(57)【要約】本出願は、バイオプロセスをモニタリングするための、特にリン酸欠乏状態を検出するための核酸結合チップに関する。該チップは、次の47個の遺伝子：yhcR、tatCD、ctaC、推定アセトインレダクターゼに対する遺伝子、spollGA、nasE、pstA、spollAA、仮定上のタンパク質に対する遺伝子、yhbD、cotE、保存された仮定上のタンパク質に対する遺伝子、yurl、spoVID、推定芳香族化合物特異的ジオキシゲナーゼに対する遺伝子、yhbE、推定ベンゾエート輸送タンパク質に対する遺伝子、pstBB、spolllAH、仮定上のタンパク質に対する遺伝子、spollQ、spolllAG、yvmA、推定リボヌクレアーゼに対する遺伝子、dhaS、yrbE、推定デカルボキシラーゼ/デヒドラターゼに対する遺伝子、htpG、yfkH、spollAB、spolllAF、alsD、gdh、yfkN、pstC、yfmQ、pstBA、dhaSのホモログ、推定ホスファターゼに対する遺伝子、phy、cypX、alsS、phoD、pstS、phoB、yvnA、yvmC、の少なくとも３つのプローブを保持し、該核酸結合チップ上の全てのリン酸代謝に特異的な異なるプローブの総数が100を超えない。本発明は、さらに対応する遺伝子プローブ、特にかかるチップ上での使用、ならびに対応する方法および使用可能性に関する。
2008523833.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全てのリン酸代謝に特異的な異なるプローブの総数が100を超えない、次の47個の遺伝子：yhcR、tatCD、ctaC、推定アセトインレダクターゼ(配列番号53のホモログ)に対する遺伝子、spollGA、nasE、pstA、spollAA、仮定上のタンパク質(配列番号65のホモログ)に対する遺伝子、yhbD、cotE、保存された仮定上のタンパク質(配列番号59のホモログ)に対する遺伝子、yurl、spoVID、推定芳香族化合物特異的ジオキシゲナーゼ(配列番号55ホモログ)に対する遺伝子、yhbE、推定ベンゾエート輸送タンパク質(配列番号49のホモログ)に対する遺伝子、pstBB、spolllAH、仮定上のタンパク質(配列番号63のホモログ)に対する遺伝子、spollQ、spolllAG、yvmA、推定リボヌクレアーゼ(配列番号93のホモログ)に対する遺伝子、dhaS、yrbE、推定デカルボキシラーゼ/デヒドラターゼ(配列番号57のホモログ)に対する遺伝子、htpG、yfkH、spollAB、spolllAF、alsD、gdh、yfkN、pstC、yfmQ、pstBA、dhaSのホモログ(DhaSアルデヒドデヒドロゲナーゼホモログ;配列番号17のホモログ)、推定ホスファターゼ(配列番号61のホモログ)に対する遺伝子、phy、cypX、alsS、phoD、pstS、phoB、yvnA、yvmC、
の少なくとも３つの遺伝子に対するプローブでドープした核酸結合チップ。
【請求項２】
請求項１に示した順序において、順に好ましいそこに示したプローブでドープした、請求項1に記載の核酸結合チップ。
【請求項３】
次の39個の遺伝子：仮定上のタンパク質(配列番号65のホモログ)に対する遺伝子、yhbD、cotE、保存された仮定タンパク質(配列番号59のホモログ)に対する遺伝子、yurl、spoVID、推定芳香族化合物特異的ジオキシゲナーゼ(配列番号55のホモログ)に対する遺伝子、yhbE、推定ベンゾエート輸送タンパク質(配列番号49のホモログ)に対する遺伝子、pstBB、spolllAH、仮定上のタンパク質(配列番号63のホモログ)に対する遺伝子、spollQ、spolllAG、yvmA、推定リボヌクレアーゼ(配列番号93のホモログ)に対する遺伝子、dhaS、yrbE、推定デカルボキシラーゼ/デヒドラターゼ(配列番号57のホモログ)に対する遺伝子、htpG、yfkH、spollAB、spolllAF、alsD、gdh、yfkN、pstC、yfmQ、pstBA、dhaSホモログ(DhaSアルデヒドデヒドロゲナーゼホモログ;配列番号17のホモログ)、推定ホスファターゼ(配列番号61のホモログ)に対する遺伝子、phy、cypX、alsS、phoD、pstS、phoB、yvnA、yvmCの少なくとも３つの遺伝子、好ましくは次の14個の遺伝子:yfkN、pstC、yfmQ、pstBA、dhaSホモログ(DhaSアルデヒドデヒドロゲナーゼホモログ;配列番号17のホモログ)、推定ホスファターゼ(配列番号61のホモログ)に対する遺伝子、phy、cypX、alsS、phoD、pstS、phoB、yvnA、yvmCの少なくとも３つの遺伝子、特に好ましくは次の8個の遺伝子：phy、cypX、alsS、phoD、pstS、phoB、yvnA、yvmCの少なくとも３つの遺伝子、より特別に好ましくは、次の3個の遺伝子:phoB、yvnA、yvmCの少なくとも一つの遺伝子に対するプローブでドープした請求項1または2に記載の核酸結合チップ。
【請求項４】
特定したプローブの少なくとも4、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45または47でドープした請求項1〜3のいずれかに記載の核酸結合チップ。
【請求項５】
全ての様々なプローブの総数が100、90、80、70、60または50を超えず、この順に好ましい、請求項1〜4のいずれかに記載の核酸結合チップ。
【請求項６】
特定したプローブが、バイオプロセスのために選択した生物由来の、対応するかまたは最も相同なイン・ビボで転写可能な遺伝子、好ましくはこの同じ生物の、対応するかまたは最も相同なイン・ビボ転写可能遺伝子から得られたものと反応するものである、請求項1〜5のいずれかに記載の核酸結合チップ。
【請求項７】
バイオプロセスのために選択された生物が、単細胞真核生物、グラム陽性またはグラム陰性細菌の代表的な生物である、請求項6記載の核酸結合チップ。
【請求項８】
単細胞真核生物が原生動物または真菌類であって、これらの中で特に酵母、より特別にはサッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスである、請求項7記載の核酸結合チップ。
【請求項９】
グラム陽性細菌がコリネフォルム細菌かまたはスタフィロコッカス属、コリネバクテリア属またはバシラス属のもの、特にスタフィロコッカス・カルノサス種、コリネバクテリウム・グルタミカム種、バシラス・サブチリス種、バシラス・リケニホルミス種、バシラス・アミロリクファシエンス、バシラス・アガーアドヘランス、バシラス・ステアロサーモフィラス、バシラス・グロビギィまたはバシラス・レンタス、より特別にはバシラス・リケニホルミスである、請求項7に記載の核酸結合チップ。
【請求項１０】
グラム陰性細菌が、エシュリキア・コリ属およびクレブシエラ属、特にエシュリキア・コリ K12、エシュリキア・コリBまたはクレブシエラ・プランチコラ由来の派生細菌、より特別にはエシュリキア・コリ BL21(DE3)株、エシュリキア・コリ RV308株、エシュリキア・コリ DH5株、エシュリキア・コリ JM109株、エシュリキア・コリ XL 1株またはクレブシエラ・プランチコラ (Rf)株の派生株である、請求項7記載の核酸結合チップ。
【請求項１１】
少なくとも一つの、さらに好ましくは複数の特定プローブが、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91 および 93として配列表に記載した配列から得られる、請求項1〜10のいずれかに記載の核酸結合チップ。
【請求項１２】
さらなる遺伝子、特に、該プロセスによってさらに発現した遺伝子と代謝的に関連のある遺伝子、より特別にはこれらの遺伝子またはこの遺伝子自身に対して少なくとも１つのプローブでさらにドープした、請求項1〜11のいずれかに記載の核酸結合チップ。
【請求項１３】
該プロセスに依存してさらに発現した遺伝子が、工業利用できるタンパク質、特にアミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、オキシドレダクターゼ、ヘミセルラーゼまたはプロテアーゼ、あるいは低分子量化合物の合成経路に存在する遺伝子か、または少なくとも部分的に該経路を調節する遺伝子である、請求項12記載の核酸結合チップ。
【請求項１４】
１つ、好ましくは複数の特定したプローブが、一本鎖形態、暗号鎖の形態で提供される、請求項1〜13のいずれかに記載の核酸結合チップ。
【請求項１５】
１つ、好ましくは複数の特定したプローブが、DNAまたは核酸アナログ、好ましくは核酸アナログの形態で提供される、請求項1〜14のいずれかに記載の核酸結合チップ。
【請求項１６】
1つの、好ましくは複数の特定したプローブが試験されるべき生物によってmRNAに転写される遺伝子領域を含んでおり、特に遺伝子領域が該mRNAの5'末端に近い、請求項1〜15のいずれかに記載の核酸結合チップ。
【請求項１７】
1つの、好ましくは複数の特定したプローブが、特定の全mRNAに基づいて、対応する核酸のフラグメントと、特に各mRNAが低度の二次ホールディングを有するものと反応する、請求項1〜16のいずれかに記載の核酸結合チップ。
【請求項１８】
一つの、好ましくは複数の特定したプローブが、200個未満のヌクレオチド長、好ましくは100個未満のヌクレオチド長、特に好ましくは20〜60個未満のヌクレオチド長、特に好ましくは45〜55個のヌクレオチド長を有する、請求項1〜17のいずれかに記載の核酸結合チップ。
【請求項１９】
mRNAと該対応する特定したプローブとの結合により電気的シグナルが生じる、請求項1〜18のいずれかに記載の核酸結合チップ。
【請求項２０】
バイオプロセスを行う生物の生理学的状態を決定するための、核酸結合チップと結合する、好ましくは同一チップに結合する、
次の47個の遺伝子：yhcR、tatCD、ctaC、推定アセトインレダクターゼ(配列番号53のホモログ)に対する遺伝子、spollGA、nasE、pstA、spollAA、仮定上のタンパク質(配列番号65のホモログ)に対する遺伝子、yhbD、cotE、保存された仮定上のタンパク質(配列番号59のホモログ)に対する遺伝子、yurl、spoVID、推定芳香族化合物特異的ジオキシゲナーゼ(配列番号55のホモログ)に対する遺伝子、yhbE、推定ベンゾエート輸送タンパク質(配列番号49のホモログ)の遺伝子、pstBB、spolllAH、仮定上のタンパク質(配列番号63のホモログ)に対する遺伝子、spollQ、spolllAG、yvmA、推定リボヌクレアーゼ(配列番号93のホモログ)に対する遺伝子、dhaS、yrbE、推定デカルボキシラーゼ/デヒドラターゼ(配列番号57のホモログ)に対する遺伝子、htpG、yfkH、spollAB、spolllAF、alsD、gdh、yfkN、pstC、yfmQ、pstBA、dhaSホモログ(DhaS アルデヒドデヒドロゲナーゼホモログ；配列番号17のホモログ)、推定ホスファターゼ(配列番号61のホモログ)に対する遺伝子、phy、cypX、alsS、phoD、pstS、phoB、yvnA、yvmC、
の少なくとも３つの遺伝子に対する核酸プローブまたは核酸アナログプローブの同時使用。
【請求項２１】
全ての異なるリン酸代謝特異的プローブの合計が100を超えない、請求項20記載の使用。
【請求項２２】
請求項20に記載のプローブを、そこに示した順番において、順に好ましく用いられる、請求項20または21に記載の使用。
【請求項２３】
核酸プローブまたは核酸アナログプローブが、次の39個の遺伝子：仮定上のタンパク質に対する遺伝子(配列番号65のホモログ)、yhbD、cotE、保存された仮定上のタンパク質に対する遺伝子(配列番号59のホモログ)、yurl、spoVID、推定芳香族化合物特異的ジオキシゲナーゼ(配列番号55のホモログ)に対する遺伝子、yhbE、推定ベンゾエート輸送タンパク質(配列番号49のホモログ)に対する遺伝子、pstBB、spolllAH、仮定上のタンパク質(配列番号63のホモログ)に対する遺伝子、spollQ、spolllAG、yvmA、推定リボヌクレアーゼ(配列番号93ホモログ)に対する遺伝子、dhaS、yrbE、推定デカルボキシラーゼ/デヒドラターゼ(配列番号57のホモログ)に対する遺伝子、htpG、yfkH、spollAB、spolllAF、alsD、gdh、yfkN、pstC、yfmQ、pstBA、dhaSホモログ(DhaSアルデヒドデヒドロゲナーゼホモログ；配列番号17のホモログ)、推定ホスファターゼ(配列番号61のホモログ)に対する遺伝子、phy、cypX、alsS、phoD、pstS、phoB、yvnA、yvmCの少なくとも３つの遺伝子、好ましくは次の14個の遺伝子:yfkN、pstC、yfmQ、pstBA、dhaSホモログ(DhaSアルデヒドデヒドロゲナーゼホモログ；配列番号17のホモログ)、推定ホスファターゼ(配列番号61 ホモログ)に対する遺伝子、phy、cypX、alsS、phoD、pstS、phoB、yvnA、yvmCの少なくとも３つの遺伝子、特に好ましいのは次の8個の遺伝子：phy、cypX、alsS、phoD、pstS、phoB、yvnA、yvmCの少なくとも３つの遺伝子、特に好ましくは次の3つの遺伝子：phoB、yvnA、yvmCの少なくとも一つの遺伝子に対するものである、請求項20〜22のいずれかに記載の使用。
【請求項２４】
特定したプローブの少なくとも4、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45または47の請求項20〜23のいずれかに記載の使用。
【請求項２５】
全ての異なるプローブの総数が、100、90、80、75、70、65、60、55、50、40、30、20または10を超えないで、この順に好ましい、請求項20〜24のいずれかに記載の使用。
【請求項２６】
バイオプロセスを行う生物のリン酸代謝における変化を決定するための、好ましくはリン酸欠乏状態を検出するための、記載の請求項20〜25からのいずれかに記載の使用。
【請求項２７】
少なくとも一つの、順に好ましくは複数の特定したプローブが、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91 および93として配列表に記載された配列から得られる、請求項20〜26のいずれかに記載の使用。
【請求項２８】
請求項1〜19のいずれかに記載の核酸結合チップを用いてバイオプロセスを行う生物の生理的状態を決定するための方法。
【請求項２９】
バイオプロセスを行う生物のリン酸代謝、好ましくはリン酸欠乏状態における変化が決定される、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
バイオプロセスに選択された生物が、単細胞真核生物、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌の代表的なものである、請求項28または29に記載の請求項28に記載の方法。
【請求項３１】
単細胞真核生物が原生動物または真菌類であって、これらの中で特に酵母、より特別にはサッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスである、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
グラム陽性細菌がコリネフォルム細菌または、スタフィロコッカス属、コリネバクテリア属またはバチルス属またはバシラス属のもの、特にスタフィロコッカス・カルノサス種、コリネバクテリウム・グルタミカム種、バシラス・サブチリス、バシラス・リケニホルミス、バシラス・アミロリケファシエンス、バシラス・アガーアドヒランス、バシラス・ステアロサーモフィラス、バシラス・グロビギィまたはバシラス・レンタス、より特別にはバシラス・リケニホルミスである、請求項30に記載の方法。
【請求項３３】
グラム陰性細菌が、エシュリキア・コリ属およびクレブシエラ属、特にエシュリキア・コリ K12の派生体、エシュリキア・コリBの派生体またはクレブシエラ・プランチコラ派生体、より特別にはエシュリキア・コリBL21 (DE3)株、エシュリキア・コリ RV308株、エシュリキア・コリ DH5株、エシュリキア・コリJM10 9株、エシュリキア・コリXL 1またはクレブシエラ・プランチコラ (Rf)株のものである、請求項30に記載の方法。
【請求項３４】
配列表に示した配列番号1、3、5、7、9、11、15、19、23、25、29、31、33、37、43、45、49、51、53、55、59、61、65、67、69、71、73、75、77、81、83、85、87、89、91 または93から得られた特定したプローブのものが使用される、請求項33または好ましくは32に記載の方法。
【請求項３５】
生理的状態が、同一プロセスの時間内の様々な時点で、好ましく複数の構造的に同一の核酸結合チップで、特に好ましくは同一核酸結合チップを用いて決定される、請求項28〜34のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
該プロセスが、発酵、特に商業的に利用し得る産物の発酵的製造であり、特に好ましくはタンパク質の製造またはその低分子量化合物の発酵製造である、請求項28〜35のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
低分子量化合物が天然物質、食品補足物または医薬関連化合物である、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
タンパク質が、酵素、特にαアミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、オキシドレダクターゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、オキシダーゼおよびヘミセルラーゼからなる群の一つである、請求項36に記載の方法。
【請求項３９】
バイオプロセスを行う生物の生理的状態を決定するための、請求項1〜19のいずれかに記載の核酸結合チップの使用。
【請求項４０】
バイオプロセスを行う生物のリン酸代謝の変化、好ましくはリン酸欠乏状態が決定される、請求項39に記載の使用。
【請求項４１】
バイオプロセスに対して選択された生物が、単細胞真核生物、グラム陽性またはグラム陰性細菌の代表的なものである、請求項39または40に記載の使用。
【請求項４２】
単細胞真核生物が、原生動物または真菌類であって、これらの中で特に酵母、より特別にはサッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスである、請求項41に記載の使用。
【請求項４３】
グラム陽性細菌が、コリネフォルム細菌またはスタフィロコッカス属、コリネバクテリア属またはバシラス属、特にスタフィロコッカス・カルノサス種、コリネバクテリア・グルタミカム属、バシラス・サブチリス、バシラス・リケニホルミス、バシラス・アミロリクエファシエンス、バシラス・アガーアドヘランス、バシラス・ステロサーモフィラス、バシラス・グロビギーまたはバシラス・レンタス、およびより特別にはバシラス・リケニホルミスのものである、請求項41に記載の使用。
【請求項４４】
グラム陰性細菌が、エシュリキア・コリおよびクレブシエラ、特にエシュリキア・コリ K12、エシュリキアコリ B またはクレブシエラ・プランチコラのもの、より特別には、エシュリキアコリ BL21 (DE3)株、エシュリキア・コリ DH5α株、エシュリキア・コリ JM109株、エシュリキア・コリ XL 1株またはクレブシエラ・プランチコラ(Rf)株である、請求項41に記載の使用。
【請求項４５】
配列表に示した配列番号1、3、5、7、9、11、15、19、23、25、29、31、33、37、43、45、49、51、53、55、59、61、65、67、69、71、73、75、77、81、83、85、87、89、91 または 93 から得られる特定したプローブが使用される、請求項44または好ましくは43に記載の使用。
【請求項４６】
生理的状態が、同一プロセスの様々な時点で、好ましくは複数の構造的に同一の核酸結合チップ、特に好ましくは同一の核酸結合チップを用いる、請求項39〜45のいずれかに記載の使用。
【請求項４７】
プロセスが、発酵、特に工業的利用可能な産物の発酵製造、特に好ましくはタンパク質または低分子量化合物の製造である、請求項39〜46のいずれかに記載の使用。
【請求項４８】
低分子量化合物が、天然物質、食品補足物または医薬関連化合物である、請求項47に記載の使用。
【請求項４９】
タンパク質が、酵素であって、特にαアミラーゼ、プロテアーゼおよびセルラーゼ、リパーゼ、オキシドレダクターゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、オキシダーゼおよびヘミセルラーゼである、請求項47記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、バイオプロセスをモニタリングするため、特にリン酸欠乏状態を検出するための核酸結合チップに関し、また特に該チップ上での対応する遺伝子プローブの使用、そしてかかるプローブを基にした使用可能な方法に関する。
【０００２】
バイオプロセスの技術的利用性は、所望の結果を得るために、所定の期間内で資材を節約しおよび／または最適の結果を達成するために、その経過をモニタリングするという根本的な問題に直面する。バイオプロセスとは、例えば寒天培地上あるいは振盪培養での微生物培養、特にその培養および微生物の発酵により原料を得ることを意味する。例えば、酵母またはストレプトミセス株のような単細胞真核生物およびグラム陰性またはグラム陽性細菌の両方に関するこれらに関連のある広範囲の先行技術が存在する。
【０００３】
かかる工程のモニタリングは、まず該プロセスの経過中に変化する特性および観察される生物の必要条件を観察することによって実施され、該変化は、例えば至適密度や培地の粘度、取込みまたは放出ガス、pH変化または栄養要求条件の変化を反映する。適切なアッセイによる酵素活性を測定すること、例えば目的とする培養上清の活性を検出することが本明細書に包含され得る。
【０００４】
次に、多様な技術が、近年目的とする遺伝子発現レベルで生物の代謝プロセスをモニタリングするために開発されてきた。この共通の方法は、目的とする真の遺伝子のプロモーターの活性についての指標として容易に検出し得るタンパク質に対する遺伝子の使用である（プロモーター分析、遺伝子発現分析)。このために対応する装置(「(バイオ)センサー」)も開発されてきた。
【０００５】
他の技術は、目的とするタンパク質または該タンパク質をコードするmRNAの検出に関わる。これらには、(1.)プロテオーム分析、すなわちタンパク質について、問題の細胞条件における変化を観察すること、これは細胞分解物の2次元電気泳動によって通常行われる、(2.)類似した方法で生成した"ゲノムDNAアレイ"によって形成したmRNA(トランスクリプトーム)の分析、および(3.)チップ技術が包含される。
【０００６】
後者は、開発の比較的初期段階である。最初の２つの方法は、問題の巨大分子の定量的単離および多大な時間を要する分析を基にしており、チップ技術は、物理的に判読し得る支持体(チップ)上でタンパク質または核酸に対するプローブを結合させる原理に基づいており、このプローブは目的のタンパク質または核酸の存在と即時反応する。前記２つの技術を比較すると、この種のチップは、観察されるプロセスのアット・ライン分析（at-line analysis）を提供することを約束する。別の利点はサンプルが比較的少量である要件である。
【０００７】
チップを基にした測定方法の原理は、例えば標題"Real-time electrochemical monitoring: toward green analytical chemistry" by J. Wang (Acc. Chem. Res., ISSN 0001 4842; Rec. Sept. 12, 2001, pages A F)の図2に図式的に紹介されている。この文献によると、分析されべきサンプルは、例えば酵素、抗体、DNA受容体であり得る生体分子認識層と接触される；これによって受容されるシグナルは、トランスデューサー、例えば電流測定用または電位差計用の電極アンプ(増幅/処理)を介して、電圧または電位として変換される。問題のこの研究は、小型化および他の利点に関して光学システムについても述べている。著者には、電気的に分析され得るシステムよりも、より好ましいように思われる。
【０００８】
本発明のために、タンパク質特異的チップは片側に置かれ、mRNAを認識するチップは、相補DNA分子またはDNAアナログで通常ドープされる。例えば、WO 95/11995 A1は、非常に詳細な問題、例えば点変異の区別のためのその調製および利用を説明している。DNA-チップ分析には、標的配列のPCR増幅物および増幅しないものも包含する。また、光学的認識によりもたらされるシグナルの光学的評価によるものおよび電気的評価によるものも存在する。
【０００９】
光学的検出方法は、シグナルを増幅するメカニズムが部分的に必要である。このために、例えばフルオロフォア、アクリジニウムエステル、または二次結合プロセス、例えばビオチン、アビジン/ストレプトアビジンまたはジゴキシジンなどによる間接的検出が説明されている。後者の場合には、光学的検出は、酵素標識されたジゴキシジン特異的抗体を用いて行われる。次いで、酵素活性は、比色分析または蛍光のいずれかにより検出される。Westin ら［Nature Biotechnol., 18, pp. 199 204, (2000)］によると、ハイブリダイゼーションは、チップ上で完全な検出反応を実施できるように、DNAチップ上でPCRと組合され得る("チップに対する研究室のコンセプト")。
【００１０】
他の研究は、DNA配列決定または分離のためにキャピラリー電気泳動の原理を小型化するDNAチップの開発を説明するものもある(Woolley and Mathies (1994), Proc. Natl. Acad. Sci., 91, pp. 11348 11352; Liu et al. (2000), Proc. Natl. Acad. Sci., 97, pp. 5369 5374).
【００１１】
いくつかの刊行物には、原理的に、電気的に判読出来るDNAチップ(Hoheisel (1999), DECHEMA Jahresbericht [Annual Report] 1999, pp. 8 11;Hintsche et al. (1997), EXS, 80, pp. 267 283) 既に紹介されている。Wright ら(2000; Anal. Biochem., 282, pp. 70 79)は、Cornell ら(1997; Nature, 387, pp. 580 583)によって初めて記載されたように、DNA検出のためにイオンチャンネルセンサー(ICS)を利用した。これは、分子イオンチャンネルの伝導性が結合反応によって検出されるという方法である。該センサーは、基本的にインピーダンス要素である。Chengら(1998; Nat. Biotechnol., 16, pp. 541 546)によれば、電気パルスは、光学的DNAチップ上でハイブリダイゼーション反応を増幅させるために利用される。Fritscheら(2002; Laborwelt II)は、例えばオリゴヌクレオチドと結合する金属性のナノ粒子を用いて作動可能な電気チップシステムを提案した。このシステムにおいて、ハイブリダイゼーション反応中の"金属性の増幅"は、電極上で電気抵抗の低下をもたらし、その後にシグナルとして測定され得る。
【００１２】
別法は、適切な酵素(例えばアルカリホスファターゼ)で標識することにより、ハイブリダイゼーション後に電気的に活性な基質を生じ、次いで電極での酸化還元反応によって検出できるDNAプローブを用いる電気的検出原理を基にしている(Hintsche et al. (1997), EXS, 80, pp. 267-283)。
【００１３】
特定の核酸認識チップ型に対する決定は、基本構造および評価システムに関して為される場合、より特別な問題が起こり、これに対して遺伝子の活動が観察される。技術的理由から、核酸チップの一つの型を用いて同時に分析され得る遺伝子の数には制限があるという事実は、ここで考慮されなければならない。従って、光学的に判読可能なチップは、現在チップ上で用いうるプローブの数に関して、電気的に分析できるものよりも優れている。後者のチップに関する制限は電気的測定ユニットの小型化によって決まる。
【００１４】
従って、遺伝子活性のどの選択が適切な方法で観察されたプロセスを示すかについて生物学的問題が生じる。また、これには、産物が製造される場合（例えば発酵的に）、産物形成のモニタリングが包含される。同時に、このプロセスが予定外の方向へと進行しているかどうかを示すコントロール遺伝子を包含すべきである。実施可能な理由について、上記モニタリングの過程で観察される異なる遺伝子の数は、あまり多すぎないようにすべきである。
【００１５】
グラム陽性細菌を用いる生物工学的方法は、特に産業的利益にある。該細菌は、その分泌能力のために価値ある物質の産生、産業的産生に使用される。これらの中で、バシラス（Bacillus）属のもの、そしてそれら中で順にB. subtilis、 B. amyloliquefaciens、B. agaradherens、B. licheniformis、B. lentus およびB. globigilが、現在最も経済的に重要なものである。
【００１６】
下記に示す研究は、例えば細菌における複数遺伝子(マルチパラメーターリーディング)の活性の同時観察に向けられている。Schwederらによる論文［Biotech. Bioeng., 65, pp. 151-159, (1999)］では、様々なストレス因子誘導性遺伝子、すなわちE.coli発酵中および、その後の濃縮段階でのclpB、dnaK (ヒートショックによって誘導される)、uspA (グルコース欠乏)、proU(浸透圧)、pflおよびfrd(O2 欠乏)およびackA (過剰グルコース) のmRNAレベルの変化を説明している。それは、常法で行われるPCRを基にした方法により記録された。ここで、発現率の違いが、反応装置の様々な部位ですでに見出されおり、また数秒以内で変化した状態に対する反応が見出された。
【００１７】
E.coliに関する別の発酵は、Juergen (2000) らによる"Monitoring of Genr that respond to overproduction of an insoluble recombinant protein in E.coli glucose-limited fed-batch cultures"［Biotech. Bioeng., 70, pp. 217 224］の研究において説明されている。この研究では、次の遺伝子Ion、dnaK、ibpB、htrA、ppiB、groEL、tig、s6、I9およびdpsの発現を、部分的にはmRNAレベルで、部分的にはタンパク質レベルで、また部分的には両方のレベルで観察している。この研究は、2D-PAGEおよびDNAアレイ技術法によって実施された。この結果を考慮すると、組換えバイオプロセス、例えば非相同タンパク質産生を、直接的にプロセス関連タンパク質およびリポーター遺伝子(例えばibpBなど）を介してモニターすることが示唆される。
【００１８】
R T. Gillらによる研究(2001; Biotech. Bioeng., 72, pp. 85-95)、改良された組換えタンパク質産生のための、"高細胞密度組み換えE.coli 発酵のゲノム分析"および"細胞順化"は、E.coliによる組換えタンパク質の発現中の培養プロセスのさらなる知見に関心をよせている。ストレス遺伝子degP、uvrB、alpA、mltB、recA、ftsH、ibpA、aceAおよびgroELが、上記条件下で低い細胞密度に比べて、高細胞密度でより強力に発現されるという事実が記載されている。該遺伝子は、該反応の強さに従って、ある特定のクラスター群を形成した。これは、RT-PCR およびDNAミクロアレイを基にしたアプローチによって決定され、これはドットブロット分析によって補完され、また発酵時間内で２点から得たサンプル、すなわち開始時の低い細胞密度および終結に向かう高細胞密度時点でのサンプルに適用される。このことから、細胞のストレス応答を軽減するために、細胞順化アプローチが開発された。
【００１９】
グラム陽性細菌とグラム陰性細菌との発現パターンにおける基本的な違いは、Jurrgenらによる研究"Proteome and transcriptome based analysis of Bacillus subtilis cell overproducing insolubleheterologous protein"［Appl.Microbiol. Biotechnol., 55, pp. 326 332(2001)］で明らかにされている。ここでは、とりわけ、B. subtilis中の該遺伝子dnaK、groEL、grpE、clpP、clpC、clpX、rpsBおよびrplJの発現が記載されており、DNAマイクロアレイ技術、または二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定できる。これにより、プリンおよびピリミジン合成のための該遺伝子、そして特定のリボゾームタンパク質に関する遺伝子は、グラム陰性細菌に対する知見の基準を基に予測された以上に強く、過剰発現に用いたグラム陽性細菌において発現される。他の違いは、プロテアーゼLonおよびClpに関連している。
【００２０】
いくつかの刊行物は、これらの遺伝子やこれらの遺伝子を含有する核酸結合チップの製造の可能性を開示、または少なくとも示唆してきた。即ち、例えば２つの特許出願DE 10136987 A1およびDE 10108841 A1は、各場合においてCorynebacterium glutamicum 遺伝子、すなわちclpC およびcitBをそれぞれ開示している。両遺伝子は、アミノ酸代謝に関係していると記載されており、これが該微生物によってアミノ酸の発酵製造を至適化するために、それらを不活性化するか、少なくとも弱めることを含むと言われている。該遺伝子の商業的に有利に利用できる理由であろう。該出願によれば、さらなる適用可能性は、核酸結合チップ上で目的とする遺伝子産物のためにプローブを提供することを含み得る。
【００２１】
一方で、様々な生物についてさらに多くゲノムデータが公開されており、これはそれらから代表的な選択が望ましいと思われる多量の配列データを含む。このように、特許出願WO 02/055655 A2は、微生物Methylococcus capsulatusのゲノムの完全な配列決定によって決定された1800 以上のDNA配列を開示する。
【００２２】
一方、例えば、グラム陽性Bacillus licheniformisの完全なゲノムもまた配列決定されている。B. Veith らによる刊行物"The Complete Genome Sequence of Bacillus licheniformis DSM13, an Organism with Great Industrial Potential"［J. Mol. Microbiol. Biotechnol., Volume 7(4), pages 204 to 211(2004)］に記載されており、さらに、GenBank データベース(National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institute of Health, Bethesda, MD, USA; http://www.ncbi.nlm.nih.gov; as of 12.2.2004)において、エントリーAE017333 (塩基1 〜4 222 645)の下に入手し得る。
【００２３】
光学的に分析し得るチップの技術を用いて、一方で、実際に完全なゲノムまたは対応するトランスクリプター(ゲノムDNAチップ)を包含する核酸結合チップを調製することができる。
【００２４】
出願WO 2004/027092 A2では、観察された微生物が培養中に経験する様々な生理学的状態を同定するために、扱い易い遺伝子数を用いる代表例を提供する。これらには、様々な栄養に関する、例えば飢餓状態またはストレス条件、例えば熱または低温ショック、剪断ストレス、酸化ストレスまたは酸素制限などを包含する。該遺伝子は、次のようなものである；acoA、ahpC、ahpF、citB、clpC、clpP、codY、cspA、cspB、des、dnaK、eno、glnR、groEL、groL、gsiB、ibpA、ibpB、katA、katE、lctP、ldh、opuAB、phoA、phoD、pstS、purC、purN、pyrB、pyrP、sigB、tnrA、trxAおよびydjFである。この出願は、B. subtilis、E.coliおよび／またはB. licheniformis由来の対応するDNA配列も明らかにする。結果として、関係する核酸結合チップも製造できるようになり、微生物、特にグラム陽性またはグラム陰性細菌を基にしたバイオプロセスをモニタリングする場合に、該プロセスを特徴づける代謝活性における変化を示す。
【００２５】
遺伝子に関するこの選択を基にした核酸結合チップは、全体としてはむしろ大ざっぱであり、特定の判読可能な状況の概略を提供するのみである。通常、それらは個々の特定の課題を具体的に明らかにできない；しかし、個々の陽性シグナルは、様々な状況から生じ得るかまたは擬陽性のみであり得る、そのため特にこのような不明確な状況においては頻繁に存在し、選択された代謝の態様を別々に分析することは実用的である。一方、特にアット・ライン分析の利点を有する電気的に判読可能な核酸結合チップを用いると、さらなる遺伝子プローブを、さらに特定の代謝状態を記録するのに単純に用いることができないために、同時に占有できる場所の数は制限されている。
【００２６】
特別な代謝状況、それらの中でも欠乏状態は、生物工学技術において利用される。即ち、出願DE 10012283 A1は、リン酸欠乏による遺伝子の誘導性を利用する発明を開示する。そこで記載された研究は、異種遺伝子発現のためのグラム陽性宿主細菌により活性化されるべきtrans遺伝子の調節について、B. subtilis 遺伝子のpstS、phoD、phoBまたはglpQ のプロモーターを使用することである。このために、B. subtilis PhoP-PhoR調節システムは、対応し得るプロモーターを活性化するためには同時に利用されるべきである。この出願によれば、PhoPおよびPhoRを介して各場合において選択されたプロモーターの誘導を得るために、人工的にリン酸欠乏にさせることが意図されている。従って、細胞の内在する調節システムが、B. subtilisの遺伝子pstS、phoD、phoBおよびglpQの人口的に誘導されるプロモーターを誘導できるとは考えられていない。従って、例えば本明細書には示していないが、例えばB. licheniformisにおけるpho遺伝子は異なって編成される、即ち個々に調製されることがよく知られている。
【００２７】
しかし、上記に説明したように、リン酸欠乏は特に微生物にとって重大となり得る代謝状況であるので、対応するバイオプロセスを制限するため、細胞をバイオプロセスの期間中にストレス状況に置くことは通常望まれていない。
【００２８】
従って、この問題についてチップを基にしたアット・ライン分析を実行するための、そして進行中のバイオプロセスにおいて介入し得るための、時間通りにさらにより具体的にこの分析により迅速に得られる結果を理由とする特別な必要性が存在する。これは、認識されるのが非常に遅いか、または少しも認識されないリン酸の障害から生じる収量損失を防止する。
【００２９】
先行技術では、追加の/別の遺伝子を説明しており、その発現はリン酸欠乏の中に増加するものの、生物工学技術に関連する全ての微生物において同一レベルではない。従って、Ishigeらによる刊行物［J. Bacteriol., Volume 185 (No. 15), pages 4519 to 4529］では、Corynebacterium glutamicumにおけるリン酸欠乏("リン酸刺激(stimulon)")によって活性化した遺伝子のDNAマイクロアレイ分析を論じている。この研究において、刺激は、唯一のリン酸源としてオルトリン酸エステルからリン酸欠乏の状態に進行することによって引き起こされる。これにより、他の微生物についてのデータと一致して、リン酸代謝に関連するいくつかの遺伝子が明らかに誘導される。対照的に、別の遺伝子の誘導は、単なる成長効果が原因と思われる。また、全てというよりはむしろ既知の幾つかのリン酸代謝遺伝子が誘導されるということが判る。逆に、いくつかのタンパク質は、次第に産生が増加し、他の微生物においてホモログは次第に増加せず、続いて該刺激因子、例えばヌクレオチダーゼ、このE.coliにおけるそのモログは発現のレベルを変えず、フェリチン様タンパク質、また推定細胞外ヌクレアーゼ、NucH、これらの発現レベルは例えばB. licheniformisなどでは有意に増加しない(データは示していない）。
【００３０】
Antelmannらによる刊行物［J. Bacteriol., Volume 182 (No. 16), pp. 4478 to 4490］は、２次元電気泳動を用いてプロテオームおよびトランスクリプトームレベルで、B. subtilisにおけるリン酸欠乏により誘導し得るタンパク質を調査した；マイクロアレイ技術は、単なるある程度までの可能な補完技術として説明されている。図4は、リン酸欠乏刺激因子に対するこの生物で徐々に産生される全数10個のタンパク質を開示する。最強のシグナルは、GlpQ、PhoDおよびPstSのものであり、次いでPhoBおよびPelのものである。これに対して、本出願に関連するいくつかの研究から、B. licheniformis におけるglpQおよびpelは、リン酸欠乏下においてほとんど僅かしか過剰発現されないことがわかった。その代わりに、例えば、B. licheniformis (実施例を参照されたい）におけるフィターゼ遺伝子は、B. subtilisにおける場合では見られない驚くべき強力なシグナルを生じた。
【００３１】
従って、バイオプロセスをモニタリングするために適切なRNA-認識チップを設計するという考えよるいくつかの根本的な難点がある。第一に、各遺伝子について、他の生物に対する移動可能性に関する疑問がある：かかるバイオプロセスに関連する出来るだけ多くの微生物において、異なるシグナルを生じる遺伝子が選択されなければならない。第二に、特異性に関する疑問がある：強力なシグナルは目的とする代謝条件に対して明確に指定できなければならない。複数の異なる代謝状況に応答するおよび／または一般的にストレスシグナルであるそれらのシグナルは出来るだけ多く排除されるべきである。
【００３２】
本発明のために選択した解決へのアプローチは、各場合において観察された生物においてシグナルを与えるプローブの、通常全てではないが、複数を用いて出来るだけ代表的な遺伝子の全体数の選択を行うことからなる。一方、それらの遺伝子はリン酸欠乏の状況以外の代謝状況において同様に強いかまたはさらに強いシグナルを与える遺伝子は排除されるべきである。
【００３３】
さらに、本発明の目的は、生物、特に微生物におけるリン酸欠乏に関するストレスシグナルにできるだけ明確に関連づけることができる遺伝子を同定することである。この目的は、対応するバイオプロセスをモニタリングするために、またそれらを用い得るようにこれらの遺伝子に対するプローブを開発することであった。
【００３４】
これにより、核酸結合チップは、いくつかまたは複数のこれらの遺伝子に対する遺伝子プローブにて占有され得るべきで、これによりモニタリングしたバイオプロセス(リン酸欠乏センサー)の間に、シグナル"リン酸欠乏"を確実に示す核酸結合チップが得られうる。これらは、それらの設計を理由に占有し得る場所の数が比較的低い、特にそれらの核酸結合チップ、特に電気的に分析可能なチップを目的にしており、このため、一方で迅速に判読可能な利点を有しており、そのためアット・ライン分析が可能となる。リン酸供給に関する問題のバイオプロセスを至適化するために、適切な場合にはこれにより早期介入が確実となる。
【００３５】
この種のDNA結合チップは、複数の比較できるプロセスに使用され得るべきであって、比較的少ない変化を有する特定の用途可能性に適合し得るべきである。Bacillus種、特にB. subtilis、B. Amyloliquefaciens、B. lentus、B. globigii、およびより特別にはB. licheniformisを基にしたバイオプロセスに関するものが好ましい。バイオプロセスのなかで、発酵は、特に製造、より特別には過剰発現したタンパク質の工業的産生の中心であった。
【００３６】
かかるリン酸欠乏センサーは、観察した細胞の生理的状態を測定する相応の方法を可能にし、観察したバイオプロセスをモニタリングするためのそれに相応じた使用を可能にすべきである。
【００３７】
該目的は、目的とする培養物を、リン酸欠乏(実施例１)状態に移行させることにより、その活性化能力に関して生物工学的に重要な微生物のB. licheniformisの遺伝子の多様性を研究することによって解決する。この関連において、驚くべきことに、リン酸代謝に関与する全ての遺伝子は、決してこの点に関して明確なシグナルを生じないことが判った。さらに−また驚くべきことに−必ずしもリン酸代謝と容易に関連づけられないそれらの遺伝子、例えば胞子形成遺伝子の活性化が観察された；本発明によれば、これらは、以前から知られているその機能とは独立しているが、同様にリン酸代謝遺伝子として見なされる。両方の点は、本出願の実施例２に包含される。この関連において、非常に異なる強度の誘導が観察された。本発明の教示により、インジケーターとしての遺伝子の適合性は、この応答強度の関数として増加すべきである。本発明によれば、上記の特定の閾値レベルを有意に超える明確に区別できるシグナルを与えるそれらの遺伝子は、リン酸欠乏のインジケーターとして選択される。該結果が、このレベルを超えれば超える程、本発明に従ってそれらがより好ましく、発明の好ましい態様に関して対応する等級を説明する。同時に、リン酸欠乏状況以外の状況において強いかまたはさらに強いシグナルを同様に生じるそれら遺伝子は再び排除される(データは示していない)。
【００３８】
表１は、有意であると見なされる少なくとも3つのファクターを用いて、実施例１で決定され、リン酸欠乏下でその誘導が観察されたBacillus licheniformis DSM13の235個の全ての遺伝子を示す。これらの中のものは、表２には、あらゆる計測点でリン酸欠乏による誘導が、少なくとも10のファクターであった47個の全ての遺伝子を挙げており、そしてこれについて本明細書では示していない平行試験の結果から、それらが該シグナルに対して比較的特異的であったと考え得る。それらの観察された最高の誘導の強度に関してこれらの遺伝子を表３に挙げた。それらのDNAおよびアミノ酸配列は、本出願の配列表に記載されており、奇数はDNA配列を示し、その次の偶数は各ケースにおいて得られたアミノ酸配列を示す。表２および表３に挙げた各配列番号は、これらの配列も示す。該遺伝子は、下記のとおりであり、リン酸欠乏によって生じる誘導の強度が低い順で示す(表2および3を比較されたい): 
-yvmC (未知機能のタンパク質と類似；配列番号75、76);
-yvnA (B. subtilis由来のタンパク質と類似；配列番号77、78);
-phoB (アルカリホスファターゼIII；配列番号21、22);
-pstS (ホスフェートABC トランスポーター/結合タンパク質；配列番号47、48);
-phoD (ホスホジエステラーゼ/アルカリホスファターゼ；配列番号23、24);
-alsS (α-アセトラクテートシンターゼ；配列番号29、30);
-cypX (シトクロム P450-様酵素；配列番号3、4);
-phy (フィターゼ；配列番号33、34);
-推定ホスファターゼに対する遺伝子(配列番号61、62);
-dhaS ホモログ (DhaS アルデヒドデヒドロゲナーゼホモログ；配列番号17、18);
-pstBA (ホスフェートABSトランスポーター；配列番号87、88);
-yfmQ (未知機能；配列番号69、70);
-pstC (ホスフェートABCトランスポーター/パーミア−ゼ；配列番号91、92);
-yfkN (2',3'-シクロ-ヌクレオチド2'-ホスホジエステラーゼと類似；配列番号11、12);
-gdh (グルコース１-デヒドロゲナーゼ；配列番号31、32);
-alsD (α-アセトラクテート・デカルボキシラーゼ；配列番号27、28);
-spolllAF (胞子形成因子III AF；配列番号79、80);
-spollAB (抗-シグマ F因子/ステージII 胞子形成 タンパク質 AB; 配列番号37、38);
-yfkH (タンパク質と類似；配列番号67、68);
-htpG (クラスIII ヒートショックタンパク質；配列番号1、2);
-推定デカルボキシラーゼ/デヒドラターゼに対する遺伝子 (配列番号57、58);
-yrbE (デヒドロゲナーゼと類似；配列番号9、10);
-dhaS (アルデヒド・デヒドロゲナーゼ；配列番号19、20);
-推定リボヌクレアーゼに対する遺伝子(配列番号93、94);
-yvmA (多剤トランスポーターと類似、配列番号51、52);
-spolllAG (胞子形成因子III AG；配列番号81、82);
-spollQ (胞子形成因子 II Q；配列番号43、44);
-仮定上のタンパク質に対する遺伝子(配列番号63、64);
-spolllAH (胞子形成因子III AH；配列番号83、84);
-pstBB (ホスフェートABC トランスポーター/ATP-結合タンパク質；配列番号89、90);
-推定ベンゾエート輸送タンパク質に対する遺伝子（配列番号49、50);
-yhbE (B. subtilis由来のタンパク質と類似；配列番号73、74);
-推定芳香族化合物特異的ジオキシゲナーゼに対する遺伝子(配列番号55、56);
-spoVID (胞子形成因子 VI D; 配列番号45、46);
-yurl (リボヌクレアーゼと類似；配列番号15、16);
-保存された仮定上のタンパク質に対する遺伝子(配列番号59、60);
-cotE (外層胞子被膜タンパク質；配列番号39、40);
-yhbD (B. subtilis由来のタンパク質と類似；配列番号71、72);
-仮定上のタンパク質に対する遺伝子(配列番号65、66);
-spollAA (抗-σ F 因子 アンタゴニスト/ステージII 胞子形成タンパク質 AA；配列番号35、36);
-pstA (ホスフェートABCトランスポーター/パーミア−ゼ; 配列番号85、86);
-nasE (同化硝酸塩還元酵素のサブユニット；配列番号7、8);
-spollGA (胞子形成因子II GA；配列番号41、42);
-推定アセトインレダクターゼに対する遺伝子(配列番号53、54);
-ctaC (シトクロム CAA3 オキシダーゼ/サブユニット II; 配列番号5、6);
-tatCD (ツインアルギニン輸送経路の成分；配列番号25、26);
-yhcR (5'-ヌクレオチダーゼと類似；配列番号13、14)。
【００３９】
上記した対象に対する一つの解決策は、次の47個の遺伝子：推定アセトインレダクターゼに対する遺伝子(配列番号53ホモログ)yhcR、tatCD、ctaC、、spollGA、nasE、pstA、spollAA、仮定上のタンパク質に対する遺伝子(配列番号65 ホモログ)、yhbD、cotE、保存された仮定上のタンパク質に対する遺伝子(配列番号59 ホモログ)、yurl、spoVID、推定芳香族化合物特異的ジオキシゲナーゼに対する遺伝子(配列番号55 ホモログ)、yhbE、推定ベンゾエート輸送タンパク質に対する遺伝子(配列番号49 ホモログ)、pstBB、spolllAH、仮定上のタンパク質に対する遺伝子(配列番号63 ホモログ)、spollQ、spolllAG、yvmA、推定リボヌクレアーゼに対する遺伝子(配列番号93 ホモログ)、dhaS、yrbE、推定デカルボキシラーゼ/デヒドラターゼに対する遺伝子(配列番号57 ホモログ)、htpG、yfkH、spollAB、spolllAF、alsD、gdh、yfkN、pstC、yfmQ、pstBA、dhaSホモログ(DhaS アルデヒドデヒドロゲナーゼホモログ;配列番号17 ホモログ)、推定ホスファターゼに対する遺伝子(配列番号61 ホモログ)、phy、cypX、alsS、phoD、pstS、phoB、yvnA、yvmC、の少なくとも３つに対するプローブでドープされた核酸結合チップであって、全てのリン酸代謝特異的な異なるプローブの総数は100を超えない。
【００４０】
これらの遺伝子についての詳細な情報は、実施例１から３および本願の表１から３に見出され得る。配列表は、B. licheniformis DSM 13から得られたものとして該遺伝子を開示する。これらの大部分は、他の種類からも説明される(下記を参照されたい)。しかし、いくつかのものは、推定の(疑わしい)遺伝子または推定の(疑わしい)酵素をコードしている遺伝子である。これらは、推定の機能を有するものと、さらに見出されたB. licheniformis遺伝子ホモログとのデータベース比較により、可能な限り本発明に従って定義されている：この関連で二点が説明されなければならない。
−第一に、いくつかのまたは他の遺伝子の生化学的分析から、該推定機能が実際の機能に対応していないことが見出され得る。この場合に、該推定機能はそこに保持されていない。むしろ、これらの知見は、本発明に従って転写増加の知見がリン酸欠乏に関連する場合に限り、目的とする遺伝子活性が最終的に発揮された酵素活性とは別のリン酸欠乏に対するインジケーターとして十分に機能するため、本発明の問題にはならない。
【００４１】
−第二に、遺伝子名のないものにおいて、該遺伝子に対して遺伝子自身の定義よりもより適切な定義を見出すことは不可能である。結果として、該遺伝子をホモログとして示す。即ち、B. licheniformis以外の種において相同な遺伝子はリン酸欠乏下で活性化されると考えられ得る。観察された種において、イン・ビボで転写物の形成が可能なこれら遺伝子のいずれかの複数のホモログが存在することが判ったならば、その時には該情報”配列番号…ホモログ”とは、各場合においてこれらの異なる遺伝子の可能性の最も類似したものを示す。
【００４２】
本発明に従って、出来る限り信頼性のあるメッセージを得るために、即ちプローブの一つの型により生じた個々の偽陽性シグナルを排除するために、これらの遺伝子の少なくとも３つが選択される。
【００４３】
本発明に従って、核酸結合チップは核酸特異的プローブによって提供され、１以上の特異的に認識される核酸の結合に対して、各場合において分析し得るシグナルを生じるあらゆる対象物を意味する。
【００４４】
プローブとして核酸でドープされたチップを設計することは、最初に説明した先行技術からよく知られている。基本的に、それら全ては、本発明の実施態様に利用できる。それらは、チップ上に提示されたプローブと検出されるべきmRNA(または、それらから得られる分子)の核酸ハイブリダイゼーションの原理を基にしている。該ハイブリダイゼーションによって生じたシグナルを評価するためのシステムによって、光学的な分析システムを有するチップと、電気的な分析システムを有するチップの間の区別が為される。本発明に従って、基本的に両方のシステムを用い得る。
【００４５】
かかるチップは、各ケースにおいて観察されたバイオプロセスを制御（モニタリング）するために次のように使用される；分析すべき生物学的物質を含有するサンプルを、特定の時点で該プロセスから取り出す。既知の方法によって、例えば細胞破砕および変性緩衝液の使用を用いてRNA、特にmRNAを該物質から単離しする。該RNAは、それ自身が標識されるかまたは測定(例えば、逆転写により得られたcDNA)に導入された分子に対する開始分子として使用され、そして得られた分子は、該チップを横切り／通り抜けて緩衝液中に有利に通過される。調製済みRNAまたはその誘導体の、チップ上で提供された相同な(即ち、その配列に関して適合する)プローブ(標的核酸、例えば標的DNAまたは標的核酸アナログ)とのハイブリダイゼーション(サンドイッチラベル)が、対応する光学的または電気的に分析し得るシグナルをもたらす。後者は、例えば色原体または蛍光マーカー、二次プローブとのハイブリダイゼーションを用いる結合mRNAまたはその転写物の標識化または二次検出反応例えばRT-PCRによる反応を基にしている。
【００４６】
通常、各ケースにおいて、同一プローブの複数の分子が該チップと結合されるため、ハイブリダイゼーションシグナルの強度は、適切な場合には個々のケースで至適化され得る特定の範囲にわたって、サンプリングの時点でサンプル中に存在する特異的なmRNAの数に比例する。このように、シグナル強度は、サンプリングの時点で目的とする遺伝子の活性の直接的な尺度である。
【００４７】
サンプリングと計測との時間間隔は、例えば実質的な自動化サンプリング、その処理およびセンサーを横切り／通り抜けるその通過により、出来るだけ短く保持されるべきである。
【００４８】
本発明のチップを用いて観察される(モニタリングする)適切な生物とは、基本的にあらゆる植物、動物および微生物、特に商業利用される生物、即ち例えば出願DE 19860313 A1の標題"Verfahren zur Erkennung und Charakterisierung von Wirkstoffen gegen Pflanzen-Pathogene"[植物病原体に対して活性な化合物を認識し、特徴分析する方法]は、植物、特に観察された穀類における代謝環境を明らかにしている。また、例えば有用な動物または実験動物を観察することもできる。真核細胞培養物は、商業的に非常に興味深く、例えばモノクローナル抗体を産生するため、特に食品の発酵製造のため、例えば酵母により行われるアルコール発酵により、細菌はタンパク質または低分子量、特に可変物質(生体内変化)、例えばビタミンまたは抗体の商業的産生のために使用される。
【００４９】
本発明に従って、プローブは、各ケースにおいて、核酸と十分特異的に(それらを結合する)相互作用し得るあらゆる分子を意味する。対応するアレンジメント(チップ)のフレームワークにおいて十分明確に分類できる分析し得るシグナルを得るために、この相互作用は本発明に従って利用される。
【００５０】
化学的な観点から、本発明のプローブは、通常水素結合を介してmRNA分子またはそれらから得た核酸を結合し得る化合物であって、その場合には、例えばDNAの二本鎖の相互作用またはDNA−RNA相互作用の場合についてもそうである。該化合物は、例えばRNAよりも加水分解に対してより安定なDNAであり得る。
【００５１】
さらに、先行技術は、バックボーンのリン酸塩エステル結合が、加水分解に感受性が低い結合で置換されているという事実から、DNAよりもより安定であるが生化学的に同じ相互作用を可能にする別の分子、特に化学的に合成された分子を開示している。かかる核酸アナログプローブは、本出願(下記を参照されたい)の好ましい実施態様を特徴付ける。各特異的プローブは、例えばこの出願と関連する本配列表のモデルに従って合成されるべきである。これは、本発明のチップは、特に一定のモニタリングが望まれる１回の観察したプロセスの間のこの期間に、有利には数回使用できるべきである態様と符号する。
【００５２】
プローブの利用可能性に対する制限は、各場合においてハイブリダイゼーションにより認識される、提供されたプローブと、mRNAまたはそれらから得られた核酸との間の相同性の程度である。最終的に、プローブと検出されるべきmRNAのハイブリダイゼーションの程度は(上記を参照されたい)、プローブとしてのその利用可能性を決定するものであり、個々の場合において実験的に至適化しおよび／またはシグナル評価を適合することにより考慮されなければならない。測定機器の構築および他の影響により決められた条件下で、目的の遺伝子にのみ特異的に関与し、また陽性シグナルを提供するためには十分に強いが、一方で次の分子に対する結合部位を空けるかまたはシグナルを消失できるように、シグナルを生じた後に再び広がらないように、認識される分子に対して強すぎないハイブリダイゼーションが起こるべきである；後者は、適切な場合には対応する洗浄工程を介する。
【００５３】
しかし、目的とする生物について本発明のチップを用いる前に、目的とする遺伝子間の相同性の程度を評価することが必要であり、そのため提示プローブに対して検出されるべきmRNAの親和性が不十分であれば、より密接に関連のある種由来の本発明の同一遺伝子のかかるプローブをチップ上に固定し、シグナル強度が特定のmRNAの濃度と一致するように信頼できる情報を得るために較正測定を行う。
【００５４】
本発明に重要な47個の遺伝子の同定は、本願の実施例において説明される。Bacillus licheniformisから得られる配列は本願の配列表に示す(配列番号1〜94)。これらの配列では、奇数配列はDNA配列であり、この配列の1つ大きい番号は各場合においてそれらDNA配列から得られたアミノ酸配列である。DNA配列はプローブ(上記を参照されたい)を調製するために即時利用できるが、アミノ酸配は、例えば配列データベース比較により遺伝子機能を確認することに使用され、さらに類似した核酸認識プローブを作成するために、例えば遺伝子コードを逆に翻訳することによって使用され得る。
【００５５】
実施例1に示したように、多くの異なる遺伝子転写物、即ちmRNA分子、特にリン酸代謝に関与することが一般的に知られている遺伝子について試験した。mRNA分子を、B. licheniformis DSM 13のリン酸欠乏状態への移行中の様々な時点で単離した。実施例1などは、B. licheniformisの細胞内の該mRNAの濃度の増加を実験的に測定した方法を説明している。これ以外の可能な決定方法は、先行技術において確立されているかもしれない；表１(実施例２)にまとめた内容は、本発明を理解する上で重要である。該移行に関連して全体で235個のmRNAの濃度変化を示した。この関連において、特定遺伝子のRNAの量とコントロールの値との比に関する閾値は有意であると考えられる；本発明に従って、RNAが＞3(即ち少なくとも3倍の増加)の比を有する遺伝子は誘導性と見なされる；明確な誘導は＞10の比を示す；＜0.3(即ち、30%未満まで低下)のRNA比を有する遺伝子は非常に抑制されている。表1に示した235個の遺伝子について、少なくとも3倍の増加が観察された時間内のいずれの時点でも観察された。
【００５６】
表2が証明するように、驚くべきことに、235個の遺伝子の中で47個の遺伝子のみが、実施例1に記載したリン酸欠乏の状態下の時間内で観察されたあらゆる時点で少なくとも10倍の誘導を示した。本発明に従って、これらの47個の遺伝子は、代表的なリン酸欠乏状態のインジケーターと見なされる。これらの遺伝子についてのさらなる情報、例えばそれらの機能または開始コドン偏向が表2および3および配列表において見出され得る；対応するタンパク質に対する特定の英名は、表3の情報の順で既に上記している。
【００５７】
これらの遺伝子全ては、先行技術において各場合で個々に説明されている。それらは、様々な生物種について、一般的にアクセスできるデータベースにおいて見出すことができる。上記したように、B. licheniformis DSM 13について配列表に示した配列は、この微生物から決定されており、実際に、B. Veith らによる刊行物"The Complete Genome Sequence of Bacillus licheniformis DSM13, an Organism with Great Industrial Potential"（J. Mol. Microbiol. Biotechnol., Volume 7(4), pages 204 to 211(2004)）に記載された情報と同一であり、さらにGenBank データベース(上記参照)においてエントリーAE017333 (1から4 222 645塩基)の下でアクセス可能である。B. licheniformis DSM 13株は、一般的にDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany (http://www.dsmz.de)から得られる。American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110 2209, USA (http://www.atcc.org)では受託番号ATCC 14580である。
【００５８】
上記した47個の遺伝子に対応する他の生物からの大部分の遺伝子は、例えば一般的に各々グラム陽性およびグラム陰性細菌のモデル生物とみなされる十分に特徴分析された種のバシラス・リケニホルミス（B. subtilis）およびE.coliについて、一般的にアクセス可能なデータベースにおいて同様に寄託されている。対応する配列は、例えば、インターネット・アドレスのhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/ (E.coliについて)およびhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/ (B. subtilisについて)(12.2.2004以後)から、各々アクセス可能なInstitut Pasteur, 25,28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX 15, Franceにおいて見出される。これに適切な他のデータベースは、EMBL-European Bioinformatics Institute (EBI) in Cambridge, United Kingdom (http://www.ebi.ac.uk), Swiss-Prot (Geneva Bioinformatics (GeneBio) S.A., Geneva, Switzerland (http://www.genebio.com/sprot.html)または GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)のものである。
【００５９】
該"対応する遺伝子"とは、各ケースにおいて観察された生物において同一の化学反応を触媒するか、またはB. licheniformis DSM 13において上記した47個のタンパク質として同一の生理学的プロセスに関与するタンパク質をコードする遺伝子を意味する。これらの大部分は、他の生物について、表1および2にあるB. licheniformisについて示したものと同様の名前と略称を有する、これはこの名前が特定の機能を示すためである。疑がわしい場合、それらは、各場合において本明細書に記載した配列に対して、目的とする生物由来のその次に類似する（最も相同な）それらの配列により認識され得る。機能を評価する場合、互いのアミノ酸配列の類似性は、アミノ酸が該タンパク質機能のキャリアーであるため、また遺伝子コードの縮重により様々なヌクレオチド配列が同一アミノ酸配列をコードできるために特に決め手となる。
【００６０】
特別に高度な関係性が、密接に関連した種間に存在する。即ち、基本的には上記した47個の遺伝子の大部分のホモログは、全ての種、シアノバクテリアにおいても、真核性細胞、例えば真菌またはグラム陰性菌種、例えばE.coliまたはクレブシエラにおいても見出され得ると考えられる。この見込みは、グラム陽性細菌、特にBacillus属についても非常に高い、これはB. licheniformis DSM 13から得られた配列表に示した配列は、かかるグラム陽性細菌から得られた派生されたものであるためである。さらに、さらに関連生物において、相同な遺伝子は、また同じ調節機構または同じように作用する調節機構に関与していることが多いと考えられる；したがって、これらのホモログは、同一の代謝状態、特にリン酸欠乏を示すはずである。この点で、商業的に特に重要な種のB. subtilis、B. amyloliquefaciens、B. lentus、B. globigiiは、Bacilli、即ちグラム陽性菌と同様であるので、B. licheniformisは代表的な生物として良好な選択である。これに関して、これは説明した目的の態様に従うものである。
【００６１】
特定の種について発明を実施するために、記載した47個の遺伝子の全てが知られれている必要はなく、それらの幾つかのものは(下記を参照されたい)はリン酸代謝を再生するためには十分であり、そして特にリン酸欠乏状態への移行を検出し得るのに十分であることに注目すべきである。しかしながら、リン酸供給状態についての情報の信頼性は、プローブの数が増加するにしたがって高くなる。本発明の開示を基に、基本的に適切であることが判る複数の遺伝子が知られていれば、実施例1またはノーザン分析を介する発現量(representation)と同様に目的とするその遺伝子が、実際に有意な情報となり得るかを確認するために、対応するチップを調製する前に発現試験を行うことを薦める。リン酸欠乏によって生じる発現レベルに関するシフトは、観察された種のB. licheniformisに対してより関連が低いようであり、そのためこれら47個の遺伝子のサブグループ(以下に記載したもの以外のサブグループを適切にする場合)が特に適切であることが証明され、そのため好ましい。
【００６２】
即ち、本明細書において特定されていない生物についての本発明の核酸結合チップの調製は、B. licheniformisについて特定される少なくともいくつかの遺伝子に対応する相同な遺伝子を、例えば本明細書に示した配列と目的とする生物の既知のDNA配列を比較することによって、同定することを包含する。これらまたはその一部(下記を参照されたい)は、次いで自体既知の方法によって核酸結合チップに適用される対応するプローブを合成するため、プローブまたはテンプレートとしてそれ自体、機能得る。
【００６３】
いくつかの相同配列がデータベースに受託されていなければ、共通の方法によって目的とするホモログに対する所望の生物(ゲノムまたは好ましくはcDNAの根拠に基づいて)を作成した遺伝子ライブラリィーを用いてスクリーニングするために、当業者は本出願の配列表において開示された配列を基にして特定のプローブを合成することが可能である。これに代わるものとして、完全なゲノムのDNA調製物または目的とする生物のcDNA調製物からプローブとして使用され得る、目的とする遺伝子またはその一部を増幅するために、PCRプライマーとして機能する配列表のオリゴヌクレオチドに示したDNA配列を基にして合成することもできる。これらまたはその一部(下記を参照されたい)は、本発明の核酸特異的チップ上のプローブとして用い得る。
【００６４】
本発明の重要な態様は、全ての異なるリン酸代謝特異的プローブの総数が100を超えないということである。この態様は、説明した対象と相関し、そのため、占有し得る場所の数がそれらの設計により比較的少ないそれらの核酸結合チップに主に焦点が向けられるべきである。これらは、特に電気的に分析できるチップである。
【００６５】
従って、全ての異なるリン酸代謝特異的プローブの総数が、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55または50を超えないものが順に好ましい。
【００６６】
これは、対照の目的のために使用される本発明において議論されていない他の遺伝子、例えば十分なリン酸供給によってのみ発現される遺伝子に対するプローブも包含し得る。それに関与し得るシグナルの消失は、リン酸欠乏状態への移行を同様に示し得る。かかるシグナルが保持されていれば、次いで本発明により決定されるべきリン酸欠乏シグナルの信頼性に関する対照として役立つ。
【００６７】
さらなるリン酸代謝特異的プローブは、例えばリン酸過剰によって誘導されるものを包含でき、またリン酸代謝とは直接関連することが明らかでないが、該誘導性により自体を定義し得るその他のものもまた包含し得る。結果として、かかるチップは、例えば適切な対策を為すことによって、リン酸欠乏が克服された後に観察されたプロセスにおいて有用な分析可能な情報を生じる。
【００６８】
核酸特異的プローブは、さらに通常、各場合において、完全な遺伝子のフラグメントのみである(下記を参照されたい)。個々の場合において、例えばスプライシングによる調節または大きな多機能ポリペプチドを用いて、２つ以上の異なるプローブにて同一遺伝子を検出することは賢明であるかもしれない。従って、対応する実施態様は、適切な場合には、47個以上のプローブによって特徴分析されるが、該47個以上の遺伝子には反応しない。
【００６９】
観察されるべきプロセスによって、さらなる遺伝子または遺伝子産物に対するプローブが本発明のチップ上で存在し得る(下記を参照されたい)。
【００７０】
一方、本発明の核心は、目的とするチップの特異性から特に構成され、これにより記録される特別な代謝条件が記録される。かかる特別な問題の場合には、様々な遺伝子に反応する100以上のプローブを有するチップの調製または大部分の生物のゲノムを再生するチップの調製は、それらに複雑に関連するため本明細書に記載した発明の一部ではない。むしろ、平行して有用な方法で観察されるバイオプロセスにおいて両方の種類のチップを用いることは可能である：即ち、多数の様々な遺伝子プローブを含有するチップまたは出願WO 2004/027092 A2にて彼らが提供したような多様な潜在的に関連のある状況の代表例は、目的とする生物の状態に関する概説を提供でき、一方で目的とする細胞がリン酸欠乏状態となる可能性について懸念すべき理由があれば本発明のチップは対照として使用される。
【００７１】
好ましい実施態様は、そこに示した順番で順に好ましくは上記に示したプローブでドープした本発明の核酸結合チップである。
【００７２】
これは、逆の順番で表３に挙げた遺伝子を意味する。従って、yhcR 遺伝子に対するプローブを有するチップ(5'-ヌクオチダーゼと類似；配列番号13、14)は、この遺伝子は記載された47個の遺伝子の中で最も弱い誘導であって、この転写はリン酸欠乏のために顕著な様式で増強されるので、プローブの形成に対する遺伝子選択に関して本発明のチップの中では依然として最も好まれないものである。これに対して、遺伝子選択に関して最も好ましいものは、yvmC遺伝子(未知機能のタンパク質；配列番号75、76)のプローブを有するそれらのチップである。この理由は、該遺伝子が開始レベルのほぼ150以上のファクターによって誘導され、そのため測定した全ての遺伝子のなかで最も高い誘導を示す。即ち、それと関連したシグナルは、代謝状態"リン酸欠乏"を示すために試験した全ての遺伝子の中で最も適切である。
【００７３】
好ましい実施態様は、本発明の核酸結合チップであって、ここで少なくとも３つのプローブは次の39個の遺伝子から選択される：仮定上のタンパク質に対する遺伝子(配列番号65ホモログ)、yhbD、cotE、保存された仮定上のタンパク質に対する遺伝子 (配列番号59ホモログ)、yurl、spoVID、推定芳香族化合物特異的ジオキシゲナーゼに対する遺伝子(配列番号55ホモログ)、yhbE、推定ベンゾエート輸送タンパク質に対する遺伝子（配列番号49ホモログ)、pstBB、spolllAH、仮定上のタンパク質に対する遺伝子(配列番号63ホモログ)、spollQ、spolllAG、yvmA、推定リボヌクレアーゼに対する遺伝子(配列番号93ホモログ)、dhaS、yrbE、推定デカルボキシラーゼ/デヒドラターゼに対する遺伝子(配列番号57ホモログ)、htpG、yfkH、spollAB、spolllAF、alsD、gdh、yfkN、pstC、yfmQ、pstBA、dhaSホモログ(DhaSアルデヒドデヒドロゲナーゼホモログ；配列番号17ホモログ)、推定ホスファターゼに対する遺伝子(配列番号61ホモログ)、phy、cypX、alsS、phoD、pstS、phoB、yvnA、yvmC。
【００７４】
B. licheniformis DSM 13 を基にし、実施例1から3に記載された実施例で行った試験において、該遺伝子は、少なくとも13のファクターまで上昇した遺伝子誘導を示した。従って、対応する好ましい実施態様は、表３に列挙した最初の39個の遺伝子により特徴付けられた。
【００７５】
さらに好ましいものは、本発明のそれらの核酸結合チップであり、ここで少なくとも３つのプローブは、次の14個の遺伝子から選択される：yfkN、pstC、yfmQ、pstBA、dhaSホモログ(DhaSアルデヒドデヒドロゲナーゼホモログ；配列番号17ホモログ)、推定ホスファターゼに対する遺伝子(配列番号61ホモログ)、phy、cypX、alsS、phoD、pstS、phoB、yvnA、yvmC。
【００７６】
B. licheniformis DSM 13を基にした、実施例1から3に記載された実施例で行った試験において、該遺伝子は、少なくとも25のファクターまで上昇した遺伝子誘導を示した。
【００７７】
さらに好ましいものは、本発明のそれらの核酸結合チップであって、ここで少なくとも３つのプローブが、次の8個の遺伝子から選択される：phy、cypX、alsS、phoD、pstS、phoB、yvnA、yvmC。
【００７８】
B. licheniformis DSM 13を基にし、実施例1から3で記載した実施例で行った試験において、該遺伝子は少なくとも40のファクターまで上昇した遺伝子誘導を示した。
【００７９】
さらに好ましいものは、本発明のそれらの核酸結合チップであって、ここで少なくとも1つの、順に好ましくは2つまたは3つのプローブが、次の3つの遺伝子から選択される：phoB、yvnA、yvmC。
【００８０】
B. licheniformis DSM 13を基にした実施例で行われ、また実施例1から3で説明した試験において、これら遺伝子は、少なくとも100のファクターまで、yvnAおよびyvmC の場合では115以上まで、そして後者の場合では140のファクター以上まで、上昇した遺伝子誘導を示した。
【００８１】
好ましい実施態様において、本発明の核酸結合チップは、本発明に特異的なプローブの少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、35、40、45 または47でドープされる。
【００８２】
該プローブが対応するシグナルに応答すればする程、その時にリン酸の供給または不十分な供給に対してそれと関連のある情報であるという信頼性も増す。即ち、偽陽性シグナルを排除し得るために、好ましい実施態様を特徴分析する、特に重要なプローブを見たところ重要ではないものと組み合わせることは理にかなっている。さらなる利点は、表2の情報に従って、そこに示した時間内の様々な時点で様々な強度のシグナルを生じるものを互いにこれらのプローブを組み合わせることからなる。即ち、リン酸欠乏の開始からサンプリングまでの時間間隔および特定の環境影響に起因している該欠乏の可能性を、培養条件の記録により推定することができる。
【００８３】
それらの特異的な配列に関して、同じmRNAに反応する様々なプローブ、例えば同じmRNA(下記を参照されたい)の異なった領域とハイブリダイズするフラグメントは、判読の信頼性を高めるために数倍存在し得るが、それらは最良のケースでは同じシグナルに対して同等に強く反応し、基本的に互いに交換できるため、本発明のこの態様の目的のために、一回計測されただけである。
【００８４】
本発明の核酸結合チップの好ましい実施態様において、全ての異なるプローブの総数は、順に好ましくは100、95、90、85、80、75、70、65、60、55 または50を超えない。
【００８５】
これは上記した新規概念に一致する、従って本明細書に記載したチップは特異的な代謝の態様をモニターすることを意図されており、そのためこの状況を記録するために必要とされるよりも多数のプローブを目的とするチップ上に用いることが必要でない。これは、個々の場合に、同一mRNAを検出するために１以上のプローブを用いることおよび／または目的の可変物質の産生に関連のある個々のプローブを用いるのが感応し易い該状況に影響しない。全体として、本発明は、技術的な理由で少数の結合部位しか持たないチップの保護範囲に包含できるような特定の範囲にある。
【００８６】
本発明の核酸結合チップの好ましい実施態様において、本発明に関連するものとして示したプローブは、バイオプロセスのために選択された生物由来の関連するかまたは最も相同なイン・ビボ-転写可能遺伝子と反応するもので、好ましくは関連するかまたは最も相同な同一生物のイン・ビボ-転写可能遺伝子である。
【００８７】
この目的のためには、すでに上記しているが、本出願で開示された該配列は、B. licheniformisから得られたものであり、特に一般に知られた関係性から、関連種、特にBacillus属のものをモニタリングするのに適切であるろう。これは、データベース比較を基にして特異的機能を分類することができ、かつ他の種において主に同一機能をコードするべきもの、およびそれらの配列によってのみ決定されたもの、これら両方の同定した遺伝子に適用する。この目的のために、観察された生物において最も密接に関連する遺伝子は、対応するプローブを誘導するために、本発明に従って使用される。しかし、プローブは、偽遺伝子についてではなく、すなわち細胞質で測定できる核酸シグナルを生じるイン・ビボ条件下でmRNAに転写されるものについて作製されることに注意を払わなければならない。
【００８８】
しかし、統計学的な観点から、かかるチップは、測定される核酸と選択されたプローブとの良好な相互作用にてより上手く使用することができる。結果として、特に、B. licheniformisに対する関係の程度が低いと、このハイブリダイゼーションに対して、記載した配列によるのではなく、配列の差違が存在すれば、目的とする種からの相同な遺伝子についての配列を使用する必要が高くなる。後者の配列は、上記に説明したように、自体既知の方法、特に遺伝子ライブラリースクリーニングまたは本明細書に開示した配列を基にしたプライマーを用いるPCRによって得られる(適切な場合、特定のランダム配列の配列変化を含有する"ミスマッチプライマー"の形態で)。
【００８９】
本発明の核酸結合チップの好ましい実施態様において、バイオプロセスに選択した生物は、単細胞真核生物、グラム陽性またはグラム陰性細菌の代表的なものである。
【００９０】
この理由は、これらの群が、特に観察されるバイオプロセスが発酵の場合に、工業的に最もよく用いられた生物を包含するためである。これには、例えば発酵プロセス、例えばワインまたはビール製造、または可変物質、例えばタンパク質または低分子化合物の生物工学的な製造が挙げられる。
【００９１】
所望の生成物のタイプによって、様々な生物は生物工学的方法について選択される。それらは、本発明の目的のために、産生株だけでなく、あらゆる生物の産生プロセスの上流、例えば対応する遺伝子のクローニングやこれらの適切な発現ベクターの選択についても重要である。この関連において、リン酸の制限を記録する必要性は該プロセスの各部分で基本的に存在する。
【００９２】
本発明の核酸結合チップの好ましい実施態様において、単細胞真核生物は、原生動物または真菌であって、これらの中で特に酵母、より具体的にはサッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスが代表的なものである。
【００９３】
この理由は、後者は宿主細胞として非常に良く用いられているためであり、特に真核生物の遺伝子産物、さらに発酵によって得られるアルコール飲料およびその他の食品を製造するために用いられる。前者の使用は、該遺伝子産物がこれらの株によって実施され得る、例えばタンパク質のグリコシル化などの特異的な修飾を行う場合に特に有利である。
【００９４】
この対象は、特に高等真核生物、例えば齧歯類またはヒトの細胞培養の増殖の経過をモニタリングすることを目的とする本発明のチップに包含される。ある意味において、それらは、特に免疫、例えばモノクローナル抗体産生に対して商業的にかなり重要である少なくとも実質的に単細胞真核生物を示すものとしてさらに理解され得る。
【００９５】
本発明の核酸結合チップの好ましい実施態様において、グラム陽性細菌は、コリネフォルム（coryneform）細菌または、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、コリネバクテリア（corynebacteria）属またはバシラス（Bacillus）属、特にスタフィロコッカス・カルノサス（Staphylococcus carnosus）種、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、バシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バシラス・リケニホルミス（B. licheniformis）、バシラス・アミロリクエファシエンス（B. amyloliquefaciens）、バシラス・アガーアドヘランス（B. agaradherens）、バシラス・ステアロサーモフィラス（B. stearothermophilus）、バシラス・グロビギィ（B. globigii）またはバシラス・レンタス（B. lentus）、およびより特別にはバシラス・リケニホルミス（B. licheniformis）のものである。
【００９６】
この理由は、それらが工業的に特に重要な産生株であるからである。それらは、特に低分子化合物、例えばビタミンまたは抗体を産生するため、またはタンパク質、特に酵素を産生するために使用できる。αアミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、オキシドレダクターゼおよびプロテアーゼについては特別に言及しなければならない。B. licheniformsに対する特に重要な点は、配列表に示した配列はこの種から得られるという事実によって、そして実施例2および3で説明したように、リン酸欠乏への移行とのその関連を証明できたという事実によって説明され得る。
【００９７】
本発明の核酸結合チップの同様に好ましい実施態様において、グラム陰性細菌は、エシュリキア・コリ（E.coli）属およびクレブシエラ(Klebsiella)属のものであって、特にE.coli K12、E.coli Bまたはクレブシエラ・プランチコラ(Klebsiella planticola)の派生物、より特別にはE.coli BL21 (DE3)、E.coli RV308、E.coli DH5α、E.coli JM109、E.coli XL 1 またはKlebsiella planticola (Rf)の株の派生物である。
【００９８】
この理由は、それらが実験室規模、例えばクローニングや発現分析、および産業的規模の両方で、生物学的に有価な物質を産生するのに使用されるためである。
【００９９】
本発明の核酸結合酸の好ましい実施態様において、少なくとも一つ、より好ましくは複数の、本明細書に記載の発明との関連から特定されたプローブが、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91 および 93として配列表に記載された配列から得らる。
【０１００】
この理由は、実施例2および3に記載したとおり、B. licheniformisにおいてリン酸欠乏への移行とこれらの遺伝子の関係を証明できたからである。従って、これらの配列は、特にB. licheniformisまたはその他の、特に関連のあるBacillus 種がモニタリングされる場合に使用されるべきである。
【０１０１】
本発明の核酸結合チップの好ましい実施態様は、さらなる遺伝子、特にこのプロセスにより発現された代謝に関連のある遺伝子に対して、より特別にはこれらの遺伝子またはこの遺伝子自身に対して少なくとも１つのプローブでさらにドープされたものである。
【０１０２】
上記説明のとおり、観察したプロセスは、さらなる特異的な遺伝子と頻繁に関連づけられる産業的関心を提供する。これは、例えばタンパク質が産生されるべき場合には、このタンパク質に対する遺伝子であって、低分子量化合物が産生されるなら、目的とする化合物の合成経路上に存在するか、または該経路を調節する１以上の遺伝子産物である。該生成物が酸化または還元による反応体または中間体から得られるはずなら、該細胞に本来備わっているその他の遺伝子、例えば生成物、例えば細胞に本来備わっているオキシドレダクターゼの産生中に順に産生されるはずである代謝遺伝子も影響され得る。
【０１０３】
さらに、特にバイオプロセス、特に微生物による商業的関連のある化合物の産生は、通常、野生型の株よりもむしろ目的とするプロセスに関する株を用いる。これは、実際の生成物の実際の製造に関与する遺伝子による形質転換とは違い、選択マーカーまたは栄養要求性までさらなる代謝調節を条件に包含するためである。かかる株は、成長条件に対する要求の特別なプロファイルを示し、それらのいくつかは、野生型遺伝子と比較して変異されている代謝遺伝子を示す。本発明のチップは、正確にはこれらの株、より特別には観察されるバイオプロセスを指向することを意図するのが有利であるので、これらの株の特異的な特性が考慮されるべきであって、目的とするプローブの選択において影響され得る。
【０１０４】
本発明のかかる核酸結合チップの好ましい実施態様において、該プロセスによってさらに発現された該遺伝子は、工業的利用可能なタンパク質、特にαアミラーゼ、セルロース、リパーゼ、オキシドレダクターゼ、ヘミセルラーゼまたはプロテアーゼか、または低分子化合物の合成経路上にあるか、または少なくとも部分的に該経路を調節するものである。
【０１０５】
次いで、これらは、該タンパク質が産生されるバイオプロセス、特に発酵に関する。後者は、例えば食品産業または洗剤工業において使用される商業的に特に重要な酵素である。後者の場合には、特に、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、ヘミセルラーゼおよび／またはプロテアーゼによる加水分解しうる汚染物質を除去するため、各材料の処理、特にセルラーゼによる処理のために、またはオキシドレダクターゼを基にした酵素漂白系を提供するために、使用される。
【０１０６】
後者の変形は生体内変化の範疇にはいり、特に適切な場合にさらに導入され、微生物の代謝活性は化合物の合成に利用される。
【０１０７】
本発明の核酸結合チップの好ましい実施態様において、本明細書に記載した本発明との関連で特定された１つ、好ましくは複数のプローブは、一本鎖形態で、また暗号鎖の形態で提供される。
【０１０８】
この実施態様は、プローブと検出されるべきサンプルの間のハイブリダイゼーションを改善する目的をもつ。これは、特に関連のあるmRNA含量がサンプルから実際に決定される場合に適用する。該mRNAは１本鎖であって、その配列は該DNAのコード鎖と対応するので、相補鎖、即ち暗号鎖との至適ハイブリダイゼーションが保証される。
【０１０９】
本発明の核酸結合チップの好ましい実施態様において、本明細書に記載した本発明との関連で特定された１つ、好ましくは複数のプローブは、一本鎖形態で、暗号鎖の形態で提供される。
【０１１０】
この実施態様は、プローブと検出されるべきサンプルの間のハイブリダイゼーションを改良する目的をもつ。これは、特に、対応するmRNA含量が、サンプルから実際に決定される場合に適用する。該mRNAは１本鎖であって、その配列が該DNAのコード鎖と対応するので、相補鎖、即ち暗号鎖との至適ハイブリダイゼーションが保証される。
【０１１１】
本発明の核酸結合チップの好ましい実施態様において、本明細書に記載した本発明との関連で特定された１つ、好ましくは複数のプローブは、DNAまたは核酸アナログ、好ましくは核酸アナログの形態で提供される。
【０１１２】
この実施態様は、本発明のチップの耐久性および複数の有用性の改良を目的とする。この必要性は、一定のモニタリングが望まれる経過中において、１つの観察されたプロセスの間で生じる。本発明のチップの耐久性、特に核酸加水分解酵素に対する耐久性は、後者が加水分解感受性がそのままで例えばRNAなどよりも低いため、DNAの形態でプローブを提供することですでに高められる。さらに安定なものは、例えば糖リン酸塩バックボーンのリン酸塩が、例えば天然のヌクレアーゼにより化学的に分解できない、化学的に異なる構成要素で置換されている核酸アナログである。かかる化合物は、一般的に先行技術において知られており、所望により、各ケースにおいて記載した所望の配列を専門に扱う会社によって商業的に合成される。該目的とするプローブは、例えば、配列表に示した配列のテンプレートに従って合成され得る。
【０１１３】
本発明の核酸結合チップの好ましい実施態様において、本明細書に記載した本発明との関連で特定された１つ、好ましくは複数のプローブは、試験されるべき生物によってmRNAに転写される遺伝子領域、特に該mRNAの5'末端に近位の遺伝子領域を含む。
【０１１４】
多くの場合、調節DNA区分も特異的な遺伝子に分けられるという態様が考慮される。しかし、本発明のチップは、観察された細胞において実際に存在するmRNAを検出するために用いることを意図されており、従って本明細書で熟考した目的のためには、実際にmRNAに翻訳される遺伝子を選択することが重要である。第二に、イントロンが、特に真核生物で存在することが考慮されるべきである、即ちコード領域がmRNA中で翻訳されない区分により遮られる。そのため、イントロンを含有するるプローブは、目的とするmRNAに、あまり反応しないか、または少しも反応しないべきである。この態様を実施するために、ゲノムDNA配列というよりもむしろcDNA配列、即ち実際のmRNAを基に得られたそれらの配列を使用することをすすめる。
【０１１５】
さらに、mRNAの検出は、完全長配列にわたるハイブリダイゼーションを必要としていないことがおおい。そのため、特異的プローブは、通常mRNAに転写された遺伝子の小さな断片を含むことが必要である。ここで、有利な点は、mRNAの5'末端に近い領域の選択である。この領域はmRNAに転写される最初のものであって、そのため遺伝子の活性化後に検出される最初のものである。これはアット・ライン検出に有益である。
【０１１６】
本発明の核酸結合チップの好ましい実施態様において、本発明に関係するものとして示される１つ、好ましくは複数のプローブは、特定の全mRNAを基にして、関連のある核酸のフラグメントと反応する、特に、二次ホールディングの程度が低い各mRNAのものと反応する。
【０１１７】
これは、プローブと検出すべきmRNAとのハイブリダイゼーションを至適化するための別の態様である。これの理由は、mRNA分子が、本来的には他の領域と個々のmRNA領域のハイブリダイゼーションを基にした二次構造を有することが多いためである。即ち、例えばループまたはステム−ループ構造が形成される。しかし、通常、かかる領域は後者が相同であっても他の核酸分子と容易にハイブリダイズしない。この種の領域は、そこに示した(下記を参照されたい）コンピュータープログラムによって、非常に正確に計算され得る。即ち、この態様を説明するために、目的とする生物について決定されることが望まれる該遺伝子の活性は、かかるプログラムによって分析されるべきであり、適切なプローブを得るために−通常小区分のみを含む(下記を参照されたい)−mRNAの二次構造の程度が低いと予測される区分が用いられるべきである。
【０１１８】
本発明の核酸結合チップの好ましい実施態様において、本明細書に記載した本発明との関連で特定された１つ、好ましくは複数のプローブは、より好ましくは200、150、125または100未満のヌクレオチド長、好ましくは20〜60のヌクレオチド、特に好ましくは45〜55のヌクレオチド長を有する。
【０１１９】
これの理由は、検出反応に使用したプローブは、それらから得られるシグナルが十分特異的であるかぎり、検出されるべきmRNAの一部を含む必要があるためである。この特異性、即ち異なるmRNA識別可能性により、目的とするプローブ長の最低限界が設定され、適切な場合には予備実験で決定される。
【０１２０】
適切なプローブ長およびプローブ領域の同定は、当業者には既知であって、通常専門用ソフトウェアによって実施される。かかるソフトウェアの例は、プログラムアレイ・デザイナー（Premier Biosoft International, USA）および、ベクターNTI（登録商標） Suite, V. 7（InforMax, Inc., Bethesda, USAから入手可能な）である。これらのソフトウェアプログラムは、例えば予め決定したプローブ長および融解温度、さらに既に言及した二次構造が考慮される。
【０１２１】
本発明の核酸結合チップの好ましい実施態様において、本発明に関連するものとしてmRNAと対応するプローブとの結合により、電気シグナルが生じる。
【０１２２】
上記したように、J. Wang (Acc. Chem. Res.; ISSN 0001 4842; Rec. Sept. 12, 2001, pp. A F)による論文で、光学システムを超える電気的に分析可能なシステムに関する利点が議論されている。また、先行技術で開発されてきたかかるセンサーの様々な実施態様も示している。
【０１２３】
このように、サンプリングからシグナルの測定までの時間的な間隔は、現行で光学的に分析し得るチップについてはおよそ24時間である。電気システムを用いると、必要な時間は現行で2時間(図１を参照されたい)未満である。これに対して、同時分析し得るサンプルの数は、現行で電気的に分析できるチップにて２桁の範囲である、しかし急速な開発により、この桁の規模はすぐに超え得るであろうと考えられる。これを制限するものは、様々なシグナルについての電気的評価ユニットである。
【０１２４】
先行技術により確立されているmRNAを定量する方法の例はRT−PCTである。この方法は、"Quantification of Bacterial mRNA by One-Step RT PCR Using the LightCycler システム" (2003) by S. Tobisch, T. Koburger, B. Juergen, S. Leja, M. Hecker and T. Schweder in BIOCHEMICA, Volume 3, pages 5 to 8の論文において説明されている。これとの比較すると、これらはRT-PCRと比較して明らかにゆらぎの程度が低いために、電気チップの検出はデータの信頼性が高いという別の利点を示す。
【０１２５】
対応する電気的に分析し得るチップの調製は、例えば特許出願WO 00/62048 A2、WO 00/67026 A1 およびWO 02/41992において説明されており、この文献に挙げられた文献全てを、出典明示により本明細書に包含する。
【０１２６】
特に好ましい実施態様の機能に関する電気的にチップを判読し得る方法は、後記のとおりに説明されている：遺伝子特異的プローブは、該チップに関する特異的に設計されたチャンバーに位置する磁性ビーズと既知の様式で共有結合される。この対応するmRNAが、このハイブリダイゼーションチャンバーにおいて特定ビーズに特異的にハイブリダイズする、この温度は制御され、目的とする溶液によって洗浄され得る。ビーズはこのチャンバー中でマグネットによって保持される。RNAサンプルのビーズ-結合DNAプローブへのハイブリダイゼーション後に、未結合RNAが洗浄工程で除去され、結果として特異的ハイブリッドは磁性ビーズと結合したインキュベーションチャンバーに存在している。
【０１２７】
洗浄後、ビオチン-エクストラビジン-結合アルカリホスファターゼによって標識した検出プローブは、インキュベーションチャンバーに導入される。このプローブは、ハイブリダイズしたmRNAの空いている第二の領域に結合する。次いで、このハイブリッドは、再度洗浄され、アルカリホスファターゼ基質、パラ−アミノフェノールリン酸塩(pAPP) とインキュベートされる。インキュベーションチャンバー中のこの酵素反応により、酸化還元-活性化生成物、パラ−アミノフェノール(pAP)が放出される。後者は、その後電気的チップ上の酸化還元電極を通過し、該シグナルが定電位電解装置に送信される。
【０１２８】
システム-特異的なソフトウェア(例えば MCDDE32)により得られたデータを読み、その結果を評価し、さらなるプログラム(例えば、Origin)を用いてコンピューター上に表示する。
【０１２９】
このプロセスは、もちろん、チップと評価の両方の技術設計に関して変化され得る。即ち、例えば計測が電気的原理のために好ましくは酸化還元反応以外の様々な反応によって、該検出反応は行われ得る。
【０１３０】
本発明のある功績は、リン酸代謝に特異的な、即ちプロセスが重要な遺伝子を同定することであって、それらを利用し易くし、相応じて設計したバイオチップを介して分析することである。従来の検出方法を超えるチップの利点は、時間短縮および高い正確性に加えて、１つの支持体上に複数のプローブを提供することによって同時に同一サンプル中の複数の異なる遺伝子の活性を検出する可能性、そして例えばリン酸欠乏が始まった時間に関してより安定かつより詳細な実体をもたらす該活性の可能性を含んでおり、特定の課題に対する用途と共に本明細書に記載される。
【０１３１】
さらに、本発明の別の課題は、バイオプロセスを行う生物の生理的状態を決定するために核酸結合チップに結合する、好ましくは同一のチップに結合する、次の47個の遺伝子： yhcR、tatCD、ctaC、推定アセトインレダクターゼ(配列番号53ホモログ)に対する遺伝子、spollGA、nasE、pstA、spollAA、仮定上のタンパク質 (配列番号65ホモログ)に対する遺伝子、yhbD、cotE、保存された仮定上のタンパク質(配列番号59ホモログ)に対する遺伝子、yurl、spoVID、推定芳香族性-特異的ジオキシゲナーゼ(配列番号55ホモログ)に対する遺伝子、yhbE、推定ベンゾエート輸送タンパク質(配列番号49ホモログ)に対する遺伝子、pstBB、spolllAH、仮定上のタンパク質(配列番号63ホモログ)に対する遺伝子、spollQ、spolllAG、yvmA、推定リボヌクレアーゼ(配列番号93 ホモログ)に対する遺伝子、dhaS、yrbE、推定デカルボキシラーゼ/デヒドラターゼ(配列番号57 ホモログ)に対する遺伝子、htpG、yfkH、spollAB、spolllAF、alsD、gdh、yfkN、pstC、yfmQ、pstBA、dhaS ホモログ(DhaSアルデヒドデヒドロゲナーゼホモログ; 配列番号17 ホモログ)、推定ホスファターゼ(配列番号61 ホモログ)に対する遺伝子、phy、cypX、alsS、phoD、pstS、phoB、yvnA、yvmC、の少なくとも３つの遺伝子に対する核酸プローブまたは核酸アナログプローブの同時使用である。
【０１３２】
上記に説明したとおりに、これらの47個の遺伝子は、実施例1〜3に記載のとおりに、それらはグラム陽性細菌 B. licheniformis のリン酸欠乏状態への移行中に有意にかつ十分特異的に誘導されるので、観察された生物のリン酸代謝の状況の実体を伝達するように選択される。同等の説明が、同じ代謝関連特性を有する相同な遺伝子またはタンパク質を持つ他の生物についても予測されうる。
【０１３３】
詳細に説明したとおりに、かかる遺伝子特性は、一般的に様々な方法、例えばノーザンハイブリダイゼーションで決定され得る。
【０１３４】
しかし、核酸結合チップ、特に上記したチップを用いる分析は、複数の遺伝子活性を、同時に非常に効率良く、さらにアット・ライン（at line）で決定することができる。結果として、バイオプロセスを行う生物の代謝変化は、アット・ラインで観察でき、適切な場合には調節様式に介入され得る。
【０１３５】
核酸結合チップに対する上記説明は、適宜目的とするプローブの本明細書で特定された用途に用いる。
【０１３６】
従って、好ましいものは、全ての異なるリン酸代謝特異的プローブの総数が100を超えないものを使用することである。
【０１３７】
より好ましいものは、全ての異なるリン酸代謝特異的プローブの数が順に95、90、85、80、75、70、65、60、55または50を超えないもので、残っているリン酸代謝からの陽性コントロールも包含する。
【０１３８】
従って、さらに好ましいものは、それらの使用を提供するものであって、ここで上記したプローブは、上記した順番において順に用いられるのが好ましい(表3に示した順と逆)。
【０１３９】
上記説明に従って、さらなる好ましいものは、核酸プローブまたは核酸アナログプローブの上記に特定した使用を下記に示される：
−次の39個の遺伝子由来の遺伝子に特異的な少なくとも３つの核酸プローブまたは核酸アナログプローブの使用：仮定上のタンパク質(配列番号65のホモログ)に対する遺伝子、yhbD、cotE、保存された仮定上のタンパク質(配列番号59のホモログ)に対する遺伝子、yurl、spoVID、推定芳香族化合物特異的ジオキシゲナーゼ(配列番号55のホモログ)に対する遺伝子、yhbE、推定ベンゾエート輸送タンパク質(配列番号49のホモログ)に対する遺伝子、pstBB、spolllAH、仮定上のタンパク質(配列番号63のホモログ)に対する遺伝子、spollQ、spolllAG、yvmA、推定リボヌクレアーゼ(配列番号93のホモログ)に対する遺伝子、dhaS、yrbE、推定デカルボキシラーゼ/デヒドラターゼ(配列番号57のホモログ)に対する遺伝子、htpG、yfkH、spollAB、spolllAF、alsD、gdh、yfkN、pstC、yfmQ、pstBA、dhaSホモログ(DhaSアルデヒドデヒドロゲナーゼホモログ;配列番号17のホモログ)、推定ホスファターゼ(配列番号61のホモログ)に対する遺伝子、phy、cypX、alsS、phoD、pstS、phoB、yvnA、yvmC;
−これらの中で、次の14個の遺伝子の少なくとも３つが好ましい：yfkN、pstC、yfmQ、pstBA、dhaSホモログ(DhaSアルデヒドデヒドロゲナーゼホモログ；配列番号17のホモログ)、推定ホスファターゼ(配列番号61のホモログ)に対する遺伝子、phy、cypX、alsS、phoD、pstS、phoB、yvnA、yvmC;
−これらの中で、次の8個の遺伝子の少なくとも３つが特に好ましい：phy、cypX、alsS、phoD、pstS、phoB、yvnA、yvmC；および
−これらの中で、少なくとも一つの次の3個の遺伝子が特に好ましい：phoB、yvnA、yvmC。
【０１４０】
上記に従って、本発明の使用は、同時に特定したプローブの少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、35、40、45または47のものが好ましい。
【０１４１】
上記に従って、本発明の好ましい使用は、全ての異なるプローブの総数が100、95、90、80、75、70、65、60、55、50、40、30、20または10を超えないで、この順で好ましい。
【０１４２】
上記に従って、より好ましくは、バイオプロセスを行う生物のリン酸代謝、好ましくはリン酸欠乏状態を検出するために本発明の使用を提供する。
【０１４３】
上記に従って、さらに好ましいのは、少なくとも１つ、順に好ましくは複数の特定したプローブが配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57,59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91 および 93として配列表に記載された配列から得られる、本発明の使用を提供する。
【０１４４】
本発明の別の主題は、本発明の核酸結合チップを使用することによってバイオプロセス下で生物の生理的状態を決定する方法である。
【０１４５】
これらの方法は、基本的に該プロセス中に観察された生物のサンプルを、プロセスを妨害することなしに、取り出し、該サンプルからのmRNAを単離することを含む。これらの化合物、または適切な場合には、それらから得られた化合物、例えばcDNAなどは、上記方法の工程−例えば十分なインキュベーション時間または非特異的に結合する核酸の洗浄−を考慮に入れて処理され、上記した核酸結合チップを通過し、最終的に検出器に送達される。この種の方法の手順は、基本的に電気的に分析可能なチップの原理に対して図１に説明した。
【０１４６】
核酸結合チップに対する上記説明は、バイオプロセスを行う生物の生理的状態を決定する本明細書において特定された適宜該方法に適用される。
【０１４７】
好ましくは、バイオプロセスを行う生物のリン酸代謝における変化、好ましくはリン酸欠乏状態が決定される、本発明の方法を提供する。 
【０１４８】
この用途の分野に関して、実施例および上記した該遺伝子が選択される。それらの有意な誘導は、少なくともB. licheniformisでは、リン酸欠乏状態の開始と同時におこり、該遺伝子を検出する方法の可能性を提供する、特にB. licheniformisだけでなく、成功の可能性をさらに改善することによって、他の関連のある種(上記を参照されたい)においても信頼性を与える。さらに、この代謝状況は多くの微生物におけるライフサイクルでの臨海点を示す。即ち、実施例に示したように、リン酸欠乏の特定の開始は常に対数増殖期への移行と関連している。この点を早期認識できる方法は、該移行を遅延させるように役立ち、特に産業的に利用し得る発酵、有価な物質の製造期間を長くさせるように役立つ。
【０１４９】
上記に従って、好ましくは、本発明のそれらの方法を提供し、この方法で、バイオプロセスについて選択された生物は、代表的な単細胞真核生物、グラム陽性またはグラム陰性細菌である。
【０１５０】
上記に従って、好ましくは、該単細胞の真核生物は、原生動物または真菌であり、これらの中で、特に酵母、特にサッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスである、本発明のそれらの方法を提供するものである。
【０１５１】
上記に従って、好ましくは、ここでは、本発明のそれらの方法を提供するものであって、該グラム陽性細菌は、コリネフォルム細菌またはスタフィロコッカス属、コリネバクテリア属およびバシラス属、特にスタフィロコッカス・カルノサス種、コリネバクテリウム・グルタミカム種、バシラス・サブチリス種、バシラス・リケニホルミス種、バシラス・アミロリクエファシエンス種、バシラス・アガーアドヘランス種、バシラス・ステアロサーモフィラス種、バシラス・グロビギィ種またはバシラス・レンタス種、および特にバシラス・リケニホルミス種のものである。
【０１５２】
上記に従って、好ましくは、ここでは本発明のそれらの方法を提供するものであって、該グラム陰性細菌は、E.coli 属およびKlebsiellia属、特にE.coli K12、E.coliＢまたはKlebsiellia planticolaおよびより特別にはE.coli BL21 (DE3)株、E.coli RV308株、E.coli DH5株、E.coli JM109株、E.coli XL 1αまたはKlebsiellia planticola (Rf)の派生物である。
【０１５３】
上記に従って、特定されたプローブを用いる本発明の方法が提供されるのが好ましく、該プローブは配列表に示したこれらの配列番号1、3、5、7、9、11、15、19、23、25、29、31、33、37、43、45、49、51、53、55、59、61、65、67、69、71、73、75、77、81、83、85、87、89、91または93から得られたものである。
【０１５４】
これらの中で、好ましいものはこれらの配列は該生物から単離されており、この種に最も成功裏に用いられ得るため、上記グラム陽性細菌、特にバシラス・リケニホルミスについて、本明細書で特定したプローブを用いる方法である。
【０１５５】
上記に従って、好ましいものは本発明の方法を提供するものであって、好ましくは複数の、構造的に同じ核酸結合チップ、特に好ましくは同一の核酸結合チップを用いて、同一プロセスの時間内の様々な時点で生理的状態が決定される方法である。
【０１５６】
上記に従って、好ましくは、さらに本発明の方法を提供するものであって、該プロセスは、発酵、特に工業的利用可能な産物の発酵製造、特に好ましくはタンパク質または低分子量化合物の製造である。
【０１５７】
上記に従って、好ましくは、本発明のそれらの方法の中で、該低分子量化合物が天然物質、食品補足物または医薬関連化合物である方法が提供される。
【０１５８】
上記に従って、好ましくは、本発明のそれらの方法を提供し、該タンパク質が酵素、特にαアミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、オキシドレダクターゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、オキシダーゼおよびヘミセルラーゼの群のうちの一つである。
【０１５９】
発明の別の主題は、本発明の核酸結合チップの使用可能性であって、バイオプロセスを行う生物の生理的状態を決定するために上記に詳細に説明されている。
【０１６０】
核酸結合チップに対する上記説明は、バイオプロセスを行う生物の生理的状態を決定することに関する本明細書で特定された使用に適宜適用される。
【０１６１】
上記に従って、好ましくは、バイオプロセスを行う生物のリン酸代謝の変化、好ましくはリン酸欠乏状態が決定される本発明のそれらの使用を提供するものである。
【０１６２】
上記に従って、好ましくは、バイオプロセスに選択された生物が代表的な単細胞真核生物、グラム陽性またはグラム陰性細菌であって、本発明のそれらの使用をさらに提供するものである。
【０１６３】
上記に従って、該単細胞真核生物が原生動物または真菌、これらの中で特に酵母、特にサッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスである生物の使用を提供する、本発明のそれらの使用が好ましい。
【０１６４】
上記に従って、該グラム陽性細菌がコリネフォルム細菌、またはスタフィロコッカス属、コリネバクテリア属およびバシラス属、特にスタフィロコッカス・カルノサス種、コリネバクテリウム・グルタミカム種、バシラス・サブチリス種、バシラス・リケニホルミス種、バシラス・アミロリクエファシエンス種、バシラス・アガーアドヘランス種、バシラス・ステアロソーモフィラス種、バシラス・グロビギィ種またはバシラス・レンタス種、より特別にはバシラス・リケニホルミス種のものである、本発明のそれらの使用を提供するものが同様に好ましい。
【０１６５】
上記に従って、同様に好ましくは、本発明の、グラム陰性細菌が、E.colo属およびKlebsiellia属、特にE.colo K12、E.colo BまたはKlebsiellia planticolaの派生物、より特別にはE.colo BL21 (DE3)株、E.coloRV308株、E.colo DH5株、E.colo JM109株、E.colo菌 XL 1αまたはKlebsiellia planticola (Rf)の派生物である。
【０１６６】
上記に従って、配列表に示したこれらの配列番号1、3、5、7、9、11、15、19、23、25、29、31、33、37、43、45、49、51、53、55、59、61、65、67、69、71、73、75、77、81、83、85、87、89、91または93から得られるそれらの特定したプローブが使用される、本発明のそれらの使用を提供するものが好ましい。
【０１６７】
上記に特記した理由に対して、これらの使用の中で、それらの使用にかえて、上記グラム陽性細菌、特にバシラス・リケニホルミスについて本明細書で特定したプローブを用いる使用を提供するのが好ましい。
【０１６８】
上記に従って、好ましくは、生理的状態が、同一プロセスの時間内の様々な時点で、好ましくは複数の構造的に同一の核酸結合チップ、特に好ましくは同一の核酸結合チップを用いて決定される、本発明のそれらの使用を提供するものである。
【０１６９】
上記に従って、好ましくは、該プロセスが発酵であって、特に工業的利用可能な産物の発酵製造、特に好ましくはタンパク質または低分子量化合物の製造である、本発明のそれらの使用をさらに提供するものである。
【０１７０】
上記に従って、好ましくは、これら方法の中で、本発明のそれらの使用を提供するものであって、その低分子化合物が、天然物質、食品補足物または医薬関連化合物である。
【０１７１】
上記に従って、好ましくは、別法として、該タンパク質が酵素、特にα-アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、オキシドレダクターゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、オキシダーゼおよびヘミセルラーゼの群のうちの一つである、本発明のそれらの使用を提供するものである。
【０１７２】
本発明は、下記実施例によりさらに説明されるものである。
【０１７３】
実施例
全ての分子生物学的研究を、例えばFritsch, Sambrook and Maniatisらによる、"Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989,または同等の専門家による文献において見出され得る標準的方法により実施した。酵素およびキットは特定の製造会社の指示書に従って用いた。
【０１７４】
実施例１
チップ分析による遺伝子プローブの同定
バクテリアの培養およびサンプルの単離
Bacillus licheniformis DSM13株の細胞(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany; http://www.dsmz.deから得た)を、リン酸制限した合成Belitsky最小培地(0.28 mM 最終濃度)中で270 rpmでの一定の振盪および37℃にて培養した。該培地は、次の組成である：(1.)基本培地(pH 7.5)：0.015 M(NH4)2SO4、0.008 M MgSO4×7H2O、0.027 M KCl、0.007 M クエン酸ナトリウム×2H2O、0.050 M Tris-HClおよび0.009 M グルタミン酸；(2.)補足:0.2 M KH2PO4、0.039 M L-トリプトファン-HCl、1M CaCl2×7H2O、0.025 MnSO4×2H2O、0.0005 M FeSO4×4H2O および20% (w/v)グルコース;および(3.)培地補充プラン：KH2PO4（0.14ml）、CaCl2(0.2 ml)、FeSO4(0.2 ml)、MnSO4(0.04 ml)、グルコース(1ml)。全量は100 mlの基本培地とする。
【０１７５】
増殖分析を確率する期間中に、対照サンプルは、500 nm (OD500)で0.4-0.5の至適光学密度で取出し、別のサンプル("移行")はOD500で0.8-0.9の増殖過渡期において取り出した。上記のBelitzky最小培地についての補充プランは、リン酸欠乏がOD500で0.8-1.0にて始まり、それによって定常期に入るような方法で設定されている。さらなるサンプルを、さらに30、60および120分間後に採取した。それらを採取した直後に、0℃に冷却した等量のKilling 緩衝液(20 mM NaN3;20 mM Tris-HCl, pH 7.5; 5 mM MgCl2)をサンプルに添加した。その後すぐに、該細胞ペレットを4℃、15 000 rpm、5分間で遠心分離により採取し、上清を廃棄し、該ペレットは、−80℃で凍結させるか、直ぐに使用するかのいずれかとする。
【０１７６】
細胞破砕
該細胞を、"Hybaid RiboLyserTM Cell Disruptor" (Thermo Electron Corporation, Dreieich, Germany)を用いて破砕した。この方法は、約0.1 mmの大きさのガラスビーズ(Sartorius BBI, Melsungen, Germany)を用いて物理的に該細胞壁と該細胞膜を破砕することに基づく。予め分解緩衝液II(3 mMEDTA; 200 mM NaCl)に懸濁した破壊すべきその細胞を、ガラスビース(株保持)と共にガラス管中に入れた。酸性フェノールを、RNasesによるRNAの分解を防止するために加えた。次いで、該管をRiboLyser内部に入れ、ここで該ガラスビーズは激しく振盪することによって細胞とコロイド状となり、該細胞が破砕する。
【０１７７】
全RNAの単離
細胞破砕後、該RNAを含有する水層を、遠心分離によりタンパク質と細胞フラグメント、染色体DNAおよびガラスビーズと分離し、該RNAを、MagNA Pure LC RNA単離キットI(Roche Diagnostics, Penzberg, Germany)を用いて、KingFisher mL装置により(Thermo Electron Corporation, Dreieich, Germany)単離した。この精製は、RNasesを不活性化するカオトロピックの塩の存在下ではRNAと磁性ガラスビーズ粒子とが結合することを基にしている。該磁性粒子は、結合、洗浄および溶出緩衝液で満たした様々な反応容器間でRNAを輸送する手段として働く。これに用いたKingFishermLは、粒子を、磁性体を用いて容器間を行ったりきたりする結合RNAと、その粒子を輸送する一種のピペッテングロボットであって、サンプルを混合するのにも利用される。RNAは、最後に磁性粒子から引き離されるので精製状態にある。
【０１７８】
RNAの定性および定量コントロール
RNAの精製を、定性および定量コントロールに供した。これに利用したAgilent Bioanalyzer 2100装置(Agilent Technologies, Berlin, Germany)は、ラボ・オン・ア・チップスケール(lab-on-a-chip scale)でRNAを分析できる。Agilent "RNA 6000 Nano Kit"と共に全RNAはゲル電気泳動で分画され、こうして部分分解およびコンタミネーションに関して、定性試験の可能性を提供する。これは、リボゾームRNA (16Sおよび23S rRNA)を検出することを包含する。後者が明確なバンドとして出現すれば、該RNAは処理中には分解されておらず、インタクトであると考えられ、その後の試験に用いられ得る。さらに正確な濃度もまたここで決定される。
【０１７９】
トランスクリプトーム分析
トランスクリプトーム分析を、常法にて(例えば、WO 95/11995 A1に従って)調製した全ゲノムB. licheniformis DSM13 DNA ミクロアレイを用いて行い、光学システムによって分析した。DNAミクロアレイは、実質的に各B. licheniformis 遺伝子の２つのコピーを含有しており、そのため基本的には同一チップ上で平行して２つのサンプルを分析し、得られた値を平均することができる。
【０１８０】
測定原理は、染料マーカーを担持する添加したデオキシリボヌクレオチドの一つを用いて、RNAへの逆転写を介して得たサンプル由来の特定のmRNA分子をイン・ビトロで転写することからなる。これらの標識分子は、次いでチップの既知の部位に位置する既知のプローブとハイブリダイズされ、蛍光マーカーに起因する目的の部位で特定のシグナル強度が光学的に記録される。対照および実際に試験されるべきサンプルに対して２つの異なる蛍光マーカーを用いた場合に、同時にハイブリダイズを行い、それにより提示したプローブと結合するのに競合し、サンプルと対照の濃度の割合の計測値を与える異なる色の値が得られる。
【０１８１】
蛍光染料のシアニン3またはシアニン5にて標識したdUTPをこの標識のために選択した。即ち、各場合において対照の全RNA（25μg）(OD500 0.4)を、蛍光染料シアニン3(Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Germanyg)にて標識し、特定のストレスサンプルの全RNA（25μg）(移行期、30、60おび120分)を、蛍光染料シアニン5(GE Healthcare, Freiburg, Germany)で標識した。２つのサンプルの競合ハイブリダイゼーションを、従来の全ゲノムB. licheniformis DSM13 DNA ミクロアレイ上で42℃にて少なくとも16時間実施した。
【０１８２】
非特異的結合を排除するためのアレイ洗浄後、このアレイを、ScanArray(登録商標) Express Laser Scanner (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Rodgau-Juegesheim, Germany)により光学的に判読した。全てのハイブリダイゼーションを、各場合でその他の染料(ダイ・スワップ方法)を用いて標識したサンプルにて繰り返した。アレイの定量評価を、製造者の指示書および標準パラメーエターに従って、ScanArray(登録商標)Express software (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Rodgau-Juegesheim, Germanyから入手可能)を用いて行った。
【０１８３】
アレイを、Lucidea Score Card の対照 (GE Healthcare, Freiburg, Germany)により規格化し、評価した。ハイブリダイゼーション効率および品質をコントロールするために使用さされるこの"Score Card"を用いて、既知の対照DNAおよびオリゴ形態にある"スパイク（spikes）"を、製造者指示書に従ってアレイに適用し、ハイブリダイゼーション中に相補配列と混合した。即ち、スキャン後に該ハイブリダイゼーションと染料の導入の成功を制御できる。該コントロールは、両方のサンプルにおいて同じ量で存在すべきである、そのためスキャン後に黄色にみえるか、または両チャンネルの間の割合は1である。このスパイクは、特定サンプルについて特異的であり、様々な希釈物中に適用される、即ちそれらは、特定のサンプルについてスキャンした後に赤に見えるか、または緑に見える。
【０１８４】
遺伝子の発現のために、２つのハイブリダイゼーションの平均および特定の標準偏差を計算した。有意な誘導または有意な抑制に対して、特定遺伝子と対照のRNAの量比に関して下記閾値を観察した：＞3 (即ち少なくとも３倍の増加)の比をもつRNA遺伝子は誘導されたと見なされる；＜0.3(即ち30%未満までの低下)のRNA比を有する遺伝子は明らかに抑制されたと見なされる。これらの結果を実施例2に示す。
【０１８５】
実施例2
リン酸欠乏下で誘導された遺伝子
表1に、実施例１で決定された全235個のBacillus licheniformis DSM13 遺伝子を列挙し、この誘導(少なくとも3のファクター)は実施例1で説明したリン酸欠乏状態下で観察された。最初の2列は、各々得られたタンパク質の特定の名称およびその略称(もしあれば)を示す；"Bli番号"は、GenBank データベース(National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; http://www.ncbi.nlm.nih.gov; as of 12.2.2004)エントリーAE017333 (塩基1〜4 222 645)の下で入手できるB. licheniformis完全ゲノムの"ローカス・タグ（locus tag）"に対応している；これは、最初に示した時間で観察された各場合において対応するmRNAの濃度増加に関するファクターに従う。
【０１８６】
表１：リン酸欠乏下でこの誘導(少なくとも3のファクター)が観察された実施例1で決定した235個のBacillus licheniformis DSM13 遺伝子(説明：本文参照)。
【０１８７】
【表１−１】
2008523833.tif 000003
【０１８８】
【表１−２】
2008523833.tif 000004
【０１８９】
【表１−３】
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【０１９０】
【表１−４】
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【０１９１】
【表１−５】
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【０１９２】
【表１−６】
2008523833.tif 000008
【０１９３】
【表１−７】
2008523833.tif 000009
【０１９４】
【表１−８】
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【０１９５】
【表１−９】
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【０１９６】
【表１−１０】
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【０１９７】
【表１−１１】
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【０１９８】
【表１−１２】
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【０１９９】
【表１−１３】
2008523833.tif 000015
【０２００】
実施例3
リン酸欠乏下において特に顕著に誘導される遺伝子
表2は実施例1で決定された全てのBacillus licheniformis DSM13 遺伝子を挙げたもので、実施例1で説明したリン酸欠乏の状態下でこの誘導はいずれの計測時点でも少なくとも10のファクターであり、比較試験を基にして(データ示さず)リン酸欠乏に比較的特異的であるとして分類され得る。これらは総数47個の遺伝子であった。
【０２０１】
標題は前記実施例と同一である。さらに、最初の欄は本発明の配列表において特定のDNAおよびアミノ酸配列の配列番号を示す。配列表中のフリーテキストとして表される特定配列の特異的な態様は、標題の遺伝子名/遺伝子機能として追加した。
【０２０２】
表2:特にあらゆる計測時点で特にリン酸欠乏によってもたらされる誘導が少なくとも10のファクターであった実施例1で決定された47個のBacillus licheniformis DSM13 遺伝子(説明:本文参照)。
【０２０３】
【表２−１】
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【０２０４】
【表２−２】
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【０２０５】
【表２−３】
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【０２０６】
【表２−４】
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【０２０７】
表3は、観察された誘導強度の順で、再度同じ47個の遺伝子を挙げたものである。ドイツ語で対応する用語は、[ドイツ語]説明部分においてはこの順番で示される。請求項の主題に関するアレンジメントは逆の順番となる。
【０２０８】
表3:実施例1で決定された47個のBacillus licheniformis DSM13 遺伝子、計測時間のいずれの時点でも特にリン酸欠乏によっておこるこの誘導は、各場合において測定した最高値(最終カラム)の低い順で、少なくとも10のファクターであった。
【０２０９】
【表３−１】
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【０２１０】
【表３−２】
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【０２１１】
【表３−３】
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【０２１２】
【表３−４】
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【０２１３】
実施例4
選択された遺伝子のリアルタイムRT-PCR 定量
リアルタイムRT-PCRにより、サンプル中の特定の転写物の分子の絶対数を決定できる。LightCycler (Roche Diagnostics, Penzberg, Germany)を、"SYBR Green I" キット (Roche Diagnostics)と組合せて用いた。この方法は、蛍光染料と二本鎖DNAとの結合を検出することを基にしている。特異的mRNA分子を、Tobisch らの(2003; Quantification of Bacterial mRNA by One-Step RT-PCR Using the LightCycler System; BIOCHEMICA, Volume 3, pages 5 to 8)記載のとおりに、外部標準曲線を試験されるべき各mRNAについて確立して定量した。
【０２１４】
この目的のために、実施例1で決定し、実施例2に挙げたmRNAのイン・ビトロ転写物の既知濃度の希釈物を、LightCyclerにより測定し、次いで装置に特化したソフトウェアを用いて標準曲線を確立した。この目的のために、試験されるべき各mRNAに特異的であって、イン・ビトロ転写物およびLightCyclerにおけるPCR増幅を合成できるプライマーは事前に選択されるべきである("Array Designer"ソフトウェア；PREMIER Biosoft International, Palo Alto, USAから入手可能)。
【０２１５】
外部標準曲線を作製した後、LightCyclerにおける計測を開始した。分析されるべき各サンプルの2つの異なる希釈物を計測に用いた。次いで、特定のプライマーを、特異的な転写を増幅するために行ったLightCyclerに用い、次いで染料の導入を測定した。
【０２１６】
LightCyclerソフトウェアおよびのウェブサイトhttp://molbiol.ru/ger/scripts/01_07.html Skripts (12.2.2004)から得られるスクリプトを用いて、選択した転写物について分子の正確な数を決定することができる。この方法で得られた値および互いのその関係を、これらの選択した転写物について表1および2に示した誘導の値を確認するために用いた。
【図面の簡単な説明】
【０２１７】
【図１】図1は、本発明の電気的DNAチップを用いるバイオプロセスのアット・ライン・モニタリングの代表的な概略図である。  バイオプロセスのアット・ライン・モニタリングは、下記ステップによって行われるのが有利である:1.サンプリング、例えば微生物の発酵からのサンプリング；2.常法による細胞破砕;3.常法によるRNA単離;4.本発明に従って荷電されたチップ上で、核酸(例えばDNA)または核酸アナログ(例えば、加水分解が困難である構造的類似化合物)とのハイブリダイゼーション;5.適切に構築した電気的チップの電気シグナルの記録;あるいは、光学的DNAチップからの光学シグナルの記録も可能である;6.好ましくはコンピューター補助データ評価。
【０２１８】
開発の現状により、電気的チップの使用により、適当な総合的な全体の分析時間が2時間未満となり、従来の光学的なDNAチップの使用では約12時間となる。
【図１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年9月4日(2007.9.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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