(57)【要約】  本発明は、ラミニン5アルファ3 G4−G5ドメインを標的とする物質を用いる扁平上皮癌の検出又は阻害のための組成物及び方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラミニン5アルファ3 G4及び/又は5ドメイン又はそのサブドメインを含む遊走促進タンパク質（MFP）と特異的に結合する抗体、及び医薬的に許容できる担体を含む、扁平上皮癌を治療する組成物。
【請求項２】
前記抗体がラミニン5アルファ3 G4ドメインを含むMFPと結合する、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗体が、前記ラミニン5アルファ3 G4ドメイン又はサブドメイン内のBMP-1切断部位のためのエピトープと結合しない、請求項2に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗体がラミニン5アルファ3 G5ドメインを含むMFPと結合する、請求項1に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項1に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項1に記載の組成物。
【請求項７】
前記SCCが、皮膚癌、肺癌、頭部癌、胃癌、結腸直腸癌、咽喉部癌、尿路の癌、生殖路の癌、食道癌及び気管支原性癌から成る群から選択される、請求項1に記載の組成物。
【請求項８】
前記MFPが配列番号:13のアミノ酸配列を含む配列を有する、請求項1に記載の組成物。
【請求項９】
前記MFPが配列番号:15のアミノ酸配列を含む配列を有する、請求項1に記載の組成物。
【請求項１０】
前記MFPが配列番号:17のアミノ酸配列を含む配列を有する、請求項1に記載の組成物。
【請求項１１】
前記MFPが配列番号:19のアミノ酸配列を含む配列を有する、請求項1に記載の組成物。
【請求項１２】
前記MFPが配列番号:21のアミノ酸配列を含む配列を有する、請求項1に記載の組成物。
【請求項１３】
前記MFPが配列番号:24のアミノ酸配列を含む配列を有する、請求項1に記載の組成物。
【請求項１４】
医薬的に許容される担体中の1つ又は2つ以上の抗体の治療的に有効な量を投与することを含む、患者で扁平上皮癌（SCC）を治療する方法であって、前記抗体の1つ又は2つ以上が、ラミニン5 G4及び/又はG5ドメイン又はそのサブドメインのMFPと特異的に結合し、SCC腫瘍形成を阻害する、前記扁平上皮癌の治療方法。
【請求項１５】
前記抗体が、配列番号:13のアミノ酸配列を含む配列を有するMFPと結合する、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体が、配列番号:15のアミノ酸配列を含む配列を有するMFPと結合する、請求項14に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体が、配列番号:17のアミノ酸配列を含む配列を有するMFPと結合する、請求項14に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体が、配列番号:19のアミノ酸配列を含むMFPと結合する、請求項14に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体が、配列番号:21のアミノ酸配列を含むMFPと結合する、請求項14に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体が、配列番号:24のアミノ酸配列を含むMFPと結合する、請求項14に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項14に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項14に記載の方法。
【請求項２３】
前記SCCが、皮膚癌、肺癌、頭部癌、胃癌、結腸直腸癌、咽喉部癌、尿路の癌、生殖路の癌、食道癌及び気管支原性癌から成る群から選択される、請求項14に記載の方法。
【請求項２４】
以下の工程を含む、SCCの存在を診断する方法：
a）ラミニン5 G4-5ドメイン又はそのサブドメインのMFPと特異的に結合することができる抗体と、新形成上皮細胞を含むと思われるサンプルとを接触させる工程；
b）前記抗体と前記MFPとの結合を検出する工程；及び
c）前記検出から前記サンプル中のSCCの有無を診断する工程。
【請求項２５】
前記抗体が、配列番号:13のアミノ酸配列を含む配列を有するMFPと結合する、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体が、配列番号:15のアミノ酸配列を含む配列を有するMFPと結合する、請求項24に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体が、配列番号:17のアミノ酸配列を含む配列を有するMFPと結合する、請求項24に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体が、配列番号:19のアミノ酸配列を含む配列を有するMFPと結合する、請求項24に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体が、配列番号:21のアミノ酸配列を含む配列を有するMFPと結合する、請求項24に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体が、配列番号:24のアミノ酸配列を含む配列を有するMFPと結合する、請求項24に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体がさらに検出可能な標識を含む、請求項24に記載の方法。
【請求項３２】
前記上皮細胞が、扁平上皮細胞、ケラチノサイト、粘膜上皮細胞、胃腸上皮細胞、眼の角膜上皮細胞、並びに尿路及び生殖路の上皮細胞から成る群から選択される、請求項24に記載の方法。
【請求項３３】
前記サンプルが組織サンプルである、請求項24に記載の方法。
【請求項３４】
前記サンプルが尿サンプルである、請求項24に記載の方法。
【請求項３５】
前記サンプルが血液サンプルである、請求項24に記載の方法。
【請求項３６】
以下の工程を含む、ラミニン5アルファ3 G4及び/又はG5ドメイン又はそのサブドメインのMFPと結合することができる候補結合物質を特定する方法：
（a）ラミニン5アルファ3 G4−G5ドメイン又はそのサブドメインのMFPを含むサンプルと1つ又は2つ以上の候補結合物質を含む組成物とを、前記MFPと前記候補結合物質の1つ又は2つ以上の間の結合を可能にするために有効な条件下で接触させる工程；及び
（b）前記候補結合物質と前記MFPとの結合を検出する工程。
【請求項３７】
前記候補結合物質が、抗体及びそのフラグメント、小分子、ポリペプチド並びにアプタマーから成る群から選択される、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
以下の工程を含む、SCCの腫瘍形成を阻害する候補物質をスクリーニングする方法：
（a）（i）Ras/IKB形質転換上皮細胞、（ii）ラミニンG4及び/又はG5ドメイン又はサブドメインの遊走促進タンパク質（MFP）、（iii）1つ又は2つ以上の候補物質を含む懸濁物をヌードマウスに皮下注射する工程；及び
（b）1つ又は2つ以上の腫瘍の有無を決定する工程。
【請求項３９】
前記候補物質が、抗体及びそのフラグメント、小分子、ポリペプチド並びにアプタマーから成る群から選択される、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
前記候補物質が、ラミニン5 G4及び/又はG5ドメイン又はそのサブドメインのMFPと結合することができる抗体を含む、請求項38に記載の方法。
【請求項４１】
SCCの候補薬の効果を患者で判定する方法であって、前記方法が、a）候補薬による処置前に、SCCの腫瘍をもつと診断された患者由来の組織サンプルにおいてSCCと結合したMFPの存在を検出する工程；及びb）前記候補薬による処置後に、前記患者由来の組織サンプルにおいて前記MFPの存在を検出する工程を含み、ここで前記候補薬による処置後の前記MFPの減少は、前記候補薬が前記患者において前記SCCの治療に有効であることを示す、前記SCC候補薬の効果を判定する方法。
【請求項４２】
前記候補物質が、抗体及びそのフラグメント、小分子、ポリペプチド並びにアプタマーから成る群から選択される、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
前記候補物質が、ラミニン5 G4及び/又はG5ドメイン又はそのサブドメインのMFPと結合することができる抗体を含む、請求項41に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互引用
本出願は、USSN10/766,317（2004年1月27日出願；前記出願は参照により本明細書に含まれる）の継続出願である。
【０００２】
技術分野
本発明は、ラミニン5アルファ3 G4−G5ドメインを標的とする物質を用いる扁平上皮癌の検出及び阻害のための組成物並びに方法に関する。
【０００３】
序文
扁平上皮癌（SCC）はよく見られる癌の形態であり、米国では皮膚癌で2番目に多い形態である。SCCは、高度に侵襲性で転移性である。SCCは比較的高い再発性を伴い、顕著な死亡率をもたらす。SCCは生検によって診断することができる。しかしながら、SCCは、典型的には基底細胞癌又はメラノーマほど明瞭ではなく、検出及び診断を困難にしている。従来の治療方法、すなわち外科手術、放射線治療、及び化学療法はこの疾患の転移性のために継続的な監視を必要とする。したがって、また別の検出方法及び治療方法の開発が所望される。
本明細書に開示する組成物及び方法は、SCCの腫瘍形成に付随するタンパク質を検出及び阻害することができる物質を特定することを目的とする。特に興味深いことには、ラミニン-5アルファ3鎖G4及び/又はG5ドメインと相互作用する物質である。
【０００４】
発明の要旨
本明細書で提供されるものは、扁平上皮癌（SCC）の検出及び治療に有用な組成物及び方法である。前記組成物は、一般的にラミニン-5アルファ3鎖G4及び/又はG5ドメイン又はサブドメインの遊走促進タンパク質（MFP）と結合することができる抗体を含む。MFPは典型的には、ラミニン-5アルファ3 G4及び/又5ドメインに存在する8、9、10又はそれ以上のアミノ酸を含み、前記は骨形態発生タンパク質-1（BMP-1）又はBMP-1関連タンパク質のための認知切断部位を含まない。例えば以下を含むMFPを生成することができる：（1）G5サブドメイン；（2）アミノ酸1358とアミノ酸1366との間に存在するG4サブドメイン；（3）アミノ酸1375とアミノ酸1390との間に存在するG4サブドメイン；（4）アミノ酸1399とアミノ酸1530との間に存在するG4サブドメイン；（5）アミノ酸1399とアミノ酸1713との間に存在するG4-5サブドメイン。当業者には理解されるところであるが、ラミニン5アルファ3 G4及び/又は5ドメイン内の他のサブドメインをコードするMFPもまた生成され、本発明の方法で用いることができる。前記組成物は、さらに追加成分、例えば検出可能な標識及び医薬的に許容できる担体を含むことができる。
本発明の方法は一般には、SCCの腫瘍形成を阻害することができる1つ又は2つ以上の抗体を含む組成物の治療的に有効な量をSCCと診断された患者に投与することを必要とする。本明細書に開示した組成物によるSCCと診断された患者の治療は、SCCを治療する他の医療手段、例えば外科手術、放射線治療、及び化学療法と併用することができる。SCCは、皮膚癌、肺癌、頭部癌、胃癌、結腸直腸癌、咽喉部癌、尿路の癌、生殖路の癌、食道癌及び気管支原性癌から成る群から選択することができる。
【０００５】
さらにまた提供されるものは、上記記載のMFPを利用する方法である。いくつかの実施態様では、以下の工程を含む、サンプル中で候補物質の結合活性を検出する方法が提供される：
（a）MFPと候補物質（もし存在するとしたら）との間の結合を可能にするために有効な条件下で、前記サンプルをMFPと接触させる工程；及び
（b）前記候補物質の結合を検出する工程。
種々の多数のアッセイを用いて候補物質の結合を検出することができる。例えば、いくつかの実施態様では、候補物質は標識され、結合は直接決定される。他の実施態様では、候補物質の結合は、競合結合アッセイを用いることにより決定される。前記アッセイでは、競合物質はMFPと結合することが知られている結合成分（すなわち抗体）である。候補物質による競合物質の置換は、前記候補物質がMFPと結合することができるということの表示である。
【０００６】
さらにまた本明細書で提供されるものは、SCCの腫瘍形成を阻害する候補物質をスクリーニングする方法である。いくつかの実施態様では、以下の工程を含む、SCCの腫瘍の発育を阻害する候補物質をスクリーニングする方法が提供される：
（a）（i）Ras/IKB形質転換上皮細胞、（ii）ラミニンG4及び/又はG5ドメイン又はサブドメインの遊走促進タンパク質（MFP）、（iii）1つ又は2つ以上の候補物質を含む懸濁物をヌードマウスに皮下注射する工程；及び
（b）腫瘍の有無を決定する工程。
いくつかの実施態様では、SCCの候補薬の効果を判定する方法が提供される。前記方法は、SCCと診断された患者に前記薬剤を投与する工程及び患者から細胞サンプルを取り出す工程を含む。多数の種々のアッセイを用いて、前記候補薬の効果を判定することができる。例えば、細胞サンプルの発現プロフィルを決定し、健常な個体の発現プロフィルと比較することができる。いくつかの実施態様では、前記細胞サンプルは、候補薬による処置の前後でSCCの成長に付随するMFPの有無について分析することができる。さらにまた別の実施態様では、薬剤が近隣の正常細胞への侵襲の阻害に有効であるか否かを決定するために、候補薬による処置の前後で腫瘍サイズを分析することができる。
本明細書でさらにまた提供されるものはSCCを診断する方法であって、前記方法は、細胞サンプルを個体から取り出す工程、及びSCCの増殖及び/又は転移に必要であると決定された1つまたは2つ以上のMFPについて前記細胞を分析する工程を含む。
本明細書に開示する組成物及び方法の前記の特徴及びその他の特徴は下記の詳細な説明からより明確になるであろう。
【０００７】
詳細な説明
前述の一般的な記載及び下記の詳細な記載は単に例示及び説明であり、本明細書に開示する発明を制限するものではないことは理解されるべきである。本出願では、別に規定しなければ単数形の使用によって複数形が含まれる。さらにまた別に規定しない場合は、“又は”は“及び/又は”を意味する。同様に、“含む（comprise及びinclude）”は限定的であることを意図しない。別に規定しないかぎり、本明細書で使用される全ての技術的及び学術的用語は、本発明が属する分野の人々が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。
１．定義
本明細書で用いられるように、以下の用語は以下の意味を有することを意図する：
“抗体”はその標準的な意味を有し、完全な分子と同様にそのフラグメント、例えばFab、F(ab')2及びFvフラグメントを指し、それらはエピトープと結合することができる。
“癌”はその標準的な意味を有し、分裂によって局所的にさらに転移によって全身的に拡大する、潜在的に無限に増殖する任意の悪性腫瘍を指す。
“新生物”はその標準的な意味を有し、組織の異常増殖（例えば腫瘍）を指す。
“核酸塩基”は、核酸分野で一般的に見出される、天然又は合成の窒素を含む芳香族成分を意味する。核酸塩基の例には、プリン及びピリミジン、遺伝コードの核酸塩基、遺伝コードの核酸塩基の類似体、及び完全合成核酸塩基が含まれる。遺伝コードの核酸塩基の具体的な例には、アデニン、シトシン、グアニン、チミン及びウラシルが含まれる。遺伝コードの核酸塩基の類似体及び合成核酸塩基の具体的な例には、5-メチルシトシン、シュードイソシトシン、2-チオウラシル及び2-チオチミン、2-アミノプリン、N-9(2-アミノ-6-クロロプリン)、N9-(2,6-ジアミノプリン)、ヒポキサンチン、N9-(7-デアザ-グアニン)、N9-(7-デアザ-8-アザ-グアニン)及びN8-(7-デアザ-8-アデニン)、5-プロピル-ウラシル、2-チオ-5-プロピル-ウラシルが含まれる。適切な核酸塩基のその他の非限定的な例には、米国特許6,357,163号(前記文献は参照により本明細書に含まれる)の図2(A)及び2(B)に示される核酸塩基が含まれる。
【０００８】
“ヌクレオシド”はペントース糖と結合した核酸塩基を指す。ペントース糖にはリボース、2'-デオキシリボース、3'-デオキシリボース及び2',3'-ジデオキシリボースが含まれる。
“ヌクレオシド類似体”は、ペントース糖以外の糖と結合した核酸塩基を指す。例えばヘキソースと結合した核酸塩基である。
“ヌクレオチド”は、核酸塩基、ペントース糖及びリン酸を含む化合物を指す。したがって、本明細書で用いられるように、ヌクレオチドはヌクレオシドのリン酸エステル、例えばトリホスフェートを指す。
“核酸塩基ポリマー又はオリゴマー”は、2つ又は3つ以上の核酸塩基であって、生成された核酸塩基ポリマー又はオリゴマーが、少なくとも部分的に相補的な核酸塩基配列をもつポリヌクレオチドとハイブリダイズすることを可能にする結合によって連結されたものを指す。核酸塩基ポリマー又はオリゴマーには、ポリ-及びオリゴヌクレオチド（例えばDNA及びRNAポリマー及びオリゴマー)、ポリ-及びオリゴヌクレオチド類似体、並びにポリ-及びオリゴヌクレオチド模倣体、例えばポリアミド核酸又はペプチド核酸が含まれるが、ただしこれらに限定されない。ポリアミド核酸及びペプチド核酸は、同じ分子を指すために文献で用いられる2つの別個の用語であり、PNAと略される。核酸塩基ポリマー又はオリゴマーは大きさが多様であり、数個の核酸塩基（例えば2から40個の核酸塩基）から数百の核酸塩基、数千の核酸塩基又はそれより大きいことが可能である。
“ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド”は、核酸塩基が糖燐酸結合（糖-リン酸骨格）によって連結された核酸塩基ポリマー又はオリゴマーを指す。例示的なポリ-及びオリゴヌクレオチドには、2'-デオキシリボヌクレオチドのポリマー（DNA)及びリボヌクレオチドのポリマー（RNA）が含まれる。ポリヌクレオチドは完全にリボヌクレオチドで構成されてあっても、完全に2'-デオキシリボヌクレオチドで構成されてあっても、又はその組合せであってもよい。
【０００９】
“ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体”は、核酸塩基ポリマー又はオリゴマーであって、前記核酸塩基が1つ又は2つ以上の糖類似体又はホスフェート類似体を含むホスフェート骨格によって連結されているものを指す。典型的なオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド類似体には、糖アルキルホスホネート、糖ホスホアミダイト、糖アルキル-又は置換アルキルホスホトリエステル、糖ホスホロチオエート、糖ホスホロジチオエート、糖ホスフェート及び糖ホスフェー類似体であって前記の糖が2'-デオキシリボース又はリボース以外であるもの、核酸塩基ポリマーであって陽性荷電の糖-グアニジル間結合を有するもの（例えば米国特許6,013,785号及び米国特許5,696,253号に記載されたもの（さらにまた以下を参照されたい：Dagani 1995, Chem. &Eng. News 4-5:1153；Dempey et al. 1995, J. Am. Chem. Soc. 117:6140-6141）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。そのような陽性荷電類似体であって、糖が2'-デオキシリボースであるものは“DNG”と称され、一方、糖がリボースであるものは“RNG”と称される。特に、ポリ-及びオリゴヌクレオチド類似体の定義に含まれるものは、ロックされた核酸である（locked nucleic acids, LNA；例えば以下を参照されたい：Elayadi et al. 2002,Biocemistry 41:9973-9981；Koshikin et al. 1998, J. Am. Chem. Soc. 120:13252-3；Koshikin et al. 1998, Tetrahedron Letters, 39:4381-4384；Jumar et al. 1998, Bioorganic & Medical Chemistry Letters 8:2219-2222；Singh and Wengel, 1998, Chem. Commun., 12:1247-1248；WO00/56746；WO02/28875；及びWO01/48190（前記全ての文献は参照により本明細書に含まれる））。
【００１０】
“ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド模倣体”は、核酸塩基ポリマー又はオリゴマーであって、その核酸塩基が糖-リン酸結合又は糖-リン酸類似体結合以外の結合によって連結されているものを指す。具体的な結合模倣体にはペプチド核酸が含まれるが、前記は、米国特許5,539,082号、5,527,675号、5,623,049号、5,714,331号、5,718,262号、5,736,336号、5,773,571号、5,766,855号、5,786,461号、5,837,459号、5,891,625号、5,972,610号、5,986,053号、6,107,470号、6,451,968号、6,441,130号、6,414,112号及び403,763号（前記全ての文献は参照により本明細書に含まれる）のいずれかの1つ又は2つ以上に記載されているとおりである。他のタイプの模倣体は以下の文献に記載されている：Lagriffoul et al. 1994, Biooruganic & Medical Chemistry Letters, 4:1081-1082；Petersen et al. 1996, Bioorganic & Medical Chemistry Letters, 6:793-796；Diderichsen et al. 1996, Tett. Lett. 37:475-478；Fujii et al. 1997, Biorg. Med. Chem. Lett. 7:637-627；Jordan et al. 1997, Bioorg. Med. Chem. Lett. 7:687-690；Krotz et al. 1995, Tett. Lett. 36:6941-6944；Lagriffoul et al. 1994, Bioorg. Med. Chem. Lett. 4:1081-1082；U. Diederichsen, 1997, Bioorganic & Medicinal Chemistry 25 Letters, 7:1743-1746；Lowe et al. 1997, J. Chem. Soc. Perkin Tras. 1, 1:539-546；Lowe et al. 1997, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 11:547-554；Lowe et al. 1997, I. Chem. Soc. Perkin Trans. 11:555-560；Howarth et al. 1997, I. Org. Chem. 62:5441-5450；K-H. Altmann et al. 1997, Bioorgnic & Medicinal Chemistry Letters, 7：1119-1122；U. Diederichsen, 1998, Bioorganic & Med. Chem. Lett., 8:165-168；Diederichsen et al. 1998, Angew. Chem. mt. Ed., 37:302-305；Cantin et al. 1997, Tett. Lett., 38:4211-4214；Ciapetti et al. 1997, Tetrahedron, 53:1167-1176；Lagriffoulr et al. 1997, Chem. Eur. 1.'3:912-919；Kumar et al. 2001, Organic Letters 3(9):1269-1272。さらにShahらのペプチド系核酸模倣体（PENAM）はWO96/04000に記載されている（前記全ての文献は参照により本明細書に含まれる）。
前記オリゴヌクレオチドは、規定にしたがい一本鎖でも二本鎖でもよく、又は二本鎖若しくは一本鎖配列の部分を含むことができる。当業者には理解されるところであるが、一本鎖（“ワトソン”）の記載はまた他方の鎖（“クリック”）の配列を規定し、したがって、本明細書に記載した配列にはまたその配列の相補鎖も含まれる。
【００１１】
“タンパク質”はその標準的な意味を有し、少なくとも2つの共有結合したアミノ酸を指す。前記には、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド及びペプチドが含まれる。タンパク質は、天然に存在するアミノ酸とペプチド結合から、又は合成ペプチド模倣体構造物、すなわちペプトイドのような“類似体”（Simon et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89(20):9367-71）から一般的には合成方法に依存しながら生成できる。したがって、本明細書で用いられる“アミノ酸”又は“ペプチド残基”は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸の両方を意味する。例えば、ホモ-フェニルアラニン、シトルリン及びノルロイシンは本発明の目的のためのアミノ酸と考えられる。“アミノ酸”にはまた、イミノ酸残基、例えばプロリン及びヒドロキシプロリンが含まれる。さらにまた、本発明の変種タンパク質の成分を表すいずれのアミノ酸も、同一アミノ酸であるが反対のキラリティーを有するものによって置換することができる。したがって、L-立体配置で天然に存在する任意のアミノ酸（前記はまた化学物質の構造にしたがってR又はSと称される）は、同一の化学構造タイプであるが反対のキラリティーをもつ（一般的にはD-アミノ酸と称されるが、前記はさらに、その組成物及び化学的構造にしたがってR-又はS-と称される）アミノ酸と置き換えることができる。そのような誘導体は、一般的には安定性が大きく増加する特性を有し、したがって経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、局所、直腸、眼内ルート又は他のルートによって投与したとき、より長いin vivo半減期を有しえる化合物製剤として利点を有する。
【００１２】
いくつかの実施態様では、アミノ酸は（S）又はL-立体配置である。例えばin vivo分解を防ぐか又は遅らせるために、天然に存在しない側鎖が用いられる場合は、非アミノ酸置換基を用いることができる。非天然アミノ酸を含むタンパク質は合成することができ、またいくつかの例では、組換えによって合成することができる（以下を参照されたい：FEBS Lett 428(1-2):68-70 (May 22, 1998)；及びTang et al. Abstr. Pap. Am. Chem. S218:U138 Part2 August 22, 1999（前記両文献は参照により本明細書に含まれる））。
“扁平上皮癌”はその標準的な意味を有し、上皮細胞の一切の新生物又は腫瘍を指す。
“腫瘍形成”はその標準的な意味を有し、腫瘍を生じる基礎的な発育過程を指す。これらの基礎的な特性には、分裂又は近隣の正常組織への侵襲能力及び腫瘍発生部位から遊走する能力が含まれる。
【００１３】
２．例示的実施態様
本明細書で提供されるものは以下のとおりである：（1）ラミニン-5α3鎖G4及び/又はG5ドメインに由来する遊走促進タンパク質（MFP）；（2）MFPと結合し、それによって新形成上皮細胞の腫瘍形成を阻害する抗体；（3）本明細書に記載のMFPの1つ又は2つ以上と特異的に結合する物質（例えば抗体、小分子など）をスクリーニングする方法；（4）MFPを用いて扁平上皮癌（SCC）の発育を阻害する物質をスクリーニングする方法；（5）SCCを診断する方法；及び（6）SCC治療に用いられる候補物質の有効性を決定する方法。これら発明のいずれも、MFP、MFPをコードする核酸及び他の分子（例えばMFPと結合する抗体）を必須とする。
ラミニン-5（以前にはカリニン、ニセイン又はBM6000と呼ばれた）はヘテロトリマーの細胞外マトリックスタンパク質であり、前記は、200kDaのα3鎖、140kDaのβ3鎖及び155kDaのγ2鎖を有する未プロセッシング形で先ず合成され分泌される（Marinkovich et al. 1992, J. Biol. Chem. 267:17900-17906）。ラミニン-5は基底膜の成分である。基底膜は、組織の完全性を提供するとともに、細胞の遊走、増殖及び分化のための基礎を提供する。したがって、ラミニン-5の野生型の機能を妨害する過程はヒト及び他の哺乳動物で疾患を生じるということは驚くに当らない。
ラミニン-5の大量のデポジットが扁平上皮癌（SCC）の先端に見出される。このラミニン-5の蓄積は腫瘍侵襲のための土台として機能すると考えられている（例えば以下を参照されたい：Pyke et al. 1995, Canc. Res. 55:4132-4139；Berndt et al. 1977, Invasion and Metastasis, 17:251-258）。ラミニン-5の免疫反応性の増加は、扁平上皮癌（SCC）患者の予後不良の指標である。ラミニン-5はまた、SCC、大腸癌及び乳癌（Pyke et al. 1994, Am. J. Pathol. 145(4):782-791）並びに悪性グリオーマ（Fukushima et al. 1998, Int. J. Cancer, 76:63-72）の他に、ヒトの多くの癌の侵襲性悪性細胞によってもまた優先的に発現される。
プロテアーゼによる細胞外マトリックスタンパク質のプロセッシングは、例えば創傷治癒及び腫瘍の転移のような過程で重要なメカニズムとして浮上してきた。いくつかのプロテアーゼがラミニン-5プロセッシングで示唆されてきた（例えば以下を参照されたい：Veitch et al. 2003, J. Biol. Chem., 278:15661-15668；及び米国特許公開公報2002/0076736）。完全に形成された組織では、ラミニン-5は完全にプロセッシングされ、G4及びG5ドメインを欠いている（Marinkovich et al. 1992, J. Biol. Chem. 267:17900-6）。理論に拘束されないが、特定のタンパク質分解プロセッシングが、腫瘍侵襲及び組織改造時に細胞遊走のために要求される前遊走シグナル由来のラミニン-5をG4及びG5ドメインを欠く粘着性基質へ変換することができるらしい。
【００１４】
２-１遊走促進配列
したがって、本明細書で提供されるものは、SCC関連ポリヌクレオチド及びアミノ酸配列で、本明細書では“遊走促進配列”又は“MFS”と称される。種々のアミノ酸配列を有するタンパク質は、本明細書では“遊走促進タンパク質”又は“MFP”と称される。この文脈での使用は、前記アミノ酸及びポリヌクレオチド配列は、正常な上皮組織と比較してSCC又は新形成上皮細胞では弁別的に発現されるか又は変更されていることを意味する。“SCC”は、本明細書では上皮細胞の任意の悪性新生物又は腫瘍を指す。上皮細胞の具体的な例には、扁平上皮細胞、扁平上皮癌細胞、ケラチノサイト、粘膜上皮細胞（例えば口腔粘膜細胞）、胃腸上皮細胞、眼の角膜上皮細胞、並びに尿路及び生殖路の上皮細胞が含まれる。新形成上皮細胞から生じるSCC癌の具体的な例には、皮膚、肺、頭部、頸部、口腔、胃、直腸結腸、咽喉部、生殖路、食道などの癌が含まれる。
SCCは、一般的に日光によって誘発される、すなわち放射線誘導SCCである。SCCはまた移植又は侵襲性外科手術からも生じる、または他の免疫抑制的状況に続くこともありえる。慢性炎症は、炎症部位（例えば火傷又は瘢痕、マルジョラン潰瘍など）でのSCCの発育をもたらすことがある。SCCはウイルスによって誘発されることがあり、例えば、SCCはヒトパピローマウイルス（HPV）感染から生じることがある。SCCにはアデノイド（棘細胞離開性）SCC、紡錘細胞SCC、いぼ状癌（VC）、角化棘細胞腫（KA）、結節性SCC、爪縁SCC、及び他の上皮性癌が含まれよう。
【００１５】
MFSはポリヌクレオチド及びアミノ酸の両配列を含むことができる。いくつかの実施態様では、MFSはリコンビナントポリヌクレオチドである。本明細書の“リコンビナントポリヌクレオチド”という用語は、ポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼによるポリヌクレオチドの操作によって本来in vitroで形成された、天然では自然に見出されない形態のポリヌクレオチドを指す。したがって、単離された線状形のポリヌクレオチド、又は発現ベクター（通常は結合していないポリヌクレオチド分子を連結することによってin vitroで生成される）はともに本発明の目的のためのリコンビナントと考えられる。いったんリコンビナントポリヌクレオチドが生成され、宿主細胞又は宿主生物に再導入されたら、前記は組換えによらないで、すなわちin vitroの操作ではなく宿主細胞のin vivoの細胞機構を用いて複製されるが、いったんは組換えによって生成されたそのようなポリヌクレオチドは（その後は組換えによらないで複製されるが）、本発明の目的のためにはやはりリコンビナントと考えられることは理解されよう。
当業者には理解されるところであり、さらに下記でより完全に概略するが、ポリヌクレオチドを含むMFSは多様な応用で有用である。前記応用は、診断での応用（前記の場合、MFSはハイブリダイゼーションプローブとして用いられ、SCC中のMFSを検出することができる）と同様に治療的応用（例えばSCC中のMFPの発現及び活性に影響を与えるために使用することができるアンチセンス配列の開発）を含む。
【００１６】
MFSには、SCCでアップレギュレートされるもの（例えばより高レベルで発現される）とともにダウンレギュレートされるもの（例えばより低レベルで発現される）も同様に含まれる。MFSはまた、改変した配列（すなわち短縮配列又は1つ若しくは2つ以上の変異（例えば点変異、欠失、挿入など）を有する配列）を含み、同じ発現プロフィル又は改変発現プロフィルを示す。いくつかの実施態様では、MFSはヒト由来である。しかしながら、当業者には理解されるところであるが、他の生物由来のMFSも疾患モデル動物及び薬剤の開発で有用であろう。したがって、他のMFSも提供される。例えば、MFSは脊椎動物から得ることができる。前記脊椎動物には、哺乳動物、例えばげっ歯類（ラット、マウス、ハムスター、モルモットなど）、霊長類、家畜（例えばヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマなど）とともに、無脊椎動物（例えばショウジョウバエ（Drosophila））が含まれる。他の生物由来のMFSも以下に概略する技術を用いて得ることができる。
いくつかの実施態様では、MFSは、改変されているが、同じ分化段階の正常な上皮組織と比較したとき同じ発現プロフィル又は改変発現プロフィルを示す。本明細書で用いられる“改変されたMFS”は、短縮されているか、挿入を含むか、又は点変異を含む配列を指す。
【００１７】
MFSは、先ず初めに本明細書に概略するMFSに対して実質的な核酸及び/又はアミノ酸配列相同性によって特定することができる。そのような相同性は、全体的なオリゴヌクレオチド又はアミノ酸配列を基準にすることができ、一般的には相同性プログラム又はハイブリダイゼーション条件を用いて決定することができる。当分野で知られているように、多数の異なるプログラムが、ポリヌクレオチド又はアミノ酸配列相同性を決定するために利用可能である。前記プログラムには、配列準拠アラインメントプログラム、配列相同性準拠アラインメントプログラム、構造アラインメントプログラムなどが含まれる。配列準拠アラインメントプログラムの非制限的な例には、スミス-ウォーターマン検索（Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 1981, 2:482）、ニードルマン-ヴァンシュ検索（Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 1970, 48:443）、ダブルアフィン（Double Affine）スミス-ウォーターマン検索、フレーム検索、グリブスコフ(Gribskov)/GCGプロフィル検索、グリブスコフ/GCGプロフィルスキャン、プロフィルフレーム検索、ブッカー（Bucher)普遍化プロフィル、隠蔽マルコフモデル（Hidden Markov model）、ダブルフレーム、ブラスト（Blast）、Psi-ブラスト、クラスタル（Clustal)及びジーンワイズ（GeneWise）が含まれる。配列相同性準拠アラインメントによる方法は文献に記載されている（Altschul et al. J. Mol. Biol. 1990, 215(3):403）。構造アラインメントプログラムの例には、NCBIのVAST；SSAP（Orengo & Taylor Methods Enzymol. 1996, 266:617-635）；SARF2（Alexandrov, Protein Eng. 1996, 9(9):727-732）、CE（Shindyalov & Bourne, Protein Eng. 1998, 11(9):739-747；Orengo et al. Strycture 1997, 5(8):1093-1108）；ダリ（Dali）（Holm et al. Nucleic Acid Res. 1998、26(1):316-9）；上記アルゴリズムのいくつかのコンピュータ処理（例えばウィスコンシンジネティクスソフトウェアパッケージ(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI)）のBLASTx、BLAST、GAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA）；ベストフィット（Best Fit）配列プログラム（Devereux et al. Nucl. Acid Res. 1984、12:387-395）が含まれる。
【００１８】
ポリヌクレオチド相同性はまたハイブリダイゼーション実験により決定することができる（例えば以下を参照されたい：Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manial, 2nd Edition, 1989；及びShort Protocols in Molecular Biology, ed., Ausubel et al.（前記両文献は参照により本明細書に含まれる））。一般的には、ストリンジェントな条件が選択されるが、ただしより低いストリンジェンシー条件も用いることができる。典型的には、ストリンジェントな条件は、一定のイオン強度pHでの個々の配列についての融解点（Tm）より約5−10℃低いように選択される。核酸のハイブリダイゼーションの徹底的な手引きは以下の文献で見出される：Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays”（1993）。
いくつかの実施態様では、MFSはポリヌクレオチドである。MFSを含むポリヌクレオチドは、ラミニン-5α3鎖をコードする完全長のゲノムポリヌクレオチド及び/又はcDNAポリヌクレオチドのどちらかから生成することができる。いくつかの実施態様では、MFSはヒトのラミニン-5のα3鎖から生成される（Ryan et al. 1994, J. Biol. Chem. 269:22779-22787；GenBank アクセッション番号NM_000227）。G4及び/又はG5ドメインに広がる種々の長さのMFSを生成することができる。例えば、ヒトのラミニン-5のα3鎖のG4ドメインのサブドメインを含むポリヌクレオチドは、ヌクレオチド4196位から開始しヌクレオチド4588位で終了させることによって生成することができる。ヒトのラミニン-5のα3鎖のG5ドメインを含むオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド4590位から始めヌクレオチド5140位で終了させることによって生成することができる。ヒトのラミニン-5のα3鎖のG4ドメインのサブドメイン及び完全なG5ドメインを含むオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド4196位から始めヌクレオチド5140位で終了させることによって生成することができる。
【００１９】
選択される正確なヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の数は、選択されたヌクレオチドの配列及び抗原決定基を含むアミノ酸をコードするヌクレオチドの存在にしたがって変動するであろう。本明細書の“エピトープ”又は“決定基”または“抗原決定基”という用語は、抗体又はMHC関連におけるT細胞レセプターを生成及び/又はこれと結合することができるタンパク質の一部分を意味する。例えば、G4及びG5ドメイン内の抗原決定基の存在は、MHCリガンド及びペプチドモチーフのデータベースを検索することによって特定することができる（H. Rammensee et al. 1999, Immunogenetics 50:213-219）。前記情報を用いて、MHCエピトープを含むMFSを生成することができる。典型的には、MHCクラスI分子によって認識されるエピトープは8から11アミノ酸を含み、したがってMHCクラスIエピトープをコードするMFSは24から33ヌクレオチドに範囲であることができる。MHCクラスII分子によって認識されるウイルスペプチドは10から20アミノ酸を含み、したがってMHCクラスIIエピトープをコードするMFSは30から60ヌクレオチドの範囲であることができる（Fundamental Immunology, 4th edition, W.F. Paul ed., Lippincott-Raven Publishers, 1999, Chapter 39, pp 1295-1334）。他の実施態様では、MFSは24から1050、又は60から300ヌクレオチド、又は60から405ヌクレオチド、又は60から555ヌクレオチド、又は60から600ヌクレオチド、又は60から750ヌクレオチド、又は60から900ヌクレオチド、又は60から1050ヌクレオチドの範囲である。さらにまた別の実施態様では、MFSは150から300ヌクレオチド、又は150から405ヌクレオチド、又は150から450ヌクレオチド、又は150から525ヌクレオチド、又は150から600ヌクレオチド、又は150から750ヌクレオチド、又は150から900ヌクレオチド、又は300から1050ヌクレオチドの範囲である
【００２０】
２-２遊走促進タンパク質
いくつかの実施態様では、“遊走促進タンパク質”又は“MFP”はラミニン-5α3 G4及び/又はG5ドメイン又はそのサブドメインをコードするアミノ酸配列から生成される。“MFP”は、近隣の組織又は身体の遠位点に位置する組織の遊走を新形成上皮細胞によって支援することができるタンパク質である。MFPはまた組換え体でもよい。“組換えMFPタンパク質”は、組換え技術を用いて、すなわち上記に記載したように組換えオリゴヌクレオチドの発現により生成されるタンパク質である。組換えタンパク質は、天然に存在するタンパク質とは少なくとも1つ又は2つ以上の特徴によって区別される。例えば、前記タンパク質は、その野生型宿主中でそれが通常付随しているタンパク質及び化合物のいくつか又は全てから単離又は精製することができ、したがって実質的に純粋でありえる。一般的には、単離されたタンパク質は、前記タンパク質が天然の状態で通常は付随されてある少なくともいくつかの物質を伴わず、好ましくはあるサンプル中で総タンパク質の少なくとも約0.5重量%、より好ましくは少なくとも約5重量％を構成する。実質的に純粋なタンパク質は総タンパク質の少なくとも約75重量%を含み、少なくとも約80%であることが好ましく、さらに少なくとも約90%であることが特に好ましい。前記定義はある生物由来のMFPを別個の生物又は宿主細胞で生産することを含む。また別には、前記タンパク質は、高濃度レベルで生成されるように誘導性プロモータ又は高発現プロモータを使用することによって、通常観察されるよりも顕著に高い濃度で生成させることができる。また別には、前記タンパク質は、下記で考察するように、エピトープタグの添加、又はアミノ酸の置換、挿入及び欠失のように、天然では通常見いだされない形態であってもよい。
【００２１】
いくつかの実施態様では、MFPは、ヒトのラミニン-5のα3鎖のG4及びG5ドメインから生成される（図1A参照）。G4及び/又はG5ドメインを含む種々の長さのMFPを生成することができる。図1Bは、G4ドメインからMFPを生成する例示的実施態様を示す。図1B−Dに示すように、種々の数のアミノ酸又はアミノ酸類似体を含むG4及び/又はG5ドメインから多数のMFPを生成することができる。選択されるアミノ酸又はアミノ酸類似体の正確な数は、選択されたアミノ酸の配列、骨形態発生タンパク質-1切断部位の存在、及び抗原決定基を含むアミノ酸の存在にしたがって変動するであろう。
上記で考察したように、G4及びG5ドメイン内の抗原決定基の存在は、MHCリガンド及びペプチドモチーフのデータベースを検索することによって特定することができる（H. Rammensee et al. 1999, Immunogenetics 50:213-219）。前記情報を用いて、MHCエピトープを特定することができる。典型的には、MHCクラスI分子によって認識されるエピトープは8から11アミノ酸を含み、一方、MHCクラスII分子によって認識されるエピトープは10から20アミノ酸を含む（Fundamental Immunology, 4th edition, W.F. Paul ed., Lippincott-Raven Publishers, 1999, Chapter 39, pp 1295-1334）。したがっていくつかの実施態様では、MFPは8から11アミノ酸の範囲である。他の実施態様では、MFPは10から20アミノ酸の範囲である。他の実施態様では、MFPは8から350アミノ酸の範囲である。さらに他の実施態様では、MFPは20から100アミノ酸の範囲、又は20から135アミノ酸の範囲、又は20から185アミノ酸の範囲、又は20から200アミノ酸の範囲、又は20から250アミノ酸の範囲、又は20から300アミノ酸の範囲、又は20から350アミノ酸の範囲である。さらに他の実施態様では、MFPは50から100アミノ酸の範囲、又は50から135アミノ酸の範囲、又は50から150アミノ酸の範囲、又は50から175アミノ酸の範囲、又は50から200アミノ酸の範囲、又は50から250アミノ酸の範囲、又は50から350アミノ酸の範囲、又は100から200アミノ酸の範囲、又は100から300アミノ酸の範囲、又は100から350アミノ酸の範囲である。
【００２２】
MFPはプロセッシングされてなくても、されてあってもよい。本明細書で用いられる、“プロセッシングされていない”とは、MFPがなおラミニン-5α3鎖と結合していることを意味する。本明細書の“プロセッシングされている”とは、MFPがラミニン-5α3鎖から解離されていることを意味する。
図1Bは、G4ドメインから生成することができる、例示的なMFPの実施態様を示す。図1Bは3つのMFP（MFP1、MFP2及びMFP3）を示す。骨形態発生タンパク質-1（BMP-1）のための既知の切断部位は、1a、1b及び1cと標識した黒四角で示されている（米国特許2002/0076736号参照）。図1Bに示されているように、本明細書に記載されているMFPは骨形態発生タンパク質-1（BMP-1）又は関連BMP-1タンパク質のための切断部位を含まない。当業者には理解されるところであるが、他のMFP（MFP4）もG4ドメインから生成することができ、前記は8から130までのアミノ酸を含む。
図1Cは、G5ドメインから生成することができる、例示的なMFPの実施態様を示す。図1Cに示すように、1つのMFP、すなわちMFP5を生成することができ、前記は完全なG5ドメインを含む。他の実施態様では1つのMFP、すなわちMFP6を生成することができ、前記はG5ドメインのサブドメインを含む。また別には、多数のMFP、すなわちMFP7を生成することができ、前記は8から182までのアミノ酸を含む。
図1Dは、G5及びG5ドメインから生成することができる、例示的なMFPの実施態様を示す。図1Dに示すように、1つのMFP、すなわちMFP8を生成することができ、前記はG4−G5ドメインに広がっている。図1Dに示すように、MFP8はBMP-1又は関連BMP-1タンパク質のための切断部位を含まない。また別には、多数のMFP、すなわちMFP9を生成することができ、前記は8から315までのアミノ酸を含む。
【００２３】
２-３発現系
MFPをコードするMFSポリヌクレオチドを用いて、MFPを発現する種々の発現ベクターを作製することができる。続いて下記に記載するように前記を診断、スクリーニング及び治療用途に用いることができる。前記発現ベクターは自己複製性染色体外ベクターであっても、又は宿主ゲノムに組み込まれるベクターであってもよい。一般的には、これらの発現ベクターは、MFPタンパク質をコードするオリゴヌクレオチドと機能的に連結された転写及び翻訳調節核酸を含む。“制御配列”という用語は、個々の宿主生物における、機能的に連結されたコード配列の発現に必要なDNA配列を指す。原核細胞に適した制御配列には、例えばプロモータ、場合によってオペレーター配列、及びリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモータ、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
あるオリゴヌクレオチドが、別のオリゴヌクレオチド配列と機能的な関係に配置されているとき、オリゴヌクレオチドは“機能的に連結”されている。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのためのDNAがあるポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されるならば、前記DNAは前記ポリペプチドのためのDNAに機能的に連結されている。プロモータ又はエンハンサーがあるコード配列の転写に影響を与えるならば、前記プロモータ又はエンハンサーは前記コード配列に機能的に連結されている。または、リボソーム結合部位が翻訳を促進するように配置されているならば、前記リボソーム結合部位はコード配列に機能的に連結されている。一般的には、“機能的に連結される”とは、連結されるDNA配列が連続していることを意味し、さらに分泌リーダーの場合には、連続的かつ読み枠内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続的である必要はない。連結は、都合のよい制限部位での連結によって達成される。そのような部位が存在しない場合は合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが一般的な慣行にしたがって用いられる。転写及び翻訳調節核酸は、MFPタンパク質の発現に用いられる宿主細胞にとって一般的に適切であろう。例えば、バシルス（Bacillus）由来の転写及び翻訳調節核酸配列は、好ましくはバシルスでMFPタンパク質を発現させるために用いられる。多数の適切な発現ベクター型及び適切な調節配列が種々の宿主細胞について当技術分野で知られている。
【００２４】
一般的には、転写及び翻訳調節配列には、プロモータ配列、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列、翻訳開始及び停止配列、並びにエンハンサー又はアクチベータ配列が含まれるが、ただしこれらに限定されない。好ましい実施態様では、調節配列にはプロモータ並びに転写開始及び停止配列が含まれる。
プロモータ配列は構成的又は誘導性プロモータをコードする。プロモータは天然に存在するプロモータでも、又はハイブリッドプロモータでもよい。2つ以上のプロモータエレメントを一緒にしたハイブリッドプロモータは当分野でも公知であり、本発明で有用である。
さらにまた、発現ベクターはさらに別のエレメントを含むことができる。例えば、発現ベクターは2つの複製系を含むことが可能であり、したがって発現のために2つの生物（例えば哺乳動物細胞又は昆虫細胞）で維持することができ、さらにクローニング及び増幅のために原核細胞宿主で維持することができる。さらにまた、発現ベクターの組込みのために、発現ベクターは、宿主細胞ゲノムと相同な少なくとも1つの配列、さらに好ましくは2つの相同配列（前記は発現構築物とフランキングする）を含む。組込みベクターは、ベクター内に含まれる適切な相同配列を選択することによって、宿主細胞の特定の遺伝子座に誘導されえる。組込みベクターのための構築物は当分野で周知である。
さらにまた、好ましい実施態様では、発現ベクターは、形質転換宿主細胞の選別を可能にする選別可能なマーカー遺伝子を含む。選別遺伝子は当分野で周知であり、使用される宿主細胞に応じて異なるであろう。
【００２５】
MFPは、MFPをコードするオリゴヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、前記MFPの発現を誘導又は引き起こす適切な条件下で培養することによって生成される。MFP発現に適した条件は、発現ベクター及び宿主細胞の選択に応じて異なり、当業者はこれを日常的な実験によって容易に確認できるであろう。例えば、発現ベクターにおける構成的プロモータの使用は宿主細胞の増殖及び分裂の最適化を必要とするであろう。一方、誘導性プロモータの使用は、誘導のために適切な増殖条件を要求するであろう。さらにまた、いくつかの実施態様では、採集の時期が重要である。例えば、昆虫細胞発現で使用されるバキュロウイルス系は細胞破壊性ウイルスであり、したがって採集時期の選択は生成物の収量に極めて重要でありえる。
適切な宿主細胞には、酵母、細菌、古細菌、菌類、並びに昆虫、植物及び動物細胞（哺乳動物細胞を含む）が含まれる。特に重要なものは初代ヒトケラチノサイトであるが、ただし他の細胞も用いることができる：すなわちショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）の細胞、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）及び他の酵母、大腸菌（E. coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、293細胞、CHO、他のヒト細胞及び細胞株である。
【００２６】
いくつかの実施態様では、MFPは哺乳動物細胞で発現される。哺乳動物の発現系はまた当分野で公知であり、レトロウイルス系を含む。好ましい発現ベクター系はレトロウイルスベクター系で、例えば以下の文献に一般的に記載されている：Dajee et al. 2003, Nature 421:639-643（前記文献は参照により本明細書に含まれる）。哺乳動物系プロモータとして特に重要なものは哺乳動物ウイルス遺伝子由来プロモータである。なぜならばウイルス遺伝子はしばしば高度に発現され、さらに広い宿主域を有するからである。前記の例には、SV40初期プロモータ、マウス乳癌ウイルスLTRプロモータ、アデノウイルス主要後期プロモータ、単純ヘルペスウイルスプロモータ及びCMVプロモータが含まれるが、ただしこれらに限定されない。典型的には、哺乳動物細胞によって認識される転写終了及びポリアデニル化配列は翻訳停止コドンの3'側に位置し、したがってプロモータエレメントと一緒にコード配列にフランキングする。転写ターミネータ及びポリアデニル化シグナルの例にはSV40由来のものが含まれる。
例えば、完全長ラミニン-5α3鎖cDNAをpENTR1A(商標)ベクター（Invitrogen）に連結することができる。完全長ラミニン-5α3鎖cDNA を切断し、さらにG4及び/又はG5ドメインからMFオリゴヌクレオチド配列を得るためにPCRを用いることができる。生成PCR産物をpENTR1A(商標)ベクターに連結し、さらにクローニング生成物を配列決定によって確認することができる。続いて、ラムダファージ組換えにより、クローン化生成物をpENTR1A(商標)ベクターからゲートウェー適応LSRZレトロウイルスベクターへ移すことができる（例えば以下を参照されたい：Dajee et al. 2003, Nature 421:639-643）。
【００２７】
いくつかの実施態様では、MFPは細菌系で発現される。細菌発現系は当分野では周知である。バクテリオファージ由来のプロモータもまた用いることができ、当分野で公知である。さらにまた、合成プロモータ及びハイブリッドプロモータもまた有用である。例えばtacプロモータは、trp及びlacプロモータ配列のハイブリッドである。さらにまた、細菌プロモータは、細菌のRNAポリメラーゼと結合して転写を開始させる能力を有する非細菌由来の天然に存在するプロモータを含むことができる。機能的プロモータ配列の他に、有効なリボソーム結合部位が所望される。発現ベクターはまた、MFPの分泌を細菌で提供するシグナルペプチド配列含むことができる。タンパク質は増殖培地に分泌されるか（グラム陰性細菌）、又は細胞の内膜と外膜の間に存在する細胞周囲間隙に分泌される（グラム陽性細菌）。細菌発現ベクターはまた選別可能なマーカー遺伝子を含み、形質転換された細菌株の選別を可能にすることができる。適切な選別遺伝子には、細菌を薬剤（例えばアンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン及びテトラサイクリン）に耐性にする遺伝子が含まれる。選別可能なマーカーにはまた生合成遺伝子、例えばヒスチジン、トリプトファン及びロイシン生合成経路に存在するものが含まれる。これらの成分は発現ベクター内でアッセンブリーされる。細菌のための発現ベクターは当分野で周知であり、とりわけ、枯草菌（Bacillus subtilis）、大腸菌（E. coli）、ストレプトコッカス・クレモリス（Streptococcus cremoris）及びストレプトコッカス・リビダンス（Streptococcus lividans）のためのベクターが含まれる。細菌発現ベクターは、当分野で周知の技術（例えば塩化カルシウム処理、エレクトロポレーション及びその他）を用いて細菌宿主細胞を形質転換する。
【００２８】
外因性核酸を哺乳動物宿主や他の宿主に導入する方法は当分野で周知であり、使用される宿主細胞に応じて異なるであろう。前記技術にはデキストラン介在トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン介在トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ウイルス感染、ポリヌクレオチドのリポソーム中への被包化、及びDNAの核への直接的マイクロインジェクションが含まれる。
MFP及びMFSは実施例に記載されているように特定することができる。例えば、具体的な実施態様では、種々のオリゴヌクレオチドがヒトラミニン-5α3鎖のG4及びG5ドメインから生成され、レトロウイルスベクターでサブクローニングすることができる。得られたレトロウイルスベクターを細胞培養に形質導入し、前記細胞を細胞拡散及び細胞遊走について分析することができる（例えば実施例及び図5及び6を参照されたい；さらにまた以下の文献を参照されたい：Ryan et al. 1994, J. Biol. Chem. 269:22779-22787）。また別には、Ras、IκBαの安定なNF-κBリプレッサー変異体（すなわちIKB）及び1つ又は2つ以上のMFSを同時発現しているラミニン-5陰性初代ヒトケラチノサイトを、レトロウイルスにより形質導入し、前記を用いて、免疫欠損マウス（すなわちヌードマウス）でヒトの皮膚を再生させることができる。前記に続く新生物の発育をモニターし、野生型マウスと比較することができる（例えば実施例及び図7を参照されたい；さらにまた以下の文献を参照されたい：Dajee et al. 2003, Nature 421:639-643）。
いくつかの実施態様では、MFPは発現後に精製又は単離される。MFPは、どのような他の成分がサンプル中に存在するかに応じて、当業者に公知の種々の方法で単離又は精製することができる。標準的な精製方法には、電気泳動、分子的、免疫学的及びクロマトグラフィー的技術（イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及び逆相HPLCクロマトグラフィー及びクロマトフォーカシングを含む）が含まれる。例えば、MFPは、標準的な抗MFP抗体カラムを用いて精製することができる。タンパク質の濃縮と組み合わせた限外ろ過及び透析技術もまた有用である。適切な精製技術における一般的な手引きのために例えば以下を参照されたい：R.Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, NY (1982)。必要とされる精製の度合いはMFPタンパク質の用途にしたがって異なるであろう。いくつかの事例では、精製は不要であろう。
【００２９】
２-４アンチセンス配列
MFS及びMFPは多様な別個の態様で用いることができる。いくつかの実施態様では、MFSは、MFPの発現及び活性に影響を与えるアンチセンス治療物質を作製するために用いることができる。アンチセンス技術は、標的タンパク質をコードするか、又はその発現を誘導する標的配列とアンチセンス配列との特異的な結合により標的タンパク質の発現を調節することを必要とする（例えば以下の文献を参照されたい：S.Agrawal, ed., 1996, Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totawa N.J.；Alama et al. 1997, Pharmacol. Res. 36(3):171-178；S.T. Crooke 1997, Adv. Pharmacol. 40:1-49；及びLavrosky et al. 1997, Biochem. Mol. Med. 62(1):11-22）。アンチセンス配列は、標的配列の少なくとも一部分と特異的にハイブリダイズすることができる核酸配列である。アンチセンス配列は細胞のmRNA又はゲノムDNAと結合し、翻訳又は転写を阻止し、したがって標的とされるタンパク質生成物の発現を妨害することができる。アンチセンス配列は任意の核酸物質であり、DNA、RNA又は任意の核酸模倣体若しくは類似体が含まれる（例えば以下の文献を参照されたい：Rossi et al. 1991, Antisense Res. Dev. 1(3):285-288；Pardridge et al. 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. 92(12):5592-5596；P.E. Nielsen and G. Haaima, 1997, Chem. Soc. Rev. 96:73-78；及びLee et al. 1998, Biochemistry 37(3):900-1010）。アンチセンス配列のデリバリーは多様な態様で、例えば発現ベクターを用いる細胞内デリバリーによって達成することができる。外因性遺伝子の位置特異的デリバリーもまた意図され、前記は例えば、培養状態の細胞が先ず初めにトランスフェクトされ、安定なトランスフェクタントが続いて標的部位にデリバーされるという技術である。
【００３０】
典型的には、15から25核酸塩基又は核酸塩基類似体のアンチセンスオリゴヌクレオチドが所望の治療効果、すなわちMFP翻訳の直接的破壊をもたらすことができる。さらにまた、化学的反応基、例えば鉄結合エチレンジアミン四酢酸（EDTA-Fe）をアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させて、ハイブリダイゼーション部位でRNAを切断させることができる。遺伝子のin vitro翻訳の阻害のためのアンチセンスによる方法のこのような使用及びその他の使用は、当分野で周知である（例えば以下を参照されたい：Marcus-Sakura (1988) Anual. Biochem. 172:289）。
いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらがラミニン-5α3鎖の翻訳を破壊できるように設計される。他の実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらがG4ドメイン又はそのサブドメインのMFP翻訳を破壊できるように設計される。さらに別の実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらがG5ドメイン又はそのサブドメインのMFP翻訳を破壊できるように設計される。さらにまた別の実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらがG4及びG5ドメイン又はそのサブドメインのMFP翻訳を破壊できるように設計される。
【００３１】
アンチセンス物質のデリバリーは、転写に際して標的タンパク質をコードする細胞内配列の少なくとも一部分と相補的な配列を生じる、組換え発現ベクター（例えばキメラウイルス系又はコロイド分散系）を用いることによって細胞内で達成することができる（例えば以下を参照されたい：Slater et al. 1998, J. Allergy Cli. Immunol. 102(3):469-475）。アンチセンス配列のデリバリーはまた、種々のウイルスベクター（レトロウイルス及びアデノ付随ウイルスベクターを含む）によって達成することができる（例えば以下を参照されたい：Miller 1990, Blood 76:271；及びUckert and Walther 1994, Pharmacol. Ther., 63(3):323-347）。適切なウイルスベクターには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア及びRNAウイルス（例えばレトロウイルス）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
レトロウイルスベクターはネズミ又はニワトリのレトロウイルスから誘導されたウイルスでもよい。レトロウイルスベクターは、例えば所望のリガンドがウイルスベクターの表面で発現されるようにタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することによって標的特異的にすることができる。前記リガンドは、糖脂質、炭水化物又はタンパク質でもよい。好ましい標的結合はまた、レトロウイルスベクターを標的とする抗体を用いて達成することができる。アンチセンスポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターの標的特異的デリバリーを可能にするために、レトロウイルスに挿入することができる特異的なポリヌクレオチド配列に関して当業者は知識を有し、又は煩雑な実験を行うことなくそれらを容易に確定することができる。例えばWO91/04753を参照されたい。
標的細胞にアンチセンス配列をデリバーするために用いることができる他のデリバリーメカニズムには、コロイド分散及びリポソーム誘導系、人工ウイルスエンベロープ、及び当業者が利用できる他の系が含まれる（例えば以下を参照されたい：Rossi, 1995, Br. Med. Bull. 51(1):217-225；Morris et al. 1997, Nucl. Acids Res. 25(14):2730-2736；Boado et al. 1998, J. Pharm. Sci. 87(11):1308-1315；WO90/10448）。例えば、デリバリー系は、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び脂質依存系（水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む）を利用することができる。
【００３２】
２-５抗体
いくつかの実施態様では、MFPを用いて、本明細書に記載するスクリーニング及び治療的用途で用いることができる抗体が作製される。好ましくは、MFPは少なくとも1つのエピトープ又は決定基を含むべきである。いくつかの実施態様では、前記エピトープは固有である。すなわち固有のエピトープに対して生じた抗体はほとんど又は全く交差反応性を示さない。“抗体”という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、抗体フラグメント、例えばFab、Fab2、単鎖抗体（例えばFv）などで、完全な抗体の改変によって生成されるか、又は組換えDNA技術を用いてde novoに合成されたものを含むことができる。
MFPは免疫原性領域を決定するために査定することができる。上記で考察されたように、分析及びエピトープ選択の方法は当分野で周知である。分析及び選択はまた、例えば種々のソフトウェアパッケージ（例えばLASERGENE NAVIGATORソフト（DNASTAR; Madison, Wis）によって達成することができる。抗体を誘発するために用いられるポリペプチド又はフラグメントは抗原性でなければならないが、生物学的に活性を有する必要はない。抗原性フラグメント又はポリペプチドは長さが少なくとも5アミノ酸、より好ましくは少なくとも10アミノ酸、もっとも好ましくは少なくとも長さが15アミノ酸である。抗体誘発フラグメント又はポリペプチドは、G4及び/又はG5ドメイン又はそのサブドメインのアミノ酸配列の少なくとも一部分と同一であることが好ましい。前記免疫物質を、免疫される哺乳動物で免疫原性であることが判明しているタンパク質と結合させることは有用であろう。そのような免疫原性タンパク質の例にはカサガイ（keyhole limpet）のヘモシアニン、血清アルブミン、ウシのサイログロブリン及びダイズトリプシン阻害物質が含まれ（ただしこれらに限定されない）、抗体は前記キメラ分子に対して作製することができる。
【００３３】
抗体の作製方法は当分野では周知である。例えば、種々の宿主（ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他を含む）を、MFP又はその任意の免疫原性フラグメント又はペプチドの注射によって免疫することができる。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用い免疫学的応答を高めることができる。そのようなアジュバントには、フロイントのアジュバント、鉱物ゲル（例えば水酸化アルミニウム）、及び界面活性物質（例えばリゾレシチン）、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、KLH、及びジニトロフェノールが含まれるが、ただしこれらに限定されない。ヒトで用いられるアジュバントの中では、BCG（杆菌カルメットゲリン）及びコリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）が特に好ましい。
【００３４】
持続的細胞株の培養によって抗体分子の産生を提供する任意の技術を用いて、モノクローナル及びポリクローナル抗体を調製することができる。in vivo及びin vitro生成技術は当分野では周知である（例えば以下を参照されたい：J.D. Pound, 1998, Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa N.J.；E. Harlow and D. Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）。単鎖抗体の製造と同様に、キメラ抗体の製造もまた周知である（例えば以下を参照されたい：Morison et al. 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855；Neuberger et al. 1984, Nature 312:604-608；Takeda et al. 1985, Nature 314:452-454）。関連する特異性を有するが、別個のイディオタイプ組成を有する抗体は、例えばランダムな順列組合せ（combinatorial）ライブラリーから鎖のシャッフリングによって作製することができる（例えば以下を参照されたい：Burton, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:11120-11123）。
抗体はまた、リンパ球集団でin vivo産生を誘発することによって、又は高度に特異的な結合試薬の免疫グロブリンライブラリー又はパネルをスクリーニングすることによって製造することができる（例えば以下を参照されたい：Orland et al. 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837；G. Winter and C. Milstein, 1991, Nature 349:293-299）。標的ポリペプチドに対して特異的な結合部位を含む抗体フラグメントもまた作製することができる。そのような抗体フラグメントには、F(ab')2フラグメント（抗体分子のペプシン消化によって生成することができる）、及びFabフラグメント（F(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成することができる）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。また別には、Fab発現ライブラリーを構築し、所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速で容易な特定を可能にすることもできる（例えば以下を参照されたい：Huse et al. 1989, Science 254:1275-1281）。
【００３５】
いくつかの実施態様では、抗体は二特異性抗体である。二特異性抗体はモノクローナルであり、好ましくは、少なくとも2つの別個の抗原に対し結合特異性を有するヒト抗体又はヒト化抗体である。本事例では、結合特異性の1つはMFPに対するものであり、他方は他の任意の抗原（例えば細胞表面タンパク質又はレセプター若しくはレセプターサブユニット）に対するもの、好ましくは腫瘍特異的であるものである。
いくつかの実施態様では、MFPに対する抗体はヒト化抗体である。非ヒト（例えばネズミ）抗体のヒト化型は、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそのフラグメント（例えばFv、Fab、F(ab')2、又は抗体の他の抗原結合サブ配列）のキメラ分子であって、最低限の非ヒト免疫グロブリン由来配列を含む。ヒト化抗体はヒトの免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含み、前記抗体では、レシピエントの相補性決定領域（CDR）由来の残基は、所望の特異性、親和性及び性能を有する非ヒト種（例えばマウス、ラット又はウサギ）のCDR由来の残基（ドナー抗体）によって置換されている。いくつかの事例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも又は移入されるCDR若しくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含むことができる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含み、前記抗体では、CDR領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのCDR領域に一致し、さらにフレームワーク残基（FR）領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の残基である。ヒト化抗体は最適にはまた、免疫グロブリン定常領域（Fc）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含むであろう（Jones et al. 1986, Nature 321:522-525；Riechmann et al. 1988, Nature 332:323-329；及びPresta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596）。
【００３６】
非ヒト抗体をヒト化する方法は当分野では周知である。一般的には、ヒト化抗体は非ヒト供給源から導入された1つ又は2つ以上のアミノ酸を有する。これら非ヒトアミノ酸残基はしばしば移入残基と称され、前記は典型的には重要な可変ドメインから採取される。ヒト化は、本質的にはWinterとその共同研究者らの方法にしたがい、げっ歯類のCDR又はCDR配列をヒト抗体の対応する配列の代用とすることによって実施することができる（Jones et al. 1986, Nature 321:522-525；Riechmann et al. 1988, Nature 332:323-329；Verhoeyen et al. 1988, Science 239:1534-1536）。したがって、そのようなヒト化抗体はキメラ抗体であり（米国特許4,816,567号）、この場合、完全なヒト可変ドメインよりも実質的に少ないものが非ヒト種由来の対応する配列によって代用される。実際には、ヒト化抗体は典型的には、いくつかのCDR残基及びおそらくはいくつかのFR残基がげっ歯類の類似の部位の残基によって置き換えられる。
ヒト抗体はまた、ファージディスプレーライブラリー（Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227:381；Marks et al. 1991, J. Mol. Biol. 222:581）を含む、当分野で公知の種々の技術を用いて作製することができる。Coleら及びBoernerらの技術もまたヒトのモノクローナル抗体の調製に利用可能である（Cole et al. 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77；及びBoerner et al. 1991, J. Immunol. 147(1):86-95）。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物（例えばマウス、前記では内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活化されている）に導入することによって作製することができる。チャレンジに際して、ヒトの抗体産生が観察され、前記抗体は、遺伝子の再編成、アッセンブリー及び抗体レパートリーを含むあらゆる点においてヒトで見出される抗体と極めて類似している。このアプローチは、例えば以下の特許文献及び学術文献に記載されている：米国特許5,545,807号；5,545,806号；5,569,825号；5,625,126号；5,633,425号；5,661,016号；Marks et al. 1992, Bio/Technology 10:779-783；Lonberg et al. 1994, Nature 368:856-859；Morrison, 1994, Nature 368:812-13；Fishwild et al. 1996, Nature Biotechnology 14:845-51；Neuberger 1996, Nature Biotechnology 14:826；Lonberg and Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93。
【００３７】
抗体は、当分野で周知の多様な方法を用いて、抗MFP活性について検査することができる。種々の技術をスクリーニングに用いて、所望の特異性を有する抗体を特定することができる。前記技術には、種々の免疫アッセイ、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）（直接及びリガンド捕捉ELISAを含む）、放射能免疫アッセイ（RIA）、イムノブロッティング、及び蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）が含まれる。確認された特異性を有するポリクローナル又はモノクローナル抗体のどちらかを用いる競合結合アッセイ又は放射能測定免疫アッセイのための多数のプロトコルが当分野では周知である（例えば上掲書（Harlow and Lane）を参照されたい）。そのような免疫アッセイは典型的には、標的ポリペプチドと特異的抗体との間での複合体形成の測定を必要とする。標的ポリペプチド上の2つの非干渉性エピトープと反応するモノクローナル抗体を利用するモノクローナル抗体依存2部位免疫アッセイが好ましいが、他のアッセイ（例えば競合結合アッセイも又利用することができる（例えば以下を参照されたい：Maddox et al. 1983, J. Exp. Med. 158:1211）。
いったん作製されたら、この抗体を用いて、例えば生検組織などから得られたサンプル中のMFPを特定することができる。MFP又はMRPをコードするmRNAの量を当分野で周知の方法を用いて決定することができる。前記方法には、定量的画像分析、及び生検組織の一部分を用いる逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。MFPに対応するmRNAの定量は、例えば既知濃度の模倣体又は変異体cDNAフラグメントの濃度を連続的に減少させたものに対して等容積の患者サンプルを反応させる競合反応によって実施することができる。
【００３８】
本明細書に記載するMFP抗体は、MFPと特異的に結合することができる。本明細書の“特異的に結合する”とは、前記抗体が、少なくとも10-4から10-9M-1の範囲、好ましくは10-4から10-6M-1の範囲の結合定数でタンパク質と結合することを意味し、好ましい範囲は10-7から10-9M-1である。
いくつかの実施態様では、MFPに対する抗体は、MFPの生物学的活性又は機能を低下又は排除することができる。すなわち、SCC又はMFPを発現する新形成上皮細胞に対する抗MFP抗体（すなわちポリクローナル又はモノクローナル）の添加は、MFP活性を低下又は排除する。一般的には、活性の少なくとも25%低下が好ましく、少なくとも約50%が特に好ましく、約95−100%低下がさらに好ましい。
いくつかの実施態様では、MFPにたいする抗体は治療成分と結合される。例えば、前記治療成分は酵素活性、例えばSCCに付随するプロテアーゼ又はタンパク質キナーゼ活性を阻害する物質でもよい。他の実施態様では、前記治療成分は細胞障害性物質でもよい。細胞障害性物質は多数存在し多様であり、前記には、放射性化学物質、細胞障害性薬剤又は毒素、又はそのような毒素の活性フラグメントが含まれるが、ただしこれらに限定されない。適切な毒素及びそれらの対応するフラグメントには、ジフテリアA鎖、外毒素A鎖、リシンA鎖、アルビンA鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシンなどが含まれる。
【００３９】
２-６診断及び治療
MFS及びMFPは多様な種々の態様で用いることができる。例えば、MFS及びMFPは、診断アッセイ、スクリーニングアッセイ、及び治療用途で用いることができる。いくつかの実施態様では、MFP及びMFPに対する抗体は、SCCの検出のための診断マーカーとして用いられる。仮定的SCC組織又は仮定的患者でのMFPの検出によって、SCCを決定又は診断することができる。SCCの検出又は診断のために、MFPの発現又は活性の基準値が確立され、患者におけるSCCの診断及び/又は予後の基礎が提供される。いくつかの実施態様では、前記は、健常者から採取された体液、組織生検材料又は細胞抽出物をMFPに対する1つ又は2つ以上の抗体と、複合体形成に適した条件下で混合することによって達成される。前記のような条件は当分野では周知である。標準的な複合体形成量は、正常なサンプル中の抗体-標的複合体レベルを陽性コントロール（既知量の抗体が既知濃度の精製MFPと混合される）の一連の希釈物と比較することによって定量することができる。正常サンプルから得られた標準値をSCCが疑われる対象者のサンプルから得られる値と比較することができる。標準値と対象者の値との間の偏差はSCCの存在又は前記疾患の素因を明らかにする。
他の実施態様では、遺伝子発現レベルが、SCC表現型の種々の細胞状態について決定される。すなわち、正常組織及びSCC組織における遺伝子発現レベルが判定され、発現プロフィルが提供される。個々の細胞の1つの状態又は発育点の発現プロフィルは本質的には前記の状態の“指紋”である。一方、2つの状態は任意の個々の遺伝子を同様に発現させるであろうが、多数の遺伝子を査定することによって、同時に細胞の状態に固有である遺伝子発現プロフィルの作製を可能にする。異なる状態にある細胞の発現プロフィルを比較することによって、これら状態の各々においてどの遺伝子が重要であるかに関する情報が得られる（遺伝子のアップレギュレーション及びダウンレギュレーションを含む）。したがって、以下のような診断を下すか、又は確認することができる：個々の患者から得られた組織が正常組織又はSCC組織の遺伝子発現プロフィルを有するか。
【００４０】
本明細書で用いられる“弁別的発現”は、細胞内及び細胞間における遺伝子の時間的発現パターン及び/又は細胞性発現パターンの定性的相違とともに定量的相違を指す。したがって、弁別的に発現される遺伝子は、例えば正常組織やリンパ腫組織で、定性的にその発現を変化させることができる（活性化又は不活化を含む）。すなわち、別の状態と比較して個々の状態において遺伝子は作動を開始し又は作動を停止する。当業者には明白であるが、2つ又は3つ以上の状態の任意の比較を実施することができる。そのような定性的に調節される遺伝子は、ある1つの状態又は細胞タイプの発現パターンを示し、前記パターンは、標準的技術によってそのような1つの状態又は細胞タイプで検出することができるが、別の両者で検出することはできない。また別には、決定は、発現が増加又は低下するという点で定量的である。すなわち、遺伝子の発現はアップレギュレートされて転写物の増量を生じるか、又はダウンレギュレートされて転写物の減量をもたらす。発現が相違する程度は、下記に概略するように、標準的な性状決定技術によって定量するために必要な大きさであればよい。前記は、例えばアフィメトリックス・ジーンチップ（Affymetrix GeneChip(商標)）発現アレー（Lockhart, Nature Biotechnology, 1996, 14:1675-1680；前記文献は参照により本明細書に含まれる）の使用によって達成される。他の技術には、定量的逆転写酵素PCR、ノザン分析及びRNase保護が含まれるが、ただしこれらに限定されない。上記に概略したように、好ましくは、発現における変化（すなわちアップレギュレーション又はダウンレギュレーション）は少なくとも約50%、より好ましくは少なくとも約100%、より好ましくは少なくとも約150%、より好ましくは少なくとも約200%であり、300から少なくとも1000%が特に好ましい。
【００４１】
当業者には理解されるところであるが、これは遺伝子転写物又はタンパク質レベルにおける判定によって実施することができる。すなわち、遺伝子発現の量は、遺伝子転写物のDNA又はRNA等価物に対する核酸プローブを用いてモニターすることができる。さらに遺伝子発現レベルの定量、また別には最終遺伝子生成物そのもの（タンパク質）を、例えばMFタンパク質に対する抗体及び標準的免疫アッセイ（ELISAなど）の使用、又は他の技術（質量分析アッセイ、2Dゲル電気泳動アッセイなどを含む）によりモニターすることができる。したがって、MF遺伝子に対応するタンパク質、すなわちSCC表現型で重要であると特定されたものはSCC診断検査で評価することができる。
当業者に公知の多数の方法がSCCの診断で有用であることが判明している。例えば、いくつかの実施態様では、サンプル又は患者から得られたタンパク質はゲル上で電気泳動によって分離される（典型的には変性及び還元タンパク質ゲルであるが、等電点フォーカシングゲルなどを含む任意の他のタイプのゲルでもよい）。タンパク質の分離に続いて、MFPは、MFPに対して作製した抗体を用いて免疫ブロッティングによって検出することができる。免疫ブロッティングの方法は当業者には周知である。
【００４２】
いくつかの実施態様では、MFPに対する抗体はin situの画像化技術で有用であることが見出されている。この方法では、1つ又は多数の抗MFP抗体と細胞を接触させる。洗浄して非特異的抗体結合を除去した後、抗体の存在を検出する。ある実施態様では、抗体は、検出可能な標識を含む二次抗体とともにインキュベートすることによって検出される。また別の方法では、MFPに対する一次抗体が検出可能な標識を含む。別の好ましい実施態様では、多数の一次抗体の各々が別個の検出可能な標識を含んでいる。この方法は、複数のMFPの同時スクリーニングで特に有用である。当業者には理解されるところであるが、他の多数の組織学的画像化技術が本発明で有用である。
いくつかの実施態様では、標識は、種々の波長の放射を検出及び識別する能力を有するフルオロメーターで検出される。さらにまた、蛍光活性化細胞分類装置（FACS）を本方法で用いてもよい。
いくつかの実施態様では、組織のアレーと標識MF核酸プローブのin situハイブリダイゼーションが実施される。例えば、組織サンプル（SCC組織及び/又は正常組織を含む）のアレーが作製される。続いて、当分野で公知のin situハイブリダイゼーションを実施することができる。
個体と標準との間で発現の指紋を比較するとき、当業者は予後とともに診断をくだすことができることは理解されよう。さらにまた、診断の指標となる遺伝子は、予後の指標となる遺伝子と異なる可能性があることも理解されよう。
【００４３】
好ましい実施態様では、MFタンパク質、抗体、核酸、及びMF配列含有細胞が予後アッセイに用いられる。いくつかの実施態様では、長期予後に関してSCCの重篤度と関連する遺伝子発現プロフィルを作製することができる。繰り返せば、これは、タンパク質レベル又は遺伝子レベルで実施することができ、遺伝子の使用が好ましい。いくつかの実施態様では、組織又は患者でMF配列を検出及び定量するためにMFプローブが固相に結合される。前記アッセイは診断について概略したように進められる。
治療物質（例えば抗体及び/又は他の候補薬）の有効性もまた、上記の診断アッセイを用いて決定することができる。当業者には理解されるところであるが、治療物質の有効性を決定するためのアッセイは、基準値の確立を必要とする。いくつかの実施態様では、前記は、候補薬で処置する前にSCCの患者から採取した体液、組織生検材料、又は細胞抽出物をMFPに対する1つ又は2つ以上の抗体と、複合体形成に適した条件下で混合することによって達成される。そのような条件は当分野では周知である。標準的な複合体形成量は、正常サンプル中の抗体-標的複合体のレベルを一連の陽性コントロールの稀釈（それには既知量の抗体が既知濃度の精製MFPと混合されている）と比較することによって定量することができる。処置前の患者から得られた標準的な値を、処置後の患者から得られた値と比較することができる。標準値と対象者の値との間の偏差によって前記物質の有効性が確立される。
【００４４】
２-７スクリーニングアッセイ
いくつかの実施態様では、MFタンパク質、抗体、核酸及びMFタンパク質含有細胞がスクリーニングアッセイに用いられる。例えば、SCC表現型を調節する物質のスクリーニングを実施することができる。これは、個々の遺伝子又はタンパク質レベルで、遺伝子発現の調節物質について、若しくはタンパク質活性の調節物質についてスクリーニングすることによって、又は候補薬の“遺伝子発現プロフィル”に対する影響を評価することによって実施することができる。いくつかの実施態様では、発現プロフィルは高処理スクリーニング技術と一緒に用いられ、候補物質の処置後の発現プロフィル遺伝子の追跡を可能にする（Zlokarnik et al. 1998, Science 279:84-8）。
“調節”には遺伝子発現又は活性における増加及び減少の両者が含まれる。好ましい調節の量は、正常組織対腫瘍組織における遺伝子発現の最初の変化に左右されるであろう。変化は少なくとも10%、好ましくは50%、より好ましくは100−300％、さらにいくつかの実施態様では300−1000%又はそれより大きい。正常組織と比較して遺伝子が腫瘍で4倍の増加を示すならば、約4倍の低下が所望される。正常組織と比較して腫瘍組織で10倍の低下が与えられるならば、10倍の発現の増加が候補物質に所望される、云々。
当業者には理解されるところであるが、これは、遺伝子又はタンパク質レベルのどちらかの評価によって実施することができる。すなわち、遺伝子発現の量は、核酸プローブを用いてモニターすることができ、さらに遺伝子発現レベルの定量また別には遺伝子生成物そのもののレベルは、例えばMFPに対する抗体及び標準的な免疫アッセイの使用によりモニターすることができる。また別には、前記タンパク質による結合アッセイ及び生物活性アッセイは下記に概略するように実施することができる。
【００４５】
いくつかの実施態様では、遺伝子発現のモニタリングが実施され、さらに多数の遺伝子、すなわち発現プロフィルも同時にモニターされる。所望の場合には、多数のタンパク質発現のモニタリングも同様に実施することができる。多数の遺伝子又はタンパク質をモニターする実施態様では、対応するMFプローブは固相に固定される。固定は、任意の手段（例えば共有結合、静電気的固定、リガンド/リガンド相互作用による結合、接触又は表面上への沈積を含む）によって達成することができることは理解されよう。“固相”又は“固形土台”は、その上でMF配列、MFP又は抗体が合成され、結合され、連結され、また別には固定される任意の固相物質を指す。固相は、有機ポリマー、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレノキシ、及びポリアクリルアミドとともにそのコポリマー及びグラフトポリマーで構成することができる。固相はまた、無機物質、例えばガラス、シリカ、孔制御ガラス（controlled-pore-glass, CPG）、又は逆相シリカでもよい。固相の外形は、ビーズ、球体、粒子、顆粒、ゲル、又は表面であってもよい。表面は、平坦、実質的に平坦、又は非平坦であってもよい。固相は多孔質でも無孔性でもよく、さらに膨潤性でも非膨潤性でもよい。固相はウェル、窪み若しくは他の入れ物、容器の形態であっても、特徴又は配置を形成していてもよい。複数の固相が種々の配置でアレーを形成し、自動装置による試薬のデリバリー又は検出手段（レーザー照射によるスキャンニング及び共焦点又は偏向集光を含む）を特徴とすることができる。
【００４６】
一般的には、生物活性を有する候補物質が分析前に添加される。本明細書で用いられる“生物活性を有する候補物質”又は“候補薬”という用語は、SCC表現型、MFPの結合及び/又はその生物活性の調節、又はMF配列の発現を直接又は間接的に改変することができる生物活性物質として検査される任意の分子、例えばタンパク質、オリゴペプチド、小さな有機又は無機分子、多糖類、ポリヌクレオチドなどをいう。特に好ましい実施態様では、前記候補物質は、SCC表現型を例えば正常な組織の指紋へと抑制する。一般的には、種々の物質濃度を用いて複数のアッセイ混合物を平行して検査し、前記多様な濃度に対する弁別的応答を得る。典型的には、これらの濃度の１つ（すなわちゼロ濃度又は検出レベル未満）が陰性コントロールとして機能する。
ある特徴では、候補物質はMFPの作用を中和させるであろう。“中和させる”とは、タンパク質の活性が阻害されるか、又は反対に作用して細胞に対して実質的に作用をもたないことを意味する。
候補物質は、多数の化合物類を包含するが、典型的にはそれらは有機若しくは無機分子、好ましくは分子量が100ダルトンより大きく約2500ダルトン未満の小さな有機化合物である。好ましい小分子は2000D未満、又は1500D未満、又は1000D未満、又は500D未満である。候補物質は、タンパク質との構造的な相互作用に必要な官能基、特に水素結合を含み、典型的には少なくとも１つのアミン、カルボニル、ヒドロキシル又はカルボキシル基、好ましくは前記官能基の少なくとも2つを含む。候補物質は、しばしば炭素環式又は複素環式構造、及び/又は芳香族若しくはポリ芳香族の構造をもち、前記は上記官能基の1つ又は2つ以上で置換されている。候補物質はまたバイオ分子の中に見出され、ペプチド、タンパク質、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、その誘導体、構造的類似体、又は前記の組合せが含まれる。
【００４７】
候補物質は、合成又は天然化合物ライブラリーを含む多様な供給源から得られる。例えば、多様な有機化合物及びバイオ分子のランダム合成及び誘導合成のために多数の手段が利用可能であり、任意抽出オリゴヌクレオチドの発現が含まれる。また別には、細菌、菌類、植物及び動物抽出物の形態の天然化合物ライブラリーも利用可能であり、また容易に作製できる。さらにまた、天然の又は合成により作製されたライブラリー及び化合物は、通常の化学的、物理的及び生化学的手段により容易に改変される。既知の薬理学的物質を誘導的又はランダムな化学的改変（例えばアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化）に付して、構造的類似体を生成することができる。
1つ又は2つ以上のMF配列の発現プロフィルを改変させるアッセイでは、候補物質を添加し、細胞をある時間インキュベートした後、分析するべきMF配列を含むサンプルを固相に添加する。必要な場合には、MF配列は公知の技術を用いて調製される。例えば、公知の溶解緩衝液を用いてサンプルを処理して細胞を溶解し、当業者には理解されるところであるが、必要に応じて精製及び/又は増幅（例えばPCR）することができる。
【００４８】
一般的には、アッセイ成分の1つを標識して、対象の結合複合物を検出する手段が提供される。本明細書の“標識する”とは、ある化合物にその検出を可能にするために少なくとも1つの元素、同位体、化合物を結合させることを意味する。一般的には、標識は3つの種類に分類される：a）同位元素標識、前記標識は放射性又は重い同位元素であろう；b）免疫標識、前記標識は抗体又は抗原であろう；及びc）着色又は蛍光染料。標識はMF核酸、タンパク質及び抗体の任意の位置に取り込ませることができる。例えば、標識は、直接又は間接的に検出可能なシグナルを生成することができなければならない。検出可能な成分は、放射性同位元素（例えば3H、14C、32P、35S、又は125I）、蛍光又は化学発光化合物（例えばフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、又はルシフェリン）、又は酵素（例えばアルカリ性ホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ）であろう。標識に抗体を結合させるために、当分野で公知の任意の方法を用いることができる。前記には以下の文献に記載された方法が含まれる：Hunter et al. 1962, Nature 144:945；David et al. 1974, Biochemistry 13:1014；Pain et al. 1981, J. Immunol. Meth. 40:219；及びNygren, 1982, J. Histochem. And Cytochem. 30:407。前記標識はまた酵素（例えばアルカリ性ホスファターゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ）でもよく、前記は、適切な基質が提供されるとき、検出可能な生成物を生じる。また別には、前記標識は、標識された化合物又は小分子（例えば酵素阻害物質）であってもよく、前記は結合するが酵素によって触媒されず又は改変されない。前記標識はまた成分又は化合物、例えばエピトープタグ又はビオチン（ストレプトアビジンと特異的に結合する）であってもよい。ビオチンの例では、ストレプトアビジンが上記のように標識され、それによって結合標的配列のための検出可能なシグナルが提供される。当分野で知られているように、未結合の標識アビジンは分析の前に取り除かれる。
【００４９】
当業者には理解されるところであるが、これらのアッセイは直接的ハイブリダイゼーションアッセイであっても、又は“サンドイッチアッセイ”を含んでいてもよい。前記サンドイッチアッセイは、多数のプローブの使用を含む、一般的には以下の文献に概略されているとおりである：米国特許6,681,702号、5,597,909号、5,545,730号、5,594,117号、5,591,584号、5,571,670号、5,580,731号、5,571,670号、5,591,584号、5,624,802号、5,635,352号、5,594,118号、5,359,100号、5,124,246号及び5,681,697号（前記文献は全て参照により本明細書に含まれる）。
多様なハイブリダイゼーション条件を本発明で用いることができる。前記には上記に概略されているように高、中等度及び低ストリンジェンシー条件が含まれる。アッセイは、一般的には、標識プローブのハイブリダイゼーション複合体の形成が標的の存在下でのみ可能であるストリンジェンシー条件下で実施される。ストリンジェンシーは、熱力学的変数である工程パラメーター（温度、ホルムアミド濃度、塩濃度、カオトロピズムを示す塩の濃度、pH、有機溶媒濃度などが含まれるが、ただしこれらに限定されない）を変更することによって制御することができる。
これらのパラメーターはまた、米国特許5,681,697号に一般的に概略されているように非特異的結合の制御のためにも用いられる。したがって、ある種の工程を高ストリンジェンシー条件で実施して非特異的結合を低下させることが望ましいであろう。
【００５０】
本明細書で概略する反応は、当業者に理解されるように多様な方法で実施することができる。反応成分は同時に又は連続的に（任意の順序で）添加できるが、好ましい実施態様は下記に概略されている。さらにまた、前記反応にはアッセイに含むことができる多様な試薬を含むことができる。これらには、塩のような試薬、緩衝液、中性タンパク質（例えばアルブミン）、界面活性剤などが含まれ、前記は最適なハイブリダイゼーション及び検出を促進するために、及び/又は非特異的若しくはバックグラウンド反応を減少させるために用いることができる。さらにまた別の態様でアッセイの有効性を改善する試薬（例えばプロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤など）を、サンプルの調製方法及び標的の純度に応じて用いてもよい。さらにまた、固相アッセイ又は溶液系（すなわちカイネティックPCR）アッセイを用いることができる。
いったんアッセイを実施したら、データを分析して、発現レベル及び、発現プロフィルを形成する個々の遺伝子又は個々のタンパク質間における発現レベルの変化を決定する。
いくつかの実施態様では、MF遺伝子の発現生成物の生物学的機能を改変するためにスクリーニングが実施される。さらにまた、ある特定の状態におけるある遺伝子の重要性を特定した後、前記遺伝子生成物と結合及び/又は前記の生物活性を調節する物質のスクリーニングを、下記にさらに完全に概略するように実施することができる。
【００５１】
いくつかの実施態様では、スクリーニングは、先ず初めにMFタンパク質と結合することができる候補物質を見つけ出すために設計される。続いて、MFP活性及びSCC表現型を調節する候補物質の能力を判定するアッセイでこれらの物質を用いることができる。当業者には理解されるところであるが、実施することができる多数の異なるアッセイ、すなわち結合アッセイ及び活性判定アッセイが存在する。
いくつかの実施態様では、結合アッセイが実施される。一般的には、精製又は単離MFPが用いられる。前記方法は、MFP及び生物活性を持つ候補物質を一緒にし、さらに前記候補物質とMFPとの結合を決定することを含む。一般的には、MFP又は候補物質は、単離サンプル受容領域を有する固相（例えばマイクロタイタープレート、アレーなど）に拡散できないように結合される。マイクロタイタープレート及びアレーは、少量の試薬及びサンプルを用いて多数のアッセイを同時に実施できるので特に便利である。組成物を結合させる個々の態様は、前記態様が試薬と適合することができ、組成物の活性を維持し、さらに拡散させないかぎり重要ではない。好ましい結合方法には、抗体の使用（抗体は、タンパク質が固相に結合したときにリガンド結合部位又は活性化配列を立体的に封鎖しない）、“粘着性”又はイオン性固相との直接結合、化学的架橋、固相表面でのタンパク質又は物質の合成などが含まれる。タンパク質又は物質の結合に続いて、過剰な未結合物質を洗浄によって除去する。サンプル受容領域は続いてウシ血清アルブミン（BSA）、カゼイン若しくは他の無害なタンパク質又は他の成分とのインキュベーションによって封鎖することができる。
【００５２】
いくつかの実施態様では、MFPは固相に結合され、さらに生物活性をもつ候補物質がアッセイに添加される。また別には、候補物質が固相に結合され、MFPが添加される。新規な結合物質には特異的抗原、化合物ライブラリーのスクリーニングで特定された非天然の結合物質、ペプチド類似体などが含まれる。特に重要なものは、ヒトの細胞に対して低毒性である物質のスクリーニングアッセイである。この目的のために多様なアッセイを用いることができる。前記には、in vitroで標識されるタンパク質-タンパク質結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、タンパク質結合についての免疫アッセイ、機能アッセイ（リン酸化アッセイなど）などが含まれる。
生物活性を有する候補物質とMFPとの結合の決定は多数の方法によって実施できる。好ましい実施態様では、生物活性を有する候補物質が標識され結合は直接的に決定される。例えば、これは、MFPの全て又は一部分を酵素に結合させ、標識（例えば蛍光標識）した候補物質を添加し、過剰な試薬を洗い流し、さらに標識が固相に存在するか否かを決定することによって実施できる。当分野で知られているように種々の封鎖工程及び洗浄工程を利用することができる。
いくつかの実施態様では、成分の１つだけが標識される。例えば、125Iを用いてチロシンの位置で又は蛍光分子団でタンパク質（又はタンパク質性候補物質）を標識することができる。また別には、2つ以上の成分を種々の標識で、例えばタンパク質のために125I及び候補物質のために蛍光分子団標識を用いて標識することができる。
いくつかの実施態様では、生物活性候補物質の結合は競合結合アッセイを用いて決定される。この実施態様では、競合物質はMFPと結合することが判明している結合成分、例えば抗体、ペプチド、結合パートナー、リガンドなどである。ある種の環境下では、生物活性物質と結合成分との間のように競合結合が存在し、結合成分は前記生物活性物質を放逐する。
【００５３】
いくつかの実施態様では、生物活性を有する候補物質が標識される。生物活性候補物質又は競合物質のどちらか、又はその両方が、先ず初めに（それが存在する場合に）結合のために十分な時間タンパク質に添加される。最適活性を促進する任意の温度（典型的には4から40℃）でインキュベーションを実施することができる。インキュベーションの時間は最適な活性のために選択されるが、前記時間はまた迅速な高処理スクリーニングを促進するために最適化することができる。典型的には0.1から1時間で十分であろう。一般的には過剰な試薬は除去されるか又は洗い流される。続いて第二の成分を添加し、標識成分の有無を追跡して結合を表示する。
いくつかの実施態様では、先ず初めに競合物質が添加され、続いて生物活性を有する候補物質が添加される。競合物質の放逐は、前記生物活性候補物質がMFPと結合したこと、したがって前記候補物質がMFPと結合し、さらにMFPの活性を潜在的に調節することができることを示す。この実施態様では、どちらかの成分が標識される。したがって、例えば競合物質が標識される場合、洗浄溶液中の標識の存在は候補物質による置換を示す。また別には、生物活性候補物質が標識される場合は、固相上の標識の存在は置換を示す。
他の実施態様では、生物活性候補物質が先ず初めに添加され、インキュベーション及び洗浄に続いて競合物質が添加される。競合物質による結合が存在しない場合、前記生物活性物質が高親和性でMFPと結合していることを示すことができる。したがって、生物活性候補物質が標識される場合、固相上の標識の存在は、競合物質の結合がないことと合わせて、候補物質はMFPと結合する能力をもつことを示すことができる。
【００５４】
いくつかの実施態様では、前記方法は、MFPの活性を調節することができる生物活性物質を特定するために弁別的なスクリーニングを含む。この実施態様では、前記方法は、MFPと競合物質を第一のサンプル中で混合する工程を含む。第二のサンプルは生物活性候補物質、MFP及び競合物質を含む。競合物質の結合は両サンプルについて決定され、2つのサンプル間の結合の変化又は相違は、MFPと結合することができ、その活性を潜在的に調節することができる物質の存在を示す。すなわち、競合物質の結合が第一のサンプルと比較して第二のサンプルで相違するならば、前記候補物質はMFPと結合することができる。
いくつかの実施態様では、MFPの活性を調節することができる生物活性物質についてスクリーニングする方法が提供される。前記方法は、上記に定義した生物活性候補物質をMFP含有細胞に添加する工程を含む。典型的には、ラミニン-5陰性初代ヒトケラチノサイトが用いられる。前記細胞はまた。MF配列、Ras及びIκBαの安定なNF-κBリプレッサー変異体（すなわちIKB）をコードする組換え核酸を含むことができる（Dajee et al. 2003, Nature 421:630-643）。細胞を培養する方法、並びに細胞分散、粘着及び遊走をアッセイする方法は以下の文献に記載されている：Russel et al. 2003, J. Cell Sci. 116:3543-3556（前記文献は参照により本明細書に含まれる）。
いくつかの実施態様では、候補物質は免疫不全マウスに導入することができる。続いて前記マウスをMFPでチャレンジし、腫瘍の発育をモニターすることができる。例えば、ヒト包皮の異種移植片をもつマウスに1つ又は2つ以上のMFPに対する抗体の腹腔内注射を実施することができる（例えば実施例及び以下の文献を参照されたい：Li et al. EMBO J. 2003, 22:2400-2410）。続いてマウスをRas/IKB形質転換ヒトケラチノサイトでチャレンジし、文献（Dajee et al. 2003, Nature, 421:630-643）に記載されたように腫瘍の増殖及び組織学についてモニターすることができる。
【００５５】
陽性コントロール及び陰性コントロールをアッセイに用いることができる。好ましくは、統計的に有意な結果を得るために全てのコントロール及びテストサンプルを少なくともトリプリケートとして実施する。全てのサンプルのインキュベーションは候補物質とタンパク質の結合に十分な時間実施される。インキュベーションに続いて、全てのサンプルを洗浄して非特異的結合物質を除き、結合した（一般的には標識された）物質の量を決定する。例えば、放射能標識が用いられる場合は、サンプルをシンチレーションカウンターで計測し、結合化合物の量を決定することができる。
その他の種々の試薬をスクリーニングアッセイに加えることができる。前記には、塩に類似する試薬、中性タンパク質（例えばアルブミン）、界面活性剤などが含まれ、これらは、最適なタンパク質-タンパク質結合を促進するため、及び/又は非特異的又はバックグラウンド反応を減少させるために用いることができる。さらにまた、アッセイの有効性を改善する試薬、例えばプロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤なども用いることができる。成分の混合物は、必須の結合を提供する任意の順序で添加することができる。
ある特徴では、アッセイは、生理的シグナルのそれ以前の暴露又はその後の暴露の有無で評価される。前記シグナルには、例えばホルモン、抗体、ペプチド、抗原、サイトカイン、増殖因子、活動電位、薬理学的因子（化学療法剤、照射、発癌物質又は他の細胞（すなわち細胞-細胞接触））が含まれる。別の実施例では、決定は細胞周期の種々の段階で実施される。
【００５６】
２-８医薬組成物
薬理学的活性を有する生物活性な物質は上記に記載したように特定される。本明細書の“薬理学的活性”とは、化合物がMFPの活性を強化するか又はMFPの活性に干渉することができることを意味する。所望の薬理学的活性を有する化合物は生理学的に許容できる担体中で患者に投与することができる。“患者”には人間及び他の動物（特に哺乳動物及び家畜）の両方が含まれる。したがって、本方法は人間の治療及び獣医師の用途の両方に適用することができる。
いくつかの実施態様では、生物活性を有する物質にはMFPを認識し、さらに本明細書に記載したようにSCCを阻害又は調節することが既に示された抗体が含まれる。他の実施態様では、生物活性物質にはアンチセンス組成物が含まれる。これらの物質は直接デリバーするか、又は当分野で周知の適切な担体又は賦形剤とともに医薬組成物としてデリバーすることができる。本発明の治療方法は、MFPの活性又は発現を阻害する化合物又は物質の有効量を治療の必要がある患者に投与することを提供する実施態様を含む。
そのような物質の有効量は、もっとも有効で便利な投与経路及びもっとも適切な製剤と同様に、日常的な実験によって容易に決定することができる。種々の製剤及びドラッグデリバリー系が当分野で利用可能である（例えば以下を参照されたい：Remington's Pharmaceutical Sciences、上掲書）。
適切な投与経路は、例えば経口、直腸、経粘膜、経皮、鼻内、又は腸内投与及び非経口デリバリーを含むことができる。前記非経口デリバリーは、筋肉内、皮下、脊髄内注射の他、クモ膜下腔内、直接脳室内注射、腹腔内、鼻内又は眼内注射を含む。前記物質又はその組成物は全身的態様ではなくむしろ局所に投与することができる。例えば、適切な薬剤は、注射によるか、又は標的に誘導されるドラッグデリバリー系（例えばデポット又は持続放出製剤）でデリバーすることができる。
【００５７】
医薬組成物は、当分野で周知の方法のいずれか、例えば通常の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠製造、ゲル化、乳化、被包化、エントラッピング又は凍結乾燥プロセスによって製造することができる。組成物は、1つ又は2つ以上の生理学的に許容可能な担体（例えば賦形剤）及び補助剤（医薬的使用のために調製物に対し活性分子のプロセッシングを促進する）を含むことができる。適切な製剤は選択される投与経路に左右される。
例えば注射の場合、組成物は、水溶液、好ましくは生理学的に許容できる緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液又は生理的食塩水緩衝液中で製剤化することができる。経粘膜又は鼻内投与の場合、浸透するべき障壁に適した浸透剤が製剤中で用いられる。そのような浸透剤は当分野で知られている。経口投与の場合、薬剤は活性物質を当分野で周知の医薬的に許容できる担体と一緒にすることによって容易に製剤化することができる。そのような担体は、対象者による口からの摂取のために、本発明の物質を錠剤、ピル、ゲル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤化することを可能にする。前記物質はまた、直腸組成物（例えば座薬又は保持浣腸）中で製剤化することができる。前記組成物は、例えば通常の座薬基剤（例えばカカオ脂又は他のグリセリド）を含む。
経口的使用のための医薬調製物は固体の賦形剤中で得ることができる。得られた混合物を場合によってすり潰し、顆粒混合物を加工し、所望の場合は適切な補助剤を添加した後、錠剤又は糖衣錠の核を得ることができる。適切な賦形剤は、特に充填剤、例えば糖（ラクトース、シュクロース、マンニトール又はソルビトールを含む）；セルロース調製物（例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び/又はポリビニルピロリドン（PVP）である。所望される場合は、崩壊剤（例えば架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天又はアルギニン酸若しくはその塩、例えばアルギニン酸ナトリウム）を添加することができる。
【００５８】
糖衣錠の核には適切なコーティングが提供される。この目的のために、濃縮糖溶液を用いることができる。前記濃縮糖溶液は場合によって、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール、及び/又は二酸化チタニウム、ラッカー溶液及び適切な有機溶媒又は溶媒混合物を含むことができる。識別のために、又は活性物質の用量の別個の組合せを特徴付けるために、着色物質または色素を錠剤又は糖衣錠コーティングに添加してもよい。
経口投与のための医薬調製物は、ゼラチンで製造されたプッシュ-フィットカプセルの他に、ゼラチンおよび可塑剤（例えばグリセロール又はソルビトール）で製造された封入軟カプセルを含む。前記プッシュ-フィットカプセルは、充填剤（例えばラクトース）、結合剤（例えばデンプン）及び/又は滑沢剤（例えばタルク又はステアリン酸マグネシウム）及び場合によって安定剤との混合物中に活性成分を含むことができる。軟カプセル中では、前記活性物質は適切な液体（例えば脂肪油、液体パラフィン又は液体ポリエチレングリコール）中に溶解又は懸濁させることができる。さらにまた、安定剤を添加することもできる。経口投与のための全製剤は、そのような投与に適した服用量でなければならない。
吸入による投与の場合、前記物質は、適切な発射薬（例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は任意の他の適切なガス）を使用して、加圧パック又はネブライザーから提供されるエーロゾルスプレーの形態で都合よくデリバーすることができる。加圧エーロゾルの事例では、適切な服用単位は、計測量をデリバーするバルブを提供することによって決定することができる。吸入装置又は注入装置で使用されるカプセル及びカートリッジを製剤化することができる。これらは典型的には、前記物質の粉末混合物及び適切な粉末基剤（例えばラクトース又はデンプン）を含む。
【００５９】
注射、例えばボーラス注射又は持続的輸液による非経口投与のために製剤化された組成物は、単位服用量形で、例えばアンプル又はマルチドース容器で保存料を添加して提供することができる。組成物は、懸濁液、溶液又は油性若しくは水性ベヒクル中のエマルジョンのような形態を有することができ、さらに製剤化のための薬剤、例えば懸濁剤、安定化剤及び/又は分散剤を含むことができる。非経口投与のための製剤は、水溶性の形態で含まれる投与されるべき化合物又は物質の水溶液を含む。
活性物質の懸濁液もまた適切な油性注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒又はベヒクルには、脂肪油（例えばゴマ油）及び合成脂肪酸エステル（例えばオレイン酸エチル又はトリグリセリド）又はリポゾームが含まれる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増す物質（例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストラン）を含むことができる。場合によって、懸濁液はまた、適切な安定剤、又は高濃縮溶液の調製を可能にするために本発明の物質の溶解性を高める薬剤を含むことができる。また別には、活性成分は、適切なベヒクル（例えば発熱物質を含まない滅菌水）で使用前に構成するために粉末形であってもよい。
上記に述べたように、組成物はまたデポット調製物として製剤化することができる。そのような長期作用製剤は、移植（例えば皮下又は筋肉内）によって、又は筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば本発明の物質は、適切なポリマー若しくは疎水性物質（例えば許容可能な油中のエマルジョンとして）、又はイオン交換樹脂を用いて製剤化するか、又は難溶性誘導体として（例えば難溶性塩として）製剤化することができる。
【００６０】
本発明の疎水性分子に適した担体は当分野で周知であり、前記には、例えばベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水に混和性の有機ポリマー及び水相を含む補助溶媒系が含まれる。前記補助溶媒系はVPD補助溶媒系でもよい。VPDは、3%w/vのベンジルアルコール、8%w/vの非極性界面活性剤ポリソルベート80、及び65%w/vのポリエチレングリコール300の溶液であり、無水アルコールで体積が補充されている。VPD補助溶媒系（VPD：5W）は、5%デキストラン水溶液で1：1に稀釈されたVPDから成る。この補助溶媒系は疎水性物質の溶解に有効であり、全身投与に際して毒性が低い。通常は補助溶媒系の割合は、その溶解性及び毒性に関する特徴を破壊することなく顕著に変動させることができる。さらにまた、補助溶媒成分そのものも変動させることができる。例えば、他の毒性の低い非極性界面活性剤をポリソルベート80の代わりに用いてもよく、ポリエチレングリコールの分画サイズを変動させてもよく、他の生体適合性ポリマーをポリエチレングリコールと置き換えてもよく（例えばポリビニルピロリドン）、さらに他の糖又は多糖類をデキストロースと置き換えてもよい。
また別には、疎水性分子のための他のデリバリー系を利用することができる。リポソーム及びエマルジョンは、疎水性薬剤のためのよく知られたデリバリーベヒクル又は担体の例である。リポゾームデリバリー系は、上記の遺伝子デリバリー系の説明の中で考察されている。ある種の有機溶媒、例えばジメチルスルホキシドもまた用いることができるが、ただし通常はより大きな毒性という犠牲を伴う。さらにまた、本発明の物質は持続的放出系を用いてデリバーしてもよい。前記の系は例えば、投与されるべき組成物の有効量を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスである。種々の持続放出材料が確立され、当業者が利用することができる。持続放出カプセルは、それらの化学的性質に応じて数週間から100日までの間、本発明の物質を放出する。治療薬の化学的性質及び生物学的安定性に応じて、タンパク質安定化のためのさらに別の方法を利用することができる。
【００６１】
本明細書で利用される任意の組成物について、治療的に有効な用量は、先ず初めに当分野で周知の種々の技術を用いて概算することができる。例えば、細胞培養アッセイで、細胞培養で決定されるIC50を含む循環濃度範囲を達成する用量を動物モデルで公式化することができる。MFP活性の阻害が所望される場合には、MFP活性の50%最大阻害を達成する試験物質の濃度を決定することができる。人間の対象に対して適切な投薬範囲は、細胞培養アッセイ及び他の動物実験から得られたデータを用いて決定することができる。
ある物質の治療的に有効な量は、対象者での症状の緩和又は生存の延長をもたらす前記物質の量を指す。そのような分子の毒性及び治療的有効性は、標準的な医薬的方法によって細胞培養又は実験動物で、例えばLD50（集団の50%にとって致死的である用量）及びED50（集団の50%で治療的に有効である用量）を決定することによって決定することができる。毒性対治療効果の用量比は治療指標であり、前記はLD50/ ED50比として表すことができる。高い治療指標を示す物質が好ましい。
投薬量は好ましくは、ほとんど又は全く毒性を示さないED50を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられる投薬形態及び利用される投与経路に応じて前記の範囲内で変動させることができる。正確な製剤、投与経路及び投薬量は、当分野で公知の方法にしたがって、対象者の症状を詳細に考慮して選択されるべきである。
【００６２】
MFPの発現又は活性に所望の影響を与えるために十分な、活性成分の血中レベル又は組織レベルを提供するために、投与の量及び間隔は個々に調節することができる（すなわち最小の有効濃度；MEC）。MECは各物質について変動するであろうが、例えば本明細書に記載のアッセイを用いたin vitroのデータ（例えばMFP活性の50−90％阻害を達成するために必要な濃度）から概算することができる。MECを達成するために必要な投薬量は固体の特徴及び投与経路に左右されるであろう。物質又はその組成物は、治療期間の約10−90%、好ましくは治療期間の約30−90%、もっとも好ましくは50−90%の間、血中レベルをMECより高く維持する治療計画を用いて投与されるべきである。局所投与又は選択的取り込みの事例では、本薬剤の有効な局所濃度は血中濃度と相関しなくてもよい。
投与される物質又は組成物の量は、もちろんのこと、多様な因子（治療される対象者の性別、年齢及び体重、疾患の重篤度、投与態様、並びに主治医の判断を含む）に左右されるであろう。
所望の場合、本組成物は、活性成分を含む1つ又は2つ以上の単位投薬形を含むパック又はディスペンサー容器で提供してもよい。そのようなパック又は容器は、例えば金属又はプラスチック薄層（例えばブリスターパック）を含むことができる。前記パック又はディスペンサー容器は投与のための指示を含むことができる。医薬的に適合しうる担体中で製剤化された本発明の物質を含む組成物を製造し、適切な容器に入れ、表示の症状の治療のために標識を付すことができる。前記標識に表示される適切な症状は、疾患又は異常（例えば扁平上皮癌又は他の癌、及びMFPの発現の変化を伴う症状）の治療を含むことができる。
【００６３】
実施例
実施例１：SCC腫瘍におけるG4及び/又はG5ドメインの必要性
ラミニン-5はそのγ2及びα3鎖両方のプロセッシングを受ける。α3鎖は主要なインテグリン結合部位を含むので、我々は更なる実験を実施して、SCC腫瘍の発育に対するα3鎖プロセッシングの機能的影響を調べた。我々は以下の部位で短縮を実施した：1）アミノ酸残基1337（1337Tr）、及び2）アミノ酸残基1450（1450Tr）。ラミニンα3鎖発現を欠く接合部表皮水疱症（JEB）の患者由来のケラチノサイトを、完全長の1450Tr又は1337Tr cDNAを含むLZRSレトロウイルスベクターで形質導入した（Matsui et al. 1998, J. Exp. Med. 187:1237-83）。前記cDNAの各々は、処置されたJEBケラチノサイトにおけるトリマーラミニン-5の発現を回復させ、さらに各cDNAは、ラミニン-α3特異的抗体によるウェスタンブロットで判定したとき、匹敵しえるレベルの分泌ラミニン-5を産生した。ラミニン-5の発現を欠く（LacZ）JEBケラチノサイトは球形であるが、WT、1337Tr及び1450Trを発現するケラチノサイトは扁平化及び拡散を示した。ラミニン-5陰性JEBケラチノサイト（LacZ）は低分裂性であったが、1337Tr及び1450Trは、野生型の分裂と比較して正常な分裂レベルを示した（図5）。
ラミニン-5プロセッシングは遊走と緊密に関連しているので、我々は1337Tr変異体をさらに詳細に調べた（なぜならば、この部位での短縮はin vivoプロセッシングの作用と類似するからである）。我々は、1337Tr細胞は遊走することができることを見出し、実際、1337Tr細胞は、スクラッチアッセイにおいて野生型α3鎖を発現する細胞と比較してより効率的に遊走した（図6）。
我々は以前に、Ras/IKBを過剰発現するヒトケラチノサイトのヌードマウスへのSQ注射から得られるヒトSCCのモデルを記載した（Dajee et al. 2003, Nature 421:639-43）。これらのマウスに組織学的及び生化学的に形成された腫瘍は、ヒトSCC腫瘍に極めて類似していた。我々は、ラミニン-5陰性ケラチノサイトはRas/IKBによる形質転換後に腫瘍を形成する傾向は示さず、ラミニン-5 cDNAのレトロウイルスによる移入は、ラミニン-5の発現を回復させ、これら細胞の腫瘍形成能力も回復させることを示した。これらの結果は、それらが、ラミニン-5の発現はSCCの発育に絶対的に必要であることを示したという点で極めて重要である。
これら腫瘍の実験の延長として、我々は次に、短縮ラミニンα3鎖のSCC発育促進能力について調べた。我々は、a3野生型（WT）、1337Tr又はLacZを発現するJEBケラチノサイトをRas/IKBで形質転換し、SQをヌードマウスに注射した。各条件に付き8匹のマウスを用いる2セットの実験により、我々は、1337Tr a3鎖発現細胞は腫瘍を全く形成せず、LacZ陰性コントロールと極めて類似することを見出した（図7）。さらにまた、1450Tr細胞も、実験は1セットで各条件につき全部で4匹であったが、SCC腫瘍を生じなかった。腫瘍形成を欠くにもかかわらず、注射部位の1337Tr及び1450Tr細胞は、変異体ラミニン-5分子の発現及び細胞外蓄積を示した。これらの結果は、それらが、ラミニン-5のG4-5ドメインがSCC発育に必須であることを示したという点で極めて重要である。
【００６４】
実施例２：G4及び/又はG5 MF配列のクローニング
N-末端配列実験によれば、ラミニンα3鎖は残基1337−1338でプロセッシングされる（Tsubota et al. 2000, Biochem. Biophys. Res. Commun. 278:614-620）。予備的な結果に示されているように、我々は、アミノ酸1337で短縮されたタンパク質をコードするヒトラミニンα3 cDNA（1337Tr）（切断生成物のシュミレーションである）を作製し、さらに1450Tr、アミノ酸1450で短縮されたα3 cDNAもまた作製した。我々は、別のラミニンα3 cDNA（1551Tr）（G5ドメインの開始部近くのアミノ酸1551で短縮されている）を作製することを提唱する。PCRプライマーは、完全長の野生型ラミニンα3 cDNAのヌクレオチド2771からヌクレオチド4653に及ぶ生成物を作製するために設計される。これはラミニンα3 cDNA上の固有のBstII部位を含み（前記部位は、PCR生成物の5'末端に存在する）、さらにNotI部位がPCR生成物の3'側に作出される。pENTR1A(商標)（Invirogen）ゲートウェープラスミド中の完全長ラミニンα3 cDNAをBstII及びNotI酵素で切断し、上記記載のPCR生成物を、ラミニンa3 cDNA中のBstII部位での3'末端連結、及びpENTR1Aマルチクローニング部位での3'末端連結によりベクターに連結する。このクローニング生成物（前記は配列決定によって確認される）は、ラミニンα3鎖アミノ酸1−1551をコードするcDNAを含むであろう。続いて、このラミニンα3 1551Tr cDNAをpENTR1Aプラスミドからゲートウェー順応LSRZレトロウイルスベクターにラムダファージ組換え反応により移動させる。
ラミニンα3Gドメインをコードする3つのcDNA構築物を作製する。G4と称するcDNAはアミノ酸1338から1560をコードし、G5と称するものはアミノ酸1560から1713をコードし、G4-5と称する三番目のものはアミノ酸1338から1713をコードする。我々は、野生型ラミニンα3 cDNAのPCRにより各々を作製する。あるPCR実験では、我々は細菌発現ベクターpGEX（Amersham）でクローニングするために、前記3つのPCR生成物の各々のどちらかの末端にEcoR1テールを作出する。これらの構築物は配列決定によって確認し、続いて細菌発現系で精製されたG4、G5及びG4-5を産生させるために利用する。
別のPCR実験では、G4、G5及びG4/5 PCR生成物の各々の5'側にNheIテールを、3'側にNotIテールを挿入する。これらを哺乳動物発現ベクターpCEPでクローニングする。pCEPはBM40シグナル配列を含み、前記に対してcDNAはNheI制限部位を介してクローニングされる。我々は以前にBM40シグナル配列をこのベクターで使用し、コラーゲンXVIIエクトドメインの分泌促進に成功した（Areida et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:1594-601）。G4、G5及びG4-5を各々pCEPベクターでクローニングし、前記BM40シグナル配列を釣り上げる。続いてBM40シグナル配列及びラミニンα3GドメインのcDNAをKpnI及びNotI制限部位により前記ベクターから取り出し、pENTR1Aゲートウェーベクターに連結する。さらにラムダファージ組換えによって、ラミニンα3GドメインcDNA（それらのBM40シグナル配列を含む）をゲートウェー順応LZRSレトロウイルスプラスミドでクローニングする。
【００６５】
実施例３：SCC腫瘍形成阻害を検出するアッセイ
現時点では、G4-5ドメインがプロセッシングを受けてラミニン-5から分離される前又は後でSCCにおけるその機能を発揮するか否かは明らかではない。我々は、Ras/IKB形質転換1337Trケラチノサイトで、外因性G4-5タンパク質又はG4-5 cDNAを添加することにより腫瘍形成能力を回復させることによってこの問題を調べることを提案する。もしもG4-5タンパク質又はcDNAを与えられた後で、Ras/IKB形質転換1337Trケラチノサイトがヌードマウスで腫瘍を形成することができれば、これはG4-5ドメインが可溶形でSCC腫瘍において活性を有することを示しているであろう。
マトリゲル（前記はその主要な成分の１つとして硫酸ヘパリンプロテオグリカンを含む）が、ヌードマウスの皮下注射時に我々のRas/IKB腫瘍細胞を懸濁させる素材である。ラミニンa3 G4-5ドメインはヘパリン結合特性を有するので（Amano et al. 2000, J. Biol. Chem. 275:22728-35）、G4-5ドメインを100μg/250μLでマトリゲル中に懸濁させ、それをRas/IKB形質転換1337Trケラチノサイトの注射のために土台として使用する。コントロールとしてマトリゲルに懸濁させたラミニンα3G4-5（Aim１に記載したとおり）を用いる。我々は、ラミニンG4-5ドメインは腫瘍細胞周辺のマトリゲルが浸み込んだマトリックスに局在して残留し、マトリックスが腫瘍細胞によって徐々に改造されるにつれてG4-5ドメインはゆっくりと放出されると仮定する。我々は、G4-5ドメイン含有マトリゲルに包埋したRas/IKB処理1337細胞を注射した4匹のマウスでこのことを調べる。G4-5ドメイン特異的抗体によるIDIFによって1週間の間隔で4つの連続生検標本を用い、G4-5ドメインタンパク質が注射/腫瘍部位に存続していることを判定する。
もしもラミニンα3 G4-5ドメインタンパク質が検出され、注射部位に存続していることが示されたならば、ラミニンα3又はラミニンα3 G4-5ドメインのどちらかを含むマトリゲルに包埋したRas/IKB形質転換細胞を注射する第二の実験セットを実施する。これらの細胞をヌードマウスに注射し、4週間にわたって腫瘍の発育について判定する。野生型Ras/IKB形質転換ケラチノサイトを陽性コントロールとして使用し、各条件に付き6匹のマウスを使用する。
【００６６】
また別には、ラミニンG4ドメインのcDNAは、下記で述べるように遺伝子治療によってデリバーすることができる。この技術は、4週間アッセイの期間にわたって1337Tr細胞でのG4-5ドメインの長期的発現を促進するはずである。
ラミニンG4-5ドメインcDNAはLZRSレトロウイルスベクターでクローニングする。LacZ又はラミニンG4-5 cDNA含有レトロウイルスを用いて、1337Trケラチノサイトを感染させる。細胞をブラスチシジンで選別し、Ras/IKBで形質転換し、続いてヌードマウスに注射する。以前に記載されたように（Dajee et al. 2003, Nature 421:639）、各条件に付き6匹のマウスを4週間にわたって判定する。腫瘍はG4/5又はLacZ抗体を用いてIDIFによって分析し、レトロウイルスcDNA生成物の分泌を実証する。
ラミニンα3 G4及びラミニンα3 G5抗体の腫瘍発育に対する影響。G4-5ドメインタンパク質のウェスタンブロット分析によってマウス血清の稀釈でテストしたとき1：1000の循環力価を維持するために十分な抗体を注射する。上記に概略したようにpGEXベクターでクローニングしたラミニンα3 G4、G5及びG4-5ドメインを利用して、G4、G5及びG4-5ドメインの細菌融合タンパク質を生成する。たんぱく質をGSTカラムでアフィニティー精製し、続いてエンテロキナーゼ（Invitrogen）によってGSTタグを除去する。続いて単離したG4及びG5ドメインタンパク質を用いて、ウサギポリクローナル抗血清をジョスマンラブ（Josman Labs, Nappa, CA）で彼らの推奨するプロトコルを用いて作製する。
いったん高力価のポリクローナル抗血清が得られたら、更なるG4、G5及びG4-5タンパク質を製造し、アフィニティー精製し、セファロースCL-4Bカラムにゲル1mLにつき0.5mgタンパク質の濃度で結合させる。G4ポリクローナル抗血清はG4-セファロースカラムでアフィニティー精製し、G5ポリクローナル抗血清はG5-セファロースカラムでアフィニティー精製する。アフィニティー精製したG4、G5及びG4-5抗体をPBSに対して透析し、フィルター滅菌する。最初に、以前に我々が用いた技術（Li et al. 2003, EMBO J., 22:2400-2410）によって、ヒト包皮異種移植片をもつ免疫不全マウスのIP注射によって抗体（G4、G5及びG4-5）を検査する。処置マウスの循環抗体の力価は、尾静脈採血から得られた血清を用いて3日間隔で判定する。注射された抗体の量及び注射の間隔は、1：1000の血清稀釈でウェスタンブロットによってラミンG4-5タンパク質を検出するために十分な力価を維持できるように調節する。臨床的に包皮移植片及びマウスの皮膚を3週間の注射期間にわたって判定し、表皮の分離が認められるか否かを決定し、さらにマウスを死体解剖して調べ、粘膜又は内部器官の一切の上皮脱落を検出する。
いったん適切な抗体用量及び注射の間隔が得られ、さらにマウスが抗体注射に耐えることができたら、我々は、Ras/IKB野生型ケラチノサイト由来腫瘍の抗体による阻害の実施を続ける。これらの実験では、ヌードマウスに周期的なG4、G5及びG4-5抗体注射を実施し、上記に記載したように一定の循環抗体力価を維持する。いったん抗体力価が開始したら、続いてマウスにRas/IKB形質転換ヒトケラチノサイトのSC注射を実施する。各々6匹を含む３つのグループを、アフィニティー精製ラミニンa3 G4抗体、ラミニンa3 G5抗体又はマウスIgGを用いて調べる。Gドメイン抗体の状態を腫瘍増殖及び腫瘍の組織学について以前に記載（Dajee et al. 2003, Nature 421:639-43）したように分析する。
前述の記載は具体的な実施態様について提供したが、これらの実施態様は単に例示の態様で提供されたことは理解されるべきである。他の態様も類推され、さらに前述のものと異なるが、本明細書及び特許請求の範囲に記載された本発明の範囲から逸脱しない変形も実施できることは予想される。本明細書に引用した全ての特許出願、特許及び参考文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる。対立及び矛盾がある場合は、定義を含み本記載が優先する。
本発明の特徴は以下の図面を参照してより完全に理解することができる。図面では同じ成分は同じ番号で示される。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図1Aは、ラミニン5のアルファ3鎖のG4（1）及びG5（2）ドメインを示す略図を提供する。前記は骨形態発生タンパク質-1（BMP-1）のための切断認識部位（1a、1b、1c）を含む。図1Bは、G4ドメインから生成することができる遊走促進タンパク質（MFP）の例示的実施態様を示す。図1Cは、G5ドメインから生成することができる遊走促進タンパク質（MFP）の例示的実施態様を示す。図1Dは、G4及びG5ドメインの両ドメインに存在するアミノ酸を含む、生成することができる遊走促進タンパク質（MFP）の例示的実施態様を示す。
【図２】図2A-１、2A-2はGenBankアクセッション番号L34156（配列番号:1）を示す。図2Bは、ホモサピエンスのラミニン関連タンパク質のアミノ酸配列（LAMA3；GenBank アクセッション番号L34156；配列番号:2）を示す。図2C-1−2C-4は、ホモサピエンスラミニン、アルファ3転写物変種1のポリヌクレオチド配列（LAMA3；GenBank NM_198129；配列番号:3）を示す。図2D-1−2D-2は、ホモサピエンスラミニン、アルファ3転写物変種1のアミノ酸配列（LAMA3；GenBank NM_198129；配列番号:4）を示す。図2E-1−2E-2は、ホモサピエンスラミニン、アルファ3転写物変種2のポリヌクレオチド配列（LAMA3；GenBank NM_000227；配列番号:5）を示す。図2Fは、ホモサピエンスラミニン、アルファ3転写物変種2のアミノ酸配列（LAMA3；GenBank NM_000227；配列番号:6）を示す。図2G-1−2G-2は、ラッツス・ノルヴェギクス（Rattus norvegicus）のラミニン5アルファ3のポリヌクレオチド配列（LAMA3；GenBank NM_173306；配列番号:7）を示す。図2Hは、ラッツス・ノルヴェギクス（Rattus norvegicus）のラミニン5アルファ3のアミノ酸配列（LAMA3；GenBank NM_173306；配列番号:8）を示す。図2I-1−2I-3は、ムス・ムスクルス（Mus musculus）のラミニン、アルファ3のポリヌクレオチド配列（LAMA3；GenBank XM14051；配列番号:9）を示す。図2Jは、ムス・ムスクルス（Mus musculus）のラミニン、アルファ3のアミノ酸配列（LAMA3；GenBank XM14051；配列番号:10）を示す。
【図３】図3Aは、合体させたG4及びG5ドメインの例示的ホモサピエンスアミノ酸配列（配列番号:11）を示す。図3Bは、合体させたG4及びG5ドメインの例示的ホモサピエンスポリヌクレオチド配列（配列番号:12）を示す。図3Cは、G5ドメインの例示的ホモサピエンスアミノ酸配列（配列番号:13）を示す。図3Dは、G5ドメインの例示的ホモサピエンスポリヌクレオチド配列（配列番号:14）を示す。図3Eは、アミノ酸1356からアミノ酸1366で区切られたG4サブドメインの例示的ホモサピエンスのアミノ酸配列（配列番号:15）を示す。図3Fは、ヌクレオチド4067からヌクレオチド4099で区切られたG4サブドメインの例示的ホモサピエンスポリヌクレオチド配列（配列番号:16）を示す。図3Gは、アミノ酸1375からアミノ酸1390で区切られたG4サブドメインの例示的ホモサピエンスのアミノ酸配列（配列番号:15）を示す。図3Hは、ヌクレオチド4127からヌクレオチド4171で区切られたG4サブドメインの例示的ホモサピエンスポリヌクレオチド配列（配列番号:18）を示す。図3Iは、アミノ酸1399からアミノ酸1592で区切られたG4サブドメインの例示的ホモサピエンスのアミノ酸配列（配列番号:19）を示す。図3Jは、ヌクレオチド4196からヌクレオチド4588で区切られたG4サブドメインの例示的ホモサピエンスポリヌクレオチド配列（配列番号:20）を示す。図3Kは、アミノ酸1399からアミノ酸1713で区切られたG4とG5ドメインに広がるポリペプチドの例示的ホモサピエンスアミノ酸配列（配列番号:21）を示す。図3Lは、ヌクレオチド4196からヌクレオチド5140で区切られたG4とG5ドメインに広がるポリヌクレオチドの例示的ホモサピエンスポリヌクレオチド配列（配列番号:22）を示す。図3Mは、アミノ酸1560からアミノ酸1713で区切られたG5ドメインに広がるポリペプチドの例示的ホモサピエンスアミノ酸配列（配列番号:24）を示す。図3Nは、ヌクレオチド4679からヌクレオチド5140で区切られたG5ドメインに広がるポリヌクレオチドの例示的ホモサピエンスポリヌクレオチド配列（配列番号:26）を示す。
【図４】図4は、正常なヒトの上皮細胞及びSCCの上皮由来腫瘍細胞を示す。
【図５】図5は、野生型細胞とラミニン-5アルファ3鎖の切端型で形質転換したケラチノサイトと比較した遊走アッセイの結果を示す。
【図６】図6はスクラッチアッセイを示す。このアッセイでは、G4及びG5ドメインを欠く細胞（すなわち1337TR）は野生型ラミニン-5アルファ3鎖を発現する細胞よりも効果的に遊走する。
【図７】図7はヒトSCCのマウスモデルを示す。左の写真は、野生型ラミニン-5アルファ3鎖で形質転換されたRAS/IKBケラチノサイトで形質転換されたヌードマウスにおける腫瘍形成を示す。中央及び右の写真は、RAS/IKBラミニン-5陰性ケラチノサイト（右写真）又はG4及びG5ドメインを欠くラミニン-5構築物（中央写真）で形質転換されたヌードマウスではSCC腫瘍は形成されないことを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ−１】
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【図２Ｃ−２】
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【図２Ｃ−３】
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【図２Ｃ−４】
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【図２Ｄ−１】
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【図２Ｄ−２】
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【図２Ｅ−１】
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【図２Ｅ−２】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ−１】
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【図２Ｇ−２】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ−１】
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【図２Ｉ−２】
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【図２Ｉ−３】
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【図２Ｊ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【図３Ｍ】
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【図３Ｎ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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