(57)【要約】  本出願は、少なくとも２個のコンパートメント(６８５、６８０)を有する多段階反応容器(６８)を実行する方法に関する。反応は、第一コンパートメント(６８５)で行われ、そして遠心により第二コンパートメント(６８０)に移される。その後、低チャンバーでの反応が行われている間に、第一コンパートメント(６８５)に入れられてもよい。ひとたび反応が完了すると、第一コンパートメント(６８５)内に存在する試薬が、遠心により下のコンパートメント(６８０)に移動されてもよい。本出願は、穿孔可能な下表面及び穿孔可能な要素又は蓋のいずれかを有する上表面を有する容器を特許請求する。静電的に荷電できるワンド、このようなワンドを含む装置、及びそのようなワンドを用いて固体試薬を移送する方法もまた特許請求される。
2008527990.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多段階反応を実行するための方法であって、当該方法が以下の：
１)  １以上の第一試薬を反応容器に加え、ここで当該反応容器は、試薬を保持できる上部チャンバーであって、試薬の流入が制限されている下部チャンバーに対して開口している上部チャンバーを含み、
２)  当該反応容器を遠心力にかけて、当該１以上の第一試薬を下部チャンバーへと移動させ、
３)  上記第一チャンバーに追加試薬を加え、そして当該チャンバーを閉じ；
４)  上記下部チャンバー又は上部チャンバーのうちの少なくとも１を、上記１以上の第一試薬又は上記追加試薬が、第一反応に加わるか、又は所望の反応条件に達する条件にかけ；
５)  上記反応容器を遠心力にかけて、上記追加試薬を下部チャンバーへと移動させ、そして、当該試薬を、当該下部チャンバーの内容物と相互作用させ；ここで少なくともステップ(２)〜(５)が自動的に行われる
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記反応容器の前記下部チャンバーがキャピラリーチューブである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１の間に、前記１以上の第一試薬が第一反応に加わるか又は所望の反応条件に達する条件に前記下部チャンバーがかけられる、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記反応容器が、ステップ(３)の間に、適切な形の蓋により閉じられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記１以上の第一試薬が、ＰＣＲ反応混合物を含み、そしてステップ(４)の間に、当該試薬が、熱サイクルにかけられる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記上部又は下部チャンバーを含むか又は当該上部又は下部チャンバーと隣接している電気伝導性ポリマーを通して電流を通過させることにより熱サイクルが達成される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記追加試薬が、第二ＰＣＲ反応を実行するために必要とされる１以上の追加試薬を含む、請求項５又は請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記追加試薬が、増幅核酸を検出するシグナルシステムを含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項９】
前記シグナルシステムが、増幅されたＤＮＡの存在下で蛍光、化学発光、又は生物発光シグナルを生成する試薬を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記シグナルシステムが、前記反応容器を開けることなく検出可能である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記シグナルシステムが、蛍光標識されたプローブであって、ＰＣＲ反応の間に増幅されたＤＮＡにおいて見られる配列に特異的に結合する蛍光標識プローブ、並びにＤＮＡ結合試薬であって、当該プローブから放出された蛍光エネルギーを吸収することにより又は蛍光エネルギーを当該プローブに提供することにより、蛍光標識プローブと相互作用できるＤＮＡ結合試薬を含む、請求項９又は請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡ結合試薬が、ＤＮＡに結合した場合に蛍光を放出しない試薬である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第一試薬又は追加試薬のうちの１以上が、標的逆転写プロセスを実行するために必須である試薬を含み、そして当該１以上の試薬又は追加試薬のもう一方が、当該標的逆転写プロセスから獲得できるｃＤＮＡを増幅することを必要とするＰＣＲ試薬を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
追加試薬が、増幅反応の生成物を分解できる試薬である、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
前記１以上の第一試薬が、増幅反応を行うために必須な試薬のうちの幾つかを含み、そしてここで、前記追加試薬が、当該増幅反応に必須な試薬であって、当該１以上の第一試薬内には含まれない試薬を含み、そしてここで、ステップ(４)のあいだに、当該１以上の第一試薬が、正確な増幅が生じるのに好ましい温度条件にかけられる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記１以上の第一試薬及び/又は前記追加試薬が、カートリッジ又は破壊可能容器中に提供され、添加前に下部チャンバー内の開口部上の上部チャンバー内に配置される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記１以上の第一試薬及び/又は前記追加試薬が、前記カートリッジ又は破壊可能な容器を破壊して開口することにより、前記反応容器に加えられる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
カートリッジ又は破壊可能な容器が、穿孔ワンド又はカッターを用いて破壊して開口される、請求小１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ステップ(１)において、前記１以上の第一試薬が固体試薬であり、そして当該固体試薬は、以下の：
(ｉ)  静電的に荷電された物質を含むワンドを、前記第一容器又は第一位置内の上記固体試薬の近くへと移動させ、ここで当該ワンドは、当該固体試薬のある量をピックアップするために、その表面上に当該固体試薬を静電的に誘引及び保持でき、
(ｉｉ)  上記ワンド及び/又は上記第一容器又は反応容器を動かし、その結果上記ワンドを反応容器の近くに存在させ、
(ｉｉｉ)  上記ワンドから上記固体試薬を放出させて、その結果当該固体試薬を第二容器又は第二位置に位置させる  
を含む方法を用いて前記反応容器に移される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
試薬貯蔵のための破壊可能な容器であって、当該容器がその下部表面に少なくとも１の穿孔可能な壁を有する試薬チャンバーを有し、そしてここで、当該上部表面が、さらなる穿孔可能な壁、又は穿孔可能な手段を含む蓋であって、当該穿孔可能な壁が、当該チャンバーから試薬の放出を導くように配置される、前記容器。
【請求項２１】
前記穿孔可能な壁が、金属又は積層金属表面である、請求項２０に記載の容器。
【請求項２２】
前記試薬チャンバーが、１超のコンパートメントを有する、請求項２０又は請求項２１に記載の容器。
【請求項２３】
前記コンパートメントが、互いに隣接して配置される、請求項２２に記載の容器。
【請求項２４】
前記コンパートメントが、互いの一番上に配置される、請求項２２に記載の容器。
【請求項２５】
前記容器が前記反応試薬内の位置に自動的に移動することを可能にする手段をさらに含む、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の容器。
【請求項２６】
前記手段が、１以上の環状のフランジを含む、請求項２５に記載の容器。
【請求項２７】
第一容器又は第一位置から固体試薬を、第二容器又は第二位置に移送する方法であって、当該方法が以下の：
(ｉ)  静電的に荷電された物質を含むワンドを、第一容器又は第一位置中の固体試薬の近くに移動させ、ここで当該ワンドは、当該固体試薬のある量をピックアップするためにその表面上に当該固体試薬を静電的に誘引及び保持することができ、
(ｉｉ)  上記ワンド及び/又は上記第一又は第二容器を移動させて、当該ワンドが、当該第二容器又は位置の近くに位置するようにし
(ｉｉｉ)  上記固体試薬を上記ワンドから取り外し、その結果、当該固体試薬を第二容器又は第二位置内に配置する
を含む、前記方法。
【請求項２８】
自動的に行われる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記固体試薬が、凍結乾燥又はスプレー乾燥された試薬の集合である、請求項２７又は請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記固体試薬が、核酸増幅反応を実行するために必須である１以上の試薬を含むビーズである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ワンドの静電的に荷電される材料は、ポリスチレン又はラテックスである、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
予備段階において、前記ワンド上の荷電は、インスレーターに対して当該ワンドをこすることにより生成又は増加される、請求項２７〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記インスレーターが合成繊維である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記こすりステップが、自動的に行われる、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ワンドが中空である、請求項２７〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
磁石が提供され、そして前記ワンド内に収容されうる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ワンドの外表面の少なくとも１部が、試薬が外形内に収容されることを可能にするような外形にされる、請求項２７〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記外形が、１以上のディンプル又は溝を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ワンドの下部表面が成形される、請求項３８又は請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ステップ(ｉｉｉ)において、前記ワンドが、液体中に浸潤されて、当該ワンドから全ての固体試薬を放出させる、請求項２７〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記固体試薬が、ＰＣＲを行うための適切な試薬を含むビーズであり、そして当該液体が、再懸濁緩衝液又はＤＮＡ/ＲＮＡ抽出物である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４３】
前記ワンドが使用後に捨てられる、請求項２７〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
静電的に荷電可能である誘電体を含むワンド、及び当該ワンドを、第一容器から第二容器へと移送する手段を含む装置。
【請求項４５】
以下の：
(ｉｖ)  以下の：
(ｃ)  サンプルを受容するために適したチャンバー；及び
(ｄ)  機能要素
を含むプラットホーム
(ｖ)  上げ下げでき、かつ上記機能要素に取り外し可能なように取り付けるための手段を含むことができるアーム、その結果、当該要素が当該アームと供に上げ下げでき、
(ｖｉ)  上記プラットホームを移動させるための手段、その結果、任意のチャンバー又は機能要素は、上記アームに対して整列される
を含み、ここで、当該機能要素は前記ワンドである、請求項４４に記載の装置。
【請求項４６】
静電的に荷電可能であり、かつその外部表面上の溝又はディンプル内に静電的に固体試薬を収容するような外形にされた誘電体を含むワンド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学反応又は生化学反応などの多段階反応、及び特にポリメラーゼ連鎖反応などの増幅反応を行う方法であって、検体検出、更なる増幅などの後続のステップが行われる方法、並びに当該方法に使用されうる試薬容器及び試薬移送手段などの構成要素に関する。
【背景技術】
【０００２】
第一反応が行われ、そしてその後に第二反応を行うため、又は第一反応が進行したことの指標を提供するために、１以上の追加試薬が必要とされるという意味において、化学的又は生化学的アッセイ又は反応が複数の反応段階で行われるというかなり多くの例が存在する。１以上の追加試薬を導入することは、特に、第一反応の後に反応容器からキャップ又は蓋を取り外して、１以上の追加試薬の添加を許容する場合、汚染の問題を生じさせうる。
【０００３】
増幅反応は、かなり少量の開始試薬しか必要としないことから、特に汚染を持ち越す傾向がある。以前に増幅された生成物などの微量の生成物でさえ、汚染を生じさせ、そしてそれにより、更なる反応の種となりうる。
【０００４】
反応が自動的に行われることを必要とする場合、問題はさらに悪化する。なぜなら、キャップなどの取り外しは、通常、自動化装置において簡単には行われないからである。結果として、反応は、開口反応容器内で行われることもあり、そうして汚染の危険性が残される。
【０００５】
近年、多くの密封チューブアッセイが開発されてきた。しかしながら、これらのアッセイでは、増幅及び検出試薬が均一システムであることが必要とされる。均一システムは現在利用可能であるけれども、特に、程度の差はあれ、使用を必要とする検出試薬が増幅反応を阻害しうる場合、非均一方法が好ましいという理由がしばしば存在する。
【発明の開示】
【０００６】
出願人は、多段階反応を行う改善された方法を発見した。
【０００７】
本発明の第一態様では、多段階反応を行う方法が提供される。当該方法は、以下の：
(１)  １以上の第一試薬を反応容器に加えること、ここで、当該反応容器は試薬を保持できる上部チャンバーを含み、当該上部チャンバーは、試薬の流入が制限されている下部チャンバーに対して開口しており；
(２)  上記反応容器を遠心力にかけて、上記１以上の第一試薬を上記下部チャンバーへと移動させ；
（３)  追加試薬を上記第一チャンバーへ加え、そして当該チャンバーを閉じ；
（４)  １以上の第一試薬又は追加試薬をそれぞれ、第一反応へと参加させるか又は所望の反応条件を達成させる条件に、下部チャンバー又は上部チャンバーのうちの少なくとも１をかけ；
（５)  上記反応容器を遠心力にかけて、上記追加試薬を上記下部チャンバーへと移動させ、そして下部チャンバーの内容と相互作用させることを可能にする；
を含み、ここで、少なくともステップ(２)〜(５)が自動的に行われる。
【０００８】
追加試薬を添加した後に反応容器を閉じることにより、後続、例えば、第一反応が行われている間、又は所望される反応条件が達成される間、における外部からの汚染が生じる可能性が効果的に除かれる。
【０００９】
適切なことに、下部チャンバーは、キャピラリー又は他の小さいチューブなどのアクセス制限チューブを含む。通常の状況の下では、試薬は、例えば表面張力の結果として、当該チューブ内を流れることはない。当該チューブは、その下部末端で閉じられるであろう。
【００１０】
物質が加熱又は冷却される反応では、迅速な熱交換が起こるように、チャンバーが体積に対する高い表面積の比を有することが好ましく、そしてキャピラリーチューブは、そのようなチャンバーの良好な例を提供する。これらのチューブは、小体積の液体サンプルの急速な加熱又は冷却に使用することができる。
【００１１】
こうして、特に好ましい実施態様では、ステップ(４)の間に、下部チャンバーが必要条件にかけられるである。
【００１２】
反応容器は、反応容器の口の上にスナップ式か又はスクリュー式で気密シールを形成しうる適切な形の蓋を用いることにより、上記ステップ(３)の間に適切に密封される。しかしながら、例えば、シーリング・フィルム、金属ホイル、又は積層金属膜を用いる他の密封方法及び手段であって、反応容器の口の上に適用されるものが使用されてもよい。さらに、以下に記載される様に、ある装置、特に自動化装置では、サンプルなどが自動的に反応容器にデリバリーされる場合、他の構成要素、例えば、デリバリーノズル、デリバリーワンド(wand)(例えば、物質の移動が磁性ビーズ及び磁性ロッドを通して達成される)、又はカッター若しくは穿孔ワンドは、反応容器を密閉するための手段として作用するように適用することができる。
【００１３】
１以上の第一試薬及び追加試薬は、上記ステップ(４)の間に適用されうる特定の条件、例えば加熱若しくは冷却、又は例えばＵＶ光の照射などの特定の条件にかけられた場合にのみ、一緒に反応する試薬の組み合わせであってもよい。或いは、１以上の第一試薬は、例えば予備遠心ステップにおいて下部チャンバーに既に分注された１以上の追加試薬と、予備ステップにおいて反応させることを意図しうる。適切な場合、予め分注された試薬は、下部チャンバー内で凍結乾燥されてもよい。
【００１４】
しかしながら、試薬は、ステップ(４)の間に反応に加わる必要はない。１以上の第一試薬又は追加試薬が、一緒に混合される前に、所望の反応条件、例えば所定の温度、にかけられること、並びに場合により当該温度に適切な時間のあいだ維持されることを単に保証することが望まれる。この例では、所望の時間のあいだ所望の条件とすることが、ステップ(４)の間に適用することができる。
【００１５】
当該方法は、様々な反応に広く適用可能である。例えば、当該方法は、反応の終点において調べられるポリメラーゼ・連鎖反応(ＰＣＲ)に使用されてもよい。このような場合、１以上の第一試薬又は追加試薬、しかしながら好ましくは１以上の第一試薬は、標的核酸、例えばＤＮＡを含んでいるか又は含んでいると疑われるサンプル、並びにＰＣＲを行うのに必須であるプライマー、緩衝液、マグネシウム塩、及びポリメラーゼを含む。
【００１６】
所望される場合、ＰＣＲを実行するために必要な幾つか又は全ての試薬、特に緩衝液、ポリメラーゼ、塩、及びいくらかの安定剤などは、固体ビーズに含めることができる。当該固体ビーズは、上部反応チャンバーに加えられ、そして液体サンプルを上部反応チャンバーに加えた際にこれらの成分を放出するように溶解又は調製される。かかるビーズの例は、例えばAmersham BioSciences UKから市販されている。
【００１７】
或いは、これらのＰＣＲ試薬は、凍結-乾燥形態で、下部チャンバーに予め分注することもできるか、又は上で記載されるように予備遠心ステップにおいてスピンダウンすることもできる。
【００１８】
ステップ４の間に、好ましくは当該段階において下部チャンバーに存在するＰＣＲ試薬は、ＰＣＲ反応を行うために必要な熱サイクルステップにかけられる。これは、反応容器の少なくとも下部チャンバーをサーマルサイクラー、例えば様々な方法により加熱及び冷却される固体ブロックヒーターなど、に導入することにより行われうる。現在の固体ブロックヒーターは、なかでも電気素子又は熱電素子により熱せられる。他の反応容器は、ハロゲン電球/乱気流配置により熱せられてもよい。当該容器は、熱電素子、コンプレッサー冷蔵技術、強制空冷又は冷却液により冷却されてもよい。
【００１９】
しかしながら、好ましくは、下部チャンバー及び/又は上部チャンバーは、電気伝導性ポリマーと接触しているか又は当該ポリマーを含み、当該ポリマーは、それ自身、抵抗ヒーターとして利用することができて、加熱及び冷却をもたらすことができる。当該タイプの反応容器の例は、WO98/24548に記載される。
【００２０】
特に、下部チャンバーは、電気伝導性ポリマーで少なくとも側壁をコートされた密封ガラスチューブを含む。電気的接触は、下部チャンバーの上部及び下部末端で提供されてもよく、コンピューターなどの制御装置を経由して電源に接続することができる。当該コンピューターは、ＰＣＲ反応を行うために必要とされる様式で、下部チャンバーを連続的に加熱及び冷却させるようにプログラムすることができる。上部接触は、ヒートシンクとして作用し、当該手順において下部チャンバーにおいて行われる任意の加熱が上部チャンバーに格納される任意の追加試薬を過度に加熱させないことを保証する。これは、追加試薬が、熱感受性である場合、例えば、生物発光又は化学発光シグナルを産生するために使用される試薬である場合に特に重要でありうる。
【００２１】
かかる試薬の特定の例として、ＤＮＡ及び好ましくは、増幅反応後に残るサンプル中の特異的に増幅されたＤＮＡを検出するシグナルシステムが挙げられる。かかるシグナルシステムは、様々な性質に基づいてもよいが、特に、蛍光、化学発光、又は生物発光である可視シグナルを産生するであろう。
【００２２】
当該方法は、その他の点で増幅反応を阻害しうる蛍光プローブを加えるために、特に有用でありうる。例えば、幾つかのＤＮＡ結合試薬、又は高濃度のプローブ、並びにペプチド核酸(ＰＮＡ)などのＤＮＡアナログを用いて作成されたプローブは、幾つかの状況下において、ポリメラーゼの阻害により、又は過度に安定な複合体の形成によりＰＣＲ増幅を止めることができる。
【００２３】
必要ならば、下部チャンバーは、当該シグナルが有効であるために必要とされる温度条件などの条件にかけられうる。例えば、プローブは、存在するＤＮＡを変性させるために反応混合物を熱し、次に一般的に増幅配列を含む標的配列に当該プローブがアニールする温度に冷却することを必要としてもよい。
【００２４】
当該シグナルシステムは、好ましくは、反応容器を開けることなく、均一に検出できるシステムである。
【００２５】
このようなシグナルシステムは、例えば、ＤＮＡ結合試薬が溶液中に遊離している場合と比べて、二本鎖ＤＮＡに結合された場合に、異なりかつ区別できる可視シグナルを放出するＤＮＡ結合試薬などの可視シグナル試薬を含んでもよい。かかる色素の例は、周知であり、そしてエチジウム・ブロミド、並びに商標名ＳＹＢＲで販売されている試薬、例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ又はＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ、又は他の色素、例えばＹＯＰＲＯー１を含む。その様な試薬からのシグナルにより指し示される有意量又は高い量のＤＮＡの存在は、増幅反応の進行を指し示すことができる。
【００２６】
或いは又はさらに、シグナルシステムは、増幅産物に特異的に結合する標識プローブを含んでもよい。標識は、適切な波長の光で照射した後に検出可能である適切な蛍光ラベルであり、続いて、当該標識から得られた発光が検出される。様々な蛍光標識が市販されている。例として、ローダミン色素、フルオレセイン、又はシアニン色素が挙げられる。色素の特別な例は、Ｃｙ５、Ｃｙ５.５、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、及びＪＯＥとして販売される。
【００２７】
特に好ましい実施態様では、当該シグナルシステムは、蛍光標識プローブ及びＤＮＡ結合試薬の組み合わせを含む。当該ＤＮＡ結合試薬は、当該プローブから放出される蛍光エネルギーを吸収することにより、又は蛍光エネルギーを当該プローブに与えることにより、蛍光標識プローブと相互作用することができる。この良く知られた現象は、蛍光エネルギー移動(ＦＥＴ)、又は蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)として知られている。ドナー分子は、その励起スペクトル範囲の特定波長の光で励起され、続いてその蛍光放出波長の範囲の光を放出するであろう。アクセプター分子は、ドナーの放出波長で励起され、そして様々な距離依存性のエネルギー移動メカニズムによりドナー分子からエネルギーを受け取る。蛍光エネルギー移動の基礎は、ドナー及びアクセプター発光波長の変化モニターすることである。
【００２８】
当該実施態様では、試薬の当該組み合わせを追加試薬として加え、そして当該下部チャンバーを加熱及び冷却して、蛍光標識プローブが、存在する場合サンプル中の標的にアニールすることを保証する。ＤＮＡ結合試薬は、プローブと標的により形成された二本鎖の間にインターカレットし、そして蛍光エネルギーをそのシグナルを増大させるために標的に蛍光エネルギーを与えることにより(それにより、プローブ上の標識が蛍光アクセプター又はクエンチャーとして作用する間に、蛍光ドナーとして作用することにより)、又は蛍光標識からえた蛍光シグナルを消すことにより、蛍光標識と相互作用するであろう。
【００２９】
ＤＮＡ結合試薬は、これらの条件下でそれ自身蛍光である物質であってもよい。しかしながら、好ましくは、ＤＮＡ結合試薬は、それ自身蛍光ではないか、又はこれらの条件下で可視光を放出するが、プローブ上で蛍光標識のクエンチャーとして単に作用する試薬である。このようにして、複合した可視シグナルを分解する必要性が避けられる。このように行われうる化合物の特別な例は、アンスロキノン化合物、例えば、以下の式(Ｉ)：
【化１】
2008527990.tif 000003
[式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ4は、独立して、水素、Ｘ、ＮＨ-ＡＮＨＲ、及びＮＨ-Ａ-Ｎ(Ｏ)Ｒ'Ｒ''(式中、Ｘは、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、Ｃ1-4アルコキシ又はＣ2-8アルカノイルオキシであり、Ａは、ＮＨとＮＨＲ又はＮ(Ｏ)Ｒ'Ｒ''の間において少なくとも２個の炭素原子の鎖長を有するＣ2-4アルキレン基であり、そしてＲ、Ｒ'、及びＲ''は、Ｃ1-4アルキル及びＣ2-4ヒドロキシアルキル及びＣ2-4ジヒドロキシアルキルから各々独立して選ばれ、但し、窒素原子に結合した炭素原子は水酸基を有さず、かつ炭素原子は２個の水酸基により置換されることはなく；或いはＲ'及びＲ''は一緒になって、Ｃ2-6アルキレン基であり、Ｒ’及びＲ’’が結合する窒素原子とともに、３〜７個の原子を有する複素環を形成し、但し、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ4のうちの少なくとも１が、ＮＨ-Ａ-Ｎ(Ｏ)Ｒ'Ｒ''基である]
で表されるＤＮＡ結合性化合物を含む。
【００３０】
このようなＤＮＡ二本鎖結合試薬の具体例は、ミトキサントロン (１,４-ジヒドロキシ５,８-ビス［［２-［(２-ヒドロキシエチル)アミノ］エチル］アミノ］-９,１０-アントラセンジオン)又はその塩、例えば塩酸塩又は二塩酸塩などである。
【００３１】
これらの条件下で可視シグナルを放出しないＤＮＡ結合試薬の他の例として、ノガラマイシン(２Ｒ-(２α,３β,４α,５β,６α,１１β,１３α,１４α)］-１１-［６-デオキシ-３-Ｃ-メチル-２,３,４-トリ-Ｏ-メチル-α-Ｌ-マンノピラノシル)オキシ］-４-(ジメチルアミノ)-３,４,５,６,９,１１,１２,１３,１４,１６-デカヒドロ-３,５,８,１０,１３-ペンタヒドロキシ-６,１３-ジメチル-９,１６-ジオキソ-２,６-エポキシ-２Ｈ-ナフタセノ［１,２-ｂ］オキソシン-１４-カルボン酸メチル・エステル)又はダウノマイシン(８Ｓ,-シス)-８-アセチル-１０-［３-アミノ-２,３,６-トリデオキシ-α-Ｌ-ｌｙｘｏ-ヘキソピラノシル)オキシ］-７,８,９,１０-テトラヒドロ-６,８,１１-トリヒドロキシ-１-メトキシ-５,１２-ナフタセンジオン)が挙げられる。
【００３２】
ＤＮＡ結合試薬及びプローブ用の蛍光標識の適切な組み合わせは、当業者により理解されるか、又は通常の方法を用いて決定されてもよい。
【００３３】
しかしながら、化学発光又は生物発光シグナルシステムが使用されてもよい。
【００３４】
生物発光シグナルシステムの特別な例は、ルシフェラーゼ/ルシフェリンシステムを含み、ここで当該酵素であるルシフェラーゼは、ＡＴＰの存在下で基質であるルシフェリンに作用して光を発生する。しかしながら、ルシフェラーゼは、高度に熱感受性の酵素であり、その結果、例えばＰＣＲの間においてもたらされうる温度を耐えることができないこともある。本発明の方法を用いることにより、かかる試薬は、高温での反応が下部チャンバー内で行われるあいだ上部チャンバーに保持される。そしてシグナルシステムは、都合のよいときにのみ、つまり反応の最後に、ルシフェラーゼが活性であるレベルに下部チャンバーの温度が下がった場合に、加えられる。生物発光シグナルシステムを、ＰＣＲとの関係で使用するアッセイの特別なタイプは、WO02/090586に記載される。この内容は、本明細書に援用される。かかる反応は、特に、本明細書に記載される方法を用いて自動操作に供されやすいであろう。
【００３５】
生成されたシグナルは、任意の都合のよい検出装置、例えば、蛍光光度計などの光学システム又は化学発光又は生物発光シグナルシステムの場合カメラを用いて読み取られる。当該装置は、機器の中に含められてもよい。光学検出システムの場合、非入射光からの干渉を伴わずに処理できることを保証するため、光学検出器は遮光されることが好ましい。
【００３６】
好ましくは、シグナルが容器から直接、例えば下部チャンバーの透明底又は容器の上部の透明なキャップ又は密封部材を介して、読み取られるように反応容器は配置される。しかしながら、必要に応じて、蛍光は、光ファイバーを通して、反応容器から運ばれてもよい。
【００３７】
しかしながら、当該方法の多くの他の適用があり、そして更なる反応段階は、必要に応じてステップ(５)の後に下部チャンバー内で行われてもよい。かかる方法の例として、ネスティド又は多重ＰＣＲ反応が挙げられる。この場合、追加試薬は、２回目のＰＣＲ反応を行うために異なるプライマー、そして必要に応じてさらに緩衝液、酵素などを含む追加のＰＣＲ反応混合液をさらに含んでもよい。このような場合、追加試薬が分注された後に、下部チャンバーは、所望される二回目のＰＣＲ反応を行うために、さらなるサーマルサイクルにかけられる。
【００３８】
２回目のＰＣＲは、ＤＮＡ増幅の優れた感受性について利点を有する。阻害剤が、サンプル物質中に存在する場合に有用である。２回目のＰＣＲは、実際の適用についてのネスティドＰＣＲに関連する重篤な持ち越しの問題を改善する。
【００３９】
当該方法は、様々な方法で逆転写(ＲＴ-ＰＣＲ)に関して使用されてもよい。例えば、１以上の第一試薬は、逆転写を行うため、ＲＮＡからｃＤＮＡを産生するために必要な試薬を含んでもよい。その結果、これらはステップ(２)の間にスピンダウンされ、そして目的のＲＮＡ配列に一致するｃＤＮＡを増幅するために必要とされるＰＣＲ試薬は、次に、追加試薬として加えられる。リバーストランスクリプターゼ反応混合物を含む下部チャンバーは、ステップ(４)の間にインキュベートされて、ＲＮＡに相補するｃＤＮＡを産生する。
【００４０】
当該ｃＤＮＡに特異的なプライマーを含むＰＣＲ試薬は、上記ステップ(５)の間にスピンダウンされ、そして下部チャンバーを、必須のサーマルサイクル条件にかけることにより増幅反応を行うことができる。
【００４１】
或いは、ＰＣＲ試薬は、１以上の第一試薬を含んでも良く、当該試薬は、ステップ(２)の間に下部チャンバーにスピンダウンされる。リバーストランスクリプターゼ反応混合物は、上部チャンバーに保持される追加試薬である。ステップ(４)の間に、ｃＤＮＡが生成するようにＲＴ反応を進行させるために上部チャンバーをインキュベートした。この目的のために、上で記載される様に電気伝導性ポリマーを用いて、上部チャンバーが独立して過熱/冷却可能であることが所望される。こうして形成された混合物であって、ｃＤＮＡを含む混合物は、次にステップ(５)の間に下部チャンバーにスピンダウンされる。その後、下部チャンバーは、ＰＣＲ反応を進行させるために必要なサーマルサイクルにかけることができる。
【００４２】
当該方法は、持ち越し予防計測(carry-over prevention measure)において使用されてもよい。例えば、第一試薬が均一な検出反応を行うことができるＰＣＲ試薬であり、そしてＰＣＲがステップ４において行われる場合、追加試薬は、内容が分析されるか又は読まれた後に生成物を分解できる試薬を含んでもよい。或いは、(上記の様に)追加試薬として加えられる別々のシグナルシステムを使用して検出が行われる場合、生成物を分解できる試薬は、以下に記載されるようにマルチコンパートメント・カートリッジ又は容器を用いて、さらに続くステップで加えられてもよい。
【００４３】
コンパートメントを含む容器は、穿孔されてもよく、そして次の反応段階において内容物がスピンダウンされる。
【００４４】
このような試薬は、ｄＵＴＰ ＰＣＲ産物を変性することができるウラシル-ｎ-グリコシラーゼ或いは適切なＤＮＡｓｅを含みうる。後者は、持ち越しの危険性を低減するばかりではなく、サンプル内に含まれうる潜在的に有害な標的核酸、例えば、感染性であると知られているＨＢＶ ＤＮＡを破壊しうる。
【００４５】
当該方法はまた、「ホットスタート」増幅反応の形態をもたらすように適用されてもよい。ＰＣＲ反応などの増幅反応は、連続的なステップ(変性、アニール、及び伸張)であって、当該ステップを実行するためにかなり正確な順番で、正確な温度で生じるステップに頼る。短い時間であっても、異なる温度で、例えば反応の開始前に試薬が混合される場合、問題が生じる。プライマーは、核酸テンプレートと相互作用して、テンプレートのプライマー伸張をもたらす。これは、所望される産物の全体の収率の低下、並びに非特異的産物の生成をもたらしうる。
【００４６】
当該問題を克服する様々な方法は、以前に提案され、そしてこれらは「ホットスタート」反応として知られた。
【００４７】
本発明に従った方法を使用することにより、増幅反応を実行するために必要とされる１以上の試薬、例えばマグネシウムイオン、ポリメラーゼ、又はプライマーを、追加試薬として保持することは可能であろう。次に、下部チャンバー内の条件が正確な増幅が生じるのに好ましい場合、例えば小さいＤＮＡ分子が関連する温度より高い温度に熱せられた場合にのみに、追加試薬が分注される。
【００４８】
反応容器の上部又は下部チャンバーの加熱又は冷却の全ては、例えば、サーマルサイクラーへの電力供給を制御するコンピューターを用いて、適切に自動化される。当該コンピューターは、所望される連続的温度ステップが達成されることを保証するように適切にプログラムされている。
【００４９】
１以上の第一試薬及び/又は追加試薬は、任意の慣用される方法を用いてそれぞれステップ(１)及び(３)の間に反応容器に分注されうる。例えば、試薬は、好ましくは適切な分注装置を用いて自動的に行われる慣用の注射技術により上部チャンバーに分注されてもよい。
【００５０】
或いは、１以上の第一試薬及び/又は追加試薬は、破壊可能な容器、例えばカートリッジ内に配置されても良く、下部チャンバーへの開口部上の上部チャンバーに分注されてもよい。
【００５１】
これらは、例えば、試薬チャンバーの上部及び/又は下部表面で穿孔可能な壁、たとえば金属又は積層金属膜表面を有していてもよい。内容物は、チャンバーの壁を破壊することにより、例えば、穿孔可能な壁を通してワンド又はピンを刺し、そうして試薬がチャンバーの底を通して放出されることにより、適切な段階で放出されうる。
【００５２】
穿孔ワンド又はピンは、試薬チャンバーの上部表面を適切に形成する容器のキャップ上に適用されても良く、そして適切な時間、当該キャップに圧力を適用することにより導入されうる。或いは、これは、反応を行うために使用される機械上で提供され、そして特に、上壁自身が穿孔可能である場合、適切な時間において自動的に適用されうる。
【００５３】
密封カートリッジ又は容器の上部表面は、膜、例えばプラスチック膜含んでもよく、そしてその中に適切な穿孔ワンド又はピンを有する。当該実施態様では、容器の上部表面自体は、容器のキャップを含む。或いは、別々のキャップが提供され、そしてワンドは、汚染リスクを最小限にするため、容器の上部表面に達する前に当該キャップを穿孔するために必要とされてもよい。
【００５４】
特に、容器は、１より多いコンパートメントを有するカートリッジの形態である。これらは、１以上の第一試薬を含んでも良く、及び/又は追加試薬をそれぞれ含んでもよい。しかしながら、容器は、追加試薬が、同時に又は連続的に、当該方法の間の適切な時間に上部チャンバーに自動的に加えられてもよいという可能性を広げることもあり、そして必要に応じてスピンダウンされ、任意の数のさらなる反応ステップを行うことができるという可能性、及び/又は一緒に貯蔵できない試薬が、反応チャンバーに達するまで混合されないという可能性を生じさせる。
【００５５】
このようなカートリッジは、さらに、当該試薬が必要以上に大気に晒されないということを保証するので、汚染のリスクを最小限にするであろう。
【００５６】
これらのコンパートメントは、互いに隣接して、例えば、環状又は車輪用配置で配置されてもよく、又はこれらは、互いの上に配置されてもよい。いずれの場合においても、１以上の適切なワンドが、当該方法の間に必要な際にコンパートメントに孔を開けるために提供される。
【００５７】
当該容器は、その上部領域において、容器を反応容器内の位置に自動的に動かす手段を提供してもよい。このような手段の例として、当該方法が行われる装置上の適切なつかみ手段と相互作用するように配置される１以上の環状のフランジ(flange)を含んでもよい。
【００５８】
当該タイプの試薬容器を用いることにより、上に記載される反応、例えばネスティドＰＣＲ、ＲＴ-ＰＣＲ、非均一検出、持ち越し予防及び/又はホットスタートＰＣＲの任意の組み合わせは、連続して、単に適切な試薬を適切な順番でかつ適切な時間でデリバリーすることにより行われてもよい。
【００５９】
このような容器は、本発明のさらなる態様を形成する。こうして、本発明のさらなる態様では、試薬を貯蔵するための破壊可能な容器が提供される。当該容器はその中に、その下部表面に少なくとも１の穿孔可能な壁を有する試薬壁を有し、そしてここで、上部表面は、さらに穿孔可能な壁又は穿孔手段を含むリッドのいずれかであって、当該穿孔可能な壁が当該チャンバーからの試薬の放出を導くように配置されるものを含む。
【００６０】
反応容器は、遠心動作で回転することができるプラットホームなどの上に適切に搭載可能である。反応容器は、プラットホーム上に枢動可能なように適切に搭載され、その結果、遠心の間に、下部チャンバーが、外側の遠心軌道に位置するように回転することができる。このことは、例えば、容器の外側表面上に提供された１以上のスピンドルを用いて達成することができる。当該スピンドルは、プラットホーム上に提供されるソケットに可動なように搭載されうる。
【００６１】
反応容器は、ステージ間で自動的に可動である。例えば、処理ステップのために、サーマルサイクル手段へと反応容器を移動させることが適切であろう。好ましい実施態様では、反応容器が電気伝導性ポリマーからなる加熱手段を提供される場合、これらは、自動移動装置を用いて、遠心機から適切な電源のソケットへと移動され、これにより、反応容器と電気的に接触される。或いは、電気的な接触は、ｉｎ-ｓｉｔｕでなされてもよい。
【００６２】
当該方法を行うための自動化手段の提供は、当該サンプルの手による取り扱いの量を最小にし、当該プロセスを効率的なものとし、そして特に操作者ＤＮＡからの汚染リスクを低減することを意味する。
【００６３】
上に記載される方法に使用するために特に適切な反応容器及び装置は、同時継続中の国際特許出願公開第WO2005019836号に記載されている。当該文献の内容は、本明細書に援用される。本明細書に記載される装置は、サンプルの高度に複雑な多段階処理を行うことができる。当該装置は、以下の：
(i)以下の：
(a)サンプルを受容するのに適したチャンバー；及び
(ｂ)機能要素(functional component)
を含むプラットホーム
(ii)上げ下げでき、かつ機能要素に取り外し可能なように取り付けられる手段を含むアーム、その結果、当該要素が、当該アームと共に上げ下げされうる 、及び
(iii)プラットホームを移動させるための手段、その結果、任意のチャンバー又は機能要素が、上記アームに関して配列されうる
を含む。
【００６４】
本装置は、様々な適用を有し、そして様々な用途に適用することができる。「機能要素」という用語は、当該装置のアームに取り外し可能なように取り付けることができるように設計された装置要素を意味するように定義される。機能要素は、本明細書の開示から明らかであるように、様々な用途を有するように設計されうる。１以上の機能要素の具体的な用途は、当該装置の具体的用途に依存して、当業者に容易に同定されうる。例えば、機能要素は、液体サンプルと相互作用するための手段を含んでもよい。かかる手段は、いくらかの当該サンプルへの物理的処理、例えば加熱、冷却、光学処理、ソニケーションなど、を提供しうる。或いは、当該機能要素は、例えば、カッターとして作用して、ホイルシールを穿孔し、チャンバーに蓋をし、フィルターを導入することにより、チャンバー自身と相互作用するための手段を含んでもよい。さらに、当該機能要素は、当該サンプル、又はそのなかに含まれる検体を、当該装置の別のチャンバーに移動させるための回収器として作用してもよい。
【００６５】
その結果、本方法との関係では、機能要素は、サンプルをデリバリーする手段を含んでもよく、反応容器に対する装置内の至る所で予め処理されてもよく、この場合、当該反応容器は「サンプルを受容するために適したチャンバー」と同じであろう。或いは、機能容器は、上に記載されるカートリッジ又は破壊可能な容器内に含まれる放出試薬のために、カッター又は穿孔ワンドを含んでもよい。
【００６６】
しかしながら、特に好ましい実施態様では、プラットホームは、実質的に環状であり、そして回転により動かされる。これにより、プラットホームが、アーム又は他の物理的手段に関して、チャンバー又は機能要素を整列させることを可能にする。これはまた、いくつかの異なる成分が含まれる場合、当該装置の大きさを最小限にする利点も有する。場合により、プラットホームは、感作メカニズムに取り付けられて、プラットホームがアーム又はプラットホームの上に位置する他の物理的処理手段の下を動く際に、機能要素又はチャンバーの正確な位置取りを可能にする。しかしながら、本方法の脈絡では、プラットホーム上に固定された反応容器を簡単に遠心することを許容するという点で、さらに利点がある。
【００６７】
さらに特別な実施態様では、当該装置は、プラットホームの全体を取り除くことができ、そして容易に置き換えることができるように設計される。このことにより、所定の一連のサンプル処理後、使用済みでありかつ潜在的に汚染されたプラットホームを取り外し、そして置き替えて、更なる処理において当該装置を使用することを可能にする。本装置がその様に設計される場合、使用を簡単にするために、例えば単純なロックを伴うツイストフィットを用いて、プラットホームを当該装置に容易にかつ安全に搭載することができる。
【００６８】
本発明の方法に使用される試薬の自動的な取り扱いは、試薬移送装置を使用することによりさらに高められてもよい。出願人はさらに、化学及び生化学的アッセイにおいて使用される試薬を取り扱う方法、並びに当該方法において使用される装置をさらに開発した。
【００６９】
化学又は生化学アッセイを行うコースにおいて、固体形態の少量の試薬を１の容器から別の容器へと移送するための必要性が多く存在する。
【００７０】
本発明の方法において、並びにWO2005019836において記載される装置において必要とされるように、これらのアッセイは、次第に自動化処理及び手順を用いて行われるようになっており、そして多くの試薬を取り、そして移送することができる自動化装置が必要とされている。
【００７１】
固体形態で利用できる試薬の具体的な例は、増幅反応、特にポリメラーゼ連鎖反応、つまりＰＣＲに必須な試薬である。市販のＰＣＲレディ-トゥ-ゴービーズは、ＤＮＡ増幅を行うために利用でき、Amersham BioSciences UKにより販売される。
【００７２】
これらは、凍結乾燥又は他の固体形態で、標準ＰＣＲを行うために必要である全ての成分、例えば、緩衝試薬、塩、及びポリメラーゼ酵素を含む。その結果、これらは、末端ユーザーが再構成する安定した「自家製」消耗品を提供する便利な手段を提供する。これらは、大量生産から、並びに長期間の貯蔵期間を有する便利な貯蔵様式で再生可能な剤形からの利益を得ることができる。
【００７３】
しかしながら、ピペット又はピペッターを用いてウェル間で簡単に移送される液体の試薬とは異なり、ビーズは、１の消耗品からもう一方の消耗品へと移送するためにピンセットを必要とする。これは、特に自動化装置において、効率的に達成することが難しいこともある。
【００７４】
出願人は、固体試薬を効率的に操作する効率的な方法を開発した。
【００７５】
さらなる態様では、本発明は、第一容器又は第一位置から第二容器又は第二位置へと移送する方法であって、当該方法が、以下の：
(ｉ)当該第一容器又は第一位置において当該固体試薬の近くに、静電的に荷電された物質を含むワンドを運び、当該ワンドは、その表面上に当該固体試薬を、静電的にくっつけ、そして保持することができ、そうして当該固体試薬の一定量を取り、
(ｉｉ)当該ワンド及び/又は当該第一又は第二容器を、容器内に移し、その結果、ワンドを第二容器又は位置の近くに存在させ、
(ｉｉｉ)当該固体試薬を当該ワンドから取り除き、その結果、第二容器又は第二位置に配置される、
を含む、前記方法を提供する。
【００７６】
本発明の第一態様の文脈では、第二容器又は第二位置は、反応容器の上部チャンバーを含むであろう。しかしながら、当該方法は、より広く適用可能であり、一般的に試薬を移送してもよい。
【００７７】
当該方法は、固体試薬の十分な移送を可能にするの特に有用である。さらに、当該方法は、自動化することが容易であり、そして様々なアッセイ装置に含まれうる。
【００７８】
本明細書に使用される「固体試薬」という用語は、固体形態である１以上の試薬又は化学物質を指す。例えば、これらは、粉末、結晶、顆粒、又はビーズを含んでもよい。特に、当該試薬は、例えば上で記載されるように、ＰＣＲレディ-トゥ-ゴー・ビーズなどのビーズ形態で一緒に混合される試薬の組み合わせを含む。試薬が水溶液などの液体の形態で一般的に見られる場合、適切な固体形態が、凍結乾燥又はスプレー乾燥などの慣用方法により調製されてもよい。ビーズ又は顆粒は、充填剤、分散剤、界面活性剤などをさらに含んで、当該顆粒又はビーズが、必要な場合に、水などの液体に加えられる際に溶解し又は分散することを保証する。
【００７９】
静電的に荷電された物質の性質は、移送される固体試薬の性質に依存して変化するであろう。一般的に、当該物質は、インスレーター又は絶縁体であるか、又はわずかな電気伝導性しか有さない誘電体を含むであろう。当該物質は、妥当な期間、静荷電を有し、又は保持できる物質であるべきである。このような物質の特別な例は、ポリマー又はプラスチック物質であり、特にポリスチレン又はラテックスである。
【００８０】
さらに、予め摩擦するステップにより、ワンド上に十分な荷電を増加させ又は発生させることができる。ここで、当該ワンドは、物質又は布などのインスレーターに対して1回以上機械的に摩擦して、静荷電を発生又は増加させる。適切な物質は、ナイロン又はポリエステル布などの合成布を含むであろう。
【００８１】
これは、好ましくは、自動化アッセイ機器内の適切に配置された動作位置において、自動的に適切に行われる。
【００８２】
本明細書に使用される場合、「ワンド」という用語は、反応容器などに導入され、そして反応容器間を移動しうる任意の適切な構造を指す。一般的に、ワンドは、細長い形であり、例えばロッド様チューブ状構造であるが、側面は傾けられて、シリンジ様又は円錐外形を形成する。
【００８３】
ワンドは、固体であってもよく、又は事実上中空であってもよい。ワンドが中空である場合、ワンドは、追加要素、例えば磁石などを収容することもできる。この場合、ワンドに磁石を導入することは、磁性の固体、例えば磁性ビーズなど、例えば磁性シリカビーズであって、場合によりさらに試薬、例えば抗体又はその結合性断片などの結合試薬などをさらに有するものを回収するために使用することを可能にする。このような回収は、個体試薬の静電的回収と同じ試行で行われてもよいが、好ましくは、別々の試行として行われる。
【００８４】
ワンド全体は、誘電性又は静電的に荷電されうる物質から作成されてもよく、又はワンドは、混合物を含んでもよい。但し、固体試薬を誘引するように意図される領域、特に下部表面又は試薬は、誘電性又は静電性荷電可能な物質を含む。
【００８５】
適切なことに、当該ワンドの外表面の少なくとも一部は、試薬が外形の中に収容されることを許容するような外形にされる。例えば、表面は、ディンプル又は溝を備え、これらは、増幅試薬ビーズ、例えばＰＣＲビーズなどの固体試薬を収容するために適切な大きさである。
【００８６】
これらの溝又はディンプルの大きさは、増幅試薬又はＰＣＲビーズであって、ワンドを用いて動かされる予定であるものなどの固体試薬の大きさに依存するであろう。しかしながら一般的に、全てのディンプルは、０.５〜２ｍｍ直径と深さであり、そして同様に、溝は、０.５〜２ｍｍの幅及び深さであろう。
【００８７】
任意の外形は、ワンドの下部表面上に適切に配置される。
【００８８】
適切な外形のワンドは新規であり、そして当該ワンドは本発明の更なる態様を形成する。
【００８９】
上記ステップ(ｉｉ)において作動される移動は、特定のアッセイ及び使用されるアッセイ装置に適した任意の方法で行われうる。固体試薬を回収した後に、ワンドは、１の場所から別の場所へと手で動かされてもよいが、当該操作は適切に自動で行われてもよい。これは、例えば、垂直方向の上向きに移動させて、例えば、第一容器から完全に取り出し、次に水平に移動させて、第二容器に対し整列させ、そして必要がある場合に下向きに移動させて、固体試薬が保持されているワンドの末端領域を第二容器内に位置させることに関する。或いは、例えば、ワンドを上向きに移動させることにより第一容器からワンドを取り除いた後に容器自身を移動させて、第二容器がワンドの下に配置されるようにしてもよい。次に、単にワンドを下げて、必要に応じて第二容器に入れられてもよい。
【００９０】
適切な輸送手段は当該技術分野に知られており、そしてコンベヤーベルト、カルーセルなどを含んでもよい。
【００９１】
適切な容器は、任意の反応容器であって、プレートなどの個々の反応容器又は反応ウェルを含む容器であってもよく、そして当該移送手段が、必要ならばこれらを動かすように配置されよう。
【００９２】
ステップ(ｉｉｉ)においてワンドから固体試薬を取り除くことは、機械的に適切に行われる。特に、当該ワンドは、当該固体をワンドから一掃する作用を有する液体中に浸漬される。適切な場合、当該液体は、当該アッセイの次の段階に必要とされる溶媒又は溶液である。例えば、ＰＣＲビーズを含む固体試薬の場合、これは、ワンドを懸濁緩衝液、つまりＤＮＡ/ＲＮＡ抽出物などに浸漬して、ワンドからビーズを取り除くことにより分注されてもよい。
【００９３】
好ましくは、ワンドは使用後に捨てられる。
【００９４】
ワンドの上部末端は、自動化アッセイ装置上への所望される適合又は取り付けに適合するような形にされるか又は適用されてもよい。
【００９５】
その結果この文脈では、本発明の方法において使用されるワンドは、上で記載される国際特許出願公開第WO2005019836号の装置の特異的機能要素を含んでもよい。特に、自動化ＰＣＲプロセスにおいて使用するために、ＰＣＲレディトゥユーズビーズをピックアップし、そして反応容器中に移動させるのに適している構成要素を含むであろう。
【００９６】
WO2005019836の装置の好ましい実施態様において、機能要素は、検体又は反応物をその上に固定しうる磁性試薬ビーズを誘引する磁石と、そのビーズとの間に接触面を提供するシースを含む。好ましくは、当該シースは、プラットホーム上に配置され、そして磁石がシースの内側に存在する場合、複合体が当該シースに誘引されるような物質から作成される。そのような実施態様では、装置は、当該装置をシース内へと下げて磁場を適用でき、そしてシースから上げて磁場を取り除くことができる当該装置のアームと一緒に配置される磁石を含むことが好ましい。次に、磁性試薬ビーズを含む装置のチャンバー内にシースが配置される。磁石をシース中に下ろし、そして磁性試薬ビーズをシースに結合させる。次にシース及び磁石が上げられる。プラットホームは、新たなチャンバーを整列させるように動かし、次に当該シース及び磁石は下げられ、そして磁石が取り除かれる。磁石を取り除く場合、磁性試薬ビーズは、シースから第二チャンバーへと移される。アームによる当該シースの上下の少しの動きは、磁性試薬ビーズが、シースに結合されないということを保証し、そして新たなチャンバー中に任意の試薬又は溶液と磁性試薬ビーズを混合するように作用するであろう。或いは、検体は、任意の適切な手段により、ビーズから溶出することができる。
【００９７】
磁石及びアームは、その他の物の操作に影響を与えることなく互いに相互作用するように設計され、その結果、シースは、当該磁石を適所に配置し、又はすることなく独立して上げ下げされうる。
【００９８】
特定の実施態様では、シースが、本発明に記載されるワンドとして形成される場合、本明細書に記載される様に固体試薬を静電的に移送させるために使用されてもよい。
【００９９】
上記試薬移送法を行うように特別に適合された装置は、本発明のさらなる態様を形成する。
【０１００】
その結果、特に、本発明は、上で記載される静電的に荷電可能な物質、及び当該ワンドを第一容器から第二容器へと移送する手段を含む装置をさらに提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０１】
図１は、本発明の方法の操作を模式的に示す。当該方法は、開口しているか又は開口可能な開口部６８６を有しており、かつ、ガラスキャピラリーチューブ６８０を含む下部チャンバーに対して開口している、上部チャンバー６８５を含む反応容器６８中で行われる。この特定の実施態様では、キャピラリーチューブ６８０の側面は、電気伝導性ポリマー６８１で被膜されており、そして電気的な接触部は、チューブ６８０の下部末端において接触部６８３を含む。第二接触部６８２は、上部チャンバー６８５の底面の周囲に提供される(図１Ｂ)。
【０１０２】
第一ステップにおいて、第一セットの試薬、例えばＰＣＲ反応混合液、を反応容器の上部チャンバー６８５に分注される。表面張力により、これらの試薬がキャピラリーチューブ６８０に侵入することが妨げられるであろう。しかしながら、反応容器６８は、プラットホーム又はカルーセル上のスピンドル７２により枢動可能なように搭載され、そして湾曲した矢印により示されるように遠心ステップにかけられる。これにより、図１(Ｃ)に示される様に、ＰＣＲ反応混合液をキャピラリーチューブに移動させる。
【０１０３】
この時点で、１以上の追加試薬を上部チャンバー６８５に分注する(図１Ｄ)。再度、表面張力により、当該試薬がキャピラリーチューブ６８０に入ることは許されないであろう。しかしながら、当該試薬は、上部チャンバー６８５に留まることを可能にし、そして容器６８は蓋６８７により閉じられる(図１Ｅ)。
【０１０４】
その後、ＰＣＲ反応などの反応を、チューブ６８０内で行うように、反応容器を処理する。この特別な実施態様では、キャピラリーチューブ６８０内の試薬は、接触部６８２、６８３により、ポリマー６８１を通して、適切に電流を通すことによりサーマルサイクルにかけられる。追加試薬は、この段階では、当該反応に参加することはできない。さらに、接触部６８２は、チューブ６８０で行われるサーマルサイクルから追加試薬を隔離するためのヒートシンクとして作用する。
【０１０５】
ひとたびこの反応が完了すると、追加試薬は、キャップ６８７を取り外すことなく、第二遠心ステップを行うことにより加えることができる。
【０１０６】
図２は、本発明の方法を行うために特に適している装置１の透視図を示す。当該装置は、ツイストロック４により適切な位置に保たれたプラットホーム２を含む。当該プラットホームは、幾つかのチャンバー及び機能要素を含む(図４にも示される)。当該プラットホームは、ステッパーモーター６及び駆動ベルト(図示無し)により駆動されて回転する。プラットホームの位置は、インデックスセンサー(図示無し)を用いて、又はステッパーモーター６の動きをモニターすることによってモニターされる。
【０１０７】
プラットホーム２上の機能要素(図示無し)に取り外し可能なように取り付けるための、フォーク１２を含むアーム１０が、プラットホーム２の上側に位置される。アーム１０は、容器６８をプラットホーム２の上側に保持している上げられた位置で示されている。当該装置はまた、アームのフォーク１２上に直接配置された磁石１４も含む。磁石１４は上げられた位置で示されている。
【０１０８】
当該装置はまた、サンプル、例えば生物学的サンプル、からＤＮＡを抽出するための予備的処理を可能にする様々な装置及び手段を含む。これらは、加熱手段１６及びサンプルをソニケーションする手段１８を含む。当該加熱手段１６は、プラットホーム２の上側に配置され、そして上げられた位置で示されており、そして当該手段１８は、プラットホーム２の上側に配置され、そして上げられた位置で示される。アーム１０及び磁石１４の直線的な動きは、駆動ベルト２２にとり付けられたモーター２０により駆動され、そして直線アクチュエーター２４により制御される。加熱手段１６及びサンプルのソニケーションするための手段１８の直線的な動きは、駆動ベルト２２に取り付けられたモーター２０により同様に駆動され、そしてそれぞれ個別に直線アクチュエーター２６及び２８により制御される。当該装置はまた、コントロールパネル３０及び電源３２を含む。
【０１０９】
図３は、図２の装置の横断面図を示す。示された要素は、直線アクチュエーター２４が当該図からは見ることができないことを除いて、図２に示された要素と同じである。この視点は、さらに、プラットホームを回転するためのモーター６に取り付けられた駆動ベルト４０及びプラットホームの位置を検知するセンサー４２を示す。
【０１１０】
図４は、核酸増幅の前に液体サンプルを処理するように設計された装置のプラットホーム２の上面図を示す。当該プラットホームは、ツイストロック機構４を用いて装置上に搭載される。当該プラットホームは、２個の機能要素、カッター５０及びシース５２、を含む。各機能要素はいずれかの側にリップ５４を含み、当該リップ５４により、機能要素が当該装置のアーム(図示無し)と相互作用することが可能になる。リップは、プラットホームが回転したときに、アームのフォーク要素が機能要素のリップの下にスライドできるような向きにされる。装置はまた、幾つかのチャンバー５６、５８、６０、６２、６４、及び６６をさらに含む。これらのチャンバー又は反応容器の各々は、異なる役割を有し、尿サンプルなどの生物学的サンプルの処理に付随して増幅反応を進行させるため、サンプルからＤＮＡを抽出する異なる役割を有する。チャンバー５６、５８、６０、６４、６６は、断面において卵型であり、そしてそれぞれチャンバー５６０、５８０、６００、及び６４０の底で環状ウェル凹部(circular well recess)を含む。チャンバー６２は、断面図で環状である。チャンバーのいずれか又は全ては、使用前に金属積層膜で被覆されて、試薬をきれいな状態で維持することができる。
【０１１１】
当該装置はさらに、本発明の方法を行うために適した反応容器である反応容器６８を含む。当該容器は、断面が環状であり、かつ下部チャンバーへと先細りになって、６８０により示される容器の底面でキャピラリーチューブを含む、上部チャンバー６８５を有する。反応容器６８は、さらに、チャンバーが装置のアーム(図示無し)と相互作用することを可能にするリップ７０をさらに含む。反応容器６８は、プラットホーム２上のソケット７４に枢動可能なように搭載されるスピンドルを備える。反応容器６８は、積層金属膜によりカバーされる。
【０１１２】
図１に関して上で記載される様に、キャピラリーチューブ６８０は、電気伝導性ポリマー６８１で被膜され(図８を参照のこと)、そしてチューブ６８０の上部末端のすぐ上側に上部電気的接触部６８２を有し、そしてチューブ６８０の下部末端に下部電気的接触部６８３を有する。
【０１１３】
チャンバー６０及び６２は、単一の容器７６に共に搭載される。当該容器７６は、プラットホームから切り離すことができる。プラットホームはまた、カットアウェイセクション７８を含む。
【０１１４】
液体サンプルの処理、そして次に本発明の方法に従って核酸増幅を行うために装置及びプラットホームを使用することは、上記図及びさらに図５〜１０を参照して以下に記載される。
【０１１５】
サンプルチャンバー６０を含む容器７６は、選択されたアッセイに基づいて選択される。チャンバー６２は、当該アッセイに必要とされる幾つかの試薬を予めロードされる。ＤＮＡ検体を含む液体サンプルは、回収され、そしてサンプルチャンバー６０に配置される。サンプルチャンバーには、サンプルを溶解しうる塩酸グアニジン、尿素、又はヨウ化ナトリウムなどのカオトロピック塩が予めロードされてもよい。磁性結合ビーズ１００を次にサンプルに加え、そしてサンプル容器の蓋を閉じる。サンプルチャンバー６０、サンプル、及び試薬チャンバー６２を含む容器７６を、プラットホーム上に搭載する。次にプラットホーム２を装置１に搭載し、そしてツイストロック４を用いて適所でロックした。アーム１０を下げ、そしてプラットホーム２を回転させて、フォーク１２がカッター５０のリップ５２の下側に接合する。次にアーム１２を上げ、そしてチャンバー５６が、カッター５０の下側に配置されるようにプラットホーム２を回転させる。アームは下げられ、そしてカッター５０は、チャンバー５６を覆う積層金属膜(図示無し)を穿孔する。カッター５０がチャンバー５８、６０、６２、６４、及び６６、並びに反応容器６８を覆う膜を順次穿孔するように繰り返される。
【０１１６】
図５は、機能要素の操作中の断面図を示す。ここで、カッター５０は、装置のチャンバー、例えば５６、の上部に積層された膜(図示無し)を穿孔する。チャンバー５６は、プラットホーム２に取り付けられる。当該図は、機能要素のリップ５２を記載し、これは、アーム(図示無し)のフォークとカッターのリップとがかみ合うように使用される。
【０１１７】
図６は、機能要素の取り付けの詳細を示す図である。ここで、カッター５０は、アーム１０のフォーク１２に取り付けられる。アーム１０のフォーク１２は、リップ５２の下側でカッターとかみ合う。
【０１１８】
ひとたび、当該装置の積層膜の全てが穿孔された場合、カッター５０は、プラットホーム２を回転させることにより元の位置に戻され、アーム１０を下げ、そして反対方向にプラットホームを回転させて、アーム１２とカッター５２のリップが外される。
【０１１９】
次にプラットホームを回転させ、そうして、サンプルチャンバー６０をサンプルをソニケーションするための手段１８の下側に位置させる。サンプルをソニケーションする手段１８は、サンプルチャンバー６０中に下げられ、そしてサンプルのソニケーションが開始される。これは、サンプル中に存在する全ての胞子(spores)を溶解して全てのＤＮＡを放出する物理的溶解ステップを提供する。同時に、カオトロピック試薬、例えば、塩酸グアニジンはまた、ＤＮＡを磁石に結合する物質へと結合されて複合体を形成することを促進するように作用する。ソニケーションが終わった場合、サンプルをソニケーションする手段１８は、サンプルチャンバー６０から取り除かれる。貯蔵前に、サンプル１８をソニケーションする手段は、２個の洗浄チャンバー、チャンバー５６及び５８中で洗浄される。これらのチャンバーには、適切な緩衝液、例えば５０％エタノール水溶液８０を予め充填する。サンプルをソニケーションするための手段１８を、サンプルチャンバー６０から上げ、緩衝液チャンバー５６がサンプルをソニケーションする手段の下側に位置するようにプラットホーム２を回転させ、サンプルをソニケーションする手段を緩衝液チャンバー５６に下げ、軽く稼動させそして上げた。当該手順はチャンバー５８について繰り返される。２回目の洗浄後、サンプルをソニケーションするための手段１８を上げ、そして貯蔵した。
【０１２０】
次に、アーム１０を下げ、そしてプラットホーム２を回転させて、１２が、シース５４のリップ５２の下にかみ合うように回転させる。次に、アーム１０を上げ、それによりシース５４をプラットホーム２の上側に上げた。次に、サンプルチャンバー６０が直接シース５４の下側になるようにプラットホーム２を回転させた。アーム１０を下げ、それによりシース５４をサンプルチャンバー６０内へと下げる。次に磁石１４をシース５４内へと下げ、そしてＤＮＡが結合された磁性ビーズ１００をシース５４へと引き寄せる。次にアーム１０を上げ、それによりシース５４をサンプルチャンバー６０から上げた。磁石１４を、アーム１０と同時に上げ、そうして磁石をシース５４内に留まらせた。
【０１２１】
図７は、機能要素の実施の断面図を示す。ここで、サンプルチャンバー６０から結合された検体を引き上げるために、シース５４は、磁石１４を備える。チャンバーは６０は、プラットホーム２に取り付けられる。シースは、アーム(図示無し)を介して、サンプルチャンバー６０中に含まれるサンプル１０２へと下げられる。磁石１４はシース５４に挿入され、そしてＤＮＡが複合体形成している磁性ビーズ１００がシース５４に誘引される。
【０１２２】
磁性ビーズ１００に結合されたＤＮＡは次に、例えば、５０％アルコール緩衝液などのアルコール緩衝液などの緩衝液中で２回洗浄されうる。プラットホーム２は回転されて、適切な緩衝溶液を含む第一緩衝チャンバー６４は、磁性ビーズ１００が誘引されるシース５４の下側に存在する。アーム１０を下げ、それによりシース５４を緩衝液チャンバー６４へと下げた。しかしながら、磁石１４は下げなかった。これは、ビーズ１００がもはやシース５４に誘引されない代わりに、緩衝溶液中に落ちることを意味する。アーム１０を素早く上げ下げすること、そしてそれによりシース５４を少し垂直方向に動かすことは、全てのビーズ１００がシース５４から放出され、そして緩衝溶液とよく混合されることを保証する。次にシース５４は、第一緩衝チャンバー６４に下げられ、磁石１４は第一緩衝チャンバー６４へと下げられ、磁石１４は、シース５４へと下げられ、そしてＤＮＡが依然として結合している磁性ビーズ１００をシース５４へと再付着させる。当該方法を繰り返して、第二緩衝チャンバー６６に含まれる５０％エタノール水溶液を含む第二緩衝液中でビーズ１００を洗浄した。磁性ビーズ１００を第二緩衝チャンバー６６中で結合されたＤＮＡで洗浄した後に、アーム１０を上げ、それによりシース５４を上げ、そして磁性ビーズ１００を緩衝チャンバー６６中に残す。しかしながら、シース５４をプラットホーム２に戻さないが、その代わりにアーム１０に取り付けたままにされた。
【０１２３】
ここで、反応容器６８が加熱手段１６の直接下側になるようにプラットホームを回転させた。反応容器６８は、キャピラリーチューブ６８０を含む下部領域９０及び上部領域９２を含む。下部領域９０は、無傷の積層膜９４により、上部領域９２から分離される。上部領域は、小体積、約１００μｌの水９６を含む。加熱手段１６を反応容器６８の上部領域９２内に下げ、そしてその水９６を約９０℃の温度へと加熱するように稼動させた。ひとたび水９６を加熱した後に加熱手段１６を上げ、そして反応容器６８から取り除いた。次に、さらなる使用のために加熱手段１６を装置１上に留める。
【０１２４】
図８は、物理的処理手段の実施の断面図を示す。ここで溶液９６のある体積を加熱するための加熱手段１６は、装置１の反応容器６８の上部チャンバーの上部分に含まれる。反応チャンバーは、プラットホーム２に取り付けられる。加熱手段は、反応容器６８の上部分９２に保持される水９６を加熱する。反応容器６８の上部分９２及び下部分９０を無傷の膜９４により分離する。
【０１２５】
プラットホームを再び回転させて、ＤＮＡが結合したままである磁性ビーズ１００を含む第二緩衝チャンバー６６を、シース５４の下側に直接位置させる。アーム１０を下げ、それにより、シース５４を第二緩衝チャンバー６６に下げる。再び、磁石１４をシース内に下げ、そして再びビーズ１００をシース５４へとくっ付ける。シース５４及び磁石１４は共に上げられ、反応容器６８が直接シース５４の下側になるようにプラットホームを回転させた。アーム１０を下げて、シース５４を反応容器６８の上部分９２へと下げる。前と同様に、ビーズ１００がもはやシース５４に誘引されないように磁石１４を下げなかった。ビーズ１００は、反応容器６８の上部分に放出される。前と同様に、アーム１０及びシース５４を少し上げ下げすることは、全てのビーズが、シース５４から放出されることを保証する。次に、温水９６によりビーズ１０からＤＮＡを溶出させる。アーム１０を上げて、シース５４を反応容器６８から取り除く。
【０１２６】
図９は、機能要素の実施の断面図を示す。ここで、磁石１４を伴うシース５４は、結合した検体１００を反応容器６８に放出させる。磁性ビーズ１００を反応容器６８の上部分９２に放出させる。ここで熱水９６は、磁性ビーズ１００からＤＮＡを溶出させる。
【０１２７】
核酸増幅反応に必須の試薬を予め充填された試薬チャンバー６２が、直接シース５４の下側になるように再びプラットホームを回転させる。アーム１０を下げ、それによりシース５４を試薬チャンバー６２内へと下げた。試薬(図示無し)を予め剤形して、磁性ビーズ(図示無し)に結合されるようにした。ひとたび、シース５４を試薬チャンバー６２中の位置にした場合、磁石１４をシース５４に下げ、そして試薬が結合された磁性ビーズをシース４に付着させた。シース５４及び磁石１４を共に上げて、試薬チャンバー６２から試薬(図示無し)を取り除いた。次に、反応容器６８が直接シース５４の下側になるようにプラットホーム２を回転させた。次にアーム１０を下げ、それにより、シース５４を、反応チャンバーの上部分に下げる。次に、試薬が結合する磁性ビーズが、シース５４から、反応容器６８の上部分９２に放出されるように磁石１４を下げなかった。温水９６により磁性ビーズから試薬を溶出させる。溶出が完了後、再びアーム１０を下げてシース５４を適切な位置にした。磁石１４をシース５４に下げ、反応容器６８の上部分９２中に存在する全ての磁性ビーズ、つまり、検体由来ビーズ及び試薬用ビーズ、をシース５４へとひきつける。シース５４及び磁石１４を共に上げて、ビーズ及を取り除き、そしてプラットホーム２を回転させた。次にビーズを使用される緩衝チャンバーのうちの一つに廃棄物として堆積させた。ビーズをシース５４から放出させた後に、再びアーム１０を移動及びプラットホーム２の回転を用いることにより、プラットホーム２のシースをその開始位置に戻した。
【０１２８】
反応容器６８の上部分９２は、精製された核酸サンプル及び増幅反応に必要とされる試薬の全てを含む。アーム１０を、カッター５０をピックアップするために使用する。反応容器６８が直接カッター５０の下になるように、プラットホーム２を再び回転させた。アーム１０を下げ、それによりカッター５０を反応容器６８に下げる。カッター５０は膜９４を穿孔し、そしてＤＮＡ及び試薬を含む水９６は、反応容器６８の下部分へと落ちる。アームを使用してカッター５０を取り除く代わりに、カッターを反応容器６８の中に残しておいた。ここで、カッターは、反応容器６８を密封するストッパーとして作用する。
【０１２９】
図９は、機能要素を伴う反応容器６８の断面図を示す。ここで、カッター５０は、反応容器６８を密封する位置に置く。カッター５０は、反応容器６８中の上部分９２と下部分９０とを分離する膜９４を穿孔させるために使用され、その結果ＤＮＡ検体及び核酸増幅反応用の試薬を含む水９６は、キャピラリーチューブ６８０へと侵入できる。カッター５０は、反応容器６８を密封するために、適所に残り、その結果、溶媒は、増幅反応の間にチャンバーから蒸発できなくなる。或いは、キャップ又は他の密封部材は、反応容器６８に適用できる。
【０１３０】
ＤＮＡ及び試薬を含有する水９６を、反応容器６８のキャピラリーチューブ６８０に入れるために、プラットホーム２を高速で回転させる。遠心力は、液体９６をキャピラリーチューブ６８０へと入れさせる。これは、回転の間に、反応容器６８がソケット７４に搭載されたスピンドル７２を用いてプラットホーム上で枢動できるという事実により助けられる。さらに、この高速回転の間に、チャンバー５６、５８、６０、６４、及び６６中に含まれる液体の漏出を防止するために、これらのチャンバーは、図３に示されるように、卵型の断面及び底の環状の凹部となるよう設計される。この内部デザインは、漏出を防止する。
【０１３１】
ＤＮＡ及び核酸増幅試薬を含む水９６をキャピラリーチューブ６８０に入れると、サンプルは、核酸増幅反応を行う準備が整う。
【０１３２】
しかしながら、この段階で、１以上の追加試薬が、反応容器６８の部分９０に加えられる。これは、アーム１０を用いてカッター５０を上げ、次に１以上の追加試薬を導入することにより行われうる。これらは、ネスティドＰＣＲ反応を行うために必要とされる更なるＰＣＲ試薬、又はシグナルシステムにおいて必要とされる試薬を含んでもよい。
【０１３３】
この段階で、反応容器６８は、当該目的に特異的なキャップで蓋をされてもよいし、又は上に記載される密封カッター５０を導入することができる。
【０１３４】
この段階で、反応容器６８は、核酸増幅が行われる他の装置内で使用するために、装置１から手で取り出すことができる。しかしながら、この場合、１の装置は、核酸増幅及びその光学検出をさらに行うように適合された。これらの操作は、装置１の下半分で行われる(図示無し)。
【０１３５】
当該プロセスを完全に自動化させるために、反応容器６８が他の機能要素５０及び５４と同様に装置アーム１０により操作できるように、反応容器６８にリップ９８を備え付けた。
【０１３６】
アーム１０を下げ、そしてプラットホーム２を回転させて、反応容器６８のリップ９８をアーム１０のフォーク１２にかみ合わせる。次にアーム１０を上げ、それにより反応容器６８を持ち上げる。上げられた反応容器６８は、図１及び図２に示される。次に、切り取り部７８が上げられた反応容器６８の下側に整列されるように、プラットホームを回転させる。次にアームを下げ、それにより、切り取り部７８を通して反応チャンバーを、装置１の下部に下げる。
【０１３７】
装置１の下部に配置される場合、核酸増幅は、サーマルサイクラーを用いて、キャピラリーチューブ６８０及び最終生成物の検出のための光学検出器内で反応混合液を加熱及び冷却することにより行われる。これは、キャピラリーチューブ６８０は、電気伝導性ポリマー６８１で被膜されるという事実により助けられる。このことは、キャピラリーチューブ６８０の急速な加熱及び冷却を可能にする。具体的に、反応容器６８は、制御電源のソケット内に配置することができ、その結果、接触部６８２及び６８３、並びにポリマー６８１は回路を形成する。当該回路への電力供給の制御は、ポリマー６８１の加熱又は冷却を引き起こし、迅速なサーマルサイクルを可能にする。
【０１３８】
ひとたびこの反応が完了すると、好ましくはアーム１０を用いて、反応容器６８をプラットホーム２に戻すことができ、第二の遠心ステップを行うことを可能にする。これにより、追加試薬又は複数の試薬がキャピラリーチューブ６８０へと入れられるであろう。次に、適宜特定の追加試薬を加えて、反応容器を更なる処理にかけてもよい。例えば、反応容器は、前のプロセスを反復することによりさらなるサーマルサイクルにかけられてもよく、又はシグナル・システムが発現され及び/又は検出されるように処理されうる。
【０１３９】
検出のために、キャピラリーチューブの密封下表面６８４は、好ましくは透明であり、その結果可視シグナルが、当該表面を通して、適切な検出装置、例えば蛍光分光計を用いて読み取ることができる。これは、例えばアーム１０を用いて、反応容器６８を蛍光分光計装置へと移すことを含む様々な方法により行われうる。しかしながら、最も好ましくは、サーマルサイクルプロセスにおいて使用される制御電力のソケット内に位置する場合、蛍光分光計は、反応容器６８からシグナルを読むように配置される。
【０１４０】
カッター５０、シース５４、及びチャンバー５６、５８、６０、６２、６４、及び６６を含むプラットホーム２の処理を完了した後に、反応容器６８は全て装置から取り除かれ、そして処分される。次に必須要素を含む新たなプラットホームを装置内に導入することができ、その結果、当該プラットホームは、他のサンプル操作に対して使用することができる。
【０１４１】
図１１Ａは、試薬容器(１５０)が、反応容器(６８)の上部チャンバー(６８５)に配置される配置を記載する。当該容器(１５０)に、その上部表面１５４でプラスチック製の蓋を与え、そしてその下表面(１５２)でホイル膜が提供される。容器の側壁は、圧縮可能である。環状に配置される個々のコンパートメント(１５３)へと分ける。各コンパートメントは、異なる試薬を含む。
【０１４２】
リッド(１５４)(図１１Ｃ)に、当該容器(１５０)の各コンパートメント(１５３)の下部(１５２)ホイル表面を穿孔するように配置される複数の穿孔ピン(１５６)を提供する。圧力をリッド(１５４)に適用する場合、例えば、上に記載される様に当該方法のステップ(３)において、全てのピン(１５６)が、下表面(１５２)を穿孔して、試薬が上部チャンバー(６８５)にデリバリーされる。
【０１４３】
しかしながら、所望される場合、個々のコンパートメントが、穿孔ワンド又は装置に付随するカッターを動かすことによって、別々に又は連続して穿孔されることができ、その結果、必要な時間、所望のコンパートメントで各々整列される。
【０１４４】
かかる容器の改変形態は、図１２で示される。この場合、容器(１６０)は、上部及び下部ホイル膜(１５１、１５２)により規定される１のチャンバーを有し、そして液体試薬(１６１)を含む。その上部領域に環状のフランジ(１６２、１６３)の対が提供される。当該対の間で、つかみアーム（図示無し）のための型 (１６４)を規定する。
【０１４５】
その結果、この容器は、自動的に反応容器(６８)内へ導入することができるか、又は、任意の他の必要とされる反応容器に導入される。リッド上の穿孔ピンを用いることにより、又は別々の穿孔ワンドを用いることによるホイル１５１、１５２の穿孔は、チャンバー１６１の内容を放出するであろう。
【０１４６】
その結果、当該容器は、試薬を例えば上部チャンバー(６８５）にデリバリーすること、そして次にその付近から取り除くために、上記方法において使用することができる。或いは、例えば穿孔ピンを含有するリッドで容器に蓋がされる場合、上部チャンバー（６８５）においてin situのまま残ってもよく、ここで蓋要素として作用する。
【０１４７】
代わりのマルチコンパートメント容器が図１３に記載される。この場合、容器(１７０)は、３個の試薬(１７１、１７２、１７３)を含み、その三番目は、磁性ビーズ(１７４)を含む。磁性ビーズは、上部ホイル膜(１５１)及び下部ホイル膜(１５２)により規定された離れたコンパートメントに存在する。
【０１４８】
ワンド(１７５)を用いた膜(１５１)及び(１５２)の穿孔により、試薬１７１、１７２、及び１７４が逐次的に混合される。磁性ビーズのを提供することにより、磁性免疫分離法を行うことを可能にする。
【０１４９】
図１４は、例えば予備ステップにおいて、例えば、ＰＣＲレディビーズなどの試薬を、容器６８６へと移すために使用されうるワンドを記載する。ひとたびコンテナ内に入れられると、ビーズは、例えばサンプルを添加することにより可溶化されうる。或いは、ビーズは、予備の可溶化のため異なる容器に移され、そして次に得られた溶液を、例えばピペッターシステムを用いて移送される。
【０１５０】
図１４に示されるワンドは、静電的に荷電されるか又は荷電可能な物質、例えばポリスチレン又はラテックスなどのの長いシャフト(１')を有する。１の位置から別の位置へと自動的に動かすための装置に取り付けられるヘッド構造(２')が与えられる。
【０１５１】
シャフト(１)の下表面(３')に、溝が備え付けられ、その中に試薬ビーズが、収容される(４')(図１５)。
【０１５２】
使用に際して(図１６)、ワンドは、ヘッド(２')を用いて、自動化アッセイ装置(図示無し)内に配置される。少なくともシャフト(１)の下部領域が、静電的に、例えば、絶縁物質に対して摩擦されることにより、荷電される。次に、試薬ビーズ(６')を保持する第一容器(５')上に配置される(図１６Ａ)。ビーズ(６')が、荷電表面(３')に取り付けられるまで、ワンドを容器(５')中に下げられ、ここで溝(４')に留められる(図１６Ｂ)。
【０１５３】
取り付けビーズ(６')と共に、ワンドは、第一容器(５')から上げられうる(図１６Ｃ)。第二容器(７')を次にワンドの下に配置する。第二容器は、溶媒又は溶液(８')を含む。ワンドを下げると、表面(３')を溶液内に浸漬され、ここの時点で、ビーズを溶液内に分注される(図１６Ｄ)。
【０１５４】
本発明は、添付の線図を参照することにより例示により特に記載されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】図１は、本発明に記載される方法を示す概略図である。
【図２】図２は、当該方法において使用されうる装置の透視図である。
【図３】図３は、側面からの図２の装置の横断面図を示す。
【図４】図４は、図２及び３の装置に使用されるプラットホームの上面図を示す。
【図５】図５は、機能要素の操作の断面図を示す。ここで、当該装置のチャンバー上にカッター、穿孔、積層膜が存在する。
【図６】図６は、機能要素の取り付けの詳細を示す図である。ここで、カッターはアームの分起点に存在する。
【図７】図７は、機能要素の操作の断面図を示す。ここで、磁石を伴うシースは、結合された検体をサンプルチャンバーから引き抜かれる。
【図８】図８は、物質的処理手段の操作の断面図を示す。ここで、加熱手段は、当該装置のチャンバーの一つのある体積の溶液を加熱する。
【図９】図９は、機能要素の操作の断面図を示す。ここで、磁石を伴うシースは、結合された検体を反応容器に放出させる。
【図１０】図１０は、反応チャンバーの断面図を示す。ここで、機能要素、ここでカッターは、反応容器を密封する位置に存在する。
【図１１】図１１は、本発明の方法において使用される容器の他の形態を示す。当該容器は、複数回の操作を行うことを可能にする。ここで(Ａ)は、所定の位置における試薬容器を伴う反応容器の概略図を示し、(Ｂ)は、(Ａ)の容器の断面図である。そして(Ｃ)は、容器の側面概略図である。
【図１２】図１２は、本発明の方法で用いられうる容器を示す。
【図１３】図１３は、当該容器の代わりの形態を示す。
【図１４】図１４は、試薬移送方法において有用なワンドの側面図を示す。
【図１５】図１５は、図１４のワンドの底面図を示す。
【図１６】図１６は、試薬移送方法を模式的に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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