(57)【要約】  本発明は、ミトコンドリアを標的とし、生細胞中でのアポトーシス誘導能が低下した修飾シトクロムｃタンパク質を含むシトクロムｃ−レポーター融合タンパク質構築物に関する。本発明はまた、そのようなタンパク質融合物をコードする核酸構築物、及びそのような構築物を安定にトランスフェクトした細胞にも関する。本発明の安定トランスフェクト細胞は、アポトーシスを検出するアッセイで使用することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型シトクロムｃに由来する修飾シトクロムｃタンパク質又はその機能的アナログを含むシトクロムｃ−レポーター融合タンパク質構築物であって、当該修飾シトクロムｃがミトコンドリアを標的とし、生細胞中でのアポトーシス誘導能が低下した融合タンパク質構築物。
【請求項２】
前記修飾シトクロムｃとアポトーシスプロテアーゼ活性化因子−１（Ａｐａｆ−１）との結合が野生型シトクロムｃの１０分の１未満である、請求項１記載の融合構築物。
【請求項３】
前記修飾シトクロムｃとアポトーシスプロテアーゼ活性化因子−１（Ａｐａｆ−１）との結合が野生型シトクロムｃの１００分の１未満である、請求項１又は請求項２記載の融合構築物。
【請求項４】
前記修飾シトクロムｃとアポトーシスプロテアーゼ活性化因子−１（Ａｐａｆ−１）との結合が野生型シトクロムｃの１０００分の１未満である、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の融合構築物。
【請求項５】
前記修飾シトクロムｃの４位、７位、８位、２５位、３９位、６２位、６３位、６４位、６５位及び７２位の少なくとも１個のアミノ酸が野生型シトクロムｃと比べて変異している、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の融合構築物。
【請求項６】
前記修飾シトクロムｃが、Ｋ４Ｅ、Ｋ７２Ａ、Ｋ７２Ｌ、Ｋ７２Ｒ、Ｋ７２Ｇ、Ｋ７２Ｘ、Ｅ６２Ｎ、Ｋ７Ｅ−Ｋ８Ｅ、Ｋ２５Ｐ−Ｋ３９Ｈ、Ｋ７Ａ−Ｅ６２Ｎ−Ｋ２５Ｐ、Ｋ７Ａ−Ｅ６２Ｎ−Ｋ３９Ｈ、Ｋ７Ｅ−Ｋ８Ｅ−Ｅ６２Ｎ、Ｋ７Ａ−Ｋ２５Ｐ−Ｅ６２Ｎ、Ｋ７Ａ−Ｅ６２Ｎ−Ｋ２５Ｐ−Ｋ３９Ｈ、Ｅ６２Ｎ−Ｔ６３Ｎ−Ｌ６４Ｍ−Ｍ６５Ｓ、Ｋ７Ｅ−Ｋ８Ｅ−Ｅ６２Ｎ−Ｋ２５Ｐ−Ｋ３９Ｈ、Ｋ７Ｅ−Ｋ８Ｅ−Ｋ２５Ｐ−Ｅ６２Ｎ−Ｔ６３Ｎ−Ｌ６４Ｍ−Ｍ６５Ｓ、Ｋ７Ｅ−Ｋ８Ｅ−Ｋ３９Ｈ−Ｅ６２Ｎ−Ｔ６３Ｎ−Ｌ６４Ｍ−Ｍ６５Ｓ及びＫ７Ｅ−Ｋ８Ｅ−Ｋ２５Ｐ−Ｋ３９Ｈ−Ｅ６２Ｎ−Ｔ６３Ｎ−Ｌ６４Ｍ−Ｍ６５Ｓからなる群から選択される１以上のアミノ酸置換を有する、請求項５記載の融合構築物。
【請求項７】
前記修飾シトクロムｃが、Ｋ７Ｅ−Ｋ８Ｅ−Ｅ６２Ｎ−Ｋ２５Ｐ−Ｋ３９Ｈ、Ｋ７Ｅ−Ｋ８Ｅ−Ｋ２５Ｐ−Ｅ６２Ｎ−Ｔ６３Ｎ−Ｌ６４Ｍ−Ｍ６５Ｓ、Ｋ７Ｅ−Ｋ８Ｅ−Ｋ３９Ｈ−Ｅ６２Ｎ−Ｔ６３Ｎ−Ｌ６４Ｍ−Ｍ６５Ｓ及びＫ７Ｅ−Ｋ８Ｅ−Ｋ２５Ｐ−Ｋ３９Ｈ−Ｅ６２Ｎ−Ｔ６３Ｎ−Ｌ６４Ｍ−Ｍ６５Ｓからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項６記載の融合構築物。
【請求項８】
前記修飾シトクロムｃが、Ｋ７２Ａ、Ｋ７２Ｌ、Ｋ７２Ｒ、Ｋ７２Ｇ及びＫ７２Ｘ（ただし、Ｘはトリメチル化を表す。）からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項６記載の融合構築物。
【請求項９】
前記修飾シトクロムｃがアミノ酸置換Ｋ７２Ａ又はＫ７２Ｌを含む、請求項６又は請求項８記載の融合構築物。
【請求項１０】
前記修飾シトクロムｃがアミノ酸置換Ｋ４Ｅを含む、請求項６記載の融合構築物。
【請求項１１】
前記レポーターが蛍光タンパク質又はその機能的アナログである、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の融合構築物。
【請求項１２】
前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）及びＥｍｅｒａｌｄからなる群から選択される、請求項１１記載の融合構築物。
【請求項１３】
前記蛍光タンパク質が高感度緑色蛍光タンパク質又はＥｍｅｒａｌｄである、請求項１１又は請求項１２記載の融合構築物。
【請求項１４】
前記ＧＦＰが、
ｉ）位置Ｆ６４Ｌでのアミノ酸置換、
ｉｉ）位置Ｓ１７５Ｇでのアミノ酸置換、及び
ｉｉｉ）位置Ｅ２２２Ｇでのアミノ酸置換
を含む、請求項１１記載の融合構築物。
【請求項１５】
配列番号４及び配列番号６からなる群から選択される、請求項１乃至請求項１４のいずれか１項記載の融合構築物。
【請求項１６】
前記レポーターが、検出可能な発光性、蛍光性又は放射活性部分によって局在位置を決定できる、請求項１乃至１０のいずれか１項記載の融合構築物。
【請求項１７】
前記レポーターが免疫原性モチーフを含む、請求項１６記載の融合構築物。
【請求項１８】
前記レポーターがシステインリッチモチーフを含む、請求項１５又は請求項１６記載の融合構築物。
【請求項１９】
前記検出可能な部分が二ヒ素化合物を含む、請求項１６記載の融合構築物。
【請求項２０】
前記部分が抗体を含む、請求項１６記載の融合構築物。
【請求項２１】
請求項１乃至請求項２０のいずれか１項記載の融合構築物をコードするヌクレオチド配列。
【請求項２２】
配列番号３及び配列番号５からなる群から選択される、請求項１５記載の融合構築物をコードするヌクレオチド配列。
【請求項２３】
適切な調節領域と請求項２１又は請求項２２記載のヌクレオチド配列とを含む核酸構築物であって、上記配列が調節領域の調節下にある核酸構築物。
【請求項２４】
天然のシトクロムｃプロモーター、哺乳類の構成型プロモーター、哺乳類の制御プロモーター、ヒトユビキチンＣプロモーター、ウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、酵母プロモーター、糸状菌プロモーター及び細菌プロモーターからなる群から選択されるプロモーターの調節下にある、請求項２３記載の核酸構築物。
【請求項２５】
前記ウイルスプロモーターがＣＭＶプロモーター又はＳＶ４０プロモーターである、請求項２４記載の核酸構築物。
【請求項２６】
前記プロモーターがヒトユビキチンＣプロモーターである、請求項２４記載の核酸構築物。
【請求項２７】
請求項２３乃至請求項２６のいずれか１項記載の核酸構築物を含む複製可能なベクター。
【請求項２８】
前記ベクターがプラスミドベクターである、請求項２７記載の複製可能なベクター。
【請求項２９】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項２７記載の複製可能なベクター。
【請求項３０】
前記ウイルスベクターが、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタインバーウイルス、サルウイルス４０、ウシパピローマウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス及びバキュロウイルスのベクターからなる群から選択される、請求項２９記載の複製可能なベクター。
【請求項３１】
請求項２３乃至請求項２６のいずれか１項記載の核酸構築物で安定に形質転換された宿主細胞。
【請求項３２】
請求項２３乃至請求項２６のいずれか１項記載の核酸構築物で一過性に形質転換された宿主細胞。
【請求項３３】
植物、昆虫、線虫、鳥類、魚及び哺乳類の細胞からなる群から選択される、請求項３１又は請求項３２記載の宿主細胞。
【請求項３４】
前記哺乳類の細胞がヒト細胞である、請求項３３記載の宿主細胞。
【請求項３５】
前記ヒト細胞が、Ｈｅｋ、ＨｅＬａ、Ｕ２ＯＳ及びＭＣＦ−７からなる群から選択される、請求項３４記載の宿主細胞。
【請求項３６】
前記Ｈｅｋ細胞がＨｅｋ２９３である、請求項３５記載の宿主細胞。
【請求項３７】
請求項１乃至２０のいずれか１項記載の融合タンパク質を発現できる、請求項３１乃至請求項３６のいずれか１項記載の宿主細胞。
【請求項３８】
生細胞中でのアポトーシスの検出方法であって、
ｉ）請求項１乃至２０のいずれか１項記載の融合構築物を過剰発現する形質転換細胞を培養する段階と、
ｉｉ）細胞内での融合構築物の局在位置を経時的に決定する段階と
を含み、細胞内での融合構築物の局在位置の変化がアポトーシスの指標となる、方法。
【請求項３９】
生細胞中でのアポトーシスの調節に作用因子が及ぼす効果を測定する方法であって、
ｉ）請求項１乃至２０のいずれか１項記載の融合構築物を過剰発現する形質転換細胞を培養する段階と、
ｉｉ）細胞内での構築物の局在位置を決定する段階と、
ｉｉｉ）細胞を作用因子で処理し、細胞内での構築物の局在位置を決定する段階と
を含み、作用因子で処理していない対照細胞との対比における細胞内での構築物の局在位置の差がアポトーシスの調節に作用因子が及ぼす効果の指標となる、方法。
【請求項４０】
生細胞中でのアポトーシスの調節に作用因子が及ぼす効果を測定する方法であって、
ｉ）請求項１乃至２０のいずれか１項記載の融合構築物を共に過剰発現する第１の細胞と第２の細胞を培養する段階と、
ｉｉ）第１の細胞を作用因子で処理し、第１の細胞内での構築物の局在位置を決定する段階と、
ｉｉｉ）作用因子で処理しなかった第２の細胞内での構築物の局在位置を決定する段階と
を含み、第１の細胞内と第２の細胞内での構築物の局在位置の差がアポトーシスの調節に作用因子が及ぼす効果の指標となる、方法。
【請求項４１】
生細胞中でのアポトーシスの調節に作用因子が及ぼす効果を測定する方法であって、
ｉ）請求項１乃至２０のいずれか１項記載の融合構築物を過剰発現する形質転換細胞を培養する段階と、
ｉｉ）細胞を作用因子で処理し、細胞内での構築物の局在位置を決定する段階と、
ｉｉｉ）作用因子の存在下での構築物の局在位置を、作用因子の非存在下での構築物の局在位置についての既知の値と比較する段階と
を含み、作用因子の存在下での細胞内での構築物の局在位置と、作用因子の非存在下での既知の値との差がアポトーシスの調節に作用因子が及ぼす効果の指標となる、方法。
【請求項４２】
前記既知の値がデータベースに保存されている、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記融合構築物の局在位置が、その発光性、蛍光性又は放射活性によって測定される、請求項３８乃至請求項４２のいずれか１項記載の方法。
【請求項４４】
前記作用因子がアポトーシスを誘導する、請求項３９乃至請求項４３のいずれか１項記載の方法。
【請求項４５】
前記作用因子がアポトーシスを阻害する、請求項３９乃至請求項４３のいずれか１項記載の方法。
【請求項４６】
前記タンパク質融合物の局在位置が細胞の固定後に決定される、請求項３８乃至請求項４５のいずれか１項記載の方法。
【請求項４７】
前記作用因子が、化学的、物理的又は生物学的な作用因子である、請求項３８乃至請求項４６のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミトコンドリアを標的とし、生細胞中でのアポトーシス誘導能が低下したシトクロムｃ−レポーター融合タンパク質構築物に関する。本発明の融合構築物は、生細胞でのアポトーシスにおける早期事象を検出するアッセイで使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
「プログラム細胞死」又はアポトーシスは多細胞生物における重要な事象であり、遺伝的にコードされた細胞死プログラムを規定し、ネクローシスとは形態、生化学及び分子的に異なる（Ｖｅｒｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．，  （２０００）  ２４３，  １６７−１９０）。アポトーシスの特徴的な形態的徴候（細胞の収縮、膜の小疱形成、核の凝集及び断片化）は複雑な生化学的事象のカスケードの結果であり、生理的ホメオスタシスの一体的部分である。
【０００３】
アポトーシスは、細胞増殖と細胞死の均衡を確保して細胞集団及び組織のサイズの調節における制御的な役割を果たしている。膜又は細胞質の受容体での細胞死シグナル伝達の異常、或いはアポトーシスを支配する遺伝子の変化は、先天性奇形及び多数の後天性疾患の病原性に関与する（Ｈａａｎｅｎ  ＆  Ｖｅｒｍｅｓ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｏｂｓｔｅｔｒ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．，  （１９９６）  ６４，  １２９−１３３）。アポトーシスが少なすぎると、悪性腫瘍（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ＆  Ｂｏｄｍｅｒ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  （１９９５）  ９２，  １１１３０−１１１３４）、白血病（Ｓａｃｈｓ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  （１９９６）  ９３，  ４７４２−４７４９）又は抗癌療法に対する抵抗性（Ｐａｈｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ，  （１９９６）  ３４８，  ４９３−４９７）が生じる可能性がある。アポトーシスが多すぎると、免疫不全（Ｍｅｙａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９９２）  ２５７，  ２１７−２１９）及び変性疾患（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  （１９９５）  ２７０，  １１８９−１１９２）を起こす可能性がある。
【０００４】
したがって、医学、薬学及び毒物学において、アポトーシスを誘発・制御する事象の理解を深めることに多大な関心がもたれている。さらに、この現象を調節できる作用因子の同定、定量及び特徴付けに使用することができる新たな技術を開発する必要がある。
【０００５】
アポトーシスの検出アッセイ
プログラム細胞死の開始を検出する多数のアッセイが開発されている（Ｓｇｏｎｅ  ＆  Ｗｉｃｋ，  Ｉｎｔ．  Ａｒｃｈ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  （１９９４）  １０５，  ３２７−３３２；Ｓｇｏｎｅ  ＆  Ｇｒｕｂｅｒ，  Ｅｘｐ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．，  （１９９８）  ３３，  ５２５−５３３）。これらのアッセイは、細胞死に付随する広範な事象に基づいており、伝統的に生体染色及び核色素を用いた光学及び電子顕微鏡法が用いられてきた。例えば、ＤＮＡのラダー化又は分解、ＤＮＡ末端標識法（例えば、ＴＵＮＥＬ末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼｄＵＴＰニック端標識法）、ヌクレアーゼ活性及び乳酸脱水素酵素放出に基づいた生化学的方法がしばしば使用される。
【０００６】
多数の細胞をスクリーニングしやすいので、アポトーシスの検出及び定量にフローサイトメトリーが最も広く使用される方法となる傾向にある（Ｖｅｒｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  （２０００）  ２４３，  １６７−１９０）。この蛍光に基づく技術では、生体色素、アポトーシス酵素（例えば、カスパーゼ）に対する抗体及び一本鎖ＤＮＡ切断が、カルシウム流量及びリン脂質再分布を測定するためのプローブと一緒に使用される。
【０００７】
フローサイトメトリーでは、毎秒細胞１０００〜１００００個の速度で、１個づつ懸濁液中の細胞についてインビボ分析を行うことができる。しかし、フローサイトメトリーに伴う問題の１つは、液体細胞培養物や造血系由来の細胞など懸濁液中の細胞でしか使用できないことである。さらに、組織細胞のフローサイトメトリーでは、細胞を懸濁液にする物理的・酵素的操作が必要であり、それ自体がアポトーシスを誘発する可能性があり、従来の光学又は蛍光顕微鏡による検査が必要となる。
【０００８】
したがって、既存の方法は、アポトーシスの後期事象に基づくものであり（例えば、ＤＮＡ分解、カスパーゼアッセイ）、その多くは、細胞の固定、及び特異的な抗体／色素での染色を必要とする。上記記載の技術では、アポトーシスの早期事象に基づいた、実時間での均一な生細胞アッセイができず、細胞のネクローシスとも区別できない。さらに、これらのアッセイでは、アポトーシス調節能について多数の化合物を試験するのに必要なハイスループット生細胞スクリーニングを容易に行うことができない。
【０００９】
アポトーシスのマーカーとしてのシトクロムｃ移動
シトクロムｃは、コードされた核タンパク質であり、ミトコンドリアを標的とし、そのミトコンドリアで電子伝達体として生物学的機能を示す。アポトーシス刺激に応じたミトコンドリアから細胞質へのシトクロムｃの移動は、アポトーシスを受ける細胞の関与における初期の決定的な段階である（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  （１９９７）  ９１，  ４７９−４８９）。シトクロムｃは、細胞質ゾル中でアポトーシスプロテアーゼ活性化因子−１（Ａｐａｆ−１）と強く結合する（Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  （１９９７）  ９０，  ４０５−４１３）。コファクターの存在下で、生じたシトクロムｃ：Ａｐａｆ−１は集合して多量体の「アポプトソーム」となり、プロテアーゼ酵素前駆体であるプロカスパーゼ−９と結合しこれを活性化する（Ｓｒｉｎｉｖａｓｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  （１９９８）  １，  ９４９−９５７）。こうして「カスパーゼカスケード」が活性化され、多数の細胞内基質が切断され、重要な細胞過程が不能となり、細胞の構造成分が破壊される（Ｓｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  （１９９９）  １４４，  ２８１−２９２；Ｓｋｕｌａｃｈｅｖ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  （１９９８）  ４２３，  ２７５−２８０）。アポトーシスにおけるミトコンドリアの役割を示した概略図を図１に示す。
【００１０】
最近のインビトロ研究（Ｋｌｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  （２０００），  ２７５，  １６１２７−１６１３３；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  （２００１），  ２７６，  １３０４−１３０３８）で、シトクロムｃ：Ａｐａｆ−１の相互作用に関与する分子的な決定要素が同定されている。ウマシトクロムｃは、ヒトシトクロムｃと相同性が高く、カスパーゼ活性化を惹起できるが、酵母シトクロムｃはＡｐａｆ−１と測定可能な程度に結合せず、カスパーゼを活性化することもない（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  （２００１）  ２７６，  １３０３４−１３０３８）。これらの研究では、ウマと酵母のシトクロムｃの重要な違いに焦点を合わせ、部位特異的変異導入を使用して突然変異体を生じさせ、続いてカスパーゼを活性化できるか否かに関して分析している。このインビトロ研究結果から、残基７、２５、３９、６２〜６５及び７２が、シトクロムｃ：Ａｐａｆ−１の相互作用に決定的に重要なアミノ酸であることが示唆されている。特にＫ７２Ａ突然変異では、検出可能な結合又はカスパーゼ−９活性化が認められないことが示されている。アラニンへのリシン７２の突然変異ではシトクロムｃとＡｐａｆ−１の相互作用が消失したが、シトクロムｃの呼吸機能は影響を受けない。
【００１１】
著者らは、インビトロでＡｐａｆ−１との結合及びカスパーゼ−９の活性化の低下を示しているが、シトクロムｃ突然変異タンパク質が生細胞中でも同様の挙動、即ち、ミトコンドリアを標的としアポトーシスを誘導しないか否かは不明である。
【００１２】
同じくインビトロ実験に基づくＡｂｄｕｌｌａｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  （２００２）  ３６２，  ７４９−７５４の最近の報文から、野生型タンパク質よりも２〜１２倍高い濃度で存在する場合、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  （２００１）  ２７６，  １３０３４−１３０３８に記載のウマＫ７２突然変異体は、野生型タンパク質と同程度のカスパーゼ活性化を示すことが示唆されている。一方で、著者らは、ウマＫ４Ｅシトクロムｃ突然変異体がカスパーゼ活性化に不活性であったと報告しており、Ｋ７２突然変異体ではなくこの突然変異体が、アポトーシスにおけるシトクロムｃの役割に関するインビボノックイン研究の良好な候補となるはずであると結論付けている。
【００１３】
蛍光タンパク質
オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の使用は、多くの細胞分子生物学的プロセスへの研究で周知である。シトクロムｃ−ＧＦＰ融合物がアポトーシスの研究に使用されている。例えば、Ｈｅｉｓｋａｎｅｎ  ａｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  （１９９９）  ２７４，  ５６５４−５６５８では、ラット褐色細胞腫−６（ＰＣ６）細胞中でラットシトクロムｃに基づくシトクロムｃ−ＧＦＰ融合物を発現させている。スタウロスポリンによってアポトーシスを誘導すると、ミトコンドリアから融合物が放出され、ミトコンドリアの脱分極に伴って起こった。
【００１４】
Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，  （２０００）  ２，  １５６−１６０には、ＨｅＬａ細胞中で過剰発現させたヒトシトクロムｃに基づくシトクロムｃ−ＧＦＰ融合物がミトコンドリアに局在することが記載されている。一連のアポトーシス誘導因子がシトクロムｃ−ＧＦＰの急速な放出を引き起こすことが記載されている。
【００１５】
他の研究者らも、シトクロムｃ−ＧＦＰ融合タンパク質を過剰産生する一過性トランスフェクト細胞を用いてアポトーシスを研究している。例えば、Ｇｏａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，  （２００１）  １１４，  ２８５５−２８６２では、ＵＶ誘導アポトーシスにおける生ＨｅＬａ細胞内でのＧＦＰタグシトクロムｃの動的再分布及びミトコンドリアの形態変化をモニターしている。同様に、Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｓｃｉ．  （２００２）；  ９，４８８−５０６では、ＣＯＳ−７細胞に各種ＧＦＰ構築物を一過性にトランスフェクトし、蛍光及び免疫化学的技術を用いて細胞内分布を決定することによって、シトクロムｃ−ＧＦＰの局在化の生化学的基礎が検討されている。
【非特許文献１】Ｖｅｒｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．，  （２０００）  ２４３，  １６７−１９０
【非特許文献２】Ｈａａｎｅｎ  ＆  Ｖｅｒｍｅｓ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｏｂｓｔｅｔｒ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．，  （１９９６）  ６４，  １２９−１３３
【非特許文献３】Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ＆  Ｂｏｄｍｅｒ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  （１９９５）  ９２，  １１１３０−１１１３４
【非特許文献４】Ｓａｃｈｓ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  （１９９６）  ９３，  ４７４２−４７４９
【非特許文献５】Ｐａｈｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ，  （１９９６）  ３４８，  ４９３−４９７
【非特許文献６】Ｍｅｙａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９９２）  ２５７，  ２１７−２１９
【非特許文献７】Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  （１９９５）  ２７０，  １１８９−１１９２
【非特許文献８】Ｓｇｏｎｅ  ＆  Ｗｉｃｋ，  Ｉｎｔ．  Ａｒｃｈ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  （１９９４）  １０５，  ３２７−３３２
【非特許文献９】Ｓｇｏｎｅ  ＆  Ｇｒｕｂｅｒ，  Ｅｘｐ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．，  （１９９８）  ３３，  ５２５−５３３
【非特許文献１０】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  （１９９７）  ９１，  ４７９−４８９
【非特許文献１１】Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  （１９９７）  ９０，  ４０５−４１３
【非特許文献１２】Ｓｒｉｎｉｖａｓｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  （１９９８）  １，  ９４９−９５７
【非特許文献１３】Ｓｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  （１９９９）  １４４，  ２８１−２９２
【非特許文献１４】Ｓｋｕｌａｃｈｅｖ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  （１９９８）  ４２３，  ２７５−２８０
【非特許文献１５】Ｋｌｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  （２０００），  ２７５，  １６１２７−１６１３３
【非特許文献１６】Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  （２００１）  ２７６，  １３０３４−１３０３８
【非特許文献１７】Ａｂｄｕｌｌａｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  （２００２）  ３６２，  ７４９−７５４
【非特許文献１８】Ｈｅｉｓｋａｎｅｎ  ａｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  （１９９９）  ２７４，  ５６５４−５６５８
【非特許文献１９】Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，  （２０００）  ２，  １５６−１６０
【非特許文献２０】Ｇｏａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，  （２００１）  １１４，  ２８５５−２８６２
【非特許文献２１】Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｓｃｉ．  （２００２）；  ９，４８８−５０６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
生細胞中でハイスループットスクリーニングを容易に行うことができ、アポトーシスにおける早期事象を実時間で検出し分析することができる高感度なアッセイの開発が求められている。
【００１７】
細胞内でのシトクロムｃの過剰発現が実証されているが、生じた高レベルのタンパク質はアポトーシス及び細胞死をもたらし、シトクロムｃレベルの上方制御が関与する研究には複雑な誘導性／一過性の系の使用が必要とされる（Ｃｈａｎｄｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  （２００２）  ２７７，  ５０８４２−５０８５４）。今まで、スクリーニングの目的で確実に使用できる、このタンパク質を過剰発現する安定な細胞系統を作製することは不可能であった。
【００１８】
したがって、レポーター基と結合して融合構築物を形成したとき、細胞内で発現させて安定な細胞系統にすることができるシトクロムｃタンパク質が必要である。得られた構築物は、細胞内でアポトーシスの誘導又は抑制における早期事象に対するバイオセンサーとして働くことができる。そのような構築物を過剰発現する安定な細胞系統は、アポトーシスを調節する作用因子を同定するハイスループットスクリーニングの目的に適している。
【００１９】
本発明は、この問題に取り組むものであり、細胞に対する毒性が認められず、生細胞中でのアポトーシスにおける早期事象の検出を可能にするバイオセンサーとして働く融合構築物を提供する。本発明の安定な形質転換細胞は、内因性のシトクロムｃが存在することにより依然としてアポトーシスを起こすことができ、それによって、シトクロムｃの移動の上流であっても下流であっても第２のアポトーシスシグナル伝達事象を検出し決定することが可能となる。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の第１の態様では、野生型シトクロムｃに由来する修飾シトクロムｃタンパク質又はその機能的アナログを含み、その修飾シトクロムｃがミトコンドリアを標的とし、生細胞中でのアポトーシス誘導能が低下したシトクロムｃ−レポーター融合タンパク質構築物が提供される。
【００２１】
レポーターは、放射活性、蛍光又は発光の特性により検出可能であり、或いは標識抗体や特異的な結合化合物など検出可能な部分によって局在位置を決定できる基であることが理解されるはずである。
【００２２】
好ましくは、修飾シトクロムｃとアポトーシスプロテアーゼ活性化因子−１（Ａｐａｆ−１）との結合は野生型シトクロムｃの１０分の１未満である。さらに好ましくは、修飾シトクロムｃとＡｐａｆ−１との結合は野生型シトクロムｃの１００分の１未満である。最も好ましくは、修飾シトクロムｃとＡｐａｆ−１との結合は野生型シトクロムｃの１０００分の１未満である。
【００２３】
好適には、野生型シトクロムｃと比べて、４位、７位、８位、２５位、３９位、６２位、６３位、６４位、６５位及び７２位で、修飾シトクロムｃの少なくとも１個のアミノ酸が突然変異している。
【００２４】
好適には、修飾シトクロムｃは、Ｋ４Ｅ、Ｋ７２Ａ、Ｋ７２Ｌ、Ｋ７２Ｒ、Ｋ７２Ｇ、Ｋ７２Ｘ、Ｅ６２Ｎ、Ｋ７Ｅ−Ｋ８Ｅ、Ｋ２５Ｐ−Ｋ３９Ｈ、Ｋ７Ａ−Ｅ６２Ｎ−Ｋ２５Ｐ、Ｋ７Ａ−Ｅ６２Ｎ−Ｋ３９Ｈ、Ｋ７Ｅ−Ｋ８Ｅ−Ｅ６２Ｎ、Ｋ７Ａ−Ｋ２５Ｐ−Ｅ６２Ｎ、Ｋ７Ａ−Ｅ６２Ｎ−Ｋ２５Ｐ−Ｋ３９Ｈ、Ｅ６２Ｎ−Ｔ６３Ｎ−Ｌ６４Ｍ−Ｍ６５Ｓ、Ｋ７Ｅ−Ｋ８Ｅ−Ｅ６２Ｎ−Ｋ２５Ｐ−Ｋ３９Ｈ、Ｋ７Ｅ−Ｋ８Ｅ−Ｋ２５Ｐ−Ｅ６２Ｎ−Ｔ６３Ｎ−Ｌ６４Ｍ−Ｍ６５Ｓ、Ｋ７Ｅ−Ｋ８Ｅ−Ｋ３９Ｈ−Ｅ６２Ｎ−Ｔ６３Ｎ−Ｌ６４Ｍ−Ｍ６５Ｓ及びＫ７Ｅ−Ｋ８Ｅ−Ｋ２５Ｐ−Ｋ３９Ｈ−Ｅ６２Ｎ−Ｔ６３Ｎ−Ｌ６４Ｍ−Ｍ６５Ｓからなる群から選択される１以上のアミノ酸置換を有する。
【００２５】
好ましくは、修飾シトクロムｃは、Ｋ７Ｅ−Ｋ８Ｅ−Ｅ６２Ｎ−Ｋ２５Ｐ−Ｋ３９Ｈ、Ｋ７Ｅ−Ｋ８Ｅ−Ｋ２５Ｐ−Ｅ６２Ｎ−Ｔ６３Ｎ−Ｌ６４Ｍ−Ｍ６５Ｓ、Ｋ７Ｅ−Ｋ８Ｅ−Ｋ３９Ｈ−Ｅ６２Ｎ−Ｔ６３Ｎ−Ｌ６４Ｍ−Ｍ６５Ｓ及びＫ７Ｅ−Ｋ８Ｅ−Ｋ２５Ｐ−Ｋ３９Ｈ−Ｅ６２Ｎ−Ｔ６３Ｎ−Ｌ６４Ｍ−Ｍ６５Ｓからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。
【００２６】
さらに好ましくは、修飾シトクロムｃは、Ｋ７２Ａ、Ｋ７２Ｌ、Ｋ７２Ｒ、Ｋ７２Ｇ及びＫ７２Ｘからなる群から選択されるアミノ酸置換を含み、Ｘはトリメチル化を表す。最も好ましくは、修飾シトクロムｃは、アミノ酸置換Ｋ７２Ａ又はＫ７２Ｌを含む。
【００２７】
好ましくは、修飾シトクロムｃは、アミノ酸置換Ｋ４Ｅを含む。
【００２８】
好適には、レポーターは、蛍光タンパク質又はその機能的アナログである。
【００２９】
蛍光タンパク質の機能的アナログには、それだけに限らないが、例えば米国特許第６２７０９６４号、同第６４２８９５１号及び同第６２９４３３０号に記載のタンパク質断片相補アッセイで形成される検出可能な蛍光タンパク質断片が含まれることが当業者には理解されるであろう。
【００３０】
好ましくは、本発明の蛍光タンパク質は、オワンクラゲ、ウミシイタケ（Renilla reniformis）又は花虫綱に属する他の種に由来する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である（Ｌａｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，  （２００２），  ９９，  ４２５６−４２６１）。
【００３１】
米国特許第６１７２１８８号は、発色団の前にある１位のアミノ酸が、蛍光強度の増大をもたらすように突然変異している変異ＧＦＰについて記載している。この突然変異体によって、励起と発光の最大値が移動せずにＧＦＰの蛍光強度が実質的に増大する。Ｆ６４Ｌ−ＧＦＰは、発色団の成熟時間が短いため３７℃での蛍光が約６倍に増大することが示されている。
【００３２】
一般に高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）と呼ばれる突然変異体の１つは、突然変異Ｆ６４Ｌ及びＳ６５Ｔを含む（Ｃｏｒｍａｃｋ，  Ｂ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  （１９９６），  １７３，  ３３−３８）。ＥＧＦＰは、哺乳類の系での発現用に最適化されており、好ましい哺乳類コドンを用いて構築されている。
【００３３】
好適には、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）及びＥｍｅｒａｌｄからなる群から選択される。好ましくは、蛍光タンパク質はＥＧＦＰ又はＥｍｅｒａｌｄである。
【００３４】
英国特許第２３７４８６８号は、均一でない細胞中で３０℃を超える温度で発現させ、約４９０ｎｍで励起したときに野生型ＧＦＰと比べて高い蛍光を示す、Ｆ６４、Ｓ６５／Ｅ２２２及びＳ１７５に三重突然変異を有するＧＦＰ誘導体について記載している。本発明の方法を用いて生成された突然変異ＧＦＰは、低レベルの発現で、及び／又は野生型ＧＦＰと比べて高い感度で哺乳類細胞中のＧＦＰレポーターを検出する手段を提供する。
【００３５】
好ましくは、本発明のＧＦＰは、
ｉ）位置Ｆ６４Ｌでのアミノ酸置換、
ｉｉ）位置Ｓ１７５Ｇでのアミノ酸置換、及び
ｉｉｉ）位置Ｅ２２２Ｇでのアミノ酸置換
を含む。
【００３６】
好ましい一実施形態では、融合構築物は、配列番号４又は配列番号６である。
【００３７】
一実施形態では、レポーターは、検出可能な発光、蛍光又は放射活性部分によって局在位置を決定できる。したがって、例えば、レポーターは免疫原性モチーフを含み、検出可能な部分は、発光、蛍光又は放射活性により標識された抗体でもよい。
【００３８】
好適には、レポーターは、ＦＬＡＧ（商標）、ＨＡ、ＨＩＳ、ｃ−Ｍｙｃ、ＶＳＶ−Ｇ、Ｖ５又はＨＳＶ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）エピトープを含み、特定の標識抗体によって局在位置を決定できる。
【００３９】
他の実施形態では、レポーターはシステインリッチモチーフを含み、検出可能な部分は、Ｇｒｉｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９９８），  ２８１，  ２６９−２７２並びに米国特許第６０５４２７１号、同第６００８３７８号及び同第５９３２４７４号に記載の標識二ヒ素化合物を含む。
【００４０】
本発明の第２の態様では、上述のタンパク質融合構築物をコードするヌクレオチド配列が提供される。
【００４１】
好ましくは、ヌクレオチド配列は、配列番号３又は配列番号５である。
【００４２】
本発明の第３の態様では、適切な調節領域と上述のヌクレオチド配列とを含み、その配列が調節領域の調節下にある核酸構築物が提供される。
【００４３】
好適には、核酸構築物は、天然のシトクロムｃプロモーター、哺乳類の構成型プロモーター、哺乳類の制御プロモーター、ヒトユビキチンＣプロモーター、ウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、酵母プロモーター、糸状菌プロモーター及び細菌プロモーターからなる群から選択されるプロモーターの調節下にある。
【００４４】
好ましくは、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター又はＳＶ４０プロモーターである。さらに好ましくは、プロモーターは、ヒトユビキチンＣプロモーターである。
【００４５】
本発明の第４の態様では、上述の核酸構築物を含む複製可能なベクターが提供される。
【００４６】
好適には、ベクターは、Ｍａｋｒｉｄｅｓ，  Ｐｒｏｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＆  Ｐｕｒｉｆ．  （１９９９）  １７，  １８３−２０２により記載されたプラスミドベクターである。
【００４７】
好ましくは、ベクターはウイルスベクターである。本発明での使用に適したウイルスベクターは、例えば、Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  （２０００）１１，  ６９３−６９９に記載され、それには、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタインバーウイルス、サルウイルス４０、ウシパピローマウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス及びバキュロウイルスのベクターが含まれる。
【００４８】
本発明の第５の態様では、上述の核酸構築物で安定に形質転換した宿主細胞が提供される。
【００４９】
本発明の第６の態様では、上述の核酸構築物で一過性に形質転換した宿主細胞が提供される。
【００５０】
好適には、宿主細胞は、植物、昆虫、線虫、鳥類、魚及び哺乳類の細胞からなる群から選択される。好ましくは、細胞はヒト細胞である。さらに好ましくは、ヒト細胞は、Ｈｅｋ、Ｈｅｌａ、Ｕ２ＯＳ及びＭＣＦ−７からなる群から選択される。最も好ましくは、細胞はＨｅｋ細胞系統２９３（Ｈｅｋ２９３）である。
【００５１】
好適には、宿主細胞は、上述の融合タンパク質を発現できる。
【００５２】
本発明の第７の態様では、生細胞中でのアポトーシスの検出方法であって、
ｉ）上述の融合構築物を過剰発現する形質転換細胞を培養する段階と、
ｉｉ）細胞内での融合構築物の局在位置を経時的に決定する段階とを含み、細胞内での融合構築物の局在位置の変化がアポトーシスの指標となる、方法を提供する。
【００５３】
本発明の第８の態様では、生細胞中でのアポトーシスの調節に作用因子が及ぼす効果を測定する方法であって、
ｉ）上述の融合構築物を過剰発現する形質転換細胞を培養する段階と、
ｉｉ）細胞内での構築物の局在位置を決定する段階と、
ｉｉｉ）細胞を作用因子で処理し、その細胞内での構築物の局在位置を決定する段階とを含み、作用因子で処理しなかった対照細胞と比較した、その細胞内での構築物の局在位置の差が、アポトーシスの調節に対して作用因子が及ぼす効果の指標となる、方法を提供する。
【００５４】
本発明の第９の態様では、生細胞中でのアポトーシスの調節に作用因子が及ぼす効果を測定する方法であって、
ｉ）どちらも上述の融合構築物を過剰発現する第１の細胞と第２の細胞を培養する段階と、
ｉｉ）第１の細胞を作用因子で処理し、第１の細胞内での構築物の局在位置を決定する段階と、
ｉｉｉ）作用因子で処理しなかった第２の細胞内での構築物の局在位置を決定する段階とを含み、第１の細胞内と第２の細胞内での構築物の局在位置の差が、アポトーシスの調節に対して作用因子が及ぼす効果の指標となる、方法を提供する。
【００５５】
本発明の第１０の態様では、生細胞中でのアポトーシスの調節に対して作用因子が及ぼす効果を測定する方法であって、
ｉ）上述の融合構築物を過剰発現する形質転換細胞を培養する段階と、
ｉｉ）細胞を作用因子で処理し、その細胞内での構築物の局在位置を決定する段階と、
ｉｉｉ）作用因子の存在下での構築物の局在位置を、作用因子の非存在下での構築物の局在位置についての既知の値と比較する段階とを含み、作用因子の存在下での細胞内での構築物の局在位置と、作用因子の非存在下での既知の値との差がアポトーシスの調節に対して作用因子が及ぼす効果の指標となる、方法を提供する。
【００５６】
好適には、既知の値は、電子又は光データベースなどのデータベースに保存されている。
【００５７】
好適には、タンパク質融合物の局在位置は、その発光、蛍光又は放射活性の特性によって測定される。
【００５８】
本発明の方法は、アポトーシスを誘導又は阻害する作用因子を同定するスクリーニングの目的に適している。
【００５９】
本発明の他の実施形態では、融合構築物の局在位置は、生存していない固定細胞上で決定される。したがって、融合構築物を過剰発現する生細胞を特定の時点で従来の手段により固定し、標識抗体や特異的な結合化学物質など検出可能な部分を用いて融合タンパク質の位置を検出する。このように、アポトーシスに対して作用因子が及ぼす効果は、作用因子がある場合とない場合の融合構築物の局在位置を比較することによって決定することができる。或いは、アポトーシスに対して作用因子が及ぼす効果は、作用因子の非存在下での局在についての既知の値（例えば、データベースに保存されているもの）に対して作用因子の存在下での構築物の局在位置を比較することによって決定することもできる。
【００６０】
好適には、作用因子は、化学的な、物理的な又は生物学的な作用因子である。化学的な作用因子の例には、薬物、毒素、ペプチド、タンパク質や核酸などの無機及び有機の化合物がある。物理的な作用因子には、電気エネルギー、磁気エネルギーや光（ＵＶ、γ線、ＩＲ、可視光線）エネルギーなどの電磁放射がある。典型的な生物学的作用因子の例には、生細胞に感染しアポトーシスを調節することができるウイルス、プリオン、細菌及び菌類がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
図面の簡単な説明
図１は、Ｂｉｏｃａｒｔａ：(www. biocarta.com/ pathfiles/ h_mitochondriaPathway.asp)の承諾の下で引用したアポトーシスにおけるミトコンドリアの役割を描いた概略図である。
【００６２】
図２ａ）は、クローン２Ｂ６のＨｅｋ２９３細胞中のシトクロムｃ（Ｋ７２Ａ−ＧＦＰ突然変異体）標識ミトコンドリアを示すＩｎＣｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ３０００の画像（倍率約４０倍）である。
【００６３】
図２ｂ）は、ＨｅＬａ細胞中でのシトクロムｃ−ＧＦＰ発現を示す共焦点顕微鏡の画像（約６０倍）である（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，  （２０００）  ２，  １５６−１６０））。
【００６４】
図３ａ）〜ｃ）は、Ｈｅｋ２９３細胞中でのシトクロムｃとテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）の二重励起を用いた、シトクロムｃ（Ｋ７２Ａ突然変異体）−ＧＦＰとＴＭＲＥの同時局在を示すＩｎＣｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ３０００の画像である。
【００６５】
図３ａ）はシトクロムｃ（Ｋ７２Ａ）−ＧＦＰを示す図である。
【００６６】
図３ｂ）は、ＴＭＲＥ標識ミトコンドリアを示す図である。
【００６７】
図３ｃ）は、二重励起後の図３ａ）と図３ｂ）を重ね合わせたものである。
【００６８】
図４は、野生型シトクロムｃをコードする核酸配列（配列番号１）である。
【００６９】
図５は、野生型シトクロムｃのアミノ酸配列（配列番号２）である。
【００７０】
図６は、Ｆ６４Ｌ−Ｓ１７５Ｇ−Ｅ２２２Ｇ−トリＧＦＰ−シトクロムｃ（Ｋ７２Ａ）構築物をコードする核酸配列（配列番号３）である。
【００７１】
図７は、Ｆ６４Ｌ−Ｓ１７５Ｇ−Ｅ２２２Ｇ−トリＧＦＰ−シトクロムｃ（Ｋ７２Ａ）構築物のアミノ酸配列（配列番号４）である。
【００７２】
図８は、シトクロムｃ（Ｋ７２Ａ）−Ｆ６４Ｌ−Ｓ１７５Ｇ−Ｅ２２２Ｇ−トリＧＦＰをコードする核酸配列（配列番号５）である。
【００７３】
図９は、シトクロムｃ（Ｋ７２Ａ）−Ｆ６４Ｌ−Ｓ１７５Ｇ−Ｅ２２２Ｇ−トリＧＦＰのアミノ酸配列（配列番号６）である。
【００７４】
図１０は、Ｆ６４Ｌ−Ｓ１７５Ｇ−Ｅ２２２Ｇ−野生型シトクロムｃ構築物をコードする核酸配列（配列番号７）である。
【００７５】
図１１は、Ｆ６４Ｌ−Ｓ１７５Ｇ−Ｅ２２２Ｇ野生型シトクロムｃ構築物のアミノ酸配列（配列番号８）である。
【００７６】
図１２は、野生型シトクロムｃ−Ｆ６４Ｌ−Ｓ１７５Ｇ−Ｅ２２２ＧトリＧＦＰをコードする核酸配列（配列番号９）である。
【００７７】
図１３は、野生型シトクロムｃ−Ｆ６４Ｌ−Ｓ１７５Ｇ−Ｅ２２２ＧトリＧＦＰのアミノ酸配列（配列番号１０）である。
【実施例】
【００７８】
実施例１
シトクロムｃ遺伝子の増幅、ＧＦＰ（Ｆ６４Ｌ−Ｓ１７５Ｇ−Ｅ２２２Ｇ）への融合及びＫ７２Ａ（ＡＰＡＦ−１結合）突然変異の導入
本発明の蛍光シトクロムｃ突然変異融合タンパク質は、シトクロムｃタンパク質をコードする核酸の配列を、蛍光タンパク質をコードする核酸の配列とインフレームで結合させ、次いでＫ７２Ａ（ＡＰＡＦ−１結合）突然変異（Ｋｌｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，  （２０００）  ２７５，  １６１２７−１６１３３）を融合タンパク質の核酸に導入することにより作製した。ヒトシトクロムｃ遺伝子の好ましい配列は、Ｚａｎｇ  ａｎｄ  Ｇｅｒｓｔｅｉｎ，  Ｇｅｎｅ，  （２００３）３１２，  ６１−７２により記載されている；ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１８９４７。（配列番号１）コードされたタンパク質を配列番号２に示す。代替のヒトシトクロムｃ配列を使用することができる。さらに、遺伝子の開始コドン及び終止コドン周辺で代替の配列を使用して、タンパク質融合に有用な制限酵素部位をもたらすことができる。そのような変更により、基準配列と比べてアミノ酸の付番が変化する場合、そのような付番は、基準配列とのアミノ酸の整列によって推測されるはずである。蛍光タンパク質をコードする遺伝子の好ましい配列には、Ｃｈａｌｆｉｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  （１９９４）  ２６３，  ８０２−５が公表したオワンクラゲに由来するもの、ＧＦＰ−Ｆ６４Ｌ−Ｓ１７５Ｇ−Ｅ２２２Ｇ突然変異体（英国特許第２３７４８６８号）、Ｅｍｅｒａｌｄ（Ａｕｒｏｒａ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ＥＧＦＰ及びその関連突然変異体（ＢＤ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社（米国カリフォルニア州パロアルト）製）並びに花虫綱の種由来の蛍光タンパク質が挙げられ、総説についてはＬａｂａｓ  ｅｔ  ａｌ，  ＰＮＡＳ，  （２００２）  ９９，  ４２５６−４２６１を参照されたい。
【００７９】
シトクロムｃ遺伝子は、認められているプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ  （２００１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に従って、混成ヒトｃＤＮＡライブラリーからプライマーＣＹＣＳ１及びＣＹＣＳ２、又はＣＹＣＳ１及びＣＹＣＳ３を用いたＲＴ−ＰＣＲによって増幅させた。
【００８０】
ＣＹＣＳ１；５′−ｇｔｔｇａａｔｔｃｇａｃｃａｔｇｇｇｔｇａｔｇｔｔｇａｇａａａｇｇｃ（配列番号１１）
ＣＹＣＳ２；５′−ｇｔｔｇｔｔｇｔｃｇａｃｃｔｔａｃｔｃａｔｔａｇｔａｇｃｔｔｔｔｔｔｇａｇ（配列番号１２）
ＣＹＣＳ３；５′−ｇｔｔｇｔｔｇｔｃｇａｃｃｃｔｃａｔｔａｇｔａｇｃｔｔｔｔｔｔｇａｇ（配列番号１３）
プライマーＣＹＣＳ１は、シトクロムｃ遺伝子の５′領域と相同性を示し、部分的なKozak配列（Ｋｏｚａｋ，  Ｃｅｌｌ  （１９８６），  ４４，  ２８３）と、ＥｃｏＲＩ制限酵素部位の両方を含む。プライマーＣＹＣＳ２は、シトクロムｃ遺伝子の３′領域と相同性を示し、終止コドン及びＳａｌＩ制限酵素部位を含む。プライマーＣＹＣＳ３は、シトクロムｃ遺伝子の３′領域と相同性を示し、ＳａｌＩ制限酵素部位を含む。ＣＹＣＳ１−ＣＹＣＳ２及びＣＹＣＳ１−ＣＹＣＳ３のＲＴ−ＰＣＲ産物を、それぞれＧＦＰ−融合ベクターｐＣＯＲＯＮ１０００−ＧＦＰ−Ｃ１及びＮ１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（英国カーディフ）製）の対応するＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ部位にクローン化し、自動配列決定によりそれを検証した。これらのベクターは、ＧＦＰ融合物を発現させるためのＣＭＶプロモーター、及びネオマイシン耐性マーカーの発現を誘発するためのＳＶ４０プロモーターを含む。これらのベクター内のＧＦＰはレッドシフトしており、英国特許第２３７４８６８号に記載の突然変異Ｆ６４Ｌ−Ｓ１７５Ｇ−Ｅ２２２Ｇを含む。
【００８１】
プライマーＣＹＣＳ４及びＣＹＣＳ５を用いて、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位特異的変異導入キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（米国カリフォルニア州ラホヤ）製）でシトクロムｃ（Ｋ７２Ａ）突然変異体を作製した。
【００８２】
ＣＹＣＳ４；５′−ｇｇａｇｔａｔｔｔｇｇａｇａａｔｃｃｃｇｃｃａａｇｔａｃａｔｃｃｃｔｇｇａａｃａａ（配列番号１４）
ＣＹＣＳ５；５′−ｔｔｇｔｔｃｃａｇｇｇａｔｇｔａｃｔｔｇｇｃｇｇｇａｔｔｃｔｃｃａａａｔａｃｔｃｃ（配列番号１５）
配列の検証後、制限酵素ＮｈｅＩ及びＮｏｔＩを用いてｐＣＯＲＯＮ１０００−ＧＦＰ−野生型シトクロムｃ及びＫ７２Ａ突然変異融合構築物をベクターｐＣＯＲＯＮ２１００中にサブクローン化した。ｐＣＯＲＯＮ２１００は、ＣＭＶプロモーター、並びにＧＦＰ−融合タンパク質及びネオマイシン耐性マーカーのバイシストロニックな発現を駆動するＩＲＥＳエレメントを含む。
【００８３】
得られたＧＦＰ−シトクロムｃ構築物の核酸及びアミノ酸の配列を図６〜１３に示す（配列番号３〜１０）。
【００８４】
実施例２
哺乳類細胞でのＧＦＰ−融合タンパク質安定細胞系統作製に対するシトクロムｃ−Ｋ７２Ａ（ＡＰＡＦ−１結合）突然変異の影響
ＨｉＳｐｅｅｄプラスミド精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社（オランダ）製）を用いて、トランスフェクションに使用するプラスミドＤＮＡをすべての構築物用に調製した。実施例１での構築物に加えて、ｐＣＯＲＯＮ１０００−ＧＦＰ及びｐＣＯＲＯＮ２１００−ＧＦＰを選択対照として用いた。ＤＮＡを１８ＭΩ水（Ｓｉｇｍａ社（英国ドーセット）製）中で１００ｎｇ／μｌに希釈し、１μｇをトランスフェクションに使用した。トランスフェクションを行う日に集密度が５０〜８０％となるように、６穴プレート中に密度５×１０４個／穴でＨｅｋ２９３細胞を播き、１晩インキュベートした。ＦｕＧｅｎｅ６試薬（Roche  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社（スイス国バーゼル）製）に対するＤＮＡの比は、一過性トランスフェクションの各反応について１：３（１μｇ：３μｌ）を用いた。即ち、３μｌのＦｕＧｅｎｅ６を無血清ＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ社製）（ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（米国カリフォルニア州カールスバッド）製］を含有）８７μｌに添加し、穏やかにたたいて混合し、次いで構築物ＤＮＡ１０μｌ（１μｇ）を添加し、再度穏やかに混合した。そのＦｕＧｅｎｅ６：ＤＮＡ複合体を室温で４０分間インキュベートし、１滴づつ穏やかに混合しながら、培地を交換せずに細胞に直接添加した。次いで、均一な分布となるようにプレートを穏やかに旋回した。２４時間後及び４８時間後に、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２００落射蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ社（米国ニューヨーク州メルヴィル）製）を用いて発現について細胞をモニターした。直径１５ｃｍプレート中に細胞を継代し、２４時間後ジェネテシン（Ｇ４１８、２５０ｎｇ／μｌ；Ｓｉｇｍａ社製）での選択下に置いた。続いての５〜７日にわたってジェネテシンの濃度を５００ｎｇ／μｌまで漸増させた。約１０日間、又は模擬トランスフェクトした対照のプレートが死滅するまで選択を継続した。次いで、クローニングリングを使用して、生存しているコロニーを単離し、９６穴、２４穴及び６穴プレートにより細胞を増殖させた。適当な場合には第２及び第３回のクローン選択にかけた。
【００８５】
初回のクローン選択後、残存している細胞は、ｐＣＯＲＯＮ１０００−ＧＦＰ、ｐＣＯＲＯＮ２１００−ＧＦＰ、並びにｐＣＯＲＯＮ２１００−ＧＦＰ−Ｎ及び−Ｃのシトクロムｃ（Ｋ７２Ａ）突然変異プラスミドを含むトランスフェクションについて認められた。他のプラスミド構築物をトランスフェクトした細胞からは、残存しているコロニーは得られなかった。
【００８６】
結果
ＩＲＥＳエレメントを利用し、安定な細胞系統の作製を促進するために、ｐＣＯＲＯＮ２１００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で、この突然変異ｃＤＮＡの発現試験を行った。ジェネテシンＧ４１８での選択下で「混合集団」の安定発現細胞系統を３週間継続して培養した。次いで単一クローン細胞系統を１５個単離した。
【００８７】
ｐＣＯＲＯＮ２１００−ＧＦＰ−シトクロムｃ（Ｋ７２Ａ）突然変異体を含むＨｅｋ２９３細胞は、４カ月間にわたって継続した培養の間安定な発現を示すことが判明した。そのレポーター融合タンパク質がミトコンドリアに局在することは、Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＬＳＭ（Ｚｅｉｓｓ社（米国ニューヨーク州ソーンウッド）製）及びハイスループットレーザー走査型共焦点顕微鏡（ＩＮＣｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ３０００、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、既知のミトコンドリアマーカーであるＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社（米国オレゴン州ユージーン）製）と共局在させることにより、この期間中に確認された。
【００８８】
ＩｎＣｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ３０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（英国）製）レーザー走査型共焦点画像化システムを使用した、この安定なクローンの１つ（２Ｂ６）の発現の結果を下記の図２中に示す。図２ａから認められるように、発現したシトクロムｃ−ＧＦＰの局在パターンは、図２ｂで再現されている、共焦点顕微鏡を用いてＧｏｌｄｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，  （２０００）  ２，  １５６−１６０が観察したものと酷似している。予想通り、その融合タンパク質は、核から排除されることを示し、ミトコンドリアに局在し、シトクロムｃ−ＧＦＰは断続的な蛍光パターンを示している（図２ａ）。
【００８９】
図３ａ及び３ｂは、Ｈｅｋ２９３細胞のミトコンドリアにおける融合タンパク質構築物（ａ）及び濃度４０ｎＭでのミトコンドリア染色剤ＴＭＲＥ（ｂ）の局在を示すものである。ＩｎＣｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒでシトクロムｃ−ＧＦＰとＴＭＲＥを二重励起させると同時局在していることが示される（図３ｃ）。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】Ｂｉｏｃａｒｔａ：(www. biocarta.com/ pathfiles/ h_mitochondriaPathway.asp)の承諾の下で引用したアポトーシスにおけるミトコンドリアの役割を描いた概略図である。
【図２ａ】クローン２Ｂ６のＨｅｋ２９３細胞中のシトクロムｃ（Ｋ７２Ａ−ＧＦＰ突然変異体）標識ミトコンドリアを示すＩｎＣｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ３０００の画像（倍率約４０倍）である。
【図２ｂ】ＨｅＬａ細胞中でのシトクロムｃ−ＧＦＰ発現を示す共焦点顕微鏡の画像（約６０倍）である（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，  （２０００）  ２，  １５６−１６０）より）。
【図３】Ｈｅｋ２９３細胞中でのシトクロムｃとテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）の二重励起を用いた、シトクロムｃ（Ｋ７２Ａ突然変異体）−ＧＦＰとＴＭＲＥの同時局在を示すＩｎＣｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ３０００の画像である。図３ａはシトクロムｃ（Ｋ７２Ａ）−ＧＦＰを示す図である。図３ｂは、ＴＭＲＥ標識ミトコンドリアを示す図である。図３ｃは、二重励起後の図３ａと図３ｂを重ね合わせたものである。
【図４】野生型シトクロムｃをコードする核酸配列（配列番号１）である。
【図５】野生型シトクロムｃのアミノ酸配列（配列番号２）である。
【図６】Ｆ６４Ｌ−Ｓ１７５Ｇ−Ｅ２２２Ｇ−トリＧＦＰ−シトクロムｃ（Ｋ７２Ａ）構築物をコードする核酸配列（配列番号３）である。
【図７】Ｆ６４Ｌ−Ｓ１７５Ｇ−Ｅ２２２Ｇ−トリＧＦＰ−シトクロムｃ（Ｋ７２Ａ）構築物のアミノ酸配列（配列番号４）である。
【図８】シトクロムｃ（Ｋ７２Ａ）−Ｆ６４Ｌ−Ｓ１７５Ｇ−Ｅ２２２Ｇ−トリＧＦＰをコードする核酸配列（配列番号５）である。
【図９】シトクロムｃ（Ｋ７２Ａ）−Ｆ６４Ｌ−Ｓ１７５Ｇ−Ｅ２２２Ｇ−トリＧＦＰのアミノ酸配列（配列番号６）である。
【図１０】Ｆ６４Ｌ−Ｓ１７５Ｇ−Ｅ２２２Ｇ−野生型シトクロムｃ構築物をコードする核酸配列（配列番号７）である。
【図１１】Ｆ６４Ｌ−Ｓ１７５Ｇ−Ｅ２２２Ｇ野生型シトクロムｃ構築物のアミノ酸配列（配列番号８）である。
【図１２】野生型シトクロムｃ−Ｆ６４Ｌ−Ｓ１７５Ｇ−Ｅ２２２ＧトリＧＦＰをコードする核酸配列（配列番号９）である。
【図１３】野生型シトクロムｃ−Ｆ６４Ｌ−Ｓ１７５Ｇ−Ｅ２２２ＧトリＧＦＰのアミノ酸配列（配列番号１０）である。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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