(57)【要約】  本発明は、水性培地中で実質的に可溶性である硫化水素を製造するための、デスルフォハロビアシアエ又はデスルフォナトロナム科の少なくとも１つの種ファミリー、あるいはリボソームＰＡＲＮ１６Ｓをコードする遺伝子がデスルフォハロビアシアエ科又はデスルフォナトロナム属のいずれか１つの種の相当する遺伝子に９７％以上の相同性を有する種から選択されるアルカリ親和性の硫酸還元細菌の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性培地中で主として可溶性の形態の硫化水素を製造するための、デスルフォハロビアシアエ科の種、又はデスルフォナトロナム属の種、又はリボソームＲＮＡ１６Ｓをコードする遺伝子がデスルフォハロビアシアエ科又はデスルフォナトロナム属のいずれか１つの種の相当する遺伝子に少なくとも９７％の相同性を示す種の少なくとも１つから選択されるアルカリ親和性の硫酸塩還元細菌又はチオ硫酸塩還元細菌の使用。
【請求項２】
約ｐＨ９以上、特に約ｐＨ９．５以上、特に約ｐＨ１０以上における、請求項１に記載のアルカリ親和性の硫酸塩還元細菌又はチオ硫酸塩還元細菌の使用。
【請求項３】
電子供与体として提供する有機化合物、特にホルメートの存在下、及び電子受容体として提供する硫黄化合物、特にチオサルフェートの存在下での培養形式における、請求項１又は２に記載のアルカリ親和性の硫酸塩還元細菌又はチオ硫酸塩還元細菌の使用。
【請求項４】
水性培地中で主として可溶性の形態の硫化水素の製造方法であって、
硫化水素の形成を引き起こす、電子供与体として提供する有機化合物、特にホルメートの存在下、及び電子受容体として提供する硫黄化合物、特にチオサルフェートの存在下での、デスルフォハロビアシアエ科の種、又はデスルフォナトロナム属の種、又はリボソームＲＮＡ１６Ｓをコードする遺伝子がデスルフォハロビアシアエ科又はデスルフォナトロナム属のいずれか１つの種の相当する遺伝子に少なくとも９７％の相同性を示す種の少なくとも１つから選択されるアルカリ親和性の硫酸塩還元細菌又はチオ硫酸塩還元細菌を培養する段階、を含む前記方法。
【請求項５】
約ｐＨ９以上、特には約ｐＨ９．５以上、特には約ｐＨ１０以上でアルカリ親和性の硫酸塩還元細菌又はチオ硫酸塩還元細菌の培養を行う、請求項４に記載の硫化水素の製造方法。
【請求項６】
前記細菌が硫化水素への耐性を有し、前記耐性は細菌が少なくとも２０ｍＭを超える硫化水素濃度に耐性であることを特徴とする、請求項４又は５に記載の硫化水素の製造方法。
【請求項７】
前記細菌がデスルフォナトロナム・ラクストレ種に属する、請求項４〜６のいずれか一項に記載の硫化水素の製造方法。
【請求項８】
前記細菌がデスルフォナトロノビブリオヒドロゲネボラン種に属する、請求項４〜６のいずれか一項に記載の硫化水素の製造方法。
【請求項９】
前記培養が細菌を増殖するのに適した支持体で行われ、バイオフィルムの形成を引き起こす、請求項４〜８のいずれか一項に記載の硫化水素の製造方法。
【請求項１０】
硫化水素の製造方法であって、連続する下記の２つの段階、
前記細菌の増殖及び硫化水素の同時の製造に適した条件下で細菌の培養を行う第１段階、及び
前記細菌の増殖がない場合における、硫化水素の製造に適する条件下で細菌の培養を行う第２段階を含み、
必要により、１つのサイクルを構成する前記段階の連続を数回繰り返すことが可能である、請求項４〜９のいずれか一項に記載の前記方法。
【請求項１１】
細菌の培養培地のｐＨの変化をもたらす１種又は数種の酸性又は塩基性の化学物質の添加によって、特に一方の段階から他方の段階への移行が行われる、請求項１０に記載の硫化水素の製造方法。
【請求項１２】
前記第１段階は約９から約１０の範囲のｐＨで行われ、前記第２段階は約１０を超えるｐＨで行われる、請求項１０又は１１に記載の硫化水素の製造方法。
【請求項１３】
１０ｍＭ以上の濃度、特に２０ｍＭ以上の濃度、特に３０ｍＭ以上の濃度で硫化水素を製造する、請求項４〜１２のいずれか一項に記載の硫化水素の製造方法。
【請求項１４】
前記細菌がデスルフォナトロナム・ラクストレ種に属し、電子供与体として提供する有機化合物がホルメートであり、電子受容体として提供する硫黄化合物がチオサルフェートであり、細菌がバイオフィルム上で継続的に培養され、ｐＨが約１０を超える、請求項４〜１２のいずれか一項に記載の硫化水素の製造方法
【請求項１５】
１種以上の溶解された金属を含む排水の汚染除去方法であって、
電子供与体として提供する有機化合物、特にホルメートの存在下、及び電子受容体として提供する硫黄化合物、特にチオサルフェートの存在下で、デスルフォハロビアシアエ科の種、又はデスルフォナトロナム属の種、又はリボソームＲＮＡ１６Ｓをコードする遺伝子がデスルフォハロビアシアエ科又はデスルフォナトロナム属のいずれか１つの種の相当する遺伝子に少なくとも９７％の相同性を示す種の少なくとも１つから選択されるアルカリ親和性の硫酸塩還元細菌又はチオ硫酸塩還元細菌の培養を用いる、水性培地中で主として可溶性の形態である硫化水素の製造の段階、及び
前記段階で得られた硫化水素と前記排水を接触させ、前記溶解された金属の減少及び／又は金属硫化物の形態で前記溶解された金属の沈殿を引き起こし、前記接触が約２から約１２の範囲のｐＨで行われる段階、
を含む、前記方法。
【請求項１６】
前記硫化水素を製造する段階が、請求項４〜１４のいずれか一項に記載の方法により行われる、請求項１５に記載の１種以上の溶解された金属を含む排水の汚染除去方法。
【請求項１７】
排水を硫化水素と接触する段階が中性又は塩基性ｐＨで行われる、請求項１５又は１６に記載の１種以上の溶解された金属を含む排水の汚染除去方法。
【請求項１８】
硫化水素の製造及び排水と硫化水素との接触を別のタンク、特にそれぞれ培養タンク及び反応タンクで行い、前記方法は硫化水素製造段階及び排水と硫化水素との接触段階との間に中間段階を含み、前記中間段階が培養タンクで製造されたすべて又は一部の硫化水素を反応タンクへ注入することにある、請求項１６又は１７に記載の１種以上の溶解された金属を含む排水の汚染除去方法。
【請求項１９】
排水のフラクションを培養タンクに注入しない、請求項１８に記載の１種以上の溶解された金属を含む排水の汚染除去方法。
【請求項２０】
排水のフラクションを培養タンクに注入する、請求項１８に記載の１種以上の溶解された金属を含む排水の汚染除去方法
【請求項２１】
気相が無い場合、ガス状の硫化水素の放出がされない方式において、反応タンク中で排水と硫化水素とを接触する段階を行う、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の１種以上の溶解された金属を含む排水の汚染除去方法。
【請求項２２】
培養タンクで製造された硫化水素の濃度の測定、
汚染除去される排水中に溶解した前記金属又は種々の金属の濃度の見積り、及び
前記測定及び前記見積りに基づいて、反応タンクに注入しなければならない硫化水素を含む溶液の量の調整、
の追加の段階を含む、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の１種以上の溶解された金属を含む排水の汚染除去方法。
【請求項２３】
前記金属又は前記汚染排水中に溶解した複数の金属が、銅、亜鉛、ヒ素、カドミウム、クロム（特に、六価のクロム）、スズ、マンガン、水銀、ニッケル及び鉛から選択される、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の１種以上の溶解された金属を含む排水の汚染除去方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、硫化水素の製造方法及びその使用、特に、重金属を含む排水の汚染除去方法に関する。
重金属は、人間及び環境に対して毒性が高い可能性がある。これらの重金属は生分解性ではない。故に、それらは自然に蓄積する。従って、ますます限定的な排出基準が金属を排出する産業活動に課されてきている。
産業排水に含まれる重金属を分離するために最も一般的に用いられる方法は、金属水酸化物の形成を利用することである。しかし、これらの方法が、排水中に溶解している金属の許容レベルに関する現在の環境基準をいつも満足するわけではない。
【０００２】
すでに使用されている別の技術は、金属硫化物の形成を含む。これは、高価な合成多硫化物の使用又は硫化ナトリウムへの塩酸の作用によるガス状の硫化水素の形成を必要とする。
ガス状の硫化水素の製造を更に必要とする、この処理方法の生物学的代替案が過去に提案されている。これらの生物学的代替案は、硫化水素の形成を引き起こすことが可能である生物学的メカニズムの２つの主なタイプに基づいている。
（１）同化型硫酸塩還元は、多数の細菌、真菌及び植物が硫黄をこれら生物の細胞内に存在するアミノ酸（システイン、メチオニン及びシスチン）、ビタミン（チアミン及びビオチン）及び他の硫黄分子（例えば、フェレドキシン）に取り込むことを可能にする同化作用である。この還元は、決して硫化水素の製造を直接には引き起こさない。それにもかかわらず、後者はタンパク性有機物を発酵している間に間接的に放出される。
（２）異化型硫酸塩還元は、硫酸塩還元菌により行われる。この嫌気呼吸プロセスにおいて、水素の酸化中又は還元型有機化合物、例えばアセテート及びプロピオネートの酸化中に、硫酸塩は最終電子受容体として使用される。この代謝中に基質は、ほとんどの場合アセテートに部分的に酸化されるか、場合によっては完全に酸化されＣＯ２が形成される。
【０００３】
多くの特許又は特許出願は、鉱山排水又は廃水等の排水を汚染除去するために、金属硫化物として金属イオンを沈殿するための硫酸塩還元菌の使用に関する。
従って、国際公開第８０／０２２８１号パンフレット及び米国特許第４，５２２，７２３号明細書は、排水中の重金属のレベルを減少するためのデスルフォビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）又はデスルフォトマクラム（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ）型細菌の使用に関する。米国特許第４，１０８，７２２号明細書は、汚染されている地下水のリザーバへのビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）及びデスルフォビブリオ細菌の注入を想定する。より詳細には、米国特許第５，０６２，９５６号明細書は、六価クロムの処理に関する。米国特許第５，５８７，０７９号明細書、国際公開第９７／２９０５５号パンフレット及び国際公開第０２／０６５４０号パンフレットの３つは、例えば最初に銅、次に亜鉛等を沈殿させるために、ｐＨ（主に、２．５〜６．５）を変化させることにより、沈殿が連続して行われるという顕著な特徴を有する、金属の生物学的沈殿のための別の方法を提供する。炭素の唯一のソースとしてメタノールを使用することが可能であるメチロトローフ細菌の使用を開示する国際公開第９７／０５２３７号パンフレットもまた引用することがある。種々の株の細菌の共培養のシステムが、例えば米国特許第４，７８９，４７８号明細書又は欧州特許第０６９２４５８号明細書において想定されていることにも注意しなければならない。
【０００４】
引用された前記方法の不利な点は、相当な量のガス状の硫化水素（Ｈ２Ｓ）がこれらの方法中に産生されることがあるという事実に存在している。これは特に汚染除去すべき排水中に最初に溶解している金属の最大沈殿物を得ることが望まれる場合であり、この場合過剰な硫化水素の使用を必要とする。現在、ガス状の硫化水素は、環境に対して毒性があり、腐食性があり、有害であり、適切な追加の抑制処理を必要とする。
この不利な点を回避する１つの方法は、ガス状の硫化水素の代わりに、（ＨＳ−状の）溶解している硫化水素を製造することにある。これを行うためには、硫化物を硫酸塩還元菌により産生される培養液のｐＨが可能な限り高い（塩基性）ことが望ましい。現在、硫酸塩還元菌の大部分において、高いｐＨの使用が硫化物の製造収率に悪影響を及ぼし、更に培養物に致死的となることさえある。
【０００５】
本発明の１つの観点は、硫酸塩還元細菌又はチオ硫酸塩還元細菌を用いて、良好な収率で、実質上可溶な硫化水素を製造することである。
本発明の他の観点の１つは、ある種の硫酸塩還元菌のための、特に、それらのチオ硫酸塩還元特性を使用することを可能にする新しい培養条件を提案することである。
本発明の他の１つの観点は、硫酸塩還元細菌又はチオ硫酸塩還元細菌の培養により製造される硫化水素を用いて、重金属を含む排水を汚染除去するための方法を提供することである。
更に、本発明の別の観点は、重金属を含む排水を汚染除去するための硫化水素を製造し、一方、ガス状の硫化水素の望ましくない存在を避けることである。
こうした種々の観点は、金属を含む排水を汚染除去するための硫化水素又はフォーティオリ（ｆｏｒｔｉｏｒｉ）を製造するために、今まで使用されていない、ある種の最近発見されたアルカリ親和性の硫酸塩還元菌（ｓｕｌｐｈａｔｅ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ）を使用することにより得られる。
【０００６】
従って、本発明は、水性培地中で主として可溶性の形態の硫化水素を製造するための、デスルフォハロビアシアエ（Ｄｅｓｕｌｆｏｈａｌｏｂｉａｃｅａｅ）科の種、又はデスルフォナトロナム（Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ）属の種、又はリボソームＲＮＡ１６Ｓをコードする遺伝子がデスルフォハロビアシアエ科又はデスルフォナトロナム属のいずれか１つの種の相当する遺伝子に少なくとも９７％の相同性を示す種の少なくとも１つから選択されるアルカリ親和性の硫酸塩還元細菌又はチオ硫酸塩還元細菌の使用に関する。
【０００７】
「アルカリ親和性の細菌（ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ）」は、生存、増殖、種々の代謝及び酵素活性が好ましくは塩基性ｐＨで起こる細菌を意味する。
本発明で使用される細菌の分類学的、形態学的及び生理学的記載は下記の文献に示されている。
-Pikutaら,Desulfonatronum lacustre gen.nov.sp.nov.:a new alkaliphilic sulphate-reducing bacterium utilizing ethanol;Microbiology 67,105;
-Zhilinaら,Desulfonatronovibrio hydrogenovorans gen.nov.sp.nov.,an alkaliphilic,sulphate-reducing bacterium;Int.J.Syst.Bacteriol.Jan.1997,p.144;
-Pikutaら,Desulfonatronum thiodismutans sp. nov.,a novel alkaliphilic,sulphate-reducing bacterium capable of lithoautotrophic growth;Int.J.Syst.Evol.Microbiol.53,1327
【０００８】
「相同性（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」は、２つの核酸配列の間の同一性の割合を意味する。例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２５：３３８９，１９９７）で定義されたアルゴリズムを使用して前記配列を並べるための探求により、又はＴｈｏｍｐｓｏｎら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２：４６７３，１９９４）で記載された当業者で周知の例えばｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗを使用することにより、この相同性を測定することは可能である。
「主として可溶性の形態」は、製造された可溶性硫化水素と製造されたガス状の硫化水素の比が１より大きい、特に１００より大きいことを意味する。
以下に詳細に述べるように、本発明による硫酸塩還元菌を培養する条件に関し、新規な基質、すなわちホルメート（ｆｏｒｍａｔｅ）及びチオサルフェートが、好ましくは使用される。ホルメートはエネルギー源として働き、一方チオサルフェートは電子受容体及び硫黄のソースとして働く。従って、本発明で使用される細菌の株は硫酸塩還元のみならず、チオ硫酸塩還元である。基質としてチオサルフェートを利用するある種の硫酸塩還元菌のこの特性は、金属を汚染除去するための前記方法で使用されていない。
【０００９】
本発明の条件下におけるアルカリ親和性の硫酸塩還元細菌又はチオ硫酸塩還元細菌の使用によって、極めて主として可溶性の形態であり、そして例外的に高収率の硫化水素を製造することを可能にする。
本発明の別の明確な利点は、任意の滅菌を行わずに純粋培養で操作することの提供の可能であり、費用をかなり抑えることを可能にすることである。実際、使用されている特定の培養条件（高ｐＨ、ミネラル含有量、Ｏ２が無い、高濃度の硫化水素等）は、強い淘汰圧を保証する。
有利なことには、本発明のアルカリ親和性の硫酸塩還元細菌又はチオ硫酸塩還元細菌の使用は、ｐＨ９以上、特にｐＨ９．５以上、特にｐＨ１０以上で行われる。
【００１０】
実際、ガス状である本発明により製造された硫化水素の比率（すなわち、製造されるガス状の硫化水素と製造される溶解している硫化水素の比）は、硫化水素が製造されるｐＨに依存する。酸性のｐＨでは、硫化水素の主な形態はガス状である。ｐＨ７では、ＨＳ−イオンとほぼ同じ量のＨ２Ｓ分子である。ｐＨ９では、ガス状硫化水素の比率はわずか約１／１００である。ｐＨ９．５では、ガス状硫化水素の比率はわずか約１／５００である。ｐＨ１０では、ガス状硫化水素の比率はわずか約１／１０００である。
本発明の別の有利な実施態様によれば、アルカリ親和性の硫酸塩還元細菌又はチオ硫酸塩還元細菌の使用は、電子供与体として提供する有機化合物、特にホルメートの存在下、及び電子受容体として提供する硫黄化合物、特にチオサルフェートの存在下での培養の形態で行われる。
【００１１】
しかし、利用された細菌の菌株に応じて、他の基質を硫化物の製造に使うことができる（例えば、電子受容体としてサルフェート、サルファイト又は硫黄、電子供与体としてエタノール又は二水素）という点に注目することは重要である。
しかし、本発明において、硫黄化合物の還元を介して硫化水素の製造が行われるであろう。この硫黄化合物がチオサルフェート（Ｓ２Ｏ３２-）である場合は、使用される酵素還元メカニズムは、特にチオ硫酸スルフルトランスフェラーゼ（又は、ロダネーゼ）及びチオ硫酸レダクターゼに基づくものを含む。
第１のケースでは、チオサルフェート還元反応の結果はチオサルフェートによるチオール基の酸化と同じであり、スルホニルの部分をサルファイトに還元する。
Ｓ２Ｏ３２-＋２ＲＳ-＋Ｈ＋→ＳＯ３２-＋Ｒ−ＳＳ−Ｒ＋ＨＳ-
第２のケースでは、チオサルフェートはサルファイト及び硫化物に開裂され、その後、最終結果としてこのサルファイトは硫化物に還元される。
Ｓ２Ｏ３２-＋４Ｈ２→２ＨＳ-＋３Ｈ２Ｏ
【００１２】
更に、本発明の目的は、水性培地中で主として可溶性の形態の硫化水素を製造する方法であって、
硫化水素の形成を引き起こす、電子供与体として提供する有機化合物、特にホルメートの存在下、及び電子受容体として提供する硫黄化合物、特にチオサルフェートの存在下での、デスルフォハロビアシアエ科の種、又はデスルフォナトロナム属の種、又はリボソームＲＮＡ１６Ｓをコードする遺伝子がデスルフォハロビアシアエ科又はデスルフォナトロナム属のいずれか１つの種の相当する遺伝子に少なくとも９７％の相同性を示す種の少なくとも１つから選択されるアルカリ親和性の硫酸塩還元細菌又はチオ硫酸塩還元細菌を培養する段階、
を含む。
【００１３】
例えば、発酵の業界、パイロットスケール及び工業スケールを問わず入手することのできる標準の反応装置で、細菌培養段階を行うことができる。
有利なことには、本発明による硫化水素の製造方法では、約ｐＨ９以上、特には約ｐＨ９．５以上、特には約ｐＨ１０以上でアルカリ親和性の硫酸塩還元細菌又はチオ硫酸塩還元細菌の培養を行う。
必要に応じて、ｐＨを酸性及び／又は塩基性物質の添加により測定及び調整することができる。
【００１４】
本発明による硫化水素の製造方法の好ましい実施態様によれば、硫化水素への耐性を示すように細菌を選択し、前記耐性は細菌が少なくとも２０ｍＭを超える硫化水素濃度に耐性であることを特徴とする。
「耐性（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）」は、細菌の生存及び正常の代謝活性の維持を意味しており、エネルギー源の消費により観察することができる。
この培養物中の細菌の良好な耐性によって、高濃度の硫化水素を含む溶液を得ることが可能となる。
【００１５】
有利には、本発明による硫化水素の製造方法で使用される細菌は、デスルフォナトロナム・ラクストレ（Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ  ｌａｃｕｓｔｒｅ）種に属する。
有利なことには、本発明による硫化水素の製造方法で使用される細菌は、デスルフォナトロノビブリオ・ヒドロゲネボラン（Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｏｖｉｂｒｉｏ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｅｖｏｒａｎｓ）種に属する。
本発明の有利な実施態様によれば、硫化水素の製造方法で使用される培養は細菌の増殖に適した支持体で行われ、バイオフィルムの形成を引き起こす。
「バイオフィルム」は、溶液中の細菌の単純な懸濁液の代わりに、例えばポゾレーン（ｐｏｚｚｏｌａｎｅ）、クロイソニル（Ｃｌｏｉｓｏｎｙｌ：商標）、バイオネット（Ｂｉｏ−Ｎｅｔ：商標）、又はセシル（Ｓｅｓｓｉｌ：商標）の適切な支持体に選択的に固定化された細菌を意味する。バイオフィルムでの培養によって、高濃度の細菌細胞を局所的に得ること及び硫化水素をより早く製造することが可能である。更に、懸濁液中に細菌がほとんどいないので、細菌細胞は硫化水素を含む培養溶液を取り出している間に反応装置からほとんど取り除かれない。
【００１６】
本発明による硫化水素の製造方法の好ましい実施態様によれば、これは以下の連続する２つの段階、前記細菌の増殖及び硫化水素の同時の製造に適した条件下で細菌の培養を行う第１段階、及び前記細菌の増殖がない場合での、硫化水素の製造に適する条件下で細菌の培養を行う第２段階を含み、必要により、１つのサイクルを構成する前記段階の連続を数回繰り返すことが可能である。
「前記細菌の増殖」は、特に細胞分裂によるそれらの増殖を意味する。
「前記細菌の増殖がない場合における硫化水素の製造」は、一方では、
増殖（すなわち、細菌の増殖）の実質的な阻止又は著しい減速、他方では、これら細菌の生存又は少なくとも培地中での硫化水素の形成を引き起こす細菌源の酵素活性の維持を意味する。
【００１７】
好ましくは、細菌の培養培地のｐＨの変化を引き起こす１種又は数種の酸性又は塩基性の化学物質の添加によって、特に一方の段階から他方の段階への移行が行われる。
特に好ましくは、前記第１段階は約９から約１０の範囲のｐＨで行われ、前記第２段階は約１０を超えるｐＨで行われる。
実際、本発明で使用される細菌は、特に極めてアルカリのｐＨ、すなわち特に１０を超えるｐＨでそれらの硫化水素生産活動を維持することが可能である。従って、初期期間は約９〜約１０の最適な培養ｐＨとし、細菌の最大限可能な数を得て、そして次の第２期間に約１０を超えるｐＨとし、硫化水素を製造することを続けて、本発明の細菌を培養することには有利であるが、これは製造されたガス状の硫化水素と製造された硫化水素の比が可能な限り低い、特に１／１００より小さいような培地の化学的条件下である。
【００１８】
本発明の好ましい実施態様によれば、１０ｍＭ以上の濃度、特に２０ｍＭ以上の濃度、特に３０ｍＭ以上の濃度、４０ｍＭ以上の濃度で、硫化水素を製造する。
本発明により達成することができる標準的な硫化水素の製造比速度は、少なくとも２．９ｍｍｏｌＨＳ−ｇ−１ｈｒ−１であり、５ｍｍｏｌＨＳ−ｇ−１ｈｒ−１まで変動することができる。
本発明の別の好ましい実施態様によれば、硫化水素は、デスルフォナトロナム・ラクストレ種に属する細菌、電子供与体として提供する有機化合物であるホルメート、及び電子受容体として提供する硫黄化合物であるチオサルフェートの培養により製造され、細菌は約１０を超えるｐＨでバイオフィルムにおいて継続的に培養される。
【００１９】
また、本発明の目的は、１種以上の溶解している金属を含む排水の汚染除去方法であって、
電子供与体として提供する有機化合物、特にホルメートの存在下、及び電子受容体として提供する硫黄化合物、特にチオサルフェートの存在下で、デスルフォハロビアシアエ科の種、又はデスルフォナトロナム属の種、又はリボソームＲＮＡ１６Ｓをコードする遺伝子がデスルフォハロビアシアエ科又はデスルフォナトロナム属のいずれか１つの種の相当する遺伝子に少なくとも９７％の相同性を示す種の少なくとも１つから選択されるアルカリ親和性の硫酸塩還元細菌又はチオ硫酸塩還元細菌の培養を用いる、水性培地中において主として可溶性の形態の硫化水素製造段階、及び
前記段階で得られた硫化水素と前記排水を接触させ、前記溶解された金属の減少及び／又は金属硫化物の形態で前記溶解された金属の沈殿を引き起こし、前記接触が約２から約１２の範囲のｐＨで行われる段階を含む。
【００２０】
「１種以上の溶解している金属を含む排水の汚染除去」は、排水中に溶解している１種以上の金属の濃度の顕著な減少、特に排水の種々の環境基準により課されている許容限界値未満の減少を意味する。
フランスの法律により現在課されている、液体排水中の金属濃度の許容限界値は、例えば、銅は０．５ｍｇ／Ｌ；亜鉛は０．５〜２ｍｇ／Ｌ；ヒ素は０．０５〜０．５ｍｇ／Ｌ；カドミウムは０．０５〜０．２ｍｇ／Ｌ；六価クロムは０．１ｍｇ／Ｌ；スズは０．５〜２ｍｇ／Ｌ；水銀は０．０３〜０．０５ｍｇ／Ｌ；ニッケルは０．５〜２ｍｇ／Ｌ、及び鉛は０．１〜０．５ｍｇ／Ｌである。許容限界値は関係する事業に応じて変化する可能性があり、条例は前記値よりも１００倍まで低い許容限界値を地域的に設定することがあることに注意しなければならない。
【００２１】
現在、クロムの特別な場合を除いて、ほとんどすべての金属を硫化水素の作用により金属硫化物として沈殿することができ、金属水酸化物の形態よりも金属硫化物の形態で低い溶解度を示す。
実際、種々のｐＨで、金属水酸化物及び硫化物について観測される最小溶解度は、以下の通りである。
硫化ヒ素５．２×１０-２ｍｇ／Ｌ（水酸化ヒ素の形成なし）；
硫化カドミウム６．７×１０-１０ｍｇ／Ｌに対し、水酸化カドミウム２．３×１０-５ｍｇ／Ｌ；
硫化銅１．０×１０-８ｍｇ／Ｌに対し、水酸化銅２．２×１０-２ｍｇ／Ｌ；
硫化スズ３．８×１０-８ｍｇ／Ｌに対し、水酸化スズ１．１×１０-４ｍｇ／Ｌ；
硫化マンガン２．１×１０-３ｍｇ／Ｌに対し、水酸化マンガン１．２ｍｇ／Ｌ；
硫化水銀９．０×１０-２０ｍｇ／Ｌに対し、水酸化水銀３．９×１０-４ｍｇ／Ｌ；
硫化ニッケル６．９×１０-８ｍｇ／Ｌに対し、水酸化ニッケル６．９×１０-３ｍｇ／Ｌ；
硫化鉛３．８×１０-９ｍｇ／Ｌに対し、水酸化鉛２．１ｍｇ／Ｌ；及び
硫化亜鉛２．３×１０-７ｍｇ／Ｌに対し、水酸化亜鉛１．１ｍｇ／Ｌ；
六価形状のクロムの特殊な場合では、硫化物の形態の沈殿は可能ではないが、他方硫化水素はＣｒ６＋イオンをＣｒ３＋イオンに還元することを可能にし(Kimら.2001,Chromium VI reduction by hydrogen sulfide in aqueous media:stoichiometry and kinetics. Environ.Sci.Technol.35(11):2219-2225)、特に水酸化物の形態で、ほとんど毒性および可溶性はない。
【００２２】
更に、金属水酸化物の溶解度は、一般的に特定の最適ｐＨ値について最小であるが、金属硫化物の溶解度は典型的には完全にｐＨの減少関数であり、これにより単に硫化物の溶解度の観点から、できるだけ塩基性のｐＨで作用することはいつも有利である。
従って、以上のことをまとめると、本発明による排水の汚染除去は、以下の水酸化物の形態で簡単なろ過を利用するのと比べて特に有利であり、
水銀は、水酸化物として不溶性とすることができず、硫化物としての不溶化は排出の許容可能値を観察することを可能にさせる；
六価クロムは、硫化水素により三価クロムにあらかじめ還元することなしに、水酸化物として効率的に沈殿することはできない；
マンガン、亜鉛及び鉛は、硫化物としての沈殿は排出の許容可能値を観察することを可能にし、水酸化物としてのそれらの沈殿と異なっている。
【００２３】
本発明により処置することができる排水としては、例えば、化学工業、化学関連工業、石油産業、特に塗料及び顔料生産工業からの排水、鉱物産業、特にガラス工業（鉛を高排出）、エンジニアリング及び表面処理部門からの排水、製鉄及び冶金部門（特に、ヒ素、六価のクロム、鉛及びマンガン排出）からの排水、及び廃棄物処理部門からの排水である。
【００２４】
本発明による１種以上の溶解している金属を含む排水の汚染除去方法では、硫化水素製造段階を前記のいずれかのやり方で行うことができる。
前記１種以上の溶解している金属を含む排水の汚染除去方法の好ましい実施態様によれば、排水を硫化水素と接触する段階は、中性又は塩基性ｐＨで行われる。
本実施態様は、接触段階の間にいずれかのガス状硫化水素の放出を最小限にすることを可能にし、低いｐＨよりも高いｐＨで可溶しない、金属硫化物のより完全な沈殿を可能にする。
【００２５】
有利なことには、前記１種以上の溶解している金属を含む排水の汚染除去方法では、硫化水素の製造及び排水と硫化水素との接触を別のタンク、特にそれぞれ培養タンク及び反応タンクで行い、前記方法は硫化水素製造段階と排水と硫化水素との接触段階との間に中間段階を含み、前記中間段階は培養タンクで製造されたすべて又は一部の硫化水素を反応タンクへ注入することにある。
汚染除去の段階（すなわち、反応タンクでの汚染排水と製造されたすべて又は一部の硫化水素との接触）において、又は前記段階の後で、不溶化金属硫化物の凝集を引き起こすためにＦｅＣｌ３等の凝固剤を添加し、その後必要に応じて、沈殿後の沈殿物を分離するために排水を層状デカンターに通すことができる。
【００２６】
本発明による１種以上の溶解している金属を含む排水の汚染除去の特定の実施態様によれば、排水のフラクションを培養タンクに注入する。
この実施態様は、排水の「接触を含む」又は「部分接触を含む」製造として記載することができる。細菌を排水と接触して培養する際に、排水が細菌により硫化水素を製造する能力を顕著に減少しないような排水の組成物の場合に、この実施態様は経済的利点を示すことができる。
【００２７】
本発明による１種以上の溶解している金属を含む排水を汚染除去する別の特定の好ましい実施態様によれば、排水のフラクションを培養タンクに注入しない。
この実施態様を、排水「と平行の」製造として記載することができる。硫化水素を製造する細菌は汚染排水と接触しないので、特に有利である。現在、培養培地中の溶解している金属の存在に対する細菌のより良い、又はより悪い抵抗性に依存している細菌の硫化水素を製造する能力を、前記の接触は予想が困難な割合で低下させることができるからである。
【００２８】
有利なことには、本発明による１種以上の溶解している金属を含む排水を汚染除去する方法は、気相がない場合に反応タンク中で排水と硫化水素とを接触する段階を行うようなものであり、これによりガス状の硫化水素の放出はない。
「気相のない場合」は、空気又はいずれか他の気体との任意の接触が無いことを意味する。確立された用語によれば、この接触は、従って「あふれている培地（ｆｌｏｏｄｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）」中で行われる。この特性は、溶解している硫化水素とガス状の硫化水素の化学平衡が後者に片寄っている場合に、ガス状の硫化水素の放出が気相の存在下で予想され、そして更に、反応タンクのｐＨを塩基性だけでなく中性又は酸性とすることができるために、有利になっている。
【００２９】
本発明による汚染除去方法の他の前記引用された実施態様において、気相の存在下の場合に、接触段階の間に放出されることが可能であるガス状の硫化水素の濃度は、好ましくは５ｍｇ／ｍ３未満である。
培養タンクに関しては、これは気相を含むことができる。その場合には、この気相中に存在することが可能であるガス状の硫化水素は、培地中に導入される酸化化合物を還元するために役立つ可能性がある。気体が加圧の場合、ガス状の硫化水素を苛性ソーダ（ＮａＯＨ）で洗浄することにより中和することができる。いかなる場合でも、培養タンクで放出されるガス状の硫化水素の濃度は、好ましくは５ｍｇ／ｍ３未満である。
【００３０】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記一種以上の溶解している金属を含む排水の汚染除去方法は、
培養タンクで製造された硫化水素の濃度の測定、
汚染除去すべき排水中に溶解された異なる金属又は前記金属の濃度の見積り、
前記測定及び前記見積りに基づいて、反応タンクに注入しなければならない硫化水素を含む溶液の量の調整、の追加の段階を含む。
換言すれば、この実施態様によれば、本発明の方法の単純で迅速な適応により、種々の用途に本発明による排水の汚染除去を使用することが可能であり、すなわち、溶解された金属の濃度に関して、多様な特性を有する排水を汚染除去することが可能である。実際、硫化水素の十分な大量製造に利用することができ、その後排水と接触させるために、硫化水素の量を汚染除去すべき排水の性質に適応することを十分満足させる。
【００３１】
金属又は本発明を用いて処理することができる汚染排水中に溶解されている金属の非限定的な例としては、銅、亜鉛、ヒ素、カドミウム、クロム（特に、六価のクロム）、スズ、マンガン、水銀、ニッケル及び鉛を挙げることができる。
再生利用の目的で、場合により選択できる、本発明による方法で得られた金属含有沈殿物の回収が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１ａ】種々の培養条件下でのデスルフォナトロナム・ラクストレの培養物の増殖を示す図である。ｘ軸は時間（単位は時間）を示す。Ｙ軸は５８０ｎｍでの吸光度測定値を示す。図１ａに関して、培養条件の構成は、下記のように変化する：Ｆ＝ホルメートの存在；Ｅ＝エタノールの存在；Ｓ＝サルフェートの存在；Ｔ＝チオサルフェートの存在；ＹＥ＝酵母エキスの存在。下記の方式で、種々の一組の条件を両方の図において表す。記号×：Ｅ及びＴ；記号○：Ｅ及びＳ；記号＋：Ｅ、Ｔ及びＹＥ；記号□：Ｅ、Ｓ及びＹＥ；太い実線：Ｆ及びＴ；破線：Ｆ及びＳ；点線：Ｆ、Ｔ及びＹＥ；細い実線：Ｆ、Ｓ及びＹＥ。
【図１ｂ】種々の培養条件下でのデスルフォナトロナム・ラクストレを培養している間の溶解硫化水素の製造を示す図である。ｘ軸は時間（単位は時間）を示す。ｙ軸はＨＳ−濃度（単位はｍＭ）を示す。図１ｂに関して、培養条件の構成は、下記のように変化する：Ｆ＝ホルメートの存在；Ｅ＝エタノールの存在；Ｓ＝サルフェートの存在；Ｔ＝チオサルフェートの存在；ＹＥ＝酵母エキスの存在。下記の方式で、種々の一組の条件を両方の図において表す。記号×：Ｅ及びＴ；記号○：Ｅ及びＳ；記号＋：Ｅ、Ｔ及びＹＥ；記号□：Ｅ、Ｓ及びＹＥ；太い実線：Ｆ及びＴ；破線：Ｆ及びＳ；点線：Ｆ、Ｔ及びＹＥ；細い実線：Ｆ、Ｓ及びＹＥ。
【００３３】
【図２ａ】デスルフォナトロナム・ラクストレを「バッチ」型反応器中でｐＨ９．５で培養した結果を示す図である。硫化水素濃度の変化を点線で表す。ホルメート濃度の変化は○記号を含む実線により表し、５８０ｎｍ（細菌濃度を表す）での光学密度の変化は□記号を含む実線により表す。ｘ軸は時間（単位は時間）に相当する。左側のｙ軸は（硫化水素及びホルメートに関する）濃度（単位はｍＭ）に相当する。右側のｙ軸は５８０ｎｍでのＯＤに相当する。
【００３４】
【図２ｂ】デスルフォナトロナム・ラクストレを「バッチ」型反応器中でｐＨ１０で培養した結果を示す図である。硫化水素濃度の変化を点線で示す。ホルメート濃度の変化は○記号を含む実線により示す、５８０ｎｍ（細菌濃度を表す）での光学密度の変化は□記号を含む実線により示す。ｘ軸は時間（単位は時間）に相当する。左側のｙ軸は（硫化水素及びホルメートに関する）濃度（単位はｍＭ）に相当する。右側のｙ軸は５８０ｎｍでのＯＤに相当する。ｔ＝９２時間で、濃縮培地の注入を行う（以下の対応実施例を参照）。
【００３５】
【図３】本発明による重金属の沈殿実験の結果を示す図である。写真Ａは溶解された鉛を実質上含んでいる産業廃水１５０ｍｌのサンプルを表す。写真Ｂは、５０ｍＭを超える硫化水素を含むデスルフォナトロナム・ラクストレの６０日間の培地後に得られる培養培地５ｍｌの注入直後の同一サンプルを表す。硫化鉛の黒い粒子が見える。
【実験】
【００３６】
［細菌株及び培地］
２つの細菌株をここで研究する：デスルフォナトロナム・ラクストレ（ｐＨ：９．５）及びデスルフォナトロノビブリオ・ヒドロゲネボラン（ｐＨ：９．５）。両方の株を３７℃で培養する。試験されるエネルギー源（電子供与体）はエタノール及びホルメートであり、試験された電子受容体はサルフェート及びチオサルフェートである。株は下記の実施例において詳細に記載する。株の選択はハンゲイト（Ｈｕｎｇａｔｅ）チューブ中で５ｍｌ培養物を使用して行う。
培地の組成（ＭＬＦと称する）は、以下の通りである（単位はｇ／Ｌ）：
ＮＨ４Ｃｌ                            １
Ｋ２ＨＰＯ４                          ０．３
ＫＨ２ＰＯ４                          ０．３
ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ                  ０．１
ＫＣｌ                                ０．１
ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ                  ０．１
システイン                            ０．５
Ｎａ２Ｓ                              ０．０４％
ウィデル（Ｗｉｄｄｅｌ）微量元素      １ｍＬ
酵母エキス                            ０．１
後者の接種直前に、下記で定義される、硫化ナトリウム、エネルギー源、電子受容体及びバッファーを培地に添加する。硫化水素によって、培地の酸化還元電位を著しく減少する可能性があり、従って、絶対嫌気性細菌の増殖に適した条件を作り出す。
ｐＨ９．５で行われる培養用のバッファーは１．６％Ｎａ２ＣＯ３．である。
【００３７】
［発酵装置］
２０Ｌ容量の「バッチ」型反応器（ＣＨＥＭＡＰ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で懸濁液中の選択された株の培養により、硫化水素製造試験を行った。
発酵槽（反応器）に隣接する制御ボックス中で、ｐＨ、温度及び攪拌速度を制御する。ｐＨは、培養培地中に浸されているｐＨプローブを用いて繰り返し調整する。規定点より低いｐＨ値を検出する場合、蠕動ポンプを用いて、苛性ソーダ又は炭酸塩溶液の容量を発酵槽に注入する。
装置の金属体を介してサーモスタット水の循環により、発酵槽の温度（３７℃）を調整する。
マリンタイププロペラにより、攪拌（１５回転／分）を行う。
ボール流量計により、窒素の供給を調整する。入ってくる窒素流量により、及び１Ｎ苛性ソーダ溶液中のガス出力の浸漬により、発酵槽中のわずかな過圧を維持する。この苛性ソーダ溶液によっても、発酵中に放出することがあるＨ２Ｓのガス流出を中和することが可能である。
【００３８】
反応槽の底に位置するタップによって、発酵中のサンプルを取ることが可能である。
これを開始するには、最初にＭＬＦ培養培地及びチオサルフェートの１０リットルを含む反応器を蒸気で殺菌し、その後、窒素流の下で冷却する。そして、ホルメート及び指数増殖期の終わりの培養物２リットルの種菌を注入する。その後、無菌の脱炭素化された炭酸塩４０ｍＭの添加によりｐＨを調整する。
その後、培養物に添加された化合物（苛性ソーダ、炭酸塩、培養ＭＬＦ培地）は滅菌しないか、又はあらかじめ脱気する。
【００３９】
［増殖のモニター］
分光光度計を用いて、５８０ｎｍの波長で培養物の光学的密度の測定により細菌の増殖をモニターする。あらかじめ行った実験によって、サーモトガ・エルフィー（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｅｌｆｉｉ）細菌（チオ硫酸塩還元菌）の細胞濃度（乾燥重量ｇ／リットル）と５８０ｎｍでの光学的密度（０．８を超えない）との直線関係（［細胞］＝０．７３×ＯＤ５８０ｎｍ）を確立することが可能である。従って、この方法をここで他の細菌に応用する。デスルフォナトロナム・ラクストレの培養物中の沈殿物の存在は、光学的密度の測定の前にこれらの必要な無機化を強いる。１Ｍ過硫酸４００μＬを細菌培養物４ｍＬに添加することにより、この無機化を行う。攪拌後、５８０ｎｍで光学的密度の読み取り前に混合物は２分間保持される。
【００４０】
コードルウィシュ法（ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｃｏｒｄ  Ｒｕｗｉｓｈ）（Cord Ruwish R.,J.Microbiol.Methods.4:33-36,1985）によって、溶解された硫化物の用量決定を行う。培養培地０．１ｍＬをサンプリング後、ボルテックスにより、これを５ｍＭＣｕＳＯ４、５０ｍＭＨＣｌの４ｍＬと素早く混合する。４８０ｎｍでの吸収を測定し、あらかじめ記録している標準曲線と比較することにより、こうして形成されたボルドーレッド色の硫化銅を滴定する。
培養培地のｐＨ１２への以前の塩基性化により、全硫化物の用量決定を行う。これが前記で滴定された、硫化物すべての溶解に帰着する。
【００４１】
［チオサルフェートの比色分析］
Ｎｏｒ＆Ｔａｂａｔａｂａｉにより記載された方法（Nor Y.M§ and Tabatabai M.A.,Anal.Lett.8:537-547,1975)によって、チオサルフェートの用量決定を行う。サンプル１ｍＬを０．１ＭＫＣＮ１ｍｌと混合する。
Ｓ２Ｏ３２-→ＳＯ３２-＋ＣＮＳ-
１５分後、０．３３ＭＣｕＣｌ２２ｍＬを添加し、その後Ｆｅ（ＮＯ３）３−ＨＮＯ３１ｍＬを添加する。
ＣＮＳ-＋Ｆｅ３＋→Ｆｅ−ＣＮＳ
混合物を浸透水で２５ｍＬに調整し、攪拌後、２分間待ち、４６０ｎｍでの鉄−チオシアネート錯体の吸収を測定し、あらかじめ記録している標準曲線と比較することにより、サンプルに存在する硫黄の量を決定する。
【００４２】
［サルフェートの量］
Ｔａｂａｔａｂａｉの方法（Tabatabai M.A.,Sulfur Institut Journal 10:11-13,1974）によって、サルフェートを滴定する。サンプル１ｍＬを無菌状態で取り出し、その後、硫化物を取り除くために、エッペンドルフチューブ中の２５０ｍＬの１ＮＨＣｌで酸性化する。細胞を遠心分離（１４０００ｒｐｍ、３分間）により取り除き、上清０．５ｍＬを蒸留水４．５ｍＬで取り上げる。ＢａＣｌ２（１％重量／用量）−ゼラチン（０．３％重量／用量）２５０μＬの添加によって、硫酸バリウムの形態でサルフェートを沈殿することは可能である。３０分間置いた後、混合物をボルテックスでホモジナイズし、４２０ｎｍでの吸収を測定する。
蒸留水５ｍＬ及びＢａＣｌ２−ゼラチン溶液２５０μＬで、下記と同じプロトコールにより標準化を行う。
前記プロトコールを応用し、サルフェート標準（１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ及び２０ｍＭＮａ２ＳＯ４）に基づいてキャリブレーションを行う。
【００４３】
［砂糖、有機酸及びアルコールの量］
ＲＩＤ  ６Ａ示差屈折計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）の検出を備えたＯＲＨ８０１カラム（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、可溶性代謝産物の用量の分離を行う。溶出液は、フィルター（０．６５μｍミリポア）処理した０．００５ＮＨ２ＳＯ４溶液である。
注入前に、サンプルを遠心分離する（１３００回転／分×１５分間）。
【００４４】
［ガスの量］
細菌代謝のガス状製造物の用量決定を気相クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により行う。クロマトグラフ（Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ  ＣＰ９０００）は、連続して装着された２つのカラム（Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ  ＧＣ及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｅｖｅ  ５Ａ）を備えている。カサロメータを使用する熱伝導率により、検出を実行する。キャリアガスは２バールのヘリウムであり、検出器のフィラメント電流は７０ｍＡである。サンプルの圧力をミニメルト（Ｍｉｎｉｍｅｒｔ：商標）型のバルブを備えたシリンジを使用して、ガス圧入（０．１ｍＬ）を行う。
【実施例】
【００４５】
［デスルフォナトロナム・ラクストレの種類］
これは、硫酸塩又はチオ硫酸塩還元、アルカリ親和性、塩耐性及び化学合成無機栄養菌である
形態：ビブリオ、０．７−０．９×２−３μｍ、分離、ペア又はスパイラルチェーン、極鞭毛を用いて移動、グラム陰性、二分裂により増殖、寒天コロニー：レンズ状、直径０．５−２ｍｍ、黄色っぽい、その後茶色、半透明、ホールエッジ
代謝：非発酵性
電子受容体：サルフェート、サルファイト、チオサルフェート
チオサルフェートの硫化物＋サルフェートへの不均化
電子供与体：Ｈ２−ＣＯ２、ホルメート、エタノール→アセテート
アセテート、プロピオネート、ブチレート、ピルベート、ラクテート、マレート、フマレート、スクシネート、メタノール、グリセロール、コリン、ベタイン、カザミノ酸、酵母エキス、グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース又はラムノースでは増殖しない
スピロシアエタ・アルカリカ（Spirochaeta alcalica）又はデスルフォナトロノビブリオ・ヒドロゲノボラン（Desulfonatronovibrio hydrogenovorans）で栄養共生
シトクロムＣ有り、デスルフォビリジン（desulphoviridine）無し
酵母エキス又はアセテートにより促進される増殖
生理機能：最適温度＝３７−４０℃（２０−４５℃）
最適ｐＨ＝９．５（８−１０）
最適ＮａＣｌ＝０％重量／用量（０−１０％重量／用量）
ナトリウムイオン及びカーボネートに依存
ＤＮＡ：５７．３ｍｏｌ％  Ｇ＋Ｃ
ＲＮＡ１６Ｓ配列：Ｙ１４５９４
代表株Ｚ−７９５１（ＤＳＭ  １０３１２）
起源：カディン（Ｋｈａｄｙｎ）湖からの堆積物
文献：Pikuta EV、Zhilina TN、Zavarzin GA、Kostrikina NA、Osipov GA、Rainey FA (1998)Desulfonatronum lacustre gen.nov.、sp.nov.、a new alkaliphilic sulphate-reducing bacterium utilizing ethanol.Microbiology(Engl.Tr.Mikrobiologiya)67、123-131
【００４６】
［デスルフォナトロノビブリオ・ヒドロゲネボランの種類］
硫酸塩又はチオ硫酸塩還元、アルカリ親和性、弱好塩菌
形態：ビブリオ、０．５×１．５−２μｍ、１極毛、糸状付属肢、分離又はペア又は短連鎖、グラム陰性
代謝：無機従属栄養性
電子受容体：サルフェート、サルファイト、チオサルフェート
電子供与体：Ｈ２＋ＣＯ２、ホルメート
炭素源：酵母エキス又はビタミンを含むアセテート
増殖を伴わないジメチル・スルホキシドの硫化物の形成
硫黄により阻害される増殖
サルフェート及びサルファイトへのチオサルフェートの不均化
デスルフォビリジン（desulphoviridine）無し
生理機能：アルカリ性弱好塩性
最適温度：３７℃（１５−４３℃）
最適ｐＨ：９．５−９．７（８−１０．２）
最適ＮａＣｌ：３％（１−１２％）
最適ｔ１／２＝２６．５時間（サルフェート）、２０．１時間（チオサルフェート）
Ｎａ＋に依存
ＤＮＡ：４８．６ｍｏｌ％Ｇ＋Ｃ（Ｔｍ）
ＲＮＡ１６Ｓ配列：Ｘ９９２３４
代表株：Ｚ−７９３５Ｔ（ＤＳＭ９２９２Ｔ）
起源：アルカリ性の湖の堆積物（赤道にあるＭａｇａｄｉ湖）
文献：Zhilina TN, Zavarzin GA, Rainey FA, Pikuta EN, Osipov GA, Kostrikina NA (1997) Desulfonatronovibrio hydrogenovorans gen. nov., sp. nov., an alkaliphilic, sulphate-reducing bacterium. Int. J. Syst. Bacteriol. 47, 144-149
【００４７】
［デスルフォナトロナム・ラクストレにより硫化水素を製造する最適培養条件の決定］
時間の関数として、細菌の濃度に直接関係する、時間の経過につれての光学密度の測定値を示す図１ａ及び時間の関数として、溶解された硫化水素の濃度の測定値を示す図１ｂについてここで言及する。
異なる培養条件を試験する。
Ｆ：ホルメートあり；Ｅ：エタノールあり；Ｓ：サルフェートあり；Ｔ：チオサルフェートあり；ＹＥ：酵母エキスあり（Ｐａｎｒｅａｃ、スペイン）
実験は二回行った。図１ａ及び図１ｂは、５８０ｎｍでのＯＤの測定値から導き出される結果及び異なる培養物に関する硫化水素量を示す。
これら結果の考察を以下に示す。
ホルメートの使用によって、エタノールの使用より、高濃度の硫化水素を得ることが可能である。
チオサルフェートが存在する培養物によって、サルフェートが存在する場合よりも高濃度の硫化水素を得ることが可能である。
培養培地の酵母エキスの添加によって、添加をしないで得られたものと有意に異なる結果を得ることが可能である。この理由としては、酵母エキスが細菌の接種に微量に存在するからである。
デスルフォナトロナム・ラクストレは、高濃度（約２２ｍＭ）の硫化水素を製造するホルメートの酸化によりチオサルフェートを還元する。
硫化水素の製造速度は０．１２２ｍＭ／時間である。
【００４８】
従って、デスルフォナトロナム・ラクストレは、硫化水素を製造するのに適しており、以下の
高濃度の硫化水素を製造する能力、
硫化水素の製造速度、
硫化水素のより大きい溶解性及び培養物中の株を維持する淘汰圧を可能にするため、実験の継続のために保持された。高いｐＨ値は外因性汚染問題を解消する。
【００４９】
［「バッチ」反応器でのデスルフォナトロナム・ラクストレによる硫化水素の製造］
１．増殖のための炭酸塩の重要性
バッチ反応器でのデスルフォナトロナム・ラクストレの第１培養物の実施態様によって、この株の炭酸塩への依存性を確認することが可能である。実際、培養培地中の炭酸ナトリウムがない場合、細菌の増殖は１週間観察されなかった。１６．６ｇ／ｌ未満の濃度の炭酸ナトリウムの添加では、いずれも増殖することができない。炭酸塩が気相のＣＯ２濃度を介するホルメートの解離平衡に関与すると仮定されている。
【００５０】
２．ｐＨ９．５での増殖及び製造
指数増殖期の終わりの２リットルの培養物からなる接種材料を培地１０リットルに接種することにより、まず最初に、デスルフォナトロナム・ラクストレの培養を行った。エネルギー源は、ホルメート（７４ｍＭ）であり、最終電子受容体はチオサルフェート（２０ｍＭ）である。ｐＨ９．５への調整は、炭酸ナトリウムで最初に行う。その後、４Ｎ苛性ソーダ溶液の注入により、ｐＨを調整する。実験結果を図２ａに示す。
デスルフォナトロナム・ラクストレの増殖は、典型的なＳ字状曲線に従う。潜伏期（ｔ＜５０時間）後、細菌は指数増殖期に入り（５０時間＜ｔ＜２００時間）、その後遅滞期が現れる（ｔ＞２００時間）。定常期は、ｔ＝２００時間から観察される。ホルメートはリアルタイムでモニターされ、その濃度が０ｍＭに達した後、ｐＨ９．５での第２シリーズの実験の間、エネルギー源は補充される。
培養物の光学密度は非常に低く、ホルメートの添加でわずかに増加するのみである。増殖制限は実施中であると思われる。実験条件下で、デスルフォナトロナム・ラクストレの世代時間は、ｐＨ９．５で７１．４５時間である。この値は硫酸塩還元菌でさえも顕著である。比較すると、同じ実験条件（培地、ホルメート、チオサルフェート、酵母エキス、温度、ｐＨ）下であるが、ハンゲイトチューブ（５ｍＬ培地）中で培養している間のデスルフォナトロナム・ラクストレの世代時間は、８４．５２時間である。従って、攪拌及びｐＨの連続調整を維持している発酵槽及び液体体積／気体体積の比がより高い発酵槽中での培養によって、この細菌の世代時間を減少する可能性があるように思われる。
【００５１】
ホルメートの消費量の観測結果は、これは細菌の増殖と相互に関係していることを示す。低い初期の潜伏期の間、ホルメートの消費量は指数増殖期において増加し、その後定常期においてゆっくりとなる。しかし、ホルメートの消費量が維持され、これは定常状態での細菌による硫化水素製造活動維持の観察と一致していることに注意されたい。
ホルメートの消費量と硫化水素の製造量との相関により、実験条件下で１モルの硫化水素の形成は、ｐＨ９．５で、２．８３モルのホルメートの酸化を必要とすると推定される。
【００５２】
反応器内部でのバイオマスの確立及びエネルギー源の消耗後、５８０ｎｍでの培養物の光学密度とバイオマスとの相関関係が証明される。従って、ＯＤ５８０ｎｍ０．４６５に関して、６７．６ｍｇ／Ｌの乾燥重量が決定される。バイオマス＝ｆｔ（ＯＤ５８０ｎｍ）の関係が直線形であると仮定すると、以下の式となる。
バイオマス（ｍｇ／Ｌ）＝１４５．３７×ＯＤ５８０ｎｍ
硫化水素の製造比速度を決定することが可能であった。実験条件下における、ｐＨ９．５での硫化水素の製造比速度は、３．３１８ｍｍｏｌ、ＨＳ−ｇ−１ｈｒ−１である。
【００５３】
３．ｐＨ１０での増殖及び製造
次に、濃縮培養培地の反応器への添加及びｐＨについての規定値の変化により、ｐＨ１０で、デスルフォナトロナム・ラクストレの増殖を行った。この実験結果を図２ｂに示す。ｔ＝９２時間で、著しく減少するエネルギー源の濃度を補充するために、濃縮培養培地１リットル（標準培地８リットルと同じ）の添加により、培養培地をエンリッチした。この添加は、硫化水素濃度の減少及びＯＤ５８０ｎｍの減少を引き起こす。
デスルフォナトロナム・ラクストレの増殖が、ｐＨ１０で維持されることを観察することができる。これは、エネルギー源、ホルメートの酸化と更に相関関係がある。しかし、ｐＨ９．５の２倍を超える遅さである。実際、実験条件下でのデスルフォナトロナム・ラクストレの世代時間はｐＨ１０で１４１．４５時間である。
硫化水素の濃度が３２ｍＭの値を達成することができることに注意されたい。高い濃度の硫化物は、デスルフォナトロナム・ラクストレの増殖速度の減少の原因となることが可能である。しかし、この株は、培養培地中で生じる硫化水素の濃度を考慮すると、硫化物に対して非常に耐性であると考えることができる。
【００５４】
ホルメート消費量と硫化水素製造量との相関関係により、培養培地のｐＨ１０の値への増加は硫化水素形成のエネルギー収量を変化させないとわれわれは推論する。実際、ｐＨ９．５及びｐＨ１０での値は、ほぼ同一である：硫化水素１モルの形成において、ｐＨ１０で、ホルメート２．６６モルの酸化を必要とする。
しかし、硫化水素製造の比速度は、ｐＨ９．５〜１０の変化と共にわずかに（１１％）減少する。実験条件下での、ｐＨ１０での、硫化水素製造の比速度は２．９７４±０．６３５ｍｍｏｌ、ＨＳ−ｇ−１ｈｒ−１である。
ｐＨ９．５〜ｐＨ１０の変化に伴うデスルフォナトロナム・ラクストレの活性のこの減少は、ｐＨ９．５〜ｐＨ１０の変化に伴うこの株のサルファィドジェニック（ｓｕｌｐｈｉｄｏｇｅｎｉｃ）活性の５０％の減少を観測したピクタ（Ｐｉｋｕｔａ）らの結果と一致していない。
【００５５】
ｐＨ１０で行われた培養の間、反応器に添加された培地は、殺菌も脱気もされていない。増殖制限条件（高ｐＨ、無機培地、高濃度の硫化物）下でデスルフォナトロナム・ラクストレのみで、それ自体を維持することができることを、顕微鏡検査によって確認することが可能である。更に、反応器中における高濃度の硫化物によって、その中に完全に酸素が無い状態を維持することが可能であり、それは高濃度の硫化水素の維持により示される。
【００５６】
［培養培地の最適化］
標準培養培地ＭＬＦ由来の異なる培養培地におけるハンゲイトチューブで培養を行った。培養シリーズに応じて、システイン、硫化ナトリウム、アセテート、酵母エキス又は微量元素を省いた。富栄養ＭＬＦ培地上の前培養物から、デスルフォナトロナム・ラクストレの第１接種を行った。その後、第２（ｔ＝１０日）及び第３（ｔ＝２０日）サブカルチャーについて、同じ型の培地上であらかじめ行われた培養物により、接種材料を提供した。これら一連のサブカルチャーによって、希釈の効果を介して所望の化合物が無いことを確実にさせる。
ＭＬＦ培地中に、デスルフォナトロナム・ラクストレ増殖に有利な低い酸化還元電位の安定を有利にすることを可能にさせる還元剤として、システイン及び硫化ナトリウムを添加する。細菌株にすぐに利用できる炭素の補足源を提供するためにアセテートを添加し、これは増殖を開始することを可能にする。酵母エキスは、従属栄養性株についてのアミノ酸源及び無機増殖因子源であり、Ｗｉｄｄｅｌ微量元素の溶液は細菌代謝に関与することがある多くの金属を提供する。
【００５７】
異なる代替培養培地の第３サブカルチャーから得られた結果を下記の表１に示す。これらの結果の比較から、１〜３番目に最も低い増殖及び最も低い１〜３番目に最も低い硫化水素製造レベルは、酵母エキスがない場合と相関関係がある（培地Ｂ、Ｄ及びＩ）。
低濃度の酵母エキス（０．１ｇ／Ｌ）は、この株によるデスルフォナトロナム・ラクストレの良好な増殖及び高濃度の硫化水素にとって不可欠であることが明らかである。より少ない程度に、Ｗｉｄｄｅｌ微量元素溶液の除外によって、デスルフォナトロナム・ラクストレによる硫化水素の製造を制限することが明らかである。硫酸塩還元菌中の硫酸塩呼吸に関与する、酵素のヘム中の金属の存在により、これら微量元素の役割を説明することができる。工業品質の製品中に生じる不純物及び研究室で使用される「分析」品質の製品において発見されない不純物により、これら元素を供給することができる。
【表１】
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【００５８】
［硫化水素による銅の沈殿］
溶解された硫化水素の用量決定は、硫酸銅への硫化水素の作用により形成されるボルドーレッド色の硫化銅の吸光度を測定することにより行う。この量に関与する反応は、排水中に溶解された金属を分離するための硫化水素の能力を例示するのに利用した。
硫化水素及び溶解された銅を攪拌により混合すると、硫化銅をすぐに形成する。従って、硫化銅はすぐに肉眼で見える沈殿物を形成した。混合物を５分間置いた場合、大部分の沈殿が試験管の底で見られる。
ＦｅＣｌ３等の凝固剤の添加により、すべての銅を沈殿することが可能である。硫酸塩還元細菌又はチオ硫酸塩還元細菌の培養物に存在する硫化水素の使用により硫化物の形態の金属の沈殿物が確認されている。
【００５９】
［工業排水の汚染除去］
ボークリューズの中央にある会社Ｘにより提供される実際の工業廃水に含まれる重金属の沈殿及び蓄積する製造物の活性との関連で転換する鉛を含む排水汚染と向かい合っている実際の工業廃水に含まれる重金属の沈殿を行う。
ＭＬＦ培地２リットル中で、２ヶ月を超えて、３７℃でデスルフォナトロナム・ラクストレを培養する。培養の最初のｐＨは９．５である。利用されるエネルギー源はホルメートであり、硫黄源はチオサルフェートである。
汚染された排水を現在処理作業中の川上で取り出す。
【００６０】
硫化水素の濃度の測定を最初に行う。培養培地を１／４に希釈後、測定値は４×１２．９＝５１．６ｍＭの濃度を示す。培養培地における、この硫化水素の例外的な濃度は、特に長い培養時間（６０日を超える）のためである。
培地の最終ｐＨの分析値は、８．８を示す。カーボネートバッファーの存在にもかかわらず９．５から８．８へのｐＨの減少は、デスルフォナトロナム・ラクストレを培養している間の大量の酸の発生を裏づけている。
培養培地中の５０ｍＭを超える硫化水素の濃度は、デスルフォナトロナム・ラクストレが特に高い濃度の硫化物に耐性能力があることを示す。
【００６１】
硫化水素５１．６ｍＭを含む培養培地５ｍｌをシリンジを用いて取り出し、汚染された排水１５０ｍｌに注入する。注入前の排水を図３の写真Ａに示し、注入直後の排水を図３の写真Ｂに示す。
排水への硫化水素の注入後に、特有の光沢のある黒色により特定される、硫化鉛の粒子が現れ、すぐに沈殿する。
従って、デスルフォナトロナム・ラクストレの代謝により製造された硫化水素を含む培養培地の注入によって、鉛の沈殿及び工業排水からの鉛の分離を行うことが瞬時に可能である。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【国際調査報告】
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