(57)【要約】  脳卒中が起こっている、または起こったことがある患者にAMPK阻害薬である化合物を投与することを含む、神経保護方法。これら物質により処置すると梗塞サイズが有意に減少し、それゆえ脳組織およびニューロンの欠損が最小限となる。つまり、脳において脳卒中または虚血性傷害後に機能を保存することができる。同様に、ニューロンにおけるエネルギー利用およびエネルギー利用可能性を乱すことによりニューロンの損傷を引き起こす変性疾患におけるニューロンの欠損を最小限とすることができる。
2008504228.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳卒中または他の病因による他の脳血流遮断が起こっている、または起こったことがある被験体に、AMPK阻害薬である化合物を投与することを含む、神経保護方法。
【請求項２】
化合物がペプチドまたは他の生物学的物質もしくは生物由来物質でない、請求項１の方法。
【請求項３】
化合物がC75である、請求項２の方法。
【請求項４】
化合物が化合物 Cである、請求項２の方法。
【請求項５】
化合物がC75または化合物 Cでない、請求項２の方法。
【請求項６】
化合物が低分子である、請求項１の方法。
【請求項７】
AMPK阻害薬を含む、脳卒中を処置するための医薬組成物。
【請求項８】
AMPK阻害薬が直接的阻害薬である、請求項７の医薬組成物。
【請求項９】
AMPK阻害薬が間接的阻害薬である、請求項７の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
脳卒中は、脳循環の崩壊に起因する脳機能異常と定義され、米国における主要な死因の１つである。脳卒中から死に至らなかった場合でも、犠牲者は深刻な身体的および感情的損傷などの負担を負い、その結果生産性が欠如しうる。これらの負担は、脳卒中により犠牲者の脳に起こった重度の損傷に起因する。酸素およびグルコースの減少により、細胞は、タンパク質合成の崩壊、細胞内エネルギー貯蔵の枯渇、細胞膜の不安定化、およびNMDA受容体の活性化を即座に示し、脳において興奮毒性的かつ酸化的な細胞損傷をもたらす。酸化的損傷を乗り越えて修復し、そして細胞に恒常性を取り戻そうとして、数多くの代償性エネルギー消費プロセスが活性化される。しかしなら、これら経路の過剰な活性化は有害な場合があり、さらに細胞エネルギーを減少させ、結果としてさらなる脳損傷をもたらす。かかる脳損傷は通常不可逆的である。したがって、脳組織を脳卒中の間の損傷から保護する(神経保護)方法 は非常に重要である。
【０００２】
AMP活性化プロテインキナーゼ(AMPK)は、代謝物感知タンパク質キナーゼファミリー（metabolite-sensing protein kinase family）のメンバーであり、末梢のエネルギーバランスのセンサーとして知られる (Carling D.,”The AMP-activated protein kinase cascade-a unifying system for energy control.”Trends Biochem Sci 6: 314 (2): 580-585,2004.)。AMPKは、触媒性αサブユニット（α1およびα2）および2つの調節サブユニット（βおよびγ）から構成されるヘテロ三量体タンパク質である。AMPKは、細胞エネルギーレベルが低い場合にリン酸化および活性化される。AMPKは続いて細胞代謝を調節し、慢性的に遺伝子発現を調節し、ATPレベルを回復させる。AMP/ATP比の増加、細胞内pHおよび還元状態の変化、およびクレアチン/ホスホクレアチン比の増加がAMPKを活性化することが知られている (Hardie DG, Salt IP, Hawley SA, Davies SP, ”AMP-activated protein kinase : an ultrasensitive system for monitoring cellular energy charge,”Biochem J 338 : 717-22,1999 ; Hawley SA, Davison M, Woods A, et al. ,”Characterization of the AMP-activated protein kinase kinase from rat liver and identification of threonine 172 as the major site at which it phosphorylates AMP-activated protein kinase,”J Biol Chem 271:27879-87, 1996. )。AMPKは、エネルギー減少細胞におけるATPレベルを補強するため、脂肪酸酸化を増加させ、脂肪酸合成を制限する。しかしながら、脂肪酸酸化の限度が制限されるニューロンでは、この効果は有害となりうる(Almeida A, Moncada S, Bolanos JP, ”Nitric oxide switches on glycolysis through the AMP protein kinase and 6-phosphofructo-2-kinase pathway, ”Nature Cell Biology 6 : 45-51, 2004)。
【０００３】
パルミテートの新規合成に重要な酵素である脂肪酸合成酵素 (FAS)を、米国特許第5981575号（引用により本明細書に含まれる）に開示される合成FAS阻害薬であるC75により阻害すると、ニューロンを含む多くのタイプの細胞においてATPレベルが増加する。AMPKは、食物摂取の調節に関与すると考えられる視床下部におけるニューロンに高発現する。視床下部のリン酸化AMPK (pAMPK) は飢餓により増加する； C75処置はAMPKを不活性化および脱リン酸化し、そして深刻な拒食症を誘発する。
【０００４】
エネルギー供給を受けられないニューロンにおけるAMPK活性化の結果は未知である。本発明より以前は、ストレス下のAMPK活性化が保護的であるが損傷的であるかは明らかでなかった。脳卒中におけるAMPKの役割を調べた先行技術は存在しない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
出願人は、脳卒中が起こっている、または起こったことがある患者にAMPK阻害薬である化合物を投与することを含む、神経保護方法を発明した。
【発明の効果】
【０００６】
これら物質の処置により、梗塞サイズが有意に減少し、それにより脳組織およびニューロンの欠損が最小限に抑えられた。つまり、脳卒中または脳における虚血性傷害後に機能を保存することができる。同様に、ニューロンにおけるエネルギー利用およびエネルギー利用可能性を乱すことによって神経損傷を引き起こす変性疾患において、ニューロンの欠損を最小限に抑えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
「神経保護」とは、脳細胞、好ましくはニューロンを、脳卒中によりその脳卒中の間または後に引き起こされる永続的な損傷から保護する手段を意味する。
【０００８】
「脳卒中」とは、脳循環の崩壊に起因する脳機能における異常を意味する。
【０００９】
「AMPK阻害薬」とは、Witters, et al., Journal of Biological Chemistry, 267, pp.2864-2867 (1992)に記載の方法により測定されるようにAMPKを阻害する化合物を意味する。
【００１０】
好ましくは、AMPK阻害薬は、ペプチドまたは他の生物学的（biological）物質（もしくは生物由来(biologically-derived)物質）ではなく低分子である化合物から選択される。
【００１１】
本発明の組成物は、ヒトおよび他の動物に投与するため、単位投与形態、例えば、錠剤、カプセル、丸剤、粉末、顆粒、滅菌非経口溶液もしくは懸濁液、経口溶液もしくは懸濁液、好適な量の化合物を含有する水中油滴および油中水滴エマルジョン、坐剤および液体懸濁液もしくは溶液にて提供することができる。本明細書で使用する場合、用語「医薬用希釈体」と「医薬用担体」は同義である。経口投与のため、固体または液体の単位投与形態のいずれも調製可能である。固体組成物、例えば錠剤を調製するため、化合物は常套的な成分と混合することができ、それは例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム、第二リン酸カルシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、硫酸カルシウム、デンプン、乳糖、アカシア、メチルセルロース、および医薬用希釈体または担体として機能的に同様の物質である。カプセルは、化合物を不活性な医薬用希釈体と混合し、この混合物を適当な大きさの硬ゼラチンカプセルに充填することによって調製する。軟ゼラチンカプセルは、化合物と許容される植物油、軽流動ワセリンまたは他の不活性油とのスラリーの機械封入によって調製する。
【００１２】
液体単位投与形態または経口投与形態、たとえばシロップ、エリキシルおよび懸濁液が調製可能である。これら形態は、水性媒体に糖、芳香族系香料および保存剤とともに溶解して、シロップとすることができる。懸濁液は、水性媒体を用いて、懸濁剤、例えばアカシア、トラガカント、メチルセルロースなどの補助のもと調製可能である。
【００１３】
非経口投与のため、液体単位投与形態を、化合物と滅菌媒体とを利用して調製可能である。溶液の調製においては、化合物を注射用水に溶解し、濾過滅菌し、そして適当なバイアルまたはアンプルに充填し密閉すればよい。アジュバント、例えば局所麻酔薬、保存剤および緩衝剤を媒体に溶解することができる。組成物をバイアルに充填後凍結して、水分を吸引により除去することができる。凍結乾燥粉末は、続いてバイアル中で計量し、使用前に再構成することができる。
【００１４】
被験体は、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトである。
【００１５】
治療の投与量および期間は、以下のような様々な因子に依存する： (1) 被験体の年齢、体重および臓器機能(例えば、肝臓および腎臓機能); (2) 処置しようとする疾患過程の性質および程度、および何らかの既存の顕著な併存疾患および使用中の併用薬、および(3) 薬物関連パラメーター、例えば投与経路、治癒に必要な投与頻度および期間、および薬物の治療インデックス。通常、投与量は、血清レベル1 ng/ml〜100 ng/mlを達成し、標的部位での有効濃度が約 1μg/ml〜10μg/mlに到達するよう選択される。
【００１６】
理想的には、化合物は、脳卒中発生後できるだけ早く投与する。 
【００１７】
本発明より以前は、脳傷害に対するニューロンの代謝の役割は知られていなかった。理論に拘束される意図ではないが、本発明によりこの度、pAMPKがマウスの局所再灌流モデルにおいて虚血性脳卒中後に上昇することが明らかとなった。AMPKは、虚血性傷害の90分以内に上昇し、初期の再灌流の間に4倍増加した。また本発明により、AMPK阻害薬の投与により、AMPK活性化が減少する(AMPKリン酸化の減少により示される)だけでなく、有意な神経保護もまた提供されることがわかった。さらに、AMPK活性化薬の投与により脳卒中損傷が悪化しうることもわかった。
【００１８】
理論に拘束される意図はないが、AMPKは、生理学的エネルギー調節に重要な役割を果たすと同時に、虚血性ストレス後の細胞生存に大きな効果を有すると考えられる。虚血性ストレス中はエネルギー要求が高いが、基質(酸素およびグルコース)の欠乏のためエネルギー供給は低い。細胞エネルギー感知とAMPK活性化を妨害することにより、細胞の虚血閾値を拡大し、エネルギー不足ではあるが静止状態にてエネルギー産生を回復できるまで細胞を生存させうる。合成FAS阻害薬/CPT-1刺激薬、例えばC75、による代謝経路の制御によって、ニューロンの代謝を変化させ、正のエネルギーバランスを創出することができる。C75は、皮質培養物およびインビボ視床下部の両方においてAMPKを阻害し、このことはAMPKが神経エネルギーバランスに応答することを示唆する。C75投与により、培養ニューロンにおける神経ATPレベルが持続的に増加する。虚血条件下では継続的なATP枯渇がエネルギー回復経路を上回り、細胞はアポトーシスのエネルギー消費プロセスにより死ぬことができなくなり、ネクローシス細胞死を起こすようにするのかもしれない。つまり、ATPレベルの感知は虚血に対する神経の応答に重要であり得、AMPK阻害薬はATPおよびニューロン。
【００１９】
AMPK活性化は脳虚血の後に起こる；この条件下において、その活性化は神経の生存に有害である。AMPKはニューロンに局在し、虚血後の脳において(グリアでの局在化とは反対に)この分布パターンを保持した。AMPKは、インビボでの血管閉塞の90分以内、およびにインビトロでの酸素グルコース欠乏(OGD)の後2時間以内に、迅速に活性化された。AMPKレベルの増加は、脳全体で、周辺部（penumbral）領域と虚血性傷害から遠く離れた領域との両方において観察された。当初この増加は、エネルギー要求が増加した場合に脳がATP産生を増加することができるメカニズムとして、神経ストレスに対する適応反応と考えられた。しかしながら驚いたことに、本発明者らの薬理学的研究は明らかに、神経虚血条件下におけるAMPK活性化の阻害により脳卒中損傷が減少することを示す。本発明者らのモデルにおいて、AMPK阻害薬の化合物 CまたはFAS 阻害薬のC75を投与すると、有意な神経保護が提供された。これに対して、AMPK活性化薬のAICARを投与すると、脳卒中損傷が悪化した。最後に、nNOS欠損マウスは脳卒中後の梗塞がより小さく、またpAMPKレベルもより低かったが、PARP-1欠損マウスは梗塞はより小さかったがAMPKレベルはWTと同程度であった。このことは、nNOSおよびONOO経路が、神経ストレス条件下におけるインビボでの重要なAMPK活性化体であることを示唆する。神経AMPKの活性化は虚血および再灌流傷害のインビボモデルにおいて有害であり、脳卒中誘発AMPKリン酸化の予防は神経保護的である。
【００２０】
虚血細胞において形成される、特徴解明が進んでいる細胞毒の1つがパーオキシナイトライト (ONOO)であり、これはスーパーオキサイドとNOがほぼ等モル量で産生される場合に形成される、強力な酸化体副産物である。スーパーオキサイドはミトコンドリア呼吸鎖から常に漏れだしており、内因性の抗酸化体、例えばスーパーオキサイドジスムターゼ (SOD)により不活性化される。NO産生の増加した条件下では、NOがスーパーオキサイドに関してSODに勝ち、その結果ONOOが形成される。ONOOは、不可逆的に酵素を阻害し、DNAを損傷し、そして、エネルギーを消費するNAD消費DNA修復酵素ポリ (ADP-リボース) ポリメラーゼ (PARP-1)を活性化する。ウシ内皮細胞を化学合成ONOOに暴露すると、AMP濃度の変化なくAMPKが活性化されるが、この効果は低酸素/再酸化により再現される。これら効果はアデノウィルスによるSOD過剰発現またはNOS阻害薬の投与によって改善され、このことはONOO仲介AMPK活性化がNOにより媒介されることを示唆する。最近、抗糖尿病薬メトホルミンもまた、AMPレベルに依存せず同様のメカニズムによりAMPKを活性化できることが明らかとなった。このことは、NO/ONOO経路がAMPK活性化の重要な刺激でありうることを示唆する。nNOS-/-マウスにおける本発明者らの研究はこの仮説を支持し、なぜならこれら動物で見られたNOおよびONOO形成の減少が脳卒中誘発AMPK活性化の劇的な減少をもたらしたからである。しかしながら、雄nNOSマウスはその対応WTよりも脳卒中が有意に小さかった。虚血性損傷を減少させる操作はいずれも、脳に存在する「穏やかな」虚血性ストレスによるpAMPK活性化を減少させる可能性がある。AMPKの上昇は単に、虚血性損傷を表すマーカーなのかもしれない。本発明者らは、雄PARP-1欠損マウスにおいてpAMPKレベルを調べることによって、この問題に取りくんだ。驚いたことに、PARP-1ヌルマウスは、WTと比較して、梗塞は有意に小さい(>50%)ものの脳卒中誘発pAMPKは同程度に上昇した。このことは、pAMPKの上昇が単なる虚血性損傷増加のマーカーでなはく、ONOOおよびnNOSのメカニズムに関与しうることを示唆する。
【００２１】
インビボにおける虚血性傷害の後のAMPK活性化の細胞生存に対する結果はこれまで知られていなかった。大部分の研究はインビトロで行われており、形質転換細胞株を使用することが多かった。AICARによるAMPK活性化は、エネルギー利用可能性の減少した条件(グルコース欠乏およびグルタミン酸興奮毒性)の下、培養海馬ニューロンにおいて生存を増強した。しかしながら今日多くの研究者が、肝細胞、神経芽腫細胞およびマウスMMIN細胞などの様々な細胞株に対する、c-jun-N末端キナーゼ(JNK)、c-mycおよびカスパーゼ3の刺激を介するAICARのアポトーシス促進効果を立証している。これに対して、AICARは虚血心筋細胞を保護し、また、セラミド誘発アストロサイトアポトーシスを予防し、これらはAICARの効果が使用した細胞タイプとモデルシステムの両方に依存することを示唆する。AICARは、細胞内に取り込まれ、細胞質にモノリン酸化ヌクレオチドのZMPとして蓄積し、これがAMPの効果を模倣し、細胞ATPレベルを変化させることなくAMPKを活性化する。しかしながら、AICARは非特異的であり、ヌクレオシド輸送の競合を介する既知の血管拡張薬であるアデノシンの誘導など、細胞内において多くの他の効果を有する。AICARはスナネズミにおいて広範囲の虚血後の海馬における遅発性細胞死を減少させたが、ここではAICARはアデノシン活性化薬として使用されていた。さらに、この虚血性傷害のモデルは、本発明者らの虚血再灌流傷害と非常に異なっている。
【００２２】
本発明者らのデータは、AMPKの活性化が脳卒中において起こること、および、この応答がAICARにより増強されると組織損傷が悪化することを示す。インビボ研究においてAICARの使用が制限されることが、AICAR処置マウスにおける一過性ではあるが有意なMAPの低下が明らかとなった我々の生理学的データにより示された。MAPの減少は、AMPKに対する効果とは関係なく、梗塞周辺領域の灌流の減少により梗塞を増加させうる。低下の短さ、CBF (LDF (レーザードップラー流量計) による) の維持、およびAMPKの生理学的阻害に伴って見られる劇的な神経保護を考慮すれば、これは主となる説明ではなさそうである。さらに、最近のデータは、CNSにおける我々の知見と同様にH2O2誘発心臓傷害が部分的に化合物 Cの処置により改善されることから、AMPK活性化が虚血心臓にも有害であることを示唆する。
【００２３】
AMPK活性化は一部の末梢組織において低酸素に対して有益でありうるが、CNSにおける状況は異なりうる。例えば、低酸素内皮細胞において、eNOSはAMPKによる直接的リン酸化によって活性化され、おそらく血管緊張性を変化させ、血流を増加させる。 しかしながら脳卒中においては、脳血流 (CBF) が（フィラメントによる）急性閉塞中に非常に減少し、eNOS誘発血管拡張が無効なエネルギー消費プロセスとなるため、このAMPKの有益と推定される効果の利用は制限されうる。さらに、低酸素条件下において、増強された（eNOSを介する）NO産生は、ONOOのレベルを増加させ、フリーラジカル傷害を伝播しうる。
【００２４】
インビボとインビトロのシステムの両方の実験が、AMPK活性化の生理学的結果の決定に重要である。インビトロのニューロンにおける過剰なNO暴露による重度のATP枯渇効果は、ミトコンドリア呼吸鎖に対する阻害効果と解糖阻害との両方に仲介され、それは酸化的エネルギー産生と解糖的エネルギー産生の両方の減少をもたらす。しかしながらアストロサイトにおいては、NO誘発呼吸阻害はアストロサイトの解糖の増加をもたらし、それとともにアポトーシスを減少させる。この急速なNO依存的なアストロサイトの解糖の活性化は、AMPK活性化とそれに続くホスホフルクト-2-キナーゼ (PFK-2)の活性化により仲介される。アストロサイトはそれゆえ、解糖の代償的増加を伴ってストレスと低酸素に応答し、エネルギーを提供し、細胞死を予防する。アストロサイトに対するAMPK siRNAのトランスフェクションにより、アストロサイトはNOに応答して解糖を増加できなくなくなり、アポトーシスのレベルが増加する。ニューロンは、PFK-2のレベルが非常に低く、脂肪酸酸化の限度が制限されるため、アストロサイトとは異なり解糖を増強する酵素機構を欠く。それゆえ、脳卒中のような病的条件下のAMPK活性化は、ニューロンの生存を増強しないのかもしれない。
【００２５】
局所脳卒中には脳の別個の領域が関与するが、脳血流 (CBF)および代謝的要求の変化を含む代償性機構が虚血「中心部」から遠く離れた領域で起こる。例えば、大規模な片側性局所損傷の後、脳浮腫が反対側の「影響をうけていない」半球に見られ、このことは脳含水量が元の傷害から離れた領域において変化しうることを示唆する。非虚血脳との通信が、経脳梁（transcallosal）または半球内（intrahemispheric）「機能解離」を通して起こり、CBF、電気生理学的活性および代謝を障害しうる。AMPK活性化のシグナルは、強力な反対側のpAMPKレベルの上昇により示唆されるように、脳全体に伝達されるようである。
【００２６】
AMPKの活性化は、既に傷害を受けたニューロンにおけるストレスを増加させる。細胞エネルギーの認知を妨害すると虚血閾値が高まり、エネルギー産生を回復できるまでエネルギー欠乏状態ではあるが静止状態にて細胞が生存しうる。AMPK活性化を減少させると「ニューロンの休止状態」が虚血カスケードの初期に促進され、完全なニューロンのエネルギー不足が予防され、血液および栄養の供給が回復できるまでニューロンの生存が延長されうる。虚血ニューロンにおいてエネルギーダイナミクスを改善すると、臨床の脳卒中における「治療域」を拡大できる可能性がある。ニューロンの代謝経路が神経保護の重要かつ新規な標的を表すという示唆が、我々の知見によって示される。 
【００２７】
本発明を以下の非限定的な実施例によりさらに説明する。
【実施例】
【００２８】
実験動物
以下の実験は、動物の管理と使用に関するNIHガイドラインにしたがい、Animal Care and Use Committee of the Johns Hopkins Universityによって承認されたプロトコールのもと行った。
【００２９】
虚血モデル
脳虚血は、雄C57B6マウス (Charles River) または雄ラットについて、それぞれMcCullough, et al., Stroke, 32, 796-802 (2001) およびMcCullough, et al., J. Neuroscience, 24, pp. 257-268 (2004)に記載のように、ハロタン麻酔下の120分の可逆的な右中大脳動脈閉塞 (MCAO) およびその後の各種時間の再灌流により誘導した。虚血中および再灌流22時間後の神経学的欠損 (NDS) は、以下のように採点した： 0, 欠損なし; 1, 尾を持った場合の前肢脱力および同側への胴回転; 2, 罹患側への回転; 3, 罹患側で体重を支えることが不可能; および4, 自然な自発運動またはバレル横転（barrel rolling）なし。欠損を有さない動物は研究から除外した。虚血の終了時に、動物を一時的に再麻酔し、フィラメントを取り除くことで再灌流を開始した。シャム（sham）動物に同じ手術を施したが、縫合は内頸動脈までは進めなかった。薬理学的神経保護研究のため、再灌流後22時間生存したマウスについて、その時間において行動採点を行った。その後、TTC組織学による病理学的試験のため脳を回収した (組織病理の説を参照)。別々の動物集団において、上記の2001 McCullough の文献に記載のように、大腿動脈血圧および皮質灌流(レーザードップラー流量計) をMCAOおよび初期再灌流の全体を通して評価した。さらなる動物に、薬理学的処置または媒体処置の後に虚血またはシャム手術を施し、4または24時間の時点でウェスタンブロット解析のために屠殺した。雄nNOSおよびPARP-1欠損マウス (参照： Huang, et al., Science, 265, 1883-1885 (1994); Eliasson, et al., Nat. Med, 3, 1089-1095 (1997) ) に2時間の右側MCAOまたはシャム手術を施し、さらなるWT集団 (nNOS-/-についてC57-BL6およびPARP-/-についてSVEV)と比較した。
【００３０】
最終的組織病理
梗塞体積は、5枚の2 mm切片において、2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム染色により解析した。梗塞体積は、McCullough, et al., J. Neuroscience 23, pp. 8701-8705 (2003)に記載のように、ビデオ顕微鏡および画像解析(Inquiry 3, Loats Associates)により測定した。
【００３１】
ウェスタンブロット解析
マウスおよびラット脳卒中サンプルおよびシャム脳サンプルを、脳を頭蓋から迅速に取り出し、小脳を切除し、続いて即座に右 (R) および左 (L)半球に分離することによって取得した。サンプルは液体窒素中で瞬時に凍結した。ラットのサンプルはさらに、両半球について中心部領域と周辺部領域に分離した。サンプルは使用まで-80℃で保存した。各サンプルを200μlの可溶化バッファー (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 250 mM ショ糖, 5 mM ピロリン酸ナトリウム, 50 mM NaF, 1 mM EDTA, 1mM EGTA,1 mM DTT, 0.5 mM PMSF, 0.1 mM ベンズアミジン, 50μg/ml ロイペプチン, 50μg/ml ダイズトリプシン阻害薬)中でホモジナイズした。SDS界面活性剤を最終濃度0.2%にて添加し、可溶化物を5分間煮沸した。上清を回収した後、タンパク質濃度をBCAキット (BioRad)を用いて測定した。40μgのタンパク質を4-15%勾配SDS-ポリアクリルアミドゲル上の各レーンにロードし、ポリビニリデンジフルオライドメンブランに転写した。抗原検出のため、ブロットを連続的にプローブ処理し、剥離し、再びプローブ処理した。
【００３２】
AMPKαのリン酸化は、抗リン酸化AMPKα (α1およびα2 Thr) 抗体 (1:1000, Cell Signaling)を用いて測定した。ACC (1:500), p-ACC (1:1000), pAkt (1:500), およびAkt (1:500) 抗体は、Upstate, Lake Placid, NYから入手した。抗AMPKα抗体(抗α1およびα2, 1:1000; Cell Signaling)、hsp-70 (1:1000; Santa Cruz)、およびβアクチン(1:5000; Sigma)をローディングコントロールとして使用した。ブロットはすべて一晩一次抗体と4℃でTBSバッファー（5% BSAおよび0.1 % Triton-X-100含有）中にてインキュベートした。二次抗体 (ヤギ抗ウサギIgG, Chemicon) を1:5,000に希釈し、ECL (pico) 検出キットをシグナル検出に使用した。
【００３３】
免疫組織化学 
浮遊脳切片をKim, et al., J. Biol. Chem., 279, 19970-19976 (2004)に記載の方法を改変して調製した。自由浮遊切片をPBS（5% ヤギ血清、1 mg/ml BSA、0.05% Triton-X100および1 mM NaF含有）中にて1時間室温でブロックし、続いて、抗リン酸化AMPKα抗体 (1:100)、GFAP (1:1000, DAKO ;アストロサイト用)、 NeuN (Chemicon 1:100; 成熟ニューロンのマーカー)またはVWF (Santa Cruz; 1: 400、内皮細胞用) と、PBS（1% ヤギ血清、1 mg/ml BSA、0.05% Triton-X-100、1 mM NaF含有）中にて一晩4℃でインキュベートした。二次抗体 (1:200; Vector Laboratories; Burlingame, CA) とPBS（1% ヤギ血清含有）中にて1時間半インキュベートした(Texas Red、FITC)。シグナルは免疫蛍光共焦点顕微鏡によりZeiss 画像取得ソフトウェア (Zeiss LSM 510)を用いて可視化した。
【００３４】
海馬切片培養およびOGD 
海馬器官型切片培養をMcCullough, et al., Stroke, 32, 796-802 (2001)に記載のように調製した。350ミクロンの冠状半球切片を生後7日のラットの子から組織チョッパー(McILwain 組織チョッパー; Vibratome Company, St. Louis, MO) を用いて得た。海馬切片を6ウェルプレートにおいて30 mm Millicell 透過性膜インサート（permeable membrane insert） (0.4μm ; Millipore, Bedford, MA)上に移し、ここで各ウェルは1 mlの培地 (50% MEM、25% HBSS、25% 熱不活化ウマ血清、6.5 mg/ml D-グルコース、5 U/ml ペニシリン Gおよび5μg/ml 硫酸ストレプトマイシン)を含んでいた。培養物を加湿インキュベーターにおいて5% CO2下37℃で13日間維持した。完全な培地交換は週2回行った。無酸素の誘導は、インビトロ13日目に行った。切片培養物を温かいBSS (mMにて表示: 125 NaCl、5 KC1、1.2 NaH2PO4、26 NaHCO3、1.8 CaCl2、0.9 MgCl2、10 HEPESおよび10 グルコース)にて2回すすぎ、インキュベーターに戻して30分間平衡化した。切片培養物を温かい脱酸素グルコース不含BSSにて2回すすぎ、気密チャンバーに移し、無酸素ガス (5% C02、85% N2、および10% H2) を流し、37℃で60分維持した。コントロールはBSSですすぎ、通常の通気インキュベーターに1時間移した。無酸素の期間を培養物を新しい培地(50% MEM、25% HBSS、25% 熱不活化ウマ血清、6.5 mg/ml D-グルコース、5U/ml ペニシリンG、および5μg/ml 硫酸ストレプトマイシン) に戻すことで終了させ、ウェスタン解析のためサンプルを2、4、6および24時間の時点で調製した（前述）。コントロールおよびOGD処置切片は、各実験にトリプリケートのウェルにて含まれるか、あるいは各実験群につき各条件あたり15切片含まれた。
【００３５】
統計学的解析
データはすべて平均±SEMにて表した。生理学的変数と組織学は、1-way ANOVA により、多数の比較を補正するのに事後Newman-Keulsを用いて、解析した。虚血後の神経学的スコアは、Mann-Whitney U 検定により解析した。値は以下の場合に統計学的に有意と見なした：＊, p<0.05 ; ＊＊, p<0.01 ; ＊＊＊, p<0.001。
【００３６】
結果
AMPKは虚血後のニューロンに発現する
2時間のMCAOとそれに続く2時間の再灌流を施されたマウス由来の脳組織切片は、AMPKおよびpAMPKの両方について顕著なニューロンの染色を示した (図１、n=5/群)。それらはNeuN (成熟ニューロン用)、GFAP (アストロサイト用)でも染色された。共焦点顕微鏡によりNeuNとAMPK/pAMPKの共局在化が示されたが、アストロサイトでは共局在化は見られなかった。
【００３７】
共焦点顕微鏡により、成熟ニューロンのマーカーであるNeuNを用いた二重標識免疫蛍光により示されるように、AMPK (図１Ａ−Ｃ)とpAMPK (図１Ｄ−Ｆ)が中大脳動脈 (MCA) 分布において皮質ニューロンに局在していることが示された。NeuNおよびpAMPKについて免疫染色したニューロンをより高倍率にすると (図１Ｇ−Ｉ)、αアイソフォームについて核および細胞質の免疫染色が見られた。AMPKはインタクトな脳の非刺激アストロサイトには最低限しか発現していない可能性があるが、以前の研究では培養アストロサイトにおいてAMPK免疫反応が見られている。AMPKおよびpAMPKのインビボにおける局在化を明らかにするため、本発明者らは、正常非虚血組織と梗塞後4および24時間(再灌流2または22時間の時点)に回収した脳との両方を試験し、AMPKが脳卒中後にアストロサイトに発現しているかを調べた。GFAPとAMPKまたはpAMPKは、MCAO後4時間では最低限しか共局在化していなかった (それぞれ図１Ｊ−Ｌおよび図１Ｍ−Ｏ)。4時間の組織と同様に、AMPKまたはpAMPKとGFAPとの共局在化は脳卒中24時間後の皮質において見られなかった (図１Ｐ−R)。さらに、AMPKまたはpAMPKのいずれかと内皮マーカーであるvon Willebrand factor (VWF) との共局在化は、インタクトな脳または虚血脳において見られなかった(データ非提示)。このpAMPK免疫局在化のパターンが局所的に維持されるのかを調べるため、pAMPKとNeuNの二重染色の低出力画像を梗塞後24時間(再灌流22時間)の時点で取得した(図２)。同様のレベルの染色が皮質 (図２Ａ−Ｃ) と海馬 (図２Ｄ−Ｆ)の両方で見られ、両領域でpAMPKとNeuNの共標識が顕著であった。一次抗体を添加していないコントロール切片においてはシグナルは見られなかった(データ非提示)。これらの結果は、AMPKが基本的にニューロンに虚血および非虚血脳の両方において発現しており、細胞自律的な様式にて神経エネルギーバランスに影響するよう機能しうることを示す。
【００３８】
AMPKはMCAO後に増加する
雄野生型 (WT) C57B16マウスに2時間の右側MCAOまたはシャム手術を様々な再灌流時間にて施した。生理学的パラメーター、例えば温度、は一定に保持した。C75および化合物 C (Cpd C) 処置動物において、各処置群とそれぞれの媒体との間の生理学的測定に有意な差は見られなかった。MAPおよびLDFは2時間の虚血を平均して示す。AICAR処置動物はMAPが15分で有意に減少したが(p<0.05)、2時間のモニタリング全体では差が見られなかった。虚血中のLDFの減少は媒体およびAICAR動物において同等であったが、再灌流30分の時点でLDFが有意に(p<0.05)減少した (n=4/群) : 
【表１】
2008504228.tif 000003
【００３９】
図３に見られるように、pAMPK (Thrリン酸化部位に対するpanαサブユニット抗体により検出(参照： Hawley, et al., J Biol Chem 271, 27879-27887 (1996) )) は、シャム手術を受けた動物と比較して、虚血脳 (脳卒中) において虚血90分後には上昇した(虚血動物につきn=6/時間点; シャム手術コントロールにつきn=4/時間点)。pAMPKレベルは、右虚血半球 (R) および左非虚血半球 (L)において上昇し、虚血右半球および非虚血左半球の両方において24時間 (再灌流22時間) 上昇したままであった。それに対して、シャム脳におけるpAMPKレベルは、24時間通して一定のままであった。全AMPKレベルはほとんど変化しなかった。hsp-70の適合した上昇が虚血性半球において見られたが、これらは後の時間点(すなわち、6、12および24時間)においてより顕著であった。βアクチンがローディングコントロールの役割を果たした。pAMPKレベルの広範な上昇は、AMPKが代謝の乱れおよび代償性の応答に続いて、虚血性領域のみならず反対側の非虚血側においても活性化されることを示唆する。
【００４０】
AMPKはインビトロOGD後に活性化される
インビボの知見に加えて、本発明者らはまた、AMPKがインビトロで海馬切片培養において酸素-グルコース欠乏(OGD)後に活性化されるかを、インビトロ脳卒中モデルにおいて調べた。OGD2時間後に、正常酸素、正常血糖のコントロール培養と比較して、pAMPKレベルが強く上昇することが明らかとなった (図４Ａ)。このpAMPKの上昇は6時間まで継続したが、本発明者らのインビボ研究で見られたように24時間までに正常化された。AMPK活性化の下流の標的はアセチルCoAカルボキシラーゼ(ACC)であるが、これは脂肪酸の新規合成を先導する（pace-setting）酵素である； 活性化されると、AMPKはACCのリン酸化を仲介し、つまりACCを不活化し、エネルギー欠乏時の脂肪酸合成の同化プロセスを制限する。OGD4時間後の切片サンプルの評価により、リン酸化または不活化アセチルCoAカルボキシラーゼ(pACC)のレベルの上昇が示され (図４Ｂ)、このことはpAMPKにおいて観察された増加は生理学的に妥当であるという考えを支持する。全AMPKおよびACCレベルは、試験した全ての時間点でOGDまたはコントロール切片の両方においてあまり変化しなかった。
【００４１】
AMPKの上昇が虚血周辺部に見られる
脳卒中における代謝の乱れは梗塞の壊死中心部においてより重度であり、一方辛うじて機能している脳を救出すべく生存促進経路が周辺部において活性化される、と仮定して、脳卒中6時間後のラット脳(n=6/群)より虚血性右半球 (IH；虚血性半球) または非虚血性左半球 (NIH；非虚血性半球) の両方から中心部 (CC) および 周辺部 (PC) 組織をウェスタンブロット解析のため解剖した(図５)。より大きなラット脳を用いると中心部および周辺部の解剖がより迅速かつ容易であることから、この実験ではラットを使用した；これにより異なる種で本発明者らの知見を確認することもできた。虚血および解剖の領域は24時間の時点でTTC染色により可視化した (図５Ａ)。pAMPKレベルは、皮質周辺非虚血性半球および反対側の非虚血性半球 (それぞれ、PC NIHおよびCC NIH)において、シャム脳のいずれの半球(PCおよびCC)におけるpAMPKレベルと比較しても、劇的に上昇した (図５Ｂ)。虚血中心部(虚血性半球のCC)におけるpAMPKレベルは脳の他の領域よりも低かったが、手術シャムと比較して上昇していた(シャムCCおよびPC)。
【００４２】
中心部におけるAMPKレベルがより低いことは、梗塞の虚血中心部におけるタンパク質合成およびエネルギー依存的リン酸化の欠如を表す可能性がある。しかしながら、予想された熱ショックタンパク質 70の増加(参照： Kury, et al., Eur J Neurosci 19, 1708-1720 (2004) ) が見られた。あるいは、AMPK活性化は、周辺部における代償性保護的経路を表すのかもしれない。pAMPKは、損傷を受けたが生存しているニューロンにおいて、利用可能なエネルギー供給を増加させる方策として上方調節される可能性がある。反対側のAMPKの上昇は、傷害領域から遠く離れたニューロンもまたエネルギー利用可能性を上昇させるシグナルを受けうることを示唆する。それゆえ、pAMPKレベルの上昇およびその活性は、適合性の内因性神経保護経路を表す可能性がある。この問題を解決するため、本発明者らは次に、薬理学的にAMPKレベルを操作し、脳卒中の結果に対するpAMPKレベルの変化の効果を調べた。
【００４３】
化合物 CはpAMPKレベルを減少させ、かつ神経保護的である
本虚血モデルにおけるAMPK活性化の機能的効果について調べるため、薬理学的AMPK阻害薬（J. Clin Invest 108, pp. 1167-1174 (2001)に記載）である化合物 C処置マウスにおいて脳卒中の結果に対する効果を検討した。脳卒中開始時(MCAO2時間および再灌流22時間)に化合物 C(20 mg/kg、腹腔内投与; n=14)または媒体 (n=8)を処置した動物における脳卒中の結果に対する効果を測定した (図６)。化合物 Cは、全梗塞体積 (% 非虚血性半球により測定、TTCにより浮腫について補正)、並びに線条体 (CP; 64±5.7 vs. 21±3.9; p>0.001)および皮質 (CTX; 63±3.4 vs. 19.4±3.3; p<0.001) の梗塞体積を、媒体処置動物と比較して有意に減少させた(図６Ａ)。24時間の時点での行動の欠陥の重症度の減少は、これらの相違を反映した (媒体 3.3±0.3 vs. 化合物 C 1.9±0.2, p< 0.01)。レーザードップラーにより測定した相対的脳血流 (CBF)には、虚血中 (媒体=9.8±0.54 vs. 化合物 C=10.6±0.9; % ベースライン; p=n.s. )または再灌流後30分のいずれの間も相違せず、このことは血流における相違が虚血性損傷の相違を説明しえないことを示唆する。処置群間で生理学的測定は相違せず（表１）、このことはこれら因子が脳卒中の結果に同等に寄与することを示す。
【００４４】
AMPKおよびpAMPKレベルの測定のため、2時間のMCAO (n=6/群) またはシャム手術 (n=4/群) のいずれかを受けた媒体または化合物 C処置マウスのさらなる群を、梗塞後4時間 (図６Ｂ) または24時間 (図６Ｃ) に屠殺した。脳卒中およびシャム手術動物の両方において、虚血性 (右, R)または非虚血性 (左, L)半球由来の可溶化物をウェスタンブロット解析により解析した。梗塞4時間(再灌流2時間)後に予想されたpAMPKの上昇が媒体処置動物において (図６Ｂ、レーン1および2) シャム動物 (レーン3および4)と比較して見られたが、pAMPKのレベルは化合物 C処置動物 (レーン5および6)において減少した; 全AMPKレベルは変化がなかった。化合物 Cの効果は一過性であった；pAMPKレベルは24時間まででは媒体処置マウスにおいてみられるレベルと同様であった (図６Ｃ, レーン1および2、レーン5および6と比較)。これらの結果は、AMPKの化合物 Cによる阻害は神経保護的であること、およびこの神経保護効果はpAMPKレベルの減少と一致することを示唆する。
【００４５】
FAS阻害薬C75によるpAMPKレベルの減少は脳卒中において神経保護的である
FAS阻害薬C75 (20 mg/kg i.p.) または媒体 (RPMI) を虚血開始直前に投与した(n=9/gp)。この投与量は、摂食行動に対する効果および海馬におけるC75活性の阻害を示した以前のインビボデータに基づいた。全および局所梗塞体積の有意な減少がC75処置群 (p<. 001) において見られた。行動スコアの改善が見られた (媒体 3.2±. 05 vs. C75 2.0±. 03, p<. 01)。化合物 Cと同様に、LDFまたは生理学的変数に差は見られなかった(n=4)。AMPKおよびpAMPKレベルの解析のため、2時間のMCAOおよび再灌流(n=6/群) またはシャム手術 (n=4/群)のいずれかを受けた媒体またはC75処置マウスのさらなる群を、脳卒中後4時間 (図７Ｂ)または24時間 (図７Ｃ)に屠殺した。再灌流2時間の時点で予想されたpAMPKの増加はC75処置および媒体処置マウスの両方 (図７Ｂ, それぞれレーン1および2 vs. レーン5および6)において見られたが、このpAMPKレベルの増加はC75処置により弱くなった。化合物 Cと同様に、pAMPKレベルの増加の減少は、虚血性右半球 (R)において非虚血性左半球 (L)と比較してより顕著であった。媒体処置マウスと比較して、C75は脳卒中24時間後にpAMPKレベルをシャムおよび脳卒中マウスの両方において著しく減少させ (図７Ｃ, それぞれレーン1-4 vs. レーン5-8)、このことはpAMPKレベルの減少におけるC75の（化合物 Cと比較して）より持続性のある中枢性効果を示唆する。
【００４６】
図５Ａに示されるように、C75処置群において全および局所梗塞体積に有意な減少が見られた(P<. 001)。非生存集団においては、レーザードップラーにより測定した虚血または再灌流中の血流にも、MAP、pHまたは血液ガス測定にも、有意な差は見られなかった(n=4, データ非提示)。AMPKおよびpAMPKレベルの解析のため、2時間のMCAO (n=6/gp) またはシャム手術 (n=4/gp) を受けた媒体またはC75処置マウスのさらなる群を、脳卒中後4時間 (図５Ｂ) または24時間 (図５Ｃ)に屠殺した。予想されたpAMPKの増加が再灌流2時間に媒体およびC75処置マウスにおいて見られた。pAMPKレベルの減少は、C75処置動物において24時間の時点でシャムおよび脳卒中マウスの両方において見られ、このことはpAMPKレベルの減少におけるC75の（化合物 Cと比較して）より持続性のある中枢性効果を示唆する。
【００４７】
AMPK活性化薬5-アミノイミダゾール-4-カルボキサミドリボヌクレオシド (AICAR) によるAMPK活性化は脳卒中を悪化させる
広く使用されているAMPK活性化薬の5-アミノイミダゾール-4-カルボキサミドリボヌクレオシド (AICAR) (参照： Corton, et al., Eur J Biochem, 229, 558-565 (1995) ) を脳卒中開始時に投与した(500 mg/kg i.p.; n=11/群)。AICARは、細胞内に取り込まれリン酸化されてZMPを形成し、これがAMPK活性化に対するAMPの効果を模倣する。全および皮質 (CTX) 脳卒中体積の有意な悪化がAICAR処置動物において見られた (図８Ａ)。生理学的モニタリングにより、AICAR処置動物において注射後15分までに自己修正された平均動脈圧 (MAP) の有意な低下が示された(MAP 媒体 84 vs. AICAR 69 mmHg, p<0.05)。虚血中のCBFに差はなかったが、AICAR処置マウスにおいてコントロールと比較してCBFの減少が再灌流後30分の時点で見られた (ベースラインの98 vs. 82.7 %, p<0.05)。これは、AICARの有害作用の一部がそのAMPKに対する効果に加えて灌流圧の減少に続いて起こる可能性を示唆する。ウェスタンブロット解析により、AICAR処置 vs. 媒体処置動物において脳卒中後4時間 (再灌流2時間) のpAMPKの上昇が示され(図８Ｂ、それぞれレーン5-8 vs. レーン1-4)、これは24時間までにベースラインまで戻った(データ非提示)。
【００４８】
nNOSの欠損は脳卒中誘発性のpAMPKの上昇を予防する
ONOO (パーオキシナイトライト) は脳卒中誘発性の神経損傷の重要な要因であり、かつAMPKはインビトロにおいて低酸素と同時にONOOによっても活性化されるので、脳卒中後のAMPK活性化における神経型NOS (nNOS) の役割を評価した(図９)。nNOSノックアウト動物は、主にONOO産生の減少により、その対応野生型動物よりも有意に梗塞が小さかった。本発明者らは、nNOS欠失の神経保護作用を本発明者らのMCAOモデルにおいて確認した(全梗塞 : WTにおいて55.8±4.9%; nNOS-/-において31.94% ; p<0.01)。雄nNOS-/-および野生型 (WT)マウス に右MCAOを施し、脳を梗塞後4時間 (図９Ａ) または24時間 (図９Ｂ) (再灌流22時間)のいずれかの時点で回収した。4時間の時点で、WTマウスはWTシャムと比較して虚血性 (右, R) および非虚血性 (左, L)半球の両方においてpAMPKの上昇を示した。しかしながら、nNOS-/-マウスにおいて脳卒中誘発性のpAMPKレベルの上昇は無くなり、pAMPKレベルはシャムと同様であった。同様の結果が24時間の時点でも見られた (図９Ｂ)。リン酸化AktのレベルもまたnNOS-/-マウスにおいてWTと比較して梗塞後24時間(再灌流22時間)の時点で減少し、このことはAkt、AMPKおよびNOSの間に関係がある可能性を示唆する (図９Ｃ)。
【００４９】
nNOS-/-マウスにおけるAMPK活性化の減少が単にこの系統で見られた虚血性損傷の減少の反映である可能性があるので、nNOS-/-雄マウスと同程度の脳卒中体積の減少を有するDNA修復酵素ポリ (ADP-リボース) ポリメラーゼ-1を欠損する雄マウス (PARP-1 ノックアウトマウス)についても調べた(図１０)。驚いたことにPARP-1欠損マウスは、その対応WTと比較して梗塞はより小さいにも関わらず虚血性半球におけるpAMPK活性化のレベルは同程度であった(図１０、虚血性半球のみを示す) 。このことは、nNOS欠損マウスにおいて見られるNOまたはONOO産生の減少がAMPK活性化の選択的な改善をもたらすことを示唆する。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】虚血マウスの脳におけるAMPKおよびpAMPKの免疫組織化学的局在化。
【図２】虚血マウスの皮質および海馬におけるpAMPKおよびNeuNの免疫組織化学的局在化。
【図３】脳卒中後のpAMPK上昇のタイムコース。
【図４】AMPKリン酸化がインビトロにおける酸素-グルコース欠乏 (OGD)後に上昇することを示すウェスタンブロット解析。
【図５】pAMPKが虚血性および非虚血性脳半球において上昇することを示すTTC染色およびウェスタンブロット解析。
【図６】化合物 C処置は局所的および全脳卒中体積を有意に減少させる。
【図７】C75の投与は有意な神経保護をもたらす。
【図８】AMPK活性化薬であるAICARの投与は脳卒中を悪化させる。
【図９】野生型 (WT)および神経型一酸化窒素合成酵素欠損(nNOS-/-)マウスにおけるAMPKおよびpAMPKレベル。
【図１０】野生型 (WT)およびポリ (ADP-リボース) ポリメラーゼ (PARP-1) 欠損マウスにおけるAMPKおよびpAMPKレベル。
【図１】
2008504228.tif 000004
【図２】
2008504228.tif 000005
【図３】
2008504228.tif 000006
【図４】
2008504228.tif 000007
【図５】
2008504228.tif 000008
【図６】
2008504228.tif 000009
【図７】
2008504228.tif 000010
【図８】
2008504228.tif 000011
【図９】
2008504228.tif 000012
【図１０】
2008504228.tif 000013