(57)【要約】  Ｔ−２０ペプチドおよびペプチド中間体の固相合成のための方法、特に優れた純度および収量を有する生成物を生じるために、低負荷因子でＴ−２０ペプチド中間体を合成することを包含する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）式Ｚ−Ｑ−［ＳＵＰ］（式中、［ＳＵＰ］が支持体樹脂であり、Ｑがグルタミン残基であり、ＺがＮＨ２末端保護基であり、Ｚ−Ｑが、０．５以下の負荷因子で［ＳＵＰ］上に存在する。）の固相合成支持体樹脂を提供する工程、
（ｂ）アミノ酸をＺ−Ｑ−［ＳＵＰ］へ結合させ、
【表１】
2008526698.tif 000038
を提供する、工程、
（ｃ）
【表２】
2008526698.tif 000039
を処理し
【表３】
2008526698.tif 000040
開裂生成物を提供する工程、
および
（ｄ）
【表４】
2008526698.tif 000041
の合成のために
【表５】
2008526698.tif 000042
を使用する工程を含む、配列
【表６】
2008526698.tif 000043
を有するペプチドを調製する方法。
【請求項２】
工程（ａ）［ＳＵＰ］が、トリチル基を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
工程（ａ）、［ＳＵＰ］が、クロロ−トリチル基を含む、請求項１または２の方法。
【請求項４】
Ｚが、Ｆｍｏｃ基である、請求項１〜３の方法。
【請求項５】
工程（ａ）において、Ｚ−Ｑが、０．５以下の負荷因子で［ＳＵＰ］上に存在する、請求項１の方法。
【請求項６】
工程（ａ）において、Ｚ−Ｑが、０．２〜０．５の負荷因子で［ＳＵＰ］上に存在する、請求項５の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）、アミノ酸が１〜１．５当量の量でＺ−Ｑ−［ＳＵＰ］へ結合する、請求項１の方法。
【請求項８】
工程（ｄ）において、
【表８】
2008526698.tif 000044
が、配列
【表９】
2008526698.tif 000045
を有するペプチドと反応し、配列
【表７】
2008526698.tif 000046
を有するペプチドを提供する、
請求項１の方法。
【請求項９】
【表１０】
2008526698.tif 000047
が、
【表１１】
2008526698.tif 000048
をフェニルアラニンアミドと反応させることによって形成される、請求項８の方法。
【請求項１０】
（ａ）式Ｚ−Ｗ−［ＳＵＰ］（式中、［ＳＵＰ］が支持体樹脂であり、Ｗがトリプトファン残基であり、ＺがＮＨ２末端保護基であり、Ｚ−Ｗが、０．５以下の負荷因子で［ＳＵＰ］上に存在する。）の固相合成支持体樹脂を提供する工程、
（ｂ）アミノ酸をＺ−Ｗ−［ＳＵＰ］へ結合させ、
【表１２】
2008526698.tif 000049
を提供する工程、
（ｃ）
【表１４】
2008526698.tif 000050
を処理し、
【表１３】
2008526698.tif 000051
開裂生成物を提供する工程
および
（ｄ）
【表１５】
2008526698.tif 000052
の合成のために、
【表１６】
2008526698.tif 000053
を使用する工程を含む、配列
【表１７】
2008526698.tif 000054
を有するペプチドを調製する方法。
【請求項１１】
工程（ｄ）において、
【表１８】
2008526698.tif 000055
がフェニルアラニンアミドと反応し、
【表１９】
2008526698.tif 000056
を形成する、
請求項１０の方法。
【請求項１２】
【表２０】
2008526698.tif 000057
が
【表２１】
2008526698.tif 000058
と反応し、
【表２２】
2008526698.tif 000059
を提供する、
請求項１０または１１の方法。
【請求項１３】
（ａ）ペプチド中間体断片が、０．５以下の負荷因子を利用する固体支持体上で合成された、配列
【表２３】
2008526698.tif 000060
の前記ペプチド中間体断片を提供する工程
（ｂ）溶液相において、
【表２４】
2008526698.tif 000061
をフェニルアラニンアミド残基と反応させ、配列
【表２５】
2008526698.tif 000062
を提供する工程、
および
（ｃ）溶液相において、
【表２６】
2008526698.tif 000063
を
【表２７】
2008526698.tif 000064
と反応させ、
【表２８】
2008526698.tif 000065
を提供する工程
を含む、配列
【表２９】
2008526698.tif 000066
を有するペプチドを調製する方法。
【請求項１４】
前記ペプチド中間体断片が、０．５未満の負荷因子を利用する固体支持体上で合成された、請求項１３の方法。
【請求項１５】
工程（ａ）において、前記ペプチド中間体断片が、０．２〜０．５の負荷因子を利用する固体支持体上で合成された、請求項１３または１４の方法。
【請求項１６】
工程（ｂ）において、前記ペプチド中間体断片が、１〜１．５当量の量で支持体と結合したアミノ酸を利用する固体支持体上で合成された、請求項１３の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、方法において使用され得るＴ−２０中間体ペプチド断片に加えて、固相および液相工程を使用して、Ｔ−２０ペプチドを調製するためのこれらの方法に関するものである。より具体的には、本発明は、固相アプローチを使用して合成される２つの断片を使用する、Ｔ−２０ペプチドの調製に関する。
【０００２】
ペプチド合成についての多くの方法が、文献（例、米国特許第６，０１５，８８１号、 Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29:4005-4008、Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29:4009-4012、Kamber et al. (eds), Peptides, Chemistry and Biology, ESCOM, Leiden (1992) 525-526、Riniker et al. (1993) Tetrahedron Letters 49:9307-9320、Lloyd-Williams et al. (1993) Tetrahedron Letters 49:11065-11133、およびAndersson et al. (2000) Biopolymers 55:227-250参照）に記載される。合成のさまざまな方法は、合成が起こる相、すなわち液相または固相の物理的な状態によって区別される。
【０００３】
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）において、アミノ酸またはペプチド基は、固体支持体樹脂へ結合される。次に、連続的なアミノ酸またはペプチド基が、関心対象のペプチド材料が形成されるまで、支持体により結合されたペプチドへ付着される。次に、支持体により結合されるペプチドが典型的に、支持体から開裂され、さらなる工程および／または精製へ供される。いくつかの場合において、固相合成は、成熟ペプチド生成物を生じ、他の場合において、支持体から開裂したペプチド（すなわち、「ペプチド中間体断片」）が、より大きな成熟ペプチド生成物の調製に使用される。
【０００４】
固相工程から生じたペプチド中間体断片は、液相合成工程（本明細書で「溶液相合成」と呼ばれる。）において互いに結合され得る。溶液相合成は、固相による有用な成熟ペプチドの合成が不可能であるかまたは実用的でないかのいずれかの場合に特に有用であり得る。例えば、固相合成において、より長いペプチドが、不規則な高次構造を結果として採用し得る一方で、固体支持体へなおも付着され、したがって、最終生成物における活性の部分的なまたは完全な損失を生じる。また、ペプチド鎖が支持体樹脂上でより長くなることから、結合および脱保護などの処理工程の効率は妥協され得る。このことは、次に、活性化可能なＲＡＵ／０２．０９．２００５、アミノ酸、共試薬、および溶媒などの出発材料における増大する損失に加えて、上述の問題を補償するために、より長い工程時間を生じ得る。これらの問題は、ペプチドの長さが増大するにつれ増大し得、それゆえ、固相手法のみを使用して合成される長さ３０超のアミノ酸の成熟ペプチドを見出すことは、比較的まれである。
【０００５】
溶液相結合において、２つのペプチド中間体断片、またはペプチド中間体断片および反応性アミノ酸は、適切な溶媒中で、および通常、結合反応の効率および質を促進させるさらなる試薬の存在下で結合される。ペプチド中間体断片は反応性に配置され、それによりある断片のＮ末端は、他の断片のＣ末端へ結合され、または逆も真である。さらに、固相合成中に存在する側鎖保護基は、断片の末端の特異的反応性を確実にするため、溶液相結合中に断片上で普遍的に保持される。これらの側鎖保護基は典型的に、成熟ペプチドが形成されるまで除去されない。
【０００６】
非常に大きなペプチドの合成について、複数の溶液相結合工程が、３または４またはそれより多くのペプチド中間体断片を使用して実施されることはまれである。複数のペプチド中間体断片が使用されるときに、溶液相反応における末端から末端への結合反応の一般的な概念が、一般的に理論上直接的であるが、実際には、これはまれな場合である。不純物およびペプチド収量などのさまざまな因子が、全長のペプチドの質および収量に有意な影響を及ぼし得る。それゆえ、ハイブリッドスキームを使用するペプチド合成は、しばしば挑戦的であり、多くの場合、実際の合成が実施されるまで、問題が合成スキームに固有であることを予測することは困難である。
【０００７】
いくつかの場合、溶液相合成は、固相合成の後でペプチド中間体断片の純度を書くことによって影響され得る。この点において、ペプチド中間体断片を精製工程へ供した後に、断片を溶液相工程において結合することは必要であり得る。精製は、次に、ペプチド中間体断片の、したがって最終ペプチド生成物の収量における低下を生じ得る。
【０００８】
また、成熟ペプチドの収量は、成熟ペプチドを合成するのに必要とされる溶液相工程の数に反比例する。いくつかの場合、ペプチド中間体生成物を利用する３、４、または４を超える溶液相工程が、成熟ペプチドを生じるのに必要とされ得る。どのさらなる溶液相結合工程も、全長のペプチド生成物の回収の低下を生じ得る。それゆえ、全般的な収量を改善するため、結合に関与する工程を最小化することが一般に望ましい。
【０００９】
全般的な合成スキームにおける１つ以上の工程における適度の改善は、成熟ペプチドの調製における有意な改善に等しくあり得る。このような改善は、時間および試薬の大きな全体的な節約に至り得、最終生成物の純度および収量も有意に改善し得る。
【００１０】
ハイブリッド合成における改善の重要性の論議が、これらの手法を使用して生じるペプチドのいずれかの種類へ適用可能である一方、それは、治療上有用であり、商業的な医学的使用のためのスケールで製造されるペプチドの脈絡において特に重要である。小分子医薬品の合成が比較的安価であり得る一方、治療用ペプチドなどのより大きな生体分子医薬品の合成の経費は、比較の上で莫大に高くあり得る。他の因子に加えて、試薬の経費、合成時間のため、これらのより大きな生体分子医薬品の合成工程における非常にわずかな改善は、このような医薬品を製造するのにさらに経済的に実行可能であるかどうかに及ぼす有意な衝撃を有し得る。このような改善は、多くの場合、より大きな生体分子医薬品のこれらのタイプのもしあれば適切な治療上の選択肢があるという事実によって支持されるように、より大きな生体分子医薬品についてのこれらの高い製造経費により、必要である。
【００１１】
このことは、レトロウイルス感染によって生じる免疫不全疾病の治療のために使用される治療用ペプチドの場合において明確に見られる。抗レトロウイルス活性を有するペプチドは、異なる方法で作用し得、ウイルス粒子とホスト免疫細胞との融合を防止することによることを含む。多くの場合、伝統的に使用される抗ウイルス剤が、突然変異によるウイルス耐性のため、これらの疾病の試料に効果的ではなくなるため、これらの新規の効果的な治療用ペプチドについての大きな需要がある。
【００１２】
免疫不全疾病と戦うのに有用な治療用ペプチドのある見込みのあるクラスは、融合阻害剤である。治療ペプチドのこれらのタイプは、ウイルス力価を低下し得、免疫不全疾病を有する患者における生活の質を有意に改善する。例えば、合成された３６個のアミノ酸のペプチドのハイブリッドペプチドＴ−１２４９である（エンフビルチドまたはＴ−２０としても公知の）ＦＵＺＥＯＮ（登録商標）ペプチド、ならびにこれらのペプチドの誘導体および対応物は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療における融合阻害剤として恩典があることを証明している。ＦＵＺＥＯＮ（登録商標）ペプチドおよびその誘導体は、ＨＩＶに感染した人間における首尾一貫した強力な活性を示すＨＩＶの初めての阻害剤である（Kilby et al. (1998) Nat Med 4:1302およびKilby et al. (2002) AIDS Res Hum Retroviruses 18:685）。
【００１３】
Ｔ−２０ペプチドおよびＴ−１２４９ペプチドなどの融合阻害剤は、ウイルスとＣＤ４＋ホスト細胞の膜との融合に関与するＨＩＶ１型（ＨＩＶ−１）の糖タンパク質４１エンベロープの領域へ結合する（Wild et al. (1993) AIDS Res. Hum. Retroviruses 9:1051）。融合阻害剤は、細胞の外側に留まり、ＨＩＶ−１が細胞へ入る前にＨＩＶ−１を遮断する。ＦＵＺＥＯＮ（登録商標）ペプチドおよびその誘導体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＩＶ−１を強力に選択的に阻害することによって、薬物の相互作用、副作用、および細胞毒性を最小化する。
【００１４】
これらの関心に加え、ペプチドの大規模生産についての生成物回収および生成物純度に関する問題は、試薬の取り扱い、保存、および廃棄と同様、ペプチド合成スキームの実行可能性に大きく影響を与え得る。したがって、改善された収量の大きなバッチ量における商業的な関心対象のペプチド材料を効率よく生産できるペプチド合成工程についての絶え間ない需要がある。ペプチドの固相合成後の開裂したペプチドの回収は、改善が必要とされる合成のある局面である。
【００１５】
本発明は、固相および溶液相（「ハイブリッド」）アプローチを使用して合成されるＴ−２０の調製に関する。一般に、このアプローチは、固相化学物質を使用して、２つの異なるＴ−２０ペプチド中間体断片（配列番号２および配列番号３、またはそれらの対応物）を合成することを含む。いくつかの本発明の局面にしたがって、固相合成の後、これらの特異的Ｔ−２０中間体配列は、それ自体を溶液相結合工程に特に十分与えることがわかってきた。さらに、これらの中間体断片の形成に至る固相工程が、これらの中間体断片の収量および純度を有意に改善するために本発明で改変され得ることもわかってきた。この改善された収量および純度は、溶液相結合工程へと持ち越され、それにより合成工程全体を改善する。
【００１６】
本発明の方法および本明細書に記載のペプチド中間体断片は、特に多くの方法でＴ−２０合成工程がより効率的になるため、特に有利である。特に、Ｔ−２０ペプチド中間体生成物配列番号２または配列番号３の形成に至る固相合成工程は、標準的な固相技術において伝統的に使用されるものよりも低い負荷因子で支持体へ第一アミノ酸が結合された支持体樹脂を利用する。好ましくは、このより低い負荷因子を使用して、非典型的に長い固相により合成された断片である配列番号２または配列番号３のＴ−２０ペプチド中間体生成物を使用して、改善された収量および改善された純度で製造されうることがわかってきた。
【００１７】
改善された純度および収量は、溶液相結合工程についての条件を有意に改善し、それによりＴ−２０の全般的な合成についての改善を生じる。
【００１８】
今まで、最も成功したＴ−２０合成アプローチは、溶液相結合を利用してきており、その中で、３つ以上のペプチド中間体断片が固相合成によって調製され、これらの中間体断片はその後、最終Ｔ−２０成熟生成物を調製するため、溶液相結合反応において使用される。３つの（またはそれより多くの）断片アプローチの利点は、中間体の固相合成のより高い質に関して見られ得るが、マイナス面は、３つの（またはそれより多くの）断片アプローチが、２断片アプローチと比較してより多くの単離工程および精製工程を包含し、これらのさらなる工程は一般に、加工時間を増大させ、合成反応の全般的な収量をその後低下させ得ることである。
【００１９】
本発明が、固相合成を介して調製されるたった２つのペプチド中間体断片を利用するため、ある明確な利点は、工程時間が短縮され、加工工程の排除によって、材料および試薬のより効率的な使用ができることである。しかしながら、２断片アプローチによる可能性のある不利は、固相合成によるより長い中間体断片の合成が複雑であり得、しばしば重大な純度および／または回収の問題に至ることである。これにもかかわらず、上述のように、本発明は、配列番号２または配列番号３に基づいた配列を有する中間体ペプチド断片を選択した後、低い樹脂負荷因子を使用する固相合成によってこれらの断片を合成することからなる方法によって、中間体断片が良好な収量および純度でうまく生成できることを示す。このような成果は、固相および溶液相の組み合わせたアプローチを使用してペプチドを合成するための従来のアプローチを考慮して、むしろ注目すべきである。
【００２０】
それゆえ、いくつかの局面において、本発明は、（ａ）０．５以下の負荷因子で結合され、好ましくは０．２〜０．５の負荷因子で結合されるグルタミン（Ｑ）である残基へ第一アミノ酸を結合された固相合成支持体樹脂を提供する工程、（ｂ）次の配列
【００２１】
【表３０】
2008526698.tif 000002
【００２２】
を提供するよう、結合された支持体上の第一アミノ酸へその後のアミノ酸を結合する工程、（ｃ）開裂反応において、支持体から
【００２３】
【表３１】
2008526698.tif 000003
【００２４】
ペプチド中間体を除去する工程、および次に、
【００２５】
【表３２】
2008526698.tif 000004
【００２６】
の全部または一部を有するペプチドの合成のために
【００２７】
【表３３】
2008526698.tif 000005
【００２８】
ペプチド中間体を試用する工程を含む、Ｔ−２０ペプチドの合成についてのペプチド中間体断片を調製するための方法を提供する。
【００２９】
他の局面において、本発明は、（ａ）０．５以下の負荷因子で結合され、好ましくは０．２〜０．５の負荷因子で結合されるトリプトファン（Ｗ）である残基へ第一アミノ酸が結合された固相合成支持体樹脂を提供する工程、（ｂ）次の配列
【００３０】
【表３４】
2008526698.tif 000006
【００３１】
を提供するため、その後のアミノ酸を第一アミノ酸へ、結合された支持体上で結合させる工程、（ｃ）開裂反応において支持体から
【００３２】
【表３５】
2008526698.tif 000007
【００３３】
ペプチド中間体を除去する工程、および次に、
【００３４】
【表３６】
2008526698.tif 000008
【００３５】
の全部または一部を有するペプチドの合成についての
【００３６】
【表３７】
2008526698.tif 000009
【００３７】
ペプチド中間体を使用する工程を含む、Ｔ−２０ペプチドの合成についてのペプチド中間体断片を調製するための方法を提供する。
【００３８】
最も好ましくは、本発明は、（ａ）配列
【００３９】
【表３８】
2008526698.tif 000010
【００４０】
を有する、０．５以下の負荷因子を利用して、好ましくは０．２〜０．５の負荷因子を利用して固体支持体上で合成されたペプチド中間体断片を提供する工程、（ｂ）溶液相において、
【００４１】
【表３９】
2008526698.tif 000011
【００４２】
ペプチドをフェニルアラニンアミド残基と反応させ、配列
【００４３】
【表４０】
2008526698.tif 000012
【００４４】
を提供する工程、および（ｃ）溶液相において、
【００４５】
【表４１】
2008526698.tif 000013
【００４６】
ペプチドを
【００４７】
【表４２】
2008526698.tif 000014
【００４８】
ペプチドと反応させ、
【００４９】
【表４３】
2008526698.tif 000015
【００５０】
ペプチドを提供する工程を含む、Ｔ−２０ペプチドを調製するための方法を提供する。
【００５１】
他の局面において、結合工程において、第一アミノ酸は、０．５未満の負荷因子で支持体上に存在する。他の局面において、結合工程において、第一アミノ酸は、０．２〜０．４５の範囲の負荷因子、または０．２５〜０．４０の範囲の負荷因子で支持体上に存在する。
【００５２】
さらに他の局面において、固相合成は、１〜１．５当量の量で、アミノ酸を新生ペプチド鎖へ結合させることによって実施される。
【００５３】
他の局面において、本発明は、配列
【００５４】
【表４４】
2008526698.tif 000016
【００５５】
を有するポリペプチドを提供する。配列番号３は、０．５以下の負荷因子を使用する固相合成によって合成され得る。
【００５６】
後述の本発明の態様は、次の詳細な記述において開示される精確な形態へ本発明を制限するか、または余すところのないことを意図したものではない。むしろ、態様は、当業者が、本発明の原理および実際を正しく認識し理解し得るよう、選択され記載される。
【００５７】
本明細書で使用される専門用語は、本発明の範囲を制限するよう企図されるものではない。上述の請求項を含む本文を通じて、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別段に脈絡が明確に記載されない限り、複数の参照を含む。したがって、例えば、「アミノ酸残基」に対する参照は、１つ以上のアミノ酸残基に対する参照であり、当業者に公知のその等価物を含む。本発明において、特定の用語が頻繁に使用され、その意味が本明細書に提供される。別段の定義がなければ、本明細書で使用される用語は、当業者に対して普遍的に理解されるのと同一の意味を有する。いくつかの用語は、明細書において後述でもより詳細に説明され得る。
【００５８】
本発明は、（エンフビルチドとしても公知の）Ｔ−２０およびＴ−２０対応物の合成を改善するための、特にＴ−２０ペプチド中間体断片の固相合成に関する合成の局面を改善するための方法に向けられる。本発明の方法論は、固相により合成されたたった２つのペプチド断片を使用して、Ｔ−２０ペプチドおよびその対応物を作るのに有用である。本発明は、一般にＴ−２０合成に向けられるが、本明細書における本発明の教示は、他のペプチド、特に固相および溶液相アプローチの組み合わせを使用して合成されるものの合成へも適用可能であり得る。本発明は、不純物、特にピログルタミン酸塩不純物と関連したペプチド中間体断片の合成へも適用可能である。
【００５９】
本明細書に記載の方法は特に、Ｔ−２０ペプチドのスケールアップした合成の局面を改善するのに適している。スケールアップした手法は典型的に、分布に有用なペプチドのある量を提供するよう実施される。例えば、スケールアップした手法におけるペプチドの量は、バッチあたり５００ｇ、または１ｋｇ、またはそれより多くあり得、より典型的にはバッチあたり数十〜数百ｋｇまたはそれより多くであり得る。大規模合成などのスケールアップした合成手法において、１つ以上の大きな反応容器が使用され得る。これらは、合成工程におけるさまざまな工程についての樹脂、溶媒、アミノ酸、および化学物質などの試薬の量を収容でき、例えば総計、例えば１００〜５００ｋｇ以上の範囲のペプチドの生産が可能である大きさである。
【００６０】
本明細書に記載の方法は、特にスケールアップした手法についてのペプチド合成の局面を改善するのに特に適している。好ましい態様において、本発明の方法は、処理（合成）時間における短縮、生成物の収量における改善、生成物の純度における改善、および必要とされる試薬および出発材料の量の削減などの改善を提供できる。
【００６１】
Ｔ−２０は、ＨＩＶ−１ＬＡＩ単離物からの膜貫通型タンパク質ｇｐ４１のアミノ酸残基６３８〜６７３に相当する、３６個のアミノ酸配列を有するペプチドである。Ｔ−２０（配列番号１）ペプチドの配列は、以下に示される。
【００６２】
【表４５】
2008526698.tif 000017
【００６３】
Ｔ−２０は、ＨＩＶ−１感染の治療のために使用される抗レトロウイルス薬である。Ｔ−２０は、膜融合に必要な高次構造の変化を遮断することによって、ＨＩＶ−１ウイルス粒子とホスト細胞との融合を遮断するよう機能する。活性のこのタイプを有するペプチドは、本明細書でＴ−２０活性を有するといわれる。
【００６４】
Ｔ−２０合成は典型的に、エンフビルチド生成物を生じるために特異的なペプチド断片の群を合成して組み合わせるために、固相および液相の両手法を利用する（Bray, B.L., Nature Rev., 2:587-593 (2003)）。本発明は、エンフビルチドペプチド中間体および全長のエンフビルチド生成物の両者の改善された合成のための方法を提供する。本発明の方法は、エンフビルチド活性を有するペプチド、およびエンフビルチド活性を有するペプチドを調製するために使用されるペプチド中間体の合成も含む。エンフビルチド活性を有するペプチドは、米国特許第５，４６４，９３３号および第５，６５６，４８０号、およびＰＣＴ刊行物第ＷＯ９６／１９４９５号に記載される。
【００６５】
本発明は、全長のＴ−２０対応物およびＴ−２０ペプチド中間体対応物を含むＴ−２０対応物の合成へも適用可能である。本明細書で使用されるように、「Ｔ−２０対応物」は、Ｔ−２０またはＴ−２０中間体断片から派生した化合物を指す。ペプチド対応物は、ペプチドアナログ、ペプチド誘導体、融合化合物、およびそれらの類似物を含むがそれらには限定されない。それゆえ、配列番号２および配列番号３の配列を有するＴ−２０ペプチド中間体断片を指すとき、それらの対応物は、例えば配列番号２および配列番号３のペプチドアナログ、ペプチド誘導体、融合化合物をそれぞれ含む。
【００６６】
本明細書に使用されるように、ペプチドアナログは一般に、別のペプチドまたはペプチド対応物に関連する１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、反転、および／または付加などによって改変されたアミノ酸配列を有するペプチドを指す。置換は好ましくは、保存され得るかまたは非常に保存され得る。保存的な置換は、一般に同一の正味の電荷および一般に同一の大きさおよび形状を有する別のアミノ酸とのアミノ酸の置換を指す。例えば、脂肪族または置換された脂肪族アミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、それらの鎖における炭素およびヘテロ原子の総数が約４以下まで異なるとき、ほぼ同一の大きさを有する。前記アミノ酸は、それらの側鎖における分岐数が、約１または２以下まで異なるとき、ほぼ同一の形状を有する。側鎖にフェニル基または置換されたフェニル基を有するアミノ酸は、ほぼ同一の大きさおよび形状を有すると考えられる。以下に列挙されるのは、アミノ酸の５つの群である。化合物中のアミノ酸を同一群からの別のアミノ酸と置換すると、一般に保存的な置換が生じる。
【００６７】
Ｉ群：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、およびＣ１〜Ｃ４脂肪族側鎖またはＣ１〜Ｃ４ヒドリキシルにより置換された脂肪族側鎖（直鎖または単一分岐した（ｍｏｎｏｂｒａｎｃｈｅｄ））を有する非天然に発生するアミノ酸。
【００６８】
ＩＩ群：グルタミン酸、アスパラギン酸、およびカルボン酸により置換されるＣ１〜Ｃ４脂肪族側鎖（非分岐または一分岐地点）を有する非天然に発生するアミノ酸。
【００６９】
ＩＩＩ群：リジン、オルニチン、アルギニン、およびアミンまたはグアニジノにより置換されるＣ１〜Ｃ４脂肪族側鎖（非分岐または一分岐地点）を有する非天然に発生するアミノ酸。
【００７０】
ＩＶ群：グルタミン、アスパラギン、およびアミドにより置換されるＣ１〜Ｃ４脂肪族側鎖（非分岐または一分岐地点）を有する非天然に発生するアミノ酸。
【００７１】
Ｖ群：フェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシン、およびトリプトファン。
【００７２】
「高度に保存的な置換」とは、側鎖に同一の機能基を有し、ほぼ同一の大きさおよび形状を有する別のアミノ酸とのアミノ酸の置換である。脂肪族または置換された脂肪族アミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、それらの側鎖に炭素およびヘテロ原子の総数が２以下まで異なるとき、ほぼ同一の大きさを有する。前記アミノ酸は、それらが側鎖に分岐の同一数を有するとき、ほぼ同一の形状を有する。非常に保存的な置換の例は、ロイシンについてのバリン、セリンについてのスレオニン、グルタミン酸についてのアスパラギン酸、およびフェニルアラニンについてのフェニルグリシンを含む。
【００７３】
ペプチド誘導体は一般に、その側鎖基、アルファ炭素原子、末端アミノ基、および／または末端カルボン酸基のうちの１つ以上の化学的改変を有するペプチド、ペプチドアナログ、または他のペプチド対応物を指す。例証として、化学的改変は、化学部分を付加すること、新たな結合を作ること、および／または化学部分を除去することを含むが、それらには限定されない。アミノ酸側鎖基での改変は、リジンｅ−アミノ基のアシル化、アルギニン、ヒスチジン、またはリジンのＮ−アルキル化、グルタミン酸基またはアスパラギン酸カルボン酸基のアルキル化、およびグルタミンまたはアスパラギンの脱アミノ化を含むが、それらには限定されない。末端アミノ基の改変は、脱アミノ、Ｎ−低級アルキル、Ｎ−ジ−低級アルキル、およびＮ−アシル（例、−ＣＯ−低級アルキル）改変を含むが、それらには限定されない。末端カルボキシ基の改変は、アミド、低級アルキルアミド、ジアルキルアミド、および低級アルキルエステルの改変を含むが、それらには限定されない。したがって、部分的または全体的に保護されるペプチドは、ペプチド誘導体を構成する。
【００７４】
参照は、ペプチドの次のセットに対してなされ、表１に記載されるＴ−２０およびＴ−２０中間体断片を含む。
【００７５】
【表４６】
2008526698.tif 000018
【００７６】
概観を提供するため、本発明の方法に基づくように、Ｔ−２０ペプチドについての全般的な合成スキームは、次のとおりである。Ｔ−２０（配列番号１）は、Ｔ−２０ペプチド中間体断片
【００７７】
【表４７】
2008526698.tif 000019
【００７８】
の固相合成を含む工程によって調製される。これらのペプチドは、本明細書に記載の方法を使用して合成された後、側鎖が保護された形態において固相樹脂から開裂される。次に、フェニルアラニンアミド残基が、溶液中で
【００７９】
【表４８】
2008526698.tif 000020
【００８０】
ペプチド中間体へ結合され、
【００８１】
【表４９】
2008526698.tif 000021
【００８２】
を生じる。次に、
【００８３】
【表５０】
2008526698.tif 000022
【００８４】
は、溶液中で
【００８５】
【表５１】
2008526698.tif 000023
【００８６】
へ結合され、
【００８７】
【表５２】
2008526698.tif 000024
【００８８】
を生じる。
【００８９】
本発明にしたがって、固相合成技術は、
【００９０】
【表５３】
2008526698.tif 000025
【００９１】
の１６個のアミノ酸配列またはその対応物を有するＴ−２０の第一ペプチド断片（中間体断片１）を調製するのに使用される。固相合成の好ましい方法に関する参照について、ペプチドのＣ末端部分に存在するアミノ末端グルタミン（Q）残基（すなわち、配列番号２の残基数１６）は、固相樹脂へ結合され、したがって固体支持体樹脂に関してアミノ酸の位置に関して断片のアルファアミノ酸を構成する第一アミノ酸残基である。この好ましい方法において、それゆえ固相合成は、アミノ末端からカルボキシル末端へとアミノ酸残基を連続して付加することによって進行し、望ましい配列に相当する方法でアミノ酸を連続的に付加する。ペプチド中間体断片の合成は、Ｎ末端残基（例えば、配列番号２のＮ末端チロシン（Ｙ））が新生ペプチド鎖へ付加された後に完了する。
【００９２】
固相合成技術は、
【００９３】
【表５４】
2008526698.tif 000026
【００９４】
の１９個のアミノ酸配列またはその対応物を有するＴ−２０の第二ペプチド断片（中間体断片２）を調製するのにも使用される。固相合成の好ましい方法に関する参照について、網の末端トリプトファン（Ｗ）残基（すなわち、配列番号３の１９番目の残基、または配列番号１の残基数３５）は、固相樹脂へ結合され、したがって固体支持体樹脂に関してアミノ酸の位置に関して断片のアルファアミノ酸を構成する第一アミノ酸残基である。この好ましい方法において、固相合成は、アミノ末端からカルボキシル末端へとアミノ酸残基を連続して付加することによっても進行し、望ましい配列に相当する方法でアミノ酸を連続的に付加する。ペプチド中間体断片の合成は、Ｎ末端残基（例えば、配列番号３のＮ末端リジングルタミン酸（E））が、新生ペプチド鎖へ付加された後に完了する。
【００９５】
中間体断片１および２の各々が、少なくとも１７個のアミノ酸の残基を含むことも注目される。これらは、固相合成の脈絡におけるむしろ大きなペプチド断片であるが、本発明の原理によって、このような大きな断片および結果として生じるＴ−２０が高い収量および高い純度で合成できる。
【００９６】
本発明にしたがって、固相樹脂上で合成されるペプチドの相対的な量を適切に調節することによって、有利な効果が、ペプチド中間体断片の収量および純度に関して得られ得ることが発見された。合成されるペプチドの相対的な量は、固相樹脂の１ｇあたりのアルファアミノ酸のミリモルとして典型的に表される樹脂のある量へ結合されるアルファアミノ酸の量を指す負荷因子によって調節され得る。例えば、０．２５の負荷因子は、固相樹脂１００ｇへ実際に結合されるアルファアミノ酸の２５ｍｍｏｌに相当するであろう。第一アミノ酸を固相樹脂へ結合する反応は、完全に効率的ではないかも知れず、それゆえ、結合される実際の量は、出発試薬の１００％結合効率および量に基づいた理論上の量よりも小さくあり得る。結合される材料の実際の量は、反応が生じた後で決定され得る。実際の結合を決定するため、ペプチドは、樹脂から開裂され得、例えば標準物質に対するＨＰＬＣ分析を使用することによってアッセイされ得る。結合される第一アミノ酸残基の実際の量を決定するための方法は、本明細書に記載される。
【００９７】
本発明にしたがって、（ペプチド中間体断片の配列番号２および配列番号３の配列などの）相対的に長いペプチド断片の収量および純度、それゆえ結果として生じるＴ−２０ペプチドの収量および純度は、０．５以下などの比較的低い付加因子でより高い傾向にある。しかしながら、負荷因子が例えば０．２未満である場合、生成物処理量は削減され得る。これらの関係を平衡化するため、工程１および２のうちの少なくとも１つ、好ましくは断片１および２の両者に関する負荷因子は、約０．２〜約０．５０であり、好ましくは約０．２〜約０．４５の範囲にあり、より好ましくは約０．２〜約０．４０の範囲にある。例えば、実際のある代表的なモードにおいて、約０．３４の負荷因子を使用することが適切であろう。
【００９８】
この局面を説明するため、次の固相手法が実施され得る。適切な樹脂を得、適切な溶媒中で洗浄することによって調製する。次に、活性化可能な保護された形態にある第一アミノ酸を含有する溶液を、洗浄した樹脂へ添加する。望ましい範囲内で負荷因子を達成するため、アミノ酸の量および／または濃度、および／またはＨＯＢＴなどの共試薬の存在および濃度、結合反応の時間、結合反応の温度、等などの他の反応因子を選択し得る。
【００９９】
Ｆｍｏｃ化学物質を使用する固相合成は、樹脂へ連結される（配列番号２および配列番号３を含むペプチド中間体断片などの）Ｔ−２０中間体断片を調製するよう使用され得る。ペプチド中間体断片は、樹脂上に合成された後、開裂試薬を使用して、保護された形態にある溶液中のペプチド中間体断片を生じるよう開裂される。次に、ペプチド中間体断片が樹脂から分離される。いくつかの場合、ペプチド中間体断片は、溶液相結合を実施する前に、ペプチド中間体断片を精製するための方法として、沈殿剤と接触する。
【０１００】
固相アプローチを使用してペプチドを合成するための方法は、当技術分野において周知である。したがって、本発明は、Ｔ−２０最終生成物の調製において使用され得るペプチド中間体断片を調製するための低い負荷因子を使用するいずれかの固相合成アプローチを使用することを熟慮する。
【０１０１】
例えば、本明細書に記載のＴ−２０ペプチド中間体断片は、標準的なＦＭＯＣプロトコールを使用するＳＳＰＳ技術によって合成され得る。例えば、Carpin et al. (1970), J. Am. Chem. Soc. 92(19):5748-5749; Carpin et al. (1972), J. Org. Chem. 37(22) :3404-3409, 「Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis」, Weng C. Chan and Peter D. White Eds. (2000) Oxford University Press Oxford Engを参照してほしい。
【０１０２】
固相ペプチド合成の実際に適した支持体のいずれかのタイプが使用され得る。好ましい態様において、支持体は、１つ以上のポリマー、共ポリマー、またはポリアミド、ポリスルフアミド、置換されたポリエチレン、ポリエチレングリコール、フェノール樹脂、多糖類、またはポリスチレンなどのポリマーの組み合わせから作られ得る樹脂を含む。ポリマー支持体は、ペプチド合成において使用される溶媒に対して十分に不溶性であり不活性であるいずれかの固体でもあり得る。固体支持体は典型的に、成長するペプチドが合成の間に結合され、支持体からペプチドを放出するのに望ましい条件下で開裂され得る連結部分を含む。適切な固体支持体は、光開裂可能な、ＴＦＡ開裂可能な、ＨＦ開裂可能な、フッ素イオン開裂可能な、還元的に開裂可能な、Ｐｄ（Ｏ）開裂可能な、求核性開裂可能な、またはラジカル性開裂可能なリンカーを有し得る。好ましい連結部分は、開裂したペプチドがなおも実質的に包括的に保護されるような条件下で開裂できる。
【０１０３】
合成のある好ましい方法において、ペプチド中間体断片は、トリチル基を含む酸感受性固体支持体上で、より好ましくは、張り出した塩素基を有するトリチル基を含む樹脂、例えば塩化２−クロロトリチル（２−ＣＴＣ）樹脂上で合成される（Barlos et al. (1989) Tetrahedron Letters 30(30):3943-3946）。例は、塩化トリチル樹脂、塩化４−メチルトリチル樹脂、塩化４−メトキシトリチル樹脂、４−アミノブタン−１−オール２−クロロトリチル樹脂、４−アミノメチルベンゾイル２−クロロトリチル樹脂、３−アミノプロパン−１−オール２-クロロトリチル樹脂、ブロモ酢酸２−クロロトリチル樹脂、シアノ酢酸２−クロロトリチル樹脂、４−シアノ安息香酸２−クロロトリチル樹脂、グリシノール２−クロロトリチル樹脂、プロピオン酸２−クロロトリチル樹脂、エチレングリコール２−クロロトリチル樹脂、Ｎ−Ｆｍｏｃヒドロキシルアミン２−クロロトリチル樹脂、ヒドラジン２−クロロトリチル樹脂も含む。いくつかの好ましい固体支持体は、反応基が固着される支持体材料を形成するためにジビニルベンゼンと共重合され得るポリスチレンを含む。
【０１０４】
ペプチド材料は典型的に、ビーズ表面およびビーズ内部内の両者で樹脂ビーズへ結合される。ＦＭＯＣおよび側鎖により保護されるペプチドは、ＤＣＭまたは酢酸中の希釈したＴＦＡなどの弱酸性試薬を使用してこの樹脂から保護された状態において簡単に開裂される。
【０１０５】
固相合成において使用される他の樹脂は、スチレンおよびジビニルベンゼンと、４−ヒドロキシメチルフェニルオキシメチル固着基（Wang, S.S. 1973, J. Am. Chem. Soc）および４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸樹脂（Richter et al. (1994), Tetrahedron Letters 35(27):4705-4706）との共重合体を含む「Ｗａｎｇ」樹脂を含む。Ｗａｎｇ、塩化２−クロロトリチル、および４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸樹脂は、例えばCalbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, Californiaから購入され得る。
【０１０６】
第一の結合されたアミノ酸を有する支持体を提供するため、樹脂は、例えば洗浄によって調製され得、次に、活性化された保護されたアミノ酸を含有する溶液とともにインキュベーションされ得る。樹脂へ結合される第一アミノ酸およびその後のアミノ酸は典型的に、Ｎ末端保護基、（特定のアミノ酸に依存する）側鎖保護基、および樹脂から張り出した基と反応性のある基または張り出したアミノ酸と反応性のある基を含む。
【０１０７】
好ましい局面において、第一アミノ酸は、カルボキシ末端で支持体へ結合されるのに対し、Ｎ末端基および側鎖基は、保護基によって適切に保護される。典型的な記載として、
【０１０８】
【表５５】
2008526698.tif 000027
【０１０９】
ペプチド中間体断片の固相合成は、保護されたグルタミン残基を塩化２−クロロトリチル（２−ＣＴＣ）樹脂へまず負荷することによって、カルボキシ末端からＮＨ２−末端の方向へ進められる。
【０１１０】
保護基の性質および使用は、当技術分野において周知である。一般に、適切な保護基は、結合される原子または部分、例えば酸素または窒素が、処理および合成中に望ましくない反応で関与することを防止するのを助け得る基のいずれかの種類である。保護基は、側鎖保護基およびアミノ−またはＮ−末端保護基を含む。保護基は、カルボン酸、チオール、およびそれらの類似物の反応または結合も防止し得る。
【０１１１】
側鎖保護基とは、ペプチド合成、処理、等の工程において使用される化学物質との反応から側鎖の一部を保護するのを助けるアミノ酸の側鎖（すなわち、一般的なアミノ酸式Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｒ）（Ｈ）−ＣＯＯＨ）へ結合される化学的な部分を指す。側鎖保護基の選択は、さまざまな因子、例えば実施される合成のタイプ、ペプチドが供されるであろう処理、および望ましい中間体生成物または最終生成物に依存し得る。側鎖保護基の性質は、アミノ酸自体の性質にも依存する。一般に、固相合成中に−アミノ酸基の脱保護中に除去されない側鎖保護基が選択される。それゆえ、−アミノ保護基および側鎖保護基は、典型的には同一ではない。
【０１１２】
いくつかの場合において、固相合成および他のペプチド処理において使用される試薬のタイプに依存して、アミノ酸は、側鎖保護基の存在を必要としないかもしれない。このようなアミノ酸は典型的に、側鎖に活性酸素種、窒素、または他の反応性部分を含まない。
【０１１３】
側鎖保護基の例は、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ｔｅｒｔ−ブチル、トリフェニルメチル（トリチル）、テトラヒドロピラニル、ベンジルエーテル（Ｂｚｌ）および２，６−ジクロロベンジル（ＤＣＢ）、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、ニトロ、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、アダマンチルオキシカルボニル、キサンチル（Ｘａｎ）、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、メチル、エチルおよびｔ−ブチルエステル、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｚ）、Ｔｏｓ、ｔ−アミルオキシカルボニル（Ａｏｃ）、および芳香族または脂肪族ウレタン型保護基、ニトロベリトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）などの感光性基、およびトリメチルシリルオキシカルボニル（ＴＥＯＣ）などのフッ化物不安定基を含む。
【０１１４】
好ましい側鎖保護基は、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、およびＡｓｐ（Ｄ）アミノ酸残基についてのｔ−Ｂｕ基、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、およびＡｓｎ（Ｎ）アミノ酸残基についてのｔｒｔ基、およびＬｙｓ（Ｋ）およびＴｒｐ（Ｗ）アミノ酸残基についてのＢｏｃ基を含む。
【０１１５】
例えば、表１に列挙されるペプチド断片のアミノ酸残基の側鎖のいずれかの１つ以上は、ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、トリチル（ｔｒｔ）、およびｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）などの標準的な保護基で保護され得る。ｔ−Ｂｕ基は、アミノ酸残基Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、およびＡｓｐ（Ｄ）についての好ましい側鎖保護基であり、ｔｒｔ基は、アミノ酸残基Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、およびＡｓｎ（Ｎ）についての好ましい側鎖保護基であり、Ｂｏｃ基は、アミノ酸残基Ｌｙｓ（Ｋ）およびＴｒｐ（Ｗ）についての好ましい側鎖保護基である。
【０１１６】
ヒスチジンを含むＴ−２０ペプチド中間体断片の合成の間、ヒスチジン残基の側鎖は、好ましくはトリチル（ｔｒｔ）保護基で望ましく保護される。保護されない場合、合成の間に、樹脂からペプチド断片を開裂させるかおよび／またはＦＭＯＣまたは他のＮ末端保護基を開裂させるのに使用される酸は、保護されていないヒスチジン残基と不利に反応し得、ペプチド断片の分解を生じ得る。非常に可能なことに、ヒスチジンが保護されない場合、別のアミノ酸のさらなる結合は生じ得ない。開裂時間の延長も、ヒスチジンからのｔｒｔなどの保護基を除去し得、典型的な質の仕様を満たすためのバッチを生じ得る。
【０１１７】
好ましくは、本発明の各ペプチド断片のアスパラギン残基は、すべて保護される。さらに、トリプトファン残基がＢｏｃ基で保護されることが好ましい。
【０１１８】
アミノ末端保護基は、アミノ酸のアルファアミノ基へ結合された化学部分を含む。典型的に、アミノ末端保護基は、付加されるべき次のアミノ酸の成長しているペプチド鎖への付加の前の脱保護反応において除去されるが、ペプチドが支持体から開裂されるとき、維持され得る。アミノ末端保護基の選択は、さまざまな因子、例えば実施される合成のタイプおよび望ましい中間生成物または最終生成物に依存し得る。
【０１１９】
アミノ末端保護基の例は、（１）ホルミル、アクリリル（Ａｃｒ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、およびアセチル（Ａｃ）などのアシル型保護基、（２）Ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニルなど、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）および置換されたＺなどの芳香族ウレタン型保護基、（３）ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、アリルオキシカルボニルなどの脂肪族ウレタン保護基、（４）９−フルオレニル−メチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、およびシクロヘキシルオキシカルボニルなどのシクロアルキルウレタン型保護基、および（５）フェニルチオカルボニルなどのチオウレタン型保護基を含む。好ましい保護基は、９−フルオレニル−メチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、２−（４−ビフェニリル）−プロピル（２）オキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、２−フェニルプロピル（２）−オキシカルボニル（Ｐｏｃ）、およびｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）を含む。
【０１２０】
本発明にしたがって、保護基は典型的に、固相合成を通じて、および溶液相結合反応へおよび溶液相結合反応を通じて、ペプチド中間体断片上に保持される。（一般に、溶液相結合工程が完了した後、脱保護工程は、ペプチドから１つ以上の保護基を除去するために実施される。）
【０１２１】
配列番号２および配列番号３を有するペプチド中間体断片の合成のための樹脂へ結合され得る特異的な保護基を有する第一アミノ酸の特異的な例はそれぞれ、ＦｍｏｃＧｌｕ（ＯｔＢｕ）ＯＨおよびＦｍｏｃＴｒｐ（Ｂｏｃ）ＯＨであり得る。
【０１２２】
固相合成のための樹脂を調製するため、樹脂は、溶媒中で前洗浄され得る。例えば、２−ＣＴＣ樹脂などの固相樹脂は、ペプチドチャンバーへ添加され、適切な溶媒で前洗浄される。洗浄は、樹脂へ結合される第一アミノ酸と接触させるための樹脂を調製するために実施されうる。本質において、前洗浄は、第一アミノ酸の樹脂への効率的結合を促進するために実施され得る。前洗浄溶媒は、結合反応において使用される溶媒（または溶媒の混合物）のタイプに基づいて選択され得、その逆もまた真である。
【０１２３】
洗浄、およびその後の結合反応にも適した溶媒は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ジクロロエタン（ＤＣＥ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、塩化メチレン、およびその類似物を、これらの試薬の混合物と同様に含む。他の有用な溶媒は、ＤＭＳＯ、ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドン、およびそれらの混合物を含む。いくつかの場合、結合は、ＤＭＦおよびＤＣＭの混合物などの、２成分溶媒システムにおいて実施され得る。
【０１２４】
本明細書に記載されるように、約０．２〜約０．５０、好ましくは約０．２〜約０．４５、より好ましくは約０．２〜約０．４０の範囲にある樹脂上で第一アルファアミノ酸の負荷因子を調節することが望ましい。それゆえ、溶液は、標的範囲において結合因子を提供するであろうアミノ酸のある量を有する溶液が調製される。このことは、結合効率が特定の反応のためのものであることを一般に公知で決定され得る。例えば、約０．３４の標的負荷因子を有することが望まれるとき、結合効率が約８０％であることが公知である場合、樹脂の１ｇについてアミノ酸０．４２５ｍｍｏｌを含有する結合溶液が使用されるべきである（０．３４／０．８）。
【０１２５】
結合反応は、結合反応を亢進させるかまたは改善する１つ以上の化合物の存在において実施され得る。反応の速度を増大し得、側鎖反応を低下させ得る化合物は、三級塩基、例えばジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）およびトリエチルアミン（ＴＥＡ）の存在下で、保護されたアミノ酸を活性化された種へ変換し得るホスホニウム塩およびウロニウム塩を含む（例えば、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰＯ、ＨＢＴＵ、およびＴＢＴＵはすべて、ＨＯＢｔエステルを生じる。）。他の試薬は、保護する試薬を提供することによってラセミ化を防止するのを助ける。これらの試薬は、付加された補助求核試薬（例えば、１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、またはＨＯＳｕ）とともにカルボジイミド（例えば、ＤＣＣまたはＷＳＣＤＩ）を含む。利用され得る別の試薬は、ＴＢＴＵである。アジ化物と関連した低ラセミ化によるアジ化物方法と同様に、付加された補助求核試薬とともにまたはそれなしでクロロギ酸イソブチルを使用する、混合した無水物の方法も利用される。化合物のこれらのタイプは、カルボジイミドにより仲介される結合の速度も増大させ得、同様に、ＡｓｎおよびＧｌｎ残基の脱水も防止し得る。
【０１２６】
結合の完了は、本明細書に記載の定量的ニンヒドリン検査でモニターされ得る。結合が完了したと決定した後、結合反応混合物を溶媒で洗浄し、ペプチド材料のその後のアミノ酸残基の各々について、結合周期を反復する。最終的な結合周期の後、樹脂をＮＭＰなどの溶媒で洗浄した後、ＤＣＭなどの不活性第二溶媒で洗浄する。
【０１２７】
次のアミノ酸を結合するため、Ｎ末端保護基（例えば、Ｆｍｏｃ基）の除去が、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの溶媒中で（重量ベースの）２０〜５０％ピペリジンを含む試薬による処理によって典型的に達成される。Ｆｍｏｃ保護基の除去後、何回もの洗浄が典型的に実施され、残存するピペリジンおよび（ジベンゾフルベンおよびそのピペリジン付加物などの）Ｆｍｏｃ副産物を除去する。
【０１２８】
第一アミノ酸が、望ましい付加因子で樹脂へ結合され、Ｎ末端保護基が除去された後、その後のアミノ酸は、ペプチド中間体断片を調製するために付加され得る。その後のアミノ酸は、付加因子に関連してアミノ酸の化学量論的過剰で利用され得る。しかしながら、本明細書に記載の特異的なＴ−２０中間体断片の固相合成が、これらの断片の固相合成において使用されるアミノ酸（および相当の試薬）の大過剰量を必要としないことがわかってきた。一般に、結合工程において使用されるアミノ酸の量は、樹脂上で第一アミノ酸の負荷因子と少なくとも等価である（１当量以上）。好ましくは、結合工程において使用されるアミノ酸の量は、１．３当量（０．３過剰）以上、最も好ましくは約１．５当量（０．５過剰）である。いくつかの場合、例えば、結合工程は、１〜１．５（１より大きく１．５より小さい）範囲でアミノ酸の等価の量を利用する。
【０１２９】
アミノ酸のこの過剰（例、約１．５）が完了に至るための結合反応に十分であることがわかってきた。この過剰は、脱保護試薬から反応許容過剰塩基を助けもし得る。
【０１３０】
結合、洗浄、Ｎ末端脱保護基の脱保護、および洗浄の工程は、望ましいＴ−２０中間体生成物が形成されるまで反復され得る。
【０１３１】
固相合成の後、Ｔ−２０中間体ペプチドを樹脂から除去するため、開裂したＴ−２０中間体ペプチドがなおも、十分な側鎖および末端保護基を有するような方法で、開裂処理を実施する。しかるべき位置に保護基を放置することは、開裂中または開裂後のペプチド断片の望ましくない結合または他の望ましくない反応を防止するのを助ける。ＦＭＯＣまたは同様の化学物質がペプチドを合成するのに使用される場合、保護された開裂は、樹脂も膨潤し得、開裂および分離工程に有用であり得るＤＣＭなどの溶媒中の酢酸または希ＴＦＡなどの比較的弱酸性の試薬を使用することなどによるいずれかの望ましい様式で達成され得る。ＤＣＭ中の０．５〜１０重量％、好ましくは１〜３重量％のＴＦＡの使用が好ましい。例えば、米国特許第６，２８１，３３５号を参照してほしい。
【０１３２】
固相樹脂からのペプチド中間体断片の開裂の工程は、次のような典型的な工程のラインに沿って進行し得る。しかしながら、樹脂からペプチド中間体断片を効率よく開裂させるいずれかの適切な工程が使用され得る。例えば、酸性開裂試薬を含有する溶媒の約５〜２０容積、好ましくは約１０容積が、容器へ添加される。樹脂ビーズは、結果として試薬中に浸漬される。開裂反応は、液体含有量が、適切な温度で適切な時間撹拌されるよう生じる。撹拌は、ビーズが凝集するのを防止するのを助ける。適切な時間および温度の条件は、使用される酸試薬、ペプチドの性質、樹脂の性質、およびそれらの類似項目などの因子に依存するであろう。一般的なガイドラインとして、約−１５〜約５℃、好ましくは約−１０〜約０℃で５分間〜２時間、好ましくは約２５〜約４５分間撹拌することが適切であろう。開裂時間は、約１０分間〜約２時間の範囲であり得る。大規模生成について、好ましい時間は、約１５〜５０分間の範囲にある。開裂は、反応時に典型的に生じ得る反応熱を収容するような冷却した温度範囲において望ましく実施される。さらに、開裂反応のより低い温度は、ｔｒｔ基などの酸感受性側鎖保護基をこの段階での除去から保護する。
【０１３３】
開裂処理の終了時に、反応物を急冷する。このことは、例えばピリジンまたは類似物などの適切な塩基を容器へ添加し、さらに５分間〜２時間などのさらなる時間撹拌し続けることによって達成され得る。塩基を添加し、撹拌し続けると、容器の内容物の温度が上昇する。撹拌の終了時に、容器の内容物は、約０〜約１５℃、好ましくは約５〜約１０℃の範囲の温度であり得る。
【０１３４】
ペプチド開封の局面を改善するために、樹脂を膨潤および収縮させるなどの因子は、場合により、全般的な合成工程へと組み込められ得る。
【０１３５】
例えば、開裂後、支持体は、場合により、結果として生じる洗浄物へと開裂ペプチドを抽出するための膨潤試薬で１回以上洗浄され得、洗浄物は、それらの洗浄からペプチドを回収できるよう回収される。例えば、ＤＣＭ中の希ＴＦＡを使用して２−ＣＴＣ樹脂からペプチドを開裂させることは、膨潤処理のすべてまたは一部をさらに構成するであろう。開裂後および膨潤処理が完了した後、支持体は、ペプチドのさらなる量が収縮洗浄から回収でき、同様に、１回以上のその後の任意の膨潤洗浄からさらなるペプチドを回収する能力を増強できる、１回以上の任意の収縮洗浄へ供され得る。さらなる膨潤処理からなるその後の任意の膨潤洗浄は、収縮処理が完了した後に実施され得る。
【０１３６】
ＤＣＭなどの膨潤溶媒が、開裂試薬中の構成要素として使用され得るため、開裂処理は、開裂したペプチドの有意な量が液体へと抽出されるであろう第一膨潤処理も構成し得る。ＤＣＭ中のＴＦＡで膨潤されるとき、ビーズの体積は、開裂処理の開始時に最大である傾向にあろう。ビーズは、なおも膨潤されるであろうが、その体積は、ペプチドが液体へと抽出されるため低下する。
【０１３７】
急冷後、容器の内容物は、洗浄物へと抽出されたペプチドを回収するため、中身を出され回収される。圧力は、フィルターを通じて容器の外へ出た液体によって運搬されるペプチド材料を含有する液体混合物に力を加えるために使用され得る。容器中に残存するビーズは、残余ＤＣＭをなおも含有するであろうし、ある程度までなおも膨潤されるであろう。残余ペプチドの有意な量は、ビーズ中にも保持される傾向があり、その後の収縮処理および膨潤処理は、残余ペプチドの有意な部分を回収するのを助ける。
【０１３８】
オプションとして、蒸留等を介する濃縮の前に、回収された開裂試薬を水で洗浄することが望ましくあり得、通常、幾分かの濃縮が達成された後は除く。開裂後の水洗浄は、ペプチドの質を亢進し、それゆえある程度まで収量を亢進させるのに有用であると信じられている。例えば、開裂試薬中のＴＦＡまたは他の成分との接触時間の延長は、ペプチドのＨｉｓ６での脱トリチル化および／またはエステル化などによってペプチドの質を低下させ得る。水洗浄は、残余ＴＦＡおよびその副産物を除去する上で役に立つと信じられている。水洗浄／抽出処理の後、液体混合物は、蒸留装置へと転移され得、そこで混合物は、例えばＤＣＭまたはその類似物を除去することによってさらに濃縮される。
【０１３９】
開裂している混合物がペプチド回収のために容器から出され回収された後、容器の内容物は、さらなるペプチドが抽出され得た後に回収され得る１回以上のさらなる膨潤洗浄へと供され得る。これらのさらなる膨潤洗浄も、容器を洗浄し、残余開裂試薬および副産物を除去するのを助ける。このような成分は、収縮処理による進行の前に望ましくは除去され、それにより収縮液体はそれらとは反応しないであろう。例えば、エタノールがＴＦＡと反応し得る限り、エタノールを含有する収縮液体を添加する前に、容器からＴＦＡを除去することが望ましい。典型的な膨潤洗浄処理は、約２分間〜約２時間、好ましくは約１０〜約５０分間撹拌しながら生じ得る。洗浄が実施された後、洗浄物は容器から除去された後、他の膨潤洗浄とともに蒸留容器へ添加され得る。場合により、蒸留ポットへ添加される前に、これらのさらなる膨潤洗浄は、もしあれば、不純物を除去するための水抽出処理へ供され得る。
【０１４０】
いくつかの局面において、ペプチド中間体断片は、それらの純度を亢進させる工程を実行することによって、例えば結晶化によって溶液相結合のために調製され得る。Ｔ−２０ペプチド中間体断片の１つ以上は、ペプチド中間体断片を結晶化するために、ＩＰＡおよびＤＣＭ、またはＩＰＡおよび水の混合物など、ＩＰＡを含有する溶液で処理され得る。
【０１４１】
固相合成、樹脂からの開裂、ペプチド中間体のいずれかの洗浄または精製の後、配列
【０１４２】
【表５６】
2008526698.tif 000028
【０１４３】
を有するペプチド中間体断片は、配列
【０１４４】
【表５７】
2008526698.tif 000029
【０１４５】
を有するペプチド中間体断片を生じるために、フェニルアラニンアミド（Ｆ−ＮＨ２）残基と反応する。この溶液相反応は、本明細書に記載されるように、適切な溶液相反応溶液中で実施され得る。このペプチド中間体生成物は、非溶媒、例えば水中で沈殿され得、純度を改善するために洗浄される。
【０１４６】
Ｔ−２０側鎖により保護されるペプチド中間体断片
【０１４７】
【表５８】
2008526698.tif 000030
【０１４８】
は、配列
【０１４９】
【表５９】
2008526698.tif 000031
【０１５０】
を有する全長のＴ−２０ペプチドを形成するため、溶液中で互いに結合される。これらの中間体断片は、
【０１５１】
【表６０】
2008526698.tif 000032
【０１５２】
ペプチド中間体断片のＮ末端は、
【０１５３】
【表６１】
2008526698.tif 000033
【０１５４】
ペプチド断片のＣ末端へ結合されるよう、化学的に配置する。
【０１５５】
好ましくは、ペプチドは、ＨＰＬＣ特性に基づいた８０％以上、またはより好ましくは８２．５％、最も好ましくは８５％以上の純度レベルで結合反応へ供給される。本発明の方法にしたがって、低い負荷因子を利用する固相合成は、より高い純度レベルを有するＴ−２０中間体ペプチド断片を調製するための有意な局面である。
【０１５６】
ペプチド結合反応は、例えば、 New Trends in Peptide Coupling Reagents; Albericio, Fernando; Chinchilla, Rafeal; Dodsworth, David J.; and Najera, Armen; Organic Preparations and Procedures International (2003), 33(3), 203- 25 303において概説される。
【０１５７】
ペプチド中間体断片の結合は、ｉｎ  ｓｉｔｕ結合試薬、例えばＢＯＰ、ヘキサフルオロリン酸ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）、ＨＡＴＵ、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣＤＩ）、またはテトラフルオロホウ酸ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム（ＴＢＴＵ）を使用して実施され得る。他の結合技術は、ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）およびｐ−ニトロフェノール（ＨＯＮｐ）エステルなどのあらかじめ形成された活性エステル、あらかじめ形成された対称性無水物、Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）、またはフッ化アシルおよび塩化アシルなどのハロゲン化酸を使用する。
【０１５８】
適切な結合溶媒は、結合反応において使用され得る。使用される結合溶媒が、形成されるペプチド結合のラセミ化の程度、ペプチドおよび／またはペプチド断片の可溶性、および結合反応速度に影響を及ぼし得ることは理解される。
【０１５９】
いくつかの態様において、結合反応は、水混和性溶媒を含む。水混和性溶媒の例は、例えば、ＤＭＳＯ、ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、またはそれらの混合物を含む。
【０１６０】
他の態様において、結合反応は、非水混和性溶媒を含む。典型的な非水混和性溶媒は、塩化メチレンである。これらの態様において、非水混和性溶媒は好ましくは、脱保護反応と互換性があり、例えば、非水混和性溶媒が好ましく使用される場合、脱保護反応に負の影響を及ぼさない。
【０１６１】
ペプチド中間体断片が、Ｔ−２０ペプチドを生じるために結合された後、生成物は、側鎖保護基を除去するための脱保護工程へ供され得る。
【０１６２】
包括的な脱保護による側鎖保護基の除去は典型的に、側鎖保護基を開裂させる酸性溶解（ａｃｉｄｏｌｙｔｉｃ）剤を含む脱保護溶液を利用する。包括的な脱保護のために普遍的に使用される酸性溶解試薬は、正味のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ＨＣｌ、ＢＦ３Ｅｔ２ＯまたはＭｅ３ＳｉＢｒなどのルイス酸、液体フッ化水素酸、臭化水素（ＨＢｒ）、トリフルオロメタン硫酸、およびそれらの組み合わせを含む。脱保護溶液は、１つ以上の適切な陽イオンスカベンジャー、例えば、ジチオスレイトール、アニソール、ｐ−クレソール、エタンジチオール、または硫化ジメチルも含む。脱保護溶液は水も含み得る。本明細書で使用されるように、脱保護組成物中に存在する試薬の量は、典型的には比で表され、個々の成分の量は、「部分重量」または「部分容積」などの「部分」における分子として表され、分母は、組成物中の総部分である。例えば、９０：５：５（重量／重量／重量）の比でＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：ＤＴＴを含有する脱保護溶液は、重量による９０／１００部分のＴＦＡ、重量による５／１００部分のＨ２Ｏ、重量による５／１００部分のＤＴＴを有する。
【０１６３】
いくつかの態様において、脱保護組成物中の酸性溶解剤、好ましくはＴＦＡの量が重量による９０／１００部分よりも大きいように、脱保護反応が実施され得る。他の好ましい脱保護組成物は、重量による９３／１００部分以上の量で、または重量による９３／１００〜９５／１００部分の範囲の量で酸性溶解剤の量を含む。
【０１６４】
Ｔ−２０ペプチドが脱保護され、最終的な形態になった後、場合により、全般的な合成スキームにおけるこの工程に存在し得る凝集したペプチドを脱凝集させる手法へ、ペプチドのバッチが供され得る。
【０１６５】
脱凝集は、水溶性塩基中にペプチド試料を溶解した後、水溶性混合物を酸性化して塩および共溶媒のうちの少なくとも１つの存在下でペプチドを沈殿させることによって、脱凝集が実施され得る。好ましくは、塩および共溶媒の両者が、脱凝集溶液中に存在する。脱凝集は、比較的低温で（後で、最終的な望ましいｐＨの酸性化、例えば３〜６がよりゆっくりと生じ得る、少なくとも、アルカリ媒体のｐＨが６〜７．５の範囲のｐＨへ低下する酸性化の第一工程において）ペプチドを比較的迅速に沈殿させることによって実施され得る。
【０１６６】
脱凝集について、水性緩衝性アルカリ溶液は、水、少なくとも１つの塩、および望ましい溶解ｐＨを提供するための少なくとも１つの塩基の十分量を含む成分から一般に派生する。Ｔ−２０ペプチドおよび水性緩衝性アルカリ溶液を構成するさまざまな成分は、いずれかの順序で組み合わせられ得る。実際のあるモードにおいて、溶液は、その構成体成分から調製された後、すでに調製された溶液へペプチドが添加される。実際の別のモードにおいて、ペプチドは、塩を含み、溶解には低すぎて生じ得ないｐＨを有する水性溶液へ添加され得る。次に、溶解が生じるであろう値までｐＨを上昇させるために、塩基がこの混合物へ添加される。なおさらに別の選択肢として、塩は、溶解の前、間、および／または後に溶液へ添加され得る。だが一般に、さらに後述にあるように、ペプチドを沈殿させる方法でｐＨを低下させる前に、塩は溶液中へと組み込まれる。
【０１６７】
溶液中のペプチドの濃度は、幅広い範囲にわたって変動し得る。一般的なガイドラインとして、溶液中のＴ−２０ペプチド濃度は、約３〜約６ｇ／Ｌの範囲にあり得る。
【０１６８】
望ましいｐＨを提供するため、多様な１つ以上の塩基が溶液中へと組み込まれ得る。適切な塩基の代表的な例は、ＮａＯＨなどの水酸化物塩基、および重炭酸ナトリウムまたは重炭酸カリウムあるいは炭酸ナトリウムまたは炭酸カリウムなどの重炭酸塩基および炭酸塩基を含む。水酸化ナトリウム、特に０．５〜１Ｎ  ＮａＯＨが好ましい。ペプチドが時間の妥当な量で溶液中に溶解するであろう望ましい値へｐＨを調整するために、塩基が使用される。多くのペプチドについて、このことは、約８〜約１１の範囲の溶解ｐＨに相当する。
【０１６９】
溶液の塩構成体は、結果として生じる沈殿したペプチドの溶解特徴を改善する。特に、より低いｐＨで水溶液中に迅速に溶解する可溶性ペプチドは、塩が適切な濃度で存在するとき、より一貫して調製される。
【０１７０】
多様な塩は、本発明の実施において有用であろう。例は、炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸アンモニウム、これらのナトリウムおよびカリウム版、これらの組み合わせ、およびそれらの類似物を含む。酢酸アンモニウムが最も好ましい。
【０１７１】
溶液中の塩の濃度は、幅広い範囲にわたって変動し得る。塩の１〜２００ｍＭ当量を使用することは、適切であろう塩濃度の範囲の一例である。実施の特異的なモードにおいて、塩、特に酢酸アンモニウムの約５〜約５ｍＭ、より好ましくは約１０ｍＭ当量を使用することは、適切であることがわかってきた。
【０１７２】
溶解温度は一般に、ペプチドが溶解する水溶液の温度を指す。溶解は、いずれかの適切な温度で生じ得る。一般に、約１０〜約３０℃、好ましくは約１０〜約２５℃、より好ましくは約１５〜約２０℃の範囲の１つ以上の温度で維持される溶液中でペプチドを溶解することが好ましいであろう。
【０１７３】
共溶媒は、ペプチドのその後の沈殿が共溶媒の存在下で生じるよう、溶液へと好ましく組み込まれる。共溶媒は、溶解の前、間、およびまたは後で溶液へ添加され得るが、好ましくは、ペプチドの溶解後に即座に添加される。共溶媒は、ペプチドが溶解ｐＨで可溶性である１つ以上のさらなる溶媒を指す。好ましくは、ペプチドの理論的な分子量に対するペプチドの測定された分子量の比が、約２：１〜約１：１の範囲にあるとき、ペプチドは、２５℃および生理学的ｐＨで可溶性である。共溶媒の例は、アセトニトリル、メタノール、これらの組み合わせ、およびそれらの類似物を含む。
【０１７４】
本発明の好ましい態様において、溶液が、共溶媒の約２〜５０容積％、好ましくは約５〜約３０容積％、およびより好ましくは約１０〜約２０容積％を含有するよう、共溶媒の十分量が添加される。
【０１７５】
溶解後および望ましくは共溶媒の添加後、望まれる場合、ペプチドのさらなる脱凝集を促進するため、さらなる塩基を添加することによって、溶液のｐＨは場合によりさらに上昇する。次に、溶液は、望ましくは即座にろ過される。０．２ミクロンフィルターを通じての圧力ろ過が適しているであろう。ろ液は、真空下で場合により脱気された後、溶液は適切な時間寝かされ得た後、脱気工程を完了するためにさらに処理される。一般に、ペプチドが、上昇したｐＨにある（寝かし時間だけではなく、ろ過時間、脱気時間、等も含む）総時間が、約５分間〜約６時間、より好ましくは約３０分間〜約２時間の範囲にあるよう寝かされる。寝かした後、溶液は、場合により再度ろ過され得る。
【０１７６】
エージング後、ペプチドが沈殿するのに効果的な条件下で、溶液のｐＨは低下し、例えば酸性化される。一般的なガイドラインとして、約３〜約６、好ましくは４〜約６の範囲の最終ｐＨが適切であり得る。
【０１７７】
溶液のｐＨは好ましくは、１つ以上の酸を溶液へ添加することによって低下する。酸の例は、ＨＣｌ、硫酸、酢酸、シュウ酸、これらの組み合わせ、およびそれらの類似物を含む。酢酸が好ましい。例えば、水溶性の５％または１０％の酢酸溶液が適していることがわかってきた。
【０１７８】
実施のいくつかのモードにおいて、優れた溶解特性を有するペプチド生成物は、ｐＨを中間的なｐＨへのみ低下させるために比較的迅速に酸が添加される場合、さらに得られ得る。この初期の比較的迅速な酸の添加の後、最終的な望ましいｐＨへと溶液のｐＨを低下させるために、酸は、第二の比較的ゆっくりとした速度で添加される。適切な中間的ｐＨ値は、約６〜約８の範囲、より好ましくは約６．０〜約７．５の範囲であろう。望ましくは、ｐＨをまず迅速に低下させることは、約１時間未満、好ましくは３０分以下、より好ましくは１５分以下の時間で生じる。
【０１７９】
例えば、実施のある適切なモードは、１１のｐＨでまずＴ−２０溶液のｐＨを低下させることを包含する。ｐＨを約６．０の中間的な値へ低下させるために、酸の十分量が、１０分間にわたって比較的迅速に添加される。次に、ｐＨを５．３〜５．５に低下させるため、酸が、１０〜２０分かけてよりゆっくり添加される。
【０１８０】
混合物は望ましくは、ペプチドの沈殿を生じさせるために酸を添加する経過の間に十分混合される。一般的なガイドラインとして、混合物をあわ立たせるのを回避するのに十分な安全上の余裕を残しながら、酸を添加する間、混合物を実施上できるだけ激しく撹拌することが好ましい。
【０１８１】
ペプチドの沈殿を生じさせる酸の添加は、いずれかの適切な温度で溶液を使用して実施され得る。ガイドラインとして、１０〜３０℃、好ましくは１５〜２５℃、もっとも好ましくは１６〜１８℃の範囲の温度で沈殿を実施することが適切であろう。
【０１８２】
沈殿後、ペプチドは、望ましく単離され乾燥した後、他の成分と組み合わされ、凍結乾燥され、包装され、保存され、さらに処理され、および／またはさもなくば取り扱われる。このことは、いずれかの適切な様式で達成され得る。ある適切なアプローチにしたがって、ペプチドは、ろ過を介して回収され、適切なレベルまで最終的な塩含有量を低下させるためにアンプル水洗浄で洗浄した後、乾燥する。
【０１８３】
ペプチドが、ろ過についての不適切な形態で沈殿する場合（例えば、沈殿物が「ゲル様」である場合）、ペプチド粒子が、粒子を「硬化させる」ために凝集する望ましい撹拌をともなう寝かし工程へ、沈殿が供され得る。
【０１８４】
実施の好ましいモードにおいて、このエージング硬化処理は、冷却／加熱／冷却処理の経過において撹拌しながらペプチドをエージングすることを包含する。このことは、ペプチドの三次構造の過度の損傷をせずに、ペプチドのろ過特徴を改善する。実施の特異的なモードにおいて、処理は、好ましくは、０℃超〜約２０℃、好ましくは１０〜２０℃、より好ましくは約１６℃の範囲にある、大気温を下回る第一温度で、５分〜４８時間、好ましくは３０分〜８時間、より好ましくは３０分〜２時間、水性混合物中で粒子を寝かすことを包含した。撹拌は望ましくは、粒子が寝かしの間に十分分散することを確実にするのに使用される。
【０１８５】
次に、混合物の温度は、適度により温かい温度に至る約２〜約３０℃だけ、好ましくは約５〜約１５℃まで上昇し、より温かい温度への移行は、約１分〜約４８時間、好ましくは５分〜８時間、より好ましくは２０分〜２時間の間にわたって、撹拌しながら生じる。好ましくは、新たな適度により温かい温度は、なおも大気温以下である。実施の特異的なモードにおいて、温度を１６℃から２１℃まで約１時間で上昇させることは、適切であることがわかった。撹拌は望ましくは、この以降の間に続行する。混合物は次に、５分〜８時間、好ましくは２０分〜４時間、より好ましくは約３時間、撹拌しながらより温かい温度でエージングされる。
【０１８６】
このエージング工程後、混合物の温度は、適度により冷たい温度に至る約２〜約３０℃、好ましくは約５〜約１５℃だけ低下し、より冷たい温度への移行は好ましくは、約１分〜約４８時間、好ましくは５分〜８時間、より好ましくは２０分〜４時間にわたって撹拌しながら生じる。好ましくは、新たな適度により冷たい温度は、約３℃超〜約１８℃の範囲で、より好ましくは約１０℃である。実施の特異的なモードにおいて、温度を２１℃から１０℃まで約２時間で低下させることは、適切であることがわかった。次に、混合物は、好ましくは約５分〜４８時間の間、より好ましくは約６時間、より冷たい温度でさらにエージングされる。
【０１８７】
このエージング処理は、ろ液からペプチド粒子をろ過および分離することが、ペプチドの二次構造を過度に変化させることなくより迅速に生じる上で、沈殿した粒子のろ過特徴を改善する。
【０１８８】
したがって、このエージングの後、沈殿はろ過され、好ましくは、１ｐｓｉｇのＮ２などで圧力ろ過される。フィルターケーキは、望ましくは約３〜約２０℃、好ましくは５〜約１５℃の範囲で、より好ましくは約１０℃の温度などへあらかじめ冷却された水で１回以上洗浄され得る。このことは、ケーキの塩含有量を低下させるのを助ける。フィルターケーキは次に、適切な温度で１分〜４８時間、好ましくは５分〜８時間、より好ましくは約６時間の適切な時間、窒素によりケーキに窒素を通過させるなどによって、部分的にまたは完全に乾燥し得る。ほぼ大気温にある窒素を使用することは、簡便かつ適切である。ケーキは、乾燥を容易にするために周期的に混合され得る。乾燥は場合により、個別の乾燥装置の中で完了され得る。このような任意の乾燥は好ましくは、真空下で、例えば３０ｍｍＨｇ未満で、ペプチドを分解しないような適度な温度、例えば約３０℃未満の温度、好ましくは約２８℃未満の温度で生じる。
【０１８９】
本発明の原理は、いまや次の実例となる実施例に関してさらに説明されるであろう。
【０１９０】
実施例
次の実施例について、次の標準的な試薬および学術用語を採用する。
【０１９１】
クロラニル検査
トルエン中のクロラニルの飽和溶液の滴下をアセトン約１ｍＬへ添加することによって、クロラニル検査溶液を調製した。洗浄の滴下をクロラニル検査溶液へ添加することによって、ＮＭＰ洗浄を検査した。青色または紫色は、二級アミンの存在についての正の表示であり、Ｆｍｏｃにより脱保護された副産物および／または残余ピペリジンがなおも存在することを示す。
【０１９２】
ニンヒドリン（カイザー（Ｋｅｉｓｅｒ））検査
定量的なニンヒドリン検査において、樹脂２〜２０ｍｇ試料を引き抜き、ＮＭＰで洗浄した後、ＤＣＭまたはメタノールで洗浄した。エタノール中のフェノールの７６％溶液３滴、ピリジン中の０．２ｍＭ  ＫＣＮ溶液６滴、およびエタノール中のニンヒドリン０．２８Ｍ溶液の３滴を試料へ添加し、試料を約１００℃で約５分間加熱ブロック中に置いた。試料を取り出し、エタノール／水溶液（９：１）で即時希釈した。青色または紫色は、遊離アミンの存在の正の表示であり、結合反応がまだ完了していないことを示す。正のニンヒドリン検査反応を結合反応の１時間後に観察した場合、結合反応はさらに１時間続行した。正のニンヒドリン検査反応が結合反応の３時間後に生じた場合、容器を排水し、活性化されたアミノ酸および試薬の約１当量を使用して、結合を反復した。
【０１９３】
実施例１．Ｔ−２０中間体断片Ａｃ−ＡＡ（１−１６）ＯＨ（配列番号２）の固相合成
【０１９４】
【表６２】
2008526698.tif 000034
を生じるための固相合成を実施した。
【０１９５】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（ＯｔＢｕ）−Ｏ−２−ＣＴＣ樹脂（２０．０ｇ）をＤＣＭ２４０ｍＬとともに固相合成反応器へ負荷した。混合物を２５℃で３０分間撹拌した。チャンバーを排水し、樹脂ベッドをＮＭＰ１２０ｍＬで３回洗浄した。（すべての洗浄について、使用される液体量は、１回の洗浄あたりの液体量である。）
【０１９６】
反応器へ負荷したのは、ＮＭＰ中の５％ピペリジン１２０ｍＬであり、次に、３０±２℃で３０分間撹拌した。反応器を排水した後、ＮＭＰ中の５％ピペリジン１００ｍＬを負荷した。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水した。次に、混合物を１２０ｍＬのＮＭＰで３回洗浄した。次に、最後の洗浄物を定量的ニンヒドリン検査によってピペリジンレベルについてサンプリングし、ピペリジンレベルが３５００ｒｐｍ以上である場合、４回目の洗浄を実施した。
【０１９７】
結合の順序は、残基＃１５から残基＃１へと進行した。
【表６３】
2008526698.tif 000035
【０１９８】
適切なアミノ酸１．５当量、ＨＯＢｔ水和物１．５当量、およびＮＭＰ９０ｍＬを添加することによって結合を実施した。固体を溶解するまで内容物を撹拌した後、ＤＩＥＡ１．７当量を添加した。溶液が均一になった後、溶液を氷槽中で０〜５℃へ１５分かけて冷却した。次に、ＮＭＰ５４ｍＬ中の１．５当量のＨＢＴＵの溶液を、冷却したアミノ酸溶液へ添加した後、ＤＣＭ４８ｍＬを添加した。次に、活性化したアミノ酸溶液を、樹脂を含有する反応器へ添加した。混合物を３０±３℃で３時間撹拌した。次に、カイザー（Ｋｅｉｓｅｒ）検査によって反応の完了について、樹脂ビーズをサンプリングした。反応が完了した後、反応器を排水し、樹脂ベッドを１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄した。
【０１９９】
脱保護工程、および適切なアミノ酸を使用する結合工程を連続して実施し、Ａｃ−ＡＡ（１−１６）Ｏ−２−ＣＴＣ樹脂を生じた。
【０２００】
次に、１２０ｍＬのＮＭＰ中の無水酢酸の５当量の溶液を調製した。ＤＩＥＡの５当量を溶液へ添加した。無水酢酸溶液を反応器へ添加した後、混合物を３０±３℃で１〜３時間撹拌した。次に、カイザー検査によって反応の完了について、樹脂ビーズをサンプリングした。
【０２０１】
実施例２．固相樹脂からのＡｃ−ＡＡ（１−１６）ＯＨ（配列番号２）の開裂および精製
実施例２において調製されるように、ＣＴＣ樹脂からの新生Ａｃ−ＡＡ（１−１６）ＯＨペプチドの開裂を実施した。
【０２０２】
樹脂からペプチドを開裂させるため、（実施例１において調製されるような）ペプチドにより結合された樹脂をＮＭＰ１００ｍＬで洗浄した後、２００ｍＬのＤＣＭで５回洗浄した。最後のＮＭＰ洗浄について、反応器を−５℃に冷却した。
【０２０３】
次に、４ｍＬのトリフルオロ酢酸および１９６ｍＬのＤＣＭの溶液を調製し、−１０℃へ冷却し、反応器へ添加し、０±５℃で３０分間撹拌した。次に、ピリジンの１．２当量（４．８ｍＬ）を添加し、樹脂を５℃へ加温し、開裂溶液を１００ｍＬの水へろ過しながら添加した。樹脂をＤＣＭ１００ｍＬで洗浄し、それをＤＣＭ／水と組み合わせた。ＤＣＭ／水を１５分間撹拌し、層を分離し、ＤＣＭを１００ｍＬの水で洗浄した。２回目の水洗浄物をＤＣＭ層から分離した後、留出物約２００ｍＬを回収するまで、ＤＣＭを減圧下で除去した。次に、１００ｍＬの水をＤＣＭへ添加した。
【０２０４】
樹脂をＤＣＭで２回洗浄し、洗浄物をＤＣＭ／水混合物と組み合わせた。混合物を３０分間撹拌して、層を分離した。次に、水層を１００ｍＬのＤＣＭで逆抽出した（ｂａｃｋ−ｅｘｔｒａｃｔｅｄ）。ＤＣＭ洗浄物をすべて組み合わせた。
【０２０５】
溶液の約８０ｍＬが残るまで、ＤＣＭ／断片液を減圧下で除去した。ＤＣＭ溶液をヘプタン３７５ｍＬへ４つの部分において添加した。ＤＣＭ／断片溶液の各添加後、留出物の約４０ｍＬを回収するまで、混合物を除去した。ＤＭＣ溶液のすべてを転移させた後、容器をすすぐのに使用されるＤＣＭ２０ｇとともに、さらなるヘプタン８０ｍＬを添加し戻した。ヘプタン／ＤＣＭスラリーをろ過し、２４ｍＬのヘプタンで洗浄した。洗浄が完了した後、断片を真空下で乾燥した。
【０２０６】
実施例３．ＦｍｏｃＴｒｐ（Ｂｏｃ）により負荷された２−ＣＴＣ樹脂の調製
５Ｌのペプチド反応器を窒素でパージした後、２−ＣＴＣ樹脂２００ｇおよびＤＣＭ２Ｌで負荷した。樹脂−ＤＣＭ混合物を２５±２℃で３０分間撹拌した。その間、５１．８ｇのＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）ＯＨ、１．４ＬのＤＭＦ、２００ｍＬのＤＣＭ、および２６．６６ｇのＤＩＥＡを２Ｌフラスコへ負荷した。固体を溶解するために、フラスコの内容物を大気温で撹拌した。
【０２０７】
ＤＣＭを反応器から排水した後、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）ＯＨを含有する混合物を反応器へ樹脂とともに負荷し、窒素下で２５±２℃で２時間撹拌した。２時間後、反応器を排水した。
【０２０８】
樹脂上の活性部位をＤＩＥＡ：ＭｅＯＨ（２００：１８００ｍＬ）の混合物で末端キャッピングした。次に、この混合物を２５±２℃で１時間撹拌した。ベッドを排水し、２ＬのＤＭＦで１回、１ＬのＤＭＦで１回、および２ＬのＤＣＭで４回洗浄した。最後の２ＬのＤＣＭ洗浄物は、負の紫外線検査値を示した。
【０２０９】
次に、樹脂をＮ−メチル−ピロリドン（ＮＭＰ）で３回洗浄した後、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン２．７５Ｌで処理し、２８±２℃で３０分間撹拌した。次に、反応器を排水し、ピペリジン処理工程を反復した。ベッドを排水し、３ＬのＮＭＰで５回の後、３ＬのＤＭＦで５回洗浄した。３×１．５ＬのＩＰＡで洗浄することによって、樹脂を脱膨潤させた。樹脂を４０±２℃で一定の重量まで真空乾燥させると、負荷した樹脂の２２０．０６ｇを付与した。
【０２１０】
樹脂からアミノ酸を開裂し、標準物質に対してアッセイすることによって、定量的ＨＰＬＣ分析を実施した。材料のＨＰＬＣアッセイは、０．３７ｍｍｏｌ／ｇでの樹脂の負荷を示した。
【０２１１】
カラム：Ｂｅｔａｂａｓｉｃ−１８、１５０×４．６ｍｍ、３μｍ粒子サイズ、１５０Å孔サイズ
流速：１．２５ｍＬ／分
検出：２６０ｎＭでの紫外線
移動相：Ａ：１０ｎＭ  ＴＥＡＰ水溶液
Ｂ：アセトニトリル
保持時間：約１３分
【０２１２】
実施例４．Ｔ−２０中間体断片Ｆｍｏｃ−ＡＡ（１７−３５）（配列番号２）の固相合成
【０２１３】
【表６４】
2008526698.tif 000036
【０２１４】
を生じるための固相合成を実施した。
【０２１５】
Ｈ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｏ−２−ＣＴＣ樹脂（実施例３において調製されるような１０．１５ｇ）および１２２ｍＬのＤＣＭを固相反応チャンバーにおいて組み合わせた。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌した。次に、反応器を排水し、樹脂ベッドを６１ｍＬのＮＭＰで３回洗浄した。（すべての洗浄について、使用される液体の量は、１回の洗浄あたりの液体の量である。）
【０２１６】
結合の順序は、残基＃３４から残基＃１８まで進行した（成熟Ｔ−２０配列のアミノ酸付番参照）。
【０２１７】
【表６５】
2008526698.tif 000037
【０２１８】
（残基＃３４）次に、７．２４ｇのＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）ＯＨ、１．８６ｇのＨＯＢＴ一水和物、１．７９ｇのＤＩＥＡ、および２５．１ｍＬのＮＭＰをフラスコ中で組み合わせ、内容物を大気温で撹拌して、固体を溶解させた後、溶液を１０℃へ冷却した。
【０２１９】
次に、分離フラスコにおいて、４．５８ｇのＨＢＴＵおよび１５ｍＬのＮＭＰを組み合わせ、大気温で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却した。冷却したＨＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）ＯＨ溶液へ添加し、この溶液をＳＰＰＳ反応器へ負荷した。フラスコを１３ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へ負荷した。次に、混合物を３０±３℃で３時間撹拌した。次に、反応の完了について樹脂ビーズをサンプリングした（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水し、樹脂ベッドを１２０ｍＬのＮＭＰで４回洗浄した。
【０２２０】
次に、ＮＭＰ中の６１ｍＬの２０％ピペリジンを反応器へ負荷し、３０±３℃で３０分間撹拌した。反応器を排水した後、ＮＭＰ中の６１ｍＬの２０％ピペリジンを反応器へ添加した。次に、混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水した。次に、樹脂ベッドを６１ｍＬのＮＭＰで５回洗浄した。最後の洗浄物を定量的ニンヒドリン検査によってピペリジンレベルについてサンプリングした。
【０２２１】
（残基＃３３）次に、６．３９ｇのＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）ＯＨ、１．８７ｇのＨＯＢＴ一水和物、１．８２ｇのＤＩＥＡ、および２５．１ｍＬのＮＭＰをフラスコへ負荷した。内容物を溶解し、第一工程において示されるように冷却した。
【０２２２】
分離フラスコにおいて、４．６０ｇのＨＢＴＵおよび１５ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、結合させ、検査し、および洗浄した。一度結合反応が完了すると、第一工程において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、および検査したが、例外は、樹脂ベッドを６１ｍＬのＮＭＰで６回洗浄したことであった。
【０２２３】
（残基＃３２）次に、４．２７ｇのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、１．８６ｇのＨＯＢＴ一水和物、１．８３ｇのＤＩＥＡ、および２５．１ｍＬのＮＭＰをフラスコへ負荷した。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
【０２２４】
分離フラスコにおいて、４．６０ｇのＨＢＴＵおよび１５ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、結合させ、検査し、および洗浄した。一度結合反応が完了すると、第一工程において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、および検査した。
【０２２５】
（残基＃３１）次に、４．６５ｇのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、１．８６ｇのＨＯＢＴ一水和物、１．８１ｇのＤＩＥＡ、および２５．１ｍＬのＮＭＰをフラスコへ負荷した。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
【０２２６】
分離フラスコにおいて、４．６０ｇのＨＢＴＵおよび１５ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、結合させ、検査し、および洗浄した。一度結合反応が完了すると、第一工程において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、および検査した。
【０２２７】
（残基＃３０）次に、４．００ｇのＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、１．８７ｇのＨＯＢＴ一水和物、１．７８ｇのＤＩＥＡ、および２５．１ｍＬのＮＭＰをフラスコへ負荷した。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
【０２２８】
分離フラスコにおいて、４．５９ｇのＨＢＴＵおよび１５ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、結合させ、検査し、および洗浄した。一度結合反応が完了すると、第一工程において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、および検査した。
【０２２９】
（残基＃２９）次に、６．３９ｇのＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、１．８６ｇのＨＯＢＴ一水和物、１．７８ｇのＤＩＥＡ、および２５．１ｍＬのＮＭＰをフラスコへ負荷した。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
【０２３０】
分離フラスコにおいて、４．５９ｇのＨＢＴＵおよび１５ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、結合させ、検査し、および洗浄した。一度結合反応が完了すると、第一工程において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、および検査した。
【０２３１】
（残基＃２８）次に、５．７１ｇのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、１．８６ｇのＨＯＢＴ一水和物、１．８１ｇのＤＩＥＡ、および２５．１ｍＬのＮＭＰをフラスコへ負荷した。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
【０２３２】
分離フラスコにおいて、４．５８ｇのＨＢＴＵおよび１５ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、結合させ、検査し、および洗浄した。一度結合反応が完了すると、第一工程において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、および検査したが、例外は、樹脂ベッドを６１ｍＬのＮＭＰで６回洗浄したことであった。
【０２３３】
（残基＃２７）次に、４．９８ｇのＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、１．９２ｇのＨＯＢＴ一水和物、１．７８ｇのＤＩＥＡ、および２５．１ｍＬのＮＭＰをフラスコへ負荷した。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
【０２３４】
分離フラスコにおいて、４．５８ｇのＨＢＴＵおよび１５ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、結合させ、検査し、および洗浄した。一度結合反応が完了すると、第一工程において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、および検査した。
【０２３５】
（残基＃２６）次に、４．２７ｇのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、１．８６ｇのＨＯＢＴ一水和物、１．８０ｇのＤＩＥＡ、および２５．１ｍＬのＮＭＰをフラスコへ負荷した。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
【０２３６】
分離フラスコにおいて、４．５９ｇのＨＢＴＵおよび１５ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、結合させ、検査し、および洗浄した。一度結合反応が完了すると、第一工程において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、および検査した。
【０２３７】
（残基＃２５）次に、５．１５ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、１．８８ｇのＨＯＢＴ一水和物、１．８０ｇのＤＩＥＡ、および２５．１ｍＬのＮＭＰをフラスコへ負荷した。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
【０２３８】
分離フラスコにおいて、４．５８ｇのＨＢＴＵおよび１５ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、結合させ、検査し、および洗浄した。一度結合反応が完了すると、第一工程において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、および検査した。
【０２３９】
（残基＃２４）次に、４．２８ｇのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、１．８８ｇのＨＯＢＴ一水和物、１．７７ｇのＤＩＥＡ、および２５．１ｍＬのＮＭＰをフラスコへ負荷した。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
【０２４０】
分離フラスコにおいて、４．５９ｇのＨＢＴＵおよび１５ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、結合させ、検査し、および洗浄した。一度結合反応が完了すると、第一工程において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、および検査した。
【０２４１】
（残基＃２３）次に、４．２７ｇのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、１．８８ｇのＨＯＢＴ一水和物、１．７７ｇのＤＩＥＡ、および２５．１ｍＬのＮＭＰをフラスコへ負荷した。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
【０２４２】
分離フラスコにおいて、４．６０ｇのＨＢＴＵおよび１５ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、結合させ、検査し、および洗浄した。一度結合反応が完了すると、第一工程において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、および検査したが、例外は、樹脂ベッドを６１ｍＬのＮＭＰで６回洗浄したことであった。
【０２４３】
（残基＃２２）次に、５．１６ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、１．８８ｇのＨＯＢＴ一水和物、１．７６ｇのＤＩＥＡ、および２５．１ｍＬのＮＭＰをフラスコへ負荷した。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
【０２４４】
分離フラスコにおいて、４．５９ｇのＨＢＴＵおよび１５ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、結合させ、検査し、および洗浄した。一度結合反応が完了すると、第一工程において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、および検査した。
【０２４５】
（残基＃２１）次に、８．３８ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（ｔｒｔ）−ＯＨ、２．１３ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．０１ｇのＤＩＥＡ、および２５．１ｍＬのＮＭＰをフラスコへ負荷した。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
【０２４６】
分離フラスコにおいて、５．２２ｇのＨＢＴＵおよび１５ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、結合させ、検査し、および洗浄した。カイザー検査は、不完全な反応を示した。反応器を排水し、試薬の５０％を１．５時間使用して再結合させることによって、再結合を実施した。一度反応が完了すると、反応器を排水し、樹脂ベッドを１２０ｍＬのＮＭＰで４回洗浄した。一度結合反応が完了すると、第一工程において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、および検査した。
【０２４７】
（残基＃２０）次に、５．８４ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、２．１５ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．０５ｇのＤＩＥＡ、および２５．１ｍＬのＮＭＰをフラスコへ負荷した。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
【０２４８】
分離フラスコにおいて、５．２１ｇのＨＢＴＵおよび１５ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、結合させ、検査し、および洗浄した。一度結合反応が完了すると、第一工程において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、および検査した。
【０２４９】
（残基＃１９）次に、８．４４ｇのＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、２．１８ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．０９ｇのＤＩＥＡ、および２５．１ｍＬのＮＭＰをフラスコへ負荷した。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
【０２５０】
分離フラスコにおいて、５．３６ｇのＨＢＴＵおよび１５ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、結合させ、検査し、および洗浄した。一度結合反応が完了すると、第一工程において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、および検査した。
【０２５１】
（残基＃１８）次に、６．４３ｇのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、２．１１ｇのＨＯＢＴ一水和物、２．０９ｇのＤＩＥＡ、および２５．１ｍＬのＮＭＰをフラスコへ負荷した。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
【０２５２】
分離フラスコにおいて、５．２０ｇのＨＢＴＵおよび１５ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、結合させ、検査し、および洗浄した。一度反応が完了すると、反応器を排水し、樹脂を１０１．５ｍＬのＮＭＰで３回洗浄した。一度結合反応が完了すると、第一工程において示されるように、樹脂をピペリジン溶液で処理し、洗浄し、および検査した。
【０２５３】
（残基＃１７）次に、３．１８ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、１．２８ｇのＨＯＢＴ一水和物、１．１１ｇのＤＩＥＡ、および２５．１ｍＬのＮＭＰをフラスコへ負荷した。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却した。
【０２５４】
分離フラスコにおいて、２．３８ｇのＨＢＴＵおよび１５ｍＬのＮＭＰを組み合わせた。第一工程において示されるように、内容物を溶解し、冷却し、樹脂と混合し、結合させ、検査し、および洗浄した。次に、樹脂ベッドを１２０ｍＬのＤＣＭで５回、１２０ｍＬのイソプロパノールで４回洗浄した。樹脂を４０±２℃で真空乾燥させると、２０．７７ｇの収量を有した。
【０２５５】
実施例５．固相樹脂からのＦｍｏｃ−ＡＡ（１７−３５）（配列番号３）の開裂および精製
実施例４において調製されるように、ＣＴＣ樹脂からの新生Ｆｍｏｃ−ＡＡ（１７−３５）ペプチドの開裂を実施した。
【０２５６】
樹脂からペプチドを開裂させるため、ペプチドにより結合された樹脂２０．７６ｇを２０８ｍＬのＤＣＭと反応器中で組み合わせた。樹脂およびＤＣＭを大気温で約５分間撹拌した。次に、反応器を排水し、ＤＣＭ洗浄を１３７ｍＬのＤＣＭでさらに２回反復した。（すべての洗浄について、使用される液体の量は、１回の洗浄あたりの液体の量である。）次に、反応器を−１０±５℃へ冷却した。
【０２５７】
２．８１ｇのトリフルオロ酢酸および２０１ｍＬのＤＣＭの溶液を調製し、０±５℃へ冷却した。
【０２５８】
次に、冷却したＴＦＡ溶液を反応器へ負荷し、スラリーを０±５℃で３０分間撹拌した。次に、２．８１ｇのピリジンを反応器へ添加し、さらに０±５℃でさらに５分間撹拌した。次に、反応器を排水し、樹脂ベッドを１３７ｍＬのＤＣＭで大気温で７回洗浄した。組み合わせたＤＣＭ洗浄物を１３７ｍＬの水で洗浄し、ＤＣＭを真空蒸留して乾燥させた。次に、残渣を３５ｍＬＤＣＭ中に溶解した。次に、１３７ｍＬのイソプロパノールを添加した後、真空下で約７５ｍＬ容積まで濃縮し、１０℃へ冷却した後、１００ｍＬの水を添加した。次に、スラリーを０℃へ冷却し、１時間寝かせた。生成物をろ過し、２５ｍＬの５℃水で洗浄した。生成物を４０±２℃で真空乾燥させると、生成物１２．９ｇ（６９．１％）
を生じた。
【０２５９】
実施例６．Ｈ−ＡＡ（１７−３６）ＮＨ２（配列番号４）の溶液相合成
ＰｈｅＮＨ２のＦｍｏｃ−ＡＡ（１７−３５）ＯＨへの溶液相結合によって、Ｔ−２０中間体断片Ｈ−ＡＡ（１７−３６）ＮＨ２を調製した。
【０２６０】
Ｆｍｏｃ−ＡＡ（１７−３５）ＯＨ（１２．０ｇ、２．８３ｍｍｏｌ、１．０当量）、ＰｈｅＮＨ２ＨＣｌ（０．７４ｇ、３．６８ｍｍｏｌ、１．３当量）、６−クロロＨＯＢＴ（０．９６ｇ、５．６６ｍｍｏｌ、２．０当量）をＤＭＦ（１００ｍＬ、８．３容積）中に溶解した。溶液を−１０℃へ冷却し、ＤＭＡ（５ｍＬ、３．６容積）中のＤＩＥＡ（１．４ｍＬ、７．９２ｍｍｏｌ、２．８当量）を添加した。ＴＢＴＵ（１．２ｇ、３．６８ｍｍｏｌ、１．３当量）を一度に添加した後、ＤＭＦ（１５ｍＬ）ですすいだ。反応混合物を−１０℃で一晩撹拌し、大気温へ加温した。さらに４時間撹拌し続けた。０．４％の出発するＦｍｏｃ−ＡＡ（１７−３５）ＯＨが残っていることを示すＨＰＬＣ分析によって、反応の完了をモニターしたピペリジン（１．２３ｍＬ、１４．４３ｍｍｏｌ、５．１当量）を添加し、溶液を３０℃で３時間撹拌した。１％未満のＦｍｏｃ−ＡＡ（１７−３６）ＮＨ２を示すＨＰＬＣ分析によって、Ｆｍｏｃ除去の完了をモニターした。水（１００ｍＬ、８．３容積）を添加して、生成物を沈殿させた。固体を吸引ろ過により回収し、水で洗浄した。大気温で一晩乾燥させると、１１．８５ｇ（１０１％、％ＡＮ  ＨＰＬＣ）を生じた。
【０２６１】
Ｈ−ＡＡ（１７−３６）ＮＨ２（１１．８５ｇ）を１：ＥｔＯＨ：水（２００ｍＬ、１７容積）中に懸濁した。スラリーを大気温で２時間撹拌した。吸引ろ過および一定重量への乾燥は、８０．０％（ＡＮ  ＨＰＬＣ）の純度を有する１１．６ｇ（両工程について９８．９％の収率）を提供した。
【０２６２】
ＨＰＬＣ条件：
カラム：Ｚｏｒｂａｘ−ＡＣＥ、３μｍ、Ｃ１８、３．０×１００ｍｍ
検出器：２２０ｎｍでの紫外線
流速：０．６ｍＬ／分
移動相：Ａ＝０．１０％ＴＦＡ／水／４０％ＩＰＡ
Ｂ＝０．０７％ＴＦＡ／アセトニトリル／４０％ＩＰＡ
勾配：０分７０％Ｂ、８分８０％Ｂ、１５〜１６分９０％Ｂ、１６．１〜２０分７０％Ｂ
保持時間：約８分
【０２６３】
実施例７．Ａｃ−ＡＡ（１−３６）ＮＨ２（配列番号１）の溶液相合成
Ａｃ−ＡＡ（１−１６）ＯＨのＨ−ＡＡ（１７−３６）ＮＨ２との溶液相結合によって、Ｔ−２０最終生成物を調製し、断片Ａｃ−ＡＡ（１−３６）ＮＨ２（配列番号１）を生じる。
【０２６４】
Ｈ−ＡＡ（１７−３６）ＮＨ２（１当量）、Ａｃ−ＡＡ（１−１６）ＯＨ（１当量）、および６−クロロＨＯＢＴ（１．５当量）をＤＭＦの２０容積中に３０分間溶解する。溶液を０±５℃へ冷却し、ＤＩＥＡ（１．８５当量）後にＨＢＴＵ（１．２当量）を添加する。０℃で一晩撹拌した後、水（５０ｍＬ）を滴下して添加する。結果として生じるスラリーを大気温で３〜４時間撹拌し、生成物を吸引ろ過により単離する。生成物を４５℃の真空オーブンの中で一晩乾燥させる。
【配列表】
2008526698000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年6月28日(2006.6.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）式Ｚ−Ｑ−［ＳＵＰ］（式中、［ＳＵＰ］が支持体樹脂であり、Ｑがグルタミン残基であり、ＺがＮＨ２末端保護基であり、Ｚ−Ｑが、０．５以下の負荷因子で［ＳＵＰ］上に存在する。）の固相合成支持体樹脂を提供する工程、
（ｂ）アミノ酸をＺ−Ｑ−［ＳＵＰ］へ結合させ、
【表１】
2008526698.tif 000067
を提供する、工程、
（ｃ）
【表２】
2008526698.tif 000068
を処理し
【表３】
2008526698.tif 000069
開裂生成物を提供する工程、
および
（ｄ）
【表４】
2008526698.tif 000070
の合成のために
【表５】
2008526698.tif 000071
を使用する工程を含む、配列
【表６】
2008526698.tif 000072
を有するペプチドを調製する方法。
【請求項２】
工程（ａ）［ＳＵＰ］が、トリチル基を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
工程（ａ）、［ＳＵＰ］が、クロロ−トリチル基を含む、請求項１または２の方法。
【請求項４】
Ｚが、Ｆｍｏｃ基である、請求項１〜３の方法。
【請求項５】
工程（ａ）において、Ｚ−Ｑが、０．５以下の負荷因子で［ＳＵＰ］上に存在する、請求項１の方法。
【請求項６】
工程（ａ）において、Ｚ−Ｑが、０．２〜０．５の負荷因子で［ＳＵＰ］上に存在する、請求項５の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）、アミノ酸が１〜１．５当量の量でＺ−Ｑ−［ＳＵＰ］へ結合する、請求項１の方法。
【請求項８】
工程（ｄ）において、
【表８】
2008526698.tif 000073
が、配列
【表９】
2008526698.tif 000074
を有するペプチドと反応し、配列
【表７】
2008526698.tif 000075
を有するペプチドを提供する、
請求項１の方法。
【請求項９】
【表１０】
2008526698.tif 000076
が、
【表１１】
2008526698.tif 000077
をフェニルアラニンアミドと反応させることによって形成される、請求項８の方法。
【請求項１０】
（ａ）式Ｚ−Ｗ−［ＳＵＰ］（式中、［ＳＵＰ］が支持体樹脂であり、Ｗがトリプトファン残基であり、ＺがＮＨ２末端保護基であり、Ｚ−Ｗが、０．５以下の負荷因子で［ＳＵＰ］上に存在する。）の固相合成支持体樹脂を提供する工程、
（ｂ）アミノ酸をＺ−Ｗ−［ＳＵＰ］へ結合させ、
【表１２】
2008526698.tif 000078
を提供する工程、
（ｃ）
【表１４】
2008526698.tif 000079
を処理し、
【表１３】
2008526698.tif 000080
開裂生成物を提供する工程
および
（ｄ）
【表１５】
2008526698.tif 000081
の合成のために、
【表１６】
2008526698.tif 000082
を使用する工程を含む、配列
【表１７】
2008526698.tif 000083
を有するペプチドを調製する方法。
【請求項１１】
工程（ｄ）において、
【表１８】
2008526698.tif 000084
がフェニルアラニンアミドと反応し、
【表１９】
2008526698.tif 000085
を形成する、
請求項１０の方法。
【請求項１２】
【表２０】
2008526698.tif 000086
が
【表２１】
2008526698.tif 000087
と反応し、
【表２２】
2008526698.tif 000088
を提供する、
請求項１０または１１の方法。
【請求項１３】
（ａ）ペプチド中間体断片が、０．５以下の負荷因子を利用する固体支持体上で合成された、配列
【表２３】
2008526698.tif 000089
の前記ペプチド中間体断片を提供する工程
（ｂ）溶液相において、
【表２４】
2008526698.tif 000090
をフェニルアラニンアミド残基と反応させ、配列
【表２５】
2008526698.tif 000091
を提供する工程、
および
（ｃ）溶液相において、
【表２６】
2008526698.tif 000092
を
【表２７】
2008526698.tif 000093
と反応させ、
【表２８】
2008526698.tif 000094
を提供する工程
を含む、配列
【表２９】
2008526698.tif 000095
を有するペプチドを調製する方法。
【請求項１４】
前記ペプチド中間体断片が、０．５未満の負荷因子を利用する固体支持体上で合成された、請求項１３の方法。
【請求項１５】
工程（ａ）において、前記ペプチド中間体断片が、０．２〜０．５の負荷因子を利用する固体支持体上で合成された、請求項１３または１４の方法。
【請求項１６】
工程（ｂ）において、前記ペプチド中間体断片が、１〜１．５当量の量で支持体と結合したアミノ酸を利用する固体支持体上で合成された、請求項１３の方法。
【国際調査報告】
2008526698.tif 000096
2008526698.tif 000097
2008526698.tif 000098