(57)【要約】  敗血症を発症するリスクのある被験者における敗血症の発症を予測する方法を提供する。一方法においては、被験者のバイオマーカープロファイル中の特性を評価する。もしこれらの特性がある特別な数値セットを満足すれば、被験者は敗血症をおそらく発生すると思われる。敗血症を発症するリスクのある被験者におけるある段階の敗血症の発症を予測する方法を提供する。一方法においては、被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性を評価する。もしこれらの特性値がある特別な数値セットを満足すれば、被験者は敗血症をおそらく発生すると思われる。被験者における敗血症を診断する方法を提供する。1つのかかる方法においては、被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性を評価する。複数の特性がある特別な数値セットを満足するとき、被験者は敗血症をおそらく発症すると思われる。
2008538007.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
敗血症を発症するリスクのあるテスト被験者における敗血症の発症を予測する方法であって、テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第1の数値セットを満足するかどうかを評価し、第1の数値セットを満足することはテスト被験者が敗血症をおそらく発症することを予測し、ここで、複数の特性は複数のバイオマーカーの測定可能な態様であり、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも3つのバイオマーカーを含み、複数のバイオマーカーがIL-6とIL-8の両方を含むときは、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも6つのバイオマーカーを含むものである前記方法。
【請求項２】
テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第2の数値セットを満足するかどうかを評価し、ここで、第2の数値セットを満足することはテスト被験者が敗血症をおそらく発症しないことを予測することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数のバイオマーカーが、表Iに掲げられた3〜54のバイオマーカーからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記複数のバイオマーカーが表Iに掲げられた3〜30のバイオマーカーからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記複数のバイオマーカーが表Iに掲げられた4〜25のバイオマーカーからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記複数のバイオマーカーが表Iに掲げられた少なくとも3つのバイオマーカーを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記複数のバイオマーカーが表Iに掲げられた少なくとも4つのバイオマーカーを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記複数のバイオマーカーが表Iに掲げられた少なくとも8つのバイオマーカーを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の特性が複数のバイオマーカー中の3〜53のバイオマーカーに対応する3〜53の特性からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数の特性が複数のバイオマーカー中の3〜40のバイオマーカーに対応する3〜40の特性からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数の特性が複数のバイオマーカー中の4〜25のバイオマーカーに対応する4〜25の特性からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数の特性が複数のバイオマーカー中の少なくとも3つのバイオマーカーに対応する少なくとも3つの特性からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記複数の特性が複数のバイオマーカー中の少なくとも4つのバイオマーカーに対応する少なくとも4つの特性からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記複数の特性が複数のバイオマーカー中の少なくとも8つのバイオマーカーに対応する少なくとも8つの特性からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数のバイオマーカー中の各バイオマーカーが表Jに掲げられたバイオマーカーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
各バイオマーカーが核酸である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記複数のバイオマーカー中の各バイオマーカーが表Kに掲げられたバイオマーカーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
各バイオマーカーがタンパク質である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記複数のバイオマーカー中の各バイオマーカーが核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
各バイオマーカーがDNA、cDNA、増幅されたDNA、RNA、またはmRNAである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記複数のバイオマーカー中の各バイオマーカーがタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記複数のバイオマーカー中の第1のバイオマーカーが表Jに掲げられた核酸バイオマーカーでありかつ前記複数のバイオマーカー中の第2のバイオマーカーが表Kに掲げられたタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記複数の特性がバイオマーカーの測定可能な態様でありかつ前記特性に対する特性値は前記テスト被験者から単一時点に得た生物学的サンプルを用いて決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記特性が前記生物学的サンプル中の前記バイオマーカーの存在量である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記特性が前記生物学的サンプル中の前記バイオマーカーの非存在または存在である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記特性が前記生物学的サンプル中の前記バイオマーカーの種の同定である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記生物学的サンプルが全血である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記生物学的サンプルが血漿、血清、唾液、痰、尿、脳髄液、組織検体、組織生検、または便検体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記生物学的サンプルが単離された好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、または単球である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記複数の特性中の特性が前記バイオマーカープロファイル中のバイオマーカーの測定可能な態様でありかつ前記特性に対する特性値は前記テスト被験者から異なる時点に得た複数のサンプルを用いて決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも1つの特性は前記バイオマーカーの存在量が経時的に増加するかまたは減少することを示す、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記複数のサンプル中の第1のサンプルは被験者が敗血症を患う前の第1の日に採取されかつ前記複数のサンプル中の第2のサンプルは被験者が敗血症を患う前の第2の日に採取される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記バイオマーカープロファイル中のバイオマーカーが核酸の表示またはタンパク質の表示である、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記バイオマーカープロファイル中のバイオマーカーがmRNA分子の表示またはcDNA分子の表示である、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記バイオマーカープロファイル中の第1のバイオマーカーが核酸の表示でありかつ前記バイオマーカープロファイル中の第2のバイオマーカーがタンパク質の表示である、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記バイオマーカープロファイルを評価するステップの前に、前記バイオマーカープロファイルを構築するステップをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記構築するステップが、前記複数の特性を前記テスト被験者のサンプルから得ることを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記サンプルが全血である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記サンプルが血漿、血清、唾液、痰、尿、脳髄液、組織検体、組織生検、または便検体である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記サンプルが好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、または単球である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記構築するステップが、データ解析アルゴリズムを、集団のメンバーから得た表Iに掲げられたバイオマーカーに対応する特性に適用することを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記集団が、後に敗血症を発症する被験者（敗血症被験者）および後に敗血症を発症しない被験者（SIRS被験者）を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
集団のメンバーから得られる表Iに掲げられたバイオマーカーに対応する特性を、集団の被験者の一部分が敗血症を患う前の時点に取得する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記データ解析アルゴリズムが、決定ツリー、マイクロアレイの予測分析、多重加法回帰ツリー、ニューラルネットワーク、クラスタリングアルゴリズム、主成分分析、最近傍分析、線形判別分析、二次判別分析、サポートベクタマシーン、進化法、射影追跡法、または重み付け投票法である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記第1の数値セットを評価するステップの前に、前記第1の数値セットを構築するステップをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
前記構築するステップが、データ解析アルゴリズムを集団のメンバーから得た特性に適用することを含んでなる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記集団が観察期間中に敗血症を発症する被験者および観察期間中に敗血症を発症しない被験者を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記データ解析アルゴリズムが、決定ツリー、マイクロアレイの予測分析、多重加法回帰ツリー、ニューラルネットワーク、クラスタリングアルゴリズム、主成分分析、最近傍分析、線形判別分析、二次判別分析、サポートベクタマシーン、進化法、射影追跡法、または 重み付け投票法である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記構築するステップが決定ルールを作製しかつ前記評価するステップが前記決定ルールを複数の特性に適用してそれらが第1の数値セットを満足するかどうかを決定することを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記決定ルールが前記集団中の被験者を（i）敗血症を発症する被験者および（ii）敗血症を発症しない被験者として70％以上の精度で分類する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記決定ルールが前記集団中の被験者を（i）敗血症を発症する被験者および（ii）敗血症を発症しない被験者として、90％以上の精度で分類する、請求項４９に記載の方法。、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
敗血症をおそらく発症する患者において、前記バイオマーカープロファイル中の第1のバイオマーカーが上方制御される、請求項１に記載の方法。
【請求項５３】
敗血症をおそらく発症する患者において、前記バイオマーカープロファイル中の少なくとも5つのバイオマーカーが上方制御される、請求項１に記載の方法。
【請求項５４】
敗血症をおそらく発症する患者において、前記バイオマーカープロファイル中の第1のバイオマーカーが下方制御される、請求項１に記載の方法。
【請求項５５】
敗血症をおそらく発症する患者において、前記バイオマーカープロファイル中の少なくとも5つのバイオマーカーが下方制御される、請求項１に記載の方法。
【請求項５６】
テスト被験者が4〜8時間以内に敗血症を発症する可能性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５７】
テスト被験者が8〜12時間以内に敗血症を発症する可能性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５８】
テスト被験者が12〜24時間以内に敗血症を発症する可能性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５９】
テスト被験者が24〜36時間以内に敗血症を発症する可能性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６０】
テスト被験者が36〜48時間以内に敗血症を発症する可能性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６１】
テスト被験者が48〜72時間以内に敗血症を発症する可能性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６２】
テスト被験者における敗血症を診断する方法であって、テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第1の数値セットを満足するかどうかを評価し、ここで、第1の数値セットを満足することはテスト被験者が敗血症をおそらく発症することを予測すること、および複数の特性が複数のバイオマーカーに対応し、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも3つのバイオマーカーを含み、ここで、複数のバイオマーカーがIL-6とIL-8の両方を含むときは、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも6つのバイオマーカーを含むことを含んでなる前記方法。
【請求項６３】
前記バイオマーカープロファイルを評価するステップの前に、前記バイオマーカープロファイルを構築するステップをさらに含んでなる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記構築するステップは、前記複数の特性を前記テスト被験者のサンプルから得ることを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記サンプルが全血である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記サンプルが血漿、血清、唾液、痰、尿、脳髄液、組織検体、組織生検、または便検体である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記サンプルが好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、または単球である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記サンプルが単一組織である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
前記サンプルが前記テスト被験者の１以上の組織由来である、請求項６４に記載の方法。
【請求項７０】
前記構築するステップが複数の特性に対応する表Iのバイオマーカーの同一性を決定することを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項７１】
前記決定する方法は、データ解析アルゴリズムを、集団のメンバーから得られる表Iに掲げられたバイオマーカーに対応する特性に適用することを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記集団が後に敗血症を発症する被験者（敗血症被験者）および敗血症を発症しない被験者（SIRS被験者）を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
複数のバイオマーカーが表Iに掲げられた少なくとも4つのバイオマーカーを含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項７４】
複数のバイオマーカーが表Iに掲げられた少なくとも8つのバイオマーカーを含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項７５】
複数のプローブスポットを含むマイクロアレイであって、複数のプローブスポット中の少なくとも20％のプローブスポットが表Iに掲げられた複数のバイオマーカーに対応し、複数のバイオマーカーがIL-6とIL-8の両方を含むときは、表Iに掲げられた少なくとも6つのバイオマーカーを含む前記マイクロアレイ。
【請求項７６】
前記マイクロアレイが１以上のコントロールスポットを含む、請求項７５に記載のマイクロアレイ。
【請求項７７】
複数のプローブスポット中の少なくとも40％のプローブスポットが表Iに掲げられたバイオマーカーに対応する、請求項７５に記載のマイクロアレイ。
【請求項７８】
マイクロアレイが基質上の約3〜50のプローブスポットから成る、請求項７５に記載のマイクロアレイ。
【請求項７９】
前記マイクロアレイが核酸マイクロアレイである、請求項７５に記載のマイクロアレイ。
【請求項８０】
前記マイクロアレイがタンパク質マイクロアレイである、請求項７５に記載のマイクロアレイ。
【請求項８１】
テスト被験者における敗血症の発症を予測するキットであって、集合して、特異的に、表Iに掲げられた少なくとも3つのバイオマーカーと結合する複数の抗体を含む前記キット。
【請求項８２】
テスト被験者における敗血症の発症を予測するキットであって、集合して、特異的に、表Kに掲げられた少なくとも3つのバイオマーカーと結合する複数の抗体を含む前記キット。
【請求項８３】
コンピューター読取可能記憶媒体およびそれに埋め込まれたコンピュータープログラム機構を含むコンピュータープログラム製品であって、コンピュータープログラム機構は、敗血症を発症するリスクのあるテスト被験者のバイオマーカープロファイルの複数の特性が第1の数値セットを満足するかどうかを評価し、ここで第1の数値セットを満足することは、テスト被験者が敗血症をおそらく発症することを予測する命令を含み、ここで、複数の特性は複数のバイオマーカーの測定可能な態様であり、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも3つのバイオマーカーを含み、複数のバイオマーカーがIL-6とIL- 8の両方を含むときは、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも6つのバイオマーカーを含むものである、前記コンピュータープログラム製品。
【請求項８４】
テスト被験者におけるバイオマーカープロファイルの複数の特性が第2の数値セットを満足するかどうかを評価し、ここで、第2の数値セットを満足することは、テスト被験者が敗血症をおそらく発症しないことを予測する命令をさらに含む、請求項８３に記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項８５】
前記バイオマーカープロファイルが表Iに掲げられた3〜50のバイオマーカーから成る、請求項８３に記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項８６】
前記バイオマーカープロファイルが表Iに掲げられた3〜40のバイオマーカーから成る、請求項８３に記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項８７】
複数のバイオマーカーが表Iに掲げられた少なくとも4つのバイオマーカーを含む、請求項８３に記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項８８】
複数のバイオマーカーが表Iに掲げられた少なくとも8つのバイオマーカーを含む、請求項８３に記載のコンピュータープログラム製品。
【請求項８９】
中央演算処理装置および中央演算処理装置に結合したメモリを含んでなるコンピューターであって、メモリは、テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第1の数値セットを満足するかどうかを評価し、第1の数値セットを満足することはテスト被験者が敗血症をおそらく発症することを予測する命令を保存し、複数の特性は複数のバイオマーカーの測定可能な態様であり、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも3つのバイオマーカーを含み、複数のバイオマーカーがIL-6とIL-8の両方を含むときは、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも6つのバイオマーカーを含むものである前記コンピューター。
【請求項９０】
メモリは、テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第2の数値セットを満足するかどうかを評価し、第2の数値セットを満足することはテスト被験者が敗血症をおそらく発症することを予測する命令をさらに保存する、請求項８９に記載のコンピューター。
【請求項９１】
前記バイオマーカープロファイルが表Iに掲げられた3〜50のバイオマーカーからなる、請求項８９に記載のコンピューター。
【請求項９２】
前記バイオマーカープロファイルが表Iに掲げられた3〜40のバイオマーカーからなる、請求項８９に記載のコンピューター。
【請求項９３】
複数のバイオマーカーが表Iに掲げられた少なくとも4つのバイオマーカーを含む、請求項８９に記載のコンピューター。
【請求項９４】
複数のバイオマーカーが表Iに掲げられた少なくとも8つのバイオマーカーを含む、請求項８９に記載のコンピューター。
【請求項９５】
被験者が敗血症をおそらく発症するかどうかを決定するためのコンピューターシステムであって、コンピューターシステムは中央演算処理装置、および中央演算処理装置に結合したメモリを含み、メモリは、テスト被験者のバイオマーカープロファイルを取得する命令（ここで、前記バイオマーカープロファイルは複数の特性を含み、複数の特性は複数のバイオマーカーの測定可能な態様であり、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも3つのバイオマーカーを含む）；バイオマーカープロファイルをリモートコンピューターへ伝達する命令（ここで、リモートコンピューターはテスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第1の数値セットを満足するかどうかを評価し、第1の数値セットを満足することはテスト被験者が敗血症をおそらく発症することを予測する命令を含む）；テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第1の数値セットを満足するかどうかについての決定をリモートコンピューターから受ける命令；およびテスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第1の数値セットを満足するかどうかを報告する命令（ここで、複数のバイオマーカーがIL-6およびIL-8の両方を含むときは、表Iに掲げられた少なくとも6つのバイオマーカーを含む）を保存する、前記コンピューターシステム。
【請求項９６】
リモートコンピューターはさらに、テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第2の数値セットを満足するかどうかを評価し、第2の数値セットを満足することは、テスト被験者が敗血症をおそらく発症しないことを予測する命令をさらに含み；そしてメモリはさらに、テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第2の数値セットを満足するかどうかについて、リモートコンピューターからの決定を受ける命令、ならびにテスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第2の数値セットを満足するかどうかを報告する命令を含む、請求項９５に記載のコンピューターシステム。
【請求項９７】
複数のバイオマーカーが表Iに掲げられた少なくとも4つのバイオマーカーを含む、請求項９５に記載のコンピューターシステム。
【請求項９８】
複数のバイオマーカーが表Iに掲げられた少なくとも8つのバイオマーカーを含む、請求項９５に記載のコンピューターシステム。
【請求項９９】
バイオマーカープロファイル中の複数の特性のそれぞれに対するそれぞれの値を含む搬送波上に表現されたデジタルシグナルであって、複数の特性は複数のバイオマーカーの測定可能な態様であり、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも3つのバイオマーカーを含み、そして複数のバイオマーカーがIL-6とIL-8の両方を含むときは、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも6つのバイオマーカーを含む、前記デジタルシグナル。
【請求項１００】
複数のバイオマーカーが表Iに掲げられた少なくとも4つのバイオマーカーを含む、請求項９９に記載のデジタルシグナル。
【請求項１０１】
複数のバイオマーカーが表Iに掲げられた少なくとも8つのバイオマーカーを含む、請求項９９に記載のデジタルシグナル。
【請求項１０２】
テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性がある数値セットを満足するかどうかの決定を含む搬送波上に表現されたデジタルシグナルであって、複数の特性は複数のバイオマーカーの測定可能な態様であり、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも3つのバイオマーカーを含み、そして数値セットを満足することはテスト被験者が敗血症をおそらく発症することを予測し；そして複数のバイオマーカーがIL-6およびIL-8の両方を含むときは、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも6つのバイオマーカーを含む、前記デジタルシグナル。
【請求項１０３】
複数のバイオマーカーが表Iに掲げられた少なくとも4つのバイオマーカーを含む、請求項１０２に記載のデジタルシグナル。
【請求項１０４】
複数のバイオマーカーが表Iに掲げられた少なくとも8つのバイオマーカーを含む、請求項１０２に記載のデジタルシグナル。
【請求項１０５】
テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性がある数値セットを満足するかどうかの決定を含む搬送波上に表現されたデジタルシグナルであって、複数の特性は複数のバイオマーカーの測定可能な態様であり、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも3つのバイオマーカーを含み、そして数値セットを満足することはテスト被験者が敗血症をおそらく発症しないことを予測し；そして複数のバイオマーカーがIL-6およびIL-8の両方を含むときは、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも6つのバイオマーカーを含む、前記デジタルシグナル。
【請求項１０６】
複数のバイオマーカーが表Iに掲げられた少なくとも4つのバイオマーカーを含む、請求項１０５に記載のデジタルシグナル。
【請求項１０７】
複数のバイオマーカーが表Iに掲げられた少なくとも8つのバイオマーカーを含む、請求項１０５に記載のデジタルシグナル。
【請求項１０８】
被験者が敗血症をおそらく発症するかどうかを決定するためのグラフィカルユーザーインターフェースであって、グラフィカルユーザーインターフェースは、リモートコンピューターから受ける搬送波上に表現されたデジタルシグナルにコードされた結果を表示する表示領域を含み、複数の特性は複数のバイオマーカーの測定可能な態様であり、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも3つのバイオマーカーを含み、テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第1の数値セットを満足する場合、結果は第1の値を有し、そしてテスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第2の数値セットを満足する場合、結果は第2の値を有し、そして複数のバイオマーカーがIL-6およびIL-8の両方を含むときは、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも6つのバイオマーカーを含む、前記グラフィカルユーザーインターフェース。
【請求項１０９】
複数のバイオマーカーが表Iに掲げられた少なくとも4つのバイオマーカーを含む、請求項１０８に記載のグラフィカルユーザーインターフェース。
【請求項１１０】
複数のバイオマーカーが表Iに掲げられた少なくとも8つのバイオマーカーを含む、請求項１０８に記載のグラフィカルユーザーインターフェース。
【請求項１１１】
被験者が敗血症をおそらく発症するかどうかを決定するためのコンピューターシステムであって、コンピューターシステムは中央演算処理装置、および中央演算処理装置に結合したメモリを含み、メモリは、テスト被験者のバイオマーカープロファイルを取得する命令（ここで、前記バイオマーカープロファイルは複数の特性を含み、複数の特性は複数のバイオマーカーの測定可能な態様であり、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも3つのバイオマーカーを含む）；テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第1の数値セットを満足するかどうかを評価し、第1の数値セットを満足することはテスト被験者が敗血症をおそらく発症することを予測する命令；およびテスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第1の数値セットを満足するかどうかを報告する命令（ここで、複数のバイオマーカーがIL-6およびIL-8の両方を含むときは、表Iに掲げられた少なくとも6つのバイオマーカーを含む）；を保存する、前記コンピューターシステム。
【請求項１１２】
複数のバイオマーカーが表Iに掲げられた少なくとも4つのバイオマーカーを含む、請求項１１１に記載のコンピューターシステム。
【請求項１１３】
複数のバイオマーカーが表Iに掲げられた少なくとも8つのバイオマーカーを含む、請求項１１１に記載のコンピューターシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関係出願の相互参照
本出願は、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる2005年4月15日出願の米国仮特許出願第60/671,620号の優先権を主張する。本出願はまた、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる2005年4月22日出願の米国仮特許出願第60/674,046号の優先権も主張する。
【０００２】
1.  発明の分野
本発明は、被験者において敗血症またはその進行段階を診断または予測する方法および組成物に関する。本発明はまた、被験者において全身性炎症反応症候群を診断する方法および組成物にも関する。
【背景技術】
【０００３】
2.  発明の背景
病状の早期検出は、典型的にはより有効な治療的処置、およびそれに対応してより望ましい臨床結果をもたらす。しかし、多くの場合、疾患の複雑さの故に、疾患の症状の早期検出には問題があり、したがって、診断が可能となる前に疾患は比較的進行しうる。全身性炎症症状は、このような疾患クラスの１つである。これらの症状、特に敗血症は、常にではないが、典型的には病原性微生物と、宿主において過剰かつ調節障害の炎症反応を始動させる宿主の防御系との相互作用から生じる。全身性炎症反応中の宿主の反応の複雑さにより、疾患の病因を理解しようとする努力は困難になっている（Healy, Annul. Pharmacother., 36:648-54, (2002)に総説）。さらに、この疾患の病因の理解が不完全であることは、診断用バイオマーカーの発見を困難なものにしている。しかし、敗血症は非常に迅速に生命を脅かす症状に進行するので、早期かつ信頼性のある診断は必須である。
【０００４】
被験者における敗血症の発症は、良く記載されているコースに従い、全身性炎症反応症候群（SIRS）陰性からSIRS陽性へ、次いで敗血症へと進行し、その後、重篤な敗血症、敗血症性ショック、多臓器機能障害（MOD）、そして最終的には死へと進行しうる。敗血症はまた、感染した被験者において、被験者が引き続いてSIRSを発症した場合にも生じうる。「敗血症」は一般に、SIRSによる感染および文書化された感染に対する全身性宿主反応として定義される。「重篤な敗血症」は、MOD、低血圧、播種性血管内血液凝固（DIC）または乳酸アシドーシス、乏尿、および精神状態の変化を含む低灌流性異常に関連している。「敗血症性ショック」は一般に、輸液蘇生法に耐性があってさらに低灌流性異常が存在する、敗血症誘発性低血圧として定義される。
【０００５】
敗血症において臨床的に有意な病原性微生物の存在を記録することは、困難であることが分かっている。原因微生物は、典型的には被験者の血液、痰、尿、創傷分泌物、留置カテーテルの表面などを培養することによって検出する。しかし、原因微生物はある特定の身体ミクロ環境中にしか存在せず、培養した特定の材料が汚染微生物を含まないかもしれない。検出は、感染部位に微生物が少数しか存在しないことによってさらに困難になりうる。血液中に病原体が少数しか存在しないことは、血液の培養による敗血症の診断に特に問題を表す。たとえば一研究では、敗血症の臨床症状を示している被験者の17％にしか陽性の培養結果が得られなかった（Rangel-Frausto他, JAMA, 273:117-23, (1995)）。診断は、非病原性微生物による試料の汚染によってさらに困難になり得る。たとえば、敗血症に罹患している707人の被験者の研究において、検出された微生物の12.4％しか臨床的に有意でなかった（Weinstein他, Clinical Clinical Infectious Diseases, 24:584-602, (1997)）。
【０００６】
敗血症の早期診断が困難なことは、この疾患に関連した罹患率および死亡率が高いことに反映されている。敗血症は現在、米国において死因の第10位であり、非冠状動脈の集中治療室（ICU）の入院患者の間で特に流行しており、ここではこれが死の最大の原因である。全体の死亡率は35％と高く、米国だけで年間推定750,000件が発生している。敗血症を処置する年間費用は米国だけで10億ドルの桁にある。
【０００７】
したがって、満足すべき特異性と感度性能を有する技法を用いて、有効な処置および予防を可能にするための、十分早期に敗血症を診断する方法の必要性が存在する。
【発明の開示】
【０００８】
3.  発明の概要
本発明は、テスト被験者における、敗血症の発症を含む、敗血症を診断する方法および組成物に関する。本発明はまた、テスト被験者における敗血症を予測する方法および組成物にも関する。
【０００９】
本発明はさらにテスト被験者における敗血症進行の段階を診断または予測する方法および組成物に関する。本発明はなお、さらにテスト被験者における全身性炎症反応症候群（SIRS）を診断する方法および組成物に関する。
【００１０】
一態様において、本発明は敗血症を発症するリスクのあるテスト被験者における敗血症の発症を予測する方法を提供する。この方法は、テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性がある数値セットを満足するかどうかを評価するステップを含んでなり、ここで、数値セットを満足することはテスト被験者が敗血症を発症しうることを、複数の特性が数値セットを満足するかどうかを決定するために適用した決定ルールの精度により決定される尤度で、意味する。いくつかの実施形態においては、決定ルールの精度は少なくとも60%である。それ故に、対応して、テスト被験者は、複数の特性が数値セットを満足する場合、被験者が敗血症を発症しうる尤度は少なくとも60％である。
【００１１】
さらに、本発明の他の態様はテスト被験者の敗血症を診断する方法を含む。これらの方法は、テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性がある数値セットを満足するかどうかを評価するステップを含んでなり、ここで、数値セットを満足することはテスト被験者が敗血症を有することを、複数の特性が数値セットを満足するかどうかを決定するために適用した決定ルールの精度により決定される尤度で、予測する。いくつかの実施形態においては、決定ルールの精度は少なくとも60%である。それ故に、対応して、複数の特性が数値セットを満足する場合、テスト被験者が敗血症である尤度は少なくとも60％である。
【００１２】
特別な実施形態において、バイオマーカープロファイルは少なくとも2つの特性を含み、それぞれの特性は対応する表30の列4または5に掲げられたバイオマーカーの特性を表す。一実施形態において、バイオマーカープロファイルは少なくとも2つの異なる、表30の列4または5に掲げられたバイオマーカーを含む。かかる実施形態においては、バイオマーカープロファイルは少なくとも2つのバイオマーカーに対するそれぞれの対応する特性を含みうる。一般に、2つのバイオマーカーは少なくとも2つの異なる遺伝子に由来する。少なくとも2つのバイオマーカー中の1つのバイオマーカーが表30の列4に掲げられている場合、バイオマーカーは、例えば、掲げられた遺伝子により作られた転写物、その補体、または判別断片もしくはその補体、またはそのcDNA、もしくはcDNAの判別断片、または転写物もしくはその補体の全てまたは一部分に対応する判別する増幅された核酸分子、または遺伝子によりコードされるタンパク質、またはタンパク質の判定断片、または以上のいずれかの表示であってもよい。さらになお、バイオマーカーは、例えば、表30の列5に掲げられたタンパク質、またはそのタンパク質の判別断片、または以上のいずれかの表示であってもよい。ここで、判別分子または断片は、検出されると、以上の同定された転写物、cDNA、増幅された核酸、またはタンパク質の存在または存在量を示す分子または断片である。この実施形態によれば、本発明のバイオマーカープロファイルは、バイオマーカーを検出するための、当業者に公知の標準アッセイまたは本明細書に記載のアッセイを用いて得ることができる。かかるアッセイは、例えば、目的の遺伝子（例えば、表30に開示された遺伝子）の特別な遺伝子または対立遺伝子の発現産物（例えば、核酸および／またはタンパク質）を検出することができる。一実施形態において、かかるアッセイは核酸マイクロアレイを利用する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは、表32の列4または5からの少なくとも2つの異なるバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態においては、バイオマーカープロファイルは、表30からの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、または50の異なるバイオマーカーを含む。
【００１３】
特別な実施形態において、バイオマーカープロファイルは、それぞれ表30の列2に掲げられたプローブセットの1つを含有する少なくとも2つの異なるバイオマーカー、表30のプローブセットの1つの補体を含有するバイオマーカー、または表30のプローブセットの1つもしくは表30のプローブセットの1つの補体を含有する遺伝子がコードするアミノ酸配列を含有するバイオマーカーを含む。かかるバイオマーカーは、例えば、mRNA転写物、cDNAまたはいずれかの他の核酸、例えば増幅された核酸、またはタンパク質であってもよい。バイオマーカープロファイルはさらに、少なくとも2つのバイオマーカーにそれぞれ対応する特性を含む。一般に、少なくとも2つのバイオマーカーは少なくとも2つの異なる遺伝子に由来する。バイオマーカーが表30に掲げられたプローブセットの配列を含む遺伝子に基づく場合、バイオマーカーは、例えば、遺伝子により作られた転写物、その補体、または判別断片もしくはその補体、またはそのcDNA、もしくはcDNAの判別断片、または転写物もしくはその補体の全てまたは一部分に対応する増幅された判別核酸分子、または遺伝子によりコードされるタンパク質、またはタンパク質の判別断片、または以上のいずれかの表示であってもよい。さらになお、バイオマーカーは、例えば、表30に記載のプローブセット配列を含む遺伝子によりコードされるタンパク質、またはタンパク質の判別断片、または以上のいずれかの表示であってもよい。ここで、判別分子または断片は、検出されると、以上の同定された転写物、cDNA、増幅された核酸、またはタンパク質の存在または存在量を示す分子または断片である。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは表31、32、33、34、または36のいずれか1つからの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10の異なるバイオマーカーを含む。
【００１４】
特別な実施形態において、バイオマーカープロファイルは、表31の列3に掲げられた少なくとも2つの異なるバイオマーカーを含む。バイオマーカープロファイルはさらに、少なくとも2つのバイオマーカーに対するそれぞれの対応する特性を含む。一般に2つのバイオマーカーは少なくとも2つの異なる遺伝子に由来する。バイオマーカーは、例えば、表31に掲げられた遺伝子により作られた転写物、その補体、または判別断片もしくはその補体、またはそのcDNA、もしくはcDNAの判別断片、または転写物もしくはその補体の全てまたは一部分に対応する判別する増幅された核酸分子、または遺伝子によりコードされるタンパク質、もしくはタンパク質の判別断片、または以上のいずれかの表示であってもよい。さらになお、バイオマーカーは、例えば、表31の列3に掲げられた遺伝子によりコードされるタンパク質、またはそのタンパク質の判別断片、または以上のいずれかの表示であってもよい。ここで、判別分子または断片は、検出されると、以上の同定された転写物、cDNA、増幅された核酸、またはタンパク質の存在または存在量を示す分子または断片である。この実施形態によれば、本発明のバイオマーカープロファイルは、バイオマーカーを検出するための、当業者に公知の標準アッセイまたは本明細書に記載のアッセイを用いて得ることができる。かかるアッセイは、例えば、特別な遺伝子または目的の遺伝子（例えば、表31に開示された遺伝子）の対立遺伝子の発現産物（例えば、核酸および／またはタンパク質）を検出することができる。一実施形態においては、かかるアッセイは核酸マイクロアレイを利用する。
【００１５】
特別な実施形態において、バイオマーカープロファイルは、それぞれ表31の列2に掲げられたプローブセットの1つを含有する少なくとも2つの異なるバイオマーカー、表31のプローブセットの1つの補体を含有するバイオマーカー、または表31のプローブセットの1つもしくは表31のプローブセットの1つの補体を含有する遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を含有するバイオマーカーを含む。かかるバイオマーカーは、例えば、mRNA転写物、cDNAまたはいずれかの他の核酸、例えば増幅された核酸、またはタンパク質であってもよい。バイオマーカープロファイルはさらに、少なくとも2つのバイオマーカーにそれぞれ対応する特性を含む。一般に、少なくとも2つのバイオマーカーは少なくとも2つの異なる遺伝子に由来する。バイオマーカーが表31に掲げられたプローブセットの配列を含む遺伝子に基づく場合、バイオマーカーは、例えば、遺伝子により作られた転写物、その補体、または判別断片もしくはその補体、またはそのcDNA、もしくはcDNAの判別断片、または転写物もしくはその補体の全てまたは一部分に対応する増幅された判別核酸分子、または遺伝子によりコードされるタンパク質、またはタンパク質の判別断片、または以上のいずれかの表示であってもよい。さらになお、バイオマーカーは、例えば、表31に記載のプローブセット配列を含む遺伝子によりコードされるタンパク質、またはタンパク質の判別断片、または以上のいずれかの表示であってもよい。ここで、判別分子または断片は、検出されると、以上の同定された転写物、cDNA、増幅された核酸、またはタンパク質の存在または存在量を示す分子または断片である。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは表31からの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、または50の異なるバイオマーカーを含む。
【００１６】
特別な実施形態においては、バイオマーカープロファイルは少なくとも3つの特性を含み、それぞれの特性は表Iの列3または4に掲げられた対応するバイオマーカーの特性を表す。一実施形態においては、バイオマーカープロファイルは少なくとも3つの異なる、表Iの列3または4に掲げられたバイオマーカーを含む。かかる実施形態において、バイオマーカープロファイルは少なくとも3つのバイオマーカーに対するそれぞれの対応する特性を含みうる。一般に、少なくとも3つのバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも3つの異なる遺伝子に由来する。少なくとも3つの異なるバイオマーカー中のあるバイオマーカーが表Iの列3に掲げられている場合、バイオマーカーは、例えば、掲げられた遺伝子により作られた転写物、その補体、そのスプライス変異体、スプライス変異体の補体、または判別断片または以上のいずれかの補体、以上いずれかのcDNA、cDNAの判別断片、または転写物もしくはその補体の全てもしくは一部分に対応する判別する増幅された核酸分子、または遺伝子によりコードされるタンパク質、またはタンパク質の判別断片、または以上のいずれかの表示であってもよい。さらになお、バイオマーカーは、例えば、表Iの列4に掲げられたタンパク質、またはタンパク質の判別断片、または以上のいずれかの表示であってもよい。ここで、判別分子または断片は、検出されると、以上の同定された転写物、cDNA、増幅された核酸、そのスプライス-変異体またはタンパク質の存在または存在量を示す分子または断片である。この実施形態によれば、本発明のバイオマーカープロファイルは、バイオマーカーを検出するための、当業者に公知の標準アッセイまたは本明細書に記載のアッセイを用いて得ることができる。かかるアッセイは、例えば、特定の遺伝子または目的の遺伝子（例えば、表Iに開示された遺伝子）の対立遺伝子の発現産物（例えば、核酸および／またはタンパク質）を検出することができる。一実施形態においては、かかるアッセイは核酸マイクロアレイを利用する。いくつかの実施形態においては、バイオマーカープロファイルは、表Iからの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、または50の異なるバイオマーカーを含む。
【００１７】
特別な実施形態においては、バイオマーカープロファイルは少なくとも3つの特性を含み、それぞれの特性は表Jの列3または4に掲げられた対応するバイオマーカーの特性を表す。一実施形態においては、バイオマーカープロファイルは少なくとも3つの異なる、表Jの列3または4に掲げられたバイオマーカーを含む。かかる実施形態において、バイオマーカープロファイルは少なくとも3つのバイオマーカーに対するそれぞれの対応する特性を含みうる。一般に、少なくとも3つのバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも3つの異なる遺伝子に由来する。少なくとも3つの異なるバイオマーカー中のあるバイオマーカーが表Jの列3に掲げられている場合、バイオマーカーは、例えば、掲げられた遺伝子により作られた転写物、その補体、そのスプライス変異体、スプライス変異体の補体、または判別断片または以上のいずれかの補体、以上いずれかのcDNA、cDNAの判別断片、または転写物もしくはその補体の全てもしくは一部分に対応する判別する増幅された核酸分子、または遺伝子によりコードされるタンパク質、またはタンパク質の判別断片、または以上のいずれかの表示であってもよい。さらになお、バイオマーカーは、例えば、表Jの列4に掲げられたタンパク質、またはタンパク質の判別断片、または以上のいずれかの表示であってもよい。ここで、判別分子または断片は、検出されると、以上の同定された転写物、cDNA、増幅された核酸、そのスプライス-変異体またはタンパク質の存在または存在量を示す分子または断片である。この実施形態によれば、本発明のバイオマーカープロファイルは、バイオマーカーを検出するための、当業者に公知の標準アッセイまたは本明細書に記載のアッセイを用いて得ることができる。かかるアッセイは、例えば、特定の遺伝子または目的の遺伝子（例えば、表Jに開示された遺伝子）の対立遺伝子の発現産物（例えば、核酸および／またはタンパク質）を検出することができる。一実施形態においては、かかるアッセイは核酸マイクロアレイを利用する。いくつかの実施形態においては、バイオマーカープロファイルは、表Jからの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40の異なるバイオマーカーを含む。
【００１８】
特別な実施形態においては、バイオマーカープロファイルは少なくとも3つの特性を含み、それぞれの特性は表Kの列3または4に掲げられた対応するバイオマーカーの特性を表す。一実施形態においては、バイオマーカープロファイルは少なくとも3つの異なる、表Kの列3または4に掲げられたバイオマーカーを含む。かかる実施形態において、バイオマーカープロファイルは少なくとも3つのバイオマーカーに対するそれぞれの対応する特性を含みうる。一般に、少なくとも2つまたは3つのバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも2つまたは3つの異なる遺伝子にそれぞれ由来する。少なくとも2つまたは3つの異なるバイオマーカー中のあるバイオマーカーが表Kの列3に掲げられている場合、バイオマーカーは、例えば、掲げられた遺伝子により作られた転写物、その補体、そのスプライス変異体、スプライス変異体の補体、または判別断片または以上のいずれかの補体、以上いずれかのcDNA、cDNAの判別断片、または転写物もしくはその補体の全てもしくは一部分に対応する判別する増幅された核酸分子、または遺伝子によりコードされるタンパク質、またはタンパク質の判別断片、または以上のいずれかの表示であってもよい。さらになお、バイオマーカーは、例えば、表Kの列4に掲げられたタンパク質、またはタンパク質の判別断片、または以上のいずれかの表示であってもよい。ここで、判別分子または断片は、検出されると、以上の同定された転写物、cDNA、増幅された核酸、そのスプライス-変異体またはタンパク質の存在または存在量を示す分子または断片である。この実施形態によれば、本発明のバイオマーカープロファイルは、バイオマーカーを検出するための、当業者に公知の標準アッセイまたは本明細書に記載のアッセイを用いて得ることができる。かかるアッセイは、例えば、特定の遺伝子または目的の遺伝子（例えば、表Kに開示された遺伝子）の対立遺伝子の発現産物（例えば、核酸および／またはタンパク質）を検出することができる。一実施形態においては、かかるアッセイは核酸マイクロアレイを利用する。いくつかの実施形態においては、バイオマーカープロファイルは、表Kからの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10の異なるバイオマーカーを含む。
【００１９】
本発明の方法はSIRS被験者の敗血症の発症を検出または予測するために特に有用であるが、当業者は本発明の方法を、限定されるものでないが、SIRSを有するかまたは敗血症のいずれかの段階にあると疑われる被験者を含むいずれかの被験者に対して利用できることを理解しうる。例えば、生物学的サンプルを被験者から採取して、サンプル中のバイオマーカーのプロファイルを、いくつかの異なるタイプの訓練集団から得たバイオマーカープロファイルと照らし合わせて評価することができる。代表的な訓練集団としては、様々なもの、例えば、SIRS陰性である被験者を含む集団、SIRS陽性である集団、および／または敗血症の特定の段階の被験者を含む集団が挙げられる。これらの色々な訓練集団のそれぞれと照らし合わせたバイオマーカープロファイルの評価を用いて、テスト被験者がSIRS陰性、SIRS陽性、敗血症になりそうな、または敗血症の特定の段階にあるかどうかを決定することができる。本発明の方法から得られる診断に基づいて、次に適当な治療体制を開始することができる。
【００２０】
特別な実施形態において、本発明はまた、被験者の敗血症の発症またはSIRSを診断または予測するのに有用であるキットも提供する（第5.3節、前掲を参照）。本発明のキットは、かかるバイオマーカーの存在または存在量を検出するために用いる、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195または200またはそれ以上のバイオマーカーおよび／または試薬を含む。いくつかの実施形態において、これらのバイオマーカーのそれぞれは表30から得られる。いくつかの実施形態において、これらのバイオマーカーのそれぞれは表31から得られる。いくつかの実施形態において、これらのバイオマーカーのそれぞれは表32から得られる。いくつかの実施形態において、これらのバイオマーカーのそれぞれは表33から得られる。いくつかの実施形態において、これらのバイオマーカーのそれぞれは表36から得られる。いくつかの実施形態において、これらのバイオマーカーのそれぞれは図39、図43、図52、図53、または図56から得られる。他の実施形態において、本発明のキットは、かかるバイオマーカーの存在または存在量を検出するために用いる、少なくとも2つ、あるいは数百以上のバイオマーカーおよび／または試薬を含む。
【００２１】
特定の実施形態において、本発明のキットは、本発明のバイオマーカーと特異的に結合する、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195または200またはそれ以上の試薬を含む。例えば、かかるキットは、本発明のバイオマーカーと特異的に結合する核酸分子および／または抗体分子を含んでもよい。
【００２２】
本発明に有用である特定の例示のバイオマーカーは、第5.6節、第5.11節、ならびに第6節の表30、31、32、34および36に記載されている。キットのバイオマーカーを用いて、本発明によるバイオマーカープロファイルを作製することができる。かかるキット内のバイオマーカーおよび／または試薬のタイプの例としては、限定されるものでないが、タンパク質およびその断片、ペプチド、ポリペプチド、抗体、プロテオグリカン、糖タンパク質、リポタンパク質、炭水化物、脂質、核酸（mRNA、DNA、cDNA）、有機および無機化学品、および天然および合成のポリマーまたは判別分子またはその断片が挙げられる。
【００２３】
特別な実施形態において、本発明はさらに、被験者の敗血症の発症またはSIRSを診断または予測するのに有用である他のキットも提供する（第5.3節、前掲を参照）。本発明のキットは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50またはそれ以上ののバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、これらのバイオマーカーのそれぞれは表Iから得られる。いくつかの実施形態において、これらのバイオマーカーのそれぞれは表Jから得られる。いくつかの実施形態において、これらのバイオマーカーのそれぞれは表Kから得られる。いくつかの実施形態において、これらのバイオマーカーのそれぞれは表Iまたは表30に見出される。いくつかの実施形態において、これらのバイオマーカーのそれぞれは表Iまたは表31に見出される。いくつかの実施形態において、これらのバイオマーカーのそれぞれは図39、図43、図52、図53、または図56から得られる。他の実施形態においては、本発明のキットは少なくとも2つ、あるいは50またはそれ以上ののバイオマーカーを含む。特定の実施形態において、本発明のキットは、本発明のバイオマーカーと特異的に結合する、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195または200またはそれ以上の試薬を含む。本発明に有用である具体的なバイオマーカーは、第5.6節、第5.11節、ならびに表I、J、K、L、M、N、およびOに記載されている。キットのバイオマーカーを用いて本発明によるバイオマーカープロファイルを作製することができる。キットの化合物のクラスの例としては、限定されるものでないが、タンパク質およびその断片、ペプチド、ポリペプチド、プロテオグリカン、糖タンパク質、リポタンパク質、炭水化物、脂質、核酸（mRNA、DNA、cDNA）、有機および無機化学品、ならびに天然および合成ポリマー、または判別分子また
はその断片が挙げられる。
【００２４】
さらに、本発明の他の態様は、テスト被験者が敗血症またはSIRSをおそらく発症するかどうかを評価するための、コンピューターおよびコンピューター読取可能媒体を含む。例えば、本発明の一実施形態は、コンピューターシステムに接続して使用するコンピュータープログラム製品を提供する。コンピュータープログラム製品は、コンピューター読取可能記憶媒体およびそれに埋め込まれたコンピュータープログラム機構を含む。コンピュータープログラム機構は、敗血症を発症するリスクのあるテスト被験者のバイオマーカープロファイルの複数の特性が第1の数値セットを満足するかどうかを評価する命令を含む。第1の数値セットを満足することは、テスト被験者が敗血症をおそらく発症することを予測する。特性は、表Iに掲げられた少なくとも3つのバイオマーカーを含む、複数のバイオマーカーの測定可能な態様である。いくつかの実施形態において、コンピュータープログラム製品はさらに、テスト被験者のバイオマーカープロファイルの複数の特性が第2の数値セットを満足するかどうかを評価する命令を含む。第2の数値セットを満足することは、テスト被験者が敗血症をおそらく発症しないことを予測する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは表Iに掲げられた3〜50のバイオマーカー、表Iに掲げられた3〜40のバイオマーカー、表Iに掲げられた少なくとも4つのバイオマーカー、または表Iに掲げられた少なくとも6つのバイオマーカーを有する。
【００２５】
他の本発明のコンピューター実施形態は、中央演算処理装置および中央演算処理装置に結合したメモリを含む。メモリは、敗血症を発症するリスクのあるテスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第1の数値セットを満足するかどうかを評価する命令を保存する。第1の数値セットを満足することは、テスト被験者が敗血症をおそらく発症することを予測する。特性は複数のバイオマーカーの測定可能な態様である。この複数のバイオマーカーは、表Iから得た少なくとも3つのバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、メモリはさらに、テスト被験者におけるバイオマーカープロファイルの複数の特性が第2の数値セットを満足するかどうかを評価する命令を保存し、その場合、第2の数値セットを満足することは、テスト被験者が敗血症をおそらく発症しないことを予測する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは表Iに掲げられた3〜50のバイオマーカー、表Iに掲げられた3〜40のバイオマーカー、表Iに掲げられた少なくとも4つのバイオマーカー、または表Iに掲げられた少なくとも8つのバイオマーカーを有する。
【００２６】
本発明による他のコンピューター実施形態は、被験者が敗血症をおそらく発症するかどうかを決定するためのコンピューターシステムを含む。コンピューターシステムは中央演算処理装置および中央演算処理装置に結合したメモリを含む。メモリはテスト被験者のバイオマーカープロファイルを取得する命令を保存する。バイオマーカープロファイルは複数の特性を含む。複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも3つのバイオマーカーを含む。メモリはさらに、バイオマーカープロファイルをリモートコンピューターへ伝達する命令を含む。リモートコンピューターはテスト被験者のバイオマーカープロファイルの複数の特性が第1の数値セットを満足するかどうかを評価する命令を含む。第1の数値セットを満足することは、テスト被験者が敗血症をおそらく発症することを予測する。メモリはさらに、テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第1の数値セットを満足するかどうかについての、リモートコンピューターからの決定を受ける命令を含む。メモリはまた、テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第1の数値セットを満足するかどうかを報告する命令も含む。いくつかの実施形態において、リモートコンピューターはさらに、テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第2の数値セットを満足するかどうかを評価する命令も含む。第2の数値セットを満足することは、テスト被験者が敗血症をおそらく発症しないことを予測する。かかる実施形態において、メモリはさらに、テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第2の数値セットを満足するかどうかについての、リモートコンピューターからの決定を受ける命令、ならびにテスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第2の数値セットを満足するかどうかを報告する命令を含む。いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも4つのバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも6つのバイオマーカーを含む。
【００２７】
本発明のなお他の実施形態は、バイオマーカープロファイル中の複数の特性のそれぞれに対するそれぞれの値を含む搬送波上に表現されたデジタルシグナルを含む。特性は複数のバイオマーカーの測定可能な態様である。複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも3つのバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも4つのバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも8つのバイオマーカーを含む。
【００２８】
本発明のなお他の態様は、バイオマーカープロファイルにおけるテスト被験者の複数の特性が数値セットを満足するかどうかの決定を含む、搬送波上に表現されたデジタルシグナルを提供する。特性は複数のバイオマーカーの測定可能な態様である。この複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも3つのバイオマーカーを含む。数値セットを満足することはテスト被験者が恐らく敗血症を発症することを予測する。いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも4つのバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも8つのバイオマーカーを含む。
【００２９】
なお他の実施形態は、テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性がある数値セットを満足するかどうかについての決定を含む、搬送波上に表現されたデジタルシグナルを提供する。特性は複数のバイオマーカーの測定可能な態様である。複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも3つのバイオマーカーを含む。数値セットを満足することはテスト被験者が敗血症をおそらく発症しないことを予測する。いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも4つのバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも8つのバイオマーカーを含む。
【００３０】
本発明のなお他の実施形態は、被験者が敗血症をおそらく発症するかどうかを決定するためのグラフィカルユーザーインターフェースを提供する。グラフィカルユーザーインターフェースは、リモートコンピューターから受ける搬送波上に表現されたデジタルシグナルにコードされた結果を表示する表示領域を含む。特性は複数のバイオマーカーの測定可能な態様である。複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも3つのバイオマーカーを含む。テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第1の数値セットを満足する場合、結果は第1の値を有する。テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第2の数値セットを満足する場合、結果は第2の値を有する。いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも4つのバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも8つのバイオマーカーを含む。
【００３１】
本発明のなお他の態様は、被験者が敗血症をおそらく発症するかどうかを決定するコンピューターシステムを提供する。コンピューターシステムは中央演算処理装置および中央演算処理装置に結合したメモリを含む。メモリはテスト被験者のバイオマーカープロファイルを取得する命令を保存する。バイオマーカープロファイルは複数の特性を含む。特性は複数のバイオマーカーの測定可能な態様である。複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも3つのバイオマーカーを含む。メモリはさらに、テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が 第1の数値セットを満足するかどうかを評価する命令を保存する。第1の数値セットを満足することは、テスト被験者が敗血症をおそらく発症することを予測する。メモリはまた、テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第1の数値セットを満足するかどうかを報告する命令も保存する。いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも4つのバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも8つのバイオマーカーを含む。
【００３２】
4.  図面の簡単な説明
図面の簡単な説明は下記参照。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
5.  好ましい実施形態の詳細な説明
本発明は、バイオマーカープロファイルにおけるバイオマーカー特性を評価することにより、敗血症の迅速かつ正確な診断または予測を可能にする。これらのバイオマーカープロファイルは、単一時点（「スナップショット」）、または複数時点（被験者が敗血症を発症するリスクのある時間経過など）における被験者の１以上の生物学的サンプルから構築することができる。有利なことに、通常の臨床敗血症症候群の発症前に、敗血症を診断または予測することができ、それによって、より効果的な治療介入が可能になる。
【００３４】
5.1  定義
「全身性炎症反応症候群」または「SIRS」は、24時間内に2以上の次の症状が現れる、様々な重症の臨床発作に対する臨床反応を意味する：
・38℃（100.4°F）を超えるかまたは36℃（96.8°F）未満の体温；
・90拍動／分を超える心拍数（HR）；
・20呼吸／分を超える呼吸数（RR）、または32mmHg未満のPco2、または機械的人工呼吸を必要とすること；および
・12.0x109/Lを超えるかまたは4.0xl09/L未満の白血球数（WBC）。
【００３５】
これらのSIRSの症候群はSIRSの一致した定義であるが、将来、他の定義に改変または補完されうる。本定義は、現在の臨床慣行を明確にするために使用され、本発明の重要な態様を表すものではない（例えば、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference: 「敗血症および器官障害の定義ならびに敗血症における革新的治療法利用のガイドライン（Definitions for Sepsis and Organ Failure and Guidelines for the Use of Innovative Therapies in Sepsis）」, 1992, Crit. Care. Med. 20, 864-874を参照）。
【００３６】
SIRSの被験者は、上に定義したSIRSとして分類される臨床症状を有するが、臨床的に敗血症であるとみなされない。どの被験者が敗血症を発症するリスクを有するかを決定する方法は当業者に周知である。かかる被験者には、例えば、ICUの被験者および火傷、外科または他の損傷など生理的外傷を患う被験者が含まれる。SIRSの証明は、頻脈、頻呼吸または過呼吸、低血圧、低灌流、欠尿、白血球増多症または白血球減少症、発熱または低体温および容積輸液の必要性により示されうる前炎症性状態の発症である。SIRSは特徴として文書化された感染源（例えば、菌血症）を含まない。
【００３７】
「敗血症」は、SIRSを伴う感染に加えて文書化された感染（例えば、ある生物の陽性培養などの、臨床的に有意な感染の事後の実験室確認）に対する全身性宿主反応を意味する。従って、敗血症は、文書化された感染に対する全身性炎症反応を意味する（例えば、本明細書に参照により組み入れられる、American College of Chest Physicians Society of Critical Care Medicine, Chest, 1997, 101:1644-1655を参照）。本明細書に使用される「敗血症」には、限定されるものでないが、敗血症の発症、重篤な敗血症、敗血症性ショックおよび敗血症を含む敗血症の全段階に関連する多臓器障害（MOD）が含まれる。
【００３８】
「敗血症の発症」とは、敗血症の早期段階、例えば、通常の臨床症状が敗血症の臨床上の疑いを支持するのに十分となる前の段階をいう。本発明の方法は、慣用技法を用いて敗血症が疑われうる時点より前に敗血症を検出するために用いられるので、敗血症の症状がより明らかになった時に、早期敗血症における被験者の病状をただ遡及的に確認できるだけである。被験者が敗血症となる正確な機構は本発明の重要な態様ではない。本発明の方法は、感染症のプロセスの起源に依ることなく敗血症の発症を検出することができる。
【００３９】
「重篤な敗血症」とは、臓器不全、低灌流性異常、または敗血症誘発性低血圧に関連する敗血症をいう。低灌流性異常には、限定されるものでないが、乳酸アシドーシス、乏尿、または精神状態の急性の変化が含まれる。
【００４０】
「敗血症性ショック」は、十分な静脈輸液負荷に応答性がなく、末梢低灌流の症状を有する敗血症誘発性低血圧を意味する。
【００４１】
「転換者」または「転換被験者」は、被験者を監視している期間、典型的にはICUに滞在中に、敗血症の臨床上の疑いへ進行するSIRS陽性被験者をいう。
【００４２】
「非転換被験者」とは、被験者を監視している期間、典型的にはICUに滞在中に、敗血症の臨床上の疑いへ進行しないSIRS陽性被験者をいう。
【００４３】
「バイオマーカー」は、生物学的サンプル中に存在するかまたは由来するタンパク質、ペプチド、プロテオグリカン、糖タンパク質、リポタンパク質、炭水化物、脂質（例えば、cDNAもしくは増幅されたDNAなどのDNA、またはmRNAなどのRNA）、有機もしくは無機化学品、天然もしくは合成のポリマー、小分子（例えば、代謝物）、または以上のいずれかの判別分子もしくは判別断片などの、実質的にいずれかの検出可能な化合物である。本明細書に使用される「から誘導される」または「に由来する」は、検出されると、特別な分子が生物学的サンプル中に存在することを示す化合物を意味する。例えば、ある特定のcDNAは生物学的サンプル中のある特定のRNA転写物の存在を示しうる。他の例としては、ある特定の抗体の検出またはその抗体との結合は、生物学的サンプル中のある特定の抗原（例えば、タンパク質）を示しうる。ここで、判別分子または断片は、検出されたときに、以上の同定された化合物の存在または存在量を示す分子または断片である。
【００４４】
バイオマーカーは、例えば、生物学的サンプルから単離する、生物学的サンプル中で直接検出する、または生物学的サンプル中で検出もしくは定量することができる。バイオマーカーは、例えば、機能性、部分的に機能性、または非機能性であってもよい。本発明の一実施形態においては、バイオマーカーを単離しかつ使用して、例えば、様々な診断アッセイにおけるバイオマーカー検出を容易にしうる特異的に結合する抗体を産生させる。イムノアッセイは、バイオマーカー分子と結合できるいずれの抗体、抗体フラグメント、またはそれらの誘導体（例えば、Fab、F(ab')2、Fv、またはscFvフラグメント）を使用してもよい。かかるイムノアッセイは当技術分野で周知である。さらに、もしバイオマーカーがタンパク質またはそれらの断片であれば、その配列を決定してそれをコードする遺伝子を十分確立された技法を用いてクローニングすることができる。
【００４５】
本明細書に使用される用語「バイオマーカーの種」は、本明細書に記載のバイオマーカーのいずれかの判別部分または判別断片、例えば、本明細書に記載のある特定の遺伝子（例えば、表30、または表I、または表J、または表Kに掲げられた遺伝子、下記）のスプライス変異体を意味する。ここで、判別部分または判別断片は、検出されると、以上同定された転写物、cDNA、増幅された核酸、またはタンパク質の存在または存在量を示す、分子の部分または断片である。
【００４６】
本明細書に使用される、用語「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は、特に断らない限り、互換性がある。
【００４７】
「バイオマーカープロファイル」は、複数の１以上のタイプのバイオマーカー（例えば、mRNA分子、cDNA分子、タンパク質および／または炭水化物など）、またはそれらの表示と一緒にバイオマーカーの特性、例えば、測定可能な態様（例えば、存在量）を含む。バイオマーカープロファイルは、少なくとも2つのかかるバイオマーカーまたはそれらの表示を含み、その場合、バイオマーカーは、例えば、核酸および炭水化物などの同じかまたは異なるクラスであってもよい。バイオマーカープロファイルはまた、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100またはそれ以上のバイオマーカーまたはそれらの表示を含んでもよい。一実施形態においては、バイオマーカープロファイルは数百、またはさらに数千のバイオマーカーまたはそれらの表示を含む。バイオマーカープロファイルはさらに、1以上のコントロールまたは内部標準を含んでもよい。一実施形態においては、内部標準となる少なくとも1つのバイオマーカー、またはその表示を含む。他の実施形態においては、バイオマーカーは１以上のタイプのバイオマーカーの表示を含む。本明細書で使用する用語「表示（indication）」は、単に、バイオマーカープロファイルが、バイオマーカー分子実体それ自体よりもむしろ、バイオマーカーに対する記号、データ、省略または他の類似の表示を含有する立場を意味する。例えば、Affymetrix（Santa Clara、California）U133 plus 2.0 205013_s_atおよび209369_atのプローブセットを含む本発明の例示のバイオマーカープロファイルを考えられたい。他の本発明の例示のバイオマーカープロファイルは、Affymetrix（Santa Clara、California）U133 plus 2.0 205013_s_atおよび209369_atプローブセットを誘導するために用いる遺伝子名を含む。なお他の本発明の例示のバイオマーカープロファイルにおいて、バイオマーカープロファイルは、205013_s_atプローブセットが誘導された遺伝子の転写物の物理量、および
209369_atプローブセットが誘導された遺伝子の転写物の物理量を含む。他の実施形態においては、バイオマーカープロファイルは、205013_s_at プローブセットが誘導された遺伝子の転写物の量の名目表示および209369_at プローブセットが誘導された遺伝子の転写物の量の名目表示を含む。本発明のなお他の例示のバイオマーカープロファイルは、205013_s_atプローブセットが誘導された遺伝子転写物の物理量がマイクロアレイ上の第1のプローブスポットに結合し、かつ209369_atプローブセットが誘導された遺伝子転写物の存在量がマイクロアレイ上の第2のプローブスポットに結合するマイクロアレイを含む。この最後の例示のバイオマーカープロファイルにおいては、少なくとも20％、40％、または40％超のプローブスポットが表30に記載のプローブセット中の配列に基づく。他の例示のバイオマーカーにおいては、少なくとも20％、40％、または40％超のプローブスポットが表31に記載のプローブセット中の配列に基づく。
【００４８】
バイオマーカープロファイル中のそれぞれのバイオマーカーは対応する「特性」を含む。本明細書に使用される「特性」は、バイオマーカーの測定可能な態様を意味する。特性は、例えば、例示のバイオマーカープロファイル1：
2008538007.tif 000003
に説明した、被験者から得た生物学的サンプル中のバイオマーカーの存在または非存在を含んでもよい。
【００４９】
例示のバイオマーカープロファイル1において、遺伝子Aの転写物の特性値は「存在」でありかつ遺伝子Bの転写物の特性値は「非存在」である。
【００５０】
特性は、例えば、例示のバイオマーカープロファイル2：
2008538007.tif 000004
に説明した、被験者から得た生物学的サンプル中のバイオマーカーの存在量を含んでもよい。
【００５１】
例示のバイオマーカープロファイル2において、遺伝子Aの転写物の特性値は300ユニットでありかつ遺伝子Bの転写物の特性値は400ユニットである。
【００５２】
特性は、例えば、例示のバイオマーカープロファイル3：
2008538007.tif 000005
に説明した、バイオマーカーの2以上の測定可能な態様の比であってもよい。
【００５３】
例示のバイオマーカープロファイル3において、遺伝子Aの転写物の特性値と遺伝子Bの転写物の特性値は0.75（300/400）である。
【００５４】
特性はまた、2つのサンプルから採取した対応するバイオマーカーの測定可能な態様の間の差であってもよく、その場合、2つのサンプルは被験者から2つの異なる時点で採集される。例えば、バイオマーカーは、テスト被験者から得たサンプル中の遺伝子Aの転写物でありそして「測定可能な態様」は、例えば、RT-PCRまたはマイクロアレイ分析により測定した転写物の存在量であるという場合を考えられたい。この事例において、遺伝子Aの転写物の存在量は第1サンプルならびに第2サンプルで測定される。第1サンプルをテスト被験者から採取して数時間後に第2サンプルを採取する。遺伝子Aの特性を計算するために、1サンプル中の遺伝子Aの転写物の存在量を第2サンプル中の遺伝子Aの転写物の存在量から差し引く。特性はまた、被験者から得た生物学的サンプル中のバイオマーカーの存在量が経時的に増加しているかどうかの表示および／または被験者から得た生物学的サンプル中のバイオマーカーの存在量が経時的に減少しているかどうかの表示であってもよい。
【００５５】
いくつかの実施形態においては、以上の例示のバイオマーカープロファイル1で説明したバイオマーカープロファイル中の特性とバイオマーカーの間に1対1の対応がある。いくつかの実施形態においては、以上の例示のバイオマーカープロファイル3で説明したバイオマーカープロファイル中の特性とバイオマーカーの間の関係がもっと複雑である。
【００５６】
当業者は、特性の他の計算方法を工夫できることを理解するであろう、そして全てのかかる方法は本発明の範囲内にある。例えば、特性は、ある被験者から2以上の時点に採集した生物学的サンプル全体にわたってのバイオマーカーの存在量の平均値であってもよい。さらに、特性は、ある被験者から単一時点に得た生物学的サンプルからの2以上のバイオマーカーの差または比であってもよい。バイオマーカープロファイルはまた、少なくとも3、4、5、10、20、30またはそれを超える数の特性を含みうる。一実施形態においては、バイオマーカープロファイルは数百、または数千の特性を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態において、バイオマーカーの特性はマイクロアレイを用いて測定される。マイクロアレイの構築および存在量データを得る目的でマイクロアレイを処理するために用いる技法は周知であり、そして、例えば、それぞれ、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Draghici, 2003, Data Analysis Tools for DNA Microarrays, Chapman & Hall/CRC、および国際公開特許WO 03/061564に記載されている。マイクロアレイは複数のプローブを含む。いくつかの事例において、それぞれのプローブは、色々なバイオマーカーを認識する、例えば、それらと結合する。いくつかの事例において、マイクロアレイ上の2以上の異なるプローブは、前記バイオマーカーを認識、例えば、と結合する。従って、典型的には、マイクロアレイ上のプローブスポットと被験者バイオマーカーとの間の関係は2対1の対応、3対1の対応、またはある他の形の対応である。しかし、マイクロアレイ上のプローブとバイオマーカーの間にユニークな1対1の対応が存在する場合もありうる。
【００５８】
「表現型変化」は、被験者の所与の状態に関連するパラメーターの検出しうる変化である。例えば、表現型変化は、その変化がSIRS、敗血症、敗血症の発症にまたは敗血症の進行のある特定の段階の進行に関連する、体液中のバイオマーカーの増加または減少を含んでもよい。表現型変化はさらに、被験者の所与の状態の検出しうる態様の変化であって、バイオマーカーの測定可能な態様の変化でない変化を含んでもよい。例えば、表現型変化は、体温、呼吸速度、脈拍、血圧、またはその他の生理学的パラメーターの検出可能な変化を含んでもよい。かかる変化は、臨床上の観察および当業者に周知である通常の技法を用いる測定を介して確認することができる。
【００５９】
本明細書に使用される、核酸配列（例えば、本明細書に記載の遺伝子をコードするヌクレオチド配列）の文脈における用語「相補的」は、水素結合特性の結果である特定の窒素性塩基間の化学親和性を意味する。例えば、グアニン（G）は、シトシン（C）とだけ水素結合を生成する一方、アデニン（A）はDNAの場合、チミン（T）、RNAの場合、ウラシル（U）とだけ水素結合を生成する。これらの反応は塩基対合として記載され、そして対合した塩基（GとC、またはAとT／U）は相補的であると云われる。従って、2つの核酸配列は、もし窒素性塩基が水素結合を生成できれば相補的でありうる。かかる配列をお互いに「相補配列（complement）」と呼ぶ。かかる相補配列は、天然であってもよいし、またはそれらは、例えば、DNA分子またはRNA分子（例えば、mRNA転写物）のセンス鎖と相補的であるアンチセンス核酸分子の場合のように、公知のいずれかの方法により、当業者が化学的に合成することができる。例えば、本明細書に参照により組み入れられる、Lewin、2002、Genes VII. Oxford University Press Inc.、New York、NYを参照されたい。
【００６０】
本明細書で使用される、敗血症またはSIRSを診断または予測する文脈の「慣用の技法」は、本発明によるバイオマーカープロファイルを取得することなく、表現型変化に基づいて被験者を分類する技法である。
【００６１】
「決定ルール」はバイオマーカープロファイルを評価するために用いる方法である。かかる決定ルールは当技術分野で公知の１以上の形態をとることができ、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Hastie ら、2001、The Elements of Statistical Learning、Springer-Verlag、New Yorkに例示されている。決定ルールを用いて、特性のデータセットを処理すること、とりわけ、敗血症の発症を診断、敗血症の進行を確認、または敗血症を診断することができる。本発明のいくつかの実施形態で利用しうる例示の決定ルールを、以下の第5.5節でさらに詳しく記載する。
【００６２】
「敗血症の発症の予測」は、被験者が敗血症を発症しうるかどうかを決定することである。いずれのかかる予測も、決定するために用いる手段の精度により制限を受ける。本発明は、例えば、60%以上の精度で行う決定ルールを利用することによりこの決定を行う方法を提供する。本明細書で使用される用語「敗血症の発症の予測」は「敗血症の予測」と互換性がある。いくつかの実施形態において、敗血症の発症を予測する（敗血症を予測する）行為は、被験者から得た１以上のバイオマーカープロファイルを、敗血症の発症を示す決定ルールを用いて評価し、この評価の結果として、被験者が敗血症になりうることを示す決定ルールからの結果を受け取ることにより実施される。テスト被験者から得た１以上のバイオマーカープロファイルの決定ルールを用いるかかる評価は、かかる結果を得るために、１以上のバイオマーカープロファイルのいくつかまたは全ての特性を用いる。
【００６３】
用語「得る」および「得ること」は、それぞれ「有する」または「有すること」を意味する。これは、例えば、コンピューターデータシステム中のデータからデータを検索することにより行うことができる。これはまた、例えば、直接測定により行うこともできる。
【００６４】
本明細書で使用される、抗体の文脈における用語「特異的に」およびそれに類する用語は、抗原もしくは断片と特異的に結合しかつ他の抗原もしくは他の断片と特異的に結合しないペプチド、ポリペプチド、および抗体またはそれらのフラグメントを意味する。標準の実験技法により、例えば、当業者に周知のイムノアッセイにより測定して、ある抗原と特異的に結合するペプチドまたはポリペプチドは、より低い親和性で他のペプチドまたはポリペプチドと結合してもよい。かかるイムノアッセイとしては、限定されるものでないが、ラジオイムノアッセイ（RIA）および酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）が挙げられる。ある抗原と特異的に結合する抗体もしくはフラグメントは関係する抗原と交差反応性であってもよい。好ましくは、ある抗原と特異的に結合する抗体もしくはそのフラグメントは、他の抗原と交差反応しない。抗原-抗体相互作用、特異性および交差反応性、および以上の全てを決定する方法に関する考察については、例えば、本明細書に参照により組み入れられる、Paul、ed.、2003、Fundamental Immunology、5th ed.、Raven Press、New York at pages 69-105を参照されたい。
【００６５】
本明細書で使用される「被験者」は動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは非ヒト霊長類、および最も好ましくはヒトである。用語「被験者」、「個体」および「患者」は本明細書において互換的に使用される。
【００６６】
本明細書で使用される「テスト被験者」は、典型的には、決定ルールを構築するために使われる訓練集団に含まれない被験者である。テスト被験者は場合により、敗血症を有するかまたは敗血症を発症するリスクがあると疑われていてもよい。
【００６７】
本明細書で使用される用語「組織型」は組織の型である。組織は共通の胚起源または経路および類似の構造と機能をもつ多細胞生物の細胞の連合体である。組織の細胞は細胞膜に近接することが多いが、組織が液体（例えば、血液）であってもよい。組織の細胞は、全て1つの型（単組織、例えば、扁平上皮、植物柔組織）であっても、または１以上の型（混合組織、例えば、結合組織）であってもよい。
【００６８】
本明細書で使用される「訓練集団」は、敗血症を発症するリスクのある被験者のバイオマーカープロファイルを評価するために、データ分析アルゴリズムを用いて、決定ルールを構築するために使われた被験者の集団から得たサンプルのセットである。ある好ましい実施形態において、訓練集団は、転換者である被験者および非転換者である被験者から得たサンプルを含む。
【００６９】
本明細書で使用される「データ分析アルゴリズム」は、訓練集団に含まれる被験者のバイオマーカープロファイルを用いる決定ルールを構築するために使われたアルゴリズムである。代表的なデータ分析アルゴリズムを第5.5節に記載した。「決定ルール」はデータ分析アルゴリズムの最終産物であって1以上の数値セットにより特徴付けられ、ここで、これらの数値セットのそれぞれはSIRS、敗血症の発症、敗血症、または被験者が敗血症になりうる予測の態様を示す。ある特定の例において、数値セットは被験者が敗血症を発症しうるという予測を表す。他の例において、数値セットは被験者が敗血症を発症しな得ないという予測を表す。
【００７０】
本明細書で使用される用語「検証集団（validation population）」は、決定ルールの精度を決定するために用いられる被験者の集団から得たサンプルのセットである。ある好ましい実施形態において、検証集団は転換者である被験者および非転換者である被験者から得たサンプルを含む。ある好ましい実施形態において、検証集団は精度測定が求められる決定ルールを訓練するために用いる訓練集団の一部である被験者を含まない。
【００７１】
本明細書で使用される「数値セット」は、バイオマーカープロファイル中の値または値の範囲の組合わせである。この数値セットおよびその中の値の性質は、バイオマーカープロファイル中に存在する特性の型、および数値セットを要求する決定ルールを構築するために使うデータ分析アルゴリズムに依存する。説明のために、例示のバイオマーカープロファイル2：
2008538007.tif 000006
を再び考えてみよう。
【００７２】
本事例においては、訓練集団のそれぞれのメンバーのバイオマーカープロファイルを得た。それぞれのかかるバイオマーカープロファイルは、遺伝子Aの転写物に対する測定された特性、ここでは存在量、および遺伝子Bの転写物に対する測定された特性、ここでは存在量を含む。これらの特性値、ここでは存在量値が、決定ルールを構築するためのデータ分析アルゴリズムにより使われる。この事例において、データ分析アルゴリズムは、第5.5.1節に記載の決定ツリーであり、そしてこのデータ分析アルゴリズムの最終産物、決定ルールは決定ツリーである。例示の決定ツリーを図1に図解した。決定ルールは数値セットを規定する。1つのかかる数値セットは敗血症の発症の予測である。バイオマーカー特性値がこの数値セットを満足する被験者は、おそらく敗血症になると思われる。このクラスの例示の数値セットは例示の数値セット1：
2008538007.tif 000007
である。
【００７３】
他のかかる数値セットは敗血症に無関係な状態の予測である。バイオマーカー特性値がこの数値セットを満足する被験者はおそらく敗血症にならないと思われる。
【００７４】
このクラスの例示の数値セットは例示の数値セット2：
2008538007.tif 000008
である。
【００７５】
データ解析アルゴリズムがニューラルネットワーク解析でありかつこのニューラルネットワーク解析の最終産物が適当に重み付けされたニューラルネットワークである場合、1つの数値セットは、おそらく敗血症の発症であることを示す重み付けされたニューラルネットワークを生起しうるバイオマーカープロファイル特性値の範囲である。他の数値セットは、おそらく敗血症の発症でないことを示す重み付けされたニューラルネットワークを生起しうるバイオマーカープロファイル特性値の範囲である。
【００７６】
マイクロアレイの関係で本明細書で使用される、用語「プローブスポット」は、本明細書で「プローブ」で呼ばれて、サンプル中の特定の核酸の存在量を決定するために利用される１本鎖DNA分子（例えば、１本鎖cDNA分子または合成DNAオリゴマー）を意味する。例えば、プローブスポットを利用してテスト被験者から得た生物学的サンプル（例えば、細胞のコレクション）中のmRNAのレベルを決定することができる。特定の実施形態において、典型的なマイクロアレイは、ガラススライド（または他の基質）上の既知の格子位置に配置された複数のプローブスポットを含む。それぞれのプローブスポットに対する核酸は、ある遺伝子または目的の遺伝子の配列の１本鎖近接部分（例えば、10量体、11量体、12量体、13量体、14量体、15量体、16量体、17量体、18量体、19量体、20量体、21量体、22量体、23量体、24量体、25量体またはそれ以上の多量体）であり、そして特別な遺伝子または目的の遺伝子によりコードされるmRNAに対するプローブである。それぞれのプローブスポットは単一の核酸配列により特徴付けられ、そしてその相補的DNA鎖またはmRNA分子とだけハイブリダイゼーションが起こる条件のもとでハイブリダイズさせる。このように、1つの基質上に多数のプローブスポットがありうるのであって、それぞれがユニークな遺伝子または目的の配列を発現できる。さらに、2以上のプローブスポットが同じ遺伝子配列を発現できる。いくつかの実施形態においては、1つの標識した核酸サンプルを1つのプローブスポットとハイブリダイズさせ、そして1つのプローブスポットと特異的にハイブリダイズした標識した核酸の量を数値化して、特別な生物学的サンプル中のその特定の核酸（例えば、特別な遺伝子のmRNA転写物）のレベルを決定することができる。プローブ、プローブスポット、およびマイクロアレイは、一般的に、本明細書に参照によりその全てが組み入れられるDraghici, 2003, Data Analysis Tools for DNA Microarrays, Chapman & Hall/CRCの第2章に記載されている。
【００７７】
本明細書で使用される用語「注釈（annotation）データ」は、バイオマーカーの性質を記載するいずれかのデータの型を意味する。注釈データには、限定されるものでないが、生物学的経路メンバーシップ、酵素のクラス（例えば、ホスホジエステラーゼ、キナーゼ、メタロプロテイナーゼ、など）、タンパク質ドメイン情報、酵素の基質情報、酵素の反応情報、タンパク質相互作用データ、疾患関連、細胞の局在、組織型局在、および細胞型局在が含まれる。
【００７８】
本明細書で使用される用語「T-12」は、被験者が臨床的に敗血症と診断される前に血液を被験者から得た最後の時点を意味する。本発明においては、血液を24時間毎に被験者から採取するので、T-12は1つのプールの患者に対する敗血症発症前の平均時間を意味し、いくつかの患者は12時間標準より前に敗血症になりそしていくつかの患者は12時間標準の後に敗血症になる。しかし、1つのプールの被験者全体について、この最後の血液サンプルに対する平均時間は12時間標準、従って「T-12」である。
【００７９】
5.2  被験者をスクリーニングする方法
本発明は、テスト被験者から得た1以上の生物学的サンプルのそれぞれについて、敗血症を発症する疑いまたはリスクのある試験個体のバイオマーカープロファイルの2以上の特性の検出を介して、敗血症の正確で迅速な予測および／または診断を可能にする。一実施形態においては、この敗血症の予測または診断に用いるバイオマーカープロファイルを構築するために、テスト被験者から単一時点で採取した単一の生物学的サンプルしか必要としない。他の実施形態においては、敗血症の予測または診断に用いるバイオマーカープロファイルを構築するために、異なる時点にテスト被験者から採取した複数の生物学的サンプルを使用する。
【００８０】
本発明の特定の実施形態においては、敗血症またはSIRSを発症するリスクのある被験者を、本発明の方法を用いてスクリーニングする。これらの実施形態によると、本発明の方法を利用して、例えば、ICUに入院した被験者および／またはいくつかの種類の外傷（例えば、外科、交通事故、銃創など）を受けた被験者をスクリーニングすることができる。
【００８１】
特定の実施形態においては、例えば、血液などの生物学的サンプルを入院時に採取する。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは血液、血漿、血清、唾液、痰、尿、脳髄液、細胞、細胞抽出物、組織検体、組織生検、または便検体である。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは全血であり、この全血を用いてバイオマーカープロファイルの測定値を得る。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは全血のいくつかの成分である。例えば、いくつかの実施形態においては、血液の細胞画分中または液中のタンパク質、核酸、および／または他の分子（例えば、代謝物）の混合物のある部分（例えば血漿または血清画分）をバイオマーカープロファイルとして分解する。これは、バイオマーカープロファイル中のバイオマーカーの特性を測定することにより行うことができる。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは全血であるが、バイオマーカープロファイルは全血から単離された特定の細胞型のバイオマーカーから分解する。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは全血であるが、バイオマーカープロファイルは全血から単離された単球に発現されたまたはそうでなければ見出されたバイオマーカーから分解する。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは全血であるが、バイオマーカープロファイルは全血から単離された赤血球に発現されたまたはそうでなければ見出されたバイオマーカーから分解する。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは全血であるが、バイオマーカープロファイルは全血から単離された血小板に発現されたまたはそうでなければ見出されたバイオマーカーから分解する。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは全血であるが、バイオマーカープロファイルは全血から単離された好中球に発現されたまたはそうでなければ見出されたバイオマーカーから分解する。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは全血であるが、バイオマーカープロファイルは全血から単離された好酸球に発現されたまたはそうでなければ見出されたバイオマーカーから分解する。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは全血であるが、バイオマーカープロファイルは全血から単離された好塩基球に発現されたまたはそうでなければ見出されたバイオマーカーから分解する。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは全血であるが、バイオマーカープロファイルは全血から単離されたリンパ球に発現されたまたはそうでなければ見出されたバイオマーカーから分解する。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは全血であるが、バイオマーカープロファイルは全血から単離された単球に発現されたまたはそうでなければ見出されたバイオマーカーから分解する。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは全血であるが、バイオマーカープロファイルは赤血球、血小板、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、および単球からなる細胞型の群から得た1、2、3、4、5、6、または7の細胞型から分解する。
【００８２】
バイオマーカープロファイルは、複数の１以上の型のバイオマーカー（例えば、mRNA分子、cDNA分子、タンパク質および／または炭水化物など）、またはそれらの表示、それらと合わせて、バイオマーカーの測定可能な態様（例えば、存在量）などの特性を含む。バイオマーカープロファイルは、少なくとも2つのかかるバイオマーカーまたはそれらの表示を含んでもよく、その場合、バイオマーカーは例えば、核酸および炭水化物などの、同じまたは異なるクラスであってもよい。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195または200以上のバイオマーカーまたはそれらの表示を含む。一実施形態においては、バイオマーカープロファイルは数百、またはさらに数千のバイオマーカーまたはそれらの表示を含む。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50以上のバイオマーカーまたはそれらの表示を含む。1つの例においては、いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは、第5.11節の表Iから選択される、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50以上のバイオマーカー、またはそれらの表示を含む。他の例においては、いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは、第5.11節の表Jから選択される、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40以上のバイオマーカー、またはそれらの表示を含む。他の例においては、いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは、第5.11節の表Kに記載の、2、3、4、5、6、7、8、9のいずれか、または10の全てのバイオマーカーまたはそれらの表示を含む。
【００８３】
典型的な実施形態において、バイオマーカープロファイル中のそれぞれのバイオマーカーは特性により表現される。言い換えれば、バイオマーカーと特性の間には対応がある。いくつかの実施形態において、バイオマーカーと特性の間の対応は1：1であり、それぞれのバイオマーカーに対して特性が存在することを意味する。いくつかの実施形態においては、それぞれのバイオマーカーに対して１以上の特性が存在する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイル中の1つのバイオマーカーに対応する特性の数はバイオマーカープロファイル中の他のバイオマーカーに対応する特性の数と異なる。従って、いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195または200以上の特性を含んでもよく、ただし、バイオマーカープロファイル中に少なくとも2、3、4、5、6、または7以上のバイオマーカーが存在することを条件とする。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50以上の特性を含んでもよい。実施形態に関わらず、これらの特性は、いずれかの再現性のある測定技法または測定技法の組合わせを用いて決定することができる。かかる技法は当技術分野で周知である技法を含み、それには、本明細書に記載のいずれかの技法または、例えば、第5.4節（後記）に開示したいずれかの技法が含まれる。典型的には、かかる技法を使って、被験者から単一時点に得た1つの生物学的サンプルまたは複数の時点に得た複数のサンプルを用いて特性値を測定する。一実施形態において、被験者から採取したサンプルからバイオマーカープロファイルを得る例示の技法はcDNAマイクロアレイである（例えば、第5.4.1.2節および第6節、下記を参照）。他の実施形態においては、被験者から採取したサンプルからバイオマーカープロファイルを得る例示の技法は、タンパク質に基づくアッセイ、またはBD Cytometric Bead Array (CBA) Human Inflammation Kit Instruction Manual（BD Biosciences）などに記載の他の型のタンパク質に基づく技法、または米国特許第5,981,180号に記載のビーズアッセイである（前記文献のそれぞれは、全て、特に生物学的サンプル中のタンパク質濃度を試験する様々な方法の教示について、本明細書に参照により組み入れられる）。さらに他の実施形態においては、バイオマーカープロファイルは混合される、すなわち、バイオマーカープロファイルは、核酸またはそれらの表示であるいくつかのバイオマーカーまたはそれらの表示、およびタンパク質であるいくつかのバイオマーカーまたはそれらの表示を含むことを意味する。かかる実施形態においては、タンパク質に基づく技法および核酸に基づく技法の両方を用いて、被験者から採取した１以上のサンプルからバイオマーカープロファイルを得る。言い換えれば、核酸であるバイオマーカープロファイル中のバイオマーカーに関連する特性に対する特性値は、核酸に基づく測定技法（例えば、核酸マイクロアレイ）により取得し、���してタンパク質であるバイオマーカープロファイル中のバイオマーカーに関連する特性に対する特性値は、タンパク質に基づく測定技法により取得する。いくつかの実施形態においては、バイオマーカープロファイルをキット、例えば以下の第5.3節に記載のキットを用いて取得してもよい。
【００８４】
特定の実施形態においては、被験者を、被験者の敗血症またはSIRSを診断または予測するスクリーニングするための本発明の方法および組成物を用いて、必要な頻度で（例えば、ICUに入院している間）スクリーニングする。好ましい実施形態においては、被験者を、ICU到着後、まもなくスクリーニングする。いくつかの実施形態においては、被験者を、ICU到着後、毎日スクリーニングする。いくつかの実施形態においては、被験者を、ICU到着後、毎1〜4時間、1〜8時間、8〜12時間、12〜16時間、または16〜24時間にスクリーニングする。
【００８５】
5.3  キット
本発明はまた、被験者の敗血症の発症を診断または予測するかまたはSIRSを診断するのに有用であるキットも提供する。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、かかるバイオマーカーの存在または存在量を検出するための少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195または200以上のバイオマーカーおよび／または試薬を含む。他の実施形態において、本発明のキットは少なくとも2つ、だが、数百以上のバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、第5.11節の表Iから選択される少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50以上のバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、第5.11節の表Jから選択される少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40以上のバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、第5.11節の表Kから選択される少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9の、または10全てのバイオマーカーを含む。第5.1節に記載のバイオマーカーの定義によって、いくつかの事例では、バイオマーカーは事実上、遺伝子、mRNA、またはタンパク質自体よりもむしろ、例えば、遺伝子、mRNA、またはタンパク質の判別分子である。従って、バイオマーカーは、実際の遺伝子またはタンパク質それ自体であるより、むしろ第5.11節の表I、J、またはKのいずれか1つで同定された特定の遺伝子またはタンパク質、またはその断片の存在または存在量を示す分子でありうる。かかる判別分子は、時々、当技術分野では「試薬」と呼ばれる。いくつかの実施形態において、本発明のキットは少なくとも2つ、だが、数百以上のバイオマーカーを含む。
【００８６】
本発明のキットのバイオマーカーを用いて、本発明によるバイオマーカープロファイルを作製することができる。キットの化合物のクラスの例には、限定されるものでないが、タンパク質およびその断片、ペプチド、プロテオグリカン、糖タンパク質、リポタンパク質、炭水化物、脂質、核酸（例えば、cDNAまたは増幅されたDNAなどのDNA、またはmRNAなどのRNA）、有機または無機化学品、天然または合成のポリマー、小分子（例えば、代謝物）、または、前記のいずれかの判別分子または判別断片が含まれる。特定の実施形態において、バイオマーカーは特別なサイズである（例えば、少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、1000、2000、3000、5000、10k、20k、100kダルトンまたはそれより大きい）。バイオマーカーはアレイの一部であってもよく、またはバイオマーカーは別におよび／または個々に包装してもよい。キットはまた、本発明のバイオマーカープロファイルを作製するのに用いられる少なくとも1つの内部標準も含む。同様に、内部標準（1つまたは複数）は、先に記載の化合物のいずれのクラスのものであってもよい。
【００８７】
一実施形態においては、本発明は、例えば、マイクロアレイに見られる基質上のアドレス可能な位置に固定してもよいしまたは固定しなくてもよいプローブおよび／またはプライマーを含むキットを提供する。特定の実施形態においては、本発明はかかるマイクロアレイを提供する。
【００８８】
特定の実施形態においては、本発明はテスト被験者における敗血症の発症を予測するキットであって、表30、31、32、33、34、36、I、J、またはKのいずれか1つに掲げられたタンパク質に基づくバイオマーカーと特異的に結合する複数の抗体を含む前記キットを提供する。かかる実施形態において、抗体それ自体は本発明の範囲内のバイオマーカーである。この実施形態によれば、キットは、表30、31、32、33、34、36、I、J、またはKのいずれか1つに記載のタンパク質に基づくバイオマーカーの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195または200以上と特異的に結合する抗体または機能性フラグメントもしくはその誘導体（例えば、Fab、F(ab')2、Fv、またはscFvフラグメント）のセットを含んでもよい。この実施形態によれば、キットは、本発明のバイオマーカーと特異的に結合する抗体、フラグメントもしくはその誘導体（例えば、Fab、F(ab')2、Fv、またはscFvフラグメント）を含んでもよい。一実施形態においては、抗体を検出可能なように標識することができる。
【００８９】
特定の実施形態において、本発明は、第5.11節の表Iに掲げられた複数のタンパク質に基づくバイオマーカーと免疫特異的に結合する複数の抗体を含む、テスト被験者における敗血症の発症を予測するキットを提供する。この実施形態によれば、キットは、表Iに記載のバイオマーカーの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50以上と特異的に結合する抗体または機能性フラグメントもしくはその誘導体（例えば、Fab、F(ab')2、Fv、またはscFvフラグメント）のセットを含んでもよい。この実施形態によれば、キットは、本発明のバイオマーカーと特異的に結合する抗体、フラグメントもしくはその誘導体（例えば、Fab、F(ab')2、Fv、またはscFvフラグメント）を含んでもよい。一実施形態においては、抗体を検出可能なように標識することができる。
【００９０】
本発明の他の実施形態においては、キットは特異的なバイオマーカー結合成分、例えばアプタマーを含んでもよい。もしバイオマーカーが核酸を含むのであれば、キットは、バイオマーカーまたはバイオマーカーの相補鎖と２本鎖を形成できるオリゴヌクレオチドプローブを提供してもよい。オリゴヌクレオチドを検出可能なように標識することができる。かかる実施形態においては、プローブはそれ自体が本発明の範囲に入るバイオマーカーである。
【００９１】
本発明のキットはまた、バイオマーカープロファイルを構築するのに利用できるバッファーなどのさらなる組成物を含んでもよい。微生物の作用の予防は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの含有により保証することができる。等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを含有することも望ましい。
【００９２】
本発明のいくつかのキットはマイクロアレイを含む。一実施形態においては、このマイクロアレイは複数のプローブスポットを含み、その場合、複数のプローブスポット中の少なくとも20％のプローブスポットは表30、31、32、33、34、36、I、J、またはKのいずれか1つのバイオマーカーに対応する。いくつかの実施形態において、複数のプローブスポット中の少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、または少なくとも60％、または少なくとも80％のプローブスポットは表30、31、32、33、34、36、I、J、またはK.のいずれか1つのバイオマーカーに対応する。かかるプローブスポットは本発明の範囲内のバイオマーカーである。いくつかの実施形態において、マイクロアレイは、基質上の約3〜約100のプローブスポットからなる。この文脈で使用される用語「約」は、表明した値の5％以内、表明した値の10％以内、または表明した値の25％以内を意味する。いくつかの実施形態において、かかるマイクロアレイは、当業者に公知である技法を用いる、マイクロアレイ間の較正のための、または参照マイクロアレイなどの他のマイクロアレイとの較正のための1以上のプローブスポットを含有する。いくつかの実施形態において、かかるマイクロアレイは核酸マイクロアレイである。いくつかの実施形態において、かかるマイクロアレイはタンパク質マイクロアレイである。
【００９３】
本発明のいくつかのキットはさらに、コンピューターシステムと接続した使用するためのコンピュータープログラム製品を含み、その場合、コンピュータープログラム製品はコンピューター読取可能記憶媒体およびそれに包埋されたコンピュータープログラム機構を含む。かかるキットにおいて、コンピュータープログラム機構は、敗血症を発症するリスクのあるテスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第1の数値セットを満足するかどうかを評価する命令を含む。第1の数値セットを満足することは、テスト被験者が敗血症をおそらく発症することを予測する。一実施形態において、複数の特性は表30、31、32、33、34、36、I、J、またはKのいずれか1つに掲げられたバイオマーカーに対応する。いくつかのキットにおいて、コンピュータープログラム製品はさらに、テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第2の数値セットを満足するかどうかを評価する命令を含む。第2の数値セットを満足することはテスト被験者が敗血症をおそらく発症しないことを予測する。
【００９４】
本発明のいくつかのキットは、中央演算処理装置および中央演算処理装置に結合したメモリを有するコンピューターを含む。メモリは、敗血症を発症するリスクのあるテスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第1の数値セットを満足するかどうかを評価する命令を保存する。第1の数値セットを満足することは、テスト被験者が敗血症をおそらく発症することを予測する。一実施形態においては、複数の特性は、表30、31、32、33、34、36、I、J、またはKのいずれか1つに掲げられたバイオマーカーに対応する。
【００９５】
図35は、前記の機能を支援する例示のシステムの詳細である。本システムは好ましくは、次のユニットから構成されるコンピューターシステム10である：
・中央演算処理装置22；
・主不揮発性記憶装置14［例えば、ソフトウエアおよびデータを保存するためのハードディスクドライブであり、記憶制御器12により制御される］；
・システムメモリ36［好ましくは、高速ランダムアクセスメモリ（RAM）であり、システム制御プログラム、データ、およびアプリケーションプログラムを保存するためのものであり、不揮発性記憶装置14から供給されたプログラムおよびデータを含み、また、読取専用メモリ（ROM）も含む］；
・ユーザーインターフェース32［１以上の入力デバイス（例えば、キーボード28）およびディスプレイ26または他の出力デバイスを含む］；
・ネットワークインターフェースカード20［有線または無線通信ネットワーク34（例えば、インターネットなどの広域ネットワーク）と接続するため］；
・内部バス30［システムの上述のエレメントを相互接続するため］；および
・電力供給源24［上述のエレメントに電力を送る］。
【００９６】
コンピューター10のオペレーションは主に、中央演算処理装置22が実行するシステム40により制御される。オペレーティングシステム40はシステムメモリ36内に保存することができる。典型的なやり方では、システムメモリ36はオペレーティングシステム40に加えて、
・本発明が使用する様々なファイルおよびデータ構造へのアクセスを制御するファイルシステム42；
・本発明により１以上の決定ルールを構築するのに使用される訓練データセット44；
・訓練データを加工しかつ決定ルールを構築するデータ解析アルゴリズムモジュール54；
・１以上の決定ルール56；
・テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第1の数値セットまたは第2の数値セットを満足するかどうかを決定する、バイオマーカープロファイル評価モジュール60；
・バイオマーカー64およびそれぞれのかかるバイオマーカーに対する特性66を含む、テスト被験者バイオマーカープロファイル62；ならびに
・本発明の選択バイオマーカー68（例えば、表30および／または表Iおよび／または表Jおよび／または表K、および／または表Lおよび／または表Mおよび／または表Nおよび／または表Oなど）および／またはこれらの選択バイオマーカーのそれぞれに対する１以上の特性のデータベース
を含んでなる。
【００９７】
訓練データセット46は、複数の被験者に対するデータ46を含む。それぞれの被験者記録46に対して、被験者確認子48および複数のバイオマーカー50が存在する。それぞれのバイオマーカー50に対して、少なくとも1つの特性52が存在する。図35に示されてないが、それぞれの特性52に対して特性値が存在する。データ解析アルゴリズムを用いて構築されたそれぞれの決定ルール56に対して、少なくとも1つの決定ルール数値セット58が存在する。
【００９８】
図35に図解したように、コンピューター10はソフトウエアプログラムモジュールおよびデータ構造を含む。コンピューター10に保存されたデータ構造は、訓練データセット44、決定ルール56、テスト被験者バイオマーカープロファイル62、およびバイオマーカーデータベース68を含む。これらのデータ構造のそれぞれは、限定されるものでないが、フラットASCIIまたはバイナリーファイル、Excelスプレッドシート、リレーショナルデータベース（SQL）、またはオンライン分析処理（OLAP）データベース（MDXおよび／またはその変形）を含むいずれの型のデータ保存システムを含んでもよい。いくつかの特定の実施形態において、かかるデータ構造はそれぞれ、階層構造（例えば、スタースキーム）を含む１以上のデータベースの形態である。いくつかの実施形態において、かかるデータ構造はそれぞれ、明示的階層構造を有しないデータベースの形態である（例えば、階層構造にアレンジされてないディメンション表）。
【００９９】
いくつかの実施形態において、システム10に保存されているまたはアクセス可能なデータ構造はそれぞれ単一データ構造である。他の実施形態においては、かかるデータ構造は、実際に、前記コンピューター10がホストであってもよいまたは全てがホストでなくてもよい複数のデータ構造（例えば、データベース、ファイル、アーカイブ）を含む。例えば、いくつかの実施形態において、訓練データセット44は、コンピューター10上におよび／またはコンピューター10が広域ネットワーク34を介してアドレス可能であるコンピューター上のいずれかに保存されている複数のExcelスプレッドシートを含む。他の例において、訓練データセット44は、コンピューター10上に保存されているまたはコンピューター10が広域ネットワーク34を介してアドレス可能である１以上のコンピューターを介して配布されているデータベースを含む。
【０１００】
図35に図解した多数のモジュールおよびデータ構造を１以上のリモートコンピューター上に配置できることは理解しうるであろう。例えば、本出願のいくつかの実施形態はウエブサービスタイプの実行である。かかる実施形態において、バイオマーカープロファイル評価モジュール60および／または他のモジュールは、コンピューター10とネットワーク34を介してつながっているクライアントコンピューター上に存在してもよい。いくつかの実施形態において、例えば、バイオマーカープロファイル評価モジュール60はインタラクティブなウエブページであってもよい。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、図35に図解した訓練データセット44、決定ルール56、および／またはバイオマーカーデータベース68は、単一コンピューター（コンピューター10）上にあり、そして他の実施形態においては１以上のかかるデータ構造およびモジュールのホストは１以上のリモートコンピューターである（示してない）。１以上のコンピューター上の図35に図解したデータ構造およびソフトウエアモジュールの配置は、これらのデータ構造およびソフトウエアモジュールがネットワーク34を介してまたは他の電子工学的手段によりお互いにアドレス可能である限り、本発明の範囲内にある。従って、本発明は広いコンピューターシステムのアレイを全て包含する。
【０１０２】
さらに本発明の他のキットは、テスト被験者がおそらく敗血症またはSIRSを発症するかどうかを評価するための、コンピューターおよびコンピューター読取可能媒体を含む。例えば、本発明の一実施形態は、コンピューターシステムと結合して使用するためのコンピュータープログラム製品を提供する。コンピュータープログラム製品は、コンピューター読取可能記憶媒体およびそれに包埋されたコンピュータープログラム機構を含む。コンピュータープログラム機構は、敗血症を発症するリスクのあるテスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第1の数値セットを満足するかどうかを評価する命令を含む。第1の数値セットを満足することは、テスト被験者が敗血症をおそらく発症することを予測する。複数の特性は、複数のバイオマーカーの測定可能な態様であり、その場合、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも3つのバイオマーカーを含む。ある特定の実施形態において、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも6つのバイオマーカーを含み、その場合、複数のバイオマーカーはIL-6およびIL-8の両方を含む。いくつかの実施形態において、コンピュータープログラム製品はさらに、テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第2の数値セットを満足するかどうかを評価する命令を含む。第2の数値セットを満足することは、テスト被験者が敗血症をおそらく発症しないであろうと予測する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは表Iに掲げられた3〜50のバイオマーカー、表Iに掲げられた3〜40のバイオマーカー、表Iに掲げられた少なくとも4つのバイオマーカー、または表Iに掲げられた少なくとも8つのバイオマーカーを有する。
【０１０３】
本発明の他のキットは、中央演算処理装置および中央演算処理装置に結合したメモリを含む。メモリは敗血症を発症するリスクのあるテスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第1の数値セットを満足するかどうかを評価する命令を保存する。第1の数値セットを満足することは、テスト被験者が敗血症をおそらく発症することを予測する。複数の特性は複数のバイオマーカーの測定可能な態様である。この複数のバイオマーカーは表Iから得た少なくとも3つのバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカーは、複数のバイオマーカーがIL-6およびIL-8の両方を含むときは、表Iに掲げられた少なくとも6つのバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、メモリはさらに、テスト被験者におけるバイオマーカープロファイルの複数の特性が第2の数値セットを満足するかどうかを評価する命令を保存し、その場合、第2の数値セットを満足することはテスト被験者が敗血症をおそらく発症しないことを予測する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは表Iに掲げられた3〜50のバイオマーカー、表Iに掲げられた3〜40のバイオマーカー、表Iに掲げられた少なくとも4つのバイオマーカー、または表Iに掲げられた少なくとも8つのバイオマーカーを含む。
【０１０４】
本発明による他のキットは、被験者が敗血症をおそらく発症するかどうかを決定するためのコンピューターシステムを含む。コンピューターシステムは中央演算処理装置および中央演算処理装置に結合したメモリを含む。メモリはテスト被験者のバイオマーカープロファイルを得るための命令を保存する。バイオマーカープロファイルは複数の特性を含む。複数の特性中のそれぞれの特性は、複数のバイオマーカー中の対応するバイオマーカーの測定可能な態様である。複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも3つのバイオマーカーを含む。メモリはさらに、バイオマーカープロファイルをリモートコンピューターへ伝達する命令を含む。リモートコンピューターはテスト被験者のバイオマーカープロファイルの複数の特性が第1の数値セットを満足するかどうかを評価する命令を含む。第1の数値セットを満足することは、テスト被験者が敗血症をおそらく発症することを予測する。メモリはさらに、テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第1の数値セットを満足するかどうかについての、リモートコンピューターからの決定を受ける命令を含む。メモリはまた、テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第1の数値セットを満足するかどうかを報告する命令も含む。いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカーがIL-6およびIL-8の両方を含むときは、複数のバイオマーカーはIに掲げられた少なくとも6つの、表バイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、リモートコンピューターはさらに、テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第2の数値セットを満足するかどうかを評価する命令も含む。第2の数値セットを満足することは、テスト被験者が敗血症をおそらく発症しないことを予測する。かかる実施形態において、メモリはさらに、テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第2の数値セットを満足するかどうかについての、リモートコンピューターからの決定を受ける命令、ならびにテスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第2の数値セットを満足するかどうかを報告する命令を含む。いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも4つのバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも6つのバイオマーカーを含む。
【０１０５】
本発明のなお他の態様は、バイオマーカープロファイル中の複数の特性のそれぞれに対するそれぞれの値を含む搬送波上に表現されたデジタルシグナルを含む。複数の特性は複数のバイオマーカーの測定可能な態様である。複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも3つのバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカーがIL-6とIL-8の両方を含むときは、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも6つのバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも4つのバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも8つのバイオマーカーを含む。
【０１０６】
本発明のなお他の態様は、バイオマーカープロファイルにおけるテスト被験者の複数の特性がある数値セットを満足するかどうかの決定を含む、搬送波上に表現されたデジタルシグナルを提供する。複数の特性は複数のバイオマーカーの測定可能な態様である。この複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも3つのバイオマーカーを含む。数値セットを満足することはテスト被験者が恐らく敗血症を発症することを予測する。いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカーがIL-6とIL-8の両方を含むときは、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも6つのバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも4つのバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカー表Iに掲げられたは少なくとも8つのバイオマーカーを含む。
【０１０７】
なお他の実施形態は、バイオマーカープロファイルにおけるテスト被験者の複数の特性がある数値セットを満足するかどうかの決定を含む、搬送波上に表現されたデジタルシグナルを提供する。複数の特性は複数のバイオマーカーの測定可能な態様である。複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも3つのバイオマーカーを含む。数値セットを満足することはテスト被験者が恐らく敗血症を発症しないことを予測する。いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカーがIL-6とIL-8の両方を含むときは、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも6つのバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも4つのバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカー表Iに掲げられたは少なくとも8つのバイオマーカーを含む。
【０１０８】
本発明のなお他の実施形態は、被験者が敗血症をおそらく発症するかどうかを決定するためのグラフィカルユーザーインターフェースを提供する。グラフィカルユーザーインターフェースは、リモートコンピューターから受ける搬送波上に表現されたデジタルシグナルにコードされた結果を表示する表示領域を含む。複数の特性は複数のバイオマーカーの測定可能な態様である。複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも3つのバイオマーカーを含む。テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第1の数値セットを満足する場合、結果は第1の値を有する。テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第2の数値セットを満足する場合、結果は第2の値を有する。いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカーがIL-6とIL-8の両方を含むときは、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも6つのバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも4つのバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも8つのバイオマーカーを含む。
【０１０９】
本発明のなお他のキットは、被験者が敗血症をおそらく発症するかどうかを決定するためのコンピューターシステムを提供する。コンピューターシステムは中央演算処理装置および中央演算処理装置に結合したメモリを含む。メモリはテスト被験者のバイオマーカープロファイルを得るための命令を保存する。バイオマーカープロファイルは複数の特性を含む。複数の特性は複数のバイオマーカーの測定可能な態様である。複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも3つのバイオマーカーを含む。メモリはさらに、テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が 第1の数値セットを満足するかどうかを評価する命令を保存する。第1の数値セットを満足することは、テスト被験者が敗血症をおそらく発症することを予測する。メモリはまた、テスト被験者のバイオマーカープロファイル中の複数の特性が第1の数値セットを満足するかどうかを報告する命令も保存する。いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカーがIL-6とIL-8の両方を含むときは、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも6つのバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも4つのバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、複数のバイオマーカーは表Iに掲げられた少なくとも8つのバイオマーカーを含む。
【０１１０】
5.4  バイオマーカープロファイルの作製
一実施形態によれば、本発明の方法は被験者より採取した生物学的サンプルからバイオマーカープロファイルを作製することを含む。生物学的サンプルは、例えば、全血、血漿、血清、赤血球、血小板、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球、唾液、痰、尿、脳髄液、細胞、細胞抽出液、組織サンプル、組織生検、便サンプル、または被験者から当業者に周知の技法を用いて得ることができるいずれのサンプルであってもよい。特定の実施形態において、バイオマーカープロファイルは被験者から１以上の分離した時点に採取したサンプルを用いて決定される。他の特定の実施形態において、バイオマーカーは被験者から分離した時点に採取したサンプルを用いて作製される。1つの例において、これらのサンプルは、被験者から、1回または、代わりに、日基準で、またはもっとしばしば、例えば、毎4、6、8または12時間に取得する。特定の実施形態においては、バイオマーカープロファイルを単一組織型から採取したサンプルを用いて決定する。他の特定の実施形態においては、バイオマーカープロファイルを少なくとも2つの異なる組織型から採取したサンプルを用いて決定する。
【０１１１】
5.4.1  核酸バイオマーカーを検出する方法
本発明の特定の実施形態において、バイオマーカープロファイル中のバイオマーカーは核酸である。かかるバイオマーカーおよび対応するバイオマーカープロファイルの特性は、例えば、本明細書に記載の１以上の遺伝子（表30、表I、表J、または表Kに掲げられた遺伝子）の発現産物（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）を検出することにより作製することができる。特定の実施形態において、バイオマーカーおよび対応するバイオマーカープロファイルの特性は、本明細書に開示された遺伝子（例えば、表30、表I、表J、または表Kに掲げられた遺伝子）から発現される１以上の核酸を、限定されるものでないが、ハイブリダイゼーション、マイクロアレイ分析、RT-PCR、ヌクレアーゼ保護アッセイおよびノーザンブロット分析を含む当業者に周知のいずれかの方法を用いて検出および／または分析することにより取得する。
【０１１２】
ある特定の実施形態においては、本発明の方法および組成物により検出および／または分析される核酸には、例えば、メッセンジャーRNA（mRNA）分子を含む発現されたRNA分子、mRNAスプライス変異体ならびに制御RNA、cRNA分子（例えば、in vitroで転写された、cDNA分子から調製されたRNA分子）およびその判別断片などのRNA分子が含まれる。本発明の方法および組成物により検出および／または分析される核酸にはまた、例えば、ゲノムDNA分子、cDNA分子、およびその判別断片（例えば、オリゴヌクレオチド、EST、STS、など）などのDNA分子も含まれる。
【０１１３】
本発明の方法および組成物により検出および／または分析される核酸分子は、サンプルから単離されたゲノムまたはゲノム外DNA分子、または生物学的サンプル中に存在する、生物学的サンプルから単離された、または生物学的サンプル由来のmRNA分子などのRNA分子などの天然の核酸分子であってもよい。本発明の方法および組成物により検出および／または分析される核酸のサンプルは、例えば、DNA、RNA、またはDNA およびRNAのコポリマーの分子を含む。一般に、これらの核酸は、特定の遺伝子または遺伝子の対立遺伝子に、または特定の遺伝子転写物に（例えば、特定の細胞型で発現される特定のmRNA配列に、またはかかるmRNA配列に由来する特定のcDNA配列に）対応する。本発明の方法および組成物により検出および／または分析される核酸は、例えば、その遺伝子の異なるスプライス変異体を検出および／または分析できるように、同じ遺伝子の異なるエキソンに対応してもよい。
【０１１４】
特定の実施形態においては、核酸を、生物学的サンプルから単離したまたは部分的に単離した核酸からin vitroで調製する。例えば、一実施形態においては、RNAをサンプル（例えば、全細胞のRNA、ポリ(A)＋メッセンジャーRNA、それらの画分）から抽出しそしてメッセンジャーRNAを全抽出RNAから精製する。全およびポリ(A)＋RNAを調製する方法は、当技術分野で周知であり、そして一般に、例えば、Sambrookら, 2001, Molecular Cloning： A Laboratory Manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press （Cold Spring Harbor, New York）（本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）に記載されている。一実施形態においては、RNAをグアニジニウムチオシアネート溶解を用いてサンプルから抽出し、次いでCsCl密度勾配法で遠心分離し、そしてオリゴdT精製を行う（Chirgwinら, 1979、Biochemistry 18：5294- 5299）。他の実施形態においては、RNAをグアニジニウムチオシアネート溶解を用いてサンプルから抽出し、次いでRNeasyカラム（Qiagen、Valencia、California）で精製を行う。次いでcDNAを、精製したmRNAから、例えばoligo-dTまたはランダムプライマーを用いて合成する。特定の実施形態において、標的核酸は、サンプルから抽出して精製メッセンジャーRNAから調製したcRNAである。本明細書で使用される、cRNAは、ソースRNAと相補的なRNAとしてここでは定義される。抽出したRNAの増幅は、アンチセンスRNAの転写を指令できる方向でRNAポリメラーゼプロモーターと連結したプライマーを用いて２本鎖DNAをRNAから合成する方法を利用して行う。次いで、アンチセンスRNAまたはcRNAを２本鎖cDNAの第2鎖からRNAポリメラーゼを用いて転写する（例えば、米国特許第5,891,636号、第5,716,785号、第5,545,522号および第6,132,997号を参照、これらは本明細書に参照により組み入れられる）。両方のオリゴdTプライマー（本明細書に参照により組み入れられる、米国特許第5,545,522号および第6,132,99号）またはRNAポリメラーゼプロモーターまたはその相補体を含有するランダムプライマーを用いてもよい。いくつかの実施形態において、標的核酸は、サンプルの元来の核酸集団を表す短いおよび／または断片化した核酸分子である。
【０１１５】
一実施形態においては、本発明の核酸を検出可能なように標識してもよい。例えば、cDNAを直接的に、例えば、ヌクレオチド類似体を用いて、または間接的に、例えば、第1鎖をテンプレートとして用いて、標識された第2のcDNA鎖を作ることにより標識することができる。あるいは、2本鎖cDNAをcRNAに転写しかつ標識することができる。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、例えば、ヌクレオチド類似体の組込みによる蛍光標識である。本発明に用いるのに好適な他の標識としては、限定されるものでないが、ビオチン、イミノビオチン、抗原、補因子、ジニトロフェノール、リポ酸、オレフィン化合物、検出可能なポリペプチド、電子リッチ分子、基質に対する作用により検出可能なシグナルを発生しうる酵素、および放射性同位体が挙げられる。好適な放射性同位体としては32P、35S、14C、15Nおよび125Iが挙げられる。本発明に好適な蛍光分子としては、限定されるものでないが、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、テキサスレッド、5'カルボキシ-フルオレセイン（FMA）、6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン、スクシンイミジルエステル（JOE）、6- カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）、6Nカルボキシ-X-ローダミン（ROX）、HEX、TET、IRD40、およびIRD41が挙げられる。本発明に好適である蛍光分子としては、限定されるものでないが、さらに、限定されないが、Cy3、Cy3.5およびCy5を含むシアニン色素；限定されないが、BODIPY-FL、BODIPY-TR、BODIPY-TMR、BODIPY-630/650、BODIPY-650/670を含むBODIPY色素； および限定されないが、ALEXA-488、ALEXA-532、ALEXA-546、ALEXA-568、および ALEXA-594を含むALEXA色素；ならびに当業者に公知でありうる他の蛍光色素が挙げられるが、これらに限定されるものでない。本発明に好適な電子リッチ指標分子としては、限定されるものでないが、フェリチン、ヘモシアニンおよび金コロイドが挙げられる。あるいは、いくつかの実施形態において、標的核酸を、核酸の第1グループと特異的に複合体を形成させることにより標識することができる。指標分子と共有結合しかつ第1グループと親和性を有する第2グループを利用して間接的に標的核酸を検出することができる。かかる実施形態において、第1グループとして用いるのに好適な化合物としては、限定されるものでないが、ビオチンおよびイムノビオチンが挙げられる。第2グループとして用いるのに好適な化合物としては、限定
されるものでないが、アビジンおよびストレプトアビジンが挙げられる。
【０１１７】
5.4.1.1  核酸アレイ
本発明のある特定の実施形態においては、本明細書に記載のいずれか１以上の遺伝子（例えば、表30、表I、表Jまたは表Kに掲げられた遺伝子）の発現を検出することにより、核酸アレイを使ってバイオマーカープロファイル中のバイオマーカー特性を作製する。本発明の一実施形態においては、cDNAマイクロアレイなどのマイクロアレイを用いてバイオマーカープロファイル中のバイオマーカーの特性値を決定する。cDNAアレイの診断利用は当技術分野で周知である（例えば、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Zouら, 2002, Oncogene 21:4855-4862；ならびにDraghici, 2003, Data Analysis Tools for DNA Microarrays, Chapman & Hall/CRCを参照）。cDNAマイクロアレイ分析についての例示の方法を、以下におよび第6節の実施例（下記参照）に記載する。
【０１１８】
ある特定の実施形態において、バイオマーカープロファイル中のバイオマーカー特性値は、生物学的サンプル中に存在するmRNA転写物中の核酸配列を表すかまたは対応する検出可能に標識された核酸（例えば、サンプルから合成した蛍光標識されたcDNA）を、１以上のプローブスポットを含んでなるマイクロアレイとハイブリダイズさせることにより得られる。
【０１１９】
核酸アレイ、例えば、マイクロアレイは、多数の方法で作ることができ、それらのいくつかを以下に記載する。好ましくは、アレイは再現性があり、所与のアレイの複数コピーを作製することができ、そして前記マイクロアレイから得られる結果はお互いに比較しうる。好ましくは、アレイを、結合（例えば、核酸ハイブリダイゼーション）条件のもとで安定である材料から作る。当業者は、試験プローブをアレイ上のプローブスポットとハイブリダイズさせるための好適な支持体、基質または担体を知っておりかつ日常的な実験を用いてそれを確認できるであろう。
【０１２０】
使用するアレイ、例えば、マイクロアレイは１以上の試験プローブを含みうる。いくつかの実施形態において、それぞれのかかる試験プローブは、検出すべきRNAまたはDNAのサブ配列と相補的である核酸配列を含む。それぞれのプローブは、典型的には異なる核酸配列を有し、アレイの固体表面上のそれぞれのプローブの位置は通常既知であるかまたは確認することができる。本発明に有用なアレイには、本明細書に記載の遺伝子（例えば、表30、表I、表Jまたは表Kに掲げられた遺伝子）を定性的、定量的または半定量的に測定することができる、例えば、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、cDNAに基づくアレイ、SNPアレイ、スプライス変異体アレイおよびいずれか他のアレイが含まれる。いくつかのマイクロアレイのタイプはアドレス可能なアレイである。さらに特定すると、いくつかのマイクロアレイは位置的にアドレス可能なアレイである。いくつかの実施形態において、アレイのそれぞれのプローブは、固体支持体上の既知の、所定の位置に配置され、それぞれのプローブの同定（例えば、配列）は、アレイ（例えば、支持体または表面）上の位置から決定することができる。いくつかの実施形態において、アレイは整列されたアレイである。マイクロアレイの概要は、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Draghici, 2003, Data Analysis Tools for DNA Microarrays, Chapman & Hall/CRCに記載されている。
【０１２１】
本発明のいくつかの実施形態において、発現された転写物（例えば、本明細書に記載の遺伝子の転写物）は核酸アレイで表現される。かかる実施形態において、結合部位のセットは、発現される転写物の色々な配列セグメントに相補的である色々な核酸をもつプローブを含みうる。このクラスに入る例示の核酸は、15〜200塩基、20〜100塩基、25〜50塩基、40〜60塩基またはある他の範囲の塩基の長さでありうる。それぞれのプローブ配列はまた、その標的配列と相補的である配列に加えて、１以上のリンカー配列を含んでもよい。本明細書で使用されるリンカー配列は、その標的配列に相補的である配列と支持体表面との間の配列である。例えば、本発明の核酸アレイはそれぞれの標的遺伝子またはエキソンに特異的な1つのプローブを含んでもよい。しかし、所望であれば、核酸アレイは、少なくとも2、5、10、100、または 1000以上の、いくつかの発現された転写物（例えば、本明細書に、例えば、表30、表 I、表 J、または 表 Kに記載の遺伝子の転写物）に特異的なプローブを含んでもよい。例えば、アレイは、遺伝子の最も長いmRNAアイソタイプの配列全体に貼り付けられたプローブを含有してもよい。
【０１２２】
細胞、例えば、生物学的サンプル中の細胞のRNAと相補的なcDNAを作って、マイクロアレイと好適なハイブリダイゼーション条件のもとでハイブリダイズさせると、本明細書に記載の遺伝子（例えば、表30、表I、表J、または表Kに掲げられた遺伝子）に対応するアレイの部位とのハイブリダイゼーションのレベルは、その遺伝子から転写されたmRNAの、細胞中の存在率を反映しうることは理解されよう。あるいは、特定の遺伝子により作られた複数のアイソタイプまたは代わりのスプライス変異体を識別しようとする場合、全細胞mRNAと相補的であり、検出可能なように（例えば蛍光体で）標識されたcDNAをマイクロアレイとハイブリダイズさせてもよく、そうすると、細胞内で転写されないかまたはRNAスプライシングの間に除去される遺伝子のエキソンに対応するアレイの部位はシグナル（例えば、蛍光シグナル）がわずかしかないかまたは全くないであろう、そして、エキソンを発現するコードされたmRNAが多く存在する遺伝子のエキソンに対応する部位は相対的に強いシグナルを有しうる。代わりのスプライシングにより同じ遺伝子から作られた異なるmRNAの相対的存在量は、次いで、遺伝子をモニターするエキソンの全セットにわたるシグナル強度パターンより決定される。
【０１２３】
一実施形態においては、異なるハイブリダイゼーション時間におけるハイブリダイゼーションレベルを、異なる、同一のマイクロアレイで別々に測定する。それぞれのかかる測定に対して、ハイブリダイゼーションレベルを測定するハイブリダイゼーション時間に、好ましくは室温で、高ないし中度の塩濃度（例えば、0.5〜3M塩濃度）の水溶液中で、全ての結合したまたはハイブリダイズした核酸を保持する一方、全ての無結合の核酸を除去する条件下で、マイクロアレイを簡単に洗浄する。次に、それぞれのプローブ上の残る、ハイブリダイズした核酸分子上の検出可能な標識を、用いた特定の標識方法に適当である方法により測定する。次いで、得られるハイブリダイゼーションレベルを組合わせてハイブリダイゼーション曲線を作る。他の実施形態においては、ハイブリダイゼーションレベルを、単一マイクロアレイを用いてリアルタイムで測定する。この実施形態においては、マイクロアレイをサンプルと中断することなくハイブリダイズさせ、そしてマイクロアレイをそれぞれのハイブリダイゼーション時間に非浸入的方法で問い合わせる。さらに他の実施形態においては、1つのアレイを使用し、短時間、ハイブリダイズさせ、洗浄し、そしてハイブリダイゼーションレベルを測定し、同じサンプルを戻して、他の時間、ハイブリダイズさせ、洗浄し、再び測定してハイブリダイゼーション時間曲線を得る。
【０１２４】
いくつかの実施形態においては、核酸ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を、分析すべき核酸バイオマーカーがアレイの相補的核酸配列、典型的にはその相補的DNAが位置する特定のアレイ部位と特異的に結合または特異的にハイブリダイズするように選択する。
【０１２５】
そこに位置する２本鎖のプローブDNAを含有するアレイを、DNAを1本鎖に変性する条件で処理して、その後に標的核酸分子と接触させてもよい。1本鎖プローブDNA（例えば、合成オリゴデオキシリボ核酸）を含有するアレイは、標的核酸分子と接触させる前に変性して自己相補性配列により生成するヘアピンまたは2量体を除く必要がありうる。
【０１２６】
最適なハイブリダイゼーション条件は、プローブおよび標的核酸の長さ（例えば、200塩基より大きい、オリゴマー対ポリヌクレオチド）および型（例えば、RNA、またはDNA）に依存しうる。核酸の特異的（すなわち、ストリンジェントな）ハイブリダイゼーション条件に対する一般的パラメーターは、Sambrookら（前記）およびAusubelら, 1988, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New Yorkに記載されている。ShenaらのcDNAマイクロアレイを用いるとき、典型的なハイブリダイゼーション条件は、5 X SSC＋0.2% SDS中で65℃にて4時間のハイブリダイゼーション、次いで、25℃にて低ストリンジェンシー洗浄バッファー（1 X SSC ＋ 0.2% SDS）による洗浄、次いで、10分間、25℃にてより高いストリンジェンシー洗浄バッファー（0.1 X SSC ＋ 0.2% SDS）による洗浄を行う（Shenaら, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93：10614）。有用なハイブリダイゼーション条件も、例えば、Tijessen, 1993, Hybridization With Nucleic Acid Probes, Elsevier Science Publishers B.V.；Kricka,1992, Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press, San Diego, CA；およびZouら, 2002, Oncogene 21:4855-4862；およびDraghici, Data Analysis Tools for DNA Microanalysis, 2003, CRC Press LLC, Boca Raton, Florida, pp. 342-343（これらは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）に提供されている。
【０１２７】
特定の実施形態においては、マイクロアレイを用いて、例えば、以下の5.4.1.2節に記載の方法により作製しておいたRT-PCR産物をソートして取り出すことができる。
【０１２８】
5.4.1.2  RT-PCR
ある特定の実施形態においては、本発明のバイオマーカープロファイル中のバイオマーカーの特性値を決定するために、本明細書に記載の１以上の遺伝子（例えば、表30、表I、表J、または表Kに掲げられた遺伝子）の発現レベルは、RNAをサンプルからポリメラーゼ連鎖反応（PCR）と組み合わせた逆転写（RT）を用いて増幅することにより測定される。この実施形態によれば、逆転写は定量的であってもまたは半定量的であってもよい。本明細書で教示するRT-PCR方法は、例えば、5.4.1.1節で先に記載したマイクロアレイ方法と組合わせて使用される。例えば、バルクPCR反応を実施し、PCR産物を分解してマイクロアレイ上のプローブスポットとして用いる。
【０１２９】
サンプルから得た全RNAまたはmRNAをテンプレートおよび遺伝子の転写部分に特異的なプライマーとして用いて、逆転写を開始する。RNAをcDNAに逆転写する方法は周知であり、Sambrookら、2001（前掲）に記載されている。プライマー設計は、出版されているかまたはGenBankなどのいずれかの公共で利用しうる配列データベースから入手しうる公知のヌクレオチド配列に基づいて実施することができる。例えば、プライマーを、本明細書（例えば、表30、表 I、表 J、または 表 Kを参照）に記載の遺伝子のいずれかについて設計することができる。さらに、プライマー設計は、市販ソフトウエア（例えば、Primer Designer 1.0、Scientific Software など）を利用することにより実施することができる。続いて、逆転写の産物をPCRのためのテンプレートとして用いる。
【０１３０】
PCRは、熱に安定でDNA依存性のDNAポリメラーゼが触媒作用をする多サイクルのDNA複製を利用することにより、特定の核酸配列を迅速に増幅して目的の標的配列を増幅する方法を提供する。PCRは、増幅すべき核酸、増幅すべき配列に隣接する２本鎖オリゴヌクレオチドプライマー、DNAポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、バッファーおよび塩の存在を必要とする。PCRの方法は当技術分野で周知である。PCRは、例えば、本明細書に参照によりその全てが組み入れられるMullis および Faloona、1987、Methods Enzymol. 155：335に記載のように実施する。
【０１３１】
PCRは、テンプレートDNAまたはcDNA（少なくとも1fg；より有用なのは、1〜1000ng）および少なくとも25pmolのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて実施できる。典型的な反応混合物は、2μlのDNA、25pmolのオリゴヌクレオチドプライマー、2.5μlの10M PCRバッファー1（Perkin-Elmer、Foster City、CA）、0.4μlの1.25M dNTP、0.15μl（または2.5ユニット）のTaq DNAポリメラーゼ（Perkin Elmer、Foster City、CA）および全体積が25μlとなる脱イオン水を含む。鉱油をオーバーレイし、PCRはプログラム可能なサーマルサイクラーを用いて実施する。
【０１３２】
PCRサイクルの各ステップの長さと温度、ならびにサイクル数を、実際に必要なストリンジェンシーに応じて調節する。アニーリング温度およびタイミングは、プライマーがテンプレートにアニーリングすると予想される効率と許容されるミスマッチの程度の両方により決定する。プライマーアニーリング条件のストリンジェンシーは、通常の当業者が有する知識で十分最適化することができる。30℃〜72℃のアニーリング温度を用いる。テンプレート分子の最初の変性は、通常、92℃〜99℃で4分間行い、次いで変性（94-99℃で15秒〜1分間）、アニーリング（以上の考察の通り決定した温度；1〜2分間）、および伸張（72℃で1分間）から成る20〜40サイクルを行う。最終の伸張ステップは一般に4分間72℃で行い、次いで不定（0〜24時間）のステップを4℃で行ってもよい。
【０１３３】
本来定量的である定量RT-PCR（QRT-PCR）を行って、遺伝子発現レベルの定量的尺度を提供することもできる。QRT-PCRにおいて、逆転写とPCRを2ステップで行ってもよいし、またはPCRと組合わせた逆転写を同時に行ってもよい。Taqman（Perkin Elmer、Foster City、California）またはApplied Biosystems（Foster City、California）などが提供する市販キットのこれらの技法の1つは、転写物に特異的なアンチセンスプローブを用いて実施する。このプローブはPCR産物（例えば、遺伝子由来の核酸断片）に特異的であり、オリゴヌクレオチドの5'末端と複合化したクエンチャーおよび蛍光レポータープローブを用いて調製する。色々な蛍光マーカーを色々なレポーターと結合して、1つの反応中の2つの産物の測定を可能にする。Taq DNAポリメラーゼが活性化されると、その5'から3'に向かうエキソヌクレアーゼ活性の所為でテンプレートと結合したプローブの蛍光レポーターを切断する。クエンチャーが存在しないと、レポーターは蛍光を発する。レポーターの色変化はそれぞれの特異的産物の量に比例し、蛍光によって測定される；それ故に、それぞれの色の量が測定されてPCR産物が定量される。PCR反応は、多数の個体から得たサンプルを処理して同時に測定できるように、96-ウエルプレート中で行われる。Taqmanシステムはゲル電気泳動を必要としないというさらなる利点を有し、標準曲線とともに用いると定量が可能になる。
【０１３４】
PCR産物を定量的に検出するのに有用な第2の技法は、市販のQuantiTect SYBR Green PCR（Qiagen、Valencia California）などのインターカレート色素を用いることである。RT-PCRは、PCR段階の間にPCR産物中に組み込まれる蛍光標識としてSYBRグリーンを用いて実施し、そしてPCR産物の量に比例する蛍光を生じさせる。
【０１３５】
TaqmanおよびQuantiTect SYBRの両方のシステムをRNAの逆転写後に利用することができる。逆転写を同じ反応混合物でPCRステップとして行ってもよいし（1ステッププロトコル）、または逆転写を最初に、PCRを利用する増幅の前に行ってもよい（2ステッププロトコル）。
【０１３６】
さらに、mRNA発現産物を定量的に測定する他のシステムが公知であり、それには蛍光分子とクエンチャー分子を有するプローブを用いるMolecular Beacons(登録商標)が含まれる。前記プローブはヘアピン構造を形成しうるのでヘアピン型では蛍光分子がクエンチされるが、ハイブリダイズされると蛍光が増加して遺伝子発現の定量的測定値を与えることができる。
【０１３７】
RNA発現を定量的に測定するさらなる技法としては、限定されるものでないが、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ鎖反応、Qβレプリカーゼ（例えば、本明細書に参照により組み入れられる国際特許出願PCT/US87/00880を参照）、恒温増幅方法（例えば、本明細書に参照により組み入れられるWalker ら,1992, PNAS 89：382- 396、を参照）、鎖置換増幅（SDA）、修復鎖反応、不斉定量PCR（例えば、本明細書に参照により組み入れられる米国特許公開第US 2003/30134307A1号を参照） および多重微小球ビーズアッセイ（本明細書に参照により組み入れられるFujaら, 2004, Journal of Biotechnology 108：193-205に記載）が挙げられる。
【０１３８】
本明細書に記載の１以上の遺伝子（例えば、表30、表I、表J、または表Kに掲げられた遺伝子）の発現レベルは、例えば、増幅を用いて、サンプルから得たRNAを増幅することにより測定することができる（NASBA）。例えば、それぞれが本明細書に参照により組み入れられる、Kwohら, 1989, PNAS USA 86：1173；国際特許公開WO 88/10315；および米国特許第6,329,179号を参照されたい。NASBAでは、通常の方法、例えば、フェノール／クロロホルム抽出、熱変性、溶解バッファーによる処理およびDNAおよびRNAを単離するためのミニスピンカラムまたはRNAの塩化グアニジニウム抽出を用いて、増幅用の核酸を調製することができる。これらの増幅技法は、特異的配列を標的化するプライマーとアニーリングすることに関わる。重合後、DNA／RNAハイブリッドをRNアーゼHにより消化する一方、２本鎖DNA分子を再び熱変性する。いずれの場合にも、1本鎖DNAは第2の標的特異プライマーの付加と続いての重合により全て2本鎖になる。次いで2本鎖DNA分子はT7またはSP6などのポリメラーゼにより転写増殖される。恒温サイクリック反応で、RNAは逆転写されて２本鎖DNAとなり、そしてT7またはSP6などのポリメラーゼにより1回転写される。得られる産物は、末端切断されても完全であっても、標的特異的配列を示す。
【０１３９】
複数の技法を用いて増幅産物を分離することができる。
【０１４０】
例えば、増幅産物を、通常の方法を用いて、アガロース、アガロース-アクリルアミドまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離することができる。Sambrookら, 2001を参照されたい。電気泳動を使わずに定量的にPCR産物を検出するいくつかの技法も、本明細書により利用できる（例えば、本明細書に参照により組み入れられる、PCR Protocols、A Guide to Methods および Applications, Innisら, 1990, Academic Press, Inc. N. Y.を参照）。例えば、クロマトグラフ技法を使って分離を行うことができる。本明細書に利用できる多数の種類のクロマトグラフィ：すなわち、吸着、分配、イオン-交換および分子篩、HPLC、およびそれらを利用するためのカラム、ペーパー、薄層およびガスクロマトグラフィを含む多数の特殊化技法が存在する（本明細書に参照により組み入れられる、Freifelder, Physical Biochemistry Applications to Biochemistry and Molecular Biology, 第2版, Wm. Freeman and Co., New York, N. Y., 1982）。
【０１４１】
分離手法の他の例は、PCR反応に用いるオリゴヌクレオチドプライマーを様々な型の小分子リガンドにより共有結合で標識する方法である。1つのかかる分離では、異なるリガンドがそれぞれのオリゴヌクレオチド上に存在する。リガンドの1つと特異的に結合する分子、おそらく抗体または、もしリガンドがビオチンであれば、アビジンを用いて、96ウエルELISAプレートなどのプレートの表面をコートする。このように調製したプレートの表面にPCR反応物を適用すると、PCR産物は表面に特異的に結合する。プレートを洗浄して無結合の試薬を除去した後、第1のリガンドに結合する第2の分子を含有する溶液を加える。第2の分子はある種のレポーター系に結合している。第2の分子は、両方のオリゴヌクレオチドプライマーが最終PCR産物中に組み込まれたPCR産物が産生しているときだけ、プレートに結合する。次いで、市販のプレートリーダーで、ELISA反応物が検出されかつ数値化されるのと同じだけ、PCR産物の量が検出されかつ数値化される。ここに記載したようなELISA様システムは、Raggio ItalgeneによってC-Trackの商品名のもとで開発されている。
【０１４２】
目的の核酸配列、すなわち、本明細書に記載の１以上の遺伝子（例えば、表30、表I、表J、または表Kに掲げられた遺伝子）の核酸配列の増幅を確認するために、増幅産物を可視化しなければならない。1つの典型的な可視化法は、ゲルを臭化エチジウムにより染色してUV光のもとで可視化することに関わる。あるいは、もし増幅産物を放射または蛍光標識したヌクレオチドにより一体で標識すれば、次いで増幅産物をX線フィルムに曝すかまたは適当な刺激スペクトルのもとで可視化した後に分離することができる。
【０１４３】
一実施形態においては、可視化を間接的に達成する。増幅産物の分離後、標識した核酸プローブを、増幅した目的の核酸配列、すなわち、本明細書に記載の１以上の遺伝子（例えば、表30、表I、表J、または表Kに掲げられた遺伝子）の核酸配列と接触させる。好ましくはプローブを発色団と結合させるが、放射標識してもよい。他の実施形態においては、結合対の他のメンバーが検出可能な部分を保持する場合、プローブを、抗体またはビオチンなどの結合パートナーと結合させる。
【０１４４】
他の実施形態において、検出はサザンブロットおよび標識したプローブとのハイブリダイゼーションによる。サザンブロットに関わる技法は、当業者に周知であり、分子プロトコルについての多数の標準的な書物に記載されている。Sambrookら, 2001を参照されたい。簡単に述べると、増幅産物をゲル電気泳動により分離する。次いでゲルを、ニトロセルロースなどの膜と接触させ、核酸の移動および非共有結合を行わせる。次に、膜を色素団が結合した、標的増幅産物とハイブリダイズできるプローブとともにインキュベートする。検出は膜をX線フィルムまたはイオン放出検出デバイスに曝すことによって行う。以上の一例は、本明細書に参照により組み入れられる、米国特許第5,279,721号に記載され、この特許は自動化電気泳動および核酸の移動についての装置および方法を開示している。この装置は、ゲルの外部操作なしの電気泳動およびブロットを可能にし、本発明による方法を行うのに理想的に適している。
【０１４５】
5.4.1.3  ヌクレアーゼ保護アッセイ
特定の実施形態においては、ヌクレアーゼ保護アッセイ（リボヌクレアーゼ保護アッセイおよびS1ヌクレアーゼアッセイの両方を含む）を行うことによりバイオマーカープロファイル中のバイオマーカー特性値を得て、特定のmRNA（例えば、表30、表I、表J、または表Kに記載の遺伝子のmRNA）を検出しかつ定量することができる。かかるアッセイは、例えば、Sambrookら, 2001（前記）に記載されている。ヌクレアーゼ保護アッセイでは、アンチセンスプローブ（例えば、放射標識したまたは非同位元素で標識した）を溶液中でRNAサンプルとハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後、1本鎖の、ハイブリダイズしてないプローブとRNAをヌクレアーゼで分解する。アクリルアミドゲルを用いて残る保護された断片を分離する。典型的には、溶液ハイブリダイゼーションは、膜に基づくハイブリダイゼーションより効率的であって、サンプルRNAの100μgまで対応することができ、ブロットハイブリダイゼーションの最大値20〜30μgと対照的である。
【０１４６】
ヌクレアーゼ保護アッセイの最も一般的なタイプであるリボヌクレアーゼ保護アッセイはRNAプローブの使用を必要とする。オリゴヌクレオチドおよび他の1本鎖DNAプローブは、S1ヌクレアーゼを含有するアッセイでだけ利用できる。1本鎖、アンチセンスプローブは、ヌクレアーゼによるプローブ：標的ハイブリッドの切断を防止するために、典型的には、標的RNAと完全に相同的でなければならない。
【０１４７】
5.4.1.4  ノーザンブロットアッセイ
当業者に公知のいずれのハイブリダイゼーション技法を用いて、バイオマーカープロファイル中のバイオマーカー特性値を作製してもよい。他の特定の実施形態においては、バイオマーカープロファイル中のバイオマーカー特性値をノーザンブロット分析により得て、特定のRNA分子（例えば、表30、表I、表J、または表Kに掲げられた遺伝子のRNA）を検出しかつ定量することができる。当業者に公知の通常のノーザンブロットハイブリダイゼーション技法によって、サンプル中のRNA転写物サイズを確認し、あるいはスプライスされたRNA転写物、および本明細書に記載の１以上の遺伝子（特にmRNA）の相対量を同定することができる。ノーザンブロットにおいては、RNAサンプルを最初に、変性条件のもとでアガロースゲル中の電気泳動を介して、サイズにより分離する。次いでRNAを膜に移し、架橋し、そして標識したプローブとハイブリダイズさせる。非同位体のまたは高特異的活性の放射標識したプローブを用いることができ、それには、ランダムプライマー、ニック翻訳された、またはPCRで作製されたDNAプローブ、in vitro転写したRNAプローブおよびオリゴヌクレオチドが含まれる。さらに、部分的にだけ相同性のある配列（例えば、異なる種由来のcDNAまたはエキソンを含有しうるゲノムDNA断片）をプローブとして用いてもよい。標識したプローブ、例えば、全長、1本鎖DNAまたはそのDNA配列の断片を含有する、放射標識したcDNAは、長さが少なくとも20、少なくとも30、少なくとも50、または少なくとも100の継続的ヌクレオチドであってもよい。プローブは、当業者に公知の多数の異なる方法のいずれにより標識してもよい。これらの研究に最も通常用いられる標識は、放射性元素、酵素、紫外線に曝したときに蛍光を発する化学品、その他である。いくつもの蛍光材料が公知であり、標識として利用することができる。これらには、限定されるものでないが、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッド、AMCAブルーおよび ルシファーイェローが含まれる。放射性標識は現在利用しうる計数手法のいずれかにより検出することができる。同位体の限定するものでない例としては、3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、1251、131I、および186Reが含まれる。酵素標識が同様に有用であり、現在利用される比色、分光光度測定、蛍光分光光度測定、電流測定またはガス分析技法のいずれかにより検出することができる。酵素を、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなどの架橋分子との反応により、選択した粒子と結合させる。当業者に公知のいずれの酵素を利用してもよい。かかる酵素の例には、限定されるものでないが、ペルオキシダーゼ、β-D-ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼが含まれる。代わりの標識材料および方法の開示の例としては、米国特許第3,654,090号、第3,850,752号、および第4,016,043号が参照される。
【０１４８】
5.4.2  タンパク質を検出する方法
本発明の特定の実施形態において、バイオマーカープロファイル中のバイオマーカーの特性値は、タンパク質を検出することにより、例えば、本明細書に記載の１以上の遺伝子（例えば、表30、表I、表J、または表Kに掲げられた遺伝子）の発現産物（例えば、核酸またはタンパク質）、または翻訳後改変された、または他の方法で改変された、またはかかるタンパク質のプロセシングされた型を検出することにより、得ることができる。特定の実施形態において、バイオマーカープロファイルは、本明細書に開示された遺伝子（例えば、表30、表I、表J、または表Kに掲げられた遺伝子）から発現される１以上のタンパク質および／またはその判別断片を、限定されるものでないが、タンパク質マイクロアレイ分析、免疫組織化学および質量分析を含む当業者に周知のいずれかの方法を用いて検出および／または分析することにより作製する。
【０１４９】
標準技法を利用して、サンプル中に存在する目的のタンパク質（例えば、表30、表I、表J、または表Kに掲げられた遺伝子から発現されるタンパク質）の量を決定することができる。例えば、ウェスタンブロットなどのイムノアッセイ、免疫沈降と続いてのドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動、（SDS-PAGE）、免疫細胞化学などを用いる、標準技法を使って、サンプル中に存在する目的のタンパク質の量を決定することができる。目的のタンパク質を検出するための例示の薬剤は、目的のタンパク質と特異的に結合できる抗体、好ましくは検出可能なように直接的または間接的に標識された抗体である。
【０１５０】
かかる検出方法に対して、所望であれば、分析すべきサンプルから得たタンパク質は、当業者に周知の技法を用いて容易に単離することができる。タンパク質単離方法は、例えば、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、HarlowおよびLane、1988、Antibodies： A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press （Cold Spring Harbor、New York）に記載の方法などであってもよい。
【０１５１】
ある特定の実施形態において、目的のタンパク質を検出する方法はタンパク質特異的抗体、例えば、目的のタンパク質（例えば、本明細書に記載の遺伝子から発現されたタンパク質、例えば、例えば、表30、表I、表J、または表Kに掲げられたタンパク質）に対する抗体との相互作用を介するそれらの検出に関わる。抗体は当業者に周知の標準技法を利用して作製することができる。特定の実施形態において、抗体はポリクローナル、またはより好ましくは、モノクローナルであってもよい。無傷の抗体、または抗体フラグメント（例えば、scFv、FabまたはF(ab')2）を、例えば、利用できる。
【０１５２】
例えば、目的のタンパク質に特異的な抗体、または抗体のフラグメントを用いてタンパク質の存在を定量的にまたは定性的に検出することができる。これは、例えば、免疫蛍光技法により実施することができる。抗体（またはそのフラグメント）は、さらに組織学的に、免疫蛍光または免疫電子顕微鏡として、目的のタンパク質のin situ検出に使うことができる。In situ検出は、生物学的サンプル（例えば、生検標本）を患者から取り出し、目的のタンパク質（例えば、表30、表I、表J、または表Kに掲げられた遺伝子から発現されるタンパク質）に対する標識した抗体をそれに適用することにより実施することができる。抗体（またはフラグメント）は好ましくは、抗体（またはフラグメント）を生物学的サンプル上にオーバーレイすることにより適用する。かかる手順を用いることにより、特定のサンプル中の目的のタンパク質の存在だけでなく、その分布も決定することが可能である。多様な周知の組織学的方法（染色する手順）をかかるin situ検出に利用してもよい。
【０１５３】
目的のタンパク質のイムノアッセイは、典型的には、生物学的サンプルを、目的のタンパク質を同定することができる検出可能に標識された抗体とインキュベートするステップ、および結合した抗体をいくつもの当技術分野で周知の技法のいずれかにより検出するステップを含んでなる。以下にさらに詳しく考察するように、用語「標識された」は、例えば、検出可能な物質の抗体との結合（すなわち、物理的連結）を介する、抗体の直接標識を意味してもよいしまた直接標識された他の試薬との反応性による抗体の間接標識を意味してもよい。間接標識の例には、蛍光標識した二次抗体を用いる1次抗体の検出が含まれる。
【０１５４】
生物学的サンプルは、ニトロセルロースなどの固相支持体もしくは担体、または細胞、細胞粒子または可溶タンパク質を固定しうる他の固体支持体と接触させて固定することができる。次いで支持体を好適なバッファーを用いて洗浄し、次いで検出可能に標識されたフィンガープリント遺伝子-特異的抗体を用いて処理する。次いで固相支持体をバッファーを用いて2回目の洗浄を行い、無結合の抗体を除去してもよい。次いで、固体支持体上の結合した標識の量を通常の方法により検出することができる。
【０１５５】
「固相支持体または担体」により抗原または抗体と結合することができるいずれかの支持体を意図する。周知の支持体または担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改変されたセルロース、ポリアクリルアミドおよびマグネタイトが挙げられる。本発明の目的のための担体の性質は、ある程度可溶であってもまたは不溶であってもよい。支持体材料は、結合された分子が抗原または抗体と結合できる限り、実質的にいずれの可能な立体構造であってもよい。従って、支持体の立体構造は、ビーズのような球形、試験管の内表面もしくは棒の外表面のような円筒状であってもよい。あるいは、表面はシート、試験片、などのように平滑であってもよい。好ましい支持体にはポリスチレン ビーズが含まれる。当業者は、抗体または抗原との結合に用いる多数の他の好適な担体を知りうるし、または日常的実験によってこれを確かめうる。
【０１５６】
目的のタンパク質に特異的な抗体を検出可能に標識する方法の1つは、その抗体を酵素に連結して酵素イムノアッセイ（EIA）に使用することによる（Voller, 1978, 「酵素結合免疫吸着アッセイ（The Enzyme Linked Immunosorbent Assay）（ELISA）」, Diagnostic Horizons 2:1-7, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD；Voller et al, 1978, J. Clin. Pathol. 31:507-520；Butler, J.E., 1981, Meth. Enzymol. 73:482-523；Maggio (編), 1980, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FL；Ishikawaら (編), 1981, Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo、これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。抗体と結合する酵素は、適当な基質、好ましくは色素生産性基質と、例えば、分光光度的、蛍光光度にまたは視覚的手段により検出できる化学的部分を生じるような方式で反応しうる。抗体を検出可能に標識するために使用することができる酵素としては、限定されるものでないが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ-5-ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α-グリセロリン酸、デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。検出は、酵素に対する色素生産性基質を使う比色法により行うことができる。検出はまた、基質の酵素反応の程度の視覚的比較により、同様に調製した標準と比較して行うこともできる。
【０１５７】
検出はまた、様々な他のイムノアッセイのいずれかを用いることにより行うこともできる。例えば、抗体または抗体断片を放射標識することにより、目的のタンパク質を、ラジオイムノアッセイ（RIA）を用いて検出することが可能である（例えば、本明細書に参照により組み入れられる、Weintraub, 1986, Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Societyを参照）。放射性同位体（例えば、125I、1311、35Sまたは3H）は、γカウンタまたはシンチレーションカウンタまたはオートラジオグラフィを用いるなどの方法により検出することができる。
【０１５８】
抗体を蛍光化合物により標識することも可能である。蛍光標識された抗体を適当な波長の光に曝すと、その存在は蛍光によって検出することができる。最も通常利用される蛍光標識化合物のなかには、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルアルデヒドおよびフルオレサミンがある。
【０１５９】
抗体はまた、152Eu、または他のランタニド系列などの蛍光放出金属を用いて、検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）またはエチレンジアミン四酢酸（EDTA）などの金属キレート剤グループを用いて、抗体と結合させることができる。
【０１６０】
抗体はまた、化学発光化合物と結合することにより検出可能に標識することもできる。次いで化学発光タグの付いた抗体の存在を、化学反応の経過で生じる発光の存在を検出することにより決定する。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマチック（theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。
【０１６１】
同様に、生物発光化合物を用いて本発明を標識することができる。生物発光は生物系に見られる化学発光のタイプであり、この場合、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増強する。生物発光タンパク質の存在は発光の存在により決定される。標識を目的とする重要な生物発光化合物はルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクロリンである。
【０１６２】
他の実施形態においては、バイオマーカーと結合するためにアプタマーなどの、抗体以外の特異的結合分子を用いてもよい。さらに他の実施形態において、バイオマーカープロファイルは、感染作用剤（例えば、リポ多糖またはウイルスタンパク質）またはその成分の測定可能な態様を含んでもよい。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、タンパク質チップアッセイ（例えば、ProteinChip(登録商標)バイオマーカーシステム、Ciphergen、Fremont、California）を用いてバイオマーカープロファイル中のバイオマーカーの特性値を測定する。例えば、Lin, 2004, Modern Pathology, 1-9； Li, 2004, Journal of Urology 171, 1782-1787； Wadsworth, 2004、Clinical Cancer Research, 10, 1625-1632； Prieto, 2003, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies 26, 2315-2328； Coombes, 2003, Clinical Chemistry 49, 1615-1623； Mian, 2003, Proteomics 3, 1725-1737； Lehreら, 2003, BJU International 92, 223-225；およびDiamond, 2003、Journal of the American Society for Mass Spectrometry 14、760-765（これらはそれぞれ、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）を参照されたい。
【０１６４】
いくつかの実施形態においては、バイオマーカープロファイル中のバイオマーカーの特性値を測定するために、ビーズアッセイを用いる。他のかかるビーズアッセイはBecton Dickinson Cytometricビーズアレイ（CBA）である。CBAは、明確な蛍光強度をもつ一連の粒子を使って、複数の可溶分析物を同時に検出する。CBAをフローサイトメトリーと組合わせて多重アッセイを作製することができる。例えば、Becton Dickinsonヒト炎症キットの実施形態であるBecton Dickinson CBAシステムは、フローサイトメトリーによる増幅された蛍光検出の感度を利用して、粒子に基づくイムノアッセイで可溶分析物を測定する。CBA中のそれぞれのビーズは特異的タンパク質に対する捕獲表面を提供し、ELISAプレート中の個々にコートされたウエルに類似する。BD CBA捕獲ビーズ混合物は懸濁していて、小体積サンプル中の複数の分析物の検出を可能にする。
【０１６５】
いくつかの実施形態においては、米国特許第5,981,180号（「180特許」と呼ぶ）（本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）に記載の多重分析方法、そして特にその全体手法、ビーズ技法、システムハードウエアおよび抗体検出の教示を用いて、バイオマーカープロファイル中のバイオマーカーに対する特性値を測定する。この分析については、微粒子のマトリックスを合成し、その場合、マトリックスは色々な微粒子のセットから構成される。それぞれの微粒子のセットは、微粒子表面上に固定された異なる抗体捕獲試薬の数千の分子を有し、2種の蛍光色素の様々な量の組み込みによりカラーコードを付けることができる。2種の蛍光色素の比はそれぞれの微粒子のセットに対して異なる放出スペクトルを与え、様々な微粒子のセットをプールした後に、微粒子セットの同定を可能にする。米国特許第6,268,222号および第6,599,331号、そして特に多重分析に対して微粒子を標識する様々な方法の教示も、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。
【０１６６】
5.4.3  他の検出方法の利用
いくつかの実施形態においては、サンプル内のバイオマーカーのサブセットだけを分析するように、分離方法を用いてバイオマーカープロファイル中のバイオマーカー特性値を決定することができる。例えば、サンプル中の分析されるバイオマーカーは、サンプル内の核酸バイオマーカーだけを得るように分画された細胞抽出物から得たmRNA種であってもよいし、または、バイオマーカーは、クロマトグラフィ技法により分画されたサンプル内のタンパク質の全補体から得ることもできる。
【０１６７】
バイオマーカープロファイル中のバイオマーカーの特性値はまた、例えば、以下に記載の１以上の方法を使って作製することもできる。例えば、それらの方法には、核磁気共鳴（NMR）分光法、質量分析方法、例えば、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）、ESI-MS/MS、ESI-MS/(MS)n（nは１以上の整数）、マトリックス支援レーザー脱着イオン化飛行時間型質量分析（MALDI-TOF-MS）、表面増強レーザー脱着イオン化飛行時間型質量分析（SELDI-TOF-MS）、シリコン上の脱着イオン化（DIOS）、二次イオン質量分析（SIMS）、四重極飛行時間型（Q-TOF）、大気圧化学イオン化質量分析（APCI-MS）、APCI-MS/MS、APCI-(MS)n、大気圧光イオン化質量分析（APPI-MS）、APPI-MS/MS、およびAPPI-(MS)nが含まれうる。他の質量分析法、とりわけ四重極フーリエ変換質量分析（FTMS）およびイオントラップも含まれうる。他の好適な方法には、化学抽出分配する、カラムクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性（逆相）液体クロマトグラフィ、等電点電気泳動、一次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（2D-PAGE）または他のクロマトグラフィ、例えば薄層、ガスまたは液体クロマトグラフィ、またはそれらのいずれかの組合わせが含まれうる。一実施形態においては、生物学的サンプルを分画した後に、分離方法を適用してもよい。
【０１６８】
一実施形態においては、レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析を用いてバイオマーカープロファイル中の特性値を作製して決定し、その場合、バイオマーカーは入射レーザー照射により固定支持体からイオン化されかつ蒸発放出されたタンパク質またはタンパク質断片であり、そして特性値は質量スペクトルプロファイル中のこれらの断片を表すピークの存在または非存在である。様々なレーザー脱着／イオン化技法が当技術分野で公知である（例えば、Guttmanら, 2001, Anal. Chem. 73：1252-62、およびWeiら, 1999、Nature 399：243-246を参照、これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）
レーザー脱着／飛行時間型質量分析は、比較的短時間に大量の情報の作製を可能にする。生物学的サンプルを、サンプル中の全てのバイオマーカーまたはそのサブセットと結合する様々な支持体のいくつかの変種の1つに適用する。細胞溶解液またはサンプルを0.5μL程度の体積でこれらの表面に、予め精製または分画してまたはしないで、直接適用する。溶解液またはサンプルを濃縮または希釈した後に支持体表面上に適用してもよい。次いでレーザー脱着／イオン化を用いてサンプルの質量スペクトルを、3時間程度の短い時間に作製する。
【０１６９】
5.5  データ解析アルゴリズム
その対応する特性値が転換者か非転換者を判別できるバイオマーカーを本発明で同定する。これらのバイオマーカーおよびそれらの対応する特性（例えば、発現レベル）の同一性を用いて、転換者と非転換者を判別する１以上の決定ルールを開発する。下記の第6節は、いかにデータ解析アルゴリズムを用いていくつかのかかる決定ルールを構築できるかを説明する。第6節に記載のデータ解析アルゴリズムはそれぞれ、転換者と非転換者を含む訓練集団全体にわたり本発明で同定されたバイオマーカーのサブセットの特性（例えば、発現値）を用いる。典型的には、SIRS被験者は、その被験者が所定の期間（例えば、観察期間）内に敗血症を発症しないとき、非転換者と考えられる。この所定の期間は、例えば、12時間、24時間、48時間、1日間、1週間、1ヶ月、またはそれより長くともよい。所定の期間内に敗血症を発症する被験者と敗血症を発症しない被験者を判別する１以上の決定ルールを構築するための特定のデータ解析アルゴリズムを、以下の小節に記載する。これらの例示のデータ解析アルゴリズムまたは当技術分野で公知の他の技法を用いて決定ルールを構築し終えると、その決定ルールを用いてテスト被験者を2以上の表現型クラス（例えば、転換者または非転換者）の1つに分類できる。これは決定ルールを、テスト被験者から得たバイオマーカープロファイルに適用することにより実施される。それ故に、かかる決定ルールは診断指標として非常に高い価値を有する。
【０１７０】
本発明は、一態様において、テスト被験者から得たバイオマーカープロファイルの、訓練集団から得たバイオマーカープロファイルに対する評価を提供する。いくつかの実施形態において、訓練集団中の被験者ならびにテスト被験者から得たそれぞれのバイオマーカープロファイルは、複数の異なるバイオマーカーのそれぞれに対する特性を含む。いくつかの実施形態において、この比較は、（i）訓練集団から得たバイオマーカープロファイルを用いて決定ルールを開発すること、および（ii）決定ルールを、テスト被験者から得たバイオマーカープロファイルに適用することにより実施される。このようにして、本発明のいくつかの実施形態において適用される決定ルールを用いて、SIRSを有するテスト被験者がおそらく敗血症になるかどうかを決定する。
【０１７１】
本発明のいくつかの実施形態においては、決定ルールの適用の結果が、被験者はおそらく敗血症になることを示すとき、被験者は「敗血症」被験者と診断される。もし決定ルールの適用の結果が、被験者はおそらく敗血症にならないことを示すとき、被験者は「SIRS」被験者と診断される。従って、いくつかの実施形態において、前記の2つの決定状態の結果から次の4つの結論が可能である：
(i)真性敗血症、すなわち、決定ルールが被験者は敗血症になることを示し、そして実際に、被験者が所定の期間内に敗血症になる場合（真陽性、TP）；
(ii)偽性敗血症、すなわち、決定ルールが被験者は敗血症になることを示し、そして実際には、被験者が所定の期間内に敗血症にならない場合（偽陽性、FP）；
(iii)真性SIRS、すなわち、決定ルールが被験者は敗血症にならないことを示し、そして実際に、被験者が所定の期間内に敗血症にならない場合（真陰性、TN）；または
(iv)偽性SIRS、すなわち、決定ルールが被験者は敗血症にならないことを示し、そして実際には、被験者が所定の期間内に敗血症になる場合（偽陰性、FN）。
【０１７２】
TP、FP、TN、FNに対する他の定義をなしうることは理解されるであろう。例えば、TPを、決定ルールが被験者は敗血症にならないことを示しそして実際に、被験者が所定の期間に敗血症にならない場合として定義しうるかも知れない。全てのかかる代わりの定義は本発明の範囲内にあるものの、本発明の理解を容易にするために、特に断らない限り、以上の(i)〜(iv)の定義により与えられたTP、FP、TN、およびFNの定義を本明細書では使用する。
【０１７３】
当業者は理解しうるように、いくつもの定量的な判断基準を用いて、テストバイオマーカープロファイルと参照バイオマーカープロファイルの間でなされた比較（例えば、テスト被験者から得たバイオマーカープロファイルに対する決定ルールの適用）の性能を伝えることができる。これらには、陽性予測値（PPV）、陰性予測値（NPV）、特異性、感度、精度、および確実性が含まれる。さらに、リシーバーオペレーター曲線（receiver operator curvesまたはROC）などの他の構築物を用いて決定ルール性能を評価することができる。本明細書で使用されるものは次の通りである：
PPV＝TP/(TP＋FP)
NPV＝TN/(TN＋FN)
特異性＝TN/(TN＋FP)
感度＝TP/(TP＋FN)
精度＝確実性＝(TP＋TN)/N。
【０１７４】
ここで、Nは比較したサンプル化合物の数（例えば、敗血症またはSIRSの決定をソートするテストサンプル数）である。例えば、SIRS/敗血症分類を求めた10人の被験者が存在する場合を考えよう。バイオマーカープロファイルを10人のテスト被験者のそれぞれについて構築する。次いで、バイオマーカープロファイルのそれぞれを、訓練集団から得たバイオマーカープロファイルに基づいて開発した決定ルールを適用することにより評価する。この事例において、前記式のNは10に等しい。典型的には、Nは、ある集団の異なるメンバーから採集したサンプルの数である。この集団は、実際には、2つの異なるタイプでありうる。1つのタイプでは、その集団に含まれる被験者のサンプルおよび表現型データ（例えば、バイオマーカーの特性値および被験者が敗血症になるかならないかの表示）は決定ルールを構築または洗練するために使われた。かかる集団を本明細書では訓練集団と呼ぶ。他のタイプでは、その集団に含まれる被験者のサンプルは決定ルールを構築するために使われなかった。かかる本明細書では検証集団と呼ぶ。特に断らない限り、Nにより表される集団は専ら訓練集団または専ら検証集団のいずれかであり、2つの集団タイプの混合物ではない。訓練集団に基づくとき、検証集団とは対照的に、かかる精度はより高い（より1に近い）ことは理解されよう。それでも、特に明確に断らない限り、確実性（精度）を含む決定ルール（またはテスト被験者から得たバイオマーカープロファイルの評価の他の形態）の性能を評価するために使われる全ての判定基準は、判定基準に対応する決定ルールを訓練集団または検証集団のいずれかに適用することにより測定された判定基準を意味する。さらに、以上に定義されたPPV、NPV、特異性、感度、および精度に対する定義はまた、Draghici、Data Analysis Tools for DNA Microanalysis、2003、CRC Press LLC、Boca Raton、Florida、pp. 342-343（本明細書に参照により組み入れられる）にも見出される。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、訓練集団は非転換者および転換者を含む。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは、訓練集団から得た生物学的サンプルを用いて、この集団の転換者による敗血症発症前のある時点に、この集団から構築される。このようにして、訓練集団の転換者について、生物学的サンプルを転換者が敗血症になる前に、2週前、1週前、4日前、3日前、1日前、またはいずれか他の時点に採集してもよい。実施に際して、かかる採集物は、SIRS診断に伴う病院への入場許可後に、規則的な間隔で生物学的サンプルを採集することによって得られる。例えば、1つの手法では、病院でSIRSと診断されている被験者を訓練集団として用いる。SIRSに伴う病院への入場が許可されると、生物学的サンプルを被験者から、選択した時点に採取する（例えば、毎時、毎8時間、毎12時間、毎日、など）。被験者のある部分は敗血症になりそして被験者のある部分は敗血症にならない。敗血症になる被験者については、敗血症発症の直前にその被験者から採取した生物学的サンプルをT-12生物学的サンプルと名づける。被験者から得た全ての他の生物学的サンプルに、これらの生物学的サンプルに対して相対的に遡及して指標を付ける。例えば、生物学的サンプルが被験者から毎日採取されているとき、前日採取された生物学的サンプルT-12はT-36生物学的サンプルとして参照される。訓練集団中の非転換者の生物学的サンプルに対する時点は、非転換被験者を転換被験者と「時間を合わせる」ことにより同定される。説明するため、訓練集団中の被験者が、登録の第6日に敗血症と臨床的に規定された場合を考えよう。説明のためであるが、この被験者については、T-36は研究の第4日であり、そしてT-36生物学的サンプルは研究の第4日に得た生物学的サンプルである。同様に、時間を合わせた非転換被験者のT-36はこれと対になる非転換被験者についての研究の第4日とみなされる。
【０１７６】
いくつかの実施形態においては、Nが1より大きく、5より大きく、10より大きく、20より大きく、10〜100であり、100より大きく、または1000より小さい被験者である。いくつかの実施形態では、訓練集団または検証集団に対して、決定ルール（または他の比較の型）は少なくとも約99%のまたはそれ以上の確実性を有しうる。他の実施形態においては、訓練集団または検証集団に対して（および、従って臨床患者などの訓練集団の一部でない単一被験者に対して）、確実性が少なくとも約97%、少なくとも約95%、少なくとも約90%、少なくとも約85%、少なくとも約80%、少なくとも約75%、少なくとも約70%、少なくとも約65%、または少なくとも約60%である。本発明の特定の方法に応じて、有用な確実性の程度は変化しうる。本明細書で使用される「確実性」は「精度」を意味する。一実施形態においては、感度および／または特異性は、訓練集団または検証集団に対して、少なくとも約97%、少なくとも約95%、少なくとも約90%、少なくとも約85%、少なくとも約80%、少なくとも約75%、または少なくとも約70%である。いくつかの実施形態においては、かかる決定ルールを用いて、表明した精度で敗血症の発症を予測する。いくつかの実施形態において、かかる決定ルールを用いて、表明した精度で敗血症の発症を診断する。いくつかの実施形態において、かかる決定ルールを用いて、表明した精度で敗血症の段階を決定する。
【０１７７】
十分な確実性をもってテスト被験者を分類するために決定ルールが使用しうる特性の数は、2以上である。いくつかの実施形態においては、その数は3以上、4以上、10以上、または10〜200である。しかし、求める確実性の程度に応じて、決定ルールに使用される特性の数は多くても少なくてもよいが、全事例において少なくとも2である。一実施形態においては、決定ルールがテスト被験者を分類するために使用しうる特性の数を最適化して、高い確実性によるテスト被験者の分類を可能にする。
【０１７８】
以下の第6節における実施例のいくつかでは、それぞれの被験者における複数のバイオマーカーについて、マイクロアレイ存在量データを採集した。すなわち、バイオマーカープロファイルのそれぞれのバイオマーカーについて、そのバイオマーカーに対する特性、マイクロアレイ存在量データを測定した。観察された遺伝子発現パターンに基づくサンプル表現型を予測する目的で、データ解析アルゴリズムを用いて、訓練集団より得たかかるバイオマーカープロファイルから、決定ルールが開発される。新しくかつマイクロアレイ特異的分類ツールが常に開発される一方、現存する一団のパターン認識および予測アルゴリズムは、決定ルールを構築するために効果的なデータ解析アルゴリズムを提供する。例えば、本明細書に参照により組み入れられる、National Research Council； Panel on Discriminant Analysis Classification and Clustering、Discriminant Analysis および Clustering、Washington、D. C： National Academy Pressを参照されたい。さらに、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Dudoitら, 2002, 「遺伝子発現データを用いて腫瘍を分類するための判別方法の比較（Comparison of discrimination methods for the classification of tumors using gene expression data.）」 JASA 97; 77-87を用いて、かかる決定ルールを開発することができる。
【０１７９】
決定ルールを開発するための関連するデータ解析アルゴリズムとしては、限定されるものでないが、線形、ロジスチック、およびよりフレキシブルな判別技法を含む判別分析（例えば、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Gnanadesikan, 1977, Methods for Statistical Data Analysis of Multivariate Observations, New York: Wiley 1977を参照）；ツリーに基づくアルゴリズム、例えば分類および回帰ツリー（CART）および変異体（例えば、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Breiman, 1984, Classification and Regression Trees, Belmont, California: Wadsworth International Group、ならびに下記第5.1.3節を参照）；一般化加法モデル（例えば、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Tibshirani 、1990、Generalized Additive Models、London： ChapmanおよびHallを参照）；およびニューラルネットワーク（例えば、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Neal, 1996, Bayesian Learning for Neural Networks, New York： Springer-Verlag； および Insua, 1998, 「ノンパラメトリック回帰に対するフィードフォワード・ニューラルネットワーク（Feedforward Neural Networks for nonparametric regression）」 In： Practical Nonparametric and Semiparametric Bayesian Statistics, pp. 181-194, New York： Springer、ならびに下記第5.5.6節を参照）が挙げられる。
【０１８０】
一実施形態においては、テスト被験者のバイオマーカープロファイルと訓練集団から得たバイオマーカープロファイルとの比較を実施し、決定ルールを適用することを含んでなる。決定ルールは、コンピューターパターン認識アルゴリズムなどのデータ解析アルゴリズムを用いて構築される。決定ルールを構築するための他の好適なデータ解析アルゴリズムとしては、限定されるものでないが、ロジスチック回帰（下記、第5.5.10節を参照）または特性値の分布における差を検出するノンパラメトリックアルゴリズム（例えば、ウイルコクソンの符号順位検定（Wilcoxon Signed Rank Test）（無調節および調節済み））が挙げられる。決定ルールは、1、2、3、4、5、10、20またはそれ以上のバイオマーカーから測定された観測値に対応する2、3、4、5、10、20またはそれ以上の特性に基づきうる。一実施形態においては、決定ルールは数百またはそれ以上の特性に基づく。決定ルールはまた、分類ツリーアルゴリズムを用いて構築してもよい。例えば、訓練集団から得たそれぞれのバイオマーカープロファイルは、少なくとも3つの特性を含んでもよく、その場合、特性は分類ツリーアルゴリズム中の予測因子である（下記、第5.5.1節を参照）。決定ルールは集団（またはクラス）内のメンバーシップを、少なくとも約70%の、少なくとも約75%の、少なくとも約80%の、少なくとも約85%の、少なくとも約90%の、少なくとも約95%の、少なくとも約97%の、少なくとも約98%の、少なくとも約99%の、または約100%の精度で予測する。
【０１８１】
好適なデータ解析アルゴリズムは当技術分野で知られており、そのいくつかはHastieら（前掲）に総括されている。特定の実施形態において、本発明のデータ解析アルゴリズムには、分類および回帰ツリー（CART；第5.5.1節、下記）、多重加法回帰ツリー（MART；第5.5.4節、下記）、マイクロアレイ用の予測分析（PAM；第5.5.2節、下記）またはランダムフォレスト分析（第5.5.1節、下記）が含まれる。かかるアルゴリズムは、血液サンプルなどの生物学的材料からの複雑なスペクトルを分類して、正常な被験者と特定の病状に特徴的なバイオマーカー発現レベルを有する被験者とを区別する。他の実施形態において、本発明のデータ解析アルゴリズムには、ANOVAおよびノンパラメトリック等価体、線形判別分析（第5.5.10節、下記）、ロジスチック回帰分析（第5.5.10節、下記）、最近傍分類器分析（第5.5.9節、下記）、ニューラルネットワーク（第5.5.6節、下記）、主成分分析 （第 5.5.8節、下記）、二次判別分析（第5.5.11節、下記）、回帰分類器（第5.5.5節、下記）およびサポートベクタマシン（第5.5.12節、下記）が含まれる。かかるアルゴリズムを用いて決定ルールを構築するおよび／または決定ルールの適用の速度と効率を増加しかつ研究者バイアスを回避できる一方、当業者は本発明の方法を実施するためにコンピューターに基づくアルゴリズムが必要でないことを理解しているであろう。
【０１８２】
バイオマーカープロファイルを作製するために使われた方法に関係なく、決定ルールを用いてバイオマーカープロファイルを評価することができる。例えば、バイオマーカープロファイルを評価するために利用できる好適な決定ルールは、Harper、「ポリマー分析における熱分解とGC（Pyrolysis and GC in Polymer Analysis）」, Dekker、New York （1985）に考察されているように、ガスクロマトグラフィを用いて作製することができる。さらに、Wagnerら, 2002、Anal. Chem. 74：1824-1835は、静的飛行時間型二次イオン質量分析（TOF-SIMS）により得たスペクトルに基づいて被験者を分類する能力を改善する決定ルールを開示している。さらに、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Brightら, 2002, J Microbiol. Methods 48：127-38は、細菌株間を、MALDI-TOF-MSスペクトルの分析により高い確実性（79-89%の正しい分類率）で識別する方法を開示している。本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Dalluge, 2000, Fresenius J. Anal. Chem. 366：701-711は、複雑な生物学的サンプル中のバイオマーカーのプロファイルを分類するための、MALDI-TOF-MSおよび液体クロマトグラフィ-エレクトロスプレーイオン化質量分析（LC/ESI-MS）の使用を考察している。
【０１８３】
5.5.1  決定ツリー
本発明に同定されたバイオマーカーの特性値を用いて構築できる他のタイプの決定ルールは決定ツリーである。ここで、「データ解析アルゴリズム」は決定ツリーを構築できるいずれかの技法であるが、最終的な「決定ツリー」は決定ルールである。決定ツリーは訓練集団および特定のデータ解析アルゴリズムを用いて構築される。決定ツリーはの概要は、本明細書に参照により組み入れられる、Duda、2001、Pattern Classification、John Wiley & Sons、Inc.、New York. pp. 395-396に記載されている。ツリーに基づく方法は、特性空間（feature space）を矩形のセットに分割し、次いでモデル（定数のように）をそれぞれの1つにはめこむ。
【０１８４】
訓練集団データは、訓練セット集団全体にわたる本発明のバイオマーカーに対する特性（例えば、発現値、またはいくつかの他の観測値）を含む。決定ツリーを構築するために利用できる1つの具体的なアルゴリズムは分類および回帰ツリー（CART）である。他の具体的な決定ツリーアルゴリズムには、限定されるものでないが、ID3、C4.5、MART、およびランダムフォレストが含まれる。CART、ID3、および C4.5は、本明細書に参照により組み入れられるDuda, 2001, Pattern Classification, John Wiley & Sons, Inc., New York. pp. 396-408 および pp. 411-412に記載されている。CART、MART、およびC4.5は、本明細書に参照によりその全てが組み入れられるHastieら, 2001, The Elements of Statistical Learning, Springer- Verlag, New York, Chapter 9に記載されている。ランダムフォレストは、本明細書に参照によりその全てが組み入れられるBreiman, 1999, 「ランダムフォレスト-ランダム特性（Random Forests - Random Features）」 Technical Report 567, Statistics Department, U.C.Berkeley, September 1999に記載されている。
【０１８５】
本発明のいくつかの実施形態においては、決定ツリーを使い、本発明のバイオマーカーの組合わせに対する特性を用いて被験者を分類する。決定ツリーアルゴリズムは
管理された学習アルゴリズムのクラスに属する。決定ツリーの目的は実世界サンプルデータから分類器（1つのツリー）を誘導することである。このツリーを用いて決定ツリーを誘導するために用いられてない未見の例を分類することができる。そのようなものとして、決定ツリーは訓練データから誘導される。例示の訓練データは複数の被験者（訓練集団）に対するデータを含有する。それぞれの関係被験者に対して、複数の特性、それぞれの被験者（例えば、敗血症/SIRS）に対するクラスが存在する。本発明の一実施形態において、訓練データは、訓練集団全体にわたるバイオマーカーの組合わせに対する発現データである。
【０１８６】
次のアルゴリズムは例示の決定ツリー誘導を記載する：
Tree(Examples,Class,Features)
［ツリー(例、クラス、特性)アルゴリズム］
Create a root node
［ルートノッドを作る］
If all Examples have the same Class value, give the root this label
［もし、全ての例が同じクラス値を有すれば、ルートにこのラベルを与える］
Else if Features is empty label the root according to the most common value
［でなければ、もし特性が空であれば、ルートを最も普通の値に従いラベルを付ける］
Else begin
［でなければ、開始する］
Calculate the information gain for each Feature
［情報ゲインを各特性に対して計算する］
Select the Feature A with highest information gain and make this the root Feature
［最高情報ゲインをもつ特性Aを選び、これをルート特性とする）］
For each possible value, v, of this Feature
［この特性のそれぞれの可能な値、v、について］
Add a new branch below the root, corresponding to A = v 
［ルートの下に、A=vに対応する新しいブランチ（branch）を加える］
Let Examples(v) be those examples with A = v
［例(v)をA=vである例とする］
If Examples(v) is empty, make the new branch a leaf node labeled with the most common value among Examples
［もし、例(v)が空であれば、最も普通の値によりらベルが付けられた新しいリーフノードを作る］
Else let the new branch be the tree created by Tree(Examples(v),Class,Features - {A}) 
［でなければ、新しいブランチをツリー(例(v)、クラス、特性)により作製されたツリーとする］
end
［終わる］
【０１８７】
情報ゲインの計算のさらに詳しい説明を次に示す。もし例の可能なクラスvjが確率P(vj)を有すれば、実際の答えの情報内容Iは次式：
【数１】
2008538007.tif 000009
により与えられる。I値は、使用した特定のデータセットに対する分類の結果を記載できるために必要な情報の量を示す。データセットがp個の陽性（例えば敗血症を発症しうる）およびn個の陰性（例えば敗血症を発症しないだろう）例（例えば被験者）を含むと仮定すると、正しい答えに含まれる情報は次式：
【数２】
2008538007.tif 000010
［式中、log2は2を基底とする対数である］
で表される。1つの特性を試験することにより、正しい分類をするために必要な情報の量を減ずることができる。特定の特性Aに対する残余（例えば特異的バイオマーカーを表す）は必要である情報の量をいくつ減ずることができるかを示し、次式：
【数３】
2008538007.tif 000011
により計算される。「v」はある特定データセットにおける特性Aに対するユニークな属性値の数であり、「i」はある特定の属性値であり、「pi」は分類が陽性である（例えば敗血症を発症しうる）特性Aに対する例の数であり、「ni」は分類が陰性である（例えば敗血症を発症しないだろう）特性Aに対する例の数である。
【０１８８】
具体的な特性Aの情報ゲインは特性Aのクラスと残余に対する情報内容の間の差として、次式：
【数４】
2008538007.tif 000012
により計算される。情報ゲインを用いて、色々な特性の分類に対する重要度（それらが例をいかにうまく分割するか）、および最高の情報をもつ特性を評価する。
【０１８９】
一般に、いくつもの異なる決定ツリーアルゴリズムが存在し、その多くは、Duda, Pattern Classification, 第2版, 2001, John Wiley & Sons, Incに記載されている。決定ツリーアルゴリズムはしばしば、特性の処理、不純物基準、停止判定基準、および剪定の考慮が必要である。具体的な決定ツリーアルゴリズムとしては、限定されるものでないが分類および回帰ツリー（CART）、多変量決定ツリー、ID3、およびC4.5が挙げられる。
【０１９０】
決定ツリーを用いる1つの手法において、訓練集団全体にわたる本発明に記載の選択遺伝子の組合わせに対する遺伝子発現データは、平均ゼロおよび単位分散を有するように標準化される。訓練集団の数を訓練セットとテストセットにランダムに分割する。例えば、一実施形態において、訓練集団数の3分の2を訓練セットに配置しかつ訓練集団数の3分の1をテストセットに配置する。本発明に記載のバイオマーカーの選択組合わせに対する発現値を用いて決定ツリーを構築する。次いで、決定ツリーがテストセット中のメンバーを正しく分類する能力を決定する。いくつかの実施形態において、この計算を、バイオマーカーの所与の組合わせに対して数回実施する。各計算の繰返しにおいて、訓練集団のメンバーを、訓練セットとテストセットにランダムに割り当てる。次いで、バイオマーカーの組合わせの品質を、それぞれのかかる決定ツリー計算の繰返しの平均値とする。
【０１９１】
それぞれの分割が対応するバイオマーカーに対する1つの特性に基づく一変量決定ツリーに加えて、本発明のバイオマーカーのセット、または2つのかかるバイオマーカーの相対的特性値の中で、多変量決定ツリーを決定ルールとして実行することができる。かかる多変量決定ツリーにおいて、いくつかのまたは全ての決定は、実際に、複数の本発明のバイオマーカーに対する線形組合わせを含む。かかる線形組合わせは、分類上の勾配下降などの公知の技法を用いてまたは平方誤差和判定基準の使用により訓練することができる。かかる決定ツリーを説明するために、式：
0.04 x1 ＋ 0.16 x2 < 500
を考えてみよう。
【０１９２】
ここで、x1およびx2は、本発明のバイオマーカーの中からの2つの異なるバイオマーカーに対する2つの異なる特性を意味する。決定ルールを適用するために、特性x1およびx2の値を未分類の被験者から得た測定値より取得する。次いで、これらの値を式に挿入する。もし500未満の値が計算されれば、決定ツリーの第1分枝をとる。そうでなければ、決定ツリーの第2分枝をとる。多変量決定ツリーは、本明細書に参照により組み入れられるDuda, 2001, Pattern Classification, John Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 408-409に記載されている。
【０１９３】
本発明に用いることができる他の手法は多変量適応的回帰スプライン（MARS）である。MARSは回帰に対する適応的手順であって、本発明が取扱う高次元の問題に好適である。MARSは、ステップワイズ線形回帰の一般化または回帰設定におけるCARTの性能を改善するCARTの変法と見ることができる。MARSは、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Hastieら, 2001、The Elements of Statistical Learning、Springer-Verlag、New York、pp. 283-295に記載されている。
【０１９４】
5.5.2  マイクロアレイの予測分析（PAM）
本発明のバイオマーカーの特性値を用いる決定ルールを開発する1つの手法は最近傍セントロイド分類器である。かかる技法は、それぞれのクラス（敗血症およびSIRS）に対して、クラス中のバイオマーカーの平均特性レベルにより与えられるセントロイドを計算し、次いで新しいサンプルを、そのセントロイドが最近傍であるクラスに割り当てる。この手法は、クラスタが既知のクラスにより置き換えられることを除くと、k平均クラスタリングと類似している。このアルゴリズムは、多数のバイオマーカーを用いるときに、ノイズに対して感度がある。本技法を増強する1つの方法は、それぞれのバイオマーカーに対して、もしそれらがたまたま似ているとみなされれば、クラスセントロイド間の差をゼロに設定する。この手法はマイクロアレイの予測分析またはPAMにおいて実行される。例えば、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Tibshiraniら, 2002、Proceedings of the National Academy of Science USA 99； 6567-6572を参照されたい。収縮は閾値により制御し、閾値未満の差はノイズと考える。ノイズレベルを超える差を示さないバイオマーカーは除去する。閾値は交差検定法により選ぶことができる。閾値を低下させると、より多くのバイオマーカーが含まれ、そして見積もられる分類誤差が低下し、最後にそれらは最低値に達し、ノイズバイオマーカーの結果として再び上昇を開始する（オーバーフィッティングと呼ばれる現象である）。
【０１９５】
5.5.3  バッギング、ブースティング、およびランダムサブ空間法
バッギング、ブースティング、ランダムサブ空間法、および加法ツリーは組合わせ技法として公知のデータ解析アルゴリズムであり、弱い決定ルールを改善するために利用することができる。これらの技法は、先の第5.5.1節に記載の決定ツリーのような決定ツリー用に設計され、かつ通常適用される。さらに、かかる技法はまた、線形判別分析のような他のタイプのデータ解析アルゴリズムを用いて開発された決定ルールにおいても有用でありうる。
【０１９６】
バッギングにおいては、訓練セットをサンプリングしてランダム独立ブートストラップ複製物を作製し、これらのそれぞれに決定ルールを構築し、そしてそれらを最終決定ルールにおいて単純な多数決により集合させる。例えば、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Breiman、1996、Machine Learning 24、123-140；およびEfron & Tibshirani、An Introduction to Boostrap、Chapman & Hall、New York、1993を参照されたい。
【０１９７】
ブースティングにおいては、従来の分類結果に依存する訓練セットの重み付けされたバージョンで決定ルールを構築する。最初、考慮されている全ての特性は等しい重みを有し、そして第1決定ルールはこのデータセットで構築する。次いで、決定ルールの性能によって重みを変える。誤って分類された特性はより大きい重みを得て、次の決定ルールは再重み付けされた訓練セットでブーストする。この方法で、1シリーズの訓練セットおよび決定ルールを得て、次いで単純な多数決によりまたは重み付けされた多数決により最終決定ルールで組合わせが行われる。例えば、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Freund & Schapire、「（新しいブースティングアルゴリズムによる実験）」"Experiments with a new boosting algorithm," Proceedings 13th International Conference on Machine Learning、1996、148-156、を参照されたい。
【０１９８】
ブースティングを説明するために、2つの表現型、すなわち、表現型1（例えば、所定の期間内に敗血症になる）、および表現型2（例えば、SIRSだけ、すなわち、被験者が所定の期間内に敗血症にならないことを意味する）が研究中の集団により表される場合を考えよう。予測因子バイオマーカー（例えば、バイオマーカーを表す特性のベクター）のベクターが訓練セットデータから与えられると、決定ルールG(X)は2つの値セット：｛表現型1、表現型2｝のうちの1つをとる予測値を作製する。訓練サンプルの誤差率は次の通りである：
【数５】
2008538007.tif 000013
［式中、Nは訓練セットの被験者数である（表現型1または表現型2を有する被験者の全数）］。例えば、敗血症になる49生物およびSIRS状態のままである72生物が存在すれば、Nは121である。弱い決定ルールとは、誤差率がランダム推定値よりほんのわずかしか良くない決定ルールである。ブースティングアルゴリズムにおいて、決定ルールを改変されたデータのバージョンに繰返し適用し、それにより、1シリーズの弱い決定ルールGm(x)（m＝1,2,...,M）を作製する。次いでこのシリーズの決定ルールの全てからの予測値を重み付けされた多数決を介して組合わせて、最終決定ルール：
【数６】
2008538007.tif 000014
を作製する。
【０１９９】
ここで、α1、α2、...、αMはブースティングアルゴリズムにより計算し、そしてこれらの目的は、それぞれの決定ルールGm(x)の寄与を重み付けすることである。この効果は、シリーズ中のより正確な決定ルールに対してより高い影響を与えることである。
【０２００】
それぞれのブースティングステップにおけるデータ改変は、重みW1、W2、...、Wnをそれぞれの訓練観察値（xi、yj、i＝1、2、...N）に適用することからなる。最初に全ての重みをwj＝1/Nに設定し、第1ステップは単に決定ルールをデータ上で通常の方法により訓練させる。それぞれの逐次繰返し、m＝2、3、...、Mに対して、観察重みを個々に改変し、そして決定ルールを重みづけされた観察値に再適用する。ステップmにおいて、前のステップで誘導された決定ルールGm-1(x)によりミス分類されたこれらの観察値はそれらの重みを増加するが、正しく分類されたものについては減少する。従って、繰返しを進めると、正しく分類することが困難である観察値は受ける影響がいつまでも増加する。それぞれの逐次決定ルールは、それにより、シリーズ中の前の決定ルールが見落とした訓練観察値に集中する。
【０２０１】
例示のブースティング アルゴリズムは次の通り総括される：
1. Initialize the observation weights wi = 1/N, i = 1, 2, ..., N.
［観察重みwi=1/N、i=1〜Nに初期化する；］
2. For m = l to M:
［m=l〜Mに対して］
(a) Fit a decision rule Gm(x) to the training set using weights wi.
［決定ルールGm(x)を訓練セットにwiを用いて適合させる］
(b) Compute
［次式を計算する］
【数７】
2008538007.tif 000015
(c) Compute αm=log((l-errm)/errm)
［αmを計算する］
(d) Set wi←wi[exp[αml(yi≠Gm(xi))], i = 1,2,...,N.
［wiを設定する］
【数８】
2008538007.tif 000016
［G(x)を出力する］
【０２０２】
このアルゴリズムによる一実施形態において、それぞれのオブジェクトは、実際は、ファクタである。さらに、このアルゴリズムにおいて、現行の決定ルールGm(x)はライン2aで重み付けされた観察値で誘導される。得られる重み付けされた誤差率をライン2bで計算する。ライン2cは最終分類器G(x)（ライン3）を作る際にGm(x)に与えられる重みαmを計算する。観察値のそれぞれの個々の重みを次の繰返しに対してライン2dで更新する。Gm(x)により分類が見過ごされた観察値はファクタexp(αm)だけスケールされ、シリーズの次の分類器Gm＋l(x)を誘導する際にそれらの相対的影響を増加する。いくつかの実施形態においては、FreundおよびSchapire、1997、Journal of Computer and System Sciences 55、pp. 119-139に記載のブースティング方法の修飾が利用される。例えば、本明細書に参照によりその全てが組み入れられるHastiら, The Elements of Statistical Learning、2001、Springer、New York、Chapter 10を参照されたい。例えば、いくつかの実施形態においては、特性の前選択を、本明細書に参照によりその全てが組み入れられるParkら, 2002、Pac. Symp. Biocomput. 6、52-63のノンパラメトリックスコアリング方法などの技法を用いて行う。特性の前選択は、分類間を最もよく判別する遺伝子を分類器に用いるために選択するディメンジョナリティ低減の1つの形態である。次いで、FreundおよびSchapireのブースティング手順よりむしろ、Friedmanら, 2000, Ann Stat 28, 337-407により導入されたLogitBoost手順が利用される。いくつかの実施形態においては、ブースティングおよび本明細書に参照によりその全てが組み入れられるBen-Dorら, 2000, Journal of Computational Biology 7, 559-583の他の分類方法が本発明で用いられる。
【０２０３】
ランダムサブ空間方法においては、決定ルールが、データ特性空間のランダムサブ空間で構築される。これらの決定ルールは通常、最終決定ルールにおいて、単純な多数決と組合わせられる。例えば、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Ho, 「決定ツリーを構築するためのランダムサブ空間方法（The Random subspace method for constructing decision forests）」, IEEE Trans Pattern Analysis and Machine Intelligence, 1998; 20(8): 832-844を参照されたい。
【０２０４】
5.5.4  多重加法回帰ツリー（Multiple additive regression trees）
多重加法回帰ツリー（MART）は本発明に利用できる決定ルールを構築する他の方法である。MARTの一般的なアルゴリズムは次のとおりである：
【数９】
2008538007.tif 000017
［f0(x)を初期化する］
2. For m = 1 to M:
［m＝1〜Mに対して］
(a) For I = 1,2,...,N compute
【数１０】
2008538007.tif 000018
［I=1〜Nに対して、γimを計算する］
(b) Fit a regression tree to the targets rim giving terminal regions Rjm, j = 1,2, ..., Jm.
［末端領域Rjm、j=1〜Jmを与えて、回帰ツリーを標的rimに適合させる］
(c) For j = 1, 2 ...,Jm compute
【数１１】
2008538007.tif 000019
［j=1〜Jmに対して、γjmを計算する］
【数１２】
2008538007.tif 000020
［fm(x)を更新する］
【数１３】
2008538007.tif 000021
［f(x)を出力する］
【０２０５】
特定のアルゴリズムは、異なる損失判定基準L(y,f(x))を挿入することにより得られる。アルゴリズムの第1ラインは、ちょうど単一末端ノードツリーである最適定常モデルに初期化する。ライン2(a)で計算される負勾配の成分は一般化擬似残差、rと呼ばれる。一般に使用される損失関数の勾配は、本明細書に参照により組み入れられるHastieら, 2001, The Elements of Statistical Learning, Springer- Verlag, New York, p. 321の表10.2に総括されている。分類のためのアルゴリズムも同様であり、本明細書に参照によりその全てが組み入れられるHastieら（前記）の第10章に記載されている。MART手順に関連する同調パラメーターは繰返し数Mおよび構成ツリーJm（m＝1〜M）のそれぞれのサイズである。
【０２０６】
5.5.5  回帰による決定ルール
いくつかの実施形態において、被験者を分類するために用いる決定ルールは回帰を使って構築する。かかる実施形態においては、決定ルールを回帰分類器、好ましくはロジスチック回帰分類器として特徴付けることができる。かかる回帰分類器には、分類器を構築するために用いるバイオマーカーのそれぞれに対する係数（例えば、それぞれのかかるバイオマーカーに対する特性）が含まれる。かかる実施形態において、回帰分類器に対する係数は、例えば、最大尤度手法を用いて計算される。かかる計算において、バイオマーカーに対する特性（例えば、RT-PCR、マイクロアレイデータ）が利用される。特定の実施形態においては、ただ2つの形質サブグループ（例えば、形質サブグループaは所定の期間に敗血症になりうる、そして形質サブグループbは所定の期間に敗血症にならないであろう）から得た分子マーカーが用いられ、そして従属変数は、バイオマーカーデータを利用できる被験者における特定の形質の非存在または存在である。
【０２０７】
他の特定の実施形態において、訓練集団は複数の形質サブグループ（例えば、3以上の形質サブグループ、4以上の特定の形質サブグループなど）を含む。これらの複数の形質サブグループは、訓練集団における、健康からSIRSへ、敗血症へ、敗血症のさらに進んだ段階への表現型進行の明確な段階に対応しうる。この実施形態においては、多カテゴリー応答を扱うロジスチック回帰モデルの一般化を用いて、訓練集団に見られる様々な形質サブグループの間を判別する決定を開発することができる。例えば、訓練集団において表される複数の形質サブグループのいずれかの間を判別できる分類器を開発するために、選択した分子マーカーに対して測定されたデータを、多カテゴリーロジットモデルのいずれかに適用することができる（本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Agresti、An Introduction to Categorical Data Analysis、1996、John Wiley & Sons、Inc.、New York、第8章を参照）。
【０２０８】
5.5.6  ニューラルネットワーク
いくつかの実施形態においては、本発明の選択バイオマーカーについて測定した特性データ（例えば、RT-PCRデータ、質量分析データ、マイクロアレイデータ）を用いてニューラルネットワークを訓練することができる。ニューラルネットワークは2段階回帰または分類決定ルールである。ニューラルネットワークは層状構造であって、重みの層により出力ユニットの層に接続された入力ユニット（および偏差）の層を含む。回帰については、出力ユニットの層は、典型的には、ちょうど1つの出力ユニットを含む。しかし、ニューラルネットワークは継目の無い方式で複数の定量的応答を扱うことができる。
【０２０９】
多層ニューラルネットワークには、入力ユニット（入力層）、隠れユニット（隠れ層）、および出力ユニット（出力層）が存在する。さらに、入力ユニット以外にそれぞれのユニットに接続された単一の偏差ユニットが存在する。ニューラルネットワークは、それぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Dudaら, 2001, Pattern Classification, Second Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York；およびHastieら, 2001, The Elements of Statistical Learning、Springer- Verlag、New Yorkに記載されている。ニューラルネットワークはまた、それぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Draghici, 2003, Data Analysis Tools for DNA Microarrays、Chapman & Hall/CRC；およびMount, 2001, Bioinformatics: sequence and genome analysis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkにも記載されている。以下に開示するのはニューラルネットワークのいくつかの例示の型である。
【０２１０】
ニューラルネットワークの使用への基本的手法は、未訓練ネットワークで出発し、訓練パターンを入力層に提示し、そしてネットワークを通してシグナルを通過させ、そして出力層における出力を確認することである。これらの出力を標的値と比較し：いずれかの差が誤差となる。この誤差もしくは判定基準関数は重みの何らかのスカラー関数であり、ネットワーク出力が所望の出力と整合すると最小化される。こうして、重みを調節してこの誤差測定値を低減する。回帰に対しては、この誤差は平方和誤差であってもよい。分類に対しては、この誤差は平方誤差または交差エントロピー（偏差）であってもよい。例えば、本明細書に参照によりその全てが組み入れられるHastie et al、2001、The Elements of Statistical Learning、Springer- Verlag、New Yorkを参照されたい。
【０２１１】
3つの通常使用される訓練プロトコルは確率的、バッチ、およびオンラインであってもよい。確率的訓練においては、パターンが訓練セットからランダムに選ばれ、そしてネットワーク重みはそれぞれのパターン提示に対して更新される。勾配降下法により訓練された多層非線形ネットワーク、例えば確率的戻し伝播は、ネットワーク位相幾何学により定義される分類器における重み値の最大尤度評価を実行する。バッチ訓練においては、全てのパターンがネットワークに表示された後に学習が起こる。典型的には、バッチ訓練においては、訓練データを通して複数のパスが作られる。オンライン訓練においては、それぞれのパターンが1回、そして1回だけネットに提示される。
【０２１２】
いくつかの実施形態においては、考慮が重みの出発値に対して与えられる。もし重み値がゼロ近くであれば、その時は、ニューラルネットワークの隠れ層に通常使われるシグモイドの操作部分（本明細書に参照により組み入れられるHastie et al、2001、The Elements of Statistical Learning、Springer- Verlag、New Yorkを参照）はほぼ線形であり、従ってニューラルネットワークはほぼ線形の分類器になる。いくつかの実施形態において、重みの出発値はランダム値がほぼゼロであるように選ばれる。従って、分類器はほぼ線形で出発し、そして重みの増加につれて非線形になる。個々のユニットは指示に従って局在化し、必要であれば非線形性を導入する。正確なゼロの重みを使うとゼロ誘導体、完全な対称体となり、アルゴリズムは決して動かない。あるいは、大きい重みを使って出発すると不十分な解を得ることが多い。
【０２１３】
入力のスケーリングはボトム層の重みの効果的なスケーリングを決定するので、最終解の品質に大きな影響を与えうる。従って、いくつかの実施形態においては、初めに発現値を標準化して平均値ゼロおよび標準偏差1を与える。これによって、全ての入力が規則化過程で等しく処理されることを保証し、かつランダム出発重みにとって有意義な範囲を選ぶことができる。標準化入力については、範囲［-0.7、+0.7］にわたってランダムな均一重みを採用するのが典型的である。
【０２１４】
3層ネットワークの使用において頻発する問題は、ネットワークに用いる隠れ層の最適数である。3層ネットワークの入力および出力数は解くべき問題によって決定される。本発明において、所与のニューラルネットワークに対する入力数は訓練集団から選択されるバイオマーカーの数に等しい。ニューラルネットワークに対する出力数は典型的にはちょうど1である。しかし、いくつかの実施形態においては、ちょうど2を超える状態をネットワークにより定義できるように、１を超える出力を用いる。例えば、多出力ニューラルネットワークを用いて、健康表現型、様々な段階のSIRS、および／または様々な段階の敗血症の間を判別することができる。もしニューラルネットワークで使われる隠れユニットが多過ぎれば、ネットワークは自由度が大き過ぎて、訓練があまりにも長くなり、ネットワークがデータを過適合しうる危険がある。もし隠れユニットが少な過ぎれば、訓練セットは学習できない。しかし、一般的に言えば、隠れユニットは多過ぎるほうが少な過ぎるよりもよい。隠れユニットが少な過ぎる場合、分類器はデータの非線形性を捕捉するのに十分なフレキシビリティを有しえない；一方、隠れユニットが多過ぎる場合、もし以下に記載のように、適当な規則化または剪定を利用すると、余分な重みをゼロに縮減しうる。典型的な実施形態において、隠れユニットの数は5〜100の範囲のいずれかにあり、その数は入力数と訓練事例数と共に増加する。
【０２１５】
使用する隠れユニットの数を決定するための1つの一般的手法は規則化手法を応用することである。規則化手法においては、新しい判定基準関数を、古典的訓練誤差だけでなく分類器複雑度にも基づいて構築する。具体的には、新しい判定基準関数は高度に複雑な分類器にペナルティを与える；この判定基準の最小値を探すことは、訓練セットの誤差を、訓練セット＋規則化項（解の制約または所望の特性を表す）の誤差と次式：
J＝Jpat＋λJreg
によりバランスさせることである。パラメーターλは規則化を課する強度の多少を調節する。言い換えれば、λの値が大きいほど、収縮重みはゼロに向かう：典型的には検証セットによる交差検定法を用いてλを見積もる。この検証セットは訓練集団のランダムサブセットを無視することにより得ることができる。ペナルティの他の形、例えば、重み削除ペナルティが提案されている（例えば、本明細書に参照により組み入れられる、Hastieら, 2001, The Elements of Statistical Learning, Springer- Verlag, New Yorkを参照）。
【０２１６】
使用する隠れユニットの数を決定するための他の手法は、ほとんど必要でない重みを削除、選定することである。1つの手法では、最小マグニチュードの重みを削除する（ゼロに設定する）。かかるマグニチュードに基づく剪定はうまく行くこともあるが、最適ではない；しばしば小さいマグニチュードの重みが学習および訓練データとして重要である。いくつかの実施形態においては、マグニチュードに基づく剪定手法を用いるより、Wald統計量を計算する。Wald統計量の基本的な考え方は、これを用いて分類器中の隠れユニットの重要度（重み）を評価できるということである。次に、最も重要度の低い隠れユニットを削除する（それらの入力および出力重みをゼロに設定する）。この点についての2つのアルゴリズムは、Optimal Brain Damage（最適脳障害）（OBD）およびOptimal Brain Surgeon（最適脳外科医）（OBS）アルゴリズムであり、これらは二次近似を用いて訓練誤差が重みに依存する程度を予測して、訓練誤差の増加を最小に導く重みを削除する。
【０２１７】
OBDとOBSは、ネットワークを訓練して重みwにおける局所最小誤差、および訓練誤差の増加を最小に導く重みを剪定する、同じ基本的手法を共有するものである。全重みベクトルδwの変化に対して予測される誤差の機能的増加は次式：
【数１４】
2008538007.tif 000022
［式中、
【数１５】
2008538007.tif 000023
はHessian行列である］で表される。第1項は誤差の極小値で消え；3次以上の高次項は無視される。1つの重みを欠失する制約が与えられたときのこの関数を最小化する一般解は次式：
【数１６】
2008538007.tif 000024
で表される。ここで、uqは重み空間の第q番目の方向に沿った単位ベクトルであり、Lqは重みqを剪定しかつ他の重みをδwだけ更新したときの、重みqの突起に対する近似値、すなわち訓練誤差の増加である。これらの式はHの逆行列を必要とする。逆行列を計算する1つの方法は、小さい値、H0-1＝α-1I（式中、αは小さいパラメーター、すなわち効果的には重み定数）を用いて出発することである。次に、行列を、それぞれのパターンを用いて、次式：
【数１７】
2008538007.tif 000025
［式中、添字は提示されるパターンに対応しamはmとともに減少する］
によって、更新する。有用な訓練セットを提示した後に、逆Hessian行列は、H-1＝Hn-1により与えられる。アルゴリズムの形で、OBS法は次の通りである：
begin initialize nH、W、θ
［nH、W、θを初期化する］
train a reasonably large network to minimum error
［合理的に大きいネットワークを訓練して誤差を最小にする］
do compute H-1 by Eqn. 1
［H-1を式1により計算する］
q*←arg minq wq2/(2[H-1]qq)(saliency Lq)
［q*を設定する］
w←w-(wq*/[H-1]q*q*)H-1eq(saliency Lq)
［wを設定する］
until J(w)>θ
［J(w)>θまで続ける］
return w
［wを返す］
end
［終わる］
【０２１８】
OBD法は計算としてはより簡単である、というのはライン3の逆Hessian行列の計算が対角行列に対して特に簡単だからである。前記アルゴリズムは誤差が、θに初期化されている判定基準値より大きいと、終結する。他の手法は、重みの削除によるJ(w)の変化がある判定基準値より大きいと、ライン6を終結するように変える方法である。いくつかの実施形態において、ニューラルネットワークはバックプロパゲーション・ニューラルネットワーク（back-propagation neural network）であり、例えば、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Abdi、1994、「ニューラルネットワークプライマー（A neural network primer）」, J. Biol System. 2、247-283を参照されたい。
【０２１９】
5.5.7  クラスタリング
いくつかの実施形態においては、本発明の選択バイオマーカーの特性を用いて訓練セットをクラスタリングする。例えば、本明細書に記載の10の特性（10のバイオマーカーに対応する）を用いる場合を考えてみよう。訓練集団のそれぞれのメンバーmは10のバイオマーカーのそれぞれに対する特性値（例えば、発現値）を有しうる。訓練集団のメンバーm由来のかかる値は、ベクトル：X1m、X2m、X3m、X4m、X5m、X6m、X7m、X8m、X9m、X10mを規定し、ここでXimは生物mにおける第i番目のバイオマーカーのレベルである。もし訓練セット中にm個の生物が存在すれば、バイオマーカーの選択はm個のベクトルを規定する。本発明の方法は、ベクトルで用いられる全ての単一バイオマーカーのそれぞれの発現値が全てのベクトルmにおいて発現されることを必要としないことに注意されたい。言い換えれば、第i番目のバイオマーカーの1つが見出されない被験者から得たデータでもクラスタリングに利用できる。かかる場合に、見当たらない発現値は「ゼロ」または何らかの他の正規化した値に割り当てられる。いくつかの実施形態においては、クラスタリングの前に特性値を正規化して、ゼロの平均値および単位分散を有するようにさせる。
【０２２０】
訓練グループ全体にわたって類似の発現パターンを示すこれらの訓練集団のメンバーは一緒にクラスタリングされる傾向がありうる。本発明の遺伝子のある特別な組合わせは、そのベクトルが訓練集団に見出される形質グループ中にクラスタリングされるとき、本発明のこの態様における優れた分類器であると考えられる。例えば、もし訓練集団がクラスa：敗血症を発症しない被験者、およびクラスb：敗血症を発症する被験者を含めば、理想的なクラスタリングをする分類器は、集団を2グループに、ユニークにクラスaを表すクラスターグループおよびユニークにクラスbを表す他のクラスターグループにクラスタリングしうる。
【０２２１】
クラスタリングは、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、DudaおよびHart, Pattern Classification and Scene Analysis, 1973, John Wiley & Sons, Inc., New Yorkのページ211〜256、（以後、「Duda 1973」と呼ぶ）に記載されている。Duda 1973の第6.7節の記載のように、クラスタリング問題はデータセットにおいて自然グルーピングを発見する問題の1つとして記載されている。自然グルーピングを同定するためには、2つの事象を取り上げる。第1に、2サンプル間の類似性（または相違点）を決定する。このメトリック（類似性尺度）を用いて1つのクラスターのサンプルがお互いに、他のクラスターのサンプルより似ていることを保証する。第2に、類似性尺度を用いてデータをクラスターに分配する機構を決定する。
【０２２２】
類似性尺度は、Duda 1973の第6.7節で考察されており、そこには、クラスタリング研究を始める1つの方法は、距離関数を定義してデータセット中の全てのサンプル対の間の距離の行列を計算することであると述べられている。もし距離が類似性の良い尺度であれば、同じクラスター中のサンプル間の距離は、異なるクラスター中のサンプル間の距離より有意に小さいであろう。しかし、Duda 1973のページ215に記載のように、クラスタリングは距離メトリックの使用を必要としない。例えば、ノンメトリック類似性関数s(x、x')を用いて2つのベクトルxとx'を比較することができる。慣用的には、s(x、x')は、xとx'がともかく「類似」しているとその値が大きい対称関数である。ノンメトリック類似性関数s(x、x')の一例がDuda 1973のpp.216に与えられている。
【０２２３】
データセット中の点の間の「類似性」または「相違点」を測定する方法が選択されると、クラスタリングは、いずれかのデータ分配のクラスタリング品質を測定する判定基準関数を必要とする。判定基準関数を特化するデータセットの分配を行ってデータをクラスタリングする。Duda 1973のpp.217を参照されたい。判定基準関数はDuda1973の第6.8節に考察されている。
【０２２４】
さらに最近、Dudaら, Pattern Classification, 第2版, John Wiley & Sons, Inc. New Yorkが出版されている。pp.537-563はクラスタリングを詳しく記載している。クラスタリング技法のさらなる情報は、KaufmanおよびRousseeuw, 1990, Finding Groups in Data： An Introduction to Cluster Analysis, Wiley, New York, NY；Everitt, 1993, Cluster Analysisi （第3版）, Wiley, New York, NY；およびBacker, 1995, Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis, Prentice Hall, Upper Saddle River, New Jerseyに見出すことができる。本発明に利用しうる特別な例示のクラスタリング技法には、限定されるものでないが、階層構造クラスタリング（最近傍アルゴリズム、最遠隔アルゴリズム、平均連鎖アルゴリズム、セントロイドアルゴリズム、または平方和アルゴリズムを用いる凝集クラスタリング）、k-平均法クラスタリング、ファジーk-平均法クラスタリングアルゴリズム、および Jarvis-Patrickクラスタリングが含まれる。
【０２２５】
5.5.8  主成分分析
主成分分析（PCA）は遺伝子発現データを分析するために提案された。さらに一般的には、転換者を非転換者から判別する決定ルールを構築する目的で、PCAを用いて本発明のバイオマーカーの特性値データを分析することができる。主成分分析は、あるデータを、データの特性を総括する変数（主成分）の新しいセットに変換することにより、データセットの次元数（dimensionality）を減ずる古典的技法である。例えば、本明細書に参照により組み入れられる、Jolliffe, 1986, Principal Component Analysis, Springer, New Yorkを参照されたい。主成分分析はまた、本明細書に参照により組み入れられる、Draghici、2003、Data Analysis Tools for DNA Microarrays、Chapman & Hall/CRCにも記載されている。以下に記載の内容は主成分分析の非限定の例である。
【０２２６】
主成分（PC）は、無関連にかつk番目のPCがPCのなかでk番目に大きい分散を有するように整理されている。k番目のPCは、最初のk-1個のPCに対して直交性である、データ点のプロジェクションの分散を最大化する方向と解釈できる。最初の少数のPCがデータセットの変化のほとんどを捕える。対照的に、最後の少数のPCはしばしばデータ中の残余の「ノイズ」だけを捕える。
【０２２７】
PCAはまた、本発明による分類器を作製するために利用できる。かかる手法においては、本発明の選択バイオマーカーに対するベクトルを、前記クラスタリングについて記載したのと同じ方法で構築できる。実際、それぞれのベクトルが訓練集団の特別なメンバーから得た選択遺伝子に対する特性値（例えば、存在量値）を表すベクトルのセットは、行列として見ることができる。いくつかの実施形態において、この行列は、モノマーの定性的バイナリー記載のFree-Wilson法で表され（Kubinyi, 1990, 3D QSAR in drug design theory methods and applications, Pergamon Press, Oxford, pp 589-638）、PCAを用いて最大限に圧縮された空間に分布され、そして第1主成分（PC）が可能な分散情報の最大量を捕え、第2主成分（PC）が全分散情報の第2の最大量を捕え、そしてそれを続けて、最後に行列中の全ての分散情報が考慮されるようにする。
【０２２８】
次いで、それぞれのベクトル（それぞれのベクトルは訓練集団のメンバーを表す）をプロットする。多くの色々なタイプのプロットが可能である。いくつかの実施形態においては、一次元プロットを行う。この一次元プロットでは、訓練集団のメンバーのそれぞれから得た第1主成分の値をプロットする。このプロットの型で期待されるのは、第1サブグループ（例えば、所定の期間に敗血症を発症しない被験者）のメンバーが1つの第1主成分値の範囲にクラスタリングしかつ第2サブグループ（例えば、所定の期間に敗血症を発症する被験者）のメンバーが第2の第1主成分値の範囲にクラスタリングしうることである。
【０２２９】
理想的な例においては、訓練集団は2つのサブグループ：「敗血症」および「SIRS」を含む。第1主成分を、本発明の選択バイオマーカーに対する分子マーカー発現を用いて、全訓練集団データセットにわたって計算する。次いで、訓練セットのそれぞれのメンバーを、第1主成分に対する値の関数としてプロットする。この理想的な例では、第1主成分が陽性である訓練集団のメンバーは「反応者（responder）」であり、そして第1主成分が陰性である訓練集団のメンバーは「敗血症を患う被験者」である。
【０２３０】
いくつかの実施形態において、訓練集団のメンバーを１以上の主成分に対してプロットする。例えば、いくつかの実施形態においては、訓練集団のメンバーを、第1次元が第1主成分でありかつ第二次元が第2主成分である二次元プロット上でプロットする。かかる二次元プロットにおいて、期待されるのは、訓練集団で表されたそれぞれのサブグループのメンバーが異なるグループ中にクラスタリングしうることである。例えば、二次元プロットのメンバーの第1クラスターは所与の期間に敗血症を発症する被験者を表し、二次元プロットのメンバーの第2クラスターは所与の期間に敗血症を発症しない被験者を表しうる。
【０２３１】
5.5.9  最近傍分析
最近傍分類器はメモリに基づくものであり、適合させる分類器を必要としない。ケリーポイントxoが与えられると、xoに距離の最も近いk個の訓練ポイントx(r)、r,..,kを規定し、次いでポイントxoをk最近傍を用いて分類する。タイ（tie）をランダムに解いてもよい。いくつかの実施形態においては、特性空間のユークリッド距離を用いて、距離を、d(i)＝||x(i)-x0||として決定することができる。典型的には、最近傍アルゴリズムを用いる場合、線形判別子を計算するために使う発現データは、平均ゼロおよび単位分散を有するように標準化される。本発明において、訓練集団のメンバーは訓練セットとテストセットにランダムに分割される。例えば、一実施形態において、訓練集団数の3分の2を訓練セットに配置しかつ訓練集団数の3分の1をテストセットに配置する。本発明のバイオマーカーの選択組合わせはテストセットのメンバーをプロットする特性空間を表す。次に、テストセットのメンバーを正しく特徴づける訓練セットの能力を計算する。いくつかの実施形態においては、最近傍計算を、本発明のバイオマーカーの所与の組合わせに対して数回実施する。計算のそれぞれの繰返しにおいて、訓練集団のメンバーをランダムに訓練セットおよびテストセットに割り当てる。次いで、バイオマーカーの組合わせの品質を、それぞれのかかる最近傍計算の繰返しの平均とする。
【０２３２】
最近傍ルールを洗練して、不平等クラス優先者（unequal class prior）の事象、示差ミス分類コスト（differential misclassification costs）、および特性選択を扱うことができる。これらの洗練手法の多くは、近傍に対する重み付け投票のなんらかの型に関わる。最近傍分析のさらなる情報については、それぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Duda, Pattern Classification, 第2版, 2001, John Wiley & Sons, Inc；およびHastie, 2001, The Elements of Statistical Learning, Springer, New Yorkを参照されたい。
【０２３３】
5.5.10  線形判別分析
線形判別分析（LDA）は、ある特定のオブジェクト性質に基づいて、被験者を2つのカテゴリーの1つに分類することを試みる。言い換えれば、LDAは実験で測定されたオブジェクト属性がオブジェクトのカテゴリーを予測するかどうかを試験する。LDAは、典型的には、連続独立変数および二分のカテゴリー従属変数を必要とする。本発明において、訓練集団のサブセット全体にわたる本発明のバイオマーカーの選択組合わせに対する特性値が、必要な連続独立変数の役割を果たす。訓練集団のメンバーのそれぞれの形質サブグループ分類が二分したカテゴリー従属変数の役割を果たす。
【０２３４】
LDAは、グルーピング情報を用いてグループ間分散とグループ内分散の比を最大化する変数の線形組合わせを求める。暗に示されるように、LDAで用いられる線形重みは訓練セット全体の分子マーカーの特性値が2グループ（例えば、所定の期間に敗血症になるグループと所定の期間に敗血症にならないグループ）で離れている程度およびこれらの特性値が他のバイオマーカーの特性値と相関をもつ程度に依存する。いくつかの実施形態においては、LDAを、訓練サンプル中のNのメンバーのデータ行列に、Kのバイオマーカーを本発明に記載のバイオマーカーの組合わせで適用する。次いで、訓練集団のそれぞれのメンバーの線形判別をプロットする。理想的には、第1サブグループ（例えば、所定の期間に敗血症を発症するこれらの被験者）を表す訓練集団のこれらのメンバーを線形判別値（例えば、陰性）にクラスタリングし、そして第2サブグループ（例えば、所定の期間に敗血症を発症しないこれらの被験者）を表す訓練集団のこれらのメンバーを線形判別値（例えば、陽性）にクラスタリングしうる。LDAは、判別値のクラスター間の分離が大きいほど好都合であると考えられる。線形判別分析のさらなる情報については、それぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Duda, Pattern Classification, 第2版, 2001, John Wiley & Sons、Inc；およびHastie, 2001, The Elements of Statistical Learning, Springer, New York； および Venables & Ripley, 1997, Modern Applied Statistics with s-plus, Springer, New Yorkを参照されたい。
【０２３５】
5.5.11  二次判別分析
二次判別分析（QDA）は、LDAと同じ入力パラメーターを使い、そして同じ結果を返す。QDAは線形式よりもむしろ二次式を用いて結果を得る。LDAとQDAは互換性があり、どちらを利用するかは、好みおよび／または分析を支援するソフトウエアの利用可能性の問題である。ロジスチック回帰は、LDAおよびQDAと同じ入力パラメーターを使い、そして同じ結果を返す。
【０２３６】
5.5.12  サポートベクタマシーン
本発明のいくつかの実施形態においては、サポートベクタマシーン（SVM）を利用し、本発明に記載の遺伝子の特性値を使って被験者を分類する。SVMは学習アルゴリズムの比較的新しいタイプである。例えば、それぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、CristianiniおよびShawe-Taylor, 2000, An Introduction to Support Vector Machines, Cambridge University Press, Cambridge；Boserら, 1992, 「最適限界分類器のための訓練アルゴリズム（A training algorithm for optimal margin classifiers）」, in Proceedings of the 5th Annual ACM Workshop on Computational Learning Theory, ACM Press, Pittsburgh, PA, pp. 142-152；Vapnik, 1998, Statistical Learning Theory, Wiley, New York; Mount, 2001, Bioinformatics: sequence and genome analysis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York；Duda, Pattern Classification, 第2版, 2001, John Wiley & Sons, Inc.；およびHastie, 2001, The Elements of Statistical Learning, Springer, New York；およびFurey ら, 2000, Bioinformatics 16, 906-914を参照されたい。分類に用いられるとき、SVMはバイナリー標識されたデータ訓練データの所与のセットを、それらを最大限に分離する超平面を用いて分離する。線形分離ができない場合、SVMは特性空間への非線形マッピングを自動的に実現する「カーネル」技法との組合わせで作用する。特性空間においてSVMにより見出される超平面は、入力空間における非線形決定境界に対応する。
【０２３７】
SVMが使われる一手法においては、特性データは平均ゼロおよび単位分散を有するように標準化され、かつ訓練集団のメンバーは訓練セットとテストセットにランダムに分割される。例えば、一実施形態においては、訓練集団のメンバーの3分の2を訓練セットに配置しかつ訓練集団数の3分の1をテストセットに配置する。本発明に記載の遺伝子の組合わせに対する発現値を用いてSVMを訓練する。次いで、SVMががテストセット中のメンバーを正しく分類する能力を決定する。いくつかの実施形態において、この計算を、分子マーカーの所与の組合わせに対して数回実施する。各計算の繰返しにおいて、訓練集団のメンバーを、訓練セットとテストセットにランダムに割り当てる。次いで、バイオマーカーの組合わせの品質を、それぞれのかかるSVM計算の繰返しの平均値とする。
【０２３８】
5.5.13  進化方法
生物学的進化プロセスにヒントを得て、決定ルール設計の進化的方法は、決定ルールに対する確率的検索を採用する。広く概観すると、かかる方法は、複数の決定ルール（本発明に記載のバイオマーカーの組合わせからの集団）を作成する。それぞれの決定ルールはお互いに若干変わっている。次に、決定ルールを、全訓練集団にわたる特性データについてスコアを付ける。生物学的進化との類似性を保って、得られる（スカラ）スコアはしばしば適応度と呼ばれる。決定ルールをそのスコアに従って順位付けをし、最良の決定ルールを保持する（決定ルールの全集団の若干の部分）。再び、生物学的用語に従って、本方法は適者生存と呼ばれる。決定ルールは、次の世代（子供または子孫）において確率的に改変される。いくつかの子孫決定ルールは前の世代の親より高いスコアを有しうるし、いくつかは低いスコアを有しうる。次いで、全プロセスをその後の世代に対して繰り返し：決定ルールをスコア付けしそして最良のものを保持し、ランダムに改変してさらに他の世代を得る、そしてこれを続ける。順位付けするので、ある程度、それぞれの世代は、平均して、前の世代より若干高いスコアを有する。一世代の単独の最良決定ルールが所望の判定基準値を超えると、プロセスを停止する。進化法についてのさらなる情報は、例えば、Duda、Pattern Classification、第2版、2001、John Wiley & Sons、Inc.に見出される。
【０２３９】
5.5.14  他のデータ解析アルゴリズム
以上記載したデータ解析アルゴリズムは、転換者を非転換者から判別する決定ルールを構築するために利用できる方法のタイプの単なる例である。さらに、以上記載した技法の組合わせを利用することができる。決定ツリーおよびブースティングの組合わせの利用などのいくつかの組合わせが記載されている。しかし、多数の他の組合わせが可能である。さらに、射影追跡法および重み付け投票法などの当技術分野の他の技法を用いて決定ルールを構築することができる。
【０２４０】
5.6  バイオマーカー
特定の実施形態において、本発明は、被験者における敗血症および／またはその進行段階を診断または予測するのに有用であるバイオマーカーを提供する。本発明の方法は予測的バイオマーカーを同定する不偏の手法を利用できる一方、生理学的応答とまたは様々なシグナル伝達経路と関連する特定グループのバイオマーカーが特に注目されることは当業者に明らかであろう。これは特に、生物学的サンプルからのバイオマーカーをアレイと接触させて、直接かつ特異的な相互作用を介して様々なバイオマーカー（例えば、抗体アレイまたは核酸アレイ）の量を測定するために利用できる場合である。この場合、アレイの成分の選択は、特定の経路が被験者の敗血症またはSIRSの状態の決定に関連があるという示唆に基づくものであってもよい。特定のバイオマーカーが敗血症またはSIRSを予測または診断する特性を有する表示は、同様に協調された様式で生理学的に調節される他のバイオマーカーが予測または診断上の特性を提供できるかも知れないという期待を生じうる。しかし、当業者は、生物学的系が複雑である故にかかる期待は実現され得ないことを理解するであろう。例えば、もし特異的mRNAバイオマーカーの量が予測特性であった場合、もし他のバイオマーカーが翻訳後のレベルで調節されれば、他のバイオマーカーのmRNA発現の協調した変化は測定できないであろう。さらに、バイオマーカーのmRNA発現レベルは、敗血症に対する生理学的応答に関わりうるまたは関わりえない複数の収束経路の影響を受けうる。
【０２４１】
バイオマーカーは、例としてであって限定するものでないが、宿主または被験者から得た、全血、血漿、唾液、血清、赤血球、血小板、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球、尿、脳髄液、痰、便、細胞および細胞抽出物、または他の生物液サンプル、組織サンプルまたは組織生検であってもよい、いずれかの生物学的サンプルから得ることができる。被験者から採取される正確な生物学的サンプルは変わりうるが、サンプリングは好ましくは最小限に浸潤性であってかつ容易に通常の技法により実施される。
【０２４２】
表現型変化の測定は、いずれかの通常の技法により行ってもよい。体温、呼吸速度、脈拍、血圧、またはその他の生理学的パラメーターの測定は臨床の観察および測定を介して行うことができる。バイオマーカー分子の測定値には、例えば、バイオマーカー分子に関連する存在、濃度、発現レベル、またはいずれかの他の値を示す測定値が含まれる。バイオマーカー分子の検出の形態は、典型的には、生物学的サンプルから得たこれらのバイオマーカーのプロファイルを形成するのに使われる方法に依存する。前記の第5.4節、および下記の表30、1、J、K、L、およびMを参照されたい。
【０２４３】
特定の実施形態において、バイオマーカープロファイルは表30の列4または5に掲げられた少なくとも2つのバイオマーカーを含む。バイオマーカーはさらに少なくとも2つのバイオマーカーにそれぞれ対応する特性を含む。かかるバイオマーカーは、例えば、mRNA転写物、cDNAまたはなんらかの他の核酸、例えば増幅された核酸、またはタンパク質であってもよい。一般に、少なくとも2つのバイオマーカーは、少なくとも2つの異なる遺伝子由来である。少なくとも2つのバイオマーカー中の1つのバイオマーカーが表30のカラム4に掲げられている場合、そのバイオマーカーは、例えば、掲げられた遺伝子により作られた転写物、その補体、または判別断片もしくはその補体、またはそのcDNA、もしくはcDNAの判別断片、または転写物もしくはその補体の全てもしくは一部分に対応する判別する増幅された核酸分子、その遺伝子によりコードされるタンパク質、またはそのタンパク質の判別断片、または以上のいずれかの表示であってもよい。さらになお、バイオマーカーは、例えば、表30の列5に掲げられたタンパク質、またはそのタンパク質の判別断片、または以上いずれかの表示であってもよい。ここで、判別分子または判別断片は、検出されると、以上の同定された転写物、cDNA、増幅された核酸、またはタンパク質の存在または存在量を示す分子または断片である。この実施形態によれば、本発明のバイオマーカープロファイルは、当業者に公知の標準アッセイを用いて、または本明細書に記載のバイオマーカーを検出するアッセイで得ることができる。かかるアッセイは、例えば、特別な遺伝子または目的の遺伝子（例えば、表30に開示された遺伝子）の対立遺伝子の発現の産物（例えば、核酸および／またはタンパク質）を検出することができる。一実施形態においては、かかるアッセイは核酸マイクロアレイを利用する。
【０２４４】
特別な実施形態においては、バイオマーカープロファイルは、表30の列2に掲げられたプローブセットの1つをそれぞれ含有する少なくとも2つのバイオマーカー、表30のプローブセットの1つの補体を含有するバイオマーカー、または表30のプローブセットの1つまたは表30のプローブセットの1つの補体を含有する遺伝子によりコードされたアミノ酸配列を含有するバイオマーカーを含む。かかるバイオマーカーは、例えば、mRNA転写物、cDNAまたはいくつかの他の核酸、例えば増幅された核酸、またはタンパク質であってもよい。バイオマーカープロファイルはさらに、少なくとも2つのバイオマーカーに対するそれぞれの対応する特性を含む。一般に、少なくとも2つのバイオマーカーは、少なくとも2つの異なる遺伝子由来である。バイオマーカーが表30に掲げられたプローブセットの配列を含む遺伝子に基づく場合、そのバイオマーカーは、例えば、掲げられた遺伝子により作られた転写物、その補体、またはその判別断片もしくは補体、またはそのcDNA、もしくはcDNAの判別断片、または転写物もしくはその補体の全てもしくは一部分に対応する判別する増幅核酸分子、または遺伝子によりコードされるタンパク質、またはタンパク質の判別断片、または以上のいずれかの表示であってもよい。さらになお、バイオマーカーは、例えば、表30に記載のプローブセット配列を含む遺伝子によりコードされるタンパク質、またはそのタンパク質の判別断片、または以上のいずれかの表示であってもよい。ここで、判別分子または判別断片は、検出されると、以上の同定された転写物、cDNA、増幅された核酸、またはタンパク質の存在または存在量を示す分子または断片である。
【０２４５】
いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは2〜626の表30に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは3〜50の表30に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは4〜25の表30に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは少なくとも3つの表30に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは少なくとも4つの表30に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、または100の表30に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、それぞれのかかるバイオマーカーは核酸である。いくつかの実施形態において、それぞれのかかるバイオマーカーはタンパク質である。
【０２４６】
いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイル中のいくつかのバイオマーカーは核酸でありかつバイオマーカープロファイル中のいくつかのバイオマーカーはタンパク質である。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは2〜130の表31に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは3〜50の表31に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは4〜25の表31に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは少なくとも3つの表31に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは少なくとも4つの表30に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは少なくとも6、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、または100の表31に掲げられたバイオマーカーを有する。
【０２４７】
いくつかの実施形態においてバイオマーカープロファイルは2〜10の表33に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは3〜10の表32に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは4〜10の表32に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは少なくとも3つの表32に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは少なくとも4つの表32に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは少なくとも6、7、8、9、または10の表32に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、それぞれのかかるバイオマーカーは核酸である。いくつかの実施形態において、それぞれのかかるバイオマーカーはタンパク質である。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイル中のバイオマーカーのいくつかは核酸でありかつバイオマーカープロファイル中のバイオマーカーのいくつかはタンパク質である。
【０２４８】
いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは2〜10の表33に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは3〜10の表33に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは4〜10の表33に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは少なくとも3つの表33に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは少なくとも4つの表33に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは少なくとも6、7、8、9、または10の表33に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、それぞれのかかるバイオマーカーは核酸である。いくつかの実施形態において、それぞれのかかるバイオマーカーはタンパク質である。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイル中のバイオマーカーのいくつかは核酸でありかつバイオマーカープロファイル中のバイオマーカーのいくつかはタンパク質である。
【０２４９】
いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは2〜130の表34に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは3〜40の表34に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは4〜25の表34に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、または40の表34に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、それぞれのかかるバイオマーカーは核酸である。いくつかの実施形態において、それぞれのかかるバイオマーカーはタンパク質である。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイル中のバイオマーカーのいくつかは核酸でありかつバイオマーカープロファイル中のバイオマーカーのいくつかはタンパク質である。
【０２５０】
いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは2〜7の表36に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは3〜6の表36に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは4〜7の表36に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは少なくとも3つの表36に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは少なくとも4つの表36に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは少なくとも6、7、8、9、または10の表36に掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、それぞれのかかるバイオマーカーは核酸である。いくつかの実施形態において、それぞれのかかるバイオマーカーはタンパク質である。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイル中のバイオマーカーのいくつかは核酸でありかつバイオマーカープロファイル中のバイオマーカーのいくつかはタンパク質である。
【０２５１】
いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは表Iに掲げられた2〜53のバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは表Iに掲げられた3〜50のバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは表Iに掲げられた4〜25のバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは表Iに掲げられた少なくとも3つのバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは表Iに掲げられた少なくとも4つのバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、15、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、または53の表Iに掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、それぞれのかかるバイオマーカーは表Iの核酸である。いくつかの実施形態において、それぞれのかかるバイオマーカーは表Iのタンパク質である。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイル中のバイオマーカーのいくつかは表Iのタンパク質でありかつバイオマーカープロファイル中のバイオマーカーのいくつかは表Iの核酸である。
【０２５２】
いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは表Jに掲げられた2〜44のバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは表Jに掲げられた3〜44のバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは表Jに掲げられた4〜25のバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは表Jに掲げられた少なくとも3つのバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは表Jに掲げられた少なくとも4つのバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、15、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、または43の表Jに掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、それぞれのかかるバイオマーカーは表Jの核酸である。いくつかの実施形態において、それぞれのかかるバイオマーカーは表Jのタンパク質である。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイル中のバイオマーカーのいくつかは表Jのタンパク質でありかつバイオマーカープロファイル中のバイオマーカーのいくつかは表Jの核酸である。
【０２５３】
いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは表Kに掲げられた2〜10のバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは表Kに掲げられた3〜10のバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは表Kに掲げられた4〜10のバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは表Kに掲げられた少なくとも3つのバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは表Kに掲げられた少なくとも4つのバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは少なくとも5、6、7、8、または9の表Kに掲げられたバイオマーカーを有する。いくつかの実施形態において、それぞれのかかるバイオマーカーは表Kの核酸である。いくつかの実施形態において、それぞれのかかるバイオマーカーは表Kのタンパク質である。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイル中のバイオマーカーのいくつかは表Kのタンパク質でありかつバイオマーカープロファイル中のバイオマーカーのいくつかは表Kの核酸である。
【０２５４】
5.6.1  有用なバイオマーカーの単離
本発明のバイオマーカーは、例えば、タンパク質であれば、バイオマーカーと結合する抗体を産生させるために（前記第5.4.2節に記載の、または当業者に周知の方法を使って）用いることができるし、また、核酸であれば、特異的オリゴヌクレオチドプローブを発生させるために（前記第5.4.2節に記載の、または当業者に周知の方法を使って）用いることができる。当業者は、有用な特性をさらに特徴付けてバイオマーカーの分子構造を決定できることを容易に理解するであろう。この要領でバイオマーカーを特徴付ける方法は当技術分野で周知であり、その方法には、X線結晶学、高分解質量分析、赤外分光光度計、紫外分光光度計および核磁気共鳴が含まれる。核酸バイオマーカーのヌクレオチド配列、ポリペプチドバイオマーカーのアミノ酸配列、および炭水化物バイオマーカーの組成および配列を決定する方法も当技術分野では周知である。
【０２５５】
5.7  SIRS被験者への本発明の応用
一実施形態においては、本発明に記載の方法を用いて敗血症を発症するリスクのあるSIRS被験者をスクリーニングする。生物学的サンプルをSIRS陽性被験者から採取し、これを用いてバイオマーカープロファイルを構築する。次いでバイオマーカープロファイルを評価して、バイオマーカープロファイルの特性値が特別な決定ルールに関連する第1の数値セットを満足するかどうかを決定する。この評価は、被験者を転換者または非転換者に分類する。もし被験者が転換者と分類されれば、次に、治療体制を開始して敗血症の進行の機先を制するまたは予防する。
【０２５６】
5.8  敗血症の段階への本発明の応用
一実施形態においては、本発明に記載の方法を用いて特に敗血症のある特定の段階を発症するリスクのある被験者をスクリーニングする。生物学的サンプルを被験者から採取し、これを用いてバイオマーカープロファイルを構築する。次いでバイオマーカープロファイルを評価して、バイオマーカープロファイルの特性値が特別な決定ルールに関連する第1の数値セットを満足するかどうかを決定する。この評価は被験者を敗血症の特別な段階を有するかまたは有しないかに分類する。次に、治療体制を開始して敗血症の特定の段階を治療することができる。いくつかの実施形態において、敗血症の段階は、例えば、敗血症の発症、重篤な敗血症、敗血症性ショック、または多臓器障害である。
【０２５７】
5.9  例示の実施形態
本発明のいくつかの実施形態においては、特に敗血症を発症するリスクのある、敗血症を有する、または敗血症を有することが疑われるテスト被験者からの生物学的サンプルを用いて、バイオマーカープロファイルを取得する。かかる実施形態のバイオマーカープロファイルを評価する。この評価は、例えば、決定ルールをテスト被験者に適用することにより行うことができる。決定ルールは、例えば、訓練集団の被験者から得たバイオマーカープロファイルに基づいて構築してもまたは構築しておいてもよい。一実施形態において、訓練集団には、(a)SIRSを有しかつ次いで観察期間中に敗血症と診断された被験者、ならびに(b)SIRSを有しかつ観察期間中に敗血症と診断されなかった被験者が含まれる。もしテスト被験者から得たバイオマーカープロファイルが適当に特徴的な特性を含有すれば、次いで、テスト被験者はおそらく敗血症になる機会を有する、敗血症を患っている、または敗血症の進行の特定の段階にあると診断される。SIRSを患うもの（例えば、SIRS陽性被験者）またはSIRSを患ってないもの（例えば、SIRS陰性被験者）を含む被験者の様々な集団が訓練集団として役立ちうる。従って、本発明により、臨床医は、とりわけ、SIRSを有しない被験者、SIRSを有するがおそらく所与の時間枠内に敗血症を発症しない被験者、SIRSを有しかつ最終的に敗血症になるリスクのある被験者、および敗血症の進行段階の特別な段階を患う被験者の間を区別することが可能になる。好適な訓練集団およびかかる集団から採集した好適なデータについてのさらなる詳細については、前記第5.5節を参照されたい。
【０２５８】
5.10  判別バイオマーカーを同定するための、注釈付きデータの利用
いくつかの実施形態において、データ解析アルゴリズムは、その特性が転換者と非転換者の間を判別する、大きいバイオマーカーのセットを同定する。例えば、いくつかの実施形態においては、訓練集団へのデータ解析アルゴリズムを応用して、500種類超のバイオマーカー、1000種類超のバイオマーカー、または10,000超のバイオマーカーの選択を得る。いくつかの実施形態において、判別すると思われるバイオマーカーの数をさらに減らすことが所望される。従って、いくつかの実施形態においては、データ解析アルゴリズム（例えば、第5.5節のデータ解析アルゴリズム）を補足するフィルタリングルールを用いて データ解析アルゴリズムにより同定される判別バイオマーカーのリストをさらに減らす。具体的には、訓練集団で測定されたバイオマーカープロファイルデータに対して１以上のデータ解析アルゴリズムを応用することにより同定したバイオマーカーのリストを、リストに対する注釈データに基づくフィルタリングルールの応用により、さらに洗練する。かかる実施形態においては、１以上の適用された注釈データに基づくフィルタリングルールを満足する１以上のデータ解析アルゴリズムにより同定されたバイオマーカーのセット中のこれらのバイオマーカーは、判別バイオマーカーのセット中に残る。いくつかの事例においては、１以上の適用された注釈データに基づくフィルタリングルールを満たさない１以上のデータ解析アルゴリズムにより同定されたバイオマーカーのセット中のこれらのバイオマーカーは、セットから除去される。他の例においては、１以上の適用された注釈データに基づくフィルタリングルールを満たさない１以上のデータ解析アルゴリズムにより同定されたバイオマーカーのセット中のこれらのバイオマーカーは、セット中に留まり、そして１以上の適用された注釈データに基づくフィルタリングルールを満足するものは、セットから除去される。この方法で、注釈データを用いて、データ解析アルゴリズムにより同定された判別バイオマーカーのセット中のバイオマーカーの数を減らすことができる。
【０２５９】
注釈データに基づくフィルタリングルールは注釈データを基にするルールである。注釈データはバイオマーカーの特性を記載するいずれかのタイプのデータを意味する。注釈データの一例は、所与のバイオマーカーが属する生物学的経路の同定である。注釈データの他の例は、酵素のクラス（例えば、ホスホジエステラーゼ、キナーゼ、メタロプロテイナーゼ、など）である。注釈データのさらに他の例には、限定されるものでないが、タンパク質ドメイン情報、酵素の基質情報、酵素の反応情報、およびタンパク質相互作用データが含まれる。なお注釈データの他の例は疾患関連であり、言い換えれば、その疾患プロセスに所与のバイオマーカーが連結しているかまたは影響を与える。注釈データの他の型は細胞局在、組織型局在、および／または細胞型局在に関連するいずれのタイプのデータについての、バイオマーカー発現、他の型のバイオマーカー存在量、および／またはバイオマーカー活性であってもよい。
【０２６０】
その名前が暗示するように、注釈データは、注釈データに基づくフィルタリングルールを構築するために使用される。注釈データに基づくフィルタリングルールの一例は次の通りである、
注釈ルール1：「訓練セットからの全ての転写因子を除去する」
このフィルタリングルールをバイオマーカーのあるセットに適用すると、そのセットから全ての転写因子を除去しうる。
【０２６１】
他の注釈データのタイプに基づくフィルタリングルールは次の通りである、
注釈ルール2：「バイオマーカーリスト中の注釈Xについて増強された全てのバイオマーカーを保持する」
このフィルタリングルールを適用すると、所与のリスト中の、リストの注釈Xについて増強された（過剰発現された）これらのバイオマーカーだけを保持しうる。このフィルタリングルールをさらに全て評価するために、第5.4節に開示された技法に従い測定した訓練集団データを利用して、データ解析アルゴリズム（第5.5節）の測定されたバイオマーカープロファイルへの適用により同定しておいた例示のバイオマーカーセットを考えてみよう。この例示のバイオマーカーセットは500のバイオマーカーを有する。この説明用の例について、ヒトにおけるバイオマーカーの全セットが25,000のバイオマーカーから成ると想定しよう。ここで、25,000のバイオマーカーは集団であり、500のバイオマーカーセットはそのサンプルである。本明細書で使用される用語「集団」は全ての観察可能なバイオマーカーから成る。用語「サンプル」は実際に考えられるデータである。今は、この例として、X＝キナーゼとする。800の既知のヒトキナーゼが存在すると仮定しかつさらに500のバイオマーカーのセットをキナーゼについてランダムに選択したと仮定する。これらの環境のもとで、データ解析アルゴリズムにより同定される500のバイオマーカーのリストは約(500/25,000)*800=16のキナーゼを選択しなければならない。実際には、サンプル中に50のキナーゼが存在するので、キナーゼは集団と比較してサンプル中で増強されているという結論に達しうる。
【０２６２】
さらに形式的に、この例において、キナーゼが、データ解析アルゴリズムにより同定されたバイオマーカーのセット（サンプル）中で集団と比較して増強されているかどうかを、観察したサンプルと集団を記載する2-ウエイ分割表の分析により決定することができる。
2008538007.tif 000026
【０２６３】
本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Agresti, 1996, An Introduction to Categorical Cata Analysis、John Wiley & Sons、New Yorkに従い、この2-ウエイ分割表を、各行を独立2項変数として分析することができる。かかる場合、比率の真の差（π1-π2と呼ばれる）は2つの列の確率を比較する。この差は-1〜+1の間に入る。π1-π2が等しいとこれはゼロになる；すなわち、集団からのサンプル中のキナーゼの選択はキナーゼ注釈に依存しない。集団中のN1=25,000のバイオマーカーのうち、800はキナーゼであり、比率p1＝800/25,000＝0.032である。データ解析アルゴリズムを用いて同定したサンプル中のN2＝500のバイオマーカーのうち、50はキナーゼであり、比率p2＝50/500＝0.10である。比率のサンプル差は0.032-0.10＝0.068である。Agrestiによれば、2つの行のカウントは独立2項サンプルであり、見積り標準誤差p1-p2は次式：
【数１８】
2008538007.tif 000027
［式中、N1およびN2はそれぞれデータ解析アルゴリズムから選択される集団およびサンプルのサンプルサイズである］で表される。標準誤差は減少し、従って、サンプルサイズの増加につれて、π1-π2の見積は改善される。π1-π2に対する大きいサンプル(100(1-α))％信頼区間は
【数１９】
2008538007.tif 000028
＝1.96である。従って、この例については、見積誤差は、
【数２０】
2008538007.tif 000029
＝0.013であり、そして真の差π1-π2に対する95％信頼区間は-0.068±1.96（0.013）、または-0.068±0.025である。95％信頼区間は陰性値しか含有しないので、サンプル（データ解析アルゴリズムにより作製されるバイオマーカーセット）中のキナーゼが、25,000のバイオマーカーの集団と比較して、増強されるという結論になりうる。
【０２６４】
前記の例の2-ウエイ分割表を、以上に開示したのとは他の当技術分野で公知の方法を用いて分析することができる。例えば、独立に対するカイ二乗検定および／またはFisherの正確な検定を用いて、2-ウエイ分割表の行および列分類変数が独立であるというヌル仮説を検定してもよい。
【０２６５】
注釈ルールの用語「X」はいずれの型の注釈データであってもよい。一実施形態において、「X」は生物学的経路である。このようなものとして、注釈データに基づくフィルタリングルールは次の型を有する。
【０２６６】
注釈ルール3：「バイオマーカーリスト中の、いずれかの増強されている生物学的経路にある全てのバイオマーカーを選択する」
特別な生物学的経路が増強されているかどうかを決定するために、例えば、前記の2-ウエイ分割表分析、または当技術分野で公知の他の技法を用いて、サンプル中の特別な生物学的経路中のバイオマーカーの数を、集団中の特別な生物学的経路中にあるバイオマーカーの数と比較した。もし生物学的経路がサンプル中で増強されていれば、同じくその生物学的経路中にあるサンプルの全てのバイオマーカーを保持して、注釈データに基づくフィルタリングルールによってさらなる分析を行う。
【０２６７】
サンプル中のキナーゼの比率が、その全95％信頼区間全体にわたり、集団のキナーゼの比率より大きかったことが示された増強の一例が与えられている。一実施形態において、2-ウエイ分割表分析により決定したその全95%信頼区間にわたって、サンプル中の注釈を有するバイオマーカーの比率が、集団中の注釈を有するバイオマーカーの比率より大きいとき、所与の注釈を有するバイオマーカーは、集団と比較してサンプル中で増強されていると考えられる。他の実施形態において、もしFisher正確検定、カイ二乗検定、または比較アルゴリズムにより決定したp値が0.05以下、0.005以下または0.005以下であれば、所与の注釈を有するバイオマーカーは、その集団と比較してサンプル中で増強されていると考えられる。
【０２６８】
注釈データに基づくフィルタリングルールの他の型は次の型を有する。
【０２６９】
注釈ルール4：「生物学的経路X中に存在する全てのバイオマーカーを選択する」
ある実施形態においては、バイオマーカーのセットを、データ解析アルゴリズムを用いて決定する。例示のデータ解析アルゴリズムを第5.5節に開示する。さらに、第6節は、データ解析アルゴリズムとしても役立ちうるある特定の検定を記載する。これらの検定には、限定されるものでないが、統計的に有意な値（例えば、0.05以下、0.04以下など）よるWilcoxon検定など、および／またはバイオマーカーが、訓練集団中の転換者から得た生物学的サンプルと非転換者から得た生物学的サンプルとの間の平均示差存在量を示す要件が含まれる。データ解析アルゴリズムを適用すると、転換者と非転換者とを判別するバイオマーカーのセットが決定される。次に、バイオマーカーのセットをさらに減らすために、注釈ルール、例えば、注釈ルール4を判別バイオマーカーのセットに適用する。当業者は、これらのルールを適用する順序は一般に重要でないことを理解するであろう。例えば、注釈ルール4を最初に適用して次いである特定のデータ解析アルゴリズムを適用してもよく、逆も真である。いくつかの実施形態において、最終的に転換者と非転換者の間を判別するとみなされるバイオマーカーは、次の判定基準のそれぞれを満足する：（i）（単時点）データを用いてWilcoxon調節検定から決定した0.05以下のp値（p<0.05）；（ii）転換者と非転換者の間で訓練セット全体にわたり、静的（単時点）データを用いて1.2以上の平均倍数（fold）変化、および（iii）特定の生物学的経路における存在。詳細な例については、下記第6.7節も参照されたい。この例において、経路のメンバーがデータ解析アルゴリズムにより同定されたバイオマーカーのセットにおいて増強されていることは要件でない。さらに、判定基準（i）および（ii）はデータ解析アルゴリズムの型でありそして判定基準（iii）は注釈データに基づくフィルタリングルールであることが特筆される。
【０２７０】
他の実施形態においては、判別バイオマーカーのリストが一旦同定されると、次に、バイオマーカーを用いて、判別バイオマーカーが関係付けられている特別な生物学的経路の同一性を決定することができる。ある特定の実施形態においては、注釈データを本発明の方法（例えば、第5.4、5.5および6節に記載の方法）により同定された判別バイオマーカーのリストに適用する。かかる注釈データに基づくフィルタリングルールは、データ解析アルゴリズムにより同定された判別バイオマーカーのリストにおいて増強された１以上の特別な生物学的経路を同定する。本発明の例示の実施形態においては、apps1.niaid.nih.gov/david/にて利用できる、DAVID 2.0ソフトウエアを用いてかかる注釈データに基づくフィルタリングルールを、データ解析アルゴリズムにより同定されたバイオマーカーのセットへ適用し、セット中の増強された経路を同定する。いくつかの実施形態においては、増強された生物学的経路に存在するこれらのバイオマーカーを選択して本発明のキットの判別バイオマーカーとして利用する。
【０２７１】
本発明のいくつかの実施形態において、（データ解析アルゴリズムを転換者と非転換者を含む訓練集団に適用することにより決定した）バイオマーカーセット中の増強された生物学的経路に存在するバイオマーカーをフィルタリングステップとして用いて、セット中のバイオマーカーの数を減らすことができる。1つのかかるアプローチにおいて、訓練集団の被験者からの生物学的サンプルは、例えば、１以上の第5.4節（前掲）および第6節（後掲）に記載の方法のいずれかを用いて得る。この実施形態に従い、選択した生物学的経路にあるのがわかっているまたは関わると思われるいずれか１つ以上の遺伝子の発現を検出することにより、cDNAマイクロアレイなどの核酸アレイを使ってバイオマーカープロファイル中のバイオマーカーの特性を作製することができる。次いで、cDNAマイクロアレイ分析から誘導したデータを、第5.5節（前掲）に記載のいずれか１以上の分析アルゴリズムを用いて分析し、転換者と非転換者の間を判別する特性をもつバイオマーカーを同定することができる。例えば、転換者（すなわち、後に敗血症を発症するSIRS患者）および非転換者（すなわち、後に敗血症を発症しないSIRS患者）の間を判別することができる対応する特性値をもつバイオマーカーを、このように、判別バイオマーカーとし同定しかつ分類することができる。増強された生物学的経路中に存在するバイオマーカーをこのセットから前記の注釈ルールを適用することにより選択することができる。見出すことができる代表的な生物学的経路は、例えば、Th1/Th2細胞分化経路に関わる遺伝子を含む。一実施形態においては、最終的に転換者と非転換者の間を判別するとみなされるバイオマーカーは、次の判定基準のそれぞれを満足する：（i） Wilcoxon調節検定から決定した0.05以下のp値（p<0.05）；（ii） 転換者と非転換者の間で訓練セット全体にわたり、1.2以上の平均倍数（fold）変化、および（iii） 判定基準（i）および（ii）の適用により誘導されるバイオマーカーのセット中で増強された生物学的経路における存在。
【０２７２】
本発明のいくつかの実施形態においては、注釈データに基づくフィルタリングルールを用いて所与のバイオマーカーセットにおける増強された生物学的経路を同定する。このバイオマーカーセットは、例えば、データ解析アルゴリズムの転換者および非転換者を含む訓練データへの適用により同定したバイオマーカーのセットであってもよい。次いで、これらの増強された生物学的経路のバイオマーカーを、転換者と非転換者の間を判別するバイオマーカーを同定するために、データ解析アルゴリズムのいずれかを用いて分析する。いくつかの事例において、増強された生物学的経路中の分析されたバイオマーカーのいくつかは元来の所与のバイオマーカーセットのバイオマーカーのなかに存在しなかった。いくつかの事例において、増強された生物学的経路中のバイオマーカーのいくつかは元来の所与のバイオマーカーセットのバイオマーカーのなかに存在した。いくつかの実施形態において、二次アッセイを用いて増強された経路中に存在するバイオマーカーに対する特性データを採集し、そして当にこのデータを用いて増強された生物学的経路中のバイオマーカーを転換者と非転換者の間で判別するかどうかを決定する。
【０２７３】
いくつかの実施形態においては、目的の生物学的経路中のバイオマーカーが同定される。1つの例においては、Th1/Th2細胞分化経路に関わる遺伝子が同定される。次いで、これらのバイオマーカーを、本明細書に開示したデータ解析アルゴリズムを用いて評価し、それらが転換者と非転換者の間を判別するかどうかを決定する。
【０２７４】
5.11  本発明による代表的な実施形態
第6.11節〜第6.13節は本発明による一実施形態において目的であるいくつかの数のバイオマーカーを同定する。具体的には、本発明の一実施形態は、以下の第6.11.1節の表48に同定された10のバイオマーカー、第6.11.2節の表59に同定された34のバイオマーカー、および第6.13.1節の表93に同定された10のバイオマーカーを含む。表48および表93はそれぞれ、MMP9を判別バイオマーカーとして同定する。このように、表Iのバイオマーカーの全数は表48、表59、および表93にて同定されたバイオマーカーの和より1だけ少ない（34＋10＋10-1）または53である。これらのバイオマーカーを以下の表15に再現する。第5.11.1節は個々のバイオマーカーのそれぞれについて詳細に述べる。以下の第5.11.2節は表JおよびKに掲げられたバイオマーカーの選択組合わせについて詳細に述べる。表Iに掲げられたバイオマーカーはそれぞれ、第6.11節〜第6.13節に総括した実験結果に基づいて選択した。いくつかの実験において、同定されたバイオマーカーはタンパク質またはその断片であった。敗血症とSIRSの間を判別するかかるタンパク質バイオマーカーは、列５に「P」呼称を付して表Iに掲げた。いくつかの実験において、同定されたバイオマーカーは核酸またはその断片であった敗血症とSIRSの間を判別するかかる核酸バイオマーカーは、列５に「N」呼称を付して表Iに掲げた。以上に示した通り、1つのバイオマーカーMMP9を、タンパク質としておよび核酸バイオマーカーとして同定した。以下の表Jは、バイオマーカーを、RT-PCRなどの第6節に記載の核酸に基づくアッセイを用いて発見された本発明の一実施形態によるバイオマーカーを掲げる。以下の表Kは、バイオマーカーを、ビーズアッセイなどの第6節に記載のタンパク質に基づくアッセイを用いて発見した本発明の一実施形態によるバイオマーカーを掲げる。本発明の一実施形態は、表48、59、または93のいずれか1つからの少なくとも3、4、5、6、7、8、9、または10のバイオマーカーを含む。
【０２７５】
以下の具体的な実施形態に示されなくても、表I、JおよびKのバイオマーカーは、第6.11節〜第6.13節に総括された実験におけるそれらの物理的型に限定されない。例えば、バイオマーカーの判別性質はRT-PCRなどの核酸アッセイで、核酸型でのバイオマーカーの存在量により発見され、従ってこれの基づいて表Iに、表Iの列5に「N」呼称を付して掲げられるが、本発明の方法、キット、およびバイオマーカープロファイル中のバイオマーカーの物理的発現は核酸に限定されるものでない。むしろ、第5.1節に用語「バイオマーカー」として規定されたバイオマーカーのいずれの物理的発現も本発明に包含される。表Iの列6は、以下の第6節に総括されたデータに基づいて、そのバイオマーカーが敗血症に転換しうる被験者（転換者）において、転換しえない被験者（SIRS被験者）と比較して、上方制御または下方制御されるかどうかを示す。従って、もしバイオマーカーが列6に呼称UPを有すれば、それはそのバイオマーカーが列5に示された型で、平均して、敗血症に転換しうる被験者（敗血症被験者）において、転換しえない被験者（SIRS被験者）と比較して、より多く存在したことを意味する。さらに、もしバイオマーカーが列6に呼称DOWNを有すれば、それはそのバイオマーカーが列5に示された型で、平均して、敗血症に転換しうる被験者（敗血症被験者）において、転換しえない被験者（SIRS被験者）と比較して、より少なく存在したことを意味する。
表I
2008538007.tif 000030
2008538007.tif 000031
2008538007.tif 000032
2008538007.tif 000033
【０２７６】
表Iに同定された配列、遺伝子、タンパク質、およびプローブセットはそれぞれ、本明細書に参照により組み入れられる。
【０２７７】
表J
2008538007.tif 000034
2008538007.tif 000035
2008538007.tif 000036
表Ｋ
2008538007.tif 000037
2008538007.tif 000038
【０２７８】
表I〜Ｋの遺伝子名は以下のとおりである。
2008538007.tif 000039
2008538007.tif 000040
2008538007.tif 000041
【０２７９】
5.11.1  バイオマーカーの説明
本節におけるバイオマーカーへの言及は、本出願において説明したバイオマーカーセットに対する例示配列を単に提供することにある。
【０２８０】
AFPのヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_001134により同定される）は、例えば、Beattieら, 1982,「クローニングしたcDNAの部分配列から推論したヒトαフェトプロテインの構造と進化（Structure and evolution of human alpha-fetoprotein deduced from partial sequence of cloned cDNA" Gene 20 (3): 415-422；Harper, M.E.ら, 1983,「進化的に関係した血清アルブミンとヒト染色体4のq11-22内のαフェトプロテイン遺伝子との連鎖（Linkage of the evolutionarily-related serum albumin and alpha-fetoprotein genes within q11-22 of human chromosome 4）」, Am. J. Hum. Genet. 35 (4):565-572；Morinaga, T.ら, 1983,「ヒトαフェトプロテインの一次構造とそのmRNA（Primary structures of human alpha-fetoprotein and its mRNA）」, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80 (15):4604-4608に開示され、そしてAFPのアミノ酸配列（アクセッション番号CAA79592により同定される）は、例えば、McVey, 1993, 直接投稿, Clinical Research Centre, Haemostasis Research Group, Watford Road, Harrow, UK, HAl 3UJ；McVeyら, 1993,「A G-->ヒトα-フェトプロテイン遺伝子のHNF I結合部位における置換は、αフェトプロテイン（HPAFP）の遺伝性持続と関連がある（A G~>A substitution in an HNF I binding site in the human alpha- fetoprotein gene is associated with hereditary persistence of alpha-fetoprotein (HPAFP)）」, Hum. MoI. Genet. 2 (4): 379-384、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０２８１】
ANKRD22のヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_144590により同定される）は、例えば、Strausberg, 2002,「ホモサピエンス・アンキリン反復ドメイン22、mRNA（cDNAクローンMGC:22805 IMAGE:3682099）（Homo sapiens ankyrin repeat domain 22, mRNA (cDNA clone MGC:22805 IMAGE:3682099)）」（未刊）に開示され、そしてANKRD22のアミノ酸配列（アクセッション番号NP_653191により同定される）は、例えば、Strausberg, 2002,「ホモサピエンス・アンキリン反復ドメイン22、mRNA（cDNAクローンMGC:22805 IMAGE:3682099）（Homo sapiens ankyrin repeat domain 22, mRNA (cDNA clone MGC:22805 IMAGE:3682099)）」（未刊）に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０２８２】
ANXA3のヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_005139により同定される）は、例えば、Pepinsky, R.B.ら, 1988,「5つの異なるカルシウムおよびリン脂質結合タンパク質はリポコルチンIと相同性を共有する（Five distinct calcium and phospholipid binding proteins share homology with lipocortin I）」, J. Biol. Chem. 263 (22): 10799-10811；Tait, J.F.ら, 1988,「胎盤抗凝血性タンパク質：リポコルチン ファミリーの4つのメンバーの単離と比較特徴付け（Placental anticoagulant proteins: isolation and comparative characterization four members of the lipocortin family）」, Biochemistry 27 (17):6268-6276；Ross, T.S.ら, 1990,「イノシトール1,2-環状リン酸2-ホスホヒドロラーゼのリポコルチンIIIとの同一性（Identity of inositol 1,2-cyclic phosphate 2- phosphohydrolase with lipocortin III）」, Science 248 (4955):605-607に開示され、そしてANXA3のアミノ酸配列（アクセッション番号NP_005130により同定される）は、例えば、Pepinsky, R.Bら, 1988,「5つの異なるカルシウムおよびリン脂質結合タンパク質はリポコルチンIと相同性を共有する（Five distinct calcium and phospholipid binding proteins share homology with lipocortin I）」, J. Biol. Chem. 263 (22): 10799-10811；Tait, J.F.ら, 1988,「胎盤抗凝血性タンパク質：リポコルチン ファミリーの4つのメンバーの単離と比較特徴付け（Placental anticoagulant proteins: isolation and comparative characterization four members of the lipocortin family）」, Biochemistry 27 (17):6268-6276；Ross, T.S.ら, 1990,「イノシトール1,2-環状リン酸2-ホスホヒドロラーゼのリポコルチンIIIとの同一性（Identity of inositol 1,2-cyclic phosphate 2-phosphohydrolase with lipocortin III）」, Science 248 (4955):605-607、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０２８３】
アポリポタンパク質CIII（APOC3）のヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_000040により同定される）は、例えば、Ruiz-Narvaez.ら, 2005 「APOC3/A5ハプロタイプ、脂質レベル、およびCosta RicaのCentral Valleyにおける心筋梗塞のリスク（APOC3/A5 haplotypes, lipid levels, and risk of myocardial infarction in the Central Valley of Costa Rica）」, J. Lipid Res. 46 (12), 2605-2613；Garencら, 2005,「LPL P207L欠損に対してヘテロ接合性の男性における空腹時トリグリセリドレベルに与える、APOC3 Sst I SNPの影響（Effect of the APOC3 Sst I SNP on fasting triglyceride levels in men heterozygous for the LPL P207L deficiency）」, Eur. J. Hum. Genet. 13, 1159-1165；Baum.ら, 2005,「チャイニーズ2型糖尿病患者における腎障害のリスクに与える、肝リパーゼ-514C->T多型およびそのアポリポタンパク質C3-482C->Tおよびアポリポタンパク質Eエキソン4多型との相互作用の効果（Effect of hepatic lipase -514C->T polymorphism and its interactions with apolipoprotein C3 -482C->T and apolipoprotein E exon 4 polymorphisms on the risk of nephropathy in Chinese type 2 diabetic patients）」, Diabetes Care 28, 1704-1709に開示され、そしてAPOC3のアミノ酸配列（アクセッション番号CAA25648により同定される）は、例えば、Prorterら, 1984,「ヒトアポリポタンパク質CIII遺伝子およびapoAIとapoCIIIの間の遺伝子間領域の単離と配列分析（Isolation and sequence analysis of the human apolipoprotein CIII gene and the intergenic region between the apo AI and apo CIII）」, DNA 3, 449-456、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０２８４】
ARG2のヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_001172により同定される）は、例えば、Gotohら,1996 「マウスマクロファージ様細胞株における、非肝ミトコンドリアアルギナーゼ（アルギナーゼII）に対するcDNAの分子クローニングおよび一酸化窒素シンターゼによるその誘導の比較（Molecular cloning of cDNA for nonhepatic mitochondrial arginase(arginase II) and comparison of its induction with nitric oxide synthase in a murine macrophage-like cell line）」, FEBS Lett. 395 (2-3): 119-122；Vockleyら, 1996,「ヒトII型アルギナーゼ遺伝子のクローニングと特徴付け（Cloning and characterization of the human type II arginase gene）」, Genomics 38 (2): 118-123；Gotohら, 1997,「ヒトアルギナーゼII遺伝子の染色体局在およびそのmRNAの組織分布（Chromosomal localization of the human arginase II gene and tissue distribution of its mRNA）」, Biochem. Biophys. Res. Commun. 233 (2):487-491に開示され、そしてARG2のアミノ酸配列（アクセッション番号CAG38787により同定される）は、例えば、Halleckら, 2004, 直接投稿, RZPD Deutsches Ressourcenzentrum fuer Genomforschung GmbH, Im Neuenheimer FeId 580, D-69120 Heidelberg, Germany, Halleckら, 未刊,「Gateway(登録商標)システムのエントリーベクター（pDONR201）中のヒト全オープンリーディングフレームのクローニング（Cloning of human full open reading frames in Gateway(TM) system entry vector (pDONR201)）」（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０２８５】
B2Mのヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_004048により同定される）は、例えば、Kxangel, M.S.ら, 1979,「HLA-AおよびHLA-B抗原のin vivoアセンブリーと成熟（Assembly and maturation of HLA-A and HLA-B antigens in vivo）」, Cell 18 (4):979-991；Suggs, S.V.ら, 1981,「合成オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションプローブとしての利用：クローニングしたヒトβ-2-ミクログロブリンに対するcDNA配列の単離（Use of synthetic oligonucleotides as hybridization probes: isolation of cloned cDNA sequences for human beta 2-microglobulin）」, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78 (11):6613-6617, Rosa, F.ら, 1983,「ヒトDaudi細胞中のβ-2-ミクログロブリンmRNAは変異した開始コドンを有するが、なおインターフェロンにより誘導しうる（The beta2-microglobulin mRNA in human Daudi cells has a mutated initiation codon but is still inducible by interferon）」, EMBO J. 2 (2):239-243に開示され、そしてB2Mのアミノ酸配列（アクセッション番号AAA51811により同定される）は、例えば、Gussow, D.ら, 1987,「ヒトβ-2-ミクログロブリン遺伝子：一次構造および転写ユニットの定義（The human beta 2-microglobulin gene. Primary structure and definition of the transcriptional unit）」, J. Immunol. 139 (9): 3132-3138、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０２８６】
BCL2A1のヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_004049により同定される）は、例えば、Lin, E. Y.ら,1993,「A1の特徴付け、bcl-2に配列類似性をもつ新規の造血特異性の初期応答遺伝子の特徴付け（Characterization of Al, a novel hemopoietic-specific early-response gene with sequence similarity to bcl-2）」, J. Immunol. 151 (4):1979-1988, Savitsky, K.ら,「ATM遺伝子のコード領域の完全配列は、色々な種における細胞周期レギュレーターに対する類似性を示す（The complete sequence of the coding region of the ATM gene reveals similarity to cell cycle regulators in different species）」, Hum. MoI. Genet. 4 (11):2025-2032, Choi, S.S.ら, 1995,「新規のBcl-2関係遺伝子であるBfI-Iは、胃癌において過剰発現されかつ骨髄に優先的に発現される（A novel Bcl-2 related gene, BfI-I, is overexpressed in stomach cancer and preferentially expressed in bone marrow）」, Oncogene 11 (9):1693-1698に開示され、そしてBCL2A1のアミノ酸配列（アクセッション番号NP_004040により同定される）は、例えば、Lin, E. Y.ら, 1993,「A1の特徴付け、bcl-2に配列類似性をもつ新規の造血性特異的な初期応答遺伝子の特徴付け（Characterization of Al, a novel hemopoietic-specific early-response gene with sequence similarity to bcl-2）」, J. Immunol. 151 (4):1979-1988；Savitsky, K.ら,「ATM遺伝子のコード領域の完全配列は、色々な種における細胞周期レギュレーターに対する類似性を示す（The complete sequence of the coding region of the ATM gene reveals similarity to cell cycle regulators in different species）」, Hum. MoI. Genet. 4 (l l):2025-2032；Choi, S.S.ら, 1995,「新規のBcl-2関係遺伝子であるBfI-Iは、胃癌において過剰発現されかつ骨髄に優先的に発現される（A novel Bcl-2 related gene, BfI-I, is overexpressed in stomach cancer and preferentially expressed in bone marrow）」, Oncogene 11 (9):1693-1698、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０２８７】
CCL5のヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_002985により同定される）は、例えば、Schall, TJ.ら, 1988,「ヒトT細胞特異的分子は新しい遺伝子ファミリーのメンバーである（A human T cell-specific molecule is a member of a new gene family）」, J. Immunol. 141 (3): 1018-1025；Donlon, T. A.ら, 1990,「ヒトT細胞特異的遺伝子、RANTES（D17S136E）の染色体17q11.2-q12への局在（Localization of a human T-cell-specific gene, RANTES (D17S136E), to chromosome 17q11.2-q12）」, Genomics 6 (3):548-553；Kameyoshi, Y.ら, 1992,「トロンビン刺激された血小板により放出されるサイトカインRANTESはヒト好酸球に対する強力な吸引物質である（Cytokine RANTES released by thrombin-stimulated platelets is a potent attractant for human eosinophils）」, J. Exp. Med. 176 (2):587-592に開示され、そしてCCL5のアミノ酸配列（アクセッション番号NP_002976により同定される）は、例えば、Schall, TJ.ら, 1988,「ヒトT細胞特異的分子は新しい遺伝子ファミリーのメンバーである（A human T cell-specific molecule is a member of a new gene family）」, J. Immunol. 141 (3): 1018-1025；Donlon, T.A.ら, 1990,「ヒトT細胞特異的遺伝子、RANTES （D17S136E）の、染色体17q11.2-q12への局在（Localization of a human T-cell-specific gene, RANTES (D17S136E), to chromosome 17q11.2-q12）」, Genomics 6 (3):548-553；Kameyoshi, Y.ら, 1992,「トロンビン刺激された血小板により放出されるサイトカインRANTESはヒト好酸球に対する強力な吸引物質である（Cytokine RANTES released by thrombin-stimulated platelets is a potent attractant for human eosinophils）」, J. Exp. Med. 176 (2):587-592、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０２８８】
CD86のヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_006889、NM_175862により同定される）は、例えば、Azuma, M.ら, 1993,「B70抗原はCTLA-4およびCD28に対する第2リガンドである（B70 antigen is a second ligand for CTLA-4 and CD28）」, Nature 366 (6450):76-79；Freeman, GJ.ら, 1993,「B7-2：ヒトT細胞増殖を共刺激するCTLA-4カウンター受容体のクローニング（Cloning of B7-2: a CTLA-4 counter-receptor that costimulates human T cell proliferation）」, Science 262 (5135):909-911；Chen, C.ら, 1994,「初期T細胞共刺激性分子-1の分子クローニングと発現、およびB7-2 分子としてのその特徴付け（Molecular cloning and expression of early T cell costimulatory molecule- 1 and its characterization as B7-2 molecule）」, J. Immunol. 152 (10):4929-4936に開示され、そしてCD86のアミノ酸配列（アクセッション番号NP_008820、NP_787058により同定される）は、例えば、Azuma, M.ら, 1993,「B70抗原はCTLA-4およびCD28に対する第2リガンドである（B70 antigen is a second ligand for CTLA-4 and CD28）」, Nature 366 (6450):76-79；Freeman, GJ.ら, 1993,「B7-2：ヒトT細胞増殖を共刺激するCTLA-4カウンター受容体のクローニング（Cloning of B7-2: a CTLA-4 counter-receptor that costimulates human T cell proliferation）」, Science 262 (5135):909-911；Chen, C.ら, 1994,「初期T細胞共刺激性分子-1の分子クローニングと発現、およびB7-2 分子としてのその特徴付け（Molecular cloning and expression of early T cell costimulatory molecule- 1 and its characterization as B7-2 molecule）」, J. Immunol. 152 (10):4929-4936、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０２８９】
CEACAM1のヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_001712により同定される）は、例えば、Svenberg, T.ら, 1979,「正常なヒト胃腸組織における、CEAに関係する胆汁糖タンパク質I（BGP I）の発生と局在についての免疫蛍光研究（Immunofluorescence studies on the occurrence and localization of the CEA-related biliary glycoprotein I (BGP I) in normal human gastrointestinal tissues）」, Clin. Exp. Immunol. 36 (3) :436-441；Hinoda, Y.ら, 1988,「胆汁糖タンパク質IをコードするcDNAの分子クローニング：癌胎児性抗原と免疫学的に交差反応性の糖タンパク質の一次構造（Molecular cloning of a cDNA coding biliary glycoprotein I: primary structure of a glycoprotein immunologically crossreactive with carcinoembryonic antigen）」, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (18):6959-6963；Barnett, T.R.ら, 1989,「癌胎児性抗原：選択的スプライシングが癌胎児性抗原ファミリーの新規メンバーをコードする複数のmRNAを説明する（Carcinoembryonic antigens: alternative splicing accounts for the multiple mRNAs that code for novel members of the carcinoembryonic antigen family）」, J. Cell Biol. 108 (2):267-276に開示され、そしてCEACAM1のアミノ酸配列（アクセッション番号NP_001703により同定される）は、例えば、 , Svenberg, T.ら, 1979,「正常なヒト胃腸組織におけるCEAに関係する胆汁糖タンパク質I（BGP I）の発生と局在についての免疫蛍光研究（Immunofluorescence studies on the occurrence and localization of the CEA-related biliary glycoprotein I (BGP I) in normal human gastrointestinal tissues）」, Clin. Exp. Immunol. 36 (3) :436-441；Hinoda, Y.ら, 1988,「胆汁糖タンパク質IをコードするcDNAの分子クローニング：癌胎児性抗原と免疫学的に交差反応性の糖タンパク質の一次構造（Molecular cloning of a cDNA coding biliary glycoprotein I: primary structure of a glycoprotein immunologically crossreactive with carcinoembryonic antigen）」, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (18):6959- 6963；Barnett, T.R.ら, 1989,「癌胎児性抗原：選択的スプライシングが癌胎児性抗原ファミリーの新規メンバーをコードする複数のmRNAを説明する（Carcinoembryonic antigens: alternative splicing accounts for the multiple mRNAs that code for novel members of the carcinoembryonic antigen family）」, J. Cell Biol. 108 (2):267-276、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０２９０】
C反応性タンパク質（CRP）のヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_000567により同定される）は、例えば、Songら, 2006,「C反応性タンパク質は冠動脈疾患の凝固性亢進状態に寄与する（C-reactive protein contributes to the hypercoagulable state in coronary artery disease）」, J. Thromb. Haemost. 4 (1), 98-106；Wakugawaら, 2006,「C反応性タンパク質と一般的日本人集団における、初めての虚血性および出血性脳卒中のリスク：久山研究（C-reactive protein and risk of first-ever ischemic and hemorrhagic stroke in a general Japanese population: the Hisayama Study）」, Stroke 37, 27- 32; Tongら, 2005,「テストステロン、インスリン様成長因子-I、およびC反応性タンパク質の、2型糖尿病の家族歴をもつ中年の中国人の代謝性症候群との関連（Association of testosterone, insulin-like growth factor-I, and C-reactive protein with metabolic syndrome in Chinese middle-aged men with a family history of type 2 diabetes）」, J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 6418-6423に開示され、そしてCRPのアミノ酸配列（アクセッション番号CAA39671により同定される）は、Tenchiniら, 1990, Tenchini M.L., Dipartimento di Biologia e Genetica per Ie Scienze mediche, via Viotti 3, 20133 Milano, Italyによる直接投稿に記載されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０２９１】
CRTAPのヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_006371により同定される）は、例えば、Castagnola, P.ら, 1997,「軟骨関連タンパク質（CASP）は新規の発生的に調節されるニワトリ胚タンパク質である（Cartilage associated protein (CASP） is a novel developmentally regulated chick embryo protein）」, J. Cell. Sci. 110 (PT 12):1351-1359；Tonachini, L.ら, 1999,「ヒト 軟骨関連タンパク質 （CRTAP）をコードする遺伝子のcDNAクローニング、特徴付けおよび染色体マッピング（cDNA cloning, characterization and chromosome mapping of the gene encoding human cartilage associated protein (CRTAP)）」, Cytogenet. Cell Genet. 87:(3-4)；Morello, R.ら, 1999,「マウス軟骨関連タンパク質をコードするCtrapのcDNAクローニング、特徴付けおよび染色体マッピング（cDNA cloning, characterization and chromosome mapping of Crtap encoding the mouse cartilage associated protein）」, Matrix Biol. 18 (3):319-324に開示され、そしてCRTAPのアミノ酸配列（アクセッション番号NP_006362により同定される）は、例えば、Castagnola, P.ら, 1997,「軟骨関連タンパク質（CASP）は新規の発生的に調節されるニワトリ胚タンパク質である（Cartilage associated protein (CASP) is a novel developmentally regulated chick embryo protein）」, J. Cell. Sci. 110 (PT 12):1351-1359；Tonachini, L.ら, 1999,「ヒト 軟骨関連タンパク質 （CRTAP）をコードする遺伝子のcDNAクローニング、特徴付けおよび染色体マッピング（cDNA cloning, characterization and chromosome mapping of the gene encoding human cartilage associated protein (CRTAP)," Cytogenet. Cell Genet. 87:(3-4)；Morello, R.ら, 1999,「マウス軟骨関連タンパク質をコードするCtrapのcDNAクローニング、特徴付けおよび染色体マッピング（cDNA cloning, characterization and chromosome mapping of Crtap encoding the mouse cartilage associated protein）」, Matrix Biol. 18 (3):319-324、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０２９２】
CSFlRのヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_005211により同定される）は、例えば、Verbeek, J.S.ら, 1985,「ヒトc-fmsプロトオンコジーン：異常な対立遺伝子との比較分析（Human c-fms proto- oncogene: comparative analysis with an abnormal allele）」, MoL Cell. Biol. 5 (2):422-426；Xu, D. Q.ら, 1985,「ヒトc-fms 遺伝子の制限断片長多型（Restriction fragment length polymorphism of the human c-fms gene）」, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (9):2862-2865；Sherr, CJ.ら, 1985,「c-fmsプロトオンコジーン遺伝子産物は単核貪食細胞成長因子、CSF-Iの受容体に関係がある（The c-fms proto-oncogene product is related to the receptor for the mononuclear phagocyte growth factor, CSF-I）」, Cell 41 (3):665-676に開示され、そしてCSFlRのアミノ酸配列（アクセッション番号NP_005202により同定される）は、例えば、Verbeek, J.S.ら, 1985,「ヒトc-fmsプロトオンコジーン：異常な対立遺伝子との比較分析（Human c-fms proto-oncogene: comparative analysis with an abnormal allele）」, MoI. Cell. Biol. 5 (2):422- 426；Xu, D. Q.ら, 1985,「ヒトc-fms遺伝子の制限断片長多型（Restriction fragment length polymorphism of the human c-fms gene）」, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (9):2862-2865；Sherr, CJ.ら, 1985,「c-fmsプロトオンコジーン遺伝子産物は単核貪食細胞成長因子、CSF-Iの受容体に関係がある（The c-fms proto-oncogene product is related to the receptor for the mononuclear phagocyte growth factor, CSF-I）」, Cell 41 (3):665-676、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０２９３】
FAD104のヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_022763により同定される）は、例えば、Clark, H.F.ら, 2003,「分泌タンパク質発見構想（SPDI）、新規のヒト分泌および膜貫通タンパク質を同定するための大規模な努力：バイオインフォーマティックスによるアセスメント（The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins : a bioinformatics assessment）」, Genome Res. 13 (10):2265-2270；Tominaga, K.ら, 2004,「フィブロネクチンIII型ドメインを含有する新規遺伝子fad104は脂肪生成に大きい役割を果たす（The novel gene fad104, containing a fibronectin type III domain, has a significant role in adipogenesis）」, FEBS Lett. 577 (l-2):49-54に開示され、そしてFAD104のアミノ酸配列（アクセッション番号NP_073600により同定される）は、例えば、Clark, H.F. et α/.,2003,「分泌タンパク質発見構想（SPDI）、新規のヒト分泌および膜貫通タンパク質を同定するための大規模な努力：バイオインフォーマティックスによるアセスメント（The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment）」, Genome Res. 13 (10):2265-2270；Tominaga, K.ら, 2004,「フィブロネクチンIII型ドメインを含有する新規遺伝子fad104は脂肪生成に大きい役割を果たす（The novel gene fad104, containing a fibronectin type III domain, has a significant role in adipogenesis）」, FEBS Lett. 577 (1- 2):49-54、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０２９４】
FCGR1Aのヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_000566により同定される）は、例えば、Eizuru, Y.ら, 1988,「ヒト胎児肺繊維芽細胞中のサルサイトメガロウイルスによるFc(IgG)受容体の誘導（Induction of Fc (IgG) receptor(s) by simian cytomegaloviruses in human embryonic lung fibroblasts）」, Intervirology 29 (6):339-345；Allen, J.M.ら, 1988,「ヒト高親和性Fc受容体（FcRI）に対する3つのcDNAのヌクレオチド配列（Nucleotide sequence of three cDNAs for the human high affinity Fc receptor (FcRI)）」, Nucleic Acids Res. 16 (24): 11824；van de Winkel, J.G.ら, 1991,「IgGに対するヒト高親和性受容体の遺伝子組織、FcγRI（CD64）：第2の遺伝子に対する特徴付けと確証（Gene organization of the human high affinity receptor for IgG, Fc gamma RI (CD64). Characterization and evidence for a second gene）」, J. Biol. Chem. 266 (20): 13449- 1345に開示され、そしてFCGR1Aのアミノ酸配列（アクセッション番号NP_000557により同定される）は、例えば、Eizuru, Y.ら, 1988,「ヒト胎児肺繊維芽細胞中のサルサイトメガロウイルスによるFc(IgG)受容体の誘導（Induction of Fc (IgG) receptor(s) by simian cytomegaloviruses in human embryonic lung fibroblasts）」, Intervirology 29 (6):339-345, Allen, J.M.ら, 1988,「ヒト高親和性Fc受容体（FcRI）に対する3つのcDNAのヌクレオチド配列（Nucleotide sequence of three cDNAs for the human high affinity Fc receptor (FcRI)）」, Nucleic Acids Res. 16 (24):11824；van de Winkel, J.G.ら, 1991,「IgGに対するヒト高親和性受容体の遺伝子組織、FcγRI（CD64）：第2の遺伝子に対する特徴付けと確証（Gene organization of the human high affinity receptor for IgG, Fc gamma RI (CD64). Characterization and evidence for a second gene）」, J. Biol. Chem. 266 (20):13449-1345、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０２９５】
GADD45Aのヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_001924により同定される）は、例えば、Papathanasiou, M. A.ら, 1991,「電離放射線による培養ヒト細胞中のgadd45遺伝子の誘導：プロテインキナーゼCによる媒介の欠如（Induction by ionizing radiation of the gadd45 gene in cultured human cells: lack of mediation by protein kinase C）」, MoI. Cell. Biol. 11 (2):1009-1016；Hollander, M.C.ら, 1993,「哺乳動物のgadd45遺伝子の分析とDNA損傷に対するその応答（Analysis of the mammalian gadd45 gene and its response to DNA damage）」, J. Biol. Chem. 268 (32):24385- 24393；Smith, M.L.ら, 1994,「p53調節タンパク質Gadd45の増殖細胞核抗原との相互作用（Interaction of the p53-regulated protein Gadd45 with proliferating cell nuclear antigen）」, Science 266 (5189): 1376- 1380に開示され、そしてGADD45Aのアミノ酸配列（アクセッション番号NP_001915により同定される）は、例えば、Papathanasiou, M. A.ら, 1991,「電離放射線による培養ヒト細胞中のgadd45遺伝子の誘導：プロテインキナーゼCによる媒介の欠如（Induction by ionizing radiation of the gadd45 gene in cultured human cells: lack of mediation by protein kinase C）」, MoI. Cell. Biol. 11 (2):1009- 1016；Hollander, M.C.ら, 1993,「哺乳動物のgadd45遺伝子の分析とDNA損傷に対するその応答（Analysis of the mammalian gadd45 gene and its response to DNA damage）」, J. Biol. Chem. 268 (32):24385-24393；Smith, M.L.ら, 1994,「p53調節タンパク質Gadd45の増殖細胞核抗原との相互作用（Interaction of the p53-regulated protein Gadd45 with proliferating cell nuclear antigen）」, Science 266 (5189):1376-1380、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０２９６】
GADD45Bのヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_015675により同定される）は、例えば、Abdollahi, A.ら, 1991,「MyD118をコードするcDNAの配列と発現：複数のサイトカインにより誘導される、新規の骨髄分化一次応答遺伝子（Sequence and expression of a cDNA encoding MyD118: a novel myeloid differentiation primary response gene induced by multiple cytokines）」, Oncogene 6 (1): 165-167；Vairapandi, M.ら, 1996,「GADD45に関係する分化一次応答遺伝子MyD118はPCNAおよびp21WAF1/CIP1と相互作用する核タンパク質をコードする（The differentiation primary response gene MyD118, related to GADD45, encodes for a nuclear protein which interacts with PCNA and p21WAF1/CIPl5）」 Oncogene 12 (12):2579-2594；Koonin, E. V., 1997,「細胞周期とアポトーシス：リボソームの タンパク質との相同性から推測される、Gadd45とMyD118タンパク質の果たしうる役割（Cell cycle and apoptosis: possible roles of Gadd45 and MyD118 proteins inferred from their homology to ribosomal proteins）」, J. MoI. Med. 75 (4):236-238に開示され、そしてGADD45Bのアミノ酸配列（アクセッション番号NP_056490により同定される）は、例えば、Abdollahi, A.ら, 1991,「MyD118をコードするcDNAの配列と発現：複数のサイトカインにより誘導される、新規の骨髄分化一次応答遺伝子（Sequence and expression of a cDNA encoding MyD118: a novel myeloid differentiation primary response gene induced by multiple cytokines）」, Oncogene 6 (1): 165-167；Vairapandi, M.ら, 1996,「GADD45に関係する分化一次応答遺伝子MyD118はPCNAおよびp21WAF1/CIP1と相互作用する核タンパク質をコードする（The differentiation primary response gene MyD118, related to GADD45, encodes for a nuclear protein which interacts with PCNA and p21WAF1/CIPl）」, Oncogene 12 (12):2579-2594；Koonin, E.V., 1997,「細胞周期とアポトーシス：リボソームの タンパク質との相同性から推測される、Gadd45とMyD118タンパク質の果たしうる役割（Cell cycle and apoptosis: possible roles of Gadd45 and MyD118 proteins inferred from their homology to ribosomal proteins）」, J. MoI. Med. 75 (4):236-238、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０２９７】
HLA-DRAのヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_002123により同定される）は、例えば、Larhammar, D.ら, 1981,「HLA-DR抗原β鎖、HLA-A、B、C抗原サブユニットおよび免疫グロブリン鎖の間の進化関係（Evolutionary relationship between HLA-DR antigen beta-chains, HLA-A, B, C antigen subunits and immunoglobulin chains）」, Scand. J. Immunol. 14 (6):617-622；Wiman, K.ら, 1982,「HLA-DR 抗原β鎖に対応するcDNAクローンの単離と同定（Isolation and identification of a cDNA clone corresponding to an HLA-DR antigen beta chain）」, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79 (6): 1703-1707；Larhammar, D.ら, 1982,「ヌクレオチド配列から予想されるHLA-DR抗原様β鎖の完全アミノ酸配列：免疫グロブリンおよびHLA-A、-B、および-C抗原との類似性（Complete amino acid sequence of an HLA-DR antigen-like beta chain as predicted from the nucleotide sequence: similarities with immunoglobulins and HLA-A, -B, and -C antigens）」, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79 (12):3687-3691に開示され、そしてHLA-DRAのアミノ酸配列（アクセッション番号NP_002114により同定される）は、例えば、Larhammar, D.ら, 1981,「HLA-DR抗原β鎖、HLA-A、B、C抗原サブユニットおよび免疫グロブリン鎖の間の進化関係（Evolutionary relationship between HLA-DR antigen beta-chains, HLA-A, B, C antigen subunits and 
immunoglobulin chains）」, Scand. J. Immunol. 14 (6): 617-622；Wiman, K.ら, 1982,「HLA-DR 抗原β鎖に対応するcDNAクローンの単離と同定（Isolation and identification of a cDNA clone corresponding to an HLA-DR antigen beta chain）」, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79 (6): 1703 -1707；Larhammar, D.ら, 1982,「ヌクレオチド配列から予想されるHLA-DR抗原様β鎖の完全アミノ酸配列：免疫グロブリンおよびHLA-A、-B、および-C抗原との類似性（Complete amino acid sequence of an HLA-DR antigen-like beta chain as predicted from the nucleotide sequence: similarities with immunoglobulins and HLA-A, -B, and -C antigens）」, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79 (12):3687-3691、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０２９８】
IFNGRlのヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_000416により同定される）は、例えば、Novick, D.ら, 1987,「ヒトインターフェロンγ受容体：抗体の精製、特徴付け、および調製（The human interferon-gamma receptor. Purification, characterization, and preparation of antibodies）」, J. Biol. Chem. 262 (18): 8483-8487；Aguet, M.ら, 1988,「ヒトインターフェロンγ受容体の分子クローニングおよび発現（Molecular cloning and expression of the human interferon-gamma receptor）」, Cell 55 (2): 273-280；Le Coniat, M.ら, 1989,「ヒトインターフェロンγ受容体1（IFNGRl）遺伝子は染色体領域6q23-6q24にマッピングする（Human interferon gamma receptor 1 (IFNGRl) gene maps to chromosome region 6q23-6q24）」, Hum. Genet. 84 (l):92-94に開示され、そしてIFNGRlのアミノ酸配列（アクセッション番号NP_000407により同定される）は、例えば、Novick, D.ら, 1987,「ヒトインターフェロンγ受容体：抗体の精製、特徴付け、および調製（The human interferon-gamma receptor. Purification, characterization, and preparation of antibodies）」, J. Biol. Chem. 262 (18):8483-8487；Aguet, M.ら, 1988,「ヒトインターフェロンγ受容体の分子クローニングおよび発現（Molecular cloning and expression of the human interferon-gamma receptor）」, Cell 55 (2): 273-280；Le Coniat, M.ら, 1989,「ヒトインターフェロンγ受容体1（IFNGRl）遺伝子は染色体領域6q23-6q24にマッピングする（Human interferon gamma receptor 1 (IFNGRl) gene maps to chromosome region 6q23-6q24）」, Hum. Genet. 84 (l):92-94、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０２９９】
IL1RNのヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_000577、NM_173841、NM_173842、NMJ73843により同定される）は、例えば、Eisenberg, S.P.ら, 1990,「ヒトインターロイキン-1受容体アンタゴニストの相補DNAからの一次構造と機能的発現（Primary structure and functional expression from complementary DNA of a human interleukin-1 receptor antagonist）」, Nature 343 (6256):341-346；Carter, D.B.ら, 1990,「インターロイキン-1受容体アンタゴニストタンパク質の精製、クローニング、発現および生物学的特徴付け（Purification, cloning, expression and biological characterization of an interleukin-1 receptor antagonist protein）」, Nature 344 (6267):633-638；Seckinger, P.ら, 1990,「自然および組換えヒトIL-1受容体アンタゴニストは骨吸収およびプロスタグランジン産生に対するIL-1の影響をブロックする（Natural and recombinant human IL-1 receptor antagonists block the effects of IL-1 on bone resorption and prostaglandin production）」, J. Immunol. 145 ( 12) :4181-4184に開示され、そしてIL1RNのヌクレオチド配列（アクセッション番号AAN87150)は、例えば、Rieder, MJ. ら, 2002, 直接投稿, Genome Sciences, University of Washington, 1705 NE Pacific, Seattle, WA 98195, USA、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３００】
IL-6のヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_000600により同定される）は、例えば、Haegeman, G.ら, 1986,「ヒト繊維芽細胞中の誘導性26-kDaタンパク質をコードする配列の構造分析（Structural analysis of the sequence coding for an inducible 26-kDa protein in human fibroblasts）」, Eur. J. Biochem. 159 (3):625-632；Zilberstein, A.ら, 1986,「ヒトインターフェロン-β-2、増殖刺激性サイトカインにより誘導しうる異なる種に対するcDNAと遺伝子の構造および発現（Structure and expression of cDNA and genes for human interferon-beta-2, a distinct species inducible by growth-stimulatory cytokines）」, EMBO J. 5 (10):2529-2537；Hirano, T.ら, 1986,「Bリンパ球を誘導して免疫グロブリンを産生する新規ヒトインターロイキン（BSF-2）に対する相補DNA（Complementary DNA for a novel human interleukin (BSF-2) that induces B lymphocytes to produce immunoglobulin）」, Nature 324 (6092):73-76に開示され、そしてIL-6のアミノ酸配列（アクセッション番号NP_000591により同定される）は、例えば、Haegeman, G.ら, 1986,「ヒト繊維芽細胞中の誘導性26-kDaタンパク質をコードする配列の構造分析（Structural analysis of the sequence coding for an inducible 26-kDa protein in human fibroblasts）」, Eur. J. Biochem. 159 (3):625-632；Zilberstein, A.ら, 1986,「ヒトインターフェロン-β-2、増殖刺激性サイトカインにより誘導しうる異なる種に対するcDNAと遺伝子の構造および発現（Structure and expression of cDNA and genes for human interferon-beta-2, a distinct species inducible by growth-stimulatory cytokines）」, EMBO J. 5 (10):2529-2537；Hirano, T.ら, 1986,「Bリンパ球を誘導して免疫グロブリンを産生する新規ヒトインターロイキン（BSF-2）に対する相補DNA（Complementary DNA for a novel human interleukin (BSF-2) that induces B lymphocytes to produce immunoglobulin）」, Nature 324 (6092):73-76、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３０１】
IL-8のヌクレオチド配列（アクセッション番号M28130により同定される）およびIL-8のアミノ酸配列（アクセッション番号AAA59158により同定される）は、それぞれ、例えば、Mukaidaら, 1989,「ヒト単球から誘導される好中球化学向性因子IL-8のゲノム構造（Genomic structure of the human monocyte-derived neutrophil chemotactic factor IL-8）」, J. Immunol. 143, 1366-1371に開示されている（これは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３０２】
IL-10のヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_000572により同定される）は、例えば、Ghosh, S.ら, 1975,「廃水スラッジの嫌気性酸生成（Anaerobic acidogenesis of wastewater sludge）」, Breast Cancer Res. Treat. 47 (l):30-45；Hsu, D.H.ら, 1990,「エプスタイン・バーウイルスタンパク質BCRF1によるインターロイキン-10活性の発現（Expression of interleukin- 10 activity by Epstein-Barr virus protein BCRF1）」, Science 250 (4982):830-832；Vieira, P.ら, 1991,「ヒトサイトカイン合成阻害因子cDNAクローンの単離と発現：Epstein-BarrウイルスオープンリーディングフレームBCRF1との相同性（Isolation and expression of human cytokine synthesis inhibitory factor cDNA clones: homology to Epstein-Barr virus open reading frame BCRF1）」, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (4): 1172-1176に開示され、そしてIL-10のアミノ酸配列（アクセッション番号CAH73907により同定される）は、例えば、Tracey, A., 2005, 直接投稿, Wellcome Trust Sanger Institute, Hinxton, Cambridgeshire, CBlO ISA、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３０３】
IL10RAのヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_001558により同定される）は、例えば、Tan, J.C.ら, 1993,「ヒトおよびマウス細胞に与えるインターロイキン-10受容体の特徴付け（Characterization of interleukin- 10 receptors on human and mouse cells）」, J. Biol. Chem. 268 (28):21053-21059；Ho, A.S.ら, 1993,「インターロイキン10の受容体はインターフェロン受容体と関係がある（A receptor for interleukin 10 is related to interferon receptors）」, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (23):11267-11271；Liu, Y.ら, 1994,「ヒトIL-10受容体の発現クローニングおよび特徴付け（Expression cloning and characterization of a human IL-10 receptor）」, J. Immunol. 152 (4):1821-1829に開示され、そしてILlORAのアミノ酸配列（アクセッション番号NP_001549により同定される）は、例えば、Tan, J.C.ら, 1993,「ヒトおよびマウス細胞に与えるインターロイキン-10受容体の特徴付け（Characterization of interleukin- 10 receptors on human and mouse cells）」, J. Biol. Chem. 268 (28):21053-21059, Ho, A.S.ら, 1993,「インターロイキン10の受容体はインターフェロン受容体と関係がある（A receptor for interleukin 10 is related to interferon receptors）」, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (23):11267-11271；Liu, Y.ら, 1994,「ヒトIL-10受容体の発現クローニングおよび特徴付け（Expression cloning and characterization of a human IL-10 receptor）」, J. Immunol. 152 (4): 1821-1829、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３０４】
IL18R1のヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_003855により同定される）は、例えば、Parnet, P.ら, 1996,「IL-1Rrpは、I型インターロイキン-1 受容体およびその同族体T1/ST2およびIL-1R AcPに類似した新規受容体様分子である（IL-1Rrp is a novel receptor-like molecule similar to the type I interleukin-1 receptor and its homologues T1/ST2 and IL-1R AcP）」, J. Biol. Chem. 271 (8):3967-3970；Lovenberg, T.W.ら, 1996,「新規インターロイキン-1受容体に関係するタンパク質（IL1R-rp2）をコードするcDNAのクローニング（Cloning of a cDNA encoding a novel interleukin-1 receptor related protein (IL lR-rp2)）」, J. Neuroimmunol. 70 (2): 113-122；Torigoe, K.ら, 1997,「ヒトインターロイキン-18受容体の精製と特徴付け（Purification and characterization of the human interleukin-18 receptor）」, J. Biol. Chem. 272 (41):25737-25742に開示され、そしてIL18R1のアミノ酸配列（アクセッション番号NP_003846により同定される）は、例えば、Parnet, P.ら, 1996,「IL-1Rrpは、I型インターロイキン-1 受容体およびその同族体T1/ST2およびIL-1R AcPに類似した新規受容体様分子である（IL-1Rrp is a novel receptor-like molecule similar to the type I interleukin-1 receptor and its homologues T1/ST2 and IL-1R AcP）」, J. Biol. Chem. 271 (8):3967-3970；Lovenberg, T.W.ら, 1996,「新規インターロイキン-1受容体に関係するタンパク質（IL1R-rp2）をコードするcDNAのクローニング（Cloning of a cDNA encoding a novel interleukin-1 receptor related protein (IL lR-rp2)）」, J. Neuroimmunol. 70 (2):113-122；Torigoe, K.ら, 1997,「ヒトインターロイキン-18受容体の精製と特徴付け（Purification and characterization of the human interleukin-18 receptor）」, J. Biol. Chem. 272 (41):25737-25742、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３０５】
INSL3のヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_005543により同定される）は、例えば、Adham, LM.ら, 1993,「精巣ライディヒ細胞の新規の インスリン様ペプチドに対するcDNAのクローニング（Cloning of a cDNA for a novel insulin-like peptide of the testicular Leydig cells）」, J. Biol. Chem. 268 (35):26668-26672；Burkhardt, E.ら, 1994,「ライディヒ細胞に特異的なインスリン様ペプチド（LEY I-L）およびヒト遺伝子の染色体局在化（INSL3）をコードする、ブタおよびヒト遺伝子の構造組織（Structural organization of the porcine and human genes coding for a Leydig cell-specific insulin-like peptide (LEY I-L) and chromosomal localization of the human gene (INSL3)）」, Genomics 20 (1):13-19；Burkhardt, E.ら, 1994,「ライディヒ・インスリン様ペプチドをコードするヒトcDNA（Ley1-L）（A human cDNA coding for the Leydig insulin-like peptide (Ley 1-L)）」, Hum. Genet. 94 (l):91-94に開示され、そしてINSL3のアミノ酸配列（アクセッション番号NP_005534により同定される）は、例えば、Adham, LM.ら, 1993,「精巣ライディヒ細胞の新規の インスリン様ペプチドに対するcDNAのクローニング（Cloning of a cDNA for a novel insulin-like peptide of the testicular Leydig cells）」, J. Biol. Chem. 268 (35):26668-26672, Burkhardt, E.ら, 1994,「ライディヒ細胞に特異的なインスリン様ペプチド（LEY I-L）およびヒト遺伝子の染色体局在化（INSL3）をコードする、ブタおよびヒト遺伝子の構造組織（Structural organization of the porcine and human genes coding for a Leydig cell-specific insulin-like peptide (LEY I-L) and chromosomal localization of the human gene (INSL3)）」, Genomics 20 (1):13-19, Burkhardt, E.ら, 1994,「ライディヒ・インスリン様ペプチドをコードするヒトcDNA（Ley1-L）（A human cDNA coding for the Leydig insulin-like peptide (Ley I-L)）」, Hum. Genet. 94 (l):91-94、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３０６】
IRAK2のヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_001570により同定される）は、例えば、Muzio, M.ら, 1997,「IL-1シグナル伝達の近位メディエーターとしてのIRAK（Pelle）ファミリーメンバーIRAK-2およびMyD88（IRAK (Pelle) family member IRAK-2 and MyD88 as proximal mediators of IL-1 signaling）」, Science 278 (5343):1612- 1615；Auron, P.E., 1998,「インターロイキン1受容体：リガンド相互作用とシグナル伝達（The interleukin 1 receptor: ligand interactions and signal transduction）」, Cytokine Growth Factor Rev. 9 (3-4):221-237；Maschera, B.ら, 1999,「酵素的に不活性なインターロイキン1受容体関連キナーゼの過発現は核因子κBを活性化する（Overexpression of an enzymically inactive interleukin- 1 -receptor-associated kinase activates nuclear factor-kappaB）」, Biochem. J. 339 (PT 2):227-231に開示され、そしてIRAK2のアミノ酸配列（アクセッション番号NP_001561により同定される）は、例えば、Muzio, M.ら, 1997,「IL-1シグナル伝達の近位メディエーターとしてのIRAK（Pelle）ファミリーメンバーIRAK-2およびMyD88（IRAK (Pelle) family member IRAK-2 and MyD88 as proximal mediators of IL-1 signaling）」, Science 278 (5343):1612-1615；Auron, P.E., 1998,「インターロイキン1受容体：リガンド相互作用とシグナル伝達（The interleukin 1 receptor: ligand interactions and signal transduction）」, Cytokine Growth Factor Rev. 9 (3- 4):221-237；Maschera, B.ら, 1999,「酵素的に不活性なインターロイキン1受容体関連キナーゼの過発現は核因子κBを活性化する（Overexpression of an enzymically inactive interleukin- 1 -receptor-associated kinase activates nuclear factor-kappaB）」, Biochem. J. 339 (PT 2):227-231、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３０７】
IRAK4のヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_016123により同定される）は、例えば、Siu, G.ら , 1986,「ヒトVβ遺伝子サブファミリーの分析（Analysis of a human V beta gene subfamily）」, J. Exp. Med. 164 (5):1600-1614；Scanlan, M.J.ら, 1999,「腎細胞癌を患う患者の自己抗体により認識される抗原（Antigens recognized by autologous antibody in patients with renal-cell carcinoma）」, Int. J. Cancer 83 (4):456-464；Li, S.ら, 2002,「IRAK-4：IRAK-キナーゼの性質をもつIRAKファミリーの新規メンバー（IRAK-4: a novel member of the IRAK family with the properties of an IRAK-kinase）」, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (8):5567-5572に開示され、そしてIRAK4のアミノ酸配列（アクセッション番号NP_057207により同定される）は、例えば、Siu, G.ら, 1986,「ヒトVβ遺伝子サブファミリーの分析（Analysis of a human V beta gene subfamily）」, J. Exp. Med. 164 (5): 1600-1614；Scanlan, MJ.ら, 1999,「腎細胞癌を患う患者の自己抗体により認識される抗原（Antigens recognized by autologous antibody in patients with renal-cell carcinoma）」, Int. J. Cancer 83 (4):456-464；Li, S.ら, 2002,「IRAK-4：IRAK-キナーゼの性質をもつIRAKファミリーの新規メンバー（IRAK-4: a novel member of the IRAK family with the properties of an IRAK-kinase）」, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 
(8):5567-5572、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３０８】
ITGAMのヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_000632により同定される）は、例えば、Micklem, KJ.ら, 1985,「アフィニティクロマトグラフィによる補体-断片-iC3b結合タンパク質の単離：p150,95のiC3b結合タンパク質としての同定（Isolation of complement- fragment-iC3b-binding proteins by affinity chromatography. The identification of p150,95 as an iC3b-binding protein）」, Biochem. J. 231 (l):233-236；Pierce, M.W.ら, 1986,「種全体にわたるヒト白血球糖タンパク質Mo1のN-末端配列保存および血小板Ilb/IIIaとの相同性（N- terminal sequence of human leukocyte glycoprotein Mo1 conservation across species and homology to platelet Ilb/IIIa）」, Biochim. Biophys. Acta 874 (3):368-371；Arnaout, M.A.ら, 1988,「ヒトおよびモルモット白血球接着糖タンパク質Mo1のαサブユニットの分子クローニング：染色体の局在およびインテグリンのαサブユニットとの相同性（Molecular cloning of the alpha subunit of human and guinea pig leukocyte adhesion glycoprotein Mo1 : chromosomal localization and homology to the alpha subunits of integrins）」, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (8):2776-2780に開示され、そしてITGAMのアミノ酸配列（アクセッション番号NP_000623により同定される）は、例えば、Micklem, KJ.ら, 1985,「アフィニティクロマトグラフィによる補体-断片-iC3b結合タンパク質の単離：p150,95のiC3b結合タンパク質としての同定（Isolation of complement-fragment-iC3b-binding proteins by affinity chromatography. The identification of p150,95 as an iC3b-binding protein）」, Biochem. J. 231 (l):233-236；Pierce, M.W.ら, 1986,「種全体にわたるヒト白血球糖タンパク質Mo1のN-末端配列保存および血小板Ilb/IIIaとの相同性（N-terminal sequence of human leukocyte glycoprotein Mo1: conservation across species and homology to platelet Ilb/IIIa）」, Biochim. Biophys. Acta 874 (3):368-371；Arnaout, M.A.ら, 1988,「ヒトおよびモルモット白血球接着糖タンパク質Mo1のαサブユニットの分子クローニング：染色体の局在およびインテグリンのαサブユニットとの相同性（Molecular cloning of the alpha subunit of human and guinea pig leukocyte adhesion glycoprotein Mo1 : chromosomal localization and homology to the alpha subunits of integrins）」, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (8):2776-2780、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３０９】
JAK2のヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_004972により同定される）は、例えば、Wilks, A.F.ら, 1991,「第2のホスホトランスフェラーゼ関連触媒ドメインをそれぞれ有する2つの新規タンパク質チロシンキナーゼがタンパク質キナーゼの新クラスを規定する（Two novel protein-tyrosine kinases, each with a second phosphotransferase-related catalytic domain, define a new class of protein kinase）」, MoI. Cell. Biol. 11 (4):2057-2065；Pritchard, M.A.ら, 1992,「タンパク質 チロシン キナーゼの JAK ファミリーの2つのメンバーが染色体1p31.3 および 9p24をマップする（Two members of the JAK family of protein tyrosine kinases map to chromosomes 1p31.3 and 9p24）」, Mamm. Genome 3 (l):36-38；Witthuhn, B.A.ら, 1993,「JAK2はエリスロポエチン 受容体と関連があり、エリスロポエチンによる刺激後チロシンリン酸化されて活性化される（JAK2 associates with the erythropoietin receptor and is tyrosine phosphorylated and activated following stimulation with erythropoietin）」, Cell 74 (2):227-236に開示され、そしてJAK2のアミノ酸配列（アクセッション番号NP_004963により同定される）は、例えば、Wilks, A.F.ら, 1991,「第2のホスホトランスフェラーゼ関連触媒ドメインをそれぞれ有する2つの新規タンパク質チロシンキナーゼがタンパク質キナーゼの新クラスを規定する（Two novel protein-tyrosine kinases, each with a second phosphotransferase-related catalytic domain, define a new class of protein kinase）」, MoI. Cell. Biol. 11 (4):2057-2065；Pritchard, M.A.ら, 1992,「タンパク質 チロシン キナーゼの JAK ファミリーの2つのメンバーが染色体1p31.3 および 9p24をマップする（Two members of the JAK family of protein tyrosine kinases map to chromosomes Ip31.3 and 9p24）」, Mamm. Genome 3 (l):36-38；Witthuhn, B.A.ら, 1993,「JAK2はエリスロポエチン 受容体と関連があり、エリスロポエチンによる刺激後チロシンリン酸化されて活性化される（JAK2 associates with the erythropoietin receptor and is tyrosine phosphorylated and activated following stimulation with erythropoietin）」, Cell 74 (2):227-236、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３１０】
LDLRのヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_000527により同定される）は、例えば、Brown, M.S.ら, 1979,「受容体介在性エンドサイトーシス：リポタンパク質受容体 系からの洞察（Receptor-mediated endocytosis: insights from the lipoprotein receptor system）」, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (7):3330-3337；Goldstein, J.L.ら, 1982,「受容体介在性エンドサイトーシスおよび低密度リポタンパク質の細胞取り込み（Receptor-mediated endocytosis and the cellular uptake of low density lipoprotein）」, Ciba Found. Symp. 92, 77-95；Tolleshaug H.ら, 1983,「家族性高コレステロール血症におけるLDL受容体遺伝子座：複数の突然変異が輸送および膜受容体のプロセシングを崩壊させる（The LDL receptor locus in familial hypercholesterolemia: multiple mutations disrupt transport and processing of a membrane receptor）」, Cell 32 (3):941-951に開示され、そしてLDLRのアミノ酸配列（アクセッション番号NP_000518により同定される）は、例えば、Brown, M.S.ら, 1979,「受容体介在性エンドサイトーシス：リポタンパク質受容体 系からの洞察（Receptor-mediated endocytosis: insights from the lipoprotein receptor system）」, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (7):3330-33373；Goldstein, J. L.ら, 1982,「受容体介在性エンドサイトーシスおよび低密度リポタンパク質の細胞取り込み（Receptor- mediated endocytosis and the cellular uptake of low density lipoprotein）」, Ciba Found. Symp. 92, 77-95, Tolleshaug, H.ら, 1983,「家族性高コレステロール血症におけるLDL受容体遺伝子座：複数の突然変異が輸送および膜受容体のプロセシングを崩壊させる（The LDL receptor locus in familial hypercholesterolemia: multiple mutations disrupt transport and processing of a membrane receptor）」, Cell 32 (3):941-951、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３１１】
LY96のヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_015364により同定される）は、例えば、Shimazu, R.ら, 1999,「MD-2、リポ多糖反応性をToll様受容体4に与える分子（MD-2, a molecule that confers lipopolysaccharide responsiveness on Toll-like receptor 4）」, J. Exp. Med. 189 (11):1777- 1782；Kato, K.ら, 2000,「ESOP-I、胎性および成体マウスの造血、神経、および生殖系に発現される分泌タンパク質（ESOP-I, a secreted protein expressed in the hematopoietic, nervous, and reproductive systems of embryonic and adult mice）」, Blood 96 (l):362-364；Dziarski, R.ら, 2001,「MD-2はリポ多糖に対するToll様受容体2（TLR2）介在性応答を与えかつグラム陽性およびグラム陰性菌ならびにそれらの細胞壁成分に対するTLR2介在性応答を増強する（MD-2 enables Toll-like receptor 2 (TLR2)-mediated responses to lipopolysaccharide and enhances TLR2-mediated responses to Gram-positive and Gram- negative bacteria and their cell wall components）」, J. Immunol. 166 (3):1938-1944に開示され、そしてLY96のアミノ酸配列（アクセッション番号NP_056179により同定される）は、例えば、Shimazu, R.ら, 1999,「MD-2、リポ多糖反応性をToll様受容体4に与える分子（MD-2, a molecule that confers lipopolysaccharide responsiveness on Toll-like receptor 4）」, J. Exp. Med. 189 (11):1777-1782；Kato, K.ら, 2000,「ESOP-I、胎性および成体マウスの造血、神経、および生殖系に発現される分泌タンパク質（ESOP-I, a secreted protein expressed in the hematopoietic, nervous, and reproductive systems of embryonic and adult mice）」, Blood 96 (l):362-364；Dziarski, R.ら, 2001,「MD-2はリポ多糖に対するToll様受容体2（TLR2）介在性応答を与えかつグラム陽性およびグラム陰性菌ならびにそれらの細胞壁成分に対するTLR2介在性応答を増強する（MD-2 enables Toll-like receptor 2 (TLR2)-mediated responses to lipopolysaccharide and enhances TLR2-mediated responses to Gram-positive and Gram-negative bacteria and their cell wall components）」, J. Immunol. 166 (3):1938-1944、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３１２】
MAP2K6のヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_002758、NM_031988により同定される）は、例えば、Han, J.ら, 1996,「新規MAPキナーゼキナーゼ（MKK6）の構造および機能の特徴付け（Characterization of the structure and function of a novel MAP kinase kinase (MKK6)）」, J. Biol. Chem. 271 (6):2886-2891；Raingeaud, J.ら, 1996,「MKK3-およびMKK6-に調節される遺伝子発現はp38マイトジェン活性化タンパク質キナーゼシグナル形質導入経路により媒介される（MKK3- and MKK6-regulated gene expression is mediated by the p38 mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway）」, MoI. Cell. Biol. 16 (3), 1247-1255；Stein, B.ら, 1996,「MEK6、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼカスケードの新規メンバーのクローニングと特徴付け（Cloning and characterization of MEK6, a novel member of the mitogen-activated protein kinase kinase cascade）」, J. Biol. Chem. 271 (19): 11427-11433に開示され、そしてMAP2K6のアミノ酸配列（アクセッション番号NP_002749、NP_114365により同定される）は、例えば、Han, J.ら, 1996,「新規MAPキナーゼキナーゼ（MKK6）の構造および機能の特徴付け（Characterization of the structure and function of a novel MAP kinase kinase (MKK6), J. Biol. Chem. 271 (6):2886-2891；Raingeaud, J.ら, 1996,「MKK3-およびMKK6-に調節される遺伝子発現はp38マイトジェン活性化タンパク質キナーゼシグナル形質導入経路により媒介される（MKK3- and MKK6-regulated  gene expression is mediated by the p38 mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway）」, MoL Cell. Biol. 16 (3), 1247-1255；Stein, B.ら, 1996,「MEK6、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼカスケードの新規メンバーのクローニングと特徴付け（Cloning and characterization of MEK6, a novel member of the mitogen-activated protein kinase kinase cascade）」, J. Biol. Chem. 271 (19): 11427-11433、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３１３】
MAPK14のヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_001315、NMJ39012、NM_139013、NMJ39014により同定される）は、例えば、Zhukov- Verezhnikov, N.N.ら, 1976,「コレラ菌のワクチン調製物中の異型遺伝子抗原の研究（Study of the heterogenetic antigens in vaccinal preparations of V. cholerae）」, Biochem. Biophys. Res. Commun. 82 (8):961-962；Schultz, SJ.ら, 1993,「偽巣性コウジ菌の細胞周期レギュレーターnimAに関係するファミリーの3つのメンバーを含む、21の新規ヒトタンパク質キナーゼの同定（Identification of 21 novel human protein kinases, including 3 members of a family related to the cell cycle regulator nimA of Aspergillus nidulans）」, Cell Growth Differ. 4 (10):821-830；Lee, J.C.ら, 1994,「炎症性サイトカイン生合成の調節に関わるプロテインキナーゼ（A protein kinase involved in the regulation of inflammatory cytokine biosynthesis）」, Nature 372 (6508):739~746に開示され、そしてMAPK14のアミノ酸配列（アクセッション番号NP_001306、NP_620581、NP_620582、NP_620583により同定される）は、例えば、Zhukov-Verezhnikov, N.N.ら, 1976,「コレラ菌のワクチン調製物中の異型遺伝子抗原の研究（Study of the heterogenetic antigens in vaccinal preparations of V. cholerae）」, Biochem. Biophys. Res. Commun. 82 (8): 961-962；Schultz, SJ.ら, 1993,「偽巣性コウジ菌の細胞周期レギュレーターnimAに関係するファミリーの3つのメンバーを含む、21の新規ヒトタンパク質キナーゼの同定（Identification of 21 novel human protein kinases, including 3 members of a family related to the cell cycle regulator nimA of Aspergillus nidulans）」, Cell Growth Differ. 4 (10):821-830；Lee, J.C.ら, 1994,「炎症性サイトカイン生合成の調節に関わるプロテインキナーゼ（A protein kinase involved in the regulation of inflammatory cytokine biosynthesis）」, Nature 372 (6508):739-746、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３１４】
単球走化性プロテイン1（MCP1）のヌクレオチド配列（アクセッション番号AF493698およびAF493697により同定される）は、例えば、Shanmugasundaramら, 2002, Virology II, National Institute of Immunology, Aruna Asag AIi Marg, J.N.U. Campus, New Delhi 110 067, Indiaに開示され、そしてMCPlのアミノ酸配列（アクセッション番号AAQ75526により同定される）は、例えば、Nyquistら, 2003, 直接投稿, Medicine, Inova Fairfax, 3300 Gallows Road, Falls Church, Virginia 22402-3300、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３１５】
MKNKlのヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_003684、NM_198973により同定される）は、例えば、Fukunagaら, 1997,「MNKl：タンパク質キナーゼ基質を同定する新規の発現スクリーニング法により単離された、新しいMAPキナーゼ活性化タンパク質キナーゼ（MNKl, a new MAP kinase-activated protein kinase, isolated by a novel expression screening method for identifying protein kinase substrates, EMBO J. 16: 1921-1933；Pyronnetら , 1999,「ヒト真核生物の翻訳開始因子4G（eIF4G）はmnk1を補充してelF4Eをリン酸化する（Human eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G) recruits mnk1 to phosphorylate eIF4E）」, EMBO J. 18: 270-279；Cuestaら, 2000,「シャペロンhsp27は、elF4Gと結合することおよびキャップ開始複合体の解離を容易にすることにより、熱ショック期間の翻訳を阻害する（Chaperone hsp27 inhibits translation  during heat shock by binding eIF4G and facilitating dissociation of cap-initiation complexes）」, Genes Dev. 14: 1460-1470に開示され、そしてMKNKlのアミノ酸配列（アクセッション番号NP_003675、NP_945324により同定される）は、例えば、Fukunagaら, 1997,「MNKl：タンパク質キナーゼ基質を同定する新規の発現スクリーニング法により単離された、新しいMAPキナーゼ活性化タンパク質キナーゼ（MNKl, a new MAP kinase-activated protein kinase, isolated by a novel expression screening method for identifying protein kinase substrates）」, EMBO J. 16:1921-1933；Pyronnetら, 1999,「ヒト真核生物の翻訳開始因子4G（eIF4G）はmnk1を補充してelF4Eをリン酸化する（Human eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G) recruits mnkl to phosphorylate eIF4E）」, EMBO J. 18: 270-279；Cuestaら, 2000,「シャペロンhsp27は、elF4Gと結合することおよびキャップ開始複合体の解離を容易にすることにより、熱ショック期間の翻訳を阻害する（Chaperone hsp27 inhibits translation during heat shock by binding eIF4G and facilitating dissociation of cap-initiation complexes）」, Genes Dev. 14: 1460-1470、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３１６】
MMP9のヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_004994により同定される）は、例えば、Wilhelmら, 1989,「SV40-形質転換したヒト肺繊維芽細胞は、正常なヒトマクロファージが分泌するものと同一である92kDaのIV型コラゲナーゼを分泌する（SV40-transformed human lung fibroblasts secrete a 92-kDa type IV collagenase which is identical to that secreted by normal human macrophages）」, J. Biol. Chem. 264: 17213-17221；Huhtalaら, 1990,「ヒトIV型コラゲナーゼ・プレプロ酵素の一次構造の完成および遺伝子（CLG4）の染色体16のq21領域への割り当て（Completion of the primary structure of the human type IV collagenase preproenzyme and assignment of the gene (CLG4) to the q21 region of chromosome 16）」, Genomics 6: 554-559；Collierら, 1991,「72-および92-kDaヒトIV型コラゲナーゼ遺伝子の構造および染色体位置について（On the structure and chromosome location of the 72- and 92-kDa human type IV collagenase genes）」, Genomics 9: 429-434に開示され、そしてMMP9のアミノ酸配列（アクセッション番号NP_004985により同定される）は、例えば、Wilhelmら, 1989,「SV40-形質転換したヒト肺繊維芽細胞は、正常なヒトマクロファージが分泌するものと同一である92kDaのIV型コラゲナーゼを分泌する（SV40-transformed human lung fibroblasts secrete a 92-kDa type IV collagenase which is identical to that secreted by normal human macrophages）」, J. Biol. Chem. 264: 17213-17221；Huhtalaら, 1990,「ヒトIV型コラゲナーゼ・プレプロ酵素の一次構造の完成および遺伝子（CLG4）の染色体16のq21領域への割り当て（Completion of the primary structure of the human type IV collagenase preproenzyme and assignment of the gene (CLG4) to the q21 region of chromosome 16）」, Genomics 6: 554-559；Collierら, 1991,「72-および92-kDaヒトIV型コラゲナーゼ遺伝子の構造および染色体位置について（On the structure and chromosome location of the 72- and 92-kDa human type IV collagenase genes）」, Genomics 9: 429-434、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３１７】
NCRlのヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_004829により同定される）は、例えば、Sivoriら, 1997,「p46、細胞活性化を媒介する新規のナチュラルキラー細胞特異的表面分子（p46, a novel natural killer cell-specific surface molecule that mediates cell activation）」, J. Exp. Med. 186:1129-1136；Vitale,M.ら, NKp44, 1998,「NKp44、活性化ナチュラルキラー細胞により特異的に発現される新規の始動表面分子は非主要組織適合性複合体に制限された腫瘍細胞溶解に関わる（NKp44, a novel triggering surface molecule specifically expressed by activated natural killer cells, is involved in non-major histocompatibility complex-restricted tumor cell lysis）」, J. Exp. Med. 187: 2065-2072；Pessinoら, 1998,「NKp46：ナチュラル細胞傷害性の始動に関わる免疫グロブリンスーパーファミリーの新規メンバーの分子クローニング（Molecular cloning of NKp46: a novel member of the immunoglobulin superfamily involved in triggering of natural cytotoxicity）」, J. Exp. Med. 188: 953-960に開示され、そしてNCRlのアミノ酸配列（アクセッション番号NP_004820により同定される）は、例えば、Sivoriら, 1997,「p46、細胞活性化を媒介する新規のナチュラルキラー細胞特異的表面分子（p46, a novel natural killer cell-specific surface molecule that mediates cell activation）」, J. Exp. Med. 186:1129-1136；Vitale et α/., NKp44, 1998,「NKp44、活性化ナチュラルキラー細胞により特異的に発現される新規の始動表面分子は非主要組織適合性複合体に制限された腫瘍細胞溶解に関わる（NKp44, a novel triggering surface molecule specifically expressed by activated natural killer cells, is involved in non-major histocompatibility complex-restricted tumor cell lysis）」, J. Exp. Med. 187: 2065-2072；Pessinoら, 1998,「NKp46：ナチュラル細胞傷害性の始動に関わる免疫グロブリンスーパーファミリーの新規メンバーの分子クローニング（Molecular cloning of NKp46: a novel member of the immunoglobulin superfamily involved in triggering of natural cytotoxicity）」, J. Exp. Med. 188: 953-96、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３１８】
OSMのヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_020530により同定される）は、例えば、Zarlingら, 1986,「オンコスタチンM：分化した組織球リンパ腫細胞により産生される増殖レギュレーター（Oncostatin M: a growth regulator produced by differentiated histiocytic lymphoma cells）」, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83 (24): 9739-9743；Malikら, 1989,「新規の増殖レギュレーターであるオンコスタチンMの分子クローニング、配列分析および機能発現（Molecular cloning, sequence analysis, and functional expression of a novel growth regulator, oncostatin M）」, MoI. Cell. Biol. 9 (7):2847-2853；Linsley, P. S.ら, 1990,「親水性C末端ドメインの切断は、オンコスタチンMの増殖阻害性活性を増加する（Cleavage of a hydrophilic C-terminal domain increases growth- inhibitory activity of oncostatin M）」, MoI. Cell. Biol. 10 (5): 1882-1890に開示され、そしてOSMのアミノ酸配列（アクセッション番号NP_065391により同定される）は、例えば、Zarling, J.M.ら, 1986,「オンコスタチンM：分化した組織球リンパ腫細胞により産生される増殖レギュレーター（Oncostatin M: a growth regulator produced by differentiated histiocytic lymphoma cells）」, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83 (24):9739-9743；Malik, N.ら, 1989,「新規の増殖レギュレーターであるオンコスタチンMの分子クローニング、配列分析および機能発現（Molecular cloning, sequence analysis, and functional expression of a novel growth regulator, oncostatin M）」, MoI. Cell. Biol. 9 (7):2847-2853；Linsley, P.S.ら, 1990,「親水性C末端ドメインの切断は、オンコスタチンMの増殖阻害性活性を増加する（Cleavage of a hydrophilic C-terminal domain increases growth-inhibitory activity of oncostatin M）」, MoI. Cell. Biol. 10 (5): 1882- 1890、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３１９】
PFKFB3のヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_004566により同定される）は、例えば、Sakai, A.ら, 1996,「ヒト胎盤由来のフルクトース6-リン酸, 2-キナーゼ/フルクトース2,6-ビスホスファターゼの新規アイソザイムをコードするcDNAのクローニング（Cloning of cDNA encoding for a novel isozyme of fructose 6-phosphate, 2-kinase/fructose 2,6-bisphosphatase from human placenta）」, J. Biochem. 119 (3):506-511；Hamilton, J.A.ら, 1997,「PRGl、6-ホスホフルクト-2-キナーゼ/フルクトース-2,6-ビスホスファターゼと配列相同性をもつ新規の女性ホルモン応答遺伝子の同定（Identification of PRGl, a novel progestin-responsive gene with sequence homology to 6-phosphofructo-2- kinase/fructose-2,6-bisphosphatase）」, MoI. Endocrinol. 11 (4):490-502；Nicholl, J.ら,「6-ホスホフラクト-2-キナーゼ/フルクトース-2,6-ビスホスファターゼ（PFKFB3）の第3のヒトイソ型は位置10p14-pl5にマップする（The third human isoform of 6-phosphofracto-2-kmase/fructose-2,6-bisphosphatase (PFKFB3) map position 10p 14- pl5）」, Chromosome Res. 5 (2):150に開示され、そしてPFKFB3のアミノ酸配列（アクセッション番号NP_004557により同定される）は、例えば、Sakai, A.ら, 1996,「ヒト胎盤由来のフルクトース6-リン酸, 2-キナーゼ/フルクトース2,6-ビスホスファターゼの新規アイソザイムをコードするcDNAのクローニング（Cloning of cDNA encoding for a novel isozyme of fructose 6-phosphate, 2-kinase/fructose 2,6-bisphosphatase from human placenta）」, J. Biochem. 119 (3):506-511；Hamilton, JA.ら, 1997,「PRGl、6-ホスホフルクト-2-キナーゼ/フルクトース-2,6-ビスホスファターゼと配列相同性をもつ新規の女性ホルモン応答遺伝子の同定（Identification of PRGl, a novel progestin-responsive gene with sequence homology to 6- phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase）」, MoI. Endocrinol. 11 (4):490-502；Nicholl, J.ら,「6-ホスホフラクト-2-キナーゼ/フルクトース-2,6-ビスホスファターゼ（PFKFB3）の第3のヒトイソ型は位置10p14-pl5にマップする（The third human isoform of 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6- bisphosphatase (PFKFB3) map position 10pl4-pl5, Chromosome Res. 5 (2):150）」、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３２０】
PRV1のヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_020406により同定される）は、例えば、Lalezari, P.ら, 1971,「NB1、新生児の好中球減少の病理発生に関わる新しい好中球特異的抗原（NB1, a new neutrophil-specific antigen involved in the pathogenesis of neonatal neutropenia）」, J. Clin. Invest. 50 (5):1108-1115；Goldschmeding, R.ら, 1992,「様々に発現される56〜62kDのGPIが結合した好中球の原形質膜および特定顆粒の糖タンパク質としての、NB1抗原のさらなる特徴付け（Further characterization of the NB 1 antigen as a variably expressed 56-62 kD GPI-linked glycoprotein of plasma membranes and specific granules of neutrophils）」, Br. J. Haematol. 81 (3):336-34；Stroncek, D.F.ら,「好中球特異的抗原NB1は好中球-内皮細胞の相互作用を阻害する（Neutrophil-specific antigen NB1 inhibits neutrophil-endothelial cell interactions）」, J. Lab. Clin. Med. 123 (2): 247-255に開示され、そしてPRV1のアミノ酸配列（アクセッション番号NP_065139により同定される）は、例えば、Lalezari, P.ら, 1971,「NB1、新生児の好中球減少の病理発生に関わる新しい好中球特異的抗原（NB1, a new neutrophil-specific antigen involved in the pathogenesis of neonatal neutropenia）」, J. Clin. Invest. 50 (5):1108- 1115；Goldschmeding, R.ら, 1992,「様々に発現される56〜62kDのGPIが結合した好中球の原形質膜および特異的顆粒の糖タンパク質としての、NB1抗原のさらなる特徴付け（Further characterization of the NB 1 antigen as a variably expressed 56-62 kD GPI-linked glycoprotein of plasma membranes and specific granules of neutrophils）」, Br. J. Haematol. 81 (3):336-345；Stroncek, D.F.ら,「好中球特異的抗原NB1は好中球-内皮細胞の相互作用を阻害する（Neutrophil-specific antigen NB1 inhibits neutrophil-endothelial cell interactions）」, J. Lab. Clin. Med. 123 (2):247-255、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３２１】
PSTPIP2のヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_024430により同定される）は、例えば、Hillier, L.D.ら, 1996,「280,000のヒトの発現された配列タグの作製と分析（Generation and analysis of 280,000 human expressed sequence tags）」, Genome Res. 6 (9):807-828；Wu, Y.ら, 1998,「PSTPIP 2、PEST型タンパク質-チロシンホスファターゼと結合する第2のチロシンリン酸化、細胞骨格関連タンパク質（PSTPIP 2, a second tyrosine phosphorylated, cytoskeletal-associated protein that binds a PEST-type protein-tyrosine phosphatase）」, J. Biol. Chem. 273 (46):30487-30496； Yeung, Y.G.ら, 1998,「新規のマクロファージアクチン関連タンパク質（MAYP）は、コロニー刺激因子1刺激後にチロシン-リン酸化される（A novel macrophage actin-associated protein (MAYP) is tyrosine- phosphorylated following colony stimulating factor- 1 stimulation）」, J. Biol. Chem. 273 (46): 30638-30642に開示され、そしてPSTPIP2のアミノ酸配列（アクセッション番号NP_077748により同定される）は、例えば、Hillier, L.D.ら, 1996,「280,000のヒトの発現された配列タグの作製と分析（Generation and analysis of 280,000 human expressed sequence tags）」, Genome Res. 6 (9):807-828；Wu, Y.ら, 1998,「PSTPIP 2、PEST型タンパク質-チロシンホスファターゼと結合する第2のチロシンリン酸化、細胞骨格関連タンパク質（PSTPIP 2, a second tyrosine phosphorylated, cytoskeletal-associated protein that binds a PEST-type protein-tyrosine phosphatase）」, J. Biol. Chem. 273 (46):30487-30496；Yeung, Y.G.ら, 1998,「新規のマクロファージアクチン関連タンパク質（MAYP）は、コロニー刺激因子1刺激後にチロシン-リン酸化される（A novel macrophage actin-associated protein (MAYP) is tyrosine- phosphorylated following colony stimulating factor- 1 stimulation）」, J. Biol. Chem. 273 (46): 30638-30642、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３２２】
SOCS3のヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_003955により同定される）は、例えば、Minamoto, S.ら, 1997,「STATの新しいメンバーにより誘導されるSTATインヒビター（SSI）：SSI-2およびSSI-3のクローニングと機能分析」（Cloning and functional analysis of new members of STAT induced STAT inhibitor (SSI) family: SSI-2 and SSI-3）」, Biochem. Biophys. Res. Commun. 237 (l):79-83；Masuhara, M.ら, 1997,「新規CISファミリー遺伝子のクローニングと特徴付け（Cloning and characterization of novel CIS family genes）」, Biochem. Biophys. Res. Commun. 239 (2):439-446；Zhang, J.G.ら, 1999,「サイトカインシグナル伝達のサプレッサー中の保存されたSOCSボックスモチーフは、エロンジンBおよびCと結合し、結合したタンパク質とカップリングしてプロテアソーム分解を起こす（The conserved SOCS box motif in suppressors of cytokine signaling binds to elongins B and C and may couple bound proteins to proteasomal degradation）」, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (5):2071-2076に開示され、そしてSOCS3のアミノ酸配列（アクセッション番号NP_003946により同定される）は、例えば、Minamoto, S.ら, 1997,「STATの新しいメンバーにより誘導されるSTATインヒビター（SSI）：SSI-2およびSSI-3のクローニングと機能分析（Cloning and functional analysis of new members of STAT induced STAT inhibitor (SSI) family: SSI-2 and SSI-3）」, Biochem. Biophys. Res. Commun. 237 (l):79-83；Masuhara, M. etal, 1997,「新規CISファミリー遺伝子のクローニングと特徴付け（Cloning and characterization of novel CIS family genes）」, Biochem. Biophys. Res. Commun. 239 (2):439-446；Zhang, J.G.ら, 1999,「サイトカインシグナル伝達のサプレッサー中の保存されたSOCSボックスモチーフは、エロンジンBおよびCと結合し、結合したタンパク質とカップリングしてプロテアソーム分解を起こす（The conserved SOCS box motif in suppressors of cytokine signaling binds to elongins B and C and may couple bound proteins to proteasomal degradation）」, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (5):2071-2076、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３２３】
SOD2のヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_000636により同定される）は、例えば、Smith, M.ら, 1978,「染色体6上のHLA、MES、およびSODMの領域局在（Regional localization of HLA, MES, and SODM on chromosome 6）」, Cytogenet. Cell Genet. 22 (l-6):428-433；Beck, Y.ら, 1987,「ヒトMnスーパーオキシドジスムターゼcDNA配列,（Human Mn superoxide dismutase cDNA sequence）」, Nucleic Acids Res. 15 (21):9076；Ho, Y.S.ら, 1988,「ヒトのマンガン含有スーパーオキシドジスムターゼをコードする相補DNAの単離と特徴付け（Isolation and characterization of complementary DNAs encoding human manganese-containing superoxide dismutase）」, FEBS Lett. 229 (2):256-260に開示され、そしてSOD2のアミノ酸配列（アクセッション番号NP_000627により同定される）は、例えば、Smith, M.ら, 1978,「染色体6上のHLA、MES、およびSODMの領域局在（Regional localization of HLA, MES, and SODM on chromosome 6）」, Cytogenet. Cell Genet. 22 (l-6):428-433；Beck, Y.ら, 1987,「ヒトMnスーパーオキシドジスムターゼcDNA配列（Human Mn superoxide dismutase cDNA sequence）」, Nucleic Acids Res. 15 (21):9076, Ho, Y.S.ら, 1988,「ヒトのマンガン含有スーパーオキシドジスムターゼをコードする相補DNAの単離と特徴付け（Isolation and characterization of complementary DNAs encoding human manganese- containing superoxide dismutase）」, FEBS Lett. 229 (2):256-260、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３２４】
TDRD9のヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_153046により同定される）は、例えば、Isogaiら, 2003,「遺伝子量補償レギュレーターに若干類似するホモサピエンスcDNA FLJ43990 fis、クローンTESTI4019566（Homo sapiens cDNA FLJ43990 fis,  clone TESTI4019566, weakly similar to Dosage compensation regulator）」、未刊、に開示され、そしてTDRD9のアミノ酸配列（アクセッション番号NP_694591により同定される）は、例えば、Isogaiら, 2003,「遺伝子量補償レギュレーターに若干類似するホモサピエンスcDNA FLJ43990 fis、クローンTESTI4019566（Homo sapiens cDNA FLJ43990 fis, clone TESTI4019566, weakly similar to Dosage compensation regulator）」, 未刊、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３２５】
TGFBIのヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_000358により同定される）は、例えば、Skonierら, 1992,「トランスフォーミング成長因子βによる処置後にヒト腺癌細胞株に誘導される新規遺伝子、β-ig-h3のcDNAクローニングと配列解析（cDNA cloning and sequence analysis of beta ig-h3, a novel gene induced in a human adenocarcinoma cell line after treatment with transforming growth factor-beta）」, DNA Cell Biol. 11 (7):511-522；Stoneら, 1994,「3つの常染色体優性角膜ジストロフィーは染色体5qにマップする（Three autosomal dominant corneal dystrophies map to chromosome 5q）」, Nat. Genet. 6 (1):47-51；Skonierら, 1994,「beta ig-h3：in vitroで細胞接着を阻害しかつヌードマウスのCHO細胞の増殖を抑制する分泌タンパク質をコードする、トランスフォーミング成長因子-β-応答遺伝子（beta ig-h3: a transforming growth factor-beta- responsive gene encoding a secreted protein that inhibits cell attachment in vitro and suppresses the growth of CHO cells in nude mice）」, DNA Cell Biol. 13 (6): 571-584に開示され、そしてTGFBIのアミノ酸配列（アクセッション番号NP_000349により同定される）は、例えば、Skonierら, 1992,「トランスフォーミング成長因子βによる処置後にヒト腺癌細胞株に誘導される新規遺伝子、β-ig-h3のcDNAクローニングと配列解析（cDNA cloning and sequence analysis of beta ig-h3, a novel gene induced in a human adenocarcinoma cell line after treatment with transforming growth factor-beta）」, DNA Cell Biol. 11 (7):511-522；Stoneら, 1994,「3つの常染色体優性角膜ジストロフィーは染色体5qにマップする（Three autosomal dominant corneal dystrophies map to chromosome 5q）」, Nat. Genet. 6 (1):47-51；Skonierら, 1994,「β-ig-h3：in vitroで細胞接着を阻害しかつヌードマウスのCHO細胞の増殖を抑制する分泌タンパク質をコードする、トランスフォーミング成長因子-β-応答遺伝子（beta ig-h3: a transforming growth factor-beta-responsive gene encoding a secreted protein that inhibits cell attachment in vitro and suppresses the growth of CHO cells in nude mice）」, DNA Cell Biol. 13: 571-584、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３２６】
TIFAのヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_052864により同定される）は、例えば、Kanamori, M.ら, 2002,「T2BP、新規TRAF2結合タンパク質は、TNF刺激なしにNF-κBおよびAP-1を活性化することができる（T2BP, a novel TRAF2 binding protein, can activate NF-kappaB and AP-1 without TNF stimulation）」, Biochem. Biophys. Res. Commun. 290 (3):1108-1113；Takatsuna, H.ら, 2003,「IL-1受容体シグナル伝達において腫瘍壊死因子受容体関連因子6（TRAF6）をインターロイキン-1（IL-1）受容体-関連キナーゼ-1（IRAK-I）に連結する、アダプタータンパク質としてのTIFAの同定（Identification of TIFA as an adapter protein that links tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 (TRAF6) to interleukin-1 (IL-1) receptor-associated kinase-1 (IRAK-I) in IL-1 receptor signaling）」, J. Biol. Chem. 278 (14):12144-12150；Matsudaら,2003,「NF-κBおよびMAPKシグナル伝達経路を活性化するヒト遺伝子の、大規模な同定と特徴付け（Large-scale identification and characterization of human genes that activate NF-kappaB and MAPK signaling pathways）」, Oncogene 22 (21):3307-3318に開示され、そしてTIFAのアミノ酸配列（アクセッション番号NP_443096により同定される）は、例えば、Kanamoriら, 2002,「T2BP、新規TRAF2結合タンパク質は、TNF刺激なしにNF-κBおよびAP-1を活性化することができる（T2BP, a novel TRAF2 binding protein, can activate NF-kappaB and AP-1 without TNF stimulation）」, Biochem. Biophys. Res. Commun. 290:1108-1113；Takatsunaら, 2003,「IL-1受容体シグナル伝達において腫瘍壊死因子受容体関連因子6（TRAF6）をインターロイキン-1（IL-1）受容体-関連キナーゼ-1（IRAK-I）に連結する、アダプタータンパク質としてのTIFAの同定（Identification of TIFA as an adapter protein that links tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 (TRAF6) to interleukin-1 (IL-1) receptor-associated kinase- 1 (IRAK-I) in IL-1 receptor signaling）」, J. Biol. Chem. 278 (14): 12144-12150；Matsuda et α/.,2003,「NF-κBおよびMAPKシグナル伝達経路を活性化するヒト遺伝子の、大規模な同定と特徴付け（Large-scale identification and characterization of human genes that activate NF-kappaB and MAPK signaling pathways）」, Oncogene 22 (21):3307-3318、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３２７】
メタロプロテイナーゼ1の組織インヒビター（TIMPl）のヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_003254により同定される）は、例えば、Domeijら, 2005,「ヒト歯肉繊維芽細胞と単球の共培養におけるMMP-IおよびTIMP-Iの細胞発現：ICAM-Iの関与（ell expression of MMP-I and TIMP-I in co-cultures of human gingival fibroblasts and monocytes: the involvement of ICAM-I）」, Biochem. Biophys. Res. Commun. 338, 1825-1833；Zureikら,「メタロプロテイナーゼ1の血清組織インヒビター（TIMP-I）と頚動脈アテローム性動脈硬化症および大動脈壁の硬化（Serum tissue inhibitors of metalloproteinases 1 (TIMP-I) and carotid atherosclerosis and aortic arterial stiffness", J. Hypertens. 23, 2263-2268；Crombez, 2005,「分泌タンパク質の高レベル産生：メタロプロテイナーゼ1のヒト組織インヒビターの例（High level production of secreted proteins: example of the human tissue inhibitor of metalloproteinases 1", Biochem. Biophys. Res. Commun. 337, 908-915 に開示され、そしてTIMPlのアミノ酸配列（アクセッション番号AAA75558により同定される）は、例えば、Hardcastleら, 1997,「ヒトTIMP-I遺伝子のゲノム組織：X染色体劣性網膜色素変性症の病理発生の原因となる役割の研究
（Genomic organization of the human TIMP-I gene. Investigation of a causative role in the pathogenesis of X-linked retinitis pigmentosa）」, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38, 1893-1896に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３２８】
TLR4のヌクレオチド配列（アクセッション番号AH009665により同定される）は、例えば、Arbour, N.C.ら, 1999, 直接投稿, Medicine, University of Iowa, 2182 Med Labs, Iowa City, IA 52242, USA；Arbour, N.C.ら, A Genetic Basis for a Blunted Response to Endotoxin in Humans, Arbour, N.C.ら, 未刊,「ヒトの内毒素に対する鈍い応答の遺伝的基礎（A Genetic Basis for a Blunted Response to Endotoxin in Humans"に開示され、そしてTLR4のアミノ酸配列（アクセッション番号AAF05316により同定される）は、例えば、Beutler, 1999, 直接投稿, Department of Internal Medicine, University of Texas Southwestern Medical Center and the Howard Hughes Medical Institute, 5323 Harry Hines Boulevard, Dallas, TX 75235-9050, USA；Smirnova, I.ら, 2000,「toll様受容体4遺伝子座（TLR4）における系統発生的変異および多型（Phylogenetic variation and polymorphism at the toll-like receptor 4 locus (TLR4)）」, Genome Biol. 1, res. 002.1-002.10、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３２９】
TNFRSF6のヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_152877により同定される）は、例えば、Oehm, A.ら, 1992,「APO-1細胞表面抗原、腫瘍壊死因子/神経成長因子受容体スーパーファミリーのメンバーの精製と分子クローニング：Fas 抗原との配列同一性（Purification and molecular cloning of the APO-1 cell surface antigen, a member of the tumor necrosis factor/nerve growth factor receptor superfamily. Sequence identity with the Fas antigen）」, J. Biol. Chem. 267 (15):10709-10715；Inazawa, J.ら, 1992,「ヒトFas抗原遺伝子（Fas）の10q24.1への割り当て（Assignment of the human Fas antigen gene  (Fas) to 10q24.1）」, Genomics 14 (3):821-822；Cheng, J.ら, 1994,「Fas分子の可溶型によるFas介在性アポトーシスからの保護（Protection from Fas- mediated apoptosis by a soluble form of the Fas molecule）」, Science 263 (5154):1759-1762に開示され、そしてTNFRSF6のアミノ酸配列（アクセッション番号NP_000034により同定される）は、例えば、Oehm, A.ら, 1992,「APO-1細胞表面抗原、腫瘍壊死因子/神経成長因子受容体スーパーファミリーのメンバーの精製と分子クローニング：Fas 抗原との配列同一性（Purification and molecular cloning of the APO-1 cell surface antigen, a member of the tumor necrosis factor/nerve growth factor receptor superfamily. Sequence identity with the Fas antigen）」, J. Biol. Chem. 267 (15):10709-10715；Inazawa, J.ら, 1992,「ヒトFas抗原遺伝子（Fas）の10q24.1への割り当て（Assignment of the human Fas antigen gene (Fas) to 10q24.1）」, Genomics 14 (3):821-822；Cheng, J. etal, 1994,「Fas分子の可溶型によるFas介在性アポトーシスからの保護（Protection from Fas-mediated apoptosis by a soluble form of the Fas molecule）」, Science 263 (5154): 1759-1762、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３３０】
TNFSF10のヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_003810により同定される）は、例えば、Wiley, S.R.ら, 1995,「アポトーシスを誘導するTNFファミリーの新しいメンバーの同定と特徴付け（Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosis）」, Immunity 3 (6):673-682；Pitti, R.M.ら, 1996,「Apo-2 リガンド、腫瘍壊死因子 サイトカイン ファミリーの新しいメンバーによるアポトーシスの誘導（Induction of apoptosis by Apo-2 ligand, a new member of the tumor necrosis factor cytokine family）」, J. Biol. Chem. 271 (22): 12687- 12690；Pan, G.ら, 1997,「細胞傷害性リガンドTRAILに対する受容体（The receptor for the cytotoxic ligand TRAIL）」, Science 276 (5309): 111-113に開示され、そしてTNFSF10のアミノ酸配列（アクセッション番号NP_003801により同定される）は、例えば、Wiley, S.R.ら, 1995,「アポトーシスを誘導するTNFファミリーの新しいメンバーの同定と特徴付け（Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosis）」, Immunity 3 (6):673-682；Pitti, R.M.ら, 1996,「Apo-2 リガンド、腫瘍壊死因子 サイトカイン ファミリーの新しいメンバーによるアポトーシスの誘導（Induction of apoptosis by Apo-2 ligand, a new member of the tumor necrosis factor cytokine family）」, J. Biol. Chem. 271 (22): 12687- 12690；Pan, G.ら, 1997,「細胞傷害性リガンドTRAILに対する受容体（The receptor for the cytotoxic ligand TRAIL）」, Science 276 (5309): 111-113、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３３１】
TNFSF13Bのヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_006573により同定される）は、例えば、Shu, H.B.ら, 1999,「TALL-1はマイトジェンによりダウンレギュレーションされるTNF ファミリーの新規メンバーである（TALL-1 is a novel member of the TNF family that is down-regulated by mitogens）」, J. Leukoc. Biol. 65 (5): 680-683；Mukhopadhyay, A.ら, 1999,「新規サイトカインTHANK、アポトーシス、核因子-κB、およびc-JunNH2-末端キナーゼを活性化するTNF相同体の同定と特徴付け（Identification and characterization of a novel cytokine, THANK, a TNF homologue that activates apoptosis, nuclear factor-kappaB, and c-Jun NH2-terminal kinase）」, J. Biol. Chem. 274 (23):15978-15981；Schneider, P.ら, 1999,「BAFF、B細胞増殖を刺激する腫瘍壊死因子ファミリーの新規のリガンド（BAFF, a novel ligand of the tumor necrosis factor family, stimulates B cell growth）」, J. Exp. Med. 189 (11):1747-1756に開示され、そしてTNFSF13Bのアミノ酸配列（アクセッション番号NP_006564により同定される）は、例えば、Shu, H.B.ら, 1999,「TALL-1はマイトジェンによりダウンレギュレーションされるTNF ファミリーの新規メンバーである（TALL-1 is a novel member of the TNF family that is down-regulated by mitogens）」, J. Leukoc. Biol. 65 (5): 680-683；Mukhopadhyay, A.ら, 1999,「新規サイトカインTHANK、アポトーシス、核因子-κB、およびc-JunNH2-末端キナーゼを活性化するTNF相同体の同定と特徴付け（Identification and characterization of a novel  cytokine, THANK, a TNF homologue that activates apoptosis, nuclear factor-kappaB, and c-JunNH2-terminal kinase）」, J. Biol. Chem. 274 (23):15978-15981；Schneider, P.ら, 1999,「BAFF、B細胞増殖を刺激する腫瘍壊死因子ファミリーの新規のリガンド（BAFF, a novel ligand of the tumor necrosis factor family, stimulates B cell growth）」, J. Exp. Med. 189 (11):1747-1756、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３３２】
VNN1のヌクレオチド配列（アクセッション番号NM_004666により同定される）は、例えば、Aurrand-Lions, M.ら, 1996,「Vanin-1、胸腺ホーミングに関わる新規GPI結合血管周囲分子（Vanin-1, a novel GPI-linked perivascular molecule involved in thymus homing）」, Immunity 5 (5):391-405；Galland, F.ら, 1998,「マウスvanin-1に関係する2つのヒト遺伝子はヒト染色体6の長腕に位置する（Two human genes related to murine vanin-1 are located on the long arm of human chromosome 6）」, Genomics 53 (2):203-213；Maras, B.ら, 1999,「パンテテイナーゼはマウスおよびヒトvanin-1タンパク質と実際に同一であるか？（Is pantetheinase the actual identity of mouse and human vanin-1 proteins?）」, FEBS Lett. 461 (3):149-152に開示され、そしてVNN1のアミノ酸配列（アクセッション番号NP_004657により同定される）は、例えば、Aurrand-Lions,M.ら, 1996,「Vanin-1、胸腺ホーミングに関わる新規GPI結合血管周囲分子（Vanin-1, a novel GPI-linked perivascular molecule involved in thymus homing）」, Immunity 5 (5):391-405；Galland, F.ら, 1998,「マウスvanin-1に関係する2つのヒト遺伝子はヒト染色体6の長腕に位置する（Two human genes related to murine vanin-1 are located on the long arm of human chromosome 6）」, Genomics 53 (2):203-213, Maras, B.ら, 1999,「パンテテイナーゼはマウスおよびヒトvanin-1タンパク質と実際に同一であるか？（Is pantetheinase the actual identity of mouse and human vanin-1 proteins?）」, FEBS Lett. 461 (3): 149-152、に開示されている（これらはそれぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）。
【０３３３】
5.11.2  本発明の実施形態によるバイオマーカーの例示の組合わせ
いくつかの実施形態において、第5.2節および第5.3節にそれぞれ記載または参照した方法またはキットは、表Iから選択される少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50またはそれ以上のバイオマーカーを使用し、その場合、それぞれのかかるバイオマーカーが表Iで「N」呼称または「P」呼称を有するかどうかを問わない。いくつかの限定するものでない例示の実施形態においては、2〜53、3〜40、4〜30、または5〜20のかかるバイオマーカーを使用する。
【０３３４】
核酸に基づくキットおよび方法
いくつかの実施形態において、第5.2節および第5.3節にそれぞれ記載または参照した方法またはキットは、表Jから選択される少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40またはそれ以上のバイオマーカーを使用する。典型的には、これらの実施形態において、それぞれのバイオマーカーは核酸（例えば、cDNAまたは増幅DNAなどの、DNA、またはmRNAなどの、RNA）、または核酸の判別分子または判別断片である。いくつかの限定するものでない例示の実施形態においては、2〜44、3〜35、4〜25、または5〜20のかかるバイオマーカーを使用する。
【０３３５】
タンパク質またはペプチドに基づくキットおよび方法
いくつかの実施形態において、第5.2節および第5.3節にそれぞれ記載または参照した方法またはキットは、表Kから選択される少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10のバイオマーカーを使用する。典型的には、かかるバイオマーカーはペプチドに基づく（例えば、ペプチド、全長タンパク質など）か、または以上の判別分子または判別断片である。いくつかの実施形態において、キット中のバイオマーカーは表Kに掲げられた2種類以上のバイオマーカーに対する特異的抗体である。いくつかの限定するものでない例示の実施形態においては、2〜10、3〜10、4〜10、または 5〜10のかかるバイオマーカーを使用する。
【０３３６】
均一なキットおよび方法
いくつかの実施形態において、第5.2節および第5.3節にそれぞれ記載または参照した方法またはキット中のそれぞれのバイオマーカーは、表Iから選択される少なくとも2種類以上のバイオマーカーを使用し、その場合、かかる方法またはキットで使用されるそれぞれのバイオマーカーは同じ物理形状である。かかる実施形態による1つの例において、第5.2節および第5.3節による方法またはキット中のそれぞれのバイオマーカーは、それぞれ、表Iから選択されるバイオマーカーでありかつ前記方法またはキット中の核酸または核酸の判別分子である。かかる実施形態による他の例において、第5.2節および第5.3節による方法またはキット中のそれぞれのバイオマーカーは、それぞれ、表Iから選択されるバイオマーカーでありかつペプチドに基づく（例えば、ペプチド、全長タンパク質など）かまたは前記の判別分子である。これらの実施形態において、バイオマーカーは、それぞれが表Iで「N」または「P」呼称を有するかどうかに関係なく選択される。従って、これらの実施形態によるキットは、バイオマーカーが表Iで「P」呼称を有する時でも、核酸型のバイオマーカーを含むことができる。対応して、この実施形態によるキットは、バイオマーカーが表Iで「N」呼称を有する時でも、ペプチド型のバイオマーカーを含むことができる。
【０３３７】
不均一なキットおよび方法
いくつかの実施形態においては、第5.2節および第5.3節にそれぞれ記載または参照された方法およびキットにおいて、それぞれのバイオマーカーは、表Iから選択される少なくとも2種類以上のバイオマーカーを使用し、その場合、それぞれのかかるバイオマーカーは以下の第6.11節〜第6.13節で同定された時にバイオマーカーが有したのと同じ物理形状である。言い換えれば、もしバイオマーカーが表Iで「N」呼称を有すれば、バイオマーカーの核酸型が、本発明のこの実施形態による第5.2節および第5.3節にそれぞれ記載または参照された方法およびキットで使用される。もしバイオマーカーが表Iで「P」呼称を有すれば、バイオマーカーのペプチド型が、本発明のこの実施形態による第5.2節および第5.3節にそれぞれ記載または参照された方法およびキットで使用される。さらに、かかる方法またはキットにおいて、表Iに少なくとも1つの「N」呼称を有するバイオマーカーおよび少なくとも1つの「P」呼称を有するバイオマーカーが使用される。かかる実施形態において、表IでN呼称を有するバイオマーカーは核酸であり、そして表IでP呼称を有するバイオマーカーはペプチドに基づくかまたはタンパク質に基づく。
【０３３８】
かかる混合された実施形態による、限定するものでない例示のキットは、表Jに掲げられたバイオマーカーの中から核酸型の2つのバイオマーカー、および表Kに掲げられたバイオマーカーの中からペプチド型の3のバイオマーカーを使用する。いくつかの実施形態において、第5.2節および第5.3節でそれぞれ記載または参照された、限定するものでない方法およびキットは、それぞれ少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40種類またはそれ以上の表Jからの核酸型のバイオマーカー、および表Kからのペプチドに基づいてまたはタンパク質に基づいた型の1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10のバイオマーカーを使用する。
【０３３９】
さらなるキットおよび方法
いくつかの実施形態において、第5.2節および第5.3節でそれぞれ記載または参照された方法およびキットのバイオマーカーは、それぞれ、表Iから選択される少なくとも1つのバイオマーカーおよび表31からの少なくとも1つの異なるバイオマーカーを使用する。いくつかの実施形態において、第5.2節および第5.3節でそれぞれ記載または参照された方法およびキットのバイオマーカーは、それぞれ、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10の表Iから選択されるバイオマーカーおよび少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10の異なる表31からの選択されるバイオマーカーを使用する。
【０３４０】
いくつかの実施形態において、第5.2節および第5.3節でそれぞれ記載または参照された方法およびキットのバイオマーカーは、それぞれ、少なくとも1つの、表Jから選択される核酸型のバイオマーカーおよび少なくとも1つの、表31からの異なるバイオマーカーを使用する。いくつかの実施形態において、第5.2節および第5.3節でそれぞれ記載または参照された方法およびキットのバイオマーカーは、それぞれ、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10の表Iから選択されるそれぞれ核酸型のバイオマーカー、および少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10の表31からの異なるバイオマーカーを使用する。
【０３４１】
いくつかの実施形態において、第5.2節および第5.3節でそれぞれ記載または参照された方法およびキットのバイオマーカーは、それぞれ、少なくとも1つの、表Kから選択されるタンパク質型のバイオマーカー、および少なくとも1つの、表31からの異なるバイオマーカーを使用する。いくつかの実施形態において、第5.2節および第5.3節でそれぞれ記載または参照された方法およびキットのバイオマーカーは、それぞれ、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10の表Iから選択されるそれぞれタンパク質型のバイオマーカー、および少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10の表31からの異なるバイオマーカーを使用する。
【０３４２】
いくつかの実施形態において、第5.2節および第5.3節でそれぞれ記載または参照された方法およびキットのバイオマーカーは、それぞれ、表Jに掲げられた少なくとも1つの核酸型のバイオマーカーから、および表Kに掲げられた少なくとも1つのタンパク質型のバイオマーカーからを使用する。いくつかの実施形態において、限定するものでない第5.2節および第5.3節でそれぞれ記載または参照された方法およびキットは、use少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40またはそれ以上の表Jからの核酸型のバイオマーカー、および1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10の表Kからのタンパク質型のバイオマーカーを使用する。
【０３４３】
いくつかの実施形態においては、前記バイオマーカーの組合わせのいずれかを第5.2節および第5.3節による方法またはキットにおいて使用するが、例外として、IL-6、IL-8、MMP9、B2M、HLA-DRA、およびMCPlバイオマーカーをかかる方法またはキットに使用しない。例えば、ある特定の単球を全血から単離しかつ試験する実施形態において、とりわけ、かかるバイオマーカーが核酸であるとき、かかるバイオマーカーを利用しない。いくつかの実施形態において、前記バイオマーカーの組合わせのいずれかを第5.2節および第5.3節による方法またはキットにおいて使用するが、例外として、IL-6、IL-8、IL-10、およびCRPタンパク質バイオマーカーをかかる方法またはキットに使用しない。いくつかの実施形態において、前記バイオマーカーの組合わせのいずれかを第5.2節および第5.3節による方法またはキットにおいて使用するが、例外として、IL-6、IL-8、IL-10、およびCRP核酸バイオマーカーをかかる方法またはキットに使用しない。いくつかの実施形態において、前記バイオマーカーの組合わせのいずれかを第5.2節および第5.3節による方法またはキットにおいて使用するが、例外として、IL-6およびMAPKバイオマーカーをかかる方法またはキットに使用しない。いくつかの実施形態において、前記バイオマーカーの組合わせのいずれかを第5.2節および第5.3節による方法またはキットにおいて使用するが、例外として、IL-6、IL-8、およびIL-10バイオマーカーをかかる方法またはキットに使用しない。いくつかの実施形態において、前記バイオマーカーの組合わせのいずれかを第5.2節および第5.3節による方法またはキットにおいて使用するが、例外として、CD86、IL-6、IL-8、IL-10、およびCRPバイオマーカーをかかる方法またはキットに使用しない。いくつかの実施形態において、前記バイオマーカーの組合わせのいずれかを第5.2節および第5.3節による方法またはキットにおいて使用するが、例外として、IL-6およびIL-10バイオマーカーをかかる方法またはキットに使用しない。いくつかの実施形態において、前記バイオマーカーの組合わせのいずれかを第5.2節および第5.3節による方法またはキットにおいて使用するが、例外として、IL-6およびCRPバイオマーカーをかかる方法またはキットに使用しない。いくつかの実施形態において、前記バイオマーカーの組合わせのいずれかを第5.2節および第5.3節による方法またはキットにおいて使用するが、例外として、CRPバイオマーカーをかかる方法またはキットに使用しない。いくつかの実施形態において、前記バイオマーカーの組合わせのいずれかを第5.2節および第5.3節による方法またはキットにおいて使用するが、例外として、IL-8バイオマーカーをかかる方法またはキットに使用しない。いくつかの実施形態において、前記バイオマーカーの組合わせのいずれかを第5.2節および第5.3節による方法またはキットにおいて使用するが、例外として、B2Mバイオマーカーをかかる方法またはキットに使用しない。
【０３４４】
5.11.3  本発明の実施形態による例示のバイオマーカーのサブ組合せ
いくつかの実施形態において、第5.2節および第5.3節にそれぞれ記載または参照した方法またはキットは、表Lに掲げられたバイオマーカーセットのいずれか1つを使用する。表Lに掲げられたバイオマーカーセットは、下記の第6.14.1節に記載の、表Jに掲げられたバイオマーカーの4600回のランダムなサブ組合わせを試験する計算実験で同定されたものである。下記の表Lは、第6.14.1節に記載の検証集団に対して高精度スコアを与えたバイオマーカーのいくつかを掲げる。表Lのそれぞれの行は第5.2節および第5.3節にそれぞれ参照された方法およびキットで使用しうる単一のバイオマーカーセットを掲げる。言い換えれば、表Lの各行は、敗血症とSIRS被験者の間を判別する（例えば、被験者がおそらく敗血症になるかどうかを決定する）ために利用しうるバイオマーカーを記載する。いくつかの実施形態において、表Lのバイオマーカーセットに掲げられたバイオマーカーの核酸型は第5.2節および第5.3節にそれぞれ参照された方法およびキットに使用される。いくつかの実施形態において、表Lのバイオマーカーセットに掲げられたバイオマーカーのタンパク質型は第2節および第5.3節にそれぞれ参照された方法およびキットに使用される。いくつかのハイブリッド実施形態において、第5.2節および第5.3節にそれぞれ参照された方法およびキット中で、表Lに掲げられたバイオマーカーセットのバイオマーカーのいくつかはタンパク質型でありかつ表Lからの同じバイオマーカーセットのバイオマーカーのいくつかは核酸型である。
【０３４５】
いくつかの実施形態において、所与の表Lに掲げられたバイオマーカーセットは、1、2、3、4、5、6、7、8、または９またはそれ以上の、表Iに掲げられた（表Lからのバイオマーカーの所与のセット内に存在しない）さらなるバイオマーカーを加えて使用される。いくつかの実施形態において、所与の表Lに掲げられたバイオマーカーセットは、表I、30、31、32、33、34、または36のいずれか1つからの1、2、3、4、5、6、7、8、または9またはそれ以上の（表Lからのバイオマーカーの所与のセット内に存在しない）さらなるバイオマーカーを加えて使用される。表Lには、精度、特異性および感度が、下記第6.14.1節に記載のT-12時点データを参照して記載されている。
表L
2008538007.tif 000042
2008538007.tif 000043
2008538007.tif 000044
2008538007.tif 000045
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2008538007.tif 000050
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2008538007.tif 000062
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2008538007.tif 000077
2008538007.tif 000078
【０３４６】
いくつかの実施形態において、第5.2節および第5.3節にそれぞれ記載または参照した方法またはキットは、表Mに掲げられたバイオマーカーセットのいずれか1つを使用する。表Mに掲げられたバイオマーカーセットは、下記の第6.14.2節に記載の、表Kに掲げられたバイオマーカーの1600回のランダムなサブ組合わせを試験する計算実験で同定されたものである。表Mは第6.14.2節に記載の検証集団に対して高精度スコアを与えたバイオマーカーのいくつかを掲げる。表Mのそれぞれの行は第5.2節および第5.3節にそれぞれ参照された方法およびキットで使用しうる単一のバイオマーカーセットを掲げる。言い換えれば、表Mの各行は、敗血症とSIRS被験者の間を判別する（例えば、被験者がおそらく敗血症になるかどうかを決定する）ために利用しうるバイオマーカーを記載する。いくつかの実施形態においては、表Mのバイオマーカーセットに掲げられたバイオマーカーの核酸型が第5.2節および第5.3節にそれぞれ参照された方法およびキットに使用される。いくつかの実施形態においては、表Mのバイオマーカーセットに掲げられたバイオマーカーのタンパク質型が使用される。いくつかのハイブリッド実施形態において、第5.2節および第5.3節にそれぞれ参照された方法およびキット中で、表Mに掲げられたバイオマーカーセットのバイオマーカーのいくつかはタンパク質型でありかつ表Mからの同じバイオマーカーセットのバイオマーカーのいくつかは核酸型である。
【０３４７】
いくつかの実施形態において、所与の表Mに掲げられたバイオマーカーセットは、1、2、3、4、5、6、7、8、または９またはそれ以上の、表Iからの（表Mからのバイオマーカーの所与のセット内に存在しない）さらなるバイオマーカーを加えて使用される。いくつかの実施形態において、所与の表Mからのバイオマーカーセットは、表I、30、31、32、33、34、または36のいずれか1つからの1、2、3、4、5、6、7、8、または9またはそれ以上の（表Mからのバイオマーカーの所与のセット内に存在しない）さらなるバイオマーカーを加えて使用される。表Mには、精度、特異性および感度が、下記第6.14.2節に記載のT-12時点データを参照して記載されている。
表M
2008538007.tif 000079
2008538007.tif 000080
2008538007.tif 000081
2008538007.tif 000082
2008538007.tif 000083
2008538007.tif 000084
【０３４８】
いくつかの実施形態において、第5.2節および第5.3節にそれぞれ記載または参照した方法またはキットは、表Nに掲げられたバイオマーカーのサブセットのいずれか1つを使用する。表Nに掲げられたバイオマーカーのサブセットは、下記の第6.14.5節に記載の、表Iに掲げられたバイオマーカーの4600回のランダムなサブ組合わせを試験する計算実験で同定されたものである。表Nは第6.14.5節に記載の検証集団に対して高精度スコアを与えたバイオマーカーのいくつかを掲げる。表Nのそれぞれの行は第5.2節および第5.3節にそれぞれ参照された方法およびキットで使用しうる単一のバイオマーカーのセットを掲げる。言い換えれば、表Nの各行は、敗血症とSIRS被験者の間を判別するために利用しうるバイオマーカーのセットを記載する。いくつかの実施形態においては、表Nのバイオマーカーセットに掲げられたバイオマーカーの核酸型が第5.2節および第5.3節にそれぞれ参照された方法およびキットに使用される。いくつかの実施形態においては、表Nのバイオマーカーセットに掲げられたバイオマーカーのタンパク質型が使用される。いくつかの実施形態において、第5.2節および第5.3節にそれぞれ参照された方法およびキット中で、表Nに掲げられたバイオマーカーセットのバイオマーカーのいくつかはタンパク質型でありかつ表Nからの同じバイオマーカーセットのバイオマーカーのいくつかは核酸型である。
【０３４９】
いくつかの実施形態において、所与の表Nに掲げられたバイオマーカーセットは、1、2、3、4、5、6、7、8、または９またはそれ以上の、表30、31、32、33、34、または36からの（表Nからのバイオマーカーの所与のセット内に存在しない）さらなるバイオマーカーを加えて使用される。いくつかの実施形態において、所与の表Mからのバイオマーカーセットは、表30、31、32、33、34、または36のいずれか1つからの（表Nからのバイオマーカーの所与のセット内に存在しない）1、2、3、4、5、6、7、8、または9またはそれ以上のさらなるバイオマーカーを加えて使用される。表Nには、精度、特異性および感度が、下記第6.14.5節に記載のT-12時点データを参照して記載されている。
【０３５０】
ここから出発する
表Ｎ
2008538007.tif 000085
2008538007.tif 000086
2008538007.tif 000087
2008538007.tif 000088
2008538007.tif 000089
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2008538007.tif 000091
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2008538007.tif 000093
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2008538007.tif 000095
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2008538007.tif 000100
2008538007.tif 000101
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2008538007.tif 000107
2008538007.tif 000108
【０３５１】
いくつかの実施形態において、第5.2節および第5.3節にそれぞれ記載または参照した方法またはキットは、表Oに掲げられたバイオマーカーのサブセットのいずれか1つを使用する。表Oに掲げられたバイオマーカーのサブセットは、下記の第6.14.5節に記載の、表Iに掲げられたバイオマーカーの4600回のランダムなサブ組合わせを試験する計算実験で同定されたものである。表Oは第6.14.5節に記載の検証集団に対して高精度スコアを与えたバイオマーカーのいくつかを掲げる。表Oのそれぞれの行は第5.2節および第5.3節にそれぞれ参照された方法およびキットで使用しうる単一のバイオマーカーのセットを掲げる。言い換えれば、表Oの各行は、敗血症とSIRS被験者の間を判別するために利用しうるバイオマーカーのセットを記載する。いくつかの実施形態においては、表Oのバイオマーカーセットに掲げられたバイオマーカーの核酸型が第5.2節および第5.3節にそれぞれ参照された方法およびキットに使用される。いくつかの実施形態においては、表Oのバイオマーカーセットに掲げられたバイオマーカーのタンパク質型が使用される。いくつかの実施形態において、第5.2節および第5.3節にそれぞれ参照された方法およびキット中で、表Oに掲げられたバイオマーカーセットのバイオマーカーのいくつかはタンパク質型でありかつ表Oからの同じバイオマーカーセットのバイオマーカーのいくつかは核酸型である。
【０３５２】
いくつかの実施形態において、所与の表Oに掲げられたバイオマーカーセットは、1、2、3、4、5、6、7、8、または９またはそれ以上の、表30、31、32、33、34、または36からの（表Oからのバイオマーカーの所与のセット内に存在しない）さらなるバイオマーカーを加えて使用される。いくつかの実施形態において、所与の表Mからのバイオマーカーセットは、表30、31、32、33、34、または36のいずれか1つからの（表Nからのバイオマーカーの所与のセット内に存在しない）1、2、3、4、5、6、7、8、または9またはそれ以上のさらなるバイオマーカーを加えて使用される。表Oには、精度、特異性および感度が、下記第6.14.6節に記載のT-36時点データを参照して記載されている。
表Ｏ
2008538007.tif 000109
2008538007.tif 000110
2008538007.tif 000111
2008538007.tif 000112
2008538007.tif 000113
2008538007.tif 000114
【０３５３】
いくつかの実施形態において、第5.2節および第5.3節にそれぞれ記載または参照した方法またはキットは、図6、14、17、または26のいずれか1つに掲げられたプローブセットをそれぞれ含有する少なくとも2つの異なるバイオマーカーを使用する。
【０３５４】
特別な実施形態において、バイオマーカープロファイルは、図6、14、17、または26のいずれか1つに掲げられたプローブセットをそれぞれ含有する少なくとも2つのバイオマーカー、図6、14、17、または26のいずれか1つのプローブセットの1つの補体を含有するバイオマーカー、または図6、14、17、または26のいずれか1つのプローブセットの1つ、もしくは図6、14、17、または26のいずれか1つのプローブセットの1つの補体を含有する遺伝子によりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ含有するバイオマーカーを含む。かかるバイオマーカーは、例えば、mRNA転写物、cDNAまたはいくつかの他の核酸、例えば、増幅された核酸、またはタンパク質であってもよい。バイオマーカープロファイルはさらに、少なくとも2つのバイオマーカーにそれぞれ対応する特性を含む。一般に、少なくとも2 バイオマーカーは少なくとも2つの異なる遺伝子由来である。バイオマーカーが図 6、14、17、または 26のいずれか1つに掲げられたプローブセットの配列を含む遺伝子に基づく場合、そのバイオマーカーは、例えば、遺伝子により作られた転写物、その補体、または判別断片もしくはその補体、またはそのcDNA、またはそのcDNAの判別断片、または転写物またはその補体の全てまたは部分に対応する判別する増幅された核酸分子、またはその遺伝子によりコードされるタンパク質、またはそのタンパク質の判別断片、以上のいずれかの表示であってもよい。さらになお、そのバイオマーカーは、例えば、図6、14、17、または26のいずれか1つに記載のプローブセット配列を含む遺伝子によりコードされるタンパク質、またはそのタンパク質の判別断片、または以上のいずれかの表示であってもよい。ここで、判別分子または断片は、検出されると、以上に同定された転写物、cDNA、増幅された核酸、またはタンパク質の存在または存在量を示すことを特徴とする分子または断片である。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは、図6、14、17、または26のいずれか1つに掲げられたプローブセットをそれぞれ含有する、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10の異なるバイオマーカーを含む。
【０３５５】
いくつかの実施形態において、第5.2節および第5.3節にそれぞれ記載または参照した方法またはキットは、図 39、43、52、53、または56のいずれか1つに掲げられた少なくとも2つのバイオマーカーを使用する。特別な実施形態において、バイオマーカープロファイルは、図39、43、52、53、または56のいずれか1つに掲げられた少なくとも2つのバイオマーカーを含む。バイオマーカープロファイルはさらに、少なくとも2つのバイオマーカーにそれぞれ対応する特性を含む。一般に、少なくとも2 バイオマーカーは少なくとも2つの異なる遺伝子由来である。少なくとも2つのバイオマーカーのうちの1つのバイオマーカーが図39、43、52、53、または56のいずれか1つに掲げられている場合、そのバイオマーカーは、例えば、遺伝子により作られた転写物、その補体、または判別断片もしくはその補体、またはそのcDNA、またはそのcDNAの判別断片、または転写物またはその補体の全てまたは部分に対応する判別する増幅された核酸分子、またはその遺伝子によりコードされるタンパク質、またはそのタンパク質の判別断片、以上のいずれかの表示であってもよい。さらになお、そのバイオマーカーは、例えば、図39、43、52、53、または56のいずれか1つに掲げられた遺伝子によりコードされるタンパク質、またはそのタンパク質の判別断片、または以上のいずれかの表示であってもよい。ここで、判別分子または断片は、検出されると、以上に同定された転写物、cDNA、増幅された核酸、またはタンパク質の存在または存在量を示すことを特徴とする分子または断片である。この実施形態によって、本発明のバイオマーカープロファイルは、バイオマーカーを検出するための、当業者に公知の標準アッセイを用いて、または本明細書に記載のアッセイで得ることができる。かかるアッセイは、例えば、特別な遺伝子または目的の遺伝子（例えば、表30に開示された遺伝子）の対立遺伝子の発現産物（例えば、核酸および／またはタンパク質）を検出することができる。一実施形態においては、かかるアッセイは核酸マイクロアレイを利用する。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは図39、43、52、53、または56のいずれかからの少なくとも2つのバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは図39、43、52、53、または56のいずれかからの少なくとも2つの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20の異なるバイオマーカーを含む。
【０３５６】
いくつかの実施形態において、第5.2節および第5.3節にそれぞれ記載または参照した方法またはキットは、表Pに掲げられたプローブセットコレクションのいずれか1つからのプローブを含有する特定のバイオマーカーを使用する。特別な実施形態において、バイオマーカープロファイルは、表Pのプローブセットコレクションのいずれか1つに掲げられたプローブセットのいずれか1つをそれぞれ含有する少なくとも2つのバイオマーカー、表Pのプローブセットコレクションのいずれか1つからのプローブセットの1つの補体をそれぞれ含有するバイオマーカー、または表Pのプローブセットコレクションのいずれか1つからのプローブセットの1つ、もしくは表Pのプローブセットコレクションのいずれか1つからのプローブセットの1つの補体を含有する遺伝子によりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ含有するバイオマーカーを含む。かかるバイオマーカーは、例えば、mRNA転写物、cDNAまたはいくつかの他の核酸、例えば、増幅された核酸、またはタンパク質であってもよい。バイオマーカープロファイルはさらに、少なくとも2つのバイオマーカーにそれぞれ対応する特性を含む。一般に、少なくとも2 バイオマーカーは少なくとも2つの異なる遺伝子由来である。バイオマーカーが表Pのプローブセットコレクションのいずれか1つに掲げられたプローブセットの配列を含む遺伝子に基づく場合、そのバイオマーカーは、例えば、遺伝子により作られた転写物、その補体、または判別断片もしくはその補体、またはそのcDNA、またはそのcDNAの判別断片、または転写物またはその補体の全てまたは部分に対応する判別する増幅された核酸分子、またはその遺伝子によりコードされるタンパク質、またはそのタンパク質の判別断片、以上のいずれかの表示であってもよい。さらになお、そのバイオマーカーは、例えば、表Pに掲げられたプローブセットコレクションのいずれか1つからのプローブセット配列を含む遺伝子によりコードされるタンパク質、またはそのタンパク質の判別断片、または以上のいずれかの表示であってもよい。ここで、判別分子または断片は、検出されると、以上に同定された転写物、cDNA、増幅された核酸、またはタンパク質の存在または存在量を示すことを特徴とする分子または断片である。いくつかの実施形態において、バイオマーカープロファイルは表Pに掲げられたプローブセットコレクションのいずれか1つからのプローブセットをそれぞれ含有する、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10の異なるバイオマーカーを含む。
表Ｐ
2008538007.tif 000115
【０３５７】
いくつかの実施形態において、第5.2節および第5.3節にそれぞれ記載または参照した方法またはキットは、少なくとも2つの、表Qのバイオマーカーセットのいずれか1つに掲げられたバイオマーカーを使用する。特別な実施形態において、バイオマーカープロファイルは、少なくとも2つの、表Qのバイオマーカーセットのいずれか1つに掲げられたバイオマーカーを含む。バイオマーカープロファイルはさらに、少なくとも2つのバイオマーカーにそれぞれ対応する特性を含む。一般に、少なくとも2 バイオマーカーは少なくとも2つの異なる遺伝子由来である。少なくとも2つのバイオマーカーのうちの1つのバイオマーカーが表Qのバイオマーカーセットのいずれか1つに掲げられている場合、そのバイオマーカーは、例えば、遺伝子により作られた転写物、その補体、または判別断片もしくはその補体、またはそのcDNA、またはそのcDNAの判別断片、または転写物またはその補体の全てまたは部分に対応する判別する増幅された核酸分子、またはその遺伝子によりコードされるタンパク質、またはそのタンパク質の判別断片、以上のいずれかの表示であってもよい。さらになお、そのバイオマーカーは、例えば、表Qのバイオマーカーセットのいずれか1つに掲げられた遺伝子によりコードされるタンパク質、またはそのタンパク質の判別断片、または以上のいずれかの表示であってもよい。ここで、判別分子または断片は、検出されると、以上に同定された転写物、cDNA、増幅された核酸、またはタンパク質の存在または存在量を示すことを特徴とする分子または断片である。この実施形態によって、本発明のバイオマーカープロファイルは、バイオマーカーを検出するための、当業者に公知の標準アッセイを用いて、または本明細書に記載のアッセイで得ることができる。かかるアッセイは、例えば、特別な遺伝子または目的の遺伝子（例えば、表Qのバイオマーカーセットのいずれか1つに開示された遺伝子）の対立遺伝子の発現産物（例えば、核酸および／またはタンパク質）を検出することができる。一実施形態においては、かかるアッセイは核酸マイクロアレイを利用する。いくつかの実施形態において、表Qのバイオマーカーセットのいずれか1つからの少なくとも2つもしくは3つのバイオマーカーを含むバイオマーカープロファイルを使用する。
表Ｑ
2008538007.tif 000116
【実施例】
【０３５８】
6.  実施例
以下の実施例は本発明に包含される実施形態の代表的なものであって、決して本発明により包含される被験者を限定するものではない。以下の実施例において、データは被験者集団中のそれぞれの被験者から24時間間隔に収集された。集団は2つの被験者型を含んだ。第1の被験者型は、分析の最終時点においてSIRSを有しかつ敗血症を発症した被験者であった。第2の被験者型は、分析の最終時点においてSIRSを有しかつ敗血症を発症しなかった被験者であった。最初にSIRSを有しかつ敗血症を発症した被験者に対して、T-12時点は臨床的に診断された敗血症の発症直前の時間枠として規定した。実際には、それぞれの敗血症被験者に対するT-12時点は、敗血症と診断される前にそれぞれの被験者から最後の血液サンプルを採集した日であった。
【０３５９】
それぞれの時点に対して、2つの型の分析、すなわち静的分析および基線分析を実施した。静的分析においては、単時点からのデータだけを考慮した。特に、一変量および／または多変量技法を用いて、U133 plus 2.0（Affymetrix、Santa Clara、California）の対応するマイクロアレイプローブセット上のその存在量が、研究期間中に敗血症を発症する被験者と敗血症を発症しない被験者の間を判別するバイオマーカーを同定した。説明のために、集団中に、時点T-12後に間もなく敗血症を発症する被験者Aと観察したいずれの時点でも敗血症を発症しない被験者Bの2被験者がいる場合を考えよう。静的分析において、U133 plus 2.0マイクロアレイ実験により測定した2被験者中で異なる存在量レベルを有するバイオマーカーを同定する目的で、ある特定の単時点に採集した2被験者からのマイクロアレイバイオマーカー存在量データを評価した。実際に、本発明の実施例において、A型とB型の被験者の全集団を評価し、そしてパラメトリックおよび／またはノンパラメトリック統計技法を用いて、その存在量レベルが観察期間中のある時点で敗血症を発症する被験者と観察期間中に敗血症を発症しない被験者の間を判別するバイオマーカーを同定した。ここで、観察期間は、時間、日数、または週のうちの時点を意味する。
【０３６０】
静的分析に加えて、以下の実施例では基線解析を実施した。基線分析においては、単一時点における対応する特性（例えば、存在量値）が敗血症被験者（観察期間中のある時点で敗血症を発症する被験者）と観察時間枠内に敗血症を発症しない被験者の間を判別するバイオマーカーを同定するよりむしろ、2以上の時点にわたるバイオマーカーの存在量値の変化が2つの集団型の間を判別するバイオマーカーを同定した。例えば、時点T-12後に間もなく敗血症を発症する被験者Aと観察したいずれの時点でも敗血症を発症しない被験者Bとを、再び考えてみよう。基線分析において必要としたのは、2つの異なる時点（例えば、時点1および時点2）からのそれぞれの被験者に対するバイオマーカー存在量値である。考察されるそれぞれのバイオマーカーに対して、2つの異なる時点におけるバイオマーカーの存在量の差を計算した。次いで、被験者のそれぞれからのこれらの存在量の差を用いて、2つの異なる時点の間に発現される、どちらの対応するバイオマーカーが、観察期間中に敗血症を発症する被験者と観察期間中に敗血症を発症しない被験者の間を判別するかを決定する。
【０３６１】
6.1  データ収集
ICUに入院したSIRS陽性被験者を本研究に募集した。被験者は18歳齢以上でかつ研究プロトコルの説明を行いそれに応じる同意を得た。被験者が：(i)妊娠している、(ii)被疑感染を治療するための抗生物質の摂取している、(iii)全身コルチコステロイドを（研究に入る前の過去48時間に、100mgを超える全投与量のヒドロコルチゾンまたはそれに相当するものを）摂取している、(iv)高用量のコルチコステロイド療法を必要とする脊椎損傷または他の疾病を有する、(v)薬理学的に（例えば、アザチオプリン、メトトレキセート、シクロスポリン、タクロリムス、シクロホスファミド、エタネルセプト、アナキンラ、インフリキシマブ、ロイフロナミド（leuflonamide）、ミコフェノール酸、OKT3、ペントキシフィリン、などで）免疫抑制の状態である、(vi)器官移植片レシピエントであった、(vii)活性なまたは転移性癌を有した、(viii)登録前8週間内に化学療法または照射療法を受けた、および／または(ix)登録前30日以内に研究用薬物を摂取していれば、研究から排除した。
【０３６２】
研究中、SIRS判定基準は毎日評価した。APACHE IIおよびSOFAスコア付けをICU承認後に実施した。APACHE IIは疾病の重篤度の評点である。APACHEは「急性生理および長期健康評価」の評価であり、集中治療室の患者に対する病院死を予測するために最も多く使われている。例えば、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Guptaら, 2004、Indian Journal of Medical Research 119、273-282を参照されたい。SOFAは敗血症の重篤度を測定する試験である。例えば、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Vincentら, 1996、Intensive Care Med. 22、707-710を参照されたい。患者を2週間まで、限定されるものでないが、次の徴候および症候群のいずれかを含む敗血症の臨床的疑いについて毎日モニタリングした：
・肺炎：温度>38.3℃または<36℃＋白血球数（WBC）>12,000/mm3または<4,000/mm3＋化膿性痰の新発症＋新しいまたは進行性胸部X線像における浸潤（4のうちの3所見）；
・創傷感染：温度>38.3℃または<36℃＋疼痛＋紅斑＋化膿性漏出（4のうち3の所見）；
・尿路感染：温度>38.3℃またはWBC>12,000/mm3または<4,000/mm3＋細菌尿および膿尿症（>10WBC/hpfまたは陽性白血球エステラーゼ）（全所見）；
・カテーテル敗血症：温度>38.3℃または<36℃＋カテーテル出口部位における紅斑／疼痛／化膿（熱を含む、4のうちの3所見）；
・腹腔内膿瘍：温度>38.3℃または<36℃＋WBC>12,000/mm3または<4,000/mm3＋体液採集物のX線撮影確証（3のうちの2判定基準）；
・CNS感染：温度>38.3℃または<36℃＋WBC>12,000/mm3または<4,000/mm3＋LPまたは心室排液法を介するCSF髄液細胞増加症。
【０３６３】
採血は、研究に入った後、24時間以内に開始し、少なくとも4連続日にわたって毎日実施した。患者をフォローし、血液サンプルを毎日、感染の臨床的疑いが起こらなければ最大14連続日間採取した。いずれの一被験者からの採血の最大体積も、14日研究のコースにわたって最大210mLを超えることはなかった。血液損失が、患者に対して医師の判断により定められたリスクを伴えば、研究用の採血は中止した。それぞれの患者から2つのPaxgene（RNA）チューブを毎日採取した。1つのチューブは第6.2節に記載のマイクロアレイ分析用に使用した。他のチューブは第6.10節に記載のRT-PCR分析用に使用した。
【０３６４】
6.2  マイクロアレイ分析
RNAを第6.1節に記載のそれぞれの血液サンプルから抽出し、標識し、逆転写して、標識されたcDNAを作製し、そして標識されたcDNAを、54,675のプローブセットを含有するAffymetrix（Santa Clara、California）U133 plus 2.0ヒトゲノムチップとハイブリダイズさせた。マイクロアレイの検出感度を増強するために、例えば、米国特許公開第20050221310号（2004年8月9日出願）および第10/948,635号（2004年9月24日出願）、（件名は両方共「遺伝子発現分析を増強する方法（Methods of Enhancing Gene Expression Analysis）」であって、それぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）に記載の方法を用いて、血液サンプルから抽出した全RNAからグロビンmRNA分子を除去した。U133 plus 2.0は、補充して加えられた転写物を測定するなどの特殊な機能について設計された62のプローブセットを有する。これが特別に設計された54,613のプローブセットをヒト遺伝子の検出用に残す。2つのマイクロアレイから成るAffymetrixヒトゲノムU133（HG-U133）セットはほとんど45,000のプローブセットを含有し、ほぼ33,000のヒト遺伝子に由来する39,000種類以上の転写物を表す。このセット設計は、GenBank、dbEST、およびRefSeqから選択される配列を使用する。本明細書では、これらのプローブセットと結合するバイオマーカーのそれぞれについて測定した存在量値を特性と呼ぶ。以下の実施例は、U133 plus 2.0ヒトゲノムチップの特別なプローブセットと結合するバイオマーカーの存在量値を考察する。
【０３６５】
6.3  静的CT-36データ分析
1つの実験ではT-36静的分析を実施した。T-36静的分析においては、訓練集団中のそれぞれの被験者からの、T-36血液サンプルと名づけられる特定の血液サンプルを用いて、バイオマーカー特性を測定する。訓練集団中のそれぞれの被験者からのこの特定の血液サンプルの同一性は、被験者がSIRS被験者（観察期間中に敗血症を発症しなかった）であったかまたは敗血症被験者（観察期間中に敗血症を発症した）であるかどうかに依存する。敗血症被験者の場合、T-36サンプルは被験者が敗血症になる前に被験者から採取した最後のさらに前の血液サンプルとして定義される。訓練集団中のSIRS被験者のT-36サンプルの同定は、敗血症の対応被験者の同定よりさらに任意性があった、何故なら、SIRS被験者には敗血症になる有意な事象が存在しなかったからである。その故に、訓練集団中の敗血症被験者に対するT-36サンプルの同一性を用いて訓練集団中のSIRS被験者中のT-36サンプルを同定した。具体的には、訓練集団中のSIRS被験者に対するT-36時点（血液サンプル）は、敗血症被験者とSIRS被験者を「時間マッチング」することにより同定した。例えば、研究に入った被験者が、登録の第6日に臨床上、敗血症として規定された場合を考えよう。この被験者について、T-36は研究の第4日であり、そのT-36血液サンプルは研究の第4日に得た血液サンプルであった。同様に、この敗血症被験者とマッチングするSIRS被験者に対するT-36はこの対となるSIRS被験者の研究の第4日とみなされる。
【０３６６】
SIRS被験者は進行して敗血症を発症することはないが、それらの発現される遺伝子（およびタンパク質など）には経時変化が見られた。そこで、SIRS被験者からのT-36血液サンプルの関係セットを得るために、敗血症被験者のSIRS被験者に対する1対1の時間マッチングを前記の方式で求めた。進行して敗血症になる被験者が様々な速度で変化するように、この時間マッチングを行ってSIRS被験者の特性可変性をまねた。SIRSと敗血症被験者の任意の対の間で時間マッチングを行って可能な限り多くの訓練集団中のSIRS被験者に対するT-36血液サンプルを同定したが、ある場合には、SIRS被験者からのT-36サンプルはサンプル利用可能性に基づく時点から選択せざるを得なかった。
【０３６７】
T-36静的分析のために、異なる84被験者から得た対応する全84マイクロアレイ実験に対する84件のサンプルについて測定した54,613のバイオマーカーが存在した。それぞれのサンプルは84被験者の集団中の異なる被験者から採集した。それぞれのマイクロアレイ実験で測定した54,613のプローブセットのうち、30,464種類は対数変換（log transformation）により変換した。対数変換は、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Draghici、2003、Data Analysis Tools for DNA Microarrays、Chapman & Hall/CRC、Boca Raton、pp. 309-311に記載されている。さらに、それぞれのマイクロアレイ実験の54,613のプローブセットのうち、2317種類は平方根変換（square root transformation）により変換した。平方根変換は本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Ranidas、2001、Genome Biology 2、47.1-47.7に記載されている。それぞれのマイクロアレイ実験の残りの21,832のプローブセットは変換しなかった。
【０３６８】
84メンバーの集団を最初に訓練セット（n=64）と検証セット（n=20）に分割した。訓練セットを用いて適当な分類アルゴリズムパラメーターを見積もる一方、訓練されたアルゴリズムを検証セットに適用して独立に性能を評価した。64件の訓練サンプルのうち、35件は敗血症であり、被験者が観察期間中のある時点で敗血症を発症したことを意味し、そして29件はSIRSであり、観察期間中に敗血症を発症しなかったことを意味する。表1はこれらのサンプルに対する人種、性別および年齢の分布を与える。
【表１】
2008538007.tif 000117
【０３６９】
20件の検証サンプルについては、9件が敗血症でありかつ11件がSIRSであった。表2はこれらのサンプルに対する人種、性別および年齢の分布を与える。
【表２】
2008538007.tif 000118
【０３７０】
訓練データ中のそれぞれのサンプルを、交差検定に用いる10グループの1つにランダムに割り当てた。これらのグループ中の訓練サンプル数は6〜7であった。サンプルは、敗血症とSIRSサンプルの数が全ての群れでバランスするように割り当てた。以下にさらに詳しく記載するように、複数の異なる方法を用いて、マイクロアレイの特別なプローブセットと結合する選択バイオマーカーが敗血症とSIRSグループの間を判別するかどうかを判断した。
【０３７１】
WilcoxonとQ値検定  判別バイオマーカーを同定するために用いた最初の方法はWilcoxon検定（無調節）であった。Wilcoxon検定は分布によらない検定であって極端な値に対して耐性がある。Wilcoxon検定は、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Agresti、1996、An Introduction to Categorical Data Analysis、John Wiley & Sons、Inc、New York、第2章に記載されている。Wilcoxon検定はp値を作製する。訓練データ中の全サンプルからの所与のバイオマーカーについての存在量値をWilcoxon検定で処理する。Wilcoxon検定は分類（敗血症対SIRS）と存在量値の両方を考慮して、所与のバイオマーカーに対するp値を計算する。p値は、訓練セット中で収集したサンプル全体にわたる所与のバイオマーカーに対する存在量値がいかに巧く敗血症とSIRS状態の間を判別するかの表示を与える。p値が特定の信頼レベル、例えば0.05より低いとき、バイオマーカーは敗血症とSIRS状態の間を判別するという推論がなされる。この方法を用いると、9520の有意なバイオマーカーが存在した（表3を参照）。
【０３７２】
判別バイオマーカーを同定するために用いた第2の方法はWilcoxon検定（調節済）であった。54613の多数のバイオマーカーと84件の比較的小さいサンプル数であるので、誤有意なバイオマーカーを見出すリスクが高かった。調節済p値を用いてこのリスクの対策を講じた。特に、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、BenjaminiおよびHochberg、1995、J.R. Statist. Soc. B 57、pp 289-300の方法を用いて誤発見率を調節した。ここで、誤発見率は、真に有意なバイオマーカー数を有意と宣言されたバイオマーカー数により除した値として定義される。例えば、もし調節済p値が0.05未満であれば、バイオマーカーが誤発見であるチャンスは5％である。この検定を用いた結果を表3に報じた。この方法を用いると1618の有意なバイオマーカーが存在した（表3を参照）。本明細書に使用されるバイオマーカーは、もしバイオマーカーに対応する特性値がWilcoxon検定（調節済）により決定して0.05未満のp値を有すれば、有意と考えられる。
【０３７３】
判別バイオマーカーを同定するために用いた第3の方法は、Q値の利用であった。Q値は、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Storey、2002、J.R. Statist. Soc. B 64、Part 3、pp. 479- 498に記載されている。バイオマーカーをそのq値の順に並べ、もしバイオマーカーがXのq値を有すれば、このバイオマーカーと全ての他のさらに有意なバイオマーカーは組合わせてXの誤発見率を有する。しかし、いずれか1つのバイオマーカーに対する誤発見率はもっと大きいことがありうる。この方法を用いると2431の有意なマーカーが存在した（表3を参照）。
【表３】
2008538007.tif 000119
【０３７４】
CART  訓練セット中の敗血症とSIRSサブ集団の間を判別するバイオマーカーを同定するために、Wilcoxon検定とQ値検定を用いてマイクロアレイデータを分析することに加えて、分類および回帰ツリー（CART）分析を用いた。CARTは前記第5.5.1節に記載されている。具体的には、以上の総括されたデータを用いて、繰り返してデータの最良の単一変数（全訓練セットにわたるバイオマーカーの特性）分割に基づいてデータを分配することにより、病状を予測する。言い換えれば、ツリー構築プロセスのそれぞれの段階において、訓練集団全体にわたるその存在量値が敗血症とSIRS集団の間を最も良く判別するバイオマーカーを決定分岐として実施した。交差検定を、10回の繰返しのそれぞれにおいて独立して評価した最適な分割数を用いて実施した。最終ツリーを図1に示す。図1において、決定102はX204319_s_atと結合するバイオマーカーの存在量に基づく決定を行う。もしX204319_s_atと結合するバイオマーカーが診断される被験者からの生物学的サンプル（テスト生物学的サンプル）中に2.331ユニットより大きい存在量を有すれば、そのとき、決定コントロールは決定104へパスする。他方では、もしX204319_s_atと結合するバイオマーカーが、テスト生物学的サンプル中に2.331ユニットより少ない存在量を有すれば、そのとき、決定コントロールは決定106へパスする。この要領で決定が行われて決定ツリーの最後のリーフに到達し、その点で敗血症またはSIRSの診断を下す。図1の決定ツリーは、次の5つのプローブセット：X204319_s_at、X1562290_at、X1552501_a_at、X1552283_s_at、およびXl17_atと結合するバイオマーカーを利用する。
【０３７５】
図2は、訓練データセット中の敗血症とSIRSの間の決定ツリーに用いられる、5つのプローブセットと結合するバイオマーカーの分布を示す。図2で、それぞれのボックスの頂部は訓練セット全体のデータの75パーセンタイルを示しかつそれぞれのボックスの底部は25パーセンタイルを示し、そして訓練セット全体のそれぞれのバイオマーカーのメジアン値をそれぞれのボックス内に一線として引いた。交差検定されたモデルから予測分類がなされた訓練データに対する混同行列を表4に与えた。この混同行列から、全精度は70.3%、95%信頼区間で57.6%〜81.1%と見積もられた。見積感度は60％でありかつ見積特異性は82.8%であった。
【表４】
2008538007.tif 000120
【０３７６】
訓練データセットから戻した20件の検証サンプルについては、全精度は70%、95%信頼区間で45.7%〜88.1%、感度88.9％、特異性54.5%と見積もられた。表5は検証サンプルに対する混同行列を示す。
【表５】
2008538007.tif 000121
【０３７７】
ランダムフォレスト  本発明のバイオマーカーを用いて開発できる他の決定ルールはランダムフォレスト決定ツリーである。ランダムフォレストは交差検定の代わりにブートストラップを用いるツリーに基づく方法である。それぞれの繰返しに対して、ランダムサンプル（置換により）を引いて可能な最大のツリーを成長させる。それぞれのツリーは最終クラス予測について一票を受ける。ランダムフォレストを適合させるために、いくつものツリー（例えばブートストラップ繰返し）を規定する。この事例においては、500より多く使用しないが、バーンイン期間（burn-in period）に少なくとも50は必要である。ツリー数は訓練データの精度に基づいて選択した。このデータについては、500ツリーを用いてアルゴリズムを訓練した（図3を参照）。図3において、曲線302はツリー数の関数として平滑化された全精度の見積である。曲線304はツリー数の関数として平滑化されたツリー感度の曲線である。曲線306はツリー数の関数として平滑化されたツリー特異性の曲線である。このアルゴリズムを用いると、901のバイオマーカーがノンゼロ重要度を有しそしてモデルに用いられた。ランダムフォレストアルゴリズムは訓練精度の平均減少によりバイオマーカー重要度を測定する。バイオマーカーをこの方法により順位付けして図4に示した。図4において、バイオマーカーは、それらが結合するU133 plus 2.0 プローブセットの名称によって標識した。図はランダムフォレスト分析を用いて見出した50の最重要バイオマーカーだけを反映する。しかし、901のバイオマーカーが実際には判別有意性を有することが見出された。ランダムフォレスト法はいくつもの異なる決定ツリーを用いる。バイオマーカーは、もしそれが有意なランダムフォレスト分析からの決定ツリーの決定分岐として役立てば、判別有意性を有すると考えられる。本明細書で使用される有意なランダムフォレスト分析は、交差検定による訓練データセットに関する精度の低い方の95％信頼区間が50％を超え、かつ検証セットに関する精度の点見積が65％を越えるものである。
【０３７８】
ランダムフォレスト法を用いて開発された決定ツリーを用いる訓練データセットに対する予測混同行列を表6に与える。この混同行列から、全精度は68.8%であると見積もられた（ブートストラップ精度見積を用いる場合、信頼区間は計算できない）。見積感度は74.3%でありかつ見積特異性は62.1%であった。
【表６】
2008538007.tif 000122
【０３７９】
訓練データセットから戻した20件の検証サンプルについては、全精度は65%、95%信頼区間で40.8%〜84.6%、感度66.7％および特異性63.6%と見積もられた。表7は検証サンプルに対する混同行列を示す。
【表７】
2008538007.tif 000123
【０３８０】
PAM  本発明のバイオマーカーを用いて開発されたさらに他の決定ルールは、前記第5.5.2節に記載されているマイクロアレイの予測分析（PAM）である。この方法では、サンプルを分類するために用いるバイオマーカー数の数を決定する収縮パラメーターが規定される。このパラメーターは交差検定法を介して選択した。見当たらない値をもつバイオマーカーは存在しなかった。交差検定に基づくと、258のバイオマーカーに対応する最適閾値は2.07であった。図5は全ての異なる閾値にわたる精度を示す。図5において、曲線502は全精度（95％信頼区間バーとともに）である。曲線504は閾値の関数として決定ルール感度を示す。曲線506は閾値の関数として決定ルール特異性を示す。2.07の閾値を用いると、訓練サンプルに対する全精度は73.4％、95%信頼区間で61.4%〜82.8%であった。見積感度は79.3％でありかつ見積特異性は68.6％であった。
【表８】
2008538007.tif 000124
【０３８１】
訓練から戻した20件の検証サンプルについては、全精度は70%、95%信頼区間で45.7%〜88.1%、感度66.7％および特異性72.7%と見積もられた。表9は検証サンプルに対する混同行列を示す。
【表９】
2008538007.tif 000125
【０３８２】
図6は、モデルにおけるその相対的判別力、およびその相対的重要度により順位付けされた、選択されたバイオマーカーを示す。図6はPAM分析を用いて見出された50の最重要バイオマーカーだけを示す。しかし、258の重要なバイオマーカーが見出された。図6のバイオマーカーを、それらが結合するU133 plus 2.0プローブセットに基づいて標識した。
【０３８３】
図7は、CART、PAM、およびランダムフォレスト分類アルゴリズム（決定ルール）性能および関連95％信頼区間の総括を与える。50の異なるバイオマーカーを図7に説明した全てのアルゴリズムにわたって選択した。図8は、共通バイオマーカーがWilcoxon（調節済）、CART、PAM、およびRFの技法全体にわたって選択された回数を図解する。図9はT-36データセットに対するバイオマーカーの全体順位付けを図解する。選択されたマーカーについて、x軸はそれが選択された回数の百分率を示す。バイオマーカーが選択された回数の百分率内で、バイオマーカーは順位付けされる。図7のバイオマーカーを、それらが結合するプローブセット（オリゴヌクレオチド同一性）に基づいて標識した。
【０３８４】
6.4  静的T-I2データ分析
他の実験においては、T-12静的分析を実施した。T-12静的分析において、バイオマーカー特性は、訓練集団中のそれぞれの被験者から得たT-12血液サンプルと名付けられた特定の血液サンプルを用いて測定した。訓練集団中の所与の被験者から得たこの特定の血液サンプルの同一性は、被験者がSIRS被験者（観察期間中に敗血症を発症しなかった）または敗血症被験者（観察期間中に敗血症を発症した）であるかに依存した。敗血症被験者の場合、T-12サンプル被験者が敗血症になる前に被験者から採取した最後の血液サンプルとして定義した。訓練集団中のSIRS被験者のT-12サンプルの同定は、敗血症の対応被験者の同定よりさらに任意性があった、何故なら、SIRS被験者が敗血症になる有意な事象が存在しないからである。その故に、訓練集団中の敗血症被験者に対するT-12サンプルの同一性を利用して訓練集団中のSIRS被験者中のT-12サンプルを同定した。具体的には、訓練集団中のSIRS被験者に対するT-12時点（血液サンプル）は、敗血症被験者とSIRS被験者を「時間マッチング」することにより同定した。例えば、研究に入った被験者が、登録の第6日に敗血症として臨床上規定された場合を考えよう。この被験者について、T-12は研究の第5日（敗血症の前の1〜24時間）であり、そのT-12血液サンプルは研究の第5日に得た血液サンプルであった。同様に、この敗血症被験者とマッチングするSIRS被験者に対するT-12はこの対となるSIRS被験者の研究の第5日とみなされる。SIRSと敗血症被験者の任意の対の間の時間マッチングを行って可能な限り多くの訓練集団中のSIRS被験者に対するT-12血液サンプルを同定したが、ある場合には、SIRS被験者からのT-12サンプルはサンプル利用可能性に基づく時点から選択せざるを得なかった。
【０３８５】
T-12静的分析のために、異なる90被験者から得た対応する全90マイクロアレイ実験に対する90件のサンプルについて測定した54,613のバイオマーカーが存在した。それぞれのサンプルは集団の異なるメンバーから採集した。それぞれのマイクロアレイ実験の54,613のプローブセットのうち、31,047種類は対数変換により変換した。さらに、それぞれのマイクロアレイ実験の54,613のプローブセットのうち、2518種類は平方根変換により変換した。それぞれのマイクロアレイ実験の残りの21,048のプローブセットは変換しなかった。
【０３８６】
90メンバーの集団を最初に訓練セット（n=69）と検証セット（n=21）に分割した。訓練セットを用いて適当な分類アルゴリズムパラメーターを見積もる一方、訓練されたアルゴリズムを検証セットに適用して独立に性能を評価した。69件の訓練サンプルのうち、34件は敗血症と標識され、被験者が観察期間中のある時点で敗血症を発症したことを意味し、そして35件はSIRSであり、観察期間中に敗血症を発症しなかったことを意味する。表10はこれらのサンプルに対する人種、性別および年齢の分布を与える。
【表１０】
2008538007.tif 000126
【０３８７】
21件の検証サンプルについては、11件が敗血症と標識されかつ10件がSIRSと標識された。表11はこれらのサンプルに対する人種、性別および年齢の分布を与える。
【表１１】
2008538007.tif 000127
【０３８８】
訓練データ中のそれぞれのサンプルを交差検定に用いる10グループの1つにランダムに割り当てた。これらのグループ中の訓練サンプル数は6〜8であった。サンプルは、敗血症とSIRSサンプルの数が全ての群れでバランスするように割り当てた。以下にさらに詳しく記載するように、複数の異なる方法を用いて、選択バイオマーカーが敗血症とSIRSグループの間を判別するかどうかを判断した。
【０３８９】
WilcoxonとQ値検定  判別バイオマーカーを同定するために用いた最初の方法はWilcoxon検定（無調節）であった。訓練データ中の全サンプルからの所与のバイオマーカーについての存在量値をWilcoxon検定で処理した。Wilcoxon検定は分類（敗血症対SIRS）と存在量値の両方を考慮して、所与のバイオマーカーに対するp値を計算する。p値は、訓練セット中で収集されたサンプル全体にわたる所与のバイオマーカーに対する存在量値がいかに巧く敗血症とSIRS状態の間を判別するかの表示を与える。p値が低いほど、判別性が優れる。p値が特定の信頼レベル、例えば0.05より低いとき、バイオマーカーは敗血症とSIRS状態の間を判別するという推論がなされる。この方法を用いると、19,791の有意なバイオマーカーが存在した（表12を参照）。
【０３９０】
判別バイオマーカーを同定するために用いる第2の方法はWilcoxon検定（調節済）であった。54613の多数のバイオマーカーと90件の比較的小さいサンプル数であるので、誤有意なバイオマーカーを見出すリスクが高かった。調節済p値を用いてこのリスクの対策を講じた。特に、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、BenjaminiおよびHochberg、1995、J.R. Statist. Soc. B 57、pp 289-300の方法を用いて誤発見率を調節した。ここで、誤発見率は、真に有意なバイオマーカー数を有意と宣言されたバイオマーカー数により除した値として定義される。例えば、もし調節済p値が0.05未満であれば、バイオマーカーが誤発見であるチャンスは5％である。この検定を用いた結果を表12に報じた。この方法を用いると11851の有意なバイオマーカーが存在した（表12を参照）。本明細書に使用されるバイオマーカーは、もしWilcoxon検定（調節済）により決定して0.05未満のp値を有すれば、有意と考えられる。
【０３９１】
判別バイオマーカーを同定するために用いる第3の方法は、Q値の利用である。かかる手法においては、バイオマーカーをそのq値の順に並べ、もしそれぞれのバイオマーカーがXのq値を有すれば、そこでそれぞれのバイオマーカーと全ての他のさらに有意なバイオマーカーは組合わせてXの誤発見率を有する。しかし、いずれか1つのバイオマーカーに対する誤発見率はもっと大きいことがありうる。この方法を用いると11851の有意なマーカーが存在した（表12を参照）。
【表１２】
2008538007.tif 000128
【０３９２】
CART  訓練セット中の敗血症とSIRSサブ集団の間を判別するバイオマーカーを同定するために、Wilcoxon検定とQ値検定を用いてマイクロアレイデータを分析することに加えて、分類および回帰ツリー（CART）分析を用いた。CARTは前記第5.5.1節に記載されている。具体的には、以上の総括されたデータを用いて、繰り返してデータの最良の単一変数分割に基づいてデータを分配することにより、病状を予測する。言い換えれば、ツリー構築プロセスのそれぞれの段階において、訓練集団全体にわたるその発現値が敗血症とSIRS集団の間を最も良く判別するバイオマーカーを決定分岐として実施した。交差検定を、10回の繰返しのそれぞれにおいて独立して評価した最適な分割数を用いて実施した。最終ツリーを図10に示す。図10において、決定1002はプローブセットX214681_atと結合するバイオマーカーの存在量に基づく決定を行う。もしX214681_atと結合するバイオマーカーが診断される被験者（テスト生物学的サンプル）からの生物学的サンプル中に7.862ユニットより大きい存在量を有すれば、そのとき、コントロールは決定1004へパスする。他方では、もしプローブセット（U133 plus 2.0オリゴヌクレオチド）X204319_s_atと結合するバイオマーカーが、テスト生物学的サンプル中に7.862ユニットより小さい存在量を有すれば、そのとき、決定コントロールは決定1006へパスする。この要領で決定が行われて決定ツリーの最後のリーフに到達し、その点で敗血症またはSIRSの診断を下す。図10の決定ツリーは、次の4つのプローブセット：X214681_at、X1560432_at、X230281_at、およびX1007_s_atと結合するバイオマーカーを利用する。
【０３９３】
図11は、訓練データセット中の敗血症とSIRSの間の決定ツリーに用いられる4のバイオマーカーの分布を示す。図11で、それぞれのボックスの頂部は訓練セット全体のデータの75パーセンタイルを示しかつそれぞれのボックスの底部は25パーセンタイルを示し、そして訓練セット全体のそれぞれのバイオマーカーのメジアン値をそれぞれのボックス内に一線として引いた。図11において、バイオマーカーは、結合するU133 plus 2.0オリゴヌクレオチドに基づいて標識した。交差検定されたモデルから予測分類がなされた訓練データに対する混同行列を表13に与えた。この混同行列から、全精度は65.2%、95%信頼区間で52.8%〜76.3%と見積もられた。見積感度は61.8％でありかつ見積特異性は68.6%であった。
【表１３】
2008538007.tif 000129
【０３９４】
訓練データセットから戻した21件の検証サンプルについては、全精度は71.4%、95%信頼区間で47.8%〜88.7%、感度90.9％および特異性50%と見積もられた。表14は検証サンプルに対する混同行列を示す。
【表１４】
2008538007.tif 000130
【０３９５】
ランダムフォレスト  本発明のバイオマーカーを用いて開発できる他の決定ルールはランダムフォレスト決定ツリーである。ランダムフォレストは交差検定の代わりにブートストラップを用いるツリーに基づく方法である。それぞれの繰返しに対して、ランダムサンプル（置換により）を引いて可能な最大のツリーを成長させる。それぞれのツリーは最終クラス予測について一票を受ける。ランダムフォレストを適合させるために、いくつものツリー（例えばブートストラップ繰返し）を規定する。この事例においては、500より多く使用しないが、バーンイン期間に少なくとも50は必要である。ツリー数は訓練データの精度に基づいて選択した。このデータについては、439ツリーを用いてアルゴリズムを訓練した（図12を参照）。図12において、曲線1202はツリー数の関数として平滑化された全精度の見積である。曲線1204はツリー数の関数として平滑化されたツリー感度の曲線である。曲線1206はツリー数の関数として平滑化されたツリー特異性の曲線である。このアルゴリズムを用いると、845のバイオマーカーがノンゼロ重要度を有しそしてモデルで用いられた。ランダムフォレストアルゴリズムは訓練精度の平均減少によりバイオマーカー重要度を測定する。バイオマーカーをこの方法により順位付けして図13に示した。図はランダムフォレスト分析を用いて見出した50の最重要バイオマーカーだけを反映する。しかし、845のバイオマーカーが実際には判別有意性を有することを見出した。ランダムフォレスト法はいくつも異なる決定ツリーを用いる。バイオマーカーは、もしそれが有意なランダムフォレスト分析からの決定ツリーの決定分岐として役立てば、判別有意性を有すると考えられる。本明細書で使用される有意なランダムフォレスト分析は、訓練データセットに関する交差検定による精度の低い方の95％信頼区間が50％を超え、かつ検証セットに関する精度の点見積が65％を越えるものである。
【０３９６】
ランダムフォレスト法を用いて開発された決定ツリーを用いる訓練データセットに対する予測混同行列を表15に与える。この混同行列から、全精度は75.4%であると見積もられた（ブートストラップ精度見積を用いる場合、信頼区間は計算できない）。見積感度は73.5%でありかつ見積特異性は77.1%であった。
【表１５】
2008538007.tif 000131
【０３９７】
訓練データセットから戻した21件の検証サンプルについては、全精度95.2%、95%信頼区間で76.2%〜99.9%、感度100%、および特異性90%であると見積もられた。表16は検証サンプルに対する混同行列を示す。
【表１６】
2008538007.tif 000132
【０３９８】
MART  「勾配ブーストマシーン」としても知られている、多重加法回帰ツリー（MART）は同時にバイオマーカーの重要度を評価しかつ被験者サンプルを分類するために使われる。いくつかのフィッティングパラメーターがこの手法では規定されていて、それには、（i）ツリーの数、（ii）ステップサイズ（通常、「収縮」と呼ばれる）、および（iii）相互作用の程度（各ツリーのスプリットの数に関係がある）が含まれる。MARTについてのさらなる情報は前の第5.5.4節に記載されている。相互作用の程度を1に設定し、加法モデルを実行した（例えば各ツリーは1つの分割を有しかつ1つのバイオマーカーだけを使う）。
【０３９９】
相互作用を見積るためには十分機能するさらなるデータを必要としうる。ステップサイズを0.05に設定し、モデル複雑度をツリーの数により規定した。最適なツリー数は、各フィッティング繰返しにおいてランダムなケースのサブセットを外し、次いでサブセットの予測の品質を評価することにより見積もる。保証されたより多いツリーを適合させた後に、予想性能の改善が止まる点を最適点として見積もる。
【０４００】
見積もられたモデルは、28ツリーおよび全ツリーにわたって17のバイオマーカーを用いた。MARTアルゴリズムはまた、図14に与えたバイオマーカー重要度（和は100％となる）の計算も提供する。ゼロ重要度のバイオマーカーは除外した。図14で、バイオマーカーはそれが結合するU133 plus 2.0オリゴヌクレオチドにより標識されている。図15は、選択されたバイオマーカーの敗血症とSIRSグループの間の分布を示す。図15で、バイオマーカーはそれが結合するU133 plus 2.0オリゴヌクレオチドにより標識されている。
【０４０１】
交差検定を、独立してそれぞれ10回繰返しで見積もった最適ツリー数を用いて行った。予測される分類を交差検定したモデルから作った訓練データに対する混同行列を表17に与える。この混同行列から、全精度は76.8%、95%信頼区間で65.1%〜86.1%と見積もられた。見積感度は76.5％でありかつ見積特異性は77.1%であった。
【表１７】
2008538007.tif 000133
【０４０２】
訓練データセットから戻した21件の検証サンプルについては、全精度は85.7%、95%信頼区間で63.7%〜97%、感度80%および特異性90.9%と見積もられた。表18は検証サンプルに対する混同行列を示す。
【表１８】
2008538007.tif 000134
【０４０３】
PAM  本発明のバイオマーカーを用いて開発されたさらに他の決定ルールは、前記第5.5.2節に記載されているマイクロアレイの予測分析（PAM）である。この方法では、サンプルを分類するために用いるバイオマーカー数の数を決定する収縮パラメーターが明記される。このパラメーターは交差検定を介して選択された。見当たらない値をもつバイオマーカーは存在しなかった。交差検定に基づくと、820のバイオマーカーに対応する最適閾値は2.1であった。図16は全ての異なる閾値にわたる精度を示す。図16において、曲線1602は全精度（95％信頼区間バーとともに）である。曲線1604は閾値の関数として決定ルール感度を示す。曲線1606は閾値の関数として決定ルール特異性を示す。2.1の閾値を用いると、訓練サンプルに対する全精度は80.9％、95%信頼区間で73.4%〜86.7%であった。見積感度は85.7％でありかつ見積特異性は76.5%であった。表19は、予測される分類が交差検定モデルから作られた訓練データ用の混同行列を示す。
【表１９】
2008538007.tif 000135
【０４０４】
訓練から戻した21件の検証サンプルについては、全精度は95.2%、95%信頼区間で76.2%〜99.9%、感度100％および特異性90%と見積もられた。表20は検証サンプルに対する混同行列を示す。
【表２０】
2008538007.tif 000136
【０４０５】
図17は、モデルにおけるその相対的判別力、およびその相対的重要度により順位付けされた、選択されたバイオマーカーを示す。図17はPAM分析を用いて見出された50の最重要バイオマーカーだけを示す。しかし、820の重要なバイオマーカーが見出された。図17において、バイオマーカーを、それらが結合するU133 plus 2.0オリゴヌクレオチドにより標識した。
【０４０６】
図18は、CART、MART、PAM、およびランダムフォレスト（RF）分類アルゴリズム（決定ルール）性能および関連95％信頼区間の総括を与える。50の異なるバイオマーカーを図18に説明したアルゴリズム全体から選択した。これらの50の選択された特性の同一性を図20に示した。図19は、共通バイオマーカーがCART、Mart、PAM、RF、およびWilcoxon （調節済）の技法全体にわたって選択された回数を図解する。図20はT-12データセットに対するバイオマーカーの全体順位付けを図解する。選択されたマーカーについて、x軸はそれが選択された回数の百分率を示す。バイオマーカーが選択された回数の百分率内で、バイオマーカーを順位付けした。図20において、バイオマーカーは、それらが結合するUI 33 plus 2.0オリゴヌクレオチドにより標識されている。
【０４０７】
6.5  基線T-12データ分析
他の実施例においては、基線T-12データ分析を実施した。この実施例においては、バイオマーカーの特性値を2時点間の差として計算した。訓練集団中のそれぞれの被験者に対する2時点は、それぞれの被験者から採取した(i)T-12時点および(ii)第1測定時点Tfirstであった。Tfirstが訓練集団全体にわたって異なりうることは理解されるであろう。例えば、いくつかの被験者では、TfirstはT-12の2日前であり、いくつかの被験者ではT-12の3日前であった；などである。T-12基線分析による特性値の計算を説明するために、バイオマーカーAを評価する場合を考えてみよう。基線T-12分析の目的でバイオマーカーに対する特性値を計算するために、訓練集団のそれぞれの被験者に対するT-12血液サンプル中のバイオマーカーAの存在量、[A]T-12を得た。さらに、それぞれの被験者から取得した最初の血液サンプルからのバイオマーカーAの存在量、[A]firstを得た。このそれぞれの被験者に対するAの特性値をΔA＝[A]T-12-[A]firstとして計算した。この計算を、訓練集団中のそれぞれの被験者についておよび考察下のそれぞれのバイオマーカーについて繰り返した。
【０４０８】
基線T-12分析のために、異なる89被験者から得た対応する全89マイクロアレイ実験に対する89件のサンプルについて測定した54,613のプローブセットが存在した。それぞれのサンプルは集団の異なるメンバーから採集した。それぞれのマイクロアレイ実験の54,613のプローブセットのうち、31,047種類は対数変換により変換した。さらに、それぞれのマイクロアレイ実験の54,613のプローブセットのうち、2518種類は平方根変換により変換した。それぞれのマイクロアレイ実験の残りの21,048のプローブセットは変換しなかった。
【０４０９】
89メンバーの集団を最初に訓練セット（n=68）と検証セット（n=21）に分割した。訓練セットを用いて適当な分類アルゴリズムパラメーターを見積もる一方、訓練されたアルゴリズムを検証セットに適用して独立に性能を評価した。68件の訓練サンプルのうち、33件は敗血症であり、被験者が観察期間中のある時点で敗血症を発症したことを意味し、そして35件はSIRSであり、観察期間中に敗血症を発症しなかったことを意味する。表21はこれらのサンプルに対する人種、性別および年齢の分布を与える。
【表２１】
2008538007.tif 000137
【０４１０】
21件の検証サンプルについては、11件が敗血症と標識されかつ10件がSIRSと標識された。表22はこれらのサンプルに対する人種、性別および年齢の分布を与える。
【表２２】
2008538007.tif 000138
【０４１１】
訓練データ中のそれぞれのサンプルを交差検定に用いる10グループの1つにランダムに割り当てた。これらのグループ中の訓練サンプル数は6〜8であった。サンプルは、敗血症とSIRSサンプルの数が全ての群れでバランスするように割り当てた。以下にさらに詳しく記載するように、複数の異なる方法を用いて、選択バイオマーカーが敗血症とSIRSグループの間を判別するかどうかを判断した。
【０４１２】
WilcoxonとQ値検定  判別バイオマーカーを同定するために用いた最初の方法はWilcoxon検定（無調節）であった。訓練データ中の全サンプルからの所与のバイオマーカーについての存在量値をWilcoxon検定で処理した。Wilcoxon検定は分類（敗血症対SIRS）と存在量値の両方を考慮して、所与のバイオマーカーに対するp値を計算する。p値は、訓練セット中で収集されたサンプル全体にわたる所与のバイオマーカーに対する存在量値がいかに巧く敗血症とSIRS状態の間を判別するかの表示を与える。p値が低いほど、判別性が優れる。p値が特定の信頼レベル、例えば0.05より低いとき、バイオマーカーは敗血症とSIRS状態の間を判別するという推論がなされる。この方法を用いると、6427の有意なバイオマーカーが存在した（表23を参照）。
【０４１３】
判別バイオマーカーを同定するために用いる第2の方法はWilcoxon検定（調節済）であった。54613の多数のバイオマーカーと89件の比較的小さいサンプル数であるので、誤有意なバイオマーカーを見出すリスクが高かった。調節済p値を用いてこのリスクの対策を講じた。特に、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、BenjaminiおよびHochberg、1995、J.R. Statist. Soc. B 57、pp 289-300の方法を用いて誤発見率を制御した。ここで、誤発見率は、真に有意なバイオマーカー数を有意と宣言されたバイオマーカー数により除した値として定義される。例えば、もし調節済p値が0.05未満であれば、バイオマーカーが誤発見であるチャンスは5％である。この検定を用いた結果を表12に報じた。この方法を用いると482の有意なバイオマーカーが存在した（表23を参照）。本明細書に使用されるバイオマーカーは、もしWilcoxon検定（調節済）により決定して0.05未満のp値を有すれば、有意と考えられる。
【０４１４】
判別バイオマーカーを同定するために用いる第3の方法は、Q値の利用である。バイオマーカーをそのq値の順に並べ、もしバイオマーカーがXのq値を有すれば、そこでこのバイオマーカーと全ての他のより多くのバイオマーカーは組合わせてXの誤発見率を有する。しかし、いずれか1つのバイオマーカーに対する誤発見率はもっと大きいことがありうる。この方法を用いると606の有意なマーカーが存在した（表23を参照）。
【表２３】
2008538007.tif 000139
【０４１５】
CART  訓練セット中の敗血症とSIRSサブ集団の間を判別するバイオマーカーを同定するために、Wilcoxon検定とQ値検定を用いてマイクロアレイデータを分析することに加えて、分類および回帰ツリー（CART）分析を用いた。CARTは前記第5.5.1節に記載されている。具体的には、以上の総括されたデータを用いて、繰り返してデータの最良の単一変数（バイオマーカー）分割に基づいてデータを分配することにより、病状を予測する。言い換えれば、ツリー構築プロセスのそれぞれの段階において、訓練集団全体にわたるその存在量値が敗血症とSIRS集団の間を最も良く判別するバイオマーカーを決定分岐として実施した。交差検定を、10回の繰返しのそれぞれにおいて独立して評価した最適な分割数を用いて実施した。最終ツリーを図21に示す。図21において、決定2102はU133 plus 2.0 probe X210119_atと結合するバイオマーカーの存在量に基づく決定を行う。もしX210119_atと結合するバイオマーカーが診断される被験者（テスト生物学的サンプル）からの生物学的サンプル中に-0.03669ユニットより小さい存在量を有すれば、そのとき、コントロールは決定2104へパスする。他方では、もしプローブセットX210119_s_atと結合するバイオマーカーが、テスト生物学的サンプル中に-0.03669ユニットより大きい存在量を有すれば、そのとき、決定コントロールは決定2106へパスする。この要領で決定が行われて決定ツリーの最後のリーフに到達し、その点で敗血症またはSIRSの診断を下す。図21の決定ツリーは、次の5つのU133 plus 2.0 オリゴヌクレオチド：X210119_at、X1552554_a_at、X1554390_s_at、X1552301_a_at、および X1555868_atと結合するバイオマーカーを利用する。
【０４１６】
図22は、訓練データセット中の敗血症とSIRSの間の決定ツリーに用いられる5のバイオマーカーの分布を示す。図22で、それぞれのボックスの頂部は訓練セット全体のデータの75パーセンタイルを示しかつそれぞれのボックスの底部は25パーセンタイルを示し、そして訓練セット全体のそれぞれのバイオマーカーのメジアン値をそれぞれのボックス内に一線として引いた。図22において、バイオマーカーは、結合するU133 plus 2.0オリゴヌクレオチドにより標識した。交差検定されたモデルから予測分類がなされた訓練データに対する混同行列を表24に与えた。この混同行列から、全精度は80.9%、95%信頼区間で69.5%〜89.4%と見積もられた。見積感度は93.9％でありかつ見積特異性は68.6%であった。
【表２４】
2008538007.tif 000140
【０４１７】
訓練データセットから戻した21件の検証サンプルについては、全精度は71.4%、95%信頼区間で47.8%〜88.7%、感度72.7％および特異性70%と見積もられた。表25は検証サンプルに対する混同行列を示す。
【表２５】
2008538007.tif 000141
【０４１８】
ランダムフォレスト  バイオマーカーを用いて開発できる他の決定ルールはランダムフォレスト決定ツリーである。ランダムフォレストを適合させるために、いくつものツリー（例えばブートストラップ繰返し）を規定する。この事例においては、500より多く使用しないが、バーンイン期間に少なくとも50は必要である。ツリー数は訓練データの精度に基づいて選択した。このデータについては、482ツリーを用いてアルゴリズムを訓練した（図23を参照）。図23において、曲線2302はツリー数の関数として平滑化された全精度の見積である。曲線2304はツリー数の関数として平滑化されたツリー感度の曲線である。曲線1206はツリー数の関数として平滑化されたツリー特異性の曲線である。このアルゴリズムを用いると、482のバイオマーカーがノンゼロ重要度を有しそしてモデルで用いられた。ランダムフォレストアルゴリズムは訓練精度の平均減少によりバイオマーカー重要度を測定する。バイオマーカーをこの方法により順位付けして図24に示した。図は、ランダムフォレスト分析を用いて見出した50の最重要バイオマーカーだけを反映する。しかし、893のバイオマーカーが実際には判別有意性を有することを見出した。ランダムフォレスト法はいくつも異なる決定ツリーを用いる。バイオマーカーは、もしそれが有意なランダムフォレスト分析からの決定ツリーの決定分岐として役立てば、判別有意性を有すると考えられる。本明細書で使用される有意なランダムフォレスト分析は、訓練データセットに関する交差検定による精度の低い方の95％信頼区間が50％を超え、かつ検証セットに関する精度の点見積が65％を越えるものである。
【０４１９】
ランダムフォレスト法を用いて開発された決定ツリーを用いる訓練データセットに対する予測混同行列を表26に与える。この混同行列から、全精度は61.8%であると見積もられた（ブートストラップ精度見積を用いる場合、信頼区間は計算できない）。見積感度は57.6%でありかつ見積特異性は65.7%であった。
【表２６】
2008538007.tif 000142
【０４２０】
訓練データセットから戻した21件の検証サンプルについては、全精度72.6%、95%信頼区間で52.8%〜91.8%、感度63.9%、および特異性90%であると見積もられた。表27は検証サンプルに対する混同行列を示す。
【表２７】
2008538007.tif 000143
【０４２１】
PAM  バイオマーカーを用いて開発されたさらに他の決定ルールは、前記第5.5.2節に記載されているマイクロアレイの予測分析（PAM）である。この方法では、サンプルを分類するために用いるバイオマーカー数の数を決定する収縮パラメーターが明記される。このパラメーターは交差検定法を介して選択された。見当たらない値をもつバイオマーカーは存在しなかった。交差検定に基づくと、269のバイオマーカーに対応する最適閾値は1.62であった。図25は全ての異なる閾値にわたる精度を示す。図25において、曲線2502は全精度（95％信頼区間バーとともに）である。曲線2504は閾値の関数として決定ルール感度を示す。曲線2506は閾値の関数として決定ルール特異性を示す。1.62の閾値を用いると、訓練サンプルに対する全精度は67.7％、95%信頼区間で55.9%〜77.6%であった。見積感度は68.6％でありかつ見積特異性は66.7%であった。表28は、予測される分類が交差検定モデルから作られた訓練データ用の混同行列を示す。
【表２８】
2008538007.tif 000144
【０４２２】
訓練から戻した21件の検証サンプルについては、全精度は81%、95%信頼区間で58.1%〜94.6%、感度72.7％および特異性100%と見積もられた。表29は検証サンプルに対する混同行列を示す。
【表２９】
2008538007.tif 000145
【０４２３】
図26は、モデルにおけるその相対的判別力、およびその相対的重要度により順位付けされた、選択されたバイオマーカーを示す。図26はPAM分析を用いて見出された50の最重要バイオマーカーだけを示す。しかし、269のバイオマーカーが見出された。図26において、バイオマーカーを、それらが結合するU133 plus 2.0オリゴヌクレオチドにより標識した。
【０４２４】
図27は、CART、PAM、およびランダムフォレスト分類アルゴリズム（決定ルール）性能および関連95％信頼区間の総括を与える。50の異なるバイオマーカーを図27に説明したアルゴリズム全体から選択した。図28は、共通バイオマーカーがCART、Mart、PAM、RF、およびWilcoxon （調節済）の技法全体にわたって選択された回数を図解する。図28において、バイオマーカーはそれらが結合するU133 plus 2.0オリゴヌクレオチドにより標識されている。図29はT0ベースデータセットに対するバイオマーカーの全体順位付けを図解する。図29において、バイオマーカーはそれらが結合するU133 plus 2.0オリゴヌクレオチドにより標識されている。選択されたマーカーについて、x軸はそれが選択された回数の百分率を示す。バイオマーカーが選択された回数の百分率内で、バイオマーカーを順位付けした。
【０４２５】
6.6  選択バイオマーカー
第6.3節〜第6.5節は、SIRS陽性被験者から得た血液サンプルを、54,613のプローブセットを含有するAffymetrix U133 plus 2.0ヒトゲノムチップを用いて試験した実験を記載した。本節は、所定の期間に敗血症を発症すると思われる被験者（敗血症被験者）と所定の期間に敗血症を発症しないと思われる被験者（SIRS被験者）の間を判別するバイオマーカーのリストを同定する目的で、第6.3節〜第6.5節に記載のデータに適用された判定基準を記載する。図30はこのバイオマーカーのリストを適用したフィルターを図解する。
【０４２６】
課された第1の判定基準は、バイオマーカーがSIRSと敗血症の間を、いずれの測定時点でも、多重比較に対する補正後のWilcoxon検定により決定した0.05以下のp値で判別すること、または、有意な分類性能をもつバイオマーカーが多変量分析に使われ、ここで前記有意な分類性能は、いずれの測定時点でも、訓練データセットの精度の低い方の95パーセンタイルが50％を超えかつ65％を超える検証セットの精度の点見積を有することにより規定されることという要件であった。T-36（第6.3節）において、1,618のバイオマーカーがこの判定基準に適合した。T-12（第6.4節）において、12,728のバイオマーカーがこの判定基準に適合した。いくつかのバイオマーカーはT-12およびT-36時点の両方でこの判定基準に適合した。全体で、敗血症とSIRS状態の間を判別する（T-12およびT-36時点からの重複を含めて）14,346のバイオマーカーが存在した。このようにして、第1フィルター判定基準は適確なバイオマーカーの数を54,613から14,346に減じた。
【０４２７】
課された第2の判定基準は、考察下のそれぞれのバイオマーカーが、T-36時点またはT-12時点において、所定の期間に敗血症となった被験者（敗血症被験者）の間でのそれぞれのバイオマーカーに対するメジアン値と所定の期間に敗血症にならない被験者（SIRS被験者）の間でのそれぞれのバイオマーカーに対するメジアン値との間で、少なくとも1.2倍の変化を示すという要件であった。さらに、第2の判定基準を満足するために、50％を超える訓練データセットの精度に対する低い方の95パーセンタイルおよび65％を超える検証セットの精度の点見積をいずれの測定時点でも有することにより規定される、有意な分類性能をもつバイオマーカーが少なくとも1つの多変量分析に使われなければならない。図30に記載したように、第2のフィルター判定基準は適確なバイオマーカーを14,346から626に減じた。
【０４２８】
表30の列1に、それぞれのバイオマーカーを、ロンドン大学生物学部の遺伝子命名委員会（the Gene Nomenclature Committee、Department of Biology、University College London）が設定したヒト遺伝子命名データベース（HUGO）記号などの遺伝子名により掲げた。当技術分野では公知のように、いくつかのヒトゲノム遺伝子はU133 plus 2.0アレイの2以上のプローブセットにより表されている。さらに、U133 plus 2.0アレイのいくつかのオリゴヌクレオチドは、公知の遺伝子に対応しない発現配列タグ（EST）を表す（表30の列2を参照）。わかっている場合には、異なるヒト遺伝子の名称を表30の列3に掲げた。
【０４２９】
バイオマーカーが表30に掲げられたプローブセットの配列を含む遺伝子もしくはその補体に基づく場合、バイオマーカーは、例えば、その遺伝子により作られた転写物、その補体、またはその判別断片もしくは補体、またはそのcDNA、もしくはcDNAの判別断片、または転写物もしくはその補体の全てもしくは一部分に対応する判別する増幅核酸分子、または遺伝子によりコードされるタンパク質、またはタンパク質の判別断片、または以上のいずれかの表示であってもよい。さらになお、バイオマーカーは、例えば、表30に記載のプローブセット配列を含む遺伝子によりコードされるタンパク質、またはそのタンパク質の判別断片、または以上の表示であってもよい。ここで、判別分子または断片は、検出されると、以上の同定された転写物、cDNA、増幅された核酸、またはタンパク質の存在または存在量を示す分子または断片である。一実施形態においては、本発明のバイオマーカープロファイルは複数のバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーは少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30種類、2〜5、3〜7種類、または15種類未満の表30のプローブセットの配列、もしくはその補体、または前記配列もしくはその補体の少なくとも5つのうちの1つを含む遺伝子、またはその判別断片、または以上の核酸配列のいずれかによりコードされるアミノ酸配列、またはかかるアミノ酸配列のいずれかの判別断片を含有する。かかるバイオマーカーはmRNA転写物、cDNAまたはいくつかの他の型の増幅された核酸またはタンパク質であってもよい。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、表30に与えられたAffymetrixプローブセット中の配列を含むいずれかの遺伝子、または表30に与えられたAffymetrixプローブセット中の配列の補体を含むいずれかの遺伝子、または前記のいずれかの判別断片に対する増幅された前記核酸のいずれかのmRNA、cDNAまたは他の型、または前記核酸によりコードされたアミノ酸配列、またはかかるタンパク質の判別断片である。
【表３０】
2008538007.tif 000146
【０４３０】
2008538007.tif 000147
【０４３１】
2008538007.tif 000148
【０４３２】
2008538007.tif 000149
【０４３３】
2008538007.tif 000150
【０４３４】
2008538007.tif 000151
【０４３５】
2008538007.tif 000152
【０４３６】
2008538007.tif 000153
【０４３７】
2008538007.tif 000154
【０４３８】
2008538007.tif 000155
【０４３９】
2008538007.tif 000156
【０４４０】
2008538007.tif 000157
【０４４１】
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【０４４２】
2008538007.tif 000159
【０４４３】
2008538007.tif 000160
【０４４４】
2008538007.tif 000161
【０４４５】
2008538007.tif 000162
【０４４６】
2008538007.tif 000163
【０４４７】
2008538007.tif 000164
【０４４８】
2008538007.tif 000165
【０４４９】
2008538007.tif 000166
【０４５０】
2008538007.tif 000167
【０４５１】
2008538007.tif 000168
【０４５２】
2008538007.tif 000169
【０４５３】
2008538007.tif 000170
【０４５４】
2008538007.tif 000171
【０４５５】
2008538007.tif 000172
【０４５６】
2008538007.tif 000173
【０４５７】
2008538007.tif 000174
【０４５８】
2008538007.tif 000175
【０４５９】
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【０４６０】
2008538007.tif 000177
【０４６１】
2008538007.tif 000178
【０４６２】
2008538007.tif 000179
【０４６３】
2008538007.tif 000180
【０４６４】
2008538007.tif 000181
【０４６５】
2008538007.tif 000182
【０４６６】
2008538007.tif 000183
【０４６７】
2008538007.tif 000184
【０４６８】
2008538007.tif 000185
【０４６９】
表30において同定された配列、遺伝子、タンパク質、およびプローブセットのそれぞれは、本明細書に参照により組み入れられる。
【０４７０】
6.7  例示のバイオマーカー組合わせ
本発明の一実施形態においては、第6.6節において同定したバイオマーカーのセットに、さらなる判定基準を適用した。具体的に説明すると、課されたさらなる判定基準は、考察下のそれぞれのバイオマーカーが、T-12時点およびT-36時点において、所定の期間に敗血症となった被験者（敗血症被験者）の間でのそれぞれのバイオマーカーに対するメジアン値と、所定の期間に敗血症にならない被験者（SIRS被験者）の間でのそれぞれのバイオマーカーに対するメジアン値との間で、少なくとも1.2倍の変化を示すという要件であった。さらに、第3の判定基準を満足するために、50％を超える訓練データセットの精度に対する低い方の95パーセンタイルおよび65％を超える検証セットの精度の点見積をいずれの測定時点でも有することにより規定される、有意な分類性能をもつバイオマーカーが少なくとも1つの多変量分析に使われなければならない。図30に記載したように、この第3のフィルター判定基準は適確なバイオマーカーを626から130に減じた。これらのバイオマーカーを表31の列2に掲げた。表31のカラム2において、バイオマーカーはそれが結合するU133 plus 2.0 プローブセットにより示されている。しかし、いくつかの実施形態において、それぞれのかかるバイオマーカーは、実際には、表31の列2に掲げられたU133 plus 2.0 プローブセットオリゴヌクレオチドプローブに対応するmRNA、cDNA、または、他のかかる核酸分子である。
【０４７１】
表31の列1に、それぞれのバイオマーカーを、ロンドン大学生物学部の遺伝子命名委員会（the Gene Nomenclature Committee、Department of Biology、University College London）が設定したヒト遺伝子命名データベース（HUGO）記号などの遺伝子名により掲げた。当技術分野では公知のように、いくつかのヒトゲノム遺伝子はU133 plus 2.0アレイの2以上のプローブセットにより表されている。さらに、U133 plus 2.0アレイのいくつかのオリゴヌクレオチドは、公知の遺伝子に対応しない発現配列タグ（EST）を表す。その結果、130の表31に掲げられたバイオマーカーは、実際は、95の異なる公知の遺伝子を表す（図30を参照）。わかっている場合には、異なるヒト遺伝子の名称を表31の列3に掲げた。
【０４７２】
表31のカラム4には、敗血症を発症する訓練集団（敗血症被験者）のT-12サンプルから測定したバイオマーカーの平均値と敗血症を発症しない訓練集団（SIRS被験者）のT-12サンプルから測定したバイオマーカーの平均値との間のメジアン倍数変化を与えた。表31のカラム5には、倍数変化の方向（ここで、「up」は敗血症被験者の平均値がSIRS被験者の平均値より大きいことを示す）を与えた。
【０４７３】
表31の列6には、敗血症を発症する訓練集団（敗血症被験者）のT-36サンプルから測定したバイオマーカーの平均値と敗血症を発症しない訓練集団（SIRS被験者）のT-36サンプルから測定したバイオマーカーの平均値との間のメジアン倍数変化を与えた。表31のカラム7には、倍数変化の方向（ここで、「up」は敗血症被験者の平均値がSIRS被験者の平均値より大きいことを示す）を与えた。
【０４７４】
特定の実施形態において、バイオマーカープロファイルは、それぞれ表32のプローブセットの1つを含有する少なくとも2つのバイオマーカー、表32のプローブセットの1つの補体を含有するバイオマーカー、または表32のプローブセットの1つの補体を含有する遺伝子によりコードされたアミノ酸配列を含有するバイオマーカーを含む。かかるバイオマーカーは、例えば、mRNA転写物、cDNAまたはいくつかの他の核酸、例えば増幅された核酸、またはタンパク質であってもよい。バイオマーカープロファイルはさらに、少なくとも2つのバイオマーカーにそれぞれ対応する特性を含む。一般に、少なくとも2つのバイオマーカーは少なくとも2つの異なる遺伝子由来である。バイオマーカーが表32に掲げられたプローブセットの配列を含む遺伝子またはその補体に基づく場合、バイオマーカーは、例えば、その遺伝子により作られた転写物、その補体、または判別断片もしくはその補体、またはそのcDNA、もしくはcDNAの判別断片、または転写物もしくはその補体の全てまたは一部分に対応する判別する増幅核酸分子、または遺伝子によりコードされるタンパク質、またはタンパク質の判別断片、または以上の表示であってもよい。さらになお、バイオマーカーは、例えば、表32に記載のプローブセット配列を含む遺伝子によりコードされるタンパク質、またはそのタンパク質の判別断片、または以上のいずれかの表示であってもよい。ここで、判別分子または断片は、検出されると、以上の同定された転写物、cDNA、増幅された核酸、またはタンパク質の存在または存在量を示す分子または断片である。一実施形態においては、本発明のバイオマーカープロファイルは複数のバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーは少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30種類、2〜5、3〜7種類、または15種類未満の表32のプローブセットの配列、もしくはその補体、または前記配列もしくはその補体の少なくとも5つのうちの1つを含む遺伝子、またはその判別断片、または以上の核酸配列のいずれかによりコードされるアミノ酸配列、またはかかるアミノ酸配列のいずれかの判別断片を含有する。かかるバイオマーカーは、例えば、mRNA転写物、cDNAまたはいくつかの他の核酸、例えば、増幅された核酸またはタンパク質であってもよい。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、表31に与えられたAffymetrixプローブセット中の配列を含むいずれかの遺伝子、または表32に与えられたAffymetrixプローブセット中の配列の補体を含むいずれかの遺伝子、または前記のいずれかの判別断片に対する増幅された前記核酸のいずれかのmRNA、cDNAまたは他の型、または前記核酸によりコードされたアミノ酸配列、またはかかるタンパク質の判別断片である。
【表３１】
2008538007.tif 000186
【０４７５】
2008538007.tif 000187
【０４７６】
2008538007.tif 000188
【０４７７】
2008538007.tif 000189
【０４７８】
2008538007.tif 000190
【０４７９】
2008538007.tif 000191
【０４８０】
2008538007.tif 000192
【０４８１】
2008538007.tif 000193
【０４８２】
2008538007.tif 000194
【０４８３】
2008538007.tif 000195
【０４８４】
表31に同定された配列、遺伝子、タンパク質、およびプローブセットはそれぞれ、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。
【０４８５】
前記の表31は本発明の選択バイオマーカーを与える。わかっている場合には、遺伝子名を与えた。下記の表32の列4は、わかっている場合、表31に掲げられたバイオマーカーのヒトヌクレオチド配列に対するGenBank(登録商標)データベースアクセッション番号を与えた。表32の列5は、わかっている場合、表31に掲げられたバイオマーカーの対応するアミノ酸配列に対するGenBank(登録商標)データベースアクセッション番号を与えた。本発明のバイオマーカーには、限定されるものでないが、表32のアクセッション番号により同定される遺伝子およびタンパク質、それらの変異体、かかる遺伝子およびタンパク質の全てまたは判別部分に対応するmRNA、cDNAまたは他の核酸および／またはペプチドの判別断片、などが含まれる。
【０４８６】
これらの遺伝子およびタンパク質アクセッション番号は、いくつかの本発明のバイオマーカーを同定する目的で与えられる。GenBank(登録商標)は公に利用しうる、the National Institutes of Health（NIH）の遺伝的配列データベースでありかつ公に利用しうるDNA配列の注釈付きコレクションである（例えば、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Nucleic Acids Research 2004 Jan l；32（l）：23-26を参照）。GenBank(登録商標)は、the International Nucleotide Sequence Database Collaborationの部分であって、これには、the DNA DataBank of Japan （DDBJ）、the European Molecular Biology Laboratory （EMBL）、および GenBank at the National Center for Biotechnology Information （NCBI）が含まれる。
【表３２】
2008538007.tif 000196
【０４８７】
2008538007.tif 000197
【０４８８】
2008538007.tif 000198
【０４８９】
2008538007.tif 000199
【０４９０】
2008538007.tif 000200
【０４９１】
2008538007.tif 000201
【０４９２】
2008538007.tif 000202
【０４９３】
2008538007.tif 000203
【０４９４】
表32に同定された配列、遺伝子、タンパク質、およびプローブセットはそれぞれ、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。
【０４９５】
6.8  さらなるフィルタリング判定基準に基づく、バイオマーカー組合わせ
第6.6節は転換者と非転換者の間を判別する例示のバイオマーカーを記載する。第6.7節は、第6.6節のバイオマーカーの例示の組合わせを記載する。第6.7節のバイオマーカーは、さらなるフィルタリング判定基準の第6.6節のバイオマーカーへの適用により同定された。本節は、第6.7節で同定されたバイオマーカーのさらなる組合わせを記載する。本節の小節で同定されるサブセクションは転換者と非転換者の間を判別する。
【０４９６】
表33は1つの例示の組合わせにおけるバイオマーカーのリストである。表33に詳述した組合わせは、表31のバイオマーカーのリストをとり、そしてさらなるフィルタリング判定基準を課することにより同定された。これらのさらなる判定基準は、考察下のそれぞれのバイオマーカーが、第6.5節に記載のT-12基線データにおいて、所定の期間に敗血症となった被験者（敗血症被験者）の間でのそれぞれのバイオマーカーに対するメジアン特性値と所定の期間に敗血症にならない被験者（SIRS被験者）の間でのそれぞれのバイオマーカーに対するメジアン値との間で、少なくとも1.2倍の変化を示すという要件を含む。さらに、T-12基線データ期間において、バイオマーカーに対するPAMスコア、CARTスコアおよびRFスコアの総和が1（unity）を超えなければならない。これらのさらなるフィルタリング判定基準を適用すると、バイオマーカーは表131に見出された130から10のバイオマーカーに減じた。
【表３３】
2008538007.tif 000204
【０４９７】
表３０〜３３の遺伝子名は以下のとおりである。
2008538007.tif 000205
【０４９８】
2008538007.tif 000206
【０４９９】
2008538007.tif 000207
【０５００】
2008538007.tif 000208
【０５０１】
2008538007.tif 000209
【０５０２】
2008538007.tif 000210
【０５０３】
2008538007.tif 000211
【０５０４】
2008538007.tif 000212
【０５０５】
2008538007.tif 000213
【０５０６】
2008538007.tif 000214
【０５０７】
2008538007.tif 000215
【０５０８】
2008538007.tif 000216
【０５０９】
2008538007.tif 000217
【０５１０】
2008538007.tif 000218
【０５１１】
2008538007.tif 000219
【０５１２】
2008538007.tif 000220
【０５１３】
2008538007.tif 000221
【０５１４】
2008538007.tif 000222
【０５１５】
2008538007.tif 000223
【０５１６】
2008538007.tif 000224
【０５１７】
表33に同定された配列、遺伝子、タンパク質、およびプローブセットはそれぞれ、本明細書に参照により組み入れられる。
【０５１８】
表34は、さらに他の例示のバイオマーカーの組合わせを掲げる。表34に詳述した組合わせは、表31のバイオマーカーのリストをとり、そしてそれぞれのバイオマーカーが対応する公知の遺伝子による注釈が付けられかつかかる遺伝子は公知の生物学的機能を有する、というさらなる要件を課することにより同定された。後者の問いかけに対する方法、表、ソフトウエアおよびその他の情報資源は、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、the Gene Ontology Consortium、（www.geneontology.org）から利用することができる。これらのさらなるフィルタリング判定基準の適用により、バイオマーカーは表31に見出された130から52のバイオマーカーに減じ、42のユニークな遺伝子配列が表された（図30を参照）。
【表３４】
2008538007.tif 000225
【０５１９】
表34において同定された配列、遺伝子、タンパク質、およびプローブセットのそれぞれは、本明細書に参照により組み入れられる
一実施形態においては、バイオマーカープロファイルは複数のバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーは集合して少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30種類、2〜5、3〜7種類、または15種類未満の表32のプローブセットの配列、もしくはその補体、または前記配列もしくはその補体の少なくとも5つのうちの1つを含む遺伝子、またはその判別断片、または以上の核酸配列のいずれかによりコードされるアミノ酸配列、またはかかるアミノ酸配列のいずれかの判別断片を含有する。かかるバイオマーカーはmRNA転写物、cDNAまたはいくつかの他の型の増幅された核酸またはタンパク質であってもよい。
【０５２０】
一実施形態においては、バイオマーカープロファイルは複数のバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーは集合して少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30種類、2〜5、3〜7種類、または15種類未満の表33のプローブセットの配列、もしくはその補体、または前記配列もしくはその補体の少なくとも5つのうちの1つを含む遺伝子、またはその判別断片、または以上の核酸配列のいずれかによりコードされるアミノ酸配列、またはかかるアミノ酸配列のいずれかの判別断片を含有する。かかるバイオマーカーは、例えば、mRNA転写物、cDNAまたはいくつかの他の型の核酸、例えば増幅された核酸またはタンパク質であってもよい。
【０５２１】
一実施形態においては、バイオマーカープロファイルは複数のバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーは集合して少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30種類、2〜5、3〜7種類、または15種類未満の表34のプローブセットの配列、もしくはその補体、または前記配列もしくはその補体の少なくとも5つのうちの1つを含む遺伝子、またはその判別断片、または以上の核酸配列のいずれかによりコードされるアミノ酸配列、またはかかるアミノ酸配列のいずれかの判別断片を含有する。かかるバイオマーカーは、例えば、mRNA転写物、cDNAまたはいくつかの他の型の核酸、例えば増幅された核酸またはタンパク質であってもよい。
【０５２２】
一実施形態においては、バイオマーカープロファイルは複数のバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーは集合して少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30種類、2〜5、3〜7種類、または15種類未満の表33または表34のプローブセットの配列、もしくはその補体、または前記配列もしくはその補体の少なくとも5つのうちの1つを含む遺伝子、またはその判別断片、または以上の核酸配列のいずれかによりコードされるアミノ酸配列、またはかかるアミノ酸配列のいずれかの判別断片を含有する。かかるバイオマーカーは、例えば、mRNA転写物、cDNAまたはいくつかの他の型の核酸、例えば増幅された核酸またはタンパク質であってもよい。
【０５２３】
一実施形態においては、バイオマーカープロファイルは、U133 plus 2.0プローブセットSLC2A3の配列もしくはその補体、またはプローブセットSLC2A3の配列を含む遺伝子もしくはその補体、またはその判別断片、または以上の核酸配列のいずれかによりコードされるアミノ酸配列、またはかかるアミノ酸配列のいずれかの判別断片を含有するバイオマーカーを含む。かかるバイオマーカーは、例えば、mRNA転写物、cDNAまたはいくつかの他の型の核酸、例えば増幅された核酸またはタンパク質であってもよい。
【０５２４】
バイオマーカーが表30、31、32、33、または34に掲げられたプローブセットの配列を含む遺伝子に基づく場合、バイオマーカーは、例えば、その遺伝子により作られた転写物、その補体、または判別断片もしくはその補体、またはそのcDNA、もしくはcDNAの判別断片、または転写物もしくはその補体の全てまたは一部分に対応する判別する増幅核酸分子、または遺伝子によりコードされるタンパク質、またはタンパク質の判別断片、または以上のいずれかの表示であってもよい。さらになお、バイオマーカーは、例えば、表30、31、32、33または34に記載のプローブセット配列を含む遺伝子によりコードされるタンパク質、またはそのタンパク質の判別断片、または以上のいずれかの表示であってもよい。ここで、判別分子または断片は、検出されると、以上の同定された転写物、cDNA、増幅された核酸、またはタンパク質の存在または存在量を示す分子または断片である。
【０５２５】
6.9  SIRSと敗血症患者における、TH1/TH2経路の示差遺伝子発現
本節は、例えば、前記の第5.10節に記載の方法を利用して、転換者と非転換者の間を判別するバイオマーカーのセットを同定するために用いた方法を記載する。概要を述べると、大きい大学の傷害センターの集中治療室に入院した97人のSIRS被験者を第6.1節に記載の方法を用いて評価した。第6.3節および第6.4節にそれぞれ記載したT-36およびT-12静的データを用いて、比較を行った。被験者を2クラスに分割した：転換者（47人）および非転換者（50人）。比較を行うために、転換者から採取した血液サンプルを、非転換者から採取したサンプルと、第6.3節および第6.4節にそれぞれ記載のとおり時間的にマッチさせた。血液サンプルを、第6.2節に記載のとおり採取して分析した。
【０５２６】
T-36またはT-12静的テストにおいて、（i）0.05以下のWilcoxon（調節済）p値、および（ii）転換者と非転換者の間で示される平均倍数1.2以上の示差発現値で、転換者と非転換者の間を判別するバイオマーカーを判別バイオマーカーのセットとして選択した。次いで、この判別バイオマーカーのセットを、the National Institutes of Healthから入手しうるDAVID2.0（その内容は本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、http：//appsl.niaid.nih.gov/david/を参照）により課された、注釈データに基づくフィルタリングルールを用いてフィルターした。具体的には、David 2.0により課された注釈データに基づくフィルタリングルールは、次に再び掲げる、第5.10節の注釈ルール4のフォームを有した。
【０５２７】
注釈ルール4：「生物学的経路X中に存在する全てのバイオマーカーを選択する」
この事例においては、この注釈データに基づくフィルタリングルールの具体的なフォームは、次のとおりであった：
「Th1/Th2生物学的経路（細胞分化経路）にある全てのバイオマーカーを選択する」
次の表35はこのTh1/Th2細胞分化経路に関わることが公知の遺伝子中にあるAffymetrix U133 plus 2.0プローブセットを掲げる。
【表３５】
2008538007.tif 000226
2008538007.tif 000227
【０５２８】
次の表36は、注釈データに基づくフィルタリングルールを適用したときに判別バイオマーカーのセットに残ったプローブセットを含有する遺伝子を同定する。
【表３６】
2008538007.tif 000228
【０５２９】
表36の遺伝子は、転換者と非転換者の間を判別するバイオマーカーを表す。さらに、これらの遺伝子はTh1/Th2 細胞分化経路中に存在する。表の結果は、臨床上類似しているが、その後敗血症を発現したSIRS患者は、ThI/Th2細胞に関係する遺伝子を、未感染のままであったSIRS患者とは異なって発現したことを示す。これらの相違は臨床上の敗血症の発症の前に起こった。Th1/Th2細胞分化経路遺伝子および関係する遺伝子の考察については、例えば、それぞれ本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Abbasら、1996、Functional diversity of helper T lymphocytes、Nature 383：787-793；FearonおよびLocksley、1996、Science 272：50-53；ならびにMossmanおよびSad、1996、Immunol. Today 17：138-146を参照されたい。
【０５３０】
6.10  RT-PCR
第6.1節において、2つのPaxgene（RNA）チューブを研究中のそれぞれの被験者からそれぞれの研究の日に採取したと記した。1つのチューブは第6.2節に記載のマイクロアレイ分析用に使用した。他のチューブはRT-PCR分析に使用した。本節において、表30に掲げられた遺伝子のうちの3つ、IL18R1、FCGR1A、およびMMP9について、RT-PCRにより得た遺伝子発現とマイクロアレイにより得た遺伝子発現値の間に相関のあることが示された。この比較においては、被験者について測定した全時点に対する両方のアッセイ（RT-PCRおよびマイクロアレイ）からの静的発現データの相関を調べて相関係数を得た。相関は「R」、すなわち、パブリックドメイン統計コンピューター言語（a public domain statistical computing language）（本明細書に参照により組み入れられる、http：//www.r-project.org/、を参照）内で、次のコードを用いて計算した：
corCalc <- function(x,y){
n <- length(x)
## if there are any missing values in the data
if(any(is.na(x)) || any(is.na(y))){
## index where missing values occur 
rm.idx <- which(is.na(x)) 
rm.idx <- c(rm.idx,which(is.na(y)))
## remove missing values x <- 
x[-rm.idx] 
y <- y[-rm.idx]
## update length 
n <- length(x)
}
R <- (n*sum(x*y)-sum(x)*sum(y))/(sqrt((n*sum(xΛ2) -
(sum(x))Λ2)*(n*sum(yΛ2) - (sum(y))Λ2))) 
return(R)
}
図31は、訓練集団全体にわたる全ての利用しうる時点を用いた、RT-PCRにより決定したIL18R1発現と、第6.2節に記載の技法を用いて決定したX206618_atプローブセットの強度との間の相関を示す。図31のそれぞれの点は、RT-PCRデータおよびマイクロアレイデータからの、訓練集団中の所与の被験者に対する遺伝子発現値である。RT-PCRとマイクロアレイデータとの間の実質的な相関が見られた。特に、RT-PCRにより決定したIL18R1の発現とX206618_atに対するマイクロアレイデータの間の全相関は0.85であった。
【０５３１】
図32は、訓練集団全体にわたる全ての利用しうる時点を用いた、RT-PCRにより決定したFCGR1Aと、第6.2節に記載の技法を用いて決定したX214511_x_at、X216950_s_at、およびX216951_atプローブセットの強度との間の相関を示す。図32のそれぞれの点は、RT-PCRデータおよびマイクロアレイデータからの、訓練集団中の所与の被験者に対する遺伝子発現値である。図32に明らかであるように、FCGR1Aの発現と表30に見出される2つのFCGR1Aプローブセット、X214511_x_atおよびX216950_s_atとの間の全相関は有意であった。特にFCGR1AとX214511_x_atの間の相関係数は0.88であった。同様に、FCGR1AとX216950_s_atの間の相関係数は0.88であった。FCGR1Aの発現と表30で見られないFCGR1Aプローブセット、X216951_atの間の相関は0.53で、これは他の2つのプローブセットのように有意でなかった。
【０５３２】
図33は、訓練集団全体にわたる全ての利用しうる時点を用いた、RT-PCRにより決定したMMP9発現と、第6.2節に記載の技法を用いて決定したX203936_s_atプローブセットの強度との間の相関を示す。図32のそれぞれの点は、RT-PCRデータおよびマイクロアレイデータからの、研究中の所与の被験者に対する遺伝子発現値である。RT-PCRとマイクロアレイデータとの間の実質的な相関が見られた。特に、RT-PCRにより決定したMMP9の発現とX203936_s_atに対するマイクロアレイデータの間の全相関は0.87であった。
【０５３３】
図34は、訓練集団全体にわたる全ての利用しうる時点を用いた、RT-PCRにより決定したCD86発現と、第6.2節に記載の技法を用いて決定したX205685_at、X205686_s_at、および X210895_s_at プローブセットの強度との間の相関を示す。図 34のそれぞれの点は、RT-PCRデータおよびマイクロアレイデータからの、研究中の所与の被験者に対する遺伝子発現値である。図34に明らかなように、CD86の発現と、表30に見出されるCD86プローブセット、210895_s_atとの間の全相関は有意であった（0.71の相関係数）。CD86の発現と、表30で見られないプローブセット、X205685_at、X205686_s_atとの間の全相関は有意でなかった（それぞれ0.66および0.56の相関係数）。
【０５３４】
一実施形態においては、本発明のバイオマーカープロファイルは、表30から選択される複数のバイオマーカーを含み、前記バイオマーカーは{X206618_at、X214511_x_at、X216950_s_at、X203936_s_at、および 210895_s_at}のセット中のプローブセットの少なくとも1つの配列、もしくはその補体、または前記配列もしくはその補体を含む遺伝子、またはその判別断片、または以上の核酸配列のいずれかによりコードされるアミノ酸配列、またはかかるアミノ酸配列のいずれかの判別断片を含有する。かかるバイオマーカーは、例えば、mRNA転写物、cDNAまたはいくつかの他の核酸、例えば、増幅された核酸またはタンパク質であってもよい。一実施形態においては、本発明のバイオマーカープロファイルは、TGFBl、IL18R1、またはFCGR1Aをコードする核酸、TGFBl、IL18R1、またはFCGR1Aの判別断片、かかる核酸の補体、かかる核酸によりコードされるタンパク質、または以上のいずれかと選択的に結合する抗体を含む。
【０５３５】
6.11  選択核酸バイオマーカーの発見
前記の実験は敗血症とSIRSの間を判別するバイオマーカーの数を同定した。この実施例においては、後に敗血症を発症する患者（「敗血症患者」）と発症しない患者（「SIRS患者」）の間を区別するバイオマーカーを確認する目的で、1つの発見プロセスを実施した。発見プロセスにおいて、SIRS患者および敗血症患者から、(i)登録日、(ii)T-60、(iii)T-36、および(iv)T-12データ時点に採取したサンプルを、第6.11.1節に記載したRT-PCRによりおよび第6.11.2節に記載したAffymetrix遺伝子チップ分析により研究した。
【０５３６】
6.11.1  RT-PCR分析
多数のサンプル中のバイオマーカーを、RT-PCRにより多時点で測定しかついくつかの異なる要領：登録の静的時間、静的T-60、静的T-36、基線T-36、および基線T-12データで分析した。RT-PCRは先の第5.4.1.2節、および 第6.10節に記載されている。これらの分析の代表的なものは、以下に詳しく記載する静的T-12データ分析である。T-12静的分析においては、バイオマーカー特性を、前記第6.4節に定義されてT-12血液サンプルと名付けられた特定の血液サンプルを用いて測定する。
【０５３７】
T-12静的分析については、96件のサンプルについて測定された72のバイオマーカーが存在した。それぞれのサンプルは集団の異なるメンバーから採取した。これらの特性のうち、15は対数変換により変換し、5は平方根変換により変換し、そして残りの52は変換しなかった。
【０５３８】
96メンバーの集団を最初に訓練セット（n=73）と検証セット（n=23）に分割した。訓練セットを用いて適当な分類アルゴリズムパラメーターを見積もる一方、訓練されたアルゴリズムを検証セットに適用して独立に性能を評価した。73件の訓練サンプルのうち、36件は敗血症と標識され、被験者が観察期間中のある時点で敗血症を発症したことを意味し、そして37件はSIRSであり、観察期間中に敗血症を発症しなかったことを意味する。表37はこれらのサンプルに対する人種、性別および年齢の分布を与える。
【表３７】
2008538007.tif 000229
【０５３９】
23件の検証サンプルについては、12件が敗血症と標識されかつ11件がSIRSと標識された。表38はこれらのサンプルに対する人種、性別および年齢の分布を与える。
【表３８】
2008538007.tif 000230
【０５４０】
訓練データ中のそれぞれのサンプルを交差検定に用いる10グループの1つにランダムに割り当てた。これらのグループ中の訓練サンプル数は6〜8であった。サンプルは、敗血症とSIRSサンプルの数が全ての群れでバランスするように割り当てた。以下にさらに詳しく記載するように、複数の異なる方法を用いて、選択バイオマーカーが敗血症とSIRSグループの間を判別するかどうかを判断した。
【０５４１】
WilcoxonとQ値検定  判別バイオマーカーを同定するために用いた最初の方法はWilcoxon検定（無調節）であった。訓練データ中の全サンプルにわたる所与のバイオマーカーについての存在量値をWilcoxon検定で処理する。Wilcoxon検定は分類（敗血症-対-SIRS）と存在量値の両方を考慮して、所与のバイオマーカーに対するp値を計算する。p値は、訓練セット中で収集したサンプル全体にわたる所与のバイオマーカーに対する存在量値がいかに巧く敗血症とSIRS状態の間を判別するかの表示を与える。p値が低いほど、判別が優れている。p値が特定の信頼レベル、例えば0.05より低いとき、バイオマーカーは敗血症とSIRS状態の間を判別するという推論がなされる。この方法を用いると、33の有意なバイオマーカーが存在した（表39を参照）。
【０５４２】
判別バイオマーカーを同定するために用いる第2の方法はWilcoxon検定（調節済）であった。72の多数のバイオマーカーと96件の比較的小さいサンプル数であるので、誤有意なバイオマーカーを見出すリスクが高かった。調節済p値を用いてこのリスクの対策を講じた。特に、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、BenjaminiおよびHochberg、1995、J.R. Statist. Soc. B 57、pp 289-300の方法を用いて誤発見率を調節した。ここで、誤発見率は、真に有意なバイオマーカー数を有意と宣言されたバイオマーカー数により除した値として定義される。例えば、もし調節済p値が0.05未満であれば、バイオマーカーが誤発見であるチャンスは5％である。この検定を用いた結果を表39に報じた。この方法を用いると27の有意なバイオマーカーが存在した（表39を参照）。本明細書に使用されるバイオマーカーは、もしそれがWilcoxon検定（調節済）により決定して0.05未満のp値を有すれば、有意と考えられる。
【０５４３】
判別バイオマーカーを同定するために用いる第3の方法は、Q値の利用である。かかる手法においては、バイオマーカーをそのq値の順に並べ、もしそれぞれのバイオマーカーがXのq値を有すれば、それぞれのバイオマーカーと全ての他のさらに有意なバイオマーカーは組合わせてXの誤発見率を有する。しかし、いずれか1つのバイオマーカーに対する誤発見率はもっと大きいことがありうる。この方法を用いると27の有意なマーカーが存在した（表39を参照）。
【表３９】
2008538007.tif 000231
【０５４４】
CART  訓練セット中の敗血症とSIRSサブ集団の間を判別するバイオマーカーを同定するために、Wilcoxon検定とQ値検定を用いてマイクロアレイデータを分析することに加えて、分類および回帰ツリー（CART）分析を用いた。CARTは前記第5.5.1節に記載されている。具体的には、以上の総括されたデータを用いて、繰り返してデータの最良の単一変数分割に基づいてデータを分配することにより、病状を予測する。言い換えれば、ツリー構築プロセスのそれぞれの段階において、訓練集団全体にわたるその発現値が敗血症とSIRS集団の間を最も良く判別するバイオマーカーを決定分岐として実施した。交差検定を、10回の繰返しのそれぞれにおいて独立して評価した最適な分割数を用いて実施した。最終ツリーを図36に示し、そして7のバイオマーカー：TNFSF13B、FCGR1A、HMOX1、MMP9、APAF1、APAF1.1、およびCCL3を用いる。
【０５４５】
図37は、訓練データセット中の敗血症とSIRSグループの間の決定ツリーに用いられる、7つのバイオマーカーの分布を示す。図37で、それぞれのボックスの頂部は訓練セット全体のデータの75パーセンタイルを示しかつそれぞれのボックスの底部は25パーセンタイルを示し、そして訓練セット全体のそれぞれのバイオマーカーのメジアン値をそれぞれのボックス内に一線として引いた。交差検定されたモデルから予測分類がなされた訓練データに対する混同行列を表40に与えた。この混同行列から、全精度は68.5%、95%信頼区間で56%〜78.9%と見積もられた。見積感度は72.2％でありかつ見積特異性は64.9%であった。
【表４０】
2008538007.tif 000232
【０５４６】
訓練データセットから戻した23件の検証サンプルについては、全精度は78.3%、95%信頼区間で56.3%〜92.5%、感度66.7％、特異性90.9%と見積もられた。表41は検証サンプルに対する混同行列を示す。
【表４１】
2008538007.tif 000233
【０５４７】
ランダムフォレスト  本発明のバイオマーカーを用いて開発できる他の決定ルールはランダムフォレスト決定ツリーである。ランダムフォレストは交差検定の代わりにブートストラップを用いるツリーに基づく方法である。それぞれの繰返しに対して、ランダムサンプル（置換により）を引いて可能な最大のツリーを成長させる。それぞれのツリーは最終クラス予測について一票を受ける。ランダムフォレストを適合させるために、いくつものツリー（例えばブートストラップ繰返し）を規定する。この事例においては、500より多く使用しないが、バーンイン期間に少なくとも50は必要である。ツリー数は訓練データの精度に基づいて選択した。このデータについては、462ツリーを用いてアルゴリズムを訓練した（図38を参照）。図38において、曲線3202はツリー数の関数として平滑化された全精度の見積である。曲線3804はツリー数の関数として平滑化されたツリー感度の曲線である。曲線3806はツリー数の関数として平滑化されたツリー特異性の曲線である。このアルゴリズムを用いると、49のバイオマーカーがノンゼロ重要度を有しそしてモデルで用いられた。ランダムフォレストアルゴリズムは訓練精度の平均減少によりバイオマーカー重要度を測定する。バイオマーカーをこの方法により順位付けして図39に示した。ランダムフォレスト法はいくつもの異なる決定ツリーを用いる。バイオマーカーは、もしそれが有意なランダムフォレスト分析からの決定ツリーの決定分岐として役立てば、判別有意性を有すると考えられる。本明細書で使用される有意なランダムフォレスト分析は、交差検定による訓練データセットに関する精度の低い方の95％信頼区間が50％を超え、かつ検証セットに関する精度の点見積が65％を越えるものである。
【０５４８】
ランダムフォレスト法を用いて開発された決定ツリーを用いる訓練データセットに対する予測混同行列を表42に与える。この混同行列から、全精度は76.7%であると見積もられた（ブートストラップ精度見積を用いる場合、信頼区間は計算できない）。見積感度は77.8%でありかつ見積特異性は75.7%であった。
【表４２】
2008538007.tif 000234
【０５４９】
訓練データセットから戻した23件の検証サンプルについては、全精度は78.3%、95%信頼区間で56.3%〜92.5%、感度75%および特異性81.8%と見積もられた。表43は検証サンプルに対する混同行列を示す。
【表４３】
2008538007.tif 000235
【０５５０】
MART  「勾配ブーストマシーン」としても知られている、多重加法回帰ツリー（MART）は同時にバイオマーカーの重要度を評価しかつ被験者サンプルを分類するために使われる。いくつかのフィッティングパラメーターがこの手法では規定されていて、それには、（i）ツリーの数、（ii）ステップサイズ（通常、「収縮」と呼ばれる）、および（iii）相互作用の程度（各ツリーのスプリットの数に関係がある）が含まれる。MARTについてのさらなる情報は前の第5.5.4節に記載されている。相互作用の程度を1に設定し、加法モデルを実行した（例えば各ツリーは1つの分割を有しかつ1つのバイオマーカーだけを使う）。
【０５５１】
相互作用を見積るためには十分機能するさらなるデータを必要としうる。ステップサイズを0.05に設定し、モデル複雑度をツリーの数により規定した。最適なツリー数は、各フィッティング繰返しにおいてランダムなケースのサブセットを外し、次いでサブセットの予測の品質を評価することにより見積もる。保証されたより多いツリーを適合させた後に、予想性能の改善が止まる点を最適点として見積もる。
【０５５２】
見積もられたモデルは、15ツリーおよび全ツリーにわたって6つのバイオマーカーを用いた。MARTアルゴリズムはまた、図40に与えたバイオマーカー重要度（和は100％となる）の計算も提供する。ゼロ重要度のバイオマーカーは除外した。図41は、選択されたバイオマーカーの敗血症とSIRSグループの間の分布を示す。
【０５５３】
交差検定を、独立してそれぞれ10回繰返しで見積もった最適ツリー数を用いて行った。予測される分類を交差検定したモデルから作った訓練データに対する混同行列を表44に与える。この混同行列から、全精度は75.3%、95%信頼区間で63.9%〜84.7%と見積もられた。見積感度は72.2％でありかつ見積特異性は78.4%であった。
【表４４】
2008538007.tif 000236
【０５５４】
訓練から戻した23件の検証サンプルについては、全精度は78.3%、95%信頼区間で56.3%〜92.5%、感度81.8%および特異性75%と見積もられた。表45は検証サンプルに対する混同行列を示す。
【表４５】
2008538007.tif 000237
【０５５５】
PAM  本発明のバイオマーカーを用いて開発されたさらに他の決定ルールは、前記第5.5.2節に記載されているマイクロアレイの予測分析（PAM）である。この方法では、サンプルを分類するために用いるバイオマーカー数の数を決定する収縮パラメーターが明記される。このパラメーターは交差検定を介して選択された。見当たらない値をもつバイオマーカーは存在しなかった。交差検定に基づくと、5のバイオマーカーに対応する最適閾値は2.12であった。図42は全ての異なる閾値にわたる精度を示す。図42において、曲線4202は全精度（95％信頼区間バーとともに）である。曲線4204は閾値の関数として決定ルール感度を示す。曲線4206は閾値の関数として決定ルール特異性を示す。2.12の閾値を用いると、訓練サンプルに対する全精度は80.8％、95%信頼区間で70.9%〜87.9%であった。見積感度は89.2％でありかつ見積特異性は72.2%であった。表46は、予測される分類が交差検定モデルから作られた訓練データ用の混同行列を示す。
【表４６】
2008538007.tif 000238
【０５５６】
訓練から戻した23件の検証サンプルについては、全精度は82.6%、95%信頼区間で61.2%〜95%、感度91.7％および特異性72.7%と見積もられた。表47は検証サンプルに対する混同行列を示す。
【表４７】
2008538007.tif 000239
【０５５７】
図43は、モデルにおけるその相対的判別力、およびその相対的重要度により順位付けされた、選択されたバイオマーカーを示す。
【０５５８】
図44は、CART、MART、PAM、およびランダムフォレスト（RF）分類アルゴリズム（決定ルール）性能および関連95％信頼区間の総括を与える。50の異なるバイオマーカーを図44に説明したアルゴリズム全体から選択した。これらの50の選択された特性の同一性を図20に示し、図45はさらにT-12データセットに対するこれらのバイオマーカーの全体順位付けを図解する。選択されたマーカーについて、x軸はそれが選択された回数の百分率を示す。バイオマーカーが選択された回数の百分率内で、バイオマーカーを順位付けした。
【０５５９】
T-12データセットおよびその他のデータセットの分析から、バイオマーカーを、CART、MART、PAM、ランダムフォレストに含まれる頻度によって順位付けした。この順位付けの結果を、次の表48に総括した。
【表４８】
2008538007.tif 000240
2008538007.tif 000241
【０５６０】
表48に示したように、全体に、T-12で重要なバイオマーカーはまた、さらに早期の時点でも重要なバイオマーカーであった。表48でイタリック字体のバイオマーカーは、次の第6.12.1節に記載の確認の前に行われたものである。この実施形態において、CD4が除外されたのは、登録日が異なることがわかったからであった。
【０５６１】
6.11.2  Affymetrix遺伝子チップ分析の発見
患者はまた、Affymetrix遺伝子チップ分析を用いて分析した。かかる分析は第6.2節に記載されている。複数サンプル中のバイオマーカーをAsymetrix遺伝子チップ分析により複数時点で測定し、そしていくつかの異なる方法：すなわち静的登録時点、静的T-60、静的T-36、基線T-60、基線T-36、および基線T-12データ点で分析した。Affymetrix遺伝子チップアッセイは、前の第6.2節に記載されている。これらの分析の代表的なものは、次に詳しく説明する静的T-12データ分析である。T-12静的分析においては、先の第6.4節でT-12血液サンプルと名付けた特定の血液サンプルを用いて、バイオマーカー特性を測定した。
【０５６２】
T-12静的分析については、90件のサンプルで測定した54,613のバイオマーカーが存在した。それぞれのサンプルは、異なるメンバー集団から採集した。これらの特性のうち、31,047種類は対数変換により変換し、2518種類は平方根変換により変換し、そして残りの21,048種類は変換しなかった。
【０５６３】
90メンバーの集団を最初に訓練セット（n=69）と検証セット（n=21）に分割した。訓練セットを用いて適当な分類アルゴリズムパラメーターを見積もる一方、訓練されたアルゴリズムを検証セットに適用して独立に性能を評価した。69件の訓練サンプルのうち、34件は敗血症と標識され、被験者が観察期間中のある時点で敗血症を発症したことを意味し、そして35件はSIRSであり、観察期間中に敗血症を発症しなかったことを意味する。表49はこれらのサンプルに対する人種、性別および年齢の分布を与える。
【表４９】
2008538007.tif 000242
【０５６４】
21件の検証サンプルについては、11件が敗血症と標識されかつ10件がSIRSと標識された。表50はこれらのサンプルに対する人種、性別および年齢の分布を与える。
【表５０】
2008538007.tif 000243
【０５６５】
訓練データ中のそれぞれのサンプルを交差検定に用いる10グループの1つにランダムに割り当てた。これらのグループ中の訓練サンプル数は6〜8であった。サンプルは、敗血症とSIRSサンプルの数が全ての群れでバランスするように割り当てた。以下にさらに詳しく記載するように、複数の異なる方法を用いて、選択バイオマーカーが敗血症とSIRSグループの間を判別するかどうかを判断した。
【０５６６】
WilcoxonとQ値検定  判別バイオマーカーを同定するために用いた最初の方法はWilcoxon検定（無調節）であった。訓練データ中の全サンプルからの所与のバイオマーカーについての存在量値をWilcoxon検定で処理した。Wilcoxon検定は分類（敗血症対SIRS）と存在量値の両方を考慮して、所与のバイオマーカーに対するp値を計算する。p値は、訓練セット中で収集されたサンプル全体にわたる所与のバイオマーカーに対する存在量値がいかに巧く敗血症とSIRS状態の間を判別するかの表示を与える。p値が低いほど、判別性が優れる。p値が特定の信頼レベル、例えば0.05より低いとき、バイオマーカーは敗血症とSIRS状態の間を判別するという推論がなされる。この方法を用いると、19,791の有意なバイオマーカーが存在した（表51を参照）。
【０５６７】
判別バイオマーカーを同定するために用いる第2の方法はWilcoxon検定（調節済）であった。54613の多数のバイオマーカーと90件の比較的小さいサンプル数であるので、誤有意なバイオマーカーを見出すリスクが高かった。調節済p値を用いてこのリスクの対策を講じた。特に、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、BenjaminiおよびHochberg、1995、J.R. Statist. Soc. B 57、pp 289-300の方法を用いて誤発見率を調節した。ここで、誤発見率は、真に有意なバイオマーカー数を有意と宣言されたバイオマーカー数により除した値として定義される。例えば、もし調節済p値が0.05未満であれば、バイオマーカーが誤発見であるチャンスは5％である。この検定を用いた結果を表51に報じた。この方法を用いると11851の有意なバイオマーカーが存在した（表51を参照）。本明細書に使用されるバイオマーカーは、もしWilcoxon検定（調節済）により決定して0.05未満のp値を有すれば、有意と考えられる。
【０５６８】
判別バイオマーカーを同定するために用いる第3の方法は、Q値の利用であった。かかる手法においては、バイオマーカーをそのq値の順に並べ、もしそれぞれのバイオマーカーがXのq値を有すれば、そこでそれぞれのバイオマーカーと全ての他のさらに有意なバイオマーカーは組合わせてXの誤発見率を有する。しかし、いずれか1つのバイオマーカーに対する誤発見率はもっと大きいことがありうる。この方法を用いると11581の有意なバイオマーカーが存在した（表51を参照）。
【表５１】
2008538007.tif 000244
【０５６９】
CART  訓練セット中の敗血症とSIRSサブ集団の間を判別するバイオマーカーを同定するために、WilcoxonおよびQ値検定を用いてマイクロアレイデータを分析することに加えて、分類および回帰ツリー（CART）分析を用いた。CARTは前記第5.5.1節に記載されている。具体的には、以上の総括されたデータを用いて、繰り返してデータの最良の単一変数分割に基づいてデータを分配することにより、病状を予測する。言い換えれば、ツリー構築プロセスのそれぞれの段階において、訓練集団全体にわたるその発現値が敗血症とSIRS集団の間を最も良く判別するバイオマーカーを決定分岐として実施した。交差検定を、10回の繰返しのそれぞれにおいて独立して評価した最適な分割数を用いて実施した。最後のツリーは、4つのプローブセット：X214681_at、X230281_at、X1007_s_at、およびX1560432_at（ここでそれぞれの所与のプローブセットはU133 plus 2.0 Affymetrixプローブセット名である）を用いる。交差検定されたCARTアルゴリズムからの最後のツリーに基づく訓練データ用の混同行列を表52に与えた。この混同行列から、全精度は65.2%、95%信頼区間で52.8%〜76.3%と見積もられた。見積感度は61.8％でありかつ見積特異性は68.6%であった。
【表５２】
2008538007.tif 000245
【０５７０】
訓練データセットから戻した21件の検証サンプルについては、全精度は71.4%、95%信頼区間で47.8%〜88.7%、感度90.9％および特異性50%と見積もられた。検証サンプルに対する混同行列は、予測される敗血症／真の敗血症＝10、予測されるSIRS／真の敗血症＝1、予測される敗血症／真のSIRS＝5、予測されるSIRS／真のSIRS＝5であった。
【０５７１】
ランダムフォレスト  本発明のバイオマーカーを用いて開発できる他の決定ルールはランダムフォレスト決定ツリーである。ランダムフォレストは交差検定の代わりにブートストラップを用いるツリーに基づく方法である。それぞれの繰返しに対して、ランダムサンプル（置換により）を引いて可能な最大のツリーを成長させる。それぞれのツリーは最終クラス予測について一票を受ける。ランダムフォレストを適合させるために、いくつものツリー（例えばブートストラップ繰返し）を規定する。この事例においては、500より多く使用しないが、バーンイン期間に少なくとも50は必要である。ツリー数は訓練データの精度に基づいて選択した。このデータについては、439ツリーを用いてアルゴリズムを訓練した。このアルゴリズムを用いると、845のバイオマーカーがノンゼロ重要度を有しそしてモデルで用いられた。ランダムフォレストアルゴリズムは訓練精度の平均減少によりバイオマーカー重要度を測定する。
【０５７２】
ランダムフォレスト法はいくつも異なる決定ツリーを用いる。バイオマーカーは、もしそれが有意なランダムフォレスト分析からの決定ツリーの決定分岐として役立てば、判別有意性を有すると考えられる。本明細書で使用される有意なランダムフォレスト分析は、訓練データセットに関する交差検定による精度の低い方の95％信頼区間が50％を超え、かつ検証セットに関する精度の点見積が65％を越えるものである。
【０５７３】
ランダムフォレスト法を用いて開発された決定ツリーを用いる訓練データセットに対する予測混同行列を表53に与える。この混同行列から、全精度は75.4%であると見積もられた（ブートストラップ精度見積を用いる場合、信頼区間は計算できない）。見積感度は73.5%でありかつ見積特異性は77.1%であった。
【表５３】
2008538007.tif 000246
【０５７４】
訓練データセットから戻した21件の検証サンプルについては、全精度76.2%、95%信頼区間で76.2%〜99.9%、感度100%、および特異性90%であると見積もられた。表54は検証サンプルに対する混同行列を示す。
【表５４】
2008538007.tif 000247
【０５７５】
MART  「勾配ブーストマシーン」としても知られている、多重加法回帰ツリー（MART）は同時にバイオマーカーの重要度を評価しかつ被験者サンプルを分類するために使われる。いくつかのフィッティングパラメーターがこの手法では規定されていて、それには、（i）ツリーの数、（ii）ステップサイズ（通常、「収縮」と呼ばれる）、および（iii）相互作用の程度（各ツリーのスプリットの数に関係がある）が含まれる。MARTについてのさらなる情報は前の第5.5.4節に記載されている。相互作用の程度を1に設定し、加法モデルを実行した（例えば各ツリーは1つの分割を有しかつ1つのバイオマーカーだけを使う）。
【０５７６】
相互作用を見積るためには十分機能するさらなるデータを必要としうる。ステップサイズを0.05に設定し、モデル複雑度をツリーの数により規定した。最適なツリー数は、各フィッティング繰返しにおいてランダムなケースのサブセットを外し、次いでサブセットの予測の品質を評価することにより見積もる。保証されたより多いツリーを適合させた後に、予想性能の改善が止まる点を最適点として見積もる。
【０５７７】
見積もられたモデルは、28ツリーおよび全ツリーにわたって17のバイオマーカーを用いた。MARTアルゴリズムはまた、バイオマーカー重要度（和は100％となる）の計算も提供する。モデルに対する重要度の下降順に並べたバイオマーカーは、最重要なバイオマーカーから始めて次の通りである：X206513_at、X214681_at、X235359_at、X221850_x_at、X213524_s_at、X225656_a、X200881_s_at、X229743_at、X215178_x_at、X215178_x_at、X216841_s_at、X216841_at、X244158_at、X238858_at、X205287_s_at、X233651_s_at、X229572_at、X214765_s_at。
【０５７８】
交差検定を、独立してそれぞれ10回繰返しで見積もった最適ツリー数を用いて行った。予測される分類を交差検定したモデルから作った訓練データに対する混同行列を表55に与える。この混同行列から、全精度は76.8%、95%信頼区間で65.1%〜86.1%と見積もられた。見積感度は76.5％でありかつ見積特異性は77.1%であった。
【表５５】
2008538007.tif 000248
【０５７９】
訓練データセットから戻した21件の検証サンプルについては、全精度は85.7%、95%信頼区間で63.7%〜97%、感度80%および特異性90.9%と見積もられた。表56は検証サンプルに対する混同行列を示す。
【表５６】
2008538007.tif 000249
【０５８０】
PAM  本発明のバイオマーカーを用いて開発されたさらに他の決定ルールは、前記第5.5.2節に記載されているマイクロアレイの予測分析（PAM）である。この方法では、サンプルを分類するために用いるバイオマーカー数の数を決定する収縮パラメーターが明記される。このパラメーターは交差検定を介して選択された。見当たらない値をもつバイオマーカーは存在しなかった。交差検定に基づくと、820のバイオマーカーに対応する最適閾値は2.1であった。
【０５８１】
2.1の閾値を用いると、訓練サンプルに対する全精度は80.9％、95%信頼区間で73.4%〜86.7%であった。見積感度は85.7％でありかつ見積特異性は76.5%であった。表57は、予測される分類が交差検定モデルから作られた訓練データ用の混同行列を示す。
【表５７】
2008538007.tif 000250
【０５８２】
訓練から戻した20件の検証サンプルについては、全精度は95.2%、95%信頼区間で76.2%〜99.9%、感度100%および特異性90%と見積もられた。表58は検証サンプルに対する混同行列を示す。
【表５８】
2008538007.tif 000251
【０５８３】
PAMにより同定されたトップ10のバイオマーカーは：最も重要度の高いもから低いものへの順に：X206513_at、X213524_s_at、X200881_s_at、X218992_at、X238858_at、X221123_x_at、X228402_at、X230585_at、X209304_x_at、X214681_atであった。
【０５８４】
図46は、Affymetrix遺伝子チップ発見訓練集団から得たT-12静的データを用いて、CART、MART、PAM、およびランダムフォレスト（RF）分類アルゴリズム（決定ルール）性能および関連95％信頼区間の総括を与える。50の異なるバイオマーカーは図46に説明したアルゴリズム全体から選択した。トップ50のバイオマーカーの同一性は、最も重要度の高いもから低いものへの順に：X204102_s_at、X236013_at、X213668_s_at、X1556639_at、X218220_at、X207860_at、X232422_at、X218578_at、X205875_s_at、X226043_at、X225879_at、X224618_at、X216316_x_at、X243159_x_at、X202200_s_at、X201936_s_at、X242492_at、X216609_at、X214328_s_at、X228648_at、X223797_at、X225622_at、X205988_at、X201978_s_at、X200874_s_at、X210105_s_at、X203913_s_at、X204225_at、X227587_at、X220865_s_at、X206682_at、X222664_at、X212264_s_at、X219669_at、X221971_x_at、X1554464_a_at、X242590_at、X227925_at、X221926_s_at、X202101_s_at、X211078_s_at、X44563_at、X206513_at、X215178_x_at、X235359_at、X225656_at、X244158_at、X214765_s_at、X229743_at、X214681_atである。
【０５８５】
T-I2データセットおよびその他のデータセットの分析から、次の表59に示した34のバイオマーカーを選択して確認した。表59に示すように、バイオマーカーは、3つの判定基準：生物学的関連（BR）、高い倍数変化（HF）、またはAffymetrix遺伝子チップ分析における統計的重要度（SI）の1つに対するAffymetrix遺伝子チップ分析に基づいて選択した。
【表５９】
2008538007.tif 000252
2008538007.tif 000253
【０５８６】
6.12  選択核酸バイオマーカーの確認
この実施例においては、どのバイオマーカーが、後に敗血症を発症する患者（敗血症患者）と発症しない患者（SIRS患者）との間を判別できるかを確認するための、確認方法を実施した。
【０５８７】
6.12.1  RT-PCRにより同定したバイオマーカーの確認分析
第6.11.1節の表48にイタリック字体で記して同定したバイオマーカー、すなわちFCGR1A、MMP9、IL18R1、ARG2、IL1RN、TNFSF13B、ITGAM、TGFBI3、CD86、およびTLR4は、複数時点でRT-PCRを用いて分析されかついくつかの異なる方法：静的登録日、静的T-60、静的T-36、基線T-60、基線T-36、および基線T-12データ点にて分析された。RT-PCRは、先の第5.4.1.2節に記載されている。これらの分析の代表的なものは、以下に詳しく記載する静的T-12データ分析である。T-12静的分析においては、バイオマーカー特性を、前記第6.4節に定義されてT-12血液サンプルと名付けられた特定の血液サンプルを用いて測定する。
【０５８８】
T-12静的分析については、50件のサンプルからバイオマーカーFCGR1A、MMP9、IL18R1、ARG2、IL1RN、TNFSF13B、ITGAM、TGFBI、CD86、およびTLR4を測定した。それぞれのサンプルは集団の異なるメンバーから採取した。これらのバイオマーカーのうち、7種類は対数変換により変換し、3種類は平方根変換により変換した。
【０５８９】
50メンバーの集団を最初に訓練セット（n=39）と検証セット（n=11）に分割した。訓練セットを用いて適当な分類アルゴリズムパラメーターを見積もる一方、訓練されたアルゴリズムを検証セットに適用して独立に性能を評価した。39件の訓練サンプルのうち、23件は敗血症と標識され、被験者が観察期間中のある時点で敗血症を発症したことを意味し、そして16件はSIRSであり、観察期間中に敗血症を発症しなかったことを意味する。表60はこれらのサンプルに対する人種、性別および年齢の分布を与える。
【表６０】
2008538007.tif 000254
【０５９０】
11件の検証サンプルについては、5件が敗血症と標識されかつ6件がSIRSと標識された。表61はこれらのサンプルに対する人種、性別および年齢の分布を与える。
【表６１】
2008538007.tif 000255
【０５９１】
訓練データ中のそれぞれのサンプルを交差検定に用いる10グループの1つにランダムに割り当てた。これらのグループ中の訓練サンプル数は3〜5であった。サンプルは、敗血症とSIRSサンプルの数が全ての群れでバランスするように割り当てた。以下にさらに詳しく記載するように、複数の異なる方法を用いて、選択バイオマーカーが敗血症とSIRSグループの間を判別するかどうかを判断した。
【０５９２】
WilcoxonとQ値検定  判別バイオマーカーを同定するために用いた最初の方法はWilcoxon検定（無調節）であった。訓練データ中の全サンプルにわたる所与のバイオマーカーについての存在量値をWilcoxon検定で処理する。Wilcoxon検定は分類（敗血症-対-SIRS）と存在量値の両方を考慮して、所与のバイオマーカーに対するp値を計算する。p値は、訓練セット中で収集したサンプル全体にわたる所与のバイオマーカーに対する存在量値がいかに巧く敗血症とSIRS状態の間を判別するかの表示を与える。p値が低いほど、判別が優れている。p値が特定の信頼レベル、例えば0.05より低いとき、バイオマーカーは敗血症とSIRS状態の間を判別するという推論がなされる。この方法を用いると、9の有意なバイオマーカーが存在した（表62を参照）。
【０５９３】
判別バイオマーカーを同定するために用いる第2の方法はWilcoxon検定（調節済）であった。10の多数のバイオマーカーと50件の比較的小さいサンプル数であるので、誤有意なバイオマーカーを見出すリスクが高かった。調節済p値を用いてこのリスクの対策を講じた。特に、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、BenjaminiおよびHochberg、1995、J.R. Statist. Soc. B 57、pp 289-300の方法を用いて誤発見率を調節した。ここで、誤発見率は、真に有意なバイオマーカー数を有意と宣言されたバイオマーカー数により除した値として定義される。例えば、もし調節済p値が0.05未満であれば、バイオマーカーが誤発見であるチャンスは5％である。この検定を用いた結果を表62に報じた。この方法を用いると9の有意なバイオマーカーが存在した（表62を参照）。本明細書に使用されるバイオマーカーは、もしそれがWilcoxon検定（調節済）により決定して0.05未満のp値を有すれば、有意と考えられる。
【０５９４】
判別バイオマーカーを同定するために用いる第3の方法は、Q値の利用である。かかる手法においては、バイオマーカーをそのq値の順に並べ、もしそれぞれのバイオマーカーがXのq値を有すれば、それぞれのバイオマーカーと全ての他のさらに有意なバイオマーカーは組合わせてXの誤発見率を有する。しかし、いずれか1つのバイオマーカーに対する誤発見率はもっと大きいことがありうる。この方法を用いると9の有意なマーカーが存在した（表62を参照）。
【表６２】
2008538007.tif 000256
【０５９５】
CART  訓練セット中の敗血症とSIRSサブ集団の間を判別するバイオマーカーを同定するために、Wilcoxon検定とQ値検定を用いてマイクロアレイデータを分析することに加えて、分類および回帰ツリー（CART）分析を用いた。CARTは前記第5.5.1節に記載されている。具体的には、以上の総括されたデータを用いて、繰り返してデータの最良の単一変数分割に基づいてデータを分配することにより、病状を予測する。言い換えれば、ツリー構築プロセスのそれぞれの段階において、訓練集団全体にわたるその発現値が敗血症とSIRS集団の間を最も良く判別するバイオマーカーを決定分岐として実施した。交差検定を、10回の繰返しのそれぞれにおいて独立して評価した最適な分割数を用いて実施した。最終ツリーは、重要度の順に掲げた3つのバイオマーカー、IL18R15、ARG2、および FCGR1Aを用いるが、IL18R1が最も重要であった。交差検定されたCARTアルゴリズムからの最終ツリーに基づく、訓練データに対する混同行列を表63に与える。この混同行列から、全精度は82.1％、95％信頼区間で66.5%〜92.5%と見積もられた。見積感度は82.6％でありかつ見積特異性は81.2％であった。
【表６３】
2008538007.tif 000257
【０５９６】
訓練データセットから戻した11件の検証サンプルについては、全精度は100%、95%信頼区間で71.5%〜100%、感度100%、特異性100%と見積もられた。表64は検証サンプルに対する混同行列を示す。
【表６４】
2008538007.tif 000258
【０５９７】
ランダムフォレスト  本発明のバイオマーカーを用いて開発できる他の決定ルールはランダムフォレスト決定ツリーである。ランダムフォレストは交差検定の代わりにブートストラップを用いるツリーに基づく方法である。それぞれの繰返しに対して、ランダムサンプル（置換により）を引いて可能な最大のツリーを成長させる。それぞれのツリーは最終クラス予測について一票を受ける。ランダムフォレストを適合させるために、いくつものツリー（例えばブートストラップ繰返し）を規定する。
【０５９８】
このデータに対して、1000ツリーを用いてアルゴリズムを訓練した。
【０５９９】
このアルゴリズムを用いて、10のうち9のバイオマーカーはノンゼロ重要度を有しそしてモデルで用いられた。バイオマーカー重要度は、最大のものから下降順に次のとおりであった：TGFBl、MMP9、TLR4、IL1RN、TNFSF、ARG2、FCGR1A、およびIL18R1。
【０６００】
ランダムフォレスト法はいくつもの異なる決定ツリーを用いる。バイオマーカーは、もしそれが有意なランダムフォレスト分析からの決定ツリーの決定分岐として役立てば、判別有意性を有すると考えられる。本明細書で使用される有意なランダムフォレスト分析は、交差検定による訓練データセットに関する精度の低い方の95％信頼区間が50％を超え、かつ検証セットに関する精度の点見積が65％を越えるものである。
【０６０１】
ランダムフォレスト法を用いて開発された決定ツリーを用いる訓練データセットに対する予測混同行列を表65に与える。この混同行列から、全精度は79.5%、95%信頼区間で63.5%〜90.7％であると見積もられた。見積感度は87％でありかつ見積特異性は68.8％であった。
【表６５】
2008538007.tif 000259
【０６０２】
訓練データセットから戻した11件の検証サンプルについては、全精度は81.8%、95%信頼区間で48.2%〜97.7%、感度60%および特異性100%と見積もられた。表66は検証サンプルに対する混同行列を示す。
【表６６】
2008538007.tif 000260
【０６０３】
MART  「勾配ブーストマシーン」としても知られている、多重加法回帰ツリー（MART）は同時にバイオマーカーの重要度を評価しかつ被験者サンプルを分類するために使われる。いくつかのフィッティングパラメーターがこの手法では規定されていて、それには、（i）ツリーの数、（ii）ステップサイズ（通常、「収縮」と呼ばれる）、および（iii）相互作用の程度（各ツリーのスプリットの数に関係がある）が含まれる。MARTについてのさらなる情報は前の第5.5.4節に記載されている。相互作用の程度を1に設定し、加法モデルを実行した（例えば各ツリーは1つの分割を有しかつ1つのバイオマーカーだけを使う）。
【０６０４】
相互作用を見積るためには十分機能するさらなるデータを必要としうる。ステップサイズを0.05に設定し、モデル複雑度をツリーの数により規定した。最適なツリー数は、各フィッティング繰返しにおいてランダムなケースのサブセットを外し、次いでサブセットの予測の品質を評価することにより見積もる。保証されたより多いツリーを適合させた後に、予想性能の改善が止まる点を最適点として見積もる。
【０６０５】
見積もられたモデルは、30ツリーおよび全ツリーにわたって7つのバイオマーカーを用いた。MARTアルゴリズムはまた、バイオマーカー重要度（和は100％となる）の計算も提供する。モデルに対する重要度の下降順に順位付けしたバイオマーカーは、最重要なバイオマーカーから始めて次のとおりであった：ITGAM、TGFBl、TLR4、TNFSF、FCGR1A、IL18R1、およびARG2。
【０６０６】
交差検定を、独立してそれぞれ10回繰返しで見積もった最適ツリー数を用いて行った。予測される分類を交差検定したモデルから作った訓練データに対する混同行列を表67に与える。この混同行列から、全精度は74.4%、95%信頼区間で57.9%〜87%と見積もられた。見積感度は73.8％でありかつ見積特異性は68.8%であった。
【表６７】
2008538007.tif 000261
【０６０７】
訓練から戻した11件の検証サンプルについては、全精度は74.4%、95%信頼区間で57.9%〜87%、感度78.3%および特異性68.8%と見積もられた。表68は検証サンプルに対する混同行列を示す。
【表６８】
2008538007.tif 000262
【０６０８】
PAM  本発明のバイオマーカーを用いて開発されたさらに他の決定ルールは、前記第5.5.2節に記載されているマイクロアレイの予測分析（PAM）である。この方法では、サンプルを分類するために用いるバイオマーカー数の数を決定する収縮パラメーターが明記される。このパラメーターは交差検定を介して選択された。見当たらない値をもつバイオマーカーは存在しなかった。交差検定に基づくと、9のバイオマーカーに対応する最適閾値は0.55であった。
【０６０９】
0.55の閾値を用いると、訓練サンプルに対する全精度は82.3％、95%信頼区間で68.8%〜90.7%であると見積もられた。見積感度は68.8％でありかつ見積特異性は91.3%であった。表69は、予測される分類が交差検定モデルから作られた訓練データ用の混同行列を示す。表69は予測される分類が交差検定されたモデルから作られた、訓練データ用の混同行列を示す。
【表６９】
2008538007.tif 000263
【０６１０】
訓練から戻した11件の検証サンプルについては、全精度は72.67%、95%信頼区間で39%〜94%、感度40%および特異性100%と見積もられた。表70は検証サンプルに対する混同行列を示す。
【表７０】
2008538007.tif 000264
【０６１１】
PAMにより同定されたトップ９のバイオマーカーを重要度の最高のものから下降順に並べると次の通りである：ARG2、TGFBl、MMP9、TLR4、ITGAM、IL18R1、TNFSF、IL1RN、およびFCGR1A。図47は、Affymetrix遺伝子チップ確認訓練集団から得たT-12静的データを用いるCART、MART、PAM、およびランダムフォレスト（RF）分類アルゴリズム（決定ルール）性能および関連する95％信頼区間の総括を与える。図47に総括したおよびその他の時点におけるRT-PCR分析の結果に基づいて、この確認方法において研究下の全ての10のバイオマーカーは有意であった。いくつかのバイオマーカーはT-60のような早い時点で判別した。
【０６１２】
6.12.2  Affymetrix遺伝子チップ分析により同定したバイオマーカーの確認分析
第6.11.2節の表59で同定された34のバイオマーカーおよび第6.11.1節の表48で同定された10のバイオマーカー（FCGR1A、MMP9、IL18R1、ARG2、IL1RN、TNFSF13B、ITGAM、TGFBI、CD86、およびTLR4）、全44のバイオマーカーを、複数時点にてRT-PCRを用いて分析しかつ複数の方法：静的登録時、静的T-60、静的T-36、基線T-60、基線T-36、および基線T-12データ点で分析した。RT-PCRは先の第5.4.1.2節に記載されている。これらの分析の代表的なものは、次に詳しく記載した静的T-12データ分析である。T-12静的分析においては、先の第6.4節でT-12血液サンプルと名付けた特定の血液サンプルを用いて、バイオマーカー特性を測定した。
【０６１３】
T-12静的分析については、37件のサンプルで測定した44のバイオマーカーが存在した。それぞれのサンプルは、異なるメンバー集団から採集した。これらの特性のうち、23種類は対数変換により変換し、21種類は平方根変換により変換した。
【０６１４】
37メンバー集団を最初に訓練セット（n=28）と検証セット（n=9）に分割した。訓練セットを用いて適当な分類アルゴリズムパラメーターを見積もる一方、訓練されたアルゴリズムを検証セットに適用して独立に性能を評価した。28件の訓練サンプルのうち、14件は敗血症と標識され、被験者が観察期間中のある時点で敗血症を発症したことを意味し、そして14件はSIRSであり、観察期間中に敗血症を発症しなかったことを意味する。表71はこれらのサンプルに対する人種、性別および年齢の分布を与える。
【表７１】
2008538007.tif 000265
【０６１５】
9件の検証サンプルについては、5件が敗血症と標識されかつ4件がSIRSと標識された。表72はこれらのサンプルに対する人種、性別および年齢の分布を与える。
【表７２】
2008538007.tif 000266
【０６１６】
訓練データ中のそれぞれのサンプルを交差検定に用いる10グループの1つにランダムに割り当てた。これらのグループ中の訓練サンプル数は2〜4であった。サンプルは、敗血症とSIRSサンプルの数が全ての群れでバランスするように割り当てた。以下にさらに詳しく記載するように、複数の異なる方法を用いて、選択バイオマーカーが敗血症とSIRSグループの間を判別するかどうかを判断した。
【０６１７】
WilcoxonとQ値検定  判別バイオマーカーを同定するために用いた最初の方法はWilcoxon検定（無調節）であった。訓練データ中の全サンプルからの所与のバイオマーカーについての存在量値をWilcoxon検定で処理した。Wilcoxon検定は分類（敗血症対SIRS）と存在量値の両方を考慮して、所与のバイオマーカーに対するp値を計算する。p値は、訓練セット中で収集されたサンプル全体にわたる所与のバイオマーカーに対する存在量値がいかに巧く敗血症とSIRS状態の間を判別するかの表示を与える。p値が低いほど、判別性が優れる。p値が特定の信頼レベル、例えば0.05より低いとき、バイオマーカーは敗血症とSIRS状態の間を判別するという推論がなされる。この方法を用いると、38の有意なバイオマーカーが存在した（表73を参照）。
【０６１８】
判別バイオマーカーを同定するために用いる第2の方法はWilcoxon検定（調節済）であった。44の多数のバイオマーカーと37件の比較的小さいサンプル数であるので、誤有意なバイオマーカーを見出すリスクが高かった。調節済p値を用いてこのリスクの対策を講じた。特に、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、BenjaminiおよびHochberg、1995、J.R. Statist. Soc. B 57、pp 289-300の方法を用いて誤発見率を調節した。ここで、誤発見率は、真に有意なバイオマーカー数を有意と宣言されたバイオマーカー数により除した値として定義される。例えば、もし調節済p値が0.05未満であれば、バイオマーカーが誤発見であるチャンスは5％である。この検定を用いた結果を表73に報じた。この方法を用いると38の有意なバイオマーカーが存在した（表73を参照）。本明細書に使用されるバイオマーカーは、もしWilcoxon検定（調節済）により決定して0.05未満のp値を有すれば、有意と考えられる。
【０６１９】
判別バイオマーカーを同定するために用いる第3の方法は、Q値であった。第3の手法においては、バイオマーカーをそのq値の順に並べ、もしそれぞれのバイオマーカーがXのq値を有すれば、そこでそれぞれのバイオマーカーと全ての他のさらに有意なバイオマーカーは組合わせてXの誤発見率を有する。しかし、いずれか1つのバイオマーカーに対する誤発見率はもっと大きいことがありうる。この方法を用いると38の有意なバイオマーカーが存在した（表73を参照）。
【表７３】
2008538007.tif 000267
【０６２０】
CART  訓練セット中の敗血症とSIRSサブ集団の間を判別するバイオマーカーを同定するために、WilcoxonおよびQ値検定を用いてマイクロアレイデータを分析することに加えて、分類および回帰ツリー（CART）分析を用いた。CARTは前記第5.5.1節に記載されている。具体的には、以上の総括されたデータを用いて、繰り返してデータの最良の単一変数分割に基づいてデータを分配することにより、病状を予測する。言い換えれば、ツリー構築プロセスのそれぞれの段階において、訓練集団全体にわたるその発現値が敗血症とSIRS集団の間を最も良く判別するバイオマーカーを決定分岐として実施した。交差検定を、10回の繰返しのそれぞれにおいて独立して評価した最適な分割数を用いて実施した。最後のツリーは、3つのプローブセット、重要度の順に掲げると、OSM、HLA-DRA、および IL-18を用い、そのうちでOSMが最も重要であった。交差検定されたCARTアルゴリズムからの最後のツリーに基づく訓練データ用の混同行列を表74に与えた。この混同行列から、全精度は67.9%、95%信頼区間で47.6%〜84.1%と見積もられた。見積感度は64.3％でありかつ見積特異性は71.4%であった。
【表７４】
2008538007.tif 000268
【０６２１】
訓練データセットから戻した9件の検証サンプルについては、全精度は88.9%、95%信頼区間で51.8%〜99.7%、感度75%および特異性100%と見積もられた。表75は検証サンプルに対する混同行列を示す。
【表７５】
2008538007.tif 000269
【０６２２】
ランダムフォレスト  本発明のバイオマーカーを用いて開発できる他の決定ルールはランダムフォレスト決定ツリーである。ランダムフォレストは交差検定の代わりにブートストラップを用いるツリーに基づく方法である。それぞれの繰返しに対して、ランダムサンプル（置換により）を引いて可能な最大のツリーを成長させる。それぞれのツリーは最終クラス予測について一票を受ける。ランダムフォレストを適合させるために、いくつものツリー（例えばブートストラップ繰返し）を規定する。
【０６２３】
このデータについては、1000ツリーを用いてアルゴリズムを訓練した。このアルゴリズムを用いると、44のうちの35のバイオマーカーがノンゼロ重要度を有しそしてモデルで用いられた。バイオマーカー重要度は、最大のものから下降順に次のとおりであった：OSM、GADD45B、ARG2、JLl8Rl、TDRD9、PFKFB3、MAPK14、PRV1、MAP2K6、TNFRSF6、FCGR1A、INSL3、LY96、PSTPIP2、ANKRD22、TNFSF10、HLA-DRA、FNDC3B、TIFA、GADD45A、VNN1、ITGAM、BCL2A1、TLR4、TNFSF13B、SOCS3、IL1RN、CEACAM1、およびSOD2。
【０６２４】
ランダムフォレスト法はいくつも異なる決定ツリーを用いる。バイオマーカーは、もしそれが有意なランダムフォレスト分析からの決定ツリーの決定分岐として役立てば、判別有意性を有すると考えられる。本明細書で使用される有意なランダムフォレスト分析は、訓練データセットに関する交差検定による精度の低い方の95％信頼区間が50％を超え、かつ検証セットに関する精度の点見積が65％を越えるものである。
【０６２５】
ランダムフォレスト法を用いて開発された決定ツリーを用いる訓練データセットに対する予測混同行列を表76に与える。この混同行列から、全精度は78.6%であると見積もられた。見積感度は78.6%でありかつ見積特異性は78.6%であった。
【表７６】
2008538007.tif 000270
【０６２６】
訓練データセットから戻した9件の検証サンプルについては、全精度77.8%、95%信頼区間で40.0%〜97.2%、感度50%、および特異性100%であると見積もられた。表77は検証サンプルに対する混同行列を示す。
【表７７】
2008538007.tif 000271
【０６２７】
MART  「勾配ブーストマシーン」としても知られている、多重加法回帰ツリー（MART）は同時にバイオマーカーの重要度を評価しかつ被験者サンプルを分類するために使われる。いくつかのフィッティングパラメーターがこの手法では規定されていて、それには、（i）ツリーの数、（ii）ステップサイズ（通常、「収縮」と呼ばれる）、および（iii）相互作用の程度（各ツリーのスプリットの数に関係がある）が含まれる。MARTについてのさらなる情報は前の第5.5.4節に記載されている。相互作用の程度を1に設定し、加法モデルを実行した（例えば各ツリーは1つの分割を有しかつ1つのバイオマーカーだけを使う）。
【０６２８】
相互作用を見積るためには十分機能するさらなるデータを必要としうる。ステップサイズを0.05に設定し、モデル複雑度をツリーの数により規定した。最適なツリー数は、各フィッティング繰返しにおいてランダムなケースのサブセットを外し、次いでサブセットの予測の品質を評価することにより見積もる。保証されたより多いツリーを適合させた後に、予想性能の改善が止まる点を最適点として見積もる。
【０６２９】
見積もられたモデルは、21ツリーおよび全ツリーにわたって9つのバイオマーカーを用いた。MARTアルゴリズムはまた、バイオマーカー重要度（和は100％となる）の計算も提供する。モデルに対する重要度の下降順に順位付けしたバイオマーカーは、最重要なバイオマーカーから始めて次のとおりであった：ARG2、GADD45B、OSM、LY96、INSL3、ANKRD22、MAP2K6、PSTPIP2、およびTGFBl。
【０６３０】
交差検定を、独立してそれぞれ10回繰返しで見積もった最適ツリー数を用いて行った。予測される分類を交差検定したモデルから作った訓練データに対する混同行列を表78に与える。この混同行列から、全精度は75%、95%信頼区間で55.1%〜89.3%と見積もられた。見積感度は71.4％でありかつ見積特異性は78.8%であった。
【表７８】
2008538007.tif 000272
【０６３１】
訓練から戻した9件の検証サンプルについては、全精度は88.9%、95%信頼区間で51.8%〜99.7%、感度100%および特異性75%と見積もられた。表79は検証サンプルに対する混同行列を示す。
【表７９】
2008538007.tif 000273
【０６３２】
PAM  本発明のバイオマーカーを用いて開発されたさらに他の決定ルールは、前記第5.5.2節に記載されているマイクロアレイの予測分析（PAM）である。この方法では、サンプルを分類するために用いるバイオマーカー数の数を決定する収縮パラメーターが明記される。このパラメーターは交差検定を介して選択された。見当たらない値をもつバイオマーカーは存在しなかった。交差検定に基づくと、6のバイオマーカーに対応する最適閾値は2.05であった。
【０６３３】
2.05の閾値を用いると、訓練サンプルに対する全精度は82.5％、95%信頼区間で68.7%〜91%であると見積もられた。見積感度は78.6％でありかつ見積特異性は85.7％であった。表69は、予測される分類が交差検定モデルから作られた訓練データ用の混同行列を示す。表80は予測される分類が交差検定されたモデルから作られた、訓練データ用の混同行列を示す。
【表８０】
2008538007.tif 000274
【０６３４】
訓練から戻した9件の検証サンプルについては、全精度は77.8%、95%信頼区間で40%〜97.2%、感度50%および特異性100%と見積もられた。表81は検証サンプルに対する混同行列を示す。
【表８１】
2008538007.tif 000275
【０６３５】
PAMにより同定されたトップ6のバイオマーカーを重要度の最高のものから下降順に並べると次の通りである：GADD45B、TDRD9、MAP2K6、OSM、TNFSF10、および ANKRD22。図48は、本節で分析した44のバイオマーカーに対するT-12静的データを用いる、CART、MART、PAM、およびランダムフォレスト（RF）分類アルゴリズム（決定ルール）性能および関連する95％信頼区間の総括を与える。図48に総括したおよびその他の時点におけるRT-PCR分析の結果に基づいて、この確認方法において研究下の全ての44のバイオマーカーは有意であった。いくつかのバイオマーカーはT-60のような早い時点で判別した。
【０６３６】
6.13  選択タンパク質バイオマーカー
この実施例においては、どのタンパク質に基づくバイオマーカーが、後に敗血症を発症する患者（「敗血症患者」）と発症しない患者（「SIRS患者」）の間を区別するかを確認する目的で、実験を実施した。発見方法において、サンプルを、第6.13.1節に記載したビーズに基づくタンパク質イムノアッセイにより分析した。
【０６３７】
6.13.1  ビーズに基づくタンパク質イムノアッセイを用いるタンパク質バイオマーカーの発見
多重分析（Multiplex Analysis）
バイオマーカーのセットを、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる米国特許第5,981,180号（「180号特許」）、特にその一般手法、ビーズ技法、システムハードウエアおよび抗体検出に対する教示を用いて、同時にリアルタイムで分析した。この分析については、異なる微粒子のセットから構成される微粒子のマトリックスを合成した。それぞれの微粒子のセットは、微粒子表面上に固定されかつ様々な量の2種の蛍光色素を結合させてカラーコードを付した異なる抗体捕獲試薬の数千の分子を有した。2種の蛍光色素の比はそれぞれの微粒子のセットに対して異なる放出スペクトルを与え、様々な微粒子のセットをプールした後のセット内の微粒子の同定を可能にした。米国特許第6,268,222号および第6,599,331号、特に多重分析のために微粒子を標識する様々な方法の教示について、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。
【０６３８】
標識されたビーズのセットをプールして個体から得た血漿サンプルと組み合わせた。標識されたビーズは、それぞれの微粒子を蛍光体標識を励起するレーザービームを用いて問いかけるフローデバイスを介する単一ファイルを通過させることにより同定された。次いで光学検出器はそれぞれのビーズの放出スペクトルを測定してそのビーズを適当なセットに分類した。それぞれの抗体捕獲試薬の同一性はそれぞれの微粒子のセットについてわかっているので、それぞれの抗体特異性をフローデバイスを通過する個々の微粒子とマッチさせた。米国特許第6,592,822号も、そして特にこのタイプの多重分析に利用しうる多重分析質診断システムの教示について、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。
【０６３９】
所与の微粒子のセットと結合する分析質の量を決定するために、レポーター分子を加えてそれぞれの分析質と結合する抗体と複合体を形成させた。本実施例におけるレポーター分子は蛍光体標識した二次抗体であった。レポーター上の蛍光体を異なる励起波長を有する二次レーザーにより励起し、二次抗体上の蛍光体標識が微粒子を標識するための蛍光体標識と区別されるようにした。二次光学検出器は二次抗体上の蛍光体標識からの放出を測定して、捕獲抗体が結合した分析質と複合化した二次抗体の量を決定した。この要領で、ビーズに捕獲された多重分析質の量を単一反応で測定することができる。
【０６４０】
データ分析と結果
それぞれのサンプルについて、複数の異なる抗体を結合した分析質の濃度を測定した。それぞれの分析質はバイオマーカーであり、そしてサンプル中のそれぞれの分析質の濃度はそのバイオマーカーの特性であってもよい。バイオマーカーは、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、米国特許公開第U.S. 2004/0096917 Al号の表14に掲げられた選択抗体試薬を用いて分析した。これらの抗体試薬はRules Based Medicine（Austin、Texas）から市販されている。抗体試薬は、（1）循環中の血液のタンパク質バイオマーカー成分、（2）様々な病原体と結合する分子と通常結合する循環中の抗体（示された、それぞれのバイオマーカーが結合する病原体により同定される）、または（3）様々な病状に関連する自己抗体バイオマーカーのいずれかと特異的に結合するとして分類される。個体をSIRSまたは敗血症グループへ分類する決定ルールを伝えることができる特性を同定するために様々な手法を利用しうる。選んだ方法はCART、MART、PAMおよびランダムフォレストであった。
【０６４１】
多数のサンプル中のバイオマーカーを、前記のアッセイを用いて多時点で測定しかついくつかの異なる要領：登録の静的時間、静的T-60、静的T-36、基線T-36、および基線T-12データで分析した。これらの分析の代表的なものは、以下に詳しく記載する静的T-12データ分析である。T-12静的分析においては、バイオマーカー特性を、前記第6.4節に定義されてT-12血液サンプルと名付けられた特定の血液サンプルを用いて測定する。
【０６４２】
T-12静的分析のために、97件のサンプルについて測定した60のバイオマーカーが存在した。それぞれのサンプルは集団の異なるメンバーから採取した。これらの特性のうち、53種類は対数変換により変換し、11種類は平方根変換により変換し、そして残りの2種類は変換しなかった。
【０６４３】
97メンバーの集団を最初に訓練セット（n=74）と検証セット（n=23）に分割した。訓練セットを用いて適当な分類アルゴリズムパラメーターを見積もる一方、訓練されたアルゴリズムを検証セットに適用して独立に性能を評価した。74件の訓練サンプルのうち、36件は敗血症と標識され、被験者が観察期間中のある時点で敗血症を発症したことを意味し、そして38件はSIRSであり、観察期間中に敗血症を発症しなかったことを意味する。表82はこれらのサンプルに対する人種、性別および年齢の分布を与える。
【表８２】
2008538007.tif 000276
【０６４４】
23件の検証サンプルについては、12件が敗血症と標識されかつ11件がSIRSと標識された。表83はこれらのサンプルに対する人種、性別および年齢の分布を与える。
【表８３】
2008538007.tif 000277
【０６４５】
訓練データ中のそれぞれのサンプルを交差検定に用いる10グループの1つにランダムに割り当てた。これらのグループ中の訓練サンプル数は6〜8であった。サンプルは、敗血症とSIRSサンプルの数が全ての群れでバランスするように割り当てた。以下にさらに詳しく記載するように、複数の異なる方法を用いて、選択バイオマーカーが敗血症とSIRSグループの間を判別するかどうかを判断した。
【０６４６】
WilcoxonとQ値検定  判別バイオマーカーを同定するために用いた最初の方法はWilcoxon検定（無調節）であった。訓練データ中の全サンプルにわたる所与のバイオマーカーについての存在量値をWilcoxon検定で処理する。Wilcoxon検定は分類（敗血症-対-SIRS）と存在量値の両方を考慮して、所与のバイオマーカーに対するp値を計算する。p値は、訓練セット中で収集したサンプル全体にわたる所与のバイオマーカーに対する存在量値がいかに巧く敗血症とSIRS状態の間を判別するかの表示を与える。p値が低いほど、判別が優れている。p値が特定の信頼レベル、例えば0.05より低いとき、バイオマーカーは敗血症とSIRS状態の間を判別するという推論がなされる。この方法を用いると、24の有意なバイオマーカーが存在した（表84を参照）。
【０６４７】
判別バイオマーカーを同定するために用いる第2の方法はWilcoxon検定（調節済）であった。60の多数のバイオマーカーと97件の比較的小さいサンプル数であるので、誤有意なバイオマーカーを見出すリスクが高かった。調節済p値を用いてこのリスクの対策を講じた。特に、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、BenjaminiおよびHochberg、1995、J.R. Statist. Soc. B 57、pp 289-300の方法を用いて誤発見率を調節した。ここで、誤発見率は、真に有意なバイオマーカー数を有意と宣言されたバイオマーカー数により除した値として定義される。例えば、もし調節済p値が0.05未満であれば、バイオマーカーが誤発見であるチャンスは5％である。この検定を用いた結果を表84に報じた。この方法を用いると16の有意なバイオマーカーが存在した（表84を参照）。本明細書に使用されるバイオマーカーは、もしそれがWilcoxon検定（調節済）により決定して0.05未満のp値を有すれば、有意と考えられる。
【０６４８】
判別バイオマーカーを同定するために用いる第3の方法は、Q値の利用である。かかる手法においては、バイオマーカーをそのq値の順に並べ、もしそれぞれのバイオマーカーがXのq値を有すれば、それぞれのバイオマーカーと全ての他のさらに有意なバイオマーカーは組合わせてXの誤発見率を有する。しかし、いずれか1つのバイオマーカーに対する誤発見率はもっと大きいことがありうる。この方法を用いると16の有意なマーカーが存在した（表84を参照）。
【表８４】
2008538007.tif 000278
【０６４９】
CART  訓練セット中の敗血症とSIRSサブ集団の間を判別するバイオマーカーを同定するために、Wilcoxon検定とQ値検定を用いてマイクロアレイデータを分析することに加えて、分類および回帰ツリー（CART）分析を用いた。CARTは前記第5.5.1節に記載されている。具体的には、以上の総括されたデータを用いて、繰り返してデータの最良の単一変数分割に基づいてデータを分配することにより、病状を予測する。言い換えれば、ツリー構築プロセスのそれぞれの段階において、訓練集団全体にわたるその発現値が敗血症とSIRS集団の間を最も良く判別するバイオマーカーを決定分岐として実施した。交差検定を、10回の繰返しのそれぞれにおいて独立して評価した最適な分割数を用いて実施した。最終ツリーを図49に示し、そして10のバイオマーカー：MlP1、トロンボポエチン、C反応性タンパク質、IL-10、IL-16、β-2ミクログロブリン、αフェトプロテイン、IL-6、アジポネクチン、およびICAM1を用いる。
【０６５０】
図50は、訓練データセット中の敗血症とSIRSグループの間の決定ツリーに用いられる、10のバイオマーカーの分布を示す。図50で、それぞれのボックスの頂部は訓練セット全体のデータの75パーセンタイルを示しかつそれぞれのボックスの底部は25パーセンタイルを示し、そして訓練セット全体のそれぞれのバイオマーカーのメジアン値をそれぞれのボックス内に一線として引いた。交差検定されたモデルから予測分類がなされた訓練データに対する混同行列を表85に与えた。この混同行列から、全精度は63.5%、95%信頼区間で51.5%〜74.4%と見積もられた。見積感度は66.7％でありかつ見積特異性は60.5%であった。
【表８５】
2008538007.tif 000279
【０６５１】
訓練データセットから戻した23件の検証サンプルについては、全精度は65.2%、95%信頼区間で42.7%〜83.6%、感度66.7％、特異性63.6%と見積もられた。表86は検証サンプルに対する混同行列を示す。
【表８６】
2008538007.tif 000280
【０６５２】
ランダムフォレスト  本発明のバイオマーカーを用いて開発できる他の決定ルールはランダムフォレスト決定ツリーである。ランダムフォレストは交差検定の代わりにブートストラップを用いるツリーに基づく方法である。それぞれの繰返しに対して、ランダムサンプル（置換により）を引いて可能な最大のツリーを成長させる。それぞれのツリーは最終クラス予測について一票を受ける。ランダムフォレストを適合させるために、いくつものツリー（例えばブートストラップ繰返し）を規定する。この事例においては、500より多く使用しないが、バーンイン期間に少なくとも50は必要である。ツリー数は訓練データの精度に基づいて選択した。このデータについては、64ツリーを用いてアルゴリズムを訓練した（図51を参照）。図51において、曲線4802はツリー数の関数として平滑化された全精度の見積である。曲線4804はツリー数の関数として平滑化されたツリー感度の曲線である。曲線4806はツリー数の関数として平滑化されたツリー特異性の曲線である。このアルゴリズムを用いると、34のバイオマーカーがノンゼロ重要度を有しそしてモデルで用いられた。ランダムフォレストアルゴリズムは訓練精度の平均減少によりバイオマーカー重要度を測定する。バイオマーカーをこの方法により順位付けして図52に示した。ランダムフォレスト法はいくつもの異なる決定ツリーを用いる。バイオマーカーは、もしそれが有意なランダムフォレスト分析からの決定ツリーの決定分岐として役立てば、判別有意性を有すると考えられる。本明細書で使用される有意なランダムフォレスト分析は、交差検定による訓練データセットに関する精度の低い方の95％信頼区間が50％を超え、かつ検証セットに関する精度の点見積が65％を越えるものである。
【０６５３】
ランダムフォレスト法を用いて開発された決定ツリーを用いる訓練データセットに対する予測混同行列を表87に与える。この混同行列から、全精度は70.3%であると見積もられた（ブートストラップ精度見積を用いる場合、信頼区間は計算できない）。見積感度は69.4%でありかつ見積特異性は71.1%であった。
【表８７】
2008538007.tif 000281
【０６５４】
訓練データセットから戻した23件の検証サンプルについては、全精度は60.9%、95%信頼区間で38.5%〜80.3%、感度83.3%および特異性36.4%と見積もられた。表88は検証サンプルに対する混同行列を示す。
【表８８】
2008538007.tif 000282
【０６５５】
MART  MARTは同時にバイオマーカーの重要度を評価しかつ被験者サンプルを分類するために使われる。いくつかのフィッティングパラメーターがこの手法では規定されていて、それには、（i）ツリーの数、（ii）ステップサイズ（通常、「収縮」と呼ばれる）、および（iii）相互作用の程度（各ツリーのスプリットの数に関係がある）が含まれる。MARTについてのさらなる情報は前の第5.5.4節に記載されている。相互作用の程度を1に設定し、加法モデルを実行した（例えば各ツリーは1つの分割を有しかつ1つのバイオマーカーだけを使う）。
【０６５６】
相互作用の程度を1に設定して加法モデルを実行した（例えば各ツリーは1つの分割を有しかつ1つの特性だけを使う）、何故なら、こうすることにより弱い相互作用が存在しても、しばしばうまく作動するからである。さらに、相互作用を見積るためには十分機能するさらなるデータを必要としうる。ステップサイズを0.05に設定し、モデル複雑度をツリーの数により規定した。最適なツリー数は、各フィッティング繰返しにおいてランダムなケースのサブセットを外し、次いでサブセットの予測の品質を評価することにより見積もる。保証されたより多いツリーを適合させた後に、予想性能の改善が止まる点を最適点として見積もる。
【０６５７】
見積もられたモデルは、11ツリーおよび全ツリーにわたって4つのバイオマーカーを用いた。MARTアルゴリズムはまた、図53に与えたバイオマーカー重要度（和は100％となる）の計算も提供する。ゼロ重要度のバイオマーカーは除外した。図54は、選択されたバイオマーカーの敗血症とSIRSグループの間の分布を示す。
【０６５８】
交差検定を、独立してそれぞれ10回繰返しで見積もった最適ツリー数を用いて行った。予測される分類を交差検定したモデルから作った訓練データに対する混同行列を表89に与える。この混同行列から、全精度は70.3%、95%信頼区間で58.8%〜80.3%と見積もられた。見積感度は63.9％でありかつ見積特異性は76.3%であった。
【表８９】
2008538007.tif 000283
【０６５９】
訓練データセットから戻した23件の検証サンプルについては、全精度は73.9%、95%信頼区間で51.6%〜89.8%、感度63.6%および特異性83.3%と見積もられた。表90は検証サンプルに対する混同行列を示す。
【表９０】
2008538007.tif 000284
【０６６０】
PAM  本発明のバイオマーカーを用いて開発されたさらに他の決定ルールは、前記第5.5.2節に記載されているマイクロアレイの予測分析（PAM）である。この方法では、サンプルを分類するために用いるバイオマーカー数の数を決定する収縮パラメーターが明記される。このパラメーターは交差検定を介して選択された。見当たらない値をもつバイオマーカーは存在しなかった。交差検定に基づくと、59のバイオマーカーに対応する最適閾値は0.08であった。図55は全ての異なる閾値にわたる精度を示す。図55において、曲線5202は全精度（95％信頼区間バーとともに）である。曲線5204は閾値の関数として決定ルール感度を示す。曲線5206は閾値の関数として決定ルール特異性を示す。0.08の閾値を用いると、訓練サンプルに対する全精度は74.9％、95%信頼区間で65.3%〜82.5%であった。見積感度は78.9％でありかつ見積特異性は69.4%であった。表91は、予測される分類が交差検定モデルから作られた訓練データ用の混同行列を示す。
【表９１】
2008538007.tif 000285
【０６６１】
訓練から戻した23件の検証サンプルについては、全精度は65.2%、95%信頼区間で42.7%〜83.6%、感度91.7％および特異性36.4%と見積もられた。表92は検証サンプルに対する混同行列を示す。
【表９２】
2008538007.tif 000286
【０６６２】
図56は、モデルにおけるその相対的判別力、およびその相対的重要度により順位付けされた、選択されたバイオマーカーを示す。
【０６６３】
図57は、CART、MART、PAM、およびランダムフォレスト（RF）分類アルゴリズム（決定ルール）性能および関連95％信頼区間の総括を与える。50の異なるバイオマーカーを図58に説明したアルゴリズム全体から選択した。これらの50の選択された特性の同一性が図58に見出された。
【０６６４】
図58はT-12データセットに対するバイオマーカーの全体順位付けを図解する。選択されたマーカーについて、x軸はそれが選択された回数の百分率を示す。バイオマーカーが選択された回数の百分率内で、バイオマーカーを順位付けした。
【０６６５】
T-12データセットとその他のデータセットの分析から、バイオマーカーに基づく10種のタンパク質を選択し、第16.3.2節に記載の手法を用いて確認した。これらのバイオマーカーを次の表93に掲げる。
【表９３】
2008538007.tif 000287
2008538007.tif 000288
【０６６６】
表93において同定された配列、遺伝子、タンパク質、および プローブセットはそれぞれ、本明細書に参照により組み入れられる。
【０６６７】
6.13.2  ビーズに基づくタンパク質イムノアッセイを用いるタンパク質バイオマーカーの確認
表 93に同定されたバイオマーカーの確認を、第6.13.1節に記載と同じアッセイを用いて複数時点：静的登録時、静的T-60、静的T-36、基線T-60、基線T-36、および基線T-12データ点にてかついくつかの異なる方法で実施した。これらの分析の代表的なものは以下に詳細に記載する静的T-12データ分析である。T-12静的分析では、バイオマーカー特性は、先の第6.4節に定義されT-12血液サンプルと名付けられた特定の血液サンプルを用いて測定した。図59は、CART、MART、PAMおよびランダムフォレストを用いる、静的T-12ビーズに基づくタンパク質アッセイの分析結果を図解し、ここで、静的T-12時点は第6.4節に定義された通りである。CARTに対する訓練と検証の両方における最良の決定ツリーは6つのバイオマーカーを用いた。訓練データおよび検証データの両方に対して、MARTに対して評価されたモデルはツリー全体で4つのバイオマーカーを用いた。全体で7つのバイオマーカーがPAMを用いる訓練と検証セットの両方で有意であった。ランダムホレストを用いると、研究下のが4つのバイオマーカーは実際に訓練および検証データセットの両方で判別有意性を有することがわかった。図 59に総括したビーズに基づくタンパク質イムノアッセイの分析の結果に基づいて、第6.13.1節に同定された10のタンパク質に基づくバイオマーカーのそれぞれがこの実験により確認された。
【０６６８】
6.13.3  BD細胞数測定ビーズアレイアッセイを用いるタンパク質バイオマーカーの確認
IL-6、IL-8、およびIL-10タンパク質を、BDTMCBAヒト炎症キットの態様である、BDTM細胞数測定ビーズアレイ（CBA）アッセイを用いて確認した。フローサイトメトリーは、サイズおよび色に基づいて色々な粒子の判別を可能にする分析ツールである。多重分析は単一サンプル中の多数の分析質の同時アッセイである。CBAは、異なる蛍光強度をもつ一連の粒子を使って、複数の可溶分析質を検出する。CBAをフローサイトメトリーと組合せて複数化アッセイを作製する。BD CBA系はフローサイトメトリーにより増幅された蛍光検出の感度を用いて、粒子に基づくイムノアッセイにおいて可溶分析質を測定する。CBAにおいてそれぞれのビーズは特異的タンパク質に対する捕獲表面を与え、ELISAプレートにおける個々にコートされたウエルと類似する。BD CBA捕獲ビーズ混合物は懸濁液中で、小体積サンプル中の複数の分析質の検出を可能にする。
【０６６９】
フローサイトメトリーを介する蛍光検出の広い動的範囲と、懸濁粒子を介する分析質の効率的な捕獲との組合せによる利点によって、CBAはより少ないサンプル希釈を用いることおよび未知のものの数値を実質的に少ない時間に得ることができる（通常のELISAと比較して）。BDTM CBAヒト炎症キットを用いて、単一サンプル中のインターロイキン-8（IL-8）、インターロイキン-1β（IL-1β）、インターロイキン-6（IL-6）、インターロイキン-10（IL-10）、腫瘍壊死因子（TNF）、およびインターロイキン-12p70（IL-12p70）タンパク質レベルを定量的に測定できる。キット性能は、組織培養上清、EDTA血漿、および血清サンプル中の特定のタンパク質の分析に対して最適化されている。
【０６７０】
異なる蛍光強度をもつ6つのビーズ集団は、IL-8、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF、およびIL-12p70タンパク質に対して特異的な捕獲抗体を用いてコートされている。6つの6ビーズ集団を一緒に混合してBDTM CBAを形成させ、これをBD FACScanTMまたはBD FACSCaliburTMフローサイトメーターなどのフローサイトメーターのFL3チャネルに分解する。捕獲ビーズ、PE-複合化検出抗体、および組換え標準またはテストサンプルを一緒にインキュベートしてサンドイッチ複合体を形成させる。フローサイトメーターを用いてサンプルデータを取得した後、サンプル結果をBDTMCBA分析ソフトウエアを用いてグラフィカルおよび表フォーマットにて作製する。BDTMCBAヒト炎症キットについてのさらなる詳細は、BDbiosciencesから入手しうるBDTMCBAヒト炎症キット取扱説明書、カタログ番号551811（本明細書に参照によりその全てが組み入れられる）に記載されている。BDTMCBAヒト炎症キットを用いてバイオマーカーIL-6、IL-8、およびIL-10が、敗血症とSIRSの間を判別するかについて確認した。
【０６７１】
6.14  表Iで同定したバイオマーカーのサブ組合わせの評価
本発明の一実施形態は、表Iに掲げられた53のバイオマーカーのうちのいずれか2以上を、被験者を敗血症またはSIRSとして分類する予測因子として包含する。本発明の一実施形態は、表Iに掲げられた53のバイオマーカーのうちのいずれか3以上を、被験者を敗血症またはSIRSとして分類する予測因子として包含する。このように、本発明はさらに表Iに掲げられた53のバイオマーカーのうちのいずれかのサブ組合わせを、被験者を敗血症またはSIRSとして分類する予測因子として包含する。本節は、表Iに掲げられた53のバイオマーカーの例示のサブ組合わせの予測力を実証する実験を開示する。数千のサブ組合わせを試験したが、これらのサブ組合わせの大多数は少なくとも70％の精度を有した。これは、表Iに掲げられた53のバイオマーカーの可能なサブ組合わせの大多数が敗血症とSIRS被験者の間を判別しうることを示す。
【０６７２】
6.14.1  T-12における核酸バイオマーカーのサブ組合わせ
RT-PCR核酸データが表Jに報じられたとおり、利用しうる全44のバイオマーカーが存在する。このバイオマーカーのセットの、全4800の異なるサブ組合わせを、第6.12節に記載のT-12時点データを用いて構築した。次いで、それぞれの異なるサブ組合わせを、敗血症被験者およびSIRS被験者の間を判別するその能力について試験した。4800のサブ組合わせは表Jに報じられた本発明の44のバイオマーカーに対して可能なサブ組合わせの全数のランダムサンプリングを表す。4800のサブ組合わせのランダム度は次のアルゴリズムを用いて確かなものにした：
CONSIDER 2 to 25 biomarkers from Table J
［表Jからの2〜25について考える］
{
LET the current number be k;
［現在の数をkとする］
DO the following 200 times
［次を200回行う］
{
SELECT k biomarkers at random from Table J; 
［ランダムに表Jからk個のバイオマーカーを選ぶ］
LET the current set of biomarkers be S; 
［現在のバイオマーカーセットをSとする］
}
DO the following 10 times
［次を10回行う］
{
FOR biomarker set S, randomly set aside 10% of patients as a validation population and 90% as a training population;
［バイオマーカーSに対して、ランダムに患者の10％を検証集団として、90％を訓練集団として分ける］
FIT a model to the training population using Random Forest with T-12 time point data;
［ランダムフォレストを用いてT-12時点データにより、モデルを訓練集団に適合させる］
PREDICT results for the validation population;
［検証集団に対する結果を予測する］
CALCULATE agreement with the known status of the validation population;
［検証集団の既知の状態との一致を計算する］
}
AVERAGE the ten agreement rates and report;
［10件の一致率の平均値を計算して報告する］
SET k = k+1;
［kを設定する］
IF k > 10 then END; ELSE return to top;
［k>10であれば終わる；でなければ元に戻る］
}
END
［終わる］
【０６７３】
前記発見および確認データの組合わせからT-12データを利用しうる患者は、全152の患者であった。これらの152の患者のうち、80の患者は敗血症であり72の患者はSIRSであった。前記計算は200のサブ組合わせを、2から25までのすべての間隔でそれぞれ試験する。言い換えれば、表Jからランダムに選んだそれぞれ2つのバイオマーカーからなる200のサブ組合わせを試験し、表Jからランダムに選んだそれぞれ3つのバイオマーカーからなる200のサブ組合わせを試験し、これを続けて、表Jからランダムに選んだそれぞれ25のバイオマーカーからなる200のサブ組合わせまで、サブ組合わせの全24のファミリーについて試験し、ここで、それぞれのサブ組合わせのファミリーは、それぞれk（ここでkはセット2〜25の数字である）のバイオマーカーを有する200のバイオマーカーのサブ組合わせから成る。
【０６７４】
考察中の全バイオマーカーに対するアッセイ結果のデータセットを、ユニークなバイオマーカー名のリストとしてメモリに保持した。特定のサイズ（例えば、k=3）のサブセットを評価するために、次いでその数（3）のバイオマーカー名を、Rソフトウエアパッケージに提供される偽ランダム数発生器を用いて、ユニークなバイオマーカー名からランダムに選んだ。本明細書に参照によりその全てが組み入れられるVenablesおよびSmith, An Introduction to R, ISBN 0-9541617-4-2を参照されたい。選んだバイオマーカー名のアッセイ結果の行列を構築した。いくつかのバイオマーカーは1以上のアッセイ結果を有するので、この行列は選んだバイオマーカー名の数より多い列数を有しうる。モデル技法「ランダムフォレスト」を用いるときの、真の予測精度の評価は従ってこの魚売れるに対して構築された。ランダムフォレストアルゴリズムは、本明細書に参照によりその全てが組み入れられるBreiman, 2001, 「ランダムフォレスト（Random Forest）」, Machine Learning 45(1), pp.5-32に記載の通り実施した。
【０６７５】
所与のデータ行列に対して、真の予測精度の予測は次の通り計算した：
10％の患者をバランスのとれたやり方でランダムに選んだ、すなわち、10％の敗血症患者および10％のSIRS患者を選んだ。選んだ患者を検証集団として別に置いて、そして残るデータ（訓練集団）にランダムフォレストモデルを当てはめた。もし訓練データまたは別に置いたデータ中に値がなければ、アッセイ値を予測するために、再帰分配モデルを他のアッセイ結果ならびに敗血症／SIRS情報にあてはめた。再帰分配モデルは本明細書に参照によりその全てが組み入れられる、Breimanら, 1984, Classification and Regression Trees、Wadsworthに記載されている。次いで見当たらない値をその予測値で置き換えた。別に置いたデータ中の見当たらない値は、訓練データに当てはめた再帰分配モデルからの予測値で置き換え、検証集団に対するSIRS／敗血症状態の知識が検証患者を分類するいずれの方法にも用いられないようにした。
【０６７６】
別においた10％セット（検証集団）の真の状態を、他の90％（訓練集団）に当てはめたランダムフォレストモデルによる予測状態と比較することにより、感度、特異性、および一致を計算した。この方法を10回繰返し、そして所与のマーカーセブセットに対する最終の感度、特異性、および一致見積（精度とも呼ばれ、性能とも呼ばれる）を、10回繰返し全体の平均値とした。この方法を全てのサブセットに適用した。考察したそれぞれのサイズ（k値、すなわち、バイオマーカーの数）に対して、200のランダムなサブセットを選んで評価した。これらの200の性能（精度）見積が、所与のサイズ（k値）のバイオマーカーの全てのサブセットの性能の分布の見積を形成する。
【０６７７】
図60は、これら24の、サブ組合わせのファミリーのそれぞれに対する精度を棒グラフとしてプロットしたものである。図61は、これら24の、サブ組合わせのファミリーのそれぞれの個々のサブ組合わせに対する精度（性能）をプロットしたものである。従って、図61は表Jに掲げられたバイオマーカーのセットの全4800のサブ組合わせの精度（性能）をプロットする。
【０６７８】
図60および61は、k>5で分布はガウス分布（ベル形状）であることを示し、それぞれの関係ファミリー（k=5〜24）は、ファミリーにより表されるサブ組合わせ空間を正確に描写することを示す。k<=5に対して、少数のサブセットは低い精度（性能）見積を与える。しかしk<=5に対して得られる結果は、このクラスのバイオマーカーサブ組合わせも敗血症およびSIRSの間をよく判別することを示す。図60および61に報じた結果は、からランダムに選んだ少数の2つのバイオマーカーにより、50%を超える精度（性能）見積が常に実質的に得られること示す。表94は、60％より大きい（列2）、70％より大きい（列3）、80％より大きい（列4）、90％より大きい（列5）閾値精度の、または60％より小さい（列6）精度の性能を有するそれぞれのファミリー（k=2〜25）中のサブ組合わせの数を示す。図60および61、ならびに表94にまとめたデータは、時点T-12データについて、表Jからの2〜25のバイオマーカーを含むほとんど全てのバイオマーカーのサブ組合わせは敗血症とSIRs被験者の間を判別しうることを実証する。
【表９４】
2008538007.tif 000289
2008538007.tif 000290
【０６７９】
6.14.2  T-12におけるタンパク質バイオマーカーのサブ組合わせ
タンパク質存在量データが表Kに報じられたとおり、利用しうる全10のバイオマーカーが存在する。このバイオマーカーのセットの、全1600の異なるサブ組合わせを、第6.13節に記載のT-12時点データを用いて構築した。次いで、それぞれの異なるサブ組合わせを、敗血症およびSIRS被験者の間を判別するその能力について試験した。1600のサブ組合わせは表Kに報じられた本発明の10のバイオマーカーに対して可能なサブ組合わせの全数のランダムサンプリングを表す。1600のサブ組合わせのランダム度は次のアルゴリズムを用いて確かなものにした：
CONSIDER 3 to 10 biomarkers from Table K
［表Kからの3〜10について考える］
{
LET the current number be k;
［現在の数をkとする］
DO the following 200 times
［次を200回行う］
{
SELECT k biomarkers at random from Table K;
［ランダムに表Kからk個のバイオマーカーを選ぶ］
LET the current set of biomarkers be S;
［現在のバイオマーカーセットをSとする］
}
DO the following 10 times
［次を10回行う］
{
FOR biomarker set S, randomly set aside 10% of patients as a validation population and 90% as a training population;
［バイオマーカーSに対して、ランダムに患者の10％を検証集団として、90％を訓練集団として分ける］
FIT a model to the training population using Random Forest with T-12 time point data;
［ランダムフォレストを用いてT-12時点データにより、モデルを訓練集団に適合させる］
PREDICT results for the validation population;
［検証集団に対する結果を予測する］
CALCULATE agreement with the known status of the validation population;
［検証集団の既知の状態との一致を計算する］
}
AVERAGE the ten agreement rates and report;
［10件の一致率の平均値を計算して報告する］
SET k = k+1;
［kを設定する］
IF k > 10 then END; ELSE return to top;
［k>10であれば終わる；でなければ元に戻る］
}
END
［終わる］
【０６８０】
第6.14.1節にさらに詳しく記載したとおり計算を実施した。前記の発見および確認データの組合わせからT-12データを利用しうる患者は全152であった。これらの152の患者のうち、80の患者は敗血症であり72の患者はSIRSであった。表Kのいくつかのバイオマーカーについては、複数のデータソースが存在した。例えば、IL-6、IL-8、およびIL-10タンパク質データは3つの異なる研究室からのものであった。従って、患者のなかの頻度には複雑なパターンが存在した。いくつかの患者は1つの研究室で試験し、他は2つの研究室でなどである。これはプロジェクトの進化の程度と利用しうるサンプルによって定まった（いくつかの患者サンプルは後に開発されたアッセイで試験できる前に消耗していた）。この複雑な頻度を扱うために、次の方法を用いた。所与の繰返しにおいて、もし複数研究室で試験したタンパク質が選ばれれば、タンパク質に対する全てのアッセイ結果を選んだ。次いで、見当たらない数値に負わせるスキームを利用して見当たらない数値を満たして、全ての患者が全てのアッセイで試験したと見えるようにした。次いでこのデータをランダムフォレストモデル中に、前記の基礎となる化合物を測定する修正済み入力として与えた。そこで、kが3に等しく、そして表Kからランダムに選んだタンパク質の1つが3つの異なる研究室からのIL-8でありかつ他のタンパク質が1つの研究室からであってユニークである場合を考えよう。全ての3つのIL-8ソースを選び、それに他の2つのタンパク質に対する他の2つのユニークなアッセイを加えて、全部で5つのアッセイとする。見当たらない値に負わせたスキームを次に用いて見当たらない値を満たして、全ての患者が3つの異なるソースからの、全部で9つのアッセイに対する結果を有すると見えるようにする。
【０６８１】
前記計算は200のサブ組合わせを、3から10までのすべての間隔でそれぞれ試験する。言い換えれば、表Kからランダムに選んだそれぞれ3つのバイオマーカーからなる200のサブ組合わせを試験し、表Kからランダムに選んだそれぞれ4つのバイオマーカーからなる200のサブ組合わせを試験し、これを続けて、表Kからランダムに選んだそれぞれ10のバイオマーカーからなる200のサブ組合わせまで、全部で8つのサブ組合わせのファミリーについて試験し、ここで、それぞれのサブ組合わせのファミリーは、全てk（ここでkはセット3〜10の数字である）のバイオマーカーを有する200のバイオマーカーのサブ組合わせから成る。図62は、これら8つの、サブ組合わせのファミリーのそれぞれに対する精度を棒グラフとしてプロットしたものである。図63は、これら8つの、サブ組合わせのファミリーのそれぞれの個々のサブ組合わせに対する精度（性能）をプロットしたものである。従って、図63は表Kに掲げられたバイオマーカーのセットの全1600のサブ組合わせの精度（性能）をプロットする。
【０６８２】
図62および63は、それぞれのサブ組合わせのファミリーの分布がガウス分布（ベル形状）であることを示し、それぞれの関係ファミリー（k=3〜10）はファミリーにより表されるサブ組合わせ空間を正確に描写することを示す。図62および63に報じた結果は、表Kからランダムに選んだ少数の3つのバイオマーカーにより、50%を超える精度（性能）見積が常に実質的に得られること示す。表95は、60％より大きい（列2）、70％より大きい（列3）、80％より大きい（列4）、90％より大きい（列5）閾値精度の、または60％より小さい（列6）精度の性能を有するそれぞれのファミリー（k=3〜10）中のサブ組合わせの数を示す。図62および63、ならびに表95にまとめたデータは、時点T-12データについて、表Kからの3〜10のバイオマーカーを含むほとんど全てのバイオマーカーのサブ組合わせは敗血症とSIRs被験者の間を判別しうることを実証する。
【表９５】
2008538007.tif 000291
【０６８３】
6.14.3  T-36におけるタンパク質バイオマーカーのサブ組合わせ
表Kのバイオマーカーのセットの全1600の異なるサブ組合わせを、T-36時点データについて、第6.13節に記載のタンパク質に基づくデータを用いて、構築した。次いで、それぞれの異なるサブ組合わせを、敗血症およびSIRS被験者の間を判別するその能力について試験した。T-36データが前記の発見および確認データの組合わせから利用しうる、全142の患者が存在した。これらの142の患者のうち、79は敗血症でありかつ63はSIRSであった。1600のサブ組合わせは、表Kに報じられた本発明の10のバイオマーカーに対して可能なサブ組合わせの全数のランダムサンプリングを表す。1600のサブ組合わせのランダム度は、ただT-12データでなくT-36データである点が異なる第6.14.2節に示したアルゴリズムを用いて、確かなものにした：計算は第6.14.1節にさらに詳しく記載したとおり行った。図64は、これら8つの、サブ組合わせのファミリーのそれぞれに対する精度を棒グラフとしてプロットしたものである。図65は、これら8つの、サブ組合わせのファミリーのそれぞれの個々のサブ組合わせに対する精度（性能）をプロットしたものである。従って、図65は表Kに掲げられたバイオマーカーのセットの全1600のサブ組合わせの精度（性能）をプロットする。
【０６８４】
図64および65に報じた結果は、表Kからランダムに選んだ少数の3つのバイオマーカーにより、60%を超える精度（性能）見積が典型的に得られること示す。表96は、60％より大きい（列2）、70％より大きい（列3）、80％より大きい（列4）、90％より大きい（列5）閾値精度の、または60％より小さい（列6）精度の性能を有するそれぞれのファミリー（k=3〜10）中のサブ組合わせの数を示す。図64および65、ならびに表96にまとめたデータは、時点T-36データについて、表Kからの3〜10のバイオマーカーを含むほとんど全てのバイオマーカーのサブ組合わせは敗血症とSIRs被験者の間を判別しうることを実証する。
【表９６】
2008538007.tif 000292
【０６８５】
6.14.4  T-36における核酸バイオマーカーのサブ組合わせ
表Jのバイオマーカーのセットの全4600の異なるサブ組合わせを、T-36時点について、第6.13節に記載の核酸に基づくデータを用いて、構築した。次いで、それぞれの異なるサブ組合わせを、敗血症およびSIRS被験者の間を判別するその能力について試験した。T-36データが前記の発見および確認データの組合わせから利用しうる、全142の患者が存在した。これらの142の患者のうち、79は敗血症でありかつ63はSIRSであった。4600のサブ組合わせは、T-36時点において表Jに報じられた本発明の44のバイオマーカーに対して可能なサブ組合わせの全数のランダムサンプリングを表す。4600のサブ組合わせのランダム度は、ただT-12データでなくT-36データでありかつ最小k値が3である点が異なる第6.14.1節に示したアルゴリズムを用いて、確かなものにした：計算は第6.14.1節にさらに詳しく記載したとおり行った。図66は、これら23の、サブ組合わせのファミリーのそれぞれに対する精度を棒グラフとしてプロットしたものである。図61は、23の、サブ組合わせのファミリーのそれぞれの個々のサブ組合わせに対する精度（性能）をプロットしたものである。従って、図61は表Jに掲げられたバイオマーカーのセットの全4600のサブ組合わせの精度（性能）をプロットする。
【０６８６】
図66および67に報じた結果は、表Jからランダムに選んだ少数の3つのバイオマーカーにより、60%を超える精度（性能）見積が典型的に得られること示す。表97は、60％より大きい（列2）、70％より大きい（列3）、80％より大きい（列4）、90％より大きい（列5）閾値精度の、または60％より小さい（列6）精度の性能を有するそれぞれのファミリー（k=3〜25）中のサブ組合わせの数を示す。図66および67、ならびに表96にまとめたデータは、時点T-36データについて、表Jからの3〜25のバイオマーカーを含むほとんど全てのバイオマーカーのサブ組合わせは敗血症とSIRs被験者の間を判別しうることを実証する。
【表９７】
2008538007.tif 000293
2008538007.tif 000294
【０６８７】
6.14.5  T-12における、核酸とタンパク質が組み合わされたバイオマーカーデータのサブ組合わせ
表Iには全53のバイオマーカーが掲げられている。このバイオマーカーのセットの全4600の異なるサブ組合わせを、全ての利用しうるT-12時点データを用いて構築した。表Jに掲げられた表Iのバイオマーカーのサブセットについては、T-12時点データは前記RT-PCRデータからなる。表Kに掲げられた表Iのバイオマーカーのサブセットについては、T-12時点データは前記ビーズに基づくデータからなる。これに対する唯一の例外は「MMP」であって、タンパク質と遺伝子発現データの両方を利用できる。それ故に、MMP9遺伝子とタンパク質存在量データは別のバイオマーカーとして扱った。これを行うために、MMP核酸データは「MMP9.GE」と呼び、ビーズに基づくアッセイからのMMPタンパク質存在量データはMMP9.タンパク質と呼んだ。
【０６８８】
それぞれの色々なサブ組合わせを、敗血症被験者とSIRS被験者の間を判別するその能力について試験した。4600のサブ組合わせは、表Iに報じた本発明の53のバイオマーカーについて可能なサブ組合わせの全数のランダムサンプリングを表す。4600のサブ組合わせのランダム度は次のアルゴリズムを用いて確かなものにした。
【０６８９】
CONSIDER 3 to 25 biomarkers from Table I 
［表Iからの3〜25について考える］
LET the current number be k;
［現在の数をkとする］
DO the following 200 times
［次を200回行う］
{
SELECT k biomarkers at random from Table I;
［ランダムに表Iからk個のバイオマーカーを選ぶ］
LET the current set of biomarkers be S;
［現在のバイオマーカーセットをSとする］
}
DO the following 10 times
［次を10回行う］
{
FOR biomarker set S, randomly set aside 10% of patients as a validation population and 90% as a training population;
［バイオマーカーSに対して、ランダムに患者の10％を検証集団として、90％を訓練集団として分ける］
FIT a model to the training population using Random Forest with T-12 time point data;
［ランダムフォレストを用いてT-12時点データにより、モデルを訓練集団に適合させる］
PREDICT results for the validation population;
［検証集団に対する結果を予測する］
CALCULATE agreement with the known status of the validation population;
［検証集団の既知の状態との一致を計算する］
}
AVERAGE the ten agreement rates and report;
［10件の一致率の平均値を計算して報告する］
SET k = k+1;
［kを設定する］
IF k > 10 then END; ELSE return to top;
［k>10であれば終わる；でなければ元に戻る］
}
END
［終わる］
【０６９０】
T-12データを前記の発見および確認データの組合わせから利用できたのは、全152患者についてであった。この152患者のうち、80は敗血症でありそして72はSIRsであった。コンピューター計算は第6.14.1節にさらに詳しく記載したとおり実施した。前記計算は200のサブ組合わせを、2から25までのすべての間隔でそれぞれ試験する。言い換えれば、表Iからランダムに選んだそれぞれ3つのバイオマーカーからなる200のサブ組合わせを試験し、表Iからランダムに選んだそれぞれ4つのバイオマーカーからなる200のサブ組合わせを試験し、これを続けて、表Iからランダムに選んだそれぞれ25のバイオマーカーからなる200のサブ組合わせまで、全23の、サブ組合わせのファミリーについて試験し、ここで、それぞれのサブ組合わせのファミリーは、それぞれk（ここでkはセット3〜25までの数字である）のバイオマーカーを有する200のバイオマーカーのサブ組合わせから成る。図68は、これら23の、サブ組合わせのファミリーのそれぞれに対する精度を棒グラフとしてプロットしたものである。図69は、これら23の、サブ組合わせのファミリーのそれぞれの個々のサブ組合わせに対する精度（性能）をプロットしたものである。従って、図69は表Iに掲げられたバイオマーカーのセットの全4600のサブ組合わせの精度（性能）をプロットする。
【０６９１】
図68および69は、k>5で分布はガウス分布（ベル形状）であることを示し、それぞれの関係ファミリー（k=5〜25）は、ファミリーにより表されるサブ組合わせ空間を正確に描写することを示す。k<=5に対して、少数のサブセットは低い精度（性能）見積を与える。図68および69に報じた結果は、からランダムに選んだ少数の3つのバイオマーカーにより、50%を超える精度（性能）見積が常に実質的に得られること示す。表98は、60％より大きい（列2）、70％より大きい（列3）、80％より大きい（列4）、90％より大きい（列5）閾値精度の、または60％より小さい（列6）精度の性能を有するそれぞれのファミリー（k=3〜25）中のサブ組合わせの数を示す。図68および69、ならびに表98にまとめたデータは、時点T-12データについて、表Iからの3〜25のバイオマーカーを含むほとんど全てのバイオマーカーのサブ組合わせは敗血症とSIRs被験者の間を判別しうることを実証する。
【表９８】
2008538007.tif 000295
2008538007.tif 000296
【０６９２】
6.14.6  T-36における、核酸とタンパク質が組合わされたバイオマーカーデータの組合わせのサブ組合わせ
バイオマーカーのサブ組合わせを、第6.14.5節に記載のとおり選んだが、ただ1つの相違はT-12データでなく、T-36データを用いた点であった。T-36データを前記の発見および確認データの組合わせから利用できたのは、全142患者についてであった。この142患者のうち、79は敗血症でありそして63はSIRsであった。コンピューター計算は第6.14.1節にさらに詳しく記載したとおり実施した。前記計算は200のサブ組合わせを、3から25までのすべての間隔でそれぞれ試験する。言い換えれば、表Iからランダムに選んだそれぞれ3つのバイオマーカーからなる200のサブ組合わせを試験し、表Iからランダムに選んだそれぞれ4つのバイオマーカーからなる200のサブ組合わせを試験し、これを続けて、表Iからランダムに選んだそれぞれ25のバイオマーカーからなる200のサブ組合わせまで、全23の、サブ組合わせのファミリーについて試験し、ここで、それぞれのサブ組合わせのファミリーは、それぞれk（ここでkはセット3〜25までの数字である）のバイオマーカーを有する200のバイオマーカーのサブ組合わせから成る。図70は、これら23の、サブ組合わせのファミリーのそれぞれに対する精度を棒グラフとしてプロットしたものである。図71は、これら23の、サブ組合わせのファミリーのそれぞれの個々のサブ組合わせに対する精度（性能）をプロットしたものである。従って、図71は表Iに掲げられたバイオマーカーのセットの全4600のサブ組合わせの精度（性能）をプロットする。
【０６９３】
図70および71は、k>5で分布はガウス分布（ベル形状）であることを示し、それぞれの関係ファミリー（k=5〜25）は、ファミリーにより表されるサブ組合わせ空間を正確に描写することを示す。k<=5に対して、少数のサブセットは低い精度（性能）見積を与える。図70および71に報じた結果は、からランダムに選んだ少数の3つのバイオマーカーにより、50%を超える精度（性能）見積が常に実質的に得られること示す。表99は、60％より大きい（列2）、70％より大きい（列3）、80％より大きい（列4）、90％より大きい（列5）閾値精度の、または60％より小さい（列6）精度の性能を有するそれぞれのファミリー（k=3〜25）中のサブ組合わせの数を示す。図70および71、ならびに表99にまとめたデータは、時点T-36データについて、表Iからの3〜25のバイオマーカーを含むほとんど全てのバイオマーカーのサブ組合わせは敗血症とSIRs被験者の間を判別しうることを実証する。
【表９９】
2008538007.tif 000297
【０６９４】
6.15  表Iで同定された敗血症とSIRS患者におけるバイオマーカーの平均発現値
表Iのバイオマーカーの平均発現値は、第6.11.2節、第6.12.2節（Affymetrixデータ）、第6.11.1節、第6.12.1節（RT-PCRデータ）、第6.13.3節（ビーズデータ）、および第6.13.1節および第6.13.2節（ビーズデータ）に記載した集団中の、敗血症になった被験者（敗血症被験者）および敗血症にならなかった被験者（SIRS被験者）について、T-12、T-36、およびT-60時点において決定した。このデータを以下の表100に記載する。表100において、_Affy語尾をもつバイオマーカーは第6.11.2節および第6.11.2節（Affymetrixデータ）の組合せデータ、.18S語尾をもつバイオマーカーは第6.11.1節および第6.12.1節（RT-PCRデータ）の組合わせデータ、BDB語尾をもつバイオマーカーは第6.13.3節のデータ、そしてRBM語尾をもつバイオマーカーは第6.13.1節および第6.13.2節のデータを表す。
【０６９５】
遺伝子アレイ（.Affy）により同定された表100の核酸バイオマーカーについては、表100中の値は試験した特異的プローブ配列について得られた平均相対蛍光強度を表す。この場合、これらは実際の測定単位でなく、ただ、1グループの他グループに対する相対量である。さらにデータ分析の一部として、これらの値のいくつかは対数変換または他の調節をした後に報じられることもある。表100に見出される核酸バイオマーカー（.18S）についての発現値は、相対的「閾値までのサイクルタイム」により定義される。この場合、これらは実際の測定単位を挙げたのでなく、ただ、1グループの他グループに対する相対量である。より高い量の核酸を含むサンプルは、低い核酸を含む（得られるシグナルが陽性閾値を横切る前により多くのサイクルを必要としうる）サンプルより早く（少ないサイクルで）陽性になりうる。表101のタンパク質バイオマーカーについては、単位は次のとおりである：αフェトプロテイン（AFP）μg/mL（血漿1ミリリットル当たりマイクログラム）、β-2-ミクログロブリンB2M）μg/mL、インターロイキン-6（IL-6）pg/mL（ピコグラム/ミリリットル）、インターロイキン-8（IL-8）pg/mL、インターロイキン-10（IL-10）pg/mL、単球走化性タンパク質1（MCP）pg/mL、マトリックスメタロプロテイナーゼ9（MMP9）ng/mL（ナノグラム/ミリリットル）、メタロプロテイナーゼ1の組織インヒビター（TIMPl）ng/mL（ナノグラム/mL）、C反応性タンパク質（CRP）μg/mL、およびアポリポタンパク質CIIIμg/mL。
【表１００】
2008538007.tif 000298
【０６９６】
2008538007.tif 000299
【０６９７】
2008538007.tif 000300
【０６９８】
2008538007.tif 000301
【０６９９】
表Iのバイオマーカーの発現値の範囲は、第6.11.2節、第6.12.2節（Affymetrixデータ）、第6.11.1節、第6.12.1節（RT-PCRデータ）、第6.13.3節（ビーズデータ）、および第6.13.1節および第6.13.2節（ビーズデータ）に記載した集団中の、敗血症になった被験者（敗血症被験者）および敗血症にならなかった被験者（SIRS被験者）について、T-12およびT-36時点において決定した。このデータを以下の表101に記載する。表101において、_Affy語尾をもつバイオマーカーは第6.11.2節および第6.11.2節（Affymetrixデータ）の組合せデータ、.18S語尾をもつバイオマーカーは第6.11.1節および第6.12.1節（RT-PCRデータ）の組合わせデータ、BDB語尾をもつバイオマーカーは第6.13.3節のデータ、そしてRBM語尾をもつバイオマーカーは第6.13.1節および第6.13.2節のデータを表す。時点は列6に与えられ、ここでT-12はT-12時点を表し、T-36はT-36時点を表す。表101の単位は表100について記載のとおりである。
【表１０１】
2008538007.tif 000302
【０７００】
2008538007.tif 000303
【０７０１】
2008538007.tif 000304
【０７０２】
2008538007.tif 000305
【０７０３】
2008538007.tif 000306
【０７０４】
2008538007.tif 000307
【０７０５】
2008538007.tif 000308
【０７０６】
7.  引用文献
本発明は、コンピューター読取可能記憶媒体に包埋されたコンピュータープログラム機構を含むコンピュータープログラム製品として実行することができる。例えば、コンピュータープログラム産物は図35に示したプログラムモジュールを含有してもよい。これらのプログラムモジュールは、CD-ROM、DVD、磁性ディスク記憶製品、またはいずれかの他のコンピューター読取可能データまたはプログラム記憶製品上に保存されてもよい。プログラムモジュールはまた永久記憶、例えばROM、１以上のプログラマブルチップ、または１以上のアプリケーション特異的集積回路（ASIC）に包埋されてもよい。かかる永久記憶はサーバー、802.11アクセスポイント、802.11無線ブリッジ／ステーション、リピーター、ルーター、移動電話、または他の電子デバイスに配置されてもよい。コンピュータープログラム製品中のソフトウエアモジュールはまた、インターネットを介してまたはそうでなければ、コンピューターデータシグナル（それにはソフトウエアモジュールが包埋されている）の伝達によりデジタルでまたは搬送波にのせて、電子的に配給することもできる。
【０７０７】
特定の代表的な実施形態および詳細を参照して本発明を完全に記載したが、本明細書中に記載した本発明の精神または範囲から逸脱せずに変更および改変を行うことができることは、当業者には明らかであろう。本発明に記載した特定の実施形態は説明の方法としてだけ提供されるのであって、本発明は添付した請求項、ならびにかかる請求項が権利を与える同一物の全範囲によってのみ限定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【０７０８】
【図１】本発明の実施形態による訓練集団から得たT-36静的データを用いて、敗血症の発症により特徴付けられるSIRS表現型と敗血症の非存在により特徴付けられるSIRS表現型のどちらかを判別する分類および回帰ツリーを示す。
【図２】本発明の実施形態により訓練集団から得たT-36静的データ全体にわたって、図1の決定ツリーで用いた5つのバイオマーカーの特性値の分布を示す。バイオマーカーは、それらの対応する表30に記載の対応するAffymetrixU133 plus 2.0プローブセット名により参照される。
【図３】本発明の実施形態により訓練集団から得たT-36静的データに基づくランダムフォレスト方法を用いて決定ツリーを訓練するために使用した500ツリーの全精度、感度および特異性を示す。
【図４】図3のツリーを用いて訓練した決定ルールにおけるバイオマーカー重要度を示す。
【図５】訓練集団から得たT-36静的データ全体にわたる本発明のバイオマーカーを用いてマイクロアレイの予測分析（PAM）により開発した、決定ルールの全精度とその95％信頼区間バー、特異性、および感度を示す。
【図６】訓練集団から得たT-36静的データを用いてPAMにより同定した、それぞれの判別力の程度による順位順のバイオマーカーのリストである。バイオマーカーは表30に記載のそれらの対応する Affymetrix U133 plus 2.0プローブセット名により参照される。
【図７】訓練集団から得たT-36静的データに対するCART、PAM、およびランダムフォレスト分類アルゴリズム性能データ、および関連95%信頼区間を示す。
【図８】訓練集団から得たT-36静的データに対する（i）CART、（ii）PAM、（iii）ランダムフォレスト、および（iv）Wilcoxon（調節済み）試験を用いて開発した決定ルール全体にわたり、共通バイオマーカーが重要であることが見出された回数を示す。
【図９】訓練集団から得たT-36静的データに対するバイオマーカーの全体にわたる順位付けを示す。バイオマーカーは表30に記載のそれらの対応する Affymetrix U133 plus 2.0プローブセット名により参照される。
【図１０】本発明の実施形態による訓練集団から得られたT-12静的データを用いて、敗血症の発症により特徴付けられるSIRS表現型状態と敗血症の非存在により特徴付けられるSIRS表現型状態の間を判別する分類および回帰ツリーを示す。
【図１１】本発明の実施形態により訓練集団から得たT-12静的データを用いて、図10の決定ツリーで用いた4つのバイオマーカーの特性値の分布を示す。バイオマーカーは、それらの対応する表30に記載の対応するAffymetrixU133 plus 2.0プローブセット名により参照される。
【図１２】本発明の実施形態により訓練集団から得たT-12静的データに基づくランダムフォレスト方法を用いて決定ツリーを訓練するために使用した500ツリーの全精度、感度および特異性を示す。
【図１３】図12のツリーを用いて訓練した決定ルールにおけるバイオマーカー重要度を示す。バイオマーカーは表30に記載のそれらの対応するAffymetrix U133 plus2.0プローブセット名により参照される。
【図１４】訓練集団から得たT-12静的データを用いる多重加法回帰ツリー（MART）により決定したバイオマーカー重要度（和は100％になる）の計算を示す。バイオマーカーは、表30に記載されたそれらの対応するAffymetrix U133 plus 2.0プローブセット名により参照される。
【図１５】敗血症とSIRSグループの間の、訓練集団から得たT-12静的データを用いる、図14で図解したMART手法により選択したバイオマーカーの特性値の分布を示す。バイオマーカーは表30に記載のそれらの対応するAffymetrix U133 plus 2.0プローブセット名により参照される。
【図１６】本発明のバイオマーカーを用い、訓練集団から得たT-12静的データを用いて、マイクロアレイの予測分析（PAM）を使用して開発した決定ルールの全精度とその95%信頼区間バー、特異性、および感度を示す。
【図１７】訓練集団から得たT-12静的データを用いてPAMにより同定した、それぞれの判別力の程度による順位順のバイオマーカーのリストである。バイオマーカーは表30に記載のそれらの対応するAffymetrix U133 plus 2.0プローブセット名により参照される。
【図１８】訓練集団から得たT-12静的データを用いたCART、MART、PAM3およびランダムフォレスト（RF）分類アルゴリズム（決定ルール）性能および関連する95%信頼区間のまとめを与える。
【図１９】訓練集団から得たT-12静的データを用いた（i）CART、（ii）MART、（iii）PAM、（iv）ランダムフォレスト、および（v）Wilcoxon（調節済み）試験を用いて開発した決定ルール全体にわたって、共通バイオマーカーが重要であることが見出された回数を示す。バイオマーカーは表30に記載のそれらの対応するAffymetrix U133 plus 2.0プローブセット名により参照される。
【図２０】バイオマーカーs using 訓練集団から得たT-12静的データを用いたバイオマーカーの全体順位付けを示す。
【図２１】本発明の実施形態により訓練集団より得たT-12基線データを用いて、敗血症の発症により特徴付けられるSIRS表現型状態と敗血症の非存在により特徴付けられるSIRS表現型状態の間を判別する分類および回帰ツリーを示す。
【図２２】本発明の実施形態により訓練集団より得たT-12基線データを用いる図21の決定ツリーに用いた、5つのバイオマーカーの特性値の分布を示す。バイオマーカーは表30に記載のそれらの対応するAffymetrix U133 plus 2.0プローブセット名により参照される。
【図２３】本発明の実施形態により訓練集団から得たT-12基線データを用いるランダムフォレスト方法を用いて決定ツリーを訓練するために使用した500ツリーの全精度、感度および特異性を示す。
【図２４】図23のツリーを用いて訓練した決定ルールにおけるバイオマーカー重要度を示す。バイオマーカーは表30に記載のそれらの対応するAffymetrix U133 plus 2.0プローブセット名により参照される。
【図２５】本発明の選択バイオマーカーおよび訓練集団から得たT-12基線データを用いて、マイクロアレイの予測分析（PAM）を使用して開発した決定ルールの全精度とその95%信頼区間バー、特異性、および感度を示す。
【図２６】訓練集団から得たT-12静的データを用いてPAMにより同定した、それぞれの判別力の程度による順位順のバイオマーカーのリストである。バイオマーカーは表30に記載のそれらの対応する Affymetrix U133 plus 2.0プローブセット名により参照される。
【図２７】本発明の実施形態による訓練集団から得たT-12基線データを用いた、CART、PAM、およびランダムフォレスト分類アルゴリズム（決定ルール）性能データ、および関連95%信頼区間を示す。
【図２８】訓練集団から得たT-12基線データを用いた（i）CART、（ii）PAM、（iii）ランダムフォレスト、および（iv）Wilcoxon（調節済み）試験を用いて開発した決定ルール全体にわたって、共通バイオマーカーが重要であることが見出された回数を示す。
【図２９】訓練集団から得たT-12基線データを用いて得たバイオマーカーの全体にわたる順位付けを示す。バイオマーカーは表30に記載のそれらの対応するAffymetrix U133 plus 2.0プローブセット名により参照される。
【図３０】本発明の実施形態により、訓練集団から得たデータを用いて、所定の期間中に敗血症になった被験者と所定の期間中に敗血症にならなかった被験者の間を判別するバイオマーカーを同定するために適用されるフィルターを示す。他のバイオマーカーの組合わせが、本明細書、例えば、第5.3節および第6節に開示されている。
【図３１】訓練集団全体にわたる、RT-PCRにより決定したIL18R1発現と、Affymetrix U133 plus 2.0マイクロアレイ測定値を用いて決定したX206618_atプローブセットの強度との間の相関を示す。
【図３２】訓練集団全体にわたる、RT-PCRにより決定したFCGR1A発現と、Affymetrix U133 plus 2.0マイクロアレイ測定値を用いて決定したX214511_x_at、X216950_s_at および X216951_atプローブセットの強度との間の相関を示す。
【図３３】訓練集団全体にわたる、RT-PCRにより決定したMMP9発現と、Affymetrix U133 plus 2.0マイクロアレイ測定値を用いて決定したX203936_s_atプローブセットの強度との間の相関を示す。
【図３４】訓練集団全体にわたる、RT-PCRにより決定したCD86発現と、Affymetrix U133 plus 2.0マイクロアレイ測定値を用いて決定したX205685_at、X205686_s_at、および X210895_s_atプローブセットの強度との間の相関を示す。
【図３５】本発明によるコンピューターシステムを示す。
【図３６】本発明の実施形態によるRT-PCR発見訓練集団から得たT-12静的データを用いて、敗血症の発症により特徴付けられるSIRS表現型と敗血症の非存在により特徴付けられるSIRSのどちらかを判別する分類および回帰ツリーを示す。
【図３７】本発明の実施形態によりRT-PCR発見訓練集団から得たT-12静的データ全体にわたって、図36の決定ツリーで用いた7つのバイオマーカーの特性値の分布を示す。
【図３８】本発明の実施形態によりRT-PCR発見訓練集団から得たT-12静的データに基づくランダムフォレスト方法を用いて決定ツリーを訓練するために使用した462ツリーの全精度、感度および特異性を示す。
【図３９】図38のツリーを用いて訓練した決定ルールにおけるバイオマーカー重要度を示す。
【図４０】RT-PCR発見訓練集団から得たT-12静的データを用いる多重加法回帰ツリー（MART）により決定したバイオマーカー重要度（和は100％になる）の計算を示す。
【図４１】敗血症とSIRSグループの間の、RT-PCR発見訓練集団から得たT-12静的データを用いる、図40で図解したMART手法により選択したバイオマーカーの特性値の分布を示す。
【図４２】本発明のバイオマーカーを用い、RT-PCR発見訓練集団から得たT-12静的データを用いて、マイクロアレイの予測分析（PAM）を使用して開発した決定ルールの全精度とその95%信頼区間バー、特異性、および感度を示す。
【図４３】RT-PCR発見訓練集団から得たT-12静的データを用いてPAMにより同定した、それぞれの判別力の程度による順位順のバイオマーカーのリストである。
【図４４】RT-PCR発見訓練集団から得たT-12静的データを用いたCART、MART、PAM3およびランダムフォレスト（RF）分類アルゴリズム（決定ルール）性能および関連する95%信頼区間のまとめを与える。
【図４５】図44でまとめた決定ルール性能に基づいて選択される、50の選択されたバイオマーカーを同定した。
【図４６】Affymetrix遺伝子チップ発見訓練集団から得たT-12静的データを用いたCART、MART、PAMおよびランダムフォレスト（RF）分類アルゴリズム（決定ルール）性能および関連する95%信頼区間のまとめを提供する。
【図４７】RT-PCR確認訓練集団から得たT-12静的データを用いたCART、MART、PAMおよびランダムフォレスト（RF）分類アルゴリズム（決定ルール）性能および関連する95%信頼区間のまとめを提供する。
【図４８】Affymetrix遺伝子チップ確認訓練集団とRT-PCR確認訓練集団の組合わせプールから得たT-12静的データを用いたCART、MART、PAMおよびランダムフォレスト（RF）分類アルゴリズム（決定ルール）性能および関連する95%信頼区間のまとめを提供する。
【図４９】本発明の実施形態によりビーズに基づくタンパク質発見訓練集団より得たT-12静的データを用いて、敗血症の発症により特徴付けられるSIRS表現型状態と敗血症の非存在により特徴付けられるSIRS表現型状態のちがいを判別する分類および回帰ツリーを示す。
【図５０Ａ】本発明の実施形態によりビーズに基づくタンパク質発見訓練集団より得たT-12静的データ全体にわたって図49の決定ツリーに用いた、10のバイオマーカーの特性値の分布を示す。
【図５０Ｂ】本発明の実施形態によりビーズに基づくタンパク質発見訓練集団より得たT-12静的データ全体にわたって図49の決定ツリーに用いた、10のバイオマーカーの特性値の分布を示す。
【図５０Ｃ】本発明の実施形態によりビーズに基づくタンパク質発見訓練集団より得たT-12静的データ全体にわたって図49の決定ツリーに用いた、10のバイオマーカーの特性値の分布を示す。
【図５１】本発明の実施形態によりビーズに基づくタンパク質発見訓練集団から得たT-12静的データに基づくランダムフォレスト方法を用いて決定ツリーを訓練するために使用した64ツリーの全精度、感度および特異性を示す。
【図５２】図51のツリーを用いて訓練した決定ルールにおけるバイオマーカー重要度を示す。
【図５３】本発明の実施形態によりビーズに基づくタンパク質発見訓練集団から得たT-12静的データを用いる多重加法回帰ツリー（MART）により決定した、バイオマーカー重要度（和は100％になる）の計算を示す。
【図５４】敗血症とSIRSグループの間の、本発明の実施形態により、ビーズに基づくタンパク質発見訓練集団から得たT-12静的データを用いる、図53で図解したMART手法により選択したバイオマーカーの特性値の分布を示す。
【図５５】本発明のバイオマーカーを用い、本発明の実施形態によるビーズに基づくタンパク質発見訓練集団から得たT-12静的データを用いて、マイクロアレイの予測分析（PAM）を使用して開発した決定ルールの全精度とその95%信頼区間バー、特異性、および 感度を示す。
【図５６】本発明の実施形態により、ビーズに基づくタンパク質発見訓練集団から得たT-12静的データを用いてPAMにより同定した、それぞれの判別力の程度による順位順のバイオマーカーのリストである。
【図５７】本発明の実施形態により、ビーズに基づくタンパク質発見訓練集団から得たT-12静的データを用いたCART、MART、PAM3およびランダムフォレスト（RF）分類アルゴリズム（決定ルール）性能および関連する95%信頼区間のまとめを与える。
【図５８】本発明の実施形態によりビーズに基づくタンパク質発見訓練集団から得たT-12静的データを用いた（i）CART、（ii）MART、（iii）PAM、（iv）ランダムフォレスト、および（v）Wilcoxon（調節済み）試験を使用して開発した決定ルール全体にわたって、共通バイオマーカーが重要であることが見出された回数を示す。
【図５９】本発明の実施形態により、ビーズに基づくタンパク質確認訓練集団から得たT-12静的データを用いたCART、MART、PAM3およびランダムフォレスト（RF）分類アルゴリズム（決定ルール）性能および関連する95%信頼区間のまとめを提供する。
【図６０Ａ】本発明の実施形態により、T-12核酸データを用いて、表Jからのサブ組合わせの24ファミリーのそれぞれの敗血症予測精度を、棒グラフ形式でプロットする。
【図６０Ｂ】本発明の実施形態により、T-12核酸データを用いて、表Jからのサブ組合わせの24ファミリーのそれぞれの敗血症予測精度を、棒グラフ形式でプロットする。
【図６１Ａ】本発明の実施形態により、T-12核酸データを用いて、表Jからの4800サブ組合わせの全てに対する、サブ組合わせの24ファミリーのそれぞれにおける、それぞれの個々のサブ組合わせの敗血症予測性能（精度）をプロットする。
【図６１Ｂ】本発明の実施形態により、T-12核酸データを用いて、表Jからの4800サブ組合わせの全てに対する、サブ組合わせの24ファミリーのそれぞれにおける、それぞれの個々のサブ組合わせの敗血症予測性能（精度）をプロットする。
【図６２Ａ】本発明の実施形態により、T-12タンパク質データを用いて、棒グラフ形式で、表Kからのサブ組合わせの8ファミリーのそれぞれの敗血症予測精度をプロットする。
【図６２Ｂ】本発明の実施形態により、T-12タンパク質データを用いて、棒グラフ形式で、表Kからのサブ組合わせの8ファミリーのそれぞれの敗血症予測精度をプロットする。
【図６３Ａ】本発明の実施形態により、T-12タンパク質データを用いて、表Kからの1800サブ組合わせの全てに対する、サブ組合わせの8ファミリーのそれぞれにおける、それぞれの個々のサブ組合わせの敗血症予測性能（精度）をプロットする。
【図６３Ｂ】本発明の実施形態により、T-12タンパク質データを用いて、表Kからの1800サブ組合わせの全てに対する、サブ組合わせの8ファミリーのそれぞれにおける、それぞれの個々のサブ組合わせの敗血症予測性能（精度）をプロットする。
【図６４Ａ】本発明の実施形態により、T-36タンパク質データを用いて、棒グラフ形式で、表Kからのサブ組合わせの8ファミリーのそれぞれの敗血症予測精度をプロットする。
【図６４Ｂ】本発明の実施形態により、T-36タンパク質データを用いて、棒グラフ形式で、表Kからのサブ組合わせの8ファミリーのそれぞれの敗血症予測精度をプロットする。
【図６５Ａ】本発明の実施形態により、T-36タンパク質データを用いて、表Kからの1800サブ組合わせの全てに対する、サブ組合わせの8ファミリーのそれぞれにおける、それぞれの個々のサブ組合わせの敗血症予測性能（精度）をプロットする。
【図６５Ｂ】本発明の実施形態により、T-36タンパク質データを用いて、表Kからの1800サブ組合わせの全てに対する、サブ組合わせの8ファミリーのそれぞれにおける、それぞれの個々のサブ組合わせの敗血症予測性能（精度）をプロットする。
【図６６Ａ】本発明の実施形態により、T-36核酸データを用いて、棒グラフ形式で、表Jからのサブ組合わせの23ファミリーのそれぞれの敗血症予測精度をプロットする。
【図６６Ｂ】本発明の実施形態により、T-36核酸データを用いて、棒グラフ形式で、表Jからのサブ組合わせの23ファミリーのそれぞれの敗血症予測精度をプロットする。
【図６７Ａ】本発明の実施形態により、T-36核酸データを用いて、表Jからの4600サブ組合わせの全てに対する、サブ組合わせの23ファミリーのそれぞれにおける、それぞれの個々のサブ組合わせの敗血症予測性能（精度）をプロットする。
【図６７Ｂ】本発明の実施形態により、T-36核酸データを用いて、表Jからの4600サブ組合わせの全てに対する、サブ組合わせの23ファミリーのそれぞれにおける、それぞれの個々のサブ組合わせの敗血症予測性能（精度）をプロットする。
【図６８Ａ】本発明の実施形態により、T-12組み合わされたタンパク質および核酸データを用いて、棒グラフ形式で、表Iからのサブ組合わせの23ファミリーのそれぞれの敗血症予測精度をプロットする。
【図６８Ｂ】本発明の実施形態により、T-12組み合わされたタンパク質および核酸データを用いて、棒グラフ形式で、表Iからのサブ組合わせの23ファミリーのそれぞれの敗血症予測精度をプロットする。
【図６９Ａ】本発明の実施形態により、T-12組み合わされたタンパク質および核酸データを用いて、表Iからの4600サブ組合わせの全てに対する、サブ組合わせの23ファミリーのそれぞれにおける、それぞれの個々のサブ組合わせの敗血症予測性能（精度）をプロットする。
【図６９Ｂ】本発明の実施形態により、T-12組み合わされたタンパク質および核酸データを用いて、表Iからの4600サブ組合わせの全てに対する、サブ組合わせの23ファミリーのそれぞれにおける、それぞれの個々のサブ組合わせの敗血症予測性能（精度）をプロットする。
【図７０Ａ】本発明の実施形態により、T-36組み合わされたタンパク質および核酸データを用いて、棒グラフ形式で、表Iからのサブ組合わせの23ファミリーのそれぞれの敗血症予測精度をプロットする。
【図７０Ｂ】本発明の実施形態により、T-36組み合わされたタンパク質および核酸データを用いて、棒グラフ形式で、表Iからのサブ組合わせの23ファミリーのそれぞれの敗血症予測精度をプロットする。
【図７１Ａ】本発明の実施形態により、T-36組み合わされたタンパク質および核酸データを用いて、表Iからの4600サブ組合わせの全てに対する、サブ組合わせの23ファミリーのそれぞれにおける、それぞれの個々のサブ組合わせの敗血症予測性能（精度）をプロットする。
【図７１Ｂ】本発明の実施形態により、T-36組み合わされたタンパク質および核酸データを用いて、表Iからの4600サブ組合わせの全てに対する、サブ組合わせの23ファミリーのそれぞれにおける、それぞれの個々のサブ組合わせの敗血症予測性能（精度）をプロットする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０Ａ】
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【図５０Ｂ】
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【図５０Ｃ】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０Ａ】
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【図６０Ｂ】
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【図６１Ａ】
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【図６１Ｂ】
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【図６２Ａ】
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【図６２Ｂ】
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【図６３Ａ】
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【図６３Ｂ】
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【図６４Ａ】
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【図６４Ｂ】
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【図６５Ａ】
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【図６５Ｂ】
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【図６６Ａ】
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【図６６Ｂ】
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【図６７Ａ】
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【図６７Ｂ】
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【図６８Ａ】
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【図６８Ｂ】
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【図６９Ａ】
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【図６９Ｂ】
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【図７０Ａ】
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【図７０Ｂ】
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【図７１Ａ】
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【図７１Ｂ】
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【国際調査報告】
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