(57)【要約】本発明はＴＳＳＥ又はプリオン病を検出する方法に関する。本発明は更に、細胞性プリオンＰｒＰＳｃのアイソフォームのオリゴマー化を増幅する為の方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰｒＰＣ細胞性プリオンタンパク質の少なくとも１のＰｒＰＳｃアイソフォームのオリゴマー化を選択的に増幅する方法であって、該ＰｒＰＳｃアイソフォームを、増幅のために適する条件下で、一般式Ｉの少なくとも１の化合物、それらの塩、溶媒和物、異性体又は誘導体の有効量と一緒にすることを特徴とする方法、
[式I]
2008545775.tif 000007
ここで、
Ａは、−Ｃ（Ｈ）ｘＲ１−、−ＣＯ−、−Ｃ（Ｈ）ｘＯ（Ｒ１）−、−Ｃ（Ｈ）ｘＳ（Ｒ１）−、ＣＮ（Ｒ１）（Ｒ２）−基を表し、ｘは０又は１に等しく、Ｒ１及びＲ２は互いに独立して、水素原子、飽和又は不飽和の、線状、分枝状又は環状のＣ１乃至Ｃ６の、必要に応じて置換されているアルキル基を表し、
記号
2008545775.tif 000008
は、ピリミジン環が飽和、不飽和又は芳香族であり得ることを意味し、
Ｒは、
水素原子
ＯＲ’１、Ｎ（Ｒ’１）（Ｒ’２）、ＳＲ’１基、ここでＲ’１及びＲ’２は互いに独立して、Ｒ１及び／又はＲ２について上で定義された基を表す
飽和又は不飽和の、線状、分枝状又は環状の、Ｃ１乃至Ｃ１０の炭化水素に基づく基、ここで炭化水素に基づく鎖が、Ｓ原子、Ｏ原子及びＮ原子から選ばれる１以上のヘテロ原子により必要に応じて中断されていてもよく、かつ必要に応じて置換されてもよい、
から選ばれる基を表し、
ｎはゼロに等しく、又は１から３の整数である。
【請求項２】
増幅がＰｒＰＣアイソフォームの存在下において実施されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ基がピリミジン環の窒素原子上に存在する場合において、Ｒ基が水素原子であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
一般式Ｉの化合物のピリミジン環が芳香環であることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
一般式Ｉ中のｎが１に等しいことを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
Ａが、−ＣＳ（Ｒ１）−モチーフであり、ここでＲ１は請求項１において定義されたアルキル基を表すことを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
一般式Ｉ中において、Ｓ原子、Ｎ原子及びＯ原子から選ばれる１又は２のヘテロ原子を組み込んでいる、不飽和又は芳香族のＣ５乃至Ｃ６のヘテロ環状基をＲが表すことを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
Ｒがチエニル基を表すことを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
フッ素原子、臭素原子、ヨウ素原子及び塩素原子；ＯＨ、ＯＲ’、ＮＲ’Ｒ’’、ＳＲ’及びＲ’基、ここでＲ’及びＲ’’は互いに独立して線状又は分枝状のＣ１乃至Ｃ１０のアルキル基を表す；Ｎ、Ｏ及びＳから選ばれる１以上のヘテロ原子を含む、任意的に置換された、飽和、不飽和又は芳香族のＣ４乃至Ｃ８の、特にはＣ５乃至Ｃ６のヘテロ環状基、から選ばれる置換基によりチエニル基が置換されていることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
一般式Ｉの該化合物が少なくとも１のアミノ酸に結合することができることを特徴とする、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
該化合物が、４−（５−ブロモ−２−チエニル）−２−（メチルチオ）ピリミジン若しくは４−(５−チエニル−２−チエニル)−２−(アミノ)ピリミジン、又はこれらの塩又は誘導体であることを特徴とする、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
一般式Ｉの該化合物が、検出の方法をそれに備えることができる少なくとも１の実体を組み込んでいるその誘導体の形態にあることを特徴とする、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
該実体が発光検出又は親和性による検出のために適当なマーカーであることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１乃至１３のいずれか１項において定義された方法の実施及びＰｒＰＳｃアイソフォームの検出の工程の実施を少なくとも含む、ＰｒＰＣ細胞性プリオンタンパク質の該アイソフォームを検出する為に有用な方法。
【請求項１５】
個体中の脳症の存在又は発生の危険性を検出する為に有用な方法であって、少なくとも：
該個体からの生物学的サンプルを、もしかすると存在するＰｒＰＳｃアイソフォームの増幅のために適当な条件下で、請求項１及び３乃至１３のいずれか１項において定義された一般式Ｉの少なくとも１の化合物の有効量と一緒にすること、及び
該個体中の脳症の存在又は発生の危険性の指標である、該ＰｒＰＳｃアイソフォームのあり得る存在を検出すること、
を含む上記方法。
【請求項１６】
伝達性亜急性海綿状脳症（ＴＳＳＥ）を検出する為に有用である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ヒトにおけるクロイツフェルトヤコブ病、ヒツジ及びヤギにおけるスクレイピー、並びにウシ海綿状脳症を検出する為に有用である、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
一般式Ｉの化合物が、標識系を備えられた誘導体の形態で用いられることを特徴とする、請求項１５乃至１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
該誘導体が発光検出又は親和性による検出に適当なマーカーを組み込むことを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
更に、正常ＰｒＰＣアイソフォームを破壊する為に該サンプルの全部又は一部をプロテアーゼにより処理すること、タンパク質の分離、並びに、特異的な抗体を用いて、もしかすると存在するＰｒＰＳｃアイソフォームの検出が実施されることを特徴とする、請求項１５乃至１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
用いられる該プロテアーゼがプロテアーゼＫであることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
プロテアーゼＫによる処理が、ＰｒＰＳｃタンパク質の全部又は一部を維持しながらＰｒＰＣタンパク質を完全に分解する為に適当な条件下で実施されること、及び続く
ＰｒＰＳｃアイソフォームの検出が実施されることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＰｒＰＣ細胞性プリオンタンパク質の少なくとも１のＰｒＰＳｃアイソフォームのオリゴマー化を選択的に増幅する為に有用なキットにおいて、試薬として、請求項１及び３乃至１３のいずれか１項において定義された一般式Ｉの少なくとも１の化合物を含むことを特徴とするキット。
【請求項２４】
試薬として、標識系を備えられた誘導体の形態にある、請求項１及び３乃至１３のいずれか１項において定義された一般式Ｉの少なくとも１の化合物を含む、脳症、特に動物又はヒトの伝達性亜急性海綿状脳症（ＴＳＳＥ）を診断する為に有用なキット。
【請求項２５】
脳症、特に動物又はヒトの伝達性亜急性海綿状脳症（ＴＳＳＥ）を診断する為に有用なキットにおいて、ＰｒＰアイソフォームに特異的に結合するリガンドとの組み合わせで、請求項１及び３乃至１３のいずれか１項において定義された一般式Ｉの少なくとも１の化合物を試薬として含むキット。
【請求項２６】
ＰｒＰＳｃアイソフォームを認識する抗体又は抗体の混合物をさらに含むことを特徴とする、請求項２４又は２５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は主に、細胞性プリオンタンパク質ＰｒＰＣのＰｒＰＳｃアイソフォームのオリゴマー化及び／又は感染力価を増幅するために有用な方法に関する。本発明は、脳症の、特にはウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含む伝達性亜急性海綿状脳症（ＴＳＳＥ）の診断、特徴付け、臨床のモニタリング等のような方法の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
プリオン病又は伝達性亜急性海綿状脳症（ＴＳＳＥ）は、ヒト及び動物の両方を冒す致死性の神経変性状態である。ＴＳＳＥは実質的に、ヒトにおけるクロイツフェルトヤコブ病（ＣＪＤ）、ヒツジ及びヤギにおけるスクレイピー並びに畜牛におけるウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含む。他の脳症は、ネコ、ミンク、又はシカやヘラジカのような或る種の野生動物において示されている。
【０００３】
これらの病気に関与する伝染性の因子は従来にないものである。現在では、主要な仮説は「プリオン」の仮説であり、それによると、宿主生物により合成された細胞性プリオンタンパク質ＰｒＰＣは、「スクレイピー」アイソフォームを意味するＰｒＰＳｃと呼ばれる病的なコンフォメーションを取り得る。
【０００４】
これら二つのアイソフォームは同じアミノ酸配列を有するが、それらの二次構造の点で異なる：ＰｒＰＳｃは、ベータプリーツシートの有意により高い含有を有するが、正常のＰｒＰ（ＰｒＰＣ）はより大数のアルファヘリックスを有する。
【０００５】
二つの生化学的な特性は概して、これら二つのアイソフォームを区別することを可能にする：
ＰｒＰＳｃは、プロテアーゼ、特に、そのＮ末端の開裂を生成するプロテイナーゼＫ（ＰＫ）に対し部分的に抵抗性である。ＰＫの作用後は、ＰｒＰＳｃは、脱グリコシル化された形態の見掛けの分子量の故に、一般にＰｒＰ２７−３０と呼ばれ：一般的に、ＰｒＰＳｃの開裂部位は、通常の株についてのアミノ酸８９と９０の間に位置されていると認められる（Prusiner S.B. et al., Cell, (1984), 38, 127-134)、
ＰｒＰＳｃはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００又はＴｒｉｔｏｎ  １１４のような、非イオン性界面活性剤に不溶性である。
【０００６】
正常型のプリオンタンパク質（ＰｒＰＣ）は、原則として、プロテアーゼにより完全に分解され、かつ非イオン性界面活性剤の存在下において完全に可溶性である。
【０００７】
ＴＳＳＥを病む個人又は動物の脳内のＰｒＰＳｃの蓄積は、該脳の変性を引き起こす。ヨーロッパでの狂牛危機及びヒトの新変異型クロイツフェルトヤコブ病（ｖＣＪＤ）の出現以来、これら病気についての研究は進展注目すべき増加を示した。結果として、これら従来にない伝染性の因子の知見という点で進歩がなされた。しかしながら、現時では、ＣＪＤを病む患者を治療するために利用可能な治療は存在せず、また早期診断のための試験もない。
【０００８】
過去２０年で、（i）デンドリマー（Supattapone S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1999) 96, 14529-34)、（ii）ポルフィリン及びフタロシアニンの誘導体（Caughey W.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1998) 21, 12117-22）、（iii）キナクリンの及びクロルプロマジンの誘導体（Doh-Ura et al., J Virol (2000) 74, 4894-7）、（Korth C et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2001) 98, 9836-41）のような、「抗プリオン」活性及び革新的な化学的構造を有するいくつかの分子が同定された。これら薬剤は、慢性的にプリオンが感染したＳｃＮ２ａマウス神経芽細胞腫の伝染性を部分的に又は完全に除去することができる。しかしながら、それらの作用はインビボではかなり制限される（Demaimay R et al., J Gen. Virol (1994) 75, 2499-503; Priola SA et al., Science (2000)287, 1503-6）。インビボにおけるこれら物質の効果の欠乏を説明する理由はおそらく、これら薬剤の作用のメカニズムがほとんど又は全く知られていない故に伝染性の因子に関する特異性をそれらが欠乏していること、及び血液脳関門を通過することにおけるこれらの物質が有する困難性である。
【０００９】
「抗プリオン」物質を同定するために実施された薬剤スクリーニング研究は、二つの化合物、すなわち2-アミノ-6-[(2-アミノフェニル)チオ]-4-(2-フリル)ピリジン-3,5-ジカルボニトリル及びN'-1-({5-[(4,5-ジクロロ-1H-イミダゾール-1-イル)メチル]-2-フリル}カルボニル)-4-メトキシベンゼン-1-スルホノヒドラジドの同定ももたらした。これらは細胞培養物中で阻害活性を示す（Perrier V. et al., Proc. Natl. Acad. Sc. U.S.A. (2000) 97, 6073-6078）。しかしながら、１５μMのオーダーである、これら物質について得られるＩＣ５０値（細胞中のＰｒＰＳｃの含量の５０％が阻害される濃度）は、インビボでの適用に適合するとは見出されなかった。更に、Etessamiら（Biochem. Biophys. Res. Comm., 2005, 330:5）は、損傷した細胞の細胞外培地へのヌクレオチドの放出は、プリオンによる新たな感染をもたらしうることも観察した。
【００１０】
診断的な点において、最も近時の方法は、伝染性の因子が付随されている異常ＰｒＰ（ＰｒＰＳｃ）の選択的な検出に基づき、該検出は、その部分的なプロテアーゼ抵抗性を利用することによる。
【００１１】
この面において、
組織抽出物中のＰｒＰＳｃの免疫検出に基づくウェスタンブロッティング方法であって、正常ＰｒＰＣアイソフォームを破壊するための組織抽出物のプロテアーゼによる処理の後の、電気泳動による該抽出物からの該タンパク質の分離、ポリマー膜上への移動、及びＰｒＰを認識する特異的な抗体による検出の上記方法（Schaller O. et al., Acta Neuropathol., 1999, 98, 437-443）、及び
プロテアーゼによる組織抽出物の処理をも含むＥＬＩＳＡ分析、
を区別することができる。
【００１２】
プロテアーゼによる組織抽出物の処理を含む、これら種々の試験のうちで、
Serbanらにより記載されたもの（Neurology, 1990, 40, 100）、ここで彼らはＰｒＰＳｃを検出する試験を開発し、その試験はニトロセルロース膜上へのタンパク質の固定化、そして続くプロテアーゼ消化、変性、及びモノクローナル抗体による免疫検出を含む、
Oeschらにより記載されたもの（Biochemistry, 1994, 33, 5926-5931）、ここで彼らはＰｒＰＳｃを定量するために、ＰｒＰＳｃの精製のための免疫ろ過分析を提案した（ＥＬＩＦＡ又は酵素結合免疫ろ過分析）、
Gratwohl K.U.らにより記載されたもの（J. Virol. Method, 1997, 64, 205-216）、ここで彼らはＥＬＩＳＡ分析を提案した。プロテイナーゼＫによるサンプルの処理及び遠心によるＰｒＰＳｃの精製の後、後者がマイクロタイトレーションプレート上に吸着され、そしてウサギポリクローナル抗体を用いて検出される、
Safar J.らにより記載されたもの（Nature Med., 1998, 10, 1157-1165）、ここで彼らはプロテイナーゼＫを用いずに、事前に変性処理に付されたかどうかによって、固体支持体上に固定化されたＰｒＰＳｃの免疫反応性を比較する、
が挙げられる。
【００１３】
より最近では、文書国際公開第０１／３５１０４号パンフレットは、ＰｒＰＳｃタンパク質の繰返しオクタペプチドモチーフの全部又は部分を維持しながらＰｒＰＣタンパク質の完全な分解を許すように調節された条件下で、ＰｒＰＳｃを含むと推定されるサンプルのプロテイナーゼＫによる処理、次にこのように処理された該サンプルをリガンド、特には該オクタペプチドモチーフに対し特異的な抗体と接触させること、並びに繰返しオクタペプチドモチーフ−リガンド複合体のあり得る検出を逐次含む試験を提案した。
【００１４】
国際公開第０２／０４９５４号パンフレットは、異常ＰｒＰを既知の量の正常ＰｒＰと接触させることによりＰｒＰＳｃタンパク質を増幅する工程を用いる、プリオンを検出する方法を記載する。
【００１５】
一般に、これら種々の試験は、敏感性を欠如すること及び従って偽陰性を生成することの欠点を有する。さらに、それらは死後に実施される。
【００１６】
実際に、血液又は尿の中のプリオンの早期検出は、現在存するものよりも、１０から１００倍でより敏感な試験を要求するだろう。加えて、異常アイソフォーム、ＰｒＰＳｃ、に関する特異性は有効な試験の改善のために必須の条件である。
【００１７】
従って、脳症を検出する新規の方法、特には生存個体において適用され、迅速であり、かつかなり早期の段階で異常を検出することを可能とする方法の必要が残る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の目的はまさに、脳症についての診断の新規な方法であって、該方法はヒト又は動物における該病気の早期の診断、すなわち生前の診断を確立することを可能とし、かつ非侵襲である方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
その面の１つに従い、必要に応じてＰｒＰＣアイソフォームとの混合物中における、ＰｒＰ細胞性プリオンタンパク質の少なくとも１のＰｒＰＳｃアイソフォームの、オリゴマー化を選択的に増幅する及び／又は該アイソフォームの伝染速度を増大するのに有用な方法に対して、本発明は主として向けられ、該方法は、該ＰｒＰＳｃアイソフォームを、増幅の為に適する条件下で、一般式Ｉの少なくとも１の化合物の有効量と一緒にすることを含むことを特徴とし、
[式Ｉ]
2008545775.tif 000002
ここで一般式Ｉ中のＡ、Ｒ及びｎは本明細書中の以下で定義されるものである。
【００２０】
その面の他に従い、ＰｒＰＣ細胞性プリオンタンパク質のＰｒＰＳｃアイソフォームを検出するために有用な方法であって、上で定義された方法の実施及び該アイソフォームの検出の工程の実施を少なくとも含む上記方法に対して、本発明は向けられる。この検出工程は、例えばハイブリダイゼーション又は抗体／抗原相互作用の様式のスクリーニング方法により、実施されうる。
【００２１】
その面の他に従い、本発明は動物又はヒトの個体における脳症の発生の存在又は危険性を検出する為に有用な方法に関し、該方法は少なくとも：
該個体からの生物学的サンプルを、該サンプル中にもしかすると存在するＰｒＰＳｃアイソフォームのオリゴマー化の増幅の為に適する条件下において、上で定義された一般式Ｉの少なくとも１の化合物の有効量と一緒にすること、及び
該個体における脳症の存在又は発生の危険性の指標である、該ＰｒＰＳｃアイソフォームのあり得る存在を検出すること、
を含む。
【発明の効果】
【００２２】
本発明に従う方法は特に、伝達性亜急性海綿状脳症（ＴＳＳＥ）、並びに特にはヒトのクロイツフェルトヤコブ病、ヒツジ及びヤギのスクレイピー、及びウシ海綿状脳症の検出に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
特定の実施態様に従い、一般式Ｉの化合物は、発光検出又は親和性による検出の為に適するマーカーが付随された形態で用いられうる。
【００２４】
本発明の他の特定の実施態様に従い、検出工程は、特には特異的抗体を用いる、免疫検出段階を含む。
【００２５】
第２の変法に従い、正常のＰｒＰアイソフォームを破壊する為に、例えばプロテイナーゼＫのようなプロテアーゼによる該サンプルの全部又は一部の処理、タンパク質の分離、並びに、特には特異的な抗体を用いる、もしかすると存在するＰｒＰＳｃアイソフォームの検出を、本検出は少なくとも含む。正常のＰｒＰのアイソフォームの破壊の工程は典型的には、ＰｒＰＳｃアイソフォームのオリゴマー化増幅の工程の後に実施される。
【００２６】
ヒトＰｒＰの配列１５７〜１６１に対して特異的な抗体ＳＡＦ６０及びＳＡＦ６９の混合物、並びにヒトＰｒＰの配列１５６〜１６２に対して特異的な抗体ＳＡＦ７０は特に、本検出に適当である。
【００２７】
同様に、プロテイナーゼＫによる処理は、文書国際公開第０１／３５１０４号パンフレットに記載された条件下で実施されてもよく、これは、ＰｒＰＳｃタンパク質の繰返しオクタペプチドモチーフの全部又は一部を維持しながら、ＰｒＰＣタンパク質の完全な分解を結果する。この場合において、繰返しオクタペプチドモチーフ−リガンド複合体のあり得る存在を検出する為に、検出は次に、このように処理された該サンプルを、リガンド、特にオクタペプチドモチーフと接触させることにより実施されうる。
【００２８】
その面の更に他に従い、少なくとも１のＰｒＰＳｃアイソフォームのオリゴマー化を選択的に増幅する為のキット及び、試薬として少なくとも１の一般式Ｉの化合物を含む、ＴＳＳＥを診断する為に有用なキットにも本発明は関する。
【００２９】
予想外にも、特に細胞性のプリオンタンパク質の非病原性の形態の存在下に、細胞性のプリオンタンパク質のＰｒＰＳｃアイソフォームのオリゴマー化を選択的に増幅する為に、一般式Ｉの化合物が特に有効であると判ったことを、本発明者らは観察した。すなわち、一般式Ｉの化合物は、正常のＰｒＰＣアイソフォームのオリゴマー型の存在を増加させること無く、ＰｒＰＳｃのオリゴマー型の存在を増加させる性質を有する。非常に明らかに、本発明に従う化合物はＰｒＰＳｃ分子に対して特異的に作用する。
【００３０】
脳症の発生の危険性を初期段階で診断することを可能にする限りにおいて、この能力は特に有利である。
【００３１】
慣用の診断方法によってはそのままで検出不可能であるＰｒＰＳｃアイソフォームを生物学的サンプル中で選択的に増幅することにより、有意に早期の段階での検出が、これからは可能とされる。
【００３２】
明白な理由の故に、そのような早期診断は治療的又は経済的な点で有益であり、かつ公衆の健康の点において及び衛生上の安全性に関して、大きな必要を構成する。
【００３３】
すなわち、本発明は、ヒツジのスクレイピーの及びウシ海綿状脳症の発症前診断の為に、尿や血のような生理学的流体中のプリオンを検出するための試験を開発すること、及びこれにより、現在は食物連鎖に入り得る病気の動物を検出することを可能とする。
【００３４】
さらに、血液サンプルに適用される、本発明に従う方法は、ヒト血液の輸血に関してより良い保証を与え、そしてヒトにおけるＴＳＳＥの早期診断のため、又はさらには将来の治療の最適化のための試験を確立することを可能とする。
【００３５】
上で明記されたように、本発明は以下のような一般式Ｉの化合物、それらの塩、溶媒和物、異性体又は誘導体の使用に基づく。
[式Ｉ]
2008545775.tif 000003
ここで、
Ａは、−Ｃ（Ｈ）ｘＲ１−、−ＣＯ−、Ｃ（Ｈ）ｘＯ（Ｒ１）、−Ｃ（Ｈ）ｘＳ（Ｒ１）−、ＣＮ（Ｒ１）（Ｒ２）−基を表し、ｘは０又は１に等しく、Ｒ１及びＲ２は互いに独立して水素原子、飽和又は不飽和の、線状、分枝状又は環状のＣ１乃至Ｃ６の、必要に応じて置換されているアルキル基を表し、
記号
2008545775.tif 000004
は、ピリミジン環が飽和、不飽和又は芳香族であり得ることを意味し、
Ｒは、
水素原子
ＯＲ’１、Ｎ（Ｒ’１）（Ｒ’２）、ＳＲ’１基、ここでＲ’１及びＲ’２は互いに独立してＲ１及び／又はＲ２について上で定義された基を表す、
飽和又は不飽和の、線状、分枝状又は環状の、Ｃ１乃至Ｃ１０の炭化水素に基づく基、ここで炭化水素に基づく鎖が、Ｓ、Ｏ及びＮから選ばれる１以上のヘテロ原子により必要に応じて中断されていてもよく、かつ必要に応じて置換されていてもよい、
から選ばれる基を表し、
ｎはゼロに等しく、又は１から３の整数である。
【００３６】
１の実施態様に従い、Ｒ基がピリミジン環の窒素原子上に存在する場合には、Ｒ基は水素原子である。
【００３７】
それらの塩に関しては、該塩が本発明の実施に適合すると見られる限りにおいて、無機又は有機の塩のいずれであってよい。
【００３８】
それらの誘導体に関しては、本発明の目的の為に、該誘導体はより特には、検出方法を提供する少なくとも１の実体（標識系に属しても属しなくてもよい）を該誘導体の構造中に組み込んでいる一般式Ｉの化合物であり、ここで、例えば該検出の方法は、例えば赤外領域において視認できるシグナル或いは、例えばユーロピウムによる、蛍光によるシグナルのような発光検出、又はストレプトアビジン／ビオチン認識の場合におけるビオチン標識のような親和性による検出である。
【００３９】
検出のための標識の方法を一般式Ｉの化合物に備えることが意図された該実体は、典型的には化学的であり、慣用の方法により、一般式Ｉの分子に結合されうる。
【００４０】
もちろん、このように得られた一般式Ｉの誘導体の所期の反応性に影響しないように、その位置が選ばれる。
【００４１】
より特には、ピリミジン環は芳香環である。
【００４２】
１の実施態様に従い、ピリミジン環が芳香環である場合には、ＲはＡ基に関してメタ位又はパラ位にある。
【００４３】
特定の実施態様では、ｎは１に等しい。
【００４４】
Ａに関しては、それはより特には−ＣＳ（Ｒ１）−モチーフであり、ここでＲ１は上で定義されたアルキル基を表す。
【００４５】
好ましくは、Ｓ、Ｎ及びＯ原子から選ばれる１又は２のヘテロ原子を組み込んでいる、不飽和又は芳香族のＣ５乃至Ｃ６へテロ環状基を、Ｒは表す。
【００４６】
それはより特には、必要に応じて置換されているチエニル基でありうる。
【００４７】
フッ素原子、臭素原子、ヨウ素原子及び塩素原子から特に選ばれるハロゲン原子、より特には臭素；ＯＨ、ＯＲ’、ＮＲ’Ｒ’’、ＳＲ’及びＲ’基、ここでＲ’及びＲ’’は互いに独立して線状又は分枝状のＣ１乃至Ｃ１０のアルキル基を表す；Ｎ、Ｏ及びＳから選ばれる１以上のヘテロ原子を含む、任意的に置換された、飽和、不飽和又は芳香族のＣ４乃至Ｃ８の、特にはＣ５乃至Ｃ６のヘテロ環状基、例えばチエニル基、チオフェニル基又はチアゾリル基、が可能な置換基として挙げられる。
【００４８】
特定の実施態様に従い、置換基は臭素基又はチエニル基から有利に選ばれる。
【００４９】
一般式１の化合物の限定されない代表として、以下の式を有する４−（５−ブロモ−２−チエニル）−２−（メチルチオ）ピリミジン
2008545775.tif 000005
及び以下の式を有する４−(５−チエニル−２−チエニル)−２−(アミノ)ピリミジン
2008545775.tif 000006
、並びにそれらの塩又は誘導体がより特には挙げられる。
【００５０】
ＰｒＰＳｃアイソフォームに関するそれらの反応性を前提とすれば、一般式Ｉの化合物は明白に、少なくとも１のアミノ酸に結合する能力を有する。
【００５１】
何らの理論に拘束されることを望まないが、本発明に従う化合物は、ＰｒＰタンパク質のＣ末端部分の以下の２つの領域の少なくとも１つに結合することができると見られるようである：
Ｈ２及びＨ３ヘリックスを連結するジスルフィド架橋（残基Ｃｙｓ１７９とＣｙｓ２１４）に位置する領域、
結晶構造中のＰｒＰダイマーの接点に位置する、Ｈ１へリックス（残基１４４〜１５４を含む）中に位置する領域。
【００５２】
増幅は典型的には、一般式Ｉの化合物の有効量との、感染した又はしていないと推定される細胞のインキュベーションにより実施される。このインキュベーションは、増幅のために適する条件下で、典型的には３７℃で、生理的なｐＨで、約３日までであり得る十分な期間、実施される。
【００５３】
本発明の目的の為に、語「有効量」は、本分析の対象である生物学的サンプル中にもしかすると存在する少なくとも１のＰｒＰＳｃアイソフォームのオリゴマー化の増幅を認めるために、少なくとも最小かつ十分な量を意味する。
【００５４】
明白な理由の故に、診断の方法に関する所望の感度及び／又は最初に存在するＰｒＰＳｃアイソフォームの量に依存して、この量は有意に変化しうる。
【００５５】
例えば、この濃度は０．１から２０μＭに及びうる。
【００５６】
ＰｒＰＳｃアイソフォームの免疫検出の方法の場合、後者は、ハイブリダイゼーション又は抗体／抗原反応のような慣用のスクリーニング方法により実施されうる。そのような処理は、慣用の物理的、機械的又は化学的方法を用いる、予めの細胞溶解を必要とする。
【００５７】
本発明の変法に従い、本発明に従う増幅方法を受けた細胞溶解物は、ＰｒＰＳｃアイソフォームの検出に先立ち、ＰｒＰＣ分子を除去するために及びそれ故に生物学的サンプル中にＰｒＰＳｃアイソフォームだけを保存するために、プロテアーゼ、特にはプロテアーゼＫによる部分的な消化に付されうる。これらＰｒＰＳｃアイソフォームの存在は次に、簡単な慣用の分析、特にはイムノブロッティングのタイプにより検出されうる。
【００５８】
例えば、該ＰＫ処理は、以下のように実施されうる：最終体積４００μｌ中の２００μｇのタンパク質の全量の場合、１時間３７℃で消化されるべき５０又は２５μｇのタンパク質当たり１μｇのＰＫ。
【００５９】
本発明の特定の実施態様に従い、プロテアーゼＫによるこの処理は、文書国際公開第０１／３５１０４号パンフレットに記載される条件下で実施されてもよく、該パンフレットの内容は引用することにより本明細書に組み込まれる。この処理は、慣用ではない伝染性物質（ＵＴＡ）の型に関係なく、正常のＰｒＰＣアイソフォームを完全に分解しながらＰｒＰＳｃの繰返しオクタペプチドモチーフの全部又は一部を維持することを目的とする。
【００６０】
いくつかのパラメーターは互いに強く関連付けられることが注目されるべきである：プロテイナーゼＫの濃度はサンプルの処理の継続時間（インキュベーションの時間）に直接的に依存する：すなわち、例えば３７℃では、１０％でホモジネートの３０乃至２００μｇ／ｍｌの濃度でのＰＫとの１０分間インキュベーションは、１０％でホモジネートの１０μｇ／ｍｌ乃至７０μｇ／ｍｌの濃度でのＰＫとの３０分間インキュベーションと同等であることが考慮されうる。例えば、２５μｇ／ｍｌのＰＫとの３０分間インキュベーションは、７５μｇ／ｍｌの濃度のＰＫとの１０分間インキュベーションと同等である。
【００６１】
一般式Ｉの化合物の誘導体の使用の場合、すなわち標識方法の場合、検出は選ばれたマーカーのために推奨される標準の条件に従い実施されうる。
【００６２】
本発明の目的は、試薬として少なくとも１の一般式Ｉの化合物を含むことを特徴とする、本発明に従う方法を実施するために有用な診断的キットでもある。
【００６３】
その面の他に従い、ＰｒＰ細胞性タンパク質のためのリガンド、及び特にはＰｒＰＣアイソフォームのためのリガンドとの組み合わせで、少なくとも１の一般式Ｉの化合物を含むことを特徴とする、ＴＳＳＥを診断するキットに本発明は関する。より特には、それは、モノクローナルである又はモノクローナルでない抗体、あるいはモノクローナル抗体の混合物である。
【００６４】
そのような抗体は特にはNishidaら（J. Virol, 74:320-325, 2000）において記載され、会社Spibioにより販売される。それらは特許国際公開第０１／３５１０４号パンフレットにも記載される。
【００６５】
その面の他に従い、標識系を備えられた誘導体の形態にある一般式Ｉの少なくとも１の化合物を含むことを特徴とする、ＴＳＳＥを診断するために有用なキットに本発明は関する。特には蛍光による標識、又は例えばストレプトアビジン／ビオチンカップルのような親和性による標識が、発光検出に適当であり得る。
【００６６】
本明細書で以下に現れる実施例及び図面は、本発明の分野の非限定的な説明として与えられる。
【００６７】
図面
【００６８】
図１：感染したＮ２ａ５８／２２Ｌ細胞からのＰｒＰＳｃに対する、本発明に従う化合物Ａの活性を示す。分析は、プロテアイナーゼＫによる処理後にイムノブロッティングにより実施された。（Ｃｏ＝処理を受けていない細胞、Ｄ＝溶媒単独（ＤＭＳＯ）により処理された細胞、ＣＲ＝コンゴレッド、Ｔ１及びＴ２は二つの効果のない対照化合物である）。
【００６９】
図２：感染したＮ２ａ５８／２２Ｌ細胞からのＰｒＰＳｃに対する、本発明に従う化合物Ａの用量応答活性を示す。分析は、プロテイナーゼＫによる処理後にイムノブロッティングにより実施された。化合物Ａは、用量応答曲線を確立するために、０．１から２０μＭの範囲の濃度を用いて試験された（Ｃｏ＝処理を受けていない細胞、０．１から２０の数字は用いられた物質濃度（μＭ）に対応する）。
【００７０】
図３：感染していないＮ２ａ５８細胞からのＰｒＰＣに対する本発明に従う化合物Ａの影響を報告する。分析は、イムノブロッティングにより実施された（数字１から１０μＭは、細胞とのインキュベーションの間に用いられた物質Ａの濃度に対応する）。
【００７１】
図４：感染したＮ２ａ５８／２２Ｌ細胞からのＰｒＰＳｃに対する化合物Ａの用量応答活性を示す。分析は、プロテイナーゼＫによる処理後のイムノブロッティングにより実施された。化合物Ａは、５又は２０μＭの範囲の濃度を用いて、３乃至１４日間試験された（Ｃｏ＝処理を受けていない細胞、数字５乃至２０は、用いられた物質濃度（μＭ）に対応する。
【００７２】
図５：感染していないＮ２ａ５８細胞からのＰｒＰＣに対する化合物Ａの影響の不存在を報告する。分析は、プロテイナーゼＫによる処理の前及び後で、イムノブロッティングにより実施された。数字５から２０μＭは細胞とのインキュベーションの間に用いられた化合物Ａの濃度に対応する。
【００７３】
図６：１４日間の化合物の延長されたインキュベーション後の、感染したＮ２ａ５８／２２Ｌ細胞からのＰｒＰＳｃに対する、５及び２０μＭでの化合物Ａの効果、及び２０μＭでの本発明に従う化合物Ｂの効果の間の比較を示す。サンプルは、プロテイナーゼＫによる処理の前及び後で分析された（Ｃｏ＝処理を受けていない細胞、数字５乃至２０は用いられた物質濃度（μＭ）に対応する）。
【００７４】
分析は、一般式Ｉの化合物として、化合物Ａ、すなわち照合番号ＡＣＤ３０４３２としてMaybridge社により販売される４−(５−ブロモ−２−チエニル)−２−(メチルチオ)ピリミジン、又は化合物Ｂ、すなわち照合番号ＳＥＷ０２３１２としてMaybridge社により販売される４−(５−チエニル−２−チエニル)−２−(アミノ)−ピリミジンのいずれかを用いて実施された。
【００７５】
実施例１：プリオンに慢性的に感染した細胞培養物についてのインビトロでのスクリーニング
【００７６】
化合物Ａが、２２Ｌプリオン株（マウスにおいて安定化されたスクレイピー株）に慢性的に感染したマウス神経芽細胞腫系統（Nishida N. et al., J. Virol. (2000) 74, 320-325）に対して、インビトロで試験された。Ｎ２ａ／２２Ｌと呼ばれる、この感染した細胞系統は、プロテイナーゼＫによる部分的消化に抵抗性でありかつプリオンの特性を思わせる特性を有する大量のＰｒＰＳｃ分子を産生する。感染したＮ２ａ／２２Ｌ細胞は、マウス内に脳内的に接種された場合に、ＴＳＳＥを引き起こすことができる。感染したＮ２ａ／２２Ｌ細胞は、２０μＭの濃度の化合物Ａと一緒に、３７℃かつ５％ＣＯ２で３日の期間インキュベートされた。
【００７７】
３日後、集密的な細胞が、界面活性剤の存在下に溶解された。タンパク質の量に関して標準に一致された細胞溶解物は、処理されていない対照細胞と比較して、ＰｒＰＣ分子を除去するために、プロテイナーゼＫ（ＰＫ）による部分的な消化に付された。産物は、再現不能の影響を排除するために二度試験された。
【００７８】
第２段階では、化合物Ａは、用量応答効果が得られるか否かを決定するために、０．１から２０μＭの範囲の濃度を用いて再試験された。処理されていない対照と比較して、シグナルにおける約９０倍の増加が、オリゴマー型について、２０μＭで認められた。
【００７９】
図１及び２は、プロテイナーゼＫ処理の後の、イムノブロッティング分析により得られた結果を報告する。化合物Ａは感染した細胞中のＰｒＰＳｃの量を明白に増加することが観察された。
【００８０】
感染した細胞はＰｒＰＣ分子及びＰｒＰＳｃ分子の両方を発現する故に、化合物Ａがこれら二つのアイソフォームのどちらに対して作用したかの問題が調査された。特に、４９ｋＤａ及び９８ｋＤａに移動するオリゴマー(図１）が、化合物Ａとのそれらの相互作用の後に、プロテイナーゼＫに対しより抵抗性となったＰｒＰＣオリゴマーかどうかの問題が調査された。この為に、ＰｒＰＣアイソフォームだけを発現する感染していない細胞が化合物Ａの存在下にインキュベートされた。図３において与えられる結果は、化合物Ａが細胞中のＰｒＰＣのオリゴマー化を増やさないことを示す。
【００８１】
実施例２：感染していない又はプリオンが感染した細胞培養物に対する化合物Ａの影響
【００８２】
化合物Ａは５及び２０μＭの濃度で、Ｎ２ａ５８／２２Ｌの存在下に、１４日の期間インキュベートされた。
【００８３】
細胞溶解物が３、７、１１及び１４日の期間後にイムノブロッティングにより分析された。
【００８４】
感染した細胞上での、この化合物の延長されたインキュベーションは、３日の期間において認められたものよりも大きなサイズを有するオリゴマー型の出現を誘発しなかったことを、その結果は示す。約５０〜６０ｋＤａのオリゴマー型のより大きな増幅の利益のための、モノマー型のＰｒＰＳｃ２７−３０の欠乏も、観察されなかった（図４）。
【００８５】
他方、化合物Ａの２０μＭの濃度では、増幅されたオリゴマー型の比率は、３日において１４日におけるものと同等であり、これは平衡の状態が３日で達せられることを示し、しかし５μＭの濃度についてはそうではなく、１１日後に平衡が達せられた。
【００８６】
正常ＰｒＰＣプリオンのタンパク質中でのプロテイナーゼＫ抵抗性型の出現の誘発に対する化合物Ａの影響が研究された。
【００８７】
感染したＮ２ａ５８／２２Ｌ細胞と同じ株に由来する正常Ｎ２ａ５８細胞が、化合物Ａの存在下に３日の期間インキュベートされた。プロテイナーゼＫ消化の前及び後での、サンプルのイムノブロッティング分析は、正常プリオンタンパク質のオリゴマー型を示すことを可能にせず、ＰｒＰはプロテイナーゼＫ消化への抵抗性のバンドの出現も示さなかった（図５）。
【００８８】
実施例３：感染していない又はプリオンに感染した細胞培養物に対する化合物Ｂの影響
【００８９】
化合物Ｂについての用量応答曲線が、５から２０μＭの濃度のＢと３日間インキュベートされたＮ２ａ５８／２２Ｌ細胞について得られた。５μＭでは、オリゴマー型のＰｒＰＳｃの量は、１０又は２０μＭの濃度について認められた量と同一であり、これは、５μＭで、用量応答曲線はすでにその安定期に達することを示唆する。
【００９０】
さらに、１４日のインキュベーション期間にわたる、化合物Ｂ及びＡの間の比較による動態は、化合物Ｂがより大きな増幅能力を有することを明らかにする。
【００９１】
２０μＭの濃度の物質Ｂとの１４日間の細胞のインキュベーション後、認められたオリゴマー型の量は同一条件下の化合物Ａについてよりもかなり大きかった。
【００９２】
これら全ての結果は図６に示される。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】感染したＮ２ａ５８／２２Ｌ細胞からのＰｒＰＳｃに対する、本発明に従う化合物Ａの活性を示すイムノブロッティング結果を表す図である。
【図２】感染したＮ２ａ５８／２２Ｌ細胞からのＰｒＰＳｃに対する、本発明に従う化合物Ａの用量応答活性を示すイムノブロッティング結果を表す図である。
【図３】感染していないＮ２ａ５８細胞からのＰｒＰＣに対する本発明に従う化合物Ａの影響を示すイムノブロッティング結果を表す図である。
【図４】感染したＮ２ａ５８／２２Ｌ細胞からのＰｒＰＳｃに対する化合物Ａの用量応答活性を示すイムノブロッティング結果を表す図である。
【図５】感染していないＮ２ａ５８細胞からのＰｒＰＣに対する化合物Ａの影響の不存在を示すイムノブロッティング結果を表す図である。
【図６】１４日間の化合物の延長されたインキュベーション後の、感染したＮ２ａ５８／２２Ｌ細胞からのＰｒＰＳｃに対する５及び２０μＭでの化合物Ａの影響、及び２０μＭでの本発明に従う化合物Ｂの影響の間の比較を示す図である。
【図１】
2008545775.tif 000009
【図２】
2008545775.tif 000010
【図３】
2008545775.tif 000011
【図４】
2008545775.tif 000012
【図５】
2008545775.tif 000013
【図６】
2008545775.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成20年2月7日(2008.2.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰｒＰＣ細胞性プリオンタンパク質の少なくとも１のＰｒＰＳｃアイソフォームのオリゴマー化を選択的に増幅する方法であって、該ＰｒＰＳｃアイソフォームを、増幅のために適する条件下で、一般式Ｉの少なくとも１の化合物、並びに、それらの塩、溶媒和物、異性体又は誘導体の有効量と一緒にすることを特徴とする方法、
[式Ｉ]
2008545775.tif 000015
ここで、
Ａは、−Ｃ（Ｈ）ｘＲ１−、−ＣＯ−、−Ｃ（Ｈ）ｘＯ（Ｒ１）−、−Ｃ（Ｈ）ｘＳ（Ｒ１）−、ＣＮ（Ｒ１）（Ｒ２）−基を表し、ｘは０又は１に等しく、Ｒ１及びＲ２は互いに独立して、水素原子、飽和又は不飽和の、線状、分枝状又は環状のＣ１乃至Ｃ６の、必要に応じて置換されているアルキル基を表し、
記号
2008545775.tif 000016
は、ピリミジン環が飽和、不飽和又は芳香族であり得ることを意味し、
Ｒは、
水素原子
ＯＲ’１、Ｎ（Ｒ’１）（Ｒ’２）、ＳＲ’１基、ここでＲ’１及びＲ’２は互いに独立して、Ｒ１及び／又はＲ２について上で定義された基を表すＲ’１及びＲ’２を有する
飽和又は不飽和の、線状、分枝状又は環状の、Ｃ１乃至Ｃ１０の炭化水素に基づく基、ここで炭化水素に基づく鎖が、Ｓ原子、Ｏ原子及びＮ原子から選ばれる１以上のヘテロ原子により必要に応じて中断されていてもよく、かつ必要に応じて置換されてもよい、から選ばれる基を表し、
ｎはゼロに等しく、又は１から３の整数である。
【請求項２】
増幅がＰｒＰＣアイソフォームの存在において実施されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ基がピリミジン環の窒素原子上に存在する場合において、Ｒ基が水素原子であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
一般式Ｉの化合物のピリミジン環が芳香環であることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
一般式Ｉ中のｎが１に等しいことを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
Ａが、−ＣＳ（Ｒ１）−モチーフであり、ここでＲ１は請求項１において定義されたアルキル基を表すことを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
Ｒがチエニル基を表すことを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
フッ素原子、臭素原子、ヨウ素原子及び塩素原子；ＯＨ、ＯＲ’、ＮＲ’Ｒ’’、ＳＲ’及びＲ’基、ここでＲ’及びＲ’’は互いに独立して線状又は分枝状のＣ１乃至Ｃ１０のアルキル基を表す；Ｎ、Ｏ及びＳから選ばれる１以上のヘテロ原子を含む、任意的に置換された、飽和、不飽和又は芳香族のＣ４乃至Ｃ８の、特にはＣ５乃至Ｃ６のヘテロ環状基、から選ばれる置換基によりチエニル基が置換されていることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該化合物が、４−（５−ブロモ−２−チエニル）−２−（メチルチオ）ピリミジン若しくは４−(５−チエニル−２−チエニル)−２−(アミノ)ピリミジン、又はこれらの塩又は誘導体であることを特徴とする、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
一般式Ｉの該化合物が、検出の方法をそれに備えることができる少なくとも１の実体を組み込んでいるその誘導体の形態にあることを特徴とする、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
該実体が発光検出又は親和性による検出のために適当なマーカーであることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１乃至１１のいずれか１項において定義された方法の実施及びＰｒＰＳｃアイソフォームの検出の工程の実施を少なくとも含む、ＰｒＰＣ細胞性プリオンタンパク質の該アイソフォームを検出する為に有用な方法。
【請求項１３】
個体中の脳症の存在又は発生の危険性を検出する為に有用な方法であって、少なくとも：
該個体からの生物学的サンプルを、もしかすると存在するＰｒＰＳｃアイソフォームの増幅のために適当な条件下で、請求項１及び３乃至１１のいずれか１項において定義された一般式Ｉの少なくとも１の化合物の有効量と一緒にすること、及び
該個体中の脳症の存在又は発生の危険性の指標である、該ＰｒＰＳｃアイソフォームのあり得る存在を検出すること、
を含む上記方法。
【請求項１４】
伝達性亜急性海綿状脳症（ＴＳＳＥ）を検出する為に有用である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ヒトにおけるクロイツフェルトヤコブ病、ヒツジ及びヤギにおけるスクレイピー、並びにウシ海綿状脳症を検出する為に有用である、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
一般式Ｉの化合物が、標識系を備えられた誘導体の形態で用いられることを特徴とする、請求項１３乃至１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
更に、正常ＰｒＰＣアイソフォームを破壊する為に該サンプルの全部又は一部をプロテアーゼにより処理すること、タンパク質の分離、並びに、特異的な抗体を用いて、もしかすると存在するＰｒＰＳｃアイソフォームの検出が実施されることを特徴とする、請求項１３乃至１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
用いられる該プロテアーゼがプロテアーゼＫであることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＰｒＰＣ細胞性プリオンタンパク質の少なくとも１のＰｒＰＳｃアイソフォームのオリゴマー化を選択的に増幅する為に有用なキットにおいて、試薬として、請求項１及び３乃至１１のいずれか１項において定義された一般式Ｉの少なくとも１の化合物を含むことを特徴とするキット。
【請求項２０】
試薬として、標識系を備えられた誘導体の形態にある、請求項１及び３乃至１１のいずれか１項において定義された一般式Ｉの少なくとも１の化合物を含む、脳症を診断する為に有用なキット。
【請求項２１】
脳症を診断する為に有用なキットにおいて、ＰｒＰアイソフォームに特異的に結合するリガンドとの組み合わせで、請求項１及び３乃至１１のいずれか１項において定義された一般式Ｉの少なくとも１の化合物を試薬として含むキット。
【請求項２２】
脳症が動物又はヒトの伝達性亜急性海綿状脳症（ＴＳＳＥ）であることを特徴とする、請求項２０又は２１に記載のキット。
【請求項２３】
ＰｒＰＳｃアイソフォームを認識する抗体又は抗体の混合物をさらに含むことに特徴付けられる、請求項２０乃至２２のいずれか１項に記載のキット。
【国際調査報告】
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2008545775.tif 000019
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2008545775.tif 000024
2008545775.tif 000025
2008545775.tif 000026