(57)【要約】本発明は、光電気化学的増幅を使用した、核酸の超高感度検出および定量のための電極システム、方法、装置、およびチップに関する。標的核酸の核酸捕獲プローブへのハイブリダイゼーション時に、縫い込み型ビス-インターカレーターを含む光レポーターは、二本鎖核酸へ選択的に結合する。光レポーター結合活性の安定性および可逆性は、核酸ハイブリダイゼーション事象の超高感度検出を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)作用電極；
(b)標的核酸の配列に相補的な配列を含む、作用電極に連結された核酸捕獲プローブ；ならびに
(c)二本鎖核酸について選択的であり、かつ照射および電位の印加時に光電気化学的反応を発生させることが可能である、安定したインターカレーター
を含み、
標的核酸が核酸捕獲プローブとハイブリダイズして、二本鎖核酸複合体を形成し、この複合体には、安定したインターカレーターが介入し(intercalate)、安定したインターカレーターの量が標的核酸の量を示すようにした、電極システム。
【請求項２】
安定したインターカレーターが、縫い込み型(threading)PIND-Ru-PINDビス-インターカレーターである、請求項1記載の電極システム。
【請求項３】
1×10-16Mまでの濃度で標的核酸が使用される場合に、標的核酸を検出することが可能である、請求項1または2記載の電極システム。
【請求項４】
作用電極が核酸捕獲プローブのアレイを含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の電極システム。
【請求項５】
(a)標的核酸を、作用電極に連結された核酸捕獲プローブとハイブリダイズさせて、二本鎖核酸複合体を形成する工程；
(b)二本鎖核酸について選択的でありかつ照射および電位の印加時に光電気化学的反応を発生させることが可能である安定したインターカレーターを、二本鎖核酸複合体に介入させる工程；
(c)安定したインターカレーターを光活性化する少なくとも1つの波長を含む光で、作用電極を照射する工程；
(d)作用電極へ電位を印加する工程；ならびに
(e)光電流作用スペクトルを得る工程
を含み、
標的核酸の量が光電流作用スペクトルから決定されるようにした、標的核酸の検出法。
【請求項６】
(a)標的核酸を、作用電極に連結された核酸捕獲プローブとハイブリダイズさせて、二本鎖核酸複合体を形成する工程； 
(b)二本鎖核酸について選択的でありかつ照射および電位の印加時に光電気化学的反応を発生させることが可能である安定したインターカレーターを、二本鎖核酸複合体に介入させる工程；
(c)安定したインターカレーターを光活性化する少なくとも1つの波長を含む光で、作用電極を照射する工程；
(d)作用電極へ電位を印加する工程；ならびに
(e)光電流作用スペクトルを得る工程
を含み、
標的核酸の量が光電流作用スペクトルから決定されるようにした、標的核酸の定量法。
【請求項７】
安定したインターカレーターが、縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーターである、請求項5または6記載の方法。
【請求項８】
1×10-16Mまでの範囲の濃度で標的核酸が使用される場合に、標的核酸を検出および定量することが可能である、請求項5〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
作用電極が核酸捕獲プローブのアレイを含む、請求項5〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
(a)請求項1記載の電極システム；
(b)電極システムの作用電極を照射する手段；
(c)作用電極へ電位を印加する手段；および
(d)光電流作用スペクトルを得る手段
を含み、
使用時に、作用電極を照射する手段による作用電極の照射、および作用電極へ電位を印加する手段による作用電極への電位の印加が、光電流作用スペクトルを発生させ、光電流作用スペクトルが、光電流作用スペクトルを得る手段により得られるようにした、標的核酸の検出装置。
【請求項１１】
(a)請求項1記載の電極システム；
(b)電極システムの作用電極を照射する手段；
(c)作用電極へ電位を印加する手段；および
(d)光電流作用スペクトルを得る手段
を含み、
使用時に、作用電極を照射する手段による作用電極の照射、および作用電極へ電位を印加する手段による作用電極への電位の印加が、光電流作用スペクトルを発生させ、光電流作用スペクトルが、光電流作用スペクトルを得る手段により得られるようにした、標的核酸の定量装置。
【請求項１２】
電極システムの安定したインターカレーターが、縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーターである、請求項10または11記載の装置。
【請求項１３】
1×10-16Mまでの範囲の濃度で標的核酸が使用される場合に、標的核酸を検出または定量することが可能である、請求項10〜12のいずれか一項記載の装置。
【請求項１４】
電極システムの作用電極が核酸捕獲プローブのアレイを含む、請求項10〜13のいずれか一項記載の装置。
【請求項１５】
(a)チップ；
(b)チップ上に配置された少なくとも1つの作用電極；
(c)標的核酸の配列に相補的な配列を含む、作用電極に連結された核酸捕獲プローブ；および
(d)安定したインターカレーター
を含む、バイオセンサーチップ。
【請求項１６】
安定したインターカレーターが、縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーターである、請求項15記載のバイオセンサーチップ。
【請求項１７】
チップが作用電極を含む、請求項15または16記載のバイオセンサーチップ。
【請求項１８】
作用電極が核酸捕獲プローブのアレイを含む、請求項15〜17のいずれか一項記載のバイオセンサーチップ。
【請求項１９】
1×10-16Mまでの範囲の濃度で標的核酸が使用される場合に、標的核酸を検出または定量することが可能である、請求項15〜18のいずれか一項記載のバイオセンサーチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、光レポーターの二本鎖核酸検体複合体への結合による光電気化学的増幅を使用した、核酸の超高感度検出および定量のための、電極システム、方法、装置およびチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
従来遺伝子発現を試験するためのバイオセンサーの使用は、固相支持体に結合した核酸捕獲プローブにハイブリダイズする実験試料のmRNAに由来した標識されたcDNAまたはcRNA標的の使用に関連している。各ハイブリダイズ事象に関連した標識の量をモニタリングすることにより、示された各mRNA種の豊富さを推測することは可能であった。時には、核酸を検出および定量するためにハイブリダイゼーションが使用されているが、この技術の小型化と巨大で量が増大しつつある配列情報の組合せは、遺伝子発現が研究され得る規模を法外に拡大した。
【０００３】
過去十年間にわたり、その後標的試料核酸との逐次ハイブリダイゼーション時に生体認識素子として使用することができる固相上への、短いオリゴヌクレオチド捕獲プローブの固定化を基にした核酸バイオセンサーの開発には大きい進展がある。最も一般的な方法は、蛍光複合された標的核酸に依然として頼る方法である1。
【０００４】
しかし低コピー数の遺伝子の検出の適切な感度は、現在の蛍光ベースのマイクロアレイ技術の適用においては依然問題が多い。最新の蛍光マイクロアレイアッセイは、液相(オフ-チップ)プレ増幅および/またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のような標識法と組合せて行われる2。しかしPCR増幅は、単にアッセイ時間を延長するのみではなく、汚染アンプリコン種を導入することも多い。加えて遺伝子は、選択的および非線形の標的増幅のために、最終PCR産物中に、最初の試料と比べ、相対的に比例したレベルでは示されない3。さらにcDNA合成時の核酸二次構造の不完全な変性は、ポリメラーゼ活性も損ない、標的遺伝子の切断型cDNAコピーを生じる。さらにPCRベースのプレ増幅工程は、そのようなPCRの産物は、互いに干渉し、それにより増幅の効率および特異性の喪失を生じるので、高い複雑性の核酸を分析する上では限定された適用である4。オフ-チップ標的プレ増幅法も、バイオセンサー手法の経費を著しく増大し、時には配列依存型の定量バイアスにつながる。
【０００５】
これらの技術的困難に対処するために、ローリングサークル増幅4、枝分かれDNA技術5、触媒レポーター結合6、樹状タグ7、酵素的増幅8,9、および化学的増幅10,11などの、いくつかのオン-チップ増幅戦略が提唱されている。これらの中で、電気的エネルギー変換(electric transduction)法に結びつけられた増幅戦略は、電子装置に固有の小型化およびそれらの進歩した半導体技術との適合性のために、核酸アッセイのための簡易で正確でかつ安価なプラットフォームを提供する最大の可能性を有する。
【０００６】
本発明は、縫い込み型(threading)ビス-インターカレーターPIND-Ru-PINDは、高い感度、高い安定性および高い選択性の光レポーターとして機能し、核酸ハイブリダイゼーション事象の光電気化学的検出を可能にすることができるという、本発明者らの驚くべき予想外の知見を基にしている。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明の第一の局面に従い、電極システムが提供され、該電極システムは、
(a)作用電極；
(b)標的核酸の配列に相補的な配列を含む、作用電極に連結された核酸捕獲プローブ；ならびに
(c)縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター
を含み、
該標的核酸が該核酸捕獲プローブとハイブリダイズして、二本鎖核酸複合体を形成し、該複合体には、該縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーターが介入する(intercalate)。介入した縫い込み型PIND-Ru-PINDの量は、標的核酸の量を示す。この電極システムは、標的核酸を検出および/または定量することができる。
【０００８】
この電極システムは、その上に作用電極が配置された支持体をさらに含むことができる。
【０００９】
この作用電極は、核酸捕獲プローブのアレイを含むことができる。
【００１０】
この作用電極は、ダイヤモンド、グラッシーカーボン、金、グラファイト、インジウムスズ酸化物、白金またはケイ素の少なくとも1つを含むことができる。この作用電極は、インジウムスズ酸化物を含むことができる。
【００１１】
この核酸捕獲プローブは、DNAを含むことができる。加えてまたは代わりに、核酸捕獲プローブは、RNAを含むことができる。核酸捕獲プローブは、作用電極に結合することができる。
【００１２】
この標的核酸は、DNAを含むことができる。DNAは、cDNAを含むことができる。加えてまたは代わりに、標的核酸は、RNAを含むことができる。RNAは、cRNAを含むことができる。
【００１３】
この電極システムは、参照電極および対電極をさらに含むことができる。
【００１４】
第一の局面の1つの態様において、二本鎖核酸複合体と縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーターのインターカレーションは、縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーターからの2個のナフタレンジイミド基と二本鎖核酸複合体とのインターカレーションに関与し、その結果二本鎖核酸複合体のリン酸基と縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーターの二価陽イオン性(bicationic)Ru(bpy)22+基との間にイオン対を形成することができる。これにより形成された安定した付加物は、光源への曝露に対する光電気化学的反応を生じ、400〜600nmの範囲、特に490nmに光電流作用スペクトルを生じることができる。照射サイクルの適用は、該照射サイクルの数が増大するにつれて最大103サイクルまで、実質的に直線状に増加する、光帯電および放電電流を引き起こすことができる。介入した縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーターの安定性および感度は、1×10-16Mの標的核酸希釈物までの標的核酸の検出を提供することができる。
【００１５】
本発明の第二の局面に従い、標的核酸の検出法が提供され、該方法は、
(a)標的核酸を、作用電極に連結された核酸捕獲プローブとハイブリダイズさせて、二本鎖核酸複合体を形成する工程；
(b)縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーターを、該二本鎖核酸複合体に介入させる工程；
(c)PIND-Ru-PINDビス-インターカレーターを光活性化する少なくとも1つの波長を含む光で、作用電極を照射する工程；
(d)作用電極へ電位を印加する工程；ならびに
(e)光電流作用スペクトルを得る工程
を含む。
【００１６】
標的核酸の量は、光電流作用スペクトルから決定することができる。
【００１７】
本発明の第三の局面に従い、標的核酸の定量法が提供され、該方法は、
(a)標的核酸を、作用電極に連結された核酸捕獲プローブとハイブリダイズさせて、二本鎖核酸複合体を形成する工程； 
(b)縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーターを、該二本鎖核酸複合体に介入させる工程；
(c)PIND-Ru-PINDビス-インターカレーターを光活性化する少なくとも1つの波長を含む光で、作用電極を照射する工程；
(d)作用電極へ電位を印加する工程；ならびに
(e)光電流作用スペクトルを得る工程
を含む。
【００１８】
標的核酸の量は、光電流作用スペクトルから決定することができる。
【００１９】
本発明の第四の局面に従い、標的核酸の検出装置が提供され、該装置は、
(a)第一の局面の電極システム；
(b)電極システムの作用電極を照射する手段；
(c)作用電極へ電位を印加する手段；および
(d)光電流作用スペクトルを得る手段
を含む。
【００２０】
使用時に、作用電極を照射する手段による電極システムの作用電極の照射、および作用電極へ電位を印加する手段による作用電極への電位の印加は、光電流作用スペクトルを得る手段により得られる光電流作用スペクトルを生じる。標的核酸の量は、光電流作用スペクトルから決定することができる。
【００２１】
この装置は、その上に作用電極が配置される支持体をさらに含むことができる。
【００２２】
この装置は任意に、データ捕獲装置をさらに含むことができる。データ捕獲装置は、電位を作用電極へ印加する手段を提供することができる。データ捕獲装置は、作用電極の光電流作用スペクトルを得るための手段を提供することができる。
【００２３】
この装置は、流体システムをさらに含むことができる。流体システムは、標的核酸を電極システムへ送達する手段を提供することができる。
【００２４】
この装置は、温度制御装置をさらに提供することができる。温度制御装置は、流体システムと組合せて使用することができる。
【００２５】
この装置は、光学スキャナまたは検出器をさらに含むことができる。光学スキャナまたは検出器は、電極システムからデータを受け取ることができる。このデータは試料識別子でありうる。加えてまたは代わりに、データは蛍光データであってもよい。
【００２６】
本発明の第五の局面に従い、標的核酸を定量する装置が提供され、該装置は、
(a)第一の局面の電極システム；
(b)電極システムの作用電極を照射する手段；
(c)作用電極へ電位を印加する手段；および
(d)光電流作用スペクトルを得る手段
を含む。
【００２７】
使用時に、電極システムの作用電極を照射する手段による作用電極の照射、および作用電極へ電位を印加する手段による作用電極への電位の印加は、光電流作用スペクトルを発生し、これは光電流作用スペクトルを得る手段により得られる。標的核酸の量は、光電流作用スペクトルから決定することができる。
【００２８】
この装置は、その上に作用電極が配置される支持体をさらに含むことができる。
【００２９】
この装置は任意に、データ捕獲装置をさらに含むことができる。データ捕獲装置は、電位を作用電極へ印加する手段を提供することができる。データ捕獲装置は、作用電極の光電流作用スペクトルを得るための手段を提供することができる。
【００３０】
この装置は、流体システムをさらに含むことができる。流体システムは、標的核酸を電極システムへ送達する手段を提供することができる。
【００３１】
この装置は、温度制御装置をさらに提供することができる。温度制御装置は、流体システムと組合せて使用することができる。
【００３２】
この装置は、光学スキャナまたは検出器をさらに含むことができる。光学スキャナまたは検出器は、電極システムからデータを受け取ることができる。このデータは試料識別子でありうる。加えてまたは代わりに、データは蛍光データであってもよい。
【００３３】
本発明の第六の局面に従い、バイオセンサーチップが提供され、これは、
(a)チップ；
(b)チップ上に配置された少なくとも1つの作用電極；
(c)標的核酸の配列に相補的な配列を含む、作用電極に連結された核酸捕獲プローブ；および
(d)縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター
を含む。
【００３４】
このチップは、作用電極を含むことができる。
【００３５】
この作用電極は、核酸捕獲プローブのアレイを含むことができる。
【００３６】
この作用電極は、ダイヤモンド、グラッシーカーボン、金、グラファイト、インジウムスズ酸化物、白金またはケイ素の少なくとも1つを含むことができる。この作用電極は、インジウムスズ酸化物を含むことができる。
【００３７】
核酸捕獲プローブは、DNAを含むことができる。加えてまたは代わりに、核酸捕獲プローブは、RNAを含むことができる。
【００３８】
標的核酸は、DNAを含むことができる。DNAは、cDNAを含むことができる。加えてまたは代わりに、標的核酸は、RNAを含むことができる。RNAは、cRNAを含むことができる。
【００３９】
定義
本明細書の状況において、用語「含む(comprising)」は、「大抵は、しかし必ずしもではないが単に含む」ことを意味する。さらに「含む(comprise)」および「含む(comprises)」のような単語「含む(comprising)」の変形は、対応する変形された意味を有する。
【００４０】
本明細書において使用される用語「プライマー」は、用語「オリゴヌクレオチド」と互換的に使用される。用語「プライマー」は、鋳型による(template-directed)DNA合成の開始点として作用することが可能である一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。「オリゴヌクレオチド」は、典型的には長さが2〜約500塩基までの一本鎖核酸である。オリゴヌクレオチドの正確な長さは、特定の適用に従い変動するが、典型的には15〜30ヌクレオチドの範囲と考えられる。オリゴヌクレオチドは鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、鋳型とハイブリダイズするのに十分な相補性でなければならない。
【００４１】
本明細書において使用される用語「ハイブリダイズ」は、核酸の状況において、当初対を形成しない2つの核酸の相補的領域の間に塩基対を形成することを意味する。
【００４２】
本明細書において使用される用語「チップ」は、用語「アレイ」または「マイクロアレイ」と互換的に使用され、作用電極を含むかまたは作用電極がその上に配置された装置を意味する。典型的には、核酸捕獲プローブは、作用電極に連結されている。
【００４３】
発明を実施する最良の態様
縫い込み型ビス-インターカレーターPIND-Ru-PINDは、核酸ハイブリダイゼーション事象の超高感度非標識検出を明らかにする実験において使用した。
PIND-Ru-PIND：
PIND＝N,N'-ビス(3-プロピル-イミダゾール)-1,4,5,8-ナフタレンジイミド
Ru＝Ru(bpy)22+(bpy＝2,2'-ビピリジン)
直接のボルタンメトリー検出と比べ、注目に値する感度増強が実現された。光電気化学的シグナルは、フェムトモル(10-15M)量といった少ない核酸が存在する場合に観察され、このことは、従来の技術に勝る核酸検出の感度の104倍の増大を表している。従って本発明は、ハイブリダイゼーションベースの核酸バイオセンサー適用の改善された方法を提供する。
【００４４】
図1は、本発明の1つの態様を図示している。システム(100)は、支持体(110)、支持体(110)上に配置された作用電極(120)、データ捕獲装置(160)、光源(170)、および任意に対電極(180)、参照電極(190)、流体システム(200)、温度制御装置(210)および光学スキャナまたは検出器(220)を含む。核酸捕獲プローブ(130)は、作用電極(120)に連結され、標的核酸(140)の配列に相補的な配列を含む。二本鎖核酸複合体を形成するための標的核酸(140)と核酸捕獲プローブ(130)のハイブリダイゼーション時に、この複合体には、縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)が介入し、介入したPIND-Ru-PIND(150)の量は、標的核酸(140)の量を示す。
【００４５】
この支持体(110)は、任意の材料を含むことができ、本発明の遂行に必要とされるような任意の形状、サイズ、寸法、密度および/または伝導度でありうる。一部の態様においては、支持体(110)および/または作用電極(120)は、光源(170)が照射される作用電極(120)上の位置を、光学スキャナまたは検出器(220)と組合せて決定する手段を含む。例えば、照射位置を決定するための格子または他の参照マークもしくはインデックスなどの識別子が提供されてよい。このような識別子は、本発明の遂行を可能にする当技術分野において公知の任意の方法により、支持体(110)および/または作用電極(120)に適用することができ、これは物理蒸着または化学蒸着、リソグラフィー、イオン補助型または電気化学的蝕刻または電気メッキを含むが、これらに限定されるものではない。別の態様において、作用電極(120)が、核酸捕獲プローブ(130)のアレイを含む場合、識別子は、核酸捕獲プローブ(130)のようなアレイの一部またはアレイ内の呈色分子、蛍光分子もしくは光電気化学的分子を含むことができる。識別子が核酸捕獲プローブ(130)である場合、識別子標的核酸(140)を、識別子核酸捕獲プローブ(130)へ添加してハイブリダイズさせ、これにより識別する核酸複合体を形成する。識別する核酸複合体と縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)のインターカレーション時に、この複合体を光源(170)により照射することは、識別する光電気化学的シグナルの発生を生じる。別の態様において、支持体(110)は、光源(170)の照射時に、光起電性手段、フォトレジスト手段または他の感光手段のような、電気シグナルを発生させる手段を含み、これにより照射の位置を同定する。
【００４６】
作用電極(120)は、開示されたアッセイと適合性がある当技術分野において公知の任意の電極であり、ダイヤモンド、グラッシーカーボン、金、グラファイト、インジウムスズ酸化物、白金またはケイ素の少なくとも1つを含むことができる。好ましくは、作用電極(120)は、インジウムスズ酸化物電極を含む。一部の態様において、これらの構成部品の光学的配置は、例えば、プリンティング、コーティング、または物理蒸着もしくは化学蒸着のいずれかによる、当技術分野において公知の任意の手段を使用し、支持体(110)上の層として配置された作用電極(120)が関与することができる。作用電極(120)は、例えば長方形、円形または任意の多角形のような、好適な物理的形状を有する。さらに作用電極(120)は、平面または非平面のいずれかでありうる。非平面の例は、円柱、円錐、三角錐のような任意のプリズムを含む。
【００４７】
核酸捕獲プローブ(130)は、例えば、DNA、cDNA、gDNA、RNA、cRNA、tRNA、mRNA、rRNA、RNAi、iRNA、shRNA、PNAもしくはLNAまたはそれらの任意の組合せを含むが、これらに限定されるものではないような、いかなる形の核酸も含むことができる。核酸捕獲プローブ(130)は、核酸捕獲プローブ(130)と標的核酸(140)のハイブリダイゼーションまたはアニーリングを提供するように、標的核酸(140)の配列に相補的な配列であるようにデザインされた任意の配列でありうる。一部の態様において、対照核酸捕獲プローブ(130)は、標的核酸(140)の配列と少なくとも1個のヌクレオチド残基が異なる配列でありうる。核酸捕獲プローブ(130)は、作用電極(120)に連結される。一部の態様において、作用電極(130)は、インジウムスズ酸化物(ITO)で構成され、シラン化により前処理され、核酸捕獲プローブ(130)は、作用電極(120)上に固定化する前に修飾されたアルデヒドである。好ましくは、変性されたアルデヒド修飾された核酸捕獲プローブ(130)のアリコートは、シラン化された作用電極(120)上に分配され、温度20℃で2〜3時間の期間インキュベートされる。その後作用電極(120)は、激しく攪拌された熱水中に2分間温度90℃〜95℃の範囲で浸される。核酸捕獲プローブ(130)でコートされた作用電極(120)はさらに、エタノール性溶液中に最大24時間の期間含浸される。好ましくはこの含浸期間は、1〜7時間の範囲である。さらにより好ましくは、含浸期間は、3〜5時間の範囲である。作用電極(120)上に固定化された核酸捕獲プローブ(130)の表面密度は、5〜8×10-12mol/cm2の範囲でありうる。別の態様において、核酸捕獲プローブ(130)は、結合基を用い、作用電極(120)へ結合し、その正体は、作用電極(120)の組成によって決まると考えられる。例えば、チオール結合基の使用による核酸捕獲プローブ(130)の金電極への結合は、当技術分野において周知であり、ジアゾニウム結合基の使用による核酸捕獲プローブ(130)のダイヤモンド電極への結合は、当技術分野において周知であり、置換アルコキシシラン結合基の使用による核酸捕獲プローブ(130)のケイ素電極への結合は、当技術分野において周知であり、アミンまたはカルボジイミド結合基の使用による核酸捕獲プローブ(130)のグラッシーカーボン電極への結合は、当技術分野において周知であり、カルボキシレート-アミン官能基およびビオチン-アビジン結合の使用による核酸捕獲プローブ(130)の他の電極への結合は、当技術分野において周知である。
【００４８】
核酸捕獲プローブ(130)は、例えば、DNA、cDNA、gDNA、RNA、cRNA、tRNA、mRNA、rRNA、RNAi、iRNA、shRNA、PNAもしくはLNAまたはそれらの任意の組合せを含むが、これらに限定されるものではない、任意の形の任意の配列の標的核酸(140)へハイブリダイズするようにデザインされる。ハイブリダイゼーション事象は、DNA-DNAホモ二本鎖、RNA-RNAホモ二本鎖もしくはDNA-RNAホモ二本鎖または他の任意の核酸複合体の形成を生じることができる。標的核酸(140)と核酸捕獲プローブ(130)のハイブリダイゼーション効率は、非限定的に、10％〜75％、20％〜40％、25％〜35％、27％〜35％、30％〜35％、31％〜35％、31％〜34％、31％〜33％または30％〜33％を含む範囲内でありうる。好ましくは、ハイブリダイゼーション効率は、約32％であり、標的核酸(140)の10％が核酸捕獲プローブ(130)にハイブリダイズすることを示す。
【００４９】
縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)は、一本鎖核酸よりも二本鎖核酸へ優先的に結合する光電気化学的インターカレーターである。一部の態様において、二本鎖核酸複合体と縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)のインターカレーションは、縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)由来の2個のナフタレンジイミド基と二本鎖核酸複合体とのインターカレーションにより、安定した付加物を形成し、これは二本鎖核酸複合体のリン酸基と縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)の二価陽イオン性Ru(bpy)22+基との間にイオン対を形成する。
【００５０】
介入した縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)および二本鎖核酸複合体を含む安定した付加物への電圧の印加は、第三および第五のサイクル、第三および第十のサイクル、第三および第二十サイクル、第三および第五十サイクルの間、または第三サイクル以降に、定常状態のサイクリックボルタモグラムを提供することができる。定常状態のボルタモグラムは、非限定的に0〜1.0V、0.1〜1.0V、0.2〜1.0V、0.3〜1.0V、0.4〜1.0V、0.5〜1.0V、0.5〜0.9V、0.5〜0.95V、0.55〜0.9V、0.6〜0.9V、0.6〜0.95V、0.65〜0.9V、0.65〜0.95Vまたは0.6〜1.0Vを含む範囲で、Ag/AgCl電極に対し電圧を印加する場合、電位走査速度10OmV/秒で実現することができる。この定常状態ボルタモグラムは、二本鎖核酸複合体に介入している場合の、縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)の高い安定性を示している。
【００５１】
介入した縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)の、可能性のあるレドックス活性インジケーターとしての評価は、検出限界0.50nM、および非限定的に0.5〜550nM、0.5〜150nM、0.5〜100nM、0.5〜75nM、0.5〜50nM、0.5〜20nM、0.5〜5nM、0.8〜5nM、0.8〜10nM、0.8〜15nM、0.8〜25nM、0.8〜50nM、0.8〜100nMまたは0.8〜200nMを含む動作範囲を提供することができる。低い走査速度での酸化または還元電流ピークの積分により決定されるような、介入した縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)分子の数は、非限定的に0.1〜0.5μC、0.25〜O.35μC、0.25〜0.34μC、0.25〜0.33μC、0.25〜0.32μC、0.25〜0.31μC、0.25〜0.30μC、0.26〜0.35μC、0.27〜0.35μC、0.27〜0.35μC、0.28〜0.35μC、0.27〜0.31μCまたは0.28〜0.30μCを含む範囲内を変化するように生じることができる。介入した縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)分子の、ハイブリダイズした核酸捕獲プローブ(130)標的核酸(140)複合体の塩基対に対する比は、非限定的に、1/1〜1/20、1/1〜1/10、1/2〜1/10、1/3〜1/10、1/4〜1/10、1/5〜1/10、1/3〜1/7、1/4〜1/7、1/5〜1/7、1/5〜1/8、1/4〜1/6、1/3〜1/6または1/5〜1/6を含む範囲内でありうる。
【００５２】
安定した付加物は、光源への曝露に対する光電気化学的反応を生じ、400〜600nmの範囲、より好ましくは490nmの光電流作用スペクトルを生じる。60分間の期間にわたる最大103照射サイクルの適用は、照射サイクルの数が増大するにつれて、実質的に直線的に増加するように、光帯電および放電電流を引き起こし、最大レベルからバックグラウンドレベルまで電流が降下する期間は、非限定的に、1.5〜5.0秒、1.7〜3.0秒、1.7〜2.0秒、1.75〜2秒、1.8〜2.0秒、1.85〜2.0秒、1.75〜2.1秒、1.75〜2.2秒、1.75〜2.3秒、1.75〜2.4秒、1.75〜2.5秒、1.75〜3.0秒、1.8〜2.1秒、1.8〜2.2秒、1.8〜2.3秒、1.8〜2.4秒、1.8〜2.5秒、1.8〜3.0秒、1.85〜2.0秒、1.85〜2.1秒、1.85〜2.2秒、1.85〜2.3秒、1.85〜2.4秒、1.9〜3.0秒、1.9〜2.5秒を含む範囲である。介入した縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)の安定性および感度は、非限定的に1.0M〜1×10-17M、1.0M〜1×10-16M、1.0M〜1×10-15M、1×10-3M〜1×10-17M、1×10-3M〜1×10-16M、1×10-3M〜1×10-15M、1×10-6M〜1×10-17M、1×10-6M〜1×10-16M、1×10-6M〜1×10-15M、1×10-9M〜1×10-17M、1×10-9M〜1×10-16M、1×10-9M〜1×10-15M、1×10-12M〜1×10-17M、1×10-12M〜1×10-16M、1×10-12M〜1×10-15M、1×10-13M〜1×10-17M、1×10-13M〜1×10-16M、1×10-13M〜1×10-15M、1×10-14M〜1×10-17M、1×10-14M〜1×10-16M、1×10-14M〜1×10-15M、1×10-10M〜1×10-16M、1×10-11M〜1×10-16M、1×10-13M〜1×10-16M、1×10-14M〜1×10-16M、1×10-15M〜1×10-16M、または1×10-15M〜5×10-17Mを含む範囲で希釈された標的核酸(140)の検出を提供することができる。標的核酸(140)の希釈および/または滴定は、核酸捕獲プローブ(130)を飽和することができる濃度を使用する場合に、必要とされることがある。
【００５３】
光帯電/放電電流は、入射光強度と共に直線的に増加することができ、これは非限定的に、0.05mW/cm2〜20.0mW/cm2、0.05mW/cm2〜19.9mW/cm2、0.05mW/cm2〜19.8mW/cm2、0.05mW/cm2〜19.7mW/cm2、0.05mW/cm2〜19.6mW/cm2、0.05mW/cm2〜19.5mW/cm2、0.05mW/cm2〜19.4mW/cm2、0.05mW/cm2〜19.3mW/cm2、0.05mW/cm2〜19.2mW/cm2、0.05mW/cm2〜19.1mW/cm2、0.05mW/cm2〜19.0mW/cm2、1.0mW/cm2〜20.0mW/cm2、1.0mW/cm2〜19.9mW/cm2、l.0mW/cm2〜19.8mW/cm2、1.0mW/cm2〜19.7mW/cm2 1.0mW/cm2〜19.6mW/cm2、1.0mW/cm2〜19.5mW/cm2、1.0mW/cm2〜19.4mW/cm2、1.0mW/cm2〜19.3mW/cm2 1.0mW/cm2〜19.2mW/cm2、1.0mW/cm2〜19.1mW/cm2、1.0mW/cm2〜19.0mW/cm2、2.5mW/cm2〜20.0mW/cm2、2.5mW/cm2〜19.9mW/cm2、2.5mW/cm2〜19.8mW/cm2、2.5mW/cm2〜19.7mW/cm2、2.5mW/cm2〜19.6mW/cm2、2.5mW/cm2〜19.5mW/cm2、2.5mW/cm2〜19.4mW/cm2、2.5mW/cm2〜19.3mW/cm2、2.5mW/cm2〜19.2mW/cm2、2.5mW/cm2〜19.1mW/cm2、2.5mW/cm2〜19.0mW/cm2、2.6mW/cm2〜20.0mW/cm2、2.6mW/cm2〜19.9mW/cm2、2.6mW/cm2〜19.8mW/cm2、2.6mW/cm2〜19.7mW/cm2、2.6mW/cm2〜19.6mW/cm2、2.6mW/cm2〜19.5mW/cm2、2.6mW/cm2〜19.4mW/cm2、2.6mW/cm2〜19.3mW/cm2、2.6mW/cm2〜19.2mW/cm2、2.6mW/cm2〜19.1mW/cmz、2.6mW/cm2〜19.0mW/cm2、2.7mW/cm2〜20.0mW/cm2、2.7mW/cm2〜19.9mW/cm2、2.7mW/cm2〜19.8mW/cm2、2.7mW/cm2〜19.7mW/cm2、2.7mW/cm2〜19.6mW/cm2、2.7mW/cm2〜19.5mW/cm2、2.7mW/cm2〜19.4mW/cm2、2.7mW/cm2〜19.3mW/cm2、2.7mW/cm2〜19.2mW/cm2、2.7mW/cm2〜19.1mW/cm2、または2.7mW/cm2〜19.0mW/cm2を含む範囲である。
【００５４】
縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)は、「励起」状態であり、それが二本鎖核酸複合体に介入している場合には、それが介入していない「基底」状態である場合よりも、より容易に酸化されると考えられる。従って、基底(非介入(non-intercalated))状態の場合ではなく、励起された(介入)状態の場合の、作用電極(120)の、縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)を酸化するのに十分な電位へのバイアスは、介入した縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)のみの酸化を生じる。一部の態様において、酸化された介入した縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)は、二本鎖核酸複合体へ結合し続ける。別の態様において、酸化された介入した縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)は、犠牲還元剤(sacrificial reductant)により還元され基底状態へ戻され、それにより犠牲還元剤が使い果たされるかまたは照射が中断されるかのいずれかまで、光電流を引き起こす。
【００５５】
データ捕獲装置(160)は、非限定的に、システム(100)内の電圧および/または電流を制御または測定するために、ポテンショスタット(potentiostat)として機能するかまたはこれを制御することを含み、システム(100)を制御する。ポテンショスタットは、作用電極(120)と参照電極(190)の間の電圧差を制御する任意の電子装置でありうる。ポテンショスタットは、対電極(180)を介し電流をシステム(100)へ投入する(inject)ことにより、この制御を実行することができる。ポテンショスタットは、作用電極(120)と他の電極の間の電流流れを測定することができる。ポテンショスタットの制御された変量は、システム電位であってよく、かつ測定された変量は、システム電流であってよい。このポテンショスタットは、作用電極(120)と参照電極(190)の間に所望の電位差を実現するほどのまさに高い対電極(180)を介して、制御電圧が電流に力を加える(force)ことを引き起こすことができる。制御電圧は、ポテンショスタットの内部電位制御電源によるか、または外部シグナル発生装置、例えば傾斜波発生器もしくは正弦波発生器により生じることができる。ポテンショスタットは、制御された精密な電圧源として使用することができ、これによりシステム(100)へ供給される(または内部電圧源により設定される)電位は、対電極(180)の電圧を直接制御することができる。最大電流は、セット電流範囲により、およびポテンショスタットの電力により限定されてよく、その結果制御電圧の範囲を超えて印加された電圧は、電位差測定用分圧器の挿入を必要とし、これによりポテンショスタットの電圧増幅を増大する。あるいはポテンショスタットは、制御された電流源としてまたは精密電流計として機能することができる。加えてポテンショスタットは、例えば、量子ドット、走査プローブ装置および単電子トンネル装置を使用し、単電子ほどの小さい電流の測定が可能であり得る。光電流は、蛍光分光光度計を用い測定することができる。
【００５６】
一部の態様において、データ捕獲装置(160)は、非限定的に、照射された作用電極(120)の1つまたは複数の部分を含む、光源(170)を調節する。例えば、データ捕獲装置(160)は、光源(170)へ向かい、予め決められたパターンで作用電極(120)を走査することができる。これは、作用電極(120)が、作用電極(120)に連結されたヌクレオチド捕獲プローブ(130)のアレイを含むような態様において有用である。別の態様において、データ捕獲装置(160)は任意に、作用電極(120)または支持体(110)のいずれかから光学情報を受け取るように構成された光学スキャナまたは検出器(220)からデータを受け取る。例えば、光学情報は、バーコードのような、光学的にエンコードされた試料識別子を含むことができる。あるいは、データ捕獲装置(160)は、例えば高周波タグまたはマイクロプロセッサーのような他の集積装置を使用することによる他の手段によりコードされた作用電極(120)または支持体(110)のいずれかから、試料識別データを受け取るように構成される。更なる態様において、データ捕獲装置(160)は、特定のエンコードされた試料識別データを受け取る際に、システム(100)に特定の操作手順を履行する。さらに別の態様において、光学スキャナまたは検出器(220)は、介入した縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)から誘発された光電気化学的反応により生じた作用電極(120)からの蛍光データを受け取り、そのような蛍光データは次にデータ捕獲装置(160)へ送られる。別の態様において、データ捕獲装置(160)は、非限定的に、対電極(180)、参照電極(190)、流体システム(200)、温度制御装置(210)および/または光学スキャナもしくは検出器(220)を含む、光学構成部品からのデータを獲得し、処理しおよび反応することができる。このデータ捕獲装置(160)は、単独の構成部品として図示されるが、いくつかの構成部品を含んでもよい。これらの構成部品は、このシステム(100)の特定の機能に対し特異的であることができ、およびモジュラー構成部品を含むことができ、これによりシステム(100)の所望の機能に応じ特異的構成部品を追加または削除する柔軟性をユーザーにもたらす。データ捕獲装置(160)は、当技術分野において公知のデータ獲得に関する少なくとも1つのインターフェース、例えばディスプレイ、キーボードまたはキーパッド、プリンターおよび/または周辺データポートを含むことができる。データ捕獲装置(160)は、ユーザーによりプログラム可能であるかもしくは予めプログラムされているか、またはこれら両方の組合せであってよい。
【００５７】
光源(170)は、縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)からの光電気化学的反応を誘発することが可能であるのに十分な強度およびエネルギーの任意の給源を含む。好適な光源は、レーザー、アークランプ、発光ダイオード(LED)、例えば青色光または青緑光発光ダイオード、蛍光ランプ、ハロゲンランプ、金属ハロゲン化物ランプ、放電ランプ、例えばキセノン放電ランプ、タングステン白熱ランプ、高圧ナトリウムランプまたは太陽光を含むが、これらに限定されるものではない。選択された光源は、少なくとも490nmの近傍または490nmの光、例えば、約400〜600nm、410〜590nm、420〜580nm、430〜570nm、440〜560nm、450〜550nm、460〜540nm、450〜550nm、460〜540nm、470〜530nm、480〜520nm、480〜510nm、480〜500nm、481〜499nm、482〜498nm、483〜497nm、484〜496nm、485〜495nm、486〜494nm、487〜493nm、488〜492nmまたは489〜491nmの範囲の光を放出するものである。この光は、赤外線、可視光または紫外線でありうる。一部の態様において、光源(170)は、作用電極(120)またはそれらの一部への電磁放射を向けるように構成される。別の態様において、光源(170)は、予め決められたパターンで作用電極(120)の表面を走査するように構成される。一部の態様において、光源(170)は、移動することによるか、または作用電極(120)の移動により、作用電極(120)を走査する。レーザーは、作用電極(120)に連結された核酸捕獲プローブ(130)のアレイを含むシステム(100)のための特に有用な光源(170)である。
【００５８】
任意の対電極(180)および参照電極(190)は、本発明の遂行に適している当技術分野において公知の任意の型である。好ましくは、対電極(180)は白金線であり、参照電極(190)は銀/塩化銀電極である。
【００５９】
任意の流体システム(200)は、例えば試料の作用電極(120)上への分配、作用電極(120)の洗浄、または試薬の添加のために、本発明の遂行に適している当技術分野において公知の任意の型である。流体システム(200)は、予め決められた速度での流体の連続流動(continuous flow-through)制御のために提供することができる。
【００６０】
任意の温度制御装置(210)は、例えば支持体(110)、作用電極(120)、ならびに/または、必要に応じ支持体(110)および/もしくは作用電極(120)に接触している流体を加熱または冷却するための、本発明の遂行に適している当技術分野において公知の任意の型である。
【００６１】
任意の光学スキャナまたは検出器(220)は、本発明の遂行に適している当技術分野において公知の任意の型である。光学スキャナまたは検出器(220)は、紫外/可視/近赤外線分光計でありうる。
【００６２】
従って本発明は、標的核酸を検出および/または定量するための電極システムを提供する。作用電極(120)に連結された核酸捕獲プローブ(130)は、標的核酸(140)とハイブリダイズさせて、核酸複合体を形成し、その後この複合体には、縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)が介入し、固定波長の光源による照射は、介入した縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)からの光電気化学的反応の発生を生じ、これにより光電流作用スペクトルを生じる。照射サイクルの印加は、介入した縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)の量に比例した光帯電および放電電流を生じる。従ってこの電流の測定は、介入した縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(15O)量の測定を提供し、縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)は優先的に二本鎖核酸複合体に介入するので、これは次に、ハイブリダイズした標的核酸(140)の量の測定となる。
【００６３】
本発明は、バイオセンサー「チップ」、そうでなければアレイまたはマイクロアレイとして公知のものも提供する。バイオセンサーチップは、チップ、チップ上の配置された少なくとも1つの作用電極(120)、作用電極(120)に連結されおよび標的核酸(140)の配列に相補的な配列を含む核酸捕獲プローブ(130)、ならびに縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)を含む。従って一部の態様において、支持体(110)上に配置された作用電極(120)は、その上に複数の核酸捕獲プローブ(130)が連結されたアレイ、マイクロアレイまたは「チップ」を含む。アレイ全体は、単独の作用電極(120)上に配置されてもよく、または支持体(110)上に各々配置される複数の作用電極(120)にわたって配置されてもよい。別の態様において、核酸捕獲プローブ(130)のアレイは、支持体(110)の1つの表面または複数の表面のいずれかに結合している、1つまたは複数の作用電極(120)上に配置される。アレイは、当技術分野において公知の任意の適した方法、例えばピペット、インクジェット印刷、密着焼付けまたはフォトリソグラフィーなどにより、作用電極(120)上に配置される。アレイは、少なくとも1つの素子で構成され、各素子は、少なくとも1つの核酸捕獲プローブ(130)を含む。少なくとも1つの素子は、同じ配列の複数の核酸捕獲プローブ(130)で構成されてよい。アレイを構成する素子の数は、1〜109またはそれ以上の任意の数であってよい。複数の素子がアレイ上に配置される場合、アレイ素子は、均一距離または可変距離で、またはそれらの組合せで間隔をあけることができる。各アレイ素子の中心の間の距離は、本発明の遂行に適した距離、例えば100μm、10μm、1μmまたは任意の他の距離でありうる。一部の態様において、アレイ素子は、無作為に配置され、その後各アレイ素子の各位置が決定される。アレイ素子のサイズおよび形状は、本発明の特定の適用によって決まり、かつ異なるサイズおよび形状の素子は、単独のアレイと組合せることができる。アレイの表面は、実質的に平面であっても、または凹部もしくは隆起のような特徴を有してもよく、アレイ素子は、凹部内または隆起上のいずれかに配置することができる。このような凹部は、その中にアレイ素子が含浸される溶液の貯蔵庫を提供することができ、またはそのような隆起は、本発明の遂行に必要であるように、アレイ素子の乾燥を促進することができる。例えば、素子は、96ウェルプレートの各ウェルに配置されてもよい。一部の態様において、作用電極(120)および/または支持体(110)は、アレイ素子の各々を識別するために、証印、高周波タグ、マイクロプロセッサーのような集積装置、バーコードまたは他の刻印のような、独自の識別子を含むことができる。独自の識別子は、加えてまたは代わりにアレイの表面に凹部または隆起を含むことができる。さらに独自の識別子を、その上にアレイが配置された作用電極(120)の正確な方向付けまたは識別のために提供することができる。独自の識別子は、データ捕獲装置(160)によるかまたは光学スキャナもしくは検出器(220)により直接読みとることができる。使用時に、バイオセンサーチップは、標的核酸(140)の配列に相補的な配列を有しかつ作用電極(120)に連結された核酸捕獲プローブ(130)のアレイを含んでもよく、これは二本鎖核酸複合体を形成す��ために核酸捕獲プローブ(130)とハイブリダイズする標的核酸(140)に関与し、次にこの複合体には、縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)が介入し、介入したPIND-Ru-PIND(150)の量は、標的核酸の量を示す。
【００６４】
本発明は、標的核酸(140)を、支持体(110)上に配置された作用電極(120)に連結された核酸捕獲プローブ(130)へハイブリダイズさせる工程、これにより二本鎖核酸複合体を形成する工程、その後縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)を、二本鎖核酸複合体に介入させる工程、次にPIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)を光活性化する波長を少なくとも1つ含む光で、作用電極(120)および/または支持体(110)を照射する工程、次に作用電極(120)へ電位を印加する工程、その後光電流作用スペクトルを得る工程を含み、標的核酸(140)の量が光電流作用スペクトルから決定される、標的核酸を検出および/または定量する方法も提供する。
【００６５】
標的核酸(140)を核酸捕獲プローブ(130)へハイブリダイズさせる工程は、標的核酸(140)および核酸捕獲プローブ(130)の各配列の間の相補性によって左右される。これらの各配列が相補的である場合、標的核酸(140)は、核酸捕獲プローブ(130)にハイブリダイズすると考えられる。各配列が相補的でない場合、標的核酸(140)は、本発明の遂行に適した様式で、核酸捕獲プローブ(130)へ効果的にはハイブリダイズしないと考えられる。標的核酸(140)は、好適な溶媒、例えば水、有機溶媒もしくは水性緩衝液、またはそれらの組合せに溶解させることができる。一部の態様において、標的核酸(140)は、一部の態様においてデータ捕獲装置(160)により制御される流体システム(200)により、核酸プローブ(130)とハイブリダイズする。別の態様において、温度制御装置(210)を使用し、ハイブリダイゼーション工程の生じる温度を変動させることができる。温度制御装置(210)は、データ捕獲装置(160)により制御することができる。標的核酸(140)の核酸捕獲プローブ(130)へのハイブリダイゼーション時に選択される条件またはストリンジェンシーは、非限定的に、関与した核酸の種類、標的核酸(140)および核酸捕獲プローブ(130)の配列、ならびに標的核酸(140)が溶解される溶媒を含む、様々なパラメータに応じて変動すると考えられる。そのような条件は、当業者に公知のものである。例えば、核酸捕獲プローブ(130)または標的核酸(140)のいずれかが二本鎖である場合、この二本鎖型は、ハイブリダイゼーション前に一本鎖型へ変性される。最適なハイブリダイゼーション条件は、標的核酸(140)および核酸捕獲プローブ(130)の両方の融解温度(Tm)により決定することができ、これは標的核酸(140)および核酸捕獲プローブ(130)に存在するAまたはT残基毎に2℃の値を割当て、GまたはC残基毎に4℃の値を割当てることにより算出することができる。ハイブリダイゼーションの速度は、Tmの温度を約20〜30℃下回る温度を使用し実行される場合に、最適でありうるが、これは本方法の特定の適用に応じ著しく変動し得る。本発明は、標的核酸(140)の、核酸捕獲プローブ(130)を含むヌクレオチド残基の全てまたは一部へのハイブリダイゼーションにより、好適に行うことができ、その結果標的核酸(140)および/または核酸捕獲プローブ(130)の一方または両方のいずれかは、ハイブリダイゼーション工程後に、一本鎖部分を有してもよい。
【００６６】
任意に、ハイブリダイゼーション工程後、支持体上に配置された作用電極(120)ならびに標的核酸(140)にハイブリダイズした連結された核酸捕獲プローブ(130)を有する支持体(110)は、核酸捕獲プローブ(130)へ完全にハイブリダイズしていない標的核酸(140)を除去するように、洗浄される。洗浄は、不完全にハイブリダイズした標的核酸(140)を効果的に除去するが、核酸捕獲プローブ(130)へ完全にハイブリダイズした標的核酸(140)は保持するような、当業者に公知の任意の方法により実現することができる。この洗浄工程は、流体システム(200)および/または温度制御装置(210)の調節に関与することができ、そのいずれかまたは両方は、本方法の特定の適用の必要に応じ洗浄工程のストリンジェンシーを変動するように、データ捕獲装置(160)により制御され得る。ストリンジェンシーは、洗浄流体の組成により変動することもできる。洗浄ストリンジェンシーの最適化は、当業者に公知の方法により実現することができ、例えば、核酸長および組成の算定、洗浄温度、塩濃度を含むことができる。
【００６７】
その後標的核酸(140)と核酸捕獲プローブ(130)のハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖核酸複合体には、縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)が介入する。一部の態様において、インターカレーション工程は、データ捕獲装置(160)により制御され得る流体システム(200)の使用により実現される。別の態様において、複数の縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)が使用される。さらに別の態様において、標的核酸(140)および縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)の両方が、同時に核酸捕獲プローブ(130)へ適用される。縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)は、二本鎖核酸複合体へ優先的に結合するが、一本鎖核酸へは結合しない。従って縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)は、標的核酸(140)が核酸捕獲プローブ(13O)へハイブリダイズし、かつ一本鎖標的核酸(140)または一本鎖核酸捕獲プローブ(130)には結合しないような核酸領域へのみ結合する。1つの好ましい態様において、二本鎖核酸複合体と縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)のインターカレーションは、縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)由来の2個のナフタレンジイミド基と二本鎖核酸複合体とのインターカレーションにより安定した付加物を形成し、二本鎖核酸複合体のリン酸基と縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)の二陽イオン性Ru(bpy)22+基との間にイオン対を形成する。縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)のインターカレーションの最適化は、非限定的に、標的核酸(140)と核酸捕獲プローブ(130)の間のハイブリダイゼーションの長さ、ならびに標的核酸(140)、核酸捕獲プローブ(130)および縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)の濃度を含む要因により左右されると考えられる。これらのおよび可能性のあるその他の要因の各々は、当業者により最適化され得る。
【００６８】
縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)と二本鎖核酸複合体のインターカレーション後、作用電極(120)は、データ捕獲装置(160)により制御される光源(170)により照射される。この照射は、介入した縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)のみ主として励起し、「基底」の非介入縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)は励起しないように校正されてもよい。照射の最適化は、非限定的に、インターカレーション時の縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)の励起効率、および犠牲還元剤が使用される場合はその濃度を含む要因により左右されると考えられる。一部の態様において、光源(170)は、光源(170)の移動または作用電極(120)の移動のいずれかにより、縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)を介入させたハイブリダイズした核酸複合体のアレイを走査することが可能である。アレイが存在する別の態様において、光源は、個別のアレイ素子を走査することが可能である。作用電極(120)の電位は、データ捕獲装置(160)により制御され、これは、励起された介入した縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)を酸化するが、基底の非介入の縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)は酸化しないことが可能な電位へとバイアスをかけることができる。一部の態様において、核酸捕獲プローブ(130)は、任意に犠牲還元剤と接触され、これは酸化された介入した縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)を、励起状態から基底状態へ還元することができる。これにより縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター(150)は、照射期間中、連続した光電流を発生させることができ、これはデータ捕獲装置(160)により測定することができる。特定の態様において、作用電極(120)は、犠牲還元剤を直接酸化せず、従ってバックグラウンド電流と干渉する可能性を最小化する。犠牲還元剤の組成は、本発明の遂行が可能な、当業者に公知の任意のものであり、例えば、第3級アミン、エチレンジアミン四酢酸、トリプロピルアミンおよびβ-ラクタムである。
【００６９】
作用電極の光電流作用スペクトルを得る工程は、本発明の遂行に適した、当業者に公知の任意の手段による、作用電極(120)での電流の測定に関連している。1つの態様において、電流は、データ捕獲装置(160)により測定される。
【００７０】
本発明は、標的核酸を検出および/または定量する装置も提供する。この装置は、電極システム(100)、電極システム(100)の作用電極(120)の照射のための手段としての光源(170)、作用電極(120)への電位の印加のための手段としてのデータ捕獲装置(160)、および光電流作用スペクトルを得るための手段としてのデータ捕獲装置(160)を含むことができる。この装置は任意に、光電流作用スペクトルを分析するためのデータ捕獲装置(160)、流体システム(200)、温度制御装置(210)および光学または検出器(220)をさらに含む。電極システム(100)の作用電極(120)を照射するための手段による電極システム(100)の作用電極(120)の照射、および作用電極(120)へ電位を印加するための手段による作用電極(120)への電位の印加は、光電流作用スペクトルを得るための手段により得られる光電流作用スペクトルを生じる。その後標的核酸の量が、光電流作用スペクトルから決定される。
【００７１】
本方法の感度および特異性の更なる改善は、より選択的な光レポーターのデザイン、ハイブリダイゼーション条件の最適化、およびインターカレーターのハイブリダイゼーションとは無関係の取込みにより引き起こされたバックグラウンドの更なる最小化を通じ企図される。
【００７２】
本発明はここで、以下の具体的実施例を参照し、より詳細にさらに説明されるが、本発明の範囲をいかなる意味においても制限するものとして実施例を解釈するべきではない。
【００７３】
実施例
実施例1. 全般的方法および材料
オリゴヌクレオチド
本発明を説明するために使用されるオリゴヌクレオチド配列は、以下である：
1. 合成標的核酸：
2008545136.tif 000002
2. 合成核酸の捕獲プローブ：
2008545136.tif 000003
3. 対照バイオセンサーの捕獲プローブ：
2008545136.tif 000004
4. TP53の捕獲プローブ1：
2008545136.tif 000005
5. TP53の捕獲プローブ2：
2008545136.tif 000006
6. 単ミスマッチ塩基による捕獲プローブ1：
2008545136.tif 000007
7. 単ミスマッチ塩基による捕獲プローブ2：
2008545136.tif 000008
8. 単ミスマッチ塩基による捕獲プローブ3：
2008545136.tif 000009
9. 単ミスマッチ塩基による捕獲プローブ4：
2008545136.tif 000010
10. 単ミスマッチ塩基による捕獲プローブ5：
2008545136.tif 000011
11. 単ミスマッチ塩基による捕獲プローブ6：
2008545136.tif 000012
A6は、ポリアデニル化配列AAAAAAを意味する。
【００７４】
光レポーター
PIND-Ru-PINDは、先に説明されたように、[Ru(bpy)2]Cl2およびPINDから調製した10 。
【００７５】
装置
電気化学実験は、CH Instrumentsモデル660A電気化学ワークステーション(CH Instruments, オースチン, TX)を使用し実行した。インジウムスズ酸化物(ITO)作用電極(0.20±0.02cm2)、無漏電(nonleak)Ag/AgCl(3.0M NaCl)参照電極(Cypress Systems, Lawrence, KS)、および白金線対電極からなる従来の3-電極システムを、全ての電気化学測定に使用した。紫外(UV)可視スペクトルを、V-570UV/可視(VIS)/近赤外(NIR)分光光度計(JASCO Corp., 日本)において記録した。光電流の測定は、Fluorolog(登録商標)-3蛍光分光光度計(Jobin Yvon Inc, エジソン, NJ)により、同期された660A電気化学ワークステーションと組合せて行った。蛍光分光光度計の表示モード(discovery mode)は、10nm間隔での光電流作用実験に適合させた。ITO電極上の単色光入射の強度は、スリット幅および照明器までの距離の両方を調節することにより、制御した。490nmでの光強度は、Newportモデル841-PEエネルギーおよび電力メーター(Newport Corp., アービン, CA)により検量した。照射は、ガラス基板による光の吸収を防止するために、ITO電極の前面から行った。3つの電極は、標準1.0cm蛍光キュベット内に収め(host)、作用電極は照射窓に面し、他の2つの電極は作用電極の後ろになるように配置した。この作業において報告された全ての電位は、Ag/AgCl電極に関する。全ての実験は、別に記さない限りは、室温で実行した。
【００７６】
バイオセンサーの調製、ハイブリダイゼーションおよび検出
ITO電極の予備処理およびシラン化は、Russellらの方法32に従い行った。オリゴヌクレオチド捕獲プローブの固定化は、以下のように行った：アルデヒドで修飾した捕獲プローブは、90℃で10分間変性し、0.10M酢酸緩衝液(pH6.0)中に濃度0.50μMとなるよう希釈した。捕獲プローブ溶液の25μlアリコートを、シラン化された電極上に分配し、環境チャンバー内で20℃で2〜3時間インキュベーションした。インキュベーション後、電極を、0.10％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)および水で連続してすすいだ。イミンの還元は、リン酸緩衝された生理食塩水(PBS)/エタノール(3/1)で生成された2.5mg/ml水素化ホウ素ナトリウム溶液中での、電極の5分間のインキュベーションにより行った。その後電極を、熱水(90〜95℃)中で2分間激しく攪拌しながら浸漬し、多量の水ですすぎ、窒素流れで風乾した。ハイブリダイゼーションとは無関係のPIND-Ru-PIND取込みを最小化しならびに捕獲プローブでコートされた電極の品質および安全性を改善するために、この捕獲プローブでコートされた電極を、11-アミノウンデカン酸(AUA)の2.0mg/mlエタノール性溶液に3〜5時間含浸した。未反応のAUA分子は、すすぎ除去し、電極は、攪拌エタノール中に10分間含浸することにより洗浄し、引き続きエタノールおよび水で完全にすすいだ。Tarlovの方法13を使用して電気化学的に評価された、固定化された捕獲プローブの表面密度は、5.0〜8.0×10-12mol/cm2の範囲内であることがわかり、これは金電極で認められる値よりも20〜25％低く、恐らく化学的結合(chemical coupling)による捕獲プローブ固定化効率がより低いためと考えられる。標的核酸のハイブリダイゼーションおよびその光電気化学的検出は、3工程で行った。第一に、バイオセンサーを、5O℃で維持した0環境チャンバー内に配置した。標的核酸を含有するハイブリダイゼーション溶液の25μlアリコートを、このバイオセンサー上に均等に播種した。その後これを、60分間ハイブリダイゼーションした後、50℃のブランクハイブリダイゼーション溶液で完全にすすいだ。トリス-エチレンジアミン四酢酸(TE)緩衝液(pH6.0, 10mM HClで調整)中の50〜100μM PIND-Ru-PINDの25μlアリコートと共に25℃で20分間インキュベーションした後、PIND-Ru-PINDは、ハイブリダイズした標的核酸へ、ビス-縫い込み型インターカレーションを介して結合した。その後pH6.0のTE緩衝液で完全にすすいだ。光電流を0.10M NaClO4中で0.10Vで測定した。
【００７７】
実施例2. PIND-Ru-PIND光電気化学による遺伝子検出のバリデーション
直接ハイブリダイゼーションおよび核酸/光レポーター付加物の形成による核酸の光電気化学的検出のためのスキームは、電気化学的検出10のものとは異なるが、類似している。単層のオリゴヌクレオチド捕獲プローブは、ITO電極表面上に化学的結合を介して固定化された。その後この電極は、標的核酸溶液およびインターカレーター溶液へ連続曝露された。照射時に、光電気化学的反応(光帯電電流)がこのシステム内で発生され、引き続き照射が消灯された時に放電電流が発生した。帯電および放電の両電流は、標的核酸濃度に直接相関した。
【００７８】
第一のハイブリダイゼーション試験において、合成オリゴヌクレオチドを、標的核酸(SEQ ID NO:1)として選択した。50℃で60分間のハイブリダイゼーション時に、標的核酸は、その相補的捕獲プローブ(SEQ ID NO:2)に選択的に結合し、バイオセンサー表面上に固定化され始めた。その後、50μM PIND-Ru-PIND溶液との引き続きのインキュベーション時に、PIND-Ru-PINDは、ビス-縫い込み型インターカレーションを介して、バイオセンサーに結合した。インターカレーション後のバイオセンサーの典型的サイクリックボルタモグラムは、図2Aに示した。図2Aのトレース1に示されたように、かなり高いピーク電流が、第一のサイクルのアノードプロセスにおいて観察され、これは最も確からしくは捕獲された核酸(グアニン塩基)の電気触媒酸化12に起因した、より高い数の電子が酸化プロセスに関与したことを示している。ピーク電流は、連続電位サイクリングの間に著しく下落し、定常状態ボルタモグラムには、0と1.0Vの間の3サイクル後に到達した(図2Aトレース2)。その後の過度の洗浄および電位サイクリングは、注目に値する変化は生じず、インターカレーターは、バイオセンサー表面で、ビス-縫い込み型インターカレーションにより、二本鎖DNA(ds-DNA)に頑強に結合したことを明らかにした。図2Aトレース3は、同じ処理後の、相補的でない捕獲プローブでコートされた電極(対照バイオセンサー)のボルタモグラムを示している。PIND-Ru-PINDのレドックス電位で、無視できるレドックス活性が認められた。これらの結果は、PIND-Ru-PINDは、ds-DNAと選択的に相互作用すること、および得られるds-DNA/PIND-Ru-PIND付加物は非常に遅い解離速度を有することを明確に明らかにしている。さらにバイオセンサー表面上の陽イオン性アミンの存在に起因したハイブリダイゼーションとは無関係のPIND-Ru-PIND取込みは、ほとんど存在しない。
【００７９】
検体複合体および光レポーター付加物の高レベルの安定性は、2個のナフタレンジイミド基がds-DNAに介入した後、PIND-Ru-PINDの二陽イオン性Ru(bpy)22+基が、ds-DNAのリン酸基とイオン対を形成し、解離プロセスを著しく遅延することに基づいて説明することができる。
【００８０】
結果的に、その後介入したPIND-Ru-PINDは、核酸の電気化学的検出のための電位レドックス活性インジケーターとして評価した。検出限界0.50nMおよびダイナミックレンジ0.8〜200nMが得られた。Tarlovとその同僚により提唱された手順13を使用するダイナミックレンジの上端で概算されたハイブリダイゼーション効率〜32％は、標的核酸の〜10％が、正確にハイブリダイズしたことを表しており、これは文献10,14,15において認められた値と同等である。介入したPIND-Ru-PIND分子の数は、定常状態ボルタモグラム下での電荷から概算された。低い走査速度≦10mV/秒での酸化または還元電流ピークの積分は、電荷0.29μCを生じ、従って活性のある介入したPIND-Ru-PINDの3.0pmolから生じた。この数は、PIND-Ru-PINDの＜0.1％は、アッセイされた液滴中に含まれ、PIND-Ru-PIND/塩基対の比は、1/5〜1/6であることを表している。
【００８１】
実施例3. 核酸/PIND-Ru-PIND付加物の光電気化学的特徴
核酸ハイブリダイゼーション事象のエネルギー変換のための光レポーターとして、介入したPIND-Ru-PINDを利用する可能性を試験した。図2Bのトレース1は、照射が点灯または消灯される時に、ハイブリダイズしおよびPIND-Ru-PIND処理されたバイオセンサーの光電気化学的反応を示す。この光電流発生は、2工程からなった。光電流の最初のスパイク(光帯電)は、照射直後に出現し、これはその後バックグラウンドレベルまで迅速に崩壊した。光電流がバックグラウンドレベルまで降下するには、＜2.0秒を要した。このことは、バイオセンサー表面での光発生された電子正孔対の分離を表している。陽性バイアス下で、この正孔は、バイオセンサー−溶液界面に「移動し」、他方で電子は、基板電極へ向かって「沈む(sank)」。この光電流の迅速な崩壊は、電子/正孔の大部分は、電解質へ電子を与えるかまたは電解質から電子を捕獲する代わりに、界面に蓄積されたことを示した16。
【００８２】
光が消灯された時、同様のカソード電流の光電流の過渡的挙動(光放電)が認められた。カソード電流は、時間と共に、最初の最大値から、バックグラウンドレベルまで、2.0秒以内で崩壊し、これは、バイオセンサー表面での光発生した電子および正孔の再結合(recombination)により生じた。光帯電/放電サイクルは、その強度が注目されるほど減少することなく、60分内に103回以上再生された。再生実験の一部(50サイクル)は、図2Bの挿入図に示した。対照的に、対照バイオセンサーは、あらゆる標的核酸の捕獲に失敗し、従って照射時に光電気化学的活性は認められなかった(図2Bトレース2)。核酸は、正孔発生(hole-generating)生体高分子として作用することは明らかにされている17-19。2つの限定的機構、すなわち超交換(superexchange)20および不連続ホッピング(discrete hopping)21が、提唱されている。両方の機構は、核酸二重らせんの構造的歪みが必要である22,23。どのようにして電荷が核酸を通り長い距離にわたり移動するのかという疑問は、依然議論の余地がある事項である17-26。それにもかかわらず、π-スタック型核酸システムは、その独自の電子特性を有し、タンパク質および炭水化物のような他の生体高分子とは著しく異なることが、一般に受け入れられている。電荷発生、分離および再結合プロセスは、照射時に生じる17-26。より最新の報告において、ds-DNAを介した光刺激された正孔輸送が認められた27。正孔輸送効率は、DNAの配列および電位バイアスに大いに左右されることが示された。電位バイアスがより小さい正となり始める場合、光電流の大きさは急激に減少し、0.0Vのバックグラウンドに近づき、システム内に光発生された電荷分離のみを残した27。
【００８３】
実施例4. 光電流作用スペクトルの分析
光電流作用スペクトル、すなわち入射光波長の関数としての観察された光電気化学的反応のプロットを、図3に示した。400〜600nmの領域内のハイブリダイズおよび介入したバイオセンサーの光電流作用スペクトル(図3トレース2)は、PIND-Ru-PIND吸収スペクトル(図3トレース3)と符号し(coincide)、490nmで最高光電流であることを認めることができ、このことはPIND-Ru-PINDが、バイオセンサー表面上の光活性素子であることを示唆した。この光電流のパターンは、多くのオン-オフ照射サイクルについて高度に再現可能であった。しかし介入した光レポーターが存在しない場合、対照バイオセンサーは、光活性をほとんど示さなかった(図3トレース1)。400〜440nmの領域に認められたかすかなアノード光電流は、主に基板電極の抑制された光電気化学活性によるものであった28。
【００８４】
実施例5. 照射強度の分析
照射強度は、光電流に対する重大な作用を有した。図4に示したように、光帯電/放電電流は、入射光強度と共に20mW/cm2まで直線的に増大し、より高い強度では水平となった。光電流と入射光強度の間の直線関係は、電荷担体の光発生は、モノフォトニクス(monophotonic)プロセスであることを示唆した28。
【００８５】
実施例6. 光電流および印加された電位の分析
図5は、印加された電位に対する光電流の依存を示している。光帯電電流は、印加された電位が負方向に移動した場合に、次第に増加した。光発生した電荷担体は電極/電解質へより低い効率で輸送される27ので、少ない正バイアスを伴う光帯電電流の増加は、電荷収集効率の低下に起因した。開始電位は、〜0.60Vであることが認められた。開始電位を上回る全ての光発生した電荷担体は、界面反応において収集/喪失された。印加された電位が減少するにつれて、収集/喪失された電荷担体の画分は減少した。この画分は、光強度に事実上無関係であり、これは、電荷担体が、光帯電電流を制限した電極へ輸送または電極から離脱(withdraw)された場合の効率のみであることを暗示している。
【００８６】
実施例7. 光電流および照射サイクル数の分析
核酸/光レポーター付加物の極めて低い解離速度および高度に可逆性である光電気化学的反応を考慮し、光電流と照射サイクル数の間の関係を試験した。図6に示したように、光帯電および放電の両電流は、照射サイクル数の増加と共に、103サイクルまで、ほぼ直線状に増加した。さらにランダムノイズは、十分に大きい数のサイクルにわたり積分した後は、互いにキャンセルする傾向があるので、バックグラウンドノイズの実質的低下も得られた。
【００８７】
実施例8. 核酸アッセイにおける分析的適用
核酸アッセイにおける光電気化学的方法の適用性を、ゲノム試料において試験した。完全長TP53マウスcDNAを、標準として使用し、pH8.0のハイブリダイゼーション緩衝液により異なる濃度で希釈し、その後相補的である捕獲プローブ(SEQ ID NO:4〜5)と共に使用した。10fM〜10nMの範囲の異なる濃度のcDNAを含む検体溶液を試験した。対照実験に関して、バイオセンサー調製において相補的でない捕獲プローブ(SEQ ID NO:3)を使用した。図7に示したように、1000サイクル積分は、動作範囲50fM〜1.0nM(R2＝0.97)、検出限界20fM、ボルタンメトリー法に勝る104倍の感度増強を生じた。
【００８８】
さらにハイブリダイゼーション効率およびPIND-Ru-PIND負荷レベルを解明するために、一連のボルタンメトリー測定を、ハイブリダイゼーションおよびインターカレーション後に、1.0nM TP53マウスcDNAで実行した。TP53の〜3.0fMがハイブリダイズし、表面結合捕獲プローブの〜0.21％が表され、先行技術において報告された8,13-15短いオリゴヌクレオチド(20〜50mer)に関するものよりもはるかに低い値であることが示された。加えて、ボルタンメトリー実験は、平均〜20個のPIND-Ru-PIND分子が、ハイブリダイズしたTP53に介入することを示した。ハイブリダイゼーション効率とPIND-Ru-PIND負荷レベルの間の矛盾は、一部のPIND-Ru-PIND分子がTP53の二次構造に介入し得ることを示唆し30,31、さらにこの方法の感度を増強する。
【００８９】
実施例9. バイオセンサー特異性の分析
標的遺伝子検出に関するバイオセンサーの特異性を、完全に相補的である捕獲プローブを、1塩基がミスマッチしたプローブ(SEQ ID NO:6〜11)と交換して、50ng mRNA抽出物を用いて評価した。このmRNAプールには30,000遺伝子よりも多くが存在すると考えると、TP53の実際に検出可能な量は、平均ピコグラム(〜サブピコモル)の範囲であった。図8に示したように、完全にマッチした捕獲プローブでコートされたバイオセンサーの電流増分は、2.2〜2.6nAの範囲であったのに対し、1塩基ミスマッチの捕獲プローブでコートされたバイオセンサーについては、増分は、少なくとも60％低下し、0.85nAほどに低く、完全にマッチした遺伝子とミスマッチした遺伝子の間で容易に識別可能である。
【００９０】
参考文献
2008545136.tif 000013
2008545136.tif 000014
2008545136.tif 000015
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】本発明の1つの態様の概略図。
【図２】(A)50nM標的核酸がハイブリダイズしPIND-Ru-PINDが介入したバイオセンサーのサイクリックボルタモグラム：(1)第一の走査、および(2)第三の走査、および(3)対照バイオセンサー。電位走査速度100mV/秒。(B)光電気化学的反応：(1)25nM標的核酸がハイブリダイズしPIND-Ru-PINDが介入したバイオセンサー；ならびに(2)対照バイオセンサー。挿入図：バイオセンサーの安定性試験。波長490nm、光強度22.4mW/cm2、印加された電位0.10V。
【図３】(1)対照バイオセンサーの光電流作用スペクトル、(2)1.0nM標的核酸がハイブリダイズしPIND-Ru-PIND処理されたバイオセンサーの光電流作用スペクトル、および(3)H2O中の25μM PIND-Ru-PINDのUV-vis吸収スペクトル。照射は、10nm間隔で単色光で行った。光電流は、0.10Vで収集した。
【図４】0.10Vでの、1.0nM核酸がハイブリダイズしPIND-Ru-PINDが介入したバイオセンサーの入射光強度(400〜600nm)に対する、光電流の依存。
【図５】1.0nM標的DNAがハイブリダイズしPIND-Ru-PIND処理された相補的捕獲プローブでコートされた電極の印加された電位に対する、光電流の依存。照射は、490nmの23.1mW/cm2 単色光ビームで行った。
【図６】100pM標的核酸がハイブリダイズしPIND-Ru-PIND処理されたバイオセンサーのマルチ照射サイクルの光電気化学的反応。波長490nm、光強度22.8mW/cm2。
【図７】様々な濃度のTP53マウスcDNAの光電気化学的反応。1000サイクルの積分、波長490nm、光強度22.7mW/cm2。挿入図：低濃度端での光電気化学的反応。
【図８】(1)および(3)相補的捕獲プローブ、ならびに(2)マウスTP53との一塩基ミスマッチ捕獲プローブを用いた50ng mRNA混合物中でのハイブリダイゼーションおよびインターカレーション後の、バイオセンサーの光電気化学的反応。波長490nm、光強度22.9mW/cm2。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
2008545136000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月4日(2007.5.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)作用電極；
(b)標的核酸の配列に相補的な配列を含む、作用電極に連結された核酸捕獲プローブ；ならびに
(c)縫い込み型(threading)PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター
を含み、
標的核酸が核酸捕獲プローブとハイブリダイズして、二本鎖核酸複合体を形成し、この複合体には、安定したインターカレーターが介入し(intercalate)、安定したインターカレーターの量が標的核酸の量を示すようにした、電極システム。
【請求項２】
1×10-16Mまでの濃度で標的核酸が使用される場合に、標的核酸を検出することが可能である、請求項1記載の電極システム。
【請求項３】
作用電極が核酸捕獲プローブのアレイを含む、請求項1または請求項2記載の電極システム。
【請求項４】
(a)標的核酸を、作用電極に連結された核酸捕獲プローブとハイブリダイズさせて、二本鎖核酸複合体を形成する工程；
(b)縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーターを、二本鎖核酸複合体に介入させる工程；
(c)安定したインターカレーターを光活性化する少なくとも1つの波長を含む光で、作用電極を照射する工程；
(d)作用電極へ電位を印加する工程；ならびに
(e)光電流作用スペクトルを得る工程
を含み、
標的核酸の量が光電流作用スペクトルから決定されるようにした、標的核酸の検出法。
【請求項５】
(a)標的核酸を、作用電極に連結された核酸捕獲プローブとハイブリダイズさせて、二本鎖核酸複合体を形成する工程； 
(b)縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーターを、二本鎖核酸複合体に介入させる工程；
(c)安定したインターカレーターを光活性化する少なくとも1つの波長を含む光で、作用電極を照射する工程；
(d)作用電極へ電位を印加する工程；ならびに
(e)光電流作用スペクトルを得る工程
を含み、
標的核酸の量が光電流作用スペクトルから決定されるようにした、標的核酸の定量法。
【請求項６】
1×10-16Mまでの範囲の濃度で標的核酸が使用される場合に、標的核酸を検出および定量することが可能である、請求項4または請求項5記載の方法。
【請求項７】
作用電極が核酸捕獲プローブのアレイを含む、請求項4〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
(a)請求項1記載の電極システム；
(b)電極システムの作用電極を照射する手段；
(c)作用電極へ電位を印加する手段；および
(d)光電流作用スペクトルを得る手段
を含み、
使用時に、作用電極を照射する手段による作用電極の照射、および作用電極へ電位を印加する手段による作用電極への電位の印加が、光電流作用スペクトルを発生させ、光電流作用スペクトルが、光電流作用スペクトルを得る手段により得られるようにした、標的核酸の検出装置。
【請求項９】
(a)請求項1記載の電極システム；
(b)電極システムの作用電極を照射する手段；
(c)作用電極へ電位を印加する手段；および
(d)光電流作用スペクトルを得る手段
を含み、
使用時に、作用電極を照射する手段による作用電極の照射、および作用電極へ電位を印加する手段による作用電極への電位の印加が、光電流作用スペクトルを発生させ、光電流作用スペクトルが、光電流作用スペクトルを得る手段により得られるようにした、標的核酸の定量装置。
【請求項１０】
1×10-16Mまでの範囲の濃度で標的核酸が使用される場合に、標的核酸を検出または定量することが可能である、請求項8または請求項9記載の装置。
【請求項１１】
電極システムの作用電極が核酸捕獲プローブのアレイを含む、請求項8〜10のいずれか一項記載の装置。
【請求項１２】
(a)チップ；
(b)チップ上に配置された少なくとも1つの作用電極；
(c)標的核酸の配列に相補的な配列を含む、作用電極に連結された核酸捕獲プローブ；および
(d)縫い込み型PIND-Ru-PINDビス-インターカレーター
を含む、バイオセンサーチップ。
【請求項１３】
チップが作用電極を含む、請求項12記載のバイオセンサーチップ。
【請求項１４】
作用電極が核酸捕獲プローブのアレイを含む、請求項12または請求項13記載のバイオセンサーチップ。
【請求項１５】
1×10-16Mまでの範囲の濃度で標的核酸が使用される場合に、標的核酸を検出または定量することが可能である、請求項12〜14のいずれか一項記載のバイオセンサーチップ。
【手続補正書】
【提出日】平成20年5月30日(2008.5.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008545136000001.app
【国際調査報告】
2008545136.tif 000027
2008545136.tif 000028