(57)【要約】【解決手段】本発明は、患者内の腫瘍細胞を処置する方法に関するものであり、患者の単球細胞から成長させた未成熟樹状細胞と、アジュバントを患者の腫瘍細胞に直接取り込むものである。未成熟樹状細胞とアジュバントは、腫瘍細胞中の抗原と結合して、悪性腫瘍ワクチンを生成し、患者の腫瘍細胞を直ちに処置する。本発明は又、放射線療法レジメン又は化学療法レジメンを用いて患者を処置する前処置ステップを含んでいる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の腫瘍組織中の腫瘍細胞を減少させる方法であって；
患者から単球細胞を採取し、
単球細胞を１又は複数のファクターと共に培養し、単球細胞から未成熟樹状細胞を生成し、
未成熟樹状細胞を患者の腫瘍組織に取り込み、及び、
アジュバントを患者の腫瘍細胞に取り込む、
ステップを有している方法。
【請求項２】
患者は、ヒトである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１又は複数のファクターは、ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＦＳから構成されるグループから選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アジュバントは、マリグナーゼ、ＬＣＭ、アガリクス、ＯＫ４３２、ＢＣＧ、レンチナン、霊芝、サルノコシカケ、ＴＮＦ、メシマコブ、フロイント完全又は不完全アジュバント、ＬＰＳ、脂肪酸、及び、リン脂質から構成されるグループから選択される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アジュバントは、サイトカインである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、及び、ＩＬ−１５から構成されるグループから選択される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
アジュバントは、ウィルスである請求項１に記載の方法。
【請求項８】
未成熟樹状細胞及びアジュバントを腫瘍組織に取り込む前のある時に、化学療法を患者に処置するステップをさらに含んでいる請求項１に記載の方法。
【請求項９】
未成熟樹状細胞及びアジュバントを腫瘍組織に取り込む前のある時に、放射線療法を患者に処置するステップをさらに含んでいる請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
未成熟樹状細胞及びアジュバントを腫瘍組織に取り込む前のある時に、抗Ｔ細胞モノクローナル抗体を患者に処置するステップをさらに含んでいる請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記取り込みをしてから１４日後に、腫瘍組織を評価し、細胞の減少が生じているかどうかを判断するステップを含んでいる請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
腫瘍組織中の腫瘍細胞を減少させる方法であって；
患者の腫瘍を化学療法レジメンを用いて処置し、
患者から単球細胞を採取し、
単球細胞を１又は複数のファクターと共に培養し、単球細胞から未成熟樹状細胞を生成し、
未成熟樹状細胞を患者の腫瘍組織に取り込み、及び、
アジュバントを患者の腫瘍細胞に取り込む、
ステップを有している方法。
【請求項１３】
患者は、ヒトである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
１又は複数のファクターは、ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＦＳから構成されるグループから選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
アジュバントは、マリグナーゼ、ＬＣＭ、アガリクス、ＯＫ４３２、ＢＣＧ、レンチナン、霊芝、サルノコシカケ、ＴＮＦ、メシマコブ、フロイント完全又は不完全アジュバント、ＬＰＳ、脂肪酸、及び、リン脂質から構成されるグループから選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
アジュバントは、サイトカインである請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、及び、ＩＬ−１５から構成されるグループから選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アジュバントは、ウィルスである請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
未成熟樹状細胞及びアジュバントを腫瘍組織に取り込む前のある時に、放射線療法を患者に処置するステップをさらに含んでいる請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
腫瘍組織中の腫瘍細胞を減少させる方法であって；
患者の腫瘍を放射線療法レジメンを用いて処置し、
患者から単球細胞を採取し、
単球細胞を１又は複数のファクターと共に培養し、単球細胞から未成熟樹状細胞を生成し、
未成熟樹状細胞を患者の腫瘍組織に取り込み、及び、
アジュバントを患者の腫瘍細胞に取り込む、
ステップを有している方法。
【請求項２１】
患者は、ヒトである請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
１又は複数のファクターは、ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＦＳから構成されるグループから選択される請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
アジュバントは、マリグナーゼ、ＬＣＭ、アガリクス、ＯＫ４３２、ＢＣＧ、レンチナン、霊芝、サルノコシカケ、ＴＮＦ、メシマコブ、フロイント完全又は不完全アジュバント、ＬＰＳ、脂肪酸、及び、リン脂質から構成されるグループから選択される請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
アジュバントは、サイトカインである請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、及び、ＩＬ−１５から構成されるグループから選択される請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
アジュバントは、ウィルスである請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
未成熟樹状細胞及びアジュバントを腫瘍組織に取り込む前のある時に、化学療法を患者に処置するステップをさらに含んでいる請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
腫瘍組織に取り込まれると、抗原と結合し、患者中の腫瘍を減少させる悪性腫瘍ワクチン前駆物質であって、
患者から採取された単球から由来する未成熟樹状細胞と、
アジュバントと、及び、
患者中の腫瘍からの抗原と、
を含んでいる。
【請求項２９】
患者は、ヒトである請求項２８に記載のワクチン。
【請求項３０】
１又は複数のファクターは、ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＦＳから構成されるグループから選択される請求項２８に記載のワクチン。
【請求項３１】
アジュバントは、マリグナーゼ、ＬＣＭ、アガリクス、ＯＫ４３２、ＢＣＧ、レンチナン、霊芝、サルノコシカケ、ＴＮＦ、メシマコブ、フロイント完全又は不完全アジュバント、ＬＰＳ、脂肪酸、及び、リン脂質から構成されるグループから選択される請求項２８に記載のワクチン。
【請求項３２】
アジュバントは、サイトカインである請求項２８に記載のワクチン。
【請求項３３】
サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、及び、ＩＬ−１５から構成されるグループから選択される請求項３２に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願に対する言及＞
本出願は、２００４年９月１７日に出願された仮出願６０／６１０，８２２号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、腫瘍治療法に関するものであり、患者(ヒト又は動物)の腫瘍細胞に直接、未成熟樹状細胞とアジュバントを注入することを含んでおり、注入部位にワクチン抗原としての抗原性を与える。腫瘍細胞内で、これらの要素が結合することにより、患者の免疫系は急速に誘発(induce)及び活性化され、腫瘍細胞を格段に減少及び／又は除去する。大部分のアジュバントは、免疫反応を増大させるものであり、未成熟樹状細胞と共に腫瘍細胞へ直接注入することができるから、腫瘍細胞の減少又は除去を達成することができる。
【背景技術】
【０００３】
免疫アジュバントは、ワクチンと組み合わせて用いられ、抗原に免疫反応を増大させる。一例として、免疫アジュバントには、マクロファージを抗原に引きつける機能があり、これにより、マクロファージは、抗原を所属リンパ節に提示して、効果的な抗原反応を開始する。アジュバントは、それ自身が抗原に対するキャリアとしても作用し、また、サイトカイン誘導、補体活性、免疫系の異なる細胞群のリクルート、異なる抗原提示細胞への抗原の送達、ＨＬＡクラスＩ又はクラスII分子の発現の調整、及び、異なる抗体の特殊型を産生するための刺激のような他のメカニズムによって、免疫反応に影響を与える。最近のワクチンの多くは、免疫原生が極めて弱いため、アジュバントの存在が必要である。
【０００４】
アジュバント活性を有する物質が知られている。ミョウバン(Ａｌ(ＯＨ)3)、及び、同様のアルミニウムゲルは、ヒト用に認可されたアジュバントである。ミョウバンのアジュバント活性は、Glenny(Chemistry and Industry, Jun. 15, 1926;J. Path. Bacteriol, 34, 267)によって１９２６年に初めて発見された。水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウム(総称してミョウバンという)は、一般的にヒト用及び家畜用のワクチンにアジュバントとして用いられている。ミョウバンがジフテリア及び破傷風トキソイドに対する抗体反応を増大させる効果は、十分に立証されており、最近では、ＨＢｓＡｇワクチンが、ミョウバンと共にアジュバントされている(adjuvanted)。
【０００５】
アジュバントの開発における研究方針は、樹状細胞の研究に方向付けられている。樹状細胞(ＤＣ)は、プロフェッショナル抗原提示細胞(ＡＰＣ)であり、インビトロ及びインビボで、初期の免疫反応を開始するための独自の能力を有している。これらは、ミエロイド系(ＤＣ１)又はリンパ球系(ＤＣ２)の前駆物質(precursors)に由来するものであり、環境病原菌に直面する組織(皮膚、粘液膜、腸管上皮等)に身体を通じて未成熟な形態で分配される。ＤＣ１及びＤＣ２は、末梢循環にある単核細胞の総数の数パーセントを構成しており、ＣＤ１４＋／ＣＤ１１ｃ＋／ＨＬＡ−ＤＲ＋単球の形態のＤＣ１前駆物質は、比較的豊富にあり、単核血液細胞(mononuclear blood cells)の約１０％〜１５％を構成している。
【０００６】
未成熟ＤＣは、抗原取込み、ＤＣ活性／成熟及び抗原提示に含まれる表面構造のホストを発現する。ＤＣが抗原に直面すると、共刺激分子と同様に、ＨＬＡクラスＩ及びII分子の増加に特徴付けられる成熟プロセスを経て、Ｔリンパ球及びＢリンパ球上の同族受容体と相互作用し、結果として、抗原特異的細胞及び体液性免疫反応を産生する。
【０００７】
ＤＣは、免疫系では初期のＡＰＣであると考えられる。これらの細胞及び／又は前駆物質を単離し、これらをインビトロで研究できることで、先天的免疫及び後天的免疫中のこれらの役割について広汎な知識が付加される。ヒト用ＤＣをインビトロで産生する標準的な方法は、末梢血からＣＤ１４＋-単球を単離して濃縮し、これらを、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＴＮＦα、ＩＬ−１０を含む多くのサイトカインと共に、又は、リポ多糖体、ＰＧＥ2、タイプ１インターフェロン、又は、二本鎖ＲＮＡを含む種々の他の物質と共に、種々の期間、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４中で培養するものである。
【０００８】
多数の治験責任医師が、これらのインビトロで産生された単球由来ＤＣは、初期及びリコールの抗原特異ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞反応を開始することができる効果的な抗原提示細胞(ＡＰＣ)であることを明らかにしている。最近のインビトロ研究では、ＤＣ１の生態に関する情報が、かなり広く展開しており、抗原特異免疫反応がインビボで産生されるというプロセスの解明に役立っている。末梢組織中、未成熟ＤＣは、近くでＤＣ及び他の細胞種によって産生された複合サイトカイン／ケモカイン環境を開始する危険シグナルの状況下で抗原性物質を捕捉する。ＤＣによって作られた可溶性メディエーターは、自己分泌又は傍分泌の方法で作用する。Ｔ細胞は、抗原武装ＤＣ(antigen armed DC)との相互作用により、更なるサイトカイン及びケモカインを産生し、解放されたサイトカインによって活性化された他の免疫細胞と同じように役立つ。この相互作用の複合ネットワークは、単球前駆物質からＤＣの産生を促す環境を順に作り出すことができる。
【０００９】
樹状細胞の成熟を促進させるこれらのアジュバントは、ワクチン抗原と組み合わせて投与されると、より多くの抗原提示細胞となり、ワクチン抗原をＴリンパ球及びＢ細胞に提示し、ワクチン抗原に対する免疫反応を高める。しかしながら、ＡＰＣの抗原性が、抗原連続変異及び／又は抗原不連続変異と共に発生することを条件としているため、最も効果の高いワクチン抗原の単離は、極めて困難であり、従って、多くの新しいワクチンが、樹状細胞及びアジュバントが存在していても、極めて弱い免疫原生である。生体腫瘍細胞に対抗する最も効果的なワクチンは、樹状細胞及びアジュバントと共に用いられ、治療過程中でより強い免疫原生を促進させ、誘発する。
【発明の開示】
【００１０】
本発明は、上記要請を、樹状細胞及びアジュバントと共に用いられる最も効果的な抗原性ワクチン抗原を提供することで解決するものであり、腫瘍細胞に対抗する免疫反応の量と質を増大させるものである。
【００１１】
本発明は、公知の及び非公知の抗原提示細胞の両方の有する抗原性を含む十分な抗原要素を用い、ヒトの身体(又は、動物の身体)中の生体腫瘍組織に配置することにより、腫瘍細胞の処置を提供するものである。これは、腫瘍細胞株から得られた抗原を培養する従来技術、又は、抗原を加えるその他のプロセスとは大きく異なる。これらは、患者の腫瘍細胞に対するワクチン抗原として、抗原性及び旧式の抗原性データ又は効能に制限を受けるためである。具体的には、本発明は、未成熟樹状細胞とアジュバントを直接患者の腫瘍組織に注入することを含む治療に関するものであり、注入部位にて、抗原要素をワクチン抗原として存在させるものである。腫瘍組織内でこれら要素が結合することで、患者の免疫系は、劇的に腫瘍細胞を減少及び／又は消滅するよう速やかに誘発され、活性化される。大部分のアジュバントは、免疫反応を増大させるものであり、腫瘍細胞に未成熟樹状細胞と共に直接注入されることで、腫瘍細胞の減少又は消滅を達成することができる。このようなアジュバントとして、脂質ベースのアジュバント、タンパク質ベースのアジュバント、多糖類ベースのアジュバントを例示でき、マリグナーゼ(Marignase)、ＬＣＭ、アガリクス(Agaricus)、ＯＫ４３２、ＢＣＧ、レンチナン(Lentinan;シイタケ)、霊芝(Reishi)、サルノコシカケ(Sarunokoshikake)、ＴＮＦ、メシマコブ(Meshimakobu)、フロイント完全又は不完全アジュバント(Froint's complete or imcomplete adjuvant)、ＬＰＳ、脂肪酸(Fatty acids)、リン脂質(Phospholipids)、サイトカイン(Cytokines)、ウィルス(Virus)が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００１２】
本発明は、腫瘍細胞の速やかな減少及び／又は消滅を提供するものであり、注射の後、２週間以内にＭＲＩ及び／又はＣＴ及び／又はエコースキャンによって視覚的に検知することができる。本発明の望ましい実施例による治療は、以下のステップを含んでいる。
ステップ１：患者から末梢血単球細胞(ＰＢＭＣ)を採取する。
ステップ２：これらＰＢＭＣをＧＭ−ＣＦＳ及びＩＬ−４と共に未成熟樹状細胞へ培養する。
ステップ３：培養された未成熟樹状細胞とアジュバントを腫瘍に注入する。
ステップ４：２週間後に腫瘍を評価する。
【００１３】
具体的な実施例として、本治療方法の有効性(免疫反応：immuno-response)は、上記ステップ１〜４の前に、既存の免疫系を減退させるように、公知の化学療法技術及び／又は放射線療法技術を用いて、予め腫瘍細胞を処置しておくことで増大させることができる。さらに、本治療方法の有効性(免疫反応)は、上記ステップ１〜４の前に抗Ｔ細胞モノクローナル抗体と共に腫瘍細胞に注入することでも(これは単独で行なってもよいし、上述の化学療法及び／又は放射線療法に加えて行なってもよい)、増大させることができる。
【手続補正書】
【提出日】平成19年12月12日(2007.12.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍組織中の腫瘍細胞を減少させる方法に用いるための未成熟樹状細胞及びアジュバントであって；
未成熟樹状細胞は、患者から採取された単球細胞を、１又は複数のファクターと共に培養することによって生成されるものであり、方法には、未成熟樹状細胞とアジュバントを、腫瘍組織に取り込むことが含まれている未成熟樹状細胞及びアジュバント。
【請求項２】
患者は、ヒトである請求項１に記載の未成熟樹状細胞及びアジュバント。
【請求項３】
１又は複数のファクターは、ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＦＳから構成されるグループから選択される請求項１に記載の未成熟樹状細胞及びアジュバント。
【請求項４】
アジュバントは、マリグナーゼ、ＬＣＭ、アガリクス、ＯＫ４３２、ＢＣＧ、レンチナン、霊芝、サルノコシカケ、ＴＮＦ、メシマコブ、フロイント完全又は不完全アジュバント、ＬＰＳ、脂肪酸、及び、リン脂質から構成されるグループから選択される請求項１に記載の未成熟樹状細胞及びアジュバント。
【請求項５】
アジュバントは、サイトカインである未成熟樹状細胞及びアジュバント。
【請求項６】
サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、及び、ＩＬ−１５から構成されるグループから選択される請求項５に記載の未成熟樹状細胞及びアジュバント。
【請求項７】
アジュバントは、ウィルスである請求項１に記載の未成熟樹状細胞及びアジュバント。
【請求項８】
未成熟樹状細胞及びアジュバントを腫瘍組織に取り込む前に、化学療法を処置する請求項１に記載の未成熟樹状細胞及びアジュバント。
【請求項９】
未成熟樹状細胞及びアジュバントを腫瘍組織に取り込む前に、放射線療法を処置する請求項１に記載の未成熟樹状細胞及びアジュバント。
【請求項１０】
未成熟樹状細胞及びアジュバントを腫瘍組織に取り込む前に、抗Ｔ細胞モノクローナル抗体を処置する請求項１に記載の未成熟樹状細胞及びアジュバント。
【請求項１１】
腫瘍細胞の減少が生じているかどうかを判断するために、未成熟樹状細胞及びアジュバントを腫瘍組織に取り込んでから１４日後に、腫瘍組織を評価する請求項１に記載の未成熟樹状細胞及びアジュバント。
【請求項１２】
腫瘍組織中の腫瘍細胞を減少させる方法に用いるための未成熟樹状細胞及びアジュバントであって；
未成熟樹状細胞は、患者から採取された単球細胞を、１又は複数のファクターと共に培養することによって生成されるものであり、方法には、腫瘍を化学療法レジメンによって処置し、未成熟樹状細胞とアジュバントを、腫瘍組織に取り込むことが含まれている未成熟樹状細胞及びアジュバント。
【請求項１３】
患者は、ヒトである請求項１２に記載の未成熟樹状細胞及びアジュバント。
【請求項１４】
１又は複数のファクターは、ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＦＳから構成されるグループから選択される請求項１２に記載の未成熟樹状細胞及びアジュバント。
【請求項１５】
アジュバントは、マリグナーゼ、ＬＣＭ、アガリクス、ＯＫ４３２、ＢＣＧ、レンチナン、霊芝、サルノコシカケ、ＴＮＦ、メシマコブ、フロイント完全又は不完全アジュバント、ＬＰＳ、脂肪酸、及び、リン脂質から構成されるグループから選択される請求項１２に記載の未成熟樹状細胞及びアジュバント。
【請求項１６】
アジュバントは、サイトカインである請求項１２に記載の未成熟樹状細胞及びアジュバント。
【請求項１７】
サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、及び、ＩＬ−１５から構成されるグループから選択される請求項１６に記載の未成熟樹状細胞及びアジュバント。
【請求項１８】
アジュバントは、ウィルスである請求項１２に記載の未成熟樹状細胞及びアジュバント。
【請求項１９】
未成熟樹状細胞及びアジュバントを腫瘍組織に取り込む前に、放射線療法を処置する請求項１に記載の未成熟樹状細胞及びアジュバント。
【請求項２０】
腫瘍組織中の腫瘍細胞を減少させる方法に用いるための未成熟樹状細胞及びアジュバントであって、
未成熟樹状細胞は、患者から採取された単球細胞を、１又は複数のファクターと共に培養することによって生成されるものであり、方法には、腫瘍を放射線療法レジメンを用いて処置し、未成熟樹状細胞とアジュバントを、腫瘍組織に取り込むことが含まれている未成熟樹状細胞及びアジュバント。
【請求項２１】
患者は、ヒトである請求項２０に記載の未成熟樹状細胞及びアジュバント。
【請求項２２】
１又は複数のファクターは、ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＦＳから構成されるグループから選択される請求項２０に記載の未成熟樹状細胞及びアジュバント。
【請求項２３】
アジュバントは、マリグナーゼ、ＬＣＭ、アガリクス、ＯＫ４３２、ＢＣＧ、レンチナン、霊芝、サルノコシカケ、ＴＮＦ、メシマコブ、フロイント完全又は不完全アジュバント、ＬＰＳ、脂肪酸、及び、リン脂質から構成されるグループから選択される請求項２０に記載の未成熟樹状細胞及びアジュバント。
【請求項２４】
アジュバントは、サイトカインである請求項２０に記載の未成熟樹状細胞及びアジュバント。
【請求項２５】
サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、及び、ＩＬ−１５から構成されるグループから選択される請求項２４に記載の未成熟樹状細胞及びアジュバント。
【請求項２６】
アジュバントは、ウィルスである請求項２０に記載の未成熟樹状細胞及びアジュバント。
【請求項２７】
未成熟樹状細胞及びアジュバントを腫瘍組織に取り込む前に、放射線療法を処置する請求項２０に記載の未成熟樹状細胞及びアジュバント。
【請求項２８】
腫瘍組織に取り込まれると、抗原と結合し、患者中の腫瘍を減少させる悪性腫瘍ワクチン前駆物質であって、
患者から採取された単球に由来する未成熟樹状細胞と、
アジュバントと、及び、
患者中の腫瘍からの抗原と、
を含んでいる物質。
【請求項２９】
患者は、ヒトである請求項２８に記載のワクチン。
【請求項３０】
１又は複数のファクターは、ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＦＳから構成されるグループから選択される請求項２８に記載のワクチン。
【請求項３１】
アジュバントは、マリグナーゼ、ＬＣＭ、アガリクス、ＯＫ４３２、ＢＣＧ、レンチナン、霊芝、サルノコシカケ、ＴＮＦ、メシマコブ、フロイント完全又は不完全アジュバント、ＬＰＳ、脂肪酸、及び、リン脂質から構成されるグループから選択される請求項２８に記載のワクチン。
【請求項３２】
アジュバントは、サイトカインである請求項２８に記載のワクチン。
【請求項３３】
サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、及び、ＩＬ−１５から構成されるグループから選択される請求項３２に記載のワクチン。
【国際調査報告】
2008513470.tif 000002