(57)【要約】目標とする蛍光色素以外の蛍光色素からの不要な蛍光を選択的に排除または低減することによって、生体組織のような対象物の蛍光画像を増強するための改善された方法を提供する。該方法は、目標とする蛍光色素の蛍光強度に関連する情報を保持しながら、蛍光色素の寿命の測定に基づく。【選択図】図１Ａ
2008527311.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つ以上の蛍光色素種を含む対象物の光学撮像のための方法であって、
‐前記２つ以上の蛍光色素種の少なくとも１つの検出に適合する励起および発光波長を用いて、前記対象物の目標領域（ＲＯＩ）の１つまたはそれ以上の画素の時間および振幅情報を含む蛍光信号を取得するステップと、
‐前記１つまたはそれ以上の画素について前記蛍光信号から蛍光強度および蛍光寿命を算出するステップと、
‐前記算出された蛍光寿命および少なくとも１つの予め定められた寿命の関数である重み係数を前記蛍光強度に乗算して、前記１つまたはそれ以上の画素の加重蛍光強度を生成するステップと、
‐前記１つまたはそれ以上の画素の前記加重蛍光強度に基づいて前記ＲＯＩの画像を生成するステップと、を含む方法。
【請求項２】
前記蛍光信号が２つ以上の蛍光色素種からの寄与を含み、
‐前記蛍光色素種の少なくとも１つの寄与分画を導出するステップと、
‐前記加重蛍光強度に前記寄与分画を乗算するステップと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記蛍光信号を多指数関数によりモデル化することによって前記寄与分画が決定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記モデル化が前記蛍光信号の時間点像分布関数（ＴＰＳＦ）に適用される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記重み係数が指標関数によって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記指標関数が前記予め定められた蛍光寿命の関数である境界によって定義される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記境界が前記測定寿命に関連する誤差の関数でもある、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記測定寿命が前記境界の範囲内である場合、前記重み係数が１であり、それ以外の場合は０である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記蛍光強度に前記重み係数または前記寄与分画を乗算する前記ステップの前に、前記算出蛍光寿命および前記２つ以上の蛍光色素種の予測寿命に対応する２つの予め定められた蛍光寿命の関数である予備重み係数を前記蛍光強度に乗算するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記蛍光信号の取得が周波数領域および時間領域モダリティから選択される、請求項１ないし９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記蛍光種が遊離状態と結合状態との間に分布する蛍光色素である、請求項１ないし９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記加重強度をさらに処理して、前記２つ以上の蛍光色素種の少なくとも１つの濃度を出す、請求項１ないし９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
２つ以上の蛍光色素種を含む対象物の光学撮像のための方法であって、
‐前記２つ以上の蛍光色素種からの蛍光を含み、かつ前記対象物の目標領域（ＲＯＩ）の１つまたはそれ以上の画素の寿命情報を含む蛍光信号を取得するステップと、
‐前記１つまたはそれ以上の画素の各々について前記蛍光信号から蛍光強度および蛍光寿命を算出するステップと、
‐前記蛍光色素種の少なくとも１つの寄与分画を導出するステップと、
‐前記算出された蛍光強度に前記寄与分画を乗算して種の加重蛍光強度を生成するステップと、
‐前記算出された蛍光寿命および少なくとも１つの予め定められた蛍光寿命の関数である重み係数を前記種の加重蛍光強度に乗算して、前記１つまたはそれ以上画素の加重蛍光強度を生成するステップと、
‐前記１つまたはそれ以上画素の前記加重蛍光強度に基づいて前記ＲＯＩの画像を生成するステップと、を含む方法。
【請求項１４】
前記蛍光信号を多指数関数によりモデル化することによって前記寄与分画が決定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記モデル化が前記蛍光信号の時間点像分布関数（ＴＰＳＦ）に適用される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記重み係数が指標関数によって決定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記指標関数が前記予め定められた蛍光寿命の関数である境界によって定義される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記境界が前記測定寿命に関連する誤差の関数でもある、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記測定寿命が前記境界の範囲内である場合、前記重み係数が１であり、それ以外の場合は０である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記蛍光強度に前記寄与分画を乗算する前記ステップの前に、前記算出蛍光寿命および前記２つ以上の蛍光色素種の予測寿命に対応する２つの予め定められた蛍光寿命の関数である予備重み係数を前記蛍光強度に乗算するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記蛍光信号の取得が周波数領域および時間領域モダリティから選択される、請求項１３ないし２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
遊離状態と結合状態との間に分布する蛍光色素である、請求項１３ないし２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記加重強度をさらに処理して、前記２つ以上の蛍光色素種の少なくとも１つの濃度を出す、請求項１３ないし２１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、２００４年１２月３０日に出願した、「METHOD FOR IMPROVING FLUOROESCENCE IMAGE CONTRAST」と称する米国特許仮出願第11/024,826号に基づく優先権を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、蛍光色素の蛍光寿命に基づいて光学画像における不要な蛍光信号を低減／排除するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
薬物動態的、遺伝的、細胞的、分子的、または他のタイプのインビボの事象の監視は、薬物または遺伝子治療の有効性のみならず、小型実験哺乳類および人体における疾患の状態または進行をも監視するのに非常に重要である。この点で、細胞内および有機体内から解剖学的および機能的情報を生成するために、インビトロ(in vitro)およびインビボ(in vivo)両方で蛍光撮像が広く使用されてきた。
【０００４】
解剖学的または機能的目的のための動物（ヒトを含む）の体内部分の蛍光撮像はしばしば、動物内に分散して目標とする細胞および器官に優先的に蓄積する、一般的に別の分子と化学的に結合された外来性蛍光色素の注入を伴う。次いで蛍光を検出し、動物の解剖学的構造に関連する信号をマッピングすることによって、画像が取得される。しかし、そのような外来性蛍光色素の励起および発光スペクトルはしばしば、内因性蛍光色素のそれと重なるので、蛍光信号は各蛍光色素からの信号の組合せとなる。さらに、そのような検査はしばしば、重複するスペクトルを持つ２つ以上の外来性蛍光色素を用いて行なわれる。その結果、蛍光画像はしばしば、目標とする蛍光色素からの信号を不明瞭にする不要信号を含む。
【０００５】
不要な蛍光信号を減衰または排除するために一般的に使用される方法は、蛍光発光のスペクトル差、蛍光寿命差（例えばＦＬＩＭ）、または周波数領域ハードウェア技術に基づく。それらの全てに制限がある。スペクトル差に基づく方法は、著しく重複しない発光スペクトルを有し、よって特定の蛍光色素に特有の非重複波長での蛍光の取得を可能にする、蛍光色素に限定される。蛍光寿命に基づく方法は異なる蛍光色素からの信号を区別するのに役立つが、蛍光色素強度に関連する情報を維持せず、したがって蛍光色素の濃度に関連する情報が失われる。周波数領域ハードウェア技術は、不要な蛍光を抑制するために、複数の位相遅延での複数の画像取得を必要とし、したがって時間がかかる。
【０００６】
したがって、上述の欠点を克服する蛍光撮像方法を提供することが望ましい。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、目標とする蛍光色素以外の蛍光色素からの不要な蛍光を選択的に排除または低減することによって、生体組織のような対象物の蛍光画像のコントラストおよび特異性を増強するための改善された方法を提供する。該方法は、測定寿命の関数として加重された強度画像の生成に基づいており、そこでは強度情報およびしたがって目標とする蛍光色素の濃度に関連する情報が維持される。
【０００８】
したがって、１実施形態では、２つ以上の蛍光色素種を含む対象物の光学撮像のための方法であって、２つ以上の蛍光色素種の少なくとも１つの検出に適合する励起および発光波長を用いて、対象物の１つまたはそれ以上の目標領域（ＲＯＩ）について、時間領域または周波数領域を使用して蛍光信号を取得するように構成された方法を提供する。蛍光強度および蛍光寿命が各々の画素の蛍光信号から算出され、蛍光強度に重み係数が乗算される。重み係数は、算出された蛍光寿命および蛍光色素種の１つまたはそれ以上の予め定められた蛍光寿命の関数であり、ＲＯＩの各画素の加重蛍光強度を生成するために使用され、そこから加重された蛍光強度画像を得ることができる。
【０００９】
さらなる実施形態では、該方法はまた、各蛍光色素の相対寄与を考慮する蛍光強度の調整にも備える。したがって、蛍光信号が２つ以上の蛍光色素種からの寄与を含む場合、蛍光色素種の少なくとも１つについて寄与分画が導出され、加重蛍光強度に寄与分画が乗算される。寄与分画は、例えば指数減衰の和により蛍光信号の時間点像分布関数（ＴＰＳＦ）を当てはめることによって決定することができる。指数関数的減衰の和を適合させる（当てはめる）ことによって決定することができる。
【００１０】
さらに別の実施形態では、該方法は、内因性蛍光色素種からの背景蛍光信号を実質的に低減することのできる、予備加重ステップに備える。したがって、蛍光強度に重み係数を乗算するステップの前に、蛍光強度信号に予備重み係数を乗算することができ、予備重み係数は、算出された蛍光寿命および撮像される２つ以上の蛍光色素種の２つの予め定められた蛍光寿命の関数である。
【００１１】
本発明のさらなる特徴および利点は、添付の図面と組み合わせて取り上げる以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【００１２】
添付の図面全体を通して、同様の特徴は同様の参照番号によって識別されることに留意されたい。
【好適な実施形態の詳細な説明】
【００１３】
本発明は、目標とする蛍光色素以外の蛍光色素からの不要な蛍光を選択的に排除または低減することによって、生体組織のような対象物の蛍光画像を強調するための改善された方法を提供する。該方法は、蛍光色素の蛍光強度および寿命の測定に基づく。結果的に得られる画像は、目標とする蛍光色素の蛍光強度（およびしたがって濃度）に関連する情報を維持する。該方法は光学撮像法、時間分解蛍光顕微鏡法、および類似物のような異なる技術に適用できることは理解されるであろう。
【００１４】
本開示において、蛍光色素種とは、異なる蛍光寿命を有する蛍光色素を意味する。したがって蛍光色素種は、異なる蛍光分子を指すと考えられるが、それはまた、各環境が蛍光色素に異なる蛍光寿命を与える状況で、異なる環境における同一蛍光分子を指すこともある。例えばｐＨ、粘度、温度、および類似物のような条件は、蛍光色素の寿命に影響を及ぼすことが知られている。環境はまた、蛍光色素の分子環境を指すこともある。例えば、遊離している蛍光色素は一般的に、別の分子と結合した同じ蛍光色素とは異なる寿命を示す。用語「蛍光色素」とは、励起したときに蛍光を発光することのできる分子電子構成を含む、小分子またはたんぱく質のような高分子を指す。
【００１５】
本発明の１実施形態では、蛍光色素種の寿命および蛍光の強度は時間領域（ＴＤ）撮像装置を用いて得られる。時間分解蛍光画像は、目標とする蛍光色素を蛍光励起波長のパルス光源により励起させ、かつ時間分解光検出器を用いて蛍光発光波長の蛍光信号を収集することによって、得ることができる。パルス光源は、任意の型のパルスレーザ（例えばダイオードレーザ、固体レーザ、気体レーザ等）または他のパルス光源（例えばパルスランプ）とすることができる。時間分解光検出器は例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）／アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）／時間相関単一光子計数（ＴＣＳＰＣ）と結合されたＰＩＮ、ストリークカメラ、またはゲート増感電荷結合デバイス（ＩＣＣＤ）とすることができる。
【００１６】
蛍光画像は、カメラを用いて蛍光性物体を直接撮像することによって、または点検出器を用いて蛍光性物体をラスタスキャンし、かつ各検出点（画素）からの情報を用いて画像を再構成することによって、生成することができる。後者のモダリティの１例は、参照によって本書に援用する国際特許出願第WO2004/044562号に記載されたｅＸｐｌｏｒｅ  Ｏｐｔｉｘ（登録商標）撮像装置によって使用されている。
【００１７】
本発明の実施形態について、データ収集の例示的モダリティとして時間領域を使用して説明するが、本発明の方法は周波数領域データ収集を用いて適用することもできる。周波数領域では、励起光信号に対する蛍光信号の変調度の変化および位相シフトを測定することによって、蛍光強度および寿命を得ることができる。そのような測定は当業界で周知である（参照によって本書に援用する、HawryszおよびSevick‐Muraca、Neoplasia vol.2(5)、2000 p.388〜417）。
【００１８】
図１Ａに示す通り、各信号取得は、特定の検出点１２で対象物によって放出された蛍光信号の時間点像分布関数（ＴＰＳＦ、Ｉij（ｔ）と表わす）１０に対応する。各画素Ｉij（ｔ）でＴＰＳＦを完全にまたは部分的に時間積分することによって、Ｉcwで表わされるＣＷ蛍光強度画像１４を得ることができ、それは濃度に関する情報を提供することができる。さらに、Ｉij（ｔ）の数学的当てはめにより、τijで表わされる寿命画像１８を生成するために使用することのできる蛍光寿命を得ることができる（図１Ｂ）。蛍光信号が２つ以上の蛍光色素種に由来する場合、多指数減衰モデルを使用してＩij（ｔ）を当てはめ、かつ各蛍光色素種の寿命および種の寄与分画を導出することができる。
【００１９】
ほとんどの実際的な場合には、所定の点で測定されるＴＰＳＦは通常、システムに存在する様々な内因性および外因性の蛍光色素種のため、幾つかの指数減衰から構成される。測定されるＴＰＳＦは次のように表わされる。
【数１】
2008527311.tif 000003
ここで指数ｋはｎ成分解析で考慮されるｋ番目の成分（蛍光色素種）を表わし、αijkはｔ＝０におけるｋ番目の成分の振幅を表わす。パラメータαijkの意味は、蛍光色素の混合物の場合には、１つの蛍光色素が複雑な減衰を示す場合とは異なる。後者の場合、αk値は、基底状態平衡に対応するｔ＝０時の各構造における分子の分画を表わすと想定することが一般的に安全である。
【００２０】
αkの意味は、蛍光色素の混合物の場合には、もっと複雑である。この場合、相対αk値は多くの要因、つまり量子収率、濃度、消光係数、励起および発光スペクトル、フィルタ特性、システムの光学要素等に依存する。一般的に、単一指数強度減衰を持つ単一蛍光色素の蛍光信号は、次のように表わすことができる。
【数２】
2008527311.tif 000004
【００２１】
この式で、Ｃkはモル濃度であり、εk（λ）はモル消光係数であり、Ｍkは蛍光色素のサイズであり、Ｑk（λ）は量子収率であり、Ｋk（λ）は蛍光色素の励起および発光スペクトルのみならず励起レーザ波長およびシステムの蛍光フィルタにも関連する因子であり、Ｓ（λ）は機器に関連する因子、例えばスペクトル応答であり、Ｉx（λ，ｔ）は励起レーザであり、ＩＲＦ（ｔ）はシステムのインパルス応答関数であり、Ｄ（λ，ｔ）は蛍光色素が混濁媒質中にある場合に光拡散によって生じる時間遅延および振幅減衰であり、（Ｘ）は畳込みを表わす。ここでは、光拡散およびシステムの応答が蛍光色素に依存しないものと想定した。それは大部分の用途に当てはまる。幾つかの蛍光色素の混合物の蛍光信号は、次の通りである。
【数３】
2008527311.tif 000005
【００２２】
式３を式１と比較することにより、αkの平均を得ることができる。
【数４】
2008527311.tif 000006
【００２３】
多指数減衰が単一の蛍光色素または複数の蛍光色素のどちらに由来するかに関係なく、αijkおよびτijkの値は定常状態（ＣＷ）強度に対する各減衰時間の分画寄与（ｆijk,cw）を決定するために使用することができる。
【数５】
2008527311.tif 000007
【００２４】
濃度に比例する分画寄与（ｆijk）は、αijkを正規化することによって算出することができる。
【数６】
2008527311.tif 000008
【００２５】
一般的に、曲線当てはめ法は、測定された蛍光信号をその構成成分に分解する必要がある。時間領域では、システムのインパルス応答関数ＩＲＦ（ｔ）を成分のモデル化された蛍光減衰と畳み込むことによって、算出信号Ｆc（ｔ）が測定蛍光信号Ｆm（ｔ）と比較される。数値曲線当てはめ法を使用することにより、ｎ個の成分の各々の寿命および／または相対分画寄与の推定値を得ることができる。例えば、最小二乗解析では、αijkおよびτijkは適合度パラメータを最小化することによって得られる。
【数７】
2008527311.tif 000009
【００２６】
ここで、和算はチャネルまたはデータ点の個数（Ｌ）全体におよび、σiは各データ点の標準偏差であり、ｖは自由度数である。
【００２７】
周波数領域では、周波数ωにおける位相シフトφωおよび変調度ｍωが測定可能である。計算値は次の通りである。
【数８】
2008527311.tif 000010
【数９】
2008527311.tif 000011
【００２８】
式中、ＮωおよびＤωは、モデルによって予測された蛍光信号のサイン変換およびコサイン変換である。式１のような幾つかの指数減衰の簡単な和の場合、ＮωおよびＤωは簡単な形を有する。
【数１０】
2008527311.tif 000012
【数１１】
2008527311.tif 000013
【００２９】
最小二乗データ解析では、パラメータ（αijkおよびτijk）は、適合度パラメータの最小値によって示される、データと算出値との間の最良適合を生じるように変化される。
【数１２】
2008527311.tif 000014
ここでｖは自由度数であり、δφおよびδｍはそれぞれ位相および変調の値の不確定性である。
【００３０】
図２に関連して、目標とする（つまり再構成する画像の元になる）蛍光色素種が蛍光寿命τを有すると仮定して、強度画像１４は、目標とする蛍光色素種の分布および濃度を表わす加重蛍光強度画像を２２で生成するために使用される、蛍光寿命τおよび測定（実効）蛍光寿命τijの関数である重み係数を２０で乗算することができる。
【００３１】
１実施形態では、重み係数は、特定画素の測定寿命τijを包含するユーザ定義寿命範囲によって定義される、指標（または矩形）関数によって決定される。予め定められた範囲外の寿命を示す画素は、それに応じて加重するか、あるいは単に排除することができる。
【００３２】
好適な実施形態では、実効寿命を算出するためのＴＰＳＦの当てはめから導出される誤差Δτは、範囲を決定するために使用することができる。したがって、次の判定基準によって論理画像マップＬijを生成することができる。
【数１３】
2008527311.tif 000015
【００３３】
このマトリックスに生の強度画像Ｉijを要素毎に乗算することによって、不要な蛍光および／またはノイズが抑制された加重強度画像Ｉwを得ることができる。蛍光信号のこの処理は蛍光信号の強度情報を維持することに注目されたい。
【００３４】
２つ（以上）の蛍光色素種がＴＰＳＦに寄与している場合、二重指数減衰モデルを使用するときにＴＰＳＦを当てはめることによって、２つの蛍光色素の蛍光寿命τij1およびτij2（より一般的にはτnij）、ならびに寄与分画ｆij1およびｆij2（より一般的にはｆijn）を得ることができる。ここでｆij1＋ｆij2＝１である。
【００３５】
今、図３に関連して、３０でマトリックスｆijnにＩwを要素毎に乗算することによって、３２で蛍光色素種ｎの強度に比例する新しい強度画像Ｉnwを得ることができる。蛍光色素種が２つしか存在しない場合、画像Ｉ2wは、図３に要約された方法によって、または単にＩwからＩ1wを減算することによって得ることができる。加重ステップを実行する前に、寄与分画を生の強度画像に乗算することができることは理解されるであろう。
【００３６】
今、図４に関連して、加重の前に、少なくとも２つの蛍光色素種の寿命に基づいて、４０で予備加重を実行することによって、強度画像を「掃除する」ことが有利であるかもしれない。例えば、蛍光寿命τ1およびτ2（τ1＜τ2）を持つ２つの蛍光色素種を含む対象物では、単一指数減衰モデルを使用した場合、測定蛍光寿命τはτ1＜τ＜τ2を満たす。さらに当てはめ誤差をΔτと仮定すると、次の判定基準に従って論理画像マップを生成することができる。
【数１４】
2008527311.tif 000016
【００３７】
このマトリックスに強度画像Ｉijを要素毎に乗算することによって、４２で背景を抑制した新しい強度画像Ｉnewを生成することができる。背景は、例えば、内在分子からの蛍光を含むかもしれない。次いでＩnewを図２および３で説明したプロセスで使用して、Ｉw、Ｉ1w等を得ることができる。
【００３８】
二重指数減衰モデルの代わりに多指数減衰モデルを蛍光寿命当てはめに使用して、上述した方法を複数蛍光色素種に拡大することができることは理解されるであろう。
【００３９】
また、加重の基礎になる寿命の範囲は、所望の蛍光情報に応じて、ユーザが定義することができることも理解されるであろう。好適な実施形態では、該範囲は、蛍光色素種の予測寿命（τn）によって定義される。
【００４０】
診断および薬理学的研究のような用途の場合、蛍光色素種の濃度および深さに関する情報を提供する画像を持つことが往々にして望ましい。しかし、蛍光強度信号が蛍光色素濃度に比例すると単純に仮定することは、蛍光色素の深さ、寿命、蛍光スペクトル、および機器の特性のみならず、組織の光拡散もまた蛍光強度信号に影響を及ぼすので、誤った結果を導くおそれがある。したがって、蛍光色素種の濃度を反映する画像を生成するために、全てのこれらの要因、ならびに組織吸収および散乱による蛍光の伝搬損失を考慮に入れる必要がある。濃度の決定の実施例を下に提示する。
【実施例】
【００４１】
「実施例１」
同量の５０ｎＭ  Ｃｙ５．５および１５０ｎＭ  Ａｔｔｏ６８０を混合した。励起光源としてｅＸｐｌｏｒｅ  Ｏｐｔｉｘ（登録商標）を６６６ｎｍのパルスダイオードレーザ波長で使用して蛍光信号を得た。量子収率、消光係数、ならびに蛍光スペクトルおよびフィルタ窓の情報を考慮すると、混合物からのＣｙ５．５とＡｔｔｏ６８０の蛍光信号比は約０．５５：０．４５である。
【００４２】
図５は、上述した方法を例示する。パネル（ａ‐ｉ）はＣｙ５．５およびＡｔｔｏ６８０の混合物の生の蛍光強度画像である。寿命画像（パネル（ａ‐ｉｉ））は、実効寿命を用いて（単一指数関数でＴＰＳＦを当てはめて）生成された。パネル（ａ‐ｉｉｉ）は、生の強度画像に予備加重を実行することによって得られた処理後の強度画像（Ｉnew）を示す。Ｃｙ５．５およびＡｔｔｏ６８０しか存在しないので、生画像と処理後の画像（背景蛍光無し）との間に差は無い。パネル（ｂ‐ｉ）および（ｃ‐ｉ）は、ＴＰＳＦの二重指数当てはめ後の１つの蛍光色素種だけの寿命に基づく寿命画像を示す。パネル（ｂ‐ｉｉ）および（ｃ‐ｉｉ）は蛍光色素種の寄与率画像を示す。寿命および分画は両方とも、二重指数減衰モデルを用いて、各画素におけるＴＰＳＦの直接当てはめによって同時に得られる。パネル（ｂ‐ｉｉｉ）および（ｃ‐ｉｉｉ）は、上述した方法によって得られた加重蛍光強度画像（Ｉ1w，Ｉ2w）を示す。本実施例では、蛍光色素は両方とも同じ深さ（ファントム面）にあり、他の要因が考慮されるので、蛍光強度はＣｙ５．５またはＡｔｔｏ６８０の濃度に比例する。
【００４３】
「実施例２」
１００ｎＭ  Ｃｙ５．５および２００ｎＭ  Ａｔｔｏ６８０の溶液を２つの別個の位置に配置した。励起光源としてｅＸｐｌｏｒｅ  Ｏｐｔｉｘを６６６ｎｍのパルスダイオードレーザ波長で使用して蛍光信号を得た。
【００４４】
対象物内における蛍光色素種の位置が重複しない特定の場合、ＴＰＳＦの多指数当てはめの必要性は無く、該方法の加重ステップにより直接処理することができる。図６は、２つの蛍光色素種が重複しない、そのような実施例を提示する。図６のパネル（ｉ）は、左側のＡｔｔｏ６８０および右側のＣｙ５．５の２つの蛍光色素種による、測定された生の蛍光強度画像である。蛍光色素がどこに配置されているかを先験的に知ることなく、強度画像のみから、蛍光色素種を識別することはできない。パネル（ｉｉ）は、単一指数減衰モデルで各画素のＴＰＳＦを当てはめることによって得られた、対応する蛍光寿命画像である。先験的に寿命が既知である場合、寿命画像は蛍光色素の種を決定することを可能にするが、それはいかなる強度情報も伝達しない。しかし本発明の方法を使用すると、強度情報が保持される。したがって、下に提示する実施例では、加重関数は、Ｃｙ５．５の場合０．９から１．０５ｎｓの間、Ａｔｔｏ６８０の場合には１．７から１．８３の間と決定された寿命の範囲に基づいている。Ｃｙ５．５の場合には、次の判定基準
Ｌij＝｛１（０．９＜τij＜１．０５の場合）、０（それ以外）｝
を使用して、パネル（ｉｉｉ）に示された画像が得られ、Ａｔｔｏ６８０の場合には、
Ｌij＝｛１（０．７＜τij＜１．８３の場合）、０（それ以外）｝
を使用して、パネル（ｉｖ）に示された画像が得られる。どちらの画像も目標とする蛍光色素の強度情報を維持している。それらは両方とも同一深さ（ファントム面）にあり、同一サイズを有するので、強度はそれらの寿命期間の濃度、量子収率、消光係数、蛍光スペクトル、フィルタ窓、および他の既知の機器パラメータに関連する。
【００４５】
「実施例３」
蛍光色素種は、異なる環境における同一蛍光色素分子とすることができる。したがって例えば対象物は、たんぱく質に結合されたときに寿命τ1を有し、遊離しているときには寿命τ2を有する１つの蛍光色素を含むことができる。この場合、次の二重指数関数によってＴＰＳＦをモデル化することが可能である。
【数１５】
2008527311.tif 000017
ここで、ｔは時間であり、τ1およびτ2は結合状態および遊離状態のそれぞれの寿命であり、ｆは結合状態の蛍光色素の分画つまりｆ＝［結合］／（［結合］＋［遊離］）である。次いでこのモデルのパラメータを、多変量曲線当てはめを通して測定データから得ることができる。遊離／結合蛍光色素種の二重指数関数は、上述の通り、加重強度画像を得るために使用することができる。
【００４６】
「実施例４」
媒質の光学特性が励起および発光波長で同じであると仮定するなど、特定の前提条件下で、時間の関数としての蛍光強度はボルン近似によって表わすことができる。
【数１６】
2008527311.tif 000018
ここで、
ｒspは、光源ｓ（光が入射する対象物上の点）から蛍光色素の深さ位置ｐまでの距離である。
ｒpdは、蛍光色素の深さ位置ｐから検出器ｄまでの距離である。
μaは、光吸収係数である。
Ｄは、光拡散係数である。μs’低減後の光散乱係数である場合、Ｄ＝１／３μs’である。
ｖは媒質中の光の速度である。
Ｑは量子効率である。
Ｃは蛍光色素の濃度である。
τは蛍光色素の寿命である。
記号＊は、畳込み演算を指す。
ＩＲＦは、蛍光を測定するために使用した機器のインパルス応答関数である。
【００４７】
式６の第１導関数を零に等しい時間の関数と設定することにより、ＴＰＳＦの最大値（ｔmax）の時間位置を求めることができる。特定の近似により（ｔmaxより短い時間では吸収が小さく、散乱係数は既知であるか、あるいは近似することができる）、かつｒspがｒpdにほぼ等しいと仮定することにより、式１６から次の式を導出することができることが明らかになった。
【数１７】
2008527311.tif 000019
ここでｄは蛍光色素対象物の深さである。
【００４８】
所定の深さに対し、表面で検出される発光信号の強度Ｉは、媒質の光学特性（吸収係数および散乱係数）ならびに蛍光色素の深さによって、蛍光色素濃度に関連付けることができる。
【数１８】
2008527311.tif 000020
【００４９】
上述の通り時間領域情報を使用して、深さｄを決定することができる。式８でＣを分離し、蛍光色素の信号強度および深さが分かると、回復した深さの精度に指数関数的に依存する精度範囲内で、蛍光色素の濃度（つまり単位体積当たりの蛍光分子の量）を回復することができる。したがって、本発明の別の態様では、その深さｄを決定し、表面強度測定値Ｉを次のように正規化することによって（式９）、蛍光色素の相対濃度の推定値Ｃｏｎｃ・relativを得ることができる。
【数１９】
2008527311.tif 000021
特定の前提条件下で、式１９は式１６から導出することができる。
【００５０】
蛍光色素対象物が組織の表面に存在しない場合、上述した方法は、加重強度画像からそれらの濃度マップを得るために使用することができる。
【００５１】
上述した本発明の実施形態は単なる例示のつもりである。したがって、本発明の範囲は、特許請求の範囲の記載によってのみ限定されることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１Ａ】対象物の目標領域（ＲＯＩ）からの蛍光信号からの強度画像の生成の略図である。
【図１Ｂ】対象物の目標領域（ＲＯＩ）からの蛍光信号からの寿命画像の生成の略図である。
【図２】生の強度画像から加重強度画像を得る、本発明の実施形態のフローチャートである。
【図３】生の強度画像から寄与分画調整された加重強度画像を得る、本発明の実施形態のフローチャートである。
【図４】生の強度画像に予備加重を適用する、本発明の実施形態のフローチャートである。
【図５（ａ−ｉ）】２つの蛍光色素種すなわちＣｙ５．５およびＡｔｔｏ６８０の［５５％：４５％］混合物の生の蛍光強度（各画素におけるＴＰＳＦの時間に対する積分）画像である。
【図５（ａ−ｉｉ）】単一指数減衰モデルにより各画素の二重色素混合物からの蛍光ＴＰＳＦを当てはめることによって生成される有効寿命画像である。
【図５（ａ−ｉｉｉ）】図１（ａ‐ｉ）の生の強度画像に予備加重を実行することによって得られる処理後の強度画像（Ｉnew）を示す。
【図５（ｂ−ｉ）】各画素の二重色素混合物の蛍光ＴＰＳＦの二重指数減衰当てはめによって算出されたＣｙ５．５の蛍光寿命画像を示す。
【図５（ｂ−ｉｉ）】各画素の二重色素混合物の蛍光ＴＰＳＦの二重指数減衰当てはめによって算出されたＣｙ５．５の強度分画画像を示す。
【図５（ｂ−ｉｉｉ）】本発明の方法によって得られたＣｙ５．５の加重蛍光強度画像（Ｉ1w）を示す。各画素で、蛍光強度はその位置のＣｙ５．５の濃度に関係付けられる。
【図５（ｃ−ｉ）】各画素の二重色素混合物の蛍光ＴＰＳＦの二重指数減衰当てはめによって算出されたＡｔｔｏ６８０の蛍光寿命画像を示す。
【図５（ｃ−ｉｉ）】各画素の二重色素混合物の蛍光ＴＰＳＦの二重指数減衰当てはめによって算出されたＡｔｔｏ６８０の強度分画画像を示す。
【図５（ｃ−ｉｉｉ）】本発明の方法によって得られたＡｔｔｏ６８０の加重蛍光強度画像（Ｉ2w）を示す。各画素で、蛍光強度はその位置のＡｔｔｏ６８０の濃度に関係付けられる。
【図６（ｉ）】Ｃｙ５．５およびＡｔｔｏ６８０の生の蛍光強度（各画素におけるＴＰＳＦの時間に対する積分）画像である。左側がＡｔｔｏ６８０、右側がＣｙ５．５である。蛍光強度のみによって蛍光を区別することはできない。
【図６（ｉｉ）】蛍光色素Ａｔｔｏ６８０およびＣｙ５．５の蛍光寿命画像である。２つの蛍光色素はそれらの蛍光寿命によって区別することができる。これは蛍光寿命画像の背後にあるメカニズムである。しかし蛍光強度（およびしたがって濃度）情報はこの画像では失われる。
【図６（ｉｉｉ）】本発明の方法を使用して図６（ｉ）から抽出されたＣｙ５．５の蛍光強度画像である。
【図６（ｉｖ）】本発明の方法を使用して図６（ｉ）から抽出されたＡｔｔｏ６８０の蛍光強度画像である。
【図１Ａ】
2008527311.tif 000022
【図１Ｂ】
2008527311.tif 000023
【図２】
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【図３】
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【図４】
2008527311.tif 000026
【図５】
2008527311.tif 000027
【図６】
2008527311.tif 000028
【国際調査報告】
2008527311.tif 000029
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