(57)【要約】  ２次元のアレイウェルアレイを有するウェルプレート中での個々の蛍光反応混合物の検出効率における不均一性が修正される。不均一性は刺激パターンおよび検出パターンの両者から発生し、そして追加のセグメントを組の分割鏡に加えることで訂正される。追加のセグメントは、アレイの最外部の範囲（すなわち、４コーナー）に光を向けるように向けられ、そしてそれによって最外部領域においてより強い強度を有する刺激パターンを生成する。これは、ウェルプレートからの放射を検出する検出器の効率における放射の低下、放射の低下はＣＣＤまたは類似の構成部分を検出器として利用するシステムの産物である放射の低下、を補う。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源からの光を再分配するための分割鏡、該分割鏡は線状に接続された約１０°以下の角度で互いに角度をなす３つの主鏡セグメントを含み、該３つの主鏡セグメントのそれぞれは共通軸と平行であり、そして該分割鏡は２つの一段高い中間鏡セグメントを含み、１つのそうした中間鏡セグメントは、隣接する主鏡セグメント各組の間にある接合線のところにあり、該中間鏡セグメントが該軸に平行でなくて該軸に対して角度５°〜１０°で角度をなしている。
【請求項２】
該光源が、約３０°〜約５０°のコーン角度の楕円形反射体を有する請求項１の分割鏡。
【請求項３】
該光源が、約４０°のコーン角度の楕円形反射体を有する請求項１の分割鏡。
【請求項４】
該主鏡セグメントが、入射光を長方形状であるターゲットへ反射するように集合的に向けられており、そして該中間鏡セグメントが、入射光を該ターゲットの片側上の２つの隣接したコーナーに反射するように向けられている請求項１の分割鏡。
【請求項５】
該主鏡セグメントが、該共通軸に沿って等幅であり、そして該中間鏡セグメントが、それぞれ該主鏡セグメントより幅が狭い請求項１の分割鏡。
【請求項６】
主鏡セグメントが互いに対して角度５°〜１０°で角度をなす請求項１の分割鏡。
【請求項７】
該中間鏡セグメントが、互いに対して角度１°〜５°で角度をなす請求項１の分割鏡。
【請求項８】
該分割鏡が、凹部と凸部との間で交互に鈍角を形成する接合点で線状に接続される４つの鏡セグメントを含む、光源からの光を再分配するための分割鏡。
【請求項９】
凹部と凸部との間で交互に鈍角を形成する接合点で線状に接続される６つの鏡セグメントを含む請求項８の分割鏡。
【請求項１０】
該鈍角が、１７０°超である請求項８の分割鏡。
【請求項１１】
該鈍角が、１７１°〜１７８°である請求項８の分割鏡。
【請求項１２】
励起光でサンプルの長方形アレイを照らすための光学システムにおいて、該光学システムが、光源、１組の分割鏡および平面鏡を含み、該分割鏡は、該光源から該平面鏡に光を反射するために配置され、そして該平面鏡は、該分割鏡から受けた励起光を反射し、且つ該励起光をサンプルの該長方形アレイに向けて反射するために配置されており、
改良点が、該分割鏡の一方として、３つの線状に接続され、主鏡セグメントが互いに角度約１０°未満で角度をなし、該３つの主鏡セグメントのそれぞれが共通軸と平行であり、そして２つが一段高い中間鏡セグメントであり、１つのそうした中間鏡セグメントがそれぞれの組の隣接した主鏡セグメント間にある接合線のところにあり、該中間鏡セグメントが該軸に平行でなくて該軸に対して５°〜１０°で角度をなす分割鏡を使用することを含む。
【請求項１３】
該主および中間鏡セグメントが第１の分割鏡として規定され、そして改良点が、分割鏡の他方として、凹部と凸部との間で交互に鈍角を形成する接合点で線状に接続された４つの鏡セグメントを含む第２の分割鏡を使用することをさらに含み、そして該平面鏡が該長方形アレイの第１の側の両コーナーに向けて該光を反射するように、該第１の分割鏡の中間鏡セグメントが、中間鏡セグメントから反射された光を該平面鏡に向けるために配置され、そして該平面鏡が、該光を該長方形アレイの第２の側の両コーナーに向けて反射するように、該第２の分割鏡の該鏡セグメントが、鏡セグメントから反射された光を該平面鏡に向けるように配置されている請求項１２の光学システム。
【請求項１４】
該主鏡セグメントが互いに角度５°〜１０°で互いに角度をなす請求項１３の光学システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連した出願へのクロスリファレンス
この出願は、２００５年５月１３日に出願された米国仮特許出願第６０/６８１、２０４号明細書の内容の利益を主張し、参照によりその内容の全てを本明細書中に取り込む。
【０００２】
本発明は、概してマルチウェルプレートまたは二次元のサンプルアレイ中の個々のウェルで保持される多数のサンプルの電磁気放射の発生および検出に関する。この発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のリアルタイム検出の性能、すなわち、ＰＣＲ反応が進行するにつれて個々の反応ウェル中の核酸の量が定量されるＰＣＲ工程に特に興味がある。しかし、本発明は、多数のウェル、容器、または２次元長方形アレイのサンプル点からの放射信号を同時に検出する任意のシステムに一般的に適用できる。
【背景技術】
【０００３】
リアルタイムＰＣＲは、同時に行われる多数の反応の進行を監視するために、エリアイメージングを使用する化学工程の多くの例の１つである。エリアイメージングは、ＰＣＲシステム中で使用されるアレイ等の反応ウェルの２次元アレイからの放射の像形成である。放射は、ウェル中の核酸セグメントに共有結合で結合した蛍光分子群によって生成される蛍光放射である。イメージング方法は、蛍光群を刺激するための反応ウェルの全アレイの照明、および蛍光群刺激の結果として発する放射の検出を含む。放射はウェルアレイに対応する２次元のイメージの形で検出される。最も普通のアレイは、単一のプレート中に９６ウェルを含み、それぞれ８ウェルの１２列で配置されているウェルを含むものであるが、しかし他のアレイおよび数のウェルが同様に使用される。放射の大きさから、システムはそれぞれのウェル中で結合の量、タグ濃度、および蛍光分子の特徴を決定する。この情報は、それぞれのウェル中の反応の進行を示すために処理される。照明の帯域は、レーザーで得られる程狭く、または白色光源で得られるほど広いことができる。
【０００４】
白色光源は、広範な刺激波長を提供する安価な手段である。普通使用される白色光源は、ハロゲン反射体を有する電球である。典型的なハロゲン電球は、５°〜５０°の範囲であるコーン角度で光を生成する。角度は、反射体の形によって部分的に制御される。このタイプの電球の例は、Ｇｅｎｅｒａｌ  ＥｌｅｃｔｒｉｃのＥＸＮ５０ＭＲｌ６/４０電球である。この電球は、光（すなわち、輝点）の非常に高い空間周波数を除去し、そして主要なビームを向け直す多面楕円形反射体を有する。多面反射体から生じる遠距離投影された光のパターンは、同じ外径および焦点の滑らかな表面の楕円形反射体から生じる遠距離投影された光パターンより低い輝点（または"温点"）を有する。製品サイズ、検出効率フィルターの性能と照明コーン角度との間に基本的なトレードオフがある。
【０００５】
電球反射体の中に小さい面を含むにもかかわらず、ウェルの２次元平面アレイを一様に照らすために、ある程度電球からの光を向け直すことが好ましい。向け直しは、電球とウェルプレートとの間の経路に位置する一連の鏡の表面によって達成される。向け直す鏡を含む従来技術の照明システム１１の例が図１に示される。このシステムでは、ウェルプレート１２が下に示され、そして白色光源電球１３がウェルプレート１２の上方で且つ片側に位置する。電球１３とウェルプレート１２の間に、１４、１５の２組の鏡があり、第１の鏡１４は広いＶ形輪郭の２つのセグメント１６、１７を有し、そして第２の鏡１５は、３つのセグメント１８、１９、２０を有する。外側のセグメント１８、２０は、内側のセグメント１９に向かってわずかに内側に角度をなしている。両鏡の組１４、１５では、隣接したセグメントの平面間の角度は非常に小さく、典型的には１０°未満である。両方の鏡の組から反射された光は（裏面のみが見える）第３の鏡２１によって受けられ、平面鏡がウェルプレート１２に向かって下向きに光の方向を変える。電球１３からの光線、そして鏡によって反射されたものは、一般的に発散しているため、第３の鏡２１によって反射された光はレンズ２２を通って、ウェルプレートに当たる前に平行な、または少なくともほぼ平行な光を与える。Ｖ形輪郭の２つのセグメントを有する鏡１４は、ウェルアレイの片側、アレイの右側のそれぞれ上半分および下半分に光の方向を変える２つのセグメントを有する、特に図１に示される図の右側に反射光の方向を向ける。３つのセグメント鏡は、左側の中心領域へ光の方向を向ける３つのセグメントで、ウェルアレイの反対側、すなわち、図１に示された図の左側に反射光の方向を変える。集合的に、５つの鏡セグメントは、全長方形ウェルアレイにわたって一様なまたはほぼ一様な光を分配することを目的とする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ウェルアレイにわたる均一な光分布が目的であるが、それぞれの鏡上の隣接したセグメントの間の角度にある線が反射光に輝線、すなわち、それより上およびそれより下の領域より明るい線を生成するので、この目的は充分に達成されない。したがって、ウェルプレート中で離れた列が照らされ、そして隣接した列より強い強度で刺激される。従来技術では、この好ましくない輝度の違いは、線に沿って、線をマスキングすること、例えばフエルト先ペンから等の黒色インクを適用することで除かれる。これはウェルプレートに到達する刺激光の量を減少させることによって光エネルギーを無駄にし、そして非均一性を是正する粗雑な方法である。
【０００７】
検出構成部分としては、種々の方法論を使用できるが、典型的に使用できる検出構成部分は、適当なレンズまたはレンズシステムと結びついた電荷結合素子（ＣＣＤ）である。一連のフィルターが含まれ、刺激光および放射光の両者を制御して、周波数帯を狭める。ある検出システムの産物は、光学経路の中心線からの角度、すなわち、検出される放射強度の半径方向に沿った勾配につれて強度が下がることである。結果として、放射それ自身がアレイにわたって均一である場合でさえ、中心から連続して遠くに位置するウェルからの放射は、連続してより低い強度で読み取られる。この勾配は、１２×８ウェルアレイからのイメージを表す図２に示される。中心がウェルアレイの中心３５と一致する同心円３１、３２、３３、３４は、一定の放射検出強度の線を示し、それぞれの円は、より隣接する小さい半径の円より弱い検出強度を有する。強度はしたがって円の半径が増加するにつれて、徐々に減少する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、非均一性、すなわち、ウェルプレートに到達する照明光中の輝線および検出構成部分の半径方向の勾配の両方の原因に取り組む。本発明は、そうでなければウェルプレートの離れた列に過剰な刺激を起こす光を利用すること、およびウェルプレートのコーナーに過剰に刺激する光を向け直すことによって、これらの不均一性に取り組む。したがって、一般的に、鏡から反射された光はターゲットが長方形アレイのウェルを有するウェルプレートであるか、またはエリアイメージで任意の他の平面の長方形エリアが求められているかいずれかの長方形であるターゲットを照らす。本発明の目的および効果は、したがって光源から光のコーンを広げて処理し、長方形のコーナーに向けられた光の量を増加させることである。これは長方形の全表面にわたって刺激光の均一の分布を生じるが、好ましくは光の中心より長方形のコーナーで刺激光のより高い強度を生成し、コーナーの領域に生成されるより低い放射の検出効率を補い、そして検出器によって記録される強度勾配を減少させる。本発明のこれらの態様の結果は、したがって非均一検出を補うための非均一刺激である。本発明は、図１に示された２つの分割鏡の一つまたは両者の改変、およびこれらの鏡の改変から生じる改良された光学システムにある。本明細書に開示された本発明および設計角度は、種々のコーン角度、好ましくは約３０°〜約５０°、最も好ましくは約４０°のコーン角度を有する電球に充分に適する。本発明は、４０度コーン角度を有するＥＸＮ設計電球、並びに類似のコーン角度の他の電球に特に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、ある変化および態様の範囲の影響を受けやすい一方で、本発明の決定的な特徴は単一の態様の詳細な研究によって最もよく理解される。あるそうした態様を、図３、図４、および図５並びに下記に示す。
【００１０】
本発明の主題である種々の鏡は、分割鏡であり、そしてそれぞれのセグメントは、それ自身カーブした表面を有する鏡と区別される平面鏡である。種々のセグメントは、互いに対して角度をなして向けられ、そして隣接したセグメントは、面を有する鏡における面のように、共通の境界または継ぎ目線を共有する。"線状に接続された"の語は、本明細書中では鎖を形成するために側面と側面を連続して接続した鏡セグメントを意味するために使用される。"セグメント"の語は、鏡の一部分を記述するために使用される場合、単一の平面またはセクションをいう。
【００１１】
"を含む"、"を含む"および"含有する"の語は、特に断らなければ本明細書中で、明確に記載されない任意の他の要素、構成部分またはステップを除外することなくの語に続く、要素、構成部分、またはステップ、または要素、構成部分、またはステップの群を含むことを意味するために使用される。同様に、"ａ"および"ａｎ"の後は、"１種または２種以上の"を意味する。
【００１２】
図３の照明システム４１は、本発明の特徴を取り込む。このシステムにおいて、図１のより小さい、Ｖ輪郭の鏡１４を、Ｖ輪郭の頂上線が少なくとも１つの、好ましくは少なくとも２つの、そして最も好ましくは４つの、追加のセグメントで置き換えられた多面分割鏡４２で置き換える。図３の態様は、全６セグメントのために４つの追加のセグメントを含む。同様に、図１のより大きい、３つの分割鏡１５を、最初の３つのセグメントを接続する２つの継ぎ目線のそれぞれの場所に２つのくさび形のセグメントを加える、多面分割鏡４３で置き換える。図３の分割鏡を、続く図でさらに詳細に示し、そして下記で説明する。
【００１３】
より大きい分割鏡４３の拡大図を図４に示し、より小さい分割鏡４２の拡大図を図５に示す。図４に示されたより大きい鏡４３において、３つの主セグメント５１、５２、５３は、線状に接続され、そしてそれぞれ、従来技術の鏡１５（図１）の３つのセグメント１８、１９、２０に対応する。３つの主セグメント５１、５２、５３は、中間セグメント５２の中心線によってこの図に示される共通軸５０と平行である。これらの主セグメント間の角度は、１０°以下、そして好ましくは５°〜１０°である。本明細書中では一段高い中間セグメントともいう、加えられたウェッジセグメント５４、５５は、３つの主セグメント５１、５２、５３を接続する継ぎ目線５６、５７に沿って位置する。上側のウェッジセグメント５４は、図３に示されるようなウェルプレートの図（プレートの後部左コーナーは見えない）にしたがって、図３のウェルプレート１２の後部左コーナーに光の方向を向ける。下部ウェッジセグメント５５は、再度図３に示された図にしたがって、ウェルプレートのコーナーの前部左コーナーに光の方向を向ける。いずれのウェッジセグメントも軸５０に平行でない。それぞれのウェッジセグメントは、軸５０と角度αをなし、そして真ん中の主セグメント５２と平面角度αをなし、角度αは５°〜１０°の範囲、そして好ましくは約７°である。２つのウェッジセグメントの広い表面５８、５９、すなわち、ウェッジセグメントの反射表面は、互いに２つのウェッジセグメントからの反射光を、ウェルプレートの片側の２つのコーナーに当たらせる角度βにある。角度βは、５°未満、そして好ましくは１°〜５°である。この態様の別の特徴は、３つの主セグメント５１、５２、５３は、（軸５０に平行して測定して）全て等幅であるが、両ウェッジセグメント５４、５５は、主セグメントより（ほぼ同じ方向で測定すると）幅が狭く、それぞれの継ぎ目線５６、５７の一部分を露出する。
【００１４】
図５に示されたより小さい分割鏡４２において、２つの終端セグメント６１、６２は、図１の従来技術の鏡１４の２つのセグメント１６、１７に対応するように、互いに対して同じ角度にある。これらの２つの終端セグメント６１、６２の間において、一連の少なくとも２つの、および好ましくは少なくとも４つの、中間セグメントは、終端セグメント６１、６２とジグザグの構造を形成する。"ジグザグ構造"は、終端セグメントと中間セグメントが、凸部と凹部間で交互に、それらの継ぎ目で鈍角で線状に接続されることを意味する。図５に示された態様では、４つの中間セグメント６３、６４、６５、６６が含まれる。いずれも図３に示された図にしたがって、これらの１番目の６３および３番目の６５は、共にウェルプレートの後部右コーナーに光の方向を変えるが、２番目および４番目の６４、６６は、共にウェルプレートの前部右コーナーに光の方向を向ける。その隣接したセグメントに対するこれらのセグメントのそれぞれの角度は、２°〜９°の範囲、すなわち、Ｖ（凹部）または隣接したセグメントの逆Ｖ（凸部）によって形成される角度は１７１°〜１７８°、またはさらに一般的に１７０超°である。
【００１５】
これらの加えられた鏡セグメントの効果を具体的に示すために、光源電球の斜面台検査測定を使用する不連続光線のトレースに基づいた数値シミュレーションを行って、照射予測を行った。好適なプログラムは、（Ｌａｍｂｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、  Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、  ＵＳＡ）のＴｒａｃｅＰｒｏ（商標）、およびＲａｄｉａｎｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ、  Ｉｎｃ．  （Ｄｕｖａｌｌ、  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、  ＵＳＡ）から入手可能である光源の斜面台検査測定である。ＴｒａｃｅＰｒｏ予測測定を、各々８ウェルで１２カラムを含有するウェルプレートのウェルの２つの終端カラム、すなわち、図２および３に示される図の最も右側のカラムおよび最も左側のカラムに沿って行った。最も右側のカラムを図２中の線６−６で示し、最も左側のカラムを図２の線７−７で示す。より小さい分割鏡４２を使用するだけの最も右側のカラム、およびより大きい分割鏡４３を使用するだけの最も左側のカラムについて予測した。予測では、それぞれのウェルに当たる光パワーを定量化する。結果を最も右側のカラムの図６および最も左側のカラムの図７に示す。それぞれの場合で、照明強度は、カラムの端部の近く、すなわち、上部および下部そして長方形アレイのコーナーにおいてより強いことを結果が示した。上で述べたように、これは、コーナーが近づくにつれて検出強度の落ち込みを補う。
【００１６】
電球からの光線に対する２つの多面分割鏡のそれぞれの角度は、屈曲マウントで調整することで容易に設定される。多面分割鏡それ自身は、射出成形に続き、金属化、または高反射シートアルミニウム等の薄い反射体材料スタンピングによって加工可能である。
【００１７】
先のものは主として具体的な説明の目的で提供した。請求項に表されたこの発明の基本的な要素を取り込む種々の構成部分の形および配置の変化は、実験室装置およびその設計、組み立て、および使用する当業者に容易に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、従来技術の光学照明システムの斜視図である。
【図２】図２は、図１の光学照明システムから得られるエリアイメージの平面図である。
【図３】図３は、本発明の特徴を取り込む光学照明システムの斜視図である。
【図４】図４は、図３の光学照明システムの２つの分割鏡の内１つの斜視図である。
【図５】図５は、図３の光学照明システムの２つの分割鏡の内反対の斜視図である。
【図６】図６は、図２の線６−６によって示される領域からの、予測された検出される照射のグラフ表示である。
【図７】図７は、図２の線７−７によって示される領域からの、予測された検出される照射のグラフ表示である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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