(57)【要約】本発明は、標的核酸の２つの末端を含むより小さい核酸を生成するために、標的核酸フラグメントを調製するための方法を提供する。具体的に、本発明は、大きい標的核酸の２つの末端を、迅速なクローニング、配列決定、または増幅のための単一の小さいＤＮＡ構築物に分離するためのクローニングストラテジーおよびＤＮＡ操作ストラテジーを提供する。本発明の方法は、ＤＮＡの大きいフラグメント由来の末端を含むＤＮＡ構築物のライブラリーを産生するために、複数の標的ＤＮＡフラグメントにおいて同時に行われ得る。本発明の１つの利点は、ライブラリーが原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞を使用することなくインビトロで構築され得ることである。
2008545448.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸の２つの末端領域を含むＤＮＡ構築物を得るための方法であって、
（ａ）標的核酸を生成するために、大きい核酸分子を断片化する工程；
（ｂ）第１の環状核酸分子を形成するために、該標的核酸に捕捉エレメントをライゲーションする工程；
（ｃ）該捕捉エレメントによって分割された該標的核酸の２つの末端を含む直鎖状核酸を生成ために、該標的核酸を切断するが該捕捉エレメントを切断しない制限エンドヌクレアーゼによって該第１の環状核酸を消化する工程；
（ｄ）第２の環状核酸を形成するために、分割エレメントを有する該直鎖状核酸をライゲーションする工程；
（ｅ）該第２の環状核酸を環状の一本鎖核酸に変換する工程；
（ｆ）一本鎖のローリングサークル型増幅産物を生成するために、第１のオリゴヌクレオチドを該環状の一本鎖核酸にアニーリングさせそしてローリングサークル型増幅によって該環状の一本鎖核酸を増幅する工程；
（ｇ）該一本鎖のローリング型増幅産物中に複数の二本鎖領域を形成するために、第２のオリゴヌクレオチドを該一本鎖のローリングサークル型増幅産物にアニーリングさせる工程；および
（ｈ）標的核酸の２つの末端領域を含む該ＤＮＡ構築物を生成するために、該複数の二本鎖領域を切断する制限エンドヌクレアーゼによって該一本鎖のローリングサークル型増幅産物を小さいフラグメントへと消化する工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
前記断片化する工程の後に、前記標的核酸フラグメントをサイズ分画し、そして好ましいサイズの標的核酸フラグメントを選択する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記捕捉エレメントまたは前記分割エレメントにアニーリングする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記捕捉エレメントまたは前記分割エレメントにアニーリングする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記制限エンドヌクレアーゼが、Ｉ型制限エンドヌクレアーゼまたはＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記標的核酸は、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも１０ｋｂまたは少なくとも５ｋｂである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記標的核酸は、５０ｋｂと３ｋｂとの間、２０ｋｂと３ｋｂとの間、または１０ｋｂと３ｋｂとの間である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記捕捉エレメントまたは前記分割エレメントは、マーカー遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記マーカー遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記捕捉エレメントまたは前記分割エレメントは、真核生物の複製起点または原核生物の複製起点を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記捕捉エレメントまたは前記分割エレメントは、ビオチン化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記消化する工程の後に、捕捉エレメントを含む核酸フラグメントを単離する工程をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
標的核酸の２つの末端領域を含むＤＮＡ構築物を得るための方法であって、
（ａ）標的核酸を生成するために、大きい核酸分子を断片化する工程；
（ｂ）アダプターを該標的核酸の各末端にライゲーションする工程；
（ｃ）環状核酸分子を形成するために、表示タグを該標的核酸にライゲーションする工程；
（ｄ）標的核酸の２つの末端領域を含む該ＤＮＡ構築物を生成するために、該標的核酸を切断するが該アダプターまたは該表示タグを切断しない制限エンドヌクレアーゼによって環状核酸を消化する工程；
を包含する、方法。
【請求項１４】
前記断片化する工程の後に、前記標的核酸フラグメントをサイズ分画し、そして好ましいサイズの標的核酸フラグメントを選択する工程をさらに包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記工程（ｄ）の後に、前記ＤＮＡ構築物を増幅する工程をさらに包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記増幅が、
（ｅ）アダプターを前記ＤＮＡ構築物の末端にライゲーションする工程；および
（ｆ）該ＤＮＡ構築物をＰＣＲによって増幅する工程；
によって行なわれる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記制限エンドヌクレアーゼが、Ｉ型制限エンドヌクレアーゼまたはＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的核酸は、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも１０ｋｂまたは少なくとも５ｋｂである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的核酸は、５０ｋｂと３ｋｂとの間、２０ｋｂと３ｋｂとの間、または１０ｋｂと３ｋｂとの間である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記表示タグは、マーカー遺伝子または複製起点を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記アダプターまたは前記表示タグは、ビオチン化される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記消化する工程の後に、表示タグまたはアダプターを含む核酸フラグメントを単離する工程をさらに包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
標的核酸の２つの末端領域を含むＤＮＡ構築物を得るための方法であって、
（ａ）標的核酸を生成するために、大きい核酸分子を断片化する工程；
（ｂ）アダプターでタグ化された標的核酸を形成するために、第１のアダプターを該標的核酸の一方の末端にライゲーションし、そして第２のアダプターを該標的核酸の第２の末端にライゲーションする工程；
（ｃ）標的核酸領域およびアダプター領域を含む環状核酸分子を形成するために、該第１のアダプターを該第２のアダプターにライゲーションすることによって該アダプターでタグ化された標的核酸を環化する工程；
（ｄ）標的核酸の２つの末端領域を含む該ＤＮＡ構築物を生成するために、該標的核酸領域にて該環状核酸分子を断片化する工程；
を包含する、方法。
【請求項２４】
前記大きい核酸または前記標的核酸が、工程（ｂ）の前にメチラーゼによってメチル化される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記メチル化は、１種以上の制限エンドヌクレアーゼによる前記標的核酸の制限エンドヌクレアーゼ切断を防ぐ、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記アダプターは、ヘアピンアダプターである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
（ｂ１）両方の末端でヘアピンアダプターにライゲーションされていないあらゆる標的核酸を消化するために、前記アダプターでタグ化された標的核酸をエキソヌクレアーゼによって処理する工程；
（ｂ２）該エキソヌクレアーゼを該アダプターでタグ化された標的核酸から除去する工程；
を工程（ｂ）の後にさらに包含する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
（ｂ３）両方の末端に切断されたアダプターを有するアダプターでタグ化された標的核酸を産生するために、前記第１のアダプターおよび前記第２のアダプターを切断しかつ前記標的核酸を切断しない制限エンドヌクレアーゼによって、前記アダプターでタグ化された標的核酸を消化する工程；
を工程（ｂ）と工程（ｃ）との間にさらに包含する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
環化されていない標的核酸を除去する工程を工程（ｃ）の後にさら包含する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記環化されていない標的核酸を除去する工程が、該標的核酸とエキソヌクレアーゼとを接触させる工程を包含する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
工程（ｄ）が、機械的せん断によって行なわれる、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記アダプターは、ビオチン化される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
アビジンまたはストレプトアビジンでコーティングされた固体支持体を用いたアフィニティー精製によって前記アダプターでタグ化された標的核酸を精製する工程を工程（ｂ）の後にさらに包含する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
アビジンまたはストレプトアビジンでコーティングされた固体支持体を用いたアフィニティー精製によって前記ＤＮＡ構築物を精製する工程を工程（ｄ）の後にさらに包含する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記標的核酸は、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも１０ｋｂまたは少なくとも５ｋｂである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３６】
前記標的核酸は、５０ｋｂと３ｋｂとの間、２０ｋｂと３ｋｂとの間、または１０ｋｂと３ｋｂとの間である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３７】
前記標的核酸は、少なくとも５００ｂｐ〜１ｋｂの間、１ｋｂと３ｋｂとの間または５００ｂｐと３ｋｂとの間である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３８】
標的核酸の２つの末端領域を含む前記ＤＮＡ構築物は、１０ｋｂ未満のサイズである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３９】
標的核酸の２つの末端領域を含む前記ＤＮＡ構築物は、２０ｋｂ未満のサイズである、請求項２３に記載の方法。
【請求項４０】
標的核酸の２つの末端領域を含む前記ＤＮＡ構築物は、４０ｋｂ未満のサイズである、請求項２３に記載の方法。
【請求項４１】
標的核酸の２つの末端領域を含む前記ＤＮＡ構築物は、５ｋｂ未満のサイズである、請求項２３に記載の方法。
【請求項４２】
標的核酸の２つの末端領域を含む前記ＤＮＡ構築物は、３ｋｂ未満のサイズである、請求項２３に記載の方法。
【請求項４３】
標的核酸の２つの末端領域を含む前記ＤＮＡ構築物は、１ｋｂ未満のサイズである、請求項２３に記載の方法。
【請求項４４】
標的核酸の２つの末端領域を含む前記ＤＮＡ構築物は、５００ｂｐ未満のサイズである、請求項２３に記載の方法。
【請求項４５】
標的核酸の２つの末端領域を含む前記ＤＮＡ構築物は、３００ｂｐ未満のサイズである、請求項２３に記載の方法。
【請求項４６】
標的核酸の２つの末端領域を含むＤＮＡ構築物を得るための方法であって、
（ａ）標的核酸を生成するために、大きい核酸分子を断片化する工程；
（ｂ）環状核酸分子を形成するために、捕捉エレメントを該標的核酸にライゲーションする工程；
（ｃ）該捕捉エレメントによって分割された標的核酸の２つの末端領域を含む該ＤＮＡ構築物を生成するために、該標的核酸を切断するが該捕捉エレメントを切断しない制限エンドヌクレアーゼによって該環状核酸を消化する工程；
を包含する、方法。
【請求項４７】
前記捕捉エレメントは、結合対の１つのメンバーを含む核酸である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記結合対は、ＦＬＡＧ／抗ＦＬＡＧ抗体、ビオチン／アビジン、およびビオチン／ストレプトアビジンからなる群より選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記捕捉エレメントは、ビオチン化される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記結合対の第２のメンバーを備える固体支持体を使用するアフィニティー精製によって前記ＤＮＡ構築物を濃縮する工程をさらに包含する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記大きい核酸または前記標的核酸は、工程（ｂ）の前にメチラーゼによってメチル化される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
前記メチル化は、１種以上の制限エンドヌクレアーゼによる前記標的核酸の制限エンドヌクレアーゼ切断を防ぐ、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
環化されていない標的核酸を除去する工程を工程（ｂ）の後にさらに包含する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
前記環化されていない標的核酸を除去する工程が、該標的核酸とエキソヌクレアーゼとを接触させる工程を包含する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記標的核酸は、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも１０ｋｂまたは少なくとも５ｋｂである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５６】
前記標的核酸は、５０ｋｂと３ｋｂとの間、２０ｋｂと３ｋｂとの間、または１０ｋｂと３ｋｂとの間である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５７】
標的核酸の２つの末端領域を含む前記ＤＮＡ構築物は、５ｋｂ未満のサイズである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５８】
標的核酸の２つの末端領域を含む前記ＤＮＡ構築物は、３ｋｂ未満のサイズである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５９】
標的核酸の２つの末端領域を含む前記ＤＮＡ構築物は、１ｋｂ未満のサイズである、請求項４６に記載の方法。
【請求項６０】
標的核酸の２つの末端領域を含む前記ＤＮＡ構築物は、５００ｂｐ未満のサイズである、請求項４６に記載の方法。
【請求項６１】
標的核酸の２つの末端領域を含む前記ＤＮＡ構築物は、３００ｂｐ未満のサイズである、請求項４６に記載の方法。
【請求項６２】
前記標的核酸は、少なくとも５００ｂｐ〜１ｋｂの間、１ｋｂと３ｋｂとの間または５００ｂｐと３ｋｂとの間、請求項４６に記載の方法。
【請求項６３】
標的核酸の２つの末端領域を含む前記ＤＮＡ構築物は、１０ｋｂ未満のサイズである、請求項４６に記載の方法。
【請求項６４】
標的核酸の２つの末端領域を含む前記ＤＮＡ構築物は、２０ｋｂ未満のサイズである、請求項４６に記載の方法。
【請求項６５】
標的核酸の２つの末端領域を含む前記ＤＮＡ構築物は、４０ｋｂ未満のサイズである、請求項４６に記載の方法。
【請求項６６】
直鎖状ポリヌクレオチド分子を環化する方法であって、該方法は、
ａ）水溶液中に該直鎖状ポリヌクレオチド分子を提供する工程；
ｂ）油中に該水溶液を乳化する工程；および
ｃ）該直鎖状ポリヌクレオチド分子の末端を共有結合させ、それによって該直鎖状ポリヌクレオチド分子を環化する工程；
を包含する、方法。
【請求項６７】
前記直鎖状ポリヌクレオチド分子は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡからなる群より選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記直鎖状ポリヌクレオチド分子の２つの末端は、ライゲーションに適した適合性末端を有する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記直鎖状ポリヌクレオチド分子の末端は、ライゲーションによって結合される、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
前記油は、１種以上の界面活性剤と混合される、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
直鎖状ポリヌクレオチド分子を環化する方法であって、該方法は、
ａ）水溶液中に直鎖状ポリヌクレオチド分子の集団を提供する工程；
ｂ）複数の水性マイクロリアクターを生成するために、油中に該水溶液を乳化する工程；および
ｃ）少なくとも１つのマイクロリアクター中の該直鎖状ポリヌクレオチド分子の末端を共有結合させる工程；
を包含し、それら工程によって該直鎖状ポリヌクレオチド分子を環化する、方法。
【請求項７２】
複数のマイクロリアクターは、正確に１つのポリヌクレオチド分子を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記複数のマイクロリアクターは、油中水型エマルションを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
工程（ｄ）において、前記環状核酸分子は、制限エンドヌクレアーゼを用いた消化によって断片化される、請求項２３に記載の方法。
【請求項７５】
前記制限エンドヌクレアーゼは、ＭｍｅＩである、請求項１７、４６または７４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７６】
ＭｍｅＩ制限酵素認識部位を含むキャリアＤＮＡが、ＭｍｅＩ消化の間に添加される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
キャリアＤＮＡの量は、前記環状核酸を上回るモルで添加される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
ＭｍｅＩ酵素および前記キャリアＤＮＡ中のＭｍｅＩ部位は、化学量論の量で存在する、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
（ｂ４）両方の末端に切断されたアダプターを有するアダプターでタグ化された標的核酸を産生するために、前記第１のヘアピンアダプターおよび前記第２のヘアピンアダプターを切断しかつ前記標的核酸を切断しないエンドヌクレアーゼによって前記アダプターでタグ化された標的核酸を消化する工程；
を工程（ｂ）と工程（ｃ）との間にさらに包含する、請求項２６に記載の方法。
【請求項８０】
前記ヘアピンアダプターは、それらの二本鎖領域の各鎖中に少なくとも１個のデオキシイノシンを有し、そして前記エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼＶである、請求項７９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本願は、米国仮特許出願第６０／６８８，０４２号（２００５年６月６日出願）、同第６０／７１７，９６４号（２００５年９月１６日出願）、および同第６０／７７１，８１８号（２００６年２月８日出願）（これらの内容は、本明細書中に参考として援用される）に基づく優先権を主張する。
【０００２】
この本文中に引用された出願および特許の各々、ならびにその出願および特許の各々に引用された各文書または参考文献（それぞれの取得された特許の遂行の間を含む；「出願引用文書」）、ならびに任意のこれらの出願および特許に対応しそして／またはそれらに基づく優先権を主張する米国および外国の出願または特許の各々、ならびに出願引用文書の各々において引用または参照された文書の各々は、本明細書によって参考として本明細書中に明確に援用される。より一般に、文書または参考文献は、添付の参考文献一覧（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔ）またはこの本文自体のいずれかにおいてこの本文に引用され；そして、これらの文書または参考文献（「本明細書中に引用された参考文献」）の各々、および本明細書中に引用された参考文献の各々において引用されたそれぞれの文書または参考文献（任意の製造業者の仕様書、説明書などを含む）は、本明細書によって参考として本明細書中に明確に援用される。参考としてこの本文中に援用された文書は、本発明の実施に利用され得る。
【０００３】
（政府の権利）
本発明は、ＮＩＨによって授与された助成金番号Ｒ０１  ＨＧ００３５６２の下で米国政府支援によって行なわれた。米国政府は、本発明において特定の権利を有し得る。
【０００４】
（発明の分野）
本発明は、核酸配列決定、ゲノム配列決定、およびその配列決定結果の隣接する配列へのアセンブリ（ａｓｓｅｍｂｌｙ）の分野に関する。
【背景技術】
【０００５】
（発明の背景）
大きい標的核酸（例えば、ヒトゲノム）を配列決定する１つのアプローチは、ショットガン配列決定の使用である。ショットガン配列決定において、上記標的核酸は、一連のオーバーラップする核酸フラグメントを生成し、そしてこれらのフラグメントの配列を決定するために、断片化またはサブクローニングされる。オーバーラップおよび各フラグメントの配列の知見に基づいて、標的核酸の完全な配列が、アセンブリされ得る。
【０００６】
ショットガンアプローチの配列決定に対する１つの不利益は、標的核酸配列が多くの小さな反復（縦列反復または逆方向反復）を含む場合に、アセンブリが困難であり得ることである。反復領域においてゲノム配列をアセンブリできないことは、アセンブリされた配列においてギャップを生じる。したがって、核酸配列の最初のアセンブリの後、配列包括度（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｖｅｒａｇｅ）におけるギャップは、埋められる必要があり、そしてアセンブリにおける不確実性は、解消される必要がある。
【０００７】
これらのギャップを解消する１つの方法は、配列決定のためにより大きいクローンまたはフラグメントを使用することである。なぜならば、これらのより大きいフラグメントは、上記反復領域を補うのに十分に長いからである。しかし、核酸の大きいフラグメントの配列決定は、より困難であり、かつ現在の配列決定装置ではより時間を浪費する。
【０００８】
上記配列中のギャップを補う別のアプローチは、大きいフラグメントの両方の末端の配列を決定することである。ショットガン配列決定フラグメントの一方の末端の単一の配列読み取りとは対照的に、両方の末端からの配列読み取りの対は、公知のスペーシングおよび方向を有する。比較的長いフラグメントの使用はまた、散在反復エレメントを含む配列のアセンブリに役立つ。この型のアプローチ（非特許文献１）は、両末端配列決定として当該分野において公知である。本発明は、両末端配列決定アプローチおよび他の核酸技術に有用な新規の方法、システムおよび組成物を包含する。
【非特許文献１】Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９４年、第７巻、ｐ．４０−４７
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の概要）
本発明の１つの実施形態は、生物体のゲノム由来の大きいセグメントであり得る標的核酸の２つの末端領域を含むＤＮＡ構築物を得るための方法に関する。その方法は、以下の工程：
（ａ）標的核酸を生成するために、大きい核酸分子を断片化する工程；
（ｂ）第１の環状核酸分子を形成するために、上記標的核酸に捕捉エレメントをライゲーションする工程；
（ｃ）上記捕捉エレメントによって分割された上記標的核酸の２つの末端を含む直鎖状核酸を生成ために、上記標的核酸を切断するが上記捕捉エレメントを切断しない制限エンドヌクレアーゼによって上記第１の環状核酸を消化する工程；
（ｄ）第２の環状核酸を形成するために、分割エレメントを有する上記直鎖状核酸をライゲーションする工程；
（ｅ）上記第２の環状核酸を環状の一本鎖核酸に変換する工程；
（ｆ）一本鎖のローリングサークル型増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）産物を生成するために、第１のオリゴヌクレオチドを上記環状の一本鎖核酸にアニーリングさせそしてローリングサークル型増幅によって上記環状の一本鎖核酸を増幅する工程；
（ｇ）上記一本鎖のローリング型増幅産物中に複数の二本鎖領域を形成するために、第２のオリゴヌクレオチドを上記一本鎖のローリングサークル型増幅産物にアニーリングさせる工程；および
（ｈ）標的核酸の２つの末端領域を含む上記ＤＮＡ構築物を生成するために、上記複数の二本鎖領域を切断する制限エンドヌクレアーゼによって上記一本鎖のローリングサークル型増幅産物を小さいフラグメントへと消化する工程；
を包含する。
【００１０】
本発明の別の実施形態は、標的核酸の２つの末端領域を含むＤＮＡ構築物を得るための第２の方法に関する。その方法は、以下の工程：
（ａ）標的核酸を生成するために、大きい核酸分子を断片化する工程；
（ｂ）アダプターを上記標的核酸の各末端にライゲーションする工程；
（ｃ）環状核酸分子を形成するために、表示タグを上記標的核酸にライゲーションする工程；
（ｄ）標的核酸の２つの末端領域を含む上記ＤＮＡ構築物を生成するために、上記標的核酸を切断するが上記アダプターまたは上記表示タグを切断しない制限エンドヌクレアーゼによって環状核酸を消化する工程；
を包含する。
【００１１】
本発明の方法は、ＤＮＡの大きいフラグメント由来の末端を含むＤＮＡ構築物のライブラリーを産生するために、複数の標的ＤＮＡフラグメントにおいて同時に行われ得る。本発明の１つの利点は、ライブラリーが原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞を使用することなくインビトロで構築され得ることである。
【００１２】
これらの実施形態および他の実施形態は、以下の詳細な説明によって開示されるか、または以下の詳細な説明から明らかであり、そしてそれらの実施形態は、以下の詳細な説明によって包含される。
【００１３】
以下の詳細な説明は、例として与えられるが、記載される特定の実施形態に本発明を限定することを意図せず、以下の詳細な説明は、参考として本明細書中に援用される添付の図面と組み合わせて理解され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が関連する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似するかまたは等価である多くの方法および材料が、本発明の実施において使用され得るが、好ましい材料および方法は、本明細書中に記載される。
【００１５】
本発明は、核酸の大きいフラグメントの両方の末端を単離および配列決定するための迅速でありかつ費用対効果の高い方法に関する。その方法は、迅速であり、かつ自動化に適しており、そしてＤＮＡの大きいフラグメントの配列決定および連鎖を可能にする。
【００１６】
両末端配列決定は、従来の階層的ショットガン配列決定法（ｃｌｏｎｅ−ｂｙ−ｃｌｏｎｅ  ｓｈｕｔｇｕｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）と比較して多くの重要な利点を保持し、そして両末端配列決定は、実際に、ショットガン配列決定を補完する。これらの利点の間で最も重要なものは、ゲノムが反復エレメントによって分散される場合でさえ大きいゲノムの骨格形成（ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ）を迅速にもたらす能力である。本発明の方法は、ＤＮＡフラグメントのライブラリーを産生するために使用され得、そのフラグメントは、ＤＮＡのより大きいフラグメント由来の末端を含む。
【００１７】
（第１の方法）
１つの実施形態において、両末端配列決定は、以下の工程において行われ得る：
（工程１Ａ）
出発材料は、任意の核酸であり得、それらとしては、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＣＲ産物、エピソームなどが挙げられる。本発明の方法が、核酸出発材料の長いストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）に対して特に有効である一方で、本発明はまた、小さい核酸（例えば、コスミド、プラスミド、小さいＰＣＲ産物、ミトコンドリアＤＮＡなど）に対して適用可能である。
【００１８】
上記ＤＮＡは、任意の供給源由来であり得る。例えば、上記ＤＮＡは、そのＤＮＡ配列が未知であるかまたは完全に知られていない生物体のゲノム由来であり得る。別の例として、上記ＤＮＡは、そのＤＮＡ配列が公知である生物体のゲノム由来であり得る。公知のゲノムのＤＮＡを配列決定することは、研究者がゲノムの多型についてのデータを収集し、そして疾患に関する遺伝子型との相互関係を示すことを可能にする。
【００１９】
上記核酸出発材料は、公知のサイズまたは公知の範囲のサイズの核酸出発材料であり得る。例えば、上記出発材料は、平均の挿入部分サイズおよび分布が公知であるｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーであり得る。
【００２０】
あるいは、上記核酸出発材料は、多くの一般的に使用される方法のうちのいずれか１つによって断片化され得（図１Ａ）、その方法としては、噴霧化、音波破砕、ＨｙｄｒｏＳｈｅａｒ、超音波による断片化、酵素的切断（例えば、限定ＤＮａｓｅ処理（ｌｉｍｉｔｅｄ  ＤＮａｓｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を含むＤＮａｓｅ処理、ＲＮａｓｅ処理（限定ＲＮａｓｅ処理（ｌｉｍｉｔｅｄ  ＲＮａｓｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を含む）、および制限エンドヌクレアーゼによる消化）、予め断片化されたライブラリー（ｐｒｅｆｒａｇｍｅｎｔｅｄ  ｌｉｂｒａｒｙ）（ｃＤＮＡライブラリーにおけるような）、および化学物質（例えば、ＮａＯＨ）誘導性の断片化、熱誘導性の断片化、およびＤＮＡサンプル全体に切断部位（例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断部位）を導入し得るトランスポゾン誘導性の変異が挙げられる。Ｇｏｒｙｓｈｉｎ  Ｉ．Ｙ．およびＲｅｚｎｉｋｏｆｆ  Ｗ．Ｓ．、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９８年３月２７日；２７３（１３）：７３６７−７４；Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ  Ｗ．Ｓ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００４年；２６０：８３−９６；Ｏｓｃａｒ  Ｒ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、２００１年４月、ｐ．２３８４−２３８８、第１８３巻、第７号；Ｐｅｌｉｃｉｃ，Ｖ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、２０００年１０月、ｐ．５３９１−５３９８、第１８２巻を参照のこと。
【００２１】
いくつかの断片化方法（例えば、噴霧化）は、２だけのサイズとして異なる標的ＤＮＡフラグメントの集団を産生し得る。他の断片化方法（例えば、制限酵素消化）は、より広い範囲のサイズをもたらす。さらに他の方法（例えば、ＨｙｄｒｏＳｈｅａｒｉｎｇ）は、大きい核酸フラグメントが所望される場合に好まれ得る。ＨｙｄｒｏＳｈｅａｒｉｎｇ（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ、ＵＳＡ）において、溶液中のＤＮＡは、急激な収縮によってチューブに通され得る。その溶液が収縮に臨む場合、その流体は、収縮のより小さい領域によって体積流量を維持するように加速する。この加速の間、抵抗力は、ＤＮＡを、それが切れる（ｓｎａｐ）まで伸ばす。ＤＮＡフラグメントは、その部分がせん断には短すぎるようになるまで、強制的に化学結合を破壊される。上記流体の流量および収縮の大きさは、最終的なＤＮＡフラグメントのサイズを決定する。核酸出発材料を調製するためのさらなる方法は、国際特許出願第ＷＯ０４／０７０００７号（これは、その全体が参考として本明細書によって援用される）に見出され得る。
【００２２】
使用される断片化方法に依存して、ＤＮＡの末端は、研磨（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）を必要とし得る。すなわち、二本鎖ＤＮＡの末端は、それらを平滑末端にし、そしてライゲーションに適するように処理される必要があり得る。この工程は、断片化方法に依存して当該分野で公知の様式で変化する。例えば、機械的にせん断されたＤＮＡは、配列の突出（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を切断するためにＢａｌ３１を使用して研磨され得、そしてポリメラーゼ（例えば、クレノウ、Ｔ４ポリメラーゼ）およびｄＮＴＰは、充填して平滑末端を生成するために使用され得る。
【００２３】
（工程１Ｂ）
上記フラグメントのサイズが、所望されるよりも変えられる場合、その核酸フラグメントは、このサイズのバリエーションを減少させるためにサイズ分画（ｓｉｚｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）され得る。
【００２４】
サイズ分画は、多くの当該分野で公知の方法論によって行われ得る必要に応じた工程である。サイズ分画サイズ分画のための方法としては、ゲル方法（例えば、パルスゲル電気泳動）、およびスクロース勾配または塩化セシウム勾配による沈降、およびサイズ排除クロマトグラフィー（ゲル透過クロマトグラフィー）が挙げられる。選択されたサイズ範囲の選択は、両末端配列決定によって測定される領域の長さに基づく。
【００２５】
サイズ分画のための１つの好ましい技術は、ゲル電気泳動である（図１Ｂを参照のこと）。好ましい実施形態において、サイズ分画されたＤＮＡフラグメントは、互いの２５％以内であるサイズ分布を有する。例えば、５Ｋｂサイズの分画は、５Ｋｂ  ＋／−  １ｋｂ（すなわち、４Ｋｂ〜６Ｋｂ）であるフラグメントを含み、そして５０Ｋｂサイズの分画は、５０Ｋｂ  ＋／−  １０ｋｂ（すなわち、４０Ｋｂ〜６０Ｋｂ）であるフラグメントを含む。
【００２６】
（工程１Ｃ）
この工程において、「捕捉エレメント」が、調製される。捕捉エレメントは、先の工程由来の核酸フラグメントをライゲーションするために使用される一本鎖末端または二本鎖末端を有し得る直鎖状二本鎖核酸である。「捕捉エレメント」は、順方向アダプター末端および逆方向アダプター末端（円の厚い領域として図１Ｃに示される）を含む環状核酸（例えば、図１Ｃに示されるようなプラスミド）として増殖され得る。この環状プラスミドは、上記捕捉エレメントが使用される前に切断され得る。これらのアダプター末端は、その後の工程において可能性のあるＰＣＲプライマーおよび配列決定プライマーに対するハイブリダイゼーション部位として機能し得る核酸配列を含む。
【００２７】
２つのアダプター末端の間に、上記捕捉エレメントは、さらなるエレメント（例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識部位および／または制限エンドヌクレアーゼ切断部位、抗生物質耐性マーカー、原核生物または真核生物の複製起点、あるいはこれらのエレメントの組み合わせ）を含み得る。このような抗生物質耐性マーカーの例としては、とりわけ、アンピシリン、テトラサイクリン、ネオマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、ブレオマイシン、ゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）、クロラムフェニコールに対する耐性を与える遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。原核生物の複製起点としては、とりわけ、ＯｒｉＣおよびＯｒｉＶが挙げられ得る。真核生物の複製起点としては、自律複製配列（ＡＲＳ）が挙げられ得るが、これらの配列に限定されない。さらに、上記捕捉エレメントは、その後の核酸産物（工程Ｌ）を小さい増幅可能（ＰＣＲによって）なフラグメントへと消化するために使用され得る制限エンドヌクレアーゼ認識部位および／または制限エンドヌクレアーゼ切断部位（例えば、固有かつ稀な部位が好ましい）を含み得る。捕捉エレメントはまた、両末端配列決定のための上記核酸の容易な精製または濃縮のためにマーカーまたはタグ（例えば、ビオチン）を含み得る。
【００２８】
（工程１Ｄ）
上記捕捉エレメントは、制限エンドヌクレアーゼ消化などの公知の技術を使用して直鎖状にされる（平滑末端または粘着末端は、異なるフラグメントの調製のために使用され得る；以下および図１Ｄを参照のこと）。コンカテマー形成（すなわち、互いに対する複数の捕捉エレメントのライゲーション）を防止するために、上記捕捉エレメントは、ＴＡクローニング用のトポイソメラーゼによって脱リン酸化または改変され得る。
【００２９】
（工程１Ｅ）
上記捕捉エレメントは、１つの捕捉エレメントと標的ＤＮＡの１つのフラグメントとを含む環状核酸を形成するために、工程Ａまたは工程Ｂのフラグメント（またはサイズ分画されたフラグメント）にライゲーションされる（図１Ｅ）。上記捕捉エレメントおよび標的ＤＮＡは、周知の方法論（例えば、ＤＮＡリガーゼによるライゲーション）またはトポイソメラーゼクローニングストラテジーによって連結される。
【００３０】
（工程１Ｆ）
先の工程の結果は、かなりのサイズのＤＮＡフラグメントにライゲーションされた捕捉エレメントの収集物（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）をもたらす。本工程は、標的ＤＮＡフラグメントの大きい内部領域を削除して、自動化されたＤＮＡ配列決定に対してより適切であり得るサイズのクローニングされた挿入部分をもたらすために使用される（図１Ｆ）。
【００３１】
この工程において、捕捉されたゲノムＤＮＡ（すなわち、工程Ｅによって生成された環状核酸）は、そのゲノムＤＮＡ内に１つ以上の切断部位を有し得る１種以上の制限エンドヌクレアーゼによって消化される。一般に、任意の制限エンドヌクレアーゼは、その制限エンドヌクレアーゼが上記捕捉エレメント内を切断しない限り「内部切断」のために使用され得る。内部切断とは、上記標的ＤＮＡに対して内部であり、かつ上記捕捉エレメントを切断しない切断をいう。内部切断制限酵素は、捕捉エレメントが選択された制限エンドヌクレアーゼの切断部位を含まないように捕捉エレメントを設計することによって選択され得る。制限エンドヌクレアーゼおよびそれらの使用は、当該分野において周知であり、そしてその使用は、本発明の方法に対して容易に適用され得る。さらに、複数の制限酵素（各々は内部切断に対して制限する）の組み合わせが、標的ＤＮＡフラグメントのサイズをさらに減少させるために使用され得る。
【００３２】
好ましい実施形態において、上記ゲノムＤＮＡは、これらの制限エンドヌクレアーゼの１種以上によって上記捕捉エレメントから５０〜１５０塩基の範囲内に切断される。
【００３３】
（工程１Ｇ）
この工程において、公知の配列の二本鎖核酸である「分割エレメント」は、環状核酸を形成するために、先の工程の消化されたゲノム材料の末端の間にライゲーションされる（図１Ｇ）。この「分割エレメント」は、２つの目的を果たす。第１に、上記分割エレメントは、ミニサークル（ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ）のローリングサークル型増幅のためのプライミング部位（ｐｒｉｍｉｎｇ  ｓｉｔｅ）を含み得る（以下、工程Ｉを参照のこと）。第２に、上記分割エレメントの配列は、公知であるので、その分割エレメントは、対応した（ｐａｉｒｅｄ）ゲノム末端の末端を標識する同定因子として機能し得る（連結した末端のトリミングおよび容易なソフトフェア分析を可能にするため）。すなわち、ゲノムフラグメントのその後の配列決定の間、上記分割エレメントの配列は、そのゲノムフラグメント全体が配列決定されたこと示す。このような分割エレメントはまた、さらなるエレメント（例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識部位および／または制限エンドヌクレアーゼ切断部位、抗生物質耐性マーカー、原核生物または真核生物の複製起点あるいはこれらのエレメントの組み合わせを含み得る。抗生物質耐性マーカーおよび複製起点のようなエレメントの必要に応じた存在にもかかわらず、本発明の方法の利点の１つは、この方法が核酸のクローニング、増幅または他の操作のために宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）の使用を必要としないことである。上記分割エレメントはまた、両配列末端配列決定法のために、ビオチン化される得るか、あるいはそうでなければ容易な精製または核酸濃縮のためのマーカーまたはタグによってタグ化され得る。
【００３４】
（工程１Ｈ）
最後の工程から産生された環状核酸（すなわち、ミニサークル）は、一本鎖核酸を生じる傾向にある一本鎖である。これは、溶液の塩、温度またはｐＨを変えることによる標準的なＤＮＡ編成技術を使用して行なわれる。他のＤＮＡ変性技術は、当該分野において公知である。変性の後、おなじミニサークル由来のＤＮＡ環は、依然として連結しているが、これは、本発明の方法に影響を及ぼさない（図１Ｈ）。
【００３５】
（工程１Ｉ）
プライマーは、そのプライマーにアニーリングされ得る配列をを含む分割エレメントにアニーリングする。したがって、この分割配列は、ローリングサークル型増幅のためのイニシエーターとして機能する（図１Ｉ）。
【００３６】
（工程１Ｊ）
上記サンプルは、長い一本鎖産物を産生するために、ローリングサークル型増幅によって増幅される（図１Ｊ）。このローリングサークル型増幅工程の１つの利点は、分割エレメントを含まないエレメントが増幅されずかつ環が閉じていないエレメントがほとんど増幅されないことである。
【００３７】
（工程１Ｋ）
１つ以上のキャッピングオリゴは、順方向アダプターおよび逆方向アダプター（それらをこれらの領域において二本鎖にする）に隣接（ｆｌａｎｋ）する一本鎖の制限酵素認識部位にアニーリングされる（図１Ｌ）。キャッピングオリゴは、上記捕捉エレメントの少なくとも一部、アダプター領域の少なくとも一部、またはそれらの両方と相補的であり得る。
【００３８】
（工程１Ｌ）
キャッピングされた一本鎖ＤＮＡは、キャッピングされた部位にて小さいフラグメントへと切断される（図１Ｍ）。これらの小さいフラグメントは、公知の配列の末端を有し、そして従来の増幅技術（例えば、ＰＣＲ）を使用して容易に増幅され得る。
【００３９】
（第２の方法）
第２の実施形態において、両末端配列決定は、以下の工程において行われ得る：
（工程２Ａ−サンプルＤＮＡの断片化）
標的核酸の断片化およびサイズ分画サイズ分画は、先の実施形態に関するものと同じである。
【００４０】
（工程２Ｂ−メチル化および末端研磨）
所望される場合、断片化された標的核酸は、任意のメチラーゼによってメチル化され得る。好ましいメチラーゼは、制限エンドヌクレアーゼ消化に影響を及ぼすものである。メチラーゼは、少なくとも２つの異なるストラテジーにおいて使用され得る。１つの好ましい実施形態において、メチラーゼは、メチル化された制限酵素認識部位のみを切断する制限エンドヌクレアーゼによる切断を可能にする。別の好ましい実施形態において、メチラーゼは、メチル化されていないＤＮＡを切断するだけの制限エンドヌクレアーゼによる切断を防止する。
【００４１】
末端研磨の工程は、第１の方法において記載されるものと同じである。
【００４２】
（工程２Ｃ−タグアダプターのライゲーション）
この工程において、アダプターが、両方の末端にアダプターを有するフラグメントを生成するために、標的核酸フラグメントの末端にライゲーションされる（図２、Ｉ）。上記アダプターは任意のサイズであり得るが、１０〜３０塩基のサイズが好ましく、そして１２〜１５塩基のサイズがより好ましい。アダプターおよび／または標的核酸フラグメントのコンカテマーの形成を防止するために、上記アダプターは、平滑末端および適合しない粘着末端（すなわち、５’突出または３’突出を有する末端）を含み得る。上記アダプターが上記ＤＮＡフラグメントにライゲーションされ、そしてリガーゼが除去された後、上記粘着末端は、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて充填され得る。
【００４３】
この節のアダプターは、捕捉フラグメントであり得る。捕捉フラグメントの例は、図４および図５に示される。
【００４４】
コンカテマー形成を防止するために、上記アダプターは、ヘアピンアダプターであり得る（図６Ａ）。ヘアピンアダプターの使用（例えば、図６）は、ヘアピンアダプターがダイマーよりも大きい任意のマルチマーを形成できないのでコンカテマーを防止する。コンカテマーを防止するための別の方法は、一方または両方の鎖の５’末端がリン酸化されていないアダプターを使用することである。
【００４５】
使用され得る他のアダプターは、より少ない処理工程を使用する利点を有するが、またキナーゼを利用するリン酸化工程を必要とするリン酸化されていないアダプターを含む。
【００４６】
本開示において他で考察される通り、アダプターは、メチル化されてもビオチン化されてもそれらの両方であってもよい。
【００４７】
（工程２Ｄ−エキソヌクレアーゼ消化およびゲル精製）
２つのヘアピンアダプターにライゲーションされるＤＮＡフラグメントは、エキソヌクレアーゼを使用して精製され得る。このエキソヌクレアーゼ精製は、両方の末端上でヘアピンアダプターにライゲーションした二本鎖ＤＮＡが露出した５’末端または３’末端を有さないＤＮＡ分子であるという利点をとる。ライゲーション混合物中の他のＤＮＡ（例えば、一方のみがヘアピンアダプターにライゲーションされた二本鎖ＤＮＡフラグメント、ライゲーションされていないＤＮＡフラグメントおよびライゲーションされていないアダプター）は、エキソヌクレアーゼに感受性である（図６Ｂ）。したがって、エキソヌクレアーゼに対する上記ライゲーション混合物の曝露は、２つのヘアピンアダプターおよびヘアピンアダプターダイマーにライゲーションしたＤＮＡフラグメントを除くほとんどのＤＮＡを除去する。ヘアピンアダプターダイマーは、そのＤＮＡフラグメントと著しく類似するので、そのヘアピンアダプターダイマーは、サイズ分画サイズ分画カラム（例えば、スピンカラム）またはアガロースゲル電気泳動もしくはアクリルアミドゲル電気泳動などの公知の技術、あるいは当該分野において公知でありそして／または本開示において他で考察される他のポリヌクレオチドのサイズを区別する方法のうちの１つを使用して除去され得る。
【００４８】
１つの実施形態において、上記アダプターは、タグを保有するフラグメントの単離／濃縮を容易にするために、ビオチン化され得る。
【００４９】
別の実施形態において、上記アダプターを含むフラグメントは、そのフラグメントに、上記タグ配列と相補的な捕捉オリゴヌクレオチドをアニーリングさせることによって精製され得る。
【００５０】
（工程２Ｅ−環化のためのフラグメントの調製）
標的核酸フラグメントの両方の末端に対してアダプターを付加した後、そのフラグメントは、環化される。
【００５１】
自己環化のための標的核酸を調製するために、アダプター領域における切断は、多くの理由により望まれ得る。例えば、ヘアピンアダプターが使用される場合、上記ＤＮＡフラグメントは、自由（ｆｒｅｅ）ではない５’末端または３’末端が存在するので自己環化しない。別の例として、上記アダプターが、平滑末端を有するＤＮＡフラグメントを残す場合、切断は、アダプターが５’突出または３’突出を有することを可能にし、そしてこれらの突出（「粘着末端」とも称される）は、ライゲーション効率を大きく促す。さらに、アダプター領域における消化は、２つのアダプター（各末端に１つのアダプターがライゲーションされる）を有するＤＮＡフラグメントの選択を可能にする。これは、上記アダプターが制限エンドヌクレアーゼによる切断が適合する粘着末端を残すように設計され得るからである。アダプター領域における切断の後、１つのアダプターのみを有するＤＮＡフラグメント（望ましくない化学種（ｓｐｅｃｉｅｓ））は、１つの粘着末端および１つの平滑末端を有し、そしてそのＤＮＡフラグメントは、自己環化における困難性を有する。したがって、両方の末端にアダプターを有するＤＮＡフラグメントのみが、環化される。
【００５２】
アダプターに対する切断を制限することは、多くの方法によって達成され得る。１つの方法において、上記アダプターは、メチル化され、そしてそのアダプターは、メチル化されていないＤＮＡにライゲーションされる。次いで、その構築物は、メチル化されたＤＮＡのみを切断する制限エンドヌクレアーゼによって消化される。上記アダプターのみがメチル化されるので、上記アダプターのみが切断される。
【００５３】
別の方法において、上記ＤＮＡフラグメントは、メチル化され得、そして上記アダプターは、メチル化されない。メチル化されていないＤＮＡのみを認識しかつそれをそれを切断する制限エンドヌクレアーゼによる切断は、上記アダプターに対する切断を制限する。これは、最初から既にメチル化されているＤＮＡを使用することによってか、またはインビトロでのメチル化することによって達成され得る。
【００５４】
アダプターの消化はいくつかの状況において必要とされないことが、理解される。例えば、先の工程由来のフラグメントが、平滑末端のみを含む場合、上記アダプターの消化は、任意である。
【００５５】
上記ＤＮＡフラグメントがライゲーション／環化を容易にするように処理され得るがまた、理解される。例えば、上記アダプターが、ブロックされるか、または５’リン酸を含まない場合、そのブロック基が、除去され得るか、またはリン酸が、ライゲーションできるようにそのフラグメントに付加され得る。
【００５６】
（工程２Ｆ  環化されたフラグメントを形成するための末端のライゲーション）
多くの方法が、環化のために使用され得る。
【００５７】
１つの実施形態において、リガーゼが、適切なリガーゼ緩衝液との反応混合物に添加され、そして上記ＤＮＡフラグメントが、再環化され得る。
【００５８】
１つの実施形態において、ライゲーションは、自己ライゲーションを促進するため、そしてコンカテマーの形成を妨害するために、希薄なＤＮＡ濃度にて行なわれる。
【００５９】
別の実施形態において、ライゲーションは、油中水型エマルション中で行われ、その水性の液滴は、本開示において他で記載されるように環化されたほぼ１つのフラグメントを含む。
【００６０】
１つの実施形態において、表示タグは、標的核酸フラグメントにライゲーションされ、そしてそのフラグメントは、自己環化する（図２を参照のこと）。上記表示タグは、２４〜３０塩基対の間の二本鎖核酸配列である。この「表示タグ」は、それが、対応したゲノム末端の末端を標識する同定因子として機能し得る（連結した末端のトリミングおよび容易なソフトフェア分析を可能にするため）先の実施形態の「分割エレメント」と同様である。ゲノムフラグメントのその後の配列決定の間において、上記表示タグの配列は、標的核酸配列の２つの末端の間の境界を示す。
【００６１】
（工程２Ｇ）
表示タグの付加および自己環化の後において、上記標的核酸フラグメントは、さらに消化または断片化される。断片化は、本開示において列挙される任意の断片化手順を使用して行なわれ得る。例えば、上記の工程１Ａを参照のこと。あるいは、１種以上の制限エンドヌクレアーゼは、標的ＤＮＡを消化してフラグメントを生成するために使用され得る。
【００６２】
１つの好ましい実施形態において、噴霧化は、平均フラグメントサイズが約２００〜３００ｂｐになるまで上記核酸を断片化するために使用される。図２に示されるように、これらのフラグメントのいくつかは、表示タグを含むが、他のフラグメントは、表示タグを含まない。
【００６３】
この点において、上記核酸フラグメントは、標準的な方法を使用して配列決定され得る。核酸フラグメントを配列決定するための方法は、公知である。配列決定の１つの好ましい方法は、国際特許出願第ＷＯ  ０５／００３３７５号（２００４年１月２８日出願）に記載される。
【００６４】
（工程２Ｈ）
必要に応じた工程において、上記表示タグを含むフラグメントは、表示タグを有さないフラグメントに対して濃縮され得る。濃縮ための１つの方法は、サンプル調製工程においてビオチン化された表示タグの使用を含む。断片化の後に、上記表示タグを含むフラグメントは、ビオチン化される、そしてそのフラグメントは、溶液中のストレプトアビジンカラムまたはストレプトアビジンビーズを使用して精製され得る。
【００６５】
濃縮の後、上記核酸フラグメントは、国際特許出願第ＷＯ  ０５／００３３７５号（２００４年１月２８日出願）に記載もののような自動化された技術を含む標準的な技術を使用して配列決定され得る。
【００６６】
（第３の方法）
両末端配列決定は、第３の方法によって行なわれ得る。
【００６７】
（工程３Ａ〜工程３Ｅ）
この方法において、工程Ａ〜工程Ｅは、第２の方法において記載された通り（すなわち、工程２Ａ〜工程２Ｅの通り）に行われ得る。さらに、第３の方法において、各アダプターは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位から約１５〜２５ｂｐ離れて直接ＤＮＡを切断し得るＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。異なるＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼ認識部位からの種々の距離にて切断すること、およびこの距離に適応する異なるＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの使用が企図されることが、公知である。
【００６８】
（工程３Ｆ  環化されたフラグメントを形成するための末端のライゲーション）
工程３Ｆは、表示タグが使用されないことを除いて第２の方法（工程２Ｆ）に従って行われ得る（図６Ｄを参照のこと）。
【００６９】
（必要に応じた濃縮工程））
本発明の任意の方法において、エキソヌクレアーゼは、環化されていないフラグメントを除去するため、そしてコンカテマーになったフラグメントの存在を減少させるために、ライゲーション後に使用され得る。適切に再環化されたＤＮＡフラグメントは、露出した５’末端または露出した３’末端を有さないので、そのＤＮＡフラグメントは、エキソヌクレアーゼ消化に対して抵抗性である。さらに、より大きいコンカテマーは、ニックに起因して、露出した５’末端または露出した３’末端を有するより高い機会を有する。エキソヌクレアーゼ処理はまた、ニックを有するこれらのコンカテマーを除去する。
【００７０】
（必要に応じたローリングサークル型増幅）
上記環化されたＤＮＡは、ローリングサークル型増幅によって増幅され得る。簡単にいうと、オリゴヌクレオチドが、上記再環化されたＤＮＡの一方の鎖にハイブリダイズさせるために使用され得る。このオリゴヌクレオチドプライマーは、ポリメラーゼによって伸長される。鋳型は、環状であるので、上記ポリメラーゼは、標的ＤＮＡの複数の反復を有する一本鎖コンカテマーを産生する。この一本鎖コンカテマーは、第２のプライマーをそれにハイブリダイズさせ、そしてこの第２のプライマーから伸長させることによって二本鎖になり得る。例えば、この第２のプライマーは、この一本鎖コンカテマーのアダプター配列と相補的であり得る。得られた二本鎖コンカテマーは、次の工程に直接使用され得る。
【００７１】
（工程３Ｇ  ＤＮＡの消化／フラグメント）
この工程において、ローリングサークル型増幅由来の環化された核酸またはコンカテマーになった核酸は、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼによって消化される（図６Ｄ）。工程３Ａについて記載される通り、各アダプターは、少なくとも１つのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む。ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼは、上記アダプター上のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ切断部位を認識し、そして約１０〜２０塩基対離れて核酸を切断する。ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの例は、ＭｍｅＩ（約２０ｂｐ）、ＥｃｏＰ１５１（２５ｂｐ）またはＢｐｍＩ（１４ｂｐ）を含む。
【００７２】
この工程は、２つの末端の間にアダプター領域を有するより大きいＤＮＡフラグメントの２つの末端を含むＤＮＡの短いフラグメント（１０〜１００ｂｐ）を生成する（図６Ｅ）。同じ構造を生成するための代替的な方法は、本開示において他に記載される（例えば、工程１Ａに記載される）ような多くのＤＮＡ断片化方法のいずれかを使用して上記環化された核酸をランダムに断片化することである。これは、任意のサイズ（１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、２５０ｂｐ、３００ｂｐ以上）のフラグメントが作製されることを可能にする。
【００７３】
いずれかの方法によって、その中間にアダプター領域を有さない他のＤＮＡフラグメントもまた、生成される（図６Ｅ）。しかし、上記アダプター領域は、ビオチン化されるので、アダプター領域を含むＤＮＡは、例えば、ストレプトアビジンビーズ、アビジンビーズ、ＢＣＣＰビーズなどのビオチンに対する親和性を有する固体支持体を使用して選択的に精製され得る。
【００７４】
（工程３Ｈ．配列決定）
本発明の任意の方法の産物は、手動か、または自動化された配列決定技術によって配列決定され得る。サンガー配列決定法またはまきサム−ギルバート配列決定法のような方法による手動の配列決定法は、周知である。自動化された配列決定法は、例えば、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴ）によって開発された４５４  ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＴＭのような自動化された配列決定法（これはまた、出願ＷＯ／０５００３３７５（２００４年１月２８日出願）ならびに同時係属中の米国特許出願ＵＳＳＮ：１０／７６７，７７９（２００４年１月２８日出願）、同ＵＳＳＮ：６０／４７６，６０２（２００３年６月６日出願）；同ＵＳＳＮ：６０／４７６，５０４（２００３年６月６日出願）；同ＵＳＳＮ：６０／４４３，４７１（２００３年１月２９日出願）；同ＵＳＳＮ：６０／４７６，３１３（２００３年６月６日出願）；同ＵＳＳＮ：６０／４７６，５９２（２００３年６月６日出願）；同ＵＳＳＮ：６０／４６５，０７１（２３、２００３年４月２３日出願）；および同ＵＳＳＮ：６０／４９７，９８５（２５、２００３年８月２５日出願）に記載される））を使用することによって行なわれ得る。
【００７５】
簡単にいうと、自動化された配列決定手順（例えば、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．によって開発された配列決定手順）において、１つの配列決定アダプター（配列決定アダプターＡ）は、上記ＤＮＡフラグメントの１つの末端にライゲーションされ得、そして第２の配列決定アダプター（配列決定アダプターＢ）は、そのＤＮＡフラグメントの第２の末端にライゲーションされ得る。ライゲーションの後、上記ＤＮＡフラグメントは、ビオチンを固体支持体に結合することによってあらゆるライゲーションされていない配列決定アダプターから精製され得る。上記単離された核酸フラグメントは、個々の反応チャンバー中におかれ得、そして配列決定アダプターＡおよび配列決定アダプターＢに対して特異的なプライマーを使用したＰＣＲによってさらに増幅され得る。ＡアダプターまたはＢアダプターのいずれかにビオチンを結合させることによって、優勢にＡ−Ｂフラグメントから構成される一本鎖ＤＮＡが、単離され得る。この増幅された核酸は、上記２つの末端の間に位置する配列決定アダプターＡ、配列決定アダプターＢに特異的な配列決定プライマーまたはそれらのアダプターに特異的な配列決定プライマー（例えば、ヘアピンアダプター）を使用して配列決定され得る。
【００７６】
一旦より大きいＤＮＡフラグメントの末端を含む複数のこれらのフラグメントが調製されると、それらは、配列決定され得、そしてその両末端配列情報は、ゲノムの部分的かまたは完全な配列地図を作成するためにアセンブリされ得る。
【００７７】
（第４の方法）
両末端配列決定は、図１２に概説されるような両末端読み取りＰＥＴランダム断片化（Ｐａｉｒｅｄ−Ｒｅａｄ  ＰＥＴ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）と称される上記に記載された方法のバリエーションを使用して行なわれ得る。この第４の方法に従う実験からの結果は、図１３に示される。
【００７８】
（工程４Ａ〜工程４Ｅ）
この方法において、工程Ａ〜工程Ｄは、第２の方法または第３の方法（すなわち、工程２Ａ〜工程２Ｄまたは工程３Ａ〜工程３Ｄ）において記載される通りに行われ得る。代替として、工程４Ｄは、エキソヌクレアーゼ処理したフラグメントを精製するために、ＳＰＲＩ（可逆的固定法（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ））を使用して行なわれ得る。例えば、図１２中の核酸フラグメントは、ビオチン化されたプライマーにライゲーションされ、そしてその核酸フラグメントは、例えば、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズ、アビジンでコーティングされたビーズ、減少した親和性のストレプトアビジンでコーティングされたビーズまたは減少した親和性のアビジンでコーティングされたビーズを使用して精製され得る。
【００７９】
工程４Ｅは、工程２Ｅまたは工程３Ｅに記載される通りに行われ得る。
【００８０】
工程４Ｆは、工程３Ｆに記載される通りに行われ得る。簡単にいうと、最後の工程において産生された直鎖状ＤＮＡフラグメントは、工程２Ｆまたは工程３Ｆに関して上記に記載されるような環化の任意の公知の方法を使用して環化され得る。
【００８１】
さらに、上記の工程３Ｆに記載されるような必要に応じた濃縮工程は、環状核酸について濃縮するために行われ得る。簡単にいうと、環化されない核酸は、自由な末端を有する核酸を分解するエキソヌクレアーゼによって除去され得る。共有結合で閉じた環状核酸は、自由な末端を有さず、そしてエキソヌクレアーゼの攻撃に対して抵抗性である。これに起因して、エキソヌクレアーゼによる処理は、直鎖状核酸を除去しつつ環状核酸を濃縮する。
【００８２】
（工程４Ｇ）
自己環化の後、断片化は、本開示に列挙される任意の断片化手順を使用して行なわれ得る。１つの好ましい方法は、フラグメント上記環状核酸を機械的せん断を使用して断片化することである。機械的せん断は、例えば、ボルテックスすることによってか、小さい開口部を通して溶液中の核酸に力を銜えることによってか、または本開示において他で記載される他の類似する手順によって行なわれ得る。機械的せん断の１つの利点は、異なる長さの核酸が生成され得ることである（図１２における工程Ｇの後の核酸を参照のこと）。
【００８３】
その中間にアダプター領域を有さないＤＮＡフラグメントもまた、生成される。図１２を参照のこと。しかし、上記アダプター領域はビオチン化されるので、アダプター領域を含むＤＮＡは、例えば、ストレプトアビジンビーズ、アビジンビーズ、ＢＣＣＰビーズなどのようなビオチンに対する親和性を有する固体支持体または半固体支持体を使用して選択的に精製され得る。
【００８４】
（工程４Ｈ）
方法４の産物は、利用可能な任意の手動または自動の方法を使用して配列決定され得る。このような方法は、上記の工程３Ｈにおいて詳細に記載される。
【００８５】
上に記載されそして図１２に概説されるような両末端読み取りＰＥＴランダム断片化は、多くの利点を提供する。第１に、方法４は、アセンブリにおける、より高い信頼性を可能にする。なぜならば、機械的せん断は、より長いフラグメントを生じ得、そのフラグメントは、次に、より長い読み取りを可能にするからである。より長い読み取りは、より高い信頼性を有する標的配列のアセンブリを可能にする。第２に、機械的せん断によって可能な作製されるより長いフラグメントは、核酸のより長い領域を測定する両末端（ｐａｉｒｅｄ  ｅｎｄ）読み取りを生じる。核酸のより長い領域を測定することによって、方法４は、ギャップ閉鎖（ｇａｐ  ｃｌｏｓｕｒｅ）を容易にし、そしてまた、分析が困難である核酸の領域を測定するより高い可能性を有する。これらの困難な領域は、例えば、反復領域または高いＧＣ含量の領域であり得る。この様式において、方法４は、改善されたギャップ閉鎖性能の利点を提供する。第３に、方法４は、ギャップ閉鎖を提供するその能力に起因して、それぞれの個々の末端がアセンブリを構築するために使用され得る場合に、完全なゲノムを配列決定するために専ら使用され得る。
【００８６】
方法４の利点の例は、図１３において見られ得る。図１３は、方法４を使用して配列決定されたＥ．Ｃｏｌｉ  Ｋ１２ゲノムＤＮＡを示す。見られ得る通り、顕著により長い読み取り長さの分布（５０未満〜約４００）は、この方法を使用して可能である。さらに、約３ｋｂのフラグメント長が、生成され得、そしてそれらの末端が、配列決定され得る。これは、方法４が他の方法と比較して優れたギャップ閉鎖性能を提供することを示す。
【００８７】
（第５の方法）
両末端配列決定は、図１５において概説されるような上に記載された方法のバリエーションを使用して行なわれ得る。
【００８８】
この方法において、上記アダプターは、ヘアピンの二本鎖領域の逆鎖上にデオキシイノシンヌクレオチド（本明細書中でイノシンとも称される）を組み込むデオキシイノシンヘアピンアダプターとして設計され得る。Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶ（ＥｎｄｏＶ）は、イノシンヌクレオチドから２番目のヌクレオチドの３’と３番目のヌクレオチドの３’との間に一本鎖切断（ニック）を導入する（Ｙａｏ  ＭおよびＫｏｗ  ＹＷ；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９５、２７０（４８）：２８６０９−１６；  Ｙａｏ  ＭおよびＫｏｗ  ＹＷ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９４、２６９（５０）：３１３９０−６；Ｙａｏ  Ｍら、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１９９４、７２６：３１５−６；Ｙａｏ  Ｍら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９４，２６９（２３）：１６２６０−８）。
【００８９】
図１４に示される通り、上記ヘアピンアダプター中のイノシンの相対配置は、３’一本鎖突出（図１４Ａおよび図１４Ｂ）、５’一本鎖突出（図１４Ｃおよび図１４Ｄ）、または平滑末端（突出なし）（図１４Ｅ）が両方の鎖のＥｎｄｏＶ切断の際に産生されるか否かを決定する。上記ヘアピンアダプターの配列はまた、ＥｎｄｏＶ切断の際に非パリンドローム（図１４Ａおよび図１４Ｂ）またはパリンドローム（図１４Ａおよび図１４Ｃ）の一本鎖突出を生成するように設計され得る。デオキシイノシンが４種の塩基（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴ）のいずれかおよびデオキシイノシン自体と対形成することは、当該分野において周知である（ＷａｔｋｉｎｓおよびＳａｎｔａＬｕｃｉａ、２００５、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３（１９）：６２５８−６７）。さらに、上記アダプターは、本開示において他で開示されるように、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ認識部位（例えば、ＭｍｅＩ）を含み得る。
【００９０】
（工程５Ａ（図１５  工程Ａ））
この方法において、工程Ａは、実質的に、工程１Ａに関して記載されるように行なわれ得る。標的ＤＮＡは、上に記載されるように、当該分野において公知である任意の物理的方法または生化学的方法によって断片化され得る。必要に応じて、得られたフラグメントは、本開示において他で記載される任意のサイズ分画方法によってサイズ分画され得る。
【００９１】
（工程５Ｂおよび工程５Ｃ（図１５  工程Ｂ＋工程Ｃ））
標的ＤＮＡの末端は、本明細書中に記載される任意の研磨方法によって研磨され得、そしてその末端は、アダプターでタグ化された標的ＤＮＡを形成するために、上に記載されるデオキシイノシンヘアピンアダプターにライゲーションされ得る。
【００９２】
（工程５Ｄ（図１５  工程Ｄ））
上記ライゲーション反応は、１種以上のエキソヌクレアーゼ（本明細書中で他に考察されるような）によって処理され得、そして所望の反応産物を濃縮するために、本明細書中で記載される任意の方法によってサイズ分画され得る。
【００９３】
（工程５Ｅ（図１５  工程Ｅ））
上記アダプターでタグ化された標的核酸は、ＥｎｄｏＶによって切断される。切断反応についての条件は、Ｙａｏらによって記載される条件のいずれか（Ｙａｏ  ＭおよびＫｏｗＹＷ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９５、２７０（４８）：２８６０９−１６；Ｙａｏ  ＭおよびＫｏｗ  ＹＷ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９４、２６９（５０）：３１３９０−６；Ｙａｏ  Ｍら、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１９９４、７２６：３１５−６；ならびにＹａｏ  Ｍら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９４、２６９（２３）：１６２６０−８）であり得る。当業者は、同様の条件がまた使用され得ることを認識する。
【００９４】
（工程５Ｆ〜工程５Ｈ（図１５  工程Ｆ〜工程５Ｈ））
この第５の方法において、工程Ｆ〜工程Ｈは、第２の方法、第３の方法、または第４の方法において記載される（すなわち、工程２Ｆ〜工程２Ｈまたは工程３Ｆ〜工程３Ｈまたは工程４Ｆ〜工程４Ｈ）ように行なわれ得る。
【００９５】
上記第５の方法のデオキシイノシンヘアピンアダプターは、有益である。なぜならば、ＥｎｄｏＶは、ＤＮＡ中のイノシンまたは損傷もしくは塩基の誤対合の特定の部位の存在下においてのみ切断するからである。したがって、標的核酸は、上記ＥｎｄｏＶ処理によって切断されない。したがって、ＥｎｄｏＶ部位が、上記アダプターに特有である場合、標的ＤＮＡは、いくつかの上記の実施形態におけるようなメチル化によって保護されない。上記メチル化工程の排除は、時間を節約し、そして標的ＤＮＡの不完全なメチル化に関する問題が、排除される。さらに、ＥｎｄｏＶ消化は、ＥｃｏＲＩ消化と比較して非常に迅速であり、したがってこの方法を実施するのに必要とされる時間を短縮する。
【００９６】
デオキシイノシンヘアピンアダプターアプローチによって得られる両末端読み取りの結果の例は、図１６に示される。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２ゲノムＤＮＡは、第５の方法に従って調製および配列決定された（図１５）。両末端読み取りの間の平均距離は、２０７０ｂｐ（標準偏差＝５９４）であった。
【００９７】
（第６の方法）
さらなる実施形態において、両末端配列決定は、図１７および図１８において記載される通り、以下の工程のいくつかまたは全てを包含する方法によって行なわれ得る。
【００９８】
（工程６Ａ−標的ＤＮＡの断片化（図１７Ａ））
第６の方法に従って、標的ＤＮＡサンプル（例えば、ゲノムＤＮＡ）のポリヌクレオチド分子は、約５００塩基より長いか、約１０００塩基より長いか、約２０００塩基より長いか、約５０００塩基より長いか、約１００００塩基より長いか、約２０，０００塩基より長いか、約５０，０００塩基より長いか、約１００，０００塩基より長いか、約２５０，０００塩基より長いか、約１００万塩基より長いか、または約５００万塩基より長い分子へと断片化される。好ましい実施形態において、上記フラグメントは、約１．５ｋｂ長〜約５ｋｂ長の範囲である。上記断片化は、本開示において他で記載される任意の物理的方法および／または生化学的方法によって達成され得る。好ましい実施形態において、標的ＤＮＡは、物理的な力（例えば、ＨｙｄｒｏＳｈｅａｒ（登録商標）装置（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）の使用）によってランダムにせん断される。上記せん断されたＤＮＡは、次いで、所望のフラグメントサイズに関して精製され得る。この必要に応じたサイズ選択は、当該分野において公知でありそして本明細書中に記載される任意のサイズ選択方法（例えば、電気泳動および／または液体クロマトグラフィー）によって達成され得る。好ましい実施形態において、上記せん断されたＤＮＡサンプルは、ＳＰＲＩ（登録商標）サイズ排除ビース（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ；Ｈａｗｋｉｎｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９５（２３）：４７４２−４７４３）における精製によってサイズについて選択される。例えば、約２〜２．５ｋｂのフラグメントの末端（対である）を配列決定することは、代表的な細菌ゲノム配列決定実験においてコンティグの順序付けを可能にし得る。より大きいフラグメントは、より高等な生物体（例えば、真菌、植物および動物）のゲノムの配列決定に有益であり得る。
【００９９】
（工程６Ｂ−特定の制限酵素認識部位のメチル化（図１７Ｂ））
下に記載されるように、標的ＤＮＡフラグメントに対するアダプターのライゲーションの後、そのアダプターは、環化のための調製において１種以上の制限酵素によって切断され得る。選択した制限酵素による標的ＤＮＡの消化を防止するために、その標的ＤＮＡは、対応するメチラーゼを用いた改変によって消化に対して保護される。好ましい実施形態において、上記アダプターは、ヘアピンアダプターであり、そしてそのアダプターは、ＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位を保有する（図１８Ａ）。したがって、好ましい実施形態において、サンプルＤＮＡフラグメントに存在するＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位は、ＥｃｏＲＩ付着末端が上記ヘアピンアダプターから産生される場合、それらの完全性を保存するために、ライゲーションによる環化の前にＥｃｏＲＩメチラーゼを使用してメチル化される。
【０１００】
（工程６Ｃ−フラグメント末端の研磨およびリン酸化（図１７Ｃ））
ＤＮＡの流体力学的なせん断は、磨り減った末端（一本鎖突出）を有するいくつかのフラグメントをもたらす。平滑末端は、その後のアダプターライゲーションに好ましい。したがって、必要に応じて、任意の磨り減った末端は、酵素的にＤＮＡポリメラーゼを用いて「充填（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）」するかそして／またはエキソヌクレアーゼ（例えば、Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎヌクレアーゼ）を用いて「チューイングバック（ｃｈｅｗｉｎｇ−ｂａｃｋ）」するかのいずれかによって、平ら（ｂｌｕｎｔ）にされ得、そしてライゲーションのために準備され得る。有益には、いくつかのＤＮＡポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性も有する。必要に応じて、平滑化反応に次いで、好ましくは上記フラグメントの５’末端は、ポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸化される。好ましい実施形態において、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４  ＰＮＫ）は、それぞれ、充填およびリン酸化のために使用される。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼは、その５’→３’ポリメラーゼ活性によってＤＮＡの３’−陥凹末端（５’−突出）を「充填する」ために使用されるが、その一本鎖３’→５’エキソヌクレアーゼ活性は、３’−突出末端を除去する。Ｔ４  ＰＮＫのキナーゼ活性は、５’−ヒドロキシ末端にリン酸基を付加する。
【０１０１】
（工程６Ｄ−ヘアピンアダプターライゲーション（図１７Ｄおよび図１８Ａ））
本発明に従って、二本鎖オリゴヌクレオチドアダプターは、標的ＤＮＡフラグメントの末端にライゲーションされる。好ましい実施形態において、上記アダプターは、ヘアピンアダプターである（図１８Ａ）。ヘアピンアダプターの１つの利点は、アダプター−アダプターライゲーション事象がアダプターダイマーのみを生じる（すなわち、マルチマーアダプターコンカテマーの形成が防止される）ことである。さらに、それらのヘアピン構造は、ライゲーションしていないフラグメントを除去するために使用されるエキソヌクレアーゼ消化からサンプルフラグメントを保護する（工程６Ｅ）。図１８Ａに示される１つの好ましいヘアピンアダプターの設計は、ＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位およびＭｍｅＩ制限酵素認識部位を含む。ＥｃｏＲＩは、各フラグメントの末端上に付着末端を形成して（工程６Ｆ）、それらの環化を可能にする（工程６Ｇ）ために使用され得、ＭｍｅＩは、その認識部位から２０ｂｐ離れてＤＮＡを切断するＩＩｓ型制限酵素である；それは、環化されたサンプルフラグメントの末端に切込みを入れて配列決定される両末端タグを産生するために使用される。当業者は、ＥｃｏＲＩが、上記アダプターオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列における同時変化、および標的ＤＮＡフラグメントの保護のための適切なメチラーゼの使用を伴って任意の多数の他のエンドヌクレアーゼによって置換され得ることを、認識する。同様に、ＭｍｅＩは、選択した酵素が、下流配列のアセンブリに十分な長さである両末端を産生するのに十分なその制限酵素認識部位からの距離にて切断する限り、他のＩＩｓ型制限酵素によって置換され得る。好ましい実施形態において、上記ヘアピンアダプターは、例えば、図１８Ａに示される部位にてビオチン化される。他のビオチン化部位もまた、適切であり、そしてそのビオチン化部位は、当業者によって選択され得る。上記ビオチン部分は、両末端アダプターのライゲーションの間、充填反応（フラグメントの修復）の間、および両末端ライブラリーの増幅の間に、アダプターを含有する両末端フラグメントの必要に応じた選択および両末端ライブラリーフラグメント（ＭｍｅＩ消化後）の必要に応じた固定化を可能にする。
【０１０２】
（工程６Ｅ−エキソヌクレアーゼ選択（図１７Ｅ））
好ましくは、エキソヌクレアーゼ消化は、両方の末端にてヘアピンアダプターと適切に適合していないあらゆるＤＮＡを除去するために、ヘアピンアダプターのライゲーションに続き；そしてＳＰＲＩサイズ排除ビーズにおける精製は、小さな望まれない分子種（例えば、アダプター−アダプターダイマー）を除去する。上記エキソヌクレアーゼ消化は、当該分野において周知である種々のエキソヌクレアーゼの１種以上によって行なわれ得る。好ましくは、その消化は、３’→５’方向および５’→３’方向の両方において一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡの消化を同時に可能にする活性の組み合わせによって達成される。好ましい実施形態において、エキソヌクレアーゼ混合物は、Ｅ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩ（３’→５’一本鎖エキソヌクレアーゼ）、ファージλエキソヌクレアーゼ（５’→３’一本鎖エキソヌクレアーゼおよび５’→３’二本鎖エキソヌクレアーゼ）およびファージＴ７エキソヌクレアーゼ（５’→３’二本鎖エキソヌクレアーゼ、ギャップおよびニックにて開始され得る）を含む。
【０１０３】
（工程６Ｆ−ＥｃｏＲＩ消化（図１７Ｆ））
好ましい実施形態において、ＥｃｏＲｌによるエンドヌクレアーゼ的切断は、上記ヘアピンアダプターを切断すること（図１８Ａ）によって各フラグメントの末端上に付着末端を形成し、そしてフラグメントの環化を可能にするために使用される。ＥｃｏＲＩによる消化は、上記フラグメントの末端においてヘアピン構造を除去し、付着末端を残す。サンプルＤＮＡに存在する内部のＥｃｏＲＩ部位は、工程６Ｂにおいてより早期に行なわれるメチル化によって保護される。
【０１０４】
（工程６Ｇ−環化（図１７Ｇ））
次いで上記フラグメントは、それらの付着ＥｃｏＲＩ末端の分子内ライゲーション環化される。したがって、上記ライゲーションの部位は、２つの部分的なヘアピンアダプター（再構成されたＥｃｏＲＩ部位と直結する；合計４４ｂｐ）を有し、それらの部分的なヘアピンアダプターは、サンプルフラグメントの末端によっていずれかの側においてフランキングされる（ｆｌａｎｋｅｄ）。別のエキソヌクレアーゼ消化は、あらゆる環化されていないＤＮＡを除去するために行なわれる。
【０１０５】
（工程６Ｈ−ＭｍｅＩ消化（図１７Ｈ））
次いで上記環化されたＤＮＡフラグメントは、ＭｍｅＩによって制限される。このＩＩｓ型制限酵素は、その制限酵素認識部位から約２０ｂｐ離れて切断する（２ｎｔの３’−突出を残す、すなわちその切り口は、２０／１８ｎｔにある；その酵素はまた、その部位から１９〜２２ｂｐの範囲の切り口を有するいくつかの少数の産物を産生する）。ＭｍｅＩ部位は、サンプルＤＮＡフラグメントにライゲーションされるヘアピンアダプターの末端に存在する（図１８Ａ）；これらの部位における制限は、両末端ＤＮＡライブラリーフラグメントを産生し、その両末端ＤＮＡライブラリーフラグメントは、それぞれ、ライゲーションされた「二重（ｄｏｕｂｌｅ）」ヘアピンアダプター（４４ｂｐ）およびサンプルフラグメントの２つの２０ｂｐ末端（合計で８４ｂｐの長さにわたる）を含む。
【０１０６】
（工程６Ｉ−ストレプトアビジンビーズによる単離（図１７Ｉ））
ビオチンタグを欠如することで、ライゲーションされた「二重」ヘアピンアダプターを有さないＭｍｅＩ制限フラグメントは、必要に応じて、この工程において排除され得る。両末端フラグメントのライブラリーは、ストレプトアビジンビーズまたはアビジンビーズに対する上記ヘアピンアダプターに存在するビオチンタグの結合によって、固定化され得る（そして、他のＭｍｅＩ制限フラグメントから単離され得る）。
【０１０７】
（工程６Ｊ−両末端アダプターのライゲーション（図１７Ｊ））
この工程において、工程６Ｈにおいて産生され、そして必要に応じて工程６Ｉにおいて精製された両末端ライブラリーフラグメントの末端は、両末端ライブラリーアダプターまたは両末端アダプターと称される二本鎖アダプターにライゲーションされる（図１８Ｂ）。これらの両末端アダプターは、増幅およびヌクレオチド配列決定の両方を補助するプライミング領域を提供し、そしてその両末端アダプターはまた、４５４  ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ上で良好に見出すために有用な短い（例えば、４ヌクレオチド）「配列決定キー（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｅｙ）」配列を含み得る。上記アダプターは、「縮合（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）」した２塩基の一本鎖３’突出を有し得る。縮合は、２つの突出する塩基がランダムである（すなわち、それらが、それぞれ、Ｇ、Ａ、Ｔ、またはＣのいずれかであり得る）ことを意味する。ＭｍｅＩ以外の酵素が使用された場合、当業者は、他の酵素と適合性である両末端アダプターを容易に設計し得る。図１８Ｂに示される例示のアダプターは、各アダプターを有する両末端ライブラリーフラグメントに対する指向性ライゲーションを強力に指示するように設計され、その各アダプターは、ＭｍｅＩによって産生された両末端ライブラリーフラグメントの末端に専らライゲーションし得る、それらの３’末端における縮合した２ｂｐの３’−突出を含む（但し、そのアダプターの５’末端は、リン酸化されていない、以下を参照のこと）。アダプターは、両末端ライブラリーフラグメントの利用を最大化すること、および両末端ライブラリーフラグメントのコンカテマーを形成する可能性を最小化することの両方のために、大きく過剰なモルのアダプター（１５：１のアダプター：フラグメント比）を含むライゲーション反応において両末端ライブラリーフラグメントと合わせられ得る。上記アダプター自体は、アダプターダイマーの形成を最小化するために、リン酸化されない可能性があるが、結果として、ライゲーション産物は、次いで、充填反応（工程６Ｋ）によって修復されなければならない。
【０１０８】
（工程６Ｋ−充填反応（図６Ｋ））
工程６Ｊにおいてライゲーションされた両末端アダプターが、リン酸化されていない場合、ギャップが、両末端ライブラリーＤＮＡフラグメントとのそれらの３’結合部に存在する。これらの２つの「ギャップ」または「ニック」は、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを使用して修復され得、ここでそのポリメラーゼは、そのニックを認識し、ニックを有する鎖を（各アダプターの自由な３’末端に）置換し、そしてニックの修復および完全長ｄｓＤＮＡの形成を生じる様式でその鎖を伸長する。好ましい実施形態において、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント（Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ））が、使用される。当該分野において公知である他の鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼもまた、この工程に適している（例えば、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）、またはＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ）。
【０１０９】
（工程６Ｌ−増幅（図６Ｌ））
必要に応じて、「適合した（ａｄａｐｔｅｄ）」両末端ＤＮＡライブラリーは、増幅され得る。好ましくは、その増幅は、ＰＣＲによって行なわれるが、当該分野において公知でありそして／または本明細書中に記載される他の核酸増幅方法もまた、使用され得る。好ましくは、図１８Ｂに示されるＦ−ＰＣＲおよびＲ−ＰＣＲのオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲプライマーとして使用され得る。
【０１１０】
次いで、「適合した」両末端ＤＮＡライブラリーは、増幅される（上の段落に記載されるように）か否かにかかわらず、配列決定される。好ましくは、上記ライブラリー由来の個々の分子が、配列決定される。選択したＤＮＡ配列決定方法が、それぞれ個々の配列決定反応において複数の同一の鋳型分子を必要とする場合、上記ライブラリー由来の分子は、クローン的に増幅され得る。好ましくは、そのクローン増幅（ｃｌｏｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、国際特許出願第ＷＯ  ２００５／００３３７５号、同第ＷＯ  ２００４／０６９８４９号、同第ＷＯ  ２００５／０７３４１０号（各々は、全部で参考として本明細書中に援用される）に記載されるようなビーズエマルションＰＣＲによって行なわれる。
【０１１１】
上に記載される６個の方法の対応する工程の任意の組み合わせもまた企図され、そして本発明に包含されることが、理解されるべきである。
【０１１２】
上記の開示から理解され得るように、類似性が、方法１と、方法２と、方法３と、方法４と、方法５と、方法６との間に存在する。特に、方法２、方法３、方法４、方法５および方法６のうちの類似する工程は、特に類似しており、そしてそれらの工程は、等価な結果または好ましい結果をもたらすために、それらの方法の間において、組み合わせられ得、そして交換され得る。
【０１１３】
両末端配列決定の一般的な方法が記載されているので、この方法のバリエーションが記載される。
【０１１４】
１つのバリエーションにおいて、上記ヘアピンアダプターは、突出アダプターによって置換され得る（図８）。上記突出アダプターは、ビオチン化される得、そしてその突出アダプターは、例えば、以下の構造を有し得る：
【０１１５】
【化１】
2008545448.tif 000003
上の鎖（配列番号２８）の６個の３’末端ヌクレオチド（すなわち、ＴＣＣＡＡＣ）は下の鎖（配列番号２９）の相補ヌクレオチドと組み合わせて、ＩＩ  Ｓ型制限酵素ＭｍｅＩに対する認識部位を形成する。
【０１１６】
バリエーションは、方法３と同様の様式で行われる。第１のゲノムＤＮＡ（図８Ａ）は、断片化および研磨され（図８Ｂ）、そして突出アダプターは、そのフラグメントの末端にライゲーションされる（図８Ｃ）。突出アダプターのダイマーは、サイズ分画クロマトグラフィー（すなわち、スピンカラム）または電荷ベースのクロマトグラフィーによって除去され得る。突出アダプターのより高いコンカテマーは、５’突出におけるリン酸の欠如に起因して形成されない可能性がある。上記突出プライマーダイマーの除去後（図８Ｄ）、上記フラグメントは、キナーゼを用いた処理によって自己ライゲーションに効果がある（図８Ｅ）。自己ライゲーション（すなわち、環化）が、実施され、次いでエキソヌクレアーゼ消化が、ライゲーションされていない非環状ＤＮＡを除去するために実施され得る。Ｓｉｎｃｅ突出アダプターにライゲーションされないＤＮＡフラグメントは、研磨に起因して平滑末端を有するので、それらは、それぞれの側にライゲーションされた２つの突出アダプターを有するフラグメントの５’突出末端（粘着末端）と同程度に効率的にライゲーションするとは期待されない。環化の後、ＭｍｅＩ消化は、上記突出アダプターより遠位のＤＮＡ  を除去し（図８Ｆを参照のこと）、ライゲーションされた突出アダプターのそれぞれの側に元のゲノムＤＮＡのうちの約２０塩基を残す（図８Ｇ）ために使用される。突出アダプターを有するフラグメントは、ビオチン化されたアダプターに結合するストレプトアビジンを使用して精製される（図８Ｈ）。
【０１１７】
得られたフラグメントは、例えば、本開示において提供される方法（例えば、工程３Ｈ）のような利用可能な任意の方法によって配列決定され得る。
【０１１８】
本発明の方法によって産生された核酸は、その配列の末端と相補的な１つ以上のプライマーを使用して配列決定され得る。すなわち、工程３Ｈに記載される配列決定プロトコルにおいて、配列決定アダプターＡおよび配列決定アダプターＢは、フラグメントが配列決定される前にフラグメントの末端にライゲーションされる。上記フラグメントの末端配列は配列決定アダプターＡまたは配列決定アダプターＢのいずれかであることが公知であるので、配列決定アダプターＡまたは配列決定アダプターＢに相補的な配列決定プライマーは、そのフラグメントを配列決定するために使用され得る。さらに、ライゲーションされたアダプターを含む各フラグメントの中間にある配列は、公知である（例えば、図７の７０３を参照のこと）。配列決定はまた、この中間領域に相補的なプライマーを使用して中間から始まり得る。さらに、末端領域由来の配列決定プライマーおよび中間領域由来の配列決定プライマーは、同時に配列決定されるようにフラグメントにハイブリダイズされ得る（図９を参照のこと）。一方のプライマーは、保護されるが、他方のプライマーは、保護されない。図９において、末端にハイブリダイズしたプライマーは、リン酸基によって保護される。配列決定の第１ラウンドは、上記保護されていないプライマー（図９、中間プライマー）から始まる。配列決定の第１ラウンドの後、上記第１のプライマーの伸長は、必要に応じて、例えば、相補ジデオキシヌクレオチドの組み込みによって終結され得る。あるいは、上記第１のプライマーの伸長は、鋳型鎖の末端へと進み、不必要な終結を行い得る。上記第２の保護されたプライマーは、上記フラグメントの末端から配列を決定するために、配列決定の第２ラウンドにおいて脱保護および伸長され得る。この方法は、一本鎖であり得る単一の鋳型からの２つの長い両末端配列決定の読み取りを可能にする。
【０１１９】
第２のバリエーションにおいて、断片化された出発ＤＮＡ（図１０Ａ）は、３’ＣＣ突出および必要に応じて、内部のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ部位を有するアダプターにライゲーションされる。ライゲーションされたフラグメントは、自己ライゲーションも自己環状もできない。なぜならば、それらの末端が、適合性ではない（相補的でない）からである。しかし、これらのフラグメントは、両側に５’ＧＧ突出を有するリンカーを使用してライゲーションされ得る（図１０Ｂ）。ライゲーションの後、上記核酸フラグメントは、上で考察される標準的なゲルクロマトグラフィーおよびカラムクロマトグラフィーによってか、または環化されていない分子を切断するエキソヌクレアーゼ消化によって、非環状ＤＮＡから精製され得る。得られた環状ＤＮＡ（図１０Ｄ）は、他の方法におけるようにＭｍｅＩによって切断され得、そして得られたＤＮＡは、配列決定され得る。
【０１２０】
別のバリエーションにおいて、本発明の方法は、ｓｓＤＮＡに適合されるＡ／Ｂを生成するために、使用され得る（図１１、工程１）。この一本鎖フラグメントは、Ａ／Ｂアダプターに相補的な配列を含むオリゴへのハイブリダイゼーションによって環化され得（図１１、工程２）、そしてリガーゼの存在下においてライゲーションされ得る。ライゲーションを容易にすることに加えて、上記オリゴは、環化されたｓｓＤＮＡのローリングサークル型増幅（図１１、工程３）を容易にするために、プライマーとして使用され得る。ローリングサークル型増幅されたＤＮＡは、方法１、工程１Ｋおよび工程１Ｌ（図１Ｌおよび図１Ｍ）に関して記載されるように切断され得る。増幅の後、標準的なライブラリー調製技術および配列決定技術は、その産物に適用され得る（図１１、工程４）。
【０１２１】
本発明のいくつかの実施形態は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株ゲノムの両末端配列決定実験における驚くべき知見に基づき、ここでその実験プロトコルは、本明細書中に記載される方法に従うＭｍｅＩ切断の使用を含み、そのゲノムにわたる読み取り包括度（ｒｅａｄ  ｃｏｖｅｒａｇｅ）の深さは、大きく変化した（図２０、「キャリアなし（−）」）。実質的にゲノムの同じ領域に対してマッピングされる配列読み取りの数が、深さによって意味される。この深さのバリエーションは、ゲノムにわたるＭｍｅＩ部位の密度に相関した（図２０）。予想外でありかつ驚くべきことに、本発明者らは、ＭｍｅＩ部位を含むことが既知である二本鎖ＤＮＡ（図２０において示された「（＋）」）（すなわち、Ｅ．Ｃｏｌｉ  Ｂ株ＤＮＡ（「ＥｃｏｌｉＢＳｔｒａｉｎ（＋）」）、サケ精子ＤＮＡ（「ＳａｌＳｐｒｍＤＮＡ（＋）」）、またはＭｍｅＩ部位を含むことが既知であるＰＣＲ増幅産物（「ＡｍｐＰｏｓＭｍｅＩ（＋）」））の付加がゲノムにわたる包括度の深さのバリエーションを大きく減少およびランダム化したことを発見した。しかし、ＭｍｅＩ部位を欠く二本鎖ＤＮＡ（図２０において示された「（−）」）（すなわち、ポリ（ｄＩｄＣ）（「ｄＩｄＣ（−）」）、またはＭｍｅＩ部位を含まないことが既知であるＰＣＲ増幅産物（「ＡｍｐＮｅｇＭｍｅＩ（−）」））の付加は、「キャリアなし」のコントロールと比較してゲノムにわたる包括度の深さのバリエーションのパターンを変えなかった。したがって、ＭｍｅＩポジティブキャリアＤＮＡの使用は、有益であるゲノムにわたる両末端読み取りのさらなる分布を提供した。これらの驚くべき知見は、以下の表に示されるデータによってさらに具体化される：
（表１．両末端読み取りの深さ分布および長さに対するＭｍｅＩキャリアＤＮＡの効果）
【０１２２】
【表１】
2008545448.tif 000004
表１は、Ｅ．Ｃｏｌｉ  Ｋ１２についての包括度統計（ｃｏｖｅｒａｇｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）の深さを示す。上側３つのサンプル（行）は、付加されたＭｍｅＩポジティブキャリアＤＮＡを有した一方で、下側３つのサンプルは、付加されたＭｍｅＩネガティブキャリアＤＮＡを有した。列の見出しは、以下を示す：「深さＡｖｅ」＝平均の深さ；「深さＳＴＤＥＶ」＝深さの標準偏差；「深さ％ＣＶ」＝深さＡｖｅによって除算された深さＳＴＤＥＶ（この商は、平均の深さによって補正された深さにおけるバリエーションを示す）；「長さＡｖｅ」＝ゲノムにおける両末端読み取り（ｐａｉｒｅｄ  ｒｅａｄ）の平均距離；「長さＳＴＤＥＶ」＝ゲノムにおける両末端読み取りの距離の標準偏差；「長さ％ＣＶ」＝長さＡｖｅによって除算された長さＳＴＤＥＶ。
【０１２３】
表１は、図２０にしたがって、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２ゲノムにわたる包括度の深さにおけるバリエーションがＭｍｅＩポジティブキャリアＤＮＡの付加によって大きく低下したことを示す（深さＳＴＤＥＶおよび深さ％ＣＶの値を参照のこと；より小さい深さＳＴＤＥＶおよび深さ％ＣＶの値が、有益である）。これは、ゲノムにわたる両末端読み取りのより均一な分布をもたらす。この均一な分布は、有益である。
【０１２４】
（表２．Ｅ．Ｃｏｌｉ  Ｋ１２のゲノム骨格形成に対するＭｍｅＩポジティブキャリアＤＮＡを有する両末端配列決定の効果）
【０１２５】
【表２】
2008545448.tif 000005
表２は、ショットガンのコンティグの骨格形成に対するＭｍｅＩポジティブキャリアＤＮＡによって得られた両末端配列決定データの効果を示す。ＧＳ２０配列決定装置（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴ、ＵＳＡ）におけるＥ．Ｃｏｌｉ  Ｋ１２ゲノムＤＮＡのショットガン配列決定によって得られた１２１の大きいコンティグが、両末端配列決定の読み取りによってアセンブリされた場合、骨格（すなわち、より大きい骨格）のより低い数（１９〜２５）は、キャリアＤＮＡを用いずにか、またはＭｍｅＩ部位を欠くキャリアＤＮＡ（４８〜５６の骨格）によってもたらされた両末端配列決定の読み取りと比較して、ＭｍｅＩポジティブキャリアＤＮＡによってもたらされた両末端配列決定の読み取り（列「Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳＳ  ｄｓＤＮＡ（＋）」、「Ｅ．Ｃｏｌｉ  Ｂ株（＋）」および「増幅されたポジティブ（＋）」）から生じた。したがって、ＭｍｅＩポジティブキャリアＤＮＡの使用は、本発明に従って行われる両末端配列決定によって達成されるゲノムアセンブリ性能を改善する。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、制限エンドヌクレアーゼＭｍｅＩによるＤＮＡ切断を含む任意の工程における二本鎖「キャリアＤＮＡ」の使用を包含する。上記キャリアＤＮＡは、ＭｍｅＩ部位を含まなくてはならない。ＭｍｅＩによるエンドヌクレアーゼ的な切断は、ＭｍｅＩ酵素分子のモル数がＤＮＡサンプルに存在するＭｍｅＩ部位のモル数とほぼ等しい場合、最も効率的に起きる（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡの製品カタログ）。本発明の方法において、ＭｍｅＩ部位の数は、確実に測定するのが困難でありかつ時間がかかる低いＤＮＡ濃度（代表的に、数ナノグラム〜数十ナノグラムの桁である）、そしてまた、配列決定される標的ＤＮＡに基づくＭｍｅＩ部位の数におけるバリエーションに起因して、推定することが困難である。したがって、（化学量論の濃度を達成するように）反応に添加されるＭｍｅＩ酵素の量の正確な計算には、問題がある。この困難性を克服するため、そしてＭｍｅＩ部位の数とＭｍｅＩ酵素分子の数との均衡に対する必要性を満たすために、本発明のいくつかの方法は、過剰（サンプルＤＮＡとの関係において）のキャリアＤＮＡの添加を包含する。この方法において、上記反応に添加されるＭｍｅＩ酵素の量が、既知の量のキャリアＤＮＡに基づいて算出され得る一方で、（環状）サンプルＤＮＡ中のＭｍｅＩ部位の数は、ごく僅かになる。したがって、サンプルＤＮＡのＤＮＡ濃度の測定は、必要なくなる。これは、速度を改善し、そして本方法に必要とされるコストおよび時間を減少させる。キャリアＤＮＡの量は、サンプルＤＮＡを、数倍〜約１０倍、約１００倍、約１０００倍、またはそれ以上で上回り得る。好ましい実施形態において、２マイクログラムの音波破砕された二本鎖サケ精子ＤＮＡは、１００マイクロリットルの容量において、２ユニットのＭｍｅＩおよび全ての必要とされる試薬（例えば、１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ  ４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）および５０μＭのＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ））と一緒にサンプルＤＮＡに添加され、そして約３７℃にて約１５分間インキュベートされる。当業者は、反応温度および持続時間が実用範囲内で調整され得ることを認識する。
【０１２７】
上に記載されるような、ほぼ化学量論の量のＭｍｅＩ酵素と組み合わせたＭｍｅＩ制限消化における過剰のＭｍｅＩ部位含有キャリアＤＮＡの使用は、必要に応じて、本開示（例えば、第６の方法の工程６Ｈ）において記載されるＭｍｅＩ消化（図１７Ｈ）を含む任意の方法に組み込まれ得る。当業者はまた、ＭｍｅＩ部位を含む「キャリアＤＮＡ」を添加するストラテジーが任意のＭｍｅＩ制限消化反応（特に、サンプルＤＮＡ量が低くそして／またはサンプルＤＮＡ中のＭｍｅＩ部位の数が未知である反応）において有用であることを認識する。
【０１２８】
（油中水型エマルションにおけるライゲーション）
本発明はまた、核酸分子の環化のための方法を包含する。一般的に、核酸分子の環化は、低い核酸濃度におけるライゲーションによって達成される。低濃度は、二次（またはより高次）反応速度論に従う分子間事象よりも、一次反応速度論に従う所望の分子内ライゲーション反応（すなわち環化）に有利に機能する（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、２００１、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．）。しかし、高い希釈度においてさえ、分子間事象を、防止できず、そして核酸の極端な希釈度は、実用的ではない。分子間ライゲーション（コンカテマー、二重の環（ｄｏｕｂｌｅ−ｃｉｒｃｌｅ）など）の発生は、所望の分子内環化事象の産生を減少させる。いくつかのシナリオにおいて、分子間ライゲーション産物は、下流の適用に不利であり得る。要約すると、従来のアプローチは、少なくとも２つの主要な欠点を有する。第１に、出発核酸を希釈する必要性は、反応容量および関連する試薬のコストを増大させる。高い希釈度はまた、反応産物の効率的な回収を困難にする。第２に、多数の分子間ライゲーション事象が、起こり、所望の分子内ライゲーション産物の産生を減少させる。
【０１２９】
本発明は、上に記載される従来の環化アプローチに関連する問題を大きく排除する方法を包含する。例えば、本発明に従って、高い希釈度（すなわち、低い核酸濃度）にて上記ライゲーション反応を行う必要性は、存在しない。１つの実施形態において、適合性のライゲーション可能な末端（例えば、平滑末端またはねじれ型（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）（「粘着」）末端）を有する個々の直鎖状の二本鎖ＤＮＡ分子は、物理的に隔離された反応環境においてライゲーションされる。ライゲーションされるＤＮＡと上記ライゲーション反応に必要な全ての試薬（例えば、ＤＮＡリガーゼ、リガーゼ緩衝液、ＡＴＰなど）とを含む水溶液は、油中（好ましくは、エマルションを安定化するように機能する界面活性剤の存在下において）に乳化される。エマルションを形成するための適切な組成物および方法は、下でより詳細に考察される。得られた油中水型エマルションは、微小滴（マイクロリアクター（ｍｉｃｒ  ｏｒｅａｃｔｏｒ））を含み、それぞれの微小滴は、０個、１個、またはそれ以上のＤＮＡ分子を含む。１つのマイクロリアクターあたりのＤＮＡ分子の数は、ＤＮＡ濃度および微小滴のサイズを改変することによって調整され得る。当業者に対して、核酸濃度、ポリヌクレオチドのサイズ（塩基の数として測定される長さ）、および微小滴の平均体積に基づいて適切な条件を算出することは、慣用的な最適化の問題である。理想的な微小滴は、単一のライゲーション可能なＤＮＡ分子を含む。しかし、マイクロリアクターの集団において、１つのマイクロリアクターあたりのＤＮＡ分子の数は、部分的に、マイクロリアクターのサイズの可変性およびＤＮＡ分子のランダムな分布に依存することが、理解される。したがって、いくつかのマイクロリアクターは、ＤＮＡ分子を含まない可能性があり、いくつかは、１個のＤＮＡ分子を含み得、そしていくつかは、２個以上のＤＮＡ分子を含み得る。当業者は、収量およびコスト（試薬の使用）が、必要とされる場合に、１つのマイクロリアクターあたりのＤＮＡ分子の平均数を変えることによって均衡を保たれ得ることを、認識する。
【０１３０】
好ましくは、ライゲーション混合物は、そのライゲーション混合物がアセンブリされている間、そして乳化工程が完了するまで冷たく（例えば、０〜４℃）保たれる。これは、上記ライゲーション反応が、所望のエマルション環境が形成される前に進行するのを防ぎ、したがって、望ましくない分子間結合の形成を防止する。次いで、乳化されたライゲーション反応は、ライゲーション反応が許容される温度にてインキュベートされる。そのインキュベーション時間は、数分間〜１時間、数時間、一晩、または２４時間あるいは１日より長い範囲であり得る。このインキュベーションの後であるが上記エマルションの破壊の前、その間、およびその後、上記ライゲーション反応は、合わせたライゲーション反応において望ましくない分子間ライゲーションを防止するために停止され得る。上記ライゲーション反応は、約０〜４℃まで温度を下げること（氷水）、リガーゼの熱失活、ＥＤＴＡの添加、リガーゼインヒビターの添加などまたはこのような方法の任意の組み合わせによって停止され得る。
【０１３１】
当業者は、本発明の上記の方法を一本鎖ＲＮＡもしくは二本鎖ＲＮＡ、または一本鎖ＤＮＡもしくは二本鎖ＤＮＡの環化に対して容易に適用する。例えば、直鎖状一本鎖ポリヌクレオチド分子の末端は、方法１の工程１Ｋにおいて記載されるように、その直鎖状一本鎖ポリヌクレオチド分子の各末端に相補的な部分を有するキャッピングオリゴヌクレオチド（架橋オリゴヌクレオチドとも称される）にアニーリングさせることによって直接並置させ得る（図１Ｌおよび図１１を参照のこと）。
【０１３２】
上記乳化されたライゲーション反応は、次いで、適切な温度にてインキュベートされ得る。例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによる「粘着末端」ライゲーションについて、適切なインキュベーション温度は、１６℃であるが、広範な温度が、受容可能である。ＤＮＡおよび他の分子のライゲーションについての条件は、幅広く当該分野において公知である。エマルションにおいて環化反応を行う１つの利点は、延長された反応時間が上記手順の成功に対して中立であるかまたは有益でさえあることである。例えば、１つのマイクロリアクターあたりに１個より多いＤＮＡ分子を有さない理想的なシナリオにおいて、インキュベーション時間は、ほとんどのＤＮＡ分子が環化されるまで延長され得る。対照的に、上に記載されるような従来の非エマルション方法を使用することによって、長いインキュベーション時間は、より高い割合の分子間ライゲーション産物をもたらし得る。本発明のエマルションベースのライゲーション方法の別の利点は、分子間ライゲーションの発生を増大させることなく比較的長い時間にわたってその反応を継続させる能力である。このような増大したインキュベーション時間は、分子間ライゲーションが起きる増大した危険性を伴わずにより多い数の環化された産物を可能にする。さらに、上記分子は、物理的手段によって単離されるものでありかつ濃度依存的様式ではないので、その反応容量は、同じ数のライゲーション事象についてずっと小さいものであり得（すなわち、水相における核酸の核酸濃度は、ずっと高いものであり得る）、その小さい反応容量は、試薬に関するコストを低下させ、そしてサンプルを処理する容易性を増大させる。当業者は、所与の微小滴においてライゲーションが起きるために、その微小滴がリガーゼ酵素の少なくとも１個の分子を含む十分な試薬を含まなければならないことを理解する。
【０１３３】
（エマルションの破壊および環化されたＤＮＡの単離）
ライゲーションの後、そのライゲーション反応は、停止され得、そしてエマルションは、「破壊される」（当該分野において「脱乳化（ｄｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とも称される）。エマルションを破壊する多くの方法（例えば、米国特許第５，９８９，８９２号およびその中に引用された参考文献を参照のこと）が、存在し、そして当業者は、適切な方法を選択し得る。脱乳化に次いで、核酸を単離するための任意の適切な方法によって行われ得る核酸単離工程が行われ得る。一旦核酸が単離されると、ライゲーションされていない材料は、この課題に適した任意の方法によって除去され得、その方法の１つは、サンプルのエキソヌクレアーゼ消化を行うことである。使用される特定のエキソヌクレアーゼ酵素は、部分的に、作用される分子の型（一本鎖または二本鎖、ＤＮＡまたはＲＮＡ）および他の考慮（例えば、その工程に都合よく組み込まれる反応温度）に依存する。上記環化された材料は、上記エキソヌクレアーゼ処理の後に当該分野において公知である多くの手順（例えば、フェノール／クロロホルム抽出またはこの目的に適した任意の市販の精製キット）のうちの１つによって精製されるなければならない。
【０１３４】
上に記載される従来の希釈ベースの環化プロトコルを使用すると、所望の環状産物の回収は直鎖状の投入したＤＮＡ分子の長さの増大に伴って減少することが、観察されている。本発明のエマルションライゲーション方法は、長いポリヌクレオチド分子（例えば、約５００塩基より長いか、約１０００塩基より長いか、約２０００塩基より長いか、約５０００塩基より長いか、約１００００塩基より長いか、約２０，０００塩基より長いか、約５０，０００塩基より長いか、約１００，０００塩基より長いか、約２５０，０００塩基より長いか、約１００万塩基より長いか、または約５００万塩基より長い分子、あるいは目的の実験プロトコルに望ましいと考えられる事実上任意のサイズ）の環化において特に有用である。
【０１３５】
本明細書中に記載されるエマルションライゲーション方法は、それらが環化をもたらすか否かにかかわらず、広範な種々のライゲーション反応において有用である。したがって、上に記載されるエマルションライゲーションは、本明細書中に記載される種々の方法の任意のライゲーション工程（特に、投入した核酸の環化が望まれるライゲーション反応）において使用され得る。
【０１３６】
（乳化）
エマルションは、他の相に顕微鏡的かまたはコロイド的なサイズではない液滴として分散される１つのを含む２つの不混和性液相の不均一な系である。本発明のエマルションは、マイクロカプセル（マイクロリアクター）の形成を可能にしなければならない。エマルションは、不混和性液体の任意の適切な組み合わせから産生され得る。本発明のエマルションは、微細に分かれた液滴の形態で存在する相（分散する、内部相または不連続相）として親水性の相（生化学的成分を含む）を有し、かつこれらの液滴が懸濁されるマトリックス（分散しない、連続相または外部相）として疎水性の不混和性液体（「油」）を有する。このようなエマルションは、「油中水型」（Ｗ／Ｏ）と称される。これは、生化学的成分を含む水相全体が分離した液滴（内部相）に区分されるという利点を有する。疎水性の油である外部相は、一般に、生化学的成分を含まず、したがって不活性である。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、マイクロリアクターは、核酸ライゲーションに必要な試薬を含む。複数のマイクロリアクターは、それぞれ、正確に１個のポリヌクレオチド分子を含み得る。特定の実施形態において、例えば、リガーゼの熱失活が上記反応後に行われる場合またはライゲーションが耐熱性リガーゼ（例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ）を使用して高い温度で行われる場合、耐熱性の油中水型エマルションが、望ましい。上記エマルションは、当該分野において公知である任意の適切な方法によって形成され得る。エマルションを形成する１つの方法は、下に記載されるが、エマルションを作製するための任意の方法が、使用され得る。これらの方法は、当該分野において公知であり、そしてその方法としては、アジュバント法（ａｄｊｕｖａｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ）、向流法（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｆｌｏｗ  ｍｅｔｈｏｄ）、逆流法（ｃｒｏｓｓ−ｃｕｒｒｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ）、振盪、回転ドラム法（ｒｏｔａｔｉｎｇ  ｄｒｕｍ  ｍｅｔｈｏｄ）、およびメンブレン法（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｍｅｔｈｏｄ）が挙げられる。さらに、上記マイクロプセルのサイズは、成分の流量および速度を変えることによって調整され得る。例えば、滴下において、液滴のサイズおよび送達の合計時間は、変えられ得る。いくつかの実施形態において、上記微小滴は、例えば、Ｌｉｎｋら（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．編、２００６、４５、２５５６−２５６０（全体が本明細書によって参考として援用される））によって記載されるようなマイクロ流体デバイス内で形成され得る。
【０１３８】
上記マイクロリアクターの少なくともいくつかは、十分な核酸および他のライゲーション試薬を含むために、十分に大きいべきである。しかし、上記マイクロリアクターの少なくともいくつかは、そのマイクロリアクター集団の一部が単一の自己ライゲーション可能なポリヌクレオチド分子を含むように十分に小さいべきである。いくつかの実施形態において、上記エマルションは、熱安定性である。好ましくは、形成される液滴は、直径が約１００ナノメートル〜約５００マイクロメートル（より好ましくは、約１マイクロメートル〜約１００マイクロメートル）のサイズの範囲である。有利には、直交流流体混合（ｃｒｏｓｓ−ｆｌｏｗ  ｆｌｕｉｄ  ｍｉｘｉｎｇ）（必要に応じて、電場と組み合わせられる）は、液滴形成の制御および液滴サイズの均一性を可能にする。
【０１３９】
生物学的反応に適した種々のエマルションは、ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＴａｗｆｉｋ、ＥＭＢＯ、２２、ｐｐ．２４−３５（２００３）；Ｇｈａｄｅｓｓｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８、ｐｐ．４５５２−４５５７（２００１）；米国特許第６，４８９，１０３号およびＷＯ  ０２／２２８６９（それぞれは、参考として本明細書中に完全に援用される）において言及される。好ましい実施形態において、上記油は、シリコーンオイルである。
【０１４０】
（界面活性剤）
本発明のエマルションは、１種以上の表面活性剤（エマルション安定化剤；界面活性剤）の添加によって安定化され得る。これらの界面活性剤は、乳化剤とも称され、そして相の分離を防止する（または少なくとも遅延させる）ように水／油界面にて作用する。多くの油および多くの乳化剤は、油中水型エマルションの産生に使用され得る；最近の編集物は、１６，０００種を超える界面活性剤を記載し、それらの多くは、乳化剤として使用される（Ａｓｈ，Ｍ．およびＡｓｈ，Ｉ．（１９９３）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ．Ｇｏｗｅｒ、Ａｌｄｅｒｓｈｏｔ）。本発明の方法において使用されるエマルション安定化剤としては、Ａｔｌｏｘ  ４９１２、モノソルビタンモノオレエート（Ｓｐａｎ８０；ＩＣＩ）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０；ＩＣＩ）ならびに他の認識された適切な安定化剤および市販の適切な安定化剤が挙げられる。種々の実施形態において、上記界面活性剤は、０．５〜５０％、好ましくは、１０〜４５％、より好ましくは、３０〜４０％のエマルションの油相中のｖ／ｖ濃度にて提供される。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、化学的に不活性なシリコーンベースの界面活性剤（例えば、シリコーンコポリマー）が、使用される。１つの実施形態において、使用されるシリコーンコポリマーは、ポリシロキサン−ポリセチル−ポリエチレングリコールコポリマー（セチルジメチコンコポリオール）（例えば、Ａｂｉｌ（登録商標）ＥＭ９０（Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ）である。
【０１４２】
化学的に不活性なシリコーンベースの界面活性剤は、エマルション組成における唯一の界面活性剤として提供され得るか、または数種の界面活性剤の１つとして提供され得る。したがって、異なる界面活性剤の混合物が、使用され得る。
【０１４３】
特定の実施形態において、使用される１つの界面活性剤は、Ｄｏｗ  Ｃｏｍｉｎｇ（登録商標）７４９  Ｆｌｕｉｄ（１〜５０％  ｗ／ｗ、好ましくは、１０〜４５％  ｗ／ｗ、より好ましくは２５〜３５％  ｗ／ｗにて使用される）である。他の特定の実施形態において、使用される１つの界面活性剤は、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）５２２５Ｃ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ａｉｄ（１〜５０％  ｗ／ｗ、好ましくは、１０〜４５％  ｗ／ｗ、より好ましくは３５〜４５％  ｗ／ｗにて使用される）である。好ましい実施形態において、油／界面活性剤混合物は、４０％（ｗ／ｗ）Ｄｏｗ  Ｃｏｍｉｎｇ（登録商標）５２２５Ｃ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ａｉｄ、３０％（ｗ／ｗ）Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）７４９  Ｆｌｕｉｄ、および３０％（ｗ／ｗ）シリコーンオイルからなる。
【０１４４】
本発明の方法は、現在の方法を上回る複数の利益および利点を提供する。先行技術を上回る現在の方法の１つの利点は、真核生物または原核生物における調製されるフラグメントのクローニングおよび増殖が必要とされないことである。これは、標的配列が宿主細胞におけるエピソームとしての増殖の間に再配列され得る複数の反復を含む場合、特に有用である。
【０１４５】
本開示の方法の別の利点は、それが、コンティグ配列だけでなく、１００ｂｐを超えるか、３００ｂｐを超えるか、５００ｂｐを超えるか、１ｋｂを超えるか、５ｋｂを超えるか、１０ｋｂを超えるか、１００ｋｂを超えるか、１Ｍｂを超えるか、１０Ｍｂを超えるか、またはより大きい長さを有し得る長いコンティグの末端配列および末端配列の方向性も提供することによってゲノムアセンブリを容易にし得ることである。この配列情報および方向性情報は、ゲノムアセンブリを容易にするため、そしてギャップ閉鎖を提供するために使用され得る。
【０１４６】
さらに、両末端読み取りは、ゲノムのアセンブリにおける信頼度の第２のレベルを提供する。例えば、両末端配列決定および定型的なコンティグ配列決定が、ほぼ一致したＤＮＡ配列である場合、その配列の信頼度のレベルは、増大される。あるいは、２つの配列データが、互いに矛盾する場合、その信頼度は、減少し、そしてさらなる分析および／または配列決定は、不一致の供給源を見出すために必要である。
【０１４７】
両末端読み取りにおける読み取り枠の存在または非存在はまた、読み取り枠の位置についての方向を提供する。例えば、コンティグの両方の配列決定された末端が、読み取り枠を含む場合、完全なコンティグが読み取り枠である機会が、存在する。これは、標準的な配列決定技術によって確認され得る。あるいは、２つの末端の知見によって、特異的ＰＣＲプライマーが、その２つの末端を増幅するために構築され得、そしてその増幅された領域は、読み取り枠の存在を決定するために配列決定され得る。
【０１４８】
本発明の方法はまた、ゲノムの組織化および構造の理解を改善する。両末端配列決定は、配列決定が困難である領域を測定する能力を有するので、ゲノムの構造は、これらの領域が配列決定されない場合でさえ推定され得る。配列決定が困難な領域は、例えば、反復領域および二次構造の領域であり得る。この場合において、これらの困難な領域の数および位置は、これらの領域の配列が公知でない場合でさえゲノムにおいてマッピングされ得る。
【０１４９】
本発明の方法はまた、延長した距離にわたってゲノムのハロタイプ分類（ｈａｐｌｏｔｙｐｉｎｇ）を可能にする。例えば、特異的プライマーが、長い距離によって連結された２つのＳＮＰを含むゲノムの領域を増幅するために作製され得る。この増幅された領域の２つの末端は、上記２つのＳＮＰの間の核酸を配列決定することなくハロタイプを決定するために、本発明の方法を使用して配列決定され得る。この方法は、上記２つのＳＮＰが配列決定するのが非経済的な領域にわたる場合に、特に有用である。これらの領域は、長い領域、反復を有する領域、または二次構造の領域を含む。
【０１５０】
本方法のビオチン化されるアダプターは、さらなる利点を提供する（図７）。図７Ａは、配列決定できる状態である様式で配列決定プライマーＡおよび配列決定プライマーＢにライゲーションされた核酸を示す。上記核酸のいくつかは、単一のコンティグ領域（７０１）の２つの末端を含まない夾雑核酸である。コンティグの両方の末端を含む核酸フラグメントは、７０２として示される。核酸７０２は、ビオチンを含む核酸の唯一の化学種（ｓｐｅｃｉｅｓ）であるので、この化学種は、ストレプトアビジンビーズを使用して精製され得る（図７Ｂ）。この化学種は、精製後に配列決定する状態になっている。アフィニティー精製を使用することによって、有用な情報をもたらす配列の分画は、実質的に増大され得る。
【０１５１】
これは、夾雑ＤＮＡ（７０１）が長い場合（例えば、図７Ｄにおける夾雑核酸（７０１）の各々が、数ｋｂ長である場合）に、特に有用である。これらの夾雑物を配列決定することは、計画に投入された試薬、人的資源、およびコンピュータの処理能力のかなりの部分を消費する。この場合において、アフィニティークロマトグラフィーによる適切なフラグメントの事前の精製（図７Ｅ）は、実質的な労力および試薬の節約を提供する。
【０１５２】
当業者は、逆鎖のイノシンを含む任意の二本鎖ＤＮＡのＥｎｄｏＶによるエンドヌクレアーゼ的な切断（図１４に示されるような、ヘアピンを有するかまたはヘアピンを有さない）が一本鎖突出（粘着末端）を生成し得ることを、即座に認識し、ここでその突出は、実質的に任意のヌクレオチド配列を有し得る。本発明はまた、実質的に図１４に類似するがヘアピンを有さないポリヌクレオチド設計および方法を含む。さらに、上に記載されるような図１４に示される（ヘアピンを有するかまたはヘアピンを有さない）本発明の方法および組成物は、固有のエンドヌクレアーゼ部位の導入が望ましい多数の分子生物学技術および組換えＤＮＡ技術において有用である。このような技術としては、ＤＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーの構築、種々のサブクローニングストラテジー、またはプライマー、アダプター、もしくはリンカー中の固有のエンドヌクレアーゼ部位から利益を受ける任意の方法論が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５３】
本明細書中に記載される方法のいずれかによって生成される両末端核酸構築物は、当該分野において公知である任意の配列決定方法によって配列決定され得る。標準的な配列決定方法（例えば、Ｓａｎｇｅｒ配列決定法またはＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定法）は、幅広く当該分野において公知である。配列決定はまた、例えば、４５４（登録商標）Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴ、ＵＳＡ）によって開発された４５４  ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＴＭとして公知である自動化された配列決定方法（例えば、国際出願番号ＷＯ／０５００３３７５（２００４年１月２８日出願）ならびに米国特許出願第１０／７６７，７７９号（２００４年１月２８日出願）、同第６０／４７６，６０２号（２００３年６月６日出願）；同第６０／４７６，５０４号（２００３年６月６日出願）；同第６０／４４３，４７１号（２００３年１月２９日出願）；同第６０／４７６，３１３号（２００３年６月６日出願）；同第６０／４７６，５９２号（２００３年６月６日出願）；同第６０／４６５，０７１号（２００３年４月２３日出願）；および同第６０／４９７，９８５号（２００３年８月２５日出願）に記載される）を使用することによって行われ得る。当該分野において公知であるさらなる配列決定方法（例えば、Ｍｅｔｚｇｅｒ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００５年１２月；１５（１２）：１７６７−７６、本明細書によって参考として援用される）によって概説されるような任意の合成による配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）方法またはライゲーションによる配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）方法もまた、企図され、そして本発明の両末端配列決定法において使用され得る。
【０１５４】
本開示全体を通して、用語「ビオチン」、「アビジン」または「ストレプトアビジン」は、結合対のメンバーを記載するために使用されている。これらの用語は結合対を使用するための１つの方法を単に例示することが、理解される。したがって、用語「ビオチン」、「アビジン」、または「ストレプトアビジン」は、結合対の任意の１つのメンバーによって置換され得る。結合対は、互いに対する特異的結合を示す任意の２つの分子であり得、そしてその結合対としては、少なくとも、ＦＬＡＧ／抗ＦＬＡＧ抗体；ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、レセプター／リガンド、抗原／抗体、レセプター／リガンド、ポリＨｌＳ／ニッケル、プロテインＡ／抗体およびそれらの誘導体などの結合対が挙げられる。他の結合対は、公知であり、そして文献において公開される。
【０１５５】
本開示中の任意の場所で引用される全ての特許、特許出願および参考文献は、その全体が参考として本明細書によって援用される。
【０１５６】
本発明は、ここで、以下の非限定的な実施例によってさらに記載される。
【実施例】
【０１５７】
（実施例１：オリゴヌクレオチド設計）
この実験において使用されるオリゴヌクレオチドは、以下の通りに設計および合成される。
【０１５８】
図３Ａの上部に示される捕捉エレメントオリゴヌクレオチドを、ＵＡ３アダプターおよびＵＡ３キーを含むように設計する。ＮｏｔＩ部位を、上記アダプターの間に配置する。完全な構築物（捕捉エレメント）を、ネステッドオリゴおよびネステッドＰＣＲを使用して形成し得る。最終産物の配列を、合成およびクローニングする。
【０１５９】
図３Ａの下部に示されるＩＩＳ型捕捉フラグメントオリゴヌクレオチドは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＭｍｅＩ）を示す配列をキー配列後の捕捉フラグメント中に含むことを除いて上に記載する捕捉フラグメントと同様である。これらのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ切断部位は、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼによって切断されるこれらの捕捉エレメントを用いて作製される任意の構築物の切断を可能にする。当該分野において公知であるように、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼは、その認識部位から種々の距離（ＭｍｅＩの場合において、２０／１８塩基）にてＤＮＡを切断する。
【０１６０】
短いアダプター捕捉フラグメントオリゴヌクレオチドを、ＳＡＤ１アダプターおよびＳＡＤ１キーを含むように設計した（図３Ｂ）。ＮｏｔＩ部位をまた、上記アダプターの間においた。このオリゴヌクレオチドを、上記キー配列後のＭｍｅＩ  ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ切断部位を用いて合成し得る（図３Ｂ、短いアダプター捕捉フラグメント（ＩＩＳ型）を参照のこと）。
【０１６１】
（実施例２：ヘアピンアダプター両末端配列決定のためのプロトコル）
１００μｌ中のＥ．Ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ＤＮＡ（２０μｇ）を、標準的なＨｙｄｒｏＳｈｅａｒアセンブリ（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ、ＵＳＡ）を使用して速度１０で２０サイクルにわたってハイドロシアー（ｈｙｄｒｏｓｈｅａｒ）した。メチル化反応を、５０μｌのＤＮＡ（５μｇ）、３４．７５μｌのＨ２Ｏ、１０μｌのメチラーゼ緩衝液、０．２５μｌの３２ｍＭ  ＳＡＭ、および５μｌのＥｃｏＲｌメチラーゼ（４０，０００ユニット／ｍｌ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を添加することによってそのせん断したＤＮＡにおいて行った。その反応を、３７℃にて３０分間インキュベートした。そのメチル化反応の後、そのせん断しメチル化したＤＮＡを、製造業者の説明書に従ってＱｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製カラムを使用して精製した。その精製したＤＮＡを、１０μｌのＥＢ緩衝液によってカラムから溶出させた。
【０１６２】
上記せん断しメチル化したＤＮＡを、平滑末端を有するせん断した材料を形成するために研磨する工程に供した。１０μｌにおけるＤＮＡを、１３μｌのＨ２Ｏと、５μｌの１０×研磨緩衝液と、５μｌの１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンと、５μｌの１０ｍＭ  ＡＴＰと、３μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰと、５μｌの１０Ｕ／μｌ  Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼと、５μｌの３Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼとを含む反応混合物に添加した。その反応を、１２℃にて１５分間インキュベートし、次いでその温度を、さらに１５分間にわたって２５℃まで上昇させた。その反応を、次いで、製造業者の説明書に従ってＱｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製カラムを使用して精製した。
【０１６３】
上記ヘアピンアダプターを、１０μｌの５μｇせん断ＤＮＡ、１７．５μｌのＨ２Ｏ、５０μｌの２×Ｑｕｉｃｋリガーゼ緩衝液、２０μｌの１０μＭヘアピンアダプター、および２．５μｌのＱｕｉｃｋリガーゼ（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ＮＥＢ）を添加することによって上記せん断した平滑末端ＤＮＡフラグメントにライゲーションした。その反応を、２５℃にて１５分間インキュベートし、次いでそのライゲーションしたフラグメントを、その混合物に２μｌのλエキソヌクレアーゼ、１μｌのＲｅｃ  Ｊ（３０，０００ユニット／ｍｌ、ＮＥＢ）、１μｌのＴ７エキソヌクレアーゼ（１０，０００ユニット／ｍｌ、ＮＥＢ）、および１μｌのエキソヌクレアーゼＩ（２０，０００ユニット／ｍｌ、ＮＥＢ）を添加することによって選択した。その反応を、３７℃にて３０分間インキュベートし、次いでそのサンプルを、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製カラムにおいて精製した。その処理したＤＮＡを、次いで、製造業者の説明書に従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｐｕｒｅｌｉｎｋカラムに通し、そして５０μｌの容量でカラムから溶出させた。
【０１６４】
上記ライゲーションしエキソヌクレアーゼ処理したＤＮＡを、ＥｃｏＲＩによる消化に供した。５０μｌのＤＮＡと、３０μｌのＨ２０と、１０μｌのＥｃｏＲＩ緩衝液と、１０μｌのＥｃｏＲＩ（２０，０００ユニット／ｍｌ）とを含む反応を、３７℃にて一晩インキュベートした。その切断した産物を、製造業者の説明書に従ってＱｉａｇｅｎ  ＱｉａＱｕｉｃｋカラムを使用して精製した。その切断した産物を、閉環状ＤＮＡを産生するために、５０μｌのＤＮＡと、２０μｌの緩衝液４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と、２μｌの１００ｍＭ  ＡＴＰと、１２３μｌのＨ２０と、５μｌのリガーゼ（上記の通り）とを含む反応においてさらに１回ライゲーションした。そのライゲーション反応を、２５℃にて１５分間インキュベートし、次いでそれらを、その混合物に１μｌのλエキソヌクレアーゼ（５，０００ユニット／ｍｌ、ＮＥＢ）、０．５μｌのＲｅｃ  Ｊ（上記の通り）、０．５μｌのＴ７エキソヌクレアーゼ（上記の通り）、および０．５μｌのエキソヌクレアーゼＩ（上記の通り）を添加することによるエキソヌクレアーゼ処理のさらなるラウンドに供した。そのエキソヌクレアーゼ反応を、３７℃にて３０分間インキュベートし、次いでそのサンプルを、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製カラムによって精製した。
【０１６５】
上記処理したＤＮＡを、次いで１０μｌのＤＮＡと、７８．７５μｌのＨ２Ｏと、１０μｌの緩衝液４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、０．２５μｌのＳＡＭと、０．５μｌのＭｍｅ  Ｉ（２，０００  ユニット／ｍｌ、ＮＥＢ）とを含む反応混合物におけるＭｍｅ  Ｉ消化に供した。その反応を、３７℃にて６０分間にわたってＭｍｅ  Ｉを用いて消化し、次いで０．１％の最終濃度の３Ｍ酢酸ナトリウムによって緩衝化したＱｉａｇｅｎ  ＱｉａＱｕｉｃｋカラムにおいて精製した。そのカラムを、７００μｌの８．０ＭグアニジンＨＣｌによって洗浄し、そしてそのサンプルを、製造業者の説明書に従ってそのカラムに添加した。そのＤＮＡを、３０μｌのＥＢ緩衝液において溶出させ、そして１００μｌの最終容量まで希釈した。
【０１６６】
ストレプトアビジン磁性ビーズ（５０μｌ）（Ｄｙｎａｌ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ２７０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を、２×ビーズ結合緩衝液によって洗浄し、そして１００μｌの２×ビーズ結合緩衝液中にそのビーズを懸濁することによって調製し、次いで１００μｌのそのＤＮＡサンプルを、そのビーズに添加し、そして室温にて２０分間にわたって混合した。そのビーズを、洗浄緩衝液において２回洗浄した。ＳＡＤ７アダプターセット（Ａ／Ｂセット、その一本鎖オリゴヌクレオチドのＳＡＤ７ＦｔｏｐおよびＳＡＤ７Ｆｂｏｔを、Ａアダプターを形成するためにアニーリングさせ、そして一本鎖オリゴヌクレオチドのＳＡＤ７ＲｔｏｐおよびＳＡＤＲＦｂｏｔを、Ｂアダプターを形成するためにアニーリングさせる）（ＳＡＤ７Ｆｔｏｐ：５’−ＣＣＧＣＣＣＡＧＣＡＴＣＧＣＣＴＣＡＧＮＮ−３’（配列番号５１）；ＳＡＤ７Ｆｂｏｔ：５’−ＣＴＧＡＧＧＣＧＡＴＧＣＴＧＧ−３’（配列番号５２）；ＳＡＤ７Ｒｔｏｐ：５’−ＣＣＧＣＣＣＧＡＧＣＡＣＣＧＣＴＣＡＧＮＮ−３’（配列番号５３）；ＳＡＤ７Ｒｂｏｔ：５’−ＣＴＧＡＧＣＧＧＴＧＣＴＣＧＧ−３’（配列番号５４）、ここでＮは、４種の塩基Ａ、Ｇ、ＴまたはＣのいずれかである）を、ストレプトアビジンビーズに結合したＤＮＡにライゲーションし、１５μｌのＨ２Ｏと、２５μｌのＱｕｉｃｋリガーゼ緩衝液と、５μｌのＳＡＤ７アダプターセットと、５μｌのＱｕｉｃｋリガーゼ（上記の通り）とを含むライゲーション反応混合物を、ビーズ−ＤＮＡ混合物に添加した。そのライゲーション反応を、２５℃に１５分間インキュベートし、次いでそのビーズを、ビーズ洗浄緩衝液によって２回洗浄した。
【０１６７】
ヌクレオチド充填反応を、そのビーズに４０μｌのＨ２Ｏと、５μｌの１０×充填緩衝液と、２μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰと、３μｌの充填ポリメラーゼ（Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、８，０００ユニット／ｍｌ、ＮＥＢ）とを含む混合物を添加することによって行った。その反応を、３７℃にて２０分間インキュベートし、そしてそのビーズを、洗浄緩衝液において２回洗浄した。次いで、そのビーズを、２５μｌのＴＥ緩衝液に懸濁した。
【０１６８】
次いで、そのビーズに結合したＤＮＡを、３０μｌのＨ２Ｏと、５μｌの１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２緩衝液と、２μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰと、１μｌの１００μＭ順方向プライマー（ＳＡＤ７ＦＰＣＲ：５’−Ｂｉｏ−ＣＣＧＣＣＣＡＧＣＡＴＣＧＣＣ−３’（配列番号５５））と、１μｌの１００μＭ逆方向プライマー（ＳＡＤ７ＲＰＣＲ：５’−ＣＣＧＣＣＣＧＡＧＣＡＣＣＧＣ−３’（配列番号５６））と、１０μｌのビーズに結合したＤＮＡと、１μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ  ２ポリメラーゼ混合物（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）とを含む反応混合物においてＰＣＲに供した。ＰＣＲを、以下のプログラムを使用して行い、次いでその反応を、１４℃に保った：（ａ）９４℃にて４分間、（ｂ）９４℃にて１５秒間、（ｃ）６４℃にて１５秒間（ここで、工程（ｂ）および（ｃ）を、１９サイクルにわたって行う）、（ｄ）６８℃にて２分間。
【０１６９】
上記ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製カラムを使用して精製し、次いでその精製した産物を、１２０ｂｐの産物の存在を検出するために、１センチメートルあたり５ボルトにて１．５％アガロースゲルにおいて電気泳動した。その１２０ｂｐのフラグメントを、そのゲルから切り出し、そしてＱｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出プロトコルを使用して回収した。その１２０ｂｐのフラグメントを、１８μｌのＥＢ緩衝液において溶出させた。二本鎖産物を、ストレプトアビジンビーズに結合させ、そしてビーズ洗浄緩衝液によって２回洗浄した。一本鎖産物を、１２５ｍＭ  ＮａＯＨにおいて溶出させ、そしてＱｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製カラムにおいて精製した。この材料を、次いで４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ自動配列決定システムにおいて標準的な４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴ、ＵＳＡ）配列決定法を使用して配列決定した。
【０１７０】
（実施例３：非ヘアピンアダプター両末端配列決定のためのプロトコル）
１００μｌ容量におけるＥ．Ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ＤＮＡ（５μｇ）を、鎖アセンブリ（ＨｙｄｒｏＳｈｅａｒ、上記の通り）を使用して速度１１において２０サイクルにわたってハイドロシアーした。そのせん断したＤＮＡを、製造業者の説明書に従ってＱｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製カラムにおいて精製し、そして２３μｌのＥＢ緩衝液によって溶出させた。その精製しせん断したＤＮＡを、２３μｌのＤＮＡと、５μｌの１０×研磨緩衝液と、５μｌの１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンと、５μｌの１０ｍＭ  ＡＴＰと、３μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰと、５μｌの１０Ｕ／μｌ  Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼと、５μｌの３Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼとを含む反応混合物において平滑末端研磨に供した。その反応を、１２℃にて１５分間インキュベートし、次いでその温度を、さらに１５分間にわたって２５℃まで上昇させた。その反応を、次いで製造業者の説明書に従ってＱｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製カラムにおいて精製した。非ヘアピンアダプターのライゲーションを、２５μｌの２×Ｑｕｉｃｋリガーゼ緩衝液と、１８．５μｌの１０μＭ非ヘアピンアダプターと、２．５μｌのＱｕｉｃｋリガーゼ（上記の通り）とを含む反応混合物において２μｇのそのせん断し精製したＤＮＡを使用して行った。そのライゲーション反応を、２５℃にて１５分間インキュベートし、次いでそのサンプルを、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  ５−４００スピンカラムに通し、次いでＱｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製カラムに通した。そのＤＮＡを、次いで、１０μｌのＥＢ緩衝液によってそのカラムから溶出させた。
【０１７１】
上記精製しライゲーションしたＤＮＡを、次いで、キナーゼ反応に供し、ここでその混合物は、１３μｌのＨ２Ｏ、２５μｌの２×緩衝液、１０μｌのＤＮＡ、および２μｌの１０Ｕ／μｌ  Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを含んだ。その反応を、３７℃にて６０分間インキュベートし、次いでそのサンプルを、１ｃｍあたり５ボルトにて１％アガロースゲルにおいて電気泳動した。１５００ｂｐと４０００ｂｐとの間のバンドを、そのゲルから切り出し、そしてＱｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出プロトコルを使用して回収した。
【０１７２】
上記精製したＤＮＡを、環状ＤＮＡを産生するために、１８μｌのＤＮＡと、２０μｌの緩衝液４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と、２μｌのＡＴＰと、１５０μｌのＨ２Ｏと、１０μｌのリガーゼ（上記の通り）とを含む反応混合物においてライゲーションのさらなるラウンドに供した。その反応を、２５℃にて１５分間インキュベートし、次いで２μｌのλエキソヌクレアーゼ（上記の通り）と、１μｌのＲｅｃ  Ｊ（上記の通り）と、１μｌのＴ７エキソヌクレアーゼ（上記の通り）と、１μｌのエキソヌクレアーゼＩ（上記の通り）とを含む混合物を、３７℃にて３０分間インキュベートした。そのエキソヌクレアーゼ反応の後、そのＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製カラムにおいて精製し、そして２０μｌのＥＢ緩衝液によって溶出させた。
【０１７３】
上記精製しライゲーションしたＤＮＡを、次いで、６８．６μｌのＨ２Ｏと、１０μｌの緩衝液４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と、０．２μｌのＳＡＭと、１μｌのＭｍｅ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ（上記の通り）とを含む混合物に添加した。そのＤＮＡを、３７℃にて３０分間切断し、次いで、そのＤＮＡを、０．１％の最終濃度の３Ｍ酢酸ナトリウムにて予め緩衝化したＱｉａｇｅｎ  ＱｉａＱｕｉｃｋカラムにおいて精製し、そして７００μｌの８．０ＭグアニジンＨＣｌによって洗浄した。その精製したＤＮＡを、次いで、３０μｌのＥＢ緩衝液によって溶出させ、そしてその容量を、１００μｌに調整した。
【０１７４】
ストレプトアビジン磁性ビーズ（５０μｌ）（上記の通り）を、２×ビーズ結合緩衝液によって洗浄し、そして１００μｌのビーズ結合緩衝液に懸濁した。そのビーズを、次いで、１００μｌの上記ＤＮＡサンプルと混合し、そして室温にて２０分間にわたって互いに結合させた。その後、そのビーズを、洗浄緩衝液において２回洗浄し、そしてＳＡＤ７アダプターセット（Ａ／Ｂセット）（上記の通り）を用いたライゲーション反応に供した。１５μｌのＨ２Ｏと、２５μｌのＱｕｉｃｋリガーゼ緩衝液と、５μｌのＳＡＤ７アダプターと、５μｌのＱｕｉｃｋリガーゼ（上記の通り）とを含む混合物を、そのビーズに結合したＤＮＡに添加し、そして２５℃にて１５分間インキュベートし、次いでそのビーズを、洗浄緩衝液において２回洗浄した。
【０１７５】
上記ビーズに結合したＤＮＡを、４０μｌのＨ２Ｏと、５μｌの１０×充填緩衝液と、２μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰと、３μｌの充填ポリメラーゼ（上記の通り）とを含む混合物において充填反応に供した。その反応を、３７℃にて２０分間にわたって行い、次いでそのビーズを、洗浄緩衝液において２回洗浄し、そして２５μｌのＴＥ緩衝液に懸濁した。そのビーズに結合したＤＮＡを、３０μｌのＨ２Ｏと、５μｌの１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２緩衝液と、２μｌのｄＮＴＰと、０．５μｌの１００μＭ順方向プライマー（上記の通り）と、０．５μｌの１００μＭ逆方向プライマー（上記の通り）と、１０μｌのビーズに結合したＤＮＡと、１μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ  ２酵素（上記の通り）とを含む反応混合物において増幅した。そのＰＣＲ反応を、以下の条件下で行い、次いでそのＰＣＲ反応を、１４℃に保った：（ａ）９４℃にて４分間、（ｂ）９４℃にて１５秒間、（ｃ）６４℃にて１５秒間（ここで、工程（ｂ）および工程（ｃ）を、２４サイクルにわたって繰り返した）、（ｄ）６８℃にて２分間。そのＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製カラムにおいて精製し、そして１ｃｍあたり５ボルトにて１．５％アガロースゲルにおいて電気泳動した。１２０ｂｐの産物を、そのゲルから切り出し、そしてＱｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出プロトコルによって回収した。そのＤＮＡを、次いで、１８μｌのＥＢ緩衝液において溶出させた。
【０１７６】
二本鎖ＤＮＡを、ストレプトアビジンビーズに結合させ、そしてそのビーズを、洗浄緩衝液によって２回洗浄した。一本鎖ＤＮＡを、次いで、１２５ｍＭ  ＮａＯＨによって溶出させ、次いで、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製カラムを使用して精製した。その精製した材料を、標準的な４５４エマルションプロトコルおよび４５４配列決定プロトコルに供した。
【０１７７】
上に記載した手順を使用して、本発明者らは、以下の結果を得た：
Ｅ．ｃｏｌｉコンティグは、４回の６０×６０の実行（約１３０万の読み取り）からの通常の４５４配列からもたらされた：１０００ｂｐよりも大きい３０３個のコンティグが、もたらされ、それは、１６，８５８ｂｐの平均サイズ、および９４，０６０ｂｐの最大サイズを有した。表３は、上記の手順を使用して得たさらなる結果を含む。
【０１７８】
（表３：両末端配列決定手順からの結果）
【０１７９】
【表３】
2008545448.tif 000006
分析を、最初にＧｅｎｂａｎｋから得たＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２ゲノムに対して全ての両末端読み取りをブラスト検索することによって行った。上記参照ゲノムと０．１未満の期待値で一致した読み取りを、保持した。内部リンカー配列によって分けられた２つの別個のブラストヒット（ｂｌａｓｔ  ｈｉｔ）を含んだ全ての読み取りを、そのゲノムにおいて離れているそれらのブラスト検索した距離について分析し、そして距離が５，０００ｂｐ未満である場合にのみ保持した。これらの読み取りを、次いで、そのゲノムにおける第１および第２の位置ヒット（ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｈｉｔ）によって順序付けし、そしてオーバーラップが次の分類した両末端配列に生じたか否かを見るために試験した。これらの順序付けしたコンティグの各々を、次いで、上記と同じ様式において４５４配列決定コンティグに対するオーバーラップパターンについて試験した。
【０１８０】
本発明の有利な実施形態をそのようにして詳細に記載したことで、上記によって定義される本発明はおそらく本発明の精神または分野を逸脱することなく可能であるその明白なバリエーションとして上記の説明に示される特定の詳述に限定されないことが、理解されるべきである。本明細書中に記載される方法の改変およびバリエーションは、当業者に明らかであり、そして添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】図１は、両末端配列決定ストラテジーの１つの実施形態の概略図を示す。数値的な標識は、核酸の由来を示す。「１０１」は、例えば、図３Ａの左側に示される捕捉エレメントの１つのフランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）領域を示す。「１０２」は、例えば、図３Ａの右側に示される捕捉エレメントの第２のフランキング領域を示す。「１０３」は、捕捉エレメントを示す。「１０４」は、断片化（および必要に応じて、サイズ分画）された出発核酸を示す。「１０５」は、分割エレメントを示す。「１０６」は、ポリメラーゼを示す。
【図２】図２は、両末端配列決定ストラテジーの第２の実施形態の概略図を示す。
【図３】図３は、捕捉フラグメントの配列および設計を示す。その配列の識別は、以下の通りである：両末端捕捉フラグメント産物  配列番号１オリゴ１  配列番号２オリゴ２  配列番号３オリゴ３  配列番号４オリゴ４  配列番号５両末端捕捉フラグメント産物（ＩＩＳ型、ＭｍｅＩ）  配列番号６短いアダプター両末端捕捉フラグメント  配列番号７短いアダプター両末端捕捉フラグメント（ＩＩＳ型、ＭｍｅＩ）  配列番号８。
【図４】図４は、ＲＥフラグメントの１つの実施形態を示す。
【図５】図５は、ＲＥフラグメントの別の実施形態を示す。
【図６−Ａ】図６は、ヘアピンアダプターを使用する両末端読み取りアプローチを示す。そのヘアピンアダプターは、以下の配列を有する：
【化２】
2008545448.tif 000007
上記ヘアピンアダプターは、上記の４つの領域へと分割されるように示される１つの連続した核酸配列である。上記４つの領域は、左から右へ、ヘアピン領域、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ビオチン化領域、およびＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ認識部位である。「６０１」は、上記ヘアピンアダプターを示す。「６０３」は、ゲノムＤＮＡを示す。Ｍｅｔは、メチル化ＤＮＡを示す。「６０２」は、ヘアピンアダプターダイマーを示す。「６０４」は、制限エンドヌクレアーゼによって切断されたヘアピンアダプターを示す。「６０５」は、制限エンドヌクレアーゼによって切断され、そして再度ライゲーションされた２つのヘアピンアダプターを示す。ＳＡは、ストレプトアビジンビーズを示す。Ｂｉｏは、ビオチン（例えば、ビオチン化ＤＮＡ）を示す。
【図６−Ｂ】図６は、ヘアピンアダプターを使用する両末端読み取りアプローチを示す。そのヘアピンアダプターは、以下の配列を有する：
【化３】
2008545448.tif 000008
上記ヘアピンアダプターは、上記の４つの領域へと分割されるように示される１つの連続した核酸配列である。上記４つの領域は、左から右へ、ヘアピン領域、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ビオチン化領域、およびＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ認識部位である。「６０１」は、上記ヘアピンアダプターを示す。「６０３」は、ゲノムＤＮＡを示す。Ｍｅｔは、メチル化ＤＮＡを示す。「６０２」は、ヘアピンアダプターダイマーを示す。「６０４」は、制限エンドヌクレアーゼによって切断されたヘアピンアダプターを示す。「６０５」は、制限エンドヌクレアーゼによって切断され、そして再度ライゲーションされた２つのヘアピンアダプターを示す。ＳＡは、ストレプトアビジンビーズを示す。Ｂｉｏは、ビオチン（例えば、ビオチン化ＤＮＡ）を示す。
【図６−Ｃ】図６は、ヘアピンアダプターを使用する両末端読み取りアプローチを示す。そのヘアピンアダプターは、以下の配列を有する：
【化４】
2008545448.tif 000009
上記ヘアピンアダプターは、上記の４つの領域へと分割されるように示される１つの連続した核酸配列である。上記４つの領域は、左から右へ、ヘアピン領域、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ビオチン化領域、およびＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ認識部位である。「６０１」は、上記ヘアピンアダプターを示す。「６０３」は、ゲノムＤＮＡを示す。Ｍｅｔは、メチル化ＤＮＡを示す。「６０２」は、ヘアピンアダプターダイマーを示す。「６０４」は、制限エンドヌクレアーゼによって切断されたヘアピンアダプターを示す。「６０５」は、制限エンドヌクレアーゼによって切断され、そして再度ライゲーションされた２つのヘアピンアダプターを示す。ＳＡは、ストレプトアビジンビーズを示す。Ｂｉｏは、ビオチン（例えば、ビオチン化ＤＮＡ）を示す。
【図６−Ｄ】図６は、ヘアピンアダプターを使用する両末端読み取りアプローチを示す。そのヘアピンアダプターは、以下の配列を有する：
【化５】
2008545448.tif 000010
上記ヘアピンアダプターは、上記の４つの領域へと分割されるように示される１つの連続した核酸配列である。上記４つの領域は、左から右へ、ヘアピン領域、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ビオチン化領域、およびＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ認識部位である。「６０１」は、上記ヘアピンアダプターを示す。「６０３」は、ゲノムＤＮＡを示す。Ｍｅｔは、メチル化ＤＮＡを示す。「６０２」は、ヘアピンアダプターダイマーを示す。「６０４」は、制限エンドヌクレアーゼによって切断されたヘアピンアダプターを示す。「６０５」は、制限エンドヌクレアーゼによって切断され、そして再度ライゲーションされた２つのヘアピンアダプターを示す。ＳＡは、ストレプトアビジンビーズを示す。Ｂｉｏは、ビオチン（例えば、ビオチン化ＤＮＡ）を示す。
【図６−Ｅ】図６は、ヘアピンアダプターを使用する両末端読み取りアプローチを示す。そのヘアピンアダプターは、以下の配列を有する：
【化６】
2008545448.tif 000011
上記ヘアピンアダプターは、上記の４つの領域へと分割されるように示される１つの連続した核酸配列である。上記４つの領域は、左から右へ、ヘアピン領域、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ビオチン化領域、およびＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ認識部位である。「６０１」は、上記ヘアピンアダプターを示す。「６０３」は、ゲノムＤＮＡを示す。Ｍｅｔは、メチル化ＤＮＡを示す。「６０２」は、ヘアピンアダプターダイマーを示す。「６０４」は、制限エンドヌクレアーゼによって切断されたヘアピンアダプターを示す。「６０５」は、制限エンドヌクレアーゼによって切断され、そして再度ライゲーションされた２つのヘアピンアダプターを示す。ＳＡは、ストレプトアビジンビーズを示す。Ｂｉｏは、ビオチン（例えば、ビオチン化ＤＮＡ）を示す。
【図６−Ｆ】図６は、ヘアピンアダプターを使用する両末端読み取りアプローチを示す。そのヘアピンアダプターは、以下の配列を有する：
【化７】
2008545448.tif 000012
上記ヘアピンアダプターは、上記の４つの領域へと分割されるように示される１つの連続した核酸配列である。上記４つの領域は、左から右へ、ヘアピン領域、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ビオチン化領域、およびＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ認識部位である。「６０１」は、上記ヘアピンアダプターを示す。「６０３」は、ゲノムＤＮＡを示す。Ｍｅｔは、メチル化ＤＮＡを示す。「６０２」は、ヘアピンアダプターダイマーを示す。「６０４」は、制限エンドヌクレアーゼによって切断されたヘアピンアダプターを示す。「６０５」は、制限エンドヌクレアーゼによって切断され、そして再度ライゲーションされた２つのヘアピンアダプターを示す。ＳＡは、ストレプトアビジンビーズを示す。Ｂｉｏは、ビオチン（例えば、ビオチン化ＤＮＡ）を示す。
【図７】図７は、両末端手順に対する改良を示す。
【図８−１】図８は、突出アダプターを有する両末端読み取りアプローチを示す。
【図８−２】図８は、突出アダプターを有する両末端読み取りアプローチを示す。
【図８−３】図８は、突出アダプターを有する両末端読み取りアプローチを示す。
【図８−４】図８は、突出アダプターを有する両末端読み取りアプローチを示す。
【図８−５】図８は、突出アダプターを有する両末端読み取りアプローチを示す。
【図８−６】図８は、突出アダプターを有する両末端読み取りアプローチを示す。
【図９】図９は、本発明の産物を配列決定するための１つの方法である「タグがプライムした（ｔａｇ  ｐｒｉｍｅｄ）」二末端の配列決定を示す。
【図１０】図１０は、アダプターが連結した環化を示す。
【図１１】図１１は、ｓｓＤＮＡベースの環化を示す。
【図１２−１】図１２は、両末端配列決定ストラテジー−両末端読み取りＰＥＴランダム断片化の別の実施形態の概略図を示す。ＳＰＲＩは、可逆的固定法を指す。
【図１２−２】図１２は、両末端配列決定ストラテジー−両末端読み取りＰＥＴランダム断片化の別の実施形態の概略図を示す。ＳＰＲＩは、可逆的固定法を指す。
【図１２−３】図１２は、両末端配列決定ストラテジー−両末端読み取りＰＥＴランダム断片化の別の実施形態の概略図を示す。ＳＰＲＩは、可逆的固定法を指す。
【図１２−４】図１２は、両末端配列決定ストラテジー−両末端読み取りＰＥＴランダム断片化の別の実施形態の概略図を示す。ＳＰＲＩは、可逆的固定法を指す。
【図１２−５】図１２は、両末端配列決定ストラテジー−両末端読み取りＰＥＴランダム断片化の別の実施形態の概略図を示す。ＳＰＲＩは、可逆的固定法を指す。
【図１２−６】図１２は、両末端配列決定ストラテジー−両末端読み取りＰＥＴランダム断片化の別の実施形態の概略図を示す。ＳＰＲＩは、可逆的固定法を指す。
【図１３】図１３は、Ｅ．Ｃｏｌｉ  Ｋ１２を配列決定することによる両末端読み取りＰＥＴランダム断片化配列決定データを示す。
【図１４−１】図１４は、Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶによって切断された二本鎖ＤＮＡの種々の方法を示す。囲まれたヌクレオチド「Ｉ」は、デオキシイノシンである。図１４Ａは、二本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列が３’一本鎖パリンドロームの突出を生じる様式におけるＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶによる二本鎖切断を指向する方法を示す。３’一本鎖突出がデオキシイノシン残基を含むことに留意すること。図１４Ｂは、二本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列が３’一本鎖非パリンドロームの突出を生じる様式におけるＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶによる二本鎖切断を指向する方法を示す。３’一本鎖突出がデオキシイノシン残基を含むことに留意すること。
【図１４−２】図１４は、Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶによって切断された二本鎖ＤＮＡの種々の方法を示す。囲まれたヌクレオチド「Ｉ」は、デオキシイノシンである。図１４Ｃは、二本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列が５’一本鎖パリンドロームの突出を生じる様式におけるＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶによる二本鎖切断を指向する方法を示す。５’一本鎖突出がデオキシイノシン残基を含まないことに留意すること。図１４Ｄは、二本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列が５’一本鎖非パリンドロームの突出を生じる様式におけるＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶによる二本鎖切断を指向する方法を示す。５’一本鎖突出がデオキシイノシン残基を含まないことに留意すること。
【図１４−３】図１４は、Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶによって切断された二本鎖ＤＮＡの種々の方法を示す。囲まれたヌクレオチド「Ｉ」は、デオキシイノシンである。図１４Ｅは、二本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列が平滑末端を生じる様式におけるＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶによる二本鎖切断を指向する方法を示す。
【図１５−１】図１５は、対向する鎖にデオキシイノシンを有するヘアピンアダプター（デオキシイノシンヘアピンアダプター）のＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶによる二本鎖切断を用いた両末端配列決定ストラテジーの別の実施形態の概略図を示す。
【図１５−２】図１５は、対向する鎖にデオキシイノシンを有するヘアピンアダプター（デオキシイノシンヘアピンアダプター）のＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶによる二本鎖切断を用いた両末端配列決定ストラテジーの別の実施形態の概略図を示す。
【図１５−３】図１５は、対向する鎖にデオキシイノシンを有するヘアピンアダプター（デオキシイノシンヘアピンアダプター）のＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶによる二本鎖切断を用いた両末端配列決定ストラテジーの別の実施形態の概略図を示す。
【図１５−４】図１５は、対向する鎖にデオキシイノシンを有するヘアピンアダプター（デオキシイノシンヘアピンアダプター）のＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶによる二本鎖切断を用いた両末端配列決定ストラテジーの別の実施形態の概略図を示す。
【図１５−５】図１５は、対向する鎖にデオキシイノシンを有するヘアピンアダプター（デオキシイノシンヘアピンアダプター）のＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶによる二本鎖切断を用いた両末端配列決定ストラテジーの別の実施形態の概略図を示す。
【図１５−６】図１５は、対向する鎖にデオキシイノシンを有するヘアピンアダプター（デオキシイノシンヘアピンアダプター）のＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶによる二本鎖切断を用いた両末端配列決定ストラテジーの別の実施形態の概略図を示す。
【図１６】図１６は、図１５に示されるデオキシイノシンヘアピンアダプター方法を使用するＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２ゲノムＤＮＡの配列決定から得られた両末端読み取り距離の分布を示す。
【図１７】図１７は、本発明の両末端配列決定法の別の実施形態の概略図を示す。ヘアピンアダプター、両末端アダプター（「Ａ」および「Ｂ」）ならびにＰＣＲプライマー「Ｆ−ＰＣＲ」および「Ｒ−ＰＣＲ」のヌクレオチド配列は、図１８に示される。両末端アダプターの各々は、図１８に示されるような二本鎖部分および一本鎖部分を有する。「Ｂｉｏ」は、ビオチンを示す。「Ｍｅｔ」は、メチル化塩基を示す。「ＳＡ−ビーズ」は、ストレプトアビジンコーティングされた微粒子を示す。「ＥｃｏＲＩ」および「ＭｍｅＩ」は、それぞれ、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＭｍｅＩに対する認識部位を示す。
【図１８】図１８は、図１７に示されるアダプターおよびプライマーオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列および改変を示す。図１８Ａは、ヘアピンアダプター配列を示す。「ｉＢｉｏｄＴ」は、内部のビオチン標識デオキシチミンを示す。「Ｂｉｏ」は、ビオチンを示す。「ＥｃｏＲＩ」および「ＭｍｅＩ」は、それぞれ、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＭｍｅＩに対する認識部位を示す。図１８Ｂは、両末端アダプター配列およびＰＣＲプライマーヌクレオチド配列を示す。両末端アダプターの各々（「Ａ」および「Ｂ」）は、２つの一本鎖オリゴヌクレオチドのアニーリング（「Ａ先端部」および「Ａ底部」、「Ｂ先端部」および「Ｂ底部」）によって生成される。図１８Ｂに示されるポリヌクレオチド配列の５’末端は、リン酸化されていない。
【図１９】図１９は、油中水型エマルションにおけるポリヌクレオチドライゲーションのための方法の１つの実施形態の概略図を示す。
【図２０】図２０は、ＭｍｅＩ部位含有キャリアＤＮＡを伴ってかまたは伴わずに得られた両末端配列決定データによって達成されたＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２ゲノムＤＮＡの包括度の深さのグラフを示す。
【図１−１】
2008545448.tif 000013
【図１−２】
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【図１−３】
2008545448.tif 000015
【図１−４】
2008545448.tif 000016
【図１−５】
2008545448.tif 000017
【図２】
2008545448.tif 000018
【図３】
2008545448.tif 000019
【図４】
2008545448.tif 000020
【図５】
2008545448.tif 000021
【図６−Ａ】
2008545448.tif 000022
【図６−Ｂ】
2008545448.tif 000023
【図６−Ｃ】
2008545448.tif 000024
【図６−Ｄ】
2008545448.tif 000025
【図６−Ｅ】
2008545448.tif 000026
【図６−Ｆ】
2008545448.tif 000027
【図７】
2008545448.tif 000028
【図８−１】
2008545448.tif 000029
【図８−２】
2008545448.tif 000030
【図８−３】
2008545448.tif 000031
【図８−４】
2008545448.tif 000032
【図８−５】
2008545448.tif 000033
【図８−６】
2008545448.tif 000034
【図９】
2008545448.tif 000035
【図１０】
2008545448.tif 000036
【図１１】
2008545448.tif 000037
【図１２−１】
2008545448.tif 000038
【図１２−２】
2008545448.tif 000039
【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１２−６】
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【図１３】
2008545448.tif 000044
【図１４−１】
2008545448.tif 000045
【図１４−２】
2008545448.tif 000046
【図１４−３】
2008545448.tif 000047
【図１５−１】
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【図１５−２】
2008545448.tif 000049
【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１５−５】
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【図１５−６】
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【図１６】
2008545448.tif 000054
【図１７】
2008545448.tif 000055
【図１８】
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【図１９】
2008545448.tif 000057
【図２０】
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【配列表】
2008545448000001.app
【国際調査報告】
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