(57)【要約】  本発明は、移植のための臓器、特に心臓の保存、灌流、及び/又は再灌流のための溶液に関する。前記溶液は、プロテインキナーゼCβII(PKCβII)及び/又はプロテインキナーゼCζ(PKCζ)のペプチドインヒビター、並びに/あるいはプロテインキナーゼCδのペプチドアクチベーターを含有する。本発明の溶液を使用する方法も開示され、移植のために臓器を保存するため、損傷から虚血臓器を保護するため、虚血後の臓器の機能不全を緩和するため、窒素酸化物の放出を維持及び/又は虚血臓器における超酸化物放出を阻害するため、並びに循環系から単離された際に損傷から臓器を保護するための方法を含む。
2008526987.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテインキナーゼCβII(PKCβII)の少なくとも１つのペプチドインヒビター、及び/又はプロテインキナーゼCζ(PKCζ)の少なくとも１つのペプチドインヒビター、及び/又はPKCδの少なくとも１つのペプチドアクチベーターを含む、臓器保存のための灌流、保存、及び/又は再灌流のための溶液。
【請求項２】
前記ペプチドインヒビターが生理食塩水溶液に溶解されている、請求項１に記載の溶液。
【請求項３】
塩化カリウムを更に含む、請求項１に記載の溶液。
【請求項４】
前記PKCβIIの少なくとも１つのペプチドインヒビターが配列番号１である、請求項１に記載の溶液。
【請求項５】
前記PKCδの少なくとも１つのペプチドアクチベーターが配列番号３である、請求項１に記載の溶液。
【請求項６】
前記PKCζの少なくとも１つのペプチドインヒビターが、配列番号２及びGo6983からなる群から選択される、請求項１に記載の溶液。
【請求項７】
前記PKCβIIの少なくとも１つのペプチドインヒビターの濃度が約5から10μMである、請求項１に記載の溶液。
【請求項８】
前記PKCδの少なくとも１つのペプチドアクチベーターの濃度が約5から10μMである、請求項１に記載の溶液。
【請求項９】
前記PKCζの少なくとも１つのペプチドインヒビターの濃度が約2.5から5μMである、請求項１に記載の溶液。
【請求項１０】
前記臓器が心臓である、請求項１に記載の溶液。
【請求項１１】
前記臓器が哺乳動物の臓器である、請求項１に記載の溶液。
【請求項１２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１１に記載の溶液。
【請求項１３】
前記臓器が移植のために保存されている、請求項１に記載の溶液。
【請求項１４】
前記ペプチドインヒビター/アクチベーターがミリストイル化されている、請求項１に記載の溶液。
【請求項１５】
臓器に請求項１に記載の溶液を灌流する工程を含む、移植のために臓器を保存する方法。
【請求項１６】
前記ペプチドインヒビター/アクチベーターが生理食塩水に溶解されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
塩化カリウムを更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記PKCβIIの少なくとも１つのペプチドインヒビターが配列番号１である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記PKCδの少なくとも１つのペプチドアクチベーターが配列番号３である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記PKCζの少なくとも１つのペプチドインヒビターが、配列番号２及びGo6983からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記PKCβIIの少なくとも１つのペプチドインヒビターの濃度が約5から10μMである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記PKCδの少なくとも１つのペプチドアクチベーターの濃度が約5から10μMである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記PKCζの少なくとも１つのペプチドインヒビターの濃度が約2.5から5μMである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記臓器が心臓である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記臓器が哺乳動物の臓器である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記臓器が移植のために保存されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ペプチドインヒビター/アクチベーターがミリストイル化されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１に記載の溶液に前記臓器を浸す工程を更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項３０】
前記灌流工程が、約20mL/分未満の速度で実施される、請求項１５に記載の方法。
【請求項３１】
前記灌流工程が、約1mL/分の速度で実施される、請求項１５に記載の方法。
【請求項３２】
前記灌流工程が逆行性灌流である、請求項１５に記載の方法。
【請求項３３】
前記灌流工程が約５分続く、請求項１５に記載の方法。
【請求項３４】
臓器に請求項１に記載の溶液を灌流する工程を含む、損傷から虚血臓器を保護するための方法。
【請求項３５】
前記ペプチドインヒビター/アクチベーターが生理食塩水溶液に溶解されている、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
塩化カリウムを更に含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記PKCβIIの少なくとも１つのペプチドインヒビターが配列番号１である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記PKCδの少なくとも１つのペプチドアクチベーターが配列番号３である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
PKCζの少なくとも１つのペプチドインヒビターが、配列番号２及びGo6983からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記PKCβIIの少なくとも１つのペプチドインヒビターの濃度が約5から10μMである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
前記PKCδの少なくとも１つのペプチドアクチベーターの濃度が約5から10μMである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
前記PKCζの少なくとも１つのペプチドインヒビターの濃度が約2.5から5μMである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
前記臓器が心臓である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４４】
前記臓器が哺乳動物の臓器である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４５】
前記哺乳動物がヒトである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記臓器が移植のために保存されている、請求項３４に記載の方法。
【請求項４７】
前記ペプチドインヒビター/アクチベーターがミリストイル化されている、請求項３４に記載の方法。
【請求項４８】
請求項１に記載の溶液に前記臓器を浸す工程を更に含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４９】
前記灌流工程が、約20mL/分未満の速度で実施される、請求項３４に記載の方法。
【請求項５０】
前記灌流工程が、約1mL/分の速度で実施される、請求項３４に記載の方法。
【請求項５１】
前記灌流工程が逆行性灌流である、請求項３４に記載の方法。
【請求項５２】
前記灌流工程が約5分続く、請求項３４に記載の方法。
【請求項５３】
臓器に請求項１に記載の溶液を灌流する工程を含む、虚血後の臓器機能不全を緩和するための方法。
【請求項５４】
前記ペプチドインヒビター/アクチベーターが生理食塩水溶液に溶解されている、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
塩化カリウムを更に含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記PKCβIIの少なくとも1つのペプチドインヒビターが配列番号１である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記PKCδの少なくとも1つのペプチドアクチベーターが配列番号３である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記PKCζの少なくとも1つのペプチドインヒビターが、配列番号２及びGo6983からなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
前記PKCβIIの少なくとも1つのペプチドインヒビターの濃度が約5から10μMである、請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
前記PKCδの少なくとも1つのペプチドアクチベーターの濃度が約5から10μMである、請求項５３に記載の方法。
【請求項６１】
前記PKCζの少なくとも1つのペプチドインヒビターの濃度が約2.5から5μMである、請求項５３に記載の方法。
【請求項６２】
前記臓器が心臓である、請求項５３に記載の方法。
【請求項６３】
前記臓器が哺乳動物の臓器である、請求項５３に記載の方法。
【請求項６４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記臓器が移植のために保存されている、請求項５３に記載の方法。
【請求項６６】
前記ペプチドインヒビター/アクチベーターがミリストイル化されている、請求項５３に記載の方法。
【請求項６７】
請求項１に記載の溶液に前記臓器を浸す工程を更に含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項６８】
前記灌流工程が、約20mL/分未満の速度で実施される、請求項５３に記載の方法。
【請求項６９】
前記灌流工程が、約1mL/分の速度で実施される、請求項５３に記載の方法。
【請求項７０】
前記灌流工程が逆行性灌流である、請求項５３に記載の方法。
【請求項７１】
前記灌流工程が約5分続く、請求項５３に記載の方法。
【請求項７２】
臓器に請求項１に記載の溶液を灌流する工程を含む、虚血臓器における窒素酸化物放出を維持するための方法。
【請求項７３】
前記ペプチドインヒビター/アクチベーターが生理食塩水溶液に溶解している、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
塩化カリウムを更に含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記PKCβIIの少なくとも1つのペプチドインヒビターが配列番号１である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
前記PKCδの少なくとも1つのペプチドアクチベーターが配列番号３である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
前記PKCζの少なくとも1つのペプチドインヒビターが、配列番号２及びGo6983からなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７８】
前記PKCβIIの少なくとも1つのペプチドインヒビターの濃度が約5から10μMである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７９】
前記PKCδの少なくとも1つのペプチドアクチベーターの濃度が約5から10μMである、請求項７２に記載の方法。
【請求項８０】
前記PKCζの少なくとも1つのペプチドインヒビターの濃度が約2.5から5μMである、請求項７２に記載の方法。
【請求項８１】
前記臓器が心臓である、請求項７２に記載の方法。
【請求項８２】
前記臓器が哺乳動物の臓器である、請求項７２に記載の方法。
【請求項８３】
前記哺乳動物がヒトである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記臓器が移植のために保存されている、請求項７２に記載の方法。
【請求項８５】
前記ペプチドインヒビター/アクチベーターがミリストイル化されている、請求項７２に記載の方法。
【請求項８６】
請求項１に記載の溶液に前記臓器を浸す工程を更に含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項８７】
前記灌流工程が、約20mL/分未満の速度で実施される、請求項７２に記載の方法。
【請求項８８】
前記灌流工程が、約1mL/分の速度で実施される、請求項７２に記載の方法。
【請求項８９】
前記灌流工程が逆行性灌流である、請求項７２に記載の方法。
【請求項９０】
前記灌流工程が約5分続く、請求項７２に記載の方法。
【請求項９１】
臓器に請求項１に記載の溶液を灌流する工程を含む、循環系から単離された後に損傷から臓器を保護するための方法。
【請求項９２】
前記ペプチドインヒビター/アクチベーターが生理食塩水溶液に溶解されている、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
塩化カリウムを更に含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
前記PKCβIIの少なくとも1つのペプチドインヒビターが配列番号１である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９５】
前記PKCδの少なくとも1つのペプチドアクチベーターが配列番号３である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９６】
前記PKCζの少なくとも1つのペプチドインヒビターが、配列番号２及びGo6983からなる群から選択される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９７】
前記PKCβIIの少なくとも1つのペプチドインヒビターの濃度が約5から10μMである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９８】
前記PKCδの少なくとも1つのペプチドアクチベーターの濃度が約5から10μMである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９９】
前記PKCζの少なくとも1つのペプチドインヒビターの濃度が約2.5から5μMである、請求項９１に記載の方法。
【請求項１００】
前記臓器が心臓である、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０１】
前記臓器が哺乳動物の臓器である、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記臓器が移植のために保存されている、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ペプチドインヒビター/アクチベーターがミリストイル化されている、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０５】
請求項１に記載の溶液に前記臓器を浸す工程を更に含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０６】
前記灌流工程が、約20mL/分未満の速度で実施される、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０７】
前記灌流工程が、約1mL/分の速度で実施される、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０８】
前記灌流工程が逆行性灌流である、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０９】
前記灌流工程が約5分続く、請求項９１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移植のための臓器、特に心臓の保存、灌流、及び/又は再灌流のための溶液に関する。前記溶液は、プロテインキナーゼCベータII(PKC βII)及び/又はプロテインキナーゼCゼータ(PKC ζ)のペプチドインヒビター、並びに/あるいはプロテインキナーゼCデルタ(PKC δ)のペプチドアクチベーターを含有する。
【背景技術】
【０００２】
臓器移植の成功は、虚血/再灌流障害によって多くの場合に制限される。4時間より長く酸素が与えられなかった単離されたヒトの心臓は、次第に活力を失くし、多くの場合には受容者において生存しない。腎臓、肝臓、膵臓、及び肺のような他の臓器も、移植の前にそれらの受容者から除去される際に、組織及び細胞が損傷を受ける。当該損傷は、低酸素性の条件、並びに生理的濃度の酸素及び栄養を通常は送達し、臓器の細胞によって生産される毒性の化合物を除去する循環の欠失によるものである。臓器移植は、それらの受容者から切除した直後に実施される際に、より高い成功率を有する。
【０００３】
最近の進歩は、臓器移植、及び心臓バイパス手術のような臓器手術の成功率を増大している。第1の進歩には、臓器保存溶液及び臓器灌流溶液が含まれる。第2の進歩は、臓器に対する臓器灌流溶液の送達のための方法及び装置の改善である。
【０００４】
短期間の心筋層の保存は、現在では、心筋保護下の心停止後に低温保存することによって為されている。しかしながら、使用される溶液の組成、保存温度、及び投与プロトコルが異なる各種の方法が存在する。心臓の停止及び保存のための各種の溶液が、心臓手術において心筋層を保護するために開発されている。これらの溶液の例としては、クレープス（クレブス）‐ヘンゼライト(Krebs-Henseleit)溶液、UW溶液、St. Thomas II溶液、Collins溶液、及びStanford溶液が含まれる(例えば米国特許第4,798,824号及び第4,938,961号；Southard and Belzer, Ann. Rev. Med. 46:235-247 (1995); 及びDonnelly and Djuric, Am. J. Hosp. Pharm. 48:2444-2460 (1991)参照)。それにもかかわらず、臓器拒絶反応が、切除時と受容者における血流の回復時との間における移植臓器の状態の劣化によって未だに存在する。
【０００５】
血流の回復は、例えば移植の間に長期の虚血状態に曝された臓器組織の治療のための主要な目標である。しかしながら、血流の再灌流は、内皮及びミオサイトの損傷を誘導し、臓器の機能不全を生じさせる(Buerke et al., Am J Physiol 266: H128- 136,1994; Lucchesi and Mullane, Ann Rev Pharmacol Toxicol 26: 2011-2024、1986; 及びLucchesi et al., J Mol Cell Cardiol 21: 1241-1251, 1989)。再灌流障害に関連して、続いて起こる現象は、再灌流後の始めの2.5-5分内における窒素酸化物(NO)の基礎的な内皮細胞による放出の低減によって特徴付けられる内皮の機能不全によって開始される(Tsao and Lefer, Am J Phyiol 259: H1660-1666, 1990)。内皮に由来するNOにおける低減は、内皮及び多形核(PMN)白血球細胞膜に対する接着分子によるアップレギュレーションに関連する(Ma et al., Circ Res 72: 403-412, 1993; and Weyrich et al., J Leuko Biol 57: 45-55, 1995)。この現象は、再灌流後の10から20分に生じるPMN/内皮相互作用を促進し、その後に続いて心筋層へのPMNの浸潤が再灌流後30分に認められる(Lefer and Hayward, In The Role of Nitric Oxide in Ischemia-Reperfusion: Contemporary Cardiology, Loscalzo et al. (Eds.), Humana Press, Totowa, NJ, pp. 357-380, 2000; Lefer and Lefer, Cardiovasc Res 32: 743-751, 1996; Tsao et al., Circulation 82.1402-1412, 1990; and Weyrich et al., J Leuko Biol 57: 45-55, 1995)。
【０００６】
再灌流された組織及び血漿因子から放出された走化性物質は、PMNを活性化して細胞毒性物質(すなわちアニオン超酸化物)のPMNによる放出を増大し、虚血/再灌流後の組織機能不全の原因となる(Lucchesi et al. JMol Cell Cardiol 21: 1241-1251, 1989; Ma et al., Circ Res 69: 95-106, 1991; Tsao et al., Circulation 82: 1402-1412, 1990; and Tsao et al., Am Heart J 123: 1464- 1471, 1992)。超酸化物はNOと結合して過酸化窒素アニオンを生じ、かくしてNOのバイオアベイラビリティーを低減させ、心筋層の虚血/再灌流後の内皮の機能不全及びPMNの浸潤を促進する(Clancey et al., J Clin Invest 90: 1116-1121, 1992; Hansen, Circulation 91 : 1872-85, 1995; Lucchesi et al., JMoI Cell Cardiol 21: 1241-1251, 1989; Rubanyi and Vanhoutte, Am J Physiol 250: H815-821, 1986; Tsao et al, Am Heart J 123: 1464-1471, 1992; and Weiss, New Eng J Med 320: 365-375, 1989)。
【特許文献１】米国特許第4,798,824号
【特許文献２】米国特許第4,938,961号
【非特許文献１】Southard and Belzer, Ann. Rev. Med. 46:235-247 (1995)
【非特許文献２】Donnelly and Djuric, Am. J. Hosp. Pharm. 48:2444-2460 (1991)
【非特許文献３】Buerke et al., Am J Physiol 266: H128- 136,1994
【非特許文献４】Lucchesi and Mullane, Ann RevPharmacol Toxicol 26: 2011-2024, 1986
【非特許文献５】Lucchesi et al., J Mol Cell Cardiol 21: 1241-1251, 1989
【非特許文献６】Tsao and Lefer, Am J Phyiol 259: H1660-1666, 1990
【非特許文献７】Ma et al., Circ Res 72: 403-412, 1993
【非特許文献８】Weyrich et al., J Leuko Biol 57: 45-55, 1995
【非特許文献９】Lefer and Hayward, In The Role of Nitric Oxide in Ischemia-Reperfusion: Contemporary Cardiology, Loscalzo et al. (Eds.), Humana Press, Totowa, NJ, pp. 357-380, 2000
【非特許文献１０】Lefer and Lefer, Cardiovasc Res 32: 743-751, 1996
【非特許文献１１】Tsao et al., Circulation 82.1402-1412, 1990
【非特許文献１２】Ma et al., Circ Res 69: 95-106, 1991
【非特許文献１３】Tsao et al., Am Heart J 123: 1464- 1471, 1992
【非特許文献１４】Clancey et al., J Clin Invest 90: 1116-1121, 1992
【非特許文献１５】Hansen, Circulation 91 : 1872-85, 1995
【非特許文献１６】Rubanyi and Vanhoutte, Am J Physiol 250: H815-821, 1986
【非特許文献１７】Weiss, New Eng J Med 320: 365-375, 1989
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、血流の回復後に臓器が正常な機能を取り戻すように、移植のための臓器の保存期間を延長し、虚血後の再灌流障害から組織を保護し得る品質が改善された溶液の必要性が未だに存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、プロテインキナーゼCβII(PKCβII)及び/又はプロテインキナーゼCζ（PKCζ)のペプチドインヒビター、並びに/あるいはプロテインキナーゼCδ(PKCδ)のペプチドアクチベーターを含有する、臓器、特に心臓の保存、灌流、及び/又は再灌流のための溶液を提供する。前記溶液は、臓器が循環系から単離されるか、又は低減された血流(虚血)に曝される間に、損傷から臓器組織及び細胞を保護する。本発明者は、PKCβII及び/又はPKCζのペプチドインヒビター、並びに/あるいはPKCδのペプチドアクチベーターが、NOの放出を向上するか、又は内皮/PMN超酸化物の放出を阻害して、虚血/再灌流を経た臓器における保護効果を奏し得ることを発見した。
【０００９】
1つの実施態様では、前記溶液は、約5-10μMのPKCβIIのペプチドインヒビター、及び/又は約2.5-5μMのPKCζのペプチドインヒビター、及び/又は5-10μMのPKCδのペプチドアクチベーターを生理食塩水溶液に溶解させて含有する。
【００１０】
本発明の溶液は、再灌流溶液又は保存溶液として使用し得る。再灌流溶液としては、臓器の脈管構造に供給されて、臓器組織及び細胞を保護する。保存溶液としては、臓器を浸すバス溶液として役立つ。好ましくは、前記臓器は本発明の溶液で灌流され、浸される。さらに、本発明の溶液は、虚血後の臓器への血流の回復に対する再灌流溶液としても役立つ。
【００１１】
本発明は、本発明の溶液を使用する方法も含む。当該方法は、損傷から虚血臓器を保護するための、虚血後の臓器の機能不全を緩和するための、虚血組織における窒素酸化物放出を維持するための、並びに循環系から単離した際に損傷から臓器を保護するための、移植臓器の保存方法を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、臓器、特に心臓の保存、灌流、及び/又は再灌流のための溶液を提供する。前記溶液は、プロテインキナーゼCβII(PKCβII)及び/又はプロテインキナーゼCζ(PKCζ)のペプチドインヒビター、並びに/あるいはPKCδのペプチドアクチベーターを含有する。好ましくは、前記PKCβIIのペプチドインヒビター又はPKCδのペプチドアクチベーターは、約5-10μMの量で溶液中に存在し、PKCζのペプチドインヒビターは約2.5-5μMの量で存在する。
【００１３】
好ましい実施態様では、前記PKCβIIのペプチドインヒビターは配列番号１のアミノ酸配列を有し、前記PKCζのペプチドインヒビターは配列番号２のアミノ酸配列を有し、前記ペプチドアクチベーターは配列番号３のアミノ酸配列を有する。また、他の実施態様では、前記ペプチドインヒビター/アクチベーターがミリストイル化されて、臓器の細胞に吸収されやすくされていることが好ましい。
【００１４】
好ましい実施態様では、前記ペプチドインヒビター又はペプチドアクチベーターは、生理食塩水溶液、好ましくは通常の生理食塩水(0.9% NaCl)に溶解されていることが好ましい。前記ペプチドインヒビターは、Krebs- Henseleit溶液、UW溶液、St. Thomas II 溶液、Collins溶液、及びStanford溶液等のような既知の保存溶液に溶解されても良い。前記溶液は、ナトリウム(Na+)、カリウム(K+)、カルシウム(Ca+)、マグネシウム(Mg+)、グルタメート、アルギニン、アデノシン、マニトール、アロプリノール、グルタチオン、ラフィノース、及びラクトビオン酸を、各々約4-7mM、約0.2-0.3mM、約108-132mM、約13-16mM、約18-22mM、約2-4mM、約0.5-1M、約27-33mM、約0.9-1.1mM、約2.7-3.3mM、約25-35mM、及び約80-120mMの濃度で含有しても良い。Na+はNaClの形態であって良く、K+はKCl及び/又はKH2PO4の形態で、最も好ましくは2-3.5mM KClと2-3.5mM KH2PO4の比率であって良く、Ca+はCaCl2の形態であって良く、Mg2+はMgCl2の形態であって良い。好ましくは、前記溶液は約7.2-7.4という生理的なpHに維持される。
【００１５】
本発明の溶液は、(1)提供者からの臓器の単離(心停止用溶液)；(2)臓器の保存(温熱保存/移植)；並びに(3)受容者における臓器の再移植(再灌流溶液)を含むが、それらに限らない、臓器、特に心臓の移植のいかなる段階の間にも使用されて良い。特に心臓の灌流又は再灌流の間に、約1mL/minの速度で5分間、臓器に灌流するのが好ましい。灌流速度は変化して良いが、約25mL/minを越えるべきではない。概して、灌流速度は、臓器の脈管構造に対して過度の圧力をかけるほど高くあるべきではない。
【００１６】
本発明の溶液は、(1)前記ペプチドインヒビター及び各種の構成成分を蒸留水に溶解又は希釈する工程；(2)例えばNaOHを使用して、pHを約7.2-7.4に調節する工程；及び(3)例えば0.2μmフィルターで濾過することによって、前記溶液を滅菌する工程、によって調製されて良い。次いで、滅菌溶液を環境中の汚染物質から隔離した状態にする。
【００１７】
更なる記載なしで、これまでの記載及び以下の実施例を用いて、当業者は本発明の化合物を製造及び利用し、特許請求の範囲に記載の方法を実施することが可能であると解される。以下の実施例を、本発明を説明するために挙げる。本発明は、当該実施例に記載の特定の条件又は部分に限定されるべきではないと解されるべきである。
【実施例】
【００１８】
（実施例１−PKCζのペプチドインヒビターの効果）
オスのSprague Dawleyラット(275-325 g, Ace Animals, Boyertown, PA)を、60mg/kgのペントバルビタルナトリウム(腹腔内)で麻酔した。ナトリウムヘパリン(1000U)も腹腔内に投与した。心臓を迅速に切除し、上行大動脈にカニューレを挿入し、80mmHgの定圧で37℃に維持した修飾Krebs緩衝液を使用して心臓の逆行性灌流を開始した。前記Krebs緩衝液は、以下の組成(mmol/l)：17 デキストロース、120 NaCl、25 NaHCO3、2.5 CaCl2、0.5 EDTA、5.9 KCl、及び1.2 MgCl2を有した。前記灌流液は、95% O2及び5% CO2で通気し、7.3-7.4のpHに平衡させた。心臓流入カニューレの近位に位置する灌流ラインの2つのサイドアームが、PMN、PKCζペプチドインヒビターを含まない血漿(対照の心臓)、又は各種の濃度のPKCζペプチドインヒビター(1、2.5、又は5μM)を含有する血漿を、心臓流入ラインに直接注入することを可能にした。心臓流入を流量計によって観察した((T 106, Transonic System, Inc., Ithaca, NY))。左心室の空洞に配置した圧力トランスデューサを使用してLVDP及び+dP/dtmaxを観察した(SPR-524, Millar Instruments, Inc., Houston, TX)。37℃に維持した160mLのKrebs緩衝液を含有するウォータージャケット式容器に心臓を浸した。Powerlab Station acquisition system(ADInstruments, Grand Junction, CO)をコンピューターと組み合わせて使用して、心臓流入、LVDP、及び+dP/dtmaxを記録した。
【００１９】
LVDP、+dP/dtmax、及び心臓流入を15分の間、5分毎に測定し、心臓を平衡化してベースラインの測定を得た。左心室収縮末期圧から左心室拡張末期圧を引いたものとして、LVDPを規定した。15分後、Krebs緩衝液の流入を20分間、0に低減して、広範囲に虚血状態を誘導した。再灌流時に、5分間、5mLのKrebs緩衝液に再懸濁した200×106PMNと5mLの血漿を1mL/minの速度で心臓に注入させた。幾つかの実験では、PKCζペプチドインヒビター(Genemed Synthesis, Inc., San Francisco, CA)を終濃度1、2.5、又は5μMで血漿に添加した。偽I/R心臓は虚血状態に曝さず、PMNで灌流しなかった。
【００２０】
単離して灌流したラットの心臓の以下の群を使用した。
【００２１】
第１群：偽虚血/再灌流(I/R)心臓は、虚血状態に曝さず、PMNで灌流しなかったが、灌流が始まって35分(15分のベースライン記録＋20分の虚血というI/R心臓が5mLの血漿を与えられるであろう時点と同じ)で5mLの血漿(1mL/min)で灌流した。これらの心臓は対照群を表わし、単離したラットの心臓がLVDP及び+dP/dtmaxを80分のプロトコルを通じて維持しうるかどうか測定した(n=6)。
【００２２】
第２群：偽I/R+PKCζペプチドインヒビター(5μM)心臓を虚血状態に曝さず、PMNで灌流しなかった。これらの心臓に、灌流から35分でPKCζペプチドインヒビター(5μM、H2O中の5mMストックから血漿に溶解した)を投与した。この群を利用して、PKCζペプチドインヒビターが強心性又は心臓抑制性の効果を生じさせるかを測定した(n=6)。
【００２３】
第３群：I/R心臓は、20分の虚血に曝し、再灌流の最初の5分間、5mLの血漿(1mL/min)で灌流したが、PMNで灌流しなかった。これらの心臓は対照群を表わし、再灌流へと続く20分の虚血が心臓を気絶させるが、LVDP及び+dP/dtmaxは45分の再灌流の期間の終わりまでにベースラインの値(初期値)に回復するかを測定した(n=6)。
【００２４】
第４群：I/R＋PKCζペプチドインヒビター(5μM、血漿に溶解した)心臓は、20分の虚血状態に曝したが、PMNで灌流しなかった。これらの心臓は、再灌流の最初の5分の間に5mLの血漿+PKCζインヒビターで灌流した。この群を利用して、PKCζペプチドインヒビターがPMN無しのI/R時において心臓抑制効果を生じさせるかを測定した(n=6)。
【００２５】
第５群：I/R+PMN心臓は、20分の虚血状態に曝し、5mLの血漿(1mL/min)及びPMN(5mLのKrebs緩衝液に再懸濁した)で再灌流の最初の5分の間に灌流した。これらの心臓は対照群を表わし、PMN(200×106)の存在下における45分の再灌流へと続く20分の虚血が、初期のベースラインの値と比較して45分の再灌流の期間を通じて持続する心臓収縮不全を生じさせるかを測定した(n=6)。
【００２６】
第６群：I/R+PMN+PKCζペプチドインヒビター(1μM)心臓は、20分の虚血状態に曝し、1μM PKCζペプチドインヒビター(血漿に溶解した)及びPMN(200×106)で再灌流の最初の5分の間に灌流した。これらの心臓は、PMN誘導心臓収縮不全の緩和におけるPKCζ阻害の効果を測定するための群を表わした(n=6)。
【００２７】
第７群：I/R+PMN+PKCζペプチドインヒビター(2.5μM)心臓は、20分の虚血状態に曝し、2.5μM PKCζペプチドインヒビター(血漿に溶解した)及びPMN(200×106)で再灌流の最初の5分の間に灌流した。これらの心臓は、PMN誘導心臓収縮不全の緩和におけるPKCζ阻害の効果を測定するための群を表わした(n=6)。
【００２８】
第８群：I/R+PMN+PKCζペプチドインヒビター(5μM)心臓は、20分の虚血状態に曝し、5μM PKCζペプチドインヒビター(血漿に溶解した)及びPMN(200×106)で再灌流の最初の5分の間に灌流した。これらの心臓は、PMN誘導心臓収縮不全の緩和におけるPKCζ阻害の効果を、PKCζペプチドインヒビターの最も高い濃度で測定するための群を表わした(n=6)。
【００２９】
第９群：I/R+PMN+PKCζペプチドインヒビター(5μM)+NG-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル(L-NAME, 50μM)心臓は、20分の虚血状態に曝し、5μM PKCζペプチドインヒビター(5mLの血漿に溶解した)及び50μM L-NAME(H2O中の50mMストックからKrebs緩衝液に溶解した)及びPMN(200×106)で再灌流の最初の5分の間に灌流した。L-NAME(50μM)は、45分の再灌流の期間を通じて連続して心臓に注入した。これらの心臓は、PKCζペプチド阻害の心臓保護効果が窒素酸化物合成インヒビター(L-NAME)で阻害され得るかを測定するための群を表わす(n=5)。
【００３０】
データは再灌流後45分間に5分毎に記録した。各実験後に、左心室を単離して、4%パラホルムアルデヒドで固定し、後に続く組織学的な分析のために4℃で保存した。
【００３１】
図１は、心臓収縮機能(すなわちLVDP)の経時変化を示した。偽I/R、I/R、I/R+PMN+PKCζペプチドインヒビター(5μM)、及びI/R+PMN群からのデータは、80分の灌流期間の間のLVDPにおける相対変化を表わした。図のように、偽I/Rは、灌流期間全体に亘ってLVDPの初期のベースラインの値付近又はそれより大きい値に維持された。I/R心臓は、再灌流の開始時にLVDPにおける低下を経るが、再灌流の終わりまでには初期のベースラインの値の95±7%に回復した。対照的に、I/R+PMN心臓は、重度の心臓収縮不全に冒され、再灌流後45分までに初期のベースラインの値の47±7%にのみ回復した。反対に、I/R+PMN+PKCζペプチドインヒビター(5μM)は、再灌流後45分で84±4%まで回復した。
【００３２】
PKCζペプチドインヒビターが、心臓の収縮機能に対して直接強心効果を生じたのか測定するために、非虚血の偽I/R心臓にPKCζペプチドインヒビター(5μM)を灌流した。PKCζペプチドインヒビターを使用する偽I/R心臓の処理は、80分の再灌流の期間の間にLVDP(図２)又は+dP/dtmax(図３)におけるいずれの有意な変化も生じさせず、5μMでPKCζペプチドインヒビターが心臓収縮機能に対して直接的な効果を奏しないことを示した。15μMの濃度がPMNによる超酸化物放出の82%阻害に相当したため、15μM PKCζペプチドインヒビター濃度を最初に試験した。しかしながら、15μMは心臓抑制効果を生じさせ(偽I/R心臓のLVDPにおいて50%の低減)、これらの実験においては使用し得なかった(データは示さず)。
【００３３】
図２及び３は、単離し、灌流したラットの心臓からのLVDP及び+dP/dtmaxの初期及び最終値を示した。初期のベースラインは全ての群で同様であった。しかしながら、最終的なLVDP及び+dP/dtmax(再灌流後45分)は、初期のベースラインと比較してPMNで灌流したI/R心臓に関しては、各々47±7%及び41±7%まで有意に低減した(p<0.01)。PKCζペプチドインヒビター(2.5μM及び5μMの濃度)は、虚血後のPMNを使用した再灌流に関連するLVDP及び+dP/dtmaxの低減を有意に緩和した。5μMの薬剤を摂取した群においては、初期のベースラインと比較して、LVDP及び+dP/dtmaxに関して84±4%及び76±5%まで心臓が回復した。最も低い効果的な用量は2.5μMであると認められ；これらの心臓は、初期のベースラインの値と比較して、LVDPに関して83±4%及び+dP/dtmaxに関して75±5%まで回復した。PKCζペプチドインヒビター(5μM)の心臓保護効果は、L-NAME(50μM)の存在下において妨げられた。これらの心臓は、再灌流後45分で、初期のベースラインと比較してLVDP及び+dP/dtmaxに関して、各々58±7%及び54±9%まで回復するのみであった。これらの心臓は、IR+PMNの群(47±7%及び41±7%のLVDP、+dP/dtmax)と類似していた。1μMでは、PKCζペプチドインヒビター処理した、I/R+PMNに曝した心臓は、再灌流後45分で、初期のベースラインと比較してLVDP及び+dP/dtmaxに関して、各々57±10%及び46±6%まで回復するのみであった。これらの心臓は、この最も低い用量では、再灌流後45分における対照のI/R+PMN心臓と有意に異なるものではなかった。
【００３４】
このモデルにおけるI/Rに関連する心臓損傷は、45分の再灌流期間内に相当数のPMNが浸潤している心筋層と近接に相関するものであった。再灌流の間、相当数のPMNが心筋層に移動し、再灌流期間の終わりには、偽I/R心臓における25 PMN/mm2未満からI/R+PMN心臓における180PMN/mm2より多くまで増大した(図４ａ)。対照的に、I/R+PMN+PKCζペプチドインヒビターで処理した心臓は、1、2.5、及び5μMの各々で、再灌流した心臓組織へのPMNの浸潤において、20±6%、46±4%、及び48±3%という有意な低減を経験し、この効果はL-NAMEの存在下で妨げられた。さらに、2.5及び5μMで処理した心臓は、1μMで処理した心臓と比較して、有意に少ないPMNの浸潤を有した(p<0.01)(図４ａ)。
【００３５】
心臓血管内皮へのPMNの接着は、血管内及び浸潤した全PMNの評価でも評価した。図４ｂに示すように、心臓内皮に接着したPMNの数は、I/R+PMN+PKCζペプチドインヒビター心臓(5μM)において有意に低減しなかった(43±10%, p<0.06)(図４ｂ)。ラット大動脈内皮からのNO放出を測定して、PKCζペプチドインヒビターが内皮NO放出の増大を含むメカニズムで心臓保護を提供しているかを決定した。図５では、PKCζペプチドインヒビターで処理した内皮が、基礎的なNO放出と比較して47±2%(2.5μM, p<0.05)、54±5%(5μM, p<0.01)、及び91±15%(15μM, p<0.01)まで、有意により多くのNOを産生した。1μMでは、NOの放出が基礎的なNO放出と有意に異なるものではなかった。アセチルコリン(200nM)をNOアッセイの正の対照として使用すると、基礎的なNO放出と比較して67±4%(p<0.01)まで有意にNO放出を増大した。eNOSインヒビターであるL-NAMEを、基礎的なNO放出を0に低減させるために、他の対照として使用した。アセチルコリン及びPKCζペプチドインヒビターに誘導されるNOの生産の双方が、L-NAME(400μM)で内皮を処理することによって完全に阻害された。NOの起源が内皮であるとするために、内皮を除去した(剥離した)ラットの大動脈片を、PKCζペプチドインヒビター(5μM)でインキュベートしたが、L-NAME処理片と異なるものではなかった。
【００３６】
PKCζペプチドインヒビターの心臓保護効果の他のメカニズムは、超酸化物の放出阻害に関する可能性ある。PKCζペプチドインヒビターは、PMAで刺激したラットPMNの懸濁物と違いの無かった1μMを除いて、33-82%(2.5-15μM, p<0.01)まで超酸化物の放出を阻害した(図６)。SOD(10μg/mL)を超酸化物アッセイにおける正の対照として使用すると、99%までPMAで刺激したラットPMNによって生産される超酸化物の放出を低下させた(p<0.01；図６)。
【００３７】
（実施例２−PKCβIIのペプチドインヒビターの効果）
PKCβIIを使用する実験を、PKCζペプチドインヒビターに関して実施例１で記載したように実質的に実施した。
【００３８】
単離して灌流したラットの心臓の以下の群を使用した。
【００３９】
第１群：偽I/R心臓は、虚血状態に曝さず、PMNで灌流しなかったが、灌流が始まって35分 (15分のベースライン記録+20分の虚血というI/R心臓が5mLの血漿(1mL/min)を与えられるであろう時点と同じ)で5mLの血漿(1mL/min)で灌流した。これらの心臓は対照群を表わし、単離したラットの心臓がLVDP及び+dP/dtmaxを80分のプロトコルを通じて維持しうるかどうか測定する(n=6)。
【００４０】
第２群：偽I/R+PKCβIIペプチドインヒビター(10μM)心臓を虚血状態に曝さず、PMNで灌流しなかった。これらの心臓に、灌流が始まって35分でPKCβIIペプチドインヒビター(10μM、H2O中の5mMストックから血漿に溶解した)を投与した。この群を利用して、PKCβIIペプチドインヒビターが強心性又は心臓抑制性の効果を生じさせるかを測定した(n=6)。
【００４１】
第３群：I/R心臓は、20分の虚血状態に曝し、再灌流の最初の5分間、5mLの血漿(1mL/min)で灌流したが、PMNで灌流しなかった。これらの心臓は対照群を表わし、再灌流へと続く20分の虚血が心臓を気絶させるが、LVDP及び+dP/dtmaxは45分の再灌流の期間の終わりまでにベースラインの値(初期値)に回復するかを測定した(n=6)。
【００４２】
第４群：I/R＋PKCβIIペプチドインヒビター(10μM、血漿に溶解した)心臓は、20分の虚血状態に曝したが、PMNで灌流しなかった。これらの心臓は、再灌流の最初の5分の間に5mLの血漿+PKCβIIペプチドインヒビターで灌流した。この群を利用して、PKCβIIペプチドインヒビターがPMN無しのI/R時において心臓抑制効果を生じさせるかを測定した。
【００４３】
第５群：I/R+PMN心臓は、20分の虚血状態に曝し、5mLの血漿(1mL/min)及びPMN(5mLのKrebs緩衝液に再懸濁した)で再灌流の最初の5分の間に灌流した。これらの心臓は対照群を表わし、PMN(200×106)の存在下における45分の再灌流へと続く20分の虚血が、初期のベースラインの値と比較して45分の再灌流の期間を通じて持続する心臓収縮不全を生じさせるかを測定した(n=6)。
【００４４】
第６群：I/R+PMN+PKCβIIペプチドインヒビター(1μM)心臓は、20分の虚血状態に曝し、1μM PKCβIIペプチドインヒビター(血漿に溶解した)及びPMN(200×106)で再灌流の最初の5分の間に灌流した。これらの心臓は、PMN誘導心臓収縮不全の緩和におけるPKCβII阻害の効果を測定するための群を表わした(n=6)。
【００４５】
第７群：I/R+PMN+PKCβIIペプチドインヒビター(5μM)心臓は、20分の虚血状態に曝し、5μM PKCβIIペプチドインヒビター(血漿に溶解した)及びPMN(200×106)で再灌流の最初の5分の間に灌流した。これらの心臓は、PMN誘導心臓収縮不全の緩和におけるPKCβII阻害の効果を、より高い濃度のPKCβIIペプチドインヒビターで測定するための群を表わした(n=7)。
【００４６】
第８群：I/R+PMN+PKCβIIペプチドインヒビター(10μM)心臓は、20分の虚血状態に曝し、10μM PKCβIIペプチドインヒビター(血漿に溶解した)及びPMN(200×106)で再灌流の最初の5分の間に灌流した。これらの心臓は、PMN誘導心臓収縮不全の緩和におけるPKCβII阻害の効果を、より高い濃度のPKCβIIペプチドインヒビターで測定するための群を表わした(n=7)。
【００４７】
第９群：I/R+PMN+PKCβIIペプチドインヒビター(10μM)+NG-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル(L-NAME, 50μM)心臓は、20分の虚血状態に曝し、10μM PKCβIIペプチドインヒビター(5mLの血漿に溶解した)及び50μM L-NAME(H2O中の50mMストックからKrebs緩衝液に溶解した)及びPMN(200×106)で再灌流の最初の5分の間に灌流した。L-NAME(50μM)は、45分の再灌流の期間を通じて連続して心臓に注入した。これらの心臓は、PKCβIIペプチド阻害の心臓保護効果が窒素酸化物合成インヒビター(L-NAME)で阻害され得るかを測定するための群を表わした(n=6)。
【００４８】
過去の試験は、PMNを与えた偽I/R心臓は初期の対照値から変化を示さないことを示していた(Lefer et al., Circulation 100: 178-184, 1999)。データは、再灌流後45分の間に5分毎に記録した。各実験後に、左心室を単離して、4%パラホルムアルデヒド中で固定し、後に続く組織学的分析のために4℃で保存した。
【００４９】
図７は、偽I/R、I/R、I/R+PMN+PKCβIIペプチドインヒビターII(10μM)、及びI/R+PMN群に関する心臓収縮機能(LVDP)の経時変化を示し、80分の灌流期間の間のLVDPにおける変化を示した。偽I/R群における心臓は、灌流期間全体に亘って、LVDPの初期のベースラインの値である103±4%のままであった。I/R群における心臓は、再灌流の初期の段階の間にLVDPにおける低下を経たが、再灌流の終わりまでには初期のベースラインの値である94±6%に回復した。しかしながら、I/R+PMN群における心臓は、重度の心臓収縮不全を示し、再灌流の終わりまでに初期のベースラインの値の43±5%に回復するのみであった。対照的に、I/R+PMN+PKCβIIペプチドインヒビター(10μM)における心臓は、再灌流が始まって15分で最初のベースラインの値の61±10%というLVDPにおける低下を最初に示したが、ベースラインの82±9%に回復した。
【００５０】
PKCβIIペプチドインヒビターが、心臓収縮機能に対していずれかの直接的な強心効果を有するか確立するために、偽I/R心臓をPKCβIIペプチドインヒビター(10μM)で灌流した。この群は、試験の対照の1つとして役立った。これらの心臓は、80分の再灌流の期間の終わりに、LVDP(図８)又は+dP/dtmax(図９)において、いずれの有意な変化も示さず、かくしてこの投与したPKCβIIペプチドインヒビターは心臓収縮に対して直接的な効果を有さないことを示した。20μM用量のPKCβIIペプチドインヒビターを、偽I/R心臓に対して試験した。当該用量では認められる心臓抑制効果は存在しなかった。
【００５１】
図８及び９は、各々、単離して灌流した心臓からのLVDP及び+dP/dtmaxの初期値及び最終値を示した。試験した全ての群の初期のベースラインの値の間には有意な差が無かった。偽I/R、I/R、偽I/R+PKCβIIペプチドインヒビター(5μM)、及びI/R+PKCβIIペプチドインヒビター(10μM)の群に関するLVDP及び+dP/dtmaxの初期値と最終値の間にも有意な差は無かった。しかしながら、I/R+PMN群に関するLVDP及び+dP/dtmaxの初期値と最終値の間には有意な差があった。灌流後45分で、LVDPにおいて43±5%及び+dP/dtmaxにおいて42±6%という初期のベースラインからの有意な低減(p<0.01)が認められた。
【００５２】
5μM及び10μM用量におけるPKCβIIペプチドインヒビターの存在が、PMNを使用する虚血後の灌流に関連するにLVDP及び+dP/dtmaxおける低減を緩和した。I/R+PMN+PKCβIIペプチドインヒビター(10μM)における心臓が、LVDP及び+dP/dtmaxの各々に関して、再灌流後45分で初期のベースラインの82±9%及び79±10%に回復したように、10μM用量が最も心臓保護的であった。これらの値は、再灌流後45分におけるI/R+PMNと優位に異なるものであった(p<0.01)。I/R+PMN+PKCβIIペプチドインヒビター(5μM)における心臓が、各々、再灌流後45分で初期のベースラインのLVDP及び+dP/dtmaxに関して、69±7%及び63±7%まで回復したように、10μ用量と同程度ではないが、5μM用量も心臓保護的であった。5μM用量に関するLVDP値は、再灌流後45分におけるI/R+PMNと有意に異なるものであった(p<0.05)。I/R+PMN+PKCβIIペプチドインヒビター(1μM)の群における心臓が、各々、LVDP及び+dP/dtmaxに関して、57±4%及び53±6%に回復するのみであったように、1μM用量のPKCβIIペプチドインヒビターは心臓保護的ではなかった。1μM用量の群におけるLVDP及び+dP/dtmaxの最終値は、I/R+PMN群の最終値と優位に異なるものではなかった。
【００５３】
PKCβIIペプチドインヒビター(10μM)の心臓保護効果は、IR+PMN+PKCβIIペプチドインヒビター(10μM)+L-NAME(50μM)の群におけるL-NAME(50μM)の存在によって妨げられ、45分の再灌流期間の終わりのLVDP及び+dP/dtmaxの値が、各々、初期のベースラインの値の56±2%及び53±5%のみであり、IR+PMN群の最終値と有意に異なるものではなかった (図３及び４)。
【００５４】
ラット大動脈内皮からのNO放出を測定して、PKCβIIペプチドインヒビターが内皮NO放出の増大を含むメカニズムによって心臓保護を提供するかを決定した。図１０は、5μM(p<0.05)及び10μM(P<0.01)において、PKCβIIペプチドインヒビターで処理した内皮の切片が、基礎的なNO放出と比較した際に、有意により多くのNOを産生したことを示した。NO放出の基礎的な値は、1.85±0.18 pmol NO/mg 組織に測定された。PKCβIIペプチドインヒビターを使用する内皮刺激の明確な用量依存的な効果が存在し、1μM、2.5μM、5μM、及び10μMが、各々0.75±0.19、1.91±0.44、2.54±0.29、及び3.49±0.62 pmol NO/mg 組織という基礎的な値を超えるNO放出を増大させた。
【００５５】
アセチルコリン(Ach, 500nM)をこのアッセイにおける正の対照として使用して、内皮を刺激してベースラインの基礎的な値を超える3.75±0.58 pmol NO/mg 組織という増大を生じさせた。NOの基礎的な放出を0に低減するために、L-NAMEを他の対照として使用した。アセチルコリン及びPKCβIIペプチドインヒビターによるNOの生産の双方は、L-NAME(400μM)で内皮を処理することによって、完全に阻害された。
【００５６】
PKCβIIペプチドインヒビターの心臓保護効果(LVDP)に寄与する可能性がある他のメカニズムは、PMN超酸化物放出の阻害である可能性がある。PKCβIIペプチドインヒビターは、fMLP刺激ラットPMNSの懸濁物からの超酸化物放出(すなわち吸光度)を、5μM、10μM、及び20μMの各々に関して、0.13±0.01から0.05±0.009(p<0.01)、0.02±0.004(p<0.01)、及び0.02±0.007(p<0.01)まで有意に阻害した(図１１)。1μMの用量では、超酸化物の優位な阻害は存在しなかった。SOD(10μg/ml)を正の対照として使用した。SODはfMLP刺激ラットPMNによって放出された超酸化物を捕捉し、0.0016±0.0006まで反応を低減させた。
【００５７】
（実施例３−PKCβII及びPKCζのペプチドインヒビターの組み合わせにおける効果）
PKCβII及びPKCζペプチドインヒビターを使用する実験を、実質的に実施例１及び２に記載のように実施した。
【００５８】
単離して灌流したラットの心臓の以下の群を使用した。
【００５９】
第１群：偽I/R心臓は、虚血状態に曝さず、PMNで灌流しなかったが、灌流を始めて35分(15分のベースライン記録+20分の虚血という、I/R心臓が5mLの血漿を与えられるであろう時点と同じ)で5mLの血漿(1mL/min)で灌流した。これらの心臓は対照群を表わし、単離したラットの心臓がLVDP及び+dP/dtmaxを80分のプロトコルを通じて維持しうるかどうか測定した(n=6)。
【００６０】
第２群：偽I/R+PKCβII(10μM)＋PKCζペプチドインヒビター(5μM)心臓を虚血状態に曝さず、PMNで灌流しなかった。これらの心臓に、灌流を始めて35分でPKCβII及びPKCζペプチドインヒビター(各々10μM及び5μM、H2O中の5mMストックから血漿に溶解した)を投与した。この群を利用して、前記ペプチドインヒビターが強心性又は心臓抑制性の効果を生じさせるかを測定した(n=6)。
【００６１】
第３群：I/R心臓は、20分の虚血状態に曝し、再灌流の最初の5分間、5mLの血漿(1mL/min)で灌流したが、PMNで灌流しなかった。これらの心臓は対照群を表わし、再灌流へと続く20分の虚血が心臓を気絶させるが、LVDP及び+dP/dtmaxは45分の再灌流の期間の終わりまでにベースラインの値(初期値)に回復するかを測定した(n=6)。
【００６２】
第４群：I/R＋PKCβII(10μM)+PKCζ(5μM)ペプチドインヒビター(血漿に溶解した)心臓は、20分の虚血状態に曝し、PMNで灌流しなかった。これらの心臓は、再灌流の最初の5分の間に5mLの血漿+PKCβII+PKCζペプチドインヒビターで灌流した。この群を利用して、前記ペプチドインヒビターがPMN無しのI/R時において心臓抑制効果を生じさせるかを測定した(n=6)。
【００６３】
第５群：I/R+PMN心臓は、20分の虚血状態に曝し、5mLの血漿(1mL/min)及びPMN(5mLのKrebs緩衝液に再懸濁した)で再灌流の最初の5分の間に灌流した。これらの心臓は対照群を表わし、PMN(200×106)の存在下における45分の再灌流へと続く20分の虚血が、初期のベースラインの値と比較して45分の再灌流の期間を通じて持続する心臓収縮不全を生じさせるかを測定した(n=11)。
【００６４】
第６群：I/R+PMN+PKCβII(5μM)+PKCζ(2.5μM)ペプチドインヒビター心臓は、20分の虚血状態に曝し、1μM PKCβIIペプチドインヒビター(血漿に溶解した)及びPMN(200×106)で再灌流の最初の5分の間に灌流した。これらの心臓は、PMN誘導心臓収縮不全の緩和におけるPKCβII阻害の効果を測定するための群を表わした(n=7)。
【００６５】
第７群：I/R+PMN+PKCβII(10μM)+PKCζ(2.5μM)ペプチドインヒビター(血清に溶解した)心臓は、20分の虚血状態に曝し、5μM PKCβIIペプチドインヒビター(血漿に溶解した)及びPMN(200×106)で再灌流の最初の5分の間に灌流した。これらの心臓は、PMN誘導心臓収縮不全の緩和におけるPKCβII阻害の効果を、より高い濃度のPKCβIIペプチドインヒビターで測定するための群を表わした(n=6)。
【００６６】
第８群：I/R+PMN+PKCβII(10μM)+PKCζ(5μM)ペプチドインヒビター心臓は、20分の虚血状態に曝し、10μM PKCβIIペプチドインヒビター(血漿に溶解した)及びPMN(200×106)で再灌流の最初の5分の間に灌流した。これらの心臓は、PMN誘導心臓収縮不全の緩和におけるPKCβII阻害の効果を、より高い濃度のPKCβIIペプチドインヒビターで測定するための群を表わした(n=7)。
【００６７】
第９群：I/R+PMN+PKCβII(10μM)+PKCζ(5μM)ペプチドインヒビター+NG-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル(L-NAME, 50μM)心臓は、20分の虚血状態に曝し、10μM PKCβII及び5μM PKCζペプチドインヒビター(5mLの血漿に溶解した)及び50μM L-NAME(H2O中の50mMストックからKrebs緩衝液に溶解した)及びPMN(200×106)で再灌流の最初の5分の間に灌流した。L-NAME(50μM)は、45分の再灌流の期間を通じて連続して心臓に注入した。これらの心臓は、前記ペプチドインヒビターの心臓保護効果が窒素酸化物合成インヒビター(L-NAME)で阻害され得るかを測定するための群を表わした(n=5)。
【００６８】
図１２の経時変化によると、PKCβII(10μM)及びPKCζ(5μM)ペプチドインヒビターの組み合わせは、I/R心臓と似通った回復速度を生じさせた。ペプチドインヒビターで処理した心臓の回復速度がI/R心臓よりも遅かった、PKCβII(10μM)又はPKCζ(5μM)ペプチドインヒビターのいずれかを単独で使用した際には(実施例１及び２)、この結果は認められなかった。
【００６９】
図１３及び１４は、各々、単離して灌流した心臓からのLVDP及び+dP/dtmaxに関する初期値及び最終値を示した。予測され、且つ実施例１及び２と同様に、I/R+PMN群に関するLVDP及び+dP/dtmaxの初期値及び最終値が有意に変化し、再灌流後45分で、LVDPでは約50%まで及び+dP/dtmaxでは約45%まで初期のベースラインから低減した(p<0.01)。
【００７０】
PKCβII及びPKCζペプチドインヒビターの存在が、虚血後のPMNを使用した灌流に関連するLVDP及び+dP/dtmaxにおける低減を緩和した。10μM PKCβII及び5μM PKCζペプチドインヒビターが、最も心臓保護的であった。5μMから10μMまでPKCβIIペプチドインヒビターの用量を増大することによっては、心臓保護効果に有意な変化を生じなかった。他方で、2.5μMから5μMまでPKCζペプチドインヒビターの用量を増大することによって、心臓保護効果における僅かな増大が生じた。
【００７１】
PKCβII及びPKCζペプチドインヒビターの組み合わせの心臓保護効果は、I/R+PMN+PKCβII(10μM)+PKCζ(5μM)ペプチドインヒビター+L-NAME(50μM)の群におけるL-NAME(50μM)の存在によって妨げられ、45分の再灌流の期間の終わりのLVDP及び+dP/dtmaxの値は、各々、初期のベースラインの値の約50%及び40%のみであり、IR+PMN群の最終値と優位な差は無かった(図１３及び１４)。
【００７２】
このモデルにおけるI/Rと関連する心臓損傷は、45分の再灌流期間内に相当数のPMNが浸潤している心筋層と密接に関連するものであった。再灌流の間、有意な数のPMNが心筋層に移動し、再灌流期間の終わりに、偽I/R心臓における25PMN/mm2未満からI/R+PMN心臓における175 PMN/mm2より多くまで増大した(図１５)。対照的に、I/R+PMN+PKCβII+PKCζペプチドインヒビターで処理した心臓は、再灌流後の心臓組織へのPMNの浸潤が有意に低減した。この効果は、L-NAMEの存在下において妨げられた。さらに、5μMから10μMにPKCβIIペプチドインヒビターの用量を倍にして、PKCζペプチドインヒビターの用量を2.5μMに維持すると、PMN浸潤の有意な低減を示さなかった。他方で、PKCζペプチドインヒビターの用量を2.5μMから5μMまで倍にして、PKCβIIペプチドインヒビターの用量を10μMに維持すると、PMNの浸潤が僅かに低減した(図１５)。
【００７３】
血管内及び浸潤した全PMNの評価で、心臓血管内皮へのPMNの接着も評価した。図１６に示すように、心臓内皮に接着したPMNの数は、I/R+PMN+PKCβII+PKCζペプチドインヒビター心臓において低減した。この保護効果は、L-NAMEの存在下で逆転した。
【００７４】
図１７では、PKCβII及びPKCζペプチドインヒビターで処理した心臓の内皮は、基礎的なNO放出と比較して、特に10μM PKCβII及び5μM PKCζペプチドインヒビターの用量で、有意に更に多くのNO放出を産生した。アセチルコリン(500nM)をNOアッセイにおける正の対照として使用して、基礎的なNO放出と比較して有意にNO放出を増大させた。NOの基礎的な放出を0に低減させるために、L-NAMEを他の対照として使用した。アセチルコリン及び前記ペプチドインヒビターに誘導されたNOの生産の双方が、L-NAME(400μM)で内皮を処理することによって完全に阻害された。
【００７５】
PKCβII及びPKCζペプチドインヒビターの心臓保護効果の他のメカニズムは、超酸化物の放出の阻害に関する可能性がある。図１８から認められるように、PKCβII及びPKCζペプチドインヒビターの組み合わせは、PMA刺激ラットPMNの懸濁物と比較、あるいは単独で使用したPKCβII又はPKCζペプチドインヒビターと比較すると、超酸化物の放出を有意に阻害した。SOD(10μg/mL)を超酸化物アッセイにおける正の対照として使用した。SODは、PMA刺激ラットPMNによって生じた超酸化物の放出を99%まで低下させた(図１８)。
【００７６】
全ての実施例は、PKCβIIペプチドインヒビター及び/又はPKCζペプチドインヒビターの十分な量の存在が、PMN誘導心臓機能不全を緩和することによって有意な心臓保護効果を提供することを示した。
【００７７】
（実施例４−PKCδのペプチドアクチベーターの効果）
PKCδペプチドアクチベーターを使用する実験を、実質的にPKCζペプチドインヒビターに関して実施例１に記載したように実施した。
【００７８】
単離して灌流したラット心臓の以下の群を使用した。
【００７９】
第１群：偽I/R心臓は、虚血状態に曝さず、PMNで灌流しなかったが、灌流を始めて35分 (15分のベースライン記録+20分の虚血というI/R心臓が5mLの血漿を与えられるであろう時点と同じ)で5mLの血漿(1mL/min)で灌流した。これらの心臓は対照群を表わし、単離したラットの心臓がLVDP及び+dP/dtmaxを80分のプロトコルを通じて維持し得るかどうか測定する(n=6)。
【００８０】
第２群：偽I/R+PKCδペプチドアクチベーター(10μM)心臓を虚血状態に曝さず、PMNで灌流しなかった。これらの心臓に、灌流を始めて35分でPKCδペプチドアクチベーター(10μM、H2O中の5mMストックから血漿に溶解した)を投与した。この群を利用して、PKCδペプチドアクチベーターが強心性又は心臓抑制性の効果を生じさせるかを測定した(n=6)。
【００８１】
第３群：I/R心臓は、20分の虚血状態に曝し、再灌流の最初の5分間、5mLの血漿(1mL/min)で灌流したが、PMNで灌流しなかった。これらの心臓は対照群を表わし、再灌流へと続く20分の虚血が心臓を気絶させるが、LVDP及び+dP/dtmaxは45分の再灌流の期間の終わりまでにベースラインの値(初期値)に回復するかを測定した(n=6)。
【００８２】
第４群：I/R＋PKCδペプチドアクチベーター(10μM、血漿に溶解した)心臓は、20分の虚血状態に曝したが、PMNで灌流しなかった。これらの心臓は、再灌流の最初の5分の間に5mLの血漿+ PKCδペプチドアクチベーターで灌流した。この群を利用して、PKCδペプチドアクチベーターがPMN無しのI/R時において心臓抑制効果を生じさせるかを測定した(n=6)。
【００８３】
第５群：I/R+PMN心臓は、20分の虚血状態に曝し、5mLの血漿(1mL/min)及びPMN(5mLのKrebs緩衝液に再懸濁した)で再灌流の最初の5分の間に灌流した。これらの心臓は対照群を表わし、PMN(200×106)の存在下における45分の再灌流へと続く20分の虚血が、初期のベースラインの値と比較して45分の再灌流の期間を通じて持続する心臓収縮不全を生じさせるかを測定した(n=10)。
【００８４】
第６群：I/R+PMN+ PKCδペプチドアクチベーター(1μM)心臓は、20分の虚血状態に曝し、1μM PKCδペプチドアクチベーター(血漿に溶解した)及びPMN(200×106)で再灌流の最初の5分の間に灌流した。これらの心臓は、PMN誘導心臓収縮不全の緩和におけるPKCδ活性化の効果を測定するための群を表わした(n=6)。
【００８５】
第７群：I/R+PMN+ PKCδペプチドアクチベーター(5μM)心臓は、20分の虚血状態に曝し、5μM PKCδペプチドアクチベーター(血漿に溶解した)及びPMN(200×106)で再灌流の最初の5分の間に灌流した。これらの心臓は、PMN誘導心臓収縮不全の緩和におけるPKCδ活性化の効果を、より高い濃度のPKCδペプチドアクチベーターで測定するための群を表わした(n=6)。
【００８６】
第８群：I/R+PMN+ PKCδペプチドアクチベーター(10μM)心臓は、20分の虚血状態に曝し、10μM PKCδペプチドアクチベーター(血漿に溶解した)及びPMN(200×106)で再灌流の最初の5分の間に灌流した。これらの心臓は、PMN誘導心臓収縮不全の緩和におけるPKCδ活性化の効果を、より高い濃度のPKCδペプチドアクチベーターで測定するための群を表わした(n=6)。
【００８７】
過去の試験は、PMNを与えられた偽I/R心臓は、初期の対照値から変化を示さないことを示していた(Lefer et al., Circulation 100: 178-184, 1999)。データは、再灌流後45分間に5分毎に記録した。各実験後に、左心室を単離して、4%パラホルムアルデヒド中で固定し、後に続く組織学的な分析のために4℃で保存した。
【００８８】
図１９は、偽I/R、I/R、I/R+PMN＋PKCδペプチドアクチベーター(10μM)、及びI/R+PMNの群に関する心臓収縮機能(LVDP)の経時変化を示し、80分の灌流期間の間におけるLVDPの変化を示した。偽I/R群における心臓は、灌流期間の全体に亘ってLVDPの初期ベースラインの値である103±4%のままであった。I/R群における心臓は、再灌流の初期の段階の間にLVDPの低下を経るが、再灌流の終わりには初期ベースライン値の82±3%に回復した。しかしながら、I/R+PMN群における心臓は、重度の心臓収縮不全を示し、再灌流の終わりには初期ベースライン値の46±9%に回復するのみであった。対照的に、I/R+PMN+PKCδペプチドアクチベーター(10μM)における心臓は、最初に再灌流を始めて15分で初期ベースライン値の58±8%のLVDPにおける低下を示すが、ベースラインの83±3%まで回復した。
【００８９】
PKCδペプチドアクチベーターが、心臓収縮機能に対していずれかの直接的な強心効果を生じるかどうかを確立するために、偽I/R心臓をPKCδペプチドアクチベーター(10μM)で灌流した。この群は、前記試験の対照の1つとして役立った。これらの心臓は、80分の再灌流器官の終わりに、LVDP(図２０)又は+dP/dtmax(図２１)において、いずれの有意な変化も示さず、この用量におけるPKCδペプチドアクチベーターは心臓収縮機能に対して直接的な効果を有さないことを示した。
【００９０】
図２０及び２１は、各々、単離して灌流した心臓からのLVDP又は+dP/dtmaxに関する初期値及び最終値を示した。試験した全ての群の初期ベースライン値の間に有意な差は無かった。偽I/R、I/R、偽I/R+PKCδペプチドアクチベーター、及びI/R+PKCδペプチドアクチベーター(10μM)の群に関するLVDP又は+dP/dtmaxの初期値と最終値との間にも、有意な差は無かった。しかしながら、I/R+PMNの群に関するLVDP及び+dP/dtmaxの初期値と最終値との間には、有意な差があった。再灌流後45分で、LVDPでは46±9%及び+dP/dtmaxでは45±8%という初期ベースラインからの有意な低減(p<0.01)が認められた。
【００９１】
5μM及び10μMの用量におけるPKCδペプチドアクチベーターの存在が、虚血後のPMNを使用する灌流と関連するLVDP及び+dP/dtmaxにおける低減を緩和した。10μMの用量が最も心臓保護的であり、I/R+PMN+PKCδペプチドアクチベーター(10μM)における心臓は、再灌流後45分でLVDP及び+dP/dtmaxの各々において初期ベースラインの83±3%及び79±5%に回復した。これらの値は、再灌流後45分のI/R+PMNとは有意に異なるものであった(p<0.01)。5μMの用量も、10μMの用量と同程度ではないが、心臓保護的であり、I/R+PMN+PKCδペプチドアクチベーター(5μM)の心臓は、再灌流後45分でLVDP及び+dP/dtmaxの各々に関して初期ベースラインの80±9%及び67±7%に回復した。5μMの用量に関するLVDP値は、再灌流後45分のI/R+PMNとは有意に異なるものであった(p<0.05)。1μMの用量のPKCδペプチドアクチベーターは心臓保護的ではなく、I/R+PMN+PKCδペプチドアクチベーター(1μM)の群の心臓は、LVDP及び+dP/dtmaxの各々に関して60±13%及び51±5%に回復するのみであった。1μMの用量の群におけるLVDP及び+dP/dtmaxの最終値は、I/R+PMNの群の最終値と優位に異なるものではなかった。
【００９２】
PKCδペプチドアクチベーターの心臓保護効果(LVDP)に寄与する可能性があるメカニズムは、PMNによる超酸化物放出の阻害である可能性がある。PKCδペプチドアクチベーターは、PMA刺激ラットPMNSの懸濁物からの超酸化物の放出(吸光度)を、5μM及び10μMの各々に関して、0.49±0.03から0.32±0.03(p<0.01)、0.32±0.02(p<0.01)まで有意に阻害した。1μMの用量では、超酸化物の優位な阻害は存在しなかった。
【００９３】
本発明のある好ましい実施態様が具体的にここに記載されているが、ここに示され、記載された各種の実施態様の変形例及び修飾例が本発明の精神及び範囲を逸脱すること無く作製されて良いことは、本発明に関連する技術分野の当業者には明らかであろう。したがって、本発明が、添付の特許請求の範囲及び適用される法の規定によって必要とされる範囲にのみ限定されることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】偽、I/R、I/R+PMN、及びI/R+PMN+PKCζペプチドインヒビター(5μM)灌流ラットにおけるLVDP(左心室発生圧力＝左心室収縮期末圧力−左心室拡張期末圧力)の経時変化。初期(ベースライン)及び20分の虚血後の0から45分の再灌流におけるLVDPデータ。偽の群(n=6)は80分間のプロトコルを通じて同一のLVDPを維持した。I/R(n=6)の群は初期ベースライン値に回復した。I/R+PMNの群(n=6)は、I/R+PMN+PKCζペプチドインヒビター(n=6)の群と比較すると、LVDPにおける有意な持続する低減を示した。全ての値は、平均±SEMで表わす。*p<0.05及び*p<0.01、I/R+PMNからI/R+PMN+PKCζペプチドインヒビターの群。
【図２】虚血(I)前 (初期)及び再灌流(R)後45分 (最終)の後の、単離して灌流したラット心臓からの、mmHgで表わされる初期及び最終のLVDP。心臓はPMNの存在又は非存在下で灌流した。PMNは有意な心臓機能不全を誘導し、それはPKCζペプチドインヒビターによって緩和されたが、NG-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル(L-NAME)によって有意に妨げられた。全ての値は平均±SEMで表わす。試験した心臓の数はバーの下部にある。**p<0.01、最終のI/R+PMNから；NS=有意でない。
【図３】虚血(I)前及び再灌流(R)後の、単離して灌流したラットにおける、mmHg/sで表わされるLVDP(+dP/dt max)の初期及び最終の最大速度。心臓はPMNの存在又は非存在下で灌流した。PMNが有意な心臓機能障害を誘導し、それはPKCζペプチドインヒビターによって緩和されたが、L-NAMEによって妨げられた。全ての値は平均±SEMとして表わされる。試験した心臓の数は、バーの下部にある。**p<0.01、最終のI/R+PMNから；NS=有意でない。
【図４ａ】一群あたりに3ラット及び1の心臓あたりに10の領域から得た、単離して灌流したラット心臓試料における、血管内及び浸潤した全PMNの組織学的な評価。再灌流後の心臓組織内及び心臓内皮に接着している、血管内及び浸潤した全PMNの数は、PKCζペプチドインヒビターによって有意に緩和された。斜線の四角はPMNで灌流していない心臓を表わし、黒色の四角はPMNで灌流した心臓を表わす。**p<0.01、I/R+PMNから。
【図４ｂ】一群あたりに3ラット及び1の心臓あたりに10の領域から得た、単離して灌流したラット心臓試料における、心臓脈管構造に接着した血管内PMNの組織学的評価。心臓脈管構造に接着したPMNの数はI/R+PMNと有意に異なるものではなかった。斜線の四角はPMNで灌流していない心臓を表わし、黒色の四角はPMNで灌流した心臓を表わす。全ての値は、心臓領域のmm2あたりのPMNの平均数(PMN/mm2)±SEMである。
【図５】ラット大動脈切片からのNO放出測定。PKCζペプチドインヒビターで処理した切片(2.5-15μM)並びにアセチルコリン(Ach, 200nM)において、内皮NO放出は基礎的なNO放出から有意に増大した。400μM L-NAMEを与えた双方の群及び内皮を除去した(剥離した)切片においては、NO放出が有意に低減した。全ての値は平均±SEMで表わす。バーの下部の数は、群あたりの独立した実験の数である。*p<0.05, **p<0.01、基礎的な値から。
【図６】ラットPMNからの超酸化物の放出。超酸化物の放出を、フォルボール-12-ミリステート-13-アセテート(PMA)(15nM)刺激後に5×106PMNから測定した。スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)(10μg/ml)を正の対照として使用した。吸光度の変化(Δ)をPMA添加の360秒後に測定した(ピーク応答)。超酸化物の放出は、PKCζペプチドインヒビターによって有意に阻害された(**p<0.01、2.5、5、及び15μM)。全ての値は平均±SEMである。バーの下部の数は、群あたりの独立した実験の数を示す。
【図７】偽I/R、I/R、I/R+PMN、及びI/R+PMN+βIIペプチドインヒビター(10μM)を灌流したラット心臓におけるLVDPの経時変化。開始時(ベースライン)及び20分の虚血後の0から45分までの再灌流時のLVDPデータ。偽の群(n=6)は、80分のプロトコルを通じて同一のLVDPを維持した。I/R+PMNの群(n=9)は、I/R(n=6)及びI/R+PMN+βIIペプチドインヒビター(n=7)の群と比較して、LVDPにおける有意且つ持続する低減を示した。全ての値は、平均±SEMで表わされる。*p<0.05及び**p<0.01、I/R+PMNから。
【図８】虚血(I)前 (初期)及び再灌流(R)後45分の後 (最終)の、単離して灌流したラット心臓からの、mmHgで表わされる初期及び最終のLVDP。心臓は、PMNの存在下又は非存在下で灌流した。PMNは有意に心臓機能不全を誘導し、それはPKCβIIペプチドインヒビターによって緩和されたが、L-NAMEの存在によって有意に妨げられた。全ての値は平均±SEMで表わされる。試験した心臓の数は、バーの下部にある。*p<0.05及び**p<0.01、最終のI/R+PMNから；NS=有意ではない。
【図９】虚血(I)前及び再灌流(R)後の、単離して灌流したラット心臓における、mmHgで表わされる初期及び最終の+dP/dt max。心臓はPMNの存在下又は非存在下で灌流した。PMNは有意な心臓機能不全を誘導し、それはPKCβIIペプチドインヒビターによって緩和されたが、L-NAMEによって妨げられた。全ての値は平均±SEMで表わされる。試験した心臓の数は、バーの下部にある。*p<0.05及び**p<0.01、最終のI/R+PMNから；NS=有意ではない。
【図１０】ラット大動脈切片からのNO放出の測定。内皮のNO放出は、PKCβIIペプチドインヒビター(1、2.5、5、及び10μM)並びにアセチルコリン(Ach, 500nM)で処理した切片において、基礎的なNO放出から有意に増大した。NO放出は、400μM L-NAMEを与えられた双方の群において有意に低減した。全ての値は平均±SEMで表わされる。バーの下部の数は、群あたりの独立した実験数である。*p<0.05、**p<0.01、基礎的な値から。
【図１１】ラットPMNからの超酸化物の放出。ホルミル-メチオニル-ロイシル-フェニルアラニン(f-MLP)(200nM)刺激後の、5×106PMNからの超酸化物の放出を測定した。SOD(10 μg/ml)を正の対照として使用した。fMLP添加後90秒(ピーク応答)で、吸光度(Δ)における変化を測定した。超酸化物の放出は、PKCβIIペプチドインヒビターによって有意に阻害された(**p<0.01、5、10、及び20μM)。全ての値は平均±SEMである。バーの下部の数字は、群あたりの独立した実験数である。
【図１２】偽、I/R、I/R+PMN、及びI/R+PMN+PKCβII(10μM)+PKCζ(5μM)ペプチドインヒビターで灌流したラット心臓におけるLVDPの経時変化。初期(ベースライン)及び20分の虚血後0から45分までの再灌流時のLVDPデータ。偽の群(n=6)は80分のプロトコルを通じて同一のLVDPを維持した。I/R(n=6)の群は、初期ベースライン値に対して部分的に回復した。I/R+PMN群(n=11)は、I/R+PMN+PKCβII(10μM)+PKCζ(5μM)ペプチドインヒビター(n=7)の群と比較して、LVDPにおける有意且つ持続した低減を示した。全ての値は、平均±SEMで表わす。*p<0.05、I/R+PMNから。
【図１３】虚血(I)前(初期)及び再灌流(R)後45分の後(最終)の、単離して灌流したラット心臓からの、mmHgで表わされる初期及び最終のLVDP。心臓は、PMNの存在下又は非存在下で灌流した。PMNは有意な心臓機能障害を誘導し、それはPKCβII及びPKCζペプチドインヒビターの存在によって緩和された。この保護効果は、L-NAMEによって妨げられた。全ての値は、平均±SEMで表わされる。試験した心臓の数は、バーの下部にある。*p<0.05、最終のI/R+PMNから；NS=有意ではない。
【図１４】虚血(I)前及び再灌流(R)後の、単離して灌流したラット心臓における、mmHgで表わされる初期及び最終の+dP/dt max。心臓は、PMNの存在下又は非存在下で灌流した。PMNは、有意な心臓機能不全を誘導し、それはPKCβII及びPKCζペプチドインヒビターによって緩和された。この保護効果はL-NAMEによって妨げられた。全ての値は平均±SEMで表わされる。試験した心臓の数はバーの下部にある。*P<0.05、最終のI/R+PMNから、NS=有意ではない。
【図１５】一群あたり3のラット及び1の心臓あたり10の領域から得られた単離して灌流したラット心臓試料における、血管内及び浸潤したPMNの組織学的な評価。再灌流後の心臓組織おける及び心臓脈管構造に接着している、血管内及び浸潤した全PMNの数はPKCβII及びPKCζペプチドインヒビターによって有意に低減された。斜線の四角は、PMNで灌流していない心臓を表わし、黒色の四角はPMNで灌流した心臓を表わす。**p<0.01、I/R+PMNから。
【図１６】単離して灌流したラット心臓における心臓脈管構造に接着した血管内PMNの組織学的評価。PKCβII及びPKCζペプチドインヒビターで処理した心臓における心臓増脈管構造に接着したPMNの数は、I/R+PMN心臓よりも少なかった。斜線の四角は、PMNで灌流していない心臓を表わし、黒色の四角はPMNで灌流した心臓を表わす。全ての値は、心臓の領域mm2あたりのPMNの平均値(PMN/mm2)±SEMである。**p<0.01、I/R+PMNから。
【図１７】ラット大動脈切片からのNO放出の測定。PKCβII及びPKCζペプチドインヒビター並びにアセチルコリン(Ach, 500nM)で処理した切片において、内皮のNO放出が、基礎的なNO放出から有意に増大された。400μM L-NAMEを与えた双方の群において、NO放出は有意に低減された。全ての値は、平均±SEMで表わされる。バーの下部の数字は、群あたりの独立した実験数である。**p<0.01、基礎的な値から。
【図１８】ラットPMNからの超酸化物の放出。超酸化物の放出を、PMA(15nM)刺激後の5×106PMNから測定した。SOD(10μg/ml)を正の対照として使用した。吸光度(Δ)における変化を、PMA添加後360秒で測定した(ピーク応答)。超酸化物の放出は、PKCβII及びPKCζペプチドインヒビターの存在によって有意に阻害された(*p<0.05、**p<0.01)。全ての値は平均±SEMである。バーの下部の数字は、群あたりの独立した実験数を示す。
【図１９】偽、I/R、I/R+PMN、及びI/R+PMN+PKCδペプチドアクチベーター(10μM)で灌流したラットの心臓におけるLVDPの経時変化。初期(ベースライン)及び20分の虚血後の0から45分までの再灌流時におけるLVDPデータ。偽の群(n=6)は、80分のプロトコルを通じて同一のLVDPを維持した。I/R(n=6)の群は初期ベースライン値に回復した。I/R+PMN群(n=6)は、I/R+PMN+PKCδペプチドアクチベーター(n=6)の群と比較すると、LVDPにおける有意且つ持続した低減を示した。全ての値は平均±SEMで表わされる。**p<0.01、I/R+PMNから。
【図２０】虚血(I)前(初期)及び再灌流(R)後45分の後(最終)の、単離して灌流したラット心臓からの、mmHgで表わされる初期及び最終のLVDP。心臓は、PMNの存在下又は非存在下で灌流した。PMNは有意な心臓機能不全を誘導し、それはPKCδペプチドアクチベーターによって緩和された。全ての値は平均±SEMで表わされる。試験した心臓の数は、バーの下部にある。*p<0.05及び**p<0.01、最終のI/R+PMNから；NS=有意ではない。
【図２１】虚血(I)前及び再灌流(R)後の、単離して灌流したラット心臓における、mmHg/sで表わされる初期及び最終の+dP/dt max。心臓は、PMNの存在下又は非存在下で灌流した。PMNは優位な心臓機能不全を誘導し、それはPKCδペプチドアクチベーターによって緩和された。全ての値は平均±SEMで表わされる。試験した心臓の数は、バーの下部にある。**p<0.01、最終のI/R+PMNから；NS=有意ではない。
【図２２】ラットPMNからの超酸化物の放出。超酸化物の放出を、PMA(15nM)刺激後の5×106PMNから測定した。吸光度(Δ)における変化を、PMA添加後360秒で測定した(ピーク応答)。超酸化物の放出は、PKCδペプチドアクチベーターによって有意に阻害された(**p<0.01、5及び10μM)。全ての値は平均±SEMである。バーの下部の数字は、群あたりの独立した実験数を示す。
【図２３ａ】一群あたり3のラット及び1の心臓あたり10の領域から得られた、単離して灌流したラット心臓試料における、血管内及び浸潤した全PMNの組織学的評価。灌流後の心臓組織における及び心臓脈管構造に接着している血管内および浸潤した全PMNの数は、PKCδペプチドアクチベーターによって低減された。斜線の四角は、PMNで灌流していない心臓を表わし、黒色の四角はPMNで灌流した心臓を表わす。
【図２３ｂ】一群当たり3のラット及び1の心臓あたり10の領域から得られた、単離して灌流したラット心臓試料における、心臓脈管構造に接着した血管内PMNの組織学的評価。心臓脈管構造に接着しているPMNの数は、PKCδペプチドアクチベーターによって低減された。斜線の四角は、PMNで灌流していない心臓を表わし、黒色の四角はPMNで灌流した心臓を表わす。全ての値は心臓の領域あたりのPMNの平均数(PMN /mm2)±SEMである。
【図２４】偽、I/R、I/R+PMN、及びI/R+PMN+PKCδペプチドアクチベーター(10μM)で灌流したラット心臓における、左心室拡張期末圧力(LVEDP)の経時変化。初期(ベースライン)及び20分の虚血後0から45分までの再灌流時のLVEDPデータ。偽の群(n=6)は、80分のプロトコルを通じて同一のLVEDPを維持した。I/R(n=6)の群は、初期のベースライン値まで部分的に回復した。I/R+PMNの群(n=6)は、I/R+PMN+PKCδペプチドアクチベーター(n=6)の群と比較すると、LVEDPにおける有意且つ持続した上昇を示した。全ての値は、平均±SEMで表わされる。*p<0.05及び**p<0.01、I/R+PMNから。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３ａ】
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【図２３ｂ】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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