(57)【要約】  核酸分子を環状化し、その最初の核酸分子の両端を特徴付けるフラグメントを、環状化した核酸分子から得る手段を提供する。これは発現プロファイリング、スプライシング、プロモーター同定、遺伝要素の同定などの研究を含むが、これに限定されない種々の研究において非常に有用である。さらに、薬剤開発、診断、法医学的研究等を含むがこれに限定されない種々の商業的応用やサービスの基本要素となる。
2008504805.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
直鎖状の核酸分子の両端の領域に対応する塩基配列を含むＤＮＡフラグメントを調製する方法であって、
ａ）核酸分子から直鎖状ＤＮＡ分子を作る工程と、
ｂ）認識部位の外側かつ直鎖状ＤＮＡ分子内の部位を切断する制限エンドヌクレアーゼによる認識部位とクローニング部位とをもつリンカーを直鎖状ＤＮＡ分子の両端に連結する工程と、
ｃ）直鎖状ＤＮＡ分子を、環状ＤＮＡ分子を作るようにクローニング部位で閉じて環状化する工程と、
ｄ）認識部位の外側の部位を切断する制限エンドヌクレアーゼにより環状ＤＮＡ分子を切断し、直鎖状の核酸分子の両端を含むＤＮＡフラグメントを切り出す工程と、
ｅ）ＤＮＡフラグメントを回収する工程と
を含む方法。
【請求項２】
直鎖状の核酸分子がＲＮＡである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
直鎖状の核酸分子がｍＲＮＡである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
直鎖状の核酸分子がＤＮＡである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
直鎖状の核酸分子がｃＤＮＡである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
直鎖状の核酸分子がゲノムＤＮＡである請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ＲＮＡ分子から直鎖状ＤＮＡ分子を作製する工程が、逆転写酵素とプライマーを用いてＲＮＡから相補ＤＮＡを作製する工程を含む請求項２に記載の方法。
【請求項８】
ポリアデニル酸を持つＲＮＡの逆転写反応のプライミングに用いられたオリゴｄＴのストレッチを除くために、プライマーがクラスＩＩＳ又はクラスＩＩＩの認識サイトを含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
直鎖状の核酸分子が、その３’末端にポリＡテールを持たない請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
直鎖状の核酸分子から直鎖状のＤＮＡ分子を作製する工程が、
ａ）一本鎖突出領域を含む二本鎖リンカーを調製する工程と、ここで、前記一本鎖突出領域は、ＲＮＡの３’末端塩基配列に相補的であり、
ｂ）二本鎖リンカー突出末端とＲＮＡの３’相補末端領域をハイブリダイズし、二本鎖リンカーにＲＮＡの３’末端を結合する工程と、
ｃ）逆転写酵素を用いてリンカーの遊離３’突出末端から逆転写反応を行なう工程と、
ｄ）逆転写反応の生成物から直鎖状ＤＮＡ分子を分離する工程と
を含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＲＮＡから作製された直鎖状のＤＮＡ分子が、ＲＮＡ中のＣａｐ構造により濃縮される請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
濃縮が、Ｃａｐトラッピング法、オリゴ−キャッピング法、あるいはＲＮＡのＣａｐ構造に特異的に結合する物質を用いて行なわれる請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項３に記載の方法であって、直鎖状ＤＮＡ分子から、ポリＡテールと相補的な配列を除去する工程を含む方法。
【請求項１４】
ｃＤＮＡが完全長ｃＤＮＡである請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
認識部位の外側の部位を切断する制限酵素が、クラスＩＩＳまたはクラスＩＩＧ制限酵素であるＧｓｕＩ、ＭｍｅＩ、ＢｐｍＩ、ＢｓｇＩまたはそれらいずれかの酵素を含んだ混合物からなる群から選ばれる請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
認識部位の外側の部位を切断する制限酵素が、クラスＩＩＩ制限酵素であるＥｃｏＰ１５ＩまたはＥｃｏＰ１５Ｉを含む混合物である請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
リンカーが選択的結合をする物質に結合され、その結合を用いて濃縮することができる請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
選択的結合をする物質が、ビオチン、ジゴキシゲニンからなる群から選ばれ、高親和性結合物質が、アビジン、ストレプトアビジン、アビジン若しくはストレプロアビジンの誘導体、抗ジゴキシゲニン抗体からなる群から選ばれる請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
少なくともひとつのリンカーが、ＤＮＡフラグメントをラベルするために用いられる塩基配列要素を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ラベルが、４から１２塩基の短い塩基配列からなる請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ラベルが制限エンドヌクレアーゼまたはリコンビナーゼの認識部位を含む請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法であって、直鎖状のＤＮＡ分子を連結あるいは結合して環状ＤＮＡ分子にする工程をさらに含む方法。
【請求項２３】
環状化工程が、ライゲーション反応あるいはリコンビナーゼによって行なわれる請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
直鎖状ＤＮＡフラグメントが、エクソヌクレアーゼにより環状ＤＮＡから除去される請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
エクソヌクレアーゼが、エクソヌクレアーゼＩＩＩ、エクソヌクレアーゼＩ、あるいはそれらの混合物である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
環状ＤＮＡ分子を増幅する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
環状ＤＮＡ分子の増幅が、ローリングサークル反応によって行なわれる請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
増幅工程がランダムプライミングとＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いて行なわれる請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
環状ＤＮＡ分子が、認識部位の外側の部位を切断する一またはそれ以上の制限酵素によって切断される請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
認識部位の外側の部位を切断する制限酵素が、クラスＩＩＳまたはクラスＩＩＧ制限酵素であるＧｓｕＩ、ＭｍｅＩ、ＢｐｍＩ、ＢｓｇＩまたはそれらいずれかの酵素を含んだ混合物からなる群から選ばれる請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
認識部位の外側の部位を切断する制限酵素が、クラスＩＩＩ制限酵素であるＥｃｏＰ１５ＩまたはＥｃｏＰ１５Ｉを含む混合物である請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
制限酵素によって切り出され、環状化に使用されるクローニング部位と直鎖状ＤＮＡ分子の両端の末端領域とを有するＤＮＡフラグメントを、前記末端領域を持たない他のＤＮＡ分子から分離する請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
コンカテマーの調製方法であって、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のＤＮＡフラグメントを互いにつなぎ合わせてコンカテマーを作製する方法。
【請求項３４】
コンカテマーをベクターに結合する工程をさらに含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ベクターがｐＧＳＣである請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ベクターｐＧＳＣ。
【請求項３７】
直鎖状核酸分子の末端塩基配列の情報を得るための方法であって、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法により、ＤＮＡフラグメントを調製する工程と、ＤＮＡフラグメントを互いに連結させてコンカテマーを作製する工程と、コンカテマーの塩基配列を決定して直鎖状核酸分子の末端塩基配列における情報を得る工程とを含む方法。
【請求項３８】
ＤＮＡフラグメントが混合サンプルから調製される請求項１〜３５及び３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
混合サンプルにおけるＤＮＡフラグメントの由来が、スペーサー中の短い特異的塩基配列であるラベルによって追跡可能である請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
逆転写反応を進める方法であって、
ａ）ＲＮＡの３’末端領域の配列に相補的な一本鎖の突出領域を持った二本鎖リンカーを調製する工程と、
b）一本鎖突出領域をＲＮＡの３’領域にハイブリダイズさせ、二本鎖リンカーをＲＮＡの３’末端に連結させる工程と、
ｃ）リンカーの３’ 突出末端から逆転写酵素により、ＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行なう工程と
を含む方法。
【請求項４１】
リンカーの突出領域がオリゴｄＴ配列を含む請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
オリゴｄＴの突出領域の３’領域がブロックされている請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＲＮＡを分画するために、リンカーが選択的結合物質に結合されている請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
濃縮のために、リンカーを高親和性選択的結合物質に結合する工程をさらに含む請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法であって、選択的結合物質がビオチンおよびジゴキシゲニンからなる群から選択され、高親和性選択的結合物質がアビジン、ストレプトアビジン、アビジンまたはストレプトアビジンの誘導体、及び抗ジゴキシゲニン抗体からなる群から選択される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分子の同定とそのフラグメントのクローニング方法に関する。前記フラグメントの情報は、ゲノム上の機能領域や転写領域に関係している可能性が高い。さらに本発明は、遺伝子の同定と発現プロファイリングを目的としたフラグメント解析に関する。すなわち、本発明により、生体システム、遺伝要素の特性の解明、そこで発現される遺伝子の解析を目的とした研究が可能となる。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムは、生物の発生や恒常性の維持に必要不可欠な情報を含んでいる。生物学的現象を理解するためには、ある時点の細胞や組織で遺伝情報がどのように利用されているかを知ることが必要である。ヒト、動物または植物において、遺伝情報や関係した制御パスウェイが誤った形で使われることが疾病の原因となる例が数多く知られている。従って、発現プロファイリングや同定された転写物の注釈付け、遺伝情報により制御される遺伝要素の解析のための技術が必要とされている。最近の発現解析の多くは、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションやマイクロアレイ、あるいはＳＡＧＥ、ＣＡＧＥ、ＭＭＰＳのような短いタグを大規模な塩基配列決定により解析する手法が用いられている。しかし、遺伝子発現を調製する原理を理解するためには、遺伝子発現を制御する遺伝的要素の情報を得ることが必要とされていた。
【０００３】
大規模な発現プロファイリングには通常ＤＮＡマイクロアレイ(Ｊｏｒｄａｎ  Ｂ．，ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ: Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ-Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２００１： Ｓｃｈｅｎａ Ａ， ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ １９９９) と呼ばれる技術が用いられている。この実験では、個々の遺伝子や転写物に対応するプローブを支持体上に固定し、そこに複数のサンプルを同時にハイブリダイズさせて行なわれる。ポジティブ信号は、支持体上に固定されたプローブとサンプル中の分子が反応した場合に得られる。これらの実験は、多数の遺伝子あるいは転写物を同時並行的に解析できるが、その反面、解析の対象が、他の実験や手段によって同定された遺伝子や転写物に限られるという制限がある。このような実験や手段は、ｃＤＮＡライブラリーや部分的塩基配列決定、タグ塩基配列決定、および／またはコンピューターによる予測結果を含むがこれに限定されるものではない。将来的には、タイリングアレイによって、ゲノムの塩基配列が判っている生物の偏りのない発現プロファイリングが可能となる(Ｋａｐｒａｎｏｖ Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６， ９１６−９１９， ２００２)であろうが、しかし、タイリングアレイはゲノム塩基配列に対応したものであるため、それを使った実験データからは、同一ゲノム領域にある複数の転写物がその領域のどこに由来するのかを特定するのは難しいと考えられる。タイリングアレイ技術はゲノム上のどの領域が活性化されているかの情報を得られるが、大規模な発現プロファイリングにおいて個々の転写物の特徴を明らかにするには不十分である。
【０００４】
ＤＮＡマイクロアレイによる解析が持つ問題を解決するために、複数のｍＲＮＡサンプルより得られる部分シーケンスや前記タグをベースとした発現プロファイリングや遺伝子探索が用いられている。いわゆるＳＡＧＥ(Ｓｅｒｉａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ)法はｍＲＮＡの塩基配列から効率的に情報を得る方法として知られている（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ Ｖ．Ｅ． ｅｔ ａｔ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０， ４８４−４８７，１９９５)。この方法は、複数のｍＲＮＡサンプルの３’末端の塩基配列情報を含む短いＤＮＡフラグメント（当初は約１０塩基対）をつなぎ合わせてコンカテマーを作り、このコンカテマーの塩基配列を決定する。最近、ＳＡＧＥ法の一つであるＬｏｎｇ ＳＡＧＥ法が発表され、長いタグをクローニングすることが可能となった（Ｓａｈａ Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０， ５０８−１２ （２００２）， 米国特許出願２００３０００８２９０号，米国特許出願２００３００４９６５３号)。ＳＡＧＥ法は現在、生物、組織、特定の細胞などの遺伝子発現を解析する重要な手法として広く用いられており、このタグの情報は HYPERLINK "http://cgap.nci.nih.gov/SAGE" 例えばｈｔｔｐ：／／ｃｇａｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＡＧＥで公開されている。
【０００５】
米国特許６，３５２，８２８号、６，３０６，５９７号、 ６，２８０，９３５号、 ６，２６５，１６３号、 ５，６９５，９３４号では短いタグ配列を大規模に塩基配列決定する別の方法が開示されている。Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｒｌ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＭＰＳＳ）と呼ばれるこの方法は、Ｂｒｅｎｎｅｒらによれば（Ｂｒｅｎｎｅｒ Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １８， ６３０−６３４ ，２０００， ａｎｄ Ｂｒｅｎｎｅｒ Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７， １６５５−１６７０，２０００）単層のビーズ上で異なる酵素を使ってサイクル反応を行ない、転写物の３’末端の短い塩基配列を極めて並列に得る方法である。
【０００６】
前記２つの手法は転写物の３’末端の塩基配列の利用に焦点を当てたアプローチであるが、反対の５’末端からタグ配列を得る方法も開発されてきた。そのような方法として、ＰＣＴ／ＪＰ０３／０７５１４, ａｎｄ Ｓｈｉｒａｋｉ Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｇ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １００， １５７７６−１５７８１，２００３）に開示されているのは、ＣＡＧＥ（Ｃａｐ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）法とよばれ、転写物の５’末端から特異的に得たタグ配列をＳＡＧＥ法と同様にコンカテマーにしてクローニングする方法である。この方法により得られるＣＡＧＥタグは、転写物の検出や発現プロファイリングだけでなく、転写開始点の情報を得るために利用され、転写調節のメカニズム解析や転写物の高度な注釈付けを行なうことができる。
【０００７】
しかしながら、これら前記の方法は核酸一分子からひとつのシーケンスタグを取ってクローニングおよび塩基配列決定をする方法であり、ひとつのタグから得られる情報だけではゲノム上へのマッピングやその他のバイオインフォマティクスの解析には不十分である場合がある。従って、核酸分子の一領域からひとつだけタグを得るのではなく、核酸分子の両端をクローニングし、同定できるような方法が望まれていた。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は核酸分子を環状化し、環状化された分子から、最初の核酸分子の両端に相当するフラグメントを得る方法を提供する。従って、本発明は、ゲノムあるいは転写される遺伝情報およびその核酸分子の解析に大きな改良をもたらし、さらに発現プロファイリング、スプライシング、プロモーター同定、遺伝要素の同定などを含み得るが、これらに限定されない高価値な手段を研究に提供し、それらは、創薬、診断薬または法医学研究を含み得るがこれに限定されない商業応用やサービスに不可欠な要素である。
【０００９】
本発明は、クローニングと解析を目的として核酸分子からフラグメントを単離する方法に関する。従って、本発明は、ひとつまたはそれ以上の核酸分子を含むサンプルの変換に関するものであり、または核酸分子あるいは核酸分子の混合物をＤＮＡに変換する方法に関する。
【００１０】
本発明のひとつの形態として、本発明は、ターゲットとする核酸の両端の塩基配列情報を含んだ直鎖状核酸分子を直鎖上二本鎖ＤＮＡの形で提供する方法に関する。
【００１１】
本発明は、直鎖状核酸分子の両端に対応する塩基配列を有するＤＮＡフラグメントを調製する方法を提供する。この方法は、核酸分子より直鎖状ＤＮＡ分子を作る工程と、直鎖状ＤＮＡの両端にクローニングサイトと、認識部位の外側に切断部位を持つ制限酵素の認識部位とを持つリンカーを連結する工程と、ＤＮＡ分子を環状化するために直鎖状ＤＮＡのクローニングサイトで直鎖状ＤＮＡを閉環して環状化する工程と、環状化ＤＮＡ分子を認識配列の外側に切断部位を持つ制限酵素で切断し環状化ＤＮＡ分子から直鎖状ＤＮＡ分子の両端を含むＤＮＡフラグメントを切り出す工程と、ＤＮＡフラグメントを単離する工程とを含む。
【００１２】
本発明は、二本鎖ＤＮＡ分子の両端に特定のリンカーを連結する操作を含み、該リンカーは、その後の二本鎖ＤＮＡ分子の増幅、操作、精製のための手段を提供する。二本鎖ＤＮＡ分子の両端に連結されたリンカーはＤＮＡ分子の環状化に必要な手段を提供する。従って、本発明は、直鎖状ＤＮＡ分子を環状ＤＮＡに変換し、この環状ＤＮＡを増幅する手段を提供するものである。
【００１３】
さらに、本発明は、例えばリンカーをＤＮＡフラグメントの末端に連結する工程を含む。該リンカーはクラスＩＩまたはクラスＩＩＩ酵素の認識部位をクローニングサイトの直近あるいは近傍に含む。従って、リンカーは、ＤＮＡ分子の末端からフラグメントやタグを切り出すために必要な手段を提供する。本発明は、核酸分子の末端からタグを単離するために用いられる。これら末端領域は異なる種々の実験的アプローチにより得られ、もとの核酸分子の特徴付けを可能とする。環状化の工程によって、同じ直鎖状ＤＮＡ分子の末端に由来するタグは互いにリンカー由来のスペーサー配列によってリンクされる。従って、本発明は、ＧＳＣタグ（Ｇｅｎｅ Ｓｃａｎｎｉｎｇ ＣＡＧＥ ｔａｇ）と呼ばれる新しいタイプのタグを調製する方法を提供し、核酸分子を両端の塩基配列により特徴付けることが可能となる。さらに、ＧＳＣタグは同じ核酸分子に由来するタグが同一のＧＳＣタグ内に一体化されており、両端のタグをリンクするリンカー由来のスペーサー配列により、短いシーケンスタグを用いてＧＳＣタグをラベルする方法を提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、ＤＮＡ分子から得られたタグをクローニングする方法を含む。これらのタグは精製され、コンカテマーとしてタグライブラリーにクローニングされ、簡便な操作や塩基配列決定に用いられる。前記ライブラリーはＧＳＣライブラリーと呼ばれる。従って、本発明は、核酸分子の末端に由来するシーケンスタグの大規模解析の手段を提供する。
【００１５】
本発明のある態様では、本発明は、異なるサンプルからタグをクローニングする方法に関する。そのような混合タグライブラリーにおいては、各々の分子はそれらの由来によってラベルを付けられる。同様に、異なる方法により調製されたタグも個々にラベルされ、プールライブラリー用に調製することができる。従って、本発明は、決定した配列によりタグをラベルする方法に関するもので、該配列はコンカテマーにクローニングする前に、環状化および／またはリンカー連結の過程で導入される。
【００１６】
本発明の別の態様として、本発明は、タグの塩基配列を決定し、コンピューター的手法や統計学的解析によりそれらの注釈付けを行なう方法に関するものである。従って、本発明は、遺伝子探索、遺伝子同定、遺伝子発現プロファイリング、注釈付けなどの方法に関する。
【００１７】
本発明のさらに別の態様として、本発明は、タグの塩基配列を決定し、コンピューター的手法や統計学的解析によりそれらの注釈付けを行なう方法に関するものである。前記タグはゲノム上の領域から得ることができる。従って、本発明は、ゲノム上の遺伝要素の特徴付けの方法に関する。
【００１８】
本発明のさらに別の態様として、本発明は、核酸分子の末端よりハイブリダイゼーション用のプローブを調製する方法に関する。そのような領域は、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションの方法によって解析することができる。好ましい形態としては、タイリングアレイによってｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションを行なう方法である。
【００１９】
本発明のさらに別の態様として、本発明は、完全長核酸分子のクローニングに関する。タグから得られた塩基配列情報を使ってプライマーをデザインし、そのプライマーを用いて増幅反応により核酸分子を増幅する。本発明には、転写物や遺伝要素やプロモーター領域を含み得るゲノムフラグメントを増幅しクローニングすることも含まれる。
【００２０】
従って、本発明は、例えば生物学的サンプルの特徴付けなどの必要に応じて、核酸分子やその短いフラグメントを解析する手段を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、直鎖状あるいは環状の核酸分子の形状である一本鎖あるいは二本鎖の核酸の処理方法を含む。二本鎖ＤＮＡとは、２つのデオキシリボヌクレオチドポリマー分子からなり、２つのポリマー分子が十分に相補的な塩基配列を有して互いに会合し、二量体の分子を形成しているあらゆる核酸分子を意味する。この２つのポリマーは、デオキリリボヌクレオチドが持つ対応する塩基対の間に特異的な水素結合を形成し、互いに結び付いている。本発明においては、２つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドからなり、互いに相補的なＤＮＡ分子を持たない１つのポリマー鎖からなるすべてのＤＮＡは、たとえ同一の分子内で二次構造を形成し二本鎖ＤＮＡ部分を含んでいても、一本鎖ＤＮＡ分子と見なされる。本明細書において、同義的には、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」とはＲＮＡあるいはＤＮＡを含み、一本鎖か二本鎖か、コーディングかノンコーディングか、相補的であるか否か、センスかアンチセンスかに関係なく、またそれらのハイブリッド配列も含む。特に、ゲノムＤＮＡおよび相補的ＤＮＡを包含し、転写されるか否か、スプライスされるか否か、不完全にスプライスされるかプロセッシングを受けるかに関係なく、その由来や、生物学的材料からクローニングされたか、合成により得られたかにも関係ない。本発明においては、ＲＮＡは、同一分子内部に二次構造を形成し二本鎖となっている部分がある場合にも、一本鎖と見なされる。特に、本発明においては、ＲＮＡの由来や特殊な塩基配列とは関係なく、ＲＮＡはリボヌクレオチドからなるあらゆる形態の核酸分子を包含する。従って、ＲＮＡはｉｎ ｖｉｖｏ あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏで人工的なシステムにより転写されることができ、あるいは転写されるか否か、スプライスされるか否か、不完全にスプライスされるかプロセッシングを受けるかに関係なく、自然由来か人工的にデザインされた鋳型より得られたかに関係なく、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡを含み、合成によっても得ることができ、あるいはそれらの混合物でも良い。さらに正確には、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、「核酸」、「配列」の表現は、あらゆる核酸材料を含む。従って、特定の塩基配列情報やベクター、ファージミド、またその他いかなる特定の核酸分子にも限定されるものではない。「核酸」もまた、本発明においては、自然に存在する核酸、人工的に合成あるいは調製された核酸、少なくともひとつあるいはそれ以上の修飾が、自然に発生する事象によりあるいは当業者が知りうる方法によりなされたあらゆる核酸を含む。同様に、本発明の「タグ」とは本発明によって調製される核酸分子のあらゆる領域でも良く、本明細書中でいう「タグ」とは、あらゆる核酸フラグメントを含み、由来が自然の事象により発生したものでも良く、人工的に合成あるいは調製されたものでも良く、また自然の事象によりあるいは当業者が知りえる方法により少なくともひとつの修飾が導入された核酸でも良い。さらに、「タグ」はいかなる特別の塩基配列情報や構成と関係するものではない。本発明においては、「純度」、「濃縮された」、「精製」、「濃縮」、あるいは「選択」という語句は、置き換え可能であり、生成物の絶対的な純度や濃縮を必要とするものではなく、むしろ、相対的な意味で用いられる。本発明において、「特異的」、「好ましい」、「優先的」とい語句は、置き換え可能であり、ＤＮＡあるいはＲＮＡのハイブリダイゼーションにおいて絶対的な特異性や酵素の基質に対する特異性、反応を意味するものではなく、むしろ、相対的な意味で用いられ、酵素がその基質と関係したあるいは無関係の他の物質に対して低い、あるいは比較してより低い親和性を持つという意味も含まれる。同様に、酵素、あるいは酵素活性という語句は、本発明においては要素の機能や活性を表し、要素の絶対的な純度を必要とするものではない。従って、酵素、酵素活性、あるいは同等の、あるいは関連したあるいは関連しない機能を持つ要素との混合物も本発明の対象となる。同様に、本発明におけるＤＮＡあるいはＲＮＡ分子は、本発明の目的のために相補的配列と関連してハイブリダイゼーションプローブとして機能することもでき、あるいは関連する核酸分子を検出するためのプローブとして実験に使用することもでき、さらにそのようなプローブとターゲット分子は、個々の位置に突然変異を人工的あるいは自然発生的に導入することにより区別する実験に使用することもできる。「生物学的サンプル」とは、微生物、動物、植物、宿主に依存して複製するウイルスやプリオンなどの感染性粒子など生きている有機体から得られるあらゆる材料を含む。このような「生物学的サンプル」は、研究、開発、診断、治療などを目的として、患者、動物、植物、感染粒子から得られたあらゆる材料を含む。従って、本発明はいかなる特定の核酸分子あるいはその由来に限定されることはなく、本発明はあらゆる核酸の操作、利用、応用のために普遍的な手段を与える。本発明に適用される核酸分子は当業者知るところのいかなる方法によっても調製、入手することができ、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ Ｊ． ａｎｄ  Ｒｕｓｓｕｅｌｌ Ｄ．Ｗ．  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２００１、参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）らの方法により得ることができるが、これに限定されるものではない。
【００２２】
本発明は、核酸分子よりクローニングと解析のためにフラグメントを単離する方法に関するものである。従って、本発明は、サンプルに含まれるひとつあるいはそれ以上の核酸分子、あるいはそれらの混合物をＤＮＡに変換する方法に関する。本発明を実施するために、核酸分子は、自然にあるゲノムＤＮＡ、ＲＮＡサンプル、ＤＮＡライブラリーから得ることができ、また、人工的な由来でも良く、またそれらのいかなる混合物でも良い。本発明は、単独あるいは任意の複数の核酸分子への適用に限定されるものではなく、核酸分子が単独であっても、複数であっても良く、自然発生的におきるか、あるいは既存のライブラリーから得られるか、あるいは人工的に作製されるかによらない。さらに、本発明は、その由来や性質に関わらず、あらゆる核酸分子を処理することができる。従って、自然事象によって得られる核酸分子でも完全長分子であっても良く、それらのフラグメントでも良い。さらに、それらの核酸分子のフラグメントは、ランダムなプロセスによって、あるいはある特定の塩基配列に作用する酵素を用いて核酸分子のターゲットを絞った方法によって、あるいは転写領域の中のエクソン、イントロンなどの核酸分子の構造をもとにフラグメント化する方法により調製することができるが、これに限定されるものではない。従って、本発明は特定の出発材料に限定されるものではない。
【００２３】
本発明は、ＤＮＡのみではなく、当業者が知りえる方法によりＲＮＡからＤＮＡに変換されるものも含まれる。ＲＮＡからＤＮＡに変換する方法として、例えば、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ． ａｎｄ Ｒｕｓｓｕｅｌｌ Ｄ．Ｗ．， ｉｂｉｄ（参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）らの方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。ＲＮＡよりＤＮＡに変換された後、一本鎖あるいは二本鎖ＤＮＡ分子は、もとのＲＮＡの配列と相補的な配列を有し、ｃＤＮＡと呼ばれる。これらのｃＤＮＡ分子は一般には直鎖状ＤＮＡの形で調製され、分子の両端は操作が可能な状態である。しかし、ｃＤＮＡがベクターにクローニングされていたとしても、当業者はベクターのインサートを直鎖状ＤＮＡにするのに必要な方法を知り得ることができる。
【００２４】
本発明のある態様として、シーケンスタグの一部は転写物の３’末端より得られる。ｍＲＮＡの３’末端よりタグをクローニングするためには、ＲＮＡからポリアデニル酸テールを除くことが重要である。ポリアデニル酸テールを取り除くひとつの方法として、Ｓｈｉｂａｔａ Ｙ． ｅｔ ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １０４２ −１０４４， １０４８−１０４９ （２００１）（参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）の方法が挙げられ、これは３’末端のタグのクローニングに適用されるものであるが（図１参照）、これに限定されるものではない。ｃＤＮＡの第一鎖合成に用いられるプライマーはクラスＩＩ酵素であるＧｓｕＩの認識配列を、プライミングの工程で使われた１４ｂｐのオリゴｄＴストレッチに隣接する部位に持つ。この酵素は、認識配列より１４／１６ｂｐ離れた部位で切断して二本鎖ＤＮＡを作る。ｃＤＮＡ合成の後、ＧｓｕＩを用いて、ｃＤＮＡの３’末端とＧｓｕＩの認識配列の間にあるポリアデニル酸／ｄＴストレッチを切り出す。ＧｓｕＩの切断により得られた突出末端は３’特異的リンカーと連結される。リンカーはクラスＩＩあるいはクラスＩＩＩ酵素の認識配列を有し、さらにそれに隣接あるいは近接してシーケンスタグを切り出すためのライゲーション部位、クローニングサイト、さらに／もしくは、タグの精製のためのラベルがある。従って、本発明は、３’末端よりポリアデニル酸テールを除去して、ｍＲＮＡの解析に重要な手段を提供する。本発明の別の形態として、本発明はポリアデニル酸テールを持たないＲＮＡの３’末端特異的プライミングの手段を提供する。この発明の形態では、ランダム配列の一本鎖突出部位を有する二本鎖リンカーがＲＮＡ分子の３’末端に連結される（図７ａ）。このようなリンカーは、当業者が知りえる他の方法と同じようにデザインされることもできる。例えば、Ｓｈｉｂａｔａ Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ３０， １２５０−１２５４ （２００１）らの方法（参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）により得ることができるが、これに限定されるものではない。ｃＤＮＡの合成に使用される３’特異的リンカーは、さらに、連結生成物の３’末端からシーケンスタグを切り出すためにクラスＩＩまたはクラスＩＩＩ酵素の認識配列を有し、さらにクローニングサイト、さらに／もしくはタグの精製のためのラベルを有することができる。従って、本発明は、ポリアデニル酸テールを持たないＲＮＡから完全長ｃＤＮＡを調製する手段を提供し得、さらに、同様のリンカー連結工程は、ポリアデニル酸テールを有するＲＮＡからのｃＤＮＡ合成を阻害するために応用することもできる。このような本発明の形態において、一本鎖のオリゴｄＴの突出末端を持つ二本鎖リンカーはＲＮＡ分子の３’末端に連結される（図７ｂ）。オリゴｄＴの突出末端により、このようなリンカーはポリアデニル酸を持ったＲＮＡに選択的に連結される。しかし、前述のランダム配列の突出末端を有するリンカーと対照的に、例えば最後の位置にジデオキシヌクレオチドを入れるなどの方法により、３’のオリゴｄＴ突出末端はブロックされ得る。従って、このような修飾をされたリンカーはそれ以上��鎖を伸長することはできない。加えて、このようなリンカーの上側の鎖の５’末端には、特異的結合物質を付加することができる。これにより、特異的結合物質に結合する高親和性リガンドを用いて、ポリアデニル酸を有するＲＮＡの選択的除去を行なうことができる。特異的結合物質と高親和性リガンドについては、当業者が知りうる種々のコンビネーションがあり、例えば、ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン抗体などがあるが、これに限定されるものではない。この方法においては、本発明はポリアデニル酸テールを持たないＲＮＡの選択的なプライミングと、このようなＲＮＡをポリアデニル酸を持つＲＮＡから分離する手段を提供する。従って、本発明は、いかなるタイプのＲＮＡも含む核酸分子の３’末端のクローニングと解析の手段を提供する。
【００２５】
本発明の異なる態様においては、シーケンスタグは転写物の５’末端より得られる。異なる５’末端特異的シーケンスタグの利用が、ＰＣＴ／ＪＰ０３／０７５１４とＳｈｉｒａｋｉ Ｔ． ｅｔ ａｌ．， ｉｂｉｄ（参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）に記載されている。これらすべての方法はｍＲＮＡ分子の５’末端に特異的なｃａｐ構造を利用しており、この方法により、完全長ｍＲＮＡ分子あるいは５’末端を選択的に濃縮することができる。当業者によく知られているように、このような方法には、例えばｃａｐ ｔｒａｐｐｅｒ法（Ｃａｒｎｉｎｃｉ Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ３０３， ｐｐ． １９−４４， １９９９)、オリゴキャッピング法（Ｍａｒｕｙａｍａ Ｋ．， Ｓｕｇａｎｏ Ｓ．， Ｇｅｎｅ ）１３８， １７１−１７４ ，１９９４）、ｃａｐ結合タンパク質の利用(Ｅｄｅｒｙ Ｉ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １５， ３３６３−３３７１ ，１９９５)、ｃａｐ構造に特異的に結合する抗体の利用（Ｔｈｅｉｓｓｅｎ Ｈ． ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １２， ３２０９−３２１７， １９８６）、ｃａｐ構造を酸化した後オリゴヌクレオチドをｃａｐ構造に加える方法（米国特許第６，０２２，７１５号）、ｃａｐ ｓｗｉｔｃｈ法（米国特許第５，９６２，２７２号）などが挙げられるが（これらは全て、参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）、これに限定されるものではない。前述の方法はどれも５’末端を選択して転写物の５’末端にリンカーを連結することができ、このリンカーは、シーケンスタグを切り出すためのクラスＩＩあるいはクラスＩＩＩ酵素の認識配列、クローニングサイト、さらに／もしくはタグの精製のためのラベルを有する。従って、本発明のこの形態においては、ｃａｐ構造はリンカーを導き、完全長転写物を捕獲するために用いられる。従って、本発明は、転写された領域の５’末端を捕獲する手段を提供する。
【００２６】
本発明のある態様においては、本発明は直鎖状二本鎖ＤＮＡを調製する核酸分子の操作法に関する。このような二本鎖ＤＮＡはＲＮＡより得ることができ、前述のいずれかの方法によっても調製することができ、あるいは、他のいかなる材料からも得ることができ、二本鎖あるいは一本鎖ＤＮＡを単離することができる。このような二本鎖あるいは一本鎖のＤＮＡを得る材料は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、クローン化されたＤＮＡ、あるいはいかなるフラグメント、あるいはそれらの混合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。従って、本発明は特定の核酸材料に限定されるものではなく、いかなる核酸分子、あるいはそれらの混合物を用いても本発明を実施することができる。さらに、本発明は、一本鎖ＲＮＡとＤＮＡに用いられ、当業者が知り得るところの方法かによって行なわれるサブトラクション、ノーマリゼーション、選択的濃縮を通じて一本鎖核酸分子の複雑性をコントロールすることも、本発明の範囲である。サブトラクション、ノーマリゼーション、選択的濃縮の方法として、Ｃａｒｎｉｎｃｉ Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １０， １６１７−１６３０（２０００）らの方法（参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）が挙げられる（図１）が、これに限定されるものではない。本発明を実施するために用いられる出発材料によらず、一本鎖の第一鎖ｃＤＮＡ材料は、サブトラクションハイブリダイゼーション、あるいは物理的分離を用いて分画され、異なって発現される遺伝子の核酸分子の濃縮や、低い頻度で現れる転写物の濃縮を行なうことができる。従って、本発明は、クローニングや解析を目的に複数の核酸分子を処理する方法に関する。
【００２７】
本発明の別の形態では、本発明は二本鎖ＤＮＡ分子の両端に特異的なリンカーを連結し、そのリンカーは二本鎖ＤＮＡ分子のさらなる増幅、操作、さらに／もしくは精製の手段を提供することによりこの二本鎖ＤＮＡ分子の操作をすることに関する。このようなひとつ、あるいは複数のリンカーは二本鎖ＤＮＡにライゲーション反応により連結され、ライゲーションにより連結された二本鎖リンカーは一本鎖ＤＮＡの突出末端を有し、あるいはＲＮＡもしくはＤＮＡの鋳型よりＤＮＡ合成を行なうプライマーの一部として導入される。二本鎖ＤＮＡ分子の末端に連結されたリンカーは、このましくは二本鎖ＤＮＡである。このようなリンカーはその利用法や導入あるいは連結法とは関係なく、二本鎖ＤＮＡ分子の操作のために特定の性質を含んでいる。このような性質は、制限酵素の認識部位、増幅に使われるプライマーに相補的な領域、選択的結合物質によるラベルを含むがこれに限定されるものではない。該選択的結合物質はビオチン、ジゴキシゲニンを含むがこれに限定されるものではない。さらに、このようなリンカーは、連結されたＤＮＡ分子のラベリングのための情報を含むことができ、そのようなラベルは片方あるいは両方のリンカーの中に短いシーケンスでコードされており、また認識配列の外側で切断する制限酵素の認識配列を含むことができる。好ましい態様としては、そのような認識部位は、核酸分子とリンカーの連結部位に隣接している。別の態様としては、そのような認識部位は、核酸とリンカーの連結部位に近く、あるいは非常に近くにあり、その場合、核酸と認識配列は１ヌクレオチド（１）、あるいは２ヌクレオチド（２）、あるいは３ヌクレオチド（３）、あるいは４ヌクレオチド（４）、あるいは５ヌクレオチド（５）、あるいは６ヌクレオチド（６）離れている。好ましい形態においては、認識部位の外側で切断する制限酵素は、クラスＩＩあるいはクラスＩＩＩ酵素である。より好ましい形態においては、認識配列の外側で切断する制限酵素は、ＧｒｕＩ，ＭｍｅＩ，ＢｐｍＩ，ＢｓｇＩ，ＥｃｏＰ１５Ｉから選ばれる。従って、本発明は、核酸にラベルを付ける手段を提供し、より詳しくは、異なる由来の核酸分子が、解析あるいはクローニングを目的として混合される場合、該ラベルをリンカーにより導入する、あるいはそれにより導く手段を提供する。
【００２８】
本発明のある態様として、二本鎖ＤＮＡ分子の末端に連結されたリンカーは、ＤＮＡ分子の環状化のための手段を提供する。ここで、本発明は、核酸分子の末端から得られるタグの単離に関するもので、そのような領域は異なる実験的方法により導かれ、もとの核酸分子の由来を特徴づけることを可能とする。環状化の工程により、同じ直鎖状ＤＮＡ分子に由来するタグは、リンカーの塩基配列に由来するスペーサーを介して互いにリンクしている。従って、本発明は、ＧＳＣタグ（Ｇｅｎｅ−Ｓｃａｎｎｉｎｇ−ＣＡＧＥ−ｔａｇ）と呼ばれる新しいタイプのシーケンスタグを調製する手段を提供するもので、これにより核酸分子の末端シーケンスにる特徴付けや、単離が可能となる。さらに、ＧＳＣタグは、同じ核酸分子に由来する関連したタグが同じＧＳＣタグ内に一体化され、両端から得られる2つのタグをつなぐスペーサーの塩基配列が、短いシーケンスタグによりＧＳＣタグのラベル付けを可能とするように調製される。それゆえ、環状化の工程は、本発明に必須の工程であり、核酸分子の両端を連結することにより、同じ核酸分子の両端が、同じＧＳＣタグにクローニングされることを確実にするものである。他の方法として、核酸分子の環状化は、ベクターにクローニングすることによりなされると考えられ、この場合、結果として得られるベクター構築物は、環状化ＤＮＡに含まれる。このようなベクターは、インサートの末端に由来するタグを単離するために必要な手段を提供するもので、インサートの中央部を切り出した後、同じ核酸分子、前記インサートに由来するタグが、ベクターのバックボーン部分からなるスペーサーを介して連結されえると考えられる。ベクター両端のセルフライゲーションにより、2つのタグを連結した後、インサート、前記核酸分子の両端に由来するタグを含むＧＳＣタグは、ベクターより切り出され、さらに本発明によって処理される。従って、ベクター、あるいは関係しない核酸分子を環状化のために使用することは、本発明の範囲内であり、この場合、前記ベクターや核酸分子はスペーサーとして機能する。直鎖状ＤＮＡ分子、前記核酸分子が、例えば長さの制限により、直接環状化できない場合は、ベクターや関係しない核酸分子の仕様が望ましい。しかしながら、多くのあるいはほとんどの場合において、本発明を実施するための工程数が少なくて済むという理由により、リンカーによって提供されるクローニング部位を利用して直鎖状ＤＮＡ分子、前記核酸分子を直接環状化することが望まししい。
【００２９】
環状化の反応は、実験の必要に応じて、突出末端あるいは平滑末端を利用することができる。本発明の好ましい態様においては、核酸分子の両端に連結されるリンカーは、同じ制限酵素、あるいはイソ制限酵素の認識部位を持ち、これらの両末端が組換え可能となるように、同じ突出末端あるいは平滑末端を作ることができる（図２）。前記の実験においては、リンカーのシーケンスの一部は切断されてセルフライゲーションのための突出末端となる。本発明の異なる形態においては、制限酵素による切断により作られたリンカーの末端に選択的結合物質を付加し、高親和性結合物質を用いて核酸分子から分離することが可能である。前記選択的結合物質と高親和性結合物質の組み合わせは、核酸のビオチンによるラベルとアビジンあるいはストレプトアビジンとの結合、あるいはジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン抗体の結合を含むが、これに限定されるものではない。両方のシステムはラベルされたリンカーフラグメントと遊離している核酸分子を分離する手段を提供し、この場合においては、前記フラグメントは高親和性結合物質を不溶性担体に結合させることで容易に回収することができる。非ラベル核酸分子からラベルされた核酸分子を分離するための不溶性担体の利用については当業者が知りえる多くのプロトコールがある。本発明の異なる形態においては、核酸分子は、リンカーを切断するために用いる制限酵素の切断に耐性を持つように調製される。このような保護は、例えば、核酸分子の化学的あるいは酵素的合成において修飾ヌクレオチドを導入する方法、あるいは、メチルトランスフェラーゼを用いて後から前記核酸分子を修飾する方法などがある。制限酵素とメチルトランスフェラーゼの適合する組み合わせについては、当業者の知りえる方法が多くあり、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社 (http://www.neb.com/nebecomm/default.asp、ホームページに掲載されている製品説明書は、参照することにより本明細書に組み込まれるものとする)、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社(http://www.fermentas.com/、ホームページに掲載されている製品説明書は参照することにより本明細書に組み込まれるものとする)より商業的に入手可能なものを含むが、これに限定されるものではない。さらに、本発明には、リコンビナーゼ、オーバーラップエクステンション反応を用いた核酸分子の環状化を実施することも含まれる。異なる形態においては、環状化の工程は、リコンビナーゼを用いて行なわれ、リンカーは組換えのために必要な手段を提供する。当業者が知るところの組換えの方法は多数あり、適用可能である。特に、バクテリオファージＰ１より得られるＣｒｅ（Ｃａｕｓｅｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）リコンビナーゼは、二箇所の同一の二本鎖ＬｏｘＰサイト（Ｌｏｃｕｓ Ｏｆ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ （Ｘ） ｉｎ Ｐ１ ｓｉｔｅｓ）の間での組換えを触媒するもので、広く有用な手段として用いられ、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムが他の補助因子やシーケンス要素を必要とせず、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて効率的な組換えが可能であることが、非常に大きな利点となっている。Ｃｒｅリコンビナーゼによる工程は精製したＤＮＡを用いて実施することができ、前記ＤＮＡは酵素と一緒に直接インキュベートされる。精製されたＣｒｅ��コンビナーゼは、ＣＬＯＮＴＥＣＨ （ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、 Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、 ＣＡ、 ＵＳＡ）、 Ｎｏｖａｇｅｎ （Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ， ＵＳＡ）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ （Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ， ＵＳＡ）等より入手可能であり、これら製造者の仕様説明書および付属文書は本明細書に参照することによって組み込まれるものとする。従って、本発明は、異なる制限酵素やリコンビナーゼの利用により、直鎖状ＤＮＡ分子を環状ＤＮＡ分子に変換する手段を提供する。環状化の工程により、直鎖状ＤＮＡ分子、前記核酸分子の両端が接合して環状化し、直鎖状ＤＮＡ分子、前記核酸分子の両端のシーケンス情報とリンカー由来のスペーサー領域を有するＧＳＣタグの調製が可能となり、前記スペーサーはその由来を示すラベル要素をシーケンスタグとして有することが可能である。環状化工程はさらに、環状核酸分子の形成後、制限酵素の認識配列がシーケンスタグとして機能し、核酸分子のラベル付けを可能とする。従って、本発明は、直鎖状ＤＮＡ分子の末端を操作することを目的として、直鎖状ＤＮＡを環状ＤＮＡに変換する手段を提供する。
【００３０】
本発明の他の態様においては、環状化反応を行なった後、エクソヌクレアーゼを用いて、直鎖状ＤＮＡは環状ＤＮＡから除去される。前記エクソヌクレアーゼは、環状ＤＮＡに比べて、はるかに高い活性を直鎖状ＤＮＡに対して持つことが必要である。このようなエクソヌクレアーゼの例として、エクソヌクレアーゼＩＩＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社製、#ＥＮ，０１９１，０１９１，http://www.fermentas.com/、ホームページに掲載されている製品説明書は、参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）、あるいはエクソヌクレアーゼＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社、#ＥＮ０５８１， http://www.fermentas.com/、ホームページに掲載されている製品説明書は、参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）が挙げられるが、他にも、本工程に使用でき、当業者が知り得るエクソヌクレアーゼは多数ある。従って、本発明は、セルフライゲーションに失敗した核酸分子を除去し、直鎖状核酸分子に対して環状核酸分子を濃縮する手段を提供する。
【００３１】
本発明の別の態様では、環状ＤＮＡは増幅反応に用いられる。当業者の知るところの、環状ＤＮＡを増幅する方法は数多くあり、ローリングサークル増幅法を含むが、これに限定されるものではない。図３に示すように、本発明の目的のために行なわれる環状ＤＮＡ増幅は、好ましくは、ランダムプライマーを用いたローリングサークル増幅法を用いて行なわれる。プライマーは、6ヌクレオチドのプライマーを含むがこれに限定されるものではない。また、前記ローリングサークル増幅は、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを含むがこれに限定されない強い鎖置換活性を持ったＤＮＡポリメラーゼを用いて行なわれる。前記増幅反応は、例えばアマシャムバイオサイエンス社のＴｅｍｐｌｉＰｈｉTM ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃａｔ． Ｎｏ． ２５−６４００−１０、このハンドブックは、参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）を用いて行なうことができる。このキット、あるいはあらゆる類似の等温増幅反応は、直鎖状ＤＮＡがローリングサークル増幅反応の鋳型をしては機能しないため、直鎖状ＤＮＡよりも環状ＤＮＡを効率的に増幅する手段を提供する。従って、本発明は、環状ＤＮＡがその後の操作に用いられるように、直鎖状ＤＮＡよりも環状ＤＮＡを選択的に増幅する手段を提供する。
【００３２】
さらに、本発明は、環状化の工程で使われた、核酸分子の末端に連結されたリンカーが、クラスＩＩあるいはクラスＩＩＩ酵素の認識部位を、クローニングサイト近傍あるいは隣接して、一つあるいはそれ以上有するような形態で、ＤＮＡフラグメントを操作する工程に関する。好ましい形態においては、クラスＩＩ酵素がＭｍｅＩ、より好ましい形態においては、クラスＩＩＩ制限酵素がＥｃｏＰ１５Ｉである。従って、ＤＮＡ分子の末端から切り出されるタグの長さは、タグを作るために使用する制限酵素に依存する。さらに、３’末端と５’末端の切断に異なる酵素を用い、３’末端と５’末端から得られるタグの長さが異なる方法も本発明に含まれる。それゆえに、ＤＮＡ分子、前記核酸分子の末端より得られるタグの長さは、１０から１５ｂｐ、あるいは１５から２０ｂｐ、あるいは２０から２５ｂｐ、あるいは２５から３０ｂｐとなり得る。例えば、好ましい酵素であるＭｍｅＩを使用した場合には、タグの長さは１６／１８ｂｐとなる。従って、リンカーは、フラグメントや前記タグを前記ＤＮＡ分子の末端より切り出すために必要な手段を提供する。従って、本発明は、核酸分子の末端よりタグを単離し、前記タグは、タグが由来する核酸分子の特徴付け同定のために利用される方法に関する。本発明の好ましい形態においては、前記タグは、セルフライゲーションの工程の後に、核酸分子から単離される。この形態においては、クラスＩＩあるいはクラスＩＩＩ酵素によって切断されたフラグメントは、核酸分子の両端より得られ、リンカーに由来するシーケンスによって互いにリンクされているタグを含んでいる。従って、本発明は、同じ核酸分子から得られた2つのタグを、リンカーに由来するスペーサーを介して互いに連結された形で、核酸分子の両端よりシーケンスタグを単離する手段を提供する。連結リンカーの配列が、環状化工程で使われた認識配列を含むのと同様に、リンカーは、さらに、異なるサンプルより得られた複数の核酸分子の中で、タグの由来をラベルするシーケンスタグを含む。
【００３３】
本発明の異なる態様においては、本発明は、ＧＳＣタグと呼ばれる、ＤＮＡ分子の両端から得られるタグのクローニングに関する。この態様においては、前記タグは精製され、コンカテマーにクローニングされ、該コンカテマーは簡便な操作や塩基配列決定のためにライブラリーにクローニングされる（図４）。本発明の好ましい形態においては、クラスＩＩあるいはクラスＩＩＩ酵素を用いた切断によって、異なるタグが互いに連結されるような突出末端が作られる。例えば、ＭｍｅＩを使用した場合には２ヌクレオチド突出の末端が作られ、この２ヌクレオチドの突出末端は１６種類の組み合わせを作ることができる。それゆえ、複数の核酸分子からなる複雑なサンプルを使う場合には、１６種類の異なる組み合わせによりタグをコンカテマーにクローニングできる。ＭｍｅＩを使用して調製されたタグの混合物のコンカテネーション反応の条件は、当業者が知り得るもので、Ｌｏｎｇ−ＳＡＧＥ ｌｉｂｒａｒｉｅｓからＤｉ−Ｔａｇｓを調製する方法（ＷＯ０２／１０４３８ Ａ２、参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）を含むが、これに限定されるものではない。本発明の異なる形態においては、クラスＩＩあるいはクラスＩＩＩ酵素の切断により作られた末端を平滑末端に変え、平滑末端の連結を利用してコンカテネーション反応が行なわれる。当業者が知り得る多数の平滑末端の調製方法があり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ． ａｎｄ Ｒｕｓｓｕｅｌｌ Ｄ．Ｗ．， ｉｂｉｄ（参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）を含むが、これに限定されるものではない。従って、本発明は、ＧＳＣタグと呼ばれる核酸分子の末端に由来するタグの大規模塩基配列決定を目的とした、タグのコンカテマーを作製する手段を提供する。
【００３４】
本発明の別の態様においては、コンカテマーは、ライブラリーを作製するためにクローニングされる（図５）。ベクターにクローニングするために、コンカテネーション反応でつかった組換え部位を用いることができ、あるいは、コンカテマーの末端は平滑化されてベクターへクローニングされることもできる。当業者が知ところのＤＮＡの平滑末端化と、その平滑末端の連結法が多数あり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ． ａｎｄ Ｒｕｓｓｕｅｌｌ Ｄ．Ｗ．， ｉｂｉｄらの方法（参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）が含まれるが、これに限定されるものではない。本発明の好ましい形態においては、コンカテマーは、ベクターｐＧＳＣ（図６）にクローニングされ、このベクターは突出あるいは平滑末端が利用可能な異なるクローニング部位を提供する。本発明の異なる態様においては、リンカーはコンカテマーの末端に連結され、前記リンカーはコンカテマーの増幅のためのプライミング部位、さらに／あるいは、ベクターにコンカテマーをクローニングするためのクローニング部位を提供する。前記リンカーを、レアカッターとライゲースを含むが、これに限定されない制限酵素を使った古典的な方法ではなく、リコンビナーゼによるコンカテマーの組換え部位導入のために、前記リンカーを使用する方法も、本発明に含まれる。一例として、コンカテマーのクローニングは、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）  システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、  HYPERLINK "http://www.invitrogen.com/" http://www.invitrogen.com/、ホームページに掲載された情報は、参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）を用いて行なうことができる。より好ましい形態として、コンカテマーを含むＰＣＲ産物をターゲットベクターにクローニングするために、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）  ＢＰ ＣｌｏｎａｓｅTM Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ，Ｃａｔ． Ｎｏ． １１７８９−０１３、その製品情報は参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）が用いられる。本発明の別の形態では、本発明は異なるサンプルから得られたタグをクローニングし、前記混合ライブラリーに含まれる各々の核酸分子の由来がラベルされているライブラリーを作製する方法に関する。同様に、異なる方法により調製されたタグも、個々にラベルされ、プールライブラリーの調製に用いることができる。その場合、前述の通り、リンカーに由来するシーケンスは、各々のタグのラベルとしての機能を持つ。さらに、リンカーがコンカテマーのクローニング、および／または、増幅に用いられる場合、前記末端リンカーは、コンカテマーとその由来を明らかにするために、シーケンスタグが導入され得る。従って、本発明は、定められたシーケンスによりラベルされたタグのライブラリーを調製する方法に関するもので、前記シーケンスは、クローニングによりライブラリーを調製する以前に、リンカーを連結する工程で導入される。
【００３５】
本発明の異なる態様においては、本発明は、塩基配列決定とコンピューターによる解析により、コンカテマーの解析を行なう手段を提供する。このような場合、核酸分子の末端に由来する領域ではなくリンカーに由来する領域が、コンカテマーを構成するシーケンスタグの方向や由来に関する情報を提供する。ＧＳＣタグの構造は判っているため、コンピューター的解析により、例えば、核酸分子やリンカーより得られた領域など、ＧＳＣタグ内にある異なる領域の同定を行なうことができる。前記シーケンスタグは、さらに、ゲノムシーケンスへのマッピング、転写領域の情報を含む公開ドメインのシーケンス情報とのアラインメント、相互のアラインメント、ＰＣＴ／ＪＰ０３／１５９５６、 ＰＣＴ／ＪＰ０３／０７５１４およびＷＯ ０２／１０４３８（これらは全て参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）に開示されている方法が含まれるがそれに限定されないライブラリー中のＧＳＣタグ頻度の統計的解析を含むが、それに限定されないコンピューター的手法により注釈付けされ解析される。従って、本発明は、例えば、生物学的サンプル中の発現や、所与のｃＤＮＡライブラリーへの寄与率など、核酸分子の解析を行なう手段を提供する。
【００３６】
本発明の他の態様においては、本発明は、ゲノムの領域に由来するタグのコンピューター的手法や統計的解析を可能にするタグの塩基配列決定に関する。ゲノムＤＮＡよりフラグメントを調製し、ゲノムＤＮＡの前記フラグメントの末端に由来するタグのシーケンスにより、前記フラグメントの特徴づけを行なうことも本発明に含まれる。ひとつの形態では、前記ゲノムＤＮＡフラグメントは、ＤＮＡ結合タンパク質が結合する領域から得ることができる。明確なＤＮＡ結合分子のターゲットを同定するためのひとつの方法は、クロマチン免疫沈降（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ “Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ”；ＣｈＩＰ）と呼ばれ、この方法では、ｉｎ ｖｉｖｏの状態で、ＤＮＡ結合分子はホルムアルデヒドによる処理により、ゲノムＤＮＡ上にあるそれらの結合部位と交差結合される（Ｋｕｒａｓ Ｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２８４， １４７−１６２， ２００４、参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）。前記ＤＮＡ結合分子に対する特異的抗体により、タンパク質―ＤＮＡの複合体の免疫沈降を行なった後、当業者の知り得る種々の方法により、ＤＮＡフラグメントを前記複合体から増幅することができ、さらに本発明の手法による、前記ゲノムフラグメントの両端から得るタグのクローニングへと進められる。同様の情報は、さらに、ＤＮＡ結合因子とｄａｍ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの融合タンパク質を応用したｄａｍ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅアッセイによって得ることができる。融合タンパク質の一部であるＤＮＡ結合因子のＤＮＡ結合ドメインは、ゲノム上の特異的な結合部位にｄａｍ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅを繋ぎ止め、結果として、結合部位のアデノシンがメチル化される。単離されたゲノムＤＮＡは、メチル化感受性制限酵素ＤｐｎＩにより切断することができ、ＤＮＡフラグメントは解析のために単離される（ｖａｎ Ｓｔｅｅｎｓｅｌ Ｂ． ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ Ｓ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １８， ４２４−４２８， ２０００， ａｎｄ ｖａｎ Ｓｔｅｅｎｓｅｌ Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ２７， ３０４−３０８， ２００１、この両論文は参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）。ＣｈＩＰによって得られたゲノムフラグメントと同様に、これらのフラグメントは、本発明に適用することができる。従って、本発明は、ゲノム上の遺伝要素を、ゲノムや類似のものに対してマッピングするなどのコンピューター的手法によって解析し、特徴づけを行なう方法に関する。
【００３７】
本発明の異なる態様においては、本発明は、核酸分子の末端からのハイブリダイゼーションプローブの調製と、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いて、この領域を解析する方法に関する（図８）。従って、本発明は、核酸分子の末端を確かめる手段を提供するもので、核酸分子の末端にリンカーを連結して、ハイブリダイゼーションプローブの調製に用いる。本発明の異なる形態においては、タグに由来するシーケンスはプライマーデザインに用いられ、前記プライマーは、ハイブリダイゼーションプローブの調製に用いられることができる。
【００３８】
本発明の異なる態様においては、シーケンスタグに由来するハイブリダイゼーションプローブは、ｉｎ  ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションの実験に用いられる。前記実験は、マイクロアレイの利用（図９）を含むがこれに限定されるものではない。好ましい形態においては、マイクロアレイはタイリングアレイであり、短いオリゴヌクレオチドは全ゲノムＤＮＡの一部をカバーするもので、例えば、Ｋａｐｒａｎｏｖ Ｐ． ｅｔ ａｌ．， ｉｂｉｄ（参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）に記載のものである。従って、本発明は、ゲノム領域が載せられたマイクロアレイにハイブリダイゼーションすることにより、シーケンスタグの注釈付けを行なう手段を提供する。シーケンスタグに由来するハイブリダイゼーションプローブの利用は、マイクロアレイ実験に限定されるものではなく、当業者が知るところの多数のハイブリダイゼーションプローブの利用方法があり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ． ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ Ｄ．Ｗ． ｉｂｉｄ（参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）により記載されている方法や、組織アレイ（Ｓａｕｔｅｒ Ｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２， ９６２−９７２， ２００３、参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）の利用があげられるが、これに限定されるものではない。
【００３９】
本発明の他の態様において、本発明は、複数のＲＮＡ分子から、直接３’末端と５’末端に特異的なハイブリダイゼーションプローブを調製する手段を提供する。この形態においては、二本鎖リンカーは、片方の鎖に一本鎖の突出部位を持ち、ＲＮＡ分子の末端シーケンスに連結され、リンカーの片鎖は第二鎖合成をプライミングし、ターミネーターを反応液に加えることにより、新しく合成する鎖の長さを制御することができる。３’末端と対応するプローブを調製する場合には、プローブはＲＮＡ鋳型より直接合成することができ、一方、５’末端に対応するプローブを調製する場合は、cＤＮＡの第一鎖を鋳型として調製される。当業者が知るところの、多数の、リンカー連結とそれに続くプライマー伸長反応の方法が多数あり、Ｓｈｉｂａｔａ Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３０， １２５０−１２５４， ２００１らの方法（参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）が挙げられるが、これに限定されるものではない。特に、ランダム突出部位あるいはシーケンスが決定している突出部位を持つ二本鎖リンカーの利用は、ＲＮＡ／ＤＮＡ分子の末端にリンカーを導くために、非常に価値が大きい。従って、本発明は、内部プライミングを防止する手段を提供する。さらに、前記リンカーは、 ポリアデニル酸を持たないＲＮＡのプライミングに用いることができ、その場合、リンカーの持つオリゴｄＴの突出部位により、特に、ポリアデニル酸を持ったＲＮＡからのプライミングをブロックすることができる。前記リンカーは、ポリアデニル酸を持ったｍＲＮＡからの伸長反応をブロックする性質を持ち、また、ライゲーション産物を選択的に除くための高親和性ラベルを有してもよい。本発明は、複数のＲＮＡから、末端特有のハイブリダイゼーションプローブを調製する手段を提供し、前記プローブは、タイリングアレイ、もしくは当業者が知るところのいかなるハイブリダイゼーション実験とも組み合わせて使用することができる
【００４０】
本発明の異なる態様においては、コンカテマーより得られたシーケンス情報は、完全長ｃＤＮＡクローニングのためのプライマーに利用することができる。前記形態においては、所与の５’末端と３’末端に特有のタグに由来するシーケンスは増幅反応に用いるフォワードプライマーとリバースプライマーのデザインを提供する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、生物学的サンプルから得られた複数のＲＮＡに由来するテンプレートとオリゴｄＴプライマーを用いて行なうことができる。第一の工程では、オリゴｄＴプライマーと逆転写酵素によりｃＤＮＡのプールが合成される。同様に、ｃＤＮＡの第一鎖合成は、前記のように、ＲＮＡの３’末端へ一本鎖突出部位を持った二本鎖リンカーを連結することにより合成することができる。第二の工程では、タグに由来するフォーワードとリバースプライマーがｃＤＮＡプールから完全長ｃＤＮＡを増幅するために使われる。同様に、既存のｃＤＮＡライブラリーから特定の完全長ｃＤＮＡライブラリーを合成することもできる。さらに、遺伝要素に関係するタグに由来するシーケンス情報を、ゲノムＤＮＡや前記プロモーター、あるいはそのフラグメントの中の領域を増幅、クローニングするために利用するプライマーのデザインに利用することも本発明に含まれる。これは、プロモーター領域のより大きなフラグメントを増幅、クローニングするために、ひとつのプライマーをＧＳＣタグから調製し、第二のプライマーを転写開始部位から調製する方法も含まれる。当業者が知るところの多数の転写開始点の同定方法があり、ＣＡＧＥ法（ＰＣＴ／ＪＰ０３／０７５１４， ａｎｄ Ｓｈｉｒａｋｉ Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｇ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １００， １５７７６−１５７８１， ２００３、参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）が含まれるがこれに限定されるものではない。
【００４１】
本発明の異なる態様において、本発明は、本発明を実施するために必要な試薬、酵素、プロトコールを含むキットに関する。従って、ある特定の問題や核酸分子に対応する反応条件を採用することにより差別化された試薬、酵素、プロトコールを用いた異なるキットが提供され得ると考えられる。前記キットは、ライフサイエンス分野の手法として、あるいは特定の核酸分子の検出、あるいは／さらに同定を目的とした法医学的検査法として、非常に価値の高いものとなり得る。ひとつの形態として、前記選択的濃縮は、サブトラクション、および／またはノーマリゼーションを用いて、一本鎖ＤＮＡを操作することにより達成される。異なる形態においては、前記選択的濃縮は、増幅工程で特定のプライマーを用いることにより達成される。さらに好ましい形態においては、前記選択的濃縮は、ローリングサークル増幅工程で特定のプライマーを用いることにより達成される。さらに、本発明によるハイブリダイゼーションプローブを調製するキットは、本発明に含まれる。同様に、前記キットは、診断の目的に本発明を適用するために必要な手段を提供する。
【００４２】
結論として、本発明は、大規模塩基配列決定を使ったシーケンスタグの解析とクローニングのための新たな手法を提供し、それは核酸分子の分析には非常に価値の高いものである。本発明は、さらに、関係するタグのシーケンスを使ってプローブデザインを行ない、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験を行なうために必要とされる特定のハイブリダイゼーションプローブを調製するのに必要な手段を提供する。従って、本発明は、特にタイリングアレイを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験の注釈付けに非常に重要であり、核酸分子の決定された領域に由来するハイブリダイゼーションプローブを調製するのに必要な手段を提供する。
【００４３】
［実施例］
本発明を、実施例をあげて詳しく説明する。本明細書中で用いるすべての名前、短縮形は、当業者に良く知られている意味で用いられる。
【実施例１】
【００４４】
［ＲＮＡの単離］
本発明を実施するために、ｍＲＮＡあるいは全ＲＮＡは当業者の良く知る標準的方法で調製することができる。例えば、さらに詳細にはＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ  ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ  ＤＷ，  ｉｂｉｄ，らの方法がある。さらに、Ｃａｒｎｉｎｃｉ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ． （Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３３  （２００２）  ３０６−３０９、参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）らは細胞質のｍＲＮＡフラクションを得る方法を開示している。細胞質ｍＲＮＡの使用が好ましいとしても、本発明は、この方法に限定されるものではなく、他のいかなる方法によって調製されたｍＲＮＡやトータルＲＮＡも同様に、本発明の実施に用いられる。
【００４５】
全ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製や細胞質ＲＮＡが好ましいが、本発明を実施するのに必須ではなく、トータルＲＮＡを用いても、完全長ｃＤＮＡライブラリーを作製する工程でＣａｐ選択工程を組み合わせることによって、十分な結果を得ることができる。ここでは、我々は通常Ｃａｐトラッパーアプローチを用い、ライブラリーの調製からリボゾームＲＮＡを効率的に除去する。一般的に、ｍＲＮＡは全ＲＮＡの１−３％であり、オリゴｄＴ−セルロース担体をベースとした市販キットを用いることにより調製することができる。前記の市販キットは、ＭＡＣＳ  ｍＲＮＡ単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙ社）を含み、これを用いることにより、推奨される条件下で十分はｍＲＮＡの収量を得て本発明を実施することができるが、これに限定されるものではない。本発明を実施するには、１サイクルのオリゴｄＴ選択で十分であり、それ以上のｍＲＮＡの精製は、長鎖ＲＮＡの損失を招くことがある。
【００４６】
本発明を実施するためのすべてのＲＮＡサンプルについて、ＲＮＡの純度を確認するために、２３０ｎｍ、２６０ｎｍ、２８０ｎｍの吸光度を測定した。２６０ｎｍの吸光度に対する２６０ｎｍの吸光度の割合が０．５以下の場合、ポリサッカライドの除去が十分であると考えられ、２８０ｎｍの吸光度に対する２６０ｎｍの吸光度の割合が１．８から２．０より高い時、効果的なタンパク質の除去がなされたと考えられた。ＲＮＡサンプルは、さらに、全ＲＮＡにおける２８Ｓと１８ＳのｒＲＮＡの割合が適切であることと、ＲＮＡフラクションの品質を確認するために、アガロースゲルの電気泳動を用いて解析した（哺乳類以外の種から全ＲＮＡの調製を行なう場合には、ｒＲＮＡのサイズは変わり得る）。
【実施例２】
【００４７】
［ｃＤＮＡライブラリーの作製］
この実施例の目的のためには、完全長ｃＤＮＡライブラリーは、Ｃａｒｎｉｎｃｉ Ｐ．  ａｎｄ Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ Ｙ．， ｉｂｉｄらの方法（参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）により作製された。このアプローチは、完全長ｃＤＮＡのクローニングのためにＣａｐトラッパー法を用いる。ＤＮＡフラグメントはＷＯ ０２／０７０７２０ Ａ１（参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）に開示されているように、ｐＦＬＣファージ／ベクターシステムにクローニングされた。本発明を実施するために、ファージ溶液は７％ＤＭＳＯを含むメディウムに保存され、−８０℃で保管された。しかし、本発明は、前述の方法によるライブラリーの作製に限定されるものではなく、当業者が知るところの、他の完全長選択ライブラリーを作製する方法でもよい。
【実施例３】
【００４８】
［ｃＤＮＡからのポリアデニル酸テールの除去］
本発明の目的にために、ＲＮＡまたはｍＲＮＡのフラクションからｃＤＮＡを調製するには、実施例２に記載の方法に、オリゴｄＴプライマーを使って作製したｃＤＮＡからポリアデニル酸テールを除去するために必要な、以下のような改変を加えて行なう。オリゴｄＴストレッチに由来するシーケンスは、クラスＩＩｓ酵素であるＧｓｕＩを用いて、Ｓｈｉｂａｔａ Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． １０４２ ｔｏ １０４４， １０４８−１０４９ （２００１）（参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）らの方法により除去される。
【００４９】
第１鎖の合成には、ＧｓｕＩの認識部位を持った下記の配列のプライマーが使われる。
プライマーＧｓｕＩ−Ｔ１４（配列番号１）：
５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＴＣＧＧＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ
【００５０】
第１鎖合成後、生成物は実施例２に記載されている方法により、Ｃａｐトラッパー法によって完全長ｃＤＮＡを選択するよう処理される。リンカーの連結工程では、下記の配列のオリゴヌクレオチドがリンカーの調製とＭｍｅＩとＸｍａＩＩの認識部位を導入するために使用された。
【００５１】
５’−アダプター ＧＳアダプターＣ Ｎ６−ｕｐ（配列番号２）：
５’−ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＴＣＣＴＡＧＧＴＣＣＧＡＣＮＮＮＮＮＮ
５’−アダプターＧＳアダプターＣ ＧＮ５−ｕｐ（配列番号３）：
５’−ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＴＣＣＴＡＧＧＴＣＣＧＡＣＧＮＮＮＮＮ ５’−アダプターＧＳアダプターＣ ｄｏｗｎ （配列番号４）：
５’− （ｐ）ＧＴＣＧＧＡＣＣＴＡＧＧＡＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣ           
【００５２】
２つの上側鎖を、ＧＮ５とＣＮ６の割合を４：１にして用いる。第２鎖合成後、二本鎖ＤＮＡは実施例２に記載の方法により精製され、その後、下記の条件下でＧｓｕＩにより切断する。
【００５３】
【表１】
2008504805.tif 000003
【００５４】
３０℃で一時間インキュベートした後、下記の溶液を加えた。
【００５５】
【表２】
2008504805.tif 000004
【００５６】
４５℃で１５分間インキュベートした後、フェノール／クロロホルム抽出を下記の要領で行なう。
フェノール／クロロホルム                                ２００μｌ
【００５７】
１５０００ｒｐｍで３分間、室温で遠心分離し、１００μｌの０．１ｘＴＥバッファーで逆抽出を行い、さらにクロロホルムのみで抽出を繰り返す。その後、水層を回収し、マイクロコンYM１００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でマイクロフィルトレーションする。
【００５８】
０．１ｘＴＥバッファーを最終容量が４００μｌになるようにｃＤＮＡに加え、メーカーの説明に従って、フィルトレーションを行なう。回収されるサンプルの量は１５μｌ程度である。
【００５９】
ひとつの見解として、ＧｓｕＩによって作られた２ｂｐの突出末端は、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エクソヌクレアーゼ活性によって平滑末端に変換することができる。この工程は、本発明を実施するのに必須ではなく、２ｂｐのランダム配列の突出末端を持ったアダプターも連結工程に用いることができる。平滑末端にする工程により、元のｃＤＮＡから２ｂｐ除かれることに注意しなくてはならない。
【００６０】
【表３】
2008504805.tif 000005
【００６１】
６５℃で５分間インキュベートした後、氷上で急冷する。ＧｓｕＩで切断した約２０００ｂｐのｃＤＮＡ１００ｎｇは約０．３ｐｍｏｌであると計算され、下記の溶液を平滑化工程のために加える。
【００６２】
【表４】
2008504805.tif 000006
【００６３】
ボルテックスで攪拌した後、０．１％ ＢＳＡ  ２μｌを加え、再度ボルテックスで攪拌する。１ ｕ／μｌ Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１μｌ （１ ｕ）加え、ピペッティングにより静かに混ぜ合わせ、３７℃で５分間インキュベートする。この時、サンプルのインキュベーション時間が長くならないように注意する。
【００６４】
氷で冷やしながらボルテックスで勢い良く攪拌し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを失活させて、下記の溶液を加える。
【００６５】
【表５】
2008504805.tif 000007
【００６６】
４５℃で１５分間インキュベートし、５０μｌのフェノール／クロロホルムを使って抽出をし、水層を回収してマイクロコンＹＭ１００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いてマイクロフィルトレーションで精製する。フィルトレーションはメーカーの説明に従って行なう。
【００６７】
平滑化された３’末端に、下記のオリゴヌクレオチドで示される二本鎖アダプターを連結する。
３’−アダプターＧＳ ３’アダプターＣ ｕｐ（配列番号５）：
５’−（ｐ）ＧＴＣＧＧＡＣＣＴＡＧＧＡＡＴＴＧＣＣＧＴＧ
３’−アダプターＧＳ ３’アダプターＣ Ｂｌｕｎｔ−ｄｏｗｎ （配列番号６）：
５’−ＧＡＴＣＣＡＣＧＧＣＡＡＴＴＣＣＴＡＧＧＴＣＣＧＡＣ                                                
【００６８】
本発明の異なる態様においては、ｃＤＮＡフラグメントはＰＣＲあるいは類似の方法によって増幅され、後の工程のためにＤＮＡ量を増やすことができることに注目すべきである。その場合、プライマーは５’末端と３’末端のアダプターから選んで用いられ、ＰＣＲは高忠実度のＤＮＡポリメラーゼを用いて行なわれる。第２のアダプターを連結した後にＤＮＡを増幅することも可能であるが、通常は、ＰＣＲ反応はより短いＤＮＡの方に高いバイアスがかかり最終ライブラリー中のタグの不均等な分布を引き起こすため、この工程でのＤＮＡ増幅は控える。
【００６９】
３’アダプターの連結工程のために、下記の反応溶液を調製する。（ｃＤＮＡとアダプターの割合は１：＜５０とする）
【００７０】
【表６】
2008504805.tif 000008
【００７１】
１６℃で一晩インキュベートし、その後６５℃で１５分インキュベートしてリガーゼを失活させる。状況に応じて、連結生成物をプロテアーゼＫで処理し、フェノール／クロロホルム抽出を行い、ウルトラフィルトレーションを行なって遊離アダプターを除く処理をすることもできる。しかし、これらの精製工程は、本発明を実施するのに必須ではなく、連結生成物は通常、本実施例で使用するＸｍａＪＩのような普通の制限酵素の反応を行なうに十分である。さらに、遊離アダプターは制限酵素反応後に除去することもできる。
【００７２】
【表７】
2008504805.tif 000009
【００７３】
３７℃で１時間インキュベートした後、酵素を失活させるために６５℃で１５分置く。さらに、ｃＤＮＡフラグメントを精製するために、プロテアーゼＫで処理し、フェノール／クロロホルム抽出、ＰＥＧ沈殿を行なう。この実施例では、アダプターはビオチンやジゴキシゲニンなどの選択的結合物質でラベルされていないので、ＰＥＧ沈殿は、非常に短いフラグメントや遊離アダプターを除去するために行なわれる。フラグメントの精製にラベルされたリンカーを用いる方法を実施例１０に記載している。ＰＥＧ沈殿の以下の反応溶液を用いる。
【００７４】
【表８】
2008504805.tif 000010
【００７５】
室温で１０分間置いた後、室温１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を完全に除去して、２０μｌのＴＥバッファーでチューブの壁をよく洗い沈殿物を完全に再懸濁する。チューブをそのまま室温でしばらく置いた後、新しいシリコナイズされたチューブに溶液を移す。２０μｌのＴＥバッファーで、もとのチューブをよく洗い、サンプルを完全に回収し、ｃＤＮＡ溶液をひとつのチューブに集める（約４０μｌ）。状況に応じて、遊離３’アダプターを除去するために、ＣＬ４Ｂカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）でゲルフィルトレーションを行なうこともできる。
【実施例４】
【００７６】
［ＧＳＣタグの調製］
前述のＧＳＣタグを調製するために、ｃＤＮＡフラグメントは、ＸｍａＪＩの切断によってできた突出末端を用いてセルフライゲーションにより環状化される。分子間のライゲーションよりもセルフライゲーションが起こり易くするために、十分な容量の反応液（１ ｎｇ ＤＮＡ／μｌ）を用いてこの工程を行うことが重要である。以下の反応溶液を用いる（十分な希釈を行なうために、必要であればｃＤＮＡのチューブを数本にわけてもよい）。
【００７７】
【表９】
2008504805.tif 000011
【００７８】
２３℃で２時間、ウォーターバスでインキュベートした後、６５℃に１０分間置いてライゲースを失活させる。生成物はさらに、”ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ”（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、メーカーの説明に従い精製された。
【００７９】
ライゲーションされなかったＤＮＡ、つまり直鎖状ＤＮＡは、エクソヌクレアーゼＩＩＩ処理によって、ライゲーション反応液中より除去される。エクソヌクレアーゼＩＩＩは、制御条件下では、直鎖状二本鎖ＤＮＡのみを切断し、環状ＤＮＡは切断しない。エクソヌクレアーゼＩＩＩ切断のための反応液は以下の通りである。
【００８０】
【表１０】
2008504805.tif 000012
【００８１】
３７℃で３０分間インキュベートした後、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ６μｌを加える。その後、エクソヌクレアーゼＩＩＩを６５℃で１５分間置いて失活させ、氷上で冷却する。前述のように、プロテアーゼＫ処理と、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行なってＤＮＡを精製する。沈殿物を１５μｌの０．１ｘＴＥバッファーに溶解する。
【００８２】
ここまでの工程で、通常、ＤＮＡ量はかなり少なくなっており、多くの場合、タグのクローニングのために必要な十分な量のＤＮＡを得るには増幅工程が必要となる。上記の第２のリンカーを連結した後、ＰＣＲによる増幅を行なわなかった場合は特に、ＤＮＡ量が不足となる場合が多い。環状ＤＮＡのみを増幅するために、ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、製品番号２５−６４００−１０、本説明書は参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）を使ってローリングサークル増幅を行なうことができるがこれに限定されるものではない。このキットはＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼと６塩基のランダムプライマーを用いて増幅を行なうキットである。通常、増幅反応には１ｎｇの環状ＤＮＡがあれば良く、４〜１２時間の反応後１μｇのＤＮＡを得ることができる。この反応は、鋳型量の過剰が問題となることがあるので、複数の反応を平行して行なうのが良い。そうでない場合は、メーカーの指示に従って増幅反応を行なう。反応生成物は、非常に長いＤＮＡを含むため、非常に粘張になることがあるので注意する。
【００８３】
増幅反応の生成物はクラスＩＩＳ酵素で切断する。この実施例ではＭｍｅＩを用いる。粘張なＤＮＡ溶液はピペッティングし易いように、希釈しても良い。ＭｍｅＩの反応は以下の反応液を用いる。
【００８４】
【表１１】
2008504805.tif 000013
【００８５】
３７℃で１時間インキュベートした後、プロテアーゼＫ処理とフェノール／クロロホルム抽出により反応溶液を精製し、下記の条件で沈殿させる。
【００８６】
【表１２】
2008504805.tif 000014
【００８７】
−２０℃で３０分間インキュベートした後、４℃で１５０００ｒｐｍ、１５分間遠心し、沈殿物を８０％エタノールで２回洗浄した後、沈殿物を５０μｌのＨ2Ｏに溶解する。ＭｍｅＩ切断が不十分な場合があるので、次の工程に進む前に反応生成物をゲル電気泳動で確認する。
【００８８】
ＭｍｅＩの切断によって作られた短いＧＳＣタグは残りのｃＤＮＡフラグメントから分離される。理論的には、ＧＳＣタグは５８ｂｐ（ｃＤＮＡフラグメント両端より２０ｂｐで切断され、加えてリンカーからの３つの認識部位１８ｂｐ）程度であるが、ＭｍｅＩの切断が正確でないことがあるので４〜８ｂｐ程度の範囲でバリエーションがある。しかし、５８ｂｐ程度の長さのＧＳＣタグは、ｃＤＮＡフラグメントよりはるかに短く、またそれ以前の調製の工程で用いたリンカーよりは長いので、従って、ＧＳＣタグはサイズ選択によって精製することができる。
【００８９】
ＧＳＣタグは、その他のｃＤＮＡフラグメントからアガロース電気泳動によって分離することができる。電気泳動は以下の方法によって行なう。
【００９０】
【表１３】
2008504805.tif 000015
【００９１】
ゲル：５％ ＳｅａＰｌａｑｕｅ／ １ｘＴＡＥ／ ＥｔＢｒ＋， Ｍｕｐｉｄ Ｍｉｎｉ Ｇｅｌ
バッファー：１ｘ ＴＡＥバッファー／ＥｔＢｒ＋
実施：Ｍｕｐｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ， ５０Ｖ， １５０分
【００９２】
電気泳動の後、３６５nmのUVを当てて、サイズマーカーと比べながら、GSCタグのサイズのバンドを切り出す。ゲルを切り出すとき、できるだけ薄く切るように注意する。さらに、５８ｂｐのバンドを正確に切り出すことが重要であり、ＤＮＡを多く回収するよりも、正確に切り出す方が好ましい。
【００９３】
切り出したゲルをチューブに入れ、３００μｌのTEバッファーを加えて１時間から一晩、氷上に置いてＧＳＣタグを溶出させる。さらに、マイクロスピンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて、メーカーの指示に従ってゲルからＧＳＣタグを回収する。ＧＳＣタグは７００μｌ程度の容量に溶出される。
【００９４】
ゲルの精製工程の後、ＧＳＣタグは、マイクロコンＹＭ−１０メンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて濃縮され、２０μｌ程度の溶液となる。
【実施例５】
【００９５】
［ＧＳＣタグのコンカテネーション］
個々のＧＳＣタグは、ＭｍｅＩの切断によって出来たＮ２突出末端を使ってコンカテマーへ連結される。１６種類の異なる突出末端がありえるが、たいていのサンプルの複雑性は異なるＧＳＣタグのコンカテネーションを行なうのに十分である。しかし、場合によっては、コンカテネーションの工程の前に、ＧＳＣタグを平滑末端化するほうが良い時があり、この場合にはタグの長さが、短くなる。ＭｍｅＩ部位の平滑化の例は以下の通りである。
【００９６】
ライゲーション反応溶液を下記の成分を０．２μｌのＰＣＲチューブの中で混合する。
【表１４】
2008504805.tif 000016
【００９７】
１６℃で５分間インキュベートする。このライゲーション反応は５分以上行なわないように注意する。０．５μｌの１０％ＳＤＳ溶液を加えて、６５℃で３分間置いてリガーゼを失活させる。
【００９８】
コンカテマーに十分な数のＧＳＣタグが連結されていることを確認するため、必須の工程ではないが、コンカテネーション生成物のサイズ分画を行い、通常５００ｂｐ以上のフラグメントを単離する。
【００９９】
コンカテマーのサイズ分画は、通常以下の条件下でアガロース電気泳動により行なわれる。
ゲル：０．８％ ＳｅａＰｌａｑｕｅ／１ｘＴＡＥ／ＥｔＢｒ＋
バッファー：１ｘ ＴＡＥ ｂｕｆｆｅｒ／ＥｔＢｒ＋
実施：５０Ｖ， １７０分， ４°Ｃ
【０１００】
５００ｂｐから７００ｂｐのフラグメントを切り出し、ＤＮＡを前述の方法により溶出する。ＤＮＡはさらに、マイクロスピンカラム（マイクロコン  ＹＭ−１０、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて濃縮することができる。
【０１０１】
この実施例では、コンカテネーション生成物は平滑末端化されてベクターへ連結される。Ｎ２の突出末端を持ったベクターを調製することもできるが、できるだけすべての組み合わせをクローニングするためには、コンカテマーを平滑末端化する方が望ましい。平滑末端化の工程は以下の通りである。
【０１０２】
【表１５】
2008504805.tif 000017
６５℃で５分間インキュベートした後、１分間氷上に置き、その後下記の溶液を加える。
【０１０３】
【表１６】
2008504805.tif 000018
【０１０４】
３７℃で５分間ウォーターバス中で水を循環させない状態でインキュベートする。その後、ボルテックスで１０分間、勢い良く攪拌することによりＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを失活させる。その後、プロテアーゼＫ処理とフェノール／クロロホルム抽出を行なう。
【実施例６】
【０１０５】
［ライゲーションのためのｐＧＳＣ調製］
この実施例では、ｐＧＳＣベクターを用いて本発明を実施するが、本発明は他のベクターを用いても実施することができる。ＧＳＣタグの平滑末端を利用するために、ベクターをＨｐａＩで切断する。切断反応は以下の通り行なう。
【０１０６】
【表１７】
2008504805.tif 000019
【０１０７】
３７℃で２時間インキュベートし、一部をゲル電気泳動にかけて、完全に切断されているかを確認する。切断が完全に行なわれていることを確認した後、プロテアーゼＫ処理、フェノール／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿により直鎖状ＤＮＡを精製する。ＤＮＡは最終的に４０μｌのＨ2Ｏに溶解する。
【０１０８】
ベクターのセルフライゲーションを防止するため、ウシ小腸由来のアルカリフォスファターゼを用いて、脱リン酸化を行なうことが望ましい。反応は以下の通り行なう。
【０１０９】
【表１８】
2008504805.tif 000020
【０１１０】
３７℃で１５分間インキュベートした後、５０℃で１５分酵素を失活させる。プロテアーゼＫ処理とフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿によりＤＮＡを精製する。最終的に、ＤＮＡ沈殿を８０μｌのＨ2Ｏに溶解する。
【０１１１】
さらに、下記の条件により、アガロースゲルを使ってさらにＤＮＡを精製することが望ましい。
【０１１２】
【表１９】
2008504805.tif 000021
ゲル：０．８％ ＳｅａＰｌａｑｕｅ／１ｘＴＡＥ／ＥｔＢｒ＋， Ｍｕｐｉｄ ｓｍａｌｌ ｇｅｌ ｕｓｉｎｇ ｗｉｄｅ ｗｅｌｌｓ
バッファー：１ｘ ＴＡＥバッファー／ＥｔＢｒ＋
実施：３５Ｖ，１６０分
【０１１３】
電気泳動の後、２８００ｂｐに相当するバンドを、３６５ｎｍのＵＶを照射してサイズマーカーと比較しながら切り出す。ゲルからのＤＮＡの溶出は以下の通り行なう。
【０１１４】
６５℃で５分間加熱し、ゲルが完全に融解したことを確認する。８００μｌのβ−アガラーゼ／バッファーミックス（ＮＥＢ社）を加え、４２℃で５時間インキュベートする。５ＭのＮａＣｌを反応液の９分の１量加え、フェノール／クロロホルム抽出を行なう。イソプロパノールを用いて、水層よりＤＮＡを沈殿させ、８０％エタノールで２回洗浄後、３０μｌのＨ2Ｏに沈殿を溶解する。約５μｇのベクターが回収され、−２０℃で保存可能である。
【実施例７】
【０１１５】
［ベクターｐＧＳＣへのＧＳＣタグコンカテマーの連結］
実施例５で調製した精製コンカテマーを、実施例６で調製したベクターｐＧＳＣ／ＨｐａＩ／ＣＩＰに連結する。連結反応のために、下記の通りのＤＮＡ濃縮沈殿を行なう。
【０１１６】
【表２０】
2008504805.tif 000022
ライゲーション割合：
ｐＧＳＣベクター：濃縮ＧＳＣ−タグ＝ １：２（モル）
【０１１７】
−２０℃で３０分以上インキュベートし、４℃で１５０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離して沈殿を回収する。上清を捨て、沈殿物を８０％エタノールで洗浄し、２６μｌの０．１ｘＴＥバッファーに溶解する。ライゲーション反応は以下の通り行なう。
【０１１８】
【表２１】
2008504805.tif 000023
【０１１９】
１６℃で３０分間インキュベートした後、６５℃で１０分間置いてライゲースを失活させる。通常、ライゲーション反応生成物はバクテリアへ形質転換できるが、ライゲーション生成物を精製した方が長期保管や電気泳動のための脱塩のために有利である。
【０１２０】
形質転換のために、通常は以下の方法を用いるが、他の方法やバクテリアをつかっても同様に行なうことができる。
サンプル：５ ｎｇ／μｌ，２ μｌ
バクテリア：ＤＨ１０Ｂ Ｔ１ファージ耐性 （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），２０ μｌ
【０１２１】
通常、セルポレーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、メーカーの指示に従い形質転換を行なう。エレクトロポレーションの後、１０μｌのバクテリアをクロラムフェニコール（１２．５μｇ／μｌ）を含むＬＢメディウム上に塗布する。３７℃で一晩培養後、コロニーを得る。プレートに播いた残りのバクテリアは−８０℃でグリセロールストックとして保管できる。
【実施例８】
【０１２２】
［ＧＳＣタグライブラリーのインサートサイズ確認］
大規模な塩基配列決定を行なう前に、ＧＳＣタグライブラリーのインサートサイズを確認することは有益である。ＧＳＣライブラリーのインサートサイズは以下の方法により確認できる。
【０１２３】
【表２２】
2008504805.tif 000024
【０１２４】
３７℃で２時間インキュベートした後、一部を採ってゲル電気泳動する。
【０１２５】
【表２３】
2008504805.tif 000025
ゲル：１％アガロース（ＥｔＢｒ ＋，１ｘ ＴＢＥ）， Ｍｕｐｉｄ ｇｅｌ
バッファー：１ｘＴＢＥバッファー
電気泳動システム：Ｍｕｐｉｄ
実施：１００Ｖ，３０分
【実施例９】
【０１２６】
［ライブラリー調製のためのオリゴヌクレオチドの精製］
この実施例で使われるオリゴヌクレオチドはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より入手し、１０％ポリアクリルアミド、７Ｍ  尿素、１ｘＴＢＥバッファーを使った電気泳動により精製される。
【実施例１０】
【０１２７】
［ストレプトアビジンコート磁気ビーズによるＰＣＲ生成物の回収］
ビオチン化リンカーかＰＣＲプライマーを使用した場合、反応性生物はストレプトアビジンとビオチンの相互作用を介して磁気ビーズに結合される。通常、Ｔａｋａｒａ ＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡ （Ｔａｋａｒａ社）を用いて、メーカーの維持に従って行なう。サンプル調製は以下の通り行なう。
【０１２８】
【表２４】
2008504805.tif 000026
【０１２９】
磁気ビーズは、懸濁液より調製される。１５０μｌのＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡを磁気スタンドに２分間静置し、上清を除去した後、１ｘ結合バッファーを２００μｌ加え、ボルテックスで静かに攪拌する。磁気を加えて上清を除去し、２ｘ結合バッファー （Ｔａｋａｒａ社）で洗浄を繰返した後、１ｘ結合バッファーに置換する。
【０１３０】
２００μｌのＰＣＲ生成物を磁気ビーズに加え、室温で１５分間、かき混ぜながらインキュベートする。磁気を加えて上清を除去し、磁気ビーズを２５０μｌの１ｘ結合バッファーで３回洗浄する。
【０１３１】
適当な制限酵素による処理によって、ｃＤＮＡフラグメントをビーズから切り離す。この実施例では、ＸｍａＪＩを用いて、実施例３記載の条件により行なう。
【実施例１１】
【０１３２】
［末端塩基配列決定］
タイターを確認後、バクテリアクローンを市販の釣菌器（Ｑ−ｂｏｔとＱ−ｐｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社）によって集め、３８４穴プレートに移す。形質転換された大腸菌クローンはＤＮＡベクターを保持し、３８４穴プレートに移された後、９６穴プレートで培養される。一晩培養後、プラスミドを、手で（Ｉｔｏｈ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５ ，１９９７， １３１５−１３１６）あるいは機械を用いて自動で（Ｉｔｏｈ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ９ ，１９９９， ４６３−４７０）回収する。塩基配列決定は、ＲＩＳＡシーケンシングユニット（島津製作所製）あるいはパーキンエルマー−アプライドバイオシステムズ社のＡＢＩ３７００を用いて、Ｓｈｉｂａｔａ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１０  （２０００）１７５７−１５７１（参照することにより本明細書に組み込まれるものとする）に記載されているような標準的な方法によって行なった。塩基配列決定は、もうひとつの方法として、クローニングベクターのフランキング部位からプライマーを使い、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖ１．１（アプライドバイオシステムズ社、カタログ番号４３３７４４９）とＡＢＩ３７００（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、メーカーの指示に従って行なわれた。
【０１３３】
ベクターｐＦＬＣあるいはｐＧＳＣファミリーに用いた標準プライマーは以下のものを含む。
Ｍ１３リバースプライマー（配列番号７）：
５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ
Ｍ１３ （−２０）フォワードプライマー（配列番号８）：
５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ
【実施例１２】
【０１３４】
［シーケンスタグのキャラクタリゼーション］
各々のシーケンスタグは、アライメントのための標準的ソフトウェアであるＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)、アクセルリス社(http://www.accelrys.com/)のＧｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＳＧ）ｐａｃｋａｇｅで入手できるＦＡＳＴＡや、類似のソフトウェアを用いて解析できる。これらのソフトウェアにより、シーケンスタグは単一のあるいは重複のないタグとして解析、アライメントされ、それらはさらにデータベース解析に用いることができる。
【実施例１３】
【０１３５】
［シーケンスタグのゲノム上へのマッピング］
この実施例で得られた個別のタグは、一部あるいは全体の塩基配列が入手されたゲノム上の転写領域を同定するのに用いることができる。これらの解析は、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)などの標準的ソフトウェアを用いてシーケンスタグをゲノム配列に並べて実行することができる。ヒトやラット、マウスのようなゲノムサイズが大きいものの場合には、コンカテマーより得られる元の塩基配列情報を拡げることが必要な場合もある。拡げられた塩基配列により、ゲノム上で活発に転写されている領域をさらに正確に同定することができる。
【実施例１４】
【０１３６】
［シーケンスタグの統計的解析］
サンプルに含まれる同じ複数種のｍＲＮＡから得られるシーケンスタグや同じｃＤＮＡライブラリーの核酸フラグメントは、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)のような標準ソフトウェアを用いて、重複のないシーケンスタグとして同定し解析することができる。すべての重複のないシーケンスタグを個々に数え、さらに同じサンプルから得られたすべてのタグ数に対する重複のないタグ数の割合を解析する。この個々のタグのすべてのタグ数に対する割合は、複数のｍＲＮＡやｃＤＮＡライブラリーの中の転写物の定量化を可能とする。このようにして得られたそれぞれのサンプルから得られた結果は、さらに他のサンプルから得られた結果と比べることにより、発現パターンの比較をすることができる。
【実施例１５】
【０１３７】
［転写開始点の同定］
ゲノム上にマッピングされた５’末端のシーケンスタグにより、制御配列を同定することが可能である。遺伝子では、通常、ＤＮＡの転写領域の５’末端上流が多くの制御因子を含んでおり、この因子が遺伝子の発現制御に使われている。これらの制御配列については、さらに、転写因子の結合領域に関する情報を含むデータベースを調査することにより機能的な解析をするこができる。公開されている転写因子の結合領域に関する情報やプロモーター解析の情報を含むデータベースには以下のようなものがある。
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｒｅｇｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ （ＴＲＲＤ）
(http://wwwmgs.bionet.nsc.ru/mgs/dbases/trrd4/)
ＴＲＡＮＳＦＡＣ
(http://transfac.gbf.de/TRANSFAC/)
ＴＦＳＥＡＲＣＨ
(http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)
Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｉｎｓｐｅｃｔｏｒ  （Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ Ｓｏｆｔｗａｒｅ (http://www.genomatix.de/)
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】図１は、ｃＤＮＡ第一鎖のプライミングとポリアデニル酸を除く工程を表す。
【図２】図２は、リンカーを連結する工程を表す。
【図３】図３は、増幅の工程を表す。
【図４】図４は、酵素による切断とコンカテネーションの工程を表す。
【図５】図５は、クローニングの工程を表す。
【図６】図６は、ベクターｐＧＳＣの構造を表す。
【図７】図７は、ポリアデニル酸を持たないターゲットに対する工程を表す。
【図８】図８は、ハイブリダイゼーション用プローブ調製の工程を表す。
【図９】図９は、タイリングアレイを用いたｉｎ  ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションの工程を表す。
【図１】
2008504805.tif 000027
【図２】
2008504805.tif 000028
【図３】
2008504805.tif 000029
【図４】
2008504805.tif 000030
【図５】
2008504805.tif 000031
【図６】
2008504805.tif 000032
【図７】
2008504805.tif 000033
【図８】
2008504805.tif 000034
【図９】
2008504805.tif 000035
【配列表】
2008504805000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月27日(2007.6.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
直鎖状の核酸分子の両端の領域に対応する塩基配列を含むＤＮＡフラグメントを調製する方法であって、
ａ）核酸分子から直鎖状ＤＮＡ分子を作る工程と、
ｂ）認識部位の外側かつ直鎖状ＤＮＡ分子内の部位を切断する制限エンドヌクレアーゼによる認識部位とクローニング部位とをもつリンカーを前記直鎖状ＤＮＡ分子の両端に連結する工程と、
ｃ）環状ＤＮＡ分子を作るようにリンカー内の前記クローニング部位で前記直鎖状ＤＮＡ分子を閉じることにより、前記直鎖状ＤＮＡ分子を環状化する工程と、
ｄ）前記制限エンドヌクレアーゼにより前記環状ＤＮＡ分子を切断し、前記直鎖状ＤＮＡの両端を含むＤＮＡフラグメントを切り出す工程と、
ｅ）ＤＮＡフラグメントを回収する工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記核酸分子が、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリＡテールを有するｍＲＮＡ、ポリＡテールを欠いたｍＲＮＡ及びそれらの任意の混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ａ）の核酸分子がポリＡテールを有するｍＲＮＡであり、工程ａ）が、逆転写酵素及びプライマーによって前記ｍＲＮＡを相補的ＤＮＡに変換することを含み、
前記プライマーが、ポリＡテールを有するＲＮＡから逆転写反応のプライミングに用いられたオリゴｄＴのストレッチを除くために、クラスＩＩＳ又はクラスＩＩＩ認識部位を含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＲＮＡの両端の領域に対応する塩基配列を含むＤＮＡフラグメントを調製する方法であって、
ａ）ＲＮＡから直鎖状ＤＮＡ分子を作る工程と、
ｂ）認識部位の外側かつ直鎖状ＤＮＡ分子内の部位を切断する制限エンドヌクレアーゼによる認識部位とクローニング部位とをもつリンカーを前記直鎖状ＤＮＡ分子の両端に連結する工程と、
ｃ）環状ＤＮＡ分子を作るようにリンカー内の前記クローニング部位で前記直鎖状ＤＮＡ分子を閉じることにより、前記直鎖状ＤＮＡ分子を環状化する工程と、
ｄ）前記制限エンドヌクレアーゼにより前記環状ＤＮＡ分子を切断し、前記直鎖状ＤＮＡ分子の両端を含むＤＮＡフラグメントを切り出す工程と、
ｅ）ＤＮＡフラグメントを回収する工程と
を含み、工程ａ）は、
１）一本鎖突出領域を含む二本鎖リンカーを調製する工程と、ここで、前記一本鎖突出領域は、前記ＲＮＡの３’末端塩基配列に相補的であり、
２）前記一本鎖突出領域と前記ＲＮＡの３’末端領域をハイブリダイズし、前記二本鎖リンカーに前記ＲＮＡの３’末端を結合する工程と、
３）逆転写酵素を用いてリンカーの突出領域の３’末端からＲＮＡに相補的な鎖を伸長させる工程と、
ｄ）逆転写反応の生成物から直鎖状ＤＮＡ分子を分離する工程と
を含む方法。
【請求項５】
前記ＲＮＡが、キャプトラップ法又はオリゴキャッピング法により濃縮され、それによって全長ｃＤＮＡが工程ａ）において調製される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ｍＲＮＡのポリＡテールに由来する任意の相補配列が直鎖状ｃＤＮＡ分子から除去される請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記制限エンドヌクレアーゼが、クラスＩＩＳ制限酵素、クラスＩＩＧ制限酵素、クラスＩＩＩ制限酵素、ＧｓｕＩ、ＭｍｅＩ、ＢｐｍＩ、ＢｓｇＩ、ＥｃｏＰ１５Ｉ及びその任意の混合物からなる群から選択される請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記リンカーが選択的結合をする物質に結合され、その結合を用いて濃縮することができる請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
選択的結合をする物質が、ビオチン及びジゴキシゲニンからなる群から選択され、前記選択的結合をする物質に結合する高親和性結合物質が、アビジン、ストレプトアビジン、アビジン若しくはストレプロアビジンの誘導体、抗ジゴキシゲニン抗体からなる群から選ばれる請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記リンカーの少なくとも一つが、前記ＤＮＡフラグメントをラベルするために用いられる塩基配列要素を含む請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記直鎖状ＤＮＡフラグメントがエクソヌクレアーゼによって前記環状ＤＮＡ分子から除去される請求項１又は４に記載の方法。
【請求項１２】
エクソヌクレアーゼがエクソヌクレアーゼＩＩＩ、エクソヌクレアーゼＩ、又はその混合物である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
環状ＤＮＡ分子を増幅する工程をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
環状ＤＮＡ分子を増幅する工程がローリングサークル反応により行われる請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法により調製された前記ＤＮＡフラグメントを互いに連結させる工程を含む、コンカテマーの調製方法。
【請求項１６】
ベクターｐＧＳＣ。
【請求項１７】
直鎖状核酸分子の末端塩基配列の情報を得るための方法であって、
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法により、ＤＮＡフラグメントを調製する工程と、
前記ＤＮＡフラグメントを互いに連結させてコンカテマーを作製する工程と、
前記コンカテマーの塩基配列を決定して直鎖状核酸分子の末端塩基配列における情報を得る工程と
を含む方法。
【請求項１８】
前記ＤＮＡフラグメントは、混合サンプルから調製される請求項１又は４の方法。
【請求項１９】
前記混合サンプル中のＤＮＡフラグメントの起源が、リンカーに由来するスペーサー中の短い特異的塩基配列であるラベルによって追跡可能である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
逆転写反応を進める方法であって、
ａ）ＲＮＡの３’末端領域の配列に相補的な一本鎖突出領域を含む二本鎖リンカーを調製する工程と、
ｂ）前記一本鎖突出領域をＲＮＡの３’領域にハイブリダイズし、前記二本鎖リンカーを前記ＲＮＡの３’末端に連結させる工程と、
ｃ）逆転写酵素を用いてリンカーの突出領域の３’末端からＲＮＡに相補的な鎖を伸長させる工程と
を含む方法。
【請求項２１】
前記リンカーの突出部分がオリゴｄＴから構成される請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記リンカーの突出部分が、ランダムな配列を有する請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
ポリＡテールを有するｍＲＮＡとポリＡテールを有さないｍＲＮＡとを選別する方法であって、
ａ）一本鎖突出領域を有する二本鎖リンカーを調製する工程と、ここで第一のリンカーの突出領域はオリゴｄＴを有し、前記オリゴｄＴ突出領域の３’末端はブロックされているが、第二のリンカーの突出領域はランダムな配列を有し、前記ランダム配列の突出領域の３’末端はブロックされていない、
ｂ）前記一本鎖突出領域をＲＮＡの３’末端にハイブリダイズし、前記二本鎖リンカーを一以上のライゲーション反応により前記ＲＮＡの３’末端に連結させる工程と、
ｃ）逆転写反応を行い、第二のリンカーの３’突出領域から鎖を伸長させる工程と、
ｄ）第一のリンカーに連結したＲＮＡを選択する工程と、
ｅ）第二のリンカーからの逆転写反応産物から、直鎖状ＤＮＡ分子を分離する工程と
を含む方法。
【請求項２４】
ＲＮＡを分画するために、リンカーが選択的結合物質に結合されている請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
濃縮のために、リンカーを高親和性選択的結合物質に結合する工程をさらに含む請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、選択的結合物質がビオチンおよびジゴキシゲニンからなる群から選択され、高親和性選択的結合物質がアビジン、ストレプトアビジン、アビジンまたはストレプトアビジンの誘導体、及び抗ジゴキシゲニン抗体からなる群から選択される方法。
【国際調査報告】
2008504805.tif 000038
2008504805.tif 000039
2008504805.tif 000040
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