(57)【要約】  本発明は、ジアリールウレア化合物およびＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤を含む癌の処置用の医薬組成物および組合せに関する。有用な組合せには、例えば、ジアリールウレア化合物としてのＢＡＹ−４３−９００６が含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の式Ｉの化合物、または、その医薬的に許容し得る塩、多形、溶媒和物、水和物、代謝物、プロドラッグ、および、少なくとも１種のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤である第２の化合物を含む組合せであって、式Ｉが、
【化１】
2008545670.tif 000020
［式中、
Ｑは−Ｃ（Ｏ）Ｒｘであり、
Ｒｘは、ヒドロキシ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシまたはＮＲａＲｂであり、
ＲａおよびＲｂは、独立して：
ａ）水素；
ｂ）−ヒドロキシ、
−Ｃ１−４アルコキシ、
−ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ピラゾール、チアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、イソチアゾール、トリアゾール、テトラゾール、チアジアゾール、オキサジアゾール、ピリジン、ピリミジン、ピリダジン、ピラジン、トリアジン、ベンゾオキサゾール、イソキノリン、キノリンおよびイミダゾピリミジンから選択されるヘテロアリール基、
−テトラヒドロピラン、テトラヒドロフラン、１,３−ジオキソラン、１,４−ジオキサン、モルホリン、チオモルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ピペリジノン、テトラヒドロピリミドン、ペンタメチレンスルフィド、テトラメチレンスルフィド、ジヒドロピラン、ジヒドロフランおよびジヒドロチオフェンから選択される複素環式基、
−アミノ、−ＮＨ２（１個または２個のＣ１−４アルキル基により置換されていることもある）、または、
−フェニル
により置換されていることもあるＣ１−４アルキル、
ｃ）−ハロゲン、または、
−アミノ、−ＮＨ２（１個または２個のＣ１−４アルキルにより置換されていることもある）
で置換されていることもあるフェニル、または、
ｄ）−ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ピラゾール、チアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、イソチアゾール、トリアゾール、テトラゾール、チアジアゾール、オキサジアゾール、ピリジン、ピリミジン、ピリダジン、ピラジン、トリアジン、ベンゾオキサゾール、イソキノリン、キノリンおよびイミダゾピリミジンから選択されるヘテロアリール基；
を表し、
Ａは、式１ｘｘ
【化２】
2008545670.tif 000021
の置換されていることもあるフェニル基、
式１ｘ
【化３】
2008545670.tif 000022
の置換されていることもあるピリジニル基、
または、式１ｙ
【化４】
2008545670.tif 000023
の置換されていることもあるナフチル部分であり、
Ｂは、置換されていることもある式２ａおよび２ｂ
【化５】
2008545670.tif 000024
のフェニルまたはナフチルであり、
Ｌは、−Ｓ−または−Ｏ−の架橋基であり；
ｐは、０、１、２、３または４であり、
ｎは、０、１、２、３、４、５または６であり、
ｍは、０、１、２または３であり、
各Ｒ１は、独立して、ハロゲン、Ｃ１−５ハロアルキル、ＮＯ２、Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ジアルキルアミン、Ｃ１−３アルキルアミン、ＣＮ、アミノ、ヒドロキシまたはＣ１−３アルコキシであり、
各Ｒ２は、独立して、Ｃ１−５アルキル、Ｃ１−５ハロアルキル、Ｃ１−３アルコキシ、Ｎ−オキソまたはＮ−ヒドロキシであり、
各Ｒ３は、独立して、ハロゲン、Ｒ４、ＯＲ４、Ｓ（Ｏ）Ｒ４、Ｃ（Ｏ）Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、オキソ、シアノまたはニトロ（ＮＯ２）であり、
Ｒ４およびＲ５は、独立して、水素、Ｃ１−６アルキルまたは過ハロゲン化までのハロゲン化Ｃ１−６アルキルである］
である、組合せ。
【請求項２】
式中、
Ａが、３−ｔｅｒｔブチルフェニル、５−ｔｅｒｔブチル−２−メトキシフェニル、５−（トリフルオロメチル）−２フェニル、３−（トリフルオロメチル）−４クロロフェニル、３−（トリフルオロメチル）−４−ブロモフェニルまたは５−（トリフルオロメチル）−４−クロロ−２メトキシフェニルであり；
Ｂが、
【化６】
2008545670.tif 000025
であり、
Ｒ１が、フッ素、塩素、臭素、メチル、ＮＯ２、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、メトキシ、ＳＣＨ３、トリフルオロメチルまたはメタンスルホニルであり；
Ｒ２が、メチル、エチル、プロピル、酸素またはシアノであり、そして、
Ｒ３が、トリフルオロメチル、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、塩素、フッ素、臭素、シアノ、メトキシ、アセチル、トリフルオロメタンスルホニル、トリフルオロメトキシまたはトリフルオロメチルチオである、
請求項１に記載の組合せ。
【請求項３】
式Ｉの化合物が、下記式ＩＩ：
【化７】
2008545670.tif 000026
［式中、
ＲａおよびＲｂは、独立して水素およびＣ１−Ｃ４アルキルであり、
式ＩＩのＢは、
【化８】
2008545670.tif 000027
であり、
ここで、ウレア基（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）および酸素架橋基は、Ｂの隣接する環の炭素に結合しておらず、むしろそれらを隔てる１個または２個の環原子が存在し、
式（ＩＩ）のＡは、
【化９】
2008545670.tif 000028
であり、
ここで、変数ｎは、０、１、２、３または４であり、
Ｒ３は、トリフルオロメチル、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、塩素、フッ素、臭素、シアノ、メトキシ、アセチル、トリフルオロメタンスルホニル、トリフルオロメトキシまたはトリフルオロメチルチオである］
の化合物またはその塩、多形、溶媒和物、水和物、代謝物、プロドラッグもしくはジアステレオ異性体でもある、請求項１ないし請求項２のいずれかに記載の組合せ。
【請求項４】
式中、
各Ｒ３置換基が、塩素、トリフルオロメチル、ｔｅｒｔ−ブチルまたはメトキシであり、
式ＩＩのＡが
【化１０】
2008545670.tif 000029
であり、
そして、
式ＩＩのＢが、フェニレン、フルオロ置換フェニレンまたはジフルオロ置換フェニレンである、
請求項２に記載の組合せ。
【請求項５】
式Ｉの化合物が、下記式Ｘ：
【化１１】
2008545670.tif 000030
［式中、
フェニル環「Ｂ」は１個のハロゲン置換基を有することもあり、
Ａは、式１ｘｘ
【化１２】
2008545670.tif 000031
の置換されていることもあるフェニル基、
式１ｘ
【化１３】
2008545670.tif 000032
の置換されていることもあるピリジニル基、
または、式１ｙ
【化１４】
2008545670.tif 000033
の置換されていることもあるナフチル部分であり、
ｎは、０、１、２、３、４、５または６であり、
ｍは、０、１、２または３であり、
各Ｒ２は、独立して、Ｃ１−５アルキル、Ｃ１−５ハロアルキル、Ｃ１−３アルコキシ、Ｎ−オキソまたはＮ−ヒドロキシであり、
各Ｒ３は、独立して、ハロゲン、Ｒ４、ＯＲ４、Ｓ（Ｏ）Ｒ４、Ｃ（Ｏ）Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、オキソ、シアノまたはニトロ（ＮＯ２）であり、そして、
Ｒ４およびＲ５は、独立して、水素、Ｃ１−６アルキルまたは過ハロゲン化までのハロゲン化Ｃ１−６アルキルである］
の化合物またはその塩、多形、溶媒和物、水和物、代謝物、プロドラッグもしくはジアステレオ異性体でもある、請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の組合せ。
【請求項６】
ｍがゼロであり、Ａが少なくとも１個の置換基Ｒ３を有する置換フェニルである、請求項５に記載の組合せ。
【請求項７】
Ｒ３が、ハロゲン、トリフルオロメチルおよび／またはメトキシである、請求項６に記載の組合せ。
【請求項８】
式Ｉの化合物が、下記式Ｚ１またはＺ２：
【化１５】
2008545670.tif 000034
のいずれかの構造またはその塩、多形、溶媒和物、水和物、代謝物、プロドラッグもしくはジアステレオ異性体でもある、請求項１に記載の組合せ。
【請求項９】
式Ｉの化合物が、式Ｚ１の化合物のトシレート塩である、請求項８に記載の組合せ。
【請求項１０】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤が、ＦＴＹ７２０、ＵＣＮ−０１、セレコキシブおよびその類似体、３−デオキシ−Ｄ−ミオ−イノシトール類似体、２'−置換、３'−デオキシ−ホスファチジル−ミオ−イノシトール類似体、３−（イミダゾ［１,２−ａ］ピリジン−３−イル）誘導体、Ｌｙ２９４００２、キナゾリン−４−オン誘導体、３−（ヘテロ）アリールオキシ置換ベンゾ（ｂ）チオフェン誘導体、ビリジン類、半合成ビリジン類、Ａｋｔ−１−１、Ａｋｔ−１−１,２、ＡＰＩ−５９ＣＪ−Ｏｍｅ、１−Ｈ−イミダゾ［４,５−ｃ］ピリジニル化合物、インドール−３−カルビノールおよびその誘導体、ペリフォシン、ホスファチジルイノシトールエーテル脂質類似体、トリシリビンおよびＦＫＢＰ１２エンハンサーからなる化合物の群から選択される、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の組合せ。
【請求項１１】
セレコキシブ類似体が、ＯＳＵ−０３０１２、ＯＳＵ−０３０１３である、請求項１０に記載の組合せ。
【請求項１２】
３−デオキシ−Ｄ−ミオ−イノシトール類似体がＰＸ−３１６である、請求項１０に記載の組合せ。
【請求項１３】
キナゾリン−４−オン誘導体がＩＣ４８６０６８である、請求項１０に記載の組合せ。
【請求項１４】
半合成ビリジン類がＰＸ−８６６である、請求項１０に記載の組合せ。
【請求項１５】
該第２の化合物がＦＫＢＰ１２エンハンサーである、請求項１０に記載の組合せ。
【請求項１６】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤が、セレコキシブ、ＯＳＵ−０３０１２、ＯＳＵ−０３０１３、ＰＸ−３１６、２'−置換、３'−デオキシ−ホスファチジル−ミオ−イノシトール誘導体、３−（イミダゾ［１,２−ａ］ピリジン−３−イル）誘導体、Ｌｙ２９４００２、ＩＣ４８６０６８、３−（ヘテロ）アリールオキシ置換ベンゾ（ｂ）チオフェン誘導体、ＰＸ−８６６、ペリフォシン、トリシリビン、ＦＫＢＰ１２エンハンサー、ホスファチジルイノシトールエーテル脂質類似体、ワートマニンもしくはラパマイシンもしくはそれらの誘導体、またはそれらの医薬的に許容し得る塩である、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の組合せ。
【請求項１７】
該第２の化合物が、式Ｗ：
【化１６】
2008545670.tif 000035
のワートマニン化合物、式Ｗのワートマニン化合物の誘導体もしくは類似体、式Ｗのワートマニン化合物の医薬的に許容し得る塩、または、式Ｗのワートマニン化合物の誘導体もしくは類似体の医薬的に許容し得る塩である、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の組合せ。
【請求項１８】
該式Ｗの誘導体または類似体が、
ａ）式Ｗ１
【化１７】
2008545670.tif 000036
（式中、Ｒは、Ｈ（１１−デスアセトキシワートマニン）またはアセトキシであり、Ｒ'はＣ１−Ｃ６アルキルである）
の化合物、
ｂ）式Ｗ２
【化１８】
2008545670.tif 000037
（式中、Ｒ'はＣ１−Ｃ６アルキルである）
のΔ９,１１−デヒドロデスアセトキシワートマニン化合物、
ｃ）式Ｗ３
【化１９】
2008545670.tif 000038
（式中、Ｒは、Ｈまたはアセトキシであり、Ｒ'はＣ１−Ｃ６アルキルであり、そして、Ｒ''は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨまたは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アルキルである）
の１７（α−ジヒドロ−ワートマニン化合物、
ｄ）式Ｗ４
【化２０】
2008545670.tif 000039
（式中、Ｒ１は、Ｈ、メチルまたはエチルであり、Ｒ２はＨまたはメチルである）
のワートマニン化合物のＡ−環が開裂した酸またはエステル、または、
ｅ）式Ｗ５
【化２１】
2008545670.tif 000040
（式中、Ｒ４は＝Ｏまたは−Ｏ（ＣＯ）Ｒ６であり、Ｒ３は、＝Ｏ、−ＯＨまたは−Ｏ（ＣＯ）Ｒ６であり、各Ｒ６は、独立して、フェニル、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたは置換Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、Ｒ４が＝Ｏまたは−ＯＨである場合、Ｒ３は＝Ｏではない）
のワートマニンの１１−置換および１７−置換誘導体
から選択される、請求項１７に記載の組合せ。
【請求項１９】
該第２の化合物がＡｋｔ−キナーゼ阻害剤である、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の組合せ。
【請求項２０】
該第２の化合物が、Ａｋｔ−１−１、Ａｋｔ−１−１,２、ＡＰＩ−５９ＣＪ−Ｏｍｅ、１−Ｈ−イミダゾ［４,５−ｃ］ピリジニル誘導体、インドール−３−カルビノールおよびその誘導体、ペリフォシン、ホスファチジルイノシトールエーテル脂質類似体、トリシリビンまたはこれらの医薬的に許容し得る塩である、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の組合せ。
【請求項２１】
該第２の化合物がｍＴＯＲ阻害剤である、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の組合せ。
【請求項２２】
該第２の化合物が、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、ＡＰ２３５７３、ＡＰ２３６７５、ＡＰ２３４６４、ＡＰ２３８４１、４０−（２−ヒドロキシエチル）ラパマイシン、４０−［３−ヒドロキシ（ヒドロキシメチル）メチルプロパノエート］−ラパマイシン、４０−エピ−（テトラゾリル）−ラパマイシン、３２−デオキソラパマイシンもしくは１６−ペンチニルオキシ−３２（Ｓ）−ジヒドロラパマイシン、ＳＡＲ９４３またはそれらの医薬的に許容し得る塩である、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の組合せ。
【請求項２３】
式（Ｉ）の化合物およびワートマニンを含む、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の組合せ。
【請求項２４】
式（Ｉ）の化合物およびラパマイシンを含む、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の組合せ。
【請求項２５】
該第２の化合物がＰＩ３−キナーゼ阻害剤である、請求項１に記載の組合せ。
【請求項２６】
該第２の化合物が、セレコキシブ、ＯＳＵ−０３０１２、ＯＳＵ−０３０１３、ＰＸ−３１６、２'−置換３'−デオキシ−ホスファチジル−ミオ−イノシトール誘導体、３−（イミダゾ［１,２−ａ］ピリジン−３−イル）誘導体、Ｌｙ２９４００２、ＩＣ４８６０６８、３−（ヘテロ）アリールオキシ置換ベンゾ（ｂ）チオフェン誘導体、ＰＸ−８６６またはそれらの医薬的に許容し得る塩である、請求項１に記載の組合せ。
【請求項２７】
該組合せの有効成分の量が相乗的である、請求項１ないし請求項２６のいずれかに記載の組合せ。
【請求項２８】
癌を処置するための請求項１ないし請求項２７のいずれかに記載の組合せ。
【請求項２９】
該癌が、黒色腫、肝細胞癌、腎細胞癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌、乳癌または膵臓癌である、請求項２８に記載の組合せ。
【請求項３０】
癌の処置を必要としている対象における癌の処置方法であって、有効量の少なくとも１種の式Ｉの化合物またはその医薬的に許容し得る塩、多形、溶媒和物、水和物、代謝物、プロドラッグもしくはジアステレオ異性体および少なくとも１種の請求項１ないし請求項２６のいずれかに記載の第２の化合物を投与することを含み、該式Ｉの化合物が、
【化２２】
2008545670.tif 000041
［式中、
Ｑは−Ｃ（Ｏ）Ｒｘであり、
Ｒｘは、ヒドロキシ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシまたはＮＲａＲｂであり、
ＲａおよびＲｂは、独立して：
ａ）水素；
ｂ）−ヒドロキシ、
−Ｃ１−４アルコキシ、
−ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ピラゾール、チアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、イソチアゾール、トリアゾール、テトラゾール、チアジアゾール、オキサジアゾール、ピリジン、ピリミジン、ピリダジン、ピラジン、トリアジン、ベンゾオキサゾール、イソキノリン、キノリンおよびイミダゾピリミジンから選択されるヘテロアリール基、
−テトラヒドロピラン、テトラヒドロフラン、１,３−ジオキソラン、１,４−ジオキサン、モルホリン、チオモルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ピペリジノン、テトラヒドロピリミドン、ペンタメチレンスルフィド、テトラメチレンスルフィド、ジヒドロピラン、ジヒドロフランおよびジヒドロチオフェンから選択される複素環式基、
−アミノ、−ＮＨ２（１個または２個のＣ１−４アルキル基により置換されていることもある）、または、
−フェニル
により置換されていることもあるＣ１−４アルキル、
ｃ）−ハロゲン、または、
−アミノ、−ＮＨ２（１個または２個のＣ１−４アルキルにより置換されていることもある）
で置換されていることもあるフェニル、または、
ｄ）−ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ピラゾール、チアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、イソチアゾール、トリアゾール、テトラゾール、チアジアゾール、オキサジアゾール、ピリジン、ピリミジン、ピリダジン、ピラジン、トリアジン、ベンゾオキサゾール、イソキノリン、キノリンおよびイミダゾピリミジンから選択されるヘテロアリール基；
を表し、
Ａは、式１ｘｘ
【化２３】
2008545670.tif 000042
の置換されていることもあるフェニル基、
式１ｘ
【化２４】
2008545670.tif 000043
の置換されていることもあるピリジニル基、
または、式１ｙ
【化２５】
2008545670.tif 000044
の置換されていることもあるナフチル部分であり、
Ｂは、置換されていることもある式２ａおよび２ｂ
【化２６】
2008545670.tif 000045
のフェニルまたはナフチルであり、
Ｌは、−Ｓ−または−Ｏ−の架橋基であり；
ｐは、０、１、２、３または４であり、
ｎは、０、１、２、３、４、５または６であり、
ｍは、０、１、２または３であり、
各Ｒ１は、独立して、ハロゲン、Ｃ１−５ハロアルキル、ＮＯ２、Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ジアルキルアミン、Ｃ１−３アルキルアミン、ＣＮ、アミノ、ヒドロキシまたはＣ１−３アルコキシであり、
各Ｒ２は、独立して、Ｃ１−５アルキル、Ｃ１−５ハロアルキル、Ｃ１−３アルコキシ、Ｎ−オキソまたはＮ−ヒドロキシであり、
各Ｒ３は、独立して、ハロゲン、Ｒ４、ＯＲ４、Ｓ（Ｏ）Ｒ４、Ｃ（Ｏ）Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、オキソ、シアノまたはニトロ（ＮＯ２）であり、そして、
Ｒ４およびＲ５は、独立して、水素、Ｃ１−６アルキルまたは過ハロゲン化までのハロゲン化Ｃ１−６アルキルである］
である、処置方法。
【請求項３１】
癌を処置するための請求項１ないし請求項２６のいずれかに記載の組合せの製造方法。
【請求項３２】
該癌が、黒色腫、肝細胞癌、腎細胞癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌、乳癌または膵臓癌である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１ないし請求項２９のいずれかに記載の組合せを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
ＢＡＹ４３−９００６は、４｛４−［３−（４−クロロ−３−トリフルオロメチルフェニル）−ウレイド］−フェノキシ｝−ピリジン−２−カルボン酸メチルアミドを表し、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ｒａｆ、ｐ３８および／またはｆｌｔ−３キナーゼシグナル伝達分子に対する阻害活性を含む様々な活性を有する強力な抗癌および抗血管新生剤である、ジアリールウレア化合物の種である。例えば、ＵＳ２００５００３８０８０参照。ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路は、細胞増殖、分化および形質変換に関与し、多くの癌に関係づけられている。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路は、細胞の別の重要な生理的経路である。それは、増殖因子、サイトカイン、細胞−細胞接着および細胞−細胞外マトリックスを含む、細胞外の刺激を媒介する（Vivanco and Sawyers, Nat Rev Cancer, 2: 489-501, 2002, Downward, Curr Opin Cell Biol, 10: 262-267, 1998)。ＡＫＴ経路は、多くのタイプのヒトの癌において活性であるように思われる (Nicholson and Anderson, Cell Signal, 14: 381-395, 2002）。
【発明の開示】
【０００２】
図面の簡単な説明
図１（Ａ−Ｂ）．ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路の遮断と対照的に、ＡＫＴシグナル伝達経路の遮断は、単層培養の黒色腫細胞の増殖に影響を与えない。対照４５１Ｌｕ転移性黒色腫細胞および２−２０μＭの範囲の用量のＰＩ３Ｋ阻害剤ワートマニンで処理した４５１Ｌｕ転移性黒色腫細胞からの単層培養を各々比較すると（Ａ）、増殖している細胞の数に対して有意な効果は見られなかった。対照的に、１−７μＭの範囲の用量のＢＡＹ４３−９００６による４５１Ｌｕ黒色腫細胞の処理（Ｂ）は、細胞増殖の有意な低下をもたらした。平均値で与えられる蛍光の強度は、ウェル中の生きている細胞の数を示す。
【０００３】
図２（Ａ−Ｂ）．ＡＫＴまたはＭＡＰＫシグナル伝達経路の遮断は、単層の４５１Ｌｕ黒色腫細胞の接着分子ＭｅｌＣＡＭおよびａｖβ３インテグリンの発現を各々下方調節する。４５１Ｌｕ転移性黒色腫細胞の単層培養を、媒体のみ、４μＭワートマニン、６μＭ ＢＡＹ４３−９００６または４μＭワートマニンと６μＭ ＢＡＹ４３−９００６の組合せで９６時間処理し、ａｖ.β３またはＭｅｌＣＡＭに対する抗体で染色し、フローサイトメトリーに付した。単独またはＢＡＹ４３−９００６との組合せにおけるワートマニンは、ＭｅｌＣＡＭの細胞表面発現を下方調節する（Ａ）。ａｖβ３インテグリンの細胞表面発現は、単独またはワートマニンとの組合せにおけるＢＡＹ４３−９００６により下方調節されるが、ワートマニン単独によってはされない（Ｂ）。
【０００４】
図３（Ａ−Ｄ）．ＭＡＰＫシグナル伝達経路の遮断は器官型培養において増殖を阻害するが、ＡＫＴの遮断は阻害しない。皮膚再構築物に導入されたＳｋｍｅｌ２８転移性黒色腫細胞を、培養培地、または、対照としてのＤＭＳＯ、４μＭ ＰＩ３Ｋ阻害剤ワートマニン、６μＭ ＲＡＦキナーゼ阻害剤ＢＡＹ４３−９００６もしくは４μＭワートマニンおよび６μＭ ＢＡＹ４３−９００６の組合せを添加した培養培地で処理し、Ｋｉ−６７増殖マーカーについて染色した（Ｋｉ−６７：赤色、ｘ１００）。対照の転移性黒色腫細胞の大部分は、Ｋｉ−６７増殖マーカーで染まった（Ａ）。ＰＩ３Ｋ阻害剤ワートマニン単独による処理は、増殖速度に対して殆どまたは全く効果がなかった（Ｂ）。ＢＡＹ４３−９００６による処理は、細胞増殖の有意な減少をもたらした（Ｃ）。組合せた阻害剤による処理後、増殖している細胞は全く検出されなかった（Ｄ）。
【０００５】
図４（Ａ−Ｄ）．ＡＫＴおよびＭＡＰＫシグナル伝達経路の遮断はアポトーシスを誘導する。ＰＩ３Ｋ阻害剤ワートマニンおよび／またはＢＡＹ４３−９００６の生理的状況の黒色腫細胞に対するアポトーシス促進効果を調べるために、対照および阻害剤処理Ｓｋｍｅｌ２８転移性黒色腫再構築物を、活性カスパーゼ３について染色した（活性カスパーゼ３：赤色、ｘ５０）。皮膚再構築物に導入された対照Ｓｋｍｅｌ２８転移性黒色腫細胞の殆どは、活性カスパーゼ３について陰性であった（Ａ）。ＰＩ３Ｋ阻害剤ワートマニン（Ｂ）またはＲＡＦキナーゼ阻害剤ＢＡＹ４３−９００６（Ｃ）または両方（Ｄ）の適用後、活性カスパーゼ３はヒト皮膚再構築物中のＳｋｍｅｌ２８転移性黒色腫細胞の大部分に見られた。
【０００６】
図５（Ａ−Ｈ）．ＡＫＴおよびＭＡＰＫシグナル伝達経路の遮断は、各々、接着分子ＭｅｌＣＡＭおよびβ３インテグリンの発現を下方調節する。転移性黒色腫再構築物を、４μＭ ＰＩ３Ｋ阻害剤ワートマニンまたは６μＭ ＢＡＹ４３−９００６または４μＭワートマニンと６μＭ ＢＡＹ４３−９００６の組合せで処理し、接着分子ＭｅｌＣＡＭおよびβ３インテグリンについて、各々染色した（ＭｅｌＣＡＭ：赤色、ｘ１００；β３インテグリン：赤色、ｘ５０）。皮膚再構築物に導入された対照の転移性黒色腫細胞は、接着分子ＭｅｌＣＡＭ（Ａ）およびβ３インテグリン（Ｅ）を強く発現した。ワートマニンによるＡＫＴシグナル伝達経路の遮断は、ＭｅｌＣＡＭの発現を下方調節したが（Ｂ）、ＢＡＹ４３−９００６によるＭＡＰＫシグナル伝達経路の阻害は、ＭｅｌＣＡＭ発現に影響を与えたように見えず（Ｃ）、このことは、両阻害剤の組合せで観察された効果（Ｄ）は、主にＡＫＴ経路の遮断によるものであることを示唆する。β３インテグリンの発現は、ワートマニン処置によって変化せず（Ｆ）、一方、単独（Ｇ）またはワートマニンとの組合せにおけるＢＡＹ４３−９００６の適用は、実質的にβ３インテグリンの発現を低下させた（Ｈ）。
【０００７】
図６（Ａ−Ｄ）．ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ（ＡＫＴ）およびＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路の遮断は、ヒト皮膚再構築物において浸潤性黒色腫の成長を阻害する。Ｓｋｍｅｌ２８転移性黒色腫細胞を、ヒト皮膚再構築物に導入し、培養培地、または、対照としてのＤＭＳＯ、４μＭ ＰＩ３Ｋ阻害剤ワートマニン、６μＭ ＢＡＹ４３−９００６もしくは４μＭワートマニンおよび６μＭ ＢＡＹ４３−９００６の組合せを添加した培養培地で処理し、ヘマトキシリンで染色した（ＨＥ、ｘ１００）。（Ａ）対照のＳｋｍｅｌ２８転移性黒色腫細胞は多数の腫瘍細胞巣の攻撃的成長を示し、腫瘍細胞は真皮全体にわたり密集している。（Ｂ）ワートマニン処理後、黒色腫細胞巣の数およびサイズは低減され、黒色腫細胞の接着は減少し、黒色腫細胞の形態は、多樹状表現型を示す黒色腫細胞に変化した。（Ｃ）ＢＡＹ４３−９００６も黒色腫細胞巣の数およびサイズを低減させ、小さい黒色腫細胞巣および単独の黒色腫細胞が真皮中に散在した。（Ｄ）ＢＡＹ４３−９００６と組み合わせたワートマニンは、浸潤性黒色腫の成長を完全に排除し、ごく少数の丸い黒色腫細胞が真皮に残った。
【０００８】
発明の説明
本発明は、細胞増殖性障害（癌など）、炎症、免疫調節性障害および異常または望ましくない血管新生に伴う症状が含まれるがこれらに限定されない疾患および症状を処置するための薬物の組合せ、組成物および方法を提供する。薬物の組合せは、少なくとも１種の式Ｉの化合物および少なくとも１種のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路の阻害剤である第２の化合物を含む。その方法は、例えば、下記のジアリールウレア化合物およびＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤、医薬的に許容し得るそれらの塩およびそれらの誘導体などを投与することを含み得る。
【０００９】
ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）およびＡＫＴ（タンパク質キナーゼＢ）シグナル伝達経路は、細胞の生存、細胞の増殖、細胞の成長および細胞の運動を含む、様々な生物学的過程を調節する。ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達の異常は、細胞増殖性障害（癌など）、炎症および免疫調節性障害を含む数々の疾患および症状の発病に寄与する。
【００１０】
多くの増殖および生存因子は、ＰＩ３Ｋファミリーの構成員を活性化して、１種の脂質シグナル伝達分子ＰＩＰ２を別のＰＩ（３,４,５）Ｐ３に特異的に変換する。リン酸化された生成物は、Ａｋｔファミリーの構成員を内側の細胞膜にリクルートし、それらのタンパク質キナーゼ活性を刺激する。今日までに、いくつかの生物学的過程に関与する多くのＡｋｔエフェクターが同定された。例えば、Ａｋｔキナーゼは、アポトーシス機構の成分のリン酸化および不活性化を介して、細胞の生存を媒介する。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路には、このシグナル伝達カスケードに関与するいかなる構成員または成分も含まれる。これらには、例えば、ＰＩ３−キナーゼ、Ａｋｔ−キナーゼ、ＦＫＢＰ１２、ｍＴＯＲ（哺乳類のラパマイシンの標的；ＦＲＡＰ、ＲＡＦＴ１またはＲＡＰＴ１としても知られている）、ＲＡＰＴＯＲ（ｍＴＯＲの調節関連タンパク質）、ＴＳＣ（結節性硬化症複合体）、ＰＴＥＮ（ホスファターゼ・テンシン・ホモログ）およびそれらの下流のエフェクターが含まれるが、これらに限定されない。本発明の組合せは、上述の活性のいずれに関連するいずれの症状および／または疾患を処置および／または予防するためにも使用できる。
【００１１】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路の阻害剤は、上述のシグナル伝達カスケードの１種またはそれ以上の構成員を阻害する化合物である。そのような化合物は、経路阻害剤と呼んでもよいが、作用メカニズムまたはどのようにして治療効果が達成されるかに拘わらず、本発明は、言及される疾患または症状のいずれかを処置するためのこれらの阻害剤の使用を含む。実際に、そのような化合物は１種以上の標的を有し得ると認識されており、ある化合物について最初に認識された活性は、対象に投与されたときにそれがインビボで有する活性またはその治療効力を達成する活性ではないことがある。従って、経路またはタンパク質標的（例えばＡｋｔまたはｍＴＯＲ）阻害剤としての化合物の説明は、化合物がそのような活性を有することを示すが、治療または予防剤として使用したときに化合物がその活性を有するとは決して限定しない。
【００１２】
ＡＫＴファミリーの構成員の例には、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２（一般的に腫瘍において過剰発現される; Bellacosa et al., Int. J. Cancer, 64:280-285, 1995）およびＡｋｔ３が含まれる。
【００１３】
ＰＩ３Ｋファミリーの構成員の例には、ｐ１１０−アルファ、ｐ１１０−ベータ、ｐ１１０−デルタおよびｐ１１０−ガンマ（触媒性）が含まれる。
【００１４】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤の例には、例えば、ＦＴＹ７２０（例えば、Lee et al., Carcinogenesis, 25(12):2397-2405, 2004）、ＵＣＮ−０１（例えば、Amornphimoltham et al., Clin Cancer Res., 10(12 Pt 1):4029-37, 2004）が含まれるが、これらに限定されない；
【００１５】
ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）阻害剤の例には、例えば、セレコキシブ並びにＯＳＵ−０３０１２およびＯＳＵ−０３０１３などのその類似体（例えば、Zhu et al., Cancer Res., 64(12): 4309-18, 2004）；
ＰＸ−３１６などの３−デオキシ−Ｄ−ミオ−イノシトール類似体（例えば、米国出願番号２００４０１９２７７０；Meuillet et al., Oncol. Res., 14:513-27, 2004);
２'−置換３'−デオキシ−ホスファチジル−ミオ−イノシトール類似体（例えば、Tabellini et al., Br. J. Haematol., 126(4): 574-82, 2004)；
縮合ヘテロアリール誘導体（米国特許第６,６０８,０５６号）；
３−（イミダゾ［１,２−ａ］ピリジン−３−イル）誘導体（例えば、米国特許第６,４０３,５８８号および第６,６５３,３２０号）；
Ｌｙ２９４００２（例えば、Vlahos, et al., J. Biol., Chem., 269(7) 5241-5248, 1994)；
ＩＣ４８６０６８などのキナゾリン−４−オン誘導体（例えば、米国出願番号２００２０１６１０１４；Geng et al., Cancer Res., 64:4893-99, 2004)；
３−（ヘテロ）アリールオキシ置換ベンゾ（ｂ）チオフェン誘導体（例えば、ＷＯ０４１０８７１５；また、ＷＯ０４１０８７１３）；
ＰＸ−８６６（酢酸（１Ｓ,４Ｅ,１０Ｒ,１１Ｒ,１３Ｓ,１４Ｒ）−［４−ジアリールアミノメチレン−６−ヒドロキシ−１−メトキシメチル−１０,１３−ジメチル−３,７,１７−トリオキソ−１,３,４,７,１０,１１,１２,１３,１４,１５,１６,１７−ドデカヒドロ−２−オキサ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１１−イルエステル）などの半合成ビリジン（viridin）類を含むビリジン類（例えば、Ihle et al., Mol Cancer Ther., 3(7):763-72, 2004；米国出願番号２００２００３７２７６；米国特許第５,７２６,１６７号）；および
ワートマニンおよびその誘導体（例えば、米国特許第５,５０４,１０３号；第５,４８０,９０６号、第５,４６８,７７３号；第５,４４１,９４７号；第５,３７８,７２５号；第３,６６８,２２２号）
が含まれるが、これらに限定されない。
【００１６】
Ａｋｔ−キナーゼ（タンパク質キナーゼＢとしても知られている）阻害剤の例には、例えば、Ａｋｔ−１−１（Ａｋｔ１を阻害する）（Barnett et al., Biochem. J., 385 (Pt.2):399-408, 2005）、Ａｋｔ−１−１,２（Ａｋ１および２を阻害する）（Barnett et al., Biochem. J., 385 (Pt.2):399-408, 2005）、ＡＰＩ−５９ＣＪ−Ｏｍｅ（例えば、Jin et al., Br. J. Cancer., 91:1808-12, 2004）、１−Ｈ−イミダゾ［４,５−ｃ］ピリジニル化合物（例えば、ＷＯ０５０１１７００）、インドール−３−カルビノールおよびその誘導体（例えば、米国特許第６,６５６,９６３号；Sarkar and Li, J Nutr., 134(12 Suppl):3493S-3498S, 2004）、ペリフォシン（perifosine）（例えば、Ａｋｔの膜局在を妨害する；Dasmahapatra et al., Clin. Cancer Res., 10(15):5242-52, 2004)、ホスファチジルイノシトールエーテル脂質類似体（例えば、Gills and Dennis, Expert. Opin. Investig. Drugs, 13:787-97, 2004）、トリシリビン（triciribine）（ＴＣＮまたはＡＰＩ−２またはＮＣＩ識別物質（identifier）：ＮＳＣ１５４０２０；Yang et al., Cancer Res., 64:4394-9, 2004）が含まれるが、これらに限定されない。
【００１７】
ｍＴＯＲ阻害剤の例には、例えば、以下のものが含まれるが、これらに限定されない；
ＦＫＢＰ１２エンハンサー、
ＣＣＩ−７７９（テムシロリムス）、ＲＡＤ００１（エベロリムス；ＷＯ９４０９０１０）、ＴＡＦＡ９３およびＡＰ２３５７３；ラパログ（rapalog）類、例えば、ＷＯ９８／０２４４１およびＷＯ０１／１４３８７に開示のもの、例えばＡＰ２３５７３、ＡＰ２３４６４、ＡＰ２３６７５またはＡＰ２３８４１；４０−（２−ヒドロキシエチル）ラパマイシン、４０−［３−ヒドロキシ（ヒドロキシメチル）メチルプロパノエート］−ラパマイシン（ＣＣ１７７９とも呼ばれる）、４０−エピ−（テトラゾリル）−ラパマイシン（ＡＢＴ５７８とも呼ばれる）、３２−デオキソラパマイシン、１６−ペンチニルオキシ−３２（Ｓ）−ジヒドロラパマイシンおよびＷＯ０５００５４３４に開示の他の誘導体；ＵＳＰ５,２５８,３８９、ＷＯ９４／０９０１０１、ＷＯ９２／０５１７９、ＵＳＰ５,１１８,６７７、ＵＳＰ５,１１８,６７８、ＵＳＰ５,１００,８８３、ＵＳＰ５,１５１,４１３、ＵＳＰ５,１２０,８４２、ＷＯ９３／１１１１３０、ＷＯ９４／０２１３６、ＷＯ９４／０２４８５、ＷＯ９５／１４０２３、ＷＯ９４／０２１３６、ＷＯ９５／１６６９１（例えばＳＡＲ９４３）、ＥＰ５０９７９５、ＷＯ９６／４１８０７、ＷＯ９６／４１８０７およびＵＳＰ５,２５６,７９０に開示の誘導体を含むラパマイシン類およびそれらの誘導体；
リン含有ラパマイシン誘導体（例えば、ＷＯ０５０１６２５２）；
４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン誘導体（例えば、米国仮出願番号６０／５２８,３４０）。
【００１８】
関心のあるホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）阻害剤の例は、ワートマニンおよびその誘導体またはその類似体並びにワートマニンおよびその誘導体および類似体の医薬的に許容し得る塩である。従って、本発明の方法には、式Ｗ：
【化１】
2008545670.tif 000002
のＰＩ３−キナーゼ阻害剤、式Ｗの化合物の誘導体または類似体、式Ｗの化合物の医薬的に許容し得る塩、および、式Ｗの化合物の誘導体または類似体の医薬的に許容し得る塩の使用が含まれる。
【００１９】
本明細書では、ワートマニンまたは「式Ｗ」の化合物の誘導体および類似体への言及には、米国特許第５,５０４,１０３号；第５,４８０,９０６号、第５,４６８,７７３号；第５,４４１,９４７号；第５,３７８,７２５号；第３,６６８,２２２号で同定される誘導体および類似体が含まれると企図する。適する式Ｗの化合物の誘導体および類似体には以下のものが含まれる：
ａ）式Ｗ１
【化２】
2008545670.tif 000003
（ここで、Ｒは、Ｈ（１１−デスアセトキシワートマニン）またはアセトキシであり、Ｒ'はＣ１−Ｃ６アルキルである）
の化合物、
【００２０】
ｂ）式Ｗ２
【化３】
2008545670.tif 000004
（ここで、Ｒ'はＣ１−Ｃ６アルキルである）
のΔ９,１１−デヒドロデスアセトキシワートマニン化合物、
【００２１】
ｃ）式Ｗ３
【化４】
2008545670.tif 000005
（ここで、Ｒは、Ｈまたはアセトキシであり、Ｒ'はＣ１−Ｃ６アルキルであり、そして、Ｒ''は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨまたは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アルキルである）
の１７（α−ジヒドロ−ワートマニン化合物、
【００２２】
ｄ）式Ｗ４
【化５】
2008545670.tif 000006
（ここで、Ｒ１は、Ｈ、メチルまたはエチルであり、Ｒ２はＨまたはメチルである）
のワートマニン化合物のＡ−環が開裂した酸またはエステル、または、
【００２３】
ｅ）式Ｗ５
【化６】
2008545670.tif 000007
（ここで、Ｒ４は＝Ｏまたは−Ｏ（ＣＯ）Ｒ６であり、Ｒ３は、＝Ｏ、−ＯＨまたは−Ｏ（ＣＯ）Ｒ６であり、各Ｒ６は、独立して、フェニル、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたは置換Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、ここで、Ｒ４が＝Ｏまたは−ＯＨである場合、Ｒ３は＝Ｏではない）のワートマニンの１１−置換および１７−置換誘導体。
【００２４】
好ましいのは、セレコキシブ、ＯＳＵ−０３０１２、ＯＳＵ−０３０１３、ＰＸ−３１６、２'−置換３'−デオキシ−ホスファチジル−ミオ−イノシトール誘導体、３−（イミダゾ［１,２−ａ］ピリジン−３−イル）誘導体、Ｌｙ２９４００２、ＩＣ４８６０６８、３−（ヘテロ）アリールオキシ置換ベンゾ（ｂ）チオフェン誘導体、ＰＸ−８６６またはこれらの医薬的に許容し得る塩から選択されるＰＩ３Ｋ阻害剤である。ＦＫＢＰ１２エンハンサーとしてのｍＴＯＲ阻害剤および／またはその医薬的に許容し得る塩も好ましい。
【００２５】
Ａｋｔ−１−１、Ａｋｔ−１−１,２、ＡＰＩ−５９ＣＪ−Ｏｍｅ、１−Ｈ−イミダゾ［４,５−ｃ］ピリジニル誘導体、インドール−３−カルビノールおよびそれらの誘導体、ペリフォシン、ホスファチジルイノシトールエーテル脂質類似体、トリシリビンまたはこれらの医薬的に許容し得る塩から選択されるＡｋｔ−キナーゼ阻害剤も好ましい。
【００２６】
ＣＣＩ−７７９（テムシロリムス）、ＲＡＤ００１（エベロリムス；ＷＯ９４０９０１０）、ＴＡＦＡ９３およびＡＰ２３５７３；ラパログ類、例えばＷＯ９８／０２４４１およびＷＯ０１／１４３８７に開示のもの、例えばＡＰ２３５７３、ＡＰ２３４６４、ＡＰ２３６７５またはＡＰ２３８４１；４０−（２−ヒドロキシエチル）ラパマイシン、４０−［３−ヒドロキシ（ヒドロキシメチル）メチルプロパノエート］−ラパマイシン（ＣＣ１７７９とも呼ばれる）、４０−エピ−（テトラゾリル）−ラパマイシン（ＡＢＴ５７８とも呼ばれる）、３２−デオキソラパマイシン、１６−ペンチニルオキシ−３２（Ｓ）−ジヒドロラパマイシン、およびＷＯ０５００５４３４に開示の他の誘導体；ＵＳＰ５,２５８,３８９、ＷＯ９４／０９０１０１、ＷＯ９２／０５１７９、ＵＳＰ５,１１８,６７７、ＵＳＰ５,１１８,６７８、ＵＳＰ５,１００,８８３、ＵＳＰ５,１５１,４１３、ＵＳＰ５,１２０,８４２、ＷＯ９３／１１１１３０、ＷＯ９４／０２１３６、ＷＯ９４／０２４８５、ＷＯ９５／１４０２３、ＷＯ９４／０２１３６、ＷＯ９５／１６６９１（例えばＳＡＲ９４３）、ＥＰ５０９７９５、ＷＯ９６／４１８０７、ＷＯ９６／４１８０７およびＵＳＰ５,２５６,７９０に開示の誘導体を含むラパマイシン類およびそれらの誘導体も好ましい。
【００２７】
式（Ｉ）の構造を有する化合物、それらの医薬的に許容し得る塩、多形、溶媒和物、水和物、代謝物およびプロドラッグは、ジアステレオ異性体（単離された立体異性体および立体異性体の混合物の両方）を含めて、本明細書では集合的に「式Ｉの化合物」と呼ばれる。
【００２８】
式（Ｉ）は、以下の通りである：
【化７】
2008545670.tif 000008
［式中、
Ｑは−Ｃ（Ｏ）Ｒｘであり、
Ｒｘは、ヒドロキシ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシまたはＮＲａＲｂであり、
ＲａおよびＲｂは、独立して：
ａ）水素；
ｂ）−ヒドロキシ、
−Ｃ１−４アルコキシ、
−ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ピラゾール、チアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、イソチアゾール、トリアゾール、テトラゾール、チアジアゾール、オキサジアゾール、ピリジン、ピリミジン、ピリダジン、ピラジン、トリアジン、ベンゾオキサゾール、イソキノリン、キノリンおよびイミダゾピリミジンから選択されるヘテロアリール基、
−テトラヒドロピラン、テトラヒドロフラン、１,３−ジオキソラン、１,４−ジオキサン、モルホリン、チオモルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ピペリジノン、テトラヒドロピリミドン、ペンタメチレンスルフィド、テトラメチレンスルフィド、ジヒドロピラン、ジヒドロフランおよびジヒドロチオフェンから選択される複素環式基、
−アミノ、−ＮＨ２（１個または２個のＣ１−４アルキル基により置換されていることもある）、または、
−フェニル
により置換されていることもあるＣ１−４アルキル、
ｃ）−ハロゲン、または、
−アミノ、−ＮＨ２（１個または２個のＣ１−４アルキルにより置換されていることもある）
で置換されていることもあるフェニル、または、
ｄ）−ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ピラゾール、チアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、イソチアゾール、トリアゾール、テトラゾール、チアジアゾール、オキサジアゾール、ピリジン、ピリミジン、ピリダジン、ピラジン、トリアジン、ベンゾオキサゾール、イソキノリン、キノリンおよびイミダゾピリミジンから選択されるヘテロアリール基
を表し、
Ａは、置換されていることもあるフェニル、ピリジニル、ナフチル、ベンゾオキサゾール、イソキノリン、キノリンまたはイミダゾピリミジンであり；
Ｂは、置換されていることもあるフェニルまたはナフチルであり：
Ｌは、−Ｓ−または−Ｏ−の架橋基であり；
Ｍは、０、１、２または３であり、そして、
各Ｒ２は、独立して、Ｃ１−５アルキル、Ｃ１−５ハロアルキル、Ｃ１−３アルコキシ、Ｎ−オキソまたはＮ−ヒドロキシである］。
【００２９】
特に関心のある式（Ｉ）のＡについて、置換されていることもあるフェニル部分の構造は、式１ｘｘの構造を含む：
【化８】
2008545670.tif 000009
【００３０】
特に関心のある式（Ｉ）のＡについて、置換されていることもあるピリジニル部分の構造は、式１ｘの構造を含む：
【化９】
2008545670.tif 000010
【００３１】
特に関心のある式（Ｉ）のＡについて、置換されていることもあるナフチル部分の構造は、式１ｙの構造を含む：
【化１０】
2008545670.tif 000011
【００３２】
構造１ｙは、置換基Ｒ３が、そうでなければ置換基としての水素原子で完結する原子価を有するいずれの環のいずれの炭素原子にあってもよいことを表す。ウレア基への結合も、そうでなければ置換基としての水素原子で完結する原子価を有するいずれの環のいずれの炭素原子を介するものであってもよい。
【００３３】
Ｂは、置換されていることもあるフェニルまたはナフチルである。特に関心のある式（Ｉ）のＢについて、置換されていることもあるフェニルまたはナフチル部分の構造は、構造２ａおよび２ｂを含む：
【化１１】
2008545670.tif 000012
【００３４】
構造２ａおよび２ｂは、置換基Ｒ１がそうでなければ置換基としての水素原子で完結する原子価を有する構造中の任意の炭素原子にあってよいこと、および、ウレア基への結合も、そうでなければ置換基としての水素原子で完結する原子価を有する構造中の任意の炭素原子を介するものであってもよいことを表す。
【００３５】
本発明のある実施態様のクラスでは、Ｂは、少なくとも１個のハロゲン置換基により置換されている。他の実施態様のクラスでは、ＲｘはＮＲａＲｂであり、ＲａおよびＲｂは独立して水素またはヒドロキシにより置換されていることもあるＣ１−４アルキルであり、Ｌは−Ｓ−または−Ｏ−の架橋基である。
【００３６】
変数ｐは、０、１、２、３または４、典型的には０または１である。変数ｎは、０、１、２、３、４、５または６、典型的には０、１、２、３または４である。変数ｍは、０、１、２または３、典型的には０である。
【００３７】
各Ｒ１は、独立して、ハロゲン、Ｃ１−５ハロアルキル、ＮＯ２、Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ジアルキルアミン、Ｃ１−３アルキルアミン、ＣＮ、アミノ、ヒドロキシまたはＣ１−３アルコキシである。存在する場合、Ｒ１は、より一般的にはハロゲンであり、ハロゲンの中でも、典型的には塩素またはフッ素、より一般的にはフッ素である。
【００３８】
各Ｒ２は、独立して、Ｃ１−５アルキル、Ｃ１−５ハロアルキル、Ｃ１−３アルコキシ、Ｎ−オキソまたはＮ−ヒドロキシである。存在する場合、Ｒ２は、典型的にはメチルまたはトリフルオロメチルである。
【００３９】
各Ｒ３は、ハロゲン、Ｒ４、ＯＲ４、Ｓ（Ｏ）Ｒ４、Ｃ（Ｏ）Ｒ４、Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５、オキソ、シアノまたはニトロ（ＮＯ２）から独立して選択される。
【００４０】
Ｒ４およびＲ５は、水素、Ｃ１−６アルキルおよび過ハロゲン化までのハロゲン化Ｃ１−６アルキルから独立して選択される。
【００４１】
Ａの他の例には、３−ｔｅｒｔブチルフェニル、５−ｔｅｒｔブチル−２−メトキシフェニル、５−（トリフルオロメチル）−２フェニル、３−（トリフルオロメチル）−４クロロフェニル、３−（トリフルオロメチル）−４−ブロモフェニルおよび５−（トリフルオロメチル）−４−クロロ−２メトキシフェニルが含まれる。
【００４２】
Ｂの他の例には、
【化１２】
2008545670.tif 000013
が含まれる。
【００４３】
好ましくは、ウレア基−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−および架橋基Ｌは、Ｂの隣接する環の炭素に結合しておらず、むしろそれらを隔てる１個または２個の環原子が存在する。
【００４４】
Ｒ１基の例には、フッ素、塩素、臭素、メチル、ＮＯ２、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、メトキシ、ＳＣＨ３、トリフルオロメチルおよびメタンスルホニルが含まれる。
Ｒ２基の例には、メチル、エチル、プロピル、酸素およびシアノが含まれる。
【００４５】
Ｒ３基の例には、トリフルオロメチル、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、塩素、フッ素、臭素、シアノ、メトキシ、アセチル、トリフルオロメタンスルホニル、トリフルオロメトキシおよびトリフルオロメチルチオが含まれる。
【００４６】
関心のある化合物のクラスは、下記式ＩＩのものである；
【化１３】
2008545670.tif 000014
［式中、
ＲａおよびＲｂは、独立して水素およびＣ１−Ｃ４アルキルであり、
式ＩＩのＢは、
【化１４】
2008545670.tif 000015
（式中、ウレア基−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−および酸素架橋基は、Ｂの隣接する環の炭素に結合しておらず、むしろそれらを隔てる１個または２個の環原子が存在する）
であり、
式（ＩＩ）のＡは、
【化１５】
2008545670.tif 000016
（式中、変数ｎは、０、１、２、３または４である）
であり、
Ｒ３は、トリフルオロメチル、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、塩素、フッ素、臭素、シアノ、メトキシ、アセチル、トリフルオロメタンスルホニル、トリフルオロメトキシまたはトリフルオロメチルチオである］。
【００４７】
そのような化合物のサブクラスでは、式ＩＩのＡの各Ｒ３置換基は、塩素、トリフルオロメチル、ｔｅｒｔ−ブチルまたはメトキシから選択される。
【００４８】
そのような化合物の他のサブクラスでは、式ＩＩのＡは、
【化１６】
2008545670.tif 000017
であり、
式ＩＩのＢは、フェニレン、フルオロ置換フェニレンまたはジフルオロ置換フェニレンである。
【００４９】
関心のある他の化合物のクラスには、下記式Ｘの構造を有する化合物が含まれ、ここで、フェニル環「Ｂ」は１個のハロゲン置換基を有することもある。
【化１７】
2008545670.tif 000018
【００５０】
式Ｘの化合物について、Ｒ２、ｍおよびＡは、式Ｉについて上記で定義した通りである。変数「ｍ」は、好ましくはゼロであり、Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ３をピリジニル部分の唯一の置換基として残す。Ａに好ましい置換基は、少なくとも１個の置換基Ｒ３を有する置換フェニルである。Ｒ３は、好ましくはハロゲン、好ましくはＣｌまたはＦ、トリフルオロメチルおよび／またはメトキシである。
【００５１】
関心のある化合物のサブクラスには、下記式Ｚ１およびＺ２の構造を有する化合物が含まれる：
【化１８】
2008545670.tif 000019
【００５２】
本発明による式Ｉの化合物として好ましく使用されるのは、４｛４−［３−（４−クロロ−３−トリフルオロメチルフェニル）−ウレイド］−フェノキシ｝−ピリジン−２−カルボン酸メチルアミド（ＢＡＹ４３−９００６）または４｛４−［３−（４−クロロ−３−トリフルオロメチルフェニル）−ウレイド］−フェノキシ｝−ピリジン−２−カルボン酸メチルアミドのｐ−トルエンスルホン酸塩（化合物（Ｉ）のトシレート塩）である。より好ましくは、４｛４−［３−（４−クロロ−３−トリフルオロメチルフェニル）−ウレイド］−フェノキシ｝−ピリジン−２−カルボン酸メチルアミドのｐ−トルエンスルホン酸塩が、少なくとも８０％、安定な多形Ｉで存在する。最も好ましくは、４｛４−［３−（４−クロロ−３−トリフルオロメチルフェニル）−ウレイド］−フェノキシ｝−ピリジン−２−カルボン酸メチルアミドのｐ−トルエンスルホン酸塩が、少なくとも８０％、安定な多形Ｉで、かつ微粉化形態で存在する。
【００５３】
微粉化は、標準的な粉末化（milling）方法により、好ましくは当業者に知られているエアチャット粉末化（air chat milling）により達成できる。微粉化形態は、０.５ないし１０μｍ、好ましくは１ないし６μｍ、より好ましくは１ないし３μｍの平均粒径を有し得る。示した粒径は、当業者に知られているレーザー回折により測定した粒径分布の平均である（測定装置: HELOS, Sympatec）。
【００５４】
４｛４−［３−（４−クロロ−３−トリフルオロメチルフェニル）−ウレイド］−フェノキシ｝−ピリジン−２−カルボン酸メチルアミドのｐ−トルエンスルホン酸塩およびその安定な多形Ｉの製造方法は、特許出願ＥＰ０４０２３１３１.８およびＥＰ０４０２３１３０.０に記載されている。
【００５５】
任意の部分が「置換されている」とき、それは、最高数までの示した置換基を有することができ、各置換基は、その部分の任意の利用可能な位置にあることができ、その置換基のいかなる利用可能な原子を介して結合していてもよい。「任意の利用可能な位置」は、当分野で知られているか、または本明細書で教示される手段により、化学的に接近可能であり、かつ、不安定な分子（例えば、ヒトへの投与が不可能であるもの）を創成しない、その部分における任意の位置を意味する。２個またはそれ以上の置換基が任意の部分に存在するとき、各置換基はいかなる他の置換基からも独立して定義され、従って、同一であっても異なっていてもよい。
【００５６】
用語「置換されていることもある」は、そのように修飾される部分が、非置換であっても、定められた置換基で置換されていてもよいことを意味する。
【００５７】
ピリジン置換基としての用語「ヒドロキシ」には、２−、３−および４−ヒドロキシピリジンが含まれ、また、当分野で１−オキソ−ピリジン、１−ヒドロキシ−ピリジンまたはピリジンＮ−オキシドと呼ばれる構造が含まれると理解される。
【００５８】
本明細書で化合物、塩などの単語の複数形が使用される場合、これは、単数の化合物、塩なども意味すると解釈される。
【００５９】
用語Ｃ１−６アルキルは、断りの無い限り、環状、直鎖または分枝鎖（単数または複数の分枝を有する）であってよい、１個ないし６個の炭素原子を有する直鎖、分枝鎖または環状のアルキル基を意味する。そのような基には、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロプロピル、シクロブチルなどが含まれる。
【００６０】
用語Ｃ１−６ハロアルキルは、断りの無い限り、少なくとも１個のハロゲン原子で過ハロゲン化まで（up to perhalo）置換されている、６個までの炭素原子を有する飽和炭化水素ラジカルを意味する。このラジカルは、環状、直鎖または分枝鎖（単数または複数の分枝を有する）であり得る。ハロ置換基には、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードが含まれる。フルオロ、クロロおよびブロモが好ましく、フルオロおよびクロロがより好ましい。ハロゲン置換基は、いかなる利用可能な炭素に位置してもよい。１個より多いハロゲン置換基がこの部分に存在する場合、それらは、同一であっても異なっていてもよい。そのようなハロゲン化アルキル置換基の例には、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、２,２,２−トリフルオロエチルおよび１,１,２,２−テトラフルオロエチルなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００６１】
用語Ｃ１−６アルコキシは、断りの無い限り、環状、直鎖または分枝鎖（単数または複数の分枝を有する）であってよい、１個ないし６個の飽和炭素原子を有する環状、直鎖または分枝鎖のアルコキシ基を意味し、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ペントキシなどのような基が含まれる。２,２−ジクロロエトキシ、トリフルオロメトキシなどのハロゲン化基も含まれる。
【００６２】
ハロまたはハロゲンは、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを意味する。フルオロ、クロロおよびブロモが好ましく、フルオロおよびクロロがより好ましい。
【００６３】
Ｃ１−３アルキルアミンは、断りの無い限り、メチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノまたはイソプロピルアミノを意味する。
【００６４】
Ｃ１−６ジアルキルアミンの例には、ジエチルアミノ、エチル−イソプロピルアミノ、メチル−イソブチルアミノおよびジヘキシルアミノが含まれるがこれらに限定されない。
【００６５】
用語ヘテロアリールは、単環式および二環式のヘテロアリール環の両方を表す。単環式ヘテロアリールは、５個ないし６個の環原子およびＮ、ＯおよびＳから選択される１個ないし４個のヘテロ原子を有し、残りの原子は炭素である、芳香族性単環式環を意味する。この部分に１個より多いヘテロ原子が存在する場合、それらは他のものから独立して選択され、よってそれらは同一であっても異なっていてもよい。単環式ヘテロアリール環には、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ピラゾール、チアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、イソチアゾール、トリアゾール、テトラゾール、チアジアゾール、オキサジアゾール、ピリジン、ピリミジン、ピリダジン、ピラジンおよびトリアジンが含まれるがこれらに限定されない。
【００６６】
二環式ヘテロアリールは、環の一方が上記の単環式ヘテロアリール環から選択され、２番目の環がベンゼンまたは他の上記の単環式ヘテロアリール環である縮合二環式部分を意味する。二環式部分の両方の環がヘテロアリール環である場合、当分野で知られている手段により化学的に接近可能である限り、それらは同一であっても異なっていてもよい。二環式ヘテロアリール環には、合成的に接近可能な５−５、５−６または６−６縮合二環式芳香族性構造が含まれ、それには、例えば、限定的ではないが、ベンゾオキサゾール（縮合したフェニルとオキサゾール）、キノリン（縮合したフェニルとピリジン）、イミダゾピリミジン（縮合したイミダゾールとピリミジン）などが含まれる。
【００６７】
指示のある場合、二環式ヘテロアリール部分は、部分飽和であり得る。部分飽和の場合、いずれかの上記の単環式ヘテロアリール環が完全または部分飽和であり、上記の第２の環が完全または部分飽和であるか、または、両方の環が部分飽和である。
【００６８】
用語「酸素、窒素および硫黄から選択される少なくとも１個の原子を含有し、飽和、部分飽和または芳香族性である５員または６員の複素環式環」には、非限定的に、テトラヒドロピラン、テトラヒドロフラン、１,３−ジオキソラン、１,４−ジオキサン、モルホリン、チオモルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ピペリジノン、テトラヒドロピリミドン、ペンタメチレンスルフィド、テトラメチレンスルフィド、ジヒドロピラン、ジヒドロフラン、ジヒドロチオフェン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ピラゾール、チアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、イソチアゾール、トリアゾール、ピリジン、ピリミジン、ピリダジン、ピラジン、トリアジンなどが含まれる。
【００６９】
用語「Ｃ１−３アルキル−フェニル」には、例えば、２−メチルフェニル、イソプロピルフェニル、３−フェニルプロピルまたは２−フェニル−１−メチルエチルが含まれる。置換例には、２−［２−クロロフェニル］エチル、３,４−ジメチルフェニルメチルなどが含まれる。
【００７０】
断りまたは指示の無い限り、用語「アリール」には、０個、１個、２個、３個、４個、５個または６個の置換基を有する６員ないし１２員の単環式または二環式芳香族性炭化水素基が含まれる（例えば、フェニル、ナフタレン、アズレン、インデン基）。
【００７１】
式（Ｉ）の化合物は、所望の様々な置換基の位置および性質次第で、１個またはそれ以上の不斉中心を含有し得る。不斉炭素原子は、（Ｒ）もしくは（Ｓ）配置または（Ｒ,Ｓ）配置で存在し得る。ある種の例では、不斉は、所定の結合、例えば、特定される化合物の２個の置換芳香環を連結する中心の結合について、回転が制限されることに起因して存在することもある。環上の置換基は、シスまたはトランス形のいずれで存在してもよい。全てのそのような配置（エナンチオマーおよびジアステレオマーを含む）が本発明の範囲内に含まれることを企図している。好ましい化合物は、より望ましい生物学的活性を奏する式（Ｉ）の化合物の絶対配置を有するものである。本発明の化合物の、分離された、純粋な、または、部分的に精製された異性体またはラセミ混合物も、本発明の範囲に含まれる。該異性体の精製および該異性体混合物の分離は、当分野で知られている標準的技法により達成できる。
【００７２】
光学異性体は、常套の方法に従うラセミ混合物の分割により、例えば、光学的に活性な酸または塩基を使用するジアステレオ異性体の塩の形成、または、共有結合のジアステレオマーの形成により、得ることができる。適切な酸の例は、酒石酸、ジアセチル酒石酸、ジトルオイル酒石酸およびカンファースルホン酸である。ジアステレオ異性体の混合物は、それらの物理的および／または化学的差異に基づき、当分野で知られている方法により、例えば、クロマトグラフィーまたは分別再結晶により、それらの個々のジアステレオマーに分離できる。次いで、光学的に活性な塩基または酸を、分離されたジアステレオマーの塩から遊離させる。光学異性体を分離するための異なる方法は、キラルクロマトグラフィー（例えば、キラルＨＰＬＣカラム）の使用を含み、常套の誘導体化を用いて、または用いずに、エナンチオマーの分離を最大化するために最適に選択される。適するキラルＨＰＬＣカラムは、Diacel により製造されており、例えば、なかんずく Chiracel OD および Chiracel OJ があり、全て日常的に選択できる。誘導体化を用いるか、または用いない、酵素的分離も有用である。光学的に活性な式Ｉの化合物は、同様に、光学的に活性な出発物質を利用して、キラル合成により得ることができる。
【００７３】
本発明はまた、医薬的に許容し得る塩、代謝物およびプロドラッグなどの、本明細書で開示する化合物の有用な形態にも関する。用語「医薬的に許容し得る塩」は、本発明の化合物の、相対的に非毒性な無機または有機酸付加塩を表す。例えば、S. M. Berge, et al. "Pharmaceutical Salts," J. Pharm. Sci. 1977, 66, 1-19 参照。医薬的に許容し得る塩には、塩基として機能する主要な化合物を、無機または有機酸と反応させて、塩、例えば塩酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、カンファースルホン酸、シュウ酸、マレイン酸、コハク酸およびクエン酸の塩を形成させることにより得られるものが含まれる。医薬的に許容し得る塩には、また、主要な化合物が酸として機能し、適切な塩基と反応して、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウムおよびコリン塩を形成するものも含まれる。当業者は、さらに、特許請求される化合物の酸付加塩は、数々の既知方法のいずれかを介する、化合物と適切な無機または有機酸との反応により製造し得ることを認識するであろう。あるいは、アルカリおよびアルカリ土類金属塩は、本発明の化合物を様々な既知方法を介して適切な塩基と反応させることにより製造される。
【００７４】
本発明の化合物の代表的な塩には、常套の非毒性の塩および四級アンモニウム塩、例えば無機または有機の酸または塩基から当分野で周知の手段により形成されるものが含まれる。例えば、かかる酸付加塩には、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、桂皮酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタン硫酸塩、フマル酸塩、グルコへプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、へプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、イタコン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、スルホン酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩およびウンデカン酸塩が含まれる。
【００７５】
塩基塩には、カリウムおよびナトリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウムおよびマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ジシクロヘキシルアミンおよびＮ−メチル−Ｄ−グルカミンなどの有機塩基とのアンモニウム塩が含まれる。加えて、塩基性窒素含有基は、塩化、臭化およびヨウ化メチル、エチル、プロピルおよびブチルなどの低級アルキルハロゲン化物；硫酸ジメチル、ジエチルおよびジブチルなどのジアルキル硫酸塩；および硫酸ジアミル、塩化、臭化およびヨウ化デシル、ラウリル、ミリスチルおよびステアリルなどの長鎖ハロゲン化物、臭化ベンジルおよびフェネチルおよび他の一置換ハロゲン化アラルキルまたは多置換ハロゲン化アラルキルなどのアリールまたはアラルキルハロゲン化物などの物質で、四級化し得る。
【００７６】
本発明の目的上、溶媒和物は、溶媒分子が固体状態で複合体を形成している化合物の形態のものであり、例えば、エタノールおよびメタノールが含まれるがこれらに限定されない。水和物は、溶媒分子が水である、溶媒和物の特別な形態である。
【００７７】
ある種の医薬的に活性な物質は、不安定な官能基でさらに修飾でき、それは、インビボ投与後に切り離され、親の活性物質および薬理的に不活性な誘導体化基をもたらす。これらの誘導体は一般的にプロドラッグと呼ばれ、例えば、活性物質の物理化学的特性を変更し、活性物質を特定の組織に標的化し、活性物質の薬物動態および薬力学的特性を変更し、望ましくない副作用を低減するために使用できる。本発明のプロドラッグには、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチルまたはペンチルエステルを含むアルキルエステルなどの、良好に耐容される医薬的に許容し得るエステルである適切な本発明の化合物のエステルが含まれる。フェニル−Ｃ１−Ｃ５アルキルなどのさらなるエステルを使用し得るが、メチルエステルが好ましい。
【００７８】
他のプロドラッグを合成するのに使用できる方法は、その主題に関する以下の概説に記載されている。これらの合成方法の説明を、出典明示により本明細書の一部とする：
・Higuchi, T.; Stella, V. eds. Prodrugs As Novel Drug Delivery Systems. ACS Symposium Series. American Chemical Society: Washington, DC (1975).
・Roche, E. B. Design of Biopharmaceutical Properties through Prodrugs and Analogs. American Pharmaceutical Association: Washington, DC (1977).
・Sinkula, A. A.; Yalkowsky, S. H. J Pharm Sci. 1975, 64, 181-210.
・Stella, V. J.; Charman, W. N. Naringrekar, V. H. Drugs 1985, 29, 455-473.
・Bundgaard, H., ed. Design of Prodrugs. Elsevier: New York (1985).
・Stella, V. J.; Himmelstein, K. J. J. Med. Chem. 1980, 23, 1275-1282.
・Han, H-K; Amidon, G. L. AAPS Pharmsci 2000, 2, 1- 11.
・Denny, W. A. Eur. J. Med. Chem. 2001, 36, 577-595.
・Wermuth, C. G. in Wermuth, C. G. ed. The Practice of Medicinal Chemistry Academic Press: San Diego (1996), 697-715.
・Balant, L. P.; Doelker, E. in Wolff, M. E. ed. Burgers Medicinal Chemistry And Drug Discovery John Wiley & Sons: New York (1997), 949-982.
【００７９】
本発明の化合物の代謝物には、１個またはそれ以上の窒素がヒドロキシ基で置換されている式Ｉ、ＩＩ、Ｘ、Ｚ１およびＺ２の化合物の酸化誘導体が含まれる；それは、ピリジン基の窒素原子がオキシド形である（当分野で１−オキソ−ピリジンと呼ばれる）か、または、ヒドロキシ置換基を有する（当分野で１−ヒドロキシ−ピリジンと呼ばれる）誘導体を含む。
【００８０】
一般的製造方法
本発明のこの実施態様で使用する化合物の製造に利用すべき特定の方法は、特定の所望の化合物次第で決まる。特定の置換基の選択などの要因が、本発明の特定の化合物の製造において辿るべき経路に役割を果たす。これらの要因は、当業者により容易に認識される。
【００８１】
本発明の化合物は、既知の化学反応、および、以下の公開された国際出願ＷＯ００／４２０１２、ＷＯ０３／０４７５７９、ＷＯ２００５／００９９６１、ＷＯ２００４／０７８７４７およびＷＯ０５／０００２８４並びに欧州特許出願ＥＰ０４０２３１３１.８およびＥＰ０４０２３１３０.０に記載の方法を使用することにより製造し得る。
【００８２】
本発明の化合物は、購入できるか、または日常的な常套の化学的方法により製造できる出発物質から、常套の化学的方法および／または下記で開示するものに従って製造できる。これらの化合物の一般的製造方法を、後述する。
【００８３】
式（Ｉ）のウレア類は、２個のアリールアミンフラグメントの縮合から、ホスゲン、ジ−ホスゲン、トリ−ホスゲン、カルボニルジイミダゾールまたは均等物の存在下で、出発物質のいずれとも反応しない溶媒中で、公開されたこれらの１つまたはそれ以上に記載の通りに製造できる。あるいは、式（Ｉ）の化合物は、アミノ化合物を、イソシアネート化合物と、上記の公開された国際出願の１つまたはそれ以上に記載の通りに反応させることにより合成できる。
【００８４】
これらのイソシアネート類は、購入できるか、または、複素環式アミン類から当業者に一般的に知られている方法に従い合成できる［例えば、アミンを、ホスゲンもしくはトリクロロメチルクロロホルメート（ジホスゲン）、ビス（トリクロロメチル）カルボネート（トリホスゲン）などのホスゲン等価物、またはＮ,Ｎ'−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）で処理することから；または、代替的に、アミドまたはカルボン酸誘導体、例えばエステル、酸ハロゲン化物または無水分のクルチウス型転位により］。
【００８５】
式のアリールアミン類は、市販されているか、当業者に一般的に知られている方法に従い合成できる。アリールアミン類は、一般的に、Ｎｉ、ＰｄまたはＰｔなどの金属触媒およびＨ２、または、ホルメート、シクロヘキサジエンまたはボロヒドリドなどの水素搬送剤（hydride transfer agent）を使用するニトロアリール類の還元により合成される（Rylander. Hydrogenation Methods; Academic Press: London, UK (1985)）。ニトロアリール類は、また、ＬｉＡｌＨ４などの強水素化物源を使用して（Seyden-Penne. Reductions by the Alumino- and borohydrides in Organic Synthesis; VCH Publishers: New York (1991)）、または、Ｆｅ、ＳｎまたはＣａなどのゼロ価の金属を多くの場合酸性媒体中で使用して、直接還元し得る。ニトロアリール類の合成のために多くの方法が存在する（March. Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed.; John Wiley: New York (1985).  Larock.  Comprehensive Organic Transformations; VCH Publishers: New York (1989)）。ニトロアリール類は、一般的に、ＨＮＯ３または代替的ＮＯ２＋源を使用する求電子性芳香族ニトロ化により形成される。
【００８６】
ピリジン環がその窒素原子上にヒドロキシ置換基を有し、Ａ、Ｂ、Ｌは広く上記の定義の通りである式（Ｉ）のピリジン−１−オキシド類は、当分野で知られている酸化条件を使用して対応するピリジン類から製造できる。例は以下の通りである：
・ジクロロメタン、ジクロロエタンまたはクロロホルムなどの塩化溶媒中のメタクロロ過安息香酸などの過酸（Markgraf et al., Tetrahedron 1991, 47, 183);
・触媒量の過レニウム酸の存在下、ジクロロメタンなどの塩化溶媒中の（Ｍｅ３ＳｉＯ）２ (Coperet et al., Terahedron Lett. 1998, 39, 761);
・ハロゲン化溶媒のいくつかの組合せ中のペルフルオロ−シス−２−ブチル−３−プロピルオキサジリジン（Amone et al., Tetrahedron 1998, 54, 7831);
・クロロホルム中の次亜フッ素酸（Hypofluoric acid）−アセトニトリル複合体（Dayan et al., Synthesis 1999, 1427);
・ＫＯＨなどの塩基の存在下、水中のオキソン（Robker et al., J. Chem. Res., Synop. 1993, 10, 412);
・氷酢酸の存在下のマグネシウムモノペルオキシフタレート (Klemm et al., J. Heterocylic Chem. 1990, 6, 1537);
・水および酢酸の存在下の過酸化水素（Lin A.J., Org. Prep. Proced. Int. 1991, 23(1), 114);
・アセトン中のジメチルジオキシラン（Boyd et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1991, 9, 2189）。
【００８７】
加えて、ジアリールウレア類および中間体化合物を製造するための特別な方法は、既に他の特許文献で記載されており、本発明の化合物に適合させることができる。例えば、Miller S. et al, "Inhibition of p38 Kinase using Symmetrical and Unsymmetrical Diphenyl Ureas" ＰＣＴ国際出願ＷＯ９９ ３２４６３、Miller, S et al. "Inhibition of raf Kinase using Symmetrical and Unsymmetrical Substituted Diphenyl Ureas" ＰＣＴ国際出願ＷＯ９９ ３２４３６、Dumas, J. et al., "Inhibition of p38 Kinase Activity using Substituted Heterocyclic Ureas" ＰＣＴ国際出願ＷＯ９９ ３２１１１、Dumas, J. et al., "Method for the Treatment of Neoplasm by Inhibition of raf Kinase using N-Heteroaryl-N'-(hetero)arylureas" ＰＣＴ国際出願ＷＯ９９ ３２１０６、Dumas, J. et al.,  "Inhibition of p38 Kinase Activity using Aryl- and Heteroaryl- Substituted Heterocyclic Ureas" ＰＣＴ国際出願ＷＯ９９ ３２１１０、Dumas, J., et al.,  "Inhibition of raf Kinase using Aryl- and Heteroaryl- Substituted Heterocyclic Ureas" ＰＣＴ国際出願ＷＯ９９ ３２４５５、Riedl, B., et al., "O-Carboxy Aryl Substituted Diphenyl Ureas as raf Kinase Inhibitors" ＰＣＴ国際出願ＷＯ００ ４２０１２、Riedl, B., et al., "O-Carboxy Aryl Substituted Diphenyl Ureas as p38 Kinase Inhibitors" ＰＣＴ国際出願ＷＯ００ ４１６９８、Dumas, J. et al. "Heteroaryl Ureas containing nitrogen hetero-atoms as p38 kinase inhibitors" 米国特許出願公開ＵＳ２００２００６５２９６、Dumas, J. et al. "Preparation of N-aryl-N'-[(acylphenoxy) phenyl]ureas as raf Kinase inhibitors" ＰＣＴ国際出願ＷＯ ０２６２７６３、Dumas, J. et al. "Inhibition of raf Kinase using quinolyl, isoquinolyl or pyridyl ureas" ＰＣＴ国際出願ＷＯ ０２８５８５７、Dumas, J. et al. "Preparation of quinolyl, isoquinolyl or pyridyl-ureas as inhibitors of raf Kinase for the treatment of tumors and/or cancerous cell growth" 米国特許出願公開ＵＳ２００２０１６５３９４。前出の全特許出願は、出典明示により本明細書の一部とする。
【００８８】
式（Ｉ）の化合物の合成および式（Ｉ）の化合物の合成に関与する中間体の合成で用い得る合成的変換は、当業者に知られているか、利用可能である。合成的変換法の総括は、以下のような編集物中に見出し得る：
・J. March.  Advanced Organic Chemistry, 4th ed.; John Wiley: New York (1992);
・R.C. Larock. Comprehensive Organic Transformations, 2nd ed.; Wiley-VCH: New York (1999);
・F.A. Carey; R.J. Sundberg.  Advanced Organic Chemistry, 2nd ed.; Plenum Press: New York (1984);
・T.W. Greene; P.G.M. Wuts.  Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd ed.; John Wiley: New York (1999);
・L.S. Hegedus.  Transition Metals in the Synthesis of Complex Organic Molecules, 2nd ed.; University Science Books: Mill Valley, CA (1994);
・L.A. Paquette, Ed.  The Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis; John Wiley: New York (1994);
・A.R. Katritzky; O. Meth-Cohn; C.W. Rees, Eds.  Comprehensive Organic Functional Group Transformations; Pergamon Press: Oxford, UK (1995);
・G. Wilkinson; F.G A. Stone; E.W. Abel, Eds.  Comprehensive Organometallic Chemistry; Pergamon Press: Oxford, UK (1982);
・B.M. Trost; I. Fleming.  Comprehensive Organic Synthesis; Pergamon Press: Oxford, UK (1991);
・A.R. Katritzky; C.W. Rees Eds.  Comprehensive  Heterocylic Chemistry; Pergamon Press: Oxford, UK (1984);
・A.R. Katritzky; C.W. Rees; E.F.V. Scriven, Eds.  Comprehensive  Heterocylic Chemistry II; Pergamon Press: Oxford, UK (1996); および
・C. Hansch; P.G. Sammes; J.B. Taylor, Eds.  Comprehensive Medicinal Chemistry: Pergamon Press: Oxford, UK (1990)。
【００８９】
加えて、合成方法論および関連する話題を再編する概説には、Organic Reactions; John  Wiley: New York; Organic Syntheses; John Wiley: New York; Reagents for Organic Synthesis: John Wiley: New York; The Total Synthesis of Natural Products; John Wiley: New York; The Organic Chemistry of Drug Synthesis; John Wiley: New York; Annual Reports in Organic Synthesis; Academic Press: San Diego CA; および Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl); Thieme: Stuttgart, Germany が含まれる。さらに、合成的変換のデータベースには、Chemical Abstracts（CAS OnLine または SciFinderを使用して検索し得る）、Handbuch der Organischen Chemie (Beilstein)（SpotFire および REACCS を使用して検索し得る）が含まれる。
【００９０】
式Ｉの化合物は、Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路、ｃ−ｒａｆ、ｂ−ｒａｆ、ｐ３８、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＲ３、ＦＬＴ３、ＰＤＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ−ベータおよびｃ−ｋｉｔの阻害を含む様々な活性を有すると過去に特徴解析された。これらの活性および様々な疾患および症状の処置におけるそれらの使用は、例えば、ＷＯ００／４２０２１、ＷＯ００／４１６９８、ＷＯ０３／０６８２２８、ＷＯ０３／０４７５７９、ＷＯ２００５／００９９６１、ＷＯ２００５／０００２８４および米国出願番号２００５００３８０８０に開示されており、それらを全体的に出典明示により本明細書の一部とする。
【００９１】
適応症
本発明の薬物の組合せは、これらの組合せを構成する化合物により調節される細胞経路に関するか、またはそれに媒介されるいかなる疾患または症状の処置にも利用できる。これらの経路には、例えば、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、Ｒａｆ／Ｍｅｋ／Ｅｒｋ、Ａｋｔ／ＰＩ３Ｋ、ＭＴＯＲ、ＰＴＥＮなどを含むシグナル伝達経路が含まれるがこれらに限定されない（上記も参照）。これらの薬物の組合せは、ＰＴＥＮ、ｒａｓ、Ｒａｆ、Ａｋｔ、ＰＩ３Ｋなどの癌関連突然変異を含む、これらの経路に存在する１種またはそれ以上の遺伝子の突然変異に関連するか、またはそれにより媒介される疾患の処置に有用であり得る。
【００９２】
上述の通り、これらの化合物は特異的阻害剤として知られているかもしれないが、本発明は、作用メカニズムまたはそれがいかにして達成されるかに拘わらず、いかなる改善または治療効果も含む。
【００９３】
この薬物の組合せは、抗増殖；抗腫瘍；抗血管新生；内皮または腫瘍細胞の増殖阻害；抗新生物；免疫抑制；免疫調節；アポトーシス促進などを含む活性の１つまたはそれ以上を有し得る。
【００９４】
本発明に従い処置できる症状または疾患には、増殖性障害（癌など）、炎症性障害、免疫調節性障害、アレルギー、自己免疫疾患（リウマチ性関節炎または多発性硬化症など）、異常または過剰な血管新生などが含まれる。
【００９５】
いかなる腫瘍または癌も処置でき、ｒａｆ、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＰＤＧＦＲ−ベータ、Ｆｌｔ−３、ｒａｓ、ＰＴＥＮ、Ａｋｔ、ＰＩ３Ｋ、ｍＴＯＲ並びにそれらが一部をなすシグナル伝達経路の上流または下流の任意の構成員に１個またはそれ以上の突然変異を有する癌が含まれるがこれらに限定されない。腫瘍または癌は、その原因であるメカニズムに拘わらず、本発明の薬物の組合せにより処置できる。いかなる器官の癌も処置でき、例えば、結腸、膵臓、乳房、前立腺、骨、肝臓、腎臓、肺、精巣、皮膚、膵臓、胃、前立腺、卵巣、子宮、頭部および頸部、血液細胞、リンパの癌が含まれるがこれらに限定されない。
【００９６】
本発明に従い処置できる癌には、特に、脳腫瘍、乳癌、骨肉腫（例えば、骨肉腫およびユーイング肉腫）、気管支の前癌状態（bronchial premalignancy）、子宮内膜癌、神経膠芽腫、血液悪性腫瘍、肝細胞癌、ホジキン病、腎臓新生物、白血病、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ腫、レルミット・ダクロス病（Lhermitte-Duclose disease）、悪性神経膠腫、黒色腫、悪性黒色腫、転移、多発性骨髄腫、骨髄化生、骨髄芽細胞性症候群（myeloplastic syndromes）、非小細胞肺癌、膵臓癌、前立腺癌、腎細胞癌（例えば、進行型、進行型難治性）、横紋筋肉腫、軟部組織肉腫、皮膚の扁平上皮癌、ＰＴＥＮ機能の喪失；活性化Ａｋｔに関連する癌（例えばＰＴＥＮヌル腫瘍およびｒａｓ突然変異を有する腫瘍）が含まれるがこれらに限定されない。
【００９７】
乳癌の例には、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、非浸潤性乳管癌および非浸潤性小葉癌が含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
呼吸管の癌の例には、小細胞、非小細胞肺癌、気管支腺腫および胸膜肺芽腫が含まれるが、これらに限定されない。
【００９９】
脳の癌の例には、脳幹および視床下部の（hypophtalmic）神経膠腫、小脳および大脳の星状細胞腫、髄芽腫、上衣腫、並びに、神経外胚葉および松果体の腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【０１００】
雄性生殖器官の腫瘍には、前立腺癌および精巣癌が含まれるが、これらに限定されない。雌性生殖器官の腫瘍には、子宮内膜、子宮頸部、卵巣、膣および外陰部の癌、並びに子宮肉腫が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０１】
消化管の腫瘍には、肛門、結腸、結腸直腸、食道、胆嚢、胃、膵臓、直腸、小腸および唾液腺の癌が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０２】
泌尿器の腫瘍には、膀胱、陰茎、腎臓、腎盂、尿管および尿道の癌が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０３】
眼の癌には、眼球内黒色腫および網膜芽腫が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０４】
肝臓の癌の例には、肝細胞癌腫（線維層板変異を伴うか、または伴わない肝細胞の癌腫）、胆管癌（肝内胆管癌）および混合性肝細胞性胆管癌が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０５】
皮膚の癌には、扁平上皮癌、カポジ肉腫、悪性黒色腫、メルケル細胞皮膚癌および非黒色腫皮膚癌が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０６】
頭頸部の癌には、喉頭、下咽頭、鼻咽頭および／または口咽頭の癌、並びに口唇および口腔の癌が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０７】
リンパ腫には、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキン病および中枢神経系のリンパ腫が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０８】
肉腫には、軟部組織の肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、リンパ肉腫および横紋筋肉腫が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０９】
白血病には、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病および有毛細胞白血病が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１０】
腫瘍細胞の増殖の阻害に加えて、本発明の薬物の組合せは、腫瘍退行、例えば、腫瘍のサイズまたは体内の癌の程度の低下も引き起こすことができる。
【０１１１】
好ましいのは、黒色腫、腎臓癌、肝細胞癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌、乳癌または膵臓癌の処置である。
【０１１２】
血管新生に関連する症状および障害も、本発明の薬物の組合せで処置できる。血管新生の不適当な異所性の発現は、生物にとって有害であり得る。数々の病状が、異質な血管の成長を伴う。これらには、例えば、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、乾癬、水晶体後線維増殖症、血管線維腫、炎症、再狭窄などが含まれる。加えて、癌性および新生物性組織に伴う血液供給の増加は、成長を促進し、急速な腫瘍の拡大および転移を導く。さらに、腫瘍における新しい血管の成長は、反乱細胞に脱出路を提供し、転移および結果的な癌の拡散を促進する。
【０１１３】
血管新生の調節に有用なシステムには、例えば、腫瘍転移片（explants）の血管新生（例えば、米国特許第５,１９２,７４４号；第６,０２４,６８８号）、ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイ（例えば、Taylor and Folkman, Nature, 297:307-312, 1982; Eliceiri et al., J. Cell Biol., 140, 1255-1263, 1998）、ウシ毛細血管内皮（ＢＣＥ）細胞アッセイ（例えば、米国特許第６,０２４,６８８号；Polverini, P. J. et al., Methods Enzymol., 198: 440-450, 1991）、遊走アッセイおよびＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯血管内皮細胞）成長阻害アッセイ（例えば、米国特許第６,０６０,４４９号）が含まれる。加えて、リンパ脈管新生の調節に有用なシステムには、例えば、ウサギ耳モデル（例えば、Szuba et al., FASEB J., 16(14):1985-7, 2002）が含まれる。
【０１１４】
血管新生の調節は、任意の適当な方法により測定できる。例えば、組織血管増生の程度は、典型的には、所定のサンプル中に存在する血管の数と密度を評価することにより決定する。例えば、微小血管密度（ＭＶＤ）は、強力な顕微鏡の視野中の内皮のクラスターの数を計数することにより、または、微小血管内皮に特異的なマーカーもしくは他の成長中または確立された血管のマーカー、例えばＣＤ３１（血小板内皮細胞接着分子またはＰＥＣＡＭとしても知られている）を検出することにより、見積もることができる。例えば、Penfold et al., Br. J. Oral and Maxill. Surg., 34: 37-41；米国特許第６,０１７,９４９号；Dellas et al., Gyn. Oncol., 67:27-33, 1997；などに記載の通り、ＣＤ３１抗体を常套の免疫組織化学的方法で用いて、組織切片を免疫染色できる。他の血管新生のマーカーには、例えば、Ｖｅｚｆ１（例えば、Xiang et al., Dev. Bio., 206:123-141, 1999）、アンジオポエチン、Ｔｉｅ−１およびＴｉｅ−２（例えば、Sato et al., Nature, 376:70-74, 1995）が含まれる。
【０１１５】
本発明の薬物の組合せは、炎症症状、冠動脈再狭窄、腫瘍関連血管新生、アテローム性動脈硬化症、自己免疫疾患、炎症、糸球体または糸球体間質細胞の増殖と関連するある種の腎臓疾患、および網膜血管増殖と関連する眼疾患、乾癬、肝硬変、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、血管移植後再狭窄、ステント内狭窄、血管新生、眼疾患、肺線維症、閉塞性細気管支炎、糸球体腎炎、リウマチ性関節炎などの広範な疾患の進行を処置または予防する幅広い治療活性も有する。
【０１１６】
本発明はまた、ヒトおよび／または他の哺乳動物における以下の症状の１つまたはそれ以上の処置、予防、調節なども提供する：糖尿病性網膜症を含む網膜症、虚血性網膜静脈閉塞、早産児の網膜症および加齢関連黄斑変性；リウマチ性関節炎、乾癬、または水疱性類天疱瘡、多形性紅もしくはヘルペス状皮膚炎を含む、表皮下水疱形成を伴う水疱性障害、リウマチ熱、骨吸収、閉経後骨粗鬆症、敗血症、グラム陰性敗血症、敗血症ショック、内毒素ショック、毒素性ショック症候群、全身性炎症反応症候群、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎）、ヤーリッシュ・ヘルクスハイマー反応、喘息、成人呼吸促迫症候群、急性肺線維性疾患、肺サルコイドーシス、アレルギー性呼吸器疾患、ケイ肺症、炭坑夫塵肺、肺胞傷害、肝不全、急性炎症における肝臓疾患、重篤なアルコール性肝炎、マラリア（熱帯熱マラリアおよび脳性マラリア）、非インシュリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、うっ血性心不全、心臓病後の損傷、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、急性脳炎、脳傷害、多発性硬化症（多発性硬化症における脱髄（demyelation）および乏突起膠細胞の損失）、進行癌、リンパ性腫瘍、膵炎、感染、炎症および癌における創傷治癒の悪化、骨髄異形成症候群、全身性エリテマトーデス、胆汁性肝硬変、腸壊死、放射線損傷／モノクローナル抗体投与後の毒性、宿主対移植片反応（虚血性再灌流傷害、並びに、腎臓、肝臓、心臓および皮膚の同種移植片拒絶）、肺同種移植片拒絶（閉塞性気管支炎）または人工股関節全置換に起因する合併症、および、結核、消化性潰瘍疾患におけるヘリコバクターピロリ感染、クルーズ・トリパノソーマ感染に起因するシャーガス病、大腸菌感染に起因する志賀様毒素の効果、ブドウ球菌感染に起因するエンテロトキシンＡの効果、髄膜炎菌感染、並びに、ライム病菌、梅毒トレポネーマ、サイトメガロウイルス、インフルエンザウイルス、タイラー脳脊髄炎ウイルスおよびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）からの感染、乳頭腫、ブラストグリオーマ（blastoglioma）、カポジ肉腫、黒色腫、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、星状細胞腫、頭部の癌、頸部の癌、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、膵癌、胃癌、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、ホジキン病、バーキット病、関節炎、リウマチ性関節炎、糖尿病性網膜症、血管新生、再狭窄、ステント内再狭窄、血管移植後再狭窄、肺線維症、肝硬変、アテローム性動脈硬化症、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、血栓性微小血管障害症候群、移植片拒絶、乾癬、糖尿病、創傷治癒、炎症、および、神経変性疾患、過免疫障害、血管腫、心筋血管新生、冠血管および脳の側副血管新生、虚血、角膜疾患、虹彩炎、血管新生緑内障、早産児の黄斑変性網膜症、創傷治癒、潰瘍性ヘリコバクター関連疾患、骨折、子宮内膜症、糖尿病性症状、猫ひっかき熱、甲状腺過形成、火傷後の喘息または浮腫、外傷、慢性肺疾患、卒中、ポリープ、嚢胞、滑膜炎、慢性およびアレルギー性炎症、卵巣過刺激症候群、肺および脳浮腫、ケロイド、線維症、硬変、手根管症候群、成人呼吸促迫症候群、腹水症、眼の症状、心血管症状、クロウ・深瀬（ＰＯＥＭＳ）病、クローン病、糸球体腎炎、骨関節炎、多発性硬化症、移植片拒絶、ライム病、敗血症���フォンヒッペル・リンダウ病、類天疱瘡、パジェット病、多発性嚢胞腎、サルコイドーシス、甲状腺炎、過粘稠度症候群、オスラー・ウェーバー・ランデュ病、慢性閉塞性肺疾患、照射、低酸素症、子癇前症、機能性子宮出血、子宮内膜症、単純ヘルペスによる感染、虚血性網膜症、角膜の血管新生、帯状疱疹、ヒト免疫不全ウイルス、パラポックスウイルス、原生動物、トキソプラズマ症、脊椎関節炎、強直性脊椎炎、ベヒテレフ病、例えば血清型Ｈ５Ｎ１を含む鳥インフルエンザ、並びに腫瘍関連滲出および浮腫。
【０１１７】
本発明は、少なくとも１種の式Ｉの化合物および少なくとも１種のＡＫＴ／ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路阻害剤である化合物の有効量を投与することを含む、上述の疾患および／または症状（参照文献のいずれかで言及されたものを含む）のいずれを処置する方法も提供する。「有効量」は、所望の結果、例えば、疾患または症状の処置を達成するのに有用な化合物の量である。
【０１１８】
本発明はまた、細胞を含む系において血管新生を阻害する方法に関し、それは、本明細書に記載の化合物の有効量の組合せをその系に投与することを含む。細胞を含む系は、患者中の腫瘍、単離された器官、組織または細胞などのインビボの系、インビトロアッセイ系（ＣＡＭ、ＢＣＥなど）、動物モデル（例えば、インビボの皮下癌モデル）、処置を必要としている宿主（例えば、血管新生成分を有する疾患、例えば癌を患っている；再狭窄を経験している宿主）などであり得る。
【０１１９】
加えて、薬物の組合せを投与して、１つまたはそれ以上の以下の過程、細胞の成長（例えば、増殖）、腫瘍細胞の成長（例えば、分化、細胞の生存および／または増殖を含む）、腫瘍の退縮、内皮細胞の成長（例えば、分化、細胞の生存および／または増殖を含む）、血管新生（血管の成長）、血管新生および／または血球新生（例えば、増殖、Ｔ細胞の発達など）を調節できる。
【０１２０】
本発明の化合物または薬物の組合せは、任意の形態で、例えば、経口で、非経腸で、経腸で、静脈内に、腹腔内に、局所で、経皮で（例えば、任意の標準的パッチを使用する）、眼に、鼻腔に、局所に、非経口で、例えばエアゾールで、吸入で、皮下に、筋肉内に、頬側に、舌下に、直腸に、膣に、動脈内に、および、くも膜下腔内になどを含む任意の有効な経路により投与できる。それらは、単独で、または、任意の活性または非活性成分と組み合わせて投与できる。それらは、任意の有効投与量で、例えば、約０.１ないし約２００ｍｇ／体重ｋｇで投与できる。
【０１２１】
本発明の組合せは、任意の時間に、任意の有効な形態で投与できる。例えば、これらの化合物は、同時に、例えば、単一の組成物または投薬単位（例えば、両組成物を含有する丸剤または液剤）として投与できるか、または、それらは、分離した組成物として、しかし同時に投与できる（例えば、一方の薬物を静脈内投与し、他方を経口または筋肉内投与する）。これらの薬物を異なる時間に連続的に投与することもできる。作用物質は、延長された期間、例えば１２時間、２４時間にわたって所望の放出速度を達成するために、従来通りに製剤化できる。これは、適する代謝半減期を有する作用物質および／またはそれらの誘導体を使用することにより、かつ／または、制御放出製剤を使用することにより、達成できる。
【０１２２】
薬物の組合せは、例えば、薬物の連合作用が、組み合わされた効果がそれらの個々の効果の代数的合計よりも大きいようなものである場合、相乗的であり得る。従って、低減された量の薬物を投与して、例えば、毒性または他の有害または望ましくない効果を低減し、かつ／または、それらの物質が単独で投与される場合と同じ量を使用するが、より大きい効力（例えば、より強力な抗増殖およびアポトーシス促進作用を有する）を達成することができる。
【０１２３】
本発明の化合物または薬物の組合せは、さらに、他の適する添加物または医薬的に許容し得る担体と組み合わせることができる。そのような添加物には、既に述べた任意の物質、並びに、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro and Gennaro, eds, 20th edition, Lippincott Williams & Wilkins, 2000); Theory and Practice of Industrial Pharmacy (Lachman et al., eds., 3rd edition, Lippincott Williams & Wilkins, 1986); Encyclopedia of Pharmaceutical Technology (Swarbrick and Boylan, eds., 2nd edition, Marcel Dekker, 2002）に記載のもののような、任意の常套に使用されるものが含まれる。これらは、本明細書では、それらが活性な薬物と組み合わされ、治療目的で対象に安全に投与できることを示すために、「医薬的に許容し得る担体」と呼ぶことができる。
【０１２４】
加えて、本発明の化合物または薬物の組合せは、上述の疾患および／または症状のいずれかを処置するために利用される他の活性物質または療法（例えば、放射線照射）と共に投与できる。
【０１２５】
本発明は、少なくとも１種の式Ｉの化合物および少なくとも１種のリストＡから選択される化合物（例えば、疾患または障害の処置に有用なＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤である）の組合せを提供する。「組合せ」は、本発明の目的上、以下のものを含む：
−少なくとも１種の式Ｉの化合物および少なくとも１種のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤である第２の化合物を含有する、単一の組成物または投与形；
−少なくとも１種の式Ｉの化合物および少なくとも１種のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤である第２の化合物を含有する、同時または連続的に投与するための組合せパック；
−投薬単位または独立した投薬単位として相互に分離されて包装されている少なくとも１種の式Ｉの化合物および少なくとも１種のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤である第２の化合物を含み、それらが同時または連続的に投与されるという指示書を含むか、または含まない、キット；および、
−同時または連続的に投与されると、協同して同じ疾患の予防または処置などの治療効果を達成する、少なくとも１種の式Ｉの化合物および少なくとも１種のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤である第２の化合物の分離した独立の投与形。
【０１２６】
組合せの各物質の投与量は、所望の治療活性を提供するために、他方並びに／または疾患のタイプおよび／もしくは病状に照らして選択できる。例えば、組合せ中の活性物質は、固定された組合せで存在および投与できる。「固定された組合せ」は、本明細書では、各成分が所望の効力を提供する固定された比率で存在する医薬形を意味することを企図する。これらの量は、特定の患者のために日常的に決定できる（この場合、様々なパラメーター（例えば、癌のタイプ、患者の年齢、病状、患者の健康状態、体重など）を利用して適切な投与量を選択する）か、または、これらの量は比較的標準的であり得る。
【０１２７】
この組合せは、いずれかの化合物を単独で使用する場合よりも大きい治療効力を達成する、少なくとも１種の式Ｉの化合物および少なくとも１種のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤である第２の化合物の有効量を含むことができる。この組合せは、物質が単独で使用されると治療効果が観察されない場合、または、この組合せを投与すると効果の増強が観察される場合に、腫瘍の退縮をもたらすのに、疾患の安定性をもたらすのに、転移を防止または低減するのに、または、他の治療的エンドポイントのために、有用であり得る。
【０１２８】
この組合せ中の各化合物の相対比は、それらの各々の作用メカニズムおよび疾患の生物学に基づいて選択することもできる。例えば、Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の活性化突然変異がヒトの黒色腫の６０％以上で観察され、黒色腫の処置用の組成物は、有利には、式Ｉの化合物を、Ｐ１３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤である化合物よりも効力の高い量で含み得る。比較して、癌がＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路の突然変異を伴う場合（例えば、卵巣癌および乳癌）、このシグナル伝達経路において活性を有する物質は、Ｒｅｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路阻害剤に対してより効力の高い量で存在できる。各化合物の相対比は、幅広く多様であることができ、本発明は、式Ｉの化合物および第２の活性物質の量をいずれかがより多い量で存在するように日常的に調節できる、癌の処置用の組合せを含む。
【０１２９】
必要に応じて、単一の投薬形、組合せパック、キットの場合に、または分離した独立の投薬形の場合に、組合せの１種またはそれ以上の物質の放出を制御して、所望の治療効果を提供することもできる。
【０１３０】
アッセイ
本発明の組合せの活性は、任意の有効なインビトロまたはインビボの方法に従い決定できる。
【０１３１】
キナーゼ活性
キナーゼ活性は、常套のアッセイ方法を使用して日常的に決定できる。キナーゼアッセイは、典型的には、キナーゼ酵素、基質、バッファーおよび検出システムの成分を含む。典型的なキナーゼアッセイは、タンパク質キナーゼのペプチド基質およびＡＴＰ、例えば３２Ｐ−ＡＴＰとの反応を含み、リン酸化された最終生成物（例えば、ペプチド基質を使用する場合、リン酸化タンパク質）を産生する。得られる最終生成物を、任意の適する方法を使用して検出できる。放射性ＡＴＰを利用する場合、アフィニティーメンブレンまたはゲル電気泳動を使用して、未反応のガンマ−３２Ｐ−ＡＴＰから放射性標識リン酸化タンパク質を分離でき、次いで、オートラジオグラフィを使用してゲル上で可視化できるか、または、シンチレーションカウンターで検出できる。非放射性の方法も使用できる。方法は、リン酸化された基質を認識する抗体、例えば、抗リン酸化チロシン抗体を利用できる。例えば、キナーゼ酵素を、基質と共に、ＡＴＰおよびキナーゼバッファーの存在下、その酵素がその基質をリン酸化するのに有効な条件下でインキュベートできる。反応混合物を、例えば電気泳動的に分離でき、次いで、例えば、抗リン酸化チロシン抗体を使用するウエスタンブロットにより、基質のリン酸化を測定できる。この抗体は、例えば、ＨＲＰなどの酵素、アビジンまたはビオチン、化学発光試薬などの検出可能な標識で標識できる。他の方法は、ＥＬＩＳＡ様式、アフィニティーメンブレン分離、蛍光偏光アッセイ、発光アッセイなどを利用できる。
【０１３２】
放射性様式の代替法は、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）である。この方法は、基質、例えばビオチン化ポリ（ＧｌｕＴｙｒ）を、ＡＴＰの存在下でタンパク質キナーゼによりリン酸化する、標準的なキナーゼ反応に従う。次いで、最終生成物を、ユーロピウムキレート化リン酸化型特異的抗体（抗−リン酸化チロシンまたはリン酸化セリン／スレオニン）およびビオチン化基質に結合するストレプトアビジン−ＡＰＣで検出できる。これらの２種の成分は結合すると空間的に一緒になり、リン酸化型特異的抗体からアクセプター（ＳＡ−ＡＰＣ）へのエネルギー転移が均一な様式で蛍光の読み取りをもたらす。
【０１３３】
Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ活性
ｃ−Ｒａｆキナーゼアッセイは、Ｌｃｋキナーゼにより活性化（リン酸化）されたｃ−Ｒａｆ酵素を用いて実施できる。Ｌｃｋ−活性化ｃ−Ｒａｆ（Ｌｃｋ／ｃ−Ｒａｆ）を、ポリヘドリンプロモーターの制御下で、ＧＳＴ−ｃ−Ｒａｆ（アミノ酸３０２からアミノ酸６４８まで）およびＬｃｋ（全長）を発現するバキュロウイルスで細胞を共感染させることにより、Ｓｆ９昆虫細胞で産生する。両バキュロウイルスは、感染効率２.５で使用し、細胞を感染の４８時間後に回収する。
【０１３４】
ＭＥＫ−１タンパク質は、ＧＳＴ−ＭＥＫ−１（全長）融合タンパク質を発現するバキュロウイルスにより、感染効率５で細胞を感染させ、細胞を感染の４８時間後に回収することにより、Ｓｆ９昆虫細胞で産生する。ＧＳＴ−ｃ−Ｒａｆ３０２−６４８およびＧＳＴ−ＭＥＫ−１に、類似の精製方法を使用する。
【０１３５】
形質移入された細胞を、湿った細胞の生物量１００ｍｇ／ｍＬで、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１４０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ７.３、０.５％ Triton X-100 およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有するバッファーに懸濁する。細胞を Polytron ホモジナイザーで破砕し、３０,０００ｇで３０分間遠心分離する。３０,０００ｇの上清を GSH-Sepharose にアプライする。この樹脂を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８.０、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０.０１％ Triton X-100 を含有するバッファーで洗浄する。ＧＳＴタグ付きタンパク質を、１００ｍＭグルタチオン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８.０、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０.０１％ Triton X-100 を含有する溶液で溶出する。精製したタンパク質を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７.５、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２０％グリセロールを含有するバッファーに透析する。
【０１３６】
試験化合物を、原液の濃度に対して三倍希釈を使用して、典型的には、５０μＭないし２０ｎＭの範囲に、ＤＭＳＯに連続希釈する（例えば、アッセイにおける最終濃度は、１μＭないし０.４ｎＭの範囲にあり得る）。ｃ−Ｒａｆ生化学アッセイは、放射性フィルターマットアッセイとして、９６ウェルの Costar ポリプロピレンプレート (Costar 3365) 中で実施する。プレートに、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.５、７０ｍＭ ＮａＣｌ、Ｌｃｋ／ｃ−Ｒａｆ８０ｎｇおよびＭＥＫ−１ １μｇを含有する溶液７５μＬを負荷する。続いて、連続希釈した個々の化合物２μＬを、ＡＴＰの添加に先立ち、この反応に添加する。５μＭ ＡＴＰおよび０.３μＣｉ［３３Ｐ］−ＡＴＰを含有するＡＴＰ溶液２５μＬで反応を開始する。プレートを密閉し、３２℃で１時間インキュベートした。４％リン酸５０μｌの添加により反応をクエンチし、Wallac Tomtec Harvester を使用してＰ３０フィルターマット (PerkinElmer) に回収する。フィルターマットを最初に１％リン酸で、２番目に脱イオンＨ２Ｏで洗浄する。フィルターをマイクロ波中で乾燥し、シンチレーション液に浸し、Wallac 1205 Betaplate Counter (Wallac Inc., Atlanta, GA, U.S.A.) で読む。結果をパーセント阻害として表す。
％阻害＝［１００−（Ｔｉｂ／Ｔｉ）］ｘ１００、式中、
Ｔｉｂ＝（阻害剤ありのカウント毎分）−（バックグラウンド）
Ｔｉ＝（阻害剤なしのカウント毎分）−（バックグラウンド）
【０１３７】
Ｒａｆ活性は、ＥＲＫリン酸化（即ち、ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ）に至るカスケードを開始させ、リン酸化−ＥＲＫをもたらす能力により監視することもできる。Bio-Plex Phospho-ERK1/2 免疫アッセイは、以下の通りに実施できる：
【０１３８】
レーザーフローサイトメトリーの基盤を使用する９６ウェルのリン酸化−ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）免疫アッセイは、細胞株の基底ｐＥＲＫの阻害を測定するために確立された。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、細胞５０,０００個／ウェルで９６ウェルのマイクロタイタープレートに完全増殖培地中で播く。基底ｐＥＲＫ１／２の阻害に対する試験化合物の効果について、播種の翌日、０.１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭにＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を移し、最終濃度３ｍＭないし１２ｎＭまで０.１％ＤＭＳＯ中に１：３希釈した試験化合物とインキュベートする。細胞を試験化合物と２時間インキュベートし、洗浄し、Bio-Plex 全細胞溶解バッファーＡに溶解する。サンプルをバッファーＢで１：１（ｖ／ｖ）に希釈し、直接アッセイプレートに移すか、または、加工するまで−８０℃で冷凍する。希釈したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞溶解液５０ｍＬを、抗−ＥＲＫ１／２抗体を結合させた約２０００個の５ミクロン Bio-Plex ビーズと、終夜、シェーカー上、室温でインキュベートする。翌日、ビオチン化リン酸化−ＥＲＫ１／２サンドイッチ免疫アッセイを実施し、各インキュベーションの間にビーズを３回洗浄し、次いで、ＰＥ−ストレプトアビジン５０ｍＬを現像剤（a developing agent）として使用する。Bio-Plex フロー細胞（プローブ）を用いて高感度で２５個のビーズを計測することにより、ｐＥＲＫ１／２の相対的蛍光単位を検出する。非処理細胞を最大値とし、細胞無し（ビーズのみ）をバックグラウンドとして、ＩＣ５０を算出する。
【０１３９】
ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ活性
ＰＫＩ３活性は、例えば、購入できるキット（例えば、Perkin-Elmer, FlashPlate Platform), Frew et al., Anticancer Res., 14(6B):2425-8, 1994 を使用して、日常的に決定できる。ＰＫＩ３阻害剤で列挙した刊行物も参照。
【０１４０】
Ａｋｔ活性
ＡＫＴは、Ｈｉｓタグ付きＡＫＴ１（ａａ１３６−４８０）を発現している昆虫細胞から、ＷＯ０５０１１７００に記載の通りに単離できる。発現している細胞を、ポリトロンを使用して、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール；ｐＨ７.５に溶解する（溶解バッファー５ｍｌ／細胞ｇ）。細胞のデブリを、２８,０００ｘｇで３０分間、遠心分離により除去する。上清を４.５ミクロンのフィルターを通して濾過し、次いで、溶解バッファーで予め平衡化したニッケルキレート化カラムに負荷する。カラムを５カラム体積（ＣＶ）の溶解バッファーで、次いで、５ＣＶの２０％バッファーＢ（ここで、バッファーＢは、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール；ｐＨ７である）で洗浄する。Ｈｉｓ−タグ付きＡＫＴ１（ａａ１３６−４８０）を、１０ＣＶを超える２０−１００％直線グラジエントのバッファーＢで溶出する。Ｈｉｓタグ付きＡＫＴＩ（１３６−４８０）溶出画分を集め、バッファーＣで３倍に希釈する（ここで、バッファーＣは、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７である）。次いで、サンプルを、バッファーＣで予め平衡化した Q-Sepharose HP カラムでクロマトグラフィーする。カラムを５ＣＶのバッファーＣで洗浄し、次いで、５ＣＶ１０％Ｄ、５ＣＶ２０％Ｄ、５ＣＶ３０％Ｄ、５ＣＶ５０％Ｄおよび５ＣＶの１００％Ｄで段階溶出する；ここで、バッファーＤは、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０００ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７.５である。
【０１４１】
Ｈｉｓタグ付きＡＫＴＩ（ａａ１３６−４８０）を含有する分画を集め、１０−ｋＤａ分子量のカットオフの濃縮器で濃縮する。Ｈｉｓタグ付きＡＫＴ１（ａａ１３６−４８０）を、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ；ｐＨ７.５で予め平衡化した Superdex 75 ゲル濾過カラムでクロマトグラフィーする。Ｈｉｓタグ付きＡＫＴ１（ａａ１３６−４８０）画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析を使用して調査する。タンパク質を集め、濃縮し、８０℃で保存する。
【０１４２】
Ｈｉｓタグ付きＡＫＴ２（ａａ１３８−４８１）およびＨｉｓタグ付きＡＫＴ３（ａａ１３５−４７９）は、同様に単離および精製できる。
【０１４３】
ＡＫＴ酵素アッセイ化合物を、ＡＫＴタンパク質セリンキナーゼ阻害活性について、基質リン酸化アッセイで試験できる。このアッセイは、低分子有機化合物の、ペプチド基質のセリンリン酸化を阻害する能力を調べるものである。基質リン酸化アッセイは、ＡＫＴ１、２または３の触媒ドメインを使用する。ＡＫＴ１７２および３も、Upstate USA, Inc. から購入できる。この方法は、単離された酵素がＡＴＰからビオチン化合成ペプチド（ビオチン−ａｈｘ−ＡＲＫＲＥＲＡＹＳＦＧＨＨＡ−アミド）のセリン−７２残渣へのガンマ−ホスフェートの移動を触媒する能力を測定する。基質のリン酸化は、ＷＯ０５０１１７００に記載されている以下の方法により検出できる。
【０１４４】
アッセイは、３８４ウェルのＵ底白色プレートで実施する。１０ｎＭの活性化ＡＫＴ酵素を、４０分間室温で、５０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７.５、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４ｕＭ ＡＴＰ、８ｕＭペプチド、０.０４ｕＣｉ［ｇ−３３Ｐ］ＡＴＰ／ウェル、１ｍＭ ＣＨＡＰＳ、２ｍＭ ＤＴＴおよび１００％ＤＭＳＯ中の試験化合物１μｌを含有するアッセイ量２０ｕｌでインキュベートする。ＳＰＡビーズミックス（ダルベッコのＭｇ２＋およびＣａ２＋を含まないＰＢＳ、０.１％ Triton X-100、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０μＭ ＡＴＰ、２.５ｍｇ／ｍｌストレプトアビジン−被覆ＳＰＡビーズ）５０μｌの添加により反応を停止する。プレートを密閉し、ビーズを終夜かけて沈殿させ、次いでプレートを Packard Topcount Microplate Scintillation Counter (Packard Instrument Co., Meriden, CT) でカウントした。
【０１４５】
用量応答についてのデータを、データ換算式１００＊（Ｕ１−Ｃ２）／（Ｃ１−Ｃ２）で算出される％対照対化合物濃度（式中、Ｕは未詳値であり、Ｃ１は、ＤＩＶＩＳＯについて得られる平均対照値であり、Ｃ２は、０.１Ｍ ＥＤＴＡについて得られる平均対照値である）として、プロットできる。データを、ｙ＝（（Ｖｍａｘ＊ｘ）Ｋ＋ｘ））（式中、Ｖｍａｘは、上側の漸近線であり、ＫはＩＣ５０である）により表される曲線にフィットさせる。
【０１４６】
細胞増殖
細胞増殖アッセイの例を下記の実施例に記載する。しかしながら、増殖アッセイは、任意の適する方法により実施できる。例えば、乳癌細胞増殖アッセイは、以下の通りに実施できる。他の細胞タイプを、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株と置き換えることができる。
【０１４７】
ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ ＭＢ−２３１、ＮＣＩ）を、１０％熱非動化ＦＢＳを添加した標準的増殖培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃、５％ＣＯ２（ｖｏｌ／ｖｏｌ）中、加湿インキュベーター内で培養する。細胞を、細胞３０００個／ウェルの密度で、増殖培地９０μＬ中、９６ウェル培養ディッシュに播く。Ｔ０時間ＣＴＧ値を決定するために、播種の２４時間後、CellTiter-Glo Luminescent Reagent (Promega) １００μＬを各ウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートする。Wallac Victor II 装置で発光を記録する。CellTiter-Glo 試薬は細胞の溶解およびＡＴＰ存在量に比例する発光シグナルの生成をもたらし、それは、今度は、存在する細胞の数に直接比例する。
【０１４８】
試験化合物を１００％ＤＭＳＯに溶解し、１０ｍＭ原液を調製する。原液をさらに増殖培地中で１：４００に希釈し、０.２５％ＤＭＳＯ中の２５μＭ試験化合物の作業原液を得る。試験化合物を、全ウェルで一定のＤＭＳＯ濃度を維持するために、０.２５％ＤＭＳＯを含有する増殖培地で連続希釈する。希釈した試験化合物６０μＬを各培養ウェルに添加し、最終体積１８０μＬとする。個々の試験化合物を含む細胞および含まない細胞を７２時間インキュベートし、以前に記載した通りにその時間でＡＴＰ依存的発光を測定し、Ｔ７２時間値を得る。場合により、ＩＣ５０値は、化合物濃度対パーセント阻害を使用して、最小二乗解析プログラムで決定できる。
％阻害＝［１−（Ｔ７２時間試験−Ｔ０時間）／（Ｔ７２時間対照−Ｔ０時間）］ｘ１００、式中、
Ｔ７２時間試験＝試験化合物存在下、７２時間でのＡＴＰ依存的発光
Ｔ７２時間対照＝試験化合物非存在下、７２時間でのＡＴＰ依存的発光
Ｔ０時間＝時間ゼロでのＡＴＰ依存的発光
【０１４９】
血管新生
血管新生を研究するための１つの有用なモデルは、増殖因子（例えばＦＧＦ−１）を添加した Matrigel などの再構成された基底膜マトリックスを宿主動物に皮下注射すると、内皮細胞がマトリックスにリクルートされ、数日間で新しい血管を形成するという観察を基礎とする。例えば、Passaniti et al., Lab. Invest., 67:519-528, 1992 参照。抽出物のサンプルを様々な時間で取ることにより、血管新生を時間的に分析でき、例えば、内皮細胞のマトリックスへの遊走、内皮細胞の血管新生経路への参入、細胞の伸長および袋状空間の形成および赤血球細胞を含有する連結した線状の構造を含む機能的毛細血管の確立を含む、血管新生の全段階に関与する遺伝子の同定を可能にする。増殖因子を安定化する、かつ／または、マトリックスからのその放出を遅延させるために、増殖因子をヘパリンまたは他の安定化剤に結合させることができる。血管新生過程を増強および延長するために、マトリックスに定期的に増殖因子を再注入することもできる。
【０１５０】
血管新生を研究するための他の有用なシステムには、例えば、腫瘍外植片の新血管新生（例えば、米国特許第５,１９２,７４４号；第６,０２４,６８８号）、ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイ（例えば、Taylor and Folkman, Nature, 297:307-312, 1982; Eliceiri et al., J. Cell Biol., 140, 1255-1263, 1998）、ウシ毛細血管内皮（ＢＣＥ）細胞アッセイ（例えば、米国特許第６,０２４,６８８号；Polverini, P. J. et al., Methods Enzymol., 198: 440-450, 1991）、遊走アッセイ、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯血管内皮細胞）増殖阻害アッセイ（例えば、米国特許第６,０６０,４４９号）が含まれる。
【０１５１】
本発明は、以下の特徴の１つまたはそれ以上を提供する：
少なくとも１種の式Ｉの化合物および少なくとも１種のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤である第２の化合物の有効量を投与することを含む、上述の疾患および／または症状のいずれかの処置方法。
少なくとも１種の式Ｉの化合物および少なくとも１種のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤である第２の化合物の有効量を投与することを含む、１つまたはそれ以上の上述の活性の調節（例えば阻害）方法。
少なくとも１種の式Ｉの化合物および少なくとも１種のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤である第２の化合物を含む組合せ。
【０１５２】
さらなる詳述がなくとも、当業者は先行する記載を使用して、本発明をその最大限まで利用できると考えられる。従って、以下の好ましい特別な実施態様は、単なる例示説明と解釈されるべきであり、本開示の残りの部分を何ら限定するものでは決してない。上記および下記で引用する全ての特許および刊行物の全開示を、出典明示により全体的に本明細書の一部とする。
【実施例】
【０１５３】
実施例
ヒト細胞の単離および培養
インフォームドコンセントを得た後、日常的な包皮切除後のヒト包皮からヒト線維芽細胞を単離した。皮膚のサンプルを、４℃で、ペニシリン、ゲンタマイシンおよびアンホテリシンを含有するＣａ２＋またはＭｇ２＋を含まないハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳｗ／ｏＣａ２＋またはＭｇ２＋）中で保存した。皮下脂肪を切り取り、残っている真皮を細分し、有効成分（１２）として０.２５％トリプシンを含有する溶液Ｂ中、約１９時間、４℃で消化した。トリプシンの作用を溶液Ａ（１２）で停止し、それに続いて表皮を真皮から分離した。ヒト線維芽細胞をヒト包皮の真皮外植片から入手し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。植え継ぎ７回までの線維芽細胞を黒色腫の再構築に使用した。Ｓｋｍｅｌ２８（１３）および４５１Ｌｕ（１４）転移性ヒト黒色腫細胞を、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地中、および、５μｇ／ｍｌインシュリンおよび２％ＦＢＳを含有するＭＣＤＢ１５３／Ｌ１５培地中で各々培養した（１５）。
【０１５４】
転移性黒色腫のインビトロでの再構築
転移性黒色腫のインビトロでの再構築は、器官型ヒト皮膚培養技法を基礎とする（１４）。１０％ＦＢＳを含むダルベッコ変法イーグル培地中、最終濃度１.３５ｍｇ／ｍｌのラット尾Ｉ型コラーゲン（BD Biosciences, Bedford, MA, USA）からなる無細胞緩衝コラーゲン溶液を調製した。無細胞コラーゲン溶液１.０ｍｌを、６ウェル組織培養プレートに置いた組織培養インサート（Millicell PC, Millipore, Bedford, MA, USA）に添加した。無細胞コラーゲン層が固体化している間に、第２のコラーゲン溶液を、第１のものと同様に、ヒト線維芽細胞および黒色腫細胞ＳＫＭＥＬ２８または４５１ＬＵを添加して調製した。準コンフルエントの培養からのヒト線維芽細胞およびヒト黒色腫細胞をトリプシン処理し、洗浄し、第２のコラーゲン溶液に１５ｘ１０５／ｍｌの密度で、線維芽細胞の黒色腫細胞に対する比１：１で、再懸濁した。コラーゲン溶液を含有する線維芽細胞および黒色腫細胞３.０ｍｌを、固体化した無細胞コラーゲン層の上に置いた。５日間、３７℃でのインキュベーションの後、線維芽細胞の収縮力はコラーゲンゲルの収縮を引き起こす。この構造は、皮膚等価物における黒色腫の再構築物に相当する。液内培養条件では、１０％ＦＢＳを添加した黒色腫細胞培養培地３ｍｌをインサートの下に、２ｍｌをインサートの内側に添加し、播種された細胞の増殖を可能にした。培養培地を２日毎に交換した。液内培養の１０ないし１４日後、黒色腫再構築物を回収し、評価した。
【０１５５】
黒色腫細胞のシグナル伝達経路阻害剤による処理
ＡＫＴおよびＭＡＰＫシグナル伝達経路の遮断のために、ＰＩ３Ｋ阻害剤ワートマニン（Sigma, Steinheim, Germany）およびＢＡＹ４３−９００６を、単独または組合せで、黒色腫再構築物または単層培養の黒色腫細胞の培養培地に、各々４μＭおよび６μＭで直接添加した。これらの濃度は、黒色腫細胞に有効であると以前に記載された（１６）。培養培地を２日毎に交換した。黒色腫再構築物を、培養培地または対照として役立つＤＭＳＯを添加した培養培地で処理した。全実験をデュプリケートで行い、２回繰り返した。
【０１５６】
免疫組織化学
黒色腫再構築物を、４％ホルムアルデヒドで８−９時間固定し、脱水し、パラフィンに包埋した。日常的な光学顕微鏡観察のために、パラフィン切片をヘマトキシリンで染色した。免疫組織化学のために、黒色腫再構築物のパラフィン切片を、リン酸化−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）およびリン酸化−ＥＲＫ（リン酸化−ｐ４４／４２ＭＡＰキナーゼ、Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）用のモノクローナル抗体（New England Biolabs, Frankfurt am Main, Germany）、増殖マーカーとしてのＫｉ−６７（Dianova, Hamburg, Germany）、活性カスパーゼ３用のポリクローナル抗体（R&D Systems, Wiesbaden, Germany）、またはβ３インテグリンサブユニット１７およびＭｅｌＣＡＭ用のモノクローナル抗体（Novocastra Laboratories, Newcastle upon Tyne, UK）とインキュベートした。切片をＰＢＳで洗浄し、各々の二次抗体（Vector, Burlingame, CA）と室温で３０分間インキュベートした。さらにＰＢＳで洗浄した後、切片を Vectastain（登録商標） ABC-AP System (Vector, Burlingame, CA）と室温で１時間インキュベートした。切片を再度ＰＢＳで洗浄し、ニューフクシンで現像し、ヘマトキシリンで対比染色した。
【０１５７】
増殖アッセイ
細胞を、トリプリケートで、９６ウェルプレートに、細胞１,５００個／ウェルの密度で、培地１５０μｌ（細胞１ｘ１０４個／ｍｌ）中に播いた。ＰＩ３Ｋ阻害剤ワートマニン（Sigma, Steinheim, Germany）を、２−２０μＭの範囲の濃度で培養培地に直接添加した。ＢＡＹ４３−９００６を、０.５−７μＭの範囲の濃度で培養培地に直接添加した。培養培地、培養培地で処理した細胞およびＤＭＳＯを添加した培養培地で処理した細胞を、対照に供した。示した時点でアッセイを開始した。培地を廃棄し、各ウェルをＰＢＳ（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まない）で２回洗浄し、ＭＵＨ（４−メチルウンベリフェリル−ヘパノエート）１００μｇ／ｍｌＰＢＳの溶液１００μｌを添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、Fluoroskan II (Labsystems, Helsinki)において、λｅｍ３５５ｎｍおよびλｅｘ４６０ｎｍを用いて測定した。蛍光の強度は、ウェル中の生存細胞の数を示す（１８,１９）。
【０１５８】
フローサイトメトリー
１ｘ１０５−１ｘ１０６個の４５１Ｌｕ転移性黒色腫細胞の表面タンパク質を、以下の通りに染色した：細胞を５分間１,８００ｒｐｍ（Heraeus variofuge 3.OR）でペレット化し、１ｘＰＢＳ／１％ＢＳＡでブロックし、遠心分離後、Ｍｅｌ−ＣＡＭ（QBiogene-Alexis）またはａｖβ３インテグリン（BD Biosciences, Heidelberg）に対する抗体と、１５分間室温でインキュベートした。細胞を１ｘＰＢＳ／１％ＢＳＡで洗浄し、続いて抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ（BD Biosciences, Heidelberg）またはマウスＩｇＧ−アイソタイプコントロール−ＦＩＴＣ単独（BD Biosciences, Heidelberg）とインキュベートした。洗浄および細胞のペレット化の後、細胞のペレットを１ｘＰＢＳに再懸濁し、FACScalibur (BD Bioscienses, Heidelberg）で測定した。
【０１５９】
結果
ＭＡＰＫまたはＡＫＴシグナル伝達経路の遮断は、黒色腫細胞の増殖および接着受容体の発現に対して異なる効果を誘導する
黒色腫細胞の増殖に対するＭＡＰＫまたはＡＫＴシグナル伝達経路のいずれかまたは両方の阻害の効果を分析するために、我々は単層の転移性黒色腫細胞株４５１ＬｕをＰＩ３Ｋ阻害剤ワートマニン、ＢＡＹ４３−９００６または両方で処理した。過去の研究（６−１６）に基づき、我々は作業用濃度として４μＭワートマニンおよび６μＭ ＢＡＹ４３−９００６を選択した。
【０１６０】
これらのシグナル伝達経路の阻害の細胞増殖に対する効果を、４−メチルウンベリフェリル−ヘパノエート（ＭＵＨ）を使用する蛍光測定アッセイにより測定した（１８,１９）。対照４５１Ｌｕ転移性黒色腫細胞および２−２０μＭの範囲の用量のＰＩ３Ｋ阻害剤ワートマニンで処理した４５１Ｌｕ転移性黒色腫細胞からの単相培養を比較すると、増殖している細胞の数に対する効果は、ほとんどまたは全く見られなかった（図１Ａ）。対照的に、４５１Ｌｕ細胞の増殖速度は、１−７μＭの範囲の用量のＢＡＹ４３−９００６による処理後に有意に低下した（図１Ｂ）。Ｓｋｍｅｌ２８転移性黒色腫細胞で同様の知見が得られた。これは、ＭＡＰＫシグナル伝達経路の遮断は単層の黒色腫細胞の増殖を阻害するが、ＡＫＴはしないことを示す。
【０１６１】
さらに、我々は、これらのシグナル伝達経路の阻害が、黒色腫細胞の浸潤において鍵となる役割を果たすと知られている接着分子ＭｅｌＣＡＭおよびａｖβ３の発現に影響を与えるか否かを調べた。４５１Ｌｕ転移性黒色腫細胞におけるＭｅｌＣＡＭおよびａｖβ３インテグリンの発現に対するＰＩ３Ｋ阻害剤ワートマニンおよびＢＡＹ４３−９００６の効果を、処理開始の９６時間後にフローサイトメトリーにより分析した（図２）。興味深いことに、ＡＫＴの遮断は接着分子ＭｅｌＣＡＭの発現を下方調節したが、ａｖβ３インテグリンを下方調節せず、一方、ＥＲＫの遮断はａｖβ３インテグリンの発現を下方調節したが、ＭｅｌＣＡＭを下方調節しなかった。同様の効果がＳｋｍｅｌ２８転移性黒色腫細胞で見られた。
【０１６２】
ＭＡＰＫシグナル伝達経路の遮断はヒト皮膚再構築物において黒色腫細胞の増殖を阻害するが、ＡＫＴはしない
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路およびＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路の阻害が生理的な状況で黒色腫の成長および生存に影響を与えられるか否かを判定するために、Ｓｋｍｅｌ２８転移性黒色腫細胞を、ヒトの皮膚再構築物に導入した。再構築した転移性黒色腫を、４μＭワートマニン、６μＭ ＢＡＹ４３−９００６またはワートマニンとＢＡＹ４３−９００６の組合せで処理した。阻害剤を培養培地に１日おきに２−３週間にわたり添加した。これらの阻害剤濃度は、リン酸化ＡＫＴまたはＥＲＫの免疫組織化学において各々見られる通り、ＡＫＴまたはＭＡＰ−キナーゼ経路のリン酸化の阻害において有効であった。これらの阻害剤の抗増殖効果を評価するために、黒色腫再構築物をＫｉ−６７増殖マーカーで染色した。図３Ａで見ることができる通り、阻害剤で処理されたか、または、ＤＭＳＯでのみ処理したＳｋｍｅｌ２８転移性黒色腫細胞の殆どは、皮膚再構築物中で増殖した。増殖速度に対する効果は、ワートマニンで処理した転移性黒色腫再構築物では殆どまたは全く観察されなかった（図３Ｂ）。対照的に、ＢＡＹ４３−９００６による処理は、細胞増殖の有意な減少をもたらした（図３Ｃ）。Ｓｋｍｅｌ２８転移性黒色腫細胞を皮膚再構築物に導入し、阻害剤を組み合わせて処理すると、Ｓｋｍｅｌ２８黒色腫細胞の増殖は完全に阻止された（図３Ｄ）。これらのデータは、ＢＡＹ４３−９００６は転移性黒色腫細胞の成長を単層で制限するのみならず、生理的状況でも制限し、ＰＩ３ＫおよびＭＡＰＫシグナル伝達経路の阻害の組合せは、黒色腫細胞の増殖を完全に排除することを示す。
【０１６３】
ＡＫＴおよびＭＡＰＫシグナル伝達経路の遮断は、皮膚再構築物において黒色腫細胞のアポトーシスを誘導する
器官型培養におけるＰＩ３Ｋ阻害剤ワートマニンおよび／またはＢＡＹ４３−９００６の黒色腫細胞の生存に対する効果を調べるために、対照および阻害剤処理Ｓｋｍｅｌ２８転移性黒色腫再構築物を、進行中のアポトーシスのマーカーとして活性カスパーゼ３について染色した。皮膚再構築物に導入された対照Ｓｋｍｅｌ２８転移性黒色腫細胞の殆どは、細胞質中の活性カスパーゼ３について陰性であった（図４Ａ）。対照的に、活性カスパーゼ３は、ＰＩ３Ｋ阻害剤ワートマニン（図４Ｂ）またはＢＡＹ４３−９００６（図４Ｃ）または両方（図４Ｄ）で処理したヒト皮膚再構築物中のＳｋｍｅｌ２８転移性黒色腫細胞の大部分で見られた。これらの観察は、転移性黒色腫細胞の生存におけるＡＫＴおよびＭＡＰＫの両シグナル伝達経路の関与を示唆する。
【０１６４】
ＡＫＴおよびＭＡＰＫシグナル伝達経路の遮断は、皮膚再構築物中の転移性黒色腫細胞において接着分子ＭｅｌＣＡＭおよびａｖβ３インテグリンの発現を各々下方調節する
我々および他の人々は、以前に、接着分子ＭｅｌＣＡＭおよびａｖβ３インテグリンが黒色腫の進行および浸潤に鍵となる役割を果たすことを記載した（９、６、１０、１１）。従って、我々は、ＭｅｌＣＡＭおよびａｖβ３インテグリンの発現に対するＡＫＴおよびＲＡＦの遮断の効果を調べた。生理的状況における受容体の発現を分析するために、転移性黒色腫細胞Ｓｋｍｅｌ２８およびＷＭ４５１Ｌｕをヒト皮膚再構築物に導入し、ＰＩ３Ｋ阻害剤ワートマニン（４μＭ）、ＢＡＹ４３−９００６（６μＭ）または両阻害剤の組合せで処理した。対照および阻害剤処理した転移性黒色腫再構築物を、接着分子ＭｅｌＣＡＭ（図５Ａ−Ｄ）およびβ３インテグリン（図５Ｅ−Ｈ）について各々染色した。
【０１６５】
ワートマニン処理はＭｅｌＣＡＭの発現を下方調節したが、β３インテグリンの発現は影響を受けなかった（図５Ａ−Ｈ）。一方で、β３インテグリンの発現はＢＡＹ４３−９００６処理で有意に減少したが、ＭｅｌＣＡＭ発現は影響を受けなかった。両阻害剤による処理は、ＭｅｌＣＡＭおよびβ３インテグリンの発現の下方調節をもたらした。これらのデータは、両接着分子を下方調節するには、両シグナル伝達経路−ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴおよびＭＡＰ−キナーゼ−を遮断しなければならないことを示す。
【０１６６】
ＡＫＴおよびＭＡＰＫシグナル伝達経路の遮断は、浸潤性黒色腫の成長を阻害する
最後に、我々は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路およびＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路の阻害が浸潤性黒色腫の成長に生理的状況で影響を与えられるか否かを判定した。Ｓｋｍｅｌ２８転移性黒色腫細胞をヒト皮膚再構築物に導入した。再構築された転移性黒色腫を４μＭワートマニン、６μＭＢＡＹ４３−９００６またはワートマニンとＢＡＹ４３−９００６の組合せで処理した。転移性Ｓｋｍｅｌ２８黒色腫細胞を再構築されたヒトの真皮に導入すると、それらは、真皮全体にわたり多数の腫瘍細胞巣の迅速な成長を示した（図６Ａ）。ワートマニンによるＡＫＴシグナル伝達経路の阻害またはＢＡＹ４３−９００６によるＭＡＰＫシグナル伝達経路などの阻害は、再構築された真皮においてＳｋｍｅｌ２８転移性黒色腫細胞の浸潤性腫瘍成長の低減をもたらした（図６ＢおよびＣ）。ＰＩ３Ｋ阻害剤ワートマニンによる処理後（図６Ｂ）、黒色腫細胞巣の数およびサイズは減少し、ゆるんだように見え、このことは、黒色腫−黒色腫細胞の接着が低下したことを示唆する。さらに、黒色腫細胞は、多樹状の形態を示した。阻害剤ＢＡＹ４３−９００６の適用（図６Ｃ）も、黒色腫細胞巣の数およびサイズを低下させた。
【０１６７】
小さい黒色腫細胞巣および単一の黒色腫細胞は、真皮中に散在していた。さらに、ワートマニンとＢＡＹ４３−９００６の組合せによるＡＫＴおよびＭＡＰＫシグナル伝達経路の同時遮断は、浸潤性黒色腫成長を完全に排除し、ごく少数の丸い黒色腫細胞が真皮に残った（図６Ｄ）。同様の結果は、転移性黒色腫細胞株４５１Ｌｕで得られた。
【０１６８】
参考文献
1. Blume-Jensen, and Hunter, Nature, 411: 355-365, 2001. 
2. Davies et al., Nature, 417: 949-954, 2002. 
3. Satyamoorthy et al., Cancer Res, 63: 756-759, 2003. 
4. Ahmad et al., The Royal Marsden experience. 2004. 
5. Nicholson and Anderson, Cell Signal, 14: 381-395, 2002. 
6. Li et al., Oncogene, 22: 6891-6899, 2003. 
7. Vivanco and Sawyers, Nat Rev Cancer, 2: 489-501, 2002. 
8. Downward, Curr Opin Cell Biol, 10: 262-267, 1998. 
9. Satyamoorthy et al. Oncogene, 20: 4676-4684, 2001. 
10. Hsu et al., Am J Pathol, 153: 1435-1442, 1998. 
11. Sturm et al., Cancer Res, 62: 226-232, 2002. 
12. Pittelkow et al., Mayo Clin Proc, 61: 771-777, 1986. 
13. Carey et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 73: 3278- 3282, 1976. 
14. Meie et al., Am J Pathol, 156: 193-200, 2000. 
15. Hsu et al., The Wistar melanoma (WM) cell lines. In J. R. W. Masters and B. Palsson (eds.), Human Cell Culture, pp. 259-274. Norwell, Massachusetts: Kluwer Academic Publishers, 1999. 
16. Karasarides et al., Oncogene, 23: 6292-6298, 2004. 
17. Van Belle et al., Hum Pathol, 30: 562-567, 1999. 
18. Virag et al., J.Immunol.Methods, 185: 199-208, 1995. 
19. Zouboulis et al., Melanoma Res., 1: 91-95, 1991. 
【国際調査報告】
2008545670.tif 000046
2008545670.tif 000047
2008545670.tif 000048
2008545670.tif 000049