(57)【要約】  本発明は、被分析物を含むゲル上に複数のウェルを形成する方法及び装置に関するものであり、本発明は、さらに、ゲルから、液状の被分析物と試薬の混合物を溶出させる方法に関するものである。本発明は、生体分子、例えば、核酸、炭水化物、タンパク質、ペプチドの分離に有用である。特に、本発明は、等電点電気泳動のゲルからペプチドを分離し、溶出させる用途に適している。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被分析物を含むゲルに、複数のウェルを形成する装置であって、
（ｉ）端部が開放しており、それぞれ１以上の壁部で画成されたチャンバーが複数設けられた本体を備えたマルチウェルテンプレートと、
（ｉｉ）マルチウェルテンプレートをゲルに押しつけるために使用され、マルチウェルテンプレートを受け止めるための１以上の開口部を備えたトッププレートと
を備えた装置。
【請求項２】
ゲルが、シート上に担持されている請求項１記載の装置。
【請求項３】
ゲル又はシート、或いはゲル又はシートのリテーナを位置決めするためのベースプレートをさらに備えた請求項１又は請求項２記載の装置。
【請求項４】
上記ベースプレートに、ベースプレートをトッププレートの所定位置に固定するための固定手段が設けられている請求項３記載の装置。
【請求項５】
上記トッププレートに、トッププレートをベースプレートの所定位置に固定するための固定手段がさらに設けられている上記請求項のいずれか１項記載の装置。
【請求項６】
ベースプレートの一方の表面上に、この表面上に、シート又はシートのリテーナを位置決めするための１以上の凹部及び／又は凸部がさらに設けられている請求項３乃至請求項５のいずれか１項記載の装置。
【請求項７】
装置が、ゲル又はシートを保持するリテーナをさらに備え、このリテーナの一方の表面上に、ゲル又はシートを受け止めるための１以上の凹部及び／又は凸部が設けられている請求項１又は請求項６記載の装置。
【請求項８】
リテーナの１以上の凹部及び／又は凸部に、シートを位置決めするための位置決め手段がさらに設けられている請求項７記載の装置。
【請求項９】
リテーナが、電気泳動のマニホールドである請求項７又は請求項８記載の装置。
【請求項１０】
マルチウェルテンプレートをトッププレートに固定するための固定用ストリップをさらに備え、このストリップに、マルチウェルテンプレートの解放端チャンバーの位置に対応する複数の開口部が設けられている請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の装置。
【請求項１１】
ストリップに、ストリップをベースプレートの所定位置に固定するための固定手段がさらに設けられている請求項１０記載の装置。
【請求項１２】
固定手段が、ベースプレートに設けられたネジ穴と、トッププレートに設けられたネジ用の開口部と、固定用ストリップとを含むものである請求項３乃至請求項１１のいずれか１項記載の装置。
【請求項１３】
シートが、低蛍光プラスチック又は低蛍光ガラスから構成されている請求項２乃至請求項７のいずれか１項記載の装置。
【請求項１４】
ゲルが、ポリアクリルアミドから構成されている請求項１乃至請求項１３のいずれか１項記載の装置。
【請求項１５】
ゲルが、ＳＤＳゲル又は等電点電気泳動ゲルである請求項１乃至請求項１４のいずれか１項記載の装置。
【請求項１６】
ゲルが、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ（登録商標）ＤｒｙＳｔｒｉｐゲルである請求項１乃至請求項１５のいずれか１項記載の装置。
【請求項１７】
マルチウェルテンプレートの本体が、第一部分と第二部分とに分かれ、第一部分が、トッププレートの開口部への挿入に適した形状、第二部分が、基部に向かってテーパーのついた、ゲルを押しつけるのに適した形状となっている以上の請求項のいずれか１項記載の装置。
【請求項１８】
第一部分と第二部分とが、トッププレートの開口部内にマルチウェルテンプレートを担持するためのフランジによって隔てられている請求項１７記載の装置。
【請求項１９】
第二部分の基部に、マルチウェルテンプレートをリテーナの所定位置に位置決めするための１以上のノッチが設けられている請求項１７又は請求項１８記載の装置。
【請求項２０】
マルチウェルプレートと、トッププレートとが、一体のユニットとなっている上記請求項のいずれか１項記載の装置。
【請求項２１】
被分析物又は修飾被分析物を、上記請求項のいずれか１項記載の装置と、液体分注溶出装置とを備えた非電気的な溶出手段によって、ゲルから溶出するシステム。
【請求項２２】
分注溶出装置が、自動制御されている請求項２１記載のシステム。
【請求項２３】
分注溶出装置が、コンピュータ制御の自動液体取扱い装置である請求項２２記載のシステム。
【請求項２４】
被分析物が、核酸、炭水化物、タンパク質、及びペプチドからなる群から選択される請求項２１乃至請求項２３のいずれか１項記載のシステム。
【請求項２５】
被分析物が、ペプチドである請求項２４記載のシステム。
【請求項２６】
上記検出装置が、蛍光検出装置である請求項２５記載のシステム。
【請求項２７】
被分析物を含むゲル上に複数のウェルを形成する方法であって、
ｉ）端部が開放しており、それぞれ１以上の壁部で画成されたチャンバーが複数設けられた本体を備えるマルチウェルテンプレートを、トッププレートの開口部に挿入し、
ｉｉ）マルチウェルテンプレートをゲルに向かって移動させて、ゲルと１以上の壁部との間に複数のウェルを形成し、
ｉｉｉ）必要に応じて、マルチウェルテンプレートに設けられた解放端チャンバーの位置に対応する複数の開口部が設けられた固定用ストリップを、トッププレート内に載置されたマルチウェルテンプレートの端部を覆うように装着する
工程を含む方法。
【請求項２８】
工程ｉｉ）を、工程ｉ）の前に実施する請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
ゲルが、シート上に担持されている請求項２７又は請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
ゲル又はシートを、ベースプレートの所定位置に直接載置するか、ゲル又はシートをリテーナ中に載置しておいて、このリテーナをベースプレートの所定位置に載置する工程をさらに含む工程をさらに含む請求項２７乃至請求項２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
ベースプレートの一方の表面上に、この表面上で、ゲル又はシート、或いはゲル又はシートのリテーナを位置決めするための１以上の凹部及び／又は凸部がさらに設けられている請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
リテーナの一方の表面上に、ゲル又はシートを受け止めるための１以上の凹部及び／又は凸部が設けられている請求項２７乃至請求項３１のいずれか１項記載の方法。
【請求項３３】
リテーナの１以上の凹部及び／又は凸部に、シートを位置決めするための位置決め手段がさらに設けられている請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
ベースプレート及び／又はトッププレート及び／又は固定用ストリップが、ゲルの所定位置に形成された複数のウェルを、ベースプレート及びトッププレートに対して位置決めするための固定手段をさらに備えている請求項２７乃至請求項３３のいずれか１項記載の方法。
【請求項３５】
固定手段が、ベースプレートに設けられたネジ穴と、トッププレートに設けられたネジ用の開口部と、固定用ストリップとを含むものである請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
ゲルが、ポリアクリルアミドゲルである請求項２７乃至請求項３５のいずれか１項記載の方法。
【請求項３７】
ゲルが、ＳＤＳゲル又は等電点電気泳動ゲルである請求項２７乃至請求項３６のいずれか１項記載の方法。
【請求項３８】
マルチウェルテンプレートの本体が、第一部分と第二部分とに分かれ、第一部分が、トッププレートの開口部への挿入に適した形状、第二部分が、ゲルに向かって移動するのに適した基部に向かって傾斜のついた形状となっている請求項２７乃至請求項３７のいずれか１項記載の方法。
【請求項３９】
第一部分と第二部分とが、トッププレートの開口部内にマルチウェルテンプレートを担持するためのフランジによって隔てられている請求項３８記載の装置。
【請求項４０】
被分析物が、ペプチド、タンパク質、核酸、又は炭水化物である請求項２７乃至請求項３９のいずれか１項記載の方法。
【請求項４１】
被分析物は、マルチウェルテンプレートをゲルに向かって移動させて、ゲルと１以上の壁部との間に複数のウェルを形成する以前に、クロマトグラフィー又は電気泳動によって分離しておく請求項２７乃至請求項４０のいずれか１項記載の方法。
【請求項４２】
被分析物は、マルチウェルテンプレートをゲルに向かって移動させて、ゲルと１以上の壁部との間に複数のウェルを形成してから、クロマトグラフィー又は電気泳動によって分離する請求項２７乃至請求項４０のいずれか１項記載の方法。
【請求項４３】
形成した複数のウェルの１つ以上に、液状試薬を加えて、液状の被分析物と試薬との混合物を形成する工程をさらに含む請求項２７乃至請求項４２のいずれか１項記載の方法。
【請求項４４】
液状試薬を、手動又は自動化された手段で加える請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
試薬が、被分析物を可溶化するか、被分析物又はその環境を化学的に修飾することができる請求項４３又は請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
試薬が、タンパク質分解酵素である請求項４３乃至請求項４５のいずれか１項記載の方法。
【請求項４７】
液状の被分析物と試薬の混合物を、手動又は自動化された手段で第二容器に移す工程をさらに含む請求項４３乃至請求項４６のいずれか１項記載の方法。
【請求項４８】
第二容器が、マイクロタイタープレートのウェルである請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
試薬を、自動液体取扱い装置で加えるか、及び／又は、液状の被分析物と試薬の混合物を、自動液体取扱い装置で移す請求項４３乃至請求項４８のいずれか１項記載の方法。
【請求項５０】
自動液体取扱い装置が、コンピュータで制御されている請求項４９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被分析物を含むゲル上に複数のウェルを形成する方法及び装置に関するものであり、特に、生体分子、例えばペプチド、タンパク質、炭水化物、又は核酸の分離に使用したゲル上に複数のウェルを形成する方法及び装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体分子、例えばタンパク質、ペプチド、核酸の識別及び定量を行う前に、或いは、そうした識別及び定量と並行して、それらの生体分子を分離するには、各種の方法を用いることができる。こうした生体分子をサイズ及び／又は帯電の有無によって分離する場合には、一般に、ゲル電気泳動が利用される。
【０００３】
今日では、タンパク質やペプチドの種類や組成の判別は、質量分析を用いて行うことが多い。この場合、必要な情報を集めることができるように、まず第一の工程で、タンパク質を、酵素的手段又は化学的手段によってペプチドに切断する。最も一般的なアプローチは、タンパク質を特定のアミノ酸残基で切断する酵素を用いて消化を行う酵素消化法で、典型的な酵素としては、タンパク質をリジン又はアルギニン残基の後ろで加水分解するトリプシンを挙げることができる。極めて限られた数のタンパク質を含むサンプルでトリプシンによる消化を行う場合には、存在するタンパク質の種類を、  消化によって得られてペプチドの質量から判定することが可能である。識別の目的で使用される第二のアプローチは、一次質量スペクトルで分離されたイオンから、衝突誘発二次質量スペクトルイオンを生成するアプローチである。二次質量スペクトルは、ペプチドを構成するアミノ酸残基の質量についての情報を含んでいるので、こうした質量を、一次スペクトルから選んだイオンの質量と組み合わせたものを、トリプシンペプチドならびにこのペプチドに対応するタンパク質の識別に使用することができる。ＭＳ／ＭＳスペクトルは、酵素によって消化したペプチドの識別や特性解析ばかりでなく、生体サンプル中にもともと存在するペプチドにも利用できることはいうまでもない。プロテオームの研究では、ＭＳ又はＭＳ／ＭＳを、タンパク質の識別ばかりでなく、相対的定量化にも使用することが通例となっている（Ａｅｂｅｒｓｏｌｄら；  Ｎａｔｕｒｅ，  ２００３，  ４２２，  １９８−２０７）。
【０００４】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳのターゲットに適用するサンプルは、限られた数のペプチドしか含有できず、同様に、ＥＳＩ−ＭＳの場合も時間単位あたり、限られた数のペプチドしか許容されない。サンプルは、通常、何千ものタンパク質を含む極めて複雑な混合物で、こうした数のタンパク質は、消化後は、１０万以上〜百万以上のペプチドと対応することになる。したがって、質量分析による特性解析や定量化を行う前に、ペプチドをしっかりと分離しておく必要があり、その際には、電気泳動やクロマトグラフィーに基づいた方法をはじめとするさまざまな分離方法を使用することができ、通常、複数の分離工程が必要とされる。
【０００５】
こうした分離は、トリプシンによる消化を行う前に、タンパク質のレベルでのみ行うこともできる。こうしたアプローチの典型例は、二次元（２Ｄ）電気泳動である。或いは、第一工程で、タンパク質のレベルで分離しておいてから、消化を行い、最後に得られたペプチドを質量分析の前に分離することもできる。このアプローチの一例では、タンパク質のレベルで逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）を使用し、その後、消化を行ってから、得られたペプチドを、ＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳを行う前に逆相クロマトグラフィーで分離する。また、別のアプローチとしては、タンパク質のレベルでＳＤＳ電気泳動を行っておいてから、消化を行い、さらにＲＰＣを行う方法が記載されている（Ｂｒｅｃｉら；  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，  ２００５，  ５，  ２０１８−２０２８）。最後に、トリプシンによる消化を行ってから、ペプチドのレベルで多次元分離を行うことができる。こうしたタイプのアプローチとしては、ＭｕｄＰｉｔ（Ｗａｓｈｂｕｒｎら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２００１，  １９，  ２４２−２４７）、より従来法的なイオン交換クロマトグラフィーを行っておいてからＲＰＣを行う方法（Ｐｅｎｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２００３，  ２，  ４３−５０）、ペプチドの等電点電気泳動（ＩＥＦ）を行ってからＲＰＣを行う方法（Ｃａｒｇｉｌｅら；  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，  ２００４，  ２５，  ９３６−９４５）を挙げることができる。
【０００６】
トリプシンによる消化を第一工程として行う場合には、別のアプローチとして、ペプチドの小分画を選択しうるような方法を使用することによって、サンプルの複雑さを下げるようなアプローチを挙げることができる（例えば、ｉＣＡＴ［Ａｅｂｅｒｓｏｌｄら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，  ２００５，  ５，  ３８０−３８７］又はＣＯＦＲＡＤＩＣ［Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２００３，  ２１，  ５６６−５６９］）。
【０００７】
一般に、ＩＥＦやＳＤＳ電気泳動のような電気泳動技術は、ゲル中でタンパク質のレベルで使用した場合には、クロマトグラフィーを利用した方法より、解像度及びタンパク質収量がはるかに高い。これらの２種の方法、すなわちＩＥＦとＳＤＳを組み合わせた二次元電気泳動も、極めて複雑なサンプルの分離を、タンパク質レベルで行う場合には、普通に使用されるアプローチである。しかし、電気泳動技術には、労働集約的で、熟練を要することが多く、自動化が困難だという欠点がある。また、被分析物をゲルから抽出する際にも、さまざまな問題がある。
【０００８】
電気泳動のゲルを処理して、ペプチド、タンパク質、炭水化物、又は核酸を含むゲル分画を回収し、さらなる分離に備えたり、被分析物を分析できるようにしたりする過程では、操作者はさまざまな困難に遭遇する。ゲルがガラス又はプラスチックの板上に存在する場合には、個々のバンド又は分画をプレートからブロッティングしたり、スパチュラ又は鋭利なナイフなどを用いて掻き取ったりして、第二ゲル又は反応容器に注意深く移して、さらなる分析に備える必要がある。ＩＰＧストリップの場合のように、ゲルがプラスチックシートに担持されている場合には、ストリップを、はさみ又は鋭利な刃物で細かい断片に注意深く切断してから、この断片を別のゲル又は反応容器に移して、さらなる処理／分析に備えることになる。
【０００９】
ゲルからバンド又はスポットを回収する自動サンプリングシステムは公知であり、例えば、国際公開第０２／０７１０７２号に記載されている。実際、二次元電気泳動では、自動ピッカーが頻繁に用いられて、そうした場合には、ゲルは、タンパク質又はペプチドサンプルを検出する目的で染色されるのが通常である。しかし、こうしたシステムでは、大抵の場合、ゲルをピペットに吸引するので、ピペットの内外に吸着したゲルが失われる。さらに、こうしたシステムでは、タンパク質／ペプチドの染色が必要で、サンプルが失われたり汚染したりすることのないよう、装置を注意深く操作せねばならないので、作業が労働集約的で、多大な時間を要することになる。
【００１０】
当業者であれば、ゲルのバンド又は分画を手動でプレート又はストリップから回収するプロセスというのは、ゲルを適切な数の分画に均等に分割して、ゲルから確実に被分析物を定量的に回収できるようにせねばならず、また、この移動の過程で使用する「汚染した」器具類によるクロスコンタミネーションを防止する必要があり、しかも入念に作業を進めねばならず、きわめて時間のかかる作業となることがあることがわかるはずである。このクロスコンタミネーションの問題は、ＩＰＧストリップを用いて被分析物を分離し、さらなる処理／分析に備えて、ストリップをはさみやメスを用いてバンドに切り離す場合には、特に重要である。というのも、こうした器具の刃は、ストリップからゲルの次のバンドを切り出す前に十分に清浄化しておく必要があるからである。また、こうしたプロセスは、一般に、ペプチド又はタンパク質を検出する目的でゲルを予め染色しておく工程をさらに含むので、システムが極度に労働集約的となる。
【００１１】
当業者であれば、さらなる処理に備えて、ゲルのバンドをプレート又はＩＰＧストリップから回収し、第二のゲル又は反応容器に移動する際に生じる上述のような問題が、バンド又は分画の数が増えるにつれて悪化することもわかるはずである。したがって、例えば、ＩＰＧストリップを５０個程度に分割し、その５０個ほどの分割片のそれぞれを、別のゲル又は反応容器に移すような場合には、クロスコンタミネーションの可能性が増し、回収量が減る可能性が高まることになる。
【００１２】
ゲルからのサンプル抽出に伴う問題を回避するために、等電点電気泳動による分離を、液相で実施することもできる（Ｚｕｏら；  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，  ２００４，  ２４４，  ３６１−７５）。Ｚｕｏらが使用した装置は、膜によって隔てられ、滴定によって特定のｐＨの値に保持された一連のチャンバーを備えている。しかし、このアプローチの不利な点として、ペプチドやタンパク質は、等電点付近では溶解度が低く、その結果、沈殿や凝集が生じて、等電点電気泳動の間のペプチドやタンパク質の解像度が低くなってしまうことを挙げることができる。
【００１３】
Ｍｉｃｈｅｌら（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，  ２００３，  ２４，  ３−１１）には、生体サンプルを等電点（ｐＩ）によって分画し、化合物を直接回収してさらなる分析に使用する方法が記載されている。この「オフ−ゲルＩＥＦ」と名づけられた方法では、ＩＰＧストリップを、両端が解放したマルチウェル器具を使用して、一連のウェルに分割し、タンパク質サンプルをＩＰＧバッファーに加え、その後、電気泳動を実施して、タンパク質混合物を分離する。その後、各ウェルの内容物を取り出して、質量分析によるタンパク質の分析を行うのだが、この方法では解像度は０．１ｐＨ単位であった。しかし、上述のＺｕｏらのアプローチと同じく、電気泳動の間にタンパク質は液相中に存在しており、その結果、沈殿や凝集の危険性が増大する。このＭｉｃｈｅｌらのアプローチでは、タンパク質は、マルチウェル器具に溶液を加えることなく、ゲルのみで電気泳動を行った場合と比較して、電界のずっと低い領域に存在する形状となっている。そのため、従来のゲルでの電気泳動に比べて、この電気泳動では解像度が低く、電気泳動に要する時間も長くなる。
【００１４】
同じグループ（Ｈｅｌｌｅｒら．；  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，  ２００５，  ２６，  １１７４−１１８８）が、最近、タンパク質とそのアイソフォームの分離と識別に、「オフ−ゲルＩＥＦ」を利用することについて報告している。この方法は、二段階法で、第一段階で、タンパク質とそのアイソフォームをｐＩを利用して分離し、第二段階で、トリプシン処理したペプチド断片の分離と識別を行う。
【００１５】
ＩＥＦは、分離したタンパク質を、膜で隔てられたチャンバーに入った溶液中に回収する形状でも実施できる（Ｒｉｇｈｅｔｔｉら；  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｍｅｔｈ．，  １９８７，  １５，  １９９−２０６）。このアプローチも、等電点に近いタンパク質は、凝集や沈殿を生じやすいという事実によって制限される。
【００１６】
タンパク質を含むゲル断片をゲルから単離し、タンパク質分解性の消化を行い、その後、生成した切断ペプチドを識別するゲル中でのタンパク質処理方法を記載した他のシステムも開示されている。国際公開第０２／０７１０７２号には、自動化されたシステムが記載されており、このシステムでは、単離したタンパク質−ゲル断片を、底部に疎水性フィルター膜が設けられた第一マイクロタイタープレートの対応する数の反応容器に、ロボットアーム装置で直接移動し、プロテアーゼとともにインキュベートする。加水分解の後、ペプチド生成物は、疎水性フィルター膜を通して第二マイクロタイタープレートへと濾過され、さらなる分析に備えて濃縮される。
【００１７】
いくつかのグループが、生体分子をゲルから移動するにあたって、電気的溶出を使用している。例えば、Ｂｕｚａｓら（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，  ２００１，  １，  ６９１−６９８）には、水平なミニゲル中のタンパク質のバンドを通して、鉛直方向に電界を印加することによって、ゲル中に存在するタンパク質を、直接、質量分析側に移動する装置が記載されている。Ｙｅｆｉｍｏｖら（Ｅｌｅｃｔｏｒｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２００１，  ２２，  ２８８１−２８８７）及びＧｏｍｂａｃｚ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，  ２００１，  ２１，  ８４６−８４９）には、蛍光標識タンパク質及び染料を、電気的な溶出が生じる位置を確定するための分子量マーカーとして使用することがが記載されている。米国特許出願公開第２００４／０１７８０７３号には、調製目的で電気泳動を行い、ゲルサンプルから電気的に溶出させた標的分子を回収する装置が開示されている。欧州特許出願公開第０３８２４２６号には、サンプルを電気的に溶出させる際に使用する、微量調整用ゲル電気泳動装置又はカラムが記載されている。米国特許第５８４０１６９号には、帯電した高分子を含むゲルを電気的溶出する装置及び方法が記載されている。米国特許第５３４０４４９号には、担体、例えばゲル又は膜から高分子を溶出させる電気溶出装置が、開示されている。  
【００１８】
電気的溶出では、電流又は電圧を、担体、例えばゲル又は膜に印加することが基本的に必要である。この方法には、担体（例えば、ゲルの場合のように、裏打ち材料も含む）が導電性なければならないこと、電流によって熱が生じること、サンプルをゲルから移動するために電気的溶出の工程がさらに必要となることなど、いくつかの問題点がある。
【００１９】
上述したように、ゲル中で電気泳動によって分離を行うことによって卓越した解像度が得られるものの、ゲルから液相にサンプルを移動する際には問題が生じることも多く、そのため、サンプルの移動工程は自動化が困難なプロセスとなっている。
【特許文献１】国際公開第０２／０７１０７２号パンフレット
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４／０１７８０７３号明細書
【特許文献３】欧州特許出願公開第０３８２４２６号明細書
【特許文献４】米国特許第５８４０１６９号明細書
【特許文献５】米国特許第５３４０４４９号明細書
【非特許文献１】Aebersold et al; Nature, 2003, 422, 198-207
【非特許文献２】Breci et al; Proteomics, 2005, 5, 2018-2028
【非特許文献３】Washburn et al; Nat Biotechnol., 2001, 19, 242-247
【非特許文献４】Peng et al; Journal of Proteome Research, 2003, 2, 43-50
【非特許文献５】Cargile et al; Electrophoresis, 2004, 25, 936-945
【非特許文献６】Aebersold et al; Proteomics, 2005, 5, 380-387
【非特許文献７】Vandekerckhove et al; Nat Biotechnol., 2003, 21, 566-569
【非特許文献８】Zuo et al; Methods Mol Biol., 2004, 244, 361-75
【非特許文献９】Michel et al; Electrophoresis, 2003, 24, 3-11
【非特許文献１０】Heller et al; Electrophoresis, 2005, 26, 1174-1188
【非特許文献１１】Righetti et al; J. Biochem. Biophys. Meth., 1987, 15, 199-206
【非特許文献１２】Buzas et al; Proteomics, 2001, 1, 691-698
【非特許文献１３】Yefimov et al; Electorphoresis 2001, 22, 2881-2887
【非特許文献１４】Gombacz; Electrophoresis, 2001, 21, 846-849
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
したがって、本発明の目的は、先行技術の諸問題を軽減しつつ、ゲル分画を調製して、さらなる処理や操作を可能とする方法及び装置を提供することにある。本発明の別の目的は、被分析物を検出するために、ゲルを予め染色しておく必要がない方法及び装置を提供することにある。本発明のさらに別の目的は、化学的又は酵素的修飾の前又は後に、試薬をゲル分画に加えて、被分析物をゲルから溶出させる方法及び装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明の第一の態様では、被分析物を含むゲル上に複数のウェルを形成する装置を提供する。この装置は、
（ｉ）端部が開放しており、それぞれ１以上の壁部で画成されたチャンバーが複数設けられた本体を備えたマルチウェルテンプレートと、
（ｉｉ）マルチウェルテンプレートをゲルに押しつけるために使用され、マルチウェルテンプレートを受け止めるための１以上の開口部を備えたトッププレートと
を備えている。
【００２２】
ゲルは、シート上に担持されているのが適当である。
【００２３】
装置は、ゲル又はシート、或いはゲル又はシートのリテーナを位置決めするためのベースプレートをさらに備えているのが適当である。ベースプレートには、ベースプレートをトッププレートの所定位置に固定するための固定手段が設けられていることが好ましい。
【００２４】
トッププレートには、トッププレートをベースプレートの所定位置に固定するための固定手段がさらに設けられているのが適当である。
【００２５】
ベースプレートの一方の表面上には、この表面上に、シート又はシートのリテーナを位置決めするための１以上の凹部及び／又は凸部がさらに設けられていることが適当である。
【００２６】
装置は、ゲル又はシートを保持するリテーナをさらに備えるものとし、このリテーナの一方の表面上に、ゲル又はシートを受け止めるための１以上の凹部及び／又は凸部が設けられているのが適当である。リテーナの１以上の凹部及び／又は凸部には、シートを位置決めするための位置決め手段がさらに設けられているのが好適であり、リテーナは、電気泳動のマニホールドであるのが、特に好適である。
【００２７】
装置は、マルチウェルテンプレートをトッププレートに固定するための固定用ストリップをさらに備えているのが適当で、このストリップには、マルチウェルテンプレートに設けられた解放端チャンバーの位置に対応する複数の開口部が設けられているのが適当である。ストリップに、ストリップをベースプレートの所定位置に固定するための固定手段がさらに設けられていることが好ましい。
【００２８】
固定手段は、ベースプレートに設けられたネジ穴と、トッププレートに設けられたネジ用の開口部と、固定用ストリップとを含むものとするのが好ましい。
【００２９】
シートは、低蛍光プラスチック又は低蛍光ガラスから構成されるものとすることが好ましい。
【００３０】
ゲルは、ポリアクリルアミドから構成されるものとすることが好ましく、ＳＤＳゲル又は等電点電気泳動ゲルとすることが、さらに好ましい。ゲルは、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ（登録商標）ＤｒｙＳｔｒｉｐゲル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）とするのが、特に好ましい。
【００３１】
マルチウェルテンプレートの本体は、第一部分と第二部分とに分かれ、第一部分が、トッププレートの開口部への挿入に適した形状、第二部分が、基部に向かってテーパーのついた、ゲルを押しつけるのに適した形状とするのが適当である。第一部分と第二部分とが、トッププレートの開口部内にマルチウェルテンプレートを担持するためのフランジによって隔てられていることが好ましい。
【００３２】
必要に応じて、マルチウェルプレートと、トッププレートとは、一体のユニットとすることができる。
【００３３】
本発明の第二の態様では、被分析物又は修飾被分析物を、上述の装置と、液体分注溶出装置とを備えた非電気的な溶出手段によってゲルから溶出させるシステムを提供する。「電気的な溶出手段」とは、電流又は電場又は電圧を印加又は使用して、被分析物又は修飾被分析物を担体、例えばゲル又は膜から溶出させる任意の方法を意味するものである。
【００３４】
分注溶出装置は、自動制御されていることが好ましく、コンピュータ制御の自動液体取扱い装置であるのがさらに好ましい。
【００３５】
被分析物は、核酸、炭水化物、タンパク質、及びペプチドからなる群から選択されるものとするのが適当である。
【００３６】
本発明の第三の態様では、被分析物を含むゲル上に複数のウェルを形成する方法を提供する。この方法は、
ｉ）端部が開放しており、それぞれ１以上の壁部で画成されたチャンバーが複数設けられた本体を備えるマルチウェルテンプレートを、トッププレートの開口部に挿入し、
ｉｉ）マルチウェルテンプレートをゲルに向かって移動させて、ゲルと１以上の壁部との間に複数のウェルを形成し、
ｉｉｉ）必要に応じて、マルチウェルテンプレートに設けられた解放端チャンバーの位置に対応する複数の開口部が設けられた固定用ストリップを、トッププレート内に載置されたマルチウェルテンプレートの端部を覆うように装着する
工程を含んでいる。
【００３７】
必要に応じて、工程ｉｉ）を、工程ｉ）の前に実施することもできる。
【００３８】
ゲルは、シート上に担持するものとするのが適当である。
【００３９】
この方法は、ゲル又はシートを、ベースプレートの所定位置に直接載置するか、ゲル又はシートをリテーナ中に載置しておいて、このリテーナをベースプレートの所定位置に載置する工程をさらに含むものとするのが適当である。ベースプレートは、例えば、水平電気泳動装置の冷却プレートに対応するものとすることもできる。
【００４０】
ベースプレートの一方の表面上には、この表面上で、ゲル又はシート、或いはゲル又はシートのリテーナを位置決めするための１以上の凹部及び／又は凸部がさらに設けられていることが好ましい。
【００４１】
リテーナの一方の表面上には、ゲル又はシートを受け止めるための１以上の凹部及び／又は凸部が設けられていることが適当である。このリテーナの１以上の凹部及び／又は凸部には、シートを位置決めするための位置決め手段がさらに設けられているのが好ましい。
【００４２】
ベースプレート及び／又はトッププレート及び／又は固定用ストリップは、ゲルの所定位置に形成された複数のウェルを、ベースプレート及びトッププレートに対して位置決めするための固定手段をさらに備えていることが好ましい。こうした固定手段の例としては、留め金、クランプ、スナップ、ピン、穴を挙げることができる。また、この固定手段は、ベースプレートに設けられたネジ穴と、トッププレートに設けられたネジ用の開口部と、固定用ストリップとを含むものとするのが、さらに好ましい。
【００４３】
ゲルは、好ましくは、ポリアクリルアミドゲルであり、より好ましくは、ＳＤＳゲル又は等電点電気泳動ゲルである。
【００４４】
マルチウェルテンプレートの本体は、第一部分と第二部分とに分かれ、第一部分が、トッププレートの開口部への挿入に適した形状、第二部分が、ゲルに向かって移動するのに適した基部に向かって傾斜のついた形状とすることが適当である。第一部分と第二部分とは、トッププレートの開口部内にマルチウェルテンプレートを担持するためのフランジによって隔てられていることが好ましい。
【００４５】
被分析物は、ペプチド、タンパク質、核酸、又は炭水化物であるのが適当であり、ペプチド又はタンパク質であるのが好適である。
【００４６】
被分析物は、マルチウェルテンプレートをゲルに向かって移動させて、ゲルと１以上の壁部との間に複数のウェルを形成する以前に、クロマトグラフィー又は電気泳動によって分離しておくのが適当である。
【００４７】
マルチウェルテンプレートは、ゲルに向かって移動させて、ゲルと１以上の壁部との間に複数のウェルを形成してから、被分析物を、クロマトグラフィー又は電気泳動によって分離するのが適当である。
【００４８】
この方法は、液状試薬を、以上のようにして形成した複数のウェルの１つ以上に加えて、液状の被分析物と試薬との混合物を形成する工程をさらに含むことが好ましい。
【００４９】
液状試薬は、手動又は自動化された手段で加えるのが適当である。手動の手段の例としては、手動で操作するピペットを挙げることができ、自動化手段の例としては、自動化又はプログラマブルな液体取扱い装置を挙げることができる。
【００５０】
試薬は、被分析物を可溶化するか、被分析物又はその環境を化学的に修飾することができることが適当である。試薬の例としては、バッファー、酸、アルカリ、有機溶剤、酵素、又は被分析物を修飾できる化学反応物質を挙げることができる。試薬は、蛋白質分解酵素とすることが好ましい。
【００５１】
この方法は、液状の被分析物と試薬の混合物を、手動又は自動化された手段で第二容器に移す工程をさらに含むことが好ましい。手動の手段の例としては、手動で操作するピペットを挙げることができ、自動化手段の例としては、自動化又はプログラマブルな液体取扱い装置を挙げることができる。第二容器は、マイクロタイタープレート、例えば９６ウェルのマイクロタイタープレートのウェルとするのが適当である。
【００５２】
試薬の添加、及び／又は、液状の被分析物と試薬の混合物の移動は、自動液体取扱い装置で行うが好ましい。この自動液体取扱い装置は、コンピュータで制御されていることが特に好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
図１に、シート上に担持されたゲルに複数のウェルを形成する装置の図を示す。ゲル（１０）、例えばＳＤＳゲルが、シート（１５）の表面に載置されている。シート（１５）は、プラスチック又は金属材料製のベースプレート（２０）に載置され、このベースプレート（２０）には、シートをベースプレート（２０）に対して所定位置に位置させるための凹部（２２）が設けられている。ベースプレート（２０）の四隅には、固定手段であるネジ穴（２４ａ−ｃ、２４ｄは図示せず）が設けてあるので、ベースプレート（２０）のネジ（図示せず）を、トッププレート（４０）の所定位置に固定することができる。なお、固定手段としては、他の形状のもの（例えば、留め金、クランプ、ピン、穴、スナップ）も使用できる。
【００５４】
ゲルには、プラスチック、金属、セラミクス、又は複合材料など、任意の適当な材料から形成されたマルチウェルテンプレート（３０）で、複数のウェルを形成する。マルチウェルテンプレート（３０）は、２枚の細長い側壁部（３１ａ、３１ｂ）と、その末端に接合された２枚の末端壁部（３３ａ、３３ｂ）を備えた細長い本体（３２）から構成されている。本体（３２）の長軸に沿って、端部が解放したチャンバー（３４ｉ〜ｎ）が複数配置され、隣接チャンバー同士は、間に介在する壁部（３５ａ〜３５ｎ−１）によって隔てられており、各壁部（３５ａ〜３５ｎ−１）は、側壁部３１ａからもう一方の側壁部３１ｂまで延在している。各チャンバー（３４）は、円、楕円、多角形、正方形、長方形（図示）など、任意の形状とすることができる。
【００５５】
マルチウェルテンプレート（３０）の本体（３２）は、フランジ（３６）によって、第一部分（３２ａ）と第二（３２ｂ）部分とに分かれており、第一部分（３２ａ）は、トッププレート（４０）の開口部（４２）への挿入に適した形状、第二部分（３２ｂ）は、基部（３８）に向かってテーパーがついており、ゲルに押しつけるのに適した形状となっている。図からも理解されるように、テンプレート（３０）を下降させ、つまりゲル（１０）に向かって押しつけて、テンプレート（３０）が、ゲル（１０）を担持しているシート（１５）に接触又は近接すると、各チャンバー（３４）はウェルを形成し、ゲル又はシートがウェルの底部に、チャンバーの壁部（図示せず）がウェルの壁部となる。こうして、ゲル上に、複数のウェルが形成される。マルチウェルテンプレート（３０）は、ゲルに向かって下降させ、つまりゲルに押しつけて、ゲル上の複数のウェルを形成する前、又は後に、プラスチック又は金属（例えばステンレス）材料製のトッププレート（４０）の開口部（４２）に挿入することができる。図示した例では、テンプレート（３０）は、フランジ（３６）によって、トッププレート（４０）の棚部（４４）に保持されている。なお、テンプレートは、ゲルを切断するのではなく、押しつけることによって複数のウェルを形成することに注意されたい。ウェルは、トッププレート（４０）をベースプレート（２０）に対して固定手段（トッププレートに設けられた固定手段（４６ａ〜ｄ）及びベースプレートに設けられた固定手段（２４ａ〜ｄ））によって固定することによって、ベースプレート（２０）及びトッププレート（４０）に対して所定位置に保持される。図１の形態では、ネジ（図示せず）を、トッププレートに設けられた開口部（４６ａ〜ｄ）を通して、ベースプレート（２０）に設けられたネジ穴（２４ａ〜ｄ）まで到達させることによって、トッププレート（４０）をベースプレート（２０）に固定している。ゲルに形成された複数のウェルは、このようにして、トッププレートとベースプレートに対して所定位置に保持されている。
【００５６】
図２は、本発明の装置の別の形態の斜視図である。図２に示す装置は、等電点電気泳動のジェル、特にＩＰＧストリップ、例えばＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ（登録商標）ＤｒｙＳｔｒｉｐゲルとともに使用するのに適している。プラスチックの基材シートと、その上に担持されたポリアクリルアミドゲル（１１０）のコーティングからなるＩＰＧストリップ（図示せず）を、リテーナ（１５０）に設けられた、電気泳動のマニホールドである凹部（１５２）に載置する。プラスチック材料製とするのが通例であるリテーナ（１５０）には、複数のＩＰＧストリップを同時に処理できるよう、複数の凹部（１５２ｉ〜ｎ）を設けることができ、図２の形態では、１２個の凹部が示してある。ＩＰＧストリップで被分析物を電気泳動した後、リテーナ（１５０）とストリップとを、ベースプレート（１２０）上面の凹部（１２２）の所定位置に載置する。ベースプレートは、プラスチック又は金属材料製とすることができる。本発明の第一の形態に関して上述したのと似た構造をもつマルチウェルテンプレート（１３０）には、開放端チャンバー（１３４ｉ〜ｎ）が複数設けられており、このマルチウェルテンプレート（１３０）を、トッププレート（１４０）の開口部（１４２）に挿入して、マルチウェルテンプレート（１３０）のフランジ（１３６）が、開口部（１４２）の棚部（図示せず）によって担持されるようにする。マルチウェルテンプレート（１３０）とトッププレート（１４０）は、通常、プラスチック材料製とするが、金属等の他の材料から製造してもよい。トッププレート（１４０）には、上述のようにして複数のマルチウェルテンプレート（１３０）を載置することができ、例えば、図示した形態では、トッププレート（１４０）に、マルチウェルテンプレート（１３０）１２個を載置することができる。
【００５７】
マルチウェルテンプレート（１３０）をトッププレート（１４０）に載置したら、マルチウェルテンプレート（１３０）を下降させ、つまりゲル（１１０）の表面まで移動させて、テンプレート本体のテーパー部分（１３２ｂ）をゲル（１１０）に対して押しつけ、テンプレートの基部（１３８）が、ゲル（１１０）を担持しているプラスチックシートに近接するようにする。この位置では、ウェルが画成され、ゲル又はプラスチックシートがウェルの底部に、テンプレートの壁部が、ウェルの壁部となっている。
【００５８】
なお、本発明の別の形態では、マルチウェルテンプレート（１３０）をトッププレート（１４０）に挿入する前に、マルチウェルテンプレート（１３０）を下降させ、ゲル（１１０）まで移動させて複数のウェルをゲル上に形成することもできる。マルチウェルテンプレートは、この時点で、固定手段（トッププレートに設けられた固定手段（１４６ａ〜ｄ）及びベースプレートに設けられた固定手段（１２４ａ〜ｄ、ｄは図示せず））によって、トッププレート（１４０）及びベースプレート（１２０）に対して所定の位置に固定することができ、例えば図２では、ネジ（図示せず）を使用してプレート同士を固定することができる。
【００５９】
図２に示す好適な形態では、マルチウェルテンプレート（１３０）を覆うように固定用ストリップ（１６０）を載置し、ストリップ（１６０）の開口部（１６４ｉ〜ｎ）と、テンプレート（１３０）の開放端チャンバー（１３４ｉ〜ｎ）の位置とが、重なり、対応するようにする。こうすると、ストリップに設けられた固定手段（１６６ａ〜ｂ）とトッププレートに設けられた固定手段（１４８Ｉ及びｎ）を使用することで、マルチウェルテンプレート（１３０）がトッププレート（１４０）に固定されるので、固定用ストリップ（１６０）によって、マルチウェルテンプレート（１３０）が所定位置に固定される。この固定手段は、固定用ストリップ（１６６ａ〜ｂ）の開口部、トッププレートに設けられたネジ穴（１４８Ｉ及びｎ）、及び孔径に合った１以上のネジからなるものとすることができる。別の形態では、固定用ストリップとマルチウェルテンプレートとを一体の部材として形成することもできる。
【００６０】
図３は、図２の装置の斜視図で、各構成部品は、図２について記載したのと同様の特徴を備えている。したがって、この装置は、凹部（２２２）と固定手段（２２４ａ〜ｄ、ｄは図示せず）が設けられたベースプレート（２２０）を備えている。リテーナ（２５０）である等電点電気泳動のマニホールドの一連の凹部（２５２ｉ〜ｎ）内には、プラスチックシートと、このプラスチックシートに担持されたポリアクリルアミドゲル（２１０）からなるＩＰＧストリップ（図示せず）が保持されている。プラスチック材料製のトッププレート（２４０）には、複数の開口部（２４２ｉ〜ｎ）が、リテーナ（２１０）内のＩＰＧストリップの位置に対応するよう設けられている。トッププレート（２４０）には、ベースプレートの固定手段（２２４ａ〜ｄ）と固定用ストリップ（２６０）の固定手段にそれぞれ対応する固定手段（２４６ａ〜ｄ、及び２４８ｉ及びｎ）が設けられている。マルチウェルテンプレート（２３０）には、開放端チャンバー（２３４ｉ〜ｎ）が複数設けられ、固定用ストリップ（２６０）には、マルチウェルテンプレート（２３０）の開放端チャンバー（２３４ｉ〜ｎ）の位置に対応する数多くの開口部（２６４ｉ〜ｎ）と、固定手段（２６６ａ及びｂ）とが設けられている。
【００６１】
図３の装置を、図２で説明したのと同様にして使用することによって、ゲル上に複数のウェルを形成することができる。
【００６２】
図４ａに、本発明のマルチウェルテンプレート（３３０）の基部（３３８）を示す。マルチウェルテンプレート（３３０）の本体（３３２）の全長にわたって、一連の壁部（３３３）によって開放端チャンバー（３３４ｉ〜ｎ）が画成されている。マルチウェルテンプレート（３３０）の基部に設けられた凹部又はノッチ（３３７）を使用して、マルチウェルテンプレート（３３０）を、ＩＰＧストリップが担持されているリテーナ（図示せず）の凸部に載置し、マルチウェルテンプレート（３３０）を、ＩＰＧストリップに対して所定位置に位置決めする。
【００６３】
図４ｂは、ＩＰＧストリップのプラスチックシート（３１５）が、マルチウェルテンプレート（３３０）の基部（３３８）に位置しているところを示す。図の斜視図では、ゲルは、シート（３１５）の裏側に位置しているので見えないが、マルチウェルテンプレート（３３０）の基部（３３８）と接触している。この位置では、各チャンバー（３３４）内に位置するシート（３１５）の基材又はゲルが、ウェルの底部に、チャンバーの壁部が、ウェルの壁部になっている。
【００６４】
図５は、本発明のトッププレート（４４０）の平面斜視図で、このトッププレート（４４０）は、鋼製である。図には、マルチウェルテンプレート（所定位置に載置）を格納する開口部（４４２ｉ〜ｎ）を、ベースプレートに固定するための固定手段（４４６ａ〜ｄ）及び固定用ストリップ固定用の固定手段（４４８ｉ〜ｎ）とともに示す。
【００６５】
図６ａは、本発明のトッププレート（５４０）の詳細を示す平面図で、固定用ストリップ（５６０）によって、マルチウェルテンプレート（図示せず）がトッププレート（５４０）に固定されている。固定手段（５６６）である開口部が、トッププレート内のリテーナ（図示せず）の開口部（図５の４４８ｉ〜ｎを参照）と同位置に配置されている。
【００６６】
図６ｂは、図６ａの配置の詳細を図示した下面図である。マルチウェルテンプレートのテーパーのついた第二部分の基部（５３８）が、トッププレート（５６０）の下面から突出しているのが、この角度からははっきりと見える。この基部（５３８）によって、ゲルが押され、各開放端チャンバー（５３４ｉ−ｎ）が、ゲルの基材シート（図示せず）とともにウェルを形成する。
【００６７】
図７は、本発明の自動溶出システムを示す。ゲル、例えばＩＰＧストリップでサンプルを電気泳動した後、上述のようにして、本発明の方法を使用して複数のウェルを形成する。次に、各ウェル中のゲルをバッファーで溶出して、被分析物（例えばペプチド）を抽出し、得られた溶出液を、さらなる処理／分析に備えて反応容器に移す。図７は、本発明の装置のトッププレート（６４０）のウェルから、マイクロタイタープレート（６８０）のウェル（６８２ｉ〜ｎ）に溶出液を移動している過程の８チャネルの溶出プローブ（６７０）を示す。このシステムは、コンピュータ（図示せず）によって制御されている。ＩＰＧストリップに形成するウェルの数は、通常、マイクロタイタープレートの長さ又は幅方向のウェルの数（例えば、９６ウェルのマイクロタイタープレートであれば、８又は１２の倍数）又はこれらの番号の整数分の１（例えば、２、３、４、６）と対応している。
【実施例】
【００６８】
等電点電気泳動、蛍光分析、ペプチドの抽出
０．５ｍｇの酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＩＩ型）のトリプシン処理サンプルを、各５μｇのｐＩマーカー「３．７３」、「４．２５」、及び「４．５４」と混合した。「ｐＩマーカー」は、等電点が既知で、蛍光をスキャンすることによって検出が可能な蛍光標識ペプチドである。蛍光標識としては、Cy５（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン））を使用し、発光スペクトルは、約６６０ｎｍで検出した（Ｅｔｔａｎ  ＤＩＧＥ  Ｓｙｓｔｅｍ、ユーザーマニュアル、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン））。２４ｃｍのＩＰＧペプチドストリップ（ｐＨ３．４〜４．８）を、３５０μｌの８Ｍ尿素とサンプル溶液で、一晩（約１５時間、室温）再水和した。再水和したストリップを、Ｅｔｔａｎ（登録商標）ＩＰＧｐｈｏｒ（登録商標）のマニホールドに移し、以下のプログラムで等電点電気泳動を行った。
【００６９】
勾配５００Ｖ（１分）、勾配４０００Ｖ（１．５時間）、勾配６０００Ｖ（１．５時間）、
勾配１００００Ｖ（１．５時間）、ステップ１００００Ｖ（１２時間）（合計約１５０ｋＶ時間）。
【００７０】
等電点電気泳動ユニットとしては、Ｅｔｔａｎ  ＩＰＧｐｈｏｒ  ＩＩを使用し、泳動は、２０℃で行った。
【００７１】
導電点電気泳動の後、ＩＰＧストリップを、蛍光スキャナー（Ｔｙｐｈｏｏｎ  ９４００スキャナー、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン）製）で、６６０ｎｍにてスキャンして、蛍光ｐＩマーカーの正確な位置を判定した。Ｔｙｐｈｏｏｎで得られた図を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔで評価し、蛍光強度のグラフを描いた。
【００７２】
スキャン後、本発明のマルチウェルテンプレートを使用して、ストリップ中のペプチドを、ゲルから液体分画に抽出し、ｐＨ勾配を、ストリップに沿った一連の別々の分画に分割した。この方法によって、ＩＰＧストリップは、約３ｍｍ間隔の７２の分画に分割された。７２分画のそれぞれに、５０μｌの水を加え、室温で６０分間インキュベートし、抽出されたペプチドを、自動で、マイクロタイタープレートに移動させた。この溶出過程を３回繰り返し、各ウェルから、すべてのペプチドを確実に抽出し、移動させた。抽出後は、マルチウェルテンプレートをＩＰＧストリップから取り外せば、この器具は、清浄後に次の実験に再使用できる。この実験では、ＩＰＧペプチドストリップを再度Ｔｙｐｈｏｏｎでスキャンし、画像をイメージクアントで評価した。
【００７３】
図８は、抽出前（図８ａ）と抽出後（図８ｂ）のＩＰＧストリップの蛍光強度を示す。図８ｃは、抽出したペプチドサンプルを含むマイクロタイタープレートと、抽出前と抽出後のストリップとを示すが、抽出前と抽出後のストリップには、それぞれ、高レベルと低レベルの蛍光が示されている。これらの図から、ペプチドが、ＩＰＧストリップから効果的に抽出され、この時点では、マイクロタイタープレートのウェルに存在していることが明らかである。
【００７４】
図９は、ＩＰＧストリップの塩基側末端に位置する互いに隣接した７分画中に含まれるすべての識別済みペプチド配列を比較した結果である。比較した７分画中の全部で７１９個の識別済みペプチドのうち、ペプチドの８２％は、１分画のみに存在しており、１６％は、２分画に存在していた。この実験結果は、ＩＰＧストリップの高解像度を裏付けるばかりでなく、本発明のマルチウェルテンプレートを用いて形成したウェルの間で漏れの問題がなかったことを示すものでもある。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、ＳＤＳゲル上に複数のウェルを形成するための本発明の装置を示す。
【図２】図２は、等電点電気泳動ゲルであるＩＰＧストリップに複数のウェルを形成する本発明の装置を示す。
【図３】図３は、図２の装置の平面斜視図である。
【図４】図４ａ及びｂは、本発明のマルチウェルテンプレートの各部を図示したものである。図４ａは、テンプレートの基部を示す下面図で、複数の開放端チャンバーが図示されている。図４ｂは、図４ａで、テンプレートの基部にＩＰＧストリップを載置したところである。
【図５】図５は、本発明のトッププレートを示す。
【図６】図６ａは、本発明のトッププレートと固定用ストリップの詳細を示す平面図である。図６ｂは、マルチウェルテンプレートを載置したトッププレートの下面図である。
【図７】図７は、本発明の自動溶出システムを示す。
【図８】図８ａ及び８ｂは、蛍光標識ペプチドの分離に使用したＩＰＧストリップの蛍光強度を、本発明の方法でゲルを溶出する前（図８ａ）と後（図８ｂ）にスキャンしたものである。また、図８ｃに、ＩＰＧストリップの蛍光を、抽出の前後にスキャンした結果を、ストリップから溶出した分画を含むマイクロタイタープレートをスキャンした結果とともに示す。
【図９】図９は、識別されたペプチドが、本発明の方法を使用してゲルから抽出した分画１ないし数個のみに分布していることを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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