(57)【要約】  本発明は、非病原性の非侵襲性グラム陽性細菌での複合莢膜多糖の異種発現、産生および／若しくは分泌のための方法および手段を提供する。本発明は、とりわけ、病原性細菌種からの異種複合多糖の発現および／若しくは分泌が可能な非病原性の非侵襲性グラム陽性細菌を提供する。こうした細菌およびその中で産生される多糖は、本発明により、感染性細菌性疾患の処置および予防のためのワクチン接種のための組成物を提供するのに応用しうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）グラム陽性細菌種の莢膜多糖（ＣＰＳ）血清型特異的遺伝子を含んでなる第一の異種ＤＮＡフラグメント；
ｂ）共通の調節遺伝子およびａ）の細菌と異なるグラム陽性細菌から得られるプライミンググリコシルトランスフェラーゼを含んでなる第二のＤＮＡフラグメント
を含んでなり；そして、
ｃ）また、前記フラグメントの発現に際してａ）の細菌種の異種多糖を産生する、
非病原性の非侵襲性グラム陽性細菌。
【請求項２】
病原性かつ／若しくは侵襲性のグラム陽性細菌種の血清型特異的ｃｐｓ遺伝子が、複合型ＣＰＳを産生する種からであり、該ＣＰＳが脂質結合した中間体を介して合成される反復オリゴ糖単位のポリマーを含んでなる、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
ｃ）で産生される多糖が細胞外間隙に分泌される、請求項１に記載の細菌。
【請求項４】
細菌が、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸球菌属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）およびオエノコッカス属（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）からの種、ならびに種枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス  サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）よりなる非病原性の非侵襲性グラム陽性細菌の群から選択される、請求項１に記載の細菌。
【請求項５】
血清型特異的配列が、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エンテロコッカス  フェーカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス  ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス  アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス  ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、ストレプトコッカス  ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス  オラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス  エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ  ａｕｒｅｕｓ）よりなる病原性かつ／若しくは侵襲性のグラム陽性複合ＣＰＳ産生細菌の群から得られる、請求項１に記載の細菌。
【請求項６】
血清型特異的遺伝子が、複合莢膜多糖血清型１、２、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｆ、１２Ｂ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１６Ａ、１７Ｆ、１７Ａ、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、２０、２１、２２Ｆ、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２５Ｆ、２５Ａ、２７、２８Ｆ、２８Ａ、２９、３３Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、１０Ｆ、１１Ｄ、１２Ａ、１８Ｆ、２３Ｆ、３１、３２Ｆ、３２Ａ、３３Ｄ、３４、３５Ｆ、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３６、３８、３９、４０、４１Ｆ、４１Ａ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ｆ、４７Ａおよび４８を産生する肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株由来である、請求項５に記載の細菌。
【請求項７】
前記発現された共通の若しくは調節遺伝子およびプライミンググリコシルトランスフェラーゼが、最低１種の共通の調節遺伝子ｅｓｐＡ若しくはｃｐｓＣ、ｅｐｓＢ若しくはｃ
ｐｓＤ、およびｅｐｓＤ若しくはｃｐｓＥ、ならびに場合によってはｅｐｓＣ若しくはｃｐｓＢを含んでなる、請求項１に記載の細菌。
【請求項８】
ｅｐｓＡにコードされるタンパク質が、ラクトコッカス  ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ＥｐｓＡと最低２０％のアミノ酸同一性を共有し、ｅｐｓＢにコードされるタンパク質が、ラクトコッカス  ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ｅｐｓＢと最低２０％のアミノ酸同一性を共有し、および、ｅｐｓＤにコードされるタンパク質が、ラクトコッカス  ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ＥｐｓＤと最低３０％のアミノ酸同一性を共有する、請求項７に記載の細菌。
【請求項９】
グラム陽性複合ＣＰＳ血清型特異的ｃｐｓ遺伝子をコードするＤＮＡフラグメントを含んでなるＤＮＡベクターであって、該血清型特異的遺伝子が、莢膜多糖遺伝子（ＣＰＳ）集団に存在する血清型特異的遺伝子よりなる群から選択される、上記ベクター。
【請求項１０】
１種若しくはそれ以上の血清型特異的遺伝子が、ｃｐｓＥ、ｃｐｓＦ、ｃｐｓＧ、ｃｐｓＨ、ｃｐｓＩ、ｃｐｓＪ、ｃｐｓＫ、ｃｐｓＬ若しくはそれらのホモログよりなる血清型特異的ｃｐｓ遺伝子の群から選択される、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
血清型特異的ｃｐｓ遺伝子が、血清型１、２、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｆ、１２Ｂ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１６Ａ、１７Ｆ、１７Ａ、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、２０、２１、２２Ｆ、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２５Ｆ、２５Ａ、２７、２８Ｆ、２８Ａ、２９、３３Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、１０Ｆ、１１Ｄ、１２Ａ、１８Ｆ、２３Ｆ、３１、３２Ｆ、３２Ａ、３３Ｄ、３４、３５Ｆ、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３６、３８、３９、４０、４１Ｆ、４１Ａ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ｆ、４７Ａおよび４８の複合ＣＰＳを産生する、ＣＰＳを産生する肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株の群から得られる、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
血清型特異的ｃｐｓ遺伝子が、グラム陽性細菌からのＥＰＳ若しくはＣＰＳ遺伝子集団制御配列の転写制御下にあり、前記細菌が、血清型特異的遺伝子が得られたグラム陽性細菌と異なる種である、請求項９ないし１１のいずれか１つに記載のＤＮＡベクター。
【請求項１３】
血清型特異的遺伝子がポリシストロン性転写単位内に含まれる、請求項１２に記載のＤＮＡベクター。
【請求項１４】
ベクターが、機能的な共通の調節ｅｐｓ遺伝子ｅｓｐＡ若しくはｃｐｓＣ、ｅｐｓＢ若しくはｃｐｓＤ、ｅｐｓＤ若しくはｃｐｓＤ、および場合によってはｅｐｓＣ若しくはｃｐｓＢの１種若しくはそれ以上を含まない、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１５】
細菌が、請求項９ないし１４のいずれか１つに記載のベクターを含んでなる、請求項１に記載の細菌。
【請求項１６】
ａ）ＣＰＳ産生に伝導性の条件下で、請求項１ないし８のいずれかに記載の細菌を培養すること、
ｂ）および、場合によっては、産生された複合ＣＰＳの回収
の段階を含んでなる、非病原性の非侵襲性グラム陽性細菌中での複合莢膜多糖（ＣＰＳ）の異種製造方法。
【請求項１７】
細菌細胞および培地が分離され、かつ、ＣＰＳが培地中に回収されるか、若しくは、場合によっては培地から単離される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１ないし７のいずれか１つに記載の細菌、および最低１種の賦形剤若しくは免疫原性アジュバントを含んでなる、製薬学的に許容できる組成物。
【請求項１９】
請求項１ないし６のいずれか１つに記載の非病原性の非侵襲性グラム陽性細菌から得られる複合ＣＰＳ、および最低１種の賦形剤若しくは免疫原性アジュバントを含んでなる、製薬学的に許容できる組成物。
【請求項２０】
複合ＣＰＳが、免疫原性分子に物理的に連結されている、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
免疫原性分子が、破傷風類毒素、ジフテリア類毒素、髄膜炎菌外膜タンパク質およびジフテリアタンパク質ＣＲＭ１９７よりなる免疫原性タンパク質の群から選択される、請求項１９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学の分野、とりわけ、微生物学、ならびに細菌細胞中でのタンパク質および多糖の異種発現に関する。本発明はまた、医学の分野、とりわけ、感染性疾患の処置および予防、より具体的にはワクチン接種の分野にも関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物多糖（ＰＳ）は、リポ多糖（ＬＰＳ）中のＯ−抗原として細胞表面と共有会合した莢膜多糖（ＣＰＳ）として存在し得るか、若しくは細胞外多糖（ＥＰＳ）として分泌され得、そして、侵襲性疾患を引き起こし得るグラム陽性および陰性双方の細菌性病原体の重要な病原性因子である。多くの侵襲性細菌は、人体への病原体の侵襲に不可欠の病原性因子である莢膜多糖を産生する。莢膜多糖は細胞表面で見出される主抗原であり、そしてワクチンの製造に頻繁に使用される。しばしばタンパク質担体と複合かつ／若しくは免疫応答を刺激するアジュバントと結合されたＣＰＳを使用するワクチン接種は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびヘモフィルス  インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タイプｂ（Ｈｉｂ）のような細菌性病原体により引き起こされる感染性疾患に対し人類を保護するための強力な一アプローチである。
【０００３】
精製若しくは純粋に有機の合成により容易に得られない、十分な量の安全、純粋かつ十分に定義された多糖は、安全かつ費用効率のよいワクチンの製造に決定的に重要である。従って、非病原性の非侵襲性細菌宿主細胞中での莢膜多糖の異種産生は、天然の供給源からのＣＰＳの精製のための代替の効率的で単純、安全かつ費用効率のよい解決策である。
【０００４】
ＣＰＳに対するかなりの量の研究が、肺炎球菌ともまた称される肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）で実施された。肺炎球菌は、気道、中耳の感染症および肺炎の共通原因である。最も重大な形態の肺炎球菌疾患は、肺炎、髄膜炎および敗血症である。肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の疾患を引き起こす能力は、多糖莢膜のその発現と明瞭に関連づけられている。全部の臨床単離物が被包化されており（非特許文献１）、また、自発的な被包化されてない変異株は非毒性である（非特許文献２）からである。現在、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）について既知の最低９０種の血清学的に異なる莢膜型が存在し（非特許文献３）、それぞれグリコシド結合の糖組成が異なる（概要については非特許文献４を参照されたい）。
【０００５】
肺炎球菌感染症の処置は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の薬剤耐性株の蔓延により、より複雑かつ高価になった。これは、莢膜生合成の調節に関与する機構のわれわれの理解を向上させかつ肺炎球菌感染症を予防するための有効なワクチンを開発する必要性を促した。莢膜多糖は免疫原性でありかつワクチン抗原として使用される。精製された多糖若しくはそれらの複合糖質のいずれかに基づく数種のワクチンが現在市販されている（非特許文献４）。有効な肺炎球菌ワクチンの開発は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の抗原の多様性により複雑にされる。今日までに既知の９０種以上の肺炎球菌の血清型は、それらのＣＰＳ産生および構造が大きく変動する。さらに、莢膜多糖は、若齢小児において、保護的かつ長期間持続する免疫保護を確実には誘導しない。現在の肺炎球菌ワクチンは、従って、２０種までの血清型若しくはそれ以上からのＣＰＳを含んでなる数種の血清型からの莢膜多糖を組合せる。こうした多血清型ワクチンは製造するのが高価かつ困難である。それは、多くの異なる病原性かつ危険な肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の培養、ＣＰＳの単離および徹底的
な精製、細菌株およびＣＰＳ単離物の品質管理、それらを適切な若しくは所望の量で混合すること、ならびにワクチン接種のための組成物への処方を必要とする。
【０００６】
最低数種の血清型特異的ｃｐｓ遺伝子を含有するｃｐｓ遺伝子集団のＤＮＡフラグメントの相同的組換えを介する、別の血清型の肺炎球菌細胞中での特定の１血清型の肺炎球菌ＣＰＳの製造もまた記述されている（特許文献１）。
【０００７】
大部分の肺炎球菌莢膜多糖の産生は、グラム陰性細菌中でのＯ−抗原多糖の生合成について記述された（非特許文献５）と類似の経路を介して起こると期待される。多糖の反復単位が、細胞膜の細胞質側のグリコシルトランスフェラーゼ酵素の連続的作用により、脂質担体上で集成される。完成すれば、反復単位は、反復単位輸送体により細胞膜を横断して輸送され、そして成長する多糖鎖の還元末端に重合され（非特許文献６）、そして細胞壁に共有結合される（非特許文献７）。
【０００８】
莢膜生合成をコードする遺伝子座はカセット様構造を有し；特定の莢膜構造を生じるのに必要とされる機能をコードする遺伝子は、全血清型に共通の調節遺伝子により隣接される。該共通領域は該集団の型特異的遺伝子の上流に位置し、そしてＣｐｓＡ、ＣｐｓＢ、ＣｐｓＣおよびＣｐｓＤをコードする（非特許文献８；非特許文献９）。ｃｐｓＡの正確な機能はなお未知であるが、しかし、転写活性化因子としての機能が、ストレプトコッカス  アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）でＣｐｓＡについて示され（非特許文献１０）、また、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）におけるｃｐｓＡの突然変異は莢膜量の低減をもたらすが、しかし莢膜の大きさ分布を変えなかった（非特許文献１１）。ＣｐｓＢ、ＣｐｓＣおよびＣｐｓＤは、最近、ＣｐｓＤに存在するチロシン残基での可逆的リン酸化事象を介する莢膜産生の調節に関与することが示された（非特許文献１２；非特許文献１１；非特許文献１３）。非病原性のラクトコッカス  ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）細菌での多糖生合成をコードする遺伝子座（非特許文献１４）、しかしまた、ブルガリア菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（非特許文献１５）、ストレプトコッカス  サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（非特許文献１６）、ラクトバシラス  プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（非特許文献１７）、ストレプトコッカス  マセドニカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｃｅｄｏｎｉｃｕｓ）（非特許文献１８）、ラクトバシラス  ヘルベチカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）（非特許文献１９）のような他の非病原性のグラム陽性細菌に存在するものは、類似の方法で構成される。
【０００９】
病原性かつ侵襲性の肺炎球菌（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃ）および非病原性の非侵襲性乳酸球菌は、それぞれ、ＣＰＳ若しくはＥＰＳ遺伝子集団からの多糖生合成のための機構で共通の特徴を共有する。Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）が、単一の連続移動的（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ）グリコシルトランスフェラーゼを包含するわずか３種のタイプ３生合成遺伝子の導入に際して、二糖反復単位を含有する比較的単純な肺炎球菌タイプ３多糖を産生することが可能であることが以前に示された（特許文献２、非特許文献２０）。単純なタイプ３多糖の生合成は、連続移動的機構を介して、ＵＤＰ−グルコースとＵＤＰ−グルクロン酸の間にグリコシド結合を形成するただ単一のグリコシルトランスフェラーゼを必要とする（非特許文献２１）。Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）中で発現される場合、肺炎球菌の血清型３ＣＰＳはＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）細胞と会合したままである。該細胞会合は、細菌細胞および細胞破片からのＣＰＳの迅速な分離を妨げる。徹底的な精製が必要とされ、細菌細胞若しくは細菌物質からのＣＰＳの精製をより困難かつ高価にする。
【００１０】
今日までに特徴づけられた肺炎球菌のｃｐｓ遺伝子座の実験は、肺炎球菌血清型３およ
び３７を除き、ＣＰＳの生合成が、莢膜多糖の重合の前の脂質結合した前駆体単位の形成を介して起こることを示す。これは、いわゆるプライミンググリコシルトランスフェラーゼ（ｐｒｉｍｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の作用により媒介される（非特許文献２２）。タイプ３  ＣＰＳと対照的に、これらのより複雑な莢膜多糖の産生は、これまで、例えば乳酸球菌属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）スピーシーズのような非病原性かつ非侵襲性細菌で、いかなる手段によっても生じられ得なかった。乳酸球菌属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）スピーシーズのような非病原性かつ非侵襲性のグラム陽性宿主細菌中で複合肺炎球菌ＣＰＳを十分な量で産生することのこの不能は、肺炎球菌および病原性かつ／若しくは侵襲性グラム陽性細菌に対する他のワクチンのより良好、より安全かつより安価な製造方法の開発を妨げる。組換えの非病原性かつ非侵襲性グラム陽性細菌中での肺炎球菌ＣＰＳのようなグラム陽性ＣＰＳの異種発現は、この問題を克服するとみられる。乳酸細菌に基づく製造方法は、通気を必要としないため、容易にスケールアップ可能、確実、低廉かつ便宜的であるという利点を有する。
【００１１】
従って、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のような、全部のグラム陽性の病原性かつ／若しくは侵襲性細菌からの複合ＣＰＳの、非病原性の非侵襲性グラム陽性宿主細菌中での異種発現を提供することが、本発明の一目的である。本発明は、脂質結合した中間体若しくは脂質結合した前駆体単位を介して合成される反復オリゴ糖単位の重合を含んでなる、複合形態のＣＰＳを包含する。
【特許文献１】米国特許第５，９４８，９００号
【特許文献２】第ＷＯ９８／３１７８６号
【非特許文献１】Ｗｈａｔｍｏｒｅら、２０００
【非特許文献２】Ｖｅｌａｓｃｏら、１９９５
【非特許文献３】Ｈｅｎｒｉｃｈｓｅｎ、１９９９
【非特許文献４】Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ（２００３）
【非特許文献５】Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ、１９９５
【非特許文献６】ＷｈｉｔｆｉｅｌｄとＲｏｂｅｒｔｓ、１９９９
【非特許文献７】Ｓｏｒｅｎｓｅｎら、１９９０
【非特許文献８】Ｇｕｉｄｏｌｉｎら、１９９４
【非特許文献９】Ｍｏｒｏｎａら、１９９７
【非特許文献１０】Ｃｉｅｓｌｅｗｉｃｚら、２００１
【非特許文献１１】Ｂｅｎｄｅｒら、２００３
【非特許文献１２】ＢｅｎｄｅｒとＹｏｔｈｅｒ、２００１
【非特許文献１３】Ｍｏｒｏｎａら、２００３
【非特許文献１４】Ｖａｎ  Ｋｒａｎｅｎｂｕｒｇら、１９９７
【非特許文献１５】Ｌａｍｏｔｈｅら、２００２
【非特許文献１６】Ｓｔｉｎｇｅｌｅら、１９９６
【非特許文献１７】Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍら、２００３
【非特許文献１８】Ｊｏｌｌｙら、２００１
【非特許文献１９】Ｊｏｌｌｙら、２００２
【非特許文献２０】Ｇｉｌｂｅｒｔら、２０００
【非特許文献２１】Ｃａｒｔｅｅら、２０００
【非特許文献２２】Ｋｒａｎｅｎｂｕｒｇら  １９９９
【発明の開示】
【００１２】
［発明の要約］
本発明は、異種複合細菌ＣＰＳを発現することが可能なグラム陽性細菌を提供する。本発明はまた、これらの非病原性かつ非侵襲性グラム陽性宿主細菌中での複合ＣＰＳをコードする遺伝子集団の発現方法にも関する。本発明は、本発明の方法および用途に適する組換えＤＮＡベクターを開示する。さらなる一局面において、本発明は、複合グラム陽性Ｃ
ＰＳ、とりわけ肺炎球菌ＣＰＳの異種製造および単離方法に関する。本方法において、ＣＰＳは本発明の非病原性の非侵襲性グラム陽性宿主細菌により産生され、そして、本発明のＤＮＡベクターを使用する異種発現および合成に際して、グラム陽性ＣＰＳ、とりわけ肺炎球菌ＣＰＳが、細胞外間隙および細菌培地に便宜的に分泌されて、ＣＰＳが宿主細菌若しくは培地から容易にかつ便宜的に単離されることを可能にする。なお別の局面において、本発明は、肺炎球菌ＣＰＳ組成物の製造方法、改変された形態のＣＰＳ、およびＣＰＳ若しくはその改変された形態を含んでなるワクチンを提供する。これらの組成物は、病原性の侵襲性グラム陽性細菌に対する免疫応答を宿主で導き出すことが可能なワクチンとしてとりわけ有用と判明するであろう。単に制限しない一例として、本発明は、本発明のＤＮＡベクターおよび方法を使用するラクトコッカス  ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）中での複合肺炎球菌タイプ１４  ＣＰＳの発現により具体的に説明される。
【００１３】
［発明の詳細な記述］
定義
遺伝子集団は、同一若しくは類似のタンパク質をコードしかつ通常は同一の染色体若しくはプラスミド上で一緒にグループ分けされ、ならびにその発現および翻訳が全体として該集団について調節される、一組の緊密に関係した遺伝子を含んでなる一配列（ｓｔｒｅｔｃｈ）のＤＮＡである。細菌では、遺伝子集団はオペロン（すなわち主として原核生物中で見出される、プロモーター、オペレーターおよび多数の構造遺伝子よりなる機能単位）ともまた称される。構造遺伝子は、一般に、数種の機能上関係する酵素をコードし、そして、それらは１種の（ポリシストロン性）ｍＲＮＡとして転写されるとは言え、それぞれは独立に翻訳される。典型的なオペロンでは、オペレーター領域はｍＲＮＡの合成のスイッチを入れる若しくは切ることにおける制御要素として作用する。その中で構造遺伝子が調節遺伝子により産生されるリプレッサーの阻害に際してそのメッセージをｍＲＮＡの形態に転写する、オペレーター遺伝子の制御下のフィードバック系よりなる遺伝子単位。しばしば、転写終止が調節される細菌オペロンのアテニュエーター（ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ）部位がここに包含される。
【００１４】
本出願で定義されるところのＤＮＡベクターは、分子クローニングの技術分野で既知のいかなるＤＮＡベクター；いかなるウイルス、ファージ、ファージミド、コスミド、ＢＡＣ、エピソーム若しくはプラスミドでもありうる。
【００１５】
配列の同一性は、配列を比較することにより決定されるところの、２種若しくはそれ以上のアミノ酸（ポリペプチド若しくはタンパク質）配列または２種若しくはそれ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列間の関係と本明細書で定義する。当該技術分野において、「同一性」は、場合によっては、こうした一連の配列間の一致により決定されるところの、アミノ酸若しくは核酸配列間の配列の関係性の程度もまた意味している。２種のアミノ酸配列間の「類似性」は、１ポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存的アミノ酸置換を第二のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。「同一性」および「類似性」は、限定されるものでないが（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｍｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．とＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．とＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９１；ならびにＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．とＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．、４８：１０７３（１９８８）に記述されるものを挙げることができる既知の方法により容易に計算し得る。
【００１６】
同一性の好ましい決定方法は、試験される配列間で最大の一致を与えるよう設計される。同一性および類似性の決定方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムに体系化されている。２配列間の同一性および類似性の好ましいコンピュータプログラム決定方法は、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７（１９８４））、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）を包含する。ＢＬＡＳＴ  ＸプログラムはＮＣＢＩおよび他の供給源から公的に入手可能である（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）。公知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムもまた同一性を決定するのに使用しうる。
【００１７】
ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータは以下を包含する。すなわち、アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）；比較マトリックス（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｍａｔｒｉｘ）：ＨｅｎｔｉｋｏｆｆとＨｅｎｔｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ．８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）からのＢＬＯＳＳＵＭ６２；ギャップペナルティ（Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ）：１２；およびギャップ長ペナルティ（Ｇａｐ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ）：４。これらのパラメータを用いて有用なプログラムは、ウィスコンシン州マディソンにあるＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐから「Ｏｇａｐ」プログラムとして公的に入手可能である。前述のパラメータは、ペプチド配列比較のためのデフォルトのパラメータである（末端ギャップについてペナルティなしと一緒に）。核酸比較のための好ましいパラメータは以下を包含する。すなわち、アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）；比較マトリックス（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｍａｔｒｉｘ）：一致（ｍａｔｃｈｅｓ）＝＋１０、不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）＝０；ギャップペナルティ（Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ）：５０；ギャップ長ペナルティ（Ｇａｐ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ）：３。ウィスコンシン州マディソンにあるＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ＧｒｏｕｐからＧａｐプログラムとして入手可能。核酸比較のためのデフォルトのパラメータが上に示される。
【００１８】
所定の（組換え）核酸若しくはポリペプチド分子と、所定の宿主生物体若しくは宿主細胞の間の関係を示すのに使用される場合の「同種の（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」という用語は、天然に、該核酸若しくはポリペプチド分子が、同一の種、好ましくは同一の変種若しくは株の宿主細胞若しくは生物体により産生されることを意味していることが理解される。宿主細胞に相同な場合、ポリペプチドをコードする核酸分子は、別のプロモーター配列、または、該当する場合は、その天然の環境で以外の別の分泌シグナル配列および／若しくは終止配列に作動可能に連結しうる。
【００１９】
核酸配列の関係性を示すのに使用される場合、「同種の」という用語は、１種の一本鎖核酸配列が相補的な一本鎖核酸配列にハイブリダイズしうることを意味している。ハイブリダイゼーションの程度は、配列間の同一性の量、ならびに、当業者に公知のところの温度および塩濃度のようなハイブリダイゼーション条件を包含する多数の要因に依存しうる。好ましくは、同一な領域は約５ｂｐ以上であり、より好ましくは同一な領域は１０ｂｐ以上である。
【００２０】
本明細書で使用されるところの「プロモーター」という用語は、遺伝子の転写の方向に関して上流に配置される１個若しくはそれ以上の遺伝子の転写を制御するように機能し、かつ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位の存在により構造的に同定される核酸フラグメント、ならびに、限定されるものでないが転写因子結合部位、リプレッサーおよび活性化タンパク質結合部位を挙げることができるいずれかの他のＤＮＡ配列、ならびにプロモーターからの転写の量を調節するように直接若しくは間接的に作用することが当業者に既知のヌクレオチドのいずれかの他の配列を指す。「構成的」プロモーターは、大部分の環境および生理学的条件下で活性であるプロモーターである。「誘導可能な」プロモーターは、特定の環境若しくは生理学的条件下でのみ活性であるプロモーターである。
【００２１】
本明細書で使用されるところの「作動可能に連結される」という用語は、機能的関係にあるポリヌクレオチド要素の連結を指す。核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係に配置される場合に「作動可能に連結される」。例えば、プロモーター若しくはエンハンサーは、それがコーディング配列の転写に影響を及ぼす場合に、該コーディング配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されるは、連結されているＤＮＡ配列が典型的に連続しており、かつ、２種のタンパク質コーディング領域を結合することが必要な場合は連続的かつ読み枠にあることを意味している。
【００２２】
ワクチン：免疫系に、腫瘍または細菌若しくはウイルスのような微生物に応答させることを意味している物質若しくは一群の物質。ワクチンは、被験体の免疫系が、感染を認識しかつそれと戦い、ならびに癌細胞若しくは微生物および／またはウイルスに感染した細胞を破壊することを助け得る。ワクチン（接種される場合に痘瘡に対する保護を提供する牛痘の感染性病原体ワクシニアにちなんで名付けられた）は、特定の病原体、通常は細菌、ウイルス若しくは毒素に対し身体を防御するようにヒト若しくは動物の免疫系を準備するのに使用される。準備する対象の感染性病原体に依存して、ワクチンは、その病原性を喪失した弱められた細菌若しくはウイルス、または類毒素（感染性病原体からの改変された弱められた毒素若しくは粒子）であり得る。免疫系はワクチン粒子を外来と認識し、それらを破壊しかつそれらを「記憶する」。該病原体の病原性バージョンが現れる場合に、免疫系は迅速な攻撃のため準備され、該病原体が蔓延しかつ莫大な数まで増殖し得る前にそれを中和する。生しかし弱められた（弱毒）ワクチンは結核、狂犬病および痘瘡に対し使用され；殺された病原体はコレラおよび腸チフスに対し使用され；類毒素はジフテリアおよび破傷風に対し使用される。
【００２３】
本発明の態様
第一の態様において、本発明は、
ａ）グラム陽性細菌種の莢膜多糖（ＣＰＳ）血清型特異的遺伝子を含んでなる第一の異種ＤＮＡフラグメント、
ｂ）共通の調節遺伝子およびａ）の細菌と異なるグラム陽性細菌から得られるプライミンググリコシルトランスフェラーゼを含んでなる第二のＤＮＡフラグメント
を含んでなり、
ｃ）ならびに、前記フラグメントの発現に際してａ）の細菌種の異種多糖を産生する、
非病原性の非侵襲性グラム陽性細菌を提供する。とりわけ、本発明は、複合型ＣＰＳを産生する病原性かつ／若しくは侵襲性グラム陽性細菌種の異種血清型特異的ｃｐｓ遺伝子を発現する、非病原性かつ／若しくは非侵襲性グラム陽性細菌を提供する。本明細で定義されるところの複合ＣＰＳは、脂質結合した中間体を介して合成される反復オリゴ糖単位のポリマーとしてｉｎ  ｖｉｖｏで産生されるＣＰＳを含んでなる。より詳細には、複合莢膜多糖は、最低４個の糖の反復多成分単位のポリマーを含んでなる。反復単位は、脂質結
合した中間体に単糖単位を連結するグリコシルトランスフェラーゼの連続的作用により、細胞内で脂質担体上で集成される。完成すれば、脂質結合した反復単位は細胞膜を横断して輸送され、そしてポリメラーゼ酵素により重合される。対照的に、単純な型のＣＰＳ、例えば肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３および３７のＣＰＳの合成は、脂質結合した中間体の介入を伴わずに、成長する多糖鎖に単糖を直接移動させる（Ｃａｒｔｅｅら、２０００）単一のグリコシルトランスフェラーゼを必要とする（Ａｒｒｅｃｕｂｉｅｔａら、１９９６；Ｌｌｕｌｌら、２００１）。加えて、このグリコシルトランスフェラーゼは、成長する多糖鎖を膜を横断して輸送するようである。
【００２４】
好ましい一態様において、本発明は、複合多糖（の少なくとも一部）を細胞外間隙、より好ましくは培地中に分泌するグラム陽性細菌を提供する。ＣＰＳの一画分は、かように、宿主細胞の細胞エンベロープ中に保持されうるが、しかしながら、好ましくは、ＣＰＳの主要な画分は培地中に分泌され、これは（連続）製造若しくは精製方法にとりわけ有利である。
【００２５】
好ましくは、異種複合ＣＰＳを発現する細菌宿主は、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸球菌属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オエノコッカス属（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス  サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）よりなる非病原性かつ／若しくは非侵襲性のグラム陽性細菌、および、当該技術分野で既知の他の非病原性かつ／若しくは非侵襲性グラム陽性細菌の群から選択される。細菌宿主細胞は、好ましくはグラム陽性細菌、より好ましくは、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸球菌属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、プロピオン酸菌属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オエノコッカス属（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）よりなる群から選択される属に属するグラム陽性細菌である。もっとも好ましくは、細菌宿主細胞は、アシドフィルス菌（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．アミロボラス（Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）、Ｌ．ババリカス（Ｌ．ｂａｖａｒｉｃｕｓ）、乳酸短杆菌（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）、カセイ菌（Ｌ．ｃａｓｅｉｉ）、Ｌ．クリスパツス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、Ｌ．クルバツス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）、デルブリュック菌（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、Ｌ．デルブリュキイ  サブスピーシーズ  ブルガリクス（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、醗酵乳酸杆菌（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、Ｌ．ガリナールム（Ｌ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｌ．ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）、Ｌ．ヘルベチカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、イエンセン菌（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、Ｌ．ジョンソニイ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、Ｌ．ミヌティス（Ｌ．ｍｉｎｕｔｉｓ）、Ｌ．ムリナス（Ｌ．ｍｕｒｉｎｕｓ）、Ｌ．パラカセイ（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）、Ｌ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｌ．ポンティス（Ｌ．ｐｏｎｔｉｓ）、Ｌ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）、Ｌ．サセイ（Ｌ．ｓａｃｅｉ）、Ｌ．サルバリウス（Ｌ．ｓａｌｖａｒｉｕｓ）、Ｌ．サンフランシスコ（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）サブスピーシーズ、Ｃ．ピシコラ（Ｃ．ｐｉｓｃｉｃｏｌａ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ロイコノストック  メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ロイコノストック  ラクティス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｌａｃｔｉｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）サブスピーシーズ、Ｌ．ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ���ｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｌ．ラクティス  サブスピーシーズ  クレモリス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ストレプトコッカス  サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）、Ｂ．ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）、Ｂ．インファンティス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）、Ｂ．ブレベ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）、Ｂ．アドレセンテ（Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｅ）、Ｂ．アニマリス（Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ）、Ｂ．ガリナールム（Ｂ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｂ．マグナム（Ｂ．ｍａｇｎｕｍ）、Ｂ．サーモフィラス（Ｂ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）よりなる群から選択される種に属する細菌である。
【００２６】
血清型特異的配列は、好ましくは、本明細書で定義されるところの複合型ＣＰＳを産生するグラム陽性細菌から得られる。好ましくは、型特異的遺伝子は、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）内の病原性かつ／若しくは侵襲性グラム陽性ＣＰＳ産生細菌の群から得られるか、または、獣医学の分野（例えば家畜、愛玩動物）に関する連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）スピーシーズのようなグラム陽性病原体でありうる。より具体的には、血清型特異的遺伝子は、限定されるものでないが、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エンテロコッカス  フェーカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス  ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ  ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス  アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス  ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、ストレプトコッカス  ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス  オラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス  エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ  ａｕｒｅｕｓ）を挙げることができる公知のグラム陽性病原体から得られる。
【００２７】
本発明の最も好ましい一態様において、かつ、実施例の節で具体的に説明されるとおり、本発明は、複合莢膜多糖を産生する肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型から得られる異種血清型特異的遺伝子から複合ＣＰＳを産生する、非病原性かつ／若しくは非侵襲性グラム陽性細菌を提供する。これらの血清型は、血清型３、３７を除く今日までに既知の全部の肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型、および、潜在的に、より単純な構造を有する異なる型のＣＰＳを産生しかつその生合成が脂質結合した前駆体単位の結合を必要としない他の肺炎球菌血清型を含んでなる。肺炎球菌血清型（デンマーク型命名法）１、２、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｆ、１２Ｂ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１６Ａ、１７Ｆ、１７Ａ、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、２０、２１、２２Ｆ、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２５Ｆ、２５Ａ、２７、２８Ｆ、２８Ａ、２９、３３Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、１０Ｆ、１１Ｄ、１２Ａ、１８Ｆ、２３Ｆ、３１、３２Ｆ、３２Ａ、３３Ｄ、３４、３５Ｆ、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３６、３８、３９、４０、４１Ｆ、４１Ａ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ｆ、４７Ａ、４８由来の型特異的遺伝子の使用は、本発明のとりわけ好ましい態様である。
【００２８】
本発明の非病原性かつ／若しくは非侵襲性グラム陽性宿主細菌は、グラム陽性細菌のＥＰＳ若しくはＣＰＳ遺伝子集団から得られる共通の調節ＥＰＳ若しくはＣＰＳ遺伝子を含んでなりかつ発現する。好ましくは、前記共通の調節ＥＰＳ若しくはＣＰＳ遺伝子は、最低１種の共通の調節遺伝子ｅｐｓＡ（若しくはｃｐｓＣ）、ｅｐｓＢ（若しくはｃｐｓＤ）、および場合によってはｅｐｓＣ（若しくはｃｐｓＢ）を含んでなる。好ましくは、共通の調節ＥＰＳ若しくはＣＰＳ遺伝子は、ｅｐｓＤ若しくはｃｐｓＥ遺伝子によりコードされる、グラム陽性ＥＰＳ若しくはＣＰＳ遺伝子集団のプライミンググリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）もまた含んでなる。
【００２９】
ＥｐｓＡ、ＥｐｓＢ、ＥｐｓＣおよびＥｐｓＤホモログについていくつかの特徴的特徴が存在する。ＥｐｓＣホモログは、一般に、保存されたＰＨＰ（ポリメラーゼおよびヒスチジノールホスファターゼ）モチーフを含有する（ＡｒａｖｉｎｄとＫｏｏｎｉｎ、１９９８）。ＥｐｓＡホモログは２個の保存された膜貫通セグメントを含有し、また、ＥｐｓＢは保存されたヌクレオチド結合モチーフを含有する（ＦａｔｈとＫｏｌｔｅｒ、１９９３）。ＥｐｓＤのようなホスホグリコシルトランスフェラーゼは、（Ｗａｎｇら、１９９６；Ｖａｎ  Ｋｒａｎｅｎｂｕｒｇら  １９９９）により以前に記述された、保存されたＡ、ＢおよびＣブロックの存在により認識され得る。このグリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）は、第一の糖を脂質担体（最もありそうにはウンデカプレニルリン酸）に連結し、かつ、グラム陽性菌の間で保存され（最低３０％の同一性）、そして従ってプライミンググリコシルトランスフェラーゼと呼称される。
【００３０】
好ましくは、本発明のグラム陽性宿主細胞により発現される、ｅｐｓＡ遺伝子にコードされるタンパク質は、ラクトコッカス  ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ＥｐｓＡと最低２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０若しくは９０％のアミノ酸同一性を共有し、ｅｐｓＢ若しくはｅｐｓＣにコードされるタンパク質は、ラクトコッカス  ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ＥｐｓＢと最低２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０若しくは９０％のアミノ酸同一性を共有し、そして、ｅｐｓＤにコードされるタンパク質は、ラクトコッカス  ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ＥｐｓＤと最低３０、４０、５０、６０、７０、８０若しくは９０％のアミノ酸同一性を共有する。Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ＥｐｓＡ、ＥｐｓＢ、ＥｐｓＣおよびＥｐｓＤのアミノ酸配列は、それぞれ配列表の配列番号１ないし４に提供され、かつ、Ｖａｎ  Ｋｒａｎｅｎｂｕｒｇら（１９９７）により公表されている。Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベース番号は、ＥｐｓＡ、ＥｐｓＢ、ＥｐｓＣおよびＥｐｓＤについてそれぞれＯ０６０２９、Ｏ０６０３０、Ｏ０６０３１、Ｏ０６０３２である。
【００３１】
別の局面において、本発明は、非病原性かつ／若しくは非侵襲性グラム陽性細菌宿主細胞中でのグラム陽性複合ＣＰＳ血清型特異的遺伝子の異種発現を賦与することが可能なＤＮＡベクターを提供する。該ＤＮＡベクターは、グラム陽性複合ＣＰＳ血清型特異的ｃｐｓ遺伝子をコードするＤＮＡフラグメントを含んでなり、ここで、ｃｐｓ遺伝子の１種若しくはそれ以上は、莢膜多糖遺伝子集団から得られる型特異的遺伝子よりなる群から選択される。
【００３２】
前記血清型特異的遺伝子は、多糖生合成遺伝子集団の共通の調節遺伝子のすぐ下流の２０ｋｂの領域内に位置する。該血清型特異的領域は、一般に、グリコシルトランスフェラーゼ、すなわち９〜１４個の予測される膜貫通セグメントをもつ高度に疎水性のポリメラーゼ、および、一般に１２〜１４個の膜貫通ドメインを含有する反復単位の輸送に関与するタンパク質をコードする。該型特異的領域によりコードされるグリコシルトランスフェラーゼは、ヌクレオチド二リン酸糖（ｄｉｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｕｇａｒ）、ヌクレオチド一リン酸糖および糖リン酸であり得（ＥＣ  ２．４．１．ｘ）、そして、Ｃａｍｐｂｅｌｌら（１９９７）により最初に記述されたところの別個の配列に基づくファミリーに分類され得る。
【００３３】
場合によっては、かつ、好ましくは、血清型特異的ｃｐｓ遺伝子を含んでなるＤＮＡ配列の血清型特異的フラグメントは、プライミンググリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含有しない。本発明のベクターは、共通の調節ｅｐｓ／ｃｐｓ遺伝子を含むか若しくは提供しても若しくはしなくてもよい。好ましくは、グラム陽性血清型特異的ｃｐｓ遺伝子を含んでなる本発明のＤＮＡベクターは、機能的な共通の調節ｅｐｓ／ｃｐｓ遺伝子を含まず、かつ、ｅｐｓＡ／ｃｐｓＣ、ｅｐｓＢ／ｃｐｓＤ、ｅｐｓＣ／ｃｐｓＢ、および／若しくはｅｐｓＤ／ｃｐｓＥの遺伝子発現を提供しない。
【００３４】
本発明のベクターで発現される型特異的遺伝子は、ｃｐｓＥ、ｃｐｓＦ、ｃｐｓＧ、ｃｐｓＨ、ｃｐｓＩ、ｃｐｓＪ、ｃｐｓＫ、ｃｐｓＬ若しくはそれらのホモログよりなる群から選択しうる。好ましくは、ＣＰＳ産生遺伝子集団の全部の型特異的遺伝子、若しくはその発現がＣＰＳ産生に不可欠である全部の型特異的遺伝子を、本発明のＤＮＡベクターにクローン化しかつそれから発現させる。該ベクターは、ファージ若しくはウイルス、ファージミド、コスミドまたはＢＡＣ（細菌人工染色体）ベクターのような当該技術分野で既知のいずれのＤＮＡベクターであってもよく、かつ、好ましくはプラスミドである。相同的組換え、遺伝子置換および／若しくはゲノム組込みに適するベクターもまた本発明の範囲内に包含される。型特異的遺伝子は、例えば選ばれたＤＮＡベクターのクローニングサイズの制限を克服するために、１宿主細胞内の数種の異なるベクターからもまた発現させうる。例えば転写制御配列の選択、ベクターのバックボーン、選択可能なマーカーをコードする配列、複製起点、エンハンサー要素などのようなベクター要素の選択は、転写および翻訳が達成されるべきである宿主細胞に依存し、そして当業者により容易に決定される。原則として、宿主細胞中で活性であるいかなる転写調節エレメントも使用することができ、また、それは宿主細胞に対し同種若しくは異種でありうる。グラム陽性細菌のような原核生物細胞中での効率的転写のためには、好ましくは、原核生物転写制御配列を使用すべきである一方、真核生物宿主細胞中での転写および翻訳のためには、好ましくは真核生物起源の要素を使用する。一態様において、好ましくは、宿主細胞に対し同種であるプロモーターを使用する。強力な構成的プロモーターおよび誘導後に強く誘導されるプロモーターがとりわけ好ましい。
【００３５】
本発明の高度に好ましい一態様において、型特異的ｃｐｓ遺伝子は、本明細書で以前に定義されたとおり合成される複合ＣＰＳを産生する、ＣＰＳ産生肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の群から；反復する脂質結合した前駆体オリゴ糖単位の重合により得られる。こうした型特異的遺伝子は、肺炎球菌血清型（デンマーク型命名法）１、２、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｆ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｆ、１２Ｂ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１６Ａ、１７Ｆ、１７Ａ、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、２０、２１、２２Ｆ、２２Ａ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２５Ｆ、２５Ａ、２７、２８Ｆ、２８Ａ、２９、３３Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、１０Ｆ、１１Ｄ、１２Ａ、１８Ｆ、２３Ｆ、３１、３２Ｆ、３２Ａ、３３Ｄ、３４、３５Ｆ、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３６、３８、３９、４０、４１Ｆ、４１Ａ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ｆ、４７Ａ、４８から得ることができ、そしてとりわけ好ましい。
【００３６】
本発明の好ましい一態様において、ＤＮＡベクター中の血清型特異的ｃｐｓ遺伝子は、ＥＰＳ若しくはＣＰＳ遺伝子集団制御配列の転写制御下にある。前記ＥＰＳ若しくはＣＰＳ遺伝子集団制御配列は、該血清型特異的遺伝子を得た遺伝子集団と異なる遺伝子集団からであることができ、そして、好ましくは、使用される非病原性かつ／若しくは非侵襲性
グラム陽性細菌宿主細胞からのＥＰＳ若しくはＣＰＳ遺伝子集団制御配列、および／または共通の調節ｅｐｓ若しくはｃｐｓ遺伝子を得た遺伝子集団である。
【００３７】
別の好ましい態様において、血清型特異的ｃｐｓ遺伝子は、グラム陽性ＥＰＳ若しくはＣＰＳ遺伝子集団制御配列の制御下のポリシストロン性転写単位内に含まれ、場合によっては該集団中の血清型特異的ｃｐｓ若しくはｅｐｓ遺伝子を置換若しくは部分的に置換する。しかしながら、ＥＰＳ若しくはＣＰＳ遺伝子集団制御配列を別にして、当該技術分野で既知のプロモーター、エンハンサー、アテニュエーター、インスレーター、ターミネーターのような他の細菌、ウイルス、人工、若しくはなお哺乳動物の制御配列もまた有利に適用されうる。クローニングおよび細菌形質転換の方法、ＤＮＡベクター、ならびに制御配列の使用は当業者に公知であり、そして、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、２００４（引用することにより本明細書に組み込まれる）に見出されうる。
【００３８】
本発明のグラム陽性血清型特異的遺伝子を含んでなるＤＮＡベクターは、好ましくは、それ自体当該技術分野で既知の手段（例えば形質転換若しくは形質導入）により、該ＤＮＡベクター中の血清型特異的ｃｐｓ遺伝子と異なる種若しくは血清型の非病原性の非侵襲性グラム陽性宿主細菌に移入される。
【００３９】
別の局面において、本発明は、
ａ）ＣＰＳ産生に伝導性の条件下で、本発明のベクターおよび／若しくはＤＮＡフラグメントを含んでなる本発明の細菌を培養すること、
ｂ）産生された複合ＣＰＳの細菌細胞からの回収
の段階を含んでなる、非病原性の非侵襲性グラム陽性細菌中での複合莢膜多糖（ＣＰＳ）の異種製造方法を提供する。好ましい一態様において、非病原性かつ／若しくは非侵襲性グラム陽性細菌宿主細胞により産生されるＣＰＳは細胞外環境に分泌され、そして細胞エンベロープに保持されないか若しくは部分的にのみ保持されて、産生された細胞外多糖が細菌培地から回収されることを可能にする。ＥＰＳ／ＣＰＳの精製方法は当該技術分野で既知であり、そして、例えばＬｏｏｉｊｅｓｔｅｉｊｎとＨｕｇｅｎｈｏｌｔｚ（１９９９）若しくはＧｏｎｃａｌｖｅｓら（２００３）に見出しうる。
【００４０】
なお別の態様において、本発明は、莢膜多糖、好ましくは、本発明の非病原性かつ／若しくは侵襲性のグラム陽性細菌宿主細胞により産生されかつそれから得られた、病原性かつ／若しくは侵襲性のグラム陽性細菌からの莢膜多糖を含んでなる製薬学的組成物を提供する。
【００４１】
第一の態様において、本発明の製薬学的若しくは栄養補給（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）組成物は、例えば生きている弱毒化された生存可能な、若しくは例えばホルマリン処理の熱処理により生存不可能な形態の、本発明の非病原性かつ／若しくは非侵襲性細菌細胞を含みうる。細菌を含んでなる製薬学的に許容できる組成物は、１種若しくはそれ以上の当該技術分野で既知の賦形剤若しくは免疫原性アジュバントを含みうる。製薬学的に許容できるアジュバントは当業者に既知であり、そして、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎにより編．Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、２００４のような教科書に見出しうる。
【００４２】
別の態様において、本発明の製薬学的に許容できる組成物は、単離かつ／若しくは精製された複合多糖、好ましくは、本明細書に記述されるところの非病原性の非侵襲性グラム
陽性細菌宿主細胞で産生されかつそれから得られる、肺炎球菌ＣＰＳのような病原性かつ／若しくは侵襲性グラム陽性細菌の莢膜多糖を含みうる。本発明の製薬学的組成物は、ワクチン接種若しくは免疫化の技術分野で既知の１種若しくはそれ以上の賦形剤および／若しくは免疫原性アジュバントをさらに含みうる。
【００４３】
好ましくは、本発明の製薬学的組成物は、ワクチン接種若しくは免疫化の目的上組成物として適用されるのに適する組成物である。一態様において、こうした組成物若しくはワクチン中で、ＣＰＳ分子は、例えば、例えば破傷風類毒素、ジフテリア類毒素、髄膜炎菌外膜タンパク質、ジフテリアタンパク質ＣＲＭ１９７、および当該技術分野で既知の他の免疫原分子を包含する抗原性タンパク質のような免疫学的分子に共有結合される。本発明の組成物中で適して適用されうる免疫原性タンパク質およびアジュバント分子は、ポリルＩＣ、ＬＰＳ、リピドＡ、ポリ−Ａ−ポリ−Ｕ、ＧＥＲＢＵ（Ｒ）、ＲＩＢＩ（Ｒ）、Ｐａｍ３（Ｒ）、Ｓｐｅｃｏｌ（Ｒ）、フロイント、Ｔｉｔｅｒｍａｘ（Ｒ）、および当該技術分野で既知かつ使用される他のアジュバントである。
【００４４】
本発明の非病原性かつ／若しくは非侵襲性グラム陽性細菌から得られるグラム陽性ＣＰＳを含んでなる組成物およびワクチンは、ワクチン接種の技術分野で既知の方法に従い、経口で若しくは鼻内に若しくは静脈内に投与しうる。本発明の肺炎球菌ワクチンは、例えば米国特許第６，２２４，８８０号明細書およびその中の参考文献に記述されるとおり投与しうる。
［実施例］
【実施例１】
【００４５】
Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）中での肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１４のＣＰＳの合成および分泌
【００４６】
材料および方法
細菌株および増殖条件
本研究で使用した全部の細胞株およびプラスミドを表１に列挙する。Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）は、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ブドウ糖を補充したＭ１７ブロス（Ｍｅｒｃｋ、独国ダルムシュタット）若しくは２％（ｗｔ／ｖｏｌ）ブドウ糖を補充した既知組成培地（ＬｏｏｉｊｅｓｔｅｉｊｎとＨｕｇｅｎｈｏｌｔｚ、１９９９）中、３０℃で通気を伴わずに増殖させた。クローニング宿主とした使用した大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）は、トリプトン−酵母（ＴＹ）ブロス（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）中３７℃で通気を伴い増殖させた。適切な場合は、培地にエリスロマイシン（５μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍｌ）若しくはテトラサイクリン（２．５μｇ／ｍｌ）を補充した。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
ＤＮＡ操作および配列分析
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミドＤＮＡの小スケール単離および標準的組換えＤＮＡ技術を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）により記述されるとおり実施した。
【００４９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の大スケールプラスミド単離のため、ＪｅｔＳｔａｒカラム（Ｇｅｎｏｍｅｄ  ＧｍｂＨ、独国バド・オーベルハウゼン）を、製造元の説明書に従って使用した。Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）プラスミドＤＮＡの単離および形質転換は以前に記述された（ｄｅ  Ｖｏｓら、１９８９）とおり実施した。
【００５０】
プラスミドの構築
ｅｐｓＡＢＣＤ遺伝子のインフレーム欠失を含有する、Ｂ４０  ｅｐｓプラスミドｐＮＺ４１３０の誘導体を構築した。プライマーの組合せＥＰＳＲＦ１／ＥＰＳＡＲ１およびＥＰＳＤＦ２／ＥＰＳＦＲ２、鋳型としてのｐＮＺ４０３０、およびＰｗｏポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、独国マンハイム）を使用して、１ｋｂアンプリコンをＰＣＲにより得た。２種の得られたＰＣＲ産物を、ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ（フラグメント１）若しくはＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ（フラグメント２）で消化し、そして、ＸｂａＩ／ＫｐｎＩで消化したｐＵＣ１８ｅｒｙに単一ライゲーション段階でクローン化して、ｐＮＺ４２２２をもたらした。プラスミドｐＮＺ４２２２をＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ＮＺ９０００に形質転換し（ｐＮＺ４１３０）、そして、単一交差プラスミド組込み体を、エリスロマイシンおよびテトラサイクリンを含有するプレート上で選択した。ｅｐｓＲＡ遺伝子座への組込みから生じる１個の単一のＥｒｙＲ／ＴｅｔＲコロニーを得た。この組込み体を、テトラサイクリンのみを含有する培地中で培養し、そして、ＴｅｔＲコロニーを、テトラサイクリン若しくはエリスロマイシンおよびテトラサイクリン双方を含有するＧＭ１７プレート上でのレプリカプレーティングにより、４０世代後にスクリーニングした。エリスロマイシン感受性（ＥｒｙＳ）でありかつ粘着性の（ｒｏｐｙ）表現型を喪失していた１個の単一コロニーを得た。正しい領域の欠失をＰＣＲおよびサザンブロッティングにより確認し、そして該プラスミドをｐＮＺ４２００と呼称した。加えて、０．９ｋｂのフラグメントを、プライマーＥＰＳＡＮＣＯＩおよびＥＰＳＦＲ２を使用してｐＮＺ４２００から増幅し、それを配列決定して、欠失がインフレームであったことを確認した。
【００５１】
Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）中での多糖産生は、多糖生合成遺伝子をコードするプラスミドのコピー数を増大させることにより上昇させ得る（Ｂｏｅｌｓら、２００３）。従って、ｅｐｓプロモーターを包含するプラスミドｐＮＺ４２００からのΔｅｐｓＡＢＣＤ遺伝子集団全体を、高コピーベクターｐＩＬ２５３にクローン化した。これは、ｐＮＺ４２００からの１４ｋｂのΔｅｐｓＡＢＣＤ遺伝子集団をＮｃｏＩフラグメントとして切り出すこと、およびＮｃｏＩ部位を保有するｐＩＬ２５３中への該フラグメントのその後のクローニングにより達成された（Ｂｏｅｌｓら、２００３）。生じるプラスミドをｐＮＺ４２２０と呼称した。
【００５２】
ｃｐｓ１４ＦＧＨＩＪＫＬ遺伝子をコードする６．８ｋｂのフラグメントを、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１４のゲノムＤＮＡから２回の別個のＰＣＲ反応で増幅した。ｃｐｓ１４ＪＫＬをコードする３．１ｋｂのフラグメントを、プライマーｃｐｓ１４Ｊｆおよびｒｅｖ−ｃｐｓ１４Ｌ、ならびにＰｆｘ  Ｐｌａｔｉｎｕｍポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、以下のＰＣＲ条件、すなわち、９４℃で１５秒、３０秒４６℃、６８℃で４．５分で増幅した。ｃｐｓ１４ＦＧＨＩＪをコードする３．９ｋｂのアンプリコンを、プライマーＦＷＤ−ＣＰＳ１４ＦおよびＣＰＳ１４Ｊｒ、ならびにＰＣＲプログラム：９４℃で１５秒、４０℃で１分、６８℃で４．５分を使用して得た。ＢａｍＨＩ（プライマーＦＷＤ−ＣＰＳ１４ＦおよびＲＥＶ−ＣＰＳ１４Ｌに導入される部位）ならびにＨｉｎｄＩＩＩ（ｃｐｓ１４Ｊ遺伝子中に存在する部位）での消化後、２個のＰＣＲフラグメントをｐＮＺ８４にサブクローニングして、それぞれｐＮＺ８４ｃｐｓＦ−ＪおよびｐＮＺ８４ｃｐｓＪ−Ｌをもたらし、そして、該挿入物を配列決定により確認した。該２フラグメントをＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして再単離し、そしてＢａｍＨＩで消化したｐＮＺ８４に単一ライゲーション反応でクローン化して、ｐＮＺ８４ｃｐｓＦ−Ｌをもたらした。ｃｐｓ１４ＦＧＨＩＪＫＬ遺伝子をコードする６．８ｋｂのフラグメントを、ＢａｍＨＩでの消化によりｐＮＺ８４ｃｐｓＦ−Ｌから再単離し、そして、ｐＮＺ４２３０を生じる同様に消化したｐＮＺ４２２０にクローン化することによりＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）に導入した。ｃｐｓ１４遺伝子の正しい向きを、ＰＣＲおよびｐＮＺ４２３０の消化の双方により確認した。
【００５３】
ｃｐｓ１４遺伝子集団のｃｐｓ１４ＢＣＤＥ遺伝子を別個のプラスミドにクローン化した。従って、ｃｐｓ１４ＣＤ遺伝子、ならびに切断型ｃｐｓ１４Ｂ（５’端切断）およびｃｐｓ１４Ｅ（３’端切断）遺伝子を含有する２．１ｋｂのフラグメントを、ＳｐｈＩおよびＸｂａＩでの消化によりｐＭＫ１０４から切り出し、そして、ｐＮＺ８０２０にクローン化して、ｐＮＺ４２３３をもたらした。ｃｐｓ１４Ｅの３’端を、ＸｂａＩ（ｃｐｓ１４Ｅ遺伝子およびｐＮＺ４０９０のマルチクローニング部位に存在する部位）での消化によりｐＮＺ４０９０から切り出し、そしてｐＮＺ４２３３にクローン化した。生じるプラスミドをｐＮＺ４２３５と呼称した。ｃｐｓ１４Ｂ遺伝子は、プライマーＣＰＳ１４ＢｆおよびＣＰＳ１４Ｂｒを使用して、染色体の肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＤＮＡから増幅した。このＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩで消化し、そして同様に消化したｐＮＺ８０２０にクローン化して、ｐＮＺ４２３１をもたらした。ｃｐｓ１４Ｂの５’端を、ｃｐｓ１４Ｂ遺伝子中に存在する内的ＳａｃＩ制限部位、およびｐＮＺ４２３１のマルチクローニング部位からのＢａｍＨＩ部位を使用して、０．６ｋｂのフラグメントとしてｐＮＺ４２３５に導入して、ｐＮＺ４２３７をもたらした。ｐＮＺ４２３８の構築のため、ｃｐｓ１４ＢＣＤを包含する２．２ｋｂのＰＣＲフラグメントを、プライマーＣＰＳ１４ＤｅｃｏおよびＰＥＰＳ０５４ｆならびにＰｗｏポリメラーゼを使用してｐＮＺ４２３７から増幅した。このアンプリコンをその後、切断型ｃｐｓ１４Ｅ遺伝子を保有するＳｍａＩ部位ｐＮＺ４０９０にクローン化し、そして、挿入物の正しい向きをＰＣＲにより確認した。プラスミドｐＮＺ４２２１を、Ｅｃｌ１３６ＩＩ消化、ならびに、ｐＮＺ４２０６からの４１５ｂｐのｅｐｓＤフラグメントのその後の除去、およびＥｃｌ１３６ＩＩで消化したプラスミドへのｃｐｓ１４ＥのＰＣＲフラグメント（プライマーＣＰＳ１４ＥＦ／ＣＰＳ１４ＥＲ）の挿入を介して、構築した。
【００５４】
【表２】
2008523804.tif 000003
【００５５】
イムノブロット分析
血清型１４の多糖産生を、免疫検出を使用することにより、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）培養物の細胞ペレットおよび上清で分析した。細胞をＭ１７培地（２％ブドウ糖）中で０．１５のＯＤ６００まで増殖させ、そして２培養物に分注し、その一方を１ｎｇ／ｍｌのニシンで誘導した。誘導したおよび誘導しない培養物の双方を一夜増殖させ、そして細胞を遠心分離によりペレットにした。１０μｌの上清をニトロセルロースフィルター上にピペットで移した。細胞ペレットをリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、かつ、ＯＤ６００＝１まで再懸濁し、そして１０μｌの再懸濁した細胞をニトロセルロースフィルター上にピペットで移した。フィルターを、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）中１％ウシ血清アルブミン中、室温で１時間ブロッキングした。ＰＳ１４の検出のため、フィルターを、一次抗血清としての１０００倍希釈の莢膜血清型１４多糖に対する抗血清（Ｓｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、デンマーク・コペンハーゲン）とともに室温で一夜インキュベートした。フィルターをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、そしてその後、２０００倍希釈のワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ウサギ免疫グロブリン（Ｐｉｅｒｃｅ、米国ロックフォード）ととともにインキュベートした。フィルターをＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、次いでＰＢＳを使用して１回洗浄した。複合物を、製造元の説明書に従ってＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して可視化した。
【００５６】
チロシンリン酸化されたＣｐｓ１４ＤおよびＥｐｓＢの分析のため、細胞を、１％ブドウ糖を補充したＭ１７培地中で増殖させた。細胞を、ＯＤ６００＝０．１５〜０．２０でニシンＺの添加により誘導した。細胞を誘導の３〜４時間後に遠心分離により収集し、そしてペレットを１０ｍＭトリス［ｐＨ８．０］、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡに再懸濁した。細胞を、ジルコニウムガラスビーズの存在下で機械的に破壊した（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｅｒら、１９９３）。細胞破片を遠心分離により除去し、そして細胞抽出液（ＣＥ）中のタンパク質を、２倍濃縮Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０）中で１０分間沸騰させた。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％ゲル）により分離し、そして電気ブロッティング（ＬＫＢ  ２０５１  Ｍｉｄｇｅｔ  Ｍｕｌｔｉｂｌｏｔ）によりニトロセルロースメンブレンに転写した。メンブレンを、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＴＢＳ−Ｔ）および２％ＢＳＡを含むトリス緩衝生理的食塩水（１００ｍＭトリス［ｐＨ７．４］、０．９％ＮａＣｌ）を使用して室温で１時間ブロッキングした。モノクローナル抗ホスホチロシン抗血清（ＰＴ−６６、Ｓｉｇｍａ）を、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０および０．５％  ＢＳＡを含むＴＢＳ中１０００倍希釈で使用し、そして一夜インキュベートした。メンブレンを上述されたとおり洗浄し、そして、２，０００倍希釈のワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｐｉｅｒｃｅ）とともにインキュベートした。二次抗体の結合を、クロロナフトールおよびＨ２Ｏ２を使用して可視化した。
【００５７】
多糖の単離および分析
細胞は、２％ブドウ糖を含有するＣＤＭ中でＯＤ６００＝０．１５〜０．２０まで増殖させた。培養物をその後２本のチューブに分割し、そして一方のチューブを１ｎｇ／ｍｌのニシンの添加により誘導した一方、他方のチューブは誘導しなかった。誘導したおよび誘導しない細胞の双方を一夜インキュベートした。多糖を、ＬｏｏｉｊｅｓｔｅｉｊｎとＨｕｇｅｎｈｏｌｔｚ（１９９９）により記述されたとおり培養物から単離した。タイプ１４の多糖を産生する株について、上述された方法、および莢膜多糖の単離についてＫａｒｌｓｓｏｎら（１９９８）により記述されたプロトコルの双方を使用した。
【００５８】
ＮＭＲ分析
多糖を、ｐＮＺ４２０６およびｐＮＺ４２３０をもつＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ＮＺ９０００の１Ｌ培養物から単離した。細胞を上述されたとおり誘導し、そして、多糖を遠心分離（１０分、１５，０００×ｇ）により上清から収集した。上清を、１０Ｍ
ＮａＯＨを添加することによりｐＨ７に調節し、そして限外濾過（ＭＷＣＯ  ２０，０００Ｄａ）により濃縮した。濃縮した多糖を流水道水に対し透析し、そして、４０ｍＭトリス［ｐＨ８．０］、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  ＣａＣｌ２中６００μｇのプロテイナーゼＫの添加、ならびに５５℃での一夜インキュベーション段階によりタンパク質を除去した。プロテイナーゼ処理した多糖溶液を流水道水に対し一夜透析し、凍結乾燥し、そして０．１Ｍ  ＮａＮＯ３に溶解した。該溶液を、ＴＳＫゲル６０００  ＰＷカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、および溶離液としての０．１Ｍ  ＮａＮＯ３を使用するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分画した。カラムからの溶離液を、屈折率（ＲＩ）および２８０ｎｍでのＵＶ検出の双方によりオンラインで分析した。ＥＰＳ含有画分を収集し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水に対し透析しかつ凍結乾燥した。凍結乾燥したサンプルを９９．９原子％のＤ２Ｏに溶解し、そして、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）で産生されたタイプ１４多糖および肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国マナサス）から精製したタイプ１４多糖のＮＭＲスペクトルを４００ＭＨｚで測定した。
【００５９】
結果
本発明を具体的に説明するため、その生合成を指図する完全な遺伝子集団が既知である（Ｋｏｌｋｍａｎら、１９９７）肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１４からのＣＰＳを、本実施例におけるラクトコッカス  ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｓ  ｌａｃｔｉｓ）のような非病原性の非侵襲性グラム陽性宿主細胞中で産生させた。
【００６０】
タイプ１４多糖は、各Ｎ−アセチルグルコサミン残基のＣ４に連結されたβ（１→４）−Ｇａｌｐ残基を伴う、→６）−β−Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃ−（１→３）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→反復単位の直鎖状バックボーンよりなる。完全な遺伝子集団は、単一の転写単位として転写される１２種の遺伝子（ｃｐｓ１４Ａからｃｐｓ１４Ｌ）を包含する（Ｋｏｌｋｍａｎら、１９９７）。ｃｐｓ１４遺伝子集団は、ポリメラーゼおよび反復単位輸送体を包含する型特異的遺伝子により隣接される共通領域をもつ典型的なカセット様構造に構成されている。
【００６１】
本発明のＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）での複合肺炎球菌ＣＰＳ産生は、３種の共通の肺炎球菌遺伝子（ｅｐｓＡＢＣ）およびグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｅｐｓＤを１プラスミド上に、ならびに残存する型特異的遺伝子を第二のプラスミド上にクローン化することにより達成される。興味深いことに、ｅｐｓ  Ｂ４０共通遺伝子とともにのタイプ１４特異的遺伝子の発現のみが、タイプ１４多糖産生をもたらした。
【００６２】
Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）での肺炎球菌タイプ１４多糖の発現系のクローニング
タイプ１４多糖（多糖）の合成のため、糖ヌクレオチドＵＤＰ−Ｇａｌ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、およびＵＤＰ−Ｇｌｃを構成要素として使用する（Ｋｏｌｋｍａｎら、１９９７）。これらの活性化糖は、中心炭素代謝の中間体からＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）中で形成される（ｗｗｗ．ｋｅｇｇ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ）。Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）でのタイプ１４多糖の発現のため、われわれは、われわれの実験室でｅｐｓ遺伝子の同種および異種双方の発現にＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）で成功することが既に判明した（Ｎｉｅｒｏｐ  Ｇｒｏｏｔら、２００４）発現系を改変した。図１は、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）での乳酸球菌および肺炎球菌の多糖産生に使用されるプラスミドの図式的概観を示す。この発現系では、細菌中の多糖生合成遺伝子集団の保存されたカセット様構成を使用する。ｃｐｓ１４遺伝子集団を２種の別個のプラスミドに分割する。グリコシルトランスフェラーゼおよびポリメラーゼならびに輸送タンパク質をコードするｃｐｓ１４型特異的遺伝子を、ｐＮＺ４２２０由来のプラスミドにクローン化する。従って、乳酸球菌ｅｐｓ遺伝子集団からのｅｐｓＥＦＧＨＩＪＫＬｏｒｆＹ遺伝子を、隣接するＢａｍＨＩ制限部位を使用してプラスミドｐＮＺ４２２０から切り出し、ｅｐｓプロモーター配列およびｅｐｓＲＸを残した。６．８ｋｂのフラグメントを、ＢａｍＨＩでの消化によりプラスミドｐＮＺ８４Ｆ−Ｌ（材料および方法）から切り出し、そして、同様に消化したｐＮＺ４２２０に連結して、プラスミドｐＮＺ４２３０をもたらした。ｐＮＺ４２３０中で、ｃｐｓ１４型特異的遺伝子の発現は、乳酸球菌ｅｐｓ遺伝子集団の構成的プロモーターの制御下にある。乳酸球菌のｅｐｓおよび肺炎球菌のｃｐｓ１４双方の遺伝子集団の調節遺伝子およびプライミンググリコシルトランスフェラーゼをコードする保存された領域を、ニシンで誘導可能なプロモーターの制御下にクローン化して、ｐＮＺ４２０６（ｅｐｓＡＢＣＤ）およびｐＮＺ４２３７（ｃｐｓ１４ＢＣＤＥ）をもたらした。これゆえに、ｃｐｓ遺伝子集団の転写活性化に関与していることが期待される（Ｃｉｅｓｌｅｗｉｃｚら（２００１）ｃｐｓ１４Ａは、本系に存在しない。本系でのｃｐｓ１４遺伝子の発現は、構成的Ｂ４０  ｅｐｓプロモーターおよびニシンで誘導可能なプロモーターにより駆動される。Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）のｅｐｓＤ変異体へのｃｐｓ１４Ｅ遺伝子の導入がＥＰＳ産生を復帰し得ることが以前に示された（Ｖａｎ  Ｋｒａｎｅｎｂｕｒｇら、１９９９）。グリコシルトランスフェラーゼＥｐｓＤおよびＣｐｓ１４Ｅ双方がブドウ糖に対する特異性を有するためである（ｖａｎ  Ｋｒａｎｅｎｂｕｒｇら、１９９９；Ｋｏｌｋｍａｎら、１９９７）。プラスミドｐＮＺ４２０６およびｐＮＺ４２３７を、ｐＮＺ４２３０をもつＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）に形質転換した。
【００６３】
Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）でのタイプ１４多糖産生の免疫検出
ｐＮＺ４２０６（ｅｐｓＡＢＣＤ）若しくはｐＮＺ４２３７（ｃｐｓ１４ＢＣＤＥ）いずれかとともにｐＮＺ４２３０をもつＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）の誘導したおよび誘導しない培養物を、免疫検出を使用して、タイプ１４多糖産生について試験した。加えて、構築物ｐＮＺ４２０９（ｅｐｓＡＢΔＹＹＹＹＣＤ）、ｐＮＺ４２０８（ｅｐｓＡＢＤ）、ｐＮＺ４２３５（ｃｐｓ１４ＣＤＥ）、ｐＮＺ４２３８（ｃｐｓ１４ＢＣＤＥ’）、およびｐＮＺ４２２１（ｅｐｓＡＢＣ＋ｃｐｓ１４Ｅ）を、ｐＮＺ４２３０とともに試験した。
【００６４】
陰性対照として、ｐＮＺ４２３０をもつ株ＮＺ９０００、およびｐＮＺ４２０６とともにｐＮＺ４２２０をもつＮＺ９０００を使用した。ニシンで誘導したおよび誘導しない細胞の双方を、２％ブドウ糖を補充したＭ１７培地中で一夜増殖させた。細胞を遠心分離し、そして、上清および細胞双方をニトロセルロースメンブレンにスポットし、そして、多糖の存在を、タイプ１４特異的抗血清を使用して検出した。強いシグナルが、ｐＮＺ４２０６、ｐＮＺ４２０８およびｐＮＺ４２０９とともにｐＮＺ４２３０をもつ誘導したＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）株の上清、ならびに、誘導しない細胞でより弱い程度まで検出された。誘導されない細胞でのこのシグナルは、ｎｉｓＡプロモーターのリーク（ｌｅａｋａｇｅ）から生じる。ｐＮＺ４２３０のみをもつレーン２の陰性対照株についてシグナルが検出されなかったためである。レーン１のＢ４０−ＥＰＳ産生株ではシグナルは検出されず、該血清がタイプ１４多糖を特異的に検出することを示す。驚くべきことに、ｐＮＺ２４３７とともにｐＮＺ４２３０をもつＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）株についてシグナルが検出されなかった（レーン７）。プラスミドｐＮＺ４２３７は肺炎球菌ｃｐｓ１４遺伝子集団からの調節遺伝子を含有するため、これは期待されなかった。レーン５の構築物ｐＮＺ４２０８はｅｐｓＣ遺伝子を欠くが、しかし、この構築物をもつＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）はタイプ１４多糖を産生する。これは、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）中で、多糖産生が機能的ｅｐｓＣ遺伝子の存在に厳密に依存しないことを示す。ＥｐｓＢのＣ末端の７アミノ酸の欠失（レーン４の構築物ｐＮＺ４２０９）は、産生される多糖の量を低下させるようである。興味深いことに、タイプ１４多糖は主として培養物上清に放出された。弱いシグナルが、ｐＮＺ４２３０／ｐＮＺ４２０６をもつＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）の細胞上清で検出され、それは、最もありそうには洗浄段階の間に完全に除去されなかったゆるく会合した多糖であった。プラスミドｐＮＺ４２３７は完全なｃｐｓ１４Ｅ遺伝子を含有する一方、以前の報告は、付加的なリボソーム結合部位がｃｐｓ１４Ｅ中に存在して、最初の９８アミノ酸を欠く切断型のしかし活性のグリコシルトランスフェラーゼをもたらすことを示す（Ｋｏｌｋｍａｎら、１９９７）。プライミンググリコシルトランスフェラーゼのＮ末端半分が、ウンデカプレニル結合した反復単位の放出に関与しうることが示唆されている（Ｗａｎｇら、１９９６）。乳酸球菌のホモログＥｐｓＤはこのドメインを欠き、そして、グリコシルトランスフェラーゼ活性に必要な保存されたドメインのみを含有する。Ｃｐｓ１４Ｅ中のこの付加的なドメインがＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）での多糖産生を妨害していたかどうかを試験するため、ｐＮＺ４２３７中の無傷のｃｐｓ１４Ｅ遺伝子を切断型ｃｐｓ１４Ｅにより置換して、ｐＮＺ４２３８をもたらした。しかしながら、ｐＮＺ４２３８とともにｐＮＺ４２３０をもつ株についてシグナルが検出されなかった。ｃｐｓ１４Ｅ遺伝子についての構築物ｐＮＺ４２０６中のｅｐｓＤの置換もまた、タイプ１４多糖産生を予防した。Ｖａｎ  Ｋｒａｎｅ���ｂｕｒｇら（１９９９）による、および表３のデータは、グリコシルトランスフェラーゼＣｐｓ１４ＥがＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）でのＢ４０多糖生合成において機能的であることを示す。これは、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）でのタイプ１４多糖生合成が、ＥｐｓＡ、ＥｐｓＢおよびＥｐｓＤの存在を必要とすること、ならびにＥｐｓＣは任意であることを示す。
【００６５】
【表３】
2008523804.tif 000004
【００６６】
Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）培養物からの多糖の単離
Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）株により産生される多糖を、サイズ排除クロマトグラフィー、次いで多角度光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ）により分析した。ｐＮＺ４２３０およびｐＮＺ４２０６をもつＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）は、１リットルあたり２５ｍｇのタイプ１４多糖を産生した（表３）。これは、ｐＮＺ４２２０およびｐＮＺ４２０６をもつＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）により産生されるＢ４０多糖の量の２３％である。多糖はまた、ｐＮＺ４２０８およびｐＮＺ４２０９をもつ株でも産生されたとは言え、後者の株での産生は有意により少なかった。誘導しない細胞では多糖は産生されなかったか、若しくは１ｍｇ／Ｌの検出限界より下の量が産生されたかのいずれかであった。免疫検出はより感受性の検出方法であり、そして、図２でのＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）の誘導しない細胞（ｐＮＺ４２３０、ｐＮＺ４２０６）について得られたシグナルを説明する。免疫検出実験により既に示唆されたとおり、ｐＮＺ４２３７とともにｐＮＺ４２３０をもつＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）から多糖を単離し得なかった。肺炎球菌莢膜多糖の単離のため開発された異なる方法（Ｋａｒｌｓｓｏｎら、１９９８）を加えて使用し、そして、多糖が産生されなかったことを確認した。興味深いことに、ｐＮＺ４２３７若しくはｐＮＺ４２３８とともにｐＮＺ４２２０をもつＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）は、それぞれ３１ｍｇ／Ｌ若しくは３７ｍｇ／ＬのＢ４０多糖を産生した。これは、ｃｐｓ１４ＢＣＤＥ遺伝子がＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）中で機能的であること、ならびに、多糖産生が無傷および切断型のｃｐｓ１４Ｅ構築物について比較可能であることを確認する。表３は、ｃｐｓ１４Ｅが、Ｂ４０多糖産生株（ｐＮＺ４２２０＋ｐＮＺ４２２１）でｅｐｓＡＢＣ遺伝子とともに機能的であるが、しかしｐＮＺ４２３０をもつ株では機能的でないことをさらに示す。肺炎球菌タイプ１４多糖は、従って、（ｅｐｓＣの存在下若しくは非存在下のいずれでも）ｅｐｓＡＢＣＤ遺伝子の制御下でのみ、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）中で産生される。
【００６７】
リン酸化されたチロシン残基の免疫検出
ＣｐｓＤに存在するチロシン残基の可逆的リン酸化が、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）での莢膜産生を調節することが既知である（ＢｅｎｄｅｒとＹｏｔｈｅｒ、２００１；Ｂｅｎｄｅｒら、２００３）。図４は、Ｃｐｓ１４Ｄが、ｃｐｓ１４ＢＣＤＥ遺伝子（レーン４）、ｃｐｓ１４ＣＤＥ遺伝子（レーン６）、ｃｐｓ１４ＢＣＤＥ’遺伝子（レーン８）とともにｐＮＺ４２３０をもつ株、およびｅｐｓＡＢＣｃｐｓ１４Ｅ構築物（レーン９）でリン酸化されることを示す。興味深いことに、これらの株はタイプ１４多糖を産生しなかった。ｐＮＺ４２２０をもつＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）で、リン酸化されたチロシンは、多糖産生がＣｐｓ１４ＢＣＤＥ若しくはＣｐｓ１４ＣＤＥの制御下にありかつ多糖産生がＥｐｓＡＢＣＤ調節タンパク質に比較して大きく低下された場合にのみ検出された。これは、チロシンリン酸化がＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）での多糖生合成を負に遂げることを示す。ＥｐｓＢタンパク質は、ｐＮＺ４２３０とともにｐＮＺ４２２１（ｅｐｓＡＢＣｃｐｓ１４Ｅ）をもつＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）中でリン酸化されたが、しかしｐＮＺ４２００と組合せではされなかった。これは、肺炎球菌のプライミンググリコシルトランスフェラーゼが多糖生合成を阻害し得、そして従って、好ましくは乳酸球菌のグリコシルトランスフェラーゼと交換されることを示す。
【００６８】
ＮＭＲ分析
Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）が産生した多糖の化学構造は、免疫原性の肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の多糖に同一であるため、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）が産生した多糖が保護免疫応答を惹起することができることが疑いなしに予期される。これは、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）が産生したタイプ３多糖により導き出されるマウスでの免疫応答が、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が産生した多糖について観察されたものに同一であることを示すＧｉｌｂｅｒｔら（２０００）からのデータによりさらに裏付けられる。
【００６９】
Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）で産生されたタイプ１４多糖、および肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）で産生されたタイプ１４多糖のプロトンＮＭＲスペクトルを測定し、そして同一スペクトルを示した（図３）。肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１４から単離されたＣＰＳに存在する少量の不純物は、乳酸球菌の単離物中に存在しない３．２７ｐｐｍの付加的なピークをもたらした。しかしながら、該スペクトルは、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）で産生された多糖の構造が、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）で産生された天然の血清型１４多糖に同一であることを
はっきりと示す。
【００７０】
要約すれば、本実施例は、非病原性かつ／若しくは非侵襲性グラム陽性宿主細胞中での、肺炎球菌からの複合型グラム陽性多糖の異種発現および産生を初めて示す。
【００７１】
Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）でのタイプ３肺炎球菌多糖産生について、Ｇｉｌｂｅｒｔら、２０００、第ＷＯ９８／３１７８６号明細書により達成されたところの産生レベルは１２０ｍｇ／Ｌであった。これは単純型多糖である。複合型１４肺炎球菌多糖は本実施例で２５ｍｇ／ｌで産生され、そして、多様な条件下で宿主細菌を培養することによりさらに高められかつ至適化されうる。タイプ１４多糖はより複雑であり、そして、大部分の他の肺炎球菌多糖は高度に類似の機構により合成される。産生レベルの改良は、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）でのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃレベルの増大を介して達成されうる。ＵＤＰ−グルコースおよびＵＤＰ−ガラクトースは、最もありそうには、（Ｂｏｅｌｓら、２００３）によれば制限しないからである。本実施例は本発明の別の利点もまた具体的に説明し；肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）で産生されるタイプ１４多糖は莢膜として産生され、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）では培地に分泌される。本発明の複合多糖の異種製造方法は、非病原性のグラム陽性細菌からの多糖の安全かつ便宜的な製造を可能にすることに関して利点を提供するが、しかしまた、異種産生された多糖型が分泌されかつより少ないタンパク質汚染である、培地からの便宜的な単離も可能にする。
【００７２】
【表４】
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【００７３】
【表５】
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【００７４】
【表６】
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【００７５】
【表７】
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【００７６】
【表８】
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【００７７】
【表９】
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【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）中での多糖産生に使用されるプラスミドの図解。図Ａ：プラスミドｐＮＺ４０３０のＢ４０  ｅｐｓ遺伝子集団；Ｐｅｐｓ、ｅｐｓ遺伝子集団のプロモーター。図Ｂ：ｐＮＺ４０３０からのｅｐｓＡＢＣＤのインフレーム欠失、生じる遺伝子集団のＮｃｏＩ消化による切り出し、およびＮｃｏＩ消化したｐＩＬ２５３へのライゲーションがｐＮＺ４２２０をもたらす。図Ｃ：ＢａｍＨＩ消化によるｅｐｓＥＦＧＨＩＪＫＬｏｒｆＹ遺伝子の切り出し、およびｃｐｓ１４ＦＧＩＪＫＬを包含する６．８ｋｂのフラグメントでの置換がｐＮＺ４２３０をもたらす。ＰＣＲ増幅したｃｐｓ１４遺伝子（材料および方法に記述される）のクローニングに使用されるＨｉｎｄＩＩＩ制限部位が示される。図Ｄ：本研究で使用した、Ｂ４０  ｅｐｓ（ｐＮＺ４２０６）およびｃｐｓ１４（ｐＮＺ４２３７）調節遺伝子を含有しかつニシンで誘導可能なプロモーターの制御下のプラスミド、ならびに数種の派生構築物（より詳細については、材料および方法の節を参照されたい）。
【図２】Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）株で産生されるタイプ１４  ＰＳの免疫検出。誘導した若しくは誘導しない細胞のいずれかの１０μｌの培養上清、および１０μｌの誘導細胞懸濁液を、ニトロセルロースメンブレンにスポットし、そしてタイプ１４特異的抗血清で検出した。Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）はｐＮＺ４２２０およびｐＮＺ４２０６（レーン１）；ｐＮＺ４２３０（レーン２）；ｐＮＺ４２３０＋ｐＮＺ４２０６（レーン３）；ｐＮＺ４２３０＋ｐＮＺ４２０９（レーン４）：ｐＮＺ４２３０＋ｐＮＺ４２０８（レーン５）；ｐＮＺ４２３０＋ｐＮＺ４２３５（レーン６）；ｐＮＺ４２３０＋ｐＮＺ４２３７（レーン７）；ｐＮＺ４２３０＋ｐＮＺ４２３８（レーン８）；ｐＮＺ４２３０＋ｐＮＺ４２２１（レーン９）いずれかをもつ。
【図３】図Ａ．肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１４から精製した多糖のＮＭＲスペクトル図Ｂ．ｐＮＺ４２３０およびｐＮＺ４２０６を発現するＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）から精製した多糖のＮＭＲスペクトル。
【図４】Ｂ４０多糖および肺炎球菌タイプ１４多糖を産生するＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）株中でのＥｐｓＢ若しくはＣｐｓ１４Ｄタンパク質のチロシンリン酸化。図Ａ．ｐＮＺ４２０６（レーン１）、ｐＮＺ４２０９（レーン２）、ｐＮＺ４２０８（レーン３）、ｐＮＺ４２３７（レーン４、５）、ｐＮＺ４２３５（レーン６、７）、ｐＮＺ４２３８（レーン８）、ｐＮＺ４２２１（レーン９）とともにｐＮＺ４２３０をもつＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）の細胞抽出液。細胞は１ｎｇ／ｍｌニシンで誘導（レーン１、２、３、４、６、８、９）したか、若しくは誘導しなかった（レーン５、７）かのいずれかであった。図Ｂ．ｐＮＺ４２０６（レーン１）、ｐＮＺ４２０９（レーン２）、ｐＮＺ４２０８（レーン３）、ｐＮＺ４２３７（レーン４、５）、ｐＮＺ４２３５（レーン６、７）、ｐＮＺ４２３８（レーン８）、ｐＮＺ４２２１（レーン９）とともにｐＮＺ４２２０をもつＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）の細胞抽出液。細胞は１ｎｇ／ｍｌニシンで誘導（レーン１、２、３、４、６、８、９）したか、若しくは誘導しなかった（レーン５、７）かのいずれかであった。  チロシンリン酸化されたタンパク質を、ホスホチロシンに対するマウスモノクローナル抗体を用いるウエスタンイムノブロッティングにより検出した。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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