(57)【要約】  本発明は、免疫クロマトグラフィーによって液体試料中の関心対象の少なくとも１つの分析物の定量的測定のために方法に関し、前記方法は、対照に関して分析物の量の加重測定を含む。本方法は、特に止血の分野における医学的な診断法に、たとえば静脈の血栓塞栓性の疾患の診断のリスクを排除するために適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫クロマトグラフィーによって液体試料中の関心対象の少なくとも１つの分析物を定量的に測定するための方法であって、以下の工程：
a）条片の形態の固体支持体を含む免疫クロマトグラフィー装置であって、前記支持体は、試料適用区域、移動区域、調査される分析物のそれぞれに対して特異的な捕獲区域および比率測定対照区域（RMC）を含み、前記特異捕な獲的区域は、それぞれ前記支持体に固定された捕獲試薬を含み、前記捕獲試薬は、前記調査される分析物の1つとの特異的結合対を形成し、かつ前記RMC区域は、前記支持体に固定された対照捕獲試薬を含み、前記試薬は、検出可能なタグを有する対照試薬と特異的結合対を形成する装置を提供することと；
b）前記試料を、検出可能なタグを有する対照試薬と、および抱合体または抱合体の混合物であって、それぞれの抱合体が前記調査される分析物の1つとの特異的結合パートナーを形成し、かつ前記対照試薬のための前記タグと同じ波長を吸収する検出可能なタグを有する試薬によって構成される抱合体と接触させることと；
c）前記対照試薬および前記抱合体または抱合体の混合物の存在下にもってきた前記試料を前記支持体の前記適用区域に沈着させることと；
d）前記調査される分析物を特異的抱合体と結合対を形成させるのに、並びに前記調査される分析物および前記対照試薬を前記固体支持体に沿って毛細管作用により前記調査される分析物に特異的な捕獲区域のそれぞれに、および前記RMC区域に輸送させるのに十分な条件下で前記装置を維持することと；
e）前記捕獲区域において前記調査される分析物を前記捕獲試薬とさらに結合させるのに、および前記RMC区域において前記対照試薬を前記対照捕獲試薬と結合させるのに十分な条件下で装置を維持することと；
f）前記捕捉区域のそれぞれにおいて前記調査される分析物に結合した前記抱合体によって生じる試験シグナルの強度および前記RMC区域にて前記対照試薬によって生じるRMC対照シグナルの強度を測定することと、
を含み、
これにより、前記試料中の関心対象のそれぞれの分析物の量は、それぞれの試験シグナルのRMC対照シグナルに対する比に正比例する方法。
【請求項２】
免疫クロマトグラフィーによって液体試料中の関心対象の少なくとも１つの分析物を定量的に測定するための方法であって、以下の工程：
a）条片の形態の固体支持体を含む免疫クロマトグラフィー装置であって、前記支持体は、試料適用区域、移動区域、調査される分析物のそれぞれに対して特異的な捕獲区域および比率測定対照区域（RMC）を含み、前記適用区域は、検出可能なタグを有する対照試薬と抱合体または抱合体の混合物とを含み、それぞれの抱合体は、前記調査される分析物の1つと特異的な結合パートナーを形成することができ、かつ前記対照試薬タグと同じ波長にて吸収する検出可能なタグを有し、前記RMC区域は、前記支持体上に固定された対照捕獲試薬を含み、前記試薬は、前記検出可能なタグを有する対照試薬と特異的結合対を形成する装置を提供することと；
b）前記支持体の前記適用区域に前記試料を沈着させることと；
c）前記調査される分析物を特異的抱合体と結合対を形成させるのに、並びに前記調査される分析物および前記対照試薬を前記固体支持体に沿って毛細管作用により前記調査される分析物に特異的な捕獲区域のそれぞれに、および前記RMC区域に輸送させるのに十分な条件下で前記装置を維持することと；
d）前記捕獲区域において前記調査される分析物を前記捕獲試薬とさらに結合させるのに、および前記RMC区域にて前記対照シグナルを前記対照捕獲試薬と結合させるのに十分な条件下で前記装置を維持することと、
e）前記捕獲区域のそれぞれにおいて前記調査される分析物に結合した前記抱合体によって生じる試験シグナルの強度および前記RMC区域にて前記対照試薬によって生じるRMC対照シグナルの強度を測定することと、
を含み、
これにより、前記試料中の関心対象のそれぞれの分析物の量（または比）は、それぞれの試験シグナルの前記RMC対照シグナルに対する比に正比例する方法。
【請求項３】
前記抱合体または抱合体の混合物およびRMC対照試薬が、乾燥形態で使用されることで特徴づけられる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記RMC区域の領域で捕獲される前記対照試薬と前記調査される分析物とが、交差反応性を有さないことで特徴づけられる、請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項５】
アッセイ法がヒト起源の試料で行われるときに、前記RMCが動物起源の分子から選択されることで特徴づけられる、請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項６】
前記対照試薬が動物起源の免疫グロブリンから選択され、かつその捕獲試薬が前記対照試薬の前記動物種に対して向けられた抗体であることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記RMC対照試薬とその特異的捕獲試薬との間で形成される結合対が、抗原／抗体型のものであることを特徴とする、請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項８】
前記抱合体または抱合体の混合物で使用されるタグが、同じ波長を吸収する前記RMC対照試薬で使用されるものであることを特徴とする、請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項９】
前記抱合体または抱合体の混合物で使用されるタグと前記RMC対照試薬で使用されるものとが、同一であることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記使用されるタグが粒子型ものであることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
【請求項１１】
前記使用されるタグがコロイド金であることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記試験シグナルおよびRMCシグナルが、条片リーダーを使用して読み込まれることを特徴とする、請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項１３】
前記測定が反射率または透過率によって行われることを特徴とする、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
請求項1または請求項2に記載の方法であって、前記試験／RMCシグナル比は、複数の濃度における参照分析物のアッセイおよびRMCアッセイから確立された標準検量線と比較され、前記検量線上のそれぞれの位置は、前記分析物シグナル／RMCシグナル比に正比例する分析物の量に対応することを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法であって、試料移動の開始時に前記条片の所与の区域（28）内への前記標識の通過を自動的に検出し、前記通過の検出のために所定の期間の計数を自動的に開始して、前記期間の終わりに、前記条片の前記試験区域および対照区域において標識によって生じるシグナルの獲得を自動的に開始することからなることを特徴とする方法。
【請求項１６】
液体試料中に存在する物質の免疫クロマトグラフィーによる定量的アッセイ法のための方法であって、前記液体試料を、アッセイされる前記物質と反応して複合体を形成することができる抱合体と、および対照製品と接触させることと（前記抱合体および前記対照製品は、検出標識を含み）、前記試料を毛細管作用下で前記抱合体および前記対照製品と共に、前記複合体と反応することができる試薬を含む試験区域（34）および前記対照製品と反応することができる含む対照区域（36）を含む多孔質材料の条片（22）に移動することと、前記試験区域（34）における、および前記対照区域（36）における前記標識によって生じるシグナルを検出することと、前記シグナルの比を作製して、そこから前記試料中に存在するアッセイされる対照産物物質の量を推定することとからなり、また、これは、前記試料移動の開始時に前記条片の所与の区域（28）内への前記標識の通過を自動的に検出し、前記通過の検出のために所定の期間の計数を自動的に開始して、前記期間の終わりに、前記条片の前記試験区域（34）および対照区域（36）の標識によって生じるシグナルの獲得を自動的に開始することからなることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法であって、これは、前記試験区域および前記対照区域における前記標識によって生じる前記シグナルの前記領域Aを測定すること、前記領域の前記比を算出すること、および前記試料中に存在する前記物質の量を前記比率から推定することを含む方法。
【請求項１８】
請求項16または請求項17に記載の方法であって、前記標識は、所与の波長に光吸収ピークを有し、前記方法は、この波長にて前記条片（22）を照射して、少なくとも１つの光検出器または光検出器（40）の組立品を使用して前記標識によって反射され、または拡散された前記光の強度を測定すること、および前記光検出器によって放射された前記シグナルを処理して前記標識によって生じる前記シグナルの前記領域Aを得ることからなることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項18に記載の方法であって、これは、前記条片（22）の種々の位置にて前記標識によって生じる前記シグナルを捕獲するために光検出器（40）のアレイを使用することからなることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項18に記載の方法であって、これは、走査距離の関数として前記標識によって生じるシグナルを捕獲するために、および前記シグナルの前記領域Aを決定するために、前記条片（22）を走査するための手段と結合された光検出器（40）を使用することからなることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法であって、前記試料移動の開始時における所与の区域（28）内での前記標識の前記通過の検出と前記試験（34）区域および対照（36）区域におけるシグナルの獲得との間の期間が、約10分であることを特徴とする方法。
【請求項２２】
血液試料中のD二量体をアッセイするための、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法の使用。
【請求項２３】
前記アッセイ法が、血漿試料で行われることを特徴とする、請求項22に記載の使用。
【請求項２４】
静脈血栓塞栓性疾患の排除診断のための、請求項22または請求項23に記載の方法の使用。
【請求項２５】
免疫クロマトグラフィーによって液体試料中の関心対象の少なくとも１つの分析物の測定のための定量的方法を行うためのキットであって：
a）(i)前記分析物のための捕獲化合物のそれぞれについて、前記分析物が検出可能なタグを有する試薬によって構成された抱合体と特異的結合パートナーを形成する場合に、前記捕獲化合物と実施する試料に含まれる分析物との間の特異的結合反応によって前記試験試料の予め定められた分析物を捕獲すること、および（ii）前記対照試薬のための捕獲化合物について、検出可能なタグを有する対照試薬を捕獲することができる捕獲化合物と呼ばれる異なるタイプの化合物が、異なった区域に固定された不活性支持体；
b）抱合体または異なる抱合体の混合物であって、それぞれの抱合体が、生体試料中の調査されている予め定められた分析物と特異的に結合することができる試薬によって構成されており、かつ前記抱合体は、さらに検出可能なタグを有し、前記抱合体は、飽和した抱合体の貯蔵所に含まれている抱合体または異なる抱合体の混合物；
c）前記抱合体のためのタグと同じ波長を吸収する検出可能なタグを有する対照試薬（RMC：比率計測定対照）；
d）複数の濃度にて抱合体と結合した参照分析物をアッセイすることによって、および同じ条件下で所与の濃度にて前記対照試薬（RMC）をアッセイすることによって確立した、それぞれの分析物についての前記分析物に特異的な標準曲線であって、曲線上のそれぞれの位置は、前記分析物捕獲化合物によって捕獲された前記分析物と結合した前記抱合体によって生じるシグナルの、前記対照試薬の前記捕獲化合物によって捕獲された前記対照試薬によって生じるシグナルに対する比に対応する標準曲線；
e）前記試験を行うための不活性支持体を含む1つまたは複数の支持体（裏材）；
f）適切な場合、不活性支持体およびシグナルリーダーに配置されるカセットを構成するこれらの付属物を含む容器；
g）適切な場合、前記分析物の量を測定するキットを使用するための説明書、
を含むキット。
【請求項２６】
前記不活性支持体がニトロセルロース膜である、請求項25に記載のキット。
【請求項２７】
請求項25または請求項26に記載のキットであって、前記捕獲化合物は、前記分析物を捕獲するための捕獲抗体、特にモノクローナル抗体、およびRMC捕獲のためのポリクローナル抗体であるキット。
【請求項２８】
捕獲抗体が2±0.1mg/mlの濃度で不活性支持体上に固定されている、請求項27に記載のキット。
【請求項２９】
RMC捕獲抗体が1±0.05mg/mlの濃度でビオチン結合されたIgGである、請求項25〜28のいずれか1項に記載のキット。
【請求項３０】
種々の捕獲化合物を沈澱させるための区域が、約5±0.5mmまで互いに分離されている、請求項25〜29のいずれか1項に記載のキット。
【請求項３１】
請求項25〜29のいずれか1項に記載のキットであって、前記調査される分析物は、D二量体であり、前記分析物捕獲化合物は、抗D二量体モノクローナル抗体であり、および前記標準検量線は、0〜4000ng／mlの間のD二量体の量について確立されており、前記RMC対照の値は、1200〜1600ng／mlの範囲のD二量体に対応するキット。
【請求項３２】
請求項1〜32のいずれか1項に記載の方法を行うための装置であって、前記試料を沈着させるための少なくとも１つの開口部（24）および条片の試験（34）区域および対照（36）区域にて結果を読むための窓（26）と共に形成された条片支持体（20）と、前記試験区域および対照区域における標識によって生じるシグナルを捕獲するための手段（40）とを含み、これは、前記試料移動の開始時に前記条片（22）の所与の区域（28）内への標識の通過を検出するための手段（40）と、時間を測定するための手段と、前記条片の所与の区域（28）内への標識の通過の検出からの時間を測定するための前記手段を制御するための、および所定の期間の経過後に前記試験区域および対照区域において前記標識によって生じるシグナルを捕獲するための手段（40）を制御するための手段（42）を含むことを特徴とする装置。
【請求項３３】
請求項32に記載の装置であって、前記標識の通過を検出するための前記手段は、前記試験（34）区域および対照（36）区域において前記標識によって生じるシグナルを捕獲するための前記手段（40）によって構成されることを特徴とする装置。
【請求項３４】
請求項33に記載の装置であって、前記検出手段および捕獲手段は、所与の波長にて前記標識を照射するための手段（38）および前記条片の前記照射される区域を走査するための手段と結合された少なくとも１つの光検出器（40）を含むことを特徴とする装置。
【請求項３５】
請求項32〜34のいずれか1項に記載の装置であって、これは、前記試験（34）区域および対照（36）区域において前記標識によって生じるシグナルの前記領域Aを決定するための手段および前記領域の比を算出するための手段を含むことを特徴とする装置。
【請求項３６】
請求項32〜35のいずれか1項に記載の装置であって、前記条片のための支持体は、ケーシング（20）を含み、その中に条片（22）を収容され、かつ固定されており、これは、前記試料移動の開始時に前記標識の通過を検出するための、および前記試験（34）区域および対照（36）区域において前記標識によって生じるシグナルを捕獲するための少なくとも１つの開口部（26）を含む上面を有することを特徴とする装置。
【請求項３７】
請求項36に記載の装置であって、開口部（26）は、試料移動の方向に延びており、その末端（28）の一方は、前記移動開始時に前記標識の通過を検出するための前記区域に入り、その他端（32）は、前記試験（34）区域および対照（36）区域に入ることを特徴とする装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫クロマトグラフィーによる液体試料中の関心対象の少なくとも１つの分析物の定量的測定のための方法に、およびこのために開発された装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
1980年代の終わりに向けて現れた、免疫クロマトグラフィーは、おびただしい進歩が見られた技術である。これは、現在、医学的または獣医学的診断法の従来の分野から環境まで、または農業栄養の分野まで、広範囲にわたる適用がある。
【０００３】
免疫クロマトグラフィーは、特異的に結合した一対のメンバー間の親和性結合反応に基づいた、ひとまとめにして免疫アッセイ法の総称下で知られる診断法のグループに分類される。
【０００４】
一般に、免疫アッセイ法は、使用されるアプローチに応じて2つの主要なカテゴリー：調査される分析物とタグを付けた分析物との間の特異的リガンドに対する競合を含むもの、および第1の特異的リガンドに対する分析物の結合が、前記分析物に固定されたタグを付けた第2の特異的リガンドによって示される「サンドイッチ」技術と呼ばれるものに分けられる。
【０００５】
免疫アッセイ法は、着実に装置へと発展し、これにより、使用するのが絶えずより単純になっており、迅速かつ適当な料金でルーチンの診断法を開発することができる。
【０００６】
その開発は、診断が、自動化された研究室解析を必要とすることなく、患者のベッドサイドまたは住居にて行われる「看護の場所」または「家庭試験」診断法の出現と共に、医療分野において特に重要となってきた。
【０００７】
免疫クロマトグラフィーは、迅速な診断法のタイプのもののために使用される技術のグループに分類される。
【０００８】
免疫クロマトグラフィーは、固相化学分析および不活性膜上での側方移動を使用する固相診断法である。このアプローチでは、多孔質支持層を、試験を行うために必要な試薬が乾燥形態にて取り込まれた条片の形態で使用する。特異的結合パートナー（一般に、抗原／抗体）間の認識反応が、予め定められた区域で生じ、かつその位置にて明らかにすることができるように膜を処置する。模式的には、解析する試料を支持体上に沈着させると、これが毛細管作用によって膜に沿って移動する。調査される分析物は、膜の予め定められた区域に固定された特異的リガンドによって捕獲され、反応がサンドイッチ法を使用して、タグを付けた第2の特異的リガンドによって明らかにされる。
【０００９】
免疫クロマトグラフィーにおいて競合型反応を使用することもできる。その場合、固定されたリガンドとの結合のために、調査される分析物と競合するタグを付けた分析物が使用される。そのタイプの試験のために、タグを付けたリガンドを使用することもでき：その場合、調査される分析物が固定された分析物と競合する。
【００１０】
最後に、免疫クロマトグラフィーによって抗体を調査するときに、血清型反応を使用することもできる。この場合、アッセイが可能である。疾患に対して特異的な抗原を支持体上に固定する。これは、抗原および疾患に対して特異的な試料中に存在するヒト抗体を捕獲することができる。ヒト抗体の存在は、ヒト免疫グロブリンに対する二次抗体を添加後に明らかになる。このような血清学的検査のために、抗体をタイピングして、向けられたヒト抗体のクラス（IgM、IgGまたはIgA）を決定することができる（免疫クロマトグラフィー条片の原理は、図1に示してある）。
【００１１】
いくつかの従来技術文献では、免疫クロマトグラフィー試験および装置、並びに一定の適用に対するこの技術の特定の適応を記述している。引用することができる文献の非網羅的一覧には、毛細管作用によって液体の移動させる試験片および条片上の予め定められた区域に固定される特異試薬による調査される分析物の捕獲を含む免疫クロマトグラフィー試験の一般的な原理を記述する、米国文献の米国特許第5 591 645号、米国特許第5 120 643号および欧州特許の欧州特許第 0 299 428号または欧州特許第0 250 137号、反応支持体を含む中身のない容器で構成される具体的解析装置を記述する欧州特許第0 291 184号、特異的膜支持体に関する欧州特許第0 383 619号、並びに試料中のいくつかの分析物の存在を同時検出するための定性的免疫クロマトグラフィー法を記述する欧州特許第0 267 006号がある。
【００１２】
しかし、従来技術に記述された免疫クロマトグラフィーを含む大部分の迅速な一体的試験は、裸眼での読みに基づいた定性的イエス(YES)／ノー(NO)型試験である。しかし、その様式による読みの主観性は、ばらつきおよび混乱の原因である。さらに、たとえば、止血分野におけるD二量体などの血栓症に関する一定の排除マーカーでの場合と同様に、決定カットオフが存在する一定の適用には、このような試験を使用することができない。
【００１３】
したがって、結果をできる限り簡単に定量化して得ることができるアプローチに対する需要が、急速に生じている。
【００１４】
最も古い現在のアプローチのうちの1つは、手順対照区域（PCZ）と呼ばれる特定の内部基準を使用するものである（たとえば、欧州特許第0 542 627号、国際特許出願国際公開第96/0179号、国際公開第94/07163号、またはAN, C D, YOSHIKI T, LEE G and OKADA Y, Cancer Letters 2001, 162: 135-139, CHAN, C P Y, SUM K W, CHEUNG K Y, GLATZ J F C, SANDERSON J E, HEMPEL A, LEHMANN M, RENNEBERG I and RENNEBERG R, J Immunol Methods, 2003, 279: 91-100を参照されたい）。
【００１５】
図式的には、その系において、解析される試料を、免疫クロマトグラフィー条片上に沈着する間に、調査される分析物に対して特異的な抱合体の存在下にもってくる。
【００１６】
抱合体は、調査される分析物に結合し、形成された複合体が、膜に沿って分析物に対して特異的な試験捕獲区域に移動する。この区域にて発色する呈色は、調査される分析物の濃度に比例する。分析物に結合しなかった過剰な抱合体は、条片上の試験捕獲区域の下流のPCZ区域にて捕獲される。そのPCZ区域には、使用した抱合体に対して特異的な固定された試薬を含む。実際に、そのアプローチでは、抱合体は、一般に動物起源のモノクローナル抗体であり、そのPCZ区域に固定される試薬は、抱合体の動物種に向けられた抗種抗体である。
【００１７】
原理的には比較的単純であるが、その系は、試験および対照を明らかにするために同じ抱合体試薬が作用するという一定の不利な点をもっている。このために、PCZシグナルは、分析物の濃度に非常に依存的である。高濃度については、シグナルが減少され、または極端な場合には、さらになくなり得る。
【００１８】
さらに、このような対照系では、試料に、および膜にリンクした変動の重み付けがない。
【００１９】
その他のアプローチにおいて、欧州特許第0 088 636号は、移動支持体上の間隔をあけた同じ分析物に対して特異的な複数の逐次反応区域の使用に基づいた定量的解析法を記述する。
【００２０】
また、国際公開第91/12528号は、模式的には、一方がタグに、他方がビオチンに結合されている2つの特異的試薬の間に調査される分析物がはさまれている多層条片を使用する定量的免疫クロマトグラフィー法を記述する。前記相互作用によって生じる産物は、条片に沿って移動して、ラテックス粒子に固定されるアビジンによって構成され、それらの全部が条片上に固定されている捕獲因子によって検出区域にて捕獲される。
【００２１】
国際公開第97/09620号は、試料中の分析物の定量的または半定量的検出のための方法であって、較正薬を使用することからなり、かつ複数の区域の存在に基づいており、そのうちの少なくとも１つが較正のためのものであり、1つが測定および試験が適切に機能することを確認するための最終区域のためのものである方法に関する。
【００２２】
国際公開第00/43786号は、呈色と関連する結果を示す免疫クロマトグラフィーによって得られた結果を定量化するためのアプローチであって、その値または値の範囲をシグナル呈色または呈色強度に適用して、呈色結果を内部検定標準のものと比較するアプローチを記述する。その参照に使用される方法は、実際は、調査される分析物の参照濃度に対応する参照呈色強度を定める半定量的試験のものである。これは、定量的試験で信頼できる結果を保証するための唯一の手段である、測定機および事前の較正を使用していない。
【００２３】
国際公開第97/37222号および国際公開第02/077646号は、RAMP（商標）（迅速抗原測定プラットフォーム）装置を使用することにより行われる定量的免疫クロマトグラフィー法に関する。これらの方法は、比較的複雑でアプリケーション的である。これらは、試料のための適用区域とこれを調査される分析物に特異的な試薬と接触させる区域との間を区別することを含む。さらに、これらは、検出試薬として、所望の分析物に特異的に結合することができる粒子の集団であって、所望の分析物と共に検出区域に移動する集団を使用する。
【発明の開示】
【００２４】
本発明は、特異的な重み付け系を使用する、試料（粘性、組成物など）または膜（構造の微小な不均一性）などの要因による一定のばらつきにもかかわらず、信頼できる結果を保証する単純な定量的な一般的免疫クロマトグラフィー法を提供することを目的とする。
【００２５】
特に、本発明は、探求される分析物さらには対照分析物の存在に関連したシグナルを収集することができる手段であって、後者は、分析物を含む主反応から独立するように、したがって対照シグナルの安定度、およびしたがって試験結果の客観性を保証するように選択されている手段を提唱する。
【００２６】
したがって、本発明は、このタイプの方法および装置であって、生体試料が多孔質材料の条片の一端に沈着されており、毛細管作用によって条片の第2の末端の方へ移動し、試料は、その移動の始めに、アッセイされる物質（分析物）と特異的な結合複合体を形成することができる試験産物（捕獲試薬）と、さらに対照製品（対照試薬）と接触するようにしてある方法および装置を提供する。試験産物と物質によって形成される複合体は、その複合体のための捕獲試薬が沈着されている試験区域を含む条片の第2の端部の方へ試料が移動する間に位置が変わる。また、対照製品は、対照製品のための捕獲試薬が沈着された対照区域（対照区域の近くに試験区域がある）を含む条片の第2端部の方へ試料が移動することによっても位置が変わる。
【００２７】
試験試薬および対照製品は、光学的、磁気、電子磁気またはその他の手段によって検出可能であるいずれかのタイプを検出し、またはマークするための標識を含む。
【００２８】
特定の側面において、本発明は、免疫クロマトグラフィーによって液体試料中の関心対象の少なくとも１つの分析物を定量的に測定するための方法であって、以下の工程：
a）条片の形態の固体支持体を含む免疫クロマトグラフィー装置であって、前記支持体は、試料適用区域、移動区域、調査される分析物のそれぞれに対して特異的な捕獲区域および比率測定対照区域（RMC）を含み、特異捕な獲的区域は、それぞれ支持体に固定された捕獲試薬を含み、前記捕獲試薬は、調査される分析物の1つとの特異的結合対を形成し、かつ前記RMC区域は、前記支持体に固定された対照捕獲試薬を含み、前記試薬は、検出可能なタグを有する対照試薬との特異的結合対を形成する装置を提供することと；
b）試料を、検出可能なタグを有する対照試薬と、および抱合体または抱合体の混合物であって、それぞれの抱合体が調査される分析物の1つとの特異的結合パートナーを形成し、かつ対照試薬のためのタグと同じ波長を吸収する検出可能なタグを有する試薬によって構成される抱合体と接触させることと；
c）対照試薬および前記抱合体または抱合体の混合物の存在下にもってきた試料を支持体の前記適用区域に沈着させることと；
d）調査される分析物を特異的抱合体と結合対を形成させるのに、並びに調査される分析物および対照試薬を固体支持体に沿って毛細管作用により調査される分析物に特異的な捕獲区域のそれぞれに、およびRMC区域に輸送させるのに十分な条件下で装置を維持することと；
e）捕獲区域において調査される分析物を捕獲試薬とさらに結合させるのに、およびRMC区域において対照試薬を対照捕獲試薬と結合させるのに十分な条件下で装置を維持することと；
f）捕捉区域のそれぞれにおいて調査される分析物に結合した抱合体によって生じる試験シグナルの強度およびRMC区域にて対照試薬によって生じるRMC対照シグナルの強度を測定することと、
を含み、
これにより、前記試料中の関心対象のそれぞれの分析物の量は、それぞれの試験シグナルのRMC対照シグナルに対する比に正比例する方法を提供する。
【００２９】
また、本発明は、本発明の方法を使用する、試料中の1つまたは複数の分析物の定量分析のための免疫クロマトグラフィー装置であって、条片の形態の固体支持体を含み、前記支持体は、試料適用区域、移動区域、調査される分析物のそれぞれに対して特異的な捕獲区域および比率測定対照区域（RMC）を含み、RMC区域は、支持体に固定された対照捕獲試薬を含み、前記試薬は、検出可能なタグを有する対照試薬との特異的結合によって対を形成することができる装置に属する。
【００３０】
本発明によれば、免疫クロマトグラフィー膜に沿って移動し、次いでRMC区域に固定された対照捕獲試薬によって捕獲される対照試薬は、調査される分析物との交差反応性を有さない。したがって、これにより、試料中の調査される分析物の濃度から独立した強度をシグナルに提供する。また、対照捕獲試薬は、投薬量のその他の試薬、特に分析物の捕獲のために使用されるものと、いずれの干渉も、特に抗体の場合にはいずれの交差反応性も有さないように選ぶことができる。
【００３１】
したがって、この区域で発生するシグナルは、粘性および試料中の組成物、膜の物理化学的性質の変化その他などの一定の実験条件の影響の重み付けにより、観察された結果を確証する。
【００３２】
本発明の方法を使用して得られるシグナルは、数値的結果を提供することができ、いずれの主観性も除去することができるシグナル読み込み装置を使用して測定されることが都合よい。
【００３３】
本発明の方法の状況の範囲内で、調査される分析物に対して特異的な抱合体または抱合体の混合物およびRMC対照試薬は、支持体の適用区域に対する沈着の前に試料に添加してもよい。この実施態様では、次いで、試料／抱合体／RMC試薬混合物を、上記した方法の工程b）およびc）に従って適用区域に沈着させる。
【００３４】
第2の好ましい本発明の局面において、抱合体または抱合体の混合物およびRMC対照試薬は、乾燥形態で使用される。そして、これらは、試料適用区域の領域内の貯蔵所に含まれており、試料が支持体の適用区域に沈着されているときは、抱合体または抱合体の混合物と、およびRMC対照試薬と液体試料の接触が生じる。試料の沈殿により、抱合体およびRMC対照試薬の溶解が生じ、抱合体がこれらの特異的分析物と結合を生じて、それぞれの分析物とその特異的抱合体との間で形成された複合体、RMC試薬およびおそらく分析物と反応しなかった過剰な抱合体の毛細管作用による支持体に沿った移動を生じさせる。
【００３５】
本発明の一つの特定の実施態様において、試料は、飽和した貯蔵所に置かれる（たとえば、飽和槽におけるPBS-1% Regilait−5% ショ糖飽和溶液（0.5ml〜1ml／試験の量で））。
【００３６】
この特定のバリエーションにおいて、本発明は、免疫クロマトグラフィーによって液体試料中の関心対象の少なくとも１つの分析物を定量的に測定するための方法であって、以下の工程：
a）条片の形態の固体支持体を含む免疫クロマトグラフィー装置であって、前記支持体は、試料適用区域、移動区域、調査される分析物のそれぞれに対して特異的な捕獲区域および比率測定対照区域（RMC）を含み、前記適用区域は、検出可能なタグを有する対照試薬と抱合体または抱合体の混合物とを含み、それぞれの抱合体は、調査される分析物の1つと特異的な結合パートナーを形成し、かつ対照試薬タグと同じ波長にて吸収する検出可能なタグを有し、前記RMC区域は、支持体上に固定された対照捕獲試薬を含み、前記試薬は、前記検出可能なタグを有する対照試薬と特異的な結合対を形成する装置を提供することと；
b）支持体の適用区域に試料を沈着させることと；
c）調査される分析物を特異的抱合体と結合対を形成させるのに、並びに調査される分析物および対照試薬を固体支持体に沿って毛細管作用により調査される分析物に特異的な捕獲区域のそれぞれに、およびRMC区域に輸送させるのに十分な条件下で装置を維持することと；
d）捕獲区域において調査される分析物を捕獲試薬とさらに結合させるのに、およびRMC区域において対照試薬を前記対照捕獲試薬と結合させるのに十分な条件下で装置を維持することと；
f）捕捉区域のそれぞれにおいて調査される分析物に対して結合した抱合体によって生じる試験シグナルの強度およびRMC区域にて前記対照試薬によって生じるRMC対照シグナルの強度を測定することと、
を含み、
これにより、試料中の関心対象のそれぞれの分析物の量（または比）は、それぞれの試験シグナルのRMC対照シグナルに対する比に正比例する方法。
【００３７】
本発明の第一の態様によれば、アッセイ法は、以下の通りに行われる：オペレーターが、解析される試料を条片の第１の端部に、任意に移動緩衝液と共に置き、次いで時計を始動する。次いで、条片を、結果を読み込むことができる装置に置き、これを、時計が始動した時から所定時間が経過したときにオペレーターがトリガーする。結果は、条片の試験区域および対照区域において標識によって生じるシグナルを検出することによって読み込み、その後に、記録したシグナルの比を作製して、検量線または表を使用して液体試料中に存在する物質の量を前記比率から決定する。試験および対照区域において検出されるシグナルの比は、試料（その性質、粘性、タンパク質またはイオン含量など）の、および条片（特に、その構造および構成要素の微細な変化）の一定の特徴による変動を相殺する。試験区域および対照区域において検出されるシグナルの比は、本質的に、試料中のアッセイされる物質の濃度の関数であり、少なくとも第一次近似について、試料および条片の前記特徴から独立する。
【００３８】
しかし、こうして行われるアッセイ法の正確さは、結果の品質および信頼性を保証するためにそれぞれのアッセイ法について常に同じ手順を行わなければならないオペレーターに大いに依存することが明らかにされているが、実際には必ずしも可能であるというわけではない。特にオペレーターが条片上に試料および随意の移動緩衝液を置いた後に時計を多少急速に始動する場合、アッセイ結果は、かなり変化し得る。
【００３９】
また、オペレーターは、時計の始動を怠ったり、または移動緩衝液を添加しなかったりなどの間違いをするかもしれず、これは、一般に結果がないことによって誤りが発見されたときに、アッセイを繰り返すことによって多くの時間を浪費することを意味する。
【００４０】
これらの理由により、本発明は、もう一つの態様に従って、アッセイ結果の正確さおよび信頼性を改善する定量的アッセイ法のための方法および装置を記述する。
【００４１】
この態様によれば、本発明は、オペレーターの誤りを防止することができ、優れた再現性およびアッセイ信頼性を保証することができる、前述のタイプの定量的アッセイ法のための方法および装置に関する。
【００４２】
この目的のために、液体試料中に存在する物質の免疫クロマトグラフィーによる定量的アッセイ法のために方法であって、本出願の記述に合致し、かつこれは、また、試料移動の開始時に条片の所与の区域内への標識の通過を自動的に検出し、前記通過の検出のために所定の期間の計数を自動的に開始して、前記期間の終わりに、条片の試験区域および対照区域の標識によって生じるシグナルの獲得を自動的に開始することからなることを特徴とする方法を提供する。
【００４３】
特に、定量的アッセイ法のための関連した方法は、液体試料を、アッセイされる物質と反応して複合体を形成することができる抱合体と、および対照製品と接触させることと（抱合体および対照製品は、検出標識を含み）、試料を、毛細管作用下で抱合体および対照製品と反応することができる含む対照区域を含む多孔質材料の条片に移動することと、試験区域における、および対照区域における標識によって生じる検出することと、
前記シグナルの比を作製して、前記比から試料中に存在するアッセイされる物質の量を推定することとからなり、前記方法は、また、これが、試料移動の開始時に条片の所与の区域内への標識の通過を自動的に検出し、前記通過の検出のために所定の期間の計数を自動的に開始して、前記期間の終わりに、条片の試験区域および対照区域の標識によって生じるシグナルの獲得を自動的に開始することからなることを特徴とする。
【００４４】
自動検出工程を含む記述した方法は、分析物の定量的測定のための方法の、または本方法の実施のための装置の特徴の異なる変種を用いて行うことができる。
【００４５】
この自動シグナル検出を含む態様によれば、本発明の方法は、したがって、試料が条片内を一定距離にわたってすでに移動しているときに、すなわちアッセイ反応と関連した乱れが生じる可能性のある間の予備段階後、条片上への試料もしくは移動緩衝液の沈着時または抱合体の溶解時または複合体形成時に、カウントダウンを始めることを想定する。この予備段階後にカウントダウンを開始することにより、結果を得る前の全ての試料について、条片における一定の移動が保証されるが、これは、カウントダウンが試料もしくは移動緩衝液の沈着の開始時もしくは終わりに、または抱合体の溶解の間に、または複合体形成の間に開始される場合は、保証されないであろう。
【００４６】
したがって、本アッセイ法の結果の品質および信頼性は、かなり改善される。
【００４７】
好ましい態様において、結果獲得は、試験区域および対照区域において標識によって生じるシグナルの領域を測定すること、これらの領域の比を作製すること、および試料中に存在する物質の量をこの比および検量線または表から推論することからなる。
【００４８】
本発明のさらなる特徴によれば、標識は、所与の波長に光吸収ピークを有し、該方法は、この波長にて条片を照射して、少なくとも１つの光検出器品を使用して前記標識によって反射され、または拡散された光の強度を測定すること、および前記光検出器によって放射された前記シグナルを処理して標識によって生じるシグナルの領域を得ることからなる。
【００４９】
好都合には、前記光検出器は、走査距離の関数として、前記標識によって生じるシグナルを捕獲するために、および前記シグナルの前記領域を決定するために、条片を走査するための手段と結合される。
【００５０】
また、本発明は、上で定義した方法を行うための免疫クロマトグラフィー装置であって、前記装置は、条片の形態の固体支持体を含み、前記支持体は、試料適用区域、移動区域、調査される分析物のそれぞれに対して特異的な捕獲区域および比率測定対照区域（RMC）を含み、適用区域は、検出可能なタグを有する対照試薬と抱合体または抱合体の混合物とを含み、それぞれの抱合体は、調査される分析物の1つと特異的な結合パートナーを形成し、かつ対照試薬タグと同じ波長にて吸収する検出可能なタグを有し、RMC区域は、支持体上に固定された対照捕獲試薬を含み、前記試薬は、前記検出可能なタグを有する対照試薬と特異的な結合対を形成する装置に属する。前記装置は、図2に模式的に示してある。
【００５１】
本発明の装置のある実施態様によれば、条片の膜は、50〜150秒／4cmの間に含まれるキャピラリー流速、特に100秒／4cm未満、たとえば90秒／4cmからを可能にするために、多孔性の不活性材料でできている。条片を形成する支持体の孔サイズは、10μmのものであることができる。
【００５２】
本発明の特定の実施態様において、分析物と特異的に反応して結合を形成することができる抱合体は、分析物の第1の抗原性部位に対して向けられた抗体、たとえばモノクローナル抗体であることができる。また、抱合体に結合した分析物捕獲試薬は、分析物の第2の部位に向けられた抗体、たとえばモノクローナル抗体であってもよい。
【００５３】
本発明の特定の実施態様において、RMC対照捕獲試薬（または化合物）は、また、抗体、たとえばポリクローナル抗体である。
【００５４】
分析物および対照捕獲試薬と結合する抱合体を形成する試薬は、気化することによって条片に沈着させることができる。
【００５５】
上に記述した本発明の方法の状況の範囲内で、PCZの使用は、随意となる。この場合、そのタイプの対照の機能は、調査される分析物に対して特異的な抱合体が複合体形成したかどうか、または反応後に過剰の使用されていない抱合体が残っているかどうかを検証することに限定される。
【００５６】
貯蔵所に抱合体を提供することにより、一方で貯蔵所、他方で移動膜への抱合体および試料の均一な移動を保証することができる。抱合体貯蔵所を含む試験装置に試料を添加した後に、トレーサーを溶解する。トレーサーは、貯蔵所から移動膜上に「放出され」または「浸出される」。検出および／またはアッセイの際に生じる残りの反応は、通常、最適条件下で生じる。
【００５７】
抱合体貯蔵所として作用するように使用される材料は、不織布材料である。以下を挙げることができる：最も一般的に使用されるガラス繊維（GF）、次いでセルロースフィルターおよび親水性ポリエステル。
【００５８】
抱合体貯蔵所は、一般に前処理され、該処理は、飽和する薬剤、すなわちタンパク質および／または界面活性物質での飽和前である。前記飽和、続いて37℃の温度において（一般に）迅速に乾燥後、抱合体を液浸によって、またはプリンティングによって沈着させる。
【００５９】
貯蔵所の使用により、放出される抱合体の量、膜上の抱合体の前記放出の、および移動の速度を制御することができる。
【００６０】
支持体上のRMC区域に置く様式は、それが捕捉区域のそれぞれのものとは異なっていることを条件として、本発明の方法を行う際に関連しない。RMC区域と捕捉区域との間の離隔距離は、3〜10mmの間にあってもよく、約5±0.5mmが都合よい。簡略化のために、RMC区域は、好ましくはその他の試験捕捉区域の下流に位置する。
【００６１】
本発明の方法は、都合よく、複数の分析物の同時定量化のために実施し、次いで、特異的捕獲区域にてそれぞれ分析物の支持体上の移動を止めて、特異的抱合体によって明らかにしてもよい。
【００６２】
それぞれの分析物の濃度の定量化は、単一RMCで行うことが都合よい。この場合、試験シグナルのそれぞれの、RMCシグナルに対する比を算出するだけで十分である。
【００６３】
上記のように、RMC区域の領域で捕獲される対照試薬および調査される分析物は、交差反応性を有さず、これにより、調査される分析物の濃度および性質から独立したRMCシグナル強度を保証する。
【００６４】
一例として、ヒト起源の試料で行われるアッセイ法の場合、RMCは、調査される分析物型と交差反応性をもたない動物起源の分子から選択される。
【００６５】
したがって、対照試薬は、ニワトリ免疫グロブリンなどの動物起源の一定の免疫グロブリンから選択してもよい。
【００６６】
この場合の捕獲試薬は、前記対照試薬の動物種に向けられた抗体、すなわちニワトリ抗免疫グロブリン抗体である。
【００６７】
RMC対照試薬およびその特異的捕獲試薬によって形成された結合対は、好ましくは抗原／抗体型のものである。
【００６８】
しかし、これは、たとえばラテックスまたはリポソーム型のその他の親和性パートナーまたは：アビジン（ストレプトアビジン）／ビオチン、プロテインA／免疫グロブリン（Ig）、プロテインG／Ig、レクチン／コンカナバリンA（ConA）、抗ハプトグロビン／ヘモグロビンなどの対によって構成されていてもよい。
【００６９】
抱合体に対して、および試薬RMCに対して使用されるタグは、一般に2つのタイプものである：
・特定のタグ（金、ラテックス、炭素、ポリカーボネートの粒子）および着色剤、着色デキストラン、蛍光トレーサー、その他などの直接的なもの。これらのタグは、補足反応を伴わずにそれ自体検出可能である；
・反応の生成物を測定し、および／または検出する路程反応を必要とする酵素タグなどの間接的なもの。
【００７０】
好ましくは、抱合体または抱合体の混合物に対するタグは、RMC対照試薬に対して使用されるものと同一である。それにもかかわらず、異なるタグを使用することも可能であるが、測定の間に常に相関を確立することができるように、これらが同じ波長を吸収することを条件とする。
【００７１】
好ましくは、使用されるタグは、粒子のタイプのもの、この場合コロイド金などの金の粒子である。
【００７２】
上で既に述べたとおり、調査される分析物の濃度は、定量的測定が任意単位で試験およびRMCシグナルを測定することができる条片リーダー使用して、たとえば反射率または透過率よって行うと都合がよい。
【００７３】
参照される最終測定値は、試験シグナル／RMC比である。したがって、測定される比は、行われたそれぞれの試験に対応する。
【００７４】
最初に、複数の濃度における参照分析物のアッセイによって標準曲線を確立する。所与の分析物について、この標準曲線は、試料中の分析物の量を決定するための参照として役立ち、測定される試験シグナル／RMCシグナル比に対応する。標準曲線上の値は、所与の濃度にいて参照分析物で得られたシグナルの、独特のRMCシグナルに対する比にさらに対応する。標準曲線を確立するためには、当業者がRMCシグナルを選択し、曲線の平らな部分にあると考えられる値とは反対に、シグナル／複合体曲線の上昇部分に位置するシグナル（RMCシグナル）を生じるRMC捕獲試薬-RMCの間で形成される複合体についての値に対応させる。
【００７５】
第2に、行われたアッセイについて測定された比をこの標準曲線に移す。次いで、測定された比を調査される分析物の濃度に変換することができる。こうして、適切な提示の形態（グラフ、バーコードなど）でリーダーによってトレースされ、または記憶された標準曲線を参照することによって、全ての試料のアッセイを行う。
【００７６】
記述した装置は、条片によって構成される固体支持体がケーシングに含まれるような方法で現実化されると都合がよい。
【００７７】
液体の漏出を防止することよって、ケーシングは、貯蔵所のレベルおよび膜のレベルで試料の流れに影響を与える。これは、さらに読み込みシステムに適応させることができる。
【００７８】
免疫クロマトグラフィー試験に一般に使用される検出薬剤は、コロイド金であり、これは約535nmに吸収ピークを有する。この場合、検出のためには、リーダーは、530nmにて放射する2つのLED（発光ダイオード）供与源を備えていてもよい。
【００７９】
この使用のためには、2つのタイプの（透過した、および反射した）光は、異なる特徴を有する：
・反射率は、多少環境から独立しており、使用した設備は、条片自体に対して影響を有さない；
・透過率は、設備に対して、およびより詳細には、反応条片が挿入される材料に対して高度に依存的である。これは、透過率を測定することは、使用する材料の性質および厚みに応じてより容易でも、またはより困難でもあり得ることを意味する。
【００８０】
反射光および透過光の測定は、コロイド金（抱合体）の粒子に結合された特異試薬によって捕獲される分析物の濃度に比例する。
【００８１】
本発明の例証において、好ましくは反射率が使用される。
【００８２】
また、本発明は、測定のための記述した装置を製造するための方法および以下の工程を含む本方法によって得られる装置に関する：
-一方では、試料中のアッセイされる分析物の投薬量（dosage reagent）により、他方では、捕獲対照試薬により、毛細管力による液体の流れを可能にする膜にコーティングすること（または固定すること）；
-たとえば35〜40℃の間に含まれる温度にて、特に37℃にて、たとえば30分間、たとえば事前にコーティングした膜の喚起されたインキュベーター内で乾燥すること。
【００８３】
本発明のある態様において、測定のための装置を製造するための方法は、コーティング後の膜のいずれの飽和工程も、いずれの洗浄工程も含まない。
【００８４】
本発明のある態様において、測定のための装置を製造するための方法は、捕捉抗体、たとえばモノクローナル抗体である試薬をコーティングすることによって行われる。沈着される試薬の量は、十分に明確なコーティング線が得られるというような方法で決定しなければならない。
【００８５】
コーティング後の乾燥温度は、分析物の捕獲試薬および捕獲対照試薬を構成する分子に応じて決定される。
【００８６】
これを伴わずに使用される、分析物試験の捕獲試薬および対照の標識（またはトレーサー）は、これらを材料（ラテックス粒子などの）に連結することが必要である。言い換えると、捕獲試薬を、たとえば捕獲試薬上の標識の吸収によってカップリング過程の終了後に標識して抱合体を提供し、次いでこれをたとえば遠心分離によって精製することができる。
【００８７】
本発明は、特に本方法を行うための装置であって、本出願に記述した特徴に応答する、試料を沈着させるための少なくとも１つの開口部および条片の試験区域および対照区域にて結果を読むための窓と共に形成された条片支持体と試験区域および対照区域における標識によって生じるシグナルを捕獲するための手段とを含み、前記装置は、これが試料移動の開始時に条片の所与の区域内への標識の通過を検出するための手段と、時間を測定するための手段と、前記条片の所与の区域への標識の通過の検出からの時間を測定するための前記手段を制御するための、および所定の期間の経過後に試験区域および対照区域における標識によって生じるシグナルを捕獲するための手段を制御するための手段を含むことを特徴とする装置を提唱する。
【００８８】
また、このような装置は、本出願に記述した変種の特色を含むことによって構成することができる。
【００８９】
前記条片の区域において標識の通過を検出するための手段は、試験および対照区域において標識によって生じるシグナルを捕獲するための手段によって構成されると都合がよい。
【００９０】
前記検出および捕獲手段は、所与の波長にて条片を照射するための手段と、条片の照射された区域を走査するための手段と結合された少なくとも１つの光検出器とを含む。
【００９１】
また、前記装置は、試験区域および対照区域において標識によって生じるシグナルの領域を決定するための、並びに前記領域の比を算出するための、およびメモリにすでに記憶された較正表または曲線から、試料中の所望の物質の量を決定するための手段を含む。
【００９２】
条片のための支持体には、ケーシングを含み、その中に条片が収容されて、かつ固定されており、これは、試料移動の開始時に標識の通過を検出するための、および前記試験区域および対照区域において前記標識によって生じるシグナルを捕獲するための少なくとも１つの開口部を含む上面を有する。
【００９３】
前記開口部は、試料移動の方向に延びており、その末端の一方は、前記移動開始時に前記標識の通過を検出するための前記区域に入り、一方その他端は、前記試験区域および対照区域に入る。
【００９４】
実施例においてさらに詳細に説明するように、本発明の方法は、一定の疾患を排除するための緊急状態下で行われる医用診断の援助を提供して、一定の侵襲的調査に、または高価な解析に頼ることが限られる。
【００９５】
これには、たとえば鬱血、深部静脈血栓および肺塞栓症を含む静脈の血栓塞栓性疾患の診断の分野における場合がある。
【００９６】
フランスでは、肺塞栓症だけで一年あたり100000人近くの患者に影響を及ぼし得るし、10000〜20000人の死因となり得ると見積もられている。したがって、これは、入院するかまたは外来かに係わらず、全ての患者のカテゴリーに関与し得る重大な疾患である。これは、臨床検査によって簡単に診断することができないので、診断には、通常下肢のドップラー走査と関連した、血管走査法、血管造影法またはシンチグラフィー法などの高価なイメージの（時には浸潤性の）補完的検査を含む。したがって、診断には、高価な装置および専門の人員が必要であり、必ずしも治療施設で利用できない。さらに、いくつかの検査では、確実性のある肺塞栓症の診断を排除するか、または対照的に、これを確認し、したがって有効な抗凝固剤を使用して治療を正当化する必要があるであろう。しかし、肺塞栓症の診断では、救急サービスに入院した外来患者の1/3未満の診査によってしか確かめられない点に留意すべきであり、それ故、肺塞栓症の、およびさらに一般的にいえば、静脈の血栓塞栓性疾患の診断を確認すること、または拒否することができる開発中の非浸潤性生物学的試験に対する関心がある。大部分の試験では、特に線維素溶解、特にフィブリンの特異的分解生成物のD二量体に対する凝固活性化タグを含んでいた。肺塞栓症の診断を排除するためにD二量体をアッセイすることの重要性は、明確に確認されている。
【００９７】
D二量体は、プラスミンの作用下でフィブリン凝塊の分解生成物として現れる。凝固活性化の間に生じるトロンビンは、フィブリノーゲン分子を切断し、2つの小さなペプチド（FPAおよびFPB）を遊離後、フィブリン単量体の産生、次いで重合（可溶性血餅）を生じる。血餅の安定化（不溶性血餅）は、その活性型がトランスグルタミナーゼである第XIII因子に依存的であり、これは、これらのDドメインを経て含まれるフィブリン分子を架橋結合することができる。次いで、構成される血栓の溶解を、したがってプラスミン産生を経て、線維素溶解系の活性化が生じる。フィブリンに対するプラスミンのプロテアーゼ作用により、D二量体を含む種々のサイズの切断断片であろうものの遊離を生じ、これは、初期の血栓過程と比較して比較的後期に見える。これは、生化学的スケールでの不均一な分解生成物の構築以外のいずれでもない。また、プラスミンは、線維素溶解系の病理学的活性化の間にフィブリノーゲン並びにその他の凝固因子を切断することができることに留意すべきである。フィブリノーゲンまたはフィブリン分解に由来する産物は、ひとまとめにしてFDPフィブリン／フィブリノーゲン分解産物として公知である。したがって、D二量体は、第XIII因子の作用に供された重合したフィブリン分子のプラスミンによる溶解を反映するものである。
【００９８】
血漿D二量体の量は、フィブリンの血餅の形成およびその溶解の優れた指標であると考えられる。これは、いくつかの臨床症例で増加している：深部静脈血栓、肺塞栓症、播種性血管内凝固（DIVC）、外科手術、癌および肝硬変、その他。したがって、D二量体の量は、深部静脈血栓（DVT）または肺塞栓症（PE）かどうかにかかわらず、静脈血栓塞栓性疾患（VTED）の診断排除のための助け使用される非常に有益なツールになってきた。
【００９９】
このために、使用者の実験および環境条件から独立した定量的アッセイ法のための十分に信頼できる迅速な試験の開発は、肺血管造影法、静脈造影法または肺シンチグラフィーなどの検査に頼るのを制限するために、特に利点がある。
【０１００】
本発明の方法を使用する血液試料中のD二量体のアッセイ法を下記の実施例にて例証してある。
【０１０１】
実施例にて例証した、本発明の有利な態様において、本投薬法により、500ng／mlのD二量体の閾値周辺の測定値の変動係数（CV）によって特徴づけられる結果をもたらし、これは約10%であり、シグナルの読み線がさらに1ミリメートル離れている場合、6〜8%ではない場合。
【０１０２】
本発明に従って定量的にアッセイされる血液試料は、たとえば血漿試料である。試験を行うために、約30μlの量の血漿を条片上に沈着してもよい。試験を読みことにより、試験分析物についてのシグナルの測定とRMC対照シグナルについてのものとの間で得られた比から生じるD二量体の量を導く。
【０１０３】
また、本発明は、免疫クロマトグラフィーによって液体試料中の関心対象の少なくとも１つの分析物の測定のための定量的方法を行うためのキットであって：
・(i)分析物のための捕獲化合物のそれぞれについて、前記分析物が検出可能なタグを有する試薬によって構成された抱合体と特異的結合パートナーを形成する場合に、前記捕獲化合物と実施する試料に含まれる分析物との間の特異的結合反応によって試験試料の予め定められた分析物を捕獲すること、および（ii）対照試薬のための捕獲化合物について、検出可能なタグを有する対照試薬を捕獲することができる捕獲化合物と呼ばれる異なるタイプの化合物が、異なった区域に固定された不活性支持体；
・抱合体または異なる抱合体の混合物であって、それぞれの抱合体が、生体試料中の調査されている予め定められた分析物と特異的に結合することができる試薬によって構成されており、前記抱合体は、さらに検出可能なタグを有し、前記抱合体は、飽和した抱合体の貯蔵所に含まれている抱合体または異なる抱合体の混合物；
・抱合体のためのタグと同じ波長を吸収する検出可能なタグを有する対照試薬（RMC：比率計測定対照）；
・複数の濃度にて抱合体と結合した参照分析物をアッセイすることによって、および同じ条件下で所与の濃度にて対照試薬（RMC）をアッセイすることによって確立した、それぞれの分析物についての前記分析物に特異的な標準曲線であって、曲線上のそれぞれの位置は、分析物捕獲化合物によって捕獲された分析物と結合した抱合体によって生じるシグナルの、対照試薬の捕獲化合物によって捕獲された対照試薬によって生じるシグナルに対する比に対応する標準曲線；
・試験を行うための不活性支持体を含む1つまたは複数の支持体（裏材）；
・適切な場合、不活性支持体およびシグナルリーダーに配置されるカセットを構成するこれらの付属物を含む容器；
・適切な場合、分析物の量を測定するキットを使用するための説明書を含むキットに属する。
【０１０４】
特に、捕獲化合物は、条片の形態で不活性膜、たとえばニトロセルロース膜に固定される（コーティングされる）。
【０１０５】
条片を含む装置の異なる部分を実施例および図4に例証してある。
【０１０６】
本発明の方法またはキットの特定の実施態様において、捕獲化合物は、捕捉抗体、特に分析物を捕獲するための特定のモノクローナル抗体およびRMC捕獲のためのポリクローナル抗体である。
【０１０７】
たとえば、分析物捕捉抗体は、1.5〜4mg/ml、たとえば約2±0.1mg/mlの濃度で不活性支持体上に固定される。
【０１０８】
たとえば、対照試薬捕捉抗体は、0.5〜2mg/mlの濃度で、たとえば約1±0.05mg/mlにて、不活性支持体上に固定される。
【０１０９】
本発明は、添付の図面を参照し、実施例として作製した以下の記述を読むとより理解されるであろう。
【０１１０】
図1は、条片免疫クロマトグラフィーの原理の概要である。
【０１１１】
この条片は、それぞれ以下を含む：
・試料が沈着される沈着区域1；沈着区域は、乾燥形態の抱合体を含む貯蔵所と共に示してある；
・調査される分析物に特異的な固定された捕捉抗体を含む捕獲区域2；
・抱合体に特異的な固定された捕捉抗体を含むPCZ区域3。試料中の分析物と反応しなかった過剰な抱合体は、膜に沿ってPCZ区域に移動し、ここで、これは捕捉抗体によって止められる；
・反応性条片上を試料の分析物が通過することによってトリガーされる免疫反応のための、ポンプおよびゴミ捨場として作用する吸収剤4。これは、装置全体の吸収能力を増大するように作用して、最後にアッセイを生じる免疫反応が起こった移動膜を「掃除する」。
【０１１２】
図2は、本発明の装置の一般的原理を示す。この図では、1つの分析物だけが調査されると仮定してある。膜5は、それぞれ以下を含む：
・試料が沈着されている沈着区域1。この例では、抱合体およびRMC対照試薬は、沈着区域の領域の貯蔵所6に乾燥形態で在る。
【０１１３】
・調査される分析物に特異的な固定された捕捉抗体を含む捕獲区域2；
・タグを付けた対照試薬に特異的な固定された対照捕捉抗体を含むRMC区域7。この対照試薬は、沈着区域に試料を沈着させることによって可溶性が与えられ、毛細管作用によって膜に沿ってRMC区域に移動し、ここで、これが対照捕獲試薬によって特異的に捕獲される。次いで、このRMC区域にて、アッセイされる分析物の濃度とは完全に独立してシグナルを発生する；
・反応性条片上を試料の分析物が通過することによってトリガーされる免疫反応のための、ポンプおよびゴミ捨場として作用する吸収剤4。これは、装置全体の吸収能力を増大するように作用して、最後にアッセイを生じる免疫反応が起こった移動膜を「掃除する」。試料中の分析物と、またはRMC捕獲試薬と反応しなかった過剰な抱合体は、膜に沿って移動し、次いで吸着剤によって吸引される
結果読み込み装置が機能する原理を図3に要約してある。
【０１１４】
この図において、リーダー8は、免疫クロマトグラフィー条片5による反射光9および透過光10を測定する。
【０１１５】
2つの異なる光の供与源11および11’は、条片5を照射するために使用される。
【０１１６】
図4は、免疫クロマトグラフィー条片の断面の組立品を示す図である。
【０１１７】
条片（寸法7cm 5mm）の構成要素の支持体形成部分の実寸法は、以下の通りである：
12=裏材（粘着性支持体）（70mm）；
13=コーティングされたニトロセルロース膜（40mm）；
14=抱合体のための貯蔵所（7mm）：
15=フィルター（16mm）；
16=吸着剤（18mm）。
【０１１８】
コーティングの位置：
吸着剤／ニトロセルロース膜=AB=4mm
抱合体貯蔵所／ニトロセルロース=CD=1mm
フィルター／貯蔵所抱合体=DE=6mm。
【０１１９】
図5は、試験／RMC比率の関数として、D二量体濃度を与えた較正のための標準曲線の例を図示する。
【０１２０】
図6の装置は、本質的に多孔質材料の条片22が配置されて保持されたプラスチック材料から形成されたケーシング20（その外形線は、点線として示してあり、ケーシング20の上面は、条片22の一端にて液体試料および随意の移動緩衝液を沈着させるための開口部24を含む）、および細長い形状で、たとえば条片22の半分の長さにわたって、液体試料が沈着された末端の反対側のその末端の近くに伸びる読み窓26を含む。
【０１２１】
条片22は、ニトロセルロースを主成分とする材料から作製され、たとえば、開口部24を介して沈着されたその中の液体試料は、毛細管作用によって移動し得る。
【０１２２】
すでに上記したように、条片22は、開口部24および窓26の第一の末端28との間に区域30を含み、この上に、最初に液体試料中のアッセイされる物質と複合体を形態することが意図される抱合体が、第2に移動対照製品が沈着されている。
【０１２３】
これらの第2の末端32の近くの、窓26に現れる条片の部分は、試験捕獲試薬および対照捕獲試薬がそれぞれ沈着された条片上の横断線によって示した試験区域34および対照区域36を含む。
【０１２４】
試験区域または線34のための試薬は、抱合体およびアッセイされる物質によって形成される複合体を捕獲することが意図される。対照線試薬36は、条片の前記区域30に沈着した対照製品を捕獲することが意図される。
【０１２５】
一例として、D二量体をアッセイする場合、乾燥形態で区域30に沈着される抱合体は、Diagnostica Stago（France）からのLiatest(登録商標)D-DIキットの9C3または8D2と命名された抗体の9C3F（ab）’2抗D二量体/F（ab）’2断片であり、また乾燥形態で沈着された対照製品は、抗ビオチン抗体または雌鶏のIgGの抗体であり；試験区域34のための捕獲試薬は、抗D二量体/2.1.16抗体であり、対照区域36のための捕獲試薬は、γビオチンまたは雌鶏の抗体-IgGであり、この産物のための対照製品および捕獲試薬は、アッセイされる物質と何ら交差反応性を有さない。
【０１２６】
区域30に沈着された抱合体および対照製品は、粒子標識（金、乳液、炭素、ポリカーボネート粒子など）または着色剤（蛍光トレーサーまたは酵素標識）などのいずれのタイプのものであってもよい検出標識またはマーキング標識を含む。
【０１２７】
本発明の1つの好ましい実施において、抱合体および対照製品のために使用される標識は、530nmの波長に光吸収ピークを有するコロイド金粒子である、その結果、前記標識が530nmの波長にて、またはこれに非常に近い波長にて放射する光源38で条片を照射することによって、および前記波長に感受性の光検出器または光検出器40の組立品にて照射された区域のイメージを形成することによって検出してもよい。
【０１２８】
好ましくは、光源38および光検出器40は、ケーシング20の窓28より上の条片の同じ側にあり、光強度は、反射によって測定される。変形において、光源38および光検出器40は、条片のいずれの側であってもよく、そして透過によって測定が行われる。
【０１２９】
光検出器40または光検出器の組立品は、データ処理手段42によって制御され、これは、また対照光源48の操作を制御し、検出手段40からの出力シグナルを受ける。単一の光検出器、または試験区域または対照区域34、36全体に整列された光検出器の電池が使用されるときは、前記光検出手段は、走査手段とされており、これにより、それが移動するにつれて、これらが液体試料によってカバーされた条片の種々の区域を連続的にターゲットすることができる。一例として、前記走査手段は、検出手段40に関して、矢印44によって示した方向にケーシング20を移動させるための手段を含んでいてもよい。また、光学走査手または光検出器のアレイを使用することもでき、余分な走査手段の使用もなされる。
【０１３０】
本発明のアッセイ方法は、血漿の試料中のD二量体をアッセイする場合、以下の通りである：
一定体積の血漿を支持体20の開口部14に沈着させ、次いで一定体積の移動緩衝液を前記開口部に沈着した。開口部20に沈着した液体は、条片22の毛細管作用下でその反対側の方向に移動して、最初に試験および対照製品として役立つ抱合体を含む区域30を通過する。抱合体は、試料によって、および移動緩衝液によって溶解されて、D二量体と反応して複合体を形成する。前記複合体は、毛細管作用によって対照製品と共に条片22内を移住し、こうして窓26の第１の末端28の方へ移動する。
【０１３１】
この期間中に、ケーシング20を光源38、検出手段40、データ処理手段42および検出手段40と結合した随意の走査手段と共に提供されたリーダーに配置する。
【０１３２】
このリーダーにおいて、窓26の第１の末端28が光源38によって照射されて、検出手段40によって観察される。条片22の移動の開始時に、複合体および対照製品が、窓36の第１の末端28に到達すると、これらの標識が検出手段40によって検出される。
【０１３３】
標識の検出に対応する検出手段40のための出力シグナルは、時間の関数として検出手段40によって捕獲された光強度の変動を示すグラフである図7に概略的に示してある。手段40によって捕獲された光強度Iは、標識が窓26の第１の末端28にて見えるとすぐに減少し、試験区域34および対照区域36で測定が行われる間に、最小を通って、次いで次第にプラトーまで増大する。
【０１３４】
標識が窓の第1の末端28にて見えた瞬間のこのシグナルの立ち上がりは、かなり急であり、従来法の、時報シグナルを発生する時計を備えたデータ処理手段42によって時計を始動するために使用してもよい。
【０１３５】
試験区域34または対照区域36を観察する検出手段40によって生じる測定シグナルは、図8に概略的に示してあり、この場合、曲線Cは、走査距離（d）の関数として光強度の変動に対応する。前記シグナルは、図8の陰影を付けた部分によって表したシグナルの領域Aを算出するデータ処理手段42に伝送される。
【０１３６】
試料に存在するD二量体の量は、試験区域34で測定されるシグナルの領域の対照区域36で測定されるシグナルの領域に対する比Rから、および比Rから直接D二量体の濃度を提供する確立された較正表または曲線（図5）から決定される。
【０１３７】
窓26の第１の末端28にて標識を検出することは、一定数の利点を有する：
・測定は、試験区域および対照区域34、36において、窓26の末端28の標識の外見を検出後に、一定時間（たとえば10分）行われ、前記時間間隔は、全ての試料について同じであり、条片の区域30において抱合体を溶解するための、および前記抱合体とアッセイされる物質との間の複合体形成のための条件に依存しない；
・図7のシグナルIは、標識の存在の立ち上がりの特徴を有さないと考えられるため、沈着にケーシング20の開口部24内の移動緩衝液を忘れること、またはすでに使用した条片22を使用することなどの、オペレーターの誤りを測定の際に迅速に検出することができる。
【実施例】
【０１３８】
実施例1
ニトロセルロース膜へのコーティングまたは固定のための方法
設備
固定させる抗D二量体捕捉抗体：2mg/mlの濃度にてモノクローナル2.1.16（Stago, France）。  
固定させるRMC捕獲抗体：1mg/mlの濃度にてヤギ抗ニワトリIg抗体（Sigma, France）。  
コーティング膜：ニトロセルロースSHF0900405（Millipore, USA）。  
コーティング緩衝液：0.15 Mリン酸緩衝液、pH 7.4。  
抗体溶液分配装置：Linomat IV (Camag, Switzerland) or Bio Jet Quanti 3000 (Bio dot, USA)。
【０１３９】
方法
捕捉抗体およびタンパク質を、簡単には下記に要約した方法を使用して、不活性支持体上にコーティングした（固定した）。試験あたり1μgの試験2.1.16捕捉抗体および試験あたり0.25μgのヤギ抗ニワトリRMC捕捉抗体をLinomat or Bio Jet Quanti装置を使用して（気化によって）、試験のために適した形態に事前に切断したニトロセルロース膜上に分配した。
【０１４０】
膜上に抗体を沈着して、膜に抗体を吸収させた後、直ちに喚起した乾燥器において37℃にて30分間乾燥させた。抗体でコーティングされた膜は、外界温度（22℃〜25℃）にて、密封したアルミニウムポーチで貯蔵した。
【０１４１】
実施例2
コロイド金粒子と抗体を結合するための方法
設備
抗D二量体モノクローナル抗体：F（ab）'2 9C3断片（Stago, France）。  
RMC暴露抗体：ニワトリIgG（Sigma, France）。  
テトラクロロ金酸（Sigma、France）。  
Triクエン酸ナトリウム（Prolabo, France）。  
PEG20000（Prolabo, France）。  
ホウ酸塩緩衝液、2mM。  
K2CO3溶液、0.2M。  
抱合体貯蔵所：Pt-R5（MDI, India）。
【０１４２】
方法
コロイド金粒子の調製
コロイド金の粒子（50nmのサイズ）は、Frens-Tinglu法のわずかに改変した物を使用して調製した。この方法を簡単に要約してある。
【０１４３】
清潔なフラスコ内の198mlの超純水に、2mlの1%のテトラクロロ金酸を添加する。  
フラスコ内にマグネチックスターラを配置し、沸点に加熱する。  
攪拌を続けて、275μlの10%のトリクエン酸ナトリウム溶液を添加する。  
加熱を続ける。  
青紫色が見えた後に、さらに10分間熱する。  
外界温度（22〜25℃）に冷却させる。  
スモークガラス瓶内で光から保護したコロイド金粒子を4℃にて貯臓。  
調製した粒子を特徴づける：この波長にて最大波長およびODを測定して、pHを測定する。  
試験抗D二量体−コロイド金粒子の抱合体の調製。
【０１４４】
この調製には、数工程を含む。
【０１４５】
a）カップリングのための抗体の調製
抗D二量体 9C3（断片F（ab）’2, Stago）抗体を以下のプロトコルを使用して金粒子に結合させる。  
1mg/mlの終濃度を生じるように2mMホウ酸塩、pH 6.5抗体を希釈し、これを外界温度（22〜25℃）にて3時間のその緩衝液に対して透析する。  
抗体溶液を5000rpmにて4℃において15分間遠心する。抗体を含む上清を回収した後、カップリング前に280nmの分光光度測定によってその濃度を検証する。
【０１４６】
b）カップリングのためのコロイド金の調製
コロイド金粒子のOD530nmを、逆浸透水を添加することによって1に合わせる。  
コロイド金粒子の溶液のpHを0.2M K2CO3を添加することによって6.5±0.1に調整する。
【０１４７】
c）吸着によるカップリング
抗体溶液をコロイド金粒子の0.2mg/mlの溶液と1/10（抗体体積／金粒子体積）の比に混合する。たとえば18.5mlのコロイド金粒子に対して1.85mlの抗体。  
外界温度（22〜25℃）にて2分間撹拌する。
【０１４８】
d）カップリング後の安定化および抱合体の回収
1.2mlの1% PEG20000を添加し、外界温度（22〜25℃）にて2分間ボルテックスする。  
2.4mlの1% BSAを添加し、外界温度（22〜25℃）にて2分間ボルテックスする。  
9000rpmにて4℃において1時間遠心する。  
上清を除去し、20mMトリス緩衝液、pH 8.2、PEG20000、1% BSA、0.09% アジ化ナトリウムに残渣を回収する。  
0.2μm以上の回収した抱合体を濾過する。  
抱合体をスペクトルによって特徴づけられる。  
最大λmaxおよびODmaxを測定する。
【０１４９】
ニワトリIgG−コロイド金粒子RMC抱合体の調製。
【０１５０】
抱合体RMCを調製するために同じ工程を行う。相違は、本質的にカップリング濃度およびカップリングpH：0.1 mg／mlおよび9.5にある。
【０１５１】
実施例3
抱合体貯蔵所の飽和および抱合体の沈着
1試験あたり1mlの溶液の量で飽和溶液（PBS、1% 乳、5% ショ糖）にPTR5フィルム（MDI, India）を浸漬する。攪拌しながら、外界温度にて1時間放置する。  
飽和溶液を除去した後に、換気したオーブン内で37℃にて3時間貯蔵所フィルムを乾燥させる。  
2つの抱合体（試験およびRMC）の混合物を飽和した抱合体貯蔵所に1cmあたり8μlの量で、すなわち抱合体貯蔵所は0.5cm幅であり、試験あたり4μlで沈着させる。沈着は、Air Jet system (Bio dot）を使用することにより行う。  
沈着後、抱合体貯蔵所を換気したオーブン内で37℃にて1時間乾燥する。
【０１５２】
実施例4
D二量体アッセイ試験カセット：免疫クロマトグラフィー条片
使用した条片の種々の構成要素は、以下の通りであった：
・吸着剤（17CHR, Whatman, USA）；
・試料フィルター（GF 3596, Schleicher & Schuell, Germany）；
・コーティングしたニトロセルロース膜（HF 0900405, Millipore, USA）；
・沈着した抱合体の貯蔵所（PT-R5, MDI, India）。
【０１５３】
これらは、「裏材」（010白いポリエステルGL-187, G&L, USA）と呼ばれる強固な不活性支持体上に組立てた。
【０１５４】
組立図は、図4に示してある。
【０１５５】
組立後、幅5mmおよび長さ70mmの条片をカッターで切断した（Bio dot, USA）。
【０１５６】
それぞれの条片を図6に図示したものと同様にプラスチックの容器に挿入した。
【０１５７】
条片を挿入後、プラスチックの容器を閉じて乾燥剤（BO54／Indice 1、Airsec、France）と共にアルミニウムポーチ（Soplaril、France）内にパックし、次いで2〜8℃に貯蔵した。
【０１５８】
実施例5
本発明の方法を使用するD二量体のアッセイ法
設備
移動緩衝液：0.5% PBSカゼイン（0.1% トリトンX100）；
D二量体較正薬：ヒト血漿（Stago, France）から調製したD二量体。
【０１５９】
条片リーダー：リーダー：Rapi-キット（77 Elektronika, Hungary）。
【０１６０】
方法
操作プロトコル
以下のプロトコルを使用した：
・条片、緩衝液、試料を外界温度（22〜25℃）に安定化させる；
・15μlのD二量体較正薬または血漿試料をプラスチック容器の試料ウェルに沈着；
・150μlの移動緩衝液を添加する；
・外界温度にて10分間放置；
・免疫クロマトグラフィー条片リーダー（77 Elektronika）で結果を読み込む。
【０１６１】
全ての試験は、繰り返し実施した。
【０１６２】
結果の取得および解釈
最初に、0〜4000ng／mlの異なる濃度にて再構成後に安定化したD二量体較正薬をアッセイすることにより、標準曲線を確立した。それぞれのアッセイについて、2つのシグナル（試験およびRMC）をリーダーによって測定して、試験／RMC比を算出した。
【０１６３】
この比をD二量体較正薬の濃度の関数に移すことより、標準曲線を構築した。これを試験カセットの所与のバッチにあてはまった。RMCシグナルは、RMC捕獲試薬間で形成されるシグナル／複合体曲線の上昇部分にあるものを当業者が選択し、該RMCは、500〜4000周辺であった。
【０１６４】
第2に、未知のD二量体濃度である血漿のそれぞれのアッセイについて測定した比を前記標準曲線上に移した。次いで、測定した比を調査される分析物の濃度に変換することができた。
【０１６５】
検量線を作製するための工程は、以下の通りであった：
a）較正薬をおおよその（4500ng／ml）MilliQ水で再構成する；
b）較正薬を30分間安定化させる。較正薬は、一旦これが再構成されたら、4時間安定である；
c）以下のD二量体濃度を得るために、較正薬を移動緩衝液に希釈する：
・250、500、1000、2000および4000ng／ml；
d）繰り返して試験を行う；
e）15μlの試料を試料ウェル内に沈着（較正の0のために、15μlの移動緩衝液を沈着する）；
f）150μlの移動緩衝液（10mM PBS-0.5%のカゼイン-0.1%のトリトンx100−0.095% アジドナトリウム）を添加する；
g）外界温度にて10分待つ；
h）リーダーを使用して結果を読み込む；
i）結果を結果フィルムへ移す；
j）検量線[D二量体の量=f（試験／RMC比）]トレースする；
k）プロトコルa〜i後に血漿および対照をアッセイする。
【０１６６】
標準曲線結果、実施例
【表１】
2008529024.tif 000002
【０１６７】
血漿アッセイ実施例
【表２】
2008529024.tif 000003
【０１６８】
本発明の方法で得られたアッセイ結果をELISA、Asserachrom DDimere (Stago, France)に基づいて参照法で得られたものと比較した。
【０１６９】
本発明者らは、本発明の方法で得られた結果が参照法のものに非常に近いことを理解することができる。
【０１７０】
したがって、本発明者らは、参照法のものと同等の結果を提供することができる定量的に決定可能な方法を有する。本発明の主題は、RMCが、免疫クロマトグラフィー技術（支持体および試料などのための変動）に固有の変動を重み付けすることができる。
【０１７１】
得られた結果からこの重み付けを見積もることができる。
【０１７２】
RMC重み付けの効果
それぞれのアッセイ法は、繰り返し行った。RMCのための重み付け効果は、それぞれのアッセイについて得られた2値間の絶対偏差から見積もった。完全な理論上の重み付け系について、同じアッセイの2値間の偏差は、0に等しくなければならない。
【表３】
2008529024.tif 000004
【０１７３】
これらの結果は、最も小さな相違が本発明の系だけで得られることを示す。
【０１７４】
対照的に、RMCの非存在下では、およびしたがって、単一の試験シグナルだけを使用して、アッセイが可能であるが、測定における不確定度はより大きい。
【０１７５】
重み付け効果は、再現性試験によってさらに証明された。この場合、同じ試料を本発明の方法を使用して、21回アッセイした。
【０１７６】
再現性試験
血漿1
【表４】
2008529024.tif 000005
【０１７７】
これらの繰り返しのアッセイで、本発明の方法は、変動を重み付けることができた。
【０１７８】
試験シグナル単独と比較して、4%〜6%の変動の増加が観察された。
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１】免疫クロマトグラフィーのための条片を非常に模式的に表す。
【図２】本発明に従った投薬の一般的原理を図示する。
【図３】結果読み込み装置の使用に関して模式的に図示する。
【図４】免疫クロマトグラフィーの条片の構築の様式を模式的に表す。
【図５】較正の標準曲線を表す。
【図６】本発明による投薬のための装置の主な構成要素を表す。
【図７】時間の関数として、光検出装置によって捕獲された光シグナルの強度の変動のグラフである。
【図８】条片の試験区域において、または対照区域において標識によって生じるシグナルの獲得を図示するグラフである。
【図１】
2008529024.tif 000006
【図２】
2008529024.tif 000007
【図３】
2008529024.tif 000008
【図４】
2008529024.tif 000009
【図５】
2008529024.tif 000010
【図６】
2008529024.tif 000011
【図７】
2008529024.tif 000012
【図８】
2008529024.tif 000013
【国際調査報告】
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2008529024.tif 000015
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