(57)【要約】本発明は、NO依存的健康状態の治療または予防、高血圧、心血管疾患、冠動脈疾患、糖尿病、認知機能障害および／または血管循環器系疾患の治療、心臓発作、脳卒中、うっ血性心不全および／または腎不全の予防または危険性の低減、あるいは腎血流等の血流の改善のためのヒトまたは動物の予防的または治療的処置のための、二量体ジガレートを含む医薬品、食品、食品添加物または栄養補助食品といった組成物、ならびにその使用方法に関するものである。組成物は、必要に応じて他のNO 調節剤および／または血管の保護剤もしくは治療剤を含んでいてよく、あるいはそのような薬剤と組み合わせて投与してもよい。
2008502691.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療上有効量のEC-(4β→8)-Cジガレートを含む医薬組成物。
【請求項２】
EC-(4β→8)-Cジガレートが(-)EC-(4β→8)-(+)Cジガレートであることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
他のNO 調節剤および／または血管の保護剤もしくは治療剤をさらに含むことを特徴とする請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項４】
治療上有効量のC-(4α→8)-Cジガレートを含む医薬組成物。
【請求項５】
C-(4α→8)-Cジガレートが(+)C-(4α→8)-(+)Cジガレートであることを特徴とする請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
他のNO 調節剤および／または血管の保護剤もしくは治療剤をさらに含むことを特徴とする請求項４または５記載の医薬組成物。
【請求項７】
治療上有効量のC-(4β→8)-Cジガレートを含む医薬組成物。
【請求項８】
C-(4β→8)-Cジガレートが(+)C-(4β→8)-(+)Cジガレートであることを特徴とする請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
他のNO 調節剤および／または血管の保護剤もしくは治療剤をさらに含むことを特徴とする請求項７または８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
治療上有効量のC-(4β→8)-ECジガレートを含む医薬組成物。
【請求項１１】
C-(4β→8)-ECジガレートが(+)C-(4β→8)-(-)ECジガレートであることを特徴とする請求項７記載の医薬組成物。
【請求項１２】
他のNO 調節剤および／または血管の保護剤もしくは治療剤をさらに含むことを特徴とする請求項１０または１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
治療上有効量のC-(4α→8)-Cを含む医薬組成物。
【請求項１４】
C-(4α→8)-Cが(+)C-(4α→8)-(+)Cであることを特徴とする請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
他のNO 調節剤および／または血管の保護剤もしくは治療剤をさらに含むことを特徴とする請求項１３または１４記載の医薬組成物。
【請求項１６】
有効量のEC-(4β→8)- Cジガレートまたは薬剤として許容されるその塩もしくは誘導体を、必要とするヒトまたは動物の対象に投与することによって、NO依存的疾患または障害を治療または予防する方法。
【請求項１７】
前記対象がヒトであることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
EC-(4β→8)-Cジガレートが(-)EC-(4β→8)-(+)Cジガレートであることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
NO依存的疾患または障害が、高血圧、心血管疾患、冠動脈疾患、血管循環器系疾患、糖尿病、認知機能障害および／または腎疾患であることを特徴とする請求項１６または１８いずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が、心臓発作、脳卒中、うっ血性心不全および／または腎不全の危険性を有するものであることを特徴とする請求項１６から１８いずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
前記対象が、糖尿病、肥満、高脂血症および／または喫煙習慣のいずれかと共に高血圧症を患っていることを特徴とする請求項１６から１８いずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
有効量のC-(4α→8)-Cジガレートまたは薬剤として許容されるその塩もしくは誘導体を、必要とするヒトまたは動物の対象に投与することによって、NO依存的疾患または障害を治療または予防する方法。
【請求項２３】
前記対象がヒトであることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
C-(4α→8)-Cジガレートが(+)C-(4α→8)-(+)C Cジガレートであることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
NO依存的疾患または障害が、高血圧、心血管疾患、冠動脈疾患、血管循環器系疾患、糖尿病、認知機能障害および／または腎疾患であることを特徴とする請求項２２から２４いずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
前記対象が、心臓発作、脳卒中、うっ血性心不全および／または腎不全の危険性を有するものであることを特徴とする請求項２２から２４いずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
前記対象が、糖尿病、肥満、高脂血症および／または喫煙習慣のいずれかと共に高血圧症を患っていることを特徴とする請求項２２から２４いずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
有効量のC-(4β→8)-Cジガレートまたは薬剤として許容されるその塩もしくは誘導体を、必要とするヒトまたは動物の対象に投与することによって、NO依存的疾患または障害を治療または予防する方法。
【請求項２９】
前記対象がヒトであることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
C-(4β→8)-Cジガレートが(+)C-(4β→8)-(+)Cジガレートであることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項３１】
NO依存的疾患または障害が、高血圧、心血管疾患、冠動脈疾患、血管循環器系疾患、糖尿病、認知機能障害および／または腎疾患であることを特徴とする請求項２８から３０いずれか１項記載の方法。
【請求項３２】
前記対象が、心臓発作、脳卒中、うっ血性心不全および／または腎不全の危険性を有するものであることを特徴とする請求項２８から３０いずれか１項記載の方法。
【請求項３３】
前記対象が、糖尿病、肥満、高脂血症および／または喫煙習慣のいずれかと共に高血圧症を患っていることを特徴とする請求項２８から３０いずれか１項記載の方法。
【請求項３４】
有効量のC-(4β→8)- ECジガレートまたは薬剤として許容されるその塩もしくは誘導体を、必要とするヒトまたは動物の対象に投与することによって、NO依存的疾患または障害を治療または予防する方法。
【請求項３５】
前記対象がヒトであることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
C-(4β→8)- ECジガレートが(+)C-(4β→8)-(-)ECジガレートであることを特徴とする請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
NO依存的疾患または障害が、高血圧、心血管疾患、冠動脈疾患、血管循環器系疾患、糖尿病、認知機能障害および／または腎疾患であることを特徴とする請求項３４から３６いずれか１項記載の方法。
【請求項３８】
前記対象が、心臓発作、脳卒中、うっ血性心不全および／または腎不全の危険性を有するものであることを特徴とする請求項３４から３６いずれか１項記載の方法。
【請求項３９】
前記対象が、糖尿病、肥満、高脂血症および／または喫煙習慣のいずれかと共に高血圧症を患っていることを特徴とする請求項３４から３６いずれか１項記載の方法。
【請求項４０】
有効量のC-(4α→8)-Cまたは薬剤として許容されるその塩もしくは誘導体を、必要とするヒトまたは動物の対象に投与することによって、NO依存的疾患または障害を治療または予防する方法。
【請求項４１】
前記対象がヒトであることを特徴とする請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
C-(4α→8)-Cが(+)C-(4α→8)-(+)Cであることを特徴とする請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
NO依存的疾患または障害が、高血圧、心血管疾患、冠動脈疾患、血管循環器系疾患、糖尿病、認知機能障害および／または腎疾患であることを特徴とする請求項４０から４２いずれか１項記載の方法。
【請求項４４】
前記対象が、心臓発作、脳卒中、うっ血性心不全および／または腎不全の危険性を有するものであることを特徴とする請求項４０から４２いずれか１項記載の方法。
【請求項４５】
前記対象が、糖尿病、肥満、高脂血症および／または喫煙習慣のいずれかと共に高血圧症を患っていることを特徴とする請求項４０から４２いずれか１項記載の方法。
【請求項４６】
有効量のEC-(4β→8)-Cジガレートまたは薬剤として許容されるその塩もしくは誘導体を、必要とするヒトまたは動物の対象に投与することによって、NO依存的疾患または障害を治療または予防する方法。
【請求項４７】
前記対象がヒトであることを特徴とする請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
EC-(4β→8)-Cジガレートが(-)EC-(4β→8)-(+)Cジガレートであることを特徴とする請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
前記対象が、糖尿病、肥満、高脂血症および／または喫煙習慣のいずれかと共に高血圧症を患っていることを特徴とする請求項４６から４８いずれか１項記載の方法。
【請求項５０】
有効量のC-(4α→8)-Cジガレートまたは薬剤として許容されるその塩もしくは誘導体を、必要とするヒトまたは動物の対象に投与することによって、高血圧を治療する方法。
【請求項５１】
前記対象がヒトであることを特徴とする請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
C-(4α→8)-Cジガレートが(+)C-(4α→8)-(+)Cジガレートであることを特徴とする請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
前記対象が、糖尿病、肥満、高脂血症および／または喫煙習慣のいずれかと共に高血圧症を患っていることを特徴とする請求項５０から５２いずれか１項記載の方法。
【請求項５４】
有効量のC-(4β→8)-Cジガレートまたは薬剤として許容されるその塩もしくは誘導体を、必要とするヒトまたは動物の対象に投与することによって、高血圧を治療する方法。
【請求項５５】
前記対象がヒトであることを特徴とする請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
C-(4β→8)-Cジガレートが(+)C-(4β→8)-(+)Cジガレートであることを特徴とする請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
前記対象が、糖尿病、肥満、高脂血症および／または喫煙習慣のいずれかと共に高血圧症を患っていることを特徴とする請求項５４から５６いずれか１項記載の方法。
【請求項５８】
有効量のC-(4β→8)- ECジガレートまたは薬剤として許容されるその塩もしくは誘導体を、必要とするヒトまたは動物の対象に投与することによって、高血圧を治療する方法。
【請求項５９】
前記対象がヒトであることを特徴とする請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
C-(4β→8)- ECジガレートが(+)C-(4β→8)-(-)ECジガレートであることを特徴とする請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
前記対象が、糖尿病、肥満、高脂血症および／または喫煙習慣のいずれかと共に高血圧症を患っていることを特徴とする請求項５８から６０いずれか１項記載の方法。
【請求項６２】
有効量のC-(4α→8)-Cまたは薬剤として許容されるその塩もしくは誘導体を、必要とするヒトまたは動物の対象に投与することによって、高血圧を治療する方法。
【請求項６３】
前記対象がヒトであることを特徴とする請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
C-(4α→8)-Cが(+)C-(4α→8)-(+)Cであることを特徴とする請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
対象が、糖尿病、肥満、高脂血症および／または喫煙習慣のいずれかと共に高血圧症を患っていることを特徴とする請求項６２から６４いずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトまたは動物の予防的または治療的処置のための、プロシアニジン二量体および／または二量体ジガレート(dimer digallate)を含む組成物およびその使用方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ポリフェノールとは、極めて多様な化合物の総称である(非特許文献１)。これらは、様々な植物内に広く存在し、中には食物連鎖のサイクルにも入ってくるものもある。これらの化合物が、ヒトの食事療法において重要な位置を占める場合もある。ポリフェノールの幾つかは栄養学的には無価値なものと考えられているが、健康に良好な効果を与え得るためこれらの化合物に対する関心は高まってきている。例えば、実験動物を使用した研究では、クエルセチン（フラボノイドの１つ）に抗ガン活性があることが示されている(非特許文献２、および非特許文献３)。(+)-カテキンと(-)-エピカテキン(フラバン-3-オール)は、白血病ウィルスの逆転写酵素活性を阻害することが示されている(非特許文献４)。ノボタニン（Nobotanin）(低重合性の加水分解性タンニン)もまた、抗腫瘍活性を持つことが示されている(Okuda等、第１６回国際ポリフェノール会議、リスボン、ポルトガル、１９９２年７月１３-１６にて発表)。プロシアニジンオリゴマーは、キッコーマン株式会社によって抗変異原性物質としての使用が報告されている(特許文献１；１９９２年、７月７日)。
【０００３】
一酸化窒素(NO)は、血小板凝集、単球の接着と遊走、および、アテロームの発生過程で必ず生じる血管平滑筋組織の増殖を阻害することが知られている。NOは酸素フリーラジカルと反応するため、アテローム組織におけるNOの濃度は低下するであろう。この反応がもたらすNO の損失により、血小板および炎症細胞の血管壁への接着が亢進し、NOによる弛緩作用はさらに損なわれてしまう。このように、NOの損失は、アテロームの発生を促進し、ひいては病状を進行させることになり得る。
【０００４】
高血圧（症）とは、血管内を循環している血液の圧力が、基準値よりも高い状態をいう。最大血圧が150 mm Hg を超える、あるいは最小血圧が90 mm Hg を超える状態が続くと、体は損傷を受ける。高血圧は、脳卒中、心臓発作、心不全、および腎不全を含む血管疾患をまねく原因となる。例えば、最大血圧が過度に高いと、血管が任意の部分で破裂してしまうことにもなる。脳内で破裂が起こったのが、脳卒中である。高血圧はまた、血管の肥厚化と狭細化も引き起こし、これはアテロームの発生をもたらし得る。また、高血圧では、心臓から血液を送り出すとき上昇した安静時（最小）血圧に打ち勝つために心臓により高い負荷がかかるため、心筋の肥大化も起こる。この肥大化は、最終的には不整脈または心不全を引き起こし得る。高血圧は自覚症状がなく、血圧を測った時にしか認識されないことから、“沈黙の殺人者”と呼ばれている。
【０００５】
血圧調節は複雑な機構であり、その内の１つに血管内皮型一酸化窒素合成酵素または eNOSとして知られる、Ca2+/カルモジュリン依存性の一酸化窒素合成酵素(NOS)の構成的な発現がある。この酵素によって産生されたNOは、血管中の平滑筋を弛緩（血管拡張）させ、血圧を降下させる。阻害剤、またはアテローム性動脈硬化症のような病理状態によりNO産生が阻害され、NOの循環濃度が低下すると、血管の筋肉は適切に弛緩することが難しくなる。結果として起こる血管収縮により、血圧は上昇し、高血圧に伴う幾つかの病態をもたらし得る。
【０００６】
高血圧とそれに関連する脈管系の病気・疾患に悩まされているヒトが多くいることから、NO量を健康的な正常レベルに維持する治療方法に多大な関心が寄せられている。いまだにニトログリセリンや硝酸イソソルビドといったNOを放出する薬剤が、血管弛緩治療において主要な位置を占めている。本出願は、高血圧のようなNO依存的疾患および障害(NO-responsive disease or disorder)を、治療および／または予防するのに有用な新しい化合物を発見したものである。
【非特許文献１】Ferriera et al., Tetrahedron, 48:10, 1743-1803,1992
【非特許文献２】Deshner et al., Carcinogenesis, 7: 1193-1196, 1991
【非特許文献３】Katoet et al., Carcinogenesis, 4, 1301- 1305 1983
【非特許文献４】Chu et al., J. of Natural Prod., 55: 2, 179-183,1992
【特許文献１】特開平04-190774号公報
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、例えば、EC-(4β→8)-Cジガレート 、C-(4α-8)-Cジガレート 、C-(4β→8)-Cジガレート 、およびC-(4β→8)-ECジガレート のような二量体ジガレート(以後、“本発明の二量体ジガレート”と呼ぶ)を含む組成物、構成単位である単量体間に4α→8結合等のアルファ結合が存在するC-(4α→8)-Cのような二量体、および、ヒトまたは動物の病気を予防や治療するためのこれらの使用方法に関するものである。ここで使用するECはエピカテキンを、Cはカテキンを意味する。
【０００８】
１つの態様においては、本発明は、有効量の本発明の二量体ジガレートを含む医薬品、食品添加物、または栄養補助食品といった組成物に関するものである。組成物は、必要に応じて他のNO 調節剤および／または血管(心血管を含む)の保護剤もしくは治療剤を含んでいてもよい。あるいはこのような薬剤と組み合わせて投与されてもよい。
【０００９】
上記の組成物と、NO依存的健康状態の治療または予防、高血圧、心血管疾患、冠動脈疾患、糖尿病(１型と２型)、認知機能障害および／または血管循環器系疾患の治療または予防、心臓発作、脳卒中、うっ血性心不全および／または腎不全の予防または危険性の低減、あるいは腎血流等の血流の改善に使用するためのラベルおよび／または使用説明書とを含む梱包製品もまた本発明の範囲内に入る。
【００１０】
別の態様においては、本発明は、本発明の二量体ジガレートおよび／または構成単位の単量体間に4α→8結合等のアルファ結合が存在するC-(4α→8)-Cのような二量体を、NO依存的健康状態、高血圧、心血管疾患、冠動脈疾患、糖尿病(１型と２型)、認知機能障害および／または血管循環器系疾患（脳内疾患を含む）の治療または予防、心臓発作、脳卒中、うっ血性心不全および／または腎不全の予防または危険性の低減、あるいは腎血流等の血流の改善に使用する方法に関するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本出願中で引用されている全ての特許、特許出願および参考文献は、これらの参照により開示に含まれる。一致しない記載があった場合は、本開示に準拠するものとする。
【００１２】
本発明は、有効量の二量体ジガレートまたは薬剤として許容されるその塩もしくは誘導体を含む組成物に関するものである。
【００１３】
本発明の二量体ジガレートは、以下の式で表されるフラバン-3-オール構成単位が２つ重合したプロシアニジン二量体の没食子酸（ガレート）エステルである：
【化１】
2008502691.tif 000003
式中、RはO-ガレートである。Rは、αまたはβ立体異性体のいずれかを持ち、構成単位である単量体が4→6位または4→8位のフラバン間結合でつながっており、各々αまたはβ立体異性体のいずれかを持つ。構成単位であるフラバン-3-オール(単量体)は、(+)-カテキン、(-)-エピカテキンおよびそれぞれのエピマー(例えば、(-)-カテキンおよび(+)-エピカテキン)であってもよい。従って、ある実施形態においては、本発明の二量体ジガレートは以下のような構造をとる：
【化２】
2008502691.tif 000004
【００１４】
また、他の単量体単位につながっていないC-4、C-6 またはC-8が、必要に応じて任意の位置でエステル結合等によってフェノール部分に置換されている糖によって誘導体化された二量体ジガレートの誘導体も本発明の範囲内に含まれる。糖は、グルコース、ガラクトース、ラムノース、キシロース、およびアラビノースよりなる群から選択され得る。糖は、単糖類または二糖類であることが好ましい。フェノール部は、カフェ酸、桂皮酸、クマール酸、フェルラ酸、没食子酸（ガレート）、ヒドロキシ安息香酸およびシナピン酸よりなる群から選ばれる。
【００１５】
１つの実施形態においては、二量体ジガレートは、EC-(4β→8)-Cジガレートまたは薬剤として許容されるその塩もしくは誘導体である。例えば、二量体は、(-)EC-(4β→8)-(+)Cジガレート であり、以下の式で表される： 
【化３】
2008502691.tif 000005
【００１６】
別の実施形態においては、EC-(4β→8)-Cジガレートは、(-)EC-(4β→8)-(-)Cジガレートでもよい。
【００１７】
別の実施形態においては、二量体ジガレートは、C-(4α→8)-Cジガレートまたは薬剤として許容されるその塩もしくは誘導体である。例えば、二量体は、(+)C-(4α→8)-(+)Cジガレートであり、以下の式で表される：
【化４】
2008502691.tif 000006
【００１８】
さらに別の実施形態においては、二量体ジガレートは、C-(4β→8)-Cジガレートまたは薬剤として許容されるその塩もしくは誘導体である。例えば、二量体は、(+)C-(4β→8)-(+)Cであり、以下の式で表される：
【化５】
2008502691.tif 000007
【００１９】
さらに別の実施形態においては、二量体ジガレートは、C-(4β→8)-ECジガレートまたは薬剤として許容されるその塩もしくは誘導体である。例えば、二量体は、(+)C-(4β→8)-(+)ECジガレートであり、以下の式で表される：
【化６】
2008502691.tif 000008
【００２０】
他の実施形態においては、構成単位の単量体間に4α→8結合等のアルファ結合が存在するC-(4α→8)-Cのような二量体、あるいは薬剤として許容されるその塩または誘導体が、本発明の範囲に入る。このような二量体は、例えば、(+)C-(4α→8)-(+)Cである。
【００２１】
本発明の二量体および二量体ジガレートは、天然に存在するものまたは合成したものでもよい。これらは、公知の方法を用いて、既知の植物原料から単離され得る。例えば、Nonaka等、Chem.Pharm. Bull., 29: 2862-2870(1981)およびKashavada等、Chem. Pharm. Bull., 34: 4083-4091(1986)（各々の関連部分はこの参照により開示に含まれる）に記載のように、二量体ジガレートはルバーブから単離され得る。ルバーブ(ダイオウ)には、二量体ジガレートが含まれていることが示されている。低分子量のフェノール物質を主成分とする市販のルバーブには、他の多様なフェノール化合物と共に二量体ジガレート類が含まれている。
【００２２】
本発明の二量体および二量体ジガレートは、合成されたものでもよい。例えば、構成単位である２つの単量体は、米国特許第 6,420,572 B1号（この参照により開示に含まれる）に記載の方法を用いて結合されエステル化されてもよい。これには、フェノール基を保護された単量体と活性化された単量体との結合が含まれる。実施例１を参照。
【００２３】
本発明の二量体および二量体ジガレートは、単離および精製されてもよい。すなわち、コンタミしている化合物量（不純物）が二量体ジガレートの効果に影響を与えない、または効果を減じない程度にまで、それらを天然に含む化合物から分離するか（二量体ジガレートが天然由来の場合）、あるいは合成されてもよい。例えば、単離および精製した本発明の二量体ジガレートは、工業用に利用されている精製および分離技術によって達成可能な程度まで、他の天然のプロシアニジンとポリフェノールから分離される。化合物は、実質的に純粋、すなわち、利用できる精製、分離および／または合成技術によって達成可能な最高レベルの均質性を持てばよい。ここで使用する“実質的に純粋な二量体ジガレート”は、他のプロシアニジンとポリフェノールから技術的および工業的に可能な程度まで分離されるが、幾つかの二量体の混合物を含んでいてもよい。言い換えれば、“単離および精製された二量体”という言い方は、主に１種類の二量体を指し、一方“実質的に純粋な二量体”は二量体の混合物を含み得る。
【００２４】
幾つかの実施形態においては、二量体および二量体ジガレートは、少なくとも純度 80%、好ましくは少なくとも純度85%、少なくとも純度90%、少なくとも純度95%、少なくとも純度98%、または少なくとも純度99%である。このような化合物は、特に薬剤としての使用に適している。
【００２５】
下記に述べるように、本発明の二量体および二量体ジガレートは、処方箋によって調製されてもよく、単独で、またはNO依存的疾患および障害を治療または予防するための他の治療剤と組み合わせて投与されてもよい。このように、本発明の二量体および二量体ジガレートは、抗高血圧剤、NO保持剤またはNO調節剤として使用されてもよい。本発明の二量体および二量体ジガレートは、他のB型プロシアニジンやA型プロシアニジンといった血管（心臓血管を含む）保護剤または治療剤と組み合わせて投与されてもよい。このように、本発明の組成物は混合物を含む。
【００２６】
使用方法
ここに記載の任意の化合物および／または組成物は、本出願に記載の方法を実行するために使用されてもよい。ここで使用する“NO依存的疾患および障害”とは、NO を処方したときに効果の現れる健康状態を指す。このような状態の例としては、NO経路が正常に機能しないことによって引き起こされるNO介在性またはNO依存性の疾患または障害が在るが、これに限定されるわけではない。この健康状態の中には、高血圧、心血管疾患、冠動脈疾患、糖尿病(１型と２型)、認知機能障害および／または血管循環器系疾患(脳内疾患を含む)、心臓発作、脳卒中、うっ血性心不全、腎不全、および腎疾患が含まれるのが好ましい。血圧が高いと、心臓発作、脳卒中、うっ血性心不全、および腎不全の危険性が増すため、これらの症状を予防するために、血管弛緩作用のある二量体および二量体ジガレートを、単独で、または他の血管(心臓血管を含む)保護剤と組み合わせて利用することができる。特に適切な対象としては、糖尿病、肥満、高脂血症(例えば高コレステロール症)および／または喫煙習慣を併せ持つ高血圧の対象等が考えられ、このような対象においては心臓発作と脳卒中の危険性が数倍も高くなる。一般的に、心血管疾患の危険因子(米国心臓協会により承認)を少なくとも１つ持つ対象は、ここで記載されているように治療され得る。
【００２７】
ここで使用する“治療”とは、例えば病状の進行の遅滞、生存期間の延長、死亡危険性の低減および／または病状を示す数値のはっきりとした好転等により、心血管疾患等の体の健康状態を、改善していくことを意味している。
【００２８】
“予防する”という用語は、病気の発展に関わる危険因子を減らすという意味で、これには病気の徴候を減らすという意味も含まれている。
【００２９】
ここで使用する“血管保護または治療剤”という用語は、本発明の二量体および二量体ジガレート以外の薬剤で、血管(心臓血管を含む)系を治療または保護するのに効果のあるものを指す。このような薬剤の例としては、抗血小板剤(例えば、アスピリンのようなCOX阻害剤；他のB型プロシアニジン、およびA型プロシアニジン)；NO調節剤、コレステロール低下剤(例えば、ステロール、スタノール)等がある。
【００３０】
二量体および二量体ジガレートは、内皮細胞の一酸化窒素(NO)経路に働きかけ、NO量を維持させる。厳密に証明はされていないものの、NO量は、NOの合成誘導および／またはNOの分解抑制により保たれる。化合物はまた、収縮した血管の血管弛緩も引き起こす。
【００３１】
従って、本発明は、二量体および二量体ジガレートまたは薬剤として許容されるその塩もしくは誘導体を有効量、必要な対象に投与することによって、NO依存的疾患および障害を治療または予防する方法に関するものである。ここで、対象とはヒトまたは動物であり、二量体ジガレートとは、以下の式で表されるフラバン-3-オール構成単位が２つ重合したプロシアニジン二量体の没食子酸（ガレート）エステルである：
【化７】
2008502691.tif 000009
式中、RはO-ガレートである。Rは、αまたはβ立体異性体のいずれかを持ち、構成単位である単量体が4→6位または4→8位のフラバン間結合でつながっており、各々αまたはβ立体異性体のいずれかを持つ。構成単位であるフラバン-3-オール(単量体)は、(+)-カテキン、(-)-エピカテキンおよびそれぞれのエピマー(例えば、(-)-カテキンおよび(+)-エピカテキン)であってもよい。
【００３２】
幾つかの実施形態において、NO依存的疾患および障害を治療または予防する方法として、以下の式で表される二量体ジガレートまたは薬剤として許容されるその塩もしくは誘導体を治療上有効な量だけ、必要な対象（ヒトまたは動物）に投与することが含まれる：
【化８】
2008502691.tif 000010
【００３３】
本発明の方法で用いる二量体および二量体ジガレートは、単離および精製されたものか、または実質的に純粋であるものでよい。幾つかの実施形態においては、ここで記載する化合物は、少なくとも純度約80%、少なくとも純度約85%、少なくとも純度約90 %、少なくとも純度95 % または少なくとも純度98 %であり得る。
【００３４】
他の単量体単位につながっていないC-4、C-6 またはC-8が、必要に応じて任意の位置でエステル結合等によってフェノール部に置換されている糖によって誘導体化されている二量体および二量体ジガレートの誘導体もまた、ここで記載する方法で用いることができる。糖は、グルコース、ガラクトース、ラムノース、キシロース、およびアラビノースよりなる群から選択され得る。糖は、単糖類または二糖類であることが好ましい。フェノール部は、カフェ酸、桂皮酸、クマール酸、フェルラ酸、没食子酸（ガレート）、ヒドロキシ安息香酸およびシナピン酸よりなる群から選ばれる。
【００３５】
幾つかの実施形態においては、本発明は以下の方法に関するものである： 
EC-(4β→8)-(+)CジガレートといったEC-(4β→8)-Cジガレートまたは薬剤として許容されるその塩もしくは誘導体の有効量を、必要な対象に投与することによって、NO依存的疾患および障害を治療または予防する方法。ここで対象とはヒトまたは動物である。二量体ジガレートは、単離および精製されてもよい。幾つかの実施形態においては、上記の化合物は少なくとも純度約90 %、少なくとも純度95 %、または少なくとも純度98 %であり得る。
【００３６】
(+)C-(4α→8)-(+)CジガレートといったC-(4α→8)-Cジガレートまたは薬剤として許容されるその塩もしくは誘導体の有効量を、必要な対象に投与することによって、NO依存的疾患および障害を治療または予防する方法。ここで対象とはヒトまたは動物である。二量体ジガレートは、単離および精製されてもよい。幾つかの実施形態においては、上記の化合物は少なくとも純度約90 %、少なくとも純度95 %、または少なくとも純度98 %であり得る。
【００３７】
(+)C-(4β→8)-(+)CジガレートといったC-(4β→8)-Cジガレートまたは薬剤として許容されるその塩もしくは誘導体の有効量を、必要な対象に投与することによって、NO依存的疾患および障害を治療または予防する方法。ここで対象とはヒトまたは動物である。二量体ジガレートは、単離および精製されてもよい。幾つかの実施形態においては、上記の化合物は少なくとも純度約90 %、少なくとも純度95 %、または少なくとも純度98 %であり得る。
【００３８】
(+)C-(4β→8)-(+)ECジガレートといったC-(4β→8)-ECジガレートまたは薬剤として許容されるその塩もしくは誘導体の有効量を、必要な対象に投与することによって、NO依存的疾患および障害を治療または予防する方法。ここで対象とはヒトまたは動物である。二量体ジガレートは、単離および精製されてもよい。幾つかの実施形態においては、上記の化合物は少なくとも純度約90 %、少なくとも純度95 %、または少なくとも純度98 %であり得る。
【００３９】
例えば、(+)C-(4α→8)-(+)C等のC-(4α→8)-C二量体といったように、構成単位である単量体間に4α→8結合等のアルファ結合が存在する二量体または薬剤として許容されるその塩もしくは誘導体の有効量を、必要な対象に投与することによって、NO依存的疾患および障害を治療または予防する方法。ここで対象とはヒトまたは動物である。二量体は、単離および精製されてもよい。幾つかの実施形態においては、上記の化合物は少なくとも純度約90 %、少なくとも純度95 %、または少なくとも純度98 %であり得る。
【００４０】
ある実施形態においては、本発明は以下の方法を例示する： 
二量体ジガレートまたは薬剤として許容されるその塩もしくは誘導体を有効量、必要な対象に投与することによって、高血圧を治療する（例えば、血管弛緩を誘導する）方法。ここで対象とはヒトまたは動物であり、二量体ジガレートとは、以下の式で表されるフラバン-3-オール構成単位２つで構成されるプロシアニジン二量体の没食子酸（ガレート）エステルである：
【化９】
2008502691.tif 000011
式中、RはO-ガレートである。Rは、αまたはβ立体異性体のいずれかを持ち、構成単位である単量体が4→6位または4→8位のフラバン間結合でつながっており、各々αまたはβ立体異性体のいずれかを持つ。構成単位であるフラバン-3-オール(単量体)は、(+)-カテキン、(-)-エピカテキンおよびそれぞれのエピマー(例えば、(-)-カテキンおよび(+)-エピカテキン)であってもよい。本発明の二量体ジガレートは、単離および精製されたものか、または実質上純粋であるものでよい。幾つかの実施形態においては、上記の化合物は少なくとも純度約８０ %、少なくとも純度約８５ %、少なくとも純度約９０ %、少なくとも純度９５%または少なくとも純度９８ %であり得る。
【００４１】
以下の式で表される二量体ジガレートまたは薬剤として許容されるその塩もしくは誘導体を有効量、必要な対象に投与することによって、高血圧を治療する（例えば、血管弛緩を誘導する）方法：
【化１０】
2008502691.tif 000012
【００４２】
幾つかの実施形態においては、ここで記載の化合物は少なくとも純度約８０ %、少なくとも純度約８５ %、少なくとも純度約９０ %、少なくとも純度９５%または少なくとも純度９８ %であり得る。
【００４３】
(-)EC-(4β→8)-(+)CジガレートといったEC-(4β→8)-Cジガレートまたは薬剤として許容されるその塩もしくは誘導体の有効量を、必要な対象に投与することによって、高血圧を治療する（例えば、血管弛緩を誘導する）方法。ここで対象とはヒトまたは動物である。二量体ジガレートは、単離および精製されてもよい。幾つかの実施形態においては、上記の化合物は少なくとも純度約90 %、少なくとも純度95 %、または少なくとも純度98 %であり得る。
【００４４】
(+)C-(4α→8)-(+)CジガレートといったC-(4α→8)-Cジガレートまたは薬剤として許容されるその塩もしくは誘導体の有効量を、必要な対象に投与することによって、高血圧を治療する（例えば、血管弛緩を誘導する）方法。ここで対象とはヒトまたは動物である。二量体ジガレートは、単離および精製されてもよい。幾つかの実施形態においては、上記の化合物は少なくとも純度約90 %、少なくとも純度95 %、または少なくとも純度98 %であり得る。
【００４５】
(+)C-(4β→8)-(+)CジガレートといったC-(4β→8)-Cジガレートまたは薬剤として許容されるその塩もしくは誘導体の有効量を、必要な対象に投与することによって、高血圧を治療する（例えば、血管弛緩を誘導する）方法。ここで対象とはヒトまたは動物である。二量体ジガレートは、単離および精製されてもよい。幾つかの実施形態においては、上記の化合物は少なくとも純度約90 %、少なくとも純度95 %、または少なくとも純度98 %であり得る。
【００４６】
(+)C-(4β→8)-(-)ECジガレートといったC-(4β→8)-ECジガレートまたは薬剤として許容されるその塩もしくは誘導体の有効量を、必要な対象に投与することによって、高血圧を治療する（例えば、血管弛緩を誘導する）方法。ここで対象とはヒトまたは動物である。二量体ジガレートは、単離および精製されてもよい。幾つかの実施形態においては、上記の化合物は少なくとも純度約90 %、少なくとも純度95 %、または少なくとも純度98 %であり得る。
【００４７】
例えば、(+)C-(4α→8)-(+)C等のC-(4α→8)-C二量体といったように、構成単位である単量体間に4α→8結合等のアルファ結合が存在する二量体または薬剤として許容されるその塩もしくは誘導体の有効量を、必要な対象に投与することによって、高血圧を治療する（例えば、血管弛緩を誘導する）方法。ここで対象とはヒトまたは動物である。二量体は、単離および精製されてもよい。幾つかの実施形態においては、上記の化合物は少なくとも純度約90 %、少なくとも純度95 %、または少なくとも純度98 %であり得る。
【００４８】
ここで提供される手引き、および当業者に一般的な知識を用いて、当業者が上記の方法で用いられる有効量を求めてもよい。例えば、有効量は、ほ乳類の体内（例えば血液内）において生理学的に適切な濃度に達する程度の量であり得る。このような生理学的に適切な濃度とは、少なくとも約１０ナノモーラー(nM)、好ましくは少なくとも約２０nM、または少なくとも約１００nM、およびより好ましくは少なくとも約５００nMであり得る。１つの実施形態においては、ヒトのようなほ乳類の血中に、少なくとも約１マイクロモル量投与される。化合物は、一日当たり約50 mg から約1000 mg 、好ましくは一日当たり約100-150 mg から約900 mg 、および最も好ましくは一日当たり約300 mg から約500 mg 、投与されてもよい。しかしながら、上記より多くの量を用いてもよい。
【００４９】
化合物は一度に投与されるか、または効果的な期間（例えば、１日、１ヶ月、２ヶ月、半年、１年、または技術を持つ開業医が必要と定めた期間）続ける処方計画として、治療的／予防的な投与が続けられてもよい。投与は、少なくとも治療的／予防的効果が現れるのに必要な期間、続けられてもよい。組成物は毎日投与されるのが好ましく、ほ乳類の体内で効果的な化合物濃度を維持するためには朝と夜といったように日に２、３回投与されるのが最も好ましい。最も有益な効果を出すためには、組成物は、少なくとも約３０日間、または少なくとも約６０日間投与されるのがよい。これらの処方計画は、定期的に繰り返されてもよい。ここで提供される手引き、および当業者に一般的な知識を基にして、当業者は、急性および／または慢性的投与に適切な化合物を選ぶことができる。例えば、素早い急性の反応が求められる時は、１回の投与後および／または投与してからすぐ（例えば、投与後２時間）に効果の現れる化合物が用いられる得る。複数回の投与後に効果の現れる化合物は、しかるべく用いられ得る。従って、このような投与（例えば、急性、慢性）に適した剤形は、本発明の範囲に入る。
【００５０】
上記の治療方法において用いられる、治療に必要な最小限の投薬量または最適な投薬量を求める試験法もまた、本発明の範囲に入る。実施例に記載の方法、または高血圧および／またはNO依存的疾患および障害の治療における化合物の効果の目安を示す他の任意の用量反応法を用いてもよい。二量体および二量体ジガレートをこのような試験法で調べてもよい。治療効果を出すための最小限の量、または最適な量を送達するのに適した剤形は、本発明の範囲に入る。
【００５１】
組成物と処方
本発明の組成物は、薬品として、食品として、食品添加物として、または栄養補助食品として摂取されてもよい。
【００５２】
ここで使用する "食品"とは、生物体の成長、修復、および生命活動を維持し、エネルギーを供給するために、体内で使用されるタンパク質、炭水化物および／または脂肪を本質的に含む物質のことである。食品にはまた、ミネラル、ビタミンおよび香辛料といった補助的成分も含まれてよい。メリアム・ウェブスター・カレッジ英英辞典、第１０版、1993を参照。食品という用語には、ヒトあるいは動物によって消費される飲料も含まれる。ここで使用する"食品添加物" とは、米国食品医薬品局（FDA）の 21 C.F.R.170.3(e)(1)によって定義されるものであり、直接的または間接的な添加物が含まれる。ここで使用する“薬品”とは、医薬物のことである。メリアム・ウェブスター・カレッジ英英辞典、第１０版、1993を参照。薬品はまた、薬剤を指すこともある。ここで使用する“栄養補助食品”とは、食事を補完するための製品で、１つまたは複数の食品成分を含む物（タバコを除く）であって、含まれる栄養成分には以下のものがある。例えば、ビタミン、ミネラル、ハーブまたは他の植物、アミノ酸、総摂取量を増加することにより食事を補完するために人間が使用する食品成分、あるいは上記成分の濃縮物、代謝物、構成物、抽出物または混合物である。
【００５３】
他の血管（心臓血管を含む）-保護剤または治療剤を、必要に応じて組み合わせた本発明の化合物を含む薬品は、経口投与、舌下投与、口腔内投与、鼻腔内投与、直腸投与、静脈内投与、非経口投与、および局所的投与といった様々な方法で投与されてもよい。当業者は、必要に応じて他の血管保護剤または治療剤と組み合わせながら、本発明の二量体および／または二量体ジガレートを、最も効率良く送達するのに適した投与方式を決められるだろう。従って、各投与法で用いられる剤形は、本発明の範囲に含まれるものであり、剤形には固体、液体および半固体の剤形が含まれ、以下のようなものがあげられる。例えば、錠剤、カプセル、ゼラチンカプセル（ジェルカップ）、大袋または単位用量に分かれた粉末または顆粒、乳剤、懸濁液、練り粉、クリーム、ジェル、泡状製剤、ゼリー、または注射剤。徐放性剤形もまた本発明の範囲に含まれ、これらは、米国特許第5,024,843号、5,091,190号、5,082,668号、4,612,008号、および4,327,725号（関連する部分はこの参照により開示に含まれる）に記載の方法で調製されてもよい。薬剤として許容される適切なキャリア、希釈剤または賦形剤は一般的に公知であり、同業者によってすぐに決められる。例えば、錠剤には、組成物、および必要ならばソルビトール、ラクトース、セルロースまたは第２リン酸カルシウムといったキャリアを含む二量体および／または二量体ジガレートが有効量含まれてもよい。
【００５４】
本発明の二量体および／または二量体ジガレート、および必要ならば他の血管保護剤または治療剤を含む栄養補助食品は、公知の方法を用いて調製されてもよく、例えば第２リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、硝酸カルシウム、ビタミンおよびミネラルといった栄養素を含んでもよい。
【００５５】
さらに、本発明の範囲内には、梱包製品といった製造物も含まれる。この梱包製品には、本発明の組成物（例えば、食品、栄養補助食品、薬品）、および本発明の化合物を含むまたは増量していることを明記したラベルや、ここで記載した方法にそった組成物の使用法を指示するラベルが含まれる。
【００５６】
少なくとも最小限の治療有効量、または治療に最適な量を送達するのに適した剤形は、本発明の範囲に含まれる。このような量は、例えば実施例中の手引き等のここで記載の方法で決められてもよい。
【００５７】
治療と併せて使用される製造物（梱包製品またはキット等）もまた、本発明の範囲内にあり、この製造物には、少なくとも１つの容器と少なくとも１つの発明した二量体および／または二量体ジガレート、あるいは薬剤として許容されるその塩またはその誘導体が含まれる。さらに、製造物には、少なくとも１つの添加剤、血管保護剤または治療剤（すなわち、本発明の二量体および／または二量体ジガレート以外のもの、あるいは薬剤として許容されるその塩またはその誘導体）が含まれ、これらは、別の組成物として、別の容器に含まれているものとして、または本発明の化合物の混合物中に含まれているものとして提供され得る。
【００５８】
前述したように、血管保護剤または治療剤は、脈管系（例えば心臓、脳血管）の治療または保護に有効である。このような物質の例としては、抗血小板薬（アスピリンのようなCOX 阻害薬）； NO調節剤、コレステロール低下薬(例えば、ステロール、スタノール)がある。
【００５９】
ある実施形態においては、必要に応じて本発明の二量体ジガレートと共に投与される血管保護剤または治療剤は、以下に記載されているようなA型プロシアニジンまたは他のB型プロシアニジンでもよい。
【００６０】
本発明で使用されるA型プロシアニジンは、以下の式で表されるフラバン-3-オール単量体単位n個から構成されるオリゴマーであってもよい：
【化１１】
2008502691.tif 000013
式中
(i)構成単位である単量体は、4→6位および／または4→8位のフラバン間結合でつながっている；
(ii)構成単位である単量体の少なくとも２つは、付加的なA型のフラバン間結合(4→8；2→O→7)または(4→6； 2→O→7)を介してつながっている；
(iii)nは2 から12である。
【００６１】
当業者ならば、A型のフラバン間結合によってつながっている２つのフラバノール単位の内の１つは、２位および４位の炭素を介した結合を含むことが分かるだろう。これらの結合は共にαまたはβいずれかの立体異性体を有し、すなわち、結合は、２α、４αまたは２β、４βのいずれかとなる。これらの結合は、A型のフラバン間結合を介した片方のフラバノール単位の６位および７位、または８位および７位の炭素とつながっている。２位および４位の炭素にA型のフラバン間結合を持たないオリゴマーのフラバノール単位においては、４位の炭素上の結合はαまたはβいずれかの立体異性体を持ち得る。フラバノール単位の３位の炭素上のOH基は、αまたはβいずれかの立体異性体を持つ。構成単位であるフラバン-3-オール(単量体)は、(+)-カテキン、(-)-エピカテキン、およびそれらのエピマー(例えば、(-)-カテキンおよび(+)-エピカテキン))であってもよい。
【００６２】
上記で定義されたA型プロシアニジンは誘導体化されてもよく、例えば、構成要素である１つまたは複数のフラバン-3-オール上のOH基が、１つまたは複数エステル化されてもよい。従って、フラバン-3-オール単位は１つまたは複数のエステル基を含んでいてもよく、好ましくは3位、5位、7位、3'位および4'位の炭素の１つまたは複数にガレートエステル基を含んでいるのがよい。特に、１箇所、２箇所、３箇所、４箇所、または５箇所がガレート化されていてもよい。
【００６３】
本発明の製品、および方法に有用な化合物としては、例えば整数nが、３から１２、 ４から１２、５から１２、４から１０、または ５から１０である化合物が含まれる。幾つかの実施形態において、nは、２から４、または２から５であり、例えば２または３である。
【００６４】
A型プロシアニジンは、エピカテキン-(4β→8 ; 2β→O→7)-カテキン(すなわち、A１の二量体)、または薬剤として許容されるこれの塩またはその誘導体でもよく、以下の式で表される：
【化１２】
2008502691.tif 000014
【００６５】
A型プロシアニジンはまた、エピカテキン-(4β→8 ; 2β→O→7)-エピカテキン(すなわち、A２の二量体)でもよく、以下の式で表される：
【化１３】
2008502691.tif 000015
【００６６】
あるいは、A型プロシアニジンは、A型三量体でもよく、以下の式で表される：
【化１４】
2008502691.tif 000016
【００６７】
A型プロシアニジンは、天然に存在するものまたは合成したものでもよい。例えば、A型プロシアニジンは、実施例２、またはLou等、Phytochemistry, 51: 297-308(1999)、または Karchesy とHemingway、J. Agric. Food Chem., 34: 966-970(1986)（各々の関連部分はこの参照により開示に含まれる）に記載のようにピーナッツの薄皮から単離されてもよい。熟したピーナッツの薄皮には、約17質量%のプロシアニジンが含まれており、二量体プロシアニジンであるエピカテキン-(4β→8 ; 2β→O→7)-カテキンが主たる成分の中で、エピカテキン-(4β→8 ; 2β→O→7)-エピカテキンも少量含まれている。しかし、ピーナッツの薄皮中には２つの結合(４→８；２→O→７)を持つプロシアニジンに加えて、(４→６；２→O→７)の結合を持つプロシアニジンもまた存在する。
【００６８】
上記化合物の他の原料としては、クランベリーがあり、例えば、Foo等、 J. Nat. Prod., 63: 1225-1228、およびPrior等、J. Agricultural Food Chem., 49(3):1270-76(2001)（各々の関連部分はこの参照により開示に含まれる）に記載されている。他の原料には、ゴムカズラ（Ecdysanthera utilis）(Lie- Chwen等、 J. Nat. Prod. , 65: 505-8(2002))と、セイヨウトチノキ（Aesculus hippocastanum)(米国特許第4,863,956号)（各々の関連部分はこの参照により開示に含まれる）等がある。
【００６９】
A型化合物はまた、中性の条件下、l,1-ジフェニルl-2-ピクリルヒドラジル(DPPH)ラジカルを用いてB型プロシアニジンを酸化することからも得られ得ることが、Kondo等、Tetrahedron Lett. , 41: 485(2000)（関連部分はこの参照により開示に含まれる）に記載されている。天然および合成のB型プロシアニジンを得る方法は同業者に公知であり、例えば、Romanczyk等の米国特許第6,670,390号、 Romanczyk等の米国特許第6,207,842号、 Romanczyk等の米国特許第6,420,572号、およびRomanczyk等の米国特許第6,156,912号に記載されている。
【００７０】
A型プロシアニジンは、ここで記載の組成物中に含まれるものとして用いられてもよく、A型プロシアニジンを主成分する抽出物(例えば、ピーナッツ薄皮の抽出物)の形体で投与されてもよい。
【００７１】
A型プロシアニジンは、単離および精製されてもよい。すなわち、コンタミしている化合物量（不純物）がA型プロシアニジンの効果に影響を与えない、または効果を減じない程度にまで、それらを天然に含む化合物から分離するか（A型プロシアニジンが天然由来の場合）、あるいは合成されてもよい。例えば、単離および精製したA１の二量体とは、天然に生成し得るA2の二量体から、工業用に利用されている精製および分離技術により達成可能な程度まで分離される。
【００７２】
本発明で使用する他のB型プロシアニジンは、天然由来のものであってもよく、例えば、カカオ豆または他の天然原料に由来するものであってもよい。あるいは合成されてもよい。例えば、B型プロシアニジンおよびその誘導体は、Romanczyk等の米国特許第6,670,390号（関連部分はこの参照により開示に含まれる）に記載されている。当業者は、その可用性またはコストを考え、天然のプロシアニジンか合成のプロシアニジンかを選択してもよい。プロシアニジンは、チョコレートに含まれるチョコレートリカーといった、カカオポリフェノールを含むカカオ成分として組成物中に含まれていてもよい。あるいは、各化合物から単離および精製された抽出物、抽出画分、蓄えられた抽出画分、または合成して調製した化合物として、カカオ成分とは独立に添加されてもよい。
【００７３】
“カカオ成分”という用語は、チョコレートリカーといった、除皮したカカオニブ由来の材料を含むカカオソリッドを指し、部分的または完全に脱脂されたカカオソリッド(例えば、かたまり(cake)または粉末)を指す。
【００７４】
B型プロシアニジンオリゴマーは、2 から約18個、好ましくは2から約12個、および最も好ましくは2から約10個の単量体単位から構成されているのがよい。あるいは、このオリゴマーは、3-18個、好ましくは 3-12個、および 最も好ましくは3-10 個の単量体単位、あるいは5-18個、好ましくは 5-12個、および 最も好ましくは5-10個の単量体単位で構成されているのがよい。例えば、オリゴマーは、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、および十量体であってもよい。このオリゴマーにおいては、単量体同士が(4→6)位および／または(4→8)位のフラバン間結合を介してつながっている。(4→8)位結合しか持たないオリゴマーは直鎖型である一方、１つでも(4→6)位結合があれば分岐型オリゴマーになる。天然には存在しない(6→6)位、(6→ 8)位、および(8→8)位結合を少なくとも１つ含むオリゴマーもまた、本発明の範囲に入る。このような天然に存在しないオリゴマーの合成については、WO 00/61547として２０００年１０月１９日に公告された国際出願番号PCT/US00/08234（関連部分はこの参照により開示に含まれる）に記載されている。
【００７５】
B型プロシアニジンは、カカオ豆、カカオのニブ、またはチョコレートリカー、部分的に脱脂されたカカオソリッドおよび／または完全に脱脂されたカカオソリッドといったカカオ成分から抽出することよって調製されてもよい。好ましくは、抽出物は完全にまたは部分的に脱脂されたカカオ粉末から調製されるのがよい。テオブロマ（Theobroma）、ヘラニア（Herrania）、またはそれらの種間・種内交配種の内任意の種から得られた豆を使用してもよい。抽出物は、発酵後、発酵途中、または発酵前の豆から調製されてもよく、発酵後の豆がカカオポリフェノールの含有量が最も少なく、発酵前の豆が最も多い。豆の選別は、豆の発酵度数を基準にしてなされてもよく、例えば約275以下の発酵度数を持つ豆から抽出が行われる。WO 98/09533として公告された国際出願番号 PCT/US97/15893（関連部分はこの参照により開示に含まれる）に記載のように、発酵の程度から、カカオ成分とその抽出物中のポリフェノールのレベルを算出してもよい。
【００７６】
カカオポリフェノールは、伝統的なカカオの処理方法を用いてカカオ成分から抽出されてもよい(例えば、Industrial Chocolate Manufacture and Use、Beckett, S. T.編、 Blackie Acad. & Professional、ニューヨーク、 1997の 1、5 および6章に記載)。あるいは、Kealey等の米国特許第6,015,913号に記載されている改良された処理方法を用いて抽出されてもよい。この方法では、伝統的な方法と異なり（ポリフェノールの破壊を防ぐことにより）カカオ成分中のポリフェノール量がより高い収率で保持される。改良されたカカオ処理方法では、焙煎工程が省略されている。従って、以下の工程すなわち、(a)焙煎せずにカカオ外皮がゆるむ温度で、カカオ豆を一定時間加熱し、(b)カカオ外皮からカカオニブをふるいわけ、(c)カカオニブを磨り潰し、(d)カカオバター、および保持されたカカオポリフェノール分を含む部分的に脱脂したカカオソリッドを回収する、工程を経て得られたカカオ成分を使用してもよい。この方法では、伝統的な処理方法よりも非常に収率の高いプロシアニジンオリゴマーが得られる。この方法で製造されたカカオソリッドは、非脂肪ソリッド１gに対して、フラバノールおよび／または プロシアニジンを合わせて20,000 g よりも多量に含んでもよく、好ましくは25,000 g/g、より好ましくは28,000 g/g、および最も好ましくは30,000 g/gよりも多量に含み得る。本発明の目的のために、フラバノールおよび／またはプロシアニジンの全量は、実施例４に記載のように求められてもよい。
【００７７】
B型プロシアニジンは、ポリフェノールが溶解する溶媒を用いて、上記の原料、あるいはポリフェノールまたはフラバノールまたはプロシアニジンを含む他の任意の原料から抽出されてもよい。適切な溶媒としては、水、あるいはメタノール、エタノール、アセトン、イソプロピルアルコール、および酢酸エチルなどの有機溶媒が在る。溶媒の混合物もまた、使用してよい。水を溶媒として使用する時は、例えば酢酸で僅かにそれを酸性化してもよい。幾つかの溶媒の例としては、メタノール水溶液、エタノール水溶液、またはアセトン水溶液といった水と有機溶媒の混合物がある。有機溶媒水溶液は、例えば、有機溶媒を約50% から約95% まで含んでいてもよい。従って、水の約50%、約60%、約70%、約80%、および約90%の有機溶媒が使われてもよい。溶媒はまた、酢酸といった酸を少量含んでいてもよく、例えば、約0.5から約1.0質量%まで含んでいてもよい。抽出物の組成、すなわちプロシアニジンオリゴマーの代表的組成（つまり重合度の分布）および量は、選んだ溶媒の種類に依存するだろう。例えば、水による抽出物は主に単量体を含み、酢酸エチルによる抽出物は単量体と、オリゴマー、主に二量体と三量体を含み、メタノール水溶液、エタノール水溶液、またはアセトン水溶液による抽出物は、単量体と高オリゴマーを含む。単量体やプロシアニジン高オリゴマーを抽出するための溶媒の１つは、約70%のアセトンである。しかし、ポリフェノールを含む任意の抽出物は、本発明で有用である。カカオポリフェノールの抽出方法は公知であり、例えば、Romanczyk等の米国特許第5,554,645号、およびWO97/36497として公告された国際出願番号PCT/US97/05693に記載されている。従って、１つの実施形態においては、カカオ豆をカカオ粉末にし、その粉末を脱脂して、カカオポリフェノールを抽出し、その抽出物を精製することによってカカオ抽出物が調製される。カカオ粉末は、カカオ豆とパルプを凍結乾燥し、この凍結乾燥したカカオ豆からパルプと外皮を除いて、外皮が除去された豆をすりつぶして粉にすることによって調製できる。
【００７８】
B型カカオポリフェノールの抽出物は、例えば、カフェインおよび／またはテオブロミンを除去したものを、さらにゲルろ過クロマトグラフィーおよび／または高速液体クロマトグラフィー(HPLC)にかけることで、精製されてもよい。ゲルろ過クロマトグラフィー(例えば、セファデックス（Sephadex)LH-20を用いる)は、プロシアニジン高オリゴマーの抽出物を濃縮するために用いられてもよい。例えば、目的のオリゴマーがカラムから溶出し始めるまでは、単量体とオリゴマーを含む溶出液は回収しなくてもよい。このような抽出物の実施例は公知であり、WO97/36497として公告された国際出願番号PCT/US97/05693（関連部分はこの参照により開示に含まれる）の実施例５に記載されている。順相HPLC等の前処理したHPLCを用いて、抽出物を例えば、少なくとも50質量%の単量体または特定のオリゴマーを含む単量体画分およびオリゴマー画分のような画分に分画してもよい。特定の画分が単量体または任意の低重合度オリゴマー（例えば、二量体、三量体または四量体画分）を含む場合、その画分は約90から95質量%のその特定オリゴマー画分を含む。分離後、望ましい画分をとっておき、例えばオリゴマーが3-10 または5-10種含まれるように、選んだオリゴマーを混ぜ合わせてもよい。当業者は、本明細書中の手引き、同業者に一般的な知識、および、例えば、Romanczyk等の米国特許第5,554,645号、およびWO97/36497として公告された国際出願番号PCT/US97/05693に記載の指示を参考にすることにより、カラム条件を調整し、望ましいプロシアニジンの組成を達成することができる。
【００７９】
単量体画分は通常、単量体のエピカテキンとカテキンの混合物を含み、オリゴマー画分は通常、二量体（二量体画分中）、三量体（三量体画分中）、四量体（四量体画分中）等の混合物を含む。単離された画分の中には単量体とオリゴマーの混合物もあり、これはカカオに、複数種の単量体、複数種の二量体等が含まれていることによるものである。オリゴマーの多様性は、プロシアニジンの構成単位であるエピカテキンおよびカテキンという２つの単量体の存在と、それらをオリゴマー中でつなぐ化学結合の存在から生じる。従って、カカオの二量体は主にB2とB5であり、各々、単量体エピカテキンを２つ含む。逆相HPLC、例えばC18カラムを用いて、各単量体およびオリゴマーを得てもよい。
【００８０】
B型カカオポリフェノールは、カカオ抽出物、例えば溶媒由来の抽出物、カカオ画分、単離された化合物として本発明の組成物中で使用されてもよく、あるいは、カカオフラバノールおよび／またはプロシアニジンを有効量含むカカオ成分またはチョコレート中で使用されてもよい。カカオ成分は、伝統的なカカオの処理方法で調製されてもよいが、好ましくはKealey等の米国特許第 6,015,913号に記載の方法で調製されるのがよい。あるいは、カカオポリフェノールの量を増やすために、発酵度数が約275以下のカカオ豆から調製されたチョコレートリカーおよびカカオソリッドを使用してもよい。これらの成分は、伝統的なカカオ処理の方法（例えば、焙煎工程あり）と完全に発酵した豆を用いた時に得られるカカオポリフェノール含有量より、高い含有量を持つ。チョコレートは、従来の技術を用いて、上記の成分から調製されてもよい。あるいは、チョコレート製造過程でより高い収率のカカオポリフェノール分を保持できる改良方法を用いて調製されてもよく、この方法はWO99/45788として公告された国際出願番号PCT/US99/05414（関連部分はこの参照により開示に含まれる）に記載されている。ここで“より高い収率のカカオポリフェノール分を保持するチョコレート”とは、以下の非伝統的工程の少なくとも１つを用いて調製されたチョコレートを指す：(i)発酵中または発酵前のカカオ豆からカカオ成分を調製し、(ii)カカオ成分の製造過程において、カカオポリフェノールが保持され、(iii)チョコレートの製造過程において、カカオポリフェノールが保持される工程。
【００８１】
合成のB型プロシアニジンもまた用いられてよく、同業者に公知の方法およびWO99/19319として公告された国際出願番号PCT/US98/21392（関連部分はこの参照により開示に含まれる）記載の方法で調製されてもよい。
【００８２】
フラバノールおよび／またはプロシアニジンの誘導体もまた、有用であり得る。これらは、ガレートエステル（例えば、エピカテキンガレートおよびカテキンガレート）といった単量体およびオリゴマーのエステル；単糖または二糖(例えば、β-D-グルコース)といった糖によって誘導体化された化合物、グリコシル化された単量体とオリゴマー、およびそれらの混合物；硫酸化プロシアニジン、グルクロン酸化プロシアニジン、メチル化プロシアニジンといったプロシアニジン単量体およびオリゴマーの代謝産物（ただし、腸内微小植物の代謝により生じるプロシアニジンの酵素分解産物は除く）を含む。誘導体は、天然の原料から得るか、または合成してもよい。
【００８３】
本発明の二量体および二量体ジガレートおよび／またはA型プロシアニジンおよび／または他のB型プロシアニジン、および必要に応じて他の血管保護／治療剤を含む食品は、ヒトまたは動物に使用されてもよく、食品にはペットフードも含まれる。食品は、菓子類以外のものでもよいが、好ましい食品には、商品規格(SOI)の在るチョコレートまたはないチョコレート等の菓子類や、ブラックチョコレート、低脂肪チョコレート、および飴（チョコレートで覆われていてもよい）を含むミルク、スィート、およびセミスィートチョコレート等の菓子類が考えられる。他の実施例としては、焼き製品（例えば、ブラウニー、焼いたスナック、クッキー、ビスケット）、香辛料、グラノーラバー、タフィー、食事代わりになるバー、スプレッド、シロップ、粉末飲料、ココアまたはチョコレート味の飲料、プディング、ライスケーキ、ライスミックス、セイバリーソース等がある。食品は、望ましければチョコレートまたはココア味でもよい。食品は、ピーナッツ、クルミ、アーモンド、およびヘーゼルナッツ等のナッツを含むグラノーラバーのような、チョコレートおよびキャンディーバーでもよい。例えば、ピーナッツの薄皮は約17%のフラバノールとプロシアニジンを含み、アーモンドの皮は約30%のフラバノールとプロシアニジンを含む。それゆえ、皮つきのナッツを本明細書で述べた食品に添加することにより、全ポリフェノール含有量もまた増加し得ることは留意すべきことである。ピーナッツ薄皮の粉末は、本発明の組成物に加えられてもよい。１つの実施形態においては、ナッツの皮、例えばピーナッツの薄皮をチョコレートキャンディーのヌガー部分に添加する。
【００８４】
ある実施形態においては、非チョコレート製品に、二量体ジガレートおよび／またはフラバノールおよび／またはB型プロシアニジンおよび／またはA型プロシアニジンが、少なくとも約５マイクログラム/gから約10mg/g含まれており、例えば、１gの製品につき少なくとも約5マイクログラム、好ましくは少なくとも約10マイクログラム、より好ましくは少なくとも約200マイクログラムの二量体ジガレートおよび／またはフラバノールおよび／またはB型プロシアニジンおよび／またはA型プロシアニジンが含まれる。望ましい場合は、非チョコレート製品は、下記のチョコレート製品に含まれている量よりも多量のカカオプロシアニジンを含むことができる。
【００８５】
チョコレート菓子は、ミルクまたはブラックチョコレートでもよい。ある実施形態において、チョコレートには、ジガレートおよび／またはフラバノールおよび／またはB型プロシアニジンおよび／またはA型プロシアニジンが、製品中の非脂肪分カカオソリッド全量に基づくチョコレート１gにつき、少なくとも3,600マイクログラム、好ましくは少なくとも4,000マイクログラム、好ましくは少なくとも4,500マイクログラム、より好ましくは少なくとも 5,000マイクログラム、および最も好ましくは少なくとも5,500マイクログラム含まれる。他の実施形態においては、ジガレートおよび／またはフラバノールおよび／またはB型プロシアニジンおよび／またはA型プロシアニジンが、製品中の非脂肪分カカオソリッド全量に基づくチョコレート１gにつき、少なくとも6,000マイクログラム、好ましくは少なくとも6,500マイクログラム、より好ましくは少なくとも7,000マイクログラム、および最も好ましくは少なくとも8,000マイクログラム含まれる。
【００８６】
ミルクチョコレート菓子には、ジガレートおよび／またはフラバノールおよび／またはB型プロシアニジンおよび／またはA型プロシアニジンが、ミルクチョコレート製品中の非脂肪分カカオソリッド全量に基づくミルクチョコレート１gにつき、少なくとも1,000マイクログラム、好ましくは少なくとも1,250マイクログラム、より好ましくは少なくとも1,500マイクログラム、および最も好ましくは少なくとも2,000マイクログラム含まれてもよい。好ましい実施形態においては、ミルクチョコレートには、二量体ジガレートおよび／またはフラバノールおよび／またはB型プロシアニジンおよび／またはA型プロシアニジンが、ミルクチョコレート製品中の非脂肪分カカオソリッド全量に基づくミルクチョコレート１gにつき、少なくとも2,500マイクログラム、好ましくは少なくとも3,000マイクログラム、より好ましくは少なくとも4,000マイクログラム、および最も好ましくは少なくとも5,000マイクログラム含まれている。
【００８７】
変動可能な量のL-アルギニンが、食品に添加されてもよい。通常、カカオには、部分的に脱脂されたカカオソリッド１００gにつき、1から1.1 グラムのL-アルギニンが含まれている。この値はカカオ１００gにつき、0.8 から1.5まで変化させることができる。幾つかの実施形態においては、天然のカカオ成分中にある量よりも多量のL-アルギニンが、本発明のチョコレート食品中に含まれる。食品中で使用されるカカオ成分とL-アルギニンの量が分かれば、平易な技術を用いて最終製品中のL-アルギニンの含有量をすぐに求めることができる。普通食品には、食品１gにつき、少なくとも5マイクログラム、好ましくは 少なくとも30マイクログラム、または少なくとも60マイクログラム、さらにより好ましくは少なくとも200マイクログラムが含まれているだろう。
【００８８】
二量体ジガレートおよび／またはフラバノールおよび／またはA型プロシアニジンおよび／またはB型プロシアニジンの一日の有効量は、１回の摂取で供給されてもよい。従って、菓子（例えばチョコレート）は、１回分に少なくとも約100mg(例えば、１回分に150-200、200-400 mg)含み得る。
【００８９】
本発明は、以下の非制限的な実施例においてさらに述べられている。
【実施例】
【００９０】
実施例１−二量体ジガレートの合成 
二量体ジガレートは、米国特許第6,420,572号（この参照により開示に含まれる）に記載されているように合成することができ、この実施例はそれを再現したものである。
【００９１】
A. (2R, 3S, トランス)-5,7,3',4'-テトラ-O-ベンジルカテキンの調製
無水ジメチルホルムアミド(DMF, 720 mL)に溶解した(+)-カテキン(65.8 g、226.7 mmol、無水物)溶液を、水素化ナトリウム（60%油分散液）(39 g、975 mmol、4.3 モル当量)のDMF(180 mL)溶液に、撹拌しながら室温で80分間かけて滴下した(S. Miura等、Radioisotopes, 32,225-230(1983))。50分撹拌した後に、フラスコを-10 ℃の塩氷浴中に置いた。臭化ベンジル(121 mL, 1.02 mol, 4.5モル当量)を80分以内に滴下し、茶色の反応液を一晩撹拌して室温まで温めた。得られた反応液を蒸発させ、結果生じた飴状固体を、200 mLのクロロホルム(CHCI3)および100 mLの水から成る２層溶媒中に、加熱撹拌しながら溶解した。２層を分取し、水層はCHCI3(20 mL)で抽出した。合わせた有機層を水(100 mL)で洗い、硫酸マグネシウム(MgSO4)で乾燥し蒸発させた。残渣をシリカゲルによるクロマトグラフィー(42X10 cm; 酢酸エチル/クロロホルム/ヘキサン 1:12:7)で精製し、真空中で蒸発乾固させた後、85 g の粗生成物を得た。これらをトリクロロエチレン(1.3 L)から再結晶化し35.1 g(24%)のクリーム色がかった白色の粉末を得た：
2008502691.tif 000017
【００９２】
あるいは、テトラ-O-ベンジル(+)-カテキンは、炭酸カリウムおよび臭化ベンジル／DMF溶液を用いて、H. Kawamoto等、木材学会誌、37,(5)488-493(1991)に記載の方法で調製してもよい。２位および３位におけるカテキンの部分的なラセミ化は、M.-C. Pierre 等、Tetrahedron Letters, 38,(32)5639-5642(1997)において観察されている。
【００９３】
B.(2R)-5,7,3',4'テトラキス(ベンジルオキシ)フラバン-3-オンの調製 
新たに調製したデス・マーチン・ペルヨージナン(39.0 g、92 mmol、D. B. DessとJ. C. Martin, J. Am. Chem. Soc. 113, 7277-7287(1991)、およびR. E. Ireland と L. Liu, J. Org. Chem. 58, 2899(1993)に記載の方法により調製)を、パートAのテトラ-O-ベンジルカテキン(54.4 g, 83.8 mmol)／塩化メチレン(420 mL)溶液に、室温で撹拌しながら１度に全量加えた。１時間半以内に、水で飽和させた塩化メチレンおよそ30 mLを反応液に滴下し、濁った琥珀色の溶液を作った。(S. D. Meyer とS. L. Schreiber、J. Org. Chem., 59, 7549-75-52(1994))２０分後に、反応液を、炭酸ナトリウム飽和溶液（NaHCO3、500 mL)とNa2S2O3.5H2Oの10%水溶液(200 mL)に希釈した。２層を分取し、水層を50 mLの塩化メチレンで抽出した。合わせた有機層は、シリカゲル(24X9 cm、クロロホルム／酢酸エチル9:1)上でろ過した。溶出液を真空中で蒸発乾固させて50.1 g(92%)のケトンを得た。これを、クロロホルム／エーテル混液から再結晶化して精製した： mp 144-144.5℃； [α] D +38.5°、[α]546 +48.7°(クロロホルム、c 20.8 g/L)；
2008502691.tif 000018
【００９４】
C. 5,7,3',4'- テトラ-O-ベンジルエピカテキンの調製
１Mのトリセカンダリーブチル水素化ホウ素リチウム／テトラヒドロフラン（本明細書では以後THF）(100 mL、L-Selectride（登録商標）、アルドリッチケミカル株式会社から販売、ミルウォーキー、ウィスコンシン州 )溶液を、アルゴン雰囲気下0 ℃で撹拌しながら、無水臭化リチウム（LiBr）(34.9 g、402 mmol)／100 mL無水THF溶液に加えた。得られた混液を、アセトン／ドライアイス浴を用いて-78 ℃まで冷却した後、パートBのフラバノン(50.1 g, 77.2 mmol)／400 mL無水THF溶液に５０分かけて滴下した。-７８℃で１３５分間、撹拌を続けた。冷却浴を除き、360 mL の2.5 M水酸化ナトリウム(NaOH)水溶液を反応液に加えた。反応フラスコは室温で水浴に置き、35%過酸化水素（H2O2）水溶液(90 mL)とエタノール(270 mL)の混液を、１３０分間かけて加えた。一晩、撹拌を続けた。結晶化した生成物を溶解するためにクロロホルム(700 mL)を加え、２層を分取し、さらに水層をCHCI3(50 mL)で抽出した。合わせた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥して、真空中で蒸発乾固させた後、56.6 g の粗生成物を得た。これを、沸騰した酢酸エチル(EtOAc)／エタノール(EtOH)(2: 3)混液600 mLに溶解し、室温、次には冷蔵庫中で結晶化させた。生成物を吸引ろ過により単離し、冷たい酢酸エチル／エタノール(1:3)混液(-２０℃)50 mLで2回洗った後、真空中最初は室温で、次に８０℃で乾燥し35.4 g(70%)の明るい黄色の固体を得た。濃縮された上清液を、シリカゲル（SiO2）(14X6.5 cm、クロロホルム、次にクロロホルム／酢酸エチル12:1)上でろ過し、溶出物を40 mLまで濃縮して残渣を60 mLのエタノールに希釈し、黄色味がかった固体のO-ベンジルエピカテキン5.5 g(11%)をさらに得た。: mp 129.5-130℃。(酢酸エチル／エタノール混液から再結晶化)；
2008502691.tif 000019
【００９５】
D. (2R,3S,4S)-5,7,3',4'-テトラ O-ベンジル-4-(2-ヒドロキシエトキシ)エピカテキンの調製 
パートCのテトラ-O-ベンジルエピカテキン(12.75 g, 19.6 mmol)／130 mL無水塩化メチレン溶液に、エチレングリコール(6.4 mL, 115 mmol, 5.8 モル当量)を室温で撹拌しながら加えた。続いて、激しく撹拌しながら2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-1,4-ベンゾキノン(DDQ, 8.9 g, 39.2 mmol, 2.0モル当量)を一度に加えた。(J. A. Steenkamp等、Tetrahedron Letters, 26,(25)3045-3048(1985)。およそ２時間後、4-ジメチルアミノピリジン(DMAP、4.8 g, 39.2 mmol)を反応液に加えると、暗緑色の沈殿が形成した。さらに５分間撹拌した後、100 g のシリカゲルを加え、減圧下で反応液を濃縮した。シリカゲルカラム(11X6.5 cm)上に残った残渣を、酢酸エチル/ヘキサン(1:1)混液で溶出し、溶出物を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルによるクロマトグラフィー(39X10 cm、酢酸エチル/ヘキサン(1:2)、次に酢酸エチル/ヘキサン(2: 3))で再度精製し、真空中で蒸発乾固させた後、泡状または固体状のベンジル-4-(2-ヒドロキシエトキシ)7.3 g(52%)を得た。これらをアセトニトリルから再結晶化した: mp 120-121℃；
2008502691.tif 000020
【００９６】
E. O-ベンジルエピカテキン(4β→8)オリゴマーの調製 
冷却した(0 ℃)、パートDのベンジル-4-(2-ヒドロキシエトキシ)エピカテキン(3.28 g、4.6 mmol)およびパートCのテトラ-O-ベンジルエピカテキン(12.0 g、18.4 mmol、4 モル当量)／無水THF(40 mL)および 無水塩化メチレン(50 mL)溶液に、撹拌しながら四塩化チタン(4.6 mL の1 M TiCl4  ／塩化メチレン)を１０分間滴下した。(H. Kawamoto等、木材学会誌、37,(5)448-493(1991))得られた琥珀色の溶液を、氷浴中で５分間、次に室温で９０分間撹拌した。30 mLの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と100 mLの水を加えて反応を止めた（最終pH：８）。得られた反応液を塩化メチレン(20 mL)で２回抽出した。合わせた有機層を50 mLの水で洗い、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空中で蒸発乾固させた。容器に塩化メチレン（CH2Cl2）を加え室温に放置し、ピンクの沈殿物を得た。得られたピンクの固体を塩化メチレン(CH2Cl2)中に沈殿させ、室温に放置した。固体をろ過し、15 mLの塩化メチレン／ヘキサン(1:1)混液で３回洗い、真空中で乾燥して、6.1 gのテトラ-O-ベンジルエピカテキンを回収した。シリカゲルによるクロマトグラフィー(45X5.2 cm)を用いて、濃縮された上清液からオリゴマーを単離した。塩化メチレン/ヘキサン/酢酸エチル(13:13:1)で溶出することによって、4.9 g のテトラ-O-ベンジルエピカテキンを回収し、それに続く2.17 gの粗製のO-ベンジル二量体を得た。二量体の溶出は、塩化メチレン/ヘキサン/酢酸エチル(10:10:1)を用いて行った。塩化メチレン/ヘキサン／酢酸エチル(8:8:1から 6:6:1)を用いて、0.98 g の粗製のO-ベンジル三量体と0.59 g の高重合度オリゴマーを溶出した。二量体と三量体は、前処理したシリカゲルカラムによるHPLCによってさらに精製した。なおこの時、溶出液として酢酸エチル／ヘキサン、または酢酸エチル／イソオクタンを用いた。UV検出器で、265または280 nm におけるピークを検出した。三量体：MS(MALDI- TOF、DHBA マトリックス)m/z(M+H+)1949.4； calcd. for C129H110O18 : 
1947.8；(M+Na+)1971.2; calcd. for C129H110 O18Na：1969.8;(M+K+)1988.3；calcd. for C129H110O18K：1985.7. 
【００９７】
F.エピカテキン二量体の調製 
パートE のO-ベンジル二量体(22.3 mg, 17.2 . μmol)／0.5 mL 酢酸エチル溶液に、2 mLのメタノールおよび7.2 mgの10% Pd/Cを続けて加えた。水素1気圧下で３時間、混液を撹拌し、綿でろ過した。ろ過の残渣をメタノールで洗い、合わせたろ液を蒸発させた。粗生成物のNMRスペクトルからは、ベンジル化物の存在が示された。従って、触媒量を17.5 mgに増加し、時間を3.7 時間に伸ばして、実験を繰り返した。粗製のポリフェノール二量体(9.6 mg)を前処理したHPLC(0.5%の酢酸を足したC18 逆相カラム水／メタノール(85:15)、265 nmにて検出)で精製し、アモルファス性の膜として4.5 mg(45%)のポリフェノール二量体を得た：
2008502691.tif 000021
【００９８】
G. O-ベンジルエピカテキン二量体ジガレートの調製
トリ-O-ベンジル没食子酸（ガレート）(38 mg、87 μmol、5モル当量)、DMF(1μ L)／塩化メチレン(0.6 mL)溶液に、塩化オキサリル(15μ L、172 μmol、10モル当量)を加えた。得られた反応液を室温で約１時間撹拌し、真空中で蒸発・乾燥させ、トリ-O-ベンジル塩化ガロイルを得た。パートEのO-ベンジル二量体(22.5 mg、17.3 μmol)／無水ピリジン(0.5 mL)溶液を、粗製の塩化ガロイルに室温で加え、得られた反応液を44.5 時間撹拌した。水20 Lを加えて、さらに2.5時間撹拌を続け、5% HCIを10 mL加えた。得られた反応液を塩化メチレン(5 mL)で３回抽出し、合わせた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥、蒸発させた。酢酸エチル/クロロホルム(1: 19)混液を用いて、シリカゲル上でろ過、精製した。溶出物を濃縮し、真空中で乾燥させると、無色薄膜状のO-ベンジル二量体ジガレートを36.0 mg(97%)得た：
2008502691.tif 000022
【００９９】
H.エピカテキン二量体ジガレートの調製
パートGのO-ベンジル二量体ジガレート(33.8 mg, 15.8μmol)／THF（4 mL）溶液に、4 mLのメタノール、0.2 mLの水および42mgの20% Pd(OH)2/Cを続けて加えた。水素１気圧下で７５分間、混合液を撹拌し、綿でろ過した。ろ過の残渣を2.2 mL のメタノール／水(10:1)混液で洗い、合わせたろ液を減圧下で濃縮し、黄味がかったアモルファス性の粗生成物を14.2 mg 得た。内7.2 mg 分を、前処理したHPLC(シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン；280 nmにて検出)によって精製し、濁ったピンク様ガラスのポリフェノール二量体ジガレートを5. 0 mg得た。これは除去できないエタノールと酢酸を少量含む：
2008502691.tif 000023
【０１００】
実施例２−A 型プロシアニジンの抽出と単離
抽出
粉砕したピーナッツ薄皮(498 g)をヘキサン(2000 mL)で２回脱脂した。ヘキサンを、周囲温度、3500 rpmで５分間遠心して除去し、残ったヘキサンは一晩かけて蒸発させた。次の日、周囲温度下、２時間かけて脱脂したピーナッツ薄皮を、アセトン：水：酢酸(70:29.5:0.5 v/v/v)混液(2000 mL)で２回抽出した。遠心(周囲温度、5 分間、3500 rpm)して抽出物を回収した。分圧下ロータリーエバポレーターを用いて(40 ℃)、有機溶媒を除去した。抽出溶媒の水層部分は凍結乾燥によって除去し、赤茶色の堅い固体(51.36 g)を得た。
【０１０１】
粗製のピーナッツ薄皮抽出物のゲル浸透クロマトグラフィー
上記で得られた粗製のピーナッツ薄皮抽出物(24 g)を70 % メタノール(150 mL)に溶解し、冷蔵庫で１時間冷却し、３秒間ボルテックスをかけた。その後、周囲温度、3500 rpm で５分間遠心した。上清を、メタノールで膨潤させたセファデックス（Sephadex）LH-20(400 g)を充填した大きなカラム上部に注いだ。カラムは、流量10 mL/分で均一濃度の100 %メタノールを用いて溶出した。250 mLずつ２９画分を回収した。これらを、順相HPLCで求めた各々の組成に従って混合し(Adamson等、J. Ag. Food Chein., 47: 4184-4188,1999)、全部で８つの画分(i-viii)にした。画分 i は、単量体のエピカテキンとカテキンを含み、画分 ii-vii は二量体、三量体、またはこれらの混合物を含んでいた。画分v(１.８g)および vii(2.7 g)が、主に二量体と三量体を含む画分であり、さらなる精製に用いた。
【０１０２】
A型二量体および三量体の精製
画分v(1.8 g)は、0.1% 酢酸／20 %メタノール(40 mg/mL)に溶解した。注入量は2mLだった。ハイパーシル（Hypersil）ODS(250 x 23 mm)のカラムを用いて、濃度勾配による分離が行われた。0.1%酢酸／水(移動相A)および 0.1%酢酸／メタノール(移動相B)を移動相とした。濃度勾配の条件は：0-10分まで20% B 均一勾配、10-60分まで20-40% B直線勾配、60-65分まで40-100% B直線勾配である。分離は、280 nmの吸収で追跡した。複数回行った分離から同じ保持時間を持つ画分を合わせ、分圧下ロータリーエバポレーターを用いて(40 ℃)有機溶媒を除去し、凍結乾燥によって水層部分を除去したところ、５つの画分(a-e)が得られた。LCMSによって、画分dとe は、それぞれ二量体Al、二量体A2を含むと同定された。AlおよびA2二量体に加えて、異なる４つの二量体がピーナッツの薄皮から既に単離されている(Lou等、Phytochemistry 51, 297-308,1999)。
【０１０３】
画分viiも上記と同様に精製され、上記で示した式のA-結合を１つ持つ三量体を１種類得た。
【０１０４】
精製された化合物の構造を質量分析法で確認し、化合物の純度を検出波長280nmのHPLC分析から求めた。Al 二量体の純度は95%、A2 二量体の純度は91% 、およびA 三量体の純度は84%であった。
【０１０５】
実施例３−NO産生および血管弛緩に対する二量体および二量体ジガレートの効果
イン・ビトロ（invitro）の無血清培地におけるヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)培養系とエクス・ビボ（ex vivo）のウサギの血管モデルをそれぞれ用いて、幾つかの化合物の一酸化窒素(NO)産生と血管弛緩に対する効果を調べた。内皮細胞による一酸化窒素産生と収縮血管の弛緩は、被験化合物の血管に対する効果を評価する際の主要なマーカーである。
【０１０６】
イン・ビトロ（In vitro）の 実験 
無血清、低タンパク質(0.5 g/l)、抗生物質無添加の上、必須の成長因子、栄養素およびミネラルを加えた細胞培養液を用いて、単一個体から得たHUVECを培養した。培養細胞は、血管内皮細胞のマーカー(フォン・ウ゛ィレブランド因子、CD31抗原、Dil-Ac-LDLの取り込み)を発現し、コンフルエンス（細胞が密着した状態）まで増殖した時には典型的な“敷石状形態”を示した。過酸化水素生成に伴う自己酸化を含む被験化合物の２次的効果を排除するために、細胞培養液にアポトランスフェリン、スーパーオキシドジスムターゼ、およびカタラーゼを添加した。
【０１０７】
NO産生は、細胞培養液中に存在する一酸化窒素の主な最終代謝産物(NOx、硝酸塩、亜硝酸塩、ニトロソチオールを含む)全ての量を測定することにより評価した。測定のため、NOxは、塩化バナジウム(III)／HCl によって９５℃でNOに還元された。培養液から放出されたNO の量は、NOアナライザー(ジーベルス（Sievers）社製、ボールダー、コロラド州)を用いて、オゾンとNOとの化学反応中放出される化学発光を測定することによって連続して計測した。
【０１０８】
実験１： 
被験化合物は、NO産生に対する急性的（２時間）および慢性的（24時間間隔で５回投与）効果それぞれに関して評価された。ポジティブコントロール（アセチルコリンおよび／またはヒスタミン）とネガティブコントロールの L-NNMA(NO合成阻害剤)を全ての実験において使用した。細胞数と全タンパク量は、実験間の誤差を評価するものとして参考にした。被験化合物の潜在毒性も調べた(MTT還元活性を測定)。
【０１０９】
ここで示したデータは、３回の実験から得たものであり、細胞培養液中に存在するNO(NOx)の濃度(μmol/l)+/-標準偏差(SD)として表す。データは、全てを添加された細胞培養液中のNOx量に補正され、試料を採取してきた培養液の体積当たりの値に換算された。データは、信頼水準95%のスチューデントのt-検定によって解析した。P値が0.05 以下の場合統計学的に有意であるとした。
【０１１０】
以下の化合物をイン・ビトロ（in vitro）で試験した：
C-(4α→8)-C 
EC-(4β→8)-EC 
EC-(4β→8)-C 
メチル化されたB2二量体(カカオから抽出された二量体およびそれがメチル化されたものとの混合物)
EC-(4β→8)-ECジガレート
EC-(4β→8)(O-メチル)4-ECジガレート 
【０１１１】
急性的効果を調べるため、5% CO2下３７℃で、濃度100 nM、1 μM、および10μMの被験化合物と共に、HUVECを２時間培養した。ポジティブコントロールであるアセチルコリンとヒスタミンは賦形剤と比べると、NO産生において統計学的に有意な増加をもたらし、一方 L-NNMAは、アセチルコリンとヒスタミンによるNO産生効果を完全に減衰させた(図 1)。
【０１１２】
EC-(4β→8)-C およびEC-(4β→8)-ECジガレートは共に、10 μMの濃度を投与した時に統計学的に有意なNO産生効果を示した(図 1)。しかし、後にEC-(4β→8)-CにはAl 二量体がかなりコンタミしていたことが分かり再度精製したが、精製後にはNO産生効果はもはや観察されなかった。他の化合物については、２時間培養後に有意なNO産生効果はみられなかった。
【０１１３】
１回の投与から２４時間後においては、C-(4α→8)-C、EC-(4β→8)-C、EC-(4β→8)-ECジガレートを濃度10μM で用いた時、およびEC-(4β→8)-C とEC-(4β→8)-ECジガレートを１mM の濃度で用いた時に、NO産生が増加した。メチル化されたB2 二量体は10μMの濃度で投与されると、コントロールに比べて、NO産生の有意な減少をもたらした(図 2a と2b)。濃度100nMでは、被験化合物の有意な効果はみられなかった。MTT試験から、被験化合物に毒性効果はないことが分かった。
【０１１４】
慢性的効果を調べるため、HUVECの培養液に、被験化合物を２４時間毎に５回続けて与えた。２４時間毎の処理の度に培養液は置換した。C-(4α→8)-Cは、単回の投与でみられたようなNO産生効果は示さなかった。メチル化されたB2 二量体とEC-(4β→8)-EC は、NO産生効果を打ち消し、同時にMTT 還元活性がそれぞれ19% と55%に低下した。EC-(4β→8)-ECは、単回の投与では観察されなかったMTT 還元活性の低下を引き起こした(図 3)。
【０１１５】
実験２：
被験化合物を、NO産生に対する急性的（２時間）および慢性的（24時間間隔で５回投与）効果それぞれに関して評価した。ポジティブコントロール（アセチルコリンおよび／またはヒスタミン）とネガティブコントロールの L-NNMA(NO合成阻害剤)を全ての実験において使用した。細胞数と全タンパク量は、実験間の誤差を評価するものとして参考にした。被験化合物の潜在毒性も調べた(MTT還元活性を測定)。
【０１１６】
ここで示したデータは、３回の実験から得たものであり、細胞培養液中に存在するNO(NOx)の濃度(μmol/l)+/-標準偏差(SD)として表す。データは、全てを添加された細胞培養液中のNOx量に補正され、試料を採取してきた培養液の体積当たりの値に換算された。データは、信頼水準95%のスチューデントのt-検定によって解析した。P値が0.05 以下の場合統計学的に有意であるとした。
【０１１７】
以下の化合物をイン・ビトロ（in vitro）で試験した：
C-(4α→8)-ECジガレート
C-(4α→8)-EC 
EC-(4β→8)-C
C-(4β→8)-C
C-(4β→8)-EC
EC-(4β→8)-ECジガレート
C-(4β→8)-ECジガレート
エピガロカテキンガレート(EGCG)
エピカテキンガレート(ECG)
エピガロカテキン(EGC)
没食子酸（ガレート)
【０１１８】
急性的効果を調べるため、5% CO2下３７℃で、濃度100 nM、1 μM、および10μMの被験化合物と共に、HUVECを２４時間培養した。ポジティブコントロールであるアセチルコリンは賦形剤と比べると、NO産生において統計学的に有意な増加をもたらし、一方 L-NNMAは、アセチルコリンによるNO産生効果を完全に減衰させた。EC-(4β→8)-C、(4β→8)-ECジガレート、およびエピガロカテキンガレート(EGCG)は、10 μMの濃度を投与した時に統計学的に有意なNO産生効果を示した(図 ４)。
【０１１９】
C-(4β→8)-ECジガレートは、10 μMの濃度を投与した時に、コントロールに比べてHUVEC のMTT 還元活性が47% 減少した。EC-(4β→8)-C、EC-(4β→8)-ECジガレート、およびC-(4β→8)-ECジガレートは、1 μMの濃度を投与した時に、統計学的に有意なNO産生の増加をもたらした(図 5)。この条件下では、細胞のMTT 還元活性に影響はなかった。他の化合物および他の濃度では、２４時間培養後にNO産生効果はみられなかった。
【０１２０】
慢性的効果を調べるため、HUVECの培養液に、被験化合物を２４時間毎に５回続けて与えた。２４時間毎の処理の度に培養液は置換した。C-(4β→8)-Cは、単回の投与ではみられなかったNO産生効果を示した。EC-(4β→8)-Cは、NO産生効果を示したが、これは単回の投与と比べると非常に小さなものだった。５日間培養後のポジティブコントロールの効果もまた、非常に小さかった(図6)。エピカテキンガレートの濃度が10 μM および20 μMで用いられた時に、EC-(4β→8)-ECジガレート、C-(4β→8)-ECジガレート、C-(4α→8)-ECジガレート、C-(4β→8)-EC、ECG、EGC、および没食子酸（ガレート）は、有意に細胞のMTT 還元活性の低下をもたらした。EGCの濃度が1 μM または2 μMで用いられた時に、EC-(4β→8)-ECジガレート、C-(4α→8)-ECジガレート、EGCG、およびEGCもまた、MTT 還元活性の低下をもたらした(図 7)。
【０１２１】
エクス・ビボ（ex vivo）の 実験 
エクス・ビボ（ex vivo）の実験を行い、内皮依存的な血管弛緩に対する種々のプロシアニジンの効果を調べた。なお、エクス・ビボ（ex vivo）の実験については既に、 Karim等、Nutrl Suppl., 130(8S): 2105S-2108S(2000)（関連部分はこの参照により開示に含まれる）に記載されている。この方法を使う利点は、血管機能に最終的に現れる効果を評価できることである。この方法のみが、短時間（急性）の効果を評価することが可能であり、薬剤によって誘導されるタンパク質の発現／活性を測定する必要がない。
【０１２２】
概略的には、ラビット、ニュージーランドホワイト種のオスから、ラビットの血管を得た。血管を摘出後、酸素化したクレブズ（Kreb's）バッファー液中にマウントし、ノルエピネフリン(NE)(10-6 M)で予め収縮させた。収縮が安定したら、被験化合物の濃度を累積的に上げて行った(10-9 から10-4 M)。
【０１２３】
ポジティブコントロールのアセチルコリン(10-9 から10-4 M)とネガティブコントロールのL-NNMA でも、実験を行った。NO合成(NOS)阻害剤であるL-NAMEの使用することによって、内皮依存的な血管弛緩と非依存的な血管弛緩を区別した。血管の露出は同様のコントロールとなった。各被験化合物をマウントした血管に加える前に、400 U/mLのカタラーゼを血管槽に添加し、観察する効果が培養液中で生じた過酸化水素(H2O2)によるものではないことを確認した。血管弛緩反応は、信頼水準95%の対応のないスチューデントのt-検定を用いて、血管の張力の低下によって測定した。ノルエピネフリン(NE)によって予め収縮させた血管の弛緩度をパーセントとして表した。上記と同様の統計学的アプローチが取られた。投与した濃度に対する弛緩度の平均パーセント(+/- SE)をプロットし、用量反応曲線を作成した。
【０１２４】
弛緩反応は、血管を露出、またはL-NAMEで前処理した時にいずれも減衰した。アセチルコリンは、10-7 Mの濃度で典型的な血管弛緩反応を引き起こし、10-6 Mで最大弛緩に達した。賦形剤のみで血管を処理した場合は、何の反応もみられなかった。
【０１２５】
実験１ 
以下に得られた各々の反応を示す：
EC-(4β→8)-ECジガレート(73.55+/- 7.08、濃度10-4 M)
EC-(4β→8)-C(58.36+/- 11.35、濃度10-4 M)
C-(4α→8)-C(60.80+/- 15.09、濃度10-4 M)
EC-(4β→8)-CおよびEC-(4β→8)-ECジガレートは、濃度10-5 Mでは、有意な弛緩反応を示さなかった(それぞれ、42.7+/- 11.81；44.6 +/- 16.6)。EC-(4β→8)-EC、メチル化されたB2 二量体、 EC(4β→8)(0-メチル)4 ECジガレート、またはC-(4β→8)-Cでは、有意な弛緩反応は観察されなかった(図8と9)。
【０１２６】
実験２ 
弛緩反応は、血管を露出、またはL-NAMEで前処理した時にいずれも減衰した。アセチルコリンは、10-7 Mの濃度で典型的な血管弛緩反応を引き起こし、10-6 Mで最大弛緩に達した。賦形剤のみで血管を処理した場合は、何の反応もみられなかった。
【０１２７】
以下に得られた各々の反応を示す（濃度10-4 M）：
C-(4α→8)-Cジガレート(71.7+/- 11.6、濃度10-4 M)
C-(4β→8)-Cジガレート(72.6+/- 9.8、濃度10-4 M)
EC-(4β→8)-Cジガレート(56.7+/- 15.4、濃度10-4 M)
C-(4β→8)-ECジガレート(72.4+/- 17.4、濃度10-4 M)
C-(4α→8)-ECジガレート(40.7+/- 9.2、濃度10-4 M)
【０１２８】
さらに、C-(4β→8)-ECもまた、濃度10-5 Mで33.1% の弛緩反応をもたらした。
【０１２９】
C-(4β→8)-C、C-(4β→8)-EC、C-(4α→8)-ECおよびEC(4β→6)EC-8メチルでは、有意な弛緩反応は観察されなかった。図10は、被験化合物の最大弛緩度（10-4 M）とアセチルコリンの最大弛緩度（10-5 M、平均+/- SE）を比較したものである。図 11は、アセチルコリン、被験化合物、およびL-NAMEで処理した時の被験化合物の用量反応曲線を示す。
【０１３０】
実験３
以下の化合物が血管弛緩を誘導した： 
最大弛緩
EC(4β→8)ECジガレート(10 μMおよび100 μM)      74%
EC(4β→8)Cジガレート(100 μM)                    57%
C(4α→8)Cジガレート(100 μM)                     72% 
C(4β→8)Cジガレート(100 μM)                     73% 
C(4α→8)ECジガレート(100 μM)                    41%
C(4β→8)ECジガレート(10 μM および100 μM)       72%
C(4α→8)C(100 μM)                                61% 
【０１３１】
実験４
10-9 M から10-4 Mの濃度の没食子酸（ガレート）、EGC、ECGまたはEGCGでは、有意な弛緩反応は観察されなかった。
【０１３２】
選ばれた化合物の上記データの概略を、表１および２に示す：
【表１】
2008502691.tif 000024
【表２】
2008502691.tif 000025
【０１３３】
実施例４-フラバノール／プロシアニジンの定量
プロシアニジンは、以下のように定量した：工業的に利用されている(-)-エピカテキン、および精製物から得られた二量体から十量体を用いて、標準組成物を作った。なお、この方法はHammerstone, J. F.等、J. Ag. Food Chem.; 1999; 47(10)490-496、Lazarus, S. A. 等、J Ag. Food Chem.; 1999; 47(9); 3693- 3701、およびAdamson, G. E. 等、J. Ag. FoodChein,.; 1999; 47(10)4184-4188に記載されている。２７６nmと３１６nmの励起および蛍光波長を持つ蛍光検出器を用いた順相HPLC法によって、これらの化合物で作った標準液を解析した。なお、このHPLC法は、既に引用したAdamsonの参考文献に記載されている。ピークをクラス分けし、各々のオリゴマークラスにおいてピーク面積を積算することで、含まれる全ての異性体の寄与分を合計した。検量線は２次関数近似を適用して作った。単量体と小さなオリゴマーは、ほとんど直線的なプロットを示し、実際に単量体、および二量体を基にした検量線を作る際は直線回帰を適用した。
【０１３４】
次に、これらの検量線を用いて、以下のように調製した試料中のプロシアニジン量を計算した：まず、ヘキサン抽出を３回繰り返して（各４５mL）、カカオまたはチョコレート試料(約8グラム)を脱脂した。次に、脱脂した試料１グラムを5 mLのアセトン／水／酢酸(70:29.5:0.5 v/v)混液で抽出した。次に、試料のHPLC データを上記で得られた検量線（これは精製したオリゴマーを使用）と比較することによって、脱脂した試料中のプロシアニジンの量を求めた。公定分析化学者協会によって規格化された方法(AOAC公定法920.177)を用いて、試料の脂肪含有率（チョコレートに対しては１グラムの試料、またはチョコレートリカーに対しては0.5グラムの試料を用いた）を求めた。次に、元の試料（含脂肪）中に含まれる全プロシアニジンの量を計算した。カラム間の誤差を避けるために、検量は試料を流す前に行った。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】HUVECのNO産生に対する被験化合物の急性的効果を示す。
【図２】10 μM(a)または1μM(b)の濃度の被験化合物を１回投与して２４時間インキュベーション後の、HUVECのNO産生における被験化合物の効果を示す。
【図３】５回の被験化合物での２４時間処理後のHUVECのNO産生を示す。
【図４】10 μMの被験化合物を１回投与して２４時間インキュベーション後のHUVECのNO産生における被験化合物の効果を示す。
【図５】1 μMの被験化合物を１回投与して２４時間インキュベーション後のHUVECのNO産生における被験化合物の効果を示す。
【図６】５回の被験化合物での２４時間処理後のHUVECのNO産生を示す。
【図７】５回の被験化合物での２４時間処理後のHUVECのMTT還元活性を示す。
【図８】予め収縮した大動脈輪(aortic ring)に対する被験化合物の効果を示す。
【図９】予め収縮した大動脈輪における被験化合物による量依存的な弛緩を示す。
【図１０】予め収縮した大動脈輪に対する被験化合物の効果を示す。
【図１１】予め収縮した大動脈輪における被験化合物による量依存的な弛緩を示す。
【図１】
2008502691.tif 000026
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2008502691.tif 000035
【図１１】
2008502691.tif 000036
【国際調査報告】
2008502691.tif 000037
2008502691.tif 000038