(57)【要約】本発明は、アジュバントペプチド、並びに粘膜、特に鼻組織における抗原吸収を促進するための使用に関する。粘膜送達のためのワクチン組成物には、アジュバントペプチド、及び免疫応答を誘導するための抗原が含まれる。本発明の第一の実施形態は、哺乳動物において抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、アミノ酸配列ＦＣＩＧＲＬ（配列番号１）を有するペプチド又はその機能的誘導体及び該抗原を該動物に投与することを含み、該哺乳動物が該抗原に対する該免疫応答を上昇させる方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物において免疫応答を誘導する方法であって、１種以上の抗原及び１種以上のペプチドアジュバントを動物の粘膜に投与することを含む、方法。
【請求項２】
少なくとも１種の抗原及び少なくとも１種のペプチドアジュバントが組成物として投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記動物が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１種のペプチドアジュバントが配列ＦＣＩＧＲＬを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１種のペプチドアジュバントが約６〜約５０個のアミノ酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１種のペプチドアジュバントが約６〜約２５個のアミノ酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１種のペプチドアジュバントが約６〜約１５個のアミノ酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１種の抗原が、麻疹ウイルス抗原、ムンプスウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、ジフテリア菌抗原、百日咳菌抗原、破傷風菌抗原、炭疽菌抗原及びインフルエンザウイルス抗原からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物が水溶液中にある、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物が１種以上の薬学的に許容される賦形剤を更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１種のペプチドアジュバントが配列ＦＣＩＧＲＬを含み、前記組成物が水溶液中にあり、該組成物が、麻疹ウイルス抗原、ムンプスウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、ジフテリア菌抗原、百日咳菌抗原、破傷風菌抗原、炭疽菌抗原及びインフルエンザウイルス抗原からなる群から選択される１種以上の抗原を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
１種以上の抗原及び１種以上のペプチドアジュバントを含む、粘膜投与のための免疫原性組成物。
【請求項１４】
少なくとも１種の抗原が、麻疹ウイルス抗原、ムンプスウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、ジフテリア菌抗原、百日咳菌抗原、破傷風菌抗原、炭疽菌抗原及びインフルエンザウイルス抗原からなる群から選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
少なくとも１種のペプチドアジュバントが配列ＦＣＩＧＲＬを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ペプチドアジュバントが約６〜約５０個のアミノ酸を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ペプチドアジュバントが約６〜約２５個のアミノ酸を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ペプチドアジュバントが約６〜約１５個のアミノ酸を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物が水溶液中にある、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物が１種以上の薬学的に許容される賦形剤を更に含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２１】
少なくとも１種のペプチドアジュバントが配列ＦＣＩＧＲＬを含み、前記組成物が水溶液中にあり、該組成物が、麻疹ウイルス抗原、ムンプスウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、ジフテリア菌抗原、百日咳菌抗原、破傷風菌抗原、炭疽菌抗原及びインフルエンザウイルス抗原からなる群から選択される少なくとも１種の抗原を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２２】
１種以上の抗原及び１種以上のペプチドアジュバントを含む、粘膜投与のためのワクチン。
【請求項２３】
少なくとも１種の抗原が、麻疹ウイルス抗原、ムンプスウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、ジフテリア菌抗原、百日咳菌抗原、破傷風菌抗原、炭疽菌抗原及びインフルエンザウイルス抗原からなる群から選択される、請求項２２に記載のワクチン。
【請求項２４】
少なくとも１種のペプチドアジュバントが配列ＦＣＩＧＲＬを含む、請求項２２に記載のワクチン。
【請求項２５】
前記ペプチドアジュバントが約６〜約５０個のアミノ酸を含む、請求項２４に記載のワクチン。
【請求項２６】
前記ペプチドアジュバントが約６〜約２５個のアミノ酸を含む、請求項２４に記載のワクチン。
【請求項２７】
前記ペプチドアジュバントが約６〜約１５個のアミノ酸を含む、請求項２４に記載のワクチン。
【請求項２８】
前記ワクチンが水溶液中にある、請求項２２に記載のワクチン。
【請求項２９】
前記ワクチンが１種以上の薬学的に許容される賦形剤を更に含む、請求項２８に記載のワクチン。
【請求項３０】
少なくとも１種のペプチドアジュバントが配列ＦＣＩＧＲＬを含み、前記ワクチンが水溶液中にあり、該ワクチンが、麻疹ウイルス抗原、ムンプスウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、ジフテリア菌抗原、百日咳菌抗原、破傷風菌抗原、炭疽菌抗原及びインフルエンザウイルス抗原からなる群から選択される少なくとも１種の抗原を含む、請求項２２に記載のワクチン。
【請求項３１】
抗原提示細胞を刺激する方法であって、該抗原提示細胞をアジュバントペプチドと接触させることを含む、方法。
【請求項３２】
前記抗原提示細胞が単球を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗原提示細胞がマクロファージを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
刺激がヒト主要組織適合性クラスＩ分子及びクラスＩＩ分子の発現の上方制御をもたらす、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
刺激がＣＤ４０の発現の上方制御をもたらす、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記アジュバントペプチドが配列ＦＣＩＧＲＬを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記アジュバントペプチドが約１μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００５年１月１４日に出願された米国仮特許出願第６０／６４３，６０６号に対する優先権を主張する。米国仮特許出願第６０／６４３，６０６号の内容は、参考として本明細書中に具体的に援用される。
【０００２】
（連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載）
本発明は、国立保健研究所の補助金ＤＫ  ０４８３７３に基づき、米国政府の基金を使用して実施された。従って、米国政府は、補助金の条件に従い、本発明に一定の権利を留保する。本発明は、イタリア保健省の補助金“Ｒｉｃｅｒｃａ  Ｆｉｎａｌｉｚｚａｔａ”補助金“３ＡＩＦ”及びＩｓｔｉｔｕｔｏ  Ｓｕｐｅｒｉｏｒｅ  ｄｉ  Ｓａｎｉｔａの内部研究補助金“Ｃ３ＭＪ”に基づき、イタリア政府の基金を使用して実施された。
【０００３】
（技術分野）
本発明は、ワクチン及び免疫療法の分野に関する。特に、本発明は、アジュバントペプチド及び抗原を含む経鼻組成物、並びに粘膜ワクチン接種のための該組成物の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
ワクチンは、感染症の予防のために、成功裏に使用される、極めて容認性の高い方法であることが立証されている。これらは費用対効果が大きく、標的病原体に対する抗生物質抵抗性を誘発せず、宿主内に存在する正常細菌叢に影響を及ぼさない。多くの場合、例えば抗ウイルス免疫を誘発するときに、ワクチンは、実行可能な治療又は改善処置がないような疾患を予防することができる。
【０００５】
当該分野で周知である通り、ワクチンは、免疫原性物質、又は抗原（抗原性物質）、一般的には非感染性又は非病原性の形態で身体に導入される感染性生物又はその一部に対する応答を増加させるように免疫系を誘発することによって機能する。いったん免疫系が「初回抗原刺激」を受けるか、生物に対して感作されると、後に感染性病原体としてのこの生物に免疫系が曝されたときに、病徴を引き起こすのに十分な宿主生物中の細胞を増殖及び感染させる前に病原体を破壊する、迅速且つ強力な免疫応答を引き起こす。免疫系を誘発するために使用される物質又は抗原は、弱毒化された生物として知られる、より感染力の少ない状態にある全体の生物であってもよく、場合によっては、生物の種々の構造成分を表わす炭水化物、タンパク質又はペプチド等の生物の構成成分であってもよい。
【０００６】
多くの場合、ワクチンを有効にするのに、即ち免疫力を与えるのに十分な程度に免疫系を刺激するためには、ワクチン中に存在する抗原に対する免疫応答を増強する必要がある。単独で投与された多くのタンパク質並びに殆どのペプチド及び炭水化物は、免疫力を与えるのに十分な抗体を誘発しない。このような抗原は、異物として認識され免疫応答を誘導するように、免疫系に存在する必要がある。この目的のために、免疫応答を刺激するアジュバントが考案された。
【０００７】
最も周知のアジュバントであるフロイント完全アジュバントは、水中油型エマルジョン中のミコバクテリアの混合物からなる。フロイントアジュバントは、２つの方法、第一に細胞及び体液性免疫を増強することにより、第二に抗原チャレンジ（蓄積効果）の急速な分散を妨害することによって機能する。しかし、この物質に対してしばしば起こる有毒な生理学的及び免疫学的応答により、フロイントアジュバントをヒトに使用することができなかった。免疫賦活又はアジュバント活性を有することが明らかとなっている別の分子には、リポ多糖類（ＬＰＳ）としても知られるエンドトキシンがある。ＬＰＳは、「先天性」の免疫応答、即ち生物を予め曝す必要なく、生物がエンドトキシン（及びエンドトキシンを一成分とする浸潤性細菌）を認識できるように進化した応答を誘発することによって、免疫系を刺激する。ＬＰＳは非常に有害なため生存可能なアジュバントではないが、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）等のエンドトキシンと構造的に関連する分子が、臨床試験においてアジュバントとして試験されている。しかし、現在のところ、ヒトに使用するアジュバントとしてＦＤＡに承認されているのは、抗原の沈殿による抗原の「蓄積」に使用されるアルミニウム塩（Ａｌｕｍ）のみである。Ａｌｕｍも又、抗原に対する免疫応答を刺激する。
【０００８】
従って、抗原を単独で又はａｌｕｍと共に注射した場合に見られるよりも、抗原に対する更に強力な抗体応答を起こすように免疫系を刺激するに、抗原と共に投与できる化合物の必要性が当該分野において認められている。更に、粘膜ワクチンの開発には特定のアジュバントの使用が必要であるため、ａｌｕｍ等の全身免疫化において作用するアジュバントは、一般的に粘膜ワクチンには有効でない。最近１０年間に粘膜ワクチンのためのアジュバントに関する集中的な研究が行われているにもかかわらず、今のところ、ヒトに使用するためのアジュバントは登録されていない。アジュバント研究における主な問題は有効性と毒性であり、候補となる粘膜アジュバントは、高い有効性を有しながら毒性を有さないという基準を完全には満たしていない。更に、提案されている粘膜アジュバントの殆どは、作用機序が十分に理解されていない複合分子である。本明細書において出願人等は、抗原に対する免疫応答を誘導する、代替となる非毒性のペプチドアジュバントを示す。このペプチドの生物学的活性は既に詳細に定義されており、アジュバントとしての作用機序も研究されている。
【０００９】
本発明の粘膜アジュバントの例には、閉鎖帯毒素（ＺＯＴ；例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６及び特許文献７を参照）のペプチドがある。特許文献８は、治療薬並びに鼻吸収を促進するのに有効な量の、精製されたコレラ菌閉鎖帯毒素を含む、鼻送達のための経鼻投与組成物を説明している。使用されている精製されたコレラ菌閉鎖帯毒素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約４４ｋＤａの分子量を有すると教示されているが、構造的情報は知られておらず、開示されていない。関連する特許文献９及び特許文献１０は、更に、精製されたコレラ菌閉鎖帯毒素受容体を説明している。
【００１０】
コレラ菌由来の閉鎖帯毒素（ＺＯＴ）は、粘膜ワクチン接種のためのアジュバントとして同定された（非特許文献１）。可溶性抗原と共にＺＯＴをマウスの鼻腔内に投与することは、全身体液性及び細胞性応答、並びに抗原オブアルブミンに特異的な粘膜応答を刺激する（非特許文献２）。ＺＯＴは、上皮細胞の受容体を結合する４４．８ｋＤａのタンパク質であり、粘膜関門の透過性の上昇を含む密着結合を調節する。密着結合に対するＺＯＴの効果は、可逆的であり、組織損傷を起こさない（非特許文献３）。上皮細胞のＺＯＴに対する受容体は、部分的に特徴付けられており、最近、ＺＯＴに対して相同性を有する哺乳動物タンパク質が同定され、ゾヌリンと命名されている。興味深いことに、このタンパク質は、上皮細胞によって放出され、ＺＯＴによって使用されるのと同一の受容体に結合する、密着結合の内因性制御因子であることが示されている（非特許文献４）。アジュバントとしてのＺＯＴの機序は、鼻粘膜の受容体との結合、密着結合の調節、粘膜下層の抗原の通過、次いで免疫系細胞への露出を伴う場合がある。
【００１１】
感染症の予防のための粘膜ワクチンの開発は、非常に望まれている。粘膜ワクチン接種は、非経口ワクチン接種よりも優れた利点が幾つかある。粘膜ワクチン接種は、感染部位（局所）において免疫応答を誘導する。更に、粘膜免疫系の本質的な特性により、１ヶ所の粘膜部位における免疫化によって、複数の遠位部位（部域）における特異的な応答を誘導することができる。（例えば、性行為感染症に対する）感染防御免疫は実際のところ離れた粘膜部位で誘導される場合があることから、このような柔軟性はワクチン接種に対する文化的及び宗教的障壁を解決する上で重要性を持つ。粘膜より獲得した病原体に対する局所応答に加えて、粘膜ワクチンは、体液性及び細胞性応答を含む全身免疫を誘導する。従って、粘膜ワクチン接種は、他の経路（即ち、血液又は皮膚）を通じて獲得した感染症と戦うために利用できると考えられる。最後に、粘膜ワクチンの投与は針を使用する必要がなく、ワクチンコンプライアンスを向上させ、血液伝播感染との関連性をなくす可能性がある。前述の全ての理由によって、予防又は治療ワクチン接種として癌と戦うためにも使用することができる。これらのワクチンは、感染因子（ピロリ菌、乳頭腫ウイルス、ヘルペスウイルス等）によって起こされる癌、及びその他の原因の癌（メラノーマ、大腸癌等）の何れに対しても抵抗性を持つ場合がある。
【００１２】
興味深いことに、殆どのヒトの病原体は粘膜経路を通じて獲得されるが、現在使用されている粘膜ワクチンは殆どない。現在使用されているワクチンには、生存する弱毒化された微生物をベースとしたものがある。更に、精製された抗原は、粘膜表面に送達された場合、本質的に免疫応答を刺激／誘導することができない。従って、このようなワクチンは特定のアジュバントの使用を必要とする。残念ながら、今のところ、前述のような安全で有効なアジュバントがないために、粘膜ワクチンの開発は進んでいない。有効な粘膜アジュバントは、抗原（Ａｇ）が粘膜関門を通過することを可能にし、抗原特異的免疫応答の誘導を促進する。
【００１３】
出願人等は、アジュバントペプチド、即ちＺＯＴのペプチド、並びにアジュバントペプチドと共に抗原を送達して、抗原に対して特異的な全身及び／又は粘膜の応答を誘導する方法を開示する。粘膜を通じた抗原の送達は免疫応答を誘導しないため、出願人等は、ＺＯＴペプチドの同時投与によって抗原に対する全身及び粘膜応答が誘導されることを見出した。アジュバントペプチドは、粘膜を通じた抗原の送達を促進する。本発明のアジュバントペプチドは、非毒性で、効果が可逆的であり、エンドトキシンの混入がなく、容易に合成でき、産生及び精製を安価に行えるという点で有利である。
【特許文献１】米国特許第５，６６５，３８９号明細書
【特許文献２】米国特許第５，９０８，８２５号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８６４，０１４号明細書
【特許文献４】米国特許第５，９１２，３２３号明細書
【特許文献５】米国特許第５，９４８，６２９号明細書
【特許文献６】米国特許第５，９４５，５１０号明細書
【特許文献７】米国特許第６，４５８，９２５号明細書
【特許文献８】米国特許第５，９０８，８２５号明細書
【特許文献９】米国特許第５，８６４，０１４号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，９１２，３２３号明細書
【非特許文献１】Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  １９９９，  ６７：  １２８７；Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ２００３，  ７１：  １８９７
【非特許文献２】Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ２００３，  ７１：  １８９７
【非特許文献３】Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １９９５，  ９６：  ７１０
【非特許文献４】Ａｎｎ．  ＮＹ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ２０００，  ９１５：  ２１４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の第一の実施形態は、哺乳動物において抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、アミノ酸配列ＦＣＩＧＲＬ（配列番号１）を有するペプチド又はその機能的誘導体及び該抗原を該動物に投与することを含み、該哺乳動物が該抗原に対する該免疫応答を上昇させる方法である。
【００１５】
本発明の第二の実施形態は、哺乳動物の粘膜を通じて抗原を送達する方法であって、該抗原、及びアミノ酸配列ＦＣＩＧＲＬを有するペプチド又はその機能的誘導体を該哺乳動物の粘膜に投与することを含む方法である。
【００１６】
本発明の第三の実施形態は、鼻孔組織を通じて抗原を送達する方法であって、該抗原、及びアミノ酸配列ＦＣＩＧＲＬを有するペプチド又はその機能的誘導体を該鼻孔組織に投与することを含む方法である。
【００１７】
本発明の第四の実施形態は、抗原に対する全身応答を誘導する方法であって、該抗原、及びアミノ酸配列ＦＣＩＧＲＬを有するペプチド又はその機能的誘導体を哺乳動物の粘膜を通じて投与することを含む方法である。
【００１８】
本発明の第五の実施形態は、抗原に対する粘膜応答を誘導する方法であって、該抗原、及びアミノ酸配列ＦＣＩＧＲＬを有するペプチド又はその機能的誘導体を哺乳動物の粘膜を通じて投与することを含む方法である。
【００１９】
本発明の第六の実施形態は、免疫応答を誘導するためのワクチン組成物である。該ワクチンは、免疫応答を誘導するための抗原、及びアミノ酸配列ＦＣＩＧＲＬ（配列番号１）を有するペプチド又はその機能的誘導体を含む。該ワクチンは、粘膜のワクチンであり、哺乳動物の粘膜に送達される。
【００２０】
本発明の第七の実施形態は、哺乳動物の粘膜に抗原を送達する方法であって、抗原、及びアミノ酸配列ＦＣＩＧＲＬ（配列番号１）を有するペプチド又はその機能的誘導体を該哺乳動物に投与することを含む方法である。
【００２１】
特定の実施形態において、投与は経鼻、経膣、経口又は腸内送達によるものである。該投与は、エアゾール、吸入薬、ドロップ、クリーム等である場合がある。
【００２２】
特定の実施形態において、ペプチドは、Ｘａａ１  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ（配列番号２）、Ｐｈｅ  Ｘａａ２  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ（配列番号３）、Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｘａａ３  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ（配列番号４）、Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ｘａａ４  Ａｒｇ  Ｌｅｕ（配列番号５）、Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｘａａ５  Ｌｅｕ（配列番号６）、及びＰｈｅ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｘａａ６（配列番号７）からなる群から選択される配列を含む。該ポリペプチドは、長さ１０個未満のアミノ酸残基である。Ｘａａ１は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＭｅｔからなる群から選択され；Ｘａａ２は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選択され；Ｘａａ３は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ及びＭｅｔからなる群から選択され；Ｘａａ４は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ａｌａ及びＧｌｎからなる群から選択され；Ｘａａ５は、Ｌｙｓ及びＨｉｓからなる群から選択され；Ｘａａ６は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ及びＭｅｔからなる群から選択される。
【００２３】
他の実施形態において、該ペプチドは、Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ（配列番号８）、Ｘａａ１  Ｃｙｓ  Ｘａａ３  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ（配列番号９）、Ｘａａ１  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ｘａａ４  Ａｒｇ  Ｌｅｕ（配列番号１０）、Ｘａａ１  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｘａａ５  Ｌｅｕ（配列番号１１）、Ｘａａ１  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｘａａ６（配列番号１２）、Ｐｈｅ  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ（配列番号１３）、Ｐｈｅ  Ｘａａ２  Ｉｌｅ  Ｘａａ４  Ａｒｇ  Ｌｅｕ（配列番号１４）、Ｐｈｅ  Ｘａａ２  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｘａａ５  Ｌｅｕ（配列番号１５）、Ｐｈｅ  Ｘａａ２  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｘａａ６（配列番号１６）、Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ａｒｇ  Ｌｅｕ（配列番号１７）、Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｘａａ３  Ｇｌｙ  Ｘａａ５  Ｌｅｕ（配列番号１８）、Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｘａａ３  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｘａａ６（配列番号１９）、Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ｘａａ４  Ｘａａ５  Ｌｅｕ（配列番号２０）、Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ｘａａ４  Ａｒｇ  Ｘａａ６（配列番号２１）、及びＰｈｅ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｘａａ５  Ｘａａ６（配列番号２２）からなる群から選択される配列を含む。該ポリペプチドは、長さ１０個未満のアミノ酸残基である。Ｘａａ１は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＭｅｔからなる群から選択され；Ｘａａ２は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選択され；Ｘａａ３は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ及びＭｅｔからなる群から選択され；Ｘａａ４は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ａｌａ及びＧｌｎからなる群から選択され；Ｘａａ５は、Ｌｙｓ及びＨｉｓからなる群から選択され；Ｘａａ６は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ及びＭｅｔからなる群から選択される。
【００２４】
他の実施形態において、該ペプチドアジュバントはＳＬＩＧＲＬ（配列番号２３）である。他の実施形態において、該ペプチドアジュバントはＳＬＩＧＫＶ（配列番号２４）である。
【００２５】
特定の実施形態において、本発明は、抗原に対する全身又は粘膜応答を誘導する方法であって、抗原、並びに配列番号２３及び配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを投与することを含む方法である。
【００２６】
特定の実施形態において、本発明は、抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、抗原、並びに配列番号２３及び配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを投与することを含む方法である。
【００２７】
一実施形態において、本発明は、動物において免疫応答を誘導する方法を提供する。このような方法は、１つ以上の抗原、及び１つ以上のペプチドアジュバントを動物の粘膜に投与することを含み得る。一部の実施形態において、少なくとも１種の抗原及び少なくとも１種のペプチドアジュバントは組成物として投与され、例えば、抗原及びアジュバントは溶液（例えば、水溶液、食塩溶液）中に存在する場合がある。組成物は更に、１種以上の薬学的に許容される賦形剤（例えば、塩、緩衝液、緩衝塩、糖、界面活性剤、タルク等）を含む場合がある。このような方法は、何れの種類の動物で、例えば、ヒト等の哺乳動物で、実施され得る。本発明において使用されるペプチドアジュバントは、配列ＦＣＩＧＲＬを含む場合があり、長さ約６〜約５０個のアミノ酸、約６〜約２５個のアミノ酸、又は約６〜約１５個のアミノ酸である場合がある。何れかの望ましい抗原、例えば、麻疹ウイルス抗原、ムンプスウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、ジフテリア菌抗原、百日咳菌抗原、破傷風菌抗原、炭疽菌抗原、インフルエンザウイルス抗原、及びそれらの組み合わせが使用される場合がある。特定の実施形態において、本発明は、動物（例えば、ヒト等の哺乳動物）において免疫応答を誘導する方法であって、少なくとも１種のペプチドアジュバントが配列ＦＣＩＧＲＬを含み、該組成物が水溶液中にあり、該組成物が、麻疹ウイルス抗原、ムンプスウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、ジフテリア菌抗原、百日咳菌抗原、破傷風菌抗原、炭疽菌抗原及びインフルエンザウイルス抗原からなる群から選択される１種以上の抗原を含む方法を提供する。
【００２８】
別の実施形態において、本発明は、粘膜投与のための免疫原性組成物を提供する。このような組成物は、１種以上の抗原及び１種以上のペプチドアジュバントを含む場合がある。このような組成物は更に、１種以上の薬学的に許容される賦形剤（例えば、塩、緩衝液、緩衝塩、糖、界面活性剤、タルク等）を含む場合がある。本発明の一部の組成物において、少なくとも１種の抗原は、麻疹ウイルス抗原、ムンプスウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、ジフテリア菌抗原、百日咳菌抗原、破傷風菌抗原、炭疽菌抗原及びインフルエンザウイルス抗原からなる群から選択される。本発明の一部の組成物において、少なくとも１種のペプチドアジュバントは配列ＦＣＩＧＲＬを含む。ペプチドアジュバントは、長さ約６〜約５０個のアミノ酸、約６〜約２５個のアミノ酸、又は約６〜約１５個のアミノ酸である場合がある。一部の実施形態において、本発明の組成物は水溶液（例えば、食塩溶液）中にある場合がある、１種以上の薬学的に許容される賦形剤を更に含む場合がある。特定の実施形態において、粘膜投与のための免疫原性組成物は、配列ＦＣＩＧＲＬを含む少なくとも１種のペプチドアジュバントを含む場合があり、該組成物は水溶液中にあり、該組成物は、麻疹ウイルス抗原、ムンプスウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、ジフテリア菌抗原、百日咳菌抗原、破傷風菌抗原、炭疽菌抗原及びインフルエンザウイルス抗原からなる群から選択される、少なくとも１種の抗原を含む場合がある。
【００２９】
本発明の別の実施形態において、本発明は粘膜投与のためのワクチンを提供する。このようなワクチンは、１つ以上の抗原及び１つ以上のペプチドアジュバントを含む場合がある。何れかの好適な抗原、例えば、麻疹ウイルス抗原、ムンプスウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、ジフテリア菌抗原、百日咳菌抗原、破傷風菌抗原、炭疽菌抗原、インフルエンザウイルス抗原及びそれらの混合物からなる群から選択される抗原が使用される場合がある。一部の実施形態において、粘膜投与のためのワクチンは、配列ＦＣＩＧＲＬを含む少なくとも１種のペプチドアジュバントを含む場合がある。好適なペプチドアジュバントは、長さ約６〜約５０個のアミノ酸、約６〜約２５個のアミノ酸、又は約６〜約１５個のアミノ酸である場合がある。粘膜投与のためのワクチンは水溶液（例えば、食塩溶液）中にある場合があり、１種以上の薬学的に許容される賦形剤を更に含む場合がある。特定の実施形態において、粘膜投与のためのワクチンは、配列ＦＣＩＧＲＬを含む少なくとも１種のペプチドアジュバントを含む場合があり、該ワクチンは水溶液中にある場合があり、該ワクチンは、麻疹ウイルス抗原、ムンプスウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、ジフテリア菌抗原、百日咳菌抗原、破傷風菌抗原、炭疽菌抗原及びインフルエンザウイルス抗原からなる群から選択される、少なくとも１種の抗原を含む場合がある。
【００３０】
別の実施形態において、本発明は、抗原提示細胞を刺激する方法を提供する。このような方法は、抗原提示細胞をアジュバントペプチドと接触させることを含む場合がある。本発明の方法を使用して何れかの抗原提示細胞が刺激される場合があり、例えば、単球及び／又はマクロファージが刺激される場合がある。抗原提示細胞がヒト細胞である場合、抗原提示細胞の刺激によって、抗原提示細胞によるヒトの主要な組織適合性クラスＩ及びクラスＩＩ分子及び／又はＣＤ４０の発現量が増大する場合がある。抗原提示細胞を刺激するのに好適なアジュバントペプチドには、配列ＦＣＩＧＲＬを含むペプチドが含まれるが、これに限定されない。一般的に、アジュバントペプチドは、抗原提示細胞を刺激するのに十分な濃度で存在する場合がある。十分な濃度は、約０．０１μｇ／ｍＬ〜約５００μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ〜約２５０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／Ｌ、約１μｇ／ｍＬ〜約７５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ〜約４０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ〜約３０μｇ／ｍＬ、又は約１μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬである場合がある。
【００３１】
本明細書を読むことで当業者に明らかになるこれらの及びその他の実施形態は、疾患を治療及び／又は予防するための試薬及び方法を当該技術分野に提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
定義
本明細書で使用される単数形の「ａ」又は「ａｎ」は、１つ以上を意味する場合がある。本明細書の請求項で使用される単数形の「ａ」又は「ａｎ」は、「含む」という語句と共に使用される場合に、１つ以上を意味する場合がある。本明細書で使用される「別の」という語句は、少なくとも第二又はそれ以上を意味する場合がある。
【００３３】
本明細書で使用される「ペプチドアジュバント」又は「アジュバントペプチド」とは、抗原に対する免疫応答を誘導、増強及び／又はブーストすることによって、抗原の作用を促進又は修飾する成分（組成物として）として機能するペプチドを指す。
【００３４】
本明細書で使用される「抗原」とは、例えば、抗原に特異的に結合する抗体の産生によって測定することのできる、免疫応答を誘導できる任意の抗原性物質（免疫原）を指す。
【００３５】
本明細書で使用される「粘膜」とは、（粘液腺が豊富な）粘膜を指し、具体的にこの粘膜は、外部と直接又は間接的に接触した身体の通路及び空洞に一列に並び；保護、支持、養分吸収並びに粘液、酵素及び塩の分泌の機能を果たし；消化管の大部分に、平滑筋の薄いながら明らかな層と、基礎となる基底膜を有し、種類及び厚みはそれぞれ異なるものの、常に柔軟且つ滑らかであり、細胞からの及び膜に埋め込まれた多数の腺からの分泌物により潤滑が維持されている表層上皮組織を含有する、深い血管結合組織基質からなる。例示的実施形態において、粘膜は、鼻、膣、直腸、口又は腸の粘膜である。
【００３６】
本明細書で使用される「ペプチド」とは、例えば、配列番号２〜２４を含むがこれらに限定されない、配列番号１（ＦＣＩＧＲＬ）のアミノ酸配列及びその機能的誘導体を有するＺＯＴのペプチドを指す。特定の実施形態において、本発明のペプチドは、ＡＴ１００２（ＦＣＩＧＲＬ、配列番号１）と称する。
【００３７】
本明細書で使用される「ワクチン」とは、特定の疾患に対する免疫力を産生する又は人工的に増大させるために対象に投与される調製物を指す。該調製物は、死滅した微生物、生存する弱毒化された生物、生存する完全に有毒の生物、組換えバイオ分子、病原体からの免疫原性タンパク質、抗体、脂質、多糖類、炭水化物等、及びペプチドアジュバントのような抗原を含む。
【００３８】
本発明
出願人等は、本明細書に開示されるように、新規のアジュバントペプチドとして機能する、コレラ菌ファージＣＴＸΦ  ＺＯＴタンパク質由来のペプチドを開発した。該アジュバントペプチドは、アミノ酸配列ＦＣＩＧＲＬ（配列番号１）及びその機能的誘導体を含む。該アジュバントペプチドは、１０個未満のアミノ酸残基である。該アジュバントペプチドは、６個のアミノ酸ＦＣＩＧＲＬ（配列番号１）しか含んでいない場合もあれば、追加のアミノ酸を有する場合もある。他のアミノ酸は、他の機能、例えば、精製を容易にする抗原タグを提供する場合がある。
【００３９】
例えば、ペプチドＦＣＩＧＲＬの機能的誘導体には、Ｘａａ１  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ（配列番号２）、Ｐｈｅ  Ｘａａ２  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ（配列番号３）、Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｘａａ３  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ（配列番号４）、Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ｘａａ４  Ａｒｇ  Ｌｅｕ（配列番号５）、Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｘａａ５  Ｌｅｕ（配列番号６）、及びＰｈｅ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｘａａ６（配列番号７）が含まれる。Ｘａａ１は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＭｅｔからなる群から選択され；Ｘａａ２は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選択され；Ｘａａ３は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ及びＭｅｔからなる群から選択され；Ｘａａ４は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ａｌａ及びＧｌｎからなる群から選択され；Ｘａａ５は、Ｌｙｓ及びＨｉｓからなる群から選択され；Ｘａａ６は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ及びＭｅｔからなる群から選択される。
【００４０】
更に、ペプチドの機能的誘導体には、Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ（配列番号８）、Ｘａａ１  Ｃｙｓ  Ｘａａ３  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ（配列番号９）、Ｘａａ１  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ｘａａ４  Ａｒｇ  Ｌｅｕ（配列番号１０）、Ｘａａ１  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｘａａ５  Ｌｅｕ（配列番号１１）、Ｘａａ１  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｘａａ６（配列番号１２）、Ｐｈｅ  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ（配列番号１３）、Ｐｈｅ  Ｘａａ２  Ｉｌｅ  Ｘａａ４  Ａｒｇ  Ｌｅｕ（配列番号１４）、Ｐｈｅ  Ｘａａ２  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｘａａ５  Ｌｅｕ（配列番号１５）、Ｐｈｅ  Ｘａａ２  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｘａａ６（配列番号１６）、Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ａｒｇ  Ｌｅｕ（配列番号１７）、Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｘａａ３  Ｇｌｙ  Ｘａａ５  Ｌｅｕ（配列番号１８）、Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｘａａ３  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｘａａ６（配列番号１９）、Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ｘａａ４  Ｘａａ５  Ｌｅｕ（配列番号２０）、Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ｘａａ４  Ａｒｇ  Ｘａａ６（配列番号２１）、及びＰｈｅ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｘａａ５  Ｘａａ６（配列番号２２）が含まれる。Ｘａａ１は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＭｅｔからなる群から選択され；Ｘａａ２は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選択され；Ｘａａ３は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ及びＭｅｔからなる群から選択され；Ｘａａ４は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ａｌａ及びＧｌｎからなる群から選択され；Ｘａａ５は、Ｌｙｓ及びＨｉｓからなる群から選択され；Ｘａａ６は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ及びＭｅｔからなる群から選択される。
【００４１】
何れの長さのペプチドアジュバントも使用される場合がある。一般的に、ペプチドアジュバントの大きさは、長さ約６〜約１００個、約６〜約９０個、約６〜約８０個、約６〜約７０個、約６〜約６０個、約６〜約５０個、約６〜約４０個、約６〜約３０個、約６〜約２５個、約６〜約２０個、約６〜約１５個、約６〜約１４個、約６〜約１３個、約６〜約１２個、約６〜約１１個、約６〜約１０個、約６〜約９個、又は約６〜約８個のアミノ酸の範囲に及ぶ。本発明のペプチドアジュバントは、長さ約８〜約１００個、約８〜約９０個、約８〜約８０個、約８〜約７０個、約８〜約６０個、約８〜約５０個、約８〜約４０個、約８〜約３０個、約８〜約２５個、約８〜約２０個、約８〜約１５個、約８〜約１４個、約８〜約１３個、約８〜約１２個、約８〜約１１個、又は約８〜約１０個のアミノ酸である場合がある。本発明のペプチドアジュバントは、長さ約１０〜約１００個、約１０〜約９０個、約１０〜約８０個、約１０〜約７０個、約１０〜約６０個、約１０〜約５０個、約１０〜約４０個、約１０〜約３０個、約１０〜約２５個、約１０〜約２０個、約１０〜約１５個、約１０〜約１４個、約１０〜約１３個、又は約１０〜約１２個のアミノ酸である場合がある。本発明のペプチドアジュバントは、長さ約１２〜約１００個、約１２〜約９０個、約１２〜約８０個、約１２〜約７０個、約１２〜約６０個、約１２〜約５０個、約１２〜約４０個、約１２〜約３０個、約１２〜約２５個、約１２〜約２０個、約１２〜約１５個、約１２〜約１４個のアミノ酸である場合がある。本発明のペプチドアジュバントは、長さ約１５〜約１００個、約１５〜約９０個、約１５〜約８０個、約１５〜約７０個、約１５〜約６０個、約１５〜約５０個、約１５〜約４０個、約１５〜約３０個、約１５〜約２５個、約１５〜約２０個、約１５〜約１９個、約１５〜約１８個、又は約１５〜約１７個のアミノ酸である場合がある。本発明のペプチドアジュバントは、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、約１１個、約１２個、約１３個、約１４個、約１５個、約２０個、約３０個、約４０個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個又は約１００個のアミノ酸を含む場合がある。
【００４２】
ペプチドアジュバントは、Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  Ｅｄｓ．  Ｍａｎｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃ．Ｒ．Ｃ．  Ｐｒｅｓｓ  （１９９１）に説明されるような周知の技法、及びＳｙｍｐｈｏｎｙ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ）等のペプチドシンセサイザーを使用して；又は組換えＤＮＡ技法、即ち、該ペプチドをコードするヌクレオチド配列が適切な発現ベクター、例えば大腸菌又は酵母発現ベクターに挿入され、それぞれの宿主細胞内で発現され、周知の技法を使用してそれらから精製される技法を使用して、化学的に合成及び精製することができる。
【００４３】
該ペプチドは、抗原の吸収を促進するために使用される。更に、該吸収は、粘膜、より詳細には鼻粘膜を通じて起こる。該ペプチドは、腸、血液脳関門、皮膚及び鼻粘膜の全体にわたる吸収を促進する（同時係属中の、２００４年６月１５日に出願され、ＵＳ２００５００５９５９３として公開され、全体が本明細書に参考文献として援用される、米国特許出願第１０／８９１，４９２号を参照）。従って、該ペプチドは、鼻及び／又は鼻粘膜組織を標的とする抗原と共に製剤化してもよければ、一緒に投与してもよい。本発明の医薬組成物は、投与前に予め混合される場合もあれば、２種の抗原を互いに２４時間以内に投与する時には生体内で形成されてもよい。好ましくは、前記の２種の抗原は、互いに１２、８、４、２又は１時間以内に投与される。
【００４４】
「経鼻」送達組成物は一般的に、粘液線毛クリアランスを減少し、経鼻投与される薬物の再現可能なバイオアベイラビリティを達成するため、直径約５０μｍの水溶性ポリマーを含む。有利な点として、「経鼻」送達組成物は、腸送達に必要とされるような胃の抵抗性を有する必要がない。ポリマーを含む経鼻組成物は好適であるが、ペプチドアジュバントが鼻粘膜に結合できるという条件で、その他の賦形剤も考慮されている。
【００４５】
経鼻送達のための経鼻組成物は、当該分野で周知である。このような経鼻投与組成物は一般的に、経鼻投与のためのペプチドの担体として作用できる（Ｄａｖｉｓ，  Ｉｎ：  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｄｒｕｇｓ，  １２５：  １−２１  （１９８６））薬学的投与形態を調製するために広範に使用されている（Ｍａｒｔｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎ：  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ３ｒｄ  Ｅｄ．，  ｐ．５９２−６３８  （１９８３））水溶性ポリマーを含む。ポリマーマトリックスに埋め込まれたペプチドの経鼻吸収は、鼻粘液線毛クリアランスの遅延により増強することが示されている（Ｉｌｌｕｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．，  ４６：  ２６１−２６５  （１９８８））。その他の可能な増強機序には、ペプチド吸収に関する濃度上昇の勾配、又は分散経路の減少が含まれる（Ｔｉｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．，  ９：  １３３０−１３３５  （１９９２））。しかし、粘液線毛クリアランス速度の減少は、経鼻投与される全身性薬物の再現可能なバイオアベイラビリティ達成への良好な手法であると予想されている（Ｇｏｎｄａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．，  ７：  ６９−７５  （１９９０））。直径約５０μｍの微粒子は鼻腔内に沈着すると予想されている（Ｂｊｏｒｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．，  ６２：  １８７−１９２  （１９９０）；及びＩｌｌｕｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．，  ３９：  １８９−１９９  （１９８７））が、直径１０μｍ以下の微粒子は、鼻のろ過システムから逃れ、より下の気道内に沈着する可能性がある。又、直径２００μｍを超える微粒子は、経鼻投与後に鼻内に保持されることはない（Ｌｅｗｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｉｎｔ．  Ｓｙｍｐ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．  Ｂｉｏａｃｔ．  Ｍａｔｅｒ．，  １７：  ２８０−２９０  （１９９０））。
【００４６】
使用される特定の水溶性ポリマーは、必ずしも本発明に重要ではなく、経鼻投与形態に使用される周知の水溶性ポリマーの何れかから選択することができる。経鼻送達に有用な水溶性ポリマーの代表的な例には、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）がある。この物質は、その物性が分子量、加水分解の程度、架橋密度及び結晶化度により異なる膨潤性及び親水性ポリマーである（Ｐｅｐｐａｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎ：  Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  ３：  １０９−１３１  （１９８７））。ＰＶＡは、相分離、スプレー乾燥、スプレー包埋化、及びスプレー高密度化を介した分散物質のコーティングに使用することができる（Ｔｉｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  同上）。
【００４７】
従来より使用されている、薬学的に許容される乳化剤、界面活性剤、懸濁剤、酸化防止剤、浸透圧増強剤、増量剤、希釈剤及び防腐剤も添加される場合がある。又、水溶性ポリマーを担体として使用することもできる。その他の薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤も当業者に周知である（例えば、全体が本明細書に参考文献として組み入れられる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １６ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｏｓｏｌ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ８９  （１９８０）；Ｄｉｇｅｎｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．，  ８３：  ９１５−９２１  （１９９４）；Ｖａｎｔｉｎｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｔｅｒａｐｅｕｔｉｃａ，  １４５：  ４４５−４５１  （１９９３）；Ｙｏｓｈｉｔｏｍｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．，  ４０：  １９０２−１９０５  （１９９２）；Ｔｈｏｍａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，  ４６：  ３３１−３３６  （１９９１）；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，  ７：  ３０９−３１９  （１９９１）；及びＬｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓ．，  ８：  ９１９−９２４  （１９９１）を参照）。
【００４８】
本発明の方法において有用な組成物は、組成物と粘膜との接触をもたらす吸入薬、液状ドロップ、エアゾール又はその他の製剤として投与される場合がある。液体として投与する場合、本発明の組成物は、食塩溶液等の水溶液として投与される場合がある。溶液のパラメータ（例えば、ｐＨ、浸透圧、粘度等）は、本発明の組成物の送達を促進するために、必要に応じて調節される場合がある。例えば、水溶液がＡＴ１００２を含む場合には、ペプチドアジュバントの安定性を向上させるためにｐＨを酸性のｐＨに調整することが好ましい場合がある。
【００４９】
使用される特定の抗原は、必ずしも本発明に重要ではなく、大きさ又は電荷と関係なく、経細胞経路を介してそれ以外の方法では吸収されない、例えば、何れかの生物学的に活性なペプチド、脂質、多糖類、ワクチン又はその他何れかの成分であってもよい。
【００５０】
本発明で使用できるワクチンの例には、ペプチド抗原及び弱毒化された微生物、ウイルス、寄生虫及び／又は真菌が含まれる。本発明で使用できるペプチド抗原の例には、毒素原性大腸菌の非耐熱性エンテロトキシンのＢサブユニット、コレラ毒素のＢサブユニット、ジフテリア毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、腸内病原体の莢膜抗原、腸内病原体の海馬采又は線毛、ＨＩＶ表面抗原、粉塵アレルゲン、及びダニアルルゲンが含まれるが、これらに限定されない。当該分野で既知のその他の抗原、例えば、インフルエンザ、百日咳、ＨＩＶ、髄膜炎菌抗原、乳頭腫ウイルス、細菌、ウイルス、寄生虫、真菌等も使用することができる。本発明に従って調製できるワクチンの更なる例には、癌由来の抗原（例えば、可溶性抗原）、ウイルス、細菌、寄生虫、真菌及び／又はプリオン由来の抗原が含まれるが、これらに限定されない。本発明のワクチンで使用される抗原は、任意の供給源由来のものである場合があり、例えば、組換え体、合成、天然又は修飾抗原である場合がある。抗原は、弱毒化又は不活性化されたウイルス、細菌、寄生虫及び／又は真菌である場合がある。抗原は、組換えウイルス、細菌、寄生虫及び／又は真菌である場合がある。又、抗原は、異種のワクチン抗原を発現する組換えウイルス、最近、寄生虫及び真菌である場合もある。抗原は又、アレルゲンである場合もある。
【００５１】
本発明で使用できる弱毒化及び／又は不活性化された微生物及びウイルスの例には、毒素原性大腸菌、腸管病原性大腸菌、コレラ菌、シゲラフレクスネリ、チフス菌及びロタウイルスが含まれる（それぞれ全体が本明細書に参考文献として組み入れられる、Ｆａｓａｎｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎ：  Ｌｅ  Ｖａｃｃｉｎａｚｉｏｎｉ  ｉｎ  Ｐｅｄｉａｔｒｉａ，  Ｅｄｓ．  Ｖｉｅｒｕｃｃｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＣＳＨ，  Ｍｉｌａｎ，  ｐ．１０９−１２１  （１９９１）；Ｇｕａｎｄａｌｉｎｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎ：  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｎｆａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ，  Ｅｌｓｅｖｉｏｒ，  Ｅｄｓ．  Ｂｕｔｚ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２５  （１９９３）；Ｌｅｖｉｎｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｍ．  Ｐｅｄ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．，  ５：  ２４３−２５０  （１９９４）；及びＫａｐｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．，  ８：  ４８−８６  （１９９５））。癌の例には、感染物質（例えば、ピロリ菌、乳頭腫ウイルス、ヘルペスウイルス）によって引き起こされる癌、及び種々の原因の癌（例えば、メラノーマ、大腸癌、前立腺癌等）が含まれる。
【００５２】
防御免疫応答を誘導できる何れかの抗原が、本発明のワクチンにおいて使用される場合がある。好適な抗原の例には、麻疹ウイルス抗原、ムンプスウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、ジフテリア菌抗原、百日咳菌抗原、破傷風菌抗原、炭疽菌抗原、インフルエンザウイルス抗原及び癌抗原が含まれるが、これらに限定されない。
【００５３】
使用される抗原の量は、必ずしも本発明に重要ではなく、選択された特定の成分、標的とする疾患又は病状、及び対象の年齢、体重及び性別により変動する。
【００５４】
使用されるＺＯＴペプチドの量も又、必ずしも本発明に重要ではなく、対象の年齢、体重及び性別により変動する。一般的に、粘膜による生物学的活性成分の吸収を増強するために本発明で使用されるペプチドの最終濃度は、約１０−５Ｍ〜１０−１０Ｍ、好ましくは約１０−６Ｍ〜５．０×１０−５Ｍの範囲となる。一例として、このような最終濃度を達成するために、腸粘膜に投与するような、単一の経口投与組成物中のペプチドの量は、一般的に約４．０ｎｇ〜約２．５μｇ、又は４．０ｎｇ〜１０００ｎｇ、好ましくは約４０ｎｇ〜８０ｎｇである。特定の実施形態において、例えば、約２０ｇの哺乳動物において、抗原の投与量は約２．５μｇであり、アジュバントペプチドの量は約２２．５μｇである（比率１：１０）。他の実施形態において、例えば、約２０ｇの哺乳動物において、抗原の投与量は約２．５μｇであり、ペプチドの量は約２２．５、又は約１５、又は約７．５μｇである。
【００５５】
使用されるペプチドに対する抗原の比率は、必ずしも本発明に重要ではなく、選択された期間内に送達される生物学的活性成分の量、更には標的とする粘膜の種類により変動する。一般的に、本発明で使用されるペプチドに対する治療又は免疫原性物質の重量比は、約１：１００〜３：１、又は約１：１０〜２：１の範囲となる。出願人等は、抗原に対するアジュバントペプチドの量が多くなる程、全身及び／又は標的となる粘膜において相対的に強い免疫応答が誘導されると予想している。
【００５６】
アミノ酸を、同様の特性を有する別のアミノ酸に変換する保存的置換を、配列番号１の配列を有するペプチドにおいて実施してもよい。保存的置換の例には、Ｇｌｙ⇔Ａｌａ、Ｖａｌ⇔Ｉｌｅ⇔Ｌｅｕ、Ａｓｐ⇔Ｇｌｕ、Ｌｙｓ⇔Ａｒｇ、Ａｓｎ⇔Ｇｌｎ、及びＰｈｅ⇔Ｔｒｐ⇔Ｔｙｒが含まれるが、これらに限定されない。一般的に、アミノ酸の保存的置換は、約１〜２個のアミノ酸残基に起こる。生物学的又は免疫学的活性を無効にすることなくどのアミノ酸残基を置換できるかを決定する目安は、当該分野において周知のコンピュータプログラム、例えば、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを使用して見出すか、又はＤａｙｈｏｆｆ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９７８）ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  （Ｎａｔｌ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｆｏｕｎｄ．，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．）に記載されている。
【００５７】
アミノ酸置換は、１個のアミノ酸の１個のアミノ酸への置換として定義される。置換アミノ酸が、同様の構造的及び／又は化学的特性を有する時には、本質的に保存的である。保存的置換の例には、ロイシンのイソロイシン又はバリンへの置換、アスパラギン酸のグルタミン酸への置換、又はスレオニンのセリンへの置換がある。
【００５８】
特に好ましいペプチド類似体には、本質的に保存的である置換、即ち側鎖において関連性があるアミノ酸ファミリー内に生じる置換が含まれる。具体的には、アミノ酸は一般的に、（１）酸性：アスパラギン酸及びグルタミン酸；（２）塩基性：リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；（４）非電荷極性：グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン及びチロシン；及び（５）芳香族アミノ酸：フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンのファミリーに分類される。例えば、ロイシンのイソロイシン又はバリンへの置換、アスパラギン酸のグルタミン酸への置換、スレオニンのセリンへの分離された置換、又はアミノ酸の構造的に関連性があるアミノ酸への同様の保存的置換は、生物学的活性に重要な効果を及ぼさないことが合理的に予想できる。
【００５９】
当該分野において既知の何れかのアッセイを、本発明のペプチドの生物学的活性を測定するために使用することができる。例えば、該アッセイは、（１）Ｆａｓａｎｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ，  ８：  ５２４２−５２４６  （１９９１）に記載されるようなＵｓｓｉｎｇチャンバー中に搭載された回腸の組織抵抗（Ｒｔ）の減少のアッセイ；（２）後述のようなＵｓｓｉｎｇチャンバー中における腸管上皮細胞単分子膜の組織抵抗（Ｒｔ）の減少のアッセイ；（３）ＷＯ９６／３７１９６；１９９５年５月２４日に出願された米国特許出願第０８／４４３，８６４号；１９９６年２月９日に出願された米国特許第０８／５９８，８５２号、及び１９９７年１月９日に出願された米国特許第０８／７８１，０５７号に記載されるような、治療又は免疫原性物質の吸収の腸又は鼻における増強のアッセイを伴う場合がある。
【００６０】
本発明のペプチドは、可逆的及び再現可能な方法で密着結合を急速に開くため、ＺＯＴを使用する場合と同じ方法で、抗原の経鼻吸収増強剤として使用することができる（ＷＯ９６／３７１９６；１９９５年５月２４日に出願された米国特許出願第０８／４４３，８６４号；１９９６年２月９日に出願された米国特許第０８／５９８，８５２号、及び１９９７年１月９日に出願された米国特許第０８／７８１，０５７号を参照）。
【００６１】
前記の開示内容において本発明が概説されている。本明細書に開示された全ての参考文献は、参考文献として明示的に組み入れられている。更に詳細に理解するには、以下の特定の実施例を参照することで可能となるが、これらの実施例は、説明の目的においてのみ示されるものであり、本発明の適用範囲を限定することを意図していない。
【００６２】
以下の実施例は、抗原並びに配列番号１の粘膜アジュバントを投与することによる経鼻免疫が、血清ＩｇＧを誘導し、異なる粘膜区域において粘膜ＩｇＡを誘導し、その他の粘膜アジュバントよりも非常に有効であることを実証している。従って、ＡＴ１００２は、粘膜アジュバントとして機能し、対象において抗原に対する免疫応答を誘導する作用を持つ。
【実施例】
【００６３】
実施例１
破傷風トキソイド（ＴＴ）及びＺＯＴペプチド（ＡＴ１００２）を使用した鼻腔内免疫化
４頭のＣ５７ＢＬ／６メスマウスの群を、２．５μｇの破傷風トキソイド（ＴＴ）単独で、又はＴＴ及び所定濃度のＡＴ１００２で、又は対照としてＴＴ及び既知の非耐熱性エンテロトキシン（ＬＴ）アジュバントで、鼻腔内免疫化を行った。
【００６４】
図１には、４回免疫化を行った後の抗ＴＴ血清ＩｇＧの幾何平均力価を示す。結果には、ＡＴ１００２が、ＴＴ単独で免疫化した動物の結果と比べて、ＴＴに対するより高い血清応答を誘導するアジュバントとして作用することが示されている。更に、結果には、３０ｎｍｏｌのＡＴ１００２が相対的に最も有効であることも示されている。
【００６５】
図２には、４回免疫化を行った後の抗ＴＴ血清ＩｇＧの幾何平均力価を示す。結果には、ＡＴ１００２によって誘導された抗ＴＴ血清応答が、４回免疫後に観察された結果よりも高いこをが示されている。又、３０ナノモルのＡＴ１００２が相対的に最も有効となっている。
【００６６】
ＴＴ及び種々の濃度のアジュバントＡＴ１００２で６回免疫化した後に誘導された血清抗ＴＴ  ＩｇＡ応答を測定した（図４）。４匹のＣ５７ＢＬ／６メスマウスの群を、２．５μｇの破傷風トキソイド（ＴＴ）単独で、又はＴＴ及び所定濃度のＡＴ１００２で鼻腔内免疫化を行った。結果には、抗ＴＴ血清ＩｇＡの幾何平均力価が示されている。又データには、同時に投与された抗原に対する血清ＩｇＡをＡＴ１００２が誘導することが示されている。出願人等は更に、この観察に基づき、１回、２回、３回、４回又は５回の免疫化の後に、誘導された応答が起こる可能性があることも予想している。
【００６７】
出願人等は又、ＴＴ及び種々の濃度のアジュバントＡＴ１００２で６回免疫化した後の膣分泌物中に、抗ＴＴ  ＩｇＡ応答が誘導されることに気づいた（図５）。結果には、抗ＴＴ  ＩｇＡの幾何平均力価が示されており、ＡＴ１００２が免疫部位から遠い粘膜部位において同時に投与された抗原に対するＩｇＡを誘導することが示されている。出願人等は更に、この観察に基づき、１回、２回、３回、４回又は５回の免疫化の後に、誘導された応答が起こる可能性があることも予想している。
【００６８】
市販のペプチドＳＬＩＧＲＬ（マウス、配列番号２３）及びＳＬＩＧＫＶ（ヒト、配列番号２４）（何れもＳｉｇｍａより市販）を、ＡＴ１００２について前述した方法で使用される場合がある。即ち、配列番号２３又は２４の一方のアジュバントペプチドを、例えばＴＴ等の抗原と共に投与される場合がある。免疫化回数は１、２、３、４、５又は６回である場合がある。又、免疫応答が測定される場合があり、特にＴＴを使用する場合は、抗ＴＴ  ＩｇＡ及び抗ＴＴ  ＩｇＧの力価が、血清及び／又は膣分泌物中の何れかで測定される場合がある。
【００６９】
実施例２
粘膜アジュバントとしてのＺＯＴペプチド
本明細書に示される結果では、ペプチドＡＴ１００２が粘膜アジュバントとして作用することが実証されている。より具体的には、哺乳動物の粘膜免疫化において、ＡＴ１００２を同時投与すると、血清中の血清ＩｇＧ、ＩｇＡ、及び膣分泌物中の粘膜ＩｇＡが誘導される。
【００７０】
実施例３
ＡＴ１００２は、同時に送達される抗原に対する防御応答を誘導する。
【００７１】
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）に破傷風トキソイド（ＴＴ；１μｇ／回）を、ＡＴ１００２（３０μｇ／回）と共に又は単独で、週1回４週間にわたり経鼻投与し、２ヶ月後、マウスに破傷風トキソイドのＤＰ５０（予備実験で確立されたように動物の５０％を麻痺させる濃度の５０倍）を使用して皮下注射し、麻痺状態及び死亡を１週間記録した。表１の結果には、ＴＴ単独で免疫化されたマウスは防御されなかったが、ＡＴ１００２を有する抗原を受けたマウスは全て防御されたことが示されている。更に、投与の直前に、抗原に特異的な血清ＩｇＧ力価を個々のマウスで解析した。この表には、測定された力価の範囲が報告されている。
【００７２】
【表１】
2008526985.tif 000002
これらの結果では、ａ）ＡＴ１００２が、同時投与された抗原に対する防御応答を誘導し；ｂ）ＡＴ１００２の鼻（経鼻）免疫化により、全身（皮下）投与に対する防御応答が誘導され；ｃ）最後のワクチン投与から２ヶ月後に投与を行うと、ＡＴ１００２が「記憶」保護応答を誘導することが実証されている。実際に、２ヶ月後の抗ＴＴ血清ＩｇＧ力価は高かった（２ヶ月はマウスの寿命にとって有意な期間であることに留意されたい）。
【００７３】
実施例４
ＡＴ１００２は細胞性応答を誘導する。
【００７４】
図６に関連して、マウス（ＣＬ５７ＢＬ／６）に、破傷風トキソイド（ＴＴ；１μｇ／回）単独（白色の棒）又はＴＴ＋ＡＴ１００２（２２．５μｇ／回、斜線の棒）を、週1回４週間にわたり経鼻投与した。最後の投与から１週間後に脾臓を取り出し、ＴＴを培地に加え、トリチウム化チミジンの取り込みを測定する増殖アッセイを使用して、脾細胞を試験した。刺激指数（ＴＴを加えた培地のｃｐｍ÷ＴＴを加えない培地のｃｐｍ）値では、ＴＴ＋ＡＴ１００２で免疫化されたマウスが抗原に対して増殖するのに対して、ＴＴ単独で免疫化されたマウスは増殖しないことが示されている（４以上の値を陽性とした）。
【００７５】
これらの結果では、同時に投与された抗原に対する細胞性応答をＡＴ１００２が誘導することが実証されている。従って、抗原特異的Ｔリンパ球は、アジュバントとしてのＡＴ１００２による粘膜免疫化によって初回抗原刺激を受ける。
【００７６】
実施例５
健康な供与者の末梢血からヒト単球を精製し、完全培地中で培養した。２時間後に培地に刺激を加え、１８時間後に細胞を回収し、所定のモノクローナル抗体で染色して、ＦＡＣＳにより解析した。結果を図７に示す。
【００７７】
図７では、ＡＴ１００２が、単球及びマクロファージ等のヒト抗原提示細胞に対する免疫賦活効果を有することが実証されている。又、図７には、ＡＴ１００２が、単球上でヒトの主要な組織適合性クラスＩ及びクラスＩＩ分子（ＨＬＡ−Ｉ；ＨＬＡ−ＤＲ）の膜発現を上方制御することが示されている（太腺の数字は平均的な蛍光強度値を表す）。興味深いことに、この活性は、２０μｇ／ｍＬにおいて、並びに２０倍薄い濃度、即ち１μｇ／ｍＬにおいて作用する。同時に刺激した分子ＣＤ８０（Ｂ７−１）及びＣＤ８６（Ｂ７．２）は、単球上で上方制御されない。
【００７８】
次いで、ヒトマクロファージに対するＡＴ１００２の効果を解析した。健康な供与者の末梢血からヒト単球を精製し、完全培地中で５日間培養し、マクロファージに分化させた。次いで、培地に刺激を加え、１８時間後に細胞を回収し、所定のモノクローナル抗体で染色して、ＦＡＣＳで解析した。結果を図８に示す。図８では、ＡＴ１００２が、ＨＬＡ−１、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ８６の膜発現を著しく上方制御することが示されている（太腺の数字は平均的な蛍光強度値を表す）。又、図には示されていないが、同時刺激の分子ＣＤ８０も上方制御されている。更に、ＡＴ１００２は、実験未使用の（ｎａiｖｅ）リンパ球の初回抗原刺激に非常に重要な分子であるＣＤ４０の発現を上方制御する。リポ多糖類（ＬＰＳ）は、マクロファージ活性化の陽性対照として使用された。この点から、ＡＴ１００２は、ＨＬＡ−１及びＨＬＡ−ＤＲ分子の上方制御においてＬＰＳよりも有効であることに留意すべきである。
【００７９】
これらの結果では、ＡＴ１００２が免疫賦活活性を有することが実証されている。これは、抗原特異的免疫応答の刺激に重要な先天免疫の抗原提示細胞である単球及びマクロファージを活性化する作用を持つ。従って、ＡＴ１００２はワクチンアジュバントとして作用する。更に、単球及びマクロファージ上で上方制御されたこれらの分子は、Ｔリンパ球の刺激にきわめて重要である。実際に、ＨＬＡ  Ｉ分子は、ウイルス及び細胞内細菌（例えば、結核菌）等の細胞内病原体、及び癌細胞と戦うのに重要なＣＤ８＋Ｔリンパ球（細胞毒細胞）を刺激し；ＨＬＡ−ＤＲ分子は、ａ）全てのクラス（ＩｇＭ、ＩｇＧ及びＩｇＡ）の抗原特異的抗体を産生するためのＢリンパ球を刺激するヘルパー細胞として作用し；ｂ）細胞内及び細胞外の病原体によって引き起こされる感染に対するエフェクター細胞として作用する、ＣＤ４＋Ｔリンパ球を刺激するのに重要である。同時刺激の分子ＣＤ８０及びＣＤ８６は、Ｔリンパ球の最適な刺激にとって重要である。ＣＤ４０分子は又、抗原特異的Ｔリンパ球の刺激にとって、特にＣＤ４０リガンド分子を発現する実験未使用のＴリンパ球の初回抗原刺激にとっても重要である。
【００８０】
理論に拘束されるわけではないが、本発明のペプチドの作用機序は、ペプチドが上皮細胞上にある受容体と結合する第一の手順を伴う可能性があると考えられる。この結合により密着結合が調節され、同時に送達される抗原が粘膜下組織に侵入することが可能となる。次に、ペプチドは免疫系細胞と相互作用し、免疫応答を促進／調節する可能性がある。
【００８１】
密着結合に対するＡＴ１００２の活性、及び抗原提示細胞に対するＡＴ１００２の効果は、ＡＴ１００２が送達系及びアジュバントとして同時に作用することを示す。実際に粘膜下組織における抗原の送達並びに免疫応答の刺激及び増幅という２つの重要な問題点がある粘膜ワクチン接種にとっては、これが極めて重要である。一般的に、これら２つの機能を得るには、粘膜ワクチンに２種の異なる化合物が含まれていなければならないが、ＡＴ１００２は１つの分子に両方の活性を有する。
【００８２】
本明細書中に言及される全ての特許及び出版物は、本発明に関係する分野における当業者のレベルを示すものである。個々の出版物が参考文献として全体が組み入れられることを具体的に且つ個別に示す場合と同程度に、特許及び出版物は全て参考文献として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】４回投与後のアジュバントＡＴ１００２（ＡＴ１００２は配列ＦＣＩＧＲＬを有する；配列番号１）の用量応答曲線である。
【図２】５回投与後のアジュバントＡＴ１００２の用量応答曲線である。
【図３】４回及び５回の免疫化後のアジュバントＡＴ１００２の用量応答曲線である。
【図４】ＴＴ及び種々の濃度のアジュバントＡＴ１００２で６回免疫化した後に誘導された、血清抗ＴＴ  ＩｇＡ応答である。
【図５】ＴＴ及び種々の濃度のアジュバントＡＴ１００２で６回免疫化した後に膣分泌物中で誘導された、抗ＴＴ  ＩｇＡ応答である。
【図６】破傷風トキソイドで刺激した時に、破傷風トキソイド（ＴＴ；１μｇ／回）単独（白色の棒）、又はＴＴ＋ＡＴ１００２（２２．５μｇ／回、斜線の棒）で４週間、経鼻投与を受けたマウス（ＣＬ５７ＢＬ／６）由来の脾細胞の増殖性応答を示す棒グラフである。
【図７】指示された濃度のＡＴ１００２（配列番号１）で刺激したヒト単球のＦＡＣＳ解析の結果を示す。１８時間後、細胞を回収し、指示されたモノクローナル抗体で染色し、ＦＡＣＳで解析した。
【図８】指示された濃度のＡＴ１００２（配列番号１）で刺激したヒトマクロファージのＦＡＣＳ解析の結果を示す。１８時間後、細胞を回収し、指示されたモノクローナル抗体で染色し、ＦＡＣＳで解析した。
【図１】
2008526985.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
2008526985000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年12月19日(2007.12.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008526985000001.app
【国際調査報告】
2008526985.tif 000020
2008526985.tif 000021