(57)【要約】  本発明は、アルツハイマー病患者及びアルツハイマー病を進展させるリスクのある個体におけるＰＲＫＸ遺伝子の調節不全及びそのタンパク質産物を開示する。この知見に基づき、本発明は、被験体のアルツハイマー病を診断及び予後判定するための方法、及び被験体がアルツハイマー病を進展させるリスクが増加しているかを決定するための方法を提供する。さらに、本発明は、アルツハイマー病及び関連する神経変性障害を治療及び予防するための、治療及び予防する方法であって、ＰＲＫＸ遺伝子及びその対応する遺伝子産物を用いる方法を提供する。神経変性疾患の調節剤のスクリーニング法もまた開示される。【選択図】図１
2008545423.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体中の神経変性疾患を診断若しくは予後判定する方法、又は被検体が該疾患を進展させる素因を有するかを決定する方法、又は神経変性疾患を有する被検体に施した治療の効果をモニタリングする方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）該被検体から採取した検体中の、（i）ＰＲＫＸタンパク質をコードした遺伝子の転写産物、及び／又は(ii）ＰＲＫＸタンパク質をコードした遺伝子の翻訳産物、及び／又は（iii）該転写産物又は翻訳産物の断片又は誘導体又は改変体のレベル及び／又は活性を決定する、工程、
ｂ）該転写産物及び／又は該翻訳産物及び／又はこれらの断片、誘導体若しくは改変体の該レベル及び／又は該活性と、公知の疾患状態を表す基準値及び／又は公知の健康状態を表す基準値及び／又は公知のブラーク病期を表した基準値とを比較する、工程
ｃ）該レベル及び／又は該活性が、公知の健康状態を表した基準値と比較して変動しているか、及び／又は公知の疾患状態を表す基準値若しくは、公知のブラーク病期を表す基準値と類似しているか又はこれに等しいかを分析する工程であって、該公知のブラーク病期が、該被検体が神経変性疾患を有していること、若しくは該被検体が該疾患を発症させる危険性が増加していること、若しくは該治療が該被検体中で効果を有することを示唆する、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記神経変性疾患が、アルツハイマー病である、方法。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の方法であって、前記ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子が、配列番号１を有するＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子であり、かつ、前記ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物が、配列番号１を有するＰＲＫＸタンパク質である、方法。
【請求項４】
請求項１又は請求項２に記載の方法であって、前記翻訳産物の改変体が、前記配列番号１のアミノ酸に対して、少なくとも２００アミノ酸の長さに亘って、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性又は少なくとも９０％の配列同一性を有する、方法。
【請求項５】
請求項１、請求項２又は請求項４に記載の方法であって、前記翻訳産物の改変体が、配列番号２を含み、好ましくは配列番号２から構成される、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法に従って、被検体中の神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を診断若しくは予後判定するための、又は被験体のそのような疾患を進展させる素因を決定するための、又は神経変性疾患を有する被検体に施した治療の効果をモニタリングするための、キットの使用であって、該キットが、（i）ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は（ii）ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は（iii）該転写産物若しくは翻訳産物の、断片若しくは誘導体若しくは改変体、を検出する試薬からなる群より選択された少なくとも一の試薬を含む、キットの使用。
【請求項７】
請求項６に記載の使用であって、前記ＰＲＫＸタンパク質が、前記配列番号１を有する、使用。
【請求項８】
請求項６に記載の使用であって、前記翻訳産物の改変体が、配列番号１の前記アミノ酸に対して、少なくとも２００アミノ酸の長さに亘って、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性又は少なくとも９０％の配列同一性を有する、使用。
【請求項９】
請求項６又は請求項８に記載の使用であって、前記翻訳産物の改変体が、配列番号２を含み、好ましくは配列番号２から構成される、使用。
【請求項１０】
遺伝的に改変された非ヒト動物であって、ＰＲＫＸタンパク質又はこれの断片若しくは誘導体若しくは改変体をコードする非ネイティブ遺伝子を、ネイティブＰＲＫＸ遺伝子転写制御エレメントではない転写エレメントで制御し、前記遺伝子配列の発現、断絶、又は変更により、該非ヒト動物が、神経変性疾患、特にアルツハイマー病関連の徴候を進展させる素因を示す、遺伝的に改変された非ヒト動物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の動物であって、前記徴候が、神経原線維変化の形成を含み、及び／又は該動物が、昆虫又は齧歯動物である、動物。
【請求項１２】
請求項１０又は請求項１１に記載の遺伝的に改変された非ヒト動物であって、ＰＲＫＸタンパク質をコードする非ネイティブ遺伝子配列を含み、該ＰＲＫＸタンパク質が、前記配列番号１を有する、遺伝的に改変された非ヒト動物。
【請求項１３】
請求項１０又は請求項１１に記載の遺伝的に改変された非ヒト動物であって、ＰＲＫＸタンパク質の改変体をコードする非ネイティブ遺伝子配列を含み、該改変体が、配列番号１の前記アミノ酸に対して、少なくとも２００アミノ酸の長さに亘って、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性又は少なくとも９０％の配列同一性を有する、遺伝的に改変された非ヒト動物。
【請求項１４】
請求項１０、請求項１１又は請求項１３のいずれか１項に記載の遺伝的に改変された非ヒト動物であって、ＰＲＫＸタンパク質の改変体をコードする非ネイティブ遺伝子配列を含み、該改変体が、配列番号２を含み、好ましくは配列番号２から構成される、遺伝的に改変された非ヒト動物。
【請求項１５】
請求項１０から請求項１４のいずれか１項に記載の遺伝的に改変された非ヒト動物の、非ヒト試験動物及び／又はコントロール動物としての使用であって、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の治療又は予防に有用な診断法及び治療法の開発における化合物、薬剤及びモジュレーターをスクリーニング、試験及び確証するための、使用。
【請求項１６】
ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子配列又はその断片若しくは誘導体若しくは改変体が、スクリーニング、試験及び確証のために発現され、破壊され又は変更された細胞の使用であって、該スクリーニング、試験及び確証が、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の治療又は予防に有用である診断法及び治療法の開発における化合物、薬剤、及びモジュレーターをスクリーニング、試験、及び認証するための、使用。
【請求項１７】
請求項１６又は請求項５５に記載の使用であって、前記ＰＲＫＸタンパク質が、配列番号１を有する、使用。
【請求項１８】
請求項１６又は請求項５５に記載の使用であって、前記改変体が、配列番号１の前記アミノ酸に対し、少なくとも２００アミノ酸の長さに亘って、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性又は少なくとも９０％の配列同一性を有する、使用。
【請求項１９】
請求項１６又は請求項５５に記載の使用であって、前記改変体が、配列番号２を含み、好ましくは、配列番号２から構成される、使用。
【請求項２０】
神経変性疾患、特にアルツハイマー病又は関連疾患の治療又は予防に使用するための、薬剤、モジュレーター、アンタゴニスト又はアゴニストを同定するためのスクリーニングの方法であって、該薬剤、モジュレーター、アンタゴニスト又はアゴニストが、以下：
（i）ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子、及び／又は
（ii）該ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は
（iii）該ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は
（iv）（i）乃至（iii）の、断片若しくは誘導体若しくは改変体、
からなる群より選択される一以上の物質の、発現又はレベル又は活性を変更させる能力を有し、
該方法が、以下：
（ａ）細胞と試験化合物とを接触させる、工程；
（ｂ）（i）乃至（iv）に列挙した一以上の物質の該活性及び／又はレベル及び／又は発現を測定する、工程；
（ｃ）該試験化合物と接触していないコントロール細胞における、（i）乃至（iv）に列挙した一以上の物質の該活性及び／又はレベル及び／又は発現を測定する、工程；並びに
工程（ｂ）及び（ｃ）の該細胞における、該物質のレベル及び／又は活性及び／又は発現を比較する工程、を包含し、該接触された細胞における該物質の該活性及び／又はレベル及び／又は発現の変更が、該試験化合物が、該神経変性疾患の治療又は予防に有用な薬剤、モジュレーター、アンタゴニスト又はアゴニストであることを示す、方法。
【請求項２１】
請求項２０の方法であって、前記ＰＲＫＸタンパク質が、前記配列番号１を有する、方法。
【請求項２２】
請求項２０に記載の方法であって、前記翻訳産物の改変体が、配列番号１の前記アミノ酸に対して、少なくとも２００アミノ酸の長さに亘って、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性又は少なくとも９０％の配列同一性を有する、方法。
【請求項２３】
請求項２０又は請求項２２に記載の方法であって、前記翻訳産物の改変体が、配列番号２を含み、好ましくは配列番号２から構成される、方法。
【請求項２４】
神経変性疾患、特にアルツハイマー病又は関連疾患の治療又は予防に使用するための、薬剤、モジュレーター、アンタゴニスト又はアゴニストを同定するためのスクリーニングの方法であって、該薬剤、モジュレーター、アンタゴニスト又はアゴニストが、以下：
（i）ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子、及び／又は
（ii）該ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は
（iii）該ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は
（iv）（i）乃至（iii）の断片若しくは誘導体若しくは改変体、
からなる群より選択される一以上の物質の、発現又はレベル又は活性を変更させる能力を有し、
該方法が、以下：
（ａ）試験化合物を、神経変性疾患又は関連疾患若しくは関連障害の徴候及び症状を進展させる素因が与えられているか又は既に進展させた非ヒト試験動物に投与する工程；
（ｂ）（i）から（iv）に列挙した一以上の物質の該活性及び／又はレベル及び／又は発現を測定する工程；
（ｃ）神経変性疾患又は関連疾患若しくは関連障害の徴候及び症状を進展させる素因が与えられているか又は既に進展させた非ヒト試験動物並びにこのような試験化合物が投与されていない非ヒト動物中の（i）乃至（iv）に列挙した一以上の物質の該活性及び／又はレベル及び／又は発現を測定する工程；
（ｄ）工程（ｂ）及び（ｃ）の該動物中の物質の活性及び／又はレベル及び／又は発現を比較する工程であって、該非ヒト試験動物における物質の該活性及び／又はレベル及び／又は発現の変更が、該試験化合物が、該神経変性疾患の治療又は予防に用いる薬剤、モジュレーター、アンタゴニスト又はアゴニストであることを示す、方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、前記ＰＲＫＸタンパク質が、配列番号１を有する、方法。
【請求項２６】
請求項２４に記載の方法であって、前記翻訳産物の改変体が、配列番号１の前記アミノ酸に対して、少なくとも２００アミノ酸の長さに亘って、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性又は少なくとも９０％の配列同一性を有する、方法。
【請求項２７】
請求項２４又は請求項２６に記載の方法であって、前記翻訳産物の改変体が、配列番号２を含み、好ましくは配列番号２から構成される、方法。
【請求項２８】
化合物を試験するためのアッセイ、或いは神経変性疾患、特にアルツハイマー病又は関連疾患の治療又は予防に使用する薬剤、モジュレーター、アンタゴニスト又はアゴニストを同定するために好ましくはハイスループット形態で複数の化合物をスクリーニングするためのアッセイであって、該アッセイにおいて、リガンドとＰＲＫＸタンパク質又はその断片若しくは誘導体若しくは改変体との結合の阻害の程度又は結合の増強の程度が決定され、及び／又は該化合物とＰＲＫＸタンパク質又はその断片若しくは誘導体若しくは改変体との結合の程度が決定される、アッセイ。
【請求項２９】
請求項２８に記載のアッセイであって、前記ＰＲＫＸタンパク質が、前記配列番号１を有する、アッセイ。
【請求項３０】
請求項２８に記載のアッセイであって、前記翻訳産物の前記改変体が、配列番号１の前記アミノ酸に対して、少なくとも２００アミノ酸の長さに亘って、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性又は少なくとも９０％の配列同一性を有する、アッセイ。
【請求項３１】
請求項２８又は請求項３０に記載のアッセイであって、前記翻訳産物の改変体が、配列番号２を含み、好ましくは配列番号２から構成される、アッセイ。
【請求項３２】
（i）ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子、及び／又は
（ii）該ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は
（iii）該ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は
（iv）（i）乃至（iii）の、断片若しくは誘導体若しくは改変体、
からなる群より選択される少なくとも一の物質の、レベル及び／又は活性及び／又は発現の、薬剤、モジュレーター、アンタゴニスト又はアゴニストであって、
該薬剤、モジュレーター、アンタゴニスト又はアゴニストが、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の治療又は予防において潜在的な活性を有する、薬剤、モジュレーター、アンタゴニスト又はアゴニスト。
【請求項３３】
請求項３２に記載の薬剤、モジュレーター、アンタゴニスト又はアゴニストであって、前記ＰＲＫＸタンパク質が、前記配列番号１を有する、薬剤、モジュレーター、アンタゴニスト又はアゴニスト。
【請求項３４】
請求項３２に記載の薬剤、モジュレーター、アンタゴニスト又はアゴニストであって、前記翻訳産物の改変体が、配列番号１の前記アミノ酸に対し、少なくとも２００アミノ酸の長さに亘って、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性又は少なくとも９０％の配列同一性を有する、薬剤、モジュレーター、アンタゴニスト又はアゴニスト。
【請求項３５】
請求項３２又は請求項３４に記載の薬剤、モジュレーター、アンタゴニスト又はアゴニストであって、前記翻訳産物の改変体が、配列番号２を含み、好ましくは配列番号２から構成される、薬剤、モジュレーター、アンタゴニスト又はアゴニスト。
【請求項３６】
請求項３２から請求項３５のいずれか１項において特許請求された薬剤、モジュレーター、アンタゴニスト又はアゴニストの使用、及びＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子又はその断片若しくは誘導体若しくは改変体の翻訳産物である免疫原に対し特異的に免疫反応性の抗体の使用であって、該使用が、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の治療又は予防のための医薬の製造における使用である、使用。
【請求項３７】
請求項３６に記載の使用であって、前記ＰＲＫＸタンパク質が、前記配列番号１を有する、使用。
【請求項３８】
請求項３６に記載の使用であって、前記改変体が、配列番号１の前記アミノ酸に対して、少なくとも２００アミノ酸の長さに亘って、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性又は少なくとも９０％の配列同一性を有する、使用。
【請求項３９】
請求項３６又は請求項３８に記載の使用であって、前記改変体が、配列番号２を含み、好ましくは配列番号２から構成される、使用。
【請求項４０】
請求項２０から請求項３１のいずれか１項に記載のアッセイにより取得可能な、請求項３２から請求項３５のいずれか１項に記載の少なくとも一の物質の、レベル及び／又は活性及び／又は発現の、薬剤、モジュレーター、アンタゴニスト又はアゴニスト。
【請求項４１】
神経変性疾患、特にアルツハイマー病を治療又は予防する方法であって、該方法が、このような治療又は予防を必要とする被検体に対し、請求項３２から請求項３５のいずれか１項に特許請求された薬剤、モジュレーター、アンタゴニスト又はアゴニストを、治療上又は予防上有効な量で投与及び処方する工程を包含する、方法。
【請求項４２】
神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を検出するための診断上の標的としての、タンパク質分子の使用であって、該タンパク質分子が、ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子又はその断片若しくは誘導体若しくは改変体の翻訳産物である、使用。
【請求項４３】
請求項４２に記載の使用であって、前記ＰＲＫＸタンパク質が、前記配列番号１を有する、使用。
【請求項４４】
請求項４２に記載の使用であって、前記改変体が、配列番号１の前記アミノ酸に対し、少なくとも２００アミノ酸の長さに亘って、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性又は少なくとも９０％の配列同一性を有する、使用。
【請求項４５】
請求項４２又は請求項４４に記載の使用であって、前記改変体が、配列番号２を含み、好ましくは配列番号２から構成される、使用。
【請求項４６】
神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を予防又は治療又は寛解する、モジュレーター、薬剤又は化合物のスクリーニング標的としてのタンパク質分子の使用であって、該タンパク質分子が、ＰＲＫＸタンパク質又はその断片若しくは誘導体若しくは改変体である、タンパク質分子の使用。
【請求項４７】
請求項４６に記載の使用であって、前記ＰＲＫＸタンパク質が、前記配列番号１を有する、使用。
【請求項４８】
請求項４６に記載の使用であって、前記改変体が、配列番号１の前記アミノ酸に対して、少なくとも２００アミノ酸の長さに亘って、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性又は少なくとも９０％の配列同一性を有する、使用。
【請求項４９】
請求項４６又は請求項４８に記載の使用であって、前記改変体が、配列番号２を含み、好ましくは配列番号２から構成される、使用。
【請求項５０】
免疫原に対して特異的に免疫反応性の抗体の使用であって、該免疫原が、ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子又はその断片若しくは誘導体若しくは改変体の翻訳産物であり、該抗体が、被験体から得られた検体中の細胞の病理学的状態を検出するための抗体であって、該検出が、該細胞の該抗体を用いた免疫細胞化学的染色を包含し、該細胞の該抗体を用いた免疫細胞化学的染色の程度又は染色パターンが、公知の健康状態を表す基準値と比較して変更されていることが、該細胞の、神経変性疾患、特にアルツハイマー病に関連する病理学的状態を示す、使用。
【請求項５１】
請求項５０に記載の使用であって、前記ＰＲＫＸタンパク質が、前記配列番号１を有する、使用。
【請求項５２】
請求項５０に記載の使用であって、前記改変体が、前記配列番号１のアミノ酸に対して、少なくとも２００アミノ酸の長さに亘って、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性又は少なくとも９０％の配列同一性を有する、使用。
【請求項５３】
請求項５０又は請求項５２の使用であって、前記改変体が、配列番号２を含み、好ましくは配列番号２から構成される、使用。
【請求項５４】
（i）ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子、及び／又は
（ii）該ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は
（iii）該ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は
（iv）（i）乃至（iii）の、断片又は誘導体若しくは改変体、
からなる群より選択される少なくとも一の物質のレベル及び／又は活性及び／又は発現のアンタゴニストを含有する医薬であって、該アンタゴニストが、アンチセンス核酸、抗体、又は抗体断片、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、アプタマー及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、医薬。
【請求項５５】
請求項１６に記載の細胞の使用であって、前記遺伝子配列の発現、断絶、又は変更が、神経変性疾患の徴候、特にアルツハイマー病に関連した徴候、及び対状螺旋状フィラメント（ＰＨＦ）の形成を含む、より詳細な徴候を進展させる素因を示す該細胞を生み出す、細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検体に対する神経変性疾患の進行を診断し、予後判定し、そしてモニタリングする方法に関する。更に、神経変性疾患の治療制御及び調整剤のスクリーニングの方法が提供される。本発明はまた、医薬組成物、キット及び動物モデルを開示する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患、特にアルツハイマー病（ＡＤ）は、患者の生命を強く衰弱させる影響を有する。更に、これらの疾患は、多大な健康的重荷、社会的重荷及び経済的重荷を生じさせる。ＡＤは、全痴呆症患者の約７０％を占める最も一般的な神経変性疾患であり、６５歳を超える人口の約１０％に、８５歳を超える人口の最大４５％に影響を及ぼすという、恐らく最も破滅的な年齢相関性ある神経変性状態である（非特許文献１；非特許文献２）。現在、その症例数は、アメリカ、ヨーロッパ及び日本で１２００万人に達すると見積もられる。この状況は、先進国での老年人口の人口統計上の増加に伴い、必然的に悪化するだろう。ＡＤにおける、個々の脳内で生ずる神経病理学的特徴は、老人斑（これは、β−アミロイドからなる）及び甚大な細胞骨格変化（これらは、異常なフィラメント構造の出現及び神経原線維変化の形成と同時に生じる）である。
【０００３】
β‐アミロイドタンパク質は、種々のプロテアーゼによる、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の切断により発達する（非特許文献３；非特許文献４）。２つの型の斑、ビ慢性老人斑及び老人斑（ｎｅｕｒｉｔｉｃ  ｐｌａｑｕｅ）は、ＡＤ患者の脳内から検出され得る。これらは、主に大脳皮質及び海馬から検出される。脳内における毒性のあるＡβの沈着の発生は、ＡＤの進行過程の非常に初期から始まり、そしてこれが、ＡＤ病理を導く後の有害な過程の主要プレーヤーであると考察されている。ＡＤの他の病理学的特徴は、神経原線維変化（ＮＦＴ）及び神経絨毛糸と記載されている（非特許文献５）異常な神経突起（ｎｅｕｒｉｔｅ）である。ＮＦＴは、ニューロン内に現れ、そして化学的に変更されたタウからなり、これは互いにねじれた対状螺旋状フィラメント（ｐａｉｒｅｄ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｆｉｌａｍｅｎｔｓ）（ＰＨＦ）を形成している。ＡＤの特色として、対状螺旋状フィラメント内で凝集したタウタンパク質と結合した微小管は、特定のアミノ酸の部位（特にセリン２１４が挙げられる）に異常なリン酸化を示す。タウリン酸化のパターンは、ニューロンの完全性の欠如と相関すると考えられ、そしてＮＦＴの形成に沿ってニューロンの喪失が観察され得る（非特許文献６；非特許文献７）。神経原線維変化の出現及びその数の増加は、ＡＤの臨床的重症度と十分に相関する（非特許文献８）。ＡＤは、記憶形成の初期の欠陥と相関し、最終的には、より高度な認知機能の完全な侵食につながる進行性疾患である。この認知障害としては、とりわけ、記憶障害（ｍｅｍｏｒｙ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）、失語症、認知不能及び高次機能の欠損が挙げられる。ＡＤ病因特有の特徴は、特定の脳領域及び神経細胞亜集団が変性過程に選択的に傷つきやすくなることである。特に、下側頭葉領域及び海馬が、早期に、そして疾患の進行の間、より激しく、影響を受ける。一方、前頭皮質、後頭皮質及び小脳内のニューロンは、大部分が無傷のままであり、神経変性から保護されている（非特許文献９）。
【０００４】
現在、ＡＤに対する療法も、有効にＡＤの進行を止めるための治療も存在せず、死前にＡＤを高確率で診断するための治療さえも存在しない。個体をＡＤに進展させるいくつかの危険因子が特定されており、その中でも、３つの特異に存在するアポリポタンパク質Ｅ遺伝子（ＡｐｏＥ）の対立遺伝子（イプシロン２，３，４）の内、イプシロン４対立遺伝子が最も顕著に個体をＡＤに進展させる（非特許文献１０；非特許文献１１）。２１番染色体におけるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、１４番染色体におけるプレセニリン−１、及び１番染色体におけるプレセニリン−２に対する遺伝子における遺伝的欠損に起因するようなＡＤ早期発症例はまれに存在するが、遅発性弧発性ＡＤの典型的形態は、これまでのところ、病因学的起源が不明となっている。神経変性障害の遅発性かつ複雑な病因のために、治療剤及び診断剤の開発は、非常な難問となっている。薬物標的及び診断マーカーとなり得るものの数の拡大が重要である。
【非特許文献１】Ｖｉｃｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０００，６０：１３９−１６５
【非特許文献２】Ｗａｌｓｈ及びＳｅｌｋｏｅ，Ｎｅｕｒｏｎ  ２００４，４４：１８１−１９３
【非特許文献３】Ｓｅｌｋｏｅ及びＫｏｐａｎ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２００３，２６：５６５−５９７
【非特許文献４】Ｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００３，３５：１５０５−１５３５
【非特許文献５】Ｂｒａａｋ及びＢｒａａｋ，Ｊ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ  １９９８，５３，：１２７−１４０
【非特許文献６】Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＪｅｎｋｉｎｓ，Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ  １９９６，１：３８−５８
【非特許文献７】Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＨａｒｔｉｇａｎ，Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ  １９９９，１：３２９−３５１
【非特許文献８】Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２０００，５５：３７０−３７６
【非特許文献９】Ｔｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １９８１，１０：１８４−９２
【非特許文献１０】Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９３，９０：１９７７−８１
【非特許文献１１】Ｒｏｓｅｓ，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １９８８，８５５：７３８−４３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
それ故、神経系疾患の病因に洞察を提供すること、とりわけ、これら疾患に対する診断及び治療の開発に適した方法、物質、薬剤、化合物及び動物モデルを提供することが本発明の目的である。この目的は、独立クレームの特徴により解決されている。サブクレームは、本発明の好ましい実施形態を明示する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ＰＲＫＸが、神経変性疾患、特にアルツハイマー病と関連するとの知見に基づく。腎上皮形態形成におけるシグナル伝達を解明することが企図された研究において同定されたＰＲＫＸ遺伝子は、ｃ−ＡＭＰ依存性セリン／スレオニンキナーゼをコードする。器官形成の間、胎児の腎中において転写が活性化されるという理由から、この遺伝子は、興味深い調節遺伝子の候補の一つとして見出された。Ｘ染色体のＸｐ２２．３に位置するＰＲＫＸ遺伝子（Ｋｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１９９５，４：８６９−８７８；Ｓｃｈｉｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１９９７，６：１９８５−１９８９）は、Ｙ染色体上にホモログ（ＰＲＫＹ）を有する。ＰＲＫＸ及びＰＲＫＹの両遺伝子は、ｃＡＭＰ依存性セリンスレオニンタンパク質キナーゼ遺伝子ファミリーのメンバーを代表する。前例のない高い配列同一性（ｃＤＮＡレベルで９５％）、及びＰＲＫＸの配向性が、Ｙ染色体上のホモログ、ＰＲＫＹ配向性と同一であることにより、Ｘ染色体及びＹ染色体における特異的領域間の異常な対形成及びこれに続く異所性の組換えの頻度が高いことが説明される。この事実のために、ＰＲＫＹは、本明細書中でＰＲＫＸファミリーのメンバーとみなされ得る。
【０００７】
以前の研究では、タンパク質キナーゼＸ（ＰＲＫＸ）リン酸化酵素とタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）リン酸化酵素との機能的な違いが立証され（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９，２７４：５３７０−５３７８）、ＰＲＫＸと顆粒球／マクロファージ系の分化とが関連づけられ（Ｓｅｍｉｚａｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５  １９９８，１５４１２−１５４１７）、ＰＲＫＸが重要な発達機能を有し得ることが示唆された。ＰＲＫＸは、脊髄性細胞の成熟及び尿管芽の発達に関与し、常染色体の多嚢性腎疾患優性遺伝子において上方調節される。ＰＲＫＸとの遺伝子組換えにより、スワイヤー症候群が生じる。ＰＲＫＸの過剰発現により、ｃＡＭＰ存在下における培養腎上皮細胞の遊走が活性化される（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２００２，９９：９２６０−９２６５）。ＰＲＫＸは、最も近似したＰＲＫＸファミリーのヒトホモログであるｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼＡ、触媒サブユニット、アイソフォームα及びβに対して、タンパク質レベルで５０％の同一性を有する。ＰＲＫＸの触媒領域は、哺乳類のＰＫＡ遺伝子に比べ、タマホコリカビ、及びショウジョウバエのキナーゼ遺伝子ＫＡＰＣ−ＤＩＣＤＩ、及びＤＣ２に対し、より大きなアミノ酸相同性を共有する（Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９２，８９：１０７０１−１０７０５；Ａｎｊａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９３，３２：９５３２−９５３８；Ｍｅｌｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９５，１４１：１５０７−１５２０；Ｋａｌｄｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１９８８，２：１５３９−１５５６）という理由から、ＰＲＫＸ及びＫＡＰＣ−ＤＩＣＤＩは、ＰＫＡ遺伝子には保存されていない独自の機能を共有し得ると言える。ＫＡＰＣ−ＤＩＣＤＩは、キイロタマホコリカビの発達に、特に形態形成の細胞遊走において、細胞分化の転写制御においてと同様（Ｐｒｉｍｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０００，２２１：１０１−１１１；Ａｕｂｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９９９，１５：４６９−５１７）、重要な役割を果たす（Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９９７，１８３：２０８−２２１；Ｈａｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９９２，１４９：９０−９９）。このことは、ＰＲＫＸもまた、造血系において細胞分化を制御するというその提唱された役割に加え、高等真核生物の形態形成を制御し得ることを示唆する。系統発生学的分析により、ＰＲＫＸ、ＫＡＰＣ−ＤＩＣＤＩ、ＤＣ２、豚回虫（ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）ＫＡＰＣ  ＡＳＣＵ、及び線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）ｋｉｎ−１／ＣＡＢ４１３５２キナーゼが、ＰＫＡ、ＰＫＢ、ＰＫＣ、ＳＧＫ、又はＰＫＧキナーゼ遺伝子ファミリーとは異なる古代遺伝子（ａｎｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ）ファミリーを構成することが示された。ＰＫＡキナーゼの発現ではなく、ＰＲＫＸキナーゼの発現が、細胞の形態形成を強く活性化し、細胞遊走の促進と関連して試験管内において上皮の管状構造の形成を促進することが見出された。それ故、ＰＲＫＸキナーゼは、腎が発達する間、管形成を制御し得、ＰＲＫＸ遺伝子ファミリーは、多細胞性真核生物の細胞の形態形成において重要な役割を果たし得る。ＰＲＫＸと神経変性疾患、特にアルツハイマー病との関係は、今までのところ明らかにされていない。
【０００８】
単数形態「一の（ａ）」「一の（ａｎ）」及び「この（ｔｈｅ）」は、本明細書中及び特許請求の範囲の中で用いられる場合、文脈に特段の指図なき限り、複数の言及を包含する。例えば、「一の細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」も、複数の細胞を意味する等である。
【０００９】
本明細書と請求項中で用いられる「及び／又は」という用語は、この用語の前後の言葉は、二者択一のもの又は組み合わせるもののいずれか一方としてみなされることを意味する。例えば、「レベル及び／又は活性の確定」は、レベルのみ、活性のみ、或いは、レベルと活性の両方が確定されることを意味する。
【００１０】
「レベル」という用語は、本明細書中で用いられる場合、物質（例えば、転写産物（例えばｍＲＮＡ）又は翻訳産物（例えば、タンパク質若しくはポリペプチド））の、量又は濃度の基準（ｇａｇｅ）又は基準（ｍｅａｓｕｒｅ）を含むことを意味する。
【００１１】
「活性」という用語は、本明細書中で用いられる場合、物質（例えば、転写産物及び翻訳産物）が生物学的効果を及ぼすことのできる能力の測定、又は生物学的に活性化した分子のレベルの測定として理解されるものとする。「活性」という用語は、キナーゼ又はキナーゼサブユニットの結合、拮抗、抑制、阻害、中和、又は分離に関連した、及びキナーゼ又はキナーゼサブユニットの活性化、作動、上方調節に関連した、生物学的及び／又は薬理学的活性にもまた相当する。
【００１２】
本明細書中で用いられる場合、用語「レベル」及び／又は「活性」とは、さらに、遺伝子発現レベル又は遺伝子活性をいう。遺伝子発現は、遺伝子産物の産生を導く転写及び翻訳による、遺伝子中に含まれる情報の利用として定義され得る。
【００１３】
「異常調節」は、遺伝子発現の上方調節若しくは下方調節、及び／又は遺伝子産物の安定性の増減を意味する。遺伝子産物は、ＲＮＡ又はタンパク質のいずれかを含み、そして遺伝子発現の結果物である。遺伝子産物の量は、ある遺伝子がどれだけ活性であるか、及びその遺伝子産物がどれだけ安定なのかを測定するのに用いられ得る。
【００１４】
本明細書及び特許請求の範囲の中で用いられる場合、用語「遺伝子」は、コード領域（エキソン）並びに非コード領域（例えば、プロモーター又はエンハンサー、イントロン、リーダー配列、及びトレーラー配列（ｔｒａｉｌｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）といった、コードされない調節エレメント）の両方を包含する。
【００１５】
用語「ＯＲＦ」は、「オープン・リーディング・フレーム」の頭字語であり、そして、ＯＲＦとは、少なくとも一つのリーディング・フレーム中にストップコドンを有しておらず、それゆえ潜在的にアミノ酸配列に翻訳され得る核酸配列をいう。
【００１６】
「調節エレメント」とは、誘導性型プロモーター及び誘導不能型プロモーター、エンハンサー、オペレーター、並びに遺伝子発現を促進及び調節するその他のエレメントをいう。
【００１７】
用語「断片」は、本明細書中で用いられる場合、例えば、選択的スプライシングされた転写産物若しくは翻訳産物、又は短縮された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）転写産物若しくは翻訳産物、又は他の方法で切断された転写産物又は翻訳産物を包含することが意図される。
【００１８】
用語「誘導体」は、本明細書中で用いられる場合、変異体、又はＲＮＡ編集された転写産物、若しくは化学的に改変された転写産物、若しくは他の方法で変更された転写産物をいうか、或いは、変異体、若しくは化学的に改変された翻訳産物、若しくは他の方法で変更された翻訳産物をいう。目的を明確にするために、転写物誘導体とは、例えば、核酸配列中に変更（例えば、単数若しくは複数のヌクレオチドの、欠失、挿入若しくは交換）を有する転写物をいう。例えば、誘導翻訳産物は、リン酸化の変更、又はグリコシル化の変更、又はアセチル化の変更、又は脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）の変更等の過程によって、或いは、変性シグナルペプチド切断、又は他のタイプの成熟切断によって生成される可能性がある。これらの過程は、翻訳後に生じ得る。
【００１９】
用語「モジュレーター」とは、本発明及び特許請求の範囲の中で用いられる場合、遺伝子又は遺伝子の転写産物又は遺伝子の翻訳産物の、レベル及び／又は活性を、変化又は変更させることのできる分子をいう。「モジュレーター」とは、タンパク質の機能的特性を、増強若しくは阻害し、従ってこれを「調節する」能力を有し、結合、競合、抑制、阻害、中和、分離、活性化、作動、及び上方調節を「調節」する能力を有する分子をいう。「調節」はまた、細胞の生物学的活性に影響を及ぼす能力をいうために用いられる。好ましくは、「モジュレーター」は、遺伝子の転写産物又は翻訳産物の生物学的活性を、変化又は変更させたりすることができる能力を有する。例えば、前述の調節は、生物学的活性及び／又は薬理学的活性の増減、結合特性における変化、或いは前述の遺伝子の翻訳産物の生物学的、機能的、又は免疫学的な特性の任意の他の変化又は変更であり得る。
【００２０】
用語「薬剤」、「試薬」又は「化合物」は、細胞、組織、体液に対して、又は任意の生物学的システム若しくは試験される任意のアッセイ系の内で、陽性又は陰性の生物学的作用を有する任意の物質、化学薬品、組成物、又は抽出物をいう。これらは、標的の、アゴニスト、アンタゴニスト、部分アゴニスト又は逆アゴニストであり得る。このような薬剤、試薬又は化合物は、核酸、天然若しくは合成のペプチド若しくはタンパク質複合体、融合タンパク質であり得る。これらはまた、抗体、有機分子若しくは無機（ａｎｏｒｇａｎｉｃ）分子、又は組成物、低分子、薬物及び前述の薬剤の任意のものの組み合わせであり得る。これらは、試験の目的で、診断の目的で、又は治療の目的で使用され得る。
【００２１】
用語「オリゴヌクレオチドプライマー」又は「プライマー」とは、所定の標的ヌクレオチドに対し、相補的塩基対のハイブリダイゼーションによりアニールし得、かつ、ポリメラーゼにより延長され得る、短い核酸配列をいう。これらは、特定の配列に対し特異的に選択され得るか、ランダムに選択され得る。例えば、これらは混合した状態において、可能性のある全配列をプライムする。本明細書中で使用されるプライマーの長さは、１０ヌクレオチドから８０ヌクレオチドまで変動し得る。「プローブ」は、本明細書中に記載及び開示された核酸配列のうち、短い核酸配列又はこれに相補的な配列である。これらは、全長配列、又は所定の配列の断片、誘導体、アイソフォーム若しくは改変体を包含する。プローブとアッセイ検体との間におけるハイブリダイゼーション複合体の同定により、その検体の中の他の類似配列の存在の検出が可能になる。
【００２２】
本明細書中で用いられる場合、「ホモログ又はホモロジー」は、当該分野において、ヌクレオチド又はペプチド配列と別のヌクレオチド又はペプチド配列との近似性（これは、該比較の配列間の同一性及び／又は類似性の程度により決定される）を記載するために使用される用語である。
【００２３】
当該分野において、用語「同一性」及び「類似性」は、ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列近似性の程度（これは、クエリー配列と他の好ましくは同一の型の配列（核酸若しくはタンパク質配列）とのマッチングにより決定される）を意味する。「同一性」及び「類似性」を計算及び決定する好ましいコンピュータープログラム法としては、ＧＣＧ  ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０，２１５：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７，２５：３３８９−３４０２；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９８４，１２：３８７）、並びにＢＬＡＳＴＮ  ２．０（Ｇｉｓｈ  Ｗ．，ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ，１９９６−２００２）、並びにＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８８，８５：２４４４−２４４８）、並びに最も長く重複した一対のコンティグを決定及びアライメントするＧＣＧ  ＧｅｌＭｅｒｇｅ（Ｗｉｂｕｒ及びＬｉｐｍａｎ，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．１９８４，４４：５５７−５６７；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７０，４８：４４３−４５３）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
用語「改変体」とは、本明細書中で用いられる場合、本発明において開示されるポリペプチド及びタンパク質に関して、一以上のアミノ酸が、Ｎ末端及び／Ｃ末端で、及び／又は本発明のネイティブなポリペプチド又はタンパク質のネイティブなアミノ酸配列内で、付加及び／又は置換及び／又は削除及び／又は挿入されているが、本質的な特性を保持している、任意のポリペプチド又はタンパク質をいう。更に、用語「改変体」は、本明細書中で用いられる場合、本発明において開示される遺伝子転写物に関して、一以上のヌクレオチドが、付加及び／又は置換及び／又は削除された、任意のｍＲＮＡをいう。
【００２５】
更に、用語「改変体」は、ポリペプチド又はタンパク質のうち、より短い又はより長い別形を包含する。「改変体」はまた、ＰＲＫＸタンパク質の少なくとも２００アミノ酸（配列番号１）の長さに亘って、少なくとも約８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、そして最も好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性を有する配列を包含する。「改変体」としては、例えば、配列番号１を有するＰＲＫＸタンパク質の改変体が挙げられる（これは、配列番号２を有するＰＲＫＹタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ取得番号（ｐｒｉｍａｒｙ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ）Ｏ４３９３０）である。改変体はまた、高度に保存された領域中において、保存されたアミノ酸が置換されたタンパク質を包含する。本発明においては、断片がＰＫＡサブユニットと等しいＰＫＡタンパク質（プロテインキナーゼＫ）の断片、誘導体又は改変体を用いないことは、有利であり得る。
【００２６】
更に、用語「改変体」はまた、遺伝子転写物のうち、より短い又はより長い別形を包含する。「改変体」は、ＰＲＫＸ遺伝子転写物の少なくとも６００ヌクレオチドの長さに亘って、少なくとも約８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、そして最も好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性を有する配列（配列番号３）を包含する。配列改変体には、一のコドンが選択的塩基配列のために他のコドンと置き換えられているが、ＤＮＡ配列によって翻訳されたアミノ酸配列が変化しないまま残っているものが包含される。当該分野において公知のこの現象は、特定のアミノ酸を翻訳する一連のコドンの重複性と呼ばれる。
【００２７】
本発明における「タンパク質及びポリペプチド」は、ＰＲＫＸタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）を含むタンパク質の改変体、断片及び化学的誘導体を包含する。機能性において影響を有しないであろうこのようなアミノ酸の交換（例えば、リシンに対するアルギニン、ロイシンに対するバリン、グルタミンに対するアスパラギン）も包含される。自然から単離され得るか、又は組換え及び／若しくは合成手段により生み出され得る、タンパク質及びポリペプチドが包含され得る。ネイティブタンパク質又はポリペプチドとは、天然に存在する短縮又は分泌された形態、天然に存在する改変体形態（例えば、スプライス改変体）及び天然に存在する対立遺伝子改変体をいう。用語「単離された」は、本明細書中で用いられる場合、天然の環境から変化させられた及び／又は取り除かれた（すなわち、これらが通常生ずる細胞又は生物（ｌｉｖｉｎｇ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）より単離された）並びに天然には結合していると見出される共存因子（ｃｏｅｘｉｓｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）より分離又は本質的に精製された分子又は物質をいうものとみなされる。この概念は、さらに、このような分子をコード化する配列が、人為的に、ポリヌクレオチド（このような分子をコード化する配列が自然な状態においては、連結されていない）に連結され得ることを意味する。そして、このような分子は、組換え及び／又は合成の手段により生成され得ことを意味し、これらはまた、「非ネイティブ」とも呼ばれる。たとえ上述の目的のために、これらの配列が、生命有機体内又は非生命有機体内に、これら当業者にとって公知の技術によって導入され得ても、そして、たとえこれらの配列が、上述の有機体に依然として存在していても、それらは常に単離されたとみなされる。本発明において、「危険性」、「感受性」及び「素因」という言葉は同等であり、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を進展させる可能性に関して用いられる。
【００２８】
用語「ＡＤ」は、アルツハイマー病を意味する。「ＡＤ型神経病理学」、「ＡＤ病理学」とは、本明細書中で用いられる場合、本発明において記載した、及び当該分野の文献（Ｉｑｂａｌ，Ｓｗａａｂ，Ｗｉｎｂｌａｄ  ａｎｄ  Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ（Ｅｔｉｏｌｏｇｙ，Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ），Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，１９９９；Ｓｃｉｎｔｏ  ａｎｄ  Ｄａｆｆｎｅｒ，Ｅａｒｌｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，２０００；Ｍａｙｅｕｘ  ａｎｄ  Ｃｈｒｉｓｔｅｎ，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅ  ｔｏ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９；Ｙｏｕｎｋｉｎ，Ｔａｎｚｉ  ａｎｄ  Ｃｈｒｉｓｔｅｎ，Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎｓ  ａｎｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｅｒｌｉｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８を参照のこと）より一般に公知の、神経病理学的、神経生理学的、病理組織学的及び臨床的な、特徴、徴候及び症状をいう。
【００２９】
用語「ブラーク病期（Ｂｒａａｋ  ｓｔａｇｅ）」又は「ブラーク病期（Ｂｒａａｋ  ｓｔａｇｉｎｇ）」とは、Ｂｒａａｋ  ａｎｄ  Ｂｒａａｋによって提起された基準に従った、脳の分類をいう（Ｂｒａａｋ  ａｎｄ  Ｂｒａａｋ、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １９９１，８２：２３９−２５９）。ＡＤのブラーク病期により、前脳の既定領域の神経原線維病変の拡張及び分布が評価され、ＡＤの神経病理学的進行が６段階に分けられる（段階０乃至６）。これは、死後のＡＤ神経病理学的段階における進行として十分に確立され、かつ一般的に受け入れられている。精神状態に関して、ＡＤ患者の臨床的状態及び認知機能／認知障害と、剖検後に得られた対応するブラーク病期との間に、顕著な相関関係があることが示されている（Ｂａｎｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９９３，１６２：１７９−１８２；Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  ２０００，９９：５７９−５８２）。同様に、神経原線維変化とニューロンの細胞病理学との間の相関関係も見出されており（Ｒoｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  ２００２，１０３：３６３−３６９）、そしてそれら両方は、認知機能を予想すると報告されている（Ｇｉａｎｎａｋｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２００３，６０：１４９５−１５００；Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２００４，６１：３７８−３８４）。さらに、βアミロイドペプチドの沈着に関与し、かつ神経原線維変化の形成が蓄積する病原性カスケードが提唱される。後者は、初期ＡＤ特異的事象の分子レベル／細胞レベルで先行することの証拠となる（Ｍｅｔｓａａｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ  ２００３，２４：５６３−５７２）。
【００３０】
本発明において、ブラーク病期は、それ故、個々のドナーの臨床的な症状／状態によらない（即ち、精神疾病、認知欠陥、他の精神神経パラメータの下落（ｄｅｃｌｉｎｅ）又はＡＤの明白な臨床的診断の報告の存否に拠らない）、疾患進行の代理マーカーとして用いられる。即ち、Ｂｒａａｋ病期判断される神経原線維変化は、基礎となる分子細胞病理メカニズムを一般的に反映し、従って、脳の（前）罹患状態を定義する。これは、例えば、ブラーク１の段階のドナーが、定義上、段階２（又はそれ以上）のドナーよりも初期段階の分子／細胞病因を示すこと、及び従ってブラーク病期１のドナーは、例えば、いずれかのより高いブラーク病期のドナーと比較した場合に、コントロールとみなされ得ることを意味する。この点で、コントロール個体と影響を受けた個体との間の差異は、健康なコントロールドナーとＡＤ患者との間の差異に基づく臨床的診断と必ずしも同一ではない可能性があるが、しかしむしろ、コントロール個体と影響を受けた個体との間の差異とは、代理マーカーから演繹されかつこれにより反映された場合の（前）病的な状態の推定上の差異をいう。
【００３１】
本発明において、ブラーク病期０は、アルツハイマー病の徴候及び症状に苦しんでいるとはみなされない人を示し得るものであり、ブラーク病期１乃至４は、該個人が、すでにＡＤの臨床的な徴候及び症状に苦しんでいるか否かにより、健康なコントロールの個体又はＡＤ患者のいずれかを示し得る。ブラーク病期が高いほど、ＡＤの徴候及び症状を示す可能性及びＡＤの徴候及び症状が進行するリスクを示す可能性がより高くなる。神経病理学的な評価（即ち、ＡＤの病理学的変化が痴呆の根本的原因である可能性の判断）に関して、勧告がＢｒａａｋ  Ｈにより与えられている（ｗｗｗ．ａｌｚｆｏｒｕｍ．ｏｒｇ）。
【００３２】
コントロールから得られた値は、既知の健康状態を表す基準値であり、患者から得られた評価は、既知の疾患状態を表す基準値である。
【００３３】
本発明における神経変性疾患又は障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、ピック病、前頭側頭型認知症（ｆｒｏｎｔｏ−ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、進行性核上麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐａｌｓｙ）、大脳皮質基底核変性症、脳血管性痴呆（ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、多発性萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｔｒｏｐｈｙ）、嗜銀性顆粒痴呆（ａｒｇｙｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｇｒａｉｎ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）及び他のタウオパシー（ｔａｕｏｐａｔｈｉｅｓ）及び軽度認知障害（Ｍｉｌｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）を包含する。更に例えば、神経変性過程を伴う状態に関しては、虚血性脳梗塞、加齢性黄斑変性、睡眠発作、運動ニューロン疾患、プリオン病、外傷性神経損傷及び修復、並びに多発性硬化症がある。
【００３４】
本発明は、セリン／スレオニンプロテインキナーゼファミリーＰＲＫＸの遺伝子及び上記ＰＲＫＸのタンパク質産物の、同定、示差的発現、示差的制御、調節不全であって、特定の検体中での、ＡＤ患者の特定の脳領域での、種々のブラーク病期に分類された個体の特定の脳領域での、互いに比較した及び／又は同年齢のコントロール個体と比較したものを開示する。本発明は、ＡＤ患者の側頭皮質及び前頭皮質においてＰＲＫＸのｍＲＮＡレベルが増加し、上方制御されるという点で、ＰＲＫＸの遺伝子発現が変動すること、コントロール個体のそれぞれの脳領域と比較して、ＡＤ患者の脳において調節不全であることを開示する。更に、本発明は、種々のブラーク病期に分類された個体の特定の脳領域において、ＰＲＫＸ発現量が異なり、発現レベルが、すでに早期のブラーク病期（ブラーク１−３）で増加を開始し、そして後期ブラーク病期（ブラーク４−６）の課程で漸進的に増加することを開示する。
【００３５】
ＡＤ患者とコントロールの個体とを比較した際の、又それのみならず種々のブラーク病期間で比較した際の、ＰＲＫＸ遺伝子転写レベルにおいて見られる差異は、ＰＲＫＸタンパク質レベルにおいて見られ得るかなりの差異によって更に裏づけされる。コントロール個体とは対照的に、ＡＤ患者由来の脳標本内において、ＰＲＫＸタンパク質は、高レベルで反応性アストロサイトに含まれ、蓄積し、そして斑結合活性化ミクログリア内でＣＤ６８タンパク質と共局在し、そして皮質βアミロイド斑と共沈着する。ＰＲＫＸ遺伝子発現のこの調節不全及び対応する遺伝子産物のレベル及び局在の変化（これは、ＡＤ型病理学の発達に対応（ｐａｒａｌｌｅｌ）する）は、明らかにＰＲＫＸとＡＤとの関連性を反映し、そして疾患の経過の間、進行性の病理学的事象の指標である。この関連性の更なる証拠は、ショウジョウバエＰＲＫＸオルソログｐｋａ−Ｃ３が、ショウジョウバエＡＤモデルにおける変性表現型を促進すること、及びこの効果がタウタンパク質の変異体形態の病理学的リン酸化の増加を伴うという知見により提供される。更に具体的には、ｐｋａ−Ｃ３キナーゼは、ＡＤにおいて異常にリン酸化されることが証明されたタウ中の一のアミノ酸部位である、セリン２１４のリン酸化を増加させる。それ故、ＰＲＫＸは、ＡＤを導く分子病理学的事象のカスケードに、表面上、関与し得、従って、ＡＤ及び他の神経変性疾患に対する治療に基づく低分子の同定及び開発のための有望な標的に相当し得る。ＰＲＫＸ遺伝子発現の調節不全及び対応する遺伝子産物のレベル及び局在における変化と、神経変性疾患（特にＡＤ）の病理学との間の関係を実証する実験は、現在まで記載されたことがない。同様に、ＰＲＫＸ遺伝子内の変異のうち、該疾患と関連することが説明されたものも存在しない。ＰＲＫＸ遺伝子とこのような病期とを関連付けることで、新規の方法、とりわけ該疾患の診断及び治療に対するものが、提供される。更に、ＰＲＫＸを、ＡＤの初期過程においてすでに生じている病理学的事象と関連付けることは、ＡＤ病理の開始を妨げる治療の可能性、脳の修復不能な損傷が生じる前に処置される治療の可能性を提供する。その結果、本発明は、神経変性疾患、特にＡＤになる素因の同定と同様、診断における評価、治療を受けている人の診断におけるモニタリング、予後に対しても実用性を有する。
【００３６】
本発明は、ＡＤ患者の特定の脳領域におけるＰＲＫＸをコードする遺伝子及びその遺伝子産物の異常調節を開示する。下側頭葉、内側嗅皮質、海馬、扁桃のニューロンが、ＡＤにおいて、変性過程を受けやすい（Ｔｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １９８１，１０：１８４−１９２）。これらの脳領域は、主として、学習機能及び記憶機能の過程に関与しており、ＡＤにおけるニューロン欠失及び変性に対する選択的脆弱性を示す。対照的に、前頭皮質、後頭皮質及び小脳の内側のニューロンは、大部分が無傷のままであり、かつ、神経変性的な過程から保護されている。ＡＤ患者及び同年齢コントロールの、前頭皮質（Ｆ）及び下側側頭皮質（Ｔ）由来の脳組織は、本明細書中で開示される実施例に関して使用された。結果として、ＰＲＫＸ遺伝子及びその対応する転写物、並びに／或いは翻訳産物は、原因的な（ｃａｕｓａｔｉｖｅ）役割を果たし、選択的な神経変性、及び／又は神経保護に影響を及ぼす。
【００３７】
一局面では、本発明は、被験体の神経変性疾患を診断若しくは予後判定する方法、又は、被験体が該疾患を進展させる素因を有しているか、被検体が該疾患を進展させるリスクが増加しているかを決定する方法、又は神経変性疾患を有する被検体に対して施される治療の効果をモニタリングする方法に特徴がある。本方法は、以下： 
（i）ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子転写産物、及び／又は
（ii）ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子翻訳産物、及び／又は
（iii）該被験体から得られた検体中の、前述の転写産物又は翻訳産物の、断片若しくは誘導体若しくは改変体、
のレベル、発現又は活性、又は両該レベル、発現及び該活性を決定する工程、
並びに該転写産物及び／又は該翻訳産物及び／又はこれらの該断片、誘導体若しくは改変体の、該レベル、発現及び／又は該活性を、公知の疾患状態（患者）を表す基準値及び／又は公知の健康状態（コントロール）を表す基準値及び／又は公知のブラーク病期を表す基準値と比較する工程、並びに該レベル及び／又は該活性が、公知の健康状態を表す基準値と比較して、変動するか、変更されるか、及び／又は公知の疾患状態を表す基準値に類似するか若しくは等しいか、或いは該被験体が神経変性疾患を有していることの指標若しくは該被験体が該疾患の徴候及び症状を進展させるリスクが増加しているかの指標である公知のブラーク病期を表す基準値と比較して類似しているか、を分析する工程、これにより該被験体中の該神経変性疾患を診断若しくは予後判定するか、又は該被験体が該神経変性疾患を進展させるリスクが増加しているかを決定する工程、を包含する。言い回し「被検体中」とは、開示された方法の結果が、被験体を苦しめる疾患に関する場合、すなわち、該疾患が被験体の「中」にある場合に、開示された方法の結果をいう。
【００３８】
更なる局面では、本発明は、被験体中の神経変性疾患の進行をモニタリングする方法に特徴がある。（i）ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は（ii）ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は（iii）該被検体から得られた検体中の該転写又は翻訳産物の、断片又は誘導体又は改変体の、レベル、発現又は活性、又は両該レベル、発現、及び該活性が決定される。該レベル、発現、及び／又は該活性は、公知の疾患又は健康状態又は公知のブラーク病期を表した基準値と比較される。これによって、該被験体における該神経変性疾患の進行がモニタリングされる。
【００３９】
なお更なる局面では、本発明は、神経変性疾患に対する治療を評価する方法又はその治療の効果をモニタリングする方法に特徴がある。この方法は、（i）ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は（ii）ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は（iii）該疾患に対する治療を受けている被検体から得られた検体中の、該転写産物若しくは翻訳産物の、断片若しくは誘導体若しくは改変体の、レベル、発現又は活性、又は両該レベル、発現、及び該活性を決定する工程を包含する。該レベル、発現又は該活性、又は両該レベル、発現及び該活性が、公知の疾患若しくは健康状態又は公知のブラーク病期を表した基準値と比較され、それによって、該神経変性疾患に対する治療を評価する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
好ましい実施形態において、（i）ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は（ii）ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は（iii）一定期間に亘って該被検体から採取した一連の検体中の、該転写産物若しくは翻訳産物の、断片若しくは誘導体若しくは改変体の、レベル、発現又は活性、又はレベル及び該活性の両方が、該疾患の進行をモニタリングするために比較される。更に好ましい実施形態では、一以上の収集された該検体に先立ち、該被検体は治療を受ける。なお別の好ましい実施形態では、該レベル及び／又は活性が、該被検体の治療の前後に決定される。
【００４１】
ＰＲＫＸの該転写産物並びに／或いは該翻訳産物及びその断片、誘導体、又は改変体の、該レベル、発現、及び／又は該活性が、ＡＤで苦しんでいない人、コントロールの人から得られた検体と比較して、ＡＤ患者から得られた検体中で増加し、上方制御されているのが好ましい。例えば、ＰＲＫＸの転写産物並びに／或いは翻訳産物及びその断片、誘導体、又は改変体の、発現及び／又は活性が、患者の検体から測定され、そして健康なコントロールの被験体の検体（基準検体）中のＰＲＫＸ及びその断片、誘導体又は改変体の、転写産物及び／又は翻訳産物の、発現及び／又は活性と比較される。
【００４２】
本明細書中及び特許請求の範囲に記載されている方法、キット、組換え動物、分子、アッセイ、そして本発明の利用に関する好ましい実施形態においては、上述のＰＲＫＸ遺伝子及びタンパク質は、配列番号１（Ｇｅｎｂａｎｋ  取得番号  Ｐ５１８１７）のタンパク質をコードするＰＲＫＸ遺伝子によって表されたものである。更に配列番号２（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ｐｒｉｍａｒｙ取得番号Ｏ４３９３０）のタンパク質をコードするＰＲＫＹ遺伝子を使用することが好ましい。上述のタンパク質のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ  取得番号  ＢＣ０４１０７３又はＥｎｓｅｍｂｌ  転写物  ＩＤ番号ＥＮＳＴ０００００３１１９７８のｃＤＮＡ配列に対応した、配列番号３又は４のｍＲＮＡ配列から推測される。本発明の好ましい実施形態においては、ＰＲＫＸとはまた、ヒトＰＲＫＸ又はＰＲＫＹをコードする配列（ｃｄｓ）を表す核酸配列（それぞれ配列番号５又は６）をいう。本発明において、該配列は、該用語が本明細書中で用いられているように、「単離」されている。
【００４３】
本明細書中で請求の範囲に記載されている方法、キット、組換え動物、分子、アッセイ、そして本発明の利用に関する更なる好ましい実施形態においては、該神経変性疾患又は神経変性障害は、アルツハイマー病であり、該被検体はアルツハイマー病の徴候及び症状に苦しんでいる。
【００４４】
分析及び決定される検体は、脳組織又は他の組織、又は体細胞からなる群より選択されることが好ましい。検体はまた、脳脊髄液又は他の体液（唾液、尿、便、血液、血清血漿、又は粘液が挙げられる）も含有し得る。好ましくは、本発明に従った、神経変性疾患に対する診断、予後診断、治療の進行のモニタリング又は評価の方法は、事実上、実施され得、そしてこのような方法は、好ましくは、被験体若しくは患者又はコントロールの人から採取され、集められ、又は単離された検体（例えば、体液又は細胞）に関する。
【００４５】
更なる好ましい実施形態においては、該基準値とは、（i）ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は（ii）ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は（iii）該神経変性疾患に苦しんでいない被検体から得られた検体（コントロール検体、コントロール、健康なコントロールの人）、或いは、神経変性疾患に、特にアルツハイマー病に苦しんでいる被検体から得られた検体（患者検体、患者、ＡＤ検体）又はＡＤの徴候及び症状に苦しんでいる可能性があるか否かを定義するブラーク病期に分類された人から得られた検体の中の該転写産物又は翻訳産物の、断片又は誘導体又は改変体の、レベル、発現、又は活性、或いは該レベルと該活性の両方の値をいう。
【００４６】
好ましい実施形態においては、被検体から採取された検体である細胞、又は組織、又は体液における、ＰＲＫＸタンパク質をコードした遺伝子の転写産物並びに／或いはＰＲＫＸタンパク質をコードした遺伝子の翻訳産物及び／又はこれらの断片若しくは誘導体若しくは改変体の、レベル及び／又は活性及び／又は発現の、公知の健康状態（コントロール検体）を表す基準値と比較した場合の変更は、神経変性疾患、特にＡＤの、診断又は予後又は該疾患に罹患する危険性の増大を示唆する。
【００４７】
更に好ましい実施形態においては、被検体から採取された検体である細胞又は組織又は体液における、ＰＲＫＸタンパク質をコードした遺伝子の転写産物並びに／或いはＰＲＫＸタンパク質をコードした遺伝子の翻訳産物及び／又はこれらの断片若しくは誘導体若しくは改変体の、レベル及び／又は活性及び／又は発現が、公知の神経変性疾患、特にアルツハイマー病の状態（ＡＤ患者検体）を表す基準値と比較して、これに等しいか又は近似することは、該神経変性疾患の診断又は予後又は該疾患になる危険性の増大を示唆する。
【００４８】
別の更なる好ましい実施形態においては、被検体から採取された検体である細胞又は組織又は体液における、ＰＲＫＸタンパク質をコードした遺伝子の転写産物並びに／或いはＰＲＫＸタンパク質をコードした遺伝子の翻訳産物及び／又はこれらの断片若しくは誘導体若しくは改変体の、レベル及び／又は活性及び／又は発現が、公知のブラーク病期（これは、ＡＤの徴候及び症状を進展させる高度な危険性を反映する）を表す基準値と比較して、これに等しいか又は近似することは、ＡＤに罹患したことの診断又は予後又は危険性の増大を示唆する。
【００４９】
しかしながら、ＰＲＫＸの該転写産物並びに／或いは該翻訳産物及びこの断片、誘導体若しくは改変体の、変動した、変更されたレベル、変更された発現及び／又は変更された活性が、増加、上方制御であることが好ましい。
【００５０】
好ましい実施形態では、転写産物のレベル及び／又はＰＲＫＸタンパク質をコードした遺伝子の発現のレベルの測定は、被検体から得られた検体において、定量的ＰＣＲ分析をプライマー組み合わせとともに用いて、該遺伝子特異的配列を、被験体の検体より抽出されたＲＮＡの逆転写により得られたｃＤＮＡから増幅して、遂行される。プライマー組み合わせ（配列番号７、配列番号８）は、本発明の実施例（iv）において記載され、本発明中に開示された配列から生成された他のプライマーもまた使用され得る。該遺伝子に対して特異的なプローブを用いたノーザンブロット又はリボヌクレアーゼプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）もまた適用され得る。チップベースのマイクロアレイテクノロジーにより転写産物を測定することが更に好ましくあり得る。これらの技術は、当業者に公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１；Ｓｃｈｅｎａ  Ｍ．，Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ，２０００を参照のこと）。免疫学的検定の一つの例は、特許出願ＷＯ０２／１４５４３で開示及び記載されているように、酵素活性の検出と測定である。
【００５１】
本発明はまた、本発明で開示されたような核酸配列又はその断片若しくは改変体に特有の、プライマー及びプローブの構築及び使用に関する。オリゴヌクレオチドプライマー及び／又はプローブは、蛍光性の、生物発光性の、磁気性の、放射性の物質で特異的に標識され得る。本発明は更に、該特異的ヌクレオチドプライマーを適切に組み合わせて使用して、該核酸配列又はその断片若しくは改変体を検出及び産生することに関する。当業者に周知のＰＣＲ分析は、該遺伝子特異的核酸配列を、核酸を含有する検体から増幅するために、該プライマー組み合わせを用いて遂行され得る。このような検体は、ブラーク病期によって定義付けられた、健康な被検体又は疾患被検体のいずれかに由来し得る。増幅が特異的な核酸産物をもたらすか否か、及び種々の長さの断片が得られ得るか否かが、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の指標であり得る。従って、本発明は、全コード配列及び遺伝子配列まで少なくとも長さ１０塩基の核酸配列、オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブを提供し、これらは、検査される核酸配列を含有する所定の検体中の遺伝子突然変異及び一塩基多型（これらは、神経変性疾患、特にアルツハイマー病と関連し得る）を検出するのに有用である。この特徴は、迅速なＤＮＡベースの診断試験の開発に有用であり、好ましくはキットの形態（ｆｏｒｍａｔ）においてもまた有用である。ＰＲＫＸのプライマーが実施例１（vi）に例示的に記載されている。
【００５２】
更に、ＰＲＫＸタンパク質をコードした遺伝子の翻訳産物及び／又は該翻訳産物の、断片又は誘導体又は改変体の、レベル及び／又は活性及び／又は発現、並びに／或いは、該翻訳産物及び／又はその断片若しくは誘導体若しくは改変体の、レベル又は活性は、免疫学的検定、活性アッセイ（ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｓｓａｙ）及び／又は結合アッセイを用いて検出され得る。これらのアッセイは、抗タンパク抗体又は該抗タンパク抗体に結合する二次抗体のいずれかに結合される、酵素標識、色彩動的（ｃｈｒｏｍｏｄｙｎａｍｉｃ）標識、放射性標識、磁気標識（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｌａｂｅｌ）、又は発光標識の使用によって、該タンパク質分子と抗タンパク抗体との間の結合量を測定し得る。更に、他の高親和性リガンドも使用され得る。使用され得る免疫学的検定としては、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、及び当業者に公知の他の技術が挙げられる（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９及びＥｄｗａｒｄｓ  Ｒ，Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；Ｅｎｇｌａｎｄ，１９９９）。これら全ての検出技術は、技術工学に基づいたマイクロアレイ、タンパク質アレイ、抗体マイクロアレイ、組織マイクロアレイ、電子バイオチップ、又はプロテインチップの形態（ｆｏｒｍａｔ）としてもまた用いられ得る（Ｓｃｈｅｎａ  Ｍ．，Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ，２０００を参照のこと）。
【００５３】
別の局面では、本発明は、被検体における神経変性疾患（特にＡＤ）を診断若しくは予後判定するための、又は被験体の神経変性疾患（特にＡＤ）を進展させる性向若しくは素因を決定するための、又は、神経変性疾患（特にＡＤ）を有する被検体に対して施された治療の効果をモニタリングするためのキットを特徴づけ、該キットは、以下：
（ａ）（i）ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子の転写産物を検出する試薬（ii）ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物を検出する試薬、及び／又は該転写産物若しくは翻訳産物の断片若しくは誘導体若しくは改変体を検出する試薬、からなる群より選択される、少なくとも一の試薬；
（ｂ）以下
・該転写産物及び／又は該翻訳産物及び／又はこれらの断片、誘導体若しくは改変体の、レベル、又は活性、又は該レベル及び該活性の両方、及び／又は発現を決定する工程；並びに
・該転写産物及び／又は該翻訳産物及び／又はこれらの断片、誘導体若しくは改変体の、該レベル及び／又は該活性及び／又は発現と、公知の疾患状態（患者）を表す基準値及び／又は公知の健康状態（コントロール）を表す基準値及び／又は公知のブラーク病期を表す基準値と比較する工程；並びに
・公知の健康状態を表す基準値と比較して、該レベル及び／又は該活性及び／又は発現が変動するか、及び／又は公知の疾患状態を表す基準値若しくは公知のブラーク病期を表す基準値と等しいか若しくは近似しているかを分析する工程；並びに
・神経変性疾患、特にＡＤを診断若しくは予後判定する工程、又は該被験体の、このような疾患を進展させる性向若しくは素因を決定する工程であって、該転写産物及び／又は該翻訳産物及び／又はこれらの断片、誘導体、若しくは改変体の、レベル、発現、若しくは活性、又は該レベル及び該活性の両方が、公知の健康状態（コントロール）を表す基準値と比較して、変動又は変更され、並びに／或いは、該転写産物及び／又は該翻訳産物及び／又はこれらの該断片、誘導体若しくは改変体が、公知の疾患状態（患者検体）、好ましくはＡＤの疾患状態（ＡＤ患者）を表す基準値、及び／又は公知のブラーク病期（神経変性疾患、特にＡＤの診断又は予後判定、又はこのような疾患を進展させる性向若しくは素因の増大、ＡＤの徴候及び症状を進展させる高い危険性）を表す基準値に近似するか又は等しい、工程
により、被験体の、神経変性疾患（特にＡＤ）を診断若しくは予後判定するための、又はこのような疾患を進展させる性向若しくは素因を決定するための、又は治療の効果をモニタリングするための、取扱説明書を含む。本発明に従うキットは、神経変性疾患、特にＡＤを発症するリスクのある個体の同定に、特に有用であり得る。
【００５４】
ＰＲＫＸタンパク質をコードした遺伝子の転写産物及び／又は翻訳産物を選択的に検出する試薬は、様々な長さの配列、配列断片、抗体、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、リボザイムであり得る。このような試薬はまた、前述の断片、誘導体又は改変体を検出するのにも使用され得る。
【００５５】
更なる局面において、本発明は、被検体における神経変性疾患、特にアルツハイマー病を診断又は予後判定する方法、及び被検体の、このような疾患を進展させる性向若しくは素因を決定する方法、並びに神経変性疾患、特にＡＤを有する被検体に施される治療の効果をモニタリングする方法におけるキットの使用に特徴がある。
【００５６】
従って、本発明に従うキットは、疾患の課程の中で不可逆的な損傷を負う前に、疾患の発症に先立って、初期の予防手段、又は治療上の介入に対し、同定された個体を標的化するための一の手段として寄与し得る。その上、好ましい実施形態において、本発明にて特徴付けられるキットは、被験体における神経変性疾患、特にＡＤに対する治療上の処置の成功又は失敗につきモニタリングするのに有用であり得るのと同様に、該被検体におけるこのような疾患の進行をモニタリングするのに有用であり得る。
【００５７】
別の局面では、本発明は、被検体における神経変性疾患、特にＡＤを治療又は予防する方法に特徴があり、該方法は、このような治療を必要とする該被検体に対する、治療上又は予防上有効な量での、薬剤、モジュレーター、アンタゴニスト、アゴニスト又は抗体の投与及び処方を包含し、該薬剤、モジュレーター、アンタゴニスト、アゴニスト又は抗体が、（i）ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子、及び／又は（ii）ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子の転写産物、及び／又は（iii）ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、及び／又は（iv）（i）乃至（ii）の、断片若しくは誘導体若しくは改変体の、レベル、若しくは活性、又は該レベル及び該活性の両方に直接的に又は間接的に影響する。該薬剤は、低分子を含有する可能性があるか、又はペプチド、オリゴペプチド、又はポリペプチドをも含有する可能性がある。該ペプチド、オリゴペプチド、又はポリペプチドは、ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、又はその断片若しくは誘導体若しくは改変体のアミノ酸配列を含み得る。神経変性疾患、特にＡＤを治療又は予防するための、本発明に従う薬剤もまた、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、又はポリヌクレオチドから構成され得る。該オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、センス配向又はアンチセンス配向のいずれかにおいて、ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を含み得る。
【００５８】
好ましい実施形態では、本方法は、該薬剤を投与するための、それ自体公知の遺伝子治療及び／又はアンチセンス核酸テクノロジーの方法の適用を包含する。一般的に、遺伝子治療は、突然変異遺伝子の分子置換、治療用タンパク質の合成をもたらす新規な遺伝子の付加及び組換え発現法若しくは薬剤による内因性の細胞遺伝子発現の調節といったいくつかのアプローチを包含する。遺伝子移入技術は詳細に記載されており（例えば、Ｂｅｈｒ，Ａｃｃ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  １９９３，２６：２７４−２７８及びＭｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９３，２６０：９２６−９３１を参照のこと）、そして、この遺伝子移入技術としては、直接的遺伝子移入技術（例えば、ＤＮＡの細胞への機械的マイクロインジェクション）及び生物学的ベクター（例えば、組換えウイルス、特にレトロウイルス）若しくはモデルリポソームを用いた間接的技術、又はポリカチオン共沈ＤＮＡを用いたトランスフェクションを基礎とした技術、化学的手段（溶剤、界面活性剤、ポリマー、酵素）若しくは物理的手段（機械的ショック、浸透圧ショック、熱ショック、電気ショック）による細胞膜撹乱（ｃｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｅｒｔｕｂａｔｉｏｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。出生後の中枢神経系への遺伝子移入は、詳細に記載されている（例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  １９９３，３：７４３−７４８を参照のこと）。
【００５９】
特に、本発明は、アンチセンス核酸治療によって神経変性疾患を治療又は予防する方法（即ち、アンチセンス核酸若しくはその誘導体を特定の重篤な細胞に導入することによる、不十分に発現された遺伝子又は欠損した遺伝子のダウンレギュレーション（例えば、Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ，ＤＮ＆Ｐ  １９９２，５：３８９−３９５；Ａｇｒａｗａｌ及びＡｋｈｔａｒ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９５，１３：１９７−１９９；Ｃｒｏｏｋｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９２，１０：８８２−６））に特徴がある。ハイブリダイゼーション戦略とは別に、リボザイム（即ち、疾患のメッセージを伝達するＲＮＡを破壊する酵素として作用するＲＮＡ分子）の適用についてもまた記載されている（例えば、Ｂａｒｉｎａｇａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９３，２６２：１５１２−１５１４を参照のこと）。好ましい実施形態では、治療を受ける被検体はヒトであり、そして、治療用アンチセンス核酸又はその誘導体は、ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子の転写産物に対して指向される。被検体の中枢神経系、好ましくは脳の細胞は、このような方法で治療されるのが好ましい。細胞貫入（ｃｅｌｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）は、公知の戦略（例えば、アンチセンス核酸及びその誘導体と担体粒子とのカップリング）又は上に記載の技術により、遂行され得る。標的化した治療用オリゴデオキシヌクレオチドを投与するための戦略は、当業者に公知である（例えば、Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９２，１０：２８１−２８７）。いくつかの場合、送達は、ほんの局所的な適用により遂行され得る。さらなるアプローチは、アンチセンスＲＮＡの細胞内発現に関する。この戦略において、細胞は、標的核酸の領域に相補的なＲＮＡの合成を指向する組換え遺伝子で、生体外で、形質転換される。細胞内で発現したアンチセンスＲＮＡの治療上の使用は、手順上は遺伝子治療に似ている。遺伝子の細胞内発現を二本鎖ＲＮＡの使用により調節する、最近開発された方法（ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として様々に公知である）は、核酸治療に対する別の有効なアプローチであり得る（Ｈａｎｎｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２００２，４１８：２４４−２５１）。
【００６０】
更に好ましい実施形態では、本方法は、ドナー細胞又は好ましくは移植片拒絶を最小化若しくは低減するために処置されたドナー細胞を、該被検体の中枢神経、好ましくは脳に移植する工程であって、該ドナー細胞が、該薬剤をコード化する少なくとも一のトランスジーンの挿入により遺伝的に改変されている工程を包含する。該トランスジーンは、ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターにより運搬され得る。トランスジーンは、トランスジーンをコード化するＤＮＡの非ウイルス性物理的トランスフェクションにより、特にマイクロインジェクションにより、ドナー細胞へと挿入され得る。トランスジーンの挿入はまた、エレクトロポレーション、化学的に媒介されたトランスフェクション、特にリン酸カルシウムトランスフェクション若しくはリポソーム媒介性トランスフェクションにより、遂行され得る（例えば、Ｍｃ  Ｃｅｌｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｐａｒｄｅｅ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ａｎｄ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ，１９９９）。
【００６１】
好ましい実施形態では、神経変性疾患、特にＡＤを治療及び予防するための該薬剤は、該被検体（好ましくは、ヒト）に、被験体細胞を該被検体に導入する工程を包含する過程であって、該被検体細胞が、試験管内で、該治療用タンパク質をコード化したＤＮＡ断片を挿入するための処理がなされており、該被検体細胞が、該被検体の生体内で、治療上有効量の該治療用タンパク質を発現している過程により、投与され得る治療用タンパク質である。該ＤＮＡセグメントは、試験管内で、ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターによって、該細胞へと挿入され得る。
【００６２】
本発明に従う治療又は予防の方法は、胚性肝細胞若しくは胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ）及びニューロン成人肝細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ａｄｕｌｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）を用いた、治療上のクローニング、移植及び幹細胞治療の適用を包含し、上述の細胞治療法及び遺伝子治療法のいずれかと組み合わせられる。幹細胞は、全能性又は多能性であり得る。これらはまた、器官特異的であり得る。罹患した及び／又は損傷した脳細胞又は脳組織を修復するための戦略は、（i）成体組織からドナー細胞を採取する工程を包含する。それらの細胞の核は、遺伝物質が取り除かれた未受精卵細胞へ移植される。胚性幹細胞は、体細胞核移植を経た胚盤胞の細胞から単離される。次いで、分化因子の使用により、この肝細胞の、専門化した細胞型、好ましくは神経細胞へと指向される進展が導かれるか（Ｌａｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９９９，９：９７５−９７７）、或いは（ii）試験管内での増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）、及びこれに続く移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）及び移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）のために、中枢神経系、又は骨髄（間葉系幹細胞）から単離した、成体幹細胞を純化（ｐｕｒｉｆｙ）する工程、又は（iii）直接的に、内因性神経幹細胞の増殖、移動、及び機能的ニューロンへの分化を誘導する工程（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ＤＡ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００２，２：３４−４２）に導かれる。成人神経幹細胞には、損傷した脳組織又は罹患した脳組織を修復する大きな可能性がある。その理由は、成人脳の胚中心には、ニューロン損傷又は機能不全がないからである（Ｃｏｌｍａｎ  Ａ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｗｏｒｌｄ  ２００１，７：６６−７１）。
【００６３】
好ましい実施形態では、本発明に従う治療又は予防のための被験体は、ヒト又は非ヒト実験動物（例えば、マウス若しくはラット、家畜動物、又は非ヒト霊長類）であり得る。実験動物は、神経変性障害についての動物モデル（例えば、ＡＤ型の神経病理を有するトランスジェニックマウス及び／又はノックアウトマウス）であり得る。
【００６４】
更なる局面では、本発明は、（i）ＰＲＫＸタンパク質をコードした遺伝子、及び／又は（ii）ＰＲＫＸタンパク質をコードした遺伝子の転写産物、及び／又は（iii）ＰＲＫＸタンパク質をコードした遺伝子の翻訳産物、及び／又は（iv）（i）乃至（iii）の、断片若しくは誘導体若しくは改変体からなる群より選択された少なくとも一つの物質の、活性又はレベル、又は該活性及び該レベルの両方、及び／又は発現の、薬剤、アンタゴニスト若しくはアゴニスト若しくはモジュレーターを特徴とする。そして該薬剤、アンタゴニスト若しくはアゴニスト、又は該モジュレーターは、神経変性疾患、特にＡＤの治療において潜在的な活性を有する。
【００６５】
別の側面では、本発明は、神経変性疾患、特にＡＤの治療又は予防のための医薬の製造において、（i）ＰＲＫＸタンパク質をコードした遺伝子、及び／又は（ii）ＰＲＫＸタンパク質をコードした遺伝子の転写産物、及び／又は（iii）ＰＲＫＸタンパク質をコードした遺伝子の翻訳産物、及び／又は（iv）（i）乃至（iii）の、断片若しくは誘導体若しくは改変体、からなる群より選択される少なくとも一の物質の、活性又はレベル、又は該活性及び該レベルの両方、及び／又は発現の、薬剤、抗体、アンタゴニスト若しくはアゴニスト、又はモジュレーターの使用を提供する。該抗体は、配列番号１を有するＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子の翻訳産物、又はその断片、誘導体、若しくは改変体（特に配列番号２を有する改変体）である免疫原に対して特に免疫反応性であり得る。
【００６６】
更なる局面では、本発明は、該薬剤、抗体、アンタゴニスト若しくはアゴニスト、又はモジュレーター、及び好ましくは医薬上の担体を含有する医薬組成物を特徴とする。担体とは、モジュレーターと共に投与される希釈薬、補助薬、賦形剤又はビヒクルをいう。
【００６７】
本発明の別の局面は、
（i）ＰＲＫＸタンパク質をコードした遺伝子、及び／又は
（ii）ＰＲＫＸタンパク質をコードした遺伝子の転写産物、及び／又は
（iii）ＰＲＫＸタンパク質をコードした遺伝子の翻訳産物、及び／又は
（iv）（i）乃至（iii）の断片若しくは誘導体若しくは改変体、
からなる群より選択される少なくとも一の物質の、レベル及び／又は活性及び／又は発現の、アンタゴニストを含有する医薬に関する。ここで、アンタゴニストは、アンチセンス核酸、抗体若しくは抗体断片、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００６８】
抗体、又は抗体断片として、以下の物質：
Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ  Ｉドメインからなる一価の断片；Ｆ（ａｂ）２又はＦ（ａｂ｀）２断片；ヒンジ領域にてジスルフィド結合により連結された二つのＦａｂ断片を含む二価の断片；ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の一本鎖アーム（ｓｉｎｇｌｅ  ａｒｍ）のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、ｄＡｂ断片；単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；並びに一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）抗体、ｓｃｆｖ、ｆ（ａｂ）断片が理解される。
【００６９】
一局面では、本発明はまた、治療上又は予防上有効な量の医薬組成物で満たした、一以上の容器を含むキットをも提供する。
【００７０】
更なる局面では、本発明は、ネイティブＰＲＫＸ遺伝子転写制御エレメントではない転写因子の制御下で、特に配列番号１を有するＰＲＫＸタンパク質又はその断片若しくは誘導体若しくは改変体（例えば、配列番号２を有する改変体）をコードする、非ネイティブＰＲＫＸ遺伝子配列を含む、組換え型の遺伝的に改変された非ヒト動物を特徴とする。該組換え型の、非ヒト動物の生産は、（i）該遺伝子配列及び選択可能なマーカー配列を含む遺伝子標的化構築物を提供する工程、及び（ii）非ヒト動物の幹細胞中へと該標的化構築物を導入する工程、及び（iii）該非ヒト動物幹細胞を非ヒト胚へと導入する工程、及び（iv）該胚を偽妊娠非ヒト動物へと移植する工程、及び（v）該胚が頂生にまで進展するのを可能にする工程、及び（vi）遺伝的に変更された非ヒト動物を同定する工程であって、該非ヒト動物のゲノムが両方の対立遺伝子に該遺伝子配列の修飾を含む、工程、並びに（vii）過程（vi）の遺伝的に変更された非ヒト動物を育種（ｂｒｅｅｄｉｎｇ）して、遺伝的に変更された非ヒト動物を得る工程であって、該非ヒト動物のゲノムが該遺伝子の配列の変更を含み、該遺伝子の発現、誤発現、低発現、又は過剰発現、及び該遺伝子配列の断絶又は変異が、神経変性疾患、特にＡＤの徴候及び症状を進展させる素因を非ヒト動物にもたらす、工程を包含する。このような動物の生産及び構築のための戦略及び技術は、当業者に公知である（例えば、Ｃａｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８９，２４４：１２８８−１２９２並びにＨｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４並びにＪａｃｋｓｏｎ及びＡｂｂｏｔｔ，Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９９９を参照のこと）。
【００７１】
遺伝的に改変された、このような組換え型の非ヒト動物を、動物モデルとして、試験動物として又はコントロール動物として、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の研究のために、利用することは好ましい。このような動物は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を治療するための診断法及び治療法の開発において、化合物、薬剤及びモジュレーターを、スクリーニング、試験、確証するのに有用であり得る。本発明では、このような遺伝的に変異した動物のスクリーニング法における使用が開示される。
【００７２】
更なる局面では、本発明は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を治療するための診断法及び治療法の開発において、化合物、薬剤及びモジュレーターをスクリーニング、試験及び確証するために、特に配列番号１を有するＰＲＫＸタンパク質又はその断片若しくは誘導体若しくは改変体（例えば、配列番号２を有する改変体）をコードした遺伝子配列が、誤発現された細胞、低発現された細胞、発現されない細胞、若しくは過剰発現された細胞、又は断絶された細胞若しくは別の様式で変更された細胞を利用する。
【００７３】
別の局面では、本発明は、神経変性疾患（特にＡＤ）又は関連する疾患及び障害の治療若しくは予防において使用するための、薬剤、モジュレーター、アンタゴニスト又はアゴニストをスクリーニングする方法に特徴があり、この薬剤、モジュレーター又はアンタゴニスト若しくはアゴニストは、（i）特に配列番号１を有するＰＲＫＸタンパク質をコードした遺伝子、及び／又は（ii）特に配列番号１を有するＰＲＫＸタンパク質をコードした遺伝子の転写産物、及び／又は（iii）特に配列番号１を有するＰＲＫＸタンパク質をコードした遺伝子の翻訳産物、及び／又は（iv）（i）乃至（iii）の断片若しくは誘導体若しくは改変体（例えば、配列番号２を有する改変体）からなる群より選択される一以上の物質の、発現及び／又はレベル及び／又は活性を変化させる能力を有する。このスクリーニング法は、（ａ）細胞と試験化合物とを接触させる工程、及び（ｂ）（i）乃至（iv）に列挙された一以上の物質の活性及び／又はレベル、又は活性及びレベルの両方、及び／又は発現を測定する工程、及び（ｃ）該試験化合物とは接触していないコントロール細胞における該物質の活性及び／又はレベル、又は活性及びレベルの両方、及び／又は発現を測定する工程、及び（ｄ）工程（ｂ）及び（ｃ）の細胞内の物質の、レベル及び／又は活性及び／又は発現を比較する工程であって、接触細胞中の該物質の、レベル及び／又は活性及び／又は発現における変更により、この試験化合物が、神経変性疾患及び障害の治療又は予防における使用のための、薬剤、モジュレーター、アンタゴニスト又はアゴニストであることが示される、工程、を包含する。該細胞は、本発明で開示された細胞であり得る。
【００７４】
別の更なる局面では、本発明は、神経変性疾患（特にＡＤ）又は関連する疾患及び障害の治療又は予防における使用のための、薬剤、モジュレーター、アンタゴニスト若しくはアゴニストをスクリーニングする方法に特徴があり、この薬剤、モジュレーター又はアンタゴニスト若しくはアゴニストが、（i）特に配列番号１を有するＰＲＫＸタンパク質をコードした遺伝子、及び／又は（ii）特に配列番号１を有するＰＲＫＸタンパク質をコードした遺伝子の転写産物、及び／又は（iii）特に配列番号１を有するＰＲＫＸタンパク質をコードした遺伝子の翻訳産物、及び／又は（iv）（i）乃至（iii）の断片若しくは誘導体若しくは改変体（例えば、配列番号２を有する改変体）からなる群より選択される一以上の物質の、発現及び／又はレベル及び／又は活性を変更させる能力を有し、（ａ）神経変性疾患又は関連疾患若しくは関連障害の徴候及び症状を進展させる素因が与えられているか、又は既に進展させている非ヒト試験動物に対し、試験化合物を投与する工程であって、該動物が、本発明において開示された動物モデルであり得る、工程、及び（ｂ）（i）乃至（iv）に列挙された一以上の物質の、活性及び／又はレベル及び／又は発現を測定する工程、及び（ｃ）神経変性疾患又は関連疾患若しくは障害の徴候及び症状を等しく進展させる素因が与えられているか、又は既に進展させている非ヒトコントロール動物、及びこのような試験化合物が投与されていない非ヒト動物における該物質の、活性及び／又はレベル及び／又は発現を測定する工程、並びに（ｄ）工程（ｂ）及び（ｃ）の動物中の該物質の、活性及び／又はレベル及び／又は発現を比較する工程であって、非ヒト試験動物中の物質の活性及び／又はレベル及び／又は発現の変化により、試験化合物が神経変性疾患及び障害の治療又は予防における使用のための、薬剤、モジュレーター、アンタゴニスト又はアゴニストであることが示される、工程、を包含する。
【００７５】
別の実施形態では、本発明は、医薬を製造するための方法を提供し、該方法は、（i）神経変性疾患の薬剤、モジュレーター、アンタゴニスト又はアゴニストを、前述のスクリーニングアッセイにより同定する工程、並びに（ii）該薬剤、モジュレーター、アンタゴニスト又はアゴニストを医薬担体と混和する工程の段階を包含する。しかし、該薬剤、モジュレーター、アンタゴニスト又はアゴニストはまた、他の型のスクリーニング法及びアッセイによっても、同定され得る。
【００７６】
別の局面では、本発明は、リガンドと、特に配列番号１を有するＰＲＫＸタンパク質又はその断片若しくは誘導体若しくは改変体（例えば、配列番号２を有する改変体）との間の、結合の阻害又は結合の増強の程度を決定するために、及び／又は特に配列番号１を有するＰＲＫＸタンパク質又はその断片若しくは誘導体若しくは改変体（例えば、配列番号２を有する改変体）に対する該化合物の結合の程度を決定するために、化合物を試験するためのアッセイ、好ましくは複数の化合物をハイスループット形態でスクリーニングするためのアッセイを提供する。リガンドと、ＰＲＫＸタンパク質又はその断片若しくは誘導体若しくは改変体との結合の阻害を決定するために、該スクリーニングアッセイは、（i）該ＰＲＫＸタンパク質又はその断片若しくは誘導体若しくは改変体の懸濁液（ｌｉｑｕｉｄ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）を、複数の容器に添加する工程、並びに（ii）該阻害のためにスクリーニングされる化合物又は複数の化合物を該複数の容器に添加する工程、並びに（iii）検出可能な、好ましくは蛍光標識されたリガンドを該容器に添加する工程、並びに（iv）該ＰＲＫＸタンパク質又はその断片若しくは誘導体若しくは改変体、及び該化合物又は複数の化合物、及び検出可能な、好ましくは蛍光標識されたリガンドを、インキュベートする工程、並びに（v）好ましくは該ＰＲＫＸタンパク質又はその断片若しくは誘導体若しくは改変体と結合した蛍光の量を測定する工程、並びに（vi）該リガンドと、該ＰＲＫＸタンパク質又はその断片若しくは誘導体若しくは改変体との結合の、一以上の該化合物による阻害の程度を決定する工程の段階を包含する。該ＰＲＫＸ翻訳産物又はその断片若しくは誘導体若しくは改変体を、人工リポソーム中に再構成し、対応するプロテオリポソームを生成し、リガンドと該ＰＲＫＸ翻訳産物との間の結合の阻害を決定することが好ましい。界面活性剤からリポソーム内へのＰＲＫＸ翻訳産物を再構成させる方法が、詳細に記載されている（Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９９，３８：９４５６−９４６４；Ｋｒｉｖｏｓｈｅｅｖ及びＵｓａｎｏｖ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ｍｏｓｃｏｗ  １９９７，６２：１０６４−１０７３）。蛍光標識されたリガンドを用いる代わりに、いくつかの局面において、当業者に公知のいずれかの他の検出可能な標識（例えば、放射性標識）を使用し、それに沿って検出するのが好ましい。該方法は、リガンドと、ＰＲＫＸタンパク質をコードした遺伝子の遺伝子産物又はその断片若しくは誘導体若しくは改変体との結合を阻害する能力において、改良されるか又は別のやり方で最適化された化合物を評価するのと同様、新規化合物の同定にも有用となり得る。担体粒子の使用に基づいたこの場合においては、蛍光結合アッセイの一つの例は、特許出願ＷＯ００／５２４５１において開示及び記載されている。更なる例は、特許ＷＯ０２／０１２２６において記載された競合アッセイ法である。本発明におけるスクリーニングアッセイについての好ましいシグナル検出法は、次の特許出願：ＷＯ９６／１３７４４、ＷＯ９８／１６８１４、ＷＯ９８／２３９４２、ＷＯ９９／１７０８６、ＷＯ９９／３４１９５、ＷＯ００／６６９８５、ＷＯ０１／５９４３６、ＷＯ０１／５９４１６において記載されている。
【００７７】
一の更なる実施形態において、本発明は、（i）前述の阻害結合アッセイにより、化合物を、リガンドとＰＲＫＸタンパク質をコードした遺伝子の遺伝子産物との間の結合の阻害剤として同定する工程、及び（ii）その化合物と医薬担体とを混和する工程、の段階を包含する、医薬の製造のための方法を提供する。しかしながら、該化合物はまた、他のタイプのスクリーニング法によっても同定され得る。
【００７８】
更に本発明は、化合物を試験するための、好ましくは、複数の化合物をハイスループット形態でスクリーニングし、該化合物と、特に配列番号１を有するＰＲＫＸタンパク質又はその断片若しくは誘導体若しくは改変体（例えば、配列番号２を有する改変体）との結合の程度を決定するためのアッセイを提供し、該スクリーニングアッセイが、
（i）該ＰＲＫＸタンパク質又はその断片若しくは誘導体若しくは改変体の懸濁液を、複数の容器に添加する工程、並びに（ii）該結合に関してスクリーニングされる、検出可能な、好ましくは蛍光標識された化合物又は複数の検出可能な、好ましくは蛍光標識された化合物を、該複数の容器に添加する工程、並びに（iii）該ＰＲＫＸタンパク質又はその断片若しくは誘導体若しくは改変体、及び該検出可能な、好ましくは蛍光標識された化合物又は検出可能な、好ましくは蛍光で標識化合物を、インキュベートする工程、並びに（iv）好ましくは該ＰＲＫＸタンパク質又はその断片若しくは誘導体若しくは改変体と結合した蛍光の量を測定する工程、並びに（v）一以上の該化合物による、該ＰＲＫＸタンパク質又はその断片若しくは誘導体若しくは改変体との結合の程度を決定する工程、を包含する。この型のアッセイでは、蛍光標識を使用することが好ましくあり得る。しかしながら、他のタイプの検出可能な標識もまた、用いられ得る。このタイプのアッセイにおいてもまた、ＰＲＫＸ翻訳産物又はその断片若しくは誘導体若しくは改変体を、本発明で記載したようにして、人工リポソーム内に再構成させることも好ましくあり得る。該アッセイ法は、新規化合物の同定及びＰＲＫＸタンパク質又はその断片若しくは誘導体若しくは改変体と結合する能力が、改良されるか又は別のやり方で最適化された化合物の評価に対して、有用であり得る。
【００７９】
更なる一実施形態では、本発明は、医薬を製造するための方法を提供し、該方法は、（i）前述の結合アッセイにより、ＰＲＫＸタンパク質をコードした遺伝子の遺伝子産物に対して結合剤として化合物を同定する工程、及び（ii）その化合物と医薬担体とを混和する工程の段階を包含する。しかしながら、該化合物は、他のタイプのスクリーニング法によってもまた、同定可能であり得る。
【００８０】
別の実施形態では、本発明は、本明細書中で特許請求されるスクリーニングアッセイに従う、いずれかの方法により得ることのできる薬剤を与える。更なる一つの実施形態において、本発明は、本明細書中で特許請求の範囲に記載されたスクリーニングアッセイに従ういずれかの方法によって得られた薬剤を与える。
【００８１】
本発明の別の局面は、配列番号１を有するタンパク質分子及び該タンパク質分子の使用に特徴がある。該タンパク質分子は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を検出するための治療上の標的としての、ＰＲＫＸをコードした遺伝子の翻訳産物又はその断片若しくは誘導体若しくは改変体（例えば、配列番号２を有する改変体）である。
【００８２】
更に本発明は、配列番号１を有するタンパク質分子及び該タンパク質分子の使用を特徴とする。該タンパク質分子は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を予防又は治療又は寛解する、薬剤、モジュレーター、アンタゴニスト、アゴニスト、試薬又は化合物のスクリーニング標的としての、ＰＲＫＸをコードした遺伝子の翻訳産物又はその断片若しくは誘導体若しくは改変体（例えば、配列番号２を有する改変体）である。
【００８３】
本発明は、特に免疫原に対して免疫反応性を有する抗体を特徴とする。ここで該免疫原は、特に配列番号１を有するＰＲＫＸタンパク質をコードしたＰＲＫＸ遺伝子の翻訳産物又はその断片若しくは誘導体若しくは改変体（例えば、配列番号２を有する改変体）である。免疫原は、該遺伝子の翻訳産物における免疫原性又は抗原性のエピトープ又は部分を含み得る。ここで該翻訳産物の免疫原性又は抗原性の部分は、ポリペプチドであり、そしてここで該ポリペプチドは、動物において抗体応答を惹起する。そして該ポリペプチドは、該抗体により免疫特異的に結合される。抗体を生成するための方法は、当業者に周知である（Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８を参照のこと）。用語「抗体」は、本発明で用いられる場合、当該分野で公知の全ての形態の抗体（例えば、ポリクロナール抗体、モノクロナール抗体、キメラ抗体、組換え抗体、抗イディオタイプ抗体、ヒト化抗体、又は一本鎖抗体及びこれらの断片）を包含する（Ｄｕｂｅｌ及びＢｒｅｉｔｌｉｎｇ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９９を参照のこと）。例えば、本発明の抗体は、最新式技術（ｓｔａｔｅ−ｉｎ−ｔｈｅ−ａｒｔ）（例えば、酵素免疫測定法（例えば、酵素結合免疫吸着測定法、ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、ケモルミネッセンスイムノアッセイ、ウエスタンブロット、免疫沈降及び抗体マイクロアレイ）に基づいた様々な診断上及び治療上の手法において有用となる（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９  ａｎｄ  Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｒ．，Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｄ，１９９９を参照のこと）。これらの方法は、ＰＲＫＸ遺伝子の翻訳産物又はその断片若しくは誘導体若しくは改変体の検出を伴う。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態では、該抗体は、被検体から得られた検体中の細胞の病理学的状態の検出に用いられ得る。そして該検出は、該抗体を用いた該細胞の免疫細胞化学的染色を含む。ここで、公知の健康状態を表す細胞と比較した場合の、該細胞の、染色の程度の変更又は染色パターンの変更は、該細胞の病理学的状態を示す。好ましくは、病理学的状態は、神経変性疾患、特にＡＤに関する。細胞の免疫細胞化学的染色は、当該分野で周知の多くの種々の実験方法によって実行され得る。しかしながら、抗体結合の検出に関して自動化された手法を適用するのが好ましくあり得、ここで細胞の染色の程度の決定、又は細胞の細胞染色若しくは細胞内染色のパターンの決定、又は細胞表面上若しくは細胞内の細胞小器官若しくは他の細胞内構造における抗原の形態的分布は、米国特許第６１５０１７３号に記載された方法に従って実行される。
【００８５】
本発明の他の特徴及び利点は、例示に過ぎず、開示の残部を決して限定する意図のない、以下の図面の記載及び実施例より明らかになるであろう。
（図面）
【００８６】
図１は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ分析によって測定及び比較された、種々のブラーク病期に対応した個体由来のヒト脳組織検体中のＰＲＫＸ遺伝子由来ｍＲＮＡのレベルの差異の同定を示す。これは、それぞれのｍＲＮＡ種のレベルがＡＤの進行と量的に相関しており、それ故、Ｂｒａａｋ  ａｎｄ  Ｂｒａａｋ（ブラーク病期）に従った脳組織検体の神経病理学的段階に基づき測定された場合にＡＤの指標であることを示唆する。ブラーク病期０の５人の異なるドナー（Ｃ０１１、Ｃ０１２、Ｃ０２６、Ｃ０２７及びＣ０３２）、ブラーク病期１の７人の異なるドナー（Ｃ０１４、Ｃ０２８、Ｃ０２９、Ｃ０３０、Ｃ０３６、Ｃ０３８及びＣ０３９）、ブラーク病期２の５人の異なるドナー（Ｃ００８、Ｃ０３１、Ｃ０３３、Ｃ０３４及びＤＥ０３）、ブラーク病期３の４人の異なるドナー（Ｃ０２５、ＤＥ０７、ＤＥ１１及びＣ０５７）、ブラーク病期４の４人の異なるドナー（Ｐ０１２、Ｐ０４６、Ｐ０４７及びＰ０６８）の各々の前頭皮質及び下側側頭皮質のｃＲＮＡプローブが、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙの分析に、それぞれ使用される。主に下側側頭組織での、ブラーク病期の進行に伴うＰＲＫＸ遺伝子の上方調節を反映する差異が示されている。
【００８７】
図２は、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析によって測定した場合の、ＡＤの指標である種々のブラーク病期に対応した個体からのヒト脳組織検体中の、ＰＲＫＸ遺伝子由来ｍＲＮＡのレベルの差異の確証のためのデータを列挙する。Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ高速熱サイクル技術を使用した定量的ＲＴ−ＰＣＲは、ＧｅｎｅＣｈｉｐ分析に対して用いたドナーと同一のドナーの前頭皮質（Ｆｒｏｎｔａｌ）及び下側側頭皮質（Ｔｅｍｐｏｒａｌ）のｃＤＮＡを適用して遂行された。データは、遺伝子発現レベルにおいて有意な差を示さないシクロフィリンＢ標準遺伝子の値に標準化された。最も低いブラーク病期０の検体と、高いブラーク病期４を示す検体との間の比較により、ＰＲＫＸの遺伝子発現レベルにおけるかなりの差が明確に実証される。
【００８８】
図３は、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析、９８％の信頼性レベルでの中央値の統計法（Ｓａｃｈｓ  Ｌ  （１９８８）Ｓｔａｔｉｓｔｉｓｃｈｅ  Ｍｅｔｈｏｄｅｎ：Ｐｌａｎｕｎｇ  ｕｎｄ  Ａｕｓｗｅｒｔｕｎｇ．Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．６０）の使用により測定された場合の、ＡＤの指標である種々のブラーク病期に該当する個体由来のヒト脳組織検体中のＰＲＫＸ遺伝子由来ｍＲＮＡの絶対的なレベルの分析を示す。このデータは、ブラーク病期０乃至２の被検体を含む、コントロールと定義付けられたグループ（ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｇｒｏｕｐ）に基づき算出された。これは、ブラーク病期３乃至４を含む、ＡＤ病理が進行した状態にあると定義付けられたグループを算出されたデータと比較される。ＧｅｎｅＣｈｉｐ分析の結果を傍証する、上方調節を反映した顕著な差違が、前頭皮質及び下側側頭皮質において示されている。ブラーク病期０乃至２の下側側頭皮質（Ｔ）とブラーク病期３乃至４の下側側頭皮質とを比較すると、最も顕著な差異が明白である。該差異は、コントロールのヒトの下側側頭皮質及び前頭皮質に対する、ＡＤ病理の進行した個体の側頭皮質及び前頭皮質におけるＰＲＫＸの上方調節、及びＡＤ病理の進行した個体の下側側頭皮質における、前頭皮質と比較したＰＲＫＸの上方調節を反映している。
【００８９】
図４Ａは、配列番号１、ヒトＰＲＫＸタンパク質のアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  取得番号Ｐ５１８１７）を開示する。全長ヒトＰＲＫＸタンパク質は、３５８アミノ酸を含む。
【００９０】
図４Ｂは、配列番号２、ヒトＰＲＫＹタンパク質のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔ  ｐｒｉｍａｒｙ  取得番号  Ｏ４３９３０）を開示する。全長ヒトＰＲＫＹタンパク質は、２７７個のアミノ酸を含む。
【００９１】
図５Ａは、ＰＲＫＸタンパク質をコード化しており、２３５０ヌクレオチドを含む、配列番号３、ヒトＰＲＫＸ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  取得番号  ＢＣ０４１０７３）を示す。
【００９２】
図５Ｂは、ＰＲＫＹタンパク質をコード化しており、８９５ヌクレオチドを含む、配列番号４、ヒトＰＲＫＹ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（Ｅｎｓｅｍｂｌ転写物ＩＤ番号ＥＮＳＴ０００００３１１９７８）を示す。
【００９３】
図６Ａは、１０７７ヌクレオチドを含み、配列番号３のヌクレオチド１８５乃至１２６１を有する、配列番号５、ヒトＰＲＫＸ遺伝子のコード配列（ｃｄｓ）を描写する。
【００９４】
図６Ｂは、８３４個のヌクレオチドを含み、配列番号４のヌクレオチド１８乃至８５２を有する、配列番号６、ヒトＰＲＫＹ遺伝子のコード配列（ｃｄｓ）を描写する。
【００９５】
図７は、配列番号３，ＰＲＫＸ  ｃＤＮＡの断片（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）に対応する定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＰＲＫＸ転写レベルプロファイリングに用いられたプライマー（プライマーＡ、配列番号７及びプライマーＢ、配列番号８）の配列アライメントを描写する。
【００９６】
図８は、ＰＲＫＸ  ｃＤＮＡ配列の配列番号３、ＰＲＫＸコード配列の配列番号５、及びＰＲＫＸ転写レベルのプロファイリングに用いられた両プライマー配列（配列番号７、配列番号８）のアラインメントを図式的に示す。
【００９７】
図９は、ＡＤ患者由来のヒト脳標本中に観察される、ＰＲＫＸタンパク質と皮質βアミロイド斑との共沈を例証する。これとは対照的に、同年齢の非ＡＤコントロールの個体由来の脳標本においては、このようなＰＲＫＸタンパク質の沈殿は観察されない。この典型的な例は、患者において、ＰＲＫＸタンパク質がアミロイド斑（コントロールでは存在しない）と共沈（例えば、矢印）するという一般的な知見を実証する。ブラーク病期４及び１において、ＡＤ患者及び同年齢の非ＡＤコントロール由来の、アセトンで固定した、新鮮凍結死後ヒト脳側頭皮質標本のクリオスタット切片の二重免疫蛍光顕微鏡写真（原倍率４倍）がそれぞれ描写されている。特異的ＰＲＫＸ免疫反応性は、親和性精製がなされたポリクロナールラビット抗ＰＲＫＸ血清（Ａｂｇｅｎｔ）、次いでＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８接合ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗血清（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって明らかにされ、グレースケール写真（各々のパネルの４枚のうちの右上）又は結合写真中の緑色シグナル（各々のパネルの４枚のうちの左下）のいずれかのようにして可視化される。神経特異的体細胞マーカータンパク質ＮｅｕＮは、マウスモノクロナール抗ＮｅｕＮ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、次いでＣｙ３結合ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗血清（Ｊａｃｋｓｏｎ／Ｄｉａｎｏｖａ）によって検出され、グレースケール写真（各々のパネルの４枚のうちの左上）又は結合写真中の赤色シグナル（各々のパネルの４枚のうちの左下）のいずれかのようにして可視化される。核は、ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）によって青く染められる。４枚のうちの右下は、対応する位相差写真を示す。
【００９８】
図１０は、ＡＤ患者の皮質中の反応性アストロサイトが、高レベルでＰＲＫＸタンパク質を含有することを例証する。これに対し、ＡＤの影響を受けていない、年齢に相応したコントロールの個体の皮質中のアストロサイトには、ＰＲＫＸタンパク質がほんの少しのレベルしか検出されない可能性がある。ブラーク病期４と０において、ＡＤ患者（原倍率２０倍）及び同年齢の非ＡＤコントロール（原倍率４０倍）由来の、アセトンで固定した、新鮮凍結死後ヒト脳側頭皮質標本のクリオスタット切片の二重免疫蛍光顕微鏡写真がそれぞれ描写されている。特異的ＰＲＫＸ免疫反応性は、親和性精製がなされたポリクロナールラビット抗ＰＲＫＸ血清（Ａｂｇｅｎｔ）、次いでＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８接合ヤギ抗ラビットＩｇＧ二次抗血清（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって明らかにされ、グレースケール写真（各々のパネルの４枚のうちの右上）又は結合写真中の緑色シグナル（各々のパネルの４枚のうちの左下）のいずれかのようにして可視化される。アストロサイト特異的マーカータンパク質ＧＦＡＰは、マウスモノクロナール抗ＧＦＡＰ抗体（Ａｂｃａｍ）、次いでＣｙ３接合ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗血清（Ｊａｃｋｓｏｎ／Ｄｉａｎｏｖａ）によって検出され、グレースケール写真（各々のパネルの４枚のうちの左上）又は結合写真中の赤色シグナル（各々のパネルの４枚のうちの左下）のいずれかのようにして可視化される。核は、ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）によって青く染められる。４枚のうちの右下は、対応する位相差写真を示す。左のパネルは、コントロール標本中の、一の典型的なアストロサイトを示す（電力４０倍）。右のパネルは、ＡＤ標本における、多くの反応性アストロサイトの特徴的な外観を示す（電力２０倍）。
【００９９】
図１１は、ＰＲＫＸタンパク質が、ＡＤ患者由来の脳組織検体中で、大量に蓄積し、斑結合活性化ミクログリア内でＣＤ６８タンパク質と共局在することを例証する。それに対し、ＡＤの影響を受けていない、同年齢のコントロール個体由来の脳組織検体中には、ＰＲＫＸタンパク質のこのような蓄積は観察されない。ブラーク病期４と１において、ＡＤ患者（原倍率４０倍）及び同年齢の非ＡＤコントロール（原倍率１００倍）由来の、アセトンで固定した、新鮮凍結死後ヒト脳側頭皮質標本のクリオスタット切片の二重免疫蛍光顕微鏡写真がそれぞれ描写されている。特異的ＰＲＫＸ免疫反応性は、親和性精製がなされたポリクロナールラビット抗ＰＲＫＸ血清（Ａｂｇｅｎｔ）、次いでＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８結合ヤギ抗ラビットＩｇＧ二次抗血清（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって明らかにされ、グレースケール画像（各々のパネルの４枚のうちの右上）又は結合写真中の緑色シグナル（各々のパネルの４枚のうちの左下）のいずれかのようにして可視化される。ミクログリア特異的マーカータンパク質ＣＤ６８は、マウスポリクロナール抗ＣＤ６８抗体（Ｄａｋｏ）、次いでＣｙ３接合ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗血清（Ｊａｃｋｓｏｎ／Ｄｉａｎｏｖａ）によって検出され、グレースケール写真（各々のパネルの４枚のうちの左上）又は結合写真中の赤色シグナル（各々のパネルの４枚のうちの左下）のいずれかのようにして可視化される。核は、ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）によって青く染められる。４枚のうちの右下は、対応する位相差写真を示す。左のパネルは、コントロール標本中の、二つの典型的な小グリア細胞を示す（電力１００倍）。右のパネルは、ＡＤ標本中の、アミロイド斑を構成する（ｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ）多くの活性型ミクログリアの特徴的な外観を示す（電力４０倍）。顕微鏡写真は、斑結合活性ミクログリアによって、ＣＤ６８タンパク質が大量に発現され、そしてＰＲＫＸタンパク質が同時に蓄積及び共局在し、強い黄色結合シグナル（これは、対照的にコントロール検体にはないことが発見される）を生ずることを特徴的に例示する。更に、この例は、反応性アストロサイトによるＰＲＫＸタンパク質の発現が、コントロールと比べて、ＡＤにおいては典型的に増強されることを明らかに実証する（矢印）。
【０１００】
図１２は、トランスジェニックハエにおける、ヒトＰＲＫＸ遺伝子のｐｋａ−Ｃ３、ショウジョウバエオルソログのｍＲＮＡ発現の検出を示す。ｇｍｒ−ＧＡＬ４の制御の下、ｐｋａ−Ｃ３特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより発現した二つの異なるｐｋａ−Ｃ３トランスジェニックハエ系における、ｐｋａ−Ｃ３発現の検出が描写される。反応の効率は、サイクル数及びｐｋａ−Ｃ３特異的プライマー対のＲＴ−ＰＣＲ反応の効率（Ｅ＝１．８６）に従って計算される。この計算に基づき、系ｐｋａ−Ｃ３［０３０６５］のｐｋａ−Ｃ３は、コントロールのハエに比べ、２．７倍高発現である一方、系［０２６８７］のｐｋａ−Ｃ３は、コントロールのハエに比べ下方調節されている。各遺伝型３通りについて測定がなされた。用いた遺伝型は、ｗ；Ｐ｛ＥＰｇｙ２｝Ｐｋａ−Ｃ３ＥＹ０２６８７／ｇｍｒ−ＧＡＬ４；ｗ；Ｐ｛ＥＰｇｙ２｝Ｐｋａ−Ｃ３ＥＹ０３０６５／ｇｍｒ−ＧＡＬ４及びｗ；ｇｍｒ−ＧＡＬ４／＋であった。
【０１０１】
図１３は、ショウジョウバエＰＲＫＸオルソログｐｋａ−Ｃ３の過剰発現により、ＡＤトランスジェニックハエモデルにおいてＴａｕＰ３０１Ｌ誘導光受容細胞変性が促進されることを示す。網膜の直径（黒矢印）によって判断すると、ｐｋａ−Ｃ３（０３０６５）の発現により、ｇｍｒ−ＧＡＬ４の制御下で、ｈＴａｕＰ３０１Ｌを発現するハエのＴａｕＰ３０１Ｌ誘導光受容細胞変性が促進される。ｐｋａ−Ｃ３（０２６８７、部分的機能喪失）の共発現は、ＴａｕＰ３０１Ｌ誘導表現型には、影響を及ぼさない。用いられた遺伝型は、ｗ；Ｐ｛ＥＰｇｙ２｝Ｐｋａ−Ｃ３ＥＹ０３０６５／ｇｍｒ−ＧＡＬ４，ＵＡＳ−ＴａｕＰ３０１Ｌ−ｗ；Ｐ｛ＥＰｇｙ２｝Ｐｋａ−Ｃ３ＥＹ０２６８７／ｇｍｒ−ＧＡＬ，ＵＡＳ−ＴａｕＰ３０１Ｌ−ｗ；ｇｍｒ−ＧＡＬ４，ＵＡＳ−ＴａｕＰ３０１Ｌ／＋であった。
【０１０２】
図１４は、ショウジョウバエＰＲＫＸオルソログｐｋａ−Ｃ３が、ＴａｕＰ３０１Ｌ及びｐｋａ−Ｃ３を共発現したハエにおけるＴａｕＰ３０１Ｌのセリン２１４のリン酸化に関与していることを示す。ｐｋａ−Ｃ３（０２６８７）の部分的機能喪失は、野生型（ｗｔ）ｐｋａ−Ｃ３（０３０６５）トランスジーンを共発現したハエと比較して、ＴａｕＰ３０１Ｌのセリン２１４におけるリン酸化を減少させる。ＴａｕＰ３０１Ｌ及びｐｋａ−Ｃ３（０３０６５）を共発現したハエにおいて、コントロールのハエと比べてＴａｕＰ３０１Ｌ  のリン酸化が増加するのを明らかにする一方、部分的機能喪失したｐｋａ−Ｃ３（０２６８７）は、セリン２１４におけるタウのリン酸化を僅かに減少させている可能性がある（データーは有意性には達していない）ことを明らかにする、ＴａｕＰ３０１Ｌのリン酸化されたセリン２１４の定量が描写される。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ３．０２を用いた統計分析がなされた。用いられた遺伝型は、ｗ；Ｐ｛ＥＰｇｙ２｝Ｐｋａ−Ｃ３ＥＹ０３０６５／ｇｍｒ−ＧＡＬ４，ＵＡＳ−ＴａｕＰ３０１Ｌ−ｗ；Ｐ｛ＥＰｇｙ２｝Ｐｋａ−Ｃ３ＥＹ０２６８７／ｇｍｒ−ＧＡＬ，ＵＡＳ−ＴａｕＰ３０１Ｌ−ｗ；ｇｍｒ−ＧＡＬ４，ＵＡＳ−ＴａｕＰ３０１Ｌ／＋であった。
【０１０３】
図１５は、Ｓｗｅｄｉｓｈ変異ＡＰＰを安定に共発現したＨ４−神経膠腫細胞における誘導性ＰＲＫＸタンパク質産物のウエスタンブロット分析を示す。ＰＲＫＸは、Ｃ末端にｍｙｃがタグ化され、かつ組織培養細胞中に導入された。ＰＲＫＸの発現は、ＣＭＶプロモーターと融合したｔｅｔ−オペレーター配列の制御下である。１μｇ／ｍｌテトラサイクリンを培地に添加すると、ＰＲＫＸの発現がスイッチオンになる。細胞は回収され、可溶化され、ｍｙｃエピトープに対して指向される抗体を１：３０００希釈で用いたウエスタンブロット分析に供された。矢印は、約４３ｋＤａに達する濃いバンドを示す。テトラサイクリン非存在下では、同等の分子量で走る薄いバンドのみが、目に見え、誘導性プロモーターのリークによるバックグラウンドの発現がかろうじて示される。
【０１０４】
図１６は、Ｓｗｅｄｉｓｈ変異ＡＰＰ及びｔｅｔリプレッサーを安定に共発現するＨ４−神経膠腫細胞中の誘導性ＰＲＫＸタンパク質産物の免疫蛍光分析を示す。ＰＲＫＸは、Ｃ末端にｍｙｃがタグ化され、かつ組織培養細胞中に導入された。ＰＲＫＸの発現は、ＣＭＶプロモーターと融合したｔｅｔ−オペレーター配列の制御下である。１μｇ／ｍｌテトラサイクリンを培地に添加すると、カバーガラス（ｇｌａｓｓ  ｃｏｖｅｒ  ｓｌｉｐ）上に播種された細胞内でＰＲＫＸの発現がスイッチオンになる。２４時間のインキュベーションの後、細胞は、免疫蛍光分析のためにメタノール固定され、ｍｙｃエピトープに対して指向される抗体（１：３０００希釈）を用いて、続いて抗ｍｙｃ抗体に対して指向される蛍光標識された抗体（１：１０００）とともにインキュベーションすることにより、ＰＲＫＸの発現が検出された。次いで、細胞は、顕微鏡のスライド上にマウントされ、蛍光顕微鏡の下で分析された。細胞の細胞質内でのＰＲＫＸの発現は、強い緑色の蛍光によって、左上及び真中の写真中で見ることができる。下のパネルでは、コントロールの細胞が同様に分析されており、緑色の蛍光を検出することはできない。上及び下の左及び右の写真における青色は、細胞の核を示し、ＤＡＰＩ（１：１０００）により可視化されている。
【０１０５】
図１７は、ニューロン内にヒトＰＲＫＸを発現したトランスジェニックマウスに対する標的化戦略を描写する。ターゲティングベクターは、トランスジーンをＲｏｓａ２６遺伝子座に組み入れるために、トランスジーン及びＲｏｓａ２６相同配列から構成される。短いホモロジーアーム（ＳＡ）は、約１．１ｋｂからなり、長いホモロジーアーム（ＬＡ）は、約４．３ｋｂからなる。Ｒｏｓａ２６遺伝子の３つのエキソンは、ローマ数字で示される。トランスジーンは、脳特異的Ｔｈｙ１．２遺伝子の調節配列を含むネズミＴｈｙ１．２発現カセットに位置する、ヒトＰＲＫＸのオープンリーデイングフレーム（ＯＲＦ  ＰＲＫＸ）から構成される。トランスジーンの５｀プライム、ネオマイシン耐性遺伝子（ＮＥＯ）及びスプライス受容体が位置し、内因性Ｒｏｓａ２６遺伝子由来のＲｏｓａプロモーターにより駆動されるＮｅｏ選択マーカーの発現を可能にする。Ｎｅｏマーカーの３｀プライム、ｐｏｌｙＡシグナル（ｐＡ）は転写を停止させる。
【実施例】
【０１０６】
（実施例１：ヒト脳組織検体中の示差的に発現されたアルツハイマー病関連遺伝子の同定及び確証）
ＡＤに関連した遺伝子の発現における具体的な差異を同定するために、臨床的にも神経病理学的にもよく特徴づけられた個体からのヒト脳組織標本に由来する多様なｃＲＮＡプローブを用いて、ＧｅｎｅＣｈｉｐマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）分析を行った。この技術は、多様な遺伝子の発現プロフィールを作製するため、及び種々の組織検体中に存在するｍＲＮＡの量（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）と比較するために広く用いられる。本発明では、選択された死後脳組織標本（前頭皮質及び下側側頭皮質）中に存在するｍＲＮＡの量の存在を分析した。組織検体は、種々のブラーク病期に分類され得る個体に由来し得、この種々のブラーク病期は、健康なコントロールの個体（ブラーク０）とＡＤの徴候及び症状で苦しむ個体（ブラーク４）との間の全範囲を反映した。個体遺伝子の示差的な発現の確証を、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲの適用によって行った。更に、免疫組織学的分析用の遺伝子産物特異的抗体を使用し、タンパク質レベルで、健康段階と疾患段階との間の特異的差異を分析した。この方法は、初期のブラーク病期（これは、疾患の初期課程で生じる病理学的事象を示す）での発現レベルの差を特別に検出することが企図された。従って、別個（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）のものと同定された該遺伝子は、事実上、ＡＤの病因に関係している。
【０１０７】
（i）ＡＤ患者の脳組織解剖：
ＡＤ患者及び同年齢のコントロールの被検体由来の脳組織を回収した。死後６時間以内に検体は直ちにドライアイスで凍結した。各組織の検体切片を、パラホルムアルデヒドで固定し、神経原線維病理の種々の段階で、Ｂｒａａｋ  ａｎｄ  Ｂｒａａｋに従って、神経病理学的にブラーク病期（０−４）に段階付けした。発現差異分析のための脳領域を同定し、ＲＮＡ抽出を行うまで、−８０℃で保存した。
【０１０８】
（ii）全ｍＲＮＡの単離：
全ＲＮＡを、製造者のプロトコールに従って、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用することによって、死後凍結脳組織より抽出した。正確なＲＮＡ濃度及びＲＮＡ品質を、２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いることにより、Ｅｕｋａｒｙｏｔｅ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｎａｎｏ  ＬａｂＣｈｉｐ  ｓｙｓｔｅｍの適用により決定した。調製したＲＮＡの追加的品質試験（すなわち、部分的分解物の除外）及びＤＮＡの混入の試験のために、特別に設計されたイントロンのＧＡＰＤＨオリゴヌクレオチド及びゲノムＤＮＡを、基準コントロールとして利用し、製造者により提供されたプロトコール中に記載されたようにして、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒテクノロジー（Ｒｏｃｈｅ）を用いて融解曲線を生み出した。
【０１０９】
（iii）プローブ合成：
ここで、上記（ii）で記載されたようにして抽出した全ＲＮＡを、出発物質として用いた。ｃＤＮＡの生産のために、製造者のプロトコール（Ｒｏｃｈｅ）に従って、ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍを行った。製造業者のプロトコールに従って試験管内転写Ｔ７−Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ−Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を利用して、ｃＤＮＡ検体を、ｃＲＮＡに転写し、そしてビオチンで標識した。ｃＲＮＡ品質を、２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ｍＲＮＡ  Ｓｍｅａｒ  Ｎａｎｏ  ＬａｂＣｈｉｐ  Ｓｙｓｔｅｍを利用し、決定した。正確なｃＲＮＡの濃度は、測光分析（ＯＤ２６０／２８０ｎｍ）により決定した。
【０１１０】
（iv）ＧｅｎｅＣｈｉｐハイブリダイゼーション：
市販のスパイクコントロール（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）ｂｉｏＢ（１．５ｐＭ）、ｂｉｏＣ（５ｐＭ）、ｂｉｏＤ（２５ｐＭ）及びｃｒｅ（１００ｐＭ）と共に、精製及び断片化したビオチン標識化ｃＲＮＡプローブを、各々ハイブリダイゼーション緩衝液（０．１ｍｇ／ｍｌ  Ｈｅｒｒｉｎｇ  Ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ，０．５ｍｇ／ｍｌ  Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ＢＳＡ，１×ＭＥＳ）中に６０ｎｇ／μｌの濃度で再懸濁し、その後５分間、９９℃で変性（ｄｅｎａｔｕｒｅ）させた。続いて、プローブを、一のプレハイブリダイズした（１×ＭＥＳ）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に各々適用した。アレイハイブリダイゼーションを、一晩、４５℃、６０ｒｐｍで行った。マイクロアレイの洗浄及び染色は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＣＯＳ）１．２（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）によって制御されたＥｕｋＧｅ＿ＷＳ２ｖ４（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）の取り扱い説明書に従った。
【０１１１】
（v）ＧｅｎｅＣｈｉｐデータ分析：
蛍光生データを、ＧＣＯＳ  １．２  ソフトウエア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）により制御されるＧｅｎｅＳｃａｎｎｅｒ  ３０００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して獲得した。データ分析は、ＤｅｃｉｓｉｏｎＳｉｔｅ  ８．０  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｓｐｏｔｆｉｒｅ）を用いることにより行った：生データを、ＧＣＯＳ  １．２  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）によって、「存在」しているとされたものに限定した；生データの標準化は、百分位数値で表した；ｍＲＮＡ発現差異プロフィールの検出を、Ｓｐｏｔｆｉｒｅソフトウェアのプロフィール探索ツールを用いて行った。ＰＲＫＸタンパク質をコードした遺伝子に対するこのようなＧｅｎｅＣｈｉｐデータ分析の結果を、図１に示す。
【０１１２】
（vi）定量的ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現差異の確証：
ＰＲＫＸ遺伝子発現差異の肯定的確証を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒテクノロジー（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行った。この技術は、増幅の間のポリメラーゼ連鎖反応についての高速熱サイクル及び蛍光シグナルのリアルタイム測定に特徴を有し、それ故、一端読み取りよりもむしろ動的読み取りを用いることにより、ＲＴ−ＰＣＲ産物の高度に正確な定量を可能としている。ＡＤ患者及び同年齢のコントロールの個体各々の前頭皮質及び下側側頭皮質由来のＰＲＫＸ  ｃＤＮＡの相対量を、最大９組織まで、ブラーク病期ごとに４つの数において各々決定した。
【０１１３】
先ず、ＰＲＫＸをコードする遺伝子に対する特異的プライマーを用い、ＰＣＲの効率を決定するために検量線を作成した。
【０１１４】
プライマーＡ、配列番号７，５’−ＴＧＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＴＣ−３’（配列番号３のヌクレオチド１８６５−１８８７）及びプライマーＢ、配列番号８，３’−ＧＧＧＡＡＧＡＴＡＴＧＧＧＡＧＣＧＡＡＴＴ−５’（配列番号３のヌクレオチド１９３９−１９５９）。
【０１１５】
ＰＣＲ増幅（９５℃及び１秒、５６℃及び５秒、並びに７２℃及び５秒）を、２０μｌの容積（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  ｍｉｘ（ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ，反応溶液，ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを混和させたｄＮＴＰ，ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉダイ及び１ｍＭ  ＭｇＣｌ２；Ｒｏｃｈｅ），０．５μＭプライマー，２μｌのｃＤＮＡ段階希釈物（最終濃度４０，２０，１０，５，１及び０．５ｎｇヒト全脳ｃＤＮＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）並びにさらに３ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する）で行った。融解曲線分析により、約７９．５℃で、目に見えるプライマーダイマーのない、単一ピークを示した。ｑＰＣＲ産物の質及び大きさを、２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたＤＮＡ  ５００  ＬａｂＣｈｉｐシステムを適用し、決定した。ＰＲＫＸタンパク質をコードした遺伝子に予想される９５ｂｐの大きさにおける単一ピークを、検体の電気泳動図において観察した。
【０１１６】
３ｍＭのＭｇＣｌ２の代わりに、ＭｇＣｌ２をさらに１ｍＭ加えた点以外は同様の様式で、シクロフィリンＢ（ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ  Ｂ）のＰＣＲ効果を決定するために、特異的プライマー配列番号９，５’−ＡＣＴＧＡＡＧＣＡＣＴＡＣＧＧＧＣＣＴＧ−３’及び配列番号１０，５’−ＡＧＣＣＧＴＴＧＧＴＧＴＣＴＴＴＧＣＣ−３’を用いて、ｑＰＣＲプロトコールを適用した。融解曲線分析により、約８７℃で、単一ピークを示し、プライマーダイマーが目に見えなかった。ＰＣＲ産物のバイオアナライザー分析は、予期された大きさ（６２ｂｐ）の一のピークを示した。
まず、標準値の計算のために、用いたｃＤＮＡ濃度の対数を、それぞれＰＲＫＸ及びシクロフィリンＢ（Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ  Ｂ）の閾周期値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ  ｖａｌｕｅ）Ｃｔに対してプロットした。検量線（すなわち、直線回帰）の傾き及び切片を計算した。第２段階において、コントロール及びＡＤ患者の前頭皮質及び下側側頭皮質由来のｍＲＮＡ発現を、並行して分析した。Ｃｔ値は、対応する検量線：
１０＾（Ｃｔ値−切片）／傾き［ｎｇ全脳ｃＤＮＡ］
を用いて測定し、そしてｎｇ全脳ｃＤＮＡに変換した。計算したｃＤＮＡ濃度値を、試験した各組織プローブについて並行して分析されたシクロフィリンＢに対して標準化し、そして得られた値を、任意相対的発現レベルとして定義した。ＰＲＫＸタンパク質をコードする遺伝子に対する、このような定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を図２に示す。
【０１１７】
（vii）種々のブラーク病期に分類された組織検体を比較したｍＲＮＡ発現の差異の統計的分析
この分析において、種々の時点での種々の実験間の、リアルタイム定量的ＰＣＲ（Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ法）の絶対値は、キャリブレーターを使用しなくても、定量的な比較に使用するのに十分一貫していることが証明された。シクロフィリンは、１００組織より多くのｑＰＣＲ実験のいずれかで、標準化の基準として使用した。標準化実験において、とりわけ、シクロフィリンが最も一貫して発現したハウスキーピング遺伝子であることが見出された。それ故、シクロフィリンに対して得られた値を用いることにより、概念の証明がなされた。
【０１１８】
第一の分析は、３人の異なるドナーの前頭皮質及び下側側頭皮質の組織のｑＰＣＲ実験からのシクロフィリン値を用いた。全分析実験において、各組織から同一のｃＤＮＡ調製物を使用した。この分析においては、データの小さな数のために、正規分布が達成されなかった。それ故、中央値及びその９８％信頼度レベルの方法を適用した（Ｓａｃｈｓ  Ｌ（１９８８）  Ｓｔａｔｉｓｔｉｓｃｈｅ  Ｍｅｔｈｏｄｅｎ：Ｐｌａｎｕｎｇ  ｕｎｄ  Ａｕｓｗｅｒｔｕｎｇ．Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．６０）。この分析は、絶対値の比較に関して中央値から８．７％の中間偏差（ｍｉｄｄｌｅ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）、及び相対的比較に関して中央値から６．６％の中間偏差を示した。
【０１１９】
第二の分析は、２人の異なる各ドナーの前頭皮質及び下側側頭皮質におけるｑＰＣＲ実験からのシクロフィリン値を用いたが、種々の時点からの種々のｃＤＮＡ調製物を用いた。この分析は、絶対値の比較に関して中央値から２９．２％の中間偏差、及び相対的比較に関して中央値から１７．６％の中間偏差を示した。この分析から、ｑＰＣＲ実験からの絶対値が使用され得るが、中央値から得られた中間偏差が、更に考慮されるべきであると結論した。
【０１２０】
ＰＲＫＸの絶対値の詳細な分析を、中央値及びその９８％信頼度レベルの方法を用いて行った。平均値とは対照的に、中央値の計算は、単一の域外値に影響されない；それ故、後者は、異常に及び／又は非対称に分布する少数のデータの選択の方法である（Ｓａｃｈｓ  Ｌ  （１９８８）  Ｓｔａｔｉｓｔｉｓｃｈｅ  Ｍｅｔｈｏｄｅｎ：Ｐｌａｎｕｎｇ  ｕｎｄ  Ａｕｓｗｅｒｔｕｎｇ．Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．６０）。それ故、ＰＲＫＸの絶対的レベルは、シクロフィリンとの相対的標準化の後に使用した。中央値及び９８％信頼度レベルを、低レベルブラーク病期（ブラーク０乃至ブラーク２）から構成されるグループ及び高レベルブラーク病期（ブラーク３乃至ブラーク４）から構成されるグループに対し、計算した。この分析は、ＡＤ病理の過程内の、ｍＲＮＡの発現差の初期の開始を同定することを目的とした。上に記載の分析を、図３に示す。
【０１２１】
（viii）免疫組織化学的分析を適用した、タンパク質レベルでのＰＲＫＸ遺伝子の発現差異とＡＤとの関連性の確証
ヒト脳内ＰＲＫＸの免疫蛍光染色のために、及びＡＤの影響を受けた組織とコントロール組織との比較のために、患者を含むドナーであって、Ｂｒａａｋ  ａｎｄ  Ｂｒａａｋに従って神経原線維病理学の種々の段階（本明細書を通して、簡潔に「ブラーク病期」と呼ばれる）で臨床的にＡＤと診断されかつ神経病理学的にＡＤと確証されたドナー及び臨床的にも神経病理学的にもＡＤの徴候のない同年齢の非ＡＤコントロールの個体に由来する死後新鮮凍結前頭前脳標本及び死後新鮮凍結側頭前脳標本を、クリオスタット（Ｌｅｉｃａ  ＣＭ３０５０Ｓ）を用いて、薄さ１４μｍに切った。この組織切片を、室温で空気乾燥し、１０分間アセトンで固定し、そして再度空気乾燥した。ＰＢＳで洗浄後、切片をブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中、１０％正常ウマ血清、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で３０分間、プレインキュベートし、そして次いで、ブロッキング緩衝液中の親和性精製抗ＰＲＫＸウサギポリクロナール抗体（Ａｂｇｅｎｔ／ＢｉｏＣａｔ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（１：２０希釈）で、一晩４℃にてインキュベートした。０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＰＢＳで３回リンスした後、切片を、１％  ＢＳＡ／ＰＢＳ中Ｆｌｕｏｒ−４８８−結合ヤギ抗ラビットＩｇＧ抗血清（Ｊａｃｋｓｏｎ／Ｄｉａｎｏｖａ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（１：１５００希釈）で２時間室温でインキュベートし、そして次いで再度ＰＢＳで洗浄した。（i）神経体細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｓｏｍａｔａ）又は（ii）アストロサイト又は（iii）ミクログリアのいずれかの同時染色は、それぞれ（i）ニューロン特異的ソマティックマーカータンパク質ＮｅｕＮ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ；３５０倍希釈）又は（ii）アストロサイト特異的マーカータンパク質のグリア酸性原線維タンパク質（ＧＦＡＰ，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ；２５０倍希釈）又は（iii）ミクログリア特異的マーカーＣＤ６８（Ｄａｋｏ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ；１００倍希釈）のいずれかに対する更なるマウスモノクロナール抗体を用いて上記のようにし、いずれの場合でも、続いて、各場合においてＣｙ３接合ヤギ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ／Ｄｉａｎｏｖａ；８００倍希釈）を用いて、行った。核の染色は、ＰＢＳ中５μＭ  ＤＡＰＩに３分間切片をインキュベーションすることにより行った。リポフスチンの自己蛍光を防止するために、切片は、７０％エタノール中、脂溶性黒染料Ｓｕｄａｎ  Ｂｌａｃｋ  Ｂ（１％ｗ／ｖ）で５分間室温で処理し、そして順次、７０％エタノール、蒸留水、そしてＰＢＳ中に連続的に浸した。切片は、ＰｒｏＬｏｎｇ−Ｇｏｌｄアンチフェードマウント媒体（ａｎｔｉｆａｄｅ  ｍｏｕｎｔ  ｍｅｄｉｕｍ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と共にカバースリップした。顕微鏡写真は、水銀灯直立顕微鏡（ＢＸ５１，Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、落射蛍光又は位相差照明条件を用いて得た。適当なジクロムフィルター及び鏡組み合わせ（本明細書中でこれ以降、「チャンネル」と呼ぶ）を、いずれかの蛍光色素（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４��８，Ｃｙ３，ＤＡＰＩ）の特異的な励起のために、及び該抗体又は核ＤＡＰＩ染色による特異的標識により生じる放出された蛍光の読み出しのために用いた。顕微鏡写真は、電荷結合ディスプレイカメラ（ｃｈａｒｇｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｃａｍｅｒａ）、及び適当な写真獲得（ｉｍａｇｅ  ａｃｑｕｉｓｉｔｏｎ）、及び処理ソフト（ＣｏｌｏｒＶｉｅｗ−II及びＡｎａｌｙＳＩＳ，Ｓｏｆｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によってデジタル方式で撮った。異なったチャンネルから得られた蛍光顕微鏡写真を、上記特異的免疫標識、及び核（ＤＡＰＩ）の、ＧＲＢモードでの同時観察を生み出すために（例えば、最大３つの異なるチャンネルからのシグナルの共局在を分析するために）重ね合わせた。
【０１２２】
（実施例２：トランスジェニックキイロショウジョウバエ、細胞培養系、そしてトランスジェニックマウスモデルを用いたＡＤにおけるＰＲＫＸの機能の分析）
【０１２３】
ヒトＢＡＣＥトランスジェニックハエ、及びヒトＴａｕＰ３０１Ｌトランスジェニックハエを、Ｇｒｅｅｖｅ等（Ｇｒｅｅｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００４，２４：３８９９−３９０６）に従って、また本発明で記載したようにして生み出した。ヒト微小管結合タンパク質タウアイソフォームＮＰ＿００５９０１．２（ＲｅｆＳｅｑペプチドＩＤ）の全オープンリーディングフレームを含んだ１．４ｋｂＥｃｏＲＩ制限断片を、ＧＡＬ４結合部位ＵＡＳ（Ｂｒａｎｄ及びＰｅｒｒｉｍｏｎ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １９９３，１１８：４０１−１５）のｐＵＡＳＴ下流のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした。ＣをＴにする変異（ｃＣ／Ｔｇｇｇａｇｇｃｇ）を、アミノ酸部位３０１においてプロリン（ＣＣＧ）をロイシン（ＣＴＧ）に変化させるために導入した（ＴａｕＰ３０１Ｌ，ｃＤＮＡを、Ｊuｒｇｅｎ  Ｇｏｅｔｚ，Ｇoｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００１；２４  Ｖｏｌ．２９３．ｎｏ．５５３４，ｐｐ．１４９１−１４９５によって親切にも提供された）。Ｐエレメント媒介性生殖細胞系列形質転換を、Ｓｐｒａｄｌｉｎｇ  と  Ｒｕｂｉｎの記載のようにして（Ｒｕｂｉｎ及びＳｐｒａｄｌｉｎｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８２，２１８：３４８−５３；Ｓｐｒａｄｌｉｎｇ及びＲｕｂｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８２，２１８：３４１−７）行った。独立した３つのヒトＴａｕＰ３０１Ｌトランスジェニックハエ系を、全長タウタンパク質の発現のために、生み出し、そして試験した。
【０１２４】
ヒトＡＰＰ及びショウジョウバエプレセニリンランスジェニックハエ、ＵＡＳ−ＡＰＰ６９５II及びＵＡＳ−ＤＰｓｎ−変異体（Ｌ２３５Ｐ）は、親切にもＲ．Ｐａｒｏ及びＥ．Ｆｏｒｔｉｎｉにより提供された（Ｆｏｓｓｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９８，９５：１３７０３−８；Ｙｅ及びＦｏｒｔｉｎｉ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９９９，１４６：１３５１−６４）。ショジョウバエの内因性ｐｋａ−Ｃ３遺伝子（ヒトＰＲＫＸ遺伝子のホモログ）の発現に影響を与える２つのショウジョウバエランスジェニックＰエレメント系は、Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（＃１９８３２；ｙ１  ｗ６７ｃ２３；Ｐ｛ＥＰｇｙ２｝Ｐｋａ−Ｃ３ＥＹ０３０６５及び＃１５５８１；ｙ１  ｗ６７ｃ２３；Ｐ｛ＥＰｇｙ２｝Ｐｋａ−Ｃ３ＥＹ０２６８７）から入手した。Ｆ．Ｐｉｇｎｏｎｉから入手したｇｍｒ−ＧＡＬ４駆動（ｄｒｉｖｅｒ）系は、トランス遺伝子の眼特異的発現を達成するために用いた。
【０１２５】
（i）トランスジェニックハエの遺伝学：
遺伝的交雑を、２５℃で標準的なショウジョウバエ培養培地で引き起こした。用いた遺伝子型は、ｗ；ＵＡＳ−ｈＡＰＰ６９５，ＵＡＳ−ｈＢＡＣＥ４３７／ＣｙＯ；ｇｍｒ−ＧＡＬ４／Ｔｍ３−ｗ；ＵＡＳ−ｈＡＰＰ６９５，ＵＡＳ−ｈＢＡＣＥ４３７／ＣｙＯ；  ｇｍｒ−ＧＡＬ４，ＵＡＳ−ＤＰｓｎＬ２３５Ｐ／Ｔｍ３−ｗ；ｇｍｒ−ＧＡＬ４，ＵＡＳ−ＴａｕＰ３１０Ｌ−ｙ１  ｗ６７ｃ２３；Ｐ｛ＥＰｇｙ２｝Ｐｋａ−Ｃ３ＥＹ０２６８７及び．ｙ１ｗ６７ｃ２３；  Ｐ｛ＥＰｇｙ２｝Ｐｋａ−Ｃ３ＥＹ０３０６５（インディアナ大学でＢｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒより入手した）であった。
【０１２６】
（ii）トランスジェニックハエの免疫組織化学：
免疫組織化学及び組織学的分析のために、成虫のハエを４％パラホルムアルデヒドにて３時間固定し、ＰＢＳで１回洗浄し、そして２５％スクロースに移し、４℃で一晩インキュベーションした。ハエは、カミソリで断頭し、頭部をＴｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ（Ｓａｋｕｒａ）に埋め込み、液体窒素にて即凍結させた。１０μｍの水平凍結切片は、クリオスタット（Ｌｅｉｃａ  ＣＭ３０５０Ｓ）を用いて調製した。免疫染色を、製造業者の取り扱い説明書に従って、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて行った。以下の一次抗体を用いて、成虫網膜細胞の光受容体細胞を染色した：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋによって提供された２４Ｂ１０（ａｌｐｈａ−  ｃｈａｏｐｔｉｎ，１：５）。
チオフラビンＳ染色のために、１０μｍパラフィンを埋め込んだ切片を、Ｍａｙｅｒｓ  Ｈｅｍａｌｕｍ（Ｓｉｇｍａ）で５分間対比染色し、水道水で１０分間リンスし、１％チオフラビンＳ（Ｓｉｇｍａ）水溶液中で３分間染色した。スライドは、蒸留水で数回リンスし、１％酢酸中で１５分間インキュベートし、水道水でリンスし、そしてＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄマウント媒体（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にマウントした。スライドを、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１蛍光顕微鏡（４３０ｎｍ  励起、５５０ｎｍ  発光）にて分析した。斑は手で数え、統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ３．０２を用いることにより行った。
【０１２７】
（iii）ＰＫＡ−Ｃ３トランスジェニックハエにおけるＡｂｅｔａ測定：
Ａｂｅｔａの免疫沈降のために、ハエ頭部を、１×ＰＢＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、及び１×プロテアーゼ阻害剤の混和Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）中で、ホモジナイズした。溶解物は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈからの抗体プロトコールガイドにおいて記載されているようにして、抗体で処理した。抗体ｍａｂ６Ｅ１０抗体（抗Ａｂｅｔａ１−１６，Ｓｉｇｎｅｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、免疫沈降のために使用した。検体を、１０−２０％勾配Ｎｏｖｅｘ  Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分離し、そしてＰｒｏｔｒａｎ  ＢＡ  ７９  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅナイトレート膜（０．１μｍ，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ／Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｄａｓｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上にブロットした。βアミロイドの検出は、ｍａｂ  ６Ｅ１０及びヤギ抗マウスペルオキシダーゼ接合二次抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）を用い、記されているようにして行った（Ｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９６，２７１：２２９０８−１４）。
【０１２８】
（iv）ＰＫＡ−Ｃ３トランスジェニックハエの発現分析：
トランスジェニックショウジョウバエにおけるショウジョウバエｐｋａ−Ｃ３の発現を検出するために、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）反応を、本発明で記載のようにして（例１（vi））、ｐｋａ−Ｃ３特異的プライマー（５’−ＡＧＡＧＧＣＡＴＣＧＣＴＧＧＴＴＣＡＡＧ，３’−ＧＴＡＣＡＴＣＧＧＧＣＡＡＡＡＴＴＧＧＴＧ）を用いて行った。
【０１２９】
（v）ｐＳ２１４特異的ＥＬＩＳＡ：
１０個のハエ頭部を、ホスファターゼ阻害剤を含有する５０μｌの細胞可溶化緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４；１００ｍＭ  ＮａＣｌ；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；１ｍＭ  ＥＧＴＡ；１ｍＭ  ＮａＦ；２０ｍＭ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７；２ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４；１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；１０％グリセロール；０．１％  ＳＤＳ；０．５％  デオキシコレート，１０μＭオカダ酸）中でホモジナイズした。溶解物を、１３０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を１００倍希釈で使用し、製造業者のプロトコールに従って、ヒト  タウ  ［ｐＳ２１４］免疫アッセイキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を用いることでＴａｕＰ３０１ＬのＳ２１４でのリン酸化を決定した。リン酸化されたＳ２１４の量を、ヒトタウ［全］イムノアッセイキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を用いることにより、ＴａｕＰ３０１Ｌの全量に対して、標準化した。同一のライセートを、８０００倍希釈で用いた。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ３．０２を、統計的分析のために用いた。
【０１３０】
（vi）ＰＲＫＸを誘導的に発現する細胞系の産生：
Ｓｗｅｄｉｓｈ変異アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を発現するＨ４−神経膠腫細胞系に、ｐｃＤＮＡ６／ＴＲ−ベクター（これは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃Ｋ１０２０−０１より購入した）上にコード化されるｔｅｔ受容体をトランスフェクトし、抗生物質ブラストサイジンの添加後、クローン細胞を単離した。次いで、得られた細胞系を用いて、細胞内のｔｅｔ−オペレーター配列の制御の下でＰＲＫＸを導入した。ＰＲＫＸの発現は、製造業者の取り扱い説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ｋ１０２０−０１）に従い、１μｇ／ｍｌテトラサイクリンの添加により、誘導され得る。
【０１３１】
（vii）ＰＲＫＸを発現したトランスジェニックマウスの産生：
特異的にヒトＰＲＫＸのｃＤＮＡを神経細胞内で発現させるために、ＰＲＫＸトランスジェニックマウスを産生した。この目的のために、神経特異的発現を導き、そして次いで脳細胞内にのみ発現を引き起こさせるため（Ｌｕｔｈｉ及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １９９７，１７：４６８８−４６９９）、脳特異的Ｔｈｙ１調節配列（Ｔｈｙ１．２プロモーター＋調節エレメント）を含むマウスのＴｈｙ１．２  発現カセットの中に、ヒトＰＲＫＸのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ  ＰＲＫＸ）ｃＤＮＡをクローン化した。トランスジーンを、Ｒｏｓａ２６遺伝子座中に配列を集約するために、Ｒｏｓａ２６ターゲティングベクターの中にクローン化した（染色体６上のマウスＲｏｓａ  ｂｅｔａ  ｇｅｏ  ２６遺伝子；Ｊ：３９８１４，Ｓｅｉｂｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００３，３１：ｅ１２）。トランスジーンの５｀プライム、Ｎｅｏ選択マーカーを置いた（図２０を参照のこと）。Ｎｅｏカセットは、内因性Ｒｏｓａ２６遺伝子由来のＲｏｓａプロモーターによって駆動されるＮｅｏ選択マーカーの発現を可能にするスプライス受容体を含む（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ及びＳｏｒｉａｎｏ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１９９１，５：１５１３−１５２３；Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９４：３７８９−３７９４）。ＮｅｏマーカーのｐｏｌｙＡシグナル（ｐＡ）の３｀プライムは、転写及びＲｏｓａプロモーターの影響を停止させる。ターゲティングベクターは、Ｒｏｓａ２６遺伝子座中において相同組換えをもたらすゲノム１２９Ｓ６ＤＮＡに由来するＲｏｓａ２６相同配列を含む。短いホモロジーアーム（ＳＡ）は、約１．１ｋｂからなり、長いホモロジーアーム（ＬＡ）は、約４．３ｋｂからなる。
ターゲティングベクターをクローン化し、そしてさらにＣ５７ＢＩ／６Ｎマウス胚幹細胞（ＥＳ）にトランスフェクトした（Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４並びにＪａｃｋｓｏｎ及びＡｂｂｏｔｔ，Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９９９）。相同組換えの後、標的化したＥＳ細胞クローンを、サザンブロット分析により同定し、標準的な技術を用いてキメラマウスを生み出すために胚盤胞へ注入した（Ｔｙｍｍｓ及びＫｏｌａ，Ｇｅｎｅ  Ｋｎｏｃｋ  Ｏｕｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１）。生み出したキメラマウスの生殖細胞系列の伝達が成功した後、この動物を、トランスジェニックＡＤマウスモデルと交雑し、ＡＤバックグラウンドでトランスジェニックＰＲＫＸマウスを生み出した。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】図１は、ヒト脳組織検体中のＰＲＫＸ遺伝子由来ｍＲＮＡのレベルの差異を同定したものであって、上記ヒト脳組織検体が、種々のＢｒａａｋ期に該当する個人に由来するもの、を開示する。Ｂｒａａｋ  ａｎｄ  Ｂｒａａｋ（ブラーク病期）に従った脳組織検体の神経病理学的な病期分類により測定した場合、これは、各々のｍＲＮＡ種のレベルがＡＤの進行と量的に相関し、従ってＡＤの指標であることを示唆する。
【図２】図２は、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により測定した場合の、ヒト脳組織検体中のＰＲＫＸ遺伝子由来のｍＲＮＡのレベルの差異を証明するためのデータを列挙するものであって、上記ヒト組織検体は、ＡＤの指標である種々のブラーク病期に該当する。
【図３】図３は、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析及び９８％信頼度レベルでの中央値の統計的方法の使用により測定された場合の、ＡＤの指標である種々のブラーク病期に従った個体由来のヒト脳組織検体中のＰＲＫＸ遺伝子由来ｍＲＮＡの絶対的レベルの分析を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、配列番号１、ヒトＰＲＫＸタンパク質のアミノ酸配列を開示する。
【図４Ｂ】図４Ｂは、配列番号２、ヒトＰＲＫＹタンパク質のアミノ酸配列を開示する。
【図５Ａ】図５Ａは、配列番号３、ヒトＰＲＫＸｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、配列番号４、ヒトＰＲＫＹｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、配列番号５、ヒトＰＲＫＸ遺伝子のコード配列（ｃｄｓ）を描写する。
【図６Ｂ】図６Ｂは、配列番号６、ヒトＰＲＫＹ遺伝子のコード配列（ｃｄｓ）を描写する。
【図７】図７は、ＰＲＫＸ遺伝子由来ｍＲＮＡのレベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、対応するＰＲＫＸ  ｃＤＮＡの断片（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）を用いて測定するために使用されたプライマーの配列アライメントを描写する。
【図８】図８は、ＰＲＫＸの、ｃＤＮＡ配列、コード配列及びＰＲＫＸ転写レベルプロファイリングに使用された両プライマーの配列アライメントを模式的に図表化したものである。
【図９】図９は、ＡＤ患者（ブラーク病期４）由来のヒト脳検体中でのＰＲＫＸタンパク質と皮質βアミロイド斑との共沈を例証する。対照的に、ＡＤの徴候及び症状に苦しんでいると診断されていない、同年齢のコントロール（ブラーク病期０）由来の脳検体中には、このようなＰＲＫＸタンパク質の沈殿は観察されない。
【図１０】図１０は、ＡＤ患者（ブラーク病期４）の皮質中の反応性アストロサイトが、ＰＲＫＸタンパク質を高レベルで含有することを例証する。対照的に、ＡＤの徴候及び症状に苦しんでいるとは診断されていない、同年齢のコントロール（ブラーク病期０）の皮質中のアストロサイト内には、低レベルのＰＲＫＸタンパク質しか見出すことが出来ない。
【図１１】図１１は、ＡＤ患者（Ｂｒａａｋ４）由来の脳組織検体において、ＰＲＫＸタンパク質が重度に蓄積され、そして斑結合活性化小神経膠細胞（ｐｌａａｑｕｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）内でＣＤ６８タンパク質と共局在していることを例証する。対照的に、ＡＤの徴候及び症状に苦しんでいるとは診断されていない、同年齢のコントロール（Ｂｒａａｋ  １）由来の脳組織検体中には、このようなＰＲＫＸタンパク質の蓄積は検知されない。
【図１２】図１２は、２つの異なるｐｋａ−Ｃ３トランスジェニックハエ系統におけるショウジョウバエｐｋａ−Ｃ３（ヒトＰＲＫＸ遺伝子のオルソログ）のｍＲＮＡの発現の検出を示す。
【図１３】図１３は、ハエ網膜の直径により判断する場合、ショウジョウバエＰＲＫＸオルソログｐｋａ−Ｃ３の過剰発現により、トランスジェニックハエにおけるＴａｕＰ３０１Ｌ誘導型光受容体の変性が加速されることを示す。
【図１４】図１４は、ＴａｕＰ３０１Ｌ及びｐｋａ−Ｃ３が共発現したハエにおいて、ショウジョウバエのＰＲＫＸオルソログｐｋａ−Ｃ３がＴａｕＰ３０１Ｌのセリン２１４のリン酸化に関与することを示している。ｐｋａ−Ｃ３（０２６８７）の部分的な機能欠損は、野生型のｐｋａ−Ｃ３（０３０６５）トランスジーンを共発現しているハエと比べて、セリン２１４におけるＴａｕＰ３０１Ｌのリン酸化を減少させる。
【図１５】図１５は、Ｓｗｅｄｉｓｈ変異ＡＰＰを安定に共発現するＨ４−神経膠腫（ｎｅｕｒｏｇｌｉｏｍａ）内で誘導性のＰＲＫＸタンパク質産物のウエスタンブロット分析を示す。
【図１６】図１６は、Ｓｗｅｄｉｓｈ変異ＡＰＰを安定に共発現するＨ４−神経膠腫内で誘導性のＰＲＫＸタンパク質産物の免疫蛍光分析を示す。
【図１７】図１７は、ニューロン内でヒトＰＲＫＸ遺伝子を発現しているトランスジェニックマウスに対する標的戦略を描写する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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