(57)【要約】本発明は、スフィンゴモナスにおけるエキソポリサッカリド産生を調整することができる核酸配列およびその変種を提供し、粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生する細菌を生成するためのこのような核酸配列の使用方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
高ストリンジェント条件下でプローブとハイブリッド形成したままである配列を含む単離された核酸分子であって、前記プローブが、配列番号１または配列番号１の相補物からなる、単離核酸分子。
【請求項２】
前記核酸分子が、スフィンゴモナス種でのエキソポリサッカリド産生を変化させることができる少なくとも１つのポリペプチドをコードする、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項３】
前記少なくとも１つのコードされたポリペプチドが、配列番号２と少なくとも８０％同一性のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の単離核酸分子。
【請求項４】
前記少なくとも１つのコードされたポリペプチドが、アミノ酸が保存的に置換された配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の単離核酸分子。
【請求項５】
前記少なくとも１つのポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の単離核酸分子。
【請求項６】
前記少なくとも１つのポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列からなる、請求項２に記載の単離核酸分子。
【請求項７】
配列番号１または配列番号１の相補物に記載のヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項８】
前記核酸分子がＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
【請求項９】
請求項２に記載の核酸分子に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む組換え発現ベクター。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのポリペプチドが、第２の核酸配列によってコードされたポリペプチド産物を含む融合タンパク質として発現される、請求項９に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１１】
前記第２の核酸配列が、ポリペプチドタグまたは酵素をコードする、請求項１０に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１２】
前記プロモーターが調節されている、請求項９に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１３】
前記ベクターがプラスミドである、請求項９に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１４】
前記プラスミドがＸ０２９（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５１２７）である、請求項１３に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１５】
配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む核酸分子に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む組換え発現ベクター。
【請求項１６】
請求項９から請求項１５のいずれか一項に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１７】
前記宿主細胞が原核細胞である、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
前記原核細胞がスフィンゴモナス細胞である、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
前記宿主細胞がスフィンガン産生細菌である、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
前記スフィンゴモナス細胞が、ゲラン、ウェラン、ラムサン、ジウタン（ｄｉｕｔａｎ）、アルカラン（ａｌｃａｌａｎ）、Ｓ７、Ｓ８８、Ｓ１９８、およびＮＷ１１からなる群から選択されるスフィンガンを産生することができる、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
前記スフィンガンが、カプセル形態または粘液形態で産生される、請求項１９または請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
前記スフィンガン産生細菌が、スフィンゴモナスα２５２株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５１２８）、Ｘ２８７株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３４８７）、Ｘ５３０株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３４８６）、Ｚ４７３株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３４８５）、またはＸ０３１株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３４８８）である、請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
前記宿主細胞がキサンタン産生細菌である、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
前記キサンタン産生細菌がザントモナス細菌である、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
前記キサンタン産生細菌が、ザントモナスＸ５９株（ＡＴＣＣ  ５５２９８）またはＸ５５株（ＡＴＣＣ  １３９５１）である、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの発現したポリペプチドまたは融合タンパク質が、前記宿主細胞中のエキソポリサッカリド産生レベルを変化させる、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
請求項２から請求項６のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされたポリペプチドを発現する場合でさえも粘液形態のエキソポリサッカリドを産生する単離細菌。
【請求項２８】
前記細菌がスフィンゴモナス細菌である、請求項２７に記載の細菌。
【請求項２９】
前記スフィンゴモナス細菌が、ゲラン、ウェラン、ラムサン、ジウタン、アルカラン、Ｓ７、Ｓ８８、Ｓ１９８、およびＮＷ１１からなる群から選択されるエキソポリサッカリドを産生することができる、請求項２８に記載の細菌。
【請求項３０】
前記細菌が、スフィンゴモナスα０６２株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４４２６）である、請求項２７に記載の細菌。
【請求項３１】
前記細菌がザントモナス細菌である、請求項２７に記載の細菌。
【請求項３２】
前記細菌が、ザントモナスα４４９株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０６４）である、請求項３１に記載の細菌。
【請求項３３】
スフィンゴモナスα０６２株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４４２６）およびその変異体または誘導体からなる群から選択される単離細菌であって、前記細菌が、請求項２から請求項６のいずれか一項に記載の核酸分子およびその混合物によってコードされたポリペプチドを発現する場合、粘液形態のエキソポリサッカリドを産生することができる、単離細菌。
【請求項３４】
ザントモナスα４４９株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０６４）およびその変異体または誘導体からなる群から選択される単離細菌であって、前記細菌が、請求項２から請求項６のいずれか一項に記載の核酸分子およびその混合物によってコードされたポリペプチドを発現する場合でさえも、粘液形態のエキソポリサッカリドを産生することができる、単離細菌。
【請求項３５】
細菌培養においてエキソポリサッカリドを産生する条件下で産生に充分な時間細菌を培養する工程であって、前記細菌が、請求項２から請求項６のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされたポリペプチドを発現する場合でさえも粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生する工程と、
前記培養物から粘液形態の前記エキソポリサッカリドを分離する工程と
を含む、エキソポリサッカリドを高産生する方法。
【請求項３６】
前記細菌がスフィンゴモナス細菌である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記スフィンゴモナス細胞が、ゲラン、ウェラン、ラムサン、ジウタン、アルカラン、Ｓ７、Ｓ８８、Ｓ１９８、およびＮＷ１１からなる群から選択されるエキソポリサッカリドを高産生することができる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記細菌が、スフィンゴモナスα０６２株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４４２６）である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記細菌が、ザントモナスα４４９株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０６４）である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記培養が発酵工程を含む、請求項３５から請求項３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記細菌が、培養物１リットルあたり約２０ｇから約６０ｇのエキソポリサッカリドを産生する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記発酵を、約２５℃〜約３５℃の範囲の温度で約４８時間〜約９６時間行う、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記エキソポリサッカリドの分離がアルコール沈殿を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記アルコール沈殿が、前記培養物に約１〜約１．５培養体積のアルコールを添加する工程を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記発酵培養物の粘度が、約１５，０００ｃｐ〜約４０，０００ｃｐの範囲である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
変異誘発物質（ａ）と粘液形態のエキソポリサッカリドを産生することができる細菌（ｂ）とを接触させる工程（Ａ）であって、前記細菌が、
（ｉ）少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む組換え発現ベクターを含むことと、前記核酸分子が請求項２から請求項６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列であり、かつ前記細菌が、
（ｉｉ）変異誘発された細菌を産生する条件下で産生に充分な時間エキソポリサッカリド産生が抑制されるように（ｉ）の少なくとも１つのポリペプチドを発現する工程（Ａ）と、
前記変異誘発された細菌の間で、粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生することができる１つまたは複数の細菌を同定する工程（Ｂ）と
を含む、粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生することができる細菌の作製方法。
【請求項４７】
前記変異誘発物質がスルホン酸エチルメタンである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記細菌がスフィンゴモナス細菌である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記スフィンゴモナス細胞が、ゲラン、ウェラン、ラムサン、ジウタン、アルカラン、Ｓ７、Ｓ８８、Ｓ１９８、およびＮＷ１１からなる群から選択されるエキソポリサッカリドを産生することができる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記細菌がザントモナス細菌である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
請求項４６から請求項４９のいずれか一項に記載の方法によって産生された細菌。
【請求項５２】
スフィンゴモナスα０６２株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４４２６）。
【請求項５３】
ザントモナスα４４９株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０６４）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、エキソポリサッカリドの産生に関し、より詳細には、エキソポリサッカリド産生を調整することができる核酸配列およびその変種ならびに粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生する細菌を生成するためのこのような核酸配列の使用方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
産業および食品産業で適用するための安価且つ環境に優しいゲル化剤の需要が高まっている。いくつかの例示的なゲル化剤の産業上の適用には、掘削、接着剤、塗料、動物の飼料、家庭用品、日常生活用品（例えば、シャンプー、ローション）、口腔ケア製品（例えば、練り歯磨き）、および医薬品などが含まれる。いくつかの例示的な食品産業におけるゲル化剤の使用には、プディング、乳製品、パイのフィリング、ドレッシング、菓子類、ソース、およびシロップでの使用が含まれる。バイオテクノロジー産業は、商業的利用に許容可能な種々のエキソポリサッカリド製品の利用可能性の増加によってこのゲル化剤の需要に答えている。
【０００３】
細菌エキソポリサッカリドは、その固有のレオロジー特性（例えば、剪断耐性、種々のイオン化合物との適合性、極端な温度、ｐＨおよび塩濃度に対する安定性）により、ゲル化剤または増粘剤として有用な化合物である。種々の細菌は、増粘剤またはゲル化剤として特に有用なエキソポリサッカリドを産生する。例えば、多くのエキソポリサッカリド型を産生する細菌は、スフィンゴモナスである。いくつかのこのようなポリサッカリドには、ゲラン、ウェラン、ラムサン、Ｓ７、およびＳ８８が含まれる（例えば、Ｐｏｌｌｏｃｋ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９：１９３９，１９９３を参照のこと）。スフィンゴモナスによって産生されたエキソポリサッカリドを、「スフィンガン」といい、少なくとも３つのスフィンガン（ゲラン、ウェラン、およびラムサン）が、大量液中発酵によって商業的に産生されている。
【０００４】
多数の細菌エキソポリサッカリド製品は、合成によって産生された材料よりも魅力的な一定範囲の改良点が得られるが、これらは、所望の生成物の回収および精製に関連するコストのために依然として比較的産生に費用かかる。さらに、エキソポリサッカリドのより高い発酵収率が可能な条件により、培養液の粘度も増加し、最終的に、発酵培養液中で充分に細菌成長させるために、酸素および栄養素を効率的に分散させるためのより高いエネルギー導入を必要とする。すなわち、より高いエキソポリサッカリド収率が得られる発酵により、より高い産生コストもかかる。
【０００５】
したがって、より多くのエキソポリサッカリドを産生し、且つ発酵培養液の粘度を増加させない形態でエキソポリサッカリドを産生する細菌の同定を補助するためにエキソポリサッカリドの細菌生合成をより深く理解する必要がある。さらに、このような細菌を作製または同定し、それにより、典型的な産業発酵条件下でエキソポリサッカリドの産生および収率が至適化される方法が必要である。本発明は、このような要求を満たし、さらに、他の関連する利点を提供する。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、一般に、エキソポリサッカリド産生を調整することができる核酸配列およびその変種の使用ならびに粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生する細菌を生成するためのこのような核酸配列の使用方法に関する。
【０００７】
１つの態様では、本発明は、高ストリンジェント条件下でプローブとハイブリッド形成したままである配列を含む単離された核酸分子であって、前記プローブが、配列番号１または配列番号１の相補物からなる、単離核酸分子を提供する。１つの実施形態では、上記単離核酸分子は、スフィンゴモナス種でのエキソポリサッカリド産生を変化させることができる少なくとも１つのポリペプチドをコードする。関連する実施形態では、少なくとも１つのコードされたポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０％同一性のアミノ酸配列を含むか、コードされたポリペプチドは、アミノ酸が保存的に置換された配列番号２のアミノ酸配列を含むか、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列からなる。さらに別の実施形態では、本発明は、配列番号１または配列番号１の相補物に記載のヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を提供する。さらに他の実施形態では、任意の上記ヌクレオチド分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。
【０００８】
別の実施形態では、本発明は、上記核酸分子のいずれか１つに作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む組換え発現ベクターを提供する。さらに別の実施形態では、組換え発現ベクターは、第２の核酸配列によってコードされたポリペプチド産物（タグまたは酵素など）を含む融合タンパク質として調整ポリペプチドを発現する。ある実施形態では、組換え発現ベクターは、調節されたプロモーターを有する。さらに他の実施形態では、組換え発現ベクターはプラスミドである。さらに別の実施形態では、組換え発現ベクターは、プラスミドＸ０２６またはプラスミドＸ０２９（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５１２７、寄託日：２００３年４月４日）である。１つの実施形態では、組換え発現ベクターは、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む核酸分子に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む。
【０００９】
さらに別の実施形態では、本発明は、上記組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞に関する。ある実施形態では、宿主細胞は、スフィンガン産生細菌、スフィンゴモナス細胞、またはスフィンガン産生スフィンゴモナス細菌などの原核細胞である。他の実施形態では、宿主細胞は、ゲラン、ウェラン、ラムサン、ジウタン（ｄｉｕｔａｎ）、アルカラン（ａｌｃａｌａｎ）、Ｓ７、Ｓ８８、Ｓ１９８、およびＮＷ１１などのスフィンガンを産生することができるスフィンゴモナス細菌である。さらに他の実施形態では、宿主細胞は、カプセル形態または粘液形態で産生される。ある実施形態では、宿主細胞は、スフィンゴモナスα２５２株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５１２８，Ｗｅｌａｍ  Ｓｌｉｍｅ；Ａｐｒｉｌ  ４，２００３）、Ｘ２８７株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３４８７，Ｇｅｌｌａｎ  Ｓｌｉｍｅ，Ｊｕｎｅ  ２８，２００１）、Ｘ５３０株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３４８６，Ｊｕｎｅ  ２８，２００１）、Ｚ４７３株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３４８５，Ｊｕｎｅ  ２８，２００１）、Ｘ０３１株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３４８８，Ｊｕｎｅ  ２８，２００１）、またはα２７株である。関連する実施形態では、宿主細胞は、ザントモナス細菌、より詳細には、ザントモナスＸ５９株（ＡＴＣＣ  ５５２９８、１９９２年２月１８日）、Ｘ５５株（ＡＴＣＣ  １３９５１）、α２８７株、α３００株、またはα３０１株などのキサンタン産生細菌である。ある実施形態では、組換え発現ベクター上の核酸から発現したポリペプチドまたは融合タンパク質は、宿主細胞中のエキソポリサッカリド産生レベルを変化させる。
【００１０】
さらに別の態様では、本発明は、上記の核酸分子のいずれかによってコードされたポリペプチドを発現する場合でさえも粘液形態のエキソポリサッカリドを産生することができる細菌を含む、エキソポリサッカリドを産生する単離細菌であって、前記細菌は、スフィンゴモナスα０２７株の変異体またはザントモナスα２８７株、α３００株、もしくはα３０１株の変異体を含む上述した細菌のいずれかである、単離細菌を提供する。他の実施形態では、上記核酸分子のいずれかによってコードされる少なくとも１つのポリペプチドが発現される場合に粘液形態のエキソポリサッカリドを産生する細菌は、α０６２株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４４２６、２００２年６月４日）、α０６３株、α０６５株、もしくはα０６９株、またはザントモナスα４４９株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０６４、２００３年３月１９日）、α４８５、もしくはα５２５株である。さらに他の実施形態では、本発明は、スフィンゴモナスα０６２株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４４２６）、α０６３株、α０６５株、またはα０６９株およびその変異体または誘導体からなる群から選択される単離細菌であって、前記細菌が、上述した核酸分子のいずれかによってコードされる少なくとも１つのポリペプチドを発現する場合でさえも粘液形態のエキソポリサッカリドを産生することができるような単離細菌、および、このような細菌の混合物を提供する。さらに他の実施形態では、本発明は、ザントモナスα４４９株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０６４）、α４８５、またはα５２５株およびその変異体または誘導体からなる群から選択される単離細菌であって、前記細菌が、上記核酸分子のいずれかによってコードされる少なくとも１つのポリペプチドを発現する場合でさえも粘液形態のエキソポリサッカリドを産生することができる単離核酸およびこのような細菌の混合物を提供する。
【００１１】
本発明の別の態様では、エキソポリサッカリドを産生する条件下で産生に充分な時間細菌を培養する工程であって、前記細菌が、前記核酸分子のいずれかによってコードされる少なくとも１つのポリペプチドを発現する場合でさえも粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生する工程と、このような培養物から粘液形態の前記エキソポリサッカリドを分離する工程とを含む、エキソポリサッカリドを高産生する方法を提供する。ある実施形態では、細菌は、スフィンゴモナス細菌（ゲラン、ウェラン、ラムサン、ジウタン、アルカラン、Ｓ７、Ｓ８８、Ｓ１９８、および、ＮＷ１１からなる群から選択されるエキソポリサッカリドを高産生することができるものなど（スフィンゴモナスα０６２株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４４２６）、α０６３株、α０６５株、およびα０６９株が含まれる））である。他のある実施形態では、細菌は、ザントモナス細菌（例えば、ザントモナスα４４９株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０６４）、α４８５、およびα５２５株を含むキサンタンを高産生することができるものなど）である。培養が発酵工程を含むか、細菌が培養物１リットルあたり約２０ｇ〜約６０ｇのエキソポリサッカリドを産生する、上記方法のいずれかも提供する。いくつかの実施形態では、発酵が、約２５℃〜約３５℃の範囲の温度で約４８時間〜約９６時間行われる。さらに他の実施形態では、本発明は、細菌からのエキソポリサッカリドの分離は、アルコール沈殿（培養物への約１〜約１．５培養体積のアルコールの添加など）による、上記方法のいずれかを提供する。他の実施形態では、発酵培養物の粘度が、約１５，０００ｃｐ〜約４０，０００ｃｐの範囲である。
【００１２】
別の態様を参照すれば、本発明は、粘液形態のエキソポリサッカリド産生のために抑制された細菌を変異誘発物質と接触させる工程であって、前記細菌が、
（ｉ）請求項２〜４のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされたポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む組換え発現ベクターを含み、かつ前記細菌が、
（ｉｉ）エキソポリサッカリド産生が抑制されるように（ｉ）のポリペプチドを発現する工程と、
エキソポリサッカリド産生を抑制することができるポリサッカリドの存在下で粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生することができる細菌をこれらの細菌から同定する工程とを含む、粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生することができる細菌の作製方法を提供する。
ある実施形態では、変異誘発物質（ａ）と、粘液形態のエキソポリサッカリドを産生することができる細菌（ｂ）とを接触させる工程であって、前記細菌が、
（ｉ）少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む組換え発現ベクターを含み、前記核酸分子が上記ヌクレオチド配列のいずれかであり、かつ前記細菌が、
（ｉｉ）変異誘発された細菌を産生する条件下で産生に充分な時間エキソポリサッカリド産生が抑制されるように（ｉ）の少なくとも１つのポリペプチドを発現する工程（Ａ）と、前記変異誘発された細菌の間で、粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生することができる１つまたは複数の細菌を同定する工程（Ｂ）とを含む、粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生することができる細菌の作製方法を提供する。１つの実施形態では、この方法で使用される変異誘発物質はスルホン酸エチルメタンであり、細菌はスフィンゴモナス細菌、例えば、ゲラン、ウェラン、ラムサン、ジウタン、アルカラン、Ｓ７、Ｓ８８、Ｓ１９８、およびＮＷ１１から選択されるエキソポリサッカリドを産生することができるものなど（スフィンゴモナスα０２７株を含む）である。
【００１３】
別の態様では、本発明は、スフィンゴモナスα０６２株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４４２６）、α０６３株、α０６５株、またはα０６９株などのスフィンゴモナスα０２７株の変異体およびα４４９株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０４６）、α４８５、または、α５２５株などのザントモナスα３００の変異体を含む、上記方法のいずれか１つによって産生された細菌を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本明細書中に記載のように、本発明は、エキソポリサッカリド生合成の調整因子をコードする核酸分子を提供し、ならびに、もはや調整因子に応答せず、それにより、より高いレベルのエキソポリサッカリドを産生することができる細菌を同定するための前記核酸分子の作製および使用方法を提供する。スフィンガンポリサッカリドなどの生体高分子の大量産生を容易にするために改良されたエキソポリサッカリド産生細菌を作製するための遺伝子技術の使用が望ましい。しかし、このような巨大分子を合成する代謝エネルギーの不必要な消費がある時期、例えば、エネルギーを成長に向かわせなければならない時期に起こる場合、細菌生存が危うくなるので、生体高分子の合成は高度に制限される。さらに、多数のタンパク質を作製してこれらの高分子を輸送する必要があるので、エキソポリサッカリドの合成およびアセンブリの制限は非常に複雑である。本発明は、もはや負の制御因子に応答しないスフィンゴモナス誘導体を生成するために、スフィンガン生合成の負の制御因子をコードし、その結果として、通常のスフィンガンエキソポリサッカリド量よりも大量に産生することができる核酸配列の同定および使用によってこれらの問題を解決する。
【００１５】
本説明では、特記しない限り、任意の濃度範囲、比率範囲、または整数範囲は、引用した範囲内の任意の整数値、および、適切な場合、その分数（整数の１／１０および１／１００など）が含まれると理解すべきである。本明細書中で使用される、「約」、「本質的に含む」は、平均±１５％を意味する。代替物（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）（例えば、「または」）の使用は、代替物のいずれか１つ、両方、または任意の組み合わせを意味すると理解すべきである。用語を単数形で記載する場合、本発明者らはその用語の複数形も意図する。さらに、本明細書中に記載の構造および置換基の種々の組み合わせ由来の各化合物または化合物の群は、各化合物または化合物の群が個別に記載されているのと同一の範囲で本出願によって開示されていると理解すべきである。したがって、特定の構造または特定の置換基の選択は、本発明の範囲内である。
【００１６】
スフィンガンポリサッカリド
本明細書中で使用される、用語「スフィンガン」および句「スフィンガンエキソポリサッカリド」は、スフィンゴモナス属のメンバーによって分泌された関連するが異なるポリサッカリド群をいう（Ｐｏｌｌｏｃｋ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９：１９３９−１９４５，１９９３）。スフィンゴモナス属の代表的なメンバーおよびこれらが産生するスフィンガンには、エキソポリサッカリドＳ−６０（ゲラン）を産生するスフィンゴモナス・パウチモビリス（ＡＴＣＣ  ３１４６１、以前はシュードモナス・エロデア）（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．４，３７７，６３６；４，３２６，０５３；４，３２６，０５２、および４，３８５，１２３を参照のこと）；エキソポリサッカリドＳ−７を産生するスフィンゴモナス種ＡＴＣＣ  ２１４２３（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．３，９６０，８３２を参照のこと）；エキソポリサッカリドＳ−８８を産生するスフィンゴモナス種ＡＴＣＣ  ３１５５４（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．４，３３１，４４０および４，５３５，１５３を参照のこと）；エキソポリサッカリドＳ−８８を産生するＳ−１３０（ウェラン）を産生するスフィンゴモナス種ＡＴＣＣ  ３１５５５（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，３４２，８６６を参照のこと）；エキソポリサッカリドＳ−１９４（ラムサン）を産生するスフィンゴモナス種ＡＴＣＣ  ３１９６１（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，４０１，７６０を参照のこと）；エキソポリサッカリドＳ−１９８を産生するスフィンゴモナス種ＡＴＣＣ  ３１８５３（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，５２９，７９７を参照のこと）；エキソポリサッカリドＳ−６５７（ジウタン）を産生するスフィンゴモナス種ＡＴＣＣ  ５３１５９（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，１７５，２７８を参照のこと）；エキソポリサッカリドＮＷ１１を産生するスフィンゴモナス種ＡＴＣＣ  ５３２７２（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，８７４，０４４を参照のこと）；および生体高分子Ｂ−１６（アルカラン）を産生するスフィンゴモナス種ＦＥＲＭ  ＢＰ−２０１５（以前はアルカリゲネス・ラタスＢ−１６）（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，１７５，２７９を参照のこと）などが含まれる。
【００１７】
スフィンガンの構造は全ていくらか関連している。各スフィンガンの主鎖は、４つの糖（Ｄ−グルコース、Ｄ−グルクロン酸、Ｌ−マンノース、およびＬ−ラムノースが含まれる）の関連配列からなる。スフィンガン群のポリサッカリドメンバーを、ポリマー骨格を形成する炭水化物、アシル置換基（例えば、アセチル、グリセリル、ピルビル、ヒドロキシブタノール）の有無、および側鎖の有無によって互いに区別可能である。例えば、スフィンガンポリサッカリドは、ポリマー骨格炭水化物に結合した炭水化物側鎖およびアセチル基またはピルビル基を含み得る。例えば、Ｍｉｋｏｌａｊｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：４０２，１９９４を参照のこと。ある実施形態では、スフィンガンエキソポリサッカリドのメンバーを、以下の一般的な反復化学構造：
【化１】
2008507267.tif 000002
（式中、Ｇｌｃはグルコースであり、ＧｌｃＡはグルクロン酸または２−デオキシ−グルクロン酸であり、Ｒｈａはラムノースであり、Ｍａｎはマンノースであり、ＸはＲｈａまたはＭａｎであってよく、ＺはＧｌｃ残基２に結合し、α−Ｌ−Ｒｈａ−（１−４）−α−Ｌ−Ｒｈａ、α−Ｌ−Ｍａｎ、またはα−Ｌ−Ｒｈａであってよく、ＹはＧｌｃ残基１に結合し、β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１−６）−α−Ｄ−Ｇｌｃ、β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１−６）−β−Ｄ−Ｇｌｃ、またはα−Ｌ−Ｒｈａであってよく、下付き文字ｍおよびｎは、独立して、０〜約１であってよく、ポリマーの「還元末端」は、骨格のＸ残基に向かっている）によって示すことができる。標準的技法では、オリゴサッカリドまたはポリサッカリドの還元末端を右側に配置する。本明細書中で使用される、用語「骨格」または「主鎖」は、Ｙ鎖およびＺ鎖を除く（すなわち、ｍおよびｎが０に等しい場合）構造の一部をいう。
例えば、ゲラン（Ｓ−６０）の主鎖は、糖であるＤ−グルコース、Ｄ−グルクロン酸、およびＬ−マンノースを２：１：１のモル比で含み、これらが互いに結合して以下のサブユニットの順序のテトラサッカリド繰り返し単位を形成する：グルコース、グルクロン酸、グルコース、ラムノース。
別のスフィンガン（ジウタン（Ｓ−６５７））の主鎖は、ヘキサポリサッカリド繰り返し単位を形成するグルコース残基２に結合したＬ−ラムノースのさらなるジサッカリド側鎖を有するという点でゲランと異なる。
さらに別のスフィンガン（ウェラン（Ｓ−１３０））は、ゲランと同一の一次構造を有するが、ペンタポリサッカリド繰り返し単位を形成するグルコース残基２に結合した１つのＬ−マンノースまたは１つのＬ−ラムノースの側鎖を有する。
【００１８】
スフィンガンポリサッカリドファミリーのいくつかのメンバーは、種々の位置でアセチル化される。例えば、本明細書中に記載するように、ゲラン（「ゲランガム」ともいう）は、ウェランと同一の炭水化物骨格（すなわち、Ｘ＝Ｒｈａ）を有するが、ウェランが有する側鎖の糖を欠き（すなわち、ｍ＝０およびｎ＝０）、ウェランと対照的に、グルコース残基１が完全にグリセリル化し（ｇｌｙｃｅｒｙｌａｔｅｄ）、部分的にアセチル化している。ゲランガムは、平均して、テトラサッカリド繰り返し単位あたり約１個のグリセリル基と、および２つの繰り返し単位あたり約１つのアセチル基とを有する。アシル基を含む別のスフィンガンは、グルコース残基２の２位および／または６位にアセチル基を含むジウタン（Ｓ−６５７）である。当分野で公知であり、且つ本明細書中に記載されているように、スフィンガンポリサッカリドを、従来の様式で脱アシル化を促進してアシル基を除去する条件に供することができる。したがって、本明細書中で使用される、「脱アシル化」は、グリセリル基およびアセチル基などの１つまたは複数のアシル置換基を欠くスフィンガンポリサッカリドをいう。
【００１９】
背景知識として、スフィンゴモナスは、カプセルまたは粘液形態のスフィンガンエキソポリサッカリドを産生することができる。本明細書中で使用される、「カプセル」は、産生される細菌細胞の表面に付着し、希釈、沈殿、または遠心分離後でさえも細胞に付着したままであるポリサッカリドをいう。典型的には、細菌細胞からカプセルエキソポリサッカリドを分離するためには、物理的（例えば、加熱）または化学的処理のいくつかの型が必要である。
本明細書中で使用される、「粘液」は、産生される細菌細胞に付着しないポリサッカリドをいう。すなわち、粘液形態のエキソポリサッカリドを、例えば、発酵培養液または培養液の水希釈物の遠心分離によって（熱処理または他の物理的または化学的処理の非存在下でさえも）細菌細胞から実質的に分離することができる。当分野で公知のように、粘液形態のエキソポリサッカリドを産生する細菌を、光学顕微鏡での観察によってカプセルポリサッカリドを産生する細菌と区別することができる：カプセル化スフィンゴモナスが多細胞凝集体を形成する一方で、粘液形成細菌は均一に分散される。さらに、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，６０５，４６１に記載の変異誘発によって、カプセル化スフィンゴモナスを、粘液性のスフィンゴモナスに変換することができる。
【００２０】
本明細書中で使用される、用語「スフィンゴモナス」は、本明細書中に記載のように、エキソポリサッカリド（例えば、スフィンガン）を産生するグラム陰性細菌属およびその誘導株をいう。グラム陰性細菌のスフィンガン産生ファミリーは、１９９３年にスフィンゴモナス属に属すると最初に同定された（Ｐｏｌｌｏｃｋ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．１３９：１９３９，１９９３を参照のこと）。本発明で有用なスフィンゴモナスには、親スフィンゴモナス株およびその誘導株が含まれる。
本明細書中で使用される、「親株」は、親株の遺伝子の中身（例えば、ゲノム配列内またはゲノム外配列の置換、挿入、または欠失）または表現型を修飾する化学的変異誘発、生物学的変異誘発、または他の型の変異誘発などの任意の処理の前の細菌群または各細菌をいう。当業者は、変異スフィンゴモナスといえども、その後の一連の変異処理にて、カプセル形態ではなく粘液形態のエキソポリサッカリドを産生するスフィンゴモナス誘導株などの「親株」になり得ることを理解している。本明細書中で使用される、用語「誘導体」は、スフィンゴモナスの種、株、または細菌をいう場合、本明細書中に記載されるように、スフィンガンエキソポリサッカリドを産生する能力が本質的に同一なままであるか増強される任意のスフィンゴモナスの種、株、または細菌を意味する。
【００２１】
さらに、本明細書中で使用される、「遺伝子が変異された」、「遺伝子が修飾された」、「変異誘発された」、および「変異体」は、１つまたは複数の自発的または誘導性の変異を有する特質、変異された細菌または株を親細菌または株と区別する性質を示す特質をいう。したがって、スフィンガンエキソポリサッカリドを高産生する変異スフィンゴモナスの種、株、または細菌は、本発明の目的のための親スフィンゴモナスの種、株、細菌の誘導体として意図される。本明細書中で使用される、「誘導性変異誘発」は、ＤＮＡの遺伝子変化を誘導することが一般に公知の薬剤（化合物、電磁照射、イオン化照射、および生物学的因子（ウイルス、プラスミド、挿入エレメント、またはトランスポゾンなど）が含まれる）での細菌細胞の処理を意味する。１つの好ましい実施形態では、本発明は、エキソポリサッカリド生合成の負の制御因子の存在下でエキソポリサッカリドを産生する変異スフィンゴモナスを提供する。
【００２２】
本明細書中で使用される、用語「生合成」は、中間体または最終産物に到達するためのいくつかの生合成工程を含み得る、核酸、ポリペプチド、またはポリサッカリドなどの任意の高分子型（例えば、スフィンゴモナスのスフィンガンまたはザントモナスのキサンタン）の生物学的な産生または合成を説明する。例えば、スフィンガンエキソポリサッカリドは、多数の細菌酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ）によって調節される一連の工程において各炭水化物単位から合成される。用語「バイオマス」は、細菌培養物中のエキソポリサッカリドおよび細菌細胞をいう。
【００２３】
ある実施形態では、本発明のスフィンゴモナスは、粘液形態のエキソポリサッカリドを産生する。例えば、粘液形態のスフィンガンエキソポリサッカリドを合成および輸送するように遺伝子が変異されたスフィンゴモナス株を、本発明の文脈では、「親株」として使用することができる。本発明で有用なスフィンゴモナス親株の例には、粘液形態のゲランガム（Ｓ−６０）を産生するＸ２８７株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３４８７）株、粘液形態のウェランガム（Ｓ−１３０）を産生するＸ５３０株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３４８６）およびα２５２株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５１２８）、粘液形態のエキソポリサッカリドＳ−８８を産生するＺ４７３株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３４８５）、ならびに粘液形態のエキソポリサッカリドＳ−７を産生するＸ０３１株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３４８８）（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．５，３３８，８４１および６，６０５，４６１を参照のこと）が含まれる。粘液形態のスフィンガンエキソポリサッカリドを産生するスフィンゴモナス株の１つの利点は、発酵培養液の粘度を有意に減少させることができ、漸増量の所望のポリサッカリドを蓄積することが可能であることである。しかし、例示的な粘液形態のＸ２８７株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３４８７）が親スフィンゴモナス・パウチモビリス（ＡＴＣＣ  ３１４６１）株と同じようなレベルでゲランガムを産生する一方で、依然として培養液の粘度が遊離に減少する。したがって、本発明の１つの態様は、スフィンガンなどのポリサッカリドの発現を調整することができる核酸配列の同定である。
【００２４】
スフィンガン生合成調整因子
多数の細菌種は、グルコースなどの容易に変換可能な炭素源および適量の酸素を供給した場合に酸性ポリサッカリドを合成および分泌する。細菌スフィンゴモナス属のいくつかのメンバーは、まとめてスフィンガンとして知られる種々の酸性ポリサッカリドを産生する。一定の環境状況下で、細菌は、負の制御因子系を介したエキソポリサッカリド産生の最小化によってエネルギーを保存する。本発明は、一般に、スフィンゴモナスにおけるエキソポリサッカリド産生を変化させる（例えば、統計的に有意な様式で増減する）ことができる１つまたは複数のポリペプチドをコードする核酸配列に関する。本発明はまた、もはやエキソポリサッカリド生合成の制御因子に応答しない細菌のスクリーニングによって粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生することができる細菌の作製方法に関する。したがって、本発明の一定の好ましい実施形態では、スフィンゴモナス属におけるエキソポリサッカリド産生を調整することができる１つまたは複数のポリペプチドをコードする単離核酸分子を使用して、例えば、粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生する（すなわち、統計的に有意な様式で親株よりも大量に産生する）ことができる変異細菌を作製する。
【００２５】
エキソポリサッカリド産生を調整することができる適切な核酸分子およびポリペプチドには、天然に存在する核酸分子およびポリペプチドならびにその誘導体または類似体が含まれるが、これらに限定されない。
「精製ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質」または「精製核酸分子」は、事実上核酸分子またはポリペプチドに会合する炭水化物、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、または他のタンパク性夾雑物などの夾雑細胞成分を個別に本質的に含まない配列である。好ましくは、精製核酸およびポリペプチドは、本発明の化学的カップリング反応での使用または必要に応じて他の用途に充分に夾雑物を含まない。「単離ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質」または「単離核酸分子」は、その元の環境から取り出されている（天然の環境下で（例えば、天然環境は変化していない細胞であり得る）共存している物質のいくつかまたは全部から分離されているなど）配列である。
【００２６】
標準的な分子遺伝子技術を使用して、エキソポリサッカリド生合成の調整因子をコードする核酸を同定および単離することができる。
本明細書中で使用される、「調整因子」は、典型的には、本明細書中に記載のアッセイまたはスクリーニングにおける生物学的過程でのインヒビターまたはアクチベーター（または両方）（例えば、リプレッサー、アクチベーター、σ因子、抗菌薬、アンチセンス分子、干渉分子、および酵素など）としての活性を（直接的または間接的に）有する生体高分子（例えば、核酸、タンパク質、非ペプチド、または有機分子）などの化合物（天然に存在するか天然に存在しない）をいう。「調整」は、統計的に有意な様式で生物活性または過程の機能的性質（例えば、遺伝子発現、酵素活性、または受容体結合）を増強または阻害する（またはその両方）化合物の能力をいう。例えば、当分野で周知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９を参照のこと）を使用して、スフィンゴモナスＳ−８８種（ＡＴＣＣ  ３１５５４）由来のゲノム発現ライブラリーを構築し、カプセル形態または粘液形態（好ましくは、粘液形態）のエキソポリサッカリドを発現する細菌（例えば、スフィンゴモナスＸ０３１株）に形質転換し、もはやエキソポリサッカリドを発現しない組換え細菌をスクリーニングすることができる。
【００２７】
本発明のこのような方法を使用して、（約２，６００個のヌクレオチド、配列番号３の）核酸分子を同定し、スフィンガン生合成を直接または間接的に阻害する１つまたは複数のポリペプチドをコードするスフィンゴモナスＳ−８８種ゲノムから単離した。さらに、配列番号３から単離した５７３個のヌクレオチド（配列番号１）のフラグメントを、スフィンゴモナス（Ｓ−７、Ｓ−８８、Ｓ−１３０、Ｓ−１９４、Ｓ−１９８、およびＮＷ１１）のスフィンガン生合成を阻害するのに充分であると同定した。配列番号１はまた、ザントモナスにおけるキサンタン生合成を阻害することができる（例えば、ザントモナス・キャンペストリスＸ５９、ＡＴＣＣ  ５５２９８）。好ましい実施形態では、エキソポリサッカリド生合成の調整因子は、ポリペプチド調整因子をコードする核酸分子であり、好ましくは、調整因子は、エキソポリサッカリド生合成の負の調整因子である。すなわち、エキソポリサッカリド生合成の負の調整因子をコードする核酸を発現する宿主細胞により、その宿主細胞におけるエキソポリサッカリドの発現が阻害される。
【００２８】
背景の目的とし、且つ理論に拘束されることを望まないが、配列番号３の核酸配列の分析により、この配列によって潜在的に３つのポリペプチド（３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ（ＤＡＨＰＳ）の相同体、ＭＰＧと呼ばれる新規のポリペプチド、およびＳｐｓＮと呼ばれる新規のポリペプチドが含まれる）がコードされることが明らかとなった。ＤＡＨＰＳは、芳香族アミノ酸の生合成に関与する。さらに、配列番号１は、ＳｐｓＮ、ＭＰＧ、およびＤＡＨＰＳのカルボキシル末端をコードする。したがって、本明細書中により詳細に記載されているように、１つまたは複数のＭＰＧおよびＳｐｓＮは、スフィンガンおよびキサンタンの生合成の直接的または間接的な調整因子として機能することができる。実施例３は、いかにｓｐｓＮ核酸配列の存在が一定の細菌のエキソポリサッカリド生合成の阻害に必要であり、且つ潜在的に充分であるかを記載する。好ましい実施形態では、本発明は、スフィンゴモナス種またはザントモナス種におけるエキソポリサッカリド産生を変化させることができる少なくとも１つのポリサッカリドをコードする配列番号３または配列番号１に記載の核酸分子を提供する。さらに、本発明は、それ自体が調整因子として機能するか、調整因子として機能する別の核酸をコードする配列番号３または配列番号１に記載の核酸分子にも関すると理解すべきである。したがって、別の好ましい実施形態では、スフィンゴモナス種またはザントモナス種におけるエキソポリサッカリド産生を変化させることができる配列番号３または配列番号１に記載の核酸分子を提供する。
【００２９】
エキソポリサッカリド生合成の調整因子をコードする単離核酸の特定の実施形態が配列番号３および１に記載されている一方で、本発明の文脈内で、１つまたは複数の単離核酸の言及には、これらが配列番号４または配列番号２などのエキソポリサッカリド生合成の調整因子と類似の構造および機能を有する天然または非天然のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードするという点で実質的に類似のこれらの配列の変種が含まれる。
本明細書中で使用されるように、ヌクレオチド配列は、
（ａ）ヌクレオチド配列がスフィンゴモナスまたはザントモナスから単離した配列番号３または１のコード領域に由来する場合（例えば、上記で考察した配列の配列または対立遺伝子異形（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）の一部が含まれる）、
（ｂ）ヌクレオチド配列が中ストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシー下で本発明のヌクレオチド配列とハイブリッド形成することができる場合、
（ｃ）ヌクレオチド配列が、（ａ）または（ｂ）で定義したヌクレオチド配列の遺伝コード中の「ゆらぎ」の結果として縮重する場合（すなわち、配列が、異なるコドン配列を使用して同一のアミノ酸をコードする配列）、または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載の任意の配列の相補物である場合、「実質的に類似している」と考えられる。本明細書中に記載のように、ポリヌクレオチド変種は、コードされたポリペプチドの活性が好ましくは実質的に減少するような１つまたは複数の置換、付加、欠失、および／または挿入を含み得る。
【００３０】
１つの実施形態では、高ストリンジェント条件下でプローブとハイブリッド形成したままである配列を含む単離された核酸分子であって、前記プローブが、配列番号１または配列番号１の相補物からなる、単離核酸分子が好ましい。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１または配列番号１の相補物からなる単離核酸分子を提供する。したがって、本発明のある単離核酸は、エキソポリサッカリド生合成の調整因子をコードする核酸、その類似体、相同体、もしくは誘導体の存在の検出に有用であるか、エキソポリサッカリド生合成を変化させることができるポリペプチドの発現に有用である。本明細書中で使用される、「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」は、少なくとも１０塩基長のヌクレオチドのポリマー形態（リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのいずれかまたはいずれかのヌクレオチド型の修飾形態）をいう。この用語には、一本鎖および日本鎖形態のＤＮＡもしくはＲＮＡまたは多数の公知の天然および非天然の核酸の変種のいずれか（例えば、ホスホロチオエートを含む核酸などのより高い分解耐性を有する核酸）が含まれる。ある実施形態では、エキソポリサッカリド生合成の調整因子をコードする核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。
【００３１】
「中ストリンジェントハイブリッド形成条件」および「高ストリンジェントハイブリッド形成条件」は、標的配列の一部が実質的にプローブ配列の相補物と類似する場合のみでハイブリッド形成を容易に検出することができる、ヌクレオチド塩基対合および水素結合形成の確立された原理にしたがった標的ヌクレオチドへのプローブヌクレオチド配列のハイブリッド形成条件である。ハイブリッド形成条件は、プローブサイズならびに当業者に公知の様式での温度、時間、および塩濃度によって変化する。例えば、５０ヌクレオチドプローブについての中ハイブリッド形成条件は、５×ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥ＝１８０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．７）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ液（１００×Ｄｅｎｈａｒｄｔ液＝２％（ｗ／ｖ）ウシ胎児血清、２％（ｗ／ｖ）Ｆｉｃｏｌｌ、２％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン）、および０．５％ＳＤＳを含む緩衝液で５５〜６０℃で一晩インキュベートしたハイブリッド条件を含む。中ストリンジェンシーでのハイブリッド形成後の洗浄を、典型的には、０．５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）または０．５×ＳＳＣ中にて５５〜６０℃で行う。高ストリンジェントハイブリッド形成条件は、典型的には、５０％ホルムアミドの存在下での４２℃で一晩の２×ＳＳＰＥ、その後の約０．１×ＳＳＣ〜０．２ＳＳＣ、および０．１ＳＤＳでの６５℃で３０分間またはそれを超えた１回またはそれを超えた洗浄を含むであろう。
【００３２】
本発明のエキソポリサッカリド生合成の調整因子をコードする単離核酸を、種々の方法を使用して得ることができる。例えば、上記のように、ＳｐｓＮまたはＭＰＧポリペプチドとの反応性を示す抗体でのスクリーニングによってｃＤＮＡまたはゲノム発現ライブラリーから核酸分子を得ることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９８７を参照のこと）。さらに、ランダムプライミングＰＣＲを行うことができる（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５４：２７５，１９９５を参照のこと）。さらに、特に、特定の遺伝子または遺伝子ファミリーが望ましい場合、ランダムプライミングＰＣＲの変形形態も使用することができる。１つのこのような方法では、一方のプライマーはランダムプライマーであり、他方はエキソポリサッカリド生合成の調整因子をコードするアミノ酸配列またはヌクレオチド配列に基づいた縮重プライマーである。
【００３３】
他の方法を使用して、エキソポリサッカリドの調整因子をコードする単離核酸分子を得ることもできる。例えば、本明細書中に提供した配列情報を使用して、放射性標識、酵素標識、タンパク質標識、または蛍光標識などで標識されることができるプローブであって、例えば、１つまたは複数の選択された宿主細胞中での複製または発現のためにデザインされたファージベクター、プラスミドベクター、ファージミドベクター、またはウイルスベクター中で構築されたゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーとハイブリッド形成することができるプローブを合成することによって、核酸分子を単離することができる（例えば、上述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．の文献；上述のＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．の文献を参照のこと）。上記のように、ＲＮＡまたはゲノム核酸配列を示すＤＮＡを、配列番号１および３に示す単離核酸配列またはその変種の５’および３’配列に相補的なプライマー対を使用した増幅によって得ることもできる。クローニングを簡単にするために、プライマーに制限酵素部位を組み込むこともできる。したがって、本発明は、特に、スフィンゴモナスまたはザントモナス由来のサンプル中でのエキソポリサッカリド生合成の調整因子をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡまたはＤＮＡの増幅に特異的なＰＣＲ増幅手順で使用するためのプライマーとして有用である核酸分子を含む（ＰＣＲ手順については、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，６８３，１９５；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，９６５，１８８；ａｎｄ  Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９５を参照のこと）。このようなＰＣＲ増幅法は当分野で公知であり、プライマー伸長ＰＣＲ、実時間ＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ（Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２６：１１２，１９９９）、逆ＰＣＲ（Ｔｒｉｇｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８１８６，１９８８）、捕捉ＰＣＲ（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．１：１１１，１９９１）、差分（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）プライマー伸長（ＷＯ  ９６／３０５４５）、および当分野で公知であるかその後に開発された他のＰＣＲ増幅法（例えば、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ．１９９５を参照のこと）が含まれる。
【００３４】
操作時、ＰＣＲ法は、一般に、化学合成されたプライマー分子の使用を含むが、これらを、酵素または組換えによって生成することができる。ＰＣＲプライマーは、一般に、特定の遺伝子または条件の同定に好ましい条件下で使用される２つのヌクレオチド配列（センス方向（５’−＞３’）のものおよびアンチセンス方向３’−＞５’のもの）を含む。同一のＰＣＲプライマー；オリゴマーのネスト化された組；またはオリゴマーの縮重プールを、密接に関連するＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列の検出および／または定量のための低ストリンジェントな条件下で使用することができる。これらの核酸分子を、サンプル中のコンタクチンｍＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子を同定するためのプローブとして個別または組み合わせて使用することもできる。これらの核酸は、以下を含む：
５’−ＧＡＣＧＧＡＴＣＣＴＴＧＣＣＧＡＧＧＴＧＣＧ−３’（配列番号５）、
５’−ＣＧＡＣＧＧＣＣＡＣＴＡＣＴＡＧＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧ−３’（配列番号６）、
５’−ＧＴＣＣＧＴＣＧＧＴＡＴＣＴＡＣＧＧＣＴＴＣＧＡＡＣＧ−３’（配列番号７）。
配列番号５は順方向プライマーであり、配列番号６および配列番号７は逆方向プライマーである。
【００３５】
本発明の核酸分子を、当分野で公知の種々の方法によって作製することができる。例えば、核酸分子を、当分野で公知の合成手順または分子生物学的技術を使用して作製することができる（例えば、上述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．の文献を参照のこと）。当業者は、本発明の核酸分子の長さを、核酸分子が使用される特定の目的に依存して容易に選択することができる。ＰＣＲプライマーのために、核酸分子の長さは、好ましくは約１０ヌクレオチド長と約５０ヌクレオチド長との間、より好ましくは約１２ヌクレオチド長と約３０ヌクレオチド長との間、最も好ましくは約１５ヌクレオチド長と約２５ヌクレオチド長との間である。プローブのために、核酸分子の長さは、好ましくは約２０ヌクレオチド長と約１，０００ヌクレオチド長との間、より好ましくは約１００ヌクレオチド長と約５００ヌクレオチド長との間、最も好ましくは約１５０ヌクレオチド長と約４００ヌクレオチド長との間である。
【００３６】
本明細書中に提供した単離された配列番号１および３のヌクレオチド配列の変種（対立遺伝子が含まれる）を、合成または構築された天然の変種（例えば、多型、変異体、および他の血清型）から容易に得ることができる。変異体生成のための多数の方法が開発されている（一般に、上述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．の文献；上述のＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．の文献を参照のこと）。簡単に述べれば、ヌクレオチド置換物の好ましい生成方法は、変異すべき塩基にわたり、且つ変異塩基を含むオリゴヌクレオチドを使用する。オリゴヌクレオチドを相補的な一本鎖核酸とハイブリッド形成し、オリゴヌクレオチドから第２の鎖の合成が開始される。大腸菌または他の原核生物および酵母および他の真核生物などの宿主細胞への形質転換のための二本鎖核酸を調製する。標準的なスクリーニングおよびベクター増幅プロトコールを使用して、変異配列を同定し、これが高収率で得られる。
【００３７】
同様に、エキソポリサッカリド生合成の調整因子をコードする核酸分子の欠失または挿入を、任意の種々の公知の方法によって構築することができる。例えば、配列は、制限酵素またはヌクレアーゼで消化され、配列が欠失、付加、または置換されるように再ライゲーションすることができる。同様に、種々のトランスポゾンおよび他の挿入エレメントを使用して、欠失および挿入された組換え体を作製することができる。したがって、１つの例では、本明細書中に記載のように、ｓｐｓＮコード配列中にＴｎ１０Ｋａｎトランスポゾンを含むｓｐｓＮ変異体を、当分野で公知の方法によって作製することができる。変種配列の他の生成手段（これも公知である）を、過度の実験を必要とすることなく使用することができる（例えば、上述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．の文献および上述のＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．の文献を参照のこと）。さらに、典型的には、制限酵素マッピング、配列分析、およびハイブリッド形成などによって変種配列の検証を行う。エキソポリサッカリド生合成を変化させることができるエキソポリサッカリド生合成の調整因子をコードする変種は、本発明の文脈で特に有用である。
【００３８】
当業者は、他のｓｐｓＮコード配列を類似の様式で同定および単離することができることを認識するであろう。例えば、ｓｐｓＮの類似体もしくは誘導体またはスフィンゴモナスまたは他の関連細菌（ザントモナスまたはシュードモナスなど）の他の種由来のｓｐｓＮ相同体を、本明細書中に記載のアッセイを使用して同定および単離することができる。したがって、ある実施形態では、スフィンゴモナスまたはザントモナスにおけるエキソポリサッカリド生合成の好ましい調整因子は、配列番号３または配列番号１に記載の核酸配列およびエキソポリサッカリド生合成を変化させることができる配列番号３または配列番号１の類似体または誘導体を含む。本明細書中で使用される、用語「誘導体」および「類似体」は、エキソポリサッカリド生合成の調整因子をいう場合、上記のように、このような親調整因子と生物学的機能または活性が本質的に同一なままであるか（少なくとも５０％、好ましくは７０％、８０％、９０％、または９５％超）、増強されたエキソポリサッカリド生合成の任意の調整因子をいう。このような類似体および誘導体の生物学的機能および活性を、本明細書中に記載され、且つ当分野で公知のアッセイなどを使用した標準的な方法（例えば、プレートアッセイ、ゲル分析、転写アッセイ、翻訳アッセイ）を使用して決定することができる。例えば、類似体または誘導体は、切断によって活性化することができるプロタンパク質であり得るか、アミノ酸修飾によって活性化または安定化されてエキソポリサッカリド生合成の活性な調整因子を産生することができる前駆体であり得る。あるいは、エキソポリサッカリド生合成の調整因子およびその類似体または誘導体を、１つまたは複数の調整因子抗体に特異的に結合する能力によって同定することができる。
【００３９】
類似体または誘導体の別の例には、天然に存在する調整因子のアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数のアミノ酸が保存的に置換されたエキソポリサッカリド生合成の調整因子（例えば、ＳｐｓＮ）が含まれる。共通のアミノ酸の間で、「保存的なアミノ酸置換」は、例えば、以下の各群内のアミノ酸間での置換によって説明する（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（３）セリンおよびトレオニン、（４）アスパラギン酸およびグルタミン酸、（５）グルタミンおよびアスパラギン、ならびに（６）リジン、アルギニン、およびヒスチジン、またはこれらの組み合わせ。さらに、調整因子の類似体または誘導体には、例えば、通常のアミノ酸の前駆体などの非タンパク質アミノ酸（例えば、ホモセリンおよびジアミノピメレート）、異化経路における中間体（例えば、ピペコリン酸および通常のアミノ酸のＤ−エナンチオマー）、およびアミノ酸類似体（例えば、アゼチジン−２−カルボン酸、ホモプロリン、およびカナバニン）が含まれ得る。
【００４０】
類似体または誘導体のさらに他の実施形態には、親分子（すなわち、「親」分子は、例えば、親が野生型ＳｐｓＮまたはＳｐｓＮの類似体であえるかどうかの出発点に依存する）と少なくとも約６０％の同一性、より好ましくは少なくとも約７０％、８０％、９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の同一性を保持するエキソポリサッカリド生合成の調整因子が含まれる。本明細書中で使用される、「パーセント同一性」または「％同一性」は、コンピューター実行アルゴリズム、典型的には、デフォルトパラメーターを使用して、被験物のポリペプチド、ペプチド、またはその類似体もしくは変種配列全体と、試験配列とを比較することにより、換算される（ｒｅｔｕｒｎｅｄ）百分率の値である。任意の標準的なソフトウェアプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標）（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）製のＬａｓｅｒｇｅｎｅ（登録商標）バイオインフォマティクス演算スイートで提供されているソフトウェアプログラムなど）を使用して、配列比較を行うことができる。ＢＬＡＳＴ（登録商標）またはＡＬＩＧＮなどのアルゴリズムについての参考文献は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５，１９９１；またはＨｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９，１９９２に見出すことができ、好ましくはＢＬＡＳＴ（登録商標）を使用する（本明細書中で使用される、ＢＬＡＳＴ（登録商標）は、１つまたは複数の以下の検索アルゴリズムをいい（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）ウェブサイト（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）で利用可能なＢＬＡＳＴｎ、ＭＥＧＡＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴｐ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、ＰＨＩ−ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴｘ、ｔＢＬＡＳＴｎ、ｔＢＬＡＳＴｘ、ＲＰＳ−ＢＬＡＳＴ、ＣＤＡＲＴ、ＶｅｃＳｃｒｅｅｎ、およびｔｒａｃｅ  ＢＬＡＳＴなど））、結果をＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）などのデータベースと比較する。適切なアラインメントの決定による複数のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の他の比較方法は当業者に周知である（例えば、Ｐｅｒｕｓｋｉ  ａｎｄ  Ｐｅｒｕｓｋｉ，Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７）；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），「Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｕｐｅｒｈｉｇｈｗａｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｄａｔａｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，」  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐａｇｅｓ  １２３−１５１（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７）；およびＢｉｓｈｏｐ（ｅｄ．），Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９８を参照のこと）。
【００４１】
本明細書中で使用される、２つまたはそれ以上のペプチドまたはポリペプチド間の「類似性」を、一般に、一方のペプチドまたはポリペプチドと、アミノ酸が保存的に置換された１つまたは複数の他方のペプチドまたはポリペプチドとのアミノ酸配列の比較によって決定する。さらに、当分野で公知であるように、ＭＰＧ（配列番号４）またはＳｐｓＮ（配列番号２）などの親化合物のアミノ酸配列に基づいて、相同体、類似体、または誘導体群についてのコンセンサス配列を決定することができる。好ましい実施形態では、ポリペプチド調整因子は、配列番号２のアミノ酸配列を含み、さらにより好ましい実施形態では、調整因子は、配列番号２のアミノ酸配列からなる。
【００４２】
類似体または誘導体はまた、エキソポリサッカリド生合成の調整因子の融合タンパク質であり得る。融合タンパク質（すなわち、キメラ）には、ポリペプチドタグ（例えば、エピトープタグまたは６ｘＨｉｓタグ）、キャリア、または酵素などの非調整因子ペプチドまたはポリペプチドと、１つまたは複数のエキソポリサッカリド生合成の調整因子との融合物が含まれる。ペプチドはまた、検出可能な標識または「タグ」（放射性標識、蛍光標識、質量分析タグ、およびビオチンなど）を有することもできる（すなわち、標識することもできる）。
【００４３】
組換え技術によってペプチドを産生することができ、種々の宿主系は、エキソポリサッカリド生合成の調整因子およびその類似体または誘導体の産生に適切であり、宿主系には、細菌（例えば、大腸菌）、酵母（例えば、出芽酵母）、昆虫（例えば、Ｓｆ９）、および哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ−７）が含まれる。多数の発現ベクターが開発されており、これらの各宿主に利用可能である。好ましい実施形態では、細菌で機能的な（すなわち、複製することができる）ベクターを本発明で使用し、さらにより好ましくは、ベクターは広い宿主範囲のプラスミド（ｐＲＫ３１１（Ｄｉｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ  １３：１４９，１９８５）およびｐＭＭＢ（ＥＨ）（Ｆｕｅｒｓｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ４８：１１９，１９８６）など）である。しかし、時折、他の宿主または１つを超える宿主で機能的なベクターを有することが好ましいかもしれない。大腸菌におけるクローニングおよび発現のためのベクターおよび手順は、本明細書中および、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ａｎｄ  ｉｎ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）中で考察されている。
【００４４】
「ベクター」は、所望のポリペプチドの発現を指示することができる核酸アセンブリをいう。ベクターは、目的の核酸コード配列または単離核酸分子に作動可能に連結された発現制御配列（例えば、転写プロモーター／エンハンサーエレメント）を含み得る。ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの２つの組み合わせ（例えば、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ）から構成され得る。任意選択的に、ベクターは、ポリアデニル化配列、１つまたは複数の制限部位、ならびに必要に応じてネオマイシンホスホトランスフェラーゼまたはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼなどの１つまたは複数の選択マーカーを含み得る。さらに、選択された宿主細胞および使用したベクターに依存して、複製起点、さらなる核酸制限部位、エンハンサー、転写の誘導性または抑制性を付与する配列、および選択マーカーを、本明細書中に記載のベクターに組み込むこともできる。
【００４５】
「クローニングベクター」は、宿主細胞中で自律的に複製することができるプラスミド、コスミド、またはバクテリオファージなどの核酸分子をいう。クローニングベクターは、典型的には、ベクターの本質的な生物学的機能を喪失することなく決定可能な様式で外来ヌクレオチド配列を挿入することができる１つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む。クローニングベクターはまた、典型的には、クローニングベクターで形質転換された細胞の同定および選択での使用に適切なマーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性コード遺伝子）を含む。マーカー遺伝子は、典型的には、テトラサイクリン、カナマイシン、およびアンピシリンなどの抗生物質に耐性を付与するタンパク質をコードする。
【００４６】
本明細書中で使用される、「核酸発現構築物」は、宿主細胞中で発現する核酸配列を含む核酸分子構築物をいう。典型的には、目的の核酸配列の発現を、発現制御配列（例えば、プロモーター）、任意選択的に、少なくとも１つの調節エレメント下におく。このような発現配列を、プロモーター「に作動可能に連結された」という。同様に、調節エレメントがプロモーターの活性を変化させる（すなわち、統計的に有意に増減する）場合、調節エレメントおよびプロモーターは作動可能に連結される。本明細書中で使用されるように、「発現制御配列」は、構造遺伝子の転写を指示するヌクレオチド配列をいう。典型的には、発現制御配列は、構造遺伝子の転写開始部位に対して近位の遺伝子の５’領域に配置される。発現制御配列が誘導性プロモーターである場合、転写率を、例えば、誘発剤の添加によって増加させることができるか、阻害剤の添加によって減少させることができる。対照的に、誘発剤または阻害剤は、構成性プロモーターの転写率に影響を与えない。
【００４７】
当業者は、例えば、配列番号４またはその変種のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離核酸配列の発現のための適切な発現制御配列および適切な宿主を選択することができ、ここで、変種は、アミノ酸が保存的に置換されているか配列番号４と少なくとも８０％の配列が同一なアミノ酸配列を含み、変種はエキソポリサッカリド生合成を変化させることができる。好ましい実施形態では、スフィンゴモナスにおいてエキソポリサッカリド生合成を変化させることができる少なくとも１つのポリペプチドをコードする配列番号１または３に記載の核酸配列に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む組換え発現ベクターを提供する。
【００４８】
エキソポリサッカリド生合成の調整因子をコードするＤＮＡ配列を、特定の宿主に適切な発現ベクターに移入することができる。ある実施形態では、核酸配列を、ベクターまたは発現ベクターにクローン化して融合タンパク質を生成することができる。融合タンパク質の単離が容易になるように、ポリペプチドタグである融合パートナーを選択することができる。融合キャリアは、宿主プロテアーゼによって調整因子の分解を防止することができるか、融合パートナーはさらに、封入体、周辺質、外膜、または細胞外環境へ融合ペプチドを輸送するように機能することができる。したがって、本発明は、スフィンゴモナスにおけるエキソポリサッカリド生合成を変化させることができる融合タンパク質として発現される少なくとも１つのポリペプチドをコードする配列番号１または３に記載の核酸分子またはその変種に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む組換え発現ベクターを意図する。典型的には、エキソポリサッカリド生合成の調整因子に融合したタンパク質部分は第２の核酸配列によってコードされ、好ましくは、本明細書中に記載され、且つ当分野で公知のように、第２の核酸配列は、ポリペプチドタグまたは酵素をコードする。ある実施形態では、発現ベクターのプロモーターは、好ましくは、調節されており、ある実施形態では、ベクターは、好ましくは、スフィンゴモナス、シュードモナス、またはザントモナスで複製するプラスミドである。好ましい実施形態では、プラスミドは、配列番号１（Ｘ０２９、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５１２７）または配列番号３を含むｐＲＫ３１１である。
【００４９】
本明細書中で使用される、「宿主細胞」は、クローニングベクターまたは核酸発現構築物のいずれかを含む任意の原核細胞または真核細胞をいう。この用語には、宿主細胞の染色体またはゲノム中にクローン化された核酸配列を含むように組換え操作された原核細胞または真核細胞も含まれる。好ましくは、宿主細胞は、原核細胞、より好ましくは細菌、さらにより好ましくはスフィンゴモナス、ザントモナス、またはシュードモナスである。スフィンゴモナスが最も好ましい。一定の好ましい実施形態では、宿主細胞は、ゲラン、ウェラン、ラムサン、ジウタン、アルカラン、Ｓ７、Ｓ８８、Ｓ１９８、およびＮＷ１１を産生するスフィンゴモナス種などのスフィンガン産生細菌である。１つの実施形態では、本発明は、プラスミドＸ０２９（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５１２７）を含むα０２７などの宿主細胞スフィンゴモナスを提供する。別の実施形態では、宿主細胞はザントモナスである。
【００５０】
増強されたエキソポリサッカリドの生合成
本発明の別の態様によれば、エキソポリサッカリドを過剰産生することができる細菌を同定および単離する方法を提供する。特に、エキソポリサッカリド生合成の調整因子を使用して、エキソポリサッカリド生合成の調整因子にもはや応答しないエキソポリサッカリド産生細菌を同定することができる。例えば、エキソポリサッカリドを産生する細菌のコロニーは、寒天プレート上に粘液性の外見を有する一方で、非産生細菌は非粘液性の外見を有する。エキソポリサッカリド産生細菌へのエキソポリサッカリド生合成の調整因子をコードする組換え発現ベクターの移入により、エキソポリサッカリド発現が抑制され、これは、細菌が寒天プレート上に非粘液性の外見を有することを意味する。これらの抑制された株を、エキソポリサッカリド生合成の調整因子の存在下でさえもエキソポリサッカリドを発現することができる自発的変異体または誘導性変異体についてスクリーニングすることができる。
【００５１】
ある実施形態内で、粘液形態のエキソポリサッカリド産生のための抑制された細菌を変異誘発物質と接触させる工程であって、
前記細菌が、
（ｉ）エキソポリサッカリド産生を変化させることができる少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む組換え発現ベクターを含み、かつ前記細菌が、
（ｉｉ）エキソポリサッカリド産生が抑制されるように（ｉ）のポリペプチドを発現する
工程と、
エキソポリサッカリド産生を抑制することができるポリサッカリドの存在下で粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生することができる細菌をこれらの細菌から同定する工程とを含む、粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生することができる細菌の作製方法を提供する。
【００５２】
用語「高産生」は、第１の細菌株が直接または間接的に由来する第２の株よりも統計的に有意により大量のエキソポリサッカリドを産生する第１の細菌株の能力をいう。第１の細菌株が１サイクルの変異誘発および／または第２の株の選択から得られる場合、第１の細菌株は、第２の細菌株に「直接由来する」。第１の株が多サイクルの変異誘発および／または第２の株の選択から得られる場合、第１の細菌株は、第２の細菌株に「間接的に由来する」。
【００５３】
１つの好ましい実施形態では、変異誘発物質（ａ）と、粘液形態のエキソポリサッカリドを産生することができる細菌（ｂ）とを接触させる工程（Ａ）であって、
前記細菌が、
（ｉ）少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む組換え発現ベクターを含み、前記核酸分子がエキソポリサッカリド産生を変化させることができる少なくとも１つのポリペプチドをコードし、ならびに、
前記細菌が、
（ｉｉ）変異誘発された細菌を産生する条件下で産生に充分な時間エキソポリサッカリド産生が抑制されるように（ｉ）の前記少なくとも１つのポリペプチドを発現する工程（Ａ）と、
前記変異誘発された細菌の間で、粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生することができる１つまたは複数の細菌を同定する工程（Ｂ）とを含む、粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生することができる細菌の作製方法を提供する。
一定の好ましい実施形態では、細菌は、Ｓ−６０、Ｓ−７、Ｓ１３０、Ｓ−７、Ｓ−１９４、Ｓ−１９８、およびＮＷ１１などのスフィンゴモナスであり、変異誘発物質は、例えば、スルホン酸エチルメタン（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）または当分野で公知の別の適切な変異誘発物質である。別の好ましい実施形態では、エキソポリサッカリド生合成の調整因子は、配列番号１または３によってコードされ、好ましくは、配列番号２または４のアミノ酸配列をコードする配列を含む核酸分子によってコードされる。１つの特に好ましい実施形態では、親細菌はスフィンゴモナスα０２７であり、もはやエキソポリサッカリド生合成の調整因子に応答しないα０２７の変異体はスフィンゴモナスα０６２（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４４２６）である（より詳細には、実施例を参照のこと）。別の実施形態では、親細菌はザントモナス・キャンペストリスＸ５９であり、もはやエキソポリサッカリド生合成の調整因子に応答しないＸ５９の変異体はザントモナス・キャンペストリスα４４９（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０６４）である。好ましくは、変異株は、（統計的に有意な様式で）親株よりも多くのエキソポリサッカリドを産生する（少なくとも約１０％〜約２０％多い、好ましくは少なくとも約２０％〜約３０％多い、より好ましくは少なくとも約３０％〜約４０％多いなど）。
【００５４】
エキソポリサッカリドの産生
本発明の別の態様は、エキソポリサッカリド産生の増強に関する。例えば、スフィンガンエキソポリサッカリドを産生するために、遺伝子操作したスフィンゴモナス細菌を、一般にＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，８５４，０３４に記載の当分野で周知の適切な発酵条件下で培養する。簡単に述べれば、遺伝子操作したスフィンゴモナスの培養に適切な培地は、一般に、例えば、炭水化物（グルコース、ラクトース、スクロース、マルトース、またはマルトデキストリンが含まれる）などの炭素源；例えば、無機アンモニウム、無機硝酸塩、有機アミノ酸、または加水分解酵母、ダイズ粉、もしくはカゼインなどのタンパク性材料；蒸留可溶性成分（ｄｉｓｔｉｌｌｅｒ’ｓ  ｓｏｌｕｂｌｅｓ）またはコーンスティープリカー；無機塩およびビタミンを含む水性培地である。広範な種々の発酵培地が、本発明のスフィンガンの細菌産生を支える。炭水化物は、発酵培養液中に種々の量で含まれるが、通常、発酵培地の約１重量％と約５重量％との間である。炭水化物を、発酵前または発酵中に同時に添加することができる。窒素量は、水性培地の約０．０１重量％〜約０．２重量％の範囲であり得る。単一の炭素源または窒素源ならびにこれらの供給源の混合物を使用することができる。無機塩のうち、スフィンゴモナス発酵で使用されるものは、ナトリウムイオン、カリウムイオン、アンモニウムイオン、硝酸イオン、カルシウムイオン、リン酸イオン、硫酸イオン、塩化物イオン、炭酸イオン、および類似のイオンを含む塩である。マグネシウム、マンガン、コバルト、鉄、亜鉛、銅、モリブデン、ヨウ化物、およびホウ酸塩などの微量金属も有利に含み得る。ビオチン、葉酸塩、リポ酸塩、ナイアシンアミド、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、およびビタミンＢ12、およびその混合物などのビタミンも有利に使用することができる。
【００５５】
一般に、約２５℃と３５℃との間（およびこれらが含まれる）の温度で発酵を行うことができ、約２８℃〜３２℃の温度範囲内（およびこれらが含まれる）で至適な生産性を得られる。接種材料を、標準的な体積増加法（フラスコ培養物の震盪および少量の撹拌液中発酵が含まれる）によって調製する。接種材料を調製するための培地は、産生培地と同一であり得るか、Ｌｕｒｉａ培養液またはＹＭ培地などの当分野で周知のいくつかの標準的な培地のうちのいずれか１つであり得る。種培養物中の炭水化物濃度を、約１重量％未満に減少させることができる。１つを超える播種期を使用して、所望の接種体積を得ることができる。典型的な接種体積は、全最終発酵体積の約０．５％〜約１０％の範囲である。発酵容器は、典型的には、内容物を撹拌するための撹拌機を含む。容器はまた、自動ｐＨ制御機器および発泡制御機器を有し得る。容器に産生培地を添加し、加熱によって適切に滅菌する。あるいは、炭水化物または炭素源を添加前に個別に滅菌することができる。予め成長させた種培養物を、冷却した培地（一般に、約２８℃〜約３２℃の発酵温度）に添加し、撹拌培地を約４８時間〜約９６時間発酵させ、約１５，０００センチポアズ（ｃｐ）〜約２０，０００ｃｐの粘度を有し、約１０〜約１５ｇ／Ｌの粘液形態のスフィンガンエキソポリサッカリドを有する培養液が得られる。対応する親スフィンゴモナス株の発酵により、典型的には、約２５，０００ｃｐ〜約５０，０００ｃｐの粘度を有する培養液が得られる。
【００５６】
この態様では、本発明は、浸漬し、撹拌し、曝気した液体培養で成長させたスフィンゴモナスまたはザントモナスから得た粘液形態のエキソポリサッカリドを提供する。培養２４時間後の液体培養物中の溶存酸素濃度は、好ましくは、水の約５％飽和を超える。カプセル化株を使用した類似の発酵では、２４時間後の溶存酸素は０％であった。粘液形態のエキソポリサッカリドによって得られたより低い粘度によって曝気が改良され、より長い期間の培養でスフィンゴモナスに産生力を持たせることが可能である。本発明の別の態様では、ある発酵由来の細菌をその後の発酵の接種材料として使用する半バッチプロセスで発酵を行うことができる。この態様では、例えば、産生されるエキソポリサッカリドから分離したスフィンゴモナスを、新鮮な発酵培養液に添加することができるか、新鮮な発酵培養液を残存するスフィンゴモナスに添加することができる。したがって、本発明の態様は、個別の種培養物を準備する必要がない。
【００５７】
エキソポリサッカリドの回収は、その産生のために使用した条件に関係なく、好ましくは、沈殿工程を含む。次いで、沈殿したエキソポリサッカリドを、遠心分離によって回収することができる。ゲランおよびウェランの典型的な回収方法は以下である。発酵直後、培養液を少なくとも９０℃に加熱して生きている細菌を死滅させる。次いで、エキソポリサッカリドを、約２体積（すなわち、培養体積に等しい）のイソプロピルアルコールでの沈殿によって培養液から分離し、沈殿したエキソポリサッカリド繊維を回収し、圧縮し、乾燥させ、粉砕する。蒸留によってアルコールを除去する。この最も簡潔な過程では、ポリサッカリドは細胞に付着したままであり、その結果、乾燥および粉砕したポリサッカリドを水に再懸濁した場合、溶液は透明ではない。ゲランガムの場合、再懸濁した生成物がより透明になるように細菌細胞からポリサッカリドを精製するためのさらなる工程を導入することができる。アルコール沈殿前に、培養液を遠心分離および／もしくは濾過またはその両方を行う一方で、遠心分離または濾過することができる高粘性状態と液化状態との間の臨界遷移温度を超えた温度で維持する。異なるスフィンガンについてのこれらの過程は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，３２６，０５２（ゲラン）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，３２６，０５３（ゲラン）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，３４２，８６６（ウェラン）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．３，９６０，８３２（Ｓ−７）；およびＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，５３５，１５３（Ｓ−８８）に開示されている。
【００５８】
ある実施形態では、本発明は、エキソポリサッカリドを産生する条件下で産生に充分な時間細菌を培養する工程であって、前記細菌が、エキソポリサッカリド産生を変化させることができる核酸分子によってコードされる少なくとも１つのポリペプチドを発現する場合に粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生する工程と、前記培養物から粘液形態の前記エキソポリサッカリドを分離する工程とを含む、エキソポリサッカリドを高産生する方法を提供する。好ましくは、細菌は、スフィンゴモナス（ゲラン、ウェラン、ラムサン、ジウタン、アルカラン、Ｓ７、Ｓ８８、Ｓ１９８、またはＮＷ１１を産生するものなど）、より好ましくは、スフィンゴモナスα０６２株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４４２６）、α０６３株、α０６５株、およびα０６９株である。好ましい実施形態では、培養は発酵によって行われ、細菌は、培養物１リットルあたり約５ｇ〜約８０ｇ、より好ましくは約１０ｇ〜約７０ｇ、さらにより好ましくは約２０ｇ〜約６０ｇのエキソポリサッカリドを産生する。至適な発酵条件は、約２５℃〜約３５℃の温度範囲で約４８時間〜約９６時間である。好ましくは、エキソポリサッカリドを、アルコール沈殿によって分離し、好ましくは、約１〜約１．５倍体積のアルコールを培養物に添加する。好ましくは、発酵培養物の最終粘度は、約５，０００ｃｐ〜約４０，０００ｃｐ、より好ましくは約１０，０００ｃｐ〜約３５，０００ｃｐ、最も好ましくは約１５，０００ｃｐ〜約３０，０００ｃｐの範囲である。
【００５９】
本明細書中で言及し、そして／または出願データシートに列挙した上記の全米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物は、その全体が本明細書中で記載されているかのように本明細書中で参照して組み込まれる。
【実施例１】
【００６０】
白色高グルコース耐性スフィンゴモナスの準備
スフィンゴモナスＸ２８７（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３４８７）を使用して、１２５ｍｌのバッフル付きフラスコ中の１％または５％グルコースを含む１／４ＹＭ−に震盪することなく３０℃で２週間接種した。このような拡大インキュベーション後に培養物を１／４ＹＭ＋プレートに塗布した場合、エキソポリサッカリド陰性変異体は認められなかった。同一の培養物を、１０％グルコースを有する１／４ＹＭのプレート上に塗布した。単離コロニー（８３）を選択し、これを使用して３％グルコースを有する２ｍｌ  １／４ＹＭに接種し、３００ｒｐｍで震盪しながら３０℃で４０時間インキュベートした。これらの培養物を、高グルコースプレート上に塗布し、１２コロニーを選択し、Ｘ７２９〜Ｘ７４１として保存した。これら１２の変異体のうちの６つは、視覚的に白色の変異体であった。
【００６１】
コロニーを使用して、小さなチューブ中の２ｍｌ  ＹＭ−に接種し、３００ｒｐｍにて３０℃で２４時間震盪した（種−１と呼ぶ）。１００μｌのこれらの培養物を使用して、５ｍｌ  Ｂ１０Ｇ３に接種し、培養物を斜めに配置し、３００ｒｐｍで２４時間インキュベートした（種−２と呼ぶ）。次いで、５ｍｌの種−２を１２５ｍｌ  バッフル付きフラスコ中の２０ｍｌ  Ｂ１０Ｇ３に添加し、最初の１７時間は２００ｒｐｍで震盪しながらインキュベートし、その後の４６時間までを４００ｒｐｍでインキュベートした。１０ｇの最終培養液を、２．０倍体積のイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）によって室温で沈殿させた。サンプルを、６０℃の減圧下にて２時間乾燥させた。
【００６２】
【表１】
2008507267.tif 000003
【００６３】
【表２】
2008507267.tif 000004
【００６４】
Ｘ７３３株が１２５ｍｌ  バッフル付きフラスコに接種され、４８時間インキュベートされた。１／４ＹＭ＋プレート上に塗布した培養液が粘液形態−カプセル形態のコロニーおよび少数の黄色のコロニーを生成した。変色指示薬は、いくらかの範囲での変異安定性を予想するためのヒントを示す。白色粘性コロニーの１つを選択し、Ｘ９９６として保存した。
【００６５】
０．１％のＸ９９６を接種し、５００ｍｌ  バッフル付きフラスコを使用して、３％および６％グルコースを含む１００ｍｌのＢ１０中にて１６０ｒｐｍで２４時間培養した。
【００６６】
【表３】
2008507267.tif 000005
【００６７】
接種率が低い場合、このＸ９９６変異体を再現可能に培養することは困難であった。この変異体は、高速振盪下でインキュベートした場合、充分に成長しなかった。
【００６８】
このＸ９９６を、１２５ｍ  バッフル付きフラスコを使用して、７％グルコースを補足した３０ｍｌのＢ１０培地中で３０時間インキュベートした。
【００６９】
接種率が低いとＸ９９６細胞成長は抑制された。この培養培地を、振盪することなく室温で１週間保存した。次いで、培養物を、１／４ＹＭ  １０％グルコースプレート上に塗布した。スフィンゴモナスα０１６〜α０１８を、高グルコース含有１／４ＹＭプレート上で単離した。
【実施例２】
【００７０】
もはやＳｐｓＮに応答しないスフィンゴモナスの同定
本実施例は、以下の工程によってスフィンガンおよびキサンタンの生合成を抑制するＤＮＡ配列の同定を記載する：（１）スフィンゴモナスＳ−８８ゲノムＤＮＡの発現ライブラリーの作製、（２）発現ライブラリーのスフィンゴモナスＳ−７への形質転換、および（３）スフィンゴモナスＳ−７におけるエキソポリサッカリドＳ−７産生の抑制についてのスクリーニング（すなわち、プレート上に細菌培養物を塗布し、コロニーについて非粘液性の外見を観察する）。プライマー（配列番号５（２２量体）ならびに配列番号６および７（それぞれ、２６量体および２７量体））を作製し、テンプレートＺ９６４（Ｚ９３９（ｐＲＫ３１１−ｓ８８ｎｃ２、２．７Ｋｂ）由来のフラグメントであるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ−ＢＨ，７１６ｂｐ）と共に使用して、特に機能的ｓｐｓＮをコードする５７３塩基対のフラグメントを産生した。５７３塩基対のＰＣＲフラグメント（配列番号１）を、プラスミドｐＲＫ３１１にクローン化し、２つの独立したクローン（Ｘ０２６およびＸ０２９）を以下のようにさらに試験した。
【００７１】
【表４】
2008507267.tif 000006
Ｘ０２５＝ｐＲＫ３１１−ＭＰＧ（３８５ｂｐ、２２量体〜２６量体）；Ｘ０２６＝ｐＲＫ３１１−ＭＰＧ＋ＳｐｓＮ（５７３ｂｐ、２２量体〜２７量体）；Ｘ０２８＝ｐＲＫ３１１−ＭＰＧ（３８５ｂｐ、２２量体〜２６量体）；Ｘ０２９＝ｐＲＫ３１１−ＭＰＧ＋ＳｐｓＮ（５７３ｂｐ、２２量体〜２７量体）；Ｚ９５９−１〜−３＝ｐＲＫ３１１−ｓ８８ｎｃ２  ＥＨ２７００ｂｐ  ｓｐｓＮ：：Ｔｎ１０Ｋｎを有する独立クローン；Ｚ９６７＝ｐＲＫ３１１−ＢＨ７１６ｂｐ；＋は、トランス抱合体（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ）が選択培地上にエキソポリサッカリドを産生することを意味し、−は、トランス抱合体（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ）が選択培地上にエキソポリサッカリドを産生しないことを意味する。
【００７２】
これらの結果は、ＳｐｓＮをコードする核酸分子（例えば、Ｘ０２９）がスフィンゴモナスＳ−７、Ｓ−１３０、Ｓ−１９４、Ｓ−１９８、Ｓ−８８、ＮＷ１１、およびザントモナスＸ５９におけるポリマー合成を阻害することができることを実証する。
【００７３】
配列決定したアンプリコンの分析から、ｓｐｓＮ（エキソポリサッカリド生合成の調整因子）を、ＤＡＨＰＳ（３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ）の下流に配置した。ＤＡＨＰＳは、芳香族アミノ酸の生合成を制御する。活性なＰＣＲ産物を、ｐＲＫ３１１にクローン化し、これをＸ０２９（ｐＲＫ３１１−ｓｐｓＮ、Ｔｅｔr）と呼ぶ。配列番号１を含むこの発現ベクターが、スフィンゴモナスα０１６に抱合され、これをα０２７と命名し、ポリマー産生表現型が抑制されている。次いで、このα０２７をＥＭＳで処理して、変異体が薬物圧（ｄｒｕｇ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）Ｔｅｔ下（すなわち、Ｘ０２９の存在下で、エキソポリサッカリド生合成の調整因子（Ｓｐｓｎ）をコードする）でエキソポリサッカリド陽性表現型を示すことが見出された。これらの条件下で、いくつかのエキソポリサッカリド陽性表現型は、ＳｐｓＮまたはほかの場所の変異に起因し得る。プラスミドＸ０２９（すなわち、ＳｐｓＮをコードする）を除去するための無薬物条件下での選択後、α０６１株〜α０７６株を選択し、さらなる試験（例えば、バイオマス産生）のために保存した。これらの株を、５％グルコースを含む４ｍｌ  Ｂ１０培地を含むガラス管中で２４時間培養した。次いで、３ｍｌのこの培養物を、１２５ｍｌ  バッフル付きフラスコ中の３％グルコースを含む２５ｍｌ  Ｂ１０培地に３００ｒｐｍで４８時間接種した。２倍体積のＩＰＡによって、各フラスコから１０ｇの培養液が沈殿した。沈殿物を、６０℃で６時間乾燥させた。
【００７４】
【表５】
2008507267.tif 000007
【００７５】
２ｍｌ培養物を、１２５ｍｌ中の５％グルコースを含む３０ｍｌ  Ｂ１０種培地に接種した。これを、２００ｒｐｍで４０時間インキュベートし、３００ｒｐｍで７２時間までインキュベートした。
【００７６】
以下の表は、変異体（すなわち、α０６２、α０６３、およびα０６５）が元のＸ２８７粘液変異体よりも２０％を超えるバイオマスを産生したことを示す。
【００７７】
【表６】
2008507267.tif 000008
【００７８】
培養培地の成分は以下であった。
【００７９】
【表７】
2008507267.tif 000009
【実施例３】
【００８０】
もはやＳｐｓＮに応答しないスフィンゴモナス株とその親株との間のエキソポリサッカリド産生の比較
元の粘液株であるＸ２８７株およびα０１６株を、いくつかの４２Ｌ発酵試験下で変異α０６２と比較した。これらの実験のための１％出発培養液として４００ｍｌの２４時間フラスコ培養物を調製した。ＡＴＣＣ３１４６４株（Ｘ２８７の親）を、カプセル形成ゲラン野生型株として使用した。
【００８１】
【表８】
2008507267.tif 000010
【００８２】
培養液を、２倍体積のＩＰＡによって沈殿させ、その後、６０℃で６時間乾燥させた。最終粘度は、４〜１２ｒｐｍであった。
【００８３】
発酵スコア（バイオマス収率）は以下である。
【００８４】
【表９】
2008507267.tif 000011
【００８５】
α０６２の培養液（Ｇ１５８）を、ＡＴＣＣ３１４６１の培養液（Ｇ１５７）と比較した。結果を、以下の表に示す。
【００８６】
【表１０】
2008507267.tif 000012
【実施例４】
【００８７】
もはやＳｐｓＮに応答しないザントモナスの同定
Ｘ０２９（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５１２７）中に生体高分子抑制因子を含むＤＮＡ配列を、交配によってザントモナス・キャンペストリスＸ５５（ＡＴＣＣ１３９５１）およびＸ５９（ＡＴＣＣ５５２９８）にトランス抱合（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）した。ポリマー産生抑制コロニーを、テトラサイクリン含有選択プレート上で、α２８７、α３００、およびα３０１として単離した。
【００８８】
このキサンタンガム産生抑制α３００（Ｘ５９：Ｘ０２９）トランス抱合体を、化学的変異誘発物質ＥＭＳで処理した。薬物圧下でさえも抑制因子Ｘ０２９に応答しない変異コロニーが最初に単離され、次いで、薬物感受性変異体α４４９（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０６４）、α４７４、α４８５、α４９９、α５０１、α５２５、α５２６、α５４４を、無薬物圧下で選択して、Ｘ０２９抑制因子を除去した。これらの変異体を、１２５ｍｌ  バッフル付きフラスコを使用して、２６ｍｌ  ＹＭ＋３＆グルコース培地中で４８時間インキュベートした。これらの変異体の性能を、以下の表に示した。
【００８９】
【表１１】
2008507267.tif 000013
【００９０】
α４４９およびα５０１は、同レベルの生細胞数でさえも３２時間で親Ｘ５９のバイオマスよりも１０〜２０％大量のバイオマスを生成した。これは、変異体のポリマー蓄積速度が親Ｘ５９よりも速いことを示す。
【００９１】
図１は、α４４９培養物の生細胞数とＯＤ600との間の関係を示す。至適種培養物を達成するために、次の産生発酵段階のために、ＯＤ600値に基づいて細胞数を最大にした。
【００９２】
図２は、ＳＥＢ−０２２−ＳＦ＋ＭＳＰ培地を使用したα４４９  ４２Ｌ産生発酵を示す。白丸は、６Ｌ発酵槽におけるＳＥＢ−０２２−ＳＦ−ＭＳＰ培地でのＸ５９またはα４４９の発酵由来のキサンタンガム産生を示し、黒丸は、７０Ｌ発酵槽におけるＳＥＢ−０２２−ＳＦ＋ＭＳＰ（「ＳＦＭ」とも呼ばれる）を使用したα４４９発酵のバイオマス（細胞およびキサンタンガムが含まれる）を示し、三角は、ＡＴＣＣ１３９５１の発酵由来のキサンタンガム産生を示す。図２中のＡＴＣＣ１３９５１発酵のデータは、Ｌｅｔｉｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５５（４）：４１７−２２，２００１に由来する。ＭＳＰは、消化ダイズタンパク質をいう。
【００９３】
８０ｇ／Ｌスクロースの最終産生収率は、５７．３ｇ／Ｌであった。この変異体は、２８℃、溶存酸素３０％、およびｐＨ６．５の条件下で抑制因子Ｘ０２９に応答せず、より高いレベルのキサンタンガムを蓄積した。
【００９４】
α４４９の４００ｍｌ種培養物を、ＳＥＢ−０２２−ＳＦ＋ＭＳＰ（スクロース＝８０ｇ／Ｌ）培地に接種し、７０Ｌ発酵槽を使用して７０時間インキュベートした。この培地は、０．６９ｇ／Ｌの総窒素（Ｓｏｙ由来の０．６ｇ／ＬおよびＭＳＰ由来の０．０９ｇ／Ｌ）を含む。最終培養液のＯＤは１１．３であり、ｐＨは６．５５であり、生細胞数は２．０×１０10／ｍｌであった。最終培養液の粘度は、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ粘度計による４番スピンドルを使用して、３４，９００ｃｐ／１６，３００ｃｐ／９，４２０ｃｐ−１２ｒｐｍ／３０ｒｐｍ／６０ｒｐｍであった。
【００９５】
本実施例で使用したＳＥＣ−０２２−ＳＦ＋ＭＳＰ培地の成分は以下である。
【００９６】
【表１２】
2008507267.tif 000014
【００９７】
本実施例で使用したＳＥＣ−０２２−ＳＦ−ＭＳＰ培地の成分は以下である。
【００９８】
【表１３】
2008507267.tif 000015
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】スフィンゴモナスα４４９株の培養物の生細胞数とＯＤ600との間の関係を示す図である。
【図２】ＳＥＢ−０２２−ＳＦ＋ＭＳＰ培地を使用したα４４９  ４２Ｌ産生発酵を示す図である。
【図１】
2008507267.tif 000016
【図２】
2008507267.tif 000017
【配列表】
2008507267000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年3月22日(2007.3.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高ストリンジェント条件下でプローブとハイブリッド形成したままである配列を含む単離された核酸分子であって、前記プローブが、配列番号１または配列番号１の相補物からなる、単離核酸分子。
【請求項２】
前記核酸分子が、スフィンゴモナス種でのエキソポリサッカリド産生を変化させることができる少なくとも１つのポリペプチドをコードする、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項３】
前記少なくとも１つのコードされたポリペプチドが、配列番号２と少なくとも８０％同一性のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の単離核酸分子。
【請求項４】
前記少なくとも１つのコードされたポリペプチドが、アミノ酸が保存的に置換された配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の単離核酸分子。
【請求項５】
前記少なくとも１つのポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の単離核酸分子。
【請求項６】
配列番号１または配列番号１の相補物に記載のヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項７】
前記核酸分子がＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
【請求項８】
請求項２に記載の核酸分子に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む組換え発現ベクター。
【請求項９】
前記少なくとも１つのポリペプチドが、第２の核酸配列によってコードされたポリペプチド産物を含む融合タンパク質として発現される、請求項８に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１０】
前記第２の核酸配列が、ポリペプチドタグまたは酵素をコードする、請求項９に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１１】
プラスミドＸ０２９（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５１２７）である、請求項８に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１２】
配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む核酸分子に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む組換え発現ベクター。
【請求項１３】
請求項８から請求項１２のいずれか一項に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
前記宿主細胞が原核細胞である、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
前記原核細胞がスフィンゴモナス細胞である、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
前記宿主細胞がスフィンガン産生細菌である、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
前記スフィンゴモナス細胞が、ゲラン、ウェラン、ラムサン、ジウタン（ｄｉｕｔａｎ）、アルカラン（ａｌｃａｌａｎ）、Ｓ７、Ｓ８８、Ｓ１９８、およびＮＷ１１からなる群から選択されるスフィンガンを産生することができる、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
前記スフィンガンが、カプセル形態または粘液形態で産生される、請求項１６または請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
前記スフィンガン産生細菌が、スフィンゴモナスα２５２株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５１２８）、Ｘ２８７株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３４８７）、Ｘ５３０株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３４８６）、Ｚ４７３株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３４８５）、またはＸ０３１株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３４８８）である、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
前記宿主細胞がキサンタン産生細菌である、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
前記キサンタン産生細菌が、ザントモナスＸ５９株（ＡＴＣＣ  ５５２９８）またはＸ５５株（ＡＴＣＣ  １３９５１）である、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの発現したポリペプチドまたは融合タンパク質が、前記宿主細胞中のエキソポリサッカリド産生レベルを変化させる、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
請求項２から請求項５のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされたポリペプチドを発現する場合でさえも粘液形態のエキソポリサッカリドを産生する単離細菌。
【請求項２４】
前記細菌が、ゲラン、ウェラン、ラムサン、ジウタン、アルカラン、Ｓ７、Ｓ８８、Ｓ１９８、およびＮＷ１１からなる群から選択されるエキソポリサッカリドを産生することができるスフィンゴモナス細菌である、請求項２３に記載の細菌。
【請求項２５】
前記細菌が、スフィンゴモナスα０６２株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４４２６）である、請求項２３に記載の細菌。
【請求項２６】
前記細菌がザントモナス細菌である、請求項２３に記載の細菌。
【請求項２７】
前記細菌が、ザントモナスα４４９株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０６４）である、請求項２６に記載の細菌。
【請求項２８】
スフィンゴモナスα０６２株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４４２６）およびその変異体または誘導体からなる群から選択される単離細菌であって、前記細菌が、請求項２から請求項５のいずれか一項に記載の核酸分子およびその混合物によってコードされたポリペプチドを発現する場合、粘液形態のエキソポリサッカリドを産生することができる、単離細菌。
【請求項２９】
ザントモナスα４４９株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０６４）およびその変異体または誘導体からなる群から選択される単離細菌であって、前記細菌が、請求項２から請求項５のいずれか一項に記載の核酸分子およびその混合物によってコードされたポリペプチドを発現する場合でさえも、粘液形態のエキソポリサッカリドを産生することができる、単離細菌。
【請求項３０】
細菌培養においてエキソポリサッカリドを産生する条件下で産生に充分な時間細菌を培養する工程であって、前記細菌が、請求項２から請求項５のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされたポリペプチドを発現する場合でさえも粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生する工程と、
前記培養物から粘液形態の前記エキソポリサッカリドを分離する工程と
を含む、エキソポリサッカリドを高産生する方法。
【請求項３１】
前記細菌がスフィンゴモナス細菌である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記スフィンゴモナス細胞が、ゲラン、ウェラン、ラムサン、ジウタン、アルカラン、Ｓ７、Ｓ８８、Ｓ１９８、およびＮＷ１１からなる群から選択されるエキソポリサッカリドを高産生することができる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記細菌が、スフィンゴモナスα０６２株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４４２６）である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記細菌が、ザントモナスα４４９株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０６４）である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記培養が発酵工程を含む、請求項３０から請求項３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記細菌が、培養物１リットルあたり約２０ｇから約６０ｇのエキソポリサッカリドを産生する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記発酵を、約２５℃〜約３５℃の範囲の温度で約４８時間〜約９６時間行う、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記エキソポリサッカリドの分離が、前記培養物に約１〜約１．５培養体積のアルコールを添加する工程を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記発酵培養物の粘度が、約１５，０００ｃｐ〜約４０，０００ｃｐの範囲である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
変異誘発物質（ａ）と粘液形態のエキソポリサッカリドを産生することができる細菌（ｂ）とを接触させる工程（Ａ）であって、前記細菌が、
（ｉ）少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む組換え発現ベクターを含むことと、前記核酸分子が請求項２から請求項５のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列であり、かつ前記細菌が、
（ｉｉ）変異誘発された細菌を産生する条件下で産生に充分な時間エキソポリサッカリド産生が抑制されるように（ｉ）の少なくとも１つのポリペプチドを発現する工程（Ａ）と、
前記変異誘発された細菌の間で、粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生することができる１つまたは複数の細菌を同定する工程（Ｂ）と
を含む、粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生することができる細菌の作製方法。
【請求項４１】
前記細菌が、ゲラン、ウェラン、ラムサン、ジウタン、アルカラン、Ｓ７、Ｓ８８、Ｓ１９８、およびＮＷ１１からなる群から選択されるエキソポリサッカリドを産生することができるスフィンゴモナス細菌である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記細菌がザントモナス細菌である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
請求項４０又は請求項４１に記載の方法によって産生された細菌。
【請求項４４】
スフィンゴモナスα０６２株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４４２６）。
【請求項４５】
ザントモナスα４４９株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０６４）。
【国際調査報告】
2008507267.tif 000024
2008507267.tif 000025