(57)【要約】BH3-オンリータンパク質を模倣する構造的に拘束されたペプチド、ならびに抗体および他の細胞標的化化合物に対するそれらの結合、これらの複合体を含む組成物、ならびに細胞死の調節におけるそれらの使用を開示する。構造的に拘束されたペプチドは、生存促進性Bcl-2タンパク質に結合してこれを中和し得る。抗体および他の細胞標的化化合物に結合した構造的に拘束されたペプチドを調製する工程、ならびに細胞死の脱調節に関連する疾患または状態の治療および/または予防におけるこれらの複合体の使用もまた開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つの細胞標的化部分、および少なくとも1つの構造的に拘束されたペプチド部分またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを含む複合体であって、構造的に拘束されたペプチド部分が、アミノ酸配列(I)を含む複合体：
2008504239.tif 000066
式中、Haa1、Haa2、Haa3、およびHaa4はそれぞれ独立して疎水性側鎖を有するアミノ酸残基であるか、またはnおよびmがいずれも1である場合は、Haa1、Haa2、およびHaa4の1つはXaa1でもよく；
Saaはそれぞれ小さな側鎖を有するアミノ酸残基であり；
Naaは負に荷電した側鎖を有するアミノ酸残基であり；
Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、およびXaa5はそれぞれ独立してアミノ酸残基、Zaa1またはZaa2であり；
Rは、H、N末端キャッピング基、N末端キャッピング基でキャッピングされていてもよいオリゴペプチドであるか、または構造的に拘束されたペプチド部分と細胞標的化部分との間の連結を表し；
R'は、H、C末端キャッピング基、C末端キャッピング基でキャッピングされていてもよいオリゴペプチドであるか、または構造的に拘束されたペプチド部分と細胞標的化部分との間の連結を表し；かつ
mおよびnは0または1であるが、ただしmおよびnの少なくとも一方は1であり；
構造的拘束は、配列中の2つのアミノ酸残基、Zaa1およびZaa2を係留するリンカー(L)によって提供され、かつ細胞標的化部分と構造的に拘束されたペプチド部分またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグは、R、R'、またはアミノ酸配列(I)中の官能性アミノ酸側鎖を介して結合している。
【請求項２】
アミノ酸配列(I)中、Haa1、Haa2、Haa3、およびHaa4のすべてが疎水性側鎖を有するアミノ酸残基である、請求項1記載の複合体。
【請求項３】
アミノ酸配列(I)中、Haa1、Haa2、Haa3、およびHaa4が、L-フェニルアラニン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-バリン、L-メチオニン、およびL-チロシンから独立して選択される、請求項1記載の複合体。
【請求項４】
アミノ酸配列(I)中、Haa2がL-ロイシンである、請求項1記載の複合体。
【請求項５】
アミノ酸配列(I)中、Saaがそれぞれ、グリシン、L-アラニン、L-セリン、L-システイン、およびアミノイソ酪酸から独立して選択される、請求項1記載の複合体。
【請求項６】
アミノ酸配列(I)中、NaaがL-アスパラギン酸またはLグルタミン酸残基である、請求項1記載の複合体。
【請求項７】
アミノ酸配列(I)中、Rが、N末端キャッピング基、Xaa1から選択される1〜10アミノ酸残基を有しN末端キャッピング基でキャッピングされていてもよいオリゴペプチドであるか、または構造的に拘束されたペプチド部分と細胞標的化部分との連結を表す、請求項1記載の複合体。
【請求項８】
RがアシルおよびN-コハク酸から選択されるN末端キャッピング基である、請求項7記載の複合体。
【請求項９】
アミノ酸配列(I)中、R'が、C末端キャッピング基、Xaa1から選択される1〜10アミノ酸残基を有しC末端キャッピング基でキャッピングされていてもよいオリゴペプチドであるか、または構造的に拘束されたペプチド部分と細胞標的化部分との連結を表す、請求項1記載の複合体。
【請求項１０】
C末端キャッピング基がNH2である、請求項9記載の複合体。
【請求項１１】
アミノ酸配列(I)中、Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、およびXaa5が、L-アラニン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-システイン、L-グルタミン、L-グルタミン酸、L-グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、およびL-バリンから独立して選択される、請求項1記載の複合体。
【請求項１２】
アミノ酸配列(I)中、リンカー(L)がi(i+7)の関係にある2つの非隣接アミノ酸を係留し、このリンカーの第1の末端は第1位にある第1のアミノ酸残基(Zaa1)に付着し、かつこのリンカーのもう一方の末端は、Zaa1の7アミノ酸後に位置する第2のアミノ酸残基(Zaa2)に付着する、請求項1記載の複合体。
【請求項１３】
Lが4〜8原子長である、請求項1記載の複合体。
【請求項１４】
アミノ酸配列(I)中、Zaa1が配列のN末端にあるHaa1の前に位置し、かつZaa2がHaa2とHaa3との間に位置する、請求項12記載の複合体。
【請求項１５】
アミノ酸配列(I)中、Zaa1がHaa1とHaa2との間に位置し、かつZaa2がHaa3とHaa4との間に位置する、請求項1記載の複合体。
【請求項１６】
アミノ酸配列(I)中、Zaa1がHaa2とHaa3のとの間に位置し、かつZaa2がアミノ酸配列のC末端にあるHaa4の後に位置する、請求項1記載の複合体。
【請求項１７】
アミノ酸配列(I)中、Zaa1およびZaa2が、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、L-リジン、L-オルニチン、D-アスパラギン酸、D-グルタミン酸、D-リジン、D-オルニチン、L-β-ホモアスパラギン酸、L-β-ホモグルタミン酸、L-β-ホモリジン、L-α-メチルアスパラギン酸、L-α-メチルグルタミン酸、L-α-メチルリジン、L-α-メチルオルニチン、D-α-メチルアスパラギン酸、D-α-メチルグルタミン酸、D-α-メチルリジン、およびL-α-メチルオルニチンから独立して選択される、請求項1記載の複合体。
【請求項１８】
アミノ酸配列(I)中、Zaa1およびZaa2が、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、L-リジン、およびL-オルニチンから独立して選択される、請求項17記載の複合体。
【請求項１９】
アミノ酸配列(I)中、Zaa1およびZaa2が、L-アスパラギン酸およびL-グルタミン酸から独立して選択される、請求項18記載の複合体。
【請求項２０】
アミノ酸配列(I)中、Zaa1およびZaa2がカルボン酸を含む側鎖を有し、かつリンカー(L)が、-NH(CH2)4NH-、-NH(CH2)5NH-、-NH(CH2)6NH-、-NH(CH2)7NH-、-NH(CH2)2O(CH2)2NH-、-NH(CH2)2N+H2(CH2)2NH-、-NH(CH2)2S(CH2)2NH-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)2NH-、-NH(CH2)2NHC(=O)CH2NH-、-NH(CH2)2SS(CH2)2-NH-、-NH(CH2)2O(CH2)3NH-、-NH(CH2)2N+H2(CH2)3NH-、-NH(CH2)2S(CH2)3NH-、-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)2NH-、-NH(CH2)2NHC(=O)(CH2)2NH-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)3NH-、-NH(CH2)3NHC(=O)CH2NH-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)4NH-、-NH(CH2)4NHC(=O)CH2NH-、-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)3NH-、-NH(CH2)3NHC(=O)(CH2)2NH-、-NH(CH2)3C(=O)NH(CH2)2NH-、および-NH(CH2)2NHC(=O)(CH2)3NH-からなる群より選択される、請求項1記載の複合体。
【請求項２１】
リンカーが、-NH(CH2)5NH-、-NH(CH2)6NH-、-NH(CH2)7NH-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)2NH-、-NH(CH2)2NHC(=O)CH2NH-、-NH(CH2)2O(CH2)3NH-、および-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)2NH-からなる群より選択される、請求項20記載の複合体。
【請求項２２】
リンカーが、-NH(CH2)5NH-および-NHCH2C(=O)NH(CH2)2NH-からなる群より選択される、請求項20記載の複合体。
【請求項２３】
アミノ酸配列(I)中、Zaa1およびZaa2がアミノ基を含む側鎖を有し、かつリンカーが、-C(=O)(CH2)4C(=O)-、-C(=O)(CH2)5C(=O)-、-C(=O)(CH2)6C(=O)-、-C(=O)(CH2)7C(=O)-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)N+H2(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)S(CH2)2C(=O)-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)2NHC(=O)CH2C(=O)-、-C(=O)(CH2)2SS(CH2)2-C(=O)-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)3C(=O)-、-C(=O)(CH2)2N+H2(CH2)3C(=O)-、-C(=O)(CH2)2S(CH2)3C(=O)-、-C(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)2NHC(=O)(CH2)2C(=O)-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)3C(=O)-、-C(=O)(CH2)3NHC(=O)CH2C(=O)-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)4C(=O)-、-C(=O)(CH2)4NHC(=O)CH2C(=O)-、-C(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)3C(=O)-、-C(=O)(CH2)3NHC(=O)(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)3C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、および-C(=O)(CH2)2NHC(=O)(CH2)3C(=O)-からなる群より選択される、請求項1記載の複合体。
【請求項２４】
リンカーが、-C(=O)(CH2)5C(=O)-、-C(=O)(CH2)6C(=O)-、-C(=O)(CH2)7C(=O)-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)2NHC(=O)CH2C(=O)-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)3C(=O)-、および-C(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-からなる群より選択される、請求項23記載の複合体。
【請求項２５】
リンカーが、-C(=O)(CH2)5C(=O)-および-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-からなる群より選択される、請求項23記載の複合体。
【請求項２６】
アミノ酸配列(I)中、Zaa1がアミノ基を含む側鎖を有し、Zaa2がカルボン酸を含む側鎖を有し、かつリンカーが、-C(=O)(CH2)4NH-、-C(=O)(CH2)5NH-、-C(=O)(CH2)6NH-、-C(=O)(CH2)7NH-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)N+H2(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)S(CH2)2NH-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)2NHC(=O)CH2NH-、-C(=O)(CH2)2SS(CH2)2-NH-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)3NH-、-C(=O)(CH2)2N+H2(CH2)3NH-、-C(=O)(CH2)2S(CH2)3NH-、-C(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)2NHC(=O)(CH2)2NH-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)3NH-、-C(=O)(CH2)3NHC(=O)CH2NH-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)4NH-、-C(=O)(CH2)4NHC(=O)CH2NH-、-C(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)3NH-、-C(=O)(CH2)3NHC(=O)(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)3C(=O)NH(CH2)2NH-、および-C(=O)(CH2)2NHC(=O)(CH2)3NH-から選択される、請求項1記載の複合体。
【請求項２７】
リンカーが、-C(=O)(CH2)5NH-、-C(=O)(CH2)6NH-、-C(=O)(CH2)7NH-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)2NHC(=O)CH2NH-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)3NH-、および-C(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)2NH-からなる群より選択される、請求項26記載の複合体。
【請求項２８】
リンカーが、-C(=O)(CH2)5NH-および-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)2NH-からなる群より選択される、請求項26記載の複合体。
【請求項２９】
アミノ酸配列(I)中、Zaa1がカルボン酸を含む側鎖を有し、Zaa2がアミノ基を含む側鎖を有し、かつリンカーが、-NH(CH2)4C(=O)-、-NH(CH2)5C(=O)-、-NH(CH2)6C(=O)-、-NH(CH2)7C(=O)-、-NH(CH2)2O(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)N+H2(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)S(CH2)2C(=O)-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)2NHC(=O)CH2C(=O)-、-NH(CH2)2SS(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)2O(CH2)3C(=O)-、-NH(CH2)2N+H2(CH2)3C(=O)-、-NH(CH2)2S(CH2)3C(=O)-、-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)2NHC(=O)(CH2)2C(=O)-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)3C(=O)-、-NH(CH2)3NHC(=O)CH2C(=O)-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)4C(=O)-、-NH(CH2)4NHC(=O)CH2C(=O)-、-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)3C(=O)-、-NH(CH2)3NHC(=O)(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)3C(=O)NH(CH2)2C(=O)-からなる群より選択される、請求項1記載の複合体。
【請求項３０】
リンカーが、-NH(CH2)5C(=O)-、-NH(CH2)6C(=O)-、-NH(CH2)7C(=O)-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)2NHC(=O)CH2C(=O)-、-NH(CH2)2O(CH2)3C(=O)-、および-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-からなる群より選択される、請求項29記載の複合体。
【請求項３１】
リンカーが、-NH(CH2)5C(=O)-および-NHCH2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-からなる群より選択される、請求項29記載の複合体。
【請求項３２】
構造的に拘束されたペプチド部分またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグが、以下の式(II)〜(VI)のいずれか1つまたはこれらの薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグから選択される、請求項1記載の複合体：
2008504239.tif 000067
式中、Haa1、Haa2、Haa3、Haa4、Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa5、Saa、Naa、およびLは式(I)について上記で定義した通りであり、mは0または1であり、R1およびR1'は式(I)中のRおよびR'について上記で定義した通りであり、Zaa1-L-Zaa2はリンカーLによって架橋された側鎖を有する2つのアミノ酸残基を表し、かつ細胞標的化部分は、R1、R1'を介してまたはペプチド内の官能性アミノ酸側鎖を介してペプチド部分に結合される；
2008504239.tif 000068
式中、Haa1、Haa2、Haa3、Haa4、Xaa1、Xaa2、Xaa4、Xaa5、Saa、Naa、およびLは式(I)について上記で定義した通りであり、Xaa6はXaa1について上記で定義したアミノ酸残基であり；mは0または1であり、R2およびR2'は式(I)中のRおよびR'について上記で定義した通りであり、Zaa1-L-Zaa2はリンカーLによって架橋された側鎖を有する2つのアミノ酸残基を表し、かつ細胞標的化部分は、R2、R2'を介してまたはペプチド内の官能性アミノ酸側鎖を介してペプチド部分に結合される；
2008504239.tif 000069
式中、Haa1、Haa2、Haa3、Haa4、Xaa1、Xaa3、Xaa4、Saa、Naa、およびLは式(I)について上記で定義した通りであり、pは0または1であり、R3およびR3'は式(I)中のRおよびR'について上記で定義した通りであり、Zaa1-L-Zaa2はリンカーLによって架橋された側鎖を有する2つのアミノ酸残基を表し、かつ細胞標的化部分は、R3、R3'を介してまたはペプチド内の官能性アミノ酸側鎖を介してペプチド部分に結合される；
2008504239.tif 000070
式中、Haa1、Haa2、Haa3、Haa4、Xaa1、Xaa2、Xaa4、Xaa5、Saa、Naa、およびLは式(I)において上記で定義した通りであり、nは0または1であり、R4およびR4'は式(I)中のRおよびR'について上記で定義した通りであり、Zaa1-L-Zaa2はリンカーLによって架橋された側鎖を有する2つのアミノ酸残基を表し、かつ細胞標的化部分は、R4、R4'を介してまたはペプチド内の官能性アミノ酸側鎖を介してペプチド部分に結合される；ならびに
2008504239.tif 000071
式中、Haa1、Haa2、Haa3、Haa4、Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa5、Saa、Naa、およびLは式(I)について上記で定義した通りであり、Xaa6はXaa1について上記で定義したアミノ酸残基であり；nは0または1であり、R5およびR5'は式(I)中のRおよびR'について上記で定義した通りであり、Zaa1-L-Zaa2はリンカーLによって架橋された側鎖を有する2つのアミノ酸残基を表し、かつ細胞標的化部分は、R5、R5'を介してまたはペプチド内の官能性アミノ酸側鎖を介してペプチド部分に結合される。
【請求項３３】
以下の構造式(VII)を有する構造的に拘束されたペプチド部分またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを含む、請求項32記載の複合体：
2008504239.tif 000072
式中、Zaa1、Haa2、Xaa3、Xaa4、Haa3、Saa、Naa、Zaa2、Haa4、R3、R3'、およびLは式(IV)において上記で定義されており、かつ細胞標的化部分は、R3、R3'、またはペプチド内の官能性アミノ酸側鎖を介してペプチド部分に結合される。
【請求項３４】
以下の構造式(VIII)を有する構造的に拘束されたペプチド部分またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを含む、請求項1記載の複合体：
2008504239.tif 000073
式中、R6はアセチルであるか、または細胞標的化部分との連結を表し；
R6'はNH2であるか、または細胞標的化部分との連結を表し；かつ
Zaa1およびZaa2がL-アスパラギン酸、L-グルタミン酸から選択され；かつ
Lが、-NH(CH2)4NH-、-NH(CH2)5NH-、-NH(CH2)6NH-、-NH(CH2)7NH-、-NH(CH2)2O(CH2)2NH-、-NH(CH2)N+H2(CH2)2NH-、-NH(CH2)S(CH2)2NH-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)2NH-、-NH(CH2)2NHC(=O)CH2NH-、-NH(CH2)2SS(CH2)2NH-、-NH(CH2)2O(CH2)3NH-、-NH(CH2)2N+H2(CH2)3NH-、-NH(CH2)2S(CH2)3NH-、-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)2NH-、および-NH(CH2)2NHC(=O)(CH2)2NH-から選択されるか；または
Zaa1およびZaa2がL-リジンおよびオルニチンから選択され；かつ
Lが、-C(=O)(CH2)4C(=O)-、-C(=O)(CH2)5C(=O)-、-C(=O)(CH2)6C(=O)-、-C(=O)(CH2)7C(=O)-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)N+H2(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)S(CH2)2C(=O)-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)2NHC(=O)CH2C(=O)-、-C(=O)(CH2)2SS(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)3C(=O)-、-C(=O)(CH2)2N+H2(CH2)3C(=O)-、-C(=O)(CH2)2S(CH2)3C(=O)-、-C(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、および-C(=O)(CH2)2NHC(=O)(CH2)2C(=O)-から選択されるか；または
Zaa1がL-アスパラギン酸、L-グルタミン酸から選択され、かつZaa2がL-リジンおよびオルニチンから選択され；かつ
Lが、-NH(CH2)4C(=O)-、-NH(CH2)5C(=O)-、-NH(CH2)6C(=O)-、-NH(CH2)7C(=O)-、-NH(CH2)2O(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)N+H2(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)S(CH2)2C(=O)-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)2NHC(=O)CH2C(=O)-、-NH(CH2)2SS(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)2O(CH2)3C(=O)-、-NH(CH2)2N+H2(CH2)3C(=O)-、-NH(CH2)2S(CH2)3C(=O)-、-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、および-NH(CH2)2NHC(=O)(CH2)2C(=O)-から選択されるか；または
Zaa1がL-リジンおよびオルニチンから選択され、かつZaa2がL-アスパラギン酸、L-グルタミン酸から選択され；かつ
Lが、-C(=O)(CH2)4NH-、-C(=O)(CH2)5NH-、-C(=O)(CH2)6NH-、-C(=O)(CH2)7NH-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)N+H2(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)S(CH2)2NH-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)2NHC(=O)CH2NH-、-C(=O)(CH2)2SS(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)3NH-、-C(=O)(CH2)2N+H2(CH2)3NH-、-C(=O)(CH2)2S(CH2)3NH-、-C(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)2NH-、および-C(=O)(CH2)2NHC(=O)(CH2)2NH-から選択され；
かつ、細胞標的化部分とペプチド部分は、R6、R6'、またはペプチド内の官能性アミノ酸側鎖を介して結合される。
【請求項３５】
以下の構造式(IX)を有する構造的に拘束されたペプチド部分またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを含む、請求項1記載の複合体：
2008504239.tif 000074
式中、R7はアセチルであるか、または細胞標的化部分との連結を表し、
R7'はNH2であるか、または細胞標的化部分との連結を表し；かつ
Zaa1およびZaa2がL-アスパラギン酸、L-グルタミン酸から選択され；かつ
Lが、-NH(CH2)4NH-、-NH(CH2)5NH-、-NH(CH2)6NH-、-NH(CH2)7NH-、-NH(CH2)2O(CH2)2NH-、-NH(CH2)N+H2(CH2)2NH-、-NH(CH2)S(CH2)2NH-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)2NH-、-NH(CH2)2NHC(=O)CH2NH-、-NH(CH2)2SS(CH2)2NH-、-NH(CH2)2O(CH2)3NH-、-NH(CH2)2N+H2(CH2)3NH-、-NH(CH2)2S(CH2)3NH-、-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)2NH-、-NH(CH2)2NHC(=O)(CH2)2NH-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)3NH-、-NH(CH2)3NHC(=O)CH2NH-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)4NH-、-NH(CH2)4NHC(=O)CH2NH-、-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)3NH-、-NH(CH2)3NHC(=O)(CH2)2NH-、-NH(CH2)3C(=O)NH(CH2)2NH-、および-NH(CH2)2NHC(=O)(CH2)3NH-から選択されるか；または
Zaa1およびZaa2がL-リジンおよびオルニチンから選択され；かつ
Lが、-C(=O)(CH2)4C(=O)-、-C(=O)(CH2)5C(=O)-、-C(=O)(CH2)6C(=O)-、-C(=O)(CH2)7C(=O)-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)N+H2(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)S(CH2)2C(=O)-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)2NHC(=O)CH2C(=O)-、-C(=O)(CH2)2SS(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)3C(=O)-、-C(=O)(CH2)2N+H2(CH2)3C(=O)-、-C(=O)(CH2)2S(CH2)3C(=O)-、-C(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)2NHC(=O)(CH2)2C(=O)-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)3C(=O)-、-C(=O)(CH2)3NHC(=O)CH2C(=O)-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)4C(=O)-、-C(=O)(CH2)4NHC(=O)CH2C(=O)-、-C(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)3C(=O)-、-C(=O)(CH2)3NHC(=O)(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)3C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、および-C(=O)(CH2)2NHC(=O)(CH2)3C(=O)-から選択されるか；または
Zaa1がL-アスパラギン酸、L-グルタミン酸から選択され、かつZaa2がL-リジンおよびオルニチンから選択され；かつ
Lが、-NH(CH2)4C(=O)-、-NH(CH2)5C(=O)-、-NH(CH2)6C(=O)-、-NH(CH2)7C(=O)-、-NH(CH2)2O(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)N+H2(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)S(CH2)2C(=O)-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)2NHC(=O)CH2C(=O)-、-NH(CH2)2SS(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)2O(CH2)3C(=O)-、-NH(CH2)2N+H2(CH2)3C(=O)-、-NH(CH2)2S(CH2)3C(=O)-、-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)2NHC(=O)(CH2)2C(=O)-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)3C(=O)-、-NH(CH2)3NHC(=O)CH2C(=O)-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)4C(=O)-、-NH(CH2)4NHC(=O)CH2C(=O)-、-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)3C(=O)-、-NH(CH2)3NHC(=O)(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)3C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、および-NH(CH2)2NHC(=O)(CH2)3C(=O)-から選択されるか；または
Zaa1がL-リジンおよびオルニチンから選択され、かつZaa2はL-アスパラギン酸、L-グルタミン酸から選択され；かつ
Lが、-C(=O)(CH2)4NH-、-C(=O)(CH2)5NH-、-C(=O)(CH2)6NH-、-C(=O)(CH2)7NH-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)N+H2(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)S(CH2)2NH-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)2NHC(=O)CH2NH-、-C(=O)(CH2)2SS(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)3NH-、-C(=O)(CH2)2N+H2(CH2)3NH-、-C(=O)(CH2)2S(CH2)3NH-、-C(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)2NHC(=O)(CH2)2NH-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)3NH-、-C(=O)(CH2)3NHC(=O)CH2NH-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)4NH-、-C(=O)(CH2)4NHC(=O)CH2NH-、-C(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)3NH-、-C(=O)(CH2)3NHC(=O)(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)3C(=O)NH(CH2)2NH-、および-C(=O)(CH2)2NHC(=O)(CH2)3NH-から選択され；かつ、細胞標的化部分とペプチド部分は、R7、R7'、またはペプチド内の官能性アミノ酸側鎖を介して結合される。
【請求項３６】
以下からなる群より選択される、構造的に拘束されたペプチド部分またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを含む、請求項1記載の複合体：
2008504239.tif 000075
式中、Raはアセチルであるか、または細胞標的化部分との連結を表し、かつRa'はNH2であるか、または細胞標的化部分との連結を表し、いずれの場合にも、細胞標的化部分は、Ra、Ra'、またはペプチド内の官能性アミノ酸側鎖を介してペプチドに結合されてもよく、かつ
Zaa1およびZaa2は請求項17に定義される通りであり、かつLはZaa1およびZaa2を係留するリンカーである。
【請求項３７】
Zaa1およびZaa2がL-アスパラギン酸およびL-グルタミン酸から独立して選択され、かつLが、-NH(CH2)5NH-、-NH(CH2)6NH-、-NH(CH2)7NH-、-NHCH2(=O)NH(CH2)2NH-、-NH(CH2)2NHC(=O)CH2NH-、-NH(CH2)2O(CH2)3NH-、および-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)2NH-からなる群より選択される、請求項36記載の複合体。
【請求項３８】
Lが-NH(CH2)5NH-および-NHCH2C(=O)NH(CH2)2NH-からなる群より選択される、請求項37記載の複合体。
【請求項３９】
以下からなる群より選択される、構造的に拘束されたペプチド部分またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを含む、請求項1記載の複合体：
2008504239.tif 000076
式中、Raはアセチルであるか、または細胞標的化部分との連結を表し、かつRa'はNH2であるか、または細胞標的化部分との連結を表し、かつ細胞標的化部分は、Ra、Ra'、またはペプチド内の官能性アミノ酸側鎖を介してペプチドに結合されてもよく、かつ
Zaa1およびZaa2は、L-アスパラギン酸およびL-グルタミン酸から独立して選択される。
【請求項４０】
Zaa1およびZaa2がいずれもL-グルタミン酸である、請求項39記載の複合体。
【請求項４１】
細胞標的化部分が抗原結合分子である、請求項1記載の複合体。
【請求項４２】
細胞標的化部分がホルモン、サイトカイン、または抗体である、請求項1記載の複合体。
【請求項４３】
ホルモンが黄体形成ホルモン放出ホルモンである、請求項42記載の複合体。
【請求項４４】
サイトカインがVEGFおよびEGFから選択される、請求項42記載の複合体。
【請求項４５】
抗体が、CD19、CD20、CD22、CD79a、CD2、CD3、CD7、CD5、CD13、CD33、CD138抗体、およびErb1、Erb2、Erb3、またはErb4受容体を標的とする抗体から選択される、請求項42記載の複合体。
【請求項４６】
抗体が、CD19、CD20、CD22、およびCD79a抗体から選択される、請求項45記載の複合体。
【請求項４７】
1つまたは複数の薬学的に許容される担体、および任意で他の治療成分および/または予防成分と共に請求項1記載の複合体を含む薬学的組成物。
【請求項４８】
細胞を、請求項1記載の複合体の有効量と接触させる段階を含む、細胞死を調節する方法。
【請求項４９】
損傷を受けたまたは不要な細胞を、請求項1記載の複合体の有効量と接触させる段階を含む、不要なまたは損傷を受けた細胞におけるアポトーシスを誘導する方法。
【請求項５０】
請求項1記載の複合体の有効量を哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物において、生存促進性Bcl-2ファミリーメンバー媒介性疾患または状態を治療および/または予防する方法。
【請求項５１】
疾患または状態が、炎症状態、癌、または自己免疫異常である、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
請求項1記載の複合体の有効量を哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物において、不要なまたは損傷を受けた細胞の不適切な残存または増殖を特徴とする疾患または状態を治療および/または予防する方法。
【請求項５３】
不要なまたは損傷を受けた細胞がB細胞であり、かつ複合体の細胞標的化部分が、CD19、CD20、CD22、およびCD79a抗体から選択される、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
疾患または状態が、B細胞非ホジキンリンパ腫、B細胞急性リンパ芽球性白血病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、および関連関節症から選択される、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
不要なまたは損傷を受けた細胞がT細胞であり、かつ複合体の細胞標的化部分が、CD2、CD3、CD7、およびCD5から選択される、請求項52記載の方法。
【請求項５６】
疾患または状態が、T細胞急性リンパ芽球性白血病、T細胞非ホジキンリンパ腫、および移植片対宿主病から選択される、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
不要なまたは損傷を受けた細胞が骨髄細胞であり、かつ複合体の細胞標的化部分がCD13およびCD33から選択される、請求項52記載の方法。
【請求項５８】
疾患または状態が、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性骨髄単球性白血病から選択される、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
不要なまたは損傷を受けた細胞が形質細胞であり、かつ複合体の細胞標的化部分がCD138である、請求項52記載の方法。
【請求項６０】
疾患または状態が多発性骨髄腫である、請求項59記載の方法。
【請求項６１】
不要なまたは損傷を受けた細胞が癌細胞であり、かつ複合体の細胞標的化部分が黄体形成ホルモン放出ホルモンである、請求項52記載の方法。
【請求項６２】
疾患または状態が、卵巣癌、乳癌、および前立腺癌から選択される、請求項61記載の方法。
【請求項６３】
細胞死を調節するため、不要なもしくは損傷を受けた細胞におけるアポトーシスを誘導するため、生存促進性Bcl-2ファミリーメンバー媒介性疾患もしくは状態を治療および/もしくは予防するため、または不要なもしくは損傷を受けた細胞の不適切な残存もしくは増殖を特徴とする疾患もしくは状態を治療および/もしくは予防するための薬物の製造における、請求項1記載の複合体の使用。
【請求項６４】
以下の段階を含む、構造的に拘束されたペプチドを調製する方法：
(i) リンカーの第1の官能基がアミノ酸側鎖の反応基と共有結合するように、第1の官能基および第2の官能基を含むリンカーを、アミノ酸側鎖上の反応基と反応させる段階；
(ii) 必要に応じて、リンカーの第2の官能基を保護する段階；
(iii) (i)または(ii)からのアミノ酸を、リンカーの第2の官能基と共有結合し得る反応性側鎖を有する第2のアミノ酸を含むペプチド中に取り込む段階；
(iv) 必要に応じて、リンカーの第2の官能基を脱保護する段階；ならびに
(v) リンカーの第2の官能基を第2のアミノ酸の反応性側鎖と反応させる段階。
【請求項６５】
以下の段階を含む、請求項64記載の方法：
(i) アミド結合によってリンカーとアミノ酸側鎖が結合されるように、1つのアミノ基および1つの任意で保護されたアミノ基、または1つのアミノ基および1つの任意で保護されたカルボン酸基を有するリンカーを、カルボン酸を含む側鎖を有するアミノ酸と反応させる段階；
(ii) (i)からのアミノ酸を、リンカーの未結合のアミノ基またはカルボン酸基と反応し得る側鎖を有する第2のアミノ酸残基を含むペプチド中に取り込む段階；
(iii) 必要に応じて、リンカーのアミノ基またはカルボン酸基を脱保護する段階；ならびに
(iv) 第2のアミノ酸側鎖を、リンカーのアミノ基またはカルボン酸基と反応させて、アミド結合を形成させる段階。
【請求項６６】
以下の段階を含む、請求項64記載の方法：
(i) アミド結合によってリンカーとアミノ酸側鎖が結合されるように、1つのカルボン酸基および1つの任意で保護されたカルボン酸基、または1つのカルボン酸基および1つの任意で保護されたアミノ基を有するリンカーを、アミノ基を含む側鎖を有するアミノ酸と反応させる段階；
(ii) (i)からのアミノ酸を、リンカーの未結合のアミノ基またはカルボン酸基と反応し得る側鎖を有する第2のアミノ酸残基を含むペプチド中に取り込む段階；
(iii) リンカーのアミノ基またはカルボン酸基を脱保護する段階；ならびに
(iv) 第2のアミノ酸側鎖を、リンカーのカルボン酸基またはアミノ基と反応させて、アミド結合を形成させる段階。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、概して、BH3-オンリー(only)タンパク質を模倣する構造的に拘束されたペプチド、ならびに抗体および他の細胞標的化化合物に対するそれらの結合、それらを含む組成物、ならびに細胞死の調節におけるそれらの使用に関する。より詳細には、本発明は、生存促進性Bcl-2タンパク質に結合してこれを中和し得るBH3-オンリータンパク質を模倣する構造的に拘束されたペプチド、ならびに抗体および他の細胞標的化化合物に対するそれらの結合に関する。本発明はまた、抗体および他の細胞標的化化合物に結合した構造的に拘束されたペプチドを調製する工程、ならびに細胞死の脱調節に関連する疾患または状態の治療および/または予防におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本明細書において言及する種々の刊行物の書誌的詳細は、本記載の末尾に収載する。
【０００３】
この10年間で、発生過程におけるおよび組織恒常性における過剰な、不要な、または損傷を受けた細胞の死滅および除去の進化的保存過程であるプログラム細胞死(アポトーシス)の分子的調節について、多くのことがわかってきた。アポトーシスの脱調節は多くの疾患状態に結びつけられているため、いかにしてこの過程を調節するかという本発明者らの知見によって、アポトーシスを促進することによりまたは阻害することにより疾患を治療する新たな方法が可能になると考えられる(Thompson, 1995)。例えば、急性心筋梗塞後の心筋組織の喪失は、損傷組織におけるアポトーシスを阻害することによって制限され得る。過剰なアポトーシスはまた、アルツハイマー病などの神経変性状態の特徴でもあり、ニューロンの完全性を保護する薬物が、重要なニューロンの損失の遅延に寄与することが示唆される。過剰な細胞死とは対照的に、不十分なアポトーシスは悪性疾患および自己免疫の特徴である(Strasser et al, 1997)。いずれの状態においても、通常は除去されるべき損傷を受けたまたは不要な細胞が残存することが、疾患に寄与し得る。
【０００４】
悪性腫瘍では、細胞死調節タンパク質または細胞損傷を感知するタンパク質に影響を及ぼす変異が、様々な腫瘍において記載されている。Bcl-2ファミリーのタンパク質の原型メンバーであるBcl-2は、ヒト濾胞性B細胞リンパ腫において、その過剰発現をきたすt(11;14)染色体転座の結果として最初に発見された(Tsujimoto et. al., 1985；Cleary et. al., 1986)。アポトーシスを阻害するよう機能するBcl-2(Vaux et. al., 1988)またはその機能的相同体の過剰発現は、他の腫瘍においても報告されている。しかし、腫瘍においては、DNA損傷の感知に関与するタンパク質に対する変異の方がより一般的である。半数を超えるヒトの癌が、癌抑制タンパク質、p53またはこの経路に影響を及ぼすタンパク質の変異を有すると予測されている(Lane, 1992)。p53は、大部分の形態のDNA損傷に対して適切な細胞応答(増殖停止、アポトーシス)を誘発するのに必要である。興味深いことに、Bcl-2の過剰発現はp53によって誘導される大部分の細胞死を阻止し得るため、p53は主にBcl-2依存的機構によって細胞を死滅させる(Lowe et. al., 1993；Strasser et. al., 1994)。マウスモデルにおける臨床的所見および実験の両方から、アポトーシスの阻害(例えば、p53変異、Bcl-2の過剰発現)(Strasser et. al., 1990；Adams et. al., 1992)が、細胞増殖のみを促進する変異(例えば、c-Mycの過剰発現、p21ras変異)によって起こる発癌性形質転換を大いに促進することが示唆される。したがって、p53機能を活性化することによる、またはBcl-2機能を阻害することによるなど、細胞死を促進することによる腫瘍形成の過程の復帰は、悪性腫瘍の現在の我々の治療法を補完する新たな方法を可能にし得る。さらに、悪性疾患を治療するために現在用いられている細胞毒性治療の大部分は、一部に内因性の細胞死機構を誘導することによって作用するが(Fisher, 1994)、この機構は他のものによって破壊されている(Brown and Wouters, 1999)。例えば、放射線療法および多くの化学療法薬は、DNA損傷を誘導することによって、間接的にアポトーシス機構を活性化する。大部分の腫瘍はp53経路に影響を及ぼす変異を有するため、p53経路を標的とする治療形態は、p53機能の喪失の頻度が高いことが理由となって顕著に鈍る。従来の薬剤に対して腫瘍細胞が耐性となることから、細胞死機構に直接作用する新規な細胞毒性薬を見出すさらなる起動力が提供される。
【０００５】
細胞死のエフェクターは、重要な細胞基質をアスパラギン酸残基の後ろで切断する、カスパーゼファミリーのシステインプロテアーゼである(Thornberry, 1998)。カスパーゼは、不活性酵素前駆体として合成され、細胞損傷に応答してのみ活性化されて、不適切な細胞死を妨げるために、正常な組織の機能過程においてアポトーシスの精巧な調節を可能にする。哺乳動物細胞には、カスパーゼを活性化する異なる経路が少なくとも2つ存在する(Strasser et. al., 2000)。TNF受容体サブファミリーのいくつかのメンバーに同族リガンドが結合すると、アダプタータンパク質FADD/MORT-1によって、イニシエーター・カスパーゼ、カスパーゼ-8/FLICEが動員されて受容体上でオリゴマーを形成し、これが活性化されて、細胞死が誘導される(Ashkenazi and Dixit, 1998)。カスパーゼ-8はひとたび活性化されたならば、カスパーゼ-3、-6、および-7などの下流のエフェクター・カスパーゼを切断し得り、それによってこの過程が大幅に増幅される。
【０００６】
カスパーゼ活性化の第2の経路は、Bcl-2ファミリーのタンパク質によって調節を受ける経路である(Adams and Cory, 2001)。Bcl-2の過剰発現は、生理的に(例えば、発生的にプログラムされた細胞死、増殖因子の欠乏による死)および実験的に付加された損傷シグナル(例えば、細胞ストレス、放射線、大部分の化学療法薬)の多くの形態を阻止し得る。Bcl-2は、アダプタータンパク質Apaf-1によって、イニシエーター・カスパーゼ、カスパーゼ-9の活性化を調節するが、Apaf-1は、Bcl-2によって調節を受ける決定的なまたは唯一の分子ではないようである(Moriishi et. al., 1999；Conus et. al., 2000；Hausmann et. al., 2000；Haraguchi et. al., 2000；Marsden et. al., 2002)。線虫C. エレガンス(C. elegance)において、Bcl-2相同体CED-9は、カスパーゼCED-3の活性化に必要なアダプタータンパク質CED-4の活性を捕捉することによって機能する(Spector et. al., 1997；Chinnaiyan et. al., 1997；Wu et. al., 1997；Ynag et. al., 1998；Chen et. al., 2000)。しかし、CED-4の真の哺乳動物相同体は、今日まで発見されていない。この機構はまた、Bcl-2の多くの構造的および機能的相同体、すなわちBcl-xL、Bcl-w、Mcl-1、およびA1を発現する哺乳動物においては、より複雑である(Adams and Cory, 1998)(Cory and Adams, 2002)。これらの生存促進性タンパク質は、一般に4つの保存されたBcl-2相同体ドメイン(BH1〜4)およびC末端疎水性領域を含んで構造的に類似しており、遠縁のタンパク質のファミリー、BH3-オンリータンパク質によって遮断されるまで細胞の生存を促進する(Baell J and Huang D C, 2002)。
【０００７】
BH3-オンリータンパク質は、相互におよびBcl-2ファミリーのタンパク質の他のメンバーと短いBH3ドメインのみを共有することから、そのように称される(Huang and Strasser, 2000)。この短いドメインはα-ヘリックス領域を形成し、その疎水面は、生存促進性Bcl-2上に存在する疎水性表面間隙に結合する(Sattler et. al., 1997；Petros et. al., 2000)。BH3-オンリータンパク質は、おそらくは重要な細胞構造または代謝過程に対する細胞損傷を感知するよう機能し、次いで、調節を解かれて、Bcl-2に結合しこれを中和することによって細胞死を起こす(Huang and Strasser, 2000；Bouillet et. al., 1999)。通常、BH3-オンリータンパク質は、転写または翻訳機構によって不活性に保たれており、それによって不適切な細胞死が妨げられている。最近になって、癌抑制タンパク質p53の転写標的である2つのBH3-オンリータンパク質、すなわちNoxa(Oda et. al., 2002)およびPuma/Bbc3(Yu et. al., 2001；Nakano and Wousden, 2001；Han et. al., 2001)に関する記載がなされた。したがって、これらのタンパク質は、p53活性化によって誘導される細胞死を媒介する良好な候補である(Vousden, 2000)。いくつかの他のBH3-オンリータンパク質は、その代わりに翻訳後機構によって調節を受ける。特に、2つは細胞の細胞骨格ネットワークに捕捉されており、Bimは微小管に、およびBmfはアクチン細胞骨格に捕捉されている(Puthalakath et. al., 1999；Puthalakath et. al., 2001)。これらの細胞骨格構造に影響を及ぼす損傷シグナルによってBimまたはBmfが活性化され、これらは遊離して、ミトコンドリア外膜の細胞質面、ならびに核および小胞体の細胞質面上に位置する生存促進性Bcl-2に結合する。
【０００８】
最近、BH3-オンリータンパク質による死滅が、Bcl-2関連タンパク質の第3のファミリー、すなわちBaxサブファミリーの活性に依存することが示された(Zong et. al., 2001；Cheng et. al., 2001)。これらのタンパク質は4つの相同ドメインのうち3つを有し、生存促進性タンパク質と構造的に非常に類似しているが(Suzuki et al, 2001)、Bax、Bak、およびBok/Mtdはそれどころか細胞死を促進するように機能する。生化学的に、損傷シグナルはこれらのタンパク質の凝集を引き起こし、そのようなオリゴマーはミトコンドリア膜に対して損傷を生じるように機能し得り(Eskes et. al., 2000；Desagher et. al., 1999；Antonsson et. al.; 2001；Mikhailov et. al., 2001；Wei et. al., 2001；Jurgensmeier et. al., 1998)、それによって、Smac/Diablo(Verhagen et. al., 2000；Du et. al., 2000)、およびApaf-1によるカスパーゼ-9の活性化に必須であるシトクロムc(Kluck et. al., 1997；Yang et. al., 1997；Zou et. al., 1997；Li et. al., 1997)などのミトコンドリアのアポトーシス促進性因子が放出される。線維芽細胞では、BH3-オンリータンパク質による死滅はBaxおよびBakに依存するため、それらの生理学的役割はBaxおよびBakを活性化することであると考えられる(Zong et. al., 2001；Korsmeyer et. al., 2000)。そのようなモデルでは、生存促進性Bcl-2タンパク質は、そのようにする能力が不十分となる時点まで、BH3-オンリータンパク質を単に捕捉するよう機能する。しかし、BaxおよびBakに対するBH3-オンリータンパク質の直接的な結合についてはほとんど報告がなく、BH3-オンリータンパク質Bidの場合でさえも弱いようである(Eskes et. al., 2000；Wei et. al., 2001；Wang et al., 1996)。今日まで、BH3-オンリータンパク質の生存促進性Bcl-2との結合を、アポトーシス促進性Baxとの結合と直接比較する実験は行われていない。
【０００９】
Bax様タンパク質に対するBH3-オンリータンパク質の直接的な結合に関する乏しい生化学的証拠に加えて、利用できる遺伝子データの綿密な解析からも、アポトーシス促進性Baxよりもむしろ生存促進性Bcl-2がBH3-オンリータンパク質の直接の標的であることが示唆される。線虫C.エレガンスでは、BH3-オンリータンパク質EGL-1によって誘導される死滅はすべて、EGL-1が線虫Bcl-2、CED-9に結合してこれを中和する能力に依存する(Conradt et al., 1998；Parrish et. al., 2000)。哺乳動物では、各クラスのタンパク質における機能的重複性から、この状況はいくぶんより複雑である。単一のBH3-オンリータンパク質(EGL-1)および単一のBcl-2相同体(CED-9)の代わりに、哺乳動物は各サブクラスのタンパク質を複数発現するため、線虫と直接比較することは困難である。さらに、線虫はBax様タンパク質を発現しないようである。しかし、Bcl-2様タンパク質が単にBH3-オンリータンパク質を捕捉するように機能するのであれば、いずれの細胞種においても生存促進性Bcl-2様タンパク質の量が制限となるはずである。したがって、bcl-2(Veis et. al., 1993；Nakayama et. al., 1994；Kamada et. al., 1995)、bcl-x(Motoyama et. al., 1995；Motoyama et. al., 1999)、またはbcl-w(Ross et. al., 1998；Print et. al., 1998)遺伝子の1つの対立遺伝子を欠くマウスが正常であって、一方、ホモ接合性ノックアウトマウスがすべて、これらの遺伝子が重要な役割を果たす細胞種において顕著な表現型を有することは、驚くべきことであった。このことから、生存促進性Bcl-2様タンパク質が制限的ではないことが示唆され；それよりもむしろ、BH3-オンリータンパク質Bimを欠くマウスの解析から、このクラスのタンパク質が制限的であることが示唆される(Bouillet et. al., 1999；Bouillet et. al., 2001)。総合すると、得られるデータから、BH3-オンリータンパク質がBcl-2に直接結合すること、およびBcl-2を中和することによって、BH3-オンリータンパク質がBax様タンパク質を活性化し得ることが示唆される。
【００１０】
したがって、BH3-オンリータンパク質を直接模倣する薬剤は細胞死を誘導し得り、よって治療的に価値があると考えられる。Bcl-2は細胞の運命を決定する臨界点を制御するため、このクラスのタンパク質は、薬物設計の魅力的な標的を表す。特に、p53に対する変異などの発癌性変異の多くは、通常であればBcl-2依存的機構によって細胞死を引き起こす細胞損傷の感知に欠陥をもたらすため、Bcl-2およびその相同体を直接標的することはそのような変異を回避することができる。これはまた、現行の治療法に対する腫瘍抵抗性を克服する別の経路も可能にし得る。
【００１１】
Bcl-2タンパク質と直接結合する化合物を提供する上での1つの問題は、Bcl-2タンパク質が、悪性疾患および自己免疫などの疾患状態に関連した、残存する損傷細胞または不要な細胞に存在するだけでなく、正常な健常細胞にも存在することである。健常細胞におけるアポトーシスの危険性を最低限に抑えるためには、特定の不要な細胞に対して化合物を標的送達することが望ましい。
【００１２】
特定の細胞種を標的するための特定抗体の使用は研究の活発な領域であり、特にその場合、抗体は細胞活性剤に結合される(Wang et. al., 1997；Goulet et. al., 1997；Sapra and Allen, 2002；Marks et. al., 2003；Deardon, 2002；Ludwig et. al., 2003；Uckun et. al., 1995)。例えば、全B細胞抗原としてのCD19は、B細胞系譜の白血病およびリンパ種の免疫毒素療法の理想的な標的である(Wang et. al., 1997；Gouet et. al., 1997；Sapra and Allen, 2002；Marks et. al., 2003；Dearden, 2002)。B細胞を標的して死滅させるため、およびB細胞に関連した癌を治療するために、ゲニステイン、リシン類似体、ドキソルビシン、および細胞毒性ペプチドなどの様々な細胞毒性薬が、抗CD19抗体に結合されている(Wang et. al., 1997；Goulet et. al., 1997；Sapra and Allen, 2002；Marks et. al., 2003；Deardon, 2002；Uckun et. al., 1995)。
【００１３】
BH3ペプチドは、いくつかの癌細胞株で過剰発現されているが、健常なヒト内臓器官では発現されない黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)受容体を標的するために、LHRHに結合されている(Dharap and Minko, 2003)。
【発明の開示】
【００１４】
発明の概要
本発明は、BH3-オンリータンパク質を模倣する構造的に拘束されたペプチドが顕著なアポトーシス促進活性を示し、拘束されていない線状ペプチドと比較してタンパク質分解に対する抵抗性の増加を有し、かつそのようなペプチドが細胞標的化化合物に結合して不要なまたは損傷を受けた細胞への直接送達を可能にするという発見に一部基づく。この発見は、以下に記載するように、新規な化合物/タンパク質複合体、それらを含む組成物、ならびにそれらの調製方法および使用方法として実行に移された。
【００１５】
発明の詳細な説明
本明細書および特許請求の範囲を通じて、特に断りのない限り、「含む(comprise)」という語ならびに「含む(comprises)」および「含む(comprising)」などの変化形は、記載の整数もしくは段階、または整数もしくは段階の群を含むことを意味するが、任意の他の整数もしくは段階または整数もしくは段階の群を排除することを意味するものではないと理解される。
【００１６】
本発明の第1の局面では、少なくとも1つの細胞標的化部分、および少なくとも1つの構造的に拘束されたペプチド部分またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを含む複合体であって、構造的に拘束されたペプチド部分が、アミノ酸配列(I)を含む複合体を提供する：
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式中、Haa1、Haa2、Haa3、およびHaa4はそれぞれ独立して疎水性側鎖を有するアミノ酸残基であるか、またはnおよびmがいずれも1である場合は、Haa1、Haa2、およびHaa4の1つはXaa1でもよく；
Saaはそれぞれ小さな側鎖を有するアミノ酸残基であり；
Naaは負に荷電した側鎖を有するアミノ酸残基であり；
Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、およびXaa5はそれぞれ独立してアミノ酸残基、Zaa1またはZaa2であり；
Rは、H、N末端キャッピング基、N末端キャッピング基でキャッピングされていてもよいオリゴペプチドであるか、または構造的に拘束されたペプチド部分と細胞標的化部分との間の連結を表し；
R'は、H、C末端キャッピング基、C末端キャッピング基でキャッピングされていてもよいオリゴペプチドであるか、または構造的に拘束されたペプチド部分と細胞標的化部分との間の連結を表し；かつ
mおよびnは0または1であるが、ただしmおよびnの少なくとも一方は1であり；
構造的拘束は、配列中の2つのアミノ酸残基、Zaa1およびZaa2を係留するリンカー(L)によって提供され、かつ細胞標的化部分と構造的に拘束されたペプチド部分またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグは、RもしくはR'、またはアミノ酸配列(I)中の官能性アミノ酸側鎖を介して結合している。
【００１７】
本明細書で使用する「複合体」という用語は、少なくとも1つの構造的に拘束されたペプチド部分に結合している少なくとも1つの細胞標的化部分という、少なくとも2つの部分から構成される分子を指す。したがって、少なくとも2つの部分は、好ましくは共有結合、より好ましくは、特定の細胞条件下で加水分解されて、その作用部位にある損傷を受けたまたは不要な細胞内で構造的に拘束されたペプチドを放出し得る共有結合により、放出可能に結合される。細胞内で加水分解され得る適切な共有結合の例には、ジスルフィド結合、エステル結合、およびアミド結合が含まれる。構造的に拘束されたペプチド部分、または細胞標的化部分と構造的に拘束されたペプチド部分との間に存在し得るスペーサーは、特定の条件下で結合の加水分解を提供して、構造的に拘束されたペプチドを放出するように、例えばプロテアーゼなどの酵素認識配列を含み得る。
【００１８】
本明細書で使用する「細胞標的化部分」という用語は、不要なまたは損傷を受けた細胞によって、好ましくは細胞表面上に発現される標的分子と相互作用し得る部分を指す。好ましくは、標的分子は、不要なまたは損傷を受けた細胞において過剰発現され、健常細胞では発現されない。適切な細胞標的化部分には、損傷を受けたまたは不要な細胞における標的分子と相互作用するタンパク質および抗原結合分子が含まれる。適切な細胞標的化部分には、これらに限定されないが、黄体形成ホルモン放出ホルモンなどのホルモン、VEGFおよびEGFなどのサイトカイン、ならびにCD19、CD20、CD22、CD79a、CD2、CD3、CD7、CD5、CD13、CD33、およびCD138などの抗体、またはErb1(EGFRとも称される)、Erb2(HER2およびNEUとも称される)、Erb3、およびErb4などの受容体を標的とする抗体が含まれる。好ましい態様においては、細胞標的化分子は、例えばCD19、CD20、CD22、およびCD79aなどの、B細胞を標的とする抗体である。複合体は、1つの細胞標的化部分および1つの構造的に拘束された部分、1つの細胞標的化部分および複数の構造的に拘束された部分、2つ以上の細胞標的化部分および1つの構造的に拘束された部分、または2つ以上の細胞標的化部分および複数の構造的に拘束された部分を含み得る。いくつかの態様において、複合体は、1つの細胞標的化部分、および1〜100、好ましくは1〜50、より好ましくは1〜20、最も好ましくは3〜15の構造的に拘束された部分を含む。他の態様において、複合体は、1つよりも多い細胞標的化部分を有し得る。2つまたはそれ以上の細胞標的化部分は同じであってもよいし、異なってもよい。2つまたはそれ以上の細胞標的化部分が異なる場合には、この複合体を用いて、各細胞標的化部分に対する標的分子を発現する細胞を標的にすることができ、これによって細胞特異性が増加する。
【００１９】
本明細書で使用する「抗原結合分子」という用語は、標的抗原に対する結合親和性を有する分子を指し、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、および抗原結合活性を示す非免疫グロブリン由来タンパク質フレームワークにまで及ぶ。
【００２０】
いくつかの態様において、細胞標的化部分は、標的対象である細胞によって発現される標的分子、典型的には細胞表面タンパク質(例えば、受容体)と免疫相互作用する抗原結合分子である。本明細書における「免疫相互作用性」への言及には、分子間の、特に分子の一方が免疫系の成分であるかまたはそれを模倣する分子間の、任意の相互作用、反応、または他の形態の会合への言及が含まれる。
【００２１】
抗原結合分子は、ポリクローナル抗体全体およびモノクローナル抗体全体などの免疫グロブリン分子、ならびに免疫グロブリンよりも小さい抗原結合分子から選択され得る。ポリクローナル抗体は、例えば、本発明の標的分子を産生種(マウスまたはウサギを含み得る)に注射して、ポリクローナル抗血清を得ることによって調製することができる。ポリクローナル抗体を作製する方法は、当業者に周知である。使用できる例示的な手順は、例えば、Coligan et. al., 「Current Protocols In Immunology」, (John Wiley & Sons, Inc, 1991)、およびAusubel et. al., 「Current Protocols In Molecular Biology」 (1994-1998)、特に第11章の第III項に記載されている。
【００２２】
産生種から得られるポリクローナル抗血清の代わりに、例えばKohler and Mil
stein, 1975によって記載されている標準的な方法を用いて、または例えばColigan et. al., 1991によって記載されているより最近のその改良法により、本発明の標的分子を接種した産生種に由来する脾臓または他の抗体産生細胞を不死化することによって、モノクローナル抗体を作製することができる。
【００２３】
免疫グロブリンよりも小さい適切な抗原結合分子には、Fv、Fab、Fab'、およびF(ab')2免疫グロブリン断片が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、免疫グロブリンよりも小さい抗原結合分子は、免疫グロブリン分子のFc部分を含まない。
【００２４】
いくつかの態様において、免疫グロブリンよりも小さい抗原結合分子は、合成Fv断片を含む。適切には、合成Fv断片は安定化されている。例示的な安定化された合成Fv断片には、ペプチドリンカーを用いてVHドメインのN末端またはC末端をVLドメインのそれぞれC末端またはN末端と架橋した一本鎖Fv断片(sFv、多くの場合scFvと称される)が含まれる。scFvは抗体全体のうち定常部分をすべて欠いており、補体を活性化する能力がない。VHドメインとVLドメインを連結するのに適したペプチドリンカーは、Fv断片の由来となった抗体全体の抗原結合部位の三次元構造と類似した三次元構造を備えた抗原結合部位を有する単一ポリペプチド鎖となるように、VHドメインおよびVLドメインを折りたたみ得るリンカーである。所望の特性を有するリンカーは、米国特許第4,946,778号に開示されている方法によって得ることができる。しかし、場合によってはリンカーは存在しない。
【００２５】
scFvは、例えば、Krebber et. al., 1997に概説されている方法に従って調製することができる。または、scFvは、米国特許第5,091,513号、欧州特許第239,400号、またはWinter and Milstein, 1991およびPluckthun et. al., 1996, In Antibody engineering: A practical approach 203-252による論文に記載されている方法によって調製することもできる。
【００２６】
あるいは、安定化された合成Fv断片は、システイン残基がVHドメインおよびVLドメイン内に導入されて、完全に折りたたまれたFv分子内で2つの残基がそれらの間でジスルフィド結合を形成する、ジスルフィド安定化Fv(dsFv)を含む。dsFvを作製する適切な方法は、例えば、Glockshuber et. al. 1990、Reiter et. al. 1994a、Reiter et.al. 1994b、Reiter et.al. 1994c、Webber et.al. 1995に記載されている。
【００２７】
免疫グロブリンよりも小さい抗原結合分子として同様に意図しているのは、例えば、Ward et. al. 1989、Hamers-Casterman et al. 1993、Davies & Riechmann, 1994に開示されている単一可変領域ドメイン(dAbと称される)である。
【００２８】
他の態様において、免疫グロブリンよりも小さい抗原結合分子は「ミニボディ(minibody)」である。この点に関して、ミニボディは抗体全体の小型版であり、抗体全体の必須要素を一本鎖内にコードしている。適切には、ミニボディは、例えば米国特許第5,837,821号に開示されているように、免疫グロブリン分子のヒンジ領域およびCH3ドメインに融合された、天然抗体のVHドメインおよびVLドメインからなる。
【００２９】
さらなる他の態様において、免疫グロブリンよりも小さい抗原結合分子は、非免疫グロブリンに由来するタンパク質フレームワークを含む。例えば、Ku & Schultz, 1995に言及することができるが、これは、相補性決定領域(CDR)を生じるようにランダム化した2つのループを有する4本ヘリックス束タンパク質シトクロムb562を開示するもので、これは抗原結合について選択されている。
【００３０】
いくつかの態様において、免疫グロブリンよりも小さい抗原結合分子は、修飾部分を含む。この種の具体例では、修飾部分は分子のエフェクター機能を修飾する。例えば、修飾部分は、例えば免疫測定法において抗原結合分子を検出するためのペプチドを含み得る。あるいは、修飾部分は、抗原結合分子の精製を容易にし得る。この場合、修飾部分には、これらに限定されないが、アフィニティークロマトグラフィーによる抗原結合分子の単離に特に有用であるグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質(MBP)、およびヘキサヒスチジン(HIS6)が含まれる。アフィニティークロマトグラフィーにより精製するためには、アフィニティークロマトグラフィー用の該当する充填剤は、当技術分野において周知であるように、それぞれグルタチオン結合樹脂、アミロース結合樹脂、およびニッケル結合樹脂、またはコバルト結合樹脂である。
【００３１】
免疫グロブリンよりも小さい抗原結合分子は、多価(すなわち、1つより多い抗原結合部位を有する)であってもよい。このような多価分子は、1つまたは複数の抗原(例えば、標的細胞によって発現される2つの標的分子)に対して特異的であり得る。この種の多価分子は、例えばAdams et. al., 1993およびCumber et. al., 1992によって開示されているように、システイニル含有ペプチドを介した2つの抗体断片の二量体化によって調製することができる。または、二量体化は、抗体断片と、自然に二量体化する両親媒性ヘリックスとの融合(Pack and Pluckthun, 1992)によって、または優先的にヘテロ二量体化するドメイン(ロイシンジッパーjunおよびfosなど)の使用(Kostelny et. al., 1992)によって促進され得る。他の態様において、多価分子は、ペプチドリンカーにより互いに連結された少なくとも2つのscFvを含む多価一本鎖抗体(多価-scFv)を含む。例えば、この点において、「ダイアボディ(diabody)」と称される非共有結合でまたは共有結合で連結されたscFv二量体が使用され得る。多価scFvは、異なる抗原結合特異性を有するscFvの使用数に応じて、二重特異性であるかまたはそれ以上であり得る。多価scFvは、例えば米国特許第5,892,020号に開示されている方法により調製することができる。
【００３２】
本明細書で使用する「構造的に拘束された」という用語は、配列内の2つのアミノ酸残基に共有結合されたリンカーによる、他の可能な構造に対する所望の構造、好ましくはヘリックス構造の安定化を指す。構造的拘束はまた、構造的拘束を欠くペプチドと比較して、タンパク質分解に対する抵抗性を増大させる。
【００３３】
本明細書で使用する「アミノ酸」という用語は、アミノ基およびカルボン酸基を有する化合物を指す。アミノ酸は天然アミノ酸であってもよいし、または非天然アミノ酸であってもよく、またタンパク質新生アミノ酸であってもよいし、または非タンパク質新生アミノ酸であってもよい。本発明のアミノ酸配列に取り込まれるアミノ酸は、L-アミノ酸、D-アミノ酸、α-アミノ酸、β-アミノ酸、糖アミノ酸、および/またはこれらの混合物であってよい。
【００３４】
適切な天然のタンパク質新生アミノ酸を、一文字コードおよび三文字コードと共に表1に示す。
【００３５】
【表１】
2008504239.tif 000003
【００３６】
適切な非タンパク質新生または非天然のアミノ酸は、側鎖修飾により、または全合成により調製され得る。本発明の意図する側鎖修飾の例には、アルデヒドとの反応後にNaBH4で還元することによる還元的アルキル化；メチルアセトイミデートによるアミド化；無水酢酸によるアシル化；シアン酸によるアミノ基のカルバモイル化；2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)によるアミノ基のトリニトロベンジル化；無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化；およびピリドキサル-5-リン酸によりリジンをピリドキシル化し、その後NaBH4により還元するなどのアミノ基の修飾が含まれる。リジンのアミノ基はまた、アミノ基とカルボン酸基を反応させる既知の方法により、脂肪酸、他のアミノ酸もしくはペプチド、または標識基との反応によって誘導体化することも可能である。
【００３７】
アルギニン残基のグアニジン基は、2,3-ブタンジオン、フェニルグリオキサール、およびグリオキサールなどの試薬を用いた複素環式縮合産物の形成により修飾し得る。
【００３８】
カルボキシル基は、O-アシルイソウレアの形成を介してカルボジイミドを活性化し、その後、例えば、対応するアミドに誘導化することにより修飾し得る。
【００３９】
スルフヒドリル基は、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化；システイン酸への過ギ酸酸化；他のチオール化合物による混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸、または他の置換マレイミドとの反応；4-クロロ水銀安息香酸、4-クロロ水銀フェニルスルホン酸、塩化フェニル水銀、2-クロロ水銀-4-ニトロフェノール、および他の水銀剤を用いる水銀誘導体の形成；アルカリ性pHにおけるシアン酸によるカルバモイル化などの方法により修飾し得る。
【００４０】
トリプトファン残基は、例えば、N-ブロモスクシンイミドによる酸化、または2-ヒドロキシ-5-ニトロベンジルブロミドもしくはハロゲン化スルフェニルによるインドール環のアルキル化によって修飾し得る。一方、チロシン残基は、テトラニトロメタンによるニトロ化により改変されて、3-ニトロチロシン誘導体を形成し得る。
【００４１】
ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化またはジエチルピロカルボネートによるN-カルボエトキシル化によって達成し得る。
【００４２】
タンパク質合成中に非天然アミノ酸および誘導体を取り込む例には、これらに限定されないが、ノルロイシン、4-アミノ酪酸、4-アミノ-3-ヒドロキシ-5-フェニルペンタン酸、6-アミノヘキサン酸、t-ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、4-アミノ-3-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン酸、2-チエニルアラニン、および/またはアミノ酸のD-異性体の使用が含まれる。本明細書において意図する適切な非タンパク質新生または非天然のアミノ酸の例を表2に示す。
【００４３】
【表２】
2008504239.tif 000004
2008504239.tif 000005
2008504239.tif 000006
2008504239.tif 000007
【００４４】
適切なβ-アミノ酸には、これらに限定されないが、L-β-ホモアラニン、L-β-ホモアルギニン、L-β-ホモアスパラギン、L-β-ホモアスパラギン酸、L-β-ホモグルタミン酸、L-β-ホモグルタミン、L-β-ホモイソロイシン、L-β-ホモロイシン、L-β-ホモリジン、L-β-ホモメチオニン、L-β-ホモフェニルアラニン、L-β-ホモプロリン、L-β-ホモセリン、L-β-ホモスレオニン、L-β-ホモトリプトファン、L-β-ホモチロシン、L-β-ホモバリン、3-アミノ-フェニルプロピオン酸、3-アミノ-クロロフェニル酪酸、3-アミノ-フルオロフェニル酪酸、3-アミノ-ブロモフェニル酪酸、3-アミノ-ニトロフェニル酪酸、3-アミノ-メチルフェニル酪酸、3-アミノ-ペンタン酸、2-アミノ-テトラヒドロイソキノリン酢酸、3-アミノ-ナフチル-酪酸、3-アミノ-ペンタフルオロフェニル-酪酸、3-アミノ-ベンゾチエニル-酪酸、3-アミノ-ジクロロフェニル-酪酸、3-アミノ-ジフルオロフェニル-酪酸、3-アミノ-ヨードフェニル-酪酸、3-アミノ-トリフルオロメチルフェニル-酪酸、3-アミノ-シアノフェニル-酪酸、3-アミノ-チエニル-酪酸、3-アミノ-5-ヘキサン酸、3-アミノ-フリル-酪酸、3-アミノ-ジフェニル-酪酸、3-アミノ-6-フェニル-5-ヘキサン酸、および3-アミノヘキシン酸が含まれる。
【００４５】
糖アミノ酸とは、少なくとも1つのアミノ基および少なくとも1つのカルボキシル基を含む糖部分である。糖アミノ酸は、ピラノース糖またはフラノース糖に基づき得る。適切な糖アミノ酸は、同一炭素原子に付着した(α-糖アミノ酸)、または隣接した炭素原子に付着した(β-糖アミノ酸)アミノ基およびカルボン酸基を有し得る。適切な糖アミノ酸には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる。
2008504239.tif 000008
【００４６】
糖アミノ酸は、例えばグルコース、グルコサミン、およびガラクトースなどの市販の単糖から合成することができる。アミノ基は、その後の還元を伴って、アジド基、シアニド基、またはニトロメタン基として導入され得る。カルボン酸基は、その後の酸化を伴ってウィティッヒ反応により、または第一級アルコールの選択的酸化により、CO2として直接導入され得る。
【００４７】
Haa1、Haa2、Haa3、およびHaa4は疎水性側鎖を有するアミノ酸であり、Bcl-2タンパク質と結合するための疎水部分を提供する。Haa3、ならびにHaa1、Haa2、およびHaa4の少なくとも2つが結合に必要である。Haa1、Haa2、およびHaa4の1つが疎水性側鎖を有するアミノ酸でない場合、それらはXaa1に関して以下に記載するいずれかのアミノ酸であってよい。好ましくは、Haa1、Haa2、Haa3、およびHaa4のすべてが、疎水性側鎖を有するアミノ酸である。適切なHaa1、Haa2、Haa3、およびHaa4は、L-フェニルアラニン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-バリン、L-メチオニン、L-チロシン、D-フェニルアラニン、D-イソロイシン、D-ロイシン、D-バリン、D-メチオニン、D-チロシン、L-β-ホモフェニルアラニン、L-β-ホモイソロイシン、L-β-ホモロイシン、L-β-ホモバリン、L-β-ホモメチオニン、L-β-ホモチロシン、アミノノルボルニルカルボン酸、シクロヘキシルアラニン、L-ノルロイシン、L-ノルバリン、L-α-メチルイソロイシン、L-α-メチルロイシン、L-α-メチルメチオニン、L-α-メチルノルバリン、L-α-メチルフェニルアラニン、L-α-メチルバリン、L-α-メチルチロシン、L-α-メチルホモフェニルアラニン、D-α-メチルロイシン、D-α-メチルメチオニン、D-α-メチルノルバリン、D-α-メチルフェニルアラニン、D-α-メチルバリン、D-α-メチルチロシン、D-α-メチルホモフェニルアラニン残基  L-トリプトファン、L-3'4'-ジクロロフェニルアラニン、L-1'-ナフチルアラニン、およびL-2'-ナフチルアラニンから選択される。好ましいHaa1、Haa2、Haa3、およびHaa4は、L-フェニルアラニン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-バリン、L-メチオニン、およびL-チロシンから独立して選択される。特に好ましい態様において、Haa2はL-ロイシンである。
【００４８】
Saaは、小さな側鎖を有するアミノ酸残基である。適切なSaa残基には、グリシン、L-アラニン、L-セリン、L-システイン、D-アラニン、D-セリン、D-システイン、L-β-ホモセリン、L-β-ホモアラニン、γ-アミノ酪酸、アミノイソ酪酸、L-α-メチルセリン、L-α-メチルアラニン  L-α-メチルシステイン、D-α-メチルセリン、D-α-メチルアラニン、およびD-α-メチルシステイン残基が含まれる。好ましくは、Saaは、グリシン、L-アラニン、L-セリン、L-システイン、およびアミノイソ酪酸からなる群より選択される。
【００４９】
Naaは、負に荷電したアミノ酸残基である。適切なNaa残基には、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、D-アスパラギン酸、D-グルタミン酸、L-β-ホモアスパラギン酸、L-β-ホモグルタミン酸、L-α-メチルアスパラギン酸、L-α-メチルグルタミン酸、D-α-メチルアスパラギン酸、およびD-α-メチルグルタミン酸が含まれる。好ましくは、Naaは、L-アスパラギン酸残基またはLグルタミン酸である。
【００５０】
Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、およびXaa5は、上記に定義したいずれかのアミノ酸から独立して選択され、任意の天然、非天然、タンパク質新生、または非タンパク質新生アミノ酸であってよい。好ましくは、Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、およびXaa5は、L-アラニン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-システイン、L-グルタミン、L-グルタミン酸、L-グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、およびL-バリンから独立して選択される。残基Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、およびXaa5の1つまたは2つはZaa1およびZaa2であってよく、構造的拘束を提供するリンカー(L)が付着する残基を提供する。
【００５１】
Rは、H、N末端キャッピング基、またはN末端キャッピング基でキャッピングされていてもよいオリゴペプチドから選択される。好ましくは、Rは、N末端キャッピング基、またはXaa1から選択される1〜10アミノ酸残基を有しN末端キャッピング基でキャッピングされていてもよいオリゴペプチドである。好ましくは、N末端キャッピング基は、通常、水素結合を形成し得る水素原子を有するか、またはヘリックス双極子(helix dipole)と適合するようにN末端において負電荷を有する、ヘリックスの末端を安定化する基である。適切なN末端キャッピング基には、アシルおよびN-コハク酸(HO2CCH2C(=O))が含まれる(Maison et. al., 2001)。または、Rは、直接結合としての、またはスペーサーを介した、構造的に拘束されたペプチドと、抗体などの細胞標的化部分との連結を表す。
【００５２】
R'は、H、C末端キャッピング基、またはC末端キャッピング基でキャッピングされていてもよいオリゴペプチドから選択される。好ましくは、R'は、C末端キャッピング基、またはXaa1から選択される1〜10アミノ酸を有しC末端キャッピング基でキャッピングされていてもよいオリゴペプチドである。好ましくは、C末端キャッピング基は、通常、水素結合を形成し得る水素原子を有するか、またはヘリックス双極子と適合するようにC末端において正電荷を有する、ヘリックスの末端を安定化する基である。好ましいC末端キャッピング基はNH2である。または、R'は、直接結合としての、またはスペーサーを介した、構造的に拘束されたペプチドと、抗体などの細胞標的化部分との連結を表す。
【００５３】
アミノ酸が適切に官能基化された側鎖であり、かつZaa1でもZaa2でも、またBcl-2タンパク質への結合に必要な残基でもないならば、構造的に拘束されたペプチド部分中の任意のそのアミノ酸の側鎖は、直接またはスペーサーを介して、細胞標的化部分に結合され得る。RまたはR'がオリゴペプチドである場合、適切に官能基化された側鎖はRまたはR'中に存在し得る。いくつかの好ましい態様において、細胞標的化部分に結合されるアミノ酸は、Xaa1、Xaa3、またはXaa4である。その側鎖を介して細胞標的化部分に結合され得る適切なアミノ酸には、これらに限定されないが、リジン、システイン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモアスパラギン酸、ホモグルタミン酸、ホモリジン、ホモセリン残基などが含まれる。好ましくは、結合する側鎖は、リジンまたはシステイン残基上に存在する。
【００５４】
官能性側鎖がスペーサーを介して細胞標的化部分に連結される場合、スペーサーは約1〜約100原子長であってよく、また1つまたは複数のアミノ酸残基を含み得る。スペーサーはまた、拘束されたペプチドまたはスペーサー上に存在するシステイン残基またはチオール基との縮合を可能にするために細胞標的化部分上に存在した、例えば、マレイミド環、N-ヒドロキシスクシンイミド活性化型マレイミド、スルホスクシンイミジル-4-[N-マレイミドメチル]-シクロヘキサミン-1-カルボン酸、またはピリジルスルフィドなどの、拘束されたペプチドと細胞標的化部分との間の連結を補助する部分を取り込み得る。
【００５５】
さらに、細胞標的化部分は、細胞膜を介したペプチド透過を補助するために拘束されたペプチド内に取り込まれた部分を通じて、直接またはスペーサーを介して、拘束されたペプチドに連結され得る。そのような部分の例には、脂肪酸、短いポリエチレングリコール、または-RRRRRRR-もしくは-SSSS-などの荷電もしくは極性のアミノ酸配列、またはSolなどの可溶化配列が含まれる。この場合、細胞標的化部分と拘束されたペプチドが作用部位において切断される際には、細胞膜を介した透過を補助する部分はそのまま残存する。
【００５６】
リンカーは、アミノ酸配列内の2つのアミノ酸残基、Zaa1およびZaa2を係留する。好ましくは、リンカーは、適切にi(i+7)の関係にある2つの非隣接アミノ酸を係留し、このリンカーの第1の末端は配列内の第1位にある第1のアミノ酸残基(Zaa1)に付着し、かつこのリンカーのもう一方の末端は、配列内で第1のアミノ酸の7アミノ酸後に出現する第2のアミノ酸残基(Zaa2)に付着する。好ましくは、リンカーは、所望の構造、好ましくはヘリックス構造を安定化する。好ましくは、リンカーは4〜8原子の長さを有し、Zaa1およびZaa2は、アミノ酸配列(i)中で以下の位置のうちの1つに位置する：
(a) iはアミノ酸配列のN末端にあるHaa1の前に位置し、かつ
i+7はHaa2とHaa3の間に位置する；
(b) iはHaa1とHaa2の間に位置し、かつ
i+7はHaa3とHaa4の間に位置する；
(c) iはHaa2とHaa3の間に位置し、かつ
i+7はアミノ酸配列のC末端にあるHaa4の後に位置する。
【００５７】
好ましい態様において、リンカー(L)は4〜8原子長である。リンカーは4〜8炭素原子長の炭化水素鎖であってよく、または炭化水素鎖中の炭素原子の1つもしくは複数は、N、O、もしくはSから選択されるヘテロ原子によって置換され得る。リンカー内の原子の1つまたは複数は、=O、OH、SH、およびCH3から選択される置換基で置換され得る。または、炭素原子のいくつかは、1,4-二置換フェニル環によって置換され得る。
【００５８】
Zaa1およびZaa2は任意のアミノ酸残基であってよいが、Zaa1およびZaa2は、リンカー前駆体と容易に反応してリンカーを形成する側鎖を有するアミノ酸残基であることが好ましい。好ましい態様において、リンカーは、アミド結合の形成によって、すなわちラクタム架橋の形成によって、2つのアミノ酸残基を共有結合する。
【００５９】
好ましくは、Zaa1およびZaa2は、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、L-リジン、L-オルニチン、D-アスパラギン酸、D-グルタミン酸、D-リジン、D-オルニチン、L-β-ホモアスパラギン酸、L-β-ホモグルタミン酸、L-β-ホモリジン、L-α-メチルアスパラギン酸、L-α-メチルグルタミン酸、L-α-メチルリジン、L-α-メチルオルニチン、D-α-メチルアスパラギン酸、D-α-メチルグルタミン酸、D-α-メチルリジン、およびL-α-メチルオルニチンから独立して選択される。好ましくは、Zaa1およびZaa2は、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、L-リジン、およびL-オルニチンから選択される。より好ましくは、Zaa1およびZaa2は、L-アスパラギン酸およびL-グルタミン酸から選択される。
【００６０】
Zaa1およびZaa2が、例えばL-アスパラギン酸またはL-グルタミン酸のようにカルボン酸を含む側鎖を有する場合、好ましいリンカーは、-NH(CH2)4NH-、-NH(CH2)5NH-、-NH(CH2)6NH-、-NH(CH2)7NH-、-NH(CH2)2O(CH2)2NH-、-NH(CH2)2N+H2(CH2)2NH-、-NH(CH2)2S(CH2)2NH-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)2NH-、-NH(CH2)2NHC(=O)CH2NH-、-NH(CH2)2SS(CH2)2-NH-、-NH(CH2)2O(CH2)3NH-、-NH(CH2)2N+H2(CH2)3NH-、-NH(CH2)2S(CH2)3NH-、-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)2NH-、-NH(CH2)2NHC(=O)(CH2)2NH-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)3NH-、-NH(CH2)3NHC(=O)CH2NH-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)4NH-、-NH(CH2)4NHC(=O)CH2NH-、-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)3NH-、-NH(CH2)3NHC(=O)(CH2)2NH-、-NH(CH2)3C(=O)NH(CH2)2NH-、および-NH(CH2)2NHC(=O)(CH2)3NH-からなる群より選択される。より好ましくは、リンカーは、-NH(CH2)5NH-、-NH(CH2)6NH-、-NH(CH2)7NH-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)2NH-、-NH(CH2)2NHC(=O)CH2NH-、-NH(CH2)2O(CH2)3NH-、および-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)2NH-からなる群より選択される。特に好ましいリンカーには、-NH(CH2)5NH-および-NHCH2C(=O)NH(CH2)2NH-が含まれる。
【００６１】
Zaa1およびZaa2が、例えばL-リジンまたはL-オルニチンのようにアミノ基を含む側鎖を有する場合、好ましいリンカーは、-C(=O)(CH2)4C(=O)-、-C(=O)(CH2)5C(=O)-、-C(=O)(CH2)6C(=O)-、-C(=O)(CH2)7C(=O)-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)N+H2(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)S(CH2)2C(=O)-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)2NHC(=O)CH2C(=O)-、-C(=O)(CH2)2SS(CH2)2-C(=O)-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)3C(=O)-、-C(=O)(CH2)2N+H2(CH2)3C(=O)-、-C(=O)(CH2)2S(CH2)3C(=O)-、-C(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)2NHC(=O)(CH2)2C(=O)-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)3C(=O)-、-C(=O)(CH2)3NHC(=O)CH2C(=O)-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)4C(=O)-、-C(=O)(CH2)4NHC(=O)CH2C(=O)-、-C(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)3C(=O)-、-C(=O)(CH2)3NHC(=O)(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)3C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、および-C(=O)(CH2)2NHC(=O)(CH2)3C(=O)-からなる群より選択される。より好ましくは、リンカーは、-C(=O)(CH2)5C(=O)-、-C(=O)(CH2)6C(=O)-、-C(=O)(CH2)7C(=O)-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)2NHC(=O)CH2C(=O)-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)3C(=O)-、および-C(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-からなる群より選択される。特に好ましいリンカーには、-C(=O)(CH2)5C(=O)-および-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-が含まれる。
【００６２】
Zaa1が、例えばL-リジンまたはL-オルニチンのようにアミノ基を含む側鎖を有し、Zaa2が、例えばL-アスパラギン酸またはL-グルタミン酸のようにカルボン酸を含む側鎖を有する場合、好ましいリンカーは、-C(=O)(CH2)4NH-、-C(=O)(CH2)5NH-、-C(=O)(CH2)6NH-、-C(=O)(CH2)7NH-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)N+H2(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)S(CH2)2NH-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)2NHC(=O)CH2NH-、-C(=O)(CH2)2SS(CH2)2-NH-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)3NH-、-C(=O)(CH2)2N+H2(CH2)3NH-、-C(=O)(CH2)2S(CH2)3NH-、-C(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)2NHC(=O)(CH2)2NH-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)3NH-、-C(=O)(CH2)3NHC(=O)CH2NH-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)4NH-、-C(=O)(CH2)4NHC(=O)CH2NH-、-C(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)3NH-、-C(=O)(CH2)3NHC(=O)(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)3C(=O)NH(CH2)2NH-、および-C(=O)(CH2)2NHC(=O)(CH2)3NH-からなる群より選択される。より好ましくは、リンカーは、-C(=O)(CH2)5NH-、-C(=O)(CH2)6NH-、-C(=O)(CH2)7NH-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)2NHC(=O)CH2NH-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)3NH-、および-C(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)2NH-からなる群より選択される。特に好ましいリンカーには、-C(=O)(CH2)5NH-および-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)2NH-が含まれる。
【００６３】
Zaa1が、例えばL-アスパラギン酸またはL-グルタミン酸のようにカルボン酸を含む側鎖を有し、Zaa2が、例えばL-リジンまたはL-オルニチンのようにアミノ基を含む側鎖を有する場合、好ましいリンカーは、-NH(CH2)4C(=O)-、-NH(CH2)5C(=O)-、-NH(CH2)6C(=O)-、-NH(CH2)7C(=O)-、-NH(CH2)2O(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)N+H2(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)S(CH2)2C(=O)-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)2NHC(=O)CH2C(=O)-、-NH(CH2)2SS(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)2O(CH2)3C(=O)-、-NH(CH2)2N+H2(CH2)3C(=O)-、-NH(CH2)2S(CH2)3C(=O)-、-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)2NHC(=O)(CH2)2C(=O)-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)3C(=O)-、-NH(CH2)3NHC(=O)CH2C(=O)-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)4C(=O)-、-NH(CH2)4NHC(=O)CH2C(=O)-、-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)3C(=O)-、-NH(CH2)3NHC(=O)(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)3C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、および-NH(CH2)2NHC(=O)(CH2)3C(=O)-からなる群より選択される。より好ましくは、リンカーは、-NH(CH2)5C(=O)-、-NH(CH2)6C(=O)-、-NH(CH2)7C(=O)-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)2NHC(=O)CH2C(=O)-、-NH(CH2)2O(CH2)3C(=O)-、および-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-からなる群より選択される。特に好ましいリンカーには、-NH(CH2)5C(=O)-および-NHCH2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-が含まれる。
【００６４】
好ましくは、構造的に拘束されたペプチド部分のアミノ酸配列は9〜32アミノ酸残基長、より好ましくは9〜31アミノ酸長、さらにより好ましくは9〜30アミノ酸長、さらにより好ましくは9〜29アミノ酸長、さらにより好ましくは9〜28アミノ酸長、さらにより好ましくは9〜27アミノ酸長、さらにより好ましくは9〜26アミノ酸長、さらにより好ましくは9〜25アミノ酸長、さらにより好ましくは9〜24アミノ酸長、さらにより好ましくは9〜23アミノ酸長、さらにより好ましくは9〜22アミノ酸長、さらにより好ましくは9〜21アミノ酸長、さらにより好ましくは9〜20アミノ酸長、さらにより好ましくは9〜19アミノ酸長、さらにより好ましくは9〜18アミノ酸長、さらにより好ましくは9〜17アミノ酸長、さらにより好ましくは9〜16アミノ酸長、さらにより好ましくは9〜15アミノ酸長、さらにより好ましくは9〜14アミノ酸長、なおさらにより好ましくは9〜13アミノ酸長である。特に好ましいアミノ酸配列は、9〜12アミノ酸残基長である。
【００６５】
本発明の特に好ましい複合体は、以下の式(II)〜(VI)の1つに表される構造的に拘束されたペプチド部分を含む：
2008504239.tif 000009
式中、Haa1、Haa2、Haa3、Haa4、Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa5、Saa、Naa、およびLは式(I)について上記で定義した通りであり、mは0または1であり、R1およびR1'は式(I)中のRおよびR'について上記で定義した通りであり、Zaa1-L-Zaa2はリンカーLによって架橋された側鎖を有する2つのアミノ酸残基を表し、かつ細胞標的化部分は、R1、R1'を介してまたはペプチド内の官能性アミノ酸側鎖を介してペプチド部分に結合される；
2008504239.tif 000010
式中、Haa1、Haa2、Haa3、Haa4、Xaa1、Xaa2、Xaa4、Xaa5、Saa、Naa、およびLは式(I)について上記で定義した通りであり、Xaa6はXaa1について上記で定義したアミノ酸残基であり；mは0または1であり、R2およびR2'は式(I)中のRおよびR'について上記で定義した通りであり、Zaa1-L-Zaa2はリンカーLによって架橋された側鎖を有する2つのアミノ酸残基を表し、かつ細胞標的化部分は、R2、R2'を介してまたはペプチド内の官能性アミノ酸側鎖を介してペプチド部分に結合される；
2008504239.tif 000011
式中、Haa1、Haa2、Haa3、Haa4、Xaa1、Xaa3、Xaa4、Saa、Naa、およびLは式(I)について上記で定義した通りであり、pは0または1であり、R3およびR3'は式(I)中のRおよびR'について上記で定義した通りであり、Zaa1-L-Zaa2はリンカーLによって架橋された側鎖を有する2つのアミノ酸残基を表し、かつ細胞標的化部分は、R3、R3'を介してまたはペプチド内の官能性アミノ酸側鎖を介してペプチド部分に結合される；
2008504239.tif 000012
式中、Haa1、Haa2、Haa3、Haa4、Xaa1、Xaa2、Xaa4、Xaa5、Saa、Naa、およびLは式(I)について上記で定義した通りであり、nは0または1であり、R4およびR4'は式(I)中のRおよびR'について上記で定義した通りであり、Zaa1-L-Zaa2はリンカーLによって架橋された側鎖を有する2つのアミノ酸残基を表し、かつ細胞標的化部分は、R4、R4'を介してまたはペプチド内の官能性アミノ酸側鎖を介してペプチド部分に結合される；ならびに
2008504239.tif 000013
式中、Haa1、Haa2、Haa3、Haa4、Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa5、Saa、Naa、およびLは式(I)について上記で定義した通りであり、Xaa6はXaa1について上記で定義したアミノ酸残基であり；nは0または1であり、R5およびR5'は式(I)中のRおよびR'について上記で定義した通りであり、Zaa1-L-Zaa2はリンカーLによって架橋された側鎖を有する2つのアミノ酸残基を表し、かつ細胞標的化部分は、R5、R5'を介して、もしくはペプチド；またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ内の官能性アミノ酸側鎖を介してペプチド部分に結合される。
【００６６】
本発明の特に好ましい複合体は、以下の式(VII)のペプチドに由来する構造的に拘束されたペプチド部分を含む：
2008504239.tif 000014
式中、Zaa1、Haa2、Xaa3、Xaa4、Haa3、Saa、Naa、Zaa2、Haa4、R3、R3'、およびLは式(IV)において上記で定義されており、かつ細胞標的化部分は、R3、R3'、またはペプチド内の官能性アミノ酸側鎖を介してペプチド部分に結合される。
【００６７】
本発明の特に好ましい複合体は、以下の式(VIII)のペプチドに由来する構造的に拘束されたペプチド部分を含む：
2008504239.tif 000015
式中、R6はアセチルであるか、または細胞標的化部分との連結を表し、
R6'はNH2であるか、または細胞標的化部分との連結を表し；かつ
Zaa1およびZaa2がL-アスパラギン酸、L-グルタミン酸から選択され；かつ
Lが、-NH(CH2)4NH-、-NH(CH2)5NH-、-NH(CH2)6NH-、-NH(CH2)7NH-、-NH(CH2)2O(CH2)2NH-、-NH(CH2)N+H2(CH2)2NH-、-NH(CH2)S(CH2)2NH-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)2NH-、-NH(CH2)2NHC(=O)CH2NH-、-NH(CH2)2SS(CH2)2NH-、-NH(CH2)2O(CH2)3NH-、-NH(CH2)2N+H2(CH2)3NH-、-NH(CH2)2S(CH2)3NH-、-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)2NH-、および-NH(CH2)2NHC(=O)(CH2)2NH-から選択されるか；または
Zaa1およびZaa2がL-リジンおよびオルニチンから選択され；かつ
Lが、-C(=O)(CH2)4C(=O)-、-C(=O)(CH2)5C(=O)-、-C(=O)(CH2)6C(=O)-、-C(=O)(CH2)7C(=O)-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)N+H2(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)S(CH2)2C(=O)-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)2NHC(=O)CH2C(=O)-、-C(=O)(CH2)2SS(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)3C(=O)-、-C(=O)(CH2)2N+H2(CH2)3C(=O)-、-C(=O)(CH2)2S(CH2)3C(=O)-、-C(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、および-C(=O)(CH2)2NHC(=O)(CH2)2C(=O)-から選択されるか；または
Zaa1がL-アスパラギン酸、L-グルタミン酸から選択され、かつZaa2がL-リジンおよびオルニチンから選択され；かつ
Lが、-NH(CH2)4C(=O)-、-NH(CH2)5C(=O)-、-NH(CH2)6C(=O)-、-NH(CH2)7C(=O)-、-NH(CH2)2O(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)N+H2(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)S(CH2)2C(=O)-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)2NHC(=O)CH2C(=O)-、-NH(CH2)2SS(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)2O(CH2)3C(=O)-、-NH(CH2)2N+H2(CH2)3C(=O)-、-NH(CH2)2S(CH2)3C(=O)-、-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、および-NH(CH2)2NHC(=O)(CH2)2C(=O)-から選択されるか；または
Zaa1がL-リジンおよびオルニチンから選択され、かつZaa2がL-アスパラギン酸、L-グルタミン酸から選択され；かつ
Lが、-C(=O)(CH2)4NH-、-C(=O)(CH2)5NH-、-C(=O)(CH2)6NH-、-C(=O)(CH2)7NH-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)N+H2(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)S(CH2)2NH-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)2NHC(=O)CH2NH-、-C(=O)(CH2)2SS(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)3NH-、-C(=O)(CH2)2N+H2(CH2)3NH-、-C(=O)(CH2)2S(CH2)3NH-、-C(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)2NH-、および-C(=O)(CH2)2NHC(=O)(CH2)2NH-から選択され；
かつ、細胞標的化部分とペプチド部分は、R6、R6'、またはペプチド内の官能性アミノ酸側鎖を介して結合される;
または式(IX)のペプチドに由来する構造的に拘束されたペプチド部分：
2008504239.tif 000016
式中、R7はアセチルであるか、または細胞標的化部分との連結を表し、
R7'はNH2であるか、または細胞標的化部分との連結を表し；かつ
Zaa1およびZaa2がL-アスパラギン酸、L-グルタミン酸から選択され；かつ
Lが、-NH(CH2)4NH-、-NH(CH2)5NH-、-NH(CH2)6NH-、-NH(CH2)7NH-、-NH(CH2)2O(CH2)2NH-、-NH(CH2)N+H2(CH2)2NH-、-NH(CH2)S(CH2)2NH-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)2NH-、-NH(CH2)2NHC(=O)CH2NH-、-NH(CH2)2SS(CH2)2NH-、-NH(CH2)2O(CH2)3NH-、-NH(CH2)2N+H2(CH2)3NH-、-NH(CH2)2S(CH2)3NH-、-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)2NH-、-NH(CH2)2NHC(=O)(CH2)2NH-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)3NH-、-NH(CH2)3NHC(=O)CH2NH-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)4NH-、-NH(CH2)4NHC(=O)CH2NH-、-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)3NH-、-NH(CH2)3NHC(=O)(CH2)2NH-、-NH(CH2)3C(=O)NH(CH2)2NH-、および-NH(CH2)2NHC(=O)(CH2)3NH-から選択されるか；または
Zaa1およびZaa2がL-リジンおよびオルニチンから選択され；かつ
Lが、-C(=O)(CH2)4C(=O)-、-C(=O)(CH2)5C(=O)-、-C(=O)(CH2)6C(=O)-、-C(=O)(CH2)7C(=O)-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)N+H2(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)S(CH2)2C(=O)-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)2NHC(=O)CH2C(=O)-、-C(=O)(CH2)2SS(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)3C(=O)-、-C(=O)(CH2)2N+H2(CH2)3C(=O)-、-C(=O)(CH2)2S(CH2)3C(=O)-、-C(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)2NHC(=O)(CH2)2C(=O)-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)3C(=O)-、-C(=O)(CH2)3NHC(=O)CH2C(=O)-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)4C(=O)-、-C(=O)(CH2)4NHC(=O)CH2C(=O)-、-C(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)3C(=O)-、-C(=O)(CH2)3NHC(=O)(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)3C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、および-C(=O)(CH2)2NHC(=O)(CH2)3C(=O)-から選択されるか；または
Zaa1がL-アスパラギン酸、L-グルタミン酸から選択され、かつZaa2がL-リジンおよびオルニチンから選択され；かつ
Lが、-NH(CH2)4C(=O)-、-NH(CH2)5C(=O)-、-NH(CH2)6C(=O)-、-NH(CH2)7C(=O)-、-NH(CH2)2O(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)N+H2(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)S(CH2)2C(=O)-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)2NHC(=O)CH2C(=O)-、-NH(CH2)2SS(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)2O(CH2)3C(=O)-、-NH(CH2)2N+H2(CH2)3C(=O)-、-NH(CH2)2S(CH2)3C(=O)-、-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)2NHC(=O)(CH2)2C(=O)-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)3C(=O)-、-NH(CH2)3NHC(=O)CH2C(=O)-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)4C(=O)-、-NH(CH2)4NHC(=O)CH2C(=O)-、-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)3C(=O)-、-NH(CH2)3NHC(=O)(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)3C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、および-NH(CH2)2NHC(=O)(CH2)3C(=O)-から選択されるか；または
Zaa1がL-リジンおよびオルニチンから選択され、かつZaa2がL-アスパラギン酸、L-グルタミン酸から選択され；かつ
Lが、-C(=O)(CH2)4NH-、-C(=O)(CH2)5NH-、-C(=O)(CH2)6NH-、-C(=O)(CH2)7NH-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)N+H2(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)S(CH2)2NH-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)2NHC(=O)CH2NH-、-C(=O)(CH2)2SS(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)3NH-、-C(=O)(CH2)2N+H2(CH2)3NH-、-C(=O)(CH2)2S(CH2)3NH-、-C(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)2NHC(=O)(CH2)2NH-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)3NH-、-C(=O)(CH2)3NHC(=O)CH2NH-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)4NH-、-C(=O)(CH2)4NHC(=O)CH2NH-、-C(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)3NH-、-C(=O)(CH2)3NHC(=O)(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)3C(=O)NH(CH2)2NH-、および-C(=O)(CH2)2NHC(=O)(CH2)3NH-から選択され；かつ、細胞標的化部分とペプチド部分は、R7、R7'、またはペプチド内の官能性アミノ酸側鎖を介して結合される;
または以下の式(X)〜(XVII)のいずれか1つのペプチドに由来する構造的に拘束されたペプチド部分：
2008504239.tif 000017
式中、Raはアセチルであるか、または細胞標的化部分との連結を表し、かつRa'はNH2であるか、または細胞標的化部分との連結を表す。いずれの場合にも、細胞標的化部分は、Ra、Ra'、またはペプチド内の官能性アミノ酸側鎖を介してペプチドに結合されてもよく、かつ
Zaa1およびZaa2がL-アスパラギン酸、L-グルタミン酸から選択され；かつ
Lが、-NH(CH2)4NH-、-NH(CH2)5NH-、-NH(CH2)6NH-、-NH(CH2)7NH-、-NH(CH2)2O(CH2)2NH-、-NH(CH2)N+H2(CH2)2NH-、-NH(CH2)S(CH2)2NH-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)2NH-、-NH(CH2)2NHC(=O)CH2NH-、-NH(CH2)2SS(CH2)2NH-、-NH(CH2)2O(CH2)3NH-、-NH(CH2)2N+H2(CH2)3NH-、-NH(CH2)2S(CH2)3NH-、-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)2NH-、および-NH(CH2)2NHC(=O)(CH2)2NH-から選択されるか；または
Zaa1およびZaa2がL-リジンおよびオルニチンから選択され；かつ
Lが、-C(=O)(CH2)4C(=O)-、-C(=O)(CH2)5C(=O)-、-C(=O)(CH2)6C(=O)-、-C(=O)(CH2)7C(=O)-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)N+H2(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)S(CH2)2C(=O)-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)2NHC(=O)CH2C(=O)-、-C(=O)(CH2)2SS(CH2)2C(=O)-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)3C(=O)-、-C(=O)(CH2)2N+H2(CH2)3C(=O)-、-C(=O)(CH2)2S(CH2)3C(=O)-、-C(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、および-C(=O)(CH2)2NHC(=O)(CH2)2C(=O)-から選択されるか；または
Zaa1がL-アスパラギン酸、L-グルタミン酸から選択され、かつZaa2がL-リジンおよびオルニチンから選択され；かつ
Lが、-NH(CH2)4C(=O)-、-NH(CH2)5C(=O)-、-NH(CH2)6C(=O)-、-NH(CH2)7C(=O)-、-NH(CH2)2O(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)N+H2(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)S(CH2)2C(=O)-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)2NHC(=O)CH2C(=O)-、-NH(CH2)2SS(CH2)2C(=O)-、-NH(CH2)2O(CH2)3C(=O)-、-NH(CH2)2N+H2(CH2)3C(=O)-、-NH(CH2)2S(CH2)3C(=O)-、-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)2C(=O)-、および-NH(CH2)2NHC(=O)(CH2)2C(=O)-から選択されるか；または
Zaa1がL-リジンおよびオルニチンから選択され、かつZaa2がL-アスパラギン酸、L-グルタミン酸から選択され；かつ
Lが、-C(=O)(CH2)4NH-、-C(=O)(CH2)5NH-、-C(=O)(CH2)6NH-、-C(=O)(CH2)7NH-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)N+H2(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)S(CH2)2NH-、-C(=O)CH2C(=O)NH(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)2NHC(=O)CH2NH-、-C(=O)(CH2)2SS(CH2)2NH-、-C(=O)(CH2)2O(CH2)3NH-、-C(=O)(CH2)2N+H2(CH2)3NH-、-C(=O)(CH2)2S(CH2)3NH-、-C(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)2NH-、および-C(=O)(CH2)2NHC(=O)(CH2)2NH-から選択され；
かつ式中、[C]は、リジン側鎖などの側鎖に連結されるシステインを表し；
ラウロイルは、N末端において、またはリジンなどの側鎖を介してペプチドに付着される脂肪酸ラウリン酸を示し；
Acpはアミノカプロン酸スペーサーの含有を示し；かつ
Solは可溶化配列を表す。
【００６８】
式(X)〜(XVII)のいずれか1つに由来する好ましい構造的に拘束されたペプチドは、Zaa1およびZaa2がグルタミン酸であり、かつ
Lが、-NH(CH2)4NH-、-NH(CH2)5NH-、-NH(CH2)6NH-、-NH(CH2)7NH-、-NH(CH2)2O(CH2)2NH-、-NH(CH2)N+H2(CH2)2NH-、-NH(CH2)S(CH2)2NH-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)2NH-、-NH(CH2)2NHC(=O)CH2NH-、-NH(CH2)2SS(CH2)2NH-、-NH(CH2)2O(CH2)3NH-、-NH(CH2)2N+H2(CH2)3NH-、-NH(CH2)2S(CH2)3NH-、-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)2NH-、および-NH(CH2)2NHC(=O)(CH2)2NH-から選択されるものである。
【００６９】
式(X)〜(XVII)の構造的に拘束されたペプチドはそれぞれ、アッセイで使用するための標識と任意に連結され得る。例えば、構造的に拘束されたペプチドは、細胞内へのペプチドの内部移行を判定するために、フルオレセインイソチオシアネート(Fitc)などの標識と、またはBcl-2タンパク質へのペプチドの結合を判定するために、ビオチンと連結され得る。標識は、スペーサーを通してリジンなどの適切なアミノ酸側鎖を介して、またはペプチドのN末端もしくはC末端を介して、構造的に拘束されたペプチドに簡便に付着され得る。標識と連結され得るアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基は、構造的拘束物に結合されておらず、またはBcl-2タンパク質への結合にも必要でない、配列中の任意のアミノ酸残基であってよい。アッセイにおいて使用するための適切な標識には、これらに限定されないが、フルオレセインイソチオシアネート(Fitc)、ローダミンイソチオシアネート(Rits)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRitc)、フルオロセインジクロロトリアジン(DTAF)、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルデヒド、フルオレスカミン、ビオチン、ストレプトアビジンなどが含まれる。他の適切な標識は、当業者に周知である。
【００７０】
式(X)〜(XIV)および(XVI)の構造的に拘束されたペプチドは、細胞膜を介したペプチド透過を補助するための脂肪酸、ラウリン酸、または配列-RRRRRRR-を含む。細胞膜を介した透過を補助するために、任意の脂肪酸を、構造的に拘束されたペプチドに付着させることができる。好ましい脂肪酸エステルには、ラウロイル、カプロイル、ミリストイル、およびパルミトイルが含まれる。溶解度を補助するために、可溶化配列、Solが存在してもよい。適切な可溶化配列は当業者に周知であり、これらに限定されないが、-SSSS-などの1つもしくは複数の残基を含む任意の荷電もしくは極性アミノ酸配列、または短いポリエチレングリコール(PEG)などの他の極性もしくは荷電部分が含まれる。
【００７１】
細胞透過脂肪酸または配列との間のジスルフィド結合を有するペプチドの使用は、内部移行した後にジスルフィド結合が還元条件下において細胞内で切断され得ることから、適切なプロドラッグであり得る。
【００７２】
特に好ましい構造的に拘束されたペプチド部分の例には、以下のものが含まれる：
2008504239.tif 000018
2008504239.tif 000019
式中、Raはアセチルであるか、または細胞標的化部分との連結を表し、かつRa'はNH2であるか、または細胞標的化部分との連結を表し、かつ細胞標的化部分は、Ra、Ra'、またはペプチド内の官能性アミノ酸側鎖を介してペプチドに結合され、かつ
Zaa1、Zaa2、およびLは上記で定義した通りである。好ましくは、Zaa1およびZaa2は、L-アスパラギン酸およびL-グルタミン酸から独立して選択され、かつ好ましくは、Lは、-NH(CH2)5NH-、-NH(CH2)6NH-、-NH(CH2)7NH-、-NHCH2(=O)NH(CH2)2NH-、-NH(CH2)2NHC(=O)CH2NH-、-NH(CH2)2O(CH2)3NH-、および-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)2NH-から選択される。特に好ましいリンカーには、-NH(CH2)5NH-および-NHCH2C(=O)NH(CH2)2NH-が含まれる。
【００７３】
特に好ましい構造的に拘束されたペプチド部分には、以下のものが含まれる：
2008504239.tif 000020
式中、Raはアセチルであるか、または細胞標的化部分との連結を表し、かつRa'はNH2であるか、または細胞標的化部分との連結を表し、かつ細胞標的化部分は、Ra、Ra'、またはペプチド内の官能性アミノ酸側鎖を介してペプチドに結合され、ならびに
Zaa1およびZaa2はL-アスパラギン酸およびL-グルタミン酸から独立して選択され、特にL-グルタミン酸である。
【００７４】
本発明は、構造的に拘束されたペプチド部分内のレトロインベルソ(retro-inverso)アミノ酸配列もまた包含する。「レトロインベルソアミノ酸配列」という用語は、配列の方向が逆転し(「レトロ」)、各アミノ酸残基の対掌性が反転している(「インベルソ」)線状ペプチドの異性体、Jameson et al., 1994、Brady et al., 1994を指す。例えば、親ペプチドがThr-Ala-Tyrである場合、レトロ修飾型はTyr-Ala-Thrであり、インベルソ修飾型はthr-ala-tyrであり、レトロインベルソ型はtyr-ala-thrである(小文字はD-アミノ酸を指す)。親ペプチドと比較すると、ヘリックスレトロインベルソペプチドは、側鎖の本来の空間構造を実質的に保持し得るが、逆転したペプチド結合を有し、その結果、すべてのペプチド骨格水素結合相互作用がヘリックス構造の維持に関与するために、親ペプチドと酷似したトポロジーを有するレトロインベルソ異性体が生じる。
【００７５】
本発明の複合体において使用するための構造的に拘束されたペプチド部分は、当技術分野において周知の技法を用いて調製することができる。例えば、ペプチドは、様々な固相技法(Roberge et. al.;1995を参照されたい)を用いて、または例えばPioneerペプチド合成機および標準的なF-moc化学を用いる自動合成、Fields (1991)により合成し得る。
【００７６】
線状ペプチドはまた、当技術分野において周知である組換えDNA技法を用いて調製することも可能である。例えば、必要なアミノ酸配列を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列を、プラスミドなどの適切なDNAベクター内に挿入することが可能である。DNAベクターを調製するのに適した技法は、Sambrook, J., et. al., 1989に記載されている。挿入したならば、ベクターを用いて適切な宿主を形質転換する。次いで、発現によって、宿主内で組換えペプチドを産生させる。形質転換宿主は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。
【００７７】
一度ペプチドが調製されると、これらのペプチドは分取HPLCによって実質的に精製し得る。合成ペプチドの組成は、アミノ酸解析によってまたは配列決定によって(エドマン分解法を用いて)確認することができる。
【００７８】
あるいは、Bimタンパク質のアミノ酸残基88〜99(全長Bimタンパク質に対して)をコードするヌクレオチド配列を、当技術分野で周知の技法を用いて、例えば、塩基類似体、脱アミノ剤、もしくはアルキル化剤などの化学変異原で、またはUVもしくは電離放射線もしくは熱などの物理変異原で処理して、突然変異を誘発し得る。次いで、当業者に周知の標準的な手順を用いて、変異体ヌクレオチド配列を適切な宿主中で発現させ、組換えポリペプチドを精製し得る。
【００７９】
リンカーは、周知の技法を用いて、構造的に拘束されたペプチド部分を形成するようにペプチド内に導入し得る。例えば、Zaa1およびZaa2が、アスパラギン酸またはグルタミン酸のように酸性側鎖を有する残基である場合には、ペプチドを合成する前に、Zaa1およびZaa2をそれぞれ選択的に保護する。ペプチド合成後、保護基の一方(P1)を選択的に除去し、生じたカルボン酸基をリンカーのアミンと反応させて、アミド結合を形成させる。もう一方の保護基(P2)を除去し、第2のカルボン酸をリンカー上の別のアミンと反応させて、第2のアミド結合を形成させる。この工程をスキーム1に示す。
【００８０】
同様に、Zaa1およびZaa2が、リジンまたはオルニチンのようにアミノ側鎖を有する残基である場合には、これらの残基をジカルボン酸と反応させ得る。ペプチドを合成する前に、アミノ酸側鎖上のアミノ基の一方を選択的に保護し得る。反応中、ジカルボン酸リンカー前駆体上のカルボン酸基の一方を選択的に保護しておく。残されたカルボン酸をリジンまたはオルニチン残基のアミンと反応させて、アミド結合を形成させる。カルボン酸保護基(P1)およびアミノ保護基(P2)を除去し、第2のカルボン酸をリジンまたはオルニチン残基上の第2のアミンと反応させて、第2のアミド結合を形成させる。この工程をスキーム2に示す。
【００８１】
Zaa1およびZaa2の一方が酸性側鎖を有し、もう一方がアミノ側鎖を有し、リンカーが1つのアミノ基および1つのカルボン酸基を有する場合にも、同様の工程を用いることができる。一方の側鎖の選択的脱保護、リンカーとの反応、その後のもう一方の側鎖およびリンカーの残存する反応基の脱保護により、リンカーを導入することが可能である。
【００８２】
カルボン酸およびアミンなどの反応性官能基に関する適切な保護および脱保護法は、例えばProtective Groups in Organic Synthesis, T.W. Green & P. Wutz, John Wiley & Son, 3rd Ed, 1999などにあるように、当技術分野において周知である。
【００８３】
2008504239.tif 000021
【００８４】
2008504239.tif 000022
【００８５】
別の合成では、アミノ酸残基Z1またはZ2をペプチド内に取り込む前に、リンカーをアミノ酸残基Z1またはZ2の側鎖と反応させる。例えば、Z1およびZ2が、例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸のようにその側鎖内にカルボン酸を有するアミノ酸であり、リンカーが、ジアミノアルキル基または上記のようにLを提供すると考えられる別のジアミノ基のようなジアミノ含有基である場合、ペプチド合成を行う前に、リンカーをZ1またはZ2と反応させ得る。例えば、標準的なアミド形成技法を用いることができる。例示的な合成をスキーム3に示す。
2008504239.tif 000023
【００８６】
Z1およびZ2が、例えばリジンまたはオルニチンのようにその側鎖内にアミノ基を有するアミノ酸側鎖を有し、リンカーが、アルキルジカルボン酸基または上記のようにLを提供すると考えられる別のジカルボン酸基のようなジカルボン酸基である場合、標準的なアミド形成技法を用いてリンカーを導入することができる。例示的な合成をスキーム4に示す。
2008504239.tif 000024
【００８７】
同様に、Z1およびZ2の一方がアミン含有側鎖を有するアミノ酸であり、もう一方がカルボン酸含有側鎖を有し、リンカーがアミノカルボン酸である場合、上記のように標準的なアミド形成技法を用いて、Z1またはZ2にリンカーを付着させることができる。例示的な合成をスキーム5および6に示す。
2008504239.tif 000025
2008504239.tif 000026
【００８８】
スキーム3〜6において、P1、P2、およびP3は適切な保護基である。P3はアミノ酸との結合中に存在してもよいし、または結合が完了した後に導入してもよい。P2は、固相ペプチド合成において直接使用できるように、好ましくはP1の存在下で容易に除去され得る。好ましくは、P1はFmocである。
【００８９】
リンカーと結合したアミノ酸が調製されたならば、例えば固相合成または液相合成など、上記の標準的なペプチド合成を用いてこれをペプチド内に導入することができる。ペプチド合成が完了した後、リンカー上およびリンカーと結合されていないアミノ酸残基、Z1またはZ2上の保護基を除去し、次いで標準的なアミド形成技法により、リンカーをペプチド内の第2のアミノ酸に結合させる。リンカーの結合は、固相合成においてペプチドが樹脂になお付着したまま達成され得るか、または液相においては樹脂から切断された後に達成され得る。
【００９０】
例示的な合成をスキーム7に示す。
2008504239.tif 000027
【００９１】
好ましい態様において、リンカー末端およびリンカーを結合させる側鎖上の保護基は、リンカー末端とアミノ酸側鎖との結合が起こる前に、他のアミノ酸側鎖の保護を除去することなく選択的に除去され得る。適切な保護基は、ペプチド合成の分野の当業者によって容易に決定される。
【００９２】
好ましい態様において、Z1およびZ2はグルタミン酸残基であり、ペプチド合成の前に、グルタミン酸の一方を、1,4-ジアミノブタン、1,5-ジアミノペンタン、または1,6-ジアミノヘキサンなどのジアミノアルカンと結合させる。
【００９３】
スキーム3〜7に記載したこの代替合成は、リンカーの導入中に起こる望ましくない副反応を軽減または除去するのに特に有用である。
【００９４】
さらに、ペプチド合成中、ペプチドがグリシン残基に隣接したアスパラギン酸を有する場合に、望ましくないアスパルチミド誘導体が形成され得ることが見出されている。これは、ベンジル保護基の使用を回避し、0.2 M HOBt/25%ピペリジン-DMF溶液を用いた1分間のFmoc脱保護段階を使用することによって回避される。
【００９５】
本発明の1つの局面により、以下の段階を含む、構造的に拘束されたペプチドを調製する方法が提供される：
(i) リンカーの第1の官能基がアミノ酸側鎖の反応基と共有結合するように、第1の官能基および第2の官能基を含むリンカーをアミノ酸側鎖上の反応基と反応させる段階；
(ii) 必要に応じて、リンカーの第2の官能基を保護する段階；
(iii) (i)または(ii)からのアミノ酸を、リンカーの第2の官能基と共有結合し得る反応性側鎖を有する第2のアミノ酸を含むペプチド中に取り込む段階；
(iv) 必要に応じて、リンカーの第2の官能基を脱保護する段階；ならびに
(v) リンカーの第2の官能基を第2アミノ酸の反応性側鎖と反応させる段階。
【００９６】
本発明の別の局面に従って、以下の段階を含む本発明による方法が提供される:
(i) アミド結合によってリンカーとアミノ酸側鎖が結合されるように、1つのアミノ基および1つの任意で保護されたアミノ基、または1つのアミノ基および1つの任意で保護されたカルボン酸基を有するリンカーを、カルボン酸を含む側鎖を有するアミノ酸と反応させる段階；
(ii) (i)からのアミノ酸を、リンカーの未結合のアミノ基またはカルボン酸基と反応し得る側鎖を有する第2のアミノ酸残基を含むペプチド中に取り込む段階；
(iii) 必要に応じて、リンカーのアミノ基またはカルボン酸基を脱保護する段階；ならびに
(iv) 第2のアミノ酸側鎖を、リンカーのアミノ基またはカルボン酸基と反応させて、アミド結合を形成させる段階。
【００９７】
本発明のさらに別の局面に従って、以下の段階を含む本発明による方法が提供される:
(i) アミド結合によってリンカーとアミノ酸側鎖が結合されるように、1つのカルボン酸基および1つの任意で保護されたカルボン酸基、または1つのカルボン酸基および1つの任意で保護されたアミノ基を有するリンカーを、アミノ基を含む側鎖を有するアミノ酸と反応させる段階；
(ii) (i)からのアミノ酸を、リンカーの未結合のアミノ基またはカルボン酸基と反応し得る側鎖を有する第2のアミノ酸残基を含むペプチド中に取り込む段階；
(iii) リンカーのアミノ基またはカルボン酸基を脱保護する段階；ならびに
(iv) 第2のアミノ酸側鎖を、リンカーのカルボン酸基またはアミノ基と反応させて、アミド結合を形成させる段階。
【００９８】
本方法のいくつかの態様では、段階(i)におけるアミノ酸残基は、例えばL-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、D-アスパラギン酸、またはD-グルタミン酸のようにその側鎖内にカルボン酸基を有し、リンカーは、H2N(CH2)4NH2、H2N(CH2)5NH2、H2N(CH2)6NH2、H2N(CH2)7NH2、H2N(CH2)2O(CH2)2NH2、H2N(CH2)2N+H2(CH2)2NH2、H2N(CH2)2S(CH2)2NH2、H2NCH2C(=O)NH(CH2)2NH2、H2N(CH2)2NHC(=O)CH2NH2、H2N(CH2)2SS(CH2)2-NH2、H2N(CH2)2O(CH2)3NH2、H2N(CH2)2N+H2(CH2)3NH2、H2N(CH2)2S(CH2)3NH2、H2N(CH2)2C(=O)NH(CH2)2NH2、H2N(CH2)2NHC(=O)(CH2)2NH2、H2NCH2C(=O)NH(CH2)3NH2、H2N(CH2)3NHC(=O)CH2NH2、H2NCH2C(=O)NH(CH2)4NH2、H2N(CH2)4NHC(=O)CH2NH2、H2N(CH2)2C(=O)NH(CH2)3NH2、H2N(CH2)3NHC(=O)(CH2)2NH2、H2N(CH2)3C(=O)NH(CH2)2NH2、およびH2N(CH2)2NHC(=O)(CH2)3NH2から選択される。より好ましくは、リンカーは、H2N(CH2)5NH2、H2N(CH2)6NH2、H2N(CH2)7NH2、H2NCH2C(=O)NH(CH2)2NH2、H2N(CH2)2NHC(=O)CH2NH2、H2N(CH2)2O(CH2)3NH2、およびH2N(CH2)2C(=O)NH(CH2)2NH2からなる群より選択される。特に好ましいリンカーには、H2N(CH2)5NH2およびH2NCH2C(=O)NH(CH2)2NH2が含まれる。
【００９９】
本方法のいくつかの態様では、段階(i)におけるアミノ酸残基は、例えばL-リジン、オルニチン、またはD-リジンのようにその側鎖内にアミノ基を有し、リンカーは、HOC(=O)(CH2)4C(=O)OH、HOC(=O)(CH2)5C(=O)OH、HOC(=O)(CH2)6C(=O)OH、HOC(=O)(CH2)7C(=O)OH、HOC(=O)(CH2)2O(CH2)2C(=O)OH、HOC(=O)(CH2)N+H2(CH2)2C(=O)OH、HOC(=O)(CH2)S(CH2)2C(=O)OH、HOC(=O)CH2C(=O)NH(CH2)2C(=O)OH、HOC(=O)(CH2)2NHC(=O)CH2C(=O)OH、HOC(=O)(CH2)2SS(CH2)2-C(=O)OH、HOC(=O)(CH2)2O(CH2)3C(=O)OH、HOC(=O)(CH2)2N+H2(CH2)3C(=O)OH、HOC(=O)(CH2)2S(CH2)3C(=O)OH、HOC(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)2C(=O)OH、HOC(=O)(CH2)2NHC(=O)(CH2)2C(=O)OH、HOC(=O)CH2C(=O)NH(CH2)3C(=O)OH、HOC(=O)(CH2)3NHC(=O)CH2C(=O)OH、HOC(=O)CH2C(=O)NH(CH2)4C(=O)OH、HOC(=O)(CH2)4NHC(=O)CH2C(=O)OH、HOC(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)3C(=O)OH、HOC(=O)(CH2)3NHC(=O)(CH2)2C(=O)OH、HOC(=O)(CH2)3C(=O)NH(CH2)2C(=O)OH、およびHOC(=O)(CH2)2NHC(=O)(CH2)3C(=O)OHから選択される。より好ましくは、リンカーは、HOC(=O)(CH2)5C(=O)OH、HOC(=O)(CH2)6C(=O)OH、HOC(=O)(CH2)7C(=O)OH、HOC(=O)CH2C(=O)NH(CH2)2C(=O)OH、HOC(=O)(CH2)2NHC(=O)CH2C(=O)OH、HOC(=O)(CH2)2O(CH2)3C(=O)OH、およびHOC(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)2C(=O)OHからなる群より選択される。特に好ましいリンカーには、HOC(=O)(CH2)5C(=O)OHおよびHOC(=O)CH2C(=O)NH(CH2)2C(=O)OHが含まれる。
【０１００】
本方法のいくつかの態様では、段階(i)におけるアミノ酸残基は、例えばL-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、D-アスパラギン酸、D-グルタミン酸、L-リジン、オルニチン、またはD-リジンのようにその側鎖内にカルボン酸基またはアミノ基を有し、リンカーは、HOC(=O)(CH2)4NH2、HOC(=O)(CH2)5NH2、HOC(=O)(CH2)6NH2、HOC(=O)(CH2)7NH2、HOC(=O)(CH2)2O(CH2)2NH2、HOC(=O)(CH2)N+H2(CH2)2NH2、HOC(=O)(CH2)S(CH2)2NH2、HOC(=O)CH2C(=O)NH(CH2)2NH2、HOC(=O)(CH2)2NHC(=O)CH2NH2、HOC(=O)(CH2)2SS(CH2)2-NH2、HOC(=O)(CH2)2O(CH2)3NH2、HOC(=O)(CH2)2N+H2(CH2)3NH2、HOC(=O)(CH2)2S(CH2)3NH2、HOC(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)2NH2、HOC(=O)(CH2)2NHC(=O)(CH2)2NH2、HOC(=O)CH2C(=O)NH(CH2)3NH2、HOC(=O)(CH2)3NHC(=O)CH2NH2、HOC(=O)CH2C(=O)NH(CH2)4NH2、HOC(=O)(CH2)4NHC(=O)CH2NH2、HOC(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)3NH2、HOC(=O)(CH2)3NHC(=O)(CH2)2NH2、HOC(=O)(CH2)3C(=O)NH(CH2)2NH2、およびHOC(=O)(CH2)2NHC(=O)(CH2)3NH2から選択される。より好ましくは、リンカーは、HOC(=O)(CH2)5NH2、HOC(=O)(CH2)6NH2、HOC(=O)(CH2)7NH2、HOC(=O)CH2C(=O)NH(CH2)2NH2、HOC(=O)(CH2)2NHC(=O)CH2NH2、HOC(=O)(CH2)2O(CH2)3NH2、およびHOC(=O)(CH2)2C(=O)NH(CH2)2NH2からなる群より選択される。特に好ましいリンカーには、HOC(=O)(CH2)5NH2およびHOC(=O)CH2C(=O)NH(CH2)2NH2が含まれる。
【０１０１】
これらのリンカーはまた、スキーム1および2に記載した、拘束されたペプチドを調製する他の方法における使用にも適している。
【０１０２】
上記の態様において、本方法において調製されるペプチドはまた、リンカーの未結合のアミノ基またはカルボン酸基と結合してアミド結合を形成し得る第2のアミノ酸残基を含む。好ましい態様において、第2のアミノ酸残基は、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、D-アスパラギン酸、D-グルタミン酸、L-リジン、オルニチン、またはD-リジンから選択される。好ましい態様において、本方法の段階(i)で調製されるアミノ酸、およびリンカーの未結合のアミノ基またはカルボン酸基と結合し得る第2のアミノ酸残基は、ペプチド内でi(i+7)の関係に位置する。
【０１０３】
アミノ酸は、固相ペプチド合成または液相ペプチド合成を用いて、ペプチド中に取り込まれ得る。好ましい態様においては、固相ペプチド合成が用いられる。
【０１０４】
好ましい態様において、段階(i)からのアミノ酸は、例えばαアミノ酸内のαアミノ基およびカルボン酸基などの、アミノ酸の側鎖の一部を形成しないアミノ基およびカルボン酸基の保護基を含む。適切な保護基には、他の保護基の存在下で除去され得る選択的保護基が含まれる。いくつかの態様において、αカルボン酸は、αアミノ保護基および任意にリンカーの未結合末端上の保護基を除去することなく除去され得る保護基で保護される。そのような保護基は、ペプチド合成の分野の当業者によって容易に確認され得る。適切なαカルボン酸保護基の一例は、t-ブチルである。好ましいαアミノ保護基は、任意のαカルボン酸保護を除去するために用いられる脱保護条件にも耐え得り、かつリンカーの未結合末端上の保護基を除去することなく脱保護され得るものである。そのような保護基は、ペプチド合成の当業者によって容易に確認され得る。適切なαアミノ保護基の一例は、Fmocである。この保護基は、固相合成手順における使用に特に適している。リンカーの未反応末端は、ペプチド合成中の望ましくない副反応を妨げるために、任意の適切な保護基で保護され得る。いくつかの態様において、この保護基は、αアミノ基および任意にαカルボン酸基上に存在する保護基を除去するために用いられる条件に耐え得る。リンカーの未反応末端がアミノ基である場合、適切な保護基には、これらに限定されないが、BOCおよびトリチルが含まれる。リンカーの未反応末端がカルボン酸基である場合、適切な保護基には、これらに限定されないが、t-ブチルおよび任意に置換されたフェニル基が含まれる。
【０１０５】
段階(i)におけるアミノ酸とリンカーとの間、またはリンカーの脱保護された未結合末端と第2のアミノ酸残基側鎖との間のアミド結合形成は、アミノ酸またはペプチド内のアミド結合形成に関する、当技術分野において周知の任意の手段によって達成され得る。一般に、アミノ窒素原子による求核攻撃のために、カルボン酸基を活性化する。カルボン酸は、周知の技法により、ハロゲン化アシル、アジ化アシル、酸無水物の形成によって、またはジカルボジイミド試薬を用いた反応によって活性化され得る。本発明の本方法の1つの態様においては、アミノ酸側鎖の一方または両方とリンカーの一方または両方の末端との間のアミド結合は、O-ベンゾトリアゾール-N,N,N',N'-テトラメチル-ウロニウムヘキサフルオロリン酸(HBTU)およびジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)を用いて行われる。
【０１０６】
構造的に拘束されたペプチド部分は、ペプチドとタンパク質または他のペプチドを結合するのに適した、当技術分野において周知である任意の手段によって、細胞標的化部分に結合され得る。例えば、カルボン酸とアミンを結合するための任意の一般的手段を用いて(Jones, 1992)、構造的に拘束されたペプチドのNもしくはC末端、またはリジン、グルタミン酸、もしくはアスパラギン酸などのNH2もしくはCO2H基を有する構造的に拘束されたペプチドの任意のアミノ酸側鎖が、細胞標的化部分上のCOOHまたはNH2基に結合され得る。細胞標的化部分が抗体またはタンパク質である場合には、抗体タンパク質の変性を妨げるよう、必要とされるいずれの脱保護段階過程においても注意を払わねばならない。
【０１０７】
1つの方法では、抗体上のリジン側鎖を、スペーサーを介してマレイミド環に連結している活性化カルボン酸エステルを含む化合物と反応させてもよい。その結果生じた抗体は複数のマレイミド環で修飾されており、構造的に拘束されたペプチド内に取り込まれたシステインなどのチオールと選択的かつ不可逆的に反応することになる。例えば、抗体を、N-ヒドロキシ-スクシンイミド(NHS)活性化型マレイミド-ACPまたはスルホスクシンイミジル-4-[N-マレイミドメチル]-シクロヘキサン-1-カルボン酸(スルホ-SMCC)と反応させてもよく、次いで、その結果生じた抗体をシステインを含む構造的に拘束されたペプチドと反応させ、その後、反応物を除去するために脱塩カラムにて精製し得る。または、抗体を、まず4-スクシンイミジルオキシカルボニル-α-メチル-α-(2-ピリジルジチオ)トルエン(SMPT)またはその水溶性変種LC-SMPTなどのNHS-ピリジルジスルフィドと反応させ；次いで、その抗体をシステイン含有ペプチドと反応させてジスルフィド結合を形成させ得る。そのようなジスルフィド結合は、細胞内で切断され得る。
【０１０８】
構造的に拘束されたペプチド部分および細胞標的化部分を含む複合体は、当業者に周知である任意の適切な技法によって生成され得る。したがって、本発明は、これらの部分を結合する任意の1つの特定の技法に依存せず、またそのような技法に関するものでもない。
【０１０９】
構造的に拘束されたペプチド部分を細胞標的化部分に付着させる方法は、各部分の生物活性が実質的に阻害されないまたは損なわれないようにあるべきである。それらを空間的に分離するために、リンカーまたはスペーサーを部分と部分との間に含めることができる。リンカーまたはスペーサー分子は、約1〜約100原子長であってよい。いくつかの態様において、リンカーまたはスペーサー分子は、1つまたは複数のアミノ酸残基(例えば、約1〜約50アミノ酸残基、望ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20アミノ酸残基)を含む。そのようなリンカーまたはスペーサーは、部分の適切な折りたたみを促進し得る。
【０１１０】
適切には、構造的に拘束されたペプチド部分は、細胞標的化部分に共有結合される。共有結合は、当業者に周知である任意の適切な手段によって達成され得る。例えば、架橋試薬を用いてポリペプチドを互いに連結することによって、キメラポリペプチドを調製することができる。そのような架橋剤の例には、これらに限定されないが、1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリニル-(4-エチル)カルボジイミド(CMC)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)、および1-エチル-3-(4-アゾニア-4,4-ジメチルペンチル)カルボジイミドなどのカルボジイミドが含まれる。この種類の例示的な架橋剤は、1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリニル-(4-エチル)カルボジイミド、(1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド(EDC)、および1-エチル-3-(4-アゾニア-4,4-ジメチルペンチル)カルボジイミドからなる群より選択される。他の適切な架橋剤の例は、臭化シアン、グルタルアルデヒド、および無水コハク酸である。
【０１１１】
一般に、ホモ二官能性アルデヒド、ホモ二官能性エポキシド、ホモ二官能性イミドエステル、ホモ二官能性N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、ホモ二官能性マレイミド、ホモ二官能性ハロゲン化アルキル、ホモ二官能性ピリジルジスルフィド、ホモ二官能性ハロゲン化アリール、ホモ二官能性ヒドラジド、ホモ二官能性ジアゾニウム誘導体、およびホモ二官能性光反応性化合物を含む多くのホモ二官能物質のいずれかを使用することができる。例えば、アミン反応基およびスルフヒドリル反応基を有する化合物、アミン反応基および光反応基を有する化合物、ならびにカルボニル反応基およびスルフヒドリル反応基を有する化合物などの、ヘテロ二官能性化合物もまた含まれる。
【０１１２】
ホモ二官能性試薬とは、少なくとも2つの同じ官能基を有する分子のことである。試薬の官能基は一般に、タンパク質上の官能基の1つ、典型的にはアミノ基と反応する。そのようなホモ二官能性架橋試薬の特定の例には、二官能性N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジチオビス(スクシンイミジルプロピオン酸)、スベリン酸ジスクシンイミジル、および酒石酸ジスクシンイミジル；二官能性イミドエステル、ジメチルアジプイミダート、ジメチルピメルイミダート、およびジメチルスベルイミダート；二官能性スルフヒドリル反応性架橋剤、1,4-ジ-[3'-(2'-ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ブタン、ビスマレイミドへキサン、およびビス-N-マレイミド-1,8-オクタン；二官能性ハロゲン化アリール、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼンおよび4,4'-ジフルオロ-3,3'-ジニトロフェニルスルホン；二官能性光反応性物質、例えばビス-[b-(4-アジドサリチルアミド)エチル]ジスルフィドなど；二官能性アルデヒド、ホルムアルデヒド、マロンジアルデヒド、スクシンアルデヒド、グルタルアルデヒド、およびアジプアルデヒド；二官能性エポキシド、例えば1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテルなど、二官能性ヒドラジド、アジピン酸ジヒドラジド、カルボヒドラジド、およびコハク酸ジヒドラジド；二官能性ジアゾニウム、o-トルイジン、ジアゾ化ベンジジンおよびビスジアゾ化ベンジジン；二官能性ハロゲン化アルキル、N,N'-エチレン-ビス(ヨードアセトアミド)、N,N'-ヘキサメチレン-ビス(ヨードアセトアミド)、N,N'-ウンデカメチレン-ビス(ヨードアセトアミド)、ならびにハロゲン化ベンジルおよびハロマスタード、例えば、それぞれα,α'-ジヨード-p-キシレンスルホン酸およびトリ(2-クロロエチル)アミンなどが含まれる。ホモ二官能性架橋剤を使用する方法は、当技術分野における実施者に周知である。例えば、架橋剤としてのグルタルアルデヒドの使用は、例えば、Poznansky et. al., 1984によって記載されている。架橋剤としてのジイミダートの使用は、例えば、Wang, et. al., 1977によって記載されている。
【０１１３】
本発明によるキメラまたは複合体分子を形成する目的でホモ二官能性架橋試薬を使用することは可能であるが、当技術分野の熟練した実施者であれば、これらの試薬を用いて異なるタンパク質を順序づけた様式で付着させることはより困難であることを理解すると考えられる。この点に関して、ホモ二官能性試薬を用いて第1のタンパク質と第2のタンパク質を連結する試みにおいて、第1のタンパク質が相互に、または第2のタンパク質が相互に連結することを回避することは不可能である。したがって、ヘテロ二官能性架橋試薬は、反応の順序を制御し、意のままにタンパク質を結合することができることから好ましい。よって、ヘテロ二官能性試薬は、2つのポリペプチドを連結するためのより精巧な方法を提供する。これらの試薬は、以後パートナーBと称される結合すべき分子のうちの一方が、以後パートナーAと称される他方には見出されない反応基を有することを必要とするか、または、もう一方の基がパートナーAと反応する間、2つの官能基のうちの一方がブロックされているかまたはさもなくば反応性が大きく低減されていることを必要とする。ヘテロ複合体を形成する典型的な2段階工程では、パートナーAをヘテロ二官能性試薬と反応させて誘導体化パートナーA分子を形成させる。架橋剤の未反応の官能基がブロックされている場合には、次いでこれを脱保護する。脱保護後、パートナーBを誘導体化パートナーAに結合させて、複合体を形成させる。誘導体化段階では、パートナーA上の第一級アミノ基を、架橋剤上の活性化カルボン酸またはイミダート基と反応させる。架橋剤のもう一方の末端の反応性チオールまたはブロックされかつ活性化されたチオールを、パートナーB上のそれぞれ求電子基または反応性チオールと反応させる。架橋剤が反応性チオールを有する場合、パートナーB上の求電子剤は、好ましくは、ブロックされかつ活性化されたチオール、マレイミド、またはハロメチレンカルボニル(例えば、ブロモアセチルまたはヨードアセチル)基である。生体高分子は天然でそのような求電子剤を含まないため、別の誘導体化反応により、求電子剤をパートナーBに付加しなければならない。架橋剤がブロックされかつ活性化されたチオールを有する場合、これと反応するパートナーB上のチオールは、パートナーBにとって天然であり得る。
【０１１４】
ヘテロ二官能性試薬の例は、N-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸(SPDP)(例えば、Carlsson et. al., 1978を参照されたい)である。タンパク質を連結するための他のヘテロ二官能性試薬には、例えば、スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸(SMCC)(Yoshitake et. al., 1979)、2-イミノチオラン(IT)(Jue et. al., 1978)、およびS-アセチルメルカプト無水コハク酸(SAMSA)(Klotz and Heiney, 1962)が含まれる。3つはいずれも第一級アミン(例えば、リジン側鎖)と優先的に反応して、1〜3炭素原子長の短い連結スペーサーアームを介して、チオールと誘導体化分子を連結するアミドまたアミジン基を形成する。
【０１１５】
ヘテロ二官能性試薬の別の例は、N-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)酪酸(SPDB)(Worrell et. al., 1986)であり、これは、硫黄原子に対して、ブロックされかつ2-チオピリジンによって活性化される単一のメチル基分枝αを含むこと以外は、SPDPと構造が同一である。Thorpe et. al. 1987により記載されるSMPTおよびSMBTは、N-ヒドロキシスクシンイミド活性化カルボキシル基とブロックされたチオールとの間にフェニルメチルスペーサーアームを含み；チオールおよび単一のメチル基分枝はいずれも、スペーサーアームの脂肪族炭素に付着している。これらのヘテロ二官能性試薬は、非分岐架橋剤よりも切断されにくいジスルフィド結合を生じる。
【０１１６】
反応性ジスルフィド結合を含むヘテロ二官能性試薬のいくつかの他の例には、S-4-スクシンイミジルオキシカルボニル-α-メチルベンジルチオ硫酸ナトリウム、4-スクシンイミジル-オキシカルボニ-α-メチル-(2-ピリジルジチオ)トルエンが含まれる。
【０１１７】
チオール基と反応する二重結合を有する反応基を含むヘテロ二官能性試薬の例には、上記のSMCC、スクシンイミジルm-マレイミド安息香酸、スクシンイミジル3-(マレイミド)プロピオン酸、スルホスクシンイミジル4-(p-マレイミドフェニル)酪酸、スルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチルシクロヘキサン)-1-カルボン酸、およびマレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)が含まれる。
【０１１８】
2つのタンパク質の複合体を形成するための他のヘテロ二官能性試薬は、例えば、Rodwell et. al.、米国特許第4,671,958号、およびMoreland et. al.、米国特許第5,241,078号によって記載されている。
【０１１９】
細胞標的化部分と構造的に拘束されたペプチド部分の架橋は、還元的アミノ化によって、カルボニル基をアミン基またはヒドラジン基に結合することによって達成され得る。
【０１２０】
構造的に拘束されたペプチドと細胞標的化部分の結合によって、細胞標的化部分のその標的分子に対する認識が妨げられることはほとんどない。細胞標的化部分の認識部位は多くの場合疎水性であり、構造的に拘束されたペプチドと結合するための適切な官能性を含まない。
【０１２１】
構造的に拘束されたペプチドが、細胞においてアポトーシスまたは細胞死を誘導し得る候補化合物となる能力は、ペプチドのBcl-2ファミリータンパク質への結合に関するスクリーニングアッセイを用いて評価することができる。適切なアッセイは、候補ペプチドが、配列IAQELRRIGDEFNを含むBim BH3ペプチドのBcl-2ファミリータンパク質への結合を遮断するか、またはそれと競合する能力に基づく。BH3ペプチドは、好ましくは標識しておく。好ましくは、Bim BH3ペプチドは以下の配列を有する。
2008504239.tif 000028
【０１２２】
競合結合アッセイにおいて、構造的に拘束されたペプチドは、Bcl-2ファミリーメンバータンパク質に対する結合に関して標識ペプチドと競合する。このタンパク質を固体表面に結合して、非結合の標識ペプチドから結合タンパクを分離することができる。または、競合結合は液相で行うことも可能であり、当技術分野で周知のように、種々の技法を用いて、タンパク質に対する標識ペプチドの結合を検出することができる。結合している標識ペプチドの量を測定して、Bcl-2ファミリータンパク質に対する被験化合物の親和性に関する情報を提供し得る。Bcl-2ファミリータンパク質は好ましくは、Bcl-2、またはその相同体、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1、またはA1から選択される。例えば、Bcl-2ファミリータンパク質は、Bcl-2 ΔC22、Bcl-w ΔC29、Bcl-xL ΔC25、またはMcl-1 ΔC23であってよい。
【０１２３】
あるいは、Bcl-2相同体がMcl-1である場合には、Bim BH3ペプチドは、BakBH3ペプチド配列、例えば：
2008504239.tif 000029
、またはMcl-1と結合するその機能的断片によって置き換えられ得る。好ましくは、ペプチドは標識しておく。
【０１２４】
典型的に、上記のスクリーニングアッセイでは、1つまたは複数の標識分子を使用する。アッセイで用いられる標識は、直接または間接的に検出可能なシグナルを提供し得る。使用され得る様々な標識には、放射性部分、蛍光化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、および特定の結合分子が含まれる。特定の結合分子には、ビオチンおよびストレプトアビジン、ジゴキシンおよび抗ジゴキシンなどの対が含まれる。アッセイで使用するペプチドまたはタンパク質へのそのような標識の結合は、当技術分野における標準的な技法を使用することで達成され得る。
【０１２５】
アッセイの反応混合物中には、種々の他の試薬を含めてもよい。これらには、塩、タンパク質(例えば、アルブミン)、プロテアーゼ阻害剤、および抗菌剤などの試薬が含まれる。
【０１２６】
好ましいアッセイでは増幅発光近接均一アッセイを使用し、このアッセイでは、6-Hisタグ付(ニッケルキレート)またはグルタチオンS-トランスフェラーゼタグ付のアクセプタービーズ、およびストレプトアビジン被覆ドナービーズが結合相互作用によって近接した際に、これら2つのビーズによって、ドナービーズからアクセプタービーズへの一重項酸素の移行が可能になる。本アッセイで使用するタンパク質に結合する、競合的な拘束されたペプチドが存在する場合、ドナービーズとアクセプタービーズは近接せず、シグナルは減少するかまたは排除される。
【０１２７】
標的細胞内への抗体結合ペプチドの特異的取り込みを判定するには、関連抗原を発現している細胞株を使用する。例えば、ヒトCD19 Fitc結合ペプチドは、REH、Raji、NALM1などのヒトB細胞腫瘍株で試験する。CD19を欠くJurkatなどのT細胞株を対照として使用する。マウスCD19結合ペプチドに関しては、CD19陽性B細胞、ならびにCD19陰性T細胞、顆粒球、および赤血球を含むマウス由来末梢血を用いて、内部移行を試験する。多パラメータのフローサイトメトリーを用いて、B細胞中の結合ペプチドの取り込みと、正常T細胞および骨髄細胞中の非取り込みとを識別する。抗体結合ペプチドのインビボ有効性は、CD19陽性であるEμ-mycなどの原発性マウスB細胞腫瘍モデルで実証される。ペプチド/抗体内部移行は、共焦点顕微鏡によって確認される。殺細胞活性は、ペプチドを細胞株と共にインキュベートし、ヨウ化プロピジウムを用いて生細胞を染色することによって確認される。死滅がアポトーシスによるものであったことの確認は、zVAD-fmkなどのカスパーゼ阻害剤とのプレインキュベーションにより試験する。
【０１２８】
本発明の別の局面は、少なくとも1つの細胞標的化部分、および少なくとも1つの構造的に拘束されたペプチド部分またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを含む複合体の有効量と細胞を接触させる段階を含む、細胞死を調節する方法であって、構造的に拘束されたペプチド部分がアミノ酸配列(I)を含む方法を提供する：
2008504239.tif 000030
式中、Haa1、Haa2、Haa3、およびHaa4はそれぞれ独立して疎水性側鎖を有するアミノ酸残基であるか、またはnおよびmがいずれも1である場合は、Haa1、Haa2、およびHaa4の1つはXaa1でもよく；
Saaはそれぞれ小さな側鎖を有するアミノ酸残基であり；
Naaは負に荷電した側鎖を有するアミノ酸残基であり；
Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、およびXaa5はそれぞれ独立してアミノ酸残基、またはZaa1もしくはZaa2であり；
Rは、H、N末端キャッピング基、N末端キャッピング基でキャッピングされていてもよいオリゴペプチドであるか、または構造的に拘束されたペプチド部分と細胞標的化部分との間の連結を表し；
R'は、H、C末端キャッピング基、C末端キャッピング基でキャッピングされていてもよいオリゴペプチドであるか、または構造的に拘束されたペプチド部分と細胞標的化部分との間の連結を表し；かつ
mおよびnは0または1であるが、ただしmおよびnの少なくとも一方は1であり；
構造的拘束は、配列中の2つのアミノ酸残基、Zaa1およびZaa2を係留するリンカーによって提供され；かつ細胞標的化部分と構造的に拘束されたペプチド部分またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグは、RもしくはR'、またはアミノ酸配列(I)中の官能性アミノ酸側鎖を介して結合している。
【０１２９】
本発明の別の局面は、少なくとも1つの細胞標的化部分、および少なくとも1つの構造的に拘束されたペプチド部分またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを含む複合体の有効量と、損傷を受けたまたは不要な細胞を接触させる段階を含む、不要なまたは損傷を受けた細胞におけるアポトーシスを誘導する方法であって、構造的に拘束されたペプチド部分がアミノ酸配列(I)を含む方法を提供する：
2008504239.tif 000031
式中、Haa1、Haa2、Haa3、およびHaa4はそれぞれ独立して疎水性側鎖を有するアミノ酸残基であるか、またはnおよびmがいずれも1である場合は、Haa1、Haa2、およびHaa4の1つはXaa1でもよく；
Saaはそれぞれ小さな側鎖を有するアミノ酸残基であり；
Naaは負に荷電した側鎖を有するアミノ酸残基であり；
Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、およびXaa5はそれぞれ独立してアミノ酸残基、Zaa1またはZaa2であり；
Rは、H、N末端キャッピング基、N末端キャッピング基でキャッピングされていてもよいオリゴペプチドであるか、または構造的に拘束されたペプチド部分と細胞標的化部分との間の連結を表し；
R'は、H、C末端キャッピング基、C末端キャッピング基でキャッピングされていてもよいオリゴペプチドであるか、または構造的に拘束されたペプチド部分と細胞標的化部分との間の連結を表し；かつ
mおよびnは0または1であるが、ただしmおよびnの少なくとも一方は1であり；
構造的拘束は、配列中の2つのアミノ酸残基、Zaa1およびZaa2を係留するリンカーによって提供され；かつ細胞標的化部分と構造的に拘束されたペプチド部分またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグは、RもしくはR'、またはアミノ酸配列(I)中の官能性アミノ酸側鎖を介して結合している。
【０１３０】
本発明の方法に従って処置される細胞は、エクスビボで存在しても、またはインビボで存在してもよいことが理解されるべきである。「エクスビボ」とは、細胞が対象の身体から除去されて、その活性の調節がインビトロで開始されることを意味する。例えば、細胞は、異常な細胞死シグナル伝達を特徴とする状態の病因の任意の1つまたは複数の局面を試験するためのモデルとして用いられる細胞であってよい。好ましい態様において、対象細胞はインビボで存在する。
【０１３１】
本発明の別の局面は、少なくとも1つの細胞標的化部分、および構造的に拘束されたペプチド部分またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを含む複合体の有効量を哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物において、生存促進性Bcl-2ファミリーメンバー媒介性疾患または状態を治療および/または予防する方法であって、構造的に拘束されたペプチド部分がアミノ酸配列(I)を含む方法を提供する：
2008504239.tif 000032
式中、Haa1、Haa2、Haa3、およびHaa4はそれぞれ独立して疎水性側鎖を有するアミノ酸残基であるか、またはnおよびmがいずれも1である場合は、Haa1、Haa2、およびHaa4の1つはXaa1でもよく；
Saaはそれぞれ小さな側鎖を有するアミノ酸残基であり；
Naaは負に荷電した側鎖を有するアミノ酸残基であり；
Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、およびXaa5はそれぞれ独立してアミノ酸残基、Zaa1またはZaa2であり；
Rは、H、N末端キャッピング基、N末端キャッピング基でキャッピングされていてもよいオリゴペプチドであるか、または構造的に拘束されたペプチド部分と細胞標的化部分との間の連結を表し；
R'は、H、C末端キャッピング基、C末端キャッピング基でキャッピングされていてもよいオリゴペプチドであるか、または構造的に拘束されたペプチド部分と細胞標的化部分との間の連結を表し；かつ
mおよびnは0または1であるが、ただしmおよびnの少なくとも一方は1であり；
構造的拘束は、配列中の2つのアミノ酸残基、Zaa1およびZaa2を繋留するリンカーによって提供され；かつ細胞標的化部分と構造的に拘束されたペプチド部分またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグは、RもしくはR'、またはアミノ酸配列(I)中の官能性アミノ酸側鎖を介して結合している。
【０１３２】
本発明の別の局面は、少なくとも1つの細胞標的化部分、および構造的に拘束されたペプチド部分またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを含む複合体の有効量を哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物において、不要なまたは損傷を受けた細胞の不適切な残存または増殖を特徴とする疾患または状態を治療および/または予防する方法であって、構造的に拘束されたペプチド部分がアミノ酸配列(I)を含む方法を提供する：
2008504239.tif 000033
式中、Haa1、Haa2、Haa3、およびHaa4はそれぞれ独立して疎水性側鎖を有するアミノ酸残基であるか、またはnおよびmがいずれも1である場合は、Haa1、Haa2、およびHaa4の1つはXaa1でもよく；
Saaはそれぞれ小さな側鎖を有するアミノ酸残基であり；
Naaは負に荷電した側鎖を有するアミノ酸残基であり；
Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、およびXaa5はそれぞれ独立してアミノ酸残基、Zaa1またはZaa2であり；
Rは、H、N末端キャッピング基、N末端キャッピング基でキャッピングされていてもよいオリゴペプチドであるか、または構造的に拘束されたペプチド部分と細胞標的化部分との間の連結を表し；
R'は、H、C末端キャッピング基、C末端キャッピング基でキャッピングされていてもよいオリゴペプチドであるか、または構造的に拘束されたペプチド部分と細胞標的化部分との間の連結を表し；かつ
mおよびnは0または1であるが、ただしmおよびnの少なくとも一方は1であり；
構造的拘束は、配列中の2つのアミノ酸残基、Zaa1およびZaa2を係留するリンカーによって提供され；かつ細胞標的化部分と構造的に拘束されたペプチド部分またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグは、RもしくはR'、またはアミノ酸配列(I)中の官能性アミノ酸側鎖を介して結合している。
【０１３３】
本発明のさらに別の局面は、治療および/または予防する方法において使用するための、少なくとも1つの細胞標的化部分、および少なくとも1つの構造的に拘束されたペプチド部分またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを含む複合体であって、構造的に拘束されたペプチド部分がアミノ酸配列(I)を含む複合体を提供する：
2008504239.tif 000034
式中、Haa1、Haa2、Haa3、およびHaa4はそれぞれ独立して疎水性側鎖を有するアミノ酸残基であるか、またはnおよびmがいずれも1である場合は、Haa1、Haa2、およびHaa4の1つはXaa1でもよく；
Saaはそれぞれ小さな側鎖を有するアミノ酸残基であり；
Naaは負に荷電した側鎖を有するアミノ酸残基であり；
Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、およびXaa5はそれぞれ独立してアミノ酸残基、Zaa1またはZaa2であり；
Rは、H、N末端キャッピング基、N末端キャッピング基でキャッピングされていてもよいオリゴペプチドであるか、または構造的に拘束されたペプチド部分と細胞標的化部分との間の連結を表し；
R'は、H、C末端キャッピング基、C末端キャッピング基でキャッピングされていてもよいオリゴペプチドであるか、または構造的に拘束されたペプチド部分と細胞標的化部分との間の連結を表し；かつ
mおよびnは0または1であるが、ただしmおよびnの少なくとも一方は1であり；
構造的拘束は、配列中の2つのアミノ酸残基、Zaa1およびZaa2を係留するリンカーによって提供され；かつ細胞標的化部分と構造的に拘束されたペプチド部分またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグは、RもしくはR'、またはアミノ酸配列(I)中の官能性アミノ酸側鎖を介して結合している。
【０１３４】
本発明のさらに別の局面は、細胞死を調節するため、または不要なもしくは損傷を受けた細胞におけるアポトーシスを誘導するため、または生存促進性Bcl-2ファミリーメンバー媒介性疾患もしくは状態を治療および/もしくは予防するため、または不要なもしくは損傷を受けた細胞の不適切な残存もしくは増殖を特徴とする疾患もしくは状態を治療および/もしくは予防するための、少なくとも1つの細胞標的化部分、および少なくとも1つの構造的に拘束されたペプチド部分またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを含む複合体の使用であって、構造的に拘束されたペプチド部分がアミノ酸配列(I)を含む使用を提供する：
2008504239.tif 000035
式中、Haa1、Haa2、Haa3、およびHaa4はそれぞれ独立して疎水性側鎖を有するアミノ酸残基であるか、またはnおよびmがいずれも1である場合は、Haa1、Haa2、およびHaa4の1つはXaa1でもよく；
Saaはそれぞれ小さな側鎖を有するアミノ酸残基であり；
Naaは負に荷電した側鎖を有するアミノ酸残基であり；
Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、およびXaa5はそれぞれ独立してアミノ酸残基、Zaa1またはZaa2であり；
Rは、H、N末端キャッピング基、N末端キャッピング基でキャッピングされていてもよいオリゴペプチドであるか、または構造的に拘束されたペプチド部分と細胞標的化部分との間の連結を表し；
R'は、H、C末端キャッピング基、C末端キャッピング基でキャッピングされていてもよいオリゴペプチドであるか、または構造的に拘束されたペプチド部分と細胞標的化部分との間の連結を表し；かつ
mおよびnは0または1であるが、ただしmおよびnの少なくとも一方は1であり；
構造的拘束は、配列中の2つのアミノ酸残基、Zaa1およびZaa2を係留するリンカーによって提供され；かつ細胞標的化部分と構造的に拘束されたペプチド部分またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグは、RもしくはR'、またはアミノ酸配列(I)中の官能性アミノ酸側鎖を介して結合している。
【０１３５】
本明細書で使用する「哺乳動物」という用語には、ヒト、霊長類、家畜動物(例えば、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ)、実験動物(例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット)、コンパニオンアニマル(例えば、イヌ、ネコ)、および捕獲野生動物(例えば、キツネ、カンガルー、シカ)が含まれる。好ましくは、哺乳動物はヒトまたは実験動物である。さらにより好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０１３６】
本明細書で使用する「生存促進性Bcl-2ファミリーメンバー媒介性疾患または状態」という用語は、不要なもしくは損傷を受けた細胞が正常な細胞過程によって除去されない疾患もしくは状態、または細胞が異常な、望ましくない、もしくは不適切な増殖を起こす疾患もしくは状態を指す。そのような疾患には、不適切な細胞増殖を特徴とする疾患をはじめとする、アポトーシス(細胞死)の不活性化に関連する疾患が含まれる。不適切な細胞増殖を特徴とする疾患には、例えば、例えば急性肺傷害をはじめとする急性組織傷害から起こる炎症などの炎症状態、前立腺肥大、遺伝子型腫瘍などのリンパ腫をはじめとする癌、自己免疫異常、組織肥大などが含まれる。
【０１３７】
特定の抗体を用いて、特定の細胞、ひいては標的される不要なもしくは損傷を受けた細胞、またはそのような細胞の増殖に関連する疾患または状態を標的することが可能である。例えば、抗体CD19、CD20、CD22、およびCD79aはB細胞を標的をすることが可能であり、よって不要なまたは損傷を受けたB細胞におけるアポトーシスを調節するために、構造的に拘束されたBH3オンリー模倣体をB細胞に送達するために用いることができる。不要なもしくは損傷を受けたB細胞またはB細胞の望ましくない増殖を特徴とする疾患および状態には、B細胞非ホジキンリンパ腫、B細胞急性リンパ芽球性白血病(B-ALL)、ならびに関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、および関連関節症などのB細胞に関連する自己免疫疾患が含まれる。CD2、CD3、CD7、およびCD5などの抗体はT細胞を標的とし得り、よって不要なまたは損傷を受けたT細胞におけるアポトーシスを調節するために、構造的に拘束されたBH3オンリー模倣体をT細胞に送達するために用いることができる。不要なもしくは損傷を受けたT細胞またはT細胞の望ましくない増殖を特徴とする疾患および状態には、T細胞急性リンパ芽球性白血病(T-ALL)、T細胞非ホジキンリンパ腫、および移植片対宿主病などのT細胞媒介性自己免疫疾患が含まれる。抗体CD13およびCD33は骨髄細胞を標的し得り、よって不要なまたは損傷を受けた骨髄細胞におけるアポトーシスを調節するために、構造的に拘束されたBH3オンリー模倣体を骨髄細胞に送達するために用いることができる。不要なもしくは損傷を受けた骨髄細胞または骨髄細胞の望ましくない増殖を特徴とする疾患および状態には、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、および慢性骨髄単球性白血病(CMML)が含まれる。抗体CD138は形質細胞を標的とし得り、よって不要なまたは損傷を受けた形質細胞におけるアポトーシスを調節するために、構造的に拘束されたBH3オンリー模倣体を形質細胞に送達するために用いることができる。不要なもしくは損傷を受けた形質細胞または形質細胞の望ましくない増殖を特徴とする疾患および状態には、多発性骨髄腫が含まれる。
【０１３８】
他の細胞標的化部分を用いて、特定の細胞を標的とすることも可能である。黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)受容体は、卵巣癌細胞、乳癌細胞、および前立腺癌細胞などのいくつかの種類の癌細胞において発現されるが、健全なヒト内臓器官では発現されない。LHRHは、LHRH受容体を発現している細胞に構造的に拘束されたBH3オンリー模倣体を送達するための細胞標的化部分として用いられ得る。LHRH-細胞標的化部分および構造的に拘束されたペプチド部分を含む複合体で治療できる疾患または状態には、卵巣癌、乳癌、および前立腺癌が含まれる。
【０１３９】
「有効量」とは、少なくとも一部に、所望の応答を獲得するのに、または処置する特定状態の発症を遅延させるかもしくは進行を阻害する、またはその発症もしくは進行を完全に停止させるのに必要な量を意味する。その量は、処置する個体の健康状態および生理的状態、処置する個体の分類群、所望される保護の程度、組成物の剤形、医学的状態の判定、および他の関連要因によって異なる。その量は、日常的試験を通じて決定され得る比較的広い範囲内に入ると予想される。ヒト患者に関連した有効量は、例えば、用量当たり約0.1 ng/kg体重〜1 g/kg体重の範囲に入り得る。用量は好ましくは、1 mg〜1 g/kg体重/用量などの1μg〜1 g/kg体重/用量の範囲である。1つの態様において、用量は1 mg〜500 mg/kg体重/用量である。別の態様において、用量は1 mg〜250 mg/kg体重/用量である。さらに別の態様において、用量は、最大で50 mg/kg体重/用量などの1 mg〜100 mg/kg体重/用量である。さらに別の態様において、用量は、1μg〜1 mg/kg体重/用量である。投与計画は、最適な治療応答が提供されるように調節され得る。例えば、いくつかの分割用量を毎日、毎週、毎月、もしくは他の適切な時間間隔で投与してもよいし、または状態の緊急性によって示されるのに応じて、用量を比例的に減少させてもよい。
【０１４０】
本明細書における「治療」および「予防」への言及は、その最も広い文脈で考えるべきである。「治療」という用語は、必ずしも対象を完全に回復するまで処置することを意味するわけではない。同様に、「予防」は、必ずしも対象が結果的に疾患状態にかからないことを意味するわけではない。したがって、治療および予防には、特定状態の症状の改善、または特定状態を発症する危険性を妨げるかもしくはさもなければ軽減することが含まれる。「予防」という用語は、特定状態の重症度または発症を軽減することと見なしてもよい。「治療」もまた、既存の状態の重症度を軽減し得る。
【０１４１】
本発明はさらに、不要なまたは損傷を受けた細胞の不適切な残存または増殖を特徴とする疾患および状態の治療に有用な他の薬剤または手順に哺乳動物を供することと併用した本発明の複合体の投与などの、治療の組み合わせを意図する。例えば、本発明の複合体は、他の化学療法薬と、または放射線治療などの他の治療と組み合わせて投与してもよい。
【０１４２】
構造的に拘束されたペプチドの薬学的に許容される適切な塩には、これらに限定されないが、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、炭酸、ホウ酸、スルファミン酸、および臭化水素酸などの薬学的に許容される無機酸の塩、または酢酸、プロピオン酸、酪酸、酒石酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フマル酸、マレイン酸、クエン酸、乳酸、粘液酸、グルコン酸、安息香酸、コハク酸、シュウ酸、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、サリチル酸、スルファニル酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、エデト酸、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、ラウリン酸、パントテン酸、タンニン酸、アスコルビン酸、および吉草酸などの薬学的に許容され得る有機酸の塩が含まれる。
【０１４３】
塩基性塩には、これらに限定されないが、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、およびアルキルアンモニウムなどの、薬学的に許容され得る陽イオンによって形成される塩が含まれる。
【０１４４】
塩基性窒素含有基は、メチル、エチル、プロピル、およびブチルの塩化物、臭化物、およびヨウ化物などの低級ハロゲン化アルキル；ジメチルおよびジエチル硫酸のようなジアルキル硫酸塩などの薬剤で四級化され得る。
【０１４５】
本発明の複合体、細胞標的化部分、または構造的に拘束されたペプチド部分の多くは不斉中心を有し、したがって1つより多くの立体異性体形態で存在することが可能であることが理解される。よって、本発明はまた、例えば約95%もしくは97% ee、または99% eeを超えるなど、約90% eeを超える、1つまたは複数の不斉中心における実質的に純粋な異性体の複合体、およびそれらのラセミ混合物を含む混合物に関する。構造的に拘束されたペプチド部分の異性体は、例えば、キラル中間体を用いて不斉合成によって、またはキラル分割によって調製され得る。
【０１４６】
「プロドラッグ」という用語はその最も広い意味で用いられ、インビボで本発明の化合物に変換される誘導体を包含する。このような誘導体は当業者に容易に思いつくと考えられ、これには、フェノールおよびアルコールのN-α-アシルオキシアミド、N-(アシルオキシアルコキシカルボニル)アミン誘導体、ならびにα-アシルオキシアルキルエステルが含まれる。プロドラッグは、本発明の複合体の1つまたは複数の官能基に対する修飾を含み得る。
【０１４７】
「プロドラッグ」という用語はまた、細胞透過性タンパク質またはペプチドおよび本発明の複合体を含む融合タンパク質またはペプチドの使用を包含する。そのような融合タンパク質またはペプチドによって、本発明の複合体または構造的に拘束されたペプチド部分の細胞膜を介した細胞質または核への移行が可能になる。そのような細胞透過性タンパク質およびペプチドの例には、膜透過性配列、タンパク質導入ドメイン(PTD)などの陽イオン性ペプチド、例えば：アンテナペディア(ペネトラチン)、tatペプチド、R7、R8、およびR9、ならびに他の薬物送達システムが含まれる(Dunican and Doherty, 2001；Shangary and Johnson, 2002；Letai et. al., 2002；Wang et. al., 2000；Schimmer et. al., 2001；Brewis et. al., 2003；Snyder et. al., 2004を参照されたい)。
【０１４８】
「プロドラッグ」という用語はまた、脂質と本発明の複合体との組み合わせを包含する。脂質の存在は、細胞膜を介した細胞質または核への複合体の移行を補助し得る。適切な脂質には、脂肪酸エステルの形成によって複合体に連結され得る脂肪酸が含まれる。好ましい脂肪酸には、これらに限定されないが、ラウリン酸、カプロン酸、パルミチン酸、およびミリスチン酸が含まれる。
【０１４９】
別の官能基に関連して用いられる「インビボで変換される誘導体」という語句は、哺乳動物への投与に際して、規定の官能基に変換され得るすべての官能基または誘導体を含む。当業者であれば、日常的な酵素試験または動物試験を用いて、インビボで基が別の官能基に変換され得るかどうかを容易に決定することができる。
【０１５０】
治療において使用する場合、本発明の複合体をそのままの化学物質として投与することも可能であるが、有効成分を薬学的組成物として提供することが好ましい。
【０１５１】
したがって、本発明はさらに、1つまたは複数の薬学的に許容される担体、および任意で他の治療成分および/または予防成分と共に、少なくとも1つの細胞標的化部分、および少なくとも1つの構造的に拘束されたペプチド部分またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを含む複合体を含む薬学的組成物であって、構造的に拘束されたペプチド部分がアミノ酸配列(I)を含む薬学的組成物を提供する：
2008504239.tif 000036
式中、Haa1、Haa2、Haa3、およびHaa4はそれぞれ独立して疎水性側鎖を有するアミノ酸残基であるか、またはnおよびmがいずれも1である場合は、Haa1、Haa2、およびHaa4の1つはXaa1でもよく；
Saaはそれぞれ小さな側鎖を有するアミノ酸残基であり；
Naaは負に荷電した側鎖を有するアミノ酸残基であり；
Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、およびXaa5はそれぞれ独立してアミノ酸残基、Zaa1またはZaa2であり；
Rは、H、N末端キャッピング基、N末端キャッピング基でキャッピングされていてもよいオリゴペプチドであるか、または構造的に拘束されたペプチド部分と細胞標的化部分との間の連結を表し；
R'は、H、C末端キャッピング基、C末端キャッピング基でキャッピングされていてもよいオリゴペプチドであるか、または構造的に拘束されたペプチド部分と細胞標的化部分との間の連結を表し；かつ
mおよびnは0または1であるが、ただしmおよびnの少なくとも一方は1であり；
構造的拘束は、配列中の2つのアミノ酸残基、Zaa1およびZaa2を係留するリンカーによって提供され、かつ細胞標的化部分と構造的に拘束されたペプチド部分またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグは、RもしくはR'、またはアミノ酸配列(I)中の官能性アミノ酸側鎖を介して結合している。担体は、組成物の他の成分と適合し、そのレシピエントに有害でないという意味において「許容され」なければならない。
【０１５２】
薬学的製剤には、経口投与、直腸投与、経鼻投与、局所(口腔および舌下を含む)投与、膣内投与、もしくは非経口(筋肉内、皮下、および静脈内を含む)投与に適した製剤、または吸入もしくは通気による投与に適した形態の製剤が含まれる。したがって、本発明の複合体は従来の佐剤、担体、または希釈剤と共に薬学的組成物およびその単位投与量の形態にすることができ、このような形態において、いずれも経口用の、錠剤もしくは充填カプセル剤のような固体、または溶液、懸濁液、乳濁液、エリキシル剤、もしくはこれらを充填したカプセル剤のような液体として、直腸投与用の坐剤の形態で；または非経口(皮下を包む)用の滅菌注射溶液の形態で用いられ得る。そのような薬学的組成物およびその単位剤形は、慣用的な割合で慣用的な成分を、付加的な活性化合物または成分と共にまたはそれら無しで含み得り、このような単位剤形は、用いるべき予定1日投与量範囲に相応する適切な有効量の有効成分を含み得る。1錠につき10ミリグラムの有効成分、またはより広範囲では0.1〜200ミリグラムの有効成分を含む製剤が、それ相応に適した典型的な単位剤形である。本発明の複合体は、非常に多様な経口および非経口剤形で投与することができる。以下の剤形が、有効成分として本発明の複合体または本発明の複合体の薬学的に許容される塩もしくは誘導体を含み得ることは、当業者に明らかであると考えられる。
【０１５３】
本発明の複合体から薬剤組成物を調製する場合、薬学的に許容される担体は固体であっても液体であってもよい。固形調製物には、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、カシェ剤、坐剤、および分散性顆粒剤が含まれる。固体担体は、希釈剤、香味剤、可溶化剤、潤滑剤、懸濁化剤、結合剤、保存剤、錠剤崩壊剤、または封入剤としても作用し得る1つまたは複数の物質であってよい。
【０１５４】
散剤では、担体は、微粉状有効成分との混合物状態にある微粉状固体である。
【０１５５】
錠剤では、有効成分を必要な結合能力を有する担体と適切な割合で混合して、所望の形状および大きさに圧縮成形する。
【０１５６】
散剤および錠剤は、好ましくは5または10パーセントから約70パーセントの活性複合体を含有する。適切な担体は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、澱粉、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、カカオ脂などである。「調製物」という用語は、活性化合物とカプセル剤を提供する担体としての封入剤との製剤を包むことが意図され、カプセル内で有効成分は担体と共にまたは担体を含まずに担体によって囲まれ、したがって担体と関連している。同様に、カシェ剤およびロゼンジ剤も包まれる。錠剤、散剤、カプセル剤、丸剤、カシェ剤、およびロゼンジ剤は、経口投与に適した固体形態として用いられ得る。
【０１５７】
坐剤を製造するには、脂肪酸グリセリドまたはカカオ脂の混合物などの低融点ワックスを最初に融融し、撹拌によってその中に有効成分を均一に分散させる。次いで、融解した均一混合物を簡便な大きさの型に流し込み、冷却し、それによって凝固させる。
【０１５８】
膣内投与に適した製剤は、有効成分に加えて、適切であることが当技術分野において周知である担体を含有する腟坐薬、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、フォーム剤、またはスプレー剤として提供され得る。
【０１５９】
液状形態の調製物には、溶液、懸濁液、および乳濁液、例えば水溶液または水プロピレングリコール溶液が含まれる。例えば、非経口注射溶液調製物を、ポリエチレングリコール水溶液中の溶液として製剤化することができる。
【０１６０】
したがって、本発明による複合体は非経口投与(例えば、ボラス投与または連続注入のような注入による)用に製剤化することができ、アンプル、充填済み注射器、もしくは小容量注入物中の単位剤形として、または保存剤を添加した複数回用量容器中で提供され得る。組成物は、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液、または乳濁液のような形状をとることができ、懸濁化剤、安定化剤、および/または分散剤のような製剤化剤を含み得る。または、有効成分は、使用前に例えば発熱物質を含まない滅菌水のような適切な媒体によって構成するための、溶液からの滅菌固体の無菌的単離または凍結乾燥によって得られる粉末形態であってもよい。
【０１６１】
経口用に適した水溶液は、有効成分を水中に溶解し、必要に応じて適切な着色剤、香料、安定化剤、および増粘剤を添加することによって調製し得る。
【０１６２】
経口用に適した水性懸濁液は、微粉状有効成分を、天然もしくは合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、または他の周知の懸濁化剤のような粘稠性物質と共に水中に分散させることによって作製し得る。
【０１６３】
使用直前に経口投与用の液状形態調製物に変換されるよう意図された固形調製物もまた含まれる。このような液状形態には、溶液、懸濁液、および乳濁液が含まれる。これらの調製物は、有効成分に加えて、着色剤、香料、安定化剤、緩衝剤、人工および天然甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤などを含み得る。
【０１６４】
表皮に局所投与するために、本発明による複合体を軟膏剤、クリーム剤、もしくはローション剤として、または経皮貼布として製剤化することができる。軟膏剤およびクリーム剤は、例えば、適切な増粘剤および/またはゲル化剤を添加して、水性または油性基剤を用いて製剤化し得る。ローション剤も水性または油性基剤を用いて製剤化することができ、一般に、1つまたは複数の乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤、または着色剤をさらに含有する。
【０１６５】
口腔への局所投与に適した製剤には、着香基剤、通常はスクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカント中に活性物質を含むロゼンジ剤；ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアゴムなどの不活性基剤中に有効成分を含むトローチ剤；ならびに適切な液体担体中に有効成分を含む洗口剤が含まれる。
【０１６６】
溶液または懸濁液は、例えば点滴器、ピペット、またはスプレーを使用する慣用的手段によって、鼻腔に直接投与される。製剤は、単一用量剤形または複数用量剤形で提供され得る。点滴器またはピペットによる後者の場合、これは、適切な所定量の溶液または懸濁液を患者が投与することによって達成され得る。スプレーの場合には、これは、例えば計量噴霧スプレーポンプを用いて達成され得る。鼻腔送達および保持を改善するには、本発明による化合物をシクロデキストリンで封入するか、または鼻粘膜における送達および保持を増強すると考えられる薬剤と共に製剤化することができる。
【０１６７】
呼吸管への投与もまた、クロロフルオロカーボン(CFC)(例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、またはジクロロテトラフルオロエタン)、二酸化炭素、または他の適切なガスなどの適切な噴霧剤と共に、加圧パック中に有効成分が提供されるエアロゾル製剤を用いて達成され得る。エアロゾル剤は、好都合にレシチンなどの界面活性剤もまた含み得る。薬物の投与量は、定量弁を備えることによって調節することができる。
【０１６８】
あるいは、有効成分は、乾燥粉末の形態として、例えばラクトース、澱粉、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの澱粉誘導体、およびポリビニルピロリドン(PVP)のような適切な粉末基剤中の複合体の粉末混合物の形態として提供され得る。
【０１６９】
都合のよいことに、粉末担体は鼻腔内でゲルを形成する。粉末組成物は、例えばゼラチンのカプセルもしくはカートリッジまたはブリスターパック中の単位剤形として提供され得り、吸入器を用いてこれらから粉末が投与され得る。
【０１７０】
鼻腔内製剤をはじめとする、呼吸管への投与を意図した製剤では、複合体製剤は一般に、例えば約1〜10ミクロンまたはそれ以下の小さい粒径を有する。このような粒径は、当技術分野において周知の手段によって、例えば微粒子化によって得ることができる。
【０１７１】
必要な場合には、有効成分を持続放出するために適合化された製剤を使用してもよい。
【０１７２】
薬学的調製物は、好ましくは単位剤形である。このような剤形では、調製物は、適切な量の有効成分を含む単位用量に細分される。単位剤形は包装された調製物であってよく、包装物は、小包装された錠剤、カプセル剤、およびバイアルまたはアンプル中の粉末のような個別量の調製物を含む。また、単位剤形は、カプセル剤、錠剤、カシェ剤、もしくはロゼンジ剤自体であってもよいし、または包装された形態の適切な数のこれらのいずれかであってもよい。
【０１７３】
鼻内投与用の液体または粉末、経口投与用の錠剤またはカプセル剤、および静脈内投与用の液体が、好ましい組成物である。
【０１７４】
本発明のいくつかの好ましい局面を説明する以下の実施例を参照して、本発明を説明する。しかしながら、本発明の以下の記載の特殊性は、本発明の先の記載の一般性に優先するものではないことが理解されるべきである。
【０１７５】
実施例
動力学シミュレーション
Gromacs力場(ffgmx2)を用いてGROMACS v. 3.1.1パッケージプログラム[Lindahl,2001 #1629]を使用することで、分子動力学シミュレーションを実施した。水の単一点電荷モデル[Berendsen, 1981 #1620]を用いて、溶媒について記載した。イオン性アミノ酸は、中性pHにおいてそれらの標準状態であると仮定した。タンパク質は、353の大きさの水の立方体中に溶媒和させた；圧力による共役は加えなかった。システム上の全電荷は、GENION手順を用いて、水分子をナトリウムまたは塩素イオンで置換することによって中性にした。LINCSアルゴリズム[Hess, 1977 #1624]を用いて、結合距離を拘束した。タンパク質、水、およびイオンは、0.1psの結合時間で供されるBerendsen恒温装置[Berendsen, 1984 #1621]を使用して、300 Kの温浴に個別に連結された。シミュレーションはすべて、10段階の隣接リスト更新頻度(20 fs)を適用して、10Åの単一非結合カットオフを用いて実施した。1.2Åのグリッド幅および三次補間図式を有する長距離静電気力に対処するには、パーティクルメッシュエワルド法を適用した。シミュレーションはすべて、(固定タンパク質を用いた)近接した接触を回避するための最初の最小化、およびその後の水分子を平衡化するための1 psの「位置的拘束」分子動力学からなった。計算は、2 fsの時間段階を用いて、50 nsの全シミュレーション時間をかけて行った。
【０１７６】
円二色性
以下のパラメータを使用して、20℃でJasco Model J-710分光偏光計を使用して、円二色性スペクトルを得た：路長、2 mm；段階分解能、0.1 nm；速度、20 nm/分；蓄積、4；応答、1秒；バンド幅、1.0 nm。ペプチドは、30% TFE水溶液中の0.5 mg/mLの濃度で解析した。ペプチドのαヘリックス含量は、モデルヘリックスペプチドとのスペクトルの比較を含む、Yang et al (1986)に記載されている方法によって決定した。
【０１７７】
ペプチド合成
ペプチドは、標準的なF-moc化学(Fields et al., 1991)を使用して、Pioneerペプチド合成機を用いてNew England Peptides, Inc,(米国)により、またはApplied Biosystems 433ペプチド合成機を用いてProteomics International Pty. Ltd.(ABN 78 096 013 455;ウェスタンオーストラリア州、パース)により調製された。アミノ酸カップリングサイクルは、製造業者の標準的手順に基づいた。各ペプチドは、品質保証データと共に提供された。
【０１７８】
アッセイで使用するBim BH3-26 アミノ酸長ペプチドは、Fmoc化学を用いて、標準的な固相ペプチド合成技法により調製された。
【０１７９】
拘束されたペプチドのBim26アミノ酸長との競合の測定
アルファスクリーン(増幅発光近接均一アッセイ)は、分子間の生物学的相互作用を測定する、ビーズに基づく技術である。このアッセイは2つのヒドロゲル被覆ビーズからなり、結合相互作用によって近接した場合に、これらのビーズによってドナービーズからアクセプタービーズへの一重項酸素の移行が可能になる。
【０１８０】
結合に際して、ドナービーズ内の光増感剤が、周囲の酸素をより励起した一重項酸素に変換する。次いで、この一重項酸素が拡散して、アクセプタービーズ内の化学発光物質と反応する。同一ビーズ内のフルオロフォアが活性化され、発光が生じる。
【０１８１】
構造的に拘束されたペプチドのスクリーニングは、ヘキサ-His検出系を用いて行った。6-Hisタグ付Bcl wΔC10タンパク質(最終濃度24 nM)およびビオチン化Bim BH3-26ペプチド、
2008504239.tif 000037
(最終濃度1.5 nM)からなるアッセイ中に、DMSOに溶解した非ビオチン化ペプチドを増量していった。この反応混合物に、共に10 ug/ml最終濃度の6Hisタグ付(ニッケルキレート)アクセプタービーズおよびストレプトアビジン被覆ビーズを添加した。
【０１８２】
アッセイ緩衝液は、50 mM Hepes pH 7.4、10 mM DTT、100 mM NaCl、0.05% Tween、および1 mg/ml BSAを含んだ。ビーズ希釈緩衝液は、50 mM Tris、pH 7.5、0.01 % Tween、および1 mg/ml BSAを含んだ。アッセイ中の最終DMSO濃度は、1%であった。アッセイは384ウェル白色Optiplateで行い、Perkin Elmer Fusionプレートリーダーで解析した(Ex680、Em520〜620 nM)。
【０１８３】
アルファスクリーン6-His検出キットおよびOptiplateは、Perkin Elmerから購入した。
【０１８４】
または、使用した検出系は、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)検出系であり、アッセイは以下の通りに行った。
【０１８５】
拘束されたペプチドとBim26アミノ酸長との競合の測定  アルファスクリーン(増幅発光近接均一アッセイ)は、分子間の生物学的相互作用を測定する、ビーズに基づく技術である。このアッセイは2つのヒドロゲル被覆ビーズからなり、結合相互作用によって近接した場合に、これらのビーズによってドナービーズからアクセプタービーズへの一重項酸素の移行が可能になる。
【０１８６】
結合および680 nmのレーザー光による励起に際して、ドナービーズ内の光増感剤が、周囲の酸素をその励起した一重項状態に変換する。次いで、この一重項酸素が拡散して、アクセプタービーズ内の化学発光物質と反応する。同一ビーズ内のフルオロフォアが活性化され、580〜620 nmで発光が生じる。
【０１８７】
構造的に拘束されたペプチドのスクリーニングは、アルファスクリーンGST(グルタチオンS-トランスフェラーゼ)検出キット検出系を用いて行った。GSTタグ付Bcl wΔC29タンパク質(最終濃度0.1 nM)およびビオチン化Bim BH3-26ペプチド、
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(最終濃度3.0 nM)からなるアッセイ中に、DMSOに溶解した非ビオチン化ペプチドを増量していった。この反応混合物に、共に10 ug/ml最終濃度の抗GST被覆アクセプタービーズおよびストレプトアビジン被覆ビーズを添加し、アッセイ混合物を室温で4時間インキュベートしてから読み取った。
【０１８８】
アッセイ緩衝液は、50 mM Hepes pH 7.4、10 mM DTT、100 mM NaCl、0.05% Tween、および0.1 mg/mlカゼインを含んだ。ビーズ希釈緩衝液は、50 mM Tris、pH 7.5、0.01 % Tween、および0.1 mg/mlカゼインを含んだ。アッセイ中の最終DMSO濃度は、0.5%であった。アッセイは384ウェル白色Optiplateで行い、Perkin Elmer Fusionアルファプレートリーダーで解析した(Ex680、Em520〜620 nM)。
【０１８９】
GSTアルファスクリーン検出キットおよびOptiplateは、Perkin Elmerから購入した。
【０１９０】
親和性測定および溶液競合アッセイ(Biacoreアッセイ)
親和性測定は、HBS(10 mM HEPES pH 7.2、150 mM NaCl、3.4 mM EDTA、0.005%Tween-20)を流動緩衝液として使用して、Biacore3000バイオセンサー(Biacore)で行った。CM5センサーチップに、アミンカップリング化学によりマウス26-アミノ酸長 wtBimBH3および4EBimBH3変異体ペプチドを固定化した。BimBH3に対する生存促進性Bcl-2様タンパク質の結合親和性を直接評価するには、このタンパク質を20 ml/分でセンサーチップに直接注入した。各結合測定後、50 mM水酸化ナトリウムまたは6 Mグアニジン塩酸(pH 7.2)を注入し、その後流動緩衝液で2回洗浄して、残存する結合タンパク質をチップから脱着した。結合動力学は、基礎応答を差し引いた後に、BIA評価ソフトウェア(バージョン3、Biacore)を用いてセンサーグラムから導出した。Bcl-2様タンパク質に対するwtBimBH3ペプチド結合と競合する能力を比較することにより、生存促進性Bcl-2タンパク質に対するBH3ペプチドの相対的親和性を評価した。競合結合アッセイは、一定の飽和量以下 (10 nM)の生存促進性Bcl-2タンパク質と様々な量の競合体BH3ペプチドを、HBS中、少なくとも2時間氷上でインキュベートすることにより行った。次いで、マウスwtBimBH3を固定化したチャネルおよびマウス4EBimBH3を固定化した対照チャネルを含むセンサーチップ上に、混合物を注入した。(対照チャネルからの)基礎応答を差し引き、絶対結合応答を得た。非結合タンパク質による応答を最大応答(100%)として、所与の注入時点(430.5s)における、競合体ペプチドの増加量の存在下における相対残存結合(%)を算出した。相対残存応答(f)を最初のペプチド濃度に対してプロットし、式f=100/(1+(c/IC50)m)(式中、c=競合体ペプチドの濃度、m=曲率定数、およびIC50=結合を50%まで減少させるのに必要な競合体ペプチドの濃度)に適合させた。
【０１９１】
抗体産生
適切な抗体は、当技術分野において周知の技法により調製し得る。例えば、Galfre et. al., 1977を参照されたい。
【０１９２】
抗体と構造的に拘束されたペプチドの結合
抗体をNHS活性化マレイミド-ACP、スルホスクシンイミジル-4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボン酸、4-スクシンイミジルオキシカルボニル-α-メチル-α-(2-ピリジルジチオ)トルエン、またはLC-SMPTと反応させて、複数のリンカーで修飾された抗体を調製する。次いで、抗体を、システインを含む構造的に拘束されたと反応させる。
【０１９３】
細胞に基づくアッセイ法
本発明の複合体の有効性はまた、種々の細胞株およびマウス腫瘍モデルを用いて、細胞に基づく死滅アッセイ法で決定することができる。例えば、それらが細胞生存度に及ぼす活性は、一連の培養した腫瘍形成細胞株および非腫瘍形成細胞株、ならびに初代マウスまたはヒト細胞集団、例えばリンパ球で評価し得る。これらのアッセイでは、96ウェルプレートにおいて、5,000〜20,000個の細胞を適切な増殖培地(例えば：プレB Eμ-Myc マウス腫瘍の場合、10%ウシ胎児血清、アスパラギナーゼ、および2-メルカプトエタノールを添加したダルベッコ変法イーグル培地100μL)中で、37℃および10% CO2にて培養する。1 nM〜100μMの複合体と共にインキュベーションし、1〜7日間にわたり細胞生存度および全細胞数をモニターして、IC50<10μMで死滅させる複合体を同定し得る。細胞生存度は、フローサイトメーター(BD FACScan)での660〜675 nmの発光波長の免疫蛍光解析により、細胞がヨウ化プロピジウム(10μg/mLを排除する能力によって決定される。または、Cell Titre 96などのハイスループット比色アッセイである。AQueous非放射性細胞増殖アッセイ(Promega)を使用することができる。アポトーシスによる細胞死は、zVAD-fmkなどの50μMのカスパーゼ阻害剤と共に細胞をプレインキュベートすることで確認される。薬物内部移行は、Fitcなどの蛍光色素で標識した複合体の共焦点顕微鏡観察により確認される。
【０１９４】
本発明の複合体はまた、その標的の特異性およびインビボでの作用様式に関して評価することができる。例えば、複合体が、Bcl-2と高い選択性で結合する構造的に拘束されたペプチド部分を含む場合、この複合体はBcl-2を欠く細胞を死滅させるべきではない。したがって、野生型細胞、およびBcl-2欠損マウスに由来するBcl-2を欠く細胞における複合体の活性を比較して、作用の特異性を確認し得る。
【０１９５】
実施例1
合成によって試験するには、可能なリンカーのごく一部でさえも極めて費用がかかるであろう。むしろ、これは、分子動力学を用いた事前の理論的研究に役立つ課題である。いくつかの折りたたみおよび非折りたたみ事象が観察されるように適切な(例えば30ns)シミュレーション時間を用いる場合、および溶媒が明確に説明される場合、分子動力学はペプチド構造の有用な予測ツールとなることが示されている(Burgi et al 2001)。
【０１９６】
いずれの種類および位置のリンカーがヘリックス形成を促進するのかを調べるため、明確な水を使用して、線状Bim様12-アミノ酸長(a)ならびに拘束された類似体(c)および(d)、13-アミノ酸長(b)、ならびに16-アミノ酸長(e)ならびに拘束された類似体(f)、(g)、および(h)において、50ナノ秒の長さの分子動力学シミュレーションを行った。(c)および(f)のリンカーは、上記の式(II)に示される第1の位置のリンカーに相当し、(d)および(g)のリンカーは、上記の式(IV)に示される第2の位置の拘束に相当し、また(h)は、残基94(101)に相当するi(i+7)の拘束を有する、上記の式(VI)に示される第3位置に相当する：
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式中、Zは、カルボン酸基を介して2つのアミノグルタミン酸残基を結合するリンカーの位置を示す。調べたリンカーは、リンカー-NH(CH2)4NH-、-NH(CH2)5NH-、-NH(CH2)6NH-、-NH(CH2)7NH-、-NH(CH2)2O(CH2)2NH-、-NH(CH2)N+H2(CH2)2NH-、-NH(CH2)S(CH2)2NH-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)2NH-、-NH(CH2)2NHC(=O)CH2NH-、-NH(CH2)2SS(CH2)2NH-、-NH(CH2)2O(CH2)3NH-、-NH(CH2)2N+H2(CH2)3NH-、-NH(CH2)2S(CH2)3NH-、-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)2NH-、-NH(CH2)2NHC(=O)(CH2)2NH-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)3NH-、-NH(CH2)3NHC(=O)CH2NH-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)4NH-、-NH(CH2)4NHC(=O)CH2NH-、-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)3NH-、-NH(CH2)3NHC(=O)(CH2)2NH-、-NH(CH2)3C(=O)NH(CH2)2NH-、および-NH(CH2)2NHC(=O)(CH2)3NH-である。
【０１９７】
動力学シミュレーションは、12アミノ酸長の第1の位置および第2の位置の両方において、リンカー-NH(CH2)4NH-、-NH(CH2)5NH-、-NH(CH2)6NH-、-NH(CH2)7NH-、-NH(CH2)2O(CH2)2NH-、-NH(CH2)N+H2(CH2)2NH-、-NH(CH2)S(CH2)2NH-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)2NH-、-NH(CH2)2NHC(=O)CH2NH-、-NH(CH2)2SS(CH2)2NH-、-NH(CH2)2O(CH2)3NH-、-NH(CH2)2N+H2(CH2)3NH-、-NH(CH2)2S(CH2)3NH-、-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)2NH-、-NH(CH2)2NHC(=O)(CH2)2NH-について行うか、さもなければ第2の位置のみを調べた。
【０１９８】
動力学シミュレーションにより、以下のことが示された：
1. 非拘束12-アミノ酸長、(a) Ac-IAQELRRIGDEF-NH2は、ヘリックスが比較的不安定であった。
2. 第1の位置で拘束された12-アミノ酸長、上記の(c)は、調べたリンカーすべてについてヘリックスはわずかにより安定していたが、グリシン後のC末端においてほどける傾向があった。例外はリンカー-NH(CH2)2S(CH2)2NH-であり、これはヘリックス形成を不安定化し、線状(非拘束)対照12-アミノ酸長(a)よりもわずかに悪いようでさえあった。
3. 第2の位置で拘束された12-アミノ酸長、上記の(d)は、一般に、第1の位置で拘束された場合よりもさらにいっそうヘリックス状態であった。特に、ジアミノペンタンリンカー、ジアミノヘプタンリンカー、ならびにリンカー-NHCH2C(=O)NH(CH2)2NH-、NH(CH2)2NHC(=O)CH2NH-、-NH(CH2)2O(CH2)3NH-、および-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)2NH-は、優れたヘリックス安定化リンカーであると考えられた。しかし、ジアミノヘキサンリンカー、およびリンカー-NH(CH2)2S(CH2)2NH-、-NH(CH2)2SS(CH2)2NH-、-NH(CH2)2S(CH2)3NH-、-NH(CH2)2NHC(=O)(CH2)2NH-、-NHCH2C(=O)NH(CH2)3NH-、-NH(CH2)3NHC(=O)CH2NH-、-NH(CH2)2C(=O)NH(CH2)3NH-、および-NH(CH2)3C(=O)NH(CH2)2NH-は、ヘリックス形成の安定化においてそれほど優れていなかった。
4. 16-アミノ酸長(e)を用いたシミュレーションは、概してこれらの結果と酷似していた。
5. 16-アミノ酸長の第3位置(h)のペンタンリンカーは、わずかにヘリックスを安定化したが、第2の位置の場合ほど優れていなかった。
【０１９９】
実施例2
環状ペプチド、アセチル-IAQ(E1)LRRIGD(E2)F-アミドを、Applied Biosystems Pioneerペプチド合成機にて、HTBU活性化によりFmoc化学を用いて合成した。固相ペプチド合成において使用した樹脂は、Pal-Peg-PS樹脂であった。基礎ペプチドは、グルタミン酸残基上にオルトゴナルな保護、(E1=ODMAB、O-4-{N-[1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)-3-メチルブチル]アミノ}ベンジル)および(E2=O-2-PhiPR)を用いて調製した。合成後、ペプチドがなお樹脂上に存在する状態でE2を選択的に脱保護し、1,5-ジアミノペンタン(モノFmoc保護)リンカーを遊離の側鎖カルボキシル基に加えた。次いで、Fmocを除去し、E1を選択的に脱保護し、ジアミノペンタンリンカーに結合させた。残存する保護基および樹脂を、TFA、水、およびチオールに基づく捕捉剤を用いて切断した。次いで、C18 YMCカラムにてRP-HPLCを用いてペプチドを精製した。MALDI-TOF DE質量スペクトル解析により、M+1：1555が得られた。
【０２００】
実施例3
2つのグルタミン酸残基を連結する1,6-ジアミノヘキサンリンカーを有するペプチドAc-IAQ-E-LRRIGD-E-F-NH2は、上記の実施例2に記載される通りに、ただし1,6-ジアミノヘキサンリンカーを用いて合成し精製した。MALDI-TOF DE質量スペクトル解析により、M+1：1571が得られた。
【０２０１】
実施例4
2つのグルタミン酸残基を連結する1,5-ジアミノペンタンリンカーを有するペプチドAc-E-IAQELR-E-IGDEF-NH2は、上記の実施例2に記載される通りに合成し精製した。MALDI-TOF DE質量スペクトル解析により、M+1：1657が得られた。
【０２０２】
実施例5
市販の化合物Fmoc-NH(CH2)2NH2.HCl(1.9 g 6 mmol)およびt-Boc-Gly-Osu(1.6 g、6 mmol)から、リンカー前駆体NH2CH2CC(=O)NHCH2CH2NH-Fmocの調製物を合成し、DMF(15 mL)中に溶解し、次いでN-エチル-N,N,-ジイソプロピルアミン(2.1 mL、12 mmol)で処理して2時間撹拌した。水(40 mL)を添加して生成物、t-Boc-NH2CH2C(=O)NHCH2CH2NH-Fmocを沈殿させ、濾過および風乾後に無色の粉末を得た。次いで、これを4 M HCl/エーテル(15 mL)中に溶解し、2時間置いた。上清を静かに移し、残存した白色顆粒をエーテルで洗浄し、濾過して乾燥させ、生成物HCl.NH2CH2C(=O)NHCH2CH2NH-Fmocを2段階で33%の全収率で得た。MS(m/z=340)、1H NMR(300 MHz、DMSO)δ：8.51(広い三重線、1H、NH)；8.14(広い一重線、3H、NH3)；7.3〜7.9(多重線、8H+1H、ArH(Fmoc)+NH)；4.15〜4.35(多重線、3H、CH2CH(Fmoc))；3.49、(一重線、2H、CH2(gly))；3.15(三重線、2H、CH2)；3.05(三重線、2H、CH2)。化学シフト(δ)は、100万(ppm)当たりに分けて測定される。
【０２０３】
実施例6
2つのグルタミン酸残基を連結する-NHCH2C(=O)NHCH2CH2NH-リンカーを有するペプチドAc-IAQ-E-LRRIGD-E-F-NH2は、E1を最初に選択的に脱保護し、モノFmoc保護リンカーを反応させること以外は、上記の実施例2と同様に、ただし実施例5に記載されるモノFmoc保護リンカーを用いて合成した。次いで、Fmocを除去し、E2を脱保護してリンカーに結合させた。
【０２０４】
実施例7
第1の位置のペンタンリンカー(A)、第2の位置のペンタンリンカー(B)、第2の位置のヘキサンリンカー(C)、および第2の位置のリンカー-NHCH2C(=O)NH(CH2)2NH-に相当する、4つの拘束されたペプチドを実施例2〜6に記載される通りに合成した。
【０２０５】
これらのヘリシティーの基準として、30%トリフルオロエタノール(TFA)水溶液中で円二色性スペクトルを測定し、またビオチン化Bim-BH3ペプチドを用いる競合アッセイにより、Bcl-2 ΔC22、Bcl-w ΔC10、およびBcl-w-ΔC29に対する親和性を測定した。結果を以下に示す。
2008504239.tif 000040
【０２０６】
円二色性スペクトルから、拘束されたペプチドが、概して線状12-アミノ酸長よりもよりヘリックス状態にあること-いくつかはより多くヘリックス状態にあることが示された。ペプチドBおよびCは、非拘束12-アミノ酸長を超える、Bcl-2およびBcl-xLに対する親和性の顕著な増加を示した。これらの種類のペプチドは、本特許請求の範囲の基礎をなす。
【０２０７】
実施例8
Bim BH3-オンリータンパク質に基づく線状16-アミノ酸長ペプチド、Ac-IWIAQELRRIGDEFNA-NH2を、Pioneerペプチド合成機を用いて調製し、HPLCにより精製した。拘束されたペプチドを、実施例2〜6に記載される通りに合成した。第1の拘束されたペプチド(E)は、2つのグルタミン酸を係留するペンタンリンカーを有する。第2の拘束されたペプチド(F)は、2つのグルタミン酸を係留する-NHCH2C(=O)(CH2)2NH2-を有する。
【０２０８】
Bcl-w ΔC29に対する線状16-アミノ酸長ならびにペプチド(E)および(F)の親和性を、ビオチン化BIM-BH3ペプチドを用いる競合アッセイにより測定した。結果を以下に示す。
2008504239.tif 000041
【０２０９】
拘束された16-アミノ酸長ペプチドでは、Bcl-w ΔC29との結合親和性が改善された。
【０２１０】
実施例9
Bcl-w ΔC29への結合に及ぼす配列内の特定の残基の影響を確認するため、配列内で置換を起こし、IC50値を測定した。使用したペプチドは、ペプチドGを除いて、標準的なF-moc化学、Fields et al. (1991)を用いてPioneerペプチド合成機またはApplied Biosystems 433ペプチド合成機で合成した線状ペプチドであった。アミノ酸カップリングサイクルは、製造業者の標準的な手順に基づいた。ペプチドGは、2つのグルタミン酸残基間にペンタンリンカーを有する拘束されたペプチドであり、実施例2〜6に記載される通りに調製した。
2008504239.tif 000042
【０２１１】
拘束されたペプチド(G)内の最初の2残基をヘリックス安定化QA配列で置換すると、拘束されたペプチドの結合が減少し(E：0.5 nM、G：2.4 nM)、IおよびW残基の一方または両方がBcl-wタンパク質と有利に相互作用することが示される。
【０２１２】
最初の2残基IおよびWの重要性はまた、線状ペプチドにおいても認められ得る。W→F(ペプチドN)、I→A(ペプチドO)、W→A(ペプチドP)、およびW→R(ペプチドQ)置換を行った場合、線状16-アミノ酸長と比較してやはり結合が低下する。
【０２１３】
結合活性の増加を提供するのが拘束であって、配列内の2つの負電荷の単なる喪失ではないことを確認するため、2つのグルタミン酸残基をアミド化して、グルタミン残基を提供した(ペプチドI)。これにより、結合親和性はわずかに減少し、増加することはなかった。
【０２１４】
疎水性残基の重要性を示すため、各Haaをアラニンで置換した。ペプチドI(I→A)は結合活性の100倍の減少を示し、ペプチドJ(L→A)は親和性の約1000倍の減少を示し、ペプチドK(I→A)は親和性の3倍の減少を示し、またペプチドL(F→A)は親和性の1,000倍の減少を示した。4つのHaaすべてをアラニンで置換した場合、結合親和性は25,000倍減少した。
【０２１５】
ペプチドS、ペプチドT、およびペプチドUは、配列内の最後の2残基における置換物である。ペプチドS(NA→AA)はたとえあったとしても結合親和性のわずかな損失を示すにすぎず、一方、ペプチドU(NA→NN)は約2倍の損失を示した。しかし、両残基を置換した場合(逆転して、NA→AN)、この損失は加算したものよりも大きく、親和性の4〜5倍の減少が認められる。
【０２１６】
実施例10
PumaおよびBmf BH3-オンリータンパク質に関連する2つのさらなるペプチドをPioneerペプチド合成機で合成し、それらのBcl-2 ΔC26に対する結合親和性を評価した。
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【０２１７】
実施例11
実施例8〜10ではBcl-wを使用したが、それはBcl-wが使用するのに頑強なタンパク質であるという理由からである。しかし以下に示すように、Biacoreアッセイを用いてBcl-2 ΔC22、Bcl-w ΔC10、およびBcl-w ΔC29に対して、ならびにGST検出によるアルファスクリーンアッセイを用いてBcl-w ΔC29に対して親和性を試験した場合、Bim-26アミノ酸長はBcl-wおよびBcl-2に関して同様の効力を示した。実施例7に示した結果と一致して、拘束されたペプチドはやはりBcl-2に対するBim26アミノ酸長の結合を強く阻害し、またそれらの線状対応物よりもより強く阻害すると考えられる。
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【０２１８】
実施例12
配列
Ac-a-n-f-e-d-g-i-r-r-l-e-q-a-i-w-i-NH2
(小文字はDアミノ酸を指す)を有するレトロインベルソペプチドを、標準的なF-moc化学、Fields et al. (1991)を用いてApplied Biosystems 433ペプチド合成機で合成した。アミノ酸カップリングサイクルは、製造業者の標準的な手順に基づいた。ペプチドはHPLCにより精製し、質量分析による分子量は1971であった。
【０２１９】
実施例13
拘束されたペプチドAc-IAQZ1LRRIGDZ2F-NH2(式中、Z1およびZ2は、ジアミノペンタンリンカーによって側鎖カルボン酸基を介して連結されるグルタミン酸残基である)の別の合成を行ったが、この場合、リンカーはペプチド内に取り込む前のグルタミン酸と反応させた。
【０２２０】
FmocGlu(モノBoc-ジアミノアルキル)-OH誘導体
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2 mMol規模で、DMF中での標準的なHBTU/DIPEAカップリングにより、Fmoc-Glu-OtBuをその側鎖を介してNH2(CH2)5NHBocに結合させた。酢酸エチルによる標準的な有機/水処理後に得られた有機層を濃縮し、Fmoc-Gln-[(CH2)5NHBoc]-OtBuを含む残渣をジクロロメタン(DCM)中の50%トリフルオロ酢酸(TFA)で1時間処理した。次いで、溶液を濃縮し、Fmoc-Gln-[(CH2)5NH2.TFA]-OHを含む残渣をメタノールに溶解し、セライトを通して濾過した。濾液を濃縮した後、残渣を、50%アセトン水溶液中のBoc2O(5 mmol)およびDIPEA(10 mmol)で3時間処理した。10%クエン酸で酸性化した後、生成物を酢酸エチル中に抽出し、水で洗浄した。分離された有機層を乾燥および蒸発させて粘性物質を生じ、これを10% MeOH/DCMによりシリカ充填物を通して精製してFmoc-Gln-[(CH2)5NHBoc]-OH(800 mg)を粘性物質として生じ、これを高真空に曝露してガラスにした。正のエレクトロスプレー質量分析による解析によって、554という分子イオン、計算上のMW 553が提供された。
【０２２１】
ペプチド合成
Fmoc保護アミノ酸、ならびに以下の保護アミノ酸、Fmoc-Gln-[(CH2)5NHBoc]-OH(Z1)、Fmoc-Gln(2-PhiPr)-OH(Z2)、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、およびFmoc-Gln(trt)-OHを用いて、ペプチドIAQZ1LRRIGDZ2F(式中、Z1は上記のBoc保護アミノペンチルグルタミン残基であり、Z2はグルタミン酸である)をRink樹脂上で固相合成により合成した。カップリングは、標準的なHBTU/DIPEAカップリング条件で行った。各サイクルにおけるFmoc保護基は、0.2 M HOBt/25%ピペリジン/DMFで1分間処理することによって除去した。ペプチドが完成した後、標準的な方法によりN末端を無水酢酸でアセチル化した。
【０２２２】
樹脂/ペプチドAc-IAQQ[(CH2)5NHBoc]LRRIGDE[2-PhiPr]F-Rinkを2% TFA/DCMで処理して、Z1およびZ2残基側鎖を脱保護し、遊離のアミン基およびカルボン酸基を生成した。標準的なHBTU/DIPEAカップリング条件を使用して、Z1とZ2の連結を完了した。標準的な脱保護および切断条件により、拘束されたペプチドを脱保護し、樹脂から切断することで、ペプチド上にアミド保護C末端が提供された。
【０２２３】
アセトニトリル勾配(25分間での0.0〜75%)を有する0.1% TFAによる、C18カラム(Alltech Absorbosphere HS C18 5μM、150 x 3.2 mm)での逆相HPLCにより、拘束されたペプチドを精製した。ペプチドを214 nmでモニターし、95%純粋であると判断された。
【０２２４】
エレクトロスプレー質量分析(Micromass Platform 2、流速20μL/分での50%アセトニトリル/水中での試料導入により、ペプチドの同一性は
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と確認された。ペプチドはm/e 777.8において二重荷電イオンを示し、519.0において三重荷電イオンを示した。このデータを変換して、1554.0(計算上1553.8)というMWが得られた。
【０２２５】
実施例14
以下に記載する溶液競合アッセイおよびアルファスクリーンGST検出を使用して、実施例2の拘束されたペプチド(ペプチドA)を、Bcl-2相同体、Bcl-w ΔC29、Bcl-xL ΔC25、およびMcl-1 ΔC23に対する競合結合について評価した。
【０２２６】
アッセイはすべて、384ウェル白色プレートを使用し、全量20μLで行った。アッセイ緩衝液は、50 mM HEPES、10 mM DTT、100 mM NaCl、0.05% Tween 20、0.1 mg/mLカゼイン、pH 7.4である。ビーズ緩衝液は、50 mM Tris、1% Tween 20、0.1 mg/mLカゼイン、pH7.5である。
【０２２７】
GST-Bcl-wΔC29タンパク質アッセイのため、タンパク質(0.10 nM)、アクセプタービーズ(10μg/mL)、50%アッセイ緩衝液、および50%ビーズ緩衝液を共に30分間インキュベートした。同時に、ビオチン化BimBH3ペプチド
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、ドナービーズ(10μg/mL)、50%アッセイ緩衝液、および50%ビーズ緩衝液を共に30分間インキュベートした。競合結合アッセイのため、タンパク質アクセプタービーズ溶液(10μL)および候補化合物、A、L1、またはL2を各ウェルに添加して30分間インキュベートし、次いでビオチン化BimBH3ペプチドドナービーズ溶液(10μL)を各ウェルに添加した。その後、各ウェル中の全DMSO濃度が0.5%〜2%になるよう調整した。プレートをアルミホイルで覆い、室温で4時間インキュベートし、その後、680 nmでの励起および520〜620 nmでの発光を用いてPackard Fusion(商標)リーダーで読み取った。光感受性のため、アッセイはすべて抑えた照明の元で行った。
【０２２８】
Mcl-1アッセイでは、GST-Mcl-1タンパク質(0.4 nM)およびビオチン化BakBH3ペプチド
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を用いて同様の手順を採用した。
【０２２９】
Bcl-xLΔC24アッセイでは、GST-Bcl-xLタンパク質(0.6 nM)およびビオチン化BimBH3タンパク質(5 nM)を用いて同様の手順を採用した。
【０２３０】
線状ペプチド対照、L1およびL2、ならびに候補化合物としての拘束されたペプチドAを用いてアッセイを行った。結果を以下に示す。
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表中、Zは、1,5-ジアミノペンタンリンカーによりそれらの側鎖を介して連結される2つのグルタミン酸残基を表す。
【０２３１】
別のアッセイ実験では、Bcl-w ΔC29、Bcl-xL ΔC25、およびMcl-1 ΔC23に対するペプチドAの直接結合の証明として、Biacore S51バイオセンサーを使用する表面プラズモン共鳴(SPR)実験を使用した。この技法はまた解離定数が得られるという利点を有し、これを以下に示す。
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【０２３２】
両実験セットから、拘束されたペプチドAがその線状対応物よりも非常に強力であることが明らかである。
【０２３３】
実施例15
ハイブリドーマ株1 D3(抗マウスCD19)を、1%ウシ胎児血清(Trace、オーストラリア)を含む無ハイブリドーマ培地(Gibco, Invitrogen、米国)で培養した。プロテインG-セファロース(Amersham-Pharmacia、スウェーデン)を使用し、製造業者の説明書に従ってアフィニティークロマトグラフィーにより、培養上清からモノクローナル抗体(MAb)を精製した。1.35 mg/mLの溶出MAbをPBSに対して透析し、滅菌濾過した。
【０２３４】
MAbをその遊離リジン側鎖を介して、N-ヒドロキシ-スクシンイミド(NHS)-Acp-マレイミド(Sigma 63177)またはNHS-ピリジルジスルフィド(Pierce SMPT 21558またはLC-SMPT 21569)と反応させた。得られたマレイミドタグ付MAbを、
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中のシステインのチオール基と反応させ、MAbにペプチドを添加した際に沈殿するペプチド-MAb複合体を得た。SDS-Pageにより複合体を解析したところ、SDS-Pageによって上清中にはMAbは存在しないことが示され、ペレットは対照MAbよりも大きい分子量のMAbを示した。
【０２３５】
実施例16
96ウェルプレート中の、10%ウシ胎児血清、2-メルカプトエタノール、およびアスパラギンを含むダルベッコ変法イーグル培地(FMA培地)中の、E-μ mycトランスジェニックマウスに由来する4 x 105/mL濃度のプレB腫瘍細胞150μLを、0.02、0.03、0.06、0.13、0.25、および0.5μMのCD19抗体のみ、実施例15で調製したCD19抗体と配列
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を有する線状Bim BH3ペプチドの複合体、またはエトポシドと共にインキュベートした。5% CO2中で37℃にて24時間インキュベートした後、細胞をPBSで洗浄し、100μg/mLヨウ化プロピジウム溶液50μLを各ウェルに添加した。フローサイトメトリー(BD Facscan)により細胞を解析し、生存細胞をヨウ化プロピジウムを排除する細胞の割合として表した。結果を以下に示す。
24時間後の生存細胞(%)
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【０２３６】
実施例17
動物モデル：
インビボにおける本発明の複合体の抗腫瘍効果を評価するため、BH3模倣複合体を単独で(静脈内に：iv；または腹腔内に：ip)、または臨床的に関連のある化学療法(例えば、腹腔内への25〜100mg/kgシクロホスファミド)と併用して投与し得る。106個のBcl-2過剰発現マウスリンパ腫細胞(Strasser 1996；Adams 1999)を腹腔内に注射したマウスは、処置しなければ4週間以内に速やかに死に至るが、シクロホスファミドに一部応答する悪性の未熟リンパ腫を発症する。リンパ腫/白血病は、コールターカウンターを用いて動物で末梢血計測を行うことにより、または動物を屠殺した際にリンパ器官(リンパ節、脾臓)を秤量することにより、容易にモニターすることができる。別のモデルは、ヒト濾胞性リンパ種(DoHH2)由来細胞株のような細胞株の、免疫不全SCIDマウスへの移植である(Lapidot 1997)。本発明の複合体は併用療法において有効であるとことが予期されるため、そのインビボ活性を単独で、または従来の化学療法薬(例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、エピポドフィロトキシン(エトポシド；VP-16))と併用して評価し得る。治療群当たり18〜20匹のマウスの同齢集団を研究して、0.05の有意水準で0.8の検出力で有効性の25%の相違を決定することが可能である。マウスにおけるこれらのインビボテストにより、予備的な薬物動態データ、薬力学的データ、および毒物学的データもまた得られることになる。
【０２３７】
本明細書中のいかなる参考文献の引用も、そのような参考文献が本願に対する「先行技術」として利用可能であることを認めるものと解釈すべきではない。
【０２３８】
本明細書全体にわたり、その目的は、本発明をいずれか1つの態様または特徴の特定の収集物に限定することなく、本発明の好ましい態様を説明することにある。したがって当業者には、本開示に照らして、本発明の範囲から逸脱することなく、例証される特定の態様に対して種々の改変および変更を行い得ることが理解されるものと思われる。そのような改変および変更はすべて、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【０２３９】
参考文献
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2008504239.tif 000056
2008504239.tif 000057
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2008504239.tif 000064
2008504239.tif 000065
【手続補正書】
【提出日】平成19年4月5日(2007.4.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008504239000001.app
【国際調査報告】
2008504239.tif 000077
2008504239.tif 000078
2008504239.tif 000079