(57)【要約】  本出願は、一般に毛細管血液採取と称され、指先またはかかとなどの末端身体部位から最も都合よく採取される血液サンプルの凝固を低減するための方法を示しており、抗凝固薬組成物を末端部位に塗布するステップと、抗凝固薬組成物と接触している皮膚を切開するステップと、分析用の血液を採取する前に部位の皮膚上で血液と抗凝固薬とを混合させるステップとを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の皮膚表面部位を切開することにより得られる血液サンプルの凝固を低減するための方法であって、
（ａ）抗凝固薬を含む液体組成物を前記皮膚表面部位に塗布することと、
（ｂ）前記血液が前記皮膚表面で前記抗凝固薬と接触するように前記部位の皮膚表面を切開することと、
（ｃ）前記血液サンプルを採取することと、
を含む方法。
【請求項２】
前記液体組成物の塗布の前に、前記皮膚部位に抗感染症薬を塗布するステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記皮膚部位が末端部位である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記末端部位が、前記動物の指先、かかと、耳たぶ、またはつま先からなる群から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記抗凝固薬が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＥＤＴＡが、前記液体組成物中で塩の形態である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記塩が、ＥＤＴＡのカリウム塩を含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記塩が、ＥＤＴＡのナトリウム塩を含む請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記塩が、ＥＤＴＡのリチウム塩を含む請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記塩が、ＥＤＴＡの２つ以上の塩の混合物を含む請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗凝固薬が、ＥＤＴＡ、クエン酸ナトリウム、酸性クエン酸ブドウ糖、クエン酸塩リン酸ブドウ糖、低分子量ヘパリン、ヘパリン、エチレングリコール−ビス−（ベータ−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）、または１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＢＡＰＴＡ）からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記液体組成物が、さらにイソプロピルアルコールを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記液体組成物が、さらに水を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記血液サンプルの採取に続いて、前記皮膚部位に抗感染症薬を塗布するステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗感染症薬が、イソプロピルアルコール溶液を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗感染症薬が、さらにカルシウムイオンを含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗感染症薬が、さらに非毒性多価イオンを含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
指先を切開することにより得られる血液サンプルの凝固を低減するための方法であって、
（ａ）抗凝固薬を含む液体組成物を前記指先に塗布するステップと、
（ｂ）前記血液が前記皮膚表面で前記抗凝固薬と接触するように前記指先の皮膚を切開するステップと、
（ｃ）前記血液サンプルを採取するステップと、
を含む方法。
【請求項１９】
前記液体組成物の塗布の前に、前記皮膚部位に抗感染症薬を塗布するステップをさらに含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗凝固薬がＥＤＴＡを含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＥＤＴＡが、前記液体組成物中で塩の形態である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記塩が、ＥＤＴＡのカリウム塩を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記塩が、ＥＤＴＡのナトリウム塩を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記塩が、ＥＤＴＡのリチウム塩を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記塩が、ＥＤＴＡの２つ以上の塩の混合物を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗凝固薬が、ＥＤＴＡ、クエン酸ナトリウム、酸性クエン酸ブドウ糖、クエン酸塩リン酸ブドウ糖、低分子量ヘパリン、ヘパリン、エチレングリコール−ビス−（ベータ−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）、または１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＢＡＰＴＡ）からなる群から選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記液体組成物が、さらにイソプロピルアルコールを含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
前記液体組成物が、さらに水を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
前記血液サンプルの採取に続いて、前記皮膚部位に抗感染症薬を塗布するステップをさらに含む請求項１８に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗感染症薬が、イソプロピルアルコール溶液を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗感染症薬が、さらにカルシウムイオンを含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗感染症薬が、さらに非毒性多価イオンを含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
指先を切開することにより得られる血液サンプルの凝固を低減するための方法であって、
（ａ）エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む液体組成物を前記指先に塗布するステップと、
（ｂ）前記血液が前記皮膚表面で前記ＥＤＴＡと接触するように前記指先の皮膚を切開するステップと、
（ｃ）前記血液サンプルを採取するステップと、
を含む方法。
【請求項３４】
前記液体組成物の塗布の前に、前記皮膚部位に抗感染症薬を塗布するステップをさらに含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記液体組成物が、さらにイソプロピルアルコールを含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記液体組成物が、さらに水を含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記血液サンプルの採取に続いて、前記皮膚部位に液体抗感染症薬を塗布するステップをさらに含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記液体抗感染症薬が、イソプロピルアルコール溶液を含む請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗感染症薬が、さらにカルシウムイオンを含む請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗感染症薬が、さらに非毒性多価イオンを含む請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、末梢または「末端」身体部位における皮膚の切開などの技術的に簡単な手順を用いる血液サンプリングに関する。このようなサンプリング法は、比較的未熟な個人による非臨床環境におけるサンプルの採取に適している。このような方法で血液サンプルを得ることができると、経済的ですぐに利用可能なポイントオブケア臨床検査医療試験が容易になる。本発明は、より侵襲性で危険な方法、およびより大型の分析機器を使用することが不可能であるか、あるいは可能性の低い場合に、私宅、田舎あるいは別の形で隔離された環境において使用することを目的とした最新式の小型血液分析機器と共に使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
医療装置の小型化における進歩は、従来必要とされているよりも著しく少ない血液容積を使用する、より正確な臨床血液分析を可能にした。これらの進歩は、多くの臨床試験を大きな集中型研究室から、個人医院、診療所、そしてさらに患者の家へ移すことを可能にした。この「ポイントオブケア」医療の原理は、診断および監視のための臨床試験の実施の容易性および経済性を最大限にすることによって、患者の独立性および管理を最大限にすることを探求する。さらなるポイントオブケア解決策を提供し、病院、診療所または試験研究室への訪問が過度に困難である患者の利益になるように現存のものを改良することが望ましい。ポイントオブケア解決策は、非臨床環境において医療サービスを提供することの経済性を大幅に改善することができる。本明細書中に記載される本発明は、全血球算定（ＣＢＣ）などの血液分析試験のために患者の皮膚を切開することによって得られる少量の血液サンプルの臨床的有用性を制限する実用上の著しい問題を解決する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本明細書中に記載される本発明は、皮膚を切開することにより得られる血液サンプルの凝固を低減するための方法を提供する。本方法は、血液がサンプリングされる皮膚部位に、最初に抗凝固薬溶液を塗布した後、皮膚の切開および血液採取を行うことを含む。抗凝固薬溶液の塗布の前、サンプルの採取の後、あるいは両方の時点で、抗感染症薬が塗布されてもよい。他の実施形態では、本発明の方法は、指先、かかと、耳たぶ、またはつま先などの末梢または末端身体部位における血液サンプリングに適用される。いくつかの実施形態では、抗凝固薬は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。ＥＤＴＡは、塩の形態、特にカリウム、ナトリウム、またはリチウム塩、もしくはこれらの塩の混合物でもよい。他の実施形態では、抗凝固薬は、クエン酸ナトリウム、酸性クエン酸ブドウ糖（ａｃｉｄ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、クエン酸塩リン酸ブドウ糖（ｃｉｔｒａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、低分子量ヘパリン、ヘパリン、エチレングリコール−ビス−（ベータ−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）または１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＢＡＰＴＡ）である。他の実施形態では、抗凝固薬は、上記のいずれかの抗凝固薬の誘導体またはポリマーである。抗凝固薬の誘導体は、上記のいずれかの抗凝固薬とは化学的に異なるが、上記のいずれかの抗凝固薬に基づいた化学構造を有する抗凝固薬である。抗凝固薬のポリマーは、互いに共有結合した上記のいずれかの抗凝固薬を含む抗凝固薬である。いくつかの実施形態では、抗凝固薬溶液は、さらに、水、イソプロピルアルコールなどの抗感染症薬、またはこれらの混合物を含む。血液採取後の凝血プロセスを容易にするために、さらに他の実施形態において、本発明は、カルシウムイオンまたは他の非毒性多価イオンを含有する溶液を血液採取部位に塗布することを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００４】
本発明は、末端身体部位から得られる血液サンプルの凝固を低減し、それによりサンプルの組成の完全性およびモルホロジーを保存する方法を提供する。血液は水性媒体中に懸濁された様々な生細胞で構成され、心臓、動脈および静脈を循環して、栄養物、ホルモン、ビタミン、抗体、熱および酸素を身体の組織に運ぶ。血液は、血漿と呼ばれる流体中に懸濁された３つの主な成分（赤血球、白血球、および血小板）を含有する。赤血球（ＲＢＣ）は、身体の全ての組織に酸素を運搬するタンパク質であるヘモグロビンを含有する。白血球（ＷＢＣ）は、細菌、菌類およびウィルスなどの異物による侵襲から身体を保護し、免疫応答を媒介する。５つの異なるタイプの白血球：好中球（分葉好中球としての「ｓｅｇ」、多形核白血球（ＰＭＮ）、または顆粒球としても知られる）、リンパ球、単球、好酸球、および好塩基球が存在し、それぞれが、感染に対する保護においてその独自の機能を有する。血小板は、凝血におけるその中心的な役割によって循環系の構造完全性の保持（止血）に最初に関与する小さい不規則な形状の細胞様物質である。血小板は、破損した血管の内面に固着（粘着）および蓄積して、出血（活性化）に対するバリアを形成することによって凝血を容易にする。これらの血液成分のいずれかの数またはモルホロジーの異常は、潜在的に重篤な内科的疾患の存在を示し得る。
【０００５】
多数の臨床検査手順は、患者の血液の採取および分析を必要とする。例えば、全血球算定（ＣＢＣ）は、血液の細胞成分についての詳細な情報を提供する。ＣＢＣは最も一般に指示される臨床血液検査のうちの１つであり、最も一般的な血液成分についての重要な情報を提供する。
【０００６】
ＣＢＣは、貧血（赤血球またはヘモグロビンの減少）、感染、白血病、および多くの他の病気などの疾患を検査するための幅広いスクリーニング検査として使用される。実際には、血液の様々な部分を調べる試験のパネルである。ＣＢＣは、以下の測定値：（１）血液１マイクロリットルあたりの数（千個）として表される白血球（ＷＢＣ）数、（２）全てのＷＢＣの割合として表される、ＷＢＣをそれぞれのタイプ（好中球、リンパ球など）に分類する白血球ディファレンシャル、（３）１マイクロリットルあたりの数（１００万個）で表される赤血球（ＲＢＣ）数、（４）血液１デシリットルあたりのグラム数で表されるヘモグロビン値、（４）ヘマトクリット（ＨＣＴ）または赤血球を含む血液容積の割合、（５）１マイクロリットルあたりの数（千個）で表される血小板数、（６）１フェムトリットル（１０−１５リットル）中で表される平均赤血球容積（ＭＣＶ）−赤血球内部のヘモグロビンの容積量、（７）平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）または赤血球内で運ばれる全てのヘモグロビンの割合、および（８）ＲＢＣサイズの変動を定量化する赤血球分布幅（ＲＤＷ）（ＲＤＷ＝１００×ＲＢＣサイズの標準偏差／平均ＲＢＣサイズ）のうちの全てまたはいくつかを包含する。
【０００７】
成人では、ＣＢＣなどの血液検査は、静脈穿刺によって得られることが最も多い、患者の血液の代表的なサンプルの採取を必要とする。静脈穿刺手順では、血液は、静脈から、通常はひじの内側（肘前）または手の甲から抜き取られる。穿刺部位は防腐薬で清浄にされ、止血帯（通常は、弾性帯）または血液測定用カフが上腕のまわりに巻かれ、圧力を加えて静脈を通る血流を制限し、止血帯の下の静脈を拡張させる（血液で充満させる）。次に、静脈内に針が挿入され、実施される血液分析のタイプに特有の添加剤を通常含有する気密性バイアルまたはシリンジに血液が採取される。針が挿入されている間に、止血帯が取り外され、循環を元に戻す。血液が採取されたら、針は除去され、穿刺部位は出血を止めるために被覆される。乳児および幼児では静脈穿刺は推奨されず、代わりに、指先またはかかとなどの末端身体皮膚部位が防腐薬で清浄にされ、ランセットと総称される鋭い針またはブレードで穿刺される。血液は、ピペット（細い管）内、スライド上、試験片上、あるいは小さい容器内に採取され、これらは全て、続いて実施される分析に応じて抗凝固薬などの添加剤を含有し得る。採取の後、穿刺部位に包帯を巻いて持続性出血を回避する。
【０００８】
静脈穿刺は、過剰な出血、血腫、失神、めまい（ｌｉｇｈｔ−ｈｅａｄｅｄｎｅｓｓ）、および感染のわずかな危険に関連する。肘前の静脈を捜すのが困難である特定の個人では、多数の穿刺を受ける可能性がより高い。全ての状況において、静脈穿刺は、熟練した経験を積んだ医療提供者または技術者によって管理された臨床環境下で実施されることが強く推奨される。末端切開または指穿刺（ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｃｋ）の手順はより簡単で、侵襲性が低く、危険性がより少なく、そして実行するために最小限の技能しか必要としない。従って、静脈穿刺と比較してはるかに経済的に、そして非臨床的な現場環境において実施することができる。しかしながら、従来の指穿刺手順は血液サンプルの凝固を起こし、これはＣＢＣを含む多くの血液測定に悪影響を与え得る。これは、血液凝固によって、急速に形成されるタンパク質（フィブリン）マトリックス中にＲＢＣ、ＷＢＣ、および血小板のような血漿成分が捕捉されるためである。捕捉は血液サンプルの完全性を危うくし、不正確で歪曲された血液分析測定をもたらす。静脈穿刺手順は、抗凝固薬で処理された針を用いて、抗凝固薬を含有するバイアル中に血液を直接採取することによって凝固を最小限にする。さらに、静脈穿刺の間に採取される比較的大量の血液は、血管（ｖｅｓｓａｌ）壁の破裂、ならびに針およびバイアルの内壁表面の接触によって起こる偶発的な凝固の影響を隠す傾向がある。
【０００９】
指またはかかとなどの末端身体部位から血液サンプルを採取すると、通常、サンプリングされる血液は、採取の前に患者の外側皮膚表面と接触することになる。この血液／皮膚の接触は、損傷を受けた血管壁および皮膚から放出される組織因子と一緒に、凝血をもたらす生化学反応カスケードを開始する。このようにして採取された比較的少量（通常、５０マイクロリットル）の血液のかなりの割合は、血小板粘着、フィブリン形成、および血液成分の捕捉を受けるであろう。このような血液サンプルは、これらの体外プロセスによって大きく歪曲されたＣＢＣ結果をもたらすであろう。患者の生体内の血液学的状態を正確に反映しないＣＢＣ結果は、信頼できる診断を策定する医療専門家の能力に悪影響を与えるであろう。
【００１０】
従って、血液−皮膚の接触から生じる付随的な凝固を最小限にしながら末端身体部位サンプリングから利益を得る、迅速かつ簡単な血液のサンプリング方法を提供することが望ましいであろう。このような方法は、様々なポイントオブケア血液検査手順の信頼性を改善し得る。
【００１１】
本発明の方法は、血液が採取される皮膚表面部位における血液の凝固を低減するように設計された抗凝固薬を含有する液体組成物を用いる。
【００１２】
液体組成物を塗布した後、皮膚は通常の方法で切開される。本発明の特定の実施形態では、組成物は、切開の前に乾燥され得る。切開の後、血液は、液体形態または乾燥されて皮膚表面に存在する抗凝固薬と接触する皮膚部位で採取される。本発明は、血液サンプルを採取の前に皮膚と接触させながら、サンプル内の著しい凝固の開始を回避する。これは、血液サンプルが皮膚表面に到達した瞬間から、抗凝固薬が血液サンプル内に存在するためである。通常、傷のある部位および皮膚の組織と血液の接触は生化学的現象のカスケードを開始し、その結果フィブリン形成および凝固が起こる。対照的に、本発明の方法を用いて得られる血液サンプルは、別の方法では皮膚、採取装置（例えば、ピペット、針、容器）、または分析装置（例えば、血球計数器）などの表面との付随的な接触から生じ得る凝固から即座に保護される。これは、抗凝固薬を含有するバイアル、ピペットまたは他の容器（バキュテイナー（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）（登録商標））内に血液を単に採取する場合に別の形で得られるよりも高められた、フィブリン形成および血液成分の捕捉からの保護を提供する。
【００１３】
本明細書中で使用される場合の抗凝固薬という用語は、凝血に伴うステップのうちの１つまたは複数を阻害することができる化合物を指す。抗凝固薬は、血液が凝固または「凝血」するのを妨げる物質である。（ｉ）カルシウムをキレート化（結合）または沈澱させて、凝固プロセスに利用できなくする、あるいは（ｉｉ）フィブリノゲンをフィブリンに転換するために必要とされるトロンビンの形成を阻害するという、凝固を防止するために一般に使用される２つの主要な方法がある。抗凝固薬は、液体組成物中に溶解または懸濁させることができる。抗凝固薬は、人工または天然に存在する化合物であり得る。既知の抗凝固薬の例としては、エチレングリコール−ビス−（ベータ−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＢＡＰＴＡ）ヘパリン、リチウムヘパリン、ナトリウムヘパリン、クエン酸ナトリウム、酸性クエン酸ブドウ糖溶液（ＡＣＤ）および変形、クエン酸塩リン酸ブドウ糖溶液および変形、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）ならびにそのカリウム、ナトリウム、およびリチウム塩を含む変形が挙げられる。臨床環境において使用される２つの抗凝固薬、シュウ酸カリウムおよびシュウ酸アンモニウムは激しい皮膚刺激薬であり、本発明の方法で使用される可能性は低い。
【００１４】
本発明の１つの実施形態では、使用される抗凝固薬は、酸性クエン酸ブドウ糖（ＡＣＤ）である。ＡＣＤは、クエン酸、クエン酸ナトリウムおよびブドウ糖の水溶液である。ＡＣＤは、保存全血の貯蔵のため、そして全血から血小板を選択的に除去する体外手順（「血小板フェレーシス」）のための抗凝固薬として使用される。典型的なＡＣＤ配合物は、１ミリリットルあたり０．００８グラム（ｇ／ｍｌ）のクエン酸、０．０２３ｇ／ｍｌのクエン酸ナトリウム、および０．０２２ｇ／ｍｌのブドウ糖を含有する。本発明のもう１つの実施形態では、抗凝固薬としてクエン酸塩リン酸ブドウ糖溶液（ＣＰＤ）が使用される。典型的なＣＰＤ配合物は、０．００３ｇ／ｍｌのクエン酸、０．０２６ｇ／ｍｌのクエン酸ナトリウム、０．００２ｇ／ｍｌの重リン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、および０．０３２ｇ／ｍｌのブドウ糖を含有する。アデニンは、赤血球の保存料としてＡＣＤおよびＣＰＤ溶液の両方に添加されることが多い（典型的な濃度は０．０３ｇ／１００ｍｌ）。変性ＡＣＤおよびＣＰＤ溶液は全血または赤血球の長期の貯蔵のために使用され、とりわけ、アドソル（Ａｄｓｏｌ）（登録商標）、ニュートリセル（Ｎｕｔｒｉｃｅｌ）（登録商標）、およびオプティソル（Ｏｐｔｉｓｏｌ）（登録商標）として市販されている。
【００１５】
本発明のさらに別の実施形態では、抗凝固薬としてクエン酸ナトリウムおよび水の溶液が使用される。クエン酸ナトリウムを含有する抗凝固薬溶液（ＡＣＤおよびＣＰＤ溶液および変形を含む）は、カルシウムと結合することによって凝固を防止する。これらは有効であるために、全血との正確な混合を必要とする。有効な抗凝固薬効果を達成するためには比較的高いクエン酸ナトリウム濃度が必要なので、ＡＣＤ、ＣＰＤおよびクエン酸ナトリウム溶液は、ＲＢＣに対して等浸透圧でなければならず、そうでなければＲＢＣの収縮が生じ、人工的に低いヘマトクリット値としてＣＢＣ測定に反映されるであろう。０．１０９ｍＭのクエン酸ナトリウム水溶液は、赤血球と等浸透圧である。適切なクエン酸ナトリウム溶液を用いる場合、溶媒が著しく蒸発することができないように注意が払われなければならない。等浸透圧のクエン酸ナトリウム溶液の塗布後、たとえ部分蒸発でも、残存の液体組成物のモル浸透圧濃度が増大され、続いて測定されるヘマトクリット値に対して悪影響を有し得る。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態では、抗凝固薬として低分子量（ＬＭＷ）ヘパリンが使用される。ヘパリンは、分子量が様々な混合多糖類性の硫酸化グリコサミノグリカンであり、Ｄ−グルコサミンとＬ−イズロン酸またはＤ−グルクロン酸との交互誘導体のポリマーで構成される。これは血液中のマスト細胞および好塩基球によって放出され、多くの組織、特に肝臓および肺に存在する。ヘパリンはいくつかの活性剤の混合物であり、そのうちのいくつかは強力な抗凝固薬特性を有し、これは、抗トロンビンＩＩＩに結合してその活性を著しく高めることと、多数の凝固因子、特に活性化因子Ｘ（因子Ｘａ）の阻害とに起因する。低分子量ヘパリンは通常のヘパリンよりも好ましい。というのは、後者は白血球数の歪曲を導く白血球の凝集を引き起こす傾向があるからである。低分子量ヘパリンは、化学的または酵素的な脱重合のいずれかによって標準ヘパリンから誘導される。標準ヘパリンは５，０００〜３０，０００ダルトンの分子量を有するが、ＬＭＷヘパリンは１，０００〜１０，０００ダルトンの範囲であり、従来のヘパリンとは異なる化学的および物理的な特性をもたらす。ＬＭＷヘパリンはタンパク質に対してあまり強力に結合せず、血小板との相互作用が少ない。抗凝固薬活性の分解および中和は、ＬＭＷヘパリンが使用される場合には、標準ヘパリンよりもあまり問題ではない。ＬＭＷヘパリンは、標準ヘパリンのように、抗トロンビンＩＩＩに結合する。しかしながら、ＬＭＷヘパリンは、標準ヘパリンよりも低い程度にトロンビンを阻害する（そして、大きい程度に因子Ｘを阻害する）。ナトリウムおよびカルシウムヘパリンナトリウムは、微臭を有する白色または青白い色の無定形の吸湿性粉末として存在する。両方とも水溶性であり、事実上アルコールに不溶性である。ヘパリンの効力はＵＳＰヘパリン単位に関して表され、標準ＵＳＰ基準との比較によって値が得られる。血液採取の間の抗凝固のために典型的な血液−ヘパリン混合物は、１０〜２０ｍｌのサンプルにつき７０〜１５０ＵＳＰ単位である。
【００１７】
本発明の特に好ましい実施形態では、抗凝固薬のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が使用される。ＥＤＴＡは、カルシウムイオンをキレート化して可溶性の錯体を形成することによって、血液凝固を阻害する金属錯化剤である。遊離カルシウムはフィブリンの形成に必要なので、十分な量のＥＤＴＡの存在下では凝血は生じることができない。ＥＤＴＡは、好ましくは、塩または塩の混合物として溶液中に存在する。ＥＤＴＡの好ましい塩としては、ＥＤＴＡのナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）またはリチウム（Ｌｉ）塩が挙げられるが、これらに限定されない。ＥＤＴＡ二カリウムは、本発明の実施において特に好ましい。ＥＤＴＡ二カリウムおよびＥＤＴＡ三カリウムは、水およびアルコールに容易に溶解する。
【００１８】
本発明の方法に適切なＥＤＴＡ溶液の配合の一例として、血液１ミリリットル（ｍｌ）あたり約１．５ミリグラム（ｍｇ）のＥＤＴＡであるＥＤＴＡ濃度は、凝固の防止において有効であることが注記される。従って、１００マイクロリットル（μｌ）の典型的な指穿刺血液サンプルは、凝固を防止するために約０．１５ミリグラムのＥＤＴＡを必要とし得る。塗布後に皮膚上に存在するＥＤＴＡ溶液の厚さの中央値が０．０１センチメートル（ｃｍ）であり、０．８ｃｍ２の面積を被覆すると仮定すると、塗布される抗凝固薬溶液の総体積は約０．００８ｃｍ３であろう。この体積中に少なくとも約０．１５ｍｇのＥＤＴＡが必要とされるので、切開の前に皮膚に塗布される液体組成物において必要とされるＥＤＴＡの濃度は、約１８．７５ｍｇ／ｃｍ３（０．１５ｍｇ／０．００８ｃｍ３）または１．９重量％（ｗ／ｖ）のＥＤＴＡであろう。あるいは、一般的な７０％イソプロピルアルコール抗感染症溶液中のＥＤＴＡの溶液を使用することができる。７０％イソプロピルアルコールを用いると、皮膚に塗布される液体組成物の３分の１だけが水であり、約０．００２６ｃｍ３であろう。このような溶液を調製するために、ＥＤＴＡの水溶液は、５８ｍｇ／ｃｍ３（０．１５ｍｇＥＤＴＡ／０．００２６ｃｍ３水）または５．６％ｗ／ｖのＥＤＴＡの濃度を有するようにされる。３０ミリリットルのこの水溶液を７０ｍｌの１００％イソプロピルアルコールと混合して、本発明の方法において使用するのに適した１．９％ｗ／ｖのＥＤＴＡ、７０％イソプロピルアルコール溶液を与える。
【００１９】
切開の前に皮膚部位に塗布される液体組成物は、抗凝固薬および抗感染症薬を含有することができる。好ましい実施形態では、０．１〜３０％ｗ／ｖのＥＤＴＡ二カリウム（Ｋ２ＥＤＴＡ）の７０％イソプロピルアルコール溶液が調製される。より好ましい実施形態では、約１〜約１０％ｗ／ｖのＫ２ＥＤＴＡの７０％イソプロピルアルコール溶液が使用される。最も好ましい実施形態では、約１〜約３％のＫ２ＥＤＴＡの７０％イソプロピルアルコール溶液が使用される。
【００２０】
イソプロピルアルコール、水およびＫ２ＥＤＴＡの液体組成物は、温かい皮膚表面に塗布されたときに蒸発して、その結果、皮膚上に残存するＫ２ＥＤＴＡ沈澱物を生じ得る。続いて皮膚が切開されると、蓄積血液がＥＤＴＡ塩と接触して、溶解して溶液に戻り得る。本発明の方法を用いると、ＥＤＴＡは、血液が皮膚表面にたまると即座に血液中に存在する。有効な抗凝固に必要な濃度が非常に低いので、モル浸透圧濃度の考慮は、ＥＤＴＡ塩溶液を用いる場合には通常問題ではない。
【００２１】
毛細管血液採取は、サンプリング場所として末端身体部位を用いる。「末端」という語は、先端（ｅｘｔｒｅｍｉｔｉｅｓ）（例えば、手、足、耳、鼻）を指す。末端血液採取は、末端身体皮膚部位の切開が毛細管血液をサンプリングするので毛細管血液採取と称されることが多い。本発明の好ましい実施形態では、大人では血液採取のために利き手ではない手の親指から数えて３番目および４番目の指が使用され（２番目の指（人差し指）はより厚く硬化した皮膚を有する傾向があり、５番目の指は骨を覆うより柔らかくない組織を有する傾向がある）、そして乳児および幼児ではかかとが使用される。手順を実行するために、患者は座っているか、あるいは横になって、腕を真っ直ぐに伸ばしていなければならない。指の先も指の中央も切開部位として使用されてはならない。血管および神経が位置し、表面に骨がより近い最小限の柔らかい組織を有する指の領域も回避されるべきである。冷たいまたはチアノーゼ（酸素欠乏、青みをおびた色）、膨張した、傷跡のある、または発疹で覆われた指は、使用されるべきではない。理想的な切開部位は、指腹（ｆｉｎｇｅｒ  ｐａｄ）の中央から少し離れたところである。
【００２２】
末端部位サンプリングに使用される滅菌ランセットは、それぞれ０．８１〜０．４６ミリメートル（ｍｍ）の外径（Ｏ．Ｄ．）に相当する２１〜２６ゲージで入手可能である。典型的な貫入深さは、１．２〜２．８ｍｍの範囲である。最適な針サイズは、患者の年齢、意図される血液サンプリング皮膚部位、および患者の皮膚の物理的性質（すなわち、繊細、粗い、硬化）に基づいて判断される。最も市販されているランセットは、偶発的な穿刺、汚染および不注意な再利用から保護する、ある種のハウジング内に含有される。ランセットを用いて、血液滴が指先の隆線を流れ落ちないように、穿刺は指紋の隆線に垂直に行うべきである。血液の蓄積を促すために指のいくらかのマッサージは許されるが、組織液を血液滴内に搾り出すかもしれない過剰な圧力は回避されるべきである。十分な量、通常約５０μｌの血液が蓄積したら、指を逆さにし、ＣＢＣのためにはＫ２ＥＤＴＡを含有する滅菌バイアル内に蓄積血液を落下させることによって、血液は採取される。あるいは、その内側表面に抗凝固薬コーティングを有する滅菌ガラス毛細管を蓄積血液に隣接して配置し、それにより、毛細管作用によって血液を管内に移動させる。次に、容器に蓋をし、回転および反転させて、採取血液を、容器内に含有されるさらなる抗凝固薬または他の添加剤と十分に混合する。
【００２３】
本発明のさらなる実施形態は、上記の抗凝固薬の皮膚表面への塗布を、抗感染症薬の塗布と共に含む。このような薬剤は、防腐薬および消毒薬のうちの一方または両方を含むことができる。防腐薬および消毒薬は、感染の危険を低減するために使用される。防腐薬（ａｎｔｉｓｅｐｔｉｃ）は、生きている組織を清浄にするために使用される薬剤を指すが、消毒薬（ｄｉｓｉｎｆｅｃｔａｎｔ）は、生きている組織以外の表面を清浄にするために使用される薬剤を指す。一般的な消毒薬の例としては、次亜塩素酸ナトリウム（塩素系漂白剤）および過酸化水素が挙げられる。一般的な皮膚細菌による汚染を防止するために、防腐薬を使用して、穿刺の前に患者の皮膚を清浄にする。最も一般的に使用される防腐薬は７０％イソプロピルアルコールであり、細菌の成長を阻害するが殺さないので、イソプロピルアルコールは静菌性である。予めパッケージ化されたアルコール「プレップパッド」は一般に、この目的のために臨床環境において使用される。
【００２４】
血液培養または動脈穿刺などのためにより厳密な感染制御が必要とされる場合には、より強い防腐薬が使用される。ベタジン（ポビドン−ヨウ素溶液）はこれらの場合に一般に使用される。ヨウ素に対してアレルギー性の患者のためには、グルコン酸クロロヘキシジン（ｃｈｌｏｒｏｈｅｘｉｄｉｎｅ  ｇｌｕｃｏｎａｔｅ）または塩化ベンザルコニウム（ゼフィラン（Ｚｅｐｈｉｒａｎ）（登録商標））が利用可能である。これらの防腐薬は皮膚に対する刺激がより強いので、採取後にイソプロピルアルコールで洗い落とされなければならない。
【００２５】
任意で、抗凝固薬液体組成物の塗布の前に抗感染症薬を塗布することができる。抗凝固薬がイソプロピルアルコールなどの一般的な防腐剤の存在下で乏しい安定性を有する場合には、予備的な抗感染症薬の塗布ステップが必要であり得る。本発明の好ましい実施形態では、抗感染症薬は液体形態であり、抗凝固薬組成物の塗布の前に乾燥させられる。これは、皮膚を消毒するのに役立つからである。
【００２６】
特定の実施形態では、本発明の方法は、カルシウムイオン、もしくは鉄、マグネシウム、およびアルミニウムイオンなどの他の非毒性多価イオンを含有する洗浄溶液を塗布する任意的なステップを含むことができる。例えば、カルシウムイオンを含有する７０％イソプロピルアルコール溶液は、最後のステップとして、血液採取部位に塗布することができる。好ましい実施形態では、このステップのために、０．１〜１％ｗ／ｖのＣａＣｌ２の溶液が使用される。カルシウムイオンの存在は、キレート化するか、あるいは別の方法でカルシウムを血液凝固カスケードのために利用できなくするＥＤＴＡなどの抗凝固薬の作用の結果として機能的に損失したカルシウムイオンを置き換えることが目的である。カルシウムイオンの置換は凝固が進行できるようにし、それにより、カルシウムイオンが供給されない場合よりも急速に塊が形成される。イソプロピルアルコール溶液中で良好な溶解度を有するカルシウムイオンの様々な塩が使用され得る。これらには、塩化物、硝酸塩、グルコン酸塩、および酢酸塩が含まれるが、これらに限定されない。これらのイオンは、特定の抗凝固薬（例えば、ＥＤＴＡ）のキレート効果を相殺するためにほんの微量しか必要とされないので、一般に使用されるイソプロピルアルコール溶液中での上記塩の溶解度は十分であろう。これらのイオンを含有する他の溶液は、当該技術分野において既知の方法を用いて調製され得る。
【００２７】
あるいは、カルシウムイオン塩は、血液採取の直後、あるいは抗感染症薬の塗布後に巻かれる包帯内に取り込まれ得る。包帯は局在的な高い多価イオン濃度を提供して、血液採取の前にその部位に塗布された特定の抗凝固薬を有効に相殺し得る。穿刺によって流れる血液は包帯内の多価イオンを溶解し、凝固プロセスを容易にするであろう。さらにもう１つの実施形態では、溶液中に多価イオンを含有する「ワイプ」またはタオレットが使用され得る。サンプリングされた皮膚部位の表面をふき取る際に、多価イオンは凝固を容易にするであろう。また、穿刺部位に圧力を加えることによって、出血が最小限にされる。これは、４分の１に折りたたまれたガーゼパッドを用いて行うことができる。出血が止まると、ガーゼは、紙テープまたは絆創膏（ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｂａｎｄａｇｅ）により穿刺部位に貼られる。
【００２８】
本発明の例示的な実施形態が本明細書において記載されているが、本発明がこれらの精密な実施形態に限定されず、本発明の範囲または精神から逸脱することなく当業者によってそこに様々な他の変化および変更がもたらされ得ることは理解されるべきである。
【実施例】
【００２９】
実施例１：７０％イソプロピルアルコールおよび２％のＫ２ＥＤＴＡを含有する液体組成物を用いて、成人の指から得られる血液サンプルの凝固を最小限にするための方法。
２％のＫ２ＥＤＴＡ液体組成物は、日常的な方法を用いて調製される。患者はいすに座り、利き手ではない手のひじを真っ直ぐに伸ばすことが求められる。切開される皮膚表面部位として中指が選択される。患者は、セッケンおよび温水で手を洗浄するように指示される。触るとまだ冷たく、重力が手への血液供給を増大できるように患者の手を下方の位置に保持しながら、患者の手は温かい湿ったタオル（４０℃／１０５°Ｆ以下）で２分間包まれる。採取を行う技術者は、ゴム手袋を付ける。患者の指は、７０％イソプロピルアルコール溶液に浸漬された綿棒（ｃｏｔｔｏｎ  ｓｗａｂ）を用いてきれいにふき取られる。指は空気乾燥させられる。次に、２％のＫ２ＥＤＴＡ抗凝固薬の液体溶液は、綿棒を用いて中指の腹にこすり付けられる。２１ゲージ（０．８１ｍｍＯ．Ｄ．）ランセットを用いて、指の中央に位置してその長さに沿って走る想像線の少なくとも２．５ｍｍ左または右で指腹を穿刺する。ランセットは、皮膚を約１．８ｍｍの深さに穿刺するために選択および操作される。血液は皮膚表面に蓄積される。十分な量の血液、約５０〜１００μｌが蓄積されたら、指は逆さにされ、血液は、抗凝固薬を含有しない滅菌エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）（登録商標）バイアル内に落下される。バイアルは密封され、さらなる分析のためにラベル付けされる。次に、穿刺部位は、７０％イソプロピルアルコール溶液できれいにふき取られる。乾燥滅菌ガーゼパッドが穿刺部位にしっかりと貼られる。
【００３０】
実施例２：７０％イソプロピルアルコールおよび２％のＫ２ＥＤＴＡを含有する液体組成物を用いて、乳児のかかとから得られる血液サンプルの凝固を最小限にするための方法。
血液サンプリング部位は、乳児の足の底に位置するその長さに沿った想像線の両側の少なくとも１ｃｍを含む領域から選択される。領域はセッケンおよび温水で徹底的に清浄にされ、清浄なタオルで乾燥される。綿棒を用いて、２％のＫ２ＥＤＴＡおよび７０％イソプロピルアルコールの液体組成物をサンプル部位に塗布する。０．２５ゲージ（０．５１ｍｍＯ．Ｄ．）ランセットを用いて、皮膚は、約１．０ｍｍの深さに穿刺される。血液は穿刺部位に蓄積される。血液は、容器に取り付けられた毛細管を用いて採取される。穿刺部位は、１％ｗ／ｖのＣａＣｌ２を含有する７０％イソプロピルアルコール溶液を用いてふき取られる。
【国際調査報告】
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