(57)【要約】本発明は、トリＰＧＣの長期培養物から得たトランスジェニックニワトリおよびその産生技術ならびに長期ＰＧＣ培養物由来のトランスジェニックトリである。いくつかの実施形態では、これらのＰＧＣを、遺伝子構築物でトランスフェクトしてＰＧＣのＤＮＡを改変し、具体的には、外因性タンパク質をコードする導入遺伝子を導入することができる。公知の手順によって宿主トリ胚と組み合わせた場合、これらの改変ＰＧＣは、生殖系列を介して伝達されてトランスジェニック子孫が得られる。本発明は、遺伝子ターゲティングによって遺伝子改変することができるＰＧＣの長期培養物を含む組成物を含み、この組成物は、大量の外来ＤＮＡを許容することができ、レシピエント胚の生殖系列に寄与する。
2008529483.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスジェニックニワトリであって、
１５ｋｂを超えるサイズの外因性ＤＮＡをコードする導入遺伝子を含む遺伝子改変された始原生殖細胞によってコロニー形成した生殖系列組織を含む、トランスジェニックニワトリ。
【請求項２】
前記導入遺伝子が安定に組み込まれている、請求項１に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項３】
前記外因性ＤＮＡがタンパク質をコードする、請求項１に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項４】
タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項３に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項５】
前記導入遺伝子がヒトポリヌクレオチド配列から構成される、請求項１に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項６】
前記外因性ＤＮＡが少なくとも１つのインスレーターに隣接している、請求項１に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項７】
前記導入遺伝子が選択マーカーから構成される、請求項１に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項８】
前記導入遺伝子がＥＲＮＩプロモーターから構成される、請求項１に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項９】
ゲノムが１０ｋｂを超える外因性ＤＮＡから構成される導入遺伝子から構成される、トランスジェニックニワトリ。
【請求項１０】
前記導入遺伝子が安定に組み込まれている、請求項７に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項１１】
前記外因性ＤＮＡがタンパク質をコードする、請求項７に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項１２】
タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項７に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項１３】
前記導入遺伝子がヒトポリヌクレオチド配列から構成される、請求項７に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項１４】
前記外因性ＤＮＡが少なくとも１つのインスレーターに隣接している、請求項７に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項１５】
前記導入遺伝子が選択マーカーから構成される、請求項１に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項１６】
前記導入遺伝子がＥＲＮＩプロモーターから構成される、請求項１に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項１７】
トランスジェニックニワトリを産生する方法であって、
１０ｋｂを超える導入遺伝子を始原生殖細胞に組み込む工程と、
前記始原生殖細胞をレシピエント胚に挿入する工程と、
トランスジェニックニワトリを孵化させる工程と
を含む、方法。
【請求項１８】
前記導入遺伝子が安定に組み込まれている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記外因性ＤＮＡがタンパク質をコードする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記導入遺伝子がヒトポリヌクレオチド配列から構成される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記外因性ＤＮＡが少なくとも１つのインスレーターに隣接している、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記導入遺伝子が選択マーカーから構成される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記導入遺伝子がＥＲＮＩプロモーターから構成される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
始原生殖細胞のゲノムに安定に組み込まれた外因性ＤＮＡを保有するニワトリ始原生殖細胞のクローン由来細胞培養物。
【請求項２６】
前記培養培地が、バッファローラット肝臓（ＢＲＬ）細胞由来の馴化培地から構成される、請求項２５に記載の培養物。
【請求項２７】
前記培養培地が線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）から構成される、請求項２５に記載の培養物。
【請求項２８】
前記培養培地が幹細胞因子から構成される、請求項２５に記載の培養物。
【請求項２９】
前記培養培地がニワトリ血清から構成される、請求項２５に記載の培養物。
【請求項３０】
前記培養物が少なくとも１×１０５個の細胞を含む、請求項２５に記載の培養物。
【請求項３１】
前記外因性ＤＮＡが少なくとも１つのインスレーターに隣接している、請求項２５に記載の培養物。
【請求項３２】
生殖系列キメラニワトリであって、
遺伝子改変された始原生殖細胞によってコロニー形成した生殖系列組織と、
遺伝子改変細胞を実質的に含まない体細胞組織と
を含む、生殖系列キメラニワトリ。
【請求項３３】
前記遺伝子改変が外因性ＤＮＡの安定な組み込みである、請求項３２に記載の生殖系列キメラ。
【請求項３４】
前記外因性ＤＮＡがタンパク質をコードする、請求項３３に記載の生殖系列キメラ。
【請求項３５】
タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項３４に記載の生殖系列キメラ。
【請求項３６】
前記モノクローナル抗体がヒトポリヌクレオチド配列を有する、請求項３５に記載の生殖系列キメラ。
【請求項３７】
前記外因性ＤＮＡが少なくとも１つのインスレーターに隣接している、請求項３４に記載の生殖系列キメラ。
【請求項３８】
前記導入遺伝子のコード領域に作動可能に連結された、神経誘導に対する発現可能な初期応答（ＥＲＮＩ）プロモーターを有する、安定に組み込まれた導入遺伝子を含む、始原生殖細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連情報）
本発明は、ＵＳＤＡ  ＳＢＩＲ  ２００３−０９０５８およびＮＩＨ  Ｒ４４  ＧＭ０６４２６１、Ｒ４３  ＧＭ０７３３０６−０１、Ｒ４４  ＨＤ  ０３９５８３および  Ｒ４３  ＨＤ  ０４７９９５−０１の下の政府支援によって行われた。政府は、本発明に対し一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
トランスジェニック動物は、抗体などの有益な医薬品の継続的生産を大幅に進歩させる潜在性がある。しかし、トランスジェニック動物の産生は、多くの技術的障害があり、そのうちの少数しか克服されていない。タンパク質をコードする遺伝子改変物を特異的発現のために種のＤＮＡに組み込むには、いくつかの異なるテクノロジーが必要であり、このテクノロジーはそれぞれの種について開発されなければならない。動物の遺伝的および物理的特徴を変化させる１つのアプローチは、動物のレシピエント胚に細胞を導入することである。これらの細胞は、レシピエント胚から誕生した動物の組織に寄与し、得られた動物のトランスジェニック子孫のゲノムに寄与する能力を有する。
【０００３】
細胞株の研究開発、細胞ゲノムの操作、およびこのようにして操作された細胞を培養物中に維持する細胞培養技術に相当な時間および資産が費やされてきた。多くの試みが行われているにもかかわらず、ほんの数種のみでしか培養物中に操作細胞の多能性を維持することができていない。維持可能な細胞培養物を容易に利用することができ、多能性を維持しながら遺伝子操作を行い易い場合、新規のテクノロジーを広範に適用することができるであろう。
【０００４】
一定の場合、細胞を、タンパク質または抗体などの外因性産物をコードするＤＮＡを含む導入遺伝子で操作することができる。導入遺伝子は、タンパク質産生の青写真を含み、レシピエント胚への細胞の挿入から作製された動物組織中でのタンパク質発現が可能なコードエレメントおよび調節エレメントを十分に含む。いくつかの環境では、発現は、全組織型で発現するように遍在することが望ましい。しかし、有益な抗体の回収などの他の環境では、発現したタンパク質の回収が容易になるように一定の特異的組織型に発現が制限されなければならない。例えば、ウシでは、乳中でのタンパク質発現により、簡単な牛乳の回収および外因性タンパク質の分離によってタンパク質を容易に回収することができる。また、ニワトリでは、卵白中の抗体の大量産生は、抗体の発現および回収のための魅力的なビヒクルを提供する。さらに、組織特異的発現がニワトリの卵管に特異的である場合、発現により、ヒト患者の治療で使用した場合に抗体の治療有用性が増大する一定の特異的な望ましい化学的特性を有する抗体が得られる。したがって、研究的および商業的開発の１つの特に魅力的な分野は、望ましい化学的性質を有するタンパク質の単離および回収を容易にするために卵中で抗体を選択的に発現する遺伝子操作ニワトリである。外因性抗体の産生のために、トリの生体系は、多数の利点（効率的な農場での育成、迅速な成長、および経済的な産生が含まれる）を付与する。さらに、トリの卵は、抗体の大量合成ならびに産物の単離および回収の容易さの両方において理想的な生物学的デザインを付与する。さらに、下記のように、本発明の文脈では、例えば、脊椎動物、植物、または細菌の細胞系と比較したトランスジェニックニワトリ発現系の利点を容易に証明し、大量の抗体産物について固有の有利な化学的性質をもたらすために適用することができる。トランスジェニックニワトリを作製する目的は、何年にもわたって科学者が追求している。この目的は他の種（マウス、ウシ、およびブタなど）で到達しているが、レトロウイルステクノロジーの使用以外でトランスジェニックニワトリは作製されておらず、このテクノロジーは、トランスジェニック動物のＤＮＡに導入することができる導入遺伝子のサイズに固有の限界がある。
【０００５】
しかし、細胞培養物が巨大な導入遺伝子を細胞のゲノムに組み込まれるようになるのに十分に安定な場合、抗体の組織特異的発現をコードする導入遺伝子を、標的細胞および導入遺伝子として使用される特異的構築物に応じたいくつかの異なる技術によってトランスジェニック生物に引き継ぐことができる。全ゲノムを細胞ハイブリッド形成よって移入することができ、微小核細胞によってインタクトな染色体を移入することができ、染色体媒介性遺伝子移入によってサブ染色体セグメント（ｓｕｂｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｓｅｇｍｅｎｔ）を移入することができ、ＤＮＡ媒介性遺伝子移入によってキロベース範囲のＤＮＡフラグメントを移入することができる（非特許文献１）。微小核細胞媒介性染色体移入（ＭＭＣＴ）によってインタクトな染色体を移入することができる（非特許文献２）。導入遺伝子の特異的デザインは、抗体をコードするＤＮＡ配列の含有量、標的細胞株、発現がターゲティングされる特異的組織、発現が起こる宿主生物、および発現すべき抗体も考慮しなければならない。組織特異的発現のためにデザインされた導入遺伝子は、細胞ゲノムへの首尾のよい組み込みが可能であり、宿主生物の選択された組織中での首尾のよい発現を確実にするためのいくつかのパラメーターを満足しなければならない。
【０００６】
導入遺伝子を慎重にデザインし、培養条件を至適化しない限り、組織特異的発現が可能な導入遺伝子の挿入は、細胞の多能性を脅かし得る。したがって、導入遺伝子での使用に適切な細胞株は、必要に応じて組織特異的および高レベルの発現に必要な全てのエレメントを含めるのに十分に大きく且つ複雑な遺伝子構築物で細胞をトランスフェクトする場合、培養中に安定であり、且つ多能性が維持されなければならない。得られたトランスジェニック動物では、導入遺伝子を、必要に応じて、導入遺伝子が発現されるようにデザインされる特定の各組織型で選択的に発現することができる。導入遺伝子の遺伝子含有量に応じて、動物の生存率または得られたタンパク質の有利な化学的性質が危うくなる場合、導入遺伝子を他の組織で発現させることができない。
【非特許文献１】Ｋｌｏｂｕｔｃｈｅｒ，Ｌ．Ａ．およびＦ．Ｈ．Ｒｕｄｄｌｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８１年，第５０巻，ｐ．５３３−５５４
【非特許文献２】Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｒ．Ｅ．およびＦ．Ｈ．Ｒｕｄｄｌｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９７７年，第７４巻，ｐ．３１９−３２３
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の概要）
本発明は、トランスジェニックニワトリおよびトランスジェニックトリを遺伝子操作することができるテクノロジーならびにトランスジェニックニワトリを作製するために使用されるＰＧＣの長期培養物を含む。本発明はまた、ニワトリから産生された抗体およびその固有の化学的性質に関する。具体的には、これらの抗体は、一定の適用においてその治療有用性を増大させる有利な化学的性質を有する。ニワトリから産生された抗体は、脊椎動物、植物、または細菌の細胞系から産生された抗体と比較して、化学改変パターンが異なり、その結果、標的組織（腫瘍など）への毒素の結合を目的として患者に投与した場合、高い治療効力で標的組織が治療される。１つの実施形態では、ＰＣＧの長期培養物を、トリに遺伝子改変物を導入するために特別にデザインした遺伝子構築物（外因性タンパク質の組織特異的発現をもたらす導入遺伝子の挿入物が含まれる）によって操作される。本発明のトランスジェニックトリはまた、卵管中で導入遺伝子由来の抗体を発現することができ、卵中に大量の抗体が蓄積する。好ましい実施形態では、外因性抗体タンパク質がヒトＤＮＡ配列によってコードされ、その結果、天然のヒト抗体がニワトリ卵管中で発現され、卵から回収することができる。
【０００８】
本発明は、抗体の組織特異的発現を示すトリ集団、外因性抗体を発現することができる導入遺伝子構築物、ニワトリで産生され、特別に定義された化学的性質を有する抗体の単離組成物、関連するトリの作製方法、抗体の産生、およびヒトでのその治療的使用を含む。本発明は、長期始原細胞培養物を使用し、そして長期細胞培養物由来のキメラトリまたはトランスジェニックトリを産生するための特別な技術であって、ＰＧＣのゲノムが外因性タンパク質を発現する導入遺伝子を安定に組み込み、その結果、培養細胞の子孫が安定に組み込まれた導入遺伝子を含む、技術を使用する。宿主トリ胚に導入する場合、下記手順により、改変されたドナー細胞は、得られた動物の特異的な選択された体細胞組織中で導入遺伝子を発現するトリを産生する。
【０００９】
本発明はまた、トランスジェニックニワトリ中で発現し、脊椎動物、植物、または細菌の細胞系と比較して一定の望ましい化学的性質を有する外因性タンパク質の組成物を含む。具体的には、これらのタンパク質、特に抗体は、フコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルノイラミン酸、およびＮ−グリコリルノイラミン酸の濃度を低下させ、マンノース濃度が上昇させた。これらの性質のいくつかまたは全てを有する抗体は、ヒトに投与した場合に治療有用性の増大を示す。具体的には、これらの抗体組成物は、増大した抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を示す。したがって、本発明の方法は、ＡＤＣＣ効果に基づいて、トランスジェニックニワトリ中での抗体組成物の発現によって抗体組成物の治療有用性を増強するためのトランスジェニックニワトリの使用を含む。
【００１０】
本発明はまた、外因性抗体が規定される量で卵白中に濃縮されるように卵管組織中で本明細書中に規定される有利な化学的性質を有する外因性抗体を発現するトランスジェニックニワトリを含む。１つの好ましい実施形態では、外因性タンパク質は、トランスジェニックトリのゲノムに組み込まれた導入遺伝子構築物によってコードされるヒト配列モノクローナル抗体である。ポリヌクレオチド配列をコードするヒトモノクローナル抗体は、導入遺伝子内に含まれ、この導入遺伝子は、卵管中での発現のために特異的に構築され、組織特異的発現を容易にするための適切なプロモーターおよび調節配列を含む。
【００１１】
本発明はまた、トリ始原生殖細胞（ＰＧＣ）の長期培養物に関し、いくつかのさらなる発明は、トリＰＧＣが増殖し、ＰＧＣ培養物を培養物の生存能を４０日、６０日、８０日、１００日、またはそれを超えて延長するための複数回の継代によって延長することができる長期培養物の作製によって可能であった。本発明のＰＧＣは、長期培養物中で増殖し、レシピエント胚に注入した場合に生殖系列キメラを産生する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で使用される、用語「ニワトリ胚幹（ｃＥＳ）細胞」は、ＥＳ細胞の形態を示し、Ｘ段階（Ｅ−Ｇ＆Ｋ）の胚（マウス胚盤胞にほぼ等しい）の明域由来のレシピエント胚中の体細胞組織に寄与する細胞を意味する。ＣＥＳ細胞は、マウスＥＳ細胞のいくつかのｉｎ  ｖｉｔｒｏ特性（ＳＳＥＡ−１＋、ＥＭＡ−１＋、およびテロメラーゼ＋など）を共有する。ＥＳ細胞は、全ての体細胞組織をコロニー形成（ｃｏｌｏｎｉｚｅ）する能力を有する。
【００１３】
本明細書中で使用される、用語「始原生殖細胞（ＰＧＣ）」は、ＰＧＣの形態を示し、レシピエント胚中の生殖系列に排他的に寄与する細胞を意味し、ＰＧＣは、１２〜１７段階（Ｈ＆Ｈ）の胚から採取した全血に由来し得る。ＰＧＣ表現型を、（１）生殖系列特異的遺伝子ＣＶＨおよびＤａｚｌがこの細胞株で強く転写されること、（２）細胞がＣＶＨタンパク質を強く発現すること、（３）Ｘ段階や１２〜１７段階（Ｈ＆Ｈ）のレシピエント胚に注入した場合に細胞が体細胞組織に寄与しないこと、（４）細胞がＥＧ細胞を生じること（以下を参照のこと）、または（５）１２〜１７段階（Ｈ＆Ｈ）の胚に注入した場合に細胞が生殖系列を介してＰＧＣ遺伝子型を伝達すること、によって確立することができる（Ｔａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ４０，５０９−５１９；Ｎａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，３９，１５３−１６１；Ｎａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．１１７，２９１−２９８）。
【００１４】
本明細書中で使用される、用語「ニワトリ胚生殖（ｃＥＧ）細胞」は、ＰＧＣに由来し、機能がマウスＥＧ細胞に類似する細胞を意味する。ｃＥＧ細胞の形態は、ｃＥＳ細胞の形態に類似し、ｃＥＧ細胞は、Ｘ段階（Ｅ−Ｇ＆Ｋ）のレシピエントに注入する場合、体細胞組織に寄与する。
【００１５】
本明細書中で使用される、用語「トランスジェニック」は、その体細胞および生殖細胞中で導入遺伝子をコードし、トランスジェニック形質をその子孫に伝達することができる動物を意味する。
【００１６】
本明細書中の例はニワトリについて記載しているが、実験下でニワトリを他の家禽類（ウズラ、シチメンチョウ、キジなど）に置き換えて、本明細書中に開示の方法が首尾よく実施されることが合理的に予測され得る。
【００１７】
組織特異的発現のためにデザインされたＤＮＡ構築物の培養物中のＥＳ細胞への挿入により、卵白中にモノクローナル抗体などの有益な医薬品を発現するニワトリが作製されている。Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．のＰＣＴＵＳ０３／２５２７０号、ＷＯ０４／０１５１２３号を参照のこと。このような動物のための重要な実現技術は、クローン化細胞の遺伝子型が培養中で操作されるために十分に長く生存し続けることができる、真に長期間のＥＳ細胞培養物の作製および維持である。
【００１８】
しかし、ＥＳ細胞と異なり、始原生殖細胞（ＰＧＣ）は、短期間を基本としてのみ培養されている。一旦培養期間が数日間を超えて延長されると、これらの細胞は生殖系列に排他的に寄与する能力を失う。典型的には、現在の培養技術を使用して培養物中で維持されたＰＧＣは、増殖および増加しない。力強く成長しない場合、培養物は、「末期」であり、無期限に維持することができない。長期にわたり、これらの末期細胞培養物は分解され、細胞はその固有のＰＧＣ形態を失い、ＥＧ細胞に戻る。胚生殖細胞は、ＰＧＣと異なる形態を獲得し、生殖系列に限定されなくなり、胚発生の初期段階に注入した場合に体細胞組織に寄与する能力を得る。予め決定した遺伝子型をレシピエント胚の生殖系列に導入し、それにより、動物が所望の遺伝子型を次世代に伝達することができるようにするために、ＰＧＣは精子および卵の先祖であることが公知であるので、ＰＧＣは非常に魅力的である。
【００１９】
ＰＧＣの長期培養物からいくつかの重要な利益（養鶏業に依存する重要なニワトリ交配株の有益な遺伝子の特徴の維持など）が得られる。現在、有益な交配株を事故または疾患による喪失から回避するために、特別な措置が取られている。これらの措置には、種鶏（ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｓｔｏｃｋ）としての多数の株メンバーの維持および世界中の複数の場所でのこれらの種鶏の複製が必要である。交配株内の遺伝的多様性の保存も重要であるので、将来のために蓄えている多数の有益な動物を維持する必要がある。ＰＧＣ細胞培養物中のこれらの遺伝的特徴の保存により、大量の保存用交配集団の費用が回避される。
【００２０】
ＰＧＣの長期培養物はまた、遺伝子操作されたニワトリの卵からの医薬品の産生に非常に有益である。ＰＧＣを使用した遺伝子操作されたニワトリの産生には、培養物中で維持しながら遺伝子改変物をＰＧＣの遺伝子型に導入することが必要である。培養物中の標的細胞の広範な遺伝子操作技術は周知である。しかし、１つの主な困難は、培養物中でＰＧＣの遺伝子型を変化させるために、遺伝子改変物を導入し、首尾よく形質転換した細胞を選択するのに適切な期間、培養物の生存を長期間維持する一方で、トランスフェクトした細胞が培養物中で成長および増殖しなければならないということである。増殖することができる首尾よく形質転換した細胞を、クローンまたはほぼクローンの誘導から数日から数週間以内に、多数の細胞（例えば、１０４〜１０７細胞）を生成する能力によって区別する。創始細胞は、所望の遺伝子改変を保有する稀な細胞である。典型的には、これらの細胞が、周知の遺伝子改変テクノロジー（例えば、リポフェクションまたはエレクトロポレーション）の適用後に１０−４〜１０−７の頻度で培養物中に生成される。したがって、培養物中の細胞の産生には、細胞が増殖し、培養物中の稀な遺伝子改変された細胞を選択するのに十分な数の細胞を生成するための空間および栄養を細胞に提供するように継代することが必要である。
【００２１】
さらに、培養条件は、個別の遺伝子改変細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏでの遺伝子分析およびキメラ産生のために使用される１０４〜１０７個の細胞のコロニーへと細胞が増殖するために十分に頑強でなければならない。したがって、真のＰＧＣとしての細胞の遺伝子型および表現型を保存しながら培養期間を延長することができる場合、細胞を操作し、遺伝子系列コンピテント細胞が生殖腺に移動する胚発生時点でレシピエント胚に導入することができる。これらの操作されたＰＧＣは、得られた動物において成熟時に、精原細胞または卵原細胞の初期集団（すなわち、精子および卵子）に排他的に寄与するであろう。このような得られた動物では、体細胞組織全体はレシピエント胚に由来し、生殖系列はドナー細胞およびレシピエント胚の両方からの寄与を受けるであろう。生殖系列への合わさった寄与（ｍｉｘｅｄ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）ゆえに、これらの動物は、「生殖系列キメラ」として公知である。キメラの範囲に応じて、生殖系列キメラの子孫は、ドナー細胞またはレシピエント胚のいずれかに由来する。
【００２２】
ニワトリの生殖系列は、Ｘ段階（Ｅ−Ｇ＆Ｋ）の胚の胚盤葉上層由来の細胞として開始され、初期胚盤葉下層に入る（Ｋａｇａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｍｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｅｖ  ４８，５０１−５１０；Ｐｅｔｉｔｔｅ，（２００２）Ｊ  Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｓｃｉ  ３９，２０５−２２８）。胚盤葉下層が前方に進行するにつれて、前始原生殖細胞（ｐｒｅｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ）は、巨大なグリコーゲン負荷細胞として同定することができる生殖三日月環に迅速に進む。これらの形態基準による生殖系列中の細胞の最も早い同定は、インキュベーション開始から約８時間後（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，（１９５１）Ｊ  Ｍｏｒｐｈ  ８８，４９−９２によって確立された段階別分類を使用した４段階）である。始原生殖細胞は、これらが１２〜１７段階（Ｈ＆Ｈ）の間に脈管構造を介して移動するまで、４段階（Ｈ＆Ｈ）由来の生殖三日月環に存在する。この時点で、始原生殖細胞は、約２００個の細胞の小集団である。脈管構造から、始原生殖細胞が生殖隆起に移動し、性腺が分化するにつれて、卵巣または精巣に組み込まれる（Ｓｗｉｆｔ，（１９１４）Ａｍ．Ｊ．Ａｎａｔ．１５，４８３−５１６；Ｍｅｙｅｒ，（１９６４）Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．１０，１５４−１９０；Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．１８５，１３９−１５４）。
【００２３】
今まで試験されてきた全ての種では、始原生殖細胞は、ＥＧ細胞に分化することなく長期培養物中で増殖しなかった。従来のエレクトロポレーションまたはリポフェクションプロトコールによって遺伝子改変を導入するのに十分な数の細胞を産生するために、長期培養が必要である。典型的には、これらのプロトコールには、１０５〜１０７個の細胞が必要であり、したがって、全ての細胞分裂が、（１）同期に起こり、且つ（２）２つの生きた娘細胞を産生すると仮定すると、１つの前駆体からのこれらの細胞の産生には、１７〜２４回倍増する必要がある。細胞ゲノムへの遺伝子改変物の導入は稀な事象であり、典型的には、１×１０４〜１×１０６個の細胞に１回生じる。遺伝子改変後、細胞は、遺伝子改変物を保有および／または発現する１つの細胞からコロニーを確立することができなければならない。コロニーは、ＰＣＲまたはサザン分析によって分析して導入遺伝子の信頼性を評価することができる１０５〜１０７個の細胞集団に拡大することによって十分な数の細胞が得られなければならならず、次いで、１３〜１５段階（Ｈ＆Ｈ）のレシピエント胚に注入する。したがって、細胞集団を産生するためにさらに１７〜２４回の細胞分裂が必要であり、遺伝子改変細胞集団を産生するために全部で３４〜５８回倍増することが必要である。細胞周期が２４時間であると仮定すると、１３〜１５段階（Ｈ＆Ｈ）レシピエント胚への注入のための遺伝子改変された始原生殖細胞を産生するために、最短で３４日間、一般に５８日間の培養が必要である。次いで、注入した細胞は、生殖系列をコロニー形成し、機能的配偶子を形成し、受精後に新規の個体に発生することができなければならない。
【００２４】
ニワトリＰＧＣの長期培養細胞株を確立するためのいくつかの試みが報告されているが、これらの試みで、維持することができる細胞株が得られたものはなかった。これらのそれぞれの場合では、ＰＧＣの培養物がＥＧ細胞（ＷＯ００／４７７１７号；ＷＯ９９／０６５３３号；ＷＯ９９／０６５３４号；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．６５，３８９−３９５；Ｐａｒｋ  ａｎｄ  Ｈａｎ，（２０００）Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．５６，４７５−４８２を参照のこと）またはＥＧ細胞表現型を有する細胞（ＷＯ０１／１１０１９を参照のこと）に分化した。他の場合では、ＰＧＣ培養物は、たった５日間（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ２１，４９５−４９９；Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  １９，５６９−５７６）または１０日間（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６８，１６５７−１６６２）しか維持することができなかった。別の場合、ＰＧＣが２ヶ月間培養物中に維持されたが、細胞は非常にゆっくりしか増殖せず、培養物を継代することができなかった（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ５８，１５３１−１５３９）。ＰＧＣ培養物の継代する能力は、ＰＧＣの遺伝子改変および最も有益な農業および交配テクノロジーのために使用される長期培養物の極めて重要な性質である。
【００２５】
ＰＧＣ細胞培養物の増殖能力は、導入遺伝子の無作為な組み込みまたは部位特異的改変によってゲノムが変化した細胞の選択に不可欠である。両遺伝子改変型では、培養物中の細胞ゲノムへの安定な組み込み物としての遺伝子改変物を獲得した細胞の割合は非常に少なく、１万個〜１億個に１つ（すなわち、１×１０−４〜１×１０−８）の規模である。したがって、培養物中の細胞ゲノム中に遺伝子改変を作製する稀な事象由来の適切な細胞集団を得るためには、急速に成長する培養物を確立する能力が必要である。
【００２６】
ニワトリ始原生殖細胞は、１１〜１５段階の胚からの単離から数時間以内にレトロウイルスベクターを使用して遺伝子改変されている（Ｖｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ  ２５１，１７９−１８２）。しかし、導入遺伝子のサイズは、一般に、約１５ｋｂ未満、通常、１０ｋｂ未満、最も一般的には、８ｋｂ未満に制限され、ゲノムの部位特異的変化をこのテクノロジーを使用して作製することができない。培養トリＰＧＣゲノムへの１５ｋｂを超える外因性ＤＮＡの挿入が必要な安定な遺伝子改変は、以前に報告されていない。
【００２７】
長期ＰＧＣ細胞培養物中に安定に導入することができる外因性ＤＮＡ導入遺伝子のサイズのいかなる制限も、培養物中のＰＧＣゲノムの有益な遺伝子改変を達成する能力における極めて重要な制約であり、言い換えると、生殖系列を介してレシピエント胚の子孫に伝達することができる遺伝子改変物の型を制限する。例えば、トランスジェニックニワトリのゲノムへのタンパク質をコードする外因性ＤＮＡの導入は、非常に望ましい遺伝子改変である。このようなトランスジェニックニワトリ群を作製することができる場合、大量の有益なタンパク質をニワトリ中で発現させ、卵中で回収することができる。トリの卵は、生物活性タンパク質の理想的な貯蔵所を提供し、タンパク質を単離することができる都合のよい環境を提供する。鳥類は、広範な種々のトランスジェニックテクノロジーのための魅力的な候補でもある。しかし、遺伝子改変物を導入して生殖系列に伝達することができる培養細胞集団が存在しないために、トリ種への全範囲の哺乳動物トランスジェニック技術の適用は成功しなかった。最近の論文では、Ｓａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．は、「ＰＧＣを培養物中で維持し、移入後に発生性腺に移動する能力を喪失することなく遺伝子ターゲティング事象を同定するために必要な長期間にわたって増殖することができる可能性は低い」と述べている。Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｃｋ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２１，１１７９−１１８６，（２００４）。したがって、今日まで、遺伝的にトランスフェクトされたＰＧＣは作製されておらず、トリＰＧＣに導入された遺伝子改変物の成熟した生きた動物への伝達は証明されていない。
【００２８】
始原生殖細胞（ＰＧＣ）は、精子および卵子の前駆体であり、ほとんどの動物の発生初期段階で体細胞組織から分離される。本発明に従って、生殖系列への関わりを維持しながら、ニワトリＰＧＣを単離し、培養し、遺伝子改変する。さらに、ＰＧＣを、胚生殖細胞（ＲＧＣ）に分化するように誘導するが、これは、その体細胞組織への関わりにおいてニワトリ胚幹細胞（ＥＳＣ）と類似している。これらのＰＧＣは、体細胞組織および生殖系列に関わり、ニワトリゲノムの遺伝子改変のための固有の資源を提供する。
【００２９】
本明細書中に記載の培養物中に維持されたＰＧＣは、培養物中で維持されながら特徴的なＰＧＣ形態を維持する。ＰＧＣ形態を、直接的観察によって観察することができ、培養物中の細胞成長を、培養物中で細胞を確実に増殖させるための一般的な技術によって評価する。増殖する細胞培養物を、非末期と定義し、２つの異なる時点のうちの後の時点の方が培養物中の細胞数が多いことが認められる。本発明の培養物中のＰＧＣは、任意の特定の培養物中に１×１０５個またはそれを超える細胞を有することができ、この数は、長期にわたって増加することが認められる。したがって、本発明は、培養物の寿命のうちのより早い時点と比較して、数日後、数週間後、または数ヵ月後に多数の細胞を含む増殖ＰＧＣ培養物を含む。理想的には、培養物は、少なくとも１×１０５個の細胞を含み、培養物の任意の成長期間後により多数の細胞を有することが認められ得る。さらに、ＰＧＣは、培養物中での主な種であることが認められ得、その結果、非ニワトリ支持細胞による最小の寄与を考慮した場合、細胞培養物の増殖成分は、他のニワトリ由来細胞を実質的に除外して、本質的に、ニワトリ始原生殖細胞からなる。
【００３０】
培養物は、既存の培養物由来の細胞のサンプルまたはアリコートを分離することができ、且つ、新規の培養培地中に入れた場合に強い成長を示すような継代による増殖特性も示す。定義により、細胞培養物を継代する能力は、細胞培養物が成長および増殖し、且つ末期ではないことを示す。さらに、本発明の細胞は、数回の継代後に生殖系列キメラを作製し、ＰＧＣ形態を維持する能力を証明する。本明細書中に記載のように、この増殖は、外因性ＤＮＡ配列の安定な組み込みに適切な任意の細胞培養物の不可欠な特徴である。
【００３１】
本発明のＰＧＣを、任意の公知の技術によって得て、本明細書中に記載の培養条件で成長させることができる。しかし、全血を１５段階の胚から取り出し、下記の培養培地に直接入れることが好ましい。このアプローチは、ＰＧＣを培地に入れる前に処理および分離工程に供する文献に記載の他のアプローチと異なる。従来の培養技術と異なり、本発明の培養物および方法は、最初は培地中に共存し得る全血由来のＰＧＣと他の細胞との間の頑強な差分成長に依存し、それにより、本明細書中に記載の培養物中のＰＧＣの巨大集団が得られる。したがって、本発明は、培養物中で巨大な細胞濃縮物に成長し、無制限の回数の継代を行うことができ、培養物中のＰＧＣが本質的に成長および増殖している細胞のみであるような頑強な成長および増殖を示す、全血に直接由来するＰＧＣの培養物を提供する。これらの培養条件によって本発明の重要な利点が得られ、それにより、培養物中のＰＧＣが特に簡潔且つ効率的に回収、保存、および維持されることを可能にし、培養ＰＧＣ細胞の遺伝子型が子孫に伝達される生殖系列キメラを作製するためのドナー細胞の容易に利用可能な供給源が得られる。
【００３２】
本発明者らによって培養物中に維持されたＰＧＣは、非末期培養物の存在を証明し、現在、培養物中で少なくとも３２７日間存在している。これらの細胞は、４０、６０、８０、または１００日目（およびその間の全ての整数値）に認められた様式と同一の様式で成長および増殖し、細胞は、下記のように生殖系列キメラに寄与し続け、したがって、真のＰＧＣの主に際立った特徴（すなわち、レシピエント胚に導入した場合の生殖系列への排他的寄与）を示す。本発明の培養方法は、赤血球および他の代謝活性細胞型を含む全血を使用すること、細胞の混合物を始原生殖細胞と共に培養物中に入れること、および本質的に本明細書中に記載の長期培養の特徴を示すトリＰＧＣからなるように培養物を進化させることを含む。本明細書中に記載の細胞培養テクノロジーにより、任意の細胞分離過程または技術が回避され、このテクノロジーは、培養物中に主にＰＧＣを得るための差分成長条件のみに依存する。確立され、培養されたＰＧＣ細胞の供給源としての全血の使用により、培養物の確立および農業またはトランスジェニック目的での細胞の使用の有効性および有用性において実用上の利点が得られる。したがって、本発明の１つの態様では、培養培地は、ＢＲＬ（バッファローラット（ｂｕｆｆａｌｏ  ｒａｔ）肝細胞）で馴化され、線維芽細胞成長因子、幹細胞因子、およびニワトリ血清を含む。培地の特徴を、以下により詳細に記載する。
【００３３】
本発明の１つの態様では、遺伝的に同一であり、増殖して長期細胞培養物が得られる多数のＰＧＣを有する培養物を確立する。これらのＰＧＣを繰り返し使用して、レシピエント胚への増殖長期培養物由来のＰＧＣの導入によって生殖系列キメラを作製することができる。生殖系列キメラを作製するためにＰＧＣを使用する以前の試みでは、作製することができるキメラ数は、ＰＧＣ表現型を保持した真のＰＧＣの長期培養物を成長させることが不可能であることにより、本質的に制限される。本発明によって長期培養が可能であるので、かなり多数の生殖系列キメラを同一の細胞培養物から作製することができ、遺伝的に同一のＰＧＣ由来生殖系列を有する生殖系列キメラの全集団を確立することができる。したがって、本発明の１つの態様は、多数の（３個超、４個超、５、１０、１５、および２０個超が含まれる）生殖系列キメラ動物の作製であり、これらは全てその生殖系列中に遺伝的に同一のＰＧＣ由来細胞を有する。本発明の別の態様は、年齢差を集団内で有する、その生殖系列中に遺伝的に同一のＰＧＣ由来細胞を有する生殖系列キメラ集団の作製であり、このことは、生殖系列キメラを作製するための同一の長期細胞培養物の使用を反映する。年齢差は、始原生殖細胞を長期間培養するための現在利用可能な能力を超え、それは凍結することなく１９０日間にもなる。したがって、本発明は、細胞を凍結することなく、４０日間、６０日間、８０日間、１００日間、１９０日間などまたはその間の任意の他の整数値を超えて年齢が異なる、その生殖系列中に遺伝的に同一のＰＧＣ由来細胞を有する２個またはそれを超える生殖系列キメラを含む。本発明はまた、これらの生殖系列キメラを作製するために使用される非末期ＰＧＣ培養物の存在と共にその生殖系列中に遺伝的に同一のＰＧＣ由来細胞を有する性的に成熟した生殖系列キメラの存在を含み、これらからさらなる生殖系列キメラを作製することができる。
【００３４】
ＰＧＣを非常に安定な様式で培養物中に維持することができるので、細胞を低温保存し、解凍して、培養物中に維持されたＰＧＣの表現型によって定義された子孫を作製する能力を有する生殖系列キメラを作製するための長期保存方法を得ることもできる。
【００３５】
多数の生殖系列キメラを産生する能力により、生殖系列キメラの子孫にＰＧＣ由来遺伝子型を伝達する能力も得られる。したがって、本発明は、生殖系列中に遺伝的に同一のＰＧＣ由来細胞を有する生殖系列キメラの両集団を含むが、その遺伝子型および表現型が培養物中で成長したＰＧＣの遺伝子型によって完全に決定される生殖系列キメラの子孫も含む。生殖系列を介したＰＧＣ由来の表現型の伝達は、２０羽を超えるトリで認められ、８６％もの伝達率であった。したがって、本発明は、培養物中に保持された始原生殖細胞の遺伝子型の生殖系列伝達によって作製された生殖系列キメラの子孫を含む。したがって、本発明は、定義された表現型のＰＧＣを含む始原生殖細胞培養物、その生殖系列の一部と同一の始原生殖細胞を有する生殖系列キメラ、ならびに培養物中のＰＧＣによって決定される遺伝子型および表現型を有する生殖系列キメラの子孫のそれぞれの存在を含む。
【００３６】
前に記載のように、長期ＰＧＣ培養物の存在によって培養物中の細胞を外因性タンパク質をコードするＤＮＡで安定にトランスフェクトする能力、または他の望ましい遺伝子操作物を導入すること（遺伝子挿入およびトランスジェニック動物のノックアウトなど）ができる。したがって、培養物中の上記ＰＧＣ集団、生殖系列キメラ、および生殖系列キメラの子孫の全てはまた、始原生殖細胞のゲノムに安定に組み込まれ、生殖系列キメラの生殖系列に伝達され、生殖系列キメラの子孫から構成される後の世代に伝達されるＤＮＡ構築物から構成され得る。
【００３７】
始原生殖細胞は、実質的に任意の操作遺伝子構築物を含むことができ、これを使用して、現在レトロウイルステクノロジー（ゲノムの部位特異的改変および／またはモノクローナル抗体などの全長外因性タンパク質をコードする導入遺伝子の挿入が含まれる）に課されているサイズの制約を超える遺伝子改変物をトリに導入することができる。好ましい実施形態では、遺伝子操作されたニワトリは、卵中に外因性タンパク質を発現するために組織特異的様式で卵管中に外因性タンパク質を発現する。
【００３８】
本発明のＰＧＣ培養物は、導入遺伝子をＰＧＣのゲノムに安定に組み込むようになり、培養物中の非改変細胞から遺伝子操作細胞を単離し、レシピエント胚に改変細胞を導入するのに十分に安定である一方で、培養されたＰＧＣが得られたキメラ中の生殖系列に寄与する能力が維持される。導入遺伝子の発現が組織特異的プロモーターによって調節される場合、導入遺伝子は、ＰＧＣ中に発現されないであろう。これらの場合、導入遺伝子は、生殖系列キメラのトランスジェニック子孫中の選択された組織中で発現するであろう。全ゲノムを細胞ハイブリッド形成によって移入することができ、微小核細胞によってインタクトな染色体を移入することができ、染色体媒介性遺伝子移入によってサブ染色体セグメントを移入することができ、ＤＮＡ媒介性遺伝子移入によってキロベース範囲のＤＮＡフラグメントを移入することができる（Ｋｌｏｂｕｔｃｈｅｒ，Ｌ．Ａ．ａｎｄ  Ｆ．Ｈ．Ｒｕｄｄｌｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５０：５３３−５５４，１９８１）。微小核細胞媒介性染色体移入（ＭＭＣＴ）によってインタクトな染色体を移入することができる（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ  Ｒｕｄｄｌｅ，Ｆ．Ｈ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４：３１９−３２３，１９７７）。
【００３９】
遺伝子操作されたニワトリが得られるＰＧＣの安定な長期培養物は、トリ遺伝子組換えにおけるいくつかの適用（医薬産業のためのタンパク質の産生、その卵中にヒトモノクローナル抗体を蓄積するニワトリの産生、およびかなり多数の他の適用（ヒト配列ポリクローナル抗体が含まれる）のためのトリゲノムの部位特異的変化が含まれる）のために必要である。
【００４０】
レシピエント胚中のドナー由来ＰＧＣとレシピエント由来ＰＧＣとの比を変化させて、ＰＧＣ由来のキメラ中の生殖系列のコロニー形成を助けることができる。発育中のニワトリおよびウズラ胚では、ブスルファンへの曝露により、始原生殖細胞集団が生殖三日月環から生殖隆起に移動するにつれて、始原生殖細胞集団が大幅に減少するか消失する（Ｒｅｙｎａｕｄ（１９７７ａ）Ｂｕｌｌ  Ｓｏｃ．Ｚｏｏｌ．Ｆｒａｎｃａｉｓｅ  １０２，４１７−４２９；Ｒｅｙｎａｕｄ（１９８１）Ａｒｃｈ  Ａｎａｔ．Ｍｉｃｒｏ．Ｍｏｒｐｈ．Ｅｘｐ．７０，２５１−２５８；Ａｉｇｅ−Ｇｉｌ  ａｎｄ  Ｓｉｍｋｉｓｓ（１９９１）Ｒｅｓ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．５０，１３９−１４４）。２４〜３０時間のインキュベーション後にブスルファンを卵黄に注入する場合、５０〜５５時間のインキュベーション後に始原生殖細胞が脈管構造に再導入され、ドナー由来始原生殖細胞と共に生殖系列が再配置され、その後、ドナー由来配偶子が産生される（Ｖｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．９８，６３７−６４１；Ｂｒｅｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｒｉｔ．Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｓｃｉ．３５  ２４１−２４７）。
【００４１】
本発明の方法は、ニワトリ（１５段階の胚の全血など）からＰＧＣを得る工程と、ＰＧＣを培養物中に入れる工程と、ＰＧＣを増殖させてその数を増加させ、多数の継代を可能にする工程と、これらの長期細胞培養物から生殖系列キメラを作製する工程と、培養されたＰＧＣによって得られる遺伝子型を有する生殖系列キメラの子孫を得る工程とを含む。本発明の方法はまた、培養物中のＰＧＣ集団に遺伝子改変物を挿入して安定にトランスフェクトされたＰＧＣを作製する工程と、安定に組み込まれた導入遺伝子を保有するこの集団から細胞を選択する工程と、安定に組み込まれた導入遺伝子を保有する遺伝子改変細胞をレシピエント胚に注入する工程と、胚を生殖細胞中に遺伝子改変を含む生殖系列キメラに発生させる工程と、生殖系列キメラを性的に成熟するまで飼育する工程と、生殖系列キメラを交配してトランスジェニック子孫を得る工程とを含み、ここで、遺伝子改変は培養ＰＧＣに由来する。
【００４２】
以下に、ＰＧＣを１２〜１７段階（Ｈ＆Ｈ）の胚の血液から単離することができ、細胞が迅速に増殖してそのＰＧＣ表現型を維持し、ＰＧＣを毎日または２〜３日間隔で継代することができ、少なくとも培養１１０日後にＰＧＣは生殖系列をコロニー形成するが体細胞組織をコロニー形成せず、１１０日間の培養物中に存在する細胞から生存能力のある子孫を得ることができ、ＰＧＣを導入遺伝子でのトランスフェクションによって遺伝子改変することができ、遺伝子改変されたＰＧＣを単離して遺伝子改変されたＰＧＣのコロニーに増殖することができるという予想外の所見を記載する。
【００４３】
本発明によれば、ニワトリＰＧＣ細胞株は、１４〜１６段階（Ｈ＆Ｈ）の胚から採取した血液に由来し、巨大な丸い形態をしている（図１）。これらの細胞は、長期培養後のその形態およびＰＧＣ由来子孫を得る能力によってニワトリＰＧＣであることが確認される。さらに、ＰＧＣ培養物は、生殖系列特異的遺伝子であるＤａｚｌおよびＣＶＨを発現し（図２）、ＣＶＨタンパク質は、培養物中の細胞によって産生される（図３）。培養物中のＰＧＣはテロメラーゼも発現し（図４）、これらが重要な表現型を有することを示す。さらに、ＰＧＣは、適切な培養条件で胚生殖（ＥＧ）細胞を生じる（図５）。マウスおよびヒトのＰＧＣは、類似の様式で処理した場合にＥＧ細胞を生じると類推される。マウスＥＧ細胞は体細胞組織に寄与し、キメラの黒色の羽の色素沈着によって示されるように、ニワトリＥＧ細胞も体細胞組織に寄与する（図６）。ニワトリＰＧＣは遺伝子改変されていることが、サザン分析によって示される（図７）。この実施形態では、ＣＸプロモーターをＰＧＣゲノムに安定に組み込み、これを使用してＰＧＣゲノムに共に組み込まれたアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードする遺伝子の発現を容易にし、これを使用して培養培地に添加したネオマイシンへの耐性を付与し、遺伝子改変されたＰＧＣを選択する。
【実施例】
【００４４】
（実施例１．ニワトリＰＧＣ培養物の誘導）
１４〜１７段階（Ｈ＆Ｈ）の胚の終洞から採取した２〜５μＬの血液を、幹細胞因子（ＳＣＦ、６ｎｇ／ｍｌまたは６０ｎｇ／ｍｌ）、ヒト組換え線維芽細胞成長因子（ｈｒＦＧＦ、４ｎｇ／ｍｌまたは４０ｎｇ／ｍｌ）、１０％ウシ胎仔血清、および８０％ＫＯ−ＤＭＥＭ馴化培地を含む培地を含む９６ウェルプレート中でインキュベートした。好ましくは、１５〜１６段階（Ｈ＆Ｈ）の胚の脈管構造から１〜３μＬを採取した。９６ウェルプレートのウェルに、照射ＳＴＯ細胞を３×１０４細胞／ｃｍ２の濃度で播種した。
【００４５】
ＫＯ−ＤＭＥＭ馴化培地を、１０％ウシ胎仔血清、１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸塩、１×ヌクレオシド、１×非必須アミノ酸、および０．１ｍＭβ−メルカプトエタノールを補足し、５％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ中での密集までのＢＲＬ細胞の３日間の成長によって調製した。２４時間後、培地を除去し、培地の新規のバッチを３日間馴化した。これを３回繰り返し、３つのバッチを合わせてＰＧＣ培養培地を作製した。
【００４６】
約１８０日間の培養後、１つのＰＧＣ株を、４０％  ＫＯ−ＤＭＥＭ馴化培地、７．５％ウシ胎仔血清、および２．５％ニワトリ血清から構成される培地中で成長させた。これらの条件下で、ＰＧＣの倍加時間は約２４〜３６時間であった。
【００４７】
培養開始時の主な細胞型は、胎仔赤血球であった。３週間以内の主な細胞型はＰＧＣの細胞型であった。２つのＰＧＣ細胞株は、各胚から開始された１８の培養物に由来した。
【００４８】
ＰＧＣ株を９ヶ月にわたって培養し、丸い形状を維持し、付着しないままである（図１ＡおよびＢ）。１０％血清および１０％ＤＭＳＯを含むＣＯ２依存培地中での低温保存後に、ＰＧＣは首尾よく解凍された。
【００４９】
（実施例２．培養ＰＧＣはＣＶＨおよびＤａｚｌを発現する）
ＣＶＨは、ショウジョウバエ中の生殖系列特異的遺伝子ＶＡＳＡのニワトリホモログであり、その発現はニワトリの生殖系列内の細胞に限定され、生殖三日月環中の約２００個の細胞によって発現される（Ｔｓｕｎｅｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ＣＶＨ発現は雄の生殖系列の適切な機能に必要であり、ＣＶＨ機能の喪失により雄マウスが不妊症を引き起こす（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。Ｄａｚｌの発現は、カエル（Ｈｏｕｓｔｏｎ  ａｎｄ  Ｋｉｎｇ，２０００）、アホロートル（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、マウス（Ｓｃｈｒａｎｓ−Ｓｔａｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、ラット（Ｈａｍｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、およびヒト（Ｌｉｆｓｃｈｉｔｚ−Ｍｅｒｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）中の生殖系列に制限される。Ｄａｚｌの欠失により、トランスジェニックマウスの精子形成欠損が起こる（Ｒｅｉｊｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。
【００５０】
３２日後、ＰＧＣをＰＢＳで洗浄し、ペレット化し、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ  Ｄｉｒｅｃｔ  ｍＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｍＲＮＡを組織サンプルから単離した。次いで、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のためのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲシステムを使用して、９μｌのｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。２μｌのｃＤＮＡを、その後のＰＣＲ反応で使用した。ＣＶＨ配列（アクセッション番号ＡＢ００４８３６）、Ｄａｚｌ配列（アクセッション番号ＡＹ２１１３８７）、またはβアクチン配列（アクセッション番号ＮＭ＿２０５５１８）由来のプライマー配列は、以下であった。
【００５１】
【化１】
2008529483.tif 000003
プライマーＶ−１およびＶ−２を使用して、ＣＶＨ転写物から７５１ｂｐのフラグメントを増幅させた。プライマーＤａｚｌ−１およびＤａｚｌ−２を使用して、Ｄａｚｌ転写物から５３６ｂｐのフラグメントを増幅させた。プライマーＡｃｔ−ＲＴ−１およびＡｃｔ−ＲＴ−Ｒを使用して、内因性ニワトリβ−アクチン転写物から５９７ｂｐのフラグメントを増幅させた。製造者の説明書にしたがってＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＰＣＲ反応を行った。
【００５２】
（実施例３．ＰＧＣはＣＶＨタンパク質を発現する）
Ｔ−Ｐｅｒ組織タンパク質抽出キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して新たに単離したＰＧＣからタンパク質を抽出した。１％  ＮＰ４Ｏ、０．４％デオキシコール酸塩添加した６６ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ，Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）中での細胞の溶解によって細胞からタンパク質を抽出した。サンプルを、４〜１５％  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬレディゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で泳動した。膜に移した後、説明書の通りにＳｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してウェスタンブロットを行った。一次抗体としてウサギ抗ＣＶＨ抗体を使用し（３００倍希釈）、二次抗体としてＨＲＰ抱合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、１００，０００倍希釈）を使用した（図３）。
【００５３】
（実施例４．培養ＰＧＣはテロメラーゼを発現する）
始原生殖細胞をペレット化し、ＰＢＳで洗浄し、その後、分析まで−８０℃で凍結した。細胞抽出物を調製し、テロメア反復増幅プロトコール（ＴＲＡＰ）（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）に基づいたＴＲＡＰｅｚｅテロメラーゼ検出キット（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、製造者の説明書にしたがって分析した。図４。
【００５４】
（実施例５．胚生殖（ＥＧ）細胞は、ＰＧＣ培養物に由来し得る）
細胞をプレートに接着させ、ＦＧＦ、ＳＣＦ、およびニワトリ血清を除去し、細胞をＥＳ細胞培養物について用いられた条件と同一の条件下で培養することによって、ニワトリＥＧ細胞をＰＧＣから誘導した（ｖａｎ  ｄｅ  Ｌａｖｏｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６  Ｈｉｇｈ  Ｇｒａｄｅ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｈｉｍｅｒａｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２，３１−４１；ｖａｎ  ｄｅ  Ｌａｖｏｉｒ  ａｎｄ  Ｍａｔｈｅｒ−Ｌｏｖｅ（２００６）Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ；Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒａ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，印刷中）。ｃＥＧの形態は、ｃＥＳ細胞の形態と非常に似ている（図５Ａ、Ｂ）。ｃＥＧ細胞をＸ段階（Ｅ−Ｇ＆Ｋ）の胚に注入する場合、ｃＥＧ細胞は体細胞組織をコロニー形成して、ｃＥＳ細胞を使用して作製されたキメラと同一と思われるキメラを幼鳥として作製する能力を有する（図６）。新規の誘導されたトランスジェニックＰＧＣ株およびクローン誘導されたトランスジェニックＰＧＣ株の両方でニワトリＥＧ細胞が認められる。ＧＦＰ陽性ＰＧＣ由来のＥＧ細胞のサザン分析（図１１）により、ＥＧ細胞がＰＧＣ起源であることが証明された。
【００５５】
（実施例６．培養雄ＰＧＣは、雄鶏中で機能的配偶子を生じる）
雄始原生殖細胞株を、各Ｂａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋ胚から誘導した。株の確立後、細胞を、１３〜１５段階（Ｈ＆Ｈ）の胚に注入した。表現型的に、孵化したニワトリは白色レグホンに類似していた。雄を性的に成熟するまで飼育し、Ｂａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋ雌鶏と交配させた（表１）。黒色の子孫は、注入したＰＧＣの生殖系列伝達を示す。雄鶏の生殖系列伝達率は、１％未満から８６％まで様々であった。
【００５６】
（表１：１４〜１５段階（Ｈ＆Ｈ）の胚の脈管構造に注入した雄始原生殖細胞の生殖系列伝達）
【００５７】
【表１】
2008529483.tif 000004
＊各値は、１つのキメラの生殖系列伝達率を示す。
【００５８】
ＰＧＣを、Ｘ段階の胚の胚下腔に注入することもできる。培養２０９日後に１０００個または５０００個のＰＧＣを照射した胚に注入した。孵化した雄ニワトリを性的に成熟するまで成長させ、交配して生殖系列伝達を試験した。試験した４羽の雄鶏のうちの３羽で生殖系列伝達が認められ、その頻度は０．１５〜０．４５％で変化した。これは、原腸形成前に注入した場合にＰＧＣが生殖系列をコロニー形成することができることを示す。雄ＰＧＣの生殖系列伝達は、１４羽の雌キメラ由来の１，６２５羽の子孫で認められなかった。
【００５９】
（実施例７．培養雌ＰＧＣは雌鶏で機能的配偶子を生じる）
６６日間培養したＢａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋ胚由来の雌ＰＧＣを、１３〜１６段階（Ｈ＆Ｈ）の白色レグホン胚に注入し、孵化した全ニワトリは、表現型が白色レグホンであった。雌鶏を性的に成熟するまで飼育し、Ｂａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋ雄鶏と交配した（表１）。雌ＰＧＣは雌キメラを介して伝達され、その頻度は６９％までであった（表１）。
【００６０】
（表２：１４〜１５段階（Ｈ＆Ｈ）の胚の脈管構造に注入した雌始原生殖細胞の生殖系列伝達）
【００６１】
【表２】
2008529483.tif 000005
＊各値は、１つのキメラの生殖系列伝達率を示す。
【００６２】
雌ＰＧＣを、雄レシピエント白色レグホン胚にも注入した。雄キメラを性的に成熟するまで飼育し、Ｂａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋ雌鶏と交配した。雌ＰＧＣの生殖系列伝達は、３羽の試験雄鶏の５０６羽の子孫で認められなかった。
【００６３】
（実施例８．ＰＧＣ由来の子孫は生殖的に正常である）
３羽の雄および４羽の雌の非トランスジェニックＰＧＣ由来の子孫を互いに交配させた。５３％と１００％との間の卵が受精し（表３）、７９％と１００％との間の受精卵から胚が孵化胚を生じ（表３）、ＰＧＣ由来の子孫が生殖的に正常であることを示す。
【００６４】
（表３：生殖系列キメラ雄鶏から得たＰＧＣ子孫の生殖パラメーター）
【００６５】
【表３】
2008529483.tif 000006
（実施例９．ネオマイシンおよびピューロマイシンに対するＰＧＣの感受性）
全組織中で強く発現するＣＸ−プロモーターの調節下で抗生物質耐性を発現する細胞の成長に必要なピューロマイシンおよびネオマイシンの濃度を確立するために、ネオマイシンおよびピューロマイシンに対するＰＧＣの感受性を決定した（Ｏｒｉｇｅｎ  Ｔｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、未発表）。これらの実験は、全ての非トランスフェクション細胞を消失するために１０日間に３００μｇ／ｍｌの濃度のネオマイシンが必要であることを証明した。０．５μｇ／ｍｌの濃度のピューロマイシンは、７〜１０日間以内にＰＧＣを消失させるのに十分であった。
【００６６】
（実施例１０．ＰＧＣの遺伝子改変）
２０μｇ（２０μｌ）のＮｏｔＩ線状化ｃｘ−ｎｅｏ導入遺伝子（図８を参照のこと）を、１６７日間培養した５．８×１０６個のＰＧＣ集団に添加した。細胞およびＤＮＡを、８００μｌのエレクトロポレーション緩衝液に再懸濁し、６７２ボルトおよび持続時間１００μ秒の方形波パルスを８回印加した。１０分後、細胞を培養培地中に再懸濁し、２４ウェルプレートに等分した。エレクトロポレーションから２日後に、培地１ｍｌあたり３００μｇのネオマイシンを添加して、ｃｘ−ｎｅｏ導入遺伝子を発現する細胞を選択した。細胞を、１９日間選択下に維持した。１９日後、細胞を選択から取り出し、分析のために拡大した。ＰＧＣの比率を、３００μｇ／ｍｌ下にさらに３１日間保持することにより、ＰＧＣが抗生物質に機能的に耐性を示すことが証明された。
【００６７】
図８に関して、プラスミドコントロールのために、ｃｘ−ｎｅｏプラスミドＤＮＡをＮｏｔＩで線状化し、次いで、ＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩで消化して、ＨｉｎｄＩＩＩ消化で認められたインタクトなプラスミドよりもわずかに小さなフラグメント（５ｋｂ）を産生した。約２ｋｂのｃｘ−ｎｅｏプラスミドの内部フラグメントを、ＳｔｙＩまたはＮｃｏＩでの消化によって放出させた。約２．６ｋｂのより大きな内部フラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩでの消化によって放出させた。ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩでのＰＧＣ株由来のゲノムＤＮＡの消化により、６ｋｂを超えるバンドが明らかとなり、これは、ｃｘ−ｎｅｏ導入遺伝子がＰＧＣゲノムに組み込まれたことを示す。ＫｐｎＩとのＳｔｙＩ、ＮｃｏＩ、およびＥｃｏＲＩでの消化後にプラスミドＤＮＡ中に明らかとなった内部フラグメントは、ＰＧＣのゲノムＤＮＡ中にも存在し、ｃｘ−ｎｅｏ導入遺伝子が変化することなくＰＧＣゲノムに組み込まれたことを示す。従来の導入遺伝子構築技術を使用して、調節エレメントなどのさらなるエレメントを組み込むことができ、その例は組織特異的プロモーターおよびタンパク質をコードする外因性ＤＮＡである。モノクローナル抗体は、外因性ＤＮＡによってコードされるタンパク質の好ましい例であり、ヒトモノクローナルはその好ましい種である。
【００６８】
上記のように、トランスジェニック動物を産生するためのＰＧＣの遺伝子改変の能力は、非常に少数の種でのみ証明されている。類似の遺伝子操作を、マウスでＥＳ細胞を使用して行われる遺伝子操作を参照することによって、ニワトリＰＧＣ中で行うことができる。マウスでは、相同組換えの個別の使用およびその後のキメラ子孫およびトランスジェニック子孫の産生のための胚幹（ｍＥＳ）細胞への染色体移入は周知である。部位特異的相同組換えまたは遺伝子ターゲティングの強力な技術が開発されている（Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．ａｎｄ  Ｍ．Ｒ．Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ  ５１：５０３−５１２，１９８７；Ｗａｌｄｍａｎ，Ａ．Ｓ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１２：４９−６４，１９９２による概説を参照のこと）。クローン化ＤＮＡの挿入（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．４：７６１−７６３，１９９４）ならびにＣｒｅ−ｌｏｘＰ系技術による染色体フラグメントの操作および選択（Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．９：３７６−３８５，１９９５；Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｓｏｌｉｓ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７８：７２０−７２４，１９９５；米国特許第４，９５９，３１７号；同第６，１３０，３６４号；同第６，１３０，３６４号；同第６，０９１，００１号；同第５，９８５，６１４を参照のこと）は、安定な遺伝子キメラを産生するための遺伝子操作およびｍＥＳ細胞への遺伝子移入に利用可能である。哺乳動物系で有用であることが証明されている多数のこのような技術は、必要な培養物が利用可能である場合、ニワトリＰＧＣに適用することが可能であろう。
【００６９】
始原生殖細胞のゲノムは、一般に、静止状態にあると考えられ、したがって、クロマチンは非常に濃縮された状態であり得る。従来のエレクトロポレーションプロトコールによる広範な試験により、ＰＧＣゲノムに遺伝子改変物を導入するためには特別な方法が必要であることが示唆される。下記のように、導入遺伝子をニワトリβ−グロビン遺伝子座由来のインスレーターエレメントで取り囲んで発現を増強することができる。β−グロビンインスレーターエレメントを含めることによって成長することができるクローンが日常的に産生され、これを分析し、レシピエント胚に注入する。
【００７０】
抗生物質（例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ｈｉｓ−Ｄ、ブラストサイジン、ゼオシン、およびｇｐｔ）耐性遺伝子の発現を駆動するために使用される従来のプロモーターは、遍在的に発現する。典型的には、プロモーターは、β−アクチン、ＣＭＶ、またはユビキチンなどの「ハウスキーピング」遺伝子に由来する。全細胞中で典型的に高レベルで発現するので構成的プロモーターが有用である一方で、これらは、ニワトリの全寿命にわたって、全組織といわないまでも、ほとんどの組織で発現し続ける。一般に、発現は、発現を必要とする組織および発生段階のみに制限されるべきである。始原生殖細胞の選択のために、発現を必要とする期間は、培地中に抗生物質が存在する場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでその耐性を示す期間である。一旦細胞が胚に挿入されると、選択マーカー（すなわち、抗生物質耐性遺伝子）の発現が終了することが好ましい。抗生物質耐性遺伝子の発現を制限するために、「神経誘導に対する初期応答」（ＥＲＮＩ）プロモーターを使用する。ＥＲＮＩは、発生の初期段階（例えば、Ｘ段階（Ｅ−Ｇ＆Ｋ））および培養物中で選択的に発現する遺伝子であり、したがって、このプロモーターを使用して抗生物質耐性遺伝子の発現を駆動し、遺伝子改変物を保有するＰＧＣを選択する。発生の初期段階でＥＲＮＩのみが発現するので、抗生物質耐性を付与する遺伝子は成熟動物中で発現しない。
【００７１】
（実施例１１．長期ＰＧＣ細胞培養物の均質性）
長期培養後のＰＧＣ培養物の均質性を決定するために、ＥＳ、ＥＧ、ＤＴ４０（ニワトリＢ細胞株）、およびＰＧＣを、抗ＣＶＨ、ニワトリ管ホモログに対する抗体、および１Ｂ３抗体で染色した（Ｈａｌｆｔｅｒ，Ｗ．，Ｓｃｈｕｒｅｒ，Ｂ．，Ｈａｓｓｅｌｈｏｒｎ，Ｈ．Ｍ．，Ｃｈｒｉｓｔ，Ｂ．，Ｇｉｍｐｅｌ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｅｐｐｅｒｌｅｉｎ，Ｈ．Ｈ．，Ａｎ  ｏｖｏｍｕｃｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ｍｉｇｒａｔｉｎｇ  ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｉｃｋ  ａｎｄ  ｒａｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２，９１５−２３．１９９６））。ＣＶＨ抗体の発現は生殖細胞に制限され、したがって、抗ＣＶＨ抗体は生殖細胞の信頼できるマーカーである。１Ｂ３抗原は、性腺の移動およびコロニー形成の間にニワトリＰＧＣの表面上に存在するオボムチン様タンパク質を認識する。
【００７２】
細胞を、ＣＭＦ／２％ＦＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで５分間固定し、再度洗浄した。管を染色すべき細胞アリコートに０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を１〜２分間浸透させた。一次抗体を２０分間添加し、細胞を２回洗浄し、二次抗体（ＣＨＶおよびコントロールのためのＡｌｅｘａ  ４８８抗ウサギＩｇＧならびに１Ｂ３のためのＡｌｅｘａ  ４８８抗ウサギＩｇＭ）と共に１５分間インキュベートした。コントロールとして、細胞のアリコートを、二次抗体のみで染色した。さらに２回の洗浄後、ＦＡＣＳ分析用の細胞を調製した。
【００７３】
図９に関して、ＤＴ４０細胞、ＥＳ細胞、およびＥＧ細胞は、ＣＨＶおよび１Ｂ３抗体で染色した場合、全てバックグラウンドを示す。しかし、ＰＧＣは、ＣＶＨ抗体および１Ｂ３抗体の両方でさらにより強く染色される。ＣＶＨおよび１Ｂ３のいずれでも染色されないＰＧＣの小集団が存在し、細胞の小集団がＰＧＣ表現型を示さないことを示す。２つの親ＰＧＣ株およびＰＧＣ１３親細胞株由来の４つのトランスフェクトされた細胞株（Ｇ−０９、Ｐ８４、Ｐ９７／６、およびＰ９７／３３）を、管および１Ｂ３抗体（ＰＧＣ１３および１０２）を使用して試験した。全て同一のパターンを示し、これは、種々のＰＧＣ培養物が同一の高い比率でＰＧＣ表現型を発現する細胞を含むことを示す。
【００７４】
（実施例１２．始原生殖細胞の遺伝子改変）
環状ＣＸ−ＧＦＰプラスミドを使用したエレクトロポレーションにより、ＰＧＣの一過性トランスフェクション率は１〜３０％の間で変動することが明らかとなった。８回の１００μ秒および８００Ｖの方形波パルスを使用して、本発明者らは、ＣＸ−ｎｅｏ構築物を保有するＰＧＣ細胞を得、Ｇ−０９と命名した。図８を参照のこと。サザンブロット分析を使用して、構築物の組み込みを評価した。しかし、この安定にトランスフェクトされた株の単離は誤った事象であり、その後の実験で再現性がなかった。Ｇ−０９を除き、方形波パルスおよび指数関数的減衰パルスの両方を使用した３７のトランスフェクション実験における線状化構築物を使用した１７×１０７個のＰＧＣのエレクトロポレーション後にＰＧＣは安定にトランスフェクトされなかった。これらの各実験では、ＰＧＣ数は、１×１０６〜１０×１０６に変化した。マウス、ニワトリ、およびヒトにおけるＥＳ細胞研究で広く使用されている以下のプロモーターを試験した：ＣＡＧとも呼ばれるＣＸプロモーター（Ｎｉｗａ，Ｈ．，Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｊ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｖｅｃｔｏｒ．Ｇｅｎｅ  １０８，１９３−９．１９９１）、ＣＭＶエンハンサーを含むニワトリβ−アクチンプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＭＣ１プロモーター、およびＵｂｃプロモーターを含む。これらのプロモーターは、トランスフェクション効率を増加させなかった。選択マーカーおよび遺伝子改変細胞株のクローン誘導体を発現させるために、組み込まれた構築物と共にインスレーターを使用した。
【００７５】
インスレーターは、不活性なクロマチンドメインから活性なクロマチンドメインを分離し、隣接するエンハンサーの活性化効果または隣接する凝集クロマチンのサイレンシング効果から遺伝子を隔離するＤＮＡ配列である。ニワトリでは、β−グロビン遺伝子座の５’側に存在する５’ＨＳ４インスレーターが、Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ  ａｎｄ  ｃｏｌｌｅａｇｕｅｓによって十分に特徴づけられている（Ｂｕｒｇｅｓｓ−Ｂｅｕｓｓｅ，Ｂ．，Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｃ．，Ｇａｓｚｎｅｒ，Ｍ．，Ｌｉｔｔ，Ｍ．，Ｍｕｔｓｋｏｖ，Ｖ．，Ｒｅｃｉｌｌａｓ−Ｔａｒｇａ，Ｆ．，Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｍ．，Ｗｅｓｔ，Ａ．，ａｎｄ  Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ，Ｇ．（２００２））．Ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９  Ｓｕｐｐｌ．４，１６４３３−７．このインスレーターはβ−グロビン遺伝子座を構成的に凝縮されたクロマチンの上流領域から保護する。本発明者らは、ニワトリβ−アクチン−ｎｅｏカセットの５’側および３’側の両方のインスレーターとしてニワトリβ−グロビン５’ＨＳ４配列を使用したネオマイシン耐性を駆動するニワトリβ−アクチンプロモーターを使用して導入遺伝子をアセンブリした。
【００７６】
ニワトリβ−グロビン遺伝子座由来の高感度部位４の２５０ｂｐコア配列を、以下のプライマー組を使用してＰＣＲ増幅した。
【００７７】
【化２】
2008529483.tif 000007
ＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔにクローン化し、配列決定した。ＨＳ４部位の直列重複を、ｐＧＲＭクローン中のＨＳ４をＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩで消化してインサートを放出させ、ＢｇｌＩＩで消化してベクターを線状化することによって作製した。ＨＳ４フラグメントを、ＨＳ４インスレーターのコピーを含むベクターにライゲーションした。クローンをスクリーニングし、２つのＨＳ４コピーが同一方向であるクローンを選択した。これを、２×ＨＳ４と呼ぶ。
【００７８】
（実施例１３．ＨＳ４β−アクチン−ｎｅｏを使用したバルク選択）
β−アクチンｎｅｏを、Ｂｕｅｒｓｔｅｄｄｅ（クローン５７４）から得て、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに移入した。次いで、β−アクチン  ｎｅｏの５’末端および３’末端で２×ＨＳ４をクローン化して、ＨＳ４−β−アクチンｎｅｏを産生した。この構築物を使用して、トランスフェクションを８回行った。各トランスフェクションのために、５×１０６個のＰＧＣを、４００μｌのエレクトロポレーション緩衝液（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍｅｄｉａ）中に再懸濁し、２０μｇの線状化ＤＮＡを添加した。１回の指数関数的減衰（ＥＤ）パルス（２００Ｖ、９００〜１１００μＦ）または８回の方形波（ＳＷ）パルス（２５０〜３５０Ｖ、１００μ秒）を印加した。トランスフェクション後、細胞を数日間成長させ、その後、ネオマイシン選択剤（３００μｇ／ｍｌ）を添加した。各トランスフェクション物をプールとして成長させた。５〜８個のトランスフェクション物から耐性細胞を単離した。
【００７９】
２プールのトランスフェクション細胞に対してサザン分析を行った（図１０）。ＰＧＣ細胞株Ｐ８４およびＰ８５由来の２μｇのゲノムＤＮＡならびに２０ｐｇのプラスミド（ＨＳ４−β−アクチンｎｅｏ）を消化した。消化物を０．７％ゲルで泳動し、１０×ＳＳＣ中でナイロン膜に毛細管現象によって一晩移し、Ｒａｐｉｄ  Ｈｙｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）中にて放射性標識ｎｅｏ遺伝子配列で２時間探索した。洗浄後、ブロットをフィルムに−８０℃で一晩感光した。図１０に関して、レーン１はＰ８４であり、レーン２はＰ８５であり、レーン３はプラスミドである。プラスミドコントロールのために、ＨＳ４−β−アクチンｎｅｏプラスミドＤＮＡを、ＮｏｔＩで線状化した。２．３Ｋｂ内部フラグメントを得るために、ＰＧＣ  ＤＮＡおよび線状化プラスミドを、ＢａｍＨＩで消化した。Ｐ８４およびＰ８５の両方は、２．３Ｋｂのサイズの内部フラグメントを示す。約２．６ｋｂのより大きな内部フラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩでの消化によって放出させた。さらに、この内部フラグメントは、Ｐ８４およびＰ８５消化物の両方に存在する。ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩでのＰ８４およびＰ８５のゲノムＤＮＡの消化により、導入遺伝子がゲノムに組み込まれた場合、２．９Ｋｂを超えるバンドが明らかとなるはずである。Ｐ８４では、連結点フラグメントは認められず、Ｐ８４がいくつかの異なるクローンの複合物であることを示す。Ｐ８５では、ＥｃｏＲＩ消化物中に４．５〜５Ｋｂの連結点フラグメントが存在し、ＢｇｌＩＩ消化物中に５Ｋｂの連結点フラグメントが存在し、このことは、Ｐ８５がゲノムに組み込まれ、培養物が実質的に１つのクローンから構成されることを示す。本実施例は、始原生殖細胞中の選択マーカーの信頼できる発現のための構築物の好ましいエレメントとしてのインスレーターの有用性を示す。
【００８０】
（実施例１４．遺伝子改変ＰＧＣのクローン誘導）
以下の実施例は、始原生殖細胞の遺伝子改変株をクローン的に誘導し得ることを示す。
【００８１】
第１に、β−アクチン−ｅＧＦＰを作製した。ｅＧＦＰ遺伝子を、ＸｍｍＩおよびＫｐｎＩを使用してＣＸ−ｅＧＦＰ−ＣＸ−ｐｕｒｏから放出させ、ＥｃｏＲＩおよびＸｍｍＩを使用してＨＳ４−β−アクチン  ｐｕｒｏからβ−アクチンを放出させ、２つを３方向（３−ｗａｙ）ライゲーションとしてＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローン化してβ−アクチンＥＧＦＰを産生した。次いで、ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩを使用してβ−アクチンｅＧＦＰを放出させ（Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを使用して平滑末端化し）、ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＶで消化したＨＳ４−β−アクチンｐｕｒｏにクローン化した。
【００８２】
この構築物を使用してトランスフェクションを５回行った。各トランスフェクションのために、５×１０６個のＰＧＣを、４００μｌのエレクトロポレーション緩衝液（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍｅｄｉａ）中に再懸濁し、２０μｇの線状化ＤＮＡを添加した。ＥＤパルス（１５０〜２００Ｖ、９００μＦ）またはＳＷ（３５０Ｖ、８パルス、１００μ秒）パルスを印加した。トランスフェクション後、細胞を４８ウェルにそれぞれプレートし、数日間成長させた後に選択剤（０．５μｇ／ｍｌ）を添加した。５回のトランスフェクションのうちの４回で全部で５つのクローンが認められた。１つのクローンＴＰ１０３を、サザンによって分析した（図１１）。図１１に関して、プラスミドコントロールＤＮＡを、ＮｏｔＩで線状化した。ＫｐｎＩでのＤＮＡの消化によって内部フラグメントを放出させた。ＴＰ１０３およびプラスミドの両方において、同サイズのフラグメントが放出された。ＮｃｏＩ、ＭｆｅＩ、およびＳｐｈＩでのＴＰ１０３のゲノムＤＮＡの消化により、消化したプラスミドＤＮＡの対応するレーンよりも大きなバンドが明らかとなるはずである。ＭｆｅＩ消化したＴＰ１０３ゲノムＤＮＡのレーンでバンドは認められず、これは、バンドが非常に大きいためであり得る。ＮｃｏＩおよびＳｐｈＩ消化を示すレーンでは、ＴＰ１０３ゲノムＤＮＡ中にプラスミドＤＮＡ中に放出されたフラグメントより実質的に大きいフラグメントが放出され、ＴＰ１０３細胞株のゲノムに導入遺伝子が組み込まれたことを示す。
ＨＳ４−β−アクチン−ｐｕｒｏのクローン誘導
第１に、β−アクチンｐｕｒｏを、ＣＸ−ＥＧＦＰ−ＣＸ−ｐｕｒｏ由来のｐｕｒｏ（ＸｍｍＩ−ＥｃｏＲＩ）、ｐＢＳ中のβ−アクチンｎｅｏ由来のβ−アクチン（上記を参照のこと）（Ｓａｌ−ＸｍｍＩ）、およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ）の３方向ライゲーションによって作製した。次に、ＢａｍＨＩ／ＳＡＰ処理２×ＨＳ４ベクターへのＢａｍＨＩ消化β−アクチンｐｕｒｏのライゲーションによって２×ＨＳ４の２つのコピーを含むｐＢＳにβ−アクチンｐｕｒｏをクローン化した。
【００８３】
この構築物を使用してトランスフェクションを３回行った。各トランスフェクションのために、４〜５×１０６個のＰＧＣを、４００μｌのエレクトロポレーション緩衝液（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍｅｄｉａ）中に再懸濁し、２０μｇの線状化ＤＮＡを添加した。２００Ｖ、９００μＦのＥＤパルスを印加した。トランスフェクション後、細胞を４８ウェルにそれぞれプレートし、数日間成長させた後に選択剤（０．５μｇ／ｍｌ）を添加した。２回のトランスフェクションでクローンは認められなかった。第３のトランスフェクションから２つのコロニーを単離した。
ＨＳ４−ｃｘ−ｅＧＦＰ−ｃｘ−Ｐｕｒｏのクローン誘導
ＨＳ４−ｃｘ−ｅＧＦＰ−ｃｘ−Ｐｕｒｏを使用してトランスフェクションを３回行った。５×１０６個のＰＧＣを、４００μｌのエレクトロポレーション緩衝液（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍｅｄｉａ）中に再懸濁し、２０μｇの線状化ＤＮＡを添加した。３５０Ｖで１００μ秒のＳＷパルスを、各トランスフェクションに８回印加した。トランスフェクション後、細胞を４８ウェルにそれぞれプレートし、数日間成長させた後にピューロマイシン選択剤（０．５μｇ／ｍｌ）を添加した。２回のトランスフェクションから全部で１６個のクローンが単離された。
ｃｘ−ｎｅｏのクローン誘導
ＰＧＣ１３細胞株に対し、ｃｘ−ｎｅｏ選択マーカーを保有するプラスミドでエレクトロポレーションを行った。ネオマイシンへの曝露後、ネオマイシンに耐性を示す細胞株（Ｇ−０９）を誘導した。この細胞株の核型を決定し、全ての細胞が第２染色体のｐアームを欠失していた（表３および図１２）。これらのデータは、Ｇ−０９が第２染色体のｐアーム中にサイン欠失（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を保有するＰＧＣにクローン的に由来することを証明する。
【００８４】
（表３：Ｇ−０９細胞株の染色体分析）
【００８５】
【表４】
2008529483.tif 000008
（実施例１５．ＰＧＣ中の選択マーカーの組織特異的発現）
遺伝子ＥＲＮＩは、ニワトリ胚の前原始線条段階から発現し、ヘンセン結節由来のシグナルに対する初期応答遺伝子である（Ｓｔｒｅｉｔ，Ａ．，Ｂｅｒｌｉｎｅｒ，Ａ．Ｊ．，Ｐａｐａｎａｙｏｔｏｕ，Ｃ．，Ｓｉｒｕｌｎｉｋ，Ａ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｍ，Ｃ．Ｄ．（２０００）．Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ＦＧＦ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｂｅｆｏｒｅ  ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０６，７４−８）。さらに、ＥＲＮＩは、ニワトリＥＳ細胞中で発現する（Ａｃｌｏｑｕｅ，Ｈ．，Ｒｉｓｓｏｎ，Ｖ．，Ｂｉｒｏｔ，Ａ．，Ｋｕｎｉｔａ，Ｒ．，Ｐａｉｎ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｓａｍａｒｕｔ，Ｊ．（２００１）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｅａｒｌｙ  ｅｍｂｒｙｏ．Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  １０３，７９−９１）。ＥＲＮＩ遺伝子（ｃＥＮＳ−１とも呼ばれる）は、固有の５’および３’ＵＴＲ配列に加えて、１つの長い読み取り枠が４８６ｂｐの直列反復配列に隣接する固有の構造を有する。この構造がレトロウイルスＬＴＲ様構造を連想させるという考えに基づいて、Ａｃｌｏｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．２００１は、プロモーター／エンハンサー活性のｃＤＮＡ配列の異なる部分をアッセイし、３’ＵＴＲ中の固有の配列領域がプロモーターとして作用することを見出した。ＰＣＲプロモーターを、本質的に（Ａｃｌｏｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）に記載のように、ＥＲＮＩ遺伝子の３’ＵＴＲの８２２ｂｐフラグメントを増幅するようにデザインした。ＥＲＮＩ配列の増幅後、これらをＳＶ４０ポリＡ部位を使用してネオマイシン耐性遺伝子の上流にクローン化して、ＥＲＮＩ−ｎｅｏ（１．８ｋｂ）を作製した。次いで、２×ＨＳ４インスレーターを、ＥＲＮＩ−ｎｅｏ選択マーカーカセットのいずれかの側にクローン化した。
【００８６】
ＨＳ４−Ｅｍｉ−ｎｅｏを使用してトランスフェクションを２回行った。５×１０６個のＰＧＣを、４００μｌのエレクトロポレーション緩衝液（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍｅｄｉａ）中に再懸濁し、２０μｇの線状化ＤＮＡを添加した。第１のトランスフェクションでは、１７５Ｖ、９００μＦのＥＤパルスを１回印加し、第２のトランスフェクションでは、１００μ秒および３５０ＶのＳＷパルスを８回印加した。トランスフェクション後、細胞を４８ウェルにそれぞれプレートし、数日間成長させた後にネオマイシン選択剤（３００μｇ／ｍｌ）を添加した。第１のトランスフェクションで（ＥＤパルス）、５つのコロニーを単離し、第２のトランスフェクションで（ＳＷパルス）、１１個のコロニーを単離した。
【００８７】
安定にトランスフェクトされたクローンの単離は、ＥＲＮＩがＰＧＣ中で発現され、これを組織特異的プロモーターとして使用することができることを示す。
【００８８】
（実施例１６．生殖系列へのトランスフェクトされたＰＧＣの寄与）
ＰＧＣをＨＳ４−βアクチン−ＧＦＰでトランスフェクトし、１３〜１５段階（Ｈ＆Ｈ）の胚の脈管構造に注入した。１８日目に、性腺を取り出し、固定し、切片にし、ＣＶＨ抗体で染色して生殖細胞を同定した。次いで、染色切片を、性腺中のＧＦＰ陽性細胞の存在について分析した。雄（図１３）および雌の性腺中でＧＦＰ陽性生殖細胞が見出された。これらの胚の脳、心臓、筋肉、および肝臓の組織学的調製物試験により、１つのスライドで４つの緑色の細胞のみが示された。これらのデータは、少数の培養ＰＧＣが異所で見出されたが、大部分の培養ＰＧＣは生殖系列を優先的にコロニー形成することを証明する。
【００８９】
ＧＦＰ陽性細胞が生殖細胞であることを決定するために、切片を抗ＣＶＨ抗体で染色した。図１４に認められるように、ＧＦＰ陽性細胞はＣＶＨタンパク質についても染色され、ＧＦＰ陽性細胞が生殖細胞であることを示す。
【００９０】
図１４に関して、ＧＦＰ陽性細胞がこの切片中に存在し、ＤＡＰＩ／ＧＦＰパネルは、これらのＧＦＰ陽性細胞が精細管内に存在することを示す。生殖細胞を抗ＣＶＨ抗体で染色する場合、これらは、生殖細胞の細胞質の輪郭を描く強く赤色に染色された環を示す。ＤＡＰＩ／ＣＶＨパネルは、これらの細胞が精細管内に存在することを示す。最後のパネルは、ＧＦＰ陽性細胞がＣＶＨについても染色され、精細管がＧＦＰ陰性のＣＶＨ陽性生殖細胞を含むことを示す。
【００９１】
（実施例１７．遺伝子改変ＰＧＣの生殖系列伝達）
導入遺伝子（βアクチン−ｎｅｏ、βアクチン−ｅＧＦＰ−βアクチン−ｐｕｒｏ、ｃｘ−ｅＧＦＰ−ｃｘ−ｐｕｒｏ）の１つでトランスフェクトされたＢａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋ  ＰＧＣを、１３〜１４段階（Ｈ＆Ｈ）の胚の脈管構造に注入した。ニワトリを孵化させ、雄鶏を性的に成熟するまで成長させ、Ｂａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋ雌鶏と交配させて導入遺伝子の生殖系列伝達を決定した。全ての黒色子孫はＰＧＣに由来し、これらを導入遺伝子の存在について試験した（表５）。生殖系列伝達率を、羽の色をスコアリングした全ニワトリ数で黒色ニワトリ数を割ることによって計算した（表５）。
【００９２】
（表５：遺伝子改変した始原生殖細胞の生殖系列伝達）
【００９３】
【表５】
2008529483.tif 000009
（実施例１８．導入遺伝子は、メンデルの法則で遺伝する）
βアクチン−ｎｅｏ、βアクチン−ＧＦＰ、またはｃｘ−ＧＦＰの１つを含むように遺伝子改変されたＢａｒｒｅｄ  ＲｏｃｋＰＧＣを保有するキメラ雄の交配に由来する黒色子孫を、導入遺伝子の存在について分析した。表６に示すように、導入遺伝子は、約５０％のＰＧＣ子孫に遺伝し、メンデル性遺伝を示す。
【００９４】
（表６：導入遺伝子のメンデル分離）
【００９５】
【表６】
2008529483.tif 000010
＊カイ二乗分析により、１：１のトランスジェニック子孫：非トランスジェニック子孫予測比と有意に異ならない。
【００９６】
（実施例１９．遺伝子改変ＰＧＣを保有するキメラの子孫における導入遺伝子の遍在発現）
βアクチン−ＧＦＰがゲノムに安定に組み込まれたＰＧＣを保有するキメラを、野生型雌鶏と交配し、胚をＧＦＰ発現についてスコアリングした。胚中の発現の例を図１５に示し、これは、ＧＦＰが発生段階３４（Ｈ＆Ｈ）までのトランスジェニック子孫の全組織中で発現することを示す。より高齢の動物では、凍結切片を使用した組織学的実験のために組織を調製した。１〜２週齢のニワトリの膵臓、皮膚、肺、脳、卵巣、腎臓、嚢、十二指腸、胸部、心臓、肝臓、および脾臓由来の組織は、孵化後の発現が動物中に遍在したままであることを証明する。
【００９７】
（実施例２０．トランスジェニックニワトリの卵白中のモノクローナル抗体の発現）
上記のように、このモノクローナル抗体は、本発明の導入遺伝子構築物を使用して発現することができるいくつかのモノクローナル抗体産物のタイプのうちのたった１つの例である。さらに、タンパク質クラスとしてのモノクローナル抗体は、本明細書中に記載の方法および技術による組織特異的様式で発現することができる多数のタンパク質産物クラスのうちのたった１つの例である。以下の実施例を使用して、公知のコード配列を有する任意のタンパク質または抗体を発現する。
【００９８】
ニワトリ卵管の管状腺細胞中でモノクローナル抗体を発現させるために使用されるベクターを、ＯｖＢＡＣと命名する。このベクターは、オボアルブミン構造遺伝子ならびに５’および３’隣接配列を含むニワトリオボアルブミン遺伝子座由来のインタクトなＢＡＣクローンから構成される。オボアルブミン翻訳開始コドンがＩｇＬイニシエーターコドンに融合するようなＢＡＣ上のオボアルブミン遺伝子へのモノクローナル抗体カセット（ＩＲＥＳ配列によって連結されたヒトＩｇＬをコードする遺伝子およびヒトＩｇＨをコードする遺伝子を含む）の挿入により、卵管中での高レベルのモノクローナル抗体の発現が駆動される。卵管中に発現された抗体が分泌され、卵白中に蓄積する。
【００９９】
固有の制限酵素部位が全長ヒトＩｇＧκを発現させる任意の所望のモノクローナル抗体の可変領域をコードする重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子が容易に挿入されるように戦略的に配置されたモノクローナル抗体モジュラーカセットをデザインした。次いで、このカセットを、目的の可変領域で改変された後、卵管でのＭＡｂの発現のためにＯｖＢＡＣに挿入する。カセットは、ヒトＣκ定常領域、ヒトＣγ１定常領域、およびヒトκＪ−Ｃイントロンの一部、およびヒトＣγ１のイントロン上流を含む。ＶＨ遺伝子および小イントロン下流のシグナルペプチドも存在する。しかし、ＶＬシグナルペプチドは存在しない。ＩＲＥＳ配列はＩｇＬ遺伝子とＩｇＨ遺伝子との間に存在し、それにより、完全な抗体が１つの導入遺伝子から発現される。可変領域遺伝子を、定常領域遺伝子のイントロン上流に存在する固有の制限部位（ＶＬについてはＳｎａＢＩまたはＳｒｆＩ；ＶＨについてはＮｒｕＩまたはＰｍｅＩなど）の１つに挿入する。可変領域遺伝子は、適切な発現のために定常領域遺伝子にスプライシングされるようにスプライスドナー配列を含まなければならない。再編成された発現可変領域遺伝子を、ハイブリドーマゲノムＤＮＡまたはハイブリドーマ由来の組換えＤＮＡ由来のＰＣＲによって増幅する。軽鎖のシグナルペプチドリーダー配列を、軽鎖Ｖの増幅時に添加しなければならず、カセット中に重鎖シグナルペプチドが存在し、したがって、重鎖Ｖの挿入時に必要ではない。ＶＬ遺伝子のために、以下を含むようにＰＣＲプライマーをデザインする。ＶＬ遺伝子の上流側の５’プライマーは、ＳｎａＢＩ制限酵素の認識部位、ＫｏｚａｋコンセンサスＡＴＧ、シグナルペプチド、およびＰＣＲ反応におけるプライミングのための目的のＶ領域との２０ｂｐの相同物を含む。ｃＤＮＡクローンをＰＣＲのテンプレートとして使用する場合、シグナルペプチドエキソンは残りのＶＬ遺伝子に既に融合している。そうでなければ、ヒトＶＬシグナルペプチドをインフレームで成熟可変領域のＮ末端に付加するようにプライマーをデザインする。シグナルペプチドを１工程で付加する場合にプライマーが長くなるので、この工程は、必要な配列を付加するために２ラウンドのネスト化ＰＣＲが必要であり得る。ＶＬ遺伝子の３’末端で、ＳｇｆＩ制限酵素の認識部位、目的のＶ領域の３’末端に対する約２０ｂｐの相同物、および約２０ｂｐのＪ−Ｃγイントロン配列（下流Ｃγ遺伝子のスプライシングのためのスプライスドナーを含む）を含むようにＰＣＲプライマーをデザインする。ＶＨ遺伝子のために、ＰＣＲ増幅のための５’プライマーは、ＮｒｕＩ酵素の認識部位、シグナルペプチド配列中に存在する約２０ｂｐのＶＨイントロン（モジュラーカセット中のＶＨシグナルペプチドスプライスドナーのスプライシングのためのスプライスアクセプターを含む）、１１ｂｐのＶＨシグナルペプチドコード配列、および目的のＶＨ遺伝子の５’末端に対する約２０ｂｐの相同物を含む。３’プライマーは、目的のＶＨ遺伝子の３’末端に対する約２０ｂｐの相同物（Ｊ領域に対応する）、約２０ｂｐのＪ−Ｃμイントロン（Ｃγ１遺伝子下流のスプライシングのためのスプライスドナーを含む）、およびＮｒｕＩ酵素の認識部位を含む。ＶＬおよびＶＨのＰＣＲ産物をクローン化および配列決定し、その後にモジュラーＭＡｂカセットベクターに挿入する。
【０１００】
Ｃｏｐｅｌａｎｄ，Ｎ．Ｇ．，Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｎ．Ａ．，Ｃｏｕｒｔ，Ｄ．Ｌ（２００１）．Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ：ａ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｍｏｕｓｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ２，７６９−７９に記載のように、オボアルブミン配列にＭＡｂカセットを挿入するためのリコンビニアリング（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）によってＯｖＢＡＣクローンを改変する。Ｗａｎｇ，Ｚ．，Ｅｎｇｌｅｒ，Ｐ．，Ｌｏｎｇａｃｒｅ，Ａ．，Ｓｔｏｒｂ，Ｕ．（２００１）．Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＢＡＣ／ＰＡＣ  ｒｅｔｒｏｆｉｔｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１１，１３７−４２のレトロフィッティングによって選択マーカー（ｎｅｏまたはピューロマイシン耐性のため）をＯｖＢＡＣに添加する。
【０１０１】
（実施例２１．トランスジェニックニワトリの卵白中の抗ＩＬ−２Ｒα）
ヒトＩＬ−２Ｒα受容体に特異的なＭＡｂを発現するための全ストラテジーを以下に示す（図１６および１８を参照のこと）。工程１では、抗ＩＬ−２Ｒα  ＩｇＬ／ＩｇＨカセットを、リコンビニアリングによる大腸菌での相同組換えによってＯｖＢＡＣに挿入する。次いで、抗体を、Ｏｖ調節エレメントの転写調節下に置く。工程２では、リコンビニアリングで使用したカナマイシン遺伝子を、Ｆｌｐリコンビナーゼによって除去する。ヒト化抗ＩＬ−２Ｒα抗体由来のＶコード配列を、ＣκおよびＣγ１定常領域を含むカセットにクローン化する。ＩｇκおよびＩｇＨ遺伝子を、ＩＲＥＳ配列によって連結し、その結果、両遺伝子は１つの導入遺伝子構築物から発現するので、たった１つのＢＡＣトランスフェクションが必要である。相同組換えによって抗体カセットをＢＡＣ上のＯｖ遺伝子に挿入する（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｃｏｐｅｌａｎｄ，２００１）。効率的な翻訳のために、Ｉｇκ遺伝子をＯｖ  Ｋｏｚａｋ翻訳開始配列に融合させる。最後に、ＰＧＣクローンのトランスフェクションおよび選択のために、ＰＧＣ中の選択マーカーであるＥＲＮＩ−ｐｕｒｏをＢＡＣに付加する。
【０１０２】
図１６は、ＯｖＢＡＣ抗ＩＬ−２Ｒαの構築を示す。重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子を得るために、各遺伝子のために４つの長いオリゴヌクレオチド（約２０ｂｐ重複する）を合成し、互いにアニーリングする。ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ４バクテリオファージ由来）を使用して、ギャップを充填する。次いで、ＭＡｂカセットへのクローニングのために、合成遺伝子を制限酵素で消化する。
【０１０３】
ヒト化抗ＩＬ−２ＲαＭａｂ（ＭＡｂ配列は、特許５，５８５，０８９号に由来する）の構築のためのオリゴヌクレオチドを以下に示す。
軽鎖Ｖ遺伝子（オリゴ１〜４）
【０１０４】
【化３】
2008529483.tif 000011
図１７に関して、オリゴ１は、クローニングのためのＸｂａＩ部位（大文字）およびその後にＶＬシグナルペプチド（イントロンなし）を有する。Ｏｖ  Ｋｏｚａｋ翻訳開始配列に下線を引き、最後の３つのヌクレオチドは開始コドンである。シグナルペプチド切断部位（対応するタンパク質配列中）をダブルスラッシュで示す。オリゴ４は、クローニングのためのＳｇｆＩ部位（大文字）およびその後にＣｋスプライシングのための１７ｂｐのヒト５’Ｊ４−Ｃｋイントロン（下線）を有する。スプライスドナーＧヌクレオチドに二重下線を引いている。
重鎖Ｖ遺伝子（オリゴ５〜８）
【０１０５】
【化４】
2008529483.tif 000012
オリゴ５は、クローニングのためのＮｒｕＩ部位（大文字）、その後のヒトＶＨシグナルペプチドイントロンの１５ｂｐの３’末端（下線）、およびその後のヒト化抗ＩＬ−２ＲαＶＨ遺伝子由来の１１ｂｐのＶＨシグナルペプチドエキソン配列（二重下線）を含む。シグナルペプチド切断部位（対応するタンパク質配列中）を、ダブルスラッシュで示す。
【０１０６】
オリゴ８は、ＮｒｕＩ部位（大文字）およびその後にヒトＪ−Ｃμイントロンの１２ｂｐの５’末端（下線）を含む。スプライスドナーＣヌクレオチドに二重線を引いている。
【０１０７】
オリゴ１〜４を混合し、オリゴ５〜８を混合し、２つの混合物を、沸騰水を含むビーカー中でインキュベートし、室温にゆっくり冷却することによってアニーリングする。相補鎖中のギャップを、ＤＮＡポリメラーゼを使用して修復する。
【０１０８】
図１８に関して、次いで、Ｖの５’末端および３’末端にデザインした固有の制限部位（本実施例では、重鎖ＶのためにＮｒｕＩおよび軽鎖ＶのためにＸｂａＩ／ＳｇｆＩ）を使用して、ＩｇκおよびＩｇＨのＶをＣκおよびＣγ１遺伝子を含むカセットにクローン化する。
【０１０９】
さらに、図１８に関して、Ｏｖ構造遺伝子の５’の１１０ｋｂの配列およびＯｖ構造遺伝子の３’の３０ｋｂの隣接配列と共に、ＯｖＢＡＣを上に示す。ＥＲＮＩ−ｐｕｒｏ選択マーカーを、３’末端に示す。以下のエレメントを含むＭＡｂカセットを示す（左から右）：相同組換えによるＯｖＢＡＣへの挿入のための５’Ｏｖ相同アーム、Ｏｖ  ＫｏｚａｋおよびＡＴＧ、ヒトＶＬシグナルペプチド（ＳｉＧＶＬ）、ＭＡｂ由来の挿入されたヒト軽鎖可変領域遺伝子（ＶＬ）、Ｊ−Ｃκイントロン、Ｃκ遺伝子、下流ＩｇＨ遺伝子の翻訳のためのＩＲＥＳ、ヒト重鎖シグナルペプチド（ＳｉＧＶＨ）、ＭＡｂ由来の挿入された重鎖可変領域遺伝子（ＶＨ）、Ｊ−Ｃγイントロン、その内部イントロンを含むＣγ１遺伝子、およびＯｖＢＡＣへの挿入のための３’Ｏｖ相同アーム。（細菌における選択のためのカナマイシン遺伝子を示さない）。
【０１１０】
ＯｖＢＡＣへの抗体カセットの挿入のために、リコンビニアリングターゲティングベクターを、Ｉｇκ−ＩＲＥＳ−ＩｇＨカセットへの相同アームの付加によって作製した。相同アームは、ＢＡＣを保有する大腸菌ＥＬ２５０株の相同組換え機構を使用して、ＢＡＣ中でＯｖ遺伝子に抗体カセットをターゲティングするように作用するＯｖ遺伝子座由来のフラグメントである（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｃｏｐｅｌａｎｄ，２００１）。５’Ｏｖ相同アームは、Ｏｖ遺伝子中のＯｖ  Ｋｏｚａｋ翻訳開始配列のすぐ上流に存在するＨｉｎｃＩＩ−ＸｂａＩフラグメントに対応する１２４ｂｐのオボアルブミン配列であり、以下の配列を有する。
【０１１１】
【化５】
2008529483.tif 000013
以下のプライマーを使用して、５’相同物を、ニワトリゲノムＤＮＡまたはクローン化Ｏｖ  ＤＮＡからＰＣＲ増幅する。
【０１１２】
【化６】
2008529483.tif 000014
３’Ｏｖ相同アームは、オボアルブミンの翻訳終結コドンのすぐ下流に存在する１２５ｂｐのオボアルブミン配列であり、以下の配列を有する。
【０１１３】
【化７】
2008529483.tif 000015
以下のプライマーを使用して、ニワトリゲノムＤＮＡまたはクローン化ＤＮＡから増幅した１５２ｂｐのＰＣＲ産物として３’Ｏｖ相同物を得る。
【０１１４】
【化８】
2008529483.tif 000016
５’および３’相同フラグメントの増幅後、ＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどのプラスミドベクターにクローン化し、配列決定によって確認する。次いで、相同アームをＭＡｂカセットのいずれかの側に配置し、５’Ｏｖ相同物をＩｇＬ遺伝子の５’側に配置し、３’Ｏｖ相同物をＩｇＨ遺伝子の３’に配置する。相同組換えによるＯｖＢＡＣへのＭＡｂカセットの挿入により、Ｏｖ構造遺伝子が欠失する。ＯｖＢＡＣへのターゲティングのためのＭＡｂカセットの最終構造も図１７に示す。
【０１１５】
選択マーカー（カナマイシン耐性をコードする遺伝子など）は、ＭＡｂカセットでの形質転換後のＯｖＢＡＣを保有する大腸菌中での相同組換え体の選択に必要である。したがって、ターゲティングベクターはまた、ＦＲＴ部位に隣接したカナマイシン耐性遺伝子を含む。例えば、１．５ＫｂのＦＲＴ−Ｋａｎカセットを、ＸｍａＩおよびＢｇｌＩ（Ｎｔ４６４４−６１３１）によってｐＩＧＣＮ２１（ＮＣＩのＮｅａｌ  Ｃｏｐｅｌａｎｄ研究所から入手したＩＲＥＳ−ｅＧＦＰｃｒｅ−ＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴカセットを含むベクター）から放出させ、平滑末端化する。次いで、このフラグメントを、Ｏｖ相同物に隣接したＭＡｂカセット中の平滑末端化ＮｏｔＩ部位に挿入する。ターゲティングベクターを、野生型ＯｖＢＡＣを保有する細菌にエレクトロポレーションし、カナマイシン耐性コロニーを選択する。正確なターゲティングを、クローンの制限マッピングによって評価する。ほとんどのカナマイシン耐性コロニーが正確にターゲティングされるはずである。次いで、ＥＬ２５０株中のＦｌｐ遺伝子のアラビノース誘導によるＦｌｐリコンビナーゼの一過性発現によって耐性カセットを除去してＯｖＢＡＣ抗ＩＬ−２Ｒαを得る。カナマイシン感受性クローンをスクリーニングし、制限マッピングによって評価する。
【０１１６】
次いで、ＢＡＣ形質転換ＰＧＣ細胞の選択のために、ＰＧＣ中で活性な選択マーカーをＢＡＣに付加する。本発明者らは、ＥＲＮＩプロモーターによって駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子を使用して、安定に形質転換されたＰＧＣ株を誘導した。ＥＲＮＩは初期ニワトリ胚中で特異的に発現した遺伝子であるので、ＥＲＮＩ−ｐｕｒｏマーカーは、成体トランスジェニックニワトリで発現しない。本発明者らは、選択マーカーのニワトリβ−グロビン遺伝子座由来のインスレーターエレメントとの隣接によってトランスフェクション後に得られるＰＧＣクローンの数が増加することも見出した。ＨＳ４と呼ばれるこのエレメントを、ＥＲＮＩ−ｐｕｒｏのいずれかの側でクローン化する。レトロフィッティングによってＨＳ４−ＥＲＮＩ−ｐｕｒｏをＢＡＣに付加する（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。最終ＯｖＭＡｂ抗ＩＬ−２ＲαＢＡＣを、ＡｓｃＩで線状化し、その後トランスフェクションする。
【０１１７】
（実施例２２．トランスジェニックニワトリの卵白中に産生された抗体の化学的性質）
トランスジェニックニワトリの管状腺中に産生された抗体の化学的性質は、固有性質を示す。米国特許出願番号１１／０４９，２２９号および（Ｚｈｕ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１５９−１１６９  ２００５）は、特に本明細書中で参考として援用される。具体的には、キメラニワトリ中に産生された抗体のモノサッカリド分析によって炭水化物組成の相違が明らかとなり、Ｎ−アセチルグルコサミン残基、マンノース残基、および非常に低い含有率のガラクトース残基の存在を示す。トランスジェニックニワトリは、同一の性質を示す。
【０１１８】
Ｎ連結オリゴサッカリドプロフィールの主な相違は、ニワトリ中で産生された抗体中に高マンノース型Ｎ−グリカンが存在すること、フコースが存在しないこと、およびガラクトース残基の含有率が非常に低いことである。これらの性質は、いくつかの理由で重要である。第１に、抗原性を示すことが公知のα１−３Ｇａｌ系統の証拠は存在しない。ガラクトース濃度の減少（典型的には、約２％未満のレベルまで）により、ガラクトース含有系統に起因する抗原性が実質的に減少する。第２に、やはり抗原性を示すことが公知のＮ−グリコリルノイラミン酸残基の証拠は存在しない。第３に、ニワトリ管状腺細胞中に産生される抗体は、抗体のＡＤＣＣ活性を増強するフコシル残基を実質的に含まない。この文脈では、実質的に含まないは、０．１％未満と定義する。第４に、ニワトリ産生抗体は、マンノース含有率が高く（典型的には、４０％超）、それにより、標準としてＣＨＯ細胞中で産生された抗体を使用してＢａｌｂ／ｃマウスでクリアランスを評価した場合にこの抗体のクリアランス率が増加する。これらの有利な化学的性質を合わせると、抗体は、ニワトリゲノムに無作為に組み込まれるか、組織特異的様式で発現されない導入遺伝子を使用して認められない濃度で卵白中に存在すると予想される。好ましい濃度は、卵あたり１ｍｇを超える抗体、卵あたり２ｍｇを超える抗体、卵あたり３ｍｇを超える抗体、および卵あたり６ｍｇもの抗体である。各卵が約２５ｍｌの卵白を含むので、好ましい濃度は、４０μｇ／ｍｌ超、８０μｇ／ｍｌ超、１２０μｇ／ｍｌ超、および２４０μｇ／ｍｌもの濃度である。
【０１１９】
卵白から抗体を抽出および精製するために、最初に卵白を低剪断速度にて室温で３０分間混合し、次いで、前に記載の改変方法によってオボムチンを沈殿させる。１体積の均質化卵白懸濁液を、３倍体積の逆浸透水に添加し、３０分間撹拌する。希釈した懸濁液を、０．５Ｍリン酸を使用してｐＨ６．０に調整し、１２，１００ｇで２０分間遠心分離する。上清を、０．５Ｍ第二リン酸ナトリウムおよび結晶塩を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム濃縮物を使用してｐＨ７．４に調整する。ヒトＩｇＧを、プロテインＡ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて流速１２０ｃｍ／ｈで精製する。吸着したヒトＩｇＧを、５カラム体積のローディング緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄し、３ｍＭリン酸で溶離する。溶離したヒトＩｇＧ画分を、２３０ｍＭ  ＮａＣｌを含む６０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）を使用してｐＨ７．５に調整し、４０ｍＭリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌの最終濃度にする。次いで、サンプルを、０．２ｍｍシリンジフィルター（Ｐａｌｌ）で濾過した。
【０１２０】
（実施例２３．結合親和性のアッセイ）
ＬＮＣａＰ細胞（ＡＴＣＣ）上のＰＳＭＡを抗原として使用して、結合をアッセイした。２００，０００細胞／ウェルを、５０μｌアリコートの表示濃度の抗体と共に３０分間２連でインキュベートした。細胞を２回洗浄し、その後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  ＰＥ標識抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の２００倍希釈物（５０μｌ／ウェル）を４℃で３０分間添加した。細胞を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳによって分析した。ＬＮＣａＰ細胞上のＰＳＭＡへのＭＡｂ結合のＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ３．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、結合曲線から決定した。細胞を、１０％ＦＢＳ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および１ｍＭピルビン酸塩ナトリウムを補足したＲＰＭＩ１６４０培地中で成長させた。ニワトリ管状腺細胞中に産生されたＭＡｂＦ１の抗原結合性を、ＣＨＯ細胞中で産生されたＭＡｂＦ１と比較した。両抗体調製物から、類似のＥＣ５０値のＬＮＣａＰ細胞上に発現したＰＳＭＡに対するほぼ同一の結合曲線が得られた。データは、ニワトリ由来の抗体およびＣＨＯ由来の抗体が異なってグリコシル化される一方で、これらは、抗原を等価に認識して結合することを証明する。
【０１２１】
（実施例２４．抗体内在化アッセイ）
ＰＳＭＡへのＭＡｂＦ１の結合により、抗体が内在化する。１つの潜在的適用では、ＭＡｂを細胞毒素と抱合し、ＰＳＭＡ発現腫瘍細胞をターゲティングして破壊することができる。ＬＮＣａＰ細胞上のＰＳＭＡへの抗体結合の内在化を、ＭＡｂおよびＨｕｍ−Ｚａｐ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）との細胞のインキュベーションによって決定した。ＨｕｍＺａｐは、リボゾーム不活化タンパク質であるサポリンに抱合したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体である。ＭＡｂＦ１／Ｈｕｍ−Ｚａｐ複合体が細胞表面上のＰＳＭＡに結合して内在化した場合に細胞が死滅するのに対して、抗体またはＨｕｍ−ＺａｐのみではＬＮＣａＰ細胞に有毒ではない。ＬＮＣａＰ細胞（１０，０００／ウェル）を、３００ｎｇ  Ｈｕｍ−Ｚａｐおよび３００ｎｇのＦ１  ＭＡｂまたはコントロールＭＡｂを含む１５０μｌの培養培地中にて３７℃で４８時間３連でインキュベートした。細胞の増殖および生存を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して決定した。また、１０，０００個の接着ＬＮＣａＰ細胞／ウェルを含む細胞培養培地中での抗体希釈物の４℃で２時間のインキュベーションによって内在化アッセイも行った。抗体溶液を穏やかに除去し、２００ｎｇのＨｕｍ−Ｚａｐを含む１５０μｌの培地と置換した。３７℃で４８時間のインキュベーション後に細胞生存度を決定した。抗体内在化についてのＥＣ５０値を、Ｐｒｉｓｍ  ３．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用した画像によって決定した。両抗体調製物は、類似の効率で内在化する。一定の抗体濃度範囲にわたって試験した場合、ニワトリ由来のＭＡｂＦ１およびＣＨＯ由来のＭＡｂＦ１の両方の内在化についてのＥＣ５０値は、０．４９ｎＭであった。
【０１２２】
（実施例２５．ＢＡＬＢ／ｃマウス中のＭＡｂのクリアランス）
放射性標識抗体の静脈内注射によって、ニワトリ産生ＭＡｂＦ１のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を、ＢＡＬＢ／ｃマウス中のＣＨＯ産生抗体と並行して分析した。１０μｇのＭＡｂタンパク質を、ヨウ素ビーズ法（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、１２５Ｉで軽度にヨウ化した（１抗体あたり１つ未満のＩ）。実験前の１週間、６週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，Ｎ．Ｙ．）に、飲料水にて０．１ｍｇ／ｍｌのヨウ化カリウムを与えた。タンパク質あたり４匹のマウスの尾静脈に約６００，０００ｃｐｍの標識ＭＡｂを静脈内注射し、全身放射能を全身γカウンター（Ｌｕｄｌｕｍ  ｓｃａｌｅｒを備えたＷｍ．Ｂ．Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＮａＩ結晶検出器）を使用して選択した時点で測定した。残存放射能の指数関数回帰分析によって半減期を計算した。ニワトリ管状腺細胞によって産生されたＭＡｂＦ１は、１０２．４±０．９時間の半減期（ｔ１／２）でクリアランスされる一方で、ＣＨＯ細胞によって産生されたＭＡｂＦ１は、２０７．５±１８．３時間の半減期でよりゆっくりクリアランスされた。
【０１２３】
（実施例２６．ＡＤＣＣアッセイ）
ＬＮＣａＰ−Ｃ４２Ｂ細胞を、改変５１Ｃｒ  ＡＤＣＣアッセイで試験した。ヒト末梢血単核細胞を、標準的なＦｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ分離によってヘパリン処理全血から精製した。細胞（１×１０Ｅ６細胞／ｍＬ）を、１０％ＦＢＳおよび１０Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−２を含むＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞を回収し、培養培地で１回洗浄し、２×１０７細胞／ｍｌに再懸濁した。２００万個の標的ＬＮＣａＰ−Ｃ４２ｂ細胞を、総体積が１ｍｌの２００μＣｉの５１Ｃｒと３７℃で１時間インキュベートした。標的細胞を１回洗浄し、１ｍｌの培地に再懸濁し、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。最終インキュベーション後、標的細胞を１回洗浄し、１×１０５細胞／ｍｌを最終体積にした。最終ＡＤＣＣアッセイのために、１００μｌの標識ＬＮＣａＰ細胞を、５０μｌのエフェクター細胞および５０μｌの抗体とインキュベートした。１：１００の最終標的：エフェクター比を選択した。全研究では、ヒトＩｇＧ１アイソタイプコントロールを泳動し、ＣＨＯ由来の抗ＰＳＭＡ  ＭＡｂＦ１抗体と比較した。含まれる他のコントロールは、ａ）標的細胞およびエフェクター細胞（抗体ではない）、ｂ）エフェクター細胞を含まない標的細胞、およびｃ）３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の存在下での標的細胞およびエフェクター細胞である。３７℃で４時間のインキュベーション後、上清を回収し、γカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのＣｏｂｒａＩＩ自動γカウンター）にて２４０〜４００ｋｅＶの読み取り枠を使用して計数した。抗体濃度の関数として数／分をプロットし、データを非線形回帰（Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用したＳ字用量応答（種々の勾配））によって分析した。溶解率（％）は以下の式により、決定した。
【０１２４】
溶解率（％）＝（サンプルＣＰＭ−抗体なしＣＰＭ）／（ＴｒｉｔｏｎＸ  ＣＰＭ−抗体なしＣＰＭ）×１００
両ＥＣ５０値および溶解率（％）を、全研究でモニタリングする。例えば、２つの抗体を比較した場合に、ＥＣ５０もしくは溶解率（％）のいずれかまたは両方の変化を有し得る。
【０１２５】
抗ＣＤ１６抗体でのＡＤＣＣの遮断を、以下の改変を使用して行った。細胞を、５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ１６抗体３Ｇ８またはアイソタイプコントロール抗体の非存在下または存在下で、１または０．０１μｇ／ｍｌのＣＨＯ産生ＭＡｂＦ１抗体またはニワトリ産生ＭＡｂＦ１抗体のいずれかとインキュベートした。
【０１２６】
ＣＨＯ由来のＭＡｂは用量依存性細胞溶解を誘導し、ＩＬ−２刺激したエフェクター細胞を使用して、０．１１μｇ／ｍｌのＥＣ５０にて溶解率３８％でプラトーに到達する。それに対し、ニワトリ卵由来のＭＡｂは、より強力且つより有効であった。２つの異なる抗体調製物を使用したニワトリ卵由来のＭＡｂの最大溶解率は６０％であった。この材料のＥＣ５０が０．０１８μｇ／ｍｌであったので、ＣＨＯ由来のＭＡｂを超える効力の増強も証明された。最後に、予想通り、アイソタイプコントロール抗体は、細胞溶解を誘導しなかった。非刺激エフェクター細胞（新鮮なＰＢＭＣ）を使用したＡＤＣＣは、ＥＣ５０値のより大きな相違を示すが、全細胞死滅の相違はより小さかった。
【０１２７】
ＣＤ１６（ＦＣｇＲＩＩＩ）は、ＡＤＣＣを媒介する重要な受容体である。ＡＤＣＣ応答の特異性は、ＣＤ１６に指向されるモノクローナル抗体を使用した標的細胞とエフェクター細胞との相互作用の遮断によって示された。本研究では、以下の２つの用量のＭＡｂＦ１抗体を使用した：飽和用量（１μｇ／ｍｌ）および最適以下の用量（０．０１μｇ／ｍｌ）。１μｇ／ｍｌのＭＡｂＦ１抗体は、抗ＣＤ１６抗体の非存在下で、ＣＨＯ由来の抗体およびニワトリ由来の抗体をそれぞれ使用して、約１５％および３８％の溶解率を誘導した。この溶解率（％）は、抗ＣＤ１６抗体の存在下で約４％に減少する一方で、アイソタイプコントロール抗体は効果がなかった。
【０１２８】
（実施例２７．ＣＤ１６結合）
ＣＨＯおよびニワトリ由来のＭＡｂＦ１を、Ｂｉａｃｏｒｅから提供されているアミンカップリングキットを使用して、第一級アミンを介してＢｉａｃｏｒｅセンサーチップ（ＣＭ５）のカルボキシメチルデキストランマトリックス表面に固定した。両抗体を、約１０，０００ＲＵの密度にコーティングした。２つの抗体のＣＤ１６−ＰｈｅおよびＣＤ１６−Ｖａｌとの結合を、固定化抗体表面上にいくつかの濃度のタンパク質を流すことによって行った。非特異的結合効果は、ブランク表面および単純な緩衝液結合サイクルの考慮によって説明された。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を、希釈のためおよびランニング緩衝液として使用した。Ｂｉａｃｏｒｅ−３０００装置にて２５℃で実験を行った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してデータを分析し、データを単一結合部位モデルに適合させて平衡解離定数を評価した。
【０１２９】
解離定数を、速度定数よりもむしろ平衡結合実験に基づいて評価した。なぜなら、速度の速さは抗体へのＦｃＲ結合の特性だからである。ニワトリ由来抗体の解離定数（ＫＤ）は、対応するＣＨＯ由来の抗体と比較して両ＦｃＲの約１／１０である。ニワトリ由来の抗体の高親和性は、ＣＨＯ由来の抗体中に存在するＦｃ領域中のグリコシル化の相違（特に、フコースの非存在に起因する）に寄与し得る。
【０１３０】
（実施例２８．治療有用性）
本発明は、特別に定義したグリコシル化パターンおよび他の化学的性質を有し、上記の遺伝子改変ニワトリを使用して生成した抗体を提供する。これらの性質により、標的組織中の抗体特異的標的への結合を目的として患者に投与した場合、治療特性が改善される。具体的には、上記のように、一定の臨床適応症について、抗体は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増強し、この効果により、一定の臨床適応症で重要な利点が得られる。
【０１３１】
いくつかのタイプの癌の治療についての非抱合モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の臨床試験から有望な結果が得られている（Ｄｉｌｌｍａｎ，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ．＆  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１２：２２３−２２５；Ｄｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １８：１２７）。非抱合キメラＩｇＧ１は、低悪性度または濾胞性のＢ細胞非ホジキンリンパ腫で承認されている一方で（Ｄｉｌｌｍａｎ，１９９７，上記）、別の非抱合ｍＡｂ（固形乳癌をターゲティングするヒト化ＩｇＧ１）は、第ＩＩＩ相臨床試験で有望な結果が得られている（Ｄｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，上記）。これら２つのＭＡｂの抗原は、その各標的組織中で高度に発現する。このような適用のために、特に、抗体がＡＤＣＣによる強力な腫瘍破壊を媒介する腫瘍細胞で、本発明の抗体は、患者への投与の際に治療上の利点を付与する。
【０１３２】
治療での使用のために、本発明の抗体を、１つまたは複数の他の分子的実体（別の抗体（例えば、二重特異性または多重特異性抗体を産生するため）、細胞毒素、細胞リガンド、または（例えば、免疫毒素などの免疫抱合体を産生するための）抗原など）に機能的に連結することもできる（例えば、化学結合、遺伝子融合、非共有結合、またはその他による）。本発明の抗体を、他の治療部分（例えば、放射性同位体、小分子抗癌薬、抗炎症薬、細胞毒素、または免疫抑制薬）に連結することができる。したがって、本発明は、ニワトリ発現系によって可能な化学的性質を有し、本質的に全ての公知の抗体抱合体、結合、および治療での使用のための関連テクノロジーと組み合わせた抗体組成物を含む。
【０１３３】
したがって、本発明の抗体を使用して、特に、標的組織でＡＤＣＣ機構を示す場合、治療に感受性を示す標的組織中で抗原を発現する細胞を含む種々の疾患を治療および／または予防することができる。治療（例えば、改善）または予防することができる例示的疾患には、固形腫瘍、リンパ腫、びまん性腫瘍、および全てのタイプの癌組織が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３４】
本発明の治療的実施形態では、特に、ＡＤＣＣの性質を示す様式によって治療される容態の診断を踏まえて、患者に本発明の抗体を投与する。このような臨床の状況では、本発明の抗体を投与し、治療の細胞傷害性効果を治療後に決定して、標的組織のＡＤＣＣ効果を決定する。本発明の治療組成物に加えて、患者を、化学療法薬、照射、またはＦｃ受容体の発現または活性を調整する（例えば、増強または阻害する）薬剤（サイトカインなど）でさらに治療することができる。治療時の投与のための典型的なサイトカインには、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＳＣＦ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が含まれる。典型的な治療薬には、特に、抗新生物薬（ドキソルビシン、シスプラチン、ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、およびシクロホスファミドなど）が含まれる。
【０１３５】
別の態様では、本発明は、本発明のニワトリ発現抗体の１つまたは組み合わせを含む組成物（例えば、薬学的組成物）を提供する。本発明の組成物を、当該分野で公知の種々の方法によって投与することができる。当業者に認識されるように、投与の経路および／または様式は、所望の結果に応じて変化する。薬学的に許容可能なキャリアには、滅菌水溶液または分散液が含まれ、薬学的に活性な物質のためのこのような媒質および薬剤の使用は当該分野で公知である。滅菌注射液を、成分の１つまたは組み合わせと共に適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込み、その後に滅菌および／または精密濾過を行うことによって調製することができる。一般に、分散液を、基剤となる分散媒および任意の他の成分を含む滅菌賦形剤に活性化合物を組み込みことによって調製する。
【０１３６】
最適な所望のＡＤＣＣ効果が得られるように投薬計画を調整する。例えば、単回ボーラスを投与することができるか、いくつかに分割した用量を長期にわたって投与することができるか、治療状況の緊急性によって示されるように、用量を比例的に増減することができる。投与を容易にするためおよび投薬量を均一にするために、投薬単位中に非経口組成物を配合することが特に有利である。本明細書中で使用される投薬単位形態は、治療を受ける被験体の単回投与に適切な物理的に個別の単位をいい、各単位は、必要な薬学的キャリアと組み合わせた所望の治療効果が得られるように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態の仕様は、（ａ）活性化合物の固有の特徴および達成すべき特定の治療効果、および（ｂ）個体の感受性の治療のためのこのような活性化合物の混合技術に固有の制限によって決定づけられ、且つこれらに直接依存する。
【０１３７】
本発明の薬学的組成物中の有効成分の実際の投薬レベルは、患者に有毒であることなく、特定の患者の所望の治療応答を達成するのに有効な有効成分の量、組成、および投与様式を得るために変化させることができる。選択された投薬レベルは、種々の薬物動態学的要因（使用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与期間、使用される特定の化合物の排出速度、治療持続時間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、および／または材料、治療を受ける患者の年齢、性別、体重、容態、一般的健康状態、および病歴、ならびに医学分野で周知の要因などが含まれる）に依存する。
【０１３８】
本発明の抗体の投与の効果が腫瘍などの標的組織で客観的に観察することができるので、本発明の治療方法は、治療（具体的には、ＡＤＣＣを使用した療法が含まれる）を必要とする患者を診断する工程と、結果が望まれる標的組織を同定する工程と、必要とする患者に本発明の組成物を投与する工程と、患者の標的組織におけるＡＤＣＣの有効性を決定する工程などによる患者の治療効果を測定する工程を含む。標的組織の長期にわたる性質の変化（細胞死、標的組織の縮み、腫瘍サイズの減少、および医学分野で公知の任意の他の診断技術など）の分析によって、治療効果を決定することができる。
【０１３９】
本発明の抗体を、当業者に利用可能な多数のＡＤＣＣの公知のモデルのいずれかにおけるＡＤＣＣ活性について試験することもできる。治療または診断での使用のための本発明の抗体の有用性を決定する目的のために、単独で、または他の哺乳動物、非哺乳動物、植物、または細菌の細胞発現系と比較して、ＡＤＣＣを測定することができる。したがって、本発明の方法は、上記系で産生された別の抗体と直接的または間接的に比較して、本発明の抗体の使用によってＡＤＣＣに影響を与える目的での有用性の差を決定する工程を含む。具体的には、この方法は、上記のニワトリ発現系で産生された抗体のＡＤＣＣ効果を比較してＡＤＣＣの増強を同定し、それにより、ニワトリ発現系に理想的な抗体候補を同定する工程を含む。
【０１４０】
上記のように、治療有用性を増強するために、本発明の抗体を、１つまたは複数の他の治療薬（例えば、細胞傷害薬、放射性毒素、または免疫抑制薬）と同時投与することができる。抗体を、薬剤（免疫複合体など）に連結することができるか、薬剤と別に投与することができる。後者の場合（個別の投与）、抗体を、薬剤の投与前、投与後、または同時に投与することができるか、または他の公知の療法（例えば、抗癌療法（例えば、放射線））と同時投与することができる。このような治療薬には、特に、抗新生物薬（ドキソルビシン、シスプラチン、ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、およびシクロホスファミドなど）が含まれる。本発明の抗体の化学療法薬との同時投与により、ヒト腫瘍細胞に対して細胞傷害効果をもたらす異なる機構を介して作用する２つの抗癌薬が得られる。このような同時投与は、薬物耐性の発生または抗体に対して無反応性になる腫瘍細胞の抗原性の変化に起因する問題を解決することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】図１Ａ：５４日間培養物中で維持されたＰＧＣ。細胞が接着せず、丸い形態を維持することに留意のこと。矢印は、この培養物中で見ることができるいくつかの分裂細胞を示す。図１Ｂ：２３４日間培養物中で維持されたＰＧＣ。これらの細胞を、照射ＳＴＯ細胞の支持細胞層上で培養する。
【図２】生殖細胞マーカーＣＶＨおよびＤａｚｌのＲＴ−ＰＣＲによって決定された遺伝子発現。細胞を、３２日間培養した。レーン１は、ＰＧＣアリコート中のＣＶＨおよびＤａｚｌの発現を示す。レーン２中の第２のサンプルは、アクチンの非存在によって決定したところ、十分なｍＲＮＡを含まなかった。ＣＥＳ細胞も分析した。アクチンは発現されたが、ｃＥＳ細胞はＣＶＨを発現せず、Ｄａｚｌが弱く発現されただけであった。
【図３】１６６日間培養物中で維持されたＰＧＣのウェスタン分析。ポジティブコントロールとして精巣を使用し、ネガティブコントロールとして肝臓を使用した。一次抗体としてウサギ抗ニワトリＣＶＨ  ＩｇＧを使用した。
【図４】テロメア反復増幅プロトコール（ＴＲＡＰ）アッセイ。異なる希釈率の２つの異なるＰＧＣ細胞株の細胞抽出物（１３および１６）を、１４６日間培養物中で維持した。ポジティブコントロールは、形質転換ヒト腎臓細胞株２９３からなり、ネガティブコントロールは、テンプレートを添加しない溶解緩衝液のみからなる。ＰＧＣおよびポジティブコントロールレーンでは、反復配列が認められ、これはテロメラーゼの存在を示す。
【図５】図５Ａ：培養物中に維持されたＰＧＣ由来のｃＥＧ細胞。図５Ｂ：ニワトリ胚幹細胞。両細胞型における小さな細胞、大きな核（淡灰色）、および明確な核小体に留意のこと。
【図６】ＰＧＣ由来のｃＥＧ細胞から得たキメラ。ＥＧ細胞は、黒い羽をしたＢａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋ胚に由来した。レシピエントとして、白い羽の（白色レグホン）胚を使用した。黒い羽によって体細胞キメラ現象が明らかである。
【図７】雄鶏ＩＶ７−５とその子孫。白色レグホンは、優性な白色遺伝子座で優性ホモ接合である（Ｉ／Ｉ）。Ｂａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋ雌鶏（ｉ／ｉ）と交配した場合、白色レグホン由来の全ての子孫は白色である（Ｉ／ｉ）。黒色の雛鶏は、注入したＰＧＣ（Ｂａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋ胚由来（ｉ／ｉ））が白色レグホンの雄鶏の生殖系列に入ったことを証明する。
【図８】始原生殖細胞（ＰＧＣ）系統中のｃｘ−ｎｅｏ導入遺伝子のサザン分析。
【図９】ニワトリ管（ｖａｓａ）ホモログ（ＣＶＨ）および１Ｂ３に対する抗体で染色したＤＴ４０細胞（ネガティブコントロール集団）、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞、およびＰＧＣのＦＡＣＳ分析。ＤＴ４０細胞、ＥＳ細胞、およびＥＧ細胞は両マーカーについて陰性であったが、大部分のＰＧＣはＣＶＨおよび１Ｂ３の両方について染色された。使用した細胞株は、ＰＧＣ１０２、ＥＳ４３９、およびＥＧ４５５であった。
【図１０】２つの始原生殖細胞ＰＧＣ株におけるＨＳ４−β−アクチン−ｎｅｏ導入遺伝子のサザン分析。
【図１１】コロニー由来のトランスフェクトしたＰＧＣ株がキメラニワトリの生殖系列に寄与し、ＥＧ細胞に分化することができることを示すサザンブロット分析。上のパネル：ＨＳ４  ｂａｃｔｉｎ−ｅＧＦＰ−ｂａｃｔｉｎ−ｐｕｒｏ構築物でトランスフェクトしたＰＧＣに由来するゲノムＤＮＡ、トランスフェクトしたＰＧＣで作製したキメラ雄鶏由来の３つの胚に由来するゲノムＤＮＡ、およびトランスフェクトしたＰＧＣ由来のＥＧ細胞に由来するゲノムＤＮＡを、導入遺伝子挿入の内部フラグメント（ＫｐｎＩ）および連結点フラグメント（ＮｃｏＩ、ＡｆｌＩＩ）を検出するために、制限酵素で消化した。消化したＤＮＡを、０．７％アガロースゲルで分離し、ナイロン膜にブロッティングし、放射性標識ｅＧＦＰ配列で探索した。ハイブリッド形成フラグメントのサイズは、ＰＧＣ細胞、ＥＣ細胞、および緑色蛍光を示した２つの胚（ＧＦＰ＋胚）で同一であった。第３の非蛍光胚（ＷＴ胚）は、ハイブリッド形成を示さなかった。下のパネル：構築物の略図を示し、そして、制限部位の位置を示し、予想制限フラグメントサイズを下に示した。５．３ｋｂフラグメントが得られる２つのＫｐｎＩ部位が存在する。ＮｃｏＩおよびＡｆｌＩＩは、構築物内を１回切断し、それによって認められる制限フラグメントは、挿入部位において隣接ゲノムＤＮＡを構築物と連結する連結点フラグメントである。
【図１２】全染色体が二倍体であることを示すＧ−０９の核型。ＧＧＡ２の１つのコピーでは、ｐアームの大部分が失われているか、別の染色体に転座している。ＣＧＡ２の他のコピーは正常である。細胞は、ＺＺ（雄）である。
【図１３】ＤＡＰＩで染色した成長１８日目の精巣の切片。ＧＦＰ陽性生殖細胞は、細精管内で明確に認められる。
【図１４】ＤＡＰＩ染色パネルは、Ｅ１８精巣の細精管を通る切片を示す。
【図１５】βアクチン−ＧＦＰ導入遺伝子で安定にトランスフェクトしたＰＧＣを保有するキメラ由来のトランスジェニック子孫。胚は、ＧＦＰが、ｘ段階（ＥＧ＆Ｋ）から３４段階（Ｈ＆Ｈ）までの全組織中で発現することを証明する。
【図１６】ステップ１では、抗ＩＬ−２Ｒα  ＩｇＬ／ＩｇＨカセットを、リコンビニアリング（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）により、大腸菌内での相同組換えによってＯｖ  ＢＡＣに挿入する。次いで、抗体を、Ｏｖ調節エレメントの転写調節下におく。ステップ２では、リコンビニアリングで使用したカナマイシン遺伝子を、Ｆｌｐリコンビナーゼによって除去する。
【図１７】示すように、全長軽鎖Ｖ領域を産生するために互いにアニーリングするようにデザインされた軽鎖Ｖ遺伝子オリゴのデザインを示す。各オリゴを、３’方向を指す矢印と共に示す。
【図１８】Ｏｖ構造遺伝子の５’側の１１０ｋｂの配列およびＯｖ構造遺伝子の３’側の３０ｋｂの隣接配列を有するＯｖＢＡＣ構築物を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年9月19日(2007.9.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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