(57)【要約】  反応混合物に熱安定ヘリカーゼを含み逆転写およびＤＮＡ合成によってＲＮＡ分子を同定するための組成物および方法。
2008526231.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）逆転写（ＲＴ）によってＲＮＡ分子からｃＤＮＡを合成してＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を形成する段階、
（ｂ）熱安定ヘリカーゼを使用して二本鎖を少なくとも部分的にｃＤＮＡとＲＮＡとに分離する段階、
（ｃ）ｃＤＮＡを増幅する段階、および
（ｄ）ＲＮＡ分子のアイデンテティ決定のためにｃＤＮＡを特性決定する段階、
を含むＲＮＡ分子の同定方法。
【請求項２】
段階（ａ）のＲＴが逆転写酵素またはＲＴ活性をもつＤＮＡポリメラーゼによって行われる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階（ｃ）がさらに、ヘリカーゼ依存性増幅、ループ介在等温増幅、ローリングサイクル増幅、鎖置換増幅またはポリメラーゼ連鎖反応によるｃＤＮＡの増幅を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ｃＤＮＡが段階（ｂ）で得られたＲＮＡから段階（ａ）に従って合成される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
段階（ａ）、段階（ｂ）および段階（ｃ）が別々のバッファまたは反応混合物中で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項６】
段階（ａ）および段階（ｂ）または段階（ｂ）および段階（ｃ）が一つのバッファ中で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項７】
段階（ａ）、段階（ｂ）および段階（ｃ）が一つのバッファ中で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項８】
熱安定ヘリカーゼが一本鎖結合タンパク質の非存在下で有効活性を有している請求項１に記載の方法。
【請求項９】
段階（ｂ）がさらに、一本鎖結合タンパク質を本質的に含まない反応混合物中の熱安定ヘリカーゼの使用を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）増幅すべきターゲット核酸の一本鎖鋳型を準備する段階と、
（ｂ）段階（ａ）の鋳型にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを加える段階と、
（ｃ）鋳型に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物をＤＮＡポリメラーゼによって合成して二本鎖を形成する段階と、
（ｄ）一本鎖結合タンパク質を本質的に含まない反応混合物中で段階（ｃ）の二本鎖を熱安定ヘリカーゼに接触させて二本鎖を巻戻す段階、を含み、ならびに
（ｅ）ターゲット核酸を指数的および選択的に増幅するために段階（ｂ）−（ｄ）を繰り返す、ターゲット核酸の指数的および選択的増幅方法。
【請求項１１】
熱安定ヘリカーゼ、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼならびにマグネシウム塩、ナトリウム塩、ｄＮＴＰおよびｄＡＴＰから成るグループから選択された少なくとも３種類の試薬を含有するバッファを含み、一本鎖結合タンパク質を利用しない反応でＤＮＡを増幅するための使用説明書を含むキット。
【請求項１２】
バッファのｐＨがｐＨ８からｐＨ１０の範囲である請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
ポリメラーゼがＢｓｔポリメラーゼである請求項１１に記載のキット。
【請求項１４】
熱安定ヘリカーゼがＴｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼである請求項１１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
増幅方法を使用するＲＮＡターゲットの同定は、ＲＮＡウイルスのようなＲＮＡ主体の病原体の診断；癌遺伝子の調節異常のような遺伝子発現レベルのモニタリングなどの用途で望ましい手法である。発現遺伝子のｍＲＮＡ転写物のコピー数は一般に遺伝子自体よりも多いので、ＲＮＡターゲットの増幅は遺伝子診断の感度を大きく増進させる。これによって、いくつかの増幅反応で適正感度が得られないという理由で生じていた問題が解消する。ＲＮＡ増幅技術は例えば、米国特許５，３２２，７７０、５，６２４，８３３および６，７９４，１７７に記載されている。これらの方法では一般に逆転写酵素および増幅の順次段階が必要である。ＲＴ−ＰＣＲはＲＮＡターゲットの検出については極めて高感度であるが、フォーマットがＰＣＲ反応自体に類似しており、その実施には高価なサーモサイクラー装置が必要である（例えば、米国特許６，７９４，１７７参照）。
【０００２】
また、逆転写（ＲＴ）と等温増幅プラットフォームとを組合せて温度サイクル処理を使用せずに一段階でＲＮＡターゲットの増幅を行うこともできる。一例は、逆転写−鎖置換増幅（ＲＴ−ＳＤＡ）であり、この場合にはＲＮＡターゲットを増幅するために逆転写酵素およびＳＤＡプラットフォームを１つの等温段階で使用する（米国特許５，９１６，７７９）。しかしながら、ＲＴ−ＳＤＡもＳＤＡと同様に、すぐれた性能効率を得るためには修飾核酸と２対以上のプライマーとを必要とする。
【発明の開示】
【０００３】
本発明の１つの実施態様は、（ａ）ＲＴによってＲＮＡ分子からｃＤＮＡを合成してＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を形成する段階と、（ｂ）熱安定ヘリカーゼを使用して二本鎖を少なくとも部分的にｃＤＮＡとＲＮＡとに分離する段階と、（ｃ）ｃＤＮＡを増幅する段階と、（ｄ）ＲＮＡ分子のアイデンテティ決定のためにｃＤＮＡを特性決定する段階と、を含むＲＮＡ分子の同定方法を含む。該方法の特定実施例では、ＲＴが逆転写酵素またはＲＴ活性をもつＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる。付加的または代替的に、ｃＤＮＡの増幅は、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ループ介在等温増幅、ローリングサイクル増幅、鎖置換増幅（ＳＤＡ）およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行うことができる。
【０００４】
本発明の１つの実施態様では、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＲＮＡをＲＴおよび増幅のために反復サイクルで再使用できる。全方法を単一反応容器を使用し単一バッファ中で行ってもよく、あるいは、いくつかまたは全部の段階を別々のバッファ中で行ってもよい。例えば、段階（ａ）および（ｂ）を単一バッファまたは異なるバッファ中で行うことができ、これらのバッファが段階（ｂ）および（ｃ）に使用した単一または複数のバッファと異なるものでもよい。
【０００５】
方法の１つの実施態様では、米国特許出願２００４−００５８３７８に記載されているような一本鎖結合タンパク質を上記の段階（ｂ）または（ｃ）に添加しない。従って方法には、一本鎖結合タンパク質を本質的に含まない反応混合物中で熱安定ヘリカーゼが使用される。熱安定ヘリカーゼは一本鎖結合タンパク質の非存在下で有効活性を有している。
【０００６】
方法の１つの実施態様では、ターゲット核酸の指数的および選択的増幅方法が提供される。方法は、（ａ）増幅すべきターゲット核酸の一本鎖鋳型を準備する段階と、（ｂ）段階（ａ）の鋳型にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを加える段階と、（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて鋳型に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物を合成して二本鎖を形成する段階と、（ｄ）段階（ｃ）の二本鎖を熱安定ヘリカーゼに接触させて二本鎖を巻戻す段階とを含み、（ｅ）ターゲット核酸を指数的および選択的に増幅するために段階（ｂ）−（ｄ）を繰り返す。方法の１つの実施例では熱安定ヘリカーゼが一本鎖結合タンパク質の非存在下で使用される。
【０００７】
方法の１つの実施態様では、熱安定ヘリカーゼと、逆転写酵素と、ＤＮＡポリメラーゼと、マグネシウム塩、ナトリウム塩、ｄＮＴＰおよびｄＡＴＰから成るグループから選択された少なくとも３種類の試薬を含有するバッファとを含むキットが提供される。該キットは、一本鎖結合タンパク質を含まない反応物中でＤＮＡを増幅するための使用説明書を含む。バッファは例えばｐＨ８−ｐＨ１０の範囲のｐＨを有している。キットの別の例では、ポリメラーゼがＢｓｔポリメラーゼであり、および／または、熱安定ヘリカーゼがＴｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼであろう。
【０００８】
本発明の実施態様では、ヘリカーゼによるＲＮＡの逆転写と得られたｃＤＮＡの順次的または同時的増幅段階とを単一反応容器または複数の反応容器で組合せる。増幅段階にはＨＤＡを選択しているが、代替的にポリメラーゼ連鎖反応、ループ介在等温増幅またはローリングサイクル増幅でもよい。ＲＴ−ＨＤＡは約２０℃−７５℃の範囲の温度、例えば６０℃−６５℃の範囲の温度で等温的に行うとよい。本発明の１つの実施態様では、ＲＮＡを検出または定量するために、増幅プロトコルでＰＣＲに代えてリアルタイムＲＴ−ＨＤＡ、相対的ＲＴ−ＨＤＡ、競合的ＲＴ−ＨＤＡおよび比較的ＲＴ−ＨＤＡのようなＨＤＡを用いてＲＴ−ＨＤＡを行う。
【０００９】
ＲＮＡは、ＲＴ、熱安定ヘリカーゼ依存性変性および増幅を含む１つの反応または一連の反応で増幅できる。反応が単一反応容器で生じるときは、単一バッファを使用するのが望ましい。別々の反応容器で生じる一連の反応でＲＮＡを増幅するときはこの制約は適用しない。単一反応容器で複数の反応を行わせる利点は、ＲＴによってＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖から遊離したＲＮＡからより多い量のｃＤＮＡが産生されると同時にＲＮＡターゲット配列のｃＤＮＡコピーがＤＮＡ増幅鋳型として作用することである。
【００１０】
本発明の１つの実施態様では、増幅プロセスがヘリカーゼ依存性増幅である（米国特許出願２００４／００５８３７８参照）。この方法では、増幅が、少なくとも１種類のヘリカーゼとヌクレオチド三リン酸のようなエネルギー源と一本鎖結合タンパク質とを含むヘリカーゼ調製物の存在下で行われるか、または、一本鎖結合タンパク質の非存在下では熱安定ヘリカーゼの存在下で行われる。ヘリカーゼ調製物をＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチドおよびプライマーと混合してＨＤＡを行わせる。熱安定ヘリカーゼを使用する場合にはヘリカーゼ調製物は不要であろう。熱安定ヘリカーゼはおそらく一本鎖結合タンパク質を要せず、ポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチドおよびプライマーと結合してＨＤＡに影響を及ぼし得る（実施例１−５参照）。
【００１１】
ＲＮＡターゲットの例は、メッセンジャーＲＮＡ、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたは細胞またはウイルス中で生じる他のＲＮＡのような細胞またはウイルス由来のＲＮＡのいずれかを含む。
【００１２】
本発明方法の実施態様に使用するための適当な逆転写酵素は、逆転写に使用される市販酵素のいずれかでよく、Ｍ−ＭｕＬＶ、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）またはＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）逆転写酵素のような熱安定逆転写酵素、または、Ｔｔｈポリメラーゼのような逆転写酵素活性をもつポリメラーゼを含む。
【００１３】
方法の実施態様に使用するためのヘリカーゼは、常温（中温性）または高温（好熱性）下で二本鎖ＤＮＡを巻戻す能力をもつ酵素である。ヘリカーゼは天然に豊富に存在し、それらの特性についても膨大な文献がある。これらは、原核生物、真核生物および古細菌で同定され、他の酵素と同様に、熱安定性（好ましい反応温度は約６０℃超）のものもあり、熱不安定性（好ましい反応温度は約２０℃−３７℃）のものもある。Ｔｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼのような熱安定ヘリカーゼの利点は、熱不安定ヘリカーゼには必要な一本鎖結合タンパク質が不要なことである。膨大な数の例を挙げることができるが、Ｔｔｅ−ＵＶｒＤヘリカーゼが一般的に熱安定ヘリカーゼの代表であり、平均的な当業者に本発明の実施方法を教示する。熱安定ヘリカーゼの例として、ＵＶｒＤ様ヘリカーゼ例えば大腸菌ＵｖｒＤヘリカーゼ、ＲｅｃＢＣＤヘリカーゼおよびＴ７遺伝子４ヘリカーゼ、および、Ｔｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼ（米国特許出願２００４００５８３７８）のような熱安定ヘリカーゼが挙げられる。
【００１４】
適当なＤＮＡポリメラーゼの例は、  大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ，ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）、ＶｅｎｔＲＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲＴＭ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼＬフラグメントおよびＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ，Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を含む。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼの５’から３’方向のエキソヌクレアーゼ活性が欠失し、鎖置換活性がある。
【００１５】
逆転写酵素、ヘリカーゼ誘発変性および場合によりＨＤＡは単一反応容器で単一バッファを使用して行うことができる。１つの実施態様で、バッファは、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．３−８．８を含有し、３−５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＫＣｌ、２０−４０ｍＭのＮａＣｌ、０．４ｍＭのｄＮＴＰおよび３ｍＭのｄＡＴＰまたはＡＴＰを含有する。
【００１６】
反応の温度は好ましくはヘリカーゼ反応に最適な温度になる方向に導く。しかしながら、逆転写酵素が感熱性であるときはそれに応じて温度を調節できる。
【００１７】
ＲＴ−ＨＤＡは単一反応容器で行うのが好ましい。このような系では、ヘリカーゼ、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを使用してＲＮＡターゲットからのｃＤＮＡコピーの産生および増幅が同時に行われる。ＲＴおよび増幅を単一反応容器で行わせるときは、最初に第一鎖ｃＤＮＡが逆転写酵素（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔＴＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）またはＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）逆転写酵素によって合成される（図１、段階１および２）。ＲＴから生じたＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖がヘリカーゼによって少なくとも部分的に巻戻されて一本鎖のＲＮＡおよびＤＮＡ鋳型を生じる（図１、段階３および４）。本発明の１つの実施態様では、ヘリカーゼがＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖の全長を巻戻す。一本鎖ＲＮＡは次回のＲＴ反応サイクルに入り（図１、段階５−１）、より多くの第一鎖ｃＤＮＡを産生する。ｓｓＤＮＡはＤＮＡポリメラーゼによって二本鎖ＤＮＡに変換され（図１、段階５−２）、同時にＨＤＡ反応で増幅される（図１、段階６−９）。このプロセスは自発的に繰り返されてＲＮＡターゲット配列の指数的増幅が達成される（図１）。単一反応容器で行われる反応にはＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖およびＤＮＡ二本鎖の双方を巻戻すヘリカーゼが好ましい。このようなヘリカーゼとしては、ＵｖｒＤヘリカーゼまたはそのホモローグ例えば熱安定Ｔｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼがある。
【００１８】
あるいは、ＲＴ−ＨＤＡを同一または別々の反応容器で２つの異なる反応として行うこともできる。例えば、選択した逆転写酵素に好ましい温度でＲＴを行わせ、ヘリカーゼ反応に好ましい温度で増幅を行わせてもよい。２相反応の一例では、第一段階でＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素を使用し例えば４２℃（ＲＴに適した温度３７℃−５０℃）で約３−１０分、より特定的には５分間でｃＤＮＡコピーを作製し、次いで第二段階で好熱性ＨＤＡ反応を使用しｔＨＤＡに適した約６２℃−６６℃、より特定的には約６５℃で約６０−１２０分間増幅させる。
【００１９】
ＲＴ−ＨＤＡに２つの異なるバッファ系（一方がＲＴ用、他方が増幅段階用）を使用する場合、第一鎖ｃＤＮＡはオリゴ−ｄＴプライマーまたはターゲットＲＮＡ配列に相補的な配列特異的プライマーの存在下で逆転写酵素によって合成される。本発明の１つの実施態様では、２相法のＲＴバッファは、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．３、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ．ＡＭＶ：５０ｍＭのトリスアセテート，ｐＨ８．４、７５ｍＭの酢酸カリウム、８ｍＭの酢酸マグネシウム、１０ｍＭのＤＴＴ、ｄＮＴＰおよびターゲットＲＮＡである。ＲＴ反応で得られたｃＤＮＡコピーのアリコートを第二反応バッファに移し、引き続いてヘリカーゼおよびポリメラーゼの存在下で増幅する。
【００２０】
出発ＲＮＡサンプルを同定するためにｃＤＮＡ産物を、配列決定、データベース比較、例えばＮａｎｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡからチップに載せて提供されたＤＮＡアレイを用いるハイブリダイゼーションのような当業界で公知の方法、および、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ  ａｎｄ  ＴａｑｍａｎＲＴＭテクノロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）の使用を含む適当なプローブテクノロジーのいずれかによって特性決定する。
【００２１】
本文中に引用したすべての参考文献および暫定米国出願６０／６４１，４１９は参照によって本発明に組み込まれるものとする。
【実施例１】
【００２２】
２反応容器／２バッファＲＴ−ＨＤＡ
この実施例では、ヒト全ＲＮＡを核酸基質として使用し、最初にＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）製のＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔＲＴＭキットを使用して一本鎖ｃＤＮＡ産物に変換した。
【００２３】
以下の材料：
１μｌのヒト全ＲＮＡ（１μｇ／μｌ）
２μｌのプライマーｄＴ２３ＶＮ（５０μＭ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）
４μｌのｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）
９μｌのヌクレアーゼ非含有Ｈ２Ｏ
を混合して反応物を準備し、最初に７０℃で５分間インキュベートし、次いで氷上に維持した。
【００２４】
次に反応管に以下の試薬を添加した：
２μｌの１０×ＲＴバッファ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）
１μｌのＲＮａｓｅインヒビター（１０単位／μｌ）
１μｌのＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（２５単位／μｌ）。
【００２５】
ＲＴ反応物を４２℃で１時間、次いで９５℃で５分間インキュベートした。次に１μｌのＲＮａｓｅ  Ｈ（２単位／μｌ）を添加し、ＲＴ反応物をさらに３７℃で２０分間、次いで９５℃で５分間インキュベートした。次いでＲＴ産物をｄＨ２Ｏで５０μｌに希釈した。次にこの希釈ＲＴ産物の系列希釈物を調製した。どの場合にも、直前に希釈した５μｌのＲＴ産物をさらにｄＨ２Ｏで５０μｌに希釈した。その後のｔＨＤＡ反応ではＧＡＰＤＨ遺伝子を特異的にターゲットとする一対のプライマーＧＡＰＤＦｌおよびＧＡＰＤＲｌを増幅に使用した。ｔＨＤＡ反応を開始するために、以下の成分を混合することによって全容量２５μｌの反応混合物Ａを調製した：
２．５μｌの１０×Ｍｇ非含有ｔＨＤＡバッファ（下記参照＊）
５μｌの系列希釈ＲＴ産物（０．０００１％−１％のＲＴ産物）
０．５μｌの１０μＭのプライマーＧＡＰＤＦ１（配列：１）
０．５μｌの１０μＭのプライマーＧＡＰＤＲ１（配列：２）
１６．５μｌのｄＨ２Ｏ。
【００２６】
また、以下の成分を混合することによって２５μｌの反応混合物Ｂを調製した：
２．５μｌの１０×Ｍｇ非含有ｔＨＤＡバッファ（下記参照＊）
１．７５μｌの１００ｍＭのＭｇＳＯ４
２μｌの５００ｍＭのＮａＣｌ
２μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ
１．５μｌの１００ｍＭのｄＡＴＰ
２．５μｌのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ，ＬＦ（８単位／μｌ；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）
１μｌのＴｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼ（１００ｎｇ／μｌ）
１１．７５μｌのｄＨ２Ｏ。
＊１０×Ｍｇ非含有ｔＨＤＡバッファは１００ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有している。
【００２７】
反応混合物Ａを９５℃で２分間、次いで６５℃で３分間加熱した。次に、調製直後の混合物Ｂを混合物Ａに添加し、６５℃で７５分間インキュベートした。増幅産物を２％アガロースゲルで分析した（図２）。９６ｂｐという予測サイズに合致する約１００ｂｐのバンドがレーン２（１％または１０ｎｇの出発全ＲＮＡ投入量）およびレーン３（０．１％または１ｎｇの出発全ＲＮＡ投入量）に観察された。
【実施例２】
【００２８】
１反応容器／２バッファＲＴ−ＨＤＡ
この実施例では、第一鎖ｃＤＮＡ合成とｔＨＤＡ反応とを合わせて１つの管で２段階インキュベーションを使用して行った。１０ｐｇ−１００ｎｇの範囲の種々の量のヒト全ＲＮＡとＧＡＰＤＨ遺伝子の一対の特異的プライマーＧＡＰＤＦ１とＧＡＰＤＲ１とを増幅に使用した。
【００２９】
１つの管で以下の材料を混合することによって全量５０μｌの反応物を準備した：
５μｌの１０×Ｍｇ非含有ｔＨＤＡバッファ
１μｌの可変量のヒト全ＲＮＡ（１０ｐｇ−１００ｎｇ）
０．５μｌの１０μＭプライマーＧＡＰＤＦ１（配列：１）
０．５μｌの１０μＭプライマーＧＡＰＤＲ１（配列：２）
１．７５μｌの１００ｍＭのＭｇＳＯ４
２μｌの５００ｍＭのＮａＣｌ
２μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ
１．５μｌの１００ｍＭのｄＡＴＰ
１μｌのＲＮａｓｅインヒビター（１０単位／μｌ）
１μｌのＭ−ＭｕＩＶ逆転写酵素（２５単位／μｌ）
２．５μｌのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ，ＬＦ（８単位／μｌ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）
１μｌのＴｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼ（１００ｎｇ／μｌ）
３０．２５μｌのヌクレアーゼ非含有Ｈ２Ｏ。
【００３０】
ＲＴ−ＨＤＡ反応は４２℃で５分、次いで６５℃で６０分間行った。増幅産物を２％アガロースゲルで分析した（図３）。１００ｎｇの出発全ＲＮＡ（レーン３）および１０ｎｇの出発全ＲＮＡ（レーン４）の存在下で約１００ｂｐの濃いバンドがアガロースゲルに観察された。１ｎｇの出発全ＲＮＡの存在下（レーン５）でも約１００ｂｐの淡いバンドがアガロースゲルに観察された。観察されたＤＮＡフラグメントサイズは９６ｂｐという予測ターゲットサイズに合致した。全ＲＮＡの投入量が１ｎｇ未満のときにはプライマー−ダイマー形態の非特異的増幅だけが観察された（レーン６−８）。さらに、逆転写酵素（レーン１）またはヘリカーゼ（レーン２）を反応物から削除すると、増幅は全く観察されなかった。これは、増幅がＲＴおよびＨＤＡの双方の機能に依存したことを示唆する。
【実施例３】
【００３１】
１反応容器／１バッファＲＴ−ＨＤＡ
この実施例では、高い熱安定性をもつ逆転写酵素を選択し、第一鎖ｃＤＮＡ合成とヘリカーゼ依存性等温ＤＮＡ増幅反応とを合わせて１つの管で１段階で行った。１００ｐｇ−１００ｎｇの範囲の種々の量のヒト全ＲＮＡとＧＡＰＤＨ遺伝子の一対の特異的プライマーＧＡＰＤＦ１とＧＡＰＤＲ１とを増幅に使用した。
【００３２】
１つの管で以下の材料を混合することによって全量５０μｌの反応物を準備した：
５μｌのＭｇ非含有ｔＨＤＡバッファ
１μｌの可変量のヒト全ＲＮＡ（１００ｐｇ−１００ｎｇ）
０．５μｌの１０μＭのプライマーＧＡＰＤＦ１（配列：１）
０．５μｌの１０μＭのプライマーＧＡＰＤＲ１（配列：２）
１．７５μｌの１００ｍＭのＭｇＳＯ４
２μｌの５００ｍＭのＮａＣｌ
２μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ
１．５μｌの１００ｍＭのｄＡＴＰ
１μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ  ＩＩＩ逆転写酵素（２００単位／μｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）
２．５μｌのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ，ＬＦ（８単位／μｌ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）
１μｌのＴｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼ（１００ｎｇ／μｌ）
３１．２５μｌのヌクレアーゼ非含有Ｈ２Ｏ。
【００３３】
１段階のＲＴ−ＨＤＡ反応は６２．５℃で６０分間行った。増幅産物を２％アガロースゲルで分析した（図４）。１００ｎｇ（レーン２）または１０ｎｇ（レーン３）の出発全ＲＮＡの存在下で９６ｂｐという予測ターゲットサイズに合致する約１００ｂｐのＤＮＡフラグメントがアガロースゲルに観察された。全ＲＮＡの投入量が１０ｎｇ未満のときにはプライマー−ダイマー形態の非特異的増幅だけが観察された（レーン４−６）。
【実施例４】
【００３４】
修正１バッファＲＴ−ＨＤＡ
この実施例では、非特異的増幅を低減するためにＲＮＡ鋳型およびプライマーの変性に関与する独立の変性段階を使用した。６５℃で高い熱安定性をもつ逆転写酵素を選択し、第一鎖ｃＤＮＡ合成およびヘリカーゼ依存性等温ＤＮＡ増幅反応を合わせて１つの管で１段階で行った。２ｐｇ−２００ｎｇの範囲の種々の量のヒト全ＲＮＡとＧＡＰＤＨ遺伝子の異なるエキソンに局在した一対の特異的プライマーＧＡＰＤＦ３とＧＡＰＤＲ３とを増幅に使用した。
【００３５】
最初にミックスＡとミックスＢとを調製することによって全量５０μｌの反応物を準備した。ミックスＡは１つの滅菌マイクロチューブで以下の材料を混合することによって調製した：
２．５μｌの１０×ＲＴ−ＨＤＡバッファ（下記参照＊）
２μｌの可変量のヒト全ＲＮＡ（２ｐｇ−２００ｎｇ）
０．３７５μｌの１０μＭのプライマーＧＡＰＤＦ３（配列：３）
０．３７５μｌの１０μＭのプライマーＧＡＰＤＲ３（配列：４）
１９．７５μｌのヌクレアーゼ非含有Ｈ２Ｏ
全量：２５μｌ。
【００３６】
陰性対照反応には、２μｌのヌクレアーゼ非含有Ｈ２Ｏを全ＲＮＡで置き換えた。
【００３７】
ミックスＢは別の滅菌マイクロチューブで以下の材料を混合することによって調製した：
２．５μｌの１０×ＲＴ−ＨＤＡバッファ（下記参照＊）
１．７５μｌの１００ｍＭのＭｇＳＯ４
４μｌの５００ｍＭのＮａＣｌ
２μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ
１．５μｌの１００ｍＭのｄＡＴＰ
０．５μｌのＲＮａｓｅインヒビター（４０単位／μｌ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）
０．７μｌのＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（１５単位／μｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
２．５μｌのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ，ＬＦ（８単位／μｌ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）
１μｌのＴｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼ（１５０ｎｇ／μｌ）
８．５５μｌのヌクレアーゼ非含有Ｈ２Ｏ
全量：２５μｌ。
＊１０×ＲＴ−ＨＤＡバッファは、１００ｍＭのＫＣｌ、２００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）を含有している。
【００３８】
ミックスＡの変性は９５℃で２分間行った。ミックスＡを氷上で冷却した後、ミックスＢをミックスＡに加えた。１段階のＲＴ−ＨＤＡ反応は６５℃で１２０分間行った。増幅産物を２％アガロースゲルで分析した（図５）。最大２００ｎｇから最小２ｐｇまでの出発全ＲＮＡの存在下で（レーン２−７）、９５ｂｐという予測ターゲットサイズに合致する約１００ｂｐの一本鎖ＤＮＡフラグメントがアガロースゲルに観察された。２ｎｇ−２００ｎｇの出発全ＲＮＡ（レーン２−７）からも鋳型非含有対照（レーン８）からも非特異的増幅は全く観察されなかった。これは、ＧＡＰＤＨ遺伝子を検出するための修正１段階ＲＴ−ＨＤＡが少なくとも５ｌｏｇの全ＲＮＡの範囲で十分な機能を発揮することを示す。
【実施例５】
【００３９】
エンテロウイルスＲＮＡの検出
この実施例では、実施例４に記載した修正１段階ＲＴ−ＨＤＡ法をＲＮＡウイルスであるエンテロウイルスの検出に応用した。エンテロウイルスＣｌｅａｒ  ＱＣパネル（Ａｒｇｅｎｅ，Ｖａｒｉｌｈｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）から精製した４０コピーから４０００コピーの範囲のエンテロウイルスＲＮＡを鋳型として使用し、エンテロウイルスの全種に保存された５’−ＵＴＲ配列をターゲットとする一対の特異的プライマーＥＶＦ１ＡおよびＥＶＲ１を増幅用プライマーとして使用した。
【００４０】
ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によってエンテロウイルスＣｌｅａｒ  ＱＣパネルの精製を行った。１０コピー／μｌ、１００コピー／μｌおよび１０００コピー／μｌの濃度の１４０μｌの各エンテロウイルス標準サンプルを精製に使用し、７０μｌの溶出バッファに溶出させた。全量５０μｌの修正１段階ＲＴ−ＨＤＡ反応物は、最初にミックスＡとミックスＢとを調製することによって準備した。ミックスＡは１つの滅菌マイクロチューブで以下の材料を混合することによって調製した：
２．５μｌの１０×ＲＴ−ＨＤＡバッファ（下記参照＊）
２μｌの可変量のエンテロウイルスＲＮＡ（４０−４０００コピー）
０．３７５μｌの１０μＭのプライマーＥＶＦ１Ａ（配列：５）
０．３７５μｌの１０μＭのプライマーＥＶＲ１（配列：６）
１９．７μｌのヌクレアーゼ非含有Ｈ２Ｏ
全量：２５μｌ。
【００４１】
陰性対照反応には、２μｌのヌクレアーゼ非含有Ｈ２ＯをエンテロウイルスＲＮＡで置き換えた。
【００４２】
ミックスＢは別の滅菌マイクロチューブで以下の材料を混合することによって調製した：
２．５μｌの１０×ＲＴ−ＨＤＡバッファ（下記参照＊）
１．７５μｌの１００ｍＭのＭｇＳＯ４
２μｌの５００ｍＭのＮａＣｌ
２μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ
１．５μｌの１００ｍＭのｄＡＴＰ
０．５μｌのＲＮａｓｅインヒビター（４０単位／μｌ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）
０．７μｌのＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（１５単位／μｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
２．５μｌのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ，ＬＦ（８単位／μｌ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）
１μｌのＴｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼ（１５０ｎｇ／μｌ）
１０．５５μｌのヌクレアーゼ非含有Ｈ２Ｏ
全量：２５μｌ。
＊１０×ＲＴ−ＨＤＡバッファは、１００ｍＭのＫＣｌ、２００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）を含有している。
【００４３】
ミックスＡの変性は９５℃で２分間行った。ミックスＡを氷上で冷却した後、ミックスＢをミックスＡに加えた。１段階ＲＴ−ＨＤＡ反応は６５℃で１２０分間行った。増幅産物を２％アガロースゲルで分析した（図６）。４０００コピー（レーン１）および４００コピー（レーン２）の出発エンテロウイルスＲＮＡの存在下で１１６ｂｐという予測ターゲットサイズに合致する約１２０ｂｐの一本鎖ＤＮＡフラグメントがアガロースゲルに観察された。４０コピーの出発エンテロウイルスＲＮＡからは増幅が全く観察されなかった（レーン３）。４０００コピーから４０コピーまでの出発エンテロウイルスＲＮＡ（レーン１−３）からも鋳型非含有対照（レーン４）からも非特異的増幅は全く観察されなかった。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ＲＴ−ＨＤＡ反応の概略図である。段階１はターゲットＲＮＡへの単一プライマーの結合を示す。段階２は逆転写酵素またはＲＴ特性をもつポリメラーゼを使用したＲＴによるターゲットＲＮＡの第一鎖ｃＤＮＡの合成を示す。段階３はＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を少なくとも部分的な一本鎖核酸に巻戻すヘリカーゼ（黒色三角記号）を示す。段階４は第一プライマーおよび第二プライマーが対象核酸配列の境界に結合して両プライマー間のＤＮＡ配列を増幅できるようにした少なくとも１つの第二プライマーの付加を示す。段階５−１は置換された一本鎖ＲＮＡまたは出発ターゲットＲＮＡがどのようにしてＲＴ反応を行うかを示す（段階１−４の反復）。段階５−２はプライマーがどのようにして一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に結合してＨＤＡまたは他の種類の増幅を生じさせるかを示す。段階６−９は増幅中の過程を示す。段階６は熱またはＨＤＡまたは他の手段によって二本鎖ＤＮＡがどのようにして巻戻されるかを示す。段階７はｓｓＤＮＡに結合するプライマーを示す。段階８はプライマーからのＤＮＡポリメラーゼの伸長を示す。段階９は増幅産物が次回の増幅周期に入ることを示す。  点線：ＲＮＡ；太い実線：ＤＮＡ；矢印付き実線：プライマー。黒色三角記号：ヘリカーゼ；灰色四角記号：逆転写酵素；灰色円記号：ＤＮＡポリメラーゼ。
【図２】２段階反応で増幅したＧＡＰＤＨ  ＲＮＡのゲル電気泳動（２％アガロース）の結果を示す。  ２段階ＲＴ−ＨＤＡ反応は異なる２つの反応管で行った。第一鎖ｃＤＮＡ合成はＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔＲＴＭキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）および１μｇのヒト全ＲＮＡを使用して行った。次に、第一鎖ｃＤＮＡ合成産物を希釈し、全量５０μｌでＴｔｅ−ＵｖｒＤ（ヘリカーゼ）とＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼとの存在下のＨＤＡを使用して増幅した。１０μｌの各サンプルをゲルで分析した。第一鎖ｃＤＮＡ合成産物のパーセンテージをレーン２−７に示すように変化させた。レーン１：２００ｎｇの低分子量ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）；レーン２：１％；レーン３：０．１％；レーン４：０．０１％；レーン５：０．００１％；レーン６：０．０００１％；レーン７：０。
【図３】種々の量のヒト全ＲＮＡを出発材料として２段階反応で増幅したＧＡＰＤＨ  ＲＮＡのゲル電気泳動（２％アガロース）の結果を示す。  ２段階ＲＴ−ＨＤＡ反応は１つの反応管で行った。ＲＴ−ＨＤＡは、１つの管でＴｔｅ−ＵｖｒＤ、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼおよび好熱性ＨＤＡ（ｔＨＤＡ）バッファを全量５０μｌで混合し、４２℃で５分、次いで６５℃で６０分間インキュベートすることによって行った。１０μｌの各サンプルをゲルで分析した。レーン１−８に使用した全ＲＮＡの量を以下に示す：レーン１，２，３：１００ｎｇ；レーン４：１０ｎｇ；レーン５：１ｎｇ；レーン６：１００ｐｇ；レーン７：１０ｐｇ；レーン８：０；レーン９：２００ｎｇの低分子量ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。  最初の２つのレーンは逆転写酵素またはヘリカーゼをそれぞれ含まない対照反応の結果である。
【図４】種々の量のヒト全ＲＮＡを出発材料として１段階反応で増幅したＧＡＰＤＨ  ＲＮＡのゲル電気泳動（２％アガロース）の結果を示す。  １段階ＲＴ−ＨＤＡ反応は単一反応容器で行った。ＲＴ−ＨＤＡは、１つの管でＴｔｅ−ＵｖｒＤ、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）逆転写酵素、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼおよびｔＨＤＡバッファを全量５０μｌで混合し、６２．５℃で６０分間インキュベートすることによって行った。１０ｍｌの各サンプルをゲルで分析した。全ＲＮＡの量を以下に示す：レーン１：２００ｎｇの低分子量ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）．レーン２：１００ｎｇ；レーン３：１０ｎｇ；レーン４：１ｎｇ；レーン５：１００ｐｇ；レーン６：０。
【図５】種々の量のヒト全ＲＮＡを出発材料とし修正１段階ＲＴ−ＨＤＡ反応を使用して増幅したＧＡＰＤＨ  ＲＮＡのゲル電気泳動（２％アガロース）の結果を示す。  ＲＴ−ＨＤＡを行うために、最初にＲＮＡ鋳型と一対のＧＡＰＤＨ特異的プライマーとを含有するミックスＡを９５℃で２分間変性した。次に、Ｔｔｅ−ＵｖｒＤ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）逆転写酵素、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを含有しているミックスＢをミックスＡに添加し、６５℃で１２０分間インキュベートした。１０μｌをゲルで分析した。全ＲＮＡの量を以下に示す：レーン１：２５０ｎｇの低分子量ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）．レーン２：２００ｎｇ；レーン３：２０ｎｇ；レーン４：２ｎｇ；レーン５：２００ｐｇ；レーン６：２０ｐｇ；レーン７：２ｐｇ；レーン８：０。
【図６】修正１段階ＲＴ−ＨＤＡ、種々の量のエンテロウイルスＤＮＡおよび２％アガロースゲル電気泳動を使用するエンテロウイルスの検出を示す。ＲＴ−ＨＤＡは一対のエンテロウイルス特異的プライマーを使用し図５の記載と同様にして行った。１０μｌをゲルで分析した。エンテロウイルスＲＮＡ（ＥＶ産生物）の量を以下に示す：レーン１：４０００コピー；レーン２：４００コピー；レーン３：４０コピー；レーン４：０．レーン５：２５０ｎｇの低分子量ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。
【図１】
2008526231.tif 000003
【図２】
2008526231.tif 000004
【図３】
2008526231.tif 000005
【図４】
2008526231.tif 000006
【図５】
2008526231.tif 000007
【図６】
2008526231.tif 000008
【配列表】
2008526231000001.app
【国際調査報告】
2008526231.tif 000009
2008526231.tif 000010
2008526231.tif 000011