(57)【要約】  本発明は、生体試料中に存在すると考えられる任意のHPV核酸の検出および/またはタイピングのための物質および方法に関し、その方法は、(i)試料中の任意のHPV核酸のB領域を含みまたはそれからなるポリ核酸断片の増幅ステップであって前記B領域が図1で示されるステップと、(ii)ステップ(i)の任意の増幅断片を、HPVのB領域との特異的なハイブリダイゼーションが可能な少なくとも1種のプローブと接触させるステップであって前記B領域が図1で示されるステップとを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中に存在すると考えられる任意のHPV核酸の検出および/またはタイピング方法であって、
(i)試料中の任意のHPV核酸のB領域を含みまたはそれからなるポリ核酸断片の増幅ステップであって前記B領域が図1で示されるステップと、
(ii)ステップ(i)の任意の増幅断片を、HPVのB領域との特異的なハイブリダイゼーションが可能な少なくとも1種のプローブと接触させるステップであって前記B領域が図1で示されるステップと
を含む方法。
【請求項２】
増幅が、試料中の任意のHPV核酸のD領域を含みまたはそれからなるポリ核酸断片の増幅であり、前記D領域が図1で示される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ステップ(i)の任意の増幅断片を、HPVのD領域との特異的なハイブリダイゼーションが可能な少なくとも1種のプローブと接触させ、前記D領域が図1で示される、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
生体試料中に存在すると考えられるHPVの検出および/またはタイピングための、前記請求項のいずれかに記載の方法であって、
(i)HPV16型のゲノムの「A」領域と特異的にハイブリダイズする5'プライマーであって前記「A」領域が図1で示される5'プライマー、および
少なくとも1種のHPV型のゲノムの「C」領域と特異的にハイブリダイズする3'プライマーであって前記「C」領域が図1で示される3'プライマー
の使用によるHPVのポリ核酸断片の増幅ステップと、
(ii)ステップ(i)の増幅断片を、HPVの「B」領域または「D」領域との特異的なハイブリダイゼーションが可能な少なくとも1種のプローブとハイブリダイズさせるステップであって前記領域が図1で示されるステップと
を含む方法。
【請求項５】
プローブが、1種のHPV型だけのゲノムのDまたはB領域内で特異的なハイブリダイゼーションが可能である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
プローブが、Table4、5〜14、17、18、19に、またはいずれかの実施例に列挙されている配列からなるリストから選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
増幅ステップで、HPV-MPF1F1、HPV-MPF1F2、HPV-MPF1F3、HPV-MPF1F4、HPV-MPF1F5、HPV-MPF1F6、HPV-MPF1F7、HPV-MPF1F8、HPV-MPF1F9、HPV-MPF1F10、HPV-MPF2R1、HPV-MPF2R2、HPV-MPF2R3、HPV-MPF2R4、HPV-MPF2R5、HPV-MPF2R6、HPV-MPF2R7、HPV-MPF2R8を含むリストから選択されるプライマーを使用する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
タイピングステップの前に、試料中でのHPV核酸の存在を確認する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
固相支持体の存在下でプローブと標的のハイブリダイゼーションを実施する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ハイブリダイゼーションステップで逆ハイブリダイゼーション形式を使用する、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
プローブを、ビーズ、場合によっては蛍光ビーズ上に直接的にまたは間接的に結合させる、請求項9に記載の方法。
【請求項１２】
フローサイトメトリーを使用してハイブリダイゼーションの検出を分析する、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
HPVゲノムのBまたはD領域に由来する核酸の増幅に適した少なくとも2種のプライマーを含むキット。
【請求項１４】
プライマーが、HPV-MPF1F1、HPV-MPF1F2、HPV-MPF1F3、HPV-MPF1F4、HPV-MPF1F5、HPV-MPF1F6、HPV-MPF1F7、HPV-MPF1F8、HPV-MPF1F9、HPV-MPF1F10、HPV-MPF2R1、HPV-MPF2R2、HPV-MPF2R3、HPV-MPF2R4、HPV-MPF2R5、HPV-MPF2R6、HPV-MPF2R7、HPV-MPF2R8からなるリストから選択される、請求項13に記載のキット。
【請求項１５】
HPVゲノムのD領域またはB領域との特異的なハイブリダイゼーションが可能な少なくとも2種のプローブを含むキット。
【請求項１６】
プローブが、Table4、5〜14、17、18、19、またはいずれかの実施例のいずれかから選択される任意の2種のプローブである、請求項15に記載のキット。
【請求項１７】
Table1または2の任意のプライマーあるいはTable3の任意のプローブならびに上記のHPV同定およびタイピングの分析方法を実施するための説明書を含むキット。
【請求項１８】
固相支持体と結合したHPVゲノムのD領域またはB領域との特異的なハイブリダイゼーションが可能なプローブを含むキット。
【請求項１９】
Table3の任意のプローブをさらに含む、請求項13から17のいずれかに記載のキット。
【請求項２０】
プローブがTable3、4、5〜14、17、18、19、またはいずれかの実施例から選択される、請求項1から12のいずれかに記載の方法における使用に適したプローブ。
【請求項２１】
Table3のDEIAプローブ、Table3の好ましいDEIAプローブ、Table4のプローブの群、Table17のプローブ、Table18のプローブ、Table19のプローブからなる群から選択される少なくとも5種のプローブを含む、HPVプローブセット。
【請求項２２】
各群から少なくとも8種のプローブを含む、請求項21に記載のHPVプローブセット。
【請求項２３】
プライマーがTable1および2から選択される、請求項1から12に記載の方法における使用に適したプライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト乳頭腫ウイルス(Human Papillomavirus)(HPV)感染の検出および同定の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮頚癌は、乳癌に続いて、女性では2番目に多い悪性腫瘍である。子宮頚部の癌は、HPVのDNAが世界中の事実上すべての症例および前駆病変で認められる第1の主要な固形腫瘍である点で独特である。
【０００３】
100種を超えるHPVの型が特徴付けられ、単離された順に番号付けられている。HPVは上皮親和性であり、皮膚(皮膚型)または呼吸器官および肛門性器管の粘膜(粘膜型)のみに感染する。40種を超えるHPVの型が子宮頚部に感染することが知られている。誘導された良性、前悪性または悪性病変に基づいて、HPVは、低リスク型(例えば、HPV6、11、42、43および44型)および高リスク型(例えば、16、18、31、33および45型)にそれぞれ分けられる。高リスク型は、全浸潤型子宮頚部癌の99%を超える割合を占める。したがって、HPV型の検出および同定は非常に重要である。高リスク型は、定義上一貫して重度SIL(扁平上皮内病変)および上皮内癌で認められるが、低リスク型は主として軽度SILで認められる。この疫学的観察結果は、分子的知見によって支持される。例えば、低リスクの6および11型由来のE6およびE7タンパク質は、p53およびpRBと弱く結合するので、in vitroでケラチン生成細胞を不死化し、またはin vivoで悪性転換を誘導することができない(Woodworth et al.,1990)。低リスクHPV型の環状ds-DNAゲノムはエピソーム状のままであるが、高リスクHPV型のゲノムは、ヒトゲノム中に組み込まれうる。
【０００４】
子宮頚部の悪性および前悪性疾患のスクリーニングは通常、パパニコロウ(PAP)の系に従って行われる。子宮頚部塗抹標本を光学顕微鏡法によって検査し、形態的に異常な細胞を含む標本を、病変の重症度が大きくなる尺度でPAP I〜Vに分類する。この細胞形態学的方法は間接法であり、HPV感染の考えられる転帰を評価するものである。したがって、患者をモニタリング(経過観察)および治療に選択するために、HPVのDNAの検出およびタイピングは二次スクリーニングとして重要である。このことは、PAP II(非定型扁平上皮化生)またはそれ以上として分類された子宮頚部塗抹標本を、低リスクおよび高リスクのHPV型について分析すべきであることを意味する。経過観察試験から、高リスクHPV型だけが、細胞学的に正常な子宮頚部細胞から重度SILへの進行に関与することが示された(Remminck et al.,1995)。これらの結果から、高リスクHPV型の存在が、子宮頚癌の発生および検出の予後マーカーであることが示唆される。
【０００５】
培養によるHPVの診断は考えられない。HPV抗体の検出による診断も、感度および特異性が不十分であるために妨げられるように思われる。HPV感染を診断する直接法は主として、HPVのDNAの事前増幅を伴うまたは伴わない様々な形式のDNA/DNAまたはRNA/DNAハイブリダイゼーションによるウイルスDNAゲノムの検出に基づくものである。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、微量の標的DNAの増幅について非常に効率のよい方法である。現在、主として3種の異なるプライマー対が、HPVのDNAの汎用的増幅に使用される(「広域プライマー」)。これらのプライマー対の3種であるMY11/MY09、GP5/GP6およびSPF10系は、LI領域中で、異なるHPV型の間で保存されている領域を対象とする(Manos et al.,1989;Van den Brule et al.,1990、WO9914377)。MY09/11の改変系であるPGMY系も使用される(Gravitt,P.,2000.Improved amplification of genital human papillomaviruses.J.Clin.Microbiol.38:357-361を参照)。他のプライマー対であるCPl/CPllgは、El領域中の保存領域を対象とする(Tieben et al.,1993)が、CPI/IIはあまり使用されない。
【０００６】
様々なHPV型を同定するいくつかの方法がある。 
1種の特異的な型のみを認識するPCRプライマーによってHPVのDNAのタイピングを行うことができる。この方法は、型特異的PCRとして知られている。そのような方法が、HPV6、11、16、18、31および33型について記載されている(Claas et al.,1989;Cornelissen et al.,1989;Falcinelli et al.,1992;Van den Brule et al.,1990;Young et al.,1989)。そのプライマーは、それぞれ6、11、16、18、31および33型のHPVゲノムのE5、L1、E6、Ll、E2およびEl領域を対象とする(Baay et al.,1996)。
【０００７】
他の方法は、全HPV型のゲノム部分の全般的な増幅を行い、その後発癌性と非発癌性の群をそれぞれ区別する型特異的プローブの2つのカクテルとのハイブリダイゼーションを行うものである。HPVのDNAの事前増幅を伴わない類似のタイピング法が記載されている。ハイブリッド捕捉アッセイ(Hybrid Capture Sharp Assay;Digene、メリーランド州Silver Springs)では、「高リスク」HPV型(例えば16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59および68型)の群、および「低リスク」HPV型(例えば6、11、42、43および44型)の他の群について各試料を試験する(Cox et al.,1995)。
【０００８】
WO9914377で開示されている検出およびタイピング系は、PCR増幅ステップおよび型特異的プローブとの逆ラインブロットハイブリダイゼーションを利用するものである。
【０００９】
現在、ヒト乳頭腫ウイルスの公式の分類は、L1領域に由来する291bpの断片の配列分析に基づいている(Chan et al.J Virol.1995 May;69(5):3074-83、DeVilliers et al.,Virology.2004 Jun 20;324(1):17-27)。これらの配列の系統発生学的分析により、異なるHPV型の分類が可能となる。定義上、2つのHPV単離物間でのこの領域にわたる配列の相違が10%より高い場合、それらは異なる型として分類される。したがって、任意の既知のHPV型と配列が10%を超えて異なる場合、それは新規のHPV型として分類される。2〜10%異なるHPV単離物は異なるサブタイプとして分類される。最後に、配列の変異が2%未満である場合、その2つの単離物は、異なる変異体として同じサブタイプ内に分類される。 
改良された検出およびタイピング系が依然として必要である。
【発明の開示】
【００１０】
発明の説明
本発明は、試料中に存在すると考えられる任意のHPV核酸のタイピング方法に関し、その方法は、任意のそのような核酸を、HPVのD領域内で特異的なハイブリダイゼーションが可能な少なくとも1種のプローブと接触させるステップであって前記領域が図1で示されるステップと、次いでそのようにして得られたハイブリダイゼーションの結果に基づいて(複数の)HPV型を分析するステップとを含む。
【００１１】
本発明はさらに、生体試料中に存在すると考えられる任意のHPV核酸を増幅するために、ハイブリダイゼーションステップの前に増幅ステップを実施する方法に関する。
【００１２】
したがって、本発明は、生体試料中に存在すると考えられる任意のHPV核酸の検出および/またはタイピング方法に関し、その方法は、
(i)試料中の任意のHPV核酸のB領域を含むポリ核酸断片の増幅ステップであって前記B領域が図1で示されるステップと、
(ii)ステップ(i)の任意の増幅断片を、HPVのB領域との特異的なハイブリダイゼーションが可能な少なくとも1種のプローブと接触させるステップであって前記B領域が図1で示されるステップと
を含む。
【００１３】
本発明はまた、生体試料中に存在すると考えられるHPVの検出および/またはタイピング方法に関し、その方法は、
(i)HPV16型のゲノムの「A」領域と特異的にハイブリダイズする5'プライマーであって前記「A」領域が図1で示される5'プライマー、および
少なくとも1種のHPV型のゲノムの「C」領域と特異的にハイブリダイズする3'プライマーであって前記「C」領域が図1で示される3'プライマー
の使用によるHPVのポリ核酸断片の増幅ステップと、
(ii)ステップ(i)の増幅断片を、HPVの「B」領域または「D」領域との特異的なハイブリダイゼーションが可能な少なくとも1種のプローブとハイブリダイズさせるステップであって前記領域が図1で示されるステップと
を含む。
【００１４】
本発明はさらに、増幅ステップを実施して、生体試料中に存在すると考えられる任意のHPV核酸とプローブのハイブリダイゼーションの検出に使用する任意のシグナルを増幅する方法に関する。シグナル増幅は、試料中に存在すると考えられる任意のHPV核酸を増幅するステップとともに、またはそれを伴わずに行うことができる。
【００１５】
本発明はさらに、生体試料中に存在すると考えられる任意のHPV核酸のタイピング方法に関し、その方法は、任意のタイピングステップの前にまたはそれと同時に、試料中に存在する任意のHPV核酸の存在を検出するステップを含む。
【００１６】
本発明はさらに、HPVの検出および/または同定の前記方法を可能にするオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーに関する。
【００１７】
本発明はさらに、それに従って前記増幅およびハイブリダイゼーションステップを行うことができるプロトコールに関する。ハイブリダイゼーションステップの一形式は、例えば、逆ハイブリダイゼーション形式である。
【００１８】
本発明はさらに、本発明を実施する際に使用するプライマーおよび/またはプローブおよび/または説明書を含むキットに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
詳細な説明
本発明は一般に、生体試料中に存在すると考えられる任意のHPV核酸の検出および/またはタイピング方法に関し、その方法は、存在する任意のそのような核酸を、HPVゲノムのD領域内で特異的なハイブリダイゼーションが可能な少なくとも1種のプローブと接触させるステップであって前記D領域が図1で示されるステップと、次いで、生じる可能性がある任意の特異的なハイブリダイゼーションを検出して、試料中にHPV核酸が存在するかどうか、およびそれがどのHPV型に属する可能性があるかを判定するステップとを含む。
【００２０】
好ましくは、プローブは、HPVゲノムのB領域内で特異的なハイブリダイゼーションが可能である。
【００２１】
HPVゲノムの77ヌクレオチドのD領域(図1を参照)、特にプライマー間にあるB領域の31ヌクレオチドが、HPVタイピングについて非常に情報的価値があることを決定した。
【００２２】
したがって、本発明の方法は一般に、HPVのD領域および/またはB領域とハイブリダイズすることが可能なプローブとHPVに由来する核酸のハイブリダイゼーションを含み、前記ハイブリダイゼーション事象が、あるいはハイブリダイゼーション事象の欠如も、異なるHPV型を識別することを可能にする情報をもたらす。
【００２３】
標的核酸とプローブのハイブリダイゼーションは、プローブの特異的なハイブリダイゼーションを起こすことができる反応条件下で起こる。
【００２４】
試料中に存在する(複数の)HPV型の分析は、様々なレベルの分解能で実施することができる。
【００２５】
分析は、例えばHPV16、18型やHPV1型などの個々のHPV型の同定に適した分解能で行うことができる。
【００２６】
型の分析は、例えば、個人が高リスク癌型または低リスク癌型や皮膚型など所与の分類の任意のHPV型を有するかどうかを特定する低い分解能で行うこともできる。
【００２７】
本発明のタイピングアッセイは、適切には、試料中で認められるすべての特定の型に対する情報をもたらすことができるが、それにも関わらず、正確なHPV型を識別できることは(使用者からみて)必要でない可能性があり、アッセイの結果は、HPV型の分類のレベルのみを必要とする可能性がある。
【００２８】
したがって、本発明は、HPVタイピング方法に関し、その方法は、特定の高リスク型が試料中に存在することを示さずに、高リスクHPV型の同定を可能にする。
【００２９】
高リスク型の分類(一貫して重度SIL[扁平上皮内病変]および上皮内癌で認められるもの)には、HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、および68型がある。
【００３０】
低リスク型の分類(主として軽度SILで認められる)には、HPV6、11、34、40、42、43、44、53、54、70、および74型がある。
【００３１】
好ましくは、本発明で使用する特異的なプローブは、HPVゲノムの77ヌクレオチドの「D」領域内で、適切には31ヌクレオチドの「B」領域内で特異的なハイブリダイゼーションが可能であり、この領域は、図1の配列の参照により示される。これらの領域は、HPV16型の基準配列K02718のヌクレオチド6543〜6619位(D領域)および6566〜6596位(B領域)に対応する。
【００３２】
本明細書における図1の番号付けを使用したDおよびB領域への言及は、特に列挙しておらず、HPVの基準配列または所与の他の配列と異なる可能性がある他のHPV配列における同等の領域を含むことが理解されるであろう。他のHPVゲノムにおける同等のA、B、CまたはD領域は、例えば、図1の配列との配列相同性または同一性に基づいて同定することができる。
【００３３】
核酸同一性/相同性の配列比較は、例えばAltschul et al.,Nucl.Acids Res.25:3389-3402(1977)、およびAltschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)にそれぞれ記載されているBLASTおよびBLAST2.0アルゴリズムを使用して、当業者により容易に実施される。例えば初期設定パラメーターを用いてBLASTおよびBLAST2.0を使用して、本発明のポリヌクレオチドの%配列同一性を決定することができる。BLAST分析を行うソフトウェアは、米国バイオテクノロジー情報センター(the National Center for Biotechnology Information)を通じて公的に利用することができる。
【００３４】
したがって、本発明は、図1で示されるHPVのD領域内で、適切にはB領域内で特異的なハイブリダイゼーションが可能なプローブ、あるいは核酸同一性および/または相同性により評価される他のHPVゲノムにおける同等の領域内で特異的なハイブリダイゼーションが可能なプローブならびにプローブの使用に関するものとみることができる。不確かさを避けるため、本明細書に記載したすべてのプローブは、個々に、かつプローブを列挙したTableから選択される(適宜)少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40種のプローブからなる群として特許請求の範囲に記載する。
【００３５】
本発明はまた、本質的に77塩基対の単離D領域および31塩基対の単離B領域からなり、どちらかの領域がRNAまたはDNAである一本鎖または二本鎖の核酸の形態である核酸断片、およびHPVのタイピングにおけるこれらの核酸断片の領域の使用にも関する。
【００３６】
本発明の1つの特色はプローブの選択である。 
HPVゲノムの好ましいDまたはB領域と特異的にハイブリダイズするプローブは、好ましくは、単独であるいは他の1種または複数種のプローブからの情報と組み合わせて、存在するHPV株の型に関して、(ハイブリダイゼーションの結果を介して)情報をもたらすことができる。HPV型についての情報は、好ましくは、標的核酸とプローブのハイブリダイゼーションの陽性検出により得られるが、所与のプローブのハイブリダイゼーションの欠如により得ることもできる。
【００３７】
適切には、本発明のプローブは、1種のHPV型だけのゲノムのD領域および/またはB領域内で特異的なハイブリダイゼーションが可能であり、したがって、この型が生体試料中に存在するときに、そのプローブによってこのHPV型の特異的な同定が可能となる。
【００３８】
したがって、本発明の実施形態は、生体試料中に存在すると考えられる任意のHPV核酸のタイピング方法に関し、その方法は、任意のそのような核酸を、1種のHPV型だけのゲノムのD領域および/またはB領域内で特異的なハイブリダイゼーションが可能な少なくとも1種のプローブと接触させるステップであって前記領域が図1で示されるステップと、次いでそのようにして得られたハイブリダイゼーションの結果に基づいて(複数の)HPV型を分析するステップとを含む。
【００３９】
本発明のプローブはさらに、2種のHPV型だけなど限られた数の型のゲノムのD領域および/またはB領域内で特異的なハイブリダイゼーションが可能である場合に有用な情報をもたらすことができる。例えば、このプローブで、これらの型の同定を行うこともでき、あるいは、他のプローブからの情報と組み合わせて各型の特異的な同定を行うこともできる。
【００４０】
上記のものなど、HPV型についての情報を得ることができるプローブは一般に、本明細書において型特異的プローブとみなされる。好ましい型特異的プローブは、1種のHPV型だけのゲノムのD領域および/またはB領域内で特異的なハイブリダイゼーションが可能である。本発明の他の好ましい実施形態によれば、プローブは1種のHPV型だけのゲノムのD領域との特異的なハイブリダイゼーションが可能であり、より具体的には、図1に示されるA領域とC領域の間に位置する31bpのB領域と特異的にハイブリダイズする。
【００４１】
試料中の異なるHPV型は、少なくとも1種、好ましくは少なくとも2種、より好ましくは少なくとも3種、さらにより好ましくは少なくとも4種、最も好ましくは少なくとも5種のオリゴヌクレオチドプローブと前記HPV型の核酸のハイブリダイゼーションによって同定することができる。
【００４２】
Table4は、D領域と特異的にハイブリダイズする好ましいプローブのリストを含む。これらのプローブは、適切には同じハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、一緒に使用することができる。例えばラインプローブアッセイ形式などの逆ハイブリダイゼーション形式が好ましい。列挙したすべてのプローブを、本明細書において個々に特許請求の範囲に記載する。さらに、プローブのすべての組合せが本明細書において意図されている。
【００４３】
Table4で列挙したプローブは、HPVのBおよび/またはD領域と特異的にハイブリダイズし、試料中に存在する可能性があるHPV標的核酸の特定の型についての情報をもたらすことができる。
【００４４】
Table4で列挙したもの以外のプローブ、好ましくは1種のHPV型だけと特異的にハイブリダイズしかつ/またはHPV型の判定を可能にする情報をもたらすことができるプローブを前記DまたはB領域内で選択できることが当業者には明らかとなるであろう。
【００４５】
本発明で使用するプローブは、プローブそれ自体の一部を形成しないが、例えば固相支持体との結合を可能にすることができるさらなるスペーサー配列を有してよい。スペーサー領域は、酵素的にまたは化学的に付加してもよく、プローブの5'でも、あるいは3'でもよい。
【００４６】
適切には、本発明のプローブの使用により、少なくとも5種の異なるHPV型、好ましくは少なくとも6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50または少なくとも51種の異なるHPV型のタイピングが可能となる。最も好ましくは、本発明は、30種を超える異なるHPV型を、適切には35種を超え、40種を超え、45種を超え、適切には50種を超える異なるHPV型を区別することを可能とする。
【００４７】
適切には、図2の系統樹で示されるHPV型のすべて、または実質的にすべてを、本明細書中で概略を示す発明を使用して区別することができる。
【００４８】
好ましくは、試料中に存在する任意のHPV核酸を、ハイブリダイゼーションの前に、例えばPCRまたは他の適切な増幅工程によって最初に増幅する。任意の標的核酸の増幅は、型と無関係に試料中のHPV核酸すべての増幅を可能にする、いわゆる「広域」プライマーまたはプライマーセットを使用して実施することができる。
【００４９】
したがって、試料中に存在するHPV核酸への言及は、試料から増幅した核酸を含み、このことは、文脈から明らかである(すなわち、増幅ステップがハイブリダイゼーションの前に存在する)。
【００５０】
適切には、任意の標的DNAの増幅は、図1の31ヌクレオチドのB領域の増幅を含む。 
したがって、一実施形態では、本発明は、生体試料中に存在すると考えられる任意のHPV核酸の検出および/またはタイピング方法に関し、その方法は、
(i)試料中の任意のHPV核酸のB領域を含むポリ核酸断片の増幅ステップであって前記B領域が図1で示されるステップと、
(ii)ステップ(i)の任意の増幅断片を、HPVのB領域との特異的なハイブリダイゼーションが可能な少なくとも1種のプローブと接触させるステップであって前記B領域が図1で示されるステップと
を含む。
【００５１】
適切には、任意の標的核酸の増幅は、図1の77ヌクレオチドの断片、すなわち図1のD領域の増幅を含む。 
したがって、一実施形態では、本発明は、生体試料中に存在すると考えられる任意のHPV核酸の検出および/またはタイピング方法に関し、その方法は、
(i)試料中の任意のHPV核酸のD領域を含むポリ核酸断片の増幅ステップであって前記D領域が図1で示されるステップと、
(ii)ステップ(i)の任意の増幅断片を、HPVのD領域との特異的なハイブリダイゼーションが可能な少なくとも1種のプローブと接触させるステップであって前記B領域が図1で示されるステップと
を含む。
【００５２】
さらなる実施形態では、本発明は、生体試料中に存在すると考えられるHPVの検出および/またはタイピング方法を提供し、その方法は、
(i)HPV16型のゲノムの「A」領域と特異的にハイブリダイズする5'プライマーであって前記「A」領域が図1で示される5'プライマー、および
少なくとも1種のHPV型のゲノムの「C」領域と特異的にハイブリダイズする3'プライマーであって前記「C」領域が図1で示される3'プライマー
の使用によるHPVのポリ核酸断片の増幅ステップと、
(ii)ステップ(i)の増幅断片を、HPVの「B」領域または「D」領域との特異的なハイブリダイゼーションが可能な少なくとも1種のプローブとハイブリダイズさせるステップであって前記領域が図1で示されるステップと
を含む。
【００５３】
適切には、増幅する領域は、番号付けが図1のHPV16型基準配列の参照により示される、HPVゲノムの6543〜6619位にあるD領域77ヌクレオチドを含み、またはこの領域からなり、または本質的にこの領域からなる。
【００５４】
増幅する領域は、適切には、番号付けがHPV16型基準配列の参照により示されるHPVゲノムの6543〜6619位の断片、または他のHPVゲノムにおける同等の領域を超えない。
【００５５】
本発明の他の好ましい実施形態によれば、少なくとも1種のHPV型のゲノムのA領域と特異的にハイブリダイズする前記5'プライマーの3'末端は、図1で示される、HPV16型(基準株、Genbankアクセッション番号K02718.1)のゲノムの6565位、または任意の他のHPVゲノムの対応する位置に位置する。
【００５６】
本発明の他の好ましい実施形態によれば、少なくとも1種のHPV型のゲノムのC領域と特異的にハイブリダイズする前記3'プライマーの3'末端は、図1で示される、HPV16型(Genbankアクセッション番号K02718.1)のゲノムの6597位、または任意の他のHPVゲノムの対応する位置に位置する。
【００５７】
試料中の核酸の増幅に好ましいプライマーには、Table1および2で列挙したものがある。これらを、個々に、また組合せの形で特許請求の範囲に記載する。フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むプライマー対が好ましい。
【００５８】
適切には、特定のタイピング前のHPV核酸の一般的な増幅用プライマーは、試料中に存在するHPV核酸すべてを増幅することができる。試料中のHPV核酸すべての増幅が可能なプライマーの群が好ましく、適切には、その群はTable1および2で列挙されたセットからの1種または複数種のプライマーを含む。場合によっては、Table1および2で列挙したプライマーをすべて使用することもできる。プライマーの組合せは、適切には、同じ反応条件下で使用することができる。
【００５９】
核酸の増幅は、本発明のDまたはB領域を含む任意の適切な断片上で実施することができる。増幅に好ましい断片は、長さが200ヌクレオチド未満であり、好ましくは150ヌクレオチド未満であり、好ましくは100ヌクレオチド未満である。増幅に好ましい断片は、例えば子宮頚部スワブ中でもパラフィンで包埋された試料からでも検出が可能であるほど十分に短い。
【００６０】
本発明の他の態様では、本発明で開示されているプライマーおよびプローブはまた、定量的PCRプロトコールまたは定量的ハイブリダイゼーションプロトコールで使用することもできる。定量的PCR(QPCR)は、開始量のDNA、cDNA、またはRNA鋳型の定量化を可能にする。QPCRは、各増幅サイクルとともにPCR産物が蓄積するにつれて増大する蛍光レポーター分子の検出に基づくものであり得る。蛍光レポーター分子には、二本鎖DNAと結合する色素(すなわち、SYBR GreenI)または配列特異的プローブ(すなわち、Molecular BeaconまたはTaqMan(登録商標)Probe)がある。
【００６１】
上記で論じたように、特定のプローブは、例えば所与の型とハイブリダイズできるが他の型とはハイブリダイズできない(すなわち型特異的プローブである)場合、正確なHPV型についての情報を提供することができる。D領域に特異的なプローブを使用して、必ずしもタイピングの情報が得られるわけではないが、試料中に存在する任意のHPV核酸があるかどうかをより一般的に判定することもできる。そのようなプローブを、本明細書において「ユニバーサルプローブ」と呼ぶことができる。次いで、HPV核酸陽性であると判明した試料について、型特異的プローブや型特異的PCRなど特異的なタイピング方法を使用して、特異的なタイピングを行うことができる。あるいは、試料について、ユニバーサルプローブでの探索と特異的なタイピングを同時に行うこともできる。
【００６２】
ユニバーサルプローブは、核酸プローブ配列の一部としてイノシン残基を含んでもよく、その残基は標的核酸とのハイブリダイゼーションにおけるいくらかの柔軟性を許容し、異なるHPV型のD領域とのハイブリダイゼーションを可能にすることができる。場合によっては、有用である場合にはプライマーもイノシンを含んでよい。
【００６３】
不確かさを避けるため、試料中の任意のHPV核酸のDおよび/またはB領域と特異的にハイブリダイズするプローブは、ユニバーサルプローブ(Dおよび/またはB領域において複数のHPV型とハイブリダイズし、かつ/あるいは特定のタイピングの情報をもたらさない場合)でもよく、あるいは不明なHPV核酸のタイピングを可能にする型特異的プローブでもよい。
【００６４】
タイピング前に標的DNAを増幅する場合、好ましいDまたはB領域の範囲内にあるユニバーサルプローブを使用して、HPV核酸を検出することもできる。
【００６５】
したがって、本発明はまた、試料中の任意のHPV核酸の存在を検出することができるプローブ、またはプローブの群にも関する。
【００６６】
ユニバーサルプローブを使用して、例えば、参照により本明細書に組み込まれている、例えばWO991437で言及され、例えばClin Diagn Virol.1995 Feb;3(2):155-64で記載されているDNAエンザイムイムノアッセイ(DEIA)技術を用いてHPV核酸を検出することができる。この方法は、PCR産物の迅速かつ特異的な検出に使用される。フォワードまたはリバースプライマーがその5'末端にビオチンを含むプライマーセットによってPCR産物が得られる。これにより、ビオチン化アンプリマーとストレプトアビジン被覆マイクロタイター穴の結合が可能となる。PCR産物を水酸化ナトリウムにより変性させ、それによってビオチン化されていない鎖の除去が可能となる。(例えば、ジゴキシゲニンを付けた)特異的標識オリゴヌクレオチドプローブを、一本鎖の固定化PCR産物とハイブリダイズさせ、酵素で標識した結合体、および比色分析法または蛍光分析法によってハイブリッドを検出する。
【００６７】
本発明では、適切にはDEIA技術において、試料中のHPV核酸の存在の判定に適した1群のユニバーサルプローブが提供される。適切には、同じ反応条件下でそのようなプローブを使用することができる。好ましいプローブはTable3で示されている。ここに記載のすべてのプローブを、個々に、また組合せとして特許請求される。本発明は、適切には、HPVの一般的検出(すなわち任意のHPV型の検出)のための、Table3の任意の2種のプローブの、適切には任意の3種、4種および5種以上のプローブの、好ましくはTable3中に含まれるすべてのプローブの組合せを提供する。
【００６８】
本発明の別の実施形態は、その後にまたは同時に行うタイピングステップと組み合わせた、Table3のプローブなどの、HPVゲノムのD領域内で特異的にハイブリダイズするユニバーサルプローブの使用に関する。
【００６９】
プローブと任意の標的DNAのハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーションの検出は、任意の適切な手段によって実施することができる。例えば、プローブおよび/または核酸標的は、検出可能となるように標識することができる。検出の助けとするため、標的および/またはシグナルを増幅することが好ましい。標的DNAのPCR増幅が特に好ましい。
【００７０】
プローブと標的のハイブリダイゼーションは、好ましくは、固相支持体の存在下で実施するが、このことは必須ではない。1種または複数種のプローブおよび標的核酸を固定化して、例えばビーズ、プレート、スライドガラスまたはマイクロタイター皿に固定することができる。
【００７１】
あるいは、プローブも標的も固定化しなくてよい。液体媒体の状況下でハイブリダイゼーションを実施することができる。
【００７２】
結合の検出は、フローサイトメトリーを使用して、例えばLuminexTMフローサイトメトリーシステム(例えば、WO9714028およびhttp://www.luminexcorp.com/を参照)を使用して実施することができる。
【００７３】
Luminexなどのビーズに基づく検出系とともに使用する標的特異的プローブ、および異なる標的特異的プローブの混合物は、本明細書の実施例で開示され、それ自体が本発明の実施形態である。混合物は、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45種またはそれ以上の異なるプローブの型の混合物を含めて、5〜70種、10〜60種、20〜50種のプローブの型など、2〜100種の異なるプローブの型を含んでよい。本明細書に記載のように、スペーサー配列と結合したそのようなプローブ、ビーズと結合したときのプローブも、それ自体が本発明の一部を形成する。
【００７４】
本明細書においてミクロスフェアとも呼ぶこともある、本発明で使用するビーズは、適切には、フローサイトメトリー分析での使用に適したビーズである。適切には、ビーズをプローブと結合して、プローブと標的の相互作用を検出することができる。一態様では、ビーズを独特の蛍光分子または分子の組合せで標識する。適切には、ビーズ内の1種または複数種の蛍光色素のレーザー励起を使用することによって、ビーズ上またはビーズ中の標識を同定することができる。一態様では、ビーズはポリスチレンビーズである。
【００７５】
結合の検出はまた、例えば、参照により本明細書に組み込まれているEP373203、EP386229、EP0804731およびEP619321に記載の方法を使用したマイクロアレイの状況下で実施することもできる。そのような技術は、当業者にとって周知である。
【００７６】
本発明の他の好ましい実施形態によれば、前述したHPVの検出および/または同定方法は、ハイブリダイゼーションステップが逆ハイブリダイゼーション形式を使用する点でさらに特徴付けられる。一実施形態では、プローブを固相支持体の特定の位置に固定化する。他の実施形態では、プローブをビーズとハイブリダイズさせるが、この場合それらは互いに固定された位置をとらない。
【００７７】
適切には、試料中の任意のHPV核酸を上記に記載のように増幅し、形成されたハイブリッドの検出を可能にするために、増幅したHPVポリ核酸を標識する。
【００７８】
この実施形態によれば、少なくとも1種のプローブ、または少なくとも2種の、好ましくは少なくとも3種の、より好ましくは少なくとも4種の、最も好ましくは少なくとも5種のプローブセットを使用する。少なくとも2種のプローブを使用するとき、それらが同じハイブリダイゼーション条件および同じ洗浄条件下でその標的配列と特異的にハイブリダイズするように、前記プローブを設計する。
【００７９】
好ましい逆ハイブリダイゼーションアッセイでは、固相支持体上に平行な線としてオリゴヌクレオチドプローブを固定化する(Stuyver et al.,1993;国際出願WO94/12670)。逆ハイブリダイゼーション形式は、他のDNA技術またはハイブリダイゼーション形式と比較して、特に、探し求める関連情報を得るのにプローブの組合せの使用が好ましくまたは不可避であるときに、多数の実際的な利点を有する。
【００８０】
場合によっては、必要な場合に、本発明の検出およびタイピング方法は、例えば、参照により本明細書に組み込まれているWO03014402で開示されている、ハイブリダイゼーションステップ後の型特異的PCRステップを含む。型特異的PCRは、HPVタイピングの前に使用することができ、一般に複数のHPV型に由来する核酸の増幅に使用する非特異的プライマーと比較して、特定のHPV核酸型、例えばHPV16型のDNAだけを増幅するように設計する。
【００８１】
本発明はまた、HPVゲノムのDおよび/またはB領域を含むHPV核酸の増幅が可能な型特異的プライマーにも関する。
【００８２】
したがって、他の実施形態では、本発明は、
1  生体試料中に存在する任意のHPVに由来する核酸の増幅、
2  生体試料中に存在する任意のHPV核酸の検出、
3  そのような核酸を、図1で示されるHPVのD領域内で、適切にはB領域内で特異的なハイブリダイゼーションが可能な少なくとも1種のプローブと接触させ、次いでそのようにして得られたハイブリダイゼーションの結果に基づいてHPV型を分析することによってそのようなHPV核酸が検出された試料中のHPV核酸のタイピング、および
4  任意選択で行う、ステップ3で同定されなかった型についての型特異的プライマーを使用した、試料中の任意の核酸の増幅および検出
を含む方法に関する。 
ステップ2および3は、同時に行うことができる。
【００８３】
本発明はまた、HPV型を検出および/または同定するための、本発明で使用するキットにも関する。
【００８４】
キットは、HPVのゲノムに由来する核酸の増幅に適した少なくとも2種のプライマー、好ましくは、Table1および2で示されるプライマーなど、少なくともHPVゲノムの6566〜6596位の断片の増幅が可能なプライマーを含んでよい。
【００８５】
キットは、図1について番号付けが示されている、HPVゲノムの6543〜6619位の断片との特異的なハイブリダイゼーションが可能な少なくとも2種のプローブを含んでよい。好ましいプローブは、異なるHPV型の識別を可能にし、適切なプローブはTable4に列挙されている。
【００８６】
キットは、上記で示したプライマーおよび/またはプローブと組み合わせて、上記のHPV同定およびタイピングの分析方法を実施するための説明書を含んでよい。
【００８７】
キットは、上記に示す通り、少なくとも1種のプライマーおよび少なくとも1種のプローブを含んでよい。
【００８８】
キットは、固相支持体上に固定化された本発明のプローブまたはプライマーを含んでよい。支持体は、例えば、ビーズ、マイクロタイタープレートまたはスライドガラスでよい。
【００８９】
キットは、1種または複数種のユニバーサルプローブ、適切にはTable3で示される1種または複数種のプローブを含んでよい。
【００９０】
本発明はまた、生体試料中に存在すると考えられるHPVの検出および/または同定用の診断キットにも関し、そのキットは以下の構成成分を含む:(i)上記で定義した少なくとも1種の適切なプライマーまたは少なくとも1種の適切なプライマー対;(ii)場合によっては固相支持体に固定されている、少なくとも1種の適切なプローブ、好ましくは少なくとも2種、より好ましくは少なくとも3種、さらに好ましくは少なくとも4種、最も好ましくは少なくとも5種の適切なプローブ。
【００９１】
適切には、キットはさらに下記のものを1つまたは複数含む:
(iii)ハイブリダイゼーション用緩衝液、または前記緩衝液の作製に必要な構成成分、または前記緩衝液を調製するための説明書;
(iv)洗浄溶液、または前記溶液の作製に必要な構成成分、または前記溶液を調製するための説明書;
(v)形成されたハイブリッドを検出するための手段;
(vi)固相支持体上の既知の位置に(複数の)プローブを結合するための手段。
【００９２】
以下の定義および説明により、本発明をよりよく理解することができるであろう。 
L1領域に由来する291bpの断片(Chan et al.,1995)において、以前から知られている任意の型に対して10%より高い配列の相違を示すHPV単離物は、異なるHPV「型」として分類される。2〜10%異なるHPV単離物は異なる「サブタイプ」として分類される。配列の変異が2%未満である場合、その単離物は、異なる「変異体」として同じサブタイプ内に分類される。HPVに当てはめるとき、「型」という用語は上記に定義した3分類のいずれかを示す。
【００９３】
分析する試料中の標的物質は、DNAまたはRNA、例えば、ゲノムDNA、メッセンジャーRNA、ウイルスRNAまたはそれらを増幅したものでもよい。これらの分子は、本出願において、「核酸」または「ポリ核酸」とも呼ばれる。
【００９４】
周知の抽出および精製手順が、試料からのRNAまたはDNAの単離について利用可能である(例えば、Sambrook et al.,1989の手順)。
【００９５】
本発明による「プローブ」という用語は一般に、HPVポリ核酸と特異的にハイブリダイズするように設計された一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。
【００９６】
「プライマー」という用語は一般に、複製する核酸の鎖と相補的なプライマー伸長産物の合成開始点として働くことができる一本鎖オリゴヌクレオチド配列を指す。プライマーの長さおよび配列は、伸長産物の合成を刺激することができるようなものでなければならない。
【００９７】
好ましくは、プライマーは、長さが約10〜50ヌクレオチドである。具体的な長さおよび配列は、必要とするDNAまたはRNA標的の複雑性、ならびに温度やイオン強度などプライマーを使用する条件に依存する。
【００９８】
本発明における「プライマー対」または「適切なプライマー対」という表現は、プローブが結合できるHPVポリ核酸断片の一部または全部の増幅を可能とする一対のプライマーを指す。
【００９９】
本発明によるプローブまたはプライマーの「標的」または「標的配列」という用語は、プローブまたはプライマーがそれと完全に相補的または部分的に相補的である(ここで部分的に相補的とはある程度のミスマッチを許容するものである)HPVポリ核酸内の配列である。前記標的配列の相補体が、ある場合では適切な標的配列でもあることが理解されるはずである。本発明のプローブは、適切には、その標的配列の少なくとも中心部と相補的である。ほとんどの場合では、プローブは、その標的配列と完全に相補的である。「型特異的標的配列」という用語は、所与のHPV型のポリ核酸内での標的配列を指し、任意の他のHPV型と比較して少なくとも1個のヌクレオチドの相違を含む。
【０１００】
プローブとHPVポリ核酸の領域の「特異的なハイブリダイゼーション」とは、前記プローブが、使用した実験条件下でこの領域の一部またはその領域全体と二重鎖を形成し、その条件下で、前記プローブが、分析する試料中に存在するポリ核酸の他の領域と二重鎖を形成しないことを意味する。HPVポリ核酸の領域内での特異的なハイブリダイゼーション用に設計されたプローブが、完全に前記領域の範囲内にあってもよく、あるいは前記領域と大幅に重複(すなわち、外側で、ならびに前記領域内でヌクレオチドと二重鎖を形成)してもよいことが理解されるはずである。
【０１０１】
適切には、プローブと核酸標的領域の特異的なハイブリダイゼーションは、3×SSC、0.1%SDS、50℃などのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で行われる。
【０１０２】
当業者なら、特異的なハイブリダイゼーションが実現できるように温度、プローブの長さおよび塩濃度のパラメーターを変更する方法を知っている。ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は周知であり、Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989)に、特にその中の第11章に例示されている。必要なとき、プローブの長さまたは配列をわずかに変更して、所与の状況下で必要とする特異性および感度を維持することができる。本明細書で列挙するプローブおよび/またはプライマーを、例えばどちらかの方向(領域Dの上流または下流)に1、2、3、4または5ヌクレオチド伸長することができる。
【０１０３】
好ましいストリンジェントな条件は、適切には、型特異的プローブが1種のHPV型だけと結合することを可能にするものである。したがって、本発明の一実施形態では、生体試料中に存在すると考えられる任意のHPV核酸のタイピング方法は、任意のそのような核酸を、ストリンジェントな条件下でHPVのDおよび/またはB領域とハイブリダイゼーションが可能な少なくとも1種のプローブと接触させるステップを含む。
【０１０４】
本明細書で定義するHPVゲノムのDおよび/またはB領域と特異的にハイブリダイズするプローブは、適切には、標的配列とその長さ全体にわたって少なくとも95%の相補性があり、適切には96%、97%、98%、99%などの95%を超える同一性があり、最も好ましくは標的HPV配列とその長さ全体にわたって100%の相補性がある。本発明のプローブは、その標的配列とすべてのヌクレオチドの位置で相補的である可能性があるが、1つ、2つまたはそれ以上のミスマッチは、例えば、プローブの長さ、温度、反応条件およびアッセイの必要条件に応じておそらく許容される。
【０１０５】
適切には、プローブの各ヌクレオチドは、その対応物である標的ヌクレオチドと水素結合を形成することができる。
【０１０６】
好ましくは、プローブと標的の相補性は、アデニンヌクレオチドがチミンと対をなし、グアニンヌクレオチドがシトシンと対をなし、またはその反対のことが起こるようなA:TおよびC:Gの塩基対形成の程度によって評価する。RNAの形態では、Tは、U(ウラシル)で置き換えることができる。
【０１０７】
例えばユニバーサルプローブで、またはプライマーでイノシンを使用する場合、相補性は、イノシン(プローブ)−標的ヌクレオチドの相互作用の程度によって評価することもできる。
【０１０８】
したがって、本発明はまた、生体試料中に存在する可能性がある任意のHPV核酸の検出および/またはタイピング方法に関するものとみることもでき、その方法は、任意のそのような核酸を、図1で示されるHPVゲノムのD領域、適切にはB領域とその長さ全体にわたって1個または0個のヌクレオチドミスマッチを有する少なくとも1種のプローブと接触させるステップと、次いでそのようにして得られたハイブリダイゼーションの結果に基づいてHPV型を分析するステップとを含む。
【０１０９】
プライマーとHPVポリ核酸の領域の「特異的なハイブリダイゼーション」とは、増幅ステップの間に、前記プライマーが、使用した実験条件下でこの領域の一部またはその領域全体と二重鎖を形成し、その条件下で、前記プライマーが、分析する試料中に存在するポリ核酸の他の領域と二重鎖を形成しないことを意味する。HPVポリ核酸の領域との特異的なハイブリダイゼーション用に設計されたプライマーが、前記領域の範囲内にあってもよく、あるいは前記領域と大幅に重複(すなわち、外側で、ならびに前記領域内でヌクレオチドと二重鎖を形成)してもよいことが理解されるはずである。
【０１１０】
本発明の一実施形態は、単一塩基対のミスマッチの検出を必要とし、正確に相補的な配列同士のハイブリダイゼーションだけを可能とするプローブのハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件が好ましい。しかし、プローブの中心部がそのハイブリダイゼーションの特性には不可欠であり、長いプローブ配列を使用するとき、標的配列に対するプローブ配列の起こり得るずれが、プローブの末端に対して許容され得ることに留意されたい。プローブの長さの変更は可能である。
【０１１１】
しかし、当技術分野における通常の知識から考え出すことができる前記のずれおよび変更は、それにより、正確に相補的なプローブと同等のハイブリダイゼーションの特性が生じるかどうかを確認するために、常に実験的に評価すべきである。
【０１１２】
好ましくは、本発明のプローブは、長さが約5〜50ヌクレオチドであり、より好ましくは約10〜25ヌクレオチドである。プローブの特に好ましい長さには、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24または25ヌクレオチド(存在する可能性がある任意のスペーサー配列は数えず)がある。本発明で使用するヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびイノシンやそのハイブリダイゼーションの特性を本質的に変化させない修飾基を含むヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドでよい。
【０１１３】
プローブ配列は、明細書全体を通じて、5'末端から3'末端への一本鎖DNAオリゴヌクレオチドとして表す。下記に明記するプローブのいずれかを、それ自体で、またはその相補的な形態で、または(TがUで置き換わった)そのRNAの形態で使用できることは当業者には明らかである。
【０１１４】
本発明によるプローブは、対応するヌクレオチド配列を含めた挿入物を含む組換えプラスミドをクローン化し、必要なら、十分なヌクレアーゼの使用によりクローン化したプラスミドから挿入物を切り出し、例えば分子量による分画化によりそれを回収することによって調製することができる。本発明によるプローブはまた、例えば従来のホスホトリエステル法によって化学合成することもできる。
【０１１５】
増幅プライマーが、適切な増幅を確実に行うのに鋳型中の対応する標的配列と正確に整合する必要がないことは、文献中に詳細に示されている(Kwok et al.,1990)。しかし、プライマーがその標的配列と完全に相補的でないとき、増幅した断片が標的配列の配列でなくプライマーの配列を有することを考慮すべきである。
【０１１６】
プライマーは、最適な標識(例えば、ビオチン)で標識することができる。使用する増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR;Saiki et al.,1988)、リガーゼ連鎖反応(LCR;Landgren et al.,1988;Wu & Wallace,1989;Barany,1991)、核酸配列に基づく増幅(NASBA;Guatelli et al.,1990;Compton,1991)、転写に基づく増幅系(TAS;Kwoh et al.,1989)、鎖置換増幅(SDA;Walker et al.,1992)またはQBレプリカーゼを用いた増幅(Lomeli et al.,1989)、あるいは当技術分野で知られている核酸分子を増幅する任意の他の適切な方法のいずれかでよい。
【０１１７】
プライマーまたはプローブとして使用するオリゴヌクレオチドはまた、ホスホロチオエート(Matsukura et al.,1987)、アルキルホスホロチオエートやペプチド核酸(Egholm M,Buchardt O,Christensen L,Behrens C,Freier SM,Driver DA,Berg RH,Kim SK,Norden B,Nielsen PE.PNA hybridizes to complementary oligonucleotides obeying the Watson-Crick hydrogen-bonding rules.Nature.1993 Oct 7;365(6446):566-8)などのヌクレオチド類似体を含んでもよく、あるいはインターカレート剤(Asseline et al.,1984)を含んでもよい。本発明の元のDNA配列中に導入された他のほとんどの変更または修飾のように、これらの変更は、必要な特異性および感度を得るのにオリゴヌクレオチドを使用すべきである条件に対する適合を必要とする。しかし、ハイブリダイゼーションの最終的な結果は、非修飾オリゴヌクレオチドを用いて得られるものと本質的に同じとなる。これらの修飾の導入は、ハイブリダイゼーション速度論、ハイブリッド形成の可逆性、オリゴヌクレオチド分子の生体安定性などの特性に正の影響を及ぼすために有利となる可能性がある。
【０１１８】
「固相支持体」という用語は、それがそのハイブリダイゼーションの特性を保持し、ハイブリダイゼーションのバックグラウンドレベルが低いままであるという条件で、オリゴヌクレオチドプローブを結合することができる任意の基材を指し得る。通常、固相基材は、(例えば、DEIA技術での)マイクロタイタープレート、膜(例えば、ナイロンまたはニトロセルロース)またはマイクロスフェア(ビーズ)またはチップとなる。膜への適用または固定の前に、固定を促進し、またはハイブリダイゼーション効率を向上させるために核酸プローブを修飾すると好都合である可能性がある。そのような修飾は、ホモポリマーテールの付加、脂肪族基、NH2基、SH基、カルボン酸基などの異なる反応基との結合、あるいはビオチン、ハプテンまたはタンパク質との結合を含んでよい。
【０１１９】
上記で論じたように、ハイブリダイゼーションを液体媒体中で行い、プローブと標的の結合を、例えば、フローサイトメトリーによって評価することができる。
【０１２０】
「標識した」という用語は一般に標識核酸の使用を指す。Saiki et al.(1988)またはBej et al.(1990)により示されるような増幅のポリメラーゼステップの間に組み込まれる標識ヌクレオチド、または標識プライマー、あるいは当業者に知られている任意の他の方法の使用によって標識を実施することができる。標識の性質は、同位体的(「P」、「S」など)でもよく、あるいは非同位体的(ビオチン、ジゴキシゲニンなど)でもよい。
【０１２１】
「試料」は、例えばヒト(または動物)から直接、または培養(濃縮)後に得られる生体物質などのHPV核酸を含む可能性がある任意の物質でもよく、あるいは宿主細胞中に発現する組換えHPV核酸でもよい。生体物質は、例えば、尿でもよく、あるいはヒトまたは動物の身体の泌尿生殖器管または任意の部分からの擦過/生検材料（scrapes/biopsies）でもよい。
【０１２２】
本発明のプローブセットは一般に、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50種またはそれ以上のプローブを含む。
【０１２３】
前記プローブを、2つ以上(おそらくプローブと同じ数だけ)の別々の既知の位置で固相支持体上に適用することができる。2種以上のプローブを前記固相支持体の1つの同じ位置に一緒に適用することが好ましいことが多い。本発明は、本発明の1種または複数種のプローブと結合した固相支持体に関する。
【０１２４】
所望の特性を有するプローブを設計するには、当業者に知られている下記の有用な指針を適用することができる。
【０１２５】
本明細書に記載のものなどのハイブリダイゼーション反応の程度および特異性はいくつかのファクターによって影響を受けるので、1つまたは複数のそのファクターの操作により、その標的と完全に相補的であってもそうでなくても、特定のプローブの正確な感度および特異性が決定される。様々なアッセイ条件の重要性および効果を本明細書においてさらに説明する。
【０１２６】
[プローブ:標的]核酸ハイブリッドの安定性は、アッセイ条件と適合するように選択すべきである。このことは、ATに富む長い配列を回避し、G:C塩基対でハイブリッドを終結させ、適当なTmを有するプローブを設計することによって実現することができる。プローブの開始点および終点は、その長さおよび%GCによって、最終アッセイを行う温度より約2℃高いTmとなるように選択すべきである。プローブの塩基組成は重要であるが、それは、水素結合がさらに多いためG-C塩基対がA-T塩基対と比較して大きな温度安定性を示すからである。したがって、G-C含有量が高い相補的な核酸を含むハイブリダイゼーションは、高い温度でより安定となる。
【０１２７】
プローブを使用するイオン強度およびインキュベーション温度などの条件も、プローブを設計するときに考慮すべきである。反応混合物のイオン強度が増大するにつれてハイブリダイゼーションの程度が増大し、ハイブリッドの温度安定性が、イオン強度が増大するとともに増大することが知られている。その一方で、水素結合を破壊するホルムアミド、尿素、DMSOやアルコールなどの化学的試薬により、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが増大する。そのような試薬による水素結合の不安定化によって、Tmを大きく低下させることができる。一般に、長さが約10〜50塩基の合成オリゴヌクレオチドプローブの最適なハイブリダイゼーションは、所与の二重鎖の融解温度より約5℃低い温度で起こる。最適条件より低い温度でインキュベートすると、ミスマッチ塩基配列がハイブリダイズすることがあり、それによって特異性の低下が生じ得る。
【０１２８】
ストリンジェンシーが高い条件下でのみハイブリダイズするプローブを有することが望ましい。ストリンジェンシーの高い条件下では、高度に相補的な核酸ハイブリッドのみが形成され、十分な程度の相補性を有さないハイブリッドは形成されない。したがって、アッセイ条件のストリンジェンシーによって、ハイブリッドを形成する2つの核酸鎖間で必要な相補性の量が決定される。ストリンジェンシーの程度は、標的核酸で形成されるハイブリッドと標的でない核酸で形成されるハイブリッドとの間で安定性の相違が最大となるように選択する。この場合、単一塩基対の変化を検出する必要があり、これはストリンジェンシーが非常に高い条件を必要とする。
【０１２９】
プローブ配列の長さも重要となり得る。ある場合では、位置および長さが様々であり、所望のハイブリダイゼーションの特性を有するプローブをもたらす、特定の領域に由来する複数の配列が存在する可能性がある。他の場合では、1つの配列が、単に1塩基だけ異なる他の配列より著しくよいものである可能性がある。完全に相補的でない核酸がハイブリダイズすることが可能であるが、完全に相補的な塩基配列の最も長い領域が、通常は主としてハイブリッドの安定性を決定する。
【０１３０】
長さおよび塩基組成がさまざまなオリゴヌクレオチドプローブを使用することができるが、本発明の好ましいオリゴヌクレオチドプローブは長さが約5〜50(より具体的には10〜25)塩基であり、標的核酸配列と完全に相補的である、配列中の十分な領域を有する。
【０１３１】
ハイブリダイゼーション阻害性の強い内部構造を形成することが知られている標的DNAまたはRNA中の領域は好ましくない。同様に、広範囲にわたる自己相補性を有するプローブも避けるべきである。上記で説明したように、ハイブリダイゼーションとは、2本の相補的な核酸の一本鎖が結合して、水素結合による二本鎖を形成することである。
【０１３２】
鎖2本のうち1本が完全にまたは部分的にハイブリッド中に含まれている場合、その鎖が新たなハイブリッドの形成に関与できないことが暗示されている。十分な自己相補性がある場合、1つの型のプローブ分子内で分子内ハイブリッドおよび分子間ハイブリッドが形成される可能性がある。そのような構造は、注意深いプローブ設計により回避することができる。対象とする配列の相当大きな部分が一本鎖となるようにプローブを設計することによって、ハイブリダイゼーションの速度および程度を大きく増大させることができる。この型の相互作用の検索にコンピュータプログラムが利用可能である。しかし、特定の場合では、このタイプの相互作用を回避できないことがある。
【０１３３】
選択したオリゴヌクレオチドプローブセットで異なるHPV型を同定するために、当技術分野で知られている任意のハイブリダイゼーション法を使用することができる(従来のドットブロット法、サザンブロット法、サンドイッチ法など)。しかし、多数のプローブが関与する場合に迅速かつ簡単な結果を得るには、逆ハイブリダイゼーション形式が最も好都合である可能性がある。好ましい実施形態では、選択したプローブを、既知の別々の位置で(点、線または他の形状で)固相支持体に固定化する。他の好ましい実施形態では、選択したプローブセットを線の形で膜の細片に固定化する。個々にまたは混合物として前記プローブを固相支持体の明確な位置に固定化することができる。上記で述べた選択的な方法の具体的なかつ非常に使いやすい実施形態は、WO9914377の実施例4に開示されており、本明細書にそれを適合させることができる。HPVポリ核酸をビオチンで標識することができ、次いでハイブリッドを、ビオチンとストレプトアビジンの結合を介して、非放射性の発色系で検出することができる。
【０１３４】
「ハイブリダイゼーション用緩衝液」という用語は、適当なストリンジェンシーの条件下で、プローブと試料中に存在するポリ核酸またはその増幅産物とのハイブリダイゼーション反応を可能にする緩衝液を意味する。
【０１３５】
「洗浄溶液」という用語は、適当なストリンジェンシーの条件下で形成されたハイブリッドの洗浄を可能にする溶液を意味する。
【０１３６】
この明細書および下記の特許請求の範囲全体を通じて、文脈上別段に必要としない限り、「含む(comprise)」という単語および「含む(comprises)」や「含む(comprising)」などの語尾変化が、一定の整数値またはステップあるいは一定の整数値またはステップの群を含むが、任意の他の整数値またはステップあるいは整数値またはステップの群を除外するものではないことを暗示することが理解されるであろう。「含む(comprising)」はまた、「〜からなる(consisting of)」および「本質的に〜からなる(consisting essentially of)」の意味を含むことも暗示する。
【０１３７】
本発明の実施形態には、
(a)試料中に存在すると考えられる任意のHPV核酸のタイピング方法であって、
(i)任意のそのような核酸を、HPVゲノムのD領域内で特異的なハイブリダイゼーションが可能な少なくとも1種のプローブと接触させるステップであって前記領域が図1で示されるステップと、
(ii)そのようにして得られたハイブリダイゼーションの結果に基づいてHPV型を分析するステップと
を含む方法、
(b)プローブがHPVゲノムのB領域内でハイブリダイゼーションが可能であり、前記B領域が図1で示される、記述(a)に記載の方法、
(c)プローブが、1種のHPV型だけのゲノムのDまたはB領域内で特異的なハイブリダイゼーションが可能である、記述(a)または(b)に記載の方法、
(d)プローブが、Table4で列挙した配列からなるリストから選択される、記述(a)に記載の方法、
(e)ハイブリダイゼーションの前に、試料中に存在する任意のHPV核酸を増幅する、前記記述のいずれかに記載の方法、
(f)増幅ステップで、HPV-MPF1F1、HPV-MPF1F2、HPV-MPF1F3、HPV-MPF1F4、HPV-MPF1F5、HPV-MPF1F6、HPV-MPF1F7、HPV-MPF1F8、HPV-MPF1F9、HPV-MPF1F10、HPV-MPF2R1、HPV-MPF2R2、HPV-MPF2R3、HPV-MPF2R4、HPV-MPF2R5、HPV-MPF2R6、HPV-MPF2R7、HPV-MPF2R8を含むリストから選択されるプライマーを使用する、記述(e)に記載の方法、
(g)タイピングステップの前に、試料中でのHPV核酸の存在を確認する、前記記述のいずれかに記載の方法、
(h)固相支持体の存在下でプローブと標的のハイブリダイゼーションを実施する、前記記述のいずれかに記載の方法、
(i)ハイブリダイゼーションステップで逆ハイブリダイゼーション形式を使用する、記述(h)に記載の方法、
(j)プローブをビーズ上にハイブリダイズさせる、記述(h)に記載の方法、
(k)フローサイトメトリーを使用してハイブリダイゼーションの検出を分析する、記述(j)に記載の方法、
(l)HPVゲノムのBまたはD領域に由来する核酸の増幅に適した少なくとも2種のプライマーを含むキット、
(m)プライマーが、HPV-MPF1F1、HPV-MPF1F2、HPV-MPF1F3、HPV-MPF1F4、HPV-MPF1F5、HPV-MPF1F6、HPV-MPF1F7、HPV-MPF1F8、HPV-MPF1F9、HPV-MPF1F10、HPV-MPF2R1、HPV-MPF2R2、HPV-MPF2R3、HPV-MPF2R4、HPV-MPF2R5、HPV-MPF2R6、HPV-MPF2R7、HPV-MPF2R8からなるリストから選択される、記述(l)に記載のキット、
(n)HPVゲノムのD領域またはB領域との特異的なハイブリダイゼーションが可能な少なくとも2種のプローブを含むキット、
(o)プローブが、Table4から選択される任意の2種のプローブである、記述(n)に記載のキット、
(p)Table1または2の任意のプライマーあるいはTable3の任意のプローブならびに上記のHPV同定およびタイピングの分析方法を実施するための説明書を含むキット、
(q)固相支持体と結合したHPVゲノムのD領域またはB領域との特異的なハイブリダイゼーションが可能なプローブを含むキット、
(r)Table3の任意のプローブをさらに含む、記述(l)〜(q)のいずれかに記載のキット、
(s)プローブがTable4から選択される、記述Aの方法における使用に適したプローブ、
(t)プローブがTable1および2から選択される、記述(e)の方法における使用に適したプライマー
がある。
【０１３８】
参照文献
2008526244.tif 000002
2008526244.tif 000003
2008526244.tif 000004
2008526244.tif 000005
2008526244.tif 000006
【実施例１】
【０１３９】
下記の手法を使用してHPVのDNAのタイピングを行うことができる。
【表１】
2008526244.tif 000007
【０１４０】
標的DNA10μlを添加し、最終体積を50μlにする。
【表２】
2008526244.tif 000008
【０１４１】
PCRプログラム
9分、94℃、AmpliTaq Goldの活性化、
30秒、94℃、
45秒、52℃、
45秒、72℃
を含むサイクルを40サイクル、
5分、72℃の最終インキュベーション。
【０１４２】
HPVゲノムDNAを含む下記のプラスミドをマルチプレックスPCRに使用した(完全なMPFのセット):
-  HPV16
-  HPV18
-  HPV31
-  HPV33
-  HPV45
-  HPV52
-  HPV56
-  HPV66
-  HPV35
-  HPV67
-  HPV11
-  HPV26
-  HPV53
-  HPV58
-  HPV71
-  HPV13
-  HPV39
-  HPV54
-  HPV69
-  HPV70
-  HPV74
-  HPV7
すべてで、予想されたサイズの断片が得られた。
【０１４３】
HPVゲノムDNAを含む下記のプラスミドを単独PCRに使用した(単独のフォワード+リバースのプライマー):
-  HPV16
-  HPV35
-  HPV59
-  HPV18
-  HPV56
-  HPV68
-  HPV39
-  HPV33
-  HPV6
-  HPV51
-  HPV26
-  HPV40
-  HPV43
すべてで、予想されたサイズの断片が得られた。
【０１４４】
単独PCRプライマーを使用したPCR産物の例(図3を参照)
レーン1:マーカー
レーン2:HPV18
レーン3:HPV56
レーン4:HPV39
レーン5:HPV26
レーン6:HPV43
レーン7:HPV33
【０１４５】
ゲルマルチプレックスPCR(図4を参照)
レーン1:マーカー
レーン2:HPV16
レーン3:HPV18
レーン4:HPV31
レーン5:HPV33
レーン6:HPV45
レーン7:HPV52
レーン8:HPV56
レーン9:マーカー
【０１４６】
逆ハイブリダイゼーション(ラインプローブアッセイ)の条件
PCR産物10μlを、選択されたプローブをいくつか含む細片とハイブリダイズさせることができる。使用に適した条件は下記の通りである:
【表３】
2008526244.tif 000009
【０１４７】
ハイブリダイゼーションは、適切には、3×SSC、0.1%SDS、50℃で実施する。図5の結果が得られた。
【０１４８】
表（TABLES）
一般的プライマーセット
【表４】
2008526244.tif 000010
【表５】
2008526244.tif 000011
【０１４９】
MPFアンプリマーの一般的検出用のユニバーサルプローブ
【表６】
2008526244.tif 000012
【表７】
2008526244.tif 000013
2008526244.tif 000014
【表８】
2008526244.tif 000015
2008526244.tif 000016
2008526244.tif 000017
【０１５０】
実施例2〜12の序論
材料および方法:
上記のWallace et al(2005)による標準的なハイブリダイゼーションの手順(段階的)は、下記の通りである:
1.適当なオリゴヌクレオチド結合マイクロスフェアのセットを選択する。 
2.約20秒間のボルテックスおよび超音波処理によりマイクロスフェアを再懸濁する。 
3.1.5×TMAC(1×TMAC=2mol/l TMAC/0.15%サルコシル/75mmol/lトリス、6mmol/l EDTA)ハイブリダイゼーション用緩衝液で結合マイクロスフェアストックをマイクロスフェア各セット150個/μlに希釈することにより、標準マイクロスフェア混合物を調製する(注:各反応に標準マイクロスフェア混合物33μlを必要とする)。 
4.約20秒間のボルテックスおよび超音波処理により標準マイクロスフェア混合物を混合する。 
5.各試料またはバックグラウンド用穴に、標準マイクロスフェア混合物を33μl添加する。 
6.各バックグラウンド用穴に、dH2Oを17μl添加する。 
7.各試料用穴に、増幅したビオチン化DNAおよびdH2Oを合計体積17μlまで添加する(注:PCR反応物7μlを検出に使用する)。 
8.ピペットで複数回出し入れすることにより、穏やかに反応用穴を混合する。 
9.サーモサイクラー中で、99℃で5分間インキュベートして、増幅したビオチン化DNAを変性させる。 
10.ハイブリダイゼーション温度(55℃)で反応用プレートを15分間インキュベートする。 
11.インキュベーションの間に、氷冷1×TMACで2回すすぐことにより、フィルタープレートを準備する。次に、氷冷1×TMACでフィルタープレートの各穴を満たす。 
12.インキュベーションの間に、1×TMACハイブリダイゼーション用緩衝液でストレプトアビジン-R-フィコエリスリンを2μg/mlに希釈することにより、新鮮なレポーター混合物を調製し(注:各反応にレポーター混合物75μlを必要とする)、ハイブリダイゼーション温度のオーブンまたは水槽にそれを入れる。 
13.洗浄用氷冷緩衝液を含むフィルタープレートに反応物全体を移すことにより、ハイブリダイゼーション反応を終結させる。 
14.移した後、真空濾過をはさむことにより氷冷1×TMAC洗浄用緩衝液でフィルタープレートをストリンジェントな条件で2回洗浄する。 
15.レポーター混合物75μlを各穴に添加し、ピペットで複数回出し入れすることにより、穏やかにそれを混合する。 
16.室温に達するまで約30分間プレート全体を放置する。 
17.ハイブリダイゼーション温度で反応用プレートを30分間インキュベートする。 
18.真空濾過によりインキュベーションを終結させる。 
19.真空濾過をはさむことにより1×TMAC洗浄用緩衝液で2回洗浄する。 
20.真空濾過をはさむことにより1×TMAC洗浄用緩衝液中に反応物を溶解させる。 
21.システムの手引書に従って、LuminexTM100分析装置上で、室温で分析する。 
[図6.Wallace et al(2005)に記載されている作業の流れの一般的な図式的全体像を参照]
【０１５１】
試験の感度および特異性は、プローブと標的核酸配列の特異的なハイブリダイゼーションに基づいている。したがって、ハイブリダイゼーションおよび洗浄はその手順で極めて重要なステップであると思われるが、PEとともにインキュベートすることも極めて重要なステップであると思われる。反応の特異性および感度を最大にするために、温度や拡散速度論などの様々なパラメーターを最適化することによってプロトコールを適合させた。この適合については、最適化ハイブリダイゼーションプロトコールで示す(下記を参照)。
【０１５２】
材料:
A.緩衝液
【表９】
2008526244.tif 000018
【表１０】
2008526244.tif 000019
【表１１】
2008526244.tif 000020
【表１２】
2008526244.tif 000021
【表１３】
2008526244.tif 000022
【表１４】
2008526244.tif 000023
【表１５】
2008526244.tif 000024
【０１５３】
B.ビーズ
1.使用するビーズの型は、L100-C123-01からL100-C172-01まで(LuminexTMCorp.、テキサス州Austin)である。
【０１５４】
C.プローブ(実施例を参照)
1.プローブは、Eurogentec(ベルギー、Seraing)によって供給された。
【０１５５】
D.機器
【表１６】
2008526244.tif 000025
【０１５６】
方法およびプロトコール:
I.プローブ結合
1.-20℃の乾燥させたPierce EDC[1-エチル-3-[ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩]粉末の新鮮なアリコートを室温に戻す。 
2.アミン置換オリゴヌクレオチド(「プローブ」または「捕捉」用のオリゴ)をdH2O中0.2mM(0.2nmol/μl)になるまで再懸濁する。 
3.約20秒間のボルテックスおよび超音波処理によりストックマイクロスフェアを再懸濁する。 
4.ストックマイクロスフェア5.0×106個をUSA Scientificの微量遠心管に移す。 
5.≧8000×g、1〜2分間の微量遠心分離によりストックマイクロスフェアをペレットにする。 
6.上清を除去し、約20秒間のボルテックスおよび超音波処理により、50μlの0.1M  MES、pH4.5中で、ペレットにしたマイクロスフェアを再懸濁する。 
7.0.2mM捕捉用オリゴの1:10のdH2O希釈物(0.02nmol/μl)を調製する。 
8.1:10希釈した捕捉用オリゴ2μl(0.04nmol)を、再懸濁したマイクロスフェアに添加し、それをボルテックスにより混合する。 
9.EDC20mg/mlのdH2O新鮮溶液を調製する。最長で使用の1分前に、dH2O500μl中にEDC10mgを溶解する。EDC(粉末)10mgのアリコートは、シリカゲルと一緒に詰めた状態で、-80℃で乾燥させて貯蔵していた。 
10.各反応物1つ1つについて、20mg/mlの新鮮調製EDC2.5μlをマイクロスフェアに添加し、ボルテックスにより混合する(注:EDC粉末のアリコートはすぐに廃棄すべきである)。 
11.室温、暗所で30分間インキュベートする。 
12.第2のEDC20mg/mlのdH2O新鮮溶液を調製する。 
13.各反応物1つ1つについて、20mg/mlの新鮮EDC2.5μlをマイクロスフェアに添加し、ボルテックスにより混合する(注:EDC粉末のアリコートはすぐに廃棄すべきである)。 
14.室温、暗所で30分間インキュベートする。 
15.結合マイクロスフェアに0.02% Tween-20を1.0ml添加する。 
16.≧8000×g、1〜2分間の微量遠心分離により結合マイクロスフェアをペレットにする。 
17.上清を除去し、ボルテックスにより、1.0mlの0.1%SDS中で結合マイクロスフェアを再懸濁する。 
18.≧8000×g、1〜2分間の微量遠心分離により結合マイクロスフェアをペレットにする。 
19.上清を除去し、約20秒間のボルテックスおよび超音波処理により、100μlのTE、pH8.0中で結合マイクロスフェアを再懸濁する。 
20.≧8000×g、1〜2分間の微量遠心分離により結合マイクロスフェアをペレットにする。 
21.上清を除去し、約20秒間のボルテックスおよび超音波処理により、100μlのTE、pH8.0中で結合マイクロスフェアを再懸濁する。 
22.血球計算盤により結合マイクロスフェアを数える:
a.再懸濁した結合マイクロスフェアをdH2Oで1:100に希釈する。 
b.ボルテックスにより完全に混合する。 
c.10μlを血球計算盤に移す。 
d.血球計算盤の格子の4個の大きな四角形内にあるマイクロスフェアを計数する。 
e.マイクロスフェアの個数/μl=(4個の大きな四角形中にあるマイクロスフェアの合計)×2.5×100(希釈倍率)。(注:最大はマイクロスフェア50,000個/μlである。)
23.2〜10℃、暗所で冷蔵して、結合マイクロスフェアを貯蔵する。
【０１５７】
II.最適化したハイブリダイゼーションおよび洗浄プロトコール
1.適当なオリゴヌクレオチド結合マイクロスフェアのセットを選択する。 
2.約20秒間のボルテックスおよび超音波処理によりマイクロスフェアを再懸濁する。 
3.4.5×SSC/0.15%サルコシルハイブリダイゼーション用緩衝液で結合マイクロスフェアストックをマイクロスフェア各セット150個/μlに希釈することにより、標準マイクロスフェア混合物を調製する(注:各反応に標準マイクロスフェア混合物33μlを必要とする)。 
4.約20秒間のボルテックスおよび超音波処理により標準マイクロスフェア混合物を混合する。 
5.各試料またはバックグラウンド用穴に、標準マイクロスフェア混合物を33μl添加する。 
6.各バックグラウンド用穴に、TE、pH8を17μl添加する。 
7.各試料用穴に、増幅したビオチン化DNAおよびTE、pH8.0を合計体積17μlまで添加する(注:通常はしっかりとしたPCR反応物50μlのうち4μlで検出には十分である)。 
8.ピペットで複数回出し入れすることにより、穏やかに反応用穴を混合する。 
9.サーモサイクラー中で、95〜100℃で5分間インキュベートして、増幅したビオチン化DNAを変性させる。 
10.サーモサイクラー中で、60℃で反応用プレートを3分間インキュベートする。 
11.ハイブリダイゼーション温度に予め加熱したサーモミキサーに反応用プレートを移す(注:8連ピペッターを使用して、8穴同時に反応物を移すことができる)。 
12.ハイブリダイゼーション温度、15分間、500rpmで反応用プレートをインキュベートする。 
13.インキュベーションの間に、蒸留水ですすぐことによりMilliporeフィルタープレートを準備する。次に、ハイブリダイゼーション温度の3×SSC/0.1%サルコシル/1mg/mlカゼイン洗浄用緩衝液200μlでフィルタープレートの各穴を満たし、ハイブリダイゼーション温度のオーブンにそれを入れる。 
14.インキュベーションの間に、3×SSC/0.1%サルコシル/1mg/mlカゼインストリンジェント洗浄用緩衝液でストレプトアビジン-R-フィコエリスリンを2μg/mlに希釈することにより、新鮮なレポーター混合物を調製し(注:各反応にレポーター混合物75μlを必要とする)、ハイブリダイゼーション温度のオーブンまたは水槽にそれを入れる。 
15.ハイブリダイゼーション温度の洗浄用緩衝液を含むフィルタープレートに反応物全体を移すことにより、ハイブリダイゼーション反応を終結させる。 
16.移した後、真空濾過をはさむことによりハイブリダイゼーション温度の3×SSC/0.1%サルコシル/1mg/mlカゼインストリンジェント洗浄用緩衝液100μlでフィルタープレートを2回洗浄する。 
17.レポーター混合物75μlを各穴に添加し、ピペットで複数回出し入れすることにより、穏やかにそれを混合する。 
18.ハイブリダイゼーション温度で反応用プレートを15分間インキュベートする。 
19.真空濾過によりインキュベーションを終結させる。 
20.真空濾過をはさむことにより室温の1×SSC/0.1%サルコシル/1mg/mlカゼインストリンジェント洗浄用緩衝液100μlで2回洗浄する。 
21.室温の1×SSC/0.1%サルコシル/1mg/mlカゼイン洗浄用緩衝液100μl中に反応物を溶解させる。 
22.システムの手引書に従って、LuminexTM100分析装置上で、室温で50μlを分析する。
【０１５８】
III.読み取り
1.LuminexTM100IS第2.3版ソフトウェアを使用してデータを読み取った。 
2.測定中、下記のパラメーターを使用する:
a.試料体積:50μl
b.試料のタイムアウト:60秒
c.XY加熱器温度(℃):35
d.二重識別ゲート:
i.下限:8000
ii.上限:18500
e.統計:中央値
【０１５９】
IV.データ管理
1.LuminexTM100IS2.3ソフトウェアによって提供される標準的な出力をすべて含む生CSVファイル(カンマで区切られる、*.csv)中にデータを保存した。 
2.得られた中央値シグナルを、標的対プローブ比およびシグナル対ノイズ比の計算用Excelファイルに転送した(レイアウトおよび計算も参照されたい)。 
本発明は、プローブ設計の最適化および試験プロトコールの最適化を含めて、LuminexTMの手順の様々な項目を検討するものである。下記の文章で、図2で概要を示す作業の流れの順にデータを提示する。 
図6.適合させた作業の流れの一般的な図式的全体像
【０１６０】
実施例における結果の提示(レイアウトおよび計算):
下記の通りに、関係する実施例および特許請求の範囲を明記し説明する。結果は、主に生データ(MFI=中央蛍光強度)、変量(例えば、温度)、プローブ、分析する標的、計算値、および所見を含むTableとして提示する。計算値は、標的対プローブ比(%標的/プローブ)およびシグナル対ノイズ比(シグナル/ノイズ)を含む。標的対プローブ比は、プローブ当たりで計算し、100%に設定する陽性対照の百分率として各シグナルを示す(実施例のTable15も参照されたい)。シグナル対ノイズ比もプローブ当たりで計算する。各シグナルは、得られたすべてのシグナルの中央値で割る(実施例のTable16も参照されたい)。標的対プローブ比からもシグナル対ノイズ比からも、シグナルの強度および特異性に対する良好な全体の示唆が得られる。
【０１６１】
特定の実施例では、参照により本明細書に完全に組み込まれているEP1012348に記載のSPF10プライマーに由来するプローブおよびプローブのセットを使用する。この特許は、本特許出願で使用する技術に対する技術的背景を提供するものである。
【０１６２】
SPF10プライマーセットから、プライマー間の領域が22ヌクレオチドである、長さがわずか65bpの小さなアンプリマーが得られる。このことは、全HPV遺伝子型間にある様々なミスマッチに対してプローブが位置付けられる可能性をストリンジェントに制限するものである。
【実施例２】
【０１６３】
目的:
ハイブリダイゼーションステップ後のハイブリダイゼーション温度の維持がシグナルの特異性に対して有意な正の効果を有するかどうかを調べること。
【０１６４】
序論:
溶液中でのビーズ上に固定化されたプローブと変性した標的配列とのハイブリダイゼーションの後、結合しなかった物質は、レポーター試薬であるストレプトアビジン-R-フィコエリスリン(PE)とのインキュベーションの前に洗浄して除く必要がある。このことは、フィルタープレート(MSBVN12、Millipore)を使用することによって実現することができ、そのプレートにおいて、ビーズおよび結合した全分子が溶液中の遊離分子から分離される。反応体積が小さく、したがってそれはその環境の急速な温度変化に弱い。ハイブリダイゼーション温度後の温度変化の効果について調べた。
【０１６５】
材料および方法:
LuminexTMシグナルに対する、ハイブリダイゼーションより低い温度でのインキュベーションの効果について、SPF10モデル系を使用して調べた。
【０１６６】
HPV31のプローブ(プローブ31SLPr31、Table5aを参照)を有するLuminexTMビーズを使用した。このプローブは、SPF10プライマーセットで増幅したHPV31配列の同定に特異的である。任意の交差反応性について評価するために、HPV44およびHPV16のアンプリマーを使用した。HPV31とHPV44の標的配列は1箇所で異なり、HPV31とHPV16の標的配列は4箇所で異なる(Table5b)。
【０１６７】
ハイブリダイゼーションを50℃で行い、アッセイを二連で行った。その後、一方のセットの反応物は、標準的なプロトコールに従って処理し、ビーズは直ちに4℃のフィルタープレート中で洗浄した。二連の他方のセットの反応物は、4℃での同じ標準的な洗浄を開始する前に室温(RT)で1分間最初にインキュベートした。Wallace et al(2005)と異なり、試料をフィルタープレートに移した後に洗浄用緩衝液を添加した(実施例3も参照されたい)。
【０１６８】
結果:
結果をTable5cに示す。示した通り、ハイブリダイゼーションからストリンジェント洗浄までの間にちょうど1分間RTでインキュベートすると、シグナルの増大が生じるが、特異性も低下する(これはHPV44について観察されるシグナルが高いことによって示される)。このことは、ハイブリダイゼーション後の短時間での温度低下によって引き起こされるストリンジェンシーの低下によって説明することができる。
【０１６９】
結論
ハイブリダイゼーションステップの後に反応の温度を維持すべきである。ハイブリダイゼーション後、ビーズは、温度の低下を避けるために、遅れることなくできるだけ速く洗浄すべきである。
【実施例３】
【０１７０】
目的:
ハイブリダイゼーション直後の希釈洗浄が、シグナルの特異性に対して有意な正の効果を有するかどうかを調べること。
【０１７１】
序論:
標準的なLuminexTMアッセイの手順は、ハイブリダイゼーションステップの直後に洗浄が行われない場合に、非特異的な結合を導入するリスクを含む(実施例2も参照されたい)。このリスクを最小限にするため、ハイブリダイゼーション直後の試料の希釈について調べた。
【０１７２】
材料および方法:
この効果を調べるため、一方のビーズがHPV31のプローブ(名称:31SLPr31、Table6aを参照)を有し、他方のビーズがHPV51のプローブ(名称:51SLPr2、Table6aを参照)を有する2種のLuminexTMビーズの混合物を使用した。これらのプローブは、SPF10プライマーセットで増幅したHPV31およびHPV51配列の同定にそれぞれ特異的である。31SLPr31との考えられる交差反応性を観察するために、HPV44およびHPV16のアンプリマーを使用した。HPV31とHPV44および16の標的配列は1箇所および4箇所でそれぞれ異なる(Table6b)。51SLPr2との考えられる交差反応性を観察するために、HPV33およびHPV16のアンプリマーを使用した。HPV51とHPV44および16の標的配列は4箇所でそれぞれ異なる(Table6c)。
【０１７３】
標準的なプロトコールを使用して、ハイブリダイゼーションを50℃で行った。
【０１７４】
その後、第1のセットの反応物は4℃のフィルタープレート中で直ちに洗浄し、さらなる洗浄は行わなかった。Wallace et al(2005)と異なり、試料をフィルタープレートに移した後に洗浄用緩衝液を添加した。
【０１７５】
ハイブリダイゼーションステップ直後のさらなる直接および間接の希釈洗浄手順の効果について下記の通りに調べた。直接的手順および間接的手順では洗浄用緩衝液(3×SSC/0.1%サルコシル/1mg/mlカゼイン。これはストリンジェント洗浄用緩衝液である)を50℃で使用した。
【０１７６】
第2のセットのビーズは、直接的な手順によって洗浄した。直接的な手順は、ハイブリダイゼーション混合物(50μl)をサーモサイクラー中でハイブリダイゼーション温度の洗浄用緩衝液200μlで希釈し、その後、希釈した試料全体をフィルタープレートに移すことを含む。
【０１７７】
第3のハイブリダイゼーション反応物は、間接的な手順によって洗浄した。間接的な手順は、ハイブリダイゼーション温度の洗浄用緩衝液200μlですでに予め満たされているフィルタープレートにハイブリダイゼーション混合物50μlを迅速に移すことによる希釈を含む(Wallace et al,2005も参照されたい)。
【０１７８】
結果:
結果をTable6dに示す。どちらのさらなる洗浄手順も、標準的な手順と比較して絶対的なシグナルが低下するが、それと同時にシグナルの特異性が有意に増大する。直接的な洗浄手順と間接的な洗浄手順の間に有意差は認められなかった。実際のところ、サーモサイクラー中での直接的な希釈洗浄は実用性が低く、したがって、間接的な希釈洗浄手順が好ましい。
【０１７９】
結論:
ハイブリダイゼーション後のさらなる希釈洗浄ステップの使用は、シグナルの特異性に対して有意な正の効果を有する。実用的な理由で、間接的な希釈洗浄手順が好ましい。
【実施例４】
【０１８０】
目的:
ストレプトアビジン-R-フィコエリスリンとのインキュベーション前のストリンジェント洗浄中でのハイブリダイゼーション温度の維持が、シグナルの特異性に対して有意な正の効果を有するかどうかを調べること。
【０１８１】
序論:
上記に記載した、ストリンジェントなハイブリダイゼーション後の温度低下の負の効果は、ストリンジェント洗浄の温度それ自体も影響を受ける可能性があることを暗示するものである。したがって、50℃、RT、または4℃のストリンジェント洗浄の温度の効果について調べた。
【０１８２】
材料および方法:
ハイブリダイゼーションステップからストレプトアビジン-R-フィコエリスリンとのインキュベーションまでの間の異なるストリンジェント洗浄用緩衝液の温度の効果について、SPF10モデル系を使用して下記の通りに調べた。
【０１８３】
この効果を調べるため、HPV31のプローブ(名称:プローブ31SLPr31、Table7aを参照)を有するLuminexTMビーズを使用した。このプローブは、SPF10プライマーセットで増幅したHPV31配列の同定に特異的である。31SLPr31との考えられる交差反応性を観察するために、HPV44およびHPV16のアンプリマーを使用した。HPV31とHPV44および16の標的配列は1箇所および4箇所でそれぞれ異なる(Table7b)。
【０１８４】
ハイブリダイゼーションを50℃で行った。その後、それぞれ50℃、RT、または4℃の洗浄用緩衝液を含むフィルタープレートに反応物のセットを移した。
【０１８５】
結果:
結果をTable7cに示す。陽性対照シグナルの絶対的レベルは、50℃とRTとで異ならないが、4℃での洗浄後でわずかに低下した。しかし、50℃で洗浄するとシグナルの特異性が有意に増大したが、RTまたは4℃で洗浄すると、シグナルの特異性が低下した。したがって、ハイブリダイゼーション温度50℃での間接的な希釈洗浄手順が好ましい。
【０１８６】
結論:
ストレプトアビジン-R-フィコエリスリンとのインキュベーション前のストリンジェント洗浄中でのハイブリダイゼーション温度の維持は、シグナルの特異性に対して有意な効果を有する。
【実施例５】
【０１８７】
目的:
サーモミキサーの使用が、シグナル強度に対して有意な正の効果を有するかどうかを調べること。
【０１８８】
序論:
ハイブリダイゼーション反応の速度論は、反応中に構成成分を混合することによって影響を受ける可能性がある。 
したがって、ハイブリダイゼーション中にサーモミキサーを使用することの影響について調べた。
【０１８９】
材料および方法:
ハイブリダイゼーション中にサーモミキサーを使用する拡散速度論の効果について、MPFモデル系を使用して下記の通りに調べた。
【０１９０】
HPV18のプローブ(名称:18MLPr7、Table8aを参照)またはHPV51のプローブ(名称:51MLPr2、Table8aを参照)を有する2種のLuminexTMビーズを使用した。これらのプローブは、MPFプライマーセットで増幅したHPV18およびHPV51配列の同定に特異的である。2種のビーズを混合し、それをHPV18およびHPV51のMPFアンプリマーとハイブリダイズさせた。HPV18とHPV51の標的配列は7箇所で異なる(Table8bおよびc)。二連で反応を試験した。
【０１９１】
一方の反応物はサーモサイクラー中で変性しハイブリダイズさせ、振盪は行わなかった。(Wallace et al,2005も参照されたい)
二連の他方の反応物は変性用のサーモサイクラー中で変性させ、それをハイブリダイゼーション用のサーモミキサーに直ちに移した。ハイブリダイゼーションを50℃で行った。その後、最適化したハイブリダイゼーションおよび洗浄プロトコールを使用して、ビーズを50℃のフィルタープレート中で直ちに洗浄した。
【０１９２】
結果:結果をTable8dに示す。サーモミキサーの使用により、陽性対照の絶対的なシグナルが有意に増大するが、バックグラウンドは影響を受けないままである。この結果、シグナルの特異性が全体的に増大した。 
この結果は、サーモミキサーを使用することによりシグナル強度が増大(向上)することを示すものである。
【０１９３】
結論:
サーモミキサーの使用は、シグナルの強度および特異性に対して有意な正の効果を有する。
【実施例６】
【０１９４】
目的:
ハイブリダイゼーション温度でのストレプトアビジン-R-フィコエリスリンとのインキュベーションが、シグナル強度に対して有意な正の効果を有するかどうかを調べること。
【０１９５】
序論:
一般に、温度は、レポーターPEとのハイブリッドの検出を含めて、任意の反応の速度論に影響を及ぼす。したがって、PEインキュベーションおよびその後の洗浄の温度の影響について調べた。
【０１９６】
材料および方法:
HPV51のプローブ(名称:51SLPr2、Table9aを参照)を有するLuminexTMビーズを使用した。このプローブは、SPF10プライマーセットで増幅したHPV51配列の同定に特異的である。このプローブとの考えられる交差反応性を観察するために、HPV33およびHPV16のSPF10アンプリマーを使用した。HPV51、HPV33およびHPV16の標的配列は4箇所で異なる(Table9b)。
【０１９７】
本明細書において概略を示す最適化したハイブリダイゼーションおよび洗浄プロトコールを使用して、2つの複製物でハイブリダイゼーションを50℃で行った。ストリンジェント洗浄の後、一方のセットの反応物は50℃でPEとともにインキュベートし(Wallace et al,2005も参照されたい)、他方のセットはRTでPEとともにインキュベートした。その後、ビーズを50℃のフィルタープレート中で洗浄した。
【０１９８】
他の実験では、最適化したハイブリダイゼーションおよび洗浄プロトコールを使用して、2つの複製物でハイブリダイゼーションを50℃で行った。ストリンジェント洗浄の後、すべての反応物を50℃でPEとともにインキュベートした(Wallace et al,2005も参照されたい)。50℃でのPEインキュベーションの後、一方のセットの反応物は50℃で洗浄し(Wallace et al,2005も参照されたい)、複製のセットはRTで洗浄した。
【０１９９】
結果:
Table9cに示すように、異なる温度でのPEインキュベーションは、有意な効果を有していた。RTでのPEインキュベーションと比較して、ハイブリダイゼーション温度50℃でのPEインキュベーションでは高い絶対的シグナルが得られる。しかし、シグナルの特異性は有意には異ならなかった。
【０２００】
したがって、ハイブリダイゼーション温度でのストレプトアビジン-R-フィコエリスリンとのインキュベーションが好ましい。その一方で、インキュベーション後のRTまたはハイブリダイゼーション温度での洗浄は有意な効果を有さなかったが、このことは、ある状況ではより実用的となる可能性がある。
【０２０１】
PEインキュベーション後の洗浄ステップに対する温度の影響は有意ではない。絶対的なシグナルもその特異性も、洗浄の温度によって影響を受けないように思われる。
【０２０２】
結論:
ストレプトアビジン-R-フィコエリスリンとのインキュベーション中におけるハイブリダイゼーション温度の維持は、シグナルの特異性ではなくシグナル強度に対して有意な効果を有する。PEインキュベーション後の洗浄の温度は有意な効果を有さない。
【実施例７】
【０２０３】
目的:
LuminexTM試料採取プローブの目詰まりを1×SSCでの最終洗浄によって防止することができるかどうかを調べること。
【０２０４】
序論:
本発明者らの最適化したハイブリダイゼーションおよび洗浄プロトコールでは、ハイブリダイゼーションは3×SSC中で行う。この濃度では、SSCはLuminexTM試料採取プローブを詰まらせ、試料の処理を著しく妨害する。したがって、低いSSC濃度の影響を、最終洗浄について調べた。
【０２０５】
結果:
最初に、ハイブリダイゼーションのSSC濃度を維持しようとした。しかし、3×SSCでの最終洗浄によりLuminexTM試料採取プローブの深刻な目詰まりが導入されたので、有意なデータを得ることができなかった。単純にこの洗浄ステップを1×SSCで行うことで、有意なデータが得られた。したがって、データの欠如のため、データによる比較は示すことができない。他のSSC濃度については調べていない。
【０２０６】
結論:
1×SSCでの最終洗浄により、LuminexTM試料採取プローブの目詰まりは防止される。
【実施例８】
【０２０７】
目的:
測定する準備ができている試料の、最終洗浄後少なくとも4日間の4℃での貯蔵が、シグナルに対する有意な効果を有するかどうかを調べること。
【０２０８】
序論:
作業の流れの柔軟性を高めるために、LuminexTMシステムを使用する直接ハイブリダイゼーション試験プロトコールに関していくつかのステップを分析した。特に試験した手順の1つは、直接ハイブリダイゼーション手順の2ステップ間での貯蔵である。したがって、4℃での貯蔵の影響について調べた。
【０２０９】
材料および方法:
最終洗浄手順後の4℃での貯蔵の効果について、SPF10モデル系を使用して下記の通りに調べた。
【０２１０】
この効果を調べるために、HPV51のプローブ(名称:51SLPr2、Table10aを参照)を有するLuminexTMビーズを使用した。このプローブは、SPF10プライマーセットで増幅したHPV51配列の同定に特異的である。51SLPr2との考えられる交差反応性を観察するために、HPV31のアンプリマーを使用した。HPV51とHPV31の標的配列は4箇所で異なる(Table10b)。
【０２１１】
最終洗浄手順の後、反応物のセットを4℃でそれぞれ0、4、24、および96時間貯蔵した。次に、これらの反応物のセットをRTで測定した。
【０２１２】
結果:
結果を10cに示す。示した通り、最終洗浄ステップ後の貯蔵は、シグナルの強度または特異性に影響を及ぼさない。それにも関わらず、貯蔵それ自体は、経時的に生シグナル強度の非常にわずかな上昇を導入するように思われる。したがって、必要なら、元のシグナルが維持される最大4日間の、最終洗浄ステップ後の貯蔵を導入することができる。
【０２１３】
結論:
最終洗浄ステップ後の貯蔵はシグナル強度およびシグナルの特異性に有意な効果を有さず、作業の流れの柔軟性を高める。
【０２１４】
プローブ(スペーサー)設計-序論
LuminexTMシステムの重要な原理は、個々のビーズ型の色の組成により独特の標識として働くマイクロビーズの表面上での特定のオリゴヌクレオチドプローブの固定化である。
【０２１５】
分子の規模では、ビーズは特定のオリゴヌクレオチドプローブよりはるかに大きい。その結果、特定のプローブ配列は、LuminexTMビーズの表面に非常に密接して位置付けられる。このプローブの位置は、立体障害、および表面疎水性などの様々なビーズ表面の効果のために、溶液中での固定化されたプローブと標的分子とのハイブリダイゼーション速度論にとって最適でない可能性がある。
【０２１６】
下記の実施例では、プローブと標的とのハイブリダイゼーション速度論を最適化するために、ビーズ表面上へのプローブの位置付けを変化させるいくつかの手法について記載する。
【０２１７】
プローブ設計における下記の変更について試験した:
1.様々な長さの炭素スペーサーの使用
2.様々な長さのさらなるオリゴヌクレオチドスペーサーの使用
3.様々な組成のオリゴヌクレオチドスペーサーの使用
【０２１８】
プローブは、異なる機能を有する3種の別々の領域を有する;
1.プローブとビーズ表面の共有結合を可能にするNH2基などの結合基;
2.(a)ビーズ表面と特定のプローブ配列との距離を生じさせ、かつ/または(b)特定のプローブをより親水性の環境中に位置付けるのに使用することができるスペーサー;および
3.実際の標的特異的プローブ配列。プローブのこの部分では、プローブの組成や長さなどの当技術分野における通常のパラメーターを適用する。
【実施例９】
【０２１９】
目的:
様々な長さの炭素スペーサーを使用する効果を判定すること。
【０２２０】
材料および方法:
C12スペーサーの付いたHPV51のプローブ(名称:51SLPr2、Table11aを参照)またはC18スペーサーの付いたHPV51のプローブ(名称:51SLPr2C18、Table11aを参照)を有するLuminexTMビーズを使用した。これらのプローブは、SPF10プライマーセットで増幅したHPV51配列の同定に特異的である。これらのプローブとの考えられる交差反応性を観察するために、HPV33のアンプリマーを使用した。HPV51とHPV33の標的配列は4箇所で異なる(Table11b)。
【０２２１】
結果:結果をTable11cに示す。C18スペーサーにより絶対的なシグナルが低下したが、C12プローブと比較して特異性は高かった。この現象は51SLPr2C18についてだけでなく、C18炭素スペーサーの付いた他のプローブ(例えば、33SLPr21C18:Table11a、c、およびd)についても認められた。
【０２２２】
結論:
様々な炭素スペーサーの長さの使用は、シグナルの特異性に対して有意な効果を有する。例えば51SLPr2に関して、最良のプローブはC18炭素スペーサーを含む。
【実施例１０】
【０２２３】
目的:
様々な長さのオリゴヌクレオチドスペーサーの効果を判定すること。
【０２２４】
材料および方法:
0、10、20、30、または40個のチミンからなるスペーサーの付いたHPV51のプローブ(名称:51SLPr2、51SLPr2T10、51SLPr2T20、51SLPr2T30、51SLPr2T40、Table12aを参照)を有するLuminexTMビーズを使用した。各ビーズ型は別々のプローブ変異体を有していた。これらのプローブは、SPF10プライマーセットで増幅したHPV51配列の同定に特異的である。これらのプローブとの考えられる交差反応性を観察するために、HPV33のアンプリマーを使用した。HPV51とHPV33の標的配列は4箇所で異なる(Table12c)。
【０２２５】
SPF10モデル系とは別に、MPFモデル系を使用して、この効果をやはり下記の通りに調べた。0、20、30、または40個のチミンからなるスペーサーの付いたHPV52のプローブ(名称:52MLPr2、52MLPr2T20、5MLPr2T30、52MLPr2T40、Table12bを参照)を有するLuminexTMビーズを使用した。各ビーズ型は別々のプローブ変異体を有していた。これらのプローブは、MPFプライマーセットで増幅したHPV52配列の同定に特異的である。これらのプローブとの考えられる交差反応性を観察するために、HPV16のアンプリマーを使用した。HPV52とHPV16の標的配列は2箇所で異なる(Table12d)。
【０２２６】
結果:
結果をTable12eおよび12fに示す。チミン領域を有するスペーサーを伸長させると、絶対的なシグナルレベルが有意に増大する。また、さらなるチミンスペーサーを有さないスペーサーと比較して、その特異性も有意に増大する。長さが異なるスペーサーを比較すると、最低限20個のチミン残基が最適なシグナルを得るのに必要となる(例えば、51SLPr2)。全体的に、プローブが40ヌクレオチドのスペーサーを含むとき(例えば、51SLPr2および52MLPr2)、プローブは最も良好に機能する。したがって、このスペーサーの長さが好ましい。
【０２２７】
結論:
異なるスペーサーの使用は、シグナル強度に対してだけでなく特異性に対しても有意な効果を有する。51SLPr2Tnに関して、良好なプローブはシグナルの強度と特異性をどちらも増大させる少なくとも20個のチミンヌクレオチドからなるスペーサーを含む。一般に、少なくとも40ヌクレオチドのスペーサーの長さが最も良好に機能する。
【実施例１１】
【０２２８】
目的:
修飾したポリ(T)スペーサーの使用により偽陽性の反応性を防止することができるかどうかを判定すること。
【０２２９】
序論:
多数のTaq DNAポリメラーゼが、合成した鎖の3'末端にさらなるAヌクレオチドを付加することがよく知られている。3'末端に複数のAをも付加し、それにより3'末端にオリゴAテールの付いた分子の部分集団を発生させることができるかどうかは知られていない。そのような分子は、合計量のPCR産物のうち非常に小さな割合にしかならないが、検出方法の感度が高いために、これらの分子から偽陰性の結果が生じる可能性がある。このことは、PCR産物のそのようなオリゴA領域とプローブのポリ(T)スペーサーとのハイブリダイゼーションに起因する。
【０２３０】
このPCRアーチファクトは一部の試料で起こり、PCRレベルで再現し難い。それは、反応条件の非常に小さな変動に依存的であると思われる。バックグラウンドは、検出レベルで非常に再現性があり、すなわち、バックグラウンドが発生するPCR産物は非常に再現性よくそのようにバックグラウンドが発生する。
【０２３１】
このPCRアーチファクトにより、ラインプローブアッセイ(LiPA)系で偽陽性の結果が生じる可能性もあるが、それは、この系もTテールの付いたプローブを含むからである。LiPAアッセイでは、この結果、その特定の配列とは無関係に、すべてのプローブに伴って弱い均等な(バックグラウンド)シグナルが生じる。LuminexTMシステムでも、そのような弱いバックグラウンドシグナルの読み取りが観察されている。したがって、修飾したスペーサーの効果について調べた。
【０２３２】
材料および方法:
T40スペーサーまたは修飾した(TTG)13スペーサーの付いたHPV18のプローブ(名称:18MLPr7T40および18MLPr7(TTG)13、Table13aを参照)を有するLuminexTMビーズを使用した。これらのプローブは、MPFプライマーセットで増幅したHPV18配列の同定に特異的である。(TTG)トリプレットがポリ(A)との最悪な理論的結合効率の1つを示すので、それを代替スペーサーとして選択した。
【０２３３】
18MLPr7T40および18MLPr7(TTG)13との考えられる交差反応性を観察するために、この偽陽性のバックグラウンドを示す試料に由来するアンプリマー(nc8と称する)を使用した。
【０２３４】
結果:
結果をTable13bに示す。
【０２３５】
13個の「TTG」ヌクレオチドトリプレットからなるスペーサーは明らかに、T40スペーサーで観察されたバックグラウンドシグナルをほとんど完全に消失させることができた。
【０２３６】
結論:
(TTG)13などのTに基づく代替スペーサーの使用は、シグナルの特異性に対して有意な正の効果を有し、その使用により、Aに富むPCRのアーチファクトによって誘導される偽陽性シグナルが消失する。
【実施例１２】
【０２３７】
目的:
プローブの5'または3'末端へのチミンに基づくスペーサーの位置付けにより、プローブと標的の結合部位に隣接するAに富む標的領域との結合が妨げられるかどうかを調べること。
【０２３８】
序論:
プローブ/標的の中間でのミスマッチが、その結合エネルギーに対して最も大きな影響があることが知られている。結合領域の端に近いミスマッチは、区別することがより困難である。プローブ/標的結合領域に隣接するAに富む領域の位置と併せて、これは、プローブの選択的な強度を害する可能性がある。したがって、プローブと標的の結合部位に隣接するAに富む標的領域とその結合を最小限にするスペーサーの位置の影響について調べた。
【０２３９】
材料および方法:
LuminexTMビーズと特定のプローブ配列の間に位置する、プローブの5'または3'末端にあるスペーサーの位置の効果について、MPFモデル系を使用して下記の通りに調べた。
【０２４０】
この効果を調べるため、チミンに基づくスペーサーの付いたHPV18およびHPV45のプローブ(名称:18MLPr7T40N5、18MLPr7T40N3、45MLPr8T40N5および45MLPr8T40N3、Table14aを参照)を有するLuminexTMビーズを使用した。これらのプローブは、MPFプライマーセットで増幅したHPV18およびHPV45配列の同定にそれぞれ特異的である。18MLPr7T40nとの考えられる交差反応性を観察するために、HPV39のアンプリマーを使用した。HPV18とHPV39の標的配列は2箇所で異なる(Table14b)。45MLPr8T40nとの考えられる交差反応性を観察するために、HPV13、39および40のアンプリマーを使用した。HPV45と、HPV13、39および40の標的配列は3、2および1箇所でそれぞれ異なる(Table14c)。
【０２４１】
結果:
結果をTable14dに示す。示した通り、5'末端ではなくプローブの3'末端にあるスペーサーは、プローブと標的の結合部位に隣接するAに富む標的領域とその結合を低下させ、結合エネルギー(dG)および融解温度(Tm)に影響を及ぼす。これらの非特異的シグナルの除外は、標的とスペーサーおよびプローブの結合によって説明することができる。これらの結果から、標的とスペーサーの結合がプローブの特異性を妨害する可能性があり、それを防止すべきであることが示唆される。原理上、同様のメカニズムが「TTG」ヌクレオチドトリプレットスペーサーの使用に関与する可能性がある。したがって、チミンに基づくスペーサーを使用するとき、スペーサーと、特異的な標的領域に隣接する配列との弱い交差ハイブリダイゼーションによってプローブ:標的のハイブリッドの安定性が増大する可能性があり、その結果、プローブ設計で考慮すべきである偽陽性シグナルが生じる。
【０２４２】
結論:
プローブの5'または3'末端にあるチミンに基づくスペーサーの位置は、プローブと標的の結合部位に隣接するAに富む標的領域の結合に関して有意な効果を有する可能性がある。
【０２４３】
参照文献:
Cowan LS,Diem L,Brake MC,Crawford JT.Related Articles.Transfer of a Mycobacterium tuberculosis genotyping method,Spoligotyping,from a reverse line-blot hybridization,membrane-based assay to the Luminex multianalyte profiling system.J Clin Microbiol.2004 Jan;42(1):474-7.
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J Mol Diagn.2005 Feb;7(1):72-80.
【０２４４】
実施例2のTable:
【表１７】
2008526244.tif 000026
【０２４５】
実施例3のTable:
【表１８】
2008526244.tif 000027
2008526244.tif 000028
【０２４６】
実施例4のTable:
【表１９】
2008526244.tif 000029
【０２４７】
実施例5のTable:
【表２０】
2008526244.tif 000030
【０２４８】
実施例6のTable:
【表２１】
2008526244.tif 000031
【０２４９】
実施例8のTable:
【表２２】
2008526244.tif 000032
【０２５０】
実施例9のTable:
【表２３】
2008526244.tif 000033
【０２５１】
実施例10のTable:
【表２４】
2008526244.tif 000034
2008526244.tif 000035
【０２５２】
実施例11のTable:
【表２５】
2008526244.tif 000036
【０２５３】
実施例12のTable:
【表２６】
2008526244.tif 000037
2008526244.tif 000038
【表２７】
2008526244.tif 000039
【表２８】
2008526244.tif 000040
【０２５４】
【実施例１３】
【０２５５】
ビーズに基づく手法とともに使用するのに適した、例えばLuminexに基づく手法に適したHPVプローブ
【表２９】
2008526244.tif 000041
【０２５６】
本発明の一態様では、上記のプローブのいずれか1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21種または22種すべてを、試料中に存在する任意のHPV標的DNAを同時に検出する同一の条件下で、ビーズに基づくマルチプレックス反応において使用することができる。そのようなビーズのセットは、上記で概略を示した最適化反応スキームでの使用に適する。さらなるポリ炭素スペーサーを組み込むことができる。
【実施例１４】
【０２５７】
96穴マイクロタイタープレートアッセイのDNAエンザイムイムノアッセイ(DEIA)におけるHPVのMPFアンプリマーの汎用的検出
序論
この実施例は、MPFプライマーを用いた広域PCR後に得られるHPVアンプリマーの汎用的検出のための、プローブ8種の混合物の使用について記載するものである。
【０２５８】
(この作業内において図1の領域の分析はMPFの分析とみなし、この中で使用したプライマーおよびプローブはMPFのプライマーおよびプローブとみなした。増幅した領域はMPFアンプリマーである。このように、プライマーおよびプローブは、L1遺伝子の異なる領域の分析で使用する、本研究室でやはり開発された「SPF10」のプライマーおよびプローブのセットと区別する。)
材料および方法
HPV MPFアンプリマーの汎用的検出では、図1におけるHPV配列のアラインメントからプローブを選択した。ユニバーサルDEIAプローブの配列は、Table3に列挙されている。
【０２５９】
HPV6、11、13、16、18、26、30、31、32、33、34、35、39、43、44、45、51、52、53、54、55、56、57、58、59、66、67、68、69、70、71および74遺伝子型を含むHPVプラスミド(Dr.E-M.de Villiers、Dr.R.Ostrow、Dr.A.Lorincz、Dr.T.Matsukura、およびDr.G.Orthより快くいずれかの提供を受けた)、またはHPV7、40、42、61、72、73、81〜87、90、91遺伝子型およびHPV16遺伝子型の変異型配列2種に相当するオリゴヌクレオチド配列の増幅によってMPFアンプリマーを得た。
【０２６０】
標的DNA10μl、1×PCR用緩衝液II(Perkin Elmer)、3.0mM MgCl2、0.2mMデオキシヌクレオシド三リン酸、10pmolの各フォワードおよびリバースプライマー(Table1および2)、およびAmpliTaqGold(Perkin Elmer、米国ニュージャージー州Branchburg)1.5Uを含む最終体積50μlでHPV DNA増幅を行った。PCR条件は下記の通りであった:94℃で9分の事前加熱、その後94℃で30秒、52℃で45秒および72℃で45秒を40サイクル、ならびに72℃での最終伸長。
【０２６１】
ビオチン化MPF PCRプライマーにより合成したアンプリマーは、HPV特異的プローブ8種の混合物(Table3の好ましいプローブを参照)とのハイブリダイゼーションによって検出した。PCR産物10μlをハイブリダイゼーション用緩衝液(150mmol/L NaCl、15mmol/Lクエン酸ナトリウム、pH7.0、0.1% Tween20)100μlで希釈し、ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート中でそれを42℃で30分間インキュベートした。ハイブリダイゼーション用緩衝液で3回洗浄することによって、捕捉されなかった物質を除去した。二本鎖の捕捉されたPCR産物を、変性溶液(100mmol/L NaOH)を100μl添加することによって変性し、それを室温で5分間インキュベートし、その後ハイブリダイゼーション用緩衝液で3回洗浄した。ジゴキシゲニン(DIG)標識HPV特異的プローブの混合物(Table3の好ましいプローブを参照)をハイブリダイゼーション用緩衝液で希釈し、それを穴に添加し、42℃で45分間インキュベートした。穴を3回洗浄し、抗DIGアルカリ性ホスファターゼ結合体を添加し、それを42℃で15分間インキュベートした。5回洗浄した後、基質を添加し室温で15分間インキュベートした。0.5mmol/L H2SO4を100μl添加することにより反応を停止した。マイクロタイタープレート読み取り器で、吸光度(OD)を450nmで測定した。OD450が陰性PCR対照より2.5倍高い場合、試料を陽性とみなした(遮断値)。各測定において、陰性対照ならびに陽性対照および境界線陽性対照を試料と一緒に試験した。
【０２６２】
結果
HPV6、7、11、13、16、18、26、30〜35、39、40、42〜45、51〜59、66〜74、81〜87、90、91遺伝子型およびHPV16遺伝子型の変異型配列2種のアンプリマーすべてが、選択したプローブ8種の混合物とよく反応した。
【０２６３】
考察
HPV MPFアンプリマーの汎用的検出用にプローブ8種の混合物を開発した。HPV51、57、71、84、87、13、91、11、59、30、44、55、70、52、69、84、86、74遺伝子型および16遺伝子型の変異体2種のアンプリマーは、最もよく整合しているプローブと1ヌクレオチドのミスマッチを示すが、選択したプローブ8種は様々なHPV遺伝子型の検出に成功した。
【実施例１５】
【０２６４】
HPV MPF遺伝子タイピングアッセイの開発
序論
この実施例は、HPV遺伝子型を同時に検出し同定するためのHPV MPF遺伝子タイピングアッセイについて記載するものである。MPFプライマーの使用によるHPV広域増幅後、逆ハイブリダイゼーション用細片上に適用する遺伝子型特異的プローブとのハイブリダイゼーションにより、合成したアンプリマーを検出し同定することができる。
【０２６５】
材料および方法
プローブの選択:
Table1および2のフォワードおよびリバースプライマー標的配列間に位置する31bpの配列に基づいて、型特異的プローブを選択した。これらのプローブ配列は、Table4および下記のTable18に列挙されている。
【０２６６】
HPVプラスミドおよびHPVオリゴ
選択したプローブを、分析上の感度および特異性について分析した。5'末端にビオチン部分を含むMPFフォワードプライマー10種およびMPFリバースプライマー8種(Table1および2を参照)を使用するPCRによってHPV MPFアンプリマーを得た。実施例1に記載のようにHPV PCRを行った。
【０２６７】
HPV MPF逆ハイブリダイゼーション遺伝子タイピングアッセイの開発:
異なるHPV遺伝子型を同時に検出し同定するために、逆ハイブリダイゼーション遺伝子タイピングアッセイを開発した。単一ハイブリダイゼーションステップでの複数プローブの分析は、類似したハイブリダイゼーション特性を有する型特異的プローブの選択を必要とする。
【０２６８】
この実験では、HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、70、82型についてプローブを選択し、53および66型について確認用プローブ2種を選択した。プローブ名は、確認用に選択したプローブを除いて、HPV型の番号から開始する。それらのプローブは、「c」から開始し、その後にHPV型の番号が続く。61型を除外するためにプローブc53L1nPr3を選択し、89型を除外するためにc66L1nPr5を選択する。
【０２６９】
オリゴヌクレオチドプローブを選択し、5'または3'末端それぞれにポリTテールを付けて注文した。これらのプローブを、ニトロセルロース細片上の平行な線として固定化した。結合および基質反応を調節するために、ビオチン化DNAも細片上に適用した。
【０２７０】
使用することができる細片の考えられる概略図を図7に示す。
【０２７１】
プライマーの5'末端にビオチン部分を含むPCR産物10μlを、NaOH溶液を10μl添加することによって変性した。10分後、逆ハイブリダイゼーション細片をトレイに入れた。(37℃に)予め温めておいたハイブリダイゼーション用緩衝液(3×SSC[1×SSCは15mMクエン酸Naおよび150mM NaClである]、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム)2mlを添加し、54±0.5℃で1時間インキュベートした。インキュベーションおよび洗浄ステップはすべて、Auto-LiPAで自動的に行った。細片は、ハイブリダイゼーション用緩衝液2mlを用いて54℃で、30秒間で2回、30分間で1回洗浄した。このストリンジェント洗浄の後、細片を、アルカリ性ホスファターゼ-ストレプトアビジン結合体2mlとともに、室温で30分間インキュベートした。細片を、すすぎ用溶液(NaCL、Tritonおよび0.5%NaN3を含むリン酸緩衝液)2mlで2回、基質用緩衝液2mlで1回洗浄した。基質(5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸およびニトロブルーテトラゾリウム)2mlを添加し、室温で30分間インキュベートした。基質溶液の吸引、および蒸留水2mlの添加によって反応を停止した。乾燥後、細片の結果を目で解釈した。
【０２７２】
結果:
HPV16、18、26、31、33および35型から得られたアンプリマーを逆ハイブリダイゼーション実験で使用して、Table18から選択したプローブの特異性を判定した。
【表３０】
2008526244.tif 000042
【０２７３】
結果を図8に示す。
【０２７４】
結論
逆ハイブリダイゼーションアッセイは、HPV16、18、26、31、33および35型の少なくとも肯定的な同定を可能にする。したがって、対応するプローブをマルチプレックス反応で同時に使用することもできる。そのアッセイは、すべての他の生殖器HPV型についてのプローブを加えることによって拡張することができる。
【実施例１６】
【０２７５】
高リスクHPV遺伝子型13種検出のための高リスク型MPF HPV DNAエンザイムイムノアッセイ(HR MPF HPV DEIA)
序論
この実施例は、他のHPV遺伝子型のアンプリマーは検出されないままの状態で、広域PCR後に得られた(選択した)高リスクHPV遺伝子型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、および68型)13種のアンプリマーの、マイクロタイタープレート中での特異的な同時検出を行うためのDNAエンザイムイムノアッセイ(DEIA)における、ジゴキシゲニンで標識したHPV型特異的オリゴヌクレオチドプローブ13種の混合物の使用について記載するものである。
【０２７６】
材料および方法
汎用的HPV増幅後、合成したビオチン化プライマーは、DEIAで、高リスク型HPVに特異的なジゴキシゲニン標識オリゴヌクレオチドプローブ(最良の選択をTable19に示す)13種の混合物とのハイブリダイゼーションにより検出することができる。これらのプローブの配列は、図1中のHPV配列のアラインメントから選択し、それをTable19に列挙する。一部のオリゴヌクレオチドプローブはロックド核酸(LNA)を含む。
【表３１】
2008526244.tif 000043
【０２７７】
DEIAの特異性を評価するために、HPV6、11、16、18、26、30、31、33、34、35、39、43、44、45、51、52、53、54、55、56、58、59、66、67、68、69、70、71および74遺伝子型を含むHPVプラスミド(Dr.E-M.de Villiers、Dr.R.Ostrow、Dr.A.Lorincz、Dr.T.Matsukura、およびDr.G.Orthより快くいずれかの提供を受けた)、またはHPV7、40、42、61、72、81、82、83、84、85、87、91遺伝子型およびHPV16遺伝子型の変異型配列2種に相当するオリゴヌクレオチド配列の増幅によってMPFアンプリマーを得た。
【０２７８】
標的DNA10μl、1×PCR用緩衝液II(Perkin Elmer)、3.0mM MgCl2、0.2mMデオキシヌクレオシド三リン酸、10pmolの各フォワードおよびリバースプライマー(Table1および2)、およびAmpliTaqGold(Perkin Elmer、米国ニュージャージー州Branchburg)1.5Uを含む最終体積50μlでHPV DNA増幅を行った。PCR条件は下記の通りであった:94℃で9分の事前加熱、その後94℃で30秒、52℃で45秒および72℃で45秒を40サイクル、ならびに72℃で5分間の最終伸長。
【０２７９】
ビオチン化MPF PCRプライマーにより合成したPCR産物10μlをハイブリダイゼーション用緩衝液(150mmol/L NaCl、15mmol/Lクエン酸ナトリウム、pH7.0、0.1% Tween20)100μlで希釈し、ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート中でそれを45℃で30分間インキュベートした。ハイブリダイゼーション用緩衝液で3回洗浄することによって、捕捉されなかった物質を除去した。二本鎖の捕捉されたPCR産物を、変性溶液(100mmol/L NaOH)を100μl添加することによって変性し、それを室温で5〜15分間インキュベートし、その後ハイブリダイゼーション用緩衝液で3回洗浄した。ジゴキシゲニン(DIG)標識HPV特異的プローブの混合物(Table3の好ましいプローブを参照)をハイブリダイゼーション用緩衝液で希釈し、それを穴に添加し、45℃で45分間インキュベートした。ストリンジェント洗浄溶液(37.5mmol/L NaCl、3.75mmol/Lクエン酸ナトリウム、pH7.0、0.025% Tween20)で穴を3回洗浄し、ストリンジェント洗浄溶液300μlを穴に添加し、45℃で45分間インキュベートした。穴をストリンジェント洗浄溶液で2回、ハイブリダイゼーション用緩衝液で2回洗浄した。その後、抗DIGアルカリ性ホスファターゼ結合体を添加し、それを45℃で15分間インキュベートした。5回洗浄した後、基質を添加し室温で15分間インキュベートした。0.5mmol/L H2SO4を100μl添加することにより反応を停止した。マイクロタイタープレート読み取り器で、吸光度(OD)を450nmで測定した。OD450が陰性対照より2.5倍高い場合、試料を陽性とみなした。各測定において、陰性対照ならびに陽性対照および境界線対照を臨床試料と一緒に試験した。
【０２８０】
結果
HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、および68遺伝子型およびHPV16遺伝子型の変異型配列2種のアンプリマーすべてが、選択したプローブ13種の混合物とよく反応したが、HPV6、7、11、26、30、34、40、42、43、44、53、54、55、61、66、67、69、70、71、72、74、81、82、83、84、85、87、および91遺伝子型のアンプリマーは検出されないままである。
【０２８１】
考察
記載したHR MPF HPV DEIAでHPV高リスク型の16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、および68遺伝子型は同時に検出されたが、他のHPV遺伝子型は検出されないままである。選択した高リスク遺伝子型13種は、本特許に記載の新規開発プライマーセットを使用する汎用的PCR後に検出することができる。その検出アッセイはさらに、他の潜在的な高リスクHPV遺伝子型についてのプローブを用いて拡張することができる。
【実施例１７】
【０２８２】
汎用的MPF HPV DEIAおよびHR MPF HPV DEIAの感度
序論
この実施例は、汎用的MPF HPV DEIAおよびHR MPF HPV DEIAの分析上の感度の判定、ならびにSPF10の検出およびタイピング系との比較について記載するものである。
【０２８３】
材料および方法
汎用的MPF HPV DEIAおよびHR MPF HPV DEIAの分析上の感度を評価するために、HPV18、31、33、35、および45遺伝子型を含むHPVプラスミド(Dr.E-M.de Villiers、Dr.R.Ostrow、Dr.A.Lorincz、Dr.T.Matsukura、およびDr.G.Orthより快くいずれかの提供を受けた)の10倍希釈物の増幅によってMPFアンプリマーを得た。
【０２８４】
SPF10のPCRおよびアンプリマー分析は、Kleter et al 1998および1999[Kleter,B.,L.J.van Doorn,L.Schrauwen,A.Molijn,S.Sastrowijoto,J.ter Schegget,J.Lindeman,B.ter Harmsel,and W.G.V.Quint.1999.Development and clinical evaluation of a highly sensitive PCR-reverse hybridization line probe assay for detection and identification of anogenital human papillomavirus.J.Clin.Microbiol.37:2508-2517;Kleter,B.,L.J.van Doorn,J.ter Schegget,L.Schrauwen,C.van Krimpen,M.P.Burger,B.ter Harmsel,and W.G.V.Quint.1998.A novel short-fragment PCR assay for highly sensitive broad-spectrum detection of anogenital human papillomaviruses.Am.J.Pathol.153:1731-1739]に従って行った。
【０２８５】
結果-下記を参照
陰性対照のOD450の2.5倍の境界線を使用すると、汎用的MPF HPV DEIAおよびHR MPF HPV DEIAの計算された分析上の感度は、それぞれ12〜72ag(ウイルスゲノム約2〜15コピーと同等のものに相当)および48〜722ag(ウイルスゲノム約10〜150コピーと同等のものに相当)と様々であった。検出試験の正式な限界の設定は行われていない。
【表３２】
2008526244.tif 000044
【０２８６】
考察
まとめると、汎用的MPF HPV DEIAおよびHR MPF HPV DEIAは、SPF10 DEIAおよびLiPAと類似した感度を有する。
【図面の簡単な説明】
【０２８７】
【図１】HPV16型の配列のGenbankアクセッション番号K02718.1の配列に関する異なるHPV配列のアラインメントを示す図であり、A、B、CおよびD領域の位置も示す。
【図２】B領域の系統発生樹を示す図である。
【図３】単独PCRプライマーを使用したPCR産物の例を示す図である。
【図４】ゲルマルチプレックスPCRを示す図である。
【図５】ラインプローブアッセイを使用して得ることができる結果を示す図である。
【図６】Luminexの(ビーズに基づく)手法を使用した、DNAの検出およびタイピングの一般的方法を示す図である。
【図７】考えられるHPV「MPF」遺伝子タイピングアッセイを示す図である。
【図８】HPV16、18、26、31、33および35型のHPV「MPF」遺伝子タイピングパターンを示す図である。
【図１】
2008526244.tif 000045
【図２】
2008526244.tif 000046
【図３】
2008526244.tif 000047
【図４】
2008526244.tif 000048
【図５】
2008526244.tif 000049
【図６】
2008526244.tif 000050
【図７】
2008526244.tif 000051
【図８】
2008526244.tif 000052
【国際調査報告】
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2008526244.tif 000054
2008526244.tif 000055
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