(57)【要約】１つまたは複数の検体の高感度検出のための構成および方法が開示される。概して、それらの方法は、多次元シグナルと称される特別な標識コンポーネントの使用が含まれる。開示された方法では、多次元シグナルの分析の結果、別のレベルの分析を実行することができるか、あるいは実行すべきかどうか、および／または分析された材料のどの部分を別のレベルの分析で分析できるか、あるいは分析すべきかどうかを示すのに役立つ１つまたは複数の所定パターンが生じる。形式によっては、等圧および非等圧エレメントを同一の検定または検定システムにおいて一緒に使用することができる。ともに使用される等圧および非等圧多次元シグナルは、分析中に、１つまたは複数の所定パターンを生成することができる。この第１のレベルの分析で生成されたパターンは、第２のレベルの分析を実行すべきかどうかを示す。第２のレベルの分析は、等圧多次元シグナルの区別を含んでもよい。
2008529035.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１セットのレポーターシグナルと１つ以上のインジケータシグナルを具備する多次元シグナル群であって、
セットのレポーターシグナルが複数のレポーターシグナルを具備し、
レポーターシグナルが共通特性を有し、共通特性によって、レポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別または分離することができ、
レポーターシグナルを変更することができ、変更された形式の各レポーターシグナルをあらゆる別の変更された形式のレポーターシグナルと区別することができ、
インジケータシグナルのうち少なくとも１つが共通特性を有しておらず、
セットのレポーターシグナルおよびインジケータシグナルのうち少なくとも１つが、共通特性によって、レポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別または分離することができる状況において所定パターンを生成する、
ことを特徴とする多次元シグナル群。
【請求項２】
共通特性が質量電荷比であり、レポーターシグナルが質量を変更することにより変更され、変更された形式のレポーターシグナルが変更された形式のレポーターシグナルの質量電荷比の差を介して区別可能であり、所定パターンが質量電荷比のパターンであることを特徴とする請求項１のセット。
【請求項３】
２つ以上のセットのレポーターシグナルと、１つ以上のインジケータシグナルとを具備する多次元シグナル群であって、
レポーターシグナルの各セットが複数のレポーターシグナルを具備し、各セット内のレポーターシグナルが共通特性を有し、共通特性によって、セット内のレポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別または分離することができ、レポーターシグナルが変更可能であり、各セット内の変更された形式の各レポーターシグナルがセット内のすべての別の変更された形式のレポーターシグナルと区別可能であり、
各セット内のレポーターシグナルの共通特性が別のセットのレポーターシグナルの共通特性と異なり、インジケータシグナルのうち少なくとも１つが共通特性を有しておらず、
セットのレポーターシグナルおよびインジケータシグナルのうち少なくとも１つが、共通特性によって、レポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別または分離することができる状況において所定パターンを生成することを特徴とする多次元シグナル群。
【請求項４】
共通特性が質量電荷比であり、レポーターシグナルが質量を変更することにより変更され、変更された形式のレポーターシグナルが変更された形式のレポーターシグナルの質量電荷比の差を介して区別可能であり、所定パターンが質量電荷比のパターンであることを特徴とする請求項３のセット。
【請求項５】
（ａ）１セットのそれぞれが共通特性を有するレポーターシグナルと１つ以上のインジケータシグナルとを共通特性を欠く分子から分離するステップと、
（ｂ）１セットのレポーターシグナルとインジケータシグナルのうち少なくとも１つとから生成される所定パターンを識別するステップと、
（ｃ）所定パターンを生成したレポーターシグナルを変更するステップと、
（ｄ）変更された形式のレポーターシグナルを検出し互いに区別するステップと、
を具備することを特徴とする方法。
【請求項６】
共通特性が質量電荷比であり、レポーターシグナルが質量を変更することによって変更され、変更された形式のレポーターシグナルが変更された形式のレポーターシグナルの質量電荷比の差を介して区別され、所定パターンが質量電荷比のパターンであることを特徴とする請求項５の方法。
【請求項７】
レポーターシグナルは特定結合分子と関連付けられ、あるいは結合され、各レポーターシグナルは異なる特定結合分子と関連付けられ、あるいは結合されることを特徴とする請求項５の方法。
【請求項８】
レポーターシグナルはペプチドを具備し、ペプチドは同じ質量電荷比を有し、少なくとも１つのインジケータシグナルはレポーターシグナルと異なる質量電荷比を有することを特徴とする請求項５の方法。
【請求項９】
ステップ（ａ）の前に、レポーターシグナルおよびインジケータシグナルと１つ以上の検体を関連付けるステップをさらに具備し、各レポーターシグナルおよびインジケータシグナルは異なる特定結合分子と関連付けられ、あるいは結合され、各特定結合分子は検体のうちの異なるものと明確に相互作用することができ、レポーターシグナルおよびインジケータシグナルは特定結合分子と検体との相互作用を介して検体と関連付けられることを特徴とする請求項５の方法。
【請求項１０】
ステップ（ａ）の前に、レポーターシグナルと１つ以上の検体を関連付けるステップをさらに具備し、各レポーターシグナルは異なる特定結合分子と関連付けられ、あるいは結合され、各特定結合分子は検体のうちの異なるものと明確に相互作用することができ、少なくとも１つのインジケータシグナルは、レポーターシグナルが関連付けられ、あるいは結合される特定結合分子と同じ特異性を有する特定結合分子と関連付けられ、あるいは結合され、レポーターシグナルおよびインジケータシグナルは特定結合分子と検体との相互作用を介して検体と関連付けられることを特徴とする請求項５の方法。
【請求項１１】
ステップ（ａ）〜（ｄｃ）がそのたびに異なるセットのレポーターシグナルを用いて１回以上の回数繰り返されることを特徴とする請求項５の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）〜（ｄ）がそのたびに異なるセットのレポーターシグナルを用いて１回以上の回数繰り返されることを特徴とする請求項５の方法。
【請求項１３】
ステップ（ａ）の前に、異なるセットのレポーターシグナルが異なるサンプルと関連付けられることを特徴とする請求項１２の方法。
【請求項１４】
複数セットのレポーターシグナルがそれぞれ単独のレポーターシグナルを含むことを特徴とする請求項１２の方法。
【請求項１５】
（ａ）２つ以上のセットのレポーターシグナルおよび１つ以上のインジケータシグナルを２つ以上のセットの共通特性を欠く分子から分離するステップであって、各セット内のレポーターシグナルは共通特性を有し、各セット内のレポーターシグナルの共通特性は別のセットのレポーターシグナルの共通特性と異なるステップと、
（ｂ）複数セットのレポーターシグナルおよび少なくとも１つのインジケータシグナルによって生成される所定パターンを識別するステップと、
（ｃ）所定パターンを生成したレポーターシグナルを変更するステップと、
（ｄ）変更された形式のレポーターシグナルを検出し相互に区別するステップと
を具備することを特徴とする方法。
【請求項１６】
共通特性は質量電荷比であり、レポーターシグナルはその質量を変更することにより変更され、変更された形式のレポーターシグナルは変更された形式のレポーターシグナルの質量電荷比の差を介して区別され、所定パターンは質量電荷比のパターンであることを特徴とする請求項１５の方法。
【請求項１７】
（ａ）１セットのレポーター分子であって、各レポーター分子はレポーターシグナルおよび復号化タグを具備し、
レポーターシグナルは共通特性を有し、共通特性によって、レポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別または分離でき、
レポーターシグナルは変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルはすべての別の変更された形式のレポーターシグナルから区別可能であり、
異なるレポーター分子はそれぞれ異なる復号化タグおよび異なるレポーターシグナルを具備するレポーター分子と、
（ｂ）１つ以上のインジケータシグナルであって、少なくとも１つのインジケータシグナルは共通特性を有しておらず、
共通特性によって、レポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別または分離することができる状況において、セットのレポーターシグナルと少なくとも１つのインジケータシグナルは所定パターンを生成するインジケータシグナルと、
１セットの符号化分子であって、各符号化分子は特定結合分子と符号化タグを具備し、各特定結合分子は異なる検体と明確に相互作用することができ、各符号化タグは異なる復号化タグと明確に相互作用することができる符号化分子と
を具備することを特徴とするキット。
【請求項１８】
（ａ）２つ以上のセットのレポーター分子であって、各セット内のレポーターシグナルは共通特性を有し、
共通特性によって、レポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別または分離でき、各セット内のレポーターシグナルの共通特性は別のセットのレポーターシグナルの共通特性と異なり、
レポーターシグナルは変更可能であり、各セット内の変更された形式の各レポーターシグナルはセット内のすべての別の変更された形式のレポーターシグナルから区別可能であるレポーター分子と、
（ｂ）１つ以上のインジケータシグナルであって、少なくとも１つのインジケータシグナルは共通特性を有しておらず、
共通特性によって、レポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別または分離することができる状況において、セットのレポーターシグナルおよび少なくとも１つのインジケータシグナルは所定パターンを生成するインジケータシグナルと
を具備することを特徴とするキット。
【請求項１９】
１セットの多次元シグナルで第１のサンプルまたは第１のセットのサンプル内の検体を標識付けするステップと、
異なるセットの多次元シグナルで第２のサンプルまたは第２のセットのサンプル内の検体を標識付けするステップと、
第１及び第２のサンプルを混合して分析サンプルを形成するステップと、
分析サンプル内の多次元シグナル−標識検体を分析して多次元シグナルから生じる１つ以上の所定パターンを識別するステップであって、１つ以上の所定パターンの識別は分析サンプルの１つ以上の部分を識別するステップと、
分析サンプルの１つ以上の識別部分のうちの１つ以上における多次元シグナルを分析して、分析サンプルの識別部分に存在する多次元シグナルを識別するステップと
を具備することを特徴とする方法。
【請求項２０】
第１のセットの多次元シグナルで第１のサンプルまたは第１のセットのサンプル内の検体を標識付けするステップと、
第２のセットの多次元シグナルで第２のサンプルまたは第２のセットのサンプル内の検体を標識付けするステップであって、第１のセットの多次元シグナルのメンバー、第２のセットの多次元シグナルのメンバー、あるいはその両方が共通特性を有する多次元シグナルを他の共通特性を欠く別の分子から区別および／または分離させることのできる１つ以上の共通特性を有するステップと、
第１及び第２のサンプルを混合して分析サンプルを形成するステップと、
分析サンプル内の多次元シグナル−標識検体を分析して多次元シグナルから生じる１つ以上の所定パターンを識別するステップであって、１つ以上の所定パターンの識別は分析サンプルの１つ以上の部分を識別するステップと、
分析サンプルの１つ以上の識別部分のうちの１つ以上における多次元シグナルを分析して、分析サンプルの識別部分に存在する多次元シグナルを識別するステップであって、１つ以上の共通特性を有するセットのメンバーが、変更された形式の異なる多次元シグナルが相互に区別可能となるように変更されるステップと
を具備することを特徴とする方法。
【請求項２１】
１つ以上の等圧多次元シグナルまたは１つ以上のセットの等圧多次元シグナルで第１のサンプルまたは第１のセットのサンプル内の検体を標識付けするステップと、
１つ以上の異なるＭＤＳまたは１つ以上の異なるセットの多次元シグナルで第２のサンプルまたは第２のセットのサンプル内の検体を標識付けするステップと、
第１及び第２のサンプルを混合して分析サンプルを形成するステップと、
分析サンプル内の多次元シグナル−標識検体を分析して多次元シグナルから生じる１つ以上の所定パターンを識別するステップであって、１つ以上の所定パターンの識別は分析サンプルの１つ以上の部分を識別するステップと、
分析サンプルの１つ以上の識別部分のうちの１つ以上における多次元シグナルを分析して、分析サンプルの識別部分に存在する多次元シグナルを識別するステップであって、１つ以上の分析サンプルの１つ以上の識別部分における多次元シグナルの分析は、異なる質量を有する多次元シグナル断片を作成するための識別部分の多次元シグナルの断片化と、質量電荷比に基づく異なる多次元シグナル断片の検出とによって達成されるステップと
を具備することを特徴とする方法。
【請求項２２】
１セットのレポーターシグナルおよび１つ以上のインジケータシグナルを具備する多次元シグナル群であって、
セットのレポーターシグナルは複数のレポーターシグナルを具備し、レポーターシグナルは共通特性を有し、
共通特性によって、レポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、
レポーターシグナルは変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルはすべての別の変更された形式のレポーターシグナルから区別可能であり、
共通特性によって、レポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、レポーターシグナルおよび１つ以上のインジケータシグナルは所定パターンを生成することを特徴とする多次元シグナル群。
【請求項２３】
セットの標識タンパク質であって、各標識タンパク質はタンパク質またはペプチドとタンパク質またはペプチドに付加されるレポーターシグナルまたはインジケータシグナルとを具備し、レポーターシグナルは共通特性を有し、共通特性によって、同一のタンパク質またはペプチドを具備する標識タンパク質を共通特性を欠く分子から区別および／または分離でき、
レポーターシグナルは変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルはすべての別の変更された形式のレポーターシグナルから区別可能であり、レポーターシグナルの変更は標識タンパク質を変更し、変更された形式の各標識タンパク質はすべての別の変更された形式の標識タンパク質から区別可能であり、
共通特性によって、標識タンパク質を共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、レポーターシグナルおよび１つ以上のインジケータシグナルは所定パターンを生成することを特徴とする標識タンパク質。
【請求項２４】
１セットのレポーターシグナルキャリブレータおよび１つ以上のインジケータシグナルキャリブレータであって、各レポーターシグナルキャリブレータは１セットの標的タンパク質断片内の標的タンパク質断片と共通特性を共有し、共通特性によって、共通特性を有する標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを共通特性を欠く分子から区別および／または分離でき、共通特性を共有する標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータは相互に対応し、
標的タンパク質断片は変更可能であり、変更された形式の標的タンパク質断片は他の変更された形式の標的タンパク質断片から区別可能であり、レポーターシグナルキャリブレータは変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルキャリブレータは、レポーターシグナルキャリブレータが共通特性を共有する変更された形式の標的タンパク質断片から区別可能であり、
共通特性を有する標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、レポーターシグナルキャリブレータおよび少なくとも１つのインジケータシグナルキャリブレータは所定パターンを生成することができることを特徴とするレポーターシグナルキャリブレータおよびインジケータシグナルキャリブレータ。
【請求項２５】
１セットの核酸分子であって、
各核酸分子はレポーターシグナルペプチドまたはインジケータシグナルペプチドおよび当該タンパク質またはペプチドを具備するアミノ酸セグメントを符号化するヌクレオチドセグメントを具備し、レポーターシグナルペプチドは共通特性を有し、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、
レポーターシグナルペプチドは変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルペプチドは変更された形式の別のレポーターシグナルペプチドから区別可能であり、
共通特性によって、レポーターシグナルペプチドを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、レポーターシグナルペプチドおよび１つ以上のインジケータシグナルペプチドは所定パターンを生成する、
ことを特徴とする核酸分子。
【請求項２６】
特定結合分子、キャリア、およびブロック群を具備する検出器であって、ブロック群がブロックを具備し、ブロックは１セットのレポーターシグナルおよび１つ以上のインジケータシグナルを具備することを特徴とする検出器。
【請求項２７】
特定結合分子、キャリア、およびブロック群を具備する検出器であって、ブロック群がブロックを具備し、ブロックは２つ以上のセットのレポーターシグナルを具備することを特徴とする検出器。
【請求項２８】
（ａ）１セットのレポーターシグナルおよび１つ以上のインジケータシグナルを共通特性を欠く分子から分離するステップであって、各レポーターシグナルは共通特性を有するステップと、
（ｂ）レポーターシグナルおよび１つ以上のインジケータシグナルによって生成される所定パターンを識別するステップと、
（ｃ）所定パターンを生成するレポーターシグナルを変更するステップと、および
（ｄ）変更された形式のレポーターシグナルを検出し相互に区別するステップと
を具備することを特徴とする方法。
【請求項２９】
（ａ）１セットの標識タンパク質を分離するステップであって、各標識タンパク質はタンパク質またはペプチドとタンパク質またはペプチドに付加されるレポーターシグナルまたはインジケータシグナルとを具備し、各レポーターシグナルは共通特性を有し、共通特性によって、同一のタンパク質またはペプチドを具備する標識タンパク質を共通特性を欠く分子から区別および／または分離できるステップと、
（ｂ）レポーターシグナルおよび１つ以上のインジケータシグナルによって生成される所定パターンを識別するステップと、
（ｃ）所定パターンを生成するレポーターシグナルを変更することにより、標識タンパク質を変更するステップと、
（ｄ）変更された形式の標識タンパク質を検出し相互に区別するステップと
を具備することを特徴とする方法。
【請求項３０】
（ａ）タンパク質サンプルを処理してタンパク質断片を作成するステップであって、タンパク質断片は１セットの標的タンパク質断片を具備し、標的タンパク質断片は変更可能であり、変更された形式の標的タンパク質断片は他の変更された形式の標的タンパク質断片から区別可能であるステップと、
（ｂ）標的タンパク質断片と１セットのレポーターシグナルキャリブレータおよび１つ以上のインジケータシグナルキャリブレータとを混合するステップであって、各標的タンパク質断片は少なくとも１つのレポーターシグナルキャリブレータと共通特性を共有し、共通特性によって、共通特性を有する標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを共通特性を欠く分子から区別および／または分離でき、共通特性を共有する標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータは相互に対応し、レポーターシグナルキャリブレータは変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルキャリブレータは、レポーターシグナルキャリブレータが共通特性を共有する変更された形式の標的タンパク質断片から区別可能であるステップと、
（ｃ）標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータの共通特性に基づき、標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを別の分子から分離するステップと、
（ｄ）レポーターシグナルキャリブレータおよび１つ以上のインジケータシグナルキャリブレータによって生成された所定パターンを識別するステップと、
（ｅ）所定パターンを生成した標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを変更するステップと、
（ｆ）変更された形式の標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを検出するステップであって、変更された形式の標的タンパク質断片の存在、不在、量、または存在および量は、変更された形式の標的タンパク質断片が得られる標的タンパク質断片のタンパク質サンプル内の存在、不在、量、または存在および量を示し、タンパク質サンプル内の標的タンパク質断片の存在、不在、量、または存在および量はタンパク質サンプルのタンパク質シグニチャを構成するステップと、
を具備することを特徴とする、タンパク質シグニチャを作成する方法。
【請求項３１】
１つ以上の発現サンプルから得られる標的変更レポーターシグナルペプチドを検出するステップであって、１つ以上の発現サンプルはまとめて１セットの核酸分子を具備し、各核酸分子は、レポーターシグナルペプチドまたはインジケータシグナルペプチドおよび当該タンパク質またはペプチドを具備するアミノ酸セグメントを符号化するヌクレオチドセグメントを具備し、レポーターシグナルペプチドは共通特性を有し、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができるステップを具備する、発現を検出する方法であって、
レポーターシグナルペプチドは変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルペプチドは変更された形式の別のレポーターシグナルペプチドから区別可能であり、標的変更レポーターシグナルペプチドは変更されたレポーターシグナルペプチドのうちの１つであり、標的変更レポーターシグナルペプチドの検出は、標的変更レポーターシグナルペプチドが得られるレポーターシグナルペプチドを具備するアミノ酸セグメントの発現を示し、
共通特性によって、レポーターシグナルペプチドを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、レポーターシグナルペプチドおよび１つ以上のインジケータシグナルペプチドは所定パターンを生成することを特徴とする方法。
【請求項３２】
１つ以上の検出器と１つ以上の標的サンプルとを関連付けるステップであって、
検出器はそれぞれ特定結合分子、キャリア、およびブロック群を具備し、ブロック群がブロックを具備し、ブロックは１セットのレポーターシグナルと１つ以上のインジケータシグナルを具備するステップと、
ブロック群を検出するステップと
を具備することを特徴とする、検体を検出する方法。
【請求項３３】
１つ以上の検出器と１つ以上の標的サンプルとを関連付けるステップであって、
検出器はそれぞれ特定結合分子、キャリア、およびブロック群を具備し、ブロック群がブロックを具備し、ブロックは２つ以上のセットのレポーターシグナルを具備するステップと、
ブロック群を検出するステップと
を具備することを特徴とする検体を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００５年２月３日に提出された米国仮出願第６０／６４９、８９７号に優先権を主張し、その全内容を参照によりここに組み込む。
【０００２】
本発明は概して、検体および生体分子の検出分野、特に、検体および生体分子の多重検出及び分析分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
分子の検出は、生医学における重要な作業である。当該分子の多くは少量存在し、検出可能なシグナルをそれ自体生成しないため、上記検出は、特殊標識分子の使用、シグナル増幅、またはその両方を必要とすることが多い。多数の標識、標識付けシステム、およびシグナル増幅技術が開発されてきた。たとえば、タンパク質は、サンドイッチ検定（ＭａｉｌｉｎｉおよびＭａｙｓｅｆ、「酵素イムノ検定のサンドイッチ法。Ｉ．ラットと人間のアルファフェトプロテインへの適用」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ。方法８：２２３〜２３４（１９７５））や酵素結合イムノソルベント検定（ＥｎｇｖａｌｌおよびＰｅｒｌｍａｎｎ、「酵素結合イムノソルベント検定」（ＥＬＩＳＡ）。イムノグロブリンの量的検定」免疫化学８：８７１〜８７４（１９７１））、および二次元（２−Ｄ）ゲル電気泳動（Ｐａｔｔｏｎ、バイオ技術２８：９４４〜９５７（２０００））などの抗体検出システムを用いて検出されてきた。これらの技術は有用だが、ほとんどが重大な欠点と制約を有する。たとえば、放射活性標識は取扱が危険で困難であり、蛍光標識は識別可能な標識の制約のため、多重検出能力が制限される。増幅方法は疑似シグナル増幅になりやすい。微量の特定分子を検出し、高度に多重化可能な、改善された検出標識および検出技術が必要とされる。
【０００４】
プロテオームプロファイリング、すなわち、プロテオミクスなどのタンパク質の発現および存在の分析には、複数のタンパク質の高感度検出が必要とされる。プロテオームプロファイリングにおける現在の方法が示唆するように、上記検出に必要なツールが不足している（ＨａｙｎｅｓおよびＹａｔｅｓ、「プロテオームプロファイリング−落とし穴と進歩」、Ｙｅａｓｔ１７（２）：８１〜８７（２０００））。クロマトグラフィおよびキャプラリ電気泳動の技術はプロテオーム研究の影響を受けやすく、相当な開発努力を行ってきた一方（たとえば、Ｋｒｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、「タンパク質、核酸類、ペプチドマッピング、抗体などの生体高分子へのキャピラリエレクトロクロマトグラフィの具体的適用」、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ、８８７：１３７〜６３（２０００）、Ｈａｇｅ、「アフィニティクロマトグラフィ：臨床適用総括」、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、４５（５）：５９３〜６１５（１９９９）、Ｈａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．、「クロマトグラフィイムノ検定」、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ、７３（０７）：１９８Ａ〜２０５Ａ、（２００１）、Ｋｒｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、「クロマトグラフィに適用可能な標識反応と微量タンパク質の電気泳動」、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ａｐｐｌ、６９９：１７３〜２０８（１９９７）を参照）、当業界の主力はいまだに、二次元が等電焦点と分子サイズである二次元電気泳動である。ＨａｙｎｅｓとＹａｔｅｓは、その技術の重大な欠点を指摘しているが、その欠点に鑑み方法の有用性についても論じている。ＨａｙｅｓとＹａｔｅｓは、アイソトープコード化アフィニティタグ（ＩＣＡＴ）の技術、ＬＣ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの技術、および安定したアイソトープ標識技術（Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．、「ナノ電気噴霧、同位体標識、四極／飛行時間  質量分析計の組み合わせにより配列を決定する高速「新規」ペプチド」。Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  １１（９）：１０１５〜１０２４（１９９７）；Ｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．、「タンパク質発現と部位特異リン酸化の正確な計量」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ９６（１２）：６５９１〜６５９６（１９９９））についても述べている。
【０００５】
Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（ＷＯ００／１１２０８）は、ＰＲＧ−Ｌ−Ａ組成の標識について説明している。ただし、ＰＲＧはタンパク質反応性基、Ｌはリンカー（同位体的に識別可能な組成を含んでもよい）、Ａは親和性成分である。Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．はタンパク質  反応性基がタンパク質に標識を付すのに使用され、アフィニティ捕捉分子が親和性成分を捕捉するのに使用され、残りのタンパク質が廃棄されてから、親和性成分が解放され、標識タンパク質が質量分析により検出される方法を記載している。Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．の方法は、標識またはタンパク質の断片化あるいはその他の修飾を含まない。
【０００６】
システイン残留物が対照および試験サンプルにおいて、それぞれが親和性成分を含む重いまたは軽いタグで標識付けされるＩＣＡＴの技術は、大きな関心を呼び、タンパク質プロファイリングの可能性を秘めている（Ｇｙｇｉ  ｅｔ  ａｌ．、「同位体コード化アフィニティタグを用いる複合タンパク質混合物の量的分析」、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１０）：９９４〜９９９（１９９９）、Ｇｒｉｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、「ＭＡＬＤＩ  四極  飛行時間型  質量分析計を用いる量的プロテオーム分析」、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７３：９７８〜９８６（２００１））。Ｇｙｇｉ  ｅｔ  ａｌ．および  Ｇｒｉｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ．は、２つのサンプルが８つの通常水素または８つの重水素（デュートリウム）原子を含むリンカーを利用して識別される、２つのタンパク質サンプルの相対プロファイリングを実証している。標識タンパク質の相対濃度は、リンカー分子内の対応する８ａｍｕの差によって分離されるピーク比で決定される。現行の実施は２つの標識に限定されている。この技術は、標識またはタンパク質の断片化あるいはその他の修飾を含まない。
【０００７】
質量分析は、リン酸化タンパク質を検出するのに使用されてきた（ＤｅＧｎｏｒｅ  およびＱｉｎ、「イオントラップ質量分析計におけるフォスホペプチドの断片化」、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ。９：１１７５〜１１８８（１９９８）；ＱｉｎおよびＣｈａｉｔ、「ＭＡＬＤＩイオントラップ質量分析によるタンパク質の転写後修飾の識別及び特徴」、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ、６９：４００２〜９（１９９７）；Ａｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．、「フォスホペプチドマッピングの多次元電気噴霧ＭＳベースアプローチ」、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：３９３〜４０４（２００１））。これらの方法は、リン酸基の存在を示すシグニチャマス、たとえば、負イオンモードでのＰＯ２−およびＰＯ３−イオンに相当するｍ／ｚ＝６３および／またはｍ／ｚ＝７９を利用する。あるいは、親イオンから９８ダルトンのニュートラルロスは、リン酸化ペプチド、リン酸化Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、ＴｈｒからＨ３ＰＯ４の損失を示す。いったんリン酸化アミノ酸が識別されれば、修飾を含むペプチドは標準的なＭＳ／ＭＳ法により配列される。プロテオミクスにとっては信頼度の高い、高度に多重化された読出しシステムが必要とされる。
【０００８】
あらゆる生体の状態は、その寿命の所与の時点において、「プロテオーム」を構成するタンパク質の複雑な配置によって定義することができる。プロテオームの完全な状態は（修飾後の変種も含め）存在するすべてのタンパク質、その細胞内位置と濃度をリストアップすることにより定義可能だが、このようなタスクは現行の単独の分析方法の能力を超えている。しかしながら、小さなサブセットのタンパク質の相対濃度を特定し測定することにより細胞または組織の状態を定義しようとする試みがなされてきた。たとえば、Ｃｏｎｒａｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７２：３３４９〜３３５４（２０００）は、プロテオーム全体のタンパク質識別に「精密質量タグ」（ＡＭＴ）を使用することを記載している。Ｃｏｎｒａｄｓ  ｅｔ  ａｌ．は、十分な質量精度と解析度を有する質量分析計が、タンパク質から特定のトリプシン消化物断片を検出するのに使用可能なことを示している。いったん識別されれば、ＡＭＴはタンパク質のトリプシン消化物、および高精度、高解析度の質量分析によってサンプル内で直接検出可能である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
精密質量タグというコンセプトはタンパク質の発見にとっても、従来の生物実験においてペプチドパターンを生成するのにも有用だが、真に有益な診断上の多様なタンパク質評価の中心にある感度の問題を解決していない。ＡＭＴから成る有効な評価には、信頼の置ける読出しを可能にするために最低２０００〜１０，０００個の細胞を含むサンプルを必要とする。これは、多くの重要な細胞タンパク質が、細胞ごとに５００〜５０００個の分子のレベルでしか存在しないからである。臨床的に適切なタンパク質が細胞１つにつき５００コピー存在し、癌患者の貴重な臨床サンプルが１０００個の細胞のみを含む場合、タンパク質の総数は５００，０００で、従来の質量分析による検出の限界に届かない。したがって、ＡＭＴの識別後のプロテオームの研究のためにＣｏｎｒａｄｓ  ｅｔ  ａｌ．によって提案される種類の測定は、癌診断のような重要な臨床上の問題に対処するには適さない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
１つまたは複数の検体の組成および高感度検出方法を開示する。概して、その方法は、多次元シグナル（ＭＤＳ）と称される特別な標識成分の使用を含む。
【００１１】
したがって、第１の側面によると、本発明は、１つ以上のセットのレポーターシグナル、および任意で１つ以上のインジケータシグナルを具備する多次元シグナル群であって、セットのレポーターシグナルが複数のレポーターシグナルを具備し、各セット内のレポーターシグナルが共通特性を有し、共通特性によって、各セット内のレポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、レポーターシグナルを変更することができ、各セット内の変更された形式の各レポーターシグナルをセット内のあらゆる別の変更された形式のレポーターシグナルと区別することができ、レポーターシグナルおよび任意の１つ以上のインジケータシグナルのうち少なくとも１つが、共通特性によって、レポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において所定パターンを生成する、ことを特徴とする多次元シグナル群を提供する。１セット以上のレポーターシグナルがある場合、レポーターシグナルの各セットの共通特性が別のセットのレポーターシグナルの共通特性と異なり、レポーターシグナルは、共通特性によって、レポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において所定パターンを生成する。
【００１２】
別の側面によると、本発明は、（ａ）１セットのレポーター分子であって、各レポーター分子がレポーターシグナルおよび復号化タグを具備し、レポーターシグナルが共通特性を有し、共通特性によって、レポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、レポーターシグナルは変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルがすべての別の変更された形式のレポーターシグナルから区別可能であり、それぞれの異なるレポーター分子が様々な復号化タグと様々なレポーターシグナルとを具備するレポーター分子と、（ｂ）１つ以上のインジケータ分子であって、各インジケータ分子がインジケータシグナルと復号化タグを具備し、レポーターシグナルと１つ以上のインジケータシグナルが、共通特性によって、レポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において所定パターンを生成するインジケータ分子とを具備するキットを提供する。
【００１３】
さらに別の側面によると、本発明は２つ以上のセットのレポーター分子を具備するキットを提供し、該キットにおいて、各レポーター分子はレポーターシグナルおよび復号化タグを具備し、各セット内のレポーターシグナルは共通特性を有し、共通特性によって、セット内のレポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、レポーターシグナルは変更可能であり、各セット内の変更された形式の各レポーターシグナルがセット内のすべての別の変更された形式のレポーターシグナルから区別可能であり、それぞれの異なるレポーター分子が様々な復号化タグおよび様々なレポーターシグナルを具備し、レポーターシグナルの各セットの共通特性が別のセットのレポーターシグナルの共通特性と異なり、共通特性によって、レポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、レポーターシグナルが所定パターンを生成する。
【００１４】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、レポーターシグナルおよびインジケータシグナルはペプチドを具備することができ、レポーターシグナルは同じ質量電荷比を有し、少なくとも１つのインジケータシグナルはレポーターシグナルと同じ質量電荷比を有していない。形式によっては、インジケータシグナルは共通特性を有していない。レポーターシグナルおよび１つ以上のインジケータシグナルは、共通特性によって、レポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において所定パターンを生成することができる。共通特性は質量電荷比の差であってもよく、レポーターシグナルはその質量を変更することにより変更可能であり、変更された形式のレポーターシグナルは、変更された形式のレポーターシグナルの質量電荷比を介して区別可能である。レポーターシグナルの質量は断片化により変更可能である。本発明のすべての側面の各種実施形態において、レポーターシグナルの変更は、その電荷を変更することもできる。共通特性は質量電荷比であってもよく、レポーターシグナルは電荷を変更することにより変更可能であり、変更された形式の標識タンパク質は、変更された形式のレポーターシグナルの質量電荷比の差を介して区別可能である。
【００１５】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、セットは２つ以上の、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、または１００以上の異なるレポーターシグナルを具備することができる。セットは１０以上の異なるレポーターシグナルを具備することができる。レポーターシグナルは、ペプチド、オリゴヌクレオチド類、炭水化物類、ポリマー、オリゴペプチド類、またはペプチド核酸類であってもよい。
【００１６】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、レポーターシグナルは、特定結合分子と関連付ける、あるいは連結することができる（たとえば、各レポーターシグナルは、様々な特定結合分子と関連付ける、あるいは連結することができる）。レポーターシグナルは、復号化タグと関連付ける、あるいは連結することができる（たとえば、各レポーターシグナルは、様々な復号化タグと関連付ける、あるいは連結することができる）。レポーターシグナルは、タンパク質またはペプチドと関連付ける、あるいは連結することができる。ペプチドは、同一のアミノ酸組成を有することができ、同一のアミノ酸配列を有することができ、様々な重同位体分布を含むことができ、様々なアミノ酸配列を有することができ、あるいは、様々な位置で不安定または切断結合を有することができる。
【００１７】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、形式によっては、インジケータシグナルは共通特性を有していない。
【００１８】
別の側面によると、本発明は複数セットの標識タンパク質を提供し、該標識タンパク質においては、各標識タンパク質がタンパク質またはペプチドとタンパク質またはペプチドに付加されるレポーターシグナルまたはインジケータシグナルとを具備し、レポーターシグナルは共通特性を有し、共通特性によって、同一のタンパク質またはペプチドを具備する標識タンパク質を共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる。実施形態によっては、レポーターシグナルは変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルは、すべての別の変更された形式のレポーターシグナルから区別可能であり、レポーターシグナルの変更は標識タンパク質を変更し、変更された形式の各標識タンパク質は、すべての別の変更された形式の標識タンパク質から区別可能であり、共通特性によって、標識タンパク質を共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、レポーターシグナルおよび１つ以上のインジケータシグナルは所定パターンを生成する。実施形態によっては、共通特性によって、標識タンパク質を共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、レポーターシグナルおよび／または１つ以上のインジケータシグナルは所定パターンを生成する。
【００１９】
別の側面によると、本発明は複数セットの標識タンパク質を提供し、該標識タンパク質においては、各標識タンパク質がタンパク質またはペプチドとタンパク質またはペプチドに付加されるレポーターシグナルまたはインジケータシグナルとを具備し、レポーターシグナルは変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルはすべての別の変更された形式のレポーターシグナルから区別可能であり、レポーターシグナルの変更は標識タンパク質を変更し、変更された形式の各標識タンパク質がすべての別の変更された形式の標識タンパク質から区別可能であり、レポーターシグナルおよび１つ以上のインジケータシグナルが所定パターンを生成する。
【００２０】
別の側面によると、本発明は複数セットの標識タンパク質を提供し、該標識タンパク質においては、各標識タンパク質がタンパク質またはペプチドとタンパク質またはペプチドに付加されるレポーターシグナルを具備し、レポーターシグナルは２つ以上のセットのレポーターシグナルのうちの１つに属し、各セット内のレポーターシグナルは共通特性を有し、レポーターシグナルの各セットの共通特性は別のセットのレポーターシグナルの共通特性と異なり、共通特性によって、同一のタンパク質またはペプチドを具備する標識タンパク質を共通特性を欠く分子から区別および／または分離でき、レポーターシグナルは変更可能であり、各セット内の変更された形式の各レポーターシグナルはセット内のすべての別の変更された形式のレポーターシグナルから区別可能であり、レポーターシグナルの変更は標識タンパク質を変更し、変更された形式の各標識タンパク質はすべての別の変更された形式の標識タンパク質から区別可能であり、共通特性によって、標識タンパク質を共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、レポーターシグナルは所定パターンを生成する  。
【００２１】
さらに別の側面によると、本発明は複数セットの標識タンパク質を提供し、該標識タンパク質において、各標識タンパク質はタンパク質またはペプチドとタンパク質またはペプチドに付加されるレポーターシグナルとを具備し、標識タンパク質は２つ以上のセットの標識タンパク質のうち１つに属し、各セット内の標識タンパク質は共通特性を有し、各セットの標識タンパク質の共通特性は別のセットの標識タンパク質の共通特性と異なる。実施形態によっては、共通特性によって、同一のタンパク質またはペプチドを具備する標識タンパク質を共通特性を欠く分子から区別および／または分離でき、レポーターシグナルは変更可能であり、各セット内の各標識タンパク質の変更された形式の各レポーターシグナルは、セット内の標識タンパク質のすべての別の変更された形式のレポーターシグナルから区別可能であり、レポーターシグナルの変更は標識タンパク質を変更し、各セット内の変更された形式の各標識タンパク質はセット内のすべての別の変更された形式の標識タンパク質から区別可能であり、共通特性によって、標識タンパク質を共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、レポーターシグナルは所定パターンを生成する。実施形態によっては、共通特性によって、標識タンパク質を共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、レポーターシグナルは変更可能であり、レポーターシグナルの変更は標識タンパク質を変更し、各セット内の変更された形式の各標識タンパク質は、セット内のすべての他の変更されていない形式の標識タンパク質から区別可能であり、共通特性によって、標識タンパク質を共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、レポーターシグナルは所定パターンを生成する。
【００２２】
別の側面によると、本発明は複数セットの標識タンパク質を提供し、該標識タンパク質において、各標識タンパク質はタンパク質またはペプチドとタンパク質またはペプチドに付加されるレポーターシグナルとを具備し、標識タンパク質は２つ以上のセットの標識タンパク質のうち１つに属し、レポーターシグナルは変更可能であり、各セット内の各標識タンパク質の変更された形式の各レポーターシグナルは、セット内の標識タンパク質のすべての別の変更された形式のレポーターシグナルから区別可能であり、レポーターシグナルの変更は標識タンパク質を変更し、各セット内の変更された形式の各標識タンパク質はセット内のすべての別の変更された形式の標識タンパク質から区別可能であり、レポーターシグナルは所定パターンを生成する。
【００２３】
さらに別の側面によると、本発明は１セットのレポーター分子および１つ以上のインジケータ分子を具備するキットを提供し、該キットにおいて、各レポーター分子はレポーターシグナルおよび結合タグを具備し、レポーターシグナルは共通特性を有し、共通特性によって、レポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、レポーターシグナルは変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルはすべての別の変更された形式のレポーターシグナルから区別可能であり、それぞれの異なるレポーター分子は様々な結合タグおよび様々なレポーターシグナルを具備し、各インジケータ分子はインジケータシグナルおよび結合タグを具備し、共通特性によって、レポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、レポーターシグナルおよび１つ以上のインジケータシグナルは所定パターンを生成する。
【００２４】
別の側面によると、本発明は標識タンパク質を提供し、標識タンパク質はタンパク質またはペプチドとタンパク質またはペプチドに付加されるレポーターシグナルまたはインジケータシグナルとを具備し、標識タンパク質は共通特性を有し、共通特性によって、標識タンパク質を共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、レポーターシグナルは変更可能であり、レポーターシグナルの変更は標識タンパク質を変更し、変更された形式の標識タンパク質は変更されなかった形式の標識タンパク質から区別可能であり、共通特性によって、標識タンパク質を共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、レポーターシグナルおよび１つ以上のインジケータシグナルは所定パターンを生成する。
【００２５】
別の側面によると、本発明は１セットのレポーター分子を具備するキットを提供し、該キットにおいて、各レポーター分子はレポーターシグナルおよび結合タグを具備し、レポーターシグナルは２つ以上のセットのレポーターシグナルのうちの１つを属し、各セット内のレポーターシグナルは共通特性を有し、各セットのレポーターシグナルの共通特性は別のセットのレポーターシグナルの共通特性と異なり、共通特性によって、レポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、レポーターシグナルは変更可能であり、各セット内の変更された形式の各レポーターシグナルは、セット内のすべての別の変更された形式のレポーターシグナルと区別可能であり、それぞれの異なるレポーター分子は様々な結合タグと様々なレポーターシグナルとを具備し、共通特性によって、レポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、レポーターシグナルは所定パターンを生成する。
【００２６】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、共通特性が質量電荷比であり、レポーターシグナルが質量を変更することにより変更可能であり、変更された形式の標識タンパク質が変更された形式のレポーターシグナルの質量電荷比の差を介して区別可能である。レポーターシグナルの質量は断片化により変更可能である。
【００２７】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、レポーターシグナルはタンパク質またはペプチドに結合することができる。共通特性により、標識タンパク質を共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる。共通特性は、レポーターシグナルと関連付けられる１つ以上のアフィニティタグであってもよい。１つ以上のアフィニティタグはレポーターシグナルと関連付けることができる。各標識タンパク質はタンパク質またはペプチドとタンパク質またはペプチドに付加されるレポーターシグナルまたはインジケータシグナルとを具備することができ、レポーターシグナルはペプチドを具備し、レポーターシグナルは同じ質量電荷比を有し、インジケータシグナルはレポーターシグナルと同じ質量電荷比を有していない。レポーターシグナルペプチドは同一のアミノ酸組成を有することができる、あるいは同一のアミノ酸配列を有することができる。各レポーターシグナルペプチドは様々な分布の重同位体を含むことができる、様々な代替的な基を含むことができる、あるいは様々なアミノ酸配列を有することができる。各レポーターシグナルペプチドは様々な位置で不安定または切断結合を有することができる。１つ以上のアフィニティタグはレポーターシグナルと関連付けることができる。
【００２８】
別の側面によると、本発明は１セットのレポーターシグナルキャリブレータ、１つ以上のインジケータシグナルキャリブレータ、および１セットの標的タンパク質断片を具備する混合物を提供し、該混合物において、各レポーターシグナルキャリブレータはセットの標的タンパク質断片内の標的タンパク質断片と共通特性を共有し、共通特性によって、共通特性を有する標的タンパク質断片（たとえば、これらのうちそれぞれ）およびレポーターシグナルキャリブレータを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、共通特性を共有する標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータは相互に対応し、標的タンパク質断片（たとえば、これらのうちそれぞれ）は変更可能であり、変更された形式の標的タンパク質断片（たとえば、これらのうちそれぞれ）は他の変更された形式の（たとえば、すべての他の変更された形式の）標的タンパク質断片から区別可能であり、レポーターシグナルキャリブレータ（たとえば、これらのうちそれぞれ）は変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルキャリブレータは、レポーターシグナルキャリブレータが共通特性を共有する変更された形式の標的タンパク質断片から区別可能であり、共通特性を有する標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを共通特性を欠く分子から区別および／または分離可能な状況において、レポーターシグナルキャリブレータおよび少なくとも１つのインジケータシグナルキャリブレータは所定パターンを生成することができる。
【００２９】
別の側面によると、本発明は複数セットの標的タンパク質断片を提供し、該標的タンパク質断片において、各標的タンパク質断片は１セットのレポーターシグナルキャリブレータ内のレポーターシグナルキャリブレータと共通特性を共有し、共通特性によって、共通特性を有する標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを共通特性を欠く分子から区別および／または分離でき、共通特性を共有する標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータは相互に対応し、標的タンパク質断片は変更可能であり、変更された形式の標的タンパク質断片は他の変更された形式の標的タンパク質断片から区別可能であり、レポーターシグナルキャリブレータは変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルキャリブレータは、レポーターシグナルキャリブレータが共通特性を共有する変更された形式の標的タンパク質断片から区別可能であり、共通特性を有する標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを共通特性を欠く分子から区別および／または分離可能な状況において、レポーターシグナルキャリブレータおよび１つ以上のインジケータシグナルキャリブレータは所定パターンを生成することができる。
【００３０】
別の側面によると、本発明は複数セットのレポーターシグナルキャリブレータおよび１つ以上のインジケータシグナルキャリブレータを提供し、各レポーターシグナルキャリブレータは１セットの標的タンパク質断片内の標的タンパク質断片と共通特性を共有し、共通特性によって、共通特性を有する標的タンパク質断片（たとえば、これらのうちそれぞれ）およびレポーターシグナルキャリブレータを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、共通特性を共有する標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータは相互に対応し、標的タンパク質断片（たとえば、これらのうちそれぞれ）は変更可能であり、変更された形式の標的タンパク質断片（たとえば、これらのうちそれぞれ）は他の変更された形式の（たとえば、すべての他の変更された形式の）標的タンパク質断片から区別可能であり、レポーターシグナルキャリブレータ（たとえば、これらのうちそれぞれ）は変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルキャリブレータは、レポーターシグナルキャリブレータが共通特性を共有する変更された形式の標的タンパク質断片から区別可能であり、共通特性を有する標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを共通特性を欠く分子から区別および／または分離可能である状況においてレポーターシグナルキャリブレータおよび少なくとも１つのインジケータシグナルキャリブレータは所定パターンを生成することができる。
【００３１】
別の側面によると、本発明はタンパク質シグニチャを作成するキットを提供し、該キットは（ａ）１セットのレポーターシグナルキャリブレータおよび１つ以上のインジケータシグナルキャリブレータであって、各レポーターシグナルキャリブレータは１セットの標的タンパク質断片内の標的タンパク質断片と共通特性を共有し、共通特性は、共通特性を有する標的タンパク質断片（たとえば、これらのうちそれぞれ）およびレポーターシグナルキャリブレータを共通特性を欠く分子から区別および／または分離可能とし、共通特性を共有する標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータは相互に対応し、標的タンパク質断片（たとえば、これらのうちそれぞれ）は変更可能であり、変更された形式の標的タンパク質断片（たとえば、これらのうちそれぞれ）は他の変更された形式の（たとえば、すべての他の変更された形式の）標的タンパク質断片から区別可能であり、各レポーターシグナルキャリブレータは変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルキャリブレータは、レポーターシグナルキャリブレータが共通特性を共有する変更された形式の標的タンパク質断片から区別可能であり、共通特性を有する標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを共通特性を欠く分子から区別および／または分離可能にする状況において、レポーターシグナルキャリブレータおよび少なくとも１つのインジケータシグナルキャリブレータは所定パターンを生成することができるレポーターシグナルキャリブレータおよびインジケータシグナルキャリブレータと、（ｂ）タンパク質サンプルを処理してタンパク質断片を作成するための１つ以上の試薬とを備える。
【００３２】
別の側面によると、本発明は複数セットの標的タンパク質断片および１つ以上のインジケータシグナルキャリブレータを提供し、各標的タンパク質断片は、１セットのレポーターシグナルキャリブレータのレポーターシグナルキャリブレータと共通特性を共有し、共通特性によって、共通特性を有する標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータの各々を共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、共通特性を共有する標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータは相互に対応し、各標的タンパク質断片は変更可能であり、変更された形式の各標的タンパク質断片はすべての別の変更された形式の標的タンパク質断片から区別可能であり、各レポーターシグナルキャリブレータは変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルキャリブレータは、レポーターシグナルキャリブレータが共通特性を共有する変更された形式の標的タンパク質断片から区別可能であり、共通特性を有する標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを共通特性を欠く分子から区別および／または分離可能とする状況において、レポーターシグナルキャリブレータおよび少なくとも１つのインジケータシグナルキャリブレータは所定パターンを生成することができる。
【００３３】
別の側面によると、本発明は複数セットのレポーターシグナルキャリブレータを提供し、レポーターシグナルキャリブレータは２つ以上のセットのレポーターシグナルキャリブレータのうちの１つに属し、各セット内の各レポーターシグナルキャリブレータは１セットの標的タンパク質断片内の標的タンパク質断片と共通特性を共有し、各セットのレポーターシグナルキャリブレータの共通特性は別のセットのレポーターシグナルキャリブレータの共通特性と異なり、共通特性によって、共通特性を有する標的タンパク質断片（たとえば、これらのうちそれぞれ）とレポーターシグナルキャリブレータを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、共通特性を共有する標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータは相互に対応し、標的タンパク質断片（たとえば、これらのうちそれぞれ）は変更可能であり、変更された形式の標的タンパク質断片（たとえば、これらのうちそれぞれ）は他の変更された形式の（たとえば、すべての他の変更された形式の）標的タンパク質断片から区別可能であり、レポーターシグナルキャリブレータ（たとえば、これらのうちそれぞれ）は変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルキャリブレータは、レポーターシグナルキャリブレータが共通特性を共有する変更された形式の標的タンパク質断片から区別可能であり、共通特性を有する標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを共通特性を欠く分子から区別および／または分離可能とする状況において、レポーターシグナルキャリブレータは所定パターンを生成することができる。
【００３４】
別の側面によると、本発明はタンパク質シグニチャを作成するキットを提供し、該キットは、（ａ）２つ以上のセットのレポーターシグナルキャリブレータであって、レポーターシグナルキャリブレータは２つ以上のセットのレポーターシグナルキャリブレータのうちの１つに属し、各セット内の各レポーターシグナルキャリブレータは１セットの標的タンパク質断片内の標的タンパク質断片と共通特性を共有し、各セットのレポーターシグナルキャリブレータの共通特性は別のセットのレポーターシグナルキャリブレータの共通特性と異なり、共通特性は、共通特性を有する標的タンパク質断片（たとえば、これらのうちそれぞれ）およびレポーターシグナルキャリブレータを共通特性を欠く分子から区別および／または分離可能とし、共通特性を共有する標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータは相互に対応し、標的タンパク質断片（たとえば、これらのうちそれぞれ）は変更可能であり、変更された形式の標的タンパク質断片（たとえば、これらのうちそれぞれ）は他の変更された形式の（たとえば、すべての他の変更された形式の）の標的タンパク質断片から区別可能であり、レポーターシグナルキャリブレータ（たとえば、これらのうちそれぞれ）は変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルキャリブレータは、レポーターシグナルキャリブレータが共通特性を共有する変更された形式の標的タンパク質断片から区別可能であり、共通特性を有する標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを共通特性を欠く分子から区別および／または分離可能な状況において、レポーターシグナルキャリブレータは所定パターンを生成することができるレポーターシグナルキャリブレータと、（ｂ）タンパク質サンプルを処理してタンパク質断片を作成するための１つ以上の試薬とを備える。
【００３５】
別の側面によると、本発明は２つ以上のセットのレポーターシグナルキャリブレータと１セットの標的タンパク質断片とを具備する混合物を提供し、該混合物において、レポーターシグナルキャリブレータは２つ以上のセットのレポーターシグナルキャリブレータのうち１つに属し、各セット内の各レポーターシグナルキャリブレータはセットの標的タンパク質断片内の標的タンパク質断片と共通特性を共有し、各セットのレポーターシグナルキャリブレータの共通特性は別のセットのレポーターシグナルキャリブレータの共通特性と異なり、共通特性によって、共通特性を有する標的タンパク質断片（たとえば、これらのうちそれぞれ）およびレポーターシグナルキャリブレータを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、共通特性を共有する標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータは相互に対応し、標的タンパク質断片（たとえば、これらのうちそれぞれ）は変更可能であり、変更された形式の標的タンパク質断片（たとえば、これらのうちそれぞれ）は他の変更された形式の（たとえば、すべての他の変更された形式の）標的タンパク質断片から区別可能であり、レポーターシグナルキャリブレータ（たとえば、これらのうちそれぞれ）は変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルキャリブレータは、レポーターシグナルキャリブレータが共通特性を共有する変更された形式の標的タンパク質断片から区別可能であり、共通特性を有する標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを共通特性を欠く分子から区別および／または分離可能とする状況において、レポーターシグナルキャリブレータは所定パターンを生成することができる。
【００３６】
さらに別の側面によると、本発明は複数セットの標的タンパク質断片を提供し、各標的タンパク質断片は１セットのレポーターシグナルキャリブレータ内のレポーターシグナルキャリブレータと共通特性を共有し、レポーターシグナルキャリブレータは２つ以上のセットのレポーターシグナルキャリブレータのうちの１つに属し、各セットのレポーターシグナルキャリブレータの共通特性は別のセットのレポーターシグナルキャリブレータの共通特性と異なり、共通特性によって、共通特性を有する標的タンパク質断片（たとえば、これらのそれぞれ）およびレポーターシグナルキャリブレータを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、共通特性を共有する標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータは相互に対応し、標的タンパク質断片（たとえば、これらのうちそれぞれ）は変更可能であり、変更された形式の標的タンパク質断片（たとえば、これらのうちそれぞれ）は他の変更された形式の（たとえば、すべての他の変更された形式の）標的タンパク質断片から区別可能であり、レポーターシグナルキャリブレータ（たとえば、これらのうちそれぞれ）は変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルキャリブレータは、レポーターシグナルキャリブレータが共通特性を共有する変更された形式の標的タンパク質断片から区別可能であり、共通特性を有する標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを共通特性を欠く分子から区別および／または分離可能な状況において、レポーターシグナルキャリブレータは所定パターンを生成することができる。
【００３７】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、セットは所定量の各レポーターシグナルキャリブレータを含むことができる。少なくとも２つのレポーターシグナルキャリブレータの量は異なっていてもよい。各レポーターシグナルキャリブレータの相対量は、タンパク質サンプル内にあると予測される各対応標的タンパク質断片の相対量に基づくことができる。レポーターシグナルキャリブレータの各々の量は同じであってもよい。標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータは、断片化により変更可能である。標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータは、光解離性アミノ酸での切断によって変更可能である。標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータは衝突細胞内で断片化することができる。標的タンパク質断片は、アスパラギン酸−プロリン結合で断片化することができる。
【００３８】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、標的タンパク質断片は、タンパク質サンプルのプロテアーゼ消化によって作成することができる。標的タンパク質断片は、セリンプロテアーゼを有するタンパク質サンプルの消化によって作成することができる。セリンプロテアーゼはトリプシンであってもよい。標的タンパク質断片は、光解離性アミノ酸での切断により作成することができる。
【００３９】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、共通特性は質量電荷比であってもよく、標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータはその質量、その電荷、またはその質量および電荷を変更することにより変更可能であり、変更された形式の標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータは、変更された形式の標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータの質量電荷比の差を介して区別可能である。
【００４０】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、セットのレポーターシグナルキャリブレータは、２つ以上の、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、または１００以上の異なるレポーターシグナルキャリブレータを具備することができる。セットのレポーターシグナルキャリブレータは、１０以上の異なるレポーターシグナルキャリブレータを具備することができる。セットの標的タンパク質断片は、２つ以上の、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、または１００以上の異なる標的タンパク質断片を具備することができる。
【００４１】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、レポーターシグナルキャリブレータはペプチドを具備することができ、ペプチドは対応する標的タンパク質断片と同じ質量電荷比を有する。ペプチドは対応する標的タンパク質断片と同一のアミノ酸組成を有することができる。ペプチドは対応する標的タンパク質断片と同一のアミノ酸配列を有することができる。各ペプチドは対応する標的タンパク質断片と異なるアミノ酸配列を有することができる。各ペプチドは様々な位置で不安定または切断結合を有することができる。
【００４２】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、レポーターシグナルキャリブレータは、ペプチド、オリゴヌクレオチド類、炭水化物類、ポリマー、オリゴペプチド類、またはペプチド核酸類であってもよい。少なくとも１つの標的タンパク質断片は少なくとも１つの修飾アミノ酸を具備することができる。修飾アミノ酸は、リン酸化アミノ酸、アシル化アミノ酸、またはグリコシル化アミノ酸であってもよい。少なくとも１つの標的タンパク質断片は、修飾アミノ酸を除き、修飾アミノ酸を具備する標的タンパク質断片と同じであってもよい。
【００４３】
別の側面によると、本発明は複数セットの核酸分子を提供し、各核酸分子はレポーターシグナルペプチドまたはインジケータシグナルペプチドおよび当該タンパク質またはペプチドを具備するアミノ酸セグメントを符号化するヌクレオチドセグメントを具備し、レポーターシグナルペプチド（あるいは、レポーターシグナルペプチドを具備するアミノ酸セグメント）は共通特性を有し、共通特性によって、レポーターシグナルペプチド（あるいは、レポーターシグナルペプチドを具備するアミノ酸セグメント）を共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、レポーターシグナルペプチドは変更可能である。実施形態によっては、変更された形式の各レポーターシグナルペプチドは変更された形式の別のレポーターシグナルペプチドから区別可能であり、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、レポーターシグナルペプチドおよび１つ以上のインジケータシグナルペプチドは所定パターンを生成する。実施形態によっては、レポーターシグナルペプチドの変更はアミノ酸セグメントを変更し、変更された形式の各アミノ酸セグメントは変更された形式の別のアミノ酸セグメントから区別可能であり、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、レポーターシグナルペプチドおよび１つ以上のインジケータシグナルペプチドは所定パターンを生成する。
【００４４】
別の側面によると、本発明は複数セットの核酸分子を提供し、各核酸分子はレポーターシグナルペプチドおよび当該タンパク質またはペプチドを具備するアミノ酸セグメントを符号化するヌクレオチドセグメントを具備し、レポーターシグナル（あるいは、アミノ酸セグメント）は２つ以上のセットのレポーターシグナルのうち１つに属し（あるいは、２つ以上のセットのアミノ酸セグメントのうちの１つに属し）、各セット内のレポーターシグナルペプチド（あるいは、アミノ酸セグメント）は共通特性を有し、各セットのレポーターシグナル（あるいは、アミノ酸セグメント）の共通特性は別のセットのレポーターシグナル（あるいは、アミノ酸セグメント）の共通特性と異なり、共通特性によって、レポーターシグナルペプチド（あるいは、アミノ酸セグメント）を共通特性を欠く分子から区別および／または分離でき、レポーターシグナルペプチドが変更可能であり、たとえば、変更された形式の各レポーターシグナルペプチドは変更された形式の別のレポーターシグナルペプチドから区別可能であり、あるいはレポーターシグナルペプチドの変更はアミノ酸セグメントを変更し、変更された形式の各アミノ酸セグメントは変更された形式の別のアミノ酸セグメントから区別可能であり、共通特性によって、レポーターシグナルペプチド（あるいは、アミノ酸セグメント）を共通特性を欠く分子から区別および／または分離できる状況において、レポーターシグナルペプチド（あるいは、アミノ酸セグメント）は所定パターンを生成する。
【００４５】
別の側面によると、本発明は複数セットの核酸分子を提供し、各核酸分子はレポーターシグナルペプチドまたはインジケータシグナルペプチドおよび当該タンパク質またはペプチドを具備するアミノ酸セグメントを符号化するヌクレオチドセグメントを具備し、各アミノ酸セグメントはアミノ酸サブセグメントを具備し、各アミノ酸サブセグメントは当該タンパク質またはペプチドの１部とレポーターシグナルペプチドまたはインジケータシグナルペプチドのすべてまたは１部とを具備し、アミノ酸サブセグメント（たとえば、レポーターシグナルペプチドのすべてまたは１部を具備するアミノ酸セグメント）は共通特性を有し、共通特性によって、アミノ酸サブセグメント（たとえば、レポーターシグナルペプチドのすべてまたは１部を具備するアミノ酸セグメント）を共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、レポーターシグナルペプチドは変更可能であり、たとえば、変更された形式の各レポーターシグナルペプチドは変更された形式の別のレポーターシグナルペプチドから区別可能であり、あるいはレポーターシグナルペプチドの変更はアミノ酸サブセグメントを変更し、変更された形式の各アミノ酸サブセグメントは変更された形式の別のアミノ酸サブセグメントから区別可能であり、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドのすべてまたは１部を具備するアミノ酸セグメントを共通特性を欠く分子から区別および／または分離可能な状況において、アミノ酸サブセグメントは所定パターンを生成する。
【００４６】
別の側面によると、本発明は複数セットの核酸分子を提供し、各核酸分子はレポーターシグナルペプチドおよび当該タンパク質またはペプチドを具備するアミノ酸セグメントを符号化するヌクレオチドセグメントを具備し、各アミノ酸セグメントはアミノ酸サブセグメントを具備し、各アミノ酸サブセグメントは当該タンパク質またはペプチドの１部とレポーターシグナルペプチドのすべてまたは１部とを具備し、アミノ酸サブセグメントは２つ以上のセットのアミノ酸サブセグメントのうちの１つに属し、各セット内のアミノ酸サブセグメントは共通特性を有し、各セットのアミノ酸サブセグメントの共通特性は別のセットのアミノ酸サブセグメントの共通特性と異なる。実施形態によっては、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドのすべてまたは１部を具備するアミノ酸サブセグメントを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、レポーターシグナルペプチドは変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルペプチドは変更された形式の別のレポーターシグナルペプチドから区別可能であり、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドのすべてまたは１部を具備するアミノ酸セグメントを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、アミノ酸サブセグメントは所定パターンを生成する。実施形態によっては、共通特性によって、アミノ酸サブセグメントを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、レポーターシグナルペプチドは変更可能であり、レポーターシグナルペプチドの変更はアミノ酸サブセグメントを変更し、変更された形式の各アミノ酸サブセグメントは変更された形式の別のアミノ酸サブセグメントから区別可能であり、レポーターシグナルペプチドのすべてまたは１部を具備するアミノ酸セグメントを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、アミノ酸サブセグメントは所定パターンを生成する。
【００４７】
別の側面によると、本発明は複数セットのアミノ酸セグメントを提供し、各アミノ酸セグメントはレポーターシグナルペプチドおよび当該タンパク質またはペプチドを具備し、レポーターシグナルペプチドは２つ以上のセットのレポーターシグナルペプチドのうち１つに属し、各セット内のレポーターシグナルペプチドは共通特性を有し、各セットのレポーターシグナルペプチド内の共通特性は別のセットのレポーターシグナルペプチドの共通特性と異なり、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、レポーターシグナルペプチドは変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルペプチドは変更された形式の別のレポーターシグナルペプチドから区別可能であり、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、レポーターシグナルペプチドは所定パターンを生成する。
別の側面によると、本発明は複数セットのアミノ酸セグメントを提供し、各アミノ酸セグメントはレポーターシグナルペプチドまたはインジケータシグナルペプチドおよび当該タンパク質またはペプチドを具備し、レポーターシグナルペプチドは共通特性を有し、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、レポーターシグナルペプチドは変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルペプチドは変更された形式の別のレポーターシグナルペプチドから区別可能であり、共通特性によって、レポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、レポーターシグナルペプチドおよび１つ以上のインジケータシグナルペプチドは所定パターンを生成する。
【００４８】
別の側面によると、本発明は細胞および複数セットの細胞を提供し、セット内の各細胞または各細胞は核酸分子を具備し、各核酸分子はレポーターシグナルペプチドまたはインジケータシグナルペプチドおよび当該タンパク質またはペプチドを具備するアミノ酸セグメントを符号化するヌクレオチドセグメントを具備し、レポーターシグナルペプチドは共通特性を有し、共通特性によって、レポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別または分離することができ、レポーターシグナルペプチドは変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルペプチドは変更された形式の別のレポーターシグナルペプチドから変更可能であり、共通特性によって、レポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別または分離することができる状況において、レポーターシグナルペプチドおよび１つ以上のインジケータシグナルペプチドは所定パターンを生成する。
【００４９】
別の側面によると、本発明は１セットの核酸分子を具備する細胞を提供し、該細胞において、各核酸分子は、レポーターシグナルペプチドおよび当該タンパク質またはペプチドを具備するアミノ酸セグメントを符号化するヌクレオチドセグメントを具備し、レポーターシグナルペプチドは２つ以上のセットのレポーターシグナルペプチドのうちの１つに属し、各セット内のレポーターシグナルペプチドは共通特性を有し、各セットのレポーターシグナルペプチドの共通特性は別のセットのレポーターシグナルペプチドの共通特性と異なり、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、レポーターシグナルペプチドは変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルペプチドは変更された形式の別のレポーターシグナルペプチドから区別可能であり、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、レポーターシグナルペプチドは所定パターンを生成する。
【００５０】
別の側面によると、本発明は複数セットの細胞または生体を提供し、各細胞または各生体は核酸分子を具備し、各核酸分子は、レポーターシグナルペプチドおよび当該タンパク質またはペプチドを具備するアミノ酸セグメントを符号化するヌクレオチドセグメントを具備し、レポーターシグナルペプチドは２つ以上のセットのレポーターシグナルペプチドのうちの１つに属し、各セット内のレポーターシグナルペプチドは共通特性を有し、各セットのレポーターシグナルペプチドの共通特性は別のセットのレポーターシグナルペプチドの共通特性と異なり、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、レポーターシグナルペプチドが変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルペプチドは変更された形式の別のレポーターシグナルペプチドから区別可能であり、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、レポーターシグナルペプチドは所定パターンを生成する。
【００５１】
別の側面によると、本発明は生体または複数セットの生体を提供し、該セット内の生体または各生体は核酸分子を具備し、各核酸分子は、レポーターシグナルペプチドまたはインジケータシグナルペプチドおよび当該タンパク質またはペプチドを具備するアミノ酸セグメントを符号化するヌクレオチドセグメントを具備し、レポーターシグナルペプチドは共通特性を有し、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、レポーターシグナルペプチドが変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルペプチドは変更された形式の別のレポーターシグナルペプチドから区別可能であり、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、レポーターシグナルペプチドおよび１つ以上のインジケータシグナルペプチドは所定パターンを生成する。
【００５２】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、各核酸分子は発現配列をさらに具備することができ、アミノ酸セグメントが発現されるように、発現配列を動作可能にヌクレオチドセグメントに結合することができる。各核酸分子の発現配列は異なっていてもよい。様々な発現配列は、差別的に調整されてもよい。発現配列は同様に調整されてもよい。複数の発現配列は、同一の発現カスケードの１部として発現される遺伝子の発現配列でもよいし、あるいはその遺伝子から得られてもよい。発現配列は翻訳発現配列および／または転写発現配列を具備することができる。アミノ酸セグメントは生体外または生体内で発現させることができる。アミノ酸セグメントは細胞培養内で発現させることができる。各核酸分子の発現配列は同一であってもよい。少なくとも２つの核酸分子の発現配列は異なっていても同一でもよい。各核酸分子はさらに複製配列を具備することができ、複製配列は核酸分子の複製を可能にする。
【００５３】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、核酸分子は生体外または生体内で複製することができる。核酸分子は細胞培養内で複製することができる。各核酸分子はさらに統合配列を具備することができ、統合配列により核酸分子を他の核酸類に統合することができる。核酸分子は（たとえば、所定の位置で）染色体に統合することができる。核酸類分子は１つ以上の核酸サンプル内で核酸類を複製することにより作成できる。核酸類は対のプライマーを用いて複製することができ、核酸分子を作成するのに使用されるプライマー対の各第１のプライマーは、レポーターシグナルペプチドを符号化するヌクレオチド配列を具備することができる。各第１のプライマーはさらに発現配列を具備することができる。各第１のプライマーのヌクレオチド配列はエピトープタグも符号化する。
【００５４】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、各アミノ酸セグメントはさらにエピトープタグを具備することができる。各アミノ酸セグメントのエピトープタグは異なっていても同一でもよい。少なくとも２つのアミノ酸セグメントのエピトープタグは異なっていても同一でもよい。各アミノ酸セグメントのレポーターシグナルペプチドは異なっていても同一でもよい。少なくとも２つのアミノ酸セグメントのレポーターシグナルペプチドは異なっていても同一でもよい。
【００５５】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、核酸分子は細胞または細胞株内にあってもよい。各核酸分子は異なる細胞（あるいは、細胞株）内にあっても、あるいは同一の細胞（あるいは、細胞株）内にあってもよい。核酸分子は生体にあってもよい。各核酸分子は異なる生体内にあっても、あるいは同一の生体内にあってもよい。核酸分子は細胞または生体の染色体（たとえば、所定の位置で）に統合することができる。染色体は人工染色体であってもよい。核酸分子はプラスミドであってもよいし、あるいはプラスミドに統合されていてもよい。核酸分子は、生体（たとえば、生体の細胞のほぼ全部または生体の細胞の１部）の細胞内にあってもよい。アミノ酸セグメントは生体の細胞のほぼ全部または生体の細胞の１部において発現させることができる。
【００５６】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、各アミノ酸セグメントの当該タンパク質またはペプチドは異なっていても同一でもよい。少なくとも２つのアミノ酸セグメントの当該タンパク質またはペプチドは異なっていても同一でもよい。当該タンパク質またはペプチドは関連していてもよい、同一のカスケード内で生成されるタンパク質であってもよい、同一の酵素経路内のタンパク質であってもよい、同一の状況下で発現されるタンパク質であってもよい、同一の疾病と関連付けられるタンパク質であってもよい、同一の細胞種または同一の組織種と関連付けられるタンパク質であってもよい。
【００５７】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、ヌクレオチドセグメントは、それぞれがレポーターシグナルペプチドまたはインジケータシグナルペプチドおよび当該タンパク質またはペプチドを具備する複数のアミノ酸セグメントを符号化することができる。ヌクレオチドセグメントのうちの１つの少なくとも２つのアミノ酸セグメントの当該タンパク質またはペプチドは異なっていてもよい。ヌクレオチドセグメントのうちの１つのアミノ酸セグメントの当該タンパク質またはペプチドは異なっていてもよい。各ヌクレオチドセグメントの少なくとも２つのアミノ酸セグメントの当該タンパク質またはペプチドは異なっていてもよい。各ヌクレオチドセグメントのアミノ酸セグメントの当該タンパク質またはペプチドは異なっていてもよい。
【００５８】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、セットの核酸分子は単独の核酸分子から成ることができる。核酸分子は、それぞれがアミノ酸セグメントを符号化する複数のヌクレオチドセグメントを具備することができる。アミノ酸セグメントは、レポーターシグナルペプチドと当該タンパク質またはペプチド間の接合部近傍に切断部位を具備することができる。切断部位はトリプシン切断部位であってもよい。切断部位はレポーターシグナルペプチドと当該タンパク質またはペプチド間の接合部にあってもよい。各アミノ酸セグメントは自己開裂セグメントをさらに具備することができる。自己開裂セグメントはレポーターシグナルペプチドと当該タンパク質またはペプチドの間にあってもよい。自己開裂セグメントはインテインセグメントであってもよい。
【００５９】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、アミノ酸セグメントはタンパク質またはペプチドであってもよい。セットのアミノ酸セグメントは単独のアミノ酸セグメントで構成することができ、アミノ酸セグメントは複数のレポーターシグナルペプチドを具備する。
【００６０】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、各細胞または生体は追加核酸分子をさらに具備することができる。セットの細胞は単独の細胞から成ることができ、細胞は複数の核酸分子を具備する。セットは単独の細胞から成ることができ、細胞は１セットの核酸分子を具備し、セットの核酸分子は単独の核酸分子から成り、核酸分子は複数の核酸セグメントを符号化する。同様に、セットの生体は単独の生体から成ることができ、生体は複数の核酸分子を具備する。セットは単独の生体から成ることができ、生体は１セットの核酸分子を具備し、セットの核酸分子は単独の核酸分子から成り、核酸分子は複数の核酸セグメントを符号化する。
【００６１】
別の側面によると、本発明は、（ａ）１つのサンプルまたは複数のサンプルのうちの各サンプルにおいて、各セット内のレポーターシグナルが共通特性を有し、各セットのレポーターシグナルの共通特性が他のセットのレポーターシグナルの共通特性と異なる２つ以上のセットのレポーターシグナルを共通特性を欠く分子から分離するステップと、（ｂ）レポーターシグナルおよび１つ以上のインジケータシグナルによって生成される所定パターンを識別するステップと、（ｃ）所定パターンを生成するレポーターシグナルを変更するステップと、（ｄ）変更された形式のレポーターシグナルを検出し相互に区別するステップとを具備する方法を提供する。
【００６２】
別の側面によると、本発明は、（ａ）１つのサンプルまたは複数のサンプルのうちの各サンプルにおいて、それぞれが共通特性を有する１つ以上のレポーターシグナルおよび１つ以上のインジケータシグナルを共通特性を欠く分子から分離するステップと、（ｂ）レポーターシグナルによって生成される所定パターンを識別するステップと、（ｃ）所定パターンを生成するレポーターシグナルを変更するステップと、（ｄ）変更された形式のレポーターシグナルを検出し相互に区別するステップとを具備する方法を提供する。
【００６３】
本発明の形式によっては、インジケータシグナルは共通特性を有していない。共通特性によって、レポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、セットのレポーターシグナルおよび１つ以上のインジケータシグナルは所定パターンを生成できる。共通特性は質量電荷比であってもよく、レポーターシグナルがその質量を変更することにより変更可能であり、変更された形式のレポーターシグナルは変更された形式のレポーターシグナルの質量電荷比の差を介して区別することができる。レポーターシグナルの質量は断片化により変更可能である。セットのレポーターシグナルは、２つ以上の、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、または１００以上の異なるレポーターシグナルを具備することができる。セットのレポーターシグナルは、１０以上の異なるレポーターシグナルを具備することができる。
【００６４】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、レポーターシグナルはペプチド、オリゴヌクレオチド類、炭水化物類、ポリマー、オリゴペプチド類、またはペプチド核酸類であってもよい。レポーターシグナルは特定結合分子と関連付ける、あるいは結合させることができ、各レポーターシグナルは様々な特定結合分子と関連付ける、あるいは結合させることができる。レポーターシグナルは復号化タグと関連付ける、あるいは結合させることができ、各レポーターシグナルは様々な復号化タグと関連付ける、あるいは結合させることができる。
【００６５】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、該方法はステップ（ａ）の前に、レポーターシグナルを１つ以上の検体と関連付けるステップをさらに具備することができ、該ステップにおいて、各レポーターシグナルは様々な特定結合分子と関連付ける、あるいは結合させることができ、各特定結合分子は検体のうちの異なる１つと具体的に相互に作用することができ、レポーターシグナルは特定結合分子と検体との相互作用を介して検体と関連付けることができる。ステップ（ａ）〜（ｄ）は、そのたびに異なるセットの１つ以上のレポーターシグナルを用いて１度以上の回数繰り返すことができる（同じまたは異なるセットのインジケータシグナルをそのたびに使用することができる場合）。ステップ（ａ）の前に、異なるセットのレポーターシグナルを異なるサンプルと関連付けることができる。
【００６６】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、異なるセットのレポーターシグナルはそれぞれ同一のレポーターシグナルを具備することができる。複数セットのレポーターシグナルはそれぞれ単独のレポーターシグナルを含むことができる。セット内のすべてのレポーターシグナルが共通特性を欠く分子から区別および／または分離される必要はなく、レポーターシグナルのすべてが変更される必要はなく、すべての変更された形式のレポーターシグナルが同時に検出される必要はない。セット内のすべてのレポーターシグナルが共通特性を欠く分子から区別および／または分離でき、すべてのレポーターシグナルが変更可能であり、すべての変更された形式のレポーターシグナルが様々な時点で検出することができる。
【００６７】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｄ）は各レポーターシグナルに対して別々に実行することができる。レポーターシグナルはペプチドを具備することができ、ペプチドは同じ質量電荷比を有する。ペプチドは同一のアミノ酸組成または同一のアミノ酸配列を有することができる。各ペプチドは様々な分布の重同位体を含むことができ、様々なアミノ酸配列を有することができ、あるいは様々な位置で不安定または切断結合を有することができる。
【００６８】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、共通特性によって、レポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、セットのレポーターシグナルおよび１つ以上のインジケータシグナルは所定パターンを生成することができる。すべてのレポーターシグナルが共通特性を欠く分子から区別および／または分離される必要はなく、レポーターシグナルのすべてが変更される必要はなく、すべての変更された形式のレポーターシグナルが同時に検出される必要はない。すべてのレポーターシグナルが共通特性を欠く分子から区別および／または分離でき、すべてのレポーターシグナルが変更可能であり、すべての変更された形式のレポーターシグナルが様々な時点で検出することができる。
【００６９】
別の側面によると、本発明は、（ａ）１つ以上の標識タンパク質を分離するステップであって、各標識タンパク質はタンパク質またはペプチドとタンパク質またはペプチドに付加されるレポーターシグナルとを具備し、レポーターシグナルは２つ以上のセットのレポーターシグナルのうち１つに属し、各レポーターシグナルは共通特性を有し、各セットのレポーターシグナルの共通特性は別のセットのレポーターシグナルの共通特性と異なり、（たとえば、１つ以上のサンプルのうちのそれぞれ内で）共通特性によって、同一のタンパク質またはペプチドを具備する標識タンパク質を共通特性を欠く分子から区別および／または分離できるステップと、（ａ）１つ以上の標識タンパク質を分離するステップと、各標識タンパク質はタンパク質またはペプチドとタンパク質またはペプチドに付加されるレポーターシグナルまたはインジケータシグナルとを具備し、各レポーターシグナルは共通特性を有し、（たとえば、１つ以上のサンプルのうちのそれぞれ内で）共通特性によって、同一のタンパク質またはペプチドを具備する標識タンパク質を共通特性を欠く分子から区別および／または分離できるステップと、または（ａ）１つ以上の標識タンパク質を別の分子から分離するステップであって、標識タンパク質は１つ以上のサンプルから得ることができ、各標識タンパク質はタンパク質またはペプチドとレポーターシグナルまたはタンパク質またはペプチドに付加されるレポータシグナルまたはインジケータシグナルを具備するステップと、（ｂ）レポーターシグナル、およびもしあれば、１つ以上のインジケータシグナルによって生成される所定パターンを識別するステップと、（ｃ）所定パターンを生成するレポーターシグナルを変更することによって標識タンパク質を変更するステップと、および（ｄ）変更された形式の標識タンパク質を検出し相互に区別するステップとを具備する方法を提供する。
【００７０】
別の側面によると、本発明は、（ａ）１セットの標識タンパク質を分離するステップであって、各標識タンパク質はタンパク質またはペプチドとタンパク質またはペプチドに付加されるレポーターシグナルまたはインジケータシグナルを具備し、各標識タンパク質は共通特性を有し、共通特性によって、同一のタンパク質またはペプチドを具備する標識タンパク質を共通特性を欠く分子から区別および／または分離できるステップと、（ｂ）レポーターシグナルおよび１つ以上のインジケータシグナルによって生成される所定パターンを識別するステップと、（ｃ）所定パターンを生成するレポーターシグナルを変更することによって標識タンパク質を変更するステップと、（ｄ）変更された形式の標識タンパク質を検出し相互に区別するステップとを具備する方法を提供する。
【００７１】
別の側面によると、本発明は、（ａ）１つ以上の標識タンパク質を変更するステップであって、標識タンパク質はタンパク質またはペプチドとタンパク質またはペプチドに付加されるレポーターシグナルまたはインジケータシグナルを具備し、標識タンパク質はレポーターシグナルを変更することによって変更可能であるステップと、（ｂ）変更された形式の標識タンパク質を変更されなかった形式の標識タンパク質から、あるいは２つ以上の標識タンパク質が変更される場合は相互に検出し区別するステップであって、レポーターシグナルおよび／または１つ以上のインジケータシグナルは所定パターンを生成するステップと、を具備する方法を提供する。実施形態によっては、該方法は、タンパク質またはペプチドを検出するのに使用される。
【００７２】
別の側面によると、本発明は、（ａ）１セットの標識タンパク質を分離するステップであって、各標識タンパク質はタンパク質またはペプチドとタンパク質またはペプチドに付加されるレポーターシグナルとを具備し、標識タンパク質は２つ以上のセットの標識タンパク質のうち１つに属し、各標識タンパク質は共通特性を有し、各セットの標識タンパク質の共通特性は別のセットの標識タンパク質の共通特性と異なり、共通特性によって、同一のタンパク質またはペプチドを具備する標識タンパク質を共通特性を欠く分子から区別および／または分離できるステップと、（ｂ）レポーターシグナルによって生成される所定パターンを識別するステップと、（ｃ）所定パターンを生成するレポーターシグナルを変更することによって標識タンパク質を変更するステップと、（ｄ）変更された形式の標識タンパク質を検出し相互に区別するステップとを具備する方法を提供する。
【００７３】
別の側面によると、本発明はタンパク質を検出する方法を提供し、該方法は標識タンパク質を検出するステップであって、標識タンパク質はタンパク質またはペプチドおよびレポーターシグナル、あるいはタンパク質またはペプチドに付加されるレポーターシグナルまたはインジケータシグナルを具備し、標識タンパク質はレポーターシグナルを変更することにより変更されるステップと、変更された形式の標識タンパク質を検出するステップであって、標識タンパク質はレポーターシグナルを変更することにより変更されるステップと、および標識タンパク質と変更された形式の標識タンパク質の特質に基づきタンパク質を識別するステップであって、レポーターシグナル、およびもしあれば１つ以上のインジケータシグナルは所定パターンを生成するステップとを具備する。
【００７４】
別の側面によると、本発明は、（ａ）別の分子から１つ以上の標識タンパク質を分離するステップであって、標識タンパク質は１つ以上のサンプルから得ることができ、各標識タンパク質はタンパク質またはペプチドとタンパク質またはペプチドに付加されるレポーターシグナルまたはインジケータシグナルとを具備するステップと、（ｂ）レポーターシグナルおよび／または１つ以上のインジケータシグナルによって生成される所定パターンを識別するステップと、（ｃ）所定パターンを生成するレポーターシグナルを変更することによって標識タンパク質を変更するステップと、（ｄ）変更された形式の標識タンパク質を検出し相互に区別するステップと、によって検出される１つ以上のサンプルにおいて、タンパク質およびペプチドを具備するタンパク質およびペプチドのカタログを提供する。
【００７５】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、共通特性は質量電荷比であってもよく、レポーターシグナルがその質量を変更することにより変更可能であり、変更された形式の標識タンパク質は変更された形式の標識タンパク質の質量電荷比の差を介して区別可能である。レポーターシグナルの質量は断片化により変更可能である。レポーターシグナルの変更は、その電荷も変更する。共通特性は質量電荷比であってもよく、レポーターシグナルは電荷を変更することにより変更可能であり、変更された形式の標識タンパク質は変更された形式のレポーターシグナルの質量電荷比を介して区別可能である。セットの標識タンパク質は２つ以上の、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、または１００以上の異なるレポーターシグナルを具備することができる。セットの標識タンパク質は１０以上の異なるレポーターシグナルを具備することができる。
【００７６】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、レポーターシグナルはペプチド、オリゴヌクレオチド類、炭水化物類、ポリマー、オリゴペプチド類、またはペプチド核酸類であってもよい。レポーターシグナルはタンパク質またはペプチドと結合させることができる。ステップ（ａ）〜（ｄ）は各標識タンパク質に対して別々に実行することができる。該方法はさらに、ステップ（ａ）の前にレポーターシグナルを１つ以上のタンパク質、１つ以上のペプチド、または１つ以上のタンパク質およびペプチドに付加するステップを具備する。ステップはそのたびに異なるセットの１つ以上のレポーターシグナルを用いて１回以上の回数繰り返すことができる（同一または異なるセットのインジケータシグナルをそのたびに使用することができる）。ステップ（ａ）の前に、異なるセットのレポーターシグナルを異なるサンプル内のタンパク質またはペプチドに付加することができる。異なるセットのレポーターシグナルはそれぞれ同一のレポーターシグナルを具備することができる。複数セットのレポーターシグナルはそれぞれ単独のレポーターシグナルを含むことができる。
【００７７】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、セット内の標識タンパク質のすべてが共通特性を欠く分子から区別および／または分離される必要はなく、すべてのレポーターシグナルが変更される必要はなく、すべての変更された形式の標識タンパク質は同時に検出される必要はないことが了解される。セット内のすべての標識タンパク質は共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、すべてのレポーターシグナルは変更可能であり、すべての変更された形式の標識タンパク質は様々な時点で検出することができる。ステップ（ａ）〜（ｄ）は、各レポーターシグナルに対して別々に実行することができる。
【００７８】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、共通特性は、レポーターシグナルに関連付けられる１つ以上のアフィニティタグであってもよい。１つ以上のアフィニティタグはレポーターシグナルと関連付けることができる。検出された、変更された形式の標識タンパク質の集合体はタンパク質のカタログを構成することができる。ステップ（ａ）〜（ｄ）は各サンプルに対して別々に実行することができる。様々なサンプルを同一のタンパク質サンプルから得ることができる。様々なサンプルを様々な時点で得ることができ、同種の生体から得ることができ、同種の組織をから得ることができ、同一の生体から得ることができ、あるいは様々な時点で得ることができる。
【００７９】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、様々なサンプルは様々な生体、様々な種類組織、様々な種の生体、様々な種の生体または様々な細胞コンパートメントからのサンプルであってもよい。該方法は、あるサンプル内にあるが、別のサンプル内にはないタンパク質またはペプチドに対応するタンパク質またはペプチドを識別または作成するステップをさらに具備する。該方法は様々なサンプル内のタンパク質またはペプチドの相対量を判定するステップをさらに具備する。
【００８０】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、サンプルのうちの１つの標識タンパク質の存在、量、存在および量、または不在のパターンは、サンプル内のタンパク質のカタログを構成する。第２のサンプル内の標識タンパク質の存在、量、存在および量、または不在のパターンは、第２のサンプル内のタンパク質のカタログを構成し、第１のサンプル内のタンパク質のカタログは第１のカタログであり、第２のサンプル内のタンパク質のカタログは第２のカタログであり、該方法はさらに第１のカタログと第２のカタログを比較するステップをさらに具備する。
【００８１】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、各標識タンパク質はタンパク質またはペプチドと、タンパク質またはペプチドに付加されるレポータシグナルまたはインジケータシグナルとを具備することができ、レポーターシグナルはペプチドを具備し、レポーターシグナルは同じ質量電荷比を有し、インジケータシグナルはレポーターシグナルと同じ質量電荷比を有していない。レポーターシグナルペプチドは同一のアミノ酸組成または同一のアミノ酸配列を有することができる。各レポーターシグナルペプチドは、様々な分布の重同位体を含むことができ、様々な分布の代替基を含むことができ、様々なアミノ酸配列を有することができ、あるいは様々な位置で不安定または切断結合を有することができる。
【００８２】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、該方法は、変更されなかった形式の標識タンパク質を検出するステップをさらに具備する。標識タンパク質および変更された形式の標識タンパク質は、標識タンパク質の質量電荷比と変更された形式の標識タンパク質の質量電荷比または変更された形式のレポーターシグナルの質量電荷比とを検出することによって検出可能である。該方法はさらに、ステップ（ａ）の前に、１つ以上のレポーターシグナルおよび１つ以上のインジケータシグナルと、１つ以上のサンプルからの１つ以上のタンパク質、１つ以上のペプチド、または１つ以上のタンパク質およびペプチドとを関連付けるステップをさらに具備し、レポーターシグナルおよび１つ以上のインジケータシグナルは所定パターンを生成する。
【００８３】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、異なるセットのレポーターシグナルはそれぞれ同一のレポーターシグナルを具備することができる。各レポーターシグナルまたは各標識タンパク質は共通特性を有することができ、共通特性によって、同一のタンパク質またはペプチドを具備する標識タンパク質を共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる。１つ以上の標識タンパク質は、単独のサンプルから得ることができる。単独の標識タンパク質は別の分子から区別および／または分離可能である。複数の標識タンパク質は別の分子から区別および／または分離可能である。
【００８４】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、検出された変更された形式の標識タンパク質はサンプル内のタンパク質のカタログを構成する。１つ以上の標識タンパク質は、複数のサンプルの各々から得ることができる。各サンプルから得られた単独の標識タンパク質は、別の分子から区別および／または分離可能である。各サンプルから得られた複数の標識タンパク質は、別の分子から区別および／または分離可能である。各サンプルから得られ、検出および変更された形式の標識タンパク質は、サンプル内のタンパク質のカタログを構成することができる。
【００８５】
別の側面によると、本発明はタンパク質シグニチャを作成する方法を提供し、該方法は  （ａ）タンパク質サンプルを処理してタンパク質断片を作成するステップであって、タンパク質断片は１セットの標的タンパク質断片を具備し、標的タンパク質断片（たとえば、これらのうちそれぞれ）は変更可能であり、変更された形式の標的タンパク質断片は他の変更された形式の標的タンパク質断片から区別可能であるステップと、（ｂ）標的タンパク質断片と１セットのレポーターシグナルキャリブレータおよび１つ以上のインジケータシグナルキャリブレータとを混合するステップであって、各標的タンパク質断片は少なくとも１つのレポーターシグナルキャリブレータと共通特性を共有し、共通特性によって、共通特性を有する標的タンパク質断片（たとえば、これらのうちそれぞれ、およびレポーターシグナルキャリブレータを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、共通特性を共有する標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータは相互に対応し、レポーターシグナルキャリブレータ（たとえば、これらのうちそれぞれ）は変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルキャリブレータは、レポーターシグナルキャリブレータが共通特性を共有する変更された形式の標的タンパク質断片から区別可能であるステップと、（ｃ）標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータの共通特性に基づき、別の分子から標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを分離するステップと、（ｄ）レポーターシグナルキャリブレータおよび１つ以上のインジケータシグナルキャリブレータによって生成される所定パターンを識別するステップと、（ｅ）所定パターンを生成した標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを変更するステップと、および（ｆ）変更された形式の標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを検出するステップであって、変更された形式の標的タンパク質断片の存在、不在、量、または存在および量は、変更された形式の標的タンパク質断片が得られる標的タンパク質断片のタンパク質サンプルの存在、不在、量、または存在および量を示し、タンパク質サンプル内の標的タンパク質断片の存在、不在、量、または存在および量はタンパク質サンプルのタンパク質シグニチャを構成するステップと、を具備する。
【００８６】
別の側面によると、本発明はタンパク質シグニチャを作成する方法を提供し、該方法は、（ａ）タンパク質サンプルを処理してタンパク質断片を作成するステップであって、タンパク質断片は１セットの標的タンパク質断片を具備し、標的タンパク質断片は変更可能であり、変更された形式の標的タンパク質断片（たとえば、これらのうちそれぞれ）は他の変更された形式の標的タンパク質断片から区別可能であるステップと、（ｂ）標的タンパク質断片と２つ以上のセットのレポーターシグナルキャリブレータとを混合するステップであって、レポーターシグナルキャリブレータは２つ以上のセットのレポーターシグナルキャリブレータのうち１つに属し、各標的タンパク質断片は少なくとも１つのレポーターシグナルキャリブレータと共通特性を共有し、各セットのレポーターシグナルキャリブレータの共通特性は別のセットのレポーターシグナルキャリブレータの共通特性と異なり、共通特性によって、共通特性を有する標的タンパク質断片（たとえば、これらのうちそれぞれ）およびレポーターシグナルキャリブレータを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、共通特性を共有する標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータは相互に対応し、レポーターシグナルキャリブレータ（たとえば、これらのうちそれぞれ）は変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルキャリブレータは、レポーターシグナルキャリブレータが共通特性を共有する変更された形式の標的タンパク質断片から区別可能であるステップと、（ｃ）標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータの共通特性に基づき、別の分子から標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを分離するステップと、（ｄ）レポーターシグナルキャリブレータによって生成される所定パターンを識別するステップ、（ｅ）所定パターンを生成した標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを変更するステップと、（ｆ）変更された形式の標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを検出するステップであって、変更された形式の標的タンパク質断片の存在、不在、量、または存在および量は、変更された形式の標的タンパク質断片が得られる標的タンパク質断片のタンパク質サンプルの存在、不在、量、または存在および量を示し、タンパク質サンプル内の標的タンパク質断片の存在、不在、量、または存在および量はタンパク質サンプルのタンパク質シグニチャを構成するステップと、を具備する。
【００８７】
別の側面によると、本発明はタンパク質シグニチャを作成する方法を提供し、該方法は、レポーターシグナルとキャリブレータおよび１つ以上のインジケータシグナルキャリブレータによって生成される所定パターンを識別するステップと、変更された形式の標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを検出するステップであって、変更された形式の標的タンパク質断片（たとえば、これらのうちそれぞれ）は他の変更された形式（たとえば、すべての他の変更された形式）の標的タンパク質断片から区別可能であり、各標的タンパク質断片は少なくとも１つのレポーターシグナルキャリブレータと共通特性を共有し、共通特性によって、共通特性を有する標的タンパク質断片（たとえば、これらのうちそれぞれ）およびレポーターシグナルキャリブレータを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、共通特性を共有する標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータは相互に対応し、変更された形式の各レポーターシグナルキャリブレータは、レポーターシグナルキャリブレータが共通特性を共有する変更された形式の標的タンパク質断片から区別可能であり、変更された形式の標的タンパク質断片の存在、不在、量、または存在および量は、変更された形式の標的タンパク質断片が得られる標的タンパク質断片のタンパク質サンプルの存在、不在、量、または存在および量を示し、タンパク質サンプル内の標的タンパク質断片の存在、不在、量、または存在および量はタンパク質サンプルのタンパク質シグニチャを構成するステップと、を具備する。実施形態によっては、共通特性によって、レポーターシグナルキャリブレータを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することのできる状況において、レポーターシグナルキャリブレータおよび１つ以上のインジケータシグナルキャリブレータは所定パターンを生成する。
【００８８】
別の側面によると、本発明はタンパク質シグニチャを作成する方法を提供し、該方法は、レポーターシグナルキャリブレータによって生成される所定パターンを識別するステップと、変更された形式の標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを検出するステップとを具備し、該方法において、変更された形式の標的タンパク質断片（たとえば、これらのうちそれぞれ）は他の変更された形式（たとえば、すべての他の変更された形式）の標的タンパク質断片から区別可能であり、レポーターシグナルキャリブレータは２つ以上のセットのレポーターシグナルキャリブレータのうちの１つに属し、各標的タンパク質断片は少なくとも１つのレポーターシグナルキャリブレータと共通特性を共有し、各セットのレポーターシグナルキャリブレータの共通特性は、別のセットのレポーターシグナルキャリブレータの共通特性と異なり、共通特性によって、共通特性を有する標的タンパク質断片（たとえば、これらのうちそれぞれ、およびレポーターシグナルキャリブレータを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、共通特性を共有する標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータは相互に対応し、変更された形式の各レポーターシグナルキャリブレータは、レポーターシグナルキャリブレータが共通特性を共有する変更された形式の標的タンパク質断片から区別可能であり、変更された形式の標的タンパク質断片の存在、不在、量、または存在および量は、変更された形式の標的タンパク質断片が得られる標的タンパク質断片のタンパク質サンプルの存在、不在、量、または存在および量を示し、タンパク質サンプル内の標的タンパク質断片の存在、不在、量、または存在および量はタンパク質サンプルのタンパク質シグニチャを構成する。実施形態によっては、共通特性によって、レポーターシグナルキャリブレータを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、レポーターシグナルキャリブレータは所定パターンを生成する。
【００８９】
別の側面によると、本発明はタンパク質シグニチャを作成する方法を提供し、該方法は、（ａ）タンパク質サンプルを処理してタンパク質断片を作成するステップであって、タンパク質断片は１セットの標的タンパク質断片を具備し、標的タンパク質断片（たとえば、これらのうちそれぞれ）は変更可能であり、変更された形式の標的タンパク質断片（たとえば、これらのうちそれぞれ）は他の変更された形式の（たとえば、すべての他の変更された形式の）標的タンパク質断片から区別可能であるステップと、（ｂ）標的タンパク質断片をタンパク質サンプル内の別のタンパク質断片から分離するステップと、（ｃ）標的タンパク質断片および、任意で１つ以上のインジケータシグナルキャリブレータによって生成される所定パターンを識別するステップと、（ｄ）所定パターンを生成した標的タンパク質断片を変更するステップと、および（ｅ）変更された形式の標的タンパク質断片を検出するステップであって、変更された形式の標的タンパク質断片の存在、不在、量、または存在および量は、変更された形式の標的タンパク質断片が得られる標的タンパク質断片のタンパク質サンプルの存在、不在、量、または存在および量を示し、タンパク質サンプル内の標的タンパク質断片の存在、不在、量、または存在および量はタンパク質サンプルのタンパク質シグニチャを構成するステップと、を具備する。
【００９０】
別の側面によると、本発明はタンパク質シグニチャを作成する方法を提供し、該方法は、（ａ）複数の標的タンパク質断片をタンパク質サンプル内の他のタンパク質断片から分離するステップと、（ｂ）標的タンパク質断片および、任意で１つ以上のインジケータシグナルキャリブレータによって生成される所定パターンを識別するステップと、（ｃ）所定パターンを生成した標的タンパク質断片を変更するステップ、（ｄ）変更された形式の標的タンパク質断片を検出するステップであって、変更された形式の標的タンパク質断片の存在、不在、量、または存在および量は、変更された形式の標的タンパク質断片が得られる標的タンパク質断片のタンパク質サンプルの存在、不在、量、または存在および量を示し、タンパク質サンプル内の標的タンパク質断片の存在、不在、量、または存在および量はタンパク質サンプルのタンパク質シグニチャを構成するステップと、を具備する。
【００９１】
別の側面によると、本発明はタンパク質サンプルを分析する方法を提供し、該方法は、（ａ）タンパク質サンプルと所定量のレポーターシグナルキャリブレータおよび１つ以上のインジケータシグナルキャリブレータとを混合するステップであって、タンパク質サンプルは既知量のタンパク質を有し、タンパク質サンプルは標的タンパク質断片を具備し、標的タンパク質断片は変更可能であり、レポーターシグナルキャリブレータは変更可能であり、変更された形式のレポーターシグナルキャリブレータは変更された形式の標的タンパク質断片から区別可能であるステップと、（ｂ）レポーターシグナルキャリブレータおよび１つ以上のインジケータシグナルキャリブレータによって生成される所定パターンを識別するステップと、（ｃ）所定パターンを生成した標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを変更するステップと、（ｄ）変更された形式の標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを検出するステップとを具備する。
【００９２】
別の側面によると、本発明はタンパク質サンプルを分析する方法を提供し、該方法は、（ａ）タンパク質サンプルと所定量の２つ以上のレポーターシグナルキャリブレータとを混合するステップであって、タンパク質サンプルは既知量のタンパク質を有し、タンパク質サンプルは標的タンパク質断片を有し、標的タンパク質断片が変更可能であり、レポーターシグナルキャリブレータは変更可能であり、変更された形式のレポーターシグナルキャリブレータは変更された形式の標的タンパク質断片から区別可能であるステップと、（ｂ）レポーターシグナルキャリブレータによって生成される所定パターンを識別するステップと、（ｃ）所定パターンを生成した標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを変更するステップと、（ｄ）変更された形式の標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを検出するステップとを具備する。
【００９３】
別の側面によると、本発明はタンパク質サンプルを分析する方法を提供し、該方法は、（ａ）タンパク質サンプルを処理してタンパク質断片を作成するステップであって、タンパク質サンプルは既知量のタンパク質を有し、タンパク質サンプルは標的タンパク質を具備し、タンパク質断片は標的タンパク質から得られる標的タンパク質断片を具備するステップと、（ｂ）タンパク質サンプルと所定量のレポーターシグナルキャリブレータおよび１つ以上のインジケータシグナルキャリブレータとを混合するステップであって、標的タンパク質断片が変更可能であり、レポーターシグナルキャリブレータは変更可能であり、変更された形式のレポーターシグナルキャリブレータは変更された形式の標的タンパク質断片から区別可能であるステップと、（ｃ）レポーターシグナルキャリブレータおよび１つ以上のインジケータシグナルキャリブレータによって生成される所定パターンを識別するステップと、（ｄ）所定パターンを生成した標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを変更するステップと、（ｅ）変更された形式の標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを検出するステップと、を具備する。
【００９４】
別の側面によると、本発明はタンパク質サンプルを分析する方法を提供し、該方法は、（ａ）タンパク質サンプルを処理してタンパク質断片を作成するステップであって、タンパク質サンプルは既知量のタンパク質を有し、タンパク質サンプルは標的タンパク質を具備し、タンパク質断片は標的タンパク質から得られる標的タンパク質断片を具備するステップと、（ｂ）タンパク質サンプルと所定量の２つ以上のレポーターシグナルキャリブレータとを混合するステップであって、レポーターシグナルキャリブレータは２つ以上のセットのレポーターシグナルキャリブレータのうちの１つに属し、標的タンパク質断片が変更可能であり、レポーターシグナルキャリブレータは変更可能であり、変更された形式のレポーターシグナルキャリブレータは変更された形式の標的タンパク質断片から区別可能であるステップと、（ｃ）レポーターシグナルキャリブレータによって生成される所定パターンを識別するステップと、（ｄ）所定パターンを生成した標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを変更するステップと、（ｅ）変更された形式の標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータを検出するステップと、を具備する。
【００９５】
形式によっては、インジケータシグナルキャリブレータは共通特性を有していない。共通特性によって、レポーターシグナルキャリブレータを共通特性を欠く分子から区別および／または分離可能とすることができる状況において、レポーターシグナルキャリブレータおよび１つ以上のインジケータシグナルキャリブレータは所定パターンを生成することができる。ステップ（ｅ）および（ｆ）は同時に実行することができる。変更された形式の標的タンパク質断片は、質量分析を用いて検出することができる。ステップ（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）はタンデム質量分析計を用いて実行することができる。
【００９６】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、タンデム質量分析計は第１のステージと最後のステージを具備することができ、ステップ（ｃ）はタンデム質量分析計の第１のステージを用いて狭い質量電荷範囲内のイオンを選択することができ、ステップ（ｅ）はガスとの衝突によって実行することができ、ステップ（ｆ）はタンデム質量分析計の最後のステージを用いて実行することができる。タンデム質量分析計の第１のステージは四極質量フィルタであってもよい。タンデム質量分析計の最後のステージは飛行時間分析器であってもよい。タンデム質量分析計は最後のステージの飛行時間分析器であってもよい。質量電荷範囲は、標的タンパク質断片のそれぞれの質量電荷範囲を対象とするように変更させることができる。
【００９７】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、所定量の各レポーターシグナルキャリブレータは標的タンパク質断片と混合させることができ、検出された各変更された形式のレポーターシグナルキャリブレータの量は、変更された形式の対応する標的タンパク質断片の量を評価するための基準を提供することができると了解される。少なくとも２つのレポーターシグナルキャリブレータの量は異なっていてもよい。各レポーターシグナルキャリブレータの相対量は、タンパク質サンプルにおいて予測される各対応標的タンパク質断片の相対量に基づくことができる。それぞれのレポーターシグナルキャリブレータの量は同一にすることができる。
【００９８】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータは断片化、または光解離性アミノ酸での切断によって変更可能である。標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータは、衝突細胞内またはアスパラギン−プロリン結合で断片化することができる。タンパク質断片は、タンパク質サンプルのプロテアーゼ消化により作成することができる。プロテアーゼはセリンプロテアーゼ（たとえば、トリプシン）であってもよい。タンパク質断片はＸａ因子またはエンテロキナーゼを有するタンパク質サンプルの消化によって、あるいは、光解離性アミノ酸の切断によって作成することができる。
【００９９】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、共通特性は質量電荷比であってもよく、標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータはその質量、その電荷、またはその質量および電荷を変更することによって変更可能であり、変更された形式の標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータは、変更された形式の標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータの質量電荷比の差を介して区別可能である。セットの標的タンパク質断片は、２つ以上の、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、または１００以上の異なる標的タンパク質断片を具備することができる。セットの標的タンパク質断片は、１０以上の異なる標的タンパク質断片を具備することができる。
【０１００】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、セットのレポーターシグナルキャリブレータは２つ以上の、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、または１００以上の異なるレポーターシグナルキャリブレータを具備する。レポーターシグナルキャリブレータはペプチドを具備することができ、ペプチドは対応する標的タンパク質断片と同じ質量電荷比を有する。
【０１０１】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、ペプチドは、対応する標的タンパク質断片と同一のアミノ酸組成を有することができる。ペプチドは、対応する標的タンパク質断片と同一のアミノ酸配列を有することができる。各ペプチドは、対応する標的タンパク質断片と異なるアミノ酸配列を有することができる。各ペプチドは様々な位置で、不安定または切断結合を有することができる。レポーターシグナルキャリブレータは、ペプチド、オリゴヌクレオチド類、炭水化物類、ポリマー、オリゴペプチド類、またはペプチド核酸類であってもよい。
【０１０２】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、該方法はさらにタンパク質シグニチャと１つ以上の他のタンパク質シグニチャとを比較するステップを具備する。少なくとも１つの標的タンパク質断片は、少なくとも１つの修飾アミノ酸を具備することができる。修飾アミノ酸は、リン酸化アミノ酸、アシル化アミノ酸、またはグリコシル化アミノ酸であってもよい。少なくとも１つの標的タンパク質断片は、修飾アミノ酸を除き、修飾アミノ酸を具備する標的タンパク質断片と同じであってもよい。
【０１０３】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、該方法はさらに複数のタンパク質サンプル上でステップ（ａ）〜（ｆ）を実行するステップを具備する。該方法はタンパク質サンプルから作成されるタンパク質シグニチャ間の差を識別するステップをさらに具備する。該方法は対照タンパク質サンプル上でステップ（ａ）〜（ｆ）を実行するステップと、タンパク質サンプルおよび対照タンパク質サンプルから作成されるタンパク質シグニチャ間の差を識別するステップとをさらに具備する。その差は、タンパク質サンプルおよび対照タンパク質サンプル内の標的タンパク質断片の存在、量、存在および量、または不在の差であってもよい。
【０１０４】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｆ）は対照タンパク質サンプルおよび試験タンパク質サンプルで実行することができ、試験タンパク質サンプルあるいは試験タンパク質サンプルのソースはステップ（ａ）の前に、試験タンパク質サンプル内の１つ以上のタンパク質分子を破壊、破棄、または除去するように処理することができ、破壊、破棄、または除去されたタンパク質分子に対応する標的タンパク質断片は、試験タンパク質サンプルではなく対照タンパク質サンプルから作成される。試験タンパク質サンプルは、試験タンパク質サンプル内の１つ以上のタンパク質分子を破壊、破棄、または除去するように処理することができる。試験サンプル内の１つ以上のタンパク質分子は、１つ以上のタンパク質分子を試験タンパク質サンプルから分離することによって除去することができる。１つ以上のタンパク質分子はアフィニティ分離によって分離することができる。試験タンパク質サンプルのソースは、試験タンパク質サンプル内の１つ以上のタンパク質分子を破壊、破棄、または除去するように処理することができる。ソースの処理は、試験サンプルが得られる細胞を、１つ以上の遺伝子の発現を低減または除去する化合物、組成、または状況にさらすことによって実行することができる。
【０１０５】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、該方法は、対照タンパク質サンプルおよび試験タンパク質サンプル内の標的タンパク質断片の差を識別するステップをさらに具備する。該方法は、タンパク質サンプル内の標的タンパク質断片間の差を識別するステップをさらに具備することができる。複数のタンパク質サンプルは分離手順によって作成することができ、分離手順は液体クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、２次元クロマトグラフィ、２次元ゲル電気泳動、等電焦点、薄層クロマトグラフィ、遠心分離、ろ過、イオンクロマトグラフィ、イモノアフィニティクロマトグラフィ、膜分離、またはこれらの組み合わせを含むことができる。タンパク質サンプルは、同一の分離手順で作成される異なる断片またはサンプルであってもよい。
【０１０６】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、該方法は、第２のタンパク質サンプル上でステップ（ａ）〜（ｆ）を実行するステップをさらに具備する。第２のタンパク質サンプルは、第１のタンパク質サンプルと同種の生体からのサンプルであってもよい。第２のタンパク質サンプルは、第１のタンパク質サンプルと同種の組織からのサンプルであってもよい。第２のタンパク質サンプルは、第１のタンパク質サンプルと同一の生体からのサンプルであってもよい。第２のタンパク質サンプルは、第１のタンパク質サンプルと異なる時点で得ることができる。第２のタンパク質サンプルは、第１のタンパク質サンプルと異なる生体からのサンプルであってもよい。第２のタンパク質サンプルは、第１のタンパク質サンプルと異なる種類の組織からのサンプルであってもよい。第２のタンパク質サンプルは、第１のタンパク質サンプルと異なる種の生体からのサンプルであってもよい。第２のタンパク質サンプルは、第１のタンパク質サンプルと異なる種の生体からのサンプルであってもよい。第２のタンパク質サンプルは、第１のタンパク質サンプルと異なる細胞コンパートメントからのサンプルであってもよい。
【０１０７】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、該方法は、第２のタンパク質サンプルから第２のタンパク質シグニチャを作成するステップと、第１のタンパク質シグニチャと第２のタンパク質シグニチャを比較するステップをさらに具備し、第１及び第２のタンパク質シグニチャの差は、第１及び第２のタンパク質サンプルのソースの差またはソースの状況を示す。該方法は、第２のタンパク質サンプルから第２のタンパク質シグニチャを作成するステップと、第１のタンパク質シグニチャと第２のタンパク質シグニチャを比較するステップをさらに具備し、第１及び第２のタンパク質シグニチャの差は、第１及び第２のタンパク質サンプルのタンパク質修飾の差を示す。
【０１０８】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、第１のタンパク質サンプルが得られる細胞が第２のタンパク質サンプルが得られる細胞に関連する修飾欠損であることを除けば、第２のタンパク質サンプルは第１のタンパク質サンプルと同種の細胞から得られるサンプルであってもよい。第２のタンパク質サンプルは、第１のタンパク質サンプルと異なる種類の細胞から得られるサンプルであってもよく、第１のタンパク質サンプルが得られる細胞は第２のタンパク質サンプルが得られる細胞に関連する修飾欠損である。タンパク質サンプルは１つ以上の細胞から得ることができる。タンパク質シグニチャは細胞の生理学的状態を示すことができる。タンパク質シグニチャは細胞の処理の効果を示すことができる。細胞は生体から得ることができ、細胞は生体を処理することによって処理することができる。生体は化合物を適用することによって処理することができる。生体は人間であってもよい。
【０１０９】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、タンパク質サンプルは分離手順によって作成することができ、分離手順は液体クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、２次元クロマトグラフィ、２次元ゲル電気泳動、等電焦点、薄層クロマトグラフィ、遠心分離、ろ過、イオンクロマトグラフィ、イモノアフィニティクロマトグラフィ、膜分離、またはこれらの組み合わせを具備することができる。
【０１１０】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、セットのレポーターシグナルキャリブレータは単独のレポーターシグナルキャリブレータから構成することができる。タンパク質サンプルのタンパク質シグニチャは、レポーターシグナルキャリブレータに対応するタンパク質サンプル内の標的タンパク質断片の存在、不在、量、または存在および量を表すことができる。標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータは、標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータの共通特性に基づき、別の分子から区別および／または分離することができる。標的タンパク質断片およびレポーターシグナルキャリブレータは、分離後に変更可能である。標的タンパク質断片は、タンパク質サンプルを処理することにより作成することができる。標的タンパク質断片をタンパク質サンプル内の別のタンパク質断片から分離させることのできる状況において、１つ以上のインジケータシグナルキャリブレータは所定パターンを生成することができる。
【０１１１】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、該方法は、検出された標的タンパク質断片の量とレポーターシグナルキャリブレータの量の比を判定するステップと、判定された比と標的タンパク質断片の量およびレポーターシグナルキャリブレータの量の予測比とを比較するステップをさらに具備する。予測比は、タンパク質サンプル内の標的タンパク質断片の予測量とレポーターシグナルキャリブレータの所定量に基づくことができ、タンパク質サンプル内の既知量のタンパク質が標的タンパク質（あるいは、標的タンパク質断片）から成る場合、標的タンパク質断片の予測量は標的タンパク質断片タンパク質サンプルの量となり、判定比と予測比との差は標的タンパク質（あるいは、標的タンパク質断片）に対するタンパク質サンプルの純度の測定値であり、判定された比が予測比に近づくほど、タンパク質サンプルの純度が高くなる。レポーターシグナルキャリブレータおよび１つ以上のインジケータシグナルキャリブレータは所定パターンを生成することができる。レポーターシグナルキャリブレータは所定パターンを生成することができる。
【０１１２】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、該方法は、ステップ（ｂ）の前または同時に、標的タンパク質断片と１セットのレポーターシグナルキャリブレータとを混合するステップをさらに具備し、各標的タンパク質断片は少なくとも１つのレポーターシグナルキャリブレータと共通特性を共有し、共通特性によって、共通特性を有する標的タンパク質断片（たとえば、これらのうちそれぞれ、およびレポーターシグナルキャリブレータを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、レポーターシグナルキャリブレータ（たとえば、これらのうちそれぞれ）は変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルキャリブレータは、レポーターシグナルキャリブレータが共通特性を共有する変更された形式の標的タンパク質断片から区別することができる。
【０１１３】
別の側面によると、本発明は発現を検出する方法を提供し、該方法は１つ以上の発現サンプルから得られる標的変更レポーターシグナルペプチドを検出するステップを具備し、１つ以上の発現サンプルは１セットの核酸分子をまとめて具備し、各核酸分子は、レポーターシグナルペプチドまたはインジケータシグナルペプチドおよび当該タンパク質またはペプチドを具備するアミノ酸セグメントを符号化するヌクレオチドセグメントを具備し、レポーターシグナルペプチド（あるいは、レポーターシグナルペプチドを具備するアミノ酸セグメント）は共通特性を有し、共通特性によって、レポーターシグナルペプチド（あるいは、アミノ酸セグメント）を共通特性を欠く分子から区別および／または分離でき、レポーターシグナルペプチドが変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルペプチド（あるいは、アミノ酸セグメント）は変更された形式の別のレポーターシグナルペプチド（あるいは、アミノ酸セグメント）から区別可能であり、標的変更レポーターシグナルペプチド（あるいは、標的変更アミノ酸セグメント）は変更されたレポーターシグナルペプチドのうちの１つ（あるいは、変更されたアミノ酸セグメントのうちの１つ）であり、標的変更レポーターシグナルペプチド（あるいは、標的変更アミノ酸セグメント）の検出は、標的変更レポーターシグナルペプチド（あるいは、標的変更アミノ酸セグメント）が得られるレポーターシグナルペプチドアミノ酸セグメントを符号化するヌクレオチドセグメントを具備する（あるいはレポーターシグナルペプチドを具備する）レポーターシグナルペプチドを具備するアミノ酸セグメントの発現を示し、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、レポーターシグナルペプチド（あるいは、アミノ酸セグメント）および／または１つ以上のインジケータシグナルペプチドは所定パターンを生成する。実施形態によっては、レポーターシグナルペプチドの変更はアミノ酸セグメントを変更する。
【０１１４】
別の側面によると、本発明は発現を検出する方法を提供し、該方法は、１つ以上の発現サンプルが得られる変更されたアミノ酸サブセグメントを検出するステップを具備し、１つ以上の発現サンプルはまとめて１セットの核酸分子を具備し、各核酸分子は、レポーターシグナルペプチドまたはインジケータシグナルペプチドおよび当該タンパク質またはペプチドを具備するアミノ酸セグメントを符号化するヌクレオチドセグメントを具備し、アミノ酸セグメントはそれぞれアミノ酸サブセグメントを具備し、各アミノ酸サブセグメントは当該タンパク質またはペプチドの１部とレポーターシグナルペプチドまたはインジケータシグナルペプチドのすべてまたは１部を具備し、レポーターシグナルペプチドのすべてまたは１部を具備するアミノ酸サブセグメントは共通特性を有し、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドのすべてまたは１部を具備するアミノ酸サブセグメントを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、レポーターシグナルペプチドは変更可能であり、レポーターシグナルペプチドの変更はアミノ酸サブセグメントを変更し、変更された形式の各アミノ酸サブセグメントは変更された形式の別のアミノ酸サブセグメントから区別可能であり、標的変更アミノ酸サブセグメントは変更されたアミノ酸サブセグメントのうちの１つであり、標的変更アミノ酸サブセグメントの検出は、標的変更アミノ酸サブセグメントが得られるアミノ酸セグメントの発現を示し、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドのすべてまたは１部を具備するアミノ酸サブセグメントを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、アミノ酸サブセグメントは所定パターンを生成する。
【０１１５】
別の側面によると、本発明は発現を検出する方法を提供し、該方法は１つ以上の発現サンプルから得られる標的変更レポーターシグナルペプチドを検出するステップを具備し、１つ以上の発現サンプルはまとめて１セットの核酸分子を具備し、各核酸分子はレポーターシグナルペプチドおよび当該タンパク質またはペプチドを具備するアミノ酸セグメントを符号化するヌクレオチドセグメントを具備し、レポーターシグナルペプチド（あるいは、アミノ酸セグメント）は２つ以上のセットのレポーターシグナルペプチド（あるいは、アミノ酸セグメント）のうち１つに属し、各セット内のレポーターシグナルペプチド（あるいは、アミノ酸セグメント）は共通特性を有し、各セットのレポーターシグナルペプチド（あるいは、アミノ酸セグメント）の共通特性は別のセットのレポーターシグナルペプチド（あるいは、アミノ酸セグメント）の共通特性と異なり、共通特性によって、レポーターシグナルペプチド（あるいは、アミノ酸セグメント）を共通特性を欠く分子から区別および／または分離でき、レポーターシグナルペプチドは変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルペプチド（あるいは、アミノ酸セグメント）は変更された形式の別のレポーターシグナルペプチド（あるいは、アミノ酸セグメント）から区別可能であり、標的変更レポーターシグナルペプチド（あるいは、標的変更アミノ酸セグメント）は変更されたレポーターシグナルペプチドのうちの１つ（あるいは、変更されたアミノ酸セグメントのうちの１つ）であり、標的変更レポーターシグナルペプチド（あるいは、標的変更アミノ酸セグメント）の検出は、標的変更レポーターシグナルペプチド（あるいは、標的変更アミノ酸セグメント）が得られるレポーターシグナルペプチド（あるいは、レポーターシグナルペプチドを具備するアミノ酸セグメントを符号化するヌクレオチドセグメント）を具備するアミノ酸セグメントの発現を示し、共通特性によって、レポーターシグナルペプチド（あるいは、レポーターシグナルペプチドを具備するアミノ酸セグメント）を共通特性を欠く分子から区別および／または分離可能な状況において、レポーターシグナルペプチド（あるいは、アミノ酸セグメント）は所定パターンを生成する。実施形態によっては、レポーターシグナルペプチドの変更はアミノ酸セグメントを変更する。
【０１１６】
さらに別の側面によると、本発明は発現を検出する方法を提供し、該方法は１つ以上の発現サンプルが得られる変更されたアミノ酸サブセグメントを検出するステップを具備し、１つ以上の発現サンプルはまとめて１セットの核酸分子を具備し、各核酸分子はレポーターシグナルペプチドまたはインジケータシグナルペプチドおよび当該タンパク質またはペプチドを具備するアミノ酸セグメントを符号化するヌクレオチドセグメントを具備し、アミノ酸セグメントはそれぞれアミノ酸サブセグメントを具備し、各アミノ酸サブセグメントは当該タンパク質またはペプチドの一部とレポーターシグナルペプチドのすべてまたは１部を具備し、アミノ酸サブセグメントは２つ以上のセットのアミノ酸サブセグメントのうちの１つに属し、各セット内のアミノ酸サブセグメントは共通特性を有し、各セットのアミノ酸サブセグメントの共通特性は別のセットのアミノ酸サブセグメントの共通特性と異なり、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドのすべてまたは１部を具備するアミノ酸サブセグメントを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、レポーターシグナルペプチドは変更可能であり、レポーターシグナルペプチドの変更はアミノ酸サブセグメントを変更し、変更された形式の各アミノ酸サブセグメントは変更された形式の別のアミノ酸サブセグメントから区別可能であり、標的変更アミノ酸サブセグメントは変更されたアミノ酸サブセグメントのうちの１つであり、標的変更アミノ酸サブセグメントの検出は、標的変更アミノ酸サブセグメントが得られるアミノ酸セグメントの発現を示し、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドのすべてまたは１部を具備するアミノ酸サブセグメントを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、アミノ酸サブセグメントは所定パターンを生成する。
【０１１７】
さらなる側面によると、本発明は細胞または細胞サンプルを検出する方法を提供し、該方法は１つ以上の細胞または細胞サンプルから得られる標的変更レポーターシグナルペプチドを検出するステップを具備し、１つ以上の細胞または１つ以上の細胞サンプルはまとめて１セットの核酸分子を具備し、各核酸分子は、レポーターシグナルペプチドまたはインジケータシグナルペプチドおよび当該タンパク質またはペプチドを具備する。アミノ酸セグメントを符号化するヌクレオチドセグメントを具備し、レポーターシグナルペプチドは共通特性を有し、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、レポーターシグナルペプチドは変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルペプチドは変更された形式の別のレポーターシグナルペプチドから区別可能であり、標的変更レポーターシグナルペプチドは変更されたレポーターシグナルペプチドのうちの１つであり、標的変更レポーターシグナルペプチドの検出は標的変更レポーターシグナルペプチドが得られる細胞または細胞サンプルの存在を示し、共通特性によって、レポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別または分離することができる状況において、レポーターシグナルペプチドおよび１つ以上のインジケータシグナルペプチドは所定パターンを生成する。
【０１１８】
別の側面によると、本発明は細胞または細胞サンプルを検出する方法を提供し、該方法は１つ以上の細胞または細胞サンプルから得られる標的変更レポーターシグナルペプチドを検出するステップを具備し、１つ以上の細胞または１つ以上の細胞サンプルはまとめて１セットの核酸分子を具備し、各核酸分子は、レポーターシグナルペプチドおよび当該タンパク質またはペプチドを具備するアミノ酸セグメントを符号化するヌクレオチドセグメントを具備し、レポーターシグナルペプチドは２つ以上のセットのレポーターシグナルペプチドのうちの１つに属し、各セット内のレポーターシグナルペプチドは共通特性を有し、各セットのレポーターシグナルペプチドの共通特性は別のセットのレポーターシグナルペプチドの共通特性と異なり、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、レポーターシグナルペプチドは変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルペプチドは変更された形式の別のレポーターシグナルペプチドから区別可能であり、標的変更レポーターシグナルペプチドは変更されたレポーターシグナルペプチドのうちの１つであり、標的変更レポーターシグナルペプチドの検出は標的変更レポーターシグナルペプチドが得られる細胞または細胞サンプルの存在を示し、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、レポーターシグナルペプチドは所定パターンを生成する。
【０１１９】
別の側面によると、本発明は細胞または生体を検出する方法を提供し、該方法は１つ以上の細胞または生体から得られる標的変更レポーターシグナルペプチドを検出するステップを具備し、１つ以上の細胞または１つ以上の生体はまとめて１セットの核酸分子を具備し、各核酸分子は、レポーターシグナルペプチドまたはインジケータシグナルペプチドおよび当該タンパク質またはペプチドを具備するアミノ酸セグメントを符号化するヌクレオチドセグメントを具備し、レポーターシグナルペプチドは共通特性を有し、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、レポーターシグナルペプチドが変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルペプチドは変更された形式の別のレポーターシグナルペプチドから区別可能であり、標的変更レポーターシグナルペプチドは変更されたレポーターシグナルペプチドのうちの１つであり、標的変更レポーターシグナルペプチドの検出は標的変更レポーターシグナルペプチドが得られる細胞または生体の存在を示し、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、レポーターシグナルペプチドおよび１つ以上のインジケータシグナルペプチドは所定パターンを生成する。
【０１２０】
別の側面によると、本発明は細胞または生体を検出する方法を提供し、該方法は１つ以上の細胞または生体から得られる標的変更アミノ酸セグメントを検出するステップを具備し、１つ以上の細胞または１つ以上の生体はまとめて１セットの核酸分子を具備し、各核酸分子は、レポーターシグナルペプチドまたはインジケータシグナルペプチドおよび当該タンパク質またはペプチドを具備するアミノ酸セグメントを符号化するヌクレオチドセグメントを具備し、レポーターシグナルペプチドを具備するアミノ酸セグメントは共通特性を有し、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドを具備するアミノ酸セグメントを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、レポーターシグナルペプチドが変更可能であり、レポーターシグナルペプチドの変更はアミノ酸セグメントを変更し、変更された形式の各アミノ酸セグメントは変更された形式の別のアミノ酸セグメントから区別可能であり、標的変更アミノ酸セグメントは変更されたアミノ酸セグメントのうちの１つであり、標的変更アミノ酸セグメントの検出は、標的変更アミノ酸セグメントが得られる細胞または生体の存在を示し、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドを具備するアミノ酸セグメントを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、アミノ酸セグメントは所定パターンを生成する。
【０１２１】
別の側面によると、本発明は細胞または生体を検出する方法を提供し、該方法は１つ以上の細胞または生体から得られる変更されたアミノ酸サブセグメントを検出するステップを具備し、１つ以上の細胞または１つ以上の生体はまとめて１セットの核酸分子を具備し、各核酸分子は、レポーターシグナルペプチドまたはインジケータシグナルペプチドおよび当該タンパク質またはペプチドを具備するアミノ酸セグメントを符号化するヌクレオチドセグメントを具備し、アミノ酸セグメントはそれぞれアミノ酸サブセグメントを具備し、各アミノ酸サブセグメントは当該タンパク質またはペプチドの１部とレポーターシグナルペプチドのすべてまたは１部とを具備し、レポーターシグナルペプチドのすべてまたは１部を具備するアミノ酸サブセグメントは共通特性を有し、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドのすべてまたは１部を具備するアミノ酸サブセグメントを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、レポーターシグナルペプチドは変更可能であり、レポーターシグナルペプチドの変更はアミノ酸サブセグメントを変更し、変更された形式の各アミノ酸サブセグメントは変更された形式の別のアミノ酸サブセグメントから区別可能であり、標的変更アミノ酸サブセグメントは変更されたアミノ酸サブセグメントのうちの１つであり、標的変更アミノ酸サブセグメントの検出は、標的変更アミノ酸サブセグメントが得られる細胞または生体の存在を示し、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドのすべてまたは１部を具備するアミノ酸サブセグメントを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、アミノ酸サブセグメントは所定パターンを生成する。
【０１２２】
別の側面によると、本発明は細胞または生体を検出する方法を提供し、該方法は、１つ以上の細胞または生体から得られる標的変更レポーターシグナルペプチドを検出するステップを具備し、１つ以上の細胞または１つ以上の生体は１セットの核酸分子をまとめて具備し、各核酸分子はレポーターシグナルペプチドおよび当該タンパク質またはペプチドを具備するアミノ酸セグメントを符号化するヌクレオチドセグメントを具備し、レポーターシグナルペプチドは２つ以上のセットのレポーターシグナルペプチドのうちの１つに属し、各セット内のレポーターシグナルペプチドは共通特性を有し、各セットのレポーターシグナルペプチドの共通特性は別のセットのレポーターシグナルペプチドの共通特性と異なり、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、レポーターシグナルペプチドが変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルペプチドは変更された形式の別のレポーターシグナルペプチドから区別可能であり、標的変更レポーターシグナルペプチドは変更されたレポーターシグナルペプチドのうちの１つであり、標的変更レポーターシグナルペプチドの検出は標的変更レポーターシグナルペプチドが得られる細胞または生体の存在を示し、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況において、レポーターシグナルペプチドは所定パターンを生成する。
【０１２３】
別の側面によると、本発明は細胞または生体を検出する方法を提供し、該方法は１つ以上の細胞または生体から得られる標的変更アミノ酸セグメントを検出するステップを具備し、１つ以上の細胞または１つ以上の生体はまとめて１セットの核酸分子を具備し、各核酸分子は、レポーターシグナルペプチドおよび当該タンパク質またはペプチドを具備するアミノ酸セグメントを符号化するヌクレオチドセグメントを具備し、アミノ酸セグメントは２つ以上のセットのアミノ酸セグメントのうちの１つに属し、各セット内のアミノ酸セグメントは共通特性を有し、各セットのアミノ酸セグメントの共通特性は別のセットのアミノ酸セグメントの共通特性と異なり、共通特性によって、アミノ酸セグメントを共通特性を欠く分子から区別および／または分離でき、レポーターシグナルペプチドが変更可能であり、レポーターシグナルペプチドの変更はアミノ酸セグメントを変更し、変更された形式の各アミノ酸セグメントは変更された形式の別のアミノ酸セグメントから区別可能であり、標的変更アミノ酸セグメントは変更されたアミノ酸セグメントのうちの１つであり、標的変更アミノ酸セグメントの検出は標的変更アミノ酸セグメントが得られる細胞または生体の存在を示し、共通特性によって、アミノ酸セグメントを共通特性を欠く分子から区別および／または分離可能である状況において、アミノ酸セグメントは所定パターンを生成する。
【０１２４】
別の側面によると、本発明は細胞または生体を検出する方法を提供し、該方法は、１つ以上の細胞または生体から得られる変更されたアミノ酸サブセグメントを検出するステップを含み、１つ以上の細胞または１つ以上の生体はまとめて１セットの核酸分子を具備し、各核酸分子はレポーターシグナルペプチドおよび当該タンパク質またはペプチドを具備するアミノ酸セグメントを符号化するヌクレオチドセグメントを具備し、アミノ酸セグメントはそれぞれアミノ酸サブセグメントを具備し、各アミノ酸サブセグメントは当該タンパク質またはペプチドの１部およびレポーターシグナルペプチドのすべてまたは１部を具備し、アミノ酸サブセグメントは２つ以上のセットのアミノ酸サブセグメントのうちの１つに属し、各セット内のアミノ酸サブセグメントは共通特性を有し、各セットのアミノ酸サブセグメントの共通特性は別のセットのアミノ酸サブセグメントの共通特性と異なり、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドのすべてまたは１部を具備するアミノ酸サブセグメントを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができ、レポーターシグナルペプチドは変更可能であり、レポーターシグナルペプチドの変更はアミノ酸サブセグメントを変更し、変更された形式の各アミノ酸サブセグメントは変更された形式の別のアミノ酸サブセグメントから区別可能であり、標的変更アミノ酸サブセグメントは変更されたアミノ酸サブセグメントのうちの１つであり、標的変更アミノ酸サブセグメントの検出は、標的変更アミノ酸サブセグメントが得られる細胞または生体の存在を示し、共通特性によって、レポーターシグナルペプチドのすべてまたは１部を具備するアミノ酸サブセグメントを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することのできる状況において、アミノ酸サブセグメントは所定パターンを生成する。
【０１２５】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、該方法は検出された標的変更レポーターシグナルペプチドの量を判定するステップをさらに具備する。標的変更レポーターシグナルペプチドの量は、標的変更レポーターシグナルペプチドが得られるレポーターシグナルペプチドを具備するアミノ酸セグメントの１つ以上の発現サンプル内に存在する量を示す。存在するアミノ酸セグメントの量は、検出された標的変更レポーターシグナルペプチドの量に比例する。
【０１２６】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、該方法は複数の変更されたレポーターシグナルペプチドを判定するステップをさらに具備し、変更された各レポーターシグナルペプチドの検出は、変更されたレポーターシグナルペプチドが得られるレポーターシグナルペプチドを具備するアミノ酸セグメントの発現を示す。該方法は、検出された変更されたレポーターシグナルペプチドの量を判定するステップをさらに具備し、変更された各レポーターシグナルペプチドの量は、変更されたレポーターシグナルペプチドが得られるレポーターシグナルペプチドを具備するアミノ酸セグメントの１つ以上の発現サンプルに存在する量を示す。存在するアミノ酸セグメントの量は、検出された変更されたレポーターシグナルペプチドの量に比例する。
【０１２７】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、変更された形式のレポーターシグナルペプチドの存在、不在、量、または存在および量は、変更された形式のレポーターシグナルペプチドが得られる発現サンプル内のレポーターシグナルペプチドの存在、不在、量、または存在および量を示すことができ、発現サンプル内のレポーターシグナルペプチドの存在、不在、量、または存在および量は、発現サンプルのタンパク質シグニチャを較正する。変更された形式のレポーターシグナルペプチドは、タンデム質量分析計を使用するなど、質量分析を利用することにより検出することができる。質量分析計は単独イオンフィルタリング、衝突細胞、および飛行時間分光計のための四極セットを含むことができる。
【０１２８】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、レポーターシグナルペプチドは、断片化または光解離性アミノ酸での切断によって変更可能である。レポーターシグナルペプチドは衝突細胞内で断片化可能である、および／またはアスパラギン−プロリン結合、メチオニン、またはリン酸化アミノ酸で断片化可能である。共通特性は質量電荷比であってもよく、レポーターシグナルペプチドはその質量、その電荷、またはその質量および電荷を変更することによって変更可能であり、変更された形式のレポーターシグナルペプチドは、変更された形式のレポーターシグナルペプチドの質量電荷比を介して区別可能である。該方法は、２つ以上の、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、または１００以上の異なるレポーターシグナルペプチドを使用することができる。１０以上の異なるレポーターシグナルペプチドを使用することができる。各ペプチドは様々な位置で不安定または切断結合を有することができる。
【０１２９】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、該方法はさらにタンパク質シグニチャと１つ以上の他のタンパク質シグニチャとを比較するステップを具備する。検出された、変更されたレポーターシグナルペプチドは、複数の発現サンプルから得ることができる。検出された、変更されたレポーターシグナルペプチドの１部は、対照発現サンプルから得ることができる。該方法はさらに発現サンプルおよび対照発現サンプルから作成されるタンパク質シグニチャ間の差を識別するステップを具備する。その差は、発現サンプルおよび対照発現サンプル内のレポーターシグナルペプチドの存在、量、存在および量、または不在の差であってもよい。複数の発現サンプルは対照発現サンプルおよび試験発現サンプルを具備することができ、試験発現サンプルまたは試験発現サンプルのソースは、試験発現サンプル内の１つ以上のアミノ酸セグメントを破壊、破棄、または除去するように処理することができ、破壊、破棄、または除去されたアミノ酸セグメントに対応するレポーターシグナルペプチドは、試験発現サンプルではなく対照発現サンプルから作成される。
【０１３０】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、試験発現サンプルは、試験発現サンプル内の１つ以上のアミノ酸セグメントを破壊、破棄、または除去するように処理することができる。試験サンプル内の１つ以上のアミノ酸セグメントは、試験発現サンプルから１つ以上のアミノ酸セグメントを分離することによって除去することができる。１つ以上のアミノ酸セグメントはアフィニティ分離によって分離することができる。試験発現サンプルのソースは、試験発現サンプル内の１つ以上のアミノ酸セグメントを破壊、破棄、または除去するように処理することができる。ソースの処理は、試験サンプルが得られる細胞を、１つ以上のヌクレオチドセグメントの発現を低減または除去する化合物、組成、または状況にさらすことによって実行することができる。
【０１３１】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、該方法は対照発現サンプルおよび試験発現サンプル内のレポーターシグナルペプチドの差を識別するステップをさらに具備する。該方法は、発現サンプル内のレポーターシグナルペプチド間の差を識別するステップをさらに具備する。少なくとも２つの発現サンプル、または少なくとも２つの発現サンプルのソースは、異なる状況に置かれてもよい。発現サンプルのソースは細胞であってもよい。少なくとも２つの発現サンプルのタンパク質シグニチャの差は、異なる状況の影響を示すことができる。異なる状況は異なる化合物の作用を受けることができる。異なる状況は化合物の作用を受けても、作用を受けなくてもよい。
【０１３２】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、該方法は第２の発現サンプルから第２のタンパク質シグニチャを作成するステップと、第１のタンパク質シグニチャと第２のタンパク質シグニチャとを比較するステップをさらに具備し、第１及び第２のタンパク質シグニチャの差は、第１及び第２の発現サンプルのソースまたはソースの状態の差を示す。該方法は第２の発現サンプルから第２のタンパク質シグニチャを作成するステップと、第１のタンパク質シグニチャと第２のタンパク質シグニチャとを比較するステップとをさらに具備し、第１及び第２のタンパク質シグニチャの差は、第１及び第２の発現サンプルのタンパク質修飾の差を示す。第１の発現サンプルが得られる細胞が第２の発現サンプルが得られる細胞に関連する修飾欠損であることを除けば、第２の発現サンプルは、第１の発現サンプル同種の細胞から得られるサンプルであってもよい。第２の発現サンプルは、第１の発現サンプルと異なる種類の細胞から得られるサンプルであってもよく、第１のタンパク質サンプルが得られる細胞は、第２のタンパク質サンプルが得られる細胞に関連する修飾欠損である。
【０１３３】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、１つ以上の細胞から発現サンプルを得ることができる。タンパク質シグニチャは細胞の生理学的状態を示すことができる、あるいは細胞の処理の効果を示すことができる。細胞は生体から得ることができ、細胞は生体を処理することにより処理可能である。生体は化合物を生体に投与することにより処理することができる。生体は人間であってもよい。
【０１３４】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、変更されたレポーターシグナルペプチドは、第１および第２の発現サンプル内で検出できることが了解される。第２の発現サンプルは、第１の発現サンプルと同一の生体、異なる生体、異なる種の生体、異なる種の生体または同種の生体から得られるサンプルであってもよい。第２の発現サンプルは、第１の発現サンプルと同種の組織から得られるサンプルであってもよい。第２の発現サンプルは、第１の発現サンプルと異なる時点で得ることができる。第２の発現サンプルは、異なる種類の組織から得られるサンプル、または第１の発現サンプルと異なる細胞コンパートメントから得られるサンプルであってもよい。
【０１３５】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、該方法はレポーターシグナルペプチドを変更するステップをさらに具備する。レポーターシグナルペプチドは断片化または光解離性アミノ酸での切断によって変更可能である。レポーターシグナルペプチドは衝突細胞内で断片化することができる。レポーターシグナルペプチドは、アスパラギン−プロリン結合、メチオニン、またはリン酸化アミノ酸で断片化することができる。
【０１３６】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、該方法はさらに発現サンプルからレポーターシグナルペプチドを分離するステップを具備する。レポーターシグナルペプチドは、共通特性に基づく発現サンプルから区別および／または分離することができる。該方法はさらにレポーターシグナルペプチドを当該タンパク質またはペプチドから切断するステップを具備する。レポーターシグナルペプチドは、共通特性に基づく当該タンパク質またはペプチドから区別および／または分離することができる。該方法はさらにアミノ酸セグメントをレポーターシグナルペプチド部分とタンパク質部分に切断するステップを具備する。該方法はさらに２つ以上の発現サンプルをともに混合するステップを具備する。
【０１３７】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、該方法は２つ以上のアミノ酸セグメントをともに混合するステップをさらに具備し、混合されたアミノ酸セグメントは２つ以上の異なる発現サンプルから得られる。標的変更レポーターシグナルペプチドが得られるレポーターシグナルペプチドを具備するアミノ酸セグメントの発現は、標的変更レポーターシグナルペプチドが得られる発現サンプルを識別することができる。発現サンプルは１つ以上の細胞から得ることができ、標的変更レポーターシグナルペプチドが得られるレポーターシグナルペプチドを具備するアミノ酸セグメントの発現は、識別された発現サンプルが得られる細胞を識別する。発現サンプルは１つ以上の生体から得ることができ、標的変更レポーターシグナルペプチドが得られるレポーターシグナルペプチドを具備するアミノ酸セグメントの発現は、識別された発現サンプルが得られる生体を識別する。発現サンプルは１つ以上の組織から得ることができ、標的変更レポーターシグナルペプチドが得られるレポーターシグナルペプチドを具備するアミノ酸セグメントの発現は、識別された発現サンプルが得られる組織を識別する。
【０１３８】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、発現サンプルは１つ以上の細胞株から得ることができ、標的変更レポーターシグナルペプチドが得られるレポーターシグナルペプチドを具備するアミノ酸セグメントの発現は、識別された発現サンプルが得られる細胞株を識別する。各核酸分子はさらに発現配列を具備することができ、発現配列はアミノ酸セグメントが発現されるように、ヌクレオチドセグメントに動作可能に連結することができる。発現配列は翻訳発現配列および／または転写発現配列を具備することができる。アミノ酸セグメントは生体外または生体内で発現させることができる。アミノ酸セグメントは細胞培養内で発現させることができる。各核酸分子の発現配列は異なっていてもよい。異なる発現配列は差別的に調整することができる。発現配列は同様に調整することができる。
【０１３９】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、複数の発現配列は、同一の発現カスケードの１部として発現される遺伝子の発現配列であってもよいし、あるいはその遺伝子から得られてもよいことが了解される。各核酸分子の発現配列は同一でもよいし、同様に調整されてもよい。少なくとも２つの核酸分子の発現配列は異なっていても同一でもよい。アミノ酸セグメントの発現は誘発させることができる。各核酸分子は複製配列をさらに具備することができ、複製配列は核酸分子の複製を仲介する。核酸分子は生体外または生体内で複製させることができる。核酸分子は細胞培養内で複製させることができる。各核酸分子は統合配列をさらに具備することができ、統合配列は核酸分子の他の核酸類への統合を仲介する。核酸分子は（たとえば、所定の位置で）染色体に組み込むことができる。
【０１４０】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、核酸類分子は、１つ以上の核酸サンプル内の核酸類を複製することによって作成することができる。核酸類は対のプライマーを利用して複製することができ、核酸分子を作成するのに使用されるプライマー対内の各第１のプライマーは、レポーターシグナルペプチドを符号化するヌクレオチド配列を具備する。各第１のプライマーはさらに発現配列を具備することができる。各第１のプライマーのヌクレオチド配列は、エピトープタグを符号化することもできる。各アミノ酸セグメントは、エピトープタグをさらに具備することができる。各アミノ酸セグメントのエピトープタグは異なっていてもよいし同一でもよい。少なくとも２つのアミノ酸セグメントのエピトープタグは異なっていてもよいし同一でもよい。アミノ酸セグメントはエピトープタグを介して１つ以上の発現サンプルから区別および／または分離することができる。
【０１４１】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、各アミノ酸セグメントのレポーターシグナルペプチドは異なっていてもよいし同一でもよい。少なくとも２つのアミノ酸セグメントのレポーターシグナルペプチドは異なっていてもよいし同一でもよい。核酸分子は、細胞または細胞株内にあることができる。各核酸分子は異なる細胞（あるいは、細胞株）内あるいは同一の細胞（あるいは、細胞株）内にあることができる。各核酸分子は発現配列をさらに具備することができ、アミノ酸セグメントが発現されるように、発現配列は動作可能にヌクレオチドセグメントに連結させることができる。各核酸分子の発現配列は異なっていてもよいし同様に調整されてもよい。複数の発現配列は、同一の発現カスケードの１部として発現される遺伝子の発現配列であってもよいし、あるいはその遺伝子から得られてもよい。
【０１４２】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、核酸分子は細胞（あるいは、細胞株）の染色体に組み込むことができる。核酸分子は染色体所定の位置で組み込むことができる。染色体は人工染色体であってもよい。核酸分子はプラスミドであってもよく、プラスミドに組み込んでもよい。細胞は細胞株内にあってもよい。各核酸分子は異なる細胞または細胞株内にあってもよく、同一の細胞または細胞株内にあってもよい。発現サンプルは細胞から作成してもよい。各発現サンプルは細胞サンプルから得た細胞から作成することができ、各発現サンプルは様々な細胞サンプルから作成することができる。各細胞サンプルは様々な状況に置くことができ、様々な試験化合物と接触させることができ、様々な状況下で培養させることができ、様々な生体から得ることができ、様々な組織から得ることができ、あるいは様々な時点で同一のソースから入手することができる。発現サンプルは細胞を溶解することにより作成することができる。
【０１４３】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、核酸分子は生体内にあってもよい。各核酸分子は異なる生体内にあっても、同一の生体内にあってもよい。各核酸分子は発現配列をさらに具備することができ、アミノ酸セグメントが発現できるように、発現配列は動作可能にヌクレオチドセグメントに連結することができる。各核酸分子の発現配列は異なっていてもよいし、同様に調整されてもよい。複数の発現配列は同一の発現カスケードの１部として発現される遺伝子の発現配列でもよいし、あるいはその遺伝子から得られてもよい。核酸分子は生体の染色体に組み込む（たとえば、所定の位置で染色体に組み込む）ことができる。染色体は人工染色体であってもよい。核酸分子はプラスミドであってもよいし、プラスミドに組み込まれてもよい。各核酸分子は異なる生体内にあっても、同一の生体内にあってもよい。核酸分子は生体の細胞内（たとえば、生体の細胞のほぼすべてまたは生体の細胞の１部に）にあってもよい。アミノ酸セグメントは、生体の細胞のほぼすべてまたは生体の細胞の１部で発現させることができる。
【０１４４】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、各アミノ酸セグメントの当該タンパク質またはペプチドは異なっていても同一でもよい。少なくとも２つのアミノ酸セグメントの当該タンパク質またはペプチドは異なっていても同一でもよい。当該タンパク質またはペプチドは関連していてもよい、同一のカスケード内で生成されるタンパク質であってもよい、同一の酵素経路内のタンパク質であってもよい、同一の状況下で発現されるタンパク質であってもよい、同一の疾病と関連付けられるタンパク質であってもよい、同一の細胞種または同一の組織種と関連付けられるタンパク質であってもよい。
【０１４５】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、ヌクレオチドセグメントは、それぞれがレポーターシグナルペプチドまたはインジケータシグナルペプチドおよび当該タンパク質またはペプチドを具備する複数のアミノ酸セグメントを符号化することができる。ヌクレオチドセグメントの１つの内の少なくとも２つのアミノ酸セグメントの当該タンパク質またはペプチドは異なっていてもよい。ヌクレオチドセグメントの１つの内のアミノ酸セグメントの当該タンパク質またはペプチドは異なっていてもよい。各ヌクレオチドセグメント内の少なくとも２つのアミノ酸セグメンの当該タンパク質またはペプチドは異なっていてもよい。各ヌクレオチドセグメント内のアミノ酸セグメントの当該タンパク質またはペプチドは異なっていてもよい。
【０１４６】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、該セットは単独の核酸分子から構成することができる。該セットは単独の核酸分子から構成することができ、核酸分子は、それぞれがアミノ酸セグメントを符号化する複数のヌクレオチドセグメントを具備する。アミノ酸セグメントは、レポーターシグナルペプチドと当該タンパク質またはペプチド間の接合部近傍に切断部位を具備することができる。切断部位は切断することができる。レポーターシグナルペプチドは当該ペプチドまたはタンパク質から区別および／または分離することができる。切断部位はトリプシン切断部位であってもよい。切断部位はレポーターシグナルペプチドと当該タンパク質またはペプチド間の接合部にあってもよい。各アミノ酸セグメントはさらに自己開裂セグメントを具備することができる。自己開裂セグメントはレポーターシグナルペプチドと当該タンパク質またはペプチドの間にあってもよい。自己開裂セグメントはアミノ酸セグメントを切断することができる。レポーターシグナルペプチドは、当該ペプチドまたはタンパク質から区別および／または分離することができる。自己開裂セグメントはインテイセグメントであってもよい。
【０１４７】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、複数の異なる変更されたレポーターシグナルペプチドを検出することができ、各変更されたレポーターシグナルペプチドの検出は、変更されたレポーターシグナルペプチドが得られるレポーターシグナルペプチドを具備するアミノ酸セグメントの発現、あるいは変更されたレポーターシグナルペプチドが得られる細胞サンプルの存在のいずれかを示すことが了解される。異なる発現サンプルまたは細胞サンプルは異なる核酸分子を具備することができ、各変更されたレポーターシグナルペプチドの検出は、変更されたレポーターシグナルペプチドが得られるレポーターシグナルペプチドを具備するアミノ酸セグメントを符号化するヌクレオチドセグメントを具備する核酸分子を備える発現サンプルの発現、あるいは変更されたレポーターシグナルペプチドが得られるレポーターシグナルペプチドを具備するアミノ酸セグメントを符号化するヌクレオチドセグメントを備える核酸分子を具備する細胞サンプルの存在のいずれかを示す。
【０１４８】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、複数の異なる発現サンプルを使用することができ、各異なる発現サンプルは異なる核酸分子を具備し、変更されたレポーターシグナルペプチドの検出は、検出された、変更されたレポーターシグナルペプチドが得られるレポーターシグナルペプチドを具備するアミノ酸セグメントを符号化するヌクレオチドセグメントを備える核酸分子を具備する発現サンプルの発現を示すことが了解される。
【０１４９】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、各細胞または生体は少なくとも１つの核酸分子を含むように設計することができ、各細胞または生体内の核酸分子のヌクレオチドセグメントによって符号化されるアミノ酸セグメントのレポーターシグナルペプチドは異なっていてもよい。当該形質を有する各細胞は同一のレポーターシグナルペプチドを具備することができ、当該形質を有する生体は同一のレポーターシグナルペプチドを具備することができる。当該形質は異種遺伝子またはトランス遺伝子であってもよい。異種遺伝子またはトランス遺伝子は核酸分子を具備することができる。異種遺伝子またはトランス遺伝子はアミノ酸セグメントを符号化することができる。複数の異なる変更されたレポーターシグナルペプチドを検出することができ、各変更されたレポーターシグナルペプチドの検出は、変更されたレポーターシグナルペプチドが得られる細胞の存在を示す。
【０１５０】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、様々な細胞または生体は様々な核酸分子を具備することができ、各変更されたレポーターシグナルペプチドの検出は、変更されたレポーターシグナルペプチドが得られるレポーターシグナルペプチドを具備するアミノ酸セグメントを符号化するヌクレオチドセグメントを備える核酸分子を具備する細胞または生体の存在を示すことが了解される。
【０１５１】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、複数の様々な細胞、細胞サンプル、または生体を使用することができ、それぞれの様々な細胞、細胞サンプル、または生体は様々な核酸分子を具備し、変更されたレポーターシグナルペプチドの検出は、検出された、変更されたレポーターシグナルペプチドが得られるレポーターシグナルペプチドを具備するアミノ酸セグメントを符号化するヌクレオチドセグメントを備える核酸分子を具備する細胞、細胞サンプル、または生体の存在を示すことが了解される。
【０１５２】
別の側面によると、本発明は検体を検出する方法を提供し、該方法は１つ以上の検出器と１つ以上の標的サンプルを関連付けるステップであって、各検出器は特定結合分子、キャリア、およびブロック群を具備し、ブロック群は複数ブロックを具備し、複数ブロックは１セットのレポーターシグナルおよび１つ以上のインジケータシグナル（および／または  ２つ以上のセットのレポーターシグナル）を具備するステップと、ブロック群を検出するステップとを具備する。各セット内のレポーターシグナルは共通特性を有し、共通特性によって、レポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別または分離でき、レポーターシグナルは変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルはすべての別の変更された形式のレポーターシグナルから区別可能である。共通特性によって、レポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別および／または分離できる状況において、レポーターシグナルおよび１つ以上のインジケータシグナル（あるいは、２つ以上のセットのレポーターシグナル）は所定パターンを生成する。形式によっては、インジケータシグナルは共通特性を有していない。共通特性は質量電荷比であってもよく、レポーターシグナルがその質量を変更することにより変更可能であり、変更された形式のレポーターシグナルは変更された形式のレポーターシグナルの質量電荷比の差を介して区別可能である。レポーターシグナルの質量は断片化により変更可能である。レポーターシグナルの変更は、電荷を変更することもできる。
【０１５３】
本発明のすべての側面の各種実施形態において、検出器は１つ以上の検体と関連付け、検出されることができる。上記検出は、たとえば、（ａ）それぞれが共通特性を有する１セットのレポーターシグナルおよび１つ以上のインジケータシグナル（および／または２つ以上のセットのレポーターシグナル）を共通特性を欠く分子から分離するステップと、（ｂ）レポーターシグナルおよび１つ以上のインジケータシグナルによって生成された（および／または２つ以上のセットのレポーターシグナルによって生成された）所定パターンを識別するステップと、（ｃ）所定パターンを生成するレポーターシグナルを変更するステップと、（ｄ）変更された形式のレポーターシグナルを検出し相互に区別するステップと、を具備することができる。
【０１５４】
したがって、本発明の目的は、検体の存在、量、または存在および量の多重判定方法を提供することである。本発明の別の目的は、タンパク質の存在、量、または存在および量を判定できるように標識タンパク質を提供することである。本発明の別の目的は、タンパク質の存在、量、または存在および量の多重判定を可能とするようにタンパク質を標識付けする方法を提供することである。本発明の別の目的は、タンパク質の存在、量、または存在および量の多重判定方法を提供することである。本発明の目的は質量タグシグニチャの検出方法を提供することである。本発明の目的は、タンパク質シグニチャの検出方法を提供することである。本発明の別の目的は、タンパク質シグニチャを具備するペプチドの独自性と純度の評価を提供することである。本発明の別の目的は、タンパク質シグニチャを具備するペプチドの中で、リン酸化ペプチドまたはその他の翻訳後タンパク質修飾を検出する方法を提供することである。本発明の別の目的は、質量タグシグニチャの生成キットを提供することである。本発明の別の目的は、タンパク質シグニチャの生成キットを提供することである。
【０１５５】
開示された方法および構成のさらなる利点は、以下の説明に部分的に記載され、および説明から部分的に理解されるであろう、あるいは開示された方法および構成の実行から学び取ることができる。開示された方法および構成の利点は、添付の請求項に具体的に指摘される構成要素および組み合わせにより認識および到達されるであろう。上記の概要および下記の詳細な説明のいずれも単に例示であり、請求される本発明を限定するものではないと理解されたい。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１５６】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を成す添付の図面は、開示された方法および構成のいくつかの実施形態を示し、説明とともに開示された方法および構成の原理を説明するのに役立つ。
【０１５７】
現行の技術は、標識を多重化することのできる能力に限定される。対照的に、本発明の開示された方法では、順次読出しシステムに比べて、多くのサンプルの同時読出しと高い内部精度を可能にする。開示された方法は、抗体またはタンパク質マイクロアレイ、ＤＮＡマイクロアレイ、発現プロファイリング、比較ゲノミクス、免疫学、診断検定、品質管理などの多数の分野における検出システムとして使用可能な有利な特性を備える。
【０１５８】
開示された方法および構成は、以下の特定の実施形態の詳細な説明、そこに含まれる実施例、図面、上記および以下の記載を参照し、より容易に理解することができる。
【０１５９】
１つまたは複数の検体（タンパク質を含む）の高感度検出のための組成および方法が開示される。概して、その方法は、多次元シグナル（ＭＤＳ）と称される特別な標識成分の使用を含む。開示された方法では、多次元シグナルの分析の結果、さらなるレベルの分析を行うことができる、あるいは行うべきであるかどうか、および／または分析された物質のどの部分をさらなるレベルの分析で分析できる、あるいは分析すべきであるかを示すのに供する１つ以上の所定パターンがもたらされる。これが有益なのは、複数レベルの分析は時間がかかり、大量のデータを生成する可能性があり、さらなる分析がどの部分に基づくべきかを示すための分析レベルにおける所定パターンの使用は作業量を限定し、当該物質に関するデータ収集に焦点を合わせるからである。分析の有効例は質量分析であり、所定パターンの有効例は質量電荷比に基づく質量分析ピークのパターンである。
【０１６０】
質量分析による等圧レポーターシグナルの分析は、概して所与の質量電荷比（当該等圧レポーターシグナルの質量電荷比に相当する）の物質を選択する第１の質量分析と、異なる形式の変更されたレポーターシグナルを検出し識別する第２の質量分析の２回の質量分析を必要とする。レポーターシグナルで標識付けされた多数の様々な検体を含むサンプルでは、それぞれの様々な検体が第１回の質量分析において別々に選択され、検体毎に変更された形式のレポーターシグナルを別々に検出する必要がある。これには非常に時間がかかる。たとえ複数の標識検体に関して分離と検出が同時に達成可能であるとしても、これにより大量のデータが生成される。というのは、質量電荷比の全範囲をまとめてカバーするサンプル部分が、存在するレポーターシグナルを識別し様々な検体と関連付けるために第２回の質量分析を別々に受ける必要があるからである。開示された方法は、どのサンプルとどのサンプル部分が、次のレベルの分析でさらに分析されるべきかを特定する手段を提供することによりこの問題を解決する。
【０１６１】
好適な形式の開示された方法は等圧技術と非等圧技術を組み合わせて使用し、高度なワークフロー特性を有するシステムをもたらす。このワークフローでは、質量分析読出しにより、等圧標識（レポーターシグナルレベルの分析）上でＭＳ／ＭＳ事象をトリガするＭＳ次元（インジケータレベルの分析）における非等圧標識の走査が、効率的なデータ収集システムを提供する。
【０１６２】
開示された方法は、ｉ−ＰＲＯＴ（米国出願第２００３／０１９４７１７号、米国出願第２００４／０２２０４１２号、米国出願第２００３／０１２４５９５号、米国特許第６，８２４，９８１号に記載）、ｉＴＲＡＱ（米国出願第２００４／０２２０４１２号およびＰＣＴ出願第ＷＯ２００４／０７０３５２号に記載）、ＴＭＴ（米国出願第２００３／０１９４７１７号に記載）などの適切な等圧標識付けシステムを利用することができる。本明細書に開示される等圧システムは、多重化ＭＳ／ＭＳ読出しとＭＳスペクトルの複雑さを増大させない特質とを通じた、強化されたデータ品質を提供する例である。このような等圧標識付けシステムは、本明細書に開示される原理を用いて組み合わせ、あるいは多重化して、等圧標識付けシステム間に非等圧関係を生み出すことができる。もしくは、あるいはさらに、開示された方法は、適切な非等圧標識、たとえば、ＩＣＡＴ標識（ＰＣＴ出願第ＷＯ００／０１１２０８号に記載、ＩＣＡＴ標識の使用例は、ＰＣＴ出願第ＷＯ０２／０９０９２９号および米国出願第２００２／０１９２７２０号に記載されている）、質量欠損タグ（米国出願第２００２／０１７２９６１号およびＨａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ３８：８０９〜８１６（２００３）に記載）、米国出願第２００４／００１８５６５、２００３／０１０００１８、２００３／００５０４５３、２００４／００２３２７４、２００２／０１４６７３、２００３／００２２２２５号、米国特許第６，３１２，８９３、６，３１２，９０４、６，６２９，０４０号、Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３（８）：６７９〜６８８（１９９６）に記載の標識のような別の標識を利用することができ、本明細書に開示される非等圧は例である。当該検体に付加されるとき、非等圧標識はＭＳにより区別することができるが、等圧標識はＭＳ／ＭＳまたはより高次（次は等圧標識の重畳および分析方法に関するレベルに応じる）を要する。すなわち、等圧ＭＳ種はＭＳ／ＭＳにより、等圧ＭＳ／ＭＳ種はＭＳ／ＭＳ／ＭＳにより分解することができる。高次スペクトルを回収するのに必要な時間は、概して低次スペクトルより長い。開示された方法は、より費用のかかる高次データ収集をトリガするために低次スペクトルを利用する（よって、より控えめで効率的な高次データ収集を利用する）。加えて、データ保存量は高次スペクトルで迅速に増大し、このようなトリガシステムによって、当該種に関するデータのみの保存が可能になる。また、関連データのみが通過する場合、下流のデータマイニングがより効率化される可能性がある。
【０１６３】
開示された多重レベル分析では、別のレベルまたは次元の分析が実行可能であるというインジケータとしての役割を果たす、および／または分析サンプルの一部を次のレベルの分析で分析すべきであるというインジケータとしての役割を果たすことのできる１つ以上の所定パターンを生成可能な分析レベルが、インジケータレベル、インジケータ分析、またはインジケータレベルの分析と称することができる。いくつかの形式の多重レベル分析は、分析レベルの１つがインジケータレベルである場合に実行することができる。このように、開示されたインジケータレベルの分析は、インジケータ分析の前または後のいずれかに、別のサンプルおよび検体の処理または分析の技術または方法と組み合わせることができる。
【０１６４】
所与のインジケータレベルの分析は、すべての存在する多次元シグナルに関連するインジケータレベルの分析である必要はない。すなわち、本明細書に開示されるような所定パターンに関して分析される、あるいは作動されることを意図する、あるいは意図しない多次元シグナルが、所定パターンに関して分析される別の多次元シグナルとともに分析レベル内に存在することができる。後者の分析により、その分析レベルは、後者の多次元シグナル（すなわち、「別の」多次元シグナル）に関連するインジケータレベルの分析となる。同様に、所与のレポーターシグナルレベルの分析は、すべての存在する多次元シグナルに関連するレポーターシグナルレベルの分析である必要はない。すなわち、本明細書に開示されるような識別レポーターシグナル（あるいは、別の多次元シグナル）に関して分析される、あるいは作動されることを意図する、あるいは意図しない多次元シグナルが、識別レポーターシグナル（あるいは、別の多次元シグナル）に関して分析される別の多次元シグナル（レポーターシグナルなど）とともに分析レベル内に存在することができる。後者の分析により、その分析レベルは、後者の多次元シグナル（すなわち、「別の」多次元シグナル）に関連するレポーターシグナルレベルの分析となる。さらに、所与のレベルまたは回の分析は一部の存在する多次元シグナルに関連するインジケータレベルの分析、および別の存在する多次元シグナルに関連するレポーターシグナルレベルの分析であってもよい。
【０１６５】
いくつかの形式のインジケータレベルの分析では、共通特性を有するレポーターシグナルが、共通特性を欠く別の多次元シグナルとともに使用することができる。この差を、開示された方法で使用される所定パターンの基本とすることができる。たとえば、セット内のメンバーが共通特性を有する場合の１セットのレポーターシグナルは、共通特性を欠く１つ以上のインジケータシグナルと一緒に使用することができる。別の例では、セット内のメンバーが共通特性を有する１セットのレポーターシグナルは、所与の別のセットのメンバーが第１のセットのレポーターシグナルの共通特性と異なる共通特性を有する場合の１つ以上の別のセットのレポーターシグナルと一緒に使用することができる。別の例では、各所与セットのレポーターシグナルのメンバーが別のセットのレポーターシグナルのメンバーの共通特性と異なる共通特性を有する場合の１つ以上のセットのレポーターシグナルは、複数セットのレポーターシグナルのうちの１つ以上またはすべての共通特性を欠く
１つ以上のインジケータシグナルと一緒に使用することができる。
【０１６６】
開示された多重レベル分析では、レポーターシグナル（あるいは、別の多次元シグナル）の識別を含む分析レベルは、レポーターシグナルレベル、レポーターシグナル識別レベル、またはレポーターシグナル分析と称することができる。いくつかの形式の多重レベル分析は、分析レベルの１つがレポーターシグナルレベルである場合に実行することができる。このように、開示されたレポーターシグナルレベルの分析は、レポーターシグナル分析の前または後のいずれで、他のサンプルおよび検体の処理または分析の技術または方法と組み合わせることができる。いくつかの形式の開示された方法は、インジケータレベルの後にレポーターシグナルレベルが続く。また、複数のインジケータレベルとレポーターシグナルレベルを同じ検定または検定システムで組み合わせることもできる。
【０１６７】
共通特性の関係は、質量（または質量電荷比）を用いて示すことができる。１例として、セットのメンバーが同じ質量（共通特性）を有する１セットのレポーターシグナルは、レポーターシグナルと異なる質量を有する（したがって、共通特性を欠く）１つ以上のインジケータシグナルとともに使用することができる。別の例では、セットのメンバーが同じ質量（共通特性）を有する１セットのレポーターシグナルは、所与の別のセットのメンバーが第１のセットのレポーターシグナルの質量（共通特性）と異なる質量（共通特性）を有する１つ以上の別のセットのレポーターシグナルと一緒に使用することができる。別の例では、各所与セットのレポーターシグナルのメンバーが別のセットのレポーターシグナルのメンバーの質量（共通特性）と異なる質量（共通特性）を有する１つ以上のセットのレポーターシグナルは、複数セットのレポーターシグナルの１つ以上またはすべてのメンバーと異なる質量を有する１つ以上のインジケータシグナルと一緒に使用することができる。よって、インジケータシグナルはレポーターシグナルの共通特性を欠く。これらの例では、所与セットのレポーターシグナルのすべてのメンバーが同じ質量を有する（よって、質量を共通特性とする）。
【０１６８】
たとえば、質量電荷比に関しても同じ関係が存在することができる。質量差は結果的に質量電荷比差を招き、異なる種に対する電荷が同一である場合、このような質量電荷比差は質量差に比例することを理解すべきである。このように、質量、質量差、および相対質量への言及は、質量電荷比、質量電荷比差、および相対質量電荷比への言及ともみなすべきである。１例として、セットのメンバーが同じ質量電荷比（共通特性）を有する１セットのレポーターシグナルは、レポーターシグナルと異なる質量電荷比を有する（よって、共通特性を欠く）１つ以上のインジケータシグナルと一緒に使用することができる。別の例では、セットのメンバーが同じ質量電荷比（共通特性）を有する１セットのレポーターシグナルは、所与の別のセットのメンバーが第１のセットのレポーターシグナルの質量電荷比（共通特性）と異なる質量電荷比（共通特性）を有する１つ以上の別のセットのレポーターシグナルと一緒に使用することができる。別の例では、各所与セットのレポーターシグナルのメンバーが別のセットのレポーターシグナルのメンバーの質量電荷比（共通特性）と異なる質量電荷比（共通特性）を有する１つ以上のセットのレポーターシグナルは、複数セットのレポーターシグナルの１つ以上またはすべてのメンバーと異なる質量電荷比を有する１つ以上のインジケータシグナルと一緒に使用することができる。よって、インジケータシグナルはレポーターシグナルの共通特性を欠く。これらの例では、所与セットのレポーターシグナルのすべてのメンバーが同じ質量電荷比を有する（よって、質量電荷比を共通特性とする）。
【０１６９】
開示された方法でのレポーターシグナルの使用によって、同一の検定において多数の様々なサンプルおよび／または検体を効率的に分析できる。たとえば、（レポーターシグナルが共通特性を有する場合、１セットのレポーターシグナルに属する）様々なレポーターシグナルが、様々なサンプルの検体を標識付けする、あるいは様々な検体を標識付けするのに使用することができる。他の多次元シグナルは、他のサンプルの検体を標識付けする、あるいは他の検体を標識付けするのに使用することができる。たとえば、異なるインジケータ標識（それぞれが共通特性においてレポーターシグナルと異なる）が他のサンプルの検体を標識付けするのに使用することができる。別の例では、異なるレポーターシグナル（レポーターシグナルが第１のセットのレポーターシグナルの共通特性と異なる共通特性を有する場合、第２のセットのレポーターシグナルに属する）が他のサンプルの検体を標識付けするのに使用することができる。第１の分析レベル（インジケータレベルの分析）が実行されるとき、レポーターシグナルは別の多次元シグナルと共通特性において異なり、この既知の差は所定パターンに基づくことができる。所定パターンによりトリガされる次のレベルの分析（レポーターシグナルレベルの分析）では、所定パターンによって示される分析サンプルの部分のレポーターシグナルは変更可能であり、変更された形式のレポーターシグナルが検出され、区別される。各セットのレポーターシグナルだけで、多くのサンプルおよび／または検体を差別的に検出でき、複数のセットのレポーターシグナルの使用は可能な多重レベルを増大させる。さらに、各異なるセットのレポーターシグナルはインジケータレベルの分析で生成されるパターンに寄与することができるため、レポーターシグナルレベルの分析をより効率的にする。
【０１７０】
該方法の形式によっては、１セットの多次元シグナルで第１のサンプルまたは第１のセットのサンプル内の検体を、あるいは異なるセットの多次元シグナルで第２のサンプルまたは第２のセットのサンプル内の検体を標識付けするステップと、第１及び第２のサンプルを混合して分析サンプルを形成するステップと、分析サンプル内の多次元シグナル−標識検体を分析して多次元シグナルから生じる１つ以上の所定パターンを識別するステップであって、１つ以上の所定パターンの識別は１つ以上の部分の分析サンプルを識別するステップと、１つ以上の識別部分の分析サンプルのうちの１つ以上における多次元シグナルを分析して分析サンプルの識別部分に存在する多次元シグナルを識別するステップとを含むことができる。該方法の形式によっては、複数セットの多次元シグナルの一方または両方が１セットのレポーターシグナルであってもよく、１つ以上の識別部分の分析サンプルのうちの１つ以上における多次元シグナルの分析はレポーターシグナルを識別する。複数セットの多次元シグナルの一方または両方が、レポーターシグナルおよびインジケータシグナルの両方、１セットのレポーターシグナルおよびインジケータシグナル、レポーターシグナルおよび１セットのインジケータシグナルまたは１セットのレポーターシグナルおよび１セットのインジケータシグナルを含むことができる。
【０１７１】
追加的な非限定的な形式の開示された方法は、１〜３のステップを含むことができる。存在する可能性のある別の分子から（たとえば、質量電荷比に基づき）等圧多次元シグナル（および付加された検体またはタンパク質）を分離するフィルタリング、選択、または分離ステップ、多次元シグナルを断片化して様々な質量を有する断片を作成する任意の断片化ステップ、および、たとえば質量電荷比に基づき、多次元シグナル、標識検体または標識タンパク質、あるいは両方を検出する、もしくは、様々な多次元シグナル、様々な標識検体、または様々な標識タンパク質、あるいはその両方を区別する検出ステップ。第１のステージのフィルタリング、選択、または分離ステップは、第２の断片化ステージを実行すべきかどうか、および／または分析された物質のどの部分を断片化ステージで分析できるか、あるいは分析すべきかどうかを示す所定パターンを作成するのに使用することができる。標識検体または標識タンパク質は好ましくは、付加された多次元シグナルによって共有されるが、存在する大部分の（または、好ましくは、すべての）別の分子には存在しない共通特性に基づき、別の分子から区別および／または分離される。標識検体または標識タンパク質は、標識検体または標識タンパク質の共通特性、概して標識検体またはタンパク質の質量電荷比に基づき、別の分子から区別および／または分離することができる。分離された標識検体は次に、様々な多次元シグナル、様々な標識検体または様々な標識タンパク質、またはその両方が区別可能となるように処理および／または検出される。様々な断片は、多次元シグナルおよび断片化標識検体またはタンパク質（検体またはタンパク質と多次元シグナルの残りの部分とで構成される）の断片を含む。一方または両方を検出することができ、最初の標識検体の特性を示す。後述するように、該方法はタンデム質量分析計を用いて最適に実行される。上記機器では、等圧多次元シグナルが最初にフィルタリングされ、次に（好ましくは衝突により）多次元シグナルが断片化され、断片が区別され検出される。
【０１７２】
開示された方法は、１つまたは複数の検体の高感度検出に有効である。概して、該方法は、検体に関連付けられる、組み込まれる、あるいは他の方法で連結される、もしくは検体と多次元シグナル間の重大な関連付けなしに単に検体とあわせて使用することのできる多次元シグナルと称される、特別な標識成分の使用を含む。その方法の実施形態によっては、多次元シグナル（あるいは、多次元シグナルの派生物）が検出されることによって、関連付けられた検体の存在を示す。別の実施形態では、検体（あるいは、検体の派生物）が多次元シグナル（あるいは多次元シグナルの派生物）と一緒に検出される。
【０１７３】
該方法の実施形態によっては、複数セットの多次元シグナル（たとえば、レポーターシグナル）は、セット内の２つ以上の多次元シグナルが共通特性を有する多次元シグナルを他の共通特性を欠く分子から区別および／または分離させることのできる１つ以上の共通特性を有する場合に使用可能である。別の実施形態では、複数セットの多次元シグナル／検体結合体（たとえば、複数セットのレポーターシグナル／検体結合体）は、１セット内の２つ以上の多次元シグナル／検体結合体が、共通特性を有する多次元シグナル／検体結合体を他の共通特性を欠く分子から区別および／または分離させることのできる１つ以上の共通特性を有する場合に使用可能である。さらに別の実施形態では、多次元シグナル／検体断片結合体（断片結合体と称することのできる）を作成するために、検体を（結合の前または後で）断片化することができる。このような場合、複数セットの断片結合体は、セット内の２つ以上の断片結合体が、共通特性を有する断片結合体を他の共通特性を欠く分子から区別および／または分離させることのできる１つ以上の共通特性を有する場合に使用可能である。断片化された検体は、それ自体で検体とみなされると理解されるべきである。これに鑑み、断片化された検体への言及は、特定の実施携帯を説明する際の便宜と明瞭化のために、ベース検体と断片化検体の両方への言及を認める。
【０１７４】
多次元シグナルと検体間に大きな物理的関連性が生じず、あるいは単独で、検体が存在しない場合、多次元シグナル（たとえば、レポーターシグナルまたはインジケータシグナル）は（多次元シグナルと検体の混合物内で）検体と組み合わせることができる。このような場合、多次元シグナルがもはや検体と関連付けられていないと、複数セットの多次元シグナルは、セット内の２つ以上の多次元シグナルが他の共通特性を欠く分子から共通特性を有する多次元シグナルを区別および／または分離することを可能にする１つ以上の共通特性を有している場合に、使用することができる。
【０１７５】
好適な実施形態では、開示された方法は２つの基本ステップ：多次元シグナル、標識検体、標識タンパク質、または多次元シグナル融合を存在する可能性のある別の分子から分離するフィルタリング、選択、または分離ステップと、様々な多次元シグナル、様々な標識検体、様々な標識タンパク質、様々な多次元シグナル融合、またはこれらの全部を検出または区別する検出ステップ、を含む。多次元シグナルは好ましくは、多次元シグナルによって共有されるが、存在する大部分の（あるいは、好ましくは全部の）別の分子には存在しない共通特性に基づき、別の分子から区別および／または分離される。次に、分離された多次元シグナルは、様々な多次元シグナルが区別可能となるように処理および／または検出される。（インジケータレベルの分析を構成する）第１のフィルタリングステップは、（レポーターシグナルレベルの検出を構成する）第２の検出ステップを実行すべきかどうかおよび／または分析された物質のどの部分を検出ステップにおいて分析できるか、あるいは分析すべきかを示す所定パターンを作成するのに使用することができる。有益な形式の開示された方法は、多次元シグナルと当該検体との関連付けを含む。多次元シグナルの検出は、結果的に対応する検体を検出する。したがって、開示された方法は、検体の標識付けと検出のための一般的な技術である。
【０１７６】
図１は、多次元シグナルの使用例を示す図である。２つのサンプルは、２セットの多次元シグナル（標識セット１および標識セット２）と関係なく標識付けされる。標識サンプルは混合され、トリプシン消化を受ける（これは、サンプル内のタンパク質を切断する）。混合され、トリプシン処理されたサンプルはＨＰＬＣで浄化され、２回の質量分析を受ける。実施例１は、図１に示されるステップ後の検定例を提供する。
【０１７７】
開示された方法の例の論理フローの有効例を図４Ａに示す。質量分析スペクトルが集められ（第１の枠）、スペクトルが分析されて非等圧パターンを検出する（第２の枠）。最初の２つの枠はインジケータレベルの分析に対応する。スペクトルは所定パターンに対して走査することができる（第１の円）。所定パターンが検出されない場合、インジケータレベルの分析は別のサンプルまたはサンプルの部分に関して繰り返される（第１の円から第１の枠へのループ）。所定パターンが検出される場合、パターンが検出されたサンプル部分は別のレベルの分析に送られる（第１の円；下向き矢印）。タンデム質量分析スペクトルがサンプルの部分に集められ（第３の枠）、スペクトルがサンプルに関する情報を得るため分析される。第３および第４の枠はレポーターシグナルレベルの分析に対応する。分析全体は追加サンプル上で繰り返すことができる（第２の円から第１の枠へのループ）。
【０１７８】
１例として実施例１を使用すると、スペクトルは１８ダルトンまたは１８ダルトンの倍数毎に分離される二重ピークに関して走査することができる。この種のパターンのコンピュータが実行する検出方法は既知である（たとえば、ｐｒｏ−ｉＣＡＴソフトウェア、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（製品番号ＷＣ０２６９９５；ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｃａｔａｌｏｇ／ｍｙａｂ／ＳｔｏｒｅＣａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ＣａｔｅｇｏｒｙＤｅｔａｉｌｓ．ｊｓｐ？ｈｉｅｒａｒｃｈｙＩＤ＝１０１＆ｃａｔｅｇｏｒｙ１ｓｔ＝１１１３９５＆ｃａｔｅｇｏｒｙ２ｎｄ＝１１１６３５＆ｃａｔｅｇｏｒｙ３ｒｄ＝１１２０５８））。所定パターンが検出されない場合、インジケータレベルの分析は別のサンプルまたはサンプル部分に対して繰り返される（円；左の矢印）。所定パターンが検出される場合、パターンが検出されたサンプル部分は別のレベルの分析に送られる（円；下向き矢印）。タンデム質量分析スペクトルは、サンプル部分上に集められ（第３の枠）、スペクトルはサンプルに関する情報を得るために分析される。最後の２つの枠はレポーターシグナルレベルの分析に対応する。図４は、図１に示される２つの質量分析ステージ内、およびその間に含めることのできる分析の例を示す。実施例１は、図４に示される論理フローの使用例を提示する。
【０１７９】
単純化するため、単独のタンパク質を図４に示す。この論理フローは、タンパク質のより広範な回収に拡張することができる。さらに、この２つのサンプル実験は、単にサンプルの作成およびプール方策を並行処理することにより拡張化することができる。１例として、図５に示される「処理済」サンプルの個体数と比較して、「通常の」入力サンプルの個体数を考えてみる。図５は、２つの異なるサンプルセット（対照サンプルおよび試験サンプル）が２つの異なるセットの多次元シグナル（標識セット１および標識セット２）の異なるメンバーで標識付けされる図１に示される方法の例である。この例では、５つの異なる試験サンプルがそれぞれ異なる標識セット２のメンバーで標識付けされ、７つの異なる対照サンプルがそれぞれ異なる標識セット１のメンバーで標識付けされる。標識セットはたとえば、表３に示される標識セットであってもよい。標識セットと対照および試験サンプル間の相関関係は明瞭化のためであって、方法の限定を表すものではない。標識サンプルは混合され、トリプシン消化を受ける（これがサンプル内のタンパク質を切断する）。混合され、トリプシン処理されたサンプルはＨＰＬＣで浄化され、２回の質量分析を受ける。好適な形式の方法は、標識セット１および標識セット２全体で標識対照および試験サンプルを混合する。
【０１８０】
この設計では、非等圧標識パターンの観察が、入力サンプルの個体数からの測定をトリガする。対照および試験状態に関する統計的推測に基づく個体数を検定に組み込むことができる。たとえば、測定数が多いほど、統計的信頼度は高くなる。好適な形式は、特定のタンパク質が対照または試験サンプル内に存在しない場合に対抗するため、複数セットの多次元シグナル（標識セット）全体で対照および試験サンプルを混合する。すなわち、各セットの多次元シグナルは、１つ以上の対照および１つ以上の試験サンプルを含むことができる。これによりセット間の偏差を低減、除去、あるいは制御することができる。
【０１８１】
開示された方法では、非等圧エレメントの数に特定の限定はない。この例では、互いに等圧でない２セットの多次元シグナルが使用されるため、２つの非等圧エレメントを検定に提供する。しかし、非等圧エレメントの数が増えるほど、ＭＳスペクトルは複雑になる。区別されるイオンの分離が測定のために使用される質量分析計の分解能より大きいことが好ましい。
【０１８２】
システムの非等圧および等圧エレメントが同一の多次元シグナルまたは複数セットの多次元シグナルによって具体化される必要はない。上記の例では、非等圧性が、それ以外は同一の組成の分子内の重グリシンの包含または排除を通じて与えられている。１例として、この方法は、単独セットの等圧多次元シグナル（たとえば  標識セット１）および該方法の非等圧性を与える第２の多次元シグナルとして使用することができる。たとえば、第一級アミンのアセチル化が既知である（Ｗｅｔｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ１：１１４〜１２２（１９９０））。重対軽の非等圧特徴は、無水酢酸との反応を通じて導入することができる。１例として、３つのエレメント非等圧システムが無水酢酸（軽い）、無水酢酸の重水素化類似体（重い）、または全フッ素化類似体の無水酢酸（非常に重い）での標識付けによって作製することができる。この場合、ＭＳスペクトルはこのセットの３つの非等圧標識に対応するパターンに関して走査することができ、次にＭＳ／ＭＳスペクトルはこれらの非等圧セットのメンバー間の差を決定する。
【０１８３】
該方法の非等圧性は、代謝手段により組み込むことができる。たとえば、重または軽リシン培養上で成長する細胞は、これらの重いまたは軽い残留物をそれぞれ組み込む。この方法に３つ以上の標識を包含する限定はない。
【０１８４】
上述したように、好適な形式の開示された方法は、質量電荷比に基づく、別の分子からの等圧多次元シグナル（および付加された検体またはタンパク質）のフィルタリング、様々な質量を有する断片を作成するための多次元シグナルの断片化、および質量電荷比に基づく様々な断片の検出を含む。第１のステージのフィルタリングは、第２の断片化ステージを実行すべきかどうかおよび／または分析された物質のどの部分を断片化ステージで分析できるか、あるいは分析すべきかを示す所定パターンを作成するのに使用することができる。
【０１８５】
該方法は上述するように、タンデム質量分析計を用いて最適に実行される。同一のサンプルは、（衝突ガスを用いて、または用いずに動作することによって）断片化有りでまたは断片化無しで分析することができ、その結果は質量電荷比の変動を検出するために比較される。非断片化と断片化のいずれの結果も、含まれる多次元シグナル（および検体）を確認する断片化を伴う、または伴わないピークと組み合わせて診断的なピークを提供すべきである。上記の区別は、適切な複数セットの等圧多次元シグナルを用いて達成され、検体の検出の大規模な多重化を可能にする。
【０１８６】
開示された方法は、ＭＡＬＤＩ−ＱｑＴＯＦ質量分析計の使用に特に適する。該方法によって、高度で非常に高感度な多重検体検出が可能になる。好適なタンデム質量分析計は、Ｌｏｂｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．、「ＭＡＬＤＩ−ＱｑＴＯＦ質量分析計の設計と性能」、第４７回ＡＳＭＳ会議、Ｄａｌｌａｓ、Ｔｅｘａｓ（１９９９）、Ｌｏｂｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１４（１２）：１０４７〜１０５７（２０００）、Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７２：２１３２〜２１４２（２０００）、およびＫｒｕｔｃｈｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、１１（６）：４９３〜５０４（２０００）に記載されている。このような機器では、サンプルがソース（たとえば、ＭＡＬＤＩ）でイオン化されて電荷イオンを作成する。イオン化条件は、一次単電荷親イオンが作成されるようにするのが好ましい。第１および第３の四極子Ｑ０およびＱ２はＲＦのみのモードで動作され、全電荷粒子のためのイオンガイドとしての役割を果たし、第２の四極子Ｑ１はＲＦ＋ＤＣモードで動作されて、特定の質量電荷のみ（すなわち、実質上、狭い質量電荷範囲）を通る。この四極子は当該質量電荷比（ｍ／ｚ）を選択する。Ｑ２の周りの衝突細胞は、衝突誘導性解離によって入力イオンを破断するためのガスで適切な圧力まで充填される（通常、衝突ガスは化学的に不活性だが、反応性ガスが意図される）。好適な分子システムは切断結合、不安定結合、またはその組み合わせを含む多次元シグナルを利用し、これらの結合はＱ２衝突細胞内で優先的に破断される。
【０１８７】
アレイ、ビーズ、超小型素子、組織サンプルなどの異種環境から得られるサンプルの多重分析を簡易化するため、ＭＡＬＤＩソースが開示された方法にとって好ましい。上記機器の例は、Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、「マトリックス支援レーザ脱離／イオン化によるペプチド分析用の実際的なイオントラップ質量分析計」、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、６８：１７８４〜１７９１（１９９６）に記載されている。異種検定に関しては、電気スプレーイオン化（ＥＳＩ）ソースは非常によく機能する。ＬＣシステムと相互作用する電気スプレーイオン化ソース機器が市販されている（たとえば、ＰＥ−ＳＣＩＥＸ製ＱＳＴＡＲ、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ製Ｑ−ＴＯＦ）。ＥＳＩソースは多電荷イオンを作成するように動作され、二重電荷イオンは開示された方法では最も一般的なイオンであることに注意されたい。上記二重電荷イオンは当該技術において既知であり、開示された方法への限定を示すものではない。ＴＯＦ分析器および四極子分析器はセクター分析器を超える好適な検出器である。フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴ−ＩＣＲ）質量分析計などのタンデムインタイムイオントラップシステムも、開示された方法で使用することができる。
【０１８８】
多数のエレメントが開示された方法の感度に貢献する。フィルタ四極子Ｑ１は狭い質量電荷比を選択し、他の質量電荷イオンに対して区別し、不適なイオンからバックグラウンドを大幅に低減する。たとえば、３０００ダルトン幅の質量電荷分布を含むサンプルに関しては、この分布に適用される２ダルトンの質量電荷送信ウィンドウは、少なくとも３０００／２＝１５００の因数で信号対雑音を向上させることができる。いったん親イオンが四極子Ｑ１により選択されると、親イオンの、好ましくは単電荷娘イオンへの断片化は親イオンを多数の娘イオンに断片化する利点をシステム全体に有する。たとえば、２０個の娘イオンに断片化された親イオンは、親イオンの平均２０分の１の強度であるシグナルをもたらす。単独の娘システムに対する親にとっては、このシグナル希釈は生じない。
【０１８９】
開示された方法で使用されるこの好適なシステムは高デューティサイクルを有し、それ自体優秀な統計を迅速に回収することができる。単独のセットの等圧親が使用される場合、フィルタ四極子を走査することなく多重検出が達成される（ただし、上記走査は、複数の標識タンパク質を有する複合タンパク質サンプルの単回分析にとって有益である）。電気スプレーソースは継続的に動作させることができ、ＭＡＬＤＩソースは数ｋＨｚで動作させることができ、四極子は継続的に動作させることができ、飛行時間分析器は数ｋＨｚの繰返し率で当該質量電荷領域全体を捕捉することができる。したがって、システム全体は、秒毎に何千回もの測定値を得ることができる。スループットに関しては、多重検定飛行時間分析器の利点は、飛行時間分析器が四極子分析器でのイオンの走査（あるいはステッピング）を必要とせずに同一の捕捉ですべての断片イオンを検出するため、最後のステージについては四極子分析器の利点よりも大きい。
【０１９０】
飛行経路に沿ったレーザポートの追加を含む機器的改良によって、光化学および光物理学プロセス（たとえば、選択的結合切断、選択的イオン化）による追加レーザ開放追加断片化方法でのタンパク質の交差が可能になる。フィルタステージ後にタンパク質を断片化するためのレーザの使用により、超高スループットのＴＯＦ−ＴＯＦ機器（５０〜１００ｋＨｚシステム）を使用することができる。
【０１９１】
開示された方法は、マルチステージ検出システムの第１のステージへの導入前にサンプルを単純化するための、バルクサンプルの切断、処理、または断片化を含む技術と両立できる。開示された方法は、未処理の抽出物および分割サンプルを含む所望のサンプルとも両立可能である。
開示された材料の形式と実施形態
Ａ．多次元分子標識付け
多次元分子標識付け（ＭＤＭＬ）と称される、ある形式の開示された方法では、多次元シグナルは最初に、検出および／または計量される検体と関連付けられ、次に解離され検出される。解離された多次元シグナルは、インジケータレベルの分析とレポーターシグナルレベルの分析を受ける。１例として、多次元シグナルは、当該検体と相互作用する特定結合分子に関連付けることができる。上記組み合わせは、多次元分子と称される。多次元分子内の特定結合分子は検体と直接相互作用し、多次元シグナルと検体を関連付ける。もしくは、多次元シグナルは、検体と間接的に関連付けることができる。多次元シグナルと特定結合分子との相互作用が直接的か間接的かにかかわらず、特定結合分子と検体との相互作用によって、多次元シグナルを検体と関連付けることができる。本発明の方法は、検体と多次元シグナル間の関連付けが、多次元シグナルが検出される際に得られる情報の１部となるように実行することができる。すなわち、多次元シグナルが検出のために検体から解離させることができるという事実は、検出された多次元シグナルが検体と関連付けられたという情報をあいまいにするものではない。様々な技術（たとえば、多次元シグナル標識付け、レポーターシグナル較正、および多次元シグナル融合）を用いて使用および／または検出される多次元シグナルは、ＭＤＭＬで使用することができる、および／またはＭＤＭＬと組み合わせることができる。
【０１９２】
開示された方法は、当該検体またはタンパク質の検出の感度および精度を向上させる。好適な形式の開示された方法は、多ステージの検出システムを利用して、非常に類似する特性を有する分子の検出の分解能を高める。１例では、該方法は少なくとも２つのステージを含む。第１のステージは、多次元シグナル（および付加された検体またはタンパク質）の固有の特性、およびすべての別の分子との区別に基づき、多次元シグナル、標識検体またはタンパク質、または多次元シグナル融合（すなわち、サブセットの分子が存在する）の通過または選択を可能にするろ過または選択である。以後のステージは、第１のステージでろ過された多次元シグナル、標識検体またはタンパク質、あるいは多次元シグナル融合をさらに分離および／または検出する。この方法の主要な側面は、多重化セットの多次元シグナル、標識検体またはタンパク質、または多次元シグナル融合がフィルタにより選択され、付加された多次元シグナルがその後切断され、分解され、反応され、または別の方法で修飾されて、次のステージで断片化多次元シグナル、断片化標識検体またはタンパク質、および／または断片化多次元シグナル融合の独自性および／または量を実現することである。多次元シグナルと検出された娘断片とは対応する。
Ｂ．多次元シグナル標識付け
多次元シグナル標識付け（ＭＤＳＬ）または多次元シグナルタンパク質標識付けと称される別の形式の開示された方法では、多次元シグナルは、１つまたは複数の検体またはタンパク質の高感度検出のために使用される。該方法は、多次元シグナル、標識検体または標識タンパク質、またはその両方検出することによって、あるいは、様々な多次元シグナル、様々な標識検体または様々な標識タンパク質、またはその両方を区別することによって、検体またはタンパク質を検出することを含む。その方法では、多次元シグナルで標識付けされる検体またはタンパク質は多次元シグナルを用いて分析され、標識検体またはタンパク質を区別する（検体またはタンパク質が多次元シグナルで標識付けされている場合）。多次元シグナルはインジケータレベルの分析および／またはレポーターシグナルレベルの分析を受ける。多次元シグナルの検出は結果的に、対応する標識検体（検体が多次元シグナルで標識付けされている場合）または対応する標識タンパク質（タンパク質が多次元シグナルで標識付けされている場合）を検出する。標識検体または標識タンパク質の検出は結果的に対応する検体およびタンパク質を検出する。検出された検体は、既知の技術を用いて分析することができる。よって、標識としての多次元シグナルの使用は、検体またはタンパク質を具体的に識別することのできる独自の検体／標識組成または独自のタンパク質／標識組成を提供する。したがって、多次元シグナル標識付けと多次元シグナルタンパク質標識付けは、検体およびタンパク質の標識付け、検出、および計量の一般的技術である。
【０１９３】
「タンパク質」の検出に対して上記および本明細書の他の場所で言及されているが、開示された方法および構成はタンパク質、ペプチド、およびタンパク質またはペプチドの断片を含むことに注意されたい。したがって、本明細書でのタンパク質に対する言及は、文脈上明らかに別の内容が示されない限り、タンパク質、ペプチド、およびタンパク質またはペプチド断片を指すことを意図する。
【０１９４】
実施形態によっては、多次元シグナルは、電荷は同様だが質量の異なる断片を生むように断片化される設計がなされている。これにより、セット内の各標識検体またはタンパク質（および／または、各多次元シグナルまたは多次元シグナル融合（たとえば、レポーターシグナル融合））を多次元シグナルの断片の様々な質量電荷比によって区別することができる。これは、セット内の非断片化多次元シグナルは等圧であるが、異なる多次元シグナルの断片は等圧ではないため可能である。開示された方法ではこれにより、各タンパク質／多次元シグナルの組み合わせ（あるいは、検体／多次元シグナルの組み合わせまたは多次元シグナル融合）を、多次元シグナルの断片化後、タンパク質／多次元シグナルの質量電荷比によって区別することができる。
【０１９５】
したがって、標識検体または標識タンパク質は分析前に断片化することができる。分析される検体またはタンパク質サンプルは、サンプルの複雑性を低減するため、分画または分離されることもできる。断片化および分画は同じ検定で一緒に使用することもできる。上記断片化および分画は、検体の分析を簡略化し拡張することができる。
【０１９６】
多次元シグナルは検体またはタンパク質と結合する、あるいは直接関連付けることができる。たとえば、多次元シグナルは反応性基を介して検体またはタンパク質に連結することができる、あるいは（特定結合分子と多次元シグナルから成る）多次元分子は検体またはタンパク質と関連付けることができる。多次元シグナルは任意の方法で検体またはタンパク質に付加することができる。たとえば、多次元シグナルは、タンパク質上のシステインと多次元シグナル上のシステイン間の硫黄−硫黄結合を通じてタンパク質に共有結合させることができる。検体に対する結合化合物のためのその他多くの化学物質および技術が既知であり、多次元シグナルを検体に結合するのに使用することができる。たとえば、結合は、チオール、エポキシド、チオール用ニトリル、ＮＨＳエステル、アミン用イソチオシアン酸塩、およびカルボン酸用アルコールを用いて実行できる。多次元シグナルは直接的または間接的に、たとえば、リンカーを介して検体に付加させることができる。
【０１９７】
多次元シグナル、または多次元シグナルを含む構築物は、連結によっても検体に付加または連結することができる。核酸類の連結方法は既知である（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．「分子クローン作成：研究所マニュアル」、第２版、１９８９、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）。効率的なタンパク質連結は既知である（たとえば、Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、「天然化学連結によるタンパク質合成」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６、７７６〜９（１９９４）；Ｈａｃｋｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、「マルチドメインタンパク質：抗凝固ミクロタンパク質Ｓの化学合成および自発的褶曲」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：１４０７４〜８（２０００）；Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、「化学連結による天然タンパク質の合成」Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６９：９２３〜９６０（２０００）；米国特許第６，１８４，３４４号；ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２８４３４を参照）。
【０１９８】
もしくは、多次元シグナルは間接的に検体と関連付けることができる。このモードでは、特定結合分子と符号化タグを含む「符号化」分子は、（特定結合分子を介して）検体と関連付けることができる。もしくは、符号化タグは検体と連結する、あるいは直接関連付けることができる。次いで、復号化タグと関連付けられる多次元シグナル（上記組み合わせは別の形式の多次元分子である）は、符号化タグと復号化タグ間の相互作用を通じて符号化分子に関連付けられる。相互作用の例は、符号化タグおよび復号化タグが補完的核酸配列であるハイブリッド形成である。その結果は、多次元シグナルと検体の間接的な関連付けである。このモードは、多次元シグナルと符号化分子との相互作用のすべてが、セット内のすべての符号化分子および多次元分子に対して同じ種類の符号化タグおよび復号化タグを使用することにより化学的および物理的に同様に行われるという利点を有する。
【０１９９】
ＭＤＳＬで使用される多次元シグナルは、インジケータレベルの分析において１つ以上の所定パターンを生成することができる。多次元シグナルが検体に連結される場合、パターンは多次元シグナルおよび検体の組み合わせによって生成することができる。
【０２００】
レポーターシグナルなどの多次元シグナルは、好ましくは特有の方法で、断片化し、分解し、反応させ、誘導体化し、あるいは別の方法で修飾することができる。これにより、多次元シグナルが付加または融合される検体またはタンパク質を、多次元シグナルの断片化、分解、反応、誘導体化、またはその他の修飾に続く、標識検体または標識タンパク質および標識検体またはタンパク質の１つ以上の産物の相関検出によって識別することができる（標識検体は検体／多次元シグナルの組み合わせで、標識タンパク質はタンパク質／多次元シグナルの組み合わせである）。タンパク質は多次元シグナルペプチドの断片化、分解、反応、誘導体化、またはその他の修飾に続く、多次元シグナル融合および多次元シグナル融合の１つ以上の産物の相関検出によって識別することもできる。多次元シグナルの変更は特有の検出可能な方法で、標識検体または標識タンパク質を変更する。ともに、特有の標識検体または標識タンパク質および標識検体または標識タンパク質の特有の産物の検出は、検体またはタンパク質を一意的に識別することができる。このように、開示された方法および材料を用いて、１つ以上の検体またはタンパク質を、個々にあるいは一緒に（たとえば、複数の検定で）検出することができる。さらに、１つ以上のサンプル内の１つ以上の検体またはタンパク質は多重的に検出することができる。たとえば、質量分析多次元シグナルに関しては、多次元シグナルは、電荷は同様だが質量の異なる断片を生むように断片化される。
【０２０１】
実施形態によっては、レポーターシグナルなどの多次元シグナルは、セット内のすべての多次元シグナルが同様の特性（たとえば、同様の質量電荷比）を有するセットで使用される。同様の特性によって、１つ以上の特性を欠く別の分子から多次元シグナルを区別および／または分離することができる。実施形態によっては、セット内の多次元シグナルは同じ質量電荷比（ｍ／ｚ）を有する。すなわち、セット内の多次元シグナルは等圧である。これにより、多次元シグナル（あるいは、多次元シグナルが付加される検体）を質量電荷比に基づき別の分子から正確に分離することができる。フィルタリングの結果、システムにとっての信号雑音比（Ｓ／Ｎ）は大幅に増大し、より高感度で正確な検出を可能にする。もしくは、またはさらに、多次元シグナルは、結果として生じる標識検体が、標識検体を１つ以上の特性を欠く別の分子から区別および／または分離することができる同様の特性を有するセット内で使用することができる。
【０２０２】
検体は様々な方法で、開示された多次元シグナルを用いて検出することができる。たとえば、検体および付加された多次元シグナルはともに検出することができ、検体および付加された多次元シグナルの１つ以上の断片はともに検出することができ、多次元シグナルの断片は検出することができる、あるいは組み合わせることができる。
【０２０３】
ある非限定的な形式の開示された方法は、多次元シグナルの断片化の前後両方における多次元シグナルの相関検出を含む。これにより、標識検体またはタンパク質を、標識検体またはタンパク質の変化を通じて検出および識別することができる。すなわち、検出された多次元シグナルの性質（非断片化対断片化）は、標識付けされる検体またはタンパク質を識別する。検体またはタンパク質および多次元シグナルが質量電荷比により検出される場合、断片化サンプルと非断片化サンプル間の質量電荷比の変化は比較の根拠を提供する。上記質量電荷比の検出は好ましくは、質量分析で達成される。
【０２０４】
１例として、サンプル内の検体は、質量分析標識として設計される多次元シグナルで標識付けすることができる。標識検体は質量分析を受けることができる。検体／多次元シグナルに対応するピークが検出される。検定で異なる多次元シグナルで標識付けされる検体は、パターンを形成する関連ピークを生成することができる。上記パターンは、さらなるレベルの分析を実行できるか、あるいは実行すべきか、および／または分析された物質のどの部分をさらなるレベルの分析で分析できるか、あるいは分析すべきかを示すために使用することができる。質量分析計内（好ましくは、衝突細胞内）での多次元シグナルの断片化は結果的に、付加された多次元シグナルの部分の損失、失われた断片に対応するピークの出現、または両事象の組み合わせに対応するピークの変動を招く。重要なことに、観察される変動は、様々な多次元シグナルが設計上、様々な質量電荷比を有する断片を作成するため、どの多次元シグナルが検体上にあるかに左右される。親質量電荷（衝突ガスなしで）および多次元シグナルからの断片の損失に対応する質量電荷（衝突ガスで）の検出の組み合わせ事象は標識検体を示す。検体の独自性は、組成分析などの標準的な質量分析技術によって判定することができる。
【０２０５】
有力な形式の開示された方法は、多次元シグナルで標識付けされる検体またはタンパク質の使用、または複数のサンプルを検定するための（たとえば、時系列検定またはその他の比較分析）多次元シグナル融合の使用である。摂動後の生体系の一時的反応に関する知識は、生体系の理解を求める上で非常に有効なプロセスである。一時的反応を追うため、生体系のサンプル（たとえば、細胞培養からの細胞、最初に同調され犠牲にされたマウス）が摂動後の所定の時点で得られる。空間的検体プロフィール（たとえば、組織部位内の相対位置）に関する知識は、生体系の理解を求める上で非常に有効なプロセスである。  開示された方法では、一連のサンプルがそれぞれ１セットの多次元シグナルからの異なる多次元シグナルによって標識付けすることができる。この目的での非限定的な多次元シグナルは、差別的に分布される質量を用いるシグナルである。特に、セットの多次元シグナルのメンバーが化学的に同一に挙動するか区別可能であることを確保するため、安定的な同位体を使用することができる。
【０２０６】
標識検体はその質量電荷比に基づく分子間の高感度な区別を可能にする質量分析を用いて検出することができる。開示された多次元シグナルは、無数の標識付けおよび／または検出技術において全般的な標識として使用することができる。多次元シグナル断片は広範囲の質量を有するように設計され、各質量は検出後個々に区別可能であるため、１つ以上のセットの等圧多次元シグナルは多くの検体の多重標識付けおよび／または検出用に使用することができる。さらに、セットが相互に等圧ではない１つ以上の等圧多次元シグナルセットは、所定パターンの生成と、開示された方法の多重能力を高める有効な方法を提供する。（たとえば、異なるサンプル内の同一の検体を標識付けすることによって）同一の検体または同種の検体が１セットの等圧多次元シグナルで標識付けされる場合、多次元シグナルの等圧セットから生じるセットの標識検体も等圧となる。同様に、他のセットに対して等圧でない非等圧多次元シグナルおよび複数セットの多次元シグナルは、（たとえば、異なるサンプル内の同一の検体を標識付けすることによって）同一の検体を標識付けするのに使用することができる。その結果、等圧でない標識検体となる。異なる質量を有する標識検体のパターンが生成される。異なるサンプルの同一の検体を標識付けするために等圧および非等圧多次元シグナルまたは複数セットの多次元シグナルの組み合わせを使用することで、インジケータレベルの分析における質量のパターンを生成することができる。レポーターシグナルレベルの分析における多次元シグナルの断片化は、独特に異なる質量を有する個々に検出可能な標識タンパク質をセットの標識検体に分割する。
【０２０７】
開示された方法は多くのモードで使用することができる。たとえば、開示された方法は、（特定サンプルまたは複数のサンプルで）特定検体またはタンパク質を、あるいは（単独のサンプルまたは複数のサンプルで）複数の検体またはタンパク質を検出するのに使用することができる。それぞれの場合、検出される検体またはタンパク質は互いに、未標識検体、または検出される標識検体の特性を欠く別の分子から分離することができる。たとえば、サンプル内の検体またはタンパク質は概して多次元シグナルで標識付けすることができ、検体またはタンパク質は検体またはタンパク質の特性に基づき分離することができる。たとえば、分離された検体またはタンパク質は特定の質量電荷比を有することができる（質量電荷比に基づく分離は、選択された質量電荷比を有する標識検体と未標識検体の両方を選択する）。別の例では、標識検体または標識タンパク質のすべてを、アフィニティタグなどの多次元シグナルの特徴に基づき未標識分子から区別および／または分離することができる。異なるアフィニティタグが使用される場合、ある標識検体は別の標識検体から区別および／または分離することができる。多次元シグナル標識付けによって、検体のプロファイリングと検体のカタログ化が可能になる。
【０２０８】
開示された方法の１つのモードでは、所与のサンプル内のすべての検体またはタンパク質が同一の多次元シグナルで標識付けされる場合、複数のサンプル内の複数の検体またはタンパク質が標識付けされる。すなわち、多次元シグナルが、サンプル内の検体またはタンパク質の全般的な標識として使用される。しかしながら、各サンプルは異なる多次元シグナルを使用する。これにより、サンプルは全体として相互に比較することができる。サンプル内の様々な検体またはタンパク質を補足的に分離または区別することによって、単独の検定で多くのサンプル内の多くの検体またはタンパク質を容易に分析することが可能になる。たとえば、複数のサンプルのタンパク質は上述したように多次元シグナルで標識付けされ、サンプルは一緒に混合される。各種標識タンパク質の１部または全部が、たとえば、タンパク質とアレイ上の抗体との関連付けによって分離される場合、各サンプル内の所与のタンパク質の存在および量は各アレイエレメントに存在する多次元シグナルを識別することによって判定可能である。所与のアレイエレメントに対応するタンパク質が特定のサンプル内に存在した場合、アレイエレメントに関連付けられるタンパク質のいくつかは、特定のサンプルを標識付けするために使用される多次元シグナルで標識付けされる。その多次元シグナルの検出はこれを示す。この同じ関係が他のサンプルすべてにも当てはまる。さらに、検出される多次元シグナルの量は、所与のサンプル内の所与のタンパク質の量を示すことができ、複数のサンプル内のタンパク質の同時計量は、各種サンプル内のタンパク質のレベルを特に正確に比較することができる。
【０２０９】
任意に、選択ステップは、標識付けされる、あるいは標識付けされているであろう検体を含むサブセットの検体がサンプル内の他の構成要素から分離される分画ステップによって先行されてもよい。たとえば、ＳＨ２ドメインを有するタンパク質は、選択ステップの前に、細胞サンプル内の他のタンパク質から分離することができる。上記ステップは必ずしも必要ではないが、存在する余分な分子の数を減らすことによって選択ステップを向上させることができる。
【０２１０】
好適な実施形態では、多次元シグナル（あるいは、レポーターシグナルまたはインジケータシグナル）は、セット内のすべての多次元シグナル（あるいは、レポーターシグナルまたはインジケータシグナル）が同様の特性（たとえば、同様の質量電荷比）を有するセットで使用される。同様の特性によって、多次元シグナル（あるいは、レポーターシグナルまたはインジケータシグナル）を１つ以上の特性を欠く別の分子から区別および／または分離することができる。実施形態によっては、セット内の多次元シグナル（あるいは、レポーターシグナルまたはインジケータシグナル）は同じ質量電荷比（ｍ／ｚ）を有する。すなわち、セット内の多次元シグナル（あるいは、レポーターシグナルまたはインジケータシグナル）は等圧である。これによって、多次元シグナル（あるいは、レポーターシグナルまたはインジケータシグナル、またはそれらが付加されるタンパク質）を質量電荷比に基づき別の分子から正確に分離することができる。フィルタリングの結果、システムにとっての信号雑音比（Ｓ／Ｎ）は大幅に増大し、より高感度で正確な検出を可能にする。もしくは、またはさらに、多次元シグナル（あるいは、レポーターシグナルまたはインジケータシグナル）は、結果として生じる標識タンパク質が標識タンパク質を１つ以上の特性を欠く別の分子から区別および／または分離することができる同様の特性を有するように、セット内で使用することができる。
【０２１１】
タンパク質は、様々な方法で開示された多次元シグナルを用いて検出することができる。たとえば、タンパク質および付加された多次元シグナルは一緒に検出することができ、タンパク質および付加された多次元シグナルの１つ以上のペプチドは一緒に検出することができ、多次元シグナルの断片は一緒に検出することができる、あるいは組み合わせることができる。好適な検出は、多次元シグナルの断片化の前後両方におけるタンパク質／多次元シグナルまたはペプチド／多次元シグナルの検出を含む。
【０２１２】
１例として、サンプル内のタンパク質は、質量分析標識として設計される多次元シグナルで標識付けすることができる。標識タンパク質は、トリプシン消化とその後の結果として生じる材料の質量分析を受ける。多次元シグナルを含むトリプシン断片に対応するピークが検出される。質量分析計での（好ましくは、衝突細胞での）多次元シグナルの断片化は結果的に、付加された多次元シグナルの部分の損失に対応するピークの変動、失われた断片に対応するピークの出現、または両事象の組み合わせを招く。重要なことに、観察される変動は、様々な多次元シグナルが設計上、様々な質量電荷比を有する断片を作成するため、どの多次元シグナルがタンパク質上にあるかに左右される。親質量電荷（衝突ガスなしで）および多次元シグナルからの断片の損失に対応する質量電荷（衝突ガスで）の検出の組み合わせ事象は標識タンパク質を示す。組み合わせ事象は、上記のリン酸化部位の検出と同様の方法で実行することができる。タンパク質のトリプシン断片の独自性は、組成分析およびペプチド配列などの標準的な質量分析技術により判定することができる。
【０２１３】
開示された方法でタンパク質サンプルから作成される標識検体断片または標識タンパク質断片のすべてが一意的であるわけではない。１部のタンパク質は異なるタンパク質と同一の共通モチーフとを有し、サンプルから作成される１部のタンパク質断片またはペプチドは、異なるタンパク質から得られるけれども同一である。たとえば、関連タンパク質のいくつかの族は、上記共通モチーフまたは共通アミノ酸配列を有する。したがって、開示された方法の実施形態によっては、特有の標識タンパク質の検出は結果的に、関連タンパク質の共通部分の検出であるかもしれない。上記の結果は、タンパク質の族の検出が所望されるときに有利である。もしくは、関連タンパク質の上記集団的検出は、族内のタンパク質の一意の断片（すなわち、非同一のポートイオン）の検出に焦点を当てることによって回避することができる。便宜上、本明細書で使用されるように、複数の関連タンパク質の共通部分の検出は、文脈上明らかに他の内容を示さない限り、独自のタンパク質、標識タンパク質、またはその他の構成要素の検出への言及を含むよう意図する。
【０２１４】
開示された方法では、一連のサンプルはそれぞれ、１セットの多次元シグナルからの様々な多次元シグナルで標識付けすることができる。この目的で好適な多次元シグナルは、差別的に分布される質量を用いるものである。特に、セットの多次元シグナルのメンバーが化学上同一に挙動するが区別可能であるように確保するため、安定的な同位体の使用が好適である。標識のセットの例が表１に示され、５つの時点がそれぞれ５つの標記標識のうちの１つで標識付けされ、サンプルの混合物を同時に読み出すことができる。非断片化標識はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で、断片化標識はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸７〜１２である。
【０２１５】
【表１】
2008529035.tif 000003
開示された方法では、これらの標識は、等圧標識と一緒に所定パターンを形成する１つ以上の他の多次元標識と組み合わせて使用される。標識タンパク質は好ましくはその質量電荷比に基づき、分子間の高感度な区別を可能とする質量分析を用いて検出される。開示された多次元シグナルは、無数の標識付けおよび／または検出技術において全般的な標識として使用することができる。多次元シグナル断片は広い範囲の質量（あるいは、質量電荷比）を有するように設計され、各質量（あるいは、質量電荷比）は検出後、個々に区別可能であるため、１セットの等圧多次元シグナルは多くのタンパク質の多重標識付けおよび／または検出のために使用することができる。同一の検体、同種の検体、同一のタンパク質、または同種のタンパク質が（たとえば、異なるサンプル内の同一のタンパク質を標識付けすることによって）１セットの等圧多次元シグナルで標識付けされる場合、等圧セットの多次元シグナルから生じるセットの標識検体または標識タンパク質も等圧となる。多次元シグナルの断片化は、セットの標識検体または標識タンパク質を、特有に異なる質量を有する、個々に検出可能な標識検体またはタンパク質に分割する。
【０２１６】
検出が検出された検体、タンパク質またはペプチドの配列またはその他の構造に関する情報を提供する場合、該方法は検体、タンパク質、ペプチド、およびタンパク質断片の検出を可能にする。たとえば、質量または質量電荷比、アミノ酸組成、またはタンパク質のアミノ酸配列を判定することができる。特定の多次元シグナルを用いてサンプル内で検出されたセットの検体、タンパク質、ペプチドおよび／またはタンパク質断片は、特有の複数セットの検体、タンパク質およびペプチド情報を作成する。該方法により、検体またはタンパク質の複合サンプルは、再現可能な方法で迅速かつ容易にカタログ化される。また、開示された方法は、サンプル内の各検体、タンパク質、ペプチド、またはペプチド断片に対する２つの「シグナル」：最初の標識検体または標識タンパク質と変更された形式の標識検体またはタンパク質とを作成すべきである。これにより、１セットの検出された検体、タンパク質およびペプチドを比較し検証することができる。
【０２１７】
好適な形式の開示された方法は、同一の検定において２つ以上のサンプルまたはタンパク質内の標識検体またはタンパク質の検出を含む。これにより、サンプル内の検体またはタンパク質間の簡潔で一貫した差の検出が可能になる。差別的な検出は、様々な多次元シグナルで標識付けされる各サンプル内の検体またはタンパク質を標識付けすることによって達成される。好ましくは、様々なサンプルに対して使用される様々な多次元シグナルは等圧セットを構成する。このように、各サンプルの同一の標識検体または標識タンパク質は、様々なサンプル内の標識検体または標識タンパク質と同じ質量電荷比を有する。しかしながら、多次元シグナルの断片化後、様々なサンプル内の各断片化標識検体またはタンパク質は様々な質量電荷比を有するため、それぞれを別々に検出することができる。すべてが同一の測定で検出可能である。これは、時間とデータ品質の両方において非常に大きな利点である。たとえば、サンプルは単独の工程で検査されるため、様々な工程で検査された様々なサンプルの結果を補正あるいは標準化する必要がない。同一の工程で測定されるため、様々なサンプル内の同一の検体の相対量を正確に比較することができる。サンプル間の不一致を引き起こす差異は生じない。
【０２１８】
開示された方法のこの複数のサンプルモードの好適な使用は、サンプルの時系列分析である。このような時系列は、長期にわたるサンプルまたは反応の変化を検出するのに有効である。たとえば、  試験化合物の添加後、長期間にわたる細胞培養内の検体またはタンパク質レベルの変化が評価される。このモードでは、様々な時点サンプルが様々な多次元シグナルで標識付けされ、好ましくは等圧セットを構成する。このように、それぞれの時点での同一の標識検体またはタンパク質は、様々な時点での標識検体またはタンパク質と同じ質量電荷比を有する。しかしながら、多次元シグナルの断片化後、様々な時点での各断片化標識検体またはタンパク質は様々な質量電荷比を有するため、それぞれ別個に検出することができる。
【０２１９】
開示された方法は、未知の検体およびタンパク質に関するカタログ情報を収集するのにも使用することができる。この検体またはタンパク質の発見モードは検体またはタンパク質の存在またはパターンと分析とを容易に連携させることができる。たとえば、標識検体またはタンパク質のサンプルは、１つ以上の他のサンプルの検体と比較することができる。１つまたはいくつかのサンプルに出現するが他のサンプルには出現しない検体またはタンパク質は、従来の技術を用いて分析することができる。標的検体またはタンパク質は開示された標識付け、検出、および計量により他と区別可能である。このモードの方法は好ましくは、質量分析を用いて実行される。
【０２２０】
実施形態によっては、開示された方法は、検体またはタンパク質の複合サンプルを再現可能な方法で迅速かつ容易にカタログ化することができる。上記カタログは相互に比較することができ、同様に、別の検体またはタンパク質サンプルの作成されたカタログによってサンプル間の差異を簡便に検出することができる。検体またはタンパク質サンプルに関する相当の情報量を組み込んでいるカタログは、関連検体またはタンパク質サンプルの検出と検体またはタンパク質サンプルの比較の両方に使用可能なサンプルのフィンガープリントとしての役割を果たすことができる。たとえば、特定生体の存在または独自性は、試験生体の検体および／またはタンパク質のカタログを作成し、結果として生じるカタログと既知の生体から作成される基準カタログを比較することによって検出可能である。検体および／またはタンパク質パターンの変化と差は、様々な細胞サンプルからの検体またはタンパク質のカタログを作成し、カタログを比較することによっても検出可能である。開示された方法で作成された検体および／またはタンパク質カタログの比較は、たとえば、質量分析で提供される高分解能によって簡易化される。
【０２２１】
開示された方法で処理される各標識検体またはタンパク質は結果的に、標識検体またはタンパク質の特質（たとえば、質量電荷比）に基づくシグナルとなる。複合検体またはタンパク質サンプルはシグナルの独自のパターンを作成することができる。検体またはタンパク質サンプルの独自のカタログ化と、様々な検体またはタンパク質サンプルから作成されるシグナルパターンの高感度で有効な比較とを可能にするのがこのパターンである。
【０２２２】
様々な標識検体または様々な標識タンパク質の存在、量、存在および量、または不在は、サンプル内の特定検体または検体断片（あるいは、タンパク質またはタンパク質断片）の存在または不在に基づく、検体またはタンパク質、よって検体またはタンパク質サンプルのシグニチャまたはフィンガープリントを提供するシグナルパターンを形成する。このため、このシグナルパターン（すなわち、標識検体またはタンパク質の存在、量、存在および量、または不在のパターン）のカタログ化は、特に関連深い開示された方法の実施形態である。
【０２２３】
カタログは、たとえば、標識検体またはタンパク質のパターン、標識検体またはタンパク質の存在のパターン、標識検体またはタンパク質のカタログ、またはサンプル内の検体またはタンパク質のカタログとして構成される、あるいは称される。カタログ内の情報は好ましくは、質量電荷情報または組成情報の形式を採る。カタログは開示された方法で生成された情報から得られる他の情報（たとえば、検出された検体またはタンパク質の独自性）を含む、あるいはその情報から構成されることができ、他のソースから入手または生成される情報と組み合わせることができる。開示された方法を用いて作成されるカタログの情報の性質は、既知のバイオインフォマティクスシステムおよび方法を用いるタンパク質の組み合わせおよび／または分析に役立つ。
【０２２４】
検体またはタンパク質サンプルの上記カタログは、サンプルの類似点および差異（サンプル内の検体またはタンパク質の類似点および差異を示す）を検出するため、別のサンプルから得られる類似のカタログと比較することができる。たとえば、第１の検体またはタンパク質サンプルのカタログは、第１の検体またはタンパク質サンプルと同種の生体からのサンプル、第１の検体またはタンパク質サンプルと同種の組織からのサンプル、第１の検体またはタンパク質サンプルと同一の生体からのサンプル、同一のソースからだが、第１の検体またはタンパク質サンプルと異なる時点で得られるサンプル、第１の検体またはタンパク質サンプルと異なる生体からのサンプル、第１の検体またはタンパク質サンプルと異なる種類の組織からのサンプル、第１の検体またはタンパク質サンプルと異なる種の生体からのサンプル、第１の検体またはタンパク質サンプルと異なる種の生体からのサンプル、または、第１の検体またはタンパク質サンプルと異なる種類の生体からのサンプルのカタログと比較することができる。
【０２２５】
同種の組織とは、肝臓組織、筋肉組織、または皮膚（同一のまたは異なる生体、あるいは生体の種類から得ることができる）などの同じ種類の組織である。同一の生体とは、同一の個人、動物、または細胞を指す。たとえば、患者から採取される２つのサンプルは同一の生体から得られるものである。同一のソースは似ているが、より広範で、たとえば、同一の生体、同一の生体からの同一の組織、同一の検体、または同一の検体サンプルからのサンプルを指す。比較対象となる同一のソースからのサンプルは、様々な時点で回収することができる（よって、検出される時間の間に起こりうる変化を考慮する）。処理の影響や状況変化を評価すべきとき、これは特に有用である。異なる処理を受けた同一ソースからのサンプルを、開示された方法を用いて回収し比較することができる。異なる生体は、異なる患者、異なる個々の動物などの異なる個々の生体を指す。異なる生体は、同種の異なる生体または異なる種の生体を含む。異なる種類の生体は、犬と猫、人間とマウス、または大腸菌とサルモネラ菌などの異なる種の生体を指す。異なる種類の組織は、肝臓と腎臓、または皮膚と脳などの異なる種類の組織を指す。異なる種の生体は、用語は当該技術において理解されるため、種の名称の異なる生体を指す。
【０２２６】
関連サンプルから得られる検体またはタンパク質のカタログを比較する際、サブセットの相関対の標識検体またはタンパク質およびその変更された形式の存在を特定することができる。開示された方法は、最初の標識検体またはタンパク質および変更された形式の標識検体またはタンパク質を検出する（およびその特質を判定する）ために使用することができる。この対の検出された検体またはタンパク質は、標識付けされる検体および使用される特定多次元シグナル（必ずしも一意的である必要はないが）を特徴とする。
【０２２７】
したがって、多次元シグナル標識付けおよび多次元シグナルタンパク質の標識付けは、検体およびタンパク質のプロファイリング、検体およびタンパク質の新規発見、および検体およびタンパク質のカタログ化を可能にする。該方法は、検体およびタンパク質分析、プロテオーム分析、プロテオーム、タンパク質発現プロファイリング、新規検体およびタンパク質の発見、機能的ゲノム学、および検体またはタンパク質検出のための検出および分析システムとして使用可能な有利な特性を有する。
【０２２８】
様々な技術（多次元分子標識付け、レポーターシグナル較正、多次元シグナル融合など）を用いて使用および／または検出される多次元シグナルは、ＭＤＳＬで、および／またはＭＤＳＬと組み合わせて使用することができる。
Ｃ．レポーターシグナルおよびインジケータシグナル較正
レポーターシグナル較正（ＲＳＣ）と称される別の形式の方法では、レポーターシグナルキャリブレータと称される１形式のレポーターシグナルが検体または検体断片（あるいは、タンパク質またはタンパク質断片）と混合され、レポーターシグナルキャリブレータおよび検体または検体断片（あるいは、タンパク質またはタンパク質断片）が変更され、変更された形式のレポーターシグナルキャリブレータおよび変更された形式の検体または検体断片（あるいは、タンパク質またはタンパク質断片）が検出される。レポーターシグナルキャリブレータは、存在する検体またはタンパク質の量を評価するための基準として有益である。すなわち、存在する検体またはタンパク質の量を評価するため既知量のレポーターシグナルキャリブレータを添加して、検出された、変更された検体または検体断片（あるいは、タンパク質またはタンパク質断片）の量と検出された、変更されたレポーターシグナルキャリブレータの量とを比較し、添加された既知量のレポーターシグナルキャリブレータ（よって、変更されたレポーターシグナルキャリブレータの予測量）でこれらの量を較正することができる。
【０２２９】
レポーターシグナルおよびそれとともに使用される別の多次元シグナル（たとえば、インジケータシグナルキャリブレータ）は、インジケータレベルの分析およびレポーターシグナルレベルの分析を受けることができる。一緒に使用される際、インジケータシグナルキャリブレータはレポーターシグナルキャリブレータとともに所定パターンを形成することができる。レポーターシグナル較正では、レポーターシグナルキャリブレータは好ましくは１つ以上の検体と１つ以上の共通特性を共有し、インジケータシグナルキャリブレータは好ましくは共通特性を共有しない。むしろ、インジケータシグナルキャリブレータは、レポーターシグナルキャリブレータを有するパターンを生成するのに供する。
【０２３０】
開示されたレポーターシグナル較正方法は、組織、ミクロ生体、またはその他の生体サンプル内の様々なタンパク質の相対存在量に関係する独自のタンパク質シグニチャを高感度で生成する。開示された方法では、少量だが非常に情報量の多いサブセットのタンパク質の相対濃度を識別し測定することによって、細胞または組織の状態を定義することができる。上記測定はタンパク質シグニチャとして知られる。タンパク質シグニチャはたとえば、癌の診断、分類、およびステージ分け、薬剤スクリーニング、毒性試験などで有効である。
【０２３１】
実施形態によっては、共通特性を有するレポーターシグナルキャリブレータおよび検体または検体断片（あるいは、タンパク質またはタンパク質断片）が他の共通特性を欠く分子から区別および／または分離されるように、各検体または検体断片（あるいは、タンパク質またはタンパク質断片）は少なくとも１つのレポーターシグナルキャリブレータと１つ以上の共通特性を共有することができる。
【０２３２】
実施形態によっては、レポーターシグナルキャリブレータおよび検体および検体断片（あるいは、タンパク質またはタンパク質断片）は変更可能であり、変更された形式の検体または検体断片（あるいは、タンパク質またはタンパク質断片）は、検体または検体断片（あるいは、タンパク質またはタンパク質断片）が共通特性を共有する変更された形式のレポーターシグナルキャリブレータから区別可能である。実施形態によっては、変更された形式の異なるレポーターシグナルキャリブレータは互いに区別することができる。実施形態によっては、変更された形式の異なる検体または検体断片（あるいは、タンパク質またはタンパク質断片）は互いに区別することができる。
【０２３３】
レポーターシグナル較正の実施形態によっては、検体または検体断片（あるいは、タンパク質またはタンパク質断片）が変更され、そのように変更されたレポーターシグナルキャリブレータおよび検体または検体断片（あるいは、タンパク質またはタンパク質断片）が検出される。この場合、検体または検体断片（あるいは、タンパク質またはタンパク質断片）は、検体または検体断片が共通特性を共有する変更された形式のレポーターシグナルキャリブレータから区別可能である。
【０２３４】
実施形態によっては、検体または検体断片（あるいは、タンパクまたはタンパク質断片）はレポーターシグナルまたはレポーターシグナルの断片であってもよい。この場合、レポーターシグナルキャリブレータは、検出されたレポーターシグナルの量のためのキャリブレータとしての役割を果たす。
【０２３５】
レポーターシグナル較正がタンパク質およびペプチドと組み合わせて使用されるとき、この形式のレポーターシグナル較正はレポーターシグナルタンパク質較正と称されることに注意されたい。レポーターシグナルタンパク質較正は、たとえば、タンパク質サンプルのタンパク質シグニチャを作成するのに有益である。本明細書で使用されるように、タンパク質シグニチャは、１セットのタンパク質またはタンパク代理の存在、不在、量、または存在および量である。
【０２３６】
レポーターシグナルタンパク質較正の実施形態によっては、タンパク質内の不安定、切断できる、または切断結合の存在を検出し活用することができる。上記結合を含むペプチド、タンパク質、またはタンパク質断片（残りの説明では、便宜上まとめてタンパク質断片と称する）は結合での断片化により変更可能である。このように、タンパク質断片と共通特性（たとえば、質量電荷比）を有するレポーターシグナルキャリブレータを使用することができ、変更された形式のレポーターシグナルキャリブレータおよび変更された形式（すなわち、断片化）のタンパク質断片は検出し区別することができる。これに関し、タンパク質断片は合致するレポーターシグナルキャリブレータと共通特性を共有するが、（たとえば、変更された形式は異なる質量電荷比などの異なる特性を有するため）変更された形式のレポーターシグナルキャリブレータおよび変更された形式のタンパク質断片は区別することができる。
【０２３７】
レポーターシグナルタンパク質較正の１例として、当該タンパク質サンプルは、セリンプロテアーゼ、好ましくはトリプシンで消化することができる。消化はタンパク質断片の複合混合物を生成する。これらのタンパク質断片の中で、ジペプチドＡｓｐ−Ｐｒｏを含むサブセット（４００毎に約１つのタンパク質断片）が存在する。このジペプチド配列は質量分析中、断片化に独自に敏感に反応し、断片化モードにおけるイオンの高収量を生む。ヒトのプロテオームは少なくとも２、０００、０００の様々なトリプシンペプチドから成るため、Ａｓｐ−Ｐｒｏ配列を含むタンパク質断片の数はほぼ５、０００である。これらの１部はリン酸化ペプチドまたはその他の修飾された形式として存在する場合があるため、数はより一層高くなることがある。この数値は、非常に有益なタンパク質シグニチャを生成するのに適した断片化可能なタンパク質断片のサブセット（約５０〜１００）を選択するには十分の高さである。Ａｓｐ−Ｐｒｏジペプチド配列を含むペプチド、細胞内のリン酸化によって修飾されるアミノ酸を含むペプチド、または内部メチオニンを含むペプチドが、レポーターシグナル較正での使用に特に好適である。もしくは、アルギニンで終端となるトリプシンペプチドはアセチルアセトン（ペンタン−２，４−ジオン）との反応によって修飾させ、断片イオンの周波数を高めることができる（Ｄｉｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ３２：１３３７−４９（１９９７））。タンパク質シグニチャの情報量を最大化するため、サブセットのタンパク質断片の選択はバイオインフォマティクスを用いて実行することができる。
【０２３８】
この形式のレポーターシグナルタンパク質較正に関しては、タンパク質消化は特別に設計されたセットのレポーターシグナルキャリブレータと混合され、その後タンデム質量分析を用いて分析される。タンデムインスペース型機器（たとえば、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ製Ｑ−ＴｏｆＴＭ）の場合、単一イオンフィルタリングのために第１の四極子の環境を用い（配列データから得ることのできる独自の断片毎の質量分子によって定義される）、その後、イオン断片化のための衝突ステージ、最後にペプチド断片（Ａｓｐ−Ｐｒｏなどの脆弱な結合、リン酸化アミノ酸を含む結合、またはメチオニンスルホキシドなどの酸化アミノ酸に隣接する結合での切断によって生成される、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｒｅｓ．２６：１０３〜１１（１９９７））のＴＯＦ分光測定が行われて最初の単一イオンを生じる。第２のステージでは、ＴＯＦ測定の信号雑音比は、従来のＭＳ測定の場合よりもずっと大きい。概して、１つのレポーターシグナルキャリブレータが、タンパク質シグニチャを構成するのに使用されるサンプル内の各タンパク質断片（このようなタンパク質断片はシグニチャタンパク質断片と称される）に対して使用され、非断片化シグニチャタンパク質断片の断片質量と異なり、それぞれが容易に検出可能な質量パターンで断片化するように設計される。その後、四極子フィルタリングの環境は、タンパク質シグニチャ（すなわち、シグニチャタンパク質断片）を具備するように予め選択された各タンパク質断片の質量に対応して、ある値の範囲で（たとえば５０）配列を変動される。各ろ過質量環境では、断片化後にＴＯＦにより検出可能な２種類のシグナルがあり、１方のセットはトリプシンペプチド（すなわち、最初のタンパク質断片）から得られ、もう１方のセットはレポーターシグナルキャリブレータに対応する。レポーターシグナルキャリブレータは、各シグニチャタンパク質断片の相対存在量を算出するのを可能にする。所与のサンプルに対して決定されるこれらの相対存在量比は、タンパク質シグニチャを構成する。ＭＳ／ＭＳモードでのタンデム質量分析計の検出限界は非常に素晴らしく、ペプチド約５００分子である。このレベルの検出はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の約１、０００倍に相当し、単独の細胞からのタンパク質シグニチャの生成を可能にするはずである。
【０２３９】
了解されるように、この形式のレポーターシグナル較正に関しては、ヒトゲノム全体と多くの他の生体のゲノムの配列が入手可能であることは、すべての既知のタンパク質に照らして独自であるタンパク質断片の識別を簡易化する。すなわち、配列情報は、タンパク質シグニチャで生成されるペプチドを特定し、レポーターシグナルキャリブレータの選択を誘導するために使用することができる。
【０２４０】
様々な技術（たとえば、多次元分子標識付け、多次元シグナル標識付け、および多次元シグナル融合）を用いて使用および／または検出される多次元シグナルは、ＲＳＣで、および／またはＲＳＣと組み合わせて使用可能である。
Ｄ．多次元シグナル融合
多次元シグナル融合（ＭＤＳＦ）と称される別の形式の開示された方法および構成では、多次元シグナルペプチドは単独のアミノ酸セグメント内の当該タンパク質またはペプチドと結合され、多次元シグナルペプチド、多次元シグナル融合、変更された形式の多次元シグナルペプチド、および／または  変更された形式の多次元シグナル融合を検出することができる。当該タンパク質およびペプチドと多次元シグナルペプチドとの上記融合は、融合を構成するアミノ酸セグメントを符号化する核酸分子から融合タンパク質またはペプチドとして発現させることができる。融合タンパク質またはペプチドは本明細書では多次元シグナル融合と称する。多次元シグナルの１形式である多次元シグナルペプチドは、それらが融合されるタンパク質およびペプチドと、それらを符号化する遺伝子、ベクター、発現構築物、および核酸類の発現とを高感度で監視および検出することを可能にする。特に、多次元シグナル融合は、特定の当該タンパク質およびペプチドおよび／または当該タンパク質およびペプチドを符号化する遺伝子、ベクター、および発現構築物の発現の高感度な多重検出を可能とする。開示された多次元シグナル融合は、他の形式の開示された方法および構成のための多次元シグナルのソースとしてなどの任意の目的で使用することもできる。
【０２４１】
「多次元シグナル融合」は、文脈上明らかに別の内容を示さない限り、多次元シグナルペプチドが融合される（すなわち、同一のポリペプチド鎖内でのペプチド結合により結合される）タンパク質、ペプチド、またはタンパク質またはペプチドの断片を指す。多次元シグナル融合は、分析前に、たとえばプロテアーゼ消化によって断片化することができる。分析される発現サンプルは、サンプルの複雑さを低減するために分画または分離を受けることができる。断片化および分画は同一の検定で一緒に使用することができる。上記断片化および分画は、発現の分析を単純化し拡張することができる。
【０２４２】
多次元シグナル融合は、融合を符号化する核酸分子からの発現によって作成することができる。したがって、開示された融合は概して、多次元シグナルペプチドおよび当該タンパク質またはペプチドを具備するアミノ酸セグメントを符号化する核酸セグメントを設計することにより設計可能である。所与の核酸分子は１つ以上の核酸セグメントを具備することができる。所与の核酸セグメントは１つ以上のアミノ酸セグメントを符号化することができる。所与のアミノ酸セグメントは、１つ以上の多次元シグナルペプチドと１つ以上の当該タンパク質またはペプチドを含むことができる。開示されたアミノ酸セグメントは、単独の、連続ポリペプチド鎖から成る。したがって、複数のアミノ酸セグメンは同一の連続ポリペプチド鎖の１部であってもよいが、所与のアミノ酸セグメントの全構成要素（すなわち、当該多次元シグナルペプチド、タンパク質、ペプチド）は同一の連続ポリペプチド鎖の１部である。
【０２４３】
したがって、開示された方法は、特定のタンパク質、遺伝子、ベクター、および／または標識付けされた（すなわち、多次元シグナル融合と関連付けられた、あるいは多次元シグナル融合に含まれた）発現配列を有する細胞、細胞株、および生体を使用することができる。たとえば、それぞれが様々な多次元シグナルペプチドで多次元シグナル融合を符号化する１セットの核酸構築物は、１セットの細胞、細胞株、および／または生体を一意的に標識付けするのに使用することができる。開示された方法において、標識ソースのいずれかからのサンプルの処理は結果的に、他の変更された形式から区別可能な各ソースに対する独自の変更された形式の多次元シグナルペプチド（あるいは、アミノ酸セグメントまたはアミノ酸サブセグメント）をもたらす。特定の変更された形式の検出は、それが基点とするソースを識別する。より具体的な例として、多次元シグナル融合を符号化する核酸構築物が導入された遺伝子的に修飾された食物種（たとえば、ラウンドアップ耐性トウモロコシ種）は、多次元シグナル融合を検出することによって識別することができる。
【０２４４】
開示された多次元シグナル融合は、特定のタンパク質、遺伝子、ベクター、および／または標識付けされた（すなわち、多次元シグナル融合と関連付けられた、あるいは多次元シグナル融合に含まれた）発現配列を有する細胞、細胞株、および生体を作成するのにも有効である。たとえば、それぞれが様々な多次元シグナルペプチドで多次元シグナル融合を符号化する１セットの核酸構築物は、１セットの細胞、細胞株、および／または生体を一意的に標識付けするのに使用することができる。開示された方法において、標識ソースのいずれかからのサンプルの処理は結果的に、他の変更された形式から区別可能な各ソースに対する独自の変更された形式の多次元シグナルペプチド（あるいは、アミノ酸セグメントまたはアミノ酸サブセグメント）をもたらす。特定の変更された形式の検出は、それが基点とするソースを識別する。より具体的な例として、多次元シグナル融合を符号化する核酸構築物を遺伝子的に修飾された食物種（たとえば、ラウンドアップ耐性トウモロコシ種）に導入し、多次元シグナル融合を検出することによって識別することができる。様々な遺伝子、タンパク質、ベクター、構築物、細胞、細胞株、または生体で使用される、あるいはそれと関連付けられる多次元シグナル融合において使用される好適な多次元シグナルペプチドは、差別的に分布される質量を有するものである。特に、同一のアミノ酸組成を用いる代替アミノ酸配列の使用が好適である。
【０２４５】
多次元シグナルペプチドを符号化する核酸配列を遺伝子の特定の構造配列に設計することができる。これは、融合されるタンパク質を符号化する遺伝子がイントロンを含むときには通常の状況だが、多次元シグナルペプチドを符号化する配列は接合される様々な構造配列間で分割することができる。多次元シグナルペプチドを符号化する核酸配列の特定の構造配列への配置は、ＲＮＡの代替スプライシングを監視し分析するのに役立つ。最後のタンパク質での多次元シグナルペプチドの出現は、多次元シグナルペプチドを符号化する構造配列がｍＲＮＡに接合されたことを示す。
【０２４６】
開示された多次元シグナル融合は、特定の経路、調節カスケード、および別の１組の遺伝子、タンパク質、ベクター、および／または発現配列を「標識付けする」ために使用することもできる。上記標識付けは、同一の細胞、細胞株、または生体内、あるいは１セットの細胞、細胞株、または生体全体にあってもよい。非限定的な例では、開示された方法は、特定の経路、調節カスケード、および別の１組の遺伝子、タンパク質、ベクター、および／または発現配列の状態および／または発現を評価するために使用することもできる。同一の細胞、細胞株、または生体、あるいは１セットの細胞、細胞株、または生体全体で上記経路、カスケードなどを「標識付け」するために多次元シグナル融合を使用することによって、経路、カスケード、および他のシステムを単独の検定で評価する、および／または細胞、細胞株、または生体全体で比較することができる。たとえば、多次元シグナル融合を符号化する核酸セグメントは、当該内在性発現配列、当該内在性遺伝子、当該外来性発現配列、当該外来性遺伝子、またはその組み合わせに関連付けることができる。その後、外来性構築物は当該細胞または生体に導入される。したがって、遺伝子および／または発現配列の発現は、多次元シグナルペプチドおよび／または多次元シグナル融合を検出することによって評価される。内在性発現配列または遺伝子との関連付けは、たとえば、当該発現配列または遺伝子の部位での挿入のために（多次元シグナル融合を符号化する）核酸分子を導入する、あるいは、ベクターまたはその他の核酸構築物（内在性発現配列または遺伝子と多次元シグナル融合を符号化する核酸セグメントの両方を含む）を生体外で作成し、構築物を当該細胞または生体に導入することによって達成することができる。多くのその他の使用および使用法が可能であり、その多くを下記の例証で説明する。開示された多次元シグナル融合は、たとえば、任意の状況で、および緑色蛍光タンパク質および緑色蛍光タンパク質融合が融合される任意の目的で使用することができる。しかし、開示された多次元シグナルタンパク質は、少なくとも開示された多次元シグナル融合をより高度に多重化する能力のため、緑色蛍光タンパク質よりも用途が高く、より有益である。
【０２４７】
多次元シグナルペプチドは、１つまたは複数のタンパク質（すなわち、多次元シグナルペプチドが融合されるタンパク質）の高感度検出のために使用することができる。該方法では、多次元シグナルペプチドと融合されるタンパク質は、多次元シグナル融合を区別するために多次元シグナルペプチドを用いて分析される。多次元シグナルペプチドの検出は、対応するタンパク質の存在を示す。次に、検出されたタンパク質は既知の技術を用いて分析することができる。多次元シグナル融合は、タンパク質を明確に識別可能な独自のタンパク質／標識組成を提供する。これは、標識として特別な多次元シグナルペプチドを使用することにより達成される。
【０２４８】
本発明によると、多次元シグナル融合は分析前に、プロテアーゼ消化などにより断片化することができる。分析される発現サンプルは、サンプルの複雑さを低減するために分画または分離を受けることができる。断片化および分画は同一の検定で一緒に使用することができる。上記断片化および分画は、発現の分析を単純化および拡張することができる。
【０２４９】
多次元シグナル融合における多次元シグナル（たとえば、レポーターシグナルペプチド）の変更は、様々な変更された組成を作成することができる。これらの変更された形式の１部または全部を検出することができる。たとえば、変更された形式の多次元シグナルペプチドを検出することができ、変更された形式のアミノ酸セグメント（多次元シグナルペプチドを含む）を検出することができ、アミノ酸セグメントの変更された形式のサブセグメントを検出することができ、あるいは、これらの組合せを検出することができる。多次元シグナルペプチドが断片化により変更される場合、その結果は概して、多次元シグナルペプチドの断片と、当該タンパク質またはペプチドおよび多次元シグナルペプチドの部分（すなわち、多次元シグナルペプチド断片ではない部分）を含む変更された形式のアミノ酸セグメントになる。
【０２５０】
当該タンパク質またはペプチドは断片化することもできる。その結果、アミノ酸セグメントのサブセグメントとなる。アミノ酸サブセグメントは、多次元シグナルペプチドと当該タンパク質またはペプチドの１部とを含む。アミノ酸サブセグメント内の多次元シグナルペプチドが変更されると（アミノ酸セグメントの断片化の前、途中、または後に起こる可能性がある）、その結果は変更された形式のアミノ酸サブセグメント（および変更された形式の多次元シグナルペプチド）である。この変更された形式のアミノ酸サブセグメントは検出することができる。多次元シグナルペプチドが断片化により変更される場合、その結果は概して、多次元シグナルペプチドの断片と変更された形式の（すなわち、断片）アミノ酸サブセグメントになる。この場合、変更された形式のアミノ酸サブセグメントは本明細書では多次元シグナル融合断片と称され、当該タンパク質またはペプチドの部分と多次元シグナルペプチドの部分（すなわち、多次元シグナルペプチド断片ではない部分）を含む。
【０２５１】
多次元シグナルと同様に、概して、多次元シグナル融合（アミノ酸セグメントとも称される）、多次元シグナル融合断片（多次元シグナル融合のサブセグメントとも称される）、または多次元シグナルペプチドは、セット内の多次元シグナル融合、多次元シグナル融合断片、または多次元シグナルペプチドがインジケータレベルの分析でパターンを生成する１つ以上の特性を有することのできるセットで使用可能である。たとえば、セット内の多次元シグナル融合、多次元シグナル融合断片、または多次元シグナルペプチドは、多次元シグナル融合、多次元シグナル融合断片、または多次元シグナルペプチドを共通特性を欠く分子から分離または区別可能とする１つ以上の共通特性を有することができる。多次元シグナル融合の場合、アミノ酸セグメントおよびアミノ酸サブセグメントは、セット内のアミノ酸セグメントおよびアミノ酸サブセグメントがパターンを生成する１つ以上の特性を有することのできるセット内で使用可能である。たとえば、多次元シグナル融合では、アミノ酸セグメントおよびアミノ酸サブセグメントは、セット内のアミノ酸セグメントおよびアミノ酸サブセグメントが、アミノ酸セグメントおよびアミノ酸サブセグメントをそれぞれ共通特性を欠く分子から分離または区別可能とする１つ以上の共通特性を有するセット内で使用可能である。概して、特性を有する多次元シグナル融合の構成要素は、検出される構成要素および／または使用されている方法のモードに左右される。
【０２５２】
多次元シグナル融合を符号化する核酸分子（または、そのセグメント）は、１セットの核酸分子によって符号化される多次元シグナル融合の多次元シグナルペプチドがインジケータレベルの分析におけるパターンを生成する１つ以上の特性を有することのできる、セット内で使用することができる。同様に、アミノ酸セグメントを符号化する核酸分子（または、そのセグメント）は、１セットの核酸分子によって符号化されるアミノ酸セグメント（または、そのセグメント）内の多次元シグナルペプチドがパターンを生成する１つ以上の特性を有することのできる、セット内で使用することができる。アミノ酸セグメントを符号化する核酸分子（または、そのセグメント）は、１セットの核酸分子によって符号化されるアミノ酸セグメントが、アミノ酸セグメントを共通特性を欠く分子から分離または区別することのできる１つ以上の特性を有することのできる、セット内で使用することができる。複数セットの核酸分子、核酸セグメント、アミノ酸セグメント、多次元シグナルペプチド、および当該タンパク質のメンバー間の他の関係を検討する。
【０２５３】
レポーターシグナルペプチドなどの多次元シグナルペプチドは、セット内の多次元シグナルペプチドが多次元シグナルペプチドを共通特性を欠く分子から分離または区別することの可能な１つ以上の共通特性を有することのできる、セット内で使用することができる。多次元シグナル融合の場合、アミノ酸セグメントおよびアミノ酸サブセグメントは、アミノ酸セグメントおよびアミノ酸サブセグメントがアミノ酸セグメントおよびアミノ酸サブセグメントをそれぞれ共通特性を欠く分子から分離または区別することのできる１つ以上の共通特性を有することのできる、セット内で使用することができる。概して、共通特性を有する多次元シグナル融合の構成要素は、検出される構成要素および／または使用されている方法のモードに左右される。
【０２５４】
多次元シグナル融合は、当該タンパク質と多次元シグナルペプチドに加えて、他の構成要素を含むことができる。たとえば、多次元シグナル融合は、エピトープタグ（たとえば、ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ｆｌｕタグ、またはｆｌａｇタグペプチド）を含むことができる（たとえば、Ｂｒｉｚｚａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）「新規の単クローン抗体およびペプチド溶出を用いるＦＬＡＧエピトープタグバクテリアアルカリホスファターゼのイムノアフィニティ精製：バイオ技術」１６：７３０〜７３５を参照）。エピトープタグは、多次元シグナル融合を操作、隔離、分離、区別、結合および／または拘束することのできるタグとしての役割を果たしうる。エピトープタグとフラグペプチドの使用は概して既知であり、開示された多次元シグナル融合での使用に適合させることができる。
【０２５５】
好適な実施形態では、多次元シグナルペプチド、多次元シグナル融合（あるいは、アミノ酸セグメント）、多次元シグナル融合を符号化する核酸セグメント、および／または多次元シグナル融合を符号化する核酸セグメントを具備する核酸分子は、セットを構成するまたはセット内に存在する多次元シグナルペプチド、多次元シグナル融合、および／または多次元シグナル融合のサブセグメントが同様の特性（たとえば、同様の質量電荷比）を有するセットで使用される。同様の特性によって、多次元シグナル、多次元シグナル融合、または多次元シグナル融合のサブセグメントを１つ以上の特性を欠く別の分子から区別および／または分離することができる。好ましくは、セットを構成するまたはセット内に存在する多次元シグナル、多次元シグナル融合、または多次元シグナル融合のサブセグメントは同じ質量電荷比（ｍ／ｚ）を有する。すなわち、セット内の多次元シグナル、多次元シグナル融合、または多次元シグナル融合のサブセグメントは等圧である。これによって、質量電荷比に基づき、多次元シグナル、多次元シグナル融合、または多次元シグナル融合のサブセグメントを別の分子から正確に分離することができる。フィルタリングの結果、システムにとっての信号雑音比（Ｓ／Ｎ）は大幅に増大し、より高感度で正確な検出を可能にする。
【０２５６】
遺伝子およびタンパク質の細胞、細胞株、生体、および発現は、様々な方法で開示された多次元シグナル融合を用いて検出することができる。たとえば、タンパク質および付加された多次元シグナルペプチドは一緒に検出することができ、タンパク質の１つ以上のペプチドおよび付加された多次元シグナルペプチドは一緒に検出することができ、多次元シグナルペプチドの断片は検出することができる。好適な検出は、多次元シグナルペプチドの断片化の前後両方における多次元シグナル融合の検出を含む。
【０２５７】
好適な形式の開示された方法は、多次元シグナルペプチドの断片化の前後両方における多次元シグナル融合の相関検出を含む。これにより、多次元シグナルペプチドで「標識付けされた」遺伝子、タンパク質、ベクター、および発現構築物を、多次元シグナル融合および／または多次元シグナルペプチドの変化を通じて検出および識別することができる。すなわち、検出された多次元シグナル融合または多次元シグナルペプチドの性質（非断片化対断片化）は、それが得られる遺伝子、タンパク質、ベクター、または核酸構築物を示す。多次元シグナル融合および多次元シグナルペプチドが質量電荷比により検出される場合、断片化サンプルと非断片化サンプル間の質量電荷比の変化は比較の根拠を提供する。上記質量電荷比の検出は好ましくは、質量分析で達成される。
【０２５８】
質量分析計での（好ましくは、衝突細胞での）多次元シグナルペプチドの断片化は結果的に、付加された多次元シグナルペプチドの部分の損失に対応するピークの変動、失われた断片に対応するピークの出現、または両事象の組み合わせを招く。重要なことに、観察される変動は、様々な多次元シグナルがペプチド設計上、様々な質量電荷比を有する断片を作成するため、どの多次元シグナルがタンパク質に融合されるかに左右される。親質量電荷（衝突ガスなしで）および多次元シグナルからの断片の損失に対応する質量電荷（衝突ガスで）の検出の組み合わせ事象は多次元シグナル融合を示す（よって、多次元シグナル融合、遺伝子、ベクター、またはそれを符号化する構築物の発現を示す）。
【０２５９】
多次元シグナル融合はその質量電荷比に基づき、分子間の高感度な区別を可能にする質量分析を用いて検出することができる。多次元シグナルペプチド断片は広範囲の質量（あるいは、質量電荷比）を有するように設計され、検出後、各質量（あるいは、質量電荷比）を個々に区別可能であるため、１セットの等圧多次元シグナルペプチドまたは多次元シグナル融合は、多くの遺伝子、タンパク質、ベクター、発現構築物、細胞、細胞株、および生体の発現の多重標識付けおよび／または検出のために使用することができる。さらに、セットが互いに等圧でない１つ以上の等圧多次元シグナルセットの使用によって、開示された方法の多重化性能を高める所定パターンおよび有効な手段の両方を生成することができる。
【０２６０】
同一の遺伝子、タンパク質、ベクター、発現構築物、細胞、細胞株、または生体（あるいは、同種の遺伝子、タンパク質、ベクター、発現構築物、細胞、細胞株、または生体）が等圧である１セットの多次元シグナル融合で標識付けされる、あるいは（たとえば、異なるサンプル内の同一の遺伝子、タンパク質、ベクター、発現構築物、細胞、細胞株、または生体を「標識付け」することによって）等圧多次元シグナルペプチドを含む場合、結果として生じるセットの多次元シグナル融合または多次元シグナルペプチドも等圧となる。多次元シグナルペプチドの断片化は、セットの多次元シグナルペプチドを、独特に異なる質量を有する個々に検出可能な多次元シグナル融合断片および多次元シグナルペプチド断片に分割する。同様に、他のセットと等圧でない非等圧多次元シグナルおよび複数セットの多次元シグナルは、（たとえば、異なるサンプル内の同一の遺伝子、タンパク質、ベクター、発現構築物、細胞、細胞株、または生体を標識付けすることによって）同一の遺伝子、タンパク質、ベクター、発現構築物、細胞、細胞株、または生体（あるいは、同種の遺伝子、タンパク質、ベクター、発現構築物、細胞、細胞株、または生体）を標識付けするのに使用することができる。その結果は、等圧でない複数セットの多次元シグナル融合または多次元シグナルペプチドとなる。様々な質量を有する多次元シグナル融合または多次元シグナルペプチドのパターンが生成される。異なるサンプル内の同一の遺伝子、タンパク質、ベクター、発現構築物、細胞、細胞株、または生体を標識付けするために等圧および非等圧多次元シグナルまたは複数セットの多次元シグナルの組み合わせを使用することで、インジケータレベルの分析における質量パターンを生成することができる。レポーターシグナルレベルの分析における等圧多次元シグナルの断片化は、セットの多次元シグナル融合または多次元シグナルペプチドを、独特に異なる質量を有する個々に検出可能な標識タンパク質に分割する。
【０２６１】
様々な技術（たとえば、多次元分子標識付け、多次元シグナル標識付け、およびレポーターシグナルキャリブレータ）を用いて使用および／または検出される多次元シグナルをＭＤＳＦで使用する、および／またはＭＤＳＦと組み合わせることができる。
【０２６２】
いくつかの形式の方法は、１つ以上の等圧多次元シグナルまたは１つ以上のセットの等圧多次元シグナルで第１のサンプルまたは第１のセットのサンプル内の検体またはタンパク質を標識付けするステップと、１つ以上の様々な多次元シグナルまたは１つ以上の様々なセットの多次元シグナルで第２のサンプルまたは第２のセットのサンプル内の検体を標識付けするステップと、第１及び第２のサンプルを混合して分析サンプルを形成するステップと、分析サンプル内の多次元シグナル−標識検体を分析して多次元シグナルから生じる１つ以上の所定パターンを識別するステップであって、１つ以上の所定パターンの識別は分析サンプルの１つ以上の部分を識別するステップと、１つ以上の分析サンプルの１つ以上の識別部分の多次元シグナルを分析して分析サンプルの識別部分に存在する多次元シグナルを識別するステップであって、１つ以上の分析サンプルの１つ以上の識別部分の多次元シグナルの分析が識別部分の多次元シグナルの断片化と質量電荷比に基づく様々な多次元シグナル断片の検出とによって達成されるステップとを含むことができる。該方法の形式によっては、１つ以上の複数セットの多次元シグナルは、１セットのレポーターシグナルであってもよく、１つ以上の分析サンプルの１つ以上の識別部分における多次元シグナルの分析はレポーターシグナルを識別する。１つ以上の複数セットの多次元シグナルは、たとえば、レポーターシグナルおよびインジケータシグナルの両方、１セットのレポーターシグナルおよびインジケータシグナル、レポーターシグナルおよび１セットのインジケータシグナルまたは１セットのレポーターシグナルおよび１セットのインジケータシグナルを含むことができる。たとえば、本明細書の他の場所に記載されるように、該方法はタンデム質量分析計を用いて実行することができる。
【０２６３】
多次元シグナル融合を融合する核酸配列およびセグメントは、任意の適切な方法で発現させることができる。たとえば、開示された核酸配列および核酸セグメントは、生体外、細胞内、および／または  生体の細胞内で発現させることができる。核酸配列およびタンパク質の発現のための多くの技術およびシステムが既知であり、開示された多次元シグナル融合とともに使用することができる。たとえば、多くの発現配列、ベクターシステム、転換および移入技術、および遺伝子組み換え生体生産方法は既知であり、開示された多次元シグナルペプチド方法および組成とともに使用することができる。
【０２６４】
たとえば、転写され翻訳されるプロモータおよび核酸配列を含むＤＮＡ構築物の生体外転写／翻訳のためのキットが既知である（たとえば、Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｃ．製ＰＲＯＴＥＩＮｃｒｉｐｔ−ＰＲＯ（ＴＭ）。Ａｕｓｔｉｎ  ＴＸ；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（１９９９）「Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  Ａｎｄ  Ｈａｐｐｙ：生体外翻訳および転写／翻訳システム」、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ１３［１３］：１５、Ｊｕｎ。２１、１９９９）。上記構築物は、生体のゲノムＤＮＡ、生体に移入可能なプラスミドまたはその他のベクター、または生体外システムで使用することができる。たとえば、転写および翻訳後、緑色蛍光タンパク質またはリシフェラーゼを生体内システム内の多次元／マーカーとして作成する、プロモータ配列および核酸配列を含む構築物が既知である（たとえば、ＳａｗｉｎおよびＮｕｒｓｅ、「緑色蛍光タンパク質とのランダムポリペプチド融合を用いる核分裂酵母核マーカーの識別」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３（２６）：１５１４６〜５１（１９９６）；Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、「哺乳類細胞内の核タンパク質移送の生体内分析」、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２３６（ｌ）：３４６〜５０（１９９７）；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、「生物の酵母細胞内のＴＡＴＡ−結合タンパク質の定量的画像」、Ｙｅａｓｔ１４（９）：８１３〜２５（１９９８）；Ｄｈａｎｄａｙｕｔｈａｐａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、「マイコバクテリアのマクロファージとの相互作用の遺伝子発現および細胞生物学のためのマーカーとしての緑色蛍光タンパク質」、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ１７（５）：９０１〜１２（１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、「ミコバクテリア内の新発現マーカーとしての緑色蛍光タンパク質」、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ１７（５）：９１３〜２２（１９９５）；Ｒｅｉｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、「バキュロウィルス発現システムを用いる昆虫細胞内の発光オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質の機能的発現」、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ２１９（１）：１４〜２０（１９９６）；Ｍａｎｋｅｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、「ヒトオクルジンプロモータからの発現は腫瘍壊死因子−αおよびインターフェロンγの影響を受ける」、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ、１１３：２０８５〜９０（２０００）；Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．、「単独の哺乳類細胞内のＨＴＶおよびｈＣＭＶプロモータの転写調節のリアルタイム分析」、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ、１０８：４４１〜５５（１９９５））。緑色蛍光タンパクまたはその変種は、安定的に組み込まれ、生体と干渉しないことが分かっている。概して、ＧＦＰは開示された多次元シグナルペプチドよりも大きいため（発光オワンクラゲからのＧＦＰはサイズ２３８アミノ酸である；ＮＣＢＩ  ＧＬ６０６３８４）、概して比較的小さな多次元シグナルペプチドは、添加される発現システムを混乱させる可能性が低い。  たとえば、ｗｈｅｒｅ  ｔｈｅ多次元が緑色蛍光タンパク質（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、「生物の酵母細胞内のＴＡＴＡ−結合タンパク質の定量的画像」、Ｙｅａｓｔ１４（９）：８１３〜２５（１９９８））またはリシフェラーゼである場合、内在性プロモータがプ��モータ−多次元構築物で置き換えられるように、プロモータ領域を修飾する技術が既知である。転写因子濃度は、ＧＦＰまたはリシフェラーゼを監視することによって追跡調査される。これらの技術は、開示された多次元シグナル融合および多次元シグナル融合構築物とともに使用することができる。通常、内在性プロモータの制御下における、当該遺伝子への核酸配列の標的ノックインのための技術も既知である。開示された方法および構成とともに使用可能な上記技術は、核酸が挿入された遺伝子の転写および翻訳の多次元／マーカーを導入するために使用されてきた。同じ技術が、開示された多次元シグナル融合を内在性発現配列の制御下に置くために使用することができる。もしくは、非標的ノックイン（そのための技術も既知である；Ｈｏｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．、「超ハイレベルの組み換えタンパク質を発現する安定した哺乳類細胞株を生み出すためのヒトポリペプチド鎖延長因子１アルファプロモータによって推進されるバイシストロンベクターの開発」、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、２５２：３６８〜７２（１９９８）；Ｋｅｒｓｈｎａｒ  ｅｔ  ａｌ．、「多タンパク質複合体のエピトープタグサブユニットを条件付きで発現するクローン性細胞株からのヒト転写因子ＩＩＨおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩのイムノアフィニティ精製および機能的特徴付け」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７３：３４４４４〜５３（１９９８）；ＷｕおよびＣｈｉａｎｇ、「テトラサイクリン調節およびエピトープタグ法により潜在的に毒性のあるタンパク質を発現する安定した細胞株の確立」、Ｂｉｏｔｅｃｈｉｑｕｅｓ、２１：７１８〜２２、７２４〜５（１９９６））が転写因子のレベルまたは活動を追跡調査するのに使用することができる−挿入された核酸コードと関連付けられる  多次元シグナルペプチド融合は、転写／翻訳活動を直接示すことができる。
【０２６５】
開示された多次元シグナル融合は、他のタンパク質および分子とタンパク質との相互作用の検出および分析に使用することもできる。たとえば、タンパク質−タンパク質相互作用のための相互作用イオントラップは、十分既知の酵母ツーハイブリッドを含む  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ、「タンパク質−タンパク質の相互作用を検出する新規遺伝子システム」、Ｎａｔｕｒｅ３４０：２４５〜６（１９８９）；Ｕｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、「出芽酵母におけるタンパク質−タンパク質相互作用の総合的分析」、Ｎａｔｕｒｅ４０３：６２３〜７（２０００）および関連システム（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、２００１；Ｖａｎ  ＣｒｉｅｋｉｎｇｅおよびＢｅｙａｅｒｔ、「酵母ツーハイブリッド：最新技術」、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  Ｏｎｌｉｎｅ、２（１）、１９９９）。ペプチド多次元シグナルを符号化する核酸配列の組み込みは、これらのシステム、たとえば通常使用されるＬａｃＺ選択領域の末端に導入することができる（ＬａｃＺ選択は、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、「分子クローニング：研究所マニュアル」、第２版、１９８９、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている）。１セットの組み込まれた配列（たとえば、各プラスミドが多次元シグナル符号化配列とＬａｃＺの機能性を有する１セットのプラスミドに）によって、同時に多くの相互作用（使用される多次元シグナルと同数の多くの様々な相互作用）を明確に検出することができる。
【０２６６】
多次元シグナル融合の別のモードでは、多次元シグナルを符号化する核酸配列を。Ｔ細胞およびＢ細胞レセプターの定数（ｃ）領域を符号化する配列に加えることができる。Ｃ領域が転写後にＪ領域に接合されるとき、多次元シグナルはＴまたはＢ細胞レセプターに現れる。
【０２６７】
多次元シグナル表示と称される多次元シグナル融合の別のモードでは、主要組織適合（ＭＨＣ）および非主要組織適合分子による特定抗原ペプチドの表示を検出し分析することができる。タンパク質抗原は細胞を表す抗原によって処理され、通常８〜１２アミノ酸の小さなペプチドはＴ細胞によって認識されるため、クラスＩおよびクラスＩＩＭＨＣ分子により表されることが既知である。特定Ｔ細胞／ペプチド−ＭＨＣ複合体の研究は、様々な標識付け要件（放射性または蛍光性のいずれか）および特定レセプターおよび／またはペプチド−ＭＨＣ複合体を認識する抗体試薬への一般的な依存のため、技術的に厄介である。
【０２６８】
抗原処理および抗原表示に関する我々の知識をさらに拡大させる必要がある。特定タンパク質抗原に設計されてきた多次元シグナルはこの処理に新たな見識を提供してくれ、新しい実験的アプローチを可能にする。たとえば、２つのウィルスまたはバクテリアタンパク質、わずか数個のアミノ酸で異なるタンパク質Ａおよびタンパク質Ｂを検討してみる。同一の効率性で、それらが処理され、免疫細胞（たとえば、Ｔ細胞）に対して表示されるかどうかを知ることは有益であろう。多次元シグナルをタンパク質Ａに、細胞を表示する抗原をタンパク質Ｂ設計することによって、表示された異なる多次元シグナルの存在をテストし、タンパク質が効率的に処理および表示されるかどうかを判定することができる。（タンパク質Ａに存在する）多次元シグナルＡの存在と（タンパク質Ｂに存在する）多次元シグナルＢの不在は、タンパク質Ａが処理され、タンパク質Ｂは処理されていないことを示す。その後、タンパク質Ｂの抗原処理の欠如は、ウィルスまたはバクテリアが免疫系による免疫監視を免れる理由の説明になるだろう。抗原ペプチドは、アミノ末端とカルボキシ末端の両方の近傍で保存された係留残留物によって特徴付けられ、中央部ではより大きな不均一性が容認される。この不均一な中央部は、多次元シグナルペプチドを添加するのに好適な部位である。
【０２６９】
様々な遺伝子、タンパク質、ベクター、構築物、細胞、細胞株、または生体で使用される、あるいは関連付けられる多次元シグナル融合での使用に好適な多次元シグナルペプチドは、差別的な質量分布を用いるものであろう。特に、同一のアミノ酸組成を用いる代替アミノ酸配列の使用が好ましい。
【０２７０】
多次元シグナル融合は、代替ＲＮＡスプライシングを監視し分析するのに使用することができる。ゲノムの情報をタンパク質発現に翻訳する際の最大の問題は、ｍＲＮＡ代替処理と、代替エクソン利用を介したタンパク質アイソフォームの生成とを理解することである（Ｂｌａｃｋ、「代替スプライシングからのタンパク質多様性：バイオインフォマティクスおよびポスト−ゲノム生物学への挑戦」、Ｃｅｌｌ１０３：３６７〜７０（２０００））。タンパク質アイソフォーム多様性を生成するための代替ｐｒｅ−ｍＲＮＡスプライシングの使用例は、たとえば赤血球識別の制御下で数多く存在する（たとえば、ＨｏｕおよびＣｏｎｂｏｙ、「赤血球識別中の代替ｐｒｅ−ｍＲＮＡスプライシング調節」、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ８：７４〜９（２００１）を参照）。構造配列は２０００アミノ酸を超えるタンパク質内の６アミノ酸でしかないので、複雑な、あるいは接合されたタンパク質アイソフォームの検出は困難な作業である場合が多い（たとえば、Ｃｉａｎｃｉ  ｅｔ  ａｌ．、「脳と筋肉は全スペクトリンの独自の代替転写を発現する」、Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３８：１５７２１〜１５７３０（１９９９）を参照）。
【０２７１】
エクソン利用および処理情報は、多次元シグナルを符号化する核酸配列の当該構造配列への挿入（多次元シグナル融合を符号化する核酸セグメントを形成する）によって入手することができる。たとえば、ゲノムＤＮＡ、適切な小遺伝子構築物、または細胞に導入された非内在性ｐｒｅ−ｍＲＮＡに挿入することができる。１セットの多次元シグナルを使用することで、翻訳されたタンパク質のすべての構造配列を１度に多重読み出しすることができる。短い外来性オープンリーディングフレームＤＮＡ配列を構造配列に組み込む小遺伝子構築物または構築物の使用、および機能的なイントロンスプライスエレメントと関連する外来ＤＮＡの組込みは、多次元シグナルの組込みのために使用される先進技術である（たとえば、Ｇｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、「タンパク質の代替スプライシング  ４．１Ｒエクソン１６：フランキングイントロンの順序切除は適切なスプライス部位の選択を確保する」、Ｂｌｏｏｄ９５：６９２−９（２０００）；Ｋｉｋｕｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．、「ｐｒｅ−ｍＲＮＡスプライソソーム媒介トランススプライシングの乱婚：遺伝子治療にとっての問題か？」、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ１２：１４２９〜４１（２００１）；Ｍａｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．、「第２のイントロンが組み換えＭＦＧレトロウィルスベクターに及ぼす影響」、Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ１４６：６０１〜９（２００１）；ＶｉｒｔｓおよびＲａｓｃｈｋｅ、「ＣＤ４５  ｃＤＮＡ構築物からの高レベル発現におけるイントロン配列の役割」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２７６：１９９１３〜２０（２００１）を参照）。多次元シグナルの検出、多次元シグナルの量、およびどの多次元シグナルがどのエクソンと相関するかに関する知識は、エクソンの使用と代替スプライシングに関する情報を提供する。
Ｅ．脂質多次元シグナル
開示された方法および構成は、脂質組成、分布、および処理を監視するのに使用することもできる。脂質は、有機溶媒に高可溶性を有する疎水性生体分子である。脂質は、監視のための貴重な標的とする様々な生物学的役割を有する。栄養源として、脂質（炭水化物類とともに）は、細胞のシグナル化およびその他のプロセスに必要な細胞エネルギーおよび中間代謝物の重要なソースを構成する。エネルギー変換のために処理される脂質は通常、様々な酵素経路を通過し、多くの代謝物を生成する。これらのサイクルの概要は、大半の近代生化学のテキストで入手可能である（たとえば、Ｓｔｒｙｅｒ、１９９５を参照）。代謝されるときのアシル鎖代謝物の監視は、脂質および細胞生物学の研究と、中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損などの生化学的疾病の臨床検出にとって重要な手段である（たとえば、Ｚｓｃｈｏｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、「軽度ＭＣＡＤ欠損の分子的および機能的特徴」、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ１０８：４０４〜８（２００１）を参照）。脂質に多次元シグナルを組み入れる、あるいは脂質に多次元シグナルを関連付けることは、たとえば、処理されたアシル鎖代謝物をより迅速に多重検出することによって脂質を検出する方法を向上させることができる（たとえば、Ａｎｄｒｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、「新生児のＭＳ／ＭＳ−ベースの予測的スクリーニングにより識別される中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＭＣＡＤ）変異は臨床症状を有する患者で観察される変異と異なる：軽度ＭＣＡＤ欠損を招く新たに流行する変異の特定と特徴」、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ６８：１４０８〜１８。（２００１））。
【０２７２】
別の役割として、脂質は、すべての生体膜のうちで最も基本的で決定的な構成要素として機能する。３つの主な種類の膜脂質は、リン脂質、糖脂質、およびコレステロールである。これらの中で最も豊富なのが、グリセロールまたはスフィンゴシンから得られるリン脂質である。グリセロールを基本とするリン脂質は通常、２つのエステル化長鎖脂肪酸（１４〜２４カーボン）およびリン酸化アルコールまたは糖を含む。スフィンゴシンリンを基本とする脂質は単独の脂肪酸を含む。まとめて、これらの脂質は生体膜の構造および流動性に寄与する。特にイノシトールリン脂質４，５リン酸塩などの酸性糖リン脂質の処理中の周期的変化は、広範な細胞プロセスを調節する（たとえば、Ｃａｎｔｒｅｌｌ、「ホスホイノシチド３−キナーゼシグナル経路」、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ１１４：１４３９〜４５（２００１）；Ｐａｙｒａｓｔｒｅ  ｅｔ  ａｌ．、「ホスホイノシチド：時間および空間における細胞シグナルの中心的存在」、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ１３：３７７〜８７（２００１）を参照）。したがって、上記分子のアシル鎖を多次元シグナルに組み込む、あるいは多次元シグナルと関連付けることによって、その後、酵素判定または生体内検定のために使用されるような生体外検定に上記多次元分子を組み入れることで、これらの脂質の個々の細胞コンパートメントへの迅速な隔離（たとえば、ゴルジ対原形質膜（たとえば、Ｇｏｄｉ  ｅｔ  ａｌ．、「ＡＲＦはＰｔｄＩｎｓ−４−ＯＨ  ｋｉｎａｓｅ−ｂｅｔａの補充を仲介し、ゴルジ複合体上でのＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２の合成を刺激する」、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ１：２８０〜７（１９９９）を参照）と、代謝および上記のようなシグナル経路を介した処理を可能にする。
【０２７３】
外来性脂質標識を容易に生物システムに組み込むことができ、開示された多次元シグナルも上記システムに組み込むことができるのは既知である。たとえば、スピン標識アシル脂肪酸およびリン脂質は、リン脂質小胞および細胞の膜に組み込まれている（たとえば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＭｃＣｏｎｎｅｌｌ、「小胞膜内のリン脂質の内外移送」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１０：１１１１〜２０（１９７１）；ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＭｃＣｏｎｎｅｌｌ、「小胞膜内のリン脂質の横拡散」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ６８：２５６４〜８（１９７１）；Ａｒｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．、「スピン標識ＥＰＲによって研究されるトリプシン化Ｎａ、Ｋ−ＡＴＰａｓｅと脂質−タンパク質との相互作用の選択性」、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ１３７１：１６３〜７（１９９８）；Ａｌｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．、「スピンラベル電子常磁性共鳴によって研究される角質層における脂質鎖ダイナミクス」、Ｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓ  Ｌｉｐｉｄｓ１０４：１０１〜１１（２０００）を参照）。
【０２７４】
トリグリセライド、またはスフィンゴ糖脂質または糖脂質のアシル鎖、およびコレステロールは多次元シグナルを含むように合成することができる。上記多次元シグナルの例は、光解離性結合を伴いカルボン酸を有する脂肪鎖からできる脂質である。光解離性結合の例は、ＧｌａｔｔｈａｒおよびＧｅｉｓｅ、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ、２：２３１５〜２３１７（２０００）；Ｇｕｉｌｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１００：２０９１〜２１５７（２０００）；Ｗｉｅｒｅｎｇａ、米国特許第４，０８６，２５４；および本明細書の別の場所に記載されている。１セットの多次元シグナルは、脂肪鎖内の様々な位置で切断結合を配置することによって作成することができる（よって、結合が切断されるとき、様々な質量の断片を結果として生じる）。光解離性結合を伴う脂肪鎖は多次元シグナルを構成する。上記合成多次元分子は、たとえば、脱水反応によって合成トリグリセライドに組み入れることができる。一旦形成されると、１セットのこれらの合成トリグリセライドは、上述したような当該生体系に導入される。多次元シグナルは、たとえば、クロロホルムへの脂質の抽出およびリパーゼまたは加水分解反応を用いるトリグリセライドからの多次元シグナルの解放によって、検出および計量のために当該生体系から回収することができる。
Ｆ．高感度符号化検出システム
レポーターシグナルおよびインジケータシグナルなどの多次元シグナルは、米国出願公開ＵＳ−２００３−０１２４５９５−Ａ１に記載される検出器システム内の複数ブロックとして使用することができ、上記公開の内容は言及により本明細書に組み込む。検出器システムは高感度符号化検出システム（ＳＣＤＳ）と称することもできる。複数セットのレポーターシグナルなどの複数セットの多次元シグナルは、ＳＣＤＳでブロック群として使用することができる。米国出願公開ＵＳ−２００３−０１２４５９５−Ａ１は、以後の検出を簡易化するように最適化された１セットの任意の分子タグを具備するキャリアの使用に基づき、検出器と称される構成を含むＳＣＤＳについて記載している。分子タグは複数ブロックと称され、セットの複数ブロックはブロック群と称される。キャリアは好ましくは共有結合により特定認識分子に連結される。特定認識分子は特定結合分子と称される。検出器は、直接的または間接的に連結される認識分子によって、生物学的検定においてレポーターとして使用することができる。複数ブロックは、たとえば、質量分析によって効率的に分離されるように、その化学組成により最適化することができる。質量分解によって分離される複数ブロックは、好ましくは  確実な分離を可能にする十分に分析された質量（あるいは、質量電荷比）差によって、分子量が異なる。質量分析による分離に関しては、変更された形式のレポーターシグナルの質量電荷比間の差がキャリアを区別し検出するために使用可能な場合、キャリアにレポーターシグナルを搭載することができる。
【０２７５】
米国出願公開ＵＳ−２００３−０１２４５９５−Ａ１はシグナルで標的分子を符号化した後、符号化シグナルを復号化することによって（ブロック群を有する検出器を用いて）、単独の検定でサンプル内の複数の検体を検出するＳＣＤＳ法について記載している。この符号化／復号化は、標的分子の検出と標的分子の化学的および物理的特性とを切り離す。基本的な形式では、該方法は、１つ以上の検出器と１つ以上の標的サンプルとの関連付け−検出器は特定結合分子、キャリア、およびブロックから成るブロック群を具備する−と、ブロックの検出を介したブロック群の検出とを含む。検出器は特定結合分子を介して、標的サンプル内の標的分子と関連付ける。概して、検出器は１つ以上の標的分子に対応し、ブロック群は１つ以上の検出器に対応する。したがって、特定のブロック群の検出は、対応する検出器の存在を示す。次に、特定の検出器の存在は対応する標的分子の存在を示す。
【０２７６】
このＳＣＤＳにおける間接的な検出は、任意の化学的および物理的特性を実質的に有することのできるブロック群を介在させることによって、標的分子の検出と標的分子の化学的および物理的特性とを切り離す。特に、ブロック群（およびブロック群が構成されるブロック）は検出に有益な特定特性を有することができ、検定内のブロック群および複数ブロックは相互に非常に規則正しい、または構造化された関係を有することができる。検出時点で関係する（そのまま取り入れる）標的分子の特性ではなく、（自由に選択される）ブロック群および複数ブロックの特性である。
【０２７７】
多次元シグナル、レポーターシグナル、インジケータシグナル、複数セットの多次元シグナル、複数セットのレポーターシグナル、および複数セットのインジケータシグナルは、ブロック群、検出器または検出器群内の複数ブロックが本明細書に示されるような所定パターンを生成するように選択することができる。たとえば、１セットのレポーターシグナルは１セットのインジケータシグナルとともに使用することができ、２セットのレポーターシグナルは一緒に使用することができ、１セットのレポーターシグナルは単独のインジケータシグナルとともに使用することができる。本明細書に記載される所定パターンの検出、分析、および使用は、検出器およびその他のＳＣＤＳ構成要素で、および米国出願公開ＵＳ−２００３−０１２４５９５−Ａ１に記載される方法で使用される際の、開示された多次元シグナルの検出、分析、および使用において利用することができる。検出器、ブロック群、ブロック、独自性の組成、量組成は米国出願公開ＵＳ−２００３−０１２４５９５−Ａ１に定義されており、その定義は言及によりここに組み込む。
【０２７８】
したがって、本発明は１つ以上の標的サンプルを有する検出器を提供し、検出器はそれぞれ特定結合分子、キャリア、およびブロック群を具備し、ブロック群は複数ブロックを具備し、ブロックは１セットのレポーターシグナルおよび１つ以上のインジケータシグナル（および／または２つ以上のセットのレポーターシグナル）を具備する。各セット内のレポーターシグナルは共通特性を有することができ、共通特性によって、レポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別または分離することができ、レポーターシグナルは変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルはすべての別の変更された形式のレポーターシグナルから区別可能である。レポーターシグナルおよび１つ以上のインジケータシグナル（あるいは、２つ以上のセットのレポーターシグナル）は共通特性によって、レポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別および／または分離できる状況において所定パターンを形成する。形式によっては、インジケータシグナルは共通特性を有していない。共通特性は質量電荷比であってもよく、レポーターシグナルがその質量を変更することにより変更可能であり、変更された形式のレポーターシグナルは変更された形式のレポーターシグナルの質量電荷比の差を介して区別可能である。レポーターシグナルの質量は断片化により変更可能である。レポーターシグナルの変更は、電荷を変更することもできる。
【０２７９】
ブロックは同じ量組成を有することができるが、ブロックはすべてが同じ量組成を必ずしも有する必要はない。複数の検出器は１つ以上の標的サンプルと関連付けることができ、各検出器のブロック群は異なる組成のブロックを有することができる。各ブロック群は同数のブロックを有することができるが、ブロック群は必ずしもすべてが同数のブロックを有する必要はない。各ブロック群はブロックの異なる独自性組成を有することができる。ブロックの同一の独自性組成を有するブロック群は、ブロックの異なる量組成を有することができる。検出器、ブロック群、ブロック、独自性組成、および量組成は米国出願公開ＵＳ−２００３−０１２４５９５−Ａ１に定義され、言及により本明細書に組み込む。
【０２８０】
ブロックは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光法により検出することができる。ブロックは等圧ブロックであってもよい。複数の検出器は１つ以上の標的サンプルと関連付けることができ、各検出器のブロックは異なっていてもよい。全検出器の全ブロックは同じ質量電荷比を有することができる。ブロックはその質量、電荷、またはその両方を変更することにより変更することができ、変更された形式のブロックは変更された形式のブロックの質量電荷比の差を介して区別可能である。
キャリアはビーズ、リポソーム、微粒子、ナノ粒子、および分枝ポリマー構造から成る群から選択することができる。キャリアはビーズであってもよい。キャリアはリポソームまたはミクロビーズであってもよい。リポソームは単一層小胞であってもよい。小胞は１５０〜３００ナノメータの平均径を有することができる。リポソームは２００ナノメータの内径を有することができる。キャリアはデンドリマーであってもよい。デンドリマーはＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡから成る群から選択された接触高分子であってもよい。高分子は長さ２０〜３００のヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドであってもよい。
【０２８１】
特定結合分子は、抗体、リガンド、結合タンパク質、レセプタータンパク質、ハプテン、アプタマー、炭水化物類、合成ポリアミド類、およびオリゴヌクレオチド類から成る群から選択することができる。特定結合分子は結合タンパク質であってもよい。結合タンパク質はＤＮＡ結合タンパク質であってもよい。ＤＮＡ結合タンパク質は亜鉛フィンガモチーフ、ロイシンジッパーモチーフ、およびヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフから成る群から選択されたモチーフを含むことができる。
【０２８２】
特定結合分子はオリゴヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドは１０〜４０ヌクレオチドの長さを有することも、１６〜２５ヌクレオチドの長さを有することもできる。オリゴヌクレオチドはペプチド核酸であってもよい。オリゴヌクレオチドは標的配列を有する三重螺旋を形成することができる。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを標的配列に共有結合することのできるソラレン派生物を具備することができる。
【０２８３】
特定結合分子はタンパク質を結合する抗体であってもよい。ブロックはオリゴヌクレオチド類、炭水化物類、合成ポリアミド類、ペプチド核酸類、抗体、リガンド、タンパク質、ハプテン、亜鉛フィンガ、アプタマー、質量標識、またはこれらの組み合わせであってもよい。特定結合分子とキャリアは共有結合することができる。キャリアとブロックは共有結合することができる。特定結合分子とキャリアは共有結合することができる。特定結合分子は第１のオリゴヌクレオチドを具備することができ、キャリアは第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズ可能な第２のオリゴヌクレオチドを具備することができる。第１のオリゴヌクレオチドは、タンパク質を結合する抗体と共役結合することができる。特定結合分子、キャリア、およびブロック群を具備する検体を検出する組成も開示され、該検体において、ブロック群はブロックを具備し、ブロックは１セットのレポーターシグナルおよび１つ以上のインジケータシグナル（および／または２つ以上のセットのレポーターシグナル）を具備する。セット内のレポーターシグナルは共通特性を有することができ、共通特性によって、レポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別または分離することができ、レポーターシグナルは変更可能であり、変更された形式の各レポーターシグナルは、すべての別の変更された形式のレポーターシグナルから区別可能である。共通特性によって、レポーターシグナルを共通特性を欠く分子から区別および／または分離することができる状況においては、レポーターシグナルおよび１つ以上のインジケータシグナル（あるいは、２つ以上のセットのレポーターシグナル）は所定パターンを形成する。形式によっては、インジケータシグナルは共通特性を有していない。
Ｇ．再配列多次元シグナル
再配列多次元シグナル（再配列ＭＤＳまたはＲＭＤＳ）と称される開示された方法および構成の別の実施形態は、特定遺伝子再配列事象の発生、そのタンパク質産物、およびレセプターを有する特定細胞の個体数の検出を可能にする。ＲＭＤＳは、多次元シグナルの存在および／または不在を監視することによって、特定レセプターおよび細胞の推移および発生または細胞の個体数を追跡調査することもできる。再配列された多次元シグナルのための設計上の考慮事項は、本明細書の別の場所で説明される多次元シグナル融合に対して要求される考慮事項と同様である。
【０２８４】
開示された方法のほとんどの実施形態は、様々な方法で検体に関連付けられるそのままの多次元シグナルを含む。ＲＭＤＳは生物学プロセスなどのプロセスを利用して、多次元シグナルピースの特定再配列または多次元シグナルの部分のみを符号化する核酸セグメントの再配列によって多次元シグナルを形成する。ある形式のＲＭＤＳは、哺乳類免疫系に存在する可変−多様性−連結（Ｖ−Ｄ−Ｊ）遺伝子再配列機構などの内在性生体系を利用する。この系では、連続していない短く延びた生殖系列のＤＮＡ（Ｖ、Ｄ、およびＪ遺伝子断片）が、転写テンプレートとしての役を果たす前に一緒にされる（再結合される）。遺伝子再配列はＴおよびＢリンパ球などの白血球内で生じ、Ｔ細胞およびＢ細胞抗原レセプターの多様性を生成するための主要機構である。論理上は、何十億もの様々なレセプターを生成することができる。このレベルの複雑性のため、稀な再配列事象またはレセプターの存在を検出するのが困難に成る。ＰＣＲベースの検定と流動細胞計測アプローチは、レセプターの多様性を検出するのに現在使用されている。しかし、ＰＣＲアプローチは困難で、発現タンパク質の状態に関する情報を提供しない。流動細胞計測アプローチは、使用される蛍光プローブの発光スペクトルの重複により、多重化性能が限定される。
【０２８５】
５０〜１００個のＴ細胞またはＢ細胞レセプターの検査を所望する場合、それらのレセプターに対して同数の抗体を利用する必要があり、それは実質上不可能である。したがって、レセプターの高度な複合プール内の特定レセプターを高感度で特定的に検出できる方法が真に必要とされる。このアプローチを高度に多重化する能力は、現在達成不能な実験的アプローチを可能にする。開示された多次元シグナル技術は、検出のためのシグナルの大規模な多重化を可能とする。
【０２８６】
ＲＭＤＳの１例として、多次元シグナルを符号化する核酸配列がマウス生殖系内に設計された遺伝子組み換えマウスを生成することができる。これを行う方法は当該技術において既知であり、再配列多次元シグナルを、たとえば、酵母またはバクテリア人工染色体（ＹＡＣおよびＢＡＣ）に設計してから、これらの構築物を用いて遺伝子組み換えマウスを生成する標準的な分子生物学方法の使用を含む。
【０２８７】
ＲＭＤＳのためのイムノグロブリン再配列の使用例として、多次元シグナルの１部をＤ領域で符号化し、多次元シグナルの別の部分をＪ領域で符号化することができる。「部分的な」多次元シグナルを符号化するＤおよびＪ領域を結合した再配列事象時、「完全な」多次元シグナルの符号化配列が生成される。転写および翻訳後、多次元シグナルはタンパク質産物内で符号化される。次に、多次元シグナルは、本発明の別の場所に記載されるように検出することができる。設計されたＤおよびＪ領域を接合する再配列事象がない場合、多次元シグナルは検出されない。異なるＤおよびＪ領域を有する様々な多次元シグナルの配列符号化部分を含めることによって、様々な異なる多次元シグナルを、異なる可能な再配列の各々に対する異なる、診断用の多次元シグナルの再配列によって生成することができる。このシステムは、たとえば、３以上の遺伝子領域（たとえば、Ｖ−Ｄ−Ｊ、Ｖ−Ｄ−Ｄ−Ｊなど）の間で分割された多次元シグナルを含むように拡張することもでき、その結果、複数の再配列事象が多次元シグナルを作成する。このモードでは、多次元シグナル部分の再配列の組み合わせが多数の異なる多次元シグナルを生み出し、そのそれぞれが、多次元シグナルを形成するように再配列された特定多次元シグナル部分によって特徴付けられる。
【０２８８】
ＲＭＤＳを担持する遺伝子導入マウスによって、そうでなければ対処が非常に困難であった、あるいは不可能であった問題に対処することができる。たとえば、（何千または何百万の中から）どの特定ＴおよびＢ細胞レセプターが特定の刺激に反応するか、あるいはどの細胞の種類が特定の発生ステージに存在するのかを調べることができる。
【０２８９】
再配列多次元シグナルを担持する遺伝子導入マウスによって、そうでなければ対処が非常に困難であった、あるいは不可能であった問題に対処することができる。たとえば、（何千または何百万の中から）どの特定ＴおよびＢ細胞レセプターが特定の刺激に反応するか、あるいはどの細胞の種類が特定の発生ステージに存在するのかを調べることができる。
Ｈ．質量分析計
開示された方法は、多次元シグナル、変更された形式の多次元シグナル、および各種検体および検体断片の分析のために質量分析計を活用する。質量分析計は概して入手可能で、上記機器およびその動作は当業者にとって既知である。質量分析計と一体化されている断片化システムは市販されており、例示されるシステムは液体クロマトグラフィ（ＬＣ）およびキャピラリ電気泳動（ＣＥ）を含む。
質量分析計の主要な構成要素は、（ａ）１つ以上のソース、（ｂ）１つ以上の分析器および／または細胞、および（ｃ）１つ以上の検出器である。ソースの種類は、電気スプレー電離（ＥＳＩ）およびマトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）を含む。分析器と細胞の種類は、四極質量フィルタ、へクサポール衝突細胞、イオンサイクロトロントラップ、および飛行時間（ＴＯＦ）を含む。検出器の種類はマルチチャンネルプレート（ＭＣＰ）およびイオンマルチプライヤを含む。開示された方法で使用される好適な質量分析計は、Ｋｒｕｔｃｈｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、「新規ＭＡＬＤＩ−イオントラップ質量分析計を利用するタンパク質の高速自動識別」、質量分析および関連トピックに関する第４９回ＡＳＭＳ会議要約（２００１年５月２７〜３１日）、Ｔｈｅ  Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
【０２９０】
２つ以上の分析器／細胞を有する質量分析計は、タンデム質量分析計として知られる。２種類のタンデム質量分析計だけでなく、これらの種類：「タンデムインスペース」分析計と「タンデムインタイム」分析計の複合および組み合わせである分析計が存在する。イオンが２つ以上の分析器／細胞を横断するタンデム質量分析計は、タンデムインスペース質量分析計として知られる。タンデムインスペース分析計は、空間的に順序付けられたエレメントを利用し、イオンが各エレメントを通過するときにイオンに作用する。イオンが主に１つの分析器／細胞にとどまるタンデム質量分析計は、タンデムインタイム質量分析計として知られる。タンデムインタイム質量分析計は、イオンが空間内に含まれるとき、イオンに関する一時的に順序付けられた操作を利用する。複合システムおよびこれらの種類の組み合わせが既知である。質量分析器における特定の当該質量電荷比を選択する能力は、通常、（選択された当該イオンの全幅半値で分割される中心質量電荷として報告される）分解能によって特徴付けられる。したがって、分解能は、分析器を通って検出器まで通過するイオン質量電荷分布の狭さを示す指標である。上記分解能への言及は概して、狭い範囲の質量電荷比のみを通過できる質量分析計の能力を言及することによって、本明細書では指摘される。
【０２９１】
開示された方法で使用される好適な形状の質量分析計はタンデムインスペース型タンデム質量分析計などのタンデム質量分析計である。タンデムインスペース型機器の使用例として、等圧多次元シグナルは最初にフィルタリング四極子を通過することができ、多次元シグナルは（好ましくは、衝突細胞内で）断片化され、断片は飛行時間（ＴＯＦ）ステージで区別され検出される。上記機器では、サンプルがソース（たとえば、ＭＡＬＤＩイオンソース）でイオン化され、電荷イオンを作成する。イオン化条件は、一次単電荷親イオンが作成されることが好ましい。第１の四極子Ｑ０は無線周波数（ＲＦ）モードのみで動作され、全電荷粒子のためのイオンガイドとしての役割を果たす。第２の四極子Ｑ１はＲＦ＋ＤＣモードで動作され、狭い範囲の質量電荷比（多次元シグナルの質量電荷比を含む）のみを通る。この四極子は当該質量電荷比を選択する。衝突細胞によって取り巻かれる四極子Ｑ２はＲＦのみのモードで動作され、イオンガイドとしての役割を果たす。多次元シグナルの断片化が所望されるとき、Ｑ２の周囲の衝突細胞は衝突誘導性解離により入力イオンを断片化するようにガスで適切な圧力まで充填される。衝突ガスは好ましくは化学的に不活性だが、反応性ガスも使用することができる。好適な分子システムは、切断結合、不安定結合、またはその組み合わせを含む多次元シグナルを利用して、これらの結合をＱ２衝突細胞内で優先的に断片化する。
【０２９２】
ＭＳＮ対応のタンデム機器を開示された方法とともに使用することができる。１例として、第１のステージフィルタ（ＭＳ）を用いて分子セットを選択し、これらの分子を光解離して１セットの多次元シグナルを生み、第２のステージ（ＭＳ／ＭＳ）を用いてこれらの多次元シグナルを選択し、衝突断片化によりこれらの多次元シグナルを変更し、飛行時間（ＭＳ／ＭＳ／ＭＳまたはＭＳ３）により検出する方法を検討する。多くのその他の組み合わせが可能であり、開示された方法は上記システムとともに使用できるように適合させることができる。たとえば、多次元シグナル断片のより多くのステージまたは分析への拡張も当該技術に含まれる。
【０２９３】
開示された方法および構成は、他に明記されない限り、特定合成方法、特定分析技術、または特定の試薬に限定されないため、変動可能であると理解すべきである。さらに、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明する目的のみに使用され、限定することを意図していないと理解すべきである。
材料
開示されている材料、組成、および構成要素は、開示された方法および構成のために使用することができる、それらと合わせて使用することができる、それらに備えて使用することができる、あるいはそれらの産物である。これらおよび他の材料が本明細書で開示されており、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどが開示されるとき、これらの化合物の様々な個々の、および全体の組み合わせおよび並び替えに対する特定の言及は明示的に開示されてはならず、本明細書ではそれぞれが具体的に意図され説明されると理解される。たとえば、多次元シグナルが開示および説明され、多次元シグナルを含む多数の分子に対して行うことのできる多数の修飾が記載されている場合、可能性のある多次元シグナルおよび修飾のすべての組み合わせおよび並び替えが、明確に逆を示されない限り、具体的に意図される。したがって、分子Ａ、Ｂ、およびＣのクラスが開示される場合、分子Ｄ、Ｅ、およびＦのクラスと組み合わせ分子Ａ−Ｄの例も開示される。たとえ個々に列挙されないとしても、それぞれが個々におよび集団で意図される。したがって、この例では、組み合わせＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、およびＣ−Ｆが具体的に意図され、Ａ、Ｂ、およびＣ；Ｄ、Ｅ、およびＦ；および組み合わせＡ−Ｄの例の開示から開示されたとみなされるべきである。同様に、これらのサブセットまたは組み合わせも具体的に意図され、開示されている。したがって、たとえば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、およびＣ−Ｅのサブグループが具体的に意図されており、Ａ、Ｂ、およびＣ；Ｄ、Ｅ、およびＦ；および組み合わせＡ−Ｄの例の開示から開示されたとみなされるべきである。この発想は、ステップ開示された構成を作成し使用する方法におけるステップを含むが、それらに限定されない、本願のすべての側面に適用される。したがって、実行可能な様々な追加ステップがある場合、これらの各追加ステップは開示された方法の特定実施形態または実施形態の組み合わせで実施可能であり、上記組み合わせは具体的に意図され、開示されているとみなされるべきだと了解される。
Ａ．多次元シグナル
多次元シグナル（ＭＤＳ）は、さらなるレベルの分析を実行できるか、あるいは実行すべきであるかどうか、および／または分析された物質のどの部分をさらなるレベルの分析で分析できるか、あるいは分析すべきかを示すのに供する１つ以上の所定パターンを生成することのできる特別な標識成分である。レポーターシグナルおよびインジケータシグナルは、多次元シグナルの形式である。多次元シグナルは、多次元シグナルを別の多次元シグナルまたは別のセットの多次元シグナルから区別および／または分離させることのできる少なくとも１つの特性を有する分子である。概して、多次元シグナルは、同一のインジケータレベルの分析で存在する別の多次元シグナルおよび／または複数セットの多次元シグナルから区別可能および／または分離可能でありさえすればよい。レポーターシグナルなどのいくつかの多次元シグナルは、レポーターシグナルの変更後、レポーターシグナルレベルの分析における１セットのレポーターシグナル内の異なるレポーターシグナルからも区別可能であるべきである。したがって、多次元シグナルは、開示された方法で２つの主要な機能または特徴を有する。すなわち、インジケータレベルの分析でのパターンを生成することのできる関連の差と、レポーターシグナルレベルの分析で異なる多次元シグナルを区別させることのできる変更された形式の多次元シグナル（概してレポーターシグナル）の差である。
【０２９４】
上述したように、多次元シグナルはレポーターシグナルおよびインジケータシグナルであってもよい。よって、レポーターシグナルおよびインジケータシグナルは２つの形式の多次元シグナルである。有益な形式の開示された方法は、少なくとも１つのセットの多次元シグナルの使用を含むことができる。レポーターシグナルは以下詳述するように、優先的に断片化され、分解され、反応され、誘導体化され、あるいは検出のために他の方法で修飾または変更されることのできる分子である。インジケータシグナルは以下詳述するように、インジケータシグナルを別の多次元シグナルから区別および／または分離させることのできる少なくとも１つの特徴を有する分子である。概して、インジケータシグナルは、同じレベルの分析に存在する別の多次元シグナルから区別可能および／または分離可能でありさえすればよい。多次元シグナル、レポーターシグナルおよびインジケータシグナルは、個々に、および一緒に、の両方でセット内で使用することができる。したがって、たとえば、１セットのレポーターシグナルは１セットのインジケータシグナルとともに使用することができ、２セットのレポーターシグナルは一緒に使用することができ、１セットのレポーターシグナルは単独のインジケータシグナルとともに使用することができる。
【０２９５】
レポーターシグナルなどの多次元シグナルは２つの主要な特徴を有することができる。第１に、多次元シグナルは、セット内のすべての多次元シグナルが同様の特性を有するセットで使用することができる。同様の特性によって、多次元シグナルを１つ以上の特性を欠く別の分子から区別および／または分離することができる。実施形態によっては、セット内の多次元シグナルは同じ質量電荷比（ｍ／ｚ）を有する。すなわち、セット内の多次元シグナルは等圧である。これにより、質量電荷比に基づき、多次元シグナルを別の分子から正確に分離することができる。フィルタリングの結果、システムにとっての信号雑音比（Ｓ／Ｎ）が大幅に増大し、より高感度で精密な検出を可能にする。フィルタリングは、第２のステージを実行すべきかどうか、および／または分析された物質のどの部分を断片化ステージで分析できるか、あるいは断片化ステージで分析すべきかを示す多次元シグナルから所定パターンを作成するのに使用可能である。
【０２９６】
第２に、セット内のすべての多次元シグナルは、セット内の様々な多次元シグナルと区別するために、断片化し、分解し、反応させ、誘導体化し、あるいは検出のために他の方法で修飾することができる。たとえば、多次元シグナルは、同一のまたは同様の電荷だが質量は異なる断片を生むように断片化することができる。これにより、セット内の各多次元シグナルを、多次元シグナルの断片の様々な質量電荷比によって区別することができる。これが可能なのは、セット内の非断片化多次元シグナルは等圧だが、様々な多次元シグナルの断片は等圧でないからである。質量電荷比に基づき検出される、および／または質量分析計を用いて検出される多次元シグナルは、質量分析計多次元シグナルと称することができる。レポーターシグナルは、これらの特徴を有することのできる１つの形式の多次元シグナルである。
【０２９７】
レポーターシグナルなどの多次元シグナルの断片の差別的質量分布は、多数の方法で達成可能である。たとえば、同一の公称構造の多次元シグナル（たとえば、同一のアミノ酸配列を有するペプチド）は重水素などの様々な分布の重同位体で構成される。セット中のすべての多次元シグナルは同数の所与の重同位体を有するが、これらの分布は様々な多次元シグナルによって異なる。同様に、同一の一般構造の多次元シグナル（たとえば、同一のアミノ酸配列を有するペプチド）は、メチル化、リン酸化、硫酸化などの異なる分布の修飾、およびメチオニンに関するセレノ−メチオニンの使用などで構成することができる。セット中のすべての多次元シグナルは同数の所与の修飾を有するが、これらの分布は異なる多次元シグナルによって異なる。同一の公称組成の多次元シグナル（たとえば、同一のアミノ酸類で構成）は、多次元シグナルの異なる次数のサブユニットまたは構成要素で構成することができる。セット中のすべての多次元シグナルは同数のサブユニットまたは構成要素を有するが、これらの分布は異なる多次元シグナルによって異なる。同一の公称組成を有する多次元シグナル（たとえば、同一のアミノ酸類で構成）は、多次元シグナル内の様々な位置での不安定または切断結合で構成することができる。セット中のすべての多次元シグナルは、同数および同次のサブユニットまたは構成要素を有すると思われる。不安定または切断結合が特定のサブユニットまたは構成要素間に存在する場合、多次元シグナル内のサブユニットまたは構成要素の次数は、不安定または切断結合を形成するサブユニットまたは構成要素を除いて同一である。これらの各モードは多次元シグナルの断片の差別的質量分布を生成するため、１つ以上の他のモードと組み合わせることができる。たとえば、様々な分布の重同位体は、不安定または切断結合が様々な位置で成される多次元シグナルにおいて使用することができる。さらに、これらの各モードは相互に、１つ以上の他のモード、および／または別の多次元シグナルと組み合わせて多次元シグナルおよび複数セットのレポーターシグナルの差別的質量分布を作成することによって、インジケータレベルの分析で検出および使用可能な質量パターンを生成することができる。
【０２９８】
レポーターシグナルおよびインジケータシグナルなどの多次元シグナルは、その質量電荷比に基づき、分子間の高感度な差別を可能にする質量分析を用いて検出することができる。レポーターシグナルおよびインジケータシグナルなどの開示された多次元シグナルは無数の標識付けおよび／または検出技術において、一般的な標識として使用可能である。多次元シグナル断片は広範囲の質量を有するように設計され、各質量（あるいは、質量電荷比）は個々に検出後に区別可能であるため、１セットの等圧多次元シグナルは、多くの検体の多重標識付けおよび／または検出用に使用可能である。等圧および非等圧多次元シグナルの組み合わせにより、質量（あるいは、質量電荷比）のパターンを生成することができ、方法の多重化を拡張することができる。
【０２９９】
したがって、多次元シグナルはセットで使用することができる。たとえば、いくつかの特性または特徴で異なる１セットの多次元シグナルは、異なるサンプルおよび／または検体を標識付けするのに使用することができる。いくつかの形式の多次元シグナルでは、特徴は、認識可能なパターンが多次元シグナルの分析中に生じるように、レポーターシグナルおよび／または別の多次元シグナル、あるいは同じ検定または検定システムで使用される複数セットの多次元シグナルの特徴と両立するように選択することができる。たとえば、別の多次元シグナルおよび複数セットの多次元シグナルの質量（あるいは、質量電荷比）と異なる質量（あるいは、質量電荷比）を有する多次元シグナルまたは複数セットの多次元シグナルは、同じ検定で使用されて、質量分析において質量（あるいは、質量電荷比）の特徴パターンを生成することができる。多次元シグナル、レポーターシグナルおよびインジケータシグナルは、個々におよび一緒に、の両方でセットで使用可能である。したがって、たとえば、１セットのレポーターシグナルは１セットのインジケータシグナルとともに使用することができ、２セットのレポーターシグナルは一緒に使用することができ、１セットのレポーターシグナルは単独のインジケータシグナルとともに使用することができる。
【０３００】
開示された多次元シグナルは好ましくは、セットのメンバーが様々な質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するセット、あるいは１セットの多次元シグナルのメンバーが同じ質量電荷比を有するセットで使用され、該セットのうち異なるセットのメンバーは異なる質量電荷比を有する。これにより、質量電荷比に基づき、多次元シグナルおよび／または複数セットの多次元シグナルが互いに、および別の多次元シグナルおよび／または複数セットの多次元シグナルから高感度で容易に区別される。多次元シグナルは、開示された方法の分析において別の多次元シグナルでパターンを生成できる任意の構造を採ることができる。
【０３０１】
好適な多次元シグナル（たとえば、レポーターシグナルまたはインジケータシグナル）は、ペプチド、オリゴヌクレオチド類、ペプチド核酸類、オリゴマー、炭水化物類、ポリマー、およびその他の天然および合成ポリマー、およびこれらの組み合わせなどのサブユニットの鎖で構成される。ほとんどの好適な鎖はペプチドであり、本明細書では多次元シグナルペプチド（あるいは、場合に応じてレポーターシグナルペプチドまたはインジケータシグナルペプチド）と称される。サブユニットとサブユニットの鎖は、ポリマーとｍｅｒの鎖と同様の関係を有する。ｍｅｒはともに接続されポリマーを形成する。同様に、サブユニットはともに接続され、サブユニットの鎖を形成する。好適な多次元シグナルは、同様のまたは関連するサブユニットの鎖で構成される。これらはホモ鎖またはホモポリマーと呼ばれる。たとえば、核酸類はホスホヌクレオシドで構成され、ペプチドはアミノ酸で構成される。
【０３０２】
多次元シグナルは、ヘテロ鎖またはヘテロポリマーで構成することもできる。ヘテロ鎖とは、鎖を構成するサブユニットが異なる種類である、あるいはポリマーを構成するｍｅｒが異なる種類である鎖またはポリマーである。たとえば、ヘテロ鎖は１つのヌクレオシドサブユニットと１つのアミノ酸サブユニットとから成るグアノシン−アラニンであってもよい。サブユニットの種類のいかなる組み合わせも開示された組成、セット、および方法で使用可能であると理解される。所要の特性を有する分子は多次元シグナルとして使用することができる。概して、多次元シグナルは同じレベルの分析（たとえば、インジケータレベルの分析）で存在する別の多次元シグナルから区別可能および／または分離可能でありさえすればよい。いくつかのレポーターシグナルなどの多次元シグナルは、レポーターシグナルの変更後、レポーターシグナルレベルの分析における１セットのレポーターシグナル内の異なるレポーターシグナルから区別可能であるべきである。
【０３０３】
多次元シグナルは好ましくは、セット内のすべてのインジケータシグナルが異なる物理的特性を有するセットで、および／または１セットの複数セット内のセットが異なる物理的特性を有する１セットのセット内の所与のセットのメンバーが同一の物理的特性を有することができる）セットで使用される。異なる（あるいは、区別する）特性によって、多次元シグナルおよび／または複数セットの多次元シグナルを、１つ以上の特性において異なる別の多次元シグナルおよび／または複数セットの多次元シグナルから区別および／または分離することができる。１例として、セット内の多次元シグナルは同一のまたは異なる質量電荷比（ｍ／ｚ）を有する。すなわち、セット内の多次元シグナルは等圧または非等圧であってもよい。概して、セット内部で、インジケータシグナルは非等圧であり、レポーターシグナルは等圧であることができる。
【０３０４】
多次元シグナルは、別の多次元シグナルと組み合わせて使用することができる。概して、少なくとも２つの異なる形式の多次元シグナルが、同じ検定または検定システムで一緒に使用することができる。ともに使用される異なる形式の多次元シグナルは、別のレベルまたは次元の分析を実行可能なインジケータとしての役割を果たしうる１つ以上の所定パターンを分析中に生成することができる。次に、各分析レベルは、別のレベルまたは次元の分析を実行可能なインジケータとしての役割を果たしうる１つ以上の所定パターンを生成することができる。開示された方法は概して、少なくとも２つの分析レベルを含み、第１の分析レベルで生成されるパターンは第２の分析レベルを実行すべきかどうかを示す。多次元シグナルの分析によって生成されるパターンは、分析されている材料の部分が次のレベルの分析で分析されるべきかどうかを示すために使用することもできる。したがって、たとえば、分割、分離、あるいは他の方法で分断される分析サンプルの異なるどの部分あるいは断片は、現在の分析レベルによって生成される所定パターンの検出に基づき、次のレベルの分析のために識別または選択することができる。
【０３０５】
インジケータレベルの分析で生成されるパターンは、検定における多次元シグナルの１つ以上の特質の結果である。たとえば、２つ以上の異なる形式の多次元シグナルは、１つ以上の特質で異なる同じ検定または検定システムで一緒に使用することができる。一緒に使用される異なる形式の多次元シグナルは、この特質差に基づき、分析中に１つ以上の所定パターンを生成することができる。たとえば、特有の質量（あるいは、質量電荷比）差を有する異なる形式の多次元シグナルは、質量分析によって分析されるとき、質量（あるいは、質量電荷比）の特徴的な所定パターンを結果的にもたらす。より具体的には、１セットの多次元シグナルのメンバーが別のセットの多次元シグナルのメンバーと特定量、質量（あるいは、質量電荷比）で異なる場合、２セットの多次元シグナルのメンバーは、特有の質量（あるいは、質量電荷比）差に基づき異なる質量分析ピークを生成する。このことは、異なる形式の多次元シグナルに融合または接合される同一の検体は特有の質量（あるいは、質量電荷比）差に基づき異なる質量分析ピークを生成するため、多次元シグナルが単独に分析されるか、あるいは多次元シグナル融合または多次元シグナル／検体結合体が分析されるかにかかわらず当てはまる。特有の質量（あるいは、質量電荷比）差は、たとえば、多次元シグナルの形式の質量差（あるいは、質量電荷比）、多次元シグナルの形式の複数質量差（あるいは、質量電荷比）、または多次元シグナルの形式および多次元シグナルの総質量の質量差（あるいは、質量電荷比）の組み合わせのいずれであってもよい。
【０３０６】
所与のインジケータレベルの分析での使用に関しては、使用される多次元シグナルおよび複数セットの多次元シグナルは、関連する、あるいは密な間隔を置く特性を有することが有益である。たとえば、（質量パターンを生成する）様々な質量電荷比を有する多次元シグナルおよび複数セットの多次元シグナルは、比較的小さな質量電荷比の差を有することができる。これにより、多次元シグナル（および／または多次元シグナルが付加されるタンパク質または別の検体）を特性（たとえば、質量電荷比）に基づき別の分子から正確に分離し、相互に、および別の多次元シグナルとパターン（たとえば、質量パターン）を生成することができる。このため、所定パターンをより容易に識別できる。
パターンを形成するための、多次元シグナル（たとえば、レポーターシグナルまたはインジケータシグナル）、多次元シグナル／検体結合体、断片結合体、多次元シグナル融合、多次元シグナル融合断片、または多次元シグナルペプチドの共通特性、または多次元シグナル（たとえば、レポーターシグナルまたはインジケータシグナル）の特性はアフィニティタグでないことが好ましい。それにもかかわらず、このような場合ですら、その他の点で共通特性を有する多次元シグナル、多次元シグナル／検体結合体、断片結合体、多次元シグナル融合、多次元シグナル融合断片、または多次元シグナルペプチドは、アフィニティタグを含むことができ、−共通特性を共有する多次元シグナル、多次元シグナル／検体結合体、断片結合体、多次元シグナル融合、多次元シグナル融合断片、または多次元シグナルペプチドを他の共通特性を欠く分子から分離するのに使用できる別の共通特性が存在する限り、あるいはパターンを生成するのに使用可能な（開示された方法の実施形態によっては、使用される）別の特性が存在する限り−実際には、同一のアフィニティタグを共有することができる。これを念頭に置くと、クロマトグラフィまたはその他の分離技術が共通特性に基づき多次元シグナル、多次元シグナル／検体結合体、断片結合体、多次元シグナル融合、多次元シグナル融合断片、または多次元シグナルペプチドを分離するのに使用される場合、アフィニティはたとえば、アフィニティタグなどの特徴または部位の存在ではなく、レポーターシグナルの一般的な物理的特性に基づくことが好ましい。本明細書で使用されるように、共通特性は、１セットの構成要素（たとえば、多次元シグナル、多次元シグナル／検体結合体、断片結合体、多次元シグナル融合、多次元シグナル融合断片、または多次元シグナルペプチド）によって共有される特性である。すなわち、構成要素は「共通の」特性を有する。セット内の多次元シグナル、多次元シグナル／検体結合体、断片結合体、多次元シグナル融合、多次元シグナル融合断片、または多次元シグナルペプチドは多数の共通する特性を有することができると理解すべきである。しかし、本明細書で使用されるように、言及される多次元シグナル、多次元シグナル／検体結合体、断片結合体、多次元シグナル融合、多次元シグナル融合断片、または多次元シグナルペプチドの共通特性は、共通特性を共有する多次元シグナル、多次元シグナル／検体結合体、断片結合体、多次元シグナル融合、多次元シグナル融合断片、または多次元シグナルペプチドを共通特性を欠く分子から区別および／または分離するために開示された方法で使用される共通特性のみである。さらに、本明細書で使用されるように、パターンを生成するために使用される多次元シグナル（たとえば、レポーターシグナルおよびインジケータシグナル）の特性（「パターン生成特性」）は、パターンを生成するために開示された方法で使用される特性のみである。
所定パターンは、多次元シグナルのいかなる特徴、特質、特性なども含むことができる。パターンは概して、特徴、特質、特性などの差を含む。特に、パターンは、たとえば、特定の、反復可能な、特有の、予測される、または一貫した特徴、特質、特性などの差を含むことができる。たとえば、パターンは２つ以上の多次元シグナル間の特定質量電荷比の差であってもよい。概して、パターンは、特徴、特質、特性などの２つ以上の様々な独自性または値を含む。すなわち、パターンは概して、様々な多次元シグナルの特徴、特質、特性などの独自性または値間の差を含む。
【０３０７】
多次元シグナルの特徴、特質、特性などの所定パターンは、特徴、特質、特性などの独自性または値の有益なまたは所望の組み合わせから形成することができる。たとえば、特徴、特質、特性などのこれらの数の独自性または値の２、２つ以上の、３、３以上、４、４以上、５、５以上、６、６以上、７、７以上、８、８以上、９、９以上、１０、１０以上、１１、１１以上、１２１２、１２以上、１３、１３以上、１４、１４以上、１５、１５以上、１６、１６以上、１７、１７以上、１８、１８以上、１９、１９以上、２０、２０以上、２１、２１以上、２２、２２以上、２３、２３以上、２４、２４以上、２５、２５以上、２６、２６以上、２７、２７以上、２８、２８以上、２９、２９以上、３０、３０以上、３５、３５以上、４０、４０以上、４５、４５以上、５０、５０以上、５５、５５以上、６０、６０以上、６５、６５以上、７０、７０以上、７５、７５以上、８０、８０以上、８５、８５以上、９０、９０以上、９５、９５以上、１００、１００以上、または任意の組み合わせを、所定パターンとして使用することができる。
【０３０８】
様々な異なる特性は、多次元シグナルからのパターン、インジケータレベルの分析のためのパターン、または他の共通特性を欠く分子から多次元シグナル（たとえば、レポーターシグナルまたはインジケータシグナル）を分離する、あるいは多次元シグナル／検体結合体、断片結合体、多次元シグナル融合、多次元シグナル融合断片および／または多次元シグナルペプチドを分離するパターンを生成するために使用される物理的特性として使用可能である。たとえば、共通特性のパターンとして有効な非限定的物理的特性には、質量、電荷、等電点、疎水性、クロマトグラフィ特質、および密度などが含まれる。ある実施形態では、パターンを生成するために使用される物理的特性、あるいはセット内の多次元シグナル／検体結合体、断片結合体、多次元シグナル融合、多次元シグナル融合断片または多次元シグナルペプチドによって共有され（および、多次元シグナル／検体結合体断片結合体、多次元シグナル融合、多次元シグナル融合断片または多次元シグナルペプチドを区別または分離するのに使用される）物理的特性は、単なる特徴または部位（たとえば、ビオチンなどのアフィニティタグ）の存在ではなく、多次元シグナル、多次元シグナル／検体結合体、断片結合体、多次元シグナル融合、多次元シグナル融合断片および／または多次元シグナルペプチドの総合的特性（たとえば、総質量、総電荷、等電点、総疎水性など）である。上記特性は本明細書では「総合的」特性と称される（よって、セット内の多次元シグナル／検体結合体、断片結合体、多次元シグナル融合、多次元シグナル融合断片または多次元シグナルペプチドは、「共通の総合的特性」を共有すると称される）。多次元シグナル（たとえば、レポーターシグナルまたはインジケータシグナル）、多次元シグナル／検体結合体、断片結合体、多次元シグナル融合、多次元シグナル融合断片および／または多次元シグナルペプチドは、アフィニティタグなどの特徴および部位を有することができ、上記特徴および部位は（たとえば、質量に寄与することによって）総合的特性に寄与することができると理解すべきである。しかし、上記の限定的で孤立した特徴および部位は概して、総合的特性の唯一の根拠としての役目は果たさない。
【０３０９】
複数セットの多次元シグナル（たとえば、レポーターシグナルおよびインジケータシグナル）は任意数の多次元シグナルを有することができる。たとえば、複数セットの多次元シグナルは、１つ、２つ以上の、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、２００以上、３００以上、４００以上、または５００以上の異なる多次元シグナルを有することができる。特定数の多次元シグナルおよび多数の多次元シグナルの範囲の特定終点が列挙されているが、特定数の多次元シグナルの１つ１つおよび多数の多次元シグナルの範囲の特定終点の１つ１つが明確にリストアップされていないものの意図されており、特定数の多次元シグナルの１つ１つおよび多数野多次元シグナルの範囲の特定終点の１つ１つがこれにより具体的に記載されている。
【０３１０】
複数セットの多次元シグナルは、鎖またはポリマーから成る多次元シグナルから構成することができる。セットの多次元シグナルは、セットが１種類の多次元シグナルから成ること、あるいは多次元シグナルがホモ鎖またはホモポリマーから成ることを意味するホモセットであってもよい。セットの多次元シグナルは、セットが異なる多次元シグナルから成ること、あるいは多次元シグナルが様々な種類の鎖またはポリマーから成ることを意味するヘテロセットであってもよい。特別な種類のヘテロセットは、異なるホモ鎖またはホモポリマー、たとえば、１つのペプチド鎖と１つの核酸鎖から成るセットである。別の特別な種類のヘテロセットは、鎖自体がヘテロ鎖またはヘテロポリマーであるセットである。さらに別の種類のヘテロセットは、ヘテロ鎖／ヘテロポリマーとホモ鎖／ホモポリマーの両方からなるセットである。
開示された多次元シグナルは、検体またはタンパク質と関連付ける、検体またはタンパク質に組み込む、あるいはその他の方法で結合することができる。多次元シグナルと検体間、または多次元シグナルとタンパク質間の実質的な物理的関連が生じない場合、あるいは単独で、検体またはタンパク質が存在しない場合、多次元シグナルは検体またはタンパク質（たとえば、多次元シグナルおよび検体またはタンパク質の混合物内で）結合することもできる。
【０３１１】
多次元シグナルが検体またはタンパク質ともはや関連付けられていない場合、複数セットの多次元シグナルは、セット内の２つ以上の多次元シグナルがインジケータレベルの分析でパターンを生成する１つ以上の特性を有するときに使用可能である。さらに、レポーターシグナルが検体ともはや関連付けられていない場合、複数セットのレポーターシグナルは、セット内の２つ以上のレポーターシグナルが共通特性を有するレポーターシグナルを他の共通特性を欠く分子から区別および／または分離させることのできる１つ以上の共通特性を有する場合に使用可能である。多次元シグナルの検出は対応する検体またはタンパク質の存在を示す。
【０３１２】
多次元シグナルは好ましくは、その質量電荷比に基づき分子間の高感度な区別を可能にする質量分析を用いて検出される。開示された多次元シグナルは、無数の標識付けおよび／または検出技術において全般的な標識として使用することができる。
【０３１３】
いくつかの形式の多次元シグナル（たとえば、レポーターシグナルまたはインジケータシグナル）は１つ以上のアフィニティタグを含むことができる。上記アフィニティタグは、アフィニティタグに基づく、標識タンパク質、標識検体、多次元シグナル、多次元シグナル断片、または多次元シグナル融合の検出、分離、選別、またはその他の操作を可能とする。インジケータシグナルに関しては、上記アフィニティタグは、パターンを生成するために使用される１セットのインジケータシグナルの（特性の根拠ではなく）特性から、および特性に加えて分離される。むしろ、上記アフィニティタグは、パターン生成特性に基づきインジケータシグナルを分離するという手段ではなく、開示された方法の前またはその１部としてサンプルを操作可能にするという異なる目的に供する。レポーターシグナルに関しては、上記アフィニティタグは、レポーターシグナルの別の分子からの分離を可能にする１セットのレポーターシグナルの（共通特性の根拠ではなく）共通特性から、および共通特性に加えて分離される。むしろ、上記アフィニティタグは、共通特性に基づきレポーターシグナルを分離するという手段ではなく、開示された方法の前またはその１部としてサンプルを操作可能にするという異なる目的に供する。
【０３１４】
多次元シグナル（たとえば、レポーターシグナルまたはインジケータシグナル）は０、１、または２つ以上のアフィニティタグを有することができる。多次元シグナルが複数のアフィニティタグを有する場合、所与の多次元シグナル上のタグはすべて同じであっても、あるいは異なるアフィニティタグの組み合わせであってもよい。上述の、および本明細書の他の部分に記載される原則に従い、アフィニティタグはインジケータシグナル上で質量および／または電荷を差別的に変更するように使用し、レポータータグ上に質量および／または電荷を差別的に分布するように使用することもできる。アフィニティタグは、ＰＣＴ出願ＷＯ００／１１２０８に記載されるようにアフィニティ標識の使用と同様な方法で、多次元シグナルとともに使用することができる。
【０３１５】
ペプチド−ＤＮＡ結合体（Ｏｌｅｊｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２７（２３）：４６２６〜３１（１９９９））、ＰＮＡ−ＤＮＡ構築物の合成、およびＷＯ００／０４０３６の光解離性ユニバーサルヌクレオチドなどの特別なヌクレオチドは、開示された方法でインジケータシグナルとして使用することができる。有益な光解離性連結は、Ｍａｒｒｉｏｔｔ及びＯｔｔｌ、「ヘテロ二機能性光解離性交差結合試薬の合成と適用」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２９１：１５５〜７５（１９９８）にも記載されている。
【０３１６】
多次元シグナルを、多次元シグナルを付加される検体またはタンパク質（あるいは、他の仲介分子）から正確に制御して解放することができるため、光解離性結合および連結は多次元シグナルにおいて（および多次元シグナルとの使用に）有効である。様々な光解離性結合および連結が既知であり、インジケータシグナル内で、およびインジケータシグナルとともに使用されるように適合させることができる。近年、光解離性アミノ酸は市販されるようになっている。たとえば、Ｆｍｏｃ保護光解離性のわずかに修飾されたフェニルアラニン（Ｆｍｏｃ−Ｄ，Ｌ−β  Ｐｈｅ（２−ＮＯ２））が入手可能である（カタログナンバー００１１−Ｆ；Ｉｎｎｏｖａｃｈｅｍ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）。ニトロ基をフェニルアラニン環に導入することで、紫外光（約３５０ｎｍの波長で）の照射下でアミノ酸を断片化させる。窒素レーザは約３３７ｎｍで光を発し、断片化に使用することができる。使用される波長は、ペプチドの残りの部分に重大な損傷を及ぼさない。
【０３１７】
Ｆｍｏｃ合成はペプチド合成にとって一般的な技術であり、この技術を用いて、Ｆｍｏｃ−派生光解離性アミノ酸をペプチドに組み込むことができる。光解離性アミノ酸は任意の多次元シグナル内および多次元シグナルとともに使用可能であるが、ペプチド多次元シグナル（たとえば、ペプチドレポーターシグナルおよびペプチドインジケータシグナル）で特に有益である。
【０３１８】
多次元シグナルにおける、および多次元シグナルを伴う光解離性結合および連結の使用は、以下の例で説明することができる。空白のプラスチック製基板（たとえば、コンパクトディスク（ＣＤ））上の物質は、ＭＡＬＤＩソースイオントラップを用いてその表面から直接測定できる。たとえば、組織サンプルの薄い部分はフラッシュ冷凍されてＣＤ面に塗布することができる。多次元シグナル分子（たとえば、光解離性連結を介して多次元シグナルを付加された抗体）は、組織表面に塗布することができる。組織内で特定構成要素を認識することにより、抗体／多次元シグナル結合体の１部を関連付けることができる（余分な結合体は以後の洗浄ステップで除去される）。その後、多次元シグナルは紫外光を照射することにより抗体から解放し、ＭＡＬＤＩイオントラップ機器を用いて直接検出することができる。
【０３１９】
たとえば、配列ＣＦ＊ＸＸＸＸＸＤＰＸＸＸＸＸＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）（レポーターシグナルを含む）のペプチドは、ジスルフィド結合連結法を用いて抗体に付加することができる。ＭＡＬＤＩレーザのＵＶソースを照射すると、修飾されたフェニルアラニン、Ｆ＊でペプチドを切断し、ＸＸＸＸＸＤＰＸＸＸＸＸＲレポーターシグナル（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のアミノ酸３〜１５）を解放する。次に、レポーターシグナルは、本明細書の別の場所で説明されるように検出された、ＤＰ結合と電荷断片で断片化することができる。別の例では、配列ＣＦ＊ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）（インジケータシグナルを含む）のペプチドはジスルフィド結合連結法を用いて抗体に付加することができる。ＭＡＬＤＩレーザのＵＶソースを照射すると、修飾されたフェニルアラニン、Ｆ＊でペプチドを切断し、ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＲインジケータシグナル（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のアミノ酸３〜１５）を解放する。
【０３２０】
多次元シグナルを伴う光解離性連結の使用の別の例では、多次元シグナル分子として使用されるＤＮＡ−ペプチドキメラが含まれる。上記多次元シグナル分子は、特定の核酸配列を検出するプローブとして有効である。ＤＮＡ−ペプチドキメラ（あるいは、ＰＮＡ−ペプチドキメラ）では、ペプチド部分は多次元シグナルであってもよいし、多次元シグナルを含んでもよい。光解離性フェニルアラニンを、たとえば、ＤＮＡペプチドと多次元シグナル分子の接合部の近傍に配置すると、紫外光によって多次元シグナルを多次元シグナル分子から解放することができる。解放された多次元シグナルは直接検出する、あるいは本明細書の他の場所で記載されたように断片化し検出することができる。上述の抗体−ペプチド多次元シグナル分子の場合と同様に、ＤＮＡ−ペプチドキメラは、ＣＤなどの基板の表面に存在する核酸分子およびＭＡＬＤＩレーザのＵＶソースを用いて解放された多次元シグナルと関連付けることができる。
【０３２１】
様々な効果を実現するため、複数の光解離性結合および／または連結は、同一の多次元シグナルまたは多次元シグナル結合体（たとえば、多次元シグナル分子または多次元シグナル融合）内でまたはそれと一緒に使用することができる。たとえば、異なる波長の光によって切断される異なる光解離性連結は、該方法の様々なステージで切断される多次元シグナルまたは多次元シグナル結合体の様々な部分で使用することができる。様々な断片化波長のおかげで、たとえば、解放と断片化方法の組み合わせを可能にする順次処理を行うことができる。
【０３２２】
１例として、２つの光解離性アミノ酸、Ｚ（赤外線での切断波長）およびＦ＊（光解離性フェニルアラニン、紫外線での切断波長）を含むペプチドは、アミノ末端を既知の化学反応を利用して検体または他の分子に付加することができる形式ＸＺＸＸＸＸＸＸＦ＊ＸＸＸＸＸＸＲで構成可能である。その結果が、レポーターシグナル／検体結合体（もしくは、レポーター分子）、またはインジケータシグナル／検体結合体（もしくは、インジケータ分子）である。多次元シグナルは、適切な光の波長（この例では赤外線）を結合体に照射し、それによってＺでの結合を切断することによって、結合体から解放することができる。いったん親イオンが選択され、イオントラップに保管されたら、多次元シグナルは適切な光の波長（この例では紫外線）を照射することによって断片化され、検出および計量可能な娘イオン（ＸＸＸＸＸＸＲ＋）を作成する。
【０３２３】
多次元シグナル、レポーターシグナルおよび／またはインジケータシグナルとして使用可能な別の標識は、米国出願第２００４／００１８５６５号、２００３／０１０００１８号、２００３／００５０４５３号、２００４／００２３２７４号、２００２／０１４６７３号、２００３／００２２２２５号、および米国特許第６，３１２，８９３号、６，３１２，９０４号、６，６２９，０４０号、およびＧｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ３（８）：６７９〜６８８（１９９６））に記載され、それらはすべて本明細書に言及により組み込む。
【０３２４】
多次元シグナルは任意の適切な技術を用いて、任意の所望の検体、化合物、基板、またはその他の組成に付加、連結、または固定することができる。本明細書で使用されるように、分子は、直接的または間接的に共有結合されるときに連結される。間接的結合の１つの形式がリンカー分子を介するものである。多次元シグナルは任意の適切な結合反応によって、検体、化合物、基板、またはその他の組成に結合することができる。結合化合物のための多くの化学物質および技術は既知であり、多次元シグナルを検体に連結するために使用することができる。たとえば、結合は、チオール、エポキシド、チオール用ニトリル、ＮＨＳエステル、イソチオシアン、アミン用イソチオシアン酸塩、アミン、およびカルボン酸用アルコールを用いて実行することができる。別の例では、第一級アミンのアセチル化を介して連結可能なペプチド多次元シグナルが既知である（Ｗｅｔｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ１、１１４〜１２２（１９９０））。
Ｂ．レポーターシグナル
レポーターシグナル（レポーターシグナルペプチドとも呼ばれる）は、優先的に断片化され、分解され、反応され、誘導体化され、あるいは検出のために他の方法で修飾または変更される分子である。レポーターシグナル多次元シグナルの１つの形式である。
多次元シグナルおよびレポーターシグナルの特性を有する派生物ならびにその派生物への言及は、多次元シグナルのレポーターシグナルバージョンと同じとみなすことができる（および、この状況で、標識は入れ替えることができる）。修飾レポーターシグナルの検出は好ましくは、質量分析によって達成される。開示されたレポーターシグナルは好ましくは、セットのメンバーが同じ質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するセット内で使用される。これにより、質量電荷比に基づく、高感度なフィルタリングまたはレポーターシグナルの別の分子からの分離が簡易化される。レポーターシグナルは、レポーターシグナルの修飾と異なる修飾レポーターシグナルの識別を可能とする任意の構造を採ることができる。レポーターシグナルは好ましくは、少なくとも１つの優先的な結合の破壊が分子内で誘発されるように構成される。名目上同一の分子質量と任意に選択された内部断片化点を有する１セットのレポーターシグナルは、断片化後、セットの各メンバーが独自の相関関係を持つ娘断片を生むように構成させることができる。便宜上、断片化され、分解され、反応され、誘導体化され、あるいは検出のために他の方法で修飾されたレポーターシグナルは断片化レポーターシグナルと称される。好適なレポーターシグナルはタンデム質量分析で断片化することができる。
【０３２５】
レポーターシグナルは好ましくは、セット内のすべてのレポーターシグナルが類似の物理的特性を有するセット内で使用される。類似の（あるいは、共通の）特性によって、レポーターシグナルを１つ以上の特性を欠く別の分子から区別および／または分離することができる。好ましくは、セット内のレポーターシグナルは同じ質量電荷比（ｍ／ｚ）を有する。すなわち、セット内のレポーターシグナルは等圧にすることができる。これにより、質量電荷比に基づき、レポーターシグナル（および／またはレポーターシグナルが付加されるタンパク質または別の検体）を別の分子から正確に分離可能である。フィルタリングの結果、システムにとっての信号雑音比（Ｓ／Ｎ）は大幅に増大し、より高感度で正確な検出を可能にする。セットのレポーターシグナルは任意数のレポーターシグナルを有することができる。
【０３２６】
好適で一般的な総合特性は、サブユニット異性体の特性である。この特性は、１セットの少なくとも２つのレポーターシグナル（通常、サブユニットで構成されるサブユニット鎖で構成される、たとえば、ポリマーとポリマーを構成するユニット間の関係のように）がサブユニット異性体で構成されるときに生じ、セットはサブユニット異性体またはサブユニット用異性体と呼ぶことができる。サブユニットは本明細書のほかの場所で論じるが、レポーターシグナルは、ペプチドまたは核酸類またはポリマー（一般）などの任意の種類の鎖で構成し、それらは次にサブユニット、たとえば、アミノ酸とホスホヌクレオシド、およびｍｅｒ（一般）でそれぞれ構成することができる。それぞれの種類のサブユニット内には、通常、すべて同種のサブユニットだが異なる複数のメンバーがある。たとえば、サブユニットの種類の「アミノ酸」内には、多くのメンバー、たとえば、ａｌａ、ｔｙｒ、およびｓｅｒ、またはその他のアミノ酸の組み合わせがある。
【０３２７】
１セットのレポーターシグナルがサブユニット異性体である、あるいはサブユニット異性体で構成される場合、セットの個々がセット内のすべての他の個々のサブユニットのサブユニット異性体であることを意味する。異性体とは、サブユニット鎖を形成するサブユニットの構成（すなわち、分布またはアレイ）は同じだが、鎖を形成するサブユニットの全体的な連結性が異なることを意味する。したがって、たとえば、第１のレポーターシグナルは鎖ａｌａ−ｓｅｒ−ｌｙｓ−ｇｌｎ、第２のレポーターシグナルは鎖ａｌａ−ｌｙｓ−ｓｅｒ−ｇｌｎ、および第３のレポーターシグナルは鎖ａｌａ−ｓｅｒ−ｌｙｓ−ｐｒｏであってもよい。１セットのレポーターシグナルが第１のレポーターシグナルおよび第２のレポーターシグナルを含んで作成される場合、第１のレポーターシグナルと第２のレポーターシグナルは同一の構成を有する、すなわち、それぞれが１つのａｌａ、１つのｓｅｒ、１つのｌｙｓ、および１つのｇｌｎを有するが、各鎖は異なる連結性を有するため、セットはサブユニット異性体となる。しかしながら、セットのレポーターシグナルが第１、第２、および第３のレポーターシグナルを含んで作成される場合、各鎖の構成は同一ではなく、第１及び第２の鎖はｐｒｏを有しておらず、第３の鎖はｇｉｎを有していないためセットは異性体とはならない。
【０３２８】
もう１つの例は以下の通りである。第１のレポーターシグナルは鎖ａｌａ−グアノシン−ｌｙｓ−アデノシン、第２のレポーターシグナルは鎖ａｌａ−アデノシン−ｌｙｓ−グアノシン、および第３のレポーターシグナルは鎖ａｌａ−ｓｅｒ−ｌｙｓ−ｐｒｏであってもよい。１セットのレポーターシグナルが第１のレポーターシグナルおよび第２のレポーターシグナルを含んで作成される場合、第１のレポーターシグナルと第２のレポーターシグナルは同一の構成を有する、すなわち、それぞれが１つのａｌａ、１つのグアノシン、１つのｌｙｓ、及び、１つのアデノシンを有するが、各鎖は異なる連結性を有するため、セットはサブユニット異性体となる。しかしながら、セットのレポーターシグナルが第１、第２、および第３のレポーターシグナルを含んで作成される場合、各鎖の構成は同一ではなく、第１及び第２の鎖はｐｒｏまたはｓｅｒを有しておらず、第３の鎖はグアノシンまたはアデノシンを有していないためセットは異性体とはならない。この例が示すように、セットはヘテロ鎖で構成する、あるいは含むことができ、依然としてサブユニット異性体とみなされる。
【０３２９】
セット内のレポーターシグナルは、断片化され、分解され、反応され、誘導体化され、あるいはセット内の異なるレポーターシグナルを区別するように他の方法で修飾または変更されることができる。好ましくは、レポーターシグナルは、電荷は同様だが質量の異なる断片を生むように断片化される。レポーターシグナルは異なる電荷および質量の断片を生むように、断片化することもできる。上記変更によって、セット内の各レポーターシグナルを、レポーターシグナルの断片の異なる質量電荷比によって区別することができる。これが可能なのは、セット内の非断片化レポーターシグナルは等圧にできるが、異なるレポーターシグナルの断片は非等圧だからである。したがって、開示されたレポーターシグナルの主要な特徴は、レポーターシグナルが同様の特性を有する一方で、修飾レポーターシグナルは区別可能なことである。
【０３３０】
レポーターシグナルの断片における差別的質量分布は様々な方法で達成可能である。たとえば、同一の公称構造のレポーターシグナル（たとえば、同一のアミノ酸配列を有するペプチド）、重水素（２Ｈ）、三重水素（３Ｈ）１７Ｏ、１８Ｏ、１３Ｃ、または１４Ｃなどの異なる分布の重同位体で作成することができる；安定的な同位体が好ましい。セット内のすべてのレポーターシグナルは同数の所与の重同位体を有するが、これらの分布は様々なレポーターシグナルによって異なる。上記１セットのレポーターシグナルの例は、Ａ＊Ｇ＊ＳＬＤＰＡＧＳＬＲ、Ａ＊ＧＳＬＤＰＡＧ＊ＳＬＲ、およびＡＧＳＬＤＰＡ＊Ｇ＊ＳＬＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）であり、アスタリスクはアミノ酸を置換した少なくとも１つの重同位体を示す。単電荷親イオンと、切断ＤＰ結合での断片化後、１つの一次電荷娘イオンに関しては、３つの区別可能な一次娘イオン、ＰＡＧＳＬＲ＋、ＰＡＧ＊ＳＬＲ＋、ＰＡ＊Ｇ＊ＳＬＲ＋（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸６〜１１）がある。
【０３３１】
同様に、同一の一般構造のレポーターシグナル（たとえば、同一のアミノ酸配列を有するペプチド）は、メチル化、リン酸化、硫酸化などの修飾または置換基の異なる分布、およびメチオニンのためのセレノ−メチオニンの使用で作成することができる。セット内のすべてのレポーターシグナルは同数の所与の修飾を有するが、これらの分布は様々なレポーターシグナルによって異なる。上記１セットのレポーターシグナルの例は、ＡＧＳ＊Ｍ＊ＬＤＰＡＧＳＭＬＲ、ＡＧＳ＊ＭＬＤＰＡＧＳＭ＊ＬＲ，およびＡＧＳ＊ＭＬＤＰＡＧＳ＊Ｍ＊ＬＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）であり、Ｓ＊はセリンではなくホスホセリン、Ｍ＊はメチオニンでなくセレノ−メチオニンを示す。単電荷親イオンと、切断ＤＰ結合での断片化後、１つの一次電荷娘イオンに関しては、３つの区別可能な一次娘イオン、ＰＡＧＳＭＬＲ＋、ＰＡＧＳＭ＊ＬＲ＋、ＰＡＧＳ＊Ｍ＊ＬＲ＋（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸７−１３）がある。
【０３３２】
同一の公称組成のレポーターシグナル（たとえば、同一のアミノ酸類で構成）は、異なる配列のサブユニットまたは構成要素のレポーターシグナルで作成することができる。セット内のすべてのレポーターシグナルは同数のサブユニットまたは構成要素を有するが、これらの分布は様々なレポーターシグナルによって異なる。上記１セットのレポーターシグナルの例は、ＡＧＳＬＡＤＰＧＳＬＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＡＬＳＬＡＤＰＧＳＧＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ＡＬＳＬＧＤＰＡＳＧＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）である。単電荷親イオンと、切断ＤＰ結合での断片化後、１つの一次電荷娘イオンに関しては、３つの区別可能な一次娘イオン、ＰＧＳＬＲ＋（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸７〜１１）、ＰＧＳＧＲ＋（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸７〜１１）、ＰＡＳＧＲ＋（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸７〜１１）がある。
【０３３３】
同一の公称組成を有するレポーターシグナル（たとえば、同一のアミノ酸類で構成）は、レポーターシグナルの様々な位置で不安定または切断結合で作成することができる。セット内のすべてのレポーターシグナルは同数および同次のサブユニットまたは構成要素を有する。不安定または切断結合が特定のサブユニットまたは構成要素間に存在する場合、レポーターシグナル内のサブユニットまたは構成要素の配列は、不安定または切断結合を形成するサブユニットまたは構成要素を除けば同じであってもよい。レポーターシグナル融合で使用されるレポーターシグナルペプチドは好ましくは、この形式の差別的な質量分布を使用する。上記１セットのレポーターシグナルの例は、ＡＧＳＬＡＤＰＧＳＬＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＡＧＳＤＰＬＡＧＳＬＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＡＤＰＧＳＬＡＧＳＬＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）である。単電荷親イオンと、切断ＤＰ結合での断片化後、１つの一次電荷娘イオンに関しては、３つの区別可能な一次娘イオン、ＰＧＳＬＲ＋（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸７〜１１）、ＰＬＡＧＳＬＲ＋（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のアミノ酸５〜１１）、ＰＧＳＬＡＧＳＬＲ＋（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸３〜１１）がある。
【０３３４】
これらの各モードは、レポーターシグナルの断片の差別的な質量分布を生成するために、１つ以上の他のモードと組み合わせることができる。たとえば、異なる分布の重同位体を、不安定または切断結合が異なる位置で成されるレポーターシグナルにおいて使用することができる。異なる質量分布は他の方法で達成可能である。たとえば、レポーターシグナルは、様々な修飾を異なる位置で導入させることができる。有効な修飾の例は、メチオニン、硫酸化ではなく、アセチル化、メチル化、リン酸化、セレノ−メチオニンである。同様の原理は、レポーターシグナルで電荷を差別的に分布するために使用することができる。質量および電荷の差別的分布は、複数セットのレポーターシグナルで一緒に使用することができる。
レポーターシグナルは、切断結合と不安定結合の組み合わせを含むこともできる。これにより、区別可能なシグナルの組み合わせを増やす、あるいは検出を簡易化することができる。たとえば、不安定結合は等圧断片を解放するのに使用することができ、切断結合はタンパク質を解読するのに使用することができる。
【０３３５】
セレン置換はレポーターシグナルの質量を変更するのに使用することができる。セレンはメチオニン内で硫黄と置換し、修飾アミノ酸セレノメチオニンを生じることができる。セレンは、硫黄よりも大きい約４７質量単位である。質量分析は、セレノメチオニンとメチオニンを特定の比率で組み込むペプチドまたはタンパク質を識別するのに使用することができる。既知のセレン／硫黄比を有する小さなタンパク質およびペプチドは好ましくは、セレノメチオニンとメチオニンを所望の比率で組み入れる化学合成によって作成される。大きなタンパク質またはペプチドは、セレノメチオニンとメチオニンを所望の比率で挿入する大腸菌発現系、またはその他の発現システムから作成することができる（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、「多波長異常回析（ＭＡＤ）によって分析用に作成されるセレノメチオニンタンパク質：３次元構造の直接判定手段」Ｅｍｂｏ  Ｊ、９（５）：１６６５〜７２（１９９０）、ＣｏｗｉｅおよびＣｏｈｅｎ、「硫黄の代わりにセレンを含む活性変更タンパク質の大腸菌による生合成」、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、２６：２５２〜２６１（１９５７）、およびＯｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．、「メタロセレノネイン、メタロチオネインのセレンアナログ：銅イオンとの複合体の合成および特徴」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８８（８）：３０５７〜９（１９９１）。
【０３３６】
上述したように、レポーターシグナルは、レポーターシグナルをレポーターシグナルが付加される検体またはタンパク質（あるいは、その他の仲介分子）から正確に制御して解放させる光解離性連結を含むことができる。光解離性連結は、レポーターシグナルに組み込んで、開示された方法でレポーターシグナルの断片化のために使用することもできる。たとえば、光解離性アミノ酸（光解離性フェニルアラニンなど）はペプチドレポーターシグナルの所望位置に組み込むことができる。光解離性フェニルアラニン（Ｆ＊）を含むＸＸＸＸＸＸＦ＊ＸＸＸＸＸＲなどのレポーターシグナルは光解離性である。その後、レポーターシグナルは適切な波長の光と検出された電荷断片を用いて断片化することができる。検出のためにレポーターシグナル（たとえば、表面から）をイオン化する際、重大な光解離（たとえば、２．９４μｍでＥｒ：ＹＡＧ）を引き起こさないＭＡＬＤＩレーザはイオン化のために使用することができ、第２のレーザ（たとえば、３３７ｎｍで窒素）はレポーターシグナルを断片化するのに使用することができる。この場合、ＸＸＸＸＸＸＦＸＸＸＸＸＲ＋は光解離されてＸＸＸＸＸＲ＋を生む。第２のレーザはレポーターシグナルイオンパケットと任意の位置で交差することができる。この目的での質量分析計の真空システムの改良は単純である。
【０３３７】
レポーターシグナルにおける光解離性連結の使用は、レポーターシグナルが付加される検体またはタンパク質（あるいは、その他の構成要素）が衝突細胞内の切断結合断片化可能であるとき特に有効である。たとえば、レポーターシグナル融合において、タンパク質断片／レポーターシグナルポリペプチドは、タンパク質断片部分とレポーターシグナル部分の両方での切断結合を含むように生成することができる。１例はＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＰＸＸＸ（ＸＸＸＸＸＸＸＤＰＸＸＸＸＸＸＸＲ）ＸＸＸＸ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）で、括弧内の配列は、レポーターシグナル部分とＤＰジペプチドが切断結合を含み、Ｘが任意のアミノ酸であることを示す。衝突細胞内のこのポリペプチドを断片化すると、ＤＰ結合の一方または両方で断片化が生じることによって、断片スペクトルが複雑化される。レポーターシグナル部分における光解離性連結（たとえば、光解離性アミノ酸）の使用は、分析中のレポーターシグナルの特定の光解離を可能にする。たとえば、類似のポリペプチドＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＰＸＸＸ（ＸＸＸＸＸＸＸＦ＊ＸＸＸＸＸＸＸＲ）ＸＸＸＸ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）はレポーターシグナルのＦ＊位置の特定光解離を可能にする。
【０３３８】
レポーターシグナルキャリブレータは、レポーターシグナル較正での使用によって特徴付けられる特別な形式のレポーターシグナルである。レポーターシグナルキャリブレータは上記および本明細書の他の部分に記載されるように、任意の形式のレポーターシグナルであってもよいが、評価される検体またはタンパク質とは物理的に関連付けられない別個の分子として使用される。したがって、レポーターシグナルキャリブレータは、検体またはタンパク質との結合のための反応性基を有する必要がなく（好ましくは有さず）、レポーターシグナルと関連付けられるとして本明細書に記載される特定結合分子または別の分子または構成要素と関連付けられる必要はない（好ましくは関連付けられない）。
【０３３９】
レポーターシグナルキャリブレータは好ましくは、１つ以上の検体と１つ以上の共通特性を共有する。１つ以上の共通特性を共有するレポーターシグナルキャリブレータおよび検体は、レポーターシグナルキャリブレータ／検体セットと称される。１つのみの検体と１つのレポーターシグナルキャリブレータが共通特性を共有する場合、それらはレポーターシグナルキャリブレータ／検体対と称することもできる。レポーターシグナルキャリブレータ／検体セット内のレポーターシグナルキャリブレータおよび検体は合致していると言われる。共通特性により、レポーターシグナルキャリブレータおよびその合致する検体を１つ以上の特性を欠く別の分子から区別および／または分離することができる。好ましくは、セット内のレポーターシグナルキャリブレータおよび検体は同じ質量電荷比（ｍ／ｚ）を有する。すなわち、セット内の合致するレポーターシグナルキャリブレータおよび検体は等圧であってもよい。これにより、質量電荷比に基づき、レポーターシグナルキャリブレータおよび検体を他の分子から正確に分離することができる。レポーターシグナルキャリブレータは、変更されたレポーターシグナルキャリブレータを合致する検体から区別するために、断片化し、分解し、反応させ、誘導体化し、あるいは他の方法で修飾する、あるいは変更することができる。検体も断片化することができる。レポーターシグナルキャリブレータは電荷は同様だが質量の異なる断片を生むように断片化される、あるいは異なる電荷および質量の断片を生むように断片化することができる。上記変更により、レポーターシグナルキャリブレータ（および、もしあれば、同一のセットのメンバーである別の検体および／またはレポーターシグナルキャリブレータ）をレポーターシグナルキャリブレータの断片の異なる質量電荷比によって合致する検体から区別することができる。セット内の非断片化レポーターシグナルキャリブレータおよび検体は等圧だが、レポーターシグナルキャリブレータの断片は等圧でないため、これが可能である。したがって、開示されたレポーターシグナルキャリブレータの主要な特徴は、レポーターシグナルキャリブレータが合致する検体と類似の特性を有し、修飾レポーターシグナルキャリブレータが合致する検体から区別可能なことである。
【０３４０】
レポーターシグナルキャリブレータとともに使用される好適な検体は、タンパク質、ペプチド、および／または  タンパク質断片（便宜上、まとめてタンパク質と称する）である。１つ以上の共通特性を共有するレポーターシグナルキャリブレータとタンパク質はレポーターシグナルキャリブレータ／タンパク質セットと称される。１つのみのタンパク質と１つのレポーターシグナルキャリブレータが共通特性を共有するとき、それらはレポーターシグナルキャリブレータ／タンパク質対とも称される。レポーターシグナルキャリブレータ／検体セット内のレポーターシグナルキャリブレータおよびタンパク質は、合致していると言われる。
【０３４１】
本明細書の別の場所で説明したように、レポーターシグナルキャリブレータは、サンプル内の検体を存在および量を評価する基準として使用することができる。この目的で、評価される各検体用に設計されるレポーターシグナルキャリブレータは、分析されるサンプルと混合することができる。次に、検体と合致するレポーターシグナルキャリブレータは一緒に処理され、（好ましくは変更された形式で）検体およびレポーターシグナルキャリブレータの両方を検出する。検出されたレポーターシグナルキャリブレータまたは変更されたレポーターシグナルキャリブレータの量は、（追加されたレポーターシグナルキャリブレータの量は既知であるため）検出された検体または変更された検体のいずれの量を比較することができるか基準を提供する。これにより、サンプルに存在する検体の量を正確に測量することができる。
【０３４２】
ｉ−ＰＲＯＴ標識は開示された組成および方法において、多次元シグナルおよびレポーターシグナルとして使用することができる。ｉ−ＰＲＯＴシステムおよび標識はレポーターシグナルと称され、米国出願第２００３／０１９４７１７号、米国出願第２００４／０２２０４１２号、米国出願第２００３／０１２４５９５号、および米国特許第６，８２４，９８１号に記載されており、レポーターシグナルの説明と標識付けおよび検出のためのレポーターシグナルの使用のためにそのすべてを言及により本明細書に組み込む。ｉ−ＰＲＯＴシステムでは、レポーターシグナルはタンパク質などの検体に任意の方法で付加することができる。
ｉ−ＰＲＯＴシステムでは、レポーターシグナルは好ましくは、電荷は同様だが質量の異なる断片を生むように断片化される。これにより、セット内の各標識検体（および／または  各レポーターシグナル）をレポーターシグナルの断片の異なる質量電荷比によって区別することができる。セット内の非断片化レポーターシグナルは等圧だが、異なるレポーターシグナルの断片は等圧でないため、これが可能である。
【０３４３】
ｉ−ＰＲＯＴシステムでは、レポーターシグナルは、セット内のすべてのレポーターシグナルが同様の特性（たとえば、同様の質量電荷比）を有するセット内で使用することができる。同様の特性によって、レポーターシグナルを１つ以上の特性を欠く別の分子から区別および／または分離することができる。好ましくは、セット内のレポーターシグナル  は同じ質量電荷比（ｍ／ｚ）を有する。すなわち、セット内のレポーターシグナルは等圧である。
【０３４４】
ｉＴＲＡＱ標識は開示された組成および方法において、多次元シグナルおよびレポーターシグナルとして使用することができる。ｉＴＲＡＱシステムおよび標識は米国出願第２００４／０２２０４１２号、およびＰＣＴ出願第ＷＯ２００４／０７０３５２号に記載されており、ｉＴＲＡＱ標識の説明と標識付けおよび検出のためのｉＴＲＡＱ標識の使用のために両者を本明細書に組み込む。ｉＴＲＡＱは、消化混合物内のペプチドのＮ−末端およびリシン側鎖に等圧質量標識を置く、計量タンパク質分析のための多重化セットの試薬を用いる標識付けシステムである。すべての誘導体化されたペプチドが等圧であり、クロマトグラフ的に区別不能となるが、多重セットの個々のメンバーを識別し計量するのに使用可能なＣＩＤ後にシグニチャまたはレポーターイオンを生じるように、試薬は差別的に同位体標識付けされる。したがって、ｉＴＲＡＱ標識は１種のレポーターシグナルである。ｉＴＲＡＱ標識は、最大４つの異なる生体サンプル内のすべてのペプチドを同時に標識付けできることによって、ＭＳ／ＭＳスペクトルからの相対的および絶対的計量を可能にするアミノ特異性の安定的な同位体試薬である。ｉＴＲＡＱシステムでは、レポーターは、検体がＮ−アルキル酢酸部位のカルボニル炭素を介して結合される置換または非置換酢酸部位でＮ−アルキル化される環窒素原子を具備する５、６または７員ヘテロ環であってもよく、異なる標識はそれぞれ１つ以上の重原子同位体を具備する。ヘテロ環は置換されても未置換であってもよい。ヘテロ環は脂肪族または芳香族である。ヘテロ環部位の可能な置換基はアルキル基、アルコキシ基、およびアリル基である。置換基は、支持する検体を結合するのに適したアミン基、ヒドロキシル基、またはチオール基などの保護基または未保護基を具備することができる。ヘテロ環は、１つ以上の窒素、酸素、または硫黄原子などの追加へテロ原子を具備することができる。
【０３４５】
ｉＴＲＡＱ標識付けの多重誘導体化化学反応の例の構成要素を図６および７に示す。Ｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、ＭＣＰ  Ｐａｐｅｒ  ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ  Ｍ４００１２９−ＭＣＰ２００（２００４年９月２８日）に記載されるように、６つのタンパク質の還元アルキル化消化混合物は、４つの同一のアリコートに分割される。Ｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．は、ｉＴＲＡＱ標識の説明と標識付けおよび検出のためのｉＴＲＡＱ標識の使用に関して、本明細書に言及により取り込む。次に、それぞれが４つの同位体標識タグのうちの１つで標識付けされ、様々な割合で混合物に結合される消化物に誘導体化される。多重等圧タグは１１４．１、１１５．１、１１６．１、１１７．１ｍ／ｚで豊富なＭＳ／ＭＳシグニチャイオンを作成し、これらのピークの相対面積は標識ペプチドの割合に対応する。
【０３４６】
ｉＴＲＡＱのこの例の各シグニチャイオンの同位体濃縮によって課せられる質量シフトは、４つのタグのそれぞれの総質量が同一になるように、派生物のカルボニル構成要素で同位体濃縮と均衡させる。したがって、４つのタグのそれぞれで標識付けられた所与のペプチドは同一の整数質量を有し、質量差標識付けを超える感度増強を提供する。等圧ペプチドでは、所与のペプチド質量でのＭＳイオン電流は、混合物内のすべてのサンプルからのイオン電流の和であるため、ＭＳ前駆シグナルの分割および２つ以上のサンプルを組み合わせることによるスペクトルの複雑化は生じない（図６、図７）。ペプチド主鎖断片イオンはすべて等圧であるため等圧、感度増強はＭＳ／ＭＳスペクトルに繰り越される（図７）。
【０３４７】
図６ではｉＴＲＡＱ多重等圧標識付け化学反応の構造図が示される。図６Ａは、レポーター基（Ｎ−メチルピペラジンを基本とする）と質量バランス基（カルボニル）およびペプチド反応性基（ＮＨＳエステル）とから成る完全な分子を示す。レポーターの総質量と分子のバランス構成要素は１３Ｃおよび１８０原子の異なる同位体濃縮を用いて一定に維持され、重水素置換を含む濃縮に見られるクロマトグラフ分離が抱える問題を回避する。４つの試薬の合わせた質量が一定になるように（１４５．１ダルトン）、レポーター基の質量は１１４．１〜１１７．１ｍ／ｚ、バランス基の質量は２８〜３１ダルトンの範囲をとる。図６Ｂは、タグがペプチドと反応し、ペプチドアミン（リシンのＮ−末端またはエプシロンアミノ基）へのアミド連結を形成するときの構造を示す。衝突誘導性解離（ＣＩＤ）を受ける際、これらのアミド連結断片は主鎖ペプチド結合と同様の方法で破断する。しかしながら、タグアミド結合の断片化後、バランス（カルボニル）部位は失われ（中性損失）、電荷はレポーター基断片によって保持される。図６Ｃは４つの異なるレポーター基の質量（左）との４つの等圧の組み合わせに至るために使用される同位体タグ付けを示す。多重セットのうち１つのメンバーでそれぞれ標識付けされる４つの同一ペプチドの混合物は、ＭＳ内の単独の未分割前駆イオンとして現れる（同一ｍ／ｚ；中央）。衝突誘導性解離（ＣＩＤ）後、４つのレポーター基イオンは別々の質量として現れる（１１４〜１１７ダルトン；右）。その他すべての配列−情報断片イオン（ｂ−、ｙ−など）は等圧を維持し、それらの個々のイオン電流シグナル（シグナル強度）は付加的である。これは、Ｎ−末端とリシン側鎖の両方で標識付けされるトリプシンペプチドとトリプシンとの不完全な切断による内部リシン残留物を含むペプチドに関するケースにも当てはまる。よって、ペプチドの相対濃度は、対応するレポーターイオンの相対強度から推定される。計量は、ＭＳではなくＭＳ／ＭＳステージで実行される。
【０３４８】
図７では、４つの等圧試薬のそれぞれで４つの別個の消化物を標識付けし、１：１：１：１の比で反応混合物を組み合わせることにより作製されたタンパク質消化混合物からのペプチドＴＰＨＰＡＬＴＥＡＫのＭＳ／ＭＳスペクトルの例が示される。前駆体の同位体分布（［Ｍ＋Ｈ］＋、１３５２．８４ｍ／ｚ）はｉ）に示される。中央に示されるスペクトルの枠内の構成要素が最下部に示される。ｉｉ）には定量化に使用されるシグニチャイオンを示す低質量領域、ｉｉｉ）にはｂ６断片の同位体分布、ｉｖ）にはＹ７断片の同位体分布が示される。ペプチドは、Ｎ−末端およびＣ−末端リシン側鎖の両方で等圧タグにより標識付けされる。したがって、前駆イオンおよび内部断片イオン（たとえば、タイプｂ−およびタイプｙ−）のすべては、タグセット内の４つのメンバーをすべて含むが、等圧なままである。示される例は、４７００ＭＡＬＤＩＴＯＦ−ＴＯＦ分析器を用いて単一電荷［Ｍ＋Ｈ］＋ペプチドから得られるスペクトルであるが、同じことがＥＳＩ−ソース質量分析計で分析されるあらゆる複数電荷ペプチドにも当てはまる。
【０３４９】
ＴＭＴ標識は、開示された組成および方法で多次元シグナルおよびレポーターシグナルとして使用することができる。ＴＭＴシステムは、米国出願第２００３／０１９４７１７号に記載されており、ＴＭＴ標識の説明と標識付けおよび検出のためのＴＭＴ標識の使用のために言及により本明細書に組み込む。ＴＭＴ、すなわち、タンデム質量タグはタンデム質量分析において個々の断片化パターンを有する化学的な質量タグである。ＴＭＴ標識は、開示された組成および方法で多次元シグナルおよびレポーターシグナルとして使用することができる。各ＴＭＴは直列で、質量レポーター基（Ｍ）または（Ｍ’）、プロ−断片化リンカー基（Ｆ）、質量正規化基（Ｎ）または（Ｎ’）およびアミン反応性基（Ｍ−Ｆ−Ｎ−（Ｒ）第１のタグ；およびＭ’−Ｆ−Ｎ’−（Ｒ）第２のタグ）を具備する。一連のすべてのメンバーは、クロマトグラフィおよび質量分析中の共溶出を確保する同一の総質量および物理的化学特性を有する。標識ペプチドがタンデムＭＳイオンビームに入ると、ＴＭＴ’のプロ−断片化エレメントは解放されて独自の質量対電荷シグナルを生じる。
Ｃ．インジケータシグナル
インジケータシグナルは、インジケータシグナルを別の多次元シグナルから区別および／または分離させることのできる少なくとも１つの特徴を有する分子である。概して、インジケータシグナルは、同じレベルの分析に存在する別の多次元シグナルから区別可能および／または分離可能でありさえすればよい。インジケータシグナルは、セット内で使用することができる。したがって、たとえば、  いくつかの特性または特徴で異なる１セットのインジケータシグナルは、異なるサンプルおよび／または検体を標識付けするのに使用することができる。インジケータシグナルの形式によっては、認識可能なパターンが多次元シグナルの分析中に結果的に生じるように、特徴は、同じ検定または検定システムで使用されるレポーターシグナルおよび／または別の多次元シグナルの特徴と両立可能に選択される。たとえば、インジケータシグナルまたは複数セットのインジケータシグナルは、レポーターシグナルの質量（あるいは、質量電荷比）と異なる質量（あるいは、質量電荷比）を有し、複数セットのレポーターシグナルは同じ検定で使用され、質量分析における質量（あるいは、質量電荷比）の特有のパターンを生成することができる。
【０３５０】
開示されたインジケータシグナルは好ましくは、セットのメンバーが異なる質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するセットで使用される。このような形式では、インジケータシグナルは、同一の検定で使用されるレポーターシグナルなどの別の多次元シグナルと異なる質量電荷比を有することが好ましい。これにより、質量電荷比に基づき、インジケータシグナルを互いにおよび別の多次元シグナルと高感度に区別しやすくなる。インジケータシグナルは、開示された方法の分析において別の多次元シグナルとともにパターンを生成できる任意の構造を採ることができる。
【０３５１】
インジケータシグナルは好ましくは、セット内のすべてのインジケータシグナルが異なる物理的特性を有するセットで使用される。異なる（あるいは、特徴的な）特性によって、インジケータシグナルを１つ以上の特性で異なる別の多次元シグナルから区別および／または分離することができる。好ましくは、セット内のインジケータシグナルは異なる質量電荷比（ｍ／ｚ）を有する。すなわち、セット内のインジケータシグナルは非等圧である。このため、インジケータシグナル（および／またはインジケータシグナルが付加されるタンパク質または別の検体）を質量電荷比に基づき別の分子から正確に分離し、相互におよび別の多次元シグナルと質量パターンを生成することができる。複数セットのインジケータシグナルは任意数のインジケータシグナルを有することができる。
【０３５２】
セット内のインジケータシグナルはサブユニット異性体であってもよいが、好ましくはそうではない。しかし、インジケータシグナルは、他のセットのメンバーの部分に対してサブユニット異性体である部分と、他のセットのメンバーの部分に対してサブユニット異性体でない部分とを有することができる。インジケータシグナルの非サブユニット異性体部分はセットのメンバー間の特性の差を根拠として役割を果たすことができる。したがって、たとえば、第１のインジケータシグナルは鎖ｔｒｐ−ａｌａ−ｓｅｒ−ｌｙｓ−ｇｌｎ、第２のインジケータシグナルは鎖ｐｒｏ−ａｌａ−ｌｙｓ−ｓｅｒ−ｇｌｎ、および第３のインジケータシグナルは鎖ｌｅｕ−ｓｅｒ−ａｌａ−ｌｙｓ−ｐｒｏであってもよい。第１のインジケータシグナルおよび第２のインジケータシグナルはそれぞれサブユニット異性体である部分（ａｌａ−ｓｅｒ−ｌｙｓ−ｇｌｎまたはａｌａ−ｌｙｓ−ｓｅｒ−ｇｌｎ）とサブユニット異性体でない部分（ｔｒｐまたはｌｅｕ）を有する。第３のインジケータシグナルは、このサブユニット異性体部分を共有しない。しかし、３つのどのインジケータシグナルもサブユニット異性体部分（ａｌａ−ｓｅｒ−ｌｙｓ、ａｌａ−ｌｙｓ−ｓｅｒまたはｓｅｒ−ａｌａ−ｌｙｓ）を有する。
【０３５３】
セレン置換はインジケータシグナルの質量を変更するのに使用することができる。セレンはメチオニン内で硫黄と置換し、修飾アミノ酸セレノメチオニンを生じることができる。セレンは、硫黄よりも大きい約４７質量単位である。質量分析は、セレノメチオニンとメチオニンを特定の比率で組み込むペプチドまたはタンパク質を識別するのに使用することができる。既知のセレン／硫黄比を有する小さなタンパク質およびペプチドは好ましくは、セレノメチオニンとメチオニンを所望の比率で組み入れる化学合成によって作成される。大きなタンパク質またはペプチドは、セレノメチオニンとメチオニンを所望の比率で挿入する大腸菌発現系、またはその他の発現システムから作成することができる（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、「多波長異常回析（ＭＡＤ）によって分析用に作成されるセレノメチオニンタンパク質：３次元構造の直接判定手段」Ｅｍｂｏ  Ｊ、９（５）：１６６５〜７２（１９９０）、ＣｏｗｉｅおよびＣｏｈｅｎ、「硫黄の代わりにセレンを含む活性変更タンパク質の大腸菌による生合成」、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、２６：２５２〜２６１（１９５７）、およびＯｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．、「メタロセレノネイン、メタロチオネインのセレンアナログ：銅イオンとの複合体の合成および特徴」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８８（８）：３０５７〜９（１９９１））。
【０３５４】
インジケータシグナルキャリブレータは、レポーターシグナル較正での使用によって特徴付けられる特別な形式のインジケータシグナルである。インジケータシグナルキャリブレータは、上記および本明細書の他の部分に記載されるような任意の形式のインジケータシグナルであってもよいが、評価される検体またはタンパク質と物理的に関連付けられない別個の分子として使用される。したがって、インジケータシグナルキャリブレータは、検体またはタンパク質との結合のための反応性基を有する必要がなく（好ましくは有さず）、インジケータシグナルと関連付けられるとして本明細書に記載される特定結合分子または別の分子または構成要素と関連付けられる必要はない（好ましくは関連付けられない）。インジケータシグナルキャリブレータは、一緒に使用されるときレポーターシグナルキャリブレータと所定パターンを生成する。レポーターシグナル較正では、レポーターシグナルキャリブレータは好ましくは１つ以上の検体と１つ以上の共通特性を共有し、インジケータシグナルキャリブレータは好ましくは共有しない。むしろ、インジケータシグナルキャリブレータは、レポーターシグナルキャリブレータとともにパターンを生成する役割を果たす。
【０３５５】
ＩＣＡＴ標識は開示された組成および方法において、多次元シグナルおよびインジケータシグナルとして使用することができる。ＩＣＡＴシステムおよび試薬（標識）はＰＣＴ出願第ＷＯ００／０１１２０８号に記載され、ＩＣＡＴシステムを使用する例はＰＣＴ出願第ＷＯ０２／０９０９２９号および米国出願第２００２／０１９２７２０号に見られ、各出願はＩＣＡＴ標識の説明および  標識付けおよび検出のためのＩＣＡＴ標識の使用に関して言及により本明細書に組み込む。ＩＣＡＴ標識は、対照サンプル対実験サンプルの消化物から得られるシステイン−含有トリプシンペプチドの安定的な同位体相対濃度の使用を介して親和性単離し計量するように設計される。ある実施形態では、ＩＣＡＴ試薬は９［１２Ｃ］または９［１３Ｃ］原子のいずれかを含むアルキルリンカーに隣接するを含むチオール−特定反応性基を有し、結果的に同一のトリプシンペプチドの対照バージョン対対応する実験バージョン間で９ダルトンの質量差が生じる。ＩＣＡＴ試薬内のアルキルリンカーは、システイン−含有トリプシンペプチドの迅速な親和性単離を可能にする（切断可能な）ビオチン基に接続される。
【０３５６】
質量欠損タグは開示された組成および方法で多次元シグナルおよびインジケータシグナルとして使用することができる。質量欠損タグとその使用は、米国出願第２００２／０１７２９６１号およびＨａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．「質量分析」３８：８０９〜８１６（２００３）に記載されており、質量欠損タグの説明と標識付けおよび検出のための質量欠損タグの使用のために両者を言及により本明細書に組み込む。質量欠損タグは、整数または略整数の質量差を有するイオン種の質量間に属する質量を有する質量分析イオン種を結果的に招くより大きな質量欠損を含むエレメントを使用する。よって、このような非整数質量を有する質量分析ピークは、標識付け種として識別され、他のピークと区別することができる。他の質量標識と同様、質量欠損タグで標識付けされる分子の特有の質量は、インジケータレベルの分析で使用される所定パターンに貢献することができる。
多次元シグナルおよび／またはインジケータシグナルとして使用可能なその他の標識は、米国出願第２００４／００１８５６５号、２００３／０１０００１８号、２００３／００５０４５３号、２００４／００２３２７４号、２００２／０１４６７３号、２００３／００２２２２５号、および米国特許第６，３１２，８９３号、６，３１２，９０４号、６，６２９，０４０号、およびＧｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３（８）：６７９〜６８８（１９９６））に記載されており、そのすべてが言及により組み込まれる。
Ｄ．検体およびタンパク質
開示された方法は、概して検出、測定および／または分析の対象として検体およびタンパク質を利用する。検体は、検出、測定、またはその他の方法で分析される分子または分子の一部である。「タンパク質」は検体の１種で、本発明によると、タンパク質、ペプチド、およびタンパク質またはペプチドの断片を含む。検体またはタンパク質は物理的に別々の分子である必要はないが、より大きな分子の１部であってもよい。検体は、生物学的分子、有機分子、化学物質、構成物、および開示された方法を適用できるその他の分子または構造を含む。異なる形式の開示された方法は他の形式の方法よりもいくつかの種類の検体にとって適切であることを理解すべきである。検体は標的分子とも称される。
【０３５７】
好適な検体は生物学的分子である。生物学的分子はタンパク質、ペプチド、酵素、アミノ酸修飾、タンパク質ドメイン、タンパク質モチーフ、核酸分子、核酸配列、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、代謝産物、炭水化物類、および核酸モチーフを含むがそれらに限定されない。本明細書で使用されるように、「生物学的分子」および「生体分子」は、分子あるいは生物組織を材料とする分子または多分子のアセンブリまたは組成の１部を指し、分子あるいは生物組織を材料とする分子または多分子のアセンブリまたは組成の１部に関連する。生体分子は、生物組織を材料とする分子に関連する完全に人工的な分子であってもよい。
Ｅ．サンプル
どのソースから得たどのサンプルも、開示された方法で使用することができる。概して、検体サンプルは、検体を含む、あるいは含むことのできるサンプルであるべきである。概して、タンパク質サンプルは、タンパク質分子を含む、あるいは含むことのできるサンプルであるべきである。適切な検体およびタンパク質サンプルの例は、細胞サンプル、組織サンプル、細胞抽出物、別のサンプルから精製された構成要素または断片、環境サンプル、バイオフィルムサンプル、培養サンプル、組織サンプル、体液、および細胞診サンプルである。その他多くのサンプルソースが既知であるか、あるいは開発されており、開示された方法とともに使用することができる。開示された方法で使用される好適なタンパク質サンプルは、細胞および組織のサンプルである。タンパク質サンプルは、複雑でも単純でもその間でもよい。たとえば、タンパク質サンプルはタンパク質の複合混合物（たとえば、組織サンプル）を含むことができ、タンパク質サンプルは高度に精製されたタンパク質製剤、または単独の種類のタンパク質であってもよい。同様に、検体サンプルは生物学的分子の複合混合物（たとえば、組織サンプル）を含むことができ、検体サンプルは高度に精製されたタンパク質製剤または単独の種類の分子であってもよい。
Ｆ．多次元分子
多次元分子（あるいは、多次元シグナル分子）は、多次元シグナルと特定結合分子または復号化タグを結合する分子である。好ましくは、多次元シグナルと特定結合分子または復号化タグは相互に共有結合される、あるいはつなげられる。本明細書で使用されるように、分子は直接的にまたは間接的に共有結合されるとき連結される。間接的な結合の１つの形式はリンカー分子を介するものである。多次元シグナルは、いくつかの確立された結合反応によって特定結合分子または復号化タグに連結させることができる。たとえば、Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２３（３）：５２２〜５２９（１９９５）はオリゴヌクレオチド類と抗体の適切な結合方法について記載している。レポーター分子は、レポーターシグナルと特定結合分子または復号化タグを結合する分子である。インジケータ分子は、インジケータシグナルと特定結合分子または復号化タグを結合する分子である。レポーター分子とインジケータ分子は多次元分子の形式である。
【０３５８】
１つの形式のレポーター分子は復号化タグとしてペプチド核酸を有し、多次元シグナルとして多次元シグナルペプチドを有する。ペプチド核酸は、たとえば、オリゴヌクレオチド符号化タグと関連付けることによって、多次元シグナルペプチドを符号化タグと関連付けることができる。本明細書の別の場所に記載されるように、符号化タグは標識検体と別の分子に対して使用することができる。
本明細書で使用されるように、ある分子の（あるいは、からの）ループが他の分子の（あるいは、からの）ループを通過するとき、分子は別の分子につなげられると言われる。２つの分子はつながれるとき共有結合されていない。ｍｕｇのハンドルの孔を通過する閉ループのストリングの類推によって、つなぎ鎖を視覚化することができる。概して、つなぎ鎖は、分子の１つまたは両方がループの周囲を自由に回転するように設計することができる。
Ｇ．特定結合分子
特定結合分子は、特定の分子または部位と特定して相互作用する分子である。特定結合分子と特定して相互作用する分子または部位は、本明細書では検体と称される。好適な検体は検体である。検体という用語は、特定結合分子と特定して相互作用する個々の分子とタンパク質のエピトープなどの上記分子の１部の両方を指すと理解される。レセプター／リガンド対のメンバーか合成ポリアミド類の抗体（Ｄｅｒｖａｎ 及び Ｂｕｒｌｉ、「ポリアミドによる配列−特定ＤＮＡ認識」、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ、３（６）：６８８〜９３（１９９９）；ＷｅｍｍｅｒおよびＤｅｒｖａｎ、「ＤＮＡの標的副溝」、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ、７（３）：３５５〜６１（１９９７））、核酸プローブ、および特定結合アフィニティを有する別の分子は、多次元分子のアフィニティ部分として有効な、特定結合分子の例である。
【０３５９】
特定の検体と特定して相互作用する特定結合分子は、その検体に特定すると言われる。たとえば、特定結合分子が特定の抗原と関連付けられる抗体である場合、特定結合分子はその抗原に特定すると言われる。抗原は検体である。特定結合分子を含む多次元分子も、特定の検体に特定すると言うことができる。特定結合分子は好ましくは、抗体、リガンド、結合タンパク質、レセプタータンパク質、ハプテン、アプタマー、炭水化物類、合成ポリアミド類、ペプチド核酸類、またはオリゴヌクレオチド類である。好適な結合タンパク質はＤＮＡ結合タンパク質である。好適なＤＮＡ結合タンパク質は亜鉛フィンガモチーフ、ロイシンジッパーモチーフ、ヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフである。これらのモチーフは、同一の特定結合分子内で組み合わせることができる。
【０３６０】
多次元分子のアフィニティ部分として有益な抗体は市販されている、あるいは、十分に確立された方法を用いて作成することができる。たとえば、ＪｏｈｎｓｔｏｎｅおよびＴｈｏｒｐｅ、「実地免疫化学」（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９８７）の３０〜８５ページには、 多クローン性および単クローン性抗体の両方を作成するのに有効な一般的方法が記載されている。著書全体が、検定システム内での抗体の使用のための多くの一般的技術および原理について述べている。
【０３６１】
亜鉛フィンガの特性、亜鉛フィンガモチーフ、およびその相互作用は、Ｎａｒｄｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、「亜鉛フィンガ−ＤＮＡ認識：位置指示突然変異生成による基本特異性の分析」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０（１６）：４１３７〜４４（１９９２）、Ｊａｍｉｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、「変更されたＤＮＡ−結合特異性を有する亜鉛フィンガの生体外選択」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３（１９）：５６８９〜９５（１９９４）、ＣｈａｎｄｒａｓｅｇａｒａｎおよびＳｍｉｔｈ、「キメラ制限酵素：次は何か」、Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ３８０（７〜８）：８４１〜８（１９９９）、およびＳｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、「キメラ制限酵素の基板特異性の詳細研究」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２７（２）：６７４〜８１（１９９９）に記載されている。
【０３６２】
１つの形式の特定結合分子は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド派生物である。上記特定結合分子は、特定核酸配列を検出するために設計および使用される。したがって、オリゴヌクレオチド特定結合分子用の検体は核酸配列である。検体はより大きな核酸分子内でヌクレオチド配列であってもよい。オリゴヌクレオチド特定結合分子は、多次元分子と検体間の特有の安定的なハイブリッド形成を支持する任意の長さを有することができる。この目的で、１０〜４０ヌクレオチドの長さが好ましく、オリゴヌクレオチド特定結合分子は１６〜２５ヌクレオチドの長さが最も好ましい。オリゴヌクレオチド特定結合分子はペプチド核酸であることが好ましい。ペプチド核酸はＤＮＡで安定的なハイブリッドを形成する。これにより、以後の増幅および検出作業中、ペプチド核酸特定結合分子を標的配列に堅固に付着することができる。
【０３６３】
この有効な効果は、Ｇａｓｐａｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２２（１４）：２８４５〜２８５２（１９９４）に記載される三重螺旋化学結合技術を利用することによって、オリゴヌクレオチド特定結合分子で得ることができる。簡潔に言うと、オリゴヌクレオチド特定結合分子は、標的配列に混成されるとき、三重螺旋を形成するように設計される。これは、概して既知なように、好ましくは一次ホモプリンまたは一次ホモピリミジン標的配列のいずれかを選択することによって達成される。特定結合分子を構成する合致するオリゴヌクレオチド配列は、選択された標的配列を補完し、よってそれぞれ一次ホモピリミジンまたは一次ホモプリンとなる。特定結合分子（Ｇａｓｐａｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．に記載される三重螺旋プローブに対応する）は、化学的に結合されるソラレン派生物を含む。特定結合分子の標的配列へのハイブリッド形成後、三重螺旋が形成される。三重螺旋に低波長紫外線を照射することによって、ソラレン派生物は標的配列へのプローブの交差結合を仲介する。
Ｈ．多次元シグナル融合
多次元シグナル融合は、単独のアミノ酸セグメントにおいて当該タンパク質またはペプチドと接合される多次元シグナルペプチド（すなわち、融合タンパク質）である。当該タンパク質およびペプチドと多次元シグナルペプチドとの上記融合は、融合を構成するアミノ酸セグメントを符号化する核酸分子からの融合タンパク質またはペプチドとして発現させることができる。多次元シグナル融合核酸分子または多次元シグナル核酸セグメントは、多次元シグナル融合を符号化する核酸分子または核酸配列とそれぞれ称される。
【０３６４】
多次元シグナル融合に含まれる当該多次元シグナルペプチドおよびタンパク質は、直接融合される必要はない。すなわち、他のアミノ酸類、アミノ酸配列、および／またはペプチドエレメントが介入することができる。たとえば、エピトープタグがあるとすれば、多次元シグナル融合内の当該タンパク質と多次元シグナルペプチドとの間に配置させることができる。多次元シグナルペプチドは、タンパク質のＮ−末端、タンパク質のＣ−末端、ドメイン接合部内または接合部で、あるいはタンパク質内のその他の適切な位置など、任意の配置でタンパク質に融合させることができる。該方法の形式によっては、タンパク質が機能的であることが望ましい。このような場合、末端融合 または 内部ドメイン融合 であることが望ましい。タンパク質融合に関する当業者は概して、当該タンパク質が機能的である場合の融合の設計方法を承知している。別の実施形態では、多次元シグナルペプチドおよびタンパク質が任意の所望の構造組織を有している場合、タンパク質が機能的である必要はない。
【０３６５】
所与の多次元シグナル融合は、１つ以上の多次元シグナルペプチドと１つ以上の当該タンパク質またはペプチドとを含むことができる。さらに、多次元シグナル融合は、１つ以上のアミノ酸類、アミノ酸配列、および／またはペプチドエレメントを含むことができる。開示された多次元シグナル融合は単独の、連続ポリペプチド鎖を具備する。したがって、複数のアミノ酸セグメントは同一の連続ポリペプチド鎖の１部であってもよいが、所与のアミノ酸セグメントのすべての構成要素（すなわち、当該の多次元シグナルペプチド、タンパク質、およびペプチド）は同一の連続ポリペプチド鎖の１部である。
【０３６６】
好適な実施形態では、多次元シグナルペプチド、多次元シグナル融合（あるいは、アミノ酸セグメント）、多次元シグナル融合を符号化する核酸セグメント、および／または多次元シグナル融合を符号化する核酸セグメントを具備する核酸分子は、セットを構成するまたはセット内に存在する、多次元シグナルペプチド、多次元シグナル融合、および／または多次元シグナル融合のサブセグメントが同様の特性（同様の質量電荷比など）を有するセットで使用される。同様の特性によって、多次元シグナル、多次元シグナル融合、または多次元シグナル融合のサブセグメントを１つ以上の特性を欠く別の分子から区別および／または分離することができる。好ましくは、セットを構成するまたはセット内に存在する、多次元シグナル、多次元シグナル融合、または多次元シグナル融合のサブセグメントが同じ質量電荷比（ｍ／ｚ）を有する。すなわち、セット内の多次元シグナル、多次元シグナル融合、または多次元シグナル融合のサブセグメントは等圧であってもよい。これにより、多次元シグナル、多次元シグナル融合、または多次元シグナル融合のサブセグメントは質量電荷比に基づき、別の分子から正確に分離することができる。フィルタリングの結果、システムにとっての信号雑音比（Ｓ／Ｎ）は大幅に増大し、より高感度で正確な検出を可能にする。
【０３６７】
複数セットの多次元シグナル融合（アミノ酸セグメントとも称される）、多次元シグナル融合断片（多次元シグナル融合のサブセグメントまたはアミノ酸サブセグメントとも称される）、多次元シグナルペプチド、多次元シグナル融合を符号化する核酸セグメント、または多次元シグナル融合を符号化する核酸セグメントを具備する核酸分子は、任意数の多次元シグナル融合、多次元シグナル融合断片、多次元シグナルペプチド、多次元シグナル融合を符号化する核酸セグメント、または多次元シグナル融合を符号化する核酸セグメントを具備する核酸分子を有することができる。たとえば、複数セットの多次元シグナル融合、多次元シグナル融合断片、多次元シグナルペプチド、多次元シグナル融合を符号化する核酸セグメント、または多次元シグナル融合を符号化する核酸セグメントを具備する核酸分子は、１つ、２つ以上の、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、２００以上、３００以上、４００以上、または５００以上の異なる多次元シグナル融合、多次元シグナル融合断片、多次元シグナルペプチド、多次元シグナル融合を符号化する核酸セグメント、または多次元シグナル融合を符号化する核酸セグメントを具備する核酸分子を有することができる。特定数の多次元シグナル融合、多次元シグナル融合断片、多次元シグナルペプチド、多次元シグナル融合を符号化する核酸セグメント、および多次元シグナル融合を符号化する核酸セグメントを具備する核酸分子と、多数の多次元シグナル融合、多次元シグナル融合断片、多次元シグナルペプチド、多次元シグナル融合を符号化する核酸セグメント、および多次元シグナル融合を符号化する核酸セグメントを具備する核酸分子の範囲に関する特定終点とが列挙されているが、特定数の多次元シグナル融合、多次元シグナル融合断片、多次元シグナルペプチド、多次元シグナル融合を符号化する核酸セグメント、および多次元シグナル融合を符号化する核酸セグメントを具備する核酸分子の１つ１つと、多数の多次元シグナル融合、多次元シグナル融合断片、多次元シグナルペプチド、多次元シグナル融合を符号化する核酸セグメント、および多次元シグナル融合を符号化する核酸セグメントを具備する核酸分子の範囲に関する特定終点の１つ１つとが具体的に意図されており、明確にリストアップされていないものの、特定数の多次元シグナル融合、多次元シグナル融合断片、多次元シグナルペプチド、多次元シグナル融合を符号化する核酸セグメント、および多次元シグナル融合を符号化する核酸セグメントを具備する核酸分子の１つ１つと、多数の多次元シグナル融合、多次元シグナル融合断片、多次元シグナルペプチド、多次元シグナル融合を符号化する核酸セグメント、および多次元シグナル融合を符号化する核酸セグメントを具備する核酸分子の範囲に関する特定終点の１つ１つが本明細書により具体的に記載されている。
【０３６８】
多次元シグナル融合は任意の適切な方法で発現させることができる。たとえば、核酸配列および多次元シグナル融合を符号化する核酸セグメントは、生体外、細胞内、および／または生体の細胞内で発現させることができる。核酸配列およびタンパク質の発現のための多くの技術およびシステムは既知であり、開示された多次元シグナル融合とともに使用することができる。たとえば、多くの発現配列、ベクターシステム、転換および移入技術、および遺伝子組み換え生体作成方法は既知であり、開示された多次元シグナルペプチド方法および組成とともに使用することができる。核酸構築物と細胞および生体の染色体とを統合するシステムが既知である（たとえば、Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）「ファージインテグレーゼはヒトの細胞における効率的な部位特異統合を導く」、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９７：５９９５〜６０００；Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）多次元シグナル融合を符号化する開示された核酸分子およびセグメントとともに使用できる、あるいは多次元シグナル融合を符号化する核酸セグメントを形成する「哺乳類細胞における大遺伝子の組換えベースのクローニングおよび調節性発現のための２つのバクテリア人工染色体シャトルベクターの開発」、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９１：１４２〜１４８）を参照）。
【０３６９】
本明細書で使用されるように、発現サンプルは、核酸分子から発現される１つ以上の多次元シグナル融合を含む、あるいは含む可能性のあるサンプルである。分析される発現サンプルは、サンプルの複雑さを低減するため分画または分離を受けることができる。断片化および分画は同一の検定で一緒に使用することもできる。上記断片化および分画は発現の分析を簡易化し拡張することができる。
【０３７０】
多次元シグナル融合を符号化する核酸分子は、１セットの核酸分子によって符号化される多次元シグナル融合内の多次元シグナルペプチドが、多次元シグナルペプチドを共通特性を欠く分子から分離または区別することの可能な１つ以上の共通特性を有することのできるセット内で使用可能である。同様に、アミノ酸セグメントを符号化する核酸分子は、１セットの核酸分子によって符号化されるアミノ酸セグメント内の多次元シグナルペプチドが、多次元シグナルペプチドを共通特性を欠く分子から分離または区別することの可能な１つ以上の共通特性を有することのできるセット内で使用可能である。アミノ酸セグメントを符号化する核酸分子は、１セットの核酸分子によって符号化されるアミノ酸セグメントが、アミノ酸セグメントを共通特性を欠く分子から分離または区別することの可能な１つ以上の共通特性を有することのできるセット内で使用可能である。
【０３７１】
同様に、多次元シグナル融合を符号化する核酸分子は、１セットの核酸分子によって符号化される多次元シグナル融合内の多次元シグナルペプチドが、インジケータレベルの分析におけるパターンを生成する１つ以上の特性を有することのできるセット内で使用可能である。同様に、多次元シグナル融合を符号化する核酸セグメント（概して、核酸分子の１部）は、１セットの核酸セグメントによって符号化される多次元シグナル融合内の多次元シグナルペプチドが、パターンを生成する１つ以上の特性を有することのできるセット内で使用可能である。複数セットの核酸分子、核酸セグメント、アミノ酸セグメント、多次元シグナルペプチド、および当該タンパク質のメンバー間のその他の関係について考える。
【０３７２】
多次元シグナル融合を符号化する核酸セグメント（概して、核酸分子の１部）は、１セットの核酸セグメントによって符号化される多次元シグナル融合内の多次元シグナルペプチドが、多次元シグナルペプチドを共通特性を欠く分子から分離または区別することの可能な１つ以上の共通特性を有することができるセットで使用可能である。同様に、アミノ酸セグメントを符号化する核酸セグメントは、１セットの核酸分子によって符号化されるアミノ酸セグメント内の多次元シグナルペプチドが、多次元シグナルペプチドを共通特性を欠く分子から分離または区別することの可能な１つ以上の共通特性を有することができるセットで使用可能である。アミノ酸セグメントを符号化する核酸セグメントは、１セットの核酸分子によって符号化されるアミノ酸セグメントが、アミノ酸セグメントを共通特性を欠く分子から分離または区別することの可能な１つ以上の共通特性を有することができるセットで使用可能である。複数セットの核酸分子、核酸セグメント、アミノ酸セグメント、多次元シグナルペプチド、および当該タンパク質のメンバー間のその他の関係について考える。
Ｉ．多次元シグナル／検体結合体
多次元シグナルが検体またはタンパク質と関連付けられる、組み込まれる、あるいは他の方法で結合される組成は、多次元シグナル／検体結合体（あるいは、ＭＤＳ／検体結合体）または多次元シグナル／タンパク質結合体（あるいは、ＭＤＳ／タンパク質結合体）と称される。上記結合体は、核酸配列に混成される多次元シグナルプローブなどの検体と関連付けられる多次元シグナル、連結基を介してタンパク質に連結される多次元シグナルなどの検体に共有結合される多次元シグナル、および当該タンパク質と多次元シグナルペプチド（あるいは、ペプチド多次元シグナル）間の融合などの検体に組み入れられる多次元シグナルを含む。
【０３７３】
多次元シグナルを採用する開示された方法の実施形態によっては、多次元シグナルは変更可能であり、変更された形式の異なる多次元シグナルを互いに区別することができる。多次元シグナル／検体結合体は変更可能であり、概して結合体の多次元シグナル部分の変更によって、変更された形式の異なる多次元シグナル、変更された形式の異なる多次元シグナル／検体結合体、またはその両方を相互に区別することができる。多次元シグナルまたは多次元シグナル／検体結合体が断片化によって変更される場合、断片の１部または全部を、実施形態によっては相互に区別することができる。たとえば、多次元シグナルが２つの部分に断片化される場合、多次元シグナルの１方または両方の部分を区別することができる。多次元シグナル／検体結合体が（多次元シグナル部分に破断点を持って）２つの部分に断片化される場合、多次元シグナル断片、多次元シグナル／検体断片、またはその両方を区別することができる。実施形態によっては、断片化された多次元シグナルの１方の部分しか検出できないため、レポーターシグナルのこの部分のみを区別する必要がある。      
【０３７４】
複数セットの多次元シグナル／検体結合体は、セット内の２つ以上の多次元シグナル／検体結合体が、共通特性を有する多次元シグナル／検体結合体を他の共通特性を欠く分子から区別および／または分離させることのできる１つ以上の共通特性を有する場合に使用することができる。さらに別の実施形態では、検体は、多次元シグナル／検体断片結合体（断片結合体と称することもできる）を作成するために（結合の前または後で）断片化することができる。このような場合、セットの断片結合体は、セット内の２つ以上の断片結合体が、共通特性を有する断片結合体を他の共通特性を欠く分子から区別および／または分離させることのできる１つ以上の共通特性を有する場合に使用することができる。断片化検体はそれ自体検体とみなされうると理解されるべきである。これに鑑み、断片化検体への言及は、特定の実施形態を説明する際に便宜上明瞭化するために成されるものであって、ベース検体と断片化検体の両方への言及とみなすことができる。
【０３７５】
複数セットの多次元シグナル／検体結合体または多次元シグナル／検体断片結合体（断片結合体）は、任意数の多次元シグナル／検体結合体または多次元シグナル／検体断片結合体を有することができる。たとえば、複数セットの多次元シグナル／検体結合体 または 多次元シグナル／検体断片結合体は、１つ、２つ以上の、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、２００以上、３００以上、４００以上、または５００以上の異なる多次元シグナル／検体結合体または多次元シグナル／検体断片結合体を有することができる。特定数の多次元シグナル／検体結合体および多次元シグナル／検体断片結合体、および多数の多次元シグナル／検体結合体および多次元シグナル／検体断片結合体の範囲の特定終点が列挙されているが、特定数の多次元シグナル／検体結合体および多次元シグナル／検体断片結合体の１つ１つ、および多数の多次元シグナル／検体結合体および多次元シグナル／検体断片結合体の範囲の特定終点の１つ１つが具体的に意図されており、明確にリストアップされていないものの、特定数の多次元シグナル／検体結合体および多次元シグナル／検体断片結合体の１つ１つ、および多数の多次元シグナル／検体結合体および多次元シグナル／検体断片結合体の範囲の特定終点の１つ１つがこれにより具体的に記載される。
【０３７６】
上述したように、検体またはタンパク質と結合される多次元シグナルは結合体にある間は変更可能であり、区別することができる。結合された多次元シグナルは変更前に、結合された検体から一部または全部解離または分離させることができる。他の結合された多次元シグナルも分析前に、結合された検体から一部または全部を解離または分離させることができる。多次元シグナルが検体から（一部または全部）解離される場合、該方法は、検体と多次元シグナル間の関連付けが多次元シグナルが検出される際に得られる情報の１部となるように実行することができる。すなわち、多次元シグナルが検出のために検体から解離させることができるという事実は、検出された多次元シグナルが検体と関連付けられたという情報をあいまいにするものではない。
【０３７７】
本明細書で使用されるように、結合された多次元シグナル結合体は、多次元シグナル／検体結合体と、多次元分子などの開示された方法の他の構成要素の両方を指す。
【０３７８】
多次元シグナルと同様に、概して、多次元シグナル／検体結合体および多次元シグナル／検体断片結合体は、セット内の多次元シグナル／検体結合体または断片結合体が、多次元シグナル／検体結合体または断片結合体を共通特性を欠く分子から分離または区別することのできる１つ以上の共通特性を有するセット内で使用可能である。
Ｊ．捕捉アレイ
捕捉アレイ（本明細書ではアレイとも称される）は、固体基板に、好ましくは固体基板上の特定または所定位置に固定される複数の捕捉タグを含む。この状況で、複数の捕捉タグは、それぞれが異なる構造を有する複数の捕捉タグを参照する。好ましくは、アレイ（本明細書ではアレイエレメントとも称される）上の所定の位置は１種類の捕捉タグを有する（すなわち、その位置のすべての捕捉タグが同一の構造を有する）。各位置は、複数の複製の捕捉タグを有する。アレイ内の異なる構造の捕捉タグの空間的分離により、捕捉タグと関連付けられる検体が個々に検出され識別される。復号化タグが捕捉アレイ内の所与の位置で検出される場合、そのアレイエレメントに対応する検体が標的サンプルに存在したことが示される。
【０３７９】
捕捉アレイ内で使用される固体基板は、捕捉タグが直接的または間接的に結合される任意の固体材料を含むことができる。これには、アクリルアミド、細胞ロース、ニトロ細胞ロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレン酸化物、ガラス、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンラバー、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフメレート、コラーゲン、グリコサミングルカン、およびポリアミノ酸などの材料が含まれる。固体基板は薄膜または膜、ビーズ、ビン、皿、ディスク、コンパクトディスク、繊維、光ファイバ、織繊維、成型ポリマー、粒子および微粒子などの任意の有効な形状を取ることができる。固体基板にとって好適な形状はコンパクトディスクである。
【０３８０】
好適ではあるが、所与の捕捉アレイは単独のユニットまたは構造である必要はない。セットの捕捉タグは、任意数の固体担体上に分布させることができる。たとえば、極端な場合、各捕捉タグは別個の反応管または容器に固定させることができる。アレイは、上述したような広範な担体組成の不透過性または透過性の担体上に構成してもよい。アレイのスポットサイズおよびスポットパッキングの密度は、使用されるプロセスおよび材料に応じて非常に広い範囲で変動する。
【０３８１】
抗体および他のタンパク質を基板に固定する方法は十分確立されている。固定は、たとえば、標準的な固定化学物質を用いてアミノ化表面、カルボキシル化表面、または水酸化表面への結合により達成することができる。結合剤の例はシアン化臭素、スクシンイミド、アルデヒド、トシルクロリド、アビジン−ビオチン、光架橋剤、エポキシド、およびマレイミドである。好適な結合剤はグルタルアルデヒドである。これらおよびその他の結合剤と、結合の際に使用される方法は、「タンパク質固定：基礎と応用」、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｆ．Ｔａｙｌｏｒ編（Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１）、ＪｏｈｎｓｔｏｎｅおよびＴｈｏｒｐｅ、「実地免疫化学」（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９８７）２０９〜２１６および２４１〜２４２ページ、および「固定アフィニティリガンド」、Ｃｒａｉｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．編（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２）に記載されている。抗体は、基板内に存在する反応性側基への抗体上の化学的な交差結合遊離アミノ基によって基板に付着することができる。たとえば、抗体は架橋剤としてグルタルアルデヒドまたはカルボジイミドを用いて、遊離アミノ基またはカルボキシル基を含む基板に化学的に架橋することができる。この方法によると、遊離抗体を含む水溶液は、グルタルアルデヒドまたはカルボジイミドの存在するところで固体基板と培養される。グルタルアルデヒドとの架橋のために、反応物質は、ｐＨ７．４で０．１Ｍのカコジル酸ナトリウムなどの溶解緩衝液内で、質量２％グルタルアルデヒドと培養させることができる。その他の標準的な固定化学物質が当業者によって既知である。
【０３８２】
オリゴヌクレオチド類の固体基板への固定方法は十分確立されている。オリゴヌクレオチド捕捉タグは、確立された結合方法を用いて基板に連結することができる。たとえば、適切な付加方法は、Ｐｅａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ,. ＵＳＡ９１（ｌｌ）：５０２２〜５０２６（１９９４）、Ｋｈｒａｐｋｏ  ｅｔ  ａｌ．、ＭｏｌＢｉｏｌ（Ｍｏｓｋ）（ＵＳＳＲ）２５：７１８〜７３０（１９９１）、Ｆｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，８７１，９２８号、Ｂｒｅｎｎｅｒの米国特許第５，６５４，４１３号、米国特許第５，４２９，８０７号、およびＰｅａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，５９９，６９５号に記載されている。カゼイン被覆スライド上への３'−アミンオリゴヌクレオチド類の固定方法は、Ｓｔｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ,. ＵＳＡ９２：６３７９〜６３８３（１９９５）に記載されている。オリゴヌクレオチド類を固体基板に付加する好適な方法は、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５４５６〜５４６５（１９９４）に記載されている。
【０３８３】
平面アレイ技術は長年利用されている（Ｓｈａｌｏｎ、Ｄ．、Ｓ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈ、およびＰ．Ｏ．Ｂｒｏｗｎ、「２色蛍光プローブハイブリッド形成を使用する複合ＤＮＡサンプルを分析するためのＤＮＡマイクロアレイシステム」、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ、１９９６．６（７）：ｐ．６３９〜４５、Ｓｉｎｇｈ−Ｇａｓｓｏｎ、Ｓ．、ｅｔ  ａｌ．、「デジタルマイクロミラーアレイを使用する光指向性オリゴヌクレオチドマイクロアレイのマスクレス製造」、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１９９９。１７（１０）：ｐ．９７４〜８、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｅ．Ｍ．、Ｕ．Ｍａｓｋｏｓ、およびＪ．Ｋ．Ｅｌｄｅｒ、「オリゴヌクレオチド類のアレイへのハイブリッド形成による核酸配列の分析と比較：実験モデルを使用する評価」、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１９９２。１３（４）：ｐ．１００８〜１７、Ｎｉｚｅｔｉｃ、Ｄ．ｅｔ ａｌ．、「ヒト染色体Ｘおよび２１の大きな挿入ライブラリの構築、配列、高密度スクリーニング：参照ライブラリとしての潜在的用途」、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ、１９９１．８８（８）：ｐ．３２３３〜７、Ｖａｎ Ｏｓｓ、ＣＪ．、ＲＪ．Ｇｏｏｄ、およびＭ．Ｋ．Ｃｈａｕｄｈｕｒｙ、「細胞ロース硝酸塩およびその他の膜でのＤＮＡ（サザン）およびタンパク質（ウェスタン）ブロット法の機構」、Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、１９８７．３９１（１）：ｐ．５３〜６５、Ｒａｍｓａｙ、Ｇ．、「ＤＮＡチップ：最新技術」、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１９９８．１６（１）：ｐ．４０〜４、Ｓｃｈｅｎａ、Ｍ．、ｅｔ ａｌ．、「パラレルヒトゲノム分析：１０００遺伝子のマイクロアレイベース発現モニタリング」、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ、１９９６．９３（２０）：ｐ．１０６１４〜９、Ｌｉｐｓｈｕｔｚ、ＲＪ．、ｅｔ ａｌ．、「高密度合成オリゴヌクレオチドアレイ」、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ、１９９９．２１（１Ｓｕｐｐｌ）：ｐ．２０〜４、Ｐｅａｓｅ、Ａ．Ｃ．、ｅｔ ａｌ．、「迅速なＤＮＡ配列分析のための発光オリゴヌクレオチドアレイ」、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ、１９９４．９１（１１）：ｐ．５０２２〜６、Ｍａｉｅｒ、Ｅ．ｅｔ  ａｌ．、「オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによる自動配列フィンガープリント分析へのロボット技術の適用」、Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１９９４．３５（２〜３）：ｐ．１９１〜２０３、Ｖａｓｉｌｉｓｋｏｖ、Ａ．Ｖ．、ｅｔ  ａｌ．、「共重合によるチップ上へのゲル固定化合物のマイクロアレイ製造」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９９。２７（３）：ｐ．５９２〜４、５９６〜８、６００ｐａｓｓｉｍ、およびＹｅｒｓｈｏｖ、Ｇ．、ｅｔ  ａｌ．、「オリゴヌクレオチドマイクロチップのＤＮＡ分析および診断」、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ、１９９６。９３（１０）：ｐ．４９１３〜８）。
【０３８４】
アレイ内のオリゴヌクレオチド捕捉タグは、同様のハイブリッド安定性を有するように設計することもできる。これにより、断片の上記捕捉タグへのハイブリッド形成がより効率化され、ハイブリッド形成のミスマッチの発生が低減される。 オリゴヌクレオチド捕捉タグのハイブリッド安定性は、既知の式と熱力学の原則を使用して算出することができる（たとえば、Ｓａｎｔａ Ｌｕｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３５：３５５５〜３５６２（１９９６）；Ｆｒｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：９３７３〜９３７７（１９８６）；Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：３７４６〜３７５０（１９８６）を参照）。オリゴヌクレオチド捕捉タグのハイブリッド安定性は、たとえば、化学的に捕捉タグを修飾することによってより類似にすることができる（ハイブリッド安定性を容易化すると称されるプロセス）（Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１５）：３０５９〜３０６５（１９９７）；Ｈｏｈｓｉｓｅｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４（３）：４３０〜４３２（１９９６））。ハイブリッド安定性は、特別な状況下でハイブリッド形成を実行することによって容易化することもできる（Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７（６）：１４９２〜１４９８（１９９９）；Ｗｏｏｄｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２（６）：１５８５〜１５８８（１９８５））。
【０３８５】
オリゴヌクレオチド捕捉タグのハイブリッド安定性を容易化するもう１つの手段は、捕捉タグの長さを変動させることである。これにより、すべての捕捉タグが類似のハイブリッド安定性（できる限りの範囲で）を有することができるように、各捕捉タグのハイブリッド安定性を調節することができる。単独のヌクレオチドの捕捉タグへの添加または捕捉タグからの削除は、固定された増分で捕捉タグのハイブリッド安定性を変更させるため、捕捉アレイにおける捕捉タグのハイブリッド安定性は均等でないと理解される。このため、ハイブリッド安定性の類似性は、本明細書で使用されるように、捕捉タグのハイブリッド安定性の類似性の増大（あるいは、別の言い方をすると、捕捉タグのハイブリッド安定性の差の低減）を指す。
【０３８６】
ハイブリッド形成の効率とオリゴヌクレオチド捕捉タグのサンプル断片への連結も、異なるハイブリッド形成条件を受けることのできる捕捉アレイの部位またはセグメントにおいて類似のハイブリッド安定性を有する捕捉タグをグループ化することによって向上させることができる。このように、ハイブリッド形成条件は、特定のクラスの捕捉タグに対して最適化することができる。
Ｋ．捕捉タグ
捕捉タグは、捕捉タグを有する化合物または複合体を捕捉または分離するために使用可能な化合物である。好ましくは、捕捉タグは、特定の分子または部位と明確に相互作用する化合物である。好ましくは、捕捉タグと明確に相互作用する分子または部位は検体である。検体という用語は、捕捉タグと特定して相互作用する、別個の分子およびタンパク質のエピトープなどの分子の１部の両方を指すと理解される。レセプター／リガンド対のメンバーか合成ポリアミド類のいずれかの抗体（ＤｅｒｖａｎおよびＢｕｒｌｉ、「ポリアミドによる配列−特定ＤＮＡ認識」、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ、３（６）：６８８〜９３（１９９９）；ＷｅｍｍｅｒおよびＤｅｒｖａｎ、「ＤＮＡ副溝を標的にする」、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ、７（３）：３５５〜 ６１（１９９７））、核酸プローブ、および特定結合アフィニティを有する別の分子が捕捉タグの例である。
【０３８７】
特定の検体と明確に相互作用する捕捉タグは、その検体に特定すると言われる。たとえば、捕捉タグが特定の抗原と関連付けられる抗体である場合、捕捉タグはその抗原に特定すると言われる。抗原は検体である。捕捉タグは好ましくは、抗体、リガンド、結合タンパク質、レセプタータンパク質、ハプテン、アプタマー、炭水化物類、合成ポリアミド類、ペプチド核酸類、またはオリゴヌクレオチド類である。好適な結合タンパク質はＤＮＡ結合タンパク質である。好適なＤＮＡ結合タンパク質は亜鉛フィンガモチーフ、ロイシンジッパーモチーフ、ヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフである。これらのモチーフは同一の捕捉タグで組み合わせることができる。
【０３８８】
多次元分子のアフィニティ部分として有益な抗体は市販されている、あるいは十分に確立された方法を用いて作成することができる。たとえば、ＪｏｈｎｓｔｏｎｅおよびＴｈｏｒｐｅ、「実地免疫化学」（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９８７）は３０〜８５ページで、多クローン性および単クローン性抗体の両方を作成するのに有効な一般的方法について述べている。著書全体が、検定システム内での抗体の使用のための多くの一般的技術および原理について述べている。
【０３８９】
亜鉛フィンガの特性、亜鉛フィンガモチーフ、およびそれらの相互作用は、Ｎａｒｄｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、「亜鉛フィンガ−ＤＮＡ認識：位置指示突然変異生成による基本特異性の分析」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０（１６）：４１３７〜４４（１９９２）、Ｊａｍｉｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、「変更されたＤＮＡ−結合特異性を有する亜鉛フィンガの生体外選択」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３（１９）：５６８９〜９５（１９９４）、ＣｈａｎｄｒａｓｅｇａｒａｎおよびＳｍｉｔｈ、「キメラ制限酵素：次は何か」、Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、３８０（７〜 ８）：８４１〜８（１９９９）、およびＳｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、「キメラ制限酵素の基板特異性の詳細研究」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２７（２）：６７４〜８１（１９９９）に記載されている。
【０３９０】
１つの形式の捕捉タグはオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド派生物である。上記捕捉タグは特定核酸配列を検出するように設計され使用される。したがって、オリゴヌクレオチド捕捉タグのための検体は核酸配列である。検体は、より大きな核酸分子内のヌクレオチド配列であってもよい。オリゴヌクレオチド捕捉タグは、捕捉タグと検体間の特定の安定的なハイブリッド形成を支持するいかなる長さであってもよい。この目的で、１０〜４０ヌクレオチドの長さが好ましく、１６〜２５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチド捕捉タグが最も好ましい。オリゴヌクレオチド捕捉タグはペプチド核酸であることが好ましい。ペプチド核酸はＤＮＡで安定的なハイブリッドを形成する。このため、ペプチド核酸捕捉タグはその後の増幅および検出作業中、標的配列に堅固に接着される。
【０３９１】
この有益な効果は、Ｇａｓｐａｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２２（１４）：２８４５〜２８５２（１９９４）に記載される三重螺旋化学結合技術を利用することによって、オリゴヌクレオチド捕捉タグで入手することができる。簡潔に言うと、オリゴヌクレオチド捕捉タグは、標的配列に混成されるとき、三重螺旋を形成するように設計される。これは、概して既知なように、好ましくは一次ホモプリンまたは一次ホモピリミジン標的配列のいずれかを選択することによって達成される。捕捉タグを構成する合致するオリゴヌクレオチド配列は、選択された標的配列を補完し、よってそれぞれ一次ホモピリミジンまたは一次ホモプリンとなる。補足タグ（Ｇａｓｐａｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．に記載される三重螺旋プローブに対応する）は、化学的に結合されるソラレン派生物を含む。補足タグの標的配列へのハイブリッド形成後、三重螺旋が形成される。三重螺旋に低波長紫外線を照射することによって、ソラレン派生物は標的配列へのプローブの交差結合を仲介する。
Ｌ．サンプルアレイ
サンプルアレイは、固体基板に、好ましくは固体基板上の特定位置または所定の位置に固定された複数のサンプル（たとえば、発現サンプル、組織サンプル、タンパク質サンプル）を含む。好ましくは、サンプルアレイ（本明細書ではサンプルアレイエレメントと称する）上の各所定位置は１種類のサンプルを有する。サンプルアレイ内の異なるサンプルを空間的に分離することによって、サンプルと関連付けられる多次元シグナル（あるいは、多次元分子、多次元シグナル、多次元分子、インジケータシグナル、インジケータ分子、または符号化タグ）を別個に検出し識別することができる。多次元シグナルがサンプルアレイ内の所与の位置で検出される場合、その多次元シグナルに対応する検体がそのサンプルアレイエレメントに対応するサンプルに存在することが示される。
【０３９２】
サンプルアレイで使用される固体基板は、サンプルを直接的または間接的に付着することのできる任意の固体材料を含むことができる。これには、アクリルアミド、細胞ロース、ニトロ細胞ロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレン酸化物、ガラス、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフメレート、コラーゲン、グリコサミングルカン、およびポリアミノ酸などの材料が含まれる。固体基板は、薄膜または膜、ビーズ、ビン、皿、ディスク、コンパクトディスク、繊維、光ファイバ、織繊維、成型ポリマー、粒子、および微粒子などの任意の有効な形状を取ることができる。固体基板の好適な形状はコンパクトディスクである。
【０３９３】
好適ではあるが、所与のサンプルアレイは単独のユニットまたは構造である必要はない。セットのサンプルは、任意数の固体担体上に分布させることもできる。たとえば、極端な場合、各サンプルは別の反応管または容器内に固定させることができる。サンプルアレイは、上述したような広範な担体組成の不透過性または透過性の担体上に構成してもよい。アレイのスポットサイズおよびスポットパッキングの密度は、使用されるプロセスおよび材料に応じて非常に広い範囲で変動する。サンプルおよびサンプル構成要素を基板に付着または固定させる方法は確立されている。
【０３９４】
サンプルアレイの好適な形状は、基板上に小さな組織サンプルがある組織アレイである。上記組織マイクロアレイは、たとえば、乳癌を研究するためのコホート内に存在し、そこで使用される。開示された方法は、たとえば、複数のサンプル内で複数の検体を精査するために使用することができる。サンプルアレイは、たとえば、異なる多次元シグナルで標識付けされ、その後、全担体が質量特性のソース領域に導入され、ＭＡＬＤＩによってサンプリングされる。
Ｍ．復号化タグ
復号化タグは、符号化タグに直接的または間接的に関連付けることのできる任意の分子または部位である。復号化タグは、多次元シグナルと検体とを間接的に関連付けることのできる多次元シグナル（多次元分子を構成する）に関連付けられる。復号化タグは好ましくは、オリゴヌクレオチド類、炭水化物類、合成ポリアミド類、ペプチド核酸類、抗体、リガンド、タンパク質、ハプテン、亜鉛フィンガ、アプタマー、または質量標識である。
【０３９５】
好適な復号化タグは、オリゴヌクレオチド符号化タグに特定して混成させることのできる分子である。最も好適なのがペプチド核酸復号化タグである。オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸復号化タグは任意の配列を有することができる。唯一の要件は、符号化タグに対するハイブリッド形成である。復号化タグはそれぞれ符号化タグと復号化タグ間の特定の安定的なハイブリッド形成を支持する任意の長さを有することができる。この目的で、１０〜３５ヌクレオチドの長さが好適であり、復号化タグは１５〜２０ヌクレオチドの長さが最も好適である。
【０３９６】
復号化タグを含む多次元分子は好ましくは、飛行時間（ＴＯＦ）質量分析によって分離および識別させるためにマトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）または別の検出技術によって解放させることができる。復号化タグは、符号化タグに混成させることのできるオリゴマー分子であってもよい。たとえば、復号化タグは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）分子であってもよい。好適な復号化タグはＰＮＡ分子である。
Ｎ．符号化タグ
符号化タグは、復号化タグと関連付けることのできる分子または部位である。符号化タグは、復号化タグの関連付けのための標的としての役割を果たしうる任意の種類の分子または部位であってもよい。好適な符号化タグは、オリゴマー、オリゴヌクレオチド類、または核酸配列である。符号化タグはストレプトアビジンまたはビオチンなどの結合対のメンバーであってもよく、その同族の復号化タグは結合対の他のメンバーである。符号化タグは、何種類かの多次元シグナルと直接関連付けられるように設計することもできる。たとえば、オリゴヌクレオチド符号化タグは、ペプチド核酸多次元シグナル（ペプチド核酸から成る多次元シグナル）と直接相互作用するように設計することができる。
【０３９７】
オリゴマー符号化タグのオリゴマーベース配列は、ペプチド核酸、メチルホスホン酸ＤＮＡ、および２'−０−メチルＲＮＡまたはＤＮＡなどの、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡ、修飾された主鎖ヌクレオチド状オリゴマーを含むことができる。オリゴマーまたはオリゴヌクレオチド符号化タグは任意の配列を有することができる。唯一の要件は、復号化タグとの関連付けである（好ましくは、混成による）。開示された方法では、複数の符号化タグは単独の検体と関連付けることができる。これらの複数の符号化タグのコンテクストは、シグナル増幅のために使用される技術に左右される。したがって、分枝ＤＮＡが使用される場合、分枝ＤＮＡ分子は分枝上の複数の符号化タグを含む。オリゴヌクレオチドデンドリマーが使用される場合、符号化タグはデンドリマーアーム上にある。回転する円の複製が使用される場合、複数の符号化タグは、増幅標的円配列の補体の縦列反復から生じる（符号化タグ配列の少なくとも１つの補体を含む）。この場合、符号化タグはタンデム配列ＤＮＡで縦一列に繰り返される。
【０３９８】
オリゴヌクレオチド符号化タグはそれぞれ符号化タグと復号化タグ間の特有の安定的なハイブリッド形成を支持する任意の長さを有することができる。この目的で、１０〜３５ヌクレオチドの長さが好ましく、符号化タグは１５〜２０ヌクレオチドの長さが最も好ましい。
【０３９９】
開示された方法で使用される分枝ＤＮＡは概して既知である（Ｕｒｄｅａ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２：９２６〜９２８（１９９４）、およびＨｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：４８３５〜４８４１（１９９７））である。本明細書で使用されるように、分枝ＤＮＡ分子の尾部は、検体と相互作用するように設計される分枝ＤＮＡ分子の１部を指す。尾部は特定結合分子である。概して、各分枝ＤＮＡ分子は１つのみの尾部を有するべきである。分枝ＤＮＡの分枝（本明細書では、分枝ＤＮＡのアームとも称される）は符号化タグ配列を含む。オリゴヌクレオチドデンドリマー（あるいは、デンドリマーＤＮＡ）も概して既知である（Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：４４４７〜４４５４（１９９７）、およびＯｒｅｎｔａｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ７７：１５３〜１６３（１９９９））。本明細書で使用されるように、オリゴヌクレオチドデンドリマーの尾部は、検体と相互作用するように設計されるデンドリマーの１部を指す。概して、各デンドリマーは１つのみの尾部を有するべきである。デンドリマーのデンドリマーストランドは、本明細書ではオリゴヌクレオチドデンドリマーのアームと称され、符号化タグ配列を含む。
【０４００】
符号化タグは標識付けられる検体または別の分子を（直接、あるいはリンカーまたはスペーサを介して）連結することができる。符号化タグは標識付けられる検体および別の分子と関連付けることもできる。この目的で、符号化分子が好ましい。符号化分子は検体および復号化タグと相互作用可能な分子である。符号化分子は特定結合分子と符号化タグを含む。特定結合分子は上述のとおりである。
Ｏ．多次元キャリアおよび符号化キャリア
多次元キャリアは、１つ以上の特定結合分子、キャリア、および複数の多次元シグナルの関連付けである。多次元キャリアは開示された方法で使用されて、多数の多次元シグナルと検体とを関連付ける。符号化キャリアは、１つ以上の特定結合分子、キャリア、および複数の符号化タグの関連付けである。符号化キャリアは開示された方法で使用されて、多数の符号化タグと検体とを関連付ける。キャリアは、多くの多次元シグナルと特定結合分子の関連付けを簡易化する分子または構造であってもよい。たとえば、リポソーム、微粒子、ナノ粒子、ヴィロン、ファージミド、および分枝ポリマー構造である。キャリアの一般的なクラスは、薬物送達のために設計された構造または材料である。多くの上記キャリアは既知である。リポソーム は好適な形状のキャリアである。
【０４０１】
リポソームは、主にリン脂質二重層から成る人工構造である。コレステロールおよび脂肪酸は、二重層構造に含めることができる。開示された方法の形式によっては、リポソームは任意の多次元シグナルまたは符号化タグのためのキャリアとしての役割を果たす。任意のシグナルまたはタグを装填されたリポソーム多次元キャリアと、シグナルおよびタグの非常に広範な重複を分離することのできる方法とを組み合わせることによって、高多重検定を実行することができる。
【０４０２】
リポソーム、好ましくは単一層小胞は、非常に多くの（数千）多次元シグナルまたは符号化タグ分子を有する内部コンパートメントの装填を導く確立した手順を用いて作成され、これらの分子の化学的性質は予め選択された検出方法による提出に適している。ある特定の種類の多次元シグナルまたは符号化タグは好ましくは、それぞれの特定の種類のリポソームキャリアに対して使用される。
【０４０３】
それぞれの特定の種類のリポソーム多次元または符号化キャリアは、特定結合分子に関連付けられる。その関連付けは直接的であっても間接的であってもよい。直接的結合の例は、リン脂質二重層の表面に共有結合された抗体を含むリポソームである。別の間接的な結合組成は、表面に共有結合された任意の配列のＤＮＡオリゴヌクレオチド類を含むリポソームである。これらのオリゴヌクレオチド類は、塩基相補性により特定多次元分子を認識するように設計される。多次元分子は抗体−ＤＮＡ共有結合複合体を具備することができ、それによってこの複合体のＤＮＡ部分は、リポソーム多次元キャリア上の補完的配列と明確に混成することができる。このようにして、リポソーム多次元キャリアは、任意の所望の結合分子と間接的に関連付けることのできる一般的な試薬となる。
【０４０４】
リポソーム多次元キャリアの使用を以下の例で説明することができる。
【０４０５】
１．リポソーム（好ましくは、平均径１５０〜３００ナノメータの単一層小胞）が押出法を用いて作製される（Ｈｏｐｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、８１２：５５〜６５（１９８５）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１０６１：２９７〜３０３（１９９１））。リポソーム製剤の他の方法も使用することができる。
【０４０６】
２．リポソームの内部体積にこの特定オリゴペプチドが搭載され、当該特定検体を識別するのに供するように、オリゴペプチドの溶液が濃度４００マイクロモルでリポソームの製剤中に使用される。内径２００ナノメータのリポソームは、平均９６０分子のオリゴペプチドを含む。３つの別個のリポソーム製剤が押し出され、それぞれに異なるオリゴペプチドが搭載される。オリゴペプチド類は、同じ質量電荷比を有するが、質量分析によって容易に分離可能となるように異なる質量電荷比を有する断片に分割されるよう選択される。
【０４０７】
３．３つのリポソーム製剤の外表面は以下のようにして特定抗体に結合される。ａ）第１のリポソーム製剤はｐ５３腫瘍抑制因子に対して特異的な抗体と反応する；ｂ）第２のリポソーム製剤はＢｃｌ−２腫瘍タンパク質に対して特異的な抗体と反応する；ｃ）第３のリポソーム製剤はＨｅｒ２／ｎｅｕ細胞膜レセプターに対して特異的な抗体と反応する。結合反応は、反応性アミノ基を収容する分子への抗体の共有結合に関する標準的な手順を使用して実行される（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｔ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２３：５２２−５２９（１９９５）;Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、５２８〜５６９ページ（１９９６）；Ｓｃｈｅｆｆｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ１：１０７〜１１０（２０００））。リポソームの場合、反応性アミノ基は、リポソームのホスファチジルエタノールアミン部位に存在する反応性アミノ基である。
【０４０８】
４．リポソームと固定された組織中に存在する対応するタンパク質抗原とを関連付けるために、標準的なホルムアルデヒド固定履歴部位を保持するガラススライドを、３つのリポソーム製剤すべての混合物と接触させ、３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％牛血清アルブミンを含む緩衝剤中に浮遊させる。１時間の培養後、スライドは同一の緩衝剤（３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％牛血清アルブミン）で５分間、２度洗浄される。スライドは空気流で乾燥させる。
【０４０９】
５．スライドは、アセトニトリルと水の５０：５０混合物内で１０ｍｇ／ｍｌのα−シアノ−４−ヒドロキシけい皮酸、０．１％トリフルオロ酢酸から成るマトリクス溶液の薄層で塗布される。スライドは空気流で乾燥させる。
【０４１０】
６．スライドはＭＡＬＤＩプレートの表面上に置かれ、Ｌｏｂｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．、「ＭＡＬＤＩ−ＱｑＴＯＦ質量分析計の設計と性能」、第４７回ＡＳＭＳ会議、Ｄａｌｌａｓ、Ｔｅｘａｓ（１９９９）、Ｌｏｂｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１４（１２）：１０４７〜１０５７（２０００）、Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７２：２１３２〜２１４２（２０００）、及び Ｋｒｕｔｃｈｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、１１（６）：４９３〜５０４（２０００）に記載されるような質量分析計に導入される。
【０４１１】
７．質量スペクトルはスライド面の所定位置から得られる。多次元シグナルポリペプチドの３つのピークの相対量が、リポソーム−検出器複合体によって検出される抗原の相対量を判定するために使用される。
【０４１２】
リポソームキャリア法は、組織部位上の検体の検出に限定されない。ソーティングによって得られた細胞も、開示された方法での分析のために使用することができる（Ｓｃｈｅｆｆｏｌｄ、Ａ．、Ａｓｓｅｎｍａｃｈｅｒ、Ｍ．、Ｒｅｉｎｅｒｓ−Ｓｃｈｒａｍｍ、Ｌ．、Ｌａｕｓｔｅｒ、Ｒ．、およびＲａｄｂｒｕｃｈ、Ａ．、２０００、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ１：１０７〜１１０）。
ｐ．標識タンパク質および検体
標識タンパク質は１つ以上の多次元シグナルが付加されるタンパク質またはペプチドである。好ましくは、多次元シグナルとタンパク質またはペプチドは共有結合される、あるいは互いにつながれる。標識検体は１つ以上の多次元シグナルが付加される検体である。好ましくは、多次元シグナルと検体は共有結合される、あるいは互いにつながれる。
【０４１３】
本明細書で使用されるように、分子は直接的または間接的に共有結合されるときに連結される。多次元シグナルは、タンパク質、ペプチド、または検体に任意の方法で付加することができる。１つの非限定的な形式の間接結合は、リンカー分子を介するものである。多次元シグナルは任意の適切な結合反応により、タンパク質、ペプチド、または検体と結合することができる。たとえば、多次元シグナルはタンパク質上のシステインまたはペプチドおよび多次元シグナル上のシステイン間の硫黄−硫黄結合により、タンパク質またはペプチドと共有結合させることができる。また、多次元シグナルは、連結（たとえば、多次元シグナルペプチドのタンパク質へのタンパク質連結）によってタンパク質およびペプチドに付加することもできる。タンパク質、ペプチドまたは検体への結合化合物のためのその他多くの化学物質および技術が既知であり、タンパク質、ペプチド、または検体に多次元シグナルを結合するのに使用することができる。たとえば、結合はチオール、エポキシド、チオール用ニトリル、ＮＨＳエステル、イソチオシアン、アミン用イソチオシアン酸塩、アミン、およびカルボン酸用アルコールを用いて実行することができる。タンパク質、ペプチド、および検体は、生体内で標識付けすることもできる。本明細書で使用されるように、「標識タンパク質」は、１つ以上の多次元シグナルが付加されるタンパク質およびペプチドの両方を指す。標識タンパク質という用語は、そのままの（たとえば、非断片化）多次元シグナルに付加されるタンパク質およびペプチドと修飾された（たとえば、断片化）多次元シグナルに付加されるタンパク質およびペプチドの両方を指す。後者の形式の標識タンパク質は断片化標識タンパク質と称される。標識タンパク質のタンパク質部分は（たとえば、プロテアーゼ消化により）断片化することができるが、断片化標識タンパク質という用語は多次元シグナルが断片化されている標識タンパク質を指す。１セットのタンパク質が同じ質量電荷比を有するように、等圧標識タンパク質は等圧多次元シグナルで標識付けされる同種のタンパク質またはペプチドである。
【０４１４】
本明細書で使用されるように、「標識検体」は、１つ以上の多次元シグナルが付加される検体を指す。標識検体という用語は、そのままの（たとえば、非断片化）多次元シグナルに付加される検体と修飾された（たとえば、断片化）多次元シグナルに付加される検体の両方を指す。後者の形式の標識タンパク質は断片化標識検体と称する。標識検体の検体部分は断片化することができるが、断片化標識検体という用語は、多次元シグナルが断片化された標識検体を指す。等圧標識検体は、１セットの検体が同じ質量電荷比を有するように等圧多次元シグナルで標識付けされる同種の検体である。
【０４１５】
分析対象であるタンパク質、ペプチド、または検体サンプルは、サンプルの複雑さを低減するため、分画または分離させることができる。同じ検定で、断片化および分画も一緒に使用することができる。上記断片化、分割、または分離は、タンパク質、ペプチド、および検体の分析を単純化し拡張することができる。
【０４１６】
ある非限定的例では、多次元シグナルがリン酸化ペプチドに特定して付加される標識タンパク質を形成することができる。ホスホレリンまたはホスホチロシン残留物の特定誘導体化のための化学反応が記載されている（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．、「タンパク質リン酸化の問題に対する系統的アプローチ」、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：３７５〜 ３７８（２００１）；Ｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．、「ホスホプロテオームを検査するためのツールとしてのリン酸化タンパク質の濃縮分析」、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ１９：３７９〜３８２（２００１））。これらの２つのプロトコルのいずれかによって処理されたトリプシンペプチドは、タンパク質リン酸化部位で反応性スルフヒドリルを表示する。これらの部位は多次元シグナルと反応して、標識タンパク質を生成することができる。非リン酸化ペプチドは誘導体化されない。
Ｑ．アフィニティタグ
アフィニティタグは、アフィニティタグを持たない化合物または複合体からアフィニティタグを持つ化合物または複合体を分離するために使用することができる任意の化合物である。好ましくは、アフィニティタグは、リガンド結合分子または抗体などの別の化合物と関連付けられる、あるいは相互作用するリガンドまたはハプテンなどの化合物である。また、ハプテンと抗体またはリガンドとリガンド結合分子間のようなアフィニティタグと捕捉構成要素間の相互作用は特定の相互作用であることが好ましい。アフィニティタグは好ましくは、抗体、リガンド、結合タンパク質、レセプタータンパク質、ハプテン、アプタマー、炭水化物類、合成ポリアミド類、またはオリゴヌクレオチド類である。好適な結合タンパク質はＤＮＡ結合タンパク質である。好適なＤＮＡ結合タンパク質は、亜鉛フィンガモチーフ、ロイシンジッパーモチーフ、ヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフである。これらのモチーフは同一の特定結合分子と組み合わせることができる。
【０４１７】
核酸プローブのコンテクストで記載されるアフィニティタグは、Ｓｙｖｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１４：５０３７（１９８６）に記載されている。好適なアフィニティタグは、核酸類に組み入れることのできるビオチンを含む。開示された方法では、多次元シグナルに組み込まれたアフィニティタグによって、多次元シグナルは基板に捕捉される、付着される、あるいは連結されることができる。上記捕捉は、多次元シグナルの洗浄と処理を簡易化する、多次元シグナルの別の分子からの分離を可能にし、該方法の全部または１部を自動化させる。
【０４１８】
亜鉛フィンガもアフィニティタグとして使用することができる。亜鉛フィンガの特性、亜鉛フィンガモチーフ、およびそれらの相互作用は、Ｎａｒｄｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、「亜鉛フィンガ−ＤＮＡ認識：位置指示突然変異生成による基本特異性の分析」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０（１６）：４１３７〜 ４４（１９９２）、Ｊａｍｉｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、「変更されたＤＮＡ−結合特異性を有する亜鉛フィンガの生体外選択」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３（１９）：５６８９〜９５（１９９４）、Ｃｈａｎｄｒａｓｅｇａｒａｎ、Ｓ．およびＪ．Ｓｍｉｔｈ、「キメラ制限酵素：次は何か」、Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ３８０（７〜８）：８４１〜８（１９９９）、及び Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、「キメラ制限酵素の基板特異性の詳細研究」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２７（２）：６７４〜８１（１９９９）に記載されている。
【０４１９】
基板上での多次元シグナルの捕捉は所望すれば、いくつかの方法で実行することができる。ある実施形態では、アフィニティドックは基板に添付または結合される。アフィニティドックは、多次元シグナル上のアフィニティタグと関連付けるあるいは相互作用することによって多次元シグナルの付着を仲介する化合物または部位である。基板に固定されたアフィニティドックによって、基板上の多次元シグナルを捕捉することができる。上記捕捉は、以後のステップを妨げる可能性のある分子を洗い流す簡便な手段を提供する。捕捉多次元シグナルは、基板から解放させることもできる。これは、アフィニティタグを分離する、あるいは多次元シグナルと基板間の光解離性連結を絶つことによって達成可能である。
【０４２０】
開示された方法で使用される基板は、多次元シグナルが付着または結合される任意の固体材料を含むことができる。基板の例はアクリルアミド、細胞ロース、ニトロ細胞ロース、ガラス、シリコン、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレン酸化物、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリアンヒドライド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフメレート、コラーゲン、グリコサミングルカン、およびポリアミノ酸などの材料を含むが、それらに限定されない。基板は、薄膜または膜、ビーズ、ビン、皿、繊維、光ファイバ、織繊維、成型ポリマー、粒子、コンパクトディスク、および微粒子などの有効な形状を取ることができる。
Ｒ．ベクターおよび発現配列
遺伝子導入は、プラスミド、ウィルスベクター、ウィルス核酸類、ファージ核酸類、ファージ、コスミッド、および人工染色体には限定されないが、それらの中の遺伝子物質の直接導入、あるいは、カチオンリポソームなどの細胞またはキャリア内の遺伝子物質の転写を介して得ることができる。上記方法は当該技術において既知であり、本明細書に記載される方法での使用に容易に適合させることができる。転写ベクターは、遺伝子を細胞（たとえば、プラスミド）に運ぶため、あるいは遺伝子を運ぶ一般的方策の１部、たとえば、組み換えレトロウィルスまたはアデノウィルスの１部として使用される任意のヌクレオチド構築物であってもよい（Ｒａｍ  ｅｔ  ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：８３〜８８（１９９３））。ウィルスベクター、化学トランスフェクタント、または電気穿孔法やＤＮＡの直接拡散などの物理機械的方法を含む適切な移入方法は、たとえば、Ｗｏｌｆｆ、Ｊ．Ａ.、ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７、１４６５〜１４６８、（１９９０）；およびＷｏｌｆｆ、Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ、３５２、８１５〜８１８（１９９１）に記載されている。
【０４２１】
本明細書で使用されるように、プラスミドまたはウィルスベクターは、劣化無しに遺伝子を細胞に移送する作用物質であり、移送される細胞内での遺伝子の発現を招くプロモータを含む。好適な実施形態では、ベクターは、ウィルスまたはレトロウィルスのいずれかから得られる。好適なウィルスベクターは、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルペスウィルス、ワクシニアウィルス、ポリオウィルス、ＡＩＤＳウィルス、ニューロン栄養ウィルス、シンドビスまたはその他のＲＮＡウィルスであり、ＨＩＶ主鎖を有するこれらのウィルスも含む。これらのウィルスをベクターとしての使用に適合させるウィルス特性を共有する任意のウィルス族も好適である。好適なレトロウィルスは、マウス白血病ウィルス、ＭＭＬＶ、およびベクターとしてのＭＭＬＶの所望の特性を発現するレトロウィルスを含む。レトロウィルスベクターは他のウィルスベクターよりも大きな遺伝的運搬、すなわち、トランス遺伝子または標識遺伝子を担持するため、一般的に使用されるベクターである。しかし、それらは非増殖性細胞では有効ではない。アデノウィルスベクターは比較的安定的でともに機能しやすく、高力価を有し、エアゾール組成物内で配送することができ、非分裂細胞を移入することができる。ポックスウィルスベクターは大型で、遺伝子を挿入するためのいくつかの部位を有する。それらは耐熱性で、室温で保管することができる。好適な実施形態は、ウィルス抗原によって誘い出される宿主生体の免疫反応を抑えるように設計されたウィルスベクターである。この種の好適なベクターは、インターロイキン８または１０のための符号化領域を担持する。
【０４２２】
ウィルスベクターは、遺伝子を細胞に導入する大半の化学的または物理的方法よりも高い処理能力（遺伝子を導入する能力）を有する。通常、ウィルスベクターは、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写、複製およびカプシド形成に必要な逆方向末端反復配列、およびウィルスゲノムの転写と複製を制御するプロモータを含む。ベクターとして設計される際、ウィルスは通常、除去される１つ以上の初期遺伝子を有し、遺伝子または遺伝子／プロモータカセットは除去されたウィルスＤＮＡの代わりにウィルスゲノムに挿入される。この種の構造物は、最大約８ｋｂの外来遺伝子物質を担持することができる。除去された初期遺伝子の必要な機能は通常、トランス内の初期遺伝子の遺伝子産物を発現するように設計された細胞株によって供給される。
１.レトロウィルスベクター
レトロウィルスは、任意の種類、亜科、族、または向性を含むレトロウィルスのウィルス族に属する動物ウィルスである。レトロウィルスベクターは概して、Ｖｅｒｍａ、Ｉ．Ｍ．、「遺伝子導入のためのレトロウィルスベクター」、Ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９８５、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２２９〜２３２ページ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、（１９８５）で説明されている。その内容は言及により本明細書に組み込む。遺伝子治療にレトロウィルスベクターを使用する方法の例は、米国特許第４，８６８，１１６号および４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ９０／０２８０６およびＷＯ８９／０７１３６；およびＭｕｌｌｉｇａｎ、（Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０：９２６〜９３２（１９９３））に記載されており、その教示は言及により本明細書に組み込む。
【０４２３】
レトロウィルスは実質上、核酸カーゴにパックされるパッケージである。核酸カーゴはそれとともにパッケージングシグナルを担持し、それによって複製された娘分子がパッケージ被膜内に効率的にパッケージングされるように確保する。パッケージシグナルに加えて、複製および複製ウィルスのパッケージングのためにシス内で必要とされる多数の分子がある。通常、レトロウィルスゲノムは、タンパク質被膜の作成に関与するｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含む。標的細胞に移送されるべきなのは、通常、外来ＤＮＡによって置き換えられるｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子である。レトロウィルスベクターは通常、パッケージ被膜への組入れのためのパッケージシグナル、gag転写ユニットの開始を知らせる配列、逆転写のｔＲＮＡプライマーを結合するためのプライマー結合部位を含む逆転写に必要なエレメント、ＤＮＡ合成中のＲＮＡストランドの切換を誘導する末端反復配列、ＤＮＡ合成の第２のストランドの合成のためのプライミング部位として機能するプリンの豊富な配列５'〜３'ＬＴＲ、およびＤＮＡ状態のレトロウィルスの宿主ゲノムへの挿入を可能にするＬＴＲの末端近傍の特定配列を含む。ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子の除去によって、約８ｋｂの外来配列をウィルスゲノムに挿入させ、逆転写させ、複製後に新レトロウィルス粒子にパッケージングさせることができる。この量の核酸は、各転写のサイズに応じて、１つの遺伝子から多くの遺伝子まで移送させるのに十分である。挿入断片内の他の遺伝子とともに、陽性または陰性選択可能マーカーのいずれかを含むことが好ましい。
【０４２４】
大部分のレトロウィルスベクター内の複製機構とパッケージングタンパク質は除去されているので（ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）、ベクターは通常、それらパッケージング細胞株に置くことによって生成される。パッケージング細胞株は、複製およびパッケージング機構を含むがパッケージングシグナルを欠くレトロウィルスと移入または転換された細胞株である。選択されたＤＮＡを運搬するベクターがこれらの細胞株に移入されるとき、当該遺伝子を含むベクターは複製され、ヘルパー細胞によってシス内に設けられた機構により、新レトロウィルス粒子にパッケージングされる。機構のためのゲノムは必要なシグナルを欠くため、パッケージングされない。
２．アデノウィルスベクター
複製欠損アデノウィルスの構造は、（Ｂｅｒｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ６１：１２１３〜１２２０（１９８７）；Ｍａｓｓｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８７２〜２８８３（１９８６）；Ｈａｊ−Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５７：２６７〜２７４（１９８６）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１：１２２６〜１２３９（１９８７）；Ｚｈａｎｇ、「リポソーム−介在形質導入とＰＣＲ分析による組み換えアデノウィルスの生成と特定」、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１５：８６８〜８７２（１９９３））に記載されている。これらのウィルスをベクターとして使用する利点は、それらのウィルスが最初に感染された細胞内で複製することができるため、他の細胞種に拡がることができる程度に制限されているが、新たな感染性ウィルス粒子を形成することができないことである。組み換えアデノウィルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、ＣＮＳ柔組織、および多数の他の組織部位への直接的な生体内輸送後、高効率の遺伝子導入を達成することが立証されている（Ｍｏｒｓｙ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１５８０〜１５８６（１９９３）；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：３８１〜３８７（１９９３）；Ｒｏｅｓｓｌｅｒ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１０８５〜１０９２（１９９３）；Ｍｏｕｌｌｉｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ４：１５４〜１５９（１９９３）；Ｌａ Ｓａｌｌｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：９８８〜９９０（１９９３）；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５１２９〜２５１３４（１９９２）；Ｒｉｃｈ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ４：４６１〜４７６（１９９３）；Ｚａｂｎｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：７５〜８３（１９９４）；Ｇｕｚｍａｎ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７３：１２０１〜１２０７（１９９３）；Ｂｏｕｔ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３〜１０（１９９４）；Ｚａｂｎｅｒ、Ｃｅｌｌ７５：２０７〜２１６（１９９３）；Ｃａｉｌｌａｕｄ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ５：１２８７〜１２９１（１９９３）；およびＲａｇｏｔ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４：５０１〜５０７（１９９３））。組み換えアデノウィルスは特定細胞表面レセプターに結合することによって遺伝子形質導入を達成し、その後、ウィルスは野生型または複製欠損アデノウィルスと同じように、受容体を介した飲食作用によって内部移行される（ＣｈａｒｄｏｎｎｅｔおよびＤａｌｅｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ４０：４６２〜４７７（１９７０）；ＢｒｏｗｎおよびＢｕｒｌｉｎｇｈａｍ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１２：３８６〜３９６（１９７３）；ＳｖｅｎｓｓｏｎおよびＰｅｒｓｓｏｎ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５５：４４２〜４４９（１９８５）；Ｓｅｔｈ、ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６５０〜６５５（１９８４）；Ｓｅｔｈ、ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１５２８〜１５３３（１９８４）；Ｖａｒｇａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ６５：６０６１〜６０７０（１９９１）；Ｗｉｃｋｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．、��ｅｌｌ７３：３０９〜３１９（１９９３））。
【０４２５】
好適なウィルスベクターは、Ｅ１遺伝子を除去させたアデノウィルスに基づくベクターであり、これらのｖｉｒｏｎｓはヒト２９３細胞株などの細胞株内で生成される。別の好適な実施形態では、Ｅ１およびＥ３遺伝子の両方が、アデノウィルスゲノムが除去される。
【０４２６】
別の種類のウィルスベクターはアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）に基づく。この欠損パルボウィルスは多くの細胞種を感染させることができ、人間に対しては非病原性であるため、好適なベクターである。ＡＡＶ種ベクターは約４〜５ｋｂを移送することができ、野生型ＡＡＶは安定的に染色体１９に挿入されることが既知である。この部位特定統合特性を含むベクターが好適である。この種のベクターの特に好適な実施形態は、Ａｖｉｇｅｎ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡによって作成され、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ遺伝子ＨＳＶ−ｔｋおよび／または緑色蛍光タンパク質ＧＦＰを符号化する遺伝子などの標識遺伝子を含むＰ４．１Ｃベクターである。
【０４２７】
ウィルスおよびレトロウィルスに挿入される遺伝子は通常、所望の遺伝子産物の発現の制御を助けるプロモータおよび／またはエンハンサーを含む。プロモータは概して、転写開始位置に対して相対的に固定された位置にあるときに機能するＤＮＡ配列である。プロモータはＲＮＡポリメラーゼと転写因子の基本的相互作用に必要なコアエレメントを含み、上流エレメントと反応エレメントを含むことができる。
３．ウィルスプロモータおよびエンハンサー
哺乳類宿主細胞内のベクターから転写を制御する好適なプロモータは、各種ソース、たとえば、ポリオーマ、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）、アデノウィルス、レトロウィルス、肝炎−Ｂウィルス、および最も好ましくは サイトメガロウィルスなどのウィルスのゲノム、あるいは異種哺乳類プロモータ、たとえば、βアクチンプロモータから得られる。ＳＶ４０ウィルスの初期および後期プロモータは、ＳＶ４０ウィルス複製起点も含むＳＶ４０制限断片として都合よく入手される（Ｆｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２７３：１１３（１９７８））。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモータは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として都合よく入手される（Ｇｒｅｅｎｗａｙ、Ｐ.Ｊ．ｅt ａｌ．、Ｇｅｎｅ１８：３５５〜３６０（１９８２））。もちろん、宿主細胞または関連種からのプロモータも本明細書では有効である。
【０４２８】
エンハンサーは概して、転写開始部位から距離を固定されず機能するＤＮＡ配列を指し、転写ユニットに対して５'（Ｌａｉｍｉｎｓ、Ｌ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：９９３（１９８１）または３'（Ｌｕｓｋｙ、Ｍ.Ｌ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．３：１１０８（１９８３））のいずれかである。さらに、エンハンサーはイントロン内（Ｂａｎｅｒｊｉ、Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ ３３：７２９（１９８３））および符号化配列自体内（Ｏｓｂｏｒｎｅ、Ｔ．Ｆ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．４：１２９３（１９８４））にあってもよい。それらは通常、長さ１０〜３００ｂｐで、シスで機能する。エンハンサーは、近傍のプロモータからの転写を増やすように機能する。また、エンハンサーは、転写の調節を仲介する反応エレメントを含む場合も多い。プロモータも、転写の調節を仲介する反応エレメントを含むことができる。エンハンサーは、遺伝子の発現の調節を判定する場合が多い。多くのエンハンサー配列は現在哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、インシュリン）から既知だが、通常は真核細胞ウィルスからエンハンサーを使用する。好適な例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００〜２７０ｂｐ）、サイトメガロウィルス初期プロモータエンハンサー複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウィルスエンハンサーである。
【０４２９】
プロモータおよび／またはエンハンサーは、機能をトリガする光または特定の化学事象によって特別に起動させることができる。システムは、テトラサイクリンおよびデキサメタゾンなどの試薬によって調節することができる。ガンマ線照射またはアルキル化化学療法薬剤などの照射によって、ウィルスベクター遺伝子発現を向上させる方法もある。
【０４３０】
プロモータおよび／またはエンハンサー領域は、転写される転写ユニットの領域の発現を最大化するため、構成的プロモータおよび／またはエンハンサーとしての役割を果たすことが好ましい。プロモータおよび／またはエンハンサー領域はすべての真核細胞種において動作可能であることも好ましい。この種の好適なプロモータはＣＭＶプロモータ（６５０ ｂａｓｅｓ）である。他の好適なプロモータは、ＳＶ４０プロモータ、サイトメガロウィルス（全長プロモータ）、およびレトロウィルスベクターＬＴＦである。
【０４３１】
すべての特定調節エレメントはクローンを作り、メラノーマ細胞などの特定細胞種内で選択的に発現される発現ベクターを構築するように使用できることが立証されている。グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモータは、グリアを起源とする細胞内の遺伝子を選択的に発現するように使用されている。
【０４３２】
真核宿主細胞（酵母、菌類、昆虫、植物、動物、人間、または有核細胞）で使用される発現ベクターは、ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼす可能性のある転写の終了に必要な配列も含むことができる。これらの領域は、組織因子タンパク質を符号化するｍＲＮＡの未翻訳領域のポリアデニル化セグメントとして転写される。３'未翻訳領域は、転写終了部位を含むこともできる。転写ユニットはポリアデニリル化領域を含むことが好ましい。この領域の利点の１つは、転写ユニットがｍＲＮＡのように処理され輸送される可能性を増やすことである。発現構築物内のポリアデニリル化シグナルの識別と使用は十分確立されている。同種ポリアデニリル化シグナルは、トランス遺伝子構築物で使用されることが好ましい。転写ユニットの好適な実施形態では、ポリアデニリル化領域は、ＳＶ４０初期ポリアデニリル化シグナルから得られ、約４００ベースから成る。転写ユニットが別の標準的な配列のみで、または上記配列と組み合わせて、構築物からの発現または構築物の安定性を向上させることも好ましい。
４．マーカー
ウィルスベクターは、マーカー産物を符号化する核酸配列を含むことができる。このマーカー産物は、遺伝子が細胞に運ばれているかどうか、およびいったん運ばれれば発現されているかどうかを判定するために使用される。好適な標識遺伝子は、β−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質を符号化する大腸菌ｌａｃＺ遺伝子である。実施形態によっては、マーカーは選択可能マーカーであってもよい。哺乳類細胞用の適切な選択可能マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ヒドロマイシン、およびピューロマイシンである。上記選択可能マーカーが哺乳類宿主細胞に無事移送されれば、転換された哺乳類宿主細胞は、選択的な圧力下に置かれた場合、生存することができる。２つの広く使用される別々のカテゴリーの選択形態がある。第１のカテゴリーは細胞の代謝と、補足された媒体にかかわらず成長する能力を欠く突然変異細胞株の使用とに基づく。２つの例がＣＨＯ  ＤＨＦＲ−細胞とマウスＬＴＫ−細胞である。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンなどの栄養素の追加無しで成長する能力を欠く。これらの細胞は完全なヌクレオチド合成経路に必要な特定の遺伝子を欠いているので、欠けているヌクレオチドが補足媒体で提供されない限り生存不能である。補足媒体の代替となるのが、そのままのＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子を各遺伝子を欠く細胞に導入することによって、成長要件を変更することである。ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子で変換されていない個々の細胞は、非補足媒体において生存することはできない。
【０４３３】
第２のカテゴリーは、任意の細胞種で使用される選択スキームを指し、突然変異細胞株の使用を必要としない支配的な選択である。これらのスキームは通常、宿主細胞の成長を阻止する薬剤を使用する。新規の遺伝子を有するそれらの細胞は、薬剤耐性を付与するタンパク質を発現させ、選択を残す。上記支配的選択の例は薬剤ネオマイシン、（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｐ．およびＢｅｒｇ、Ｐ．、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２））、ミコフェノール酸、（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｒ．Ｃ．およびＢｅｒｇ、Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２０９：１４２２（１９８０））またはヒグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ、Ｂ．ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０〜４１３（１９８５））を使用する。３つの例は、適切な薬剤Ｇ４１８またはネオマイシン（ジェネテシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）またはヒグロマイシンにそれぞれ耐性を付与するため、真核制御下でバクテリア遺伝子を採用する。その他はネオマイシン類似体Ｇ４１８およびプラマイシンなどである。
Ｓ．キット
上述の材料およびその他の材料は、開示された方法を実行する、あるいは開示された方法の実行を助けるのに有効なキットとして、任意の適切な組み合わせで一緒にパッケージングすることができる。所与のキット内のキット構成要素が開示された方法でともに使用されるように設計され適合されていれば有用である。たとえば、１セットのレポーターシグナルおよび１つ以上のインジケータシグナルを具備する、検体分析用のキットが開示されている。
Ｔ．混合物
開示された方法を実行する、あるいは実行を準備することによって形成される混合物が開示されている。たとえば、多次元シグナル、レポーターシグナル、インジケータシグナル、または組み合わせを具備する混合物が開示されている。
【０４３４】
該方法が構成物、構成要素、または試薬を混合する、あるいは接触させることを含む場合は必ず、該方法を実行すると、多数の様々な混合物が生じる。たとえば、該方法が３つの混合ステップを有する場合、これらの各ステップの実行後、ステップが別々に実施されていれば独自の混合物が形成される。さらに、ステップの実行方法にかかわらず、混合物は全ステップの終了時に形成される。本開示では、開示された方法の実行によって得られるこれらの混合物と、たとえば、本明細書に開示される開示された試薬、構成物、または構成要素の混合物を意図する。
Ｕ．システム
開示された方法を実行する、あるいは実行を助けるのに有効なシステムが開示されている。システムは概して、構造、機械、装置など、および構成物、化合物、材料などの製品の組み合わせを具備する。開示される、あるいは開示から自明である組み合わせも意図される。たとえば、パターンを分析し、分析サンプルの部分またはさらなる分析を選択する手段を有する質量分析計を具備するシステムが開示され意図される。
Ｖ．データ構造およびコンピュータ制御
開示された方法で使用され、開示された方法によって生成され、あるいは開示された方法から生成されるデータ構造が開示される。データ構造は概して、組成または媒体において回収され、編成され、記憶され、および／または具体化される任意の形式のデータ、情報、および／またはオブジェクトである。ＲＡＭまたは記憶ディスクなどに電子形式で記憶されるタンパク質シグニチャは、１種のデータ構造である。
【０４３５】
開示された方法、あるいはその１部またはそのための準備は、コンピュータ制御によって制御され、管理され、あるいはそれ以外の方法で支援されることができる。上記コンピュータ制御はコンピュータ制御化プロセスまたは方法によって達成することができ、データ構造を使用および／または生成することができ、コンピュータプログラムを使用することができる。上記コンピュータ制御、コンピュータ制御化プロセス、データ構造、およびコンピュータプログラムが意図されており、本明細書で開示されていると理解されるべきである。
例証
開示された方法は、開示された方法の例を含む以下の例証によって理解を深めることができる。例証は、いかなる形でも該方法の範囲を制限することを意図していない。
Ａ．例証１：セットの等圧レポーターシグナルおよびインジケータシグナル；重同位体
この例証は、特定のペプチド結合を断片化し、重同位体を使用して異なるレポーターシグナルで質量を差別的に分布する、同じ質量のペプチドレポーターシグナルを利用する。たとえば、イオントラップでは、アルギニンを含むペプチドはアスパラギン酸またはグルタミン酸残留物のＣ−末端で優先的に断片化し、ペプチドを含むプロリンはプロリン残留物のＮ−末端で断片化することが実証されている（ＱｉｎおよびＣｈａｉｔ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．（オランダ）、１９０〜１９１：３１３〜２０（１９９９））。ＤＰ（アスパラギン酸（Ｄ）およびプロリン（Ｐ））アミノ酸配列は開示されたレポーターシグナルで使用することができ、結果的にアスパラギン酸とプロリン間の切断結合で衝突誘導断片化を招く。
【０４３６】
典型的なペプチドＡＧＳＬＤＰＡＧＳＬＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の単電荷イオンは、質量分析計の衝突細胞内の「Ｄ」と「Ｐ」間を断裂する。自然に豊富な同位体を使用し、単電荷親イオンは平均名目（ｍ／ｚ）＝１０４３ａｍｕを有し、推定される、結果として生じる娘イオンＡＧＳＬＤ＋（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸１〜５）およびＰＡＧＳＬＲ＋（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸６〜１１）はそれぞれ名目（ｍ／ｚ）４６１ａｍｕおよび６００ａｍｕを有する。実質的には、断片化は通常、１つの支配的な娘イオン、すなわちこの場合ＰＡＧＳＬＲ＋（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸６〜１１）をもたらす。この例証のために、単電荷親の個体数から１つのみの電荷娘について検討する。一般性または適用可能性を失うことなく、これらの娘イオンチャネルへの分枝比は、ＰＡＧＳＬＲ＋（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸６〜１１）娘断片への１００％以外となることができることに注意されたい。
【０４３７】
上記ペプチドを構築するために標準的な合成方法を利用することができる。このレポーター分子の例証では、同位体標識アミノ酸について検討する（たとえば、Ａ対Ａ＊、ただし、ＡはＣＨ３、Ａ＊はＣＤ３側鎖を有する）。括弧内に示される名目（ｍ／ｚ）を有する合成ペプチドに関してはＡＧＳＬＤＰＡＧＳＬＲ（１０４３）、Ａ＊ＧＳＬＤＰＡＧＳＬＲ（１０４６）、ＡＧＳＬＤＰＡ＊ＧＳＬＲ（１０４６）、Ａ＊ＧＳＬＤＰＡ＊ＧＳＬＲ（１０４９）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の４つの可能性がある。この例では、レポーターシグナルおよび未標識ペプチドＡＧＳＬＤＰＡＧＳＬＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）として１０４６の一般的な記載質量電荷比、インジケータシグナルとして１０４３の記載質量電荷比を有する２つの単標識ペプチドＡ＊ＧＳＬＤＰＡＧＳＬＲ、ＡＧＳＬＤＰＡ＊ＧＳＬＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を検討する。
【０４３８】
開示された方法の好適なモードの簡単な実証として、３つの合成ペプチドを含む溶液について検討する。この溶液は、以下の任意数の生物学的実験後に回収され、概して処理のため、多くの追加構成要素を含む。
【０４３９】
ＡＧＳＬＤＰＡＧＳＬＲ、Ａ＊ＧＳＬＤＰＡＧＳＬＲ、およびＡＧＳＬＤＰＡ＊ＧＳＬＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を含む溶液は、質量分析による分析を実行するため適切なマトリクス溶液と混合される。シナピン酸、４−ヒドロキシ−α−シアノ桂皮酸、または２，５−ジヒドロキシ安息香酸などの適切な基質は当該技術において既知である。
【０４４０】
結果として生じる溶液はＭＡＬＤＩ標的上に斑点をつけられ、結晶化させることができる。標的は、四極子飛行時間型（たとえば Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＱＳＴＡＲまたはＷａｔｅｒｓ ＱｔｏＦ）のタンデム質量分析計のソースに挿入される。ＭＡＬＤＩ標的上のサンプル斑点に衝突するレーザを利用して、多くのイオンが第１の四極子Ｑ０に導入される。Ｑ０に導入された種の中で、当該技術において既知なように、大部分は単電荷種（ＡＧＳＬＤＰＡＧＳＬＲ＋、Ａ＊ ＧＳＬＤＰＡＧＳＬＲ+<「１」>、ＡＧＳＬＤＰＡ＊ＧＳＬＲ＋；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、各種断片化イオン、中性マトリクス、マトリクスイオン、および多量体である。中性粒子は、第２の四極子Ｑ１内に誘導されずにＱ０から消え去る。
【０４４１】
Ｑ０に導入されるイオンは、ＤＣ界のみで動作する（質量／電荷フィルタではなくイオンパイプとしての役割を果たす）、Ｑ１を含むより高い真空領域に誘導され、飛行時間分析器で検出される。結果として生じるスペクトル（ＭＳスペクトル）は、ｍ／ｚ＝３によって分離されるダブレットピーク毎に分析される。ダブレットピークの識別に基づき、四極子Ｑ１は、より高い質量電荷比のダブレットを有するイオンを第３の四極子Ｑ２を通過させるように設定される（Ａ＊ＧＳＬＤＰＡＧＳＬＲおよびＡＧＳＬＤＰＡ＊ＧＳＬＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）が同じ質量対電荷を有する、質量分析の専門用語で言えば「等圧」であることを想起されたい）。１０４６と異なる質量電荷比を有するイオンは、Ｑ１−Ｑ２軸上でＱ１を出ない軌道をたどり、有効に切り捨てられる。これにより、システムの信号対雑音が大幅に増大し、この質量フィルタリングを持たないシステムに対して約１００〜１０００倍向上する。
【０４４２】
Ｑ２を取り巻く衝突細胞はペプチドイオン、通常、数ミリトールのアルゴンまたは窒素のＤＰ切断結合の優先的な切断を引き起こすように、適切な圧力で化学的に不活性なガスを充填される。上述したように、単電荷親イオンの断片化は、主に１つの娘イオンをもたらすと予測される。この場合、等圧親（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）はそれぞれ、相関関係を有する独自の娘（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸１〜５および６〜１１）をもたらす。
Ａ＊ＧＳＬＤＰＡＧＳＬＲ＋→Ａ＊ＧＳＬＤ＋ＰＡＧＳＬＲ＋（ｍ／ｚ６００）
ＡＧＳＬＤＰＡ＊ＧＳＬＲ＋→ＡＧＳＬＤ＋ＰＡ＊ＧＳＬＲ＋（ｍ／ｚ６０３）
本明細書で説明される質量分析計の解析度は約５０００〜１００００であるため、３ａｍｕの差はこれらの（ｍ／ｚ）で容易に得られる。
【０４４３】
Ｑ２を出るイオンは、機器の飛行時間（ＴＯＦ）部に入る。過渡電場勾配が印加されて、正電荷イオンはリフレクトロンに向かって加速され、最終的に検出器に至る。イオンはすべて同一の電場勾配を通って加速される（当該技術において既知なように、リフレクトロンはこの判定での小さな乱れを相殺する）ため、すべてのイオンに同一の運動エネルギーを加えられる。運動エネルギーはすべてのイオンで同一であり、イオンの質量は異なるため、イオンが検出器に到達するのにかかる時間は異なる。重いイオンは軽いイオンよりも後で到着する。
【０４４４】
結果として生じる質量スペクトル（ＭＳ／ＭＳスペクトル）は、最初のサンプル内の２つの検体（たとえば、ペプチド）の相対量を反映する。
【０４４５】
所定パターンの識別（ｍ／ｚ＝３によって分離されるダブレットピーク）およびその後のダブレットにおけるより高いｍ／ｚのピークの通過の利点は、様々なｍ／ｚの多次元シグナルをさらに多く含む検定においてより自明である。このような場合、ＭＳスペクトルはダブレット毎に分析され、所定パターンに含まれるピークのみがＭＳ／ＭＳスペクトルの回収のために通過される。このスキームはより多くの検体（たとえば、ペプチド）に拡張可能である。Ｘ／Ｘ＊差を利用する、上記ペプチドに基づく等圧検出器のパネルに関する最も基本的な拡張を表２に示す。アスタリスクは重同位体標識アミノ酸を表す。このセットは、各残留物に対する未標識質量から標識質量への変化｛（ｍ／ｚ）ｘ＊−（ｍ／ｚ）ｘ｝が同一であると推定する。｛（ｍ／ｚ）ｘ＊ −（ｍ／ｚ）ｘ｝がすべての残留物に対して同一ではない一般的なケースでは、質量分析計によって分解可能な所与のペプチドはより多い。親分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２であり、一次娘はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸６−１１である。
【０４４６】
【表２】
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特定同位体標識アミノ酸の合成は、パネルサイズの急速な増大を促進する。たとえば、ＣＨ３、ＣＨ２Ｄ、ＣＨＤ２、ＣＤ３側鎖と独自のアラニンの合成は、小さなペプチドで相当なパネルサイズをもたらすのに使用することができる。
【０４４７】
このモードの開示された方法は、すべての検出されたイオンが非常に類似した化学的環境を起点とし（数個の中性子の位置で異なるだけである）、ＭＡＬＤＩソースおよび衝突細胞内で処理されるときに（すべて実質的な目的で）同一の挙動をとるという所望の特性を有する。特に注目すべきは、等圧レポーターシグナル分子のうちの１つが検定のために使用される等圧検出器分子に対する計量基準として追加されるケースである。検定で使用される全セットの検出器分子の計量は単純であり、定量的である。分子が同位体濃縮を除いてほぼ同一である場合、すべての同重核は処理を通じて同一の挙動をとる。
Ｂ．例証２：２つの等圧セットの多次元シグナル；切断結合
この例証は、結合が異なるレポーターシグナルでは異なる位置に配置される特定のペプチド結合で切断される、同じ質量を有するペプチドレポーターシグナルを利用する。上述したように、アミノ酸配列を有するＤＰは、衝突細胞内のアスパラギン酸とプロリン間を切断する。開示された方法で有効な複数セットのペプチドは以下であってもよい。
等圧セット１：
ペプチドＣ：ＹＦＭＴＳＧＣＤＰＧＧＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）
ペプチドＤ：ＹＦＭＴＳＧＤＰＣＧＧＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）
ペプチドＥ：ＹＦＭＴＳＤＰＧＣＧＧＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）
ペプチドＦ：ＹＦＭＴＤＰＳＧＣＧＧＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）
ペプチドＧ：ＹＦＭＤＰＴＳＧＣＧＧＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）
等圧セット２：
ペプチドＨ：ＹＦＭＴＳＧＣＤＰＧＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）
ペプチドＩ：ＹＦＭＴＳＧＤＰＣＧＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）
ペプチドJ：ＹＦＭＴＳＤＰＧＣＧＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）
ペプチドK：ＹＦＭＴＤＰＳＧＣＧＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）
ペプチドL：ＹＦＭＤＰＴＳＧＣＧＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）
２つのセットのペプチドは、ＤＰジペプチドの位置と、位置１１のアミノ酸（グリシンまたはアラニン）で異なる。等圧セット１のペプチドは、等圧セット２のペプチドと質量で１４ａｍｕ異なる（グリシンとアラニン間の質量差に基づく）。
【０４４８】
簡潔にするため、これらの合成ペプチドを含む溶液について検討する。この溶液は、任意数の生物学的実験後に回収することができ、概して処理のため、多くの追加の構成要素を含む。Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌを含む溶液は、質量分析による分析を実行するため適切なマトリクス溶液と混合される。シナピン酸、４−ヒドロキシ−α−シアノ桂皮酸、または２，５−ジヒドロキシ安息香酸などの適切なマトリクスは当該技術において既知である。
【０４４９】
結果として生じる溶液はＭＡＬＤＩ標的上に斑点をつけられ、結晶化させることができる。
【０４５０】
標的は、四極子飛行時間型（たとえば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＱＳＴＡＲまたはＷａｔｅｒｓ  ＱｔｏＦ）のタンデム質量分析計のソースに挿入される。
【０４５１】
ＭＡＬＤＩ標的上の斑点に衝突するレーザを利用して、多くのイオンが第１の四極子Ｑ０に導入される。Ｑ０に導入された種は、当該技術において既知なように、Ｃ＋、Ｄ＋、Ｅ＋、Ｆ＋、Ｇ＋、Ｈ＋、Ｉ＋、Ｊ＋、Ｋ＋、Ｌ＋、各種断片化イオン、マトリクスイオン、および多量体である。中性粒子は、Ｑ１内に誘導されずにＱ０から消え去る。
【０４５２】
Ｑ０に導入されるイオンは、ＤＣ界のみで動作する（質量／電荷フィルタではなくイオンパイプとしての役割を果たす）、Ｑ１を含むより高い真空領域に誘導され、飛行時間分析器で検出される。結果として生じるスペクトル（ＭＳスペクトル）は、ｍ／ｚ＝１４によって分離されるダブレットピーク毎に分析される。ダブレットピークの識別に基づき、四極子Ｑ１は、より低い質量電荷比のダブレット（（ｍ／ｚ）Ｃ、（ｍ／ｚ）Ｄ、（ｍ／ｚ）Ｅ、（ｍ／ｚ）Ｆ、（ｍ／ｚ）Ｇ。それらは同一の分子量を有し「等圧」である）有するイオンと、より高い質量電荷比のダブレット（（ｍ／ｚ）Ｈ、（ｍ／ｚ）Ｉ、（ｍ／ｚ）Ｊ、（ｍ／ｚ）Ｋ、（ｍ／ｚ）Ｌ。それらは同一の分子量を有し「等圧」である）有するイオンとを第３の四極子Ｑ２を個々に通過させるように設定される。（ｍ／ｚ）Ｃ、（ｍ／ｚ）Ｄ、（ｍ／ｚ）Ｅ、（ｍ／ｚ）Ｆ、（ｍ／ｚ）Ｇ、（ｍ／ｚ）Ｈ、（ｍ／ｚ）Ｉ、（ｍ／ｚ）Ｊ、（ｍ／ｚ）Ｋ、（ｍ／ｚ）Ｌと異なる質量電荷比を有するイオンは、Ｑ１−Ｑ２軸上でＱ１を出ない軌道をたどり、有効に切り捨てられる。これにより、システムの信号対雑音が大幅に増大し、この質量フィルタリングを持たないシステムに対して約１００〜１０００倍向上する。
【０４５３】
Ｑ２を取り巻く衝突細胞は、Ｄ−Ｐ結合、通常、数ミリトールのアルゴンまたは窒素の切断を引き起こすように、適切な圧力で化学的に不活性なガスが充填される。低い質量電荷比のダブレットを有するイオンのみ、ＤＰ結合での断片化、Ｃ末端断片による電荷の総保持、およびＲＦのみのモードでのＱ２の動作を考えると、Ｑ２から現れＴＯＦ部に至ることのできるイオンは５つある。
Ｃ１＋：ＰＧＧＲ＋（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のアミノ酸９〜１２）
Ｄ１＋：ＰＣＧＧＲ＋（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸８〜１２）
Ｅ１＋：ＰＧＣＧＧＲ＋（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５のアミノ酸７〜１２）
Ｆ１＋：ＰＳＧＣＧＧＲ＋（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のアミノ酸６〜１２）
Ｇ１＋：ＰＴＳＧＣＧＧＲ＋（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７のアミノ酸５〜１２）
断片化イオンの同様のシリーズは、高い質量電荷比のダブレットを有するイオンのＱ２分析から生じる。
【０４５４】
Ｑ２を出るイオンは、機器の飛行時間（ＴＯＦ）部に入る。過渡電場勾配が印加されて、正電荷イオンはリフレクトロンに向かって加速され、最終的に検出器に至る。イオンはすべて同一の電場勾配を通って加速される（当該技術において既知なように、リフレクトロンはこの判定での小さな乱れを相殺する）ため、同一の運動エネルギーを加えられる。運動エネルギーはすべてのイオンで同一であり、イオンの質量は異なるため、イオンが検出器に到達するのにかかる時間は異なる。重いイオンは軽いイオンよりも後で到着する。
【０４５５】
結果として生じる質量スペクトル（ＭＳ／ＭＳスペクトル）は、最初のサンプルにおける検体（たとえば、ペプチド）の相対量を表す。
【０４５６】
所定パターンの識別（ｍ／ｚ＝１４によって分離されるダブレットピーク）およびその後のダブレットにおけるピークの通過の利点は、様々なｍ／ｚの多次元シグナルをさらに多く含む検定においてより自明である。このような場合、ＭＳスペクトルはダブレット毎に分析され、所定パターンに含まれるピークのみがＭＳ／ＭＳスペクトルの回収のために通過される。
【０４５７】
検体と同じ質量を有する基準は、数量的な結果を得る助けとなるように追加することができる。数量的な結果を引き出すために、検討中の分子の相対的効率を、単純なプロセスである較正で使用されるように判定すべきである。
例
この例は、多次元シグナルでのタンパク質の標識付けと、ＭＳ／ＭＳデータの収集および分析のためＭＳ次元でのパターン認識とを含む開示された方法の例を提供する。
【０４５８】
図１に示される２サンプル検定を検討する。この検定では、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）が典型的なタンパク質として選択された。一般的なＢＳＡサンプルが（２つのサンプルを構成する）２つの部分に分割され、複数セットの多次元シグナル（表３）と反応させられた。
【０４５９】
２セットの多次元標識が使用された（標識セット１および標識セット２；表３を参照）。所与のセットのメンバーは等圧である（標識セット１の全メンバーが互いに等圧であり、標識セット２の全メンバーが互いに等圧である）。すなわち、セット内で、標識は等圧である。上記セットは、等圧セットと称することができる。標識セット１のメンバーは、標識セット２のメンバーと等圧ではない。すなわち、標識セット１および標識セット２は互いに等圧ではない。多次元シグナルの特性を表３に示す。  
【表３】
2008529035.tif 000005
表３．システイン側鎖を標識付けするための多次元シグナル（標識）の選択された特性。Ｒｘは、アルキル化による共有結合を生成するスルフヒドリル反応性基（短リンカーを含む）を表す。ｇはグリシン残留物を表す。Ｇは、ｇに対して１３Ｃ（２位置）と１５Ｎ（１位置）で濃縮されたグリシン残留物を表す。標識セット１のメンバーは、６つの重グリシン残留物を組み込むため、標識セット２のメンバーより名目上１８ダルトン重いことに注意されたい。
【０４６０】
牛血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ＃  Ａ７０３０）は、変性緩衝剤（５０ｍＭの重炭酸アンモニウム、ｐＨ８．５、６Ｍ  Ｕｒｅａ、０．５ｍＭトリス（２−カルボキシル、塩酸ホスフィン、すなわち、ＴＣＥＰ）内で溶解され、３０分間３７℃で培養することによって変性させられた。ｉＰＲＯＴペプチド標識は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｏ  Ｃｏ．によって合成され精製された。各標識はＤＭＳＯ内で１０ｍｇ／ｍｌ濃度まで溶解された。等圧ｉＰＲＯＴ標識の名目上等圧のカクテルは、標識の同量の等圧セットを組み合わせることによって調剤された。７つの「重」標識（標識セット１、表３）を有するものと、５つの「軽」標識（標識セット２、表３）を有するものの２つのカクテルが作成された。変性後、ＢＳＡは、ＢＳＡの１μｇ当たりに６μｇの標識（「重」または「軽」カクテルのいずれか）を混合し、室温（２４〜２５℃）の暗所で２時間培養することによって標識付けされた。標識付け反応ごとのｉＰＲＯＴ濃度は３．６ｍＭだった。標識付け後、β−メルカプトエタノールが、余分な標識を消失させるために、８０ｍＭの最終濃度まで追加された。
【０４６１】
非等圧セットの標識ＢＳＡの混合物は、等量の「重」および「軽」 標識付け反応を混合することによって作成された（図１を参照）。その後、標識付け溶液の混合物は、０．１Ｍの重炭酸アンモニウムに対して透析された。標識ＢＳＡは、アガロースビーズ（ＰＩＥＲＣＥ  ＣＡＴ＃２０２３０）に固定されたトリプシンで消化された。最初に、ビーズは０．１Ｍの重炭酸アンモニウム内で完全に洗浄処理され、５０％スラリーとして作成された。ある量のこのスラリーは、ある量の透析されたＢＳＡ溶液と混合され、一晩（〜１６時間）３７℃で攪拌して培養された。上澄みはｉＰＲＯＴ−標識トリプシンペプチドを含んで回収された。
【０４６２】
結果として生じる混合物は、ＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析された。サンプルペプチド（多次元シグナルで標識付けされたＢＳＡのトリプシン断片を表す）は、当該技術によって既知なように、逆相高性能液体クロマトグラフィによって疎水性にしたがい分離された。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ＬＴＱに接続されたＡｇｉｌiｅｎｔ１１００ＬＣ、またはｏ−ＭＡＬＤＩソースを有するＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ  ＱＳＴＡＲ  Ｐｕｌｓａｒを用いてデータが回収された。結果として生じる断片は、ＭＡＬＤＩタンデム質量分析とＥＳＩタンデム質量分析によって分析された。ＬＣ工程の典型的スペクトルは、多次元シグナルで標識付けされた牛血清アルブミン断片の質量分析スペクトルのグラフである図２Ａおよび２Ｂに示される。図２Ａは１２００〜２５００ｍ／ｚを対象とする。図２Ｂは５００〜１２００ｍ／ｚを対象とする。これらのスペクトルは所定パターンが識別される、開示された方法におけるインジケータレベルの分析の例を表し、ＭＡＬＤＩデータ（図２Ａ）は単電荷種（すなわちz＝１）によって支配され、ＥＳＩ（図２Ｂ）は多電荷種（ｚ＝２、３）によって支配される。
【０４６３】
対のイオンのパターンは極めて認識可能で、いくつかのイオン種を表す。図２Ａは１２００〜２５００ｍ／ｚを対象とする。図２Ｂは５００〜１２００ｍ／ｚを対象とする。これらのスペクトルは所定パターンが識別される、開示された方法におけるインジケータレベルの分析の例を表す。図２ＡはＭＡＬＤＩ  ＱＳＴＡＲ機器からである。１８ダルトンの間隔を置くダブレットは、表３に示される標識セット１（重）および標識セット２（軽）のメンバー間の質量差に相当する。ｍ／ｚ＝１３６０に近い対は、２つのシステインを有するペプチド、よって２つの多次元シグナルに対応する３６ダルトン毎に間隔を置く。２つの多次元シグナルの存在は、標識セット１のメンバーと標識セット２のメンバーで標識付けされる断片間の質量差を２倍にする。図２Ｂは、ＥＳＩ  ＬＴＱ  ＦＴＭＳからである。１８ダルトンの間隔を置くダブレットは、表３に示される標識セット１（重）および標識セット２（軽）のメンバー間の質量差に相当する。これらのダブレット（１８ダルトンの倍数の間隔を置く）は、標識セット１および標識セット２での多次元標識の使用から予測される所定パターンを表す。これらの個々のイオン種は、ＭＳ／ＭＳ実験を実行することによって引き出すことができる。
【０４６４】
ＥＳＩ  ＬＴＱ  ＦＴＭＳ機器からの典型的ＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図３Ａおよび３Ｂは、多次元シグナルで表示付けされる牛血清アルブミン断片の質量分析スペクトルのグラフである。これらのスペクトルは、所定パターンにより識別されるサンプル部分がさらなる分析を受ける（この場合、ＭＳ／ＭＳ）、開示された方法におけるレポーターレベルの分析の例を示す。図３Ａは、図２Ｂに示される８９８．４４ｍ／ｚがピーク（ダブレットの軽い方のピーク）のＭＳ／ＭＳスペクトルである。このピークは、所定パターン（１８ダルトンの倍数で間隔を置かれたピークダブレット）に基づく図３に示されるさらなる分析のために識別された図２Ｂで分析されるサンプル部分を示す。このピークは、標識セット２（軽い方のセット；表３を参照）からの多次元シグナルで標識付けされるタンパク質断片を表す。多次元シグナルは、シグナル内のＤ−Ｐ残留物で断片化され、特徴的な質量の断片の対を生成する。図３Ａの２セットの５つのピークは、多次元シグナルの断片化から生じる断片の対を示す（１セットのピーク中の１つのピークが別のセット中の１つのピークと対を成す）。１セットの５つのピークは約６０ダルトン毎に分離される。図３Ａおよび３Ｂのスペクトルは、多次元シグナルで標識付けされる牛血清アルブミン断片の質量分析スペクトルのグラフである。これらのスペクトルは、所定パターンにより識別されるサンプル部分がさらなる分析を受ける（この場合、ＭＳ／ＭＳ）、開示された方法におけるレポーターレベルの分析の例を示す。図３Ａは、図２Ｂに示される８９８．４４ｍ／ｚがピーク（ダブレットの軽い方のピーク）のＭＳ／ＭＳスペクトルである。このピークは、所定パターン（１８ダルトンの倍数で間隔を置かれたピークダブレット）に基づく図３Ａに示されるさらなる分析のために識別された図２Ｂで分析されるサンプル部分を示す。このピークは、標識セット２（軽い方のセット；表３を参照）からの多次元シグナルで標識付けされるタンパク質断片を表す。多次元シグナルは、シグナル内のＤ−Ｐ残留物で断片化され、特徴的な質量の断片の対を生成する。図３Ａの２セットの５つのピークは、多次元シグナルの断片化から生じる断片の対を示す（１セットのピーク中の１つのピークが別のセット中の１つのピークと対を成す）。１セットの５つのピークは約６０ダルトン毎に分離され、ｍ／ｚ＝９００に近い二重電荷状態のイオンの選択に担当する図２Ａおよび２Ｂは多次元シグナルで標識付けされた牛血清アルブミン断片の質量分析スペクトルのグラフである。図２Ａは１２００〜２５００ｍ／ｚを対象とする。図２Ｂは５００〜１２００ｍ／ｚを対象とする。これらのスペクトルは、所定パターンが識別される開示された方法におけるインジケータレベルの分析の例を示す。ＢＣダブレットのうち１方のピークが図３Ａで分析され、他方が図３Ｂで分析された後で、衝突誘発断片化から２つの単独電荷断片が生じる（１方の群が約ｍ／ｚ＝４６０を中心とし、他方の群が約ｍ／ｚ＝１３５０を中心とする）。図３Ａは、図２Ｂに示される８９８．４４ｍ／ｚがピーク（ダブレットの軽い方のピーク）のＭＳ／ＭＳスペクトルである。このピークは、所定パターン（１８ダルトン��倍数で間隔を置かれたピークダブレット）に基づく図３Ａに示されるさらなる分析のために識別された図２Ｂで分析されるサンプル部分を示す。このピークは、標識セット２（軽い方のセット；表３を参照）からの多次元シグナルで標識付けされるタンパク質断片を表す。多次元シグナルは、シグナル内のＤ−Ｐ残留物で断片化され、特徴的な質量の断片の対を生成する。図３Ａの２セットの５つのピークは、多次元シグナルの断片化から生じる断片の対を示す（１セットのピーク中の１つのピークが別のセット中の１つのピークと対を成す）。１セットの５つのピークは約６０ダルトン毎に分離される。
【０４６５】
図３Ｂは、図２Ｂに示される９０７．４５ｍ／ｚがピーク（ダブレットの重い方のピーク）のＭＳ／ＭＳスペクトルである。このピークは、所定パターン（１８ダルトンの倍数で間隔を置かれたピークダブレット）に基づく図３Ｂに示されるさらなる分析のために識別された図２Ｂで分析されるサンプル部分を示す。このピークは、標識セット１（重い方のセット；表３を参照）からの多次元シグナルで標識付けされるタンパク質断片を表す。多次元シグナルは、シグナル内のＤ−Ｐ残留物で断片化され、特徴的な質量の断片の対を生成する。図３Ｂの２セットの７つのピーク（グラフではより密な間隔である）は、多次元シグナルの断片化から生じる断片の対を示す（１セットのピーク中の１つのピークが別のセット中の１つのピークと対を成す）。１セットの７つのピークは約３ダルトン毎に分離される（グラフの解像度ではあまりよく解析されていない）。
【０４６６】
開示された方法および構成は、上述された特定の方法論、プロトコル、および試薬に限定されず、変更可能であると理解される。また、本明細書で使用される用語は特定の実施形態のみを記載する目的で使用されており、本発明の範囲を限定することを目的とせず、本発明の範囲は添付の請求項によってのみ限定されると理解される。
【０４６７】
本明細書および添付の請求項において使用されるように、文脈上明確に別の意味が示されない限り、単数表現は複数表現を含むと了解しなければならない。よって、たとえば、「レポーターシグナル」という言及は複数のレポーターシグナルを含み、「オリゴヌクレオチド」という言及は、１つ以上のオリゴヌクレオチド類および当業者にとって既知な等価物などを指す。
「任意の」または「任意に」は、後で記載される事象、状況、または材料が生じる、または存在してもよいし、生じないまたは存在しなくてもよいことと、説明が事象、状況、または材料が生じるまたは存在する例、事象、状況、または材料が生じないまたは存在しない例を含むことを意味する。
【０４６８】
範囲は本明細書では、「ほぼ」ある特定の値から、および/または、「ほぼ」別の特定の値までとして表すことができる。上記範囲が示される場合、文脈が具体的に別の値を示さない限り、ある特定の値から、および/または、別の特定の値までの範囲が明確に開示されていると意図および考慮される。同様に、「約」という先行詞を用いて値が概算値で示される場合、特定の値は、文脈上明確に別の内容が示されない限り、開示されたとみなすべき他の具体的に意図された実施形態を形成すると理解される。範囲のそれぞれの終点は文脈上明確に別の内容が示されない限り、他の終点に対して、および他の終点とは関係なく、有効であると理解される。最後に、明確に開示された範囲内のすべての値およびその範囲に含まれる値の部分範囲も特定して意図され、文脈上明確に別の内容が示されない限り、開示されたとみなされるべきであると理解すべきである。上記は、特定の場合、これらの実施形態の１部または全部が明確に開示されるかどうかにかかわらず適用される。
【０４６９】
別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、開示された方法および組成が属する技術の当業者にとって共通に理解される意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または等価の方法および材料が本方法および組成の実行または試験に使用可能であるが、特に有益な方法、装置、および材料が記載されている。本明細書に引用される出版物および引用される材料は、言及することにより特にここに組み込む。本明細書のいずれの部分も、本発明が先行する発明に基づき上記開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈すべきではない。どの引例も先行技術を構成するとは認められない。引例に関する説明は、それらの著者が主張する内容を述べており、出願人は引用文献の正確さと関連性に異議を唱える権利を有する。多くの出版物が本明細書で言及されているが、その言及は文献のいずれかが当該技術の一般的知識の一部を成すと認めるものではない。
【０４７０】
明細書と請求項全体を通じて、「具備する」および「具備し」、「具備して」などの変異は、「含むがそれらに限定されない」ことを意味し、たとえば、他の添加物、構成要素、整数、またはステップを排除することを意図するものではないと理解されたい。
【０４７１】
当業者であれば、本明細書に記載される方法および組成の特定の実施形態の多くの等価物を、単なるルーティンの実験を通じて認識する、あるいは突き止めることができるだろう。そのような等価物は請求項に包含されていると意図される。
【図面の簡単な説明】
【０４７２】
【図１】図１は、多次元シグナルの使用例の図である。２つのサンプルは、２セットの多次元シグナル（標識セット１および標識セット２）で個々に標識付けされる。標識サンプルは混合され、トリプシン消化を受ける（これでサンプル内のタンパク質を切断する）。混合されトリプシン処理されたサンプルはＨＰＬＣで浄化され、２回の質量分析を受ける。実施例１は、図１に示されるステップに続く検定の例である。
【図２Ａ】図２Ａおよび２Ｂは多次元シグナルで標識付けされた牛血清アルブミン断片の質量分析スペクトルのグラフである。図２Ａは１２００〜２５００ｍ／ｚを対象とする。図２Ｂは５００〜１２００ｍ／ｚを対象とする。これらのスペクトルは、所定パターンを識別することのできる、開示された方法のインジケータレベルの分析の例を示す。図２ＡはＭＡＬＤＩ  ＱＳＴＡＲ機器からである。１８ダルトンの間隔を置くダブレットは、表３に示される標識セット１（重）と標識セット２（軽）のメンバー間の質量差に相当する。ｍ／ｚ＝１３６０に近い対は、２つのシステイン、したがって２つの多次元シグナルを有するペプチドに対応し、３６ダルトンの間隔を置く。２つの多次元シグナルの存在は、標識セット１のメンバーと標識セット２のメンバーで標識付けされる断片間の質量差を２倍にする。図２ＢはＥＳＩ  ＬＴＱ  ＦＴＭＳからである。１８ダルトンの間隔を置くダブレットは、表３に示される標識セット１（重）と標識セット２（軽）のメンバー間の質量差に相当する。これらのダブレット（１８ダルトンの倍数で間隔を置く）は、標識セット１および標識セット２における多次元標識の使用から予想される所定パターンを表す。実施例１は、図２Ａおよび２Ｂのグラフの生成について説明する。
【図２Ｂ】図２Ａおよび２Ｂは多次元シグナルで標識付けされた牛血清アルブミン断片の質量分析スペクトルのグラフである。図２Ａは１２００〜２５００ｍ／ｚを対象とする。図２Ｂは５００〜１２００ｍ／ｚを対象とする。これらのスペクトルは、所定パターンを識別することのできる、開示された方法のインジケータレベルの分析の例を示す。図２ＡはＭＡＬＤＩ  ＱＳＴＡＲ機器からである。１８ダルトンの間隔を置くダブレットは、表３に示される標識セット１（重）と標識セット２（軽）のメンバー間の質量差に相当する。ｍ／ｚ＝１３６０に近い対は、２つのシステイン、したがって２つの多次元シグナルを有するペプチドに対応し、３６ダルトンの間隔を置く。２つの多次元シグナルの存在は、標識セット１のメンバーと標識セット２のメンバーで標識付けされる断片間の質量差を２倍にする。図２ＢはＥＳＩ  ＬＴＱ  ＦＴＭＳからである。１８ダルトンの間隔を置くダブレットは、表３に示される標識セット１（重）と標識セット２（軽）のメンバー間の質量差に相当する。これらのダブレット（１８ダルトンの倍数で間隔を置く）は、標識セット１および標識セット２における多次元標識の使用から予想される所定パターンを表す。実施例１は、図２Ａおよび２Ｂのグラフの生成について説明する。
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂは多次元シグナルで標識付けされた牛血清アルブミン断片の質量分析スペクトルのグラフである。これらのスペクトルは、所定パターンにより識別されるサンプルの部分がさらなる分析を受ける開示された方法（この場合、ＭＳ／ＭＳ）におけるレポーターレベルの分析の例を示す。図３Ａは、図２Ｂに示される８９８．４４ｍ／ｚがピーク（ダブレットの軽い方のピーク）のＭＳ／ＭＳスペクトルである。このピークは、所定パターン（１８ダルトンの倍数で間隔を置かれたピークダブレット）に基づく図３Ａに示されるさらなる分析のために識別された図２Ｂで分析されるサンプル部分を示す。このピークは、標識セット２（軽い方のセット；表３を参照）からの多次元シグナルで標識付けされるタンパク質断片を表す。多次元シグナルは、シグナル内のＤ−Ｐ残留物で断片化され、特徴的な質量の断片の対を生成する。図３Ａの２セットの５つのピークは、多次元シグナルの断片化から生じる断片の対を示す（１セットのピーク中の１つのピークが別のセット中の１つのピークと対を成す）。１セットの５つのピークは約５７ダルトン毎に分離される。
【０４７３】
図３Ｂは、図２Ｂに示される９０７．４５ｍ／ｚがピーク（ダブレットの重い方のピーク）のＭＳ／ＭＳスペクトルである。このピークは、所定パターン（１８ダルトンの倍数で間隔を置かれたピークダブレット）に基づく図３Ｂに示されるさらなる分析のために識別された図２Ｂで分析されるサンプル部分を示す。このピークは、標識セット１（重い方のセット；表３を参照）からの多次元シグナルで標識付けされるタンパク質断片を表す。多次元シグナルは、シグナル内のＤ−Ｐ残留物で断片化され、特徴的な質量の断片の対を生成する。図３Ｂの２セットの７つのピーク（グラフではより密な間隔である）は、多次元シグナルの断片化から生じる断片の対を示す（１セットのピーク中の１つのピークが別のセット中の１つのピークと対を成す）。１セットの７つのピークは約３ダルトン毎に分離される（グラフの解像度ではあまりよく解析されていない）。実施例１は図３Ａおよび３Ｂのグラフの生成について説明する。
【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは多次元シグナルで標識付けされた牛血清アルブミン断片の質量分析スペクトルのグラフである。これらのスペクトルは、所定パターンにより識別されるサンプルの部分がさらなる分析を受ける開示された方法（この場合、ＭＳ／ＭＳ）におけるレポーターレベルの分析の例を示す。図３Ａは、図２Ｂに示される８９８．４４ｍ／ｚがピーク（ダブレットの軽い方のピーク）のＭＳ／ＭＳスペクトルである。このピークは、所定パターン（１８ダルトンの倍数で間隔を置かれたピークダブレット）に基づく図３Ａに示されるさらなる分析のために識別された図２Ｂで分析されるサンプル部分を示す。このピークは、標識セット２（軽い方のセット；表３を参照）からの多次元シグナルで標識付けされるタンパク質断片を表す。多次元シグナルは、シグナル内のＤ−Ｐ残留物で断片化され、特徴的な質量の断片の対を生成する。図３Ａの２セットの５つのピークは、多次元シグナルの断片化から生じる断片の対を示す（１セットのピーク中の１つのピークが別のセット中の１つのピークと対を成す）。１セットの５つのピークは約５７ダルトン毎に分離される。
【０４７４】
図３Ｂは、図２Ｂに示される９０７．４５ｍ／ｚがピーク（ダブレットの重い方のピーク）のＭＳ／ＭＳスペクトルである。このピークは、所定パターン（１８ダルトンの倍数で間隔を置かれたピークダブレット）に基づく図３Ｂに示されるさらなる分析のために識別された図２Ｂで分析されるサンプル部分を示す。このピークは、標識セット１（重い方のセット；表３を参照）からの多次元シグナルで標識付けされるタンパク質断片を表す。多次元シグナルは、シグナル内のＤ−Ｐ残留物で断片化され、特徴的な質量の断片の対を生成する。図３Ｂの２セットの７つのピーク（グラフではより密な間隔である）は、多次元シグナルの断片化から生じる断片の対を示す（１セットのピーク中の１つのピークが別のセット中の１つのピークと対を成す）。１セットの７つのピークは約３ダルトン毎に分離される（グラフの解像度ではあまりよく解析されていない）。実施例１は図３Ａおよび３Ｂのグラフの生成について説明する。
【図４Ａ】図４Ａおよび４Ｂは、開示された方法における例の論理フローの例を示す図である。図４Ａでは、質量分析スペクトルが集められ（第１の枠）、スペクトルが分析されて非等圧パターンを検出する（第２の枠）。最初の２つの枠はインジケータレベルの分析に対応する。所定パターン（第１の円）に関してスペクトルを走査することができる。所定パターンが検出されない場合、別のサンプルまたはサンプル部分に関してインジケータレベルの分析が繰り返される（第１の円から第１の枠へのループ）。所定パターンが検出される場合、パターンが検出されたサンプル部分が別のレベルの分析のために送られる（第１の円；下向き矢印）。タンデム質量分析スペクトルがサンプル部分上で集められ（第３の枠）、サンプルに関する情報を得るためスペクトルが分析される。第３および第４の枠はレポーターシグナルレベルの分析に対応する。追加サンプル上で分析全体を繰り返すことができる（第２の円から第１の枠へのループ）。
【０４７５】
図４Ｂでは、質量分析スペクトルが集められる（第１の枠）。タンデム質量分析スペクトルがサンプル部分上で集められる（第２の枠）。最初の２つのステージを追加サンプル上で繰り返すことができる（第１の円から第１の枠へのループ）。スペクトルが分析されて非等圧パターンを検出し（第３の枠）、サンプルに関する情報を得るためスペクトルが分析される（第４の枠）。第１および第３の枠はインジケータレベルの分析に対応する。第２および第４の枠はレポーターシグナルレベルの分析に対応する。図４Ｂは、開示された方法におけるレベルの分析のデータ収集およびデータ分析の部分の分離例である。図４は、図１に示される２つの質量分析ステージ内およびステージ間に含めることのできる分析の例である。実施例１は、図４に示される論理フローの使用例を提供する。
【図４Ｂ】図４Ａおよび４Ｂは、開示された方法における例の論理フローの例を示す図である。図４Ａでは、質量分析スペクトルが集められ（第１の枠）、スペクトルが分析されて非等圧パターンを検出する（第２の枠）。最初の２つの枠はインジケータレベルの分析に対応する。所定パターン（第１の円）に関してスペクトルを走査することができる。所定パターンが検出されない場合、別のサンプルまたはサンプル部分に関してインジケータレベルの分析が繰り返される（第１の円から第１の枠へのループ）。所定パターンが検出される場合、パターンが検出されたサンプル部分が別のレベルの分析のために送られる（第１の円；下向き矢印）。タンデム質量分析スペクトルがサンプル部分上で集められ（第３の枠）、サンプルに関する情報を得るためスペクトルが分析される。第３および第４の枠はレポーターシグナルレベルの分析に対応する。追加サンプル上で分析全体を繰り返すことができる（第２の円から第１の枠へのループ）。
【０４７６】
図４Ｂでは、質量分析スペクトルが集められる（第１の枠）。タンデム質量分析スペクトルがサンプル部分上で集められる（第２の枠）。最初の２つのステージを追加サンプル上で繰り返すことができる（第１の円から第１の枠へのループ）。スペクトルが分析されて非等圧パターンを検出し（第３の枠）、サンプルに関する情報を得るためスペクトルが分析される（第４の枠）。第１および第３の枠はインジケータレベルの分析に対応する。第２および第４の枠はレポーターシグナルレベルの分析に対応する。図４Ｂは、開示された方法におけるレベルの分析のデータ収集およびデータ分析の部分の分離例である。図４は、図１に示される２つの質量分析ステージ内およびステージ間に含めることのできる分析の例である。実施例１は、図４に示される論理フローの使用例を提供する。
【図５】図５は、多次元シグナルの使用例の図である。図５は、２つの異なるサンプルセット（対照サンプルおよび試験サンプル）が２つの異なるセットの多次元シグナル（標識セット１および標識セット２）の異なるメンバーで標識付けされる、図１に示される方法の例を示す。この例では、５つの異なる試験サンプルがそれぞれ異なる標識セット２のメンバーで標識付けされ、７つの異なる対照サンプルがそれぞれ異なる標識セット１のメンバーで標識付けされる。標識セットは、たとえば、表３に示される標識セットであってもよい。標識セットと対照および試験サンプル間の相関関係は明瞭化のためであって、方法の限定を示すものではない。標識サンプルが混合されて、トリプシン消化を受ける（これでサンプル内のタンパク質を切断する）。混合され、トリプシン処理されたサンプルはＨＰＬＣで浄化され、２回の質量分析を受ける。好適な形式の方法では、標識セット１および標識セット２全体で標識対照および試験サンプルを混合する。
【図６Ａ】図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃは、ｉＴＲＡＱ多重等圧標識付け化学反応の構造図である。図６Ａは、レポーター基（Ｎ−メチルピペラジンを基本とする）、質量バランス基（カルボニル）、およびペプチド反応性基（ＮＨＳエステル）から成る完全な分子を示す。レポーター基の質量は１１４．１〜１１７．１ｍ／ｚ、バランス基の質量は２８〜３１ダルトンであるため、合わせた質量は４つの試薬のそれぞれで一定である（１４５．１ダルトン）。図６Ｂは、タグがペプチドと反応し、ペプチドアミン（リシンのＮ−末端またはエプシロンアミノ基）へのアミド連結を形成するときの構造を示す。図６Ｃは４つの異なるレポーター基の質量（左）との４つの等圧の組み合わせに至るために使用される同位体タグ付けを示す。多重セットのうち１つのメンバーでそれぞれ標識付けされる４つの同一ペプチドの混合物は、ＭＳ内の単独の未分割前駆イオンとして現れる（同一ｍ／ｚ；中央）。衝突誘導性解離（ＣＩＤ）後、４つのレポーター基イオンは別々の質量として現れる（１１４〜１１７ダルトン；右）。
【図６Ｂ】図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃは、ｉＴＲＡＱ多重等圧標識付け化学反応の構造図である。図６Ａは、レポーター基（Ｎ−メチルピペラジンを基本とする）、質量バランス基（カルボニル）、およびペプチド反応性基（ＮＨＳエステル）から成る完全な分子を示す。レポーター基の質量は１１４．１〜１１７．１ｍ／ｚ、バランス基の質量は２８〜３１ダルトンであるため、合わせた質量は４つの試薬のそれぞれで一定である（１４５．１ダルトン）。図６Ｂは、タグがペプチドと反応し、ペプチドアミン（リシンのＮ−末端またはエプシロンアミノ基）へのアミド連結を形成するときの構造を示す。図６Ｃは４つの異なるレポーター基の質量（左）との４つの等圧の組み合わせに至るために使用される同位体タグ付けを示す。多重セットのうち１つのメンバーでそれぞれ標識付けされる４つの同一ペプチドの混合物は、ＭＳ内の単独の未分割前駆イオンとして現れる（同一ｍ／ｚ；中央）。衝突誘導性解離（ＣＩＤ）後、４つのレポーター基イオンは別々の質量として現れる（１１４〜１１７ダルトン；右）。
【図６Ｃ】図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃは、ｉＴＲＡＱ多重等圧標識付け化学反応の構造図である。図６Ａは、レポーター基（Ｎ−メチルピペラジンを基本とする）、質量バランス基（カルボニル）、およびペプチド反応性基（ＮＨＳエステル）から成る完全な分子を示す。レポーター基の質量は１１４．１〜１１７．１ｍ／ｚ、バランス基の質量は２８〜３１ダルトンであるため、合わせた質量は４つの試薬のそれぞれで一定である（１４５．１ダルトン）。図６Ｂは、タグがペプチドと反応し、ペプチドアミン（リシンのＮ−末端またはエプシロンアミノ基）へのアミド連結を形成するときの構造を示す。図６Ｃは４つの異なるレポーター基の質量（左）との４つの等圧の組み合わせに至るために使用される同位体タグ付けを示す。多重セットのうち１つのメンバーでそれぞれ標識付けされる４つの同一ペプチドの混合物は、ＭＳ内の単独の未分割前駆イオンとして現れる（同一ｍ／ｚ；中央）。衝突誘導性解離（ＣＩＤ）後、４つのレポーター基イオンは別々の質量として現れる（１１４〜１１７ダルトン；右）。
【図７】図７は、４つの等圧試薬のそれぞれで４つの別個の消化物を標識付けし、１：１：１：１の比で反応混合物を組み合わせることにより作製されたタンパク質消化混合物からのペプチドＴＰＨＰＡＬＴＥＡＫのＭＳ／ＭＳスペクトルの例を示す。前駆体の同位体分布（［Ｍ＋Ｈ］＋、１３５２．８４ｍ／ｚ）はｉ）に示される。中央に示されるスペクトルの枠内の構成要素が最下部に示される。ｉｉ）には定量化に使用されるシグニチャイオンを示す低質量領域、ｉｉｉ）にはｂ６断片の同位体分布、ｉｖ）にはＹ７断片の同位体分布が示される。ペプチドは、Ｎ−末端およびＣ−末端リシン側鎖の両方で等圧タグにより標識付けされる。したがって、前駆イオンおよび内部断片イオン（たとえば、タイプｂ−およびタイプｙ−）のすべては、タグセット内の４つのメンバーをすべて含むが、等圧なままである。示される例は、４７００ＭＡＬＤＩＴＯＦ−ＴＯＦ分析器を用いて単一電荷［Ｍ＋Ｈ］＋ペプチドから得られるスペクトルである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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