(57)【要約】【課題】乳癌の診断または経過の予測を行うための方法を提供すること。【解決手段】患者に由来する細胞または組織サンプルにおいて、少なくとも１つの組織特異的遺伝子を含むマーカー遺伝子と少なくとも１つの非組織特異的遺伝子を含むマーカー遺伝子との組合せの発現を測定して、乳癌の存在の診断または経過の予測をするための方法を提供する。発明の一態様では、これらの遺伝子は、マンマグロビンおよびＣＫ１９である。キット、核酸プライマーおよびプローブ、および対照を提供する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳癌の存在の診断または経過の予測をするための方法において、
患者に由来する細胞または組織サンプル中の、少なくとも１つの組織特異的遺伝子を含むマーカー遺伝子と少なくとも１つの非組織特異的遺伝子を含むマーカー遺伝子との組合せの発現を測定するステップ、
を含む、方法。
【請求項２】
組成物において、
核酸プライマー／プローブのセットであって、
AGTTGCTGATGGTCCTCATGC（配列番号９）、
ATCACATTCTCCAATAAGGGGCA（配列番号１０）、
Fam-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQ1-TT（配列番号１１）、
CAAACGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA（配列番号１８）、
TCTGTGAGCCAAAGGTCTTGCAGA（配列番号１９）、
TGTTTATGCAATTAATATATGACAGCAGTCTTTGT（配列番号２０）、
CGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA（配列番号４２）、
GAGCCAAAGGTCTTGCAGAAAGT（配列番号４３）、および、
TGTTTATGCAATTAATATATGACAGCAGTCTTTGTG（配列番号４４）、
からなる群から選択される、核酸プライマー／プローブのセット、
を含む、組成物。
【請求項３】
組成物において、
核酸プライマー／プローブのセットであって、
配列番号１２、配列番号１３、配列番号４９；
配列番号５１、配列番号１３、配列番号４９；
配列番号１２、配列番号５３、配列番号４９；
配列番号５１、配列番号５３、配列番号４９；
配列番号４７、配列番号５３、配列番号１４；
配列番号１２、配列番号５３、配列番号１４；
配列番号５１、配列番号５３、配列番号１４；
配列番号５２、配列番号５３、配列番号１４；
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４；
配列番号５１、配列番号１３、配列番号１４；および、
配列番号５２、配列番号１３、配列番号１４、
からなる群から選択される、核酸プライマー／プローブのセット、
を含む、組成物。
【請求項４】
組成物において、
配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７、の核酸プライマー／プローブのセット、
を含む、組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の術中にリンパ節アッセイを行うためのキットにおいて、
核酸増幅試薬および核酸検出試薬、
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔発明の分野〕
本発明は、特に乳癌の分子診断の分野に関する。
【０００２】
〔発明の背景〕
リンパ節転移は、多くの固形腫瘍における最も強力な予後因子であり、リンパ節の微小転移の検出は、病理学者および外科医にとって大きな関心事である。現在のリンパ節の評価では、Ｈ＆Ｅ染色した組織切片の顕微鏡検査が行われ、３つの主な制限がある。（ａ）単一の腫瘍細胞や細胞の小病巣が容易に見逃されること、（ｂ）迅速に結果を得ることができない、つまり、センチネルリンパ節（ＳＬＮ）法における全ての陽性結果で、腋窩リンパ節の除去のための二次外科手術が必要になること、および、（ｃ）１つの組織切片のみ、または２つの組織切片のみを検査するだけなので、各リンパ節の大部分が検査されないこと、である。連続した切出し（serial sectioning）により、組織のサンプリングエラーを低減でき、免疫組織化学染色（immunohistochemistry）（ＩＨＣ）により、個々の腫瘍細胞を容易に同定することができる。しかしながら、これらの方法の組合せは、通常的な分析としてはコストと時間がかかり過ぎるため、ＳＬＮ検査などの特殊な場合に限定される。
【０００３】
外科的な決定は、リンパ節の術中の凍結切片分析（frozen section analysis）に基づいている場合が多いが、このような方法の感度は、標準的なＨ＆Ｅ病理学に対して５０％〜７０％の範囲と比較的低く、第２の外科手術率が許容できないほど高くなる。リンパ節転移のないステージ０とステージ１の乳癌患者の５年生存率はそれぞれ、９２％と８７％である。他方、リンパ節転移のあるステージが進行した乳癌患者の５年生存率は、著しく低下する。例えば、ステージ２の乳癌患者の５年生存率は７５％、ステージ３は４６％、ステージ４は１３％である。リンパ節陰性乳癌患者では、生存率が好転するが、組織学的にリンパ節陰性患者の２０％〜３０％は疾病を再発する。これは、おそらく、リンパ節サンプリングに関連した問題を含む微小転移の検出における現行の技術の限界、および、個々の腫瘍細胞または小さな腫瘍病巣の検出における低感度によるものである。
【０００４】
乳癌のリンパ節転移（metastases in breast cancer nodes）のより正確で高感度の検出の必要性に加えて、特に術中のセッティングにおける外科的余地のより正確な検出が必要である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、このセッティングで有用である分子生物学の分野で強力なツールである。この技術により、少量の核酸断片（nucleic acid fragments）を有意に分析できる量まで複製／増幅できる。さらに、定量リアルタイムＲＴ-ＰＣＲ（Ｑ-ＲＴ-ＰＣＲ）の開発により、この技術は、信頼性がより高くなり、自動化しやすくなった。Ｑ-ＲＴ-ＰＣＲは、汚染されにくく、遺伝子発現を定量できる。このような定量は、術中リンパ節アッセイにおける微小転移の検出に適用できる。分子診断におけるＰＣＲは、利点もあるが、一般的な臨床診断のセッティング、特に術中のセッティングに適用するのが困難であるという複数の制限もある。
【０００５】
このような１つの制限は、通常はＰＣＲ診断を実施するのに時間がかかることである。一般的なＰＣＲ反応には、分単位ではなく、数時間かかる。この技術を術中に有用にするには、ＰＣＲ反応を実施する時間を短縮する必要がある。さらに、Ｑ‐ＲＴ‐ＰＣＲでは、定量結果を得ることができるが、これまで、このような技術に基づいて陽性と陰性を識別するための既知のカットオフ値が存在せず、微小転移の存在に関連してどの核酸断片を検出するのが最良であるかも明らかでない。核酸断片を増幅および検出するための他の方法も存在するが、それぞれに同様の問題がある。
【０００６】
既存の問題点を解消する術中の分子リンパ節アッセイは、医学界で確実に受け入れられるであろう。
【０００７】
サイトケラチン１９（ケラチン１９、ＣＫ１９、およびＫＲＴ１９としても知られる）は、上皮細胞の検出に有用な遺伝子として認識されている。いくつかの身体の区画（血液、骨髄、および、リンパ節を含む）におけるこのような細胞の検出は、乳癌を含む複数の癌の転移に関連する。ＣＫ１９のｍＲＮＡの検出は、４つの偽遺伝子（第６染色体上に１つ、第４染色体上に１つ、および、第１２染色体上に２つ）の存在によって複雑である。これらの偽遺伝子の配列は、スプライシングされたｍＲＮＡとＤＮＡとの識別を可能にするイントロン領域を備えておらず、ＣＫ１９ ｍＲＮＡの全配列と最大９０％の相同性を有する。ＣＫ１９ ｍＲＮＡとＣＫ１９ ＤＮＡとを識別し、かつＣＫ１９ ｍＲＮＡと４つの偽遺伝子とを識別するプライマーおよびプローブのデザインは、困難であることが証明されている。ＣＫ１９ ｍＲＮＡとＣＫ１９ ＤＮＡとを識別するプライマーは公表されているが、他のグループが、このようなプライマーがＤＮＡと交差反応することを見出した。ＤＮＡとの交差反応の問題に対処するべく、多くのグループが、（１）ＤＮＡ分解ステップ（デオキシリボヌクレアーゼを用いる）を含むか、または、（２）汚染ＤＮＡの９９％超を除去する方法（Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）など）に基づくか、のいずれかのＲＮＡ精製法を利用している。
【０００８】
一般に、ＤＮＡ分解ステップまたはＴｒｉｚｏｌ（登録商標）を用いたＲＮＡ精製を必要とするのは望ましくない。これらの方法では、ＲＮＡの調製に必要な時間が長くなり、より複雑になる。したがって、これらの方法は、術中の適用の場合と同様に、使い易さと迅速さの両方を必要とする用途には適していない。このような場合、ｍＲＮＡとＤＮＡとを識別できるＣＫ１９増幅法を利用する必要がある。
【０００９】
〔発明の概要〕
本発明は、乳癌の存在の診断または経過の予測を行うためのアッセイである。一実施形態では、このアッセイは、微小転移を診断する。別の実施形態では、微小転移の検出は、特に術中にＳＬＮにおいて行う。外科医が、既知の方法に従った外科手術の際にＳＬＮを識別する。ＳＬＮを除去し、下記のように調製する。次に、核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）を、ＳＬＮから迅速に抽出する。微小転移を示唆するマーカーが存在する場合は、これを増幅して検出する。次に、外科医は、このようなマーカーの検出結果に基づいて行動する。
【００１０】
本発明の別の態様では、マーカーは、特定の組織に対して特異的な核酸断片、および、非組織特異的な少なくとも１つのマーカーである。
【００１１】
本発明のさらに別の態様では、マーカーは、悪性を示唆する核酸断片である。
【００１２】
本発明のさらに別の態様では、マーカーは、乳癌診断の場合は、マンマグロビン（mammaglobin）（配列番号１）およびＣＫ１９（配列番号２）、または、ＰＩＰ（配列番号３）、Ｂ３０５Ｄ（特に、アイソフォームＣ、配列番号４）、Ｂ７２６（配列番号５）、ＧＡＢＡ（配列番号６）、またはＰＤＥＦ（配列番号７）のいずれかのマーカーである。ワトソン（Watson）他、キャンサー・リサーチ（Cancer Res.）、１９９６年、第５６巻、ｐ．８６０‐８６５；ホフマン・フェイゼル（Hoffman-Fazel）他、アンチキャンサー・リサーチ（Anticancer Res.）、２００３年、第２３巻、ｐ．９１７‐９２０；シュトラウスベルク（Strausberg）他、米国科学アカデミー紀要（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、２００２年、第９９巻、ｐ．１６８９９‐１６９０３；ゼヘントナー（Zehentner）他、クリニカル・ケミストリー（Clin. Chem.）、２００２年、第４８巻、ｐ．１２２５‐１２３１（Ｂ３０５ＤおよびＢ７２６）；メータ（Mehta）他、ブレイン・リサーチ・ブレイン・リサーチ・レビュー（Brain Res. Brain Res. Rev.）、１９９９年、第２９巻、ｐ．１９６‐２１７；フェルドマン（Feldman）他、キャンサー・リサーチ（Cancer Res.）、２００３年、第６３巻、ｐ．４６２６‐４６３１；および、グランドチャンプ（Grandchamp）他、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Eur. J. Biochem）、１９８７年、第１６２巻、ｐ．１０５‐１１０、をそれぞれ参照されたい。
【００１３】
本発明は、最適にマンマグロビンＲＮＡを増幅して、増幅産出物を検出する特異的なプライマー／プローブのセットを明確にする。
【００１４】
本発明の別の態様では、ＣＫ１９ ｍＲＮＡの特異的な検出に最適なプライマーおよびプローブを開示する。
【００１５】
本発明のさらに別の態様では、ＳＬＮからＲＮＡを得るステップと、２つ以上の目的の遺伝子に特異的な定量ＲＴ‐ＰＣＲを実施するステップと、所定のカットオフ値を超えるマーカーが存在するか否かを決定するステップと、を含む方法で、微小転移を検出する。このカットオフ値は、絶対値、または対照遺伝子（control gene）の発現に対する値とすることができる。
【００１６】
本発明の別の態様では、このアッセイは、恒常的に発現される内部対照遺伝子をエンコードし、かつ、アッセイの全ＲＮＡ関連部分の反応の質および妥当性のための対照として用いるためのマーカーをエンコードするＤＮＡを含む。一態様では、内部対照遺伝子は、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（porphobilinogen deaminase）（ＰＢＧＤ、配列番号８）である。
【００１７】
本発明のさらに別の実施形態では、キットは、アッセイを実施するための試薬を含む。
【００１８】
〔詳細な説明〕
癌の診断および予測の方法を説明する。これらの方法では、細胞またはリンパ節などの組織から核酸を抽出し、乳癌を示唆する核酸断片（このような断片を、以下「マーカー（Markers）」と呼ぶ）の増幅および検出方法を利用する。
【００１９】
アッセイを術中に行う場合、特定の遺伝子の発現を示唆するマーカーの迅速な増幅および検出は必須である。このような方法が、術中のアッセイとして許容される時間内（すなわち、約３５分以内）で実施できるとすると、あらゆる信頼できる高感度の特定の方法を用いることができる。このような方法には、ＰＣＲ法、ローリングサークル増幅法（Rolling Circle Amplification methods）（ＲＣＡ）、リガーゼ連鎖反応法（Ligase Chain Reaction methods）（ＬＣＲ）、ＳＤＡ法（Strand Displacement Amplification methods）（ＳＤＡ）、核酸配列を用いた増幅法（Nucleic Acid Sequence Based Amplification methods）（ＮＡＳＢＡ）などが含まれる。迅速な分子診断法には、ＱＲＴ‐ＰＣＲを含め、最も好ましい定量ＰＣＲ法が用いられる。
【００２０】
使用する増幅法に関係なく、アッセイを実施するために使用する組織を十分に採取することが重要である。センチネルリンパ節（ＳＬＮ）の場合、適切な摘出、ＳＬＮの処理、およびＳＬＮからのＲＮＡの抽出が重要である。組織を採取したら、存在する全ての癌細胞を検出できるようにリンパ節を適切に処理することが重要である。
【００２１】
組織サンプルからの核酸の抽出には、様々な技術を利用することができる。それぞれの場合における標準的な実施は、組織サンプルからの核酸抽出専用に設計された市販のキットを用いたとしても時間がかかり、困難である。一般的な市販の核酸抽出キットでは、核酸を抽出するのに少なくとも１５分かかる。本発明の方法では、核酸は８分未満、好ましくは６分未満で抽出される。このような迅速な抽出法は、米国特許出願第１０／４２７，２１７号の課題である。
【００２２】
ＲＮＡを損傷せずに上手に単離するには、通常は４つのステップが用いられる。具体的には、細胞または組織の効果的な破壊、核タンパク質複合体の変性、内因性リボヌクレアーゼ（ＲＮＡａｓｅ）の不活化、および汚染ＤＮＡおよびタンパク質の除去である。細胞抽出物に存在するリボヌクレアーゼを不活化するグアニジンチオシアネート（guanidinium thiocyanate）（ＧＴＣ）およびβ‐メルカプトエタノールの破壊および保護の特性から、これらの物質は、第１のステップに好適な試薬である。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤と共に使用する場合、核タンパク質複合体が破壊され、ＲＮＡが溶液中に遊離し、タンパク質を含まないＲＮＡを単離することができる。高濃度のＧＴＣの存在下での細胞抽出物の希釈により、細胞タンパク質が選択的に沈降し、ＲＮＡが溶液中に残る。遠心分離により、沈降したタンパク質および細胞ＤＮＡの溶解物を除去する。この遠心分離は、カラムを介して行うのが好ましい。このようなカラムは、ＤＮＡを切断し、サンプルの粘度を低下させる。ＲＮＡの精製は、シリカまたは他の物質を含むスピンカラム上で実施するのが好ましい。使い捨ての組織グラインダーを用いて手動で行う細胞と組織の破壊が、米国特許第４，７１５，５４５号に開示されている。均質化の時間は、１分〜２分以内、好ましくは３０秒〜４５秒である。
【００２３】
次に、このサンプルを、破砕カラム（カリフォルニア州バレンシア（Valencia, CA）所在のキアゲン社（QIAGEN Inc.）のＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ、または、適切な代用品など）、または、バージニア州ウォレントン（Warrenton, VA）所在のオムニ・インターナショナル社（Omni international）が販売するＰＣＲ組織均質化キットなどのＲＮＡ処理装置を用いて処理し、その粘度を低下させる。ＲＮＡは、前記したようにスピンカラムによって沈降させる。遠心分離の時間は、３０秒未満である。キアゲン社（Qiagen Inc.）が販売するような市販のＲＮＡ抽出キットを用いる場合、カラム乾燥ステップおよびＲＮＡ溶出ステップを除く全てのステップで、遠心分離の代わりに濾過（filtration）を用いる。通常は、このサンプルを、カラムにかける前に等量の７０％エタノールで希釈する。濾過によって洗浄した後、カラムを遠心分離で乾燥させ、ＲＮＡを、リボヌクレアーゼを含まない水に溶出する。このＲＮＡを、エタノールを用いて溶液から選択的に沈降させ、基板（好ましくは、シリカ含有の膜またはフィルター）に結合させる。基板へのＲＮＡの結合は、カオトロピック塩によって水分子が破壊され、シリカに核酸が吸着されて迅速に生じる。結合した全ＲＮＡを、単純な水洗ステップで、汚染する塩、タンパク質、および細胞不純物からさらに精製する。最後に、この全ＲＮＡを、ヌクレアーゼを含まない水を添加して膜から溶出させる。この迅速なプロトコルに要した合計時間は、８分未満、好ましくは６分未満である。
【００２４】
要約すると、この迅速なＲＮＡ抽出法は、
（ａ）生物系から細胞を含むサンプルを得るステップ、
（ｂ）任意の選択として、処理用サンプルを作製するのに必要な目的のＲＮＡを含まない細胞をサンプルから除去するステップ、
（ｃ）目的のＲＮＡを含む細胞を溶解し、細胞のホモジネートを得るステップ、
（ｄ）任意の選択として、このホモジネートを希釈するステップ、
（ｅ）湿分を与えられ、均質化された処理用サンプルを、ＲＮＡが結合する物質を含むか、この物質が取り付けられた基板に接触させるステップ、
（ｆ）サンプルを基板に結合させるステップ、
（ｇ）汚染物質および干渉物質を除去するステップ、
（ｈ）基板を乾燥させるステップ、
（ｉ）基板からＲＮＡを溶出させるステップ、を含む。
ただし、遠心分離を利用する場合は、ステップ（ｇ）、（ｈ）、または（ｉ）の後、抽出ステップで減圧／濾過を行うのが好ましい。
この迅速な抽出法で使用する試薬には、
溶解／結合バッファー（好ましくは、４．５Ｍ 塩酸グアニジン（guanidinium-HCl）、１００ｍＭ ＮａＰＯ4）、
洗浄バッファーＩ（好ましくは、５Ｍ 塩酸グアニジン、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣＬを含む３７％エタノール）、
洗浄バッファーＩＩ（好ましくは、２０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣＬを含む８０％エタノール）、
溶出バッファー、および、
ヌクレアーゼを含まない滅菌再蒸留水（sterile double distilled water）、
が含まれる。
【００２５】
リンパ節における癌細胞の分布が均一ではないため、リンパ節の複数の部分からサンプリングするのが望ましい。任意の選択として、病理学に基づいて１または複数のリンパ節を検査することができる。同じリンパ節サンプルの分子試験と病理学による試験の両方を行うある方法では、リンパ節を少なくとも４つの切片に切断して、１つの外側切片と内側切片を病理学試験に用い、１つの外側切片と内側切片を分子試験に用いる。リンパ節や他の組織において、組織における転移および微小転移の分布は均一でないため、転移を見逃さないように十分に大きなサンプルを採取すべきである。本方法におけるこのサンプリングの問題に対する１つのアプローチでは、大きな組織サンプルを均質化してから、次の分子試験で用いるために、十分に混合した均質化サンプルを希釈する。
【００２６】
通常のＰＣＲ反応は、ターゲットの核酸種を選択的に増幅する複数の増幅ステップまたはサイクルを含む。一般的なＰＣＲ反応は、３つのステップ、すなわち、ターゲットの核酸を変性する変性ステップと、ＰＣＲプライマーのセット（順方向および逆方向プライマー）が相補的なＤＮＡ鎖にアニーリングするアニーリングステップと、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがプライマーを伸長させる伸長ステップと、を含む。このステップを複数回繰返してＤＮＡ断片を増幅し、ターゲットのＤＮＡ配列に一致するアンプリコン（単位複製配列）を生成する。一般的なＰＣＲ反応は、変性、アニーリング、および、伸長の２０以上のサイクルを含む。多くの場合、アニーリングステップと伸長ステップは、同時に行うことができ、この場合は、１つのサイクルが２つのみのステップを含む。
【００２７】
本発明の方法では、ＲＴ‐ＰＣＲを用い、このＲＴ‐ＰＣＲ増幅反応を、術中の診断に適した時間内で行う。これらの各ステップの時間は、分単位ではなく、秒単位である。具体的には、少なくとも約５℃／秒の温度の変化速度を達成できる新しい特定のサーマルサイクラー（thermal cycler）を用いて、このＲＴ‐ＰＣＲを３０分以内で行う。より好ましくは、増幅時間は、２５分未満である。これを考慮して、ＰＣＲサイクルの各ステップに対する以下の時間は、変化時間（ramp time）を含まない。変性ステップは、１０秒間以内で、行うことができる。実際、ある種のサーマルサイクラーは、変性ステップの最適時間である「０秒」の設定を有する。すなわち、サーマルサイクラーが変性温度に達すれば十分である。アニーリングステップおよび伸長ステップはそれぞれ、最も好ましくは１０秒未満であり、同じ温度で行う場合、アニーリング／伸長の組合せステップは１０秒未満とすることができる。しかしながら、ある種の同種プローブ（homogenous probe）検出法は、迅速なアッセイの実施を最大限にするために伸長に対して別のステップを必要とする場合もある。増幅の合計時間と非特異的副反応の成立との両方を最小限にするために、アニーリング温度は、通常は５０℃超である。より好ましくは、アニーリング温度は、５５℃超である。
【００２８】
実験者が介入しないＲＴ‐ＰＣＲの１つの組合せ反応は、次の理由から望ましい。（１）実験誤差のリスクの低減、（２）ターゲットまたは産出物の汚染のリスクの低減、（３）アッセイ速度の増大、である。この反応は、１種類または２種類のポリメラーゼを用いることができる。２種類のポリメラーゼを用いる場合、一方の酵素は、通常はＲＮＡ系ＤＮＡポリメラーゼ（RNA-based DNA polymerase）（逆転写）であり、もう一方の酵素は、熱安定性ＤＮＡ系ＤＮＡポリメラーゼ（thermostable DNA-based DNA polymerase）である。アッセイの性能を最大限にするために、これらの酵素機能の両方に「ホットスタート（hot start）」技術の形態を利用するのが好ましい。米国特許第５，４１１，８７６号および同第５，９８５，６１９号に、異なる「ホットスタート」のアプローチの例が開示されている。好適な方法では、効率的なＤＮＡ重合に必要な１または複数の成分を隔離する１または複数の熱活性化法を用いている。米国特許第５，５５０，０４４号および同第５，４１３，９２４号に、このような方法に使用するための試薬の調製方法が開示されている。米国特許第６，４０３，３４１号に、ＰＣＲ試薬成分の１つを化学的に変化させる隔離法が開示されている。最も好適な実施形態では、ＲＮＡ依存およびＤＮＡ依存ポリメラーゼ活性が、１つの酵素に存在する。効率的な増幅に必要な他の成分には、ヌクレオシド三リン酸（nucleoside triphosphate）、二価の塩、およびバッファー成分が含まれる。場合によっては、非特異的核酸および酵素安定剤が有用なこともある。
【００２９】
あらゆる所定の増幅を用いた分子診断の特異度は、排他的ではないが、プライマーのセットの同一性に強く依存する。プライマーのセットは、順方向および逆方向オリゴヌクレオチドプライマーの対であって、ターゲットのＤＮＡ配列にアニーリングしてターゲット配列の増幅を可能にし、ターゲット配列特異的なアンプリコンを生成する。このようなプライマーは、対象の病状のマーカーを増幅できなければならない。本発明の場合、これらのマーカーは、乳癌に対するものである。
【００３０】
乳癌の場合、本発明の方法では、乳房組織または乳癌組織に特異的な組織マーカーの増幅、および非組織特異的マーカーの増幅を行う。非組織特異的マーカーは、上皮細胞特異的であることが好ましい。好適な上皮細胞特異的マーカーには、限定するものではないが、ルミカン（lumican）、セレン含有タンパク質Ｐ（selenoprotein P）、結合組織成長因子、ケラチン１９（ＣＫ１９）、ＥＰＣＡＭ、Ｅ‐カドヘリン、およびＩＶ型コラーゲンα‐２が含まれる。存在する場合には、リンパ節における乳房および／または癌細胞の臨床的に重要で信頼性のある検出が可能となるように、少なくとも２種類のマーカーの組合せが用いられる。好ましくは、このようなマーカーは、同時に１つの反応容器内で増幅および検出される（すなわち、マルチプレックス（multiplex）である）。最も好ましくは、プライマー／プローブのセットは、このようなマーカーに特異的な核酸断片に相補的である。
【００３１】
このようなマーカーには、マンマグロビン（mammaglobin）（配列番号１）およびサイトケラチン１９（ＣＫ１９、配列番号２）、またはマンマグロビンの代わりまたはこれに加えて、好ましくは、Ｂ３０５Ｄ（配列番号４）、プロラクチン誘導タンパク質（ＰＩＰ、配列番号３）、Ｂ７２６（配列番号５）、ＧＡＢＡ‐π（配列番号６）、または前立腺由来Ｅｔｓ‐転写因子（ＰＤＥＦ、配列番号７）の１つが含まれる。組織特異的マーカーおよび癌特異的マーカーの組合せにより、９０％を超える感度および９５％を超える特異度が得られる。驚くべきことに、非組織特異的マーカー（ＣＫ１９、配列番号２）と癌特異的マーカー（マンマグロビン、配列番号１）の組合せにより、さらに高い９１％の感度および９７％の特異度が得られる。一部のマーカーは、様々なアイソフォームで存在し、特定のアイソフォームは、特定の組織または癌に対して他のものよりも特異度が高い。Ｂ３０５Ｄの場合、最も好適なアイソフォームは、Ｂ３０５ＤアイソフォームＣ（配列番号４）である。マンマグロビンとＣＫ１９マーカーの組合せもまた、最も好適なマーカーである。
【００３２】
反応は、特異的な信号検出のある手段を含まなければならない。これは、目的のターゲット配列の重合から得られるＤＮＡ配列の領域を検出する試薬の使用によって達成するのが好ましい。検出のための好適な試薬は、目的の特異的な核酸配列に結合する際に異なる測定可能な信号を発する。多くの場合、このような方法は、目的の配列に結合すると強い蛍光を発する核酸プローブを含む。本発明の方法のＰＣＲ反応の進行は、通常は、各ＰＣＲプライマーのセットに対するアンプリコン生成の相対速度の分析によってモニタリングすることができる。アンプリコン生成のモニタリングは、限定するものではないが、蛍光プライマー、二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光発生的プローブおよび蛍光染色剤、分子ビーコン、スコーピオン（Scorpion）、および、その他を含め、多数の検出試薬および検出方法によって行うことができる。
【００３３】
ＰＣＲ反応をモニタリングする一般的な方法では、ＰＣＲプロセスの際に、特定の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａｑまたはＴｆｌ ＤＮＡポリメラーゼなど）の５’ヌクレアーゼ活性を利用してオリゴマープローブを切断する蛍光加水分解プローブアッセイを利用する。このオリゴマーは、伸長の条件下で、増幅されたターゲット配列にアニーリングするように選択される。一般に、このプローブは、その５’末端に蛍光レポーター、その３’末端にこのレポーターの蛍光クエンチャー（蛍光消光剤）（fluorescent quencher）を有する。オリゴマーに損傷がない限り、レポーターからの蛍光信号は消光される。しかしながら、伸長プロセスの際にオリゴマーが消化されると、蛍光レポーターは、蛍光クエンチャーから離れる。所定のアンプリコンにおける遊離蛍光レポーターの相対蓄積量を、対照サンプルにおける同じアンプリコンおよび／または限定しないがβ‐アクチンおよびＰＢＤＧ（ポルホビリノーゲンデアミナーゼ）などの対照遺伝子の相対蓄積量を比較して、ＲＮＡ集団における所定のＲＮＡの所定のｃＤＮＡ産出物の相対存在量を決定することができる。蛍光加水分解プローブアッセイの製品および試薬は、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）などから容易に入手可能である。
【００３４】
他の検出試薬は、一般に「スコーピオン（Scorpions）」と呼ばれ、米国特許第６，３２６，１４５号および同第５，５２５，４９４号に開示されている。このような試薬は、尾状プライマー（tailed primer）および組込み信号伝達システムを含む、１または複数の分子を含む。このプライマーは、テンプレート結合領域と、リンカーおよびターゲット結合領域を含む尾部を有する。尾部のターゲット結合領域は、プライマーの伸長産出物である相補的な配列にハイブリダイズする。このターゲット特異的ハイブリダイゼーション現象は、このハイブリダイゼーションによって検出可能に変化する信号伝達システムと共役している。ＰＣＲ反応では、ターゲット結合領域および尾部領域は、この尾部領域が一本鎖のまま、すなわち複製されないように有利に配列されている。したがって、この尾部領域は、ＰＣＲ増幅産出物において増幅可能ではない。このリンカーは、ポリメラーゼによるプライマーテンプレート上の鎖伸長を防止する遮断部分を含む。
【００３５】
カリフォルニア州サニーベール（Sunnyvale, California）所在のセフェイド（Cepheid）が販売するスマート・サイクラー・サーモサイクラー（Smart Cycler thermocylcer）およびアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）が販売するＡＢＩプリズム７７００シーケンス検出システム（ABI Prism 7700 Sequence Detection System）を含め、ＰＣＲおよびＱＲＴ‐ＰＣＲにおけるアンプリコンの蓄積を制御およびモニタリングするための器具およびソフトウエアも、容易に入手可能である。
【００３６】
好適なＲＴ‐ＰＣＲ反応では、ある種のサーマルサイクラーの迅速な温度変化時間を利用するために、特定の逆転写酵素およびＰＣＲ反応成分の量が一般的でない。特に、プライマーの濃度が極めて高い。
【００３７】
逆転写反応における一般的な遺伝子特異的プライマーの濃度は、約２０ｎＭ未満である。約１分〜２分の迅速な逆転写反応を達成するために、逆転写のプライマーの濃度を、２０ｎＭ超まで、好ましくは少なくとも約５０ｎＭまで、一般的には約１００ｎＭまで上げた。標準的なＰＣＲプライマーの濃度は、１００ｎＭ〜３００ｎＭの範囲である。Ｔｍのばらつきを補正するために、標準的なＰＣＲ反応に高濃度を用いることができる。しかしながら、本明細書において、基準プライマー濃度は、Ｔｍ補正が必要ない場合に用いられる。プライマーの比例的に高い濃度は、Ｔｍ補正が必要であるか、または望ましい場合に、経験的に決定して使用することができる。迅速なＰＣＲ反応を達成するために、ＰＣＲのプライマー濃度は通常、２５０ｎＭ超、好ましくは約３００ｎＭ超、一般的には約５００ｎＭである。
【００３８】
マンマグロビンおよびＣＫ１９の両方に対して好適なプライマー／プローブのセットを用意した。このようなプライマー／プローブの組合せに対する要求は、臨床的に有意な量のＣＫ１９のｍＲＮＡを識別でき、大量のゲノムＤＮＡを検出しないことである。このようなプライマーおよびプローブは、ＣＫ１９のｍＲＮＡの個別の検出の用途に有用である。予期せずに、このプライマー／プローブの組合せのサブセットは、試験した他の組合せよりも格段に優れていることが証明された。サイトケラチン１９は、約８６％〜９１％の同一性を有する４つの偽遺伝子を有する。これらの偽遺伝子は、第４、第６、および第１２染色体上に存在する。アッセイの設計は、ＣＫ１９ ＤＮＡが効率的に増幅および検出されないように、エキソン−イントロン接合部（exon-intron junction）を含むように制限されている。
【００３９】
マンマグロビンの場合は、以下に示すプライマー／プローブのセットで最適な結果が得られることが分かった。
ＭＧ順方向プライマー（配列番号９）：AGTTGCTGATGGTCCTCATGC
ＭＧ逆方向プライマー（配列番号１０）：ATCACATTCTCCAATAAGGGGCA
ＭＧプローブ（配列番号１１）：Fam-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQ1-TT
【００４０】
ＣＫ１９の場合は、以下に示すプライマー／プローブのセットで最適な結果が得られることが分かった。
ＣＫ１９順方向プライマー（配列番号１２）：CACCCTTCAGGGTCTTGAGATT
ＣＫ１９逆方向プライマー（配列番号１３）：TCCGTTTCTGCCAGTGTGTC
ＣＫ１９プローブ（配列番号１４）：Q570-ACAGCTGAGCATGAAAGCTGCCTT-BHQ2-TT
【００４１】
これらのプライマー／プローブのセットが使用される場合、以下に示すプライマー／プローブのセットがＰＢＧＤを増幅および検出するための対照として最適である。
ＰＢＧＤ順方向プライマー（配列番号１５）：GCCTACTTTCCAAGCGGAGCCA
ＰＢＧＤ逆方向プライマー（配列番号１６）：TTGCGGGTACCCACGCGAA
ＰＢＧＤプローブ（配列番号１７）：Q670-AACGGCAATGCGGCTGCAACGGCGGAA-BHQ2
【００４２】
別のプライマー、プローブ、およびそれらの組合せを、ここに記載する例で示す。
【００４３】
商業的に使用されている診断にも、陰性結果に対して特定の増幅反応の実施を確認する１または複数の内部陽性対照を利用するのが好ましい。ＲＴ‐ＰＣＲにおいて、制御しなければならない間違った陰性結果を生じさせうるものには、不十分な量のＲＮＡ、ＲＮＡの分解、ＲＴおよび／またはＰＣＲの阻害、および実験者の誤差（experimenter error）が含まれる。遺伝子発現アッセイの場合、目的の組織で恒常的に発現されている遺伝子を利用するのが好ましい。ＰＢＧＤ（配列番号７）は、複数の因子によって内部対照として一般的に使用されている遺伝子である。具体的には、ＰＢＧＤは、ヒトの既知の偽遺伝子を含んでいない。ヒトの組織で恒常的に発現されている。比較的低いレベルで発現されているため、目的のターゲット配列の増幅を阻害する可能性が低い。対照としてＰＢＧＤを使用することにより、間違った陰性結果の全ての潜在的な原因から生じる誤った結果の報告を最小限にするか、または排除できる。
【００４４】
ＱＲＴ‐ＰＣＲのための前記した方法の製品化において、特定の核酸の検出のためのある種のキットが特に有用である。一実施形態では、このようなキットは、マーカーを増幅および検出するための試薬を含む。任意の選択として、キットは、リンパ節組織から核酸を抽出するための、サンプル調製試薬、および、または、サンプル調製製品（例えば、試験管）を含む。キットはまた、サンプルの汚染のリスクを最小限にする製品（例えば、リンパ節切除および調製のための使い捨ての外科用メスおよび表面（surface））も含む。
【００４５】
好適なキットでは、前記した１試験管ＱＲＴ‐ＰＣＲプロセスに必要な試薬には、逆転写酵素、逆転写（酵素）プライマー（reverse transcriptase primer）、対応するＰＣＲプライマーセット（マーカーおよび対照に好ましい）、Ｔａｑポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、および好適な検出試薬が含まれる。このような検出試薬には、限定するものではないが、スコーピオン（Scorpion）プローブ、蛍光加水分解アッセイのためのプローブ、分子ビーコンプローブ、単一色素プライマー（single dye primer）、または臭化エチジウムなどの二本鎖ＤＮＡに特異的な蛍光色素が含まれる。これらのプライマーは、前記した高濃度が得られる量とするのが好ましい。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、様々な製造業者から容易に入手可能である。キットに含まれる別の製品には、好適な反応試験管またはバイアル、任意の選択としてマグネシウムを含む通常はワックスビーズである障壁組成物（barrier composition）；必要なバッファーおよびｄＮＴＰなどの試薬を含む、逆転写段階およびＰＣＲ段階のための反応混合液（典型的には１０倍）；ヌクレアーゼ（すなわちＲＮＡ分解酵素）を含まない水；リボヌクレアーゼ阻害剤；対照核酸（１または複数）および／またはあらゆる追加のバッファー、化合物、補助因子、イオン成分、タンパク質および酵素、ポリマー、およびＱＲＴ‐ＰＣＲ反応の逆転写段階および／またはＰＣＲ段階で使用できるものが含まれる。任意の選択として、キットは、核酸抽出試薬および物質を含む。
【００４６】
以下に示す限定目的でない例は、本発明のさらなる説明を補助する。ここに記載する全ての文献は、参照して本明細書に組み入れる。
【００４７】
例
リアルタイムＰＣＲ
本発明の例は、リアルタイムＰＣＲの使用に基づいている。リアルタイムＰＣＲでは、ポリメラーゼ連鎖反応の産出物は、エンドポイント測定ではなくＰＣＲの対数期の際にリアルタイムでモニタリングされる。したがって、ＤＮＡおよびＲＮＡの定量は、より正確で再現性がある。各サイクルの際に蛍光値を記録する。この蛍光値は、増幅反応におけるその時点までに生成された産出物の量を表す。反応の開始時に存在するテンプレートが多いほど、（Ｃｔ）値の定義であるバックグラウンド値よりも統計的に有意として蛍光信号が初めに記録される点に達するまでにかかるサイクル数が少ない。閾値サイクル（Ｃｔ）の概念により、蛍光に基づいたＲＴ‐ＰＣＲを用いた正確で再現性のある定量が可能となる。ＰＣＲ産出物の同種検出は、（ａ）二本鎖ＤＮＡ結合色素（例えば、サイバーグリーン（SYBR Green））、（ｂ）蛍光発生プローブ（例えば、モレキュラー・ビーコンズ（Molecular Beacons）のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）、および、（ｃ）指向性標識プライマー（direct labeled primer）（例えば、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ（商標）プライマー）に基づいて実施するのが好ましい。好適な方法は、米国特許出願第１０／４２７，２４３号にも開示されている。
【００４８】
例１‐センチネルリンパ節（ＳＬＮ）における乳癌細胞の２つの遺伝子の同定
腋窩リンパ節（ＡＬＮ）転移の存在が、乳癌患者の最も重要な予後因子である。ＳＬＮの状態から、全てのＡＬＮ転移を高度に予測できる。ＳＬＮ陽性患者は、これまでの結果として、二次外科手術でＡＬＮ切除を受けている。術中のＳＬＮ分析法が、二次外科手術のコストおよび複雑さを軽減するために実施されているが、このような方法は、感度が低くばらつきがあり、標準化が十分でない。以降の例は、臨床的に関連したＳＬＮ転移の術中の診断を改善するための基礎としてのＲＴ‐ＰＣＲの実現可能性を示している。
【００４９】
方法
マンマグロビンを含む８つの分子マーカーを、乳房および他の組織のゲノム全体にわたる遺伝子発現分析から同定した。２５４人の乳癌患者からのＳＬＮの交互連続切片を、ＲＮＡ抽出のために永久切片のＨ＆Ｅ染色または急速冷凍によって分析した。ブラインドされたＳＬＮのｃＤＮＡ（blinded SLN cDNA）を、定量ＲＴ‐ＰＣＲによって分析した。ＰＣＲ信号を、患者基準におけるＨ＆Ｅ染色の結果に対して比較した。多変量受診者動作特性（ＲＯＣ）分析（multivariate receiver operating characteristic analysis）を用いて、ＰＣＲカットオフを、Ｈ＆Ｅ染色の結果に最適に相関するように選択した。
【００５０】
患者のサンプル
ＳＬＮのＲＮＡサンプルは、イーストカロライナ大学（East Carolina University）における乳癌患者のリンパ節のマンマグロビンの臨床的エンドポイントＰＣＲ研究から得た。リンパ節ＲＮＡは、元のリンパ節の半分に由来する。サンプルの量は、アジレント社（Agilent）の分光法およびハウスキーピング遺伝子のＰＣＲ分析によって評価した。サンプルの質が低い患者、および、サンプルが乳房に対してＰＣＲ陰性と考えられる患者は、研究から除外した。２５４人の患者からの全てのＳＬＮを、この研究に含めた。
【００５１】
マーカーの検証
マンマグロビンを含む７つのマーカーを、文献および内部バイオインフォマティクス法で見出してから、第１の乳房組織サンプルについて検証した。ＰＢＧＤおよびβ‐アクチンを、ハウスキーピング遺伝子として利用した。リンパ節ｃＤＮＡを、ＡＢＩプリズム７９００ＨＴ配列検出システム（ABI Prism 7900HT sequence detection system）において、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ケミストリを利用した定量ＰＣＲで分析した。データは、Ｃｔで記録した。Ｃｔは、正規化されたレポーター発光において統計的に有意な増大が見られたサイクルと定義されている。マンマグロビンプライマー（配列番号１８および配列番号１９）は、カリフォルニア州カールスバッド（Carlsbad, CA）所在のインビトロジェン社（Invitrogen Corp.）によって合成され、マンマグロビンＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（配列番号２０）は、カリフォルニア州サンディエゴ（San Diego, CA）所在のエポック・バイオサイエンス（Epoch Biosciences）からのものである。ＣＫ１９プライマー（配列番号２１および配列番号２２）およびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（配列番号２３）。Ｂ７２６プライマー（配列番号２４および配列番号２５）およびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（配列番号２６）。Ｂ３０５Ｄプライマー（配列番号２７および配列番号２８）は、インビトジェン社（Invitrogen Corp.）で合成され、プローブ（配列番号２９）は、アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems Inc.）による。ＰＩＰプライマー（配列番号３０および配列番号３１）およびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（配列番号３２）。ＰＤＥＦプライマー（配列番号３３および配列番号３４）およびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（配列番号３５）。ＧＡＢＡプライマー（配列番号３６および配列番号３７）およびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（配列番号３８）。ＰＢＧＤプライマー（配列番号３９および配列番号４０）は、カリフォルニア州アラメダ（Alameda, CA）所在のキアゲン・オペロン社（QIAGEN Operon）によって合成され、プローブ（配列番号４１）は、テキサス州ヒューストン（Houston, TX）所在のシンテゲンＬＬＣ社（Synthegen, LLC）による。全てのＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、カルボキシフルオレセイン（carboxyfluorescein）（ＦＡＭ）、およびカルボキシテトラメチルローダミン（carboxytetramethylrhodamine）（ＴＡＭＲＡ）は、色素およびクエンチャーの対として用いた。
配列番号１８：CAAACGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA
配列番号１９：TCTGTGAGCCAAAGGTCTTGCAGA
配列番号２０：6-FAM-tgtttatgca attaatatat gacagcagtc tttgtg-TAMRA
配列番号２１：AGATGAGCAGGTCCGAGGTTA
配列番号２２：CCTGATTCTGCCGCTCACTATCA
配列番号２３：FAM-ACCCTTCAGGGTCTTGAGATTGAGCTGCA-TAMRA
配列番号２４：GCAAGTGCCAATGATCAGAGG
配列番号２５：ATATAGACTCAGGTATACACACT
配列番号２６：FAM TCCCATCAGAATCCAAACAAGAGGAAG
配列番号２７：TCTGATAAAG GCCGTACAAT G
配列番号２８：TCACGACTTG CTGTTTTTGC TC
配列番号２９：6-FAM-ATCAAAAAACA AGCATGGCCTCA CACC-TAMRA
配列番号３０：GCTTGGTGGTTAAAACTTACC
配列番号３１：TGAACAGTTCTGTTGGTGTA
配列番号３２：FAM-CTGCCTGCCTATGTGACGACAATCCGG-TAMRA
配列番号３３：GCCGCTTCATTAGGTGGCTCAA
配列番号３４：AGCGGCTCAGCTTGTCGTAGTT
配列番号３５：AAGGAGAAGGGCATCTTCAAAATTGAGGACTCAGC
配列番号３６：CAATTTTGGTGGAGAACCCG
配列番号３７：GCTGTCGGAGGTATATGGTG
配列番号３８：FAM CATTTCAGAGAGTAACATGGACTACACA TAMRA
配列番号３９：CTGCTTCGCTGCATCGCTGAAA
配列番号４０：CAGACTCCTCCAGTCAGGTACA
配列番号４１：FAM-CCTGAGGCACCTGGAAGGAGGCTGCAGTGT-TAMRA
【００５２】
データの分析
サンプルは、ＰＣＲ試験の終わりで非ブラインドにした（unblinded）。Ｈ＆Ｅ染色、ＩＨＣ、再発（recurrence）、および追加の病理データを、このようなときに利用できた。Ｃｔカットオフは、多変量受信者動作特性（ＲＯＣ）分析および目視観察を用いた陽性リンパ節状態の決定のために設定した。矛盾の解決（病理レポートに基づいた）を、全ての偽陰性および偽陽性の結果に対して実施した。推定的な陽性サンプル（不十分なリンパ節サンプリングによって標準的な病理学によって見逃された真陽性の可能性が高いサンプル）を、次の基準に基づいて特定した。この基準とは、少なくとも４つの分子マーカーが陽性であり、この内の少なくとも１つが強い陽性である（Ｃｔは、単一マーカーアッセイのカットオフよりも低い少なくとも５サイクル）。
【００５３】
この結果を、図１および表１‐２に示す。図１では、ＶＢＭ１はＣＫ１９である。
【表１】
2008502330.tif 000002
【表２】
2008502330.tif 000003
【表３】
2008502330.tif 000004
【表４】
2008502330.tif 000005
【００５４】
結果
２‐遺伝子アッセイ（マンマグロビンとＣＫ１９）で、感度が９０％で特異度が９３％の臨床的に有意な転移（ＩＨＣの非存在でＨ＆Ｅ陽性）を検出した。第３の遺伝子の追加は、全体の機能に対する影響が最小限であった。
【００５５】
より良い感度および特性を得るために遺伝子を特徴付ける試みの一部として、ＰＤＥＦおよびＣＫ１９のアッセイを、これらのリンパ節サンプルに対して実施した。マーカーのＣＫ１９とＭＧの組合せにより、表５に示すようにアッセイの感度をさらに上げた。
【表５】
2008502330.tif 000006
【表６】
2008502330.tif 000007
【００５６】
これらのデータは、ＣＫ１９がアッセイの感度を上げたことを示すだけでなく、マンマグロビンが相補的なマーカーである主マーカーもアッセイの感度を上げたことを示している。このマーカーの組合せにより、アッセイの性能が改善される。
【００５７】
結論
この研究は、ＳＬＮ転移の標準的なＨ＆Ｅ検出に密接に相関するマンマグロビン／ＣＫ１９の発現を用いた、臨床的に有意な乳房転移を検出する術中アッセイの基礎としてのＲＴ‐ＰＣＲの利用を示しており、２‐遺伝子（１つが乳癌特異的、もう１つが非組織特異的）分子シグネチャ分析により、乳房ＳＬＮにおける臨床的に関連する転移を検出できることを実証している。したがって、この試験は、ＳＬＮ生検を受ける患者の二次外科手術を大幅に減少できる可能性がある。
【００５８】
例２‐マンマグロビン、ＣＫ１９、およびＰＢＧＤのｍＲＮＡの個別の検出のための最適なプライマーおよびプローブ
マンマグロビンプライマーおよびプローブ
迅速なアッセイのためのヌクレアーゼ活性および十分な鎖置換を可能にするＴｔｈポリメラーゼの能力を決定し、好適なアッセイ条件についてプライマーおよびプローブを最適化した。第１のセットのプライマー／プローブは、エキソン２および３に特異的であった。成功した増幅と検出を区別するために、サイバーグリーン（Sybr Green）を用いて、および用いずに実験を行った。二価の陽イオン濃度およびマンガン（ＭｎＳＯ4）へのマグネシウム（ＭｇＣｌ2）の添加を最適にして、ＲＴおよび増幅を改善した。これらの実験の１つは、ＭｎＣｌ2とＭｎＳＯ4との間に有意な差を示さなかった。これらの実験により、ＲＴのための２．５ｍＭのマンガン（ＭｎＳＯ4）、および、ＰＣＲのための３．５ｍＭのマグネシウム（ＭｇＣｌ2）の、２つの二価の陽イオンを利用したアッセイが最適になる。
【００５９】
初めのデザインで１０５ｂｐ（base pair、塩基対）のアンプリコンを作製し、同じ領域を再デザインして９６ｂｐの小さなアンプリコンを作製した。初めのデザインと再デザインは非常に良好に機能したが、非常に強い信号であり、ＦａｍチャンネルからＣｙ３チャンネルへの溢流が示された。
【００６０】
エキソン２と３にわたるデザインがＡＴの多い領域にあり、サイクリング温度における柔軟性が制限されてマルチプレックスの際に問題が生じうるため、アッセイを、エキソン１と２にわたるマンマグロビンについて再デザインした。２つのプローブを同じ領域でデザインした。両方のプローブを、Ｆａｍチャンネル、Ｃｙ３チャンネル、およびＣｙ５チャンネルで試験した。この新しいデザインを、これらのプローブの存在によるＲＴの際の阻害がないことを確認するために、サイバーグリーンを用いて、および用いないで検証した。
【００６１】
マンマグロビンのデザインの経緯
配列番号１８：CAAACGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA              エキソン２‐３
配列番号１９：TCTGTGAGCCAAAGGTCTTGCAGA                   １０５ｂｐ
配列番号２０：TGTTTATGCAATTAATATATGACAGCAGTCTTTGT        産出物
配列番号４２：CGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA                  エキソン２‐３
配列番号４３：GAGCCAAAGGTCTTGCAGAAAGT                    ９６ｂｐ
配列番号４４：TGTTTATGCAATTAATATATGACAGCAGTCTTTGTG       産出物
配列番号９：AGTTGCTGATGGTCCTCATGC                        エキソン１‐２
配列番号１０：ATCACATTCTCCAATAAGGGGC                     ８２ｂｐ
配列番号４５：GCACTGCTACGCAGGCTCTGGC                     産出物
配列番号１１：CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA                    産出物
両方のプローブのデザインを用いて収集したデータに基づいて、配列番号４８を、エキソン１‐２の領域の最終デザインとして選択した。
【００６２】
シングレックス（Singlex）試験からのマンマグロビンの最終デザイン
新しいデザインを検証する試験の後、マンマグロビンを、プライマーおよびプローブとして次の配列を用いてＦａｍチャンネルに入れた。
配列番号９：AGTTGCTGATGGTCCTCATGC
配列番号１０：ATCACATTCTCCAATAAGGGGCA
配列番号１１：Fam-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQ1
加水分解プローブアッセイがＴｔｈポリメラーゼに適していることが分かったら、このアッセイを、Ｂ３０５ＤおよびＣＫ１９についても試験した。
【００６３】
ＣＫ１９
第１のオリゴヌクレオチドのセット
デザインに接合部特異的ＰＣＲプライマー（junction-specific PCR primer）を含めた初めのデザインを試験した。これは、ＣＫ１９とその偽遺伝子を最適に識別できると思われたからである。このデザインについて試験したプライマーおよび二重標識加水分解プローブ配列（dual-labeled hydrolysis probe sequences）は、次の通りである。
順方向プライマー配列番号２１：AGATGAGCAGGTCCGAGGTTA
逆方向プライマー配列番号４６：GCAGCTTTCATGCTCAGCTGT
プローブ（5'FAM/3'BHQ）配列番号２３：ACCCTTCAGGGTCTTGAGATTGAGCTGCA
【００６４】
下の表７に示すように、このデザインは、ゲノムＤＮＡと強く交差反応することが実証された。
【表７】
2008502330.tif 000008
【００６５】
ターゲット濃度の差を補正するために調節する場合、ＤＮＡで観察されたプローブＣｔとＲＮＡで観察されたＣｔが本質的に同一であった。加えて、加水分解プローブからのエンドポイント蛍光もまた、本質的に同一であった。総合すると、これらの結果は、ＤＮＡに対するＲＮＡのプライマーおよびプローブの低い特異度を示している。別個の反応からのサイバーグリーン信号は、増幅が、ＲＮＡターゲットに対してＤＮＡターゲットで実際に優れていることを示唆している。これは、１ステップのＲＴ‐ＰＣＲの際のＲＮＡからＤＮＡへの変換における複数の偽遺伝子配列の増幅すなわち効率の悪さによると考えられる。
【００６６】
第２のオリゴヌクレオチドのセット
別個のエキソンに接合部特異的プローブおよびプライマーを含めた次のデザインを試験した。このデザインについて試験したプライマーおよび二重標識加水分解プローブの配列は次の通りである。
順方向プライマー配列番号４７：CACCCTTCAGGGTCTTGAGA
逆方向プライマー配列番号４８：TCCGTTTCTGCCAGTGTGTC
プローブ配列番号４９（5'FAM/3'BHQ）：GCTGAGCATGAAAGCTGCCTTGGA
【００６７】
この場合、ＤＮＡに対する調節したＣｔは、ＲＮＡよりも２．５サイクル高く、ＤＮＡに対するＲＮＡの所定のレベルの特異度を示している。ＲＮＡとＤＮＡとのＣｔの差が、サイバーグリーンに対してよりもプローブに対して大きく（２．５サイクル対０．２サイクル）、これは、特異度の改善がプライマーとプローブの両方によることを示唆している。先のデザインに比べて、プライマーの特異度における改善（サイバーグリーンＣｔ）は、３．１サイクル（０．２サイクル対−２．９サイクル）である。プローブの特異度における改善は、ＤＮＡに対するＲＮＡの蛍光における２倍増によって裏付けられている（表８）。特異度におけるこの増大は望ましいが、ＲＮＡ信号とＤＮＡ信号を確実に識別するには十分ではないであろう。
【表８】
2008502330.tif 000009
【００６８】
第３のオリゴヌクレオチドのセット
ＲＮＡに対する特異度をさらに改善するために、追加のプライマーおよびプローブをデザインした。これらのプライマーおよびプローブの位置及び長さに小さな変更を加えて、同じ領域で別のデザインをした。試験したプライマーおよび二重標識加水分解プローブの配列は表９に示す。
順方向プライマー：
配列番号４７：CACCCTTCAGGGTCTTGAGA
配列番号５０：CACCCTTCAGGGTCTTGAGAT
配列番号１２：CACCCTTCAGGGTCTTGAGATT
配列番号５１：ACCCTTCAGGGTCTTGAGATTG
配列番号５２：ACCCTTCAGGGTCTTGAGATTGA
逆方向プライマー：
配列番号１３：TCCGTTTCTGCCAGTGTGTC
配列番号５３：CTCCGTTTCTGCCAGTGTGT
プローブ(5'FAM/3'BHQ)：
配列番号４９：GCTGAGCATGAAAGCTGCCTTGGA
配列番号１４：ACAGCTGAGCATGAAAGCTGCCTT
【表９】
2008502330.tif 000010
【００６９】
前記した条件（条件Ａ）と比べると、いくつかの条件が、調節したＲＮＡ／ＤＮＡプローブのＣｔの差またはＲＮＡ／ＤＮＡプローブの蛍光比における改善を示している。最適な条件は、Ｌ、Ｎ、およびＯであった。これら３つの全ての条件は、少なくとも３．６サイクルのＣｔの差、および、少なくとも８の蛍光比を示した。３つ全ての条件は、陽性を定義するために用いられる蛍光カットオフの最小限の操作によって、ＤＮＡ検出の全ての排除に対して十分な信号の識別を示す。条件Ｂ、Ｄ、Ｇ、Ｉ、およびＫは全て、Ｃｔ差≧２．２サイクル、および、蛍光比≧３．４を有しており、ＲＮＡとＤＮＡを決定するためにこれらの組合せを利用することに対する妥当な可能性を示している。試験していないが、条件Ｐ、Ｑ、およびＲ（逆方向プライマーの配列番号１３を利用することを除き、それぞれＬ、Ｎ、およびＯに類似）は、最適な機能を果たすと推測される。
【００７０】
条件ＬおよびＰは、アッセイの蛍光カットオフを変更してＲＮＡに対する特異度をさらに高める能力を実証するために試験した。この例のために試験したプライマーおよび二重標識加水分解プローブの配列は次の通りである。
順方向プライマー：
配列番号１２：CACCCTTCAGGGTCTTGAGATT
逆方向プライマー：
配列番号１３：TCCGTTTCTGCCAGTGTGTC
配列番号５３：CTCCGTTTCTGCCAGTGTGT
プローブ(5'Q570/3'BHQ2)：
配列番号１４：ACAGCTGAGCATGAAAGCTGCCTT
【００７１】
表１０に示すように、最大蛍光の約１．５％の現行のセットポイントから最大蛍光の６％〜７％にカットオフを上げることにより、ＤＮＡに対するＣｔは４０サイクルまで観察されず、ＲＮＡに対するＣｔは約２サイクルだけ増大した。カットオフのこのタイプの小さな変更は、最小限で、条件Ｌ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｑ、およびＲに対して機能が最適になると推定される。
【表１０】
2008502330.tif 000011
配列番号１５：GCCTACTTTCCAAGCGGAGCCA              エキソン１‐２
配列番号５４：ACCCACGCGAATCACTCTCA                ８３ｂｐ
配列番号１７：AACGGCAATGCGGCTGCAACGGCGGAA         産出物
配列番号５５：CAAGCGGAGCCATGTCTGG                 エキソン１‐２
配列番号５４：ACCCACGCGAATCACTCTCA                ９３ｂｐ
配列番号１７：AACGGCAATGCGGCTGCAACGGCGGAA         産出物
【００７２】
両方のデザインは、等しく良好に機能するが、より長い産出物を最終デザインとして選択した。ＰＢＧＤは、Ｃｙ５チャンネルに入れた。これは、内部対照のあらゆる陽性結果が、他のチャンネルからの溢流によって引き起こされないことを確実にするように行った。
シングレックス（Singlex）試験からのＰＢＧＤの最終デザイン
配列番号５５：CAAGCGGAGCCATGTCTGG
配列番号５４：ACCCACGCGAATCACTCTCA
配列番号１７：Q670-AACGGCAATGCGGCTGCAACGGCGGAA-BHQ2
【００７３】
マルチプレックス試験
シングレックス試験の後、前記選択したデザインを、サイバーグリーンの存在下および非存在下で、Ｆａｍチャンネルにおけるマンマグロビン、Ｃｙ３チャンネルにおけるＣＫ１９、および、Ｃｙ５チャンネルにおけるＰＢＧＤでマルチプレックス試験を行った。マルチプレックスにおいて、テンプレートのない反応が大幅に低いＣｔを生成することが観察された。異なるプライマーとプローブの組合せでのさらなる実験から、ＰＢＧＤ下側プライマー（PBGD lower primer）とＣＫ１９上側プライマー（CK19 upper primer）との間に３’二量体化（3' dimerization）が存在することが分かった。これら２つのプライマーの一方がマルチプレックスミックスに存在しないと、テンプレートのない反応がより高いＣｔを生成するようになった。
【００７４】
プライマーの相互作用を最小限にするために、次のプライマーを最終マルチプレックスアッセイのために選択した。
ＭＧ順方向プライマー（配列番号９）：AGTTGCTGATGGTCCTCATGC
ＭＧ逆方向プライマー（配列番号１０）：ATCACATTCTCCAATAAGGGGCA
ＭＧプローブ（配列番号１１）：Fam-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQ1-TT
ＣＫ１９順方向プライマー（配列番号１２）：CACCCTTCAGGGTCTTGAGATT
ＣＫ１９逆方向プライマー（配列番号１３）：TCCGTTTCTGCCAGTGTGTC
ＣＫ１９プローブ（配列番号１４）：Q570-ACAGCTGAGCATGAAAGCTGCCTT-BHQ2-TT
ＰＢＧＤ順方向プライマー（配列番号１５）：GCCTACTTTCCAAGCGGAGCCA
ＰＢＧＤ逆方向プライマー（配列番号１６）：TTGCGGGTACCCACGCGAA
ＰＢＧＤプローブ（配列番号１７）：Q670-AACGGCAATGCGGCTGCAACGGCGGAA-BHQ2
【００７５】
ＣＫ１９の最終的なプライマーの選択の際に、プライマー、プローブ、および、サイクリングの条件の比較を行った。これらの実験から、ＣＫ１９とその偽遺伝子との間の蛍光レベルにおける１０倍の識別により、偽遺伝子がＣｙ３チャンネルで検出されないことが分かった。実行可能性試験の後、別個の実験を、ゲノムＤＮＡを用いた偽遺伝子の増幅を観察するようにデザインした。全ての場合、増幅産出物は、いずれの場合も正しい長さであり、イントロンの増幅を示さないため、偽遺伝子は増幅されるが、ゲノムＤＮＡは増幅されないことが明らかであった。この実験は、増幅と検出とを識別するためにサイバーグリーンを用いて、および用いないで行った。異なる濃度のゲノムＤＮＡを、テンプレート対照を含まずに、テンプレートとして用いた。反応は、ＰＣＲおよびＲＴ‐ＰＣＲだけで実施した。Ｃｙ３チャンネルにおける加水分解プローブケミストリ（hydrolysis probe chemistry）は、偽遺伝子をピックアップしなかった。
【００７６】
しかしながら、ＳＹＢＲデータから、偽遺伝子は増幅されるが、たとえ１０6コピーの濃度であっても、Ｃｙ３チャンネルにおける加水分解プローブケミストリを使用して、偽遺伝子は検出されないことが明らかである。全ての産出物は、結果を確認するためにゲル上で行った。テンプレートを用いた場合はいずれも、Ｃｔが全く検出されないＳＹＢＲを用いない反応を含む正確な大きさのバンド（８１ｂｐ）が確認された。この確認は、Ｃｙ３チャンネルにおける信号の非存在が、増幅の非存在のためではなく、加水分解プローブケミストリによる識別のためであることを確認するために必須である。
【表１１】
2008502330.tif 000012
【００７７】
例３‐標準的な方法によって精製されたサンプルの迅速なアッセイ試験
サンプル
ＲＮＡを、標準的なＴｒｉｚｏｌ法によって乳房リンパ節から単離した。このＲＮＡを、２６０ｎｍでの吸光度によって定量した。全ＲＮＡを２００ｎｇ／μＬまで希釈した。ＲＮＡの質は、ハウスキーピング遺伝子ＰＢＧＤとβ‐アクチンを用いた２ステップＲＴ‐ＰＣＲによって決定した。両方のハウスキーピング遺伝子が、試験した全てのサンプルにおいて、平均信号の３サイクル以内の信号を生成した場合、サンプルは、その質が十分であると見なした。試験したサンプルの最終セットは、２５１人の患者からの４８７のリンパ節サンプルを表す。
【００７８】
１ステップＲＴ‐ＰＣＲ試験
前記したＲＮＡサンプルを、マンマグロビン（ＭＧ）、ケラチン１９（ＣＫ１９）、およびＰＢＧＤのプライマーおよびプローブを含む、迅速でリアルタイムの１ステップＲＴ‐ＰＣＲで増幅した。利用したプライマーとプローブの配列は次の通りである。
ＭＧ順方向プライマー（配列番号９）：AGTTGCTGATGGTCCTCATGC
ＭＧ逆方向プライマー（配列番号１０）：ATCACATTCTCCAATAAGGGGCA
ＭＧプローブ（配列番号１１）：Fam-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQ1-TT
ＣＫ１９順方向プライマー（配列番号１２）：CACCCTTCAGGGTCTTGAGATT
ＣＫ１９逆方向プライマー（配列番号１３）：TCCGTTTCTGCCAGTGTGTC
ＣＫ１９プローブ（配列番号１４）：Q570-ACAGCTGAGCATGAAAGCTGCCTT-BHQ2-TT
ＰＢＧＤ順方向プライマー（配列番号１５）：GCCTACTTTCCAAGCGGAGCCA
ＰＢＧＤ逆方向プライマー（配列番号１６）：TTGCGGGTACCCACGCGAA
ＰＢＧＤプローブ（配列番号１７）：Q670-AACGGCAATGCGGCTGCAACGGCGGAA-BHQ2
【００７９】
ＲＴ‐ＰＣＲ増幅の条件
各サンプルからの１μＬ（２００ｎｇ）のＲＮＡを、２５μＬの反応液中で増幅させた。この反応液は、５０ｍＭ バイシン（Bicine）／ＫＯＨ（ｐＨ ８．２）、３．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２．５ｍＭ 硫酸マンガン、１１５ｍＭ 酢酸カリウム、１２ｍＭ 塩化カリウム、６ｍＭ 塩化ナトリウム、０．８ｍＭ リン酸ナトリウム、１０％ｖ／ｖ グリセロール、０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１５０ｍＭ トレハロース、０．２％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０、０．０１６％ｖ／ｖ ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００、５０ｍＭトリス塩酸（Tris-Cl）（ｐＨ８）、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ＴＴＰ、０．０８％ｖ／ｖ ＰｒｏＣｌｉｎ３００、５単位Ｔｔｈポリメラーゼ（サーマス・サーモフィルス（Thermos thermophilis）由来の組換えＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素クローン）、４００ｎｇ 抗体ＴＰ６‐２５．３、４５０ｎＭ ＭＧおよびＣＫ１９の各プライマー、３００ｎＭ ＰＢＧＤの各プライマー、および２００ｎＭ 各プローブを含む。ＲＴ‐ＰＣＲ条件は、次に示すプロフィールを利用して、セフェイド・スマート・サイクラーＩＩ（Cepheid Smart Cycler II）で実施した。
９５℃で、３秒のインキュベーション
６３℃で、１５０秒のインキュベーション
各温度（６３．２℃、６３．４℃、６４．０℃、６４．５℃、６５．０℃、６５．５℃、６６．０℃、６６．５℃、６７．０℃、６７．５℃、６８．０℃、６８．５℃、６９．０℃、６９．５℃）で、４秒のインキュベーション
７０℃で、９０秒のインキュベーション
次に、９５℃で１秒のインキュベーションと６０．０℃で６秒のインキュベーションを４０サイクル
【００８０】
蛍光信号を、チャンネル１に対して３０、チャンネル２に対して２０、およびチャンネル３に対して２０の陽性Ｃｔの閾値蛍光値を用いて、スマート・サイクラーＩＩ（Smart Cycler II）のチャンネル１（Ｆａｍ）、チャンネル２（Ｑ５７０）、およびチャンネル４（Ｑ６７０）において、６０．０℃の際にモニタリングした。各サンプルのＣｔ値を、３つ全てのチャンネルに対して決定し、次に、ＩＨＣの非存在でＨ＆Ｅ陽性とアッセイ信号とを関連付けるために最適なカットオフを決定した。５つのサンプルが、ＰＢＧＤ信号によって決定された許容できないＲＮＡの質を有すると決定され、試験結果でないと見なした。以下に示す表１２は、有効な結果が得られた２４６人の患者の結果の要約である。
【表１２】
2008502330.tif 000013
【００８１】
例４‐迅速なサンプルプレップ法で精製されたサンプルの迅速なアッセイ試験
サンプル
ＲＮＡは、均質化のためのＯｍｎｉホモジナイザーおよび使い捨てのプローブを用いて乳房リンパ節から単離し、以下に示すプロトコルを用いてＲＮｅａｓｙ（キアゲン社（QIAGEN））キットの試薬でＲＮＡを精製した。
【００８２】
均質化
予め記録されていない場合は、サンプルの重量（ｍｇ）を決定する。ワックスペーパーの新しい紙片を天秤の上に載せ、このペーパーの重量を量ってから、サンプルの重量を量った。
【００８３】
３０ｍｇ未満のリンパ節は、ＢＬＮアッセイを用いた試験には十分な組織を提供しないことに留意されたい。
【００８４】
新しい外科用メスを用いて、同じリンパ節からの全ての組織を、直径が約１ｍｍの小片に刻んだ。処理の際に組織が汚染しないように注意を払った。
【００８５】
必要な量を決定するために、表１３を利用して均質化試験管に均質化バッファーを添加した（８ｍＬまたは１５ｍＬのポリプロピレン培養試験管、均質化バッファーの量が４ｍＬ未満の場合は、８ｍＬ試験管を使用し、それ以外の場合には１５ｍＬ試験管を用いる）。
【表１３】
2008502330.tif 000014
１．清潔な鉗子を用いて、組織を均質化バッファーに移す。
２．新しい均質化プローブを手動ホモジナイザーに配置する。
３．各リンパ節を完全に均質化する。
４．ＲＮＡ精製過程で説明するように、ホモジネートを処理する。
５．均質化プローブを廃棄する。
６．−６５℃またはそれ以下の温度で残余のホモジネートを保存する。
【００８６】
ＲＮＡの精製
この手順を用いて複数のホモジネートを並列処理したことに留意されたい。
１．１０秒間振盪して、４．５ｍＬの試験管内で４００μＬのホモジネートと４００μＬの７０％エタノールを混合する。
２．各サンプルに対して、真空弁（VacValve）を真空マニホールド（Vacuum Manifold）に取り付け、使い捨ての真空コネクタ（VacConnector）を各弁に取り付ける。
３．スピンカラムを真空コネクタに取り付け、キャプを開けたままにする。
４．ステップ１のホモジネート／エタノールをカラム上に分注する。ホモジネート／エタノール混合物の量は、元の組織の量に基づいており、以下の表１４に示す。
【表１４】
2008502330.tif 000015
５．真空弁をオンの位置に回して、サンプルが濾過されるまで減圧（８００〜１０００ｍｂａｒ（８０〜１００ｋＰａ））する（約３０秒）。
６．減圧を停止し、７００μＬの洗浄バッファー１をカラムに添加する。減圧を開始し、溶液がカラムを通過するようにする。減圧を停止する。
７．７００μＬの洗浄バッファー２をカラムに添加する。減圧を開始し、溶液がカラムを通過するようにする。減圧を停止する。
８．真空マニホールドから各カラムを取り外し、２ｍＬの収集試験管に入れる。
９．スピンカラムを含む試験管を、微量遠心機（microcentrifuge）で、３０秒間、１３，２００ｒｐｍで遠心分離する。
１０．収集試験管を廃棄する。カラムを取り外して、新しい収集試験管に入れる。
１１．５０μＬのリボヌクレアーゼを含まない水をカラムの濾過膜に直接添加する。
１２．微量遠心機で、３０秒間、１３，２００ｒｐｍで遠心分離する。
１３．カラムを廃棄する。約５０μＬの希釈ＲＮＡ溶液を収集試験管内に入れる。２５μＬの反応液につき、この溶液５μＬを使用する。
【００８７】
試験したサンプルの最終セットは、センチネルリンパ節陽性乳房癌患者からの３０のＨ＆Ｅ陽性および２５のＨ＆Ｅ陰性腋窩リンパ節を示した。
【００８８】
１ステップＲＴ‐ＰＣＲ試験
５μＬの希釈したＲＮＡに、この例で試験した患者のサンプルから得たカットオフを用いて、例３に記載した２５μＬの迅速な１ステップＲＴ‐ＰＣＲ反応を実施した。ただし、利用した２つのサンプルの調製法の差を補正するためにカットオフを正規化した点は異なる。３つのサンプルは、ＰＢＧＤ信号からＲＮＡの質が許容できないことが分かり、試験結果としないことにした。次に示す表１５は、有効な結果が得られた５２のリンパ節の結果の要約である。
【表１５】
2008502330.tif 000016
【００８９】
現在の反応条件
【表１６】
2008502330.tif 000017
【００９０】
〔実施の態様〕
（１）乳癌の存在の診断または経過の予測をするための方法において、
患者に由来する細胞または組織サンプル中の、少なくとも１つの組織特異的遺伝子を含むマーカー遺伝子と少なくとも１つの非組織特異的遺伝子を含むマーカー遺伝子との組合せの発現を測定するステップ、
を含む、方法。
（２）実施態様（１）に記載の方法において、
前記組織特異的遺伝子は、マンマグロビン（配列番号１）、ＰＩＰ（配列番号３）、Ｂ３０５Ｄ（配列番号４）、Ｂ７２６（配列番号５）、ＧＡＢＡ（配列番号６）、およびＰＤＥＦ（配列番号７）、からなる群から選択される、方法。
（３）実施態様（１）に記載の方法において、
前記組織特異的遺伝子は、マンマグロビン（配列番号１）である、方法。
（４）実施態様（１）に記載の方法において、
前記非組織特異的遺伝子は、上皮細胞に特に関連したタンパク質をエンコードする、方法。
（５）実施態様（４）に記載の方法において、
前記遺伝子は、ＣＫ１９（配列番号２）、ルミカン（lumican）、セレン含有タンパク質Ｐ（selenoprotein P）、結合組織成長因子、ＥＰＣＡＭ、Ｅ‐カドヘリン、およびＩＶ型コラーゲンα‐２（collagen, type IV, α-2）、からなる群から選択される、方法。
【００９１】
（６）実施態様（５）に記載の方法において、
前記遺伝子は、ＣＫ１９（配列番号２）である、方法。
（７）実施態様（１）に記載の方法において、
前記遺伝子は、マンマグロビン（配列番号１）およびＣＫ１９（配列番号２）である、方法。
（８）実施態様（７）に記載の方法において、
前記サンプル中で恒常的に発現される遺伝子の発現を対照反応測定（control reaction measuring）するステップ、
をさらに含む、方法。
（９）実施態様（８）に記載の方法において、
前記遺伝子は、ＰＢＧＤ（配列番号８）である、方法。
（１０）実施態様（１）に記載の方法において、
転移のリスクのある患者を診断するために用いる、方法。
【００９２】
（１１）実施態様（１）に記載の方法において、
転移を検出するために用いる、方法。
（１２）実施態様（８）に記載の方法において、
乳癌の転移を検出するために用いる、方法。
（１３）実施態様（１）に記載の方法において、
全てのステップを外科処置の際に行う、方法。
（１４）実施態様（１３）に記載の方法において、
発現が、術中分子診断アッセイを行うことにより測定され、
前記術中分子診断アッセイは、
患者からリンパ節組織サンプルを得るステップと、
このサンプルを核酸増幅および検出によって分析するステップと、
カットオフ値を超える２つ以上のマーカー遺伝子が存在するか否かを決定するステップと、
を含む、
方法。
（１５）実施態様（１４）に記載の方法において、
核酸増幅および核酸検出を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行う、方法。
【００９３】
（１６）実施態様（３）に記載の方法において、
マンマグロビンの発現を、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを用いて検出し、
前記オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、
AGTTGCTGATGGTCCTCATGC（配列番号９）、
ATCACATTCTCCAATAAGGGGCA（配列番号１０）、
Fam-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQ1-TT（配列番号１１）、
CAAACGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA（配列番号１８）、
TCTGTGAGCCAAAGGTCTTGCAGA（配列番号１９）、
TGTTTATGCAATTAATATATGACAGCAGTCTTTGT（配列番号２０）
CGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA（配列番号４２）、
GAGCCAAAGGTCTTGCAGAAAGT（配列番号４３）、および、
TGTTTATGCAATTAATATATGACAGCAGTCTTTGTG（配列番号４４）、
からなる群から選択される、
方法。
（１７）実施態様（１６）に記載の方法において、
前記プライマー／プローブのセットは、
AGTTGCTGATGGTCCTCATGC（配列番号９）、
ATCACATTCTCCAATAAGGGGCA（配列番号１０）、および、
Fam-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQ1-TT（配列番号１１）、
である、
方法。
（１８）実施態様（６）に記載の方法において、
ＣＫ１９の発現を、ポリマーおよびプローブを用いて検出し、
前記ポリマーおよびプローブは、
配列番号１２、配列番号１３、配列番号４９；
配列番号５１、配列番号１３、配列番号４９；
配列番号１２、配列番号５３、配列番号４９；
配列番号５１、配列番号５３、配列番号４９；
配列番号４７、配列番号５３、配列番号１４；
配列番号１２、配列番号５３、配列番号１４；
配列番号５１、配列番号５３、配列番号１４；
配列番号５２、配列番号５３、配列番号１４；
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４；
配列番号５１、配列番号１３、配列番号１４；および、
配列番号５２、配列番号１３、配列番号１４、
からなる群から選択される、
方法。
（１９）実施態様（１８）に記載の方法において、
前記プライマーおよびプローブは、
配列番号１２、配列番号５３、配列番号１４；
配列番号５１、配列番号５３、配列番号１４；
配列番号５２、配列番号５３、配列番号１４；
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４；
配列番号５１、配列番号１３、配列番号１４；および、
配列番号５２、配列番号１３、配列番号１４、
からなる群から選択される、
方法。
（２０）実施態様（１９）に記載の方法において、
前記プライマーおよびプローブは、
配列番号１２、配列番号５３、配列番号１４；
配列番号５１、配列番号５３、配列番号１４；
配列番号５２、配列番号５３、配列番号１４；および、
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、
からなる群から選択される、
方法。
【００９４】
（２１）実施態様（２０）に記載の方法において、
前記プライマーおよびプローブは、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４である、方法。
（２２）実施態様（９）に記載の方法において、
前記プライマーおよびプローブは、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７である、方法。
（２３）組成物において、
核酸プライマー／プローブのセットであって、
AGTTGCTGATGGTCCTCATGC（配列番号９）、
ATCACATTCTCCAATAAGGGGCA（配列番号１０）、
Fam-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQ1-TT（配列番号１１）、
CAAACGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA（配列番号１８）、
TCTGTGAGCCAAAGGTCTTGCAGA（配列番号１９）、
TGTTTATGCAATTAATATATGACAGCAGTCTTTGT（配列番号２０）、
CGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA（配列番号４２）、
GAGCCAAAGGTCTTGCAGAAAGT（配列番号４３）、および、
TGTTTATGCAATTAATATATGACAGCAGTCTTTGTG（配列番号４４）、
からなる群から選択される、核酸プライマー／プローブのセット、
を含む、組成物。
（２４）実施態様（２３）に記載の組成物において、
前記プライマー／プローブのセットは、
AGTTGCTGATGGTCCTCATGC（配列番号９）、
ATCACATTCTCCAATAAGGGGCA（配列番号１０）、および、
Fam-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQ1-TT（配列番号１１）、
である、
方法。
（２５）組成物において、
核酸プライマー／プローブのセットであって、
配列番号１２、配列番号１３、配列番号４９；
配列番号５１、配列番号１３、配列番号４９；
配列番号１２、配列番号５３、配列番号４９；
配列番号５１、配列番号５３、配列番号４９；
配列番号４７、配列番号５３、配列番号１４；
配列番号１２、配列番号５３、配列番号１４；
配列番号５１、配列番号５３、配列番号１４；
配列番号５２、配列番号５３、配列番号１４；
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４；
配列番号５１、配列番号１３、配列番号１４；および、
配列番号５２、配列番号１３、配列番号１４、
からなる群から選択される、核酸プライマー／プローブのセット、
を含む、組成物。
【００９５】
（２６）実施態様（２５）に記載の組成物において、
前記プライマーおよびプローブは、
配列番号１２、配列番号５３、配列番号１４；
配列番号５１、配列番号５３、配列番号１４；
配列番号５２、配列番号５３、配列番号１４；
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４；
配列番号５１、配列番号１３、配列番号１４；および、
配列番号５２、配列番号１３、配列番号１４、
からなる群から選択される、
組成物。
（２７）実施態様（２６）に記載の組成物において、
前記プライマーおよびプローブは、
配列番号１２、配列番号５３、配列番号１４；
配列番号５１、配列番号５３、配列番号１４；
配列番号５２、配列番号５３、配列番号１４；および、
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、
からなる群から選択される、
組成物。
（２８）実施態様（２７）に記載の組成物において、
前記プライマーおよびプローブは、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４である、組成物。
（２９）組成物において、
配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７、の核酸プライマー／プローブのセット、
を含む、組成物。
（３０）実施態様（１）に記載の術中リンパ節アッセイを行うためのキットにおいて、
核酸増幅試薬および核酸検出試薬、
を含む、キット。
【００９６】
（３１）実施態様（３０）に記載のキットにおいて、
前記試薬は、配列番号１〜８からなる群から選択されるマーカー群の存在を検出するための配列を有するプライマーを含む、キット。
（３２）実施態様（３１）に記載のキットにおいて、
前記プライマー／プローブのセットは、
AGTTGCTGATGGTCCTCATGC（配列番号９）、
ATCACATTCTCCAATAAGGGGCA（配列番号１０）、
Fam-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQ1-TT（配列番号１１）、
CAAACGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA（配列番号１８）、
TCTGTGAGCCAAAGGTCTTGCAGA（配列番号１９）、
TGTTTATGCAATTAATATATGACAGCAGTCTTTGT（配列番号２０）
CGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA（配列番号４２）、
GAGCCAAAGGTCTTGCAGAAAGT（配列番号４３）、および、
TGTTTATGCAATTAATATATGACAGCAGTCTTTGTG（配列番号４４）、
からなる群から選択される、
キット。
（３３）実施態様（３２）に記載のキットにおいて、
前記プライマー／プローブのセットは、
AGTTGCTGATGGTCCTCATGC（配列番号９）、
ATCACATTCTCCAATAAGGGGCA（配列番号１０）、および、
Fam-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQ1-TT（配列番号１１）、
である、
キット。
（３４）実施態様（３０）に記載のキットにおいて、
前記プライマー／プローブのセットは、
配列番号１２、配列番号１３、配列番号４９；
配列番号５１、配列番号１３、配列番号４９；
配列番号１２、配列番号５３、配列番号４９；
配列番号５１、配列番号５３、配列番号４９；
配列番号４７、配列番号５３、配列番号１４；
配列番号１２、配列番号５３、配列番号１４；
配列番号５１、配列番号５３、配列番号１４；
配列番号５２、配列番号５３、配列番号１４；
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４；
配列番号５１、配列番号１３、配列番号１４；および、
配列番号５２、配列番号１３、配列番号１４、
からなる群から選択される、
キット。
（３５）実施態様（３４）に記載のキットにおいて、
前記プライマーおよびプローブは、
配列番号１２、配列番号５３、配列番号１４；
配列番号５１、配列番号５３、配列番号１４；
配列番号５２、配列番号５３、配列番号１４；
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４；
配列番号５１、配列番号１３、配列番号１４；および、
配列番号５２、配列番号１３、配列番号１４、
からなる群から選択される、
キット。
【００９７】
（３６）実施態様（３５）に記載のキットにおいて、
前記プライマーおよびプローブは、
配列番号１２、配列番号５３、配列番号１４；
配列番号５１、配列番号５３、配列番号１４；
配列番号５２、配列番号５３、配列番号１４；および、
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、
からなる群から選択される、
キット。
（３７）実施態様（３０）に記載のキットにおいて、
前記プライマーおよびプローブは、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４である、キット。
（３８）実施態様（３０）に記載のキットにおいて、
前記プライマーおよびプローブは、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７である、キット。
（３９）実施態様（３０）に記載のキットにおいて、
ＲＴ‐ＰＣＲ試薬、
を含む、キット。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】９５％の特異度における個々のマーカーの感度を示す棒グラフである。
【図１】
2008502330.tif 000018
【配列表】
2008502330000001.app