(57)【要約】  本発明は、ボツリヌス菌によって形成される神経毒の重鎖を改変することによって得ることができる輸送タンパク質に関し、（ｉ）本タンパク質は天然神経毒よりも高いまたは低い親和性で神経細胞と特異的に結合し、（ii）本タンパク質は天然神経毒と比較して増大または減少した神経毒性を有し、神経毒性は半横隔膜アッセイで調べられることが好ましく、かつ／または（iii）本タンパク質は、中和抗体に対して天然神経毒と比較してより低い親和性を含む。本発明はまた、輸送タンパク質の製造方法および化粧料組成物および薬剤組成物におけるその使用に関する。
2008538902.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボツリヌス菌によって形成される神経毒の重鎖を改変することによって得ることができる輸送タンパク質であって、
（ｉ）天然神経毒よりも高いまたは低い親和性で神経細胞と結合するタンパク質、
（ii）天然神経毒と比較して増大または減少した神経毒性を有するタンパク質であって、神経毒性が半横隔膜アッセイで調べられることが好ましいタンパク質、および／または
（iii）天然神経毒と比較して、中和抗体に関して低い親和性を示すタンパク質。
【請求項２】
中和抗体が天然神経毒の、タンパク質受容体またはガングリオシド受容体との結合を阻害するか、かつ／または神経細胞における神経毒の吸収を阻害する、請求項１に記載の輸送タンパク質。
【請求項３】
エンドサイトーシスによって細胞によって吸収される、請求項１または２に記載の輸送タンパク質。
【請求項４】
原形質膜結合分子、膜貫通タンパク質、シナプス小胞タンパク質、シナプトタグミンファミリーのタンパク質またはシナプス小胞糖タンパク質２（ＳＶ２）および／またはシナプトタグミンＩおよび／またはシナプトタグミンII（コリン作動性運動ニューロン）および／またはＳＶ２Ａ、ＳＶ２ＢまたはＳＶ２Ｃと、好ましくは、ヒトシナプトタグミンＩおよび／またはヒトシナプトタグミンIIおよび／またはヒトＳＶ２Ａ、ＳＶ２ＢまたはＳＶ２Ｃと特異的に結合する、請求項１から３のいずれか一項に記載の輸送タンパク質。
【請求項５】
天然神経毒よりも少なくとも１５％高いかまたは少なくとも１５％低い、好ましくは、少なくとも５０％、特に好ましくは、少なくとも８０％、特に、少なくとも９０％である親和性を示す、請求項１から４のいずれか一項に記載の輸送タンパク質。
【請求項６】
輸送タンパク質のＨＣ−断片が、天然に存在するか、または天然に存在しないアミノ酸のいずれかの、少なくとも１つの置換および／または欠失および／または挿入および／または付加および／または翻訳後修飾を含み、これが天然神経毒に対して親和性を増大させるかまたは減少させる、請求項１から５のいずれか一項に記載の輸送タンパク質。
【請求項７】
神経毒がボツリヌス神経毒血清型Ａ〜Ｇである、請求項１から６のいずれか一項に記載の輸送タンパク質。
【請求項８】
アミノ酸位置
ボツリヌス菌神経毒血清型Ａの８６７〜１２９６、
ボツリヌス菌神経毒血清型Ｂの８６６〜１２９１、
ボツリヌス菌神経毒血清型Ｃ１の８６４〜それぞれ１２９１または１２８０、
ボツリヌス菌神経毒血清型Ｄの８６０〜それぞれ１２７６または１２８５、
ボツリヌス菌またはクロストリジウム・ブチリカム(Clostridium butyricum)神経毒血清型Ｅの８４３〜それぞれ１２５１または１２５２、
それぞれボツリヌス菌またはクロストリジウム・バラティ(Clostridium baratii)神経毒血清型Ｆの８６１〜１２７４、８６２〜それぞれ１２８０または１２７８および８５４〜１２６８、
ボツリヌス菌神経毒血清型Ｇの８６１〜１２９７
にある少なくとも１個のアミノ酸が、天然に存在するか、または天然に存在しないアミノ酸のいずれかによって、翻訳後修飾および／または付加および／または欠失および／または挿入および／または置換されている、請求項７に記載の輸送タンパク質。
【請求項９】
天然神経毒が神経毒血清型Ａであり、かつ、輸送タンパク質が好ましくは、シナプス小胞糖タンパク質２（ＳＶ２）と、特に好ましくは、ＳＶ２Ａ、ＳＶ２ＢまたはＳＶ２Ｃと結合する、請求項１から８のいずれか一項に記載の輸送タンパク質。
【請求項１０】
ボツリヌス神経毒血清型Ａタンパク質配列の位置トレオニン１１９５、アスパラギン１１９６、グルタミン１１９９、リジン１２０４、イソロイシン１２０５、ロイシン１２０６、セリン１２０７、ロイシン１２０９、アスパラギン酸１２１３、ロイシン１２１７、フェニルアラニン１２５５、アスパラギン１２５６、イソロイシン１２５８および／またはリジン１２６０にある少なくとも１個のアミノ酸が、天然に存在するか、または天然に存在しないアミノ酸のいずれかによって、翻訳後修飾および／または付加および／または欠失および／または挿入および／または置換されている、請求項９に記載の輸送タンパク質。
【請求項１１】
位置アスパラギン１１９６、グルタミン１１９９、セリン１２０７、フェニルアラニン１２５５、イソロイシン１２５８および／またはリジン１２６０にある少なくとも１個のアミノ酸が、天然に存在するか、または天然に存在しないアミノ酸のいずれかによって、翻訳後修飾および／または付加および／または欠失および／または挿入および／または置換されている、請求項１０に記載の輸送タンパク質。
【請求項１２】
位置１２０７においてアミノ酸セリンがアルギニンまたはチロシンによって置換されている、請求項１０または１１のいずれか一項に記載の輸送タンパク質。
【請求項１３】
位置１２６０においてアミノ酸リジンがグルタミン酸によって置換されている、請求項１０または１１のいずれか一項に記載の輸送タンパク質。
【請求項１４】
神経毒がボツリヌス神経毒血清型Ｂであり、好ましくは、シナプトタグミンＩまたはIIと結合する、請求項１から８のいずれか一項に記載の輸送タンパク質。
【請求項１５】
ボツリヌス神経毒血清型Ｂタンパク質配列の位置リジン１１１３、アスパラギン酸１１１４、セリン１１１６、プロリン１１１７、バリン１１１８、トレオニン１１８２、チロシン１１８３、フェニルアラミン１１８６、リジン１１８８、グルタミン酸１１９１、リジン１１９２、ロイシン１１９３、フェニルアラニン１１９４、フェニルアラミン１２０４、フェニルアラニン１２４３、グルタミン酸１２４５、リジン１２５４、アスパラギン酸１２５５およびチロシン１２５６にある少なくとも１個のアミノ酸が、天然に存在するか、または天然に存在しないアミノ酸のいずれかによって、翻訳後修飾および／または付加および／または欠失および／または挿入および／または置換されている、請求項１４に記載の輸送タンパク質。
【請求項１６】
ボツリヌス神経毒血清型Ｂタンパク質配列の位置バリン１１１８、チロシン１１８３、グルタミン酸１１９１、リジン１１９２、グルタミン酸１２４５および／またはチロシン１２５６にある少なくとも１個のアミノ酸が、天然に存在するか、または天然に存在しないアミノ酸のいずれかによって、翻訳後修飾および／または付加および／または欠失および／または挿入および／または置換されている、請求項１５に記載の輸送タンパク質。
【請求項１７】
位置１１８３でアミノ酸チロシンがロイシンによって置換されている、請求項１６に記載の輸送タンパク質。
【請求項１８】
位置１１９１でアミノ酸グルタミンがロイシンによって置換されている、請求項１６に記載の輸送タンパク質。
【請求項１９】
神経毒がボツリヌス神経毒血清型Ｇである、請求項１から８のいずれか一項に記載の輸送タンパク質。
【請求項２０】
ボツリヌス神経毒血清型Ｇタンパク質配列の位置フェニルアラニン１１２１、リジン１１２３、アラニン１１２４、セリン１１２５、メチオニン１１２６、バリン１１９０、ロイシンｌ１９１、セリン１１９４、グルタミン酸１１９６、トレオニン１１９９、グルタミン１２００、ロイシン１２０１、フェニルアラニン１２０２、フェニルアラニン１２１２、フェニルアラニン１２４８、リジン１２５０、アスパラギン酸１２５１およびチロシン１２６２にある少なくとも１個のアミノ酸が、天然に存在するか、または天然に存在しないアミノ酸のいずれかによって、翻訳後修飾および／または付加および／または欠失および／または挿入および／または置換されている、請求項１９に記載の輸送タンパク質。
【請求項２１】
ボツリヌス神経毒血清型Ｇタンパク質配列の位置メチオニン１１２６、ロイシン１１９１、トレオニン１１９９、グルタミン１２００、リジン１２５０およびチロシン１２６２にある少なくとも１個のアミノ酸が、天然に存在するか、または天然に存在しないアミノ酸のいずれかによって、翻訳後修飾および／または付加および／または欠失および／または挿入および／または置換されている、請求項２０に記載の輸送タンパク質。
【請求項２２】
位置１２６２においてアミノ酸チロシンがフェニルアラニンによって置換されている、請求項２１に記載の輸送タンパク質。
【請求項２３】
請求項１から２２のいずれか一項に記載の輸送タンパク質と、少なくとも１種の介在分子とを含む組成物。
【請求項２４】
介在分子が、ペプチド結合、エステル結合、エーテル結合、スルフィド結合、ジスルフィド結合または炭素−炭素結合によって輸送タンパク質と共有結合している、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
介在分子が小さい有機分子、ペプチドまたはタンパク質のいずれかである、請求項２３または２４に記載の組成物。
【請求項２６】
小さい有機分子がウイルス増殖抑制剤、細菌増殖抑制剤、抗生物質または免疫グロブリンである、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
タンパク質がプロテアーゼである、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２８】
プロテアーゼが、ボツリヌス菌神経毒の血清型Ａ、Ｂ、Ｃ１、Ｄ、Ｅ、Ｆおよび／またはＧのうち１種または複数の軽鎖（ＬＣ）を含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
プロテアーゼが、ボツリヌス菌神経毒の血清型Ａ、Ｂ、Ｃ１、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧの軽鎖（ＬＣ）に由来し、天然プロテアーゼのタンパク質分解活性の少なくとも０．０１％、好ましくは少なくとも５０％を示すことを特徴とするタンパク質分解活性断片を含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
プロテアーゼが、コリン作動性運動ニューロン内の規定の基質を特異的に開裂する、請求項２８および２９に記載の組成物。
【請求項３１】
基質が、神経細胞における神経伝達物質の放出に関与しているタンパク質から、および神経細胞内で反応を触媒できるタンパク質から選択される、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
プロテアーゼおよび輸送タンパク質が、エンドペプチダーゼによって特異的に認識され、開裂されるアミノ酸配列によって共有結合している、請求項２８および２９に記載の組成物。
【請求項３３】
アミノ酸配列が配列ＣＸＸＸＺＫＴＫＳＬＶＰＲＧＳＫＢＸＸＣ(Ｘはいずれかの所望のアミノ酸であり、ＺおよびＢは互いに独立に、アラニン、バリン、セリン、トレオニンおよびグリシンから選択される）を含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
エンドペプチダーゼによる開裂後、ジスルフィド架橋がプロテアーゼと輸送タンパク質を連結し、これが次いで、活性なホロ毒素の形成をもたらす、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３５】
請求項１から２２のいずれか一項に記載の輸送タンパク質または請求項２３から３４のいずれか一項に記載の組成物と、場合によって、製薬上許容される賦形剤、希釈剤および／もしくは添加物とを含有する薬剤組成物。
【請求項３６】
ボツリヌス神経毒を用いる療法が指示される障害および疾患を治療するための、請求項３５に記載の薬剤組成物の使用。
【請求項３７】
障害または疾患が以下：片側顔面痙攣、痙性斜頸、眼瞼痙攣、痙縮、ジストニア、片頭痛、疼痛、頚部および腰椎柱の障害、斜視、流涎過多、いびき、創傷治癒および鬱病性疾患のうち１種である、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
請求項１から２２のいずれか一項に記載の輸送タンパク質または請求項２３から３４のいずれか一項に記載の組成物と、場合によって、化粧品上許容される賦形剤、希釈剤および／もしくは添加物とを含有する化粧料組成物。
【請求項３９】
化粧料の適応症、多汗症および顔のしわを治療するための、請求項３８に記載の化粧料組成物の使用。
【請求項４０】
公知の方法による組換えによる、請求項１から２２に記載の輸送タンパク質または請求項２３から３４に記載の組成物の製造方法。
【請求項４１】
ＨＣ−断片の遺伝子を、制限エンドヌクレアーゼのインターフェースを含む２種の核酸によってフランキングし、制限エンドヌクレアーゼのインターフェースがボツリヌス菌神経毒のその他のＨＣ−断片のものと適合しており、アミノ酸配列の類似性を保ちながら、それらの容易なモジュラー置換を可能にする、請求項４０に記載の輸送タンパク質の製造方法。
【請求項４２】
プロテアーゼの遺伝子を、制限エンドヌクレアーゼのインターフェースを含む２種の核酸によってフランキングし、制限エンドヌクレアーゼのインターフェースがボツリヌス菌神経毒のその他のプロテアーゼドメインのものと適合しており、アミノ酸配列の類似性を保ちながら、それらの容易なモジュラー置換を可能にする、請求項４０に記載の組成物の製造方法。
【請求項４３】
請求項１から２２に記載の輸送タンパク質または請求項２３から３４に記載の組成物をコードする組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４４】
宿主細胞が大腸菌(Escherichia coli)、特に、大腸菌Ｋ１２、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)または巨大菌(Bacillus megaterium)の細胞であり得る、請求項４３に記載の宿主細胞。
【請求項４５】
請求項１から２２のいずれか一項に記載の輸送タンパク質または請求項２３から３４のいずれか一項に記載の組成物をコードする核酸を含む発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ボツリヌス菌によって形成される神経毒よりも高いまたは低い親和性でニューロンと結合する輸送タンパク質に関する。本輸送タンパク質は、受容体媒介性エンドサイトーシスによって吸収されることが好ましい。このタンパク質は、生理学的には原形質膜を通って神経細胞のサイトゾル中に透過できないその他の化学物質（例えば、プロテアーゼ）を、酸性エンドソームコンパートメントからニューロンのサイトゾル中に輸送するための輸送手段として用いられる。本発明は、詳しくは、神経伝達物質の放出の阻害剤の導入のための輸送タンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経細胞はエキソサイトーシスによって伝達物質を放出する。細胞内小胞の膜の、原形質膜との融合がエキソサイトーシスと呼ばれる。このプロセスの過程で、シナプス間隙に小胞の内容物が同時に放出される。２種の膜の融合は、タンパク質シナプトタグミンと反応するカルシウムによって制御されている。シナプトタグミンは、その他の補助因子とともに、３種のいわゆる融合タンパク質、ＳＮＡＰ−２５、シナプトブレビン２およびシンタキシン１Ａの状態を制御する。シンタキシン１Ａおよびシナプトブレビン２が原形質膜および／または小胞膜に組み込まれているのに対し、ＳＮＡＰ−２５は原形質膜と軽く結合しているだけである。細胞内カルシウム濃度が上昇する限り、３種のタンパク質は互いに結合し、両方の膜が互いに接近し、続いて、一緒になって融合する。コリン作動性ニューロンの場合には、アセチルコリンが放出され、筋収縮、発汗およびその他のコリン作動性誘発反応を引き起こす。
【０００３】
上記の融合タンパク質が、細菌ボツリヌス菌(C. botulinum)、Ｃ．ブチリカム(C. butyricum)、Ｃ．バラティ(C. baratii)およびＣ．テタニ(C. tetani)によって形成されるクロストリジウム神経毒の軽鎖（ＬＣ）の標的分子（基質）である。
【０００４】
嫌気性グラム陽性菌ボツリヌス菌は、７種の異なる血清型のクロストリジウム神経毒を産生する。後者はボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ａ〜ＢｏＮＴ／Ｇ）と呼ばれる。これらの中でも、特に、ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｂが、ヒトおよび動物においてボツリヌス中毒と呼ばれる神経麻痺性障害を引き起こす。ボツリヌス菌の胞子は、土壌中に見られるが、誤って滅菌され、密閉された自家製貯蔵食品中で発育する場合もあり、これが、ボツリヌス中毒の多くの場合の原因である。
【０００５】
ＢｏＮＴ／Ａは、全ての既知の生物学的物質のうちで最も活性である。５〜６ｐｇほどの少量の精製ＢｏｎＴ／Ａが、ＭＬＤ（半数致死量）に相当する。ＢｏＮＴ／Ａの１ユニット（英語：Ｕｎｉｔ、Ｕ）は、腹腔内注射後に、各々体重１８〜２０ｇ雌のスイスウェブスターマウスの半数を死滅させるＭＬＤとして定義される。７種の免疫学的に異なるＢｏＮＴが特性決定された。それらはＢｏＮＴ／Ａ、Ｂ、Ｃ１、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧと表され、血清型特異的抗体での中和によって区別できる。ＢｏＮＴの種々の血清型は、引き起こされる麻痺の重篤度および期間に関して、感染した動物種で異なる。したがって、麻痺に関して、例えば、ラットではＢｏＮＴ／ＡはＢｏＮＴ／Ｂより５００倍より強力である。さらに、ＢｏＮＴ／Ｂは、霊長類では、４８０Ｕ／体重１Ｋｇの投与量では毒性ではないことが証明されている。同量のＢｏＮＴ／Ａは、霊長類におけるこの物質の致死量（ＬＤ）の１２倍に相当する。他方、マウスにおけるＢｏＮＴ／Ａ注射後の麻痺期間は、ＢｏＮＴ／Ｅの注射後よりも１０倍長い。
【０００６】
ＢｏＮＴは、病的に過敏性の末梢神経によって引き起こされる骨格筋の運動亢進を特徴とする神経筋障害を治療するために使用されている。ＢｏＮＴ／Ａは、眼瞼痙攣、斜視、多汗症、しわおよび片側顔面痙攣を治療するために米国食品医薬品局によって承認されている。ＢｏＮＴ／Ａと比較して、残りのＢｏＮＴ血清型は明らかにあまり有効でなく、短期間の効力しか示さない。末梢−筋内投与されたＢｏＮＴ／Ａの臨床効果は、通常、１週間以内に気付かれる。ＢｏＮＴ／Ａの１回の単一筋内注射による症状抑制期間は、通常、約３〜６ヶ月である。
【０００７】
クロストリジウム神経毒は、融合装置の種々のタンパク質を特異的に加水分解する。ＢｏＮＴ／Ａ、Ｃ１およびＥはＳＮＡＰ−２５を破壊するのに対し、ＢｏＮＴ／Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｇならびに破傷風神経毒（ＴｅＮＴ）は、小胞結合膜タンパク質（ＶＡＭＰ）２（シナプトブレビン２とも呼ばれる）を攻撃し、ＢｏＮＴ／Ｃ１はさらに、シンタキシン１Ａを破壊する。
【０００８】
クロストリジウム細菌は、神経毒を、各々１２５１〜１３１５アミノ酸を有する一本鎖ポリペプチドとして放出する。その後、内在性プロテアーゼがこれらのタンパク質の各々を規定の位置で、各々２つの鎖に開裂する（「ニッキング」）が、２つの鎖はジスルフィド架橋によってまだ連結されている。これらの二重鎖タンパク質がホロ毒素と呼ばれる（ショーン(Shone)ら、（１９８５）、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(European Journal of Biochemistry)１５１、７５〜８２頁を参照のこと）。この２つの鎖は異なる機能を有する。小さい断片、軽鎖（light chain＝ＬＣ）がＺｎ２＋依存性エンドプロテアーゼに相当し、大きいユニット（heavy chain＝ＨＣ）が軽鎖の輸送手段に相当する。ＨＣをエンドペプチダーゼで処理することによって、２つの５０ｋＤａの断片が得られた（ヒメネス(Gimenez)ら、（１９９３）、ジャーナル・オブ・プロテイン・ケミストリー(Journal of Protein Chemistry)１２、３５１〜３６３頁を参照のこと）。アミノ末端側の半分（ＨＮ−断片）は、低ｐＨ値で膜に組み込まれ、ＬＣが神経細胞のサイトゾルに移動する。カルボキシ末端側の半分（ＨＣ−断片）は、もっぱら、神経細胞膜に生じる複合体ポリシアロガングリオシドと、および今日まで部分的にしか同定されていないタンパク質受容体と結合する（ハルパーン(Halpern)ら、（１９９３）、カレント・トピックス・イン・マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー(Current Topics in Microbialogy and Immunology)１９５、２２１〜２４１頁）。後者は、クロストリジウム神経毒の高い神経選択性を説明している。結晶構造により、ＢｏＮＴ／Ａは３つのドメインを配置していることが確認され、これは３ステップの作用機序と一致し得る（レイシー(Lacy)ら（１９９８）ネイチャー・ストラクチュラル・バイオロジー(Nature Structural Biology)５、８９８〜９０２頁を参照のこと）。さらに、これらのデータは、ＨＣ−断片内に、各２５ｋＤａの２つの自律的サブユニット（サブドメイン）が存在するという結論につながる。２つの機能的サブドメインの存在についての第1の証拠は、ＴｅＮＴのＨＣ−断片のアミノ末端側の半分（ＨＣＮ）およびカルボキシ末端側の半分（ＨＣＣ）によってもたらされ、これらは組換え型で発現され、ＨＣＣドメインはニューロンと結合するがＨＣＮドメインは結合しないということを示した（エレロス(Herreros)ら（２０００）、バイオケミカル・ジャーナル(Biochemical Journal)３４７、１９９〜２０４頁を参照のこと）。後者の段階では、ＢｏＮＴ／ＡおよびＢのＨＣＣドメイン内の単一のガングリオシド結合部位の場所が特定され、特性決定された（ルンメル(Rummel)ら（２００４）、モレキュラー・ミクロバイオロジー(Molecular Microbiology)、５１、６３１〜６４３頁）。ＢｏＮＴ／ＢおよびＧのタンパク質受容体として同定されるシナプトタグミンＩおよびIIの結合部位は、同様に、ＢｏＮＴ／ＢおよびＧのＨＣＣ−ドメインの領域内に制限され得る（ルンメル(Rummel)ら、（２００４）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal of Biological Chemistry)２７９、３０８６５〜７０頁を参照のこと）。しかし、この文書は、ＢｏＮＴ／ＢおよびＧの結合ポケットと関係するアミノ酸は開示していない。
【０００９】
ＨＣ断片を含むＨＣは、生理学的条件下では、ニューロンのガングリオシドと結合し、受容体媒介性エンドサイトーシスによって細胞の内側に吸収され、エンドソームコンパートメントを介して天然の小胞の循環に到達する。初期エンドソームの酸性媒質では、ＨＮ断片は小胞膜中に貫通し、孔を形成する。ジスルフィド架橋を介してＨＣと結合している各物質（Ｘ）は、細胞内レドックスシステムによってＨＣから開裂されて離れ、ジスルフィド架橋に近づき、これを還元する。Ｘは最終的にはサイトゾル中に現れる。
【００１０】
クロストリジウム神経毒の場合には、ＨＣはＬＣの担体であり、最終ステップでサイトゾルにおいてその特異的基質を開裂する。融合タンパク質の複合体の形成および解離のサイクルが妨げられ、その結果、アセチルコリンの放出が阻害される。その結果として、横紋筋が麻痺し、汗腺がその分泌を停止する。個々のＢｏＮＴ血清型の活性期間は、サイトゾル中の無傷のＬＣの存在に応じて変わる。すべてのニューロンがクロストリジウム神経毒の受容体を有するので、影響を受け得るのはアセチルコリンの放出だけではなく、サブスタンスＰの、ノルアドレナリンの、ＧＡＢＡ、グリシン、エンドルフィンおよびその他の伝達物質およびホルモンの放出も可能性がある。
【００１１】
コリン作動性伝達が選択的に遮断されることは、末梢においてＨＣがニューロンに入るという事実によって説明できる。中枢シナプスは、タンパク質では克服できない血液−脳関門によって保護されている。
【００１２】
リガンド−受容体研究では、タンパク質受容体の結合ポケットを同定および特性決定するため、ひいては、タンパク質受容体に対する親和性を改変するために、ＢｏＮＴ／ＢおよびＧのＨＣＣ−ドメイン内で特定のアミノ酸残基を置換した。突然変異させたＢｏＮＴ／ＢおよびＧのＨＣ断片の親和性は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）プルダウン実験においてシナプトタグミンによって調べた。続いて、同じ突然変異を示すＨＣを、それぞれ、ＬＣ−ＢまたはＬＣ−Ｇと結合させた。これらの構築物の効力を、マウスの単離した神経−筋−調製物によって分析した（半横隔膜アッセイ＝ＨＤＡ）。この調製物では、コリン作動性運動ニューロンからなり、クロストリジウム神経毒の最も重要な生理学的対象に相当する横隔神経が見られるはずである。続いて、抑制におけるＢｏＮＴ／ＡのＨＣＣ−ドメインにおいて、ＢｏＮＴ／ＢおよびＧにおけるタンパク質−受容体−結合ポケットの部位と同様に局在する個々のアミノ酸を置換した。続いて、全長ＢｏＮＴ／Ａ単一突然変異体を、改変された効力に関してＨＤＡによって同様に分析し、これにより、改変されたリガンド−タンパク質−受容体−相互作用についての指標が得られた。
【００１３】
より最近では、ＢｏＮＴ／Ａ複合体はまた前駆体毒素Ａとも呼ばれ、ジストニア運動を治療するために、ならびに過度の交感神経活性を減弱するために（ベネケ(Benecke)ら（１９９５）、エーケーティー・ニューロロジー(Akt Neurology)２２、２０９ｆｆ参照のこと）、また疼痛および片頭痛を軽減するために（シチャ(Sycha)ら（２００４）ジャーナル・オブ・ニューロロジー(Journal of Neurology)２５１、１９〜３０頁を参照のこと）用いられている。この複合体は、神経毒、種々の赤血球凝集素および非毒性の赤血球凝集性でないタンパク質からなる。この複合体は、生理学的ｐＨで数分内に解離する。結果として生じる神経毒が、治療上関連があり、症状の軽減をもたらす、複合体の唯一の成分である。根本にある精神疾患は治療されないので、複合体は３〜４ヶ月間隔で再度注射される必要がある。注射される外来タンパク質の量に応じて、患者の中には、特異的ＢｏＮＴ／Ａ抗体を作るものもある。これらの患者は神経毒に対して耐性となる。一度、抗原感受性細胞が神経毒を認識し、抗体が形成されると、関連する記憶細胞は数年にわたって保存される。このために、できる限り少ない投与量で、できる限り高い活性の調製物を用いて患者を治療することが重要である。さらに、調製物は、細菌起源のいかなるさらなるタンパク質も含んではならないが、これはこれらが免疫アジュバントとして作用する可能性があるからである。このような物質は、マクロファージを誘引し、マクロファージは免疫アジュバントと神経毒の両方を認識し、それらをリンパ球に提示し、その結果、リンパ球が免疫グロブリンを形成することによって対応する。したがって、外来タンパク質を全く含まない極めて純粋な生成物のみが治療に用いられるべきである。分子レベルで見られる神経毒に対する患者の耐性は、主に、中和抗体の存在に基づいている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
以下では、本発明は、今日までに知られている方法の上記の問題を克服できる輸送タンパク質（Ｔｒａｐｏ）を提案する。
【００１５】
この主題は、ボツリヌス菌によって形成される神経毒の重鎖を改変することによって得られる新規輸送タンパク質によって得られ、
ここで、
（ｉ）このタンパク質は、天然神経毒よりも高いまたは低い親和性で神経細胞と結合し、
（ii）このタンパク質は、天然神経毒と比較して、増大または減少した神経毒性を有し、神経毒性は半横隔膜アッセイで調べられることが好ましく、および／または、
（iii）このタンパク質は、天然神経毒と比較した場合に、中和抗体に関してより低い親和性を示す。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態によれば、ボツリヌス菌によって形成される天然神経毒よりも高いまたは低い親和性で神経細胞と結合する輸送タンパク質を提供する。
【００１７】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、ボツリヌス菌によって形成される神経毒のＨＣを改変することによって得られ、天然神経毒よりも高いまたは低い親和性で神経細胞と特異的に結合する輸送タンパク質を提供する。輸送タンパク質はエンドサイトーシスによってこれらの細胞によって吸収されることが好ましい。
【００１８】
さらに、さらなる好ましい実施形態によれば、ボツリヌス菌によって形成される神経毒のＨＣを改変することによって得られる輸送タンパク質を提供し、特に、もはや利用できない中和抗体の結合のガングリオシド−およびタンパク質−受容体結合ポケット上の表面に露出されたアミノ酸を置換することによるタンパク質を提供する。
【００１９】
以下では、本願との関連で理解されなければならない用語を定義する。
【００２０】
「天然神経毒よりも高いまたは低い親和性での神経細胞との結合」。この場合において天然神経毒とは、ボツリヌス菌の天然神経毒である。この関連では、天然神経毒は、ボツリヌス菌由来のボツリヌス神経毒Ａおよび／またはボツリヌス神経毒Ｂおよび／またはボツリヌス神経毒Ｇであることが好ましい。大腸菌由来の組換え型で調製されたボツリヌス神経毒、とりわけ、天然ボツリヌス神経毒と同一のアミノ酸配列を含むものは、薬理学的に、天然のボツリヌス神経毒と同一の方法で作用し、組換えボツリヌス神経毒野生型と呼ばれる。この場合に記載される神経細胞とは、コリン作動性運動ニューロンである。輸送タンパク質は、原形質膜結合分子、膜貫通タンパク質、シナプス小胞タンパク質、シナプトタグミンファミリーのタンパク質またはシナプス小胞糖タンパク質２（ＳＶ２）、好ましくは、シナプトタグミンＩおよび／またはシナプトタグミンIIおよび／またはＳＶ２Ａ、ＳＶ２ＢまたはＳＶ２Ｃ、特に好ましくは、ヒトシナプトタグミンＩおよび／またはヒトシナプトタグミンIIおよび／またはヒトＳＶ２Ａ、ＳＶ２ＢまたはＳＶ２Ｃと特異的に結合することが好ましい。結合は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定されることが好ましい。測定は、実施例において詳細に説明されるＧＳＴプルダウンアッセイを用いて実施することが特に好ましい。
【００２１】
「タンパク質が、天然神経毒と比較して増大または減少した神経毒性を有する」。この場合には、天然神経毒とは、ボツリヌス菌の天然神経毒である。この場合には、天然神経毒は、ボツリヌス菌由来のボツリヌス神経毒Ａおよび／またはボツリヌス神経毒Ｂおよび／またはボツリヌス神経毒Ｇであることが好ましい。大腸菌由来の組換え型で調製されたボツリヌス神経毒、とりわけ、天然ボツリヌス神経毒と同一のアミノ酸配列を含むものは、天然のボツリヌス神経毒と薬理学的に同一の方法で作用し、組換えボツリヌス神経毒野生型と呼ばれる。この場合に記載される神経細胞とは、コリン作動性運動ニューロンである。神経毒性は、当技術分野で公知の半横隔膜アッセイ（ＨＤＡ）を用いて測定されることが好ましい。突然変異体の神経毒性は、ハーバーマン(Habermann)ら、ナウニン・シュミーデベルグス・アーカイブ・オブ・ファルマコロジー(Naunyn Schmiedeberg's Archives of Pharmacology)３１１（１９８０）、３３〜４０頁によって記載されるように測定できることが好ましい。
【００２２】
「中和抗体」。ボツリヌス神経毒を対象とする中和抗体は公知である（ゴッシェル(Goeschel)Ｈ、ウォールファース(wohlfarth)Ｋ、フレバート(Frevert)Ｊ、デングラー(Dengler)R、ビガルケ(Bigalke)Ｈ、ボツリナム・エー・トキシン・セラピー：ニュートラライジング・アンド・ノンニュートラライジング・アンチボディーズ−−セラピューティック・コンシークエンセズ(Botulinum A toxin therapy:neutralizing and nonneutralizing antibodies-- therapeutic consequences)、エクスペリメンタル・ニューロロジー(Experimental Neurology)１９９７年９月、１４７（１）、９６〜１０２頁）。神経毒を中和する抗体は、詳しくは、活性中心、例えば、神経毒のＨＣＣ−ドメイン内のガングリオシド−およびタンパク質−受容体結合ポケットとなどと相互作用することがわかった。神経毒において結合ポケットの周囲の表面が、その機能を負に損なうことなくアミノ酸置換によって改変されている場合には、中和抗体はその結合部位を失い、突然変異された神経毒はもはや中和されない。
【００２３】
用語「ボツリヌス菌によって形成される神経毒の重鎖の改変」。ボツリヌス菌によって形成される神経毒の重鎖（ＨＣ）のアミノ酸配列および／または核酸配列は、通常、既知血清型Ａ〜Ｇの各々について公的にアクセス可能なデータベースから入手可能である（また、表１を参照のこと）。これに関連して改変としては、少なくとも１個のアミノ酸がアミノ酸配列に欠失、付加、挿入されていること、または天然神経毒の少なくとも１個のアミノ酸が別の天然に存在する、もしくは天然に存在しないアミノ酸によって置換されていること、および／または所与のアミノ酸配列中の１個のアミノ酸が翻訳後修飾されていることが挙げられる。これに関連して翻訳後修飾としては、グリコシル化、アセチル化、アシル化、脱アミノ化、リン酸化(phosphorylisation)、イソプレニル化(isoprenylisation)、グリコシルホスファチジルイノシトリゼーション(inositolisation)および当業者に公知のさらなる改変が挙げられる。
【００２４】
ボツリヌス菌によって形成される神経毒のＨＣは、３つのサブドメイン、すなわち、アミノ末端の５０ｋＤａの大きさの輸送ドメインＨＮ、それに続く２５ｋＤａのＨＣＮ−ドメインとカルボキシル末端に位置する２５ｋＤａのＨＣＣ−ドメインを含む。ＨＣＮ−およびＨＣＣ−ドメインは一緒に、ＨＣ−断片として示される。個々の血清型およびその変形のそれぞれのサブドメインの対応するアミノ酸部分は表１から明らかである。
【００２５】
「ガングリオシド受容体」
ボツリヌス神経毒のＨＣは、末梢神経細胞に対して高親和性を示し、これは複合体ポリシアロガングリオシド（これらは２以上のシアル酸からなる糖脂質である）との相互作用によって大部分が媒介される（ハルパーン(Halpern)ら、（１９９５）、カレント・トピックス・イン・マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー(Current Topics in Microbiology and Immunology)１９５、２２１〜２４１頁；ＷＯ２００６／０２７０７）。それらと結合しているＬＣは、結果として、この細胞種のみに到達し、これらの細胞においてのみ活性となる。ＢｏＮＴ／ＡおよびＢは、１分子のガングリオシドＧＴ１ｂとのみ結合する。
【００２６】
ＢｏＮＴ／ＢおよびＢｏＮＴ／Ｇの場合には、タンパク質受容体はシナプトタグミンＩおよびシナプロタグミンIIである。ＢｏＮＴ／Ａの場合には、タンパク質受容体は、シナプス小胞糖タンパク質２（ＳＶ２）、好ましくは、ＳＶ２Ａ、ＳＶ２ＢおよびＳＶ２Ｃである。
【００２７】
現在、シナプトタグミンのファミリーに関係する１３種のアイソフォームが知られている。すべては、２つのカルボキシル末端Ｃａ２＋結合Ｃ２ドメインと、シナプロタグミンをシナプス小胞膜に固定する中央の膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）と、種々の長さを有するアミノ末端とを特徴とする。Ｃａ２＋流入後、シナプス小胞の原形質膜との融合が開始され、するとすぐに、シナプトタグミンの内腔アミノ末端が細胞外に示され、ＢｏＮＴ／ＢおよびＧの受容体アンカーとして利用可能である。それと同様に、ＳＶ２アイソフォームの第４の管腔ドメインが、エキソサイトーシス後に、ＢｏＮＴ／Ａとの相互作用に細胞外で利用可能である。
【００２８】
結合ポケットの個々のアミノ酸の特徴を、特異的突然変異誘発によって、タンパク質受容体の結合がより困難になるか、阻害されるよう改変した。この目的のために、ＢｏＮＴ／ＢおよびＢｏＮＴ／ＧのＨＣ−断片を大腸菌で発現させ、野生型として、あるいは個々のアミノ酸が置換した（突然変異／置換）組換え型で、推定結合ポケットにおいて単離する。ＧＳＴプルダウンアッセイについては、ＢｏＮＴ／ＢおよびＢｏＮＴ／Ｇの間、ならびにシナプロタグミンＩおよびシナプトタグミンIIの間のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける相互作用を調べるために、それぞれのＧＳＴ−シナプトタグミン融合タンパク質を、種々の量のそれぞれＢｏＮＴ／ＢまたはＢｏＮＴ／ＧのそれぞれのＨＣ−断片とともにインキュベートし、相分離を実施した。遊離ＨＣ−断片は分離した上清中に残ったのに対し、結合しているＢｏＮＴ  ＨＣ−断片は、ＧＳＴ−シナプトタグミン融合タンパク質と一緒に固体相では検出できた。ＧＳＴプルダウンアッセイにおける全長ＢｏＮＴ／ＢおよびＢｏＮＴ／ＧによるそれぞれのＨＣ−断片の置換は同様の結果を示した。
【００２９】
これに関連して、ＢｏＮＴ／Ｂ野生型は複雑なガングリオシドおよびシナプトタグミンＩの存在下で、膜貫通ドメインを用いてのみ結合するが、シナプトタグミンIIは、膜貫通ドメインを用いてまたは用いずに、ならびに複雑なガングリオシドの存在下または不在下の双方で結合するということがわかった。ＢｏＮＴ／Ｂのタンパク質受容体結合部位内のアミノ酸を特異的に置換することによって、両シナプトタグミン分子間の相互作用を大幅に増大させることまたは減少させることが可能となった（図１）。
【００３０】
さらに、ＢｏＮＴ／Ｇ野生型については、シナプトタグミンIおよびシナプトタグミンIIとの結合は、膜貫通ドメインを用いるか、または用いない各場合において、複雑なガングリオシドの存在下ならびに不在下の双方で起こるということが示された。ＢｏＮＴ／Ｇのタンパク質受容体結合部位内のＢｏＮＴ／Ｂと相同のアミノ酸を特異的に置換することによって、両シナプトタグミン分子間の相互作用を大幅に増大させることまたは減少させることが可能となった（図２）。
【００３１】
ＢｏＮＴ／Ａ、ＢおよびＧ野生型の全長型の効力は、用量−作用グラフによってＨＤＡにおいて測定した（図３および６）。続いて、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢおよびＧ単一突然変異体の種々の全長型の効力を、ＨＤＡにおいて測定し（図６）、応用効力関数によってＢｏＮＴ／ＢおよびＧ野生型の効力に対してプロットした（図４および５）。例えば、ＢｏＮＴ／Ｂにおけるアミノ酸バリン１１１８のアスパラギン酸による置換またはリジン１１９２のグルタミン酸による置換は、＜２％への効力の著しい減少をもたらす。それと対照的に、チロシン１１８３のそれぞれロイシンまたはアルギニンでの突然変異は、ＢｏＮＴ／Ｂの効力の大幅な増大を引き起こす（図４）。ＢｏＮＴ／Ｇにおいてチロシン１２５６をフェニルアラニンに改変することは、同様に効力の増大をもたらすが、グルタミン酸、リジンまたはチロシンでのグルタミン１２００の突然変異は、ＢｏＮＴ／Ｇの効力の相当な減少を引き起こす（図５）。ＢｏＮＴ／Ａの場合には、セリン１２０７をアルギニンまたはチロシンに改変することによって、効力の増大が起こるが、リジン１２６０のグルタミン酸への突然変異は、ＢｏＮＴ／Ａの著しい効力の減少を引き起こす（図６）。
【００３２】
好ましい実施形態によれば、輸送タンパク質は、天然神経毒よりも少なくとも１５％高いかまたは少なくとも１５％低い親和性を示す。輸送タンパク質は、天然神経毒よりも、少なくとも５０％高いまたは低い、特に好ましくは、少なくとも８０％高いかまたは低い、特に、少なくとも９０％高いまたは低い親和性を示すことが好ましい。
【００３３】
好ましい具体例によれば、ＨＣの改変は、所与の神経毒のＨＣ−断片の領域において起こる。改変が置換、欠失、挿入または付加を含む場合には、後者は、例えば、特異的突然変異誘発、この関連では、当業者に公知の方法によって実施できる。天然神経毒中に存在するアミノ酸は、この関連では、天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸のいずれかで改変される。原則として、アミノ酸は種々の物理化学的群に分けられる。アスパラギン酸およびグルタミン酸は、負に荷電したアミノ酸に属する。ヒスチジン、アルギニンおよびリジンは、正に荷電したアミノ酸に属する。アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、システインおよびチロシンは極性アミノ酸に属する。グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニンおよびトリプトファンは、非極性アミノ酸に属する。芳香族側鎖基は、アミノ酸の中でもヒスチジン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンの中に見い出される。一般に、アミノ酸を、別の物理化学的群に属する異なるアミノ酸で置換することが好ましい。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態によれば、輸送タンパク質はボツリヌス神経毒血清型Ａ〜Ｇである。天然神経毒のアミノ酸配列は、この関連では、以下の公的にアクセス可能なデータベースから入手できる。
【００３５】
【表１】
2008538902.tif 000003
【表２】
2008538902.tif 000004
【００３６】
これらのボツリヌス神経毒のＨＣ−断片に関しては、
ボツリヌス菌神経毒血清型Ａの８６７〜１２９６、
ボツリヌス菌神経毒血清型Ｂの８６６〜１２９１、
ボツリヌス菌神経毒血清型Ｃ１の８６４〜それぞれ１２９１または１２８０、
ボツリヌス菌神経毒血清型Ｄの８６０〜それぞれ１２７６または１２８５、
ボツリヌス菌またはＣ．ブチリカム(butyricum)神経毒血清型Ｅの８４３〜それぞれ１２５１または１２５２、
それぞれボツリヌス菌またはＣ．バラティ(baratii)神経毒血清型Ｆの８６１〜１２７４、８６２〜それぞれ１２８０または１２７８および８５４〜１２６８、
ボツリヌス菌神経毒血清型Ｇの８６１〜１２９７
のアミノ酸位置におけるアミノ酸が改変にとって好ましい。
【００３７】
したがって、前記の位置にある少なくとも１個のアミノ酸を、天然に存在するか、または天然に存在しないアミノ酸のいずれかによって、翻訳後修飾および／または付加および／または欠失および／または挿入および／または置換することがすることが好ましい。
【００３８】
好ましい実施形態によれば、神経毒はボツリヌス神経毒血清型Ａである。この場合には、ボツリヌス神経毒血清型Ａタンパク質配列の位置トレオニン１１９５、アスパラギン１１９６、グルタミン１１９９、リジン１２０４、イソロイシン１２０５、ロイシン１２０６、セリン１２０７、ロイシン１２０９、アスパラギン酸１２１３、ロイシン１２１７、フェニルアラニン１２５５、アスパラギン１２５６、イソロイシン１２５８および／またはリジン１２６０にある少なくとも１個のアミノ酸を、天然に存在するか、または天然に存在しないアミノ酸のいずれかによって、翻訳後修飾および／または付加および／または欠失および／または挿入および／または置換することが好ましい。ボツリヌス神経毒血清型Ａタンパク質配列の位置アスパラギン１１９６、グルタミン１１９９、セリン１２０７、フェニルアラニン１２５５、イソロイシン１２５８および／またはリジン１２６０が特に好ましい。特に、位置、アルギニンまたはチロシンによって置換されたセリン１２０７、グルタミン酸によって置換されたリジン１２６０が好ましい。
【００３９】
好ましい具体例によれば、神経毒はボツリヌス神経毒血清型Ｂである。この場合には、ボツリヌス神経毒血清型Ｂタンパク質配列の位置リジン１１１３、アスパラギン酸１１１４、セリン１１１６、プロリン１１１７、バリン１１１８、トレオニン１１８２、チロシン１１８３、フェニルアラミン１１８６、リジン１１８８、グルタミン酸１１９１、リジン１１９２、ロイシン１１９３、フェニルアラニン１１９４、フェニルアラミン１２０４、フェニルアラニン１２４３、グルタミン酸１２４５、リジン１２５４、アスパラギン酸１２５５およびチロシン１２５６にある少なくとも１個のアミノ酸を、天然に存在するか、または天然に存在しないアミノ酸のいずれかによって、翻訳後修飾および／または付加および／または欠失および／または挿入および／または置換することが好ましい。ボツリヌス神経毒血清型Ｂタンパク質配列の位置バリン１１１８、チロシン１１８３、グルタミン酸１１９１、リジン１１９２、グルタミン酸１２４５およびチロシン１２５６が特に好ましい。特に、ロイシンによって置換されたチロシン１１８３およびグルタミン酸１１９１の位置が好ましい。
【００４０】
さらなる好ましい実施形態によれば、神経毒はボツリヌス神経毒血清型Ｇである。この場合には、ボツリヌス神経毒血清型Ｇタンパク質配列の位置フェニルアラニン１１２１、リジン１１２３、アラニン１１２４、セリン１１２５、メチオニン１１２６、バリン１１９０、ロイシンｌ１９１、セリン１１９４、グルタミン酸１１９６、トレオニン１１９９、グルタミン１２００、ロイシン１２０１、フェニルアラニン１２０２、フェニルアラニン１２１２、フェニルアラニン１２４８、リジン１２５０、アスパラギン酸１２５１およびチロシン１２６２にある少なくとも１個のアミノ酸を、天然に存在するか、または天然に存在しないアミノ酸のいずれかによって、翻訳後修飾および／または付加および／または欠失および／または挿入および／または置換することが好ましい。ボツリヌス神経毒血清型Ｇタンパク質配列の位置メチオニン１１２６、ロイシン１１９１、トレオニン１１９９、グルタミン１２００、リジン１２５０およびチロシン１２６２が特に好ましい。特に、位置、フェニルアラニンによって置換されたチロシン１２６２が好ましい。
【００４１】
本発明において提供される輸送タンパク質は、特に、シナプトタグミンのファミリーまたはシナプス小胞糖タンパク質２に関する分子に対する、そのタンパク質結合ドメインの増大または減少した特異的親和性を示す。
【００４２】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の輸送タンパク質と、少なくとも１種の介在分子（Ｘ）とを含む組成物に関する。介在分子は、ペプチド結合、エステル結合、エーテル結合、スルフィド結合、ジスルフィド結合または炭素−炭素結合によって輸送タンパク質と共有結合していることが好ましい、小さい有機分子、ペプチドまたはタンパク質であり得る。
【００４３】
さらに、介在分子は、すべての既知の治療上活性な物質を含む。この関連では、細菌増殖抑制剤、抗生物質、ウイルス増殖抑制剤、さらに免疫グロブリンも好ましい。
【００４４】
好ましい実施形態では、本タンパク質は、ボツリヌス菌神経毒、特に、血清型Ａ、Ｂ、Ｃ１、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧのＬＣ、あるいは、天然のプロテアーゼのタンパク質分解活性の少なくとも０．０１％、好ましくは、少なくとも５％、特に好ましくは、少なくとも５０％、特には、少なくとも９０％を示す、ボツリヌス菌神経毒、特に、血清型Ａ、Ｂ、Ｃ１、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧの神経毒のＬＣのタンパク質分解活性を有する断片からなる神経毒の群から選択される、神経伝達物質の放出装置の１種または複数のタンパク質を開裂するプロテアーゼである。輸送タンパク質およびプロテアーゼは、同一のボツリヌス菌神経毒血清型由来であることが好ましく、輸送タンパク質のＨＮ−ドメインおよびプロテアーゼがボツリヌス菌神経毒血清型Ａ由来であることが特に好ましい。プロテアーゼの配列は、通常、データベースでアクセス可能であり、データベース番号は表１から明らかである。プロテアーゼのタンパク質分解活性は、基質分離動力学によって求める（ビン(Binz)ら（２００２）、バイオケミストリー(Biochemistry)４１（６）、１７１７〜２３頁）。
【００４５】
本発明のさらなる実施形態によれば、輸送タンパク質の製造方法を提供する。この場合には、第１のステップでは、輸送タンパク質をコードする核酸を提供する。これに関連してコーディング核酸とは、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれらの混合物を表す。核酸は、例えば、ホスホロチオエート(phosphorthioate)結合を挿入することによって、そのヌクレアーゼ耐性に関してさらに改変することができる。核酸は出発核酸から作製でき、後者は、例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡデータベースからクローニングすることによってアクセス可能である。さらに、核酸は固相合成によって直接製造できる。適した方法は当業者には公知である。出発核酸を用いて開始する場合には、例えば、位置特異的突然変異誘発による特異的改変を引き起こし、その結果、アミノ酸レベルでの少なくとも１つの付加、挿入、欠失および／または置換をもたらすことができる。次いで、核酸を適したプロモーターと機能しうる形で連結する。公知の発現系における発現に適したプロモーターは、当業者には公知である。この場合には、プロモーターの選択は、発現に用いる発現系に応じて変わる。一般に、構成的プロモーターが好ましいが、誘導性プロモーターも同様に使用できる。このようにして製造される構築物は、例えば、λ−誘導体、アデノウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、ＳＶ−４０ウイルスおよびレトロウイルスから選択されるベクターの少なくとも１つの部分、特に、調節エレメントを含む。ベクターは、所与の宿主において核酸を発現できることが好ましい。
【００４６】
本発明は、ベクターを含み、ベクターを発現するのに適した宿主細胞をさらに提供する。最先端では、多数の原核生物の発現系および真核生物の発現系が知られており、宿主細胞は、例えば、大腸菌または巨大菌などの原核細胞から、Ｓ．セレビシエ(S.cerevisiae)およびＰ．パストリス(P.pastoris)などの真核細胞から選択される。昆虫細胞または哺乳類細胞などの高等真核細胞も同様に使用できるが、それでも、宿主細胞はボツリヌス菌同様、グリコシル化装置を有さないものが好ましい。
【００４７】
好ましい実施形態によれば、核酸はボツリヌス菌神経毒のＨＣ−断片をコードする。この核酸は、ＨＣ−断片をコードする核酸をフランキングするエンドヌクレアーゼインターフェースを含み、アミノ酸配列の類似性が保たれながら、輸送タンパク質をコードする遺伝子における容易なモジュラー置換を可能にするよう、エンドヌクレアーゼ部位はボツリヌス菌神経毒のその他のＨＣ−断片のものと適合する。
【００４８】
本発明の組成物が提供される場合には、輸送システムとは別に、少なくとも１種の介在分子をさらに含み、この介在分子は、カルボキシ末端システインまたはメルカプト基のいずれかで官能基化したペプチドまたはタンパク質であり、そこで、このペプチドおよび／またはタンパク質は、上記と類似の方法で、例えば、バイナリーベクターまたは種々の宿主細胞を用いることによって組換えにより製造できる。輸送タンパク質とペプチドまたはタンパク質の両方の発現に同一宿主細胞を用いる場合には、分子間ジスルフィド結合がｉｎ  ｓｉｔｕで形成されることが好ましい。同一宿主細胞におけるより効率的な製造には、一本鎖ポリペプチドが製造されるよう、ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸を輸送タンパク質のものと同一のリーディングフレーム内で翻訳させることもできる。この場合には、分子内ジスルフィド結合がｉｎ  ｓｉｔｕで形成されることが好ましい。輸送タンパク質とペプチドおよび／またはタンパク質の間を架橋する同様に存在するペプチドの簡単な加水分解のためには、輸送タンパク質のアミノ末端に、プロテアーゼトロンビンによって、または宿主細胞の特異的エンドプロテアーゼによって特異的に認識され、分離されるアミノ酸配列を挿入する。
【００４９】
驚くべきことに、挿入配列ＣＸＸＸＺＫＴＫＳＬＶＰＲＧＳＫＢＸＸＣ（配列番号１）（Ｘはいずれかの所望のアミノ酸を示し、ＺおよびＢは互いに独立に、アラニン、バリン、セリン、トレオニンおよびグリシンから選択される）は、細菌宿主、好ましくは、大腸菌の内在性プロテアーゼによってｉｎ  ｖｉｖｏで効率的に開裂されるということがわかった。したがって、挿入配列の、輸送タンパク質のアミノ酸配列と、さらなるペプチドまたはタンパク質の間への挿入が、後の段階で、例えば、トロンビンによる後処理が不要であるという利点を提供する。大腸菌株大腸菌ｋ１２は特に好ましい。
【００５０】
挿入配列が、好ましくは、１８２０個のアミノ酸を含むループの一部を形成することが好ましい。
【００５１】
これが不可能である場合は、輸送タンパク質およびタンパク質の分離精製の後に、続いて、当業者に公知の酸化プロセスによって適当な分子間ジスルフィド結合を引き起こしてもよい。ペプチドまたはタンパク質はまた、合成または断片縮合によって直接得ることができる。適当な方法は当業者には公知である。
【００５２】
輸送タンパク質およびペプチドまたはタンパク質はそれぞれ、続いて精製する。この目的のために、当業者に公知の方法、例えば、クロマトグラフィー法または電気泳動などを用いる。
【００５３】
本発明のさらなる実施形態は、輸送タンパク質または組成物と、場合により、製薬上許容される賦形剤、希釈剤および／または添加剤とを含む薬剤組成物に関する。
【００５４】
薬剤組成物は、経口、静脈内、皮下、筋内および局所投与に適している。これに関連して、筋内投与が好ましい。薬剤組成物の投薬単位は、およそ０．１ｐｇ〜１ｍｇの本発明の輸送タンパク質および／または組成物を含む。
【００５５】
薬剤組成物は、神経伝達物質放出の障害および片側顔面痙攣、痙性斜頸、眼瞼痙攣、痙縮、ジストニア、片頭痛、疼痛、頚部および腰椎柱の障害、斜視、流涎過多、創傷治癒、いびきおよび鬱病などの障害を治療するのに適している。
【００５６】
本発明のさらなる実施形態は、輸送タンパク質と、化粧品上許容される賦形剤、希釈剤および／または添加剤とを含む化粧料組成物を含む。化粧料組成物は、多汗症および顔面のしわを治療するのに適している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５７】
詳細には、本発明は、ボツリヌス菌によって産生される神経毒のＨＣを改変することによって形成され、好ましくは、ニューロンと特異的に結合し、好ましくは、受容体媒介性エンドサイトーシスによって細胞内に吸収され、酸性エンドソームコンパートメントからニューロンのサイトゾル中に輸送される、輸送タンパク質（Ｔｒａｐｏ）に関する。このタンパク質は、生理学的には原形質膜中に貫通して神経細胞のサイトゾルに到達できない、前記輸送手段と結合している細胞プロテアーゼおよびその他の物質を細胞内に導入するための輸送手段として用いられる。プロテアーゼの基質は、伝達物質放出に関与している細胞内に局在しているタンパク質およびペプチドである。基質を分離した後、ニューロンの特定の機能がブロックされる。細胞自身は損傷を受けない。これらの機能のうちの１種は、神経伝達物質放出を引き起こすエキソサイトーシスである。伝達物質の放出が阻害される場合には、細胞から細胞へのシグナルの伝達がブロックされる。例えば、神経筋接触点でアセチルコリンの放出が阻害されると横紋筋が麻痺する。輸送タンパク質を痙攣性筋肉または筋緊張性筋肉の神経末端に適用すれば、この作用を治療的に使用できる。その他の活性物質としては、例えば、抗ウイルス作用を示す物質がある。輸送タンパク質と結合すれば、それらは神経系のウイルス感染を治療するのに役に立つ。本発明はまた、神経伝達物質の放出を阻害するための輸送タンパク質の使用に関する。
【００５８】
輸送タンパク質は相対的に低い親和性で神経細胞と結合するが、それらによって取り込まれる。したがって、これらの輸送タンパク質は、神経細胞の表面への特異的輸送手段として働くのに適している。
【００５９】
患者をボツリヌス菌由来の前駆体毒素ＡおよびＢで治療する場合には、これらの非ヒトタンパク質の注射は、低投与量であっても、抗体の形成を引き起こし、その結果、療法は効果を示さず、ゆえに、アナフィラキシーショックを防ぐために停止しなければならない。酵素活性のより高い輸送効率を有する同様の活性な機序を有する物質を適用することによって、投与量を著しく低下することができ、抗体の形成も起こらない。これらの特徴は、本明細書に記載される輸送タンパク質によって起こる。
【００６０】
適用のための実施例を示すが、通常、適した適用様式および投与量は治療している医師によって個々に決定される。このような決定は、関連する特定の分野に十分に精通した各医師によって日常的に行われる。したがって、神経毒の適用様式および投与量は、例えば、選択された神経毒の可溶性または治療される疼痛の強度などの基準に基づいて、本明細書に記載される本発明にしたがって選択できる。
【００６１】
ボツリヌス菌由来の天然の前駆体毒素ＡおよびＢの治療間隔は、現在、平均して３〜４ヶ月である。この間隔を延長することによって、抗体が形成される危険が減少し、ＢｏＮＴを用いる、より長期間の治療が可能となる。サイトゾル中のＬＣの増加は、その分解を遅らせ、したがって、作用期間も延長される。本明細書に記載される輸送タンパク質は、天然のＨＣよりもより高い親和性および吸収速度を示す。
【実施例】
【００６２】
以下の実施例は単に説明に役立つものであって、制限するように理解されてはならない。
【００６３】
材料および方法
プラスミド構築および組換えタンパク質の調製
親和性精製のためのカルボキシル末端Ｓｔｒｅｐタグを含む、ＢｏＮＴ／ＢおよびＢｏＮＴ／Ｇの組換えＨＣ−断片ならびにＢｏＮＴ／Ａ、ＢおよびＧの全長型の大腸菌発現のためのプラスミドを、適したプライマー、ＢｏＮＴ／Ａをコードする染色体ＤＮＡ（ＡＡＡ２３２６２）ＢｏＮＴ／Ｂをコードする染色体ＤＮＡ（ＡＡＡ２３２１１）およびＢｏＮＴ／Ｇをコードする染色体ＤＮＡ（ＣＡＡ５２２７５）および出発ベクターとして働く発現ベクターｐＱｅ３（Ｑｕｉａｇｅｎ  ＡＧ）を用い、ＰＣＲ法によって得た。ラットシナプトタグミンＩ（ｓｙｔ  Ｉ）の短縮変形（アミノ酸１〜５３、アミノ酸１〜８２）およびラットシナプトタグミンII（ｓｙｔ  II）の短縮変形（アミノ酸１〜６１、アミノ酸１〜９０）を、ＧＳＴコードベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ）にクローニングした。すべてのプラスミドの核酸配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。組換えＨＣ−断片およびＢｏＮＴの全長型のものを、１０時間の誘導の間に大腸菌株Ｍ１５［ｐＲｅｐ４］（Ｑｉａｇｅｎ）において室温で調製し、製造業者の使用説明書にしたがってＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ−マトリックス（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）で精製した。大腸菌ＢＬ２１から得られたＧＳＴ融合タンパク質を、セファロースマイクロビーズ上に固定されたグルタチオンによって単離した。所望のタンパク質を含有する画分を合わせ、Ｔｒｉｓ−ＮａＣｌ−トライトンバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ７．２）に対して透析した。
【００６４】
ＧＳＴプルダウンアッセイ
１０μｌのＧＴセファロースマイクロビーズ上に固定しておいたＧＳＴ融合タンパク質（各０．１２ｎｍｏｌ）を、総容積１８０μｌのＴｒｉｓ−ＮａＣｌ−トライトンバッファー中、ウシ脳ガングリオシド混合物（１８％のＧＭ１、５５％のＧＤ１ａ、１０％のＧＴ１ｂ、２％のその他のガングリオシド；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；各２０μｇ）の不在下または存在下で、ＨＣ−断片（０．１ｎｍｏｌ）とともに４℃で２時間インキュベートした。遠心分離によってマイクロビーズを集め、上清を除去し、各場合において分離したマイクロビーズを４００μｌの同バッファーで３回すすいだ。すすいだペレット画分をＳＤＳサンプルバッファー中で煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色によって上清画分とともに調べた。
【００６５】
ＢｏＮＴ／Ｂ野生型は、複雑なガングリオシドおよびシナプトタグミンＩの存在下でのみ膜貫通ドメインを用いて結合するが、シナプトタグミンIIは膜貫通ドメインを用いてまたは用いずに、ならびに複雑なガングリオシドの存在下または不在下で結合する。ＢｏＮＴ／Ｂのタンパク質受容体結合部位内のアミノ酸を特異的に置換することによって、シナプトタグミン分子間の相互作用を大幅に増大させること（Ｅ１１９１Ｌ、Ｙ１１８３Ｌ）または減少させること（Ｖ１１１８Ｄ、Ｋ１１９２Ｅ）が可能であった（図１）。
【００６６】
ＢｏＮＴ／Ｇ野生型については、シナプトタグミンIおよびシナプトタグミンIIとの結合は、膜貫通ドメインを用いるか、または用いない各場合において、複雑なガングリオシドの存在下ならびに不在下の双方で起こるということが示された。ＢｏＮＴ／Ｇのタンパク質受容体結合部位内のＢｏＮＴ／Ｂと相同のアミノ酸を特異的に置換することによって、両シナプトタグミン分子間の相互作用を大幅に増大させること（Ｙ１２６２Ｆ）または減少させること（Ｑ１２００Ｅ）が可能であった（図２）。
【００６７】
ＢｏＮＴ／ＢおよびＧの組換えＨＣ−断片の、単離され、固定されたガングリオシドとの結合を検出することによって、ｓｙｔ結合ポケット中に導入された突然変異による隣接するガングリオシド結合ポケットの機能に対する損傷を排除することおよびＨＣ−断片の無傷の三次構造に対する適当な結論に達することが可能であった。これらの結果は、ＢｏＮＴ／ＢおよびＧの突然変異されたＨＣ−断片の無傷の三次構造を同様に示す、ＣＤ分光学的研究によって、ならびに熱変性実験によって支持された。
【００６８】
マウス半横隔膜アッセイ（ＨＤＡ）
ＢｏＮＴ／Ａ、ＢおよびＧ突然変異体の神経毒を、ハーバーマン(Habermann)ら、ナウニン・シュミーデベルグス・アーカイブ・オブ・ファルマコロジー(Naunyn Schmiedeberg's Archives of Pharmacology)３１１（１９８０）、３３〜４０頁に記載されるように調べた。
【００６９】
ＢｏＮＴ／Ａ、ＢおよびＧ野生型の全長型の効力を、ＨＤＡにおいて用量作用グラフによって調べた（図３および６）。続いて、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢおよびＧ単一突然変異体の種々の全長型の効力を、ＨＤＡにおいて測定し（図６）、応用効力関数によってＢｏＮＴ／ＢおよびＧ野生型の効力に対してプロットした（図４および５）。このようにして、ＢｏＮＴ／Ｂにおけるアミノ酸バリン１１１８のアスパラギン酸による置換またはリジン１１９２のグルタミン酸による置換は、＜２％への効力の著しい減少をもたらす。それと対照的に、チロシン１１８３の、それぞれロイシンまたはアルギニンでの突然変異は、ＢｏＮＴ／Ｂの効力の大幅な増大を引き起こす（図４）。ＢｏＮＴ／Ｇにおいてチロシン１２５６をフェニルアラニンに改変することは、同様に効力の増大をもたらすが、グルタミン酸、リジンまたはチロシンでのグルタミン１２００の突然変異は、ＢｏＮＴ／Ｇの効力の相当な減少を引き起こす（図５）。ＢｏＮＴ／Ａの場合には、セリン１２０７をアルギニンまたはチロシンに改変することによって、効力の増大が起こるが、リジン１２６０のグルタミン酸への突然変異は、ＢｏＮＴ／Ａの著しい効力の減少を引き起こす（図６）。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】ＧＳＴプルダウンアッセイによる、複雑なガングリオシドの存在下または不在下での、野生型および突然変異ＢｏＮＴ／Ｂ  ＨＣ−断片の、短縮したＧＳＴ−ｓｙｔＩおよびＧＳＴ−ｓｙｔII融合タンパク質とのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合についての研究を示す図である。
【図２】ＧＳＴプルダウンアッセイによる、複雑なガングリオシドの存在下または不在下での、野生型および突然変異ＢｏＮＴ／Ｇ  ＨＣ−断片の、短縮したＧＳＴ−ｓｙｔＩおよびＧＳＴ−ｓｙｔII融合タンパク質とのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合についての研究を示す図である。
【図３】ＨＤＡにおけるＢｏＢＮＴ／ＢおよびＧ野生型の用量作用グラフである。応用効力関数によって、単一突然変異体の麻痺時間の、関連野生型のものとの相対比較が可能となる。
【図４】ＨＤＡにおける、野生型と比較した、ＢｏＢＮＴ／Ｂ単一突然変異体の神経毒性の増大および減少を示す図である。
【図５】ＨＤＡにおける、野生型と比較した、ＢｏＢＮＴ／Ｇ単一突然変異体の神経毒性の増大および減少を示す図である。
【図６】ＨＤＡにおけるＢｏＢＮＴ／Ａ野生型およびＢｏＢＮＴ／Ａ単一突然変異体の用量作用グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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