(57)【要約】  本発明は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ又はｅＩＦ-５Ａ１とも呼ばれるアポトーシス特異的真核生物開始因子５Ａ(ｅＩＦ-５Ａ)、核酸、及びポリペプチド、並びにアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を阻害するアンチセンス・ヌクレオチド又はｓｉＲＮＡを使用して、細胞においてアポトーシスを阻害又は抑制するための方法に関する。本発明はまた、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を抑制することにより、炎症性サイトカインの発現抑制又は阻害、或いはＮＦκＢの活性化を活性化を阻害することに関する。
2008507278.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞においてアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの内在性の発現を抑制する、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａのアンチセンス・オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａが、配列番号２０のヌクレオチド配列によりコードされる、請求項１に記載のアンチセンス・オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａが、配列番号４１のヌクレオチド配列によりコードされる、請求項１に記載のアンチセンス・オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記アンチセンス・オリゴヌクレオチドが、配列番号３５に記載される配列を有する、請求項１に記載のアンチセンス・オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記アンチセンス・オリゴヌクレオチドが、配列番号３７に記載される配列を有する、請求項１に記載のアンチセンス・オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記アンチセンス・オリゴヌクレオチドが、配列番号３９に記載される配列を有する、請求項１に記載のアンチセンス・オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１に記載のアンチセンス・オリゴヌクレオチド及び当該アンチセンス・オリゴヌクレオチドに作動可能なように結合されて細胞において当該アンチセンス・オリゴヌクレオチドの転写を許容する制御配列を含む、哺乳動物細胞をトランスフェクションするための発現ベクター。
【請求項８】
請求項４に記載のアンチセンス・オリゴヌクレオチド及び当該アンチセンス・オリゴヌクレオチドに作動可能なように結合されて細胞において当該アンチセンス・オリゴヌクレオチドの転写を許容する制御配列を含む、哺乳動物細胞をトランスフェクションするための発現ベクター。
【請求項９】
請求項５に記載のアンチセンス・オリゴヌクレオチド及び当該アンチセンス・オリゴヌクレオチドに作動可能なように結合されて細胞において当該アンチセンス・オリゴヌクレオチドの転写を許容する制御配列を含む、哺乳動物細胞をトランスフェクションするための発現ベクター。
【請求項１０】
請求項６に記載のアンチセンス・オリゴヌクレオチド及び当該アンチセンス・オリゴヌクレオチドに作動可能なように結合されて細胞において当該アンチセンス・オリゴヌクレオチドの転写を許容する制御配列を含む、哺乳動物細胞をトランスフェクションするための発現ベクター。
【請求項１１】
細胞においてアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を阻害する方法であって、請求項７に記載の発現ベクターを当該細胞に投与し、それにより当該細胞において当該アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａアンチセンス・オリゴヌクレオチドが内在性のアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を阻害する、前記方法。
【請求項１２】
細胞においてアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を阻害する方法であって、請求項８、９、又は１０に記載の発現ベクターを当該細胞に投与し、それにより当該細胞において当該アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａアンチセンス・オリゴヌクレオチドが内在性のアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を阻害する、前気方法。
【請求項１３】
前記細胞において内在性アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現の抑制が、当該細胞においてアポトーシスを抑制すること、当該細胞においてｐ５３の発現を低減すること、当該脂肪において産生されるサイトカインのレベルを低減すること、当該細胞において産生されるサイトカインのレベルを低減すること、当該細胞においてＢｃｌ２の発現を増加させること；当該細胞において産生されるミエロペルオキシダーゼのレベルを低減すること、当該細胞において活性化ＮＦκβのレベルを低減すること、当該細胞においてＴＬＲ４のレベルを低減すること、当該細胞においてＴＮＦＲ-１のレベルを低減すること、及び
当該細胞においてｉＮＯＳのレベルを低減することからなる群から選ばれる当該細胞への効果を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞において内在性アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現の抑制が、当該細胞においてアポトーシスを抑制すること、当該細胞においてｐ５３の発現を低減すること、当該脂肪において産生されるサイトカインのレベルを低減すること、当該細胞において産生されるサイトカインのレベルを低減すること、当該細胞においてＢｃｌ２の発現を増加させること；当該細胞において産生されるミエロペルオキシダーゼのレベルを低減すること、当該細胞において活性化ＮＦκβのレベルを低減すること、当該細胞においてＴＬＲ４のレベルを低減すること、当該細胞においてＴＮＦＲ-１のレベルを低減すること、及び
当該細胞においてｉＮＯＳのレベルを低減することからなる群から選ばれる当該細胞への効果を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ｉｎ ｖｉｖｏで哺乳動物の肺細胞にｓｉＲＮＡをデリバリーする方法であって、当該ｓｉＲＮＡを水と混合し、そして哺乳動物に鼻腔内でデリバリーすることを含む、前記方法。
【請求項１６】
細胞においてアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの内在的発現を抑制する、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５ＡのｓｉＲＮＡ。
【請求項１７】
アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａが、配列番号２０のヌクレオチド配列によりコードされる、請求項１６に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１８】
アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａが、配列番号４１のヌクレオチド配列によりコードされる、請求項１６に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１９】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号３０において記載される配列を有する、請求項１６に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項２０】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号３１において記載される配列を有する、請求項１６に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項２１】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号３２において記載される配列を有する、請求項１６に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項２２】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号３３において記載される配列を有する、請求項１６に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項２３】
細胞においてアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を阻害する方法であって、請求項１６に記載のｓｉＲＮＡを当該細胞に投与し、それにより当該アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡが、当該細胞において内在性のアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を阻害することを含む、前記方法。
【請求項２４】
細胞においてアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を阻害する方法であって、請求項１９、２０、２１、又は２２に記載のｓｉＲＮＡを当該細胞に投与し、それにより当該アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡが、当該細胞において内在性のアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を阻害することを含む、前記方法。
【請求項２５】
細胞においてアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を阻害する方法であって、請求項１６に記載のｓｉＲＮＡを当該細胞に投与し、それにより当該アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡが、当該細胞において内在性のアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を阻害することを含む、前記方法。
【請求項２６】
細胞においてアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を阻害する方法であって、請求項１９、２０、２１、又は２２に記載のｓｉＲＮＡを当該細胞に投与し、それにより当該アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡが、当該細胞において内在性のアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を阻害することを含む、前記方法。
【請求項２７】
前記細胞において内在性アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現の阻害が、当該細胞においてアポトーシスを抑制すること、当該細胞においてｐ５３の発現を低減すること、当該細胞において産生されるサイトカインのレベルを低減すること、当該細胞において産生されるサイトカインのレベルを低減すること、当該細胞においてＢｃｌ２の発現を増加させること；当該細胞において産生されるミエロペルオキシダーゼのレベルを低減すること、当該細胞において活性化ＮＦκβのレベルを低減すること、当該細胞においてＴＬＲ４のレベルを低減すること、当該細胞においてＴＮＦＲ-１のレベルを低減すること、及び当該細胞においてｉＮＯＳのレベルを低減することからなる群から選ばれる効果を当該細胞に与える、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞において内在性アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現の阻害が、当該細胞においてアポトーシスを抑制すること、当該細胞においてｐ５３の発現を低減すること、当該細胞において産生されるサイトカインのレベルを低減すること、当該細胞において産生されるサイトカインのレベルを低減すること、当該細胞においてＢｃｌ２の発現を増加させること；当該細胞において産生されるミエロペルオキシダーゼのレベルを低減すること、当該細胞において活性化ＮＦκβのレベルを低減すること、当該細胞においてＴＬＲ４のレベルを低減すること、当該細胞においてＴＮＦＲ-１のレベルを低減すること、及び当該細胞においてｉＮＯＳのレベルを低減することからなる群から選ばれる効果を当該細胞に与える、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポトーシス特異的真核細胞阻害因子(ｅＩＦ-５Ａ)、つまり「アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ」又は「ｅＩＦ-５Ａ１」とも呼ばれる因子、及びデオキシハイプシンシンターゼ(ＤＨＳ)に関する。本発明は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ１並びにＤＨＳ核酸及びポリペプチド、そしてアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ及びＤＨＳの発現を抑制するための方法に関する。
【０００２】
本出願は、２００４年６月７日に出願された米国特許出願第10/861,980号の継続出願であり、当該出願は２００４年３月５日に出願された米国特許出願第10/792,893号の継続出願であり、当該出願は２００３年３月１０日に出願された米国特許出願第10/383,614号の継続出願であり、当該出願は２００２年１０月２３日に出願された米国特許出願第10/277,969号の継続出願であり、当該出願は２００２年７月２３日に出願された米国特許出願第10/200,148号の継続出願であり、当該出願は２００２年５月７日に出願された米国特許出願第10/141,647の継続出願であり、当該出願は２００１年７月２３日に出願された米国特許出願第9/909,796号の継続出願であり、これらの全ての出願は、その全てを本明細書中に援用する。本出願はまた、２００３年６月６日に出願された米国仮特許出願第60/476,194号；２００３年９月２２日に出願された米国仮特許出願60/504,731号、２００３年１２月１０日に出願された米国仮特許出願第60/528,249号；２００４年３月１日に出願された米国仮特許出願第60/557,671号、及び２００４年６月２日に出願された米国仮特許出願第60/575,814号の優先権を主張する。これら全ての出願はその全てを本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００３】
アポトーシスは遺伝的にプログラムされた細胞的事象であり、明瞭な形態学的特徴、例えば細胞収縮、クロマチン凝集、核の断片化、及び膜ブレブ形成により特徴付けられる(Kerrら、(1972) Br. J. Cancer, 26, 30 239-257; Wyllieら、(1980) Int. Rev. Cytol., 68, 251-306)。アポトーシスは、通常組織の発達及びホメオスタシスにおいて重要な役割を果たし、そしてアポトーシスプログラムの欠損は、神経変性及び自己免疫疾患から新生物にわたる広い疾患に寄与することが知られている(Thompson (1995) Science, 267, 1456-1462; Mullauerら (2001) Mutat. Res, 488, 211-231)。アポトーシス細胞の形態学的特徴はよく特徴付けられているが、当該方法を制御する分子経路は、解明され始めただけに過ぎない。
【０００４】
アポトーシスにおいて主要な役割を果たすと知られている一群のタンパク質は、カスパーゼと名付けられるシステイン・プロテアーゼファミリーであり、当該ファミリーは、アポトーシスの多くの経路に必要とされているようである(Creagh & Martin (2001) Biochem. Soc. Trans, 29, 696-701; Dalesら、(2001) Leuk. Lymphoma, 41, 247-253)。カスパーゼは、様々な細胞タンパク質を切断することにより、アポトーシス刺激に応じてアポトーシスを引き起こし、細胞収縮、膜ブレブ形成、及びＤＮＡ断片化などのアポトーシスの古典的な徴候をもたらす(Chang & Yang (2000) Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64, 821-846)。
【０００５】
Ｂａｘ又はＢａｋなどのプロアポトーシス・タンパク質はまた、カスパーゼ活性化分子、例えばミトコンドリア・シトクロームｃなどを放出することにより、アポトーシス経路において重要な役割を果たし、それによりアポトーシスを通した細胞死を促進する(Martinou & Green (2001) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 2, 63-67; Zouら、(1997) Cell, 90, 405-413.)。抗アポトーシスタンパク質、例えばＢｃｌ-２は、プロアポトーシスタンパク質Ｂａｘ及びＢａｋの活性を拮抗作用することにより細胞の生存を促進する(Tsujimoto (1998) Genes Cells, 3, 697-707; Kroemer (1997) Nature Med., 3, 614-620)。Ｂａｘ：Ｂｃｌ-２の割合は、細胞の運命を決定づける方法の一つであると考えられている。過剰量のＢａｘはアポトーシスを促進し、そして過剰量のＢｃｌ-２は細胞生存を促進する(Salomonsら、(1997) Int. J. Cancer, 71, 959-965; Wallace-Brodeur & Lowe (1999) Cell Mol. Life Sci.,55, 64-75)。
【０００６】
アポトーシスに関与する別の主要なタンパク質は、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３によりコードされるタンパク質である。当該タンパク質は、細胞成長を調節し、そして損傷を受けて遺伝的に不安定な細胞において、おそらくＢａｘの上方制御を介してアポトーシスを誘導する転写因子である(Boldら、(1997) Surgical Oncology, 6, 133-142; Ronenら, 1996; Schuler & Green (2001) Biochem. Soc. Trans., 29, 684-25 688; Ryanら、 (2001) Curr. Opin. Cell Biol., 13, 332-337; Zdrnigら、(2001) Biochem. Biophys. Acta, 1551, F1-F37)。
【０００７】
アポトーシス経路における変化は、癌を含む多くの疾患過程において主要な役割を果たすと考えられている(Wyllieら、(1980) Int. Rev. Cytol., 68, 251-306; Thompson (1995) Science, 267, 1456-1462; Sen & D'lncalci (1992) FEES Letters, 307, 122-127; McDonnellら、(1995) Seminars in Cancer and Biology, 6, 53-60.)。癌の発達及び進行についての研究は、伝統的に細胞増殖について焦点を当ててきた。しかしながら、腫瘍形成においてアポトーシスが果たす重要な役割は、近年明らかになってきた。実際、アポトーシスについて現在知られている事実の多くは、腫瘍モデルを用いて研究された。なぜなら、アポトーシスの制御は、腫瘍細胞の幾つかの点で必ず変化されるからである(Bold ら(1997))。
【０００８】
サイトカインもまたアポトーシス経路に関与した。生物学的システムは、その調節のための細胞相互作用を必要とし、そして細胞間のクロストークは一般的に、多くのサイトカインに関与する。サイトカインは、広汎な刺激に応答して多くの異なる細胞型により産生されるメディエーターである。サイトカインは、多くの異なる細胞型に多くの異なる効果を発揮できる多面的な分子であるが、免疫応答並びに細胞増殖及び分化の制御において特に重要である。標的細胞上へのサイトカインの作用は、細胞の生存、増殖、活性化、分化、又はアポトーシスを、特定のサイトカイン、相対濃度、及び他のメディエーターの存在に依存して促進することができる。
【０００９】
乾癬、リューマチ様関節炎、及びクローン病などの自己免疫疾患を治療するために抗サイトカインを使用することは一般的になってきている。炎症性サイトカインＩＬ-１及びＴＮＦは、これらの慢性疾患の病原において大きな役割を果たす。これらの２個のサイトカインの生物学的活性を低減する抗サイトカイン治療は、治療利得を提供することができる(Dinarello及びAbraham, 2002)。
【００１０】
インターロイキン１(ＩＬ-１)は、局所的及び全身性の炎症反応を媒介する重要なサイトカインであり、そして多くの障害、例えば血管炎、骨粗鬆症、神経変性障害、糖尿病、ループス腎炎、及び自己免疫疾患、例えばリウマチ様関節炎などの発病機序においてＴＮＦと相乗作用することができる。腫瘍の血管形成及び侵襲性ついてのＩＬ-１βの重要性は、メラノーマ細胞を注射された際にＩＬ-１βノックアウトマウスが転移及び血管形成に対して抵抗性を有することにより近年示されてきた(Voronovら、２００３)。
【００１１】
インターロイキン１８(ＩＬ-１８)は、ＩＬ-１ファミリーの最近発見されたメンバーであり、そして構造、受容体、及び機能の点でＩＬ-１に関連する。ＩＬ-１８は、インターフェロンγ(ＩＦＮ-γ)、ＴＮＦ-α、及びＩＬ-１を誘導する能力の結果として、中心的なサイトカインである。ＩＬ-１β及びＩＬ-１８は、両方ともＴＮＦ-αの産生を誘導できる。ＴＮＦ-αは心筋虚血の間に心機能異常に関与すると知られているサイトカインである(Maekawaら、2002)。ＩＬ-１８結合タンパク質で中和することによりＩＬ１８を阻害することは、スープラフューズドヒト心房心筋(supprafused human atrial myocardium)の虚血／再環流モデルにおいて虚血誘導性心筋不全を低減することが発見された(Dinarello,2001)。マウスＩＬ-１８結合タンパク質を用いたＩＬ-１８の中和は、ＩＦＮ-γ、ＴＮＦ-α、及びＩＬ-１β転写レベルを低減させることができ、そしてコラーゲン誘導性関節炎マウスモデルにおいて関節損傷を低減させることができる(Bandaら, 2003)。ＩＬ-１８産生の低下又は利用能は、マウスメラノーマモデルにＩＬ-１８結合タンパク質を注射することが転移を上手く抑制するので転移性の癌を制御するのに有効であると証明されうる(Carrascalら, 2003)。炎症性サイトカインとしての重要性のさらなる示唆として、ＩＬ-１８の血漿レベルが慢性肝臓疾患を患う患者において上昇し、そして誘導されたレベルは疾患の重篤度と相関した(Ludwiczekら、 2002)。同様に、ＩＬ-１８及びＴＮＦ-αは、腎症を患う糖尿病の血清中で増加した(Moriwaki ら、2003)。外傷性脳損傷の跡の神経炎症は、炎症性サイトカインにより媒介され、そしてＩＬ１８結合タンパク質によりＩＬ１８を阻害することにより、脳外傷後のマウスにおいて神経回復が改善された(Yatsivら, 2002)。
【００１２】
サイトカインのＴＮＦファミリーのメンバーであるＴＮＦ-αは、造血細胞における共分裂効果、炎症反応の誘導、及び多くの細胞型における細胞死の誘導にわたる多面的な効果を有する炎症性サイトカインである。ＴＮＦ-αは、通常、リポ多糖、寄生虫、ウイルス、悪性細胞、及びサイトカインにより誘導され、そして通常、感染及び癌から細胞を防御するために有利に作用する。しかしながら、ＴＮＦ-αの不適切な誘導は、自己免疫疾患などの急性及び慢性炎症をもたらす主要な引き金となり、そして癌、ＡＩＤＳ、心臓病、及び敗血症に寄与しうる(Aggarwal及びNatarajan, 1996; Sharma及びAnker, 2002により総説される)。疾患(つまり敗血症ショック及びリウマチ様関節炎)の実験動物モデル並びにヒトの障害(つまり、炎症性腸疾患及び急性移植片対宿主疾患)は、ＴＮＦ-αを阻害する有益な効果を示した(Wallachら, 1999)。クローン病(van Deventer, 1999)及びリウマチ様関節炎 (Richard-Miceli及びDougados, 2001)などの自己免疫疾患を患う患者に緩和を提供するのに、ＴＮＦ-αの阻害は有効であった。Ｂリンパ球の生存及び成長を促進するＴＮＦ-αの能力は、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病(Ｂ-ＣＬＬ)の発症機序において役割を果たすと考えられており、Ｂ-ＣＬＬにおいてＴ細胞により発現されるＴＮＦ-αのレベルは、腫瘍重量及び疾患ステージと正の相関を示す(Bojarska-Junakら、2002)。インターロイキン１β(ＩＬ-１β)はＴＮＦ-αの産生を誘導することが知られているサイトカインである。
【００１３】
こうして、過剰量のサイトカイン及びＴＮＦ-αの蓄積が、細胞死を含む体への有害な結果を導きうるので、体内においてサイトカインのレベルを低減し、並びにアポトーシスを阻害し又は低減する方法に対する必要性が存在する。本発明はこれらの必要性を満たす。
【００１４】
デオキシハイプシン・シンターゼ(ＤＨＳ)及びハイプシンを含有する真核生物翻訳開始因子５Ａ(ｅＩＦ-５Ａ)は、細胞増殖及び分化を含む細胞過程において重要な役割を果たすことが知られている。独特なアミノ酸であるハイプシンは、全ての試験された真核生物及び古細菌において見つかっているが、真生細菌においては見つかっておらず、そしてｅＩＦ-５Ａは、ハイプシンを含有する唯一のタンパク質である(Park (1988) J. Biol. Chem., 263, 7447-7449; Schumann & Klink (1989) System. Appl. Microbiol, 11, 103-107; Bartigら、(1990) System. Appl. Microbiol., 13, 112-116; Gordonら、(1987a) J. Biol. Chem., 262, 16585-16589)。活性ｅＩＦ-５Ａは、２つの翻訳後ステップで形成される。第一ステップは、ｅＩＦ-５Ａ前駆体の特異的リジンのαアミノ基に、スペルミジンの４-アミノブチル部分を移動させることによるデオキシハイプシン残基の形成である。第二ステップは、デオキシハイプシン・ヒドロキシラーゼにより、４-アミノブチル部分に水酸基を付加して、ハイプシンを形成することを含む。
【００１５】
ｅＩＦ-５Ａのアミノ酸配列は、種間においてよく保存されており、そしてｅＩＦ-５Ａのハイプシン残基の周囲のアミノ酸配列において厳格な保存が存在する。このことにより、ハイプシンへの改変が生存にとって重要であるということが示唆される(Parkら、(1993) Biofactors, 4, 95-104)。酵母においてｅＩＦ-５Ａの両方のアイソマーを不活性化すること、又は活性化における第一ステップを触媒するＤＨＳ遺伝子の不活性化が、細胞分裂を阻害するという観察によりこの仮説はさらに支持される(Schnierら、(1991) Mol. Cell. Biol., 1 1, 3105-31 14; Sasakiら、 (1996) FEES Lett, 384, 151-154; Parkら、(1998) J. Biol. Chem., 273, 1677-1683)。しかしながら、酵母においてｅＩＦ-５Ａタンパク質を枯渇させることは、全体のタンパク質合成を少し低下させるのみであり、ｅＩＦ-５Ａがタンパク質の全体の合成に必要とされるというよりは、ｍＲＮＡの特定のサブセットの翻訳に必要とされるということが示唆される(Kangら、1993、"Effect of initiation factor ｅＩＦ-５Ａ depletion on cell proliferation and protein synthesis," in Tuite, M. (著), Protein Synthesis and Targeting in Yeast, NATO Series H)。ｅＩＦ-５Ａに結合するリガンドが、保存性の高いモチーフを共有するという最近の発見は、ｅＩＦ-５Ａの重要性を示唆する(Xu & Chen (2001) J. Biol. Chem., 276, 2555-2561)。さらに、改変ｅＩＦ-５Ａのハイプシン残基は、ＲＮＡへの配列特異的結合に必須であることがわかっており、そして当該結合は、リボヌクレアーゼからの保護を提供しない。
【００１６】
さらに、ｅＩＦ-５Ａの細胞内枯渇は、核内の特定のｍＲＮＡの有意な増加をもたらし、ｅＩＦ-５Ａが、特定のクラスのｍＲＮＡを、核から細胞質へと運搬することに関与しうるということが示唆される(Liu&Tartakoff (1997) Molecular Biology of the Cellの補遺, 8, 426a. Abstract No. 2476, 37th American Society for Cell Biology Annual Meeting.)。核孔付随核内フィラメントにおけるｅＩＦ-５Ａの増加及びその一般的核輸送受容体との相互作用は、ｅＩＦ-５Ａがポリソームの構成要素であるというよりはむしろ、核細胞質間シャトルタンパク質であるということがさらに示唆された(Rosoriusら、(1999) J. Cell Science, 112, 2369-2380)。
【００１７】
ｅＩＦ-５Ａの第一ｃＤＮＡは、Smit-McBrideらにより１９８９年にヒトからクローン化された。そしてｅＩＦ-５ＡのｃＤＮＡ又は遺伝子が酵母、ラット、ニワトリ胚細胞、トウモロコシ、及びトマトを含む様々な真核生物からクローン化された(Smit-McBrideら、(1989) J. Biol. Chem., 264, 1578-1583; Schnierら、(1991) (酵母); Sano, A. (1995) in Imahori, M. ら(共著), Polyamines, Basic and Clinical Aspects, VNU Science Press, The Netherlands, 81-88 (ラット); Rinaudo & Park (1992) FASEB J., 6, A453 (ニワトリ胚); Payら、 (1991) Plant Mol. Biol., 17, 927-929 (トウモロコシ); Wangら、(2001) J. Biol. Chem., 276, 17541-17549 (トマト))。
【００１８】
ｅＩＦ-５Ａ・ｍＲＮＡの発現は、様々なヒト組織及び哺乳動物細胞系列において探索された。例えば、ｅＩＦ-５Ａの発現変化は、血清枯渇に続き血清を添加後、ヒト線維芽細胞において観察された(Pang & Chen (1994) J. Cell Physiol., 160, 531-538.)。年齢に応じたデオキシハイプシン・シンターゼ活性の低下、及び前駆体ｅＩＦ-５Ａが多く存在することが老化線維芽細胞において観察されたが、アイソフォームの微分変化の平均を反映するという可能性は決定されなかった(Chen & Chen (1997) J. Cell Physiol., 170, 248-254.)。
【００１９】
ｅＩＦ-５Ａが、ヒト免疫不全ウイルス１型Ｒｅｖタンパク質及びヒトＴ細胞白血病ウイルス１型Ｒｅｘタンパク質などのウイルスタンパク質の細胞内標的でありうると研究により示された(Ruhlら、(1993) J. Cell Biol.,123, 1309-1320;  Katahiraら、(1995) J. Virol, 69, 3125-3133)。以前の研究によりｅＩＦ-５Ａが、Ｒｅｖなどの他のＲＮＡ結合タンパク質と相互作用することによりＲＮＡを標的とすることが示され、そしてこれらのウイルスタンパク質がｅＩＦ-５ＡをウイルスＲＮＡプロセッシングへとリクルートするということが示唆される(Liuら、 (1997) Biol. Signals, 6, 166-174.)。
【００２０】
こうして、ｅＩＦ-５Ａ及びＤＨＳが知られているが、これらのタンパク質がアポトーシス経路並びにサイトカイン刺激に関与して、アポトーシス及びサイトカイン発現を調節することができるのかを理解する必要性が残る。本発明はこの必要性を満たす。
【発明の開示】
【００２１】
本発明は、「アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ」又は「ｅＩＦ-５Ａ１」と呼ばれるアポトーシス特異的真核生物阻害因子５Ａ(ｅＩＦ-５Ａ)に関する。本発明はまた、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ核酸及びポリペプチド、並びにアンチセンスヌクレオチド又はｓｉＲＮＡを用いてアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を抑制するために、アポトーシスを阻害又は抑制するための方法に関する。本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて哺乳動物肺細胞に、ｓｉＲＮＡをデリバリーする方法に関する。本発明は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を抑制することにより、炎症性サイトカインの発現を抑制又は阻害することにも関する。さらに、本発明は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を抑制することによりｐ５３の発現を阻害又は抑制することに関する。本発明は、アンチセンスヌクレオチド又はｓｉＲＮＡを用いてアポトーシス因子５Ａの発現を抑制又は阻害することにより、Ｂｃｌ-２発現を抑制する方法にも関する。本発明は、ヒト上皮細胞においてサイトカイン、特にＴＮＦ-αの産生を阻害する方法も提供する。本発明の別の実施態様では、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに標的化されたアンチセンス・オリゴヌクレオチドを使用することにより、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を抑制することは、緑内障の眼における網膜ガングリオン細胞死を抑制する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
真核細胞開始因子５Ａ(ｅＩＦ-５Ａ)の幾つかのアイソフォームは単離されており、そして公開データーバンクに公開されている。これらのアイソフォームは機能的に重複していると考えられていた。本発明の発明者は、１つのアイソフォームがアポトーシスの誘導前に即座に上方制御されるということを発見し、当該アイソフォームをアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ又はｅＩＦ-５Ａ１と名付けた。本発明の対象は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ及びＤＨＳであり、ｅＩＦ-５Ａの活性化に関する。
【００２３】
アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａは、アポトーシスが引き起こす疾患状態への介入のための適切な標的となりそうである。なぜなら、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａは、アポトーシス経路に関与する下流のエフェクター及び転写因子を転写後調節するレベルで作用すると考えられるからである。具体的に、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａは、下流エフェクター及びアポトーシスの転写因子をコードするｍＲＮＡの核から細胞質への移動を選択的に促進し、次に細胞質においてこれらのｍＲＮＡは翻訳されるようである。アポトーシスを開始するという最終的な決定は、内部及び外部からのアポトーシス促進性シグナル及び抗アポトーシスシグナルとのあいだの複雑な相互作用から決定される(Lowe & Lin (2000) Carcinogenesis, 21, 485-495)。アポトーシスの下流のエフェクター及び転写因子の翻訳を促進する能力をとおして、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａは、これらのシグナル間バランスを、アポトーシス側に傾けるように思われる。
【００２４】
従って、本発明は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ又はＤＨＳのいずれかの発現をそれぞれ阻害又は低減する薬剤を投与することにより、細胞のアポトーシスを抑制又は低減する方法を提供する。ＤＨＳの発現を低下させることにより、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａを活性化するために利用できるＤＨＳタンパク質が減少する。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ又はＤＨＳの発現を阻害又は低減できる１の薬剤は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ又はＤＨＳのアンチセンス・オリゴヌクレオチドである。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの活性化を低減することにより、又はアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を低減又は抑制することにより、細胞のアポトーシスは遅延又は停止されうる。
【００２５】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方における遺伝子の特異的抑制を達成するために上手く使用された。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、短いＤＮＡ(又はＤＮＡアナログ)、ＲＮＡ(又はＲＮＡアナログ)、又はＤＮＡ/ＲＮＡハイブリットの合成鎖であり、これらは特異的ＤＮＡ又はＲＮＡ標的に対してアンチセンスである(つまり相補する)。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡに結合し、そして転写、翻訳、又はスプライシングのレベルで発現を停止することにより、ＤＮＡ又はＲＮＡ標的によりコードされるタンパク質の発現を阻害するように設計される。分解に絶える改変骨格を使用することにより(Blakeら、1985)、ヌクレアーゼ分解を遅延するようにホスホロチオエート結合でオリゴヌクレオチド中のホスホジエステル結合を置き換えることにより、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、細胞培養及び疾患動物モデルの両方において成功裏に使用された(Hogrefe,1999)。オリゴヌクレオチドをより安定にし、そして分解に対してより抵抗性にするアンチセンス・オリゴヌクレオチドに対する他の改変が当業者に知られており、そして理解されている。本明細書において使用されるアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡ、二本鎖又は一本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ/ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ及びＲＮＡアナログ、並びに塩基、糖、又は骨格改変を有するオリゴヌクレオチドを包含する。当該オリゴヌクレオチドは、安定性を高め、核酸分解などへの抵抗性を増加させるために、当業者に知られている方法により改変されうる。これらの改変は当業者に知られており、そして非限定的に、オリゴヌクレオチドの骨格を改変すること、糖部分を改変すること、又は塩基を改変することを含む。
【００２６】
好ましくは、本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａポリペプチド又はＤＨＳポリペプチドの配列の一部又は全体をコードするヌクレオチド配列を有する。本発明は、以下に記載されるようにアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａポリペプチドの一部をコードするアンチセンスヌクレオチドで様々な細胞系列をトランスフェクションし、そしてアポトーシスを引き起こしている細胞の数を計測した。アンチセンス・オリゴヌクレオチドでトランスフェクションされた細胞集合は、アンチセンスオリゴでトランスフェクションされていない同様の細胞と比較して、アポトーシスを引き起こしている細胞の数の低下を示した。図５４〜５８により、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａアンチセンス・オリゴヌクレオチドでトランスフェクションされなかった細胞に比較して、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａのアンチセンス・オリゴヌクレオチドで処理された細胞においてアポーシスを引き起こしている細胞の割合の低下が示された。
【００２７】
本発明は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａポリペプチド又はＤＨＳポリペプチドをコードする多くの安定した核酸配列を使用することを意図する。例えば、本発明は、以下のアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ核酸配列(配列番号１、３、４、５、１１、１２、１５、１６、１９、２０、及び２１)及びＤＨＳ配列(配列番号６、７、８)のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを提供する。本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、提供された配列番号の配列の全長である必要はない。当該アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ又はＤＨＳの発現を抑制又は低減することができるために十分な長さでありさえすれば十分である。「発現の阻害又は低下」又は「発現の抑制」は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ又はＤＨＳなどの標的遺伝子からのタンパク質及び/又はｍＲＮＡ産物がなくなること又は当該産物のレベルの検出可能な低下を指す。
【００２８】
コード配列の全体を含まないアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの代表的なアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、以下の配列番号３５、３７、及び３９の配列を有するアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａのアンチセンス・オリゴヌクレオチドである。
【００２９】
「アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａのアンチセンス・オリゴヌクレオチド」は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対して実質的な配列同一性又は又は実質的な相同性を有するオリゴヌクレオチドを含む。本発明のアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａのさらなるアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、上で列挙された配列に対して実質的な配列同一性(つまり、９０％の相同性)を有するオリゴヌクレオチドか、又は高度にストリンジェントな条件下で列挙された配列番号の配列にハイブリダイズする配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。本明細書に使用される場合、「実質的な配列同一性」又は「実質的な相同性」は、ある配列が、他の配列と実質的な構造又は機能の等価性を示すということを指す。実質的な配列同一性又は実質的な相同性を有する配列間の構造又は機能的な差はわずかであろう；つまり、これらの配列は、所望される適用において予定される機能に対して配列の能力に影響を与えないであろう。違いは、異なる種間におけるコドン使用の固有の変動のため生じることもある。２以上の異なる配列間でかなりの量の配列の重なり又は類似性が存在する場合、又は配列が長さ又は構造の点で異なる場合であっても異なる配列が同様の物理的性質を有する場合、構造的な違いはわずかであると考えられる。かかる特徴は、例えば、規定の条件下でハイブリダイズする能力、又はタンパク質の場合、免疫学的交差反応性、類似する酵素活性などを含む。当業者は、当該分野に既知の方法によりこれらの特徴の各々を容易に決定することができる。
【００３０】
さらに、２個のヌクレオチド配列は、その配列間で少なくとも約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらにより好ましくは約９０％以上、そして最も好ましくは約９５％以上の配列類似性を有する場合、「実質的に相補する」。２個のアミノ酸配列は、それらが、当該ポリペプチドの活性部分又は機能的な関連性を有する部分のあいだで、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の類似性を有する場合、実質的に相同である。
【００３１】
２個の配列の同一性割合を決定するために、配列は、最適比較をする目的のためにアライメントされる(例えば、最適アライメントのために第一及び第二アミノ酸配列又は核酸配列の一方又は両方にギャップが入れられることもあるし、そして非相同配列は比較目的では無視されることもある)。好ましい実施態様では、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％以上の長さの参照配列が、比較の目的でアライメントされる。次に対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置においてアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第一配列における位置が、第二配列における対応する位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドと同じアミノ酸残基又はヌクレオチドにより占められる場合、分子は当該位置で同一である(本明細書で使用される場合、アミノ酸又は核酸「同一性」は、アミノ酸又は核酸「相同性」に等しい)。２個の配列間の同一性割合は、ギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮に入れた当該配列により共有される同一の位置の数の関数であり、これらの考慮は２個の配列の最適アライメントを導くために必要とされる。
【００３２】
２個の配列間の配列比較及び同一性割合及び類似性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成されうる(Computational Molecular Biology, Lesk, A. M.著、Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W.著、Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., 及びGriffin, H. G.,共著, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 及び Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. 及びDevereux, J., 共著, M Stockton Press, New York, 1991)。
【００３３】
本発明の核酸及びタンパク質配列を、他のファミリーのメンバー又は関連する配列を同定するために配列データーベースに対する検索を実行するための「クエリー配列」としてさらに使用することもできる。かかる検索は、Altschulら、(1990) J. Mol Biol. 215:403-10のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム(バージョン２.０)を使用して実行することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラムを用いて実行することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラムで実行して、本発明のタンパク質に対して相同であるアミノ酸配列を取得することができる。比較目的のため、ギャップアライメントを得るために、ギャップＢＬＡＳＴ(Gapped BLAST）は、Altschulら、 (1997) NucleicAcids Res. 25(17):3389-3402において記載されるように利用されうる。ＢＬＡＳＴ及びギャップＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム(例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ)のデフォルト・パラメーターが使用されうる。
【００３４】
「アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ」という用語は、その機能的誘導体を含む。核酸の「機能的誘導体」という用語は、本明細書においてアミノ酸又はヌクレオチド配列のホモログ又はアナログを意味するように使用される。機能的誘導体は、所定の遺伝子の機能を維持し、これにより本発明に記載される機能的誘導体の有用性が許容される。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａポリペプチドの「機能的誘導体」、又は本明細書に記載されるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａのアンチセンス・オリゴヌクレオチドの機能的誘導体は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの活性を保持するか又はアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対して特異的な抗体との免疫学的交差反応性を保持するアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの断片、バリアント、アナログ、又は化学誘導体である。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａポリペプチドの断片は、当該分子の任意のサブセットを指す。
【００３５】
機能的なバリアントは、機能において変化をもたらさないか又はわずかな変化しかもたらさない類似するアミノ酸の置換を含みうる。機能について必須であるアミノ酸を、当該技術分野に知られている方法、例えば部位特異的突然変異誘発法又はアラニンスキャニング突然変異誘導法(Cunninghamら、(1989) Science 244: 1081-1085)などにより同定することができる。後者の方法は、分子内の各残基に１つのアラニン変異を導入する。次に得られた突然変異分子をキナーゼ活性などの生物学的活性について試験するか、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅活性などのなどのアッセイにおいて試験する。結合パートナー/基質結合について決定的である部位は、結晶化、核磁気共鳴法、又は光親和性標識などの構造分析によっても測定されうる(Smithら、(1992) J. Mol. Biol. 224:899-904; de Vos ら(1992) Science 255:306-312)。
【００３６】
「バリアント」は、遺伝子全体又はその断片のいずれかに実質的に類似する分子、例えば１以上の置換されたヌクレオチドを有するが、特定の遺伝子とハイブリダイズする能力又は元のＤＮＡとハイブリダイズするｍＲＮＡ転写産物をコードする能力を維持するヌクレオチド置換バリアントを指す。「ホモログ」は、異なる動物の属又は種由来の断片又はバリアント配列を指す。
【００３７】
バリアントペプチドは、天然バリアント、並びに当該技術分野に周知の方法により製造されるバリアントを含む。かかるバリアントは、本明細書に開示される分子技術及び配列情報を使用して容易に同定/作成されうる。さらに、かかるバリアントは、本発明のｅＩＦ-５Ａ又はＤＨＳに対する配列及び/又は構造相同性に基づいて、他のタンパク質から容易に区別されうる。存在する相同性/同一性の程度は、主に、当該タンパク質が機能的バリアントであるか、又は非機能的バリアントであるか、パラログファミリー中に存在する相違の量、及びオルソログ間の進化的距離に主に基づくであろう。
【００３８】
ｅＩＦ-５Ａ又はＤＨＳポリヌクレオチドの非天然バリアント、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、又は本発明のタンパク質を、組換え技術を使用して容易に作成することができる。かかるバリアントは、非限定的に、ヌクレオチド又はアミノ酸配列の欠失、添加、及び置換を含む。例えば、置換の１クラスは、アミノ酸の保存置換である。かかる置換は、タンパク質中の所定のアミノ酸を、似たような特徴の別のアミノ酸により置換することである。脂肪性アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅのうちの一つを別のアミノ酸に置換すること；水酸基残基ＳｅｒとＴｈｒの交換；酸性残基ＡｓｐとＧｌｕの交換；アミド残基ＡｓｎとＧｌｎのあいだの置換；塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇの交換；及び芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒのあいだの交換が、保存置換として一般的に考えられている。どのアミノ酸変化が、表現型として変化がないかに関する指針は、Bowieら、Science 247:1306-1310 (1990)に見られる。
【００３９】
当業者に容易に明らかであることだが、「ハイブリダイゼーション」という用語は、本明細書に使用されるとき、プローブ配列と標的配列の性質に依存して適切なストリンジェントな条件における核酸のハイブリダイゼーションを意味する。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は当該技術分野に知られており、そしてインキュベーション時間の変動、温度、及び/又は溶液のイオン強度を変えることにより、所望される強度に依存した条件調節が容易に達成されうる。例えば、Sambrook, J.ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版, Cold Spring Harbour Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989を参照のこと。
【００４０】
条件の選択は、ハイブリダイズされる配列の長さ、特にプローブ配列の長さ、核酸の相対Ｇ-Ｃ含量、及び許容されるミスマッチ量の影響を受ける。低ストリンジェント条件は、低い程度の相補性を有する鎖間の部分的ハイブリダイゼーションが所望されるときに好ましい。完全又はほぼ完全の相補性が所望される場合、高ストリンジェントな条件が所望される。高ストリンジェントな条件は、６×Ｓ.Ｓ.Ｃ.、０.０１Ｍ・ＥＤＴＡ、１Ｘデンハー溶液、及び０.５％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション溶液を意味する。ハイブリダイゼーションを、クローン化されたＤＮＡの断片について約３〜４時間、そして真核生物の全ＤＮＡについて約１２〜１６時間６８℃にて行う。低ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーションの温度を二本鎖形成の融点(Ｔm)以下である約４２度に下げる。Ｔmは、ＧＣ含量及び二本鎖長、並びに溶液のイオン強度の関数であることが知られている。
【００４１】
本明細書に使用されるとき、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子の「対応する部分にハイブリダイズする」という用語は、例えば(センス又はアンチセンスの向きで)オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又は任意のヌクレオチド配列にハイブリダイズする分子が、大体同じ大きさであり、そしてそれらに対して十分な配列同一性を有して、適切な条件下でハイブリダイゼーションを起こすということを意味する。例えば、１００のヌクレオチド長のセンス分子が、２つの配列間に約７０％以上の配列類似性が存在する限り、ヌクレオチド配列のおよそ１００のヌクレオチド部位を認識し、そしてハイブリダイズするであろう。「対応する部分」の大きさが、ハイブリダイゼーションにおける幾つかのミスマッチを許容し、その結果「対応する部分」は、当該部分にハイブリダイズする分子よりも、小さくても大きくてもよく、例えば２０〜３０％大きいか又は小さく、好ましくは多くとも約１２〜１５％大きいか又は小さくてもよいということが理解される。
【００４２】
さらに、ポリペプチドの機能的バリアントは、機能における変化をもたらさないか、又は微々たる変化しかもたらさない類似するアミノ酸の置換を含みうる。機能に必須であるアミノ酸は、当該技術分野に知られている方法、例えば部位特異的突然変異誘導、又はアラニンスキャニング突然変異誘導において知られている方法により同定されうる(Cunninghamら、Science 244: 1081-1085 (1989))。後者の方法は、１個のアラニン突然変異を、分子の全ての残基に導入する。得られた突然変異分子を次に、生物学的活性について試験するか、又はアッセイにおいて試験する。
【００４３】
本発明は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ又はＤＨＳの発現を阻害又は低減できる他の薬剤を提供する。１のかかる薬剤は、小さい阻害性のＲＮＡ(small inhibitory RNA)(ｓｉＲＮＡ)を含む。ｓｉＲＮＡ技術は、アンチセンス・オリゴヌクレオチドの実行可能な代替物として出現した。なぜならアンチセンス・オリゴヌクレオチドで達成されるレベルと同等又はそれより優れた抑制レベルを達成するために、より少ない濃度しか必要としないからである(Thompson,２００２)。長い二本鎖ＲＮＡが、様々な生物、例えば植物、線虫、及びショウジョウバエなどにおいて特定の遺伝子の発現をサイレンスするために使用されてきた。ダイサーと呼ばれるＲＮａｓｅ-ＩＩＩファミリー酵素は、これらの長い二本鎖ＲＮＡを２１〜２３ヌクレオチドの小さい干渉性ＲＮＡへと分解し、当該ＲＮＡが次にＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体(ＲＩＳＣ)中へと取り込まれる。紐解かれたｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣを活性化し、そして一本鎖ｓｉＲＮＡが、塩基対形成により当該複合体を内在ｍＲＮＡへと導くことを可能にする。内在性ｍＲＮＡがＲＩＳＣにより認識されると、当該ｍＲＮＡの切断がもたらされ、そして結果として翻訳に利用できないものとする。長い二本鎖ＲＮＡを動物細胞へと導入することは、強力な抗ウイルス応答をもたらす。当該応答はｓｉＲＮＡを使用することにより避けることができる(Elbashirら、2002)。ｓｉＲＮＡは、細胞培養において広く使用されてきており、そして特異的遺伝子発現の９０％以上の減少を通常達成する。
【００４４】
ｓｉＲＮＡを用いることは、疾患動物モデルにおいて遺伝子発現を阻害する際に一般的になってきている。ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡは、出産後のマウスにおいて、広範な組織に共トランスフェクションされたプラスミドからのルシフェラーゼ発現を阻害することができた(Lewisら、2002)。ＴＮＦファミリーの受容体であるＦａｓに対するｓｉＲＮＡは、マウスの尾静脈中に水力学的に注射され、肝細胞の８０％超にトランスフェクションでき、そして最後の注射から１０日後まで肝臓においてＦａｓ発現を９０％低減した(Songら、2003)。Ｆａｓ・ｓｉＲＮＡは、肝臓線維症及び劇症肝炎からマウスを守ることができる。致死量のリポ多糖で処理されたマウスにおいて敗血症の発達は、ＴＮＦ-αに対するｓｉＲＮＡの使用により阻害された(Sorensenら、2003)。ｓｉＲＮＡは、細胞培養において長期間の有効性の観点から、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける特異的遺伝子発現の阻害のためのかなり強力な薬剤である可能性を有し、そしてｉｎ ｖｉｖｏで細胞をトランスフェクションすることができる能力、及びｉｎ ｖｉｖｏで血清中での分解に対する抵抗性を有する。
【００４５】
本発明の発明者は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５ＡのｓｉＲＮＡを細胞にトランスフェクションし、そしてアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現の効果を研究した。図６４は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａでトランスフェクションされた細胞が、少ない量のアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａタンパク質しか産生しないということを示す。図６５〜６７により、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞集合が、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされなかった細胞と比較して、カンプトテシン及びＴＮＦ-αに晒した後に、アポトーシスを引き起こしている細胞の割合が低いということが示される。こうして、本発明の一の実施態様は、細胞をアポトーシス特異的ｅＩＦ-５ＡのｓｉＲＮＡを含むベクターでトランスフェクションすることにより、細胞内におけるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を阻害することを提供する。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの好ましいｓｉＲＮＡは、配列番号３１、３１、３２、及び３３を有するｓｉＲＮＡを含む。さらなるｓｉＲＮＡは、列挙された配列に対し実質的な配列同一性(つまり、９０％の相同性)を有するｓｉＲＮＡ、又は高度にストリンジェントな条件下で、列挙された配列番号の配列にハイブリダイズする配列を有するｓｉＲＮＡを含む。実質的な配列同一性及び相同性により意味されることは、本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチドに関して上に記載される。「アポトーシス特異的ｅＩＦ-５ＡのｓｉＲＮＡ」という用語は、本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチドに関して上で記載される機能的バリアント又は誘導体を含む。
【００４６】
ｓｉＲＮＡ、並びにｓｉＲＮＡを含む発現コンストラクト／ベクターのデリバリーは、当業者に知られている。米国特許出願第2004/106567号及び第2004/0086884号(当該文献は本明細書にその全てを援用される)は、多くの発現コンストラクト／ベクター、並びにウイルスベクター、非ウイルスベクター、リポソームデリバリービヒクル、プラスミド注射システム、人工ウイルス外被、及びポリリジン複合体などを含むデリバリーメカニズムを提供した。
【００４７】
当業者は、アンチセンス・オリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡに関して発現コンストラクト／ベクターにおいて有用な制御配列を理解するであろう。例えば、制御配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、又はそれらの組合せであってもよい。
【００４８】
多くの重要なヒトの疾患は、アポトーシスの制御異常により引き起こされる。これらの異常は、細胞数の病的増加(例えば癌)、又は損傷を受けた細胞の消失(例えば変性疾患)のいずれかをもたらしうる。非限定的な例として、本発明の方法及び組成物は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を低減又は阻害することにより、以下のアポトーシスに関連する疾患及び障害：神経障害／神経変性障害(例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症(ルーゲーリッグ病)、自己免疫疾患(例えばリウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、多発性硬化症)、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(ＤＭＤ)、運動ニューロン疾患、虚血、心臓虚血、慢性心不全、脳卒中、乳児脊髄性筋萎縮症、心停止、腎不全、アトピー性皮膚炎、敗血症及び敗血症ショック、ＡＩＤＳ、肝炎、緑内障、糖尿病(１型及び２型)喘息、網膜色素変性症、骨粗鬆症、移植片拒絶、及び火傷を患う患者を予防又は治療するために使用されうる。
【００４９】
アポトーシスの制御異常により引き起こされる１のかかる疾患は、緑内障である。様々な当該組織におけるアポトーシスは、緑内障患者において失明をもたらす重要な要素である。緑内障は進行性の盲目もたらす視神経への損傷から生じる目の病気の群である。アポトーシスは、当外視神経の損傷の直接的な原因であると示された。
【００５０】
緑内障研究の分野における初期の仕事により、眼内圧力(ＩＯＰ)の増加が篩板(lamina cribosa)(孔の空いたコラーゲン製の接続組織)のレベルで軸索輸送の妨害を導き、それに続き網膜ガングリオン細胞の細胞死が生じるということが示唆された(Quigley and Anderson (1976) Invest. Ophthahnol. Vis. Sci., 15, 606-16; Minckler, Bunt,及び Klock, (1978) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 17, 33-50; Anderson及び Hendrickson, (1974) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci, 13, 771-83; Quigleyら、(1980) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 19, 505-17.)。緑内障の動物モデル及びヒトの死体組織の研究により、網膜ガングリオン細胞の細胞死がアポトーシスにより生じるということが示唆された(Garcia-Valenzuelaら, (1995) Exp. Eye Res., 01, 33-44; Quigleyら, (1995) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 36, 774-786; Monard, (1998) In: Haefliger IO, Flammer J (eds) Nitric Oxide and Endothelin in the Pathogenesis of Glaucoma, New York, NY, Lippincott-Raven, 213-220.)。増大されたＩＯＰの結果としての軸索輸送の妨害は、栄養要素の枯渇により網膜ガングリオン細胞に寄与しうる(Quigley, (1995) Aust NZJ Ophthalmol, 23(2), 85-91.)。緑内障を患った眼における視神経頭正常細胞(optic nerve head astrocyte)は、いくらかの神経毒性物質のレベルの増加をもたらすことも分かってきた。例えば、腫瘍壊死因子-α(ＴＮＦ-α)の産生増加(Yanら、(2000) Arch. Ophthalmol., 118, 666-673)、及び一酸化窒素合成(Neufeld ら、(1997) Arch. Ophthalmol., 115, 497-503)は、緑内障を患った眼における視神経頭において見つかった。さらに、活性化された網膜グリア細胞による誘導型一酸化窒素合成酵素(ｉＮＯＳ)及びＴＮＦ-αの発現増加は、遺伝性網膜疾患のラットモデルにおいて観察された(Cotinetら、(1997) Glia, 20, 59-69; de Kozakら, (1997) OcuL Immunol. Inflamm., 5, 85-94; Goureau ら、(1999) J. Neurochem, 72, 2506-2515.)。緑内障視神経頭において、過剰量の一酸化窒素は、網膜ガングリオン細胞の軸索変性に関与した(Arthur及び Neufeld, (1999) Sum Ophthalmol, 43 (Suppl 1), S129-S135)。最後に、虚血の模倣又は静圧の増加に応答した網膜グリア細胞によるＴＮＦ-αの産生の増加は、共培養された網膜ガングリオン細胞においてアポトーシスを誘導することが示された(Tezel及びWax、(2000)J. Neurosci,20(23), 8693-8700)。
【００５１】
アポトーシスによる変性からの網膜ガングリオン細胞の保護は、緑内障のため生じる盲目の見込みある新たな治療として研究されている。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、眼の疾患の動物モデルにおいて成功裏に使用されてきた。一過的な全体的な網膜虚血のモデルでは、カスパーゼ２の発現が虚血のあいだに増加し、特に網膜の内部神経及びガングリオン細胞層において特に増加した。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いてカスパーゼを抑制すると、組織病理学的異常の改善及び網膜電図により測定された機能的改善を導いた(Singhら、(2001) J. Neurochem., 77(2), 466-75)。別の研究により、視神経へのトランスフェクションの際に、網膜ガングリオン細胞が、アポトーシス促進性タンパク質Ｂａｘを上方制御し、そしてアポトーシスを引き起こすことが示された。Ｂａｘアンチセンス・オリゴヌクレオチドを、ラットの側頭上網膜(temporal superior retina)に繰り返し注射することは、Ｂａｘの局所発現を阻害し、そして視神経の相互作用に従い網膜ガングリオン細胞の生存数を増加させた(Isenmannら, (1999) Cell Death Differ. , 6(7). 673-82)。
【００５２】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドを、網膜ガングリオン細胞へとデリバリーすることは、リポソーム中にオリゴヌクレオチドを封入することにより改善される。リポソームは、次に不活性型の日本赤血球凝集性ウイルス(ＨＶＪ；センダイウイルス)の外被で被膜された。ＨＶＪリポソーム中に封入されたＦＩＴＣ標識アンチセンス・オリゴヌクレオチドをマウス中に静脈注射することは、ガングリオン層の４４％の細胞に高い蛍光をもたらし、この蛍光は３日間持続した。一方ＦＩＴＣ標識された裸のアンチセンス・オリゴヌクレオチドで注射されたものは、１日後に蛍光が消失した。(Hangaiら、(1998)Arch Ophthalmol, 116(7), 976.)。
【００５３】
本発明の１の方法は、眼の細胞及び組織、例えば非限定的に、星状細胞、網膜ガングリオン、網膜グリア細胞、及び篩板などにおけるアポトーシスを予防又は低減することに関する。緑内障における網膜ガングリオン細胞の細胞死は、アポトーシスにより生じ、そして失明をもたらす。こうして、網膜のガングリオン細胞においてアポトーシスを阻害又は低減する方法を提供すること、又はアポトーシスによる変性から網膜ガングリオン細胞を保護することは、緑内障のため生じる失明の予防のための新たな治療を提供する。当該方法は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を抑制してアポトーシスを低減することに関する。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａは、全てのアポトーシス過程を制御しうる強力な遺伝子である。こうして、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を阻害することにより視神経頭においてアポトーシスを制御することは、緑内障の治療をもたらす。
【００５４】
アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現抑制は、ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａのアンチセンス・オリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡを眼の細胞、例えば非限定的に篩板、星状細胞、網膜ガングリオン、又は網膜グリア細胞に投与することにより達成される。アンチセンス・オリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡは、上で定義されるとおりであり、つまり、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａポリペプチドの少なくとも１部をコードするヌクレオチド配列を有する。本発明の態様において有用である代表的なアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、配列番号２６又は２７を含み、或いは高ストリンジェントな条件下で配列番号２６又は２７に対する相補配列に結合し、そしてアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を阻害するオリゴヌクレオチドを含む。
【００５５】
本発明の別の実施態様は、篩板細胞、星状細胞、網膜ガングリオン細胞、又は網膜グリア細胞においてアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を抑制する方法を提供する。ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対し標的されたアンチセンス・オリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡ、例えば非限定的に配列番号２６及び２７は、篩板細胞、星状細胞、網膜ガングリオン細胞、又は網膜グリア細胞に投与される。細胞はヒト起源であってもよい。
【００５６】
アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａレベルが、虚血心臓組織において２個のサイトカイン(インターロイキン１-β(ＩＬ-β)及びインターロイキン１８(ＩＬ-１８)のレベルの上昇と相関することを本発明者は発見した。そうしてさらに、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａが、虚血心臓組織において存在するので、細胞死に関与するということが証明された。当該アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ／インターロイキンの相関は、非虚血心臓組織においては見られない。図５０Ａ-Ｆ、及び図５１を参照のこと。ＰＣＲ計測を用いて、様々な虚血性心臓組織(冠動脈バイパスグラフト及びバルブ(僧帽弁及び心房弁)置換患者由来)においてアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ、及び増殖ｅＩＦ-５Ａ(別のアイソフォームであるｅＩＦ-５Ａ２)、ＩＬ-１β、及びＩＬ-１８のレベルを計測し、そして比較された。
【００５７】
アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａが上記強力なインターロイキンに相関することにより、虚血における炎症及びアポトーシス経路は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａのレベルを制御することを介して制御されうるということがさらに示唆される。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａが免疫応答に関与するという更なる証拠が、ヒト末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)が通常低いレベルのｅＩＦ-５Ａを発現するが、Ｔリンパ球特異的刺激で刺激した際、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現が劇的に増加したという事実により示唆される(Bevecら、１９９４)。これにより、T細胞増殖及び／又は活性化におけるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの役割が示唆される。活性化T細胞は、様々なサイトカインを産生することができるので、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａが、サイトカインｍＲＮＡの核-細胞質シャトルとして必要とされうるということがありうる。上記論文の著者は、ＨＩＶ-１患者のＰＢＭＣにおいてｅＩＦ-５Ａのレベルの増加を発見し、ｅＩＦ-５Ａがこれらの細胞において十分なＨＩＶ複製に寄与しうる。なぜならｅＩＦ-５Ａは、ＨＩＶＲｅｖタンパク質に対する細胞結合因子であり、そしてＨＩＶ複製に必要とされると示されたからである(Ruhlら、1993)。
【００５８】
最近、ｅＩＦ-５Ａの発現が樹状細胞成熟のあいだに上昇するということが発見された(Kruseら、2000)。樹状細胞は、ヘルパー及びキラーＴ細胞を感作して、Ｔ細胞媒介性の免疫を誘導する抗原提示細胞である(Steinman、1991)。未成熟の樹状細胞は、Ｔ細胞を刺激する能力を欠き、そしてＴ細胞を活性化できる細胞へと成熟するために、適切な刺激(つまり、炎症性サイトカイン及び／又は微生物産物)を必要とする。デオキシハイプシン・シンターゼ、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａを活性化するために必要とされる酵素、の阻害剤は、ＣＤ８３表面発現を妨害することにより樹状細胞によるＴリンパ球活性化を阻害することが分かった(Kruseら、2000)。こうして、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａは、ＣＤ８３ｍＲＮＡの核-細胞質シャトルとして作用することにより、樹状細胞成熟を促進しうる。
【００５９】
免疫系におけるｅＩＦ-５Ａの役割に関するこれらの研究(Bevecら、1994；Kruseら、2000)の両方において、これらの著者達は、どちらのｅＩＦ-５Ａアイソフォームを試験したか明確化も同定もしておらず、また明確化又は同定をする理由を持っていなかった。上に記載したように、ヒトは、ｅＩＦ-５Ａの２つのアイソフォーム、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ(ｅＩＦ-５Ａ１)及び増殖ｅＩＦ-５Ａ(ｅＩＦ-５Ａ２)を有すると知られており、その両方ともが、別々の染色体上にコードされている。本発明者の発見前においては、これらのアイソフォームの両方が機能的に重複していると信じられていた。Bevecらにより記載されたオリゴヌクレオチドであって、刺激されたＰＢＭＣ中のｅＩＦ-５ＡのｍＲＮＡを検出するために使用されたオリゴヌクレオチドは、ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａと１００％の相同性を有し、そして当該研究は、増殖ｅＩＦ-５Ａのクローニングより前に行われている。同様に、Kruseらにより記載され、樹状細胞の成熟のあいだ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によりｅＩＦ-５Ａを検出するために使用されたプライマーは、ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対して１００％の相同性を有した。
【００６０】
本発明は、樹状細胞成熟及びＰＢＭＣ活性化の割合を制御するために、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を制御することに関し、これは次にＴ細胞媒介性免疫の割合を制御しうる。単球及びマクロファージは、免疫系において中枢である。なぜなら、それらは外来の進入物を認識することができ、そして当該外来侵入物により活性化／刺激されるからであり、そして残りの免疫系を変化させるサイトカインを産生できるからである。本発明の発明者は、単球が接着性マクロファージへと分化する際におけるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの役割を、Ｕ-９３７細胞系列を使用して研究した。なぜなら、Ｕ-９３７はｅＩＦ-５Ａ・ｍＲＮＡを発現すると知られているからである(Bevecら、1994)。Ｕ-９３７は、懸濁状態で成長し、そしてＰＭＡで刺激された際に接着性になり、マクロファージへと分化するヒト単球の細胞系列である。培地交換によりＰＭＡを取り除いたとき、細胞は、静止期になり、そしてサイトカインを産生することができる(Barrios-Rodilesら、J. Immunol., 163:963-969(1999))。一般的な炎症応答を誘導することが知られている多くの細菌の外膜上に見られる因子であるリポ多糖(ＬＰＳ)に応答して、当該マクロファージはＴＮＦ-α及びＩＬ-１β(Barrios-Rodilesら、1999)を産生する。幹細胞分化及びその結果生じたサイトカインのチャートを示す図７８を参照のこと。Ｕ９３７細胞はまた、ＬＰＳ刺激の後にＩＬ-６及びＩＬ-１０を産生する (Izeboudら, J. Receptor & Signal Transduction Research, 19(1-4):191-202. (1999))。
【００６１】
Ｕ-９３７細胞を用いて、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａが、単球分化及びＴＮＦ-α分泌のあいだ上方制御されることが示された。図７７を参照のこと。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａタンパク質発現は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡで抑制された。対照ｓｉＲＮＡ及びアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡで処理された細胞は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ、トール様受容体(toll-like receptor 4)(ＴＬＲ４)、腫瘍壊死因子受容体(ＴＮＦ-Ｒ１)、及びインターフェロンγ受容体(ＩＦＮγ-Ｒα)の発現についてウエスタンブロットすることにより比較された。サイトカイン、ＴＮＦ、インターロイキン１β(ＩＬ-１β)、ＩＬ-６、及びＩＬ-８をＥＬＩＳＡにより、そして液相電気化学発光(ＥＣＬ)により定量した。
【００６２】
アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでの処理が、対照ｓｉＲＮＡで処理された細胞に対して、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａタンパク質の発現を８０％超の分だけ特異的に下方制御した。ＰＭＡ、ＬＰＳ、及びＩＦＮ-γ処理は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａタンパク質発現を誘導した。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ発現を低下された細胞はまた、ＴＬＲ４、ＴＮＦ-Ｒ１、及びＩＦＮγ-Ｒαのタンパク質発現の低下を示した。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ発現が低下した細胞において、ＬＰＳ誘導性ＴＮＦ発現は、３ｈで低下され、そしてＬＰＳ誘導性のＩＬ-１β及びＩＬ-８産生は２４時間で低下した。これらの研究によりアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａが受容体(ＴＬＲ４、ＴＮＦ-Ｒ１、及びＩＦＮγ-Ｒα)及びサイトカイン(ＴＮＦα、ＩＬ-１β、及びＩＬ-８)を含む多くの主要なサイトカインシグナル分子の転写後調節に関与しうることが示唆される。
【００６３】
従って、本発明の１の態様は、サイトカインの産生を阻害又は低減するために、マクロファージの成熟を阻害又は遅延させる方法を提供する。当該方法は、ＤＨＳ又はアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を低減できる薬剤を提供することに関する。ＤＨＳの発現を低下又は削除することにより、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ活性化が低減されるか又は削除される。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａが単球分化及びＴＮＦ-α分泌のあいだに上方制御されるので、これらの出来事が生じるために必須であるということが信じられている。こうして、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの活性化を低減又は取り除くことにより、或いはアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ発現を直接低減又は削除することにより、単球分化及びＴＮＦ-α分泌は低減されうるか又は削除されうる。ＤＨＳ又はアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を低下できる任意の薬剤が、使用されてもよく、そして非限定的に、好ましくは、本明細書に記載されるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するアンチセンス・オリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡを含み、そして当該アンチセンス・オリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡである。
【００６４】
本発明の発明者により、特定の刺激に応答してサイトカインを予想通りに産生すると知られている細胞系列を用いて、ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてサイトカインｍＲＮＡの核-細胞質シャトルとして作用することにより、サイトカインの翻訳を促進する能力について研究された。いくつかの最近の研究により、ヒト肝臓細胞系列が、他のサイトカインの産生を誘導することによりサイトカイン刺激に応答できるということが発見された。ＨｅｐＧ２は、サイトカインに対して感受性があると分かっているよく特徴付けられたヒト肝臓細胞癌細胞である。ＩＬ-βに応答して、ＨｅｐＧ２細胞は、即座にＴＮＦ-αｍＲＮＡ及びタンパク質を、用量依存的様式で産生する(Fredeら, 1996; Rowellら, 1997; Wordemannら, 1998)。こうして、ＨｅｐＧ２細胞は、ＴＮＦ-α産生の制御を研究するモデルシステムとして使用された。本発明の発明者は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドでトランスフェクションされた後、ＨｅｐＧ２細胞におけるヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ発現の抑制により、当該細胞がより少ない量のＴＮＦ-αしか産生しないということを示した。
【００６５】
こうして、本発明の一の実施態様は、サイトカインのレベルを低減する方法を提供する。当該方法は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を低減できる薬剤を投与することに関する。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を低減することは、サイトカインの発現を低減し、そうして細胞により産生される減少した量のサイトカインを導く。当該サイトカインは、好ましくは非限定的にＩＬ-１、ＩＬ-１８、ＩＬ-６、及びＴＮＦ-αを含む炎症性サイトカインである。
【００６６】
アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を低減するために適している薬剤は、上で記載されるようにアンチセンス・オリゴヌクレオチドを含む。ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの典型的なアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、配列番号３５、３７、及び３９からなる群から選ばれるか、又は高度にストリンジェントな条件下で、配列番号３５、３７、及び３９からなる群から選ばれる配列にハイブリダイズするアンチセンスヌクレオチドである。
【００６７】
別の適切な薬剤は、上で記載されるようにヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ-５ＡのｓｉＲＮＡを含んでもよい。典型的なｓｉＲＮＡは、配列番号３０、３１、３２、及び３３からなる群から選ばれる配列を有するか、又は高度にストリンジェントな条件下で、配列番号３０、３１、３２、及び３３からなる群から選ばれる配列にハイブリダイズするｓｉＲＮＡである。図６５〜６７により、ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞は、カンプトテシン及びＴＮＦ-αに晒された後に、アポトーシスを引き起こす細胞の割合が低いということが示される。
【００６８】
本発明は、ｐ５３の発現を低減させる方法にも関する。当該方法は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を低下できる薬剤、例えば、アンチセンス・オリゴヌクレオチド又は上記ｓｉＲＮＡを投与することに関する。図５２及び実施例１０に示されるようにアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現低下は、ｐ５３の発現を低下させる。
【００６９】
本発明は、Ｂｃｌ-２の発現を増加させる方法にも関する。当該方法は、ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を低下できる薬剤を投与することを含む。好ましい薬剤は、上記アンチセンス・オリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡを含む。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を低減することは、図６３及び実施例１３に示されるように、Ｂｃｌ-２の発現を増加させる。図６３により、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞が、少ない量のアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａタンパク質しか産生せず、そしてより多くのＢｃｌ-２を産生することを示す。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ発現は、Ｂｃｌ-２発現と相関する。
【００７０】
本発明はまた、ＴＮＦ-αのレベルの低下を必要とする患者において、ＴＮＦ-αのレベルを低下させる方法であって、当該患者に上で記載されるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａのアンチセンス・オリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡのいずれかを投与することを含む。図６９及び実施例１４に示されるように、本発明のアンチセンス・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａオリゴヌクレオチドでトランスフェクションされた細胞は、かかるアンチセンス・オリゴヌクレオチドでトランスフェクションされていない細胞に比べて、ＩＦＮ-γを誘導された後に、少ない量のＴＮＦ-αしか産生しなかった。
【００７１】
さらに、本発明は、ＩＬ-１、ＴＮＦ-α、ＩＬ-６、又はＩＬ-１８の増加レベルにより特徴付けられる生理学的条件を治療する方法であって、当該病理状態を有する哺乳動物に、上で記載されるようにアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を低下する薬剤(アンチセンス・オリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡ)を投与することを含む。ＩＬ-１、ＴＮＦ-α、又はＩＬ-６レベルにより特徴付けられる既知の病理学的条件は、非限定的に、リューマチ様関節炎及び骨関節炎、喘息、アレルギー、動脈炎、クローン病、炎症性腸疾患(ｉｂｄ)、潰瘍性大腸炎、冠状動脈性心臓病、嚢胞性線維症、糖尿病、ループス、多発性硬化症、グレーブス病、歯周病、緑内障及び黄斑変性症、眼表面疾患、例えば表皮角層異常、組織虚血-心臓、腎臓、再還流損傷、敗血症、多発性骨髄腫、組織移植拒絶、乾癬、及び湿疹を含む。例えば、炎症性腸疾患は、一部において、腸管上皮細胞により放出される炎症性サイトカイン及びケモカインにより引き起こされる組織損傷により特徴付けられる。
【００７２】
インターフェロンγ(ＩＦＮ-γ)は、ナチュラルキラー細胞(ＮＫ)及びＴリンパ球により産生されるサイトカインであり、サイトカインネットワークにおいて中心的役割を果たす。ＩＦＮ-γは、感受性細胞において、抗ウイルス、抗増殖、及び免疫調節活性を含む様々な応答を誘導する。ＩＦＮ-γの、その受容体(ＩＦＮ-γＲ)への結合は、ヤヌスキナーゼＪＡＫ-１及びＪＡＫ-２の自己リン酸化を導く。チロシン残基１０２２及び１０２３におけるＪＡＫ-１のリン酸化は、触媒作用の活性化に関与すると信じられている(Liuら, Curr. Biol. (7): 817-826 (1997))。ＩＦＮ-γＲは、ＩＦＮ-γＲαとＩＦＮ-γＲβと名付けられる少なくとも２つの鎖から構成される。受容体がそのリガンドであるＩＦＮ-γに結合すると、ＪＡＫ１の自己リン酸化がもたらされ、それはシグナル伝達及び翻訳活性化因子(ＳＴＡＴ)転写因子のリクルート及びチロシンリン酸化をもたらす。ＳＴＡＴ転写因子のリン酸化は、二量化及びＳＴＡＴの核移行を導き、ここで次にＳＴＡＴは標的プロモーターの上流エレメントに結合して転写を調節する。ＪＡＫ-ＳＴＡＴ経路は、抗炎症性治療においての良好な標的を表す。なぜなら、ＪＡＫ-ＳＴＡＴシグナル伝達は、サイトカイン誘導性の炎症性応答を低減することができ、そしてＩＦＮ-γの不適切な発現が自己免疫疾患に寄与すると考えられるからである。
【００７３】
通常の生理条件下における腸上皮細胞は、リポ多糖(ＬＰＳ)を含む通常の腸内フローラの生産物に対し応答性が低い。ＩＦＮ-γは、腸上皮細胞をＬＰＳに対して反応性にすることができる。なぜなら、ＩＦＮ-γはＩＬ-８及びＴＮＦ-αなどのサイトカインの産生を導くからである。ＩＦＮγが腸上皮細胞にＬＰＳ感受性を与えることができる１のメカニズムは、ＭＤ-２及びＴｏｌｌ受容体４(ＴＬＲ４)の発現を増加させることによりＬＰＳ取り込みを増加させることである。当該２個のタンパク質は、ＬＰＳの認識に必要とされる(Suzukiら、Infection and Immunity; (71): 3503-351 1 (2003))。Ｔｈ１サイトカイン、例えばＩＦＮ-γの産生の増加は、腸上皮細胞の共生細菌の微生物生産物に対する反応性の変化をもたらし、炎症性腸疾患を特徴付ける慢性炎症に寄与すると考えられる。
【００７４】
炎症に関与する別の分子は、ＮＦκ-β(ＮＦκ-ベータ又はＮＦκＢとも記載される)である。ＮＦκβは、その活性化が組織炎症を導くＣＯＸ-２の発現を誘導するので、炎症についての主要な細胞シグナル伝達分子である。炎症部位でのプロスタグランジンの大量産生に関与すると信じられているＣＯＸ-２をコードする遺伝子の発現は、ＮＦκＢにより転写について制御されている。ＮＦκＢは、細胞の細胞質中に存在し、そしてそのインヒビターに結合されている。傷害性及び炎症性刺激は、当該インヒビターからのＮＦκＢの放出を刺激する。ＮＦκＢは、核内へ移行し、そしてＣＯＸ-２発現に関与する遺伝子を活性化する。こうして、ＮＦκ-βのレベルを低減することにより、炎症は低減されうる。
【００７５】
本発明の発明者による１の実験において、ヒト上皮細胞(ＨＴ-２９細胞)を、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａについて標的化されたｓｉＲＮＡで処理した。ＴＮＦ又はインターフェロンγ及びＬＰＳを加えることにより、炎症を１時間ＮＦκＢにより誘導させた。当該実験の結果により、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現をｓｉＲＮＡで阻害することが、インターフェロンγ及びＬＰＳにより活性化されたＮＦκＢのレベルの低下をもたらすということが示された。図９０を参照のこと。
【００７６】
本発明の発明者により、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡが、ＨＴ-２９細胞において、ＩＦＮ-γ刺激に応答したＴＬＲ４(図１２３を参照のこと)及びＩＦＮ-γＲαタンパク質(図１２２を参照のこと)の上方制御を阻害するということが示された。図１２１により、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡが、内在性アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を抑制することが示される。図１２４により、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ発現のｓｉＲＮＡ媒介性の抑制が、ＩＦＮ-γ処理に応答したＳＴＡＴ１α及びＪＡＫ１のリン酸化の低下をもたらすということが示される。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａを用いてＩＦＮ-γ-刺激によるＴＬＲ４の上方制御を低下させることは、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡがＮＦκＢ・ｐ５０の活性化及びＨＴ-２９細胞におけるＴＮＦ-α産生を低減することを示す以前のデーターと一致する。当該データーは、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａが、ＪＡＫ-ＳＴＡＴ経路を介してＩＦＮ-γシグナル伝達を制御するという理論と一致する。その結果、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ発現の妨害は、ＩＦＮγ刺激性のＴＬＲ４の上方制御を妨げ(ＴＬＲ４は、ＬＰＳを検出するために大腸上皮細胞に必要とされる)、そして当該細胞はこうして、ＬＰＳに対して低反応性のままとなる。結果として、ＮＦκＢｐ５０は、ＴＬＲ４によるＬＰＳへの結合に応答して活性化されることはなく、そしてサイトカイン産生(ＴＮＦ-α及びＩＬ-８)は阻害される。
【００７７】
アポトーシス特異的ｅＩＦ-５ＡがＩＦＮ-γシグナル伝達を調節するという考えをさらに支持するものとして、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡが劇的にＳＴＡＴ１α及びＪＡＫ１のリン酸化、つまりＩＦＮ-γシグナルの導入における２個の重要なステップ、を低減するという発見が存在する。ＩＦＮ-γで刺激された際にＩＦＮ-γ受容体αの上方制御の減少が観察されるが、ＩＦＮ-γの量は、対照ｓｉＲＮＡで処理されていようと、又はアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡで処理されていようと、ＩＦＮ-γ処理前と同じであるようだ。ＩＦＮ-γＲβ鎖が、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡにより影響されることはおこりうることではあるが、当該データーにより、ＩＦＮ-γ受容体に結合しているＩＦＮ-γは、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡにより影響されないということが示唆される。これにより、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａが、ＪＡＫ１、又はＪＡＫ１発現又はリン酸化を制御するタンパク質の転写後調節に必要とされうることが示唆される。ＪＡＫ-ＳＴＡＴ経路の適切な機能、及びそれによるＩＦＮ-γシグナル伝達は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａを必要とすることは明らかである。
【００７８】
対照ｓｉＲＮＡが、ＨＴ２９細胞において、ＴＬＲ３を介した二本鎖ＲＮＡの検出の結果であると考えられる応答を誘発できることに気付くことは重要である。具体的に、対照ｓｉＲＮＡで処理されたＨＴ２９細胞は、トランスフェクションされていない細胞に比べて、より多くのＴＮＦ-α及びＩＬ-８を産生した。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡは、この応答を示さなかった。また、ＩＦＮ-γで処理されずｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞において、Ｊａｋ１はリン酸化された(図１２４を参照のこと)。このことは、ＪＡＫ-ＳＴＡＴ経路の活性化を反映する可能性があり、ＴＬＲ３による二本鎖ＲＮＡ認識から生じるインターフェロン応答に関与する。当該データーは、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡを処理された細胞において、ＩＦＮ-ガンマ処理がない場合でさえ、ＪＡＫ１のリン酸化を示さず、このことにより、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡが、ＪＡＫ-ＳＴＡＴ経路を介して生じる二本鎖ＲＮＡの検出により引き起こされるインターフェロン応答を阻害することができるという可能性が示唆される。
【００７９】
本発明の発明者は、ｓｉＲＮＡを用いてＨＴ-２９細胞においてアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を阻害して、インターフェロンγ(ＩＦＮ-γ)のシグナル伝達への影響を試験した。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡは、ＩＦＮ-γ及びＬＰＳに応答してＴＮＦ-αを分泌するＨＴ-２９細胞の能力を９０％超低減する。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡは、ＩＦＮ-γに応答してＩＬ-８の分泌を阻害したが、ＴＮＦ-αには応答しなかった。同様に、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡは、ＩＦＮ-γ特異的様式でＮＦ-κＢ・ｐ５０の活性化を低減することが発見され、そしてＩＦＮ-γに刺激されたＴＬＲ４及びＴＮＦＲ１の発現を低減する。さらなる関心事は、細胞がＩＦＮ-γで刺激され、そしてアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡが当該応答を有意に低減できる場合、モックトランスフェクションされた対照に比べて、対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクションすることが有意にＴＮＦ-αの分泌を増加させたという発見である。これらの結果により、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａは、ＩＦＮ-γ-シグナル伝達経路の転写後レギュレーターであるかもしれず、そして二本鎖ＲＮＡに対する細胞応答に関与しうる。ｓｉＲＮＡによるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの阻害は、ＩＦＮγシグナル伝達と干渉し、そしてＴＬＲ４及びＴＮＦＲ１それぞれを介したＬＰＳ及びＴＮＦ-αに応答する腸上皮細胞の能力を低減する。こうして、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの阻害は、腸上皮細胞への直接的な免疫調節効果を有する様に思え、そして炎症性腸疾患の治療標的でありうる。
【００８０】
従って、本発明の１の実施態様は、内在性アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を阻害又は低減することにより炎症性応答を阻害又は低減する方法を提供する。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を抑制することは、前に記載されるように、好ましくは本発明のアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａのアンチセンスポリヌクレオチド又はｓｉＲＮＡを使用することにより行われる。本発明の発明者により、内在性アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現低下が生じたとき、細胞への様々な効果が生じる。これらの効果は、様々な生体分子(例えば、ｐ５３、炎症性サイトカイン(例えば図１１２、１１３、１１４)；活性ＮＦκβ；ＴＬＲ４(図１０９及び１２３を参照のこと)；ＴＮＦＲ-１(図１１１を参照のこと)；ＩＦＮ-γＲα(図１２２を参照のこと)、及びｉＮＯＳ)の低下、並びにＴＮＦ-α産生の低下及びＳＴＡＴ１α及びＪＡＫ１のリン酸化の低下を含み、これらは、炎症カスケードに関与した。これらの生体分子のレベルの低下、又は炎症カスケードに必要とされるこれらの生体分子の活性化の低下は、炎症の低下を引き起こす。炎症カスケードに進行する細胞の能力の低下は、慢性炎症、例えば、非限定的に、炎症性腸疾患、関節炎、クローン病、及びループスなどに関連する疾患／障害を治療するのに有用であることが証明されうる。
【００８１】
従って、本発明は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するアンチセンス又はｓｉＲＮＡを用いてアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を阻害又は抑制することにより、ｐ５３のレベルを低減し、炎症性サイトカインを低減し(例えば、図１１２、１１３、１１４を参照のこと)；活性ＮＦκβのレベル；ＴＬＲ４；ＴＮＦＲ-１,ＩＦＮ-γＲα、ｉＮＯＳ、又はＴＮＦ-αのレベルを低下させ、そしてＳＴＡＴ１及びＪＡＫ１のリン酸化を低減させる方法を提供する。
【００８２】
本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて哺乳動物肺細胞にｓｉＲＮＡをデリバリーする方法を提供する。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡは、(水と混合されて)マウスに鼻腔内投与された。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡの投与の２４時間後、リポ多糖をマウスに鼻腔内投与した。ＬＰＳは、細菌の巨大分子細胞表面抗原であり、ｉｎ ｖｉｖｏで投与されると、炎症反応のネットワークを引き起こす。ＬＰＳを鼻腔内でデリバリーすることは、肺における好中球数の増加を引き起こす。初期事象のうちの一つは、受容体媒介性のプロセスを介した単核貪食細胞の活性化であり、多くのサイトカイン、例えばＴＮＦ-αの放出を導く。次に、ＴＮＦ-αにより誘導される好中球の上皮細胞への接着の増加は、肺空間において過剰な浸潤を導く。
【００８３】
さらに２４時間後、右の肺を取り出し、そしてミエロペルオキシダーゼを計測した。ミエロペルオキシダーゼ(ＭＰＯ)は、好中球において見られるリソソームの酵素である。ＭＰＯは、水素ペルオキシダーゼを使用して、塩化物イオンを次亜塩素酸に変換する。当該次亜塩素酸は、細菌と反応し、そして細菌を破壊する。ミエロペルオキシダーゼは、動脈が炎症を起こした際にも産生される。こうして、ミエロペルオキシダーゼが好中球及び炎症反応に付随しているということは明らかである。マウスアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡは、対照ｓｉＲＮＡと比較すると、９０％近くのミエロペルオキシダーゼを抑制した。当該研究の結果により、ｓｉＲＮＡは哺乳動物の肺組織へとうまくｉｎ ｖｉｖｏでデリバリーされ、そしてアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡが、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を阻害して、ミエロペルオキシダーゼの産生の抑制をもたらす。
【００８４】
本発明の発明者により、ｓｉＲＮＡを用いてアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａを下方制御することは、ＬＰＳ(ＬＰＳは通常ミエロペルオキシダーゼの産生に関与する炎症反応をもたらす)に晒した後の肺組織において、ミエロペルオキシダーゼのレベルを低減し、そうして炎症反応を低減又は抑制する。従って、本発明の一の実施態様は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡをデリバリーしてアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を阻害又は低減することにより、肺組織においてＭＰＯのレベルを低減する方法を提供する。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現の低下は、ＭＰＯの低下を導く。ｓｉＲＮＡアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａのデリバリーは、鼻腔内デリバリーであってもよい。
【００８５】
ＭＰＯレベルは、心臓発作及び自己免疫障害により引き起こされるサイトカイン誘導性炎症の決定的な判断材料である。炎症応答を低減又は抑制する能力は、自己免疫障害などの炎症関連障害を治療するのに有用でありうる。さらに、ＭＰＯを低減する能力は、虚血事象及び心臓発作から患者を保護する手段でありうる。
【００８６】
図１１６は、マウスにおいて行われる実験の結果を示す。ここで、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５ＡのｓｉＲＮＡは、マウス血清中においてＴＮＦ-αのレベル低減することができる。ｓｉＲＮＡは、マウス尾静脈に静脈内デリバリーされる。ＴＮＦαの血清レベルをＬＰＳの投与後９０分で計測し、そしてアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡを静脈内トランスフェクションをした４８時間後に計測した。図１１７はマウスにおいて行われた実験の結果を示す。ここで、ｓｉＲＮＡは、(上で記載されるように)経鼻デリバリーされた。ＴＮＦ-αのトータルレベルは、マウス血清中で計測された。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡは、ＴＮＦα量を低下させた。従って、本発明の１の実施態様は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡをデリバリーして、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を阻害又は低減することにより、血清中のＴＮＦ-αのレベルを低減させる方法を提供する。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現低下は血清中におけるＴＮＦ-αの低下を導く。
【００８７】
図１１８は、マクロファージ炎症性タンパク質１α(ＭＩＰ-１α)のレベルが低減したことを示す。ＭＩＰ-１αは、サイトカインのＲＡＮＴＥＳ(regulated on activation normal T cell expressed and secreted)ファミリーに属し、そして受容体ＣＣＲ１、ＣＣＲ５、及びＣＣＲ９に結合する低分子量ケモカインである。従って、本発明の一の実施態様は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡをデリバリーして、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を阻害又は低減することにより、肺組織においてＭＩＰ-１αのレベルを低減する方法を提供する。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現低下は、ＭＩＰ-１αの低下を導く。
【００８８】
図１１９は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡで(鼻腔内、経鼻腔デリバリーで)処理した実験の結果を示す。この結果により、ＬＰＳで処理後９０分及びｓｉＲＮＡで治療後４８時間において、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡで処理されなかったマウス肺に比べて、マウス肺において計測されたＩＬ-１αのレベルの顕著な低下があったことが示される。従って、本発明の一の実施態様は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡをデリバリーして、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を阻害又は低減することにより肺組織においてＩＬ-１αのレベルを低減する方法を提供する。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現低下は、ＩＬ-１αの低下を導く。
【００８９】
こうして、本発明により、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａと免疫反応とのあいだの相関が示され、そしてアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡが、ミエロペルオキシダーゼの産生(つまり、炎症応答の一部)を抑制することが示された。本発明の発明者は、簡単な鼻腔内デリバリーにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて肺組織へとｓｉＲＮＡをデリバリーすることができるということを示した。ｓｉＲＮＡは水中に混合されただけであった。このことは、他の当業者がｓｉＲＮＡについて許容されるデリバリー方法を設計することを試みてきたことから、大きなブレークスルーでありそして発見である。
【００９０】
別の実験では、マウスを、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡで同様に処理した。炎症及び免疫系反応を誘導するためにリポ多糖(ＬＰＳ)をマウスに投与した。制御された条件下において、ＬＰＳは、胸腺内で作成されて感染を防ぐ重要な免疫系前駆細胞である胸腺細胞を殺す。しかしながら、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡを使用することにより、ＬＰＳの存在下においても胸腺細胞の約９０％の生存率が可能になる。胸腺細胞が破壊されると、胸腺細胞がＴ細胞の前駆体であることから、体の自然免疫がＴ細胞を産生することができないことにより危険に晒され、そうして細菌感染などを撃退することができなくなる。こうして、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡは、体の自然免疫防御システムを破壊することなく、(第一実施例においてＭＰＯのレベルの低下により示されるように)炎症を低減させるために使用されうる。
【００９１】
本発明のアンチセンス核酸及びｓｉＲＮＡは、予防又は治療の目的で動物において使用される場合、医薬として許容される担体を含む組成物の形態で投与されよう。適切な医薬として許容される担体は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、並びにそれらの組合せのうちの１以上を含む。医薬として許容される担体は、結合タンパク質の有効期間又は有効性を高める少量の補助物質、例えば湿潤剤又は乳濁剤、保存剤又は緩衝剤をさらに含むことがある。注射液組成物は、当業者に周知であるが、哺乳動物に投与した後に活性成分の迅速な放出、持続性の放出、又は遅延放出を提供するように剤形されうる。
【００９２】
本発明の組成物は、様々な形態でありうる。これらの組成物は、例えば、固体、半固体、及び液体投与形態、例えば錠剤、ピル、粉末、溶液、分散剤、又は懸濁液、リポソーム、坐剤、注射剤、及び輸液溶液を含む。好ましい形態は、予定される投与様式及び治療適用に左右される。
【００９３】
かかる組成物は、医薬の分野において周知の方法で製造されうる。当該組成物の製造にあたり、活性成分は、通常、担体と混合されるか、又は担体により希釈され、及び／又は担体中に封入され、これは例えば、カプセル、サチェット、ペーパー、又は他の容器の形態でありうる。担体が希釈剤として働く場合、当該担体は、固体、半固体、又は液体の物質であってもよく、活性成分のビヒクル、賦形剤、又は溶媒として働く。こうして、組成物は、錠剤、ロゼンジ、サチェット、カチェット、エリクシル、懸濁液、(固体又は液体溶媒としての)エアロゾル、例えば最大１０重量％の活性化合物を含む軟膏、ソフト及びハードゼラチンカプセル、坐剤、注射液、懸濁液、滅菌パッケージ粉末、及び局所用パッチとしての形態であってもよい。
【００９４】
本発明を一般的に記載してきたが、本発明と同じものが、例示の方法により提供される以下の実施例を参照して容易に理解されるであろう。実施例は、本発明の理解を助けるために記載されているが、その範囲をどのようにも制限することを意図しないし、そして制限するように解釈すべきではない。当該実施例は、慣用方法の詳細な記載を含まない。その様な方法は、当業者に周知であり、多くの刊行物において記載される。慣用される方法の詳細な記載、例えばベクター及びプラスミドの構築において使用される方法、ポリペプチドをコードする核酸をかかるベクター及びプラスミドへ挿入する方法、プラスミドを宿主細胞へと導入する方法、遺伝子及び遺伝子産物の発現及び決定は、多くの刊行物、例えばSambrook,J.ら、(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第二版, Cold Spring Harbor Laboratory Pressから得ることができる。本明細書において言及された全ての参考文献は、その全てを援用される。
【実施例】
【００９５】
実施例１
ＤＮＡラダー化によるラット黄体のアポトーシスの可視化
アポトーシスの程度をＤＮＡラダー化により測定した。ゲノムＤＮＡを分散された黄体細胞から、又は切除した黄体組織から、QIAamp DNA Blood Kit(Qiagen)を使用して、製品説明書に従って単離した。ＰＧＦ-２αで処理することによりアポトーシスを誘導する前、アポトーシスの誘導後１時間、及び２４時間で、黄体組織を切除した。５００ｎｇのＤＮＡを、０.２μＣｉ[α-32Ｐ]ｄＣＴＰ、１ｍＭトリス、０.５ｍＭ・ＥＤＴＡ、３ユニットのクレノー酵素、及び０.２ｐＭづつのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰと室温で３０分インキュベーションすることにより、単離されたＤＮＡを末端標識した。取り込まれていないヌクレオチドを、Sambrookらに従ってサンプルを１ｍｌのSepadex G50カラムに通すことにより取り除いた。サンプルを次にトリス-酢酸-ＥＤＴＡ(１.８％)ゲル電気泳動により分離した。ゲルを３０分間、室温にて吸引下で乾燥して、そして-８０℃で２４時間Ｘ線フイルムに露光した。
【００９６】
１の実験では、過排卵処理されたラット黄体におけるアポトーシスの程度を、ＰＧＦ-２αを注射した０、１、又は２４時間後で試験した。０時間の対照において、卵巣は、ＰＧＦ-２α注射することなく取り出された。アポトーシスに関連するヌクレアーゼ活性を反映する低分子量のＤＮＡ断片のラダーは、ＰＧＦ-２αで処理する前に切除された対照の黄体組織において明確ではなかったが、アポトーシスの誘導後１時間内に認められるようになり、そしてアポトーシスの誘導後２４時間でより強調される。これらは図１６に示される。この図では、上のパネルが、32Ｐ-ｄＣＴＰ-標識されたラット黄体アポトーシス特異的ＤＨＳのｃＤＮＡの３’非翻訳領域でプローブされたノーザン・ブロットのオートラジオグラフィーである。下のパネルは、全てのＲＮＡを臭化エチジウム染色したゲルである。各レーンは、１０μｇのＲＮＡを含む。このデーターにより、ｅＩＦ-５Ａ転写産物が、血清の使用を止めた後に下方制御されるということを示す。
【００９７】
別の実施態様では、対応する対照動物は、ＰＧＦ-２αの代わりに生理食塩水で処理された。生理食塩水又はＰＧＦ-２αで処理後１５分で、黄体を動物から取り出した。ゲノムＤＮＡを、動物から組織を取り出した後３時間及び５時間で、黄体から単離した。ＤＮＡラダー及び増大された末端標識されたゲノムＤＮＡは、ＰＧＦ-２α処理された動物から組織を取り出した後６時間で明確であったが、組織から取り出した３時間後では、明らかではなかった。図１７を参照のこと。アポトーシスを反映するＤＮＡラダーはまた、黄体をＰＧＦ-２αで処理後１５分で切除し、そしてＥＢＳＳ(Gibco)中のin vitro条件下で６時間維持した時にも明らかである。アポトーシスと関連するヌクレアーゼ活性はまた、ゲノムＤＮＡの末端標識が過度に多いことからも明らかである。
【００９８】
別の実験では、５００μｇのＰＧＦ-２αで皮下注射することにより、過排卵を誘導した。対照のラットを、等量の生理食塩水溶液で処理した。１５〜３０分後、卵巣を取り出し、そしてコラゲナーゼで細分化した。ＰＧＦ-２αで処理されたラット由来の分散された細胞を、１０ｍｍグルタミン+１０ｍｍスペルミジンで１時間インキュベーションし、そしてスペルミジンを含まない１０ｍｍグルタミンでさらに５時間インキュベーションするか(レーン２)、又は１０ｍｍグルタミン+１０ｍｍスペルミジンで１時間インキュベーションし、そしてさらに１０ｍｍグルタミン+１ｍｍスペルミジンで５時間インキュベーションした(レーン３)。生理食塩水で処置されたラット由来の対照細胞を、コラゲナーゼで分散させ、そして１時間インキュベーションし、さらに５時間グルタミンのみの中でインキュベーションした(レーン１)。各サンプル由来の５００ナノグラムのＤＮＡを、クレノー酵素を使用して[α-32Ｐ]-ｄＣＴＰで標識し、１.８％のアガロースゲルで分離して、フイルムに２４時間露光した。結果を図１８に示した。
【００９９】
さらに別の実施態様では、過排卵処理されたラットを、５００μｇのＰＧＦ-２αを皮下注射する２４、１２、及び２時間前に、０.３３３ｍｇ/１００ｇ体重の等しい投与量で３回デリバリーして、１００ｍｇ/１００体重ｇのスペルミジンを皮下に注射した。対照ラットを、３のセット：注射なし；スペルミジンを３回注射するが、ＰＧＦ-２αの注射なし；及びＰＧＦ-２α処理前に同じ量の生理食塩水の３回注射する群に分けた。プロスタグランジン処理後１時間３５分で、又は３時間４５分で卵巣をラットから取り出し、そしてＤＮＡの単離に使用した。各サンプル由来のＤＮＡ５００ｎｇを、クレノー酵素を使用して[α-32Ｐ]-ｄＣＴＰで標識し、１.８％アガロースゲル上で分離し、そしてフィルムに２４時間露光した。レーン１、注射なし(レーン３〜５と同じ時に動物を屠殺した)；レーン２、スペルミジンで３回注射(レーン３〜５と同じ時に動物を屠殺した)；レーン３、生理食塩水の３回注射の後にＰＧＦ-２αを注射(動物をＰＧＦ-２αで処理後１時間３５分で屠殺した)；レーン４、スペルミジンの３回注射の後にＰＧＦ２αを注射(ＰＧＦ-２αで処理後１時間３５分で動物を屠殺した)；レーン５、スペルミジンの３回注射の後にＰＧＦ２-αで注射(動物をＰＧＦ-２αで処理後１時間３５分で屠殺した)；レーン６、スペルミジンの３回注射の後にＰＧＦ-２αを注射(動物をＰＧＦ-２αで処理後３時間４５分で屠殺した)；レーン７、スペルミジンの３回注射の後にＰＧＦ-２αを注射(動物をＰＧＦ-２αで処理後３時間４５分で屠殺した)。結果を図１９に示す。
【０１００】
ＲＮＡ単離
ＰＧＦ-２αでアポトーシスを誘導した後、様々な時間でラットから取り出した黄体から全量ＲＮＡを単離した。簡潔に記すと、組織(５ｇ)を液体窒素中で粉末にした。粉末は、３０ｍｌのグアニジウム緩衝液(４Ｍグアニジウム・イソチオシアネート、２.５ｍＭ・ＮａＯＡｃ、ｐＨ８.５、０.８％β-メルカプトエタノール)と混合した。混合体をミラクロス(Miracloth)の４層を通してろ過し、そして４℃１００００ｇで３０分間遠心した。上清を次に、１１２００ｇで２０時間、塩化セシウム密度勾配遠心にかけた。ペレット化されたＲＮＡを７５％エタノールで洗浄し、６００ｍｌのＤＥＰＣ処理水中に再懸濁し、そしてＲＮＡを-７０℃にて１.５ｍｌの９５％エタノール及び６０ｍｌの３Ｍ・ＮａＯＡｃで沈殿させた。
【０１０１】
ゲノムＤＮＡ単離及びラダー化
製品説明書に従ってQIAamp DNA Blood Kit (Qiagen)を使用して、抽出された黄体組織又は分散された黄体細胞からゲノムＤＮＡを単離した。５００ｎｇのＤＮＡを０.２μＣｉ［α-32Ｐ］ｄＣＴＰ、１ｍＭトリス、０.５ｍＭ・ＥＤＴＡ、３ユニットのクレノー酵素、及び０.２ｐＭづつのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰと、室温で３０分間インキュベーションすることにより、ＤＮＡを末端標識した。Maniatisら、により記載された方法に従って、サンプルを１ｍｌセファデックスＧ-５０カラムを通すことにより、取り込みされていないヌクレオチドを取り除いた。サンプルを次にトリス-酢酸ＥＤＴＡ(２％)ゲル電気泳動により分離した。ゲルを吸引下で３０分間乾燥し、そしてＸ線フィルムに-８０℃で２４時間露光した。
【０１０２】
プラスミドＤＮＡ単離、ＤＮＡシーケンス
上記Sambrookらにより記載されるアルカリ溶解法を使用して、プラスミドＤＮＡを単離した。全長の陽性ｃＤＮＡクローンを、ジデオキシ・シーケンス法(Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467)を使用してシーケンスした。オープンリーディング・フレームをＢＬＳＴ検索(GenBank, Bethesda, MD)を使用してコンパイルし、そして分析し、そして配列比較をＢＣＭサーチ・ランチャー：多配列比較・パターン誘導性の多配列比較法(F. Corpet, Nuc. Acids Res., 16: 10881-10890, (1987)を参照のこと)を使用してシーケンスした。シーケンス及びシーケンス比較を図５-１１に示す。
【０１０３】
ラット黄体ＲＮＡのノーザン・ブロット・ハイブリダイゼーション
アポトーシスの種々のステージでのラット黄体から単離された２０ｍｇの全ＲＮＡを、１％変性ホルムアルデヒド・アガロース・ゲル上で分離し、そしてナイロン膜上に固定した。ランダム・プライマー・キット(Boehringer)を使用して32Ｐ-ｄＣＴＰで標識された全長ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｃＤＮＡ(配列番号１)を使用して、膜をプローブした(７×１０7ｃｐｍ)。代わりに、ランダム・プライマー・キット(Boehringer)を使用して32Ｐ-ｄＣＴＰで標識された全長ラットアポトーシス特異的ＤＨＳ・ｃＤＮＡ(配列番号６)を使用して膜をプローブした(７×１０7ｃｐｍ)。膜を１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで室温で１回、そして０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで６５℃にて３回洗浄した。膜を乾燥し、そして-７０℃で一晩Ｘ線フィルムに露光した。
【０１０４】
上記のように、ｅＩＦ-５Ａ及びＤＨＳは、両方ともラット組織をアポトーシスさせる際に上方制御される。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現は、ＰＧＦ-２αで処理することによりアポトーシスを誘導した後に有意に増大される。つまり、時間０で低く、処理後１時間以内にかなり増加し、処理後８時間以内でさらに増加し、そして処理後２４時間以内で少し増加した(図１４)。ＤＨＳの発現は、時間０で低く、処理後１時間でかなり増加し、処理後８時間以内でさらに増加し、そして処理後２４時間以内でさらに少し増加した(図１５)。
【０１０５】
酵母、真菌、及びヒトｅＩＦ-５Ａ配列に基づいたプライマーを使用した、ラット黄体ＲＴ-ＰＣＲ産物の作成
アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの遺伝子の３’末端に対応する部分長のアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ配列(配列番号１１)を、酵母、真菌、及びヒトｅＩＦ-５Ａ配列から設計されたオリゴヌクレオチド・プライマー対を使用するＲＴ-ＰＣＲにより、アポトーシスを起しているラット黄体ＲＮＡテンプレートから作成した。ラットｅＩＦ-５Ａ遺伝子の３’末端を単離するために使用される上流のプライマーは、２０ヌクレオチドの縮重プライマー：５’ＴＣＳＡＡＲＡＣＨＧＧＮＡＡＧＣＡＹＧＧ３’(配列番号９)である。ここで、Ｓは、Ｃ及びＧから選ばれ；ＲはＡ及びＧから選ばれ；ＨはＡ、Ｔ、及びＣから選ばれ；ＹはＣ及びＴから選ばれ、そしてＮは任意の核酸である。ラットｅＩＦ-５Ａ遺伝子の３’末端を単離するために使用される下流のプライマーは、４２ヌクレオチド：５’ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＣＣＡＴＧＧＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３’(配列番号１０)を含む。リバース・トランスクリプターゼ・ポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ-ＰＣＲ)を行った。簡潔に記載すると、下流プライマー５ｍｇを使用し、ｃＤＮＡの主鎖を合成した。上流及び下流のプライマーの両方を使用して、ＲＴ-ＰＣＲにおいて、主鎖をテンプレートとして使用した。
【０１０６】
アガロースゲル上でＲＴ-ＰＣＲ産物を分離することにより、９００ｂｐ断片が存在することがわかった。該９００ｂｐの断片を、平滑末端ライゲーションを使用して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(商標)(Stratagene Cloning Systems, LaJolla, CA)中にサブクローニングし、配列を決定した(配列番号１１)。３’末端のｃＤＮＡ配列は、配列番号１１であり、そして３’末端のアミノ酸配列は配列番号１２である。図１-２を参照のこと。
【０１０７】
アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ遺伝子の５’末端に対応し、かつ３’末端の配列と重なる部分長のアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ配列(配列番号１５)を、ＲＴ-ＰＣＲにより、アポトーシスを起しているラット黄体ＲＮＡテンプレートから作成した。５’プライマーは、以下の配列：５’ＣＡＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＴＧＧＡＡＴＣＧＡＡＧＣ３’(配列番号１３)を有する２４ｍｅｒであり、該配列は、ヒトｅＩＦ-５Ａ配列から設計された。３’プライマーは、以下の配列：５’ＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＣＣＴＴＧＡＴＴＧＣＡＡＣＡＧＣＴＧＣＣ３’(配列番号１４)を有する３０ｍｅｒであり、該配列は、３’末端ＲＴ-ＰＣＲ断片に従って設計された。リバース・トランスクリプターゼ・ポリメラーゼ・連鎖反応(ＲＴ-ＰＣＲ)を行った。簡潔に記載すると、５ｍｇの下流プライマーを使用して、ｃＤＮＡの主鎖を合成した。上流及び下流プライマーの両者を使用するＲＴ-ＰＣＲにおいて当該主鎖をテンプレートとして使用した。
【０１０８】
アガロース・ゲル上でのＲＴ-ＰＣＲ産物の分離は、５００ｂｐの断片を明らかにし、上流及び下流に存在するＸｂａＩ及びＸｈｏＩクローニング・サイトを使用して、該断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(商標) (Stratagene Cloning Systems, LaJolla, CA)中にサブクローニングし、そしてシーケンスした(配列番号１５)。５’末端のｃＤＮＡ配列は、配列番号１５であり、そして５’末端のアミノ酸配列は配列番号１６である。図２を参照のこと。
【０１０９】
ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの３’末端及び５’末端の配列(配列番号１１と配列番号１５のそれぞれ)は、重なり合い、そして全長ｃＤＮＡ配列を与えた(配列番号１)。全長配列を整列し、そしてＧｅｎＢａｎｋデータ・ベースの配列と比較した。図１-２を参照のこと。ｃＤＮＡクローンは、１６.８ＫＤａの計算された分子量を有する１５４個のアミノ酸のポリペプチド(配列番号２)をコードする。ＲＴ-ＰＣＲにより得られたラットアポトーシス特異的黄体ｅＩＦ-５Ａ遺伝子の全長ｃＤＮＡについてのヌクレオチド配列、配列番号１は、図３に示され、そして対応する派生アミノ酸配列は、配列番号９である。得られたｅＩＦ-５Ａのアミノ酸配列の全長は、ヒト及びマウスｅＩＦ-５Ａ配列と配列比較される。図７-９を参照のこと。
【０１１０】
ヒトＤＨＳ配列に基いたプライマーを使用した、アポトーシスを起しているラット黄体のＲＴ-ＰＣＲ産物の作成
アポトーシス特異的ＤＨＳ遺伝子の３’末端に対応する部分長のアポトーシス特異的ＤＨＳ配列(配列番号６)をヒトＤＨＳ配列から設計されたオリゴヌクレオチド・プライマーのペアを使用するＲＴ-ＰＣＲにより、アポトーシスを起しているラット黄体ＲＮＡテンプレートから作成した。５’プライマーは、以下の配列５’ＧＴＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＧＧＣＣＣ３’(配列番号１７)を有する２０ｍｅｒであり;３'プライマーは、以下の配列５’ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＣＣＡＴＧＧＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３’(配列番号１８)を有する４２ｍｅｒである。リバース・トランスクリプターゼ・ポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ-ＰＣＲ)を行った。簡潔に記載すると、５ｍｇの下流プライマーを使用して、ｃＤＮＡの主鎖を合成した。上流及び下流プライマーの両者を使用するＲＴ-ＰＣＲで、当該主鎖をテンプレートとして使用した。
【０１１１】
ＲＴ-ＰＣＲの産物をアガロース・ゲル上で分離することにより、６０６ｂｐの断片の存在を明らかにした。該断片を、平滑末端ライゲーションを使用してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(商標)(Stratagene Cloning Systems, LaJolla, CA) 中にサブクローニングし、そしてシーケンスした(配列番号６)。ＲＴ-ＰＣＲにより得られるラット・アポトーシス特異的黄体ＤＨＳ遺伝子の部分長ｃＤＮＡに対するヌクレオチド配列(配列番号６)を、図４に記載し、そして対応する派生アミノ酸配列は、配列番号７である。
【０１１２】
ゲノムＤＮＡの単離及びサザン分析
サザンブロッティング用のゲノムＤＮＡを、切除したラット卵巣から単離した。約１００ｍｇの卵巣組織を、小片に分割し、そして１５ｍｌチューブ内に入れた。１ｍｌのＰＢＳでを加え、組織懸濁液をゆっくり振盪し、次にピペットを用いてＰＢＳを取り除くことにより、組織を２回ＰＢＳで洗浄した。組織を２.０６ｍｌＤＮＡ緩衝液(０.２Ｍトリス-ＨＣｌ・ｐＨ８.０及び０.１ｍＭ・ＥＤＴＡ)中に再懸濁し、そして２４０μｌの１０％ＳＤＳ及び１００μｌのプロテイナーゼＫ(Boehringer Manheim ; 10 mg/ml)を加えた。組織を４５℃の振盪水浴中に一晩配置した。次の日、別の１００μｌのプロテイナーゼＫ(１０ｍｇ/ｍｌ)を加え、そして組織懸濁液をさらに４時間４５℃にて水浴中でインキュベーションした。インキュベーションした後に、組織懸濁液を等量のフェノール：クロロホルム：イソ-アミル・アルコール(２５：２４：１)で一回抽出し、そして等量のクロロホルム：イソアミルアルコール(２４：１)で抽出した。抽出に続いて、１/１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム(ｐＨ５.２)と２倍量のエタノールを加えた。ブンゼンバーナーを使用して密閉されそしてフック型にされたガラス・ピペットを使用して、ＤＮＡスレッドを溶液からとり、そしてＤＮＡをきれいなマイクロ遠心チューブ中にいれた。ＤＮＡを７０％エタノールで一回洗浄し、そして１０分間風乾した。ＤＮＡペレットを５００μｌの１０ｍＭトリス-ＨＣｌ(ｐＨ８.０)中に溶解し、１０μｌ・ＲＮａｓｅＡ(１０ｍｇ/ｍｌ)を加え、そしてＤＮＡを３７℃で１時間インキュベーションした。ＤＮＡをフェノール：クロロホルム：イソ-アミルアルコール(２５：２４；１)で抽出し、そしてＤＮＡを１/１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム(ｐＨ５.２)及び２倍量のエタノールを加えることにより沈殿させた。ＤＮＡを４℃１３０００×ｇで１０分間遠心することにＤＮＡをペレット化した。ＤＮＡペレットを７０％エタノールで１回洗浄し、そしてＤＮＡを４℃で一晩回転させることにより、２００μｌの１０ｍＭ・トリス-ＨＣｌ(ｐＨ８.０)中に溶解した。
【０１１３】
サザンブロット分析では、ラット卵巣から単離されたゲノムＤＮＡを、内部の遺伝子を切断しないか、又は１回だけ切断する種々の制限酵素で切断した。これを達成するために、１０μｇのゲノムＤＮＡ、２０μｌの１０×反応緩衝液、及び１００Ｕの制限酵素を総反応量２００μｌで５〜６時間反応させた。切断されたＤＮＡを０.７％アガロース・ゲル上にロードし、そして４０ボルトで６時間又は１５ボルトで一晩電気泳動にかけた。電気泳動後、ゲルを１０分間０.２Ｎ・ＨＣｌ中で脱プリン化し、その後変性溶液(０.５Ｍ・ＮａＯＨ、１.５Ｍ・ＮａＣｌ)中で１５分間２回洗浄し、そして中和緩衝液(１.５Ｍ・ＮａＣｌ、０.５Ｍトリス・ＨＣｌ、ｐＨ７.４)中で１５分間２回洗浄した。ＤＮＡをナイロン膜に転写し、そして膜をハイブリダイゼーション溶液(４０％ホルムアミド、６×ＳＳＣ、５×デンハート溶液(１×デンハート溶液は、０.２％フィコール、０.０２％ＰＶＰ、及び０.０２％ＢＳＡ)、０.５％ＳＤＳ、及び１.５ｍｇ変性サケ精子ＤＮＡ)中でプレハイブリダイゼーションした。ラットｅＩＦ-５Ａ・ｃＤＮＡの３’ＵＴＲにおける７００ｂｐのＰＣＲ断片(６５０ｂｐの３’ＵＴＲ及び５０ｂｐのコード領域)を[α-32Ｐ]-ｄＣＴＰでランダム・プライミングをすることにより標識し、そして１×１０6ｃｐｍ/ｍｌで膜に加えた。
【０１１４】
同様に、ラットＤＨＳ・ｃＤＮＡの６０６ｂｐのＰＣＲ断片(４５０ｂｐのコード領域及び１５６ｂｐの３’ＵＴＲ)を、[α-32Ｐ]-ｄＣＴＰでランダム・プライム標識し、そして１×１０6ｃｐｍ/ｍｌで加えて、第二の同一膜へと加えた。ブロットを一晩４２℃でハイブリッド形成させ、そして２×ＳＳＣ及び０.１％ＳＤＳで４２℃にて２回洗浄し、そして１×ＳＳＣ及び０.１％ＳＤＳで４２℃にて２回洗浄した。ブロットを次にフィルムに３〜１０日間露光した。
【０１１５】
図２０に示されるようにラット黄体ゲノムＤＮＡを、制限酵素で切断し、そして32Ｐ-ｄＣＴＰ-標識された全長ｅＩＦ-５Ａ・ｃＤＮＡでプローブした。高度にストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションにより、全長ｃＤＮＡプローブが、各制限酵素で切断されたＤＮＡサンプルについて、幾つかの制限断片にハイブリダイゼーションすることを明らかにされ、このことは、ｅＩＦ-５Ａの幾つかのアイソフォームが存在することを示唆する。特に注目すべきなのは、ラット・ゲノムＤＮＡを、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａのオープン・リーディング・フレーム内に制限酵素部位を有するＥｃｏＲＶで切断したとき、ｅＩＦ-５Ａのアポトーシス特異的アイソフォームの２個の制限酵素断片が、サザンブロットにおいて検出できるということである。この２個の断片を、図２０において二個の矢印で示す。アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａのアイソフォームに対応する制限酵素断片をＥｃｏＲ１及びＢａｍＨ１と記されたレーンにおいて１の矢印により示す。ここで、ＥｃｏＲ１及びＢａｍＨ１は、オープン・リーディング・フレーム内に切断部位が存在しない制限酵素である。これらの結果により、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａが、ラットにおいてシングルコピーの遺伝子であるということが示唆された。図５〜１３において示されるように、ｅＩＦ-５Ａ遺伝子は、種を通じて高度に保存されており、そしていずれかの種におけるアイソフォーム間においてかなりの程度、保存することが予期される。
【０１１６】
図２１は、32Ｐ-ｄＣＴＰ標識された部分長ラット黄体アポトーシス特異的ＤＨＳ・ｃＤＮＡでプローブされたラット・ゲノムＤＮＡのサザン・ブロットを示す。ゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲＶで切断した。ここで該制限酵素は、プローブとして使用される部分長ｃＤＮＡを切断しない。２個の切断断片が明らかであり、該遺伝子の２つのコピーが存在するか、又はこの遺伝子がＥｃｏＲＶサイトを伴うイントロンを含むということが示唆される。
【０１１７】
実施例２
本実施例は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの調節(センスの向きのアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａを用いたアポトーシスの増加)を示す。
ＣＯＳ-７細胞の培養及びＲＮＡの単離
ＣＯＳ-７、つまり野生型Ｔ抗原をコードするＳＶ４０の突然変異体で形質転換されたアフリカミドリザル腎臓線維芽細胞様細胞系列、をトランスフェクションに基く全ての実験に使用した。ＣＯＳ-７細胞を、１リットルあたり０.５８４ｇのＬ-グルタミン、１リットルあたり４.５ｇのグルコース、及び０.３７％重炭酸ナトリウムを伴うダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ)中で培養した。該培養培地に１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)及び１００ユニットのペニシリン/ストレプトマイシンを加えた。細胞を、５％ＣＯ2及び９５％空気の３７℃の加湿環境内で成長させた。細胞を３〜４日毎に、接着細胞を０.２５％トリプシン及び１ｍＭ・ＥＤＴＡの溶液で引き剥がすことにより継代した。引き剥がされた細胞を、新鮮な培地が入った新たな培養ディッシュ中に１：１０の分割比で分配した。
【０１１８】
ＲＮＡの単離に使用されるＣＯＳ-７細胞を、１５０ｍｍ組織培養処理されたディッシュ(Corning)中で成長させた。細胞を、トリプシンＥＤＴＡの溶液で引き剥がすことにより回収した。引き剥がされた細胞を、遠心チューブ中に回収し、そして細胞を３０００ｒｐｍで５分間遠心することによりペレット化した。上清を取り除き、そして細胞ペレットを、液体窒素中で急冷凍した。ＲＮＡを冷凍細胞から、製品説明書に従ってジーン・エリュート哺乳動物トータルＲＮＡミニプレップ・キット(GenElute・Mammalian TotalRNA・Miniprep・Kit)(Sigma)を使用して単離した。
【０１１９】
組換えプラスミドの構築及びＣＯＳ-７細胞のトランスフェクション
ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの全長コード配列をセンスの向きに含み、かつラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの３’非翻訳領域(ＵＴＲ)をアンチセンスの向きに含む組換えプラスミドを、哺乳動物エピトープ・タグ発現ベクター、ｐＨＭ６(Roche Molecular Biochemicals)を使用して構築し、該プラスミドを図２１に例示する。該ベクターは、以下の：ＣＭＶプロモーター-ヒト・サイトメガロウイルス前初期プロモーター/エンハンサー；ＨＡ-インフルエンザ・ヘマグルチニン由来のノナペプチド・エピトープ・タグ；ＢＧＨｐＡ-ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル；ｆ１ｏｒｉ-Ｆ１開始点；ＳＶ４０ｏｒｉ-ＳＶ４０初期プロモーター及び開始点；ネオマイシン-ネオマイシン耐性(Ｇ４１８)遺伝子；ＳＶ４０ｐＡ-ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル；ＣｏｌＥ１-ＣｏｌＥ１開始点；アンピシリン-アンピシリン耐性遺伝子を含む。ラット・アポトーシスｅＩＦ-５Ａ及びラット・アポトーシスｅＩＦ-５Ａの３’ＵＴＲの全長コード配列は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中のオリジナルのラットｅＩＦ-５Ａ・ＲＴ-ＰＣＲ断片(配列番号１)からＰＣＲにより増幅された。全長ｅＩＦ-５Ａを増幅するために使用されるプライマーは、以下の：フォワード５’ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＧＧＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＧＧ３’(配列番号５９)(Ｈｉｎｄ３)とリバース５’ＣＴＧＡＡＴＴＣＣＡＧＴＴＡＴＴＴＴＧＣＣＡＴＧＧ３’(配列番号６０)(ＥｃｏＲ１)である。ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの３’ＵＴＲを増殖させるために使用されるプライマーは、以下の：フォワード５’ＡＡＴＧＡＡＴＴＣＣＧＣＣＡＴＧＡＣＡＧＡＧＧＡＧＧＣ３’(配列番号６１)(ＥｃｏＲ１)とリバース５’ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＣＣＡＴＧＧＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３’(配列番号６２)(Ｈｉｎｄ３)である。
【０１２０】
アガロース・ゲル電気泳動後に単離された全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ＰＣＲ産物は、４３０ｂｐの長さであり、一方３’ＵＴＲラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ＰＣＲ産物は６９７ｂｐの長さであった。両方のＰＣＲ産物のは、ｐＨＭ６のＨｉｎｄ３及びＥｃｏＲ１サイトにサブクローンされて、ｐＨＭ６-全長アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ及びｐＨＭ６-アンチセンス３’ＵＴＲｅＩＦ５Ａを作った。全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ＰＣＲ産物を、抗-[ＨＡ]-ペルオキシダーゼ抗体を使用して組換えタンパク質の検出を許容するように、多重クローニング部位の上流のインフルエンザ・ヘマグルチニン(ＨＡ)由来のノナペプチド・エピトープタグとインフレームでサブクローニングした。発現は、ヒト・サイトメガロウイルス前初期プロモーター/エンハンサーにより行われて、哺乳動物細胞系列において高い発現レベルを保証する。該プラスミドはまた、安定な形質転換体の選別を可能にするネオマイシン-抵抗性(Ｇ４１８)遺伝子、ＣＯＳ-７などのＳＶ４０巨大Ｔ抗原を発現する細胞内でエピソーム複製を許容するＳＶ４０初期プロモーター及び開始点を特徴とする。
【０１２１】
トランスフェクション実験において使用されるＣＯＳ-７細胞を、タンパク質抽出に使用される細胞については２４ウェル細胞培養プレート(Corning)内で、或いは染色に使用される細胞については４チャンバー培養スライド(Falcon)内で培養した。細胞を１０％FBSを加えたが、ペニシリン/ストレプトマイシンを欠いたＤＭＥＭ中で、５０〜７０％コンフルエントになるまで成長させた。２４ウェル・プレートの１ウェル又は培養スライドに十分なトランスフェクション培地を、０.３２μｇのプラスミドＤＮＡを４２.５μｌの無血清ＤＭＥＭ中に希釈し、そして室温で１５分間インキュベーションすることにより調製した。１.６μｌのトランスフェクション試薬、リポフェクタミン(LipofectAMINE)(Gibco, BRL)を４２.５μlの無血清ＤＭＥＭ中に希釈し、そして室温で５分間インキュベーションした。５分後、リポフェクタミン混合物をＤＮＡ混合液に加え、そして室温で３０〜６０分間インキュベーションした。トランスフェクションされる細胞を、トランスフェクション培地を重層する前に、無血清ＤＭＥＭで１回洗浄し、そして細胞を成長チャンバー中に４時間戻した。
【０１２２】
インキュベーション後、０.１７ｍｌのＤＭＥＭ+２０％ＦＢＳを細胞に加えた。ウエスタン・ブロット分析用の染色又は回収に先立ってアポトーシスを起すように誘導される前に、細胞をさらに４０時間培養した。対照として、プラスミドＤＮＡをトランスフェクション培地に入れていないモック・トランスフェクションを行った。
【０１２３】
タンパク質抽出及びウエスタン・ブロッティング
細胞をＰＢＳ(８ｇ/Ｌ・ＮａＣｌ、０.２ｇ/Ｌ・ＫＣｌ、１.４４ｇ/Ｌ・Ｎａ2ＨＰＯ4、及び０.２４ｇ/Ｌ・ＫＨ2ＰＯ4)中で２回洗浄し、次に１５０μｌの熱ＳＤＳゲルローディング緩衝液(５０ｍＭトリスＨＣｌ・ｐＨ６.８、１００ｍＭジチオスレイトール、２％ＳＤＳ、０.１％ブロモフェノール・ブルー、及び１０％グリセロール)を加えることにより、トランスフェクションされた細胞からタンパク質をウエスタン・ブロッティング用に単離した。細胞ライセートをマイクロ遠心チューブ内に回収し、９５℃で１０分間熱し、そして次に１３０００×ｇで１０分間遠心した。上清を新たなマイクロ遠心チューブに移し、そして-２０℃で使用するまで貯蔵した。
【０１２４】
ウエスタン・ブロッティング用に、２.５又は５μｇの全タンパク質を、１２％ＳＤＳ-ポリアクリルアミド・ゲル上で分離した。分離したタンパク質を、ポリビニリデン・ジフロリド膜に転写した。該膜を次に１時間、ブロッキング溶液(５％スキムミルク粉末、０.０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ)中でインキュベーションし、そしてＰＢＳ-Ｔ(ＰＢＳ+０.０５％Ｔｗｅｅｎ-２０)で１５分間３回洗浄した。膜を一晩ＰＢＳ-Ｔ中で、４℃で保存した。次の日に室温まで温め、膜を３０秒間１μｇ/ｍｌのポリビニル・アルコール中でブロッキングした。膜を脱イオン水で５回洗浄し、そしてＰＢＳ中の５％ミルクの溶液中で３０分間ブロッキングした。膜とインキュベーションする前に、一次抗体をＰＢＳ中５％ミルクの溶液中で３０分間プレインキュベーションした。
【０１２５】
幾つかの一次抗体を使用した。抗-[ＨＡ]-ペルオキシダーゼ抗体(Roche Molecular Biochemicals)を、１：５０００の希釈度で使用して、組換えタンパク質の発現を検出した。この抗体が、ペルオキシダーゼに結合されているので、二次抗体は必要がなく、そしてブロットを洗浄し、そして化学発光により現像された。使用された他の一次抗体は、Oncogeneから購入したモノクローナル抗体であって、ｐ５３を認識するもの(Ａｂ-６)、Ｂｃｌ-２を認識するもの(Ａｂ-１)、及びｃ-Ｍｙｃを認識するもの(Ａｂ-２)である。ｐ５３に対するモノクローナル抗体を０.１μｇ/ｍｌの希釈度で使用し、そしてＢｃｌ-２及びｃ-Ｍｙｃに対するモノクローナル抗体は、０.８３μｇ/ｍｌの希釈度で使用した。一次抗体で６０〜９０分間インキュベーションした後に、膜をＰＢＳ-Ｔ中で１５分間３回洗浄した。二次抗体を１％ミルクを含むＰＢＳ中に希釈し、そして膜と６０〜９０分間インキュベーションした。ｐ５３(Ａｂ-６)を一次抗体として使用したとき、使用される二次抗体は、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ (Rockland)であり、１：１０００の希釈度であった。Ｂｃｌ-２(Ａｂ-１)及びｃ-Ｍｙｃ(Ａｂ-２)を一次抗体として使用するとき、ペルオキシダーゼ結合ラビット抗マウスＩｇＧを、１：５０００の希釈度で使用した。二次抗体とインキュベーションした後に、膜をＰＢＳ-Ｔ中で３回洗浄した。
【０１２６】
ブロットを現像するために２種の検出方法、比色法と化学発光法を使用した。比色法は、ｐ５３(Ａｂ-６)を一次抗体として、アルカリホスファターゼ結合二次抗体と組み合わせて使用するときのみ使用した。結合された抗体を、暗所で、０.３３ｍｇ/ｍｌニトロ・ブルー・テトラゾリウム、０.１６５ｍｇ/ｍｌ５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル・ホスフェート、１００ｍＭ・ＮａＣｌ、５ｍＭ・ＭｇＣｌ2、及び１００ｍＭ・トリス-ＨＣｌ(ｐＨ９.５)の溶液中でインキュベーションすることにより可視化された。ブロットを２ｍＭ・ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中でインキュベーションすることにより呈色反応を停止した。化学発光検出法を、抗-[ＨＡ]-ペルオキシダーゼ、Ｂｃｌ-２(Ａｂ-１)、及びｃ-Ｍｙｃ(Ａｂ-２)を含む他の一次抗体全てについて使用した。ＥＣＬプラス・ウエスタン・ブロッティング検出キット(ECL Plus Western blotting detection kit )(Amersham Pharmacia Biotech)を使用して、ペルキシダーゼ結合抗体を検出した。簡潔に記載すると、膜を軽く乾燥状態でブロットし、次に暗所で試薬Ａと試薬Ｂの４０：１混合液と５分間インキュベーションした。膜を乾燥状態でブロットし、アセテートのシートの間に置き、そして１０秒〜１０分で時間を変えて、Ｘ線フイルムに露光した。
【０１２７】
ＣＯＳ７細胞におけるアポトーシスの誘導
トランスフェクションされたＣＯＳ-７細胞においてアポトーシスを誘導するために、２種の方法、血清飢餓及びアクチノマイシンＤ、ストレプトマイシスｓｐ(streptomyces sp)(Calbiochem)処理を使用した。両方の処理において、培地をトランスフェクション後４０時間で取り除いた。血清飢餓実験においては、培地を、血清-及び抗生物質を伴わないＤＭＥＭと置換した。１０％ＦＢＳを加えた抗生物質を伴わないＤＭＥＭ中で成長させた細胞を対照として使用した。アクチノマイシンＤによるアポトーシス誘導では、培地を１０％ＦＢＳ及びメタノール中に溶解した１μｇ/ｍｌアクチノマイシンＤを加えた抗生物質を含まないＤＭＥＭと置換された。対照細胞を、１０％ＦＢＳ及び等量のメタノールを加えた抗生物質を含まないＤＭＥＭ中で成長させた。両方の方法において、アポトーシスを起している細胞の割合(％)を、ヘキスト又はアネキシンＶ-Ｃｙ-３で染色することにより４８時間後に測定した。アポトーシスの誘導を、図２２において示されるようにノーザンブロット分析により確認した。
【０１２８】
ヘキスト染色
核断片化及び凝集などの形態的特徴に基いたアポトーシスを起している細胞を同定するために、核染色であるヘキストを使用して、トランスフェクションされたＣＯＳ-７の細胞の核を標識した。３：１の無水メタノール及び氷酢酸からなる固定液を、使用直前に調製した。等量の固定液を、培養スライド上で成長しているＣＯＳ-７細胞の培地に加え、そして２分間インキュベーションした。培地/固定液の混合液を細胞から取り除いて、捨て、そして１ｍｌの固定液を細胞に加えた。５分後、固定液を捨て、そして１ｍｌの新たな固定液を細胞に加えて５分間インキュベーションした。固定液を捨て、細胞を４分間風乾し、その後１ｍｌのヘキスト染色液(０.５μｇ/ｍｌへキスト３３２５８を含むＰＢＳ)を加えた。暗所で１０分のインキュベーションの後、染色溶液を捨て、そしてスライドを脱イオン水で１分間３回洗浄した。洗浄後、１ｍｌのマックルバイン(McIlvine's)緩衝液(０.０２１Ｍクエン酸、０.０５８Ｍ・Ｎａ2ＨＰＯ4７Ｈ2Ｏ；ｐＨ５.６)を細胞に加え、そして細胞を暗所で２０分間インキュベーションした。緩衝液を捨て、そして細胞を暗所で５分間風乾し、そして培養スライドのウェルを区切るチャンバーを取り除いた。蛍光用ベクタシールド(Vectashield)標本用培地(Vector Laboratories)の数滴をスライドに加え、そしてカバーガラスを被せた。染色された細胞をＵＶフィルターを使用する蛍光顕微鏡の下で観察した。明るく染色されるか又は断片化された核を有する細胞を、アポトーシスを起している細胞として計測した。
【０１２９】
アネキシンＶ-Ｃｙ３染色
アネキシンＶ-Ｃｙ３アポトーシス検出キット(Sigma)は、アポトーシス細胞上の外表面に現われたホスファチジルセリンを蛍光標識するために使用された。該キットを、以下の改変を伴った製品プロトコルに従って使用した。簡潔に記載すると、４個のチャンバー培養スライド上で成長するトランスフェクションされたＣＯＳ-７細胞を、ＰＢＳで二回洗浄し、そして１×結合緩衝液で３回洗浄した。１５０μｌの染色溶液(１×結合緩衝液中の１μｇ/ｍｌＡｎｎＣｙ３)を加え、そして細胞を暗所で１０分間インキュベーションした。染色溶液を次に取り除き、そして細胞を１×結合緩衝液で５回洗浄した。チャンバー壁を培養スライドから取り除き、そして数滴の１×結合緩衝液を細胞上に配置し、そしてカバーガラスを被せた。染色された細胞を、緑色のフィルターを使用する蛍光顕微鏡により分析して、陽性染色された(アポトーシスを起している)細胞の赤色蛍光を可視化した。全細胞数を、可視光の下で細胞数を計数することにより測定した。
【０１３０】
実施例３
本実施例は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの調節を示す。
一般的方法及び前の実施例において記載される方法を使用して、図２３は、ＣＯＳ-７細胞の一過性トランスフェクションの方法を記載するフローチャートであり、ここで無血清培地中の細胞を、プラスミドＤＮＡを含むリポフェクタミン中で４時間インキュベーションし、血清を加え、そして細胞をさらに４０時間インキュベーションした。細胞を次に、分析前にさらに血清を含む通常培地中で４８時間インキュベーションするか(つまり更なる処理なし)、分析前に血清を４８時間欠乏させてアポトーシスを誘導するか、又はアクチノマイシンＤで４８時間処理して分析前にアポトーシスを誘導した。
【０１３１】
図２２は、ｐＨＭ６でトランスフェクションした後、ＣＯＳ-７細胞中における外来タンパク質の一過的な発現を示すウエスタンブロットである。モック・トランスフェクション、或いはｐＨＭ６-ＬａｃＺ、ｐＨＭ６-アンチセンス３’ｒＦ５Ａ(ｐＨＭ６-アンチセンス３’ＵＴＲラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ)、又はｐＨＭ６-センスｒＦ５Ａ(ｐＨＭ６-全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ)でトランスフェクションされた４８時間あとで、タンパク質をＣＯＳ-７細胞から単離した。各サンプルからの５μｇのタンパク質をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分画し、ＰＶＤＦ膜に転写し、そして抗-[ＨＡ]-ペルオキシダーゼでウエスタンブロットした。結合抗体を、化学発光により検出し、そしてＸ線フイルムに３０秒間露光した。ＬａｃＺ(レーン２)及びセンス・ラット・アポトーシスｅＩＦ-５Ａ(レーン４)の発現は、明らかに見ることができる。
【０１３２】
上で記載されるように、ＣＯＳ-７細胞は、モック・トランスフェクションされるか、或いはｐＨＭ６-センスｒＦ５Ａ(ｐＨＭ６-全長ラットｅＩＦ-５Ａ)でトランスフェクションされる。トランスフェクション後４０時間で、４８時間血清を取り除くことによりアポトーシスを引き起こすように、細胞を誘導した。トランスフェクションされた細胞抽出液におけるカスパーゼのタンパク質分解活性を、蛍光定量的に均一なカスパーゼ・アッセイ・キット(fluorometric homogenous caspase assay kit)(Roche Diagnostics)を使用して計測した。ＤＮＡ断片を、ＦｒａｇＥＬ・ＤＮＡ断片アポトーシス検出キット(FragEl DNA Fragmentation Apotosis Detection Kit)(Oncogene)を使用して計測した。該キットは、ＤＮＡ断片の晒された３’ＯＨ末端をフルオレセイン標識されたデオキシヌクレオチドで標識する。
【０１３３】
更なるＣＯＳ-７細胞を、モック・トランスフェクションし、或いは ｐＨＭ６-センスｒＦ５Ａ(ｐＨＭ６-全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ)でトランスフェクションした。トランスフェクション後４０時間で、細胞を血清を含む通常培地中でさらに４８時間成長させるか、４８時間血清を取り除くことによりアポトーシスを誘導させるか、又は４８時間０.５μｇ/ｍｌのアクチノマイシンＤで処理することによりアポトーシスを誘導させた。アポトーシスに付随する核の断片化を表すヘキスト３３２５８で細胞を染色するか、又はアポトーシスに付随するホスファチジルセリンの露出を表すアネキシンＶ-Ｃｙ３で染色した。染色された細胞を、緑色フィルターを使用する蛍光顕微鏡により観測し、そしてアポトーシスを起している細胞の割合(％)測定するために計数した。全細胞数を、可視光のもとで計数した。
【０１３４】
図２５は、ＣＯＳ-７細胞が全長ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａをセンスの向きで含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされたとき、増加されたカスパーゼ活性により反映されるアポトーシスの増加を表す。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現は、カスパーゼ活性の６０％増加をもたらす。
【０１３５】
図２６は、ＣＯＳ-７細胞が、全長ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａをセンスの向きに含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされたとき、増大されたＤＮＡの断片により反映されるアポトーシスの増加を表す。ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現は、ＤＮＡ断片の２７３％の増加をもたらした。図２７は、ＣＯＳ-７細胞が全長ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａをセンスの向きに含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされたとき、増大された核断片により反映されるアポトーシスの検出を表す。ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａを発現する細胞において、断片化された核がより多く発生する。図２８は、ＣＯＳ-７細胞が、全長ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａをセンスの向きで含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされたとき、増加した核断片化により反映されるアポトーシスの増加を表す。ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現は、非血清飢餓及び血清飢餓サンプルの対照に対して、それぞれ２７％及び６３％増加した。
【０１３６】
図２９は、ＣＯＳ-７細胞が全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａをセンスの向きに含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされた場合の、ホスファチジルセリンの露出により反映されるアポトーシスの検出を表す。図３０は、ＣＯＳ-７細胞が全長ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａをセンスの向きに含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされるとき、ホスファチジルセリンの露出の増加により反映されるアポトーシスの増加を表す。ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現は、非血清飢餓及び血清飢餓サンプルの対照に対して、ホスファチジルセリンの露出の１４０％及び１９８％の増加をもたらした。
【０１３７】
図３１は、ＣＯＳ-７細胞が全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａをセンスの向きに含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされたとき、増大した核断片により反映されるアポトーシスの増加を表す。ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現は、未処理及び処理サンプルにおける対照に対して、それぞれ１１５％及び６２％の核断片の増加をもたらした。図３２は、全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａをセンスの向きに含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされるＣＯＳ-７細胞が、アポトーシスを起すための更なる処理を受ける条件下、又は受けない条件下でのアポトーシスの増加の比較を表す。
【０１３８】
実施例４
本実施例は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの投与の後のアポトーシス活性の調節を示す。
ＣＯＳ-７細胞は、モック・トランスフェクションされるか、ｐＨＭ６-ＬａｃＺでトランスフェクションされるか、又はｐＨＭ６-センスｒＦ５Ａ(ｐＨＭ６-全長ラットｅＩＦ-５Ａ)でトランスフェクションされ、そして４０時間インキュベーションされた。各サンプルから抽出されるタンパク質５μｇのサンプルを、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分画し、ＰＶＤＦ膜へと転写し、そしてＢｃｌ-２を認識するモノクローナル抗体でウエスタン・ブロットした。ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスＩｇＧを二次抗体として使用し、そして結合した抗体を化学発光及びＸ線フィルムへの露光により検出した。結果を図３３において示す。ｐＨＭ６-ＬａｃＺでトランスフェクションされた細胞において検出できるＢｃｌ-２より少ないＢｃｌ-２を、ｐＨＭ６-センス-ｒＦ５Ａでトランスフェクションされた細胞で検出した。これより、Ｂｃｌ-２がｐＨＭ６-センスｒＦ５Ａコンストラクトを用いて下方制御されている。
【０１３９】
さらなるＣＯＳ-７細胞は、モック・トランスフェクションされるか、ｐＨＭ６-アンチセンス３’ｒＦ５Ａ(ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５ＡのｐＨＭ６-アンチセンス３’ＵＴＲ)でトランスフェクションされるか、又はｐＨＭ６-センスｒＦ５Ａ(ｐＨＭ６全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ)でトランスフェクションされた。トランスフェクション後４０時間で、血清を４８時間取り除くことによりアポトーシスを誘導した。各サンプル由来のタンパク質抽出液サンプル５μｇを、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分画して、ＰＶＤＦ膜に転写し、そしてＢｃｌ-２を認識するモノクローナル抗体でウエスタンブロットした。ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスＩｇＧを二次抗体として使用し、そして結合された抗体を、化学発光及びＸ線フィルムへの露光により検出した。
【０１４０】
さらに、ＣＯＳ-７細胞を、モック・トランスフェクションするか、ｐＨＭ６-ＬａｃＺでトランスフェクションするか、又はｐＨＭ６-センスｒＦ５Ａ(ｐＨＭ６-全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ)でトランスフェクションし、そして４０時間インキュベーションした。各サンプルから抽出されたタンパク質のサンプル５μｇをＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分画し、ＰＶＤＦ膜へ転写し、そしてｐ５３を認識するモノクローナル抗体でウエスタン・ブロットした。アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧを二次抗体として使用し、そして結合された抗体を、比色分析により検出した。
【０１４１】
最後に、ＣＯＳ-７細胞をモック・トランスフェクションするか、ｐＨＭ６-ＬａｃＺでトランスフェクションするか、またはｐＨＭ６-センスｒＦ５Ａ(ｐＨＭ６-全長アポトーシス特異的ラットｅＩＦ-５Ａ)でトランスフェクションし、そして４０時間インキュベーションした。各サンプル由来のタンパク質抽出物のサンプル５μｇを、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分画し、ＰＶＤＦ膜に転写し、そしてｐ５３を認識するモノクローナル抗体でプローブした。対応するタンパク質のブロットを、抗[ＨＡ]-ペルオキシダーゼでプローブして、ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ発現のレベルを測定した。アルカリホスファターゼ結合ヤギ-抗-マウスＩｇＧを二次抗体として使用し、そして結合された抗体を化学発光により検出した。
【０１４２】
図３３は、ＣＯＳ-７細胞が、全長ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａをセンスの向きに含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされるとき、Ｂｃｌ-２の下方制御を表す。上のパネルは、クマシー・ブルーで染色されたタンパク質ブロットを表し；下のパネルは、対応するウエスタン・ブロットを表す。ｐＨＭ６-ＬａｃＺでトランスフェクションされた細胞において検出できるＢｃｌ-２に比較して、より少ないＢｃｌ-２がｐＨＭ６-センスｒＦ５Ａでトランスフェクションされた細胞で検出できる。
【０１４３】
図３４は、ＣＯＳ-７細胞が全長ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａをアンチセンスの向きに含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされる場合におけるＢｃｌ-２の上方制御を表す。上のパネルは、クマシー・ブルーで染色されたタンパク質ブロットを表し；下のパネルは、対応するウエスタン・ブロットを表す。モック・トランスフェクションされた又はｐＨＭ６-センスｒＦ５Ａでトランスフェクションされた細胞において検出できるＢｃｌ-２に比較して、より多くのＢｃｌ２が、ｐＨＭ６-アンチセンス３’ｒＦ５Ａでトランスフェクションされた細胞で検出できる。
【０１４４】
図３５は、ＣＯＳ-７細胞が全長ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａをセンスの向きに含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされるとき、ｃ-Ｍｙｃの上方制御を表す。上のパネルは、クマシー・ブルーで染色されたタンパク質ブロットを表し；下のパネルは、対応するウエスタン・ブロットを表す。ｐＨＭ６-ＬａｃＺ又はモック対照でトランスフェクションされた細胞において検出できるｃ-Ｍｙｃと比較して、より高いレベルのｃ-Ｍｙｃが、ｐＨＭ６-センスｒＦ５Ａでトランスフェクションされた細胞において検出される。
【０１４５】
図３６は、ＣＯＳ-７細胞が全長ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａをセンスの向きに含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされるとき、ｐ５３の上方制御を表す。上のパネルは、クマシー・ブルーで染色されたタンパク質ブロットを表し；下のパネルは、対応するウエスタン・ブロットを表す。ｐＨＭ６-ＬａｃＺ又は偽対照でトランスフェクションされた細胞において検出できるｐ５３と比較して、より高いレベルのｐ５３が、ｐＨＭ６-センスｒＦ５Ａでトランスフェクションされた細胞において検出される。
【０１４６】
図３７は、ＣＯＳ-７細胞において、ｐＨＭ６-全長ラット・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現の際、Ｐ５３上方制御の依存性を表す。第二トランスフェクションにおいて検出できるラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａより多くのラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａが、第一トランスフェクションにおいて検出できる。抗ｐ５３でプローブされたウエスタンブロットでは、パネルは、対応するクマシーブルー染色されたタンパク質ブロットを指し、そしてパネルは、ｐ５３でのウエスタンブロットを記載する。第一トランスフェクションでは、ｐＨＭ６-ＬａｃＺ又はモック対照でトランスフェクションされた細胞においてよりも多くのｐ５３が、ｐＨＭ６-センスｒＦ５Ａでトランスフェクションされた細胞において検出できる。ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現が少ない第二トランスフェクションでは、ｐＨＭ６-センスｒＦ５Ａ、ｐＨＭ６-ＬａｃＺ又はモック対照でトランスフェクションされた細胞とのあいだで、ｐ５３のレベルの検出できる差は存在しない。
【０１４７】
実施例５
図４７は、ヒト心臓の鼓動及び続いて誘導された心臓発作を模倣するために、心臓組織において行われる実験を表す。図４９は、研究室のベンチの配置を示す。弁置換手術の間にヒト心臓組織の切片を電極に取り付けた。小さい重りを心臓組織につけて、心臓鼓動の強さを計測することを容易にした。電極は、電気刺激を提供して、組織を鼓動させ始めた。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ及び増殖ｅＩＦ-５Ａの両方の遺伝子発現レベルを、虚血が誘導される前に、心臓組織において計測した。図４６を参照のこと。虚血前心臓組織において、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ及び増殖ｅＩＦ-５Ａの両方のレベルが低く、そしてそのレベルは、相対バランスにあった。この時間のあいだ、酸素及び二酸化炭素を、緩衝液中の心臓に、９２.５％及び７.５％でそれぞれデリバリーした。後に、酸素レベルを減らし、そして窒素レベルを増加させて、低酸素状態及び虚血を誘導し、そして最終的に「心臓発作」を誘導した。心臓組織は鼓動を止めた。酸素レベルを次に通常に戻し、心臓組織を再び電気刺激でパルスをかけて、心臓鼓動を再び開始させた。「心臓発作」の後、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ及び増殖ｅＩＦ-５Ａ(ｅＩＦ５ｂ)の発現レベルを再び計測した。今回は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａレベルの発現レベルは有意に増加したが、一方増殖ｅＩＦ-５Ａ(ｅＩＦ５ｂ)の発現レベルの増加は、著しく少なかった。図４６を参照のこと。
【０１４８】
「心臓発作」の後、より少ない圧縮/取り付けられた重りの移動により示されるように、強く鼓動せず、該心臓組織細胞が、アポトーシス-特異的ｅＩＦ-５Ａの存在のために急速に死滅されたということが示された。
【０１４９】
ＥＫＧの結果を図４８に表した。パネルの左側に、通常の心臓の鼓動を表した(虚血前心臓組織)。「心臓発作」(直線)及び心臓鼓動の再開の後、ＥＫＧは、筋肉細胞死のため活動性の低下を示す。ＥＫＧは、心臓鼓動の強さの相対的な減少を示す。
【０１５０】
実施例６
以下の実施例は細胞培養条件を提供する
ヒト篩板及び樹状細胞
ヒトの両目を、Canada, Ontario Divisionのアイバンクから死後４８時間以内に得た。(付着された極を伴う)視神経乳頭を取り出し、そして抗生物質／抗真菌剤、グルタミン、及び１０％ＦＢＳを含むダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ)中に３時間置いた。視神経乳頭(ＯＮＨ)ボタンを、各組織サンプルから回収し、そして解剖ハサミで細かく切って、４の小片にした。移植片を１２.５ｃｍ2プラスチック製培養フラスコ内のＤＭＥＭ培地中で培養した。生育できた移植片について１月間成長を観測した。細胞が９０％コンフルエントに達すると、トリプシン処理され、そして分化継代培養に供して、篩板(ＬＣ)及び星状細胞集合を産生した。具体的に、ＬＣ細胞を、ゲンタマイシン、グルタミン、及び１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭを入れた２５ｃｍ2フラスコ内で継代した。ここで、星状細胞を、ＦＢＳを含まないＥＢＭ完全培地(Clontics)を含んだ２５ｃｍ2フラスコ内で成長させた。ＦＢＳを、１０日の継代の後に、星状細胞に加えた。細胞を維持し、そしてこのプロトコルにより、継代した。
【０１５１】
異なる継代により得た細胞集合を、８ウェル培養スライド上で、異なる蛍光抗体を使用することにより、同一性及び集合の均一性について特徴づけした。細胞を１０％ホルマリン溶液中で固定し、そしてダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩水(ＤＰＢＳ)で３回洗浄した。２％脱脂乳を含むＤＰＢＳでブロッキングしたのちに、抗体を１％ＢＳＡを含むＤＰＢＳ中で希釈し、そして６個のウェルに細胞を加えた。残った２個のウェルを、１％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)溶液のみで、及び対照として一次抗体なしで処理した。細胞を、一次抗体で、１時間室温でインキュベーションし、そして３回ＤＰＢＳで洗浄した。適切な二次抗体を１％ＢＳＡを含むＤＰＢＳ中に希釈し、各ウェルに加え、そして１時間インキュベーションした。ＤＰＢＳで洗浄した後に、培養スライドのウェルを区切るチャンバーを、スライドから取り除き、そしてスライドを２回蒸留水に浸し、次に風乾した。蛍光標本培地(Fluoromount)(Vector Laboratories)を各スライドに加え、そして２２×６０ｍｍのカバーガラスを被せた。
【０１５２】
免疫蛍光染色を、適切なフィルターを備える蛍光顕微鏡の下で観察し、そして一次抗体で処理されていない対照ウェルと比較した。全ての一次抗体を、他に記載がない限りSigmaから得た。全ての二次抗体をMolecular Prove社から購入した。ＬＣ細胞を同定するために使用される一次抗体は、抗-コラーゲンＩ、抗-コラーゲンＩＶ、抗ラミニン、及び抗-細胞フィブロネクチンであった。星状細胞を同定するために使用した一次抗体は、以下：抗-ガラクトセレブロシド(Chemicon International)、抗-Ａ２Ｂ５(Chemicon International)、抗-ＮＣＡＭ、抗-ヒト・フォン・ウィルブランド因子であった。両方の細胞集合に使用される更なる抗体は、抗グリア線維(ＧＦＡＰ)及び抗α-平滑筋アクチンを含む。細胞集合が、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ラミニン、細胞フィブロネクチン、α平滑筋アクチンについて陽性に染色され、かつグリア線維(ＧＦＡＰ)について陰性に染色される場合、細胞集合はＬＣ細胞から構成されるということが確定される。細胞集合は、ＮＣＡＭ、グリア線維(ＧＦＡＰ)について陽性に染色され、かつガラクトセレブロシ、Ａ２Ｂ５、ヒトフォン・ウィルブランド因子、及びアルファ平滑筋アクチンについて陰性に染色される場合、該細胞集合は、星状細胞から構成されるということが確定される。
【０１５３】
この予備試験において、３セットのヒトの目を使用して、培養を開始する。ＬＣ細胞系列＃５０６、＃５１７、及び＃５２４を、８３歳男性、１７歳男性、及び２６歳女性の視神経乳頭から確立した。全てのＬＣ細胞系列は、完全に十分に特徴付けられており、そして９０％を超えるＬＣ細胞を含むことが分かっている。
【０１５４】
ＲＫＯ細胞培養
ＲＫＯ(American Type Culture Collection CRL-2577)、野生型ｐ５３を発現するヒト大腸癌細胞系列を使用して、アンチセンス・オリゴヌクレオチドが、ｅＩＦ５Ａ１タンパク質発現を抑制する能力について試験した。ＲＫＯを、非必須アミノ酸、アールの塩(Earl'ｓ salt)、及びＬグルタミンを伴う最小必須イーグル培地(ＭＥＭ)中で培養した。培養培地に１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)、そして１００ユニットのペニシリン/ストレプトマイシンを加えた。細胞を、５％ＣＯ2、及び９５％空気の加湿環境内で３７℃にて成長させた。接着細胞を、０.２５％トリプシン及び１ｍＭ・ＥＤＴＡの溶液で引き剥がすことにより、細胞を３〜４日ごとに継代した。引き剥がした細胞を、１：１０〜１：１２の分割比で、新たな培地を含む新たな培養ディッシュに加えた。
【０１５５】
ＨｅｐＧ２細胞培養
ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａに対するアンチセンス・オリゴがＩＬ-１βでの処理に応答するＴＮＦ-αの産生を抑制する能力を試験するために、ＨｅｐＧ２、ヒト肝細胞癌細胞系列を使用した。ＨｅｐＧ２細胞を、ゲンタマイシン、グルタミン、及び１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ中で培養し、そして５％ＣＯ2及び９５％空気の加湿環境中で、３７℃にて成長させた。
【０１５６】
実施例７
アポトーシスの誘導
アクチノマイシンＤ、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、カンプトテシン、及びトポイソメラーゼ阻害剤をそれぞれ使用して、ＲＫＯ及び篩板細胞においてアポトーシスを誘導した。アクチノマイシンＤを０.２５μｇ/ｍｌで使用し、そしてカンプトテシンを２０、４０、又は５０μＭの濃度で使用した。アポトーシスはまた、篩板細胞において、カンプトテシン(５０μＭ)とＴＮＦ-α(１０ｎｇ/ｍｌ)の組合せを使用して誘導された。カンプトテシンとＴＮＦ-αの組合せは、単独のカンプトテシン又はＴＮＦαのいずれかよりは、アポトーシスを誘導する点でより有効であることが分かった。
【０１５７】
アンチセンス・オリゴヌクレオチド
ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ１に対して標的された３個のアンチセンス・オリゴヌクレオチドのセットが、Molecular Research Labsにより設計され、そしてそこから購入した。ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対して標的された第一アンチセンス・オリゴヌクレオチド(＃１)は、５’ＣＣＴ  ＧＴＣ  ＴＣＧ  ＡＡＧ  ＴＣＣ  ＡＡＧ  ＴＣ３’(配列番号６３)であった。ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａに対して標的された第二アンチセンスの配列(＃２)は、５’ＧＧＡ  ＣＣＴ  ＴＧＧ  ＣＧＴ  ＧＧＣ  ＣＧＴ  ＧＣ３’(配列番号６４)であった。ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａに対して標的される第三アンチセンス・オリゴヌクレオチドの配列(＃３)は、５’ＣＴＣ  ＧＴＡ  ＣＣＴ  ＣＣＣ  ＣＧＣ  ＴＣＴ  ＣＣ３’(配列番号６５)であった。対照のオリゴヌクレオチドは、以下の配列：５’ＣＧＴ  ＡＣＣ  ＧＧＴ  ＡＣＧ  ＧＴＴ  ＣＣＡ  ＧＧ  ３’(配列番号６６)であった。蛍光イソチオシアネート(ＦＩＴＣ)-標識アンチセンス・オリゴヌクレオチド(Molecular Research Labs)は、トランスフェクション効率をモニターするために使用されて、そして以下の配列：５’ＧＧＡ  ＣＣＴ  ＴＧＧ  ＣＧＴ  ＧＧＣ  ＣＧＴ  ＧＣＸ３’を有し、ここでXはＦＩＴＣ標識である。全てのアンチセンス/オリゴヌクレオチドを完全にホスホロチオエート化した。
【０１５８】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドのトランスフェクション
アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ１タンパク質発現を阻害するアポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ１アンチセンス・オリゴヌクレオチドの能力は、ＲＫＯ細胞において試験された。ＲＫＯ細胞に、トランスフェクション試薬、オリゴフェクタミン(Invitrogen)を使用して、アンチセンス・オリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間前に、細胞に１０％ＦＢＳを加えたが、ペニシリン/ストレプトマイシンを欠くＭＥＭ培地中で、１ウェルあたり１５７０００で２４ウェルプレートに分配した。２４時間後、細胞は通常、おおよそ５０％コンフルエントに達した。ＲＫＯ細胞は、モック・トランスフェクションされるか、又は１００ｎＭ又は２００ｎＭのアンチセンス・オリゴヌクレオチドでトランスフェクションされた。２４ウェル・プレートの１ウェルあたりに十分なトランスフェクション培地は、０、１.２５、又は２.５μｌのアンチセンス・オリゴヌクレオチドの２０μＭストックを、無血清ＭＥＭで４２.５μｌの最終体積に希釈し、そして室温で１５分間混合液をインキュベーションすることにより調製した。１.５μｌのオリゴフェクタミンを、６μｌの無血清ＭＥＭ中に希釈し、そして室温で７.５分間インキュベションした。５分後、希釈されたオリゴフェクタミン混合液を、ＤＮＡ混合液に加え、そしてともに２０分間室温でインキュベーションした。細胞を無血清ＭＥＭで１回洗浄し、その後２００μｌのＭＥＭを細胞に加え、そして５０μｌのトランスフェクション培地を加えた。細胞を４時間成長チャンバー内に戻した。インキュベーション後、１２５μｌのＭＥＭ＋３０％ＦＢＳを細胞に加えた。細胞を次にさらに４８時間培養し、０.２５μｇ／ｍｌアクチノマイシンＤで２４時間処理し、次に細胞抽出液をウエスタンブロット分析用に回収した。
【０１５９】
１００及び２００ｎＭアンチセンス・オリゴヌクレオチド及びオリゴフェクタミンを使用し、ＲＫＯ細胞について記載された方法と同じ方法を使用して、篩板細胞のトランスフェクションを試験した。しかしながら、篩板細胞の有効なトランスフェクションは、１μＭ〜１０μＭで無血清培地中に希釈されたアンチセンス・オリゴヌクレオチドを細胞に２４時間加え、その後、全体として２〜５日間、２４時間ごとに培地を、血清を含む培地中に希釈された新たなアンチセンス・オリゴヌクレオチドに置き換えることによって単純に達成された。
【０１６０】
アンチセンス・オリゴヌクレオチド・トランスフェクションの効率は、アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ１アンチセンス・オリゴヌクレオチド＃２と同じ配列を有するが、３’末端でＦＩＴＣに結合されたＦＩＴＣ標識アンチセンス・オリゴヌクレオチドでトランスフェクションを行うことにより、最適化しそしてモニターした。ＲＫＯ及び篩板細胞を、８ウェル培養スライド上で、ＦＩＴＣ標識アンチセンス・オリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、そして３.７％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中で１０分間固定した。ウェルを取り除き、そして標本培地(Vectashield)を加え、続いてカバーガラスを載せた。細胞を次に蛍光顕微鏡上のＵＶ光の下で、蛍光フィルター(グリーンH５４６、フィルターセット４８９１５)を使用して可視化し、そして鮮緑色の蛍光を発する細胞を、当該オリゴヌクレオチドを取り込んだと決定した。
【０１６１】
アポトーシスの検出
篩板細胞をアンチセンス・オリゴヌクレオチドでトランスフェクションし、そしてカンプトテシンでアポトーシスを誘導した後に、対照アンチセンス・オリゴヌクレオチド又はアンチセンス・オリゴヌクレオチドアポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ配列番号２６で処理された細胞においてアポトーシスを起す細胞の割合(％)を測定した。二つの方法-ヘキスト染色及びDeadEnd(商標)蛍光定量ＴＵＮＥＬを、アポトーシスを起している篩板細胞を検出するために使用した。核断片化及び凝集などの形態学的特徴に基いてアポトーシスを起している細胞を同定するために、核染色であるヘキストを使用して篩板細胞の核を染色した。３：１の無水メタノール及び氷酢酸の混合液からなる固定液を、使用直前に調製した。等量の固定液を培養スライド上で成長する細胞の培地に加え、そして２分間インキュベーションした。培地／固定液混合液を細胞から取り除いて廃棄し、そして１ｍｌの固定液を細胞に加えた。５分後、固定液を捨て、そして１ｍｌの新たな固定液を加え、細胞を５分間インキュベーションした。固定液を捨て、そして細胞を４分間風乾し、その後１ｍｌのヘキスト染色液(０.５μｇ／ｍｌへキスト３３２５８を含むＰＢＳ)を加えた。暗所で１０分間インキュベーション後、染色溶液を捨て、培養スライドのウェルを区切るチャンバーを取り除き、そしてスライドを１分間脱イオン水で３回洗浄した。洗浄後、数滴のマックルバイン緩衝液(０.０２１Ｍクエン酸、０.０５８Ｍ・Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ；ｐＨ５.６)を細胞に加え、そしてカバーガラスを被せた。染色された細胞を、ＵＶフィルターを使用して蛍光顕微鏡の下で可視化した。明るく染色された細胞又は断片化された核を有する細胞を、アポトーシスを起している細胞として数えた。１ウェルあたり最低２００個の細胞を計数した。
【０１６２】
アポトーシスを起している細胞の特徴であるＤＮＡの断片化を検出するために、DeadEnd(商標)蛍光定量ＴＵＮＥＬ(Promega)を使用した。ヘキスト染色の後に、細胞スライドを蒸留水で簡単に洗浄し、そしてさらにスライドをＰＢＳ(１３７ｍＭ・ＮａＣｌ、２.６８ｍＭ・ＫＣｌ、１.４７ｍＭ・ＫＨ2ＰＯ4、８.１ｍＭ・Ｎａ2ＨＰＯ4)中に５分間二回スライドを浸し、洗浄と洗浄との間でスライドをペーパータオル上にブロットすることによりさらに洗浄した。細胞を０.２％トライトンＸ-１００を含むＰＢＳ中に５分間浸すことにより透過処理した。次に、スライドをＰＢＳ中に５分間２回浸すことにより再び洗浄し、そして洗浄と洗浄の間でペーパータオル上にスライドをブロットした。１ウェルあたり２５μｌの平衡緩衝液[２００ｍＭカコジル酸カリウム(ｐＨ６.６)、２５ｍＭトリス-ＨＣｌ(ｐＨ６.６)、０.２ｍＭジチオスレイトール、０.２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、及び２.５ｍＭ塩化コバルト]を加えて、そして５〜１０分間インキュベーションした。平衡化の間、３０μｌの反応混合液を各ウェルについて、４５：５：１の比率の平衡緩衝液、ヌクレオチドミックス[５０μＭフルオレセイン-１２-ｄＵＴＰ、１００μＭ・ｄＡＴＰ、１０ｍＭ・トリス-ＨＣｌ(ｐＨ７.６)、および１ｍＭ・ＥＤＴＡ]、及び末端デオキシヌクレオチド・トランスフェラーゼ酵素(Ｔｄｔ、２５Ｕ／μｌ)を混合することにより調製した。平衡緩衝液中でインキュベーションした後に、３０μｌの反応混合液を１ウェルあたりに加え、そしてカバーガラスを被せた。反応を暗所にて３７℃で１時間進ませた。スライドを、２×ＳＳＣ[０.３Ｍ・ＮａＣｌ、及び３０ｍＭクエン酸ナトリウム(ｐＨ７.０)]中に浸し、そして１５分間インキュベーションすることにより反応を終わらせた。スライドを次にＰＢＳ中に浸すことにより５分間３回洗浄した。ＰＢＳをキムワイプで、ウェルの周りを吸い取ることにより取り除き、そして標本培地(Oncogene Reearch Project、Ja1750-4ML)を各ウェルに加え、そしてスライドにカバーガラスを被せた。ヘキスト染色された核を計数するために、ＵＶフィルター(ＵＶ-Ｇ３６５、フィルターセット４８７９０２)を使用して、細胞を蛍光顕微鏡の下で観察した。明るく染色された核又は断片化された核を有する細胞の全てをアポトーシスを起している細胞として数えた。同じ視野を使用して、次に蛍光フィルター(グリーンH546、フィルターセット48915)を使用して観察し、そして鮮緑色の蛍光を発する核の全てをアポトーシスを起している細胞として計数した。フルオレセイン・フィルターを使用して計数された鮮緑色の核の数をＵＶフィルターの下計数された核の総数で割ることにより、視野においてアポトーシスを起している細胞の割合(％)を計算した。１ウェルあたり、最低でも２００細胞を計数した。
【０１６３】
図５４〜５７は、これらの研究の結果を示す。アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ１でトランスフェクションされたサンプルにおけるアポトーシスを起している細胞の割合(％)は、対照オリゴヌクレオチドでトランスフェクションされた細胞の場合より明らかにずっと少ない。
【０１６４】
タンパク質抽出及びウエスタン・ブロッティング
トランスフェクションされたＲＫＯ細胞由来のタンパク質を、当該細胞をＰＢＳで洗浄し、１ウェルあたり４０μｌの熱溶解緩衝液[０.５％ＳＤＳ、１ｍＭジチオスレイトール、５０ｍＭトリス-ＨＣＬ(ｐＨ８.０)]を加えることによりウエスタン・ブロット分析用に回収した。細胞を掻き剥がし、そして得られた抽出物を遠心チューブへと移し、５分間煮沸し、そして-２０℃で貯蔵した。バイオラッド・タンパク質アッセイ(Bio-Rad protein Assay)(Bio-Rad)を、製品説明書に従って使用して、タンパク質を定量した。
【０１６５】
ウエスタン・ブロッティング用に、５μｇの全タンパク質を、１２％ＳＤＳ-ポリアクリルアミド・ゲル上で分離した。分離されたタンパク質をポリビニリデン・ジフロリド膜へと転写した。次に膜をブロッキング溶液(５％スキムミルク粉末を含むＰＢＳ)中で１時間インキュベーションし、そして０.０５％Ｔｗｅｅｎ-２０／ＰＢＳ中で１５分間、３回洗浄した。膜を一晩ＰＢＳ-Ｔ中で４℃にて貯蔵した。次の日、室温に温めた後に、膜を１μｇ／ｍｌポリビニル・アルコール中で３０秒間ブロックした。膜を脱イオン水で５回洗浄し、次に５％ミルクを含む０.０２５％Ｔｗｅｅｎ-２０／ＰＢＳの溶液中で３０分間ブロッキングした。膜とインキュベーションする前に、一次抗体を５％ミルクを含む０.０２５％Ｔｗｅｅｎ-２０／ＰＢＳ中でプレインキュベーションした。
【０１６６】
幾つかの一次抗体を使用した。ｐ５３を認識するOncogeneから購入したモノクローナル抗体(Ａｂ-６)並びにヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａのｃ末端に相同性を有する合成ペプチド(アミノ-ＣＲＬＰＥＧＤＬＧＫＥＩＥＱＫＹＤ-カルボキシ)(配列番号６８)に対するポリクローナル抗体であって、トリにおいて産生された抗体(Gallus Immunotech)を使用した。抗-β-アクチン抗体(Oncogene)を使用して、等量のタンパク質をロードしたことを示した。ｐ５３に対するモノクローナル抗体を、０.０５μg／ｍｌの希釈度で使用し、アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａに対する抗体を、１：１０００の希釈度で使用し、そしてアクチンに対する抗体を１：２００００の希釈度で使用した。一次抗体で６０〜９０分間インキュベーションした後、膜を０.０５％Ｔｗｅｅｎ-２０／ＰＢＳ中で１５分間、３回洗浄した。次に、二次抗体を１％ミルクを含む０.０２５％Ｔｗｅｅｎ-２０／ＰＢＳ中に希釈し、そして膜と６０〜９０分インキュベーションした。ｐ５３(Ａｂ-６)を一次抗体として使用したとき、使用される二次抗体は、ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスＩｇＧ(Sigma)であり、１：５０００の希釈度であった。抗アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａを一次抗体として使用したとき、ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗トリＩｇＹ(Gallus Immunotech)を１：５０００の希釈度で使用した。アクチンについて使用される二次抗体は、１：５０００の希釈度で使用されるペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＭであった。二次抗体でインキュベーション後、膜をＰＢＳ-Ｔで３回洗浄した。
【０１６７】
ＥＣＬプラス・ウエスタン・ブロッティング検出キット(Amersham Pharmacia Biotech)を使用して、結合されたペルオキシダーゼ結合抗体を検出した。簡潔に記載すると、膜を軽くブロットして乾かし、次に暗所で、試薬Ａと試薬Ｂの４０：１混合体と５分間インキュベーションした。膜をブロットして乾かし、アセテートのシートの間に配置し、そして１０秒〜３０分で変化する期間、Ｘ線フィルムに露光した。膜を剥離緩衝液[１００ｍＭ・２-メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ、及び６２.５ｍＭトリス-ＨＣｌ(ｐＨ６.７)]に沈め、そして５０℃で３０分間インキュベーションすることにより、膜を剥離させた。次に膜を脱イオン水で洗浄し、そして多量の０.０５％Ｔｗｅｅｎ-２０／ＰＢＳで１０分間２回洗浄した。膜を剥離させ、そして３回再ブロットした。
【０１６８】
実施例８
ｓｉＲＮＡの構築
ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａに対する小さい阻害性のＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)を使用して、ＲＫＯ及び篩板細胞において、アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａの発現を特異的に抑制した。６種のｓｉＲＮＡを、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ(商標)ｓｉＲＮＡ構築キット(Ambion Inc)を使用してin vitro転写により作成した。４種のｓｉＲＮＡを、ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａに対して作成した(ｓｉＲＮＡ＃１〜＃４)(配列番号３０〜３３)。２種のｓｉＲＮＡ、キット内に提供されるＧＡＰＤＨに対するｓｉＲＮＡ、及びアポトーシス特異的ｅＩＦ５ＡｓｉＲＮＡ＃１(配列番号３０)の逆配列を有するが、それ自身はアポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａを標的としないｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃５)を、対照として使用した。これらのｓｉＲＮＡを製品プロトコルに従って作成した。簡潔に記載すると、Ｔ７プロモーター・プライマーとアニールさせ、そしてクレノー断片でのフィルイン反応(fill-in reaction)後に、所望のｓｉＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドを、Ｔ７ＲＮＡ・ポリメラーゼのテンプレートとして使用して、ｓｉＲＮＡの個々の鎖を作成した。センス及びアンチセンス鎖の両方について転写反応後に、反応物を混合し、そして２本のｓｉＲＮＡ鎖をアニールし、ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅで処理し、そして次にカラム精製した。ｓｉＲＮＡを作成するために使用されるＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列(Ｔ７プライマーがアニールする部位に下線を引いた)は：
【化１】
2008507278.tif 000003
であった。
【０１６９】
ｓｉＲＮＡのＲＫＯ及び篩板細胞中への取り込みをモニターするために、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ(商標)ｓｉＲＮＡ標識キット-ＦＡＭ(Ambion)を使用して、ＧＡＰＤＨのｓｉＲＮＡをＦＡＭで標識した。８ウェル培養スライド上でトランスフェクションした後に、細胞をＰＳＳで洗浄し、３.７％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中で１０分間固定した。ウェルを取り除き、そして標本培地(Vectashield)を加えた後、カバーガラスを被せた。ＦＡＭ標識ｓｉＲＮＡの取り込みは、フルオレセイン・フィルターを使用してＵＶ光の下蛍光顕微鏡下で可視化された。ＧＡＰＤＨ・ｓｉＲＮＡを製品プロトコルに従って標識した。
【０１７０】
ｓｉＲＮＡのトランスフェクション
ＲＫＯ細胞及び篩板細胞を、同じトランスフェクション・プロトコルを使用して、ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。トランスフェクションする前の日に、ＲＫＯ細胞を、８ウェル培養スライド又は２４ウェル・プレート上に、それぞれ１ウェルあたり４６０００及び１０５８００細胞密度で蒔いた。細胞集密度が４０〜７０％であるとき、篩板細胞はトランスフェクションされ、そして一般的に篩板細胞は、１ウェルあたり７５００〜１０００細胞で、トランスフェクションの３日前に８ウェル培養スライド上に蒔かれた。８ウェル培養スライドの１ウェルに十分な量のトランスフェクション培地は、２５.５ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡストックを、Ｏｐｔｉ-Ｍｅｍ(Ｓｉｇｍａ)中に最終体積２１.２μｌまで希釈することにより調製した。０.４２５μｌのリポフェクタミン２０００を終量２１.２μｌのＯｐｔｉ-Ｍｅｍに希釈し、７〜１０分間室温にてインキュベーションした。希釈されたリポフェクタミン２０００混合体を、次に希釈ｓｉＲＮＡ混合液に加え、そして室温で２０〜３０分間インキュベーションした。細胞を無血清培地で一回洗浄し、その後１３５μｌの無血清培地を細胞に加え、そして４２.４μｌのトランスフェクション培地を加えた。細胞を成長チャンバーに４時間戻した。インキュベーションの後、６５μｌの無血清培地＋３０％ＦＢＳを細胞に加えた。ウエスタン・ブロット分析について使用される細胞中へのｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、８ウェルスライドでトランスフェクションした条件と同じ条件であるが、体積を２.３倍に増加させた条件を使用して、２４ウェルプレートで行われた。
【０１７１】
トランスフェクションに続いて、ウエスタン・ブロット分析用の細胞抽出液を集める前に、ＲＫＯ及び篩板細胞を７２時間インキュベーションした。アポトーシスをブロックするアポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａに対するｓｉＲＮＡの有効性を測定するために、篩板細胞を５０μＭのカンプトテシン(Sigma)及び１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ-α(Leinco Technologies)で処理して、トランスフェクション後４８又は７２時間でアポトーシスを誘導した。アポトーシスを起している細胞の割合(％)を測定するために、２４又は４８時間後で、細胞をヘキストで染色した。
【０１７２】
実施例９
ＨｅｐＧ２のＴＮＦ-α産生の定量
ＨｅｐＧ２細胞を、１ウェルあたり２００００細胞で、４８ウェルプレートに蒔いた。７２時間後、培地を取り除き、そして、２.５μＭの対照アンチセンス・オリゴヌクレオチド又は２.５μＭアンチセンス・オリゴヌクレオチドｅＩＦ５Ａ１＃２を含む新たな培地を細胞に加えた。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを含む新たな培地を、２４時間後に加えた。オリゴヌクレオチドと合計４８時間のインキュベーションの後、培地をインターロイキン１β(ＩＬ-１β、１０００ｐｇ／ｍｌ；Leinco Technologies)を含む培地と置き換え、そして６時間インキュベーションした。ＴＮＦ-α定量用に培地を回収し、そして凍結した(-２０℃)。未処理の細胞(アンチセンス・オリゴヌクレオチド及びＩＬ-１βを含まない)及びＩＬ-１βのみで処理された細胞との、平行して行った更なるインキュベーションを、対照に使用した。全ての処理を二回行った。培地中に放出されたＴＮＦ-αを、製品プロトコルに従ってＥＬＩＳＡアッセイ(Assey Designs Inc)により計測した。
【０１７３】
実施例１０
以下の実験により、アンチセンス・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａヌクレオチドが、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ並びにｐ５３の発現を阻害できることが示される。
【０１７４】
ＲＫＯ細胞をトランスフェクションしないままにするか、モック・トランスフェクションするか、又は２００ｎＭのアンチセンス・オリゴヌクレオチド・アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ＃１、＃２、又は＃３(配列番号２５、２６、及び２７)でトランスフェクションした。ＲＫＯ細胞を１００ｎＭのアンチセンス・オリゴヌクレオチドアポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ＃２(配列番号２６)でトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を０.２５μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤで処理した。２４時間後、細胞抽出液を回収し、そして各サンプル由来の５μｇのタンパク質を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜へ転写し、そしてアポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａに対する抗体を用いてウエスタン・ブロットした。化学発光検出後、膜を剥離し、そしてｐ５３に対する抗体を用いて再プローブした。化学発光検出の後、膜を再び剥離し、そしてアクチンに対する抗体で再プローブした。図５２は、(アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対する)アンチセンスオリゴ１、２、及び３(それぞれ配列番号２５、２６、及び２７)で処理された後、ＲＫＯ細胞により産生されるタンパク質のレベルを示す。ＲＫＯ細胞は、アンチセンス・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａヌクレオチドでトランスフェクションされた後では、より少ない量のアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ並びにより少ない量のｐ５３を産生した。
【０１７５】
実施例１１
以下の実験により、アンチセンスアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａヌクレオチドがアポトーシスを低減することができるということが示される。
１の実施態様では、篩板細胞系列＃５０６は、(Ａ)オリゴフェクタミン・トランスフェクション試薬を使用して、１００ｎＭのＦＩＴＣ標識されたアンチセンス・オリゴヌクレオチドでトランスフェクションされるか、又は(Ｂ)無血清培地中に直接希釈される１０μＭの剥き出しのＦＩＴＣ標識アンチセンス・オリゴヌクレオチドでトランスフェクションされた。２４時間後、１０％ＦＢＳを含む新たな培地及び１０μＭに希釈される新たなアンチセンス・オリゴヌクレオチドを、細胞に加えた。細胞、(Ａ)及び(Ｂ)を合計で４８時間後に固定し、そしてフルオレセイン・フィルターを使用して、ＵＶ光の下で蛍光顕微鏡上で可視化した。図５３は、蛍光標識されたアンチセンス・オリゴヌクレオチドの取り込みを示す。
【０１７６】
他の実験において、篩板細胞系列＃５０６を、１０μＭの対照アンチセンス・オリゴヌクレオチド又はアンチセンス・オリゴヌクレオチドアポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ＃２(配列番号２６)で、合計４日間トランスフェクションした。アンチセンス・オリゴヌクレオチド処理を開始後４８時間で、細胞を２０μＭ又は４０μＭのカンプトテシンで４８時間処理した。アンチセンス・オリゴヌクレオチド及びカンプトテシンを含む培地を、毎日交換した。アポトーシスを起こしている細胞の割合(％)を、細胞をヘキスト及びＴＵＮＥＬで標識することにより測定した。図５４を参照のこと。
【０１７７】
別の実験では、篩板細胞系列＃５０６を、１０μＭの対照アンチセンス・オリゴヌクレオチド又はアンチセンス・オリゴヌクレオチドアポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ＃２(配列番号２６)でトランスフェクションした。２４時間後、培地を交換し、そして新たなアンチセンス・オリゴヌクレオチドを加えた。アンチセンス・オリゴヌクレオチド処理を始めた４８時間後において、アンチセンス・オリゴヌクレオチドを取り除き、そして細胞を２０μＭカンプトテシンで３日間処理した。カンプトテシンを含む培地を毎日交換した。アポトーシスを起している細胞の割合(％)を、細胞をヘキスト及びＴＵＮＥＬで標識することにより測定した。図５５を参照のこと。
【０１７８】
さらに別の実験において、篩板細胞系列＃５１７を１μＭの対照アンチセンス・オリゴヌクレオチド又はアンチセンス・オリゴヌクレオチド・アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ＃２(配列番号２６)で、合計５日間トランスフェクションした。アンチセンス・オリゴヌクレオチド処理を開始後４８時間で、細胞を２０μＭカンプトテシンで３又は４日間処理した。アンチセンス・オリゴヌクレオチド及びカンプトテシンを含む培地を毎日交換した。アポトーシスを起こしている細胞の割合(％)を細胞をヘキスト及びＴＵＮＥＬで標識することにより測定した。図５６を参照のこと。
【０１７９】
別の実験では、篩板細胞系列＃５１７を、２.５μＭの対照アンチセンス・オリゴヌクレオチド又はアンチセンス・オリゴヌクレオチドアポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ＃２で、合計５日間トランスフェクションした。アンチセンス・オリゴヌクレオチド処理を開始後４８時間で、細胞を４０μＭのカンプトテシンで３日間処理した。アンチセンス・オリゴヌクレオチド及びカンプトテシンを含む培地を毎日交換した。アポトーシスを起している細胞の割合(％)を、細胞をヘキストで標識することにより計測した。図５７を参照のこと。
【０１８０】
別の実験では、篩板細胞系列＃５１７を１μＭ又は２.５μＭのいずれかの対照アンチセンス・オリゴヌクレオチド又はアンチセンス・オリゴヌクレオチド・アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ＃２(配列番号２６)で合計５日間トランスフェクションした。アンチセンス・オリゴヌクレオチド処理を開始後４８時間で、細胞を４０μＭカンプトテシンで３日間処理した。アンチセンス・オリゴヌクレオチド及びカンプトテシンを含む培地を毎日交換した。アポトーシスを起している細胞の割合(％)を細胞をヘキストで標識することにより検出した。図５８を参照のこと。
【０１８１】
別の実験では、篩板細胞＃５１７を未処理のままにするか、或いは１０ｎｇ／ｍｌ・ＴＮＦ-α、５０μＭカンプトテシン、又は１０ｎｇ／ｍｌ・ＴＮＦ-α及び５０μＭカンプトテシンで処理した。アポトーシスを起している細胞の割合を、細胞をヘキストで標識することにより測定した。図５９を参照のこと。
【０１８２】
別の実験では、篩板細胞系列＃５０６及び＃５１７を２.５μＭ又は５μＭのいずれかの対照アンチセンス・オリゴヌクレオチド又はアンチセンス・オリゴヌクレオチドアポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ＃２(配列番号２６)のいずれかで合計２日間トランスフェクションした。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを含む新たな培地を２４時間後に加えた。アンチセンス・オリゴヌクレオチドの開始後４８時間で、細胞を５０μＭのカンプトテシン及び１０ｎｇ／ｍｌ・ＴＮＦ-αで２日間処理した。アポトーシスを起している細胞の割合(％)を、細胞をヘキストで標識することにより測定した。図６０を参照のこと。
【０１８３】
別の実験では、篩板細胞系列＃５０６、＃５１７、及び＃５２４を、２.５μＭの対照アンチセンス・オリゴヌクレオチド又はアンチセンス・オリゴヌクレオチドアポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ＃２(配列番号２６)のいずれかで、合計２日間トランスフェクションした。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを含む新たな培地を、２４時間後に加えた。アンチセンス・オリゴヌクレオチド処理を開始後４８時間で、細胞を５０μＭカンプトテシン及び１０ｎｇ／ｍｌＴＮＦ-αで２日間処理した。アポトーシスを起している細胞の割合(％)を、細胞をヘキストで標識することにより測定した。図６１を参照のこと。
【０１８４】
実施例１２
以下の実験により、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａを標的としたｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞が、より少ない量のアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａを発現することが示された。当該実験はまた、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａを標的としたｓｉＲＮＡが、アポトーシスを低減することができるいうことを示す。
【０１８５】
一の実験では、篩板細胞系列＃５１７を、トランスフェクションの間、血清有り(Ａ)又は血清なし(Ｂ)のリポフェクタミン２０００・トランスフェクション試薬を使用して、１００ｎＭ・ＦＡＭ標識ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。(Ａ)及び(Ｂ)の細胞を、合計２４時間後に固定し、そしてフルオレセイン・フィルターを使用するＵＶ光の下で蛍光顕微鏡上で可視化した。図６２を参照のこと。
【０１８６】
別の実験では、ＲＫＯ細胞を、トランスフェクションの間血清の存在又は非存在下のいずれかで、１００ｎＭ・ｓｉＲＮＡとトランスフェクションした。６種のｓｉＲＮＡ、つまり２個の対照ｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃５(配列番号３４)及びＧＡＰＤＨに対して標的されたｓｉＲＮＡ)と４種のアポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａを標的としたｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃１〜＃４)(配列番号３０〜３３)をトランスフェクションした。トランスフェクションの７２時間後、細胞抽出液を回収し、そして各サンプルからの５μｇのタンパク質を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、そしてアポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａに対する抗体でウエスタン・ブロットした。化学発光検出の後、膜を剥離し、そしてｂｃｌ-２に対する抗体で再プローブした。化学発光検出の後に、膜を再び剥離し、そしてアクチンに対する抗体で再プローブした。図６３を参照のこと。
【０１８７】
別の実験では、篩板細胞系列＃５０６及び＃５１７を、１００ｎＭのｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。６種のｓｉＲＮＡ、つまり２種の対照ｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃５(配列番号３４)及びＧＡＰＤＨを標的とするｓｉＲＮＡ)及び４種のアポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａを標的とするｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃１〜＃４)(配列番号３０〜３３)をトランスフェクションした。トランスフェクションの７２時間後、細胞抽出液を回収し、そして各サンプル由来の５μｇのタンパク質を、ＳＡＳ-ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜へと転写し、そしてアポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａに対する抗体でウエスタン・ブロットした。化学発光検出の後に、膜を剥離し、そしてアクチンに対する抗体で再プローブした。図６４を参照のこと。
【０１８８】
別の実験では、篩板細胞系列＃５０６を１００ｎｍのｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。６種のｓｉＲＮＡ、つまり２種の対照ｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃５(配列番号３４)及びＧＡＰＤＨを標的とするｓｉＲＮＡ)及び４種のアポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａを標的とするｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃１〜＃４)(配列番号３０〜３３)をトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、培地を５０μＭカンプトテシン及び１０ｎｇ／ｍｌ・ＴＮＦ-αを含む培地と置換した。２４時間後、アポトーシスを起している細胞の割合(％)を、細胞をヘキストで標識することにより測定した。図６５を参照のこと。
【０１８９】
別の実験では、篩板細胞系列＃５０６を、１００ｎｍのｓｉＲＮＡとトランスフェクションした。６種のｓｉＲＮＡ、つまり２種の対照ｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃５(配列番号３４)及びＧＡＰＤＨを標的とするｓｉＲＮＡ)及び４種のアポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａを標的とするｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃１〜＃４)(配列番号３０〜３３)でトランスフェクションした。トランスフェクションの７２時間後、培地を５０μＭのカンプトテシン及び１０ｎｇ／ｍｌ・ＴＮＦ-αを含む培地と置き換えた。２４時間後、アポトーシスを起こしている細胞の割合(％)を、細胞をヘキストで標識することにより測定した。図６６を参照のこと。
【０１９０】
別の実験では、篩板細胞系列＃５０６をトランスフェクションされないままにするか、又は１００ｎｍのｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。６種のｓｉＲＮＡ、つまり２種の対照ｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃５(配列番号３４)及びＧＡＰＤＨを標的とするｓｉＲＮＡ)及びアポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａを標的とする４種類のｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃１〜＃４)(配列番号３０〜３３)をトランスフェクションした。トランスフェクションの７２時間後、培地を５０μＭカンプトテシン及び１０ｎｇ／ｍｌ・ＴＮＦ-αを含む培地と置き換えた。新たな培地をトランスフェクションされていない、未処理対照細胞に加えた。４８時間後、アポトーシスを起こしている細胞の割合(％)を、細胞をヘキストで標識することにより測定した。図６７を参照のこと。
【０１９１】
図６７及び実施例１３に記載された実験からえられた、ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされ、そしてカンプトテシン及びＴＮＦαで処理された篩板細胞系列＃５０６であってヘキスト染色されたものの写真が、図６８に与えられる。
【０１９２】
実施例１３
ヒト細胞系列をアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドで処理することにより、細胞のＴＮＦ-αの産生が少なくなることが本実施例により示される。
ＨｅｐＧ２細胞を、合計２日間、２.５μＭの対照アンチセンス・オリゴヌクレオチド又はアンチセンス・オリゴヌクレオチドｅＩＦ５Ａ１＃２で処理した。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを含む新たな培地を、２４時間後に加えた。さらなる細胞を２日間未処理のまま置いておいた。処理の開始後４８時間で、細胞をＩＬ-１β(１０００ｐｇ／ｍｌ)で６時間処理した。実験の終わりに、ＴＮＦ-α定量用に、培地を回収し、そして冷凍した(-２０℃)。培地中に放出されるＴＮＦ-αを、Assay Designs Inc.から購入したＥＬＩＳＡアッセイを使用して計測した。図６９を参照のこと。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａのアンチセンス・オリゴヌクレオチドでトランスフェクションされた細胞は、より少ないＴＮＦ-αしか産生しなかった。
【０１９３】
実施例１４
ＨＴ-２９細胞(ヒト大腸腺癌)を、アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａに対するｓｉＲＮＡ又は逆配列を有する対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。使用されたｓｉＲＮＡは、以下の通りである。
６９０位(３’ＵＴＲ)％Ｇ／Ｃ＝４８
５’ＡＡＧＣＵＧＧＡＣＵＣＣＵＣＣＵＡＣＡＣＡ３’(配列番号７９)
使用された対照ｓｉＲＮＡは以下のとおりである。
％Ｇ／Ｃ＝３９
５’ＡＡＡＣＡＣＡＵＣＣＵＣＣＵＣＡＧＧＵＣＧ３’(配列番号８０)
【０１９４】
４８時間後、細胞をインターフェロン-γ(ＩＦＮ-γ)で１６時間処理した。１６時間後、細胞を新たな培地で洗浄し、そしてリポ多糖(ＬＰＳ)で８又は２４時間処理した。各時間点において(８又は２４時間)、細胞培養培地を細胞から取り除き、冷凍し、そして培地中に存在するＴＮＦ-αを、ＥＬＩＳＡにより定量した。細胞ライセートを回収し、タンパク質について定量し、そしてＴＮＦ-α値を、ｐｇ／ｍｇタンパク質へと調節した(異なるウェルにおける細胞数の差を調節した)。ウエスタン・ブロット及びＥＬＩＳＡの結果を図７４Ａ及びＢに提供する。図７５は、細胞が高密度であることを除いて同じである実験の結果である。
【０１９５】
実施例１５
Ｕ-９３７細胞系列の組織培養条件
Ｕ-９３７は、懸濁状態で成長し、そしてＰＭＡで刺激された際に、接着を開始し、そしてマクロファージへと分化するヒト単球細胞系列(ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ-１５９３.２)である(これらの細胞はＡＴＣＣから直接得たものではない)。細胞を、２ｍＭ・Ｌ-グルタミン、１.５ｇ/Ｌ炭酸水素ナトリウム、４.５ｇ/Ｌグルコース、１０ｍＭ・ＨＥＰＥＳ、１.０ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０内で、３７℃・ＣＯ2(５％)のインキュベーター内にて維持した。週に二回細胞を新たな培地に分け(分割比１：４又は１：５)、そして細胞密度をつねに１０5及び２×１０6細胞/ｍｌの間に維持した。細胞を、組織培養処理Ｔ２５フラスコ中で、懸濁状態で培養し、そして実験を２４ウェル・プレート内で行った。
【０１９６】
タイムコース実験
実験の開始２日前に、細胞密度を、３×１０5細胞／ｍｌ培地に調節した。実験の日に、細胞を対数期で回収した。細胞懸濁液を１５ｍｌチューブに移し、そして４００×ｇで１０分間、室温で遠心した。上清を吸引し、そして細胞ペレットを新たな培地で洗浄／再懸濁した。細胞を再び４００×ｇで１０分間遠心し、上清を吸引し、そして細胞ペレットを最終的に新たな培地で最終的に再懸濁した。等量の細胞懸濁液及びトリパン／ブルー溶液(０.４％トリパン・ブルー色素を含むＰＢＳ)を混合し、そして血球計数板及び顕微鏡を使用して生細胞を計数した。細胞を４×１０5細胞／ｍｌに希釈した。
【０１９７】
ＰＭＡ又はＤＭＳＯ(溶媒対照)のいずれかを各ウェルに加えることにより、２４ウェル・プレートを準備した。１ｍｌの細胞懸濁液を各ウェルに加え、その結果各ウェルは、４００,０００細胞、０.１％ＤＭＳＯ＋／-１６２ｎＭ・ＰＭＡを含んだ。３７℃・ＣＯ2(５％)インキュベーター内で細胞を維持した。区分けされたウェルの細胞を、０、２４、４８、７２、９６、９９及び１０２時間で回収した。実験時間及び添加の要約について、図７６を参照のこと。
【０１９８】
培地を７２時間で交換した。幾つかの細胞が接着し、そして残りは懸濁状態であったので、接着細胞がバラバラになることを避けるために注意を払った。各ウェルからの培地を注意深く対応するマイクロ遠心チューブに移し、そしてチューブを１４０００×ｇで３分間遠心した。チューブを吸引処理し、細胞ペレットを、新たな培地(１ｍｌ、(-)ＤＭＳＯ、(-)ＰＭＡ)中で懸濁し、そしてそれらの元のウェルに戻した。細胞は、ＰＭＡを伴わない新たな培地中において静止状態となった。９６時間で、ＬＰＳ(１００ｎｇ／ｍｌ)を加え、そして細胞を３時間後(９９時間)及び６時間後(１０２時間)に回収した。
【０１９９】
その時点で、懸濁細胞及び培地を各ウェルからマイクロ遠心チューブ中に移した。細胞を１４０００×ｇで３分間ペレット化した。培地(上清)をきれいなチューブに移し、そしてＥＬＩＳＡ／サイトカイン分析用に貯蔵した(-２０℃)。ウェル内に残っている細胞をＰＢＳで洗浄し(１ｍｌ、３７℃)、そしてこのＰＢＳを使用して、対応するマイクロ遠心チューブ内の細胞ペレットを洗浄した。細胞を、１４０００×ｇ、３分間で再びペレット化した。細胞を煮沸溶解緩衝液(５０ｍＭ・トリスｐＨ７.４及び２％ＳＤＳ)で溶解した。各ウェルからの接着細胞及び懸濁細胞を取っておいた。サンプルを煮沸し、そして次に-２０℃で貯蔵した。
【０２００】
ウエスタン・ブロット
各細胞サンプルにおけるタンパク質濃度を、ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)を標準タンパク質として使用して、ＢＣＡ(ビシンコニン酸)法により測定した。タンパク質サンプル(５μｇ全量タンパク質)を１２％ＳＤＳ-ＰＡＧＥ電気泳動により分離し、そしてＰＶＤＦ膜へと転写した。膜をポリビニル・アルコール(１μｇ／ｍｌ、３０秒)でブロッキングし、そして５％スキム・ミルクを含むＰＢＳ-ｔ(１時間)ブロッキングした。膜を、ヒトｅＩＦ-５Ａに対するマウス・モノクローナル抗体(ＢＤ Biosciences cat＃611976；５％スキムミルクを含むPBS-t中1：20,000で１時間)でプローブした。膜をＰＢＳ-ｔで３×１０分洗浄した。二次抗体は、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体(Sigma、１：５０００、１％スキムミルク、１時間)であった。タンパク質のバンドを、化学発光により可視化した(ＥＣＬ検出システム、Amersham Pharmacia Biotech)。
【０２０１】
同等の量のタンパク質を各ゲル・レーンにロードしたことを示すために、膜を剥離し、そしてアクチンについて再プローブ化した。膜を剥離し(１００ｍＭ・２メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ、６２.５ｍＭトリス-ＨＣｌ・ｐＨ６.７；５０℃で３０分間)、洗浄し、次に上記のようにブロッキングした。膜をアクチン・一次抗体(マウス中で作成したアクチン・モノクローナル抗体；Oncogene, Ab-1；５％スキムミルク中に１：２０,０００)でプローブした。二次抗体、洗浄、及び検出は上記と同様であった。
【０２０２】
図７７は、アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａが、単球(Ｕ-３９７)が分化する間上方制御され、そしてその後にＴＮＦ-αが分泌されることを示す。
【０２０３】
実施例１６：アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ・ｓｉＲＮＡによるインターフェロンγに応答したＩｌ-８産生の抑制
ＨＴ-２９(ヒト結腸腺癌)細胞を、アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａに対するｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。トランスフェクションの約４８時間後に培地を交換し、幾つかの試験サンプルは、インターフェロン・ガンマを伴う培地を有し、そして幾つかのサンプルはインターフェロン・ガンマを伴わない培地を有するようにした。インターフェロン・ガンマの添加後１６時間で細胞を洗浄し、そしてＴＮＦ-αを伴うか又は伴わない培地を細胞に加えた。(ＩＬ-８のＥＬＩＳＡ検出に使用する)培地及び細胞ライセートを、８時間後又は２４時間後に回収した。
【０２０４】
図７９及び８０は、ＩＬ-８がＴＮＦ-αに応答して、並びにインターフェロンに応答して産生されることを示す。ＴＮＦ処理の前に、インターフェロン-γで細胞を刺激することにより、細胞は、単独の処理より多くのＩＬ８を産生するようになる。これは、インターフェロンに応答して生じるＴＮＦ受容体の既知の上方制御のために生じるようである。それゆえ、当該細胞をインターフェロンで「刺激」することによって、当該細胞がより多くの受容体を有するようになるので、細胞がＴＮＦにより応答しやすくなる。アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａに対するｓｉＲＮＡは、ＴＮＦのみに応答したＩＬ-８の産生に影響を与えることはない(前述の実験)が、当該ｓｉＲＮＡは、インターフェロンに応答して産生されたほとんど全てのＩＬ-８、並びにインターフェロン及びＴＮＦの併用処理の結果として産生されたＩＬ-８のかなりの量を阻害した。これらの結果により、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡを使用することによって、ＩＬ-８を導くが、ＴＮＦ経路を導かないインターフェロン・シグナル伝達経路を有することが分かった。図８１は、ＨＴ-２９細胞においてインターフェロンγに応答するアポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａの上方制御(８時間で４倍)を示すウエスタンである。
【０２０５】
実施例１７
ヒト篩板細胞培養
ヒトの両目を、Canada, Ontario Divisionのアイバンクから死後４８時間以内に得た。(付着された極を伴う)視神経乳頭を取り出し、そして抗生物質／抗真菌剤、グルタミン、及び１０％ＦＢＳを含むダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ)中に３時間置いた。視神経乳頭(ＯＮＨ)ボタンを、各組織サンプルから回収し、そして解剖ハサミで細かく切って、４の小片にした。移植片を１２.５ｃｍ2プラスチック製培養フラスコ内のＤＭＥＭ培地中で培養した。生育できた移植片について１月間成長を観測した。細胞が９０％コンフルエントに達すると、トリプシン処理され、そして分離継代培養に供して、篩板(ＬＣ)及び星状細胞集合を産生した。ＬＣ細胞を、ゲンタマイシン、グルタミン、及び１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭを入れた２５ｃｍ2フラスコ内で継代することにより濃縮した。このプロトコルに従って細胞を維持し、そして継代培養した。
【０２０６】
分離継代培養により得た細胞の身元及び集合均一性を、８ウェル培養スライド上で染色する判別用蛍光抗体を使用して特徴づけした。細胞を１０％ホルマリン溶液中で固定し、そしてダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩水(ＤＰＢＳ)で３回洗浄した。２％脱脂乳を含むＤＰＢＳでブロッキングしたのちに、抗体を１％ＢＳＡを含むＤＰＢＳ中で希釈し、そして６個のウェルに加えた。残った２個のウェルを、１％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)溶液のみで、及び対照として二次抗体のみで処理した。細胞を、一次抗体で、１時間室温でインキュベーションし、そしてＤＰＢＳで３階洗浄した。適切な二次抗体を１％ＢＳＡを含むＤＰＢＳ中に希釈し、各ウェルに加え、そして１時間インキュベーションした。ＤＰＢＳでの洗浄に続き、スライドを水で洗浄し、風乾し、そして蛍光標本培地 (Vector Laboratories)を各スライドに重層した。免疫蛍光染色を、適切なフィルターを備える蛍光顕微鏡の下で観察し、そして一次抗体で処理されていない対照ウェルと比較した。全ての一次抗体を、他に記載がない限りSigma社から得た。全ての二次抗体をMolecular Prove社から購入した。ＬＣ細胞を同定するために使用される一次抗体は、抗-コラーゲンＩ、抗-コラーゲンＩＶ、抗ラミニン、及び抗-細胞フィブロネクチン、抗グリア線維酸性タンパク質(ＧＦＡＰ)、及び抗アルファ-平滑筋アクチンであった。細胞集合が、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ラミニン、細胞フィブロネクチン、α平滑筋アクチンについて陽性に染色され、かつグリア線維(ＧＦＡＰ)について陰性に染色される場合、細胞集合はＬＣ細胞から構成されるということが確定される。この試験において、２セットのヒトの目を使用して、培養を開始する。ＬＣ細胞系列＃５０６及び＃５１７を、８３歳男性及び１７歳男性の視神経乳頭からそれぞれ確立した。全てのＬＣ細胞系列は、十分に特徴付けられており、そして９０％を超えるＬＣ細胞を含むことが分かった。
【０２０７】
ＬＣ細胞の処理
５０μＭのカンプトテシン(Sigma)及び１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ-α(Leinco Technologies)の組合せを使用して、篩板細胞にアポトーシスを誘導した。カンプトテシン及びＴＮＦ-αの組合せは、アポトーシスを誘導する点で、カンプトテシン又はＴＮＦ-αいずれかのみより有効であることが分かった。
【０２０８】
ｓｉＲＮＡの構築及びトランスフェクション
ヒトｅＩＦ５Ａ１に対する低分子抑制ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)を使用して、篩板細胞において、ｅＩＦ５Ａ１の発現を特異的に抑制した。６種のｓｉＲＮＡを、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ(商標)ｓｉＲＮＡ構築キット(Ambion Inc)を使用してin vitro転写により作成した。４種のｓｉＲＮＡを、ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ(ｓｉＲＮＡ＃１〜＃４)に対して作成した(ｓｉＲＮＡ(＃１〜＃４)。２種のｓｉＲＮＡ、キット内に提供されるＧＡＰＤＨに対するｓｉＲＮＡ、及びアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡ＃１の逆配列を有するが、それ自身はアポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａを標的としないｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃５)を、対照として使用した。ｓｉＲＮＡを製品プロトコルに従って作成した。アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ及び対照ｓｉＲＮＡ標的は、以下の配列：
ｓｉＲＮＡ＃１  ５’ＡＡＡＧＧＡＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＡ３’(配列番号８１)；
ｓｉＲＮＡ＃２  ５’ＡＡＧＡＴＣＧＴＣＧＡＧＡＴＧＴＣＴＡＣＴ３’(配列番号８２)；
ｓｉＲＮＡ＃３  ５’ＡＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴＧＧＴＴＧＧＴＡＴＴ３’(配列番号８３)；
ｓｉＲＮＡ＃４  ５’ＡＡＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＡＣＡ３’(配列番号８４)；
ｓｉＲＮＡ＃５  ５’ＡＡＡＧＴＣＧＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＡＧＧＡ３’(配列番号８５)
を有した。リポフェクタミン２０００を使用してｓｉＲＮＡを篩板細胞にトランスフェクションした。
【０２０９】
細胞集密度が４０〜７０％であるときに篩板細胞はトランスフェクションされ、そして一般的に篩板細胞は、１ウェルあたり７５００細胞で、トランスフェクションの３日前に８ウェル培養スライド上に蒔かれた。８ウェル培養スライドの１ウェルに十分な量のトランスフェクション培地は、２５.５ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡを、Ｏｐｔｉ-Ｍｅｍ(Ｓｉｇｍａ)中に最終体積２１.２μｌまで希釈することにより調製した。０.４２５μｌのリポフェクタミン２０００を終量２１.２μｌのＯｐｔｉ-Ｍｅｍに７〜１０分間室温にてインキュベーションした。希釈されたリポフェクタミン２０００混合物を、次に希釈されたｓｉＲＮＡ混合液に加え、そして室温で２０〜３０分間インキュベーションした。細胞を無血清培地で一回洗浄し、その後１３５μｌの無血清培地を細胞に加え、そして４２.４μｌのトランスフェクション培地を加えた。細胞を成長チャンバーに４時間戻した。インキュベーションの後、６５μｌの無血清培地＋３０％ＦＢＳを細胞に加えた。ウエスタン・ブロット分析について使用される細胞中へのｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、８ウェルスライドでトランスフェクションした条件と同じ条件であるが、体積を２.３倍に増加させた条件を使用して、２４ウェルプレートで行われた。トランスフェクションの後に、篩板細胞を７２時間インキュベーションし、次に５０μＭのカンプトテシン(Ｓｉｇｍａ)及び１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ-α(Leinco Technologies)で処理してアポトーシスを誘導した。細胞ライセートを次にウエスタンブロッティング用に回収するか、又は細胞をアポトーシスについて試験した。
【０２１０】
アポトーシス細胞の検出
アポトーシスを起している細胞の割合(％)を測定するために、トランスフェクションされた細胞であって、ＴＮＦ-α及びカンプトテシンで２４時間処理された細胞をヘキスト３３２５８で染色した。簡潔に記載すると細胞を、３：１の無水メタノール及び氷酢酸の混合液で固定し、次にヘキスト染色液 (０.５μｇ／ｍｌへキスト３３２５８を含むＰＢＳ)を加えた。暗所で１０分間インキュベーションした後に、染色溶液を捨て、培養スライドのウェルを区切るチャンバーを取り除き、そしてスライドを１分間脱イオン水で３回洗浄した。洗浄後、数滴のマックルバイン緩衝液(０.０２１Ｍクエン酸、０.０５８Ｍ・Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ；ｐＨ５.６)を細胞に加え、そしてカバーガラスを被せた。染色された細胞を、ＵＶフィルターを使用して蛍光顕微鏡の下で可視化した。明るく染色された細胞又は断片化された核を有する細胞を、アポトーシスを起している細胞として数えた。１ウェルあたり最低２００個の細胞を計数した。アポトーシスを起している細胞の特徴であるＤＮＡの断片化を検出するために、DeadEnd蛍光定量ＴＵＮＥＬ(Promega)も使用した。ヘキスト染色の後に、細胞スライドを蒸留水で簡単に洗浄し、そしてさらにスライドをＰＢＳ(１３７ｍＭ・ＮａＣｌ、２.６８ｍＭ・ＫＣｌ、１.４７ｍＭ・ＫＨ2ＰＯ4、８.１ｍＭ・Ｎａ2ＨＰＯ4)中に５分間二回スライドを浸し、洗浄と洗浄との間でスライドをペーパータオル上にブロットした。細胞を０.２％トリトンＸ-１００を含むＰＢＳ中に５分間浸すことにより透過処理した。次に、スライドをＰＢＳ中に５分間２回浸すことにより再び洗浄し、そして洗浄と洗浄の間でペーパータオル上にスライドをブロットした。１ウェルあたり２５μｌの平衡緩衝液[２００ｍＭカコジル酸カリウム(ｐＨ６.６)、２５ｍＭトリス-ＨＣｌ(ｐＨ６.６)、０.２ｍＭジチオスレイトール、０.２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、及び２.５ｍＭ塩化コバルト]を加えて、そして５〜１０分間インキュベーションした。平衡化の間、３０μｌの反応混合液を各ウェルについて、４５：５：１の比率の平衡緩衝液、ヌクレオチドミックス[５０μＭフルオレセイン-１２-ｄＵＴＰ、１００μＭ・ｄＡＴＰ、１０ｍＭ・トリス-ＨＣｌ(ｐＨ７.６)、および１ｍＭ・ＥＤＴＡ]、及び末端デオキシヌクレオチド・トランスフェラーゼ酵素(Ｔｄｔ、２５Ｕ／μｌ)を混合することにより調製した。平衡緩衝液中でインキュベーションした後に、３０μｌの反応混合液を１ウェルあたりに加え、そしてカバーガラスを被せた。反応を暗所にて３７℃で１時間進ませた。スライドを、２×ＳＳＣ[０.３Ｍ・ＮａＣｌ、及び３０ｍＭクエン酸ナトリウム(ｐＨ７.０)]中に浸し、そして１５分間インキュベーションすることにより反応を終わらせた。スライドを次にＰＢＳ中に浸すことにより５分間３回洗浄した。ＰＢＳをキムワイプでウェルの周りを吸い取ることにより取り除き、そして標本培地(Oncogene Reearch Project、Ja1750-4ML)を各ウェルに加え、そしてスライドにカバーガラスを被せた。ヘキスト染色された核を計数するために、ＵＶフィルター(ＵＶ-Ｇ３６５、フィルターセット４８７９０２)を使用して、細胞を蛍光顕微鏡の下で観察した。明るく染色された核又は断片化された核を有する細胞の全てをアポトーシスを起してい��細胞として数えた。同じ視野を使用して、次に蛍光フィルター(グリーンH546、フィルターセット48915)を使用して観察し、そして鮮緑色の蛍光を発する核の全てをアポトーシスを起している細胞として計数した。フルオレセイン・フィルターを使用して計数された鮮緑色の核の数をＵＶフィルターの下計数された核の総数で割ることにより、視野においてアポトーシスを起している細胞の割合(％)を計算した。１ウェルあたり、最低でも２００細胞を計数した。
【０２１１】
タンパク質抽出及びウエスタン・ブロット分析
細胞をＰＢＳ(８ｇ/Ｌ・ＮａＣｌ、０.２ｇ/Ｌ・ＫＣｌ、１.４４ｇ/Ｌ・Ｎａ2ＨＰＯ4、及び０.２４ｇ/Ｌ・ＫＨ2ＰＯ4)中で２回洗浄し、次に５０μｌの溶解緩衝液[２％ＳＤＳ、５０ｍＭトリス-ＨＣｌ(ｐＨ７.４)]を加えることにより、２４ウェル・プレート内で成長している篩板細胞からタンパク質をウエスタン・ブロッティング用に単離した。細胞ライセートをマイクロ遠心チューブ内に回収し、５分間煮沸し、そして-２０℃で使用するまで貯蔵した。タンパク質濃度を、ビシンコニン酸キット(ＢＣＡ；Sigma)を使用して測定した。ウエスタン・ブロッティング用に、５μｇの全タンパク質を、１２％ＳＤＳ-ポリアクリルアミド・ゲル上で分離した。分離したタンパク質を、ポリビニリデン・ジフロリド膜に転写した。該膜を次に１時間、ブロッキング溶液(５％スキムミルク粉末、０.０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ)中でインキュベーションし、そしてＰＢＳ-Ｔ(ＰＢＳ+０.０５％Ｔｗｅｅｎ-２０)で１５分間３回洗浄した。膜を一晩ＰＢＳ-Ｔ中で、４℃で保存した。次の日に室温まで温め、膜を３０秒間１μｇ/ｍｌのポリビニル・アルコール中でブロッキングした。膜を脱イオン水で５回洗浄し、そしてＰＢＳ中の５％ミルクの溶液中で３０分間ブロッキングした。一次抗体をＰＢＳ中５％ミルクの溶液中で、膜とインキュベーションする前に、３０分間プレインキュベーションした。使用された一次抗体は、１：２００００での抗-ｅＩＦ５Ａ(ＢＤ Transduction Laboratories)及び抗β-アクチン(Oncogene)であった。膜をＰＢＳ-Ｔ中で３回洗浄し、そして１％ミルクを含むＰＢＳ中に希釈された適切なＨＲＰ-結合二次抗体と１時間インキュベーションした。ブロットを洗浄し、そしてＥＣＬプラス・ウエスタン・ブロッティング検出キット(Amersham Pharmacia Biotech)を使用して、結合されたペルオキシダーゼ結合抗体を検出した。
【０２１２】
結果
２種の篩板細胞(ＬＣ)細胞系列を、８３歳(＃５０６)〜１７歳(＃５１７)の範囲の男性ドナーから得た視神経乳頭から樹立した。ヒト篩板から単離された細胞は、他の研究で観察された目立った核を有する広く平らな形態を有した(Lambert et al., 2001)。他の群の性質決定と一致して、ＬＣ細胞は、α平滑筋アクチン(図８２ａ)、並びに多くの細胞外マトリックスタンパク質、例えば細胞フィブロネクチン(図８２ｂ)、ラミニン(図８２ｃ)、コラーゲンＩ及びコラーゲンＩＶ(データー未掲載)に対する免疫反応性を示した(Clark et al., 1995; Hernandez et al., 1998 ; Hernandez and Yang, 2000; Lambert et al. ; 2001)。ＬＣ細胞がグリア線維酸性タンパク質(ＧＦＡＰ)に対して免疫反応性を示さないことは、以前の発見と一致して観測された(図８２ｄ)(Lambert et al., 2001)。これらの結果は、単離された細胞が、視神経乳頭星状細胞であるよりはむしろＬＣ細胞であるという同定を支持した。
【０２１３】
ＴＮＦ-αが、緑内障発症プロセスの間、重要な役割を果たすということが信じられているので、ＴＮＦ-αの細胞傷害性効果に対するＬＣ細胞の感受性を試験した。コンフルエントなＬＣ細胞を、カンプトテシン、ＴＮＦ-α、又はカンプトテシン及びＴＮＦ-αに４８時間晒した(図８３)。ヘキスト染色により、ＴＮＦ-αのみではＬＣ細胞に対して細胞傷害性ではなかったということが示された。カンプトテシンでの処理は、ＬＣ細胞のおおよそ３０％の細胞死をもたらした。しかしながら、ＬＣ細胞がカンプトテシン及びＴＮＦ-αの両者で処理されたとき、ＬＣ細胞アポトーシスの相乗的増加が観察され、４８時間で４５％のＬＣ細胞死をもたらした。カンプトテシンによりアポトーシスを刺激した場合、ＬＣ細胞がＴＮＦ-αの細胞傷害性効果に応答できるということが、これらの結果により示された。
【０２１４】
ｅＩＦ５Ａは、細胞分裂に必須であると知られており、そしてアポトーシスに関与することが最近示唆された核細胞質輸送タンパク質である。ＬＣ細胞におけるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａタンパク質の発現は、カンプトテシン又はカンプトテシン＋ＴＮＦ-αのいずれかにより誘導されてアポトーシスを引き起こす。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現は、おそらくわずかな減少を除いて、カンプトテシンで処理された際に有意に変化しなかった(図８４Ａ)。しかしながら、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａタンパク質の有意な上方制御が、カンプトテシン＋ＴＮＦ-α処理の８時間後及び２４時間後に観察された(図８４Ｂ)。これらの結果により、ＴＮＦ-αへの暴露により、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ発現が特異的に誘導され、そして当該発現がアポトーシスの誘導に相関することが示される。このことは、ＴＮＦ-α受容体結合の下流のアポトーシス経路におけるアポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａの役割を指摘する。
【０２１５】
ＬＣ細胞におけるＴＮＦ-α誘導性アポトーシスの間、アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ発現の重要性を試験するために、アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａを標的とする４種のｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃１〜＃４)が設計され、in vitro転写により合成された。ｅＩＦ５Ａタンパク質発現を抑制する点でのｓｉＲＮＡの有効性を決定するために、ＬＣ細胞系列＃５０６及び＃５１７を、各ｓｉＲＮＡでトランスフェクションし、そして細胞ライセートにおいてｅＩＦ５Ａタンパク質の発現を、７２時間後に試験した(図８５)。比較のため、細胞をＧＡＰＤＨに対するｓｉＲＮＡ及び／又はｓｉＲＮＡ＃１と同じ化学組成を有するが、ｅＩＦ５Ａを認識しない対照ｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃５)(配列番号８５)でトランスフェクションした。ｅＩＦ５Ａに対する全てのｓｉＲＮＡは、両方のＬＣ細胞系列において有意にアポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａの発現を抑制することができた(図８５)。ＧＡＰＤＨ・ｓｉＲＮＡを、さらなる対照として使用した。なぜなら、ｓｉＲＮＡ＃１の逆配列を単に有し、細胞内標的を有さない対照ｓｉＲＮＡ＃５とは違って、ＧＡＰＤＨ・ｓｉＲＮＡは、その標的タンパク質であるＧＡＰＤＨの発現を抑制することができる活性型のｓｉＲＮＡであるからである(データー未掲載)。ｅＩＦ５Ａに対する４種全てのｓｉＲＮＡもまた、ＴＮＦ-α及びカンプトテシンで２４時間処理することにより誘導されたアポトーシスから、トランスフェクションされたＬＣ細胞(＃５０６)を守ることができた(図８６)。ヘキスト染色を使用して細胞死を検出すると、ｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃１〜＃４)(配列番号８１〜８４)は、ＬＣ細胞のアポトーシスを、５９％(ｓｉＲＮＡ＃１)(配列番号８１)、３５％(ｓｉＲＮＡ＃２)(配列番号８２)、５０％(ｓｉＲＮＡ＃３)(配列番号８３)、及び６９％(ｓｉＲＮＡ＃４)(配列番号８４)だけ低減することができることが分かった。興味深いことに、ＧＡＰＤＨに対するｓｉＲＮＡは、ＬＣ細胞のアポトーシスを４２％低減することができた(図８６)。ＧＡＰＤＨは、糖分解酵素としてのその役割のほかに、細胞内機能を有していることが知られており、例えば細胞ニューロンのアポトーシスにおけるの提案された機能を含む(Ishitani and Chuang, 1996; Ishitani et al., 1996a; Ishitani et al., 1996b)。同様の実験において、ｓｉＲＮＡ＃１は、ＴＮＦ-α及びカンプトテシンに応答するＬＣ系列＃５１７のアポトーシスを５３％低減することができ、それによりアポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ・ｓｉＲＮＡは、異なる視神経乳頭から単離されたＬＣ細胞を守ることが示される(図８７)。これらの結果により、アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａは、アポトーシスの間において機能を有し、そしてＬＣ細胞においてＴＮＦ-α-誘導性のアポトーシスを導く経路における重要な媒介物でありうることが示される。
【０２１６】
ＴＮＦ-α及びカンプトテシンに晒されたＬＣ細胞が、古典的なアポトーシスにより死滅するということを確かめるために、末端デオキシヌクレオチド・トランスフェラーゼ媒介性ｄＵＴＰジゴキシゲニン・ニック末端標識(ＴＵＮＥＬ)を使用してＤＮＡ断片化をｉｎ ｓｉｔｕで評価した。ＬＣ細胞(＃５０６)を、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃１)(配列番号８１)又は対照ｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ＃５)(配列番号８５)のいずれかでトランスフェクションした３日後に、ＴＮＦ-α及びカンプトテシンで２４時間処理した。細胞をまた、ヘキストで染色して、核を可視化した。対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされたＬＣ細胞の４６％がＴＵＮＥＬ染色に対し陽性であり、一方アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ・ｓｉＲＮＡ＃１でトランスフェクションされたＬＣ細胞の８％のみが陽性に標識され、このことから、アポトーシス特異的ｅＩＦ５ＡｓｉＲＮＡがアポトーシスからの８０％超の保護を与えたということが示される(図８８)。同様の結果を、ｅＩＦ５ＡｓｉＲＮＡ＃４について得た。当該ｅＩＦ５Ａ・ｓｉＲＮＡ＃４は対照ｓｉＲＮＡに対してアポトーシスからの６０％超の保護を与えた(データー未掲載)。
【０２１７】
実施例１８
血液採取及びＰＢＭＣの調製
約１０ｍｌの血液を各健常なドナーから回収した。血液を静脈穿刺により、抗凝血剤としてクエン酸ナトリウムを含むｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）中に回収した。当該サンプルを回収後２４時間のうちに処理した。
【０２１８】
６０％ＳＩＰ(９体積量のパーコールと１体積量の１.５Ｍ・ＮａＣｌ)を、１５ｍｌコニカルチューブの底に入れた。次に血液を血液とパーコール層との混合を最小限にして、重層した。最初の５分間ゆっくり加速し、そして最後の５分間ゆっくり減速させて、全体で３０分間１０００×ｇで遠心した。得られた勾配の最上部の純粋な血清を取り除き、そして白色の層(１〜２ｍｌ)のＰＢＭＣを回収し、そして１０ｍｌの暖められたＲＰＭＩ＋１５％ＦＢＳを含むチューブに滴下して加えられた。ＰＢＭＣをペレット化し、そして計数した。
【０２１９】
ＰＢＭＣにおいてサイトカインの産生を誘導するタイムコースにおける刺激
ＰＢＭＣを単離し、そして２×１０5〜５×１０5細胞／ウェルで蒔いた。細胞をホルボール１２-ミリスチン酸１３-アセテート(ＰＭＡ；１００ｎｇ／ウェル)で処理した。７２時間において、培地を交換し、そして刺激因子を含まないようにした。次に、ＰＭＡをＰＢＭＣに加えた９６時間後に、リポ多糖(ＬＰＳ(大腸菌由来)；１００ｎｇ／ウェル、セロタイプ０１１１)をウェルに加えた。ＬＰＳを添加する前(９６時間)、そして図９１に概説されるように様々な時間でＬＰＳを回収した。両方の接着性細胞(単球及びマクロファージのようである)を、浮遊細胞(リンパ球のようである)とともに回収した。サイトカイン分泌の分析用のサンプルを回収するため、各ウェルの培地を新たなマイクロ遠心チューブに移し、そして１３０００×ｇで３分間遠心することにより全ての残骸を取り除いた。得られたペレットを接着性細胞とともに回収した。培地を、分析まで２００〜２５０μｌのアリコートで-２０℃にて貯蔵した。細胞を１ｍｌの３７℃リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)で洗浄し、次に沸騰している溶解緩衝液(５０ｍＭ・Ｔｒｉｓ・ｐＨ７、２％ＳＤＳ；１ウェルあたり１００μｌ)中で溶解させた。細胞ライセートを沸騰させ、そして-２０℃で貯蔵した。ウェスタンブロットを図９２に示し、そして対応するＥＬＩＳＡを図９３に示す。
【０２２０】
アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を誘導するＰＢＭＣ刺激
ＰＢＭＣを回収し、そして２×１０5〜５×１０5細胞／ウェルで蒔いた。どの刺激がアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａを誘導するか、並びにこれらの刺激が相乗的に作用するかを調べるため、ＰＢＭＣを、フィトヘマグルチニン(ＰＨＡ；１００ｎｇ／ｍｌ)、ホルボール１２-ミリスチン酸１３-アセテート(ＰＭＡ；１００ｎｇ／ｍｌ)、リポ多糖(ＬＰＳ；１００ｎｇ／ｍｌ)、又はこれらの３種の全て(各々１００ｎｇ／ｍｌ)とインキュベーションした。サンプルを刺激の１２及び３６時間後に回収し、そしてアポトーシス特異的ｅＩＦ−５Ａ発現について分析した（図９４）。
【０２２１】
ＰＢＭＣのトランスフェクション
ＰＢＭＣを準備した日に、ＰＢＭＣをトランスフェクションした。細胞を２×１０5〜５×１０5細胞／ウェルで蒔いた(２４ウェルプレートでトランスフェクションするためには、１ウェルあたり１５０μｌ)。各ウェルにおいて個別にＰＢＭＣにトランスフェクションするか(ドナー７７、７８、及び７９；図９５及び図９６)、又は蒔く前にコニカルチューブ中で全ての細胞に一回でトランスフェクションした(ドナー８０及び８４；図９６)。トランスフェクションを行う各ウェルに対し、１５ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡを５０μｌのＯｐｔｉＭＥＭ(Sigma)中に希釈した。１μｌのリポフェクタミン２０００(Invitrogen)を４９μｌのＯｐｔｉ-ＭＥＭ中に希釈し、７〜１０分間インキュベーションし、希釈されたｓｉＲＮＡに加え、そして２５分間インキュベーションした。トランスフェクション培地を細胞に重層し、３７℃の培養機中に４時間おいた。最終的なトランスフェクション培地は、９％の血清を含んだ。インキュベーション後、２５０μｌの無血清ＲＰＭＩ＋２１％ＦＢＳを細胞に加えて、最終血清濃度を１５％にした。
【０２２２】
トランスフェクション後のＰＢＭＣにおけるサイトカイン産生を誘導する刺激
上で概説されるように、ＰＢＭＣのトランスフェクションの７２時間後において、リポ多糖(ＬＰＳ；１００ｎｇ／ウェル；大腸菌由来、血清型０１１１)を５００μｌの培地中の細胞に加えた。サンプルを刺激後２４時間で回収した。ＬＰＳで処理されたウェルと、トランスフェクションのみされたウェル(つまり刺激無し)の両方を回収した。サイトカイン分泌についてのサンプルを回収するため、各ウェルからの培地を新たなマイクロ遠心チューブに移し、そして１３０００×ｇで３分間遠心することにより全ての破砕物を取り除いた。得られたペレットを接着細胞と共に回収した。分析するまで２００〜２５０μｌの一定量で、培地を-２０℃で貯蔵した。細胞を１ｍｌの３７℃リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、次に煮沸溶解緩衝液(５０ｍＭ・Ｔｒｉｓ・ｐＨ７、２％ＳＤＳ；１ウェルあたり１００μｌ)中に溶解させた。細胞ライセートを煮沸し、そしてＢＣＡタンパク質定量用に-２０℃で貯蔵した。
【０２２３】
実施例１９
細胞培養
ＨＴ２９細胞、ヒト大腸癌細胞系列を、１０％胎児ウシ血清(ＦＢＳ)を伴うＲＰＭＩ中で維持した。Ｕ９３７、組織球性リンパ細胞系列を、１０％ＦＢＳを伴うＲＰＭＩ中で懸濁状態で成長させた。両方の細胞系列を３７℃で、５％ＣＯ2の加湿環境中で維持した。Ｕ９３７についての実験のために、細胞を計数し、そして実験開始前２日において３×１０5細胞/ｍｌに調節した。実験の第一日目に、細胞を４００×ｇで１０分間の遠心により回収し、細胞ペレットを１０％ＦＢＳを伴う新たなＲＰＭＩ培地中に懸濁し、遠心を繰り返し、そして再びペレット化された細胞をＦＢＳを伴わない新たなＲＰＭＩ培地中に再懸濁した。細胞を計数し、そして２×１０6細胞/ｍｌに調節した。
【０２２４】
ｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ配列を、ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ配列に基づいて設計し、そしてｓｉＲＮＡはDharmacon RNA Technologiesにより合成された。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡ(ｈ５Ａ１)標的配列は、以下の：
５’ＮＮＧＣＵＧＧＡＣＵＣＣＵＣＣＵＡＣＡＣＡ３’(配列番号＿)
であった。対応する二本鎖ｓｉＲＮＡ配列は、以下の：
５’ＧＣＵＧＧＡＣＵＣＣＵＣＣＵＡＣＡＣＡｄＴｄＴ３’(配列番号＿)
３’ｄＴｄＴＣＧＡＣＣＵＧＡＧＧＡＧＧＡＵＧＵＧＵ５’(配列番号＿)
であった。対照ｓｉＲＮＡ(ｈ対照)配列は、以下の：
５’ＮＮＡＣＡＣＡＵＣＣＵＣＣＵＣＡＧＧＵＣＧ３’(配列番号＿)
であった。対応する二本鎖ｓｉＲＮＡ配列は、以下の：
５’ＡＣＡＣＡＵＣＣＵＣＣＵＣＡＧＧＵＣＧｄＴｄＴ３’(配列番号＿)
３’ｄＴｄＴＵＧＵＧＵＡＧＧＡＧＧＡＧＵＣＣＡＧＣ５’(配列番号＿)
であった。
【０２２５】
ＨＴ-２９細胞のトランスフェクション
トランスフェクションする前日に、ＨＴ-２９細胞を、２４ウェルプレート上に１ウェルあたり１０５,０００細胞で蒔いた。トランスフェクションを行う細胞の各ウェルについて、２５.５ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡを５０μｌのＯｐｔｉ-Ｍｅｍ(Ｓｉｇｍａ)中に希釈した。１μｌのリポフェクタミン２０００(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を４９μｌのＯｐｔｉＭｅｍ中に希釈し、７〜１０分間インキュベーションし、そして希釈されたｓｉＲＮＡに加え、そして２５分間インキュベーションした。トランスフェクションされる細胞を無血清ＲＰＭＩで１回洗浄し、次に３００μｌの無血清ＲＰＭＩを加え、そして１００μｌのトランスフェクション培地を重層した。細胞を成長チャンバーに４時間戻した。インキュベーション後、３００μｌの無血清ＲＰＭＩ＋３０％ＦＢＳを細胞に加えた。
【０２２６】
Ｕ９３７細胞の電気泳動
アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ及び対照ｓｉＲＮＡをＯｐｔｉ-Ｍｅｍ培地中に希釈した(Sigma)。４００μｌの細胞(８００,０００細胞)及び１００ｐmolのｓｉＲＮＡを０.４ｍｍ電気穿孔キュベット中で混合した。細胞を３００Ｖ、１０ｍ秒、１パルスで、ＥＣＭ８３０Electrosquare Porator(BTX、SanDiego, CA)を用いて電気穿孔した。電気穿孔後、細胞をゆっくり混合し、そしてＲＰＭＩ、及びＦＢＳ終濃度が１０％になるように濃縮されたＦＢＳを含むウェルに加えた。
【０２２７】
ＨＴ-２９細胞の処理
Suzukiら、2003により開発された方法に従って、ＨＴ-２９細胞にＴＮＦ-α産生を誘導した。ＨＴ-２９細胞を、トランスフェクションの４８時間後、２００ユニット／ｍｌのインターフェロンγ(Roche Diagnostics)で刺激した。インターフェロンγ(ＩＦＮγ)刺激の１６時間後、細胞を培地で洗浄し、そしてリポ多糖(ＬＰＳ；１００ｎｇ／ｍｌ；大腸菌由来、血清型０１１１；Sigma)を１００μｇ／ｍｌで加えた。ＬＰＳ刺激の８又は２４時間後、各ウェルからの培地をマイクロ遠心チューブに移し、そして、ＥＬＩＳＡによりＴＮＦαをアッセイするときまで-２０℃で貯蔵した。細胞を３７℃に暖められたリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)１ｍｌで洗浄し、そして沸騰溶解緩衝液中で溶解した(５０ｍＭ・ＴｒｉｓｐＨ７、２％ＳＤＳ)。細胞ライセートを煮沸し、そして-２０℃で凍結させて貯蔵した。細胞ライセートのタンパク質濃度を、ウシ血清アルブミンを標準として用いるビシンコニン酸アッセイ(ＢＣＡ)により測定した。
【０２２８】
ＨＴ-２９細胞において、ＩＦＮγ処理することによりＩＬ-８産生を誘導した。ＨＴ-２９細胞を、トランスフェクションの４８時間後、２００ユニット／ｍｌのＩＦＮγで処理した。処理の２４時間後、各ウェルからの培地をマイクロ遠心チューブに移し、そして液相電気化学発光によりＩＬ-８についてアッセイするまで-２０℃で貯蔵した。細胞を１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水で洗浄して３７℃に熱し、そして次に煮沸溶解緩衝液(５０ｍＭ・ＴｒｉｓｐＨ７、２％ＳＤＳ)中に溶解した。細胞ライセートを煮沸し、そして-２０℃で凍結して貯蔵した。細胞ライセート中のタンパク質濃度を、ウシ血清アルブミンを標準として使用するビシンコニン酸アッセイにより測定した。
【０２２９】
Ｕ９３７細胞における分化誘導
Ｕ９３７細胞を回収し、そして電気穿孔の１６時間後に計数した。１ｍｌの培地中の２０００００細胞を２４ウェルプレートの各ウェルに加えた。マクロファージの分化を、ホルボール１２-ミリスチン酸１３-アセテート(ＰＭＡ；１００ｎｇ／ｍｌ)を加えることにより刺激した。ＰＭＡで４８時間処理後、８０％を超える単球が、懸濁状態の細胞(単球)から接着性細胞(マクロファージ)へと変換した。４８時間目に、培地及び全ての非接着性の細胞を取り除き、そして１０％ＦＢＳを伴う新たなＲＰＭＩ培地(１ｍｌ／ウェル)を加えた。細胞を新たな培地中に２４時間おいて静止状態にした。
【０２３０】
Ｕ９３７細胞におけるサイトカイン産生を誘導する刺激
ＰＭＡをＵ９３７に添加した７２時間後、リポ多糖(ＬＰＳ；１００ｎｇ／ｍｌ；大腸菌由来、血清型０１１１)、インターフェロンγ(ＩＦＮγ；１００ユニット／ｍｌ)、又はＬＰＳとＩＦＮγとの組合せをウェルに加えた。刺激因子添加前(７２時間)、及び図１０８に概説される添加後の様々な時間においてサンプルを回収した。サイトカイン分泌の分析のためにサンプルを回収するために、各ウェルからの培地を新たなマイクロ遠心チューブに移し、そして１３０００×ｇで３分遠心することにより破砕物を取り除いた。培地を２００〜２５０μｌのアリコートで、分析まで-２０℃で貯蔵した。細胞を１ｍｌの３７℃リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)で洗浄し、次に煮沸溶解緩衝液(５０ｍＭ・Ｔｒｉｓ、ｐＨ７、２％ＳＤＳ；１ウェルあたり７５μｌ)中に溶解した。同様にウェルを貯蔵した。細胞ライセートを煮沸し、そして-２０℃で凍結貯蔵した。
【０２３１】
サイトカイン定量
全ての培地サンプルを-２０℃で凍結貯蔵した。ＴＮＦαを、０〜２５０ｐｇのＴＮＦα／ｍｌで供給された標準を用いて、製品説明書に従ってAssay Designsから得たＥＬＩＳＡキットを用いて定量した。Ｕ９３７について、ＴＮＦαに関しては実験培地サンプルをＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳで２０倍に希釈し(０時間、３時間のＬＰＳ処理)、又は８０倍に希釈した(６時間、２４時間、３０時間のＬＰＳ処理)。ＩＬ-１β、ＩＬ-８、及びＩＬ-６を液相電気化学発光により定量した。ＨＴ-２９実験からの培地については希釈しなかった。全てのサイトカインの計測結果を、１ウェルあたりの細胞タンパク質の総量について補正した。
【０２３２】
ＩＬ-８、ＩＬ-１β、及びＩＬ-６を液相によりアッセイした。簡潔に記載すると、精製されたモノクローナル・マウス抗マウス抗ヒトＩＬ-８、ＩＬ-６、又はＩＬ-１β(Ｒ＆ＤSystems)をビオチンで標識した(Igen, Inc., Gaithersburg, MD)。さらに、ヤギ抗ヒトＩＬ-８、ＩＬ-６、又はＩＬ-１β抗体(Ｒ＆Ｄ)を、製品説明書に従ってルテニウム(Ｉｇｅｎ)で標識した。ビオチン化抗体を、０.２５％ＢＳＡ、０.５％Ｔｗｅｅｎ-２０、及び０.０１％アジドを含むＰＢＳ、ｐＨ７.４(ＥＣＬ緩衝液)中に終濃度１ｍｇ／ｍｌに希釈した。アッセイチューブごとに、２５ｍｌのビオチン化抗体を、１ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン-被膜常磁性ビーズ(Dynal Corp., Lake Success, NY)の溶液２５ｍｌと、激しく攪拌することにより３０分間前もって室温でインキュベーションした。ＲＰＭＩ中に希釈された披験サンプル(２５ｍｌ)又は標準をチューブにいれ、続いて２５ｍｌのルテニウム化された抗体(終濃度１ｍｇ／ｍｌ、ＥＣＬ緩衝液中に希釈する)をチューブに入れた。次にチューブをさらに２時間振盪した。反応を２００ｍｌ／チューブのＰＢＳを加えることにより反応を止め、そしてＯｒｉｇｅｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ(Ｉｇｅｎ)を用いて、化学発光量を測定した。
【０２３３】
ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びウエスタン・ブロッティング
細胞ライセートにおけるタンパク質濃度を、ウシ血清アルブミンを標準として用いたビシンコニン酸アッセイにより測定した。５μｇの総細胞タンパク質を１０％又は１４％ＳＤＳ-ＰＡＧＥ(ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動)により分離した。１０％のゲルを５０ｋＤａを超えるタンパク質(ＴＬＲ４、ＩＦＮγ、ＴＮＦ-Ｒ１、iＮＯＳ)の分析のために用いた。一方、１４％のゲルをアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ(１７ｋＤａ)の分析に用いた。セミドライ転写ユニットを用いて転写緩衝液(４８ｍＭのＴｒｉｓ、３９ｍＭのグリシン、１.３ｍＭのＳＤＳ、ｐＨ９.２；１５Ｖで１８分間)でゲルをポリビニリデン・フロリド(ＰＶＤＦ)膜に転写した。膜をスキムミルクを含むＰＢＳ-ｔ(０.１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ)で１時間ブロッキングした。一次抗体をブロッキング溶液中に希釈し、そして全てのブロットを室温で振盪しながらインキュベーションした。使用した一次抗体は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ(ＢＤ Biosciences; １：２００００；１時間のインキュベーション、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５ＡとｅＩＦ-５Ａ２の両方を認識する)、ＴＬＲ４(Santa Cruz Biotechnology Inc; ＩＦＮ-γＲα(Ｃ-２０)：ｓｃ-７００；１：１０００；１時間インキュベーション)、ＴＮＦ-Ｒ１(Santa Cruz Biotechonology Inc;ＴＮＦ-Ｒ１(Ｈ-５)：ｓｃ-８４３６；１：２００；３時間のインキュベーション)、ｉＮＯＳ(ＢＤ Transduction Laboratories：610431；１：１００００；１時間のインキュベーション)及びβ-アクチン(Oncogene；アクチン(Ａｂ-１)；１：２００００；１時間のインキュベーション)であった。一次抗体のインキュベーションに続き、ブロットを５〜１０分間ＰＢＳ-ｔで３回洗浄した。西洋わさびペルオキシダーゼ結合(ＨＲＰ)二次抗体を１％スキムミルク中で希釈し、そして膜と１時間インキュベーションした。使用した二次抗体は、抗マウスＩｇＧ-ＨＲＰ(Sigma；１：５０００；アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ及びＴＮＦ-Ｒ１について)、抗ラビットＩｇＧ-ＨＲＰ(Amersham Pharmacia Biotech;１：２５００；ＴＬＲ４及びＩＦＮγ-Ｒαについて)、抗マウスＩｇＭ-ＨＲＰ(Calbiochem；１：５０００；アクチンについて)であった。二次抗体とのインキュベーションの後に、ブロットをＰＢＳ-ｔで５〜１０分間洗浄した。ブロットを高感度化学発光検出試薬(ＥＣＬ；Amersham Pharmacia Biotech)を製品説明書に従って現像し、そしてバンドをＸ線フィルム(Fuji)上で可視化した。
【０２３４】
ＲＴ-ＰＣＲ
ＲＴ-ＰＣＲをMedvedevら、２００２に従って行い、ＩＦＮγに応答したトランスフェクションＨＴ-２９におけるＴＬＲ４・ｍＲＮＡの変化を観察した。サンプル間で等量のｃＤＮＡが使用されたということを示す対照として、ＧＡＰＤＨの発現を用いた。飽和していない条件下で増幅された生成物をもたらす最適サイクル数を決定するために、増加させたＰＣＲサイクル(２０、２５、３０、及び３５)を使用した。ＰＣＲ産物を臭化エチジウムの取り込みにより検出し、そしてアガロース・ゲル電気泳動により分離した。ＩＦＮγで６時間処理されたｓｉＲＮＡトランスフェクションＨＴ-２９細胞から単離された総ｍＲＮＡをＲＴ-ＰＣＲして、ＴＬＲ４及びＧＡＰＤＨ転写を検出した。ＨＴ-２９細胞を、上記のようにｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を２００ユニット／ｍｌのＩＦＮγで処理した。ＩＦＮγで処理されなかった対照細胞については、培地交換のみが行われた。総ｍＲＮＡをＧｅｎＥｌｕｔｅ哺乳動物ＲＮＡミニプレップキット(Ｓｉｇｍａ)を、接着細胞についての製品プロトコルに従って使用して単離した。培地を取り除き、そして細胞を暖めたＰＢＳで２回洗浄した。溶解緩衝液を細胞に加え、そしてライセートをマイクロ遠心チューブに移し、そして総ＲＮＡを製品プロトコルに従って単離した。
【０２３５】
ＴＬＲ４(ＮＭ＿００３２６６)についてのプライマーは、以下の：
フォワード  ５’ＣＧＧＡＴＧＧＣＡＡＣＡＴＴＴＡＧＡＡＴＴＡＧＴ３’(配列番号＿)
リバース    ５’ＴＧＡＴＴＧＡＧＡＣＴＧＴＡＡＴＣＡＡＧＡＡＣＣ３’(配列番号＿)
予想される断片の大きさ：６７４ｂｐ
であった。
【０２３６】
ＧＡＰＤＨ(ＢＣ０２３６３２)についてのプライマーは、以下の：
フォワード  ５’ＣＴＧＡＴＧＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＣＧＴＣＡＴ３’(配列番号＿)
リバース    ５’ＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡＧ３’(配列番号＿)
予想される断片の大きさ：５９９ｂｐ
であった。
【０２３７】
総ＲＮＡを、以下の条件：
ＲＮＡ                      ２.５μｇ
ポリ(Ｔ)プライマー          ６.２５μｌ
ＤＥＰＣ水                  １３.７５μｌ
を混合し、
７０℃で５分熱し、
氷上で５分間冷やし、
以下の：
５×ＡＭＶ緩衝液            ５.０μｌ
ｄＮＴＰ(１０ｎＭ)          ２.５μｌ
Ｒｎａｓｅ阻害剤            １.２５μｌ
ＡＭＶ  ＲＴ                ２.５μｌ
を加え、
４２℃で６０分間熱し、
７０℃で１０分間熱する
を用いて逆転写を行った。
【０２３８】
１のＰＣＲ反応を、以下の条件：
１０×Ｔｓｇ緩衝液                              ２.０μｌ
ｄＮＴＰ(１０ｍＭ)                              ０.４μｌ
フォワード・プライマー(２５ｐｍｏｌ／μｌ)      ０.４μｌ
リバース・プライマー(２５ｐｍｏｌ／μｌ)        ０.４μｌ
ＭｇＣｌ2(１５ｍＭ)                             ２.０μｌ
ｃＤＮＡ                                        ０.８μｌ
Ｈ2Ｏ                                           １３.８８μｌ
Ｔｓｇポリメラーゼ                              ０.１２μｌ
を用いて行った。
【０２３９】
ＴＬＲ４についてのＰＣＲ条件は以下の：
９５℃    ５分
以下の：
９５℃    １分
５５℃    １分
７２℃    ２分
を２０、２５、３０、又は３５サイクル
７２℃    １０分の伸張
４℃で冷却
であった。
【０２４０】
ＧＡＰＤＨについてのＰＣＲ条件は以下の：
９５℃    ５分
以下の：
９５℃    １分
５７℃    １分
７２℃    ２分
を２０、２５、３０、又は３５サイクル
７２℃    １０分の伸張
４℃で冷却
であった。
【０２４１】
実施例２０：ＮＦκＢアッセイ用の物質及び方法
当該アッセイの結果により、ＩＦＮ-γ及びＬＰＳに晒されたＨＴ-２９細胞が、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡでトランスフェクションされるとき、ＮＦκＢｐ５０活性化及びＴＮＦ-α産生が低下したということが示される。図１２０を参照のこと。
【０２４２】
培養
ＨＴ-２９、ヒト結腸直腸腺癌細胞系列をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中で、３７℃及び５％ＣＯ2の加湿環境下で維持した。
【０２４３】
トランスフェクション
トランスフェクションの前日に、ＨＴ-２９細胞を６ウェルプレート上に、１ウェルあたり５０００００細胞で蒔いた。トランスフェクションを行う細胞の各ウェルについて、１５５ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡを、２４０μｌのＯｐｔｉ-Ｍｅｍ(Sigma)中に希釈した。４.８μｌのリポフェクタミン２０００(Invitrogen)をＯｐｔｉ-ＭＥＭで２４０μｌに希釈し、７〜１０分間インキュベーションし、そして希釈されたｓｉＲＮＡに加え、そして２５分間インキュベーションした。トランスフェクションされた細胞を１回無血清ＲＰＭＩで洗浄し、１４００μｌの無血清ＲＰＭＩを加え、そして４８０μｌのトランスフェクション培地を加えた。細胞を成長チャンバーに４時間戻した。インキュベーション後、７２０μｌの無血清ＲＰＭＩ＋３０％ＦＢＳを細胞に加えた。トランスフェクションの２４時間後に新たな培地を細胞に加えた。
【０２４４】
細胞の処理
トランスフェクションの４８時間後、インターフェロンγ(ＩＦＮγ：Roche Diagnostics)で刺激された細胞に、２００ユニット／ｍｌのＩＦＮγを与えた。残りのウェル全てにおいて培地を交換した。ＩＦＮγ添加の１６時間後、細胞をＴＮＦα(２０ｎｇ／ｍｌ；Lecino Technologies Inc., St. Louis, MO)又はリポ多糖(ＬＰＳ；１００ｎｇ／ｍｌ；大腸菌由来、血清型０１１１；Sigma)で処理するか、又は未処理対照については添加無しの培地で処理した。ＩＦＮγのみで処理される細胞については、一晩ＩＦＮγで刺激し、そして新たなＩＦＮγを含む培地を１６時間後に加えた。
【０２４５】
核抽出及びＮＦκＢ転写因子アッセイ
様々な刺激で処理した１時間後、核タンパク質を細胞から回収し、そしてＮＦκＢ活性を計測するために用いた。製品プロトコルに従ってＴｒａｎｓＡＭ核抽出キット(Active Motif, Carlsbad, CA)を用いて核抽出を行った。ＮＦκＢのｐ５０サブニットのＤＮＡ結合能力を、製品プロトコルに従って２０μｇの核抽出液を使用して、ＴｒａｎｓＡＭ・ＮＦκＢファミリー転写因子アッセイキット(Active Motif、Carlsbad,CA)を用いて計測した。
【図面の簡単な説明】
【０２４６】
【図１】図１は、ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの３’末端のヌクレオチド配列(配列番号１１)及び当該配列から生成されるアミノ酸配列(配列番号１２)を記載する。
【図２】図２は、ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの５’末端のヌクレオチド配列(配列番号１５)及び当該配列から生成されるアミノ酸配列(配列番号１６)を記載する。
【図３】図３は、ラット黄体アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ全長ｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号１)を記載する。アミノ酸配列は、配列番号２において示される。
【図４】図４は、ラットアポトーシス特異的ＤＨＳｃＤＮＡの３’末端のヌクレオチド配列(配列番号６)及び当該配列から生成されるアミノ酸配列(配列番号７)を記載する。
【図５】図５は、ラット黄体アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｃＤＮＡの全長ヌクレオチド配列(配列番号２０)と、ヒトｅＩＦ-５Ａのヌクレオチド配列(配列番号３)(受託番号BC000751又はNM_001970、配列番号３)とのアライメントである。
【０２４７】
【図６】図６は、ラット黄体アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｃＤＮＡ(配列番号２０)と、ヒトｅＩＦ-５Ａのヌクレオチド配列(配列番号４)(受託番号NM-020390、配列番号４)とのアライメントである。
【図７】図７は、ラット黄体アポトーシス特異的ｅＩＦ-５ＡｃＤＮＡの全長ヌクレオチド配列(配列番号２０)と、マウスｅＩＦ-５Ａのヌクレオチド配列(受託番号BC003889)とのアライメントである。マウスヌクレオチド配列(受託番号BC003889)は、配列番号５である。
【図８】図８は、ラット黄体アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの生成された全長アミノ酸配列(配列番号２)と、ヒトｅＩＦ-５Ａの生成されたアミノ酸配列(配列番号２１)(受託番号 BC000751又はNM_001970)とのアライメントである。
【図９】図９は、ラット黄体アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの生成された全長アミノ酸配列(配列番号２)と、ヒトｅＩＦ-５Ａの生成されたアミノ酸配列(配列番号２２)(受託番号NM_020390)とのアライメントである。
【図１０】図１０は、ラット黄体アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの生成された全長アミノ酸配列(配列番号２)と、マウスｅＩＦ-５Ａの生成されたアミノ酸配列(配列番号２３)(受託番号BC_003889)とのアライメントである。
【０２４８】
【図１１】図１１は、ラット黄体アポトーシス特異的ＤＨＳｃＤＮＡの部分長ヌクレオチド配列(配列番号６の残基１〜４５３)と、ヒトＤＨＳのヌクレオチド配列(受託番号BC_000333、配列番号８)とのアライメントである。
【図１２】図１２は、ラット黄体アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｃＤＮＡの制限酵素地図である。
【図１３】図１３は、部分長のラットアポトーシス特異的ＤＨＳ・ｃＤＮＡの制限酵素地図である。
【図１４】図１４は、32Ｐ-ｄＣＴＰ標識３’末端のラット黄体アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｃＤＮＡでプローブされた総ＲＮＡのノーザンブロット(上段)及び臭化ブロミド染色ゲル(下段)である。
【図１５】図１５は、32Ｐ-ｄＣＴＰ標識３’末端のラット黄体アポトーシス特異的ＤＨＳ・ｃＤＮＡでプローブされた総ＲＮＡのノーザンブロット(上段)及び臭化ブロミド染色ゲルである。
【０２４９】
【図１６】図１６は、ＤＮＡラダー化実験を記載する。ここで、ＰＧＦ-２αを注射後の過剰排卵された黄体におけるアポトーシスの程度が試験される。
【図１７】図１７は、アポトーシスをしているラット黄体から単離されたゲノムＤＮＡのアガロースゲルであり、ラットをＰＧＦ Ｆ-２αで処理した後のＤＮＡラダー化が示される。
【図１８】図１８は、ＤＮＡラダー化実験を記載する。ここで過排卵されたラット黄体分散細胞においてアポトーシスの程度が、ＰＧＦ-２αに晒す前にスペリミジンで処理されたラットにおいて試験された。
【図１９】図１９は、ＤＮＡラダー化実験を記載する。ここで過排卵されたラット黄体におけるアポトーシスの程度が、スペリミジン及び／又はＰＧＦ-２αで処理されたラットにおいて試験された。
【０２５０】
【図２０】図２０は、32Ｐ-ｄＣＴＰ標識されたラット黄体アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｃＤＮＡを用いてプローブされたラットゲノムＤＮＡのサザンブロットである。
【図２１】図２１は、ｐＨＭ６、つまり哺乳動物エピトープ・タグ発現ベクター(Roche Molecular Biochemicals)を記載する。
【図２２】図２２は、血清を取り除くことによりアポトーシスを誘導した後のＣＯＳ-７細胞から単離され、32ＰｄＣＴＰ標識されたラット黄体アポトーシス特異的ＤＨＳ・ｃＤＮＡの３’非翻訳領域を用いてプローブされた総ＲＮＡのノーザンブロット(上段)及び臭化エチジウム染色されたゲル(下段)である。
【図２３】図２３は、ＣＯＳ-７細胞の一過的トランスフェクションのための方法を記載するフローチャートである。
【図２４】図２４は、ｐＨＭ６でトランスフェクションした後のＣＯＳ-７細胞中における外来タンパク質の一過的発現のウエスタンブロットである。
【図２５】図２５は、ＣＯＳ-７細胞がセンスの向きに全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａを含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされた際における増大したカスパーゼ活性により反映されるアポトーシスの増加を示す。
【０２５１】
【図２６】図２６は、ＣＯＳ-７細胞がセンスの向きに全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａを含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされた際におけるＤＮＡ断片化の増加により反映されるアポトーシスの増加を示す。
【図２７】図２７は、ＣＯＳ-７細胞がセンスの向きに全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａを含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされた際において、核断片化の増加により反映されるアポトーシスの検出を示す。
【図２８】図２８は、ＣＯＳ-７細胞がセンスの向きに全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａを含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされた際において、核断片化の増加により反映されるアポトーシスの増加を示す。
【図２９】図２９は、ＣＯＳ-７細胞がセンスの向きに全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａを含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされた際において、ホスファチジルセリンにより反映されるアポトーシスの検出を示す。
【図３０】図３０は、ＣＯＳ-７細胞がセンスの向きに全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａを含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされた際において、ホスファチジルセリン暴露の増加により反映されるアポトーシスの増加を示す。
【０２５２】
【図３１】図３１は、ＣＯＳ-７細胞がセンスの向きに全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａを含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされた際において、核断片化の増加により反映されるアポトーシスの増加を示す。
【図３２】図３２は、ＣＯＳ-７細胞がセンスの向きに全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａを含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされた際において、アポトーシスの増加を示す。
【図３３】図３３は、ＣＯＳ-７細胞がセンスの向きで全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａを含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされた際において、Ｂｃｌ-２の下方制御を示す。上段の写真は、クマシーブルー染色されたタンパク質のブロットであり；下段の写真は、対応するウエスタンブロットである。
【図３４】図３４は、アンチセンスの向きに全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａを含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされたＣＯＳ-７細胞のクマシーブルー染色されたタンパク質ブロットと、Ｂｃｌ-２をプローブとして用いた対応するウエスタンブロットである。
【図３５】図３５は、センスの向きに全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａを含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされたＣＯＳ-７細胞のクマシーブルー染色されたタンパク質ブロットと、ｃ-Ｍｙｃをプローブとして用いた対応するウエスタンブロットである。
【０２５３】
【図３６】図３６は、センスの向きに全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａを含むｐＨＭ６で一過的にトランスフェクションされたＣＯＳ-７細胞のクマシーブルー染色されたタンパク質ブロットと、ｐ５３をプローブとして用いた際の対応するウエスタンブロットである。
【図３７Ａ】図３７は、ＣＯＳ-７細胞中のｐＨＭ６-全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現のクマシーブルー染色ブロット及び抗[ＨＡ]ペルオキシダーゼプローブを用いた対応するウエスタンブロット、並びにＣＯＳ-７中におけるｐＨＭ６-全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａのクマシーブルー染色されたタンパク質ブロット、及びｐ５３プローブを用いた際の対応するウエスタンブロットである。
【図３７Ｂ−Ｃ】図３７は、ＣＯＳ-７細胞中のｐＨＭ６-全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現のクマシーブルー染色ブロット及び抗[ＨＡ]ペルオキシダーゼプローブを用いた対応するウエスタンブロット、並びにＣＯＳ-７中におけるｐＨＭ６-全長ラットアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａのクマシーブルー染色されたタンパク質ブロット及びｐ５３プローブを用いた際の対応するウエスタンブロットである。
【図３８】図３８は、ＲＫＯ細胞から単離されたヒトｅＩＦ-５Ａ２(配列番号２４)と、ヒトｅＩＦ-５Ａ(配列番号２２)(Genbank受託番号XM_113401)のアライメントである。コンセンサス配列は、配列番号２８に示される。
【図３９】図３９は、一過的トランスフェクションの後にＲＫＯ及びＲＫＯ-Ｅ６細胞において生じるアポトーシス割合を図示するグラフである。ＲＫＯ及びＲＫＯ-Ｅ６細胞は、ｐＨＭ６-ＬａｃＺ又はｐＨＭ６アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａで一過的にトランスフェクションされた。アクチノマイシンＤで処理され、そしてｐＨＭ６アポトーシス特異的ｅＩＦ-５ＡでトランスフェクションされたＲＫＯ細胞は、アクチノマイシンＤで処理されずに、ｐＨＭ６-ＬａｃＺでトランスフェクションされた細胞に対して、２４０％のアポトーシスの増加を示した。アクチノマイシンＤで処理され、そしてｐＨＭ６-アポトーシス特異的ｅＩＦ-５ＡでトランスフェクションされたＲＫＯ-Ｅ６細胞は、アクチノマイシンＤで処理されずに、ｐＨＭ６-ＬａｃＺでトランスフェクションされた細胞に対して、１０５％のアポトーシスの増加を示した。
【図４０】図４０は、一過的トランスフェクションの後にＲＫＯ細胞において生じるアポトーシスの割合を示すグラフである。ＲＫＯ細胞をｐＨＭ６-ＬａｃＺ、ｐＨＭ６-アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ、ｐＨＭ６-ｅＩＦ-５Ａ２、又はｐＨＭ６-切り詰め型アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａで一過的にトランスフェクションした。ｐＨＭ６-アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａでトランスフェクションされた細胞は、ｐＨＭ６-ＬａｃＺでトランスフェクションされた対照細胞に対して２５％のアポトーシスの増加を示した。この増加は、ｐＨＭ６-ｅＩＦ-５Ａ２又はｐＨＭ６-切り詰め型アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａでトランスフェクションされた細胞については明確ではなかった。
【０２５４】
【図４１】図４１は、一過的トランスフェクションの後にＲＫＯ細胞において生じるアポトーシスの割合を示すグラフである。ＲＫＯ細胞をトランスフェクションされないままにするか、又はｐＨＭ６-ＬａｃＺ又はｐＨＭ６-アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａでトランスフェクションした。トランスフェクション効率について補正した後に、ｐＨＭ６-アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａでトランスフェクションされた細胞の６０％がアポトーシスした。
【図４２】図４２は、一過的トランスフェクションの次にＲＫＯ細胞アポトーシスのフローサイトメトリー分析の結果を提供する。ＲＫＯ細胞を、トランスフェクションしないままにするか、又はｐＨＭ６-ＬａｃＺ、ｐＨＭ６-アポトーシス-特異的ｅＩＦ-５Ａ、ｐＨＭ６-ｅＩＦ-５Ａ２、又はｐＨＭ６-切り詰め型アポトーシス-特異的ｅＩＦ-５Ａで一過的にトランスフェクションした。表は、各ゲートのピーク下の領域に基づいて計算されたアポトーシスを起こしている細胞の割合を記載する。トランスフェクションされていない細胞におけるバックグラウンドのアポトーシスについて、そしてトランスフェクション効率について補正した後に、ｐＨＭ６-アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａでトランスフェクションされた細胞の８０％はアポトーシスを示した。ｐＨＭ６-ＬａｃＺ、ｐＨＭ６-ｅＩＦ-５Ａ２、又はｐＨＭ６-切り詰め型アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａは、バックグランドレベルのアポトーシスしか示さなかった。
【図４３】図４３は、０.２５μｇ/ｍｌアクチノマイシンＤで０、３、７、２４、及び４８時間処理されたＲＫＯ細胞から抽出されたタンパク質のウエスタンブロットを提供する。上段は、抗ｐ５３を一次抗体として用いたウエスタンブロットを指す。中段は、抗アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａを一次抗体として用いたウエスタンブロットを示す。下段は、抗アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａブロットについて用いられたメンブランであって、化学発光検出の後にクマシーブルーで染色された当該メンブランを示し、等ロード量であることを示す。ｐ５３及びアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａは、両方ともアクチノマイシンＤ処理により上方制御される。
【図４４】図４４は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ及び増殖ｅＩＦ-５Ａの両方が、心臓組織において発現されることを示す棒グラフである。心臓組織は、冠動脈バイパスグラフト(ＣＡＢＧ)を受けた患者から取られた。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ(ライトグレーの棒グラフ)の遺伝子発現レベルを、増幅ｅＩＦ-５Ａ(ダークグレーの棒グラフ)と比較した。Ｘ軸は患者の識別情報である。Ｙ軸はｐｇ/ｎｇ(１８ｓ)(リボソームＲＮＡ１８Ｓの１ナノグラムあたりのメッセンジャーＲＮＡのピコグラム)である。
【図４５】図４５は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ及び増殖ｅＩＦ-５Ａの両方が、心臓組織において発現されることを示す棒グラフである。心臓組織は、弁置換術を受けた患者から取られた。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ(ライトグレーの棒グラフ)の遺伝子発現レベルを、増幅ｅＩＦ-５Ａ(ダークグレーの棒グラフ)と比較した。Ｘ軸は患者の識別番号である。Ｙ軸はｐｇ/ｎｇ(１８ｓ)(リボソームＲＮＡ１８Ｓの１ナノグラムあたりのメッセンジャーＲＮＡのピコグラム)である。
【０２５５】
【図４６】図４６は、虚血前の心臓組織と虚血後の心臓組織におけるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ(ｅｉｆ５ａ)のリアルタイムＰＣＲにより計測された遺伝子発現レベル対増幅ｅＩＦ-５Ａ(ｅＩＦ-５ｂ)のＰＣＲにより計測された遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。Ｙ軸は、ｐｇ/ｎｇ(１８ｓ)(リボソームＲＮＡ１８Ｓの１ナノグラムあたりのメッセンジャーＲＮＡのピコグラム)である。
【図４７】図４７は、心臓組織において行われる実験を模式的に表す。心臓組織は、通常の酸素レベルに晒され、そしてアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ及び増殖ｅＩＦ-５Ａの発現レベルを計測した。後に、心臓組織にデリバリーされた酸素の量を低下させ、そうして低酸素状態及び虚血状態を誘導し、そして最終的に心臓組織において心臓発作を誘導した。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ及び増殖ｅＩＦ-５Ａを計測し、そして虚血により損傷される前に、心臓組織の発現レベルと比較した。
【図４８】図４８は、虚血が誘導される前及び後の心臓組織のＥＫＧを示す。
【図４９】図４９は、図４７において記載される実験装置を設置した実験台を示す。
【図５０Ａ−Ｂ】図５０Ａ-Ｆは、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａのレベルが、ＩＬ-１β及びＩＬ-１８と相関する患者のデーターを報告する。図５０Ａは、冠動脈バイパスグラフト(ＣＡＢＧ)患者から得られたデーターのチャートである。図５０Ｂは、弁置換術をうけた患者から得たデーターのチャートである。
【図５０Ｃ】図５０Ａ-Ｆは、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａのレベルが、ＩＬ-１β及びＩＬ-１８と相関する患者のデーターを報告する。図５０Ｃは、ＣＡＢＧ患者におけるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５ＡのＩＬ-１８への相関を示すグラフである。
【図５０Ｄ】図５０Ａ-Ｆは、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａのレベルが、ＩＬ-１β及びＩＬ-１８と相関する患者のデーターを報告する。図５０Ｄは、ＣＡＢＧ患者における増殖ｅＩＦ-５ＡのＩＬ-１８への相関を示すグラフである。
【図５０Ｅ】図５０Ａ-Ｆは、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａのレベルが、ＩＬ-１β及びＩＬ-１８と相関する患者のデーターを報告する。図５０Ｅは、弁置換術の患者におけるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５ＡのＩＬ-１８への相関を示すグラフである。
【図５０Ｆ】図５０Ａ-Ｆは、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａのレベルが、ＩＬ-１β及びＩＬ-１８と相関する患者のデーターを報告する。図５０Ｆは、弁置換術の患者における増殖ｅＩＦ-５ＡのＩＬ-１８への相関を示すグラフである。
【０２５６】
【図５１】図５１は、図５０Ａ-Ｆにおいて使用される患者データーの取得元の患者データーの表である。
【図５１Ａ】図５１は、図５０Ａ-Ｆにおいて使用される患者データーの取得元の患者データーの表である。
【図５１Ｂ】図５１は、図５０Ａ-Ｆにおいて使用される患者データーの取得元の患者データーの表である。
【図５１Ｃ】図５１は、図５０Ａ-Ｆにおいて使用される患者データーの取得元の患者データーの表である。
【図５１Ｄ】図５１は、図５０Ａ-Ｆにおいて使用される患者データーの取得元の患者データーの表である。
【図５２】図５２は、(アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの)アンチセンスオリゴ１、２、及び３(それぞれ、配列番号３５、３７、及び３９)で処理された後の、ＲＫＯ細胞により産生されるタンパク質のレベルを示す。ＲＫＯ細胞は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａのアンチセンス・オリゴヌクレオチドでトランスフェクションされた後において、少ないアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ並びに少ないｐ５３しか産生しなかった。
【図５３Ａ−Ｂ】図５３は、蛍光標識されたアンチセンス・オリゴヌクレオチドの取り込みを示す。
【図５４】図５４は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションされていない細胞に比較して、アンチセンス・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａオリゴヌクレオチドでトランスフェクションされた細胞においてアポトーシスを起こしている細胞の割合の低下を示す。
【図５５】図５５は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションされていない細胞に比較して、アンチセンス・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａオリゴヌクレオチドでトランスフェクションされた細胞においてアポトーシスを起こしている細胞の割合の低下を示す。
【０２５７】
【図５６】図５６は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションされていない細胞に比較して、アンチセンス・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａオリゴヌクレオチドでトランスフェクションされた細胞においてアポトーシスを起こしている細胞の割合の低下を示す。
【図５７】図５７は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションされていない細胞に比較して、アンチセンス・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａオリゴヌクレオチドでトランスフェクションされた細胞においてアポトーシスを起こしている細胞の割合の低下を示す。
【図５８】図５８は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションされていない細胞に比較して、アンチセンス・アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａオリゴヌクレオチドでトランスフェクションされた細胞においてアポトーシスを起こしている細胞の割合の低下を示す。
【図５９】図５９は、篩板細胞をＴＮＦ-α及び/又はカンプトテシンで処理することが、アポトーシスを引き起こしている細胞数の増加させることを示す。
【図６０】図６０及び６１は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａアンチセンス・オリゴヌクレオチドでトランスフェクションされなかった細胞に比べて、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された細胞においてアポトーシスを引き起こす細胞の割合が低下することを示す。
【０２５８】
【図６１】図６０及び６１は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａアンチセンス・オリゴヌクレオチドでトランスフェクションされなかった細胞に比べて、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された細胞においてアポトーシスを引き起こす細胞の割合が低下することを示す。
【図６２】図６２は、篩板細胞が、血清の存在下又は血清の非存在下において、標識ｓｉＲＮＡを取り込むことを示す。
【図６３】図６３は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞が、少ないアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａタンパク質しか産生せず、そしてさらに、より多くのＢｃｌ-２タンパク質を産生することを示す。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ発現の低下は、ＢＣＬ-２発現の増加と相関する。
【図６４】図６４は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞が、少ない量のアポトーシス因子５ａタンパク質しか産生しないことを示す。
【図６５】図６５〜６７は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞が、トランスフェクションされていない細胞に比べて、カンプトテシン及びＴＮＦ-αに晒された後にアポトーシスを引き起こす細胞の低い割合しか有さないということを示す。
【図６６】図６５〜６７は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞が、トランスフェクションされていない細胞に比べて、カンプトテシン及びＴＮＦ-αに晒された後にアポトーシスを引き起こす細胞の低い割合しか有さないということを示す。
【図６７】図６５〜６７は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞が、トランスフェクションされていない細胞に比べて、カンプトテシン及びＴＮＦ-αに晒された後にアポトーシスを引き起こす細胞の低い割合しか有さないということを示す。
【図６８】図６８は、ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされ、そして図６７及び実施例１３において記載された実験からカンプトテシン及びＴＮＦ-αで処理された篩板細胞系列＃５０６であってヘキスト染色されたものの写真である。アポトーシスをしている細胞は、より明るく染色された細胞として観察される。これらの細胞は、クロマチン凝集のため生じる小さい核を有し、そして小さくかつ不定形な形である。
【図６９】図６９は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａでトランスフェクションされ、ＩＬ-１に晒されたＨｅｐＧ２細胞は、トランスフェクションされていない細胞よりも少ないＴＮＦ-αを分泌することが示される。
【図７０】図７０は、ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ(配列番号２９)の配列及び本発明の５個のｓｉＲＮＡの配列(配列番号３０、３１、３２、３３、及び３４)を示す。
【０２５９】
【図７１】図７１は、ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ(配列番号２９)と、本発明の３個のアンチセンス・オリゴヌクレオチドの配列(それぞれ出てきた順に配列番号３５、３７、及び３９)を示す。
【図７２】図７２は、ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに標的化された３個のアンチセンス・オリゴヌクレオチド(それぞれ出てきた順に配列番号２５〜２７)の結合部位を示す。全長オリゴヌクレオチド配列は、配列番号１９である。
【図７３Ａ】図７３Ａ及びＢは、ヒト増殖ｅＩＦ-５Ａに対するヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａのヌクレオチドアライメント(それぞれ出てきた順に配列番号４１及び４２)とアミノ酸アライメント(それぞれ出てきた順に配列番号４３と２２)を示す。
【図７３Ｂ】図７３Ａ及びＢは、ヒト増殖ｅＩＦ-５Ａに対するヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａのヌクレオチドアライメント(それぞれ出てきた順に配列番号４１及び４２)とアミノ酸アライメント(それぞれ出てきた順に配列番号４３と２２)を示す。
【図７４Ａ】図７４Ａは、ウエスタンブロットの写真を提供する。ここでアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡが、トランスフェクションされたＨＴ２９細胞においてＴＮＦ-αの産生を阻害するまではいかないが低減した。
【図７４Ｂ】図７４Ｂは、ＥＬＩＳＡの結果を提供する。
【図７５】ＥＬＩＳＡの結果を提供する。ＴＮＦ-α産生は、対照細胞に比較して、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡで処理された細胞において低減した。
【図７６】図７６は、Ｕ-９３７分化実験のタイムコースを示す。実施例１６を参照のこと。
【図７７】図７７は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａが、単球分化及びそれに続くＴＮＦ-α分泌のあいだ上方制御されることを示す。
【図７８】図７８は幹細胞分化、及びサイトカイン産生を阻害するためにアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するsiＲＮＡを使用することを示す。
【図７９】図７９は、ＩＬ-８がＴＮＦ-αに応答して、並びにインターフェロンに応答して産生されることを示す棒グラフである。当該グラフは、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡが、インターフェロンに応答して産生されるほとんど全てのＩＬ-８、並びにインターフェロンとＴＮＦとの混合処理の結果として産生されるＩＬ-８のかなりの量を阻害するということを示す。
【図８０】図８０は、ＩＬ-８がＴＮＦ-αに応答して、並びにインターフェロンに応答して産生されるということを示す別の棒グラフである。当該グラフにより、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡが、インターフェロンに応答して産生されるほとんど全てのＩＬ-８を阻害し、並びにインターフェロンとＴＮＦとの混合処理の結果として産生されるかなりの量のＩＬ-８を阻害するということが示される。
【０２６０】
【図８１】図８１は、８〜２４時間、ＩＦＮγで処理されたＨＴ-２９細胞のウエスタンブロットである。当該ブロットは、ＨＴ２９におけるインターフェロンガンマに応答したアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの上方制御(８時間で４倍)を示す。
【図８２】図８２は、免疫蛍光による篩板細胞の特徴決定である。８３歳の男性の視神経頭から単離された篩板細胞は免疫蛍光により特徴決定した。一次抗体はａ）アクチン；ｂ）フィブロネクチン；ｃ）ラミニン；ｄ）ＧＦＡＰであった。全ての写真を４００倍で撮った。
【図８３】図８３は、カンプトテシン及びＴＮＦ-αでの処理に応答した篩板細胞系列＃５０６のアポトーシス割合を示すグラフである。篩板細胞系列＃５０６細胞は、８ウェル培養スライド上で、１ウェルあたり４００００細胞で蒔いた。３日後、コンフルエントＬＣ細胞を、１０ｎｇ/ｍｌＴＮＦ-α、５０μＭカンプトテシン、又は１０ｎｇ/ｍｌＴＮＦ-α+５０μＭカンプトテシンで処理した。カンプトテシンの溶媒対照である等体積のＤＭＳＯを、未処理の対照細胞に加えた。細胞を、処理後４８時間でヘキスト３３２５８で染色し、そしてＵＶフィルターを用いた蛍光顕微鏡により観察した。明るく染色され凝集又は断片化された核を有する細胞を、アポトーシスをしている細胞として計数した。
【図８４Ａ−Ｂ】図８４は、カンプトテシン又はＴＮＦ-α+カンプトテシン処理のあいだ、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現レベルを示す。篩板細胞＃５０６細胞を１ウェルあたり４００００細胞で、２４ウェルプレート上に蒔いた。３日後、ＬＣ細胞を５０μＭのカンプトテシン又は１０ｎｇ/ｍｌのＴＮＦ-α＋５０μＭのカンプトテシンで処理し、そしてタンパク質ライセートを１、４、８、及び２４時間後に回収した。等体積のＤＭＳＯを対照細胞に溶媒対照として加え、そして細胞ライセートを１〜２４時間後に回収した。各サンプルからの５μｇのタンパク質を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、そして抗-アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ抗体を用いてウエスタンブロットした。結合された抗体を化学発光により検出し、そしてＸ線フィルムに露光させた。次に当該膜を引き剥がし、そしてロード量の内部対照として抗-β-アクチンで再ブロットした。
【図８５】図８５はｓｉＲＮＡでのトランスフェクションの後に、篩板細胞系列＃５０６及び＃５１７におけるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現レベルを示す。篩板細胞＃５０６及び＃５１７細胞を、１ウェルあたり１００００細胞で２４ウェルプレート上に蒔いた。３日後、ＬＣ細胞を、ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡ、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡ＃１〜４(配列番号３０〜３３)又は対照ｓｉＲＮＡ＃５(配列番号３４)でトランスフェクションした。トランスフェクションの３日後、タンパク質ライセートを回収し、そして各サンプルから得た５μｇのタンパク質をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、そして抗ｅＩＦ-５Ａ抗体でウエスタンブロットすることにより分離した。結合された抗体を化学発光により検出し、そしてＸ線フィルムに露光させた。次ぎに膜を剥がし、そしてロード量内部対照として抗βーアクチンで再ブロットした。この図により、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５ＡのｓｉＲＮＡで処理された細胞が、少ない量のアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａタンパク質しか産生しないことが示される。
【０２６１】
【図８６】図８６により、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされ、そしてＴＮＦ-α及びカンプトテシンで処理された篩板細胞系列＃５０６のアポトーシス割合が示される。篩板細胞系列＃５０６細胞を、８ウェル培養スライド上に１ウェルあたり７５００で蒔いた。３日後ＬＣ細胞をＧＡＰＤＨｓｉＲＮＡ、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡ＃１〜４(配列番号３０〜３３)、又は対照ｓｉＲＮＡ＃５(配列番号３４)でトランスフェクションした。トランスフェクションの７２時間後、トランスフェクションされた細胞を、１０ｎｇ/ｍｌのＴＮＦ-α+５０μＭカンプトテシンで処理した。２４時間後、細胞をヘキスト３３２５８で染色し、そしてＵＶフィルターを用いて蛍光顕微鏡により観察した。明るく染色された凝集又は断片化された核を有する細胞をアポトーシスしている細胞として計数した。当該グラフは、ｎ＝４の独立した実験の平均を表す。当該図は、カンプトテシン及びＴＮＦで処理された際に、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５ＡのｓｉＲＮＡでトランスフェクションされていない細胞に比べて、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５ＡのｓｉＲＮＡで処理された細胞が、少ない割合のアポトーシスしか示さないことを示す。
【図８７】図８７により、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡ＃１でトランスフェクションされ、そしてＴＮＦ-α及びカンプトテシンで処理された篩板細胞系列＃５１７のアポトーシス割合が示される。篩板細胞系列＃５１７細胞を、１ウェルあたり７５００細胞で、８ウェル培養スライド上に蒔いた。３日後、ＬＣ細胞をアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡ＃１(配列番号３０)又は対照ｓｉＲＮＡ＃５(配列番号３４)でトランスフェクションした。トランスフェクションの７２時間後、トランスフェクションされた細胞を、１０ｎｇ/ｍｌのＴＮＦ-α＋５０μＭカンプトテシンで処理した。２４時間後、細胞をヘキスト３３２５８で染色し、そしてＵＶフィルターを用いて蛍光顕微鏡により観察した。明るく染色され、凝集又は断片化している核を有する細胞をアポトーシスしている細胞として計数した。２個の独立した実験を本明細書に示す。当該実験により、ｓｉＲＮで処理された細胞がアポトーシスの低い割合しか有さなかったということが示される。
【図８８Ａ−Ｂ】図８８は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡ＃１でトランスフェクションされ、そしてＴＮＦ-α及びカンプトテシンで処理された篩板細胞系列＃５０６のＴＵＮＥＬ標識を示す。篩板細胞系列＃５０６細胞を、１ウェルあたり７５００の細胞で８ウェル培養スライドに蒔いた。３日後、ＬＣ細胞をアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡ＃１(配列番号３０)又は対照ｓｉＲＮＡ＃５(配列番号３４)でトランスフェクションした。トランスフェクション後７２時間において、トランスフェクションされた細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα＋５０マイクロＭのカンプトテシンで処理した。２４時間後、細胞をヘキスト３３２５８で染色し、ＤＮＡ断片化を、末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ媒介性ｄＵＴＰジゴキシゲニン・ニック末端標識(ＴＵＮＥＬ)法を用いてin  situで評価した。パネルAは、アポトーシス細胞のＤＮＡ断片のＴＵＮＥＬ標識を可視化するために蛍光フィルターを用いて蛍光顕微鏡により観測されたスライドを表す。パネルＢは、ヘキスト染色された核を可視化するＵＶフィルターを通すことにより観測された同じスライドを表す。結果は、２個の独立した実験を表す。全ての画像を４００倍の倍率で撮った。
【図８９Ａ】図８９は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡの設計を示す。ｓｉＲＮＡは、配列番号４５、４８、５１、５４、及び５６を有する。全長ヌクレオチド配列は、配列番号２９に示される。
【図８９Ｂ】図８９は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡの設計を示す。ｓｉＲＮＡは、配列番号４５、４８、５１、５４、及び５６を有する。全長ヌクレオチド配列は、配列番号２９に示される。
【図９０】図９０は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡが、インターフェロンガンマ及びＬＰＳの存在下でＮＦκＢの低下をもたらす実験の結果を示す。
【０２６２】
【図９１】図９１は、ＰＢＭＣ実験のためのタイムコースを示す(実施例１８を参照のこと)。
【図９２】図９２は、タイムコースに渡り２つのドナーから回収されたＰＢＭＣからの細胞ライセートのウエスタンブロットを示す。ＰＢＭＣを、ＰＭＡで処理し、そして次にＬＰＳで刺激して、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を増加させた。
【図９３Ａ】図９３は、ＰＭＡで処理され、次にＬＰＳで刺激されたＰＢＭＣが、増加したアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ発現を有し、これがＴＮＦ産生の増加に一致することを示す。
【図９３Ｂ】図９３は、ＰＭＡで処理され、次にＬＰＳで刺激されたＰＢＭＣが、増加したアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ発現を有し、これがＴＮＦ産生の増加に一致することを示す。
【図９４】図９４は、ＰＢＭＣがＰＭＡ分化をすることなく、ＬＰＳに応答することを示す。
【図９５】図９５は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされたＰＢＭＣが、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を抑制することを示す。
【０２６３】
【図９６Ａ】図９６は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされ、そしてＬＰＳで刺激されたＰＢＭＣが、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされていないＰＢＭＣよりも少ない量のＴＮＦしか産生しないということを示す。
【図９６Ｂ】図９６は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされ、そしてＬＰＳで刺激されたＰＢＭＣが、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされていないＰＢＭＣよりも少ない量のＴＮＦしか産生しないということを示す。
【図９６Ｃ】図９６は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされ、そしてＬＰＳで刺激されたＰＢＭＣが、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされていないＰＢＭＣよりも少ない量のＴＮＦしか産生しないということを示す。
【図９６Ｄ】図９６は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされ、そしてＬＰＳで刺激されたＰＢＭＣが、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされていないＰＢＭＣよりも少ない量のＴＮＦしか産生しないということを示す。
【図９７】図９７は、ガンマ-インターフェロンで処理されたＨＴ２９細胞、又は処理されていないHT２９細胞からの細胞ライセートのウエスタンブロットを示す。
【図９８】図９８は、対照ｓｉＲＮＡ又はアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされたＨＴ-２９からの細胞ライセートのウエスタン・ブロットを示す。当該図は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５ＡのｓｉＲＮＡが、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を抑制することを示す。
【図９９】図９９は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされたＨＴ２９細胞が、低減されたＴＮＦ産生レベルを有することを示す。
【図１００】図１００は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされたＨＴ-２９細胞が、対照細胞に比べてアポトーシスを低下させることを示す。対照及びｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞の両方を、インターフェロンγで刺激し、そしてＴＮＦ-αで処理した。
【０２６４】
【図１０１】図１０１は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされたＨＴ-２９細胞が、対照細胞より少ないＴＬＲ４タンパク質を発現することを示す。
【図１０２】図１０２は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされたＨＴ-２９細胞が、対照細胞より少ないＴＮＦＲ１タンパク質を発現することを示す。
【図１０３】図１０３は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされたＨＴ-２９細胞が、対照細胞より少ないｉＮＯＳタンパク質を発現することを示す。
【図１０４】図１０４は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされたＨＴ-２９細胞が、対照細胞より少ないＴＬＲ４ｍＲＮＡを発現することを示す。
【図１０５】図１０５は、Ｕ９３７処理のタイムコースを示す。
【０２６５】
【図１０６】図１０６は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａが、Ｕ９３７細胞においてＰＭＡで上方制御されることを示す。
【図１０７】図１０７は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａが、Ｕ９３７細胞においてＬＰＳで上方制御されることを示す。
【図１０８】図１０８は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａタンパク質発現が、ｓｉＲＮＡ処理後数時間後においても低減していることを示す。
【図１０９】図１０９は、ｓｉＲＮＡにより仲介されるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの下方制御が、ＴＬＲ-４の減少に一致することを示す。
【図１１０】図１１０は、ｓｉＲＮＡにより仲介されるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの下方制御が、Ｕ９３７細胞のインターフェロンγのグリコシル化形態が少ないことに一致することを示す。
【０２６６】
【図１１１】図１１１は、ｓｉＲＮＡにより仲介されるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの下方制御が、Ｕ９３７細胞のＴＮＦＲ１の減少と一致することを示す。
【図１１２】図１１２は、ｓｉＲＮＡにより仲介されるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの下方制御が、Ｕ９３７細胞におけるＬＰＳ誘導性ＴＮＦ-αの減少と一致することを示す。
【図１１３】図１１３は、ｓｉＲＮＡにより仲介されるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの下方制御が、Ｕ９３７細胞におけるＬＰＳ誘導性ＩＬ-１βの減少と一致することを示す。
【図１１４】図１１４は、ｓｉＲＮＡにより仲介されるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの下方制御が、Ｕ９３７細胞におけるＬＰＳ誘導性ＩＬ-８の減少と一致することを示す。
【図１１５】図１１５は、ＩＬ-６産生が、Ｕ９３７細胞において、ｓｉＲＮＡにより仲介されるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの下方制御と無関係であることを示す。
【図１１６】図１１６は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡの静脈内デリバリーが、血清中におけるＴＮＦ-αのレベルの低下を引き起こすことを示す。
【図１１７】図１１７は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡの経鼻デリバリーが、肺内におけるＴＮＦ-αのレベルの低下を引き起こすことを示す。
【図１１８】図１１８は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡの経鼻デリバリーが、肺内におけるＭＩＰ-１のレベルの低下を引き起こすことを示す。
【図１１９】図１１９は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡの経鼻デリバリーが、ＩＬ-１αのレベルの低下を引き起こすことを示す。
【図１２０】図１２０は、ＩＦＮ-γ及びＬＰＳに晒されるＨＴ-２９細胞において、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡでのトランスフェクションが、ＮＦκＢｐ５０の活性化及びＴＮＦ-αの産生の低下を引き起こすことを示す。
【０２６７】
【図１２１】図１２１は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡが、ＨＴ-２９細胞において内在性のアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を抑制するということを示す。
【図１２２】図１２２は、ＨＴ-２９細胞において、ｓｉＲＮＡにより仲介されるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの減少がＩＦＮ-γに応答したＩＦＮ-γ受容体αの集積を低減させることを示す。
【図１２３】図１２３は、ＨＴ-２９細胞において、ｓｉＲＮＡにより仲介されるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの減少がＩＦＮ-γに応答したトール受容体４(Toll Receptor4(TLR4))の集積を低減させることを示す。
【図１２４】図１２４は、ＨＴ-２９細胞において、ｓｉＲＮＡにより仲介されるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの減少がＩＦＮ-γに応答したＪＡＫ１及びＳＴＡＴ１リン酸化を低減させることを示す。
【図１】
2008507278.tif 000004
【図２】
2008507278.tif 000005
【図３】
2008507278.tif 000006
【図４】
2008507278.tif 000007
【図５】
2008507278.tif 000008
【図６】
2008507278.tif 000009
【図７】
2008507278.tif 000010
【図８】
2008507278.tif 000011
【図９】
2008507278.tif 000012
【図１０】
2008507278.tif 000013
【図１１】
2008507278.tif 000014
【図１２】
2008507278.tif 000015
【図１３】
2008507278.tif 000016
【図１４】
2008507278.tif 000017
【図１５】
2008507278.tif 000018
【図１６】
2008507278.tif 000019
【図１７】
2008507278.tif 000020
【図１８】
2008507278.tif 000021
【図１９】
2008507278.tif 000022
【図２０】
2008507278.tif 000023
【図２１】
2008507278.tif 000024
【図２２】
2008507278.tif 000025
【図２３】
2008507278.tif 000026
【図２４】
2008507278.tif 000027
【図２５】
2008507278.tif 000028
【図２６】
2008507278.tif 000029
【図２７】
2008507278.tif 000030
【図２８】
2008507278.tif 000031
【図２９】
2008507278.tif 000032
【図３０】
2008507278.tif 000033
【図３１】
2008507278.tif 000034
【図３２】
2008507278.tif 000035
【図３３】
2008507278.tif 000036
【図３４】
2008507278.tif 000037
【図３５】
2008507278.tif 000038
【図３６】
2008507278.tif 000039
【図３７Ａ】
2008507278.tif 000040
【図３７Ｂ−Ｃ】
2008507278.tif 000041
【図３８】
2008507278.tif 000042
【図３９】
2008507278.tif 000043
【図４０】
2008507278.tif 000044
【図４１】
2008507278.tif 000045
【図４２】
2008507278.tif 000046
【図４３】
2008507278.tif 000047
【図４４】
2008507278.tif 000048
【図４５】
2008507278.tif 000049
【図４６】
2008507278.tif 000050
【図４７】
2008507278.tif 000051
【図４８】
2008507278.tif 000052
【図４９】
2008507278.tif 000053
【図５０Ａ−Ｂ】
2008507278.tif 000054
【図５０Ｃ】
2008507278.tif 000055
【図５０Ｄ】
2008507278.tif 000056
【図５０Ｅ】
2008507278.tif 000057
【図５０Ｆ】
2008507278.tif 000058
【図５１】
2008507278.tif 000059
【図５１Ａ】
2008507278.tif 000060
【図５１Ｂ】
2008507278.tif 000061
【図５１Ｃ】
2008507278.tif 000062
【図５１Ｄ】
2008507278.tif 000063
【図５２】
2008507278.tif 000064
【図５３Ａ】
2008507278.tif 000065
【図５３Ｂ】
2008507278.tif 000066
【図５４】
2008507278.tif 000067
【図５５】
2008507278.tif 000068
【図５６】
2008507278.tif 000069
【図５７】
2008507278.tif 000070
【図５８】
2008507278.tif 000071
【図５９】
2008507278.tif 000072
【図６０】
2008507278.tif 000073
【図６１】
2008507278.tif 000074
【図６２】
2008507278.tif 000075
【図６３】
2008507278.tif 000076
【図６４】
2008507278.tif 000077
【図６５】
2008507278.tif 000078
【図６６】
2008507278.tif 000079
【図６７】
2008507278.tif 000080
【図６８】
2008507278.tif 000081
【図６９】
2008507278.tif 000082
【図７０】
2008507278.tif 000083
【図７１】
2008507278.tif 000084
【図７２】
2008507278.tif 000085
【図７３Ａ】
2008507278.tif 000086
【図７３Ｂ】
2008507278.tif 000087
【図７４Ａ】
2008507278.tif 000088
【図７４Ｂ】
2008507278.tif 000089
【図７５】
2008507278.tif 000090
【図７６】
2008507278.tif 000091
【図７７】
2008507278.tif 000092
【図７８】
2008507278.tif 000093
【図７９】
2008507278.tif 000094
【図８０】
2008507278.tif 000095
【図８１】
2008507278.tif 000096
【図８２Ａ】
2008507278.tif 000097
【図８２Ｂ】
2008507278.tif 000098
【図８２Ｃ】
2008507278.tif 000099
【図８２Ｄ】
2008507278.tif 000100
【図８３】
2008507278.tif 000101
【図８４Ａ−Ｂ】
2008507278.tif 000102
【図８５】
2008507278.tif 000103
【図８６】
2008507278.tif 000104
【図８７】
2008507278.tif 000105
【図８８Ａ−Ｂ】
2008507278.tif 000106
【図８９Ａ】
2008507278.tif 000107
【図８９Ｂ】
2008507278.tif 000108
【図９０】
2008507278.tif 000109
【図９１】
2008507278.tif 000110
【図９２】
2008507278.tif 000111
【図９３Ａ】
2008507278.tif 000112
【図９３Ｂ】
2008507278.tif 000113
【図９４】
2008507278.tif 000114
【図９５】
2008507278.tif 000115
【図９６Ａ】
2008507278.tif 000116
【図９６Ｂ】
2008507278.tif 000117
【図９６Ｃ】
2008507278.tif 000118
【図９６Ｄ】
2008507278.tif 000119
【図９７】
2008507278.tif 000120
【図９８】
2008507278.tif 000121
【図９９】
2008507278.tif 000122
【図１００】
2008507278.tif 000123
【図１０１】
2008507278.tif 000124
【図１０２】
2008507278.tif 000125
【図１０３】
2008507278.tif 000126
【図１０４】
2008507278.tif 000127
【図１０５】
2008507278.tif 000128
【図１０６】
2008507278.tif 000129
【図１０７】
2008507278.tif 000130
【図１０８】
2008507278.tif 000131
【図１０９】
2008507278.tif 000132
【図１１０】
2008507278.tif 000133
【図１１１】
2008507278.tif 000134
【図１１２】
2008507278.tif 000135
【図１１３】
2008507278.tif 000136
【図１１４】
2008507278.tif 000137
【図１１５】
2008507278.tif 000138
【図１１６】
2008507278.tif 000139
【図１１７】
2008507278.tif 000140
【図１１８】
2008507278.tif 000141
【図１１９】
2008507278.tif 000142
【図１２０】
2008507278.tif 000143
【図１２１】
2008507278.tif 000144
【図１２２】
2008507278.tif 000145
【図１２３】
2008507278.tif 000146
【図１２４】
2008507278.tif 000147
【配列表】
2008507278000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年12月4日(2007.12.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２４】
ｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ配列を、ヒトアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ配列に基づいて設計し、そしてｓｉＲＮＡはDharmacon RNA Technologiesにより合成された。アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡ(ｈ５Ａ１)標的配列は、以下の：
５'ＮＮＧＣＵＧＧＡＣＵＣＣＵＣＣＵＡＣＡＣＡ３'(配列番号８６)
であった。対応する二本鎖ｓｉＲＮＡ配列は、以下の：
５'ＧＣＵＧＧＡＣＵＣＣＵＣＣＵＡＣＡＣＡｄＴｄＴ３'(配列番号８７)
３'ｄＴｄＴＣＧＡＣＣＵＧＡＧＧＡＧＧＡＵＧＵＧＵ５'(配列番号８８)
であった。対照ｓｉＲＮＡ(ｈ対照)配列は、以下の：
５'ＮＮＡＣＡＣＡＵＣＣＵＣＣＵＣＡＧＧＵＣＧ３'(配列番号８９)
であった。対応する二本鎖ｓｉＲＮＡ配列は、以下の：
５'ＡＣＡＣＡＵＣＣＵＣＣＵＣＡＧＧＵＣＧｄＴｄＴ３'(配列番号９０)
３'ｄＴｄＴＵＧＵＧＵＡＧＧＡＧＧＡＧＵＣＣＡＧＣ５'(配列番号９１)
であった。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３５】
ＴＬＲ４(ＮＭ＿００３２６６)についてのプライマーは、以下の：
フォワード  ５'ＣＧＧＡＴＧＧＣＡＡＣＡＴＴＴＡＧＡＡＴＴＡＧＴ３'(配列番号９２)
リバース    ５'ＴＧＡＴＴＧＡＧＡＣＴＧＴＡＡＴＣＡＡＧＡＡＣＣ３'(配列番号９３)
予想される断片の大きさ：６７４ｂｐ
であった。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３６】
ＧＡＰＤＨ(ＢＣ０２３６３２)についてのプライマーは、以下の：
フォワード  ５'ＣＴＧＡＴＧＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＣＧＴＣＡＴ３'(配列番号９４)
リバース    ５'ＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡＧ３'(配列番号９５)
予想される断片の大きさ：５９９ｂｐ
であった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６２】
【図９１】図９１は、ＰＢＭＣ実験のためのタイムコースを示す(実施例１８を参照のこと)。ＰＭＡ(１００ｎｇ／ｍｌ)で７２時間処理することにより、単球を接着性のマクロファージへと分化させた。７２時間目において、培地を交換することにより細胞を静止状態にした。９６時間目において、ＬＰＳ(１００ｎｇ／ｍｌ)を加えた。サンプル(培地及び細胞ライセート)を指摘された時間点で回収した。この実験は、Ｕ９３７細胞が受ける刺激に近似させた。
【図９２】図９２は、タイムコースに渡り２つのドナーから回収されたＰＢＭＣからの細胞ライセートのウエスタンブロットを示す。ＰＢＭＣを、ＰＭＡで処理し、そして次にＬＰＳで刺激して、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を増加させた。ＰＢＭＣをＰＭＡ(１００ｎｇ／ｍｌ)及びＬＰＳ(１００ｎｇ／ｍｌ)で刺激した。細胞ライセートを回収し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルで分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、そして、ｅＩＦ５Ａに対する抗体(BD Biosciences LABORATORIES)でブロットした。ブロットを剥がし、そしてβ-アクチンに対する抗体(Oncogene)でブロットした。ＰＭＡを加えることでマクロファージの分化が誘導される一方、ＬＰＳの添加は、マクロファージを誘導して、ＴＮＦを産生する。
【図９３Ａ】図９３は、ＰＭＡで処理され、次にＬＰＳで刺激されたＰＢＭＣが、増加したアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ発現を有し、これがＴＮＦ産生の増加に一致することを示す。
【図９３Ｂ】図９３は、ＰＭＡで処理され、次にＬＰＳで刺激されたＰＢＭＣが、増加したアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ発現を有し、これがＴＮＦ産生の増加に一致することを示す。
【図９４】図９４は、ＰＢＭＣがＰＭＡ分化をすることなく、ＬＰＳに応答することを示す。様々な刺激因子で処理されたＰＢＭＣは、早い段階で(２４時間以内に)アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ発現のピークを迎え、その後発現は低下する。左側の数字は、ドナーの情報一覧表に対応する。細胞ライセートを回収し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルで分離し、ＰＶＤＦ膜へと転写し、そしてｅＩＦ５Ａに対する抗体(ＢＤ Biosciences Laboratories)でブロットした。総アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ発現レベルは、精製されたＰＢＭＣに対して上昇したが、刺激後最初の２４時間の内にピークに達し、そして次に低下した。当該実験により、ＰＢＭＣは、ＰＭＡ分化なしでＬＰＳに応答することが示される。
【図９５】図９５は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされたＰＢＭＣが、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を抑制することを示す。アポトーシス特異的ｅＩＦ５ＡｓｉＲＮＡでトランスフェクションされたＰＢＭＣは、対照に比べた場合にいくらかの低減を示す。トランスフェクションの７２時間後、ＰＢＭＣをＬＰＳで２４時間処理した。培地及び細胞ライセートを回収し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、そしてｅＩＦ５Ａに対する抗体(BD BIOSCIENCES LABORATORIES)でブロットした。抑制レベルは、トランスフェクション効率により決定される。上記ブロットはまた総ｅＩＦ５Ａ発現を(つまり、アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ及びｅＩＦ５Ａ２の両方の発現)を示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６３】
【図９６Ａ】図９６は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされ、そしてＬＰＳで刺激されたＰＢＭＣが、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされていないＰＢＭＣよりも少ない量のＴＮＦしか産生しないということを示す。アポトーシス特異的ｅＩＦ５ＡｓｉＲＮＡでトランスフェクションされ、そしてＬＰＳで２４時間刺激されたＰＢＭＣは、少ないＴＮＦしか産生しない。ＰＢＭＣは、パーコール勾配により新たに採取された血液から回収し、計数し、そしてｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。７２時間(ｅＩＦ５Ａの枯渇に必要とされる時間)の後に、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを２４時間加えることにより細胞を刺激した。分泌されたＴＮＦをＥＬＩＳＡにより定量し、そして総細胞タンパク質について補正した。上記表により、本実験の各ドナーサンプルにおいて、ＴＮＦ産生の低下割合が示される。
【図９６Ｂ】図９６は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされ、そしてＬＰＳで刺激されたＰＢＭＣが、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされていないＰＢＭＣよりも少ない量のＴＮＦしか産生しないということを示す。アポトーシス特異的ｅＩＦ５ＡｓｉＲＮＡでトランスフェクションされ、そしてＬＰＳで２４時間刺激されたＰＢＭＣは、少ないＴＮＦしか産生しない。ＰＢＭＣは、パーコール勾配により新たに採取された血液から回収し、計数し、そしてｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。７２時間(ｅＩＦ５Ａの枯渇に必要とされる時間)の後に、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを２４時間加えることにより細胞を刺激した。分泌されたＴＮＦをＥＬＩＳＡにより定量し、そして総細胞タンパク質について補正した。上記表により、本実験の各ドナーサンプルにおいて、ＴＮＦ産生の低下割合が示される。
【図９６Ｃ】図９６は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされ、そしてＬＰＳで刺激されたＰＢＭＣが、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされていないＰＢＭＣよりも少ない量のＴＮＦしか産生しないということを示す。アポトーシス特異的ｅＩＦ５ＡｓｉＲＮＡでトランスフェクションされ、そしてＬＰＳで２４時間刺激されたＰＢＭＣは、少ないＴＮＦしか産生しない。ＰＢＭＣは、パーコール勾配により新たに採取された血液から回収し、計数し、そしてｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。７２時間(ｅＩＦ５Ａの枯渇に必要とされる時間)の後に、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを２４時間加えることにより細胞を刺激した。分泌されたＴＮＦをＥＬＩＳＡにより定量し、そして総細胞タンパク質について補正した。上記表により、本実験の各ドナーサンプルにおいて、ＴＮＦ産生の低下割合が示される。
【図９６Ｄ】図９６は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされ、そしてＬＰＳで刺激されたＰＢＭＣが、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされていないＰＢＭＣよりも少ない量のＴＮＦしか産生しないということを示す。アポトーシス特異的ｅＩＦ５ＡｓｉＲＮＡでトランスフェクションされ、そしてＬＰＳで２４時間刺激されたＰＢＭＣは、少ないＴＮＦしか産生しない。ＰＢＭＣは、パーコール勾配により新たに採取された血液から回収し、計数し、そしてｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。７２時間(ｅＩＦ５Ａの枯渇に必要とされる時間)の後に、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを２４時間加えることにより細胞を刺激した。分泌されたＴＮＦをＥＬＩＳＡにより定量し、そして総細胞タンパク質について補正した。上記表により、本実験の各ドナーサンプルにおいて、ＴＮＦ産生の低下割合が示される。
【図９７】図９７は、ガンマ-インターフェロンで処理されたＨＴ２９細胞、又は処理されていないHT２９細胞からの細胞ライセートのウエスタンブロットを示す。ライセートを回収し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、そしてｅＩＦ５Ａに対する抗体(BD Bioscience Laboratories)でブロットした。
【図９８】図９８は、対照ｓｉＲＮＡ又はアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされたＨＴ-２９からの細胞ライセートのウエスタン・ブロットを示す。当該図は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５ＡのｓｉＲＮＡが、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を抑制することを示す。トランスフェクションの４８時間後に、ＨＴ-２９細胞をインターフェロンγで刺激した。インターフェロンγ刺激の１６時間後、細胞をＬＰＳで８又は２４時間処理した。ライセートを回収し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、そしてｅＩＦ５Ａに対する抗体(BD Bioscience Laboratories)でブロットした。
【図９９】図９９は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされたＨＴ２９細胞が、低減されたＴＮＦ産生レベルを有することを示す。トランスフェクションされていない[(-)ｓｉＲＮＡ]又はトランスフェクションされたＨＴ-２９細胞を、トランスフェクションの４８時間後にインターフェロンγで刺激した。インターフェロンγ刺激の１６時間後、細胞をＬＰＳで８又は２４時間処理した。刺激されたが、ＬＰＳを受けていない細胞について培地交換を行った。培地を当該細胞から回収し、そしてＴＮＦ-αＥＬＩＳＡ(Assay Designs)により分析されるまで、-２０℃で保存した。細胞ライセートを回収し、タンパク質濃度をＢＣＡタンパク質定量キットを用いて測定し、そして細胞数について補正するために使用した。
【図１００】図１００は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされたＨＴ-２９細胞が、対照細胞に比べてアポトーシスの低下を示す。対照及びｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞の両方を、インターフェロンγで刺激し、そしてＴＮＦ-αで処理した。トランスフェクションされたＨＴ-２９細胞をトランスフェクション後４８時間でインターフェロンγで刺激した。インターフェロンγ刺激の１６時間後、細胞をＴＮＦ-αで２４時間処理した。アポトーシスを、固定された細胞のヘキスト染色及びＴＵＮＥＬ染色により検出した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６４】
【図１０１】図１０１は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされたＨＴ-２９細胞が、対照細胞より少ないＴＬＲ４タンパク質を発現することを示す。トランスフェクション後４８時間で、ＨＴ-２９細胞をインターフェロンγで８又は２４時間処理した。細胞ライセートを回収し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルで分離し、ＰＶＤＦ膜へと転写し、そしてＴＬＲ４に対する抗体(Santa Cruz Biotechnology)でブロットした。次にブロットを剥がし、そしてβ-アクチンに対する抗体(ONCOGENE)でブロットした。
【図１０２】図１０２は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされたＨＴ-２９細胞が、対照細胞より少ないＴＮＦＲ１タンパク質を発現することを示す。トランスフェクションの４８時間後、ＨＴ-２９細胞をインターフェロンγで０又は８時間処理した。細胞ライセートを回収し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、そしてＴＬＲ４に対する抗体でブロットした(Santa Cruz Biotechnology)。次にブロットを剥がし、そしてβアクチンに対する抗体(ONCOGENE)に対する抗体でブロットした。
【図１０３】図１０３は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされたＨＴ-２９細胞が、対照細胞より少ないｉＮＯＳタンパク質を発現することを示す。トランスフェクションの４８時間後、ＨＴ-２９細胞をインターフェロンγで２４時間処理した。細胞ライセートを回収し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、そしてｉＮＯＳに対する抗体でブロットした(ＢＤ Transduction Laboratories)。次にブロットを剥がし、そしてβアクチンに対する抗体(ONCOGENE)に対する抗体でブロットした。
【図１０４】図１０４は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａ・ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされたＨＴ-２９細胞が、対照細胞より少ないＴＬＲ４ｍＲＮＡを発現することを示す。トランスフェクションの４８時間後、ＨＴ-２９細胞をインターフェロンγの有り又は無しの下で６時間処理した。総ｍＲＮＡを単離し、そしてＲＴ-ＰＣＲのテンプレートとして使用した。ＲＴ-ＰＣＲは、ＴＬＲ４及びＧＡＰＤＨに対するプライマーを用いて行った。
【図１０５】図１０５は、Ｕ９３７処理のタイムコースを示す。電気穿孔によりｓｉＲＮＡ(アポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ１又は対照ｓｉＲＮＡ)で細胞をトランスフェクションした。ＰＭＡ(１００ｎｇ／ｍｌ)で４８時間処理することにより単球を接着性マクロファージへと分化させた。４８時間目の培地交換は、当該細胞が静止状態になることを許容した。７２時間目で、ＬＰＳ(１００ｎｇ／ｍｌ)、ＩＦＮγ(１０ユニット／ｍｌ)又はその両方を加えた。サンプルを記載されるように回収した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６５】
【図１０６】図１０６は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａが、Ｕ９３７細胞においてＰＭＡで上方制御されることを示す。Ｕ９３７細胞に対照ｓｉＲＮＡを電気穿孔した。１６時間後、ＰＭＡ(１００ｎｇ／ｍｌ)を加え(時間０)、そして細胞を３７℃でインキュベーションし、０ｈ(ＰＭＡ添加前)、２４ｈ、４８ｈ、及び７２ｈにおいてサンプルを回収した。サンプル(5μｇ)をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜へと転写し、そしてｅＩＦ５Ａ成分及びアクチン(ロード対照)について、ウエスタンブロッティングにより分析した。Ｕ９３７細胞は、このタイムコースの間に懸濁状態の単球から接着性のマクロファージへと分化した。接着の初期段階は、ＰＭＡを加えた６時間後において観察された。
【図１０７】図１０７は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａが、Ｕ９３７細胞においてＬＰＳで上方制御されることを示す。Ｕ９３７細胞は対照ｓｉＲＮＡで電気穿孔され、ＰＭＡ(１００ｎｇ／ｍｌ、４８時間)を加えてマクロファージに分化させ、そして７２時間目においてＬＰＳを添加する前に静止状態にした。説明のために図１０５のタイムコーススキームを参照した。ＬＰＳ(１００ｎｇ／ｍｌ)を、静止状態のマクロファージに加えて、そしてサンプルを、添加前及び３７℃でのインキュベーションの２４時間後に回収した。サンプル(５μｇ)をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜へと転写し、そしてアポトーシス特異的ｅＩＦ５Ａ含量及びアクチン(ロード対照)についてウエスタンブロッティングにより分析した。
【図１０８】図１０８は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａタンパク質発現が、ｓｉＲＮＡ処理後１１２時間でさらに低減していることを示す。Ｕ９３７細胞にｅＩＦ５Ａ１(５)又は対照ｓｉＲＮＡ(Ｃ)を電気穿孔した。１６時間後、ＰＭＡ(１００ｎｇ／ｍｌ)を加え、そして細胞を接着性マクロファージに分化させ、そして７２時間においてＬＰＳ(１００ｎｇ／ｍｌ)を加えるまで静止状態にした。細胞をＬＰＳ添加(時間０)及び３時間、６時間、及び２４時間において回収した。説明のため、図１０５に用いたタイムコースを参照した。サンプル(５μｇ)をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、そしてｅＩＦ５Ａ含量及びアクチン(ロード対照)についてウエスタンブロッティングをすることにより分析した。
【図１０９】図１０９は、ｓｉＲＮＡにより仲介されるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの下方制御が、ＴＬＲ-４の減少に一致することを示す。Ｕ９３７細胞にｅＩＦ５Ａ１又は対照ｓｉＲＮＡを電気穿孔した。１６時間後、ＰＭＡ(１００ｎｇ／ｍｌ)を加え、そして細胞を接着性マクロファージに分化させ、そしてＩＦＮγ(１００ユニット／ｍｌ)との６時間のインキュベーション前において静止状態にした。説明のため、図１０５のタイムコースを参照した。サンプル(５μｇ)をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、そしてＴＬＲ４含量及びアクチン(ロード対照)についてウエスタンブロッティングをすることにより分析した。
【図１１０】図１１０は、ｓｉＲＮＡにより仲介されるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの下方制御が、Ｕ９３７細胞のインターフェロンγのグリコシル化形態が少ないことに一致することを示す。Ｕ９３７細胞にｅＩＦ５Ａ１又は対照ｓｉＲＮＡを電気穿孔した。１６時間後、ＰＭＡ(１００ｎｇ／ｍｌ)を加え、そして細胞を接着性マクロファージに分化させ、そしてＩＦＮγ(１００ユニット／ｍｌ)との６時間のインキュベーション前において静止状態にした。説明のため、図１０５のタイムコースを参照した。サンプル(５μｇ)をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、そしてＩＦＮγーＲα含量及びアクチン(ロード対照)についてウエスタンブロッティングをすることにより分析した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６６】
【図１１１】図１１１は、ｓｉＲＮＡにより仲介されるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの下方制御が、Ｕ９３７細胞のＴＮＦＲ１の減少と一致することを示す。Ｕ９３７細胞にｅＩＦ５Ａ１又は対照ｓｉＲＮＡを電気穿孔した。１６時間後、ＰＭＡ(１００ｎｇ／ｍｌ)を加え、そして細胞を接着性マクロファージに分化させ、そしてＩＦＮγ(１００ユニット／ｍｌ)との６時間のインキュベーション前において静止状態にした。説明のため、図１０５のタイムコースを参照した。サンプル(５μｇ)をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、そしてＴＮＦ-Ｒ１及びアクチン(ロード対照)についてウエスタンブロッティングをすることにより分析した。
【図１１２】図１１２は、ｓｉＲＮＡにより仲介されるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの下方制御が、Ｕ９３７細胞におけるＬＰＳ誘導性ＴＮＦ-αの減少と一致することを示す。Ｕ９３７細胞にｅＩＦ５Ａ１又は対照ｓｉＲＮＡを電気穿孔した。１６時間後、ＰＭＡ(１００ｎｇ／ｍｌ)を加え、そして細胞を接着性マクロファージに分化させ、そしてＬＰＳ(１００ｎｇ／ｍｌ)の添加前に静止状態にした。サンプルをＬＰＳ添加前及び３時間後に回収した。説明のため、図１０５のタイムコースを参照した。分泌されたＴＮＦαをＥＬＩＳＡにより定量し、そして総細胞タンパク質について補正した。結果は、２個の独立した実験の特徴を示す。
【図１１３】図１１３は、ｓｉＲＮＡにより仲介されるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの下方制御が、Ｕ９３７細胞におけるＬＰＳ誘導性ＩＬ-１βの減少と一致することを示す。Ｕ９３７細胞にｅＩＦ５Ａ１又は対照ｓｉＲＮＡを電気穿孔した。１６時間後、ＰＭＡ(１００ｎｇ／ｍｌ)を加え、そして細胞を接着性マクロファージに分化させ、そしてＬＰＳ(１００ｎｇ／ｍｌ)＋／-ＩＦＮγ(１００ユニット／ｍｌ)の添加前に静止状態にした。サンプルをＬＰＳ添加前及び３時間後に回収した。説明のため、図１０５のタイムコースを参照した。分泌されたＩＬ-１βを液相電気化学発光（ＥＣＬ）により定量し、そして総細胞タンパク質について補正した。
【図１１４】図１１４は、ｓｉＲＮＡにより仲介されるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの下方制御が、Ｕ９３７細胞におけるＬＰＳ誘導性ＩＬ-８の減少と一致することを示す。Ｕ９３７細胞にｅＩＦ５Ａ１又は対照ｓｉＲＮＡを電気穿孔した。１６時間後、ＰＭＡ(１００ｎｇ／ｍｌ)を加え、そして細胞を接着性マクロファージに分化させ、そしてＬＰＳ(１００ｎｇ／ｍｌ)及び／又はＩＦＮγ(１００ユニット／ｍｌ)の添加前に静止状態にした。ＬＰＳ又はＬＰＳとＩＦＮγの添加前と添加の２４時間後においてサンプルを回収した。説明のため、図１０８のタイムコースを参照した。分泌されたＩＬ-８を液相電気化学発光（ＥＣＬ）により定量し、そして総細胞タンパク質について補正した。
【図１１５】図１１５は、ＩＬ-６産生が、Ｕ９３７細胞において、ｓｉＲＮＡにより仲介されるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの下方制御と無関係であることを示す。Ｕ９３７細胞にｅＩＦ５Ａ１又は対照ｓｉＲＮＡを電気穿孔した。１６時間後、ＰＭＡ(１００ｎｇ／ｍｌ)を加え、そして細胞を接着性マクロファージに分化させ、そしてＬＰＳ(１００ｎｇ／ｍｌ)及び／又はＩＦＮγ(１００ユニット／ｍｌ)の添加前に静止状態にした。ＬＰＳ又はＬＰＳとＩＦＮγの添加前と添加の２４時間後においてサンプルを回収した。説明のため、図１０５のタイムコースを参照した。分泌されたＩＬ-６を液相電気化学発光（ＥＣＬ）により定量し、そして総細胞タンパク質について補正した。
【図１１６】図１１６は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡの静脈内デリバリーが、血清中におけるＴＮＦ-αのレベルの低下を引き起こすことを示す。
【図１１７】図１１７は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡの経鼻デリバリーが、肺内におけるＴＮＦ-αのレベルの低下を引き起こすことを示す。
【図１１８】図１１８は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡの経鼻デリバリーが、肺内におけるＭＩＰ-１のレベルの低下を引き起こすことを示す。
【図１１９】図１１９は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡの経鼻デリバリーが、ＩＬ-１αのレベルの低下を引き起こすことを示す。
【図１２０】図１２０は、ＩＦＮ-γ及びＬＰＳに晒されるＨＴ-２９細胞において、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡでのトランスフェクションが、ＮＦκＢｐ５０の活性化及びＴＮＦ-αの産生の低下を引き起こすことを示す。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６７】
【図１２１】図１２１は、アポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａに対するｓｉＲＮＡが、ＨＴ-２９細胞において内在性のアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの発現を抑制するということを示す。ＨＴ-２９細胞を、トランスフェクションの２日後において０又は２４時間インターフェロンガンマで処理した。ライセートを回収し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、そしてｅＩＦ５Ａに対する抗体(BD Bioscience Laboratories)でブロットした。次に膜を剥がし、そしてβ-アクチンに対する抗体(Oncogene)でブロットした。
【図１２２】図１２２は、ＨＴ-２９細胞において、ｓｉＲＮＡにより仲介されるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの減少がＩＦＮ-γに応答したＩＦＮ-γ受容体αの集積を低減させることを示す。ＨＴ-２９細胞を、トランスフェクションの２日後において０、４、８、又は２４時間インターフェロンガンマで処理した。ライセートを回収し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、そしてＩＦＮ-γＲαする抗体(C-20；Santa Cruz Biotechnology Inc.;1：1000)でブロットした。次に膜を剥がし、そしてβ-アクチンに対する抗体(Oncogene)でブロットした。
【図１２３】図１２３は、ＨＴ-２９細胞において、ｓｉＲＮＡにより仲介されるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの減少がＩＦＮ-γに応答したトール受容体４(Toll Receptor4(TLR4))の集積を低減させることを示す。ＨＴ-２９細胞を、トランスフェクションの２日後において０、４、８、又は２４時間インターフェロンγで処理した。ライセートを回収し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、そしてＴＬＲ４に対する抗体(H-89；Santa Cruz Biotechnology Inc.;  １：２：５０)でブロットした。次に膜を剥がし、そしてβ-アクチンに対する抗体(Oncogene)でブロットした。これは、ＩＦＮ-γＲαについて使用された膜と同じである。
【図１２４】図１２４は、ＨＴ-２９細胞において、ｓｉＲＮＡにより仲介されるアポトーシス特異的ｅＩＦ-５Ａの減少がＩＦＮ-γに応答したＪＡＫ１及びＳＴＡＴ１リン酸化を低減させることを示す。ＨＴ-２９細胞を、トランスフェクションの２日後において０、２０分、１時間、又は４時間インターフェロンガンマで処理した。ライセートを回収し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、そしてＴｙｒ-１０２２及びＴｙｒ-１０２３リン酸化ＪＡＫ１を認識するｐＪａｋ１に対する抗体(ｐＪａｋ１(Ｔｙｒ１０２２/１０２３)；Santa Cruz Biotechnology Inc.;1：500)でブロットした。次に膜を剥がし、そしてTyr-701リン酸化Ｓｔａｔ１αｐ９１を検出するＳＴＡＴ１に対する抗体[ｐＡＴＡ１(Ｔｙｒ７０１)；Santa Cruz Biotechnology Inc.；1：1000)でブロットした。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１４】
2008507278.tif 000148
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１５】
2008507278.tif 000149
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１６】
2008507278.tif 000150
【手続補正１３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１７】
2008507278.tif 000151
【手続補正１４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１８】
2008507278.tif 000152
【手続補正１５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１９】
2008507278.tif 000153
【手続補正１６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２０】
2008507278.tif 000154
【手続補正１７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２２】
2008507278.tif 000155
【手続補正１８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２４】
2008507278.tif 000156
【手続補正１９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２７】
2008507278.tif 000157
【手続補正２０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２９】
2008507278.tif 000158
【手続補正２１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３３】
2008507278.tif 000159
【手続補正２２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３４】
2008507278.tif 000160
【手続補正２３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３５】
2008507278.tif 000161
【手続補正２４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３６】
2008507278.tif 000162
【手続補正２５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３７Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３７Ａ】
2008507278.tif 000163
【手続補正２６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３７Ｂ−Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３７Ｂ−Ｃ】
2008507278.tif 000164
【手続補正２７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４３】
2008507278.tif 000165
【手続補正２８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４９】
2008507278.tif 000166
【手続補正２９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５２】
2008507278.tif 000167
【手続補正３０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５３Ａ−Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５３Ａ−Ｂ】
2008507278.tif 000168
【手続補正３１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６２】
2008507278.tif 000169
【手続補正３２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６３】
2008507278.tif 000170
【手続補正３３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６４】
2008507278.tif 000171
【手続補正３４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６８】
2008507278.tif 000172
【手続補正３５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７４Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７４Ａ】
2008507278.tif 000173
【手続補正３６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７７】
2008507278.tif 000174
【手続補正３７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８１】
2008507278.tif 000175
【手続補正３８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８２】
2008507278.tif 000176
【手続補正３９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８４Ａ−Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８４Ａ−Ｂ】
2008507278.tif 000177
【手続補正４０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８５】
2008507278.tif 000178
【手続補正４１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８８Ａ−Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８８Ａ−Ｂ】
2008507278.tif 000179
【手続補正４２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９２】
2008507278.tif 000180
【手続補正４３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９４】
2008507278.tif 000181
【手続補正４４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９５】
2008507278.tif 000182
【手続補正４５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９６Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９６Ａ】
2008507278.tif 000183
【手続補正４６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９６Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９６Ｂ】
2008507278.tif 000184
【手続補正４７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９６Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９６Ｃ】
2008507278.tif 000185
【手続補正４８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９６Ｄ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９６Ｄ】
2008507278.tif 000186
【手続補正４９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９７】
2008507278.tif 000187
【手続補正５０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９８】
2008507278.tif 000188
【手続補正５１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９９】
2008507278.tif 000189
【手続補正５２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１００】
2008507278.tif 000190
【手続補正５３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０１】
2008507278.tif 000191
【手続補正５４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０２】
2008507278.tif 000192
【手続補正５５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０３】
2008507278.tif 000193
【手続補正５６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０４】
2008507278.tif 000194
【手続補正５７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０５】
2008507278.tif 000195
【手続補正５８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０６】
2008507278.tif 000196
【手続補正５９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０７】
2008507278.tif 000197
【手続補正６０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０８】
2008507278.tif 000198
【手続補正６１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０９】
2008507278.tif 000199
【手続補正６２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１１０】
2008507278.tif 000200
【手続補正６３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１１１】
2008507278.tif 000201
【手続補正６４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１１２】
2008507278.tif 000202
【手続補正６５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１１３】
2008507278.tif 000203
【手続補正６６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１１４】
2008507278.tif 000204
【手続補正６７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１１５】
2008507278.tif 000205
【手続補正６８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１１６】
2008507278.tif 000206
【手続補正６９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１１７】
2008507278.tif 000207
【手続補正７０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１１８】
2008507278.tif 000208
【手続補正７１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１１９】
2008507278.tif 000209
【手続補正７２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１２０】
2008507278.tif 000210
【手続補正７３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１２１】
2008507278.tif 000211
【手続補正７４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１２２】
2008507278.tif 000212
【手続補正７５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１２３】
2008507278.tif 000213
【手続補正７６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１２４】
2008507278.tif 000214
【国際調査報告】
2008507278.tif 000215
2008507278.tif 000216
2008507278.tif 000217
2008507278.tif 000218