(57)【要約】【解決手段】レシピエント雌の子宮へ移植された胚は、プロスタグランジンアンタゴニストに前記胚を暴露することによって、プロスタグランジンＦ２αの胎児毒性作用から保護されるものである。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レシピエント雌動物の生殖器系に移植された哺乳類胚を保護する方法であって、
プロスタグランジンＦ２αの胎児毒性作用から前記胚を保護するのに十分な量と時間で、プロスタグランジンアンタゴニストである化学物質に前記胚を暴露する工程
を有する方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記胚は、前記プロスタグランジンアンタゴニストを含有する培養液中に存在する間、前記プロスタグランジンアンタゴニストに暴露されているものである。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、前記胚は、ウシ胚である。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、前記胚は、収縮前の胚、収縮胚、及び収縮後の胚から成る群から選択されるものである。
【請求項５】
請求項１の方法において、前記胚は、胚盤胞である。
【請求項６】
請求項１記載の方法において、前記プロスタグランジンアンタゴニストは、プロスタグランジンＦ２αの選択的アンタゴニストである。
【請求項７】
請求項１記載の方法において、前記プロスタグランジンアンタゴニストは、プロスタグランジン受容体アンタゴニストである。
【請求項８】
胚移植を実行するための方法であって、
レシピエント雌動物の子宮へ移植される胚を取得する工程と、
プロスタグランジンＦ２αの胎児毒性作用から前記胚を保護するのに十分な量と時間で、プロスタグランジンアンタゴニストに前記胚を暴露する工程と、
前記レシピエント雌動物の子宮へ前記胚を移植する工程と
を有する方法。
【請求項９】
請求項８記載の方法において、前記胚は、前記胚がプロスタグランジンアンタゴニストを含有する培養液中に存在する間、前記プロスタグランジンアンタゴニストに暴露されるものである。
【請求項１０】
請求項８記載の方法において、前記胚は、ウシ胚である。
【請求項１１】
請求項８記載の方法において、前記胚は、収縮前の胚、収縮胚、及び収縮後の胚から成る群から選択されるものである。
【請求項１２】
請求項８の方法において、前記胚は、胚盤胞である。
【請求項１３】
請求項８記載の方法において、前記プロスタグランジンアンタゴニストは、プロスタグランジンＦ２αの選択的アンタゴニストである。
【請求項１４】
請求項８記載の方法において、前記プロスタグランジンアンタゴニストは、プロスタグランジン受容体アンタゴニストである。
【請求項１５】
胚移植或いは卵母細胞成熟において使用する培養液であって、
プロスタグランジンＦ２αの胎児毒性作用から、前記培養液に入れられた胚或いは前記培養液に置かれた卵母細胞の受精によって生じた胚を保護するのに有効な濃度で、プロスタグランジンアンタゴニストを有するものである培養液。
【請求項１６】
請求項１５記載の培養液であって、この培養液は、レシピエント雌動物へ移植される胚を保持、回収、培養、凍結、処置、及び移植するための培養液から成る群から選択されるものである。
【請求項１７】
請求項１５記載の培養液において、前記プロスタグランジンアンタゴニストは、プロスタグランジンＦ２αの選択的アンタゴニストである。
【請求項１８】
請求項１５記載の培養液において、前記プロスタグランジンアンタゴニストは、プロスタグランジン受容体アンタゴニストである。
【請求項１９】
プロスタグランジンＦ２αの胎児毒性作用に対して前記胚を保護するのに有効な量と時間で、プロスタグランジンアンタゴニストに暴露された非ヒト哺乳類胚。
【請求項２０】
請求項１９記載の胚において、前記胚は、ウシ胚である。
【請求項２１】
請求項１９記載の胚において、前記胚は、収縮前の胚、収縮胚、及び収縮後の胚から成る群から選択されるものである。
【請求項２２】
請求項１９記載の胚において、前記胚は、胚盤胞である。
【請求項２３】
請求項１９記載の胚において、前記プロスタグランジンアンタゴニストは、プロスタグランジンＦ２αの選択的アンタゴニストである。
【請求項２４】
請求項１９記載の胚において、前記プロスタグランジンアンタゴニストは、プロスタグランジン受容体アンタゴニストである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精及び胚移植の分野に関するものである。特に、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏ作製胚或いはｉｎ  ｖｉｔｒｏ作製胚をヒト女性或いは他の哺乳類の子宮に移植する分野に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
胚損失は、酪農及び肉牛産業において深刻な問題であり、これらの損失の大部分は、非桑実胚が孵化胚盤胞へ分化する期間である妊娠第一週間に生じる。そのような胚損失は一般的に、胚発達及び／又は黄体の機能を変化させる或いは阻害する輸卵管或いは子宮環境の要因に関連するものである。
【０００３】
畜牛において、このような初期胚損出は、人工授精或いは自然奉仕（サービス）による妊娠において生じる。これらの損失は、胚移植による妊娠においても生じる。胚移植後の胚損失は、少なくとも部分的に、子宮における胚の着床の間に起こる胎児毒性の放出を伴う生殖器系の操作に関連していると考えられている。
【０００４】
畜牛における胚移植手順の間、胚は黄体と同側の子宮角に配置される。この方法は、子宮頸部の処理を含む生殖器系の操作を必要とする。そのような操作によって、プロスタグランジンＦ２α（ＰＧＦ２α）が子宮の内腔へ放出されると報告されている（Ｗａｎｎ  ａｎｄ  Ｒａｎｄｅｌ，Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．６８：１３８９−１３９４（１９９０）；Ｏｄｅｎｓｖｉｋ  ｅｔ  ａｌ，Ａｃｔａ．Ｖｅｔ．Ｓｃａｎｄ．３４：２１９−２２１（１９９３））。ＰＧＦ２αは、女性によって分泌される天然黄体融解物質であり、これは、妊娠していない場合、黄体を破壊することによって雌動物の性周期を終了させ、次の周期の開始を可能にするものである。本発明者らの研究によって、胚移植間の生殖器系の最少操作でさえＰＧＦ２αの放出を生じさせることが明らかになった（Ｓｃｈｒｉｃｋ，ＦＮ，ｅｔ  ａｌ，"Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｆ２α  Ａｐｐｅａｒｓ  ｔｏ  Ｄｉｒｅｃｔｌｙ  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  Ｅａｒｌｙ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  Ｃａｔｔｌｅ：Ｗｏｕｌｄ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｌｕｎｉｘｉｎ  Ｍｅｇｌｕｍｉｎｅ  ｂｅ  Ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ？"，ｉｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，ｐｐ９−１６，Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ  ＣＡ（２０００））。
【０００５】
いくつかの研究によって、妊娠のかなり初期に、胎児毒性としてＰＧＦ２αが関わっていることが報告されている。Ｓｃｈｒｉｃｋら（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，４９：６１７−６２１（１９９３））は、正常周期の雌ウシと比較して、分娩後雌ウシの黄体においてＰＧＦ２αの濃度が上昇することを報告している。このような雌ウシにおける子宮ＰＧＦ２αの上昇は、より低いレベルのＰＧＦ２αを産生する雌ウシと比較して、より低い質の胚の回復と関連していた。Ｓｅａｌｓら（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  ５６：３７７−３８９（１９９８））によると、妊娠５〜８日目の間にプロゲスチン補充された雌ウシにＰＧＦ２αを投与すると、生理食塩水コントロールと比較して、妊娠率の減少を引き起こすことが報告されている。しかしながら、１０〜１３日或いは１５〜１８日目にＰＧＦ２αを投与しても、妊娠率に全く影響を及ぼさなかった。Ｆａｚｉｏ及びＳｃｈｒｉｃｋ（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．  ５６（Ｓｕｐｐｌ．１）：１８７（１９９７））、Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｆｏｎｓｅｃａら（Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．７５（Ｓｕｐｐｌ．１）：２２１（１９９７））、及びＤｏｎａｌｄｓｏｎ，Ｖｅｔ．（Ｒｅｃ．１１８：６６１−６６３（１９８６））による更なる研究によると、ＰＧＦ２αは、胚の質を低下させ、桑実段階への発達に対する胚の発達率或いは能力を減少させることによって、胚生存に対して有害な影響を及ぼすことが示唆された。
【０００６】
胚生存に対するＰＧＦ２αの有害な影響はさらに、Ｓｃｈｒｉｃｋら（Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ５５（１）：３７０（２００１））によって見出され、彼らは、胚移植時のレシピエントウシへのＰＧＦ阻害剤の投与によって、妊娠率が改善されるという研究を報告している。この研究において、プロスタグランジン阻害剤フルニキシンメグルミン（ｆｌｕｎｉｘｉｎ    ｍｅｇｌａｍｉｎｅ）（ＢＡＮＡＭＩＮＥ，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，米国ニュージャージー州）を黄体と同側の子宮角への非外科的胚移植の直前或いは直後にレシピエントウシに筋肉内注射した。妊娠率は、コントロールと比較して、プロスタグランジン阻害剤を投与されたウシにおいて有意に高かった。
【０００７】
従って、先行技術において、ＰＧＦ２αは、胚の質、及び桑実段階を超えて発達する胚の発達率或いは能力を抑制することにより、ウシの胚生存に対して有害な影響を及ぼすことが開示されている。先行技術ではさらに、ＰＧＦ２αによるこのような有害な影響は、胚移植時にプロスタグランジン阻害剤でレシピエントウシを処理することによって減少させる、従って、胚が暴露されるＰＧＦ２αのレベルを有効的に減少させることが可能であることが開示されている。
【０００８】
胚生存に対するＰＧＦ２αの同様の有害な影響、及びレシピエント雌の処理によるこの有害な影響の減少は、ウシよりもヒトを含む哺乳類に対して見出されている。例えば、Ｗｏｌｌｅｎｈａｕｐｔ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｇｅｒ，Ｈ，Ａｒｃｈ  Ｅｘｐ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｍｅｄ．，３５（３）：４７１−４８０（１９８１）；Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍ，  Ｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ，８１（６）：１５６０−１５６４（２００４）、及びＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ，７１（５）：８２５−８２９（１９９９）を参照のこと。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
動物及びヒトへの胚移植後の胚損失を減少させる方法、特にレシピエント（代用）雌の追加的な処理を必要とすることなくそのような損失を減少する方法に対する大きなニーズが存在している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
レシピエント雌動物の子宮に胚を移植する前に、前記胚をプロスタグランジンアンタゴニストで前処理すると、前記レシピエント動物の子宮内の胚をＰＧＦ２αに暴露することによって生じる胎児毒性作用に対して前記胚に保護的な利点をもたらすことが予想外に発見された。本発明は、ヒト及び他の哺乳類の胚移植において有用であり、移植可能な胚、妊娠及び生存子孫のパーセンテージの上昇をもたらす。
【００１１】
一実施形態において、本発明は、レシピエント雌動物の子宮に移植された胚を保護する方法である。本発明のこの実施形態によると、前記胚は、前記胚を子宮に移植する前にプロスタグランジンアンタゴニストに暴露される。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、胚を保持、回収、凍結、培養或いは移植するための、若しくは胚を産生するために受精させる卵母細胞を成熟させるための培養液であり、その胚はレシピエント雌動物の子宮へ移植されるものである。この実施形態によると、前記培養液は、胚の保持、回収、培養、凍結あるいは移植する、若しくは受精させ移植させる卵母細胞の成熟に必要な成分に加えて、プロスタグランジンアンタゴニストを含有している。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、胚移植を実施する方法である。この実施形態によると、胚は雌動物の子宮に移植され、移植前に前記胚はプロスタグランジンアンタゴニストに暴露される。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、ＰＧＦ２αに暴露することによって生じる胎児毒性作用に対して保護された非ヒト胚に関する。この実施形態によると、前記胚がレシピエント雌動物の子宮の外に置かれている間に、前記胚がプロスタグランジンアンタゴニストに暴露される。
【００１５】
本明細書で用いられるプロスタグランジンアンタゴニスト、及び胚或いは卵母細胞に関する場合の「暴露」という用語は、雌の子宮に投与されたプロスタグランジンアンタゴニストが循環することによる前記プロスタグランジンアンタゴニストの胚への併用暴露を受けたレシピエント雌へのプロスタグランジンアンタゴニストの投与以外による、プロスタグランジンアンタゴニストへの胚或いは卵母細胞の暴露を意味するものである。レシピエント雌動物への投与によるそのような「暴露」は、本発明の範囲内には含まれないか、或いは本明細書で用いられる「暴露」の意味には含まれない。レシピエント雌の子宮へのプロスタグランジンアンタゴニストの注入によるプロスタグランジンアンタゴニストへの胚の暴露は、本発明の範囲内に含まれ、「暴露」という用語の意味にも含まれる。
【００１６】
本明細書で用いられる「保護する」という用語は、直接的に及び／若しくは間接的にＰＧＦ２αの胎児毒性作用に対して胚を防御し、ＰＧＦ２αに暴露された胚の発達における死滅、遅延、或いは減少を阻害することを意味する。「保護する」という用語の使用は、ＰＧＦ２α或いは他の因子に暴露された場合、胚が死滅する或いは他の被害を受けないことを保証することを意味するものでも暗示するものでもない。更に、本明細書で用いられるこの用語は、ＰＧＦ２αに暴露されたが、プロスタグランジン受容体アンタゴニストには暴露されていない胚の死滅率或いは異常発生と比較して、ＰＧＦ２αへの暴露に起因した胚の死滅率が減少する、若しくは本発明に従って前記胚がプロスタグランジン受容体アンタゴニストに暴露されるといったＰＧＦ２αの暴露に直面した場合、胚の発達が正常であることを意味している。あらゆる特定の胚をテストし、その胚が「保護された」のかどうかを決定することは実用的ではないため、そのような保護は組織学的あるいは統計的な手段によって決定されると考えられる。
【００１７】
本明細書で用いられるレシピエント雌動物の「子宮への胚の配置或いは移植」は、輸卵管などの胚移植に利用される雌生殖器システムの他の部位へのそのような配置或いは移植を含む。
【００１８】
本明細書で用いられる「プロスタグランジンアンタゴニスト」は、例えばアスピリン及びフルニキシンメグルミンなどのプロスタグランジンの作用を阻害する化学物質、及び例えばＰＧＦ２αの１１β―フルオロ類似体であるＡＬ−８８１０（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，ミシガン州アナーバー）（Ｇｒｉｆｆｅｎ，Ｂ．Ｗ．，Ｋｌｉｍｋｏ，Ｐ．，Ｃｒｉｄｅｒ，Ｊ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ，２９０：１２７８−１２８４（１９９９）に記載されている）などのプロスタグランジン受容体と相互作用するプロスタグランジン受容体アンタゴニストである化学物質を含む。従って、「プロスタグランジンアンタゴニスト」という用語は、あらゆる手段によってプロスタグランジン自体の作用を拮抗する化学物質、及びプロスタグランジン受容体と相互作用することによってプロスタグランジンの作用を拮抗する化学物質の両方を含む。本明細書で用いられる「プロスタグランジン受容体アンタゴニスト」という用語は特に、プロスタグランジン受容体と相互作用する化学物質に言及している。例えば、プロスタグランジン合成酵素の作用を阻害するが、プロスタグランジンの作用は阻害しないなどの、プロスタグランジンの合成を唯一妨げる化学物質は、本明細書で用いられるプロスタグランジンアンタゴニストの定義の範囲内には含まれない。
【００１９】
本発明は、本発明の様々な実施形態によって、胚移植後の妊娠率の増加が提供されるという実質的な利点を提供する。本発明は、本発明によって、プロスタグランジンアンタゴニストを用いてレシピエント女性或いは動物を処置する必要性を減らす若しくは除くという更なる利点を提供する。レシピエント動物の処置は高価で重労働であり、その結果は個々の差異に左右される。移植前に胚を処置することによってＰＧＦ２αへの暴露による胚致死を減少する方法を提供することによって、本発明は、コスト及び労働力における実質的な省力、更には、より高い妊娠率など、レシピエント雌動物の処置によって達成できる以上のより良い結果を提供する。
【００２０】
本発明は、胚移植或いはｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精が実行可能なあらゆる哺乳類種において実行され得る。本発明は、本明細書においてウシ（Ｂｏｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）を参照して記載されているが、本分野の当業者であれば、本発明が水牛などの他のウシや他の哺乳類にも同様に適用可能であることが理解されるであろう。本発明に適している哺乳類の例としては、ヒト及び他の霊長類（例えば猿や類人猿など）、奇蹄類（例えば馬やサイなど）、偶蹄類（例えばブタ、ウシ、羊、ヤギ、ラクダ、ラマ、カバなど）、食肉類（例えばイヌ、ネコ、クマ、ミンク、及びイタチなど）、アシカ亜目（例えばアザラシ及びアシカなど）、ウサギ目（例えばウサギ及びノウサギなど）、げっ歯類（例えばリス、ラット及びマウスなど）、クジラ目（例えばクジラ、イルカ及びネズミイルカなど）、及び長鼻目（例えばゾウなど）を含む。
【００２１】
ＰＧＦ２α受容体は桑実胚期の胚に存在することが発見されている。理論に束縛されることなく、そのようなＰＧＦ２α受容体を介して作用するＰＧＦ２αは、卵割球間の結合複合体の形成及び／若しくは機能を破壊し、その結果、連続性胚発達を阻害すると考えられている。更に、プロスタグランジンアンタゴニスト、及び好ましくは、プロスタグランジン受容体アンタゴニストは、本発明に従って胚に暴露された場合、そのような受容体へのＰＧＦ２αの結合を阻害或いは阻止し、前記結合複合体の形成及び／若しくは機能の破壊を阻止或いは抑制し、この連続性胚発達の阻害を抑制或いは排除することも考えられる。
【００２２】
プロスタグランジンアンタゴニストへの前記胚の暴露は、胚を作製するためにドナー動物或いは卵母細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精から胚を回収した後、及び前記胚をレシピエント動物へ移植する前であればいつでもよい。従って、プロスタグランジン受容体アンタゴニストは、胚が暴露される洗浄液に含有されている。好ましくは、前記プロスタグランジン受容体アンタゴニストは、例えば卵母細胞成熟培養液、或いは回収液、培養液、或いは移植溶媒などの１若しくはそれ以上の培養液に含まれており、前記胚は回収及び／培養の間その中に入れ、レシピエント動物の生殖器系に移植される。
【００２３】
例えば、前記胚は、保持、洗浄、培養、移植、操作、凍結、或いは成熟培養液の１若しくはそれ以上に含まれるプロスタグランジンアンタゴニストに暴露される。或いは、好ましくはないが、前記胚は、培養液への前記胚の配置或いはレシピエント雌への胚の移植前後に前記胚或いは卵母細胞を漬ける或いは洗浄するための液体内に含まれたプロスタグランジンアンタゴニストに暴露される。
【００２４】
前記胚或いは卵母細胞が暴露されるプロスタグランジンアンタゴニストの濃度、及び前記胚或いは卵母細胞がプロスタグランジンアンタゴニストに暴露される時間は、前記プロスタグランジンアンタゴニストが含有される培養液或いは洗浄液の特性、前記胚が暴露される特定のプロスタグランジン受容体アンタゴニスト、及び前記胚或いは卵母細胞が前記液体あるいは培養液に漬けられるか、または代わりに前記培養液或いは液体が前記胚或いは卵母細胞上を流れるかなどを含む、いくつかのバリエーションに依存して変更することが可能である。
【００２５】
本発明の方法に有用なプロスタグランジンアンタゴニストは、例えば、プロスタグランジン受容体へのプロスタグランジンの結合を阻害するなど、プロスタグランジンの作用を阻害する化学物質である。従って、本発明に適切なプロスタグランジンアンタゴニストは、例えば、フルニキシンメグルニン、アスピリン、或いはオメガ−３脂肪酸などの一般的なプロスタグランジンアンタゴニストである。
【００２６】
好ましい実施形態において、前記プロスタグランジンアンタゴニストは、ＰＧＦ２αを選択的に阻害し、好ましくはプロスタグランジンＥ（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ：ＰＧＥ）の活性を実質的に阻害しない化学物質である。ＰＧＥは、黄体及び胚に対してＰＧＦ２αの効果とは逆の効果を有する平滑筋刺激薬である。ＰＧＦ２αとは対照的に、ＰＧＥは、ＰＧＦ２αによって誘導される黄体溶解を阻害するという点で抗黄体融解作用を有する。
【００２７】
本発明に有用な選択的なプロスタグランジン受容体アンタゴニストの例としては、ＰＧＦ２αの１１β−フルオロ類似体であるＡＬ−８８１０（１１β−フルオロ−１５−エピ−１５−インダニル−テトラノルＰＧＦ２α）（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  ミシガン州アナーバー）である。他のプロスタグランジン受容体アンタゴニストの例としては、ＡＬ−３１３８（１１−デオキシ−１６−フルオロＰＧＦ２α）、ＴＨＧ１１３（Ｐｅｒｉ  ＫＧ，ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｍｉｎ  Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ．２６（６）：３８９−３９７（２００２）を参照）、及びフロレチンを含む。既知及び未知の他の選択的ＰＧＦ２αアンタゴニスト及びＰＧＦ２α受容体アンタゴニストもまた本発明に適している。
【００２８】
レシピエント雌動物の子宮へ移植される胚を保護するための本発明の方法の好ましい実施形態によると、レシピエント雌動物の子宮へ移植される胚は、前記胚がドナー動物から回収される間及び／若しくはその後、及び前記胚が前記レシピエント雌に移植される前にプロスタグランジン受容体アンタゴニストに暴露される。前記胚は、胚盤胞などの収縮前、収縮或いは収縮後のものである。一般的に、プロスタグランジンアンタゴニストへの前記胚の暴露は、１若しくはそれ以上のプロスタグランジンアンタゴニストを含有した培養液における前記胚の保持、洗浄、培養、凍結、或いは移植することによって行われる。プロスタグランジンアンタゴニストは好ましくは、ＰＧＦ２αの選択的遮断薬である。前記胚は、ＰＧＦ２αの胎児毒性作用から完全にあるいは部分的に胚を保護するのに有効な時間と濃度で、プロスタグランジンアンタゴニストに暴露される。
【００２９】
胚移植を実行するための本発明の方法の好ましい実施形態によると、移植される胚は、前記胚を作製しレシピエント動物へその胚を移植するためにドナー動物から胚を回収している若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで卵母細胞を培養している間若しくはその最中に、プロスタグランジンアンタゴニストに暴露され、前記胚は次に前記レシピエント動物の子宮に移植される。一般的に、プロスタグランジンアンタゴニストへの胚の暴露は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、１若しくはそれ以上のプロスタグランジンアンタゴニストを含有する回収液或いは培養液において胚を保持、培養、凍結、或いは移植されることによって行われる。前記プロスタグランジンアンタゴニストは、好ましくはＰＧＦ２αの選択的遮断薬である。前記胚は、ＰＧＦ２αの胎児毒性作用から完全に或いは部分的に前記胚を保護するのに有効な時間及び濃度で、前記プロスタグランジンアンタゴニストに暴露される。ドナー動物から胚を回収するあらゆる方法、胚を作製するために卵母細胞を受精させるあらゆる方法、レシピエント動物の子宮に移植するための胚を準備するあらゆる方法、及びレシピエント動物の子宮へ胚を移植するあらゆる方法は、そのような方法が現在既知であろうが後に発見されようが、本発明のこの方法に適切である。
【００３０】
本発明の培養液によると、前記培養液は、例えば、受精させレシピエント雌動物の子宮に移植される卵母細胞の成熟のためのもの、或いはレシピエント雌動物の子宮へ移植される胚を保持、回収、培養、凍結、処置、或いは移植するためのものである。本発明の培養液は、培養液としての利用に必要な成分を含み、さらに、前記レシピエント雌の子宮へ前記胚を移植した後に直面するＰＧＦ２αの胎児毒性から培養液に置かれた胚を保護するのに有効な濃度でプロスタグランジンアンタゴニストを含む。
【００３１】
本発明の非ヒト胚によると、前記胚は、雌動物の子宮へ前記胚を移植すると直面するＰＧＦ２αの胎児毒性から前記胚が保護されるように、雌動物の内部或いは外部に置かれ、プロスタグランジンアンタゴニストに暴露される或いは暴露された哺乳類胚である。
【００３２】
本発明はさらに、以下の限定されない実施例によって説明される。
【実施例１】
【００３３】
胚（胎仔）に対するＰＧＦ２αの直接的な効果に関する評価
ＰＧＦ２α及び胚発達に関する先行技術の研究は、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われているため、報告されているＰＧＦ２αの胚への効果は、胚に対する直接的な効果というよりはむしろＰＧＦ２αの間接的な効果である可能性がある。従って、本研究は、収縮前（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ作製）または収縮（ｉｎ−ｖｉｖｏ作製）胚を培養している期間中に、ＰＧＦ２αの胚発達への直接的な効果が生じるか否かの測定を行うものである。
【００３４】
実施例１．ａ  収縮前胚（ｐｒｅ−ｃｏｍｐａｃｔｅｄ  ｅｍｂｒｙｏｓ）
Ｅｄｗａｒｄｓ及びＨａｎｓｅｎ（ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５５：３４０−３４６（１９９６））によって記載されているｉｎ  ｖｉｔｒｏ胚作製の改良プロトコールによって、胚を作製する。収縮前１６〜３２細胞期の胚をポリビニルアルコール（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ：ＰＶＡ）３ｍｇ／ｍｌ（０．３％）を添加したＫＳＯＭ培地中（Ｂｉｇｇｅｒｓ，Ｊ．Ｄ．１９９１．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．９１：５４３）で迅速に洗浄する。この胚の質（正常な形状、規定の割球、突出割球、細胞質分裂、均一な細胞質）を評価し、４つのグループ（良い質の胚によって形成されたもの）に均等に分類し、以下に記載したように４ウェルのプレート中、実験処理物に移植し、インキュベータ（３８．５℃において５．５％  ＣＯ２、７％  Ｏ２、及び８７．５％  Ｎ２）に戻す。この胚を更に４日間、各処理物中で維持する。ウシの胚を分類するためのガイドラインであるＩＥＴＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ：ＩＥＴＳ（国際胚移植学会））を用いて、胚発達を評価する。
【００３５】
ＰＧＦ２α（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、アナーバー、ミシガン州）の希釈物（すなわち処理物）を調整し、０、１、１０、及び１００ｎｇ／ｍＬとする。処理物を４ウェルプレート（５００μＬ／ウェル）の各ウェルに入れ、胚を入れる少なくとも５時間前にインキュベータ（３８．５℃において５．５％  ＣＯ２、７％  Ｏ２、及び８７．５％Ｎ２）中で平衡化する。各複製物に対しては、各処理物からの２つの培地サンプルを収集し、放射免疫測定（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）によってＰＧＦ２αの濃度を測定する。前記処理を開始した日（培養約５日目）に第１のサンプルを収集し、胚盤胞の発達を測定した後（培養９日目）に第２のサンプルを収集する。
【００３６】
合計７個の複製物を使用する。各複製物において、１６〜３２の細胞期の胚を０．３％ＰＶＡを添加したＫＳＯＭ培地中に入れ、以下の培養処理物の１つを前記胚に与える。１）コントロール（ｎ＝１６８）、２）１ｎｇ／ｍＬ  ＰＧＦ２α（ｎ＝１４３）、３）１０ｎｇ／ｍＬ  ＰＧＦ２α（ｎ＝１６８）、４）１００ｎｇ／ｍＬ  ＰＧＦ２α（ｎ＝１３６）、及び５）５ｎｇ／ｍＬ  ＰＧＥ２（ｎ＝６２）。プロスタグランジンＥ２は胚発達期間中、「有益」なプロスタグランジンであると考えられている（Ｂｉｇｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．１９：５１９−５３３．（１９７８））。従って、５ｎｇ／ｍＬを添加した培地で培養した胚は陽性コントロールグループと見なし（Ｇｕｒｅｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．５：２８１−２８３（１９９３））、単にプロスタグランジンそのもののみに関連する効果があるか否かを確認する。
【００３７】
不完全ブロック法及び乱塊法のそれぞれを用いて胚盤胞発達及び孵化率の試験を行うために、データを分析する。混合モデル（ＳＡＳ  ８．０２、ＳＡＳ協会、ノースカロライナ州カリー）を用いて分散分析を行い、コントロール試験を行い、胚発達におけるＰＧＦ２α値の相違を特定する。その後、カイ二乗分析（ＳＡＳ  ８．０２、ＳＡＳ協会、カリー、ノースカロライナ州）を用いて分析値の妥当性を検証する。
【００３８】
結果によると、培地中、１、１０、又は１００ｎｇ／ｍＬのＰＧＦ２αを有する１６〜３２細胞期の収縮（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ作製）胚の培養物では、胚盤胞の発達がコントロールと比較して抑制されていることが示された（ｐ＝０．００２）。更に、この胚盤胞発達は、コントロールとＰＧＥ２処理物の間では相違がなかった（Ｐ>０．１０）。従って、ＰＧＦ２αの培地への添加は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ作製した胚における１６〜３２細胞期から胚盤胞への発達に対して直接的な悪影響を及ぼすものである。
【００３９】
実施例１．ｂ  収縮胚
ｉｎ  ｖｉｖｏ誘導したグリセロール凍結桑実胚期ウシ胚を、三段階グリセロール除去方法を用いて解凍する。前記胚を洗浄後、３０分間Ｖｉｇｒｏ保持培地中で形態学的に正常に回復させ、ウシ胚を分類するためのＩＥＴＳガイドラインに従って、発達段階及びその質によって前記胚を分類する。この研究のために、４つの複製物を用いる。
【００４０】
Ｓｃｈｒｉｃｋら（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．４９：６１７−６２１（１９９３））は、短周期のウシから得られるフラッシュ培地中の０．６４ｎｇ／ｍＬのＰＦＧ２αが存在し、ＰＧＦ２α濃度と胚の質との間に関連性がないことを報告していた。これらの知見に基づき、培地中、０（コントロール、ＫＳＯＭ−ＰＶＡ）、０．１、１、及び１０ｎｇ／ｍＬ濃度のＰＧＦ２αが処理液として選択される。各処理液を４ウェルプレート（５００μＬ／ウェル）の異なるウェルに入れた後、胚を入れる前にインキュベータ（３８．５℃において５．５％  ＣＯ２、７％  Ｏ２、８７．５％  Ｎ２）中で少なくとも５時間保持し、培地を平衡化させる。これと同時に、各処理液からの培地サンプルを収集し、ラジオイムノアッセイ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）によってＰＧＦ２α濃度を測定するために−２０℃で保存する。
【００４１】
１、２、又は３等級の質の桑実胚（ステージ４）をＫＳＯＭ−ＰＶＡ中で４回洗浄し、４つの処理、すなわち１）コントロール（ｎ＝１１０）、２）０．１ｎｇ／ｍＬ  ＰＧＦ２α（ｎ＝１０８）、３）１ｎｇ／ｍＬ  ＰＧＦ２α（ｎ＝１０９）、４）１０ｎｇ／ｍＬ  ＰＧＦ２α（ｎ＝１０９）のうちの１つに割り当てて、インキュベータ（３８．５℃において５．５％  ＣＯ２、７％  Ｏ２、８７．５％  Ｎ２）に入れる。前記胚を各処理物液中で２４時間培養した後、この胚を洗浄し、ＰＧＦ２αを含まないＫＳＯＭ−ＢＳＡ中にさらに４８時間入れる。ウシ胚の分類のためのＩＥＴＳガイドラインを用いて、これらの処理を知らされていない熟練技術者によって胚発達の評価を行う。実施例１．ａに記載したようにデータを分析する。
【００４２】
この研究結果によると、収縮（ｉｎ  ｖｉｖｏ誘導化）桑実胚段階の胚の発達は、発達に関するＩＥＴＳガイドラインを活用した桑実胚を過ぎた少なくとも２つの段階において、処理液間では相違がなかった（ｐ>０．１０）。しかしながら、０．１、１、１０ｎｇ／ｍＬのＰＧＦ２α中で、胚を２４時間培養することにより、コントロールと比較して孵化速度の減少が見られた（ｐ＝０．０５）。
【実施例２】
【００４３】
桑実胚段階の胚におけるＰＧＦ２α受容体転写産物の存在
上述したように、胚はｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製される。胚発達の６日目、桑実胚段階の胚を、０．１％ＰＶＡ（ポリビニルアルコール  ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ：ＰＶＡ、シグマ、セントルイス、ミズーリ州）が添加された予め温めたＰＢＳを含む「Ｘ」プレートに移植する。この胚を同じ溶液で２回洗浄した後、５０μＬのＲＮＡ後期溶液（ｌａｔｅｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．、オースティン、テキサス州）を含む１．５ｍＬのリボヌクレアーゼ不含エッペンドルフチューブに入れる。ＲＮＡ後期溶液中、約２０個の胚の貯蔵物を一晩４℃に維持し、ＲＮＡが単離されるまで−８０℃で保存し、更なる処理を行う。
【００４４】
Ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ  ＲＮＡ（登録商標）Ｎａｎｏｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホーヤ）を使用し、製造業者の使用説明書に記載されているように、ウシ胚から高純度全ＲＮＡを単離する。ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）の粘度を低減させるために、７０μｌのヌクレアーゼ不含水を各サンプルに加える。このサンプルを７，０００ｇで５分間回転させて、上清を除去する。その後、β−メルカプトエタノール及び溶解緩衝液の組み合わせ溶液を加えて胚を溶解させる。細胞溶解の後、前記サンプルをナノスピンカップに移し、ここでＲＮＡをシリカを基材とした繊維マトリックスに結合させる。汚染物質ＤＮＡをＤｎａｓｅ  Ｉ酵素を用いるＤｎａｓｅ消化工程により除去する。その後、一連の高及び低塩濃度緩衝液洗浄によって、Ｄｎａｓｅ  Ｉ酵素及びそのほかのタンパク質を除去する。その後、１０μＬの低イオン強度緩衝液を用いて、高純度ＲＮＡを繊維マトリックスから溶出する。溶出サンプルは使用するまで−８０℃で保存する。
【００４５】
陽性コントロールとして、ウシ舌上皮から得られる全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバーグ、カリフォルニア州）を用いて単離する。０．５ｃｍ未満の厚さの切片の上皮を薄く切り取ることで新鮮な舌から上皮細胞を得た後、この上皮細胞をＲＮＡｌａｔｅｒ溶液に入れる。その後、舌サンプルを一晩４℃で放置した後、使用するまで−８０℃で保存する。ＲＮＡを単離するために、１００ｍｇの舌上皮を、１ｍＬのＴｒｉｚｏｌ（トリゾール）を含む１７×１００ｍｍのポリプロピレンチューブに入れ、この組織サンプルをパワーホモジナイザー（Ｔｅｋｍａｒ’ｓ  Ｔｉｓｓｕｍｉｚｅｒ、Ｔｅｋｍａｒ  Ｃｏ．、オハイオ州シンシナティ）を用いてホモジナイズする。ホモジナイズしたサンプルを室温で５分間インキュベートした後、０．２ｍＬのクロロホルムを加える。前記チューブを激しく手で１５秒間振とうし、室温で１５分間インキュベートする。その後、前記サンプルを４℃、１２，０００ｇで１０分間遠心分離する。遠心分離後、前記水相を新鮮なチューブに移し、ここで０．５ｍＬのイソプロピルアルコールを加えて、このサンプルを室温で１５分間インキュベートすることによりＲＮＡを沈殿させる。前記サンプルを４℃、１２，０００ｇで１０分間遠心分離して上清を除去し、得られたＲＮＡペレットを７５％エタノールで１回洗浄する。最後に、前記ＲＮＡペレットを５分間空気乾燥し、５０μｌのヌクレアーゼ不含水中に溶解し、使用するまで−８０℃で保存する。
【００４６】
４つの各複製物において、２０個の収縮桑実胚から単離したＲＮＡ、及びウシ舌上皮からの１８０ｎｇの全ＲＮＡを総容積２５μｌのｃＤＮＡに逆転写する。反応混合物は１ＸＲＴ緩衝液、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．２５ｎＭ  無作為六量体（ヘキサマー）、２０ｉｕ  ＲＮａｓｅ阻害剤、及び１００ｉｕ  ネズミ白血病ウイルス逆転写酵素（ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ：ＭＭＬＶ−ＲＴ）から成るものである。前記ＲＴ反応のために使用する全ての試薬は、Ｐｒｏｍｅｇａ（ウィスコンシン州マディソン）から購入する。前記ＲＴ反応を２５℃で１０分間実行し、９９℃で５分間の変性工程の後、４℃にフラッシュ冷却（ｆｌａｓｈ  ｃｏｏｌｉｎｇ）した後、４２℃で１時間行う。陰性コントロールとして、前記ＲＴ反応期間中、逆転写酵素を排除したチューブを常に調整する。
【００４７】
ＰＧＦ２α受容体の存在については、リアルタイムＰＣＲで分析する。ＰＧＦ２α受容体転写産物を測定するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ由来桑実胚期の胚から単離されたＲＮＡを用いて、リアルタイムＰＣＲによる３回の複製を行う。各複製において、１チューブ当たり１０当量の胚（１当量の胚＝ある定義された容量中、１つ胚を用いた前記ＲＴ反応から得られる容量パーセント）を使用して、各転写産物の発現を測定する。ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ（商標）  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）、及びｉＱ（商標）ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を行う。前記ＰＣＲ反応混合物は、２５μｌの１ＸｉＱＳｕｐｅｒｍｉｘ（１００ｍＭ  ＫＣｌ、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．４、０．４ｍＭ  各ｄＮＴＰ、ｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ  ５０ユニット／ｍｌ、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、２０ｎＭ  フルオロセイン、及び安定剤）、１μＭ濃度の順方向プライマー、１μＭ濃度の逆方向プライマー、４．５ヌクレアーゼ不含水、前記ＲＴ反応からの１０μｌテンプレート、及び０．５μｌのフルオロセインを含む。各プライマーセットの陰性コントロールは、ｃＤＮＡを含まないＰＣＲ反応混合物から成るものである。
【００４８】
リアルタイムＰＣＲの標準コントロールとして、ヒストンＡ２の増幅を使用する。前記リアルタイムＰＣＲ手順は、９５℃で１５分の開始段階の後、９５℃で１５秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒を４０サイクル行う。蛍光データは伸長段階で得られる。ＰＧＦ２α受容体及びヒストンＡ２遺伝子の融解温度は、それぞれ８４℃及び９０℃である。従って、融解曲線分析では、前記種々生成物の期待Ｔｍにおいて鋭いピークが見られる。前記融解手順は、６０秒間４５℃で維持した後、４５℃から９４℃に加熱し、蛍光観察期間中は各温度を５秒間維持する。１ＸＴＢＥ緩衝液（９０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、９０ｍＭ  ホウ酸塩、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）中、エチジウムブロマイド染色２％アガロースゲルの電気泳動法によって、生成物の同定を行う。更に、ＰＧＦ２α受容体の単位複製配列の同定は、リアルタイムＰＣＲフラグメントのＤＮＡ配列によって確認する。
【００４９】
ＲＴ−ＲＴ−ＰＣＲ分析によって、ＰＧＦ２αの転写産物が胚の初期発達段階において存在することが示された。ウシ舌上皮及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成したウシ胚から得られるＰＧＦ２α転写産物の陽性コントロールは、エチジウムブロマイド染色アガロースゲル上にすぐに現れた。
【実施例３】
【００５０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの胚発達に対するＰＧＦ２α受容体アンタゴニストの効果
収縮前１６〜３２細胞期のウシ胚（受精後４日目）をＫＳＯＭ−ＰＶＡ中で洗浄し、４つのグループに分け、各グループを以下のうち１つを含むＫＳＯＭ−ＰＶＡ中、４８時間培養する：（１）１０００ｎＭ  ＡＬ−８８１０、ｎ＝９５（ＡＬ−８８１０グループ）、（２）１ｎｇ／ｍｌ  ＰＧＦ、ｎ＝９１（ＰＧＦグループ）、（３）１０００ｎＭ  ＡＬ−８８１０＋１ｎｇ／ｍｌ  ＰＧＦ、ｎ＝９０（ＡＬ−８８１０＋ＰＧＦグループ）、又は（４）ＡＬ−８８１０又はＰＧＦを含まないＫＳＯＭ−ＰＶＡ（コントロールグループ）。
【００５１】
４８時間の培養後、各グループの胚をＨＥＰＥＳ−ＴＡＬＰ中に入れ、前記各グループの胚の処理液を知らされていない技術者によって胚発達を評価する。各処理グループからの胚をＫＳＯＭ−ＰＶＡにて洗浄し、ＫＳＯＭ−ＰＶＡを含む４ウェルプレートに移し、さらに受精後８日目まで培養し、胚発達を再び評価する。
【００５２】
データによると、４〜６日目にＰＧＦを添加すると、胚盤胞段階に達する胚のパーセントが８日目には減少する事を示していた。しかし、ＡＬ−８８１０を前記培地に添加すると、ＰＧＦの胚発達に対する悪影響が減少し、胚発達がコントロールグループと類似の値に回復した。
【実施例４】
【００５３】
用量反応研究
収縮前１６〜３２細胞期のウシ胚（受精後４日目）をＨＥＰＥＳ−ＴＡＬＰで洗浄し、４つのグループの分け、各グループを５００μｌのＫＳＯＭ−ＰＶＡ（０．３％）を含む４ウェルプレートの処理液中に移し、その後９６時間インキュベータに戻しておく。インキュベータ条件は、３８．５℃において５．５％  ＣＯ２、７％  Ｏ２、及び８７．５％  Ｎ２である。前記４つのグループは以下のとおりである。：（１）ＫＳＯＭ−ＰＶＡ  ＋  １０００ｎＭのＡＬ−８８１０、ｎ＝９３（高濃度ＡＬ−８８１０グループ）、（２）ＫＳＯＭ−ＰＶＡ  ＋  ５００ｎＭのＡＬ−８８１０、ｎ＝９５（中濃度ＡＬ−８８１０グループ）、（３）ＫＳＯＭ−ＰＶＡ  ＋  ２５０ｎＭのＡＬ−８８１０、ｎ＝９３（低濃度ＡＬ−８８１０グループ）、及び（４）前述の３つのグループで使用したものと等しい容量のＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ：ＤＭＳＯ）とＫＳＯＭ−ＰＶＡ、ｎ＝９５（コントロールグループ）。９６時間のインキュベーション後、各グループからの胚をＨＥＰＥＳ−ＴＡＬＰに入れ、前記各グループの胚の処理を知らされていない技術者によって胚発達を評価する。
【００５４】
このデータによると、受精後５〜８日目、３つの異なる濃度のプロスタグランジン阻害剤ＡＬ−８８１０を培地に添加することにより、収縮前胚の初期胚発達が、コントロールと比較して抑制又は増強されないことを示した。高度濃度ＡＬ−８８１０及びコントロールグループのみを分析した場合、これらの２つのグループに有意な相違がみられた（６０．３％＋／−３．９％（高濃度ＡＬ−８８１０グループ）に対して４９．９％＋／−３．９％（コントロールグループ）、ｐ<０．０５）。
【実施例５】
【００５５】
移植前の胚の前処理
肉用牛及び乳牛（泌乳乳牛及び乾乳牛）の発情後７日目に、約１００個の胚を回収する。既に報告されているように（Ｓｃｈｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．４９：６１７−６２１（１９９３））、ウシに過剰排卵させ（Ｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ（商標））、胚を回収し、評価し、凍結させる（１．５Ｍ  エチレングリコール；ＥＧ）。回収した胚の半分に、以下の各代替培地調整液を１Ｌ使用する：１）胚回収（フラッシュ）培地（ＣＯＮ、ｎ＝５０回収、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ＋１％ＦＣＳ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ、カタログ番号２１３００−０２５、グランドアイランド、ニューヨーク州）、又は２）胚回収（フラッシュ）培地＋ＡＬ−８８１０（ＴＲＴ、ｎ＝５０回収、４３０ｎＭのＡＬ−８８１０）。
【００５６】
濾過後、胚ディッシュを探し、胚を除去し（Ｖｉｇｒｏに入れ）、その質と発達を評価する（ＩＥＴＳガイドライン）。許容可能な発達及び質（ＩＥＴＳ１〜３）を有する、各フラッシュから回収した胚の半分を、１）Ｖｉｇｒｏ（Ｆ／Ｔコントロール、ｎ＝２５０個の胚）、又は２）Ｖｉｇｒｏ＋ＡＬ−８８１０（Ｆ／Ｔ処理、ｎ＝２５０個の胚）を添加した１．５ＭのＥＧを用いて、直接移植のためにそれぞれ凍結させる。評価後、凍結ユニット（ＢｉｏＣｏｏｌ制御速度冷凍庫、ＦＴＳ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、ミシガン州ウォレン）に設置する前に、胚を５〜１０分以内の間、それぞれのＦ／Ｔ培地処理物液に入れる。標識（Ｅｍｂｒｙｏ  ＩＤ）した０．２５ｍＬのストロー（ｓｔｒａｗｓ）に入れた後、この胚を−３２℃に凍結し（−６℃で播種、凍結速度−０．５℃／分）、液体窒素貯蔵タンクに入れる。受け入れ可能なレシピエント動物に移植する前に、この胚を２週間以上保存する。
【００５７】
２年間以上の間、レシピエント動物（乳牛、肉用牛、及び未経産牛、ｎ＝５００）は、１００μｇのＧｎＲＨ（Ｃｙｓｔｅｒｏｌｉｎ、Ｍｅｒｉａｌ）を投与して０日目にＣＩＤＲ（膣内プロゲステロン放出装置、ファイザー）を挿入し、７日目にＣＩＤＲを除去し、２ｍＬのＥｓｔｒｕｍａｔｅ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）を注射し、８〜１２日目までに発情期を検出する（１日に２回）、ＧｎＲＨ／ＣＩＤＲ／Ｅｓｔｒｕｍａｔｅプロトコールを用いて発情を同期化する。同期化された発情期を検出後７日目に、前記動物をウシ取り扱い施設に入れ、プロゲステロン濃度のために尾静脈から血液を収集し（１９９８年Ｓｅａｌｓらによって説明されたようにＰ４濃度を測定する）、許容性及び位置に関しては黄体（ｃｏｒｐｕｓ  ｌｕｔｅｕｍ：ＣＬ）を触診し、前記ＣＬと同側の子宮角の上半分に胚を配置する（胚移植、ｅｍｂｒｙｏ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＥＴ）（Ｓｃｈｒｉｃｋら、１９９３年）。ＥＴに使用する胚を解凍し（１０秒間空気解凍、３０秒間２５℃の水浴）、ストロー標識（胚ＩＤ）情報を記録し、さらにレシピエントＩＤを収集する。
【００５８】
胚を食用牛ドナーから回収してウシレシピエント（Ａｎｇｕｓ）に配置し、乳牛ドナーからの胚を乳牛（Ｈｏｌｓｔｅｉｎ）にのみ配置する。２１〜２８日目、妊娠決定するため経直腸的超音波断層法を用いてにレシピエントを走査する。移植後９０〜１５０日後、最終妊娠コールのために、全ての動物を直腸触診する。分娩時に、子牛の健康状態、全体的に異常がないかを評価し、体重をはかり、識別タグを挿入し、さらに性別を記録する。
【００５９】
この研究結果は、胚が存在する胚回収及び／または凍結／移植（Ｆ／Ｔ）培地などの培地にＰＧＦ２αアンタゴニストを添加することにより、受け入れ可能なレシピエントに配置された胚の妊娠率を高めることを立証するものであった。前記妊娠の結果から得られた子牛に異常性は見られなかった。
【００６０】
本願明細書に記載された本発明の更なる変法、使用方法、及び用途は当業者には明らかとなるものである。そのような変法は以下の請求項に包含されるものである。
【国際調査報告】
2008526268.tif 000002
2008526268.tif 000003