(57)【要約】  脂肪組織中に存在する再生細胞が、筋骨格疾患もしくは傷害を持った患者を含めた患者を治療するために使用される。患者を治療する方法は、脂肪組織から得られた濃縮された量の再生細胞を患者に送達するために、脂肪組織を処理することを含む。この方法は、幹細胞が患者に投与される前に外部環境に露出されないように、閉じたシステムの中で行われてよい。従って、好ましい方法において、脂肪組織に存在する再生細胞は、治療的な筋骨格的利益を促進、産出または支援するために必要な添加剤と共に、レシピエントの中に直接配置される【選択図】          図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨、軟骨、骨格筋、腱、靭帯、またはプロテオグリカンに富むマトリックスの形成を誘導する方法であって：
（１）組織から再生細胞を濃縮するための、プログラム可能な自動化されたシステムを準備すること；および
（２）濃縮された再生細胞を患者の中に配置して、骨、軟骨、骨格筋、腱、靭帯、またはプロテオグリカンに富むマトリックスの形成を誘導すること；
を含む前記方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、準備することが、下記を含む自動化されたシステムを準備することを含む前記方法：
ａ．患者から取り出された組織を収容するためのチャンバアセンブリーであって、前記組織から再生細胞が分離されるように、前記組織の脱凝集を促進する前記チャンバアセンブリー；
ｂ．前記チャンバアセンブリーからの再生細胞を濃縮するために連結することができる濃縮装置；および
ｃ．前記チャンバアセンブリーおよび前記濃縮装置と通信して、前記チャンバアセンブリーおよび前記濃縮装置を制御することができる、プログラム可能なプロセッシング装置。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、濃縮装置が遠心分離装置を含む前記方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、チャンバアセンブリーが収集チャンバおよび処理チャンバを含む前記方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって：
準備することが、処理チャンバを収集チャンバに結合することを含み、遠心分離装置が、前記収集チャンバに連結されて、前記収集チャンバから脱凝集された組織を収容するように構成されている前記方法。
【請求項６】
請求項２に記載の方法であって、組織が脂肪組織である前記方法。
【請求項７】
請求項２に記載の方法であって、再生細胞が幹細胞である前記方法。
【請求項８】
請求項２に記載の方法であって、再生細胞が前駆細胞である前記方法。
【請求項９】
請求項２に記載の方法であって、再生細胞が幹細胞および前駆細胞の組み合わせである前記方法。
【請求項１０】
請求項２に記載の方法であって、分離および濃縮された再生細胞が、患者の中への注入に適しているものである前記方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、再生細胞が、患者を治療することに使用される前記方法。
【請求項１２】
請求項２に記載の方法であって、再生細胞が、椎間板を修復することに使用される前記方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、椎間板が、プロテオグリカンに富むマトリックスの産生により修復される前記方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法であって、再生細胞が、椎間板の中への直接注入を介して患者の中に配置される前記方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載の方法であって、再生細胞が、固定可能なヒドロゲルの中への注入を介して患者の中に配置される前記方法。
【請求項１６】
請求項２に記載の方法であって、再生細胞が、椎間体脊椎固定術のための骨形成を誘導することに使用される前記方法。
【請求項１７】
請求項２に記載の方法であって、再生細胞が、横突間棘突起脊椎固定術のための骨形成を誘導することに使用される前記方法。
【請求項１８】
請求項２に記載の方法であって、再生細胞が、軟骨形成を誘導することに使用される前記方法。
【請求項１９】
請求項２に記載の方法であって、軟骨形成が長骨の末端におけるものである前記方法。
【請求項２０】
請求項２に記載の方法であって、軟骨形成が膝関節におけるものである前記方法。
【請求項２１】
請求項２に記載の方法であって、軟骨形成が肋骨におけるものである前記方法。
【請求項２２】
請求項１８に記載の方法であって、再生細胞が、軟骨形成部位への直接注入を介して患者の中に配置される前記方法。
【請求項２３】
請求項１８に記載の方法であって、再生細胞が、固定可能なヒドロゲルの中への注入を介して軟骨形成部位に配置される前記方法。
【請求項２４】
請求項２に記載の方法であって、再生細胞が、長骨の骨折を修復するための骨形成を誘導することに使用される前記方法。
【請求項２５】
請求項２に記載の方法であって、再生細胞が、骨および軟骨の形成を誘導することに使用される前記方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、再生細胞が、腱を修復することに使用される前記方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、腱が、腱−骨付着部位にある前記方法。
【請求項２８】
請求項２に記載の方法であって、再生細胞が、骨格筋形成を誘導することに使用される前記方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、骨格筋形成が、骨−筋肉付着部位での腱修復のために使用される前記方法。
【請求項３０】
請求項２８に記載の方法であって、骨格筋形成が、靭帯−筋肉付着部位での靭帯修復のために使用される前記方法。
【請求項３１】
請求項２８に記載の方法であって、骨格筋形成が、靭帯−骨付着部位での靭帯修復のために使用される前記方法。
【請求項３２】
請求項２に記載の方法であって、再生細胞が、腱の形成を誘導することに使用される前記方法。
【請求項３３】
請求項２に記載の方法であって、再生細胞が、靭帯の形成を誘導することに使用される前記方法。
【請求項３４】
請求項４に記載の方法であって、自動化されたシステムの収集チャンバが、該収集チャンバ内のフィルタケージに収容されたフィルタを更に含み、組織を保持し、且つ遊離脂質、血液および洗浄溶液からなる群から選択される非組織成分を濾過により取り出す前記方法。
【請求項３５】
請求項４に記載の方法であって、自動化されたシステムの収集チャンバが、パドルを含む回転シャフトの撹拌を介して組織の脱凝集を促進し、前記パドルは前記回転シャフトが撹拌されるときに組織の脱凝集を促進する前記方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法であって、パドルが、収集チャンバ内のフィルタケージに取り付けられている前記方法。
【請求項３７】
請求項３５に記載の方法であって、回転シャフトが、磁気撹拌機を介して撹拌される前記方法。
【請求項３８】
請求項２に記載の方法であって、自動化されたシステムの収集チャンバが、パドルを含む回転シャフトの撹拌を介して組織の脱凝集を促進し、前記パドルは前記回転シャフトが撹拌されるときに組織の脱凝集を促進する前記方法。
【請求項３９】
請求項３５に記載の方法であって、回転シャフトが、駆動機構を介して回転される前記方法。
【請求項４０】
請求項４に記載の方法であって、自動化されたシステムが、更に洗浄溶液供給源を含む前記方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法であって、洗浄溶液が生理食塩水である前記方法。
【請求項４２】
請求項４に記載の方法であって、自動化されたシステムが、更に脱凝集剤の供給源を含む前記方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法であって、脱凝集剤が、コラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リベラ−ゼＨ１、ペプシン、およびそれらの混合物からなる群から選択される前記方法。
【請求項４４】
請求項５に記載の方法であって、自動化されたシステムの処理チャンバが、脱凝集された組織を遠心分離装置で遠心分離する間、前記処理チャンバの中に存在する前記脱凝集された組織を保持するための１以上の遠心分離チャンバを含む前記方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法であって、１以上の遠心分離チャンバが、脱凝集された組織を遠心分離装置で遠心分離する間、濃縮された再生細胞を集めるための１以上のアウトプットチャンバを更に含む前記方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法であって、１以上のアウトプットチャンバが、遠心分離の間は異なる角度に傾けられ、濃縮された再生細胞の回収のために異なる角度に傾けられる前記方法。
【請求項４７】
請求項４５に記載の方法であって、１以上のアウトプットチャンバが、濃縮された再生細胞を回収するための角度に達するように、手動で再配置できる前記方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法であって、再生細胞が、シリンジを使用して取り出される前記方法。
【請求項４９】
請求項４に記載の方法であって、自動化されたシステムの処理チャンバが、脱凝集された組織の滅菌状態での回収を容易にするための回転シールを含む前記方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法であって、回転シールが、回転シャフト、２以上のベアリング、３以上のリップシール、外部ハウジング、円形チャンネル、および円形バネを含む前記方法。
【請求項５１】
請求項４９に記載の方法であって、回転シールが、回転シャフト、単一のゴムシール、空気ガスケット、１以上のバネ負荷シール、および二つのセラミックディスクを含む前記方法。
【請求項５２】
請求項２に記載の方法であって、自動化されたシステムが、更に廃棄チャンバを含む前記方法。
【請求項５３】
請求項５２に記載の方法であって、廃棄チャンバが、患者から取り出された組織の非再生細胞成分を収容する前記方法。
【請求項５４】
請求項５３に記載の方法であって、廃棄チャンバの中に存在する非再生細胞成分が遠心分離されて、コラーゲン、タンパク質、脂質、脂肪細胞およびマトリックス成分を含む成分が分離および濃縮される前記方法。
【請求項５５】
請求項５３に記載の方法であって、廃棄チャンバの中に存在する非再生細胞成分が濾過されて、コラーゲン、タンパク質、脂質、脂肪細胞およびマトリックス成分を含む成分が分離および濃縮される前記方法。
【請求項５６】
請求項５に記載の方法であって、自動化されたシステムの収集チャンバおよび処理チャンバが配管を介して連結されている前記方法。
【請求項５７】
請求項５６に記載の方法であって、配管が更にセンサを含む前記方法。
【請求項５８】
請求項５に記載の方法であって、自動化されたシステムの収集チャンバおよび処理チャンバが、更に、１以上の弁、ポンプ、センサ、またはそれらの組み合わせを含む前記方法。
【請求項５９】
請求項５６に記載の方法であって、収集チャンバ、処理チャンバおよび配管が使い捨て可能である前記方法。
【請求項６０】
請求項５に記載の方法であって、自動化されたシステムの遠心分離装置およびプロセッシング装置が再使用可能である前記方法。
【請求項６１】
請求項５８に記載の方法であって、遠心分離装置が、更に、遠心分離モータ、遠心分離モータコントローラ、および遠心分離ブレーキコントローラを含む前記方法。
【請求項６２】
請求項５に記載の方法であって、自動化されたシステムのプロセッシング装置が、１以上のポンプの使用を介して組織の流れを方向付けることにより、遠心分離チャンバ、処理チャンバおよび遠心分離チャンバを制御する前記方法。
【請求項６３】
請求項６２に記載の方法であって、ポンプが蠕動ポンプである前記方法。
【請求項６４】
請求項６２に記載の方法であって、ポンプが再使用可能である前記方法。
【請求項６５】
請求項２に記載の方法であって、プロセッシング装置が、更に、ユーザが自動化されたシステムにパラメータを入力するためのユーザインターフェースを含む前記方法。
【請求項６６】
請求項２に記載の方法であって、プロセッシング装置が、更に、パラメータの入力、予めプログラムされた工程の確認、エラーの警告、またはそれらの組み合わせにユーザを導く指示を表示するディスプレー画面を含む前記方法。
【請求項６７】
請求項２に記載の方法であって、患者から取り出された組織の一部が再生細胞を分離および濃縮することに使用され、患者から取り出された組織の残部が取り分けておかれる前記方法。
【請求項６８】
請求項６７に記載の方法であって、患者から取り出された組織の残部がサンプルチャンバの中に取り分けておかれる前記方法。
【請求項６９】
請求項２に記載の方法であって、１以上の添加剤が再生細胞に添加される前記方法。
【請求項７０】
請求項６９に記載のシステムであって、添加剤が、成長因子、再懸濁液、細胞培養試薬、細胞増殖試薬、細胞保存試薬、または細胞改変試薬、およびそれらの組み合わせから選択される前記方法。
【請求項７１】
請求項２に記載の方法であって、再生細胞が、装置の中に配置される前に細胞培養で増殖される前記方法。
【請求項７２】
請求項７１に記載の方法であって、再生細胞は、骨原性表現型への分化を促進する培養条件で増殖される前記方法。
【請求項７３】
請求項２に記載の方法であって、再生細胞が、患者の中に配置される前に外科装置または外科インプラント上に配置される前記方法。
【請求項７４】
請求項７３に記載の方法であって、外科装置が脊椎固定装置である前記方法。
【請求項７５】
請求項７３に記載の方法であって、外科インプラントが足場である前記方法。
【請求項７６】
請求項７５に記載の方法であって、足場が多孔質である前記方法。
【請求項７７】
請求項２に記載の方法であって、再生細胞が、患者の中に配置される前にゲルまたはヒドロゲルの中に配置される前記方法。
【請求項７８】
請求項２に記載の方法であって、更に第二のシステムを含み、該第二のシステムは第一のシステムに接続されている前記方法。
【請求項７９】
請求項７８に記載の方法であって、第二のシステムが、再生細胞を培養する前記方法。
【請求項８０】
請求項７８に記載の方法であって、第二のシステムが、再生細胞を遺伝子的に操作する前記方法。
【請求項８１】
物質を再生細胞と接触させる方法であって：
（１）自動的に、第一のシステムの中に収容された組織から再生細胞を分離し、第二のシステムを使用して前記組織から前記再生細胞を濃縮することであって、前記第一および第二のシステムは、該第一および第二のシステムを使用して複数の協調した分離および濃縮の手順を自動的に実施するようにプログラム可能なコントローラの制御下で、自動的に作動させること；ならびに
（２）濃縮された再生細胞を物質と接触させて配置し、所定の効果を誘導すること；
を含む前記方法。
【請求項８２】
請求項８１に記載の方法であって、物質が、骨、軟骨、骨格筋、腱および靭帯の少なくとも一つを含む前記方法。
【請求項８３】
請求項８２に記載の方法であって、所定の効果が、骨、軟骨、骨格筋、腱および靭帯の少なくとも一つの誘導形成を含む前記方法。
【請求項８４】
請求項８３に記載の方法であって、組織から再生細胞を分離することが、患者から取り出された組織由来の再生細胞を少なくとも部分的に脱凝集させることを含み、再生細胞を濃縮することが、前記再生細胞を遠心分離することを含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．発明の分野
本発明は、一般には、広範な組織に由来する再生細胞、特に脂肪由来の再生細胞（例えば幹細胞および／または前駆細胞）、脂肪由来の再生細胞を使用する方法、脂肪由来の再生細胞を含有する組成物、並びに筋骨格の疾患および障害（例えば脊椎、腱、靭帯、軟骨、骨格筋、および骨に関連した疾患および障害）を治療するために使用される脂肪由来の再生細胞を調製および使用するためのシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
２．関連技術の説明
筋骨格障害は、骨、筋肉、靭帯、腱、軟骨および関節が関与し得るあるありふれた大きな疾患群および障害群である。筋骨格障害は頻繁に生じ、背中の痛み、首の痛み、反復酷使傷害のような非特異的愁訴、慢性的炎症もしくは変形性リウマチ障害、並びに広範な他のスポーツ傷害および労働関連傷害を含んでいる。忍耐により我慢している人は別として、筋骨格障害は、仕事の長期欠勤および勤労不能によって蒙る高コストのために、実質的な社会的および経済的問題を生じる。筋骨格障害は、患者が彼等の一般開業医を訪問する主要な原因の一つである。実際に、労働統計局は最近、日中の離職を生じる２３００万人の非致死的な職業傷害および職業病のうちの１／２は、筋骨格傷害が関与していると報告した。これらの傷害は、傷病で失われる全労働日の３４％以上を占め、また使用者に対しては、労働者の直接保証に１年当り１５０〜２００億ドルのコストを課し、更に、逸失された生産、従業員の入替え、および他の関節低経費に関して更に１０００億ドルを負担させる。
【０００３】
筋骨格障害の例には：捻挫、肉離れ、腱炎、腱滑膜炎、線維筋痛、骨関節炎、リウマチ性関節炎、リウマチ性多発性筋痛、滑液嚢炎、急性および慢性の背中の痛みおよび骨粗鬆症が含まれる。スポーツおよび労働に関連した傷害には、捻挫、肉離れ、並びに靭帯、腱、筋肉および軟骨の断裂が含まれる。痛みは最も普通の症状であり、傷害または炎症によって頻繁に生じる。痛み以外に、硬直（凝り）、圧痛、脱力感、並びに患部の膨潤または変形のような他の症状が、筋骨格障害の徴候である。
【０００４】
現在、筋肉、腱および筋膜成分に対する、肉離れおよび捻挫傷害を含む筋骨格障害を治療するための非外科的方法は、治癒プロセスの際の痛みをマスクするための薬物療法、固定、および種々の理学療法に制限されており、これらは多くの場合、限定的な成功を有するに過ぎない。治癒プロセス自身を促進することによって、傷害および付随する痛みを治療するような、現在既知の方法は存在しない。進行した疾患状態のための外科的介入は、広く使用されているオプションである。しかし、現在の外科的方法は、骨形成または軟骨形成を誘導するために、一般には自己骨（当該患者由来の骨）または同種移植骨（他人由来の骨）の使用を必要とする。自己骨は、一般に、融合を促進するために最も優れていると考えられている。しかし、この方法は、患者の身体の別の領域、例えば骨盤または腓骨から骨を取り出すための余分な手術を必要とする。従って、患者の約３０％が移植片収集部位に顕著な痛みおよび圧痛を有し、これは長引く可能性があり、幾つかの場合には矯正しようとする背中の痛みを後まで残すことが報告されている。同様に、同種移植骨および他の骨移植片置換は、第二の手術の必要性を排除するけれども、自己骨融合のためのコスト効果的、および効率的な代替物であることが更に立証されなければならないという欠点を有している。同様に、骨形成を促進する成長因子、例えば骨形成タンパク質（「ＢＭＰ」）の使用は、コスト効果的であることが示されていない。
【０００５】
母集団の加齢および不健康なライフスタイルを想定すれば、近い将来に、筋骨格障害の発生および蔓延が実質的に増大するであろうことが予測される。従って、無限に再生して、成熟した特殊化された細胞を発生させる再生細胞、例えば幹細胞および前駆細胞の能力を利用する再生医療は、筋骨格疾患を治療するための新しい有望なアプローチを提供する。
【発明の開示】
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、筋骨格障害、例えば骨、筋肉、腱、靭帯、軟骨および関節の障害を治療するための、脂肪由来の再生細胞、例えば、成熟幹細胞および前駆細胞の使用に関する。例えば、本発明の再生細胞は、椎間板修復におけるプロテオグリカンに富むマトリックスの生成；横突起間固定術における椎間板のための骨生成；長骨の骨折治癒のための骨生成；軟骨の生成；腱の生成；および骨格筋の生成を促進するために使用してよい。該再生細胞は、椎間板変性症、および筋ジストロフィーを含む多くの筋骨格傷害を治療するために使用してよい。
【０００７】
本発明はまた、患者の中に再注入するために適した所定の組織から、再生細胞、例えば幹細胞および前駆細胞を分離および濃縮することができる、高度に汎用性のシステムおよび方法に関する。好ましい実施形態において、該システムは自動化される。本発明のシステムは一般に、収集チャンバ、処理チャンバ、廃棄チャンバ、アウトプット(output)チャンバおよびサンプルチャンバのうちの１以上を含んでいる。これらの種々のチャンバは、１以上入の導管を介して一緒に連結され、閉じた滅菌済みの液体／組織経路内で、生物学的材料を含む流体が、一つのチャンバからもう一つのチャンバへと通され得るようになっている。一定の実施形態においては、廃棄チャンバ、アウトプットチャンバ、およびサンプルチャンバは任意である。一つの実施形態において、組織摘出から、処理、およびレシピエントの目的とする骨、軟骨、腱、靭帯または筋肉形成部位の中への装置の配置に亘る全体の方法は、全て同じ施設において、実際には当該処置を受ける患者の同じ部屋内で行われるであろう。
【０００８】
従って、一つの実施形態において、筋骨格障害の患者を治療する方法は、（ａ）組織取り出しシステムを準備するステップ；（ｂ）該組織取り出しシステムを使用して患者から脂肪組織を取り出すステップ、ここで該脂肪組織はある濃度の幹細胞を有する；（ｃ）該脂肪組織の少なくとも一部を処理して、処理前の前記脂肪組織の再生細胞濃度以外のある濃度の再生細胞を得るステップ；および（ｄ）前記再生細胞を、患者に投与する前に前記組織取り出し装置から再生細胞を取り出すことなく患者に投与し、それによって前記筋骨格障害を治療するステップとを含んでいる。他の実施形態において、前記再生細胞は、前記患者に投与する前に、軟骨、骨、腱、靭帯または骨格筋の前駆細胞を更に富化させてもよい。更に別の実施形態においては、目的の治療効果を向上、制御または指令するための添加剤を、ここで説明した患者への投与の前に、該投与と同時に、または該投与の後に、前記細胞と共に使用してもよい。前記細胞はまた、ここで説明したように、細胞担体格納装置内の足場(scaffold)または細胞担体を介して患者に投与されてよい。
【０００９】
ここに記載した何等かの特徴または特徴の組合せは、このような組合せに含められる特徴が相互に、この明細書の内容および当業者の知識から明らかに矛盾しないことを条件として、本発明の範囲内に含められる。本発明の追加の利点および側面は、以下の詳細な説明において明らかである。
【００１０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、少なくとも部分的には、本発明の脂肪由来の再生細胞が：（１）骨芽前駆細胞の豊富な供給源であり；（２）それらは非骨性部位において、in vivoで軟骨および骨を形成し；（３）それらはin vitroで軟骨、骨および骨格筋を形成するとの発見に基づいている。従って、再生細胞は、筋骨格の疾患および傷害、例えば、脊椎、腱、靭帯、軟骨、骨格筋、および骨に関連した疾患および傷害の治療に使用されてよい。例えば、本発明の再生細胞は脊椎障害の治療に多くの用途を有しており、これには椎間板修復におけるプロテオグリカンに富むマトリックスの産生の促進；横突間棘突起脊椎固定術（intertransverse process）における椎間体のための骨生成；長骨の骨折治癒のための骨生成が含まれる。また、当該再生細胞は、軟骨、腱、および靭帯の修復のためにも有用であり、これには例えば、関節軟骨（長骨の末端）、半月状弾性軟骨（膝関節の関節軟骨の間）、および胸骨弾性軟骨（肋骨末端）の修復のための軟骨生成；腱−骨付着(insertion)部位における腱修復のための軟骨および骨生成；腱−筋肉付着部位における腱修復のための骨格筋生成；腱−腱界面における腱断裂を修復するための腱生成；靭帯−筋肉付着部位における靭帯修復のための骨格筋生成；靭帯−軟骨／骨付着部位における靭帯修復に使用するための骨格筋生成；靭帯−靭帯界面における靭帯修復に使用するための靭帯生成が含まれる。本発明の再生細胞はまた、骨格筋関連の疾患および傷害、例えば筋ジストロフィーを治療するためにも使用することができる。
【００１１】
また、本発明は、再生細胞、例えば幹細胞および／または前駆細胞を、広範な組織から分離および濃縮するための迅速且つ信頼性のあるシステムおよび方法に関し、前記組織には脂肪、骨髄、血液、皮膚、筋肉、肝臓、結合組織、筋膜、脳および他の神経系組織、血管、および他の軟質もしくは液状の組織もしくは組織成分または組織混合物（例えば皮膚、血管、脂肪および結合組織を含む組織の混合物）が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、前記システムは、脂肪組織から再生細胞を分離および濃縮する。もう一つの好ましい実施形態においては、全体の方法が最小限のユーザの介入または熟練で実行され得るように、前記システムが自動化される。特に好ましい実施形態では、本発明のシステムおよび方法を使用して得られた再生細胞は、前記組織が取出された、腎の疾患もしくは傷害に罹患しているレシピエントに直接導入するために適している。
【００１２】
好ましくは、組織の取り出しから、再生細胞の分離および濃縮を通して、レシピエントへの導入までのプロセスは、全て同じ施設で、更に実際には、処置を受けている患者の同じ部屋の中で行われるであろう。該再生細胞は、摘出および濃縮の後に比較的短時間で使用できるであろう。例えば、該再生細胞は、患者からの組織の採取から約１時間で使用できるようになり、一定の状況においては、組織の採取から約１０〜４０分で使用できるようになる好ましい実施形態において、この再生細胞は、組織の採取から約２０分で使用できるようになるであろう。摘出から分離および濃縮を経る処置の全体の長さは、患者のプロファイル、採取される組織の種類、および所定の治療的応用に必要な再生細胞の量を含む多くの因子に依存して変化するであろう。この細胞はまた、レシピエントに対する治療的、構造的または美容的利益を誘導する目的で、１回の手術処置の状況において、他の細胞、組織、組織断片、細胞増殖および／または分化の足場または他の刺激因子と組合せてレシピエントの中に導入されてもよい。前記システムの分離段階および濃縮段階以外の何等かの更なる操作は、かかる操作の方法にみあった追加の時間を必要とするであろう。
【００１３】
本発明が更に容易に理解され得るように、まず最初に、一定の用語を定義する。追加の定義は、詳細な説明の全体を通して与えられる。
【００１４】
ここで使用する「再生細胞」は、本発明のシステムおよび方法を用いて得られる異種または同種の細胞であって、器官、組織、生理学的ユニットまたはシステムの構造もしくは機能の完全もしくは部分的な再生、修復または置換を生じさせ、またはこれに寄与し、それによって治療的、構造的または美容的利益を提供するものを意味する。再生細胞の例には、ＡＳＣ、内皮細胞、内皮前駆細胞、内皮前駆細胞、マクロファージ、繊維芽細胞、周皮細胞、平滑筋細胞、前脂肪細胞、分化または脱分化した脂肪細胞、ケラチン生成細胞、単能性および多能性の前駆細胞および前駆細胞（およびそれらの子孫）、並びにリンパ球が含まれる。
【００１５】
再生細胞が治療的、構造的または美容的利益を提供する一つの機構は、該再生細胞またはその子孫を、新たに生じる、現存の、または修復された組織もしくは組織成分の中に組み込むことによるものである。例えば、ＡＳＣおよび／またはそれらの子孫は、新たに生じた骨、筋肉、軟骨、腱、靭帯、結合組織または他の構造的もしくは機能的組織の中に合体され、それによって治療的、構造的または美容的改善を生じ、またはこれに寄与する。再生細胞が治療的、構造的または美容的利益を提供し得るもう一つの機構は、所定の組織もしくは組織成分の構造もしくは機能の形成保持、修復および／または再生を促進する分子、例えば成長因子を発現および／または分泌することによるものである。
【００１６】
再生細胞は、前記組織中に存在し、または該組織から分離および濃縮されたその「天然の」形態で使用されてよく、或いは、成長因子または他の生物学的応答の改変試薬で刺激もしくはプライミングすることによって、遺伝子導入（一過性または安定な導入）によって、更には、得られた細胞集団を物理的性質（例えばサイズまたは密度）、固相材料に対する異なる付着性、細胞表面分子もしくは細胞内分子の発現、細胞培養、または以下で更に説明する他のex vivoもしくはin vitroの操作、改変または分画に基づく更なる副次分画によって改変されてもよい。当該再生細胞はまた、合成もしくは生物学的足場のような他の細胞または装置、以下で更に説明する当該細胞の関連する特徴を変更または向上させる因子、薬物、化学物質もしくは他の薬剤を放出する材料または装置と組合せて使用されてもよい。
【００１７】
ここで使用する「再生細胞組成物」は、典型的には組織（例えば脂肪組織）が洗浄されて少なくとも部分的に脱凝集された後の、ある容積の液体中に存在する細胞の組成物を意味する。例えば、本発明の再生細胞組成物は、多くの異なる種類の再生細胞を含有しており、このような再生細胞にはＡＳＣ、内皮細胞、内皮前駆細胞、内皮前駆細胞、マクロファージ、繊維芽細胞、周皮細胞、平滑筋細胞、前脂肪細胞、分化または脱分化した脂肪細胞、ケラチン生成細胞、単能性および多能性の前駆細胞および前駆細胞（およびそれらの子孫）、並びにリンパ球が含まれる。また、この再生細胞組成物は、組織断片中に存在し得るコラーゲン、或いは、ここで説明する組織脱凝集プロセスに用いられ、または該プロセスから生じた残留コラゲナーゼもしくは他の酵素のような、１以上の汚染物を含む可能性がある。
【００１８】
ここで使用する「再生医療」の用語は、直接的または間接的に再生細胞を患者の中に配置することから導かれる、何らかの治療的、構造的、または美容的利益を意味する。ここで使用する「筋骨格障害」の用語は、骨、筋肉、靭帯、腱、軟骨および関節に関連した全ての障害を含むものである。筋骨格疾患または障害の治療は、再生医療の領域内である。例えば、脊椎固定術、脊椎安定化、身体における分節（例えば長骨および平板骨）の欠損の修復を必要とする障害、脊椎および椎間板の障害［輪状裂溝のような輪状円板破損、椎間板の慢性炎症、内包型（contained）または逸脱型（escaped）の髄核脱出を含む局部的椎間板ヘルニア、および椎間板を取囲む脊椎の相対的不安定性を含むが、これらに限定されない］は、筋骨格障害である。筋骨格障害にはまた、靭帯、腱、筋肉および軟骨の捻挫、過労および断裂、腱炎、腱鞘炎、線維筋痛、骨関節炎、リウマチ性関節炎、リウマチ性多発性筋痛、滑液包炎、急性および慢性の背痛、骨粗鬆症、手根管症候群、ドゥ・ケルヴァン氏病、腱鞘炎、バネ指、テニス肘、回旋筋腱板、および神経節嚢を含む、スポーツ傷害および労働関連傷害も含まれる。加えて、筋骨格障害には、骨形成不全症、Ｄｕｓｃｈｅｎｎｅｓおよび他の筋ジストロフィーのような筋骨格系の遺伝病、並びにフルラー症候群およびハンター症候群のようなリソゾーム蓄積病の筋骨格的側面が含まれる。
【００１９】
ここで使用する「幹細胞」の用語は、１以上の特定の機能を実行し且つ自己再生する能力を有する、種々の他の細胞型へと分化する能力を備えた多能性の再生細胞を意味する。ここに開示した幾つかの幹細胞は、多能性である。
【００２０】
ここで使用する「前駆細胞(progenitor cell)」の用語は、二以上の細胞型へと分化する能力を備え、且つ自己再生する制限された能力にみを有するか、またはその能力をもたない多能性再生細胞を意味する。特に、ここで使用する「内皮前駆細胞」は、血管内皮細胞へと分化する能力を備えた多能性または単能性細胞を意味する。
【００２１】
ここで使用する「前駆体細胞(precursor cell)」の用語は、一つの細胞型へと分化する能力を備えた、単能性の再生細胞を意味する。前駆体細胞およびそれらの子孫、例えば、適切な条件下で増殖することができるリンパ球および内皮細胞は、広範な増殖能力を有するであろう。
【００２２】
ここで使用する「幹細胞数」または「幹細胞頻度」の用語は、脂肪由来細胞（ＡＤＣ）を低細胞密度（＜１０，０００細胞／ウエル）で播種して、ＭＳＣ成長をサポートする成長培地（例えば、１０％仔牛、５％ウマ血清、および抗生物質／抗真菌剤を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）中で成長させるクローン原性試験で観察されるコロニーの数を意味する。細胞を２週間増殖させ、その後、培養をヘマトキシリンで染色して、５０細胞を超えるコロニーをＣＦＵ−Ｆとして計数する。幹細胞頻度は、播種された有核細胞１００当りで観察されるＣＦＵ−Ｆの数として計算される（例えば、１，０００個の有核再生細胞で開始されたプレート中で計数された１５のコロニーは、１．５％の幹細胞頻度を与える）。幹細胞数は、得られた有核ＡＤＣ細胞の全数を乗算した幹細胞頻度として計算される。再生細胞から増殖された高パーセンテージ（〜１００％）のＣＦＵ−Ｆは、細胞表面分子ＣＤ１０５を発現し、これはまた骨髄由来幹細胞によっても発現される（Zuk et al., 2002）。
【００２３】
ここで使用する「脂肪組織」の用語は、脂肪を蓄積する結合組織を含む脂肪を意味する。脂肪組織は、ＡＳＣ並びに内皮の前駆細胞および前駆体細胞を含む、複数の再生細胞型を含んでいる。
【００２４】
ここで使用する「脂肪組織のユニット」の用語は、別個の測定可能な量の脂肪組織を意味する。脂肪組織のユニットは、該ユニットの重量および／または体積を決定することによって測定すればよい。上記で同定されたデータに基づいて、患者から取出された処理された脂肪吸引細胞は、細胞成分の０．１％が幹細胞である細胞成分を有する；即ち、それは、上記で測定された少なくとも０．１％の幹細胞頻度を有している。ここでの開示を参照すると、脂肪組織のユニットは、患者から取出された脂肪組織の全体の量、または患者から取出された脂肪組織の全体の量よりも少ない量を意味してよい。従って、脂肪組織のあるユニットは、もう一つのユニットの脂肪組織と組合されて、個々のユニットの合計である重量または体積を有する脂肪組織のあるユニットを形成してよい。
【００２５】
ここで使用する「部分」の用語は、全体よりも少ない量の物質を意味する。マイナーな部分は５０％未満の量を言い、メジャーな部分は５０％よりも大きい量を言う。従って、患者から取り出された脂肪組織の全体の量よりも少ない脂肪組織のユニットは、取り出された脂肪組織の部分である。
【００２６】
ここで使用する「処理された脂肪吸引物」の用語は、成熟した脂肪組織および結合組織を意味する。この画分を、ここでは「脂肪由来細胞」または「ＡＤＣ」と称する。典型的には、ＡＤＣは、脂肪組織からの細胞を洗浄および分離および濃縮することによって得られた再生細胞のペレットを指称するものである。このペレットは、典型的には、細胞が遠心チャンバまたは細胞濃縮器の底で凝集するように、細胞懸濁液を遠心分離することによって得られる。
【００２７】
ここで使用する「投与する」、「導入する」、「送達する」、「配置する」および「移植する」の用語は、ここでは互換的に使用され、望ましい部位における再生細胞の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路によって、本発明の再生細胞を患者の中に導入することを意味する。この再生細胞は、患者の中で望ましい場所への送達が生じる適切な経路によって投与することができ、ここで該細胞の少なくとも一部または細胞の成分は前記望ましい場所において生きたまま残る。患者に投与した後の細胞の生存期間は、数時間、例えば２４時間と短期間であることができ、また数日、数年のように長期間であることができる。
【００２８】
ここで使用する「治療する」の用語には、疾患または障害の少なくとも一つの悪影響または症状を低減または緩和することが含まれる。
【００２９】
ここで使用する「再生細胞の治療的有効投与量」の用語は、有利なまたは望ましい臨床的効果をもたらすために充分な再生細胞の量を意味する。前記投与量は、１回以上の投与で投与することができるであろう。しかし、何が有効投与量とみなされるかの正確な決定は、各患者の個人的因子に基づく可能性があり、これらの因子には患者の年齢、サイズ、疾患の種類または範囲、疾患の段階、再生細胞の投与経路、使用される補充療法の種類または範囲、進行中の疾患プロセス、および望ましい治療の種類（例えば積極的治療ｖｓ．慣用的治療）が含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
ここで使用される「患者」の用語には、温血動物、好ましくは、ヒトを含む哺乳類が含まれる。好ましい実施形態において、患者は霊長類である。さらに好ましい実施形態において、患者はヒトである。
【００３１】
先に述べた通り、再生細胞、例えば幹細胞および前駆細胞は、広範な組織から収集することができる。本発明のシステムは、このような全ての組織について使用することができる。しかし、脂肪組織は再生細胞の特に豊富な供給源である。従って、一例として、脂肪組織を再生細胞の供給源に使用して本発明のシステムを説明するが、それに限定されるものではない。
【００３２】
脂肪組織は、当業者に既知の如何なる方法によっても得ることができる。例えば、脂肪吸引（シリンジまたは動力補助による）によって、或いは脂肪組織切除術、例えば、吸引補助による脂肪形成術（lipoplasty）、超音波補助による脂肪形成術、切除脂肪形成術またはこれらの組合せによって、脂肪組織は患者から取り出されてよい。脂肪組織は、ここに記載する本発明のシステムの何れかの実施形態に従って取り出され、収集され、処理されてよい。収集される組織の量は、患者の肥満度指数および年齢、収集のために利用可能な時間、アクセス可能な脂肪組織採取部位の利用可能性、同時および以前に存在する投薬および状態（例えば抗凝固剤療法）、並びに該組織を収集するための臨床目的を含む多くの因子に依存する。例えば、痩せた個体から摘出される１００ｍＬの脂肪組織における再生細胞のパーセンテージは、肥満したドナーから摘出されたものよりも大きい（表１）。これは多分、肥満した個体における増大した脂肪含量の希釈効果を反映している。従って、本発明の一つの側面に従えば、過体重のドナーからは、痩せた患者から抜取られる量に比較して、大量の組織を入手するのが望ましいであろう。この所見はまた、本発明の有用性が、多量の脂肪組織を持った個体に限定されないことを示している。
【００３３】
表１：  組織および細胞収量に対する肥満度指数の影響
2008504867.tif 000003
【００３４】
脂肪組織が処理された後、得られた再生細胞は、成熟した脂肪細胞および結合組織を実質的に含んでいない。従って、本発明のシステムは、脂肪由来の異種の複数の再生細胞を生じ、これら細胞は研究および／または治療目的のために使用できる。好ましい実施形態において、これら細胞は、レシピエントの身体内に配置または再注入するために適している。他の実施形態において、当該細胞は研究のために使用されてよく、例えば、該細胞は長期間生存することができ、更なる研究のために使用できる幹細胞または前駆細胞を樹立するために使用することができる。
【００３５】
次に、本発明の現時点での好ましい実施形態（その例は添付の図面に示されている）を詳細に参照する。可能なときは常に、図面および説明において、同一または類似の部分を指すためには同一または類似の参照番号が用いられる。なお、図面は単純化された形態のものであり、正確な縮尺には一致しない。ここでの開示の参照において、便宜性および明瞭性の目的だけのために、方向性を示す用語、例えば頂部、底部、左、右、上流、下流、越えて、上、下、直下、後方、前方、遠位、および近位の用語が、添付の図面に関して使用される。このような方向性の用語は、如何なる意味においても本発明の範囲を制限するように解釈されるべきではない。
【００３６】
ここでの開示は、例示した一定の実施形態を参照するが、これらの実施形態は例として提示されるものであり、限定のためのものではないことが理解されるべきである。以下の詳細な説明の目的は、例示の実施形態について議論してはいるが、特許請求の範囲によって定義された本発明の精神および範囲内に入り得るような、当該実施形態の全ての改変、変更および均等物をカバーするように解釈されるべきである。本発明は、当該技術において慣用的に使用される種々の医療処置と共に利用されてよい。
【００３７】
次に、図を参照すると、本発明のシステム１０は、一般に、組織収集チャンバ２０、処理チャンバ３０、廃棄チャンバ４０、アウトプットチャンバ５０およびサンプルチャンバ６０のうちの１以上を含んでいる。種々のチャンバが、１以上の導管１２を介して一緒に連結されていて、生物学的材料を含有する流体が、閉じた無菌の流体／組織経路を維持しながら、一つのチャンバからもう一つのチャンバへと通過し得るようになっている。前記導管はそれぞれ、ここでは互換的にルーメンおよび配管と称される、剛性体または可撓性体であってよい。一定の実施形態において、この導管は、臨床設定で慣用的に使用されるポリエチレン配管、シリコーン、または当該技術において既知の他の材料等の可撓性配管の形態である。導管１２は、流体または組織の通過が望ましいかどうかに応じて、サイズを変更することができる。また、導管１２は、当該システムを通って循環される組織または流体の量に応じて、サイズを変更してよい。例えば、流体の通過のためには、該導管は約０．０６０〜約０．７５０インチに亘る直径を有してよく、また組織の通過のためには、該導管は０．３１２〜０．７５０インチに亘る直径を有してよい。一般に、この導管のサイズは、該導管が収容できる容積と、該導管を通して組織または流体を輸送するために必要な時間とをバランスさせるように選択される。当該システムの自動化された実施形態において、上記のパラメータ（即ち、輸送のための容積および時間）は、適切な信号を該システムのプロセッシング装置に伝達できるように決定しなければならない。これは、該装置が、正確な容積の液体および組織を、一つのチャンバからもう一つのチャンバへと移動させることを可能にする。使用される可撓性配管は、潰れる可能性を低下させるために、負圧に耐えられるものであるべきである。使用される可撓性配管はまた、例えば、当該システムにおいて使用され得る容積式ポンプ（positive displacement pump）によって発生される陽圧に耐え得るべきである。
【００３８】
当該システムの全てのチャンバは、１以上のポート、例えば、標準のＩＶシリンジおよび吸引配管の接続部を受入れる出口ポート２２、または入口口ポート２１を備えることができる。該ポートは、ゴム隔壁で閉鎖されたシリンジ針アクセスポート５１のような、密封されたポートであってよい。入口ポートは、導管によって、１以上のカニューレ（図示せず）に結合されてよい。例えば、組織入口ポート２１は、単回使用の一体型脂肪吸引カニューレに結合されてよく、また該導管は可撓性配管であってよい。該導管は、一般に、当該システムの一つのチャンバからもう一つのチャンバへの流体通路を提供するように配置される。この目的に向けて、該導管およびポートは、例えば手動または自動で操作され得る吸引装置（図示せず）に連結されてよい。該吸引装置は、例えば、シリンジまたは電気ポンプであってよい。この吸引装置は、患者から組織を吸引するために、充分な負圧を提供し得るべきである。一般には、当業者（例えば外科医）に既知の、何れか適切な吸引装置が使用されてよい。
【００３９】
導管１２は、更に、当該システムの種々の部品間の流れを制御するために、１以上のクランプ（図示せず）を含んでよい。このクランプは、当該システムの異なる領域を効果的に密封することによって、該システムの無菌性を維持するために有用である。或いは、導管１２は、当該システムを通る材料の流れを制御する１以上の弁を含んでもよい。図において、弁１４は開いた円で示されている。好ましい実施形態において、これらの弁は、電子機械的なピンチ弁であってよい。もう一つの実施形態において、これらの弁は空気圧弁であってよい。更に他の実施形態において、前記弁は水圧弁または機械式弁であってよい。このような弁は、好ましくは、レバーに結合され得る制御システムにより駆動される。このレバーは、該レバーが駆動されるように手動で操作される。自動化された実施形態において、該制御システムは、前記レバー、並びに所定の活性化条件で前記弁を活性化するプロセッシング装置に結合されてよい。一定の自動化された実施形態では、前記弁の活性化は、当該プロセスが最適化され得るように部分的に自動化されてよく、且つ部分的にはユーザの選択に服してもよい。更に他の実施形態において、一定の弁は手動で駆動され、他は前記プロセッシング装置を介して自動的に活性化される。弁１４はまた、１以上入のポンプ、例えば蠕動ポンプ３４または容積式ポンプ（図示せず）と共に使用されてよい。また、導管１２および／または弁１４は、種々の流体成分の間を識別でき且つ該システムを流れる流体レベルの間を識別できるセンサ２９、例えば光学センサ、超音波センサ、圧力センサ、または当該技術において既知の他の形態のモニターを含んでよい。好ましい実施形態において、前記センサは光学センサである。
【００４０】
当該システムはまた、複数のフィルタ３６を含んでいる。一定の実施形態において、該フィルタは、当該システムのチャンバ２８内にあってよい。当該システム内の異なるチャンバは、異なるフィルタを含んでなるものであってよい。該フィルタは、再生細胞、例えば幹細胞および／または前駆細胞を、望ましくない細胞および当該システムに従って使用され得る脱凝集剤から分離するために有効である。一つの実施形態において、フィルタアセンブリー３６は、中空糸濾過装置を含んでいる。もう一つの実施形態において、フィルタアセンブリー３６は、浸透濾過装置を含んでおり、これは沈降分離プロセスと共に使用されてもよく、そうでなくてもよい。更なる実施形態において、第一のアセンブリー３６は遠心分離装置を含み、これは水簸装置および水簸プロセスと共に使用されてもよく、そうでなくてもよい。更にもう一つの実施態様において、当該システムは、これら濾過装置の組合せを含む。本発明のフィルタ機能は二つの部分からなることができ、幾つかのフィルタは、最終濃縮物からコラーゲン、遊離の脂質、遊離の脂肪細胞および残留コラゲナーゼ等を除去し、他のフィルタは最終製品を濃縮するために使用することができる。当該システムのフィルタは、直径および／または長さが２０〜８００μｍに亘る複数の孔を含んでいてよい。好ましい実施形態において、収集チャンバ２０は、８０〜４００μｍに亘る複数の孔を備えた前置フィルタ２８を有している。もう一つの好ましい実施形態において、収集チャンバ２０は、２６５μｍの複数の孔を備えた前置フィルタを有している。他の実施形態において、該フィルタは着脱可能および／または使い捨て可能である。
【００４１】
当該システムはまた、１以上の温度制御装置（図示せず）を含んでよく、これは当該システムの１以上のチャンバ内に含まれる材料の温度を調節するために配置される。この温度制御装置は、加熱器、冷却器またはその両者であってよく、即ち、加熱器および冷却器の間で切替え可能であってもよい。該温度制御装置は、当該システムを通過する如何なる材料（組織、脱凝集剤、再懸濁剤、濯ぎ剤、洗浄剤または添加剤を含む）の温度をも調節してよい。例えば、脂肪組織の加熱は脱凝集を促進するのに対して、再生細胞生産品の冷却は生存を維持するために望ましい。また、最適な組織処理のために予め加温された試薬が必要とされるのであれば、温度制御装置の役割は、温度を増大または減少させることよりも、むしろ所定の温度を維持することであろう。
【００４２】
閉じた無菌の流体／組織通路を維持するために、全てのポートおよび弁は、当該システムの密封構造を維持する閉鎖手段を含むことができる。該閉鎖手段は、流体、空気および他の不純物に対して不浸透性の膜であってよく、或いは、当該技術において既知の他の適切な閉鎖手段であってよい。更に、当該システムの全てのポートは、それらが、当該システムの無菌性を損なうことなくチャンバ内の材料を抜取るための、シリンジ、針、または他の装置を収容できるように設計されてよい。
【００４３】
ここに記載するように、組織は、何れかの当該技術で認められた方法によって、患者から摘出されてよい。吸引された組織は、処理のためにシステム内に配置される前に摘出されてよい。吸引された組織は、典型的には、ゴム隔壁で閉鎖されたシリンジ針アクセスポート（収集チャンバには示されていない）のような密封された導入ポートから、導管１２を通して収集チャンバ２０へと移送される。或いは、組織摘出工程が当該システムの一部であってもよい。例えば、収集チャンバ２０は真空ライン１１を含んでよく、これは患者の中に挿入される標準カニューレを使用して、組織の取り出しを容易にする。こうして、この実施形態では、全体のシステムが患者に取り付けられる。組織は、入口ポート２０を通り、閉じた無菌通路の一部である１２のような導管を介して、収集チャンバ１０の中に導入されてよい。収集チャンバ２０は、複数の可撓性または剛性の容器もしくはシリンダ、またはそれらの組み合わせを含んでよい。例えば、収集チャンバ２０は、多様なサイズの１以上の剛性容器を含んでよい。また、収集チャンバは、１以上の可撓性バッグを含んでもよい。このようなシステムにおいて、該バッグには、好ましくは内部フレームまたは外部フレームのような支持体が設けられており、これは、該バッグに吸引が適用されたときにバッグが潰れる可能性を低減するための補助となる。収集チャンバ２０は、処理チャンバ３０内で行われるプロセスの洗浄および濃縮段階に先立って、組織を適切に洗浄および脱凝集させるのに必要な量の生理食塩水を保持する大きさである。好ましくは、収集チャンバ２０の中に存在する組織または流体の容積は、肉眼で容易に確認可能である。例えば、脂肪組織から再生細胞を得るために適切な収集チャンバは、８００ｍＬの脂肪吸引物および１２００ｍＬの生理食塩水を保持する容量を有している。従って、一つの実施形態において、収集チャンバ２０は少なくとも２リットルの容量を有している。血液から赤血球を分離および濃縮するもう一つの実施形態では、収集チャンバ２０は少なくとも１．５リットルの容量を有している。一般に、収集チャンバ２０のサイズは、患者から採取する組織の種類および量に応じて変化するであろう。該収集チャンバ２０は、約５ｍＬと少ない量から約２リットルの組織を保持するように採寸されてよい。より小さい組織体積、例えば５ｍＬ〜１００ｍＬの場合、組織は収集チャンバ２０に輸送される前に、シリンジの中に集められてよい。
【００４４】
収集チャンバ２０は、滅菌できる何れかの適切な生体適合性材料を使用して構築されてよい。好ましい実施形態において、収集チャンバ２０は、ＩＳＯ１０９９３標準に記載された、接触のための生体適合性要件に合致する使い捨て材料で構築される。例えば、ポリカーボネート、アクリル、またはＡＢＳが使用されてよい。収集チャンバ２０の流体経路は、好ましくはパイロジェンを含まず、疾患伝染の危険を伴わない血液使用のために適している。一つの実施形態において、収集チャンバ２０は、ユーザがチャンバ内に存在する組織の近似容積を目視で決定することを可能にする材料で構築される。他の実施形態において、収集チャンバ２０の中の組織および／または流体の容積は、自動化されたセンサ２９によって決定される。好ましくは、収集チャンバ２０は、自動化された実施形態において、当該システムは、チャンバ内における組織および／流体の容積を合理的な精度で決定できるように設計される。好ましい実施形態において、当該システムは、収集チャンバ内の容積を±１５％の精度で検知する。
【００４５】
例示としてのみ提供される特定の実施形態において、収集チャンバ２０は、例えば、医療等級のポリカーボネートで構築された剛性チャンバの形態であり、医療等級ポリエステル製で概ね円錐形の、２６５μｍのメッシュサイズを備えた前置フィルタ２８を含んでいる（図５参照）。この剛性の組織回収容器は、高さ約８インチおよび直径約５インチの寸法を有してよく、壁の厚さは約０．１２５インチであってよい。該シリンダの内部は、例えば、吸引配管のための１以上のポート、滅菌ドッキング技術を介した結合のための配管を備えたポート、および／またはゴム隔壁を通しての針穿刺アクセスのための、１以上のポートを通してアクセスされてよい。収集チャンバ２０の中の前置フィルタ２８は、好ましくは、例えば、患者から組織を取出すときに、脂肪組織を保持し且つ非脂肪組織を通過させるように構成される。更に詳細に言えば、該フィルタ２８は、脂肪組織の初期収集の際に、または別の実施形態ではその後に、脂肪組織の断片を保持しながら、遊離の脂質、血液および生理食塩水を通過させることができる。この点において、フィルタ２８は、同じサイズまたは異なるサイズで、且つ２０μｍ〜５ｍｍ範囲の複数の孔を含んでいる。好ましい実施形態において、フィルタ２８は４００μｍの複数の孔を含んでいる。好ましい実施形態において、フィルタ２８は、約２６５μｍの孔サイズおよび約４７％の開放面積を有する厚さ約２００μｍの医療等級ポリエステルメッシュである。この材料は、濯ぎの際には該組織を保持するが、組織の脱凝集の後には、該メッシュを通して細胞を通過させる。従って、患者から組織が吸引されるときに、非脂肪組織は脂肪組織から分離される。この同じ機能は、異なる材料、メッシュサイズ、並びにポートの数および種類を用いても達成できるであろう。例えば、１００μｍよりも小さいメッシュの孔サイズ、または数千ミクロンと大きい孔サイズは、脂肪組織凝集体および断片を保持しながら、生理食塩水および血液細胞を通過させる同じ目的を達成するであろう。同様に、別の剛性プラスチック材料を使用することによって、または当業者に既知の他の多くの変形によって、この同じ目的を達成できるであろう。
【００４６】
システム１０はまた、１以上の溶液供給源２２を含んでいてもよい。該溶液供給源は、洗浄溶液供給源２３、およびコラゲナーゼのような組織脱凝集剤供給源２４を備えていてよい。収集チャンバ２０は、洗浄溶液および脱凝集溶液もしくは薬剤が、無菌状態で組織に添加されるのを可能にする閉じた流体経路を含んでいる。
【００４７】
洗浄溶液２３および脱凝集剤２４のための容器は、それらの内容物を無菌的に保持できる何れか適切な容器、例えば、折畳み可能なバッグ、例えば臨床設定で使用されるＩＶバッグであってよい。これらの容器は導管１２、例えば、洗浄溶液および脱凝集剤が収集チャンバ２０の内部に移送されるように、収集チャンバ２０に結合された導管１２ｅを有してよい。洗浄溶液および脱凝集剤は、生理食塩水２３および／または脱凝集剤２４の容器の外側に加わる単純な重力圧、または導管（例えば図４における導管１２ｄ）に容積式ポンプを配置することを含む、当該技術において認められている何れかの方法で収集チャンバ２０の内部に輸送されてよい。自動化された実施形態では、当該システムのプロセッシング装置が、ユーザによって最初に入力された情報（例えば処理される組織の容積）に基づいて、種々のパラメータ、例えば洗浄のために必要な生理食塩水の容積、時間またはサイクル数、並びに脱凝集剤の濃度もしくは量、および脱凝集に必要な時間を計算する。或いは、量、時間等はユーザが手動で操作することができる。
【００４８】
収集チャンバ内の組織および／または流体は、３０℃〜４０℃の温度範囲に維持すべきである。好ましい実施形態において、収集チャンバ内部の懸濁液の温度は３７℃に維持される。一定の実施形態において、外科的処置または治療的適用を遅延させる必要があるならば、選択された組織は、後で使用するために収集チャンバの中に保存されてよい。該組織は、室温もしくはほぼ室温または約４℃において、９６時間まで保存されてよい。
【００４９】
洗浄溶液は当業者に既知の何れの溶液であってよく、これには生理食塩水または他の緩衝もしくは非緩衝の電解質溶液が含まれる。処理される組織の種類によって、使用される洗浄溶液の種類または組合せが指定される。典型的には、生理食塩水のような洗浄液は、脂肪組織が患者から取出されて収集チャンバの中に配置された後に、収集チャンバ２０の中に導入される。しかし、この洗浄液は、脂肪組織が摘出される前に収集チャンバ２０へ搬送されてもよく、または脂肪組織と同時に収集チャンバ２０へ輸送されてもよい。収集チャンバ２０の中では、洗浄溶液および摘出された脂肪組織が、以下で説明する方法を含む何れかの手段によって混合されてよい。
【００５０】
例えば、組織は撹拌によって洗浄されてよい（これは細胞の生存を最大化し、放出される遊離脂肪の量を最小化する）。一つの実施形態では、種々の角度の円弧（例えば約４５°〜約９０°の円弧）を通して、種々の速度、例えば約３０ｒｐｍで全体の収集チャンバ２０を回転させることによって組織が撹拌される。一つの実施形態において、組織は、収集チャンバの内表面に固定された１以上のパドルまたは突起を含む全体の収集チャンバ２０を、種々の角度の円弧を通して（例えば約４５°〜約９０°の円弧）を通して、種々の速度、例えば約３０ｒｐｍで回転させることによって撹拌される。上記の収集チャンバ２０の回転は、収集チャンバ２０に取り付けられた、またはその近傍に配置された駆動機構によって達成されてよい。該駆動機構は、単純なベルトもしくは歯車、または当該技術において基地の他の駆動機構であってもよい。回転の速度は、例えば毎分３０回転であってよい。一般に、速度が大きいほど容積の大きい遊離脂肪を生じ、また最適ではない可能性があることが分かっている。
【００５１】
他の実施形態において、当該組織は回転可能なシャフト２５を収集チャンバ２０の内部に配置することによって撹拌され、ここでの回転可能なシャフトは、該回転可能なシャフト２５に固定された１以上のパドル２５ａまたは突起を含んでおり、これは該シャフトが回転されるときに前記混合物を通過させる。一定の実施形態において、パドル２５ａを固定された回転可能なシャフト２５は、収集チャンバ２０の底に配置されてよい。これは、例えば、パドル様の装置を回転磁界（例えば磁気撹拌機）の中に配置することによって達成されてよい。或いは、組織の撹拌は、当該技術において既知の単純な撹拌機、例えば回転なしに上下に揺動させる装置を使用して達成されてもよい。該組織はまた、動転、撹拌、反転などを含む、当該技術で認められた何れか他の手段を使用して洗浄されてよい。
【００５２】
望ましい量の洗浄サイクルの後に、再生細胞を残りの脂肪組織成分から分離するために、組織脱凝集剤を収集チャンバ２０に送給してよい。この脱凝集剤は、当業者に既知の如何なる脱凝集剤でもよい。使用し得る脱凝集剤には、中性プロテアーゼ、コラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、ブレンドザイム（Blendzyme）酵素混合物ファミリーのなかの一つ、例えばリベラ−ゼ（Ｌｉｂｅｒａｓｅ）Ｈ１、ペプシン、超音波もしくは他の物理的エネルギー、レーザ、マイクロ波、他の機械的装置、および／またはそれらの組み合わせが含まれるであろう。本発明の好ましい脱凝集剤はコラゲナーゼである。該脱凝集剤は、他の溶液と共に添加されてよい。例えば、上記で述べた生理食塩水源２３から送達される生理食塩水が、コラゲナーゼと共に脂肪組織に添加されてよく、または該生理食塩水に続いて直ちにコラゲナーゼを添加してもよい。一つの実施形態において、洗浄された脂肪組織は、３７℃またはその付近で約２０〜６０分間、コラゲナーゼ含有酵素液と混合される。一つの実施形態では、消化時間を減少させるために、更に高濃度のコラゲナーゼまたは同様の薬剤が添加されてよい。次いで、洗浄された脂肪組織および組織脱凝集剤は、洗浄された脂肪組織が脱凝集されるまで、上記で説明した撹拌方法と類似した方法で撹拌されてよい。例えば、洗浄された脂肪組織および組織脱凝集剤は、全体の収集チャンバを約９０°の円弧を通して回転させることによって、シャフトが回転されるときに溶液を通過させる１以上のパドルを含むシャフトを有することによって、および／または収集チャンバの内表面にパドルまたは突起を含む全体の収集チャンバを回転させることによって撹拌されてよい。
【００５３】
脂肪由来の細胞が使用される目的に応じて、脂肪組織は部分的に脱凝集されるか、または完全に脱凝集されてよい。例えば、脂肪由来細胞が脂肪組織のユニットと組合される実施形態においては、回収された脂肪組織を部分的に脱凝集させて、該部分的に脱凝集された脂肪組織の一部を取り出し、次いで、収集チャンバの中に残っている脂肪組織の残部の脱凝集を続けるのが望ましいかもしれない。或いは、洗浄された脂肪組織の一部を取り出し、消化の前にサンプル容器の中に取り分けておいてもよい。もう一つの実施形態において、回収された脂肪組織は、患者の中に再導入して戻される前に、細胞を濃縮するために部分的に脱凝集される。一つの実施形態において、脂肪組織は、一般には約２０分未満の時間だけ組織脱凝集剤と混合される。次いで、部分的に脱凝集された組織の一部は収集チャンバから取り出されてよく、残りの部分的に脱凝集された組織は、該脂肪組織をもう４０分だけ組織脱凝集剤と混合することによって更に脱凝集されてよい。脂肪由来細胞が実質的に純粋な再生細胞の集団として使用されるときは、該脂肪組織は完全に脱凝集されてよい。
【００５４】
消化の後、組織および脱凝集剤溶液は、該溶液の浮遊成分および非浮遊成分の区別を可能にするのに十分な時間だけ、収集チャンバ内で静置される。典型的には、この時間は約１５秒〜数分の範囲であるが、変形例においては他の時間で実施されてもよい。浮遊層は、更なる洗浄および濃縮を必要とする再生細胞を含んでいる。非浮遊層は、血液、コラーゲン、脂肪、および再生細胞でない他の組織成分を含んでいる。非浮遊層は、洗浄チャンバへと除去されなければならない。
【００５５】
従って、収集チャンバ２０は、好ましくは、該チャンバの最低点に出口ポート２２を含んでいて、血液および組織の他の非浮遊成分が１以上の導管１２を介して１以上の廃棄容器４０へと排液され得るようになっている。収集チャンバ２０は、出口ポート２２が収集チャンバの底に位置するように、一般には直立型の配置である（または直立に配置されてよい）。排液は、受動的または能動的であってよい。例えば、上記で述べた非浮遊成分は重力を使用することによって、またはポンプ３４の使用もしくは通気孔３２の使用により、陽圧もしくは負圧を適用することによって排液することができるであろう。自動化された実施形態では、当該プロセッシング装置は、一定の弁および／またはポンプに信号を送って、非浮遊層を収集チャンバ２０から排液することができる。また、この自動化された実施形態は、浮遊層および非浮遊層の間の界面が到達したときを検知できるセンサ２９を含んでもよい。この自動化された実施形態はまた、収集チャンバから外へと導出される導管の中を流れている流出液中の光屈折率の変化を検出できるセンサ２９、例えば光学センサを含んでもよい。光屈折率の適切な変化は、出て行く導管の中に浮遊層が存在することの信号を発し、これは非浮遊層が既に排出されたことを示す。
【００５６】
しかし、一定の実施形態において、組織は、組織の非再生細胞成分を回収するために処理されてよい。例えば、一定の治療的または研究的応用では、コラーゲン、タンパク質、マトリックスもしくは間質成分、脂質、脂肪細胞、または組織の他の成分が望ましいかもしれない。このような実施形態では、上記で述べたように廃棄チャンバへと除去されなければならないのは、再生細胞を含んでなる浮遊層である。次いで、非浮遊層は、必要に応じて更なる処理のためにシステム中に保持される。
【００５７】
非浮遊層が除去されたら、再生細胞を含んでなる浮遊層は、残留する汚染物を除去するために１回以上洗浄されてよい。従って典型的には、収集チャンバ２０は、洗浄溶液を該チャンバの内部に送給することを可能にするための１以上のポート２１、および廃棄物および他の材料を収集チャンバ２０から外部へ出すことを可能にするための１以上のポート２２を含んでいる。例えば、該収集チャンバは、ここで述べたような１以上の密封された導入ポートを含んでよい。収集チャンバ２０はまた、当該システムが滅菌性を残しながら洗浄溶液を収集チャンバの中に導入し、および／または廃棄物を外に排出することを更に保証するために、頂部キャップおよび低部キャップのような１以上のキャップ（図示せず）を含んでよい。ポート２１は、収集チャンバのキャップに設けてもよく、収集チャンバの側壁に設けてもよい。
【００５８】
新鮮な洗浄溶液で洗浄するプロセスは、溶液中における非浮遊汚染物の残留含量が、所定のレベルに達するまで反復されてよい。換言すれば、脂肪組織断片を含む上記で述べた混合物の浮遊材料を含んだ収集チャンバ２０中の残留物質は、望ましくない物質の量が所定の所望のレベルに低下するまで、更に１回以上洗浄されてよい。洗浄の終点を決定する一つの方法は、組織溶液中の赤血球の量を測定することである。これは、波長５４０ｎｍで吸収される光を測定することによって達成することができる。好ましい実施形態では、約０．５４６〜約０．８４２の範囲が許容可能とみなされる。
【００５９】
洗浄および／または脱凝集の際、結果を向上するために、必要に応じて１以上の添加剤を種々の容器に添加してもよい。添加物の幾つかの例には、洗浄および脱凝集を最適化する薬剤、処理の際の活性な細胞集団の生存率を高める添加剤、抗菌剤（例えば抗生物質）、脂肪細胞および／または赤血球細胞を溶解する添加剤、或いは興味の対象である細胞集団を豊富にする添加剤（固相部分に対する付着力の差、または細胞集団の実質的な低下または富化を促進することによる）が含まれる。他の可能な添加剤には、再生細胞の回収および生存を促進するもの（例えばカスパーゼ阻害剤）、または注入もしくは設置に対して悪影響を及ぼす反応の可能性を低減するもの（例えば、細胞もしくは結合組織の再凝集阻害剤）が含まれる。
【００６０】
十分な鎮静時間が経過した後に、得られた洗浄済の脂肪組織断片および組織脱凝集剤の混合物の非浮遊画分には、再生細胞、例えば幹細胞および他の脂肪由来の前駆細胞が含まれているであろう。ここで述べるように、再生細胞を含む非浮遊画分は、処理チャンバ３０へと搬送され、そこでは脂肪組織由来の幹細胞のような興味の対象である再生細胞が、当該混合物の非浮遊画分に存在する他の細胞および材料から分離されるであろう。この非浮遊画分はここでは再生細胞組成物と称され、該画分は、ここで説明した幹細胞、前駆細胞、内皮前駆細胞、脂肪細胞および他の再生細胞を含む複数の異なるタイプの細胞を含んでいる。また、この再生細胞組成物は、当該脂肪組織断片中に存在していたコラーゲンおよび他の結合組織タンパク質ならびにそれらの断片、または組織脱凝集プロセスからの残留コラゲナーゼのような、１以上の汚染物を含んでいてもよい。
【００６１】
本発明の処理チャンバ３０は、好ましくは当該システム内に配置され、再生細胞組成物が、収集チャンバ２０から配管１２、弁１４、およびポンプ３４を通って無菌状態で処理チャンバ３０へと移動するようになっている。この処理チャンバは、１０ｍＬ〜１．２Ｌの組織／流体混合物を収容する大きさである。好ましい実施形態において、該処理チャンバは８００ｍＬの組織／流体混合物を収容する大きさである。一定の実施形態では、収集チャンバ２０からの全再生細胞組成物が、処理チャンバ３０へと方向付けられる。しかし、他の実施形態では、再生細胞組成物の一部が処理チャンバ３０へと方向付けられ、もう一つの部分は当該システムの異なる領域、例えばサンプルチャンバ６０に方向付けられ、後で処理チャンバ３０で処理される細胞と再度合体される。
【００６２】
処理チャンバ３０は、滅菌できる如何なる適切な生体適合性材料を使用して構築されてもよい。好ましい実施形態において、この処理チャンバ３０は、ＩＳＯ１０９９３規格に記載されたような、血管内接触のための生体適合性要件に合致する使い捨て材料で構築される。例えば、ポリカーボネート、アクリル、ＡＢＳ、エチレン酢酸ビニル、またはスチレン／ブタジエン共重合体（ＳＢＣ）を使用してよい。もう一つの実施形態において、使い捨て処理チャンバの流体経路はパイロジェンを含まない。該処理チャンバは、血液銀行における血液処理に慣用的に使用されているようなプラスチックバッグの形態であってよく、或いは、他の実施形態において、それは構造的に剛性のもの（図６）であってよい。一つの実施形態において、処理チャンバ３０は、共通人の所有になる２００１年１２月７日に出願の米国出願第１０／３１６，１２７号、および２００２年１２月２０日出願の米国出願第１０／３２５，７２８号に開示された処理チャンバに類似のものでよく、これら出願の内容は本明細書の一部として援用される。
【００６３】
処理チャンバ３０は、濾過、遠心分離、および／またはそれらの組合わせを含む、細胞を分離および濃縮するのに適した如何なる方法で構築されてもよい。一定の実施形態において、収集チャンバ２０からの再生細胞組成物は処理チャンバ３０に導入され、そこでは特定の再生細胞集団を分離および／または濃縮するために、該組成物を濾過することができる。細胞濾過は、特定の成分および細胞を、他の異なる成分または細胞型から分離する方法である。例えば、本発明の再生細胞組成物は、幹細胞、前駆細胞および脂肪細胞を含む複数の異なる種類の細胞を含有すると共に、脂肪組織断片中に存在していたコラーゲンン、または組織脱凝集プロセスに由来する残留コラーゲンのような、１以上の汚染物を含有している。処理チャンバ３０の中に存在するフィルタ３６は、特定の再生細胞のサブ集団、例えば幹細胞または内皮前駆細胞等の分離および濃縮を可能にしてもよい。
【００６４】
液体からの細胞の濾過に関係した幾つかの変数には、フィルタ媒質の孔サイズ、孔の幾何学（形状）、フィルタの表面積、濾過される溶液の流れ方向、膜貫通圧力、特定の細胞集団の希釈、特定のサイズおよび形状、並びに細胞サイズおよび細胞生存率が含まれるが、これらに限定されない。ここでの開示に従えば、分離または濾過するのが望ましい特定の細胞特定の細胞は、典型的には脂肪由来の幹細胞である。しかし、一定の実施形態において、該特定の細胞には、脂肪由来の前駆細胞、例えば単独または幹細胞との組み合わせでの、内皮前駆細胞が含まれてよい。
【００６５】
再生細胞組成物は、フィルタアセンブリー（例えばフィルタアセンブリー３６）を通過するように方向付けられる。一定の実施形態において、フィルタアセンブリー３６は、異なる機能を実行して再生細胞組成物を異なる部分または成分に分離するように構成された、複数のフィルタを含んでいる。例えば、一つの該フィルタは再生細胞組成物からコラーゲンを分離するように構成されてよく、前記フィルタの一つは、前記再生細胞組成物から脂肪細胞および／または脂肪成分を分離するように構成されてよく、また前記フィルタの一つは、組織脱凝集剤のような残留酵素を前記組成物から分離するように構成されてよい。一定の実施形態において、前記フィルタの一つは、前記組成物からコラーゲンおよび組織脱凝集剤を分離する等のように、二つの機能を実行することができる。前記複数のフィルタは、典型的には直列に配列されるが、同様に、前記フィルタの少なくとも一部は並列に配列されてよい。フィルタアセンブリー３６におけるフィルタの直列構成が図２に示されている。フィルタアセンブリー３６におけるフィルタの並列構成が図３に示されている。
【００６６】
一つの実施形態において、フィルタアセンブリー３６は、第一のフィルタ、第二のフィルタ、および第三のフィルタを含んでいる。第一のフィルタは、再生細胞組成物中に存在するコラーゲン粒子を除去するように構成される。これらのコラーゲン粒子は、典型的には直径が約０．１ミクロンであり、長さは２０ミクロン以下であることができる。該コラーゲン粒子は、消化に依存してサイズが変化する可能性がある。また、該コラーゲン粒子はフィブリルであってもよく、この場合はそれらがねじれやターンを有することを意味する。ここに記載したフィルタは何れも、ポリエーテルスルホン、ポリエステル、ＰＴＦＥ、ポリプロピレン、ＰＶＤＦ、または可能であればセルロース製であってよい。コラーゲンを濾過するためには二つの可能性が存在する。一つは、最初に大きな粒子を除去し、おそらくは１０ミクロン範囲のフィルタを必要とするであろう細胞を通過させることである。第二の方法は、コラーゲンを充分に消化してコラーゲンを通過させ、細胞をトラップすることを目的として、より小さいサイズ（例えば４．５ミクロン）のフィルタを使用することである。これは、細胞をフィルタの背後に浮遊させる手段を必要とするであろう。また、コラーゲン繊維を引き付けて保持するようなフィルタを実装する可能性が存在するかも知れない。
【００６７】
第二のフィルタは、前記再生細胞組成物中の浮遊しない遊離の未成熟脂肪細胞を除去するように構成される。一つの実施形態において、第二のフィルタはポリエステルで構築することができ、また約３０〜約５０ミクロンの孔サイズを有することができ、好ましい孔サイズは約４０ミクロンである。第二のフィルタと称するが、このような装置の配置は、より大きな細胞および粒子を最初に除去するのを容易にするために、第二の位置ではなく第一の位置であってよい。第三のフィルタは、当該組成物中における未使用の、または残留するコラゲナーゼまたは他の組織脱凝集剤を除去するように構成される。好ましい実施において、コラゲナーゼは経時的に変性してもよい。一つの実施形態において、この第三のフィルタは、１μｍ未満の直径または長さを有する複数の孔を備えている。一定の実施形態において、前記孔は、１μｍよりも小さい直径を有してよい。他の実施形態において、前記孔は、１０ｋＤ〜５ミクロンの直径を有する。一定の実施形態において、前記第三のフィルタは、前記再生細胞集団を、ここで述べた小容積の生理食塩水または洗浄溶液中に濃縮するように構成されてよい。現時点で好ましいものとしては、最終フィルタのみが中空糸ユニットである。全てのフィルタが中空糸型である必要はない。この中空糸ユニットは、前記再生細胞への有害な影響を最も小さくしてコラゲナーゼを除去する上で最も効果的なので、好ましい実施形態では最終フィルタのために使用される。当該装置が規格品である実施形態において、前記三つのフィルタは別々のハウジング内にある。中空糸ユニットが第三のフィルタのために使用されるのであれば、第一および第二のフィルタを一つのハウジング内に有するのが便利である。最終フィルタが中空糸設定でない場合には、三つのフィルタを一つのハウジング内に収容することができる。
【００６８】
フィルタアセンブリー３６のフィルタは、処理チャンバ３０の中に配置されてよく、或いは処理チャンバ３０とは別の部品として提供されてもよい。加えて、フィルタアセンブリー３６のフィルタは、複数の処理チャンバの中に提供されてよく、またはインライン様式で提供されてもよい。一定の実施形態において、前記導管または配管は、１以上の処理チャンバとして働いてもよい。該処理チャンバは、それがフィルタを連結する導管の内部容積になるようにサイズを縮小することができる。この型のシステムは、組織溶液の容積が適切な大きさであれば正しく機能するであろう。従って、前記導管は、前記流体が前記フィルタを流れているときに、該流体を細胞と共に収容することによって、処理チャンバとして働くことができるであろう。当該システムのプライミングおよび運転するプロセスにおいて細胞／組織が不必要に喪失されないように、導管の容積を最小化するように注意した方がよいであろう。
【００６９】
上記で述べた実施形態を参照すると、洗浄された細胞および残留するコラーゲン、脂肪細胞、および／または未消化の組織脱凝集剤を含む前記再生細胞組成物は、第一のフィルタを通され、濾過された溶液中にはコラーゲン粒子が僅かしか、好ましくは全く存在しないように、前記組成物から少なくとも一部および好ましくは実質的に全てのコラーゲン粒子が除去される。脂肪細胞および／または未消化の組織脱凝集剤を含むこの濾過された再生細胞組成物は、次いで、前記濾過された再生細胞組成物から、遊離の脂肪細胞の少なくとも一部および好ましくは実質的に全てを除去するために、第二のフィルタを通されてよい。その後、未消化の組織脱凝集剤を含むこの２回濾過された再生細胞組成物は、未消化の組織脱凝集剤を該再生細胞組成物から除去または低減するために、ここで述べた中空糸フィルタ装置のような第三のフィルタを通されてよい。
【００７０】
この３回濾過された再生細胞組成物（即ち、第一、第二および第三のフィルタを通過した後に残留する組成物）は、次いで複数の出口に方向付けられるが、これには複数の出口を備えた処理チャンバ３０の一部が含まれてよい。これらの出口は、必要な圧力を維持するように働くと共に、導管を介して他の容器（収集チャンバ２０、アウトプットチャンバ５０および／または廃棄容器４０を含み得る）への接続を提供することができる。
【００７１】
一つの実施形態において、フィルタアセンブリー３６の一つのフィルタは、中空糸濾過部材を含んでいる。或いは換言すれば、該フィルタは濾過媒体で形成された中空管の集合体を含んでなるものである。開示されたシステム１０と共に使用できるフィルタ媒体の例には、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、または混合エステルの材料等が含まれる。これら中空糸またはフィルタ媒体の中空管は、フィルタアセンブリー３６の円筒状カートリッジの中に収容されてよい。フィルタ媒体の個々の管または繊維は、典型的には約０．１ｍｍ〜約１ｍｍの範囲の内径を有しており、好ましい値は約０．５ｍｍである。適切な円筒形カートリッジの直径および長さは、当該カートリッジ内部に配置され得るフィルタ媒体の個々の管の数を決定するであろう。適切な中空糸フィルタカートリッジの一つの例は、ＦｉｂｅｒＦｌｏ（登録商標）接線流れフィルタ、カタログ番号Ｍ−Ｃ−０５０−Ｋ（Ｍｉｎｎｔｅｃｈ社、ミネアポリス市、ミネソタ州）である。該フィルタ媒体の孔サイズは、約１０キロダルトン〜約５ミクロンの範囲で変化することができ、好ましい孔サイズは約０．５ミクロンである。
【００７２】
中空糸フィルタにおいて、各中空管は、第一の末端および第二の末端を備えた本体を有し、該本体内には、前記第一および第二の末端の間に延びるルーメンが配置されている。各中空管の本体は複数の孔を含んでいる。この孔は一般的には、図１２Ａに示すように、前記再生細胞組成物が前記本体のルーメンを通って流れ、且つ濾過すべき生成物は前記孔を接線方向に通過することによって濾過されるように、本体の中で配向されている。換言すれば、液体中の小さい粒子は、本体のルーメンを通る液体の流れに対して接線方向に孔を通過する。該組成物が濾過されるときに、該組成物は再生細胞と共に各中空管のルーメンを通過する。好ましくは、組成物の流れは各中空管本体の孔に対して接線方向である。
【００７３】
流体の接線方向の流れを使用することにより、他の濾過技術に比較して、幹細胞の濾過効率を向上できるであろう。例えば、幾つかの濾過技術に従えば、図１２Ｂに示すように、フィルタ媒体の孔は、フィルタが流体の流れに対して直角に配向されるように配置され、フィルタ媒体が濾過される流体の経路を阻止するようになっている。このタイプの濾過では、濾過により取り出される再生細胞組成物の粒子（例えば幹細胞）がフィルタの一方の側に蓄積して、前記孔を通る流体の流れを阻止する傾向がある。この阻止によって、濾過の効率は低下する可能性がある。加えて、当該細胞は流体の流れ圧力、並びにフィルタの上流側に蓄積する細胞の重量によって一定に圧縮される。これは、幹細胞の増大した溶解を導く可能性がある。従って、流体の流れがフィルタの孔の向きに対して並行であるこのような濾過技術は、望ましくないことに、流体が孔を通過するときに大きな細胞および小さな粒子の両者をフィルタ媒体に対して当接するように方向付けする可能性がある。結局、細胞のような液体中の大きな生成物が孔を塞ぎ、それによって濾過効果を減少させ、また細胞の破壊または損傷の発生を増大させる可能性がある。
【００７４】
これとは対照的に、本システムの中空糸構成では、濾過される流体が中空間のルーメンの内部を流れる。フィルタ本体の孔を通過する能力を有する液体の一部は、本体の内部に対する陽圧、ならびに本体の外側に加わる陰圧に補助されて前記孔を通過する。この実施形態において、細胞は、典型的には流体の流れ圧力および他の細胞の重力を受けず、従って幹細胞に対する剪断力は低減される。こうして、濾過の効率および有効性は、目詰まり速度の低下および再生細胞溶解の低減によって向上することができる。生理食塩水および望ましくないタンパク質分子のサイズに起因して、濾過の際に、これら分子および他の小成分は中空管の本体の孔を中空間の外側へと通過し、廃棄容器４０へと向う。一つの実施形態では、中空管フィルタ媒体の外側に真空を発生させることによって、濾過が向上される。再生細胞（例えば幹細胞もしくは前駆細胞）のサイズに起因して、これら細胞は典型的には本体の孔を通過することができず、従って中空間フィルタの内側（例えば管のルーメン内）に残り、フィルタと処理チャンバの間の導管を介して処理チャンバ３０へと戻され、またはアウトプットチャンバ５０へと向う。
【００７５】
一つの特定の実施形態において、中空糸フィルタは約０．０５ミクロンの孔サイズを有し、また約５５０ｃｍ2のフィルタ媒体の表面積を含んでいる。個々の媒体管は、典型的には約０．５ｍｍの直径を有している。１３０ｍＬの再生細胞組成物を処理する際には、約１２０ｍＬの追加の生理食塩水が該組成物に添加されてよい。処理または濾過時間は、約８分であってよい。中空糸管の本体の両側（例えば、本体ルーメンの内側および本体の外側）における圧力差が、膜貫通圧力とみなされる。この膜貫通圧力波、約１ｍｍＨｇ〜約５００ｍｍＨｇで変化することができ、好ましい圧力は約２００ｍｍＨｇである。中空糸濾過を使用したときの有核細胞の平均の回収および生存率は、約８０％の生存細胞であることができる。
【００７６】
このようなシステムで典型的に除去されるコラゲナーゼの量は、３ｌｏｇの減少に等しい。例えば、収集チャンバから処理チャンバへと輸送される再生細胞組成物中のコラーゲンの初期濃度が０．０７８Ｕ／ｍＬであれば、最終的な再生細胞組成物中のコラゲナーゼ濃度は、０．０００７８Ｕ／ｍＬであろう。コラゲナーゼは中空糸フィルタにおいて除去され、該中空糸フィルタは上記で述べた第三のフィルタに相当する。
【００７７】
上記で述べた１以上の濾過方法を示す処理チャンバが、図面、特に図１〜図３に示されている。図１〜図３を参照すると、処理チャンバ３０とフィルタアセンブリー３６の濾過チャンバの間には、ポンプ３４のようなポンプが設けられてよい。加えて、処理チャンバ３０およびフィルタアセンブリー３６を備えたラインに、通気孔３２および圧力センサ３９を設けてもよい。また、アウトプットチャンバ５０のための取付け部品を設けてもよい。これらの任意の部品（例えばポンプ３４、通気孔３２、圧力センサ３９、およびアウトプットチャンバ５０のための取付け部品）は、処理チャンバ３０の中に含まれている液体が、フィルタアセンブリー３６を通って流れる前に１以上のこれら任意部品へと流れることができるように、処理チャンバとフィルタアセンブリー３６の間に設けられてよい。例えば、液体は、それがフィルタアセンブリー３６を通って流れる前に、ポンプ３４を通って流れてよい。或いは、液体は、フィルタアセンブリーを通って流れる前に、フィルタ前の液圧を得るために圧力センサ３９を通って流れてよい。一定の状況では、１以上のこれら部品はまた、図６に示した通気孔３２のように、処理チャンバ３０の素子として設けられてもよい。図示の実施形態において、再生細胞組成物がフィルタアセンブリー３６の濾過チャンバに導入されるとき、ポンプ３４により発生される該組成物の圧力を測定するために、圧力センサ３９はインラインで設けられる。この構成は、フィルタ膜を横切る膜貫通圧力のモニタリングを容易にすることができる。該組成物がフィルタアセンブリー３６を通して濾過されるとき、望ましくないタンパク質の除去を補助するために、追加の生理食塩水または他の緩衝液および洗浄溶液を再生細胞組成物に加えることができる。再生細胞の純度を高めるために、この反復洗浄は複数回行うことができる。一定の実施形態において、前記生理食塩水は、濾過を向上させるために必要と思われる如何なるステップにおいても添加することができる。
【００７８】
限定ではなく例としてのみ提供される一つの特定の実施形態においては、望ましくないタンパク質および生理食塩水もしくは他の洗浄溶液が次のようにして除去される。再生細胞、並びにコラーゲンおよび結合組織の粒子または断片、脂肪細胞、およびコラゲナーゼを伴った組成物は、最小容積に達するまで一連のフィルタを通して循環される。該最小容積は、当該システムの全滞留容積および幾つかの所定の定数の関数である。この滞留容積は、全ての処理チャンバが空であるときの、配管および導管に含まれる液体の容積である。一つの実施形態において、この最小容積は１５ｍＬである。該最小容積に達したときに、所定の容積の洗浄溶液が当該システムの中に導入されて、再生細胞組成物と混合される。次いで、この洗浄溶液および再生細胞組成物の混合物は、前記最小容積に再度到達するまで前記フィルタを通して循環される。再生細胞の純度を高めるため、或いは換言すれば、当該組成物中の他の物質に対する当該組成物中の再生細胞の比率を増大させるために、この循環は複数回反復させることができる。
【００７９】
再生細胞組成物が望ましくないタンパク質を浄化され、且つ既に充分に濃縮されたことが決定された後に（例示した実施形態においては、約１×１０5〜約１×１０7細胞／ｍＬの範囲内の最小濃度を使用することができ、好ましい実施形態においては、最小濃度は約１×１０7細胞／ｍＬであることができる）、アウトプットバッグのようなアウトプットチャンバ５０が、特定の実施形態に応じて、処理チャンバ３０および／またはフィルタアセンブリー３６の出力部分に接続されてよい。次いで、濃縮された再生細胞の出力を容易にするために、通気孔３２のような通気孔が開放されてよい。一つの実施において、最小濃度に到達した時点の決定は、複数回の実験運転がなされた後に経験的に行われ、また当該装置の電子的制御の中にプログラムされる。この決定は、如何なる収率または如何なる範囲の細胞濃度が望ましいか（即ち、どのように多くの幹細胞／前駆細胞が望ましいか）のプロセスへの入力であることができる。科学的データに基づけば、望ましい出力を達成するためには、所定の量の脂肪組織を入手して、当該システムの中に配置すること必要とされる。通気孔３２を開くと、ポンプ３４のようなポンプは、濃縮された再生細胞をアウトプットバッグの中へ搬送するように機能することができる。一つの実施形態において、アウトプットバッグ５０は、一端に取り付け部材を備えた配管を有する空の血液バッグに類似している。滅菌様式にで、アウトプットバッグ上の取り付け部材は出力ポートに取付けられてよく、また濃縮された再生細胞はアウトプットバッグへと搬送されてよい。
【００８０】
図１〜図３に示すように、特に当該システムにおける圧力を変化させるために、システム１０の中に真空ポンプ２６が設けられてよい。例えば、収集チャンバ２０内の圧力を減少させるために、真空ポンプ２６を、導管１２ｂのような導管を介して収集チャンバ２０に連結してよい。真空ポンプ２６はまた、導管１２ｇのような導管によって処理チャンバ３０に結合されてよい。ポンプ３４に関連した真空ポンプ２６の動作に関しては、二つの別々の真空ポンプまたは真空源が実装されてよく、或いは、当該プロセスでの特定の点において真空吸引を必要とする異なる導管へと真空吸引を方向付ける弁を使用することにより、単一のものが実装されてもよい。加えて、真空ポンプ２６は、導管１２ｆのような導管を介して廃棄容器４０に結合されてもよい。
【００８１】
図１０および図１１を参照すると、真空ポンプ２６によって発生される圧力は、再生細胞を含む流体の流れを、導管１２を通して指向させるために使用することができる。この圧力は、例えば、当該システムにおける１以上の弁１４の位置を自動的または手動で制御することによって、複数の方向に供給することができる。該システム１０は、陽圧の使用、負圧の使用、またはそれらの組み合わせによって、適正に機能するように作製することができる。例えば、再生細胞は、上記で述べた第一および第二のフィルタを通して、第三のフィルタに連結される軟質面（soft sided）の容器中に吸引されることができる。この軟質側の容器は、第三のフィルタの前方にインライン（直列）で接続することができる。最終のアウトプットチャンバは、第三のフィルタの他の側（例えば下流側）にある軟質面の容器であってよい。この実施形態では、圧力を使用して、再生細胞を、フィルタを通して一つの軟質面容器から第二の軟質面容器へと移動させる。
【００８２】
当該システム１０のもう一つの実施形態においては、幹細胞および／または脂肪由来の前駆細胞の濾過が、浸透濾過および沈降分離の組合せを使用して達成されてよい。例えば、このようなシステムは生理食塩水を使用し、該生理食塩水は組織再生細胞組成物（例えば幹細胞および／または脂肪由来の前駆細胞を含む組成物）を通過し、次いでフィルタを通過する。再生細胞組成物からの細胞の浸透濾過に関連する幾つかの変数には、フィルタ媒体の孔サイズ、孔の幾何学もしくは形状、フィルタの表面積、濾過される再生細胞組成物の流れ方向、注入される生理食塩水の流速、膜貫通圧力、細胞集団の希釈、細胞のサイズおよび生存が含まれるが、これらに限定されない。
【００８３】
当該システムの一つの実施形態において、処理チャンバ３０はフィルタアセンブリーを使用し、該アセンブリーは、再生細胞を分離および濃縮するために浸透濾過および沈降分離を実施する。限定するものではないが例として言えば、図６に示すように、処理チャンバ３０は側壁３０ａ、頂面３０ｂおよび底面３０ｃを有する一般的には円筒体として定義される。滅菌通気孔３２が頂面３０ｂに設けられる。
【００８４】
図６の実施形態において、処理チャンバ３０は、孔の大きいフィルタ３６ａおよび孔の小さいフィルタ３６ｂのような、二つのフィルタを含んだフィルタアセンブリー３６を含むものとして図示されている。フィルタ３６ａおよび３６ｂの孔サイズは、典型的には約０．０５ミクロン〜約１０ミクロンの範囲である。孔の大きいフィルタ３６ａは、直径が約５μｍの孔を含んでよく、また孔の小さいフィルタ３６ｂは、直径が約１〜３μｍの孔を含んでいてよい。一つの実施形態において、該フィルタは約７８５ｍ2の表面積を有している。フィルタ３６ａおよび３６ｂは、第一のチャンバ３７ａ、第二のチャンバ３７ｂおよび第三のチャンバ３７ｃを含むように、処理チャンバ３０の内部を分割する。図６に示したように、第一のチャンバ３７ａは、第二のチャンバ３７ｂと第三のチャンバ３７ｃの間に位置する。加えて、第一のチャンバ３７ａは、入口ポート３１ａおよび出口ポート３１ｂを有する処理チャンバ３０の領域であるとして示されている。図示の処理チャンバ３０は、処理チャンバ３０の外部から処理チャンバ３０の内部への流通経路を提供するポート３１ａ、３１ｂおよび３１ｃのような、複数のポートを含んでいる。これらポート３１ａ、３１ｂおよび３１ｃは、処理チャンバ３０の本体側壁３０ａに配置されるものとして図示されている。しかし、ポート３１ａ、３１ｂおよび３１ｃは、ウエルのような他の領域に配置することもできるであろう。ポート３１ａは、導管に結合されて、再生細胞を含有する組成物が処理チャンバ３０の内部へと通過できるように構成された、サンプル入口ポートとして図示されている。ポート３１ｂは、導管に結合されて、分離および濃縮された細胞が処理チャンバ３０の内部から取り出され得るように構成された、出口ポートとして図示されている。ポート３１ｃは、生理食塩水のような新鮮な洗浄溶液を処理チャンバ３０の内部へと送給するための導管に連結されるように構成された、入口ポートとして示されている。
【００８５】
使用において、再生細胞は、入口ポート３１ａを介して中央のチャンバ３７ａの中に導入されてよい。生理食塩水または他の緩衝液が、入り口ポート３１ｃを通して底部チャンバ３７ｂの中に導入される。生理食塩水は、約１０ｍＬ／ｍｉｎの速度で、チャンバ３７ａの中の再生細胞組成物を通るように方向付けられる。この生理食塩水の流速は、重力を打消すような速度である。該生理食塩水の流れは、前記チャンバ内の細胞に対して、細胞の密度に基いて分離する能力を与える。典型的には、生理食塩水が当該組成物に強制的に通されるときに、該組成物中の大きな細胞は中央チャンバ３７ａの底へと沈降し、小さい細胞およびタンパク質は第二のフィルタを通して頂部チャンバ３７ｃの中へと運び去られるであろう。この濾過は、大きな細胞がその場所で転動され、これにより小さい粒子が放出されて生理食塩水で運び去られることを可能にするように、生理食塩水の流速を調節することによって達成される。処理ユニット内の三つのチャンバにおいて正しい圧力勾配が維持されることを保証するために、滅菌弁３２がチャンバ３０の中に含められる。上方のチャンバ３７ｃは、吸収媒体３３を含むことができる。吸収媒体の目的は、前記溶液中の望ましくないタンパク質をトラップして、例えば生理食塩水の流速が減少したときに、それらがフィルタ媒体を横切って処理溶液の中に戻らないことを保証することである。吸収媒体は、吸収材であるか、または濾過により除去されるべき物質もしくは成分を引付けるタイプのフィルタ材料であることができる。廃棄物の抜き取りを補助するために、頂部フィルタの上に流出ポートを加えることができる。このもう一つの実施形態は、廃棄物の抜き取りを補助するために、頂部から穏やかな真空を適用するものであってよい。吸収媒体は、図示の実施形態におけるように、流速が比較的小さいときに実施することができる。次いで、過剰な生理食塩水およびタンパク質が廃棄物容器へと運び去られる。
【００８６】
大きな細胞（例えば脂肪由来の幹細胞および／または前駆細胞）が、小さい細胞およびタンパク質から充分に分離されてしまったときに、分離された細胞を含有する組成物は、ここで述べたようにして濃縮されてよい。該組成物は、出口ポート３１ｂを通してチャンバ３７ａから取り出されてしまった後に、またはそれがチャンバ３７ａの中にある間に、さらに濃縮されてよい。一つの実施形態において、前記組成物中における細胞の濃度は、以下のようにして増大される。細胞が充分に分離された後に、フィルタ３６ａおよび３６ｂのようなフィルタは、互いに向けて移動されてよい。この移動は、二つのフィルタの間の容積（例えばチャンバ３７ａの容積）を減少させる効果を有する。当該組成物中の細胞を濃縮するのを容易にするために、処理チャンバ３０に関連して振動膜が設けられてもよい。一つの実施形態において、振動部材はフィルタ３６ｂ（例えば孔の小さいフィルタ）に結合されてよい。振動は、細胞がフィルタの中にトラップされるに至る発生率を低下させることができる。当該組成物の容積における減少は、過剰な生理食塩水が廃棄物として除去され、細胞が小さい容積中に濃縮されることを可能にする。
【００８７】
もう一つの実施形態において、前記再生細胞の濃縮は次のようにして達成される。細胞が充分に分離された後、前記再生細胞組成物は、重力を使用して過剰な生理食塩水を濾過により除去するもう一つのチャンバ（図示せず）へと搬送されることができる。好ましい実施形態においては、濾過と同時に沈降が生じることができる。この沈降は、当該組成物を、約１０ｋＤ〜約２ミクロンの範囲の孔サイズを有するフィルタの頂部へと導入することによって達成される。一つの実施形態において、適切なフィルタは、約１ミクロンの孔サイズを有している。重力の力は、生理食塩水および小さい粒子がフィルタを通過することを可能にする一方、当該組成物中の細胞がフィルタを通って流れるのを防止する。細胞の望ましい濃度が得られた後、また濾過された小粒子がフィルタの下から除去された後に、再生細胞組成物はフィルタから細胞を取り出すために撹拌されてよく、その後、濃縮された再生細胞はアウトプットバッグへと搬送されてよい。小さい粒子は、廃棄物として出口を通して抜き出されることができる。
【００８８】
特定の実施形態において、収集チャンバ２０からの再生細胞組成物は処理チャンバ３０へと輸送され、ここで、組成物は再生細胞を分離および濃縮するために遠心分離されることができる。遠心分離の原理は当該技術において周知であり、簡略化のためにここでは繰返さない。ここでは、標準の、技術的に認められた遠心分離装置、部品およびパラメータが利用される。遠心分離装置の一部として使用するための処理チャンバの例が、図７および図８に示されている。典型的には、遠心分離装置は、遠心分離チャンバ（例えば図７に示したもの）を軸の回りに回転させ、それにより溶液中の細胞に加わる力を増大させて、重力よりも大きくなるようにする。溶液中のより密度の高い、またはより重い物質が、典型的には遠心分離チャンバの一端、即ち、図７のアウトプットチャンバ５０の一端に沈降して再生細胞ペレットを形成する。図７に示された処理チャンバは、遠心分離および重力の両方を使用して、細胞を分離および濃縮するように構成されている。即ち、遠心分離の際に、遠心力は前記再生細胞組成物の密度の高い成分（例えば再生細胞）を、遠心分離チャンバの最も外側の端部へと向わせる。遠心分離チャンバがスローダウンして最終的に停止するときに、重力は、再生細胞が遠心分離チャンバの最も外側の端部に残留して、細胞ペレットを形成するのを補助する。従って、再生細胞組成物の望ましくない成分、即ち、廃棄物は細胞ペレットを乱すことなく除去することができる。
【００８９】
本発明の更にもう一つの実施形態において、処理チャンバは、回転膜フィルタ形態の細胞濃縮器で構成されてよい。遠心分離プロセスの更なる実施形態においては、遠心水簸もまた適用されてよい。この実施形態において、細胞は、遠心によって加わる指向性（例えば外側への）の力が細胞および溶液を異なる速度で沈降させるように、個々の細胞の沈降速度に基づいて分離されてよい。水簸において、標的細胞集団の沈降速度は、遠心力に対して反対方向に溶液をポンピングすることにより加わる反対方向（即ち内側への）の流速によって抵抗を受ける。この反対方向の流れは、溶液中で細胞および粒子が分離されるように調節される。水簸は、細胞分離の多くの例において応用されてきており（Inoue, Carsten et al. 1981; Hayner, Braun et al. 1984; Noga 1999）、また遠心分離パラメータを最適化するために使用される原理および実務は、当業者が本開示を考慮して適用することができる。
【００９０】
図９は、本発明に従う水簸実施に関連した原理を図示している。水簸の実施形態は、回転ロータを使用して溶液に力が加えられる限りにおいて、遠心分離の実施形に類似することができる。現在の実施形態の水簸分離関連した可変要素の幾つかには、回転チャンバのサイズおよび形状、ロータの直径、ロータの速度、向流(counterflow)配管の直径、向流の流速、並びに溶液から取り出されるべき粒子および細胞のサイズおよび密度が含まれるが、これらに限定されない。遠心分離におけると同様に、再生細胞は、個々の細胞密度に基づいて分離することができる。
【００９１】
一つの実施形態において、再生細胞組成物、例えば再生細胞およびコラゲナーゼを含む溶液は、図９Ａに示すように、回転ロータのチャンバの中に導入される。溶液がチャンバに加えられた後に、所定の流速で、追加の生理食塩水が該チャンバに添加される。該生理食塩水の流速は、ロータの速度、細胞の直径、および経験的に樹立されたチャンバ定数の関数として、予め決定することができる。この流速は、例えばＩＶポンプに類似した装置を用いて制御されるであろう。この追加の生理食塩水の目的は、ロータチャンバの内部に、図９Ｂに示すように大きな粒子がチャンバの一方の側に移動し、小さな粒子は他方へと移動する条件を与えることである。この応用では、図９Ｃに示すように、小さい粒子がチャンバを出て廃棄物容器へと移動するように、流れが調節される。この移動は、幹細胞のような細胞の実質的に均一な集団を有する溶液を、ロータチャンバの中にもたらす。幹細胞が前記溶液中の残りの成分から分離された（望ましくないタンパク質および遊離の脂肪が該チャンバから除去された）ことが決定された後に、向流は停止される。該向流は反転され、細胞ペレットがアウトプットバッグへと輸送される。
【００９２】
先に述べたように、処理チャンバ３０またはアウトプットチャンバ５０１以上のポート、例えばポート５１または５２を含んでよい。１以上のこれらポートは、上記で述べた方法の何れかの組み合わせを使用して得られた再生細胞、またはその一部を、導管を介して他の外科装置、細胞培養装置、細胞マリネ装置、遺伝子治療装置、または精製装置へと輸送するために設計されてよい。また、これらポートは、上記で述べた同じ目的のために、再生細胞を、当該システムまたはもう一つのシステム内における追加のチャンバまたは容器へと導管を介して輸送するように設計されてよい。また、該ポートおよび導管は、１以上の添加剤、例えば成長因子、再懸濁液(resuspension fluid)、細胞増殖試薬、細胞保存試薬、または該細胞への遺伝子導入剤を含む細胞改変試薬を添加するために使用されてもよい。該ポートおよび導管はまた、再生細胞を、インプラント材料（例えば足場細胞担体、脊椎固定装置または骨断片）、並びに他の外科的インプラントおよび装置のような他の標的へ移送するためにも使用されてよい。
【００９３】
現存のシステムにおける使い捨てセットの相互連結を再構成し、現存のシステムのプロセッシング装置を再プログラミングすることによって、現存のシステムのための異なるまたは追加の容器および／またはチャンバを提供することによって、前記細胞を１以上の追加のシステムまたは装置へ輸送することによって、および／またはそれらの組み合わせによって、更なる処理が開始されてよい。例えば、当該システムは、当該システムを使用して得られた再生細胞が下記の１以上を受け得るように、上記で述べた何れかの手段によって再構成することができる：細胞増殖（１以上の種類の再生細胞）および細胞維持（細胞シートの濯ぎおよび培地交換を含む）；継代培養；細胞播種；一過性形質導入（バルク供給源からの形質導入された細胞の播種を含む）；細胞収集（酵素的、非酵素的収集、機械的掻爬による収集を含む）；細胞生存率の測定；細胞のプレーティング（例えばマイクロタイタープレート上で、増殖のために個々のウエルからの細胞のピッキング、新たなウエルの中への細胞の増殖を含む）；高処理量スクリーニング；細胞療法の適用；遺伝子治療の適用；組織エンジニアリングの適用；治療用タンパク質の適用；ウイルスワクチンの適用；保存またはスクリーニングのため、または細胞増殖、溶菌、接種、感染もしくは誘導の測定のための、再生細胞または上清の収集；細胞株（ハイブリドーマ細胞を含む）の作製；透過性の研究のための細胞の培養；ＲＮＡｉおよびウイルス抵抗性の研究のための細胞；ノックアウトおよびトランスジェニック動物の研究のための細胞；アフィニティー精製の研究；構造生物学の適用；アッセイの開発およびタンパク質工学の適用。
【００９４】
例えば、特定の用途のために再生細胞集団の増殖が必要とされるならば、当該集団を優先的に増殖させる一方、他の集団を維持され（それにより増殖する選択された細胞による希釈によって減少する）、または必要な増殖条件が存在しないことによって失われる培養条件を使用するアプローチを使用することができるであろう。Ｓｅｋｉｙａ等は、骨髄由来の幹細胞について、この点で用い得るであろう条件を記載している（Sekiya et al., 2002）。このアプローチ（組織培養プラスチックへの異なる付着を伴って、または伴わずに）は、本発明の更なる実施形態にも適用できるであろう。この実施形態において、最終的な再生細胞ペレットはアウトプットチャンバから取り出され、細胞培養成分を提供する第二のシステムの中に配置される。これは、従来の実験室的組織培養インキュベータの形態、またはＴｓａｏ等の米国特許第６，００１，６４２号もしくはＡｒｍｓｔｒｏｎｇ等の米国特許第６，２３８，９０８号に記載されたようなバイオリアクタ型の装置であることができるであろう。別の実施形態では、現存のシステム（例えばアウトプットチャンバ）に細胞増殖または細胞培養成分を添加して、脂肪由来の細胞集団の短期間の付着および／または細胞培養を可能にすることもできるであろう。この別の実施形態は、細胞培養および／または細胞増殖成分の当該システムへの組込みを可能にし、またこのシステムから細胞を取出してもう一つのシステムの中に配置する必要性を排除することを可能にするであろう。
【００９５】
処理の際、結果を向上させるために必要なときは、１以上の添加剤を種々のチャンバまたは容器に添加し、またはその中に準備してもよいであろう。これらの添加剤はまた、現存のシステムに関連したもう一つのシステムの一部として提供されてもよく、または現存のシステムとは別に提供されてもよい。例えば、一定の実施形態では、これら添加剤は当該システムから再生細胞を取り出す必要なしに添加または提供される。他の実施形態においては、これらの添加剤は、該添加剤を含んだ新たな容器またはチャンバを、当該システムの未使用のポートに無菌的に連結することによって、添加または提供される。更に他の実施形態では、これらの添加剤は、本発明のシステムには連結されていない第二のシステムまたは装置の中に添加または提供される。添加剤の幾つかの例には、ここに記載した、洗浄および脱凝集を最適化する薬剤、処理の際の活性細胞集団の生存率を高める添加剤、抗菌剤（例えば抗生物質）、脂肪細胞および／または赤血球を溶解する添加剤、または興味ある細胞集団を豊富にする添加剤（固相部分への異なる付着によって、または細胞集団の実質的な減少または富化を促進することによる）が含まれる。
【００９６】
例えば、同種の再生細胞集団を得るためには、例えば幹細胞または前駆細胞（例えば内皮前駆細胞）上に存在する抗原を認識して結合する、細胞特異的抗体を使用するような、特定の再生細胞型を分離および濃縮するための何れか適切な方法を用いてもよい。これらには、陽性選別（標的細胞の選別）、陰性選別（望ましくない細胞の選択的除去）の両者またはそれらの組み合わせが含まれる。また、特定の酵素で活性化されたときに蛍光を発する分子を使用する選別においては、酵素のような細胞内マーカーが使用されてもよい。加えて、最終的な細胞ペレット内における特定の再生細胞集団の異なる付着および／または溶出を可能にするように選択された付着特性をもった固相材料を、当該システムのアウトプットチャンバの中に挿入することもできるであろう。
【００９７】
この差別的付着アプローチの別の実施形態は、標的再生細胞および望ましくない細胞に差別的に発現した表面分子を認識する、抗体および／または抗体の組み合わせの使用を含むであろう。特定の細胞表面マーカー（またはその組み合わせ）の発現に基づく選別は、もう一つの普通に適用される技術であり、ここでは抗体が（直接または関節に）固相支持体構造に結合される（Geiselhart et al., 1996; Formanek et al., 1998; Graepler et al., 1998; Kobari et al., 2001; Mohr et al., 2001）。
【００９８】
もう一つの実施形態において、前記細胞ペレットは、再懸濁され、連続または不連続な密度勾配に形成された流体材料の上（または下）に重層され、また細胞密度に基づく細胞集団の分離のために遠心分離機の中に配置されてもよい。同様の実施形態において、除去療法（apheresis；Smith, 1997）、水簸（向流と伴って、または伴わずに）（Lasch et al., 2000）（Ito and Shinomiya, 2001）のような、連続流れアプローチが用いられてもよい。
【００９９】
添加剤の他の例には、ここで述べたような細胞分化因子、成長促進剤、免疫抑制剤、医療装置、またはそれらの何れかの組み合せのような、追加の生物学的または構造的成分が含まれてよい。例えば、他の細胞、組織、組織断片、ＶＥＧＦおよび既知の他の血管形成性または動脈形成性成長因子のような成長因子、生物学的に活性または不活性な化合物、再吸収可能な足場、或いは再生細胞の集団の送達、有効性、耐性または機能を高めることを目的とした他の添加剤を加えてもよい。また、DNAの挿入によって、または構造的誘導もしくは治療の目的で再生細胞の機能を変化、向上または補充するように細胞培養システム（ここで説明した、または当該技術において既知のもの）中に配置することによって、再生細胞集団は改変されてよい。例えば、（Morizono et al., 2003; Mosca et al., 2000）に開示されたように、幹細胞のための遺伝子導入技術は当業者に既知であり、またウイルストランスフェクション技術、特に（Walther and Stein, 2000）（Athanasopoulos et al., 2000）に開示されたアデノ関連ウイルスによる遺伝子導入技術が含まれてよい。（Muramatsu et al., 1998）のような、ウイルスに基づかない技術が実施されてもよい。また、1以上の細胞分化因子、例えば成長因子またはサイトカインをコードする遺伝子も添加できるであろう。種々の細胞分化剤の例は、（Gimble et al., 1995; Lennon et al., 1995; Majumdar et al., 1998; Caplan and Goldberg, 1999; Ohgushi and Caplan, 1999; Pittenger et al., 1999; Caplan and Bruder, 2001; Fukuda, 2001; Worster et al., 2001; Zuk et al., 2001）に開示されている。また、抗アポトーシス因子または薬剤をコードする遺伝子も添加できるであろう。遺伝子（または遺伝子の組み合わせ）の添加は、当該技術において既知の何れかの技術によることができ、これにはアデノウイルス遺伝子導入、「遺伝子銃」、リポソーム媒介性形質導入、およびレトロウイルスもしくはレンチウイルス媒介性形質導入、プラスミド、アデノ関連ウイルスが含まれるが、これらに限定されない。次いで、これらの再生細胞は、形質導入がin situで継続または開始され得るように、遺伝子を経時的に細胞に放出／およびまたは提示できる遺伝子送達担体をもった担体材料と共に、インプラントすることができる。
【０１００】
細胞および／または該細胞を含んだ組織が、該細胞および／または組織を得た患者以外の患者に投与されるときは、移植の拒絶を低減し、また好ましくは防止するために、該細胞および／または組織を受取る患者に対して１以上の免疫抑制剤を投与してもよい。ここで使用するとき、「免疫抑制薬または薬剤」の用語は、正常な免疫機能を阻害または妨害する医薬物質を含むことを意図したものである。ここに開示した方法に関して適切な免疫抑制剤の例には、Ｔ細胞／Ｂ細胞に共同刺激された経路を阻害する薬剤、例えば、米国公開特許出願第20020182211号に開示されたような、ＣＴＬＡ４およびＢ７経路を介したＴ細胞およびＢ細胞の結合を妨害する薬剤が含まれる。好ましい免疫抑制剤は、シクロスポリンＡである。他の例には、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン、および抗胸腺細胞グロブリンが含まれる。一つの実施形態において、免疫抑制薬は少なくとも一つの他の治療剤と共に投与される。免疫抑制薬は、投与経路に適合した処方で投与され、また所望の治療効果を達成するのに充分な投与量で対象に投与される。もう一つの実施形態では、免疫抑抑制薬は、本発明の再生細胞に対する耐性を誘導するのに充分な時間だけ、一時的に投与される。
【０１０１】
これらの実施形態において、当該再生細胞は、撹拌装置のような装置およびここに記載した関連方法を含む、何れかの技術的に認められた方法によって添加剤に接触され、組み合され、混合され、または添加されてよい。例えば、揺動、反転、圧縮パルス化されたローラまたは移動ローラが使用されてよい。
【０１０２】
もう一つの側面において、当該細胞集団はレシピエントの中に配置することができ、また再吸収可能なプラスチック製の鞘、またはＭａｃｒｏＰｏｒｅ・Ｂｉｏｓｕｒｇｅｒｙ社が製造するような他の材料（例えば米国特許第６，２６９，７１６号；同第５，９１９，２３４号；同第６，６７３，３６２号；同第６，６３５，０６４号；同第６，６５３，１４６号；同第６，３９１，０５９号；同第６，３４３，５３１号；同第６，２８０，４７３号参照）に取囲まれることができるであろう。
【０１０３】
上記実施例の全てにおいて、分離および濃縮された再生細胞の少なくとも一部は、共通人に譲渡された2001年９月１４日に提出された米国仮出願第６０／３２２，０７０号の利益を主張して２００２年９月１２日に提出された、「非造血組織由来の非胚性細胞の保存」と題する米国特許出願第１０／２４２，０９４号に記載されたように、冷凍保存されてよく、これら出願の内容は、それらの全体を本明細書の一部として明示的に援用する。
【０１０４】
処理の最後に、再生細胞は、アウトプットチャンバから手動で回収されてよい。該細胞は、皮下、筋肉内、または患者内の標的部位への細胞の送達を可能にする他の技術によってレシピエントの中に配置するために、シリンジのような送達装置の中に装填されてよい。換言すれば、細胞は当業者に既知の何れかの手段によって患者の中に配置されてよい。好ましい実施形態は、針またはカテーテルによる、または直接の外科的移植による細胞の配置を含んでいる。他の実施形態において、当該細胞はアウトプットチャンバへと自動的に移送され、該チャンバは細胞を患者の中に配置するために使用し得る容器、シリンジまたはカテーテル等の形態であってよい。この容器はまた、後で使用するため或いは冷凍保存のために、細胞を保存するために使用してもよい。全ての回収方法は、無菌で実施される。外科的移植の実施形態において、当該細胞は、ここで述べた予め形成されたマトリックスまたは足場のような添加物と共に適用できるであろう。
【０１０５】
本発明の好ましい実施例体（例えば図４に示した実施形態）において、当該システムは自動化される。もう一つの実施形態において、当該システムは自動化された部品および手動の部品の両方を有する。当該システムは、再使用可能なハードウエア部品またはモジュールに連結または装着される、１以上の使い捨て部品を含んでよい。本発明の自動化されたシステムは、該システムの適正な操作を促す画面ディスプレーを提供する（図１６参照）。また、この自動化されたシステムは、該システムの使い捨て部品の適正な設置に関するステップの教示によって、手順および／またはステップの状態を提供する画面をも提供する。この画面はまた、それが生じた場合にはシステムにおける問題または欠陥を示し、また適切であれば「トラブルシューティング」の案内を提供する。一つの実施形態において、この画面は、例えばタッチ画面を介してユーザがパラメータをシステムに入力することを可能にするユーザインターフェース画面である。
【０１０６】
部分的または完全に自動化されたシステムは、プロセッシング装置（例えばマイクロプロセッサまたはパーソナルコンピュータ）および関連のソフトウエアプログラムを含んでよく、該プログラムは、ユーザ入力に基づいて、プロセスの１以上のステップを運転および自動化する当該システムのための制御論理を提供するものである。一定の実施形態において、当該システムの１以上の側面は、プロセッシング装置に駐在しているソフトウエアを介してユーザがプログラム可能あってよい。該プロセッシング装置は、読取り専用メモリー（ＲＯＭ）の中に、１以上の予めプログラムされたソフトウエアプログラムを有していてよい。例えば、該プロセッシング装置は、血液を処理するために適応させた予めプログラムされたソフトウエア、脂肪組織を処理して小容積の再生細胞を得るためのもう一つのプログラム、および脂肪組織を処理して大容積の再生細胞を得るためのもう一つのプログラムを有してよい。また、このプロセッシング装置は、必要とされる再生細胞の量、処理される組織の種類、処理後に必要とされる操作の種類、治療用途の種類等のような関連情報のユーザの入力に基づいて、プロセスを最適化するための適切なパラメータをユーザに提供する予めプログラムされたソフトウエアを有していてもよい。
【０１０７】
このソフトウエアはまた、当該システムのポンプおよび弁を制御することにより、特定の配管経路に沿った流体および組織の侵入および排出を制御すること；活性化の適正なシーケンスおよび／または方向を制御すること；圧力センサを用いて閉塞を検出すること；混合機構；容積測定機構を使用して、特定の経路に沿って取り出されるべき組織および／または流体の量を測定すること；加熱制御装置を使用して種々の成分の温度を維持すること；および分離および濃縮プロセスをタイミングおよびソフトウエアメカニズムと合体させること等のような、複数のステップの自動化を可能にしてもよい。このプロセッシング装置はまた、処理される組織および／または回収される細胞集団または副集団の種類、および実施される処理の種類（例えば、再生細胞を増大させ脂肪組織を用いる組織増強、または再生細胞を被覆した骨移植片を用いる骨修復用途のための細胞の処理）に基づいて、遠心分離速度を制御することもできる。また、このプロセッシング装置は、他のチャンバまたはネットワークと通信するための、パラレルまたはシリアルの標準ポートまたは他の手段を含んでよい。従って、該プロセッシング装置は、スタンドアローンのユニットであることができ、またはここに記載した更なる処理方法のための１以上の追加の装置を伴ってもよい。
【０１０８】
当該ソフトウエアは、例えば、使い捨て部品のロット番号、温度および容積測定値、組織容積および細胞数のパラメータ、適用される酵素の使用量、インキュベーション時間、オペレータの特定、日付および時間、患者の特定等を含む、「運転データ」の自動的収集を可能にしてもよい。当該装置の好ましい実施形態においては、バーコード読取りシステムのような特徴認識システムを組込んで、処理の記録の一部として、これら変数（例えば、使い捨てセットのロット番号および有効期限データ、コラゲナーゼのロット番号および有効期限日、患者／サンプルの識別子等）のプロセッシング装置へのデータエントリーを可能にするであろう。これは、データエントリーの誤りを減少させるであろう。このようなバーコード読取りシステムは、ＵＳＢまたは他のインターフェースポートおよび当該技術で既知のシステムを使用して、プロセッシング装置に容易に組み込むことができるであろう。この方法ようにして、当該装置は、当該プロセスのデータエントリーおよび記録の組み込まれた制御を提供するであろう。これらパラメータの印刷されたレポートは、当該システムのプログラムされた動作のユーザに定義されたパラメータの一部であろう。当然ながら、これはプリンタ部品（ハードウエアおよびドライバ）、または当該装置のハードウエアにおけるソフトウエアにおいて駆動されるプリンタに加えて、当該装置のハードウエアにおけるプリンタのためのインターフェース出力コネクタ（例えばＵＳＢポート）の組み込みをヒツヨイウとするであろう。
【０１０９】
一定の実施形態において、当該システムは完全に自動化されたシステムである。例えば、ユーザは最初に、処理されるべき組織の量を選択し、該システムを患者に取り付ければよく、該システムは、更なるユーザ入力なしに、中断のないシーケンスで必要な組織を自動的に吸引し、再生細胞を分離および濃縮してよい。ユーザはまた、必要とされる再生細胞の量を入力して、該システムが必要量の組織を吸引し、該組織を処理することを可能にしてもよい。完全に自動化されたシステムはまた、例えば洗浄サイクルの数、遠心分離の速度等のような、ユーザが入力したパラメータの数（例えば二つ以上）に基づいて再構成できるシステムを含んでいる。該システムはまた、半自動モードで運転することもでき、その間、当該システムはユーザの介在なしに一定のステップを通過するが、一定のプロセスが起き得る前にユーザの介在を必要とする。他の実施形態において、当該システムは、所定の時間において所定の操作を実行するようにユーザを案内するための指示を表示する、単一の集積されたシステムである。例えば、このプロセッシング装置は、当該システムの配管、チャンバおよび他の部品の適正な挿入のために必要なステップの全体を通して、ユーザを促してよい。従って、ユーザは、適正な操作シーケンスが実行されることを保証することができる。このようなシステムは更に、当該プロセスにおけるステップの偶発的な活性化または停止を防止するために、ユーザによる各操作ステップの確認を必要とする。更なる実施形態において、当該システムは、配管、チャンバの正確な挿入、閉塞の不存在等を確認するために、自動化された試験を開始してもよい。更にもう一つの実施形態において、本発明のシステムは、当該システムを通る組織の流れの自動化された制御によって、複数回の分離および濃縮プロセスを実行するようにプログラムされることができる。この特徴はまた、例えば、さもなければ喪失するであろう組織を当該システムの中に収集し、該組織から再生細胞を分離および濃縮して患者に戻す、患者に対する手術において重要であるかもしれない。
【０１１０】
上記で述べたように、当該システムの部分が単回使用の後に廃棄できるように、当該システムの部品は使い捨てであってよい（以下では「使い捨てセット」と称する）。この実施は、患者の組織と接触する何れかの表面が使用された後に適正に廃棄されるであろうことを保証する補助となることができる。使い捨てセットの一例が図１３に示されている。好ましい実施形態において、当該システムの使い捨て部分は、使用が容易かつ装填が容易であり、また多くの配管接続および配管接続の複雑なルーティングの必要性がない使用可能な「規格品」であるように、予め滅菌および包装される。このような使い捨て部品は、製造が比較的安価であり、従って、それらの廃棄による実質的な費用は発生しない。一つの実施形態において、該使い捨てシステム（ここでは互換的に「使い捨てセット」と称する）は、収集チャンバ２０、処理チャンバ３０、廃棄チャンバ４０、アウトプットチャンバ５０、フィルタアセンブリー３６、サンプルバッグ６０、および関連の導管１２または配管を含み、本質的にこれらからなり、またはこれらからなる。当該システムの使い捨てセットの好ましい実施形態において、収集チャンバ２０および処理チャンバ３０は、剛性フレームの中に収容される導管１２によって接続される。処理チャンバ３０の回転シールネットワーク（図７および図８）もまた、同じ剛性フレームの中に収容されてよい。もう一つの好ましい実施形態において、使い捨てセットの種々のチャンバおよび容器は、該システムのプロセッシング装置と通信できる必要なインターフェースを含んでおり、当該システムを自動化するポンプ、弁、センサおよび他の装置が、ユーザの介入なしに必要に応じて適切に活性化または不活性化されるようになっている。このインターフェースはまた、該システムを設置するために必要とされる時間および熟練を減少させ、また該システムを適正に設置する方法を指示し、且つユーザに設置エラーの発生を警告することによってエラーを低減する。
【０１１１】
本発明の使い捨てセットの殆どは、多くの共通の要素を有するであろう。しかし、当業者は、当該システムの異なる適用は、使い捨てセットの一部であり得る追加の部品を必要とする可能性があることを理解するであろう。従って、使い捨てセットは更に、患者から脂肪組織または他の組織を取得し、また再生細胞を患者に戻すのに適した1以上の針またはシリンジを含んでよい。含められる針およびシリンジのタイプ、数および種類は、処理される組織の酒類および量に依存するであろう。この使い捨てセットは、更に、該システムにおいて使用される洗浄液および他の処理試薬を保持するための、１以上の剛性または可撓性の容器を含んでよい。例えば、この使い捨てセットは、当該処理のために必要とされる生理食塩水、酵素および何れか他の処理もしくは補充液を保持するための容器を含んでよい。加えて、適切な洗浄溶液、再懸濁液、添加剤、薬剤、移植剤には、本発明のシステムおよび方法と共に使用するための使い捨てセットが設けられてよい。
【０１１２】
ここに記載した、或いは本発明を実施するために必要とされるシステム部品、装置または供給物の如何なる組み合わせも、キットの形態で与えられてよい。例えば、本発明のキットは、シリンジベースの脂肪吸引のための最適な長さおよびゲージの針、および小容積の組織の処理を可能にする好ましいフィルタ媒体を含む滅菌シリンジを含んでよい。本発明と共に使用されてよく、且つ本発明のキットと共に含められてよい他の例になる器具および供給物が、下記の表ＩＩおよび表ＩＩＩに列記されている。
【０１１３】
下記の表ＩＩは、本発明のシステムおよび方法に従って、脂肪由来の再生細胞を得るために使用できる供給物の例を特定している。
表ＩＩ
2008504867.tif 000004
【０１１４】
下記の表ＩＩＩは、ここに開示したシステムおよび方法と共に使用し得る器具を特定している。
表ＩＩＩ
2008504867.tif 000005
【０１１５】
当該システムの再使用可能な部品は、収集チャンバのための撹拌機構、ポンプ、弁およびポンプコントロールを活性化する多彩なセンサ、遠心分離モータ、遠心分離モータの回転フレーム、ユーザインターフェース画面およびＵＳＢポート、使い捨てセットが再使用可能なハードウエア部品および他の関連装置に固定されてこれとインターフェースするように、使い捨て製品を連結するインターロックもしくはドッキング装置または構成を含み、実質的にこれらからなり、またはこれらからなる。再使用可能な部品の例が図１４に示されている。好ましい実施形態において、この再使用可能な部品は、再生細胞組成物から再生細胞を分離および濃縮するための手段、例えば回転遠心分離機を含んでいる。この実施形態において、再使用可能な部品は、図１５Ａに示すように、使い捨てセットの処理チャンバ（遠心分離チャンバを含む）の一部に接続され、これとインターフェースするように設計される。再使用可能な部品において再生細胞を分離および濃縮するための手段は、回転遠心分離機に限定されず、スピン膜フィルタを含むここに記載した他の何れかの構成であってもよい。再使用可能な部品はまた、ここに記載したプロセッシング装置を収容してもよく、該装置は幾つかの異なる組織処理手順を実行し、従って該システムの種々のポンプおよび弁を選択的に活性化するための予めプログラムされたソフトウエアを含んでいる。このプロセッサはまた、後でダウンロードまたはコンパイルするためのドナー／患者情報、処理もしくは回収情報、および他のデータを保存するためのデータ保存能力を含んでいる。この再使用可能な部品は、種々の使い捨てセットと共に使用されてよい。該使い捨てセットは、例えばインターロック装置または使い捨てセットを結合する構成を介して再使用可能な部品に連結されており、その結果、使い捨てセットが再使用可能なハードウエア部品に固定されて、これとインターフェースするようになっており、それによって、再使用可能な部品上に存在するプロセッシング装置は、使い捨てセットの種々の部品、並びに再使用可能な部品および他の関連装置およびシステムの種々の部品を制御（即ち、これに信号を送り、またこれらから信号を受取る）するようになっている。
【０１１６】
一つの実施形態において、当該システムにおいて使用するための使い捨てセットは、約８００ｍＬの組織を蓄積できる収集チャンバ２０；収集チャンバ２０中で洗浄および消化された約８００ｍＬの組織によって発生された再生細胞を処理できる処理チャンバ３０；少なくとも０．５ｍＬの再生細胞を収容できるアウトプットチャンバ５０；および約１０Ｌの廃棄物を収容できる廃棄物容器４０で構成される。この実施形態において、ハードウエア装置は、２４”Ｌ  Ｘ  １８”Ｗ  Ｘ  ３６”Ｈ以下の大きさである。或いは、使い捨てセットの種々の部品、並びにハードウエア装置の大きさは必要に応じて構成してよく、限定されることなく本発明に包含されるものである。
【０１１７】
当該システムの使い捨て部品は、容易に装置上に配置される。対応する再使用可能な部品と一緒に組みたてて利用される使い捨てセットの例が、図１５Ａに示されている。このシステムは、好ましくは、それが不適正に装着された使い捨て部品を検出できるように設計される。例えば、各使い捨てセットの部品は、該システム内の適切な場所に配管、チャンバ等を適正に整列および挿入する色で案内されるマークを有している。追加の実施形態において、ここに開示されるシステムは可搬ユニットである。例えば、可搬ユニットは、脂肪組織の収集が生じた一つの場所から、脂肪組織収集のためのもう一つの場所へと移動させることができるであろう。一定の実施において、この可搬ユニットは、患者のベッドサイドでの脂肪組織の収集および処理に適している。こうして、可搬ユニットは患者から患者へと移動させることができるシステムの一部であってよい。従って、可搬ユニットは、正しい場所にロックする車輪上にあってよく、従って処理手順の全体を通して、安定かつ心配のない位置の便利な場所に容易に配置し、使用することができる。他の実施形態において、この可搬ユニットは、テーブルの頂部のような平坦な表面上において設置および動作させるために設計される。可搬ユニットは、ハウジングユニットの中に収容されてもよい。更に、この可搬ユニットは、手順を補助するためのハンガー、フック、ラベル、スケールおよび他の装置を含んでいてもよい。当該システムのここに記載した再使用可能な部品の全て、例えば遠心分離機、プロセッシング装置、ディスプレー画面は、該システムの可搬ユニット上に装着されてよい。
【０１１８】
再生細胞を得るための別の手動の実施形態もまた、本発明の範囲内にある。例えば、一つの実施形態において、脂肪組織は、ここに記載したシステム、器具および／または供給物の如何なる組合せを使用して処理されてもよい。
【０１１９】
本発明を用いたシステムの特定の例が、図４に示されている。図４は、自動化されたシステムおよび方法を示している。組織（例えば脂肪組織）から、患者内での再注入に適した再生細胞を分離および濃縮するための、自動化されたシステムおよび方法を示している。図４に示したシステムの一定の実施形態において、該システムは更に、患者から所定量の組織を吸引するための自動化されたステップを含んでいる。図４に示したシステムは図１３に示した使い捨てセットを含み、これは図１４に示したシステムの再使用可能な部品に結合されて、図１５Ａに示した自動化された実施形態に到達する。この使い捨てセットは、例えばインターロックもしくはドッキング装置または構成を介して再使用可能な部品に連結されており、その結果、該使い捨てセットが再使用可能なハードウエア部品に固定されて、これと関連するようになっており、それによって、前記再使用可能な部品上に存在するプロセッシング装置は、使い捨てセットの種々の部品、並びに再使用可能な部品および他の関連装置およびシステムの種々の部品を制御（即ち、これに信号を送り、またこれらから信号を受取る）するようになっている。
【０１２０】
ユーザは、前記使い捨てセットを再使用可能な部品に接続し、ユーザインターフェースを使用して一定のパラメータ（例えば補修される組織の容積）を入力し、当該システムを患者に取り付けてよく、該システムは、予めプログラムされたおよび／またはユーザ入力パラメータを使用して、図４に示す全てのステップを連続したシーケンスで自動的に実行する。一つのこのようなシーケンスが図１５Ｂに示されている。或いは、該組織は、ユーザから手動で吸引され、処理（即ち、再生細胞の分離および濃縮）のためのシステムに搬送されてよい。
【０１２１】
即ち、図４に示すように、組織（例えば脂肪組織）は、導管１２を使用して患者から抜き取られ、収集チャンバ２０の中に導入されてよい。図４の収集チャンバの詳細な図が、図５に示されている。図５に示すように、収集チャンバ２０は真空ライン１１を含んでよく、これは標準のカニューレを使用した組織の取り出しを容易にする。ユーザは、この時点で、収集チャンバ２０に方向付けられる組織の容積見積りを入力してよい。該組織は、閉じた流体経路の一部である入口ポーと２１を通って収集チャンバ２０の中に導入され、これは該組織、生理食塩水および他の薬剤を無菌状態で該組織に添加することを可能にする。当該システムの光学センサ（例えばセンサ２９）は、ユーザが入力した容積の組織が補修チャンバ２０の中に存在する時点を検出することができる。一定の実施形態では、ユーザが入力したよりも少ない組織が収集チャンバの中に存在していても、ユーザは、収集チャンバの中に存在する容積の組織の処理を開始するオプションを有する。一定の実施形態において、患者から取り出された組織の一部は、ユーザインターフェースを利用したユーザ入力を介して活性化され得るポンプ（例えば蠕動ポンプ）の使用により、導管を通してサンプルチャンバ６０へと向わせてもよい。
【０１２２】
センサ２９は、再使用可能な部品に存在するプロセッシング装置へと信号を送って、組織を洗浄および脱凝集するために必要なステップを活性化することができる。例えば、該プロセッシング装置は、自動化された弁およびポンプを使用して、収集された組織の容積に基づいて予め設定された容積の洗浄剤を導入してよい。このサイクルは、流出する液体が充分に透明で、望ましくない物質が全くないことを光学センサが決定するまで、収集チャンバ内で繰返されてよい。例えば、収集チャンバ１２ｂまたは１２ｄから導出する導管に沿った光学センサ２９は、望ましくない物質が既に取り出されていることを検出することができ、また前記プロセッシング装置に信号を送って、必要な弁を閉じて次のステップを開始させることができる。
【０１２３】
次いで、プロセッシング装置は、収集された組織の容積に基づいて、予めプログラムされた量の脱凝集剤を導入してよい。このプロセッシング装置はまた、収集された組織の初期容積またはユーザ入力に基づいて、所定の時間だけ、収集チャンバの中の組織の撹拌を活性化させてよい。図４の実施形態においては、脱凝集剤（例えばコラゲナーゼ）がコラゲナーゼ供給源２４を通して補修チャンバ２０の中に加えたれたら、プロセッシング装置を介して補修チャンバ２０の中のモータが駆動される。該モータは、磁気撹拌機およびパドル様装置を含む回転可能なシャフト２５を駆動し、ここでは１以上のパドル２５ａが、収集チャンバ２８に予め固定されたフィルタケージ２７に硬く結合されている。これらパドルは、再生細胞が組織から分離するように、前記脱凝集剤の存在下で撹拌を行う。
【０１２４】
収集チャンバ２０の中の溶液は、予め設定された時間だけ沈殿させられる。溶液中の浮遊部分は、該溶液の頂部へと上昇させられる。予め設定された時間が経過したら、必要な弁およびポンプがプロセッシング装置によって活性化され、非浮遊部分は廃棄チャンバ４０へと除去される。廃棄チャンバ４０への搬送は、収集チャンバ１２ｂまたは１２ｄから導出する導管に沿ったセンサ２９が、該溶液の浮遊画分が廃棄チャンバ３０に移送されそうになっていることを検出できるまで継続される。例えば、収集チャンバ１２ｂまたは１２ｄから導出する導管に沿ったセンサ２９は、望ましくない物質が除去されてしまったことを検出でき、またプロセッシング装置に必要な弁を閉じる様に信号を送ることができる。
【０１２５】
この時点において、溶液の浮遊画分、即ち、再生細胞組成物は処理チャンバ３０へと移動される。これは、必要な弁および蠕動ポンプの使用によって達成される。一定の実施形態では、再生細胞組成物を処理チャンバ３０への移送する前に、追加の容積の生理食塩水が、収集チャンバ２０の中に残留する溶液の浮遊画分に添加されてよい。もう一つの洗浄サイクルが繰り返されてよい。このサイクルの後に、該溶液は沈降させられ、非浮遊画分（再生細胞を含有する）が処理チャンバ３０へと移送され、浮遊画分は廃棄チャンバ４０へと排出される。全ての分離された再生細胞の処理チャンバ３０への移送を最適化するために、追加の洗浄サイクルが使用される。
【０１２６】
再生細胞組成物が導管１２によってプロセッシングチャンバ３０に移送されたら、当該組成物は、濃縮段階を開始する前に、１以上の追加の洗浄ステップを受けてよい。これは、廃棄物および残留汚染物の収集チャンバ２０からの除去を確実にする。同様に、濃縮ステップの後に、再生細胞組成物は、残留汚染物を除去するために１以上の追加の洗浄ステップを受けてよい。
【０１２７】
図４に示した処理チャンバ３０の種々の実施形態を、以下で詳細に説明する。図４に示した処理チャンバ３０は、遠心分離チャンバの形態である。図４の処理チャンバの詳細な図が、図７および図８に示されている。このような処理チャンバ３０は、一般には回転シールネットワーク３０．１を含んでおり、これは外部ハウジング３０．２、１以上のシール３０．３、１以上のベアリング３０．４、および該処理チャンバを当該システムの再使用可能な部品に存在する遠心装置に結合するための取付け点３０．６を含んでおり；導管の形態の１以上の流体経路３０．５が、前記回転シールから延びて遠心分離チャンバの中で終端しており、その各末端は、フレーム５３の中に収容されたアウトプットチャンバ５０の形態であり、ここでのフレームは、１以上のポート５２およびアウトプットチャンバ５０を手動で再位置決めするための１以上のハンドルを含んでいる。
【０１２８】
回転シールネットワーク３０．１は、処理チャンバの流体経路を滅菌状態に維持できることを保証するために含められる。加えて、処理チャンバの遠心分離チャンバが回転している間であっても、該処理チャンバの流体経路は、（例えば、薬剤または洗浄溶液を加えるために）何時でも滅菌的にアクセスされることができる。
【０１２９】
図７および図８に示した回転シールネットワークは、二つ以上のベアリング３０．４、三つ以上のリップシール３０．３、および外部ハウジング３０．２を含む回転シャフトを含んでいる。この実施形態において、ベアリング３０．４は更に、ここではレースと称する外側および内側シャフト（図示せず）を含んでいる。これらのレースは、精密に研磨された球によって分離されてよい。ベアリングを構成する該レースおよび球は、好ましくは、体液との接触に適した材料で製造され、または体液との接触に適した材料でコートされる。好ましい実施形態において、これらレースおよび球は、例えば窒化シリコンまたはジルコニアを使用して製造される。更に、この実施形態において、前記三つのリップシールは、丸い「Ｕ」形状のチャンネル（図示せず）並びに円形バネ（図示せず）を含んでいる。前記「Ｕ」形状のチャンネルは、好ましくは、回転シールネットワーク３０．１の回転シャフトとの間に漏出のない接合が形成されるような、可撓性材料を使用して製造される。加えて、前記リップシールは好ましくは、処理チャンバを通って流れる再生細胞組成物からの圧力によって、前記シールアセンブリーが前記回転シャフトとのその接合を緊密にさせるように配向される。該シールは、１以上の円形クリップ（図示せず）によってその位置を固定されてよく、該クリップは、回転シールネットワーク３０．１の外部ハウジングの溝と係合するために、必要に応じて膨張および／または崩壊することができる。回転シールネットワーク３０．１によって、またはその付近で発生した熱は、該通路を通って移動している溶液中の細胞の溶解を防止するために、制御されなければならない。これは例えば、回転シャフトを構築するために硬質材料を選択し、該回転シャフトの前記シールと接触する領域を磨き、また前記回転シャフトと前記シールの間の接触を最小化することによって達成されてよい。
【０１３０】
もう一つの実施形態において、前記回転シールネットワーク３０．１は、単一のゴムシール３０．３および空気ガスケット（図示せず）で構成される。このシールおよびガスケットは、何れかの生物学的物質のための曲りくねった経路を提供し、これは当該システムの無菌性を損なう可能性があるかもしれない。もう一つの実施形態において、前記回転シールネットワーク３０．１は、個々の流体経路を隔離する複数のバネ負荷シール３０．３を含んでいる。該シール３０．３は、滅菌できると共に、潤滑剤なしで前記回転シャフトをシールできる材料で作製される。もう一つの実施形態において、前記回転シールネットワーク３０．１は一対のセラミックディスク（図示せず）を具備しており、これは異なる流体経路を形成し、当該システムの回転に耐えることができ、また細胞溶解を生じない。もう一つの実施形態において、前記流体経路は可撓性であり、前記処理チャンバに対して屈曲され、または屈曲されない。これは、処理チャンバ３０の２回転毎に１回転だけ回転する可撓性流体経路を有することによって達成される。これは、回転シールの必要性を完全になくする。
【０１３１】
当該再生細胞組成物は、収集チャンバ２０から回転シールネットワーク３０．１の回転軸を通る流体経路に沿ってポンプ輸送され、次いで最小限二つの流体経路３０．５に分割され、その各々は処理チャンバ３０の中心軸から外側に広がり、処理チャンバ３０の外側端部付近、即ち、アウトプットチャンバ５０を収容する遠心チャンバ内で終端する（図７および図８）。従って、好ましい実施形態において、処理チャンバ３０は、図７および図８に示すように、二つ以上のアウトプットチャンバ５０を含んでいる。これらのアウトプットチャンバ５０は、それらが処理中の一つの配向３０．７、および濃縮された再生細胞の回収のためのもう一つの配向３０．８にあるように配置される。例えば、該アウトプットの変化(changes)は、処理の間はある特定の角度に傾けられ、また細胞回収のために別の角度に傾けられる。細胞回収角度は、処理角度よりも更に垂直である。アウトプットチャンバ５０のこれら二つの位置は、処理チャンバ３０から突出するハンドル５３を介して、手動で操作されてよい。もう一つの実施形態において、流体経路３０．５は、それが処理チャンバの外側で分離し、次いで処理チャンバ３０の外側端部、即ち、アウトプットチャンバ５０を収容する遠心分離チャンバ（図示せず）内で結合するように構成される。この実施形態において、大容積の再生細胞組成物および／または添加剤、溶液等は、遠心分離チャンバおよび／またはアウトプットチャンバへと直接輸送されてもよい。
【０１３２】
図４および図７〜９を参照すると、収集チャンバ２０と処理チャンバ３０の間には、ポンプ３４および１以上の弁１４が設けられてよい。好ましい実施形態において、弁１４は電子機械的弁である。加えて、センサ２９のようなセンサが、処理チャンバ３０および収集チャンバ２０と共にインラインで設けられてよい。これらの弁、ポンプおよびセンサは、当該システムの濃縮ステップを自動化するために、再使用可能な部品上に存在するプロセッシング装置（図１４）と協働して動作する。
【０１３３】
前記センサは、遠心分離チャンバの中の再生細胞組成物の存在を検出し、該システムの前記プロセッシング装置との通信を通して遠心分離装置を活性化させる。次いで、再生細胞組成物は、最初に収集された組織の量および／またはユーザ入力に基づいて、予めプログラムされた時間だけ、予めプログラムされた加重負荷を受ける。一定の実施形態において、このステップは自動的にまたはユーザ入力を介して反復されてよい。例えば、該組成物は、約５分の時間だけ、重力の４００倍の力の加重負荷を受ける。アウトプットチャンバ５０は、該チャンバの外端が、高密度の粒子および細胞のための小さい容器を形成するように構築される。アウトプットチャンバ５０は、この高密度の粒子を「細胞ペレット」と称されるものの中に保持させる一方、軽い上清については、流体経路、例えば回転シールネットワーク３０．１の回転軸に沿った流体経路を通して除去し、回転シールネットワーク３０．１を通って処理チャンバ３０の中心の低い点から排気容器４０へと移動させる。弁１４およびポンプ３４はプロセッシング装置に信号を送り、アウトプットチャンバ５０の中に存在する細胞ペレットを乱すことなく、上清を排気容器４０へ除去するステップを活性化させる。
【０１３４】
図４に示したシステムを使用して得られる細胞ペレットは、本発明の濃縮された再生細胞を含んでいる。幾つかの実施形態では、上清が除去されて廃棄チャンバ４０に方向付けられた後、追加の溶液および／または他の添加剤と共に遠心分離した後に形成される細胞ペレットを再懸濁させるために、流体経路３０．５が用いられてよい。このような方法での細胞ペレットの再懸濁は、細胞への酸素の流れを増大させると共に、望ましくないタンパク質および化合物を除去するための更なる洗浄を可能にする。得られた懸濁液は、もう一度、重力の約４００倍の力で約５分間の加重負荷を受けてよい。第二の細胞ペレットが形成された後に、得られた上清は廃棄チャンバ４０へと除去され、上記で説明した方法で、生理食塩水または幾つかの適切な他の緩衝溶液を用いた最終洗浄が行われてよい。この反復された洗浄は、再生細胞溶液の純度を向上するために複数回行うことができる。図４に示したシステムを使用して得られた再生細胞の濃度は、収集された組織の量、患者の年齢、患者のプロファイル等に応じて変化してよい。収量の例が表１に与えられている。
【０１３５】
次いで、アウトプットチャンバ５０に存在する最終ペレットは、アウトプットチャンバ５０が細胞取り出しのために適切な向きに配置された後に、適切なシリンジを使用して無菌的に回収される。他の実施形態において、最終ペレットはアウトプットチャンバ５０の中の容器へと自動的に移動されてよく、これは取り出されおよび保存され、または必要に応じて使用されてよい。この容器は、何れか適切な形態またはサイズであってよい。例えば、該容器はシリンジであってよい。一定の実施形態において、アウトプットチャンバ自体はヒートシールされ（自動的または手動で）てよく、またその後の回収のために、および患者の中への再注入を含むここで説明した治療的用途に該再生細胞を使用ために、処理チャンバの他の部品から隔離されてよい。また、該細胞は、前記アウトプットチャンバから回収される前、または第二のシステムまたは装置に移送された後に、ここで説明した更なる処理を受けてもよい。図１４に示した再使用可能な部品は、それを、必要に応じて更なる処理のための１以上の追加のシステムまたは装置に接続できるように構成される。
【０１３６】
ここで述べたように、背中痛は、特に老齢の人々の間に大きな公衆衛生状の問題を残している。持続的かつ重篤な背中痛は、しばしば衰弱および不能を生じる。この痛みは、脊椎の椎間板異常と密接に関連している。背景として、ヒトの脊椎は３３個の椎骨を含んでなる柔軟な構造である。椎間板は、隣接する椎骨を分離し且つクッションで支え、脊椎に加わる負荷を最小化するように作用し、また椎骨の間の運動（屈曲、伸長、回転）を可能にする。椎間板は二つの主要な成分、即ち、髄核および線維輪を含んでいる。 髄核はディスクの中央に位置し、椎間板の合計断面積の２５〜４０％を占めている。髄核のマトリックスは、水、多糖類およびタンパク質分子で形成された厚いゼラチン質の物質で構成されている。線維輪は髄核を取囲み、椎間板に加わる捩れおよび曲げ力に抵抗する。椎骨終板は、椎間板の両側で椎骨から椎間板を分離する。外側リング層は、構造的には主に繊維軟骨の重畳する直交層からなり、これは主に細胞外マトリックス中のＩ型コラーゲンで構成される。この交差パターンは、隣接する椎骨によって加わる圧力に対する顕著な構造的弾性を付与する。繊維輪の中間に位置する内核は、ヒアルロン酸およびＩＩ型コラーゲンに富むマトリックスの中に埋設された僅かな細胞からなり、生体機械的な衝撃吸収材として作用する。
【０１３７】
作業、損傷、病気、事故または酷使の結果として、１以上の椎骨および／または１以上の椎間板が損傷されるに至る可能性がある。詳細には、椎骨および椎間板の障害には、（１）環状亀裂のような輪状板の破損；（２）椎間板の慢性炎症；（３）内包または逸脱型の突出を伴う局部的椎間板ヘルニア；（４）椎間板を取囲む椎骨の相対的不安定性；および（５）外傷が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３８】
繊維輪および髄核の両者における椎間板細胞は、椎間板体積の小さいパーセンテージを構成するに過ぎないが、それらは、椎間板の細胞外マトリックスを構成するプロテオグリカンに富む組織（軟骨に類似した）を合成する能力を有することが示されている。疾患に冒された椎間板では、髄核における椎間板細胞密度の減少に、親水性細胞外マトリックスの減少した産生が伴う。従って、椎間板細胞の減少は、徐々に椎間板スペースの構造的減少をもたらし、変形性椎間板疾患に寄与する。慣習的には、軟骨は硝子軟骨、弾性軟骨または繊維軟骨に分類される。髄核のゲル状の解剖学的特徴（並びにそのユニークな脊索胚起源）は、如何なる軟骨カテゴリーにも適合せず、古典的には軟骨とみなされていない。しかしながら、それは軟骨に類似したプロテオグリカンに富む細胞外マトリックスで浸潤される。軟骨および骨を産生する本発明の再生細胞の能力に基づけば、これらの細胞はまた、軟骨様のプロテオグリカンに富む細胞外マトリックスの形成を刺激し、それによって椎間板を修復する。
【０１３９】
従って、軽微な程度から中程度の変成した椎間板は、椎間板、髄核および繊維輪内の損傷した組織を修復することによって治療されてよい。本発明の再生細胞は、軟骨発生を刺激し、それによって種々の変性段階にある椎間板を修復するために使用されてよい。例えば、椎間板が大部分は無傷なままであるが、破損が始まっている軽微な変性の場合、本発明の再生細胞は、生理学的溶液中の注射を介して椎間板の髄核の中に直接的に送達されてよい。椎間板が顕微鏡的に変性している中程度の椎間板変性の場合は、当該再生細胞は、髄核中に注入されたときにin situでゲル化するヒドロゲル液と混合されることができるであろう。このゲル化は、熱的または熱化学的に媒介され得るであろう。
【０１４０】
しかし、損傷および／または機能不全の背部の成分の少なくとも一部を除去することが屡々必要とされる。例えば、椎間板が破損されたときは、破損した椎間板を取り出し、取り出された椎間板の間の二つの椎骨を一緒に固定するために、切除手術を行うことができる。脊椎固定術は、脊柱を形成する２以上の椎骨が、単一の個体骨へと治癒する骨移植片および内部装置（例えばロッド）を用いて一緒に固定される処置である。脊椎固定術は、椎骨の間の不自然な運動を排除して、神経末端に対する圧力を減少させることができる。加えて、脊椎固定術は、例えば、外傷によって生じた脊椎に対する障害；椎骨の間のクッションを与える椎間板の突出および変性（ときには滑脱椎間板またはヘルニア椎間板と称される）；異常な湾曲（例えば側弯症または後弯）；および感染または腫瘍によって生じた脆弱または不安定な脊椎を治療するために使用することができる。
【０１４１】
脊椎固定術はまた、構造的変形、外傷性の不安定性、変性による不安定性、医原性の切除後不安定性のために、脊柱の安定化を提供することができる。従って、固定または関節固定は、例えば隣接する移動切片の間に骨性ブリッジを形成することによって達成することができる。該固定は、連続的な椎骨の間の前方側で、または他の連続的な横突起、ラミナまたは椎骨の後方相の間の後方側で達成することができる。椎骨を固定するための典型的な実施に関する詳細は、米国特許第６，０３３，４３８号および同第５，０１５，２４７号に開示されており、その内容の全体を本明細書の一部として援用する。
【０１４２】
自己骨または同種異系骨の顆粒は、椎間体または横突間突起脊椎固定のために、脊椎固定装置のための固定装置と協働して最も普通に使用されている。自己移植片は、痛みが治療部位に等しいか、またはこれを越えるドナー部位の病的状態のため、理想的なものではない。しかし、同種異系移植片は、自己移植片よりも相対的に低い骨形成能力を有し、疾患伝染の固有のリスクを提示する。
【０１４３】
本発明の再生細胞は、非骨部位においてin vivoで骨を形成することが示されているので、該再生細胞は、脊椎固定手術において従来使用されている骨移植片の代りに使用されてよい。即ち、当該再生細胞は、二つの隣接する椎骨の間（椎骨体内）、並びに隣接する横突起間（脊椎の両側の横突起空間内）での骨形成を刺激するために使用されてよい。椎間体配置の場合、再生細胞は、細胞包接装置内に含められる細胞担体内に配置されてよい。この全体の装置は、次のようにして椎骨体の中に配置される：担体が移植部位に配置される前または後に再生細胞が細胞担体の中に配置され、次いで、レシピエントの標的部位の中への配置の前または後に、細胞を負荷された担体が細胞包接装置の中に配置される。加えて、細胞担体内の再生細胞は、前記細胞包接装置の外側部分に適用されてもよい。これは、標的部位においてex situまたはin vivoで適用されてよい。横突起間配置の場合、再生細胞は、足場に播種または注入されてよく、次いで、これは隣接する除皮質または非除皮質の横脊椎突起の頂部に適用される。足場、細胞担体および細胞担体格納装置の例は、それらを製造および使用する方法を含めて、脊椎固定技術の例と共に、２００４年３月１９日に提出された「脂肪由来細胞を含む細胞担体および細胞担体格納装置」と題する、共通人が所有する米国仮出願番号第６０／５５４，４５５号に記載されており、その全体を本明細書の一部として援用する。
【０１４４】
本発明は、自己骨移植片を採取するための二次的手術の必要性を排除し、その代りにコスト効果がよく且つ移植拒絶の恐れがない骨増殖を促進する自己再生細胞を提供するので、当該技術において認識された脊椎固定技術を凌駕する固有の利点を提供する。同様に、自己再生細胞は長骨骨折の治療のために使用してもよい。現在、自己骨移植または同種異系移植は、非融合骨折、挫傷骨折、複雑骨折などのような非治癒性骨折をケアするための臨床的標準である。これらの方法は、脊椎固定骨移植について上述したのと同じ制限を受ける。従って、再生細胞療法は、外傷性骨折を治療するための好ましい代替を提供する。関節軟骨の修復は、それが健康な関節、変形性関節症の関節の中にあろうと、または腱または靭帯と長骨末端との間の付着部位にあっても、本発明の再生細胞を使用して治療されてよい。損傷した関節軟骨は、制限された修復能力しか持たない。未治療の欠陥内に形成する繊維軟骨修復組織は機械的に弱く、従って寿命が制限される。時間が経つと、未治療の欠陥は骨関節炎を生じることが多い。現在の治療には、損傷を受けた軟骨を機械的に安定な合成の生体材料または組織加工された軟骨移植変で置換すること、或いは、産骨細胞またはその前駆体の移植によるものが含まれる。成熟軟骨細胞での細胞療法は、損傷組織を治療するのに充分な一次軟骨細胞を生じるのに十分な量の健康な軟骨ドナー組織を入手するのが困難なので、非実用的である。従って、軟骨細胞のin vitro増殖が、この特別な細胞療法への有効なアプローチである。軟骨を産生する本発明の再生細胞の能力に基づけば、これら細胞の使用は、長骨の末端における関節軟骨、膝関節の関節軟骨の間の半月状軟骨、および肋骨の末端における胸骨軟骨を修復するための現在の技術を置換えることができる。例えば、本発明の再生細胞は、生理学的溶液の中への注入を介して、軟骨部位に直接送達されてよい。当該再生細胞はまた、軟骨部位の中に注入されたときにin situでゲル化するヒドロゲル液体と混合することもできるであろう。このゲル化は、熱的または熱化学的に媒介されることができるであろう
【０１４５】
本発明の再生細胞はまた、腱および靭帯の修復のために使用することができる。腱および靭帯の断裂は、機械的に劣る修復組織を用いて治癒する。損傷を受けた組織が関節の付着部位にあるときは、損傷した組織が取り出され、多くの場合は合成の非再吸収性装置を介して当該骨に再度結合される。損傷が腱または靭帯の内部にあるならば、縫合が一つの選択肢である。重篤に損傷を受けた靭帯組織は、前方十字型靭帯治療の場合のように、自己腱での置換を正当化することが多い。しかし、現在の治療は、損傷した組織を同一の健康な組織で置換することはない。本発明の再生細胞の能力に基づけば、腱の再生を必要とする傷害はこれら細胞を使用して治療することができる。靭帯は腱と同様の機能、即ち、骨格組織を繋ぐ機能を果すから、本発明の再生細胞が靭帯修復のために適した組織を作製する際にも有用である可能性が高い。
【０１４６】
一般に、筋肉への付着部位または軟骨／骨部位における断裂した腱および靭帯の治療は、患部組織の取り出しと、これに続く縫合およびネジによる固定によって行われ、後者は骨界面における組織損傷のためのものである。腱−腱断裂または靭帯−靭帯断裂の修復は、二つの末端を縫合することによって達成されることが多い。再生細胞は、生理学的緩衝液中の再生細胞を直接注入することによって、またはin situで硬化する再生細胞を注入されたヒドロゲルを介して、または細胞担体を介しての損傷部位への送達によって、腱および靭帯の断裂を治療するために使用することができる。この再生細胞は、例えば骨、軟骨、筋肉、腱、または靭帯のような組織を合成することによって機能することができ、或いは、再生細胞によって分泌されたサイトカインおよび成長因子に対するそれらのパラクリン分泌応答を介してそうするために、存在するレシピエント細胞を刺激する。本発明は、損傷組織の除去および未損傷組織への固定および一体化ではなく、同じ組織での患部組織の置換を生じるので、当該技術において認識されている技術凌駕する固有の利点を提供する。
【０１４７】
大きな組織喪失をもたらす筋骨格組織外傷もまた、再生細胞療法から利益を受けることができる。自己組織移植片（患者からの組織）、例えば軟骨（低負荷支持部位から）、骨、腱、および靭帯、または同種移植片組織（もう一人の個体からの組織）が、骨格組織修復を刺激するために最も普通に使用される材料である。一般的に、組織の小片（骨移植の場合のように）または大きな切片が、損傷された隣接する組織が損傷を受けていないホスト組織で再アニールされなければならない組織空隙の中に移植される。自己組織移植法は、治療部位とは異なる患者の身体領域から組織を取り出すために、余分な手術を必要とする。ドナー部位における罹病は珍しいものではない。例えば、自己骨移植片で治療された患者の約３０％が、移植片採取部位において顕著な痛みおよび圧痛を経験しており、これは長引く可能い性があり、幾つかの事例では、当該処置が矯正しようとした背中の痛みが後まで残る。異種移植片組織は、組織の取得と移植との間に費やされる時間が変化する結果として、機能的に変化するという欠点を有している。異種移植片の機能における可変性はまた、組織機能の喪失を生じ得る凍結保存の期間および方法の結果でもある。
【０１４８】
骨格筋の産生を刺激する本発明の再生細胞の能力に基づけば、これらの細胞は、骨格組織を修復するために組織移植片の代りに使用されてよい。これは、再性細胞の筋肉空隙への直接注入、または細胞担体を筋肉感激の中に直接注入すること、または再生細胞を播種もしくは注入された細胞担体を介して送達することによって達成できるであろう。例えば、先天性骨格不全、例えば筋ジストロフィーに罹患している患者は、再生細胞療法を使用して機能的改善を経験する可能性がある。外再生細胞は、放射線照射を受けた患者に対して、再生細胞を用いて彼らの造血成分集団を増やすために静脈注射されてよい。次いで、これらの細胞は、冒された部位においてジストロフィーを部分的に修復できるであろう。
【０１４９】
本発明の再生細胞は、ここでは特に例示されていない他の筋骨格障害の治療にも関係するので、筋骨格窓外の治療における本発明の再生細胞の上記の用途は単なる例示に過ぎず、本発明の範囲を限定するものはない。
【０１５０】
好ましい実施形態において、再生細胞は、それらを移植すべき人間の組織から摘出され、それによって該移植に対する抗原性および／または免疫原性の応答に関連した潜在的な合併症を低減する。患者は、典型的には、医者または他の臨床提供者によって実施される１以上の次の処置によって筋骨格障害を評価されることが予想される：患者の健康履歴、身体検査、およびレントゲン写真（これに限定されない）を含む客体データ。
【０１５１】
一つの実施形態において、採取処置は、筋骨格障害（例えば脊椎固定手術）のための治療に関連して、血液凝固を低下させるように設計された何らかの薬物を受ける前に実施される。しかし、一定の実施形態において、患者は、採取処置の前に既に凝固に影響する薬物（例えばアスピリン）の投与を受けている可能性がある。加えて、一つの好ましい方法は、全ての企画された外科処置の前に、脂肪組織を採取することを含んでいる。しかし、当業者が理解するように、収集のタイミングは変化し、なかでも患者の安定性、患者の凝集プロファイル、プロバイダの利用可能性、および医療品質基準を含む幾つかの因子に依存するであろう。結局、収集のタイミングは、罹患した患者への医療に責任を負う臨床医によって決定されるであろう。
【０１５２】
患者から収集される脂肪組織の容積は、約１ｃｃ〜約２０００ｃｃまで変化することができ、幾つかの実施形態においては約３０００ｃｃ以下である。取り出される脂肪の容積は患者によって変化し、また多くの因子に依存するであろう。これらの因子には、限定されるものではないが、年齢、体質、凝集プロファイル、血行動態的安定性、同時罹患している病気、および医者の選択が含まれる。
【０１５３】
細胞は、前もって摘出されて冷凍保存で保存されてよく、または定義された必要時に摘出されてよい。ここに開示するように、該細胞は更なる処理を伴わずに、または細胞を更に精製、改変、刺激または変化させるための追加の処置の後に、患者に投与され、または損傷を受けた組織に直接もしくは損傷を受けた組織の近傍に適用される。例えば、患者から得られた細胞は、それらを患者に投与する前に細胞を培養することなく、再吸収可能な細胞担体および再吸収可能な細胞担体格納部分を介して、それを必要としている患者に投与されてよい。一つの実施形態において、脂肪組織の収集は患者のベッドサイドで行われるであろう。血行動態モニタリングを使用して、患者の臨床状態をモニターしてもよい。
【０１５４】
ここに開示する発明に従えば、再生細胞は、患者から脂肪組織を採取した後に直ちに患者に送達することができる。最終的には、送達のタイミングは患者の準備状態、および脂肪組織を処理するのに必要な処理時間に依存するであろう。もう一つの実施形態において、送達のタイミングは、ここで述べるように、患者に再注入される細胞が追加の改変、精製、刺激、または他の操作を受けるときには比較的長くなるであろう。患者に投与される細胞の数は、例えば、脂肪組織の処理後の細胞収率に関連する可能性がある。細胞の合計数の一部は、後での使用または冷凍保存のために保持されてよい。本発明の一つの実施形態において、患者に送達されるべき細胞数（例えば未処理の細胞数）は、約５．５×１０4細胞と予想される。しかし、この数は、望ましい治療効果を達成するために桁のレベルで大幅に調節することができる。
【０１５５】
脂肪組織から脱凝集の後に得られた細胞は、更に、軟骨前駆細胞、骨前駆細胞、またはこれら全ての細胞の一つを捕捉する装置内の、またはこれとは別の生物学に基づく成分上を通過させることによって、骨もしくは軟骨前駆細胞を富化されてよい。前者であれば、追加のステップは、前記装置の内側または外側に含められる追加のステップが、前記生物学に基づく成分から、前記捕捉された細胞を放出させるために使用されるであろう。この軟骨前駆細胞または骨前駆細胞の豊富化の一例は、軟骨前駆細胞または骨前駆細胞（例えばＳＨ３細胞）を認識する抗体が結合するクロマトグラフィー樹脂であろう。放出剤の一例は、前記抗体／細胞複合体を前記樹脂から開裂できるパパインまたはペプシンである。
【０１５６】
当該細胞はまた、目的の治療効果を向上、抑制、または指令するための添加剤が適用されてよい。細胞は、それらが該細胞によって提供される治療的反応を促進すると思われ、またはそれを目的とした遺伝子産物を発現するように、遺伝子操作の後に投与されてよい。この操作の例には、骨または軟骨形成を促進する因子の発現、特定の軟骨もしくは骨細胞系統への分化を促進する発生遺伝子の発現、または軟骨もしくは骨細胞増殖の成長および増殖を刺激する遺伝子の発現を制御（増大または減少させる）するような操作が含まれる。当該細胞集団はまた、プラスミドもしくはウイルスベクター中のＤＮＡを挿入することによって、または構造的もしくは治療的目的を導き出すための細胞機能を変更、向上もしくは補充するように細胞培養中に配置することによって、改変されてよい。もう一つの側面において、該細胞は、軟骨形成もしくは骨形成の際に、細胞をそれ自身の増殖因子供給源として働かせるであろう前軟骨形成増殖因子、または前骨形成増殖因子をコードする遺伝子と組み合せることができるであろう。特に、該細胞および／または該細胞を含む組織が、該細胞および／または組織を提供した患者以外の患者に投与されるときは、ここで説明した移植の拒絶を低減し、好ましくは防止するために、該細胞および／または組織を受取る患者に１以上の免疫抑制剤を投与してもよい。本発明の一定の実施形態において、該細胞は、ここに記載したサイトカインおよび成長因子のような１以上の細胞分化剤と共に患者に投与される。
【０１５７】
以下の実施例により本発明を更に例示するが、これら実施例は如何なる意味でも更なる限定として解釈されるべきではない。この出願の全体を通して引用された参照文献、発行済み特許、公開された特許出願、および同時継続特許出願を含む全ての引用文献の内容は、本明細書の一部として明示的に本願に援用される。
【実施例】
【０１５８】
下記に提供する実施例の全体を通して使用されるＡＤＣまたは再生細胞は、本開示に記載された方法によって、および／または２００２年１２月９日に出願された「処理された脂肪吸引細胞で患者を治療するためのシステムおよび方法」と題する米国出願第１０／３１６，１２７号（これは２００１年１２月７日に出願された米国仮出願第６０／３３８，８５６号の優先権を主張する）に記載の方法、並びに２００４年６月２５日に出願された「組織から再生細胞を分離および濃縮するためのシステムおよび方法」と題する米国出願第 号（これは２００２年１２月９日に出願された「処理された脂肪吸引細胞で患者を治療するためのシステムおよび方法」と題する米国出願第１０／３１６，１２７号の優先権を主張する）に記載の方法によって得ることができる。上記の出願は全て共通人に譲渡されており、それらの全内容を本明細書の一部として明示的に本願に援用する。
【０１５９】
実施例１：  in vivoの軟骨、骨および骨格筋由来の再生細胞
＜材料および方法＞：
再生細胞製剤：
ヒト再生細胞を、ここに記載したようにして酵素消化により採取した。次いで、単離された再生細胞を、免疫磁気ビーズを使用して、ＣＤ３４（＋）集団およびＣＤ３４（−）集団に分離した。各サブ集団の細胞を、多重ウエル培養プレートにおいて多重濃度の完全培地（ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清、５％ウマ血清、および１％抗生物質、抗真菌剤溶液）中で培養した。３週目に、これら培養物からＣＤ３４（−）クローンを分離し、次の培地のうちの一つにおいて約２月継代培養した：完全培地、骨形成培地、または軟骨形成培地。
【０１６０】
分析：
クローン細胞の軟骨または骨への分化を、アルシアンブルーまたはアルカリホスファターゼを用いてそれぞれ染色することにより決定した。クローン細胞の筋肉への分化を、ヒトミオシン重鎖に対する抗体、並びに骨格筋特異的マーカのｍｙｆ５およびｍｙｏＤ１を使用して、ＣＤ３４（＋）細胞およびＣＤ３４（−）細胞を免疫組織染色することにより評価した。ＲＴ−ＰＣＲを行って、ミオシン重鎖、ｍｙｆ５、およびｍｙｏＤ１の遺伝子発現を評価した。
【０１６１】
＜結果＞：
それぞれアルシアンブルーおよびアルカリホスファターゼを用いた組織化学的染色によって明らかなように、ＣＤ３４（−）クローンコロニー由来の再生細胞は、使用した培地に応じて軟骨細胞、骨芽細胞および筋肉細胞に分化し、骨形成培地中で培養された再生細胞は骨芽細胞に分化する一方、軟骨形成培地中で培養された再生細胞は、軟骨細胞に分化した。更に、如何なる分化培地も存在しない完全培地中で培養されたＣＤ３４（−）クローンコロニー由来の再生細胞は、ミオシン重鎖、ｍｙｆ５およびｍｙｏＤについて免疫組織化学的に陽性であり、それらの筋芽細胞発現型への分化を示した。免疫組織化学的データと一致して、これらの筋クローンは、ミオシン重鎖、ｍｙｆ５およびｍｙｏＤの遺伝子を発現した。
【０１６２】
＜要約＞：
要約すると、これ等のデータは、ヒトの培養された再生細胞コロニーは、軟骨細胞、骨が細胞および骨格筋芽細胞を生じる。従って、本発明の再生細胞は、失われた組織（例えば、軟骨、腱、または靭帯における軟組織断裂）を修復するため、並びに一体でない長骨の骨折におけるような硬組織破断を修復する際のように、軟骨、骨、および骨格筋形成を刺激する能力を有している。加えて、本発明の再生細胞は、例えば横突起または椎骨の間での骨形成による脊椎固定用途において機械的支持を与えるために、組織をデノボ生成させる能力を有している。
【０１６３】
実施例２：  ヒト再生細胞は骨前駆細胞の豊富な供給源である
＜方法および材料＞
脂肪吸引：
選択的脂肪形成術（脂肪吸引）を受けている個体から、ヒト脂肪細胞を得た。一般に、脂肪吸引処置は、腹部および／または大腿の皮膚に０．５ｃｍの切開を形成し、続いて皮下空隙に肥大性の溶液（リドカインおよびエピネフィリンを補充した生理食塩水）を浸潤させることを含んでいた。約１０分後に、機械的補助による吸引の下で、カニューレ（医者の選択に従って３〜５ｍｍの直径）を通して皮下脂肪組織を吸引した。脂肪組織、血液、および肥大性溶液（脂肪吸引液）を、使い捨て容器の中に収集し、実験室への輸送の間は４℃で保存した
【０１６４】
組織消化：
脂肪組織を温生理食塩水（３７℃）で数回洗浄し、過剰な血液および遊離の脂質を取り出した。次いで、この組織をブレンドザイムコラゲナーゼ（ブレンドザイム１で４５分、またはブレンドザイム３で２０分 ；Roche、Indianapolis、IN）を用いて３７℃で消化した。消化の全体を通して一定の撹拌を適用し、組織および培地の充分な混合を保証した。消化の後に非浮遊性細胞を取り出し、３回洗浄して残留酵素を除去した。蛍光顕微鏡を用いた血球計数器上で、生体色素（ヨウ化プロピジウム）を使用して細胞を計数した。
【０１６５】
ＣＦＵ−ＡＰアッセイ：
洗浄された細胞を、６個の多重ウエルプレート（Corning, New York）において、１，０００細胞、５，０００細胞、および２５，０００細胞／ウエルでプレーティングした。０．１μＭデキサメタゾン（Sigma, St. Louis, MO）、１０ｍＭのβ-グリセロリン酸（Sigma, St. Louis, MO）および５０μＭのＬ−アスコルビン酸 2-リン酸（Sigma, St. Louis, MO）を補充したα−ＭＥＭ（Cellgro, Herndon, VA）、１０％ＦＢＳ／５％ウマ血清／１％抗生物質−抗真菌溶液（Omega Scientific, Tarzana, CA）からなる培地中において、細胞を３週間培養することによって骨原性分化を誘導した。誘導の最初の週の後、デキサメタゾンを含まない骨形成培地で培地を毎週交換した。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性を検出するために、培養プレートをＰＢＳで濯ぎ、１％ナフトールＡＳ−ＢＩリン酸（Sigma, St. Louis, MO）および１ｍｇ／ｍＬの迅速赤ＴＲ（Sigma, St. Louis, MO）を用いて３７℃で２０分間染色した。染色の後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１０％緩衝ホルマリンリン酸（Fisher Scientific, Pittsburgh, PA）で１５分間固定した。ＡＰ染色陽性の５０細胞を越えるコロニーを、ＣＦＵ−ＡＰとして定義した。ＣＦＵ−ＡＰの数を各ウエルにおいて計数し、複製サンプルからのＣＦＵ−ＡＰの平均数を計算した。
【０１６６】
アルカリホスファターゼアッセイ：
脂肪組織から誘導された細胞の２１日培養物における全アルカリホスファターゼ活性を、熱量測定アッセイ（Sigma Diagnostics, St. Louis, MO）を使用して測定した。簡単に説明すると、２１日培養遺物を掻き取りにより採取し、細胞を生理食塩水中に再懸濁させ、超音波処理によって溶解させた。次いで、細胞溶解物をリン酸ｐ−ニトロフェニルと共に、３０℃においてｐＨ１０．２で１５分間インキュベートした。Ｔｕｒｎｅｒ  ＳＰ−８３０分光光度計（Turner Designs, Sunnyvale, CA）を使用して、４０５ｎｍでの吸光度を測定した。
【０１６７】
＜結果＞：
ドナー特性
ドナー集団の特徴が、下記の表Ａに示されている。この集団は、美容的脂肪形成術を受けている集団を代表している。アメリカ美容整形外科協会からのデータは、２００３年に米国において３８４，６２６件の脂肪形成処置が行われ、これは男性および女性の両方について最も普通の美容外科処置になっていることを示している。女性は、全ての脂肪形成処置の８４％（現在の研究では８１％）を占めている。２００３年に脂肪形成術を受けた全ての患者の約半分が３５〜５０歳であり、この研究での中間年齢は４６歳である。
表Ａ：ドナー特性
性別          女性４４      男性１０
中間年齢      ４６（範囲１９〜７２）
脂肪吸引の平均容積      ５１０±４７ｍＬ（範囲５０〜１，５００）
脂肪吸引から組織処理までの時間      ６時間未満１７    一晩３７
肥満℃指数    正常２０    過体重１２    肥満６    未知１６
【０１６８】
ＣＦＵ−ＡＰアッセイの開発および有効性
組織処理は、単位容積（ｍＬ）の脂肪組織当り、平均で（７．３±０．１）×１０5の生存非浮遊有核細胞を生じた。次いで、この細胞供給源についてこのアッセイの有効性を確認するために、これらの細胞を複数の密度でＣＦＵ−ＡＰアッセイに播種した。更に、我々は、１，０００〜５０，０００細胞／ウエルの範囲に亘って、ＣＦＵ−ＡＰの計数が、播種された細胞数に対して線型であることを立証した。検出された発生頻度の範囲は、標準アッセイについて、ウエル当りのコロニー数がウエル当り１０〜６０の範囲にある培養物を得ることを保証するために、細胞をルーチンに二つの異なる細胞濃度で３回播種するものである。
【０１６９】
骨前駆細胞の発生頻度および収率
このアプローチを使用して、我々は、５４人のドナーから得た脂肪組織を試験した（表Ａ）。このデータは、新鮮な組織（補修の６時間以内に処理した組織）から処理されたサンプルにおけるＣＦＵ−ＡＰの発生頻度が、組織収集の次の日に処理されたサンプルのそれよりも顕著に高かったことを示している（０．６±０．２のＣＦＵ−ＡＰ／１００細胞に比較して、２．０±０．３のＣＦＵ−ＡＰ／１００細胞；ｐ＝０．００１）。ＣＦＵ−ＡＰ発生頻度は、ドナーの年齢または性別とは相関しなかった。
骨前駆細胞の平均収量は、７，２２５±ｌ，７６０のＣＦＵ−ＡＰ／ｍＬ脂肪組織（範囲１２０〜６７，５００）であった。ＣＦＵ−ＡＰ発生頻度とは異なり、ドナー年齢が増大するに伴って、脂肪組織の単位容積当りのＣＦＵ−ＡＰ収量が減少する傾向があった。しかし、年齢が高い方の１／４（＞４８才）を年齢が低い方の１／４（＜３４歳）と比較すると、その差は統計的有意差に達しなかった（年少ドナーについての９，２００±１，８００に比較して、年長ドナーについては４，３００±ｌ，５００細胞／ｍＬ組織；ｐ＝０．０９）。
【０１７０】
アルカリホスファターゼ活性
この研究において、コロニーは、それがアルカリホスファターゼ陽性であれば少なくとも５０細胞を含むというアッセイの目的のためにのみ計数された。コロニーのサイズは顕著に変化し、幾つかのコロニーは数千の細胞からなる。全アルカリホスファターゼ活性は、全骨芽細胞数（前駆細胞増殖の関数）およびこれら細胞の分化の程度の両方を考慮するので、骨形成活性を測定するための優れた方法を表すであろう。従って、アルカリホスファターゼアッセイは１５人の連続ドナーにおいて反復ウエルで実施された。全アルカリホスファターゼ活性は、播種された細胞数に対して線型の関係を示した。次いで、アルカリホスファターゼ活性（播種された細胞数に対して正規化された）を年齢に対してプロットすると、そのデータは、年齢とアルカリホスファターゼ活性の間に逆の関係を示す（図２；γ2＝０．５７）。
【０１７１】
骨前駆細胞の収率および肥満度指数
ドナーの身長および体重に関するデータは、３８人のドナーから入手可能であった。これは、肥満度指数（ＢＭＩ）の計算、および三つのグループへの層別化を可能にした；正常なＢＭＩ（１８．５〜２４．９）の２０人のドナー、過体重分類（２５．０〜２５．９）の１２人のドナー、および肥満（＞３０）の６人のドナー。単位容積組織当りのＣＦＵ−ＡＰの収量は、正常なＢＭＩの人では過体重の人よりも顕著に高かった（ＢＭＩの正常なドナーの５，２７９±７８０に対して、過体重のドナーのｌ，３７３±ｌ，１５０；ｐ＜０．０２）。肥満のドナーは、組織の単位容積当りのＣＦＵ−ＡＰ収量において顕著な変動を示した（８６７〜１８，４６２のＣＦＵ−ＡＰ／ｍＬ；図３）。平均は過体重のドナーよりも高かったが、これは統計的有意差に達しなかった（ｐ＝０．０８）。
【０１７２】
＜要約＞
要約すると、上記の結果は、ヒト脂肪組織が骨前駆細胞の豊富な供給源であり得ることを示している。即ち、この結果は、ヒトの脂肪が、１ｇの組織当り平均で約７，２００の骨前駆細胞を含んでいることを示している。この細胞集団内におけるＣＦＵ−ＡＰの発生頻度は、組織収集から組織処理までの時間に依存し、収集の６時間入ないに処理された組織は、２．０±０．３のＣＦＵ−ＡＰ／１００有核細胞の発生頻度を生じる。新鮮に採取されたヒト骨髄は、５０，０００中で約１の発生頻度で２００〜２，０００のＣＦＵ−ＡＰ／ｍＬ骨髄と見積もられたＣＦＵ−ＡＰ収量を有する（Banfi, 2001; Galotto, 1999; D'Ippolito 1999）。従って、このデータは、ヒト脂肪組織が同じ容積の骨髄よりも実質的に多い骨前駆細胞を含んでいることを示している。
上記の方法で達成されるよりも高い細胞収率が、適用される吸引力の量および使用するカニューレの種類およびサイズを含む脂肪吸引処置のパラメータを変更することによって可能であるかもしれない。
【０１７３】
実施例３：  再生細胞は、非骨部位においてin vivoで軟骨および骨を形成する
＜方法および材料＞：
細胞足場：
ＰＬＡ足場の製造および製剤
９０％の近似多孔質度を有する多孔性ポリマー足場を、溶媒キャスティング／粒子浸出方によって製造した。簡単に説明すると、塩化ナトリウムを浸出可能な孔形成剤として使用し、直径３００〜５００μｍの範囲の粒子に篩別した。７０：３０のポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ＤＬ−ラクチド）とクロロホルムを混合することによって、３％のポリマー溶液を作製した。この篩別された塩およびポリマー溶液をテフロン（登録商標）製ペトリ皿の中で混合して、９：１の重量比の塩／ポリマーを作製し、フードの中で２日間、溶媒を蒸発させた。８〜１２時間毎に水を交換しながら水中で３日間浸漬することによって、足場から塩を浸出させた。この多孔質ポリマースポンジを低真空下に２日間置くことにより、残留溶媒を除去した。このポリマーシートから直径８ｍｍの移植片をパンチングすることにより、移植のための足場を採寸した。足場を７０％エタノール中に一晩浸漬し、紫外線に露出し、０．９％の注射用生理食塩水で３回濯ぐことにより足場を無菌にし、次いで細胞接種の前にこの足場から残留生理食塩水を除去した。
【０１７４】
ミネラルを除去した骨マトリックス（ＤＢＭ）足場調製および細胞接種
足場から残留生理食塩水を除去する前に、均等に分割された部分（インプラント当り約７０ｍｇ）を０．９％の注射可能な生理食塩水で３回濯ぐことにより、グラフトン（Grafton；登録商標）脱ミネラル化骨マトリックスパテ（Osteotech, New Jersey）インプラントを、細胞接種のために調製した。
【０１７５】
再生細胞の単離、培養、および細胞接種
緑色蛍光タンパク質［ＣＳＴＢｌＺｏ−ＴｇＮ（ＡＣＴｂＥＧＦＰ）１Ｏｓｂ］を発現するトランスジェニックマウスから、白色皮下脂肪組織を切除することによって、再生細胞を得た。組織に酵素消化を施した。簡単に説明すると、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、０．０７５％のコラゲナーゼＩ（Sigma）中において３７℃で震盪しながら４５分間消化させ、次いで、ダルベッコ改変必須培地（Gibco）中の１０％ＦＢＳ（Fisher）で中和し、細胞染色フィルタの勾配（１００μｍ，７０μｍおよび４０μｍ）を通過させ、４０Ｏｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを骨形成培地［α−ＭＥＭ（Cellgro, Herndon, VA）、１０％ＦＢＳ、０．１μＭデキサメタゾン（Sigma, St. Louis, MO）を補充した１％抗生物質−抗真菌剤溶液（Omega Scientific, Tarzana, CA）、１０ｍＭグリセロリン酸（Sigma, St. Louis, MO）、および ５０μＭのＬ−アスコルビン酸２−リン酸  （Sigma, St. Louis, MO）］中に再懸濁させた。最初の３日間の誘導の後、デキサメタゾンを含まない骨形成培地で培地を毎週交換した。フラスコを、３週間の培養器官に２回継代させた。次いで、培養された再生細胞を、組換えヒトＢＭＰ−２（５μｇ／ｍＬ）の存在または不存在下において、骨形成培地と共に一晩インキュベートした。次いで、細胞を０．９％の注射可能な生理食塩水の中に再懸濁させ（５ｘ１０7細胞／ｍＬ）、２．５×１０6細胞／足場でＰＬＡまたはＧｒａｆｔｏｎ・ＤＢＭ足場に接種されるまで、４℃に保った。
【０１７６】
外科的処置：
胸腺欠損ラット（約２００ｇ）をケタミン／キシラジン[それぞれ１００／１０ｍｇ／ｋｇ（TW Medical Veterinary Supply）]で麻酔した。ラットの腹部を剃り、ベタジンおよび７０％イソプロパノールを塗布した。無菌条件下で、臀部に近い脚部の皮膚を通して、約１．５ｃｍの長さの充分に厚い切開を形成した。鈍い切開を通して張筋筋肉を露出させ、張筋筋肉に沿って１．０ｃｍの切開を形成し、筋膜を切開して直筋筋肉を露出させた。微小スパチュラを使用してチャンネルを形成し、その中に一つのインプラントを配置した。５〜０絹縫合糸の単回通過を使用して前記チャンネルを閉じ、続いて張筋筋肉切開を５〜０被覆Ｖｉｃｒｙｌ（登録商標）編み縫合糸で縫合し、９ｍｍの創傷クリップで皮膚切開の閉鎖を行う。手術に続いて、加熱パッド上で動物を麻酔から回復させる。術後の痛みを緩和するために、覚醒時にブプレノルフィン（０．０２〜０．０５ｍｇ／ｋｇ、皮下）を投与した。
【０１７７】
分析：
手術の２週間後にラットをＣＯ2露出により安楽死させ、移植片を回収した。組織を０．４％パラホルムアルデヒドの中で一晩固定し、パラフィン中に埋め込み、５ミクロンの切片に切断し、次いで軟骨および石灰化した組織を可視化するためにトルイジンブルーまたはＶｏｎ・Ｋｏｓｓａで染色した。緑色蛍光を生じるドナー細胞の存在について、未染色の切片を評価した。
【０１７８】
＜結果＞：
エクスサイチューでＢＭＰ−２によりプライミングされている再生細胞を接種したＰＬＡおよびＤＢＭ足場を移植された組織は、軟骨、骨様体および石灰化された骨の混合物を含んでいた。軟骨は、異染性に染色された細胞および組織の存在によって、トルイジンブルーで染色された切片において同定された。軟骨細胞は陰窩内に存在した。これらはプロテオグリカンに富むマトリックスに取囲まれていた。骨様体は、Ｖｏｎ・Ｋｏｓｓａで染色された切片において、骨細胞が埋設された平滑なマトリックスとして明らかであった。石灰化された骨は、Ｖｏｎ・Ｋｏｓｓａで染色された切片において明らかであった。早期の造血要素は、骨の中で、細胞を負荷された延髄キャビティーの存在によって同定された。軟骨もまた、プライムされなかった再生細胞およびＤＢＭで構成されたインプラントと共に、組織中において明らかであった。対照的に、軟骨または骨は、再生細胞なしで移植された何れの足場型にも存在しなかった。
【０１７９】
＜要約＞：
要約すると、上記の結果は、再生細胞が、骨伝導性足場（ＤＢＭ）または非骨伝導性足場（ＰＬＡ）上で骨格筋の中に送達されたときに、軟骨および骨を形成する能力を有することを立証している。従って我々は、再生細胞が、椎間板を修復するために軟骨に類似したプロテオグリカンに富む組織の形成を刺激する上で有用であろうと想定している。
【０１８０】
更に、これらのデータは、椎間体および横突起脊椎固定の両方（その両方の環境は骨格筋によって取囲まれる）における骨形成を刺激する際の、再生細胞の使用に向けた支援を与えている。既知の骨前駆細胞であるサテライト細胞を含む骨格筋は、再生細胞と協働で作用して、頑丈な骨形成を刺激するようである。少なくとも、骨格筋は再生細胞が骨形成を刺激できる支援環境を提供する。
【０１８１】
ここに記載した特徴のうちの何れかの特徴またはその組み合せは、このような何れかの組み合わせに含められる特徴が、その内容、本明細書、および当業者の知識から明らかに相互に矛盾しないことを条件として、本発明の範囲内に含められる。本発明を要約する目的のために、本発明の一定の側面、利点、および新規な特徴をここに記載してきた。勿論、全てのこのような側面、利点、または特徴が、必ずしも本発明の何れか特定の実施形態の中に具体化されるものでないことが理解されるべきである。本発明の追加の利点および側面は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲において明らかである。
【０１８２】
上記の実施形態は例として提供されたものであり、本発明はこれらの例に限定されない。上記の説明を考慮したときに、相互に排斥しない範囲において、開示された実施形態に対する多くの変形例および改変が当業者に生じるであろう。加えて、ここでの開示を考慮すると、他の組み合せ、省略、置換および改変が当業者に明らかであろう。従って、本発明は開示された実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲を参照することによって定義されるべきである。
多くの刊行物および特許が上記において引用されている。これらの引用された刊行物および特許の各々は、その全体が、本明細書の一部として本願に援用される。
【０１８３】
(均等)
当業者は、ルーチンを越えない実験を使用して、ここに記載した発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または確めることができるであろう。このような均等物は、特許請求の範囲に包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【０１８４】
【図１】図１は、一つのフィルタアセンブリーを含む、組織から再生細胞を分離および濃縮するためのシステムを示している。
【図２】図２は、直列構成の複数のフィルタアセンブリーを有する、図１と同様のシステムを示している。
【図３】図３は、並列構成の複数のフィルタアセンブリーを有する、図１と同様のシステムを示している。
【図４】図４は、遠心分離チャンバを含んだ、組織から再生細胞を分離および濃縮するためのシステムを示している。
【図５】図５は、組織から再生細胞を分離および濃縮するためのシステムにおいて利用される、前置固定されたフィルタを含む収集チャンバの断面図である。
【図６】図６は、浸透濾過システムを利用して、組織から再生細胞を分離および濃縮するシステムの処理チャンバを示す断面図である。
【図７】図７は、再生細胞を濃縮するために遠心分離装置を利用して、組織から再生細胞を分離および濃縮するシステムの処理チャンバを示す断面図である。
【図８】図８は、図７の処理チャンバのもう一つの断面図である。
【図９】図９Ａ、図９Ｂおよび図９Ｃは、本発明のシステムと共に使用する水簸部品を示している。
【図１０】図１０は、システムを通して液体を移動させるために真空圧を利用する、組織から再生細胞を分離および濃縮するためのシステムを示している。真空システムは、真空ポンプまたは真空源を該システムの出口に適用することによって構築することができ、流れの方向およびタイミングを制御するための停止コック、排出孔、およびクランプのシステムを使用して、組織および流体を所定の速度で吸引するように制御することができる。
【図１１】図１１は、システムを通して液体を移動させるために陽圧を利用する、組織から再生細胞を分離および濃縮するためのシステムを示している。陽圧システムは、流れの方向およびタイミングを制御するための停止コック、排出孔、およびクランプのシステムを使用して、流体および組織を所定の速度で該システムを押し通すように、蠕動ポンプのような機械的手段を使用する。
【図１２Ａ】図１２Ａは、流体の供給流が、フィルタの孔に対して接線方向に流れる濾過プロセスを示している。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、流体の供給流が、フィルタの孔に対して垂直に流れる濾過プロセスを示している。
【図１３】図１３は、本発明のシステムのための使い捨てセットの一例を示している。
【図１４−１】図１４−１は、本発明のシステムのための再使用可能な部品の一例を示している。
【図１４−２】図１４−２は、本発明のシステムのための再使用可能な部品の一例を示している。
【図１５Ａ−１】図１５Ａ−１は、図１３の使い捨てセットおよび図１４の再使用可能な部品を使用して組み立てられた本発明の装置の一例を示している。
【図１５Ａ−２】図１５Ａ−２は、図１３の使い捨てセットおよび図１４の再使用可能な部品を使用して組み立てられた本発明の装置の一例を示している。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、本発明のシステムの自動化された実施形態を制御する、ソフトウエアプログラムを介して実施される予めプログラムされたステップの例を描いたフローチャートである。二つの択一的な処理パラメータが示されており、本システムの多用途性を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
2008504867.tif 000018
【図１３】
2008504867.tif 000019
【図１４−１】
2008504867.tif 000020
【図１４−２】
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【図１５Ａ−１】
2008504867.tif 000022
【図１５Ａ−２】
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【図１５Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年7月2日(2007.7.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
閉じた無菌の液体／組織経路を維持しながら筋骨格障害を患う患者から得られた脂肪由来の濃縮した再生細胞集団を含む、前記患者における軟骨、骨格筋、腱、靭帯、髄核、またはプロテオグリカンに富むマトリックスの形成を促進するための組成物。
【請求項２】
脂肪由来の濃縮した再生細胞集団が、
筋骨格障害を患う患者から取り出された脂肪由来の再生細胞を含む脂肪組織を、閉じた経路を維持するように構成されているプログラム可能な自動化された処理ユニットへ導入すること、及び、前記脂肪組織を処理して、濃縮した再生細胞集団を得ることによって得られ、
前記処理ユニットが、
閉じた無菌の液体／組織経路を維持しながら、前記脂肪組織を収容して脱凝集させるように構成されている、チャンバアセンブリー；
前記チャンバアセンブリーに連結されており、閉じた無菌の液体／組織経路を維持しながら、前記チャンバアセンブリーから受け取った脂肪由来の再生細胞を濃縮して、脂肪由来の再生細胞を含む濃縮した細胞集団を生成するように構成されている、濃縮装置；
前記チャンバアセンブリーと前記濃縮装置とを接続しており、閉じた無菌の液体／組織経路を維持しながら、脂肪由来の濃縮した再生細胞集団を通過させるように構成されている、導管；及び
前記チャンバアセンブリー及び前記濃縮装置と通信して、前記チャンバアセンブリー及び前記濃縮装置を制御することができる、プログラム可能なプロセッシング装置；
を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
濃縮装置が遠心分離装置を含む、請求項２記載の組成物。
【請求項４】
チャンバアセンブリーが収集チャンバ及び処理チャンバを含む、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
処理チャンバが収集チャンバに連結されており、遠心分離装置は、収集チャンバに接続されていて、閉じた無菌の液体／組織経路を維持しながら脱凝集した組織を収集チャンバから受け取る、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
収集チャンバが収集チャンバ内のフィルタケージに収容されているフィルタを更に含み、前記フィルタが、分離した脂肪由来の再生細胞を保持して遊離脂質、血液及び洗浄溶液を通過させるように構成されている、請求項４記載の組成物。
【請求項７】
処理チャンバが遠心分離チャンバを含み、前記遠心分離チャンバが、遠心分離の間、分離した脂肪由来の再生細胞を処理チャンバ内に保持するように構成されている、請求項４記載の組成物。
【請求項８】
遠心分離チャンバが更に少なくとも１のアウトプットチャンバを含み、前記アウトプットチャンバが、濃縮した再生細胞を回収するように構成されている、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
アウトプットチャンバが、遠心分離の間は第一の角度に傾けられており、濃縮した再生細胞集団の回収の間は第二の角度に傾けられている、請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
アウトプットチャンバは、濃縮した再生細胞集団の回収のための第二の角度に達するように手動で再配置することができる、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
脂肪由来の濃縮した再生細胞集団はシリンジで取り出すことができる、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
処理チャンバが、無菌性を維持するように構成されている回転シールを含む、請求項４記載の組成物。
【請求項１３】
回転シールが、回転シャフト、ベアリング、リップシール、外部ハウジング、円形チャンネル、円形バネ、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
回転シールが、回転シャフト、単一のゴムシール、空気ガスケット、バネ負荷シール、セラミックディスク、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１２記載の組成物。
【請求項１５】
処理ユニットが、チャンバアセンブリーに接続されている廃棄チャンバを更に含む、請求項２記載の組成物。
【請求項１６】
廃棄チャンバが、コラーゲン、タンパク質、脂質、脂肪細胞、マトリックス成分、又はそれらの組み合わせを収容するように構成されている、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
廃棄チャンバによって収容されているコラーゲン、タンパク質、脂質、脂肪細胞、マトリックス成分又はそれらの組み合わせが、遠心分離又は濾過による分離又は濃縮に適している、請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
収集チャンバ及び処理チャンバが配管を介して連結されている、請求項４記載の組成物。
【請求項１９】
配管が更にセンサを含む、請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
収集チャンバおよび処理チャンバが、更に、弁、ポンプ、センサ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項４記載の組成物。
【請求項２１】
収集チャンバ、処理チャンバおよび配管が使い捨て可能である、請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
遠心分離装置およびプロセッシング装置が再使用可能である、請求項４記載の組成物。
【請求項２３】
遠心分離装置が、更に、遠心分離モータ、遠心分離モータコントローラ、遠心分離ブレーキコントローラ、又はそれらの組み合わせを含む、請求項２２記載の組成物。
【請求項２４】
プロセッシング装置が、少なくとも１のポンプの使用を介して組織の流れを方向付けることにより、遠心分離チャンバ、処理チャンバおよび遠心分離チャンバを制御する、請求項４記載の組成物。
【請求項２５】
ポンプが蠕動ポンプである、請求項２４記載の組成物。
【請求項２６】
ポンプが再使用可能である、請求項２４記載の組成物。
【請求項２７】
脂肪由来の濃縮した再生細胞集団が幹細胞を含む、請求項１〜２６のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２８】
脂肪由来の濃縮した再生細胞集団が前駆細胞を含む、請求項１〜２７のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２９】
脂肪由来の濃縮した再生細胞集団が幹細胞および前駆細胞を含む、請求項１〜２８のいずれか１項記載の組成物。
【請求項３０】
脂肪由来の濃縮した再生細胞集団が、筋骨格障害を患う患者への注入のために処方されている、請求項１〜２９のいずれか１項記載の組成物。
【請求項３１】
脂肪由来の濃縮した再生細胞集団が、椎間板への導入のために処方されている、請求項１〜３０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項３２】
脂肪由来の濃縮した再生細胞集団が、筋骨格障害を患う患者の髄核への投与のために処方されている、請求項１〜３１のいずれか１項記載の組成物。
【請求項３３】
脂肪由来の濃縮した再生細胞集団が、長骨の末端における使用のために処方されている、請求項１〜３２のいずれか１項記載の組成物。
【請求項３４】
脂肪由来の濃縮した再生細胞集団が、膝関節における使用のために処方されている、請求項１〜３３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項３５】
脂肪由来の濃縮した再生細胞集団が、肋骨における使用のために処方されている、請求項１〜３４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項３６】
脂肪由来の濃縮した再生細胞集団が、軟骨形成部位における使用のために処方されている、請求項１〜３５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項３７】
脂肪由来の濃縮した再生細胞集団が、筋骨格障害を患う患者の中に配置される固定可能なゲル又はヒドロゲルにおける使用のために処方されている、請求項１〜３６のいずれか１項記載の組成物。
【請求項３８】
脂肪由来の濃縮した再生細胞集団が、筋骨格障害を患う患者への導入のため、外科インプラント又は外科装置の上に配置されている、請求項１〜３７のいずれか１項記載の組成物。
【請求項３９】
外科装置が脊椎固定装置である、請求項３８記載の組成物。
【請求項４０】
外科インプラントが足場である、請求項３８記載の組成物。
【請求項４１】
足場が多孔質である、請求項４０記載の組成物。
【請求項４２】
脂肪由来の濃縮した再生細胞集団が、筋骨格障害を患う患者への配置に適するゲル又はヒドロゲルへ組み込まれている、請求項１〜４１のいずれか１項記載の組成物。
【請求項４３】
脂肪由来の濃縮した再生細胞集団が、長骨骨折箇所における使用のために処方されている、請求項１〜４２のいずれか１項記載の組成物。
【請求項４４】
脂肪由来の濃縮した再生細胞集団が、腱の修復における使用のために処方されている、請求項１〜４３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項４５】
脂肪由来の濃縮した再生細胞集団が、腱−骨付着部位における使用のために処方されている、請求項１〜４４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項４６】
脂肪由来の濃縮した再生細胞集団が、骨格筋形成における使用のために処方されている、請求項１〜４５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項４７】
脂肪由来の濃縮した再生細胞集団が、靱帯修復における使用のために処方されている、請求項１〜４６のいずれか１項記載の組成物。
【請求項４８】
脂肪由来の濃縮した再生細胞集団が、靱帯−筋肉付着部位における使用のために処方されている、請求項１〜４７のいずれか１項記載の組成物。
【請求項４９】
筋骨格障害を患う患者が骨又は軟骨の形成を必要としている、請求項１〜４８のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５０】
筋骨格障害を患う患者が椎間体脊椎固定術を必要としている、請求項１〜４９のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５１】
筋骨格障害を患う患者が横突間棘突起脊椎固定術を必要としている、請求項１〜５０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５２】
チャンバアセンブリー内で洗浄溶液が使用される、請求項２記載の組成物。
【請求項５３】
洗浄溶液が生理食塩水である、請求項５２記載の組成物。
【請求項５４】
チャンバアセンブリー内で脱凝集剤が使用される、請求項２記載の組成物。
【請求項５５】
脱凝集剤が、コラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リベラ−ゼＨ１、ペプシン、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項５４記載の組成物。
【請求項５６】
脂肪由来の濃縮した再生細胞集団に、少なくとも１の添加剤が添加される、請求項１〜５５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５７】
添加剤が、成長因子、再懸濁液、細胞培養試薬、細胞増殖試薬、細胞保存試薬、脱凝集剤、細胞改変試薬、成長促進剤およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項５６記載の組成物。
【請求項５８】
成長促進剤がヒアルロン酸である、請求項５７記載の組成物。
【請求項５９】
脂肪由来の濃縮した再生細胞集団が培養されたものである、請求項１〜５８のいずれか１項記載の組成物。
【請求項６０】
脂肪由来の濃縮した再生細胞集団が骨原性表現型への分化を促進する培養条件で増殖させられる、請求項５２記載の組成物。
【請求項６１】
処理ユニットが、濃縮装置に接続されている細胞培養装置を更に含む、請求項２記載の組成物。
【請求項６２】
脂肪由来の濃縮した再生細胞集団及び添加剤が、筋骨格障害を患う患者の髄核への投与のために処方されている、請求項５６記載の組成物。
【請求項６３】
脂肪由来の濃縮した再生細胞集団及び外科装置又は外科インプラントが、筋骨格障害を患う患者の髄核への投与のために処方されている、請求項３８記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５７】
上述した本発明の好ましい実施態様の具体例としては、例えば、以下のようなものが挙げられる。
（実施態様１）
骨、軟骨、骨格筋、腱、靭帯、またはプロテオグリカンに富むマトリックスの形成を誘導する方法であって：
（１）組織から再生細胞を濃縮するための、プログラム可能な自動化されたシステムを準備すること；および
（２）濃縮された再生細胞を患者の中に配置して、骨、軟骨、骨格筋、腱、靭帯、またはプロテオグリカンに富むマトリックスの形成を誘導すること；
を含む前記方法。
（実施態様２）
実施態様１の方法であって、準備することが、下記を含む自動化されたシステムを準備することを含む前記方法：
ａ．患者から取り出された組織を収容するためのチャンバアセンブリーであって、前記組織から再生細胞が分離されるように、前記組織の脱凝集を促進する前記チャンバアセンブリー；
ｂ．前記チャンバアセンブリーからの再生細胞を濃縮するために連結することができる濃縮装置；および
ｃ．前記チャンバアセンブリーおよび前記濃縮装置と通信して、前記チャンバアセンブリーおよび前記濃縮装置を制御することができる、プログラム可能なプロセッシング装置。
（実施態様３）
実施態様２の方法であって、濃縮装置が遠心分離装置を含む前記方法。
（実施態様４）
実施態様３の方法であって、チャンバアセンブリーが収集チャンバおよび処理チャンバを含む前記方法。
（実施態様５）
実施態様４の方法であって：
準備することが、処理チャンバを収集チャンバに結合することを含み、遠心分離装置が、前記収集チャンバに連結されて、前記収集チャンバから脱凝集された組織を収容するように構成されている前記方法。
（実施態様６）
実施態様２の方法であって、組織が脂肪組織である前記方法。
（実施態様７）
実施態様２の方法であって、再生細胞が幹細胞である前記方法。
（実施態様８）
実施態様２の方法であって、再生細胞が前駆細胞である前記方法。
（実施態様９）
実施態様２の方法であって、再生細胞が幹細胞および前駆細胞の組み合わせである前記方法。
（実施態様１０）
実施態様２の方法であって、分離および濃縮された再生細胞が、患者の中への注入に適しているものである前記方法。
（実施態様１１）
実施態様１０の方法であって、再生細胞が、患者を治療することに使用される前記方法。
（実施態様１２）
実施態様２の方法であって、再生細胞が、椎間板を修復することに使用される前記方法。
（実施態様１３）
実施態様１２の方法であって、椎間板が、プロテオグリカンに富むマトリックスの産生により修復される前記方法。
（実施態様１４）
実施態様１２の方法であって、再生細胞が、椎間板の中への直接注入を介して患者の中に配置される前記方法。
（実施態様１５）
実施態様１２の方法であって、再生細胞が、固定可能なヒドロゲルの中への注入を介して患者の中に配置される前記方法。
（実施態様１６）
実施態様２の方法であって、再生細胞が、椎間体脊椎固定術のための骨形成を誘導することに使用される前記方法。
（実施態様１７）
実施態様２の方法であって、再生細胞が、横突間棘突起脊椎固定術のための骨形成を誘導することに使用される前記方法。
（実施態様１８）
実施態様２の方法であって、再生細胞が、軟骨形成を誘導することに使用される前記方法。
（実施態様１９）
実施態様２の方法であって、軟骨形成が長骨の末端におけるものである前記方法。
（実施態様２０）
実施態様２の方法であって、軟骨形成が膝関節におけるものである前記方法。
（実施態様２１）
実施態様２の方法であって、軟骨形成が肋骨におけるものである前記方法。
（実施態様２２）
実施態様１８の方法であって、再生細胞が、軟骨形成部位への直接注入を介して患者の中に配置される前記方法。
（実施態様２３）
実施態様１８の方法であって、再生細胞が、固定可能なヒドロゲルの中への注入を介して軟骨形成部位に配置される前記方法。
（実施態様２４）
実施態様２の方法であって、再生細胞が、長骨の骨折を修復するための骨形成を誘導することに使用される前記方法。
（実施態様２５）
実施態様２の方法であって、再生細胞が、骨および軟骨の形成を誘導することに使用される前記方法。
（実施態様２６）
実施態様２５の方法であって、再生細胞が、腱を修復することに使用される前記方法。
（実施態様２７）
実施態様２６の方法であって、腱が、腱−骨付着部位にある前記方法。
（実施態様２８）
実施態様２の方法であって、再生細胞が、骨格筋形成を誘導することに使用される前記方法。
（実施態様２９）
実施態様２８の方法であって、骨格筋形成が、骨−筋肉付着部位での腱修復のために使用される前記方法。
（実施態様３０）
実施態様２８の方法であって、骨格筋形成が、靭帯−筋肉付着部位での靭帯修復のために使用される前記方法。
（実施態様３１）
実施態様２８の方法であって、骨格筋形成が、靭帯−骨付着部位での靭帯修復のために使用される前記方法。
（実施態様３２）
実施態様２の方法であって、再生細胞が、腱の形成を誘導することに使用される前記方法。
（実施態様３３）
実施態様２の方法であって、再生細胞が、靭帯の形成を誘導することに使用される前記方法。
（実施態様３４）
実施態様４の方法であって、自動化されたシステムの収集チャンバが、該収集チャンバ内のフィルタケージに収容されたフィルタを更に含み、組織を保持し、且つ遊離脂質、血液および洗浄溶液からなる群から選択される非組織成分を濾過により取り出す前記方法。
（実施態様３５）
実施態様４の方法であって、自動化されたシステムの収集チャンバが、パドルを含む回転シャフトの撹拌を介して組織の脱凝集を促進し、前記パドルは前記回転シャフトが撹拌されるときに組織の脱凝集を促進する前記方法。
（実施態様３６）
実施態様３５の方法であって、パドルが、収集チャンバ内のフィルタケージに取り付けられている前記方法。
（実施態様３７）
実施態様３５の方法であって、回転シャフトが、磁気撹拌機を介して撹拌される前記方法。
（実施態様３８）
実施態様２の方法であって、自動化されたシステムの収集チャンバが、パドルを含む回転シャフトの撹拌を介して組織の脱凝集を促進し、前記パドルは前記回転シャフトが撹拌されるときに組織の脱凝集を促進する前記方法。
（実施態様３９）
実施態様３５の方法であって、回転シャフトが、駆動機構を介して回転される前記方法。
（実施態様４０）
実施態様４の方法であって、自動化されたシステムが、更に洗浄溶液供給源を含む前記方法。
（実施態様４１）
実施態様４０の方法であって、洗浄溶液が生理食塩水である前記方法。
（実施態様４２）
実施態様４の方法であって、自動化されたシステムが、更に脱凝集剤の供給源を含む前記方法。
（実施態様４３）
実施態様４２の方法であって、脱凝集剤が、コラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リベラ−ゼＨ１、ペプシン、およびそれらの混合物からなる群から選択される前記方法。
（実施態様４４）
実施態様５の方法であって、自動化されたシステムの処理チャンバが、脱凝集された組織を遠心分離装置で遠心分離する間、前記処理チャンバの中に存在する前記脱凝集された組織を保持するための１以上の遠心分離チャンバを含む前記方法。
（実施態様４５）
実施態様４４の方法であって、１以上の遠心分離チャンバが、脱凝集された組織を遠心分離装置で遠心分離する間、濃縮された再生細胞を集めるための１以上のアウトプットチャンバを更に含む前記方法。
（実施態様４６）
実施態様４５の方法であって、１以上のアウトプットチャンバが、遠心分離の間は異なる角度に傾けられ、濃縮された再生細胞の回収のために異なる角度に傾けられる前記方法。
（実施態様４７）
実施態様４５の方法であって、１以上のアウトプットチャンバが、濃縮された再生細胞を回収するための角度に達するように、手動で再配置できる前記方法。
（実施態様４８）
実施態様４７の方法であって、再生細胞が、シリンジを使用して取り出される前記方法。
（実施態様４９）
実施態様４の方法であって、自動化されたシステムの処理チャンバが、脱凝集された組織の滅菌状態での回収を容易にするための回転シールを含む前記方法。
（実施態様５０）
実施態様４９の方法であって、回転シールが、回転シャフト、２以上のベアリング、３以上のリップシール、外部ハウジング、円形チャンネル、および円形バネを含む前記方法。
（実施態様５１）
実施態様４９の方法であって、回転シールが、回転シャフト、単一のゴムシール、空気ガスケット、１以上のバネ負荷シール、および二つのセラミックディスクを含む前記方法。
（実施態様５２）
実施態様２の方法であって、自動化されたシステムが、更に廃棄チャンバを含む前記方法。
（実施態様５３）
実施態様５２の方法であって、廃棄チャンバが、患者から取り出された組織の非再生細胞成分を収容する前記方法。
（実施態様５４）
実施態様５３の方法であって、廃棄チャンバの中に存在する非再生細胞成分が遠心分離されて、コラーゲン、タンパク質、脂質、脂肪細胞およびマトリックス成分を含む成分が分離および濃縮される前記方法。
（実施態様５５）
実施態様５３の方法であって、廃棄チャンバの中に存在する非再生細胞成分が濾過されて、コラーゲン、タンパク質、脂質、脂肪細胞およびマトリックス成分を含む成分が分離および濃縮される前記方法。
（実施態様５６）
実施態様５の方法であって、自動化されたシステムの収集チャンバおよび処理チャンバが配管を介して連結されている前記方法。
（実施態様５７）
実施態様５６の方法であって、配管が更にセンサを含む前記方法。
（実施態様５８）
実施態様５の方法であって、自動化されたシステムの収集チャンバおよび処理チャンバが、更に、１以上の弁、ポンプ、センサ、またはそれらの組み合わせを含む前記方法。
（実施態様５９）
実施態様５６の方法であって、収集チャンバ、処理チャンバおよび配管が使い捨て可能である前記方法。
（実施態様６０）
実施態様５の方法であって、自動化されたシステムの遠心分離装置およびプロセッシング装置が再使用可能である前記方法。
（実施態様６１）
実施態様５８の方法であって、遠心分離装置が、更に、遠心分離モータ、遠心分離モータコントローラ、および遠心分離ブレーキコントローラを含む前記方法。
（実施態様６２）
実施態様５の方法であって、自動化されたシステムのプロセッシング装置が、１以上のポンプの使用を介して組織の流れを方向付けることにより、遠心分離チャンバ、処理チャンバおよび遠心分離チャンバを制御する前記方法。
（実施態様６３）
実施態様６２の方法であって、ポンプが蠕動ポンプである前記方法。
（実施態様６４）
実施態様６２の方法であって、ポンプが再使用可能である前記方法。
（実施態様６５）
実施態様２の方法であって、プロセッシング装置が、更に、ユーザが自動化されたシステムにパラメータを入力するためのユーザインターフェースを含む前記方法。
（実施態様６６）
実施態様２の方法であって、プロセッシング装置が、更に、パラメータの入力、予めプログラムされた工程の確認、エラーの警告、またはそれらの組み合わせにユーザを導く指示を表示するディスプレー画面を含む前記方法。
（実施態様６７）
実施態様２の方法であって、患者から取り出された組織の一部が再生細胞を分離および濃縮することに使用され、患者から取り出された組織の残部が取り分けておかれる前記方法。
（実施態様６８）
実施態様６７の方法であって、患者から取り出された組織の残部がサンプルチャンバの中に取り分けておかれる前記方法。
（実施態様６９）
実施態様２の方法であって、１以上の添加剤が再生細胞に添加される前記方法。
（実施態様７０）
実施態様６９のシステムであって、添加剤が、成長因子、再懸濁液、細胞培養試薬、細胞増殖試薬、細胞保存試薬、または細胞改変試薬、およびそれらの組み合わせから選択される前記方法。
（実施態様７１）
実施態様２の方法であって、再生細胞が、装置の中に配置される前に細胞培養で増殖される前記方法。
（実施態様７２）
実施態様７１の方法であって、再生細胞は、骨原性表現型への分化を促進する培養条件で増殖される前記方法。
（実施態様７３）
実施態様２の方法であって、再生細胞が、患者の中に配置される前に外科装置または外科インプラント上に配置される前記方法。
（実施態様７４）
実施態様７３の方法であって、外科装置が脊椎固定装置である前記方法。
（実施態様７５）
実施態様７３の方法であって、外科インプラントが足場である前記方法。
（実施態様７６）
実施態様７５の方法であって、足場が多孔質である前記方法。
（実施態様７７）
実施態様２の方法であって、再生細胞が、患者の中に配置される前にゲルまたはヒドロゲルの中に配置される前記方法。
（実施態様７８）
実施態様２の方法であって、更に第二のシステムを含み、該第二のシステムは第一のシステムに接続されている前記方法。
（実施態様７９）
実施態様７８の方法であって、第二のシステムが、再生細胞を培養する前記方法。
（実施態様８０）
実施態様７８の方法であって、第二のシステムが、再生細胞を遺伝子的に操作する前記方法。
（実施態様８１）
物質を再生細胞と接触させる方法であって：
（１）自動的に、第一のシステムの中に収容された組織から再生細胞を分離し、第二のシステムを使用して前記組織から前記再生細胞を濃縮することであって、前記第一および第二のシステムは、該第一および第二のシステムを使用して複数の協調した分離および濃縮の手順を自動的に実施するようにプログラム可能なコントローラの制御下で、自動的に作動させること；ならびに
（２）濃縮された再生細胞を物質と接触させて配置し、所定の効果を誘導すること；
を含む前記方法。
（実施態様８２）
実施態様８１の方法であって、物質が、骨、軟骨、骨格筋、腱および靭帯の少なくとも一つを含む前記方法。
（実施態様８３）
実施態様８２の方法であって、所定の効果が、骨、軟骨、骨格筋、腱および靭帯の少なくとも一つの誘導形成を含む前記方法。
（実施態様８４）
実施態様８３の方法であって、組織から再生細胞を分離することが、患者から取り出された組織由来の再生細胞を少なくとも部分的に脱凝集させることを含み、再生細胞を濃縮することが、前記再生細胞を遠心分離することを含む前記方法。
以下の実施例により本発明を更に例示するが、これら実施例は如何なる意味でも更なる限定として解釈されるべきではない。この出願の全体を通して引用された参照文献、発行済み特許、公開された特許出願、および同時継続特許出願を含む全ての引用文献の内容は、本明細書の一部として明示的に本願に援用される。