために用いた）。２０量体二次試薬は、５’ＴＣＣ  ＣＧＡ  ＧＴＧ  ＣＡＡ  ＴＴＣ  ＧＴＡ  ＣＣ−ＯＰＯ３Ｈ−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）（ＣＨ２）４ΝＨ２（配列番号４）の配列を含むものであった。このオリゴヌクレオチドを、以下の捕捉試薬の出発材料として使用した。
【０１０４】
３’ブロモ酢酸エステル連結ＤＮＡ（この試薬は、鋳型１１および鋳型１２の生成物を捕捉するために用いた）。ブロモ酢酸のＮＨＳエステルを、等容量の９００ｍＭブロモ酢酸（ＤＭＦ中）、９００ｍＭ  ＥＤＣ（ＤＭＦ中）および９００ｍＭ  ＮＨＳ（ＤＭＦ中）を２５℃で１時間混合することにより調製した。粗製ＮＨＳエステル（１００μＬ）を、５’アミノ修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチド（５０μＬ，典型的には３００μＭ）を１００ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．２，３５０μＬ）中に含む溶液に添加した。カップリング反応を２５℃で１時間進行させた。反応混合物を、ＮＡＰ−５サイズ排除カラムに直接ローディングし、有機溶媒、塩および過剰の低分子を除去し、分析スケール逆相ＨＰＬＣ（８〜３０％  ＭｅＣＮ／０．１Ｍ  ＴＥＡＡ勾配）によってさらに精製した。所望のオリゴヌクレオチド生成物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって特徴付けした。
【０１０５】
３’４−ホルミル安息香酸エステル連結ＤＮＡ（この試薬は、鋳型７生成物を捕捉するために用いた）。４−ホルミル安息香酸エステル連結２０量体ＤＮＡは、ブロモ酢酸エステル連結ＤＮＡのプロトコルに従い、ブロモ酢酸の代わりに４−ホルミル安息香酸を用いて調製した。
【０１０６】
３’コハク酸モノエステル連結ＤＮＡ（この試薬は、鋳型１〜６の生成物を捕捉するために用いた）。無水コハク酸（２２ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）をＮＨＳ（１０ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）（ＤＭＦ中）（２００μＬ）により２５℃で１５分間活性化させた。１００μＬの混合物を、３’アミノ修飾鋳型（５０μＬ，典型的には３００μＭ）を含む１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．５；８５０μＬ）に添加し、３７℃で１６時間インキュベートした。反応混合物をＮＡＰ−５サイズ排除カラムによって脱塩し、分析スケールＨＰＬＣ（８〜３０％  ＭｅＣＮ／０．１Ｍ  ＴＥＡＡ勾配）によってさらに精製した。所望のオリゴヌクレオチド生成物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって特徴付けした。
【０１０７】
（ＩＩ．結果および結論）
（ｉ）アジドからアミンへのＤＮＡ鋳型変換
３０量体ＤＮＡオリゴヌクレオチド鋳型の５’末端に連結させた多様な有機アジドを、相補的なＤＮＡ１０量体の３’末端にコンジュゲートさせたトリフェニルホスフィンと反応させた（図５Ａ参照）。アジドからアミン官能基へのＤＮＡ鋳型変換を、３０量体５’アジド連結鋳型（１２ｐｍｏｌ）および１０量体３’トリフェニルホスフィン連結試薬（２４ｐｍｏｌ）を、全容量２００μＬの１００ｍＭ  ＣＡＰＳバッファー（ｐＨ１０）（５００ｍＭのＮａＣｌを含有する）中で２５℃にて１６時間混合することにより行った。基質４および５では、１Ｍ  ＮａＣｌ、およびホスフィン酸化を抑制するための０．５ｍＭ  ＤＴＴの添加により、収率が増加することがわかった。代表的な反応条件は、１〜７では、６０ｎＭアジド、１２０ｎＭホスフィン、０．１Ｍ  ＣＡＰＳ  ｐＨ１０、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含むもの；８〜１１では、０．１Ｍ  ＭＥＳ  ｐＨ６．０、１Ｍ  ＮａＣｌ以外は上記のとおり；および１２では、０．１Ｍ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．５、１Ｍ  ＮａＣｌ以外は上記のとおりとした。
【０１０８】
ＤＮＡ鋳型カップリング反応とは異なり、アジドからアミンへの変換は、出発材料および生成物が同様の分子量を有したため、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって直接モニターすることができなかった。これらの反応の進行をアッセイするため、推定アミン生成物を、カルボジイミドの存在下で２０量体連結カルボン酸により、またはＮａＢＨ３ＣＮの存在下で２０量体連結アルデヒドにより捕捉した。これらの二次試薬または捕捉試薬は、１０量体連結ホスフィンオキシドと置き換えられ、第１級アミンと効率的にカップリングしたが、アジドとはカップリングしなかった。得られたアミドまたは第２級アミン生成物は、２０量体の分子量を獲得し、ＰＡＧＥによって出発物質アジドと容易に識別することができた。
【０１０９】
基質１〜６から誘導したアミン生成物を捕捉するため、２０量体３’カルボン酸連結試薬（２４ｐｍｏｌ）を反応混合物に、ＥＤＣ（３０ｍＭ）およびスルホＮＨＳ（１５ｍＭ）を含むＭＥＳバッファー（ｐＨ６．５）とともに添加した。基質７から誘導したアミン生成物を捕捉するため、生成物を、ＮａＢＨ３ＣＮ（３ｍＭ）含有ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．５）の存在下、２０量体３’アルデヒド連結試薬により捕捉した。生成物の捕捉後、ＤＮＡ連結種をＮａＯＡｃ（ｐＨ５）、エタノールおよびグリコーゲンにより沈殿させた。
【０１１０】
得られたペレットを変性ゲルローディングバッファーに溶解し、変性ＰＡＧＥ解析に供した。特に記載のない限り、変性ＰＡＧＥ解析は、１５％ポリアクリルアミドゲル（ＴＢＥ−尿素）を用いて行った。
【０１１１】
反応収率を、生成物および鋳型バンドのゲルの臭化エチジウム染色、ＵＶ可視化およびＣＣＤに基づくデンシトメトリーによって定量した。収率の計算により、変性ゲル中の鋳型および生成物は、塩基ごとに等しい強度で染色されることが推測された。生成物が定量中に部分二本鎖となる場合、染色強度の変化によって、より高い見かけ上の収率がもたらされ得る。
【０１１２】
変性ＰＡＧＥ解析によって得られた典型的な結果を図６に示す。図６Ａに、図５Ｂのアジド３でのアジドからアミンへのＤＮＡ鋳型変換の変性ＰＡＧＥ解析を示す。図６Ｂに、図５Ｂのアジド７でのアジドからアミンへのＤＮＡ鋳型変換変性ＰＡＧＥ解析を示す。
【０１１３】
試験した７種類のアジド（図５Ｂの基質１〜７）では、ＤＮＡ鋳型アジド還元はｐＨ１０で効率的に進行した。反応生成物の実際の収率を図５Ｂにまとめる。各場合において、ホスフィンを非相補的ミスマッチオリゴヌクレオチドに連結させた対照反応では、有意なアミドも第２級アミン生成物も生成されず、これらのアジドからアミンへのＤＮＡ鋳型変換が配列特異的に進行したことを示す。
【０１１４】
（ｉｉ）アジドからカルボン酸またはチオールへのＤＮＡ鋳型変換
反応の範囲をさらに拡張し、アジドからカルボン酸へ、およびアジドからチオール官能基への変換を行った（図５Ａを参照）。両方の場合において、アジド還元によって自発的フラグメンテーションが誘導され、カルボン酸基またはチオール基が脱マスキングされた。これらの反応の効率を評価するため、ＤＮＡ連結アミンを用い、カルボジイミドの存在下でカルボン酸（基質８〜１０から生じた生成物）を捕捉し、一方、ＤＮＡ連結臭化アルキルを用いてチオール生成物（基質１１および基質１２から生じた生成物）を捕捉した。
【０１１５】
アジドからカルボン酸へのＤＮＡ鋳型変換を、バッファーが０．１Ｍ  ＭＥＳ  ｐＨ６．０および１Ｍ  ＮａＣｌを含有するものとした以外は、アジドからアミンへの変換と同様にして行った。カルボン酸生成物を捕捉するため、２０量体３’アミン連結試薬を反応混合物に、ＥＤＣ（３０ｍＭ）およびスルホＮＨＳ（１５ｍＭ）を含むＭＥＳバッファー（ｐＨ６．５）とともに添加した。変性ＰＡＧＥの典型的な結果を図６Ｃに示す（図５Ｂの試薬８を用いた場合を示す）。
【０１１６】
アジドからチオールへのＤＮＡ鋳型変換を、バッファーが０．１Ｍ  ＭＥＳ  ｐＨ６．０（基質１１の場合）またはＭＯＰＳ  ｐＨ７．５（基質１２の場合）のいずれか、および１Ｍ  ＮａＣｌを含むものとしたこと以外は上記のようにして行った。チオール生成物を捕捉するため、２０量体３’臭化アルキル連結試薬を反応混合物に添加し、３７℃で６時間インキュベートした。変性ＰＡＧＥの典型的な結果を、図６Ｄに示す（図５Ｂの試薬１１を用いた場合を示す）。
【０１１７】
カルボン酸からアミンへ、およびチオールからアミンへの変換では、変性ＰＡＧＥ解析によって、ＤＮＡ鋳型官能基変換によるカルボン酸基およびチオール基の脱マスキング（図５Ｂの基質８〜１２）もまた、効率的および配列特異的に進行することが示された。
【０１１８】
（実施例２．第１級アミン、カルボン酸およびチオールへのアジドのＤＮＡ鋳型変換（質量分析による特徴付け））
この実施例は、反応生成物を、ＰＡＧＥではなく質量分析法によって特徴付けしたこと以外は実施例１と同様である。これを容易にするため、より小さい鋳型および異なる捕捉系を、同じまたは同様の条件下で使用した。
【０１１９】
（Ｉ．材料および方法）
（ｉ）アジド酸の合成
図５Ｂに示す化合物１〜１２の合成のためのアジド基質を、実施例１に記載のようにして調製した。
【０１２０】
（ｉｉ）官能性付与したオリゴヌクレオチドの調製
この実施例で用いたオリゴヌクレオチドは、以下の変更を行って、実施例１と同様にして調製した。
【０１２１】
（ａ）鋳型オリゴヌクレオチド
鋳型オリゴヌクレオチドを、３０量体鋳型を用いるのではなく、以下の１０量体鋳型：５’−ＮＨ２（Ｃ２Ｈ４Ｏ）２−ＰＯ３Ｈ−ＧＧＴ  ＡＣＧ  ＡＡＴ  Ｔ−ＯＰＯ３Ｈ−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）ＣＨ２（ＯＣ２Ｈ４）４ＣＨ２ＮＨＣＯ−ビオチン（配列番号５）を用いたこと以外、実施例１に記載のようにして調製した。
【０１２２】
（ｂ）転移単位
トリフェニルホスフィン連結試薬を実施例１に記載のようにして調製した。
【０１２３】
（ｉｉｉ）質量分析による解析
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  Ｐｒｏ  Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎにおいて行い、Ｖｏｙａｇｅｒ  Ｄａｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒソフトウエアにより処理した。９部のヒドロキシピコリン酸（ＨＰＡ，５０％  ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ中５０ｍｇ／ｍＬ）と１部のクエン酸アンモニウム（Ｈ２Ｏ中５０ｍｇ／ｍＬ）の混合物を、すべての実験でマトリックスとして使用した。
【０１２４】
（ＩＩ．結果および結論）
相補ＤＮＡ連結ホスフィン試薬（２４ｐｍｏｌ）を、１０量体５’−アジド連結３’−ビオチン化鋳型（１２ｐｍｏｌ）を、１００ｍＭ  ＣＡＰＳバッファー（ｐＨ１０）（５００ｍＭ  ＮａＣｌ含有）中に含む溶液に添加した。混合物を、２５℃で０．５時間、次いで３７℃で１２時間攪拌した。ビオチン化生成物および未反応鋳型を、反応混合物をストレプトアビジン連結磁性粒子（Ｒｏｃｈｅ）で処理することにより精製し、製造業者のプロトコルに従って溶出した。溶出物中のＤＮＡを、エタノールおよびグリコーゲンにより沈殿させた。基質１１および基質１２を、直接、次の質量分析による解析に供した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析のための試料は、マトリックス溶液に溶解したペレットをＺｉｐＴｉｐ  Ｃｌ  ８カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて脱塩することにより調製した。
【０１２５】
得られたイミノホスホランをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって同定し、おそらく安定なＨＣｌ塩の形成のため、予期に反して、加水分解（特に、酸性条件条件下での）に安定であることがわかった（Ｓｈａｌｅｖ，ら（１９９６）Ｊ．ＯＲＧ．ＣＨＥＭ．６１：１６８９−１７０１）。しかしながら、ｐＨ１０のバッファー中、２５℃で０．５時間、続いて３７℃で１２時間のＤＮＡ連結ホスフィンによる鋳型連結アジドの処理により、定量的なイミノホスホラン加水分解がもたらされ、対応する第１級アミンが生成した。
【０１２６】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析の結果を表１にまとめる。表中、試薬１〜１２は、図５Ｂで表したとおりである。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ実験条件下での不安定性のため、チオール連結生成物（１１と１２）を、ＤＮＡ鋳型スタウディンガー反応に従ってヨードアセトアミド（５ｍＭ）で処理することにより、アルキルチオエーテル付加物として捕捉した（表１の１１および１２に関するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦデータは、捕捉されたチオエーテル付加物のものである）。
【０１２７】
【表１】
2008528000.tif 000012
アジド還元反応の質量分析による解析は、各場合において、予測された第１級アミン生成物の形成と一致した。代表的なスペクトルを図７に示す。
【０１２８】
表１に示す質量分析による解析に基づくと、アジドからアミンへ、アジドからカルボン酸へ、およびアジドからチオールへの配列特異的な変換はすべて、適切な生成物を生成した。
【０１２９】
（実施例３．低分子試薬を用いたアミン連結鋳型の変換）
ＤＮＡ鋳型官能基変換により非ＤＮＡ連結試薬が配列プログラム化合成に関与できる可能性をさらに探究するため、各々が、鋳型の操作および精製を助長するために、５’末端に異なるアジド、４種類の特有の６塩基コドンのうちの１つ、および３’末端にビオチン基を含有する４種類のＤＮＡ鋳型（鋳型１３〜１６、図８）を調製した。次いで、アジド連結鋳型を、ＴＣＥＰ−ＨＣｌに曝露することによってアミン連結鋳型へと化学的に変換した。次いで、得られたアミンを遊離試薬と反応させ、アミン中間体から最終生成物への変換が起こり得るか否かを調べた。特に、塩化ダンシル（２１）、エチルクロロホルメート（２２）、４−メトキシフェニルイソシアネート（２３）および６−モルホリノピリジニル３−イソチオシアネート（２４）はその構造または水との反応性が理由でＤＮＡに容易には結合できないため、これらすべてをアミン反応性薬剤として選択した。出発試薬および理論上の最終生成物を示す簡略化した反応スキームを図９に示す。
【０１３０】
（Ｉ．材料および方法）
鋳型のコード配列を、（ｉ）少なくとも６つの非相補的塩基対が任意の２つの異なるコドン間に存在することを確実にするため、（ｉｉ）試薬間の融解温度の差を最小限にするためにコドン１つあたり一定％のＧＣを維持するため、および（ｉｉｉ）１６通りの理論上の低分子カップリング生成物の分子量が異なり、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって識別可能となるように質量を変化させるために、コンピューテーショナルスクリーニングによって設計した。
【０１３１】
図８に示すスキームで用いた鋳型の各々（鋳型１３〜１６）は、５’ＮＨ２（Ｃ２Ｈ４Ｏ）２−ＰＯ３Ｈ−ＴＴ−（コドン）−ＧＴＡｎ−ＯＰＯ３Ｈ−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）ＣＨ２（ＯＣ２Ｈ４）４ＣＨ２ＮＨＣＯ−ビオチンを含むものであった。各鋳型に用いたコドンは以下のとおりであった：鋳型１３のコドンは、ＧＴＧ  ＣＡＡ  ＣＧＴ  ＣＡＴ、ｎ＝０（配列番号６）であった；鋳型１４のコドンは、ＣＣＴ  ＡＧＴ  ＣＧＴ  ＣＡＴ、ｎ＝３（配列番号７）であった；鋳型１５のコドンはＴＡＡ  ＧＣＣ  ＣＧＴ  ＣＡＴ、ｎ＝２（配列番号８）であった；鋳型１６のコドンは、ＡＧＣ  ＴＴＧ  ＣＧＴ  ＣＡＴ、ｎ＝１（配列番号９）であった。
【０１３２】
アジド含有鋳型１３〜１６を、実施例１に記載のようにして調製した（それぞれ、鋳型１、３、４および２を参照）。
【０１３３】
鋳型１３〜１６のアジド基をＴＣＥＰ−ＨＣｌに曝露することによってアミン基へと化学的に変換した。簡単には、次いでアミン連結鋳型を、アジド連結鋳型（鋳型１３〜１６）を５ｍＭ  ＴＣＥＰ−ＨＣｌ含有１００ｍＭ  ＭＯＰＳバッファー（ｐＨ７．５）で２５℃にて３時間処理することにより調製した。得られた鋳型をＨＰＬＣによって精製した。その後、得られた鋳型（アミン中間体）を可溶性試薬と反応させ、官能基変換が起こり得るか否かを調べた。
【０１３４】
（ＩＩ．結果および結論）
一旦アミン連結鋳型１３〜１６が創製されたら、次いで、これらを可溶性試薬に曝露し、官能基変換が起こり得るか否かを調べた。各変換について、以下に詳細に論考する。
【０１３５】
アミン連結鋳型１３（４００ｐｍｏｌ）を含む１００μＬの１００ｍＭ  水性ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．０）を、２０ｍＭ塩化ダンシル２１を含む１００μＬのＤＭＦと混合し、３７℃で１時間攪拌した。反応混合物を２００μＬの０．１Ｍ  ＴＥＡＡ中で希釈し、ＮＡＰ−５サイズ排除カラムに通した。溶出物（１ｍＬ  ０．１Ｍ  ＴＥＡＡ中）を、分析スケール逆相ＨＰＬＣ（８〜３０％  ＭｅＣＮ／０．１Ｍ  ＴＥＡＡ勾配）によって解析した。生成物の収率を、出発材料、生成物および任意の副生成物の積分ピーク面積（２６０ｎｍにおけるＵＶ吸光度に基づく）に基づいて計算した。代表的なクロマトグラムを図１０Ａに示す。
【０１３６】
アミン連結鋳型１４（４００ｐｍｏｌ）を含む１００μＬの２００ｍＭ水性ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．０）を、４０ｍＭエチルクロロホルメート２２を含む１００μＬのＤＭＦと混合し、３７℃で１時間攪拌した。反応物を、グリコーゲン含有ＮａＯＡｃバッファー（ｐＨ５．０）の添加、続いてエタノール沈殿によってクエンチした。ペレットを０．１Ｍ  ＴＥＡＡに溶解し、分析スケール逆相ＨＰＬＣ（８〜３０％  ＭｅＣＮ／０．１Ｍ  ＴＥＡＡ勾配）によって解析した。代表的なクロマトグラムを図１０Ｂに示す。
【０１３７】
アミン連結鋳型１５（４００ｐｍｏｌ）を含む１００μＬの５００ｍＭ水性トリエチルアミン（ｐＨ１０）を、２０ｍＭの４−メトキシフェニルイソシアネート２３を含む１００μＬのＤＭＦと混合し、３７℃で１時間攪拌した。反応混合物をクエンチし、上記のようにして解析した。代表的なクロマトグラムを図１０Ｃに示す。
【０１３８】
アミン連結鋳型１６（４００ｐｍｏｌ）を含む１００μＬの５００ｍＭ水性トリエチルアミン（ｐＨ１０）を、２０ｍＭと混合し、２０ｍＭの６−モルホリノイソチオシアネート２４を含む１００μＬのＤＭＦと反応させ、３７℃で１時間攪拌した。反応混合物をクエンチし、上記のようにして解析した。代表的なクロマトグラムを図１０Ｄに示す。
【０１３９】
可溶性試薬（遊離反応体）２１、２２、２３または２４を、過剰量（１０または２０ｍＭの終濃度）（ＤＭＦ中）で鋳型連結第１級アミンに、塩基性条件（ｐＨ９〜１０）下で添加すると、対応するスルホンアミド、カルバメート、尿素またはチオ尿素が効率的に生成された（２１では７０％の収率、２２、２３および２４では＞８６％）。これらの結果は、アミドに連結させた鋳型を、遊離反応体を用いてスルホンアミド、カルバメート（ｃａｒｂｏｍａｔｅ）、尿素またはチオ尿素に変換することが可能であることを示した。
【０１４０】
（実施例４．低分子試薬を用いた４種類のアジド連結鋳型の配列特異的変換）
この実施例は、反応体結合鋳型の配列特異的変換を行って反応中間体を生成させ、次いで、これを遊離反応体と反応させて反応生成物を生成させ得ることが可能であることを示す。特に、アジド連結鋳型の単一溶液混合物は、アミン中間体に配列特異的に変換された。次いで、アミン中間体は、ＤＮＡに連結されていない塩化スルホニル、クロロホルメート、イソシアネートおよびイソチオシアネート反応体を用い、スルホンアミド、カルバメート、尿素およびチオ尿素生成物に配列特異的に修飾された。
【０１４１】
（Ｉ．材料および方法）
（ｉ）官能性付与したオリゴヌクレオチドの調製
（ａ）鋳型オリゴヌクレオチド
鋳型１３〜１６を、実施例３に記載のようにして調製した。
【０１４２】
（ｂ）転移単位
以下のトリフェニルホスフィン連結オリゴヌクレオチドの各々を、実施例１に記載のようにして調製した。
【０１４３】
オリゴヌクレオチド１７（図９）は、５’ＣＧＴ  ＴＧＣ  ＡＣＡ  Ａ−ＯＰＯ３Ｈ−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＣ６Ｈ４ＰＰｈ２（配列番号１０）の構造を有した。オリゴヌクレオチド１８（図９）は、５’ＣＧＡ  ＣＴＡ  ＧＧＡ  Ａ−ＯＰＯ３Ｈ−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＣ６Ｈ４ＰＰｈ２（配列番号１１）の構造を有した。オリゴヌクレオチド１９（図９）は、５’ＣＧＧ  ＧＣＴ  ＴＡＡ  Ａ−ＯＰＯ３Ｈ−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＣ６Ｈ４ＰＰｈ２（配列番号１２）の構造を有した。オリゴヌクレオチド２０（図９）は、５’ＣＧＣ  ＡＡＧ  ＣＴＡ  Ａ−ＯＰＯ３Ｈ−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＣ６Ｈ４ＰＰｈ２（配列番号１３）の構造を有した。
【０１４４】
（ＩＩ．結果および結論）
鋳型１３〜１６の混合物を、配列特異的反応体１７と、次いで遊離反応体２１と合わせた。得られた溶液を、同様に、配列特異的反応体１８、続いて遊離反応体２２と合わせ；配列特異的反応体１９、続いて遊離反応体２３と合わせ；そして配列特異的反応体２０、続いて遊離反応体２４と合わせた。
【０１４５】
より詳しくは、３’トリフェニルホスフィン連結オリゴヌクレオチド１７（８当量）を、該４種類の５’アジド連結鋳型（鋳型１３〜１６，各鋳型について１００ｎＭ）を１００ｍＭ  ＣＡＰＳバッファー（ｐＨ１０）および５００ｍＭのＮａＣｌ中に含む単一溶液混合物に添加し、アジドからアミンへの変換を行った。混合物を、２５℃で０．５時間、次いで３７℃で１２時間インキュベートした。オリゴヌクレオチドを、グリコーゲンを含むＮａＯＡｃバッファー（ｐＨ５．０）およびエタノールの添加によって沈殿させた。ペレットを１００μＬの１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３に溶解し、塩化ダンシル２１（１００μＬのＤＭＦ（２０ｍＭ）中）と３７℃で１時間反応させた。反応混合物をエタノール沈殿によって脱塩した。アジドからアミンへのＤＮＡ鋳型変換が配列特異的に進行した場合、鋳型１３から生じたアミンのみが、配列特異的反応体２１と反応してスルホンアミド２５が生成するはずであり、一方で鋳型１４〜１６は変化なしのままとなるはずである（図８参照）。過剰の塩化スルホニルは、エタノール沈殿時に除去され、あらゆる未反応アミンは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステル連結樹脂を用いて除去した。
【０１４６】
次いで、上記のアジドからアミンへのＤＮＡ鋳型変換を、ホスフィン連結オリゴヌクレオチド１８を用いて繰り返した。ペレットを１００μＬの２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３に溶解し、エチルクロロホルメート２２（１００μＬのＤＭＦ（４０ｍＭ）中）と３７℃で１時間反応させた。反応混合物をエタノール沈殿によって脱塩し、乾燥させた。
【０１４７】
次いで、上記のアジドからアミンへのＤＮＡ鋳型変換を、ホスフィン連結オリゴヌクレオチド１９を用いて繰り返した。ペレットを１００μＬの５００ｍＭ  水性トリエチルアミン溶液に溶解し、４−メトキシフェニルイソシアネート２３（１００μＬのＤＭＦ（２０ｍＭ）中）と３７℃で１時間反応させた。反応混合物をエタノール沈殿によって脱塩し、乾燥させた。
【０１４８】
次いで、上記のアジドからアミンへのＤＮＡ鋳型変換を、ホスフィン連結オリゴヌクレオチド２０を用いて繰り返した。ペレットを１００μＬの５００ｍＭ  水性トリエチルアミン溶液に溶解し、６−モルホリノ−３−ピリジニルイソチオシアネート２４（１００μＬのＤＭＦ（２０ｍＭ）中）と３７℃で１時間反応させた。反応混合物をエタノール沈殿によって脱塩し、乾燥させた。ペレットを１００ｍＭ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ６）に溶解し、まずＴＣＥＰ−ＨＣｌ（５ｍＭ）により２５℃で２時間、次いでＮＨＳ活性化樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；１００ｐｍｏｌの鋳型に対して５μＬの樹脂溶液）によりさらに２時間処理した。樹脂を濾過によって除去し、０．１Ｍ  ＴＥＡＡで３回洗浄した。
【０１４９】
生成物の最終混合物は、鋳型連結ビオチン基を、磁性粒子に連結させたストレプトアビジンで捕捉することにより精製した。捕捉されたオリゴヌクレオチドを該粒子から、製造業者のプロトコルに従って溶出した。溶出液中のＤＮＡをＮａＯＡｃ（ｐＨ５．０）、グリコーゲンおよびエタノールにより沈殿させた。２６０ｎｍでの出発材料プールおよび最終生成物プールのＵＶ吸光度をモニターすることにより、分光分析によってＤＮＡの回収率を測定した。等量の生成物２５〜２８（図８参照）を含有し、２６０ｎｍで１．０のＵＶ吸光度を有する混合物の濃度は、５．５μＭであると推定された。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析のための試料を、実施例２に記載のようにして調製した。図１１Ａおよび図１１Ｂに、それぞれ、出発材料（鋳型１３、１４、１５および１６）ならびに生成物（生成物２５、２６、２７、２８）の代表的なスペクトルを示す。
【０１５０】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により、最終生成物混合物が、主に、この４種類の配列プログラム化生成物（スルホンアミド２５、カルバメート２６、尿素２７およびチオ尿素２８）を含有することが明らかになった。１２通りの考えられ得る望ましくない交差生成物はいずれも観察されなかった。
【０１５１】
ＵＶスペクトロメトリー解析により、最終生成物混合物が、４回の連続的なＤＮＡ鋳型還元および低分子カップリングシーケンスについて５１％の合計収率で生成されたことが示された。これらの結果により、ＤＮＡ鋳型官能基変換は、非ＤＮＡ連結低分子を配列プログラム化反応に関与させるのを可能にすることが確立される。また、このプロセスの効率により、この微量（ｎｍｏｌ以下）規模で有機合成を行う場合に可能となる分子生物学精製および洗浄ストラテジーの価値が強調される。
【０１５２】
総合すると、この実施例に記載したＤＮＡ鋳型官能基変換では、試薬をオリゴヌクレオチドに係留させる必要性に取り組むことにより、核酸鋳型合成の合成能力が拡張される。オリゴヌクレオチドに対する試薬の連結が可能でないか、または不都合である場合、それにもかかわらず、このような変換により、かかる試薬が、オリゴヌクレオチド配列と生成物の構造との対応性を保持したまま低分子合成に寄与することが可能になる。
【０１５３】
（引用による援用）
本明細書で言及した特許文献および学術論文の各々の全開示は、あらゆる目的のために、本明細書中に参考として援用される。
【０１５４】
（均等物）
本発明は、その精神および本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化され得る。したがって、前述の実施形態は、あらゆる点において、本明細書に記載の本発明の限定ではなく例示であると考えられるべきである。したがって、本発明の範囲は、前述の記載ではなく、添付の特許請求の範囲によって示されるものであり、特許請求の範囲の均等の意味および範囲に含まれるあらゆる変更は、これに包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】図１は、第１の反応性単位（ＦＲＵ）および第２の反応性単位（ＳＲＵ）を反応させて反応中間体（ＲＩ）を形成させる本発明の一態様の概略図である。反応中間体（ＲＩ）を同定用配列（ＩＳ）に結合させる。ＲＩ−ＩＳ複合体を、ＲＩと選択的反応性である遊離反応体（ＦＲ）と合わせ、ＩＳに連結された反応生成物（ＲＰ）を得る。
【図２】図２は、反応中間体（ＲＩ）の形成前に、第１の反応性単位（ＦＲＵ）および第２の反応性単位（ＳＲＵ）を、それぞれコドン配列（ＣＳ）および相補的なアンチコドン配列（ＡＣＳ）に連結させる本発明の別の態様の概略図である。ＣＳとＡＣＳが互いにアニーリングしてＦＲＵとＳＲＵが互いに反応するのを可能にし、ＲＩが生成される。ＣＳは、ＲＩに連結されたままである。ＣＳは、ＲＩを遊離反応体（ＦＲ）と反応させたとき、反応中間体（ＲＰ）に連結された状態で維持されている。
【図３】図３は、図１に示すスキームの実施形態の概略図であり、ここでは、第１の反応性単位の集団（ＦＲＵ１〜ＦＲＵ４）の混合物において、第１の反応性単位の少なくとも１種類（ＦＲＵ１）が第２の反応性単位（ＳＲＵ１）と反応して反応中間体（ＲＩ１）が形成され、これは、該第１の反応性単位の集団（ＦＲＵ２〜ＦＲＵ４）と共存している。反応中間体（ＲＩ１）を同定用配列（ＩＳ）に連結させる。次いで、ＩＳに連結され、該第１の反応性単位の集団（ＦＲＵ２〜ＦＲＵ４）と共存している反応中間体（ＲＩ１）を、ＲＩ１と選択的反応性である遊離反応体（ＦＲ）と反応させ、ＩＳに連結された反応生成物（ＲＰ１）を得る。
【図４】図４は、図２に示すスキームの実施形態の概略図であり、ここでは、反応中間体（ＲＩ１）の形成前に、第１の反応性単位（ＦＲＵ１〜ＦＲＵ４）および第２の反応性単位（ＳＲＵ）を、それぞれ、コドン配列（ＣＳ）および相補的なアンチコドン配列（ＡＣＳ）に連結させる。ＣＳは、ＲＩ１に連結されたままである。ＣＳは、ＲＩ１を遊離反応体（ＦＲ）と反応させてＲＰ１を生成させたとき、反応中間体（ＲＰ１）に連結された状態で維持されている。
【図５Ａ】図５Ａは、第１級アミン（上部スキーム）、カルボン酸（中央スキーム）およびチオール（下部スキーム）へのアジドのＤＮＡ鋳型変換を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、基質アジド１〜１２を用いる例示的なＤＮＡ鋳型反応を示し、図中、表示した収率は下限を表す。
【図６Ａ】図６Ａは、図５Ｂのアジド３のアジドからアミンへのＤＮＡ鋳型変換後の変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）ゲルを図示したものである。レーン１は、アジド連結３０量体鋳型を含む。レーン２は、アジド連結３０量体鋳型＋カルボン酸連結２０量体捕捉試薬＋３０ｍＭ  ＥＤＣ＋１５ｍＭスルホＮＨＳ（生成物形成を示さない）を含む。レーン３は、アジド連結３０量体鋳型＋ホスフィン連結１０量体試薬（１０量体は見えない）を含む。レーン４は、アジド連結３０量体鋳型＋ホスフィン連結１０量体試薬＋カルボン酸連結２０量体捕捉試薬＋３０ｍＭ  ＥＤＣ＋１５ｍＭスルホＮＨＳを含み、アジドからアミンへの変換後のＤＮＡ鋳型アミンアシル化によって生じた５０量体副生成物が見える。レーン５は、アジド連結３０量体鋳型＋ミスマッチ配列を含むホスフィン連結１０量体試薬＋カルボン酸連結２０量体捕捉試薬＋３０ｍＭ  ＥＤＣ＋１５ｍＭスルホＮＨＳを含む。レーン６は、アジド連結３０量体鋳型＋５ｍＭ  ＴＣＥＰ−ＨＣｌ＋カルボン酸連結２０量体捕捉試薬＋３０ｍＭ  ＥＤＣ＋１５ｍＭスルホＮＨＳ（アジドがＴＣＥＰによってインサイチュで還元される陽性対照）を含む。電気泳動の開始時の３０量体鋳型と２０量体捕捉試薬との間での二本鎖の不完全な変性により、バンドにじみ（ｂｌｕｒｒｉｎｇ）（レーン２および４〜６）がもたらされるようである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、図５Ｂのアジド７  のアジドからアミンへのＤＮＡ鋳型変換後の変性ＰＡＧＥゲルを図示したものである。レーン１は、アジド連結３０量体鋳型＋アルデヒド連結２０量体捕捉試薬＋３ｍＭ  ＮａＢＨ３ＣＮを含む。レーン２は、アジド連結３０量体鋳型＋ホスフィン連結１０量体試薬＋アルデヒド連結２０量体捕捉試薬＋３ｍＭ  ＮａＢＨ３ＣＮを含む。レーン３は、アジド連結３０量体鋳型＋ミスマッチ配列を含むホスフィン連結１０量体試薬＋アルデヒド連結２０量体捕捉試薬＋３ｍＭ  ＮａＢＨ３ＣＮを含む。わずかに５０量体捕捉生成物の形成がレーン１および３において観察され、これは、基質連結鋳型の調製中およびＤＮＡ鋳型反応中でのフェニルアジドのゆっくりとした自発的還元に起因する。レーン１および３において観察されたバックグラウンド反応性（＜１３％）は、レーン２の報告した収率を測定するため差し引いた。
【図６Ｃ】図６Ｃは、図５Ｂのアジド８  のアジドからカルボン酸へのＤＮＡ鋳型変換後の変性ＰＡＧＥゲルを図示したものである。レーン１は、アジド連結３０量体鋳型＋アミン連結２０量体捕捉試薬＋３０ｍＭ  ＥＤＣ＋１５ｍＭスルホＮＨＳを含む。レーン２は、アジド連結３０量体鋳型＋ホスフィン連結１０量体試薬＋アミン連結２０量体捕捉試薬＋３０ｍＭ  ＥＤＣ＋１５ｍＭスルホＮＨＳを含む。レーン３は、アジド連結３０量体鋳型＋ミスマッチ配列を含むホスフィン連結１０量体試薬＋アミン連結２０量体捕捉試薬＋３０ｍＭ  ＥＤＣ＋１５ｍＭスルホＮＨＳを含む。
【図６Ｄ】図６Ｄは、図５Ｂのアジド１１のアジドからチオールへのＤＮＡ鋳型変換後の変性ＰＡＧＥゲルを図示したものである（１０％ポリアクリルアミドゲルを使用）。レーン１は、アジド連結３０量体鋳型＋臭化アルキル連結２０量体捕捉試薬を含む。レーン２は、アジド連結３０量体鋳型＋ホスフィン連結１０量体試薬＋臭化アルキル連結２０量体捕捉試薬を含む。レーン３は、アジド連結３０量体鋳型＋ミスマッチ配列を含むホスフィン連結１０量体試薬＋臭化アルキル連結２０量体捕捉試薬を含む。
【図７】図７は、ＤＮＡ鋳型官能基変換による代表的なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルである（この場合、アミン生成物は、アジド１から生成）。
【図８】図８は、４種類の配列プログラムされたスルホンアミド、カルバメート、尿素およびチオ尿素生成物を生成させる、４種類のアジドを含有する単一溶液と４種類の非ＤＮＡ連結低分子求電子剤との反応を示す。鋳型１３は、コドン配列ａを有するオリゴヌクレオチドに結合されている。転移単位１７を含有するトリフェニルホスフィンは、アンチコドン配列ａ’を有するオリゴヌクレオチドに結合されている。鋳型合成中、コドン配列ａはアンチコドン配列ａ’にアニーリングする。同様に、鋳型１４、１５および１６は、それぞれコドン配列ｂ、ｃおよびｄを含み、それぞれアンチコドン配列ｂ’、ｃ’およびｄ’を介して転移単位１８、１９および２０にアニーリングする。
【図９】図９は、図８で使用した出発試薬および創製された反応生成物を示す概略図である。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜図１０Ｄは、アミン連結鋳型と低分子試薬との反応のＨＰＬＣ解析後のＨＰＬＣトレース（２６０ｎｍでモニター）の図である。ＳＭは、未反応の出発材料アミン連結鋳型のピークを示す。ＰＲＤは、誘導体化された生成物を示す。特に記載のない限り、ＳＭまたはＰＲＤの表示したもの以外のピークは、ＤＮＡ連結種に対応しない（２３０ｎｍにおけるＵＶ吸収およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析によって判断）。図１０Ａは、アミン連結鋳型１３と塩化ダンシル２１との反応の結果を示す（試薬１３および２１は図８に示す）。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜図１０Ｄは、アミン連結鋳型と低分子試薬との反応のＨＰＬＣ解析後のＨＰＬＣトレース（２６０ｎｍでモニター）の図である。ＳＭは、未反応の出発材料アミン連結鋳型のピークを示す。ＰＲＤは、誘導体化された生成物を示す。特に記載のない限り、ＳＭまたはＰＲＤの表示したもの以外のピークは、ＤＮＡ連結種に対応しない（２３０ｎｍにおけるＵＶ吸収およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析によって判断）。図１０Ｂは、アミン連結鋳型１４とエチルクロロホルメート２２との反応の結果を示す（試薬１４および２２は図８に示す）。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜図１０Ｄは、アミン連結鋳型と低分子試薬との反応のＨＰＬＣ解析後のＨＰＬＣトレース（２６０ｎｍでモニター）の図である。ＳＭは、未反応の出発材料アミン連結鋳型のピークを示す。ＰＲＤは、誘導体化された生成物を示す。特に記載のない限り、ＳＭまたはＰＲＤの表示したもの以外のピークは、ＤＮＡ連結種に対応しない（２３０ｎｍにおけるＵＶ吸収およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析によって判断）。図１０Ｃは、アミン連結鋳型１５と４−メトキシフェニルイソシアネート２３との反応の結果を示す（試薬１５および２３は図８に示す）。
【図１０Ｄ】図１０Ａ〜図１０Ｄは、アミン連結鋳型と低分子試薬との反応のＨＰＬＣ解析後のＨＰＬＣトレース（２６０ｎｍでモニター）の図である。ＳＭは、未反応の出発材料アミン連結鋳型のピークを示す。ＰＲＤは、誘導体化された生成物を示す。特に記載のない限り、ＳＭまたはＰＲＤの表示したもの以外のピークは、ＤＮＡ連結種に対応しない（２３０ｎｍにおけるＵＶ吸収およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析によって判断）。図１０Ｄは、アミン連結鋳型１６と６−モルホリノピリジニル３−メトキシルフェニルイソシアネート２４との反応の結果を示す（試薬１６および２４は図８に示す）。
【図１１Ａ】図１１Ａは、１つの溶液中の４種類のアジド出発材料（図８の試薬１３〜１６）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、アジド出発材料１３〜１６の４種類の配列特異的変換生成物（図８の生成物２５〜２８）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。
【図１】
2008528000.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2008528000.tif 000020
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2008528000.tif 000025
【図１０Ａ】
2008528000.tif 000026
【図１０Ｂ】
2008528000.tif 000027
【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【配列表】
2008528000000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年10月22日(2007.10.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008528000000001.app
【国際調査報告】
2008528000.tif 000035
2008528000.tif 000036
2008528000.tif 000037