(57)【要約】  本発明は、0.7〜0.9MDaの平均分子量を有するヒアルロン酸又はその塩を含んで成る、保湿、化粧、又は抗−しわ生成物、そのような生成物を含んで成る組成物、及びそのような生成物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
0.7〜0.9MDaの平均分子量を有するヒアルロン酸又はその塩を含んで成る、保湿、化粧、又は抗−しわ生成物。
【請求項２】
前記ヒアルロン酸又はその塩が、好ましくはグラム陽性細菌、より好ましくはバシラス属の細菌より、組換え的に生成される請求項１記載の生成物。
【請求項３】
ヒアルロン酸の無機塩、好ましくはヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸アンモニウム、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸亜鉛、又はヒアルロン酸コバルトを含んで成る請求項１又は２記載の生成物。
【請求項４】
本明細書において定義されるように測定される場合、８週間にわたって、少なくとも３％好ましくは少なくとも5％、最も好ましくは少なくとも７％の皮膚保湿効果を有する請求項１〜３のいずれか１項記載の生成物。
【請求項５】
本明細書において定義されるようにして測定される場合、８週間にわたって、少なくとも10％、好ましくは少なくとも15％、より好ましくは少なくとも20％、全体の皮膚弾性（R2）を高めることができる請求項１〜４のいずれか１項記載の生成物。
【請求項６】
前記ヒアルロン酸又はその塩が、ホウ酸及び/又はポリマー性α−ヒドロキシ酸、好ましくはポリ乳酸又はグリコール酸のエステルを含んで成る請求項１〜５のいずれか１項記載の生成物。
【請求項７】
前記ヒアルロン酸又はその塩が、ジビニルスルホン（DVS）により十分に又は部分的に架橋されている請求項１〜６のいずれか１項記載の生成物。
【請求項８】
活性成分、好ましくは薬理学的活性物質をまた含んで成る請求項１〜７のいずれか１項記載の生成物。
【請求項９】
水溶性賦形剤、好ましくはラクトースをまた含んで成る請求項１〜８のいずれか１項記載の生成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項記載の生成物及び活性成分、好ましくは薬理学的活性成分を含んで成る組成物。
【請求項１１】
水溶性賦形剤、好ましくはラクトースをまた含んで成る請求項10記載の生成物。
【請求項１２】
有効量の請求項１〜９のいずれか１項記載の生成物、及び医薬的に許容できるキャリヤー、賦形剤又は希釈剤を含んで成る医薬組成物。
【請求項１３】
ビークルとしての有効量の請求項１〜９のいずれか１項記載の生成物、及び薬理学的活性剤を含んで成る医薬組成物。
【請求項１４】
有効量の請求項１〜９のいずれか１項記載の生成物を活性成分として含んで成る化粧製品。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか１項記載の生成物を含んで成る、衛生、医学又は手術製品、好ましくは手術用スポンジ、創傷治癒スポンジ、又はバンドエイド又は他の創傷包帯材料。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれか１項記載の生成物を含んで成る、医薬カプセル、又はマイクロカプセル。
【請求項１７】
請求項１〜９のいずれか１項記載の生成物、又は請求項10〜13のいずれか１項記載の組成物の使用を包含する、眼科学的処置を実施するための方法。
【請求項１８】
請求項１〜９のいずれか１項記載の生成物、又は請求項10〜13のいずれか１項記載の組成物の使用を包含する、変形性関節炎の処理工程を実施するための方法。
【請求項１９】
請求項１〜９のいずれか１項記載の生成物、又は請求項10〜13のいずれか１項記載の組成物の使用を包含する、癌の処理工程を実施するための方法。
【請求項２０】
請求項１〜９のいずれか１項記載の生成物、又は請求項10〜13のいずれか１項記載の組成物の使用を包含する、薬理学的活性剤の経皮投与を実施するための方法。
【請求項２１】
請求項１〜９のいずれか１項記載の生成物、又は請求項10〜13のいずれか１項記載の組成物の使用を包含する、薬理学的活性剤の皮膚投与を実施するための方法。
【請求項２２】
請求項１〜９のいずれか１項記載の生成物、又は請求項10〜13のいずれか１項記載の組成物の使用を包含する、化粧品の皮膚投与を実施するための方法。
【請求項２３】
請求項１〜９のいずれか１項記載の生成物、又は請求項10〜13のいずれか１項記載の組成物の眼科学的使用方法。
【請求項２４】
有効量の請求項１〜９のいずれか１項記載の生成物、又は請求項10〜13のいずれか１項記載の組成物を哺乳類に、皮膚、経皮、経口又は注射投与することを含んで成る、変形性関節炎の処理方法。
【請求項２５】
有効量の請求項１〜９のいずれか１項記載の生成物、又は請求項10〜13のいずれか１項記載の組成物を哺乳類に投与することを含んで成る創傷の処理方法。
【請求項２６】
変形性関節炎の処理のための薬剤の製造のためへの、請求項１〜９のいずれか１項記載の生成物、又は請求項10〜13のいずれか１項記載の組成物の使用。
【請求項２７】
眼科学的処理のための薬剤の製造のためへの、請求項１〜９のいずれか１項記載の生成物、又は請求項10〜13のいずれか１項記載の組成物の使用。
【請求項２８】
癌の処理のための薬剤の製造のためへの、請求項１〜９のいずれか１項記載の生成物、又は請求項10〜13のいずれか１項記載の組成物の使用。
【請求項２９】
創傷の処理のための薬剤の製造のためへの、請求項１〜９のいずれか１項記載の生成物、又は請求項10〜13のいずれか１項記載の組成物の使用。
【請求項３０】
脈管形成のための薬剤の製造のためへの、請求項１〜９のいずれか１項記載の生成物、又は請求項10〜13のいずれか１項記載の組成物の使用。
【請求項３１】
モイスチュライザーの製造のためへの、請求項１〜９のいずれか１項記載の生成物、又は請求項10〜13のいずれか１項記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、0.7〜0.9MDaの平均分子量を有するヒアルロン酸又はその塩を含んで成る、保湿、化粧、又は抗−しわ生成物、そのような生成物を含んで成る組成物、及びそのような生成物及び組成物の、皮膚、又は経皮適用及び化粧用クリーム又はローション（ここで、HA画分が保湿及び抗−しわ性質を兼備えている）への使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景：
身体中の最も豊富なヘテロ多糖は、グリコサミノグリカンである。グリコサミノグリカンは、反復する二糖単位からなる枝なしの炭水化物ポリマーである（ケラタン硫酸のみが炭水化物のコアー領域において枝分かれされている）。二糖単位は一般的に、第１のサッカリド単位として、２種の変性された糖、すなわちN−アセチルガラクトサミン（GalNAc）又はN−アセチルグルコサミン（GlcNAc）の１つを含んで成る。第２の単位は通常、ウロン酸、例えばグルクロン酸（GlcUA）又はイズロネートである。
【０００３】
グリコサミノグリカンは負に荷電された分子であり、そして溶液において高い粘度を付与する拡張されたコンホメーションを有する。グリコサミノグリカンは、細胞の表面上に又は細胞外マトリックスに位置する。グリコサミノグリカンはまた、溶液において低い圧縮性を有し、そして結果として、生理学的潤滑液、例えば関節として理想的である。グリコサミノグリカンの剛性が、細胞に構造的に結合性を付与し、そして細胞間に通路を提供し、細胞移動可能にする。最高の生理学的に重要なグリコサミノグリカンは、ヒアルロナン、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸及びケラタン硫酸である。ほとんどのグリコサミノグリカンは、特定のオリゴ糖構造を通してプロテオグリカンコアータンパク質に共有結合する。ヒアルロナンは、一定のプロテオグリカンと大きな凝集体を形成するが、しかし遊離炭水化物鎖がプロテオグリカンと非共有複合体を形成する場合、例外である。
【０００４】
身体中でのヒアルロナンの多くの役割は同定されている（Laurent T. C. and Fraser J. R. E. , 1992, FASEB J. 6: 2397-2404; 及び Toole B. P. , 1991, "Proteoglycans and hyaluronan in morphogenesis and differentiation."In : Cell Biology of the Extracellular Matrix, pp. 305-341, Hay E. D. , ed., Plenum, New Yorkを参照のこと）。ヒアルロナンは、硝子軟骨、滑膜関節液及び皮膚組織（真皮及び表皮の両者）に存在する。ヒアルロナンはまた、多くの生理学的機能、例えば付着、成長、細胞運動性、癌、脈管形成及び創傷治癒における役割を有すると思われる。ヒアルロナンのユニークな物理的及び生理学的性質のために、それは眼及び関節の手術に使用され、そして他の医学的方法においても評価される。
【０００５】
用語“ヒアルロン酸”とは、細胞表面、脊椎贓物の結合組織の塩基性細胞外物質、関節の滑液、眼の眼内流体、ヒト臍帯組織及び鶏冠において天然において存在する、D−グルクロン酸及びN−アセチル−D−グルコサミン酸の残基により構成される、異なった分子量を有する酸性多糖類を意味するために文献において使用される。
【０００６】
用語“ヒアルロン酸”とは、種々の分子量を有するD−グルクロン酸及びN−アセチル−D−グルコサミン酸の交互の残基、又はその分解された画分を有する一連の多糖類を意味するものとして実際使用され、そして従って、“ヒアルロン酸”の複数用語を用いることが、より正しいと思われる。しかしながら、単一用語は、この記載においてすべて同じに使用され；さらに、略語“HA”は時折、この集合的な用語の代わりに使用されるであろう。
【０００７】
HAは、多くの組織、例えば皮膚、腱、筋肉及び軟骨の細胞のための機械的な支持体として、生物において重要な役割を演じ、すなわちそれは、細胞内マトリックスの主成分である。HAはまた、生物学的工程、例えば組織の保湿及び湿潤において他の重要な部分を演じている。
【０００８】
HAは、上記天然の組織から抽出され得るが、但し今日、感染剤の移行の可能性ある危険性を低め、そして生成物の均等性、品質及び利用性を高めるために、微生物学的方法により、それを調製することが好ましい（WO03/0175902号、Novozymes）。
【０００９】
HA及びその種々の分子サイズ画分、及びそれらのそれぞれの塩は、特に関節症の処理における薬剤として、特に眼科学及び美容外科における天然の器官及び組織のための助剤及び/又は置換剤として、及び化粧製品における剤として使用されて来た。ヒアルロナンの生成物はまた、整形外科、リウマチ学及び皮膚学への使用のためにも開発されて来た。
【００１０】
HAはまた、衛生及び手術製品のために使用される種々のポリマー材料、例えばポリウレタン、ポリエステル、等のための、それらの材料を生物適合性にする効果を有する添加剤としても使用され得る。
【００１１】
多官能エポキシ化合物によりHAを架橋することにより調製される、架橋されたHA又はその塩の調製は、EP0161887B1に開示されている。脂肪族アルコールによるHAの全体的又は部分的架橋のエステル、及び無機又は有機塩基によるその部分的エステルの塩が、アメリカ特許第4,957,744号に開示される。
【００１２】
US6673919B2（Chisso Corp. 公開日06/01/2004）は、ヒアルロン酸又はその塩、及びカチオン性化合物の溶液から成る複合体のO−アセチル化、アルコキシル化又は架橋により、ヒアルロン酸又はその塩を化学的に修飾するための方法に関する。
FR2707653号（Vetoquinol）は、生物適合性及び生分解性ポリマーと、分子、特に移動水素を含む生物学的活性分子との間の接合体；その調製方法；及びこの接合体を含む医薬生成物に関する。
【００１３】
約１〜約1.5MDaの平均分子量を有するHAの高分子量画分は、化粧組成物、例えばローション及びクリームにおいて卓越した保湿性質を付与することが良く知られている。
典型的には、約0.02〜約0.4MDaの平均分子量を有するHAの低分子量画分は、それらの画分の皮膚バリヤーを侵入する能力のために、抗−しわ性質を示すことが報告されている。
保湿及び抗−しわの両性質は多くの用途において高く所望され、そして両性質を示す単独の化合物が商業的に非常に興味あるものである。
【発明の開示】
【００１４】
発明の要約：
本発明者は最近、約0.7〜約0.9MDaの平均分子量を有するHA画分を生成し、そして彼らは、保湿及び抗−しわ効果についてそれらの画分を評価している。
驚くべきことには、この範囲での平均分子量を有するHA画分が、保湿及び抗−しわ効果の両者を示すことが見出された。
【００１５】
従って、第１の観点においては、本発明は、0.7〜0.9MDaの平均分子量を有するヒアルロン酸又はその塩を含んで成る、保湿、化粧、又は抗−しわ生成物に関する。
第２の観点においては、本発明は、第1の観点において定義されるような生成物及び活性成分、好ましくは薬理学的活性成分を含んで成る組成物に関する。
第３の観点は、有効量の第1の観点において定義されるような生成物、及び医薬的に許容できるキャリヤー、賦形剤又は希釈剤を含んで成る医薬組成物に関する。
【００１６】
第４の観点は、ビークルとしての有効量の第1の観点において定義されるような生成物、及び薬理学的活性剤を含んで成る医薬組成物に関する。
第５の観点は、有効量の第1の観点において定義されるような生成物を活性成分として含んで成る化粧製品に関する。
【００１７】
第６の観点においては、本発明は、第1の観点において定義されるような生成物を含んで成る、衛生、医学又は手術製品、好ましくは手術用スポンジ、創傷治癒スポンジ、又はバンドエイド又は他の創傷包帯材料に関する。
重要な観点は、第１の観点に定義されるような生成物を含んで成る医薬カプセル又はマイクロカプセルに関する。
【００１８】
本発明の最終観点は、眼科学的処理、変形性関節炎又は眼の処理、創傷の処理、又は薬理学的活性剤の皮膚又は経皮投与又は化粧品の皮膚投与の実施方法に関し、ここで前記方法は、第１の観点において定義されるような生成物、又は第２、第３又は第４の観点のいずれかに定義されるような組成物の使用を包含する。
多くの観点は、変形性関節炎、癌の処理のための薬剤の製造、創傷の処理のための薬剤の製造、又はモイスチャライザーの製造のためへの、第１の観点において定義されるような生成物又は前記観点のいずれかに定義されるような組成物の使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
定義：
核酸構造体：
“核酸構造体”は、本明細書においては、天然に存在する遺伝子から単離され、又は他方では、天然に存在しない態様で組み合わされ、そして並置される、核酸のセグメントを含むように修飾されている、一本鎖又は二本鎖核酸分子として定義される。用語、核酸構造体は、核酸構造体がコード配列の発現のために必要とされるすべての制御配列を含む場合、用語“発現カセット”と同じ意味である。用語“コード配列”とは、本明細書において定義される場合、mRNAに転写され、そして下記に言及される制御配列の制御下に配置される場合、興味ある酵素に翻訳される配列である。コード配列の境界は、一般的に、mRNAの5’末端で読み取り枠のすぐ上流に位置するリボソーム結合部位、及びmRNAの3’末端で読み取り枠のすぐ下流に位置する転写ターミネーター配列により決定される。コード配列は、DNA、cDNA,及び組換え核酸配列を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００２０】
ポリペプチドをコードする核酸配列を単離し、又はクローン化するために使用される技法は、当業界において良く知られており、そしてゲノムDNAからの単離、cDNAからの調製、又はそれらの組み合わせを包含する。そのようなゲノムDNAからの本発明の核酸配列のクローニングは、例えば良く知られているポリメラーゼ鎖反応（PCR）、又は共有する構造特徴を有するクローン化されたDNAフラグメントを検出するために発現ライブラリーの抗体スクリーニングを用いることによってもたらされ得る。例えば、Innisなど., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application; Academic Press, New York を参照のこと。
【００２１】
他の核酸増幅方法、例えばリガーゼ鎖反応、連結された活性化転写及び核酸配列に基づく増幅が使用され得る。クローニング方法は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る所望する核酸フラグメントの切除及び単離、ベクター分子中への前記フラグメントの挿入、及び核酸配列のクローンが複製されるであろうバシラス細胞中への組換えベクターの組み込みを包含することができる。核酸配列は、ゲノム、cDNA, RNA, 半合成、合成起原、又はそれらのいずれかの組み合わせのものであり得る。
【００２２】
酵素をコードする単離された核酸配列は、酵素の発現を提供するために種々の手段で操作され得る。構造体又はベクター中へのその挿入の前、核酸配列の操作は、発現ベクター又はバシラス宿主細胞に依存して、所望されるか又は必要とされる。クローニング方法を用いて核酸配列を修飾するための技法は、当業界において良く知られている。核酸配列がまた、当業界において良く知られている方法を用いて宿主細胞においてインビボで操作され得ることは理解されるであろう。
【００２３】
多くの酵素が、ヒアルロン酸の生合成に関与する。それらの酵素は、ヒアルロナンシンターゼ、UDP−グルコース６−デヒドロゲナーゼ、UDP−グルコースピロホスホリラーゼ、UDP−N−アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼヘキソキナーゼ、ホスホグルコムターゼ、アミドトランスフェラーゼ、ムターゼ及びアセチルトランスフェラーゼを包含する。ヒアルロナンシンターゼは、ヒアルロン酸の生成における主要酵素である。
【００２４】
“ヒアルロナンシンターゼ”とは、GluUA及びGlcNAc糖前駆体の付加によりヒアルロナン鎖の延長を触媒するシンターゼとして、本明細書においては定義される。ストレプトコーカスヒアルロナンシンターゼ、脊椎動物ヒアルロナンシンターゼ及びウィルスヒアルロナンシンターゼのアミノ酸配列は、パステウレラヒアルロナンシンターゼとは異なり、そしてグループI及びグループIIヒアルロナンシンターゼとしての分類のために提案されており、ここで前記グループIヒアルロナンシンターゼはストレプトコーカスヒアルロナンシンターゼを包含する（DeAngelis, 1999）。バシラス宿主細胞におけるヒアルロナンの生成に関しては、真核生物起源のヒアルロナンシンターゼ、例えば哺乳類ヒアルロナンシンターゼはほとんど好ましいものではない。
【００２５】
ヒアルロナンシンターゼコード配列は、バシラス宿主細胞において発現され得るいずれかの核酸配列であり得る。前記核酸配列はいずれの起源のものでもあり得る。好ましいヒアルロナンシンターゼ遺伝子は、グループI又はグループIIのいずれか、例えばストレプトコーカス・エクイシミリス、ストレプトコーカス・ピオゲネス、ストレプトコーカス・ウベリス又はストレプトコーカス・エクイ亜種ズーエピデミカスからのグループIヒアルロナンシンターゼ遺伝子、又はパスツレラ・ムルトシダのグループIIヒアルロナンシンターゼ遺伝子を包含する。
【００２６】
ヒアルロナンの前駆体糖が宿主細胞、すなわち培養培地に供給されるか、又は内因性遺伝子により、非内因性遺伝子により、又はバシラス宿主細胞における内因性及び非内因性遺伝子の組み合わせによりコードされる構造体が、本発明のHAの生成において好ましい。前記前駆体糖は、D−グルクロン酸又はN−アセチル−グルコサミンであり得る。
【００２７】
本発明の方法においては、核酸構造体はさらに、ヒアルロナンの前駆体糖の生合成における酵素をコードする１又は複数の遺伝子を含んで成ることができる。他方では、バシラス宿主細胞は、さらに、前駆体糖の生合成における酵素をコードする１又は複数の遺伝子を含んで成る１又は複数の第２核酸構造体を含んで成ることができる。ヒアルロナン生成は、ヒアルロナンの前駆体糖の合成路における段階を指図する１つの遺伝子又は複数の遺伝子をコードする核酸配列を有する構造体の使用により改良される。“ヒアルロナンの前駆体糖の合成路における段階を指図する”とは、前記遺伝子の発現されたタンパク質がN−アセチル−グルコサミン又はD−グルクロン酸、又はN−アセチル−グルコサミン及びD−グルクロン酸のいずれかの前駆体である糖の形成において活性的であることを意味する。
【００２８】
前駆体糖を供給するための好ましい方法においては、ヒアルロナンの前駆体糖の合成路における段階を指図する遺伝子をコードする核酸配列に作用可能に結合される異種プロモーター領域を有する組換え構造体を有する宿主細胞を培養することによって、ヒアルロナンシンターゼを有する宿主細胞におけるヒアルロナン生成を改良するための構造体が提供される好ましい方法においては、宿主細胞はまた、N−アセチル−グルコサミンの生合成に関与するシンターゼに対して、前記核酸配列と同じか又は異なったプロモーターを使用することができる、ヒアルロナンシンターゼに作用可能に結合されるプロモーターを使用することができる、ヒアルロナンシンターゼに作用可能に結合されるプロモーター領域を有する組換え操作体を含んで成る。さらなる好ましい態様においては、宿主細胞は、ヒアルロナンの前駆体糖の合成に関与する第２遺伝子をコードする異なった核酸配列に作用可能に結合されるプロモーター領域を有する組換え構造体を有することができる。
【００２９】
従って、本発明はまた、ヒアルロナンの前駆体糖の合成路における段階を指図する遺伝子をコードする核酸配列を有する構造体の使用により、ヒアルロナン生成を改良するための構造体にも関する。核酸配列は、ヒアルロナンシンターゼをコードする核酸配列と同じか又は異なったプロモーターから前駆体糖に発現され得る。
【００３０】
ヒアルロン酸の生成のための前駆体糖の生合成に関与する遺伝子は、UDP−グルコース６−デヒドロゲナーゼ遺伝子、UDP−グルコースピロホスホリラーゼ遺伝子、UDP−N−アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ遺伝子、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ遺伝子、ヘキソキナーゼ遺伝子、ホスホグルコムターゼ遺伝子、アミドトランスフェラーゼ遺伝子、ムターゼ遺伝子及びアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を包含する。
【００３１】
ヒアルロナンシンターゼを含む細胞においては、hasB, hasC及びhasD又はそれらの相同体、例えばバシラス・サブチリスtuaD, gtaB及びgcaDのいずれか１つ又は組合せが、ヒアルロナンシンターゼに利用できる前駆体糖のプールを高めるために発現され得る。バシラスゲノムは、Kunst, など., Nature 390,249-256,"The complete genome sequence of the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis" (20 November 1997)記載される。いくつかの場合、例えば宿主細胞が生来のヒアルロナンシンターゼ活性を有さない場合、構造体はhasA遺伝子を含むことができる。
【００３２】
生合成酵素をコードする核酸配列は、宿主細胞に対して生来のものであり得るが、ところが他の場合、異種配列が使用され得る。複数の遺伝子が発現される場合、それらは、生来のオペロンにおいてお互い関連する遺伝子、例えばhasA, hasB, hasC及びhasDを含んで成る、ストレプトコーカス・エクイシミリスのHASオペロンの遺伝子であり得る。他の場合、前駆体遺伝子配列のいくつかの組合せの使用が所望されるが、オペロン中の個々の要素は包含されない。宿主細胞に対して生来のいくつかの遺伝子、及び外因性である他の遺伝子の使用がまた、他の場合、好ましい。選択は、所定の宿主細胞における利用できる糖のプール、宿主細胞の他の機能を妨げないで、過剰生成に対する細胞の適合能力、及び細胞が外因性遺伝子とは異なってその生来の遺伝子からの発現を調節するかどうかに依存するであろう。
【００３３】
１つの例として、細胞の代謝必要条件及び増殖条件、及び利用できる前駆体糖プールに依存して、UDP-N−アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼをコードする核酸配列、例えばhasD遺伝子、バシラスgcaD遺伝子及びそれらの相同体の発現によりN−アセチル−グルコサミンの生成を高めることが所望される。他方では、前駆体糖はD−グルクロン酸であり得る。１つのそのような態様においては、核酸配列は、UDP−グルコース６−デヒドロナーゼをコードする。そのような核酸配列は、バシラスtuaD遺伝子、ストレプトコーカスのhasB遺伝子、及びそれらの相同体を包含する。核酸配列はまた、UDP−グルコースピロホスホリラーゼ、例えばバシラスgtaB遺伝子、ストレプトコーカスのhasC遺伝子及びそれらの相同体をコードすることができる。本発明の方法においては、UDP−グルコース６−デヒドロゲナーゼ遺伝子は、hasB遺伝子又はtuaD遺伝子；又はそれらの相同体であり得る。
【００３４】
本発明の方法においては、ヒアルロナンシンターゼ遺伝子、及び前駆体糖をコードする１又は複数の遺伝子は、同じプロモーターの制御下にある。他方では、前駆体糖をコードする１又は複数の遺伝子は、同じプロモーターであるが、しかしヒアルロナンシンターゼ遺伝子を駆動する異なったプロモーターの制御下にある。さらなる態様においては、ヒアルロナンシンターゼ遺伝子、及び前駆体糖をコードする遺伝子の個々は、異なったプロモーターの制御下にある。好ましい態様においては、ヒアルロナンシンターゼ遺伝子、及び前駆体糖をコードする１又は複数の遺伝子は同じプロモーターの制御下にある。
【００３５】
本発明はまた、ヒアルロナンシンターゼ遺伝子及びUDP−グルコース６−デヒドロゲナーゼ遺伝子、及び任意には、UDP−グルコースピロホスホリラーゼ遺伝子、UDP−N−アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ遺伝子及びグルコース−６−リン酸イソメラーゼ遺伝子から成る群から選択された１又は複数の遺伝子を含んで成るヒアルロナンシンターゼオペロンをコードする単離された核酸配列を含んで成る核酸構造体に関する。
【００３６】
いくつかの場合、宿主細胞は、組換え構造体からのヒアルロナンシンターゼの発現に関係する、ヒアルロナンの前駆体糖の合成路における段階を指図する遺伝子をコードする核酸分子に作用可能に結合される異種プロモーター領域を有する組換え構造体を有するであろう。ヒアルロナンシンターゼは、前駆体の生合成に関与する酵素をコードする核酸配列と同じか又は異なったプロモーター領域から発現され得る。もう1つの好ましい態様においては、宿主細胞は、ヒアルロナン前駆体糖の合成に関与する第２遺伝子をコードする異なった核酸配列に作用可能に結合されるプロモーター領域を有する組換え構造体を有することができる。
【００３７】
前駆体糖の生合成に関与する酵素コードする核酸配列は、ヒアルロナンシンターゼをコードする核酸配列と同じか又は異なったプロモーターから発現され得る。前者においては、個々のhasH, hasB, hasC及びhasD、又はそれらの相同体を有することにおいて、スタフィロコーカス・エクイシミリスのオペロンを模倣することができるか、又は他方では、ストレプトコーカス・エクイシミリスオペロンに存在する十分な補体を決して利用できない“人口オペロン”が構成される。
【００３８】
“人工オペロン”はまた、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ遺伝子（hasE）、及びヘキソキナーゼ遺伝子、ホスホグルコムターゼ遺伝子、アミドトランスフェラーゼ遺伝子、ムターゼ遺伝子及びアセチルトランスフェラーゼ遺伝子から成る群から選択された１又は複数の遺伝子を含んで成ることができる。人工オペロンにおいては、要素の少なくとも１つは、他の１つの要素、例えばコード配列に対して異種であるプロモーター領域に対して異種である。
【００３９】
好ましい態様においては、核酸構造体は、hasA, tueD及びgtaBを含んで成る。もう1つの好ましい態様においては、核酸構造体は、hasA, tauD, gtaB及びgcaDを含んで成る。もう１つの好ましい態様においては、核酸構造体は、hasA及びtuaDを含んで成る。もう1つの好ましい態様においては、核酸構造体はhasAを含んで成る。もう１つの好ましい態様においては、核酸構造体は、hasA, tuaD, gtaB, gcaD及びhasEを含んで成る。もう１つの好ましい態様においては、核酸構造体は、hasA, hasB, hasC, hasD及びhasEを含んで成る。上記の好ましい態様に基づけば、示される遺伝子は、その相同体により置換され得る。
【００４０】
本発明の方法においては、核酸構造体は、ヒアルロナンシンターゼコード配列に対して外来性のプロモーター配列に作用可能に結合されるヒアルロナンシンターゼコード配列を含んで成る。前記プロモーター配列は、例えば単一のプロモーター又はタンデムプロモーターであり得る。
【００４１】
“プロモーター”とは、１つの遺伝子の転写を開始するためにRNAポリメラーゼの結合に関与する核酸配列として本明細書において定義される。“タンデムプロモーター”とは、複数のプロモーター配列として本明細書においては定義され、これらの個々は、コード配列に作用可能に結合され、そしてmRNAへのコード配列の転写を仲介する。“作用可能に結合される”とは、制御配列、例えばプロモーター配列が、制御配列がコード配列によりコードされるポリペプチドの生成を指図するよう、コード配列に関する位置で適切に置換される配置として本明細書において定義される。
【００４２】
前述のように、“コード配列”とは、適切な制御配列の制御下に置かれる場合、mRNAに転写され、そしてポリペプチドに翻訳される核酸配列として本明細書において定義される。コード配列の境界は一般的に、mRNAの5’末端での読み取り枠のすぐ上流に位置するリボソーム結合部位、及びmRNAの3’末端での読み取り枠のすぐ下流に位置する転写ターミネーター配列により決定される。コード配列は、DNA、cDNA、半合成、合成及び組換え核酸配列を含むことができるが、但しそれらだけには限定されない。
【００４３】
好ましい態様においては、プロモーター配列は、細菌源から得られる。より好ましくは態様においては、プロモーター配列は、グラム陽性細菌、例えばバシラス株、例えばバシラス・アガラドヘレンス（Bacillus agaradherens）、バシラス・アルカロフィラス（Bacillus alkalophilus）、バシラス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バシラス・ブレビス（Bacillus brevis）、バシラス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バシラス・クラウジ（Bacillus clausii）、バシラス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バシラス・ファーマス（Bacillus firmus）、バシラス・ラウタス（Bacillus lautus）、バシラス・レンタス（Bacillus lentus）、バシラス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バシラス・メガテリウス（Bacillus megaterium）、バシラス・プミラス（Bacillus pumilus）、バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）及びバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）；又はストレプトミセス株、例えばストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）又はストレプトミセス・ムリナス（Streptomyces murinus）；又はグラム陰性細菌、例えばE. コリ又はシュードモナスから得られる。
【００４４】
本発明の方法に置ける核酸配列の転写を指図するための適切なプロモーターの例は、E. コリlacオペロン、ストレプトミセス・コエリコロルアガラーゼ遺伝子（dagA）、バシラス・レンタス又はバシラス・クラウジアルカリプロテアーゼ遺伝子（aprH）、バシラス・リケニホルミスアルカリプロテアーゼ遺伝子（ズブチリシンCarlsberg遺伝子）、バシラス・サブチリスレバンスクラーゼ遺伝子（sacB）、バシラス・サブチリスα−アミラーゼ遺伝子（amyE）、バシラス・リケニホルミスα−アミラーゼ遺伝子（amyL）、バシラス・ステアロサーモフィラスマルトゲンアミラーゼ遺伝子（amyM）、バシラス・アミロリケファシエンスα−アミラーゼ遺伝子（amyQ）、バシラス・リケニホルミスペニシリナーゼ遺伝子（penP）、バシラス・サブチリスzylA及びzylB遺伝子、バシラス・ツリンギエンシス亜種テネブリオニスCryIII A遺伝子(cryIII A)、又はそれらの一部、又は原核生物β−ラクタマーゼ遺伝子から得られたプロモーターである（Villa- Kamaroffなど., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727- 3731）。他の例は、spo1細菌ファージプロモーター及びtacプロモーターである（(DeBoer など., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25）。さらなるプロモーターは、"Useful proteins from recombinant bacteria"in Scientific American, 1980,242 : 74-94;及び Sambrook, Fritsch, and Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載される。
【００４５】
プロモーターはまた、“-35”領域のための配列TTGACA及び“-10”領域のためのTATAATを有する“コンセンサス”プロモーターであり得る。コンセンサスプロモーターは、バシラス宿主細胞において機能することができるいずれかのプロモーターから得られる。“コンセンサス”プロモーターの構成は、バシラス・サブチリスのための増殖性“シグマA−型”プロモーターの“-10”及び“-35”領域のための確立されたコンセンサス配列に対してより完全に適合するプロモーターを創造するために、特定の部位の突然変異誘発により達成され得る（Voskuil など., 1995, Molecular Microbiology 17: 271-279）。
【００４６】
好ましい態様においては、“コンセンサス”プロモーターは、E. コリlacオペロン、ストレプトミセス・コエリコロルアガラーゼ遺伝子（dagA）、バシラス・レンタス又はバシラス・クラウジアルカリプロテアーゼ遺伝子（aprH）、バシラス・リケニホルミスアルカリプロテアーゼ遺伝子（ズブチリシンCarlsberg遺伝子）、バシラス・サブチリスレバンスクラーゼ遺伝子（sacB）、バシラス・サブチリスα−アミラーゼ遺伝子（amyE）、バシラス・リケニホルミスα−アミラーゼ遺伝子（amyL）、バシラス・ステアロサーモフィラスマルトゲンアミラーゼ遺伝子（amyM）、バシラス・アミロリケファシエンスα−アミラーゼ遺伝子（amyQ）、バシラス・リケニホルミスペニシリナーゼ遺伝子（penP）、バシラス・サブチリスzylA及びzylB遺伝子、バシラス・ツリンギエンシス亜種テネブリオニスCryIII A遺伝子(cryIII A)、又はそれらの一部、又は原核生物β−ラクタマーゼ遺伝子spo1細菌ファージプロモーターから得られたプロモーターから得られる。より好ましい態様においては、“コンセンサス”プロモーターは、バシラス・アミロリケファシエンスα−アミラーゼ遺伝子（amyQ）から得られる。
【００４７】
Widner, など., アメリカ特許第6,255,076号及び第5,955,310号は、短いコンセンサスamyQプロモーター（また、scBANとも呼ばれる）を包含する、バシラス細胞における発現への使用のためのタンデムプロモーター及び構造体、及び方法を記載する。バシラスにおける改良された生成のためへの、cryIII Aスタビライザー配列の使用及び前記配列を用いての構造体がまた記載される。
【００４８】
タンデムプロモーター中の個々のプロモーター配列は、変異、切断された及びハイブリッドプロモーターを包含する、選択のバシラス細胞における転写活性を示すいずれかの核酸配列であり得、そしてバシラス細胞に対して相同の又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られる。個々のプロモーター配列は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列に対して生来のものであるか又は外来のものであり得、そしてバシラス細胞に対して生来のものであるか又は外来のものであり得る。プロモーター配列は、同じプロモーター配列か又は異なったプロモーター配列であり得る。
【００４９】
タンデムプロモーター中の複数のプロモーター配列は、核酸配列の転写を同時に促進することができる。他方では、タンデムプロモーター中の１又は複数のプロモーター配列は、バシラス細胞の増殖の異なった段階で核酸配列の転写促進することができる。
【００５０】
好ましい態様においては、タンデムプロモーターは、バシラス・アミロリケファシエンスα−アミラーゼ遺伝子の少なくともamyQプロモーターを含む。もう１つの好ましい態様においては、タンデムプロモーターは、少なくとも、“-35”領域のための配列TTGACA及び“-10”領域のためのTATAATを有する“コンセンサス”プロモーターを含む。もう1つの好ましい態様においては、タンデムプロモーターは少なくとも、バシラス・リケニホルミスα−アミラーゼ遺伝子のamyLプロモーターを含む。もう１つの好ましい態様のいては、タンデムプロモーターは、少なくともcryIII Aプロモーター又はその一部を含む（Agaisse and Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107）。
【００５１】
より好ましい態様においては、タンデムプロモーターは、少なくともamyLプロモーター及びcryIII Aプロモーターを含む。もう１つのさらなる好ましい態様においては、タンデムプロモーターは少なくともamyQプロモーター及びcryIII Aプロモーターを含む。さらにもう１つの好ましい態様においては、Aタンデムプロモーターは、少なくとも、“-35”領域のための配列TTGACA及び“-10”領域のためのTATAATを有する“コンセンサス”プロモーター、及びcryIII Aプロモーターを含む。さらにもう１つの好ましい態様においては、少なくともamyLプロモーターの２つのコピーを含む。
【００５２】
さらにもう１つの好ましい態様においては、タンデムプロモーターは、少なくともamyQプロモーターの２つのコピーを含む。さらにもう１つの好ましい態様においては、タンデムプロモーターは、“-35”領域のための配列TTGACA及び“-10”領域のためのTATAATを有する“コンセンサス”プロモーターの少なくとも２つのコピーを含む。さらにもう1つの好ましい態様においては、タンデムプロモーターは、cryIII Aプロモーターの少なくとも２つのコピーを含む。
【００５３】
“mRNAプロセッシング/安定化配列”とは、１又は複数のプロモーター配列の下流に位置し、そして前記１又は複数のプロモーター配列の個々が、その個々のプロモーター配列から合成されるすべてのmRNAが転写体の5’末端でスタビライザー配列を有するmRNA転写体を生成するためにプロセッシングされ得るよう作用可能に結合されるコード配列の上流に位置する配列として、本明細書において定義される。mRNA転写体の5’末端でのそのようなスタビライザー配列の存在は、それらの半減期を高める（Agaisse and Lereclus, 1994, Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177 : 3465-3471）。
【００５４】
mRNAプロセッシング/安定化配列は、細菌16SリボソームRNAの3’末端に対して相補的である。好ましい態様においては、mRNAプロセッシング/安定化配列は、鋳型の5’末端で安定化配列を有する実質的に単一サイズの転写体を生成する。mRNAプロセッシング/安定化配列は好ましくは、細菌16SリボソームRNAの3’末端に対する相補的である配列である。アメリカ特許第6,255,076号及び第5,955,310号を参照のこと。
【００５５】
より好ましい態様においては、mRNAプロセッシング/安定化配列は、WO94/25612号及びAgaisse and Lereclus, 1994前記に開示されるバシラス・スリンジエンシスcryIII A mRNAプロセッシング/安定化配列、又はmRNAプロセッシング/安定化機能を保持するその一部である。さらにもう１つの好ましい態様においては、mRNAプロセッシング/安定化配列は、Hueなど., 1995, 前記に開示されるバシラス・サブチリスSP82 mRNAプロセッシング/安定化配列、又はmRNAプロセッシング/安定化機能を保持するその一部である。
【００５６】
cryIII Aプロモーター及びそのmRNAプロセッシング/安定化配列が本発明の方法に使用される場合、WO94/25612号及びAgaisse and Lereclus, 1994, 前記に開示される配列、又はプロモーター及びmRNAプロセッシング/安定化機能を保持するその一部を含むDNAフラグメントが使用され得る。さらに、cryIII Aプロモーターのみ、又はcryIII A mRNAプロセッシング/安定化配列のみを含むDNAフラグメントは、種々のタンデムプロモーター及びmRNAプロセッシング/安定化配列の組合せを構成するために、当業界において良く知られている方法を用いて調製され得る。この態様においては、cryIII Aプロモータ及びそのmRNAプロセッシング/安定化配列が好ましくは、タンデムプロモーターを構成する他のプロモーター配列の下流及び興味ある遺伝子コード配列の上流に配置される。
【００５７】
ヒアルロン酸生成に関与する所望する酵素をコードする単離された核酸配列がさらに、核酸配列の発現を改良するために操作され得る。発現は、ポリペプチドの生成に関与するいずれかの段階、たとえば転写、後−転写修飾、翻訳、後−翻訳修飾及び分泌を包含することが理解されているが、但しそれだけには限定されない。クローニング方法を用いての核酸配列を修飾するための技法は、当業界において良く知られている。
【００５８】
酵素をコードする核酸配列を含んで成る核酸構造体は、制御配列と適合できる条件下でバシラス細胞におけるコード配列の発現を指図できる1又は複数の制御配列に作用可能に結合され得る。
【００５９】
用語“制御配列”とは、核酸配列のコード配列の発現のために必要であるか、又はそのために好都合であるすべての成分を包含するよう定義される。個々の制御配列は、酵素をコードする核酸配列に対して生来であっても又は外来性であっても良い。上記プロモーター配列の他に、そのような制御配列は、リーダー、シグナル配列、及び転写ターミネーターを包含するが、但しそれらだけには限定されない。最少で、制御配列は、プロモーター、及び転写及び翻訳停止シグナルを包含する。制御配列は、異種ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域と制御配列との連結を促進する特定の制限部位を導入するためにリンカーを提供され得る。
【００６０】
制御配列はまた、適切な転写ターミネーター配列、すなわち転写を終結するようバシラス細胞により認識される配列でもあり得る。ターミネーター配列は、酵素又はオペロンの最後の酵素をコードする核酸配列の3’側末端に作用可能に連結される。選択のバシラス細胞において機能的であるいずれかのターミネーターが、本発明において使用され得る。
【００６１】
制御配列はまた、適切なリーダー配列、すなわち、バシラス細胞による翻訳のために重要であるmRNAの非翻訳領域でもあり得る。リーダー配列は、酵素をコードする核酸配列の5’側末端に作用可能に連結される。選択のバシラス細胞において機能的であるいずれかのリーダー配列が、本発明に使用され得る。
【００６２】
制御配列はまた、発現されたポリペプチドを細胞の分泌路中に方向づけるポリペプチドのアミノ末端に連結されるアミノ酸配列をコードするシグナルペプチドコード領域でもあり得る。そのシグナルペプチドコード領域は、ポリペプチドに対して生来のものであり得るか、又は外来性源から得られ得る。核酸配列のコード配列の5’側末端は、本来、分泌されたポロペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳読み取り枠を整合して、天然において連結されるシグナルペプチドコード領域を含むことができる。他方では、コード配列の5’側末端は、分泌されたポリペプチドをコードするコード配列のその部分に対して外来性であるシグナルペプチドコード領域を含むことができる。
【００６３】
通常、そのコード配列がシグナルペプチドコード領域を含まない外来性シグナルペプチドコード領域が必要とされる。他方では、外来性シグナルペプチドコード領域は、コード配列と通常関連しない天然のシグナルペプチドコード領域に対して、ポリペプチドの増強された分泌を得るために、天然のシグナルペプチドコード領域を単純に置換することができる。シグナルペプチドコード領域は、アミラーゼ、又はバシラス種からのプロテアーゼ遺伝子から得られる。しかしながら、選択のバシラス細胞の分泌路中に発現されたポリペプチドを方向づけるいずれかのシグナルペプチドコード領域が、本発明に使用され得る。
【００６４】
バシラス細胞のための効果的なシグナルペプチドコード領域は、バシラスNCIB11837からのマルトゲン性アミラーゼ遺伝子、バシラス・ステアロサーモフィラスα−アミラーゼ遺伝子、バシラス・リケニホルミススブチリシン遺伝子、バシラス・リケニホルミスβ−ラクタマーゼ遺伝子、バシラス・アステロサーモフィラス中性プロテアーゼ遺伝子（nprT, nprS, nprM）、及びバシラス・スブチリスprsA遺伝子から得られるシグナルペプチド領域である。追加のシグナルペプチドは、Sinomen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137 により記載される。
【００６５】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端で位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域であり得る。得られるポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（又は多くの場合、チモーゲン）として知られている。プロポリペプチドは一般的に不活性であり、そしてプロポリペプチドからプロペプチドの触媒又は自己触媒分解により成熟した活性ポリペプチドに転換され得る。プロペプチドコード領域は、バシラス・サブチリスアルカリプロテアーゼ（aprE）、及びバシラス・サブチリス中性プロテアーゼ（nprT）。
【００６６】
シグナルペプチド及びプロペプチド領域の両者がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、そのプロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の次に位置し、そしてシグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の次に位置する。
宿主細胞の増殖に関して、ポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を付加することがまた所望される。調節システムの例は、調節化合物の存在を包含する、化学的又は物理的刺激に応答して、遺伝子の発現の開始又は停止を引き起こすそれらのシステムである。原核生物系における調節システムは、lac, tac及びtrpオペレーターシステムお包含する。
【００６７】
生成：
本発明の生成方法においては、宿主細胞は、当業界において知られている方法を用いて、ヒアルロン酸の生成のために適切な栄養培地において培養される。例えば、細胞は、ポリペプチドの発現及び/又は単離を可能にする、適切な培地において、及びヒアルロン酸合成に関与する酵素の発現及びヒアルロン酸の単離を可能にする条件下で行われる実験室用又は産業用発酵器において、振盪フラスコ培養、小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、供給バッチ、又は団体状態発酵を包含する）により培養され得る。培養は、炭素及び窒素源及び無機塩を含んで成る適切な栄養培地において、当業界において知られている方法を用いて行われる。適切な培地は、市販されているか、又は公開されている組成（例えば、American Type Culture Collection のカタログにおける）に従って調製され得る。分泌されたヒアルロン酸は、培地に直接的に回収され得る。
【００６８】
得られるヒアルロン酸は、当業界において知られている方法により単離され得る。例えば、ヒアルロン酸は、便利な方法、例えば遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発又は沈殿（但し、それらだけには限定されない）により、栄養培地から単離され得る。次に単離されたヒアルロン酸は、当業界において知られている種々の方法、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング及びサイズ排除）、電気泳動方法（例えば、分離用等電点電気泳動）、示差溶解性（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、又は抽出（例えば、Protein Purification, J. -C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989を参照のこと）（但し、それらだけには限定されない）により、さらに精製され得る。
【００６９】
発明の特定の記載：
“ヒアルロン酸”は、β−１，４及びβ−１，３グリコシド結合を変えることによって一緒に結合される、N−アセチルグルコサミン（GlcNAc）及びグルクロン酸（GlcUA）の反復二糖単位から構成される、硫酸化されていないグリコサミノグリカンとして、本明細書においては定義される。ヒアルロン酸はまた、ヒアルロナン、ヒアルロネート又はHAとして知られている。用語、ヒアルロナン及びヒアルロン酸は、本明細書においては、交換可能的に使用される。
【００７０】
雄鶏の鶏冠は、ヒアルロナンのための有意な商業的源である。微生物は他の源である。アメリカ特許第4,801,539号は、１L当たり約3.6gのヒアルロン酸の報告される収率を伴って、ストレプトコーカス・ズーエピデシカス（Streptococcus zooepidemicus）の株を包含するヒアルロン酸の調製のための発酵方法を開示する。ヨーロッパ特許第0694616号は、１L当たり約3.5gのヒアルロン酸の報告される収率を伴って、ストレプトコーカス・ズーエピデシカスの改良された株を用いての発酵方法を開示する。引用により本明細書に組み込まれるWO03/054163号（Novozymes）に開示されるように、ヒアルロン酸又はその塩は、グラム陽性バシラス宿主において組換え的に生成され得る。
【００７１】
ヒアルロナンシンターゼは、脊椎動物, 細菌病原体,及び藻類ウィルス (DeAngelis, P. L., 1999, Cell. Mol. Life Sci, 56: 670-682)から記載されている。WO99/23227号は、ストレプトコーカス・エクイシミリスからのグループIヒアルロン酸シンターゼを開示する。WO99/51265号及びWO00/27437号は、パステウレラ・マルトシダからのグループIIヒアルロン酸シンターゼを記載する。Ferrettiなどは、それぞれヒアルロン酸シンターゼ、UDPグルコースデヒドロゲナーゼ及びUDP−グルコースピロホスホリラーゼをコードする３種の遺伝子、hasA, hasB及びhasCから構成される、ストレプトコーカス・ピロゲネスのヒアルロナンシンターゼオペロンを開示する（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 4658-4663,2001）。WO99/51265号は、ストレプトコーカス・エクイシミリスヒアルロナンシンターゼのためのコード領域を有する核酸セグメントを記載する。
【００７２】
組換えバチルス細胞のヒアルロナンは、培養培地に直接的に発現されるので、単純な方法が、培養培地からヒアルロナンを単離するために使用され得る。第１に、バチルス細胞及び細胞残骸が培養培地から物理的に除去される。最初に、培養培地が、所望により、希釈され、培地の粘度が低められる。培養培地から細胞を除去するための多くの方法、例えば遠心分離又はマイクロフィルトレーションは、当業者に知られている。
【００７３】
所望には、次に残る上清液が、例えば限外濾過により濾過され、濃縮され、そしてヒアルロナンから小さな分子汚染物が除去される。細胞及び細胞残骸の除去に続いて、培地からのヒアルロナンの単純な沈殿が既知機構により行われる。塩、アルコール、又は塩及びアルコールの組合せが、濾液からヒアルロナンを沈殿するために使用され得る。沈殿物に減じられると、ヒアルロナンは物理的手段により、溶液から容易に単離され得る。ヒアルロナンは、当業界において知られている蒸発技法、例えば凍結乾燥又は噴霧乾燥により、濾液溶液から乾燥されるか又は濃縮され得る。
【００７４】
本発明の第１の観点は、0.7〜0.9MDaの平均分子量を有するヒアルロン酸又はその塩を含んで成る、保湿、化粧、又は抗−しわ生成物に関する。
【００７５】
宿主細胞：
好ましい態様は、第１の観点の生成物に関し、ここでヒアルフロン酸又はその塩は、好ましくはグラム陽性細菌又は宿主細胞、より好ましくはバシラス属の細菌により、組換え的に生成される。
【００７６】
宿主細胞は、ヒアルロン酸の組換え生成のために適切ないずれかのバチルス細胞であり得る。バチルス宿主細胞は、野生型バチルス細胞又はその変異体であり得る。本発明の実施において有用なバチルス細胞は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：バチルス・アガラドヘレンス、バチルス・アルカロフィラス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・サーキュランス、バチルス・クラウジ、バチルス・コアギュランス、バチルス・ファーマス、バチルス・ラウタス、バチルス・レンタス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・メガテリウス、バチルス・プミラス、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・サブチリス及びバチルス・スリンジエンシス細胞。変異体バチルス・サブチリス細胞は、WO98/22598号に記載されるように、組換え発現のために特に適合される。非被包性バチルス細胞は、本発明において特に有用である。
【００７７】
好ましい態様においては、バチルス宿主細胞は、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・クラウジ、バチルス・レンタス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・ステアロサーモフィラス又はバチルス・サブチリス細胞である。より好ましい態様においては、バチルス宿主細胞は、バチルス・アミロリケファシエンス細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、バチルス宿主細胞は、バチルス・クラウジ細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、バチルス宿主細胞は、バチルス・レンタス細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、バチルス宿主細胞は、バチルス・リケニホルミス細胞である。もう１つのより好ましい態様においては、バチルス宿主細胞は、バチルス・サブチリス細胞である。最も好ましい態様においては、バチルス宿主細胞は、バチルス・サブチリスA164Δ5（アメリカ特許第5,891,701号を参照のこと）、又はバチルス・サブチリス168Δ4である。
【００７８】
本発明の核酸構造体によるバチルス宿主細胞の形質転換は、プロトプラスト形質転換（例えば、Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115を参照のこと）により、コンピテント細胞の使用（Young and Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology 81 : 823- 829, 又は Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56 : 209-221を参照のこと）により、エレクトロポレーション（Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751を参照のこと）により、又は接合（Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5271-5278を参照のこと）により行われ得る。
【００７９】
分子量：
ヒアルロン酸のレベルは、改良されたカルバゾール方法（Bitter and Muir, 1962, Anal Biochem. 4: 330-334）に従って決定され得る。さらに、ヒアルロン酸の平均分子量は、当業界における標準の方法、例えばUeno など., 1988, Chem. Pharm. Bull. 36, 4971-4975; Wyatt, 1993, Anal. Chim. Acta 272: 1-40; 及び Wyatt Technologies, 1999, "Light Scattering University DAWN Course Manual" and "DAWN EOS Manual" Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, Californiaにより記載されるそれらの方法を用いて決定され得る。
【００８０】
塩及び架橋されたHA：
好ましい態様は、ヒアルロン酸の無機塩、好ましくはヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸アンモニウム、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸亜鉛、又はヒアルロン酸コバルトを含んで成る、第１の観点の生成物に関する。
【００８１】
ヒアルロン酸ナトリウムとポリ乳酸一又は二−アシル塩化物との反応が、未処理のHA又はPLAの標準スペクトルに比較して、結合されたHA−PLA生成物における新しく形成されたポリ乳酸エステルの存在に対応する、IRスペクトル上での1736cm-1での強められたピークを示す、結合された又は架橋されたHA−PLA又はHA−PLA−HA生成物をもたらしたことが見出された。
【００８２】
従って、好ましい態様は、ヒアルロン酸又はその塩が、ポリマー性αヒドロキシ酸、好ましくはポリ乳酸又はグリコール酸のエステルを含んで成る、第１の観点の生成物に関する。
ホウ酸によるヒアルロン酸ナトリウムの溶液の処理が、未処理のNa−HAの標準スペクトルに比較して、架橋されたHA−ボレートヒドロゲルにおける新しく形成されたボレートエステルの存在に対応する、FT−IRスペクトル上での1200及び945cm-1での新しいピークを示す、架橋されたHA−ボレートヒドロゲルをもたらしたことが見出された。
【００８３】
従って、好ましい態様は、ヒアルロン酸又はその塩がボレートエステルを含んで成る、第１の観点の生成物に関する。
第１の観点の生成物のもう１つの好ましい態様においては、ヒアルロン酸又はその塩がジビニルスルホン（DVS）により十分に又は部分的に架橋される。
【００８４】
保湿及び抗−しわの効果：
下記例に示されるように、第１の観点の生成物は、下記例に定義されるようにして測定される場合、好ましい態様においては、８週間にわたって、少なくとも３％、好ましくは少なくとも５％、最も好ましくは少なくとも７％である皮膚保湿効果を有する。
さらに、第１の観点の生成物は、下記例に定義されるようにして測定される場合、好ましい態様においては、８週間にわたって、少なくとも10％、好ましくは少なくとも15％、より好ましくは少なくとも20％高められる体積の皮膚弾性R2を高められることができる。
【００８５】
他の成分：
好ましい態様においては、本発明の生成物はまた、他の成分、好ましくは１又は複数の活性成分、好ましくは１又は複数の薬理学的活性物質、及びまた好ましくは、水溶性賦形剤、例えばラクトースを含んで成ることができる。
【００８６】
もう１つの好ましい態様においては、本発明はまた、１又は複数の酵素、好ましくはリガーゼ、トランスフェラーゼ、オキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ及び/又はイソメラーゼ；より好ましくは澱粉分解酵素、脂質分解酵素、タンパク質分解酵素、セルロース分解酵素、オキシドレダクターゼ、又は植物細胞壁分解酵素、及びより好ましくは次のものから成る群から選択された、活性を有する酵素を含んで成ることができる：
【００８７】
アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ヘミセルラーゼ、インバーターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、フェノールオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラーゼ。
【００８８】
本発明においては使用され得る活性成分又は薬理学的活性物質の非制限的例は、タンパク質及び/又はペプチド薬剤、例えばヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン/ペプチド、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子、マクロファージ−コロニー刺激−因子、エリスロポイエチン、骨形態発生性タンパク質、インターフェロン又はその誘導体、インシュリン又はその誘導体、アトリオペプチン−III、モノクロナール抗体、腫瘍壊死因子、マクロファージ活性化因子、インターロイキン、腫瘍分解因子、インスリン様成長因子、表皮成長因子、組織プラスミノゲン活性化因子、第IIV因子、第IIIV因子、及びウロキナーゼを包含する。
【００８９】
水溶性賦形剤は、活性成分を安定化するために包含され得、そのような賦形剤は、タンパク質、例えばアルブミン又はゼラチン；アミノ酸、例えばグリシン、アラニン、グルタミン酸、アルギニン、リシン及びその塩；炭水化物、例えばグルコース、ラクトース、キシロース、ガラクトース、フルクトース、マルトース、サッカロース、デキストラン、マンニトール、ソルビトール、トレハロース及びコンドロイチンスルフェート；無機塩、例えばホスフェート；界面活性剤、例えばTWEEN（商標）（ICI）、ポリエチレングリコール及びその混合物を包含することができる。賦形剤又は安定剤は、生成物の0.001〜99重量％の範囲の量で使用され得る。
【００９０】
本発明のいくつかの観点は、他の構成成分の中で、有効量の第１の観点において定義されるような生成物、及び活性成分、好ましくは薬理学的活性剤；医薬的に許容できるキャリヤー、賦形剤又は希釈剤、好ましくは水溶性賦形剤、及び最も好ましくはラクトースを含んで成る種々の医薬組成物に関する。
【００９１】
さらに、本発明の観点は、第１の観点において定義されるような生成物又は上記観点及び態様において定義されるような組成物を含んで成る製品、例えば化粧品、衛生製品、医学又は手術製品に関する。最終観点においては、本発明は、第１の観点において定義されるような生成物、又は本発明の他の観点及び態様において定義されるような組成物を含んで成る薬剤カプセル又はマイクロカプセルに関する。
【００９２】
生成物又は組成物の使用方法：
本発明の種々の観点は、第１の観点の生成物又は本発明の組成物を用いて、例えば医学分野における処理工程を実施するための方法に関する。
１つの観点は、第１の観点において定義されるような生成物、又は本発明の組成物の使用を包含する、眼科学的処置を実施するための方法に関する。
もう１つの観点は、第１の観点において定義されるような生成物、又は本発明の組成物の使用を包含する、変形性関節炎の処置を実施するための方法に関する。
【００９３】
さらにもう１つの観点は、第１の観点において定義されるような生成物、又は本発明の組成物の使用を包含する、癌の処置を実施するための方法に関する。
１つの観点は、第１の観点において定義されるような生成物、又は本発明の組成物の使用を包含する、薬理学的活性剤の経皮投与を実施するための方法に関する。
もう１つの観点は、本発明の生成物、又は組成物の使用を包含する、化粧品の皮膚投与を実施するための方法に関する。
【実施例】
【００９４】
化粧配合物におけるHAの効能試験を、“活性クリーム”と称する組成物について次の配合を用いて行った。
【表１】
2008526693.tif 000002
“プラシーボクリーム”を、同じ成分（但し、HAを含まない）から構成した。
【００９５】
例１：保湿効果（水和化）：
試験対象の皮膚表面水和化の評価を、角質測定法を用いて実施し、それにより、角質層（SC）の電気キャパシタンス相対的SC湿分に正確に影響を及ぼす）を決定する。測定は、角質測定器：Combi CM825（Courage & Khazaka）を用いて行われた。
【００９６】
水和化研究を、12人のボランティア（女性、平均年齢38）の前腕上にクリームを適用し、そして次に活性クリーム及びプラシーボクリームの適用からの得られる水和化と、未処理の領域の水和化とを比較することにより実施した。
水和化を、クリームの適用の後、短期間（180分まで）、及び８週間、結果を比較することにより、長期間、評価した。
【００９７】
短期間の水和化測定値は、図１に示されている。活性クリームは、すべての時点で皮膚水和化の平均基本地において高い有意な変動を明らかに誘発した。
長期評価の結果が図２に示される。水和化における７％の有意な上昇が、活性クリームによる８週間の処理の間、記録された。
【００９８】
例２：表皮を通しての水損失（TEWL）：
表皮を通しての水損失（TEWL）は、水和化又は保湿に関して皮膚バリヤーの効能を評価するための重要なパラメーターである。TEWLは、Fick拡散式に基づいて、皮膚表面により放される水蒸気を測定する。これを測定するために使用される装置は、Tewameter TM210（Courage & Khazaka）である。測定は、活性クリーム（0.1％のHA）及びプラシーボクリームの適用の後、及び未処理の皮膚領域から、12人のボランティア試験対象に対して行われた。
【００９９】
１回の適用後のTEWLの短期間変動が図３に示される。活性クリームは、適用の後、60, 90, 120及び180分でTEWLの平均基本値の有意な低下を誘発する。
【０１００】
例３：抗−しわ効果（弾性）：
抗−しわ研究を、８週間、毎日２度、顔面上へのクリームの適用により、12人のボランティアヒト試験対象を用いて実施した。すべての試験は、24℃及び50％相対室温（RH）で、生物気候性部室において実施された。
【０１０１】
皮膚弾性を、Cutometer SEM 575（Courage & Khazaka）を用いて、試験対象に対して測定した。Cutometerは、測定プローブの開口中に吸込まれる場合、皮膚の垂直な変形を測定する。この方法は、皮膚弾性に関して次の変形パラメーターを提供する：RO（最大の変形）、R2（全体的な弾性）及びR6（粘弾性比）。弾性試験を、活性クリーム（0.1％のHAを含んで成る）及びプラシーボクリームによる８週間の処理の間、個々の顔面用クリームの通用の後、行った。
結果は図４に示されている。８週間の通用の後、全体的弾性（R2）において27％の有意な上昇が観察された。
【０１０２】
例４：皮膚局所解剖学：
皮膚表面の局所解剖学を、皮膚表面レプリカ及び映像分析により評価する。試験の原理は、早く硬化する合成ポリマー（SILFLO−Flexico Ltd. UK.）の適用により、皮膚表面の負の圧痕を得ることである。次に、このレプリカを、映像デジタル化により分析する。この映像から、標準の荒さパラメーターRa（平均的荒さ）及びRz（深いしわについての最大の荒さ）を計算する。
【０１０３】
この試験を、プラシーボクリームに比較して、活性クリームにより、８週間、毎日２度、顔面の処理の後、実施した。活性生成物により処理された領域においては、平均最大荒さ値（Rz）は、８週間の処理の後、有意に10％低下した。プラシーボにより処理された領域は、Rz値においていずれの変動も示さなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】図１は、水和化の短期間評価を示す。活性クリームは、すべての時点で皮膚水和化の平均基本値の有意に高い変動を誘発する。
【図２】図２は、水和化の長期間評価を示す。水和化における７％の有意な上昇が８週間の処理の後、記録される。
【図３】図３は、単一の適用の後、上皮を通しての水の損失（TEWL）の短期間変動を示す。活性クリームは、適用の後、60, 90, 120, 180分で、TEWLの平均基本値の有意な変動を誘発する。
【図４】図４は、８週間の適用の後の全体的弾性を示す。全体的弾性（R2）における27％の有意な上昇が観察される。
【図１】
2008526693.tif 000003
【図２】
2008526693.tif 000004
【図３】
2008526693.tif 000005
【図４】
2008526693.tif 000006
【国際調査報告】
2008526693.tif 000007
2008526693.tif 000008
2008526693.tif 000009
2008526693.tif 000010
2008526693.tif 000011
2008526693.tif 000012