(57)【要約】乳癌患者、特に早期の乳癌患者の予後を評価するための方法及び組成物を提供する。本発明の方法は身体試料中のバイオマーカーの少なくとも１つ、特に少なくとも２つの発現を検出することを含み、ここでバイオマーカー又はバイオマーカーの組み合わせの過剰発現は乳癌の予後を示すものである。一部の実施形態においては、身体試料は乳房組織試料、特に原発乳房腫瘍試料である。本発明のバイオマーカーは過剰発現が良好又は不良な癌の予後のいずれかを示すタンパク質及び／又は遺伝子である。目的とされるバイオマーカーは細胞周期の調節、ＤＮＡ複製、転写、シグナル伝達、細胞増殖、侵襲、タンパク分解又は転移に関与するタンパク質及び遺伝子を包含する。
2008513032.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳癌患者の予後を評価するための方法であって、該方法は該患者由来の試料中の少なくとも１つのバイオマーカーの過剰発現を検出することを含み、ここで該バイオマーカーはＳＬＰＩ、ｐ２１ｒａｓ、ＭＵＣ−１、ＤＡＲＰＰ−３２、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ２７、ｓｒｃ、ＭＧＣ１４８３２、ｍｙｃ、ＴＧＦβ−３、ＳＥＲＨＬ、Ｅ２Ｆ１、ＰＤＧＦＲα、ＮＤＲＧ−１、ＭＣＭ２、ＰＳＭＢ９及びＭＣＭ６よりなる群から選択され、そして該バイオマーカーの過剰発現は予後を示すものであり、そしてこれにより該乳癌患者の予後を評価する方法。
【請求項２】
前記バイオマーカーの過剰発現が予後不良を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リンパ節陰性乳癌患者の予後を評価するための方法であって、該方法は該患者由来の試料中の少なくとも２つのバイオマーカーの発現を検出することを含み、ここで該バイオマーカーの発現を検出することは、免疫組織化学的分析、核酸ハイブリダイゼーション又は定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施することを含み、そして少なくとも２つの該バイオマーカーの過剰発現は予後不良を示すものであり、そしてこれにより該乳癌患者の予後を評価する方法。
【請求項４】
乳癌患者の予後を評価するための方法であって、該方法は該患者由来の試料中の少なくとも２つのバイオマーカーの発現を検出することを含み、ここで該バイオマーカーの発現を検出することは、免疫組織化学的分析、核酸ハイブリダイゼーション又は定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施することを含み、そして少なくとも２つの該バイオマーカーの過剰発現の非存在は予後良好を示すものであり、そしてこれにより該乳癌患者の予後を評価する方法。
【請求項５】
少なくとも２つのバイオマーカーの過剰発現が予後不良を有する乳癌患者を予後良好を有する患者から特定的に識別する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記バイオマーカーが細胞周期の調節、ＤＮＡ複製、転写、シグナル伝達、細胞増殖、侵襲、アポトーシス、タンパク分解又は転移に関与する、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
乳癌患者の予後を評価するための方法であって、該方法は該患者由来の試料中の少なくとも２つのバイオマーカーの発現を検出することを含み、ここで該バイオマーカーの少なくとも１つの過剰発現は予後不良を示すものであり、ここで該バイオマーカーはＳＬＰＩ、ｐ２１ｒａｓ、ＭＵＣ−１、ＤＡＲＰＰ−３２、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ２７、ｓｒｃ、ＭＧＣ１４８３２、ｍｙｃ、ＴＧＦβ−３、ＳＥＲＨＬ、Ｅ２Ｆ１、ＰＤＧＦＲα、ＮＤＲＧ−１、ＭＣＭ２、ＰＳＭＢ９及びＭＣＭ６よりなる群から選択され、そしてこれにより該乳癌患者の予後を評価する方法。
【請求項８】
前記バイオマーカーがＳＬＰＩ、ＰＳＭＢ９、ＭＵＣ−１、ｓｒｃ、Ｅ２Ｆ１及びｐ２１ｒａｓよりなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法であって、該方法が試料中の２つのバイオマーカーの発現を検出することを含み、ここで該バイオマーカーはＳＬＰＩ及びＥ２Ｆ１であり、そしてここで該バイオマーカーの少なくとも１つの過剰発現が予後不良を示すものであり、そしてこれにより前記乳癌患者の予後を評価する方法。
【請求項１０】
請求項７に記載の方法であって、該方法が試料中の３つのバイオマーカーの発現を検出することを含み、ここで該バイオマーカーはＳＬＰＩ、Ｅ２Ｆ１及びＭＵＣ−１であり、そしてここで該バイオマーカーの少なくとも１つの過剰発現が予後不良を示すものであり、そしてこれにより前記乳癌患者の予後を評価する方法。
【請求項１１】
請求項７に記載の方法であって、該方法が試料中の４つのバイオマーカーの発現を検出することを含み、ここで該バイオマーカーはＳＬＰＩ、Ｅ２Ｆ１、ＭＵＣ−１及びｓｒｃであり、そしてここで該バイオマーカーの少なくとも１つの過剰発現が予後不良を示すものであり、そしてこれにより前記乳癌患者の予後を評価する方法。
【請求項１２】
請求項７に記載の方法であって、該方法が試料中の５つのバイオマーカーの発現を検出することを含み、ここで該バイオマーカーはＥ２Ｆ１、ＳＬＰＩ、ＭＵＣ−１、ｓｒｃ及びｐ２１ｒａｓであり、そしてここで該バイオマーカーの少なくとも１つの過剰発現が予後不良を示すものであり、そしてこれにより前記乳癌患者の予後を評価する方法。
【請求項１３】
請求項７に記載の方法であって、該方法が試料中の６つのバイオマーカーの発現を検出することを含み、ここで該バイオマーカーはＥ２Ｆ１、ＳＬＰＩ、ＭＵＣ−１、ｓｒｃ、ｐ２１ｒａｓ及びＰＳＭＢ９であり、そしてここで該バイオマーカーの少なくとも１つの過剰発現が予後不良を示すものであり、そしてこれにより前記乳癌患者の予後を評価する方法。
【請求項１４】
リンパ節陰性乳癌患者の予後を評価するための方法であって、該方法は該患者由来の試料中の少なくとも２つのバイオマーカーの発現を検出することを含み、ここで少なくとも２つの該バイオマーカーの過剰発現は予後不良を示すものであり、ここで該バイオマーカーは伏在する乳癌による乳癌再発又は死亡の尤度の評価について統計学的に有意であることがｌｏｇ−ｒａｎｋ検定を用いて決定され、そしてこれにより該乳癌患者の予後を評価する方法。
【請求項１５】
乳癌患者の予後を評価するための前記方法が更に臨床情報の検査を含む請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
前記臨床情報が腫瘍の大きさ、腫瘍の等級、リンパ節の状態及び家族の病歴を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法を用いて前記乳癌患者に対する治療方策を開発する請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
乳癌患者の予後を評価するための前記方法がＨｅｒ２／ｎｅｕの発現水準の分析と組み合わせられる請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
乳癌患者の予後を評価するための前記方法が前記患者のエストロゲン受容体又はプロゲステロン受容体の状態の分析と組み合わせられる請求項３に記載の方法。
【請求項２０】
乳癌患者の予後を評価するための前記方法が前記患者のエストロゲン受容体の状態とは無関係である請求項３に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法を用いてエストロゲン受容体陽性又はエストロゲン受容体陰性の乳癌患者の予後を評価する請求項３に記載の方法。
【請求項２２】
前記乳癌患者が早期の乳癌を有する請求項３に記載の方法。
【請求項２３】
乳癌患者の予後を評価するための方法であって、該方法が下記工程：
ａ）該患者から試料を得ること；
ｂ）少なくとも１つの抗体に該試料を接触させること、ここで該抗体はバイオマーカータンパク質に特異的に結合し、ここで該バイオマーカータンパク質はＳＬＰＩ、ｐ２１ｒａｓ、ＭＵＣ−１、ＤＡＲＰＰ−３２、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ２７、ｓｒｃ、ＭＧＣ１４８３２、ｍｙｃ、ＴＧＦβ−３、ＳＥＲＨＬ、Ｅ２Ｆ１、ＰＤＧＦＲα、ＮＤＲＧ−１、ＭＣＭ２、ＰＳＭＢ９及びＭＣＭ６よりなる群から選択されること；
ｃ）該バイオマーカータンパク質への該抗体の結合を検出すること；
ｄ）該バイオマーカータンパク質が該試料中で過剰発現されているかどうか測定すること、ここで該バイオマーカータンパク質の過剰発現は予後不良を示すものであること；及び、
ｅ）これにより該乳癌患者の予後を評価すること；
を含む方法。
【請求項２４】
前記バイオマーカータンパク質がＥ２Ｆ１、ＳＬＰＩ、ＭＵＣ−１、ｓｒｃ、ｐ２１ｒａｓ及びＰＳＭＢ９よりなる群から選択される請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
乳癌患者の予後を評価するための方法であって、該方法が下記工程：
ａ）該患者から試料を得ること；
ｂ）少なくとも２つの抗体に該試料を接触させること、ここで該抗体の各々は異なるバイオマーカータンパク質に特異的に結合すること；
ｃ）該バイオマーカータンパク質への該抗体の結合を検出すること；
ｄ）該バイオマーカータンパク質が該試料中で過剰発現されているかどうか測定すること、ここで少なくとも２つの該バイオマーカータンパク質の過剰発現は予後不良を示すものであること；及び、
ｅ）これにより該乳癌患者の予後を評価すること；
を含む方法。
【請求項２６】
前記バイオマーカータンパク質がＳＬＰＩ、ｐ２１ｒａｓ、ＭＵＣ−１、ＤＡＲＰＰ−３２、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ２７、ｓｒｃ、ＭＧＣ１４８３２、ｍｙｃ、ＴＧＦβ−３、ＳＥＲＨＬ、Ｅ２Ｆ１、ＰＤＧＦＲα、ＮＤＲＧ−１、ＭＣＭ２、ＰＳＭＢ９及びＭＣＭ６よりなる群から選択される請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
乳癌患者の予後不良を示す異なるバイオマーカータンパク質に前記抗体の各々が特異的に結合する少なくとも２つの抗体を含むキット。
【請求項２８】
前記バイオマーカータンパク質が細胞周期の調節、ＤＮＡ複製、転写、シグナル伝達、細胞増殖、侵襲、アポトーシス、タンパク分解又は転移に関与する、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記バイオマーカータンパク質がＳＬＰＩ、ｐ２１ｒａｓ、ＭＵＣ−１、ＤＡＲＰＰ−３２、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ２７、ｓｒｃ、ＭＧＣ１４８３２、ｍｙｃ、ＴＧＦβ−３、ＳＥＲＨＬ、Ｅ２Ｆ１、ＰＤＧＦＲα、ＮＤＲＧ−１、ＭＣＭ２、ＰＳＭＢ９及びＭＣＭ６よりなる群から選択される、請求項２７に記載のキット。
【請求項３０】
前記バイオマーカータンパク質がＥ２Ｆ１、ＳＬＰＩ、ＭＵＣ−１、ｓｒｃ、ｐ２１ｒａｓ及びＰＳＭＢ９よりなる群から選択される、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記キットが前記バイオマーカータンパク質に結合する抗体の検出のための薬品を更に含む請求項２７に記載のキット。
【請求項３２】
前記キットが市販の抗体結合検出システムと共に使用される請求項２７に記載のキット。
【請求項３３】
前記キットが陽性対照試料を更に含む請求項２７に記載のキット。
【請求項３４】
前記キットが使用のための説明書を更に含む請求項２７に記載のキット。
【請求項３５】
選択された治療への乳癌患者の応答を予測するための方法であって、該方法が該患者由来の試料中の少なくとも２つのバイオマーカーの発現を検出することを含み、ここで少なくとも２つの該バイオマーカーの過剰発現は陽性治療応答を示すものであり、そしてこれにより該治療への該乳癌患者の応答を予測する方法。
【請求項３６】
選択された治療への乳癌患者の応答を予測するための方法であって、該方法が該患者由来の試料中の少なくとも２つのバイオマーカーの発現を検出することを含み、ここで少なくとも２つの該バイオマーカーの過剰発現は陰性治療応答を示すものであり、そしてこれにより該治療への該乳癌患者の応答を予測する方法。
【請求項３７】
乳癌患者由来の試料中の少なくとも５つのバイオマーカーの発現を検出することを含む乳癌患者の生存の尤度を予測する方法であって、該バイオマーカーのいずれも過剰発現されないことは生存の増大した尤度を示し、そして該バイオマーカーの少なくとも２つが過剰発現されることが生存の低減した尤度を示す方法。
【請求項３８】
前記バイオマーカーの増大した数の過剰発現が生存の低減した尤度を示す、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記バイオマーカーがＳＬＰＩ、ｐ２１ｒａｓ、ＭＵＣ−１、ＤＡＲＰＰ−３２、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ２７、ｓｒｃ、ＭＧＣ１４８３２、ｍｙｃ、ＴＧＦβ−３、ＳＥＲＨＬ、Ｅ２Ｆ１、ＰＤＧＦＲα、ＮＤＲＧ−１、ＭＣＭ２、ＰＳＭＢ９及びＭＣＭ６よりなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は乳癌、特に早期乳癌に罹患した患者の予後を評価するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
乳癌は米国女性で第２番目に一般的な癌であり、皮膚癌にのみ頻度で劣っている。米国女性が生涯で乳癌を発症する確率は８分の１であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙによれば、本年は合衆国において２５０，０００超の乳癌新規症例が報告されると推定されている。乳癌は女性における死因の第２番目であり、２００４年には米国人４０，０００人超が疾患により死亡すると推定される。
【０００３】
向上した検出方法、集団検査及び過去１０年に渡る治療方法の進展は乳癌と診断された女性の前途を有意に改善している。今日では約８０％の乳癌患者が、生存率がその最高値となる疾患の早期の段階において診断されている。その結果、乳癌患者の約８５％が診断後少なくとも５年間生存している。
【０００４】
これらの進歩にも関わらず、早期乳癌と診断された女性の約２０％が不良な１０年転帰を示しており、そして、この期間内に疾患の再発、転移又は死亡に至ることになる。しかしながら、早期で診断された乳癌患者の残余８０％は良好な１０年予後を示し、そして追加的な積極的副次的療法（例えば化学療法）を必要又はそれから利益を被ることがないと考えられる。現在の臨床的合意事項は少なくとも一部の早期の節陰性の乳癌患者は副次的化学療法を受けなければならないが、現時点ではより積極的な治療に関して患者をリスク層別するための広範に使用されている試験は存在しない。これらの早期の癌患者の大部分は更に治療を行うことなく手術及び／又は放射線療法後の長期の生存が可能であるため、これらの患者の全てに対して積極的な副次的療法を推奨することは、特に癌の化学療法に伴う多大な副作用を鑑みれば、不適切であると考えられる。初回診断の時点において早期の乳癌患者の集団の良好及び予後不良群への識別分類を可能にする組成物及び方法は臨床担当者が適切な治療過程を選択することを支援するものである。即ち、乳癌患者、特に早期の乳癌患者の予後を評価するための方法が必要とされている。
【０００５】
乳癌予後の検査及び治療応答の予測のための方法及び要因を発見することに多くの研究が着目している。（一般的には全て参照により全体が本明細書に組み込まれる、非特許文献１）及びその引用文献を参照できる）。予後インジケーターはより多くの従来の要因、例えば腫瘍の大きさ、節の状態及び組織学的な等級、並びに予後及びおそらくは特定の治療に対する応答に関する一部の情報を提供する分子マーカーを包含する。例えば、エストロゲン（ＥＲ）及びプロゲステロン（ＰＲ）ステロイドホルモン受容体の状態の測定は乳癌患者の検査において日常的な操作法となっている。例えば非特許文献２を参照できる。ホルモン受容体陽性である腫瘍はホルモン療法により応答性があると考えられ、そして又典型的には増殖の攻撃性は低く、従って、ＥＲ＋／ＰＲ＋腫瘍患者に対しては予後良好がもたらされる。
【０００６】
ヒト表皮成長因子受容体２（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ）、即ち膜貫通チロシンキナーゼ受容体タンパク質の過剰発現は不良な乳癌予後に相関付けられている。非特許文献３。乳房腫瘍におけるＨｅＲ−２／ｎｅｕの発現水準は現在抗ＨｅＲ−２／ｎｅｕ抗体治療薬トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）への応答を予測するために使用されている。例えば同上及び非特許文献３を参照できる。更に又、乳癌のほぼ３分の１が腫瘍サプレッサー遺伝子ｐ５３における突然変異を有しており、そしてこれらの突然変異は増大した疾患の攻撃性及び予後不良的結果に関連付けられている。非特許文献２。Ｋｉ−６７は細胞周期のＧ期からＭ期の間に発現される非ヒストン核タンパク質である。研究によれば細胞増殖マーカーＫｉ−６７の過剰発現もまた不良な乳癌予後に相関付けられている。同上。
【非特許文献１】ＲｏｓｓおよびＨｏｒｔｏｂａｇｙｉ，編，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ
【非特許文献２】Ｆｉｔｚｇｉｂｂｏｎｓら，Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．，２０００年，第１２４巻，ｐ．９６６−９７８
【非特許文献３】Ｒｏｓｓら，Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ，２００３年，ｐ．３０７−３２５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現在の予後の基準及び分子マーカーは患者の転帰を予測し、そして治療の適切な過程を選択するに当たっては何らかの指針を与えるものであるが、特に早期のリンパ節陰性患者において乳癌の予後を評価するための特異的で感度の良い方法の必要性は多大である。このような方法は予後不良を有する乳癌患者を予後良好を有するものから特定的に識別し、そして積極的な副次的療法を必要としていると考えられる高リスクの早期乳癌患者の発見を可能にするものでなければならない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
癌患者、特に乳癌患者の予後を評価するための方法及び組成物を提供する。方法は身体試料中のバイオマーカーの少なくとも１つ、特に少なくとも２つの発現を検出することを含み、ここでバイオマーカー又はバイオマーカーの組み合わせの過剰発現は乳癌の予後を示すものである。本発明のバイオマーカー又はバイオマーカーの組み合わせの過剰発現は予後良好（即ち疾患のない生存）又は予後不良（即ち癌の再発、転移又は伏在癌による死亡）のいずれかを示すものである。即ち、本発明の方法は予後良好を有する乳癌患者の予後不良のものとの差別化を可能にする。本明細書に開示する方法は従来の臨床要因（例えば腫瘍の大きさ、腫瘍の等級、リンパ節の状態及び家族の病歴）の検査及び／又はＨｅＲ−２／ｎｅｕ、Ｋｉ６７、ｐ５３及びエストロゲン及びプロゲステロンホルモン受容体のような分子マーカーの発現水準の分析と組み合わせて使用してよい。この態様に置いて、本発明の方法は乳癌の予後のより正確な評価を可能にする。
【０００９】
本発明のバイオマーカーは、細胞周期の調節、ＤＮＡ複製、転写、シグナル伝達、細胞増殖、侵襲又は転移に関与しているバイオマーカーを包含する、その過剰発現が癌の予後を示すタンパク質及び／又は遺伝子である。本発明のバイオマーカー遺伝子又はタンパク質の過剰発現の検出は癌予後の評価を可能にし、そして、例えば治療法選択の目的のための、乳癌患者の良好及び予後不良リスク群への分割を容易にする。
【００１０】
バイオマーカーの発現はタンパク質又は核酸のレベルにおいて検査することができる。一部の実施形態においては、乳房腫瘍試料中のバイオマーカータンパク質の発現を検出するための抗体を利用した免疫組織化学的手法が提供される。本発明のこの態様において、目的とされる特定のバイオマーカーに指向させた抗体少なくとも１つを使用する。発現はまた核酸系の手法、例えばハイブリダイゼーション及びＲＴ−ＰＣＲにより検出することもできる。
【００１１】
組成物は本発明のバイオマーカータンパク質に結合することができるモノクローナル抗体を包含する。これらのモノクローナル抗体の抗原結合フラグメント又は改変体、これらの抗体を生産するハイブリドーマ細胞系統、及びこれらのモノクローナル抗体のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子も本発明において包含される。本発明の方法を実施するための試薬を含むキットも更に提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本発明は癌患者、特に乳癌患者、とりわけ早期の乳癌患者の予後を評価するための方法及び組成物を提供する。方法は患者組織又は体液試料中のバイオマーカーの発現を検出すること、及び、該バイオマーカーが過剰発現されているかどうか測定することを含む。本発明の実施において使用されるバイオマーカー又はバイオマーカーの組み合わせの過剰発現は乳癌の予後を示す（即ち不良又は予後良好）。即ち、目的とされる特定のバイオマーカー又はバイオマーカーの組み合わせの過剰発現は疾患の再発を経験すると考えられる（即ち予後不良の）乳癌患者の癌非存在で存続する尤度が高い（即ち予後良好の）患者から差別化できるようにする。本発明の一部の態様においては、方法は不良な乳癌予後を示す乳房腫瘍試料中のバイオマーカー少なくとも１つの過剰発現を検出すること、そしてそれにより、伏在癌の再発に罹患する尤度がより高い患者を発見することを包含する。本発明の方法はまた治療の適切な過程を選択する場合の支援となるために、そして、より積極的な治療から利益を被る患者を発見するためにも使用できる。特定の実施形態においては、抗体及び免疫組織化学的手法を用いて目的のバイオマーカーの発現を検出し、そして乳癌患者の予後を評価する。目的とされるバイオマーカーに対して特異的なモノクローナル抗体及び本発明の方法を実施するためのキットも更に提供される。
【００１３】
「乳癌」とは、例えば生検により悪性の病態に分類された状態を意図する。乳癌の診断の臨床的解説は医学分野でよく知られている。当業者の知る通り、乳癌は例えば癌腫又は肉腫を包含する乳房組織のいずれかの悪性疾患を指す。特定の実施形態においては、乳癌は非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ）又は粘液性癌腫である。乳癌は又浸潤性の腺管（ＩＤＣ）又は浸潤性の小葉癌（ＩＬＣ）である。本発明の大部分の実施形態においては、目的とされる対象は乳癌と疑われているか、又は実際に診断されたヒト患者である。
【００１４】
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ（ＡＪＣＣ）は「ＴＮＭ」分類スキームを用いた乳癌の病期分類のための標準化された系統を開発している。患者は原発腫瘍の大きさ（Ｔ）、局所的なリンパ節の状態（Ｎ）及び遠位の転移の存在／非存在（Ｍ）に関して検査され、そして次に要因のこの組み合わせに基づいて０期〜ＩＶ期に分類される。この系統においては、原発腫瘍の大きさは０〜４の尺度に分類される（Ｔ０＝原発腫瘍の証拠なし；Ｔ１≦２ｃｍ；Ｔ２≧２ｃｍ〜≦５ｃｍ；Ｔ３≧５ｃｍ；Ｔ４＝胸壁又は皮膚にまで直接拡張しているいずれかの大きさの腫瘍）。リンパ節の状態はＮ０〜Ｎ３に分類される（Ｎ０＝局所的なリンパ節は無転移である；Ｎ１＝可動の同じ側の腋窩リンパ節への転移；Ｎ２＝相互に、又は他の構造物に固定された同じ側のリンパ節への転移；Ｎ３＝胸骨下部の同じ側のリンパ節への転移）。転移は遠隔転移の非存在（Ｍ０）又は存在（Ｍ１）により分類する。いずれの臨床段階にある乳癌患者も本発明に包含されるが、早期乳癌の乳癌患者が特に目的となる。「早期乳癌」とは、０期（上皮内乳癌）、Ｉ（Ｔ１、Ｎ０、Ｍ０）、ＩＩＡ（Ｔ０−１、Ｎ１、Ｍ０又はＴ２、Ｎ０、Ｍ０）及びＩＩＢ（Ｔ２、Ｎ１、Ｍ０又はＴ３、Ｎ０、Ｍ０）を意図している。早期の乳癌患者はリンパ節の関与は僅かであるか、全くない。本明細書においては、「リンパ節の関与」又は「リンパ節の状態」とは癌がリンパ節に転移しているかどうかを指す。乳癌患者はこれに基づいて「リンパ節陽性」又は「リンパ節陰性」と分類される。乳癌患者を発見して疾患の病期分類を行うための方法は良く知られており、そして手操作による試験、生検、患者及び／又は家族の病歴の検討、及び画像化手法、例えばマンモグラフィー、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）及び陽電子射出断層画像化（ＰＥＴ）を包含してよい。
【００１５】
「予後」という用語は当該分野で知られており、そして、特に疾患の緩解、疾患の回帰、腫瘍の再発、転移及び死亡に関して、疾患の考えられる経過又は疾患の進行について予測することを包含する。「予後良好」とは癌、特に乳癌に罹患した患者が無疾患（即ち癌非存在）の状態で存続する尤度を指す。「予後不良」とは伏在する癌又は腫瘍の回帰又は再発、転移又は死亡の尤度を意味する。「良好な転帰」を有するものとして分類された癌患者は伏在する癌又は腫瘍の非存在下に存続する。一方「不良な転帰」の癌患者は疾患の回帰、腫瘍の再発、転移又は死亡を経験する。特定の実施形態においては、予後及び転帰を検査する時間枠は例えば１年未満、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０又はそれより長期である。本明細書においては、予後又は無疾患の生存時間を検査するための該当する時間は腫瘍の外科的除去、又は、腫瘍生育の抑止、軽減又は抑制と共に開始する。即ち、例えば特定の実施形態においては、「予後良好」とは、少なくとも５年、特に少なくとも１０年の期間、伏在癌又は腫瘍を伴うことなく乳癌患者が存続する尤度を指す。本発明の別の態様においては、「予後不良」とは、少なくとも５年、特に少なくとも１０年未満内に疾患の回帰、腫瘍の再発、転移又は死亡を乳癌患者が経験する尤度を指す。上記した予後及び転帰を検査するための時間枠は例示であり、これに限定されない。
【００１６】
本明細書に記載した一部の実施形態においては、バイオマーカー及び／又は他の臨床パラメーターの予後判定性能はＣｏｘ  Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  Ｈａｚａｒｄｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓを利用して検査しており、これはハザード比の推定及びその信頼区間を与える生存データに関する回帰法である。Ｃｏｘモデルは患者の生存と特定の変数との間の関係を探索するための充分認知された統計学的手法である。この統計学的方法は診断変数（例えば本明細書に記載する特定のバイオマーカーの過剰発現）があれば個体の危険度（即ちリスク）の推定を可能にする、Ｃｏｘモデルデータは一般的にはＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線として提示される。「ハザード比」は特定の予後変数を示す患者に対するいずれかの時点における死亡の危険性である。一般的には、Ｓｐｒｕａｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ＆Ｃｈｅｍｏ．４８：２７８７−２７９２を参照できる。特定の実施形態においては、目的のバイオマーカーは伏在乳癌による乳癌の再発又は死亡の尤度の評価について統計学的に有意である。統計学的有意を検査するための方法は当該分野でよく知られており、例えばｌｏｇ−ｒａｎｋ試験Ｃｏｘ分析及びＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線の使用を包含する。本発明の一部の態様においては、０．０５未満のｐ値が統計学的に有意である。
【００１７】
上記した通り、多くの臨床及び予後の乳癌の要因が当該分野で知られており、そして治療の転帰及び疾患再発の尤度を予測するために使用されている。このような要因はリンパ節の関与、腫瘍の大きさ、組織学的等級、家族の病歴、エストロゲン及びプロゲステロンホルモン受容体の状態、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ濃度、及び腫瘍の倍数性を包含する。本明細書においては、エストロゲン及びプロゲステロンホルモン受容体の状態とは、これらの受容体が特定の乳癌患者の乳房腫瘍において発現されるかどうかを指す。即ち、「エストロゲン受容体陽性患者」は乳房腫瘍におけるエストロゲン受容体の発現を示すが、「エストロゲン受容体陰性患者」は示さない。本発明の方法を用いれば、乳癌患者の予後は、これら又は他の臨床及び予後の要因の検査とは独立して、又はこれと組み合わせて、測定できる。一部の実施形態においては、本明細書に開示した方法と他の診断要因の評価を組み合わせることにより、乳癌予後のより正確な測定が可能になる。本発明の方法は例えばＨｅＲ−２／ｎｅｕ、Ｋｉ６７及び／又はｐ５３の分析と組み合わせてよい。他の要因、例えば患者の臨床病歴、家族の病歴及び閉経状態もまた、本発明の方法を介して乳癌の予後を評価する場合に考慮してよい。一部の実施形態においては、本明細書に開示した方法を介して得られた患者のデータを臨床情報の分析及び乳癌予後に関する既存の試験と組み合わせることにより比較対照の研究用の予後アルゴリズムを開発してよい。そのようなアルゴリズムは乳癌患者、特に早期の乳癌患者を予後良好及び予後不良集団に層別する場合に有用である。予後不良を有すると判断された患者はより積極的な乳癌治療に対するより高等級としてよい。
【００１８】
本発明の方法は他の既知の予後インジケーター（例えばリンパ節の関与、腫瘍の大きさ、組織学的等級、エストロゲン及びプロゲステロン受容体の濃度、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの状態、腫瘍の倍数性及び家族の病歴）の分析と比較して乳癌の予後の優れた検査を可能にする。本発明の特定の態様においては、感度及び特異性は、既知の癌の予後評価方法のものと同等以上である。特異性及び感度を検査する場合の評価項目は本発明の方法を用いて予測された予後又は転帰（即ち診断時又はその近傍における）を実際の臨床転帰（即ち患者が癌非存在で存続し続けているか、で特定の時間内に再発したか）と比較することである。本明細書においては、「特異性」とは本発明の方法が真の陰性を正確に発見できる水準を指す。臨床試験においては、特異性は真の陰性の数を真の陰性と擬陽性の総和で割ることにより計算される。「感度」とは、本発明の方法が真の陽性である試料を正確に発見できる水準を意図している。感度は真の陽性の数を真の陽性と擬陰性の総和で割ることにより臨床試験において計算される。一部の実施形態においては、乳癌の評価に関する開示した方法の感度は、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上である。更に又本発明の方法の特異性は好ましくは少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上である。別の実施形態においては、本発明の予後方法のための組み合わせた感度及び特異性の値を検査する。「組み合わせた感度及び特異性の値」とは、上記定義した個体の特異性及び感度の値の総和を意図している。本発明の方法の組み合わせた感度及び特異性の値は好ましくは少なくとも約１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％以上である。
【００１９】
本明細書においては、「真」及び「擬」陽性及び陰性の定義は検討中のバイオマーカー又はバイオマーカーの組み合わせが良好な転帰又は不良な転帰のバイオマーカーのいずれであるかにより異なる。即ち、良好な転帰のバイオマーカー（即ち予後良好を示すもの）の場合は、「真の陽性」とは、確認された良好な実際の臨床転帰を有する、本発明の方法（例えば免疫組織化学による陽性染色）により測定した場合に、目的のバイオマーカーの過剰発現を示す試料を指す。一方、「擬陽性」は良好な転帰のバイオマーカーの過剰発現を示すが、確認された不良な実際の臨床転帰を有する。良好な転帰のバイオマーカーに関する「真の陰性」及び「擬陰性」はバイオマーカーの過剰発現を示さず（例えば免疫組織化学的方法により陽性染色されない）、そして、それぞれ確認された不良及び良好な実際の臨床転帰を有する。
【００２０】
同様に、不良な転帰のバイオマーカーの場合は、「真の陽性」とは確認された不良な実際の臨床転帰を有する、目的のバイオマーカー又はバイオマーカーの組み合わせの過剰発現を示している試料を指す。即ち、良好及び不良の転帰のバイオマーカーの両方に関して「真の陽性」とは、実際の臨床転帰（即ち良好又は不良）が正しく予測されている試料を指す。「擬陽性」は不良の転帰のバイオマーカーの過剰発現を示すが、確認された良好な実際の臨床転帰を有する。不良な転帰のバイオマーカーに関する「真の陰性」及び「擬陰性」はバイオマーカーの過剰発現を示さず、そして、それぞれ確認された良好及び不良な実際の臨床転帰を有する。
【００２１】
乳癌は例えば手術、放射線療法、ホルモン療法、化学療法又はこれらの何らかの組み合わせを包含してよい数種の代替戦略により管理される。当該分野で知られている通り、個々の乳癌患者に対する治療の決定は関与するリンパ節の数、エストロゲン及びプロゲステロン受容体の状態、原発腫瘍の大きさ及び診断時の疾患の病期に基づくことができる。種々の臨床要因及び臨床試験の分析はＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｐａｎｅｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔ．Ｇａｌｌｅｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ（２００１）により早期乳癌のための推奨事項及び治療指針の開発をもたらしている。参照により全体が本明細書に組み込まれるＧｏｌｄｈｉｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９：３８１７−３８２７を参照できる。ガイドラインは節陰性乳癌を有する患者の治療は、ベースライン予後に実質的に従って変動することを示している。より積極的な治療は、再発が比較的低リスクの患者と比較して再発が比較的高リスクの患者に対して推奨される。高リスク集団に対する化学療法は回帰の危険性を低減さえることが示されている。低リスクの分類の女性は通常は放射線及びホルモン療法により治療される。本明細書に開示した方法を用いて診断時に予後不良又は予後良好の危険性のグループに患者を層別することは、追加的又は代替となる治療意思決定要因を与える。本発明の方法は予後良好を有する乳癌患者を再発の可能性がより高いもの（即ち診断時において別の積極的治療が必要か、それにより利益を被ると考えられる患者）から差別化できるようにする。本発明の方法は早期の乳癌患者に対する適切な治療法を選択する場合に特に有用である。上記した通り、疾患の早期において診断された乳癌患者の大部分は手術及び／又は放射線療法の後、更に副次的治療を行うことなく長期生存を享受している。しかしながらこれらの患者のかなり（約２０％）が疾患の再発又は死亡にいたることになり、早期乳癌患者の一部又は全てが副次的治療（例えば化学療法）を受けるべきであるという臨床的推奨事項がもたらされる。本発明の方法は早期の乳癌患者のこの高リスク予後不良集団を発見する場合に有用であり、そしてこれによりどの患者が継続的及び／又はより積極的な治療及び治療後の緊密なモニタリングから利益を被るかを決定することができる。例えば、本明細書に開示した方法により予後不良を有すると判断された早期の乳癌患者は、手術及び／又は放射線療法の後に、化学療法のようなより積極的な副次的療法向けに選択してよい。特定の実施形態においては、本発明の方法はＳｔ．Ｇａｌｌｅｎｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅにより確立された治療指針と組み合わせて使用してよく、これにより、医師はより多い情報に基づく乳癌治療の決定を行うことができる。乳癌予後を評価するための本発明の方法はまた、適切な乳癌治療法を選択する目的のために当該分野で知られた他の予後方法及び分子マーカー分析（ＨｅＲ−２／ｎｅｕ、Ｋｉ６７及びｐ５３の発現水準）と組み合わせることができる。更に又、本発明の方法は当該分野で現在知られていない後期発症の予後方法及び分子マーカーの分析と組み合わせることもできる。
【００２２】
本明細書に開示した方法は選択された治療に対する乳癌患者の応答を予測する場合に有用である。「選択された治療に対する乳癌患者の応答を予測する」とは特定の治療を用いた場合に患者が陽性又は陰性の転帰を経験することになる尤度を判断することを意図している。本明細書においては、「陽性治療転帰を示す」とは、患者が選択された治療から有益な結果を経験する（例えば完全又は部分的緩解、低減した腫瘍の大きさ等）尤度が増大していることを指す。「陰性治療転帰を示す」とは、伏在乳癌の進行に関して患者が選択された治療から利益を被らない尤度が増大していることを指す。本発明の一部の態様においては選択された治療とは化学療法である。
【００２３】
一部の実施形態においては乳癌患者の生存の尤度を予測するための方法が提供される。特に方法は長期の無疾患の生存の尤度を予測するために使用してよい。「乳癌患者の生存の尤度を予測する」とは、伏在する乳癌の結果として患者が死亡することになる危険性を判断することを意図している。「長期の無疾患の生存」とは初回の診断又は治療の後、少なくとも５年、特に１０年以上の期間内に伏在乳癌の再発により患者が死亡しないか、それに罹患しないことを意味することを意図している。乳癌患者の生存の尤度を予測するためのこのような方法は、患者試料中の複数のバイオマーカーの発現を検出することを含み、ここで生存、特に長期の無疾患の生存の尤度は、患者試料中に過剰発現していることが測定されたバイオマーカーの数が増大するに従って低下する。例えば、本発明の１つの態様において、少なくとも５つのバイオマーカーの発現を測定し、ここで、バイオマーカーのいずれも過剰発現していないことは生存の増大した尤度を示し、そして２つ以上のバイオマーカーの過剰発現は生存の低下した尤度を示す。生存の尤度は、例えば当該分野で入手可能な乳癌生存統計と比較することにより判断してよい。別の実施形態においては、乳癌患者の生存の尤度を予測するための方法は、少なくとも６つのバイオマーカーの発現を測定すること、及び、過剰発現されているこれらのバイオマーカーの数を検査することを含む。これらの方法のために有用なバイオマーカーは、例えばＥ２Ｆ１、ＳＬＰＩ、ＭＵＣ−１、ｓｒｃ、ｐ２１ｒａｓ及びＰＳＭＢ９から選択してよい。一般的に実施例８及び９を参照できる。
【００２４】
本発明のバイオマーカーは遺伝子及びタンパク質を包含する。このようなバイオマーカーはバイオマーカーをコードする核酸配列の全体又は部分的な配列又はそのような配列の相補体を含むＤＮＡを包含する。バイオマーカー核酸は又目的の核酸配列のいずれかの全体又は部分的な配列を含むＲＮＡを包含する。バイオマーカータンパク質は本発明のＤＮＡバイオマーカーによりコードされるか、それに相当するタンパク質である。バイオマーカータンパク質はバイオマーカータンパク質又はポリペプチドのいずれかの全体又は部分的なアミノ酸配列を含む。バイオマーカー遺伝子及びタンパク質のフラグメント又は改変体もまた本発明により包含される。「フラグメント」とは、ポリヌクレオチドの一部又はアミノ酸配列の一部、そして従って、それによりコードされるタンパク質を意図している。バイオマーカーヌクレオチド配列のフラグメントであるポリヌクレオチドは一般的に少なくとも１０、１５、２０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００又は１４００の連続ヌクレオチド、又は、本明細書に開示した完全長バイオマーカーポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチド数までを含む。バイオマーカーポリヌクレオチドのフラグメントは一般的に少なくとも１５、２５、３０、５０、１００、１５０、２００又は２５０の連続アミノ酸、又は本発明の完全長バイオマーカータンパク質中に存在するアミノ酸の総数までをコードする。「改変体」とは実質的に同様の配列を意味することを意図している。一般的に本発明の特定のバイオマーカーの改変体は配列アライメントプログラムにより測定した場合そのバイオマーカーに少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有することになる。
【００２５】
「バイオマーカー」とは組織又は細胞中のその発現水準が正常又は健常な細胞又は組織のものと比較して改変されているいずれかの遺伝子又はタンパク質である。本発明のバイオマーカーはその過剰発現が癌、特に乳癌の予後に相関する遺伝子及びタンパク質である。特定の実施形態において、患者試料中の目的のバイオマーカー又はバイオマーカーの組み合わせの選択的過剰発現は不良な癌の予後を示している。「予後不良を示す」とは、特定のバイオマーカー又はバイオマーカーの組み合わせの過剰発現が、上記定義した通り、伏在する癌又は腫瘍の回帰又は再発、転移又は死亡の増大した尤度と関連していることを意図している。例えば、「予後不良を示す」とは５年、特に１０年以内の、伏在する癌又は腫瘍の回帰又は再発、転移又は死亡の増大した尤度を指す。予後不良を示すバイオマーカーは本明細書においては「転帰不良バイオマーカー」と称してよい。本発明の別の態様において、目的のバイオマーカー又はバイオマーカーの組み合わせの過剰発現が不在であることは、予後良好を示している。本明細書においては、「予後良好を示す」とは、上記した通り患者が癌非存在状態で存続する増大した尤度を指す。一部の実施形態においては、「予後良好を示す」とは少なくとも５年、特に１０年間、患者が癌非存在状態で存続数する増大した尤度を指す。このようなバイオマーカーは「転帰良好バイオマーカー」と称してよい。
【００２６】
本発明のバイオマーカーは上記した通り乳癌予後に過剰発現が相関しているいずれかの遺伝子又はタンパク質を包含する。バイオマーカーは不良な乳癌予後を示す遺伝子及びタンパク質（即ち転帰不良バイオマーカー）並びに予後良好を示すもの（即ち転帰良好バイオマーカー）を包含する。特に有利なバイオマーカーは細胞の成育及び増殖の調節、細胞周期制御、ＤＮＡ複製及び転写、アポトーシス、シグナル伝達、血管形成／リンパ形成又は転移に関与する遺伝子及びタンパク質を包含する。一部の実施形態においては、バイオマーカーは組織リモデリング、細胞外マトリックス分解および隣接組織侵襲に関与するプロテアーゼ系を調節する。その過剰発現が乳癌予後を示すいずれのバイオマーカーも本発明を実施するために使用できるが、バイオマーカーはＳＬＰＩ、ｐ２１ｒａｓ、ＭＵＣ−１、ＤＡＲＰＰ−３２、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ２７、ｓｒｃ、ＭＧＣ１４８３２、ｍｙｃ、ＴＧＦβ−３、ＳＥＲＨＬ、Ｅ２Ｆ１、ＰＤＧＦＲα、ＮＤＲＧ−１、ＭＣＭ２、ＰＳＭＢ９、ＭＣＭ６及びｐ５３よりなる群から選択される。表４３を参照できる。１つの実施形態において、目的のバイオマーカーはＳＬＰＩ、ＰＳＭＢ９、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ２７、ｓｒｃ、Ｅ２Ｆ１、ｐ２１ｒａｓ又はｐ５３を含む。本発明の１つの態様において、乳癌予後を評価するための方法はＥ２Ｆ１及びＳＬＰＩの発現を検出することを含み、ここでこれらのバイオマーカーの少なくとも１つの過剰発現は予後不良を示している。別の実施形態においては、方法はＥ２Ｆ１、ｓｒｃ及びＳＬＰＩの発現を検出することを含み、ここでこれらのバイオマーカーの少なくとも２つの過剰発現は不良な乳癌の予後を示している。更に別の実施形態においては、本発明の方法はＥ２Ｆ１、ｓｒｃ、ＰＳＭＢ９及びＳＬＰＩの発現を検出することを含み、ここでこれらのバイオマーカーの少なくとも２つの過剰発現は不良な乳癌の予後を示している。本発明の他の態様において、Ｅ２Ｆ１、ＳＬＰＩ、ＰＳＭＢ９、ｐ２１ｒａｓ及びｓｒｃの発現が検出され、そして、これらのバイオマーカーの少なくとも２つの過剰発現が予後不良を示している。更に別の実施形態においては、方法は患者試料中のＳＬＰＩ、ｐ２１ｒａｓ、Ｅ２Ｆ１、ＰＳＭＢ９、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ２７及びｓｒｃの発現を検出することを含み、ここでこれらのバイオマーカーの少なくとも４つの過剰発現が予後不良を示している。
【００２７】
別の実施形態においては、目的のバイオマーカーはＥ２Ｆ１、ＳＬＰＩ、ＭＵＣ−１、ｓｒｃ，ｐ２１ｒａｓ及びＰＳＭＢ９を含む。本発明の１つの態様においては、乳癌予後を評価するための方法はＥ２Ｆ１及びＳＬＰＩの発現を検出することを含み、ここでこれらのバイオマーカーの少なくとも１つの過剰発現は予後不良を示している。別の実施形態においては、方法はＥ２Ｆ１、ＳＬＰＩ及びＰＳＭＢ９の発現を検出することを含み、ここでこれらのバイオマーカーの少なくとも２つの過剰発現は不良な乳癌の予後を示している。更に別の実施形態においては、本発明の方法はＥ２Ｆ１、ＳＬＰＩ、ＭＵＣ−１及びｓｒｃの発現を検出することを含み、ここでこれらのバイオマーカーの少なくとも２つの過剰発現は不良な乳癌の予後を示している。本発明の１つの態様においては、Ｅ２Ｆ１、ＳＬＰＩ、ＭＵＣ−１、ｓｒｃ及びｐ２１ｒａｓの発現が検出され、そして、これらのバイオマーカーの少なくとも２つの過剰発現が予後不良を示している。更に別の実施形態においては、方法は患者試料中のＥ２Ｆ１、ＳＬＰＩ、ＭＵＣ−１、ｓｒｃ、ｐ２１ｒａｓ及びＰＳＭＢ９の発現を検出することを含み、ここでこれらのバイオマーカーの少なくとも４つの過剰発現が予後不良を示している。
【００２８】
分泌白血球プロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）は白血球エラスターゼ、トリプシン、キモトリプシン及びカテプシン（例えばカテプシンＧ）を包含する多くのプロテアーゼを不活性化できる非特異的阻害剤である。ＳＬＰＩは炎症及び組織修復に関連する炎症応答に関与していることが知られている。プロテアーゼ阻害剤は一般的に腫瘍の進行及び転移に対抗すると考えられている。しかしながら、腫瘍におけるセリンプロテアーゼ阻害剤（ＳＰＩ）の発現は癌患者の予後不良に関連する場合が多い。カテプシンＧは乳癌において過剰発現され、そして予後不良のインジケーターである。その阻害作用は内因性タンパク分解酵素による攻撃から上皮表面を保護することにより免疫応答に寄与している。ＳＬＰＩの遺伝子位置は２０ｑ１２であり、これは乳癌の染色体改変及び異数性に関係があると考えられている染色体領域である。
【００２９】
ＰＳＭＢ９は２０ＳコアベータサブユニットであるＴ１Ｂファミリーとしても知られているプロテアソームＢ型のファミリーのメンバーである。この遺伝子はＭＨＣ（主要組織適合性複合体）のクラスＩＩの領域に位置する。この遺伝子の発現はガンマインターフェロンにより誘導され、そしてこの遺伝子産物は免疫プロテアソーム中の触媒性サブユニット１（プロテアソームベータ６サブユニット）を置き換える。成熟サブユニットを形成するためにはタンパク分解性のプロセシングが必要である。
【００３０】
ＮＤＲＧ−１（Ｎ−Ｍｙｃ下流調節）は細胞の分化の間にアップレギュレートされ、胚細胞においてＮ−ｍｙｃ及びｃ−ｍｙｃによるレプレッサ作用に付され、そして数種の腫瘍細胞においてサプレッサ作用に付される。過剰発現は低酸素、及び血管形成を誘導するその後のシグナリングに関連する場合がある。低酸素は転写因子低酸素誘導因子１（ＨＩＦ−１）の蓄積を誘発し、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）及びＮＤＲＧ−１の場合のように低酸素誘導遺伝子の発現にいたる。ＮＤＲＧ−１は過剰発現されたｍＲＮＡとして一部の乳癌において観察される。ＮＤＲＧ−１はｃ−ｍｙｃ遺伝子に隣接する染色体８ｑ２４上に位置する。
【００３１】
ＭＵＣ１は乳腺及び一部の造血細胞を包含する大部分の分泌上皮上に発現される高度にＯ−グリコシル化された膜貫通タンパク質である。それは乳汁分泌中の乳腺において抱負に発現され、乳房癌腫及び転移の９０％超において過剰発現されている。正常な乳腺においては、腺上皮の先端表面において発現される。
【００３２】
ｐ２７は細胞周期の重要な調節物質であり、Ｇ１からＳ期への進行に関与している。これはＧ１期においてサイクリンＥ／ｃｄｋ２複合体と、そして、Ｄ型サイクリン−ｃｄｋ類とも特異的に相互作用する。ｐ２７はＣｄｋによりスレオニン１８７上でホスホリル化されることができる。スレオニン１８７におけるｐ２７のホスホリル化はまた細胞周期依存性であり、増殖中の細胞には存在するが、Ｇ１細胞には検出されない。ｐ２７分解の活性化は増殖中の細胞及び積極的ヒト癌腫の多くの型において観察される。ｐ２７の過剰発現はアポトーシスの抑制及び一部の化学療法剤への耐性をもたらす場合がある。
【００３３】
チロシンキナーゼのＳｒｃファミリー（Ｓｒｃ、Ｌｙｎ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ｌｃｋ、Ｂｌｋ、ＩＩｃｋ等を包含する）は真核細胞の成育及び分化の調節において重要である。Ｓｒｃの活性は逆の作用を有する２つの部位におけるチロシンホスホリル化により調節される。キナーゼドメインの活性化ループにおけるＴｙｒ４１６のホスホリル化は酵素をアップレギュレートする。ＣｓｋによるＣ末端テールにおけるＴｙｒ５２７のホスホリル化は酵素をより低活性とする。
【００３４】
Ｅ２Ｆ１はＧ１及びＳ期のサイクリンの両方、特にサイクリンＤ１の調節に関与している転写因子のファミリーである。これらのタンパク質は細胞周期調節のＲｂ経路及びＤＮＡ合成の制御に関わっている。細胞周期のＧ１期の間、Ｅ２Ｆ転写因子はＲｂ腫瘍サプレッサタンパク質と不活性複合体において結合している。細胞周期のＧ１／Ｓ境界の間、Ｒｂタンパク質は過剰ホスホリル化され、その抑制複合体からＥ２Ｆ転写因子を放出する。その後Ｅ２Ｆ転写因子が細胞周期のＳ期を担っている遺伝子に関する転写を活性化させ、主にＤＮＡ合成の開始及び有糸分裂の準備及びその後細胞分裂をもたらす。Ｅ２Ｆ１の過剰発現は恐らくはｐ１６関連転写物の誘導と組み合わせられたサイクリンＤ１依存性キナーゼ活性の阻害を介してアポトーシスの誘導をもたらすことがわかっている。更に又転写レベルにおけるＥ２Ｆ１の調節、Ｅ２Ｆ１タンパク質濃度もまたユビキチンプロテオソーム依存性分解経路により制御される。ユビキチン化はＲｂ及びＥ２Ｆ１複合体によりブロックされ、これが細胞周期の進行の様相を直接制御する。
【００３５】
ｐ２１ｒａｓはシグナル伝達に関与している原形質タンパク質の大きなグループのメンバーである。グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）はシグナル伝達に関与している真核細胞中に存在する原形質タンパク質の大きなグループを含む。大型ヘテロ３量体Ｇタンパク質及びより小型の単量体の２つの型がある。３つのｒａｓ癌遺伝子、Ｈ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓ及びＮ−ｒａｓはより小型の単量体Ｇタンパク質のメンバーであり、そしてそれぞれ染色体１１、１２及び１の上に位置している。それらはｐ２１と称される２１−ｋＤのタンパク質をコードしており、そして、１８８アミノ酸を含有する。ｐ２１ｒａｓタンパク質は正常な細胞の成育、プロテアーゼ活性及び細胞接着に関与している。
【００３６】
総括するとｐ２１ｒａｓの３つの型はリガンド媒介細胞外受容体活性化を細胞内チロシンキナーゼ活性化に、そしてその後の乳癌進行に関連する多くの細胞過程、例えばＤＮＡ複製、増殖及びアンカリング非依存性の生育の開始と連結することにより機能している。Ｋ−及びＨ−ｒａｓ遺伝子は乳癌に最も頻繁に関与するとされている。これらのｒａｓ遺伝子の両方において、コドン１２及び１３における突然変異が共通している。これらの機能獲得性（ｇａｉｎ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）の突然変異はｒａｓシグナリング経路内の正常なリガンド誘導シグナル伝達を切断する構成的活性化をもたらす。乳癌で共通性が低いものはＮ−ｒａｓの関与である。２つの機序が乳癌におけるＮ−ｒａｓ関連の変化について報告されており：Ｋ−ｒａｓ及びＨ−ｒａｓについて上記記載した突然変異と同様の癌遺伝子の構成的活性化をもたらすコドン６１における突然変異および染色体増幅である。更に又、細胞内シグナリング経路の活性化に加えて、ｒａｓ癌遺伝子は組織のリモデリング及び侵襲に重要なプロテアーゼの過剰発現を誘導すると報告されている。Ｈ−ｒａｓはマトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）過剰発現に関連するとされており、そしてＮ−ｒａｓはＭＭＰ−９の過剰発現に関連している。一般的に全て参照により全体が本明細書に組み込まれるＣｏｒｒｅｌｌ  ａｎｄ  Ｚｏｌｌ（１９８８）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７９：２２５−２５９；Ｔｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：９０−９３；Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．１７：１６１−１６９；Ｄａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４７：８３３−８３８；Ａｒｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７２：１２５９−１２６６；Ｂｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２２１：７０６−７１８；Ｓｈａｃｋｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４：９１３−９２８；及びＧｏｈｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌ．２０：１７３−１８３を参照できる。ｐ２１ｒａｓタンパク質のいずれかの型（即ちＨ−、Ｋ−、Ｎ−ｒａｓ）の検出は本発明に包含される。
【００３７】
ミニ染色体維持（ＭＣＭ）タンパク質は真核細胞ＤＮＡ複製において必須の役割を果たしている。ＭＣＭタンパク質の各々はその高度に保存された中央ドメインにＤＮＡ依存性ＡＴＰａｓｅモチーフを有している。ＭＣＭタンパク質の濃度は一般的に正常細胞が細胞周期のＧ０からＧ１／Ｓ期に進行するに従って可変の態様において増大する。Ｇ０期においては、ＭＣＭ２及びＭＣＭ５タンパク質はＭＣＭ７及びＭＣＭ３タンパク質よりも遥かに少量である。ＭＣＭ６はＭＣＭ２、ＭＣＭ４及びＭＣＭ７と複合体を形成し、これらはヒストンＨ３に結合する。更に、ＭＣＭ４、ＭＣＭ６及びＭＣＭ７のサブ複合体はヘリカーゼ活性を有し、これはＭＣＭ６のＡＴＰ結合活性及びＭＣＭ４のＤＮＡ結合活性により媒介される。例えばすべて参照により全体が本明細書に組み込まれるＦｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５：２１２１−２１３２；Ｌｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１４：１４４７−１４５４；Ｉｓｈｉｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１０８９−１１０１を参照できる。
【００３８】
ＤＡＲＰＰ３３はＤＡＲＰＰ３２タンパク質内の特定のアミノ酸残基ホスホリル化を介して生物学的機能及び阻害活性がモジュレートされるタンパク質ホスファターゼ１の阻害剤である。スレオニン３４（Ｔ３４）ホスホリル化はＤＡＲＰＰ３２タンパク質を特定のタンパク質ホスファターゼ１阻害剤とする。しかしながらスレオニン７５（Ｔ７５）のホスホリル化はＤＡＲＰＰ３２をタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）の阻害剤とする。ＤＡＲＰＰ３２の遺伝子位置は１７ｑ２１．２であり、これは、１７ｑ１２のｈｅｒ２／ｎｅｕ（ｃ−ｅｒｂ−Ｂ２受容体チロシンキナーゼ）遺伝子に隣接することがわかっている。この領域は乳癌の染色体増幅及びその結果として生じる乳癌の２５〜３５％内の転帰不良に関与しているとされている。一部の文献は乳癌におけるこの１７ｑ１２−２１の特定の転写活性化を明らかにしており、このアンプリコン内に位置する多くの遺伝子が過剰発現されている。
【００３９】
ｐ５３は細胞において多重の役割を果たしている。野生型ではあるが突然変異体ではないｐ５３の高濃度の発現は、２つの転帰、即ち、細胞周期の停止又はアポトーシスを有する。ＤＮＡ損傷剤は細胞内のｐ５３の濃度を誘導するという観察は、恐らくはコウボにおけるｆａｄ９遺伝子の産物と同類のチェックポイント因子としてのｐ５３の定義をもたらした。生存性のためには必要ではないものの、遺伝子毒性のストレスに応答してｐ５３は「緊急ブレーキ」として機能し、停止又はアポトーシスのいずれかを誘導し、過剰な突然変異の蓄積からゲノムを保護する。この考えと合致して、ｐ５３を有さない細胞は遺伝子的に不安定であり、そしてこのため、より腫瘍になりやすい。ｐ５３タンパク質は細胞の核に位置し、そして極めて不安定である。ｐ５３は全てのヒトの腫瘍の概ね５０％において、主にＤＮＡ結合ドメインコドンにおいて、突然変異する。
【００４０】
上記バイオマーカーを詳細に考察したが、過剰発現が乳癌予後を示すいずれのバイオマーカーも本発明の実施のために使用することができ、それには当該分野でいまだ発見されていないバイオマーカーも包含する。このようなバイオマーカーは例えば細胞増殖、細胞周期の制御又は癌の運動性及び侵襲の全体的機序に関与する遺伝子及びタンパク質を包含する。伏在する目的のバイオマーカーはシクロオキシゲナーゼ２（ｃｏｘ２）、ｒｈｏＣ、ｃ−ｍｙｃ、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）、ウィルムス腫瘍抑制因子、ａｋｔキナーゼおよびオステオポンチンを包含する。例えば参照により全体が本明細書に組み込まれるＰｅｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：７４７−７５２；Ｓｏｒｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８：１０８６９−１０８７４；Ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：５３０−５３６；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｌａｎｃｅｔ  ３６１：１５９０−１５９６を参照できる。
【００４１】
特定の実施形態においては、バイオマーカーはシグナル伝達経路に関与しているキナーゼ、例えばＰ１３Ｋ調節ａ、ＬＴｋ、Ｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼ１５、ＭＡＰＫ８ＩＰＩ、ＭＡＰＫＡＰＫ２及びＰＫ４２８、ＰＲＫＲである。成長因子、細胞外シグナル伝達タンパク質及び細胞外マトリックスタンパク質もまた目的のバイオマーカーである。このようなタンパク質はＥＧＦＲ、ＴＮＦ受容体関連因子４、ＧＦＲ結合タンパク質７、ＥｒｂＢ２（ｈｅｒ２）、ＶＥＧＦ、ＧＤＦ１、ＩＧＦＢＰ５、ＥＧＦ８ｒａｓホモログ、ＭＭＰ９、ＭＭＰ７、ＳＬＰＩ、ケラチン５、ケラチン１７、ラミニンガンマ２（ラミニンＶ）、トロポニン及びチュブリンを包含する。
【００４２】
本発明の一部の態様においては、バイオマーカーは染色体縮合及び維持に関与する遺伝子及びタンパク質、例えばＣｒ関連、ＨＭＣ非ヒストン染色体１１、ＭＭＤ５、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６及びＳｗｉ／ｓｎｆ関連アクチンを含む。動原体及び中心体の機能に関連するバイオマーカー、例えばＣＥＮＰＡ、ＣＥＮＰＦ、ＣＥＮＰＥ、Ｂｕｂ１、ｐｏｌｏ様キナーゼ及びＨｓＥｇ５、ＭＣＡＫ及びＨＳＥＴもまた、本明細書に記載した方法において使用できる。本発明のバイオマーカーはまた転写因子、特に細胞周期の調節に関連するものも含んでよい。目的の転写因子は例えばＥ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ４、ＮＤＲＧ−１、ＯＲＣ６Ｌ、ＰＣＮＡ、核因子１、ＥＺＨ２及びＴＦＡＰ２Ａを包含する。サイクリン、例えばＣＤＣ２０、ＣＤＣ２５Ｂ、サイクリンＡ２，サイクリンＥ及びサイクリンＦもまた開示した方法の実施のために使用してよい。
【００４３】
本発明の方法は乳癌の予後を評価するために患者試料中の少なくとも１つ、特に少なくとも２つのバイオマーカーの検出を必要とするが、本発明を実施するために３、４、５、６、７、８、９、１０以上のバイオマーカーを使用してもよい。認識されている通り、身体試料中の１つより多いバイオマーカーの検出を用いて癌、特に乳癌の予後を評価してよい。従って、一部の実施形態においては、２つ以上のバイオマーカー、より好ましくは２つ以上の相補的なバイオマーカーを使用する。「相補的」とは、身体試料中のバイオマーカーの組み合わせの検出が１つのみのバイオマーカーを使用した場合に発見されるものよりもより高いパーセンテージの症例において癌予後の正確な決定がもたらされることを意図している。即ち、一部の場合において、癌予後のより性格な決定は少なくとも２つのバイオマーカーを用いて行うことができる。従って、少なくとも２つのバイオマーカータンパク質が使用される場合は、個別のバイオマーカータンパク質に指向された抗体少なくとも２つを用いて本明細書に開示した免疫組織化学的方法を実施することになる。抗体は身体試料に同時に又は順次接触させてよい。
【００４４】
バイオマーカー２つ以上の組み合わせを使用する場合は、バイオマーカーは典型的には実質的に統計学的に相互に独立している。「統計学的に独立した」バイオマーカーとは、１つのバイオマーカーが相補的バイオマーカーに関して実質的に反復する情報を提供しないように、自身より発生する予後が独立していることを意図している。これにより、例えばあるバイオマーカーを第１のバイオマーカーと組み合わせたて使用することは、２つが実質的に統計学的に独立していない場合には、確実に回避されるのである。２つのバイオマーカーの依存性は、それらが重複していること、そして、第２のバイオマーカーを追加することがある一対のバイオマーカーの診断力になんら追加的価値を付加しないことを示している。バイオマーカーのあるパネルの診断力を最適化するためには、パネル内の他のバイオマーカーと比較した場合に二重の予後情報を与えるバイオマーカーの使用を最小限にすることにより、シグナルの「ノイズ」の量を低減することも望ましい。統計学的な独立性を調べるための方法は当該分野で知られている。目的のバイオマーカーの統計学的独立性は、本明細書と同時に出願され、そして参照により全体が本明細書に組み込まれるＭｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓと題された米国特許出願＿に開示された方法を包含するいずれかの方法を用いて検査することができる。独立している予後バイオマーカーを用いて本発明の方法を実施する場合、バイオマーカー２、３、４、５、６、７以上の発現を検出することにより予後値が増大する。そのような場合、独立したバイオマーカーのいずれかの組み合わせを使用できる。
【００４５】
当業者の知る通り、バイオマーカーのパネルを用いて本発明の方法に従いながら乳癌患者の予後を評価することができる。一部の実施形態においては、ＳＬＰＩ、ｐ２１ｒａｓ、ＭＵＣ−１、ＤＡＲＰＰ−３２、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ２７、ｓｒｃ、ＭＧＣ１４８３２、ｍｙｃ、ＴＧＦβ−３、ＳＥＲＨＬ、Ｅ２Ｆ１、ＰＤＧＦＲα、ＮＤＲＧ−１、ＭＣＭ２、ＰＳＭＢ９、ＭＣＭ６及びｐ５３よりなる群から選択されるバイオマーカー少なくとも２つを含むパネルが提供される。１つの特定のバイオマーカーパネルは例えばＥ２Ｆ１、ＳＬＰＩ、ＭＵＣ−１、ｓｒｃ、ｐ２１ｒａｓ及びＰＳＭＢ９の全て又は部分集合を含んでよい。バイオマーカーパネルは目的のバイオマーカーのいずれかの数量又は組み合わせを含んでよい。本発明の特定の態様においては、パネルは少なくとも２つの統計学的に独立した予後バイオマーカーを含む。
【００４６】
特定の実施形態において、乳癌予後を評価するための方法は、患者の身体試料、好ましくは乳房組織試料、より好ましくは原発乳房腫瘍組織試料を採取すること、試料を目的のバイオマーカーに特異的な抗体少なくとも１つと接触させること、抗体の結合を検出すること、及びバイオマーカーが発現されているかどうかを調べること、を含む。即ち、試料をバイオマーカー抗体と共に、抗体−抗原複合体が形成されるのに充分な時間インキュベートし、そして、抗体の結合を、例えば標識された二次抗体により検出する。抗体結合で調べた場合に少なくとも１つの転帰不良バイオマーカーの過剰発現を示す試料は予後不良を有するものとして分類される。同様に、少なくとも１つの転帰良好バイオマーカーの過剰発現を示す患者試料は予後良好を有するものとして分類される。更に又、目的のバイオマーカーの特定の組み合わせの過剰発現を特別に使用することにより、予後不良の乳癌患者を予後良好のものと識別する。本発明の一部の態様においては、方法は患者試料中の２つ以上のバイオマーカーの発現を検出すること、及び、該バイオマーカーが過剰発現されているかどうかを調べることを含み、ここでこれらのバイオマーカーの全て又は一部の過剰発現は乳癌の予後を示す。例えば、１つの実施形態において、方法はＳＬＰＩ、ｐ２１ｒａｓ、Ｅ２Ｆ１、ＰＳＭＢ９、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ２１及びｓｒｃの発現を検出することを含み、ここでこれらのバイオマーカーの少なくとも４つの過剰発現は予後不良を示している。本発明の別の態様において、方法はＳＬＰＩ、Ｅ２Ｆ１及びｓｒｃの発現を検出することを含み、ここでこれらのバイオマーカーの少なくとも２つの過剰発現は予後不良を示している。別の実施形態において、方法はＥ２Ｆ１、ＳＬＰＩ、ＭＵＣ−１、ｓｒｃ、ｐ２１ｒａｓ及びＰＳＭＢ９の発現を検出することを含み、ここでこれらのバイオマーカーの少なくとも４つの過剰発現は予後不良を示している。本発明の別の態様において、方法はＳＬＰＩ、Ｅ２Ｆ１及びＭＵＣ−１の発現を検出することを含み、ここでこれらのバイオマーカーの少なくとも２つの過剰発現は予後不良を示している。
【００４７】
「身体試料」とは、バイオマーカーの発現を検出することができうる細胞、組織又は体液のいずれかの採取物を意図している。このような身体試料の例は血液、リンパ、尿、婦人科体液、生検試料及び塗沫物を包含する。本発明において有用な体液は血液、尿、唾液、乳首吸引物、又は、いずれかの他の身体性の分泌物又はその誘導体を包含する。血液は全血、血漿、血清又は血液のいずれかの誘導体を包含する。好ましい実施形態においては身体試料は乳房細胞、特に生検で得られた乳房組織、更に特定すれば乳房腫瘍組織試料を含む。身体試料は種々の手法、例えば領域を掻き取るかスワビングすることによるか、体液を吸引するために針を使用することによるか、又は組織試料を採取すること（即ち生検）により患者から得てよい。種々の身体試料を収集するための方法は当該分野でよく知られている。一部の実施形態においては、乳房組織試料は、例えばファインニードル吸引生検試料、コアニードル生検又は切除生検により得られる。標本を保存するため、及び、検査を容易にするために、固定及び染色用の溶液を細胞又は組織に適用してよい。身体試料、特に乳房組織試料は拡大して観察するためにスライドガラスに移してよい。好ましい実施形態においては、身体試料はホルマリン固定し、パラフィン包埋した乳房組織試料、特に原発乳房腫瘍試料である。
【００４８】
バイオマーカーの発現を検出するための当該分野で使用できるいずれの方法も本明細書に包含される。本発明のバイオマーカーの発現は核酸レベルで、又はタンパク質レベルで検出できる。「発現を検出する」とは、バイオマーカー遺伝子又はタンパク質の量又は存在を測定することを意図する。即ち、「発現を検出する」とは、バイオマーカーが発現されていない、検出可能に発現されていない、低濃度で発現されている、正常濃度で発現されている、又は過剰発現されていると測定される場合も包含する。過剰発現を測定するためには、検査すべき身体試料を健常者起源の相当する身体試料と比較してよい。即ち発現の「正常な」濃度とは、例えば、乳癌に罹患していないヒト対象又は患者に由来する乳房組織試料中のバイオマーカーの発現の濃度である。このような試料は標準化された形態で存在できる。一部の実施形態においては、バイオマーカーの過剰発現の測定は、身体試料と健常者起源の相当する身体試料の間の比較を必要としない。例えば、乳房腫瘍試料中の予後不良を示すバイオマーカーの過剰発現の検出は、健常者起源の相当する乳房組織試料との比較の必要性を排除する場合がある。更に又、本発明の一部の態様においては、目的のバイオマーカー又はバイオマーカーの組み合わせの無発現、過少発現又は正常発現（即ち過剰発現の非存在）が乳癌患者の予後に関する有用な情報を与える。
【００４９】
本発明のバイオマーカーの発現を検出するための方法は核酸又はタンパク質のいずれかのレベルでバイオマーカーの量又は存在を測定するいずれかの方法を含む。このような方法は当該分野でよく知られており、そして例えばウエスタンブロット、ノーザンブロット、サザンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、免疫蛍光、フローサイトメトリー、免疫組織化学、核酸ハイブリダイゼーション手法、核酸逆転写法、及び核酸増幅方法を包含するがこれらに限定されない。特定の実施形態においては、バイオマーカーの発現は例えば特定のバイオマーカータンパク質に対して指向された抗体を用いてタンパク質レベルで検出される。これらの抗体は種々の方法、例えばウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降又は免疫組織化学的手法において使用できる。同様に、乳房組織、特に乳房腫瘍組織の免疫染色を臨床データの検査、従来の予後方法、及び、当該分野で知られた分子マーカー（例えばＨｅｒ２／ｎｅｕ、Ｋｉ６７、ｐ５３及びホルモン受容体状態）と組み合わせることができる。この態様に置いては、開示された方法は乳癌予後のより正確な決定を可能にする。
【００５０】
１つの実施形態においてバイオマーカータンパク質に特異的な抗体を利用して身体試料中のバイオマーカータンパク質の発現を検出する。方法は患者から身体試料を得ること、ＳＬＰＩ、ｐ２１ｒａｓ、ＭＵＣ−１、ＤＡＲＰＰ−３２、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ２７、ｓｒｃ、ＭＧＣ１４８３２、ｍｙｃ、ＴＧＦβ−３、ＳＥＲＨＬ、Ｅ２Ｆ１、ＰＤＧＦＲα、ＮＤＲＧ−１、ＭＣＭ２、ＰＳＭＢ９又はＭＣＭ６に対して指向された抗体少なくとも１つに身体試料を接触させること、及び、結合抗体を検出することにより患者試料中でバイオマーカーが過剰発現されているかどうか調べることを含む。バイオマーカータンパク質の過剰発現は予後、特に不良乳癌予後を示す。他の実施形態においては、本発明の方法はバイオマーカー少なくとも２つの発現を検出することを含み、ここでバイオマーカー少なくとも１つの過剰発現は予後を示す。このような方法は患者試料中の複数のバイオマーカーの検出を含んでよく、ここで乳癌予後を示すものはこれらのバイオマーカーの全て又は部分集合である。
【００５１】
本発明の１つの態様は、乳癌患者の予後を評価するための免疫組織化学的手法を提供する。特に本方法は予後を示す乳房組織試料、特に乳房腫瘍試料内のバイオマーカーの抗体染色を含む。当業者の知るとおり、本明細書において後述する免疫組織化学的方法は手作業又は例えばＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄａｋｏ）を用いながら自動化された態様に置いて実施してよい。乳房組織試料の抗体染色（即ち免疫組織化学）のための１つのプロトコルは実施例１に示す。
【００５２】
１つの免疫組織化学的方法においては、患者の乳房組織試料を例えば当該分野で知られた生検手法により採取する。試料を後の試料調製のために凍結するか、又は、即座に固定化溶液中に入れる。組織試料はホルマリン、グルタルアルデヒド、メタノール等のような試薬で処理することにより固定化してよく、そしてパラフィン包埋する。ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料からの免疫組織化学的分析のためのスライドの調製方法は当該分野でよく知られている。
【００５３】
一部の実施形態、特に本発明の免疫組織化学的方法においては、抗体結合に使用することができるバイオマーカー抗原を作成するために試料を修飾することが必要となる場合がある。例えば、組織試料のホルマリン固定により抗原部位のマスキング又は破壊、及びその後の不良な抗体染色をもたらす可能性のあるタンパク質の広範な交差結合が起こる。本明細書においては、「抗原賦活」又は「抗原脱マスキング」とは、例えばホルマリン固定パラフィン包埋組織試料において抗原の使用し易さを増大させるか又は抗原性を回復するための方法を指す。当該分野で知られた抗原賦活法を包含する、抗体結合のために抗原をより使用し易くするためのいずれかの方法を本発明の実施において使用してよい。例えば、共に参照により全体が本明細書に組み込まれるＨａｎａｕｓｅｋ  ａｎｄ  Ｗａｌａｓｚｅｋ，  ｅｄｓ．（１９９８）Ｔｕｍｏｒ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）；及びＳｈｉ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（２０００）Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ（Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｎａｔｉｃｋ，  ＭＡ）を参照できる。
【００５４】
抗原賦活法は例えばタンパク分解酵素（例えばトリプシン、キモトリプシン、ペプシン、プロナーゼ等）又は抗原賦活溶液による処理を包含するがこれらに限定されない。目的の抗原賦活溶液は例えばクエン酸塩緩衝液、ｐＨ６．０（Ｄａｋｏ）、トリス緩衝液、ｐＨ９．５（Ｂｉｏｃａｒｅ）、ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０（Ｂｉｏｃａｒｅ）、ＬＡＢ（Ｌｉｂｅｒａｔｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗原賦活Ｇｌｙｃａ溶液（Ｂｉｏｇｅｎｅｘ）、クエン酸塩緩衝液、ｐＨ４．０（Ｚｙｍｅｄ）、Ｄａｗｎ（登録商標）洗剤（Ｐｒｏｃｔｏｒ＆Ｇａｍｂｌｅ）、脱イオン水、及び、２％氷酢酸を包含する。一部の実施形態においては、抗原賦活は抗原賦活溶液をホルマリン固定組織試料に適用すること、及び、次に、試料をオーブン（例えば６０℃）、スチーマー（例えば９５℃）又は圧力クッカー（例えば１２０℃）中で所定の温度において所定時間加熱することを含む。本発明の他の態様においては、抗原賦活は室温で実施してよい。インキュベーション時間は選択される特定の抗原賦活溶液により、そして、インキュベーション温度により変動する。例えば、抗原賦活溶液は僅か５分、１０分、２０分又は３０分、又は一夜にわたり、試料に適用してよい。適切な抗原賦活溶液及び最適なインキュベーションの時間及び温度を決定するための試験設計は標準的であり、当業者の日常的な許容範囲内である。
【００５５】
抗原賦活の後、試料は適切なブロッキング剤、例えば過酸化水素を用いてブロッキングする。次に目的のバイオマーカーに指向された抗体を、抗原−抗体結合を可能にするために充分な時間、試料と共にインキュベートする。上記した通り、場合により、患者試料中の１つより多いバイオマーカーの過剰発現を検出することによって更に正確な乳癌予後が達成されることは当業者の知る通りである。従って、特定の実施形態においては、２つの異なるバイオマーカーに指向された少なくとも２つの抗体を用いて乳癌患者の予後を評価する。１つより多い抗体を使用する場合は、これらの抗体は個々の抗体試薬として逐次的に、又は、抗体カクテルとして同時に、単一の試料に添加してよい。或いは、各個々の抗体を単一の患者試料に由来する別個の組織区分に添加し、そして得られるデータをプールしても良い。
【００５６】
抗体結合を検出するための手法は当該分野でよく知られている。目的のバイオマーカーへの抗体の結合は抗体結合の水準に相当する、従ってバイオマーカータンパク質発現の水準に相当する検出可能なシグナルを発生する化学薬品の使用を介して検出してよい。例えば、抗体の結合は標識された重合体にコンジュゲートする二次抗体の使用を介して検出することができる。標識された重合体の例は重合体−酵素コンジュゲートを包含する。これらの複合体における酵素は典型的には抗原−抗体結合部位における色素原の付着を触媒するために使用され、これにより目的のバイオマーカーの発現濃度に相当する細胞染色がもたらされる。特に有利な酵素はセイヨウワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）及びアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を包含する。市販の抗体検出システム、例えばＤａｋｏ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋システム及びＢｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ’ｓ  Ｍａｃｈ  ３システムを使用して本発明を実施してよい。
【００５７】
本発明の１つの免疫組織化学的方法において、バイオマーカーに結合している抗体は二次抗体にコンジュゲートしたＨＲＰ標識重合体の使用を介して検出される。スライドは色素原３，３−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を用いて抗体結合に関して染色し、次にヘマトキシリン、及び場合により水酸化アンモニウムのようなブルーイング剤を用いて逆染色する。本発明の一部の態様においては、スライドは、細胞染色（即ちバイオマーカー過剰発現）を検査するため、そして乳癌の予後を評価するために病理学者により顕微鏡的に観察される。或いは、試料は自動顕微鏡を介するか、又は、陽性染色細胞の発見を容易にするコンピューターソフトウエアの支援と共に担当者により観察されて良い。
【００５８】
「抗体」という用語は広範に天然に存在する型の抗体及び組み換え抗体、例えば１本鎖抗体、キメラ及びヒト化抗体、及び多重特異性抗体、並びに、上記全てのフラグメント及び誘導体を包含し、そのフラグメント及び誘導体は抗原結合部位を少なくとも有するものである。抗体誘導体は抗体にコンジュゲートしたタンパク質又は化学部分を含んでよい。
【００５９】
「抗体」および「免疫グロブリン」（Ｉｇｓ）は同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は抗原に対する結合特異性を示すが、免疫グロブリンは抗体及び抗原特異性を有さない他の抗体様分子の両方を包含する。後者のポリペプチドは、例えば、リンパ系により低濃度で、そして、骨髄腫細胞により高濃度で生産される。
【００６０】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、そして完全に組み立てられた抗体、抗原に結合できる抗体フラグメント（例えばＦａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、１本鎖抗体、ダイアボディー）及び上記を含む組み換えペプチドを網羅している。
【００６１】
「モノクローナル抗体」という用語は本明細書においては、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し、即ち、集団を含む個々の抗体は、少量において存在するかもしれない可能性のある天然に存在する突然変異を除いて、同一である。
【００６２】
「抗体フラグメント」は未損傷の抗体の部分、好ましくは未損傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２及びＦｖフラグメント；ダイアボディー；線状抗体（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２）；一本鎖抗体分子；及び抗体フラグメントから形成された多重特異性の抗体を包含する。抗体のパパイン消化により、各々が１つの抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」フラグメントと称される２つの同じ抗原結合フラグメント、及び名称が３５を容易に結晶化させる能力を反映している残余の「Ｆｃ」フラグメントが生成する。ペプシン処理により、２つの抗原複合化部位を有し、そしてなお抗原と交差結合することができるＦ（ａｂ’）２フラグメントが生成する。
【００６３】
「Ｆｖ」が完全な抗原認識結合部位を含有する最小の抗体フラグメントである。２本鎖Ｆｖ種においては、この領域は、堅固な非共有結合製の会合における１つの重鎖及び１つの軽鎖の可変ドメインの２量体よりなる。一本鎖のＦｖ種においては、１つの重鎖及び１つの軽鎖の可変ドメインは可撓性のペプチドリンカーにより共有結合されることができ、これにより、軽鎖及び重鎖は２本鎖Ｆｖ種の場合と類似した「２量体」構造において会合することができる。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ２量体の表面上の抗原結合部位を定義する場合がこの配置となる。総括すれば、６つのＣＤＲが抗体に対する抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に対して特異的なＣＤＲ３つのみを含むＦｖの半分）であっても、全結合部位よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
【００６４】
Ｆａｂフラグメントはまた軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂフラグメントは、抗体ヒンジ領域に由来するシステイン１つ以上を包含する重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における数個の残基の付加により、Ｆａｂ’フラグメントとは異なっている。Ｆａｂ’−ＳＨは本明細書においては定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を担持しているＦａｂ’の標記とする。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、当初は間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として形成された。
【００６５】
モノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９６の方法、又はその変法を用いながら製造できる。典型的にはマウスを抗原を含有する溶液で免疫化する。免疫化は食塩水中、好ましくはＦｒｅｕｎｄ完全アジュバントのようなアジュバント中で抗原含有溶液を混合又は乳化すること、及び、混合物又は乳液を非経腸注射することにより行うことができる。当該分野で知られた免疫化のいずれかの方法を用いて本発明のモノクローナル抗体を得てよい。動物の免疫化の後、脾臓（及び場合により幾つかの大型のリンパ節）を摘出し、単細胞にまで解離させる。目的の抗原をコーティングしたプレート又はウェルに細胞懸濁液を適用することにより脾細胞をスクリーニングして酔い。抗原に特異的な膜結合免疫グロブリン種を発現するＢ細胞はプレートに結合し、洗浄除去されない。得られたＢ細胞又は全解離脾細胞を次に骨髄腫細胞と融合するように誘導し、これによりハイブリドーマを形成し、選択培地中で培養する。得られた細胞を連続希釈法によりプレーティングし、目的の抗原に特異的に結合する（そして未関連の抗原には結合しない）抗体の生産に関して試験する。次に選択されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）分泌ハイブリドーマをインビトロ（例えば組織培養ビン又は中空糸反応器中）又はインビボ（マウス腹水）で培養する。
【００６６】
ハイブリドーマの使用の代替として、抗体は参照により本明細書に組み込まれる米国特許５，５４５，４０３；５，５４５，４０５；及び５，９９８，１４４に開示されているように、ＣＨＯ細胞系統のような細胞系統において生産することができる。慨すれば、細胞系統を、それぞれ軽鎖及び重鎖を発現することができるベクターでトランスフェクトする。別個のベクター上の２つのタンパク質をトランスフェクトすることにより、キメラ抗体が形成される。別の利点は抗体の正しいグリコシル化である。モノクローナル抗体はまた、バイオマーカータンパク質を用いた組み換え体のコンビナトリアルな免疫グロブリンライブラリをスクリーニングしてバイオマーカータンパク質に結合する免疫グロブリンライブラリメンバーを単離することにより、発見して単離することもできる。ファージディスプレイライブラリを作成してスクリーニングするためのキットは市販されている（例えばＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．２７−９４００−０１；及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ  ９  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｋｉｔ，  カタログ番号２４０６１２）。更に又、抗体ディスプレイライブラリの作成及びスクリーニングにおける使用に特に適している方法及び試薬の例は、例えば米国特許５，２２３，４０９；ＰＣＴ公開ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９１／１７２７１；ＷＯ９２／２０７９１；ＷＯ９２／１５６７９；９３／０１２８８；ＷＯ９２／０１０４７；９２／０９６９０；及び９０／０２８０９；Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４に記載されている。
【００６７】
ポリクローナル抗体は適当な対象（例えばウサギ、ヤギ、マウス又は他の哺乳類）をバイオマーカータンパク質免疫原で免疫化することにより作成できる。免疫化された対象における抗体力価は標準的な手法により、例えば固定化されたバイオマーカータンパク質を用いた酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）を用いて経時的にモニタリングできる。免疫化の後の適切な時間において、例えば抗体力価が最高値となった時点で、抗体生産細胞を対象から採取し、これを用いて標準的な手法、例えばＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  ＭＩｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７により最初に記載されたハイブリドーマ手法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ４：７２）、ＥＢＶハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５），  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ｅｄ．Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ａｎｄ  Ｓｅｌｌ（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ），ｐｐ．７７−９６）又はトリオーマ手法により、モノクローナル抗体を作成する。ハイブリドーマを作成するための技術は良く知られている（一般的にＣｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ）；Ｇａｌｆｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：５５０５２；Ｋｅｎｎｅｔｈ（１９８０）  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ  （Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，  ＮＹ；及びＬｅｒｎｅｒ（１９８１）Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，５４：３８７−４０２）を参照できる）。
【００６８】
本発明の組成物は更に、目的のバイオマーカータンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体及びその改変体及びフラグメントを含む。例えばＳＬＰＩ（指定クローン５Ｇ６．２４）、ＤＡＲＰＰ−３２（８Ｇ１１．２０）、ＭＧＣ１４８３２（１Ｆ３．９及び２Ｄ１．１４）、ＮＤＲＧ−１（１０Ａ９．３４）、ＰＳＭＢ９（３Ａ２．４）及びＭＵＣ−１（１６Ｅ３．３）に特異的なモノクローナル抗体が提供される。モノクローナル抗体は後述するような検出可能な物質で標識することにより試料中のバイオマーカータンパク質検出を用意にしてよい。このような抗体は本発明の方法を実施する場合に有用である。本明細書に開示した抗体の結合特性を有するモノクローナル抗体もまた本発明に包含される。組成物は更に、モノクローナル抗体の抗原結合改変体及びフラグメント、これらの抗体を生産するハイブリドーマ細胞系統及びこれらのモノクローナル抗体のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子を含む。
【００６９】
本発明のモノクローナル抗体の結合特性を有する抗体も提供される。抗体に言及して使用される場合の「結合特性」又は「結合特異性」とは、抗体が比較抗体と同じか同様の抗原性エピトープを認識することを意味する。このような抗体の例は、例えば、競合的結合試験において本発明のモノクローナル抗体と競合する抗体を包含する。当業者であれば標準的な方法を用いて、抗体が別の抗体を競合的に妨害するかどうかを調べることができる。
【００７０】
「エピトープ」とは、それに対して抗体が作成され、そして抗体がそれに結合するような、抗原性分子の部分を意図する。エピトープは線状アミノ酸残基（即ちエピトープ内の残基が線状に相互に逐次的に配置されている）、非線状アミノ酸残基（本明細書においては「非線状エピトープ」と称し；これらのエピトープは逐次的には配置されていない）、又は線状及び非線状の両方のアミノ酸残基を含むことができる。典型的にはエピトープは短いアミノ酸配列、例えば約５アミノ酸長のものである。エピトープを発見するための系統的手法は当該分野で知られており、例えば米国特許４，７０８，８７１に記載されている。慨すれば、抗原から誘導された重複するオリゴペプチドのセットを合成し、ピンの固相アレイに結合させ、その際、各ピン上に独特のオリゴペプチドがくるようにする。ピンのアレイは、例えば、バイオマーカー特異的モノクローナル抗体への結合に関して全９６種のオリゴペプチドを同時に検査できるようにする９６穴のマイクロプレートを含んでよい。或いは、ファージディスプレイペプチドライブラリキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）がエピトープのマッピングのために現在市販されている。これらの方法を用いながら、連続アミノ酸の全ての可能なサブセットに関する結合親和性を測定することにより、所定の抗体が結合するエピトープを発見してよい。エピトープはまた、抗体の入手原料である動物を免疫化するためにエピトープ長のペプチド配列を使用する場合に、推論により発見しても良い。
【００７１】
本明細書に開示したモノクローナル抗体の抗原結合フラグメント又は改変体が更に提供される。このような改変体は親抗体の所望の結合特性を温存することになる。抗体フラグメント及び改変体を作成するための方法は当該分野で一般的に入手できる。例えば本明細書に記載するモノクローナル抗体のアミノ酸配列改変体は、目的の抗体をコードするクローニングされたＤＮＡ配列における突然変異により製造できる。突然変異誘発及びヌクレオチド配列改変のための方法は当該分野でよく知られている。例えばＷａｌｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇａａｓｔｒａ，  ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；米国特許４，８７３，１９２及びこれらで引用されている参考文献を参照にでき；これらは参照により本明細書に組み込まれる。目的のポリペプチドの生物学的活性に影響しない適切なアミノ酸置換に関する指針は参照により本明細書に組み込まれるＤａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８），Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  （Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．）のモデルにおいて記載されている。１つのアミノ酸を同様の特性を有する別のものと交換することのような保存的な置換も好ましい場合がある。保存的置換の例は、Ｇｌｙ⇔Ａｌａ、Ｖａｌ⇔Ｉｌｅ⇔Ｌｅｕ、Ａｓｐ⇔Ｇｌｕ、Ｌｙｓ⇔Ａｒｇ、Ａｓｎ⇔Ｇｌｎ及びＰｈｅ⇔Ｔｒｐ⇔Ｔｙｒを包含するがこれらに限定されない。
【００７２】
目的の抗体ポリペプチドの改変体の構築においては、改変体が所望の活性、即ちバイオマーカーに対する同様の結合親和性を保有し続けることができるように修飾を行う。明らかに、改変体ポリペプチドをコードするＤＮＡ内で起こったいずれの突然変異も読み枠外に配列を置いてはならず、そして、好ましくは、二次ｍＲＮＡ構造を形成する可能性のある相補領域を創出しないものである。欧州特許出願公開７５，４４４を参照できる。
【００７３】
好ましくは比較対照バイオマーカー抗体の改変体は、比較対照抗体分子のアミノ酸配列又は比較対照抗体分子のより短い部分に対して、少なくとも７０％又は７５％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％又は８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％又は９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。より好ましくは、分子は少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を共有する。本発明の目的のためには、パーセント配列同一性はギャップオープンペナルティー１２及びギャップエクステンションペナルティー２、ＢＬＯＳＵＭマトリックス６２においてアファインギャップ検索を用いながら、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを用いて測定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９に教示されている。改変体は例えば比較対照抗体との相違が僅か１〜１５アミノ酸残基、僅か１〜１０アミノ酸残基、例えば６〜１０、僅か５、僅か４、３、２又は更には１アミノ酸残基である。
【００７４】
２つのアミノ酸配列の最適なアライメントに関しては、改変体アミノ酸配列の隣接セグメントは、比較対照アミノ酸配列に関して、追加的アミノ酸残基又は欠失したアミノ酸残基を有してよい。比較対照アミノ酸配列との比較に用いる隣接セグメントは少なくとも２０隣接アミノ酸残基を含むことになり、そして、３０、４０、５０又はこれより多いアミノ酸残基であってよい。保存的な残基の置換又はギャップに関連する配列同一性の補正を行うことができる（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズム参照）。
【００７５】
本発明を実施するために使用される抗体は目的のバイオマーカータンパク質に対する特異性を有するように選択する。抗体を作成するため、及び、適切な抗体を選択するための方法は当該分野で知られている。例えば参照により全体が本明細書に組み込まれるＣｅｌｉｓ編．（印刷中）Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｇｙ  ＆  Ｌａｂｏｄａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ第３版（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照できる。一部の実施形態においては、バイオマーカータンパク質に特異的に指向された市販の抗体を使用して本発明を実施してよい。本発明の抗体は組織学的試料の所望の染色に基づいて選択してよい。即ち、好ましい実施形態においては、抗体は最終的な試料の型（例えばホルマリン固定パラフィン包埋乳房腫瘍組織試料）を念頭に置きながら、そして、結合特異性があるように選択される。
【００７６】
本発明の一部の態様においては、目的の特定のバイオマーカーに指向された抗体は、多工程のスクリーニング過程を経て選択され精製される。特定の実施形態においては、特異性及び感度の所望の形質を保有するバイオマーカー特異的抗体を発見するためにポリドーマをスクリーニングする。本明細書においては、「ポリドーマ」とは多重ハイブリドーマを指す。本発明のポリドーマは典型的には多重ウェル組織培養プレート中に提供される。初回の抗体スクリーニング工程において、正常（即ち非癌性）乳房組織及びＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ期の乳房腫瘍試料の個々のスライドのセット又は腫瘍組織のマイクロアレイを使用する。単一のスライド上に多重組織アレイを形成するための方法及び装置、例えばＣｈｅｍｉｃｏｎ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｒｒａｙｅｒは当該分野で知られている。例えば米国特許４，８２０，５０４を参照できる。ポリドーマを含有する各ウェルの未希釈の上澄みを標準的な免疫組織化学的手法を用いて陽性染色があるかどうか検査する。この初回スクリーニング工程においては、バックグラウンドの非特異的結合は本質的に無視される。陽性染色をもたらしたポリドーマを選択し、抗体スクリーニングの第２段階において使用する。
【００７７】
第２のスクリーニング工程においては、陽性のポリドーマを限界希釈法に付す。得られた非スクリーニング抗体は、既知５年転帰の乳房腫瘍組織試料の陽性染色について標準的な免疫組織化学的手法を介して検査する。これを行うためには、正常乳房組織、既知良好５年転帰の早期乳房腫瘍試料、既知不良５年転帰の早期乳房腫瘍試料、正常非乳房組織及び癌性非乳房組織を含む組織マイクロアレイを作成する。この段階において、バックグラウンド染色が関連し、そして異常細胞（即ち癌細胞）のみに対して陽性染色する候補ポリドーマを選択してその後の分析に付すことにより、良好及び不良な転帰の患者試料を差別化する抗体を発見する。
【００７８】
陽性染色培養物は個々の候補モノクローナル抗体を選択するために個々のクローンとして作成する。個々のクローンを単離するため、及び、アフィニティー吸着クロマトグラフィーを介した抗体の精製は当該分野で良く知られている。最適化された抗原賦活条件及び作業希釈度を調べるために個々のクローンを更に分析する。
【００７９】
当業者の知る通り、染色の試薬及び条件、例えば抗体力価及び検出化学パラメーターの至適化は、特定の抗体に関するＳＮ比を最大限にするために必要である。本発明のバイオマーカーへの特異的結合を最大にし、そして非特異的結合（又は「バックグラウンド」）を最小限にする抗体濃度を求めることになる。特定の実施形態においては、適切な抗体力価は、まず、ホルマリン固定パラフィン包埋の正常及び癌性の乳房組織試料に対して種々の抗体希釈度を試験することにより求める。抗体力価を最適化する検査及び検出条件の設計は、標準的なものであり、そして当業者の日常的な許容範囲内である。一部の抗体はバックグラウンド染色を低減するため、及び／又は、染色の特異性及び感度を増大させるために追加的な最適化を必要とする。
【００８０】
更に又、当業者の知る通り、本発明の方法を実施するために使用される特定の抗体の濃度は結合時間、バイオマーカータンパク質に対する抗体の特異性の水準、及び身体試料調製の方法のような要因に応じて変動する。更に又、複数の抗体を単一の試料において使用する場合は、必要とされる濃度は抗体を試料に適用する順序により、即ち、カクテルとして同時に、又は、個々の抗体試薬として逐次的に適用されるかにより影響を受ける。更に、目的のバイオマーカーへの抗体の結合を可視化するために使用する検出の化学的特徴もまた所望のＳＮ比を得るために最適化しなければならない。免疫組織化学の染色試薬及び条件の最適化の１つの例は実施例６に記載する。
【００８１】
抗体結合の検出は検出可能な物質に抗体を結合させることにより促進できる。検出可能な物質の例は、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、ルミネセント物質、バイオルミネセント物質及び放射性物質を包含する。適当な酵素の例は、セイヨウワサビパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼを包含し；適当な補欠分子団複合体の例はストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンを包含し；適当な蛍光物質の例はウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリスリンを包含し；ルミネセント物質の例はルミノールを包含し；バイオルミネセント物質の例はルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンを包含し；そして適当な放射性物質の例は１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ又は３Ｈを包含する。
【００８２】
本発明の免疫組織化学的方法における抗体染色の検出に関しては、生物学的試料中の複数の分子種（例えばバイオマーカータンパク質）の量を定量的に測定するためのビデオ顕微鏡及びソフトウエア法が当該分野には存在し、その場合、存在する各分子種は特定の色を有する代表的染料マーカーにより示される。このような方法は当該分野においては比色分析法としても知られている。これらの方法においては、ビデオ顕微鏡を使用して染色後の生物学的試料の画像を得ることにより、目的の特定のバイオマーカーの存在を目視可能に示すことができる。これらの方法の一部、例えば参照により本明細書に組み込まれるＭａｒｃｅｌｐｏｌｉ等の米国特許出願０９／９５７，４４６及びＭａｒｃｅｌｐｏｌｉ等の米国特許出願１０／０５７，７２９に開示されているものは、画像化システム及び関連のソフトウエアにより測定される代表的な色素染料マーカーの光学密度及び光透過度の値により示されるそれぞれの色素染料マーカーの存在に基づいて存在する各分子種の相対的な量を測定するための画像化システム及び関連のソフトウエアの使用を開示している。これらの手法は、染色された生物学的試料における各分子種の相対的量の定量的測定を、自身の成分色部分に「脱構築」された単一のビデオ画像を用いながら可能にするものである。
【００８３】
本発明の方法はバイオマーカー発現の検出のための画像化システム及び関連の画像化ソフトウエアと組み合わせて使用できる。本発明の方法において使用するためのバイオマーカーは本明細書と共に出願され、参照により全体が本明細書に組み込まれる「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ」と題された米国特許出願＿＿＿＿に開示されているもののような方法及びコンピュータープログラムに基づいて選択できる。そこに開示されている方法は乳癌予後の評価のためのアルゴリズムの開発のために使用できる。
【００８４】
他の実施形態において目的のバイオマーカーの発現は核酸レベルで検出される。発現を検査するための核酸系手法は当該分野で良く知られており、そして例えば身体試料中のバイオマーカーｍＲＮＡの濃度を測定することを包含する。多くの発現検出方法は単離されたＲＮＡを使用する。ｍＲＮＡの単離に対抗して選択することのないいずれかのＲＮＡ単離手法をＲＮＡ精製のために利用できる（例えばＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７−１９９９を参照できる）。更に又、多数の組織試料を当該分野で良く知られている手法、例えばＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ（１９８９、米国特許４，８４３，１５５）の単一工程ＲＮＡ単離方法を用いて容易に処理することができる。
【００８５】
「プローブ」という用語は特に意図される標的生体分子、例えばバイオマーカーによりコードされるかそれに相当するヌクレオチド転写物又はタンパク質に特異的に結合することができるいずれかの分子を指す。プローブは当業者が合成するか、又は適切な生物学的調製物から誘導できる。プローブは標識されるように特異的に設計してよい。プローブとして使用できる分子の例は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体及び有機分子を包含するがこれらに限定されない。
【００８６】
単離されたｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーション又は増幅試験、例えばサザン又はノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応分析又はプローブアレイにおいて使用できる。ｍＲＮＡ濃度の検出のための１つの方法は検出すべき遺伝子によりコードされるｍＲＮＡにハイブリダイズできる核酸分子（プローブ）に単離されたｍＲＮＡを接触させることを包含する。核酸プローブは例えば完全長ｃＤＮＡ又はその部分、例えば少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０又は５００ヌクレオチド長であり、そして本発明のバイオマーカーをコードするｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするために充分なオリゴヌクレオチドであることができる。プローブへのｍＲＮＡのハイブリダイゼーションは問題となるバイオマーカーが発現されていることを示す。
【００８７】
１つの実施形態においては、例えば単離されたｍＲＮＡをアガロースゲル上に流し、ｍＲＮＡをゲルからニトロセルロースのようなメンブレンに移行させることにより、ｍＲＮＡを固体表面に固定化し、そしてプローブと接触させる。別の実施形態においては、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップアレイにおいて、プローブを固体表面に固定化し、そしてｍＲＮＡをプローブと接触させる。当業者であれば、本発明のバイオマーカーによりコードされるｍＲＮＡの濃度を検出する場合に使用するための知られたｍＲＮＡ検出方法を容易に適合させることができる。
【００８８】
試料中のバイオマーカーｍＲＮＡの濃度を測定するための別の方法においては、例えばＲＴ−ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ，１９８７米国特許４，６８３，２０２に記載の実験例）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１８９−１９３）、自己持続性配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−Ｂｅｔａ  Ｒｅｌｉｃａｓｅ（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許５，８５４，０３３）又はいずれかの他の核酸増幅方法による核酸増幅の過程を行い、その後、当該分野で良く知られている手法を用いて増幅された分子を検出する。これらの検出スキームは核酸分子の検出のためには、このような分子が極めて少数で存在する場合に、特に有用である。本発明の特別の態様において、バイオマーカーの発現は定量的蛍光発生ＲＴ−ＰＣＲ（即ちＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ）により検査する。
【００８９】
ＲＮＡのバイオマーカー発現濃度は、メンブレンブロット（例えばノーザン、サザン、ドット等のようなハイブリダイゼーション分析で使用されるもの）又はマイクロウエル、試料チューブ、ゲル、ビーズ又は繊維（又は結合した核酸を含むいずれかの固体支持体）を用いてモニタリングしてよい。参照により本明細書に組み込まれる米国特許５，７７０，７２２、５，８７４，２１９、５，７４４，３０５、５，６７７，１９５及び５，４４５，９３４を参照できる。バイオマーカー発現の検出はまた溶液中で核酸プローブを使用することを含んでよい。
【００９０】
本発明の１つの実施形態において、マイクロアレイを用いてバイオマーカー発現を検出する。マイクロアレイは異なる実験の間での再現性のためにこの目的のために特に適している。ＤＮＡマイクロアレイは多数の遺伝子の発現濃度の同時測定のための１つの方法である。各アレイは固体支持体に結合したキャプチャープローブの再現性のあるパターンよりなる。標識されたＲＮＡ又はＤＮＡをアレイ上の相補プローブにハイブリダイズさせ、次にレーザースキャニングにより検出する。アレイ上の各プローブに関するハイブリダイゼーションの強度を測定し、相対的な遺伝子発現濃度を示す定量的な値に変換する。参照により本明細書に組み込まれる米国特許６，０４０，１３８、５，８００，９９２及び６，０２０，１３５、６，０３３，８６０及び６，３４４，３１６を参照できる。高密度のオリゴヌクレオチドアレイは試料中の多数のＲＮＡのための遺伝子発現プロファイルを測定する場合に特に有用である。
【００９１】
機械的合成方法を用いたこれらのアレイの合成のための手法は例えば全ての目的のために参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許５，３８４，２６１に記載されている。平面のアレイ表面が好ましいが、アレイは実質的には如何なる形状の面、又は、更には多重の面の上に工作してもよい。アレイはビーズ、ゲル、重合体表面、繊維、例えば光ファイバー、ガラス又はいずれかの他の適切な表面上のペプチド又は核酸であってよく、全ての目的のために参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許５，７７０，３５８、５，７８９，１６２、５，７０８，１５３、６，０４０，１９３及び５，８００，９９２を参照できる。アレイは診断薬又はオールインクルーシブ装置における診断薬又は他の操作を可能にするような態様に置いてパッケージされてよい。例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許５，８５６，１７４及び５，９２２，５９１を参照できる。
【００９２】
１つの方策においては、試料から単離された全ｍＲＮＡを標識ｃＲＮＡに変換し、次にオリゴヌクレオチドアレイにハイブリダイズする。各試料を別個のアレイにハイブリダイズする。相対的な転写物の濃度はアレイ上及び試料に存在する適切な対照と比較対照することにより計算してよい。
【００９３】
本発明の方法を実施するためのキットも又提供される。「キット」とは、本発明のバイオマーカーの発現を特異的に検出するための、少なくとも１つの試薬、例えば抗体、核酸プローブなどを含むいずれかの製作品（例えばパッケージ又は容器）を意図している。キットは本発明の方法を実施するためのユニットとして宣伝、流通又は販売されてよい。更にまた、キット及びその使用方法を説明するパッケージインサートを含有してよい。
【００９４】
特定の実施形態において、本発明の免疫組織化学的方法を実施するためのキットが提供される。このようなキットは本明細書中の実施例１において後述するような手作業又は自動化された免疫組織化学的手法（例えば細胞染色）の両方に適合する。キットは目的のバイオマーカータンパク質に指向された抗体少なくとも１つを含む。バイオマーカーに結合する抗体の検出のための化学薬品、逆染色剤、及び陽性染色された細胞の発見を容易にするためのブルーイング剤もまた場合により提供される。或いは、本発明の免疫組織化学キットは市販の抗体結合検出システム、例えばＤａｋｏ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋システム及びＢｉｏｃａｒｅ  ＭｅｄｉｃａｌのＭａｃｈ３システムと組み合わせて使用される。抗原−抗体結合を検出するためのいずれかの化学薬品を本発明の実施において使用してよい。一部の実施形態においては、検出用薬品は二次抗体にコンジュゲートした標識された重合体を含む。例えば、抗原−抗体結合部位において発色原の付着を触媒する酵素にコンジュゲートされた二次抗体が提供される。抗体結合の検出におけるこのような酵素及びその使用のための手法は当該分野で良く知られている。１つの実施形態において、キットはＨＲＰ標識重合体にコンジュゲートした二次抗体を含む。コンジュゲートした酵素に適合する発色原（例えばＨＲＰ標識二次抗体の場合はＤＡＢ）及び非特異的染色をブロックするための過酸化水素のような溶液も更に提供される。本発明のキットは又例えばヘマトキシリンのような逆染色剤も含んでよい。ブルーイング剤（例えば水酸化アンモニウム）もまた陽性染色細胞の検出を容易にするためにキット内において提供してよい。
【００９５】
別の実施形態において、本発明の免疫組織化学キットは少なくとも２つの異なるバイオマーカーの発現を特異的に検出するための少なくとも２つの試薬、例えば抗体を含む。核抗体はキット内に個々の試薬として、又は目的の種々のバイオマーカーに指向された抗体の全てを含む抗体カクテルとして提供される。更に又、キット試薬のいずれか又は全てはそれらを外部の環境から保護する容器、例えば密封容器内に提供してもよい。本発明に従って使用される試薬の活性及び正しい使用を確認するために陽性及び／又は陰性対照をキット内に包含させてよい。対照は試料、例えば組織切片、目的のバイオマーカーの存在に関して陽性又は陰性のいずれかであることがわかっているスライドガラス等に固定化された細胞等を包含してよい。対照の設計及び使用は標準的であり、当業者の日常的な許容範囲内である。
【００９６】
他の実施形態においては、核酸レベルでバイオマーカーの過剰発現を検出することを含む乳癌患者の予後を評価するためのキットが更に提供される。このようなキットは例えばバイオマーカー核酸又はそのフラグメントに特異的に結合する核酸プローブ少なくとも１つを含む。特定の実施形態においては、キットは異なるバイオマーカー核酸とハイブリダイズする核酸プローブ少なくとも２つを含む。
【００９７】
当業者の知るとおり、本発明の方法におけるいずれか又は全ての工程は、担当者により実施されるか、又は、自動化された態様で実施される。即ち、身体試料の調製、試料の染色及びバイオマーカー発現の検出の工程は自動化してよい。更に又、一部の実施形態においては、本発明の免疫組織化学的方法は病理学者による陽性染色細胞の発見を容易にするためのコンピューター画像化装置及びソフトウエアと組み合わせて使用される。本明細書に開示した方法はまた他の予後方法又は分析と組み合わせることができる（例えば腫瘍の大きさ、リンパ節の状態、ＨｅＲ−２／ｎｅｕ、Ｋｉ６７及びｐ５３）。このような態様において、本発明のバイオマーカーの過剰発現の検出は乳癌患者の予後のより正確な測定を可能にする。
【００９８】
本明細書においては、英文標記単数であっても１つ又は１つより多い（即ち少なくとも１つ）の文法的客体の物品とする。例えば「要素」は１つ又はそれより多い要素を意味する。
【００９９】
明細書全体を通じて、「含む」という動詞又はその活用型は、記載した要素、整数又は工程、又は要素、整数又は工程の群が包含されることを意味するものとし、如何なる他の要素、整数又は工程、又は要素、整数又は工程の群を排除するものではない。
【０１００】
以下の実施例は説明を目的として提示するものであり、限定するものでない。
【実施例】
【０１０１】
（実験）
（実施例１：免疫組織化学を用いた生物学的活性過剰発現の検出）
（スライドの作成）
ホルマリン固定パラフィン包埋乳房腫瘍組織試料の４μＭ切片をミクロトームを用いて切り出し、ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ＋スライド上に置いた（ＶＷＲ）。スライドを２０分間強制空気オーブン内でベーキングし、次にパラフィンが溶融するまでＨｉｓｔｏ−Ｏｒｉｅｎｔｅｒと接触させる。５分間キシレンで３回スライドを洗浄することによりパラフィンを除去し、そして次に２分間／洗浄で無水アルコール中３回洗浄する。
【０１０２】
（前処理及び抗原賦活）
非特異的なバックグラウンド染色を防止するために、スライドを過酸化水素／メタノールブロック中５分間室温でインキュベートする。次にｄＨ２Ｏを数回交換しながらスライドを充分に洗浄する。
【０１０３】
抗体結合に使用できる抗原を作成するために、スライドを５分間圧力クッカー中で抗原賦活溶液中インキュベートする。スライドをベンチ上で２０分間室温まで放冷し、クエン酸塩緩衝液を徐々にｄＨ２Ｏ、トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）又はリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で順次希釈しながら置き換える。次にスライドを洗浄当たり２分間でＴＢＳ中３回洗浄する。表面張力を妨害するために１％ＢＳＡ／ＴＢＳ７５０μｌを各スライドに添加する。
【０１０４】
（手動免疫組織化学分析）
非特異的なバックグラウンド染色を防止するために、スライドを染色操作中は乾燥しないようにする。抗原賦活に付してあるスライドを水で湿潤させたペーパータオルを充填した湿潤チャンバー内に導入する。ＳＬＰＩ抗体（クローン５Ｇ６．２４；１：１００希釈）を室温で１時間組織切片が完全に被覆されるのに充分な容量でスライドに適用する。一次抗体と共にインキュベートした後、スライドを洗浄当たり２分間ＴＢＳ中で３回洗浄する。１％ＢＳＡ／ＴＢＳ７５０μｌ／５０ｍｌを最終洗浄液に添加する。
【０１０５】
ＤａｋｏＥｎｖｉｓｉｏｎ＋ＨＲＰ−標識重合体二次抗体を室温で３０分間スライドに適用し、その後ＴＢＳ洗浄する。ＨＲＰ基質の発色原ＤＡＢを１０分間適用し、次にスライドを水で５分間洗浄する。各スライドを５秒間ヘマトキシリンで逆染色し、次に透明になるまで水で洗浄する。逆染色の後、スライドを１０秒間アンモニア水に浸積することにより「ブルーイング」し、次に１分間水で洗浄する。
【０１０６】
スライドを１分間９５％エタノールに、次に更に１分間無水エタノールに浸積することにより試料を脱水する。洗浄当たり１分間、キシレン中で３回洗浄することによりスライドを清浄化する。次にスライドを永久マウント培地を用いながらカバーガラスで被覆し、３５℃でインキュベートして乾燥させる。バイオマーカー染色は明視野顕微鏡を用いて可視化する。ソーティングは盲検法において広範に資格を有する病理学者により行う。
【０１０７】
（自動化免疫組織化学分析）
Ｄａｋｏ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇシステムを製造元の指示に従ってプログラミングし、そして手動免疫組織化学分析に関して上記した通りの必要な染色及び逆染色試薬を機械にロードする。調製したスライドをＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒにロードし、プログラムを実行する。実行終了後、スライドを取り外し５分間水で洗浄する。上記した通り、スライドを脱水し、清浄化し、カバーガラスを被覆し、分析する。
【０１０８】
（実施例２：臨床試料における個々のバイオマーカーの過剰発現の検出）
種々の疾患段階にある患者から約１３０点の乳房腫瘍組織試料を採取した。患者の平均年齢は７７歳であった。各患者に関する実際の臨床転帰のデータが判っており、そして各患者は良好又は不良の転帰を有するものとして分類した。この試験においては、良好な転帰は少なくとも５年間癌非存在存続として定義し、転帰不良は５年以内に疾患の回帰、再発又は死亡に至ったものとして定義した。以下の表は分析した各診断群内の試料数、並びに、実際の臨床転帰のデータを示す。
【０１０９】
（表１：分析した臨床試料）
【０１１０】
【表１】
2008513032.tif 000003
過剰発現が不良癌予後を示すバイオマーカーを発見するために、実施例１に記載した自動免疫組織化学分析により試料を分析した。即ち、この臨床試験の目標は良好及び不良な転帰の患者の試料を区別することができるバイオマーカーを発見することであった。抗体を用いて目的の８種のバイオマーカー、即ちＳＬＰＩ、ＰＳＭＢ９、ＮＤＲＧ−１、Ｅ２Ｆ１、ｐ２１ｒａｓ、ＭＵＣ−１、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ２７及びｓｒｃの過剰発現を検出した。品質管理目的のために、試料は更にＥＲ、ＰＲ、ｐ５３、Ｋｉ６７及びＨｅｒ２／ｎｅｕの発現に関しても分析した。
【０１１１】
市販の抗体又は本明細書に記載する通りポリドーマスクリーニングにより発見された目的のバイオマーカーに対して指向されたモノクローナル抗体を表２に記載する通り希釈し、バイオマーカー過剰発現の検出のために使用した。各バイオマーカーに関する抗原賦活条件は以下の表に示す通りである。
【０１１２】
（表２：抗体希釈及び抗原賦活条件）
【０１１３】
【表２】
2008513032.tif 000004
（スライドの読み取り）
各スライドは実際の臨床的な患者の転帰を知らない広範に資格を有する病理学者により検討され採点された。試料を０〜３の尺度でバイオマーカー染色強度について採点した。例えば参照により共に全体が本明細書に組み込まれるＨａｎａｕｓｅｋ  ａｎｄ  Ｗａｌａｚｅｋ，  ｅｄｓ．（１９９８）Ｔｕｍｏｒ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）；及びＳｈｉ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（２０００）Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ（Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｎａｔｉｃｋ，  ＭＡ）を参照できる。各バイオマーカーにつき、閾値染色強度を確立した。特定のバイオマーカーについてこの閾値未満の染色強度を示す試料はそのバイオマーカーについては陰性とみなした。目的のバイオマーカーに関する染色強度の閾値は以下の通りである。
【０１１４】
【化１】
2008513032.tif 000005
染色強度の結果を各患者について入手可能な既知の実際の臨床転帰データと比較し、そして次に各スライドに以下のパラメーターに従って真の陽性（ＴＰ）、真の陰性（ＴＮ）、擬陽性（ＦＰ）、擬陰性（ＦＮ）の最終結果を与えた。各バイオマーカーに関する感度及び特異性の値を計算した。
【０１１５】
（表３：転帰不良バイオマーカーに関するスライドの分類）
【０１１６】
【表３】
2008513032.tif 000006
＊良好な臨床転帰＝少なくとも５年間癌非存在で生存
不良な臨床転帰＝５年以内に伏在癌による再発又は死亡
（使用した計算）
感度＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）
特異性＝ＴＮ／（ＦＰ＋ＴＮ）
陽性予測力（ＰＰＰ）＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ）
陰性予測力（ＮＰＰ）＝ＴＮ／（ＦＮ＋ＴＮ）
（結果）
各バイオマーカーに関する結果を以下に総括する。
【０１１７】
（表４：個々のバイオマーカーの結果の総括）
【０１１８】
【表４】
2008513032.tif 000007
（実施例３：臨床試料中のバイオマーカー過剰発現の検出−バイオマーカーの組み合わせ）
本発明の方法の感度及び特異性が複数のバイオマーカーを組み合わせれば向上するかどうかを調べるために、実施例２のデータを更に分析に付した。即ち、バイオマーカーの種々の組み合わせを考え、そして、目的の組み合わせにおけるバイオマーカーのいずれかに対して陽性染色された試料を陽性とみなした。これらの結果を各患者について入手可能な既知の実際の臨床転帰データと比較し、そして次に各スライドに前述の通り真の陽性（ＴＰ）、真の陰性（ＴＮ）、擬陽性（ＦＰ）、擬陰性（ＦＮ）の最終結果を与えた。バイオマーカーの各組み合わせについて感度、特異性、陽性予測値（ＰＰＶ）及び陰性予測値（ＮＰＶ）を計算した。
【０１１９】
（結果）
バイオマーカーの各組み合わせに関する結果を以下に総括する。
【０１２０】
（表５：ＳＬＰＩ、ＰＳＭＢ９、ＭＵＣ−１及びｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ２７）
【０１２１】
【表５】
2008513032.tif 000008
（表６：ＳＬＰＩ、ＰＳＭＢ９、ＭＵＣ−１、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ２７及びｓｒｃ）
【０１２２】
【表６】
2008513032.tif 000009
（表７：ＳＬＰＩ、ＰＳＭＢ９、ＭＵＣ−１、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ２７、ｓｒｃ、ｐ２１ｒａｓ、Ｅ２Ｆ１及びＮＤＲＧ−１）
【０１２３】
【表７】
2008513032.tif 000010
（実施例４：マーカー分析研究システム（ＭＡＲＳ）を用いた臨床試料中の個々のバイオマーカーの過剰発現の検出）
本試験では２００人超の患者を分析した。表８に総括する通り、この患者集団は極めて非均質であり、Ｔ１Ｎ０からＴ３Ｎ０の範囲で変動する種々の段階の腫瘍を示していた。
【０１２４】
（表８：分析した患者集団）
【０１２５】
【表８】
2008513032.tif 000011
患者の標的特徴はその良好な転帰又は不良な転帰の状態とした。本試験では、良好な転帰の患者は５年間なお無疾患であり；不良な転帰の患者は５年以内に再発、回帰又は死亡に至ったものとして定義した。
【０１２６】
（バイオマーカーの選択）
バイオマーカーの選択に用いた範例は、バイオマーカー過剰発現は転帰不良患者の一部を把握し、そして極めて高い特異性を示すこととした。従って、種々のマーカーを組み合わせることは、高い特異性を確保するものであり、そして例えば８０％感度及び８０％特異性に達するような感度を獲得する。多工程の選択過程の後、９つのバイオマーカーを現試験のために選択した。これらのマーカーをその対応する細胞未満レベルの局在性と共に表９に示す。
【０１２７】
（表９：分析したバイオマーカー）
【０１２８】
【表９】
2008513032.tif 000012
（自動化免疫組織化学分析）
過剰発現が不良癌予後を示すバイオマーカーを発見するために、実施例１に記載したものと本質的に同様の自動化免疫組織化学分析により患者試料を分析した。即ち、この臨床試験の目標は良好及び不良な転帰の患者の試料を区別することができるバイオマーカーを発見することであった。抗体を用いて目的の９種のバイオマーカー、即ちＳＬＰＩ、ＰＳＭＢ９、ＮＤＲＧ−１、Ｅ２Ｆ１、ｐ２１ｒａｓ、ｐ５３、ＭＵＣ−１、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ２７及びｓｒｃの過剰発現を検出した。試料は更にＥＲ、ＰＲ、Ｋｉ６７及びＨｅｒ２／ｎｅｕ（ＣｅｒｂＢ２）の発現に関しても分析した。
【０１２９】
スライドは実施例１に記載の通り調製し、抗原賦活に付した。特に、調製したスライドは抗原賦活溶液に浸積し、５分間圧力クッカー（１２０〜１２５℃、１７〜２３ｐｓｉ）内に置いた。各バイオマーカーに関する抗原賦活溶液は下記の表１０に示す通りである。
【０１３０】
（表１０：抗原賦活溶液）
【０１３１】
【表１０】
2008513032.tif 000013
スライドを徐々に室温脱イオン水に戻した。スライドを洗浄当たり２分間ＴＢＳ／ツイーン２０中３回洗浄した。バイオマーカー特異的抗体２００μｌを各スライドに添加し、１時間室温でインキュベートした。市販の抗体又は本明細書に記載する通りポリドーマスクリーニングにより発見された目的のバイオマーカーに指向されているモノクローナル抗体を用いて生物学的活性の過剰発現を検出した。
【０１３２】
一次抗体と共にインキュベートした後、スライドをＴＢＳ／ツイーン２０中２回洗浄した。次に標識重合体（Ｄａｋｏ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋ＨＲＰ標識重合体二次抗体）２００μｌを室温で３０分間添加した。スライドを再度ＴＢＳ／ツイーン２０で３回洗浄した後、室温で５分間ＤＡＢ溶液２００μｌを添加した。次にスライドをＴＢＳ／ツイーン２０で３回、脱イオン水で１回洗浄した。ヘマトキシリン２００μｌを５分間添加した。次にスライドを脱イオン水で３回、ＴＢＳ／ツイーン２０で１回、そして更に２回脱イオン水で洗浄した。実施例１に記載の通りスライドを脱水し、正常化し、カバーガラスを被覆した。
【０１３３】
（病理学者の評価）
広範に資格を有する病理学者が手作業によりスライドを採点した。ｐ５３の発現は０、０．５、１、２又は３の尺度を用いた染色強度、標識細胞のパーセンテージ及び臨床診断評点に関して採点した。ＳＬＰＩ及びＰＳＭＢ９は０、０．５、１、２又は３の尺度を用いた染色強度及び標識細胞のパーセンテージについて採点した。病理学者はまた測定を行う際に使用した腫瘍領域（ＲＯＩ）をスライド上に注記した。単一の焦点において統括された各腫瘍の選択された領域内から得た個々の２０倍視野１０点までをＭＡＲＳを用いて得た。各試料から得られた画像の実際の数は個々の腫瘍の大きさにより異なるものであった。患者の転帰、リンパ節状態及び腫瘍の大きさと共に上記採点情報の全てを含むＥｘｅｌスプレッドシートを作成した。データは以下に記載する通り更に分析した。
【０１３４】
（データ抽出）
ＭＡＲＳを用いながら各ファイルにつき以下の工程を系統的に実施した。
・発色原の分離は最高品質の染色を示した使用可能なスライドを用いて各バイオマーカーにつき最適化した。
・セグメント化セットアップは細胞未満レベルの局在化（核、原形質又は膜）に従って各バイオマーカーにつきカスタマイズした。
・所定のＲＯＩ内における細胞、視野（ＦＯＶ）及び焦点のレベルにおいて特徴を抽出して出力ファイル（ＸＭＬフォーマット）に送った。
【０１３５】
（データ分析）
新しい分析アルゴリズムを統合し、この分析のための多大なコンピューター処理の必要性に合致するために、Ｍｕｌｔｉ  Ｍａｒｋｅｒ  Ａｎａｌｙｚｅｒと称される特定のプログラムを開発した。このソフトウエアはＴＭＡ又はＭＡＲＳで作成された組織切片ＸＭＬファイルのいずれかの全体又は一部分をロードしてこれらのファイルに含有されるデータをＴＭＡキーを記載するＸＭＬファイル（ＴＭＡ分析の場合）又は患者の臨床状態及び患者の評価を示すＥｘｃｅｌファイル（組織切片分析の場合）を用いてマージするための手段及び他の全ての分析を可能にするものである。このマージ過程は、患者に関するＴＭＡキー（又はＥｘｃｅｌファイル）に保存されている情報：認識番号及び医学的状態（良好又は不良の転帰）を用いて各コア（即ち患者）についてＭＡＲＳにより測定されたパラメーターの集合、及び、ＸＭＬフォーマットのＭＡＲＳファイルに含まれない場合は病理学者の評価を包含するものであった。
【０１３６】
試料の一部は完全な実験過程を経ていなかったため、分析した患者数は上記表８で報告された患者数より少数であり、そしてバイオマーカー毎に変動している。各バイオマーカーについて分析した組織切片の数を下記表１１に示す。従来の乳癌マーカー（即ちＥＲ、ＰＲ、Ｋｉ６７及びＨｅｒ２／ｎｅｕ（ＣｅｒｂＢ２））に関して分析された組織試料の数は表１２に示す。
【０１３７】
（表１１：バイオマーカー過剰発現に関して分析した組織切片の数）
【０１３８】
【表１１】
2008513032.tif 000014
（表１２：従来の乳癌マーカーに関して分析した組織切片の数）
【０１３９】
【表１２】
2008513032.tif 000015
（セグメンテーション及びディスパッチャーセットアップ）
スライドを特性化する病理学者の手順にＭＡＲＳ分析を近似させるため、少なくとも＋１とみなされた細胞のみを選択した。表１３はこの分析のためにＭＡＲＳにおいて使用したセグメンテーションセットアップを総括したものである。このセグメンテーションセットアップは最も染色した細胞を検出する。セグメンテーション及びディスパッチャートランスミッタンス閾値は細胞学者の入力に基づくものとした。セグメンテーションセットアップはコンピューターＴＲＯ−ＲＤＬＡＢ５上においてＤａｇｅカメラを用いてキャプチャーされた２０ｘ画像を用いてピクセルベースで行った。
【０１４０】
（表１３：メインセグメンテーションセットアップパラメーター）
【０１４１】
【表１３】
2008513032.tif 000016
標的細胞コンパートメント内のバイオマーカー染色強度に基づいたカテゴリに選択された細胞を割り付けるために、セグメンテーションにより得られた有効細胞を３カテゴリ：１（ＭＡＲＳ中；ＮｅｇＲｅｆ）、２（ＭＡＲＳ中：Ｔｅｓｔ）及び３（ＭＡＲＳ中：ＰｏｓＲｅｆ）内にディスパッチした。表１４はこのディスパッチを実施するために使用したＭＡＲＳの特徴、及びその数値をマーカーの細胞内局在化の関数として示す。
【０１４２】
（表１４：カテゴリー１、２及び３への選択された細胞の割付をもたらすディスパッチャーのセッティング）
【０１４３】
【表１４】
2008513032.tif 000017
カテゴリー０の評価（「非染色細胞の予測される数」に相当する）を実施した。これらの細胞の概数は１、２及び３細胞の染色強度を有する細胞の面積から得られる平均腫瘍細胞面積（ＣＥＬＬ＿ＡＲＥＡと称されるＭＡＲＳ特徴から推定して１１００ピクセル）を用いて計算した。
【０１４４】
【化２】
2008513032.tif 000018
Ｎ０、Ｎ１、Ｎ２及びＮ３を用いながら、細胞染色０、１、２及び３細胞のパーセンテージを計算した。表１５はこれらの新しい特徴の名称を示す。
【０１４５】
（表１５：パーセンテージ総括特徴）
【０１４６】
【表１５】
2008513032.tif 000019
これらの特徴は単純なパーセントとして計算し、例えばＣＥＬＬ＿ＰＥＲＣＥＮＴ＿０については以下の通りとした。
【０１４７】
【化３】
2008513032.tif 000020
この試験はＭＡＲＳ特徴、これらの新しい総括特徴及び病理学者の評点を用いて実行した。ＵＳＥＲ＿ＴＹＰＥは病理学者採点のみに関するＭＡＲＳ特徴の名称である。
【０１４８】
（多重バイオマーカー分析）
向上した感度／特異性の組み合わせを得るために、多重バイオマーカーから得られたデータを組み合わせて分析した。各バイオマーカーに対する特異性の標的は組み合わせるバイオマーカーの数により変動するものであった。一例として、３バイオマーカーの組み合わせは、それぞれ個々のマーカーの特異性が少なくとも０．８１／３＝９３％の場合は８０％特異性に達することになる。表１６は１〜９の組み合わせにおけるバイオマーカーの数に基づいた必要な特異性の値を列挙したものである。
【０１４９】
（表１６：９個までのバイオマーカーの所定の組み合わせに対して全体的特異性０．８をターゲティングした場合のバイオマーカー当たりに必要とされる最小特異性）
【０１５０】
【表１６】
2008513032.tif 000021
（データの解釈）
本明細書においては、「マーカー性能」という用語はマーカーの真の生物学的判別力、並びに、生物学的試料の起源及び保存物、染色プロトコル、スキャニング過程、画像化及びデータマイニングの操作法に関する完全な実験的性能を包含する。
【０１５１】
（結果）
（１．バイオマーカー当たり）
（Ａ．病理学者の採点）
病理学者の採点のみを考えた場合の最良の感度／特異性の組み合わせを与える閾値を計算した（ＭＡＲＳにおけるＵＳＥＲ＿ＴＹＰＥ）。０．７５の特異性を標的とした場合の大部分の有意な結果を表１７に示す。
【０１５２】
（表１７：バイオマーカーの最良の感度と特異性の組み合わせ（病理学者採点））
【０１５３】
【表１７】
2008513032.tif 000022
最良の感度と特異性の組み合わせを与える閾値はまた、乳房パネルの従来のマーカー（即ちＥＲ、ＰＲ、Ｋｉ６７及びＨｅｒ２／ｎｅｕ（ＣｅｒｂＢ２））に関する病理学者の評価のみを考えた場合についても計算した。０．７５の特異性を標的とした場合の大部分の有意な結果を表１８に示す。
【０１５４】
（表１８：従来のマーカーの最良の感度と特異性の組み合わせ（病理学者採点））
【０１５５】
【表１８】
2008513032.tif 000023
各バイオマーカー及び従来の乳癌マーカー（即ちＥＲ、ＰＲ、Ｋｉ６７及びＨｅｒ２／ｎｅｕ（ＣｅｒｂＢ２））に関して、病理学者の評価のみを考えた場合の最良の感度／特異性の組み合わせを与える特徴及び閾値を計算した（ＵＳＥＲ＿ＴＹＰＥ）。相当する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作成した（データ示さず）。
【０１５６】
（Ｂ．単一特徴分析）
各バイオマーカーにつき、分析したバイオマーカーに関して意味があると決定された各ＭＡＲＳ特徴を考えた場合の最良の感度／特異性の組み合わせを与える特徴及び閾値を計算した。相当するＲＯＣを作成した（データ示さず）。０．７５の特異性を標的とした場合の各バイオマーカーに関して最良の結果を与える特徴及び閾値を表１９にまとめた。
【０１５７】
（表１９：ＭＡＲＳ特徴から得られる各バイオマーカーに関する最良の感度及び特異性の組み合わせ（単一特徴アルゴリズム））
【０１５８】
【表１９】
2008513032.tif 000024
＊決定規則１は閾値を超える患者が陽性とみなされる（即ち不良な実際の臨床転帰の場合には真の陽性）のに対し、決定規則８は閾値を超える患者が陰性とみなされる（即ち不良な実際の臨床転帰の場合には擬陰性）。
【０１５９】
（Ｃ．多重特徴分析）
各パーセント総括特徴を２つずつ組み合わせ、最良の感度／特異性の組み合わせを与える閾値を計算した。０．７５の特異性を標的とした場合の各バイオマーカーに関する大部分の有意な結果を表２０に示す。
【０１６０】
（表２０：ＭＡＲＳ特徴から得られる各バイオマーカーに関する最良の感度及び特異性の組み合わせ（多重特徴アルゴリズム））
【０１６１】
【表２０】
2008513032.tif 000025
＊決定規則は２特徴のスペースにおける象限作用（ｑｕａｄｒａｎｔ  ａｆｆｅｃｔｉｏｎ）に相当する。
【０１６２】
（２．バイオマーカーの組み合わせ）
１〜９マーカーの可能な組み合わせの完全なセットを順次、マーカー当たり、病理学者採点、１つのＭＡＲＳ特徴、及び２つのＭＡＲＳ特徴を用いながら調査した。感度及び特異性はＦＤＡ様で順序に基づいた解釈方法に従って計算した。「ＦＤＡ様」とはいずれかのマーカーのＯＮ（１）が転帰不良決定をもたらすことを意味する。即ち、マーカーの組み合わせは少なくとも１つのマーカーが陽性である場合に陽性とみなす。順序に基づいた解釈は各特定のＯＮ／ＯＦＦ組み合わせの感度／特異性に依存している。病理学者の採点で得られた結果（表２１）及びパーセント特徴の評価（表２２）を以下に示す。
【０１６３】
【表２１】
2008513032.tif 000026
【０１６４】
【表２２】
2008513032.tif 000027
４及び６バイオマーカーの組み合わせに関する特定の例を実施例５に示す。
【０１６５】
（浸潤小葉癌（ＩＬＣ）患者のデータを用いない分析）
表８に記載した患者集団を更に診断に基づいて細分した。特に、浸潤小葉癌（ＩＬＣ）を有する患者のデータを除外し、そして得られたデータセットに対して上記した分析を実施した。本試験において分析した患者集団の詳細は表２３に示す通りである。
【０１６６】
（表２３：分析した患者集団（ＩＬＣ患者を除く））
【０１６７】
【表２３】
2008513032.tif 000028
（結果）
（１．バイオマーカー当たり）
（Ａ．病理学者の採点）
（表２４：ＩＬＣ患者データを除いた場合のバイオマーカーに関する最良の感度及び特異性の組み合わせ（病理学者採点））
【０１６８】
【表２４】
2008513032.tif 000029
（表２５：ＩＬＣ患者データを除いた場合の従来のマーカーに関する最良の感度及び特異性の組み合わせ（病理学者採点））
【０１６９】
【表２５】
2008513032.tif 000030
（Ｂ．単一特徴分析）
（表２６：ＩＬＣ患者データを用いない場合のＭＡＲＳ特徴から得られる各バイオマーカーに関する最良の感度及び特異性の組み合わせ（単一特徴アルゴリズム））
【０１７０】
【表２６】
2008513032.tif 000031
＊決定規則１は閾値を超える患者が陽性とみなされる（即ち不良な実際の臨床転帰の場合には真の陽性）のに対し、決定規則８は閾値を超える患者が陰性とみなされる（即ち不良な実際の臨床転帰の場合には擬陰性）。
【０１７１】
（Ｃ．多重特徴分析）
（表２７：ＩＬＣ患者データを用いない場合のＭＡＲＳ特徴から得られる各バイオマーカーに関する最良の感度及び特異性の組み合わせ（多重特徴アルゴリズム））
【０１７２】
【表２７】
2008513032.tif 000032
＊決定規則は２特徴のスペースにおける象限作用に相当する。
【０１７３】
（Ｄ．分析間の変動：全患者およびＩＬＣ患者除外）
完全な患者集団（表８）及びＩＬＣ患者を除外した集団（表２３）の分析によるバイオマーカー毎に得られた感度及び特異性の値の変動を調べた。結果を以下の表２８に示す。合計のコラム（ｄ２）はＲＯＣ曲線に関する象限距離の差、即ち感度及び特異性における全体的増分を与える。
【０１７４】
（表２８：完全な患者集団及びＩＬＣ患者を除外した集団で得られた感度及び特異性の変動（バイオマーカー当たり））
【０１７５】
【表２８】
2008513032.tif 000033
（２．バイオマーカーの組み合わせ）
（Ａ．病理学者採点）
（表２９：異なる標的特異性（７５％及び９５％）及び異なる解釈アルゴリズムを用いたＩＬＣ患者データを除外した場合のバイオマーカー組み合わせに関する最良の感度／特異性の組み合わせ（病理学者の採点））
【０１７６】
【表２９】
2008513032.tif 000034
＊特異性、感度、（６）各患者は病理学者の評点により特性化する。
【０１７７】
（Ｂ．パーセンテージ特徴分析）
（表３０：異なる標的特異性（７５％及び９５％）及び異なる解釈アルゴリズムを用いたＩＬＣ患者データを除外した場合のバイオマーカー組み合わせに関する最良の感度／特異性の組み合わせ（パーセンテージ特徴））
【０１７８】
【表３０】
2008513032.tif 000035
＊各患者は１、２及び３染色細胞のパーセンテージにより特性化する。
【０１７９】
表３０は単一のパーセント特徴を用いた場合のＩＬＣ患者を除外した５バイオマーカーの組み合わせを考えた場合の特異性の増大を示す（０．８８と０．８１、表２８参照）。感度の上昇は試験の患者からＩＬＣを除外した場合の５バイオマーカーの順序に関する２特徴（０．７１ｖｓ０．６５、表２８参照）を用いた場合に観察された。
【０１８０】
（Ｃ．分析間の変動：全患者およびＩＬＣ患者除外）
完全な患者集団及びＩＬＣ患者を除外した集団の分析によるバイオマーカーの組み合わせに対して得られた感度及び特異性の値の変動を調べた。結果を以下の表３１に示す。合計のコラム（ｄ２）はＲＯＣ曲線に関する象限距離の差、即ち感度及び特異性における全体的増分を与える。試験からＩＬＣ患者を除外した場合、１つ又は２つのパーセンテージ特徴を使用した５バイオマーカー順序分析に関する性能の僅かな増分が観察された。
【０１８１】
（表３１：完全な患者集団及びＩＬＣ患者を除外した集団で得られた感度及び特異性の変動（バイオマーカー組み合わせ））
【０１８２】
【表３１】
2008513032.tif 000036
（実施例５：特異的バイオマーカー組み合わせ）
実施例４において上記した試験において得られたデータを更に分析して、特定のバイオマーカー組み合わせを検討した。４つ（ＳＬＰＩ／ｐ２１ｒａｓ／Ｅ２Ｆ１／ｓｒｃ）及び６つ（ＳＬＰＩ／ｐ２１ｒａｓ／ＰＳＭＢ９／Ｅ２Ｆ１／ｓｒｃ／ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ２７）のバイオマーカーの組み合わせで得られた結果を以下に示す。
【０１８３】
（４つのバイオマーカーの組み合わせ：ＳＬＰＩ／ｐ２１ｒａｓ／Ｅ２Ｆ１／ｓｒｃ）
表３２に示した閾値及び決定規則を用いてＳＬＰＩ、ｐ２１ｒａｓ、Ｅ２Ｆ１及びｓｒｃについて１つのパーセンテージ特徴のみを用いながら分析を行った。Ｅ２Ｆ１がＯＮ（即ち１）であり、そしてＯＮである唯一のバイオマーカーではない場合には、患者は転帰不良とみなされ；それ以外は転帰良好とみなす、という規則を用いた場合、６０％感度及び８０％特異性が得られた。図１はＥ２Ｆ１について不良及び転帰良好の患者の関数としてのパーセンテージ特徴の分布を示す。２．４６％の閾値を用いた場合、それぞれ０．５４及び０．７５の感度及び特異性の値が得られた。
【０１８４】
（表３２：４バイオマーカー分析に関するパーセンテージ総括特徴）
【０１８５】
【表３２】
2008513032.tif 000037
順序に基づいた解釈の方法を用いて４つのバイオマーカーの組み合わせを分析した。使用した順序に基づいた決定規則は、Ｅ２Ｆ１がＯＮ（即ち１）であり、そしてＯＮである唯一のバイオマーカーではない場合には、患者は転帰不良とみなされ；それ以外は転帰良好とみなすというものであった。４バイオマーカーの可能な組み合わせの全てについて感度及び特異性の値を表３３に示した。ＳＬＰＩ／ｐ２１ｒａｓ／Ｅ２Ｆ１／ｓｒｃ組み合わせについて順序解釈法を用いて得られたＲＯＣ曲線を作成した（データ示さず）。
【０１８６】
（表３３：ＳＬＰＩ、ｐ２１ｒａｓ、Ｅ２Ｆ１及びＳＲＣの組み合わせに関する順序に基づいた解釈方法を用いた感度及び特異性の組み合わせ）
【０１８７】
【表３３】
2008513032.tif 000038
＊順序Ｓ０１１０はＳＬＰＩ＝ＯＦＦ／ｐ２１ｒａｓ＝ＯＮ／Ｅ２Ｆ１＝ＯＮ／ｓｒｃ＝ＯＦＦと読む。
【０１８８】
Ｅ２Ｆ１単独に基づいた解釈はそれぞれ５４％及び７５％の感度及び特異性を与えた。上記の順位に基づくアルゴリズム（即ちＥ２Ｆ１がＯＮ（即ち１）であり、そしてＯＮである唯一のバイオマーカーではない場合には、患者は転帰不良とみなされ；それ以外は転帰良好とみなす）を用いた場合には、それぞれ６０％及び８０％の特異性及び感度が得られた。
【０１８９】
（６バイオマーカー組み合わせ：ＳＬＰＩ／ｐ２１ｒａｓ／ＰＳＭＢ９／Ｅ２Ｆ１／ｓｒｃ／ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ２７）
表３４に定義した閾値及び決定規則を用いて、ＳＬＰＩ、ｐ２１ｒａｓ、Ｅ２Ｆ１、ｓｒｃ、ＰＳＭＢ９及びｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ２７の６バイオマーカーの組み合わせについて１つのパーセンテージ特徴のみを用いて分析を行った。
【０１９０】
（表３４：６バイオマーカー分析のパーセンテージ総括特徴）
【０１９１】
【表３４】
2008513032.tif 000039
順序に基づいた解釈の方法を用いて６つのバイオマーカーの組み合わせを分析した。使用した順序に基づいた決定規則は、Ｅ２Ｆ１がＯＮ（即ち１）であり、そしてＳＬＰＩ又は２１ｒａｓのいずれか、又はＥ２Ｆ１及びいずれかの２バイオマーカー、又はＳＬＰＩ及びいずれかの２バイオマーカー、又はいずれかの４バイオマーカー以上がＯＮである場合は、患者は転帰不良とみなされ；それ以外は転帰良好とみなすというものであった。目的の６バイオマーカーの可能な組み合わせの全てについて感度及び特異性の値を表３５に示した。ＳＬＰＩ／ｐ２１ｒａｓ／Ｅ２Ｆ１／ＰＳＭＢ９／ｓｒｃ／ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ２７組み合わせについて順序解釈法を用いて得られたＲＯＣ曲線を図２に示す。
【０１９２】
（表３５：ＳＬＰＩ、ｐ２１ｒａｓ、Ｅ２Ｆ１、ＰＳＭＢ９、ＳＲＣ及びｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ２７の組み合わせに関する順序に基づいた解釈方法を用いた感度及び特異性の組み合わせ）
【０１９３】
【表３５】
2008513032.tif 000040
上記した順序に基づくアルゴリズムを用いた場合にはそれぞれ７０％及び７７％の特異性及び感度が得られた。
【０１９４】
（実施例６：免疫組織化学分析のための試薬及び染色条件の最適化）
本明細書に開示した免疫組織化学的方法を用いた特定のバイオマーカーの発現の検出に関してＳＮ比を最適化するために、最適な抗原賦活溶液及び条件、抗体濃度及び希釈剤の処方、及び検出の化学的パラメーターを選択するための実験を行った。実験の各セットにつき、通常のパラフィンブロックから円筒状の組織標本を取り出し、単一のブロックにそれらを組み立て、そして多重組織標本を含有する切片を調製することにより、バイオマーカー特異的組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を構築した。各乳房バイオマーカーにつき２〜３点の予め選択された既知陽性及び陰性の腫瘍によるＴＭＡを使用した。スライドを調製し、本質的に実施例１に記載の通り免疫組織化学分析を実施した。最適化実験の全ての間以下の対照試薬を使用した。
・陰性対照については、一次抗体の適用は既成のユニバーサル陰性試薬、非特異的マウス又はウサギＩｇＧのいずれかに置き換えた。
・ＥＦ１−αを陽性対照として使用した。
・試験すべき各抗体について実現可能性の間に確立された最適化標識パラメーターに従って陽性マーカー対照スライドを操作した。
・陽性及び陰性腫瘍の両方を含有するバイオマーカー特異的ＴＭＡを各乳房マーカー抗体の試験において使用した。
【０１９５】
（１．抗原賦活の最適化）
（Ａ．抗原賦活溶液）
以下に示す各抗原賦活溶液を目的のバイオマーカー抗体の各々を用いて試験した。個々で使用した時間及び温度は後に記載する通り標準的に受け入れられている値とした。
【０１９６】
（表３６：試験した抗原賦活溶液）
【０１９７】
【表３６】
2008513032.tif 000041
スライドは病理学者が採点し、陽性及び陰性の腫瘍の間で標識の特異性及び強度を比較することにより、最良の性能を示した抗原賦活溶液を決定した。結果が本質的に陰性であった場合は、代替抗原賦活溶液をスクリーニングした。結果が陽性であった場合、即ち非抗原賦活よりもより高強度に標識された場合は、上位（１〜３）の溶液を発見し、抗原賦活の時間及び温度の試験のために用いた。選択された抗原賦活溶液の活性は、陽性及び陰性の全組織切片の代表的試料を標識することにより確認した。
【０１９８】
（Ｂ．抗原賦活条件−時間及び温度）
最良の性能を示した抗原賦活溶液を、以下の時間及び温度の基準を用いて試験した。
【０１９９】
（表３７：試験した抗原賦活の時間及び温度の条件）
【０２００】
【表３７】
2008513032.tif 000042
スライドは病理学者が採点し、陽性及び陰性の腫瘍の間で標識の特異性及び強度を比較することにより、最良の性能を示した抗原賦活の時間及び温度の組み合わせを決定した。選択された抗原賦活溶液の活性および時間と温度の組み合わせは、上記した対照を使用しながら陽性及び陰性の全組織切片の代表的試料を標識することにより確認した。
【０２０１】
（２．抗体希釈及び希釈剤処方の最適化）
（Ａ．抗体希釈）
各乳癌バイオマーカー抗体を抗体希釈のある範囲にわたって試験した。表３８はＳＬＰＩ５Ｇ６．２４抗体に対して試験した抗体希釈度の例を示す。全ての他の乳房バイオマーカー抗体は同様の態様に置いて試験した。
【０２０２】
（表３８：試験した抗体希釈度）
【０２０３】
【表３８】
2008513032.tif 000043
スライドは病理学者が採点し、対照、既知陽性及び既知陰性の腫瘍の間で標識強度を検査した。標識データを分析することにより、所望の標識強度及び各抗体の使用範囲の広さを維持していた抗体希釈度の上限及び下限の両方を決定した。試験した初期希釈度範囲が上限及び下限の発見をもたらさなかった場合は、別の抗体希釈度を試験した。
【０２０４】
（Ｂ．抗体希釈剤の処方）
目的の乳房バイオマーカー抗体の各々を用いながら種々の抗体希釈剤を試験した。以下の表は試験した希釈剤のパラメーターの説明である。
【０２０５】
（表３９：試験した抗体希釈剤）
【０２０６】
【表３９】
2008513032.tif 000044
スライドは標識強度について病理学者が採点した。実験スライドにバイオマーカー対照スライドの標識等級を比較することにより希釈剤処方の有効性を調べた。陽性及び陰性の腫瘍の標識を比較することにより最も特異的で高いＳＮ比をもたらしたものをその後使用した。最適な標識強度を示した希釈剤処方（約１〜３）をその後の最適化及び安定性の試験に付した。選択された希釈剤の活性は、陽性及び陰性の全乳癌組織切片の代表的試料を標識することにより確認した。
【０２０７】
（３．検出化学法の最適化）
以下に示す時間及び濃度の範囲に渡ってＤＡＫＯ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋検出キットを利用しながら乳房バイオマーカー抗体の各々を試験した。
【０２０８】
（表４０：試験した検出化学法の時間及び濃度状態）
【０２０９】
【表４０】
2008513032.tif 000045
スライドは病理学者が採点し、対照、既知陽性及び既知陰性の腫瘍の間で標識強度を検査した。選択された検出化学法の時間及び濃度の組み合わせの活性は、陽性及び陰性の全乳癌組織切片の代表的試料を標識することにより確認した。
【０２１０】
（結果）
有意に向上したＳＮ比は最適化された染色試薬の条件（データ示さず）と共に観察された。
【０２１１】
（実施例７：臨床試料中のバイオマーカーのリアルタイムＰＣＲ検出）
ＴａｑＭａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲをＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７７００Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて実施した。プライマー及びプローブは、本試験においてターゲティングされた乳房病気分類マーカー（例えばＤＡＲＰＰ３２及びＮＤＲＧ−１）の特異的増幅のためにＰｒｉｍｅｒ  ＥｘｐｒｅｓｓＴＭプログラム、バージョン１．５（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を使用しながら設計した。プライマー及びプローブに関する配列情報を以下に示す。
【０２１２】
（ＤＡＲＰＰ３２：）
フォワードプライマー名：ＤＡＲＰＰ３２＿ｔ１−Ｆ
配列：ＴＡＣＡＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＧＣＴＧＡＡＡＧ（配列番号３３）
リバースプライマー名：ＤＡＲＰＰ３２＿ｔ１−Ｒ
配列：ＧＧＣＣＴＧＧＴＴＣＴＣＡＴＴＣＡＡＡＴＴＧ（配列番号３４）
ＴａｑＭａｎプローブ名：ＤＡＲＰＰ３２＿ｔ１−プローブ
配列：ＣＧＣＡＴＴＧＣＴＧＡＧＴＣＴＣＡＣＣＴＧＣＡＧＴＣ（配列番号３５）
フォワードプライマー名：ＤＡＲＰＰ３２＿ｔ２−Ｆ
配列：ＣＡＧＣＣＴＴＡＣＡＧＡＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡ（配列番号３６）
リバースプライマー名：ＤＡＲＰＰ３２＿ｔ２−Ｒ
配列：ＧＡＧＧＣＴＣＡＧＧＧＡＣＣＣＡＡＡＧ（配列番号３７）
ＴａｑＭａｎプローブ名：ＤＡＲＰＰ３２＿ｔ２−プローブ
配列：ＣＣＡＡＡＣＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＴ（配列番号３８）
（ＮＤＲＧ−１：）
フォワードプライマー名：ＮＤＲＧ−１−Ｆ
配列：ＣＣＴＡＣＣＧＣＣＡＧＣＡＣＡＴＴＧＴ（配列番号３９）
リバースプライマー名：ＮＤＲＧ−１−Ｒ
配列：ＧＣＴＧＴＴＧＴＡＧＧＣＡＴＴＧＡＴＧＡＡＣＡ（配列番号４０）
ＴａｑＭａｎプローブ名：ＮＤＲＧ−１−プローブ
配列：ＡＡＴＧＡＣＡＴＧＡＡＣＣＣＣＧＧＣＡＡＣＣＴＧ（配列番号４１）
プローブは５’塩基上では蛍光染料ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）で、そして３’塩基上ではクエンチング染料ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）で標識した。アンプリコンの大きさは約１００ｂｐであった。１８ＳリボソームＲＮＡを内因性対照に適用した。１８ＳｒＲＮＡプローブを蛍光染料ＶＩＣで標識した。前発色させた１８ＳｒＲＮＡプライマー／プローブ混合物をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐ／Ｎ：４３１０８９３Ｅ）から購入した。２０凍結乳房組織（即ち６転帰不良腫瘍、１２転帰良好腫瘍、及び２正常組織）を本試験において分析した。本試験においては、転帰良好とは少なくとも５年間癌非存在存続として定義し、転帰不良は５年以内に疾患の回帰、再発又は死亡に至ったものとして定義した。凍結乳房組織から抽出した全ＲＮＡ５μｇを、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡＡｒｃｈｉｖｅ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐ／Ｎ：４３２２１７１）を用いることにより、ランダムヘキサマー（オリゴｄＴではない）を有する一本鎖ｃＤＮＡ型に定量的に変換した。以下の反応試薬を製造した。
【０２１３】
（プライマー／プローブの２０Ｘマスターミックス（２００μｌ中））
１８０μＭフォワードプライマー：２０μｌ
１８０μＭリバースプライマー：２０μｌ
１００μＭＴａｑＭａｎプローブ：１０μｌ
Ｈ２Ｏ：１５０μｌ
（最終反応ミックス（２５μｌ／ウェル））
プライマー／プローブの２０Ｘマスターミックス：１．２５μｌ
２ＸＴａｑＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲマスターミックス（Ｐ／Ｎ：４３０４４３７）：１２．５μｌ
ｃＤＮＡ鋳型：５．０μｌ
Ｈ２Ｏ：６．２５μｌ
２０ＸＴａｑＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲマスターミックスをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐ／Ｎ：４３０４４３７）より購入した。総容量２５μｌ中の最終プライマー及びプローブ濃度はそれぞれ０．９μＭ及び０．２５μＭとした。全ＲＮＡ１０ｎｇを反応の各ウェルに適用した。増幅条件は５０℃２分間、９５℃１０分間、及び、２工程サイクルとしての１５秒９５℃及び６０秒６０℃を合計４０サイクルとした。各施行において少なくとも３つの非鋳型対照反応混合物を使用した。全ての実験を３連で実施した。
【０２１４】
各反応の終了時に記録した蛍光強度を用いて以下の計算を行った。即ち、Ｒｎ＋は全ての成分を含有する反応のＲｎ値であり、Ｒｎ−は未反応試料のＲｎ値であり（ベースライン値又はＮＴＣで検出された値）である。ΔＲｎはＲｎ＋とＲｎ−の差である。これはＰＣＲにより発生するシグナルの大きさの指標である。標的遺伝子の発現濃度は比較ＣＴ法により計算した。この方法は既知量の標準物質を使用しないが、選択された比較対照値に標的配列の相対量を比較する（１８ＳｒＲＮＡをこの試験では比較対照として選択した）。ＭＳＥｘｃｅｌ系のデータ分析に関して詳細な説明書を含んでいるＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＴａｑＭａｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｐｌａｔｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌを参照できる。
【０２１５】
（結果）
各バイオマーカーを用いて、そして特定のプライマーを用いて得られた結果を以下の表に示す。正常乳房組織試料から得られた結果はＮと標記し；乳癌試料から得られたものはＴと標示した。
【０２１６】
（表４１：ＤＡＲＰＰ３２ＴａｑＭａｎ（登録商標）結果）
【０２１７】
【表４１】
2008513032.tif 000046
ＤＡＲＰＰ３２は２つの転写物、ｔ１及びｔ２を有する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）のデータによれば、ｔ１及びｔ２は両方とも、転帰良好を有するものと比較して転帰不良（太字）を有する乳房腫瘍において過剰発現されていた。
【０２１８】
（表４２：ＮＤＲＧ−１ＴａｑＭａｎ（登録商標）結果）
【０２１９】
【表４２】
2008513032.tif 000047
ＮＤＲＧ−１は１つの転写物を有する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）のデータによれば、ＮＤＲＧ−１は転帰良好を有するものと比較して転帰不良（太字）を有する乳房腫瘍において過剰発現されていた。
【０２２０】
（実施例８：１０年臨床フォローアップによる化学療法ナイーブな患者集団におけるバイオマーカー過剰発現の検出（５バイオマーカーパネル））
本試験においては２５５例の早期乳癌患者から初回診断時又はその近傍において収集された乳房腫瘍組織試料をバイオマーカー過剰発現について分析した。１０年臨床フォローアップデータは試験における全患者について入手可能であった。乳癌の治療の期間中のいずれの時点においても細胞毒性化学療法を受けた患者はいなかった。患者集団に関する臨床的人口統計学的特徴、分布及び標準的組織病理学的パラメーター（例えばＥＲ／ＰＲホルモン受容体状態、組織学的等級等）は以下の表４３に総括する。
【０２２１】
（表４３：化学療法ナイーブな患者集団の臨床特徴）
【０２２２】
【表４３】
2008513032.tif 000048
ＳＬＰＩ、ｓｒｃ、ＰＳＭＢ９、ｐ２１ｒａｓ及びＥ２Ｆ１を包含する５つのバイオマーカーパネルの発現の検出は本質的に上記した通り実施した。即ち、実施例１に記載の通りＤａｋｏ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒを用いながら乳房腫瘍試料を作成しバイオマーカー発現について染色した。バイオマーカー過剰発現は実施例４に記載の画像化分析を用いて測定した。
【０２２３】
５バイオマーカーパネルの予後判定性能はＣｏｘ  Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  Ｈａｚａｒｄｓ  Ｍｏｄｅｌ  ａｎａｌｙｓｉｓを利用して検査した。例えば上出のＳｐｒｕａｎｃｅ  ｅｔ  ａｌを参照できる。各バイオマーカーの予後値及び／又は１０年後無疾患の患者を超えた１０年以内に疾患再発又は死亡に至った患者を発見するための組織学的特性を計算した。バイオマーカーパネルを用いない分析においては、年齢及び腫瘍の大きさはｐ値＜０．０５で独立した診断要因であることがわかった。バイオマーカーをこの分析に付加させた場合、それらはｐ値＜０．０００１で最高の統計学的に有意な独立した診断上の利用性を示した。Ｃｏｘ  Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  Ｈａｚａｒｄｓ分析の結果は表４４に総括する通りである。
【０２２４】
（表４４：化学療法ナイーブの患者集団を用いたＣｏｘ  Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  Ｈａｚａｒｄｓ分析の結果（ＳＬＰＩ、ｓｒｃ、ＰＳＭＢ９、ｐ２１ｒａｓ及びＥ２Ｆ１バイオマーカーパネル））
【０２２５】
【表４４】
2008513032.tif 000049
ＳＬＰＩ、ｓｒｃ、ＰＳＭＢ９、ｐ２１ｒａｓ及びＥ２Ｆ１バイオマーカーパネルの診断性能を図３にＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットとしてグラフ標示する。ｘ軸は初回診断からの年数を表し、ｙ軸は無疾患生存のパーセントである。バイオマーカー分析とは無関係の一般的な乳癌集団に関する相当するグラフを図４に示す。これらのプロットは疾患の再発及び／又は原発疾患による死亡についてこの早期の乳癌患者集団をリスク層別するこのバイオマーカーパネルの能力を示している。再発及び／又は原発疾患による死亡の危険性は患者試料中で過剰発現するバイオマーカーの数が増大するに従って上昇する。過剰発現したバイオマーカーの数により発見された患者サブ集団の無疾患生存率は、０陽性、１陽性、２陽性、３以上陽性バイオマーカー群の比較のためのｌｏｇ−ｒａｎｋ試験により測定した場合、ｐ値＜０．００１で相互に統計学的有意であった。本明細書に記載した画像化分析により過剰発現と分類されたバイオマーカーは「陽性」とみなす。
【０２２６】
乳癌患者の診断の最も重要な臨床的特徴の１つはエストロゲン受容体（ＥＲ）状態に関連しているため、ＥＲ陽性及び陰性の患者サブ集団においてＣｏｘ  Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  Ｈａｚａｒｄｓ分析を用いてＳＬＰＩ、ｓｒｃ、ＰＳＭＢ９、ｐ２１ｒａｓ及びＥ２Ｆ１バイオマーカーパネルの予後判定性能を更に検査した。これらの２つのサブ集団の臨床経過管理及び予後は、ＥＲ陽性患者がタモキシフェン療法の候補であるのに対し、ＥＲ陰性患者は異なるために、相違している。分析結果は以下の表４５に総括する。データはＥＲ陽性及び陰性の乳癌患者サブ集団の両方において目的の５バイオマーカーが予後の利用性を有していることを示している。従って、バイオマーカーＳＬＰＩ、ｓｒｃ、ＰＳＭＢ９、ｐ２１ｒａｓ及びＥ２Ｆ１は患者のＥＲの状態とは無関係に予後を示すものであるが、これらのバイオマーカーはＥＲの状態と相関してもいる。
【０２２７】
（表４５：化学療法ナイーブの患者集団を用いたＣｏｘ  Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  Ｈａｚａｒｄｓ分析の結果（ＥＲ陽性及び陰性の患者サブ集団におけるＳＬＰＩ、ｓｒｃ、ＰＳＭＢ９、ｐ２１ｒａｓ及びＥ２Ｆ１バイオマーカーパネル））
【０２２８】
【表４５】
2008513032.tif 000050
（実施例９：１０年臨床フォローアップによる化学療法ナイーブの患者集団におけるバイオマーカーの過剰発現の検出（６バイオマーカーパネル））
実施例８に記載した化学療法ナイーブの患者集団からの１００患者（５０転帰良好；５０転帰不良患者）に由来する乳房腫瘍組織試料を目的の６バイオマーカー（ＳＬＰＩ、ｓｒｃ、ＰＳＭＢ９、ｐ２１ｒａｓ、Ｅ２Ｆ１及びＭＵＣ−１）のバイオマーカー過剰発現に関して分析した。６バイオマーカーパネルの発現の検出は代替の染色プラットホームＶｅｎｔａｎａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  ＸＴをＤａｋｏ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒの代わりに使用した以外は、本質的に上記した通りの自動化免疫組織化学的方法により実施した。Ｖｅｎｔａｎａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  ＸＴの操作に関する標準的なマニュアルは製造元より容易に入手できる。Ｖｅｎｔａｎａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  ＸＴ染色プラットホームと共に使用した免疫組織化学的パラメーターへの追加的変更を以下の表４６に総括する。バイオマーカー過剰発現は実施例４に記載した画像化分析を用いて前述の通り測定した。
【０２２９】
（表４６：Ｖｅｎｔａｎａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  ＸＴ染色プラットホームを用いたバイオマーカー染色に関する免疫組織化学的パラメーター）
【０２３０】
【表４６】
2008513032.tif 000051
＊ＣＣ１及びＣＣ２はＶｅｎｔａｎａから販売されている市販の細胞コンデショニング試薬を指す。抗原賦活時間に関しては、短縮＝３０分；標準＝６０分；及び延長＝９０分である。
【０２３１】
６バイオマーカーパネルの予後判定性能は上記した通りＣｏｘ  Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  Ｈａｚａｒｄｓ  Ｍｏｄｅｌ分析を用いて検査した。各バイオマーカーの予後値及び／又は１０年後無疾患の患者を超えた１０年以内に疾患再発又は死亡に至った患者を発見するための組織学的特性を計算した。目的のバイオマーカー（ＳＬＰＩ、ｓｒｃ、ＰＳＭＢ９、ｐ２１ｒａｓ、Ｅ２Ｆ１及びＭＵＣ−１）はｐ値０．０２２０で統計学的に有意な予後利用性を示した。Ｃｏｘ  Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  Ｈａｚａｒｄｓ分析の結果は以下の表４７に総括する。
【０２３２】
（表４７：化学療法ナイーブの患者集団を用いたＣｏｘ  Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  Ｈａｚａｒｄｓ分析の結果（ＳＬＰＩ、ｓｒｃ、ＰＳＭＢ９、ｐ２１ｒａｓ、Ｅ２Ｆ１及びＭＵＣ−１バイオマーカーパネル））
【０２３３】
【表４７】
2008513032.tif 000052
ＳＬＰＩ、ｓｒｃ、ＰＳＭＢ９、ｐ２１ｒａｓ、Ｅ２Ｆ１及びＭＵＣ−１バイオマーカーパネルの予後判定性能を図５にＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットとしてグラフ標示する。ｘ軸は初回診断からの年数を表し、ｙ軸は無疾患生存のパーセントである。これらのプロットは疾患の再発及び／又は原発疾患による死亡についてこの早期の乳癌患者集団をリスク層別するこのバイオマーカーパネルの能力を示している。再発及び／又は原発疾患による死亡の危険性は患者試料中で過剰発現するバイオマーカーの数が増大するに従って上昇する。過剰発現したバイオマーカーの数により発見された患者サブ集団の無疾患生存率は、０陽性、１陽性、２陽性、３以上陽性バイオマーカー群の比較のためのｌｏｇ−ｒａｎｋ試験により測定した場合、ｐ値＜０．００６５で相互に統計学的有意であった。上記した通り本明細書に記載した画像化分析により過剰発現と分類されたバイオマーカーは「陽性」とみなす。
【０２３４】
（表４８：バイオマーカーヌクレオチド及びアミノ酸配列の情報）
【０２３５】
【表４８】
2008513032.tif 000053
明細書において言及した全ての出版物及び特許出願は本発明が関係する技術分野の当業者の水準を示している。全ての出版物及び特許出願はそれらの個々の出版物及び特許出願が特に、そして個別に、参照により本明細書に組み込まれた場合と同じ程度まで参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３６】
上記した本発明は理解を明確化する目的のために説明及び例示によりある程度詳述したが、特定の変更及び変形は添付する請求項の範囲内で実施してよいことは当然である。
【図面の簡単な説明】
【０２３７】
【図１】図１は実際の乳癌の転帰の関数としての強度２で染色された細胞のパーセンテージの分布を示す。実験の詳細は実施例４に示す。
【図２】図２はＳＬＰＩ／ｐ２１ｒａｓ／Ｅ２Ｆ１／ＰＳＭＢ９／ｓｒｃ／ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ２７の組み合わせに関する順序にもとづいた解釈方法を用いて得られたＲＯＣ曲線を示す。実験の詳細は実施例５に示す。
【図３】図３はＳＬＰＩ、ｓｒｃ、ＰＳＭＢ９、ｐ２１ｒａｓ及びＥ２Ｆ１バイオマーカーパネルの予後判定性能に関するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを示す。実験の詳細は実施例８に示す。
【図４】図４はバイオマーカー過剰発現の分析とは無関係の一般的乳癌患者集団に関する長期生存のグラフ標示を示す。実験の詳細は実施例８に示す。
【図５】図５はＳＬＰＩ、ｓｒｃ、ＰＳＭＢ９、ｐ２１ｒａｓ、Ｅ２Ｆ１及びＭＵＣ−１バイオマーカーパネルの予後判定性能に関するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを示す。実験の詳細は実施例９に示す。
【図１】
2008513032.tif 000054
【図２】
2008513032.tif 000055
【図３】
2008513032.tif 000056
【図４】
2008513032.tif 000057
【図５】
2008513032.tif 000058
【配列表】
2008513032000001.app
【国際調査報告】
2008513032.tif 000059
2008513032.tif 000060
2008513032.tif 000061
2008513032.tif 000062
2008513032.tif 000063