(57)【要約】  本発明は体脂肪減少機能を有する乳酸菌に関し、ラクトバシラスラムノサスストレインpl60(Lactobacillus  rhamnosus  Strain  PL60)  KCCM‐10654Pを提供する。  本発明の菌株は体脂肪低下機能性食品として直接使用するかまたは体脂肪低下機能性食品の添加剤として使用することもでき、或は体脂肪低下機能性発酵食品の発酵種菌として使用することができ、本菌株が生産する体脂肪抑制物質を分離して使用するもできる。  また、本菌株を利用して発酵食品を製造する場合、最大の体脂肪低下効果を得られる条件を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
LＡ(linoleic  acid)をCLA(conjugated  linoleic  acid)に変換させるラクトバシラスラムノサス(Lactobacillus  rhamnosus)菌株。
【請求項２】
前記菌株はラクトバシラスラムノサスストレインPL60(Lactobacillus  
rhamnosus  Strain  PL60)  KCCM‐10654Pであることを特徴とする請求項1記載のラクトバシラスラムノサス(Lactobacillus  rhamnosus)菌株。
【請求項３】
前記菌株は生菌または乾燥菌であることを特徴とする請求項1または2記載の
ラクトバシラスラムノサス(Lactobacillus  rhamnosus)菌株。
【請求項４】
請求項1乃至3の何れ1項の菌株を含むことを特徴とするCLA生産用組成物。
【請求項５】
請求項1乃至3の何れ1項の菌株を先培養することを特徴とするラクトバシラ
スラムノサス(Lactobacillus  rhamnosus)菌株を利用したCLAの大量生産方法。
【請求項６】
菌株の先培養培地に0.01〜1.0％のLAまたは紅花の種油を添加することを特徴
とする請求項5記載のラクトバシラスラムノサス(Lactobacillus  rhamnosus)菌株を利用したCLAの大量生産方法。
【請求項７】
菌株の先培養培地に0.01〜1.0％のTween‐80を添加することを特徴とする請
求項6記載のラクトバシラスラムノサス(Lactobacillus  rhamnosus)菌株を利用したCLAの大量生産方法。
【請求項８】
菌株の先培養培地に炭水化物気質として果糖または砂糖或は乳糖を添加する
ことを特徴とする請求項7記載のラクトバシラスラムノサス(Lactobacillus  rhamnosus)菌株を利用したCLAの大量生産方法。
【請求項９】
請求項1乃至3の何れ1項の菌株を添加剤に含むことを特徴とする体脂肪低下
機能性食品。
【請求項１０】
食品はヨーグルト、乳製品、チーズ、キムチ、唐辛子味噌、味噌を含む発酵食
品または健康補助食品であることを特徴とする請求項9記載の体脂肪低下機能性食品。
【請求項１１】
ラクトバシラスラムノサスストレインPL60(Lactobacillus  rhamnosus  Strain    
PL60)  KCCM‐10654P菌株を種菌として用いて製造されることを特徴とする乳製品。
【請求項１２】
ラクトバシラスラムノサスストレインPL60(Lactobacillus  rhamnosus  Strain  
PL60)  KCCM‐10654P菌株を発酵種菌として用いて製造されることを特徴とする穀物発酵食品。
【請求項１３】
ラクトバシラスラムノサスストレインPL60(Lactobacillus  rhamnosus  Strain
PL60)  KCCM‐10654P菌株の生菌または乾燥菌あるいは前記菌株の培養余液を含むことを特徴とする肥満関連疾病の予防または治療用服用剤。
【請求項１４】
服用剤の適量は平均体重が60kgの人がラクトバシラスラムノサスストレインPL60(Lactobacillus  rhamnosus  Strain  PL60)  KCCM‐10654P菌株を1日1〜2回一度に1×107〜1×1011CFUを摂取するものであることを特徴とする請求項13記載の肥満関連疾病の予防または治療用服用剤。                            
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は体脂肪低下機能性ラクトバシラスラムノサスとこれを含有した食品に関する。本発明は体脂肪低下機能を有する乳酸菌を提供する。また、本発明は本乳酸菌の生菌・死菌・破砕された細胞壁分劃・培養液・培養液乾燥物・体脂肪効果を有するCLAを含む培養液抽出物らとこれらを含む体脂肪低下機能性食品と食品添加剤を提供する。また,  本発明は体脂肪低下効果を有する乳酸菌を種菌または添加剤として用いた体脂肪低下機能性食飲料を提供する。また、本発明は本乳酸菌を含有した体脂肪低下効果の服用剤を提供する。
【０００２】
尚、本菌株を利用して発酵食品を製造する場合、最大の体脂肪低下効果を得られる条件を提供する。
【背景技術】
【０００３】
現代社会で肥満は癌より完治率が低い疾病でこれに因る各種の成人病は勿論これに因る死亡率が増加している。米国では“肥満との戦争”を宣布する程度の深刻な問題を惹き起こしている。肥満の予防および治療の効果があると主張されている物質には色々なものがあるが、現在まではピブル酸とconjugated  linoleic  acid(CLA)だけが科学的な根拠でその効能が立証されている(Lenz  TL，Hamilton  WR．Supplemental  products  used  for  weight  loss．2004．J  Am  Pharm  Asocc(Wash  DC)  44：59‐67)。CLAの体脂肪減少機転としては脂肪細胞の自殺機転誘導で脂肪細胞数の減少、脂肪細胞の大きさ減少、エネルギーと飲食物摂取減少、脂肪生産減少、エネルギー消費増加、脂肪分解増加、脂肪酸化増加などが提案されている(Chardigny  JM，Hasselwander  O，Genty  M，Kraemer  K，Ptock  A，Sebedio  JL，2003．Effect  of  conjugated  FA  on  feed  intake，body  composition，and  liver  FA  in  mice．Lipids．38(９)：895‐902)。
【０００４】
CLA(ｃ9ｔ11‐Octadecadienoic  acid，ｔ10ｃ12‐Octadecadienoic  acid)はlinoleic  acid(LA，C18：2  cis９cis12)のisomerization過程を通じて形成される。CLAは二重結合の位置によって抗酸化効果、コレステロール低下効果、成長促進効果、抗癌効果を有するものと知られており、最近には人体血漿脂質と体脂肪減少効果などを有しているのが知られている。これらは動物の肉と乳酸菌発酵油などに含まれていると報告されている。CLAの異性質体のうちで特にc９，T11‐CLAの体脂肪減少効果は動物実験と臨床実験で既に立証されている。最も理想的にはc9t11とt10c12が同量生産されるのが最も好ましい。
【０００５】
CLAを生産する微生物のうち最初に発見されたのは牛のような反芻動物から分離された嫌気性微生物であるButyrivibrio  fibriosolventsでLAのbiohydrogenation時に2段階を経てtrans‐11‐octadecenoic  acidを生産する。Linoleic  acid  isomeraseの作用でcis‐9，trans‐11‐octadecadienoic  acidを生産し連続生産されたconjugated  acidのhydrogenationでtrans‐11‐octadecenoic  acidを生産する。
【０００６】
最近2004年のノルウェーの研究結果によれば(Gaullier  JM，Halse  J，Hoye  K，Kristiansen  K，Fagertun  H，Vik  H，Gudmundsen  O，2004．Conjugated  linoleic  acid  supplementation  for  １  ｙ  reduces  body  fat  mass  in  healthy  overweight  humans．Am  J  Clin  Nutr．79(６)：1118‐1125)、CLAを1年間180人の過体重の人に1年間投与した結果、副作用なしに４〜10％の体重減少を起こした。
【０００７】
本発明では体脂肪減少効果を有しているｔ10ｃ12を過量生産する韓国型乳酸菌を選別して同定し、この菌株の腸定着性などのプロバイオチックとしての性質を確認し、この菌株がCLAを最大に生産し得る条件、この菌株で動物実験を行い体重減少を確認して体脂肪減少効果を有している乳酸菌を開発した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明はCLAを生産する菌株を提供することを目的とする。
【０００９】
本菌株はラクトバシラスラムノサスストレインPL60(Lactobacillus  rhamnosus  Strain  PL60)であって、この乳酸菌は韓国微生物保存センター(Korean  Culture  Center  of  Microorganism)に2005年5月9日付KCCM‐10654Pで菌株寄託されている。
【００１０】
また、本発明は体脂肪を減少し得る乳酸菌を提供することを目的とする。
【００１１】
また、本発明は体脂肪減少を誘導することにより各種の成人病を予防或は治療することを目的とする。
【００１２】
また，本発明は体脂肪減少効果を有するCLAの生産を極大化する条件を提供することを目的とする。
【００１３】
また、本発明は体脂肪減少効果を有すると共に腸付着性・耐酸耐胆汁性の優れた菌株を提供することを目的とする。
【００１４】
また、本発明はプロバイオチックであって抗生剤耐性転移がなく、人体に安全な乳酸菌を提供することを目的とする。
【００１５】
乳酸菌は各種の組成物で製剤化することができ、望ましくはこの組成物はカプセル・錠剤および粉末などの組成物形態と各種の食品添加に容易な形態も好ましい。
【００１６】
このような製剤は公知された方法により製造上許容される担体・賦形剤・溶媒または補助剤を用いて製造することができる。このような方法および成分は良く知られており、標準テキストおよびマニュアル、例えば本願に参考用として含まれる文献(Remington．1995．The  Science  and  Practice  of  Pharmacy．Mack  Publising  Co．Easton，PA  18042，USA)に詳しく記載されている。
【００１７】
また、当業界に一般的に良く知られた方法により整腸性乳酸菌食品に製造することもできる。
【００１８】
また、当業界に一般的に知られた方法により乳製品を含む発酵食品の種菌または添加剤として用いて体脂肪減少効果を有する飲食料製造に用いることができる。
【００１９】
また、本特許で提示した条件を用いて体脂肪効果を最大に有する発酵食品を生産することができる。
【００２０】
以下、本発明を詳しく説明する。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
前記の目的を達成するために、本発明は体脂肪減少機能性食品を提供する。
【００２２】
また、本発明は体脂肪減少のためのラクトバシラスラムノサスストレインPL60(Lactobacillus  rhamnosus  Strain  PL60)  KCCM‐10654Pを提供する。
【００２３】
また、本発明は体脂肪減少効果を利用して成人病予防と治療のためにラクトバシラスラムノサスストレインPL60(Lactobasillus  rhamnosus  Strain  PL60) KCCM‐10654Pが１×10６〜１×1011 CFU／g含まれた体脂肪減少機能食品を提供する。
【００２４】
また、本発明はラクトバシラスラムノサスストレインPL60(Lactobacillus  rhamnosus  Strain  PL60)  KCCM‐10654Pを含む飲食料添加剤を提供する。
【００２５】
また、本発明はラクトバシラスラムノサスストレインPL60(Lactobacillus  rhamnosus  Strain  PL60)  KCCM‐10654Pを利用した発酵食品で最大の体脂肪効果を得られる条件を提供する。
【００２６】
以下、本発明の理解を助けるために望ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものであるのみ本発明が下記の実施例に限定されるのではない。
【発明の効果】
【００２７】
本発明のラクトバシラスラムノサスストレインPL60(Lactobacillus  rhamnosus   Strain  PL60)は体脂肪減少効果を有しているため、肥満による疾患を予防あるいは治療することができる。また、本発明のラクトバシラスラムノサスストレインPL60(Lactobacillus  rhamnosus     Strain  PL60)の乾燥物とラクトバシラスラムノサスストレインPL60(Lactobacillus  rhamnosus   Strain  PL60)の菌株培養余液、培養余液乾燥物は各種飲食料の添加剤として用いられて体脂肪予防および治療する用途に用いることができるため、全ての肥満関連疾患予防および治療の目的に用いることができる。また、本ラクトバシラスラムノサスストレインPL60(Lactobacillus  rhamnosus   Strain  PL60)を利用した発酵食品は体脂肪減少効果による肥満予防および治療の目的に用いることができる。
【００２８】
また、本発明では発見したCLA最大生産のためにLAが含有された培地で先培養しなければならなく、ラクトバシラスラムノサスストレインPL60(Lactobacillus  rhamnosus   Strain  PL60)を利用した発酵食品が最大の体脂肪効果を有するためにはLAは100〜1000ppm、Tween‐80は最大の体脂肪効果を有するためにはLAは100〜1000ppm、Tween‐80は１〜0.01％、炭水化物気質は果糖・砂糖・乳糖が適合であり、このうち果糖が最も適合である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
実施例１：Conjugated  Linoleic  Acid(以下、CLAと略称する)生産機能を有する乳索  
CLAを生産する菌株を選別するためにCLAの気質であるLAが含有された培地で成長する乳酸菌を選別し、このうちでCLA生産に関与する酵素であるisomerase酵素の発現を確認した。
【００３０】
＜材料および方法＞
リノール酸(LA)が添加された培地で成長する乳酸菌を1次的に選抜し、これら乳酸菌のうちからCLAを生産する乳酸菌を選抜する。これのためにisomerase  assay(Ogawa  J．Matsumura  K．Kishino  S．Omura  Y．and  Shimizu  S．2001．Conjugated  Linoleic  acid  accumulation  via  10‐hydroxy‐12‐octadecaenoic  acid  during  microaerobic  transformation  of  linoleic  acid  by  Lactobasillus  acidophilus．Appl．Envir．Microbiol．67：1246‐1252)を利用して大量の乳酸菌からCLA生産菌株を容易に選別し出す。先ず、0.1％LAが含まれたMRS培地で成長する乳酸菌を1次に選別し出す。次に、これら乳酸菌をMRS  brothで二度継代培養した後、10mlの0.1％のLAが含まれたMRS  brothに2日間培養する。培養液のうち5mlを8,000rpm、10分間遠心分離してcellを集めこれを0.1M  potassium  phosphate  緩衝溶液で(pH  7.0)二度洗浄する。更に、0.1M  potassium  phosphate  buffer(pH  7.0)  1.0mlを添加した後、超音波破砕機を利用して3分ずつ冷蔵状態で破砕し、遠心分離してcrude  enzyme  solutionを得る。気質溶液(0.1ml  LA，  2.7ml  0.1M  potassium  phosphate  buffer，0.2ml  1,3‐propanediol)に準備されたcrude  enzyme  solutionを添加し、233nmで吸光度を測定する。
【００３１】
＜結果および考察＞
總200余個以上の乳酸菌のうちisomerase  assayを利用してCLAを生産する乳酸菌を選別した。
【００３２】
実験例１：ガスクロマトグラフィーを利用したCLA生産確認
Isomerase酵素を発現する乳酸菌が実際にCLAを幾ら生産するかを確認するためにガスクロマトグラフィーを利用してCLAの生産された量を測定した。
【００３３】
＜材料および方法＞
LAが含有されたMRS液体培地で候補乳酸菌を接種した後、37℃で24〜48時間培養した。4日間培養した培養培地をHeptadecanoic  acidとchloroform：methanolで抽出した。sodium  sulfateを処理して試料の水分を除去しevaporationさせる。準備された試料に１N  sodium  hydroxide(in  methanol)を添加した後、100℃で15分間saponificationさせる。次に、４％  HCl(in  methanol)を添加してメチル化させる。メチル化されたサンプルにhexane：water(１：1，ｖ／ｖ)を添加して混合した後に遠心分離する。有機溶媒層を窒素ガスで全て飛散し更にこれを１ml  hexaneに溶かし準備する。
【００３４】
本発明で酸化物の除去前と後に夫々の試料に含有されたCLA含量は火炎イオン化検出器(FID  dector)が装着されたガスクロマトグラフィー(Hewlett  Packard  5890  Series  ＩＩ  GC)を用い、コラム(DB  FFAP  capillary  column)の長さ30m、内径0.25μm、フィルムの厚さ0.25μmの毛細管コラムを用いた。コラムをGCに装着した後、GCのオーブン温度は210℃、検出器の温度は270℃にし、注入部(injector)の温度は250℃にし、運搬用気体はヘリウム(1ml／min)を用い、分解比(split  ratio)は50：1にした。試料注入量は2μlであり、各ピークの面積は機器に連結された積分計(3395，Hewlett  Packard)を利用して求めた。CLAの同定は標準物質の停留時間と比較して確認し、CLAの含量を計算するために内部標準物質としてHeptadecanoic  acidを利用した(Lin，T．Y．2000．Conjugated  linoleic  acid  concentration  as  affected  by  lactic  cultures  and  additives，Food  Chemistry  69，27‐31)。
【００３５】
＜結果および考察＞
図1のガスクロマトグラムの結果に現れている通り分離された乳酸菌はCLAのc9t11とt10c12の形態を全て生産していた。体脂肪効果を有しているt10c12の生産能力をppmに換算したとき、43.25ppmでこれは既存にCLAを生産するものと報告されたラクトバシラスルテリ(Lactobacillus  reuteri)の30ppm、ラクトバシラスファーメンタム(Lactobacillus  fermentum)の28ppmに比べて越等に優れた生産能力を備えていた。
【００３６】
実験例２：乳酸菌の同定：グラム染色、API  kitを利用した同定、16S  rRNA塩基序
列分析、multiplex  PCR
CLA生産乳酸菌を同定するためにグラム染色時にグラム陽性棒菌、カタラーゼ陰性
を確認し、API  kitを利用して各種の生化学・生理的検査をし、16S  rRNA塩基序列を分析して同定した。また、近縁種間の分類のためにgroup‐specific  primerを利用したmultiplex  PCRで菌を同定した。
【００３７】
１．グラム染色
スライドに細菌を塗抹し熱固定させた後、crystal  violet溶液を加えて約1分間反応させた。Iodine溶液を処理して過量の染料を洗浄し、更にIodineを加えて1分間処理した。      
【００３８】
95％エタノールで30秒間脱色させた。水で2~3秒洗浄した後、吸紙で水分を除去した。対応染色のためにSafranin  O溶液を約10~30秒処理した。染料がそれ以上溶け出ないときまで用心深く水で洗浄し、吸紙で乾かした後、油浸オイルを1滴落として顕微鏡下で観察した(×1,000)。
【００３９】
＜結果および考察＞
図２に示された通り、CLAを生産する乳酸菌はグラム陽性棒菌として現われた。
【００４０】
２．API  kitを利用した生化学・生理的特性検査
菌株が純粋分離されたかを確認し、MRS培地で30℃または37℃で24時間培養した。MRS培地でコロニーを分離する前にMRS  brothで二度以上継代培養した後に用いた。Suspension  mediumアンプルを開封し綿棒を利用して非常に濁度が高い溶液(heavy  suspension)を準備した。suspension  medium  5mlに準備された菌液を数滴落として濁度をMcFarland  2に合わせた。前記の通り準備された菌が含有されたAPI  50  CHL培地をストリップのチューブに分株し、30℃または37℃で48時間好気的に培養した。API  kitは酸が生成されると培地に含まれているbromocresol  purpul指示薬により培地の色が黄色に変わる。Esculin  test(Tube  No．25)は紫色から黒色に変わると陽性である。
【００４１】
＜結果および考察＞
表１に示されている通り、API  50CH  kitを用いた結果、ラクトバシラスラムノサス(L．rhamnosus)とラクトバシラスパラパラカゼイ(L．para  paracasei)と類似なものと判定されたが％には判定されなかった。
【００４２】
【表１】
2008507991.tif 000002
【００４３】
３．16S  rRNA塩基序列分析を利用した同定
Genomic  DNAを分離して16S  ribosomal  DNA部分を増幅し増幅されたDNA断片を電気泳動で確認した。DNA断片をQiagen  PCR  purification  kit(Qiagen，Hilden，Germany)で精製してd‐Rhodamine  dye‐labeling  dd‐NTPを含む反応液と混合してsequencing  PCRをした後に得られたDNAをEthanol／Sodium  acetate沈澱法を利用して精製した。精製したDNAをTSR(Template  Suppression  Reagent)に溶かしてABI prism  310  Genetic  Analyzer(PE  Applied  Biosystems，U.S.A)で分析し、分析された塩基序列はGenbank(http：//www．ncbi．nlm．nih．gov/)を利用して同定した。
＜結果および考察＞
CLA生産乳酸菌の塩基序列を分析した結果(図3)、ラクトバシラスラムノサス(Lactobacillus  rhamnosus)  842／844(99％)とラクトバシラスカゼイ(Lactobacillus  casei)(99％)に同一性を現わした。
【００４４】
４．Multiplex  PCRを利用した同定
ラクトバシラスラムノサス(L．rhamnosus)とラクトバシラスカゼイ(L．casei(L．paracasei))を区分するためにmultiplex  PCRを行いPL60から生産されるDNA断片を比較した(Song，Y．，N．Kato，C．Liu，Y．Matsumiya，H．Kato，and  K．Watanabe．2000．Rapid  identification  of  11  human  intestinal  Lactobacillus  species  by  multiplex  PCR  assays  using  group‐and  species‐specific  primers  derived  from  the  16S  23S  rRNA  intergenic  spacer  region  and  its  flanking  23S  rRNA，FEMS  Microbiol．Letters，187：167‐173)。これのためにPCR反応は１×reaction  buffer，200μM  dNTPs，0.15  units  Taq  polymerase,10pmol  primers(LU‐5,CTA  GCG  GGT  GCG  ACT  TTG；Lpar‐4，GGC  CAG  CTA  TGT  ATT  CAC  TGA；Rha  ＩＩ，GCG  ATG  CGA  ATT  TCT  ATT  ATT)、20ng  DNAの組成で最終30μlの量で行った。PCR反応条件は95℃で20秒、62℃で2分、74℃で2分間を１cycleとして全て35回繰り返し、72℃で10分間反応させた後、4℃で保管した。0.5×TBE(0.045M  Tris‐borate，0.001M  EDTA)  bufferを用いて1.5％  agarose  gelで20分電気泳動をした後、UV箱で展開されたDNA断片らの様相を観察した。
【００４５】
＜結果および考察＞
Multiplex  PCR結果、図4の通り、ラクトバシラスパラカゼイ(Lactobacillus  paracasei)  ATCC  25302の場合は312bpの大きさのDNA切片が生成された反面、ラクトバシラスラムノサス(L．rhamnosus)とPL60菌株は113bpのDNA切片を生産した。従って、PL60はラクトバシラスラムノサス(L．rhamnosus)であると確認された。これは現在までCLA生産ラクトバシラスラムノサス(L．rhamnosus)は全世界的に報告されたことがないため、本発明が世界最初にCLA生産ラクトバシラスラムノサス(L．rhamnosus)を報告するのである。
【００４６】
実験例３：ラクトバシラスラムノサス(L．rhamnosus)の腸定着性
プロバイオチックとしては耐酸耐胆汁性が強く腸細胞定着性が優れなければならなく、これを人体身体実験により腸に定着性を確認しなければならない。
【００４７】
１．耐酸性実験
選抜菌株の生存性に対するpHの影響を知るためにMRS(DeMan-Rogosa-Sharpe)培地を10N  HClを利用してpHを7.0，4.8，4.5に調整した後に用いた。MRS培地に活性化された菌液(O.D＝2.0)を2％水準に接種し、37℃で24時間培養した後、吸光度を600nmで測定した吸光度によりpHが選抜菌株の成長に及ぼす影響を知った。PH  7.0のO.Dは１/10に稀釈して計り記録する(Conway  PL，Gorback  SL，Goldin  BR，1987．Survival  of  lactic  acid  bacteria  in  the  human  stomach  and  adhesion  to  intestinal  cells．J．Dairy  Sci．70：1-12)。
【００４８】
＜結果および考察＞
低酸性での生存性を実験した結果、表２の通り、24時間処理にも生存性を見せて耐酸性が強いのが分った。
【００４９】
【表２】
2008507991.tif 000003
【００５０】
２．耐胆汁性実験
選抜菌株の成長に及ぼす胆汁の影響を知るためにMRS(DeMan  Rogosa  Sharpe)培地にox  gall(OXOID)を0.125％、0.25％濃度で添加した後、滅菌して活性化された菌液(O．D＝2.0)を2％水準で接種し、37℃で24時間経過後に吸光度を600nmで測定した。  Bilc  0％でのO．Dは1／10に稀釈して計り記録した(Ibrahim  SA，Bezkorovainy  A．1993．Survival  of  bifidobacteria  in  the  presence  of  bile  salt．J．Sci．Food  Agric．62：351‐354)。
【００５１】
＜結果および考察＞
正常人の小腸の胆汁濃度は0.06％で、これに比べて濃度がずっと高い0.250％の胆汁でも生存性を見せて耐胆汁性が非常に強いものと現われた。
【００５２】
【表３】
2008507991.tif 000004
【００５３】
３．腸付着性実験
人体の腸に付着する能力があるかを知るために人体の腸表皮細胞由来の細胞株であるCaco‐2細胞に付着させて見た。これのためにCaco‐2細胞株を2.7g／Lのソジウムバイカーボネート、20％(v／v)  fetal  bovine  serum(FBS)およびアンチバイオチックス  アンチマイコチックスを含むDMEM培地(pH  7.0)で培養した。30mm培養皿に３×105細胞を2mlの培養培地に接種して単一層で培養した。培地は2日に一度交換した。6日間培養した後、2mlの燐酸緩衝溶液(PBS)で細胞単一層を2回洗浄した。1×107細胞の乳酸菌を培養培地2mlに懸濁させて培養皿に添加し、37℃、5％のCO2‐95％空気条件で培養した。60〜90分間培養後に細胞を滅菌してPBSで2回洗浄し、メタノールで10分間固定させた。グラム染色後光学顕微鏡下で観察した。定量的測定のために100倍顕微鏡上で20個のフィールドを観察し、付着された菌数を数えてCaco2細胞100個当り付着された菌数で表記した(Bibiloni  R，Perez  PF，DeAntoni  GL．1999．Anacrobe  5，483‐485；Edited  by  R．Fuller(1997)  Probiotics  2，10‐22)。
【００５４】
＜結果および考察＞
図５に示された通り、ラクトバシラスラムノサスストレインPL60(L．rhamnosus  Strain  PL60)はCaco‐2細胞に付着能力が非常に優れた。これを20個のフィールドで各フィールド当り付着された細菌数を計数してフィールド当り付着された細菌数の平均を計算するとフィールド当り59.29‐5.33の乳酸菌が付着されていた。これは培養皿当り4000個以上の乳酸菌が細胞に付着されたので既存の知られた乳酸菌より腸定着性が優れたものと現われた。
【００５５】
４．人体腸定着性実験
実際に人が乳酸菌を服用したとき、腸に定着するか否かを確認するために毎日一度ラクトバシラスラムノサスストレインPL60(L．rhamnosus  Strain  PL60)  1010CFUを8日間経口投与し、翌日採便してMRS(with  1％  bromo  phenol  blue，30μｇ／ml  vancomycin)を用いて培養した。48時間培養した後、観察された類似colonyを全てグラム染色で観察しsubcultureして純粋分離されたcolonyを利用してSpecies‐specific  PCRを行った。
【００５６】
＜結果および考察＞
図６に示された通り、乳酸菌を摂取した1日後から乳酸菌が検出され、服用を禁止した6日まで検出された。検出された乳酸菌集落はspecies‐specific  PCRでラクトバシラスラムノサス(L．rhamnosus)と確認された(図７)。これはラクトバシラスラムノサスストレインPL60(L．rhamnosus  Strain  PL60)が腸に定着されることを見せてくれる証拠であり、特に、図６から見られる通り、ラクトバシラスラムノサスストレインPL60(L．rhamnosus  Strain  PL60)を服用した後から腸内細菌叢が単純になることから推して整腸作用もあるのが分かった。
【００５７】
実験例４：乳酸菌の安全性実験
人体服用のために乳酸菌の安全性を実験しなければならない。これのためにアンモニア・インドル・溶血毒素などの有害物質を生産するか否かと有害酵素が存在するか否かを確認した。
【００５８】
１．溶血現象検査
Sheep  blood  Agar培地にL．rhamnosus  Strain  PL60を接種し、37℃で24時間培養したとき、α‐hemolysisのみあり、β‐hemolysisは観察されなかった。
【００５９】
２．ゼラチン液化反応検査
MRS  gelatin培地(0．3g  beef  extract，0.5g  peptone，12g  gelatin，100ml  MRS  broth)で4面培地を作り、ラクトバシラスラムノサスストレインPL60(L．rhamnosus  Strain  PL60)を接種し、35℃で6週間培養する。接種しなかった対照区と共に4℃で4時間程度冷却してゼラチンが液化したか否かを確認したとき、液化を見せてくれないため、ゼラチン分解酵素がないのが確認された。
【００６０】
３．アンモニア生成確認
Urea  agar培地(20g  urea，５g  NaCl，2g  KH2PO4，1g  peptone，  1g  glucose，12mg  phenol  red，100ml  蒸留水)を濾過滅菌した後、寒天15gを蒸留水900mlに溶かして湿潤滅菌をし混ぜて總嵩を1Lに合わせる(pH  6.9)。ここにラクトバシラスラムノサスストレインPL60(L．rhamnosus  Strain  PL60)を接種し、37℃で12時間程度培養して培地の色の変化を確認した。ラクトバシラスラムノサスストレインPL60(L．rhamnosus  Strain  PL60)は培地の色が黄色を帯びた陰性でアンモニアを生成しないものと判明された。
【００６１】
４．インドル生成確認
0.1％  Tryptoneを含有したMRS  agarにラクトバシラスラムノサスストレイン
PL60(L．rhamnosus  Strain  PL60)を接種し、18時間程度培養する。ここに、Kovac's  reagent(10g  p‐dimethylaminobenzaldehyde，150ml  buthnol，50ml  hydrocholic  acid)を５滴程度加え色の変化を観察したとき、色の変化がないためインドルが生成されていないのが確認できた。
【００６２】
５．フェニールアラニン脱アミン調査
MRS培地にＤ．L‐phenylalanine  0.2％を添加してラクトバシラスラムノサスストレインPL60(Ｌ．Rhamnosus  Strain  PL60)を接種し、24時間程度培養した。ここに5〜10滴の10％  ferric  chlorideを落とし4面培地上へ流れ下るようにして1〜5分内に色の変化を観察する。陽性である場合、生成されたphenylpyruvic  acidに10％  ferric  chlorideと反応して緑色に変わる。ラクトバシラスラムノサスストレインPL60(L．rhamnosus  Strain  PL60)は陰性に現われた。
【００６３】
６．β‐glucuronidase確認検査
p‐nitrophenyl‐β‐D‐glucuronideを0.1M  sodium  phosphate  buffer，pH  6.0に0.2％になるように溶解させた。ラクトバシラスラムノサスストレインPL60(L．rhamnosus  Strain  PL60)をAb600＝4でphosphate  bufferに良く浮遊させて懸濁液を作り、200μｌ懸濁液に気質があるbuffer  200μｌを添加して、37℃で16時間処理する。培養液の色が黄色に変わると陽性に判読したとき陰性であり、遠心分離して上澄液を405nmで測定したとき0.078と現われた。
【００６４】
７．Nitroreductase  activity確認検査
MRS液体培地で一夜培養されたラクトバシラスラムノサスストレインPL60(L．rhamnosus  Strain  PL60)を3,000×gで10分間遠心分離して菌体を集めて5分間sonication(超音波分解)させた。上澄液に4‐nitrobenzoic  acid(final  conc．30μｇ／ml)とtrichloroacetic  acid(final  conc．0.21％)を添加して37℃で1時間処理し、sodium  nitrite(final  conc．0.007％)を添加し、室温で20分間処理した。Ammonium  sulfamate(final  conc．0.04％)添加し、室温で3分間処理する。NEDD(N‐(1‐naphtyl)ethylenediamine  dihydrocholide)(final  conc．0.35％)を添加し、4℃で発色させて540nm  spectrophotometerでしたとき、陰性に現われた。この際、陽性反応は1μｇ／mlの4‐aminobenzoic  acidを添加して比較した。
【００６５】
８．抗生剤耐性
プロバイオチックは抗生剤に耐性が強いほど腸内生存性が高くなるので、抗生剤耐性が強いほど良い。しかし、これら耐性が伝達される場合、耐性問題を惹き起こすことがあるため、他の菌への耐性転移を確認した。
【００６６】
【表４】
2008507991.tif 000005
【００６７】
９．抗生剤耐性の転移確認
抗生剤耐性の転移を確認するためにfilter  binding  assayを行った(givers，D．，G．Huys，and  J．Swings．2003．In  vitro  conjugal  transfer  of  tetracycline  resistance  from  lactobacillus  isolates  to  other  Gram‐positive  bacteria．FEMS  Microb．Letters  225：125‐130)。ラクトバシラスラムノサスストレインPL60(L．rhamnosus  Strain  PL60)をmid‐exponential  phase(略4~5時間)まで培養し、これの1mlと1mlのEnterococcus  feccalis  CCARM  5110を混合して滅菌されたcellulose  acetate  filterに濾過させ、PPS(peptone  physiological  saline  solution)で洗浄した。濾過紙をnon‐selective  agar  medium上に上げて37℃で16時間培養する。濾過紙に成長した菌体を2mlのPPSで洗浄して落し、これを更に稀釈して夫々の抗生剤が含有されたEnterococcosal選択培地に接種し、37℃で24〜48時間培養して耐性E．faecalisを確認したが、耐性E．faecalisは発見されないため耐性が転移されていないのを確認した。
【００６８】
実施例２：CLA生産のための最適条件
CLAを最大に生産するためのLA濃度と気質の種類を知り出した。
【００６９】
１．CLAを最大に生産するためのLAの濃度
高濃度のLAは菌自体の成長を抑制するため高濃度で培地に添加することができない。また、培地に所要されるLAを節約するために最大のCLA生産を得られるLAの濃度を確認した。
【００７０】
＜材料および方法＞
Skim  milk培地とMRS培地に夫々の濃度になるように水溶性LA  esterを添加し、一夜培養して培地内に生産されたCLAの量を確認した。これのために培養液内の脂質を抽出してメチル化させた後、GCを利用して測定した。これのために20ml培養液にheptadecanoic  acid  1000ppmとchloroform：methanol(2：1)  20mlを添加し、glass  beadを添加して5分間強く振りながら5分間均質化させる。
【００７１】
これを6,000rpmで15分間(4℃)遠心分離して二つの層を分離する。有機溶媒層の水分除去のためにsodium  sulfateで処理し、evaporationして有機溶媒を飛散し窒素ガスで乾燥する。乾燥された試料に1N  sodium  hydroxide(methanol)を3ml添加した後、100℃で15分間saponification(鹸化)させる。この際、テフロン処理されたscrew‐capped  test  tubeを用いparafilmで蓋を良く包む。ここに4％  HCl(methanol)を6ml添加した後、20分間メチル化させる。メチル化された試料に2ml  hexane：water(1：1，v／v)を混ぜて約10分程度強く混合した後、8,000rpm、4℃で15分間遠心分離する。有機溶媒層を取った後に窒素ガスを利用して全て乾燥して1ml  hexaneに溶解させる。
【００７２】
＜結果および考察＞
標準物質であるheptodecanoic  acidのpeak  areaを100としたときのpeak  areaを計算すると、少なくとも100ppm以上のLAが培地に添加されたとき、CLAの生産が充分に発生した(表５)。また、1000ppmと500ppm添加された場合、CLAの生産量に大した差異がなかった。  即ち、CLAを生産するためにはLAを100〜1000ppm添加するのが望ましく、費用と効率面では500ppmが最も適合であった。
【００７３】
【表５】
2008507991.tif 000006
【００７４】
２．CLA最大生産のための乳化剤添加条件
乳化剤を添加して培地内のLAが培養液と良く混合されるようにすればCLA生産が増加するのかを実験して見た。これのためにSkim  milk培地とMRS培地にLA濃度が0.1％になるように添加した。この際、添加されるLAをLA、LA  salt形態、LAとTween‐80(0.2％)の三つの形態で添加し、一夜培養してラクトバシラスラムノサスストレインPL60(L．rhamnosus  Strain  PL60)のCLA生産能力を確認した。CLAの量は前述の方法を用いて培養液内の脂質を抽出してメチル化させた後、GCを利用して測定した。
【００７５】
＜結果および考察＞
培地に添加されたLAの溶解度を高めるためにTween‐80を添加した場合がsalt形態のLAを添加した場合に比べて3倍以上のt10c12のCLAを生産した。これは培地にLAを添加するとき乳化剤を添加してLAの溶解度を高めるのが重要であるのを明かし出した。
【００７６】
【表６】
2008507991.tif 000007
【００７７】
３．CLA生産誘導のための先培養時の乳化剤添加条件
ラクトバシラスラムノサスストレインPL60(L．rhamnosus  Strain  PL60)を直接服用するか種菌形態あるいは添加剤に用いて服用即時最大にCLAを生産するためにラクトバシラスラムノサスストレインPL60(L．rhamnosus  Strain  PL60)を培養して凍結乾燥粉末などで製品を製造するとき、培養培地にLAを入れて培養した場合と前記のCLA生産条件のようなTween‐80添加でLAの溶解度を増加させた条件が効率的であるかを比較確認した。これのために種菌の先培養時にLa  salt添加培地、LAとTween‐80  0.01％、LAとTween‐80  0.1％、LAとTween‐80  0.2％、LAとTween‐80  0.5％を添加した。このように先培養されたラクトバシラスラムノサスストレインPL60(L．rhamnosus  Strain  PL60)をCLA生産培地(0.1％のLAが含有されたSkim  milk)で培養して生産されたCLAの量を測定した。
【００７８】
＜結果および考察＞
商業目的の大量培養に用いられるskin  milk培地(フェイ培地)でCLAを最大に生産するためにはラクトバシラスラムノサスストレインPL60(L．rhamnosus  Strain  PL60)を先ず0.1％のLAとこれを培地に良く混合されるようにTween‐80が0.1〜0.5％含有されたskim  milkで培養してCLAの生産能力を誘導した場合がCLA生産能力が最も良かった(表７)。0.2％  Tween‐80が添加された場合、0.5％添加された場合よりCLA生産能力が高いのは0.5％Tween‐80による乳酸菌成長抑制のためであると思われた。
【００７９】
【表７】
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【００８０】
４．CLA最大生産のための糖添加条件
CLA生産を最大にするための糖の種類を探し出した。これのために0.1％のLAが添加されたskim  milk培地に果糖・砂糖・乳糖を夫々6％になるように培地に添加してCLAの生産程度を測定した。
【００８１】
＜結果および考察＞
果糖を添加した場合に最もCLAの生産率が高く、次が砂糖と乳糖であり、glucose添加の場合には効果的なCLA生産を観察することができなかった。
【００８２】
【表８】
2008507991.tif 000009
【００８３】
実施例３：CLA生産ラクトバシラスラムノサスストレインPL60(L．rhamnosus  Strain  
PL60)を投与した鼠の体重変化
高脂肪食餌を投与しながら0.1％のLAと0.2％のTween‐80が添加された培地で培養されたラクトバシラスラムノサスストレインPL60(L．rhamnosus  Strain  PL60)をskim  milkを賦形剤に用いて凍結乾燥させたものを1匹当り109 CFU／1日と107 CFU／1日投与して体重の変化を観察した。
【００８４】
＜材料および方法＞
C57BL／6N(Charles  river  laboratory  animal  facility，USA)を4匹ずつ1群を形成して実験した。第1群は普通の食餌(Purina  rodent  chow  ＃5057(3.28cal／g))を投与した群、第2群は高脂肪食餌(Research  diet  45％  high  fat  diet  D12451(5.252cal／g))を投与した群(Research  diet  45％  high  fat  diet  D12451(5.252cal/g))、第3群は高脂肪食餌と賦形剤であるskin  milkを投与した対照群、第4群は高脂肪食餌とラクトバシラスラムノサスストレインPL60(L．rhamnosus  Strain  PL60)を高濃度で投与した群(109CFU／day)、第5群は高脂肪食餌とラクトバシラスラムノサスストレインPL60(L．rhamnosus  Strain  PL60)を低濃度で投与した群(107CFU／day)に分けて実験した。３週齢である鼠に高脂肪食餌と水を充分に食べるようにし、毎日体重の変化、給与された食餌の量を測定した。８週目に解剖して腸脂肪の重量、各臓器の脂肪細胞の大きさ、数を染色した後、顕微鏡で観察した。
【００８５】
＜結果および考察＞
表９はラクトバシラスラムノサスストレインPL60(L．rhamnosus  Strain  PL60)を投与した鼠の体重変化を示したもので、ラクトバシラスラムノサスストレインPL60(L．rhamnosus  Strain  PL60)を高濃度で投与した群(109CFU／day)は4週目に統計的に有意的ではないがcontrolに比べて2g以上体重増加が少なく、8週目には統計的に有意性を見せるように体重増加が少なかった(図８、図９)。即ち、一般食餌投与群の平均体重は24.7g、高脂肪食餌群の平均体重は33.4g、賦形剤であるskim  milk投与群の場合31.9gであったが、ラクトバシラスラムノサスストレインPL60(L．rhamnosus  Strain  Pl60)の高濃度投与群の場合は26.9g、低濃度投与群の場合は28.7gであった。これは高濃度投与群が高脂肪食餌群に比べて6.5g体重増加が少なく、これは19.5％程体重増加が少ないことに該当する。低濃度投与群の場合も高脂肪食餌群に比べて4.7g体重増加が少なく、これは14％程体重増加が少ないものに該当する。これは賦形剤であるskim  milk投与群に比べても高濃度投与群は5g(15.7％)、低濃度投与群は3.2g(10％)の体重増加が少なくなったのである。高脂肪食餌群とskim  milk群の体重差異は1.5g(4.5％)で、これは誤差許容範囲でskim  milkによる体重減少ではないものと思われる。
【００８６】
【表９】
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【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明のラクトバシラスラムノサスストレインPL60(L．rhamnosus  Strain  PL60)は体脂肪減少効果を有しているため、肥満による疾患を予防あるいは治療するための機能性食品として直接使用するか、または体脂肪低下機能性食品の添加剤として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】ラクトバシラスラムノサスストレインPL60(Lactobacillus  rhamnosus   Strain  PL60)のCLA生産を確認したガスクロマトグラムに関するものである。
【図２】ラクトバシラスラムノサスストレインPL60(Lactobacillus  rhamnosus   Strain  PL60)の顕微鏡写真図である。
【図３】ラクトバシラスラムノサスストレインPL60(Lactobacillus  rhamnosus   Strain  PL60)の16S  rRNA塩基序列を示したものである。
【図４】ラクトバシラスラムノサスストレインPL60(Lactobacillus  rhamnosus   Strain  PL60)をmultiplex  PCRを利用して同定したゲル写真図である。
【図５】ラクトバシラスラムノサスストレインPL60(Lactobacillus  rhamnosus   Strain  PL60)のCaco‐2細胞付着実験結果を示したものである。
【図６】aとbはラクトバシラスラムノサスストレインPL60(Lactobacillus  rhamnosus   Strain  PL60)の人体腸定着性実験結果を示したものである。
【図７】ラクトバシラスラムノサスストレインPL60(Lactobacillus  rhamnosus   Strain  PL60)の人体経口投与後に分離された集落のPCR結果を示したゲル写真図である。
【図８】ラクトバシラスラムノサスストレインPL60(Lactobacillus  rhamnosus   Strain  PL60)を投与した鼠の体重変化を示したものである。
【図９】ラクトバシラスラムノサスストレインPL60(Lactobacillus  rhamnosus   Strain  PL60)を10数次投与後に各群鼠の体重を比較したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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