(57)【要約】  本発明は、ＣＨＫ１活性を阻害する縮合ピラゾールを含む化合物を提供する。本発明は、このような阻害的化合物を含む組成物及び癌の治療を必要とする患者に前記化合物を投与することによってＣＨＫ１活性を阻害する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ａ：
【化１】
2008526865.tif 000045
の化合物又は医薬として許容されるその塩若しくは立体異性体。
（ａは０又は１であり；ｂは０又は１であり；ｍは０、１又は２であり；ｎは０、１、２、３又は４であり；
環Ｚは、Ｃ４−Ｃ８シクロアルキル及び非芳香族ヘテロシクリルから選択され；
Ｒ０は、Ｈ、オキソ、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ１−Ｃ１０アルキル、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂアリール、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ２−Ｃ１０アルケニル、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ２−Ｃ１０アルキニル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＯｂＣ１−Ｃ６ペルフルオロアルキル、（Ｃ＝Ｏ）ａＮＲ７Ｒ８、ＣＮ、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｓ（Ｏ）ｍＮＲ７Ｒ８、ＳＨ、Ｓ（Ｏ）ｍ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル及び（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂヘテロシクリルから選択され、前記アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル及びヘテロシクリルは、Ｒ６から選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換されており；
Ｒ１は、Ｈ、オキソ、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ１−Ｃ１０アルキル、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂアリール、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ２−Ｃ１０アルケニル、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ２−Ｃ１０アルキニル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＯｂＣ１−Ｃ６ペルフルオロアルキル、（Ｃ＝Ｏ）ａＮＲ７Ｒ８、ＣＮ、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｓ（Ｏ）ｍＮＲ７Ｒ８、ＳＨ、Ｓ（Ｏ）ｍ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル及び（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂヘテロシクリルから選択され、前記アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル及びヘテロシクリルは、Ｒ６から選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換されており；
Ｒ２は、オキソ、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ１−Ｃ１０アルキル、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂアリール、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ２−Ｃ１０アルケニル、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ２−Ｃ１０アルキニル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＯｂＣ１−Ｃ６ペルフルオロアルキル、（Ｃ＝Ｏ）ａＮＲ７Ｒ８、ＣＮ、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ３−Ｃ８アシクロアルキル、Ｓ（Ｏ）ｍＮＲ７Ｒ８、ＳＨ、Ｓ（Ｏ）ｍ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル及び（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂヘテロシクリルから選択され、前記アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル及びヘテロシクリルは、Ｒ６から選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換されており；
Ｒ’は、Ｈ、オキソ、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ１−Ｃ１０アルキル、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂアリール、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ２−Ｃ１０アルケニル、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ２−Ｃ１０アルキニル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＯｂＣ１−Ｃ６ペルフルオロアルキル、（Ｃ＝Ｏ）ａＮＲ７Ｒ８、ＣＮ、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｓ（Ｏ）ｍＮＲ７Ｒ８、ＳＨ、Ｓ（Ｏ）ｍ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル及び（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂヘテロシクリルから選択され、前記アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル及びヘテロシクリルは、Ｒ６から選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換されており；
Ｒ’’は、Ｈ、オキソ、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ１−Ｃ１０アルキル、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂアリール、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ２−Ｃ１０アルケニル、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ２−Ｃ１０アルキニル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＯｂＣ１−Ｃ６ペルフルオロアルキル、（Ｃ＝Ｏ）ａＮＲ７Ｒ８、ＣＮ、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｓ（Ｏ）ｍＮＲ７Ｒ８、ＳＨ、Ｓ（Ｏ）ｍ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル及び（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂヘテロシクリルから選択され、前記アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル及びヘテロシクリルは、Ｒ６から選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換されており；
Ｒ６は、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ１−Ｃ１０アルキル、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂアリール、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂヘテロシクリル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＣＮ、ＯＨ、ＯｂＣ１−Ｃ６ペルフルオロアルキル、Ｏａ（Ｃ＝Ｏ）ｂＮＲ７Ｒ８、オキソ、ＣＨＯ、（Ｎ＝Ｏ）Ｒ７Ｒ８、Ｓ（Ｏ）ｍＮＲ７Ｒ８、ＳＨ、Ｓ（Ｏ）ｍ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル又は（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ３−Ｃ８シクロアルキルであり、前記アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル及びシクロアルキルは、Ｒ６ａから選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換されており；
Ｒ６ａは、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂ（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、Ｏａ（Ｃ１−Ｃ３）ペルフルオロアルキル、（Ｃ０−Ｃ６）アルキレン−Ｓ（Ｏ）ｍＲａ、オキソ、ＯＨ、ハロ、ＣＮ、（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０−Ｃ６）アルキレン−アリール、（Ｃ０−Ｃ６）アルキレン−ヘテロシクリル、（Ｃ０−Ｃ６）アルキレン−Ｎ（Ｒｂ）２、Ｃ（Ｏ）Ｒａ、（Ｃ０−Ｃ６）アルキレン−ＣＯ２Ｒａ、Ｃ（Ｏ）Ｈ及び（Ｃ０−Ｃ６）アルキレン−ＣＯ２Ｈから選択され、前記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール及びヘテロシクリルは、Ｒｂ、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ハロゲン、ＣＯ２Ｈ、ＣＮ、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｃ１−Ｃ６アルキル、オキソ及びＮ（Ｒｂ）２から選択される最大３個の置換基で場合により置換されており；
Ｒ７及びＲ８は、Ｈ、（Ｃ＝Ｏ）ＯｂＣ１−Ｃ１０アルキル、（Ｃ＝Ｏ）ＯｂＣ３−Ｃ８シクロアルキル、（Ｃ＝Ｏ）Ｏｂアリール、（Ｃ＝Ｏ）Ｏｂヘテロシクリル、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、ヘテロシクリル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、ＳＯ２Ｒａ及び（Ｃ＝Ｏ）ａＮＲｂ２から独立に選択され、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、アルケニル及びアルキニルは、Ｒ６ａから選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換されており、又はＲ７及びＲ８は、これらが結合している窒素とともに、各環中に３−７員を有し及び前記窒素の他に、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１個若しくは２個の追加の複素原子を場合により含有する単環式若しくは二環式複素環を形成することが可能であり、前記単環式若しくは二環式複素環は、Ｒ６ａから選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換されており；
Ｒａは、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、アリール又はヘテロシクリルであり；並びに
Ｒｂは、独立に、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アリール、ヘテロシクリル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ＝Ｏ）ＯＣ１−Ｃ６アルキル、（Ｃ＝Ｏ）Ｃ１−Ｃ６アルキル又はＳ（Ｏ）ｍＲａである。）
【請求項２】
他の全ての置換基及び変数が、請求項１において定義されているとおりである、式Ｂ：
【化２】
2008526865.tif 000046
の、請求項１に記載の化合物又は医薬として許容されるその塩若しくは立体異性体。
【請求項３】
他の全ての置換基及び変数が、請求項１において定義されているとおりである、式Ｃ：
【化３】
2008526865.tif 000047
の、請求項２に記載の化合物又は医薬として許容されるその塩若しくは立体異性体。
【請求項４】
他の全ての置換基及び変数が、請求項１において定義されているとおりである、式Ｄ：
【化４】
2008526865.tif 000048
の、請求項３に記載の化合物又は医薬として許容されるその塩若しくは立体異性体。
【請求項５】
Ｒ１が、プロピル−ＮＲ３Ｒ４から選択され；前記プロピルは、１つ又はそれ以上のＲ６で場合により置換されており；
Ｒ３及びＲ４が、Ｈ、（Ｃ＝Ｏ）ＯｂＣ１−Ｃ１０アルキル、（Ｃ＝Ｏ）ＯｂＣ３−Ｃ８シクロアルキル、（Ｃ＝Ｏ）Ｏｂアリール、（Ｃ＝Ｏ）Ｏｂヘテロシクリル、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、ヘテロシクリル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、ＳＯｍＲａ及び（Ｃ＝Ｏ）ａＮＲｂ２から独立に選択され、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、アルケニル及びアルキニルが、Ｒ６ａから選択される１つ若しくはそれ以上の置換基で場合により置換されており、又はＲ３及びＲ４が、これらが結合している窒素とともに、各環中に３−７員を有し及び前記窒素の他に、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１個若しくは２個の追加の複素原子を場合により含有する単環式若しくは二環式複素環を形成し、前記単環式若しくは二環式複素環が、Ｒ６ａから選択される１つ若しくはそれ以上の置換基で場合により置換されており；並びに
他の全ての置換基及び変数が、請求項１において定義されているとおりである、式Ｄの、請求項４に記載の化合物又は医薬として許容されるその塩若しくは立体異性体。
【請求項６】
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン；
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−２，５，８，９−テトラヒドロ−４Ｈ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン；
５−（３−ヒドロキシプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン；
５−［３−（ベンジルアミノ）プロピル］−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン；
５−［３−（ジベンジルアミノ）プロピル］−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−  オン；
５−｛３−［（２−フルオロベンジル）アミノ］プロピル｝−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン；
５−｛３−［ビス（２−フルオロベンジル）アミノ］プロピル｝−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン；
５−｛３−［（３−フルオロベンジル）アミノ］プロピル｝−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン；
５−｛３−［（４−フルオロベンジル）アミノ］プロピル｝−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン；
３−メチル−５−｛３−［（ピリジン−３−イルメチル）アミノ］プロピル｝−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン；
３−メチル−５−｛３−［（ピリジン−４−イルメチル）アミノ］プロピル）−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン；
５−｛３−［ビス（ピリジン−４−イルメチル）アミノ］プロピル｝−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン；
５−｛３−［（３，４−ジフルオロベンジル）アミノ］プロピル｝−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン；
５−（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン；
Ｎ−［３−（３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）プロピル］メタンスルホンアミド；
Ｎ−［３−（３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）プロピル］アセトアミド；
Ｎ−［３−（３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）プロピル）−Ｎ’−プロピル尿素；
２−ヒドロキシ−Ｎ−［３−（３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）プロピル］アセトアミド；
Ｎ−［３−（３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）プロピル］グリシンアミド；
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−９，１０−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４，８（５Ｈ，７Ｈ）−ジオン；
５−（３−アミノプロピル）−８−ヒドロキシ−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン；
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−８，９−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４，１０（５Ｈ，７Ｈ）−ジオン；
５−（３−アミノプロピル）−１０−ヒドロキシ−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン；
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−５，７，８，９−テトラヒドロシクロペンタ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４（２Ｈ）−オン；
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−７，９−ジヒドロ−２Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］チエノ［３，４−ｇ］キノリン−４（５Ｈ）−オン−８，８−ジオキシド；
８−アミノ−５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−５，７，８，９−テトラヒドロシクロペンタ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４（２Ｈ）−オン；
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリド［３，４−ｇ］キノリン−４−オン；
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−５，７，８，１０−テトラヒドロピラノ［３，４−ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４（２Ｈ）−オン；  及び
５−（３−アミノ−２−メトキシプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−  オン；
である、請求項１に記載の化合物又は医薬として許容されるこれらの塩若しくは立体異性体。
【請求項７】
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン；
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−２，５，８，９−テトラヒドロ−４Ｈ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン；
５−［３−（ベンジルアミノ）プロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン；
５−［３−（ジベンジルアミノ）プロピル］−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン；
５−｛３−［（２−フルオロベンジル）アミノ］プロピル｝−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン；
５−｛３−［ビス（２−フルオロベンジル）アミノ］プロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン；
５−｛３−［（３−フルオロベンジル）アミノ］プロピル｝−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン；
５−｛３−［（４−フルオロベンジル）アミノ］プロピル｝−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン；
５−｛３−［（３，４−ジフルオロベンジル）アミノ］プロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン；
Ｎ−［３−（３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）プロピル］グリシンアミド；
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−９，１０−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４，８（５Ｈ，７Ｈ）−ジオン；
５−（３−アミノプロピル）−８−ヒドロキシ−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン；
５−（３−アミノプロピル）−１０−ヒドロキシ−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン；
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−５，７，８，９−テトラヒドロシクロペンタ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４（２Ｈ）−オン；
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−７，９−ジヒドロ−２Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］チエノ［３，４−ｇ］キノリン−４（５Ｈ）−オン８，８−ジオキシド；
８−アミノ−５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−５，７，８，９−テトラヒドロシクロペンタ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４（２Ｈ）−オン；
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリド［３，４−ｇ］キノリン−４−オン；
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−５，７，８，１０−テトラヒドロピラノ［３，４−ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４（２Ｈ）−オン；及び
５−（３−アミノ−２−メトキシプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン；
である、請求項１に記載のＴＦＡ塩又はこれらの立体異性体。
【請求項８】
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−８，９−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４，１０（５Ｈ，７Ｈ）−ジオンである、請求項１に記載のＨＣｌ塩又はその立体異性体。
【請求項９】
医薬担体を含み、及び請求項１に記載の化合物の治療的有効量をその中に含む医薬組成物。
【請求項１０】
癌の治療又は予防を必要とする哺乳動物中の癌の治療又は予防において有用な医薬の調製のための、請求項１に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
細胞周期のチェックポイントは、細胞周期の遷移の順序及びタイミングを調節する制御経路である。細胞周期のチェックポイントは、ＤＮＡ複製及び染色体分離などの重要な現象が高い精度で完結されることを保証する。これらの細胞周期のチェックポイントの制御は、腫瘍細胞が多くの化学療法及び放射線照射に応答する様式の重要な決定要因である。多くの有効な癌療法は、ＤＮＡに損傷を引き起こすことによって機能するが、これらの因子に対する耐性は、なお、癌の治療における重大な制約となっている。薬物耐性の幾つかの機序のうち、重要な機序は、チェックポイント経路の重大な活性化の制御を通じて、細胞周期の進行を抑制することに起因する。これは、修復のための時間を与えるために細胞周期を停止させ、修復を促進するための遺伝子の転写を誘導することにより、即座の細胞死を回避する。例えば、Ｇ２チェックポイントでのチェックポイントの停止を無効にすることによって、ＤＮＡ損傷によって誘導された腫瘍の細胞死を相乗的に増強し、耐性を回避することが可能であり得る。
【０００２】
ヒトＣＨＫ１は、ｃｄｃ２／サイクリンＢの活性化を抑制し、有糸分裂を開始することに関与し得るホスファターゼｃｄｃ２５のセリン２１６をリン酸化することによって細胞周期の停止を制御する上で役割を果たす。従って、ＣＨＫ１の阻害は、ＤＮＡ修復が完了する前に有糸分裂を開始し、これにより腫瘍の細胞死を引き起こすことによってＤＮＡ損傷因子を増強するはずである。
【０００３】
ＣＨＫ１（Ｃｈｅｋ１とも称される。）の阻害剤である新規化合物を提供することが、本発明の目的である。
【０００４】
ＣＨＫ１の阻害剤である新規化合物を含む医薬組成物を提供することも、本発明の目的である。
【０００５】
ＣＨＫ１活性のこのような阻害剤を投与することを含む、癌を治療するための方法を提供することも、本発明の目的である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ＣＨＫ１活性を阻害する縮合ピラゾールを含む化合物を提供する。本発明は、このような阻害的化合物を含む組成物、及び癌の治療を必要とする患者に、前記化合物を投与することによってＣＨＫ１活性を阻害する方法も提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の化合物は、ＣＨＫ１の活性の阻害において有用である。本発明の第一の実施形態において、ＣＨＫ１活性の阻害剤は、式Ａ：
【０００８】
【化５】
2008526865.tif 000002
【０００９】
（ａは０又は１であり；ｂは０又は１であり；ｍは０、１又は２であり；ｎは０、１、２、３又は４であり；
環Ｚは、Ｃ４−Ｃ８シクロアルキル及び非芳香族ヘテロシクリルから選択され；
Ｒ０は、Ｈ、オキソ、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ１−Ｃ１０アルキル、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂアリール、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ２−Ｃ１０アルケニル、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ２−Ｃ１０アルキニル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＯｂＣ１−Ｃ６ペルフルオロアルキル、（Ｃ＝Ｏ）ａＮＲ７Ｒ８、ＣＮ、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｓ（Ｏ）ｍＮＲ７Ｒ８、ＳＨ、Ｓ（Ｏ）ｍ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル及び（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂヘテロシクリルから選択され、前記アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル及びヘテロシクリルは、Ｒ６から選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換されており；
Ｒ１は、Ｈ、オキソ、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ１−Ｃ１０アルキル、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂアリール、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ２−Ｃ１０アルケニル、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ２−Ｃ１０アルキニル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＯｂＣ１−Ｃ６ペルフルオロアルキル、（Ｃ＝Ｏ）ａＮＲ７Ｒ８、ＣＮ、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｓ（Ｏ）ｍＮＲ７Ｒ８、ＳＨ、Ｓ（Ｏ）ｍ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル及び（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂヘテロシクリルから選択され、前記アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル及びヘテロシクリルは、Ｒ６から選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換されており；
Ｒ２は、オキソ、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ１−Ｃ１０アルキル、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂアリール、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ２−Ｃ１０アルケニル、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ２−Ｃ１０アルキニル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＯｂＣ１−Ｃ６ペルフルオロアルキル、（Ｃ＝Ｏ）ａＮＲ７Ｒ８、ＣＮ、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ３−Ｃ８アシクロアルキル、Ｓ（Ｏ）ｍＮＲ７Ｒ８、ＳＨ、Ｓ（Ｏ）ｍ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル及び（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂヘテロシクリルから選択され、前記アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル及びヘテロシクリルは、Ｒ６から選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換されており；
Ｒ’は、Ｈ、オキソ、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ１−Ｃ１０アルキル、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂアリール、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ２−Ｃ１０アルケニル、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ２−Ｃ１０アルキニル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＯｂＣ１−Ｃ６ペルフルオロアルキル、（Ｃ＝Ｏ）ａＮＲ７Ｒ８、ＣＮ、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｓ（Ｏ）ｍＮＲ７Ｒ８、ＳＨ、Ｓ（Ｏ）ｍ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル及び（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂヘテロシクリルから選択され、前記アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル及びヘテロシクリルは、Ｒ６から選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換されており；
Ｒ’’は、Ｈ、オキソ、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ１−Ｃ１０アルキル、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂアリール、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ２−Ｃ１０アルケニル、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ２−Ｃ１０アルキニル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＯｂＣ１−Ｃ６ペルフルオロアルキル、（Ｃ＝Ｏ）ａＮＲ７Ｒ８、ＣＮ、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｓ（Ｏ）ｍＮＲ７Ｒ８、ＳＨ、Ｓ（Ｏ）ｍ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル及び（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂヘテロシクリルから選択され、前記アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル及びヘテロシクリルは、Ｒ６から選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換されており；
Ｒ６は、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ１−Ｃ１０アルキル、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂアリール、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂヘテロシクリル、ＣＯ２Ｈ、ハロ、ＣＮ、ＯＨ、ＯｂＣ１−Ｃ６ペルフルオロアルキル、Ｏａ（Ｃ＝Ｏ）ｂＮＲ７Ｒ８、オキソ、ＣＨＯ、（Ｎ＝Ｏ）Ｒ７Ｒ８、Ｓ（Ｏ）ｍＮＲ７Ｒ８、ＳＨ、Ｓ（Ｏ）ｍ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル又は（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂＣ３−Ｃ８シクロアルキルであり、前記アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル及びシクロアルキルは、Ｒ６ａから選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換されており；
Ｒ６ａは、（Ｃ＝Ｏ）ａＯｂ（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、Ｏａ（Ｃ１−Ｃ３）ペルフルオロアルキル、（Ｃ０−Ｃ６）アルキレン−Ｓ（Ｏ）ｍＲａ、オキソ、ＯＨ、ハロ、ＣＮ、（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０−Ｃ６）アルキレン−アリール、（Ｃ０−Ｃ６）アルキレン−ヘテロシクリル、（Ｃ０−Ｃ６）アルキレン−Ｎ（Ｒｂ）２、Ｃ（Ｏ）Ｒａ、（Ｃ０−Ｃ６）アルキレン−ＣＯ２Ｒａ、Ｃ（Ｏ）Ｈ及び（Ｃ０−Ｃ６）アルキレン−ＣＯ２Ｈから選択され、前記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール及びヘテロシクリルは、Ｒｂ、ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ハロゲン、ＣＯ２Ｈ、ＣＮ、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｃ１−Ｃ６アルキル、オキソ及びＮ（Ｒｂ）２から選択される最大３個の置換基で場合により置換されており；
Ｒ７及びＲ８は、Ｈ、（Ｃ＝Ｏ）ＯｂＣ１−Ｃ１０アルキル、（Ｃ＝Ｏ）ＯｂＣ３−Ｃ８シクロアルキル、（Ｃ＝Ｏ）Ｏｂアリール、（Ｃ＝Ｏ）Ｏｂヘテロシクリル、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、ヘテロシクリル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、ＳＯ２Ｒａ及び（Ｃ＝Ｏ）ａＮＲｂ２から独立に選択され、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、アルケニル及びアルキニルは、Ｒ６ａから選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換されており、又はＲ７及びＲ８は、これらが結合している窒素とともに、各環中に３−７員を有し及び前記窒素の他に、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１個若しくは２個の追加の複素原子を場合により含有する単環式若しくは二環式複素環を形成することが可能であり、前記単環式若しくは二環式複素環は、Ｒ６ａから選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換されており；
Ｒａは、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、アリール又はヘテロシクリルであり；並びに
Ｒｂは、独立に、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アリール、ヘテロシクリル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ＝Ｏ）ＯＣ１−Ｃ６アルキル、（Ｃ＝Ｏ）Ｃ１−Ｃ６アルキル又はＳ（Ｏ）ｍＲａである。）
又は医薬として許容されるその塩若しくは立体異性体によって表される。
【００１０】
本発明の第二の実施形態において、ＣＨＫ１活性の阻害剤は、式Ｂ：
【００１１】
【化６】
2008526865.tif 000003
【００１２】
（他の全ての置換基及び変数は、第一の実施形態において定義されているとおりである。）
又は医薬として許容されるその塩若しくは立体異性体によって表される。
【００１３】
本発明の第三の実施形態において、ＣＨＫ１活性の阻害剤は、式Ｃ：
【００１４】
【化７】
2008526865.tif 000004
【００１５】
（他の全ての置換基及び変数は、第一の実施形態において定義されているとおりである。）
又は医薬として許容されるその塩若しくは立体異性体によって表される。
【００１６】
本発明の第四の実施形態において、ＣＨＫ１活性の阻害剤は、式Ｄ：
【００１７】
【化８】
2008526865.tif 000005
【００１８】
（他の全ての置換基及び変数は、第一の実施形態において定義されているとおりである。）
又は医薬として許容されるその塩若しくは立体異性体によって表される。
【００１９】
本発明の第五の実施形態において、ＣＨＫ１活性の阻害剤は、式Ｄ：
【００２０】
（Ｒ１は、プロピル−ＮＲ３Ｒ４から選択され；前記プロピルは、１つ又はそれ以上のＲ６で場合により置換されており；
Ｒ３及びＲ４は、Ｈ、（Ｃ＝Ｏ）ＯｂＣ１−Ｃ１０アルキル、（Ｃ＝Ｏ）ＯｂＣ３−Ｃ８シクロアルキル、（Ｃ＝Ｏ）Ｏｂアリール、（Ｃ＝Ｏ）Ｏｂヘテロシクリル、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、ヘテロシクリル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、ＳＯｍＲａ及び（Ｃ＝Ｏ）ａＮＲｂ２から独立に選択され、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、アルケニル及びアルキニルは、Ｒ６ａから選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換されており、又はＲ３及びＲ４は、これらが結合している窒素とともに、各環中に３−７員を有し及び前記窒素の他に、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１個若しくは２個の追加の複素原子を場合により含有する単環式若しくは二環式複素環を形成することが可能であり、前記単環式若しくは二環式複素環は、Ｒ６ａから選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換されており；
他の全ての置換基及び変数は、第一の実施形態において定義されているとおりである。）
又は医薬として許容されるその塩若しくは立体異性体によって表される。
【００２１】
本発明の具体的な実施形態は、
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−９）；
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−２，５，８，９−テトラヒドロ−４Ｈ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１０）；
５−（３−ヒドロキシプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１１）；
５−［３−（ベンジルアミノ）プロピル］−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（２−１）；
５−［３−（ジベンジルアミノ）プロピル］−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（２−２）；
５−｛３−［（２−フルオロベンジル）アミノ］プロピル｝−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（２−３）；
５−｛３−［ビス（２−フルオロベンジル）アミノ］プロピル｝−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（２−４）；
５−｛３−［（３−フルオロベンジル）アミノ］プロピル｝−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（２−５）；
５−｛３−［（４−フルオロベンジル）アミノ］プロピル｝−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（２−６）；
３−メチル−５−｛３−［（ピリジン−３−イルメチル）アミノ］プロピル｝−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（２−７）；
３−メチル−５−｛３−［（ピリジン−４−イルメチル）アミノ］プロピル）−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（２−８）；
５−｛３−［ビス（ピリジン−４−イルメチル）アミノ］プロピル｝−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（２−９）；
５−｛３−［（３，４−ジフルオロベンジル）アミノ］プロピル｝−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（２−１０）；
５−（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（３−３）；
Ｎ−［３−（３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）プロピル］メタンスルホンアミド（４−５）；
Ｎ−［３−（３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）プロピル］アセトアミド（４−６）；
Ｎ−［３−（３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）プロピル）−Ｎ’−プロピル尿素（４−７）；
２−ヒドロキシ−Ｎ−［３−（３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）プロピル］アセトアミド（４−８）；
Ｎ−［３−（３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）プロピル］グリシンアミド（４−９）；
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−９，１０−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４，８（５Ｈ，７Ｈ）−ジオン（６−１２）；
５−（３−アミノプロピル）−８−ヒドロキシ−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（６−１３）；
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−８，９−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４，１０（５Ｈ，７Ｈ）−ジオン（６−１４）；
５−（３−アミノプロピル）−１０−ヒドロキシ−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（６−１５）；
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−５，７，８，９−テトラヒドロシクロペンタ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４（２Ｈ）−オン（６−１６）；
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−７，９−ジヒドロ−２Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］チエノ［３，４−ｇ］キノリン−４（５Ｈ）−オン−８，８−ジオキシド（６−１７）；
８−アミノ−５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−５，７，８，９−テトラヒドロシクロペンタ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４（２Ｈ）−オン（６−１８）；
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリド［３，４−ｇ］キノリン−４−オン（６−１９）；
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−５，７，８，１０−テトラヒドロピラノ［３，４−ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４（２Ｈ）−オン（７−７）；及び
５−（３−アミノ−２−メトキシプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（８−７）；
又は医薬として許容されるこれらの塩若しくは立体異性体である。
【００２２】
本発明のＴＦＡ塩は、
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−９）；
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−２，５，８，９−テトラヒドロ−４Ｈ−［１，４］ジオキシノ［２，３−ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−１０）；
５−［３−（ベンジルアミノ）プロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（２−１）；
５−［３−（ジベンジルアミノ）プロピル］−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（２−２）；
５−｛３−［（２−フルオロベンジル）アミノ］プロピル｝−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（２−３）；
５−｛３−［ビス（２−フルオロベンジル）アミノ］プロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（２−４）；
５−｛３−［（３−フルオロベンジル）アミノ］プロピル｝−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン；（２−５）
５−｛３−［（４−フルオロベンジル）アミノ］プロピル｝−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（２−６）；
５−｛３−［（３，４−ジフルオロベンジル）アミノ］プロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（２−１０）；
Ｎ−［３−（３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）プロピル］グリシンアミド（４−９）；
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−９，１０−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４，８（５Ｈ，７Ｈ）−ジオン（６−１２）；
５−（３−アミノプロピル）−８−ヒドロキシ−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（６−１３）；
５−（３−アミノプロピル）−１０−ヒドロキシ−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（６−１５）；
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−５，７，８，９−テトラヒドロシクロペンタ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４（２Ｈ）−オン（６−１６）；
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−７，９−ジヒドロ−２Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］チエノ［３，４−ｇ］キノリン−４（５Ｈ）−オン８，８−ジオキシド（６−１７）；
８−アミノ−５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−５，７，８，９−テトラヒドロシクロペンタ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４（２Ｈ）−オン（６−１８）；
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリド［３，４−ｇ］キノリン−４−オン（６−１９）；
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−５，７，８，１０−テトラヒドロピラノ［３，４−ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４（２Ｈ）−オン（７−７）；及び
５−（３−アミノ−２−メトキシプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（８−７）；
又はこれらの立体異性体である。
【００２３】
本発明の化合物は、（「Ｅ．Ｌ．Ｅｌｉｅｌ  ａｎｄ  Ｓ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ，Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４，ｐａｇｅｓ  １１１９−１１９０」に記載されているように）不斉中心、キラル軸及びキラル平面を有することがあり、ラセミ体、ラセミ混合物及びそれぞれのジアステレオマーとして存在する場合があり、光学異性体を含む全ての可能な異性体及びこれらの混合物が、本発明に含まれる。さらに、本明細書に開示されている化合物は、互変異性体として存在することがあり、互変異性構造が一つだけ図示されている場合でも、本発明の範囲には、両方の互変異性形態が包含されるものとする。
【００２４】
任意の変数（例えば、Ｒ１、Ｒ６、Ｒ６ａなど）が任意の構成要素中に２回以上現れる場合、各出現時におけるその定義は、他のあらゆる出現と独立である。また、置換基及び変数の組み合わせは、かかる組み合わせが安定な化合物を与える場合にのみ許容される。置換基から環系に引かれた線は、表記の結合が置換可能な環原子の何れに付着してもよいことを表している。環系が二環式である場合、前記結合は、二環式部分の各環上の適切な原子の何れかに結合されるものとする。
【００２５】
化学的に安定で、容易に利用可能な出発物質から、本分野において公知の技術及び以下に示されている方法によって、容易に合成できる化合物を提供するために、本発明の化合物上の置換基及び置換パターンは当業者によって選択され得ることが理解される。置換基自体が２個以上の基で置換されている場合、これらの複数の基は、安定な構造をもたらす限り、同一の炭素又は別異の炭素上に存在し得るものと理解される。「１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換された」という用語は、「少なくとも１つの置換基で場合により置換された」という用語と等価であると解釈すべきであり、このようなケースにおいて、好ましい実施形態は、０から３個の置換基を有する。
【００２６】
１つ又はそれ以上のＳｉ原子は、化学的に安定で、容易に利用可能な出発物質から、本分野において公知の技術によって、容易に合成できる化合物を提供するために、本発明の化合物中に当業者によって取り込まれ得ることが理解される。
【００２７】
本明細書において使用される「アルキル」は、炭素原子の指定された数を有する、分枝及び直鎖の飽和脂肪族炭化水素基の両方を含むものとする。例えば、「Ｃ１−Ｃ１０アルキル」におけるような、Ｃ１−Ｃ１０は、直鎖又は分枝配置で、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の炭素を有する基を含むものと定義される。例えば、「Ｃ１−Ｃ１０アルキル」は、具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｉ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどを含む。「シクロアルキル」という用語は、炭素原子の指定された数を有する単環式飽和脂肪族炭化水素基を意味する。例えば、「シクロアルキル」には、シクロプロピル、メチル−シクロプロピル、２，２−ジメチル−シクロブチル、２−エチル−シクロペンチル、シクロヘキシルなどが含まれる。
【００２８】
「アルコキシ」は、酸素架橋を通じて結合された、炭素原子の表記の数を有する環状又は非環状アルキル基の何れかを表す。従って、「アルコキシ」は、上記アルキル及びシクロアルキルの定義を包含する。
【００２９】
炭素原子の数が指定されていない場合、「アルケニル」という用語は、２から１０個の炭素原子と、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含有する、直鎖、分枝又は環状の非芳香族炭化水素基を表す。好ましくは、１個の炭素−炭素二重結合が存在し、最大４個の非芳香族炭素−炭素二重結合が存在し得る。従って、「Ｃ２−Ｃ６アルケニル」とは、２から６個の炭素原子を有するアルケニル基を意味する。アルケニル基には、エテニル、プロペニル、ブテニル、２−メチルブテニル及びシクロヘキセニルが含まれる。前記アルケニル基の直鎖、分枝又は環状部分は、二重結合を含有することができ、置換されたアルケニル基が表記されている場合には、置換されることができる。
【００３０】
「アルキニル」という用語は、２から１０個の炭素原子と、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含有する、直鎖、分枝又は環状の炭化水素基を表す。最大３個の炭素−炭素三重結合が存在し得る。従って、「Ｃ２−Ｃ６アキキニル」とは、２から６個の炭素原子を有するアルキニル基を意味する。アルキニル基には、エチニル、プロピニル、ブチニル、３−メチルブチニルなどが含まれる。アルキニル基の直鎖、分枝又は環状部分は、三重結合を含有することができ、置換されたアルキニル基が表記されている場合には、置換されることができる。
【００３１】
一部の例では、置換基は、（Ｃ０−Ｃ６）アルキレン−アリールなど、ゼロを含む炭素の範囲で定義され得る。アリールがフェニルである場合、この定義は、フェニル自体及び−ＣＨ２Ｐｈ、−ＣＨ２ＣＨ２Ｐｈ、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｐｈなどを含む。
【００３２】
本明細書において使用される「アリール」とは、各環中に最大７個の原子を有し、少なくとも一つの環が芳香族である、あらゆる安定な単環式又は二環式炭素環を意味するものとする。このようなアリール要素の例には、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、ビフェニル、フェナントリル、アンスリル又はアセナフチルが含まれる。アリール置換基が二環式であり、一つの環が非芳香族である場合には、結合は芳香環を介するものと理解される。
【００３３】
本明細書において使用されるヘテロアリールという用語は、各環中に最大７個の原子を有し、少なくとも１つの環が芳香族であり、並びにＯ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１から４個までの複素原子を含有する安定な単環式又は二環式環を表す。本定義の範囲に属するヘテロアリール基には、アクリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、キノキサリニル、ピラゾリル、インドリル、ベンゾトリアゾリル、フラニル、チエニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、キノリニル、イソキノリニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、インドリル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピロリル、テトラヒドロキノリンが含まれるが、これらに限定されない。以下の複素環の定義に関しては、「ヘテロアリール」は、あらゆる含窒素ヘテロアリールのＮオキシド誘導体を含むものと理解される。ヘテロアリール置換基が二環式であり、一つの環が非芳香族であり、又は複素原子を含有しない場合には、結合は、それぞれ、芳香環又は含複素原子環を介するものと理解される。
【００３４】
当業者によって理解されるように、本明細書において使用される「ハロ」又は「ハロゲン」には、クロロ、フルオロ、ブロモ及びヨードが含まれるものとする。
【００３５】
本明細書において使用される「複素環」又は「ヘテロシクリル」という用語は、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１から４個の複素原子を含有する４員から１０員の芳香族又は非芳香族複素環を意味するものとし、二環式の基が含まれる。従って、「ヘテロシクリル」には、上記のヘテロアリール、並びにそのジヒドロ及びテトラヒドロ類縁体が含まれる。「ヘテロシクリル」のさらなる例には、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾフラザニル、ベンゾピラゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、カルバゾリル、カルボリニル、シンノリニル、フラニル、イミダゾリル、インドリニル、インドリル、インドラジニル、インダゾリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ナフトピリジニル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、オキサゾリン、イソオキサゾリン、オキセタニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドピリジニル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、テトラヒドロピラニル、テトラゾリル、テトラゾロピリジル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、アゼチジニル、１，４−ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ジヒドロベンゾイミダゾリル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチオフェニル、ジヒドロベンゾオキサゾリル、ジヒドロフラニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジアゾリル、ジヒドロチアゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、ジヒドロアゼチジニル、メチレンジオキシベンゾイル、テトラヒドロフラニル及びテトラヒドロチエニル、並びにこれらのＮ−オキシドが含まれるが、これらに限定されるものではない。ヘテロシクリル置換基の結合は、炭素原子を介して、又は複素原子を介して行われ得る。
【００３６】
本明細書において使用される「非芳香族ヘテロシクリル」という用語は、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１から４個の複素原子を含有する４員から１０員の非芳香族複素環を意味するものとし、二環式の基が含まれ、さらに、それらのジヒドロ及びテトラヒドロ類縁体が含まれる。「非芳香族ヘテロシクリル」の例には、オキサゾリン、イソオキサゾリン、オキセタニル、ピラニル、ピラジニル、テトラヒドロピラニル、アゼチジニル、１，４−ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ジヒドロフラニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジアゾリル、ジヒドロチアゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、ジヒドロアゼチジニル、テトラヒドロフラニル及びテトラヒドロチエニル、並びにこれらのＮ−オキシドが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３７】
特段の定義がなければ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリル置換基は、非置換であり、又は非置換であり得る。例えば、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルは、ＯＨ、オキソ、ハロゲン、アルコキシ、ジアルキルアミノ又はヘテロシクリル（モルホリニル、ピペリジニルなど）から選択される１、２又は３個の置換基で置換されてもよい。この場合、一方の置換基がオキソであり、他方がＯＨであれば、以下のもの：−（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２（ＯＨ）ＣＨ２ＣＨ（Ｏ）などが定義に含まれる。
【００３８】
ある種の例において、Ｒ７及びＲ８は、これらが結合している窒素とともに、各環中に４−７員を有し並びに前記窒素の他に、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１個若しくは２個の追加の複素原子を場合により含有する単環式若しくは二環式複素環を形成し、前記複素環は、Ｒ６ａから選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換されている。このようにして形成され得る複素環の例には、以下のもの：
【００３９】
【化９】
2008526865.tif 000006
が含まれるが（但し、これに限定されるものではない。）、複素環は、Ｒ６ａから選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換されることを銘記されたい。
【００４０】
式Ｃの実施形態において、ｎは０、１又は２である。
【００４１】
式Ｃの別の実施形態において、ｎは０である。
【００４２】
式Ｃの別の実施形態において、Ｒ１はＣＨ３である。
【００４３】
式Ｃの別の実施形態において、Ｒ２は、
【００４４】
【化１０】
2008526865.tif 000007
である。
【００４５】
式Ｃの別の実施形態において、Ｒ１はＣＨ３であり、及びＲ２は、
【００４６】
【化１１】
2008526865.tif 000008
である。
【００４７】
式Ｄの実施形態において、ｎは０、１又は２である。
【００４８】
式Ｄの別の実施形態において、ｎは０である。
【００４９】
式Ｄの別の実施形態において、Ｒ１はＣＨ３である。．
式Ｄの別の実施形態において、Ｒ２は、
【００５０】
【化１２】
2008526865.tif 000009
である。
【００５１】
式Ｄの別の実施形態において、Ｒ１はＣＨ３であり、及びＲ２は、
【００５２】
【化１３】
2008526865.tif 000010
である。
【００５３】
式Ｃの実施形態において、ｎは０、１又は２である。
【００５４】
式Ｃの別の実施形態において、ｎは０である。
【００５５】
式Ｃの別の実施形態において、Ｒ０はＣＨ３である。
【００５６】
式Ｃの別の実施形態において、Ｒ１は、
【００５７】
【化１４】
2008526865.tif 000011
である。
【００５８】
式Ｃの別の実施形態において、Ｒ０はＣＨ３であり、及びＲ１は、
【００５９】
【化１５】
2008526865.tif 000012
である。
【００６０】
式Ｄの実施形態において、ｎは０、１又は２である。
【００６１】
式Ｄの別の実施形態において、ｎは０である。
【００６２】
式Ｄの別の実施形態において、Ｒ０はＣＨ３である。
【００６３】
式Ｄの別の実施形態において、Ｒ１は、
【００６４】
【化１６】
2008526865.tif 000013
である。
【００６５】
式Ｄの別の実施形態において、Ｒ０はＣＨ３であり、及びＲ１は、
【００６６】
【化１７】
2008526865.tif 000014
である。
【００６７】
式Ａ、Ｂ及びＣの別の実施形態において、環Ｚは、
【００６８】
【化１８】
2008526865.tif 000015
から選択され、並びに他の全ての置換基及び変数は、式Ａ、Ｂ及びＣに定義されているとおりである。
【００６９】
式Ａ、Ｂ及びＣの別の実施形態において、環Ｚは、
【００７０】
【化１９】
2008526865.tif 000016
から選択され、Ｒ０は、ＣＨ３であり、Ｒ１は、プロピル−ＮＲ３Ｒ４から選択され；前記プロピルは、１つ又はそれ以上のＲ６で場合により置換されており、Ｒ３及びＲ４が、Ｈ、（Ｃ＝Ｏ）ＯｂＣ１−Ｃ１０アルキル、（Ｃ＝Ｏ）ＯｂＣ３−Ｃ８シクロアルキル、（Ｃ＝Ｏ）Ｏｂアリール、（Ｃ＝Ｏ）Ｏｂヘテロシクリル、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、ヘテロシクリル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、ＳＯｍＲａ及び（Ｃ＝Ｏ）ａＮＲｂ２から独立に選択され、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、アルケニル及びアルキニルが、Ｒ６ａから選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換されており、又はＲ３及びＲ４は、これらが結合している窒素とともに、各環中に３−７員を有し及び前記窒素の他に、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１個若しくは２個の追加の複素原子を場合により含有する単環式若しくは二環式複素環を形成し、前記単環式若しくは二環式複素環が、Ｒ６ａから選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換されており；並びにＲ２は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、オキソ、ＮＨ２及び（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される。
【００７１】
式Ｃの別の実施形態において、環Ｚは、
【００７２】
【化２０】
2008526865.tif 000017
から選択され、
Ｒ０はＣＨ３であり、Ｒ２は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、オキソ、ＮＨ２及び（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択され、並びに他の全ての置換基及び変数は、式Ａにおいて定義されているとおりである。
【００７３】
式Ｃの別の実施形態において、環Ｚは、
【００７４】
【化２１】
2008526865.tif 000018
から選択され、
ｎは、１又は２であり；
Ｒ０は、ＣＨ３であり；
Ｒ１は、プロピル−ＮＲ３Ｒ４から選択され；前記プロピルは、１つ又はそれ以上のＲ６で場合により置換されており；
Ｒ２は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、オキソ、ＮＨ２及び（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択され；
Ｒ３及びＲ４は、Ｈ及びＣＨ３から独立に選択され；並びに
Ｒ６は、ＯＨ、オキソ、ハロ、ＯＣ１−Ｃ６アルキル及びＣ１−Ｃ６アルキルから選択される。）
式Ａ、Ｂ及びＣの別の実施形態において、環Ｚは、
【００７５】
【化２２】
2008526865.tif 000019
から選択され、並びに他の全ての置換基及び変数は、式Ａ、Ｂ及びＣに定義されているとおりである。
【００７６】
式Ａ、Ｂ及びＣの別の実施形態において、環Ｚは、
【００７７】
【化２３】
2008526865.tif 000020
から選択され、Ｒ０は、ＣＨ３であり、Ｒ１は、プロピル−ＮＲ３Ｒ４から選択され；前記プロピルは、１つ又はそれ以上のＲ６で場合により置換されており、Ｒ３及びＲ４は、Ｈ、（Ｃ＝Ｏ）ＯｂＣ１−Ｃ１０アルキル、（Ｃ＝Ｏ）ＯｂＣ３−Ｃ８シクロアルキル、（Ｃ＝Ｏ）Ｏｂアリール、（Ｃ＝Ｏ）Ｏｂヘテロシクリル、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、ヘテロシクリル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、ＳＯｍＲａ及び（Ｃ＝Ｏ）ａＮＲｂ２から独立に選択され、前記アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、アルケニル及びアルキニルは、Ｒ６ａから選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換されており、又はＲ３及びＲ４は、これらが結合している窒素とともに、各環中に３−７員を有し及び前記窒素の他に、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１個若しくは２個の追加の複素原子を場合により含有する単環式若しくは二環式複素環を形成し、前記単環式若しくは二環式複素環は、Ｒ６ａから選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換されており；並びにＲ２は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、オキソ、ＮＨ２及び（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択される。
【００７８】
式Ｃの別の実施形態において、環Ｚは、
【００７９】
【化２４】
2008526865.tif 000021
から選択され、Ｒ０はＣＨ３であり、Ｒ２は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、オキソ、ＮＨ２及び（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択され、並びに他の全ての置換基及び変数は、式Ａにおいて定義されているとおりである。
【００８０】
式Ｃの別の実施形態において、環Ｚは、
【００８１】
【化２５】
2008526865.tif 000022
から選択され、
ｎは、１又は２であり；
Ｒ０は、ＣＨ３であり；
Ｒ１は、プロピル−ＮＲ３Ｒ４から選択され；前記プロピルは、１つ又はそれ以上のＲ６で場合により置換されており；
Ｒ２は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、オキソ、ＮＨ２及び（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択され；
Ｒ３及びＲ４は、Ｈ及びＣＨ３から独立に選択され；並びに
Ｒ６は、ＯＨ、オキソ、ハロ、ＯＣ１−Ｃ６アルキル及びＣ１−Ｃ６アルキルから選択される。
【００８２】
式Ｄの別の実施形態において、ｎは１又は２であり；Ｒ０はＣＨ３であり；Ｒ１はプロピル−ＮＲ３Ｒ４から選択され；前記プロピルは、１つ又はそれ以上のＲ６で場合により置換されており；Ｒ２は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、オキソ、ＮＨ２及び（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択され；Ｒ３及びＲ４は、Ｈ及びＣＨ３から独立に選択され；並びにＲ６は、ＯＨ、オキソ、ハロ、ＯＣ１−Ｃ６アルキル及びＣ１−Ｃ６アルキルから選択される。
【００８３】
本発明には、式Ａの化合物の遊離形態並びに医薬として許容されるそれらの塩及び立体異性体が含まれる。本明細書中に例示されている単離された具体的な化合物の幾つかは、アミン化合物のプロトン化された塩である。「遊離形態」という用語は、非塩形態のアミン化合物を表す。包含される医薬として許容される塩には、本明細書中に記載されている具体的な化合物に対して例示される単離された塩のみならず、式Ａの化合物の遊離形態の、医薬として許容される典型的な全ての塩も含まれる。記載されている具体的な塩化合物の遊離形態は、本分野で公知の技術を用いて単離することができる。例えば、前記遊離形態は、希ＮａＯＨ水溶液、炭酸カリウム、アンモニア及び炭酸水素ナトリウムなどの、適切な希塩基水溶液で前記塩を処理することによって、再生することができる。遊離形態は、極性溶媒中での溶解度など、ある種の物理特性が、それらの各塩形態と若干異なる場合があるが、酸塩及び塩基塩は、本発明の目的に対して、それらの各遊離形態とそれ以外の点で医薬的に等価である。
【００８４】
本発明の化合物の医薬として許容される塩は、塩基性部分又は酸性部分を含有する本発明の化合物から、慣用の化学的方法によって合成することができる。一般に、塩基性化合物の塩は、イオン交換クロマトグラフィーによって調製され、又は、遊離塩基を、適切な溶媒若しくは溶媒の様々な組み合わせ中で、所望の塩を形成する無機酸若しくは有機酸の化学量論的な量若しくは過剰量と反応させることによって調製される。同様に、酸性化合物の塩は、適切な無機塩基又は有機塩基との反応によって形成される。
【００８５】
従って、本発明の化合物の医薬として許容される塩には、塩基性の本発明の化合物を無機酸又は有機酸と反応させることによって形成される、本発明の化合物の無毒な慣用の塩が含まれる。例えば、無毒な慣用の塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸から誘導される塩；及び酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）などの有機酸から調製される塩が含まれる。
【００８６】
本発明の化合物が酸性である場合には、適切な「医薬として許容される塩」は、無機塩基及び有機塩基を含む、医薬として許容される無毒の塩基から調製される塩を表す。無機塩基から誘導される塩には、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン塩、亜マンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛などが含まれる。特に好ましいのは、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム及びナトリウム塩である。医薬として許容される無毒の有機塩基から誘導される塩には、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ１−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなどの、一級、二級及び三級アミン、天然に存在する置換されたアミンを含む置換されたアミン、環状アミン、及び塩基性イオン交換樹脂の塩が含まれる。
【００８７】
上記医薬として許容される塩及びその他の典型的な医薬として許容される塩の調製は、「Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ，”Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９７７：６６：１−１９」にさらに詳しく記載されている。
【００８８】
生理的条件下では、化合物中の脱プロトン化された酸性部分（カルボキシル基など）は、陰イオンとなることができ、この電荷は、次いで、プロトン化又はアルキル化された塩基性部分（四級窒素原子など）の陽イオン電荷に対して内部的に打ち消され得るので、本発明の化合物は、内部塩又は双性イオンとなり得る可能性を秘めていることにも留意すべきである。
【００８９】
用途
本明細書に記載されている化合物、組成物及び方法は、特に、癌の治療に有用であると考えられる。本発明の化合物、組成物及び方法によって治療され得る癌には、心臓：肉腫（血管肉腫、繊維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫）、粘液腫、横紋筋腫、繊維腫、脂肪腫及び奇形腫；肺：気管支癌（扁平上皮細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌）、肺胞（細気管支）癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫；胃腸：食道（扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃（癌腫、リンパ腫、平滑筋肉腫）、膵臓（膵管腺癌、インシュリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ）、小腸（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、繊維腫）、大腸（腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）；尿生殖路：腎臓（腺癌、ウィルムス腫瘍［腎芽細胞腫］、リンパ腫、白血病）、膀胱及び尿道（扁平上皮細胞癌、移行上皮癌、腺癌）、前立腺（腺癌、肉腫）、精巣（精上皮癌、奇形腫、胎生期癌、奇形癌、絨毛癌、肉腫、間質細胞腫、繊維腫、繊維腺腫、類腺腫瘍、脂肪腫）；肝臓：肝臓癌（肝細胞癌）、胆管腫、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫；骨：骨原性肉腫（骨肉腫）、繊維肉腫、悪性繊維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫脊索腫、骨軟骨腫（ｏｓｔｅｏｃｈｒｏｎｆｒｏｍａ）（骨軟骨腫（ｏｓｔｅｏｃａｒｔｉｌａｇｉｎｏｕｓ  ｅｘｏｓｔｏｓｅｓ））、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液繊維腫、類骨骨腫及び巨細胞腫；神経系：頭蓋骨（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症）、脳（星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣細胞腫、胚細胞腫［松果体腫］、多形性膠芽腫、乏突起膠腫、シュワン腫、網膜芽腫、先天性腫瘍）、脊髄神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫）；婦人科：子宮（子宮内膜癌）、子宮頸部（子宮頸癌、前腫瘍子宮頸部形成異常）、卵巣（卵巣癌［漿液性嚢胞腺腫、ムチン性嚢胞腺癌、分類されていない癌腫］、顆粒膜細胞腫、セルトーリ−ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、外陰部（扁平上皮細胞癌、上皮内癌、腺癌、繊維肉腫、悪性黒色腫）、膣（明細胞癌、扁平上皮細胞癌、ブドウ状肉腫（胎児性横紋筋肉腫）、卵管（癌腫）、乳房；血液：血液（骨髄性白血病［急性及び慢性］、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫［悪性リンパ腫］；皮膚：悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、カポジ肉腫、あざ  形成異常母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚繊維腫、ケロイド、乾癬；並びに副腎：神経芽細胞腫が含まれるが、これらに限定されるものではない。従って、本明細書で使用される「癌細胞」という用語には、上記症状の何れか一つに罹患した細胞が含まれる。
【００９０】
本発明の化合物、組成物及び方法によって治療され得る癌には、乳癌、前立腺癌、大腸癌、肺癌、脳腫瘍、精巣癌、胃癌、膵臓癌、皮膚癌、小腸癌、大腸癌、咽喉癌、頭部及び頸部癌、口腔癌、骨癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、甲状腺癌及び血液癌が含まれるが、これらに限定されない。
【００９１】
本発明の化合物は、癌を治療するのに有用である医薬を調製する上でも有用である。
【００９２】
本発明の化合物は、単独で、又は、医薬組成物中の医薬として許容される担体、賦形剤若しくは希釈剤と組み合わせて、標準的な医薬慣行に従って、哺乳動物（ヒトを含む。）に投与され得る。本化合物は、経口的に、又は、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、直腸及び局所投与経路など、非経口的に投与することができる。
【００９３】
活性成分を含有する医薬組成物は、経口用途、例えば、錠剤、トローチ剤、舐剤、水性又は油性懸濁液剤、分散性散剤又は顆粒剤、エマルジョン、硬若しくは軟カプセル剤、又はシロップ剤若しくはエリキシル剤として、適切な形態とすることができる。経口で使用することが意図された組成物は、医薬組成物の製造の分野で公知の何れかの方法に従って調製することができ、このような組成物は、医薬として上品で、口当たりのよい調製物を提供するために、甘味剤、着香剤、着色剤及び防腐剤からなる群から選択される１つ又はそれ以上の薬剤を含有することができる。錠剤は、錠剤の製造に適切である、医薬として許容される無毒の賦形剤と混合された活性成分を含有する。これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤；顆粒化剤及び崩壊剤、例えば、微結晶性セルロース、クロスカルメロースナトリウム、コーンスターチ又はアルギン酸；結合剤、例えば、デンプン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン又はアラビアゴム、及び潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクとすることができる。錠剤は被覆されていなくてもよく、又は薬物の不快な味を隠すために、若しくは消化管内での崩壊及び吸収を遅らせ、これによってさらに長時間にわたる持続作用をもたらすために、公知の技術によって被覆することもできる。例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース若しくはヒドロキシプロピルセルロースなどの、味を隠す水溶性物質、又はエチルセルロース、酢酸酪酸セルロースなどの時間遅延物質を使用し得る。
【００９４】
経口用製剤は、活性成分が不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム若しくはカオリンと混合されている硬質ゼラチンカプセル剤、又は活性成分が、ポリエチレングリコールなどの水溶性担体若しくはオイル媒体、例えば、落花生油、流動パラフィン若しくはオリーブオイルと混合されている軟質ゼラチンカプセル剤として与えることもできる。
【００９５】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適する賦形剤と混合された活性物質を含有する。このような賦形剤は、懸濁剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム及びアラビアゴムであり；分散剤又は湿潤剤は、天然に存在するホスファチド、例えば、レシチン、又はアルキレンオキシドの脂肪酸との縮合産物、例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン、又はエチレンオキシドの長鎖脂肪酸アルコールとの縮合産物、例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトールなどのエチレンオキシドの脂肪酸由来部分エステル及びヘキシトールとの縮合産物、又はエチレンオキシドの脂肪酸由来部分エステル及びヘキシトール無水物との縮合産物、例えば、モノオレイン酸ポリエチレンソルビタンであり得る。水性懸濁液は、１つ又はそれ以上の防腐剤、例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル又はｎ−プロピル、１つ又はそれ以上の着色剤、１つ又はそれ以上の着香剤及びスクロース、サッカリン又はアスパルテームなどの１つ又はそれ以上の甘味剤も含有し得る。
【００９６】
油性懸濁液は、植物油、例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油若しくはココナッツ油、又は液体パラフィンなどの鉱物油中に活性成分を懸濁することによって調合され得る。油性懸濁液は、濃縮剤、例えば、蜜蝋、固形パラフィン又はセチルアルコールを含有し得る。口当たりのよい経口調製物を提供するために、上述のものなどの甘味剤、及び着香剤を添加することができる。これらの組成物は、ブチル化ヒドロキシアニソール又はα−トコフェロールなどの抗酸化剤を添加することによって保存することができる。
【００９７】
水の添加による水性懸濁液の調製に適した分散可能な粉末及び顆粒は、分散又は湿潤剤、懸濁剤及び１又はそれ以上の防腐剤と混合された活性な化合物を与える。適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤は、既述されたものが例として挙げられる。追加の賦形剤、例えば、甘味剤、着香剤及び着色剤も存在し得る。これらの組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤を添加することによって保存することができる。
【００９８】
本発明の医薬組成物は、水中油エマルジョンの形態とすることもできる。油相は、植物油、例えば、オリーブ油若しくはラッカセイ油、若しくは鉱物油、例えば、液体パラフィン、又はこれらの混合物とすることができる。適切な乳化剤は、天然のホスファチド、例えば、ダイズレシチン、及び脂肪酸と無水ヘキシトールから誘導されるエステル又は部分エステル、例えば、ソルビタンモノオレアート、及び前記部分エステルとエチレンオキシドの縮合産物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートとすることができる。エマルジョンは、甘味料、着香剤、防腐剤及び抗酸化剤を含有することもできる。
【００９９】
シロップ及びエリキシルは、甘味剤、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール又はスクロースとともに調合され得る。かかる製剤は、粘滑薬、防腐剤、着香剤及び着色剤並びに抗酸化剤を含有することもできる。
【０１００】
前記医薬組成物は、無菌注射用水性液剤の形態とすることができる。使用され得る許容可能なビヒクル及び溶媒には、水、リンゲル溶液及び等張の塩化ナトリウム溶液がある。
【０１０１】
無菌注射用調製物は、活性成分が油相に溶解されている、無菌の注射用水中油ミクロエマルジョンとすることもできる。例えば、まず、ダイズ油及びレシチンの混合物中に活性成分を溶かすことができる。次いで、油溶液を水とグリセロール混合物中に導入し、処理を施して、ミクロエマルジョンを形成させる。
【０１０２】
注射可能な溶液又はミクロエマルジョンは、局所ボーラス注射によって、患者の血流中に導入することができる。あるいは、本発明の化合物の一定循環濃度を維持するように、溶液又はミクロエマルジョンを投与することが有用であり得る。このような一定濃度を維持するために、連続静脈内送達装置を使用し得る。このような装置の例は、Ｄｅｌｔｅｃ  ＣＡＤＤ−ＰＬＵＳＴＭモデル５４００静脈内ポンプである。
【０１０３】
前記医薬組成物は、筋肉内及び皮下投与のために、無菌注射用水性又は油性懸濁液の形態とすることができる。この懸濁液は、適切な上記分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて、公知の方法に従って調合され得る。無菌の注射可能な調製物は、非経口的に許容される無毒の希釈剤又は溶媒中の無菌注射可能溶液又は懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液とすることもできる。さらに、無菌の不揮発性油は、溶媒又は懸濁媒体として慣用される。この目的のために、合成モノグリセリド又はジグリセリドなどの、任意の無刺激性不揮発性油が使用され得る。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤の調製に用途を見出す。
【０１０４】
式Ａの化合物は、薬物を直腸投与するために、坐剤の形態で投与することもできる。これらの組成物は、常温では固体であるが、直腸温では液体であり、このため、直腸内で融解して薬物を放出し得る適切な非刺激性賦形剤と薬物を混合することによって調製することができる。かかる材料には、カカオバター、グリセリン化されたゼラチン、硬化植物油、様々な分子量のポリエチレングリコールの混合物及びポリエチレングリコールの脂肪酸エステルが含まれる。
【０１０５】
局所に使用する場合は、式Ａの化合物を含有するクリーム剤、軟膏剤、ゼリー剤、液剤又は懸濁液剤などが使用される。（本願では、局所適用は、洗口及びうがいを含むものとする。）。
【０１０６】
本発明の化合物は、適切な鼻内ビヒクル及び送達装置の局所使用を通じて、又は、当業者に周知の経皮パッチの形態を用いた、経皮経路を通じて、鼻内形態で投与することができる。経皮送達系の形態で投与するために、もちろん、投薬は、投薬計画を通じて、断続的に行われるのではなく、継続的に行われ得る。本発明の化合物は、カカオバター、グリセリン化されたゼラチン、硬化植物油、様々な分子量のポリエチレングリコールの混合物及びポリエチレングリコールの脂肪酸エステルなどの基剤を使用し、坐剤として送達することもできる。
【０１０７】
本発明の組成物が、ヒト患者に投与される場合、一日投薬量は、処方医によって決定されるのが通常であり、投薬量は、一般に、年齢、体重及び各患者の反応、並びに患者の症候の重度に応じて変動する。
【０１０８】
一実施形態において、ＣＨＫ１の阻害剤の適切な量が、癌に対する治療を行っている哺乳動物に投与される。投与は、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日と約６０ｍｇ／ｋｇ体重／日の間、又は０．５ｍｇ／ｋｇ体重／日と約４０ｍｇ／ｋｇ体重／日の間の阻害剤の量で行われる。
【０１０９】
本発明の組成物を含む別の治療的用量は、ＣＨＫ１の阻害剤約０．０１ｍｇから約１０００ｍｇまでを含む。別の実施形態において、用量は、ＣＨＫ１の阻害剤約１ｍｇから約１０００ｍｇまでを含む。
【０１１０】
本発明の化合物は、治療剤、化学療法剤及び抗癌剤と組み合わせても有用である。本明細書に開示されている化合物と、治療剤、化学療法剤及び抗癌剤との組み合わせは、本発明の範囲に属する。このような薬剤の例は、「Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｂｙ  Ｖ．  Ｔ．  Ｄｅｖｉｔａ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈｅｌｌｍａｎ  （ｅｄｉｔｏｒｓ），  ６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １５，２００１），  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ」に見出すことができる。当業者であれば、関与する薬物と癌の具体的な特徴に基づいて、何れの薬剤の組み合わせが有用であるか識別できる。このような薬剤には、以下のもの、すなわち、エストロゲン受容体調節物質、アンドロゲン受容体調節物質、レチノイド受容体調節物質、細胞毒性／細胞増殖抑制剤、抗増殖剤、プレニル−タンパク質転移酵素阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤及びその他の血管新生阻害剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、細胞増殖及び生存シグナル伝達の阻害剤、ビスホスホナート、アロマターゼ阻害剤、ｓｉＲＮＡ治療剤、γ−セクレターゼ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を妨害する薬剤並びに細胞周期チェックポイントを妨害する薬剤が含まれるが。本発明の化合物は、放射線療法とともに投与すると、特に有用である。
【０１１１】
「エストロゲン受容体調節物質」とは、機序を問わず、エストロゲンの受容体への結合を妨害又は阻害する化合物をいう。エストロゲン受容体調節物質の例には、タモキシフェン、ラロキシフェン、イドキシフェン、ＬＹ３５３３８１、ＬＹ１１７０８１、トレミフェン、フルベストラン、４−［７−（２，２−ジメチル−１−オキソプロポキシ−４−メチル−２−［４−［２−（１−ピペリジニル）エトキシ］フェニル］−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−イル］−フェニル−２，２−ジメチルプロパノアート、４，４’−ジヒドロキシベンゾフェノン−２，４−ジニトロフェニル−ヒドラゾン及びＳＨ６４６が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１２】
「アンドロゲン受容体調節物質」とは、機序を問わず、アンドロゲンの受容体への結合を妨害又は阻害する化合物をいう。アンドロゲン受容体調節物質の例には、フィナステリド及び他の５α−還元酵素阻害剤、ニルタミド、フルタミド、ビカルタミド、リアロゾール及び酢酸アビラテロンが含まれる。
【０１１３】
「レチノイド受容体調節物質」とは、機序を問わず、レチノイドの受容体への結合を妨害又は阻害する化合物をいう。このようなレチノイド受容体調節物質の例には、ベキサロテン、トレチノイン、１３−シス−レチノイン酸、９−シス−レチノイン酸、α−ジフルオロメチルオルニチン、ＩＬＸ２３−７５５３、トランス−Ｎ−（４’−ヒドロキシフェニル）レチナミド及びＮ−４−カルボキシフェニルレチナミドが含まれる。
【０１１４】
「細胞毒性／細胞抑制剤」とは、主として、細胞の機能を直接妨害することによって、細胞死を引き起こし、若しくは細胞増殖を阻害する化合物、又は、細胞の有糸分裂を阻害し、若しくは妨害する化合物をいい、アルキル化剤、腫瘍壊死因子、インターカレート物質、低酸素状態で活性化される化合物、微小管阻害剤／微小管安定化剤、有糸分裂キネシンの阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、有糸分裂の進行に関与するキナーゼの阻害剤、増殖因子及びサイトカインシグナル伝達経路に関与するキナーゼの阻害剤、代謝拮抗物質、生物反応修飾物質、ホルモン／抗ホルモン治療剤、造血成長因子、モノクローナル抗体によって標的誘導された治療剤、トポイソメラーゼ阻害剤、プロテオソーム阻害剤、ユビキチンリガーゼ阻害剤及びオーロラキナーゼ阻害剤が含まれる。
【０１１５】
細胞毒性／細胞抑制剤の例には、セルテネフ（ｓｅｒｔｅｎｅｆ）、カケクチン（ｃａｃｈｅｃｔｉｎ）、イフォスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、タソネルミン（ｔａｓｏｎｅｒｍｉｎ）、ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ジブロモダルシトール（ｄｉｂｒｏｍｏｄｕｌｃｉｔｏｌ）、ラニムスチン（ｒａｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、ヘプタプラチン（ｈｅｐｔａｐｌａｔｉｎ）、エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、インプロスルファン・トシラート（ｉｍｐｒｏｓｕｌｆａｎ  ｔｏｓｉｌａｔｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ニムスチン（ｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ジブロスピジウム・クロリド（ｄｉｂｒｏｓｐｉｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、プミテパ（ｐｕｍｉｔｅｐａ）、ロバプラチン（ｌｏｂａｐｌａｔｉｎ）、サトラプラチン（ｓａｔｒａｐｌａｔｉｎ）、プロフィロマイシン（ｐｒｏｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、イロフルベン（ｉｒｏｆｕｌｖｅｎ）、デキシフォスファミド（ｄｅｘｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、シス−アミンジクロロ（２−メチル−ピリジン）プラチナ（ｃｉｓ−ａｍｉｎｅｄｉｃｈｌｏｒｏ（２−ｍｅｔｈｙｌ−ｐｙｒｉｄｉｎｅ）ｐｌａｔｉｎｕｍ）、ベンジルグアニン（ｂｅｎｚｙｌｇｕａｎｉｎｅ）、グルフォスファミド（ｇｌｕｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ＧＰＸ１００，（トランス、トランス、トランス）−ビス−ｍｕ−（ヘキサン−１，６−ジアミン）−ｍｕ−［ジアミン−プラチナ（ＩＩ）］ビス［ジアミン（クロロ）プラチナ（ＩＩ）］テトラクロリド、ジアリジジニルスペルミン（ｄｉａｒｉｚｉｄｉｎｙｌｓｐｅｒｍｉｎｅ）、三酸化ヒ素（ａｒｓｅｎｉｃ  ｔｒｉｏｘｉｄｅ）、１−（１１−ドデシルアミノ−１０−ヒドロキシウンデシル−３，７−ジメチルキサンチン、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）、ピナファイド（ｐｉｎａｆｉｄｅ）、バルルビシン（ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）、アムルビシン（ａｍｒｕｂｉｃｉｎ）、アンチネオプラストン（ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｏｎ）、３’−デアミノ−３’−モルホリノ−１３−デオキソ−１０−ヒドロキシカルミノマイシン、アナマイシン（ａｎｎａｍｙｃｉｎ）、ガラルビシン（ｇａｌａｒｕｂｉｃｉｎ）、エリナファイド（ｅｌｉｎａｆｉｄｅ）、ＭＥＮ１０７５５、４−デメトキシ−３−デアミノ−３−アジリジニル−４−メチルスルホニル−ダウノルビシン（ＷＯ  ００／５００３２を参照。）、Ｒａｆキナーゼ阻害剤（Ｂａｙ４３−９００６）及びｍＴＯＲ阻害剤（ＷｙｅｔｈのＣＣＩ−７７９など）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１６】
低酸素状態で活性化される化合物の例は、チラパザミン（ｔｉｒａｐａｚａｍｉｎｅ）である。
【０１１７】
プロテオソーム阻害剤の例には、ラクタシスチン及びＭＬＮ−３４１（Ｖｅｌｃａｄｅ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１８】
微小管阻害剤／微小管安定化剤の例には、パクリタキセル、ビンデシン硫酸、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルビンカロイコブラスチン（３’，４’−ｄｉｄｅｈｙｄｒｏ−４’−ｄｅｏｘｙ−８’−ｎｏｒｖｉｎｃａｌｅｕｋｏｂｌａｓｔｉｎｅ）、ドセタキソール（ｄｏｃｅｔａｘｏｌ）、リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）、ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）、ミボブリン・イセチオナート（ｍｉｖｏｂｕｌｉｎ  ｉｓｅｔｈｉｏｎａｔｅ）、オーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、セマドチン（ｃｅｍａｄｏｔｉｎ）、ＲＰＲ１０９８８１、ＢＭＳ１８４４７６、ビンフルニン（ｖｉｎｆｌｕｎｉｎｅ）、クリプトフィシン（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｉｎ）、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルホンアミド（２，３，４，５，６−ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏ−Ｎ−（３−ｆｌｕｏｒｏ−４−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）、無水ビンブラスチン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロピル−Ｌ−プロリン−ｔ−ブチルアミド、ＴＤＸ２５８、エポチロン（例えば、米国特許第６，２８４，７８１号及び６，２８８，２３７号を参照。）及びＢＭＳ１８８７９７が含まれる。一実施形態において、エポチロンは、微小管阻害剤／微小管安定化剤に含まれない。
【０１１９】
トポイソメラーゼ阻害剤の幾つかの例は、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、ハイカプタミン（ｈｙｃａｐｔａｍｉｎｅ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、ルビテカン（ｒｕｂｉｔｅｃａｎ）、６−エトキシプロピオニル−３’，４’−Ｏ−エキソ−ベンジリデン−チャルトレウシン（ｃｈａｒｔｒｅｕｓｉｎ）、９−メトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−５−ニトロピラゾロ［３，４，５−ｋｌ］アクリジン−２−（６Ｈ）プロパンアミン、１−アミノ−９−エチル−５−フルオロ−２，３−ジヒドロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［デ］ピラノ［３’，４’：ｂ，７］−インドリジノ［１，２ｂ］キノリン−１０，１３（９Ｈ，１５Ｈ）ジオン、ラルトテカン（ｌｕｒｔｏｔｅｃａｎ）、７−［２−（Ｎ−イソプロピルアミノ）エチル］−（２０Ｓ）カンプトテシン、ＢＮＰ１３５０、ＢＮＰＩ１１００、ＢＮ８０９１５、ＢＮ８０９４２、エトポシドホスファート、テニポシド、ソブゾキサン（ｓｏｂｕｚｏｘａｎｅ）、２’−ジメチルアミノ−２’−デオキシ−エトポシド、ＧＬ３３１、Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−９−ヒドロキシ−５，６−ジメチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール−１−カルボキサミド、アスラクリン（ａｓｕｌａｃｒｉｎｅ）、（５ａ，５ａＢ，８ａａ，９ｂ）−９−［２−［Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ］エチル］−５−［４−ヒドロオキシ−３，５−ジメトキシフェニル］−５，５ａ，６，８，８ａ，９−ヘキソヒドロフロ（３’，４’：６，７）ナフト（２，３−ｄ）−１，３−ジオキソール−６−オン、２，３−（メチレンジオキシ）−５−メチル−７−ヒドロキシ−８−メトキシベンゾ［ｃ］−フェナントリジニウム、６，９−ビス［（２−アミノエチル）アミノ］ベンゾ［ｇ］イソギノリン−５，１０−ジオン、５−（３−アミノプロピルアミノ）−７，１０−ジヒドロキシ−２−（２−ヒドロキシエチルアミノメチル）−６Ｈ−ピラゾロ［４，５，１−デ］アクリジン−６−オン、Ｎ−［１−［２（ジエチルアミノ）エチルアミノ］−７−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−チオキサンテン−４−イルメチル］ホルムアミド、Ｎ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）アクリジン−４−カルボキサミド、６−［［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ］−３−ヒドロキシ−７Ｈ−インデノ［２，１−ｃ］キノリン−７−オンおよびジメスナ（ｄｉｍｅｓｎａ）である。
【０１２０】
有糸分裂キネシン、特にヒト有糸分裂キネシンＫＳＰの阻害剤の例は、ＰＣＴ公開公報ＷＯ  ０１／３０７６８及びＷＯ  ０１／９８２７８、並びに係属中の米国特許出願第６０／３３８，７７９号（２００１年１２月６日出願）、第６０／３３８，３４４号（２００１年１２月６日出願）、第６０／３３８，３８３号（２００１年１２月６日出願）、第６０／３３８，３８０号（２００１年１２月６日出願）、第６０／３３８，３７９号（２００１年１２月６日出願）及び第６０／３４４，４５３号（２００１年１１月７日）に記載されている。一実施形態において、有糸分裂キネシンの阻害剤には、ＫＳＰの阻害剤、ＭＫＬＰ１の阻害剤、ＣＥＮＰ−Ｅの阻害剤、ＭＣＡＫの阻害剤及びＲａｂ６−ＫＩＦＬの阻害剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１２１】
「ヒストンデアセチラーゼ阻害剤」の例には、ＳＡＨＡ、ＴＳＡ、オキサムフラチン、ＰＸＤ１０１、ＭＧ９８及びスクリプタイドが含まれるが、これらに限定されない。他のヒストンデアセチラーゼ阻害剤に関するさらなる参考文献は、以下の原稿；「Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｔ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ４６（２４）：５０９７−５１１６  （２００３）」に見出し得る。
【０１２２】
「有糸分裂の進行に関与するキナーゼの阻害剤」には、オーロラキナーゼの阻害剤、Ｐｏｌｏ様キナーゼの阻害剤（ＰＬＫ；特に、ＰＬＫ−１の阻害剤）、ｂｕｂ−１の阻害剤及びｂｕｂ−Ｒ１の阻害剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。「オーロラキナーゼ阻害剤」の例は、ＶＸ−６８０である。
【０１２３】
「抗増殖剤」には、Ｇ３１３９、ＯＤＮ６９８、ＲＶＡＳＫＲＡＳ、ＧＥＭ２３１、及びＩＮＸ３００１などのアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡオリゴヌクレオチド、並びにエノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、カルモフール（ｃａｒｍｏｆｕｒ）、テガフール（ｔｅｇａｆｕｒ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、トリメトトレキサート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、ガロシタビン（ｇａｌｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、シタラビンオクオスファート（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅｏｃｆｏｓｆａｔｅ）、フォステアビンナトリウム水和物（ｆｏｓｔｅａｂｉｎｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｈｙｄｒａｔｅ）、ラルチトレキセド（ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｄ）、パルチトレキシド（ｐａｌｔｉｔｒｅｘｉｄ）、エミテフール（ｅｍｉｔｅｆｕｒ）、チアゾフリン（ｔｉａｚｏｆｕｒｉｎ）、デシタビン（ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、ノラトレキセド（ｎｏｌａｔｒｅｘｅｄ）、ペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、ネルザラビン（ｎｅｌｚａｒａｂｉｎｅ）、２’−デオキシ−２’−メチリデンシチジン、２’−フルオロメチレン−２’−デオキシシチジン、Ｎ−［５−（２，３−ジヒドロ−ベンゾフリル）スルホニル］−Ｎ’−（３，４−ジクロロフェニル）尿素、Ｎ６−［４−デオキシ−４−［Ｎ２−［２（Ｅ），４（Ｅ）−テトラデカジエノイル］グリシルアミノ］−Ｌ−グリセロ−Ｂ−Ｌ−マンノ−ヘプトピラノシル］アデニン、アプリジン、エクテイナシジン（ｅｃｔｅｉｎａｓｃｉｄｉｎ）、トロキサシタビン（ｔｒｏｘａｃｉｔａｂｉｎｅ）、４−［２−アミノ−４−オキソ−４，６，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−ピリミジノ［５，４−ｂ］［１，４］チアジン−６−イル−（Ｓ）−エチル］−２，５−チエノイル−Ｌ−グルタミン酸、アミノプテリン、５−フルオロウラシル、アラノシン（ａｌａｎｏｓｉｎｅ）、１１−アセチル−８−（カルバモイルオキシメチル）−４−ホルミル−６−メトキシ−１４−オキサ−ｌ，１１−ジアザテトラシクロ（７．４．１．０．０）−テトラデカ−２，４，６−トリエン−９−イル酢酸エステル、スワインソニン（ｓｗａｉｎｓｏｎｉｎｅ）、ロメトレキソール（ｌｏｍｅｔｒｅｘｏｌ）、デクスラゾキサン（ｄｅｘｒａｚｏｘａｎｅ）、メチオニナーゼ、２’−シアノ−２’−デオキシ−Ｎ４−パルミトイル−１−Ｂ−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン、３−アミノピリジン−２−カルボキサルデヒドチオセミカルバゾン及びトラスツズマブなどの代謝拮抗剤が含まれる。
【０１２４】
モノクローナル抗体で標的に誘導される治療剤の例には、癌細胞特異的又は標的細胞特異的モノクローナル抗体に結合された細胞毒性剤又は放射性同位体を有する治療剤が含まれる。例には、Ｂｅｘｘａｒが含まれる。
【０１２５】
「ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤」は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ還元酵素の阻害剤を表す。使用され得るＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤の例には、ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）（ＭＥＶＡＣＯＲ（Ｒ））；米国特許第４，２３１，９３８号、第４，２９４，９２６号及び第４，３１９，０３９号を参照）、シンバスタチン（ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）（ＺＯＣＯＲ（Ｒ））；米国特許第４，４４４，７８４号、第４，８２０，８５０号及び第４，９１６，２３９号を参照）、プラバスタチン（ｐｒａｖａｓｔａｔｉｎ）（ＰＲＡＶＡＣＨＯＬ（Ｒ）；米国特許第４，３４６，２２７号、第４，５３７，８５９号、第４，４１０，６２９号、第５，０３０，４４７号及び第５，１８０，５８９号を参照）、フルバスタチン（ｆｌｕｖａｓｔａｔｉｎ）（ＬＥＳＣＯＬ（Ｒ）；米国特許第５，３５４，７７２号、第４，９１１，１６５号、第４，９２９，４３７号、５，１８９，１６４号、第５，１１８，８５３号、第５，２９０，９４６号及び第５，３５６，８９６号を参照）、アトロバスタチン（ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ）（ＬＩＰＩＴＯＲ（Ｒ）；米国特許第５，２７３，９９５号、第４，６８１，８９３号、第５，４８９，６９１号及び第５，３４２，９５２号を参照）及びセリバスタチン（リバスタチン及びＢＡＹＣＨＯＬ（Ｒ）としても知られる。；  米国特許第５，１７７，０８０号参照）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法において使用され得る、これら及びその他のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤の構造式は、「Ｍ．  Ｙａｌｐａｎｉ，  “Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｌｏｗｅｒｉｎｇ  Ｄｒｕｇｓ”，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，  ｐｐ．  ８５−８９（５  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９９６）」の８７ページ並びに米国特許第４，７８２，０８４号及び第４，８８５，３１４号に記載されている。本明細書において使用されるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤という用語には、医薬として許容される全てのラクトン及び開環した酸の形態（すなわち、ラクトン環が開環されて、遊離酸を形成している。）並びにＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害活性を有する化合物の塩及びエステル形態が含まれ、従って、このような塩、エステル、開環した酸及びラクトン形態の使用は、本発明の範囲に含まれる。「プレニル−タンパク質転移酵素阻害剤」は、ファルネシル−タンパク質転移酵素（ＦＰＴａｓｅ）、ゲラニルゲラニル−タンパク質転移酵素Ｉ型（ＧＧＰＴａｓｅ−Ｉ）及びゲラニルゲラニル−タンパク質転移酵素ＩＩ型（ＧＧＰＴａｓｅ−ＩＩ、Ｒａｂ  ＧＧＰＴａｓｅとも称される。）などの、プレニル−タンパク質転移酵素のうち何れか一つ又は何れかの組み合わせを阻害する化合物を表す。
【０１２６】
プレニル−タンパク質転移酵素阻害剤の例は、以下の公報及び特許に記載されている。ＷＯ  ９６／３０３４３、ＷＯ  ９７／１８８１３、ＷＯ  ９７／２１７０１、ＷＯ  ９７／２３４７８、ＷＯ  ９７／３８６６５、ＷＯ  ９８／２８９８０、ＷＯ  ９８／２９１１９、ＷＯ  ９５／３２９８７、米国特許第５，４２０，２４５号、米国特許第５，５２３，４３０号、米国特許第５，５３２，３５９号、米国特許第５，５１０，５１０、米国特許第５，５８９，４８５号、米国特許第５，６０２，０９８号、欧州特許公報０  ６１８  ２２１、欧州特許公報  ０  ６７５  １１２、欧州特許公報  ０  ６０４  １８１、欧州特許公報  ０  ６９６  ５９３、ＷＯ  ９４／１９３５７、ＷＯ  ９５／０８５４２、ＷＯ  ９５／１１９１７、ＷＯ  ９５／１２６１２、ＷＯ  ９５／１２５７２、ＷＯ  ９５／１０５１４、米国特許第５，６６１，１５２号、ＷＯ  ９５／１０５１５、ＷＯ  ９５／１０５１６、ＷＯ  ９５／２４６１２、ＷＯ  ９５／３４５３５、ＷＯ  ９５／２５０８６、ＷＯ  ９６／０５５２９、ＷＯ  ９６／０６１３８、ＷＯ  ９６／０６１９３、ＷＯ  ９６／１６４４３、ＷＯ  ９６／２１７０１、ＷＯ  ９６／２１４５６、ＷＯ  ９６／２２２７８、ＷＯ  ９６／２４６１１、ＷＯ  ９６／２４６１２、ＷＯ  ９６／０５１６８、ＷＯ  ９６／０５１６９、ＷＯ  ９６／００７３６、米国特許第５，５７１，７９２号、ＷＯ  ９６／１７８６１、ＷＯ  ９６／３３１５９、ＷＯ  ９６／３４８５０、ＷＯ  ９６／３４８５１、ＷＯ  ９６／３００１７、ＷＯ  ９６／３００１８、ＷＯ  ９６／３０３６２、ＷＯ  ９６／３０３６３、ＷＯ  ９６／３１１１１、ＷＯ  ９６／３１４７７、ＷＯ  ９６／３１４７８、ＷＯ  ９６／３１５０１、ＷＯ  ９７／００２５２、ＷＯ  ９７／０３０４７、ＷＯ  ９７／０３０５０、ＷＯ  ９７／０４７８５、ＷＯ  ９７／０２９２０、ＷＯ  ９７／１７０７０、ＷＯ  ９７／２３４７８、ＷＯ  ９７／２６２４６、ＷＯ  ９７／３００５３、ＷＯ  ９７／４４３５０、ＷＯ  ９８／０２４３６、及び米国特許第５，５３２、３５９号。プレニル−タンパク質転移酵素阻害剤の血管新生に対する役割の例については、「Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，  Ｖｏｌ．  ３５，  Ｎｏ．  ９，  ｐｐ．１３９４−１４０１  （１９９９）」を参照されたい。
【０１２７】
「血管新生阻害剤」とは、機序を問わず、新しい血管の形成を阻害する化合物を表す。血管新生阻害剤の例には、チロシンキナーゼ受容体Ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ１）及びＦｌｋ−１／ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２）の阻害剤などのチロシンキナーゼ阻害剤、上皮由来、繊維芽細胞由来、又は血小板由来の増殖因子の阻害剤、ＭＭＰ（マトリックスメタロプロテアーゼ）阻害剤、インテグリンブロッカー、インターフェロン−α、インターロイキン−１２、ペントサンポリサルフェート、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（アスピリン及びイブプロフェンのような非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）並びにセレコキシブ（ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）及びロフェコキシブ（ｒｏｆｅｃｏｘｉｂ）のような選択的シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤を含む。）（ＰＮＡＳ，  Ｖｏｌ．８９，  ｐ．７３８４（１９９２）；ＪＮＣＩ，  Ｖｏｌ．６９，  ｐ．４７５（１９８２）；Ａｒｃｈ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．，  Ｖｏｌ．１０８，  ｐ．５７３（１９９０）；  Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．，  Ｖｏｌ．２３８，  ｐ．６８（１９９４）；  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  Ｖｏｌ．３７２，  ｐ．８３  （１９９５）；Ｃｌｉｎ，  Ｏｒｔｈｏｐ．Ｖｏｌ．３１３，  ｐ．７６（１９９５）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，  Ｖｏｌ．１６，  ｐ．１０７  （１９９６）；Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  Ｖｏｌ．７５，  ｐ．１０５（１９９７）；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  Ｖｏｌ．５７，  ｐ．１６２５（１９９７）；  Ｃｅｌｌ，  Ｖｏｌ．９３，  ｐ．７０５（１９９８）  ；  Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，  Ｖｏｌ．２，  ｐ．７１５（１９９８）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  Ｖｏｌ．２７４，  ｐ．９１１６（１９９９））、ステロイド系抗炎症薬（コルチコステロイド、鉱質コルチコイド、デキサメタゾン、プレドニソン、プレドニソロン、メチルプレド、ベタメタゾンなど）、カルボキシアミドトリアゾール、コンブレタスタチンＡ−４、スクアラミン、６−Ｏ−クロロアセチル−カルボニル）−フマギロール、サリドマイド、アンギオスタチン、トロポニン−１、アンギオテンシンＩＩアンタゴニスト（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｌａｂ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｅｄ．  １０５：１４１−１４５（１９８５）を参照。）、及びＶＥＧＦに対する抗体（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １７，  ｐｐ．  ９６３−９６８（Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９９９）；  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３６２，８４１−８４４（１９９３）；  ＷＯ  ００／４４７７７；及びＷＯ  ００／６１１８６を参照。）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２８】
血管新生を調節又は阻害し、本発明の化合物と併用され得る他の治療剤には、凝固系及び繊維素溶解系を調節又は阻害する治療剤が含まれる（Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌａ．  Ｍｅｄ．３８：６７９−６９２（２０００）の総説を参照。）。凝固経路及び繊維素溶解経路を調節又は阻害する、このような治療剤の例には、ヘパリン（Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ８０：１０−２３（１９９８）参照）、低分子量ヘパリン及びカルボキシペプチダーゼＵ阻害剤（活性トロンビン活性化可能繊維素溶解阻害剤［ＴＡＦＩａ］の別称でも知られる。）（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓ．  １０１：３２９−３５４（２００１）を参照）が含まれるが、これらに限定されない。ＴＡＦＩａ阻害剤は、米国特許出願第６０／３１０，９２７号（２００１年８月８日出願）号及び米国出願６０／３４９，９２５号（２００２年１月１８日出願）に記載されている。
【０１２９】
「細胞周期チェックポイントを妨害する薬剤」とは、細胞周期チェックポイントシグナルを伝達するタンパク質キナーゼを阻害することにより、ＤＮＡ損傷剤に対して癌細胞を増感させる化合物を表す。このような薬剤には、ＡＴＲ、ＡＴＭ、Ｃｈｋ１１及びＣｈｋ１２キナーゼの阻害剤並びにｃｄｋ及びｃｄｃキナーゼ阻害剤が含まれ、具体例としては、７−ヒドロキシスタウロスポリン、フラボピリドール、ＣＹＣ２０２（Ｃｙｃｌａｃｅｌ）及びＢＭＳ−３８７０３２が挙げられる。
【０１３０】
「受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を妨害する薬剤」とは、ＲＴＫを阻害し、従って、腫瘍発生及び腫瘍進行に関与する機序を阻害する化合物を表す。このような薬剤には、ｃ−Ｋｉｔ、Ｅｐｈ、ＰＤＧＦ、Ｆｌｔ３及びｃ−Ｍｅｔの阻害剤が含まれる。さらなる薬剤には、「Ｂｕｍｅ−Ｊｅｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｈｕｎｔｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１１：３５５−３６５，  ２００１」に記載されているようなＲＴＫの阻害剤が含まれる。
【０１３１】
「細胞増殖及び生存シグナル伝達経路の阻害剤」とは、細胞表面受容体の下流にあるシグナル伝達カスケードを阻害する化合物を表す。このような薬剤には、セリン／スレオニンキナーゼの阻害剤（ＷＯ  ０２／０８３０６４、ＷＯ  ０２／０８３１３９、ＷＯ  ０２／０８３１４０、ＷＯ  ０２／０８３１３８、ＷＯ  ０３／０８６２７９、ＷＯ  ０３／０８６３９４、ＷＯ  ０３／０８６４０３、ＷＯ  ０３／０８６４０４及びＷＯ  ０４／０４１１６２に記載されているようなＡｋｔの阻害剤を含むが、これらに限定されない。）、Ｒａｆキナーゼの阻害剤（例えば、ＢＡＹ−４３−９００６）、ＭＥＫの阻害剤（例えば、ＣＩ−１０４０及びＰＤ−０９８０５９）、ｍＴＯＲの阻害剤（例えば、Ｗｙｅｔｈ  ＣＣＩ−７７９）及びＰＩ３Ｋの阻害剤（例えば、ＬＹ２９４００２）が含まれる。
【０１３２】
上述されているように、ＮＳＡＩＤとの組み合わせは、強力なＣＯＸ−２阻害剤であるＮＳＡＩＤの使用に向けられる。本明細書において、細胞又はミクロソームアッセイによって評価された場合に、ＣＯＸ−２の阻害に対するＩＣ５０が１μＭ又はそれ未満であれば、ＮＳＡＩＤは強力である。
【０１３３】
本発明は、選択的ＣＯＸ−２阻害剤であるＮＳＡＩＤとの組み合わせも包含する。本明細書において、ＣＯＸ−２の選択的阻害剤であるＮＳＡＩＤとは、細胞又はミクロソームアッセイによって評価されたＣＯＸ−１のＩＣ５０に対するＣＯＸ−２のＩＣ５０の比によって測定した場合に、ＣＯＸ−１に対するＣＯＸ−２阻害の特異性が少なくとも１００倍であるＮＳＡＩＤとして定義される。このような化合物には、米国特許第５，４７４，９９５号、米国特許第５，８６１，４１９号、米国特許第６，００１，８４３号、米国特許第６，０２０，３４３号、米国特許第５，４０９，９４４号、米国特許第５，４３６，２６５号、米国特許第５，５３６，７５２号、米国特許第５，５５０，１４２号、米国特許第５，６０４，２６０号、米国特許第５，６９８，５８４号、米国特許第５，７１０，１４０号、ＷＯ  ９４／１５９３２、米国特許第５，３４４，９９１号、米国特許第５，１３４，１４２号、米国特許第５，３８０，７３８号、米国特許第５，３９３，７９０号、米国特許第５，４６６，８２３号、米国特許第５，６３３，２７２号及び米国特許第５，９３２，５９８号に開示されている化合物が含まれるが、これらに限定されるものではない（全て、参照により、本明細書に組み込まれる。）。
【０１３４】
本発明の治療法において特に有用なＣＯＸ−２の阻害剤は、３−フェニル−４−（４−（メチルスルホニル）フェニル）−２−（５Ｈ）−フラノン；及び５−クロロ−３−（４−メチルスルホニル）フェニル−２−（２−メチル−５−ピリジニル）ピリジン；又は医薬として許容されるそれらの塩である。
【０１３５】
ＣＯＸ−２の特異的阻害剤として記載され、それ故、本発明において有用である化合物には、パレコキシブ、ＢＥＸＴＲＡ（Ｒ）及びＣＥＬＥＢＲＥＸ（Ｒ）又は医薬として許容されるこれらの塩が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１３６】
血管新生阻害剤の他の例には、エンドスタチン、ウクライン、ランピルナーゼ、ＩＭ８６２、５−メトキシ−４−［２−メチル−３−（３−メチル−２−ブテニル）オキシラニル］−１−オキサスピロ［２，５］オクト−６−イル（クロロアセチル）カルバメート、アセチルジンアニリン（ａｃｅｔｙｌｄｉｎａｎａｌｉｎｅ）、５−アミノ−１−［［３，５−ジクロロ−４−（４−クロロベンゾイル）フェニル］メチル］−１Ｈ−１、２，３−トリアゾール−４−カルボキサミド、ＣＭ１０１、スクアラミン、コンブレタスタチン、ＲＰＩ４６１０、ＮＸ３１８３８、硫酸化マンノペンタオースリン酸（ｓｕｌｆａｔｅｄ  ｍａｎｎｏｐｅｎｔａｏｓｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、７，７−（カルボニル−ビス−［イミノ−Ｎ−メチル−４，２−ピロロカルボニルイミノ［Ｎ−メチル−４，２−ピロール］−カルボニルイミノ］−ビス−（１，３−ナフタレンジスルホナート）、及び３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４１６）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１３７】
上で使用したように、「インテグリンブロッカー」とは、生理的リガンドのαｖβ３インテグリンへの結合を選択的に拮抗し、阻害し、又は打ち消す化合物、生理的リガンドのαｖβ５インテグリンへの結合を選択的に拮抗し、阻害し、又は打ち消す化合物、生理的リガンドのαｖβ３インテグリン及びαｖβ５インテグリンの両方への結合を拮抗し、阻害し、又は打ち消す化合物、並びに毛細血管の内皮細胞上に発現された特定のインテグリンの活性を拮抗し、阻害し、又は打ち消す化合物を表す。本用語は、αｖβ６、αｖβ８、α１β１、α２β１、α５β１、α６β１及びα６β４インテグリンのアンタゴニストも表す。本用語は、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、αｖβ８、α１β１、α２β１、α５β１、α６β１及びα６β４インテグリンのあらゆる組み合わせのアンタゴニストも表す。
【０１３８】
チロシンキナーゼ阻害剤の幾つかの具体例には、Ｎ−（トリフルオロメチルフェニル）−５−メチルイソオキサゾール−４−カルボキサミド、３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル）インドリン−２−オン、１７−（アリルアミノ）−１７−デメトキシゲルダナマイシン、４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−メトキシ−６−［３−（４−モルホリニル）プロポキシル］キナゾリン、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス−（２−メトキシエトキシ）−４−キナゾリナミン、ＢＩＢＸ１３８２、２，３，９，１０，１１，１２−ヘキサヒドロ−１０−（ヒドロキシメチル）−１０−ヒドロキシ−９−メチル−９，１２−エポキシ−１Ｈ−ジインドロ［１，２，３−ｆｇ：３’，２’，１’−ｋｌ］ピロロ［３，４−ｉ］［１，６］ベンゾジアゾシン−１−オン、ＳＨ２６８、ゲニステイン、ＳＴＩ５７１、ＣＥＰ２５６３、４−（３−クロロフェニルアミノ）−５，６−ジメチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンメタンスルホナート、４−（３−ブロモ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン、４−（４’−ヒドロキシフェニル）アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン、ＳＵ６６６８、ＳＴＩ５７１Ａ、Ｎ−４−クロロフェニル−４−（４−ピリジルメチル）−１−フタラジンアミン及びＥＭＤ１２１９７４が含まれる。
【０１３９】
抗癌化合物以外の化合物との組み合わせも、本発明の方法に包含される。例えば、本明細書の特許請求の範囲に記載されている化合物の、ＰＰＡＲ−γ（すなわち、ＰＰＡＲ−ガンマ）アゴニスト及びＰＰＡＲ−δ（すなわち、ＰＰＡＲ−デルタ）アゴニストとの組み合わせは、ある種の悪性腫瘍の治療において有用である。ＰＰＡＲ−γ及びＰＰＡＲ−δは、核ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ及びδである。内皮細胞上へのＰＰＡＲ−γの発現及び血管新生におけるその関与が、文献に報告されている（Ｊ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １９９８；３１：９０９−９１３；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９；２７４：９１１６−９１２１；Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ．  Ｓｃｉ．  ２０００；４１：２３０９−２３１７を参照。）。さらに最近になって、ＰＰＡＲ−γアゴニストが、ＶＥＧＦに対する血管新生応答をインビトロで阻害することが示された；トログリタゾン及びロシグリタゾンのマレイン酸塩は何れも、マウスにおいて、網膜の新血管新生の発達を阻害する。（Ａｒｃｈ．  Ｏｐｈｔｈａｍｏｌ．  ２００１；  １１９：７０９−７１７）。ＰＰＡＲ−γアゴニスト及びＰＰＡＲ−γ／αアゴニストの例には、チアゾリジンジオン（ＤＲＦ２７２５、ＣＳ−０１１、トログリタゾン、ロシグリタゾン及びピオグリタゾンなど）、フェノフィブラート、ゲムフィブロジル、クロフィブラート、ＧＷ２５７０、ＳＢ２１９９９４、ＡＲ−Ｈ０３９２４２、ＪＴＴ−５０１、ＭＣＣ−５５５、ＧＷ２３３１、ＧＷ４０９５４４、ＮＮ２３４４、ＫＲＰ２９７、ＮＰ０１１０、ＤＲＦ４１５８、ＮＮ６２２、ＧＩ２６２５７０、ＰＮＵ１８２７１６、ＤＲＦ５５２９２６、２−［（５，７−ジプロピル−３−トリフロオロメチル−１，２−ベンズイソキサゾール−６−イル）オキシ］−２−メチルプロピオン酸（ＵＳＳＮ  ０９／７８２，８５６に開示されている。）及び２（Ｒ）−７−（３−（２−クロロ−４−（４−フルオロフェノキシ）フェノキシ）プロポキシ）−２−エチルクロマン−２−カルボン酸（ＵＳＳＮ  ６０／２３５，７０８及び６０／２４４，６９７に開示されている。）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１４０】
本発明の別の実施形態は、癌の治療用遺伝子療法と組み合わせた、本明細書に開示されている化合物の使用である。癌を治療するための遺伝子戦略の総説については、Ｈａｌｌら（Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  ６１：７８５−７８９，  １９９７）及びＫｕｆｅら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ５ｔｈ  Ｅｄ，  ｐｐ  ８７６−８８９，  ＢＣ  Ｄｅｃｋｅｒ，  Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ２０００）を参照されたい。遺伝子療法は、あらゆる腫瘍抑圧遺伝子を送達するために使用することができる。このような遺伝子の例には、ｐ５３（組換えウイルスを介した遺伝子導入によって送達することができる（例えば、米国特許第６，０６９，１３４号を参照。）。）、ｕＰＡ／ｕＰＡＲアンタゴニスト（“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  ｕＰＡ／ｕＰＡＲ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ，”Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｕｇｕｓｔ  １９９８；５（８）：１１０５−１３）」及びインターフェロンガンマ（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０００；１６４：２１７−２２２）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１４１】
本発明の化合物は、固有の多剤耐性（ＭＤＲ）、特に、輸送体タンパク質の高レベル発現を伴うＭＤＲの阻害剤と組み合わせて、投与することもできる。このようなＭＤＲ阻害剤には、ＬＹ３３５９７９、ＸＲ９５７６、ＯＣ１４４−０９３、Ｒ１０１９２２、ＶＸ８５３及びＰＳＣ８３３（ｖａｌｓｐｏｄａｒ）などの、ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）の阻害剤が含まれる。
【０１４２】
本発明の化合物は、単独で又は放射線療法とともに、本発明の化合物を使用することによって生じ得る悪心又は嘔吐（急性、遅延、晩発及び先行嘔吐を含む。）を治療するための制吐剤とともに使用し得る。嘔吐を予防又は治療する場合、本発明の化合物は、他の制吐剤、特に、ニューロキニン−１受容体アンタゴニスト、５ＨＴ３受容体アンタゴニスト（オンダンセトロン（ｏｎｄａｎｓｅｔｒｏｎ）、グラニセトロン（ｇｒａｎｉｓｅｔｒｏｎ）、トロピセトロン（ｔｒｏｐｉｓｅｔｒｏｎ）及びザチセトロン（ｚａｔｉｓｅｔｒｏｎ）など）、ＧＡＢＡＢ受容体アゴニスト（バクロフェンなど）、コルチコステロイド（Ｄｅｃａｄｒｏｎ（デキサメタゾンなど）、Ｋｅｎａｌｏｇ、Ａｒｉｓｔｏｃｏｒｔ、Ｎａｓａｌｉｄｅ、Ｐｒｅｆｅｒｉｄ、Ｂｅｎｅｃｏｒｔｅｎなど）又は米国特許第２，７８９，１１８号、第２，９９０，４０１号、第３，０４８，５８１号、第３，１２６，３７５号、第３，９２９，７６８号、第３，９９６，３５９号、第３，９２８，３２６号及び第３，７４９，７１２号に開示されているものなどこれら以外のもの、フェノチアジン（例えば、プロクロルペラジン、フルフェナジン、チオリダジン及びメソリダジン）などの抗ドーパミン作動薬、メトクロプラミド又はドロナビノールなど）とともに、使用し得る。別の実施形態では、本発明の化合物の投与時に生じ得る嘔吐を治療又は予防するために、ニューロキニン−１受容体アンタゴニスト、５ＨＴ３受容体アンタゴニスト及びコルチコステロイドから選択される制吐剤を用いた結合療法が開示される。
【０１４３】
本発明の化合物とともに使用するニューロキニン−１受容体アンタゴニストは、例えば、米国特許第５，１６２，３３９号、第５，２３２，９２９号、第５，２４２，９３０号、第５，３７３，００３号、第５，３８７，５９５号、第５，４５９，２７０号、第５，４９４，９２６号、第５，４９６，８３３号、第５，６３７，６９９号、第５，７１９，１４７号；欧州特許公開０  ３６０  ３９０、０  ３９４  ９８９、０  ４２８  ４３４、０  ４２９  ３６６、０  ４３０  ７７１、０  ４３６  ３３４、０  ４４３  １３２、０  ４８２  ５３９、０  ４９８  ０６９、０  ４９９  ３１３、０  ５１２  ９０１、０  ５１２  ９０２、０  ５１４  ２７３、０  ５１４  ２７４、０  ５１４  ２７５、０  ５１４  ２７６、０  ５１５  ６８１、０  ５１７  ５８９、０  ５２０  ５５５、０  ５２２  ８０８、０  ５２８  ４９５、０  ５３２  ４５６、０  ５３３  ２８０、０  ５３６  ８１７、０  ５４５  ４７８、０  ５５８  １５６、０  ５７７  ３９４、０  ５８５  ９１３、０  ５９０  １５２、０  ５９９  ５３８、０  ６１０  ７９３、０  ６３４  ４０２、０  ６８６  ６２９、０  ６９３  ４８９、０  ６９４  ５３５、０  ６９９  ６５５、０  ６９９  ６７４、０  ７０７  ００６、０  ７０８  １０１、０  ７０９  ３７５、０  ７０９  ３７６、０  ７１４  ８９１、０  ７２３  ９５９、０  ７３３  ６３２及び０  ７７６  ８９３；ＰＣＴ国際特許公開ＷＯ  ９０／０５５２５、９０／０５７２９、９１／０９８４４、９１／１８８９９、９２／０１６８８、９２／０６０７９、９２／１２１５１、９２／１５５８５、９２／１７４４９、９２／２０６６１、９２／２０６７６、９２／２１６７７、９２／２２５６９、９３／００３３０、９３／００３３１、９３／０１１５９、９３／０１１６５、９３／０１１６９、９３／０１１７０、９３／０６０９９、９３／０９１１６、９３／１００７３、９３／１４０８４、９３／１４１１３、９３／１８０２３、９３／１９０６４、９３／２１１５５、９３／２１１８１、９３／２３３８０、９３／２４４６５、９４／００４４０、９４／０１４０２、９４／０２４６１、９４／０２５９５、９４／０３４２９、９４／０３４４５、９４／０４４９４、９４／０４４９６、９４／０５６２５、９４／０７８４３、９４／０８９９７、９４／１０１６５、９４／１０１６７、９４／１０１６８、９４／１０１７０、９４／１１３６８、９４／１３６３９、９４／１３６６３、９４／１４７６７、９４／１５９０３、９４／１９３２０、９４／１９３２３、９４／２０５００、９４／２６７３５、９４／２６７４０、９４／２９３０９、９５／０２５９５、９５／０４０４０、９５／０４０４２、９５／０６６４５、９５／０７８８６、９５／０７９０８、９５／０８５４９、９５／１１８８０、９５／１４０１７、９５／１５３１１、９５／１６６７９、９５／１７３８２、９５／１８１２４、９５／１８１２９、９５／１９３４４、９５／２０５７５、９５／２１８１９、９５／２２５２５、９５／２３７９８、９５／２６３３８、９５／２８４１８、９５／３０６７４、９５／３０６８７、９５／３３７４４、９６／０５１８１、９６／０５１９３、９６／０５２０３、９６／０６０９４、９６／０７６���９、９６／１０５６２、９６／１６９３９、９６／１８６４３、９６／２０１９７、９６／２１６６１、９６／２９３０４、９６／２９３１７、９６／２９３２６、９６／２９３２８、９６／３１２１４、９６／３２３８５、９６／３７４８９、９７／０１５５３、９７／０１５５４、９７／０３０６６、９７／０８１４４、９７／１４６７１、９７／１７３６２、９７／１８２０６、９７／１９０８４、９７／１９９４２及び９７／２１７０２；並びに英国特許公開２  ２６６  ５２９、２  ２６８  ９３１、２  ２６９  １７０、２  ２６９  ５９０、２  ２７１  ７７４、２  ２９２  １４４、２  ２９３  １６８、２  ２９３  １６９及び２  ３０２  ６８９に完全に記載されている。このような化合物の調製は、参照により本明細書に組み込まれる、上記特許及び公報に完全に記載されている。
【０１４４】
一実施形態において、本発明の化合物とともに使用するためのニューロキニン−１受容体アンタゴニストは、米国特許第５，７１９，１４７号に記載されている２−（Ｒ）−（１−（Ｒ）−（３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル）エトキシ）−３−（Ｓ）−（４−フルオロフェニル）−４−（３−（５−オキソ−１Ｈ，４Ｈ−１，２，４−トリアゾロ）メチル）モルホリン、又は医薬として許容されるこれらの塩から選択される。
【０１４５】
本発明の化合物は、貧血の治療において有用な薬剤とともに投与することもできる。このような貧血治療剤は、例えば、継続的な赤血球生成（ｅｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ）受容体活性化因子（エポエチンαなど）である。
【０１４６】
本発明の化合物は、好中球減少症の治療において有用な薬剤とともに投与することもできる。このような好中球減少症治療剤は、例えば、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）などの好中球の産生及び機能を制御する造血性増殖因子である。Ｇ−ＣＳＦの例には、フィルグラスチムが含まれる。
【０１４７】
また、本発明の化合物は、レバミソール、イソプリノシン及びＺａｄａｘｉｎなどの、免疫増強薬とともに投与され得る。
【０１４８】
本発明の化合物は、ビスホスホナート（ビスホスホナート、ジホスホナート、ビスホスホン酸及びジホスホン酸を含むものと理解される。）とともに、骨癌を含む癌を治療又は予防するのにも有用であり得る。ビスホスホナートの例には、エチドロナート（Ｄｉｄｒｏｎｅｌ）、パミドロナート（Ａｒｅｄｉａ）、アレンドロナート（Ｆｏｓａｍａｘ）、リセドロナート（Ａｃｔｏｎｅｌ）、ゾレドロナート（Ｚｏｍｅｔａ）、イバンドロナート（Ｂｏｎｉｖａ）、インカドロナート又はシマドロナート、クロドロナート、ＥＢ−１０５３、ミノドロナート、ネリドロナート、ピリドロナート及びチルドロナート（医薬として許容される、これらの全ての塩、誘導体、水和物及び混合物が含まれる。）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１４９】
本発明の化合物は、アロマターゼ阻害剤と組み合わせて、乳癌を治療又は予防するためにも有用であり得る。アロマターゼ阻害剤の例には、アナストロゾール、レトロゾール及びエキセメスタンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５０】
本発明の化合物は、ｓｉＲＮＡ治療剤と組み合わせて、乳癌を治療又は予防するためにも有用であり得る。
【０１５１】
本発明の化合物は、γ−セクレターゼ阻害剤と組み合わせて、癌を治療又は予防するためにも有用であり得る。
【０１５２】
従って、本発明の範囲は、以下から選択される第二の化合物：エストロゲン受容体調節物質、アンドロゲン受容体調節物質、レチノイド受容体調節物質、細胞毒性／細胞増殖抑制剤、抗増殖剤、プレニル−タンパク質転移酵素阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、血管新生阻害剤、ＰＰＡＲ−γアゴニスト、ＰＰＡＲ−δアゴニスト、固有多剤耐性の阻害剤、制吐剤、貧血の治療に有用な薬剤、好中球減少症の治療に有用な薬剤、免疫増強薬、細胞増殖及び生存シグナル伝達の阻害剤、ビスホスホナート、アロマターゼ阻害剤、ｓｉＲＮＡ治療剤、γ−セクレターゼ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を妨害する薬剤並びに細胞周期チェックポイントを妨害する薬剤と組み合せた、本明細書の特許請求の範囲に記載された化合物の使用を包含する。
【０１５３】
本発明の化合物に関する「投与」及びその変形語（例えば、化合物を「投与する」）という用語は、化合物又は化合物のプロドラッグを、治療を必要としている動物の系内に導入することを意味する。本発明の化合物又はそのプロドラッグを、１つ又はそれ以上の他の活性剤（例えば、細胞毒性剤など）とともに与える場合、「投与」及びその変形語は、それぞれ、化合物又はそのプロドラッグと他の薬剤の同時導入及び順次導入を含むものと理解される。
【０１５４】
本明細書において使用される「組成物」という用語は、特定量の指定された成分を含む製品、及び、特定量の指定された成分の組合せから、直接又は間接的に得られる全ての製品を包含するものとする。
【０１５５】
本明細書において使用される「治療的有効量」という用語は、研究者、獣医、医師又はその他の臨床医によって求められている、組織、系、動物又はヒトでの生物的応答又は医薬的応答を惹起する活性化合物又は薬剤の量を意味する。
【０１５６】
「癌を治療する」又は「癌の治療」という用語は、癌性症状に罹患した哺乳動物に投与することを表し、並びに癌細胞を死滅させることによって癌性症状を緩和する効果に加えて、癌の増殖及び／又は転移の阻害をもたらす効果を表す。
【０１５７】
一実施形態において、第二の化合物として使用すべき血管新生阻害剤は、チロシンキナーゼ阻害剤、上皮由来増殖因子の阻害剤、繊維芽細胞由来増殖因子の阻害剤、血小板由来増殖因子の阻害剤、ＭＭＰ（マトリックスメタロプロテアーゼ）阻害剤、インテグリンブロッカー、インターフェロンα、インターロイキン１２、ペントサンポリサルファート、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、カルボキシアミドトリアゾール、コンブレタスタチンＡ−４、スクアラミン、６−Ｏ−クロロアセチル−カルボニル）−フマギロール、サリドマイド、アンギオスタチン、トロポニン−１、又はＶＥＧＦに対する抗体から選択される。一実施形態において、エストロゲン受容体調節物質は、タモキシフェン又はラロキシフェンである。
【０１５８】
同じく、特許請求の範囲に含まれるのは、放射線療法と組み合わせて、及び／又はエストロゲン受容体調節物質、アンドロゲン受容体調節物質、レチノイド受容体調節物質、細胞毒性／細胞増殖抑制剤、抗増殖剤、プレニル−タンパク質転移酵素阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、血管新生阻害剤、ＰＰＡＲ−γアゴニスト、ＰＰＡＲ−δアゴニスト、固有多剤耐性の阻害剤、制吐剤、貧血の治療に有用な薬剤、好中球減少症の治療に有用な薬剤、免疫増強薬、細胞増殖及び生存シグナル伝達の阻害剤、ビスホスホナート、アロマターゼ阻害剤、ｓｉＲＮＡ治療剤、γ−セクレターゼ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を妨害する薬剤並びに細胞周期チェックポイントを妨害する薬剤から選択される第二の化合物と組み合わせて、本発明の化合物の治療的有効量を投与することを含む、癌を治療する方法である。
【０１５９】
本発明のさらに別の実施形態は、パクリタキセル又はトラスツズマブと組み合わせて、本発明の化合物の治療的有効量を投与することを含む、癌を治療する方法である。
【０１６０】
本発明は、さらに、ＣＯＸ−２阻害剤と組み合わせて、本発明の化合物の治療的有効量を投与することを含む、癌を治療又は予防する方法を包含する。
【０１６１】
本発明は、本発明の化合物の治療的有効量と、エストロゲン受容体調節物質、アンドロゲン受容体調節物質、レチノイド受容体調節物質、細胞毒性／細胞増殖抑制剤、抗増殖剤、プレニル−タンパク質転移酵素阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、血管新生阻害剤、ＰＰＡＲ−γアゴニスト、ＰＰＡＲ−δアゴニスト、細胞増殖及び生存シグナル伝達の阻害剤、ビスホスホナート、アロマターゼ阻害剤、ｓｉＲＮＡ治療剤、γ−セクレターゼ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を妨害する薬剤並びに細胞周期チェックポイントを妨害する薬剤から選択される第二の化合物と、を含む、癌を治療又は予防するのに有用な医薬組成物も包含する。
【０１６２】
特定されている全ての特許、公報及び係属中の特許出願は、参照により、本明細書中に組み込まれる。以下の化学の記述及び実施例で使用した略号は、次のとおりである。ＡＥＢＳＦ（ｐ−アミノエチルベンゼンスルホニルフルオリド）；Ｂｏｃ２Ｏ（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボナート）；ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）；ＢｕＬｉ（ｎ−ブチルリチウム）；ＣＤＣｌ３（クロロホルム−ｄ）；ＣｕＩ（ヨウ化銅）；ＣｕＳＯ４（硫酸銅）；ＤＣＥ（ジクロロエタン又は１，２−ジクロロエタン）；ＤＣＭ（ジクロロメタン）；ＤＥＡＤ（アゾジカルボン酸ジエチル）；ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン）；ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）；ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）；ＤＴＴ（ジチオスレイトール）；ＥＤＴＡ（エチレン−ジアミン−四酢酸）；ＥＧＴＡ（エチレン−グリコール−四酢酸）；ＥｔＯＡｃ（酢酸エチル）；ＥｔＯＨ（エタノール）；ＨＯＡｃ（酢酸）；ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）；ＨＲＭＳ（高分解能質量分析）；ｉ−ＰｒＮＥｔ２（ヒューニッヒの塩基）；ＬＣＭＳ（液体クロマトグラフ−質量分析）；ＬＨＭＤＳ（リチウムビス（トリメチルシリル）アミド）；ＬＲＭＳ（低分解能質量分析）；ＭｅＯＨ（メタノール）；ｍＣＰＢＡ（３−クロロ過安息香酸）；ＭＰ−Ｂ（ＣＮ）Ｈ３（マクロ多孔性シアノ水素化ホウ素）；ＮａＨＣＯ３（重炭酸ナトリウム）；Ｎａ２ＳＯ４（硫酸ナトリウム）；Ｎａ（ＯＡｃ）３ＢＨ（トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム）；ＮＨ４ＯＡＣ（酢酸アンモニウム）；ＮＢＳ（Ｎ−ブロモスクシンアミノ）；ＮＩＳ（Ｎ−ヨードスクシンアミド）；ＮＭＰ（１−メチル−２−ピロリジノン）；ＮＭＲ（核磁気共鳴）；ＰＢＳ（リン酸緩衝化食塩水）；ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）；Ｐｄ（ｄｐｐｆ）（［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウム）；Ｐｄ（Ｐｈ３）４（パラジウム（Ｏ）テトラキス−トリフェニルホスフィン）；ＰＯＣｌ３（オキシ塩化リン）；ＰＳ−ＤＩＥＡ（ポリスチレンジイソプロピルエチルアミン）；ＰＳ−ＰＰｈ３（ポリスチレン−トリフェニルホスフィン）；ＰＴＳＡ（ｐ−トルエンスルホン酸）；ｐＴｓＯＨ（ｐ−トルエンスルホン酸）；ＰｙＣｌｕ（１−（クロロ−１−ピロリジニルメチレン）−ピロリジニウムヘキサフルオロホスファート）；ＲａＮｉ（ラネーニッケル）；Ｓｅｌｅｃｔｆｌｕｏｒ（１−クロロメチル−４−フルオロ−１，４−ジアゾニアビシクロ［２．２．２］オクタンビス（テトラフルオロボラート）；ＴＢＡＦ（テトラブチルアンモニウムフルオリド）；ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）；ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）；及びＴＭＳＣＨ２Ｎ２（トリメチルシリルジアゾメタン）。
【０１６３】
本発明の化合物は、文献において公知であり、又は実験操作において例示されている他の標準的な操作に加えて、以下の反応スキーム中に示されている反応を用いることによって調製され得る。従って、以下の例示的な反応スキームは、列記されている化合物によって、又は例示目的のために使用されている具体的なあらゆる置換基によって限定されない。反応スキーム中に示されている置換基の付番は、特許請求において使用されている付番と必ずしも呼応するものではなく、しばしば、明確にするために、本明細書中の上記式Ａの定義の下で場合により複数の置換基が許容される場合でも、単一の置換基が化合物に結合して示されている。
【０１６４】
本発明の化合物を生成するために用いた反応は、反応スキームＩ及びＩＩに示されている反応を利用することによって調製される。
【０１６５】
反応スキームの概要
反応スキームＩに示されているように、置換された環縮合のアミノ安息香酸は、エチルクロロアセタートと環化して、ベンゾオキサジノン（Ａ−１）を提供することができる。これらの潜在性求電子試薬は、置換されたメチルアセトアセタートのナトリウムアニオンと反応し、アクリラート（Ａ−２）を提供することが可能である。ナトリウムメキトシドの処理を行うと、アクリラート（Ａ−２）は、内部で環化及び脱カルボキシル化し、４−ヒドロキシキノリノン（Ａ−３）を提供できる。マイクロ波加熱下において、ピラゾロキノリノン（Ａ−４）をヒドラジン及び触媒性酸から形成できる。選択的保護がピラゾールの窒素上に生じ、Ｎ−ＢＯＣ−ピラゾロキノリノン（Ａ−５）を与え、これは、炭酸セシウムの存在下において、様々な臭化物によりアルキル化を行い、Ｎ−アルキル化された化合物（Ａ−６）を与えることが可能である。次いで、ＴＦＡでＢＯＣ基を除去し、完全に合成されたピラゾロキノリノン（Ａ−７）を得ることができる。
【０１６６】
或いは、反応スキームＩＩに示されているとおり、置換された環縮合アニリンをＮＩＳでヨウ化し、オルト置換されたヨードアニリン（Ｂ−１）を提供できる。ＰｙＣｌｕを使用した、Ｂ−１の、１−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸とのカップリング反応が、アミドＢ−２を提供し、これは、様々な求電子試薬でアルキル化されて、Ｂ−３を与えることができる。次いで、Ｂ−３のパラジウム触媒された環化は、Ｂ−４を与えることができ、ＴＦＡを用いた脱保護により、完全に合成されたピラゾロキノリノン（Ｂ−５）を得ることができる。
【０１６７】
反応スキームＩ
【０１６８】
【化２６】
2008526865.tif 000023
【０１６９】
反応スキームＩＩ
【０１７０】
【化２７】
2008526865.tif 000024
【０１７１】
実施例
提供されている実施例は、本発明を更に理解する補助を与えることを目的とする。使用されている具体的な物質、種及び条件は、本発明を更に例示するためのものであり、その合理的な範囲を限定することを意図したものではない。以下の表中に図示されている化合物を合成する際に使用される試薬は、市販されているか、又は当業者によって容易に調製される。
【０１７２】
スキームＩ
【０１７３】
【化２８】
2008526865.tif 000025
【０１７４】
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−９）
３−アミノ−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−カルボン酸（１−２）
９０℃にて、イソプロパノール：水１：１（４００ｍＬ）中の、活性化されたラネーニッケル（アルミニウム上における水中の５０％スラリー２００ｇ、７００ｍｍｏｌ、１３当量）及び３−アミノ−２−ナフトエ酸（１−１）（１０ｇ、５３ｍｍｏｌ、１当量）の混合物へ、１％ＮａＯＨ水溶液（２００ｍＬ）を１時間にわたり添加した。反応混合物を９０℃で１６時間攪拌し、追加のラネーニッケル（５０ｇ、１８０ｍｍｏｌ、３．４当量）を添加して、生じた混合物を９０℃で２４時間加熱した。混合物をろ過し、ろ液を水２００ｍＬまで濃縮して、１Ｎ塩酸水溶液を添加してｐＨ＝３にし、生成物を沈殿した。灰白色の沈殿物をろ過し、逆相液体クロマトグラフィーにより精製して（０．１％ＴＦＡが存在するＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ勾配）、３−アミノ−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−カルボン酸（１−２）を白い固体として生成した。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値１９２．２、理論値１９２．１。
【０１７５】
２−エトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−４Ｈ−ナフト［２，３−ｄ］［１，３］オキサジン−４−オン（１−３）
−１０℃で窒素下において、ピリジン（５０ｍＬ）中の３−アミノ−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−カルボン酸（１−２）（５．０ｇ、２６ｍｍｏｌ、１当量）の溶液へ、クロロギ酸エチル（１０ｍＬ、１１ｇ、１００ｍｍｏｌ、４．０当量）を１時間にわたり滴下した。生じた溶液を、−１０℃〜２３℃で、２０時間にわたって攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発し、１時間にわたって攪拌しながら、固体の残留物を水（１００ｍＬ）中に懸濁した。沈殿物をろ過し、水で洗浄して、乾燥させ、２−エトキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−４Ｈ−ナフト［２，３−ｄ］［１，３］オキサジン−４−オン（１−３）を黄色の固体として生成した。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値２４６．４、理論値２４６．１。
【０１７６】
メチル（２Ｚ）−２−アセチル−３−｛３−［（エトキシカルボニル）アミノ］−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル｝−３−ヒドロキシプロプ−２−エノアート（１−４）
窒素下において、無水ベンゼン（１００ｍＬ）中の水素化ナトリウム（９５％）（０．８０ｇ、３３ｍｍｏｌ、２．１当量）の分散液へ、アセト酢酸メチル（５．０ｍＬ、５．４ｇ、４６ｍｍｏｌ、２．９当量）を滴下し、生じた混合物を２３℃で１時間攪拌した。２−エトキシ−６，７，８．９−テトラヒドロ−４Ｈ−ナフト［２，３−ｄ］［１，３］オキサジン−４−オン（１−３）（３．８ｇ、１６ｍｍｏｌ、１当量）を添加し、反応混合物を２０時間攪拌した。過剰の水素化ナトリウムを水で反応停止し、有機層を分離して、水で３回抽出し、混合水層を濃塩酸溶液で酸性化した。生じた沈殿物をろ過し、乾燥させ、（２Ｚ）−２−アセチル−３−｛３−［（エトキシカルボニル）アミノ］−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル｝−３−ヒドロキシプロプ−２−エン酸メチル（１−４）を黄色の油状物として生成した。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値３６２．５、理論値３６２．２。
【０１７７】
３−アセチル−４−ヒドロキシ−６，７，８，９−テトラヒドロベンゾ［ｇ］キノリン−２（１Ｈ）−オン（１−５）
２３℃で、窒素下において、ベンゼン（１００ｍＬ）中の水素化ナトリウム（９５％）（０．７０ｇ、２９ｍｍｏｌ、２．６当量）の混合物へ、メタノール（２．５ｍＬ、２．０ｇ、６２ｍｍｏｌ、５．４当量）を１０分間にわたり滴下した。更に５分間攪拌した後、（２Ｚ）−２−アセチル−３−｛３−［（エトキシカルボニル）アミノ］−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル｝−３−ヒドロキシプロプ−２−エン酸メチル（１−４）（４．１ｇ、１１ｍｍｏｌ、１当量）を添加し、生じた混合物を７２℃で２０時間加熱した。溶媒を減圧下で蒸発し、固体の残留物を水（５０ｍＬ）中で３０分間懸濁し、続いて、攪拌しながら更に３０分間、１Ｎ塩酸水溶液（１００ｍＬ）で懸濁した。固体をろ過し、水（１００ｍＬ）及びヘキサン（１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ、３−アセチル−４−ヒドロキシ−６，７，８，９−テトラヒドロベンゾ［ｇ］キノリン−２（１Ｈ）−オン（１−５）を灰白色の固体として生成した。ＬＲＭＳｍ／ｚ実測値（Ｍ＋Ｈ）２５８．４、理論値２５８．１。
【０１７８】
３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−６）
ＤＭＡ（３０ｍＬ）中の、３−アセチル−４−ヒドロキシ−６，７，８，９−テトラヒドロベンゾ［ｇ］キノリン−２（１Ｈ）−オン（１−５）（２．０ｇ、７．８ｍｍｏｌ、１当量）、ヒドラジン（０．４０ｍＬ、０．４１ｇ、１３ｍｍｏｌ、１．６当量）及び触媒性濃塩酸溶液（２滴）の混合物を、窒素下において、１４０℃で１６時間加熱した。溶液を冷却し、水（３０ｍＬ）で希釈した。沈殿物をろ過し、ヘキサン（３×１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ、３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−６）を灰白色の固体として生成した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１３．５１（ｓ，１Ｈ），１０．９９（ｓ，１Ｈ），７．７０（ｓ，１Ｈ），７．０４（ｓ，１Ｈ），２．７８（ｍ，４Ｈ），２．５９（ｓ，３Ｈ），１．７６（ｍ，４Ｈ）。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値２５４．４、理論値２５４．１。
【０１７９】
ｔｅｒｔ−ブチル３−メチル−４−オキソ−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−２−カルボキシラート（１−７）
０℃で、窒素下において、ＤＭＦ（１２ｍＬ）中の、３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−６）（１．０ｇ、４．１ｍｍｏｌ、１当量）及びＢｏｃ２Ｏ（１．０ｇ、４．６ｍｍｏｌ、１．１当量）の溶液へ、ＤＭＡＰ（１０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、０．０２当量）を添加し、生じた溶液を１６時間攪拌した。追加のＢｏｃ２Ｏ（１００ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ、０．１１当量）を添加し、反応混合物を２３℃で２４時間攪拌した。減圧下で溶媒を蒸発し、ジエチルエーテル（３×７５ｍＬ）で固体を洗浄して、乾燥させ、ｔｅｒｔ−ブチル３−メチル−４−オキソ−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−２−カルボキシラート（１−７）を白い固体として生成した。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値３５４．４、理論値３５３．２。
【０１８０】
ｔｅｒｔ−ブチル５−｛３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］プロピル｝−３−メチル−４−オキソ−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−２−カルボキシラート（１−８）
ＤＭＦ（７ｍＬ）中の、３−メチル−４−オキソ−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−２−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１−７）（０．３０ｇ、０．８５ｍｍｏｌ、１当量）及び炭酸セシウム（１．４ｇ、５．０ｍｍｏｌ、５．１当量）の混合物へ、Ｎ−（３−ブロモプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（０．６０ｇ、２．５ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加し、生じた混合物を２３℃で２時間攪拌した。追加のアルキル化剤（０．６０ｇ、２．５ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加し、生じた混合物を２３℃で更に２時間攪拌した。反応混合物をろ過し、ろ液を逆相液体クロマトグラフィーによって精製し（０．０５％ＮＨ４ＯＨが存在するＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ勾配）、ｔｅｒｔ−ブチル５−｛３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］プロピル｝−３−メチル−４−オキソ−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−２−カルボキシラート（１−８）を白い固体として生成した。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値５１１．７、理論値５１１．３。
【０１８１】
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−９）
ジクロロメタン（６ｍＬ）中の、５−｛３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］プロピル｝−３−メチル−４−オキソ−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−２−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１−８）（０．１１ｇ、０．２８ｍｍｏｌ、１当量）及びトリフルオロ酢酸（３ｍＬ）の溶液を、２３℃で１．５時間攪拌した。減圧下で溶媒を蒸発し、逆相液体クロマトグラフィーによって残留物を精製し（０．０５％ＮＨ４ＯＨが存在するＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ勾配）、続いて逆相液体クロマトグラフィーにより２回目の精製を行って（０．１０％ＴＦＡが存在するＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ勾配）、５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−９）のＴＦＡ塩を白い固体として生成した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ７．８２（ｓ，１Ｈ），７．２９（ｓ，１Ｈ），４．５４（ｔ，２Ｈ），２．９９（ｍ，４Ｈ），２．９０（ｍ，２Ｈ），２．６６（ｓ，３Ｈ），２．１５（ｔ，２Ｈ），１．８８（ｍ，４Ｈ）。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値３１１．５、理論値３１１．２。
【０１８２】
上記のとおり、３−アミノ−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−カルボン酸（１−２）の代わりに適切なアントラニル酸を使用することにより、化合物（１−１０）を調製した。上記のとおり、Ｎ−（３−ブロモプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの代わりに適切な求電子試薬を使用することにより、化合物（１−１１）を調製した。
【０１８３】
【表１】
2008526865.tif 000026
【０１８４】
スキーム２
【０１８５】
【化２９】
2008526865.tif 000027
【０１８６】
５−［３−（ベンジルアミノ）プロピル］−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（２−１）及び５−［３−（ジベンジルアミノ）プロピル］−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（２−２）
ジクロロメタン（５ｍＬ）中の、５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−９）（０．１０ｇ、０．３２ｍｍｏｌ、１当量）、トリアセトキシホウ水素化ナトリウム（０．２０ｇ、０．９４ｍｍｏｌ、２．９当量）、酢酸（０．０６ｇ、１．０ｍｍｏｌ、３．１当量）及びベンズアルデヒド（０．１０ｇ、０．９４ｍｍｏｌ、２．９当量）の混合物を、窒素下において、２３℃で２時間攪拌した。混合物をろ過し、ろ液を濃縮して、逆相液体クロマトグラフィーによって精製し（０．１％ＴＦＡが存在するＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ勾配）、５−［３−（ベンジルアミノ）プロピル］−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（２−１）及び５−［３−（ジベンジルアミノ）プロピル］−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（２−２）を白い固体として生成した。１Ｈ  ＮＭＲ（２−１）（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ７．７５（ｓ，１Ｈ），７．５２−７．４３（ｍ，５Ｈ），７．２２（ｓ，１Ｈ），４．４２（ｔ，２Ｈ），４．１９（ｓ，２Ｈ），３．０７（ｔ，２Ｈ），２．９３（ｍ，４Ｈ），２．６６（ｓ，３Ｈ），２．２１（ｔ，２Ｈ），１．８７（ｍ，４Ｈ）。ＬＲＭＳ（２−１）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値４０１．３、理論値４０１．２。
【０１８７】
１Ｈ  ＮＭＲ（２−２）（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ７．７８（ｓ，１Ｈ），７．４０−７．３２（ｍ，１０Ｈ），７．１８（ｓ，１Ｈ），４．３６（ｓ，４Ｈ），４．３２（ｍ，２Ｈ），３．１４（ｔ，２Ｈ），２．９１（ｍ，４Ｈ），２．６４（ｓ，３Ｈ），２．３０（ｍ，２Ｈ），１．８８（ｍ，４Ｈ）。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値４９１．３、理論値４９１．３。
上記のとおり、適切なアルデヒドを使用することによって、表２中の次の化合物を調製した。
【０１８８】
【表２】
2008526865.tif 000028
2008526865.tif 000029
【０１８９】
スキーム３
【０１９０】
【化３０】
2008526865.tif 000030
【０１９１】
ｔｅｒｔ−ブチル３−メチル−５−（オキシラン−２−イルメチル）−４−オキソ−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−２−カルボキシラート（３−１）
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の、３−メチル−４−オキソ−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−２−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１−７）（０．０５ｇ、０．１４ｍｍｏｌ、１当量）及び炭酸セシウム（０．２０ｇ、０６１ｍｍｏｌ、４．４当量）の混合物へ、エピブロモヒドリン（０．１０ｇ、０．７３ｍｍｏｌ、５．２当量）を添加し、窒素下において、生じた混合物を２３℃で攪拌した。１６時間後、混合物をろ過し、ろ液を逆相液体クロマトグラフィーによって精製し（０．１％ＴＦＡが存在するＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ勾配）、ｔｅｒｔ−ブチル３−メチル−５−（オキシラン−２−イルメチル）−４−オキソ−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−２−カルボキシラート（３−１）を白い固体として生成した。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値３１０．３、理論値３１０．２。
【０１９２】
５−（３−アジド−２−ヒドロキシプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（３−２）
酢酸（３ｍＬ）中の３−メチル−５−（オキシラン−２−イルメチル）−４−オキソ−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−２−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３−１）（０．０４０ｇ、０．１３ｍｍｏｌ、１当量）の溶液へ、水（０．２５ｍＬ）中のアジ化ナトリウム（０．０５０ｇ、０．７７ｍｍｏｌ、５．９当量）を添加し、生じた溶液を６５℃で４時間加熱した。反応混合物を冷却し、次いで逆相液体クロマトグラフィーにより精製し（０．１％ＴＦＡが存在するＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ勾配）、５−（３−アジド−２−ヒドロキシプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（３−２）を白い固体として生成した。ＬＲＭＳｍ／ｚ実測値（Ｍ＋Ｈ）３５３．２、理論値３５３．２。
【０１９３】
５−（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（３−３）
エタノール（１０ｍＬ）中の、５−（３−アジド−２−ヒドロキシプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（３−２）（０．０１ｇ、０．０３ｍｍｏｌ、１当量）及び炭素上の１０％パラジウム（２０ｍｇ）の混合物を、水素バルーン下において、２３℃で３時間攪拌した。生じた懸濁液をろ過し、ろ液を濃縮して、逆相液体クロマトグラフィーにより精製し（０．０５％ＮＨ４ＯＨが存在するＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ勾配）、５−（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（３−３）を白い固体として生成した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ７．８２（ｓ，１Ｈ），７．２９（ｓ，１Ｈ），４．６７（ｍ，１Ｈ），４．４８（ｍ，１Ｈ），３．８５（ｍ，１Ｈ），３．７５（ｍ，１Ｈ），３．６６（ｍ，１Ｈ），３．３５（ｓ，１Ｈ），２．９２（ｍ，４Ｈ），２．６６（ｓ，３Ｈ），１．８７（ｍ，４Ｈ）。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値３２７．２、理論値３２７．２が要求された。
【０１９４】
スキーム４
【０１９５】
【化３１】
2008526865.tif 000031
【０１９６】
２−ベンジル−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（４−１）
窒素下において、ＤＭＦ（１００ｍＬ）中の、３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（１−６）（１０．２ｇ、４０．３ｍｍｏｌ、１当量）及び炭酸カリウム（３０．０ｇ、２１７ｍｍｏｌ、５．３８当量）の混合物へ、臭化ベンジル（３５．０ｇ、２０５ｍｍｏｌ、５．０９当量）を添加し、生じた混合物を２３℃で１６時間攪拌した。反応混合物をろ過し、ろ過した固体をエーテル（３×２００ｍＬ）で洗浄し、続いて水（３×２５０ｍＬ）で洗浄して、乾燥させ、２−ベンジル−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（４−１）を白い固体として生成した。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値３４４．２、理論値３４４．２。
【０１９７】
ｔｅｒｔ−ブチル３−（２−ベンジル−３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）プロピルカルバマート（４−２）
ＤＭＦ（２５ｍＬ）中の、２−ベンジル−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（４−１）（１．０７ｇ、３．１２ｍｍｏｌ、１当量）及び炭酸セシウム（５．００ｇ、１５．４ｍｍｏｌ、４．９４当量）の混合物へ、Ｎ−（３−ブロモプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２．００ｇ、８．４０ｍｍｏｌ、２．６９当量）を添加し、反応混合物を２３℃で１６時間攪拌した。混合物をろ過し、ろ液を濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製し（１時間にわたり、１００％ヘキサン−１００％酢酸エチル）、ｔｅｒｔ−ブチル３−（２−ベンジル−３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−ヘキサヒドロ−５−イル）プロピルカルバマート（４−２）を白い固体として生成した。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値５０１．３、理論値５０１．３。
【０１９８】
５−（３−アミノプロピル）−２−ベンジル−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（４−３）
ジクロロメタン（１０ｍＬ）及びトリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）中の３−（２−ベンジル−３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）プロピルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（４−２）（１．１６ｇ、２．３２ｍｍｏｌ、１当量）の溶液を、２３℃で１６時間攪拌した。溶液を濃縮し、５−（３−アミノプロピル）−２−ベンジル−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（４−３）のＴＦＡ塩を白い固体として生成した。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値４０１．２、理論値４０１．２。
【０１９９】
Ｎ−［３−（２−ベンジル−３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）プロピル］メタンスルホンアミド（４−４）
ＤＭＦ（４ｍＬ）中の５−（３−アミノプロピル）−２−ベンジル−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（４−３）（０．２０ｇ、０．５０ｍｍｏｌ、１当量）の溶液へ、ｉ−ＰｒＮＥｔ２（１ｍＬ、０．７３ｇ、５．６ｍｍｏｌ、１１当量）を添加し、続いて塩化メタンスルホニル（０．３０ｇ、２．６ｍｍｏｌ、５．２当量）を添加して、生じた溶液を２３℃で４時間攪拌した。逆相液体クロマトグラフィーによって溶液を精製し（０．０５％ＮＨ４ＯＨが存在するＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ勾配）、Ｎ−［３−（２−ベンジル−３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）プロピル］メタンスルホンアミド（４−４）を白い固体として生成した。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値４７９．２、理論値４７９．２。
【０２００】
Ｎ−［３−（３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）プロピル］メタンスルホンアミド（４−５）
ＤＭＦ（１０ｍＬ）及びメタノール（１０ｍＬ）中の、Ｎ−［３−（２−ベンジル−３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）プロピル］メタンスルホンアミド（４−４）（０．０７５ｇ、０．１６ｍｍｏｌ、１当量）及び炭素上の１０％パラジウム（１００ｍｇ）の混合物を、水素バルーン下において、２３℃で７２時間攪拌した。反応混合物をろ過し、ろ液を濃縮した。逆相液体クロマトグラフィーによって残留物を精製し（０．１％ＴＦＡが存在するＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ勾配）、Ｎ−［３−（３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）プロピル］メタンスルホンアミド（４−５）を白い固体として生成した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．８０（ｓ，１Ｈ），７．２９（ｓ，１Ｈ），７．０９（ｔ，２Ｈ），４．２５（ｔ，２Ｈ），３．０６（ｍ，２Ｈ），２．９２（ｓ，３Ｈ），２．８９（ｍ，４Ｈ），２．５４（ｓ，３Ｈ），１．８２（ｍ，２Ｈ），１．７９（ｍ，４Ｈ）。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値３８９．２、理論値３８９．２。
【０２０１】
上記のとおり、（４−４）の塩化メタンスルホニルの代わりに適切な求電子試薬を使用することによって、表３中の次の化合物を調製した。
【０２０２】
【表３】
2008526865.tif 000032
【０２０３】
スキーム５
【０２０４】
【化３２】
2008526865.tif 000033
【０２０５】
メチル（３Ｅ）−３−［（アミノカルボニル）ヒドラゾノ］ブタノアート（５−２）
水（１０００ｍＬ）中の、塩酸セミカルバジド（５１．０ｇ、４５７ｍｍｏｌ、１．０６当量）、アセト酢酸メチル（５０．０ｇ、４３１ｍｍｏｌ、１当量）及び酢酸カリウム（４５．０ｇ、４５８ｍｍｏｌ、１．０６当量）の溶液を、５０℃で１５分間攪拌し、次いで２３℃で１時間放置した。生じた沈殿物をろ過し、ろ過した固体を冷水（３×１００ｍＬ）で洗浄して、乾燥させ、（３Ｅ）−３−［（アミノカルボニル）ヒドラゾノ］ブタン酸メチル（５−２）を白い固体として生成した。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値１７４．１、理論値１７４．１。
【０２０６】
メチル３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキシラート（５−３）
ジクロロメタン（１００ｍＬ）中の、（３Ｅ）−３−［（アミノカルボニル）ヒドラゾノ］ブタン酸メチル（５−２）（１４．０ｇ、８０．８ｍｍｏｌ、１当量）及び（クロロメチレン）ジメチルイミニウムクロリド（５１．０ｇ、４５７ｍｍｏｌ、１．０６当量）の混合物を、ジクロロメタンを留去しながら、７０℃で一晩加熱した。残留油状物を飽和酢酸ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）で希釈し、溶液をクロロホルム（２×２００ｍＬ）で抽出した。混合有機抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮し、メチル３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキシラート（５−３）をオレンジ色のゴム状物として生成した。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値１４０．９、理論値１４１．１。
【０２０７】
３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸（５−４）
水（１００ｍＬ）及びアセトニトリル（２０ｍＬ）中の、３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸メチル（５−３）（１１．３ｇ、８０．６ｍｍｏｌ、１当量）及び水酸化ナトリウム（７．００ｇ、１７５ｍｍｏｌ、２．１７当量）の混合物を、６５℃で５時間攪拌した。溶液を冷却し、濃塩酸溶液を用いてｐＨ３−４に酸性化し、酢酸エチル（３×２５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、濃縮して、３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸（５−４）
を黄色の固体として生成した。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値１２６．７、理論値１２７．０。
【０２０８】
３−メチル−１−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸（５−５）
酢酸エチル（１５０ｍＬ）及びＤＭＦ（１５ｍＬ）中の、３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸（５−４）（３．３ｇ、２６ｍｍｏｌ、１当量）、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（４．５ｇ、５４ｍｍｏｌ、２．０当量）及びｐ−トルエンスルホン酸（０．５０ｇ、２．９ｍｍｏｌ、０．１１当量）の溶液を、２３℃で５時間攪拌した。溶液を濃縮し、残留油状物を、酢酸エチル（１００ｍＬ）及び炭酸ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）中に採取した。水層を分離し、酢酸を用いてｐＨ＝５に酸性化し、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過し、濃縮して、３−メチル−１−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸（５−５）を黄色の固体として生成した。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値２１１．２、理論値２１１．１。
【０２０９】
スキーム６
【０２１０】
【化３３】
2008526865.tif 000034
【０２１１】
７−ニトロ−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−オール（６−２）
ＥｔＯＨ（８５０ｍＬ）中の７−ニトロ−１−テトラロン（６−１）（４２ｇ、２２０ｍｍｏｌ、１当量）の溶液へ、水素化ホウ素ナトリウム（８．１ｇ、２１０ｍｍｏｌ、０．９７当量）を少量ずつ添加し、生じた混合物を、２３℃で３時間攪拌した。溶媒を濃縮し、水（５００ｍＬ）で希釈した。３Ｎ塩酸水溶液を添加して、溶液をｐＨ＝７にし、水層をジエチルエーテル（２×５００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物を水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮し、茶色の固体を生成した。固体をエタノール／水から再結晶化し、７−ニトロ−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−オール（６−２）を茶色の固体として生成した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．３５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２Ｈｚ），８．０３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，８．５Ｈｚ），７．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ），４．８４（ｍ，１Ｈ），２．９５−２．７９（ｍ，２Ｈ），２．１３−１．８７（ｍ，６Ｈ）。
【０２１２】
６−ニトロ−１，２−ジヒドロナフタレン（６−３）
ベンゼン（８００ｍＬ）中の、７−ニトロ−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−オール（６−２）（３１ｇ、１６０ｍｍｏｌ、１当量）及びＡｍｂｅｒｌｙｓｔ１５樹脂（４０ｇ）の混合物を、２時間加熱還流した。溶液を冷却し、ろ過して、ろ液を濃縮し、６−ニトロ−１，２−ジヒドロナフタレン（６−３）を黄色の油状物として生成した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．９８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，５．５Ｈｚ），７．８６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．２４（ｍ，１Ｈ），６．５３（ｍ，１Ｈ），６．２０（ｍ，１Ｈ），２．８９（ｍ，２Ｈ），２．４０−２．３６（ｍ，２Ｈ）。
【０２１３】
６−ニトロ−１ａ，２，３，７ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｂ］オキシレン（６−４）
ＣＨＣｌ３（４００ｍＬ）中の、６−ニトロ−１，２−ジヒドロナフタレン（６−３）（１８．２ｇ、１０４ｍｍｏｌ、１当量）及びｍＣＰＢＡ（７５％３０．０ｇ、１３１ｍｍｏｌ、１．２６当量）の溶液を、２時間加熱還流した。反応混合物を０℃に冷却し、残留物をろ別した。ろ液を濃縮し、ジクロロメタン（４００ｍＬ）中で溶解し、生じた溶液をシリカのパッドを通して、濃縮し、ヘキサンから再結晶化して黄色っぽい固体を生成し、６−ニトロ−１ａ，２，３，７ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｂ］オキシレン（６−４）を白い固体として生成した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．２８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．５Ｈｚ），８．１２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，８．５Ｈｚ），７．２６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），３．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．５Ｈｚ），３．７９（ｍ，１Ｈ），２．８９−２．７０（ｍ，１Ｈ），２．６６（ｍ，１Ｈ），２．５０（ｍ，１Ｈ），１．８４−１．７７（ｍ，１Ｈ）。
【０２１４】
７−ニトロ−３，４−ジヒドロナフタレン−２（１Ｈ）−オン（６−５）
窒素下において、ベンゼン（１２５ｍＬ）中の、６−ニトロ−１ａ，２，３，７ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｂ］オキシレン（６−４）（１２．５ｇ、６５．４ｍｍｏｌ、２．１７当量）及びヨウ化亜鉛（９．５ｇ、３０ｍｍｏｌ、１当量）の混合物を、暗闇において、２３℃で２０時間攪拌した。混合物をろ過し、ろ液を濃縮して、黄色の残留物を得た。残留物をエタノール中で懸濁し、沈殿物をろ過により収集し、７−ニトロ−３，４−ジヒドロナフタレン−２（１Ｈ）−オン（６−５）を黄色の固体として生成した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．１０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，８．０Ｈｚ），８．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），７．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．６９（ｓ，１Ｈ），３．１８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），２．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）。
【０２１５】
７−ニトロ−３，４−ジヒドロナフタレン−２（１Ｈ）−オンのエチレンケタール（６−６）
ＴＨＦ（２００ｍＬ）中の、７−ニトロ−３，４−ジヒドロナフタレン−２（１Ｈ）−オン（６−５）（３．３０ｇ、１７．３ｍｍｏｌ、１当量）、ｐ−トルエンスルホン酸（０．２４ｇ、１．４ｍｍｏｌ、０．０８１当量）及びエチレングリコール（６１．０ｇ、９８３ｍｍｏｌ、５７．０当量）の溶液を、１６時間加熱還流した。溶液を冷却し、水（５００ｍＬ）で希釈して、ＣＨＣｌ３（３×３００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物を水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮し、７−ニトロ−３，４−ジヒドロナフタレン−２（１Ｈ）−オンのエチレンケタール（６−６）を黄色の固体として生成した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．９６（ｍ，２Ｈ），７．２７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），４．０７−４．０２（ｍ，４Ｈ），３．０９（ｍ，４Ｈ），２．０１（ｍ，２Ｈ）。
【０２１６】
７−アミノ−３，４−ジヒドロナフタレン−２（１Ｈ）−オンのエチレンケタール（６−７）
エタノール（２５０ｍＬ）中の、７−ニトロ−３，４−ジヒドロナフタレン−２（１Ｈ）−オンのエチレンケタール（６−６）（３．９０ｇ、１６．６ｍｍｏｌ、１当量）及び炭素上の１０％パラジウム（３．０ｇ）の混合物を、水素バルーン下において、７２時間攪拌した。セライトを通して、生じた懸濁液をろ過し、ろ液を濃縮して、暗色の油状物を生成した。ヘキサン層下において、油状物を凝固するまで放置した。沈殿物をろ過し、７−アミノ−３，４−ジヒドロナフタレン−２（１Ｈ）−オンのエチレンケタール（６−７）を灰色の固体として生成した。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値２０６．２、理論値２０６．１。
【０２１７】
７−アミノ−６−ヨード−３，４−ジヒドロナフタレン−２（１Ｈ）−オンのエチレンケタール（６−８）
ＤＭＦ（３０ｍＬ）中の、７−アミノ−３，４−ジヒドロナフタレン−２（１Ｈ）−オンのエチレンケタール（６−７）（２．３０ｇ、１１．２ｍｍｏｌ、１当量）及びＮ−ヨードスクシンイミド（２．６０ｇ、１１．６ｍｍｏｌ、１．０３当量）の溶液を、窒素下にて、２３℃で６時間攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発し、シリカゲルクロマトグラフィーにより残留物を精製し（１時間にわたり、１００％ヘキサン−１００％酢酸エチル）、７−アミノ−６−ヨード−３，４−ジヒドロナフタレン−２（１Ｈ）−オンのエチレンケタール（６−８）を黄色の油状物として生成した。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値３３２．１、理論値３３２．０。
【０２１８】
Ｎ−（３−ヨード−７−オキソ−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル）−３−メチル−１−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミドのエチレンケタール（６−９）
ジクロロメタン（１５ｍＬ）中の、７−アミノ−６−ヨード−３，４−ジヒドロナフタレン−２（１Ｈ）−オンのエチレンケタール（６−８）（０．２ｇ、０．６ｍｍｏｌ、１当量）、（５−５）（０．２５ｇ、１．２ｍｍｏｌ、２．０当量）、ＰｙＣｌｕ（０．４０ｇ、１．２ｍｍｏｌ、２．０当量）及びヒューニッヒ塩基（０．３２ｇ、２．５ｍｍｏｌ、４．１当量）の混合物を、密閉した管内にて、５５℃で１６時間加熱した。シリカゲルクロマトグラフィーにより反応混合物を精製し（１時間にわたり、１００％ヘキサン−１００％酢酸エチル）、Ｎ−（３−ヨード−７−オキソ−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル）−３−メチル−１−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミドのエチレンケタール（６−９）を白い固体として生成した。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値５２４．２、理論値５２４．２。
【０２１９】
ｔｅｒｔ−ブチル３−｛（３−ヨード−７−オキソ−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル）［（３−メチル−１−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）カルボニル］アミノ｝プロピルカルバマートのエチレンケタール（６−１０）
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の、Ｎ−（３−ヨード−７−オキソ−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル）−３−メチル−１−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミドのエチレンケタール（６−９）（０．３０ｇ、０．５７ｍｍｏｌ、１当量）、炭酸セシウム（１．０ｇ、３．１ｍｍｏｌ、５．３当量）及びＮ−（３−ブロモプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（０．６０ｇ、２．５ｍｍｏｌ、４．４当量）の混合物を、窒素下において、２３℃で１６時間攪拌した。反応混合物をろ過し、逆相液体クロマトグラフィーによりろ液を精製して（０．０５％ＮＨ４ＯＨを伴うＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ勾配が存在）、ｔｅｒｔ−ブチル３−｛（３−ヨード−７−オキソ−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル）［（３−メチル−１−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）カルボニル］アミノ｝プロピルカルバマートのエチレンケタール（６−１０）を白い固体として生成した。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値６８１．３、理論値６８１．２。
【０２２０】
ｔｅｒｔ−ブチル３−（３−メチル−４，８−ジオキソ−２−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ―ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）プロピルカルバマートのエチレンケタール（６−１１）
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の、ｔｅｒｔ−ブチル３−｛（３−ヨード−７−オキソ−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル）［（３−メチル−１−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）カルボニル］アミノ｝プロピルカルバマートのエチレンケタール（６−１０）（０．１８ｇ、０．２７ｍｍｏｌ、１当量）、酢酸カリウム（０．１５ｇ、１．５ｍｍｏｌ、５．６当量）、塩化テトラエチルアンモニウム（０．０７０ｇ、０．４２ｍｍｏｌ、１．５当量）及び酢酸パラジウム（０．０３０ｇ、０．１３ｍｍｏｌ、０．４９当量）の混合物を、窒素下において、９０℃で１２時間加熱した。生じた懸濁液をろ過し、逆相液体クロマトグラフィーによりろ液を精製し（０．０５％ＮＨ４ＯＨが存在するＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ勾配）、ｔｅｒｔ−ブチル３−（３−メチル−４，８−ジオキソ−２−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）プロピルカルバマートのエチレンケタール（６−１１）を白い固体として生成した。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値５５３．４、理論値５５３．３。
【０２２１】
５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−９，１０−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４，８［５Ｈ，７Ｈ］−ジオン（６−１２）
ジクロロメタン（５ｍＬ）中の、ｔｅｒｔ−ブチル３−（３−メチル−４，８−ジオキソ−２−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ―ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）プロピルカルバマートのエチレンケタール（６−１１）（０．０７５ｇ、０．１４ｍｍｏｌ、１当量）及びトリフルオロ酢酸（５ｍＬ）の溶液を、２３℃で２．５時間攪拌した。溶媒を濃縮し、５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−９，１０−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４，８［５Ｈ，７Ｈ］−ジオン（６−１２）を白い固体として生成した。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値３２５．３、理論値３２５．２。
【０２２２】
５−（３−アミノプロピル）−８−ヒドロキシ−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（６−１３）
エタノール（５ｍＬ）中の５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−９，１０−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４，８［５Ｈ，７Ｈ］−ジオン（６−１２）（０．０１２ｇ、０．０３７ｍｍｏｌ、１当量）の溶液へ、水素化ホウ素ナトリウム（０．０１５ｇ、０．４０ｍｍｏｌ、１１当量）を添加し、生じた混合物を２３℃で１時間攪拌した。混合物をろ過し、ろ液を濃縮して、逆相液体クロマトグラフィーにより精製し（０．１０％ＴＦＡが存在するＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ勾配）、５−（３−アミノプロピル）−８−ヒドロキシ−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（６−１３）を白い固体として生成した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ７．８４（ｓ，１Ｈ），７．３０（ｓ，１Ｈ），４．５４（ｍ，２Ｈ），４．１４（ｍ，１Ｈ），３．２３（ｍ，１Ｈ），３．１０（ｍ，１Ｈ），３．００−２．８６（ｍ，５Ｈ），２．６５（ｍ，２Ｈ），２．１５（ｍ，３Ｈ），２．１１（ｍ，１Ｈ）。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値３２７．３、理論値３２７．２。
【０２２３】
上記のとおり、７−アミノ−３，４−ジヒドロナフタレン−２（１Ｈ）−オンのエチレンケタール（６−７）の代わりに適切なアニリンを使用することにより、表４中の次の化合物を調製した。
【０２２４】
【表４】
2008526865.tif 000035
【０２２５】
スキーム７
【０２２６】
【化３４】
2008526865.tif 000036
【０２２７】
２−［２−メトキシ−１−（メトキシカルボニル）−２−オキソエチル］−４−ニトロ安息香酸（７−２）
ナトリウムメトキシド（１２．９ｇ、２３８ｍｍｏｌ、２．４０当量）を、マロン酸ジメチル（１１３ｍＬ、９９２ｍｍｏｌ、２０当量）中の、２−クロロ−４−ニトロ安息香酸（７−１、１０．０ｇ、４９．６ｍｍｏｌ、１当量）及び臭化銅（Ｉ）（７１２ｍｇ、４．９６ｍｍｏｌ、０．１００当量）のスラリーへ慎重に添加した。生じた反応混合物を、２３℃で１５分間攪拌し、次に激しく攪拌しながら７０℃で７２時間加熱した。反応混合物を２３℃に冷まし、その後、水（１１５ｍＬ）及びヘキサン（１１５ｍＬ）で希釈した。水層を分離し、トルエン（１１５ｍＬ）と混合した。セライトを通して二層混合物をろ過し、水層を分離した。ヘキサン（１１５ｍＬ）及びトルエン（１１５ｍＬ）で、水層を洗浄し、次いでトルエン（２００ｍｌ）と混合した。生じた二層混合物を、６ＮのＨＣｌ水溶液でｐＨ１に酸性化した。生じた沈殿物をろ過により収集し、トルエン（３００ｍＬ）で洗浄して、続いてヘキサン（３００ｍＬ）で洗浄し、２−［２−メトキシ−１−（メトキシカルボニル）−２−オキソエチル］−４−ニトロ安息香酸（７−２）を白い沈殿物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ）δ８．３１（ｄｄ，１Ｈ，ｄ＝８．６，２．１Ｈｚ），８．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１Ｈｚ），８．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），５．８３（ｓ，１Ｈ），３．７１（ｓ，６Ｈ）。
【０２２８】
２−（カルボキシメチル）−４−ニトロ安息香酸（７−３）
水酸化ナトリウム水溶液（２Ｍ、６０ｍＬ）を、メタノール（６０ｍＬ）中の２−［２−メトキシ−１−（メトキシカルボニル）−２−オキソエチル］−４−ニトロ安息香酸（７−２、７．００ｇ、２３．６ｍｍｏｌ、１当量）の溶液へ、２３℃で１時間にわたり滴下した。生じた深紅色の反応混合物を、２３℃で２０時間攪拌した。混合物を部分的に濃縮してＭｅＯＨを除去し、残りの水溶液を、濃ＨＣｌ水溶液でｐＨ約１に酸性化した。生じた白い固体のスラリーを、酢酸エチル（２×７５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。最少量の酢酸エチル中に残留物を溶解し、６５℃で３時間加熱した。次いで、混合物を２３℃に冷まし、生じた沈殿物をろ過により収集し、乾燥させ、２−（カルボキシメチル）−４−ニトロ安息香酸（７−３）を白い固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ）δ１３．５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），１２．５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．２８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１Ｈｚ），８．２１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６，２．１Ｈｚ），８．１０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），４．１０（ｓ，２Ｈ）。
【０２２９】
２−［２−（ヒドロキシメチル）−５−ニトロフェニル］エタノール（７−４）
テトラヒドロフラン（２５ｍＬ）中の三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート（６．８０ｍＬ、５３．７ｍｍｏｌ、３．０２当量）の溶液を、０℃にて、１時間にわたり、テトラヒドロフラン（９０ｍＬ）中の、２−（カルボキシメチル）−４−ニトロ安息香酸（７−３、４．００ｇ、１７．８ｍｍｏｌ、１当量）及び水素化ホウ素ナトリウム（２．０２ｇ、５３．３ｍｍｏｌ、３．００当量）の溶液へ、カニューレを通して少量ずつ添加した。生じた濁白色の懸濁液を２３℃に温め、２０時間攪拌した。水酸化ナトリウム（１Ｎ）の水溶液を、前もって冷却した（０℃）反応混合物へ慎重に添加した。混合物を部分的に濃縮してＴＨＦを除去し、生じた沈殿物をろ過により収集し、乾燥させ、２−［２−（ヒドロキシメチル）−５−ニトロフェニル］エタノール（７−４）を淡黄色の固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ）δ８．０９（ｂｒ  ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５，２．４Ｈｚ），８．０６（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），５．４６（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），４．７７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），４．６６（ｓ，２Ｈ），３．６６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），２．８２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）。
【０２３０】
６−ニトロ−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソクロメン（７−５）
濃塩酸水溶液（２００ｍＬ）中の２−［２−（ヒドロキシメチル）−５−ニトロフェニル］エタノール（７−４、８．８０ｇ、４４．６ｍｍｏｌ、１当量）の溶液を、１００℃で２０時間加熱した。反応混合物を冷却し、沈殿物をろ過して、乾燥させ、６−ニトロ−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソクロメン（７−５）を白い固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．０２（ｍ，２Ｈ），７．１７（ｍ，１Ｈ），４．８４（ｓ，２Ｈ），４．００（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），２．９６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）。
【０２３１】
３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソクロメン−６−アミン（７−６）
エタノール（１５０ｍＬ）中の６−ニトロ−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソクロメン（７−５、４．００ｇ、２２．３ｍｍｏｌ、１当量）及び１０％Ｐｄ／Ｃ（１．０ｇ）の混合物を、水素バルーン下において、２３℃で５時間攪拌した。セライトのパッド上に、触媒をろ過し、酢酸エチル（４００ｍＬ）で洗浄し、続いてエタノール（４００ｍＬ）で洗浄した。合わせたろ液を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィーにより残留物を精製し（１００％ＥｔＯＡｃ）、３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソクロメン−６−アミン（７−６）を白い固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ６．７８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．５２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．１，２．２Ｈｚ），６．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．２Ｈｚ），４．６８（ｓ，２Ｈ），３．９３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），２．７６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ）。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値１５０．０、理論値１５０．１。
【０２３２】
スキーム６に記載の方法により、３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソクロメン−６−アミン（７−６）から、５−（３−アミノプロピル）−３−メチル−５，７，８，１０−テトラヒドロピラノ［３，４−ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４（２Ｈ）−オン（７−７）を調製した。
【０２３３】
【表５】
2008526865.tif 000037
【０２３４】
スキーム８
【０２３５】
【化３５】
2008526865.tif 000038
【０２３６】
２−ベンジル−３−メチル−５−（オキシラン−２−イルメチル）−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（８−１）
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の、２−ベンジル−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（４−１）（０．５０ｇ、１．５ｍｍｏｌ、１当量）及び炭酸セシウム（３．０ｇ、９．２ｍｍｏｌ、６．３当量）の混合物へ、エピブロモヒドリン（２．０ｇ、１５ｍｍｏｌ、１０当量）を添加し、窒素下において、生じた混合物を２３℃で１６時間攪拌した。混合物をろ過し、ろ液を逆相液体クロマトグラフィーにより精製し（０．１％ＴＦＡを伴うＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ勾配が存在）、２−ベンジル−３−メチル−５−（オキシラン−２−イルメチル）−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（８−１）を白い固体として生成した。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値４００．１、理論値４００．２。
【０２３７】
５−（３−アジド−２−ヒドロキシプロピル）−２−ベンジル−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（８−２）
酢酸（１ｍＬ）及びＤＭＦ（２ｍＬ）中の、２−ベンジル−３−メチル−５−（オキシラン−２−イルメチル）−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（８−１）（０．１３ｇ、０．３２ｍｍｏｌ、１当量）の溶液へ、水（１ｍＬ）中のアジ化ナトリウム（０．２０ｇ、３．１ｍｍｏｌ、９．４当量）を添加し、生じた溶液を６５℃で１６時間加熱した。反応物を冷却し、逆相液体クロマトグラフィーにより精製し（０．１％ＴＦＡが存在するＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ勾配）、５−（３−アジド−２−ヒドロキシプロピル）−２−ベンジル−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（８−２）を白い固体として生成した。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値４４３．２、理論値４４３．２。
【０２３８】
５−（３−アジド−２−メトキシプロピル）−２−ベンジル−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（８−３）
ＴＨＦ（１５ｍＬ）中の、２−ベンジル−３−メチル−５−（オキシラン−２−イルメチル）−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（８−１）（０．０９５ｇ、０．２１５ｍｍｏｌ、１当量）及び水素化ナトリウム（０．５０ｇ、２０．８３ｍｍｏｌ、９７当量）の混合物を、１０分間攪拌し、次いでヨウ化メチル（２．３ｇ、１６．１ｍｍｏｌ、７５当量）を添加し、生じた混合物を、窒素下において、２３℃で７２時間攪拌した。過剰の水素化ナトリウムを水（５ｍＬ）で反応停止し、濃縮した。ジクロロメタン（２５ｍＬ）中に残留物を溶解し、生じた溶液を水で洗浄して、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮して、５−（３−アジド−２−メトキシプロピル）−２−ベンジル−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（８−３）を白い固体として生成した。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値４５７．１、理論値４５７．２。
【０２３９】
５−（３−アミノ−２−メトキシプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（８−４）
メタノール（１０ｍＬ）及びジクロロメタン（１０ｍＬ）中の、５−（３−アジド−２−メトキシプロピル）−２−ベンジル−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（８−３）（０．１０ｇ、０．２２ｍｍｏｌ、１当量）及び炭素上の１０％パラジウム（２０ｍｇ）の混合物を、水素バルーン下において、２３℃で３時間攪拌した。懸濁液をろ過し、ろ液を濃縮して、５−（３−アミノ−２−メトキシプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（８−４）を白い固体として生成した。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値４３１．３、理論値４３１．２。
【０２４０】
ｔｅｒｔ−ブチル３−（２−ベンジル−３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）−２−メトキシプロピルカルバメート（８−５）
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の、５−（３−アミノ−２−メトキシプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（８−４）（０．０９２ｇ、０．２１ｍｍｏｌ、１当量）及びＢｏｃ２Ｏ（０．２９ｇ、１．３ｍｍｏｌ、６．２当量）の溶液へ、ＤＭＡＰ（０．０１ｇ、０．０８ｍｍｏｌ、０．４当量）を添加し、生じた溶液を、窒素下において、２３℃で２時間攪拌した。溶媒を濃縮し、逆層液体クロマトグラフィーにより残留物を精製し（０．１％ＴＦＡが存在するＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ勾配）、ｔｅｒｔ−ブチル３−（２−ベンジル−３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）−２−メトキシプロピルカルバマート（８−５）を白い固体として生成した。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値５３１．４、理論値５３１．３。
【０２４１】
ｔｅｒｔ−ブチル２−メトキシ−３−（３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）プロピルカルバマート（８−６）
ＤＭＦ（５ｍＬ）、ジクロロメタン（１０ｍＬ）及びメタノール（１０ｍＬ）中の、３−（２−ベンジル−３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）−２−メトキシプロピルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（８−５）（０．０２３ｇ、０．０４３ｍｍｏｌ、１当量）及び炭素上の１０％パラジウム（１００ｍｇ）を、水素バルーン下において、２３℃で１６時間攪拌した。生じた懸濁液をろ過し、ろ液を濃縮して、２−メトキシ−３−（３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）プロピルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（８−６）を白い固体として生成した。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値４４１．２、理論値４４１．２。
【０２４２】
５−（３−アミノ−２−メトキシプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（８−７）
ジクロロメタン（５ｍＬ）中の、ｔｅｒｔ−ブチル２−メトキシ−３−（３−メチル−４−オキソ−２，４，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−５−イル）プロピルカルバマート（８−６）（０．０１９ｇ、０．０４３ｍｍｏｌ、１当量）及びトリフルオロ酢酸（５ｍＬ）の溶液を、２３℃で１時間攪拌した。溶液を濃縮し、逆相液体クロマトグラフィーにより残留物を精製し（０．１％ＴＦＡが存在するＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ勾配）、５−（３−アミノ−２−メトキシプロピル）−３−メチル−２，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−４Ｈ−ベンゾ［ｇ］ピラゾロ［４，３−ｃ］キノリン−４−オン（８−７）のＴＦＡ塩を白い固体として生成した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ７．９７（ｓ，１Ｈ），７，８１（ｓ，１Ｈ），７．２６（ｓ，１Ｈ），４．６８（ｍ，１Ｈ），４．４４（ｍ，１Ｈ），３．６８（ｍ，２Ｈ），３．５７（ｍ，１Ｈ），３．３９（ｓ，３Ｈ），２．９６−２．８８（ｍ，４Ｈ），２．６５（ｓ，３Ｈ），１．８７（ｍ，４Ｈ）。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）実測値３４１．３、理論値３４１．２。
【０２４３】
実施例１−８
本発明の様々な特徴及び利点を更に例示するため、実施例が以下に提供されている。また、実施例は、本発明を実行するための有用な方法論も例示している。これらの実施例は、特許請求の範囲に記載されている本発明を限定するものでない。
【実施例１】
【０２４４】
リアルタイムＰＣＲを使用したＣＨＫ１ｓｖ１の同定
化合物の阻害特性の決定を容易にするために、ＣＨＫ１をコードするエキソン領域の「正常な」スプライシングのバリアントを同定するのが望ましい。特に、ＣＨＫ１のＣ末端制御ドメインの喪失をもたらす天然のスプライシング変異を探索した。Ｃ末端の欠失が、ＣＨＫ１へより大きなキナーゼ活性を付与する（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００、Ｃｅｌｌ  １００：６８１−６９２，Ｋａｔｓｕｒａｇｉ  ａｎｄ  Ｓａｇａｔａ，２００４，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．１５：１６８０−１６８９）。エキソン２−８は、触媒キナーゼドメインをコードし、エキソン９は、リンカー領域をコードする。ＳＱ及びＣ末端制御ドメインは、エキソン１０−１３内に存在する（Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，２７７：１４９７−１５０１，Ｋａｔｓｕｒａｇｉ  ａｎｄ  Ｓａｇａｔａ、２００４，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．１５：１６８０−１６８９）。リアルタイムＰＣＲ実験及びＲＴ−ＰＣＲを用い、ヒトＣＨＫ１  ｍＲＮＡの新規スプライスバリアントの存在を同定及び確認した。化合物の阻害特性を決定するのに有用なＣＨＫ１キナーゼアッセイで使用するために、ＣＨＫ１阻害ドメインのＣ末端切断をコードする天然のスプライスバリアントを同定し、クローニングし、発現し、精製した。
【０２４５】
ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＴ−ＰＣＲベースのアッセイを使用して、エキソン８〜１１に対応する領域中のＣＨＫ１  ｍＲＮＡの構造が、ヒト精巣から抽出されたＲＮＡについて決定された。ヒト精巣から単離された全ＲＮＡは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ＰＡｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）から取得した。ＣＨＫ１（ＮＭ ００１２７４）中の基準エキソンコード配列のエキソン８及びエキソン１１中の配列に相補的であるＲＴ−ＰＣＲプライマーを選択した。ＣＨＫ１  ｍＲＮＡのヌクレオチド配列に基づいて、ＣＨＫ１のエキソン８及びエキソン１１のプライマーセット（以下、ＣＨＫ１８−１１プライマーセット）は、「基準」ＣＨＫ１  ｍＲＮＡ領域を表す４７８塩基対のアンプリコンを増幅すると予想された。ＣＨＫ１８−１１プライマーセットは、エキソン９〜エキソン１１の選択的スプライシングを有する転写物中の３００塩基対のアンプリコンを増幅すると予想された。ＣＨＫ１エキソン８のフォワードプライマーは、配列：５’ＡＴＣＡＧＣＡＡＧＡＡＴＴＡＣＣＡＴＴＣＣＡＧＡＣＡＴＣ３’（配列番号１）を有し、ＣＨＫ１エキソン１１のリバースプライマーは、配列：５’ＣＡＴＡＣＡＡＣＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＧＡＴＡＧＣＣＣ３’（配列番号２）を有する。
【０２４６】
ヒト精巣からの全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）のＯｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキットを使用したワンステップの逆転写−ＰＣＲ増幅プロトコルに供し、次のサイクル条件を用いた：
１）５０℃で３０分間
２）９５℃で１５分間
３）以下を３５サイクル：
９４℃で３０秒間
６３．５℃で４０秒間
７２℃で５０秒間、次いで
７２℃で１０分間
ＲＴ−ＰＣＲの増幅産物（アンプリコン）を、２％アガロースゲル上でサイズ分画した。２５０〜３５０塩基対のアンプリコンに相当する選択された断片を、ゲルから手作業で抽出し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔで精製した。精製されたアンプリコンの断片を、ＣＨＫ１８−１１プライマーセットを用いて再増幅し、これらのアンプリコンをアガロースゲル上でサイズ分画した。２５０〜３５０塩基対のアンプリコンに相当する断片を、ゲルから手作業で抽出し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔで精製した。精製されたアンプリコンの断片を、ＣＨＫ１８−１１プライマーセットでもう一度再増幅した。アガロースゲル上のサイズ分画及び手作業による２５０〜３５０塩基対アンプリコンの抽出に続き、ＴＡＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）とともに提供される試薬及び指示書を使用して、精製されたアンプリコンの断片（Ｑｕｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｐＣＲ２．１ベクター中にクローニングした。次いで、１プレートにつき４４０コロニーのプールを、１５のプレート上へ、計６６００のクローンを配置した。各プレートからのプールされた４４０のコロニーからＤＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲの鋳型として使用した。
【０２４７】
リアルタイムＰＣＲ／ＴＡＱｍａｎ
ＣＨＫ１の基準タンパク質（ＮＰ ００１２６５）に対して選択的にスプライシングされたイソフォームの存在を決定するために、リアルタイムＰＣＲアッセイを使用した。
【０２４８】
ＣＨＫ１ｓｖ１のイソフォームを検出するために使用されるＴＡＱｍａｎプライマー及びプローブを、予め設定された混合物として設計及び合成した（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）。ＣＨＫ１の基準形態（配列番号３、４及び５）及びＣＨＫ１ｓｖ１イソフォーム（配列番号６，７及び８）を検出するために使用されるＴＡＱｍａｎプライマー及びプローブの配列を表１に示す。５’末端の６−ＦＡＭフルオロフォア（ＦＡＭ）及び３’末端の非蛍光性消光物質（ＮＦＱ）で、スプライス連結部特異的プローブを標識した。ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用し、ヒト精巣のｃＤＮＡに対して、リアルタイムＰＣＲを実施した。ＴＡＱｍａｎ反応は、以下のものを含有した。
【０２４９】
【表６】
2008526865.tif 000039
【０２５０】
【表７】
2008526865.tif 000040
【０２５１】
ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で、ＴＡＱｍａｎ反応を実施した。熱サイクリング条件は、５０℃で２分間、９５℃で１０分間、並びに９５℃で１５分間及び６０℃で１分間の４０サイクルであった。Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＳＤＳ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）により、蛍光発光のデータ分析を実行した。
【０２５２】
ＴＡＱｍａｎアッセイの結果は、１５プレートのうち１３プレート由来のプールされたＤＮＡが、選択的エキソン９〜エキソン１１のスプライス連結部に相当するクローンを有するように見受けられることを示した。４４０のコロニーに相当するこれらの陽性プールの１つから得たＤＮＡを使用して、細菌宿主細胞を形質転換した。クローンは、１プレートにつき５５のコロニーのプール中、合計１２のプレート上に播種した。１２の各プレート上のコロニーを再度プールし、ＴＡＱｍａｎアッセイのために使用した。１２のプレートうち１つから得た、プールされたＤＮＡは、選択的エキソン９〜エキソン１１のスプライス連結部を表すクローンを有しているように見受けられた。ＴＡＱｍａｎアッセイを使用して、この陽性プレート上の５５のコロニーを個別にスクリーニングし、１つのクローンが、選択的エキソン９〜エキソン１１のスプライン連結部を有しているとして同定された。次いで、ＣＨＫ１エキソン８のフォワードプライマー（配列番号１）及び５’ＴＧＣＡＴＣＣＡＡＴＴＴＧＧＴＡＡＡＧＡＡＴＣＧ３’の配列を有する、異なるエキソン１１のリバースプライマー（配列番号９）を使用して、各末端から、この陽性クローンを配列決定した。
【０２５３】
クローンの配列分析により、これは、ＣＨＫ１異核ＲＮＡのエキソン９のエキソン１１への選択的スプライシングに対する予想配列と合致すること、すなわち、エキソン１０のコード配列が完全に存在しないことが明らかとなった。
【実施例２】
【０２５４】
ＣＨＫ１ｓｖ１のクローニング
リアルタイムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ及び配列データは、ＣＨＫ１タンパク質、ＮＰ ００１２６５をコードする正常なＣＨＫ１の基準ｍＲＮＡ配列ＮＭ ００１２７４に加えて、ＣＨＫ１  ｍＲＮＡの新規スプライスバリアント形態が精巣組織及びＭＯＬＴ−４並びにＤａｕｄｉ細胞系中にも存在することを示している。
【０２５５】
酵母中の組換え媒介プラスミド構築を使用して、実施例１で同定されたＣＨＫ１ｓｖ１のスプライスバリアントを含むヌクレオチド配列を有するクローンを単離した。２つのプライマー対の組を使用して、ＣＨＫ１ｓｖ１のｍＲＮＡコード配列の全体を増幅及びクローニングした。ＣＨＫ１ｓｖ１の場合には、リアルタイム定量的ＰＣＲ分析は、このスプライスバリアント形態の転写物が非常に低いレベルで存在することを示した。ＣＨＫ１ｓｖ１をクローニングするために、所望のエキソン９〜エキソン１１のスプライス連結部を作出にするように設計された８０塩基対リンカーを用いる、酵母での更なる組換え工程によって、基準ＣＨＫ１（ＮＭ ００１２７４）のコード配列を含有するクローンを改変した。
【０２５６】
ＣＨＫ１ｓｖ１に対応する完全長クローンの単離のために、５’「フォワード」プライマー及び３’「リバース」プライマーを設計した。５’「フォワード」のＣＨＫ１ｓｖ１プライマーは、５’ＴＴＡＣＴＧＧＣＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＣＡＴＧＧＣＡＧＴＧＣＣＣＴＴＴＧＴ３’（配列番号１０）のヌクレオチド配列及びＣＨＫ１  ｍＲＮＡ（ＮＭ ００１２７４）のエキソン２に相補的な配列を有するように設計した。３’「リバース」のＣＨＫ１ｓｖ１プライマーは、５’ＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＴＣＧＡＧＧＣＴＧＡＴＣＡＧＣＧＧＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＡＴＧＣＡＴＣＣＡＡＴＴＴＧＧＴＡＡＡＧＡＡＴＣＧ３’（配列番号１１）のヌクレオチド配列及びＣＨＫ１  ｍＲＮＡ（ＮＭ ００１２７４）のエキソン１１に相補的な配列を有するように設計された。イタリック体で示されるプライマー配列の５’末端における４０のヌクレオチドは、ＰＣＲアンプリコン中に組み込まれ、酵母での、その後のプラスミドの組換え事象を容易にした「尾部」である。これらのＣＨＫ１ｓｖ１の「フォワード」及び「リバース」プライマーは、基準ＣＨＫ１  ｍＲＮＡ（ＮＭ ００１２７４）のコード配列を増幅すると予想され、次いで、これは、ＣＨＫ１ｓｖ１特異的配列を作製するために、その後の組換えクローニング工程において使用された、
ＲＴ−ＰＣＲ
逆転写（ＲＴ）及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の組み合わせを用いて、ＣＨＫ１ｓｖ１のｃＤＮＡ配列をクローニングした。更に具体的には、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｌｓｂａｄ、ＣＡ）及びオリゴｄ（Ｔ）プライマー（ＲＥＳＧＥＮ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）を使用し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩの製造者の指示書に従って、ＭＯＬＴ−４細胞系のｍＲＮＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）約２５ｎｇを逆転写した。ＰＣＲのために、完了したＲＴ反応物１μｌを、水４０μｌ、１０Ｘ緩衝液５μｌ、ｄＮＴＰ１μｌ及びＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）のＡｄｖａｎｔａｇｅ  ２ＰＣＲキットからの酵素１μｌに添加した。ＣＨＫ１ｓｖ１に対するＣＨＫ１ｓｖ１「フォワード」及び「リバース」プライマー（配列番号１０、１１）を用いて、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）中で、ＰＣＲを行った。最初の９４℃で１分の変性後、９４℃で３０秒の変性、続いて６３．５℃で４０秒のアニーリング及び７２℃で５０秒の合成を使用し、増幅の３５サイクルを実行した。ＰＣＲの３５サイクルに続き、７２℃で１０分間伸長した。次いで、反応物５０μｌを４℃に冷やした。生じた反応産物１０μｌを、臭化エチジウム（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ、ＮＪ）０．３μｇ／ｍｌで染色された１％アガロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｕｌｔｒａ  ｐｕｒｅ）ゲル上で走行させた。ゲル中の核酸バンドを紫外線光ボックスで可視化して写真撮影し、ＣＨＫ１  ｍＲＮＡの場合に、ＰＣＲが、予期されるサイズの産物（約１２４３塩基対の産物）をもたらすどうか判断した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）、続いてキットとともに提供されたＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製プロトコルを使用して、ＭＯＬＴ−４細胞から得たＰＣＲ反応物５０μｌの残りを精製した。Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｖａｃｕｕｍ  Ｓｙｓｔｅｍ  ４００（Ｓａｖａｎｔから）に取り付けられたＳｐｅｅｄ  Ｖａｃ  Ｐｌｕｓ（ＳＣ１１０Ａ、Ｓａｖａｎｔ、Ｈｏｌｂｒｏｏｋ、ＮＹから）中で、中温で約３０分間乾燥させることにより、精製プロトコルから取得された産物の約５０μｌを約６μｌに濃縮した。
【０２５７】
ＣＨＫ１ｓｖ１の完全長クローンのクローニング及び構築並びに酵母の形質転換
Ｒａｙｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００２、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１２：１９０−１９７）によってすでに記載されているものと同様のシクロヘキシミドに基づいたカウンター選択スキームを使用して、酵母での相同的組換えクローニングによる完全長ＣＨＫ１ｓｖ１クローンの構築を実行した。
【０２５８】
前述されたＣＨＫ１ｓｖ１のフォワード及びリバース「尾部付き」プライマー及び発現ベクターを使用して作製された１２４３塩基対のＣＨＫ１アンプリコン間での相同的組換えによる完全長ＣＨＫ１ｓｖ１の完全長クローンの構築を、酵母細胞中へこれらの断片を同時形質転換することにより実行した。８０塩基対のオリゴヌクレオチドリンカーを用いた後続の組換え工程は、ＣＨＫ１ｓｖ１のエキソン９〜エキソン１１のスプライス連結部を作製した。後続のパラグラフに記載されている全ての酵母形質転換工程は、電気穿孔により実行した（Ｒａｙｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１２：１９０−１９７）。
【０２５９】
酵母株ＣＭＹ１−５（Ｍａｔａ、ＵＲＡ３Δ、ＣＹＨ２Ｒ）１００μｌの同時形質転換により、１２４３塩基対ＣＨＫ１の精製されたアンプリコン１μｇを、ＳｒｆＩ消化されたｐＣＭＲ１１の１００ｎｇ中へ直接クローニングした。１μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを含有するＵｒａ欠損培地プレート上で（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｕｒａ＋、シクロヘキシミド耐性コロニーを選択した。標準的な酵母培地を使用した（Ｓｈｅｒｍａｎ，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４：３−２１）。ＣＨＫ１クローンを含有する酵母細胞培養からの全ＤＮＡを使用して、大腸菌をクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）耐性に形質変換し、Ｈｏｆｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｉｎｓｔｏｎ（１９８７  Ｇｅｎｅ  ５７：２６７−７２）に記載されているように、組換えプラスミドの大量を調製した。プレートから、２Ｘ  ＬＢ培地２ｍＬ中へコロニーを採取した。これらの液体培養を３７℃で一晩インキュベートした。Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｎｃｉａ、ＣＡ）のＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して、プラスミドＤＮＡをこれらの培養から抽出した。
【０２６０】
【表８】
2008526865.tif 000041
【０２６１】
ＣＨＫ１ｓｖ１クローンを構築するために、エキソン９〜エキソン１１の選択的スプライシングの領域を包含する、表３に示されている８０塩基対リンカー１μｇ（配列番号１２、１３）及びＢａｍＨＩ消化されたＣＨＫ１／ｐＣＭＲ１１クローン１００ｎｇを使用して、シクロヘキシミド感受性酵母菌株１００μｌを同時形質転換した。リンカー及びＣＨＫ１／ｐＣＭＲ１１クローン間での重複ＤＮＡは、ほとんどの酵母形質転換体が正しく構築されたコントラストを有することを表している。続いて行われるＥ．コリの調製及び形質転換のために、Ｕｒａ＋、シクロヘキシミド耐性コロニーを選択した。制限消化によって、Ｅ。コリから抽出されたプラスミドＤＮＡを分析して、ＣＨＫ１ｓｖ１クローン中に、エキソン９のエキソン１１への選択的スプライシングが存在することを確認した。８つのＣＨＫ１ｓｖ１クローンを配列決定して同一性を確認し、複数の系でのタンパク質発現のために、適切な配列を有するクローンを使用する。
【０２６２】
【表９】
2008526865.tif 000042
【０２６３】
ＣＨＫ１ｓｖ１ポリヌクレオチドの概要
ＣＨＫ１ｓｖ１  ｍＲＮＡ（配列番号１４）のポリヌクレオオチドコード配列は、基準ＣＨＫ１タンパク質（ＮＰ ００１２６５）と同様のＣＨＫ１ｓｖ１タンパク質（配列番号１５）をコードするオープンリーディングフレームを含有するが、基準ＣＨＫ１  ｍＲＮＡ（ＮＭ ００１２７４）の完全長コード配列のエキソン１０に対応する１７８塩基対領域によってコードされるアミノ酸を欠如している。１７８塩基対領域の欠失は、基準ＣＨＫ１タンパク質のリーディングフレームと比較すると、タンパク質翻訳リーディングフレームのシフトをもたらし、ＣＨＫ１ｓｖ１に特有であるカルボキシ末端ペプチド領域（配列番号１５中では、イタリック体で記されている。）を作製する。フレームシフトもエキソン９／エキソン１１のスプライス連結部の２９ヌクレオチド下流に、未成熟な終止コドンをもたらす。従って、ＣＨＫ１ｓｖ１タンパク質は、エキソン１０によってコードされたアミノ酸領域に対応する内部５９アミノ酸領域を喪失しており、基準ＣＨＫ１（ＮＰ ００１２６５）と比較すると、未成熟な終始コドンの下流のヌクレオチドによりコードされるアミノ酸も欠如している。エキソン１０は、ＣＨＫ１のＳＱ／ＴＱドメインをコードし、エキソン１１−１３は、自己疎阻害領域（Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：１４９７−１５０１，Ｋａｔｓｕｒａｇｉ  ａｎｄ  Ｓａｇａｔａ，２００４，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．１５：１６８０−１６８９）をコードする。自己阻害領域の欠失は、ＣＨＫ１キナーゼドメインに恒常的な活性を付与するのに対して、ＳＴ／ＴＱドメインも除去されると、ＣＨＫ１の酵素活性が低下する（Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：８８０８−８８１９）。
【０２６４】
【表１０】
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【実施例３】
【０２６５】
ＣＨＫ１ｓｖ１タンパク質の発現
バキュロウイルスの遺伝子発現ベクター系により、昆虫細胞でのタンパク質発現が可能になるが、これは安価であり、簡単に維持できる。産生されるタンパク質は、哺乳動物細胞中のタンパク質と同様の品質である（Ｍｉｌｌｅｒ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：４５７−４６５，Ｍｉｌｌｅｒ，１９８９，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  １１：９１−９５）。昆虫細胞中でのバキュロウイルス発現ベクターを用いたタンパク質発現の方法は、当技術分野において公知であり、技術は、「Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２」及び「Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９９」の中で論じられている。
【０２６６】
昆虫細胞発現のためのＣＨＫ１ｓｖ１のクローニング
ＣＨＫ１ｓｖ１／バキュロウイルストランスファーベクター構築物を作製するために、表５に列挙されているプライマー（配列番号１６、１７）を使用して、ＣＨＫ１ｓｖ１／ｐＣＭＲ１１クローン（実施例２を参照）をＰＣＲに対する鋳型として使用し、ＣＨＫ１ｓｖ１（配列番号１４）のコード配列を増幅した。配列番号１６によって表されるプライマーは、ＡＴＧ開始コドンのすぐ上流に最適な翻訳開始配列を含有し、及びアンプリコン中に取り込まれる上流のＥｃｏＲＩ制限部位を含有する。配列番号１７によって表されるプライマーは、ＣＨＫ１ｓｖ１コード配列のＣ末端の６つのヒスチジン残基及びＣＨＫ１ｓｖ１アンプリコン中に取り込まれるＥａｇＩ制限部位をコードする配列を含有する。このＣＨＫ１ｓｖ１アンプリコンを、１％アガロースゲル上で走行させた。ＣＨＫ１ｓｖ１の場合において、予期されるサイズの選択されたアンプリコンの断片（ＣＨＫ１ｓｖ１の場合には、約９９４塩基対の産物）で、ゲルから手作業で抽出し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。精製されたアンプリコンの断片を、ＥｃｏＲＩ及びＥａｇＩで消化した。ＥｃｏＲＩ及びＥａｇＩで消化し、アルカリホスファターゼで脱リン酸化されたバキュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ１３９３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）中に、ＥｃｏＲＩ／ＥａｇＩ消化されたアンプリコンを連結した。次いで、ＣＨＫ１ｓｖ１／ｐＶＬ１９３９の構築物をＥ．コリの菌株ＤＨ５α中に形質転換した。アンピシリン耐性コロニーから選択され抽出されたプラスミドＤＮＡを配列決定して同一性を確認し、昆虫細胞中でのタンパク質発現のために、適切な配列を有するクローンを使用した。
【０２６７】
【表１１】
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【０２６８】
ＣＨＫ１ｓｖ１の昆虫細胞発現
ＣＨＫ１ｓｖ１／ｐＶＬ１３９３構築物を、直鎖化されたＡｃＮＰＶ  ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ  ＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）とともに、ＳＦ９昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中に、同時形質移入した。終点希釈により、個々の組換えウイルスを選択した。ウイルスのクローンを増幅して、高力価の原株を取得した。これらのウイルス原株を、小規模なＳＦ９培養におけるタンパク質発現テストに対して使用し、ＣＨＫ１ｓｖ１の組換えタンパク質の産生を検証した。ＣＨＫ１ｓｖ１のタンパク質発現に対して、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、形質移入されたＳＦ９細胞溶解物を分析した。抗ＣＨＫ１抗体（Ｇ４抗体、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）を使用した、クマシー染色又はウエスタンブロッティングにより、ＣＨＫ１ｓｖ１タンパク質を可視化した。発現に基づいて、大規模なＣＨＫ１ｓｖ１発現のために、個々のウイルスを選択した。リットル規模での組換えタンパク質発現のために、ＥＸ細胞４０１の無血清培地（ＪＲＨ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）中でＳＦ９の懸濁培養物を２７℃で増殖させ、細胞あたり０．３のウイルスの感染多重度を用いて、組換えウイルス原株に感染させた。ウイルスの形質移入の７２時間後、感染したＳＦ９培養物を採集し、遠心分離によりペレット化した。ペレットは、−７０℃で保管した。
【０２６９】
ＣＨＫ１ｓｖ１の組換えタンパク質の精製
１μＭのミクロシスチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、１０μＭのシペルメトリン（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含有するＢ−ＰＥＲタンパク質抽出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）及びＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）（１錠／５０ｍｌの溶解緩衝液）を用いて、昆虫細胞のペレットを溶解した。タンパク質精製中の全操作を４℃で行った。溶解緩衝液中に細胞を再懸濁し、４５分間攪拌した。次いで、ＤＮＡｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）を、２００Ｕ／ｍｌの最終濃度の細胞に添加し、細胞懸濁液を更に３０分間攪拌した。３０，０００ｇで３０分間、溶解した細胞懸濁液を遠心分離した。溶解上清のデカンテーションを行い、３０，０００ｇで３０分間、遠心分離した。清澄化された上清１０ｍｌの各々に対し、Ｔａｌｏｎ金属アフィニティ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）の１ｍｌのベッド容積を添加して、懸濁液を４５分間攪拌した。アフィニティ樹脂／溶解物懸濁液を、５０００ｇで３分間遠心分離し、次いで上清を廃棄した。樹脂の５倍容積を使用して、緩衝液Ａ（５０μＭのトリス、ｐＨ８．０、２５０ｍＭのＮａＣｌ）で、アフィニティ樹脂を４回洗浄した。洗浄した樹脂を、緩衝液Ａ中に２倍のスラリーとして再懸濁し、クロマトグラフィーカラム中に充填した。樹脂を充填したカラムを、緩衝液Ａの６倍ベッド容積で洗浄した。緩衝液Ａ中の段階的なイミダゾール勾配を使用して、ＣＨＫ１ｓｖ１のＨｉｓタグ付きタンパク質をカラムから溶出する。２倍ベッド容積の画分中のイミダゾール濃度は、５、１０、２０、３０、４０、５０及び６０ｍＭであった。Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、３０，０００の公称分子量限界（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して、溶出画分を濃縮した。濃縮された酵素画分をグリセロール中に５０％希釈し、−２０℃で保存した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動に続いて、抗ＣＨＫ１抗体（Ｇ４抗体、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）を用いたクマシー染色又はウエスタンブロッティングを使用して、ＣＨＫ１ｓｖ１のＨｉｓタグ付きタンパク質の存在について、画分を分析した。以下の節に記載されているキナーゼアッセイを使用して、カラム画分のＣＨＫ１ｓｖ１キナーゼ活性を測定した。
【実施例４】
【０２７０】
ＣＨＫ１ｓｖ１キナーゼアッセイ
合成ペプチド基質を使用して、ＣＨＫ１ｓｖ１活性をインビトロでアッセイした。Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  Ｔｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＨＴＲＦ）アッセイシステム（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：９４−１０４）を使用して、ホスホペプチド産物を定量した。反応混合物は、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのジチオスレイトール、０．１％ＢＳＡ、０．１ｍＭのＡＴＰ、０．５μＭのペプチド基質及び０．１ｎＭのＣＨＫ１ｓｖ１酵素を、最終容量４０μｌ中に含有した。ペプチド基質は、アミノ酸配列のアミノ末端−ＧＧＲＡＲＴＳＳＦＡＥＰＧ−カルボキシ末端（ＳｙｎＰｅｐ、Ｄｕｂｌｉｎ  ＣＡ）（配列番号１８）を有し、Ｎ末端がビオチン化されている。キナーゼ反応物を２２℃で３０分間インキュベートし、次いでユーロピウムキレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）で標識された６０μｌのＳｔｏｐ／Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ緩衝液（４０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．３、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．１２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１．２５％ＢＳＡ、２５０ｎＭのＰｈｙｃｏＬｉｎｋ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｐｒｏｚｙｍｅ、Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）、及び０．７５ｎＭのＧＳＫ３α抗ホスホセリン抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、カタログ番号９３３８）を用いて停止させた。２２℃で２時間、反応物を平衡化させ、相対蛍光単位をＤｉｓｃｏｖｅｒｙプレートリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で読み取った。上記の反応物中で阻害剤化合物をアッセイし、化合物のＩＣ５０を測定する。１ｎＭ〜１００μＭの範囲に及ぶ半対数希釈系列として、ＤＭＳＯ中に溶解された化合物１μＬを、各４０μｌの反応物に添加した。化合物の濃度範囲及び４パラメーターのシグモイドフィットを使用して作製された滴定曲線にわたって、ＨＴＲＦ蛍光単位として読み取られた相対的リン基質の形成を測定する。
【０２７１】
本発明における具体的化合物を上記アッセイにおいて検査し、基質に対して５０μＭ以下のＩＣ５０を有することを発見した。
【実施例５】
【０２７２】
細胞中のＣＨＫ１自己リン酸化の阻害
ＤＮＡ損傷に応答するＣＨＫ１の自己リン酸化をモニタリングすることにより、細胞中のＣＨＫ１の阻害能について、阻害剤化合物をアッセイした。Ｈ１２９９細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を培地（１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ１６４０、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｘ非必須アミノ酸及びペニシリン−ストレプトマイシン）で増殖させる。Ｔ−７５フラスコから細胞をプールし、計数し、２ｍｌ培地中のウェルあたり２００，０００万個の細胞で６つのウェルディッシュ中に接種し、インキュベートする。ＤＭＳＯ中の１０００倍の作業原液から、ＤＭＳＯ中の化合物の段階希釈系列又はＤＭＳＯ対照を各ウェルに加え、３７℃で２時間インキュベートする。２時間のインキュベーション期間の後、薬剤処理された全細胞（高用量のウェルの１つを除く）及びＤＭＳＯ対照ウェルの１つへ、１００ｎＭのカンプトテシン（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、ＰＢＳ中の２００倍の作業原液から添加する。カンプトテシンとともに４時間のインキュベーションを行った後、各ウェルを氷冷したＰＢＳで一回洗浄し、溶解緩衝液３００μＬ（５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａＦ、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ、０．５μＭのＮａ３ＶＯ４及び１ＸＰｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ−ＥＤＴＡなし（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ））を各ウェルに添加する。４℃で１０−１５分間、プレートを振盪し、次いで１．５ｍｌのマイクロ遠心管に溶解物を移し、−８０℃で冷凍する。溶解物を氷上で融解し、１５，０００ｘｇで２０分間の遠心分離により清澄化し、清浄な管に上清を移す。
【０２７３】
５倍の試料ローディング緩衝液５μＬの添加及び１００℃での５分間の熱変性により、ゲル電気泳動のために試料（２０μＬ）を調製する。トリス／グリシンのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１０％）中で試料を電気泳動し、タンパク質をＰＶＤＦ上に移す。次いで、ＴＢＳ中の３％ＢＳＡ中で、ブロットを１時間ブロックし、ホスホ−Ｓｅｒ−２９６ＣＨＫ１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−カタログ番号２３４６）に対する抗体を使用してプローブする。西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合二次抗体（ヤギ抗ウサギ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ−カタログ番号１１１−０３５−０４６）を用いて、結合した抗体を可視化し、化学増強（ＥＣＬ−プラス、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を増強する。６２．５ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ６．７、２％ＳＤＳ及び１００μＭになる２−メルカプトエタノール中において、５５℃で３０分間、インキュベーションすることにより、一次抗体セットを除去した後、ＣＨＫ１モノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、カタログ番号ＳＣ−８４０８）を使用して、全ＣＨＫ１に対して、ブロットを再プローブする西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、カタログ番号ＮＡ９３１）を使用して、ＣＨＫ１モノクローナルを検出し、化学発光（ＥＣＬ−プラス、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を増強する。ＥＣＬ露光フィルムをスキャンし、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて特異的バンドの強度を定量化する。全ＣＨＫ１に対して標準化されたホスホ−ＣＨＫ１（Ｓｅｒ２９６）信号のレベルについて滴定を評価して、ＩＣ５０値を計算する。
【実施例６】
【０２７４】
チェックポイントエスケープアッセイにおける阻害剤の機能的活性
ＤＮＡ損傷の停止
細胞中でのＣＨＫ１阻害剤の機能的活性を測定するために、ＤＮＡ損傷によって誘発された細胞周期の停止を抑止する能力について、化合物をアッセイする。アッセイは、ＤＮＡ損傷剤カンプトテシンによってもたらされた細胞周期停止後にＭ期に入る細胞量の指標として、細胞のホスホヌクレオリンのレベルを測定する。
【０２７５】
１０％ウシ胎仔血清が補充されたＲＰＭＩ６４０培地中に、５０００細胞／ウェルの密度で、Ｈ１２９９細胞（ＡＴＣＣ、ＭａｎａｓｓａＶＡ）を播種する。５％ＣＯ２において、３７℃で２４時間のインキュベーションした後、２００ｎＭの最終濃度になるようにカンプトテシンを添加し、１６時間インキュベートする。２００ｎＭのカンプトテシン及び３３２ｎＭのノコドゾールを加えた増殖培地中の検査化合物の段階希釈系列の等容量（最終濃度：５０ｎｍ／ｍｌ）を添加し、３７℃でのインキュベーションを８時間継続する。ウェルから培地を除去し、５０μＬの溶解緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａＦ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％グリセロール、１ｘＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、１μｌ／ｍｌのＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、３００μＭのオルトバナジウム酸ナトリウム、１μＭのミクロシスチン（Ｓｉｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加する。溶解緩衝液を加えたプレートを４℃で３０分間振盪し、２０分間凍結（−７０℃）させる。ＩＧＥＮ  Ｏｒｉｇｅｎ技術（Ｂｉｏ  Ｖｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して、細胞溶解物中のホスホヌクレオリンレベルを測定する。
【０２７６】
細胞溶解物中のホスホヌクレオリンの検出
Ｏｒｉｇｅｎ  Ｂｉｏｔｉｎ−ＬＣ−ＮＨＳ−Ｅｓｔｅｒ（Ｂｉｏ  Ｖｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐ．）を使用し、製造会社によって記載されたプロトコルを用いて、４Ｅ２抗ヌクレオリン抗体（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ）をビオチン化した。ルテニル化キット（ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐ．，カタログ番号１１００３４）を使用し、製造会社によって記載されたプロトコルに従い、ヤギ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を、ルテニル化した。９６ウェルプレートの各ウェルへ、細胞溶解物２５μＬ（上記）とともに２μｇ／ｍｌのビオチン化された４Ｅ２抗ヌクレオリン抗体及び０．４ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジンでコーディングされた常磁性Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐ．）を含有する抗体緩衝液２５μＬ（リン酸緩衝化生理食塩水ｐＨ７．２、１％ウシ血清アルブミン、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を添加する。抗体及び溶解物を室温で１時間振盪しながらインキュベートする。次に、抗体緩衝液（上記）５０μＬ容量中の抗ホスホヌクレオリンＴＧ３抗体５０ｎｇ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＮｕｅｒｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．、Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ、ＩＬ）を、溶解物混合物の各ウェルへ添加し、室温で３０分間インキュベーションを継続する。最後に、抗体緩衝液中のルテニル化されたヤギ抗マウス抗体の２４０ｎｇ／ｍｌ溶液２５μＬを各ウェルに添加し、室温で３時間インキュベーションを継続する。溶解物の抗体混合物をＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｍ−シリーズＭ８アナライザー中で読み取り、化合物依存性のホスホヌクレオリンの増加に対するＥＣ５０を測定する。
【実施例７】
【０２７７】
他の生物学的アッセイ
ＣＨＫ１の発現及び精製：標準バキュロウイルスベクター及びＧＩＢＣＯＴＭ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した（Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（Ｒ））昆虫細胞発現システムを使用して、アミノ末端にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼを有する融合タンパク質（ＧＳＴ−ＣＨＫ１）として、組換えヒトＣＨＫ１を発現することができる。グルタチオンセファローズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、製造会社によって記載された標準的な手順を用いて、昆虫細胞中で発現された組換えタンパク質を精製することが可能である。
【０２７８】
ＣＨＫ１の蛍光偏光アッセイ：キナーゼ活性をモニタリングするために、蛍光偏光を用いてＣＨＫ１のキナーゼ阻害剤を同定することができる。このアッセイでは、１０ｎＭのＧＳＴ−ＣＨＫ１を用い、５ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ、ｐＨ６．５）、５ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（Ｒ）−２０、１μＭのアデノシン５’三リン酸（ＡＴＰ）、２ｍＭの１，４−ジチオ−ＤＬ−スレイトール（ＤＴＴ）、１μＭのペプチド基質（Ｂｉｏｔｉｎ−ＩＬＳＲＲＰＳＹＲＫＩＬＮＤ−遊離酸）（配列番号：１９）、１０ｎＭのペプチド基質トレーサー（フルオレシン−ＧＳＲＲＰ−ｐＳ−ＹＲＫＩ−遊離酸）（ｐＳ＝リン酸化されたセリン）（配列番号：２０）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から購入した未精製マウス腹水から、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇセファロース上で精製された６０ｎｇの抗ホスホ−ＣＲＥＢ（Ｓ１３３）マウスモノクローナルＩｇＧ、４％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及び３０μＭの阻害剤化合物を含有する。室温で１４０分間、反応物をインキュベートし、２５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の添加により終了した。停止された反応物を、室温で１２０分間インキュベートし、標準のフルオレシン設定を用いて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ／ＬＪＬＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡｎａｌｙｓｔＴＭ  ＡＤ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して、蛍光偏光値を測定する。
【０２７９】
ＣＨＫ１のＳＰＡろ過アッセイ：アッセイ（２５μ．）は、１０ｎＭのＧＳＴ−ＣＨＫ１、１０ｍＭのＭＥＳ、２ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０２５％のＴｗｅｅｎ（Ｒ）−２０、１μＭのペプチド基質（Ｂｉｏｔｉｎ−ＩＬＳＲＲＰＳＹＲＫＩＬＮＤ−遊離酸）（配列番号：１９）、１μＭのＡＴＰ、０．１μＣｉ３３Ｐ−γ−ＡＴＰ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ、ＮＥＮ）を含有し、室温で９０分間反応させる。５０ｍＭのＥＤＴＡ、６．９ｍＭのＡＴＰ、０．５ｍｇのシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）ビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有するリン酸緩衝化生理食塩水５５μｌを添加することにより、反応を停止する。室温で１０分間、ペプチド基質をビーズに結合させ、続いてＰａｃｋａｒｄ  ＧＦ／Ｂ  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒプレート上でろ過し、リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄する。乾燥させたプレートをＴｏｐｓｅａｌＴＭ（ＮＥＮ）で密閉し、３３Ｐに対する標準設定を用いたＰａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐｃｏｕｎｔ（Ｒ）シンチレーションカウンターを使用して、３３Ｐをペプチド基質に取り込む。
【０２８０】
ＣＨＫ１のＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（Ｒ）キナーゼアッセイ：アッセイ（２５μｌ）は、８．７ＧＳＴ−ＣＨＫ１、１０ｍＭのＭＥＳ、０．１ｍＭのエチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ、ｐＨ８．０）、２ｍＭのＤＴＴ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、３μＭのペプチド基質（Ｂｉｏｔｉｎ−ＩＬＳＲＲＰＳＹＲＫＩＬＮＤ−遊離酸）（配列番号：１９）、１μＭのＡＴＰ、０．４μＣｉ３３Ｐ−γ−ＡＴＰ（ＮＥＮ）及び４％ＤＭＳＯを含有する。反応物を室温で３０分間インキュベートし、５０ｍＭのＥＤＴＡ５０μｌで停止する。ストレプトアビジンで被覆されたＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（Ｒ）（ＮＥＮ）に、反応物９０μｌを移し、室温で１時間インキュベートする。プレートを０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０及び１０ｍＭのピロリン酸ナトリウムを含有するリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄する。プレートを乾燥させ、ＴｏｐｓｅａｌＴＭ（ＮＥＮ）で密閉し、標準設定を用いたＰａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐｃｏｕｎｔ（Ｒ）ＮＸＴＴＭシンチレーションカウンターを使用して、ペプチド基質中に取り込まれた３３Ｐの量を測定する。
【０２８１】
ＣＨＫ１のＤＥＬＦＩＡ（Ｒ）キナーゼアッセイ：アッセイ（２５μｌ）は、２５ｍＭのトリス、ｐＨ８．５、２０％のグリセロール、５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、０．１Ｓｕｒｆａｃｔ−Ａｍｐｓ（Ｒ）２０、１μＭのペプチド基質（Ｂｉｏｔｉｎ−ＧＬＹＲＳＰＳＭＰＥＮ−アミド）（配列番号：２１）、２ｍＭのＤＴＴ、４％のＤＭＳＯ、１２．５μＭのＡＴＰ、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する６．４ｍＭのＧＳＴ−ＣＨＫ１を使用しており、室温で３０分間反応させる。１％のＢＳＡ、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び１００ｍＭのＥＤＴＡを含有する１００μｌの停止緩衝液で反応を停止する。停止した反応物（１００μｌ）を、９６ウェルＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）に移して、室温で３０分間のインキュベーション中にビオチンペプチド基質を捕捉する。ウェルを洗浄し、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から得た２１．５ｎｇ／ｍｌの抗ホスホ−Ｓｅｒ２１６−Ｃｄｃ２５ｃウサギポリクローナル抗体及び２９２ｎｇ／ｍｌのユーロピウム標識抗ウサギ−ＩｇＧを含有する１００μｌのＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃ  Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒと、室温で１時間反応させる。ウェルを洗浄し、エンハンスメント溶液（１００μｌ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃ）の添加により、結合した抗体からユーロピウムを放出させ、製造会社の標準設定を用いたＷａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２ＴＭを使用して検出を行う。
【０２８２】
上記のＣＨＫ１  ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（Ｒ）キナーゼアッセイにおいて、本発明の化合物を検査し得る。
【０２８３】
ＷＳＴアッセイ：線形成長曲線を与える密度で、７２時間、ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６（５０００細胞／ウェル）又は他の細胞を、９６ウェルの清浄なボトムプレートへ接種する（７５μｌ）。適切な培地中、無菌状態下で、細胞を培養し、ＨＴ２９及びＨＣＴ１１６の場合、この培地は、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＭｃＣＯＹ’ｓ  ５Ａである。細胞の最初の接種に続き、５％ＣＯ２で、３７℃にて１７〜２４時間、細胞をインキュベートし、その際、４８時間以内に少なくとも８０％の細胞の死滅をを引き起こすことが可能な点までの漸増濃度で、適切なＤＮＡ損傷剤（カンプトテシン、５−フルオロウラシル及びエトポシド）を添加する。全ＤＮＡ損傷剤及び化合物添加の最終容量は、２５μｌである。アッセイは、最終１％未満のＤＭＳＯを含有する。ＤＮＡ損傷剤の添加と同時に、細胞の死滅の強化を観察するために、ＣＨＫ１の阻害剤化合物を、各ＤＮＡ損傷剤滴定へ一定濃度で添加する。ＤＮＡ損傷及びＣＨＫ１阻害剤化合物の添加に続いて、及び３７℃、５％ＣＯ２での３．５時間又は２．５時間のインキュベーション（ＯＤ４５０が測定される。）に続いて、製造会社に従い、４７時間の時点でＷＳＴ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を添加することにより、上記の条件下での細胞の生存／死滅を測定する。
【０２８４】
本発明の化合物は、上記のアッセイにおいて、検査し得る。
【実施例８】
【０２８５】
他の生物学的アッセイ
本発明の化合物の生物学的活性を測定するために利用し得る他のアッセイには、以下の公報：ＷＯ０４／０８０９７３、ＷＯ０２／０７０４９４及びＷＯ０３／１０１４４４に記載されているアッセイが含まれる。
【配列表】
2008526865000001.app
【国際調査報告】
2008526865.tif 000049