(57)【要約】  本発明は、マラリアに対する保護に関する。より詳しくは、本発明は、スポロゾイト期、新規な肝臓期およびスポロゾイトのP.falciparum抗原（ＬＳＡ−５という）の特徴付けに基づく。この抗原は、高度に抗原性であり、そして流行地域で生活する被験者内での抗体の有病率は極めて高い（約９０％）。本発明は、抗原性ペプチド、その混合物、またはポリペプチド、ミクソトープ、およびＬＳＡ−５の配列の一部を含むコンジュゲート、ならびに免疫原性組成物、ワクチン、およびこれらを含むキットに関する。
2008504005.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１〜１４およびその変異体から成る群より選択される少なくとも２個のペプチド、特に少なくとも３個のペプチドを含むか、またはこれらから成り、かつ抗ＬＳＡ−５特異的抗体によって認識される、抗原性ペプチド混合物またはポリペプチド。
【請求項２】
配列番号：１の少なくとも２個のペプチドおよび／または前記ペプチドの変異体を少なくとも１個を含むか、またはこれらから成るペプチド混合物もしくはポリペプチドであって、前記変異体が配列番号１と：
−  第１位のアミノ酸が、Ｑ、Ａ、またはＬであり、そして／あるいは
−  第３位のアミノ酸が、Ｋ、Ｑ、またはＶであり、そして／あるいは
−  第４位のアミノ酸が、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、またはＥであり、そして／あるいは
−  第５位のアミノ酸が、ＶもしくはＲであり、そして／あるいは
−  第６位のアミノ酸が、Ｋであり、そして／あるいは
−  第７位のアミノ酸が、ＱまたはＫであり、そして／あるいは
−  第８位のアミノ酸が、Ｉであり、そして／あるいは
−  第９位のアミノ酸が、Ｐ、Ｖ、またはＡである
点で異なり、
前記ペプチドまたはポリペプチドが、配列番号：１６のＬＳＡ−５抗原に対して生成された抗体によって認識される、ペプチド混合物またはポリペプチド。
【請求項３】
アミノ酸が、９〜１５０個、１８〜１２２個、より好ましくは１８〜３６個から成る、請求項１または２記載の抗原性ペプチド。
【請求項４】
配列ＥＥＶＶＥＥＬＩＥＥＶＩＰＥＥＬＶＬ（配列番号：１５）の少なくともコンセンサスＬＳＡ−５ペプチド、または１個もしくは数個のアミノ酸の付加、欠失、または同類置換によるＬＳＡ−５由来のその変異体を含み、かつ配列番号：１６のＬＳＡ−５抗原に対して生成された抗体によって認識される、抗原性ペプチドまたはポリペプチド。
【請求項５】
配列ＥＥＶＶＥＥＬＩＥＥＶＩＰＥＥＬＶＬ（配列番号：１５）のコンセンサスＬＳＡ−５ペプチド、または１個もしくは数個のアミノ酸の付加、欠失、または同類置換によるＬＳＡ−５由来のその変異体を更に含み、かつ配列番号：１６のＬＳＡ−５抗原に対して生成された抗体によって認識される、請求項１〜３いずれか一項記載のペプチド混合物またはポリペプチド。
【請求項６】
配列番号：１６のＬＳＡ−５抗原、または１個もしくは数個のアミノ酸の付加、欠失、または同類置換によるＬＳＡ−５由来のその変異体を含み、かつ配列番号：１６のＬＳＡ−５抗原に対して生成された抗体によって認識される、抗原性ペプチドまたはポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６いずれか一項記載のペプチドまたはポリペプチドである抗原性部分、およびＬＳＡ−５抗原に対して非相同性である第２の部分を含む融合タンパク質から成る抗原性ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７いずれか一項記載のペプチド混合物またはポリペプチドであり、該ペプチドまたは該ポリペプチドのそれぞれに脂質分子が結合されている、リポペプチド抗原性混合物または抗原性リポポリペプチド。
【請求項９】
脂質分子が、Ｃ末端パルミトイリシラアミド残基である、請求項７記載のリポペプチドまたはリポポリペプチド。
【請求項１０】
配列
Ｘ1−Ｅ−Ｘ2−Ｘ2−Ｐ−Ｅ−Ｅ−Ｌ−Ｘ3−Ｅ−Ｘ4−Ｖ−Ｉ−Ｘ5−Ｅ−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ2（配列番号：１７）
〔式中、
Ｘ1＝Ｅ、Ｋ、または無し；
Ｘ2＝ＶまたはＩ；
Ｘ3＝Ｉ、Ｖ、またはＲ；
Ｘ4＝ＥまたはＫ；
Ｘ5＝ＰまたはＡ；
Ｘ6＝Ｅ、Ｖ、またはＫ；
Ｘ7＝ＬまたはＩ〕
を有する種々の合成ペプチドを含むミクソトープ。
【請求項１１】
配列番号：１７に相当する異なる配列の少なくとも５０個、少なくとも１００個、または少なくとも５００個のペプチド混合体である、請求項１０記載のミクソトープ。
【請求項１２】
合成ペプチドの少なくとも一部が、脂質分子と結合された、請求項９または１０記載のミクソトープであるリポミクソトープ。
【請求項１３】
脂質分子が、パルミチン酸である、請求項１１記載のリポミクソトープ。
【請求項１４】
支持体に結合させた、請求項１〜１３いずれか一項記載のペプチド、ペプチド混合物、ポリペプチド、リポペプチド、リポポリペプチド、リポペプチド混合物、リポポリペプチド、ミクソトープ、またはリポミクソトープを含むコンジュゲート。
【請求項１５】
支持体が、ウイルス粒子、またはニトロセルロースもしくはポリスチレンビーズ、またはリポホスホグリカンもしくはポリ−Ｌ乳酸などの生分解性ポリマーである、請求項１４記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
免疫原として、請求項１〜７いずれか一項記載のペプチド混合物もしくはポリペプチド、あるいは請求項８または９記載のリポペプチド混合物もしくはリポポリペプチド、請求項１０〜１３いずれか一項記載のミクソトープもしくはリポミクソトープ、あるいは請求項１４または１５記載のコンジュゲートを含む免疫原性組成物。
【請求項１７】
免疫原として、請求項１〜７いずれか一項記載のペプチドまたはポリペプチド、請求項８または９記載のリポペプチド、あるいはリポポリペプチド、請求項１０〜１３いずれか一項記載のミクソトープもしくはリポミクソトープ、あるいは請求項１４または１５記載のコンジュゲートを含む、マラリアに対するワクチン。
【請求項１８】
ＬＳＡ−１、ＬＳＡ−３、ＬＳＡ−５、ＳＡＬＳＡ、ＳＴＡＲＰ、ＴＲＡＰ、ＰｆＥＸＰ１、ＣＳ、ＭＳＰ−３、Ｐ１２６−ＣＥＲＰ−ＳＥＲＡ、およびＧＬＵＲＰの中から選択される少なくとも１種類の抗原を更に含む、請求項１６記載の免疫原性組成物または請求項１７記載のワクチン。
【請求項１９】
ＩｇＧ１またはＩｇＧ３クラスの細胞親和性である抗体を惹起するように処方される、請求項１６または１７記載の免疫原性組成物、あるいは請求項１６または１８記載のワクチン。
【請求項２０】
皮内または筋肉内注射用に処方される、請求項１６〜１９いずれか一項記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２１】
１回の注射用量に対して１〜１００μgの免疫原、好ましくは２〜５０μgを含む、請求項２０記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２２】
前赤内期のマラリア原虫感染の予防または治療のための、請求項１６〜２１のいずれか一項記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２３】
血中期のマラリア原虫感染の予防または治療のための、請求項１６〜２２いずれか一項記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２４】
ＳＢＡＳ２および／またはミョウバン、および／またはモンタニドをアジュバントとして更に含む、請求項１６〜２３いずれか一項記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項２５】
マラリアに対するワクチン組成物の調製のための、請求項１〜７いずれか一項記載のペプチド混合物、またはポリペプチド、請求項８または９記載のリポペプチド混合物もしくはリポポリペプチド、請求項１０〜１３いずれか一項記載のミクソトープもしくはリポミクソトープ、あるいは請求項１４または１５記載のコンジュゲートの使用。
【請求項２６】
配列番号：１６のＬＳＡ−５抗原を認識する、精製されたポリクローナル血清またはモノクローナル抗体。
【請求項２７】
配列番号：１６のＬＳＡ−５抗原を認識する、ヒト組換え抗体またはヒト化マウス抗体。
【請求項２８】
マラリアに対する医薬物の調製のための、配列番号：１６のＬＳＡ−５抗原を認識する抗体を含む組成物の使用。
【請求項２９】
請求項２６または２７記載の血清もしくは抗体を含む、マラリアの受動免疫療法のための医薬。
【請求項３０】
ＬＳＡ−１、ＬＳＡ−３、ＬＳＡ−５、ＳＡＬＳＡ、ＳＴＡＲＰ、ＴＲＡＰ、ＰｆＥＸＰ１、ＣＳ、ＭＳＰ−３、Ｐ１２６−ＣＥＲＰ−ＳＥＲＡ、およびＧＬＵＲＰの中から選択される少なくとも１種類の抗原に対して指向される抗体を更に含む、請求項２９記載の医薬。
【請求項３１】
脳マラリア患者治療用薬物の調製のための、配列番号：１６のＬＳＡ−５抗原に対して生成される抗体を含む組成物の使用。
【請求項３２】
脳マラリア患者の治療が、低分子抗マラリア薬と併用して行われる、請求項３１記載の使用。
【請求項３３】
抗体が細胞親和性抗体、特に、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３クラスに属するものである、請求項２８または３２記載の組成物の使用、あるいは請求項２９または３０記載の医薬の使用。
【請求項３４】
個体由来の生物学的試料を請求項１〜７いずれか一項記載の抗原性ペプチド混合物またはポリペプチドと、前記抗原性ペプチドまたはポリペプチドと生物学的試料中に存在する可能性がある抗体との抗原／抗体複合体の形成を可能にする条件下で接触させること、および形成されている可能性がある抗原／抗体複合体のインビトロ検出を含む、P.falciparumに感染している可能性がある個体においてマラリアのインビトロ診断のための方法。
【請求項３５】
インビトロ診断が、ＥＬＩＳＡアッセイにより行われる、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
生物学的試料を、更に、ＬＳＡ−１、ＬＳＡ−３、ＬＳＡ−５、ＳＡＬＳＡ、ＳＴＡＲＰ、ＴＲＡＰ、ＰｆＥＸＰ１、ＣＳ、ＭＳＰ−３、Ｐ１２６−ＣＥＲＰ−ＳＥＲＡ、およびＧＬＵＲＰの中から選択される他の抗原起源の１個または数個の抗原性ペプチドと接触させる、請求項３４または３５記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも請求項１〜７いずれか一項記載のペプチド混合物またはポリペプチドを含む、マラリアのインビトロ診断のためのキット。
【請求項３８】
抗原性ペプチドまたはポリペプチドを支持体に結合させる、請求項３７記載のキット。
【請求項３９】
抗原性ペプチドまたはポリペプチドと生物学的試料中に存在する可能性がある抗体との抗原／抗体複合体の形成を可能にするための試薬、および形成されている可能性がある抗原／抗体複合体のインビトロ検出を可能にする試薬を更に含む、請求項３７または３８記載のキット。
【請求項４０】
個体由来の生物学的試料を請求項２６または２７記載の抗体と、前記抗体と生物学的試料中に存在する可能性があるP.falciparumに特異的な抗原との抗原／抗体複合体の形成を可能にする条件下で接触させること、および形成されている可能性がある抗原／抗体複合体のインビトロ検出を含む、P.falciparumに感染している可能性がある個体におけるマラリアのインビトロ診断のための方法。
【請求項４１】
請求項２６または２７記載の抗体を含む、マラリアのインビトロ診断のためのキット。
【請求項４２】
抗体と生物学的試料中に存在する可能性があるＬＳＡ−５抗原との抗原／抗体複合体の形成を可能にする試薬、および形成されている可能性がある抗原／抗体複合体のインビトロ検出を可能にする試薬を更に含む、請求項４１記載のキット。
【請求項４３】
請求項１〜１１いずれか一項記載のペプチド混合物の抗原性ペプチドまたはポリペプチドをコードする、単離されたヌクレオチド配列。
【請求項４４】
プロモーター配列、および請求項１〜１１いずれか一項記載のペプチド混合物の抗原性ペプチド、またはポリペプチドをコードする単離された配列を含む、組換えヌクレオチド配列。
【請求項４５】
配列番号：１８の配列を含む、請求項４３または４４記載のヌクレオチド配列。
【請求項４６】
請求項４３〜４５いずれか一項記載のヌクレオチド配列を含む、組換えクローニングおよび／または発現ベクター。
【請求項４７】
ヌクレオチド配列が、宿主細胞に対して同種または異種の、宿主細胞における発現のためのプロモーターおよび調節エレメントの制御下にある、請求項４６記載の組換えクローニングおよび／または発現ベクター。
【請求項４８】
Plasmodium falciparumに対する遺伝子による免疫用医薬の調製のための、請求項４６または４７記載の発現ベクターの使用。
【請求項４９】
請求項４３〜４５いずれか一項記載のヌクレオチド配列を含むＤＮＡワクチン。
【請求項５０】
請求項４５記載のベクターにより形質転換された組換え宿主細胞。
【請求項５１】
細菌、酵母、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である、請求項５０記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マラリアに対する保護に関する。より詳しくは、本発明は、スポロゾイト（sporozoite）期、肝臓期、および血中期で発現される、新規なP.falciparum抗原（以下、ＬＳＡ−５という）の特徴付けに基づく。この抗原は、高度に抗原性であり、そして流行地域で生活する被験者内での抗体の有病率（prevalence）は極めて高い（約９０％）。以下に記載する結果は、ａ）ＬＳＡ−５は、相当数の免疫処置した霊長類において、高用量の毒性のスポロゾイト期の寄生虫（人類に対し致死的である種由来）による攻撃感染（challenge infection）に対し、完全な殺菌性保護を得るために使用され得ること、およびｂ）自然感染に対する曝露により誘導される抗体は、マラリアに対する保護と非常に強く関連することを示す。したがって、本発明は、新しいポリペプチド分子に関し、そして抗マラリアワクチンおよび該疾患の診断方法における活性な本質（principle）としてのその使用に関する。ＬＳＡ−５を認識する抗体、および抗マラリア治療または診断におけるその使用もまた想定される。
【０００２】
ヒトにおいてマラリアの原因となる寄生虫は、ヒト宿主内で種々の形態を示し、そして体内でのその位置に応じて種々の抗原を発現する。ヒトにおけるこれらの寄生虫のそのライフサイクルにおける形態および抗原性の違いは、肝臓内および血液中での異なる発育期を規定することを可能にする。スポロゾイトは、媒介動物である蚊により注入される感染性形態であり、宿主の肝細胞内のシゾント（schizont）へと急速に形態変化し、そして、その後、赤血球に感染する。肝臓内の位置のP.falciparumは、それ自体をこの発育期に特異的な一群の抗原の発現において示し、そしてこれは、該疾患に晒される自然条件下で高度に免疫原性である。
【０００３】
前赤内期（pre-erthrocytic stage）のマラリアに対する完全な殺菌性保護は、試験用宿主およびヒトの両方において、放射線照射したスポロゾイトによる免疫処置により得られうる。長い間「抗スポロゾイト免疫」とみなされてきたものは、実際は、肝臓期（liver phase）トロフォゾイト（trophozoite）の発生と関連しているようであり、そして「肝臓期依存性免疫」と称するべきである（Druilheら, 1998）。
【０００４】
本発明者らは、P.falciparum肝臓期の抗原を、ゲノム発現ライブラリー（クローンＴ９〜９６）をヒト病期限定血清（２５年間にわたってスポロゾイト接種に曝露したが、まだ連続的クロロキン予防法による血液形態（blood forms）を発現していない被験者由来）を用いたスクリーニングすることに基づいて同定するための方法形態を開発した。クローンは、２９の遺伝子に割り当てられ、これらは、すべて、曝露された個体に認識される抗原をコードするという興味深い特徴を有する（Druilheら, 1998,（Charlotte Gruner, Snounouら 2003）。このファミリーのクローンの最初のスクリーニングは、ａ）様々な種のライフサイクルの異なる期における発現パターンおよびｂ）スポロゾイト期のP.falciparum野生型単離株間での遺伝子の保存の研究を含んだ。したがって、アフィニティ精製抗体を、各クローンの産生物に対して調製し、そしてP.falciparum、P.yoelii、P.bergheiおよびある程度P.vivaxとの反応性を、ａ）スポロゾイト期、ｂ）肝臓期およびｃ）血中期にて研究するために使用した。保存の程度は、抗原の発現を、スポロゾイト期のタイ人からの一連の野生型単離株の表面上の同じ抗体を用いて研究することにより評価した。選択したクローンを、更に、その抗原性、免疫原性および予防効果について研究した。これにより、国際公開公報第９２／１３８８４号に記載のＬＳＡ−１（肝臓期の抗原）、欧州特許第０，４０７，２３０号に記載のＳＡＬＳＡ（スポロゾイト肝臓期の抗原）ポリペプチド、ＳＴＡＲＰ（Fidock, Bottiusら 1994）、および国際公開公報第９６／４１８７７号に記載のＬＳＡ−３の特徴付けが導かれた。
【０００５】
以下に試験的実施例に記載するように、ＬＳＡ−５は最も抗原性および免疫原があり、様々な単離株間で充分保存されており、そして、ＬＳＡ−３とともに、P.falciparum攻撃に対して保護的効果を誘導できる非常に数少ない分子の１つとして卓越している。更に、保護の代用（surrogate）は、見かけ上、ＬＳＡ−５、ＬＳＡ−３、および放射線照射したスポロゾイトにより誘導される免疫と類似し、これは、３種類すべてが同様の防御機構を誘導し得ることを示唆する。
【０００６】
本発明の第１の目的は、したがって、以下の表１に記載する配列番号：１〜１４から成る群より選択される少なくとも１つのモチーフ（配列）を含む抗原性ペプチドまたはポリペプチドであって、抗ＬＳＡ−５特異的抗体によって認識されるペプチドまたはポリペプチドである。配列番号：１〜１４のモチーフの１つの少なくとも１種類の変異体を含む抗原性ペプチドまたはポリペプチドもまた本発明の一部であるが、これらは、なお抗ＬＳＡ−５特異的抗体によって認識されるものとし、そして上記変異体が１つの元のモチーフと、そのアミノ酸残基の１個または数個が、他方のモチーフの１個または数個の対応するアミノ酸残基（１個または複数）で置換されているという点で異なるものである。
【０００７】
しかしながら、配列番号：３または配列番号：４で指定される配列から成るペプチドは、国際公開公報第８６／００６２０号を鑑みて、本発明の範囲から除外する。しかしながら、これらのペプチドは、混合物またはミクソトープに含まれ得、本発明の適用にしたがって使用され得る。
【０００８】
【表１】
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表１：ＤＧ５７１  クローンのアミノ酸配列（配列番号：１６）のアラインメントであり、ＬＳＡ−５内に存在するＥ、Ｉ、Ｖ富化モチーフを示す。
【０００９】
配列番号：１〜１４のペプチド（モチーフ）および本発明によるその変異体を含む特定の群の配列は、したがって、配列番号：１のペプチド配列、配列番号：６ペプチド配列、ならびに以下のような配列番号：１および配列番号：６と異なるペプチド配列：
−  第２位のアミノ酸が、Ｋ、Ｑ、またはＶであり、そして／あるいは
−  第３位のアミノ酸が、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、またはＥであり、そして／あるいは
−  第４位のアミノ酸が、ＶまたはＲであり、そして／あるいは
−  第５位のアミノ酸が、Ｋであり、そして／あるいは
−  第６位のアミノ酸が、ＱまたはＫであり、そして／あるいは
−  第７位のアミノ酸が、Ｉであり、そして／あるいは
−  第８位のアミノ酸が、Ｐ、Ｖ、またはＡであり、そして／あるいは
−  第９位のアミノ酸が、Ｑ、Ａ、またはＬである；
の点で配列番号：１と異なる変異体、
−  第１位のアミノ酸が、Ｋであり、そして／あるいは
−  第２位のアミノ酸が、ＱまたはＫであり、そして／あるいは
−  第３位のアミノ酸が、Ｉであり、そして／あるいは
−  第４位のアミノ酸が、Ｐ、ＶもしくはＡであり、そして／あるいは
−  第５位のアミノ酸がＱ、Ｙ、ＡもしくはＬである；
点で配列番号：６と異なる変異体
を含む。
【００１０】
かかる特定の群の配列は、上記表１のものの中から選択される少なくとも２個、特に少なくとも４個のペプチドの混合物中に含まれ得る。
【００１１】
先に定義したように配列番号：１のモチーフの少なくとも１種類の変異体を含み、抗ＬＳＡ−５特異的抗体によって認識される抗原性ペプチドまたはポリペプチドは、本発明の特定の一実施態様であり、そして、特に、先に定義したペプチド混合物の調製のために使用される。
【００１２】
本発明によるペプチド、ポリペプチド、またはリポペプチドは、好ましくは９〜１５０個のアミノ酸、特に１２〜３０個、または４０個のアミノ酸、特に１８〜３６個のアミノ酸を含む。
【００１３】
本発明はまた、表１に記載する配列番号：１〜１４から成る群より選択される配列から成るアミノ酸配列を有するペプチドが２個以上、特に３個より多く会合（association）する結果生じるペプチド混合物に関する。
【００１４】
特定の実施態様において、上記ペプチド混合物は、少なくとも４個を含むか、またはそれらから成り、そして上記の群から選択される１４個までの異なるペプチドを有する。
【００１５】
上記ペプチド混合物の別の実施態様において、前記の開示した群から選択されるペプチドは、以下に記載するコンセンサスＬＳＡ−５ペプチドと会合する。
【００１６】
好ましい実施態様において、ペプチド混合物は、該混合物が患者への投与に使用されるとき、免疫原性となる形態で調製される。したがって、上記混合物は、大集団の患者において使用するために、好都合には、寄生虫においてＬＳＡ−５抗原間で観察される相違を代表するものである。
【００１７】
本発明の別の実施態様では、ペプチド混合物は、２個以上、特に、３または４個より多いペプチド、例えば、表１に記載する配列番号：１〜１４から成る群より選択される３〜１４個の異なるペプチド（これには、異なる配列を有する更なるペプチドまたはポリペプチド、例えば、以下に開示するコンセンサスＬＳＡ−５ペプチドなどが付加されていてもよい）の組合せの結果生じる組換えポリペプチドによって構成されている。
【００１８】
本発明のペプチドまたはポリペプチドは、化学合成によって得られうるか、または組換え発現の産生物であり得る。
【００１９】
本発明はまた、以下の配列：ＥＥＶＶＥＥＬＩＥＥＶＩＰＥＥＬＶＬ（配列番号：１５）を有する配列コンセンサスＬＳＡ−５ペプチドに関し、これは、脂質分子と結合させてリポペプチドを形成させ得る。かかるコンセンサスリポペプチドの一例は、（ＥＥＶＶＥＥＬＩＥＥＶＩＰＥＥＬＶＬ  （Ｐｌｍ）−ＣＯＮＨ2）（式中、Ｐｌｍは、Ｃ末端パルミトイリシラアミド（palmitoylysylamide）残基である）。
【００２０】
本発明の別の態様は、配列番号：１６のＬＳＡ−５抗原（ＤＧ５７１の配列）それ自体、および任意の抗原性ペプチドまたはポリペプチドであり、これらは、ＬＳＡ−５または１個もしくは数個のアミノ酸の付加、欠失、または同類置換によりＬＳＡ−５に由来するその変異体を含むが、上記ペプチドまたはポリペプチドは、抗ＬＳＡ−５特異的抗体によって認識されるものとする。
【００２１】
かかる変異体は、例えば、配列番号：１６に相当するＬＳＡ−５抗原の配列との６０％を超える、特に６２％を超えるか、または６５％を超えるか、または更に７０％を超える同一性もしくは類似性（すなわち、同類置換）を有するポリペプチドであり、上記の同一性または類似性は、上記両配列を、最適なグローバルアラインメント（global alignment）手順にしたがってアラインメントし、そして公知の方法に依存し、例えば、利用可能なバージョンのＢＬＡＳＴ（例えば、ＮＣＢＩにより入手可能なバージョンなど）を用いて比較すると決定される。
【００２２】
本発明のペプチドまたはポリペプチドは、発現ベクターを用いた細胞内での生物学的合成によって、または、例えば、R.B Merrifield により1963年に記載された固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）方法形態（J.Am.Chem.Soc.85, 2149）に従う化学合成、またはその後の誘導型の１つ（例えば、Ｆｍｏｃもしくはｔ−Ｂｏｃ化学反応など）による、いずれかにより得られうる。本発明によるペプチドまたはポリペプチドのいずれかへの脂質分子の条件付きの付加は、例えば、Deprezらにより記載された手法（Deprez, Gras-Masseら 1995）を用いて行い得る。
【００２３】
ペプチドまたはポリペプチドが、本発明の意味において「抗ＬＳＡ−５特異的抗体によって認識される」か否かを調べる試験は、以下のとおりである。ヒト抗ＬＳＡ−５特異的抗体を以下の材料および方法に記載のようにして得、そして、次いで、上記ペプチドまたはポリペプチドと配列番号：１６のＬＳＡ−５抗原間の競合試験を、得られたヒト抗ＬＳＡ−５特異的抗体に対するそれらの結合能力を試験することにより行う。あるいは、結合試験は、配列番号：１６のＬＳＡ−５抗原で免疫処置した動物において誘導した抗ＬＳＡ−５抗体、または直接ＥＬＩＳＡもしくはウエスタンブロッティング、または試験対象のペプチド、またはポリペプチドの存在下で、ＬＳＡ−５抗原で免疫処置した動物由来のリンパ球を伴う細胞試験を行うことにより免疫精製した抗ＬＳＡ−５抗体を用いて行い得る。ペプチドまたはポリペプチドが、「抗ＬＳＡ−５特異的抗体によって認識される」か否かを試験するためのより詳細なプロトコルは、以下の実施例９に記載している。
【００２４】
本発明の他の目的は、前述のような抗ＬＳＡ−５特異的抗体によって認識されるペプチドまたはポリペプチドである抗原性部分、およびＬＳＡ−５抗原に対して非相同性である第２の部分を含む融合タンパク質である。「ＬＳＡ−５抗原に対して非相同性である」とは、本明細書では、この第２の部分の配列がＬＳＡ−５に由来しないことを意味する。特に、配列番号：１６の配列と４０％未満または３０％未満の同一性を有する任意の配列が、ＬＳＡ−５に対して非相同性であるとみなされる。かかる融合タンパク質の例を以下に記載するもの、例えば、βｇａｌ−ＤＧ５７１、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−ＬＳＡ−５、および６−ヒスチジン−テイルとの融合タンパク質（この場合、ＬＳＡ−５がＮ末端位置にある）などである。もちろん、ＬＳＡ−５部分を含む任意の他の融合タンパク質もまた本発明の一部であるが、「ＬＳＡ−５部分」は、前述のような、ＬＳＡ−５抗原それ自体およびＬＳＡ−５に由来する任意の抗原性ペプチドまたはポリペプチドを示し、抗ＬＳＡ−５特異的抗体によって認識されるものとすることを理解されたい。
【００２５】
本発明はまた、ＬＳＡ−５ミクソトープに関する。「ミクソトープ（mixotope）」は、独自の合成によって、１個ではなく数個の異なるアミノ酸を、既に得たペプチド断片に同時に添加し、それにより、得られたペプチドの多様性の制御をもたらすことにより得られたペプチドの収束型（convergent）コンビナトリアルライブラリーである（Gras-Masse, Ameisenら 1992）。特に、本発明によるＬＳＡ−５ミクソトープは、配列：
Ｘ1−Ｅ−Ｘ2−Ｘ2−Ｐ−Ｅ−Ｅ−Ｌ−Ｘ3−Ｅ−Ｘ4−Ｖ−Ｉ−Ｘ5−Ｅ−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ2（配列番号：１７）
〔式中、
Ｘ1＝Ｅ、Ｋ、または無し；
Ｘ2＝ＶまたはＩ；
Ｘ3＝Ｉ、Ｖ、またはＲ；
Ｘ4＝ＥまたはＫ；
Ｘ5＝ＰまたはＡ；
Ｘ6＝Ｅ、Ｖ、またはＫ；
Ｘ7＝ＬまたはＩ〕
を有する種々の合成ペプチドを含む。
【００２６】
本発明のミクソトープは、好ましくは、配列番号：１７に相当する異なる配列の少なくとも５０個、少なくとも１００個または少なくとも５００個のペプチド混合体である。可能なすべての組合せが実現され、ミクソトープは、１１５２個までの異なるペプチドを含む。
【００２７】
ペプチドまたはミクソトープの同様のコンビナトリアルライブラリーは、表１の配列１〜１４によるミクソトープを調製することにより得ることができ、この場合、可能な組合せの各々は、ミクソトープの手法により表１に示すアミノ酸置換にしたがって再現される（表１に列挙されていないが、可能であるものを含む）。
【００２８】
本発明はまた、リポミクソトープに関し、これは、先に定義したミクソトープにおいて、合成ペプチドの少なくとも一部が脂質分子と結合されたものである。この脂質分子は、例えば、パルミチン酸、または１１〜２５の炭素を有する任意の脂質鎖であり得る。
【００２９】
本発明の特定の態様では、抗原性ペプチド、リポペプチド、ポリペプチド、リポポリペプチド、ペプチド混合物、ミクソトープまたはリポミクソトープを支持体に結合させる。したがって、本発明はまた、本発明によるペプチドと、特に、免疫原性が、それぞれ、担体分子およびペプチドにより担持される相補的な反応性基により高められることを可能にする生理学的に許容され得、かつ非毒性の（天然または合成の）担体分子との共有結合により得られるコンジュゲートに関する。天然タンパク質、例えば、破傷風トキソイド、オボアルブミン、血清アルブミン、ヘモシアニン、ツベルクリンＰＰＤ（精製したタンパク質誘導体）など、およびウイルス粒子（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス粒子など）は、本発明によるコンジュゲートの構成に関与する巨大分子担体分子または支持体の考えられ得る例として挙げられ得る。これらのコンジュゲートの好ましい形態は、直径が１ナノメートル〜５００ナノメートルの不溶性のミクロ粒子を生成するものである。というのは、かかる不溶性のミクロ粒子は抗原提示細胞、特に樹状細胞によって優先的に取り込まれ、そして抗原をリンパ球への抗原提示経路に伝える（channel）からである。ＬＳＡ−５抗原とニトロセルロース粒子またはポリスチレン粒子との結合により得られる微粒子製剤の実用価値は、実施例５に示す。
【００３０】
生分解性ポリマー、例えば、リポホスホグリカン（lipophosphoglycane）（ＬＰＧ）またはポリ−Ｌ乳酸などは、本発明によるコンジュゲートにおける支持体として好都合に使用され得る。
【００３１】
合成の巨大分子支持体、例えば，ポリリシンまたはポリ（ＤＬ−アラニン）−ポリ（−リシン）などもまた使用され得る。
【００３２】
炭化水素または脂質支持体、例えば、飽和または不飽和脂肪酸、および好ましくはオレイルまたはパルミトレイルタイプのＣ16またはＣ18酸もまた、本発明による抗原性ペプチドまたはポリペプチドに結合させ得る。したがって、リシン架橋により飽和または不飽和脂質残基に共有結合させたＬＳＡ−５に由来するポリペプチドから成るコンジュゲートもまた、より特別には、脂質残基がパルミトイルまたはパルミチルまたはオレイルの場合、本発明の一部を構成する。
【００３３】
最後に、および限定を示唆することなく、本発明による抗原またはペプチドは、従来の支持体に結合させ得るか、またはかかる支持体、特に、ニトロセルロース、ラテックス、またはポリスチレンミクロスフェア、またはビーズ上に吸着させ得るか、またはＴｙｌ粒子に組込み得る。
【００３４】
本発明によるコンジュゲートを合成するため、ペプチドおよび適切な担体分子を用い、それ自体が公知の方法、例えば、Frantz および Robertson によりInfect.And Immunity, 33, 193-198(1981)に記載されたもの、またはApplied and Environmental Microbiology(1981年10月), 第42巻, No.4, 611-614にP.E.Kauffmanにより記載されたものなどを利用し得る。
【００３５】
本発明はまた、免疫原として、先に定義したペプチド、ペプチド混合物、ポリペプチド、特に、組換えポリペプチド、リポペプチド、リポポリペプチド、ミクソトープ、リポミクソトープ、またはコンジュゲートを含む免疫原性組成物に関する。文言の簡略化のため、表現「ペプチドまたはポリペプチド」はまた、以下において、リポペプチド、リポポリペプチド、ペプチド混合物、ポリペプチド（組換えポリペプチドを含む）、ミクソトープおよびリポミクソトープ（支持体に結合させたもの、またはされていないもののいずれも）を示し、これらに適用する。
【００３６】
実施例５および６に示すように、ＬＳＡ−５による免疫処置は、P.yoelii攻撃（マウスにおいて、実施例５参照）およびP.falciparum攻撃（ヨザル属（Aotus）サルにおいて、実施例６参照）に対する保護を誘導し得る。これは、ＬＳＡ−５が、抗マラリア前赤内期サブユニットワクチンの調製のための優れた候補物質であることを示す。したがって、本発明はまた、マラリアに対するワクチン組成物の調製のための、先の定義に従う免疫原性ペプチドまたはポリペプチドの使用に関する。免疫原として、先に定義したペプチドまたはポリペプチドを含むマラリアに対するワクチンもまた本発明の一部である。
【００３７】
実施例８に記載するように、ＬＳＡ−５と別の抗原との会合、特にＬＳＡ−３との会合は、ＬＳＡ−５の免疫原性の増大をもたらす。したがって、本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、Daubersiesら（2000）により記載されたＬＳＡ−３抗原、またはＬＳＡ−３特異的抗体によって認識されるその変異体を更に含み得る。ＬＳＡ−５との会合に使用され得るＬＳＡ−３の変異体の定義は、国際公開公報第９６／４１８７７号の請求項１に規定されるポリペプチド分子に相当する。これらのＬＳＡ−３／ＬＳＡ−５会合体において、該２つの抗原は、実施例８に記載のように、共有結合されていてもよく（例えば、融合タンパク質の場合）、共有結合されていなくてもよい。
【００３８】
ＬＳＡ−５を含む他の抗原会合体もまた、本発明に従って想定される。特に、本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、ＬＳＡ−５に加えて、ＬＳＡ−１、ＬＳＡ−３、ＳＡＬＳＡ、ＳＴＡＲＰ、ＴＲＡＰ、ＰｆＥＸＰ１、ＣＳ、ＭＳＰ−３、Ｐ１２６−ＣＥＲＰ−ＳＥＲＡ、およびＧＬＵＲＰを含む抗原の群において選択される１種類以上の他の抗原を含み得る。
【００３９】
本発明の特定の実施態様において、免疫原性組成物またはワクチンは、皮下、皮内または筋肉内注射用に処方される。皮下注射用に処方される場合、本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、好ましくは、１回の注射用量に対して１〜１００μgの抗原性ペプチド、より好ましくは２〜５０μg／用量を含む。
【００４０】
もちろん、通常のアジュバント、例えば、ミョウバンおよび／またはモンタニド（Montanide）などを、本発明の免疫原性組成物またはワクチンを添加してもよい。本発明の免疫原性組成物またはワクチンに使用され得る他の可能なアジュバントは、欧州特許第１  ２１０  ２５０  Ａ１号に記載されており、例えば、ＳＢ６２、ＳＢ２６およびＳＢＡＳ２（Ａｓ０２）などであり、この後者が特に好ましい。
【００４１】
実施例１１に示すように、ワクチンの好ましい形態（特に、アジュバントとの組合せが挙げられる）は、単球と協働することができる抗体（特に、細胞親和性クラスに属する抗体、主に、そのＦｃ断片が白血球上のＦｃγレセプターに結合し得るＩｇＧ１およびＩｇＧ３）を誘導して血中期の寄生虫を致死させるものである。
【００４２】
かかる抗体は、単球依存性であり得、そしてその作用能力は、単球の存在下でP.falciparumインビトロ成長を阻害する抗体の能力を評価するためにデザインされたAntibody Dependent Cellular Inhibition（抗体依存型増殖阻害：ＡＤＣＩ）機構によりアッセイされ得る。ＡＤＣＩ手順は、特に、Bouharoun-Tayoun H.ら, 1995; Bouharoun-Tayoun H.ら 1990, Theisen M.ら, 2000）に開示されている。かかる抗体はまた、インビボでP.falciparum成長阻害を媒介し得ると考えられており、これは、例えば、P.falciparumに感染させたマウスにおいてアッセイされ得る。
【００４３】
以下の実施例４に記載するように、抗ＬＳＡ−５抗体の受動輸送は、少なくとも肝細胞内への寄生虫侵入を阻害するために有用であり得る。本発明の別の重要な態様は、したがって、配列番号：１６のＬＳＡ−５抗原を認識する精製したポリクローナル血清またはモノクローナル抗体、および受動免疫療法により、感染した被験者および該疾患の症状を示しているか、または示す被験者を保護するための医薬組成物におけるその使用である。
【００４４】
ポリクローナル抗体は、感染した人々の血清からのアフィニティ精製（以下の材料および方法に記載されている）、または当業者に既知の任意の他の方法、例えば、天然または組換えＬＳＡ−５タンパク質もしくは本発明によるペプチド、ペプチド混合物、リポペプチド、ポリペプチド、ミクソトープ、またはリポミクソトープ（単独で、または担体分子に結合させるかのいずれかで）、できればアジュバントの存在下で、哺乳動物を免疫処置することのいずれかにより作製され得る。かかるポリクローナル血清を得るためのプロトコルは、一般的なハンドブック、例えば、「Handbook of Experimental Immunology」，第5版、D.M.Weir, L.A.Herzenberg, C.C.および L.A.Herzenberg編.Black well  Scientific Publications, Ltd., Edimburgh, 1997などに記載されている。
【００４５】
モノクローナル抗体は、
−細胞と、本発明による抗原の１つで予め免疫処置した動物の脾臓細胞とミエローマ細胞との融合
−上記の両細胞の融合により形成されたハイブリドーマの培養
−上記動物の免疫処置に使用した抗原を認識するモノクローナル抗体を形成し得るハイブリドーマの選択を含む標準的な手順にしたがうハイブリドーマ手法により作製され得る。
【００４６】
免疫処置に選択される動物は、例えば、マウスであり得る。
【００４７】
これらのモノクローナル抗体のうち、好都合には、細胞親和性モノクローナル抗体、すなわち、そのＦｃ断片がヒト単球のＦｃγレセプターに結合し得るものが選択される。かかる抗体は、特に、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３のクラスのものである。
【００４８】
抗体作製の別の手順により、ヒトモノクローナル抗体をインビトロで形成することが可能であり得る。これを行うため、例えば、エプスタイン‐バーウイルスで不死化させたＢリンパ球が使用される。これらのリンパ球は、P.falciparumに感染したヒトから採取されたものであり得る。この場合、新規な抗原によるインビトロ刺激に頼ることなく、いくつかの抗原に対するモノクローナル抗体を産生させることが可能である。
【００４９】
別の可能性としては、前述のような不死化させたＢリンパ球と、事前に本発明による抗原（これに対するモノクローナル抗体が、リンパ球の刺激を許容する培養条件下で形成されるのが望ましい）でインビトロ刺激したヒトＢリンパ球との融合にある。
【００５０】
参照として、好都合には、本発明のヒトモノクローナル抗体の調製に関するDesgranges C.ら（1987, J.of Virological Methods, Vol.16, p: 281-292）により記載された手法が好ましい。
【００５１】
ヒト組換え抗体はまた、国際公開公報第０３／０１６３５４号（Nielsen Leif Kofoedら）に記載された方法を用いることにより得られうる。
【００５２】
遺伝子組換えによって、抗体の可変部分をコードする遺伝子の細菌を感染させるベクター内へのインビトロトランスフェクションを、ヒト免疫グロブリンの発現を許容する条件下で行うことによりヒトモノクローナル抗体を作製することもまた本発明の枠組み内で想定される。
【００５３】
最後に、本発明は、任意のタイプのモノクローナル抗体、キメラもしくはハイブリッド、または更にＦａｂまたはＦａｂ’２タイプのポリクローナルもしくはモノクローナル抗体の任意の断片、または抗体の可変鎖の更により小さい断片であって、配列番号：１６のＬＳＡ−５抗原性ポリペプチドのエピトープに対する同じ親和特性を示すものに関する。
【００５４】
本発明による好ましいモノクローナル抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３クラスのヒト抗体、または動物において得られ、ヒトにおいて細胞親和性を有し、そしてその配列を上記に示した抗原の１種類以上に指向される抗体である。
【００５５】
前述のような抗体を含有するマラリアの受動免疫療法、または予防用の医薬物もまた本発明の一部である。実際、ＬＳＡ−５抗原は、スポロゾイトの表面に存在し、それにより、抗ＬＳＡ−５抗体は、スポロゾイトの肝細胞内への浸透を阻害し得る。
【００５６】
この医薬物は、ＬＳＡ−１、ＬＳＡ−３、ＬＳＡ−５、ＳＡＬＳＡ、ＳＴＡＲＰ、ＴＲＡＰ、ＰｆＥＸＰ１、ＣＳ、ＭＳＰ−３、Ｐ１２６−ＣＥＲＰ−ＳＥＲＡ、およびＧＬＵＲＰの中から選択される少なくとも１種類の他の抗原に対して指向される（すなわち、認識する）抗体を更に含み得る。これらの抗体は、抗ＬＳＡ−５抗体について記載したものと同じプロトコルに従って作製され得る。
【００５７】
また、本発明者らは、抗ＬＳＡ−５抗体がまた、血中期のマラリア原虫（Plasmodium）、特にP.falciparum感染の予防のため、または治療用の薬物の調製に有用であり得ることを示した。
【００５８】
更にまた、本発明者らは、抗ＬＳＡ−５抗体が、脳マラリア患者治療用薬物の調製のために使用され得ることを示した。
【００５９】
かかる場合において、抗ＬＳＡ−５抗体は、低分子抗マラリア薬、例えば、キニーネ、アーテスネート、および／またはメフロキンなどと関連させて、またはより一般的には、これらとともに治療に使用され得る。
【００６０】
マラリア患者において寄生虫血症を低減させるため、またはマラリアの症状を示すか、もしくはマラリアに感染している可能性がある被験者おいてPlasmodium falciparumに対して保護するか、もしくは治療するための方法もまた提供される。かかる方法は、上記被験者に前述のような抗ＬＳＡ−５抗体を含む医薬物を投与することにある。
【００６１】
本発明はまた、P.falciparumに感染している可能性がある個体におけるマラリアのインビトロ診断のための方法に関し、これは、上記個体由来の生物学的試料を、本発明の抗原性ペプチド、ペプチド混合物、またはポリペプチドもしくはミクソトープと、上記抗原性ペプチドまたはポリペプチドと生物学的試料中に存在する可能性がある抗体との抗原／抗体複合体の形成を可能にする条件下で接触させること、および形成されている抗原／抗体複合体のインビトロ検出を含む。この方法を行うために使用され得る生物学的試料の例は、赤血球、白血球、血清、または尿である。抗原／抗体複合体の形成を可能にする条件は、
当業者には既知であり、そして例えば、「Handbook of Experimental Immunology」（前出）に見られ得る。
【００６２】
上記方法において、インビトロ診断は、例えば、「Handbook of Experimental Immunology」（前出）に記載された条件を用いるＥＬＩＳＡアッセイにより行われ得る。
【００６３】
本発明はまた、生物学的試料（例えば、血液など）に現れる（start from）P.falciparumによる感染に対する患者のワクチン接種をモニターするための手順において：
−P.falciparumに対する保護的抗体を含む生物学的試料を、本発明による少なくとも１種類の抗原に接触させて置くこと
−抗原−抗体反応の検出
を含むことを特徴とする、P.falciparumによる感染に対する患者のワクチン接種をモニターするための手順に関する。
【００６４】
これらのインビトロ検出方法を行うため、本発明による抗原は、好都合には、放射能マーカー、酵素標識もしくは蛍光標識の補助により、または物理的な（physical）タイプのマーカーさえの補助により標識する。
【００６５】
前記の診断およびモニター方法において、生物学的試料を、更に、他の前赤内期の抗原起源および／またはスポロゾイト期の抗原起源の１個または数個の抗原性ペプチド、例えば、ＬＳＡ−１、ＬＳＡ−３、ＳＡＬＳＡ、ＳＴＡＲＰ、ＴＲＡＰ、ＰｆＥＸＰ１、ＣＳ、ＭＳＰ−３、Ｐ１２６−ＣＥＲＰ−ＳＥＲＡ、およびＧＬＵＲＰの中から選択される抗原起源のペプチドと接触させ得る。
【００６６】
本発明はまた、本発明の抗原に対して指向される抗体の存在のインビトロ検出のための（例えば、マラリアのインビトロ診断のための、またはマラリアに対するワクチン接種をモニターするための）キットにおいて、本発明による少なくとも１個のペプチド、特に、その混合物、またはポリペプチドを、必要であれば、支持体に結合させて含有することを特徴とするキットに関する。
好都合には、かかるキットは、
−本発明による少なくとも１種類の抗原を含む抗原性組成物、および、場合により、
−上記抗原と生物学的試料中に存在する抗体との免疫学的反応を行わせるのに必要な試薬および／または
−免疫学的反応により生成する抗原−抗体複合体の検出を可能にする試薬
を含む。これらの試薬は、例えば、標識されているか、または標識された試薬により認識され得る。
【００６７】
これらの試薬は、抗原または抗体のいずれかがフルオロフォアで標識されている場合、例えば、基質および／または発色団であり得る。本発明のキットに含まれ得る試薬の例は、「Handbook of Experimental Immunology」（前出）に記載されている。
【００６８】
本発明によるキットの具体例は、以下の通りである。
・本発明によるＬＳＡ−５由来抗原でプレコートされたプレート（または任意の固相支持体）を含む、抗ＬＳＡ−５抗体を検出するためのＥＬＩＳＡキット。このキットにより、種々の液体（例えば、血液または血清など）中に存在する抗体が、ＥＬＩＳＡプレート上の抗原との接触後、洗浄し、そしてその体内で上記抗体が追求（seek）される動物種に対して指向される第２の抗体（例えば、抗ヒト二次抗体）を用いた可視化により検出される。上記第２の抗体は、酵素（例えば、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）、または蛍光分子（例えば、フルオレセイン、フィコエリトリン）などで標識されており、これにより、発色、酵素、もしくは蛍光による手段または任意の他の手段による第１の抗体の固定の可視化が可能になる。
【００６９】
・上記抗原に特異的な抗体でプレコートされたプレート（または任意の固相支持体）を含む、ＬＳＡ−５抗原を検出するためのＥＬＩＳＡキット。このキットにより、ＬＳＡ−５抗原を、生体液（例えば、血液、血清、尿など）から捕捉試験において単離すること、およびＬＳＡ−５に特異的で標識された第２の抗体により、前記段落に記載した手段のいずれかを用いて、この捕捉を可視化することが可能になる。
【００７０】
・ＬＳＡ−５抗原に特異的な抗体の検出を可能にする免疫獲得（immunocapture）ＥＬＩＳＡキットであって、プレート（または任意の他の固相支持体）が、その体内で抗ＬＳＡ−５抗体の検出が追求される動物種由来の免疫グロブリンに特異的な抗体でプレコートされたキット。かかるキットを用い、上記動物種由来の血清をプレート上でインキュベートし、そして、次いで、プレート上に保持された抗体の可視化を、標識されたＬＳＡ−５由来ペプチドを用いて前記の記載にしたがって行う。
【００７１】
・免疫着色（immunochromatic）キット、または計深棒（dipstick）もまた想定される。かかる「高速キット」は、抗原に結合できる１種類もしくは数種類のモノクローナル抗体、または抗ＬＳＡ−５抗体に結合できる抗原を含む。
【００７２】
・ＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取器）解析用のプラスチックビーズを含むキット。上記ビーズは、その検出が追求される要素に応じて、ＬＳＡ−５抗原または抗ＬＳＡ−５抗体のいずれかでプレコートされている。
【００７３】
・抗体または抗原のマイクロアレイ、すなわち、極めて少量の抗体または抗原を、ＥＬＩＳＡキットに対して前記のものと同様の条件で固定するために処理されたプラスチックまたはガラスの表面。
【００７４】
本発明によるキットはまた、好ましくは、その特定な用途のための使用説明書を含む。P.falciparumに感染している個体におけるマラリアのインビトロ診断のための、本発明の別の方法は、前記個体由来の生物学的試料を前述のような抗ＬＳＡ−５抗体と、上記抗体と生物学的試料中に存在するP.falciparumに特異的な抗原との抗原／抗体複合体の形成を可能にする条件下で接触させること、そして形成されている可能性がある抗原／抗体複合体のインビトロ検出を含む。この方法に使用され得る生物学的試料としては、例えば、血液、赤血球、白血球、血清、および尿が挙げられる。
【００７５】
抗ＬＳＡ−５抗体を含むマラリアのインビトロ診断のためのキットもまた本発明の一部である。かかるキットは、上記抗体と生物学的試料中に存在する可能性があるＬＳＡ−５抗原との抗原／抗体複合体の形成を可能にするための試薬、および形成されている可能性がある抗原／抗体複合体のインビトロ検出を可能にする試薬を更に含み得る。
【００７６】
本発明の別の態様によれば、マラリアの診断はまた、前述のような抗原性ペプチドまたはポリペプチドを含む免疫原性組成物の皮内注射によりインビボで行われ得る。適切な量の本発明の免疫原性組成物を含む既製のシリンジまたはデバイスもまた本発明の一部である。
【００７７】
本発明の別の態様は、前述のような抗原性ペプチドまたはポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド配列、ならびにプロモーター配列、およびかかる抗原性ペプチドまたはポリペプチドをコードする配列を含む組換えヌクレオチド配列である。
【００７８】
本発明の特定の配列は、配列番号：１９のポリペプチド（すなわち、ＬＳＡ−５抗原の変異体）をコードする配列番号：１８の配列を含む。
【００７９】
前記のようなヌクレオチド配列を含む組換えクローニングおよび／または発現ベクターもまた本発明の一部である。このベクターにおいて、ヌクレオチド配列は、好ましくは、宿主細胞に対して同種または異種の、宿主細胞における発現のためのプロモーターおよび調節エレメントの制御下にある。
【００８０】
本発明のベクターは、Plasmodium falciparumに対する遺伝子による免疫のための医薬の調製に使用され得る。したがって、本発明はまた、前述のようなヌクレオチド配列を含むＤＮＡワクチンに関する。例えば、ＶＲ１０２０ベクター（ＶＩＣＡＬ（登録商標））（例えば、（Kang、Calvoら 1998）および（Valenzuela、Belkaidら 2001）に記載）が、直接ＤＮＡ免疫のための構築物を得るために使用され得る。
【００８１】
本発明によるベクターで形質転換された組換え宿主細胞もまた本発明の一部である。この細胞は、例えば、細菌、酵母、および昆虫細胞、または哺乳動物細胞であり得る。
【００８２】
本発明はまた、免疫原性組成物、ペプチド性ワクチン、または前述のような発現ベクターもしくはＤＮＡワクチンを投与することにより、P.falciparumに感染している可能性がある個体に免疫処置を行う方法に関する。当業者は、使用する組成物のタイプに応じて、最良の投与形態を決定することができる。例えば、ペプチド性ワクチンは、皮下注射により投与され得、そしてＤＮＡワクチンは、遺伝子ガンにより投与され得る。例えば、ペプチド性ワクチンは、皮下または筋肉内注射により、適切なアジュバントとともに投与され得、そしてＤＮＡワクチンは、皮内、皮下または筋肉内注射により、針によって、遺伝子ガンによって、または粉末注射（powderject）によって、エンハンシング（enhancing）配列（例えば、ＣＰＧなど）とともに、または無しで投与され得る。
【００８３】
また、本発明のさらなる特徴は、図面とともに説明し、そして本発明の分子の特別な特徴を示した以下の実施例において明らかとなる。
【００８４】
以下の実施例は、以下に記載する材料および方法を用いて行った。
【００８５】
材料および方法
スポロゾイトおよび肝臓形態
P.falciparumのスポロゾイトは、感染したAnopheles gambiaeまたはAnopheles dirusのいずれかから、蚊を、Ponnodurai（Ponnudurai, Lensenら 1989）により記載されたＮＦ５４の培養物由来生殖母細胞で、または３２例のタイ人患者由来、すなわち、野生型のアジア人の単離株（Galey, Druilheら 1990）由来の生殖母細胞で膜上飼育（membrane feeding）した後に得た。
【００８６】
P.yoelii（１７ＸＮＬ株、１７ＸＮＬクローン１．１および２６５ＢＹ）ならびにP.berghei（Anka株）のスポロゾイトは、感染したA.stephensiから、蚊を感染性マウス血液飼料で飼育してから、それぞれ１４日および１８日後に抽出した。
【００８７】
スポロゾイトは、無菌的に調製し、記載の０．０１％グルタルアルデヒド（Druilhe Pradierら 1986）で速やかに固定し、そしてＩＦＡＴに使用する前に４℃で保存した。
【００８８】
P.falciparum肝臓シゾントは、アフリカ人の単離株７３０ＸＩ（Druilhe, Pueblaら 1984）の１０6スポロゾイトで感染の５日後のカツラサル（Cebus appela）、またはＮＦ５４株（Meis, Ponnuduraiら 1990）でのスポロゾイト感染後の第６日のチンパンジー（Pantroglytes）のいずれかの肝臓生検組織から得た。
【００８９】
P.yoelii肝臓シゾントは、１７ＸＮＬクローン１．１の１×１０6スポロゾイトでの感染の４２時間後のＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスの肝臓生検組織から得た。
【００９０】
ヒト抗ＬＳＡ−５特異的抗体
ヒト抗体を、組換えタンパク質βｇａｌ−ＤＧ  ５７１（ＬＳＡ−５）およびβｇａｌ−ＤＧ  ６６２（ＰｆＥＭＰ３）（Gruner, Brahimiら 2001）ならびにβｇａｌ−ＤＧ  ４３８（Marchand および Druilhe 1990）において、β−ガラクトシダーゼに対して反応性であるＡｂを欠損させた７例のヒト過免疫血清由来の抗体の逐次吸収によりアフィニティ精製した（Brahimi, Perignonら 1993）。簡単には、イソプロピルチオガラクトシド含浸ニトロセルロースフィルター（BA 85, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany）により誘導し、そして更に面に吸着させた組換えタンパク質を、各過免疫血清とともに逐次インキュベートし、そして充分に洗浄した。特異的結合性Ａｂを、０．２Ｍ  グリシン  ｐＨ２．５を用いて回収し、そして、２Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ１１の添加により直ちに中和した。アフィニティ精製したＡｂを、まずＰＢＳ  ｐＨ７．４に対して、次いでＲＰＭＩに対して、両方の場合において２４時間にわたって４℃で透析した。試料を、Centricon 30膜（Amicon, Millipore, USA）を用い、元の血清２０分の１希釈に相当する容量まで濃縮した。また、同様の調製を、ＧＳＴおよびＨｉｓ６組換えＬＳＡ−５からも行った。
【００９１】
マウス抗ＬＳＡ−５血清は、βｇａｌ−ＤＧ５７１で免疫処置したマウスから得た。この試験で使用した血清は、３回目の免疫処置の１５日後に回収し、そして使用時まで−８０℃で凍結保存したものであった。
【００９２】
間接蛍光抗体試験
ヒト抗体および動物抗体とスポロゾイトおよび感染肝細胞との反応性を、抗体を３０分間３７℃で、ｉ）グルタルアルデヒド固定スポロゾイト、ii）ＬＳ  感染肝臓組織の５μｍ切片とともにインキュベートすることにより評価した。次いで、スライドを３回、ＰＢＳで洗浄し、そして、更に３０分間、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ａ、Ｍ（Bio-Rad, France）、または抗マウスＩｇＧ、Ａ、Ｍ（Cappel, Organon Teknika, Belgium）とともに（すべての場合において、１／２０００エバンスブルーを加えたＰＢＳ中で１／２００に希釈した）インキュベートした。肝臓シゾントでのＩＦＡＴによる陽性は、位相差顕微鏡検査およびその後の切片のギムザ染色（Druilhe, Pueblaら 1984）により確認した。
【００９３】
免疫学的疫学的調査
調査対象地域および被験者。本発明者らは、過去に調査した３つの流行地域を当てにし、それにより、抗原間の比較を可能にした（Fidock, Gras-Masseら 1994; Trape, Rogierら 1994; Bottius, BenMohamedら 1996）。個体は、あらゆる年齢群（１〜７５歳の範囲）を含んだ。ポドル（Podor）村は、セネガル北部に位置し、そしてサハラ砂漠の極めて乾燥した一地域である。蚊によるマラリアの伝染は季節限定的であり、そして伝染は、平均、１年につき１人あたり１箇所の感染性刺傷と推定された（１〜５箇所の範囲の感染性刺傷／年）。ドンセ（Donse）は、ブルキナファソ（Burkina Faso）のワガドゥグー（Ouagadougou）の北５０  ｋｍのサバンナ地域である。マラリア伝染は、１００箇所の感染性刺傷／個体／年に達し（Druilhe, Pradierら 1986）、これは高い数字であるが、アフリカ標準の平均である。
【００９４】
ディエルモ（Dielmo）村は、セネガルのシン−サロウム（Sine-Saloum）地域に位置する。マラリアの伝染は激しく、年中見られるが、年ごとおよび季節ごとの変動が著しい。蚊による感染性の刺傷の平均は約２５０／人／年である。
【００９５】
組換えタンパク質のイムノブロッティング。組換えタンパク質βｇａｌ−５７１（ＬＳＡ−５）およびβｇａｌ−６４（ＰｆＥＭ３）を、７．５％アクリルアミド上でのドデシルナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動およびニトロセルロース膜へのエレクトロブロッティングに供した。ＬＳＡ−５、およびＰｆＥＭＰ３組換え分子に対するＡｂの有病率を調べるため、ポドル村からの４３例の血清を、１／１００希釈で試験し、そしてペルオキシダーゼ標識した第２の抗体により顕在化させた。対照として、健常個体由来の９例の血清を、パラレルで試験した。
【００９６】
ＥＬＩＳＡアッセイ。ＥＬＩＳＡは、マイクロタイタープレートを、１０μg/mlのＰＢＳ中のＬＳＡ−５−７１コンセンサスペプチド（ＥＥＶＶＥＥＬＩＥＥＶＩＰＥＥＬＶＬ（Ｐｌｍ）−ＣＯＮＨ2）溶液でコートすることにより行った（図１）。プレートを、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ中で２回洗浄し、そして１時間、１／１００希釈（ＰＢＳ  ０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳＴ）、１．２５％無脂肪乳中）のヒト血清５０μlを添加する前に２．５％無脂肪乳（Regilait）を補充したＰＢＳ中でブロックした。次いで、プレートを、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、結合したＩｇＧを、ペルオキシダーゼ−コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Byosis, Compiegne, france）（ＰＢＳＴ  １．２５％無脂肪乳中１／４０００希釈で添加）を用いて検出した。室温で１時間のインキュベーションおよび最終洗浄後、Ｈ2Ｏ2およびオルト−フェニレンジアミン（OPD, Sigma, St Louis）を、ペルオキシダーゼの基質として添加した（０．０３％、１mg/ml  ｏ−フェニレンジアミン、０．１  Ｍクエン酸塩pH  ５．５中）。３０分後、４５０nmにおける吸光度を、Titertek Multiskan MCC/340（Flow Laboratories, France）において読み取った。結果を、試験血清の平均O.D.の、同じプレートにおいてパラレルで試験した１０例の健常個体の平均＜O.D.＋３ＳＤに対する比で示す。結果は、比率＞１を陽性とみなす。
【００９７】
肝臓期進展阻害アッセイ（ＩＬＳＤＡ）
組換えタンパク質ＬＳＡ−５−７１（ＤＧ５７１）およびＤＧ  ８８（１１．１）においてアフィニティ精製したヒト抗体を、ヒトまたはマウス肝細胞の初代培養物内へのP.falciparumおよびP.yoelii侵入に対するその阻害作用について、既報のように試験した（Mellouk, Berbiguierら 1990）。ヒト抗ＤＧ６７１（ＳＡＬＳＡ）抗体を対照として使用した（Bottius, BenMohamedら 1996）。簡単には、完全培地中に懸濁した肝細胞を、８チャンバＬａｂ−Ｔｅｋ  プラスチックスライド（Nunc Inc., Napper Ville, IL）内に、１０5細胞／チャンバの比で播種した。３７℃での５％ＣＯ2雰囲気内での２４時間のインキュベーション後、培地を除き、そして、Ａｂ  抗ＤＧ５７１、抗ＤＧ  ８８または抗ＳＡＬＳＡ  Ａｂとともに６×１０4P.yoeliiまたはP.bergheiスポロゾイト（それぞれ、ＮＦ５４株、１７ＸＮＬクローン１．１またはＡＮＫＡ株）を培養培地中に懸濁したものを、肝細胞培養物に添加した。３７℃で３時間後、抗体および非侵入スポロゾイトを含有する培地を廃棄し、そして新鮮培地に交換した。ヒト肝細胞を培養の９６時間後に、そしてマウス肝細胞は４４時間後に、冷メタノール中で１０分間固定した。発育中のP.falciparumまたはP.yoeliiの肝臓期を、ＩＦＡＴにより、それぞれ、抗ＬＳＡ１（ＤＧ５３６）Ａｂまたはモノクローナル抗体（ＭＡｂ）ＮＹＬＳ３のいずれかで、記載のようにして（Charoenvit, Melloukら 1995）、Olympus紫外線（ＵＶ）顕微鏡を用いたエピ蛍光で同定した。
【００９８】
種内（inter-species）阻害を評価するため、P.bergheiを用いてパラレル試験を行った。P.bergheiのＣＳに対して指向されるＭＡｂを、P.bergheiスポロゾイト侵入の阻害の対照として、およびのP.berghei肝臓シゾントをＩＦＡＴ染色により記載のようにして（Charoenvit, Melloukら 1995）検出するために使用した。各培養ウェル内の肝臓シゾントの総数を計測し、そして二重培養ウェル内の肝臓シゾントの平均数を計算するために使用した。結果を、（対照における肝臓シゾントの数−試験における肝臓シゾントの数／対照における肝臓シゾントの数）×１００で計算される阻害のパーセンテージで表示した。
【００９９】
スポロゾイト誘導感染に対する抗体によるインビボ受動保護
ヒト親和性精製抗体である抗ＬＳＡ−５のP.yoeliiの発育に対するインビボでの効果を、既報のように（Brahimi、Badellら 2001）評価した。抗ＬＳＡ−５−７１、抗ＤＧ−７２９（ＬＳＡ３）、および対照ヒト抗ＤＧ６７１（ＳＡＬＳＡ）特異的抗体のいずれか１００μg/mlの溶液０．２ml、またはＲＰＭＩを、P.yoeliiのスポロゾイト１５０個に添加した。したがって、マウス１匹あたりのＡｂの最終量は、２０μgとした。２つの成分を、ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾静脈へのi.v.接種直前にシリンジ内で混合した。寄生虫血症を、第４日から第２１日まで、尾部血液のギムザ染色薄膜（thin）スメアの顕微鏡検査によりモニターした。
【０１００】
免疫原
免疫原性試験のほとんどは、最初に同定されたクローンＬＳＡ−５−７１を用いて行った。このクローンは、様々なタイプの抗原送達用の多種多様なベクター系において、すなわち、ベクターλＧＴ１１にて発現させたβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質として、ベクターＰＧＥＸにて発現させたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質として、ベクターｐＴＣＲＨｉｓ−６において発現させた６−ヒスチジン−テイルにより、また、２つの異なるタイプのベクター（一方は、本発明者らの研究所においてデザインされたｐＮＡＫおよびＶｉｃａｌ社特許のベクターＶＲ１０２０）を用いる遺伝子による免疫治療用の多種多様なベクター系において発現させた。研究の一部はまた、λＧＴ１１またはＨｉｓ−テイルベクターのいずれかにおいて発現させた１１．１抗原クローンＤＧ８８を用いて行った。
【０１０１】
最後に、免疫処置はまた、リポミクソトープペプチドまたは脂質系成分、すなわちパルミチン酸に結合した配列内に観察される潜在的置換の各々に対応する合成ペプチドのコンビナトリアルライブラリーに相当するコンバトープ（convertope）を用いて行った。イムノアッセイでは、リピート間で最も高頻度に見られる配列を表すコンセンサスペプチド、および比較として１１．１遺伝子配列由来のＰ９Ｂペプチドもまた使用した（図１）。
【０１０２】
マウスにおける免疫処置および攻撃
第１群：Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃおよびＦ１：（Ｃ５７ＢＬ／６ｘＢＡＬＢ／ｃ）マウスを、ニトロセルロースのミクロ粒子上に吸着させたβｇａｌ−ＤＧ  ５７１  １０μgで、第０日に免疫処置し、続いて、第３０日、１００日および第１７４日に組換えタンパク質５μgの３回の注射を行った。対照群は、βｇａｌ−ＤＧ  ６７１（ＳＡＬＳＡ）で上記のようにして免疫処置した。
【０１０３】
第２群：Ｃ３Ｈ／Ｈｅｊ、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、５．６×１０4ポリスチレンビーズ（０．５μｍ径）上に吸着させたＧＳＴ−ＤＧ  ５７１  ５０μgの高用量で、第０日に免疫処置し、続いて、第１５日および第３６日に同じ数のポリスチレンビーズに吸着させた組換えタンパク質２５μgの２回の注射を行った。Ｃ３Ｈ／Ｈｅｊ対照マウスは、ＧＳＴ−ＤＧ６７１（ＳＡＬＳＡ）で上記のようにして免疫処置した。
【０１０４】
P.yoeliiスポロゾイト攻撃
低用量。最終免疫処置の１ヶ月後、Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃおよびＦ１：（Ｃ５７ＢＬ／６ｘＢＡＬＢ／ｃ）マウスに１００００個の生P.yoeliiスポロゾイト（１７ＸＮＬ株）で攻撃し、そしてＣ３Ｈ／Ｈｅｊマウスは、低用量（１７ＸＮＬクローン１．１由来５００個のスポロゾイト）で攻撃した（後眼窩血洞内に注射、これは、尾静脈よりもかなり信頼性が高い）。寄生虫血症を、第５日〜第１４日の各マウスからのギムザ染色血液スメアにおいて調べた。保護は、血中期の非存在または対照と比べたときのその出現の有意な遅滞のいずれかで規定し、これは、Sauzet, Perlazaら 2001に記載されており、そして現在、A.Hillらにより臨床試験にも適用されている。
【０１０５】
高用量。この群では、マウスを、１００万個の生P.yoeliiスポロゾイトでi.v.により攻撃した。肝臓を、攻撃の４２時間〜４４時間後に取り出した。各肝臓組織を４〜６個の小片に切断し、そして直ちにカルノア中で固定した。試料を、５μに切断したパラフィン内に包埋し、ヘマトキシリン−エオシンで染色した。
【０１０６】
肝シゾントの数を、各動物から得た感染肝臓組織の種々の試料由来の１００個以上の切片を観察した後に測定した。同じシゾントを２度計測することを回避するため、切片１０個毎に１個だけを調べた。
【０１０７】
ヨザル属サルの免疫処置および攻撃
免疫処置計画。免疫学研究所（Immunology Institute）の霊長類センター（ＦＵＣＥＰ）（バレ大学、Colombia Cali）のAotus lemurinus griseimembraを使用した。８００ｇを超えない未処置成体サルのみを試験に含めた。免疫原性および保護に関する結果の解釈上の問題を回避するため、妊娠した雌または過去にマラリアに感染したことのある動物は除外した。
【０１０８】
合計５匹の未処置ヨザル属を、アジュバントなしでポリスチレンビーズに吸着させたＧＳＴ  ＤＧ  ５７１−組換えタンパク質２μgで皮下免疫処置した。この低抗原用量は、マウスにおいてＬＳＡ３およびＬＳＡ−５の両方の場合で得られた比較データ、およびヨザル属における同用量でのＬＳＡ３の場合の結果（Perlaza, Zapataら 2003）を考慮して選択した。各動物に３用量の免疫原を２１日間隔で投与した。３匹のヨザル属には、ＧＳＴを単独で注射し、抗原対照として使用した。２匹の更なる未処置サルを感染力対照とした。
【０１０９】
スポロゾイト攻撃。P.falciparumスポロゾイトを、P.falciparum Santa Lucia株生殖母細胞で感染させたサル由来のマラリア感染血液を含有する人工フィーダーにて飼育したAnopheles albimanus蚊から得た。スポロゾイトを正常サル血清を含むＲＰＭＩ培地中で、蚊の飼育の１４日後に別途に記載のようにして（Hurtado, Salasら 1997）回収した。蚊の唾液腺切開後、スポロゾイトをサル大腿静脈内に注射して攻撃した。免疫処置群および対照群に、P.falciparum Santa Lucia スポロゾイトで感染させた（Hurtado, Salasら 1997）。各ヨザル属に、スポロゾイト中用量１０5を静脈内注射した。２匹の免疫処置をしていないヨザル属（Ｍ２９およびＶ９７）に対照として１回分の（batch）感染力の同用量のスポロゾイトを投与した。寄生虫血症を、攻撃後、厚膜（thick）スメア、ＰＣＲおよび寄生虫ＬＤＨ（ｐＬＤＨ）試験により、４０日間追跡調査した。寄生虫／μlで表示する寄生虫密度を、別途に記載のようにして（Zapata, Perlazaら 2002）計算した。寄生虫血症の追跡調査の最後に、動物を、サルファドキシンとピリメタミンとの併用（Kinnamon およびRothe 1975; Landgraf, Kollaritschら 1994）で処置した。
【０１１０】
ＩＦＮ−γ測定。各サル由来のＰＢＭＣを、Ficoll Paque（Pharmacia Biotech）での勾配遠心分離により、ＩＦＮ−γ産生の測定のために免疫処置前と最終注射の１５日後に単離した。
【０１１１】
抗原（１０μg/ml）によるインビトロ刺激時、ＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ産生を、Ｅｌｉｓｐｏｔにより、および細胞培養上清み中の両方で測定した。Ｔ細胞アッセイを、Ficoll Paque（Pharmacia Biotech）にて、これらの小型霊長類（＜１kg）由来の倫理的に許容され得る最大量（すなわち、第０日（免疫処置前）および３回目の免疫処置の１５日後に大腿静脈穿刺により採取した血液３ml）の血液から単離されたヨザル属ＰＢＭＣを用いて行った。ＩＦＮ−γ産生ＰＢＭＣの数を、ヒトＩＦＮ−γ  ＥＬＩｓｐｏｔ用の市販のキット（MABTECH, Stockholm, Sweden）を用いて評価した。マイクロタイタープレートウェル（Millipore, MAHA S45, Bedford, MA, USA）を、抗ヒトＩＦＮ−γ  ｍＡｂ  （1-D1K MABTECH AB, Sweden）５μg/mlで、一晩４℃でコートした。ＲＰＭＩ  培地＋１０％  ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で２時間室温でのブロッキング後、５×１０5  ＰＢＭＣ／ウェルの懸濁液を、組換えタンパク質または合成ペプチドのいずれか２０μg/mlと混合した。プレートを、４０時間３７℃で、５％ＣＯ２−９５％大気雰囲気中でインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）０．０５％での洗浄後、ビオチン化抗ＩＦＮ−γ  ｍＡｂ（7-B6-1, MABTECH AB, Sweden）を０．３μg/mlで添加し、そして一晩４℃でインキュベートした。ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（Boehringer Mannheim）（１／１０００希釈）を添加し、そして反応を基質ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（５−ブロモ−２−クロロ−３−インドリルホスファターゼ／ニトロブルーテトラゾリウム）（Sigma, St Louis, MO, U.S.A.）で顕在化させると、暗青色のスポットの出現がみられた。スポットの数を、立体顕微鏡を用い、２つの独立した読取装置により測定した（×４０）。結果を、１０6  ＰＢＭＣあたりのＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）の平均数で示す。定量上の理由から、免疫処置したヨザル属のうちの１匹に由来する細胞は、この手法で試験することができなかった。
【０１１２】
第５日に回収したＰＢＭＣ上清み中のＩＦＮ−γ濃度を、２サイト（two-site）捕捉ＥＬＩＳＡにより、別途に記載のようにして（Benmohamed, Thomasら 2000）、ヨザル属ＩＦＮ−γと反応できることが確認された抗ヒトＩＦＮ−γ  ｍＡｂの別の組合せを用いて測定した。
【０１１３】
陰性対照および陽性対照（非刺激細胞およびＰＨＡで刺激した細胞）を、各アッセイに含めた。ＩＦＮ−γ濃度（IU/ml）は、各プレートに含まれ、そして既知量の組換えヒトＩＦＮ−γ（Pharmingen International, 19751G）から作製される標準的な曲線から計算した。特異性は、試験上清みおよび対照上清み中での濃度を比較することにより測定した。
【０１１４】
ＬＳＡ−５およびＬＳＡ３による併用免疫処置
５匹のＣ３Ｈマウスから成る群を、ａ）３回、１ヶ月間隔で、組換えＬＳＡ３−ＤＧ７２９もしくは組換えＬＳＡ−５．７１もしくはＬＳＡ３−ＤＧ７２９＋ＬＳＡ−５．７１の混合物のいずれか５０μgにより、またはｂ）２回のみ、１ヶ月間隔で、同じ単独または併用の組換え体により、のいずれかで皮下にて免疫処置した。すべての抗原は、ｓ．ｃ．でＡＳ０２アジュバントとともに送達した。抗体応答を、組換え体の各々に対する最終免疫処置の３週間後にＥＬＩＳＡにより測定した。結果を、免疫処置をしていないＣ３Ｈマウス由来血清と比べた、１群あたり５匹のマウスでのＡｂ比の平均（＋／−ＳＤ）で示す。
【実施例１】
【０１１５】
ＬＳＡ−５抗原の部分的特徴付け
最初に同定されたクローンＤＧ５７１は、２６年間スポロゾイト攻撃に曝露されたが、連続して毎日クロロキン予防を受けた聖職者の血清のスクリーニングにより同定された最初の１１９個の前赤内期断片の１２個のクローンから成る一群または一ファミリーの一部であることがわかった。これらのクローン間の相同性は、１２個のクローン生成物の各々に対するアフィニティ精製抗体を用いた免疫交差反応性によってだけでなく、これらの挿入断片間の交差ハイブリダイゼーションによっても示された。
断片の配列決定により、７個が、Ｐｆ１１．１をコードする遺伝子の様々な領域との有意な相同性（＞６０％）を有することが示され、一方、１個は、ＧＬＵＲＰに属し、そして、残りの４個は、P.falciparumのゲノムに特徴的な反復配列を含有する。クローンＤＧ５７１の配列（３９９塩基対の挿入断片に相当する）は、９個アミノ酸から成るリピートおよそ１５個から構成され、そしてグルタミン酸、イソロイシンおよびバリンを豊富に含むことがわかった（図１）。この理由のため、これは、グルタミン酸を豊富に含む他のP.falciparum抗原（例えば、ＧＬＵＲＰのＲ２領域、ＬＳＡ−３、１１．１抗原、Ｐｆ３３２抗原およびＲＥＳＡなどのリピート領域）との様々な程度の相同性を有する。
【０１１６】
公表されているゲノムデータの解析では、ＤＧ５７１が巨大遺伝子Ｐｆ１１．１に属するか否かに関する明確な結論は得られなかった。実際、いくつかのクローンは、１１．１の公表されている配列との１００％相同性を有したが、タンパク質レベルでのＤＧ５７１の相同性の程度は、わずかに５５％であり（一方、核酸レベルでは８７％である）、すなわち、すべてのうちで最も発散性であった。（表２参照）。更に、第１０染色体に位置するｐＦ１１．１の遺伝子座の配列は完全ではなく、そしてリピートのみで構成される非常に大きな領域について注解するのは困難である。最後に、ＤＧ５７１  リピートは、これがＤＧ５７１よる保護を誘導することが可能であった（下記参照）が、１１．１タイプのリピートによる免疫処置では保護は誘導されなかったので、固有の免疫学的特性を有するようである。したがって、これが１１．１に属するとしても、まだ報告されていない、かなり固有の配列が内部にある。
【０１１７】
【表２】
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表２：スポロゾイトおよび肝臓期に対する抗体反応性
【０１１８】
ＩＦＡＴは、ヒト（ＬＳＡ−５）抗βＧａｌ−ＤＧ５７１（ＬＳＡ−５）免疫精製したマウスを用い、１１例のタイ人単離株およびＮＦ５４株；
ｉ）スポロゾイト感染後のCebus apella（５日）およびチンパンジー（６日）から得たP.falciparum肝臓期；
ii）ハマダラカ（Aanopheles stephensi）の唾液腺から単離したP.yoelii（１７ＸＮＬ）およびP.berghei（ＡＮＫＡ）スポロゾイト
由来のP.faclciparumスポロゾイトにおいて行った。ヒト抗βＧａｌ−ＤＧ  ６６２（ＰｆＭＰ３）および抗βＧａｌ−ＤＧ  ４３８  免疫精製抗体を対照として使用した。
【０１１９】
マウス血清について、反応性≧１００を陽性とみなした。アフィニティ精製抗体は未希釈で使用した。したがって、結果は、陰性または陽性で表示する。
【実施例２】
【０１２０】
ＬＳＡ−５は、３２例の患者単離株由来のスポロゾイトの表面上および肝臓期に一貫して発現される
ＬＳＡ−５−７１に対してアフィニティ精製したヒト抗体は、ＩＦＡＴ（免疫蛍光抗体試験）により、ＮＦ５４のスポロゾイトの表面と強く反応性であることがわかり、スポロゾイト表面全体において均一に分布された標識で示される。この反応性はまた、１２／１２タイ人単離株においても検出された（表２）。蛍光のパターンおよび強度は、各株および単離株のスポロゾイトで同じであり、そして同じ試料において試験したヒト抗ＤＧ７０５（ＣＳ遺伝子に対応するクローン）の場合で得られる反応性と同等であった（図２−Ａ）。異なるP.falciparum単離物間でのＬＳＡ−５の抗原性保存を更に評価するため、ＩＦＡを、更に２０例のタイ人単離株由来のスポロゾイトを用いて行い、そしてそれらの各々に対する反応性において同じ一貫したパターンを得た（図示せず）。
【０１２１】
ヒト特異的抗ＬＳＡ−５抗体を、ＩＦＡＴ（間接蛍光抗体試験）により、２種類の齧歯類マラリア種P.yoeliiおよびP.berghei由来のスポロゾイトにおいて更に試験した。同様のパターン（スポロゾイトの表面全体に均一な分布を伴う）がこれらの２種の場合でも得られたが、反応性は、P.yoeliiの場合のほうがより強かった（図２−Ｃ）。P.yoeliiまたはP.bergheiスポロゾイトのＩＦＡＴ標識は、対照組換えタンパク質ＤＧ  ４３８に対してアフィニティ精製したヒト抗体を用いても、またはP.bergheiに対するＤＧ  ６６２（ＰｆＥＭＰ３）を用いても得られなかった。また、ＬＳＡ−５免疫処置マウスにおいて誘導された抗体は、調べたすべての株（ＮＦ５４および７例のタイ人単離株）由来のP.falciparumスポロゾイトと強く反応した。また、ヒト抗ＬＳＡ−５抗体との場合で得られるP.yoeliiスポロゾイト（１７ＸＮＬ）に対する交差反応性は、マウス由来の抗ＬＳＡ−５−抗体を用い、ＩＦＡＴにより、試験したすべてのP.yoelii株（２６５ＢＹ株、１７ＸＮＬ株および１７ＸＮＬクローン１．１）において検出した。P.yoeliiおよびP.falciparumスポロゾイト抽出物のウエスタンブロッティングにより、１９５〜８１  ｋＤａ（図示せず）の範囲のいくつかのバンドが得られ、該分子の高Ｇｌｕ富化含量を反映していると考えられる。
【０１２２】
肝臓期のP.falciparumおよびP.yoeliiにおいて、ＬＳＡ−５の発現もまた、ヒト抗体およびマウス抗体を用いて検出することができた（図２−ＢおよびＤ）。ＩＦＡによると、ＬＳＡ−５は、未成熟肝臓シゾント（５日）の寄生虫恐怖症空胞（parasitophorous vacuole）内に位置し、そして、ＬＳＡ１（Fidock, Bottiusら 1994）、ＳＡＬＳＡ（Bottius, BenMohamedら 1996）およびＬＳＡ３（Daubersies, Thomasら 2000）と同様、偽胞子虫生殖体（pseudocytomeres）間に分布するようである。発現は、チンパンジーにおいて得たＮＦ５４株およびこれから誘導した３Ｄ７クローン、ならびにCebus appellaの感染に用いたアフリカ系単離物の両方に由来する、調べた肝臓シゾントすべてにおいて見られた。
【０１２３】
無性血中期のP.falciparumでは、Ｐ．ｆ．１１．１で見られるものと類似する交差反応性が、両方タンパク質における高含量のＧｌｕ富化領域のため、ＬＳＡ−５に対するヒト抗体およびマウス抗体で観察された。対照的に、同じヒト抗体およびマウス抗体は、非同期性物質（すなわち、すべての発育期を含む）を用いると無性血中期のP.yoeliiと非反応性であることがわかった。
【０１２４】
ＬＳＡ−５の超微形態的位置は、ａ）スポロゾイト（図３−ＡおよびＢ）（この場合、膜と会合しているが、細胞質内にも豊富にある）、およびｂ）完全に成熟した肝臓形態（これは、該タンパク質が、出現している赤血球外メロゾイトを囲む寄生虫恐怖症空胞内に存在する綿毛状または羊毛状物質と会合していることを示した）（図４−Ａ、Ｂ、およびＣ）の免疫金標識により明らかとなった。注目すべきことに、ＬＳＡ−５の標識は、ＰＶＭ（寄生虫恐怖症空胞膜）内で常に見られ、そして、肝細胞細胞質内では全く見られず、肝細胞表面上でも見られなかった。染色の強度は、ＩＦＡＴおよびＥＭのいずれの場合でも、ＬＳＡ−５は、肝臓でのシゾゴニー（schyzogony）中に活発に合成されることを示す。
【０１２５】
ＬＳＡ−５の期特異的な発現が、上記試験により示された。ＬＳＡ−５−７１の、放射線照射したスポロゾイトにより免疫処置し、かつ攻撃時に保護された（したがって、主に、前赤内期の抗原に指向された抗体により）３例のヒトボランティア由来の血清、ならびに２例の他の聖職者の血清（Pere Mauvaisに加えてSoeur NeveuおよびPere Gouel）およびピリメタミン（スポロゾイトおよび肝臓期に対するＡｂのみを発生させる）の処置を受けたP.yoelii攻撃マウス由来の血清との反応性が確認された（図示せず）。
【実施例３】
【０１２６】
ＬＳＡ−５は、種々のレベルのマラリア伝染に曝露させた個体において高度に抗原性である
ヒトにおける免疫応答の高有病率は、マウスにおける保護が示された後のＬＳＡ−５の選択および保持の更なる基準の１つであった。
【０１２７】
有病率を、まず、地域的流行が非常に低い（１〜５箇所の感染性刺傷／年）地域であるポドル（セネガル）で生活する年齢２〜７５歳の個体由来の４３例の血清を用いた、組換えタンパク質Ｂｇａｌ−５７１（ＬＳＡ−５）のウェスタンブロットにおいて評価した。ＬＳＡ−５に対するＡｂ応答は、試験した個体の９１％において検出され（図示せず）、したがって、同じ個体においてＰｆＥＭＰ３では７８％およびＳＡＬＳＡでは８０％（Bottius, BenMohamedら 1996）と比較すると、その抗原性を示す。
【０１２８】
この初期に示されたことは、２つの高伝染地域（ディエルモ（セネガル）およびドンセ（ブルキナファソ））および低伝染地域（ポドル（北セネガル））で生活する全年齢群の３２８例の個体由来の血清を用いた、更なるＥＬＩＳＡ試験により完結した。結果を、表５にまとめる。コンセンサスペプチド５７１に対するＡｂ応答が、すべての試験群において検出され、抗体応答者の有病率の増加は年齢および地域の関数として、すなわち、寄生虫の曝露および伝染のレベルに依存した（ポドルで５１．５％、ドンセで６６％、およびディエルモで７５．５％）。
【０１２９】
各地域では、若年被験者間で特に検出され得るＡｂの有病率および力価の両方に年齢依存性の増加があった。５〜１０歳と比較した場合の０〜５歳群における高有病率は、この第２の群が少数であること（８対１２）と関連している。地域ごとに、特異的ＩｇＧの有病率または平均レベルのいずれかとスポロゾイト接種の平均回数との間に関連性があった。図２に示すように、ＩｇＧ  Ａｂ応答は、蚊による感染刺傷への曝露とともに増加し、ポドルでは１７．５％、ドンセでは３３．５％、およびディエルモでは５２％と高度に応答した。
【０１３０】
低伝染地域であるポドルで得られた結果は、この場合も、特異的抗体応答が、非常に少ないマラリア感染性蚊刺傷の後に惹起されたため、天然のＬＳＡ−５の高い抗原性を支持した。
【０１３１】
ＬＳＡ−５に関して記録された有病率は、したがって、同地域の同被験者で過去に記録された、ＬＳＡ１（Fidock, Gras-Masseら 1994）、Ｓａｌｓａ（Bottius, BenMohamedら 1996）、Ｓｔａｒｐ（Fidock, Bottiusら 1994）、ＣＳ（Bottius, BenMohamedら 1996）、Ｐｆ  ＥＭＰ３およびＥＢＡ１７５に関するものよりも有意に高い。これらは、ＬＳＡ３について記録されたもの（Perlaza, Sauzetら 2001）と同程度に高いか、それよりも高い。
【実施例４】
【０１３２】
抗ＬＳＡ−５抗体は、肝細胞内へのP falciparumおよびP.yoelii侵入を、インビトロおよびインビボの両条件下において、強く阻害する
４．１．インビトロ結果。ＬＳＡ−５と２種類の齧歯類マラリア寄生虫P.yoeliiおよびP.bergheiとの間に共有されるＢ細胞エピトープの存在が示されたため、抗ＬＳＡ−５抗体の、P.yoeliiおよびP.bergheiスポロゾイトによるマウス肝細胞のインビトロ侵入に対する効果を調べた。
【０１３３】
２種類の齧歯類種を用いた試験をパラレルで行った、すなわち、単一の肝細胞調製物を用いて行った（図６）。ＬＳＡ−５−７１において免疫精製したヒト抗体は、それぞれ、P.yoeliiスポロゾイト侵入の９９％阻害およびP.bergheiスポロゾイト侵入の６０％阻害を示した。阻害は、抗体を１１．１抗原に属する組換えタンパク質ＤＧ８８において免疫精製した場合、５０％であった。非交差反応性抗原ＳＡＬＳＡにおいて免疫精製した抗体は、有意な効果を有さなかった（＜１０％阻害）。
【０１３４】
抗ＬＳＡ−５抗体の場合に得られたほぼ完全な阻害は、抗ＬＳＡ−３（Bottius, BenMohamedら 1996）の場合で得られるものと類似し、そしてこれまでに得られた中で最も高い。実際、スポロゾイト侵入の阻害は、抗スポロゾイト周囲タンパク質モノクローナル抗体およびＳＴＡＲＰ、ＳＡＬＳＡ、ＬＳＡ−３に対するヒト抗体を用いて、過去に得られた。しかしながら、抗ＣＳ、ＳＴＡＲＰおよびＳＡＬＳＡでは、阻害は、強い場合もあるが、完全ではなかった。肝臓期に変換できるスポロゾイトが常にある割合で残った。これは、標的抗原と関連する。それは、試験したいかなる抗体濃度（抗ＣＳ  Ｍａｂに関して１リットルあたり１ｇもの高い濃度）でも存在したためである。一方、ＬＳＡ−３およびＬＳＡ−５の結果は、アフィニティ精製抗体、すなわち、比較的中程度の抗体濃度（スポロゾイト表面で１：２〜１：１００に漸増）（一方、０．５  ｇ／ｌの抗ＣＳ  Ｍａｂは１×１０７の力価を有した）を用いてまとめた。
【０１３５】
ヒト肝細胞内へのP.falciparumスポロゾイト侵入阻害：ヒト親和性精製した抗ＬＳＡ−５−７１およびマウスにおいて生成された抗体（エンドポイント力価１／５０に調整）を、P.falciparumスポロゾイトとともにヒト肝細胞初代培養物に添加した。二重で行った予備試験では、侵入の９５％阻害がヒトＡｂの場合で観察された。抗体の効果の特異性は、阻害作用の復活（reversion）により、ＬＳＡ−５−７１抗原の１０μg/mlの濃度での添加により確認した。対照ウェルでは、抗原はそれ自体が阻害作用を示さず、また、抗ＬＳＡ−５−７１ヒト抗体に添加すると、観察された侵入阻害が完全に復活し、それにより、阻害作用はパラトープ（抗体抗原結合性部位）によるものであること、すなわち、抗体調製物と関連するいずれかの種類の毒性効果によるものでないことが明白に示された。更に、抗ＬＳＡ−５−７１抗体を含むウェルでは、残留したスポロゾイトが凝集し（すなわち、抗体によると考えられる）、そして、これは、抗原により逆戻り（reverse）した。マウスにおいて生成された抗体は、ヒト親和性精製抗体よりもはるかに弱い効果を有した（４５％）。抗スポロゾイト周囲タンパク質２Ａ１０  Ｍａｂを陽性対照として用い、そしてスポロゾイトにおいて発現されないＤＧ５３６（ＬＳＡ−１）に対する抗体を陰性対照として用いた。これらの結果は最近得られ、そして別の試験で繰り返されるべきであるため、これらは示さない。
【０１３６】
４．２．インビボ結果：受動輸送試験。インビトロ侵入阻害を、インビボ試験により確認した。ヒト親和性精製抗ＤＧ５７１抗体を、受動輸送試験において試験した。ヒト抗ＤＧ７２９（ＬＳＡ３  Ｎｔｅｒｍ）抗体（これについては、P.yoeliiスポロゾイト感染に対する保護的効果が過去に示された）を、パラレルで陽性対照として使用した。１群あたり２匹のマウスを試験した。各群では、マウスに、特異的抗体を併せて混合したスポロゾイトを注射した。陰性対照の群には、スポロゾイトを抗ＳＡＬＳＡ抗体（P.yeoliiスポロゾイトとは反応しない）と一緒に注射したマウスを含めたが、最後の群のマウスには、寄生虫感染力を確認するためにスポロゾイトを単独で投与した。接種後、第４日から第２１日までは、抗ＬＳＡ−５抗体を投与したマウスにおいて寄生虫は検出され得ず、これは、ヒト抗ＬＳＡ−５抗体が、マウスをP.yoeliiスポロゾイト感染に対して完全な保護を示した。対照的に、抗ＳＡＬＳＡ抗体とともにプレインキュベートしたスポロゾイト、または未処置スポロゾイトを投与した対照マウスは、第５日からパテント（patent）の寄生虫血症を有し、そして感染は、通常の過程にしたがった（表３）。P.yeoliiのモノクローナルＡｂ抗ＴＲＡＰまたは抗ＣＳＰを用いて行った受動試験（この場合、大量の抗体を輸送しなければならなかった（それぞれ、５００μg（Gantt, Perssonら 2000）、および１mg（Charoenvit, Melloukら 1991））とは対照的に、抗ＬＳＡ−５抗体は、はるかに少ない量（２０μg）で保護的であったことを理解されたい。
【０１３７】
【表３】
2008504005.tif 000005
表３：受動輸送試験における抗ＬＳＡ−５Ａｂのインビボ保護的効果。ヒト抗ＬＳＡ−５、抗βｇａｌ−ＤＧ７２９（ＬＳＡ３）または抗βｇａｌ−ＤＧ６７１（ＳＡＬＳＡ）Ａｂ  １００μg/mlを１５０個のP.yoeliiスポロゾイトに最終容量２００μ／マウスで添加し、そしてＢａｌｂ／Ｃマウスの尾静脈内に注射した。寄生虫血症を、攻撃後、第４日から第２１日まで記録した。
【実施例５】
【０１３８】
ＬＳＡ−５による免疫処置は、いくつかの系統のマウスにおいてP.yeoliiスポロゾイト攻撃に対する保護を誘導する
低用量スポロゾイト攻撃。第１の試験において、３つの系統のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃおよびＦ１（Ｃ５７ＢＬ／６ｘＢＡＬＢ／ｃ））に、βｇａｌ−ＤＧ５７１（ＬＳＡ−５）またはβｇａｌ−ＤＧ６７１（ＳＡＬＳＡ）のいずれかの４回の免疫処置を行い、そして、１０，０００個のP.yeoliiスポロゾイト（１７ＸＮＬ株）の静脈内接種により攻撃を与えた。
【０１３９】
Ｃ５７ＢＬ／６同系交配マウスの４／５（８０％）、ＢＡＬＢ／ｃの４／５（８０％）および非近交系交配マウスＦ１：（Ｃ５７ＢＬ／６ＸＢＡＬＢ／ｃ）１４／１６（８７％）が有意な程度の保護（図７）を示した。
【０１４０】
５匹のＣ５７ＢＬ／６のうち２匹（４０％）は、殺菌性保護を有し、一方、２匹の他のマウスでは、対照群のマウスと比べ、寄生虫血症は３日遅滞した（肝内寄生虫負荷の平均９９．２％低下に相当）。ＬＳＡ−５免疫処置したＢＡＬＢ／ｃマウスの５匹のうち４匹は、部分保護され、寄生虫血症の発現の４８時間遅滞を示した。非近交系交配マウス５匹の５匹とも、部分保護を示し、２匹のマウスは３日の遅滞および３匹は、１日の遅滞を示した。第２の試験では、部分保護が、１１匹の非近交系交配マウスの９匹（８１％）において更に確認され、そして５匹のマウスは３日、４匹は２日遅滞した。対照的に、血液寄生虫血症の発症は、攻撃後第５日に起こり、すなわち、抗原βｇａｌ−ＤＧ６７１（ＳＡＬＳＡ）で免疫処置したすべての３１例の対照マウスおよび２０匹の対照の免疫処置をしていないマウスで遅滞はなかった。
【０１４１】
第３の試験では、５匹のＣ３Ｈ／ＨｅＪおよび５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを、ポリスチレンビーズ上に吸着させたＬＳＡ−５組換えＧＳＴ−ＤＧ  ５７１  ５０μgで免疫処置し、そして、続いて、５  ＧＳＴ  対照とともに、５００個の生きたP.yoeliiスポロゾイト（１７ＸＮＬクローン１．１）（これは、動物１匹あたり１００個スポロゾイトの率で一貫して感染性である）で攻撃した。すべての５匹のＣ３Ｈおよび５匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスは保護を示し、２匹では完全に、残りの免疫処置マウスでは一部であった。遺伝子による免疫処置を試みたが、９匹の対照に比べ、８匹の免疫処置動物の各々において、明白さ（patency）において、より中程度の２４時間の遅滞しかもたらされなかった。
【０１４２】
一連のＬＳによる高用量攻撃。続いて、保護率を、高スポロゾイト接種を用いて調べた後、感染肝臓のインサイチュー（in situ）試験を行った。図８に示すように、得られる肝臓シゾントの数の大きな低下が、ＬＳＡ−５で免疫処置した４つのすべての系統のマウスにおいて観察され、対照と比べると、８２〜９８．２％阻害であった。
【０１４３】
肝臓シゾントの数の９８．２％減少がＢＡＬＢ／ｃにおいて得られ、Ｃ５７ＢＬ／６では９５％、およびＦ１：（Ｃ５７ＢＬ／６ｘＢＡＬＢ／ｃ）マウスでは８２％であった。また、完全な保護が、ＣＦＡ  とともにＬＳＡ−５−７１で免疫処置した２／２  ＣＤ１  マウスにおいて得られた。これらのレベルの保護は、過去にＬＳＡ３免疫処置したマウス（Sauzet, Perlazaら 2001）において得られたものと同程度に高い。
【０１４４】
インサイチュー観察結果。ＬＳＡ−５での免疫処置は、高用量攻撃時の肝臓形態の総数の顕著な減少をもたらすだけでなく、肝臓内における寄生虫の周囲での強いインサイチュー細胞防御とも関連した（図９）。健常肝臓形態は、１００万個のスポロゾイトを投与した対照Ｆ１：（Ｃ５７ＢＬ／６ｘＢＡＬＢ／ｃ）マウスの肝臓において観察された（図９−Ａ）。逆に、ＬＳＡ−５で免疫処置した動物では、肝臓はリンパ−単核細胞により浸潤され、稀に細胞肉芽腫の存在を伴い、ほとんどリンパ球およびマクロファージから成り、ここでは、無傷の肝臓形態は見られ得なかったが、寄生虫抗原は検出され得た（抗ＬＳＡ３特異的Ａｂにより顕在化した）（図９−Ｄ）。場合によっては、肝臓形態はなお、形態学的に可視的であったが、変形し、そして白血球が浸潤していた（図９−Ｂ、Ｃ）。
【０１４５】
P.yoelii低用量攻撃試験は、これを、同時に攻撃した対照抗原または対照アジュバントマウスにおける血液中での寄生虫の出現の再現性、すなわちＬＳ成熟までの時間と対比させることによってのみ解釈され得る。＞１００匹の対照マウス間では遅滞は観察されないことが過去に報告され（Sauzet, Perlazaら 2001）、そして、最近、３００匹を超える対照マウスにおいて、最大２４時間の遅滞が、症例の３％未満において観察されると計算された。わずかな部分保護が高頻度に得られることは、驚くべきことではなかろう。マウスを、P.falciparum分子で免疫処置し、P.yoelii（これは相同な交差反応性分子含有する）で攻撃した。これらの２種間で共有されるエピトープの数は減少し、このため、完全な殺菌性保護は、標的抗原が同一でなく、そして限定的なエピトープ類似性のみ含有するため、達成することがより困難になると考えられる。様々な数のスポロゾイトを攻撃に使用した試験では、寄生虫血症における１、２、３日の遅滞が、それぞれ、８０、９６および９９．２％の寄生虫負荷の低下に相当することがわかった（Sauzet, Perlazaら 2001）。高用量攻撃後にインサイチュー評価した保護の程度（このとき、動物１匹あたりの肝臓形態の総数の実際の低下を正確に測定した）は、実際にこれらの数値と一致する。
【０１４６】
最近の結果により、ＬＳＡ−５の非常に高い免疫原性、特に、アジュバントなしの微粒子製剤の高い免疫原性が確認される。２つの血統のマウス、すなわち、Ｃ３ＨまたはＢａｌｂ／Ｃにおいて、免疫処置を、アジュバントなしで、ＬＳＡ−５−ＤＧ５７１タンパク質をコートしたポリスチレンミクロ粒子の皮下接種により行った。高レベル増殖性応答、抗体応答およびＩＦＮ−γ分泌が、全用量の全動物において、両方の血統のマウスでみられた。図１５および１６は、特に、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより測定されたインターフェロン−γの分泌を示し、これは、保護の状態と最も相関している。結果は、Ｃ３Ｈと比較した場合、Ｂａｌｂ／Ｃにおける結果のより大きな用量依存性を示す。最高用量では、応答性細胞の数は、ＰＢＭＣ１００万個あたり１００〜２５０のスポットと非常に高く、５７１−ヒスチジン組換えタンパク質および／またはコンセンサス５７１  ＬＳＡ−５ペプチド、ミクソトープＬＳＡ−５に応答し、公表されている１１．１配列由来のＰ９ＡおよびＰ９Ｂペプチドまたは対照抗原（例えば、ＬＳＡ−１など）に対してはかなり少なく応答した。
【０１４７】
最後に、肝臓におけるインサイチュー調査では、ＬＳＡ−５抗原周囲でのＴリンパ球の非常に強い動員が示され、これは、特異的リンパ球がこの位置に移動およびホーム（home）し得ることを示す。
【０１４８】
結局、これらの結果は、アジュバントなしで、ミクロ微粒子形態で送達される非常に低用量から中用量の抗原非常に強い免疫応答、特に、マウス、非ヒト霊長類またはヒトにおける保護の状態と関連することが過去にわかっているものを誘導し得ることを示す。
【実施例６】
【０１４９】
ヨザル属サルのアジュバントなしでのＬＳＡ−５による免疫処置は、P.falciparum攻撃に対する保護を誘導し得ることを示した。
ミクロ粒子に吸着させたＤＧ  ５７１組換えタンパク質で免疫処置した４匹のヨザル属のうち３匹は、Ｓａｎｔａ  Ｌｕｃｉａ株由来のスポロゾイトでの攻撃後、完全に保護された（図１０−Ｃ）。対照的に、対照Ａｇで免疫処置した３匹のヨザル属（図１０−Ａ）および２匹の免疫処置をしていない動物（図１０−Ｂ）は、パテントP.falciparum寄生虫血症（第０日から第１０日に検出可能）を発症した。すべてのヨザル属には、第６０日に薬物投与を施した。
【０１５０】
ＬＳＡ−５免疫処置した群のうち、３匹のサル（Ｍ２１７、Ｍ２１９およびＶ８６）は、４０日の追跡調査期間におけるいずれの時点においても（whatsoeoverer）寄生虫血症を示さなかったが、残りの１匹（Ｍ２２１）は、一日だけ（第１３日）明白さ（patency）を示した。対照群および２匹の免疫処置した非保護ヨザル属における寄生虫血症は、７１〜５００の寄生虫／μlと中等度であった。すべてのヨザル属には、第６０日に薬物投与を施した。
【０１５１】
結果はなお予備的であるが、それにもかかわらず、これらは、ヨザル属サルにおいてP.falciparum  スポロゾイト攻撃（この場合、異種株の攻撃による）に対する保護を誘導できるマラリア前赤内期サブユニットワクチン候補物質の第２の報告を表す。
この結果は、免疫処置サルにおけるＬＳＡ−５の保護的効果を示唆している。
【０１５２】
他の前赤内期Ａｇｓ（例えば、ＣＳまたはＳｐｆ  ６６など）を有するヨザル属において行った過去の試行では、これまで、ＬＳＡ３（Perlaza, Zapataら 2003）を除き、P.falciparumスポロゾイトでの攻撃後に保護を誘導することができなかった。
【０１５３】
重要なことは、他のマラリアワクチン候補物質で報告されている高い多型性を考慮し、Ｔ９−９６クローンに由来するＬＳＡ−５タンパク質により提供される保護を、Santa Lucia株による攻撃に拡張された。これは、前記の報告された寄生虫単離物間における高い割合でのＬＳＡ−５配列保存と一致する。
【実施例７】
【０１５４】
ＬＳＡ−５により誘導される保護は、ＩＦＮ−γ応答の増大と関連する
ＩＦＮ−γは、ここでは、２つの理由：第１は、これがマラリア肝臓期に対する保護の主要なメディエーターとして確立されているため、そして第２は、これが、増殖性アッセイ（これは、特に、ヨザル属リンパ球の場合、困難である（Perlaza, Zapataら 2003）より信頼性のあるＴ細胞活性化の指標であることを考慮した。
【０１５５】
上清み中のＩＦＮ−γ：すべてのＬＳＡ−５免疫処置サル由来の細胞によるＩＦＮ−γ産生を、組換えタンパク質ＤＧ−５７１により特異的に誘導した（図１１）。レベルは、ＬＳＡ−３免疫処置動物（Perlaza, Zapataら 2003）において特異的に産生されるものと同等であった。重要な点としては、ＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ分泌もまた、P.falciparumスポロゾイト抽出物に応答して誘導され、これは、ＬＳＡ−５内の天然のエピトープが、ワクチン刺激細胞によって良好にプロセッシングおよび認識されたことを示す。ＩＦＮ−γ産生の特異性は、パラレルで試験した３匹の対照サルから得られた陰性結果によって、および免疫処置前に得た細胞により示された（図示せず）。
【０１５６】
ＥＬＩＳＰＯＴ：３匹の免疫処置したヨザル属の細胞のみを、この手法により研究（定量上の理由から）。ＩＦＮ−γ産生細胞の頻度は、６２〜１９０／１×１０6  ＰＢＭＣの範囲であり、組換えタンパク質に対応した（図１２）。非保護ヨザル属Ｍ２２１のみがＬＳＡ−５に対して最低の応答を示したこと、およびより重要なことには、同じアッセイで使用したＬＳＡ−５由来合成ペプチドに対して全く応答しなかったことは、注目に値する。対照的に、研究したその他の２匹の動物は、該ペプチドに対して有意な応答を有した。最後に、ＬＳＡ−５特異的ＩＦＮ−γ産生細胞は、３匹のＧＳＴ−免疫処置対照ヨザル属のいずれにおいても検出され得なかった。
【０１５７】
ＬＳＡ−５で免疫処置したすべての３匹の保護ヨザル属は、ＬＳＡ−５に対する特異的Ｔ細胞応答を高める（mount）ことができた。非保護動物では、上清み中に有意なシグナルが存在したが、Ｅｌｉｓｐｏｔではなかった。しかしながら、この動物は、寄生虫血症を１日だけ示したこと、すなわち、一部保護され得たこと、および第２に、ＩＦＮ−γ力価は、攻撃の２ヶ月前に測定したことに注目されたい。
【０１５８】
逆に、特異的Ａｂは、ほとんど検出され得なかった。Ｅｌｉｓａでは、これらは、１匹（Ｍ２１７、表４参照）を除き、すべての動物において非存在であり、そして、ＩＦＡＴでは、これらは、有意なレベル（陽性度（positivity）の閾値１／１００）で存在したが、力価は低から中程度であった（１／２００〜１／８００、表４）。この免疫応答プロフィール（高いＩＦＮ−γ応答および少ない抗体で構成される）は、保護に関連するプロフィールに典型的である。これは、送達されたＬＳＡ３を用い、同様にして、マウスおよびヨザル属の両方において過去に観察され（Perlaza, Zapataら 2003）、そして、遺伝子による免疫処置後にも、マウス（Sauzet, Perlazaら 2001）およびチンパンジーの両方において観察され、そして、また、アジュバントなしでのリポペプチドの場合に得られたもの（この場合、強いＴ細胞応答が支配的であった（BenMohamed, Gras-Masseら 1997; Perlaza, Arevalo-Herreraら 1998））と非常に近い。
【０１５９】
【表４】
2008504005.tif 000006
表４：抗体応答
ａ：ＥＬＩＳＡ力価は、３回目の免疫処置の１４０日に採取した試料測定した。力価は、４５０nmでの光学密度を１０匹の対照ヨザル属血清の平均＋２ＳＤとした試験血清の希釈率に相当する。
ｂ：ＩＦＡ、間接免疫蛍光アッセイ。データは、エンドポイント希釈率の逆数で表示する。
ｃ：３回目の免疫処置後、第４０日の血清に対するＩＦＡ力価。
ｄ：希釈率１：１００の陰性
【実施例８】
【０１６０】
ＬＳＡ−３およびＬＳＡ−５による同時免疫処置は、両分子が、一緒に提示されたときに免疫原性となることを示す。
【０１６１】
ＬＳＡ−５は、スポロゾイト攻撃に対する保護を誘導できる非常に稀な抗原の１つであるため、ＬＳＡ３＋ＬＳＡ−５の併用免疫処置を行い、そして、同じバッチのマウスにおける単独免疫処置と比較した。各組換えタンパク質で個々に免疫処置したマウスでは、最高用量で強い特異的抗体応答が誘導された。１μgという低用量では、両タンパク質は、なお高度に免疫原性であった（図１３）。しかしながら、抗ＬＳＡ−３  Ａｂ力価は、高用量と比べて有意な相違は認められなかったが、抗ＬＳＡ−５力価は、３分の２倍、低かった。両抗原を合わせた場合、すなわち、同じシリンジにて一緒に注射した場合、各々の免疫原性は低用量であっても温存され、そして、これらのマウスでの各タンパク質に対する抗体力価は用量に非依存性であった。特に興味深い点は、低用量のＬＳＡ−３＋ＬＳＡ−５で免疫処置したマウスは、ＬＳＡ−５単独で免疫処置したマウスよりも、３桁多い抗ＬＳＡ−５抗体を示した（力価は、高用量で免疫処置したレベルと同様のレベルになった）ことである。この結果は、両抗原を関連させることは、免疫学的レベルで（少なくともＡｂ応答の点で）有益なことを示す傾向にある。というのは、抗ＬＳＡ−５Ａｂ応答は、とりわけ、共有結合していない場合でも、抗ＬＳＡ−３特異的応答の補助がある程度有益であり得るためである。
【０１６２】
本発明者らは、過去に、抗原を組み合わせると、各々の免疫原性が高頻度に低減されることを観察した。例えば、ＬＳＡ１の免疫原性は、スポロゾイト周囲タンパク質と関連させた場合、顕著に低減した（Londono, Gras-Masseら 1990）。同じことが、ＲＴＳ’ＳをＴＲＡＰと関連させた場合に起こり、そして、ＲＴＳＳ単独で見られた保護は消失した。チンパンジーでは、ＬＳＡ３と、Ｓｔａｒｐ、ＳａｌｓａまたはＬＳＡ１のいずれかとの関連させることにより、ＬＳＡ３に対するＩＦＮ力価の顕著な減少およびＬＳＡ３単独により誘導された保護の消失の両方が導かれた（未公表物質）。したがって、ＬＳＡ３とＬＳＡ−５間のマイナスの障害の非存在、および更には記録された免疫原性の増大は、非常に肯定的であり、むしろ例外的な所見である。
【０１６３】
考察
ＬＳＡ−５の期特異性は、ヒト抗体、マウス抗体およびヨザル属抗体のスポロゾイト表面および肝臓期に対する反応性により（ＩＦＡＴおよびＥＭの両方によって）、また、インビトロおよびインビボの両方での侵入阻害により示された。ＬＳＡ−５の同定を、P.falciparumスポロゾイト表面上のＡｂによって標的化され得る分子の範囲に拡張する。更に、スポロゾイトおよび肝臓期の両方において発現されるＬＳＡ−５は、液性防御機構および細胞性防御機構の両方により標的化され得る。
【０１６４】
他の前赤内期ワクチン候補物質（例えば、ＣＳＰおよびＴＲＡＰなど）とは対照的に、ＬＳＡ−５は、ドミナントエピトープ（dominant epitopes）が、患者の生殖母細胞に由来するスポロゾイト期の３２例の単離株において検出され得たため、非常に良好に保存されている。これは、抗原多型性がワクチン開発にとって主な制限となっていることが繰り返し強調されていることから、明らかに重要な特徴である（Facer および Tanner 1997）。攻撃をヨザル属の異種性寄生虫Ｓａｎｔａ  Ｌｕｃｉａ株を用いて行ったこと、一方、ワクチン製剤がＴ９−９６クローンから得られた遺伝子配列に基づいたものであったこと強調しておくことは重要である。これは、多型性が存在し、保護が限定的であることが既知であり、したがって、攻撃は、同種の株に依存しなければならない（Kwiatkowski および Marsh 1997）他のマラリアワクチン候補物質とは非常に対照的である。
【０１６５】
該分子の抗原性は、非常に満足のいくものであることがわかった。特異的抗体は、３つの流行地域で高い有病率で検出された。有病率は、他の前赤内期の候補物質（例えば、ＬＳＡ１、ＳＡＬＳＡ、ＳＴＡＲＰおよびＣＳなど）（Fidock, Bottiusら 1994; Fidock, Gras-Masseら 1994; Bottius, BenMohamedら 1996）（ならびに多くの無性血中期の抗原の場合）と、同程度に高いか、またはこれらよりも高く、これは、調査したマラリア伝染が最も低い地域の場合、特に明白であった。ポドルでの１人あたり平均１〜５箇所の感染性の蚊刺傷および各刺傷による平均１０個のスポロゾイト送達で、０〜５歳および５〜１０歳の年齢群の応答性小児（したがって、合計で、平均５０〜２５０および１００〜５００匹の寄生虫を有する）の割合は、驚くほど高い。調べた３つの異なる地域のデータおよび応答の年齢パターンの比較は、免疫応答が、感染性の蚊刺傷への曝露の関数であることを示す。
【０１６６】
保護を支持する示唆は、インビトロ試験により、P.yoeliiおよびP.falciparumの両方で、抗体のインビボ受動輸送により、P.yoeliiスポロゾイトで免疫処置したマウスの攻撃により、およびP.falciparumで免疫処置したヨザル属霊長類の攻撃により得られた。
【０１６７】
インビトロ阻害に関し、そのＡｇ−特異性を、過剰Ａｇ存在下でのＡｂ効果の復活により確認した。信頼性のある結果をもたらすことができる唯一の宿主細胞であるヒト肝細胞の使用に加え（Mellouk, Berbiguierら 1990）、復活のこの手順は、血液または肝臓形態のいずれかのために行った他の侵入阻害アッセイにおいて、他の研究グループによっては使用されていなかった。しかしながら、これは、その抗原特異性を示すための最も信頼性のある手段である。
【０１６８】
P.yoeliiインビボモデルに関し、このモデルの厳格性の高さを主張することは、以下の理由により重要である：ｉ）マウスは、１００個程度の少ないスポロゾイト注射により血液感染が誘導され得るため、スポロゾイト感染に高度に感受性である。ii）免疫処置に使用される組換えタンパク質は、ヒトマラリアP.falciparum寄生虫に由来するが、攻撃に使用される寄生虫は、齧歯類P.yoelii種である。したがって、観察された保護は、これら２つの種の間で共有される限定的な数のエピトープに依存する。高用量での攻撃後に測定された保護の割合は、寄生虫血症の発症の遅滞に基づいて推定される低下と十分に一致する。更に、インサイチュー調査により、リンパ球動員は、保護を担う主要な防御機構であることが強調された。最近、肝臓におけるエピトープ特異的細胞動員を解析するためにデザインされ、そしてペプチドコートポリスチレンビーズを組換え免疫処置したマウスの門脈内（intra-portally）に注射する手法が報告された。この手法は、ＬＳＡ３由来ペプチドを用いて確認され（Hebert, Sauzetら 2003）、保護を誘導し得るか、または誘導し得ない（明確に異なるアジュバントを用いる）いずれかの免疫処置プロトコルにより誘導された細胞動員を比較するために更に使用された。これはまた、ＬＳＡ−５コンセンサスペプチドでコートされた肝内粒子を投与したＬＳＡ−５．７１免疫処置マウスにおいて用いられた。これは、試験ビーズ周囲で強いペプチド特異的細胞動員を誘導し、対照ビーズの周囲では誘導しなかった（図示せず）。これは、報告された攻撃寄生虫周囲で見られたものと本質的に類似し（図９−Ｄ）、そして、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ細胞およびマクロファージで大半が構成された。抗体は、明白な役割を果たすことがわかったが、これらのインサイチュー調査は、細胞性機構、特に、高レベルのＩＦＮ−γを分泌でき、そして肝内シゾントに対して移動できるＴ細胞が、最も重要な役割を果たすことを強く示唆する。
【０１６９】
ヨザル属サルで得られた結果は、ＬＳＡ−５が、P.falciparumスポロゾイト攻撃に対する保護を成し得る非常に稀な候補物質の１つであることを示唆している。実際、マウスにおいて、齧歯類マラリア攻撃、ＣＳ、ＴＲＡＰ  およびこれら２つの組合せ（最も研究されている）に対する免疫を誘導したいくつかの分子が存在する（Schneider, Gilbertら 1998）。逆に、霊長類またはヒトにおいて、P.falciparum攻撃に対する保護的効果を示した分子はほとんどない。これは、これまで、同種および異種の両方の株の攻撃に対するＬＳＡ−３およびＬＳＡ−５によってのみ達成され、および、より限定的な程度で短時間だが、ＲＴＳＳ（ＣＳの微粒子製剤）によって達成された（Stoute, Slaouiら 1997）。これらの結果は、ヒト高等霊長類において、他の特徴付けされた分子（同程度の保護を達成することが証明されなかった分子、すなわち、ＬＳＡ−１、ＴＲＡＰ、ＳＡＬＳＡ、ＳＴＡＲＰ、ＰｆＥＸＰ１、ＳｐＦ６６）の場合で過去に得られたものと対照的である。
【０１７０】
保護が、非常に低用量の抗原を用いて、任意の強力なまたは毒性のアジュバントの使用を必要としない送達系により得ることができたことは、注目すべきである。この結果は、この形態の免疫処置はマウスにおける過去の試験での保護と関連するＴ細胞応答を優先的に誘導することがわかっており、そして低免疫処置用量の抗原は、高用量よりもより効果的であることがわかっていたため（Sauzetらの調製物）、予期された。登録可能な霊長類（稀少かつ貴重で高価な動物）の数のため、統計的有意性を達成することが許容され得ないが、ヨザル属におけるＳａｎｔａ  Ｌｕｃｉａ株のスポロゾイトによる攻撃の再現性は、過去に１１を超える感染において確立され（Zapata, Perlazaら 2002）、そして、ここで用いた５匹の対照および過去の試験で用いた４匹（Perlaza, Zapataら 2003）で得られた結果により確認される。本発明でマウスおよび霊長類において成功裏に用いられたこの形態の免疫処置は、マウスおよびヨザル属においてＬＳＡ−３の場合で過去に成功裏であることがわかったものと同じであることは、注目に値し、そして両方の種において同様のタイプの応答および保護をもたらした（Perlaza, Zapataら 2003）。
【０１７１】
ＩＦＮ−γは、ＬＳ発達に対して活性な最も強力なサイトカインである（Ferreira, Schofieldら 1986; Mellouk, Maheshwariら 1987; Schofield, Ferreiraら 1987）。結果は、ＰＢＭＣによる特異的ＩＦＮ−γ分泌が、前赤内期のP.falciparumに対する防御の重要な成分であること確認する傾向にある（少なくとも本発明の試験のＥｌｉｓｐｏｔにより）。スポロゾイト天然のタンパク質に応答して得られた特異的ＩＦＮ−γ分泌は、Ｔ細胞への提示、すなわち、免疫原適正なコンホメーションのための、天然の、そして「人工」のエピトープの両方の適正なプロセッシングを示唆する。これらの結果は、別のワクチン候補物質ＬＳＡ−３の場合で、チンパンジーおよびヨザル属の両方において得られた過去のデータと一致する。実際、マウスおよび霊長類の両方において、ＬＳＡ−５誘導性保護と関連する高いＩＦＮ−γおよび低い抗体応答は、ＬＳＡ−３試験で過去に記録されたもの（BenMohamed, Gras-Masseら 1997; Benmohamed, Thomasら 2000; Daubersies, Thomasら 2000）と本質的に類似した代用である。これらはまた、放射線照射したスポロゾイトにより免疫処置したマウスおよびチンパンジーにおいて記録されたもの（Druilheら、1998, ら JI、および未公表物質）と類似する。したがって、３つの状況において保護に利用可能なマーカーには収束性（convergence）があり、これは、保護が３つの状況において同じ効果または機構に媒介され得るという間接的表示とみなされ得る。
【０１７２】
ヒトマラリアスポロゾイトによる攻撃の利用可能な形態の制限内で、ＬＳＡ−３およびＬＳＡ−５は、今日、２つの非常に有望な候補物質と思われ、これらは、非常に抗原性の免疫源であり、非毒性であり、そして有効性が示されているが、免疫処置した動物すべてにおけるものではない。併用ワクチンの開発は、臨床前レベルで有効性が証明される可能性がある候補物質（これは、ＬＳＡ−３およびＬＳＡ−５の両方についていえる）を組み合わせることを示唆する。更に、ここでは、ＬＳＡ−３およびＬＳＡ−５による併用免疫処置が、ＬＳＡ−５応答の改善をもたらすことが示された。したがって、２つの異なる抗原標的に対する発症を組み合わせることにより、改善された保護が達成され得るか否かを調査することは価値があると考えられる。
【実施例９】
【０１７３】
ペプチドまたはポリペプチドが抗ＬＳＡ−５特異的抗体によって認識されるか否かを試験するための試験プロトコル
典型的な試験プロトコルはＥＬＩＳＡアッセイ（例えば、前記の材料および方法に記載したものなど）であり、この場合、試験ペプチドを、このＥＬＩＳＡ方法に記載されたＬＳＡ−５７１  コンセンサスペプチドの代わりに使用し、そしてコンセンサスペプチドまたは表１に示す任意の他の配列に指向される抗体を、試験ペプチドとのその反応性を試験するために使用する（コンセンサスペプチドに対するヒト親和性精製抗体またはコンセンサスペプチドで免疫処置した動物由来の血清のいずれかを、適切なアジュバント（例えば、モンタニドＩＳＡ７２０またはフロイント完全アジュバントなど）とともに用いる）。
【０１７４】
ペプチドまたはポリペプチドがＬＳＡ−５特異的抗体によって認識されるか否かを評価する別の方法は、前記図１３の開示に関して記載した手順を使用することであり、そしてこのとき、コンセンサスペプチドでのコートを伴い、そして試験ペプチドを、抗体のコンセンサスペプチドに対する結合が阻害され得るか否かを調べるため、様々な濃度（試験抗体１mlに対して１０μg〜１mgの範囲）で混合する競合アッセイにおいて使用する。
【０１７５】
イムノブロッティング試験においてペプチドをニトロセルロース表面に結合させる場合、または、最終的に、試験ペプチドを前記ＥＬＩＳＡで記載したものと同様のＩＦＡＴ阻害アッセイにおいて使用する場合、同じタイプの手順を使用し得、このとき、試験ペプチドを抗コンセンサス配列抗体と混合し、そしてＩＦＡＴアッセイにおいて寄生虫に対する結合を阻害するために使用する。
【実施例１０】
【０１７６】
前赤内期に対する保護に関する更なるデータ
Ｉ．１−放射線照射したスポロゾイトで免疫処置したヒトボランティアの血清によるＬＳＡ−３およびＬＳＡ−５の認識
これらの試験は、２つの目的：ａ）前赤内期、すなわち、スポロゾイトおよび肝臓期におけるこれらの２つの分子の発現を、前赤内期のPlasmodium falciparumを保有しない個体における免疫応答を示すことにより、間接的に確認すること、およびｂ）他の分子と比較した分子の免疫原性を評価することを達成するために行った。実際、前赤内期の分子に属する１２０個の遺伝子断片間（約３９個の遺伝子に相当）では、極めて少数しか、放射線照射したスポロゾイトで免疫処置した個体により発現された免疫応答により認識されなかった（これらの個体は保護されるという事実にもかかわらず）。これは、１２０個の遺伝子断片の中からP.falciparumの放射線照射したスポロゾイトで免疫処置した個体由来の血清の場合で最も強い最も顕著な陽性度を示したＬＳＡ−３を最初に同定するために実際に使用された手段である。例えば、曝露の天然条件下で免疫原性が強い他の分子（例えば、ＬＳＡ−１、ＳＡＬＳＡ、ＳＴＡＲＰ、ＰｆＥＸＰ１、ＴＲＡＰなど）は、放射線照射したスポロゾイト保護されたボランティア由来の血清によって認識されない。これは、またＴ細胞レベルでの放射線照射したスポロゾイトで免疫処置し、そしてこれに保護された４例の個体由来の細胞を用いて行ったＥｌｉｓｐｏｔアッセイにも該当する。
【０１７７】
ＥＬＩＳＡアッセイは、８例の未処置ボランティア血清（これは、陽性度の閾値を規定するために使用した）を用いて行った。これは、８例の陰性対照の平均ＯＤ値＋３標準偏差に相当した。試験血清には、それぞれ、２６年および２１年間、連続的な毎日のクロロキンによる予防条件下で生活した２例の聖職者（Pere Mauvais および Soeur Neveu）由来の血清（彼らは、スポロゾイト表面抗原および肝臓期の抗原に対して非常に強い応答を示したが、血中期分子は、あったとしてもごくわずかであった）、およびNaval Medical Research Instituteにより伝達された（communicate）、一年にわたって数百の放射線照射した蚊による１２〜１４回の免疫処置および半分の免疫処置を受けそして攻撃時に保護されたボランティア由来の４例の血清（血清ＶＩ−４）を含めた。血清は、免疫処置後で攻撃前に回収した。
【０１７８】
随意単位または対照の平均＋３ＳＤと比べた試験血清のＯＤ値の比で表示した主な結果を以下の表にまとめる。
【０１７９】
これらは（表１）は２つの分子、ＬＳＡ−３およびＬＳＡ−５との特異的抗体反応性を示し、これは、スポロゾイトおよび／または肝臓形態との接触がこれらの２つ分子に特異的な抗体を誘導したこと、そして、更に、前記のように、これらの分子は、かかる免疫処置条件下で免疫原性であることを示し、これまでに開発された他の前赤内期の大半のワクチン候補物質（Circum Sporozoite Proteinを含む）と明確に異なる
【０１８０】
２−抗ＬＳＡ−５応答と野外条件下での感染性蚊刺傷に対する保護との関連性
この試験では、本発明者らは、ディエルモ、セネガルでの設定を用い、この場合、臨床でのマラリアの発症の極めて正確な記録が各居住区への毎日の医師の訪問、医療チームとの終日を通しての連続的接触、寄生虫密度の正確な計測および年齢依存的な発熱発生率の閾値を測定することで得られ、マラリア発症に、任意の発熱エピソード、頭痛またはマラリアに明確に関連する他の症状を正確に割り当てた。
【０１８１】
抗ＬＳＡ−５総ＩｇＧ抗体応答を、ＥＬＩＳＡアッセイにより、コンセンサスＬＳＡ−５ペプチドをコート抗原（１０ミクロＧ／mlの濃度で使用）としてを用いて測定した。
【０１８２】
抗体データを、完全治療および感染した蚊刺傷への天然曝露後の血液リポジティベーション（repositivation）の遅滞を統計学的解析により解析した。ディエルモ村のあらゆる年齢群の９５例の個体に２５mg／kg／日の割合で８日間、キニーネによる完全治療を施し、そして、毎日血液スメアを用い、連続的な天然スポロゾイト攻撃下で血中期における寄生虫の再出現の遅滞を追跡調査した。このパラメータを、以下「リポジティベーションの遅滞」と呼ぶ。
【０１８３】
重要な混乱（confounding）因子、例えば、年齢または鎌形赤血球形質、グルコース−６−ホスフェート欠損によりもたらされる保護などを考慮するため、本発明者らは、多変量段階的回帰分析モデルを用いた。この場合、いくつかの変量の影響は、ソフトウェアを用いて同時に試験した。ヌル仮説の試験は、Ｆで示される分散比に基づき、そしてヌル仮説からの逸脱は、Ｆ＞１の値を与える傾向がみられた。
【０１８４】
抗ＬＳＡ−５抗体を、多変量段階的回帰分析においていくつかの変量、すなわち、リポジティベーションの遅滞、年齢、ヘモグロビンタイプ（ＡＡまたはＡＳ）Ｇ６ＰＤ欠損、脾臓割合、抗血中期のＩｇＧ応答とともに解析した場合、唯一の有意な関連は以下のとおりである。
リポジティベーションの遅滞は年齢とともに増加（Ｆ比＝４．２２；Ｐ＝０．０４２）、脾臓割合とともに減少（Ｆ比＝４．７９；Ｐ＝０．０３１）、抗ＬＳＡ−５応答とともに増加
（Ｆ比＝４．１６；０．０４４）。
【０１８５】
換言すると、抗ＬＳＡ−５抗体は、スポロゾイトの肝臓形態への変換および血液形態の出現に対して、年齢の場合と同程度に強い効果を有した。
【実施例１１】
【０１８６】
血中期に対する保護を支持する証拠
１：次いで、本発明者らは、抗ＬＳＡ−５抗体データを、マラリアの発症とともに解析した。マラリアの発症は、寄生虫の赤血球内侵入期、（血液のサンプリング後の１年間に観察された）、年齢、ヘモグロビン（ＡＡまたはＡＳ）、Ｇ６ＰＤ欠損、脾臓指数、血中期の抽出物に対する抗体応答による。９５例の個体において同じ抗体データを使用し、抗ＬＳＡ−５抗体と抗ＬＳＡ−５抗体を測定するために採取した血液試料後の１年間での臨床マラリア発症からの保護との関連性を多変量段階的回帰分析により解析した。
【０１８７】
年齢の関数として減少する（Ｆ比＝２０．７２；Ｐ＜０．０００１）マラリア発症は、ＡＳ  ヘモグロビンを有する被験者においてあまり優勢でなく（Ｆ比＝８．８５；Ｐ＝０．００３７）、そしてマラリア発症は、抗ＬＳＡ−５ＩｇＧ応答の関数として減少した（Ｆ比＝１３．６８：Ｐ＝０．０００４）ことがわかった。
【０１８８】
このため、抗ＬＳＡ−５抗体の保護的効果は、鎌形赤血球形質に付与される場合よりも強く、マラリア発症に対する抵抗の主要な遺伝因子の１つとして充分確立される。
【０１８９】
２：前記のことを更に解析し、そして免疫応答を全血中期抽出物を越えて他のマラリア抗原に含めるため、更なる解析を、１５５例の個体において行った。該個体では、体内で抗ＬＳＡ−５抗体、１年間のマラリアの発症、年齢、ヘモグロビンタイプ、Ｇ６ＰＤ欠損、抗ＡＭＡ−１  ＩｇＧ応答、抗ＭＳＰ−１  ＩｇＧ応答を得ることができた。
【０１９０】
この解析でもまた、予期したとおり、マラリア発症が年齢の関数として減少すること（Ｆ比＝２３．４３；Ｐ＜０．００１）、抗ＭＳＰ−１  ＩｇＧ力価の関数としてのマラリアの発症が増加傾向にあること（Ｆ比＝２．８５；Ｐ＝０．００９３）、およびマラリア発症が抗ＬＳＡ−５  ＩｇＧ応答の関数として減少すること（Ｆ比＝１８．９８；Ｐ＜０．０００１）が示された。
【０１９１】
換言すると、この解析は、抗血中期の抽出物抗体、抗ＡＭＡ−１抗体の保護的効果除外し、ボーダーラインの有意性により抗ＭＳＰ−１  抗体の増加に伴うマラリアのリスクの増加を示し（すなわち、陰性効果）、および抗ＬＳＡ−５が保護的効果を有することを示した。これは、年齢の場合と同程度の極めて強い効果を示し、これは、他の場所のようにディエルモでマラリア発症に対する保護に対する感受性の状態間での変換の主要な変数であることは、周知である。
【０１９２】
３  インビトロ試験：寄生虫致死、抗体−単球協働性効果によるエビデンス
上記の免疫学的疫学的試験の観点から、抗ＬＳＡ−５抗体は、マラリアの発症回数を大きく低下させるという証拠があった。本発明者らは、したがって、抗ＬＳＡ−５抗体の直接および間接効果を調べた。過去にタイで行った受動輸送で用いたヒト抗体を、組換えＤＧ５７１に対するアフィニティ精製抗体を調製するために使用した。
【０１９３】
対応する抗体は、無性血中期の寄生虫増殖に対して直接的な効果を示さない、例えば、赤血球内へのメロゾイト侵入を阻害しないことがわかった。逆に、正常血液単球の存在下では、抗ＬＳＡ−５抗体が正常血液単球と協働してPlasmodium falciparumのインビトロ成長を低下させる寄生虫致死因子を生成し得ることが観察された。試験は、３回、対照、すなわち、陰性対照ＩｇＧ、陽性対照アフリカ人ＩｇＧ（これは、タイの小児に保護を伝播し得る）とともに行い、そして、同様の結果が各試験において観察された。アフィニティ精製抗体（１：２００に滴定、これは、１０倍または２０倍に希釈して用いた（すなわち、１：２０または１：１０の最終力価、これは極めて低い抗体濃度））を用い、強い寄生虫致死効果７８％（１：２０力価で）または４５％（１：１０力価で）のいずれかが再現可能に得られた。
【０１９４】
この結果は、抗ＬＳＡ−５抗体が、抗ＭＳＰ−３抗体について記載したもの同様のタイプの寄生虫致死効果を有することを示す。
【０１９５】
４：ディエルモ、セネガルで行った更なる試験は、ＩｇＧ３−抗ＬＳＡ−５の役割を示す。
上記の免疫学的疫学的およびインビトロデータを考慮し、本発明者らは、保護における様々なサブクラスの役割を調べた。実際、細胞親和性サブクラスの抗体、ｇＧ１およびＩｇＧ３のみが、ＡＤＣＩ機構において機能し得る。詳細な試験は、ディエルモの個体１３８例でのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４抗ＬＳＡ−５抗体の量の測定をもたらした。
【０１９６】
抗ＬＳＡ−５のＩｇＧ３サブクラスのみが、マラリアの発症に反比例することがわかった（標準係数＝−０．３８０；ｐ＝０．０００３）。
【０１９７】
段階的回帰モデルの解析では、マラリアの発症回数とＩｇＧ３抗ＬＳＡ−５抗体の増加との関連が確認され、Ｆ比＝１４．６およびａ  ｐ  値＝０．０００２であった。
【０１９８】
最後に、Nominal Logistic解析を用い、これを再度確認した（ＬＲｃｈｉ２  １０．４５；ｐ＝０．００１）。
【０１９９】
５：ディオップ（Ｎｄｉｏｐ）（セネガル）で行った追加試験
同じ試験を、ディオップ近隣の、伝染が少ない村で、９０例の個体（６月齢〜９２歳）において行った。
【０２００】
この場合も、この集団で、マラリア発症に対する保護とＩｇＧ３  抗ＬＳＡ−５抗体レベルとの間に極めて強い関連が観察された（Ｆ比＝２７．５３；ｐ＞０．０００１）が、これは、抗ＬＳＡ−５応答では見られなかった。
【０２０１】
６：コレ（Kolle）、マリで行った更なる試験
この試験では、マラリア寄生虫の薬物耐性の試験を行うことを主な目的とし、クロロキンに耐性である寄生虫を保有する個体のコホートの半数が、明白な寄生虫血症にもかかわらず、マラリアから回復し得たことが観察された。試験した５０例の個体のうち３１例は、寄生虫学的観察および臨床的観察の両方にしたがって保護された。寄生虫血症を消失し得た患者は、これを消失し得なかった患者よりもＬＳＡ−５に対して有意に高い抗体力価を有し、そして同じことがＭＳＰ−３にもあてはまった。両方の場合で、最も強い関連が、ＩｇＧ３抗ＬＳＡ−５およびＩｇＧ３抗ＭＳＰ−３についてわかった。寄生虫密度の減少と関連する抗体応答の更なる試験は、ＩｇＧ３抗ＬＳＡ−５抗体力価と低い寄生虫密度に対する強い関連を示した：Ｆ比＝７．０６；ｐ＝０．０１）。
【０２０２】
７：ＩｇＧ３抗ＬＳＡ−５抗体を保有する脳マラリア患者の生存率の改善
２１７例における東南アジアマラリア患者の（このうち、１０８例は脳マラリアの発症を、１０９例は、急性合併症のないマラリアの発症を呈した）間で、寄生虫全抽出物、ＭＳＰ−３、またはＬＳＡ−５に対する抗体力価の差はなかった。これらの結果は、過去に４つの他の脳マラリアコホートで得られた結果と一致する。
【０２０３】
１０８例の脳マラリア患者の亜群はすべて、最も有効な薬物の併用、すなわち、アーテスネートとメフロキンを投与した。入院時での抗体力価の解析は、これらの患者に予め存在する抗マラリア抗体力価に応じて、薬物投与した脳マラリアの治療成績に関して有意差を示した。有意な改善がみられた、すなわち、生存率の増加が、高いＩｇＧ３抗ＭＳＰ−３抗体または高いＩｇＧ３抗ＬＳＡ−５抗体を有する個体において見られた（下記参照）。対照的に、他のマラリアワクチン候補物質（例えば、抗ＳＥＲＰ−Ｐ１２６または抗ＡＭＡ−１など）に対する対照抗体は、薬物投与した脳マラリアの治療成績と関連しなかった（これらのマラリアワクチン候補物質に対する抗体力価と関連する改善は見られなかった）。
【０２０４】
したがって、総合すると、研究は、予め存在する抗ＬＳＡ−５抗体および抗ＭＳＰ−３抗体では、生存率が改善し、これは、脳マラリアの新規な治療のための道を開くことを強く示唆する、すなわち、薬物投与した脳マラリア患者の生存率を改善するための抗マラリア薬物とＬＳＡ−５および／またはＭＳＰ−３に対する抗体との関連を強く示唆する。
【０２０５】
結論として、ＬＳＡ−５は、最も有望なワクチン候補物質の１つと考えられ、２つの主要な標的（一方は前赤内期の、他方は血中期の）を有する。
【０２０６】
１．ＬＳＡ−５は、マウス、ヨザル属サル、およびヒトにおいて、スポロゾイト攻撃に対する保護を誘導することができ、そして肝細胞内へのスポロゾイト侵入をブロックする抗体を誘導することができる。
【０２０７】
２．ＬＳＡ−５は、単球依存性寄生虫致死を、インビトロ条件およびインビボ条件下で、マラリアに晒されたヒトにおいて、多くの異なる設定において、急性合併症のないマラリアおよび合併症のあるマラリアに対して保護する形態で媒介することができる。
【０２０８】
臨床マラリアが極めて正確に記録された最も詳細な設定の１つにおいて、抗ＬＳＡ−５応答は、臨床マラリアに対する後天的耐性の主要な、高度に  有意な要因の１つのようである。用いた統計学的解析のタイプは、考えられる混乱性因子（このうち、年齢およびヘモグロビンタイプが主要である）を制御し、そして、他の抗体応答（これは、保護と関連しないことがわかっている）と比較した場合、マラリアに対する後天的保護に関するＬＳＡ−５に指向される所与の抗体の特異性の影響を明白に示す。
【０２０９】
【表５】
2008504005.tif 000007
【０２１０】
【表６】
2008504005.tif 000008
【０２１１】
【表７】
2008504005.tif 000009
【０２１２】
−多変量解析で得られた表示
年齢を調整した場合、脳マラリアのリスク（急性合併症のないマラリアの場合との比較）は、ｒｌｇＧ３−ＬＳＡ−５応答が高い場合、低下が見られた：
Ｌ−Ｒ  カイ二乗＝７，６５；ｐ＝．００５７。
【０２１３】
治療成績（死亡対生存）を、次いで、脳マラリア患者の亜群において、年齢および抗体応答の両方に関して試験した。
【０２１４】
治療成績は有意に改善された（生存者の存在の増加が見られた）、このとき、ｒＩｇＧ３−ＭＳＰ３−ＣｒｔｅｒｍまたはｒＩｇＧ３−ＭＳＰ３ｂまたはｒＩｇＧ３−ＬＳＡ−５が上昇した。
【０２１５】
高いＩｇＧ３特異的応答の相対的な「利益」（＝死亡者の存在の減少）（抗体応答は、個々に試験した）以下のとおりである
ＩｇＧ３−ＭＳＰ３−Ｃｒｔｅｒｍでは  Ｌ−Ｒ  カイ二乗＝７．４１；ｐ＝．００６５
ＩｇＧ３−ＭＳＰ３ｂでは  Ｌ−Ｒ  カイ二乗＝１０．７０；ｐ＝．００１１
ＩｇＧ３−ＬＳＡ−５では  Ｌ−Ｒ  カイ二乗＝６．０４７；ｐ＝  ０．０１３９
【０２１６】
【表８】
2008504005.tif 000010
【０２１７】
【表９】
2008504005.tif 000011
2008504005.tif 000012
2008504005.tif 000013
2008504005.tif 000014
2008504005.tif 000015
【図面の簡単な説明】
【０２１８】
【図１】ＤＧ５７１のペプチド配列（配列番号：１６）および誘導されるペプチド。
【図２】前赤内期のP.falciparumおよびP.yoeliiの間接免疫蛍光。（Ａ）非固定ＮＦ５４スポロゾイトの、および（Ｂ）P.falciparumの肝臓シゾントにおけるヒト親和性精製単一特異的抗ＬＳＡ−５．７１によるの免疫蛍光。（Ｃ、Ｄ）同じ抗体で標識した１７  ＸＮＬスポロゾイトおよびP.yoelii由来肝臓シゾントにおけるＩＦＡＴ。
【図３】P.falciparumＮＦ５４スポロゾイトの免疫電子顕微鏡検査。金標識された二次抗体として用い（１５nm）、ヒト親和性精製抗体である抗ＬＳＡ−５．７１で標識した（λｇｔ１１にてβ−ガラクトシダーゼ組換え）P.falciparumスポロゾイトの免疫電子顕微鏡写真。
【図４】金標識された抗ヒト抗体（１０nm粒子）により顕在化させた、ヒト親和性精製抗体である抗ＬＳＡ−５．７１で標識した（β−ガラクトシダーゼ組換え）成熟（第６日）P.falciparum肝臓シゾントの免疫電子顕微鏡写真。ＬＳＡ−５は、出現中の若い赤血球外メロゾイド（分裂小体）を囲むフロキュラ物質（flocular material）において見られ、明白なロプトリー（杵小体）（Ｒ）および核（Ｎ）を伴う。β―ｇａｌからから精製した対照抗体は、陰性であった。
【図５】様々な流行地域における抗ＬＳＡ−５  Ａｂの有病率。
【図６】インビトロP.yoeliiおよびP.bergheiスポロゾイト侵入に対する抗ＬＳＡ−５抗体の効果。ヒト過免疫血清由来のヒト抗体を組換えＬＳＡ−５−Ｃ−ｔｅｒｍまたは組換えＬＳＡ−５−Ｎ−ｔｅｒｍに対してアフィニティ精製し、そしてP.yoeliiまたはP.bergheiスポロゾイトによるマウス肝細胞の初代培養物のインビトロ侵入に関して試験した。同様に、ＬＳＡ−３又はＳＡＬＳＡタンパク質に対して精製した抗体をP.yoeliiのそれぞれ陽性または陰性対照として試験した。P.berghei CSPに対する１つのモノクローナル抗体を、P.bergheiの陽性対照として使用した。％阻害は、抗体なしのアッセイにおける肝臓シゾントの数から推定した。
【図７】スポロゾイト攻撃時の、ＬＳＡ−５によりマウスにおいて誘導された保護のＬＳＡ３との比較。マウスは、３回、ミクロ粒子上に吸着させた組換えＬＳＡ−５またはＬＳＡ−３（ＤＧ７２９）またはＳＡＬＳＡ  ２〜５０μgで免疫処置した。これらを、１０００個のP.yoeliiスポロゾイト（１７ＸＮＬ）のＩＶ注射により攻撃した。血中期の寄生虫血症を攻撃後の第４日〜第１４日に追跡調査した。
【図８】P.yoeliiスポロゾイト１００万個で攻撃したＬＳＡ−５免疫処置したマウスにおける肝臓期負荷におけるＬＳＡ−５の低下。４２時間後、肝臓を、感染マウスから取り出し、生検組織をカルノア（Carnoy）中に固定し、そしてパラフィン内に包埋した。肝臓シゾントの数を、ヘマトキシリンで染色した肝臓切片５μgから測定した。肝臓形態を、生検材料１つあたり１００個の切片において計測した。
【図９】肝臓におけるインサイチュー（in situ）細胞イベントである。ＬＳＡ−５免疫処置したマウスを、P.yoeliiスポロゾイト１００万個の静脈内接種により攻撃した。（Ａ）対照マウスで観察された健常シゾント。（Ｂ、Ｃ）ニトロセルロース粒子上に吸着させたβ−ｇａｌ−ＬＳＡ−５．７１で免疫処置したＣ５７ＢＬ６の肝臓において単核細胞に浸潤された２個の肝臓シゾント。（Ｄ）同じ動物において残留シゾントが見られない細胞肉芽腫。
【図１０】１０6  P falciparumスポロゾイトでの攻撃後のＰｆ．ＬＳＡ−５で免疫処置したヨザル属の保護。
【図１１】ＩＦＮ−γヨザル属／サーネジアント（surnageant）。
【図１２】ＥＬＩＳＰＯＴヨザル属。
【図１３】同じ混合物中で、各々または両方のタンパク質のいずれかで免疫処置したマウスにおけるＬＳＡ３およびＬＳＡ−５の免疫原性。Ｃ３Ｈマウスを、組換え体ＬＳＡ−３ＤＧ７２９、またはＬＳＡ−５．７１、またはＬＳＡ−３−ＤＧ７２９＋ＬＳＡ−５．７１との混合物３×５０μgまたは２×１μg（アジュバントＡＳＯ２中）で免疫処置した。抗体応答を、最終免疫処置の３週間後にＥＬＩＳＡにより、組換え体の各々に対して測定した。結果を、１群あたり５匹のマウスでの抗体比の平均（＋／−ＳＤ）で示し、免疫処置していないＣ３Ｈマウスの血清と比較する。
【図１４】ＬＳＡ−５タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号：１８）。
【図１５】ミクロ粒子上のＬＳＡ−５で免疫処置したＢＡＬＢ／ｃマウス：脾臓細胞上のＥＬＩＳＰＯＴ／ＩＦＮ−ｇ。
【図１６】ミクロ粒子上のＬＳＡ−５で免疫処置したＣ３Ｈ／Ｈｅｊマウス：脾臓細胞のＥＬＩＳＰＯＴ／ＩＦＮ−ｇ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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