(57)【要約】  本発明は乳癌の診断に関する。本発明は乳癌の診断におけるタンパク質PDX1（ペルオキシレドキシン１）の使用を開示する。本発明は、個体に由来する液体試料中のPDX1を測定することによる、該試料からの乳癌の診断の方法に関する。PDX1の測定は、例えば、乳癌の早期検出または診断に用いられ得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の
a）PDX1（＝ペルオキシレドキシン１）
b）任意に、乳癌の1つ以上の他のマーカー
の濃度を測定すること、および
c）乳癌の評価において、工程（a）、および任意に工程（b）において測定された濃度を用いることを含む、
インビトロで乳癌を評価する方法。
【請求項２】
前記試料が血清であることをさらに特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記試料が血漿であることをさらに特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記試料が全血であることをさらに特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記試料が乳頭吸引液であることをさらに特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記1つ以上の他のマーカーがCEA、CA 15-3、CRABP-II、およびASCからなる群より選択されることをさらに特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記1つ以上の他のマーカーがCEAであることをさらに特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記1つ以上の他のマーカーがCA 15-3であることをさらに特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記1つ以上の他のマーカーがCRABP-IIであることをさらに特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
前記1つ以上の他のマーカーがASCであることをさらに特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項１１】
乳癌の評価におけるマーカー分子としてのタンパク質PDX1の使用。
【請求項１２】
PDX1および乳癌の1つ以上の他のマーカーを含む、乳癌の評価におけるマーカーパネルの使用。
【請求項１３】
1つ以上の他のマーカーがCEA、CA 15-3、CRABP-II、およびASCからなる群より選択される、請求項１２記載のマーカーパネルの使用。
【請求項１４】
病期Tis-3、N0、M0のBC患者に由来する試料で評価がなされる、請求項１１〜１３いずれか記載の使用。
【請求項１５】
PDX1を測定するために必要とされる試薬を含む、請求項１記載の方法を行うためのキット。
【請求項１６】
PDX1、および乳癌の1つ以上の他のマーカーを測定するために必要とされる試薬を含む、請求項６記載の方法を行うためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は乳癌の診断に関する。本発明は乳癌の診断におけるPDX1（＝ペルオキシレドキシン1）の使用を開示する。さらに本発明は特に、個体から得た液体試料中のPDX1を測定することによる乳癌の診断方法に関する。PDX1の測定は、例えば、乳癌の早期発見もしくは診断、または手術を受けた患者のサーベイランスに用いられ得る。
【背景技術】
【０００２】
癌は、検出や治療法の発展にもかかわらず、未だ主要な公衆衛生課題のままである。様々な種類の癌の中で、乳癌（=BC）は西洋の女性の間で最も頻出する癌の一つである。
【０００３】
癌の病期分類は、程度、進行、および重症度に関する疾患の分類である。癌の病期分類は、予後および治療法の選択について総括できるように癌患者を分類する。
【０００４】
今日、TNMシステムは最も広く用いられる、癌の解剖学的程度の分類法である。TNMシステムは国際的に認められた一律病期分類システムに相当する。３つの基本的な変数：T（原発腫瘍の程度）、N（局所リンパ節の状態）、およびM（遠隔転移の有無）がある。TNM基準はUICC (International Union Against Cancer)(Sobin, L.H., Wittekind, Ch. (編): TNM Classification of Malignant Tumours, 第5版、1997)に発表されている。乳癌の病期分類システムは、最近改訂されている(Singletary, S.E.ら, J. Clin. Oncol. 20 (2002) 3628-3636)。
【０００５】
特に重要なことはBCの早期診断がはるかに良い予後に転換することである。従って、最も良い予後は、早くも病期Tis, N0, M0またはT1-3; N0; M0の患者であり、もし適切に治療されれば、診断後5年生存する可能性が90％を上回るのに比べ、既に遠隔転移がある時に診断された患者は5年後の生存率がたった18％しかない。
【０００６】
本発明の意味におけるBCの早期診断は、前癌状態、非浸潤性乳管癌（DCIS）、または転移が全く（近位にも遠位にも）ない腫瘍病期、すなわち、Tis, N0, M0またはT1-4; N0; M0がある時の診断をいう。Tisは上皮内癌を意味する。
【０００７】
好ましい態様において、PDX1の検出は非転移病期におけるBCの診断に用いられる、すなわち病期Tis, N0, M0またはT1-3; N0; M0 (=Tis-3; N0; M0)で診断される。
【０００８】
癌が発見／診断され得るのが早いほど、全体的な生存率はよくなる。この事は特にBCに当てはまる。腫瘍の進行した段階での予後は芳しくない。1／3を上回る患者が診断後5年以内に、これは5年間の生存率で約40％に相当するが、進行性疾患で死亡するであろう。現在の治療は、わずかな患者が治癒するだけで、疾患の早期段階で診断された患者が明らかにもっとも良い結果を出している。
【０００９】
公衆衛生課題のBCに関しては、より効果的なスクリーニング、および乳癌が発生しないための予防措置が開発されることが不可欠である。
【００１０】
現在利用できる乳癌の最も早い発見手段は、臨床的乳房検査およびマンモグラフィを用いるものを含む。しかしながら、腫瘍が触診可能または乳房X線像によって発見され得る前に、顕著な腫瘍の大きさが通常は存在している必要がある。乳房組織の密度および年齢はマンモグラフィによるスクリーニングの正確さを予測するのに重要な判断材料である。感度は、極めて密度の高い乳房の女性において63％から、ほとんど全体に脂肪質の乳房の女性において87％、の範囲にわたる。感度は、およそ40歳の女性において69％から、80歳以上の女性において83％に、年齢と共に上昇する(Carney, P.A.ら, Ann. Intern. Med. 138 (3) (2003) 168-175)。マンモグラフィで発見される異常のたった20-25％が、生検によって悪性であると証明される。前癌状態および癌の病変の視覚化は早期発見の最も良いやり方に相当するが、マンモグラフィは、実行および結果の解釈の両方に、高度の注意および専門的知識を必要とする、費用がかかる検査である(WHO, Screening for Breast Cancer, 2002年5月10日; Esserman, L.ら, J. Natl. Cancer  Inst. 94 (2002) 369-375)。
【００１１】
近年、いわゆる乳房特有の、またはさらにいわゆる乳癌特有の、多大な量の遺伝子が報告されている。対応する論文または特許出願の大部分は、乳房の（癌）組織におけるRNA発現パターンを、別の組織または近接する通常の組織、それぞれと対比した分析によって得られたデータに基づく。かかる手段は、ディファレンシャルmRNAディスプレイ法として要約され得る。
【００１２】
mRNAディスプレイ法から得られるデータの一例として、WO 00/60076について言及し、議論するべきである。この出願は200を上回る単離されたポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチドそれ自体、ならびにBCの発見におけるそれらの使用を記載し、主張する。しかしながら、mRNAのレベルの違いが対応するタンパク質のレベルによって正確に反映されないことは、一般知識である。珍しいmRNAによってコードされるタンパク質は非常に多量に発見され得、豊富なmRNAによってコードされるタンパク質はそれにもかかわらず検出されるのが困難で全く発見され得ない(Chen, Gら, Mol. Cell. Proteomics 1 (2002) 304-313)。このmRNAのレベルとタンパク質レベルの間の相関関係がないのは、例えばmRNA安定性、翻訳の能率、タンパク質の安定性、等の理由による。
【００１３】
また、BCの診断に用いられ得るマーカー分子の候補を同定するために、異なる組織間、または、健康な組織と病気の組織間の、タンパク質パターンの違いを調査する最近の手段もある。Wulfkuhle, J.D.ら, Cancer Res. 62 (2002) 6740-6749は、BC組織と近接する通常の組織の間に異なった形で発現された57のタンパク質を同定している。個体から得られた液体試料からのデータは報告されない。
【００１４】
WO 02/23200は、表面増強レーザー脱離イオン化（SELDI）によって発見された約12の乳癌に関連する集積(spot)について報告する。これらの集積は、健常対照群から得られる血清に比べ、BCを持つ患者から得られる血清中により頻繁に見られる。しかしながら、かかる集積に含まれる分子の同一性、例えばそれらの配列、は知られていない。
【００１５】
乳頭吸引液（NAF）は、乳癌特異的マーカーを同定する潜在的な非侵襲性の方法として、長年にわたり用いられている。Kuererらは、一方が侵襲性の乳癌腫をもつ女性から得た、対となる双方の乳頭吸引液を2Dゲル電気泳動により比較した(Kuerer, H.M.ら, Cancer 95 (2002) 2276-2282)。30から202の異なるタンパク質集積が乳癌腫を患う乳房のNAFで発見され、対となる健常な乳房のNAFでは発見されなかった。これらの集積はゲル画像解析により発見された。しかしながら、タンパク質集積の同一性は知られていない。
【００１６】
多数でますます増加する、BCの領域におけるタンパク質マーカー候補のリストにもかかわらず、今日までこれらの分子の臨床的／診断的有効性は知られていない。臨床的有効性を持つために、単独のマーカーとしての新しい診断マーカーは、少なくとも当該分野で公知の最も優れた単独のマーカー程度であるべきである。または、新しいマーカーは、単独でもしくは1つ以上の他のマーカーと併用してそれぞれ用いられたいずれの場合にも、診断の感度および／または特異性において、進歩をもたらすべきである。診断の感度および／または検査の特異性は、下記に詳細に記載される受信者動作特性で最も良く評価される。
【００１７】
現在、腫瘍に関連するムチンである癌抗原15-3（CA 15-3）および腫瘍に関連する糖タンパクである癌胎児抗原（CEA）の検出に基づく診断血液検査のみが、BCの領域における診断を助けることに利用できる。CA 15-3は通常、進行性の乳癌をもつ患者において増加する。CA 15-3のレベルは早期乳癌の女性では滅多に上昇しない(Duffy, M.J., Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 38 (2001) 225-262)。卵巣、肺および前立腺の癌もまた、CA 15-3レベルを上昇し得る。CA 15-3の上昇したレベルは、乳房または卵巣の良性疾患、子宮内膜症、骨盤腹膜炎、肝炎等の非癌状態と関連し得る。妊娠および授乳もまたCA 15-3レベルを上昇し得る(National Cancer Institute,  Cancer Facts, Fact Sheet 5.18 (1998)1-5)。CEAの主な使用は、特に疾患が転移した時の結腸癌のモニタリングである。しかしながら、乳癌を含む様々な癌は、CEAのレベルの上昇を引き起こし得る。
【００１８】
器官および腫瘍の特異性がないために、CA 15-3の測定もCEAの測定もBCのスクリーニングには推奨されない。これらの腫瘍マーカーは、BC患者のフォローアップ治療における有益な診断ツールである(Untch, M.ら, J. Lab. Med. 25 (2001) 343-352)。
【００１９】
全血、血清、血漿、または乳頭吸引液は、臨床的業務において最も広く用いられる試料の源である。信頼性のある癌検出を可能にする、または早期の予後情報を提供する、早期のBC腫瘍マーカーの同定は、診断において、および疾患の管理において大いに助けになる診断分析をもたらし得る。従って、インビトロでのBCの評価を改善する緊急の臨床的必要性が存在する。早期に診断された患者の生存可能性は、疾患の進行した段階に診断された患者に比べるとはるかに高いので、BCの早期診断を改善することが特に重要である。
【００２０】
BCを評価する際に用いられ得る新しいマーカーが同定され得るかどうかを、調査することが本発明の課題であった。
【００２１】
驚いたことに、マーカーPDX1の使用は、当該分野の水準で公知の課題を少なくとも部分的に克服し得ることが見出されている。
【００２２】
本発明は従って、a)個体から得られた液体試料を提供する工程、b)PDX1に特異的な結合剤とPDX1間の複合体の形成に適当な条件下で、該試料を該結合剤に接触させる工程、およびc)(b)で形成された複合体の量を乳癌の評価と相互に関連付ける工程を含む、乳癌の評価方法に関する。
【００２３】
本発明の別の好ましい態様は、a)PDX1に特異的な結合剤とPDX1間の複合体の形成に適当な条件下で、個体から得られた液体試料を結合剤に接触させる工程、およびb)(a)で形成された複合体の量を乳癌の評価と相互に関連付ける工程を含む、乳癌の評価方法である。
【００２４】
本発明のさらに別の好ましい態様は、試料中のPDX1の濃度および乳癌の1つ以上の他のマーカーの濃度を測定し、乳癌の評価において、測定された前記濃度を用いることを含む、生化学マーカーによるインビトロでの乳癌の評価方法に関する。
【００２５】
本発明はまた、BCの評価において、少なくともPDX1およびCA 15-3を含むマーカーパネルの使用に関する。
【００２６】
本発明はまた、BCの評価において、少なくともPDX1およびCEAを含むマーカーパネルの使用に関する。
【００２７】
本発明はまた、BCの評価において、少なくともPDX1およびCRABP-IIを含むマーカーパネルの使用に関する。
【００２８】
本発明はまた、BCの評価において、少なくともPDX1およびASCを含むマーカーパネルの使用に関する。
【００２９】
本発明はまた、少なくともPDX1およびCA 15-3をそれぞれ測定するために必要な試薬、および任意に測定を実施するための補助試薬を含む、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。
【００３０】
本発明はまた、少なくともPDX1およびCEAをそれぞれ測定するために必要な試薬、および任意に測定を実施するための補助試薬を含む、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。
【００３１】
さらに好ましい態様において、本発明は、試料中のa)PDX1、b)任意に乳癌の1つ以上の他のマーカーの濃度を測定し、c)乳癌の評価において、工程(a)および任意に工程(b)で測定された前記濃度を用いることを含む、インビトロでの乳癌の評価方法に関する。
【００３２】
本明細書中において、以下の用語のそれぞれはこの項中でそれと関連する意味を有する。
【００３３】
冠詞「a」および「an」は本明細書中では、冠詞の文法的目的語の1つ以上（すなわち、少なくとも１つ）をいうのに用いられる。一例として、「マーカー(a marker)」は1つのマーカーまたは１つより多いマーカーを意味する。
【００３４】
本明細書中で用いられる、用語「マーカー」または「生化学マーカー」は、患者の検査試料を分析するための標的として用いられる分子をいう。かかる分子標的の例は、タンパク質またはポリペプチドそれら自身、ならびに試料中に存在する抗体である。本発明でマーカーとして用いられるタンパク質もしくはポリペプチドは、該タンパク質の任意の変異体ならびに該タンパク質もしくは該変異体の断片、特に免疫学的に検出可能な断片を含むことを意図される。当業者は細胞によって遊離した、または例えば炎症の間に損傷した細胞外基質に存在していた、タンパク質がかかる断片に分解または開裂され得ることを理解するだろう。ある特定のマーカーは不活性な形態で合成され、引き続いてタンパク質分解によって活性化され得る。当業者はタンパク質またはそれらの断片もまた複合体の一部として存在し得ることを認識するであろう。かかる複合体もまた、本発明の意味ではマーカーとして用いられ得る。マーカーポリペプチドの変異体は同じ遺伝子によってコードされるが、PIもしくはMW、または両者において異なり（例えば、選択的mRNAまたはmRNA前駆体プロセシング、例えば、選択的スプライシングまたは制限タンパク質分解、の結果として）および、さらに、もしくは代わりに、特異な翻訳後修飾（例えば、糖化、アシル化、および／またはリン酸化反応）から起こり得る。
【００３５】
用語「乳癌の評価」は、本発明の方法（単独で、または他のマーカーもしくは変数、例えばUICC (UICC (International Union Against Cancer), Sobin, L.H., Wittekind, Ch. (編), TNM Classification of Malignant Tumours, 第５版, 1997)により示された基準、と共に）が、例えば医師がBCの有無の確証または確認する助けとなったり、予後の再発検出（術後患者の追跡調査）および／もしくは、治療の、特に化学療法のモニタリングにおいて医師の助けとなったりすることを示すのに用いられる。
【００３６】
用語「試料」は、本明細書中において、インビトロでの評価の目的のために得た生物学的試料をいう。本発明の方法において、試料または患者試料は好ましくは任意の体液を含み得る。好ましい検査試料としては、血液、血清、血漿、乳頭吸引液、尿、唾液、および滑液が挙げられる。好ましい試料は、全血、血清、血漿、または乳頭吸引液で、血漿もしくは血清が最も好ましい。当業者は、任意のかかる評価がインビトロでできることを認識するであろう。患者試料はその後、廃棄される。患者試料は、単にインビトロでの本発明の方法に用いられるだけのためのもので、患者試料の物質は患者の身体には戻されない。通常は、試料は液体試料で、例えば、全血、血清、または血漿である。
【００３７】
好ましい態様において、本発明は、試料中のPDX1の濃度を測定し、BCの評価において、測定された前記濃度を用いることを含む、生化学マーカーによるインビトロでのBCの評価方法に関する。
【００３８】
タンパク質PDX1（ペルオキシレドキシン1、チオレドキシンペルオキシダーゼ2、チオレドキシン依存性過酸化物レダクターゼ2、増殖関連タンパク質パグ（pag）、ナチュラルキラー細胞増強因子A（nkef-A）; ナチュラルキラー増強因子A; Swiss-PROT: Q06830としても公知）は、配列番号１に所定の配列、またはそのイソフォームを特徴とする。この配列は22,110 Daの分子量に翻訳される。
【００３９】
PDX1は以下の出版物から当該分野で公知である： Chang, J.W.ら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (2) (2001) 507-512; Noh, D.Y.ら, Anticancer Res. 21 (3B) (2001) 2085-2090; Yanagawa, T.ら, Cancer Lett. 156 (1) (2000) 27-35。PDX1は細胞中で抗酸化作用のある保護の役割を果たし得、CD8(+)T細胞の抗ウイルス活性に貢献し得る。このタンパク質は増殖性の効果を有し得、癌の発生および進行において役割を果たし得る。ペルオキシレドキシン(Prx)は、チオレドキシン(Trx)または他の物質からの電子を用いてH2O2を還元し得る25kDaペルオキシダーゼのファミリーである。
【００４０】
当業者には自明のように、本発明は、配列番号1のタンパク質PDX1全長に限られると解釈されるべきではない。PDX1の生理学的な、または人工の断片、PDX1の二次修飾、ならびにPDX1の対立遺伝子変異体もまた、本発明によって包含される。その際「対立遺伝子変異体」は、単一遺伝子座に存在し得る遺伝子またはDNA配列の２つ以上の異なる形態の一つの遺伝子産物を意味すると理解される。人工断片は好ましくは、合成的に、または組換え技術によって生成されたペプチドを含み、配列番号1において開示される配列から由来する少なくとも６つの連続的なアミノ酸からなる診断の目的の少なくとも１つのエピトープを含む。かかる断片は、抗体の生成のために、またはイムノアッセイにおける標準として有利に用いられ得る。より好ましくは人工的な断片は、サンドイッチイムノアッセイをするのに適当な、少なくとも２つの目的のエピトープを含む。好ましくは、PDX1全長またはこのマーカーの生理学的変異体は本発明の方法において検出される。
【００４１】
本発明の評価方法は、個体から得られる液体試料に基づく。当該分野に公知の方法とは異なり、PDX1は特異的な結合剤の使用により、この液体試料から測定される。特異的な結合剤は、例えばPDX1のレセプター、PDX1に結合したレクチン、またはPDX1に対する抗体である。特異的な結合剤は、対応する標的分子に対して少なくとも107 l/molの親和力を有する。特異的な結合剤は、標的分子に対して、好ましくは108 l/molの親和力、更により好ましくは109 l/molの親和力を有する。当業者には認識されるように、特異的という用語は試料に存在する他の生体分子がPDX1に特異的な結合剤に著しくは結合しないことを示すのに用いられる。好ましくは、標的分子以外の生体分子に結合する度合いは、標的分子の親和力のたった１０％以下、より好ましくはたった５％以下の結合親和力という結果になる。最も好ましい特異的結合剤は、親和力ならびに特異性、両者の上記最低基準を満たすであろう。
【００４２】
特異的結合剤は好ましくは、PDX1に結合する抗体である。用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、かかる抗体の断片、ならびに抗体の結合ドメインを含む遺伝子構築物をいう。
【００４３】
特異的結合剤の上記基準を保持する任意の抗体断片が用いられ得る。抗体は、例えばTijssen (Tijssen, P., Practice and theory of enzyme immunoassays 11 (1990) 全編、特に43-78ページ; Elsevier, Amsterdam)に記載されるような、当該分野の水準の手段により生成される。また、当業者は、抗体の特異的な単離に用いられ得る免疫吸着剤に基づく方法についてよく承知している。これらの方法によって、ポリクローナル抗体の品質および従ってイムノアッセイにおけるそれらの性能が高められ得る（Tijssen, P., 上記、108-115ページ）
【００４４】
本発明に開示される成果のために、ウサギにおいて産生されたポリクローナル抗体が用いられている。しかしながら、異なる種、例えばネズミまたはモルモットからのポリクローナル抗体もまた明らかに、ならびにモノクローナル抗体もまた、用いられ得る。モノクローナル抗体は一定の性質で必要な任意量で生成され得るので、臨床的業務のための検定法の開発における理想的なツールの代表である。本発明の方法において、PDX1へのモノクローナル抗体の生成および使用は、さらに別の好ましい態様である。
【００４５】
本発明による診断方法は、個体から得られる液体試料に基づく。当該分野で公知の方法とは異なり、PDX1は特異的な結合剤の使用により、この液体試料から測定される。
【００４６】
ここで、当業者にはPDX1がBC評価において有用なマーカーとして同定されていることが認識されるように、代替的方法が本発明の成果に相当する結果に至るのに用いられ得る。例えば、抗体を生成する代替的戦略が用いられ得る。かかる戦略は、数ある中でも、免疫付与にPDX1のエピトープを示す合成ペプチドの使用を含む。好ましくは、合成ペプチドはPDX1に特異的な、すなわち他の／関連するポリペプチドに比較的低い相同性をもつ、配列番号１の下位配列を含む。合成ペプチドが、配列番号１の5から25のアミノ酸残基からなる連続的な下位配列を含むことが好ましい。より好ましくは、ペプチドが配列番号１の10から15のアミノ酸残基からなる連続的な下位配列を含む。
【００４７】
あるいは、DNAワクチンとしてもまた知られるDNA免疫付与が用いられ得る。
【００４８】
測定のために、個体から得られた液体試料はPDX1の特異的結合剤と共に結合剤とPDX1との複合体の形成に適当な条件下で、インキュベートされる。かかる条件は特異的である必要は無く、当業者は独創的な努力をすることなく、容易にかかる適当な培養条件を同定できる。
【００４９】
本発明に開示される方法の最終工程として、複合体の量が測定され、BCの診断と相互に関連付けられる。当業者には認識されるように、特異的結合剤PDX1複合体の量を測定する方法が非常に多くあり、全て関連した教則本（例えばTijssen P., 上記、またはDiamandisら, 編. (1996) Immunoassay, Academic Press, Boston参照）に詳細に記載されている。
【００５０】
好ましくは、PDX1はサンドイッチ型検定方式で検出される。かかる検定において、第一の特異的結合剤はPDX1を一方の側面に補足するのに用いられ、直接的または間接的に検出できるように標識される第二の特異的結合剤はもう一方の側面に用いられる。
【００５１】
上述の通り、驚くべきことに、PDX1が個別の試料から得られた液体試料から測定され得ることが見出さている。BCの診断においてマーカーPDX1を適用するために、組織および生検試料は必要でない。
【００５２】
好ましい態様において、本発明の方法は液体試料物質として血清を用いて実施される。さらに好ましい態様において、本発明の方法は液体試料物質として血漿を用いて実施される。さらに好ましい態様において、本発明の方法は液体試料物質として全血を用いて実施される。さらに好ましい態様において、本発明の方法は液体試料物質として乳頭吸引液を用いて実施される。
【００５３】
本発明の発明者らは、驚くべきことに、体液試料中においてタンパク質PDX1を検出することができた。またさらに驚いたことに、本発明者らは、個体から得たかかる液体試料におけるPDX1の存在を乳癌の診断と相関させ得ることを示すことができた。好ましくは、PDX1に対する抗体が、定性的(PDX1 の有無)または定量的 (PDX1量が測定される) イムノアッセイにおいて使用される。
【００５４】
BCの評価において、特に、以下の意図される用途が重要であると考えられる。
【００５５】
スクリーニング:
BCは、先進国の女性に最も頻繁に起こる癌の１つである。その高い有病率、その長い無症候基および前悪性病変の存在のため、BCはスクリーニングの基準の多くを満たす。明らかに、許容され得る感度および特異性を有する血清腫瘍マーカーが、確立された方法よりもスクリーニングに、より適当であり得る。好ましい態様では、本発明による診断方法は、スクリーニング目的に使用される。すなわち、それは、PDX1のレベルを測定し、測定されたレベルをBCの有無と相関させることにより、以前にBCの診断のない被験体を評価するために使用される。
【００５６】
PDX1単独は、例えば、BCのリスク集団の一般的なスクリーニングを可能にするに充分でないと考えられる。血液循環中の単一の生化学的マーカーで、スクリーニング目的に必要とされる感度および特異性基準をみたすものは、ほぼ絶対になさそうである。むしろ、マーカーパネルがBCスクリーニングに使用されるべきであることに期待するべきである。したがって、マーカーPDX1は、スクリーニング目的に適切なマーカーパネルの不可欠な部分を形成する。本発明は、したがって、BCスクリーニング目的のBCマーカーパネルのマーカーの１つとしてのPDX1の使用に関する。
【００５７】
診断の補助
本発明者らはまた、PDX1が、特に、乳癌手術前の腫瘍容積(load)を示すベースライン値を確立することにより、診断の補助として使用されると考える。したがって、本発明はまた、BCの手術前のベースライン値を確立するためのPDX1の使用に関する。大きな利点を有するPDX1に対する抗体もまた、確立された手順において、例えば、乳癌細胞を原位置で、生検材料中で、または免疫組織学的手順において検出するために使用され得る。
【００５８】
予後
PDX1単独は、BC患者と健康な対照または健康な対照＋非悪性疾患との区別に寄与するため、BCを患う患者の予後の評価を補助するであろうことが期待されるべきである。手術前のPDX1のレベルは、たいてい、BCの１つ以上の他のマーカーおよび／またはTNM分類システムを組み合わせる。好ましい態様では、PDX1はBCの患者の予後において使用される。
【００５９】
治療のモニタリング
本発明者らは、さらに、PDX1は、化学療法、放射線療法または免疫療法のモニタリングのための臨床的に有用なマーカーであろうと考える。PDX1の増加したレベルは、腫瘍負荷と直接相関する。例えば、化学療法後の短期間(数時間〜14 日間)では、PDX1の増加が腫瘍細胞死のインジケーターとなり得る。したがって、本発明はまた、化学療法下のBC患者のモニタリングにおけるPDX1の使用に関する。また、本発明は、したがって、放射線療法下のBC患者のモニタリングにおけるPDX1の使用にも関する。さらにまた、本発明は、免疫療法下のBC患者のモニタリングにおけるPDX1の使用に関する。
【００６０】
追跡調査:
【００６１】
治癒を目的とした外科的切除を受ける患者の若干数は、後に転移性疾患の再発が起こる。再発性/転移性疾患は、常に致死的であるため、相当な研究が、その初期ひいては潜在的に治療可能な段階での同定に焦点を当てている。その結果、これらの患者の多くは、術後のサーベイランスプログラムを受ける。
【００６２】
術後のBCの患者の追跡調査は、適切な生化学的マーカーの使用の最も重要な領域の１つである。追跡調査(3ヶ月〜10年間)では、PDX1の増加が、腫瘍再発のインジケーターとして使用され得る。調査されるBC患者におけるPDX1の高感度により、PDX1単独または１つ以上の他のマーカーとの組合せは、BC患者、特に術後のBC患者の追跡調査において非常に有用であることが期待される。BC患者の追跡調査におけるPDX1およびBCの１つ以上の他のマーカーを含むマーカーパネルの使用は、本発明のさらに好ましい態様を表す。
【００６３】
タンパク質PDX1のレベルを測定することは、BCの分野において、非常に都合がよいことがわかっている。したがって、さらに好ましい態様において、本発明は、個体から得た液体試料から乳癌の診断におけるマーカー分子としてのタンパク質PDX1の使用に関する。
【００６４】
診断の理想的なシナリオは、例えば、感染性疾患のように、単一の事象または経過がそれぞれの疾患を引き起こし得るという状況であろう。他のすべての場合では、正確な診断は、特に、BCの場合のように疾患の病因が充分理解されていない場合、非常に困難であり得る。当業者には認識されるように、例えば、BCの分野において、所定の疾患について100％特異性であると同時に100％感度で診断する生化学的マーカーはない。むしろ、生化学的マーカーは、一定の尤度または予測価を用いて疾患の有無を評価するために使用される。したがって、通常の臨床診断では、一般的に、種々の臨床症状および生化学的マーカーが、基礎疾患の診断、治療および管理において一緒に考慮される。
【００６５】
生化学的マーカーは、個々に測定され得るか、または本発明の好ましい態様では、チップ系もしくはビーズ系アレイ技術を用いて同時に測定され得るかのいずれかである。次いで、バイオマーカーの濃度を、各マーカーに対する個々のカットオフ(cut-off)を用いて独立して解釈するか、または解釈のために組合せる。
【００６６】
タンパク質PDX1それ自体の使用は、BC診断の困難な領域に対する重要な進歩を示す。PDX1の測定を他の公知のマーカー、例えば、CA 15-3およびCEAまたは現在公知もしくは未だ見出されていないBCの他のマーカーと組み合わせることは、さらなる改善に通じる。 
【００６７】
最近、BCを評価するための臨床的有用性を有する新規なマーカーが見出された。これには、細胞のレチノイン酸結合タンパク質II (CRABP-II)およびカスパーゼ関連結合(recruitment domain)領域(ASC)を含有するアポトーシス関連小粒(speck)様タンパク質が含まれる。
【００６８】
細胞のレチノイン酸結合タンパク質II
細胞のレチノイン酸結合タンパク質II (CRABP-II) (Swiss-PROT: P29373)は、現在公知の２つのアイソフォームの１つである。２つのアイソフォーム (CRABP-I および -II)は、最初に、Siegenthalerら 1992によって特徴付けられた。CRABP-II は、ヒト表皮において線維芽細胞およびケラチノサイトによって高度に発現される主要なアイソフォームであることが示された(Siegenthaler, G., Biochemical Journal 287 (1992) 383-389)。
【００６９】
CRABP-IIの濃度の増加は、Vahlquistら (Vahlquist, A.ら, J. Invest. Dermatol. 106 (1996) 1070-1074)により、皮膚の角化棘細胞腫および扁平上皮癌において見られたが、基底細胞癌腫では見られなかった。
【００７０】
細胞質において、CRABP-IIは、細胞内レチノイン酸 (RA) 濃度、輸送および代謝を調節する。RAは、転写の上方調節により、扁平上皮癌において２倍のCRABP-II mRNAレベルを誘導することが示されている (Vo, H.P., Crowe, D.L., Anticancer Res. 18 (1998) 217-224)。
【００７１】
ヒト乳癌細胞におけるCRABP-IIの存在は、最初に、Wangら 1998によって記載された。彼らは、免疫組織化学により、CRABP-IIをヒト乳癌細胞内において位置特定(localize)した(Wang, Y.ら, Laboratory Investigation 78 (1998) 30 A)。
【００７２】
哺乳動物癌腫細胞におけるCRABP-IIの機能は、Budhu, A.S. および Noy, N.
によって記載された(Mol. Cell. Biol. 22 (2002) 2632-2641)。サイトゾルCRABP-IIは、RAに結合すると、核局在を受け、寿命の短い(short lived)CRABP-II-RAR-複合体をつくることにより、レチノイン酸レセプター (RAR) と相互作用する。MCF7 哺乳動物細胞株におけるCRABP-IIの過剰発現は、レチノイン酸誘導性成長阻害に対するその感度を増強する(Budhu, A.S., Noy, N.、上記)。
【００７３】
ヒト乳房の対応(matched)正常管/小葉単位および腺管上皮内癌(DCIS)の第１のプロテオミクス解析において、Wulfkuhleら (Cancer Res. 62 (2002) 6740-6749) は、正常および前癌細胞において識別的に発現される５７種のタンパク質を同定した。CRABP-IIのレベルは、DCIS で正常細胞よりも５倍高いと報告された。同様の増加が、23種もの多くのタンパク質について報告された。しかし、さらなる調査、例えば、CRABP-II が液体試料中で検出され得るかどうかは行なわれなかった (Wulfkuhle, J.D.ら、上記)。
【００７４】
BCを評価するためのCRABP-IIの臨床的有用性は、最近、WO 2004/111650に記載された。
【００７５】
カスパーゼ関連結合領域を含むアポトーシス関連小粒様タンパク質
「カスパーゼ関連結合領域を含むアポトーシス関連小粒様タンパク質」 (ASC)はまた、「メチル化誘導性サイレンシング1の標的」(TMS1) (Swiss-PROT: Q9ULZ3) として公知である。
【００７６】
カスパーゼ関連結合領域(CARD) は、APAF1 (アポトーシスプロテアーゼ活性化因子1) などのアダプタータンパク質とアポトーシスに関与するカスパーゼのプロ形態(例えば、CASP 9) との相互作用を媒介する。ASC は、CARD含有アダプタータンパク質ファミリーの１つである。
【００７７】
前骨髄性細胞株のイムノスクリーニングにより、Masumotoらは、ASCをコードするcDNAを単離した。推定195-アミノ酸タンパク質は、N末端 ピリン様ドメイン(PYD)および87残基 C末端 CARDを含有する。ウエスタンブロット解析により、22-kDa タンパク質発現が示され、ASCは、抗癌薬によるアポトーシス刺激に対する白血病細胞株の感受性を増加させることにより、プロアポトーシス活性を有し得ることが示された(Masumoto, J.ら, J. Biol. Chem. 274 (1999) 33835-33838)。
【００７８】
Conwayらによるメチル化感受性制限PCRおよびメチル化特異的PCR (MSP) 解析は、ASCのサイレンシングがエキソン1 の周囲のCpG 島の過剰メチル化と相関し、DNMT1 (DNA シトシン-5-メチルトランスフェラーゼ-1) の過剰発現が過剰メチル化およびASCのサイレンシングを促進することを示した。正常乳房組織でなく乳癌細胞株は、ASCの完全なメチル化を示し、ASC メッセージは発現しなかった。乳癌細胞株におけるASCの発現は、成長を抑制し、生存コロニーの数を減少させた。Conwayらは、ASC は、カスパーゼ依存性アポトーシスの促進において機能し、ASCの過剰発現は、乳癌細胞の成長を抑制すると結論づけた (Conway, K.E.ら, Cancer Res. 60 (2000) 6236-6242)。
【００７９】
McConnell および Vertinoは、ASC の誘導性発現は、細胞の増殖を抑制し、カスパーゼインヒビターによって阻止され得るDNA断片化を誘導することを示した。免疫蛍光顕微鏡検査により、アポトーシスの誘導が、散在的細胞質での発現から球面的な核周辺での凝集へのCARD依存性転換を引き起こすことが示された(McConnell, B.B. および Vertino, P.M., Cancer Res. 60 (2000) 6243-6247)。
【００８０】
Morianiらは、ASC遺伝子のメチル化を、乳癌細胞だけでなく、胃癌においても観察した。彼らは、プロアポトーシスASC遺伝子の下方調節を伴う乳癌および胃癌の進行におけるASC遺伝子の異常なメチル化の直接的な役割を示唆した(Moriani, R.ら, Anticancer Res. 22 (2002) 4163-4168)。
【００８１】
Conwayらは、TMS1メチル化の初期乳房組織を調べ、健康な組織におけるメチル化に対する結果と比較した (Conway, K.E.ら, Cancer Res. 60 (2000) 6236-6242)。Levineらは、ASC サイレンシングは、特定のCpG部位のメチル化と相関せず、むしろ、ASC CpG島の密な(dense)メチル化と関連することを見出した。排他的にメチル化されたASCコピーを含む乳房腫瘍細胞株は、ASCを発現しないが、部分的にメチル化された細胞株では、ASC 発現のレベルは、細胞集団内に存在するメチル化 ASC対立遺伝子の割合と直接関連する (Levine, J.J.ら, Oncogene 22 (2003) 3475-3488)。
【００８２】
Virmaniらは、肺癌および乳癌組織においてASCのメチル化状態を調べた。彼らは、ASCの異常なメチル化が、乳癌細胞株の46％および乳房腫瘍組織の32％に存在することを見出した。メチル化は、非悪性乳房組織にはほとんどなかった(7％) (Virmani, A.ら, Int. J. Cancer 106 (2003) 198-204)。Shioharaらは、ASCの上方調節がヒト好中球における炎症およびアポトーシスと密接に関連することを見い出した(Shiohara, M.ら, Blood 98 (2001) 229a)。Masumotoらは、高レベルのASCが上皮細胞および白血球において豊富に発現されることを観察した(Masumoto, J.ら, J. Histochem. Cytochem. 49 (2001) 1269-1275)。
【００８３】
BCを評価するためのASCの臨床的有用性が、最近、WO 2005/040806に記載された。
【００８４】
したがって、さらに好ましい態様において、本発明は、個体から得た液体試料から乳癌の診断における乳癌の１つ以上のマーカー分子と組み合わせた乳癌のマーカー分子としてのPDX1の使用に関する。この点に関して、表現「１つ以上」は、1〜10、好ましくは1〜5、より好ましい3または4を表す。PDX1の測定と組み合わされ得る好ましい選択された他のBCマーカーは、CEA、CA 15-3, CRABP-IIおよびASCである。最も好ましくは、PDX1は、少なくともPDX1ならびにCEA、CA 15-3、CRABP-IIおよびASCからなる群から選択されるマーカーを含むマーカーパネルの一部として使用される。
【００８５】
本発明のさらに好ましい態様では、本発明による乳癌の評価は、a) PDX1、b) 任意に１つ以上の乳癌の他のマーカーの濃度を試料中において測定する工程、ならびにc) 工程(a)および任意に工程(b)で測定した濃度を乳癌の評価において使用する工程を含む方法において行なわれる。
【００８６】
本発明はまた、PDX1およびBCの１つ以上の他のマーカーの濃度を試料中において測定する工程、および測定された濃度をBCの評価において使用する工程を含む、BCを生化学的マーカーによってインビトロで評価する方法に関する。
【００８７】
好ましくは、BCの評価方法は、PDX1および１つ以上の他のマーカーの濃度を測定すること、ならびにPDX1および１つ以上の他のマーカーの濃度をBCの評価において使用することにより行なわれる。
【００８８】
好ましくは、本発明による方法は、乳癌を患っていることが疑われる患者の試料とともに使用される。乳癌を患っていることが疑われる個体は、他の型の癌が除外された個体である。他の癌としては、結腸、肺、胃、卵巣および前立腺の癌が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の好ましい態様は、したがって、a) 乳癌を患っていることが疑われる個体から得た液体試料を提供する工程、b) 前記試料をPDX1特異的結合剤と、前記結合剤とPDX1との複合体の形成に適切な条件下で接触させる工程、およびc) (b)で形成された複合体の量を乳癌の診断と相関させる工程を含む、乳癌の診断方法である。
【００８９】
イムノアッセイなどの特異的結合アッセイの分野における診断試薬は、通常、特異的結合剤および該アッセイを行なうために必要とされる補助試薬を含むキットの形態で最もよく提供される。したがって、本発明はまた、少なくとも１つのPDX1特異的結合剤およびPDX1の測定のための補助試薬を含む免疫学的キットに関する。
【００９０】
試験の精度は、その受信者動作特性(ROC)によって最もよく示される(特にZweig, M.H.およびCampbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 561-577を参照のこと)。ROCグラフは、観察されたデータの全範囲にわたって判定閾値を連続的に変えることにより得られる全ての感度／特異性の組のプロットである。
【００９１】
実験室試験の臨床的成績は、その診断の精度または被験体を臨床的に関連する亜群へと正確に分類する能力に依存している。診断の精度は、検査を受けた被験体の２つの異なる状態を正確に区別する試験の能力を評価するものである。かかる状態は、例えば健康と疾患または良性疾患対悪性疾患である。
【００９２】
各場合において、ROCプロットは、判定閾値の全範囲で１−特異性に対して感度をプロットすることにより２つの分布間の重複を示す。Y軸上は感度、または真陽性の割合［（真陽性試験結果の数）（真陽性の数＋偽陰性試験結果の数）として定義される］である。これはまた、疾患または症状の存在下において陽性と称されている。それは罹患した亜群単独から算出される。X軸上は偽陽性の割合、すなわち１−特異性［（偽陽性結果の数）／（真陰性の数＋偽陽性結果の数）として定義される］である。これは特異性の指標であり、罹患していない亜群単独から算出される。真陽性および偽陽性の割合は、２つの異なる亜群由来の試験結果を用いて全く別々に算出されるため、ROCプロットは試料中の疾患の罹患率から独立している。ROCプロット上の各点は、特定の判定閾値に対応する感度／１−特異性の組を表している。完全な区別を伴う試験は（結果の２つの分布に重複がない）、左上の角を通るROCプロットを有し、この場合、真陽性の割合は1.0または100％（完全な感度）であり、偽陽性の割合は0（完全な特異性）である。区別を伴わない試験の理論的プロット（２つの群の結果の分布が同一）は、左下の角から右上の角に向かって４５度の斜め線となる。ほとんどのプロットはこれらの両極間に含まれる。（ROCプロットが４５度の斜め線の下方に完全に含まれる場合、これは「陽性度（positivity）」についての基準を「より大きい」から「より少ない」に入れ換えることにより容易に修正される。逆も同じ）。定性的には、プロットが左上の角に近づくにしたがって、試験の全体的な精度は高くなる。
【００９３】
実験室試験の診断の精度を定量化するためのある都合のよい最終目標は、単独の数によりその成績を表すことである。最も一般的な世界的尺度はROCプロットの下の面積である。慣例により、この面積は常に≧0.5である（もしそうでなければ、そうなるように決定基準を入れ換え得る）。数値は1.0（２群の試験値の完全な分離）と0.5（２群間の試験値に明らかな分布の差が無い）の間の範囲である。該面積は、該斜め線に最も近い点または90％特異性における感度などのプロットの特定の部分だけでなく、全プロットにも依存する。これは、ROCプロットが完全なもの（面積＝1.0）にどれだけ近いかということの定量的で説明的な表現である。
【００９４】
新規マーカーPDX1の臨床的有用性は、確立されたマーカーCA 15-3との比較において、およびこれとの組合せにおいて、受信者動作特性(receiver operator)曲線解析(ROC; Zweig, M. H. および Campbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 561-577)を用いて最もよく評価される。この解析は、各々、それぞれ、浸潤性管または小葉癌腫、T1-3; N0; M0、より進行した腫瘍、すなわちT4および／または種々の重篤度の転移(N+および／またはM+)、髄質、乳頭、ムチンおよび管の癌腫、腺管上皮内癌ならびに健康な対照の患者の50試料からなる充分規定された患者コホートに基づく。
【００９５】
PDX1と、最近見出されたマーカー、またはCEAおよびCA 15-3などの公知のマーカー、またはまだ見出されていないBCの他のマーカーの測定を組み合わせることは、それぞれ、BCの評価のさらなる改善をもたらすか、またはもたらすだろう。
【００９６】
以下の実施例、参考文献、配列表および図面は、本発明の理解を補助するために提供され、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載する。本発明の精神から逸脱せずに、手順において変更がなされ得ることを理解されたい。
【００９７】
略語
ABTS  2,2'-アジノ-ジ-[3-エチルベンズチアゾリンスルホネート(6)]ジアンモニウム塩
BSA  ウシ血清アルブミン
cDNA  相補DNA
CHAPS  (3-[(3-コラミドプロピル)-ジメチルアンモニオ]-1-プロパン-スルホネート)
DMSO  ジメチルスルホキシド
DTT  ジチオトレイトール
EDTA  エチレンジアミン四酢酸 
ELISA  酵素免疫測定法
HRP  西洋ワサビペルオキシダーゼ
IAA  ヨードアセトアミド(iodoacetamid)
IgG  免疫グロブリンG
IEF  等電点電気泳動
IPG  固定化pH勾配
LDS  ドデシル硫酸リチウム 
MALDI-TOF  マトリックス支援レーザー脱離／イオン化法−飛行時間型質量分析
MES  メシチル-2,4,6-トリメチルフェニル
OD  光学濃度
PAGE  ポリアクリルアミドゲル電気泳動
PBS  リン酸緩衝生理食塩水
PI  等電点
RTS  ラピッドトランスレーションシステム
SDS  ドデシル硫酸ナトリウム
UICC  国際対癌連合
【実施例】
【００９８】
実施例１
潜在的な乳癌のマーカーとしてのPDX1の同定
組織源
乳癌の潜在的な診断的マーカーとしての腫瘍特異的タンパク質を同定するために、プロテオミクス法を用いて2つの異なる種類の組織の分析を行う。
【００９９】
総計で乳癌を患う10人の患者からの組織標本を分析する。各患者から治療的切除に由来する2つの異なる組織の種類：腫瘍組織（>80%腫瘍）（T）、および近隣の健康な組織（N）を収集する。後者の組織の種類は適合（matched）する健康対照標本とする。組織を切除の直後、即座に凍結させ、処理の前に-80℃で貯蔵する。腫瘍を組織病理学的基準によって診断する。
【０１００】
組織の調製
0.8〜1.2 gの凍結組織を乳鉢に入れ、液体窒素により完全に凍結させる。組織を乳鉢の中で微粉状にし、10倍容量（w/v）の溶解緩衝液（40 mMクエン酸Na（Na-citrate）、5 mM MgCl2、1%ゲナポール（Genapol） X-080、0.02%アジ化Na（Na-azide）、Complete（登録商標）  EDTA非含有 [Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, カタログ番号1 873 580] ）に溶解し、その後Wheaton（登録商標）ガラスホモジナイザー（20 x ゆるいフィッティング（loose fitting）、20 x きつい（tight）フィッティング）でホモジナイズする。3 mlのホモジネートを1時間、4,500 x gで、ショ糖密度遠心分離（10〜60%のショ糖）に供する。この遠心分離工程の後、3つの画分を得る。勾配の頂部の画分は、可溶性タンパク質を含有し、さらなる分析に用いる。
【０１０１】
モノクローナル抗体抗ヒトアルブミンのCNBr活性化セファロース（Sepharose）4B上への固定
凍結乾燥したCNBr活性化セファロース4B（Amersham Biosciences, 17-0430-01）を製造業者の使用説明書に従って再膨張させ（reswollen）、洗浄する。ヒトアルブミンに対して向けられるモノクローナル抗体を0.1 M NaHCO3, pH 8.3, 0.5 M NaClに10 mg/mlで溶解する。1 mlの抗体溶液を1 mlの再膨張させたCNBr活性化セファロース4Bと混合する。反応時間は1時間である。残存する活性基の阻害、およびゲルの洗浄を製造業者の使用説明書に従って行う。
【０１０２】
血清アルブミンの除去
7 mlの抗アルブミンゲルをGenapol X-080なしで、溶解緩衝液で平衡化させる。ショ糖密度遠心分離（上記、組織の調製参照）の7 mlの上方の画分をカラムに負荷し、Genalpol X-080なしで、溶解緩衝液を通して洗浄する。合わせた溶出液をさらなる分析に用いる。
【０１０３】
LC-ESI-MSMS分析のための試料の調製
供給業者のマニュアルの指示に従い、可溶性タンパク質画分のタンパク質濃度をBio-Rad（登録商標）タンパク質アッセイ（カタログ番号500-0006、Bio-Rad Laboratories GmbH, Muenchen, Germany）を用いて測定する。200 μgのタンパク質に相当する容積に、4 mlの還元緩衝液（9 M 尿素、2 mM DTT、100 mM KH2PO4、pH 8.2 NaOH）を加え、1時間インキュベートする。溶液をAmicon（登録商標） Ultra 10 kD デバイス（Millipore GmbH, Schwalbach, Germany）で250 μlに濃縮する。アルキル化のために、該250 μlを1 mlのアルキル化緩衝液（9 M 尿素、4 mM ヨードアセトアミド、100 mM KH2PO4、pH 8.2 NaOH）に移し、6時間インキュベートし、その後Amicon（登録商標） Ultra 10 kD デバイスで250 μlに濃縮する。洗浄のために1 mlの9 M 尿素を加え、再度Amicon（登録商標） Ultra 10 kD デバイスで250 μlに濃縮する。洗浄を3回繰り返す。
【０１０４】
プロテアーゼ消化のために、濃縮した溶液を希釈して2.5 M 尿素にし、4 μgのトリプシン（プロテオミクスグレード、Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）と共に一晩インキュベートする。1 mlの1% ギ酸を加えることにより消化を止め、分析する。
【０１０５】
LC-ESI-MSMS分析
トリプシン消化産物 (500 μl) を、SCXおよびRP Pepmep C18カラム (LC Packings, Idstein, Germany) からなる2次元Nano-HPLC-System (Ultimate, Famos, Switchos; LC Packings, Idstein, Germany) で分離する。11個のSCX画分（0、5、10、25、50、100、200、300、400、500、1,500 mM NH4Acを用いる段階溶離）を、90分のグラジエント（5〜95%のアセトニトリル）を用い、RPカラムで、連続的にさらに分離し、ESI-MSイオントラップ (LCQ deca XP; Thermo Electron, Massachusetts, USA; パラメーターについては表2参照) で、データ依存的スキャンを用いてオンライン分析する。各試料について、3回のランを行う。表2に記載されたパラメーターを用いて、生のデータをBioworks 3.1ソフトウェア（Thermo Electron, Massachusetts, USA）で処理する。反復ランから得られる同定されたペプチドおよびタンパク質の併せたリストを得る。
【０１０６】
タンパク質PDX1は、表1に与えた配列を用いて同定する。
【０１０７】
乳癌の潜在的マーカーとしてのPDX1の検出
各患者について、腫瘍試料から同定されたタンパク質、および対応するペプチドの数を、近隣の正常な組織に由来する対応する結果と比較する。この手段によって、タンパク質PDX1は、腫瘍組織において、特異的に発現されているか、または強く過剰発現されていることがわかる。したがって、多くの他のタンパク質の中で、PDX1は、乳癌の診断における使用のための候補マーカーとして適する。
【０１０８】
【表１】
2008502891.tif 000002
【０１０９】
【表２】
2008502891.tif 000003
【０１１０】
実施例２
乳癌のマーカータンパク質PDX1に対する抗体の産生
免疫検出アッセイ、例えばウエスタンブロッティングおよびELISAによる、PDX1の血清中濃度、および血漿中濃度、ならびに血中濃度の測定における、抗体のさらなる使用のために、乳癌のマーカーのタンパク質PDX1に対するポリクローナル抗体を産生させる。
【０１１１】
組み換えタンパク質の発現および精製
PDX1に対する抗体を産生させるために、免疫原を得るために、タンパク質の組み換え発現を行う。RTS 100発現系および大腸菌の組み合わせを適用することにより発現させる。最初の段階において、「ProteoExpert RTS E.coli HY」システムを用いて、該DNA配列を分析し、高収率のcDNAサイレント突然変異体、およびそれぞれのPCRプライマー配列についての推奨を得る。これは商業的なウェブに基づくサービス（www.proteoexpert.com）である。推奨されるプライマー対を用い、cDNAから線状PCR鋳型を産生させるための、PDX1タンパク質をコードするヌクレオチド配列のインビトロの転写および発現のための、「RTS 100大腸菌線状鋳型産生セット、His標識（RTS 100 E. coli Linear Template Generation Set, His-tag）」（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, カタログ番号3186237）を用いる。ウエスタンブロット検出および後の精製のために、発現されるタンパク質はHis標識を含む。最もよく発現する変異体を同定する。PCRから発現および検出までのすべての工程は、製造業者の使用説明書に従って行う。すべての必要なT7調節領域（プロモーター、リボソーム結合部位、およびT7ターミネーター）を含むそれぞれのPCR産物を、製造業者の使用説明書に従い、pBAD TOPO（登録商標）ベクター（Invitrogen, Karlsruhe, Germany, カタログ番号K 4300/01）の中にクローン化させる。T7調節配列を用いる発現のために、該構築物を大腸菌BL 21 (DE 3) に形質転換させ (Studier, F.W.,ら, Methods Enzymol. 185 (1990) 60〜89) 、形質転換された細菌をタンパク質発現のために1 lのバッチで培養する。
【０１１２】
His-PDX1融合タンパク質の精製を、Niキレートカラムで、標準的な手順に従って行う。手短に言えば、His-PDX1融合タンパク質の発現ベクターを含有する1 lの細菌培養物を遠心分離によりペレット状にする。pH 8.0のリン酸塩、7 Mグアニジニウムクロリド（guanidium chloride）、イミダゾール、およびチオグリセロールを含有する溶菌緩衝液に、細胞ペレットを再懸濁させ、その後にUltra-Turrax（登録商標）を用いてホモジナイズする。不溶性物質を高速遠心分離によりペレット状にし、上澄みをNiキレートクロマトグラフ用カラムに与える。数カラム床体積の溶菌緩衝液でカラムを洗浄し、その後pH 8.0のリン酸塩、および尿素を含有する緩衝液で洗浄する。最後に、酸性条件下でSDSを含有するリン酸塩緩衝液を用いて、結合抗体を溶出する。
【０１１３】
抗体の産生のためのヘモシアニン-ペプチド結合体の合成
ヘテロ二官能性（heterobifunctional）化学作用（マレイミド/SH化学作用）を用いて合成を行う。選択したシステイン含有PDX1ペプチドを、Concholepas concholepas (Sigma, B-8556) 由来の3-マレイミドヘキサノイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル (MHS) 活性化ヘモシアニンに結合させる。
【０１１４】
100 mM NaH2PO4/NaOH, pH 7.2でヘモシアニンを10 mg/mlにする。ヘモシアニン1 mlあたり100 μlのMHS（DMSO中の12.3 mg）を加え、1時間インキュベートする。試料を100 mM NaH2PO4/NaOH, pH 6.5に対して一晩透析し、透析緩衝液で6 mg/mlに調節する。選択したシステイン含有PDX1ペプチドをDMSOに溶解する（1500ダルトンのペプチドについて5 mg/ml）。MHS活性化ヘモシアニン (6 mg/ml) 1 mlあたり、20 μlの100 mM EDTA, pH 7.0、および100 μlの選択したシステイン含有PDX1ペプチドを加える。1時間後、反応混合物1 mlあたり10 μlの0.5 Mシステイン/HClを加えることにより、残存するマレイミド基を阻害する。この調製物をさらに精製せずに免疫化に用いる。
【０１１５】
PDX1に対するモノクローナル抗体の産生
a）マウスの免疫化
最初に100 μgのPDX1またはヘモシアニン-ペプチド結合体（上記参照）で12週齢のA/Jマウスを腹腔内で免疫する。これに続いて6週間後に、1箇月間隔で2回さらに腹腔内で免疫する。この方法において、各マウスに、水酸化アルミニウムに吸着された100μgのPDX1またはヘモシアニン-ペプチド結合体、および細菌数109の百日咳菌（Bordetella pertussis）を投与する。その後、最後の2回の免疫化を、各々についてPBS緩衝液中の100 μgのPDX1またはヘモシアニン-ペプチド結合体を用いる融合の3日前、および2日前に、静脈内で行う。
【０１１６】
b）融合およびクローニング
a）に従って免疫したマウスの脾臓細胞を、Galfre, G.およびMilstein, C., Methods in Enzymology 73 (1981) 3〜46による骨髄腫細胞と融合させる。この方法において、免疫したマウスの約1*108の脾臓細胞を2x107の骨髄腫細胞（P3X63-Ag8-653, ATCC CRL1580）と混合し、遠心分離する（300 x g で10分、および4℃）。次いで細胞をウシ胎児血清（FCS）なしのRPMI 1640培地で一度洗浄し、50 mlの円錐管で、400 x gで再度遠心分離する。上澄みを捨て、細胞沈降物を軽くたたくことにより穏やかに緩め、1 mlのPEG（分子量4,000, Merck, Darmstadt）を加え、ピペッティングにより混合する。1分間37℃の水浴の中に入れた後、FCSなしの5 mlのRPMI 1640を室温で4〜5分の時間内で一滴ずつ加える。その後、10%のFCSを含有する5 mlのRPMI 1640を、約1分以内で一滴ずつ加え、完全に混合し、培地（RPMI 1640+10% FCS）を満たして50 mlにし、続いて400 x g で10分間、および4℃で遠心分離する。沈降した細胞を10%のFCSを含有するRPMI 1640培地で溶かし、ヒポキサンチン-アザセリン選択培地（RPMI 1640+10% FCS中の100 mmol/l ヒポキサンチン、1 μg/ml アザセリン）中に広める。成長因子として100 U/mlのインターロイキン 6を培地に加える。
【０１１７】
約10日後に初代培養物を特異的抗体に対して試験する。PDX1陽性初代培養物を、蛍光活性化セルソーターによって、96ウェル細胞培養プレートでクローン化させる。この方法において、再度成長添加物として100 U/mlのインターロイキン 6を培地に加える。
【０１１８】
c）細胞培養物上澄みからの免疫グロブリンの単離
得られたハイブリドーマ細胞を、10%のFCSを含有するRPMI 1640培地に、1 mlあたり1x105細胞の密度で播種し、発酵槽（Thermodux Co., Wertheim/Main, Model MCS-104XL, 注文番号144-050）の中で7日間増殖させる。培養物上澄みにおいて、平均して1 mlあたり100 μgのモノクローナル抗体の濃度が得られる。培養物上澄みからのこの抗体の精製を、タンパク質化学における常套の方法（例えばBruck, C.ら, Methods Enzymol. 121 (1986) 587〜695による）により行う。
【０１１９】
ポリクローナル抗体の作製
a）免疫化
免疫化のために、タンパク質溶液の新鮮なエマルション（100 μg/mlのPDX1またはヘモシアニン-ペプチド結合体）および1:1の比のフロイント完全アジュバントを調製する。各ウサギを1日目、7日目、14日目、ならびに30日目、60日目、および90日目に1 mlのエマルションで免疫する。血液を取り、生じた抗PDX1血清を、実施例3および実施例4に記載したように、さらなる実験に用いる。
【０１２０】
b）カプリル酸および硫酸アンモニウムを用いた連続的沈殿によるウサギ血清からのIgG（免疫グロブリン G）の精製
ウサギ血清1容を酢酸塩緩衝液（60 mM、pH 4.0）4容で希釈する。pHを2 M Tris塩基で4.5に調節する。カプリル酸（25 μl/mlの希釈した試料）を激しい攪拌のもとで1滴ずつ加える。30分後、試料を遠心分離し（13,000 x g、30分、4℃）、ペレットを捨て、上澄みを収集する。2 M Tris塩基を加えることにより上澄みのpHを7.5に調節し、濾過する（0.2 μm）。
【０１２１】
上澄みの中の免疫グロブリンを、激しい攪拌のもとで、4 M硫酸アンモニウム溶液を1滴ずつ添加して沈殿させ最終濃度を2 Mにする。沈殿した免疫グロブリンを遠心分離（8,000 x g、15分、4℃）により収集する。
【０１２２】
上澄みを捨てる。ペレットを10 mM NaH2PO4/NaOH、pH 7.5、30 mM NaClに溶解し、完全に透析する。透析物を遠心分離し（13,000 x g、15分、4℃）、濾過する（0.2 μm）。
【０１２３】
ポリクローナルウサギIgGのビオチン化
ポリクローナルウサギIgGを10 mM NaH2PO4/NaOH、pH 7.5、30 mM NaClで10 mg/mlにする。IgG溶液1 mlあたり50 μlのビオチン-N-ヒドロキシスクシンイミド（DMSO中の3.6 mg/ml）を加える。室温で30分放置した後に、試料をSuperdex 200でクロマトグラフィーによって分離する（10 mM NaH2PO4/NaOH、pH 7.5、30 mM NaCl）。ビオチン化IgGを含有する画分を収集する。モノクローナル抗体を、同じ手順によってビオチン化する。
【０１２４】
ポリクローナルウサギIgGのジゴキシゲニン化（Digoxygenylation）
ポリクローナルウサギIgGを10 mM NaH2PO4/NaOH、30 mM NaCl、pH 7.5で10 mg/mlにする。IgG溶液1 mlあたり50 μlのジゴキシゲニン-3-O-メチルカルボニル-ε-アミノカプロン酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, カタログ番号1 333 054）（DMSO中3.8 mg/ml）を加える。室温で30分放置した後に、試料をSuperdex（登録商標） 200でクロマトグラフィーによって分離する（10 mM NaH2PO4/NaOH、pH 7.5、30 mM NaCl）。ジゴキシゲニン化IgGを含有する画分を収集する。モノクローナル抗体を、同じ手順によってジゴキシゲニンで標識する。
【０１２５】
実施例３
ヒト血清および血漿試料におけるPDX1の検出のためのウエスタンブロット
SDS-PAGE、およびウエスタンブロッティングをInvitrogen, Karlsruhe, Germanyの試薬、および装置を用いて行う。ヒト血漿試料を還元性（reducing）NuPAGE（登録商標） (Invitrogen) LDS試料緩衝液で1:20で希釈し、5分間95℃で加熱する。10 μlのアリコートをMES泳動（running）緩衝液系中で4〜12%のNuPAGE（登録商標）ゲル (Bis-Tris) において泳動させる。Invitrogen XCell IITM Blot Module (Invitrogen) およびNuPAGE（登録商標）移行緩衝液系を用いて、ゲルで分離したタンパク質混合物をニトロセルロース膜にブロットする。膜をPBS/0.05% Tween-20で3回洗浄し、SuperBlock Blocking Buffer (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA) でブロックする。ビオチン化一次抗体をSuperBlock Blocking Bufferで希釈し（0.01〜0.2 μg/ml）、1時間膜とともにインキュベートする。膜をPBS/0.05% Tween-20で3回洗浄する。特異的に結合したビオチン化一次抗体をストレプトアビジン-HRP結合体 (SuperBlock Blocking Buffer中の20 mUABTS/ml) で標識する。1時間のインキュベーションの後、膜をPBS/0.05% Tween-20で3回洗浄する。結合したストレプトアビジン-HRP結合体を化学発光の基質（SuperSignal West Femto Substrate, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA）およびオートラジオグラフのフイルムを用いて検出する。露光（Exposure）時間は10分から一晩まで変化させる。
【０１２６】
実施例４
ヒト血清および血漿試料におけるPDX1の測定のためのELISA
ヒト血清および血漿におけるPDX1の検出のために、サンドイッチ型ELISAを展開（developed）する。抗原の捕捉および検出のために、抗PDX1ポリクローナル抗体のアリコート（実施例2参照）をビオチンおよびジゴキシゲニンとそれぞれ結合させる。
【０１２７】
ストレプトアビジン被覆96ウェルマイクロウェルプレートを、10 mMリン酸塩、pH 7.4、1% BSA、0.9% NaCl、および0.1% Tween-20で10 μg/mlにした、100 μlのビオチン化抗PDX1ポリクローナル抗体とともに、60分間インキュベートする。インキュベーションの後、プレートを0.9% NaCl、0.1% Tween-20で3回洗浄する。次いで、標準抗原としての組み換えタンパク質の連続希釈物（実施例2参照）、または患者からの希釈した血漿試料のいずれかとともに、ウェルを2時間インキュベートする。PDX1の結合の後、プレートを0.9% NaCl、0.1% Tween-20で3回洗浄する。結合したPDX1の特異的検出のために、10 mMリン酸塩、pH 7.4、1% BSA、0.9% NaCl、および0.1% Tween-20で10 μg/mlにした、100 μlのジゴキシゲニン化抗PDX1ポリクローナル抗体とともにウェルを60分間インキュベートする。その後プレートを3回洗浄し、非結合抗体を除去する。次の工程において、10 mMリン酸塩、pH 7.4、1% BSA、0.9% NaCl、および0.1% Tween-20中の20 mU/mlの抗ジゴキシゲニン-POD結合体 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, カタログ番号1633716)とともにウェルを60分間インキュベートする。その後プレートを同じ緩衝液で3回洗浄する。抗原抗体複合体の検出のために、100 μlのABTS溶液 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, カタログ番号11685767)とともにウェルをインキュベートし、30〜60分後ELISAリーダーを用い405 nmでODを測定する。
【０１２８】
実施例５
診断の精度の点からの臨床的有用性を評価するためのROC解析
十分に特性付けがなされた患者のコホート、すなわちマンモグラフィを受け、BCを有さないことがわかった50人の患者、BCの浸潤性腺管（invasive ductal）および浸潤性小葉T1-3、N0、M0と各々診断され、病期分類がなされた50人の患者、少なくとも1つの近位リンパ節において少なくとも腫瘍浸潤物を有する、またはより重篤な形態の転移を有する進行したBCと診断された50人の患者、髄様、粘液性、管状腺、または乳頭状乳癌と各々診断された50人の患者、およびDCISと診断された50人の患者、それぞれから得られた個々の液体試料を分析することにより精度を評価する。市販されているアッセイ (Roche Diagnostics, CA 15-3アッセイ(Elecsys（登録商標）Systems イムノアッセイアナライザーについてのカタログ番号0 304 5838) によって測定されるようなCA 15-3、および上記のように測定されるPDX1をこれらの個体の各々から得られた血清で定量した。上掲のZweig, M. H.およびCampbellに従ってROC解析を行う。PDX1と確立されたマーカーCA 15-3との組み合わせについて健康な個体とTis-3、N0、M0のグループの患者とを区別する識別能力を正規化（regularized）判別分析により算出する（Friedman, J.H., Regularized Discriminant Analysis, Journal of the American Statistical Association 84 (1989) 165〜175）。
【０１２９】
予備的なデータは、PDX1が手術後の患者の追跡調査においてもまた非常に有用であり得ることを示す。
【０１３０】
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【配列表】
2008502891000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年12月20日(2006.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の
a）PDX1（＝ペルオキシレドキシン１）
b）任意に、乳癌の1つ以上の他のマーカー
の濃度を測定すること、および
c）乳癌の評価において、工程（a）、および任意に工程（b）において測定された濃度を用いることを含む、
インビトロで乳癌を評価する方法。
【請求項２】
前記1つ以上の他のマーカーがCEA、CA 15-3、CRABP-II、およびASCからなる群より選択されることをさらに特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記1つ以上の他のマーカーがCEAであることをさらに特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
乳癌の評価におけるマーカー分子としてのタンパク質PDX1の使用。
【請求項５】
PDX1および乳癌の1つ以上の他のマーカーを含む、乳癌の評価におけるマーカーパネルの使用。
【請求項６】
1つ以上の他のマーカーがCEA、CA 15-3、CRABP-II、およびASCからなる群より選択される、請求項５記載のマーカーパネルの使用。
【請求項７】
PDX1を測定するために必要とされる試薬を含む、請求項１記載の方法を行うためのキット。
【国際調査報告】
2008502891.tif 000004
2008502891.tif 000005
2008502891.tif 000006
2008502891.tif 000007