(57)【要約】  修飾された生合成ポリペプチド分子、これらを製造する方法及びこれらの使用が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
ＬＴ−Ｐ−Ｔ’
（式中（ＬＴ）は、局在化ペプチド（Ｌ）、タグ又はリンカー（Ｔ）、任意の順序の局在化ペプチド（Ｌ）及びタグ又はリンカー（Ｔ）、メチオニン及び不存在からなる群から選択され；
Ｐは、ＢＳＰ配列を含み；並びに、
Ｔ’は、タグ若しくはリンカーを含み、又は不存在であり、
Ｌ、Ｔ、Ｐ又はＴ’は、１又は複数の非天然コードアミノ酸を含む。）
を含むポリペプチド。
【請求項２】
式：
Ｆ−（ＬＴ）−Ｐ−Ｔ−Ｆ’
（式中、Ｆはポリペプチド配列を含み、又は不存在であり；
（ＬＴ）は、局在化ペプチド（Ｌ）、タグ又はリンカー（Ｔ）、任意の順序の局在化ペプチド（Ｌ）及びタグ又はリンカー（Ｔ）、メチオニン及び不存在からなる群から選択され；
Ｐは、最大１００個のアミノ酸を有する所望のポリペプチド配列を含み、且つＦ又はＦ’とは異なり；
Ｔ’は、タグ若しくはリンカーを含み、又は不存在であり、
Ｆ’は、ポリペプチド配列を含み、又は不存在であり、
Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｐ、Ｔ’又はＦ’は、１又は複数の非天然コードアミノ酸を含む。）
を含むポリペプチド。
【請求項３】
Ｐが１又は複数の非天然コードアミノ酸を含むＢＳＰをさらに含む、請求項２に記載ポリペプチド。
【請求項４】
ポリペプチドコード配列に作用可能に連結されたプロモーター配列を含み、前記ポリペプチドコード配列が式（ＷＸ）−Ｚを有し、（ＷＸ）が、局在化ペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ｗ）、タグ又はリンカーをコードするヌクレオチド配列（Ｘ）、任意の順序の局在化ペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ｗ）及びタグ又はリンカーをコードするヌクレオチド配列（Ｘ）、及び不存在からなる群から選択され；
Ｚは所望のＢＳＰをコードするヌクレオチド配列を含み、Ｗ、Ｘ又はＺをコードするヌクレオチド配列はセレクターコドンを含む、核酸分子。
【請求項５】
Ｚに作用可能に連結されたＹ’をさらに含み、Ｙ’がタグをコードするヌクレオチド配列を含み、前記タグをコードする前記ヌクレオチド配列が必要に応じてセレクターコドンを含む、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
ａ）式：
（ＬＴ）−Ｐ−Ｔ’
（式中（ＬＴ）は、局在化ペプチド（Ｌ）、タグ又はリンカー（Ｔ）、任意の順序の局在化ペプチド（Ｌ）及びタグ又はリンカー（Ｔ）、メチオニンおよび不存在からなる群から選択され；
Ｐは、ＢＳＰ配列を含み；
Ｔ’は、タグ若しくはリンカーを含み、又は不存在であり、
Ｌ、Ｔ、Ｐ又はＴ’は、選択された条件下で１又は複数のペプチド結合を切断するように決定された官能基を有する１又は複数の非天然コードアミノ酸を含む。）
を含むポリペプチドを、組換え宿主細胞中で生産すること；
ｂ）１又は複数のペプチド結合を少なくとも部分的に切断するのに十分な時間にわたって、選択された条件下で、前記ポリペプチドを反応すること、
ｃ）Ｐを含むペプチドを、反応産物から回収すること、
を含む方法。
【請求項９】
１又は複数の非天然コードアミノ酸を含む、ＢＳＰ。
【請求項１０】
ＢＳＰが１又は複数の翻訳後修飾を含む、請求項９に記載のＢＳＰ。
【請求項１１】
ポリペプチドがリンカー、ポリマー又は生物活性分子に連結されている、請求項９に記載のＢＳＰ。
【請求項１２】
非天然コードアミノ酸が、配列番号２（ＧＬＰ−１）から得られる７位に（すなわち、Ｎ末端に）存在する最初のアミノ酸の前の残基、７Ｈ、８Ａ、９Ｅ、Ｖ１６、１７Ｓ、１８Ｓ、１９Ｙ、２０Ｌ、２１Ｅ、２２Ｇ、２３Ｑ、２４Ａ、２５Ａ、２６Ｋ、２７Ｅ、２８Ｆ、２９Ｉ、３０Ａ、３１Ｗ、３２Ｌ、３３Ｖ、３４Ｋ、３５Ｇ、３６Ｒ、３７Ｇ、３８位での（すなわち、カルボキシ末端の）付加及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される位置において置換されている、請求項９に記載のＢＳＰ。
【請求項１３】
非天然コードアミノ酸が、配列番号２２又は２４（Ｔ−２０）から得られる残基Ｗ６３１、Ｄ６３２、Ｉ６３５、Ｎ６３６、Ｎ６３７、Ｙ６３８、Ｔ６３９、Ｓ６４０、Ｌ６４１、Ｌ６４５、Ｎ６５１及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される位置において置換されている、請求項９に記載のＢＳＰ。
【請求項１４】
ストリンジェントな条件下で、配列番号１、２、３、２１、２２、２３又は２４をコードするポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが少なくとも１つのセレクターコドンを含む単離された核酸。
【請求項１５】
非天然コードアミノ酸を含む単離されたＢＳＰを、前記非天然コードアミノ酸と反応する部分を含むリンカー、ポリマー又は生物活性分子と接触させることを含む、請求項１１に記載のＢＳＰを製造する方法。
【請求項１６】
請求項９に記載のＢＳＰと薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組成物の治療的有効量を患者に投与することを含む、ＢＳＰによって調節される疾患を有する患者を治療する方法。
【請求項１８】
請求項１４に記載の核酸を含む細胞。
【請求項１９】
セレクターコドン、オルソゴナルＲＮＡシンテターゼ及びオルソゴナルｔＲＮＡを含むＢＳＰをコードする一又は複数のポリヌクレオチドを含む細胞を、非天然コードアミノ酸を含むＢＳＰの発現を可能とする条件下で培養することと；及び前記ＢＳＰを精製することとを含む、非天然コードアミノ酸を含むＢＳＰを作製する方法。
【請求項２０】
ＢＳＰ中の天然に存在する一又は複数の何れかのアミノ酸を一又は複数の非天然コードアミノ酸に置き換えることを含む、ＢＳＰの血清半減期又は循環時間を調節する方法。
【請求項２１】
セレクターコドンを含み、且つ少なくとも一つの非天然コードアミノ酸を含むポリペプチドによってコードされるＢＳＰ。
【請求項２２】
請求項２１に記載のＢＳＰと薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項２３】
ＢＳＰの単一のアミノ酸に、共有結合によって連結された水溶性ポリマーを含むＢＳＰ。
【請求項２４】
少なくとも一つのリンカー、ポリマー、又は生物活性分子を含み、前記リンカー、ポリマー、又は生物活性分子が、リボソームによってポリペプチド中に取り込まれた非天然コードアミノ酸の官能基を通じてポリペプチドに結合されている、ＢＳＰ。
【請求項２５】
一又は複数の非天然コードアミノ酸に結合された、リンカー、ポリマー又は生物活性分子を含み、前記非天然コードアミノ酸が、予め選択されたポリペプチドの部位中にリボソームによって取り込まれる、ＢＳＰ。
【請求項２６】
ポリペプチドが配列番号１、２、３、２１、２２、２３、２４及びこれらの断片からなる群から選択されるＢＳＰ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００４年７月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／５９０，０３５号及び２００５年３月７日に出願された米国仮特許出願第６０／６５９，７０９号の優先権を主張し、これらの明細書は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、少なくとも１つの非天然コードアミノ酸を含み、又は少なくとも１つの非天然コードアミノ酸を用いて作製される生合成ポリペプチド及び融合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００３】
ペプチドは、研究及び医療において広く使用されており、ペプチド製品の製造及び性能に対する挑戦が行われるにつれて、ペプチドの重要性は増大すると予測できる。本明細書に記載されているような治療用ペプチドは、生合成ポリペプチド（ＢＳＰ）と称される。多くの内在性ペプチドが、生物学的プロセスの重要な成分として記載されている。これらのペプチドのうち幾つかは、様々な疾患を管理するための重要な治療剤として同定されている。一般に、内在性ペプチドは、非固有配列を有する合成ペプチドに比べて、治療剤としてより望ましいが、内在性であるが故に、免疫応答を引き起こさないからである。さらに、内在性ペプチドは、それらの標的受容体に対して極めて特異的であり、合成及び製造が容易である。しかしながら、このような治療用ペプチドの送達に伴う大きな困難は、主に、迅速な血清クリアランス、及びペプチダーゼの作用によるタンパク分解のために、それらの血漿半減期が短いことである。
【０００４】
固有ペプチド又はこれらの類縁体が治療で使用される場合には、分解及び／又はクリアランスの速度が高いことが一般に見出される。その後反復投与が必要となり得るので、長期間にわたって治療剤の高い血液レベルを維持したい場合には、治療剤のクリアランス速度が高いことは不都合である。分解及び／又はクリアランスの速度が高いペプチドの例には、ＡＣＴＨ、コルチコトロピン放出因子、アンギオテンシン、カルシトニン、インシュリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１、グルカゴン様ペプチド−２、インシュリン様成長因子−１、インシュリン様成長因子−２、胃抑制ペプチド、成長ホルモン放出ホルモン、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド、セクレチン、エンテロガストリン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、副甲状腺ホルモン、トロンボポエチン、エリスロポエチン、視床下部放出因子、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、エンドルフィン、エンケファリン、バソプレッシン、オキシトシン、オピオイド及びその類縁体、スーパーオキシドジスムターゼ、インターフェロン、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ及びリボヌクレアーゼが含まれる。一部の事例では、適切な薬学的組成物を与えることによって、ペプチドの放出特性に影響を及ぼすことが可能であるが、このアプローチには様々な欠点があり、一般的に適用できるとは限らない。
【０００５】
ペプチダーゼは、結合の間に水分子を挿入することによって、ペプチド中のペプチド結合を切断する。一般的に、多くのペプチドは、数分以下で、体内のペプチダーゼによって切断される。さらに、幾つかのペプチダーゼは、ペプチドのある種類に対して特異的であるために、分解がさらに素早いものとなる。このため、ペプチドが治療剤として使用される場合には、ペプチダーゼの作用によってペプチドが体内で迅速に分解するにつれて、ペプチドの活性は一般的に減少する。
【０００６】
この欠点を克服するための一つの方法は、ペプチドの一部が分解されても、十分治療的に有効であり続けるように、目的の治療用ペプチドを患者に大量投与することである。しかしながら、この方法は、患者にとって、極めて不快である。多くの治療用ペプチドは、経口投与できないので、治療用ペプチドは、絶えず注入するか、静脈内注射によって頻繁に投与するか、又は皮下注射という不便な経路によって頻繁に投与しなければならないであろう。頻繁に投与する必要があるため、可能性がある多くのペプチド治療法の治療単位当たりの費用が、受容できないほど高騰する。分解されたペプチドが大量に存在すると、望ましくない副作用が生じる可能性もある。
【０００７】
投与時の不快さと高いコストが、魅力的な生物活性特性を有する多くの治療用ペプチドが薬物候補として開発されていない２つの理由である。その代わり、これらの治療用ペプチドは、治療用ペプチドを代替するためのペプチド模倣化合物を開発するための鋳型として使用されている。バイオテクノロジー及び巨大製薬会社は、受容できない副作用特性を引き起こさずに、治療用ペプチドに見られる活性を模倣する非ペプチド有機化合物を開発するために、しばしば、非常に長く、且つコストのかかる最適化プログラムを実施する。例えば、高価なＳＡＲ（構造活性相関）及び分子モデリング研究から得られた環状ペプチド、ペプチド模倣物及び小分子は、ペプチド模倣物の信じられない量の開発に結びついている。しかしながら、これらのペプチド模倣物は、治療用ペプチドの正確な本来の生物学的性質を反映するものではないため、治療剤として、内在性治療用ペプチドに比べて劣る。
【０００８】
ペプチド模倣物を作製する別の方法は、生物活性を維持しながら、治療用ペプチドの分解が遅くなるように、治療用ペプチドの分解を抑制し、又は治療用ペプチドを修飾するためにペプチダーゼの作用を遮断することである。このような方法には、デキストラン、ポリビニルピロリドン、糖ペプチド、ポリエチレングリコール及びポリアミノ酸などのポリマー性材料との抱合、硫酸アドロイチン（ａｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）との抱合、並びに多糖、アミノレシチン（ａｍｉｎｏｌｅｔｈｉｃｉｎ）、脂肪酸、ビタミン１２及びグリコシドなどの低分子量化合物との抱合が含まれる。幾つかの方法には、担体タンパク質とのエキソビボ抱合が含まれる。ポリマー材料の添加によって生じる無作為化された抱合体の産生及び／又は治療活性の減少が妨げられるように、治療用ペプチドに対する改良が必要とされる。このため、低毒性を維持しているが、修飾されたペプチドの治療的な利点をなお保持しながら、ペプチダーゼ活性から保護され且つインビボでのより長い作用期間を有する改善された治療用ペプチドに対する必要性が存在する。
【０００９】
親水性ポリマーであるポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧと略記される。）の共有結合は、水溶性、生物学的利用性を増大し、血清半減期を増大し、治療的半減期を増大し、免疫原性を調節し、生物学的活性を調節し、又はタンパク質、ペプチド及び特に疎水性分子などの多くの生物活性分子の循環時間を延長する方法である。ＰＥＧは、薬剤、人工のインプラント、並びに生体適合性、毒性の欠如及び免疫原性の欠如が重要であるその他の用途で広く使用されている。ＰＥＧの所望の特性を最大化するために、生物活性分子に結合された一又は複数のＰＥＧの総分子量及び水和状態は、親分子の生物活性に悪影響を与えないようにしつつ、水溶性及び循環半減期の増加などの、ＰＥＧポリマー結合に通例付随する有利な特性を付与するのに十分高くなければならない。
【００１０】
ＰＥＧ誘導体は、しばしば、リジン、システイン及びヒスチジン残基、Ｎ末端及び炭水化物部分などの反応性の化学的官能基を通じて、生物活性分子に連結される。タンパク質及びその他の分子は、多くの場合、ポリマー付着に利用できる限られた数の反応部位を有する。しばしば、ポリマー付着を介した修飾に最も適した部位は、受容体結合において重要な役割を果たしており、分子の生物学的活性の保持に必要である。その結果、生物活性分子上のこのような反応性部位へのポリマー鎖の無差別的な付着が、しばしば、ポリマーによって修飾された分子の著しい減少をもたらし、又は完全な喪失さえもたらす。Ｒ．  Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２７１：２１９６９−２１９７７。標的分子への所望の有利さを付与するのに十分なポリマー分子量を有する抱合体を形成するために、従来技術のアプローチでは、多数のポリマーアームを分子に無作為に付着していたが、これにより、親分子の生物活性の減少又は完全な喪失のリスクは増加する。
【００１１】
ＰＥＧ誘導体がタンパク質に付着するための場所を形成する反応性部位は、タンパク質の構造によって決定される。酵素を含むタンパク質は、一般式Ｈ２Ｎ−−ＣＨＲ−−ＣＯＯＨを有するα−アミノ酸の様々な配列から構成される。一つのアミノ酸のαアミノ部分（Ｈ２Ｎ−−）が、隣接するアミノ酸のカルボキシル部分（−−ＣＯＯＨ）に結合して、アミド結合を形成し、これは、−−（ＮＨ−ＣＨＲ−ＣＯ）ｎ−−（ｎは、数百または数千に等しいことができる。）として表すことができる。Ｒによって表される断片は、タンパク質の生物活性及びＰＥＧ誘導体の付着に対する反応性部位を含有することが可能である。
【００１２】
例えば、アミノ酸リジンの場合には、α位とε位に−−ＮＨ２部分が存在する。ε−−ＮＨ２は、塩基性ｐＨの条件下で自由に反応できる。ＰＥＧを用いたタンパク質誘導化の分野の多くは、タンパク質中に存在するリジン残基のε−−ＮＨ２に付着するためのＰＥＧ誘導体を開発することに向けられてきた。“Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ”、Ｎｅｋｔａｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃａｔａｌｏｇ，  ２００３，  ｐｐ．  １−１７。しかしながら、これらのＰＥＧ誘導体は全て、タンパク質の表面上にしばしば多数存在するリジン残基を選択的に取り付けることができないという共通の限界を有している。リジン残基が、例えば、酵素活性部位中に存在するタンパク質活性にとって重要である事例において、又は、受容体結合部位の場合のように、他の生物分子とのタンパク質の相互作用を媒介する上でリジン残基が役割を果たしている事例において、著しい制約となり得る。
【００１３】
タンパク質をＰＥＧ化するための既存の方法の、同じく重要な第二の困難は、ＰＥＧ誘導体が所望の残基以外の残基と望ましくない副反応を行い得ることである。ヒスチジンは、−−Ｎ（Ｈ）−−として構造的に表される反応性イミノ部分を含有するが、ε−−ＮＨ２と反応する多くの化学的反応性種は、−−Ｎ（Ｈ）−−とも反応することが可能である。同様に、構造的に−ＳＨとして表されるアミノ酸システインの側鎖は遊離のスルフヒドリル基を有している。幾つかの事例では、リジンのε−−ＮＨ２基に誘導されたＰＥＧ誘導体は、システイン、ヒスチジン又は他の残基とも反応する。これは、ＰＥＧで誘導体化された生物活性分子の複雑な異種混合物を生成し、標的とされている生物分子の活性を破壊するリスクをもたらし得る。化学的官能基をタンパク質内の単一部位に導入することを可能とし、次いで、これにより、生物活性分子のタンパク質表面上に存在する確定され且つ予測可能な特異的部位に一又は複数のＰＥＧポリマーを選択的に結合することを可能とするＰＥＧ誘導体を開発することが望ましいと思われる。
【００１４】
リジン残基に加え、本分野における多大な努力は、システイン、ヒスチジン及びＮ末端などの他のアミノ酸側鎖を標的とする活性化されたＰＥＧ試薬の開発に向けられている。例えば、米国特許第６，６１０，２８１号（参照により本明細書に組み込まれる。）及び“Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ”，  Ｎｅｋｔａｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃａｔａｌｏｇ，  ２００３，  １−１７を参照。システイン残基は、部位特異的突然変異誘発及び本分野で公知の他の技術を用いて、タンパク質の構造中に部位選択的に導入することが可能であり、生じた遊離のスルフヒドリル部分は、チオール反応性官能基を有するＰＥＧ誘導体と反応することが可能である。しかしながら、遊離のスルフヒドリル基の導入によって、生じたタンパク質の発現、折り畳み及び安定性が悪化することがあるという点で、このアプローチには問題が多い。このため、スルフヒドリル基及びタンパク質中に典型的に見出される他の化学的官能基との適合性を同時に維持しつつ（すなわち、所望でない副反応に関与せずに）、タンパク質の一又は複数のＰＥＧ重合体の選択的結合を可能とする生物活性分子中に化学的官能基を導入するための手段を有することが望ましいであろう。
【００１５】
本分野の研究から明らかであるように、タンパク質の側鎖、特に、リジンアミノ酸側鎖上の−−ＮＨ２部分及びシステイン側鎖上のーＳＨ部分に付着するために開発されたこれらの誘導体の多くは、それらの合成及び使用において問題があることが明らかとなっている。加水分解に供せられる、タンパク質との不安定な結合を形成するものがあり、従って、血流中などの水性環境中では、分解（ｄｅｃｏｍｐｏｓｅ）し、分解（ｄｅｇｒａｄｅ）し、又はその他不安定となる。より安定な結合を形成するが、結合が形成する前に加水分解に供せられるものもあり、これは、タンパク質が付着できる前にＰＥＧ誘導体上の反応性基が活性化され得ることを意味している。幾分毒性があり、従って、インビボでの使用にあまり適していないものもある。反応が遅すぎて、実用的でないものもある。タンパク質の活性に必要な部位に付着することによって、タンパク質活性の喪失をもたらすものもある。それらが付着される部位において特異的でないものもあり、これも、望ましい活性の喪失と結果の再現性の欠如をもたらし得る。ポリ（エチレングリコール）部分でタンパク質を修飾することに伴う困難な課題を解決するために、さらに安定であるＰＥＧ誘導体（例えば、米国特許第６，６０２，４９８号（参照により、本明細書に組み込まれる。））又は分子及び表面上のチオール部分と選択的に反応するＰＥＧ誘導体（例えば、米国特許第６，６１０，２８１号（参照により、本明細書に組み込まれる。））が開発されている。安定な化学結合を形成するために選択的に反応するように動員されるまで、生理的な環境中で化学的に不活性であるＰＥＧ誘導体に対する要求が本分野において明らかに存在する。
【００１６】
最近、タンパク質科学において全く新しい技術が報告されており、本技術は、タンパク質の部位特異的修飾に伴う制約の多くを克服する有望な技術である。具体的には、原核生物であるエシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えば、Ｌ．Ｗａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，（２００１），  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００）及び真核生物であるサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（例えば、Ｊ．Ｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：９６４−７（２００３））のタンパク質生合成機構に新たな成分が追加され、これによって、遺伝的にコードされていないアミノ酸を、インビボでタンパク質に取り込むことが可能となる。光親和性標識及び光異化性アミノ酸、ケトアミノ酸及びグリコシル化されたアミノ酸など、新規化学的、物理的又は生物学的特性を有する多数の新規アミノ酸が、この方法を用いて、アンバーコドンＴＡＧに応答してＥ．コリ及び酵母中のタンパク質中に、効率的に且つ高い精度で取り込まれている。例えば、「Ｊ．  Ｗ．  Ｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２），  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２４：９０２６−９０２７；  Ｊ．  Ｗ．  Ｃｈｉｎ，  ＆  Ｐ．  Ｇ．  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），  ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ３（１１）：１１３５−１１３７；  Ｊ．  Ｗ．  Ｃｈｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，（２００２），  ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９９：１１０２０−１１０２４；  ａｎｄ，  Ｌ．  Ｗａｎｇ，  ＆  Ｐ．  Ｇ．  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），  Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，  １：１−１１」を参照されたい。これらの研究は、ケトン基、アルキン基及びアジド部分など、タンパク質中に見出されず、遺伝子によってコードされる２０の一般的アミノ酸中に見出される全ての官能基に対して化学的に不活性であり、並びに安定な共有結合を形成するために効率的且つ選択的に反応するために使用され得る化学的官能基を選択的且つ定型的に導入することが可能であることを実証している。
【００１７】
遺伝子によってコードされていないアミノ酸をタンパク質中に取り込ませる能力によって、リジンのε−ＮＨ２、システインのスルフヒドリル−ＳＨ、ヒスチジンのイミノ基などの天然に存在する官能基に対する価値ある代替物を提供し得る化学的官能基の導入が可能となる。化学的官能基のなかには、遺伝子によってコードされる２０の共通アミノ酸中に見出される官能基に対して不活性であるが、きれいに且つ効果的に反応して安定な結合を形成するものがあることが知られている。例えば、アジド及びアセチレン基は、触媒量の銅の存在下、水性条件中でＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応を行うことが本分野において公知である。例えば、「Ｔｏｒｎｏｅ，  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）  Ｊ．  Ｏｒｅ．  Ｃｈｅｍ．  ６７：３０５７−３０６４；  ａｎｄ，  Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ，  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ  ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ４１：２５９６−２５９９」を参照されたい。例えば、タンパク質構造中にアジド部分を導入することによって、タンパク質中に見出されるアミン、スルフヒドリル、カルボン酸、ヒドロキシル基に対して化学的に不活性であるが、アセチレン部分と円滑且つ効率的に反応して、付加環化産物を形成する官能基を取り込ませることが可能である。重要なことは、アセチレン部分の不存在下では、アジドは化学的に不活性で、他のタンパク質側鎖の存在下及び生理的条件下で非反応性状態を保つということである。
【００１８】
本発明は、とりわけ、生合成ポリペプチド（ＢＳＰ）の活性及び製造に関連する問題に取り組み、並びに改善された治療的半減期など、改善された生物学的又は薬理学的特性を有するＢＳＰの製造に取り組む。
【発明の開示】
【００１９】
本発明は、１又は複数の非天然コードアミノ酸を含む、ＧＬＰ−１、Ｔ−２０ポリペプチドなどのグルカゴン遺伝子由来ポリペプチド、膜融合阻害ペプチド及びペプチドＹＹペプチドを含む（これらに限定されない。）生合成ペプチド（ＢＳＰ）を提供する。本発明において、治療活性を有する全てのＢＳＰ、断片、類縁体又はこれらのバリアントを使用し得る。本発明において使用し得るＢＳＰの例が数多く記載されている。しかしながら、記載されているリストは網羅的なものではなく、本発明において使用され得るＢＳＰの数又は種類を決して限定するものではない。このため、本発明に従って、あらゆるＢＳＰ及び／又は断片、類縁体、及び新規ＢＳＰを含むあらゆるＢＳＰから作製されるバリアントを修飾することができ、治療的に使用することができる。
【００２０】
幾つかの実施形態において、ＢＳＰは、１又は複数の翻訳後修飾を含む。幾つかの実施形態において、ＢＳＰは、リンカー、ポリマー又は生物活性分子に連結されている。幾つかの実施形態において、ＢＳＰは、二官能性ポリマー、二官能性リンカー又は少なくとも一つのさらなるＢＳＰに連結されている。
【００２１】
幾つかの実施形態において、前記非天然コードアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む。幾つかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は二官能性ポリマーである。幾つかの実施形態において、前記二官能性ポリマーは第二のポリペプチドに連結されている。幾つかの実施形態において、前記第二のポリペプチドは、ＢＳＰである。
【００２２】
幾つかの実施形態において、前記非天然コードアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。幾つかの実施形態において、非天然コードアミノ酸は、リンカーを用いて、水溶性ポリマーに連結されている。幾つかの実施形態において、非天然コードアミノ酸は、生物分解可能なリンカーを用いて、水溶性ポリマーに連結されている。幾つかの実施形態において、生物分解可能なリンカーは、ＢＳＰを含むプロドラッグを形成するために使用することが可能である。このプロドラッグアプローチの一例では、水溶性ポリマーがＧＬＰ−１活性を遮断し、リンカーの分解が活性なＧＬＰ−１を放出する。幾つかの実施形態において、前記非天然コードアミノ酸は、アシル部分又はアシル鎖に連結されている。幾つかの実施形態において、非天然コードアミノ酸は、リンカーによって、アシル部分又はアシル鎖に連結されている。幾つかの実施形態において、非天然コードアミノ酸は、ポリ（エチレングリコール）リンカー又はプロドラッグによって、アシル部分又はアシル鎖に連結されている。幾つかの実施形態において、前記非天然コードアミノ酸は、血清アルブミンに連結されている。幾つかの実施形態において、非天然コードアミノ酸は、リンカーによって、血清アルブミンに連結されている。幾つかの実施形態において、リンカーは、ポリ（エチレングリコール）又はプロドラッグである。幾つかの実施形態において、リンカーは二重切断プロドラッグであり、二重切断プロドラッグでは、段階１がアルブミンなどの分子の制御された放出であり、段階２がリンカー又はその一部を放出する第二の放出である。
【００２３】
幾つかの実施形態において、ＢＳＰは、ＢＳＰ中に存在する２つのアミノ酸の間の分子内架橋を含む。幾つかの実施形態において、ＢＳＰは、１又は複数の非天然コードアミノ酸を含む。２つの架橋された残基のうち１つは、非天然コードアミノ酸又は天然にコードされるアミノ酸としてもよい。非天然アミノ酸は、リンカー、ポリマー又は生物活性分子によって連結されてもよい。
【００２４】
幾つかの実施形態において、ＢＳＰは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む水溶性ポリマーに連結されている少なくとも二つのアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、少なくとも一つのアミノ酸は非天然コードアミノ酸である。
【００２５】
幾つかの実施形態において、最初のアミノ酸（アミノ末端に位置する）の前に存在するＢＳＰ（ＧＬＰ−１など）中の任意の位置、カルボキシ末端における付加又はこれらのあらゆる組み合わせに、１又は複数の非天然コードアミノ酸が取り込まれる。幾つかの実施形態では、１又は複数の非天然コードアミノ酸は、以下のように、ＧＬＰ−１中の任意の位置に取り込まれる。以下の残基が含まれるが、これらに限定されるものではない。７位の最初のアミノ酸（すなわち、Ｎ末端）の前、７Ｈ、８Ａ、９Ｅ、Ｖ１６、１７Ｓ、１８Ｓ、１９Ｙ、２ＯＬ、２１Ｅ、２２Ｇ、２３Ｑ、２４Ａ、２５Ａ、２６Ｋ、２７Ｅ、２８Ｆ、２９Ｉ、３０Ａ、３１Ｗ、３２Ｌ、３３Ｖ、３４Ｋ、３５Ｇ、３６Ｒ、３７Ｇ、３８位の（すなわち、カルボキシ末端の）付加又はこれらの任意の組み合わせ。
【００２６】
幾つかの実施形態において、天然に存在しないアミノ酸は、これらの位置の１又は複数において、水溶性ポリマーに連結されている。以下のＧＬＰ−１の位置を含むが、これらに限定されるものではない。７位の最初のアミノ酸（すなわち、Ｎ末端）の前、７Ｈ、８Ａ、９Ｅ、Ｖ１６、１７Ｓ、１８Ｓ、１９Ｙ、２ＯＬ、２１Ｅ、２２Ｇ、２３Ｑ、２４Ａ、２５Ａ、２６Ｋ、２７Ｅ、２８Ｆ、２９Ｉ、３０Ａ、３１Ｗ、３２Ｌ、３３Ｖ、３４Ｋ、３５Ｇ、３６Ｒ、３７Ｇ、３８位の（すなわち、カルボキシ末端の）付加又はこれらの任意の組み合わせ。
【００２７】
幾つかの実施形態において、本発明のＧＬＰ−１ポリペプチドは、以下の位置の１又は複数に、１又は複数の天然に存在しないアミノ酸を含み、アンタゴニスト：７、８、９、２２、１８、２９、２５、３２、２１、２８、１７、２４、３１、２０又はこれらの組み合わせを提供する。
【００２８】
幾つかの実施形態において、Ｔ−２０ポリペプチド（ＴＥＸを含む。）中の任意の位置（最初のアミノ酸（アミノ末端に位置する）の前、カルボキシ末端における付加又はこれらのあらゆる組み合わせ）に、１又は複数の非天然コードアミノ酸が取り込まれる。幾つかの実施形態では、１又は複数の非天然コードアミノ酸は、Ｔ−２０（ＴＥＸを含む。）中の任意の位置に取り込まれる。以下の残基：Ｗ６３１、Ｄ６３２、Ｉ６３５、Ｎ６３６、Ｎ６３７、Ｙ６３８、Ｔ６３９、Ｓ６４０、Ｌ６４１、Ｌ６４５、Ｎ６５１又はこれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
幾つかの実施形態において、ペプチドＹＹ中の任意の位置（最初のアミノ酸（アミノ末端に位置する）の前、カルボキシ末端における付加又はこれらのあらゆる組み合わせ）に、１又は複数の非天然コードアミノ酸が取り込まれる。
【００３０】
幾つかの実施例では、ＢＳＰは、ＢＳＰ受容体又は結合対（タンパク質、ポリペプチド、小分子又は核酸が含まれるが、これらに限定されるものではない。）に対するＢＳＰの親和性を調節する置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施例では、ＢＳＰは、置換、付加又は欠失が存在しない対応するＢＳＰの安定性と比較したときに、ＢＳＰの安定性を増加する置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施例では、ＢＳＰは、置換、付加又は欠失が存在しない対応するＢＳＰの免疫原性と比較したときに、ＢＳＰの免疫原性を調節する置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施例では、ＢＳＰは、置換、付加又は欠失が存在しない対応するＢＳＰの血清半減期又は循環時間と比較したときに、ＢＳＰの血清半減期又は循環時間を調節する置換、付加又は欠失を含む。
【００３１】
幾つかの実施例では、ＢＳＰは、置換、付加又は欠失が存在しない対応するＢＳＰの水溶解度と比較したときに、ＢＳＰの水溶解度を増加する置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施例では、ＢＳＰは、置換、付加又は欠失が存在しない対応するＢＳＰの溶解度と比較したときに、宿主細胞中で産生されたＢＳＰの溶解度を増加する置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施例では、ＢＳＰは、置換、付加又は欠失が存在しない対応するＢＳＰの発現又は合成と比較したときに、宿主細胞中でのＢＳＰの発現を増加し、又はインビトロでの合成を増加する置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施例では、ＢＳＰは、置換、付加又は欠失が存在しない対応するＢＳＰのペプチダーゼ又はプロテアーゼ感受性と比較したときに、ＢＳＰのペプチダーゼ又はプロテアーゼ感受性を減少する置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施例では、ＢＳＰは、置換、付加又は欠失が存在しない対応するＢＳＰの活性と比較したときに、ＢＳＰ受容体又は結合対のシグナル伝達活性を調節する置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施例では、ＢＳＰは、置換、付加又は欠失が存在しない対応するＢＳＰの結合と比較したときに、受容体などの別の分子へのその結合を調節する置換、付加又は欠失を含む。幾つかの実施例では、ＢＳＰは、置換、付加又は欠失が存在しない対応するＢＳＰが結合した後の、結合対の立体構造又は生物学的活性と比較したときに、ＢＳＰの結合対の立体構造又は１若しくは複数の生物学的活性を調節する置換、付加又は欠失を含む。
【００３２】
幾つかの実施例では、ＢＳＰ中のアミノ酸置換は、天然又は非天然アミノ酸を用いて行うことができるが、但し、少なくとも一つの置換は非天然コードアミノ酸である。
【００３３】
幾つかの実施形態では、前記非天然コードアミノ酸は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基又はアルキン基を含む。
【００３４】
幾つかの実施形態では、前記非天然コードアミノ酸がカルボニル基を含む。幾つかの実施形態では、前記非天然コードアミノ酸は、構造：
【００３５】
【化１】
2008507280.tif 000002
を有する。
（ｎは、０ないし１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキル又は置換されたアリールであり；Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換されたアルキル及び置換されたアリールであり；Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、Ｒ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）
幾つかの実施形態では、前記非天然コードアミノ酸は、アミノオキシ基を含む。幾つかの実施形態では、前記非天然コードアミノ酸はヒドラジド基を含む。幾つかの実施形態では、前記非天然コードアミノ酸はヒドラジン基を含む。幾つかの実施形態では、前記非天然コードアミノ酸残基はセミカルバジド基を含む。
【００３６】
幾つかの実施形態では、非天然コードアミノ酸残基はアジド基を含む。幾つかの実施形態では、前記非天然コードアミノ酸は、構造：
【００３７】
【化２】
2008507280.tif 000003
を有する。
（ｎは、０ないし１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキル、置換されたアリールであり、又は存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであり、又は存在せず；ｍは、０ないし１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、及び、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）
幾つかの実施形態では、非天然コードアミノ酸は、アルキン基を含む。幾つかの実施形態では、前記非天然コードアミノ酸は、構造：
【００３８】
【化３】
2008507280.tif 000004
を有する。
（ｎは、０ないし１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキル又は置換されたアリールであり；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであり、又は存在せず；ｍは、０ないし１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、及び、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）
幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、ＢＳＰのアゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト又は逆アゴニストである。幾つかの実施形態では、ＢＳＰのアゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト又は逆アゴニストは、水溶性ポリマーに連結された、非天然コードアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、前記水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む。幾つかの実施形態では、ＢＳＰのアゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト又は逆アゴニストは、非天然コードアミノ酸と、一又は複数の、翻訳後修飾、リンカー、ポリマー又は生物活性分子とを含む。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーに連結された非天然コードアミノ酸が、ＢＳＰの受容体結合領域内に存在し、又はＢＳＰの受容体結合を妨害する。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーに連結された非天然コードアミノ酸は、結合対に結合するＢＳＰの領域内に存在し、又はＢＳＰへの結合対の結合を妨害する。
【００３９】
本発明は、ストリンジェントな条件下で、配列番号１、２、３、２１、２２、２３又は２４中のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズし、少なくとも１つのセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを含む単離された核酸も提供する。幾つかの実施形態において、前記セレクターコドンは、アンバーコドン、オクレコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン及び四塩基コドンからなる群から選択される。
【００４０】
本発明は、水溶性ポリマーに連結されたＢＳＰを作製する方法も提供する。幾つかの実施形態において、前記方法は、非天然コードアミノ酸を含む単離されたＢＳＰを、前記非天然コードアミノ酸と反応する部分を含む水溶性リンカーと接触させることを含む。幾つかの実施形態において、ＢＳＰ中に取り込まれた前記非天然コードアミノ酸は、該アミノ酸がなければ２０の共通アミノ酸の何れとも反応しない水溶性ポリマーに対して反応性を示す。幾つかの実施形態において、ＢＳＰ中に取り込まれた前記非天然コードアミノ酸は、該アミノ酸がなければ２０の共通アミノ酸の何れとも反応しないリンカー、ポリマー又は生物活性分子に対して反応性を示す。
【００４１】
幾つかの実施形態では、水溶性ポリマーに連結されたＢＳＰは、カルボニル含有アミノ酸を含むＢＳＰを、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド基を含むポリ（エチレングリコール）分子と反応させることによって作製される。幾つかの実施形態において、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド基は、アミド結合を通じて、ポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。
【００４２】
幾つかの実施形態では、水溶性ポリマーに連結されたＢＳＰは、カルボニル基を含むポリ（エチレングリコール）分子を、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド基を含む非天然コードアミノ酸を含むＢＳＰと反応させることによって作製される。
【００４３】
幾つかの実施形態では、水溶性ポリマーに連結されたＢＳＰは、アルキン含有アミノ酸を含むＢＳＰを、アジド部分を含むポリ（エチレングリコール）分子と反応させることによって作製される。幾つかの実施形態において、アジド又はアルキン基は、アミド結合を通じて、前記ポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。
【００４４】
幾つかの実施形態では、水溶性ポリマーに連結されたＢＳＰは、アジド含有アミノ酸を含むＢＳＰを、アルキン部分を含むポリ（エチレングリコール）分子と反応させることによって作製される。幾つかの実施形態において、アジド又はアルキン基は、アミド結合を通じて、ポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。
【００４５】
幾つかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、約０．１ｋＤａないし約１００ｋＤａの分子量を有する。幾つかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、０．１ｋＤａないし５０ｋＤａの分子量を有する。
【００４６】
幾つかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は分岐されたポリマーである。幾つかの実施形態において、前記ポリ（エチレングリコール）分岐ポリマーの各分岐は、１ｋＤａないし１００ｋＤａ又は１ｋＤａと５０ｋＤａの間の分子量を有する。
【００４７】
幾つかの実施形態において、ＢＳＰに連結された水溶性ポリマーは、ポリアルキレングリコール部分を含む。幾つかの実施形態では、ＢＳＰ中に取り込まれた前記非天然コードアミノ酸残基は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジドン、セミカルバジド基、アジド基又はアルキン基を含む。幾つかの実施形態において、ＢＳＰ中に取り込まれた前記非天然コードアミノ酸残基はカルボニル部分を含み、水溶性ポリマーはアミノオキシ、ヒドラジド、ヒドラジン又はセミカルバジド部分を含む。幾つかの実施形態において、ＢＳＰ中に取り込まれた非天然コードアミノ酸残基はアルキン部分を含み、水溶性ポリマーはアジド部分を含む。幾つかの実施形態において、ＢＳＰ中に取り込まれた非天然コードアミノ酸残基はアジド部分を含み、水溶性ポリマーはアルキン部分を含む。
【００４８】
本発明は、非天然コードアミノ酸を含むＢＳＰと薬学的に許容される担体とを含む組成物も提供する。幾つかの実施形態において、非天然コードアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。
【００４９】
本発明は、セレクターコドンを含むＢＳＰをコードするポリヌクレオチドを含む細胞も提供する。幾つかの実施形態において、細胞は、非天然コードアミノ酸をＢＳＰ中に置換するために、オルソゴナルＲＮＡシンテターゼ及び／又はオルソゴナルｔＲＮＡを含む。
【００５０】
本発明は、非天然コードアミノ酸を含むＢＳＰを作製する方法も提供する。幾つかの実施形態において、該方法は、ＢＳＰの発現を許容する条件下で、ＢＳＰをコードする１又は複数のポリヌクレオチド、オルソゴナルＲＮＡシンテターゼ及び／又はオルソゴナルｔＲＮＡを含む細胞を培養することと、細胞及び／又は培地からＢＳＰを精製することを含む。
【００５１】
本発明は、ＢＳＰの治療的半減期、血清半減期又は循環時間を増加させる方法も提供する。本発明は、ＢＳＰの免疫原性を調節する方法も提供する。幾つかの実施形態において、該方法は、天然に存在するＢＳＰ中の一又は複数の任意のアミノ酸を、非天然コードアミノ酸と置換することと、及び／又はＢＳＰをリンカー、ポリマー、水溶性ポリマー又は生物活性分子に連結することとを含む。
【００５２】
本発明は、本発明のＢＳＰの有効量を用いて、このような治療を必要としている患者を治療する方法も提供する。幾つかの実施形態において、該方法は、非天然コードアミノ酸を含むＢＳＰと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物の治療的有効量を患者に投与することを含む。幾つかの実施形態において、非天然コードアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。
【００５３】
本発明は、少なくとも一つのアミノ酸が非天然コードアミノ酸によって置換されていることを除き、配列番号１、２、３、２１に示されている配列若しくは他の任意のＧＬＰ−１ポリペプチド配列、配列番号２２、２４若しくは他の任意のＴ−２０ポリペプチド配列、又は配列番号２３若しくは他の任意のペプチドＹＹ配列を含むＢＳＰも提供する。幾つかの実施形態において、前記非天然コードアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。幾つかの実施形態において、前記水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む。幾つかの実施形態では、前記非天然コードアミノ酸は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、セミカルバジド基、アジド基又はアルキン基を含む。
【００５４】
本発明は、薬学的に許容される担体と、配列番号１、２、３、２１に示されている配列若しくは他の任意のＧＬＰ−１ポリペプチド配列、配列番号２２、２４若しくは他の任意のＴ−２０ポリペプチド配列、又は配列番号２３若しくは他の任意のペプチドＹＹ配列を含むＢＳＰとを含み、少なくとも１つのアミノ酸が非天然コードアミノ酸によって置換されている、薬学的組成物も提供する。幾つかの実施形態では、非天然コードアミノ酸は糖質部分を含む。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーは、糖質部分を介して、ポリペプチドに連結されている。幾つかの実施形態において、リンカー、ポリマー又は生物活性分子は、糖質部分を介して、ＢＳＰに連結されている。
【００５５】
本発明は、共有結合によって、ＢＳＰの単一のアミノ酸に連結された水溶性ポリマーを含むＢＳＰも提供する。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーに共有結合されたアミノ酸は、ポリペプチド中に存在する非天然コードアミノ酸である。
【００５６】
本発明は、少なくとも一つのリンカー、ポリマー又は生物活性分子を含み、前記リンカー、ポリマー、又は生物活性分子が、リボソームによってポリペプチド中に取り込まれた非天然コードアミノ酸の官能基を通じて前記ポリペプチドに付着されている、ＢＳＰを提供する。幾つかの実施形態において、ＢＳＰは、モノＰＥＧ化されている。本発明は、一又は複数の非天然コードアミノ酸に結合された、リンカー、ポリマー又は生物活性分子を含み、非天然コードアミノ酸が、予め選択されたポリペプチドの部位中にリボソームによって取り込まれる、ＢＳＰも提供する。
【００５７】
別の実施形態において、１又は複数の天然に存在するアミノ酸を含むＢＳＰを、別の分子（ＰＥＧを含むが、これに限定されない。）に抱合することによって、非天然アミノ酸への抱合のために使用された一意的な化学的反応のために、実質的に精製されたＢＳＰが得られる。１又は複数の非天然コードアミノ酸を含むＢＳＰの、別の分子（ＰＥＧなど）への抱合は、実質的に純粋なＢＳＰを提供するための抱合工程の前又は後に行われる他の精製技術とともに行ってもよい。
【００５８】
本発明は、式（ＬＴ）−Ｐ−Ｔ’（式中、（ＬＴ）は、局在化ペプチド（Ｌ）、タグ又はリンカー（Ｔ）、任意の順序の局在化ペプチド（Ｌ）及びタグ又はリンカー（Ｔ）、メチオニン及び不存在からなる群から選択され；Ｐは、ＢＳＰ配列を含み；並びにＴ’は、タグ若しくはリンカーを含み、又は不存在であり、Ｌ、Ｔ、Ｐ又はＴ’は、１又は複数の非天然コードアミノ酸を含む。）を含むポリペプチドも提供する。本発明は、式Ｆ−（ＬＴ）−Ｐ−Ｔ’−Ｆ’（式中、Ｆはポリペプチド配列を含み、又は不存在であり、（ＬＴ）は、局在化ペプチド（Ｌ）、タグ又はリンカー（Ｔ）、任意の順序の局在化ペプチド（Ｌ）及びタグ又はリンカー（Ｔ）、メチオニン及び不存在からなる群から選択され；Ｐは、最大１００個のアミノ酸を有する所望のポリペプチド配列を含み、且つＦ又はＦ’とは異なり；Ｔ’は、タグ若しくはリンカーを含み、又は不存在であり、Ｆ’は、ポリペプチド配列を含み、又は不存在であり、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｐ、Ｔ’又はＦ’は、１又は複数の非天然コードアミノ酸を含む。）を含むポリペプチドも提供する。Ｐは、１又は複数の非天然コードアミノ酸を含むＢＳＰをさらに含んでもよい。
【００５９】
本発明は、ポリペプチドコード配列に作用可能に連結されたプロモーター配列を含み、前記ポリペプチドコード配列が式（ＷＸ）−Ｚを有し、（ＷＸ）が、局在化ペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ｗ）、タグ又はリンカーをコードするヌクレオチド配列（Ｘ）、任意の順序の局在化ペプチドをーコードするヌクレオチド配列（Ｗ）及びタグ又はリンカーをコードするヌクレオチド配列（Ｘ）、及び不存在からなる群から選択され、Ｚは所望のＢＳＰをコードするヌクレオチド配列を含み、Ｗ、Ｘ又はＺをコードするヌクレオチド配列はセレクターコドンを含む、核酸分子も提供する。該核酸分子は、Ｚに作用可能に連結されたＹ’をさらに含み、Ｙ’がタグをコードするヌクレオチド配列を含み、前記タグをコードする前記ヌクレオチド配列が必要に応じてセレクターコドンを含み得る。本発明は、ａ）式：（ＬＴ）−Ｐ−Ｔ’（式中（ＬＴ）は、局在化ペプチド（Ｌ）、タグ又はリンカー（Ｔ）、任意の順序の局在化ペプチド（Ｌ）及びタグ又はリンカー（Ｔ）、メチオニンおよび不存在からなる群から選択され；Ｐは、ＢＳＰ配列を含み；Ｔ’は、タグ若しくはリンカーを含み、又は不存在であり、Ｌ、Ｔ、Ｐ又はＴ’は、選択された条件下で１又は複数のペプチド結合を切断するように決定された官能基を有する１又は複数の非天然コードアミノ酸を含む。）を含むポリペプチドを、組換え宿主細胞中で生産すること；ｂ）１又は複数のペプチド結合を少なくとも部分的に切断するのに十分な時間にわたって、選択された条件下で、前記ポリペプチドを反応すること；並びにｃ）Ｐを含むペプチドを、反応産物から回収すること、を含む方法も提供する。
【００６０】
本発明は、ＧＬＰ−１ポリペプチドの治療的有効量を投与することを含む、血中グルコースレベルの正常化を必要としている哺乳動物において血中グルコースレベルを正常化する方法も包含する。本発明は、Ｔ−２０ポリペプチドの治療的有効量を投与することを含む、ウイルスレベルの調節を必要としている哺乳動物においてウイルスレベルを調節する方法も包含する。本発明は、ＰＹＹポリペプチドの治療的有効量の投与を必要としている哺乳動物に、ＰＹＹポリペプチドの治療的有効量を投与することを含む方法も包含する。
【００６１】
定義
本発明は、本発明に記載されている特定の方法、プロトコール、細胞株、構築物及び試薬に限定されるものではなく、従って、変動し得ることを理解しなければならない。また、本明細書で使用されている用語は、具体的な実施形態を記載するためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解すべきである。
【００６２】
本明細書中及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈において明らかに別に示されない限り、複数形の意味を含む。このため、例えば、「ＢＳＰ」又は［ＧＬＰ−１］、［Ｔ−２０］又は「ＰＹＹ」という表記は、一又は複数のこのようなポリペプチドを表し、当業者に公知のその均等物などが含まれる。
【００６３】
別段の定義がなされている場合を除き、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野における当業者に一般的に理解されている意味と同一の意味を有する。明細書に記載されているものと類似又は均等な任意の方法、装置、及び材料を本発明の実施又は検査において使用することができるが、ここでは、好ましい方法、装置及び材料が記載されている。
【００６４】
本明細書に記載されている全ての公報及び特許は、例えば、本明細書に記載されている発明と組み合わせて使用され得る、公報に記載されている構築物及び方法を記載及び開示する目的で、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に論述されている公報は、専ら本出願の出願日以前の開示のために提供されている。本明細書の記載は、以前の発明のため、又は他の何らかの理由のため、本発明者らがこのような開示を遡及させる権限を有しないことを認めたものと解釈すべきでない。
【００６５】
「生合成ポリペプチド」又は「ＢＳＰ」は、セレクターコドンを有するｍＲＮＡから生じる、ペプチド結合によって共有結合された約１００以下のアミノ酸残基のポリマーを表す。ＢＳＰには、「ＧＬＰ−１」、「Ｔ−２０」及び「ＰＹＹ」並びに「ＧＬＰ−１ポリペプチド」、「Ｔ−２０ポリペプチド」及び「ＰＹＹポリペプチド」が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＢＳＰは、約１００アミノ酸を超える長さである、ポリマーの断片であってもよく、リーダー配列又は分泌シグナル配列など（これらに限定されない。）の追加アミノ酸を含んでもよく、又は含まなくてもよい。
【００６６】
「ポリペプチド」という記載は、「ペプチド」という記載に対して等しく適用され、逆も同様である。「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマー及び１又は複数のアミノ酸残基が非天然コードアミノ酸であるアミノ酸ポリマーに適用される。当業者であれば、タンパク質に対する技術及び修飾は、ポリペプチド及びペプチドに対しても適用可能であり、このためＢＳＰに対しても適用可能であることが理解できるであろう。
【００６７】
「実質的に精製された」という用語は、それが天然に存在する環境中、すなわち、野生型細胞、又は組換え的に産生されたＢＳＰの場合には宿主細胞中で通常ＢＳＰを伴い、又はＢＳＰと相互作用する成分を実質的に又は本質的に含まない場合があり得るＢＳＰを表す。細胞物質を実質的に含まないことができるＢＳＰには、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満（乾燥重量に対して）の莢雑タンパク質を有するタンパク質の調製物が含まれる。ＢＳＰ又はそのバリアントが宿主細胞によって組換え的に産生される場合には、該タンパク質は、細胞の乾燥重量の、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％又は約１％未満で存在し得る。ＢＳＰ又はそのバリアントが宿主細胞によって組換え的に産生される場合には、該タンパク質は、細胞の乾燥重量の、約５ｇ／Ｌ、約  ４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ又は約１ｍｇ／Ｌ以下で、培地中に存在し得る。このため、本発明の方法によって作製された「実質的に精製された」ＢＳＰは、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ及びキャピラリー電気泳動などの適切な方法によって測定された場合に、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％の純度レベル、具体的には、少なくとも約７５％、８０％、８５％以上の純度レベル、より具体的には、少なくとも約９０％の純度レベル、少なくとも約９５％の純度レベル、少なくとも約９９％以上の純度レベルを有し得る。
【００６８】
「組換え宿主細胞」又は「宿主細胞」とは、挿入のために使用される方法、例えば、直接取り込み、形質導入、ｆ−接合（ｆ−ｍａｔｉｎｇ）又は組換え宿主細胞を作製するための本分野で公知の他の方法にかかわらず、外来ポリヌクレオチドを含む細胞を表す。外来ポリヌクレオチドは、組み込まれていないベクター、例えば、プラスミドとして維持されることができ、あるいは、宿主ゲノム中に組み込まれ得る。
【００６９】
本明細書中で使用する場合、「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」又は「培地（ｍｅｄｉａ）」という用語は、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物宿主細胞、真核生物宿主細胞、哺乳動物宿主細胞、ＣＨＯ細胞又はＥ．コリ及び細胞含有物を含む何らかの宿主細胞を支持し得るか、又は含有し得る、あらゆる培養用培地、溶液、固体、半固体又は強固な支持体を含む。このため、本用語は、宿主細胞をその中で増殖させている培地、例えば、ＢＳＰがその中に分泌されている培地（増殖工程前又は後の培地を含む。）を包含し得る。本用語は、ＢＳＰが細胞内で産生され、ＢＳＰを放出するために宿主細胞が溶解又は破壊される場合など、宿主細胞可溶化液を含有する緩衝液又は試薬も包含し得る。
【００７０】
タンパク質の再折りたたみに関して本明細書で使用される「還元剤」は、スルフヒドリル基を還元状態に保ち、分子内又は分子間ジスルフィド結合を還元する任意の化合物又は物質として定義される。適切な還元剤には、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、ジチオエリスリトール、システイン、システアミン、（２−アミノエタンチオール）及び還元されたグルタチオンが含まれるが、これらに限定されない。様々な還元剤が本発明の方法及び組成物における使用に適していることが、当業者に自明である。
【００７１】
タンパク質の再折りたたみに関して本明細書で使用される「酸化剤」は、酸化される化合物から電子を除去することができる任意の化合物又は物質として定義される。適切な酸化剤には、酸化されたグルタチオン、シスチン、シスタミン、酸化されたジチオスレイトール、酸化されたエリスリトール及び酸素が含まれるが、これらに限定されない。様々な酸化剤が本発明の方法における使用に適していることが、当業者に自明である。
【００７２】
「変性試薬」又は「変性剤」とは、本明細書中で使用する場合、ポリペプチドの可逆的な折り畳み解除を引き起こす、あらゆる化合物又は物質として定義される。変性剤の強度は、具体的な変性剤の特性及び濃度の両方によって決定され得る。適切な変性剤は、カオトロプ、界面活性剤、有機溶媒、水混和性溶媒、リン脂質又は２以上のこのような薬剤の組み合わせであり得る。適切なカオトロプには、尿素、グアニジン及びチオシアン酸ナトリウムが含まれるが、これらに限定されない。有用な界面活性剤には、ドデシル硫酸ナトリウム、又はポリオキシエチレンエーテル（例えば、Ｔｗｅｅｎ又はＴｒｉｔｏｎ界面活性剤）、Ｓａｒｋｏｓｙｌなどの強い界面活性剤、穏やかな非イオン性界面活性剤（例えば、ジギトニン）、Ｎ−２，３−（ジオレイルオキシ）−プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムなどの穏やかな陽イオン性界面活性剤、穏やかなイオン性界面活性剤（例えば、コール酸ナトリウム又はデオキシコール酸ナトリウム）、又はスルホベテイン（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）、３−（３−クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンサルファート（ＣＨＡＰＳ）及び３−（３−クルルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ）を含む（これらに限定されない。）双性イオン界面活性剤が含まれ得るが、これらに限定されない。アセトニトリル、低級アルカノール（特に、エタノール又はイソプロパノールなどのＣ２−Ｃ４アルカノール）、又は（低級アルカンジオール（特に、エチレングリコールなどのＣ２−Ｃ４アルカンジオール）などの水混和性有機溶媒は、界面活性剤として使用され得る。本発明において有用なリン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルイノシトールなどの天然リン脂質又は合成リン脂質誘導体又はジヘキサノイルホスファチジルコリン又はジヘプタノイルホスファチジルコリンなどの合成リン脂質誘導体若しくはバリアントであり得る。
【００７３】
本明細書に使用される「再折り畳み」は、ポリペプチドを含有するジスルフィド結合を、不適切に折りたたまれ、又は折り畳み解除された状態から、ジスルフィド結合に関して固有の高次構造又は適切に折りたたまれた高次構造へと転換する任意のプロセス、反応又は方法を記載する。
本明細書において使用される「同時折り畳み」とは、互いに相互作用して、折り畳み解除されたポリペプチド又は不適切に折り畳まれたポリペプチドを、適切に折り畳まれた固有のポリペプチドに変換させる少なくとも２つのポリペプチドを使用する再折り畳みプロセス、反応又は方法を具体的に表す。
【００７４】
本明細書において使用される「グルカゴン様ペプチド−１」又は「ＧＬＰ−１」には、ヒトＧＬＰ−１の少なくとも一つの生物活性を有するポリペプチド及びタンパク質（米国特許第２００４０１２７４１２、ＥＰ０６９９６８６−Ａ２及びＥＰ０７３３，６４４、米国特許第５，５４５，６１８号；  第５１１８，６６６号；第５，５１２，５４９号；ＷＯ  ９１／１１４５７；ＷＯ  ９０／１１２９６；ＷＯ  ８７／０６９４１（参照により、本明細書に組み込まれる。）を記載されているものが含まれるが、これらに限定されない。）、その生物活性にかかわらず、さらに、組換え（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又は核酸の他の形態から産生されたか否かを問わない。）、合成、トランスジェニック及び遺伝子活性化された方法など（これらに限定されない。）の合成又は製造の方法にかかわらず、並びにそれらのＧＬＰ−１類縁体、ＧＬＰ−１イソフォーム、ＧＬＰ−１模倣体、ＧＬＰ−１断片、ハイブリッドＧＬＰ−１タンパク質、融合タンパク質、オリゴマー及び多量体、相同体、グリコシル化パターンバリアント、ミュテインが含まれるものとする。多数のＧＬＰ−１類縁体及び誘導体が公知であり、本明細書では、「ＧＬＰ−１化合物」と称される。これらのＧＬＰ−１類縁体には、ＧＩＬＡ−モンスターの毒の中に見出されるペプチドであるエキセンディンが含まれる。ＧＬＰ−１の具体例には、ＧＬＰ−１（３−３６）、ＧＬＰ−１（３−３７）、ＧＬＰ−１（１−４５）及びエキセンディン１ないし４が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、「Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．  Ｙ．（１９８２）」によって開示されているように、組換えＤＮＡ技術の使用を通じてＧＬＰ−１を取得し、当業者に公知の方法によって宿主細胞中でＧＬＰ−１を産生することが可能である。
【００７５】
「ヒトＧＬＰ−１（ＧＬＰ−１）」又は「ＧＬＰ−１ポリペプチド」という用語は、本明細書に記載されているＧＬＰ−１、並びに天然のＧＬＰ−１の少なくとも一つの生物活性を保持するポリペプチドを表す。ＧＬＰ−１ポリペプチドには、天然のヒトＧＬＰ−１の薬学的に許容される塩及びプロドラッグ、並びに天然のヒトＧＬＰ−１の塩、多形、水和物、溶媒和物、生物活性断片、生物活性バリアント及び立体異性体のプロドラッグ、並びに天然のヒトＧＬＰ−１、エキセンディン１ないし４を含むエキセンディンのファミリーのアゴニスト、模倣物及びアンタゴニストバリアント及びこれらのポリペプチド融合物が含まれる。ＧＬＰ−１ポリペプチドの例には、米国特許第５，１１８，６６６号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているものが含まれるが、これらに限定されない。アミノ末端、カルボキシル末端又はその両方にさらなるアミノ酸を含む融合物が、「ＧＬＰ−１ポリペプチド」という用語に包含される。典型的な融合物には、ＧＬＰ−１の組換え発現、（ポリヒスチジン又は親和性エピトープなど（これらに限定されない。）への）精製のための融合物、血清アルブミン結合ペプチドとの融合物；血清アルブミンなどの血清タンパク質との融合物；Ｆｃなどの免疫グロブリン分子の定常領域との融合物並びに脂肪酸との融合物から得られる、例えば、メチオニンがＧＬＰ−１のＮ末端に連結されたメチオニルＧＬＰ−１が含まれるが、これらに限定されるものではない。様々な形態に対する天然のＧＬＰ−１核酸及びアミノ酸配列は、単一アミノ酸バリアント又はスプライスバリアントなどのバリアントと同様に、公知である。
【００７６】
「ＧＬＰ−１ポリペプチド」という用語は、１又は複数のアミノ酸置換、付加又は欠失を含むＧＬＰ−１ポリペプチドを包含する。天然のＧＬＰ−１中の様々なアミノ酸位置における典型的な置換（ＧＬＰ−１の生物学的活性の１又は複数を調節する（アゴニスト活性を増加する、ポリペプチドの溶解度を増加する、ポリペプチドをアンタゴニストに変換する、ペプチダーゼ又はプロテアーゼ感受性を減少するなど。但し、これらに限定されない。）置換を含むが、これに限定されない。）が記載されており、用語「ＧＬＰ−１ポリペプチド」に包含される。
【００７７】
ヒトＧＬＰ−１アンタゴニストには、７、８、９、２２、１８、２９、２５、３２、２１、２８、１７、２４、３１及び２０に置換を有するものが含まれるが、これらに限定されるものではない（配列番号１、２、３、２１又は任意の他のＧＬＰ−１配列）。幾つかの実施形態において、ＧＬＰ−１アンタゴニストは、ＧＬＰ−１分子の受容体結合領域中に存在する水溶性ポリマーに連結された、非天然コードアミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、水溶性ポリマーが、アミノ酸位置：７、８、９、２２、１８、２９、２５、３２、２１、２８、１７、２４、３１及び２０のうち一又は複数に（配列番号１、２、３、２１又は他の任意のＧＬＰ−１ポリペプチド）のうち一又は複数において、ＧＬＰ−１ポリペプチドに連結されている。
【００７８】
ＧＬＰ−１アミノ酸配列並びにエキセンディン−４及びエキセンディン−３アミノ酸配列については、それぞれ、本明細書中の配列番号１（ＧＬＰ−１（７−３６））、配列番号２（ＧＬＰ−１（７−３７））、配列番号３（エキセンディン−４）及び配列番号２１（エキセンディン−３）を参照されたい。幾つかの実施形態において、本発明のＧＬＰ−１ポリペプチドは、配列番号１若しくは配列番号２若しくは配列番号３若しくは配列番号２１またはＧＬＰ−１ポリペプチドの他の任意の配列と実質的に同一である。ＧＬＰ−１変異体及び変異体ＧＬＰ−１ポリペプチドをコードする核酸分子が周知である。ＧＬＰ−１変異体の例には、米国特許公開２００４０１２７４１２Ａ１号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に開示されているものが含まれる。
【００７９】
ＧＬＰ−１ペプチド類縁体、抱合物、融合タンパク質及び薬物送達又は併用療法など、多数のＧＬＰ−１製品が、前臨床及び臨床開発中である。開発中の製品の幾つかは、エキセナチド（Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ）（ＡＣ２９９３，  Ａｍｙｌｉｎ／Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＡＶＥ−００１０（ＺＰｌ１０，Ｚｅａｌａｎｄ  Ｐｈａｒｍ／Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＢＩＭ−５１０７７（Ｉｐｓｅｎ／Ｒｏｃｈｅ）、リラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）（ＮＮ２２１１，  Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、ＣＪＣ−１１３１（Ｃｏｎｊｕｃｈｅｍ）、アルブゴン（Ａｌｂｕｇｏｎ）（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ）、ＧＬＰ−１トランスフェリン（Ｂｉｏｒｅｘｉｓ）、ＡＣ２９９３  ＬＡＲ（Ａｍｙｌｉｎ／Ａｌｋｅｒｍｅｓ）、ＧＬＰ−１  ｎａｓａｌ（Ｓｕｎｔｏｒｙ）及びＧＬＰ−１−ＩＮＴ（Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）である。
【００８０】
ＧＬＰ−１の生物活性は開示されており、本分野において公知であり、例えば、米国特許公開２００４００８２５０７Ａ１及び２００４０２３２７５４Ａ１（参照により、本明細書に組み込まれる。）に見出すことが可能である。
【００８１】
ＧＬＰ−１（７−３７）のバリアント及びこれらの類縁体も開示されている。これらのバリアント及び類縁体には、例えば、ＧＩｎ９−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｄ−ＧＩｎ９−ＧＬＰ−１（７−３７）、アセチル−Ｌｙｓ９−ＧＬＰ−１（７−３７），Ｔｈｒ１６−Ｌｙｓ１８−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｌｙｓ１８−ＧＬＰ−１（７−３７）など、及び、例えば、酸付加塩、カルボン酸塩、低級アルキルエステル及びアミドを含むこれらの誘導体が含まれる［例えば、ＷＯ９１／１１４５７；ＥＰ０７３３，６４４（１９９６）；及び米国特許第５，５１２，５４９号（１９９６）、参照により組み込まれる。］。一般的に、ＧＬＰ−１の様々な開示された形態は、インシュリン分泌（インシュリン分泌促進作用）及びｃＡＭＰ形成を刺激することが知られている（例えば、Ｍｏｊｓｏｖ，  Ｓ．  ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ４０：３３３−３４３（１９９２）参照）。
【００８２】
本明細書において使用される「Ｔ−２０」又は「ＤＰ−１７８」には、ヒトＤＰ−１７８の少なくとも１つの生物活性を有するポリペプチド及びタンパク質、同じ生物活性かどうかにかかわらず、さらに、組換え（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又は核酸の他の形態から産生されたか否かを問わない。）、合成、トランスジェニック及び遺伝子活性化された方法など（これらに限定されない。）の合成又は製造の方法にかかわらず、並びにそれらのＤＰ−１７８類縁体、ＤＰ−１７８イソフォーム、ＤＰ−１７８模倣体、ＤＰ−１７８断片、ハイブリッドＤＰ−１７８タンパク質、融合タンパク質、オリゴマー及び多量体、相同体、グリコシル化パターンバリアント及びミュテインが含まれるものとする。本用語のハイフンが付された形態及びハイフンが付されていない形態（Ｔ２０、ＤＰ１７８）は等価である。
【００８３】
「ヒトＤＰ−１７８」又は「ＤＰ−１７８ポリペプチド」という用語は、本明細書に記載されているＤＰ−１７８又はＴ−２０、並びに天然のＤＰ−１７８の少なくとも１つの生物活性を保持するポリペプチドを表す。「ＤＰ−１７８」には、ＤＰ−１７８の一部、類縁体及び相同体が含まれ、これらは全て抗ウイルス活性を示す。抗ウイルス活性には、非感染ＣＤ４＋細胞へのＨＩＶ伝達の阻害が含まれるが、これに限定されない。さらに、本発明は、ヒト及びヒト以外中の非感染細胞へのレトロウイルス伝達（特に、ＨＩＶ）の阻害剤としての、ＤＰ−１７８及びＤＰ−１７８断片及び／又は類縁体又は相同体の使用に関する。本発明のペプチドによってその伝達が阻害され得る非レトロウイルスウイルスには、エンベロープに封入されたウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、イヌジステンパーウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス及びインフルエンザウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
【００８４】
ＤＰ−１７８ポリペプチドには、天然に存在するヒトＤＰ−１７８の薬学的に許容される塩及びプロドラッグ、並びに天然に存在するヒトＤＰ−１７８の塩、多形、水和物、溶媒和物、生物活性断片、生物活性バリアント及び立体異性体のプロドラッグ、並びに天然に存在するヒトＤＰ−１７８のアゴニスト、模倣体及びアンタゴニストバリアント並びにそれらのポリペプチド融合物が含まれる。アミノ末端、カルボキシル末端又はその両方にさらなるアミノ酸を含む融合物が、「ＤＰ−１７８ポリペプチド」という用語に包含される。典型的な融合物には、ＤＰ−１７８の組換え発現、（ポリヒスチジン又は親和性エピトープなど（これらに限定されない。）への）精製のための融合物、Ｎ末端が伸長したＴ−２０、血清アルブミン結合ペプチドとの融合物；血清アルブミンなどの血清タンパク質との融合物；Ｆｃなどの免疫グロブリン分子の定常領域との融合物並びに脂肪酸との融合物から得られる、例えば、メチオニンがＤＰ−１７８のＮ末端に連結されたメチオニルＤＰ−１７８が含まれるが、これらに限定されるものではない。天然に存在するＤＰ−１７８核酸及びアミノ酸配列は、単一アミノ酸バリアント又はスプライスバリアントなどのバリアントと同様に、公知である。
【００８５】
「ＤＰ−１７８ポリペプチド」という用語は、１又は複数のアミノ酸置換、付加又は欠失を含むＤＰ−１７８ポリペプチドを包含する。アゴニスト活性を増加する置換、ポリペプチドの溶解度を増加する置換、ポリペプチドをアンタゴニストに変換する置換、ペプチダーゼ又はプロテアーゼ感受性を減少する置換などの（これらに限定されない。）、ＤＰ−１７８の１又は複数の生物活性を調節する置換など（これらに限定されない。）、天然のＤＰ−１７８中の様々なアミノ酸位置における典型的な置換が記載されており、「ＤＰ−１７８ポリペプチド」という用語によって包含される。
【００８６】
ＤＰ−１７８アミノ酸配列については、それぞれ、本明細書中の配列番号２２を参照されたい。幾つかの実施形態において、本発明のＤＰ−１７８ポリペプチドは、配列番号２２、２４またはＤＰ−１７８ポリペプチドの他の任意の配列と実質的に同一である。ＤＰ−１７８変異体及び変異体ＤＰ−１７８ポリペプチドをコードする核酸分子も周知である。
【００８７】
ＤＰ−１７８の市販形態は、Ｆｕｚｅｏｎ（Ｒ）（エンフビルチド（ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ）、Ｒｏｃｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．及びＴｒｉｍｅｒｉｓ  ｉｎｃ．）である。Ｆｕｚｅｏｎ（Ｒ）は、アセチル化されたＮ末端を有し、Ｃ末端としてカルボキサミドを有する。Ｆｕｚｅｏｎ（Ｒ）は、抗レトロウイルス治療が行われているにもかかわらず、ＨＩＶ−１複製を示すＨＩＶ−１患者中で、他の抗ウイルス剤と組み合わせて使用される。
【００８８】
本明細書において使用される「ＰＹＹ」又は「ペプチドＹＹ」には、ヒトＰＹＹの少なくとも１つの生物活性を有するポリペプチド及びタンパク質、同じ生物活性かどうかにかかわらず、さらに、組換え（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又は核酸の他の形態から産生されたか否かを問わない。）、合成、トランスジェニック及び遺伝子活性化された方法など（これらに限定されない。）の合成又は製造の方法にかかわらず、並びにそれらのＰＹＹ類縁体、ＰＹＹイソフォーム、ＰＹＹ模倣体、ＰＹＹ断片、ハイブリッドＰＹＹタンパク質、融合タンパク質、オリゴマー及び多量体、相同体、グリコシル化パターンバリアント、ミュテインが含まれるものとする。
【００８９】
「ＰＹＹ」又は「ＰＹＹポリペプチド」という用語は、本明細書に記載されているＰＹＹ、並びに天然のＰＹＹの少なくとも１つの生物活性を保持するポリペプチドを表す。「ＰＹＹ」には、ＰＹＹの一部、類縁体及び相同体（ＰＹＹ（３−３６）、完全長ＰＹＹ、ＰＹＹ（２２−３６）及びＰＹＹのＤＰＰＩＶ耐性バリアントが含まれるが、これらに限定されるものではない。）が含まれる。「ＰＹＹ」という用語には、国際公開ＷＯ０２／４７７１２（米国特許公開２００２／０１４１９８５号のＰＣＴ対応物であり、参照により、本明細書に組み込まれる。）及び「Ｔａｔｅｍｏｔｏ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ７９：２５１４−８，  １９８２」（参照により、本明細書に組み込まれる。）の配列番号２に記載されているヒト完全長、３６アミノ酸ペプチドが両方含まれる。
【００９０】
ＰＹＹアゴニストも、「ＰＹＹ」という用語に含まれる。ＰＹＹアゴニストには、栄養素の利用可能性を低減するＰＹＹの効果を惹起するあらゆる化合物が含まれ、例えば、（１）ＷＯ０２／４７７１２号及び米国特許公開２００２／０１４１９８５号の実施例１、２、５又は６に記載されている食物摂取、胃内容排除、膵臓分泌又は体重減少アッセイにおいて活性を有する化合物、並びに（２）Ｙ受容体を大量に有するある種の組織（例えば、最後野など）（ＷＯ０２／４７７１２及び米国特許第２００２／０１４１９８５号の実施例９）から得られる標識されたＰＹＹ又はＰＹＹ［３−３６］を用いた、Ｙ受容体アッセイ（ＷＯ０２／４７７１２及び米国特許第２００２／０１４１９８５号の実施例１０）又は競合結合アッセイで特異的に結合する化合物が含まれる（ＰＹＹアゴニストは、膵臓ポリペプチドではない。）。好ましくは、ＰＹＹアゴニストは、このようなアッセイにおいて、約１μＭを超える親和性で結合し、さらに好ましくは、約１ないし約５ｎＭを超える親和性で結合するであろう。
【００９１】
このようなアゴニストは、機能的ＰＹＹドメイン、ＰＹＹの活性断片又は化学分子若しくは低分子を有するポリペプチドを含むことが可能である。ＰＹＹアゴニストは、ペプチド又は非ペプチド化合物であってもよく、「ＰＹＹアゴニスト類縁体」を含み、「ＰＹＹアゴニスト類縁体」は、典型的には、ＰＹＹ受容体若しくは他の受容体若しくはＰＹＹそのものが相互作用して生物学的応答を惹起し得る受容体と結合し、又はその他、直接的若しくは間接的に相互作用することによって、ＰＹＹ活性を有するＰＹＹに構造的に似たあらゆる化合物を表す。このような化合物には、ＰＹＹの誘導体、ＰＹＹの断片、３６アミノ酸を超える伸長されたＰＹＹ分子、３６アミノ酸未満を有する末端切断されたＰＹＹ分子、及び１若しくは複数の異なるアミノ酸を有する置換されたＰＹＹ分子又は上記のあらゆる組み合わせが含まれる。このような化合物は、ＰＥＧ化、アミド化、グリコシル化、アシル化、硫酸化、リン酸化、アセチル化及び環化などのプロセスによって修飾されてもよい。
【００９２】
このような１つのＰＹＹアゴニスト類縁体は、ＷＯ０２／４７７１２及び米国特許公開２００２／０１４１９８５；Ｅｂｅｒｌｅｉｎ，Ｅｙｓｓｅｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １０：７９７−８０３（１９８９）；及びＧｒａｎｄｙ，Ｓｃｈｉｍｉｃｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｇｕｌ  Ｐｅｐｔ  ５１：１５１−９（１９９４）の配列暗号３として同定される、ＰＹＹ［３−３６］である。米国特許公開２００５０００２９２７には、さらなるＰＹＹ断片、類縁体及び誘導体が記載されている。上記参照された特許公開は全て、参照により、本明細書に組み込まれる。
【００９３】
ＰＹＹポリペプチドには、天然に存在するヒトＰＹＹの薬学的に許容される塩及びプロドラッグ、並びに天然に存在するヒトＰＹＹの塩、多形、水和物、溶媒和物、生物活性断片、生物活性バリアント及び立体異性体のプロドラッグ、並びに天然に存在するヒトＰＹＹのアゴニスト、模倣体及びアンタゴニストバリアント並びにこれらのポリペプチド融合物も含まれる。アミノ末端、カルボキシル末端又はその両方にさらなるアミノ酸を含む融合物が、「ＰＹＹポリペプチド」という用語に包含される。典型的な融合物には、分泌シグナルペプチド又はその一部を欠如するＰＹＹの組換え発現、（ポリヒスチジン又は親和性エピトープなど（これらに限定されない。）への）精製のための融合物、血清アルブミン結合ペプチドとの融合物；血清アルブミンなどの血清タンパク質との融合物；Ｆｃなどの免疫グロブリン分子の定常領域との融合物並びに脂肪酸との融合物から得られる、例えば、メチオニンがＰＹＹのＮ末端に連結されたメチオニルＰＹＹが含まれるが、これらに限定されるものではない。天然に存在するＰＹＹ核酸及びアミノ酸配列は、単一アミノ酸バリアント又はスプライスバリアントなどのバリアントと同様に、公知である。
【００９４】
「ＰＹＹポリペプチド」という用語は、１又は複数のアミノ酸置換、付加又は欠失を含むＰＹＹポリペプチドを包含する。天然のＰＹＹ中の様々なアミノ酸位置における典型的な置換（ＰＹＹの生物活性の１又は複数を調節する（アゴニスト活性を増加する、ポリペプチドの溶解度を増加する、ポリペプチドをアンタゴニストに変換する、ペプチダーゼ又はプロテアーゼ感受性を減少するなど。但し、これらに限定されない。）置換を含むが、これに限定されない。）が記載されており、用語「ＰＹＹポリペプチド」に包含される。
【００９５】
ＰＹＹ（３−３６）アミノ酸配列については、それぞれ、本明細書中の配列番号２３を参照されたい。幾つかの実施形態において、本発明のＰＹＹポリペプチドは、配列番号２３またはＰＹＹポリペプチドの他の任意の配列と実質的に同一である。ＰＹＹ変異体及び変異体ＰＹＹポリペプチドをコードする核酸分子も周知である。
【００９６】
様々な参考文献が、ポリマー抱合又はグリコシル化によるポリペプチドの修飾を開示している。ＢＳＰという用語には、ＰＥＧなどのポリマーに抱合されたポリペプチドが含まれ、システイン、リジン又はその他の残基の一又は複数のさらなる誘導化から構成され得る。さらに、ＢＳＰは、当該リンカー又はポリマーが抱合されているアミノ酸が本発明に従って非天然アミノ酸であり得、又はリジン若しくはシステインへの結合などの分野で公知の技術を使用して天然にコードされているアミノ酸へ抱合され得るリンカー又はポリマーを含み得る。
【００９７】
ポリペプチドのポリマー修飾が報告されている。米国特許第４，９０４，５８４号は、ＰＥＧ化され、リジンが喪失されたポリペプチド（少なくとも一つのリジン残基が、欠失され、又は他の任意の残基と交換されている。）を開示している。ＷＯ９９／６７２９１号は、タンパク質上の少なくとも一つのアミノ酸残基が欠失され、該タンパク質への抱合を達成するのに十分な条件下で該タンパク質がＰＥＧと接触される、タンパク質をＰＥＧと抱合するための方法を開示している。ＷＯ９９／０３８８７号は、ポリペプチドの特定された領域中に位置する非必須アミノ酸残基でシステイン残基が置換されている、成長ホルモンスーパーファミリーに属するポリペプチドのＰＥＧ化されたバリアントを開示する。ＷＯ００／２６３５４号は、対応する親ポリペプチドと比較して少なくとも一つの追加のグリコシル化部位を含む、軽減されたアレルゲン性を有するグリコシル化されたポリペプチドバリアントを作製する方法を開示する。米国特許第５，２１８，０９２号は、野生型ポリペプチドに比べて少なくとも一つの追加の炭水化物鎖を導入するための、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）及び他のポリペプチドの修飾を開示する。ＰＥＧ化されたペプチドの例には、ＧＷ３９５０５８、ＰＥＧ化されたペプチドトロンボポイエチン受容体（ＴＰＯｒ）アゴニスト（ｄｅ  Ｓｅｒｒｅｓ  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｔｍ  Ｃｅｌｌｓ．１９９９；１７（４）：２０３−９）及び成長ホルモン放出因子のＰＥＧ化された類縁体（ＰＥＧ−ＧＲＰ；  Ｄ’Ａｎｔｏｎｉｏ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍ  ＩＧＦ  Ｒｅｓ．２００４  Ｊｕｎ；１４（３）：２２６−３４）が含まれる。
【００９８】
ＢＳＰという用語には、任意のアミノ酸位置でグリコシル化されたＢＳＰ、本ポリペプチドのＮ結合又はＯ結合型グリコシル化形態など（これらに限定されない。）、グリコシル化されたＢＳＰも含まれる。単一ヌクレオチドの変化を含有するバリアントも、ＢＳＰの生物活性バリアントと考えられる。さらに、スプライスバリアントも含まれる。ＢＳＰという用語には、化学的手段によって連結された又は融合タンパク質として発現された、一若しくは複数の任意のＢＳＰ、又は他の任意のポリペプチド、タンパク質、炭水化物、ポリマー、小分子、リンカー、リガンド若しくは任意の種類の他の生物活性分子、並びに、例えば生物活性を維持しつつ特異的な欠失又は他の修飾を含有するポリペプチド類縁体の、ＢＳＰヘテロ二量体、ホモ二量体、ヘテロ多量体又はホモ多量体も含まれる。
【００９９】
様々な参照文献が、Ｊ．  ｏｆ  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．（２０００）４３：１６６４−１６６９（参照により組み込まれる。）に記載されているＧＬＰ親類縁体及びアシル化部位などの（これらに限定されない。）、さらなるＧＬＰ−１のバリアント及びＧＬＰ−１のアシル化を開示している。
【０１００】
本明細書で記載されているＧＬＰ−１中のアミノ酸位置についての全ての表記は、別段の記載がなければ、配列番号１、２、３又は２１中の位置に基づいている。当業者であれば、配列番号１、２、３、２１又は他の任意のＧＬＰ−１配列中の位置に対応するアミノ酸位置は、ＧＬＰ−１融合物、バリアント、断片などの他の任意のＧＬＰ−１分子中に容易に同定可能であることが自明であろう。例えば、視覚的手段又はコンピュータプログラムによるＢＬＡＳＴなどの配列整列は、配列番号１、２、３、２１又は他のＧＬＰ−１配列中の位置と対応する、タンパク質中の特定の位置を整列し、同定するために使用することが可能である。配列番号２２、２４及び他のあらゆるＤＰ−１７８配列又は配列番号２３（ＰＹＹ（３−３６））及び他のあらゆるＰＹＹ配列に対して類似の分析を行ってもよい。配列番号１、２、３、２１又は他のＧＬＰ−１配列、配列番号２２、２４又は他のＤＰ−１７８配列、又は配列番号２３および他の任意のＰＹＹ配列に関して本明細書に記載されているアミノ酸の置換、欠失又は付加は、本明細書に記載され又は本分野で公知のＧＬＰ−１、ＤＰ−１７８又はＰＹＹ融合物、バリアント、断片などにおける対応する位置の置換、欠失又は付加も表し、本発明によって明示的に包含される。
【０１０１】
ＢＳＰという用語は、１又は複数のアミノ酸置換、付加又は欠失を含むＢＳＰポリペプチドを包含する。本発明のＢＳＰは、１又は複数の非天然アミノ酸修飾とともに、１又は複数の天然アミノ酸を用いた修飾から構成され得る。アゴニスト活性を増加する置換、ポリペプチドの溶解度を増加する置換、ポリペプチドをアンタゴニストに変換する置換、ペプチダーゼ又はプロテアーゼ感受性を減少するなどの（これらに限定されない。）、ＢＳＰの生物活性の一又は複数を調節する置換など（これらに限定されない。）、天然のＢＳＰ中の様々なアミノ酸位置における典型的な置換が記載されており、「ＢＳＰ」という用語によって包含される。
【０１０２】
ヒトＧＬＰ−１アンタゴニストには、１９、２３、２６、２７、２８、２９、３０及び３３に置換を有するものが含まれるが、これらに限定されるものではない（配列番号１、２、３、２１又は任意の他のＧＬＰ−１配列）。幾つかの実施形態において、ＧＬＰ−１アンタゴニストは、ＧＬＰ−１分子の受容体結合領域中に存在する水溶性ポリマーに連結された、非天然コードアミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、水溶性ポリマーが、アミノ酸位置：１９、２３、２６、２７、３０及び３３のうち１又は複数に（配列番号１、２、３、２１又は他の任意のＧＬＰ−１ポリペプチド）おいて、ＧＬＰ−１ポリペプチドに連結されている。
【０１０３】
幾つかの実施例では、ＢＳＰは、さらに、ＢＳＰの生物学的活性を調節する付加、置換又は欠失を含む。例えば、付加、置換又は欠失は、ＢＳＰの１又は複数の特性又は活性を調節し得る。例えば、付加、置換又は欠失は、ＢＳＰ受容体又は結合対に対する親和性を調節し、受容体の二量体化を調節し（増加又は減少させることを含むが、これらに限定されない。）、受容体の二量体を安定化し、結合対の立体構造又は１若しくは複数の生物活性を調節し、循環半減期を調節し、治療半減期を調節し、ポリペプチドの安定性を調節し、ペプチダーゼ若しくはプロテアーゼによる切断を調節し、用量を調節し、放出若しくは生物学的利用可能性を調節し、精製を促進し、又は投与の具体的経路を改善若しくは改変し得る。同様に、ＢＳＰは、プロテアーゼ切断配列、反応性の基、該ポリペプチドの検出（ＧＦＰを含むが、これに限定されない。）、精製又は他の形質を向上させる、抗体結合ドメイン（ＦＬＡＧ又はポリーＨｉｓを含むが、これらに限定されない。）又はアフィニティーを基礎とした他の配列（ＦＬＡＧ、ポリ−Ｈｉｓ、ＧＳＴなどを含むが、これらに限定されない。）又は連結された分子（ビオチンを含むが、これに限定されない。）を含み得る。
【０１０４】
ＢＳＰという用語には、非天然コードアミノ酸側鎖を介して、同一若しくは別異の非天然コードアミノ酸側鎖に、天然にコードされているアミノ酸側鎖に直接的に連結されたもの又はリンカーを介して間接的に連結されたものなど（これらに限定されない。）、連結されたホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体及びヘテロ多量体も包含される。典型的なリンカーには、小有機化合物、ポリ（エチレングリコール）又はポリデキストランなどの様々な長さの水溶性ポリマー又は様々な長さのポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０５】
「非天然コードアミノ酸」とは、２０の共通アミノ酸うちの一つ又はピロリジン（ｐｙｒｏｌｙｓｉｎｅ）又はセレノシステインでないアミノ酸を表す。「非天然コードアミノ酸」と同義的に使用され得る他の用語は、「非天然アミノ酸」、「不天然アミノ酸」、「天然に存在しないアミノ酸」、並びに様々にハイフンが付されたそのバージョン及びハイフンが付されていないそのバージョンである。「非天然コードアミノ酸」という用語には、天然にコードされているアミノ酸（２０の共通アミノ酸又はパイロリジン及びセレノシステインを含むが、これらに限定されない。）の修飾（例えば、翻訳後修飾）によって生じるが、それ自体は、成長しているポリペプチド鎖中に翻訳複合体によって本来取り込まれないアミノ酸も含まれるが、これに限定されない。このような天然に存在しないアミノ酸の例には、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−スレオニン及びＯ−ホスホチロシンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０６】
「アミノ末端修飾基」とは、ポリペプチドのアミノ末端に付着させることが可能な任意の分子を表す。同様に、「カルボキシ末端修飾基」とは、ポリペプチドのカルボキシ末端に付着させることが可能な任意の分子を表す。末端修飾基には、様々な水溶性ポリマー、血清アルブミン、Ｆｃなどの免疫グロブリン定常領域部分などのペプチド若しくはタンパク質、又はペプチドの血清半減期を増加させるその他の部分が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０７】
「官能基」、「活性部分」、「活性化基」、「脱離基」、「反応性部位」、「化学的反応基」及び「化学的反応部分」という用語が、分子の異なる、確定可能な部分又は単位を表すために、本分野及び本明細書において使用されている。前記用語は、化学の分野において若干同義的であり、何らかの機能又は活性を発揮し、他の分子と反応する分子の部分を表すために本明細書に使用される。
【０１０８】
本明細書において「結合」又は「リンカー」という用語は、化学反応の結果として通常形成される基又は結合を表すために使用され、典型的には、共有結合である。加水分解に対して安定な結合とは、該結合が水中で実質的に安定であり、生理的条件下を含む（これに限定されない。）有用なｐＨ値で、長期にわたって、おそらくは永久に水と反応しない結合を意味する。加水分解に対して不安定な結合又は分解可能な結合とは、該結合が、水又は例えば、血液などの水溶液中で分解可能であることを意味する。酵素的に不安定な結合又は分解可能な結合とは、該結合が一又は複数の酵素によって分解可能であることを意味する。本分野で理解されているように、ＰＥＧ及び関連ポリマーは、ポリマー骨格中に、又はポリマー骨格とポリマー分子の末端官能基の一又は複数との間のリンカー基中に分解可能な結合を含み得る。例えば、ＰＥＧカルボン酸又は活性化されたＰＥＧカルボン酸の、生物活性因子上のアルコール基との反応によって形成されたエステル結合は、一般的には、生理的条件下で加水分解されて、前記因子を放出する。加水分解によって分解可能な他の結合には、炭酸塩結合；アミンとアルデヒドの反応から得られたイミン結合；アルコールとリン酸基との反応によって形成されたリン酸エステル結合；ヒドラジドとアルデヒドの反応産物であるヒドラゾン結合；アルデヒドとアルコールの反応産物であるアセタール結合；ギ酸塩とアルコールの反応産物であるオルトエステル結合；アミン基（ＰＥＧなどのポリマーの末端に位置するものを含むが、これに限定されない。）とペプチドのカルボキシ基によって形成されるペプチド結合；及びホスホルアミダイト基（ポリマーの末端に位置するものを含むが、これに限定されない。）とオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基によって形成されるオリゴヌクレオチド結合が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０９】
「生物活性分子」、「生物活性部分」又は「生物活性因子」という用語は、本明細書中で使用する場合、以下に限定されないが、ウイルス、細菌、バクテリオファージ、トランスポゾン、プリオン、昆虫、真菌、植物、動物及びヒトを含む、生物系、生物に関連する、経路、分子もしくは相互作用の何らかの身体的又は生化学的特性に影響を与え得るあらゆる物質を意味する。特に、本明細書中で使用する場合、生物活性分子には、以下に限定されないが、ヒトもしくは動物における疾患の、診断、治療、緩和、処置もしくは予防のための、又は、ヒトもしくは動物の身体的もしくは精神的健康を促進するためのあらゆる物質が含まれる。生物活性分子の例には、以下に限定されないが、ペプチド、タンパク質、酵素、小分子薬物、ハードドラッグ、ソフトドラッグ、炭水化物、無機原子又は分子、顔料、脂質、ヌクレオシド、放射性核種、オリゴヌクレオチド、毒素、細胞、ウイルス、リポソーム、微小粒子及びミセルが含まれる。本発明とともに使用するのに適した生物活性因子のクラスには、以下に限定されないが、薬物、プロドラッグ、放射性核種、造影剤、ポリマー、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、心血管作動薬、抗不安薬、ホルモン、増殖因子、ステロイド剤、微生物由来毒素などが含まれる。
【０１１０】
「二官能性ポリマー」とは、他の部分（アミノ酸側鎖基を含むが、これに限定されない。）と特異的に反応して、共有又は非共有結合を形成することができる２つの別個の官能基を含むポリマーを表す。第一の生物活性成分と、二官能性リンカーと、及び第二の生物活性成分とを含む抱合体を形成するために、ある生物活性成分上の基と反応する１つの官能基と、第二の生物成分上の基と反応する別の基とを有する二官能性リンカーを使用することができる。ペプチドに様々な化合物を付着するための数多くの手順及びリンカー分子が公知である。例えば、欧州特許出願第１８８，２５６号；米国特許第４，６７１，９５８号、第４，６５９，８３９号、第４，４１４，１４８号、第４，６９９，７８４号；第４，６８０，３３８号；第４，５６９，７８９号；及び第４，５８９，０７１号（これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。「多官能性ポリマー」とは、他の部分（アミノ酸側鎖基を含むが、これに限定されない。）と特異的に反応して、共有又は非共有結合を形成することができる２以上の別個の官能基を含むポリマーを表す。二官能性ポリマー又は多官能性ポリマーは、あらゆる所望の分子長又は分子量であってもよく、ＢＳＰに連結された１又は複数の分子とＢＳＰの結合対又はＢＳＰの間に特定の所望されるスペース又は立体構造を提供するように選択され得る。
【０１１１】
置換基が、左から右へ書かれた慣用の化学式によって特定されている場合、それらは、右から左へ構造を書くことによって得られる化学的に同一の置換基を等しく包含し、例えば、構造−ＣＨ２Ｏ−は、構造−ＯＣＨ２−と等価である。
【０１１２】
「置換基」という用語は、以下に限定されないが、「非妨害置換基」を含む。「非妨害置換基」は、安定な化合物を生じる基である。適切な非妨害置換基又はラジカルには、以下に限定されないが、ハロ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ１−Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１−Ｃ１２アラルキル、Ｃ１−Ｃ２アルカリル、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルケニル、フェニル、置換されたフェニル、トルオイル、キシレニル、ビフェニル、Ｃ２−Ｃ１２アルコキシアルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルコキシアリール、Ｃ７−Ｃ１２アリールオキシアルキル、Ｃ７−Ｃ１２オキシアリール、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルフィニル、Ｃ１−Ｃ１０アルキルスルホニル、−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）（式中、ｍは１から８である。）、アリール、置換されたアリール、置換されたアルコキシ、フルオロアルキル、複素環基、置換された複素環基、ニトロアルキル、−−ＮＯ２、−−ＣＮ、−−ＮＲＣ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、Ｃ２−−Ｃ１０アルキルチオアルキル、−−Ｃ（Ｏ）Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、−−ＯＨ、−−ＳＯ２、＝Ｓ、−−ＣＯＯＨ、−−ＮＲ２、カルボニル、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）−−ＣＦ３、−−Ｃ（Ｏ）−−ＣＦ３、−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−−（Ｃ１−Ｃ１０アリール）−−Ｓ−−（Ｃ６−Ｃ１０アリール）、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アリール）、−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）（式中、各ｍは１から８である。）、−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−−Ｃ（Ｓ）ＮＲ２、−−ＳＯ２ＮＲ２、−−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ２、−−ＮＲＣ（Ｓ）ＮＲ２、それらの塩などが含まれる。各Ｒは、本明細書中で使用する場合、Ｈ、アルキルもしくは置換されたアルキル、アリールもしくは置換されたアリール、アラルキル又はアルカリルである。
【０１１３】
「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、ヨウ素及び臭素を含む。
【０１１４】
「アルキル」という用語は、単独で又は別の置換基の一部として、別段の断りがない限り、直鎖もしくは分枝鎖もしくは環状炭化水素基又はそれらの組合せを意味し、完全に飽和、モノ又はポリ不飽和であり得、指定の炭素原子数を有する（即ち、Ｃ１−Ｃ１０は、１から１０個の炭素を意味する。）、二価及び多価の基を含み得る。飽和炭化水素基の例としては、以下に限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどの相同体及び異性体などの基が挙げられる。不飽和アルキル基は、１又は複数の二重結合又は三重結合を有する基である。不飽和アルキル基の例としては、以下に限定されないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−及び３−プロピニル、３−ブチニル及び高級相同体及び異性体が挙げられる。「アルキル」という用語はまた、別段の注記がない限り、「ヘテロアルキル」など、下記でさらに詳細に定義するアルキルの誘導体を含むものとする。炭化水素基に限定されるアルキル基は「ホモアルキル」と呼ぶ。
【０１１５】
「アルキレン」という用語は、単独で又は別の置換基の一部として、アルカン由来の二価の基を意味し、例としては、以下に限定されないが、構造−ＣＨ２−ＣＨ２−及び−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−が挙げられ、さらに、「ヘテロアルキレン」として下記で述べる基が含まれる。典型的には、アルキル（又はアルキレン）基は、１から２４個までの炭素原子を有し得るが、本発明では、１０個以下の炭素原子を有する基が好ましい。「低級アルキル」又は「低級アルキレン」は、より短い鎖のアルキル又はアルキレン基であり、通常、８個以下の炭素原子を有する。
【０１１６】
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」及び「アルキルチオ」（又はチオアルコキシ）という用語は、これらの慣用の意味で使用し、分子の残りの部分にそれぞれ酸素原子、アミノ基又はイオウ原子を介して結合するアルキル基を指す。
【０１１７】
単独で又は別の用語と一部として組み合わされた「ヘテロアルキル」という用語は、別段の記載がなければ、表記の炭素原子数と、Ｏ、Ｎ、Ｓｉ及びＳからなる群から選択される少なくとも一つの複素原子とからなり、窒素原子及び硫黄原子が必要に応じて酸化されていてもよく、窒素複素原子が必要に応じて四級化されていてもよい、安定な直鎖若しくは分枝鎖若しくは環状炭化水素基又はそれらの組み合わせを意味する。複素原子Ｏ、Ｎ及びＳ及びＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置又はアルキル基が分子の残部に付着される位置に配置され得る。例には、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３及び−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が含まれるが、これらに限定されるものではない。最大２個の複素原子が、例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３及び−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ−（ＣＨ３）３のように、連続してもよい。同様に、「ヘテロアルキレン」という用語は、単独で又は別の置換基の一部として、ヘテロアルキル由来の二価の基を意味し、例としては、以下に限定されないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−及び−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−が挙げられる。ヘテロアルキレン基の場合、同一又は別異の複素原子が、鎖末端の一方又は両方を占めることも可能である（アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ、アミノオキシアルキレンなどを含むが、これらに限定されない。）。さらに、アルキレン及びヘテロアルキレン連結基の場合、連結基の式が書かれている方向によって連結基の配向は示唆されない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−及び−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−の両方を表す。
【０１１８】
「シクロアルキル」及び「ヘテロシクロアルキル」という用語は、単独で又は他の用語と組み合わせて、別段の断りがない限り、それぞれ「アルキル」及び「ヘテロアルキル」の環状形態を表す。このため、シクロアルキル又はヘテロシクロアルキルには、飽和及び不飽和環結合が含まれる。さらに、ヘテロシクロアルキルの場合、複素原子は、複素環が分子の残部に付着されている位置を占めることが可能である。シクロアルキルの例には、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが含まれるが、これらに限定されない。ヘテロシクロアルキルの例としては、以下に限定されないが、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられる。さらに、本用語は、二環式及び三環式の環構造を包含する。同様に、「ヘテロシクロアルキレン」という用語は、単独で又は別の置換基の一部として、ヘテロシクロアルキル由来の二価の基を意味し、「シクロアルキレン」という用語は、単独で又は別の置換基の一部として、シクロアルキル由来の二価の基を意味する。
【０１１９】
本明細書中で使用する場合、「水溶性ポリマー」という用語は、水性溶媒中で可溶性であるあらゆるポリマーを指す。ＢＳＰへの水溶性ポリマーの結合は、非修飾形態に比べて、増加若しくは調節された血清半減期、又は増加若しくは調節された治療半減期、調節された免疫原性、凝集及び多量体の形成、改変された受容体結合、１又は複数の結合対への改変された結合及び改変された受容体二量体化又は多量体化などの調節された物理的会合特性を含む（これらに限定されない。）変化をもたらすことが可能である。水溶性ポリマーは、それ自身の生物活性を有していても有していなくてもよく、以下に限定されないが、１もしくは複数のＢＳＰ又は１もしくは複数の生物活性分子を含む他の物質へのＢＳＰの連結のためにリンカーとして利用され得る。適切なポリマーとしては、以下に限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、モノＣ１−Ｃ１０アルコキシ又はそれらのアリールオキシ誘導体（米国特許第５，２５２，７１４号に記載（本明細書中に参照により組み込む。）。）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテル無水マレイン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、硫酸デキストランを含むデキストラン誘導体、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ヘパリン、ヘパリン断片、多糖類、オリゴ糖、グリカン、セルロース及びセルロース誘導体（以下に限定されないが、メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースを含む。）、デンプン及びデンプン誘導体、ポリペプチド、ポリアルキレングリコール及びそれらの誘導体、ポリアルキレングリコールとそれらの誘導体とのコポリマー、ポリビニルエチルエーテル及びα−β−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルタミドなど又はそれらの混合物が挙げられる。このような水溶性ポリマーの例には、ポリエチレングリコール及び血清アルブミンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２０】
本明細書中で使用する場合、「ポリアルキレングリコール」又は「ポリ（アルケングリコール）」という用語は、ポリエチレングリコール（ポリ（エチレングリコール））、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール及びそれらの誘導体を指す。「ポリアルキレングリコール」という用語は、直鎖及び分岐ポリマーの両方、並びに０．１ｋＤａないし１００ｋＤａの平均分子量を表す。他の例示的な実施形態は、例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのカタログ「“Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”（２００１）」など、供給業者のカタログに列記されている。
【０１２１】
「アリール」という用語は、別段の断りがない限り、単環又は多環式（好ましくは１から３環）であり得、一緒に縮合するか又は共有結合している、ポリ不飽和、芳香族、炭化水素置換基を意味する。「ヘテロアリール」という用語は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１から４個までの複素原子を含有し、窒素及び硫黄原子が必要に応じて酸化されており、並びに窒素原子が必要に応じて四級化されているアリール基（又は環）を表す。ヘテロアリール基は、複素原子を通じて分子の残部に付着させることが可能である。アリール及びヘテロアリール基の非限定例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル及び６−キノリルが含まれる。上記アリール及びヘテロアリール環系の各々に対する置換基は、以下に記載されている許容される置換基の群から選択される。
【０１２２】
簡略のため、他の用語と組み合わせて使用される場合（アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキルを含むが、これらに限定されない。）、「アリール」という用語は、上記定義のアリール及びヘテロアリールの両方を含む。このため、「アリールアルキル」という用語は、アリール基がアルキル基（炭素原子（メチレン基を含むが、これに限定されない。）が、例えば、酸素原子によって置換されたアルキル基（フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）を含むが、これらに限定されない。）に付着された基（ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなどが含まれるが、これらに限定されない。）を含むものとする。
【０１２３】
上記各用語（「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」及び「ヘテロアリール」を含むが、これらに限定されない。）は、表記されている基の置換された形態及び置換されていない形態の両方を含むものとする。各種類の基に対する典型的な置換基が、以下に記載されている。
【０１２４】
アルキル及びヘテロアルキル基に対する置換基（しばしば、アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル及びヘテロシクロアルケニルと呼ばれることが多い基を含む。）は、０から（２ｍ’＋１）（ｍ’は、このような基の中の炭素原子の総数である。）までの範囲の数の、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ及び−ＮＯ２から選択される様々な一又は複数の基とすることができるが、これらに限定されない。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’は、各々独立に、水素、置換された又は置換されていないヘテロアルキル、置換された又は置換されていないアリール（１ないし３個のハロゲンで置換されたアリールを含むが、これに限定されない。）、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ若しくはチオアルコキシ基、又はアリールアルキル基を表す。本発明の化合物が２以上のＲ基を含む場合、例えば、Ｒ基のそれぞれは、これらの基が２以上存在する場合には、独立に、各々Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’基として選択される。Ｒ’及びＲ’’が同一の窒素原子に付着されている場合には、それらは、窒素原子と組み合わされて５、６又は７員環を形成することが可能である。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、１−ピロリジニル及び４−モルホリニルが含まれるが、これらに限定されない。置換基についての上記論述から、当業者であれば、「アルキル」という用語には、ハロアルキル（−ＣＦ３及び−ＣＨ２ＣＦ３が含まれるが、これらに限定されない。）及びアシル（−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３が含まれるが、これらに限定されない。）、水素基以外の基に結合された炭素原子を含む基が含まれることが理解できるであろう。
【０１２５】
アルキル基に対して述べた置換基と同様に、アリール及びヘテロアリール基に対する置換基は、様々であり、以下に限定されないが、ハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ及び−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ及びフルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル（０から芳香環系におけるオープンバレンスの総数の範囲の数；Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’は、水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール及びヘテロアリールから独立に選択される。）から選択される。本発明の化合物が２以上のＲ基を含む場合、例えば、Ｒ基のそれぞれは、これらの基が２以上存在する場合には、独立に、各々Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’基として選択される。
【０１２６】
本明細書において使用される、「調節された血清半減期」という用語は、修飾されていない形態に比した、修飾されたＢＳＰの循環半減期の正又は負の変化を意味する。血清半減期は、ＢＳＰの投与後の様々な時点に血液試料を採取し、各試料中のその分子の濃度を決定することによって測定される。血清濃度と時間の相関関係は、血清半減期の循環を可能とする。望ましくは、増加された血清半減期は、少なくとも約２倍を有するが、それより小幅な増加も有用であり、例えば、これにより、満足のいく投与計画を可能とするか、又は毒性の影響を避けることができる。幾つかの実施形態では、増加は、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍である。
【０１２７】
「調節された治療半減期」という用語は、本明細書中で使用する場合、その非修飾形態と比較して、ＢＳＰの治療的有効量の半減期が正又は負に変化することを意味する。治療半減期は、投与後に、様々な時間点で分子の薬物動態及び／又は薬力学特性及び／又は治療効果を測定することにより測定される。増加された治療的半減期は、望ましくは、特定の有益な投薬治療、特定の有益な総投薬を可能とし、又は所望でない効果を回避する。ある実施形態において、効力の増強、その標的に対する修飾された分子の結合の増加又は減少、このようなペプチダーゼ若しくはプロテアーゼなどの酵素による分子の増加若しくは減少した分解、又は別のパラメーターの増加又は減少又は非修飾分子の作用機構の結果、治療半減期が延びる。
【０１２８】
「単離された」という用語は、核酸又はタンパク質に対して適用される場合、核酸又はタンパク質が自然の状態でそれとともに随伴している他の細胞成分を、該核酸又はタンパク質が実質的に含まないことを表す。それは、均質な状態であり得る。単離された物質は、乾燥若しくは半乾燥状態、又は溶液（水溶液を含むが、これに限定されない。）とすることができる。純度及び均質性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高性能液体クロマトグラフィーなどの分析的化学技術を用いて測定される。調製物中に存在する主な種であるタンパク質は、実質的に精製される。特に、単離された遺伝子は、該遺伝子に隣接し、対象遺伝子とは別のタンパク質をコードする読み取り枠から分離されている。「精製された」という用語は、核酸又はタンパク質が電気泳動ゲル中で実質的に一つのバンドを生じることを表す。特に、「精製された」という用語は、核酸又はタンパク質が、少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９９％以上純粋であることを意味する。
【０１２９】
「核酸」という用語は、一本鎖又は二本鎖形態の、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド又はリボヌクレオチド及びそれらのポリマーを表す。別段の制限がなければ、本用語は、基準核酸と同様の結合特性を有し、天然ヌクレオチドに類似する様式で代謝される天然ヌクレオチドの公知の類縁体を含有する核酸を包含する。別段の制限がなければ、本用語は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、アンチセンス技術で使用されるＤＮＡの類縁体（ホスホロチオアート、ホスホロアミダートなど）を含む、オリゴヌクレオチド類縁体も表す。別段の記載がなければ、ある核酸配列は、保存的に修飾されたそのバリアント（縮重コドン置換を含むが、これに限定されない。）及び相補的配列並びに明示的に記されている配列も黙示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、選択された一又は複数（又は全て）のコドンの三番目の位置が混合された塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １９：  ５０８１（１９９１）；  Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６０：  ２６０５−２６０８（１９８５）；  ａｎｄ  Ｃａｓｓｏｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）；  Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｒｏｂｅｓ  ８：  ９１−９８（１９９４））。
【０１３０】
「アミノ酸」という用語は、天然及び非天然アミノ酸並びに天然アミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類縁体及びアミノ酸模倣体を表す。天然にコードされるアミノ酸は、２０の共通アミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン）並びにパイロリジン及びセレノシステインである。アミノ酸類縁体は、天然アミノ酸と同一の基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどのＲ基に結合されているα炭素を有する化合物を表す。このような類縁体は、修飾されたＲ基（ノルロイシンなど）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同一の基礎的化学構造を保持する。
【０１３１】
本明細書では、アミノ酸は、一般的に知られている三文字記号によって、又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨されている一文字記号の何れかによって表記され得る。同様に、ヌクレオチドは、一般的に受容されている一文字コードによって表記され得る。
【０１３２】
「保存的に修飾されたバリアント」は、アミノ酸及び核酸配列の両方に対して適用される。ある核酸配列に関して、「保存的に修飾されたバリアント」は、同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を表し、又は核酸がアミノ酸配列をコードしていない場合には、実質的に同一の配列を表す。遺伝コードの縮重のため、機能的に同一の多数の核酸が任意の与えられたタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。このように、アラニンがコドンによって指定されている全ての場所で、該コドンは、コードされているポリペプチドを変化させずに、任意の対応する記載されているコドンへと変化させることができる。このような核酸の変化は、保存的に修飾された変異の一種である「サイレント変異」である。本発明において、ポリペプチドをコードする全ての核酸配列は、該核酸の全ての可能なサイレント変異も記載する。当業者であれば、核酸中の各コドン（通常、メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常、トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く。）、機能的に同一の分子を生成するために修飾することが可能なことを認識できるであろう。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、各記載された配列に含意される。
【０１３３】
アミノ酸配列については、当業者であれば、コードされている配列中の単一アミノ酸又は僅かな割合のアミノ酸を変化し、付加し、又は欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列に対する、各置換、欠失又は付加は、変化があるアミノ酸の化学的に類似するアミノ酸との置換をもたらす「保存的に修飾されたバリアント」であることを理解するであろう。機能的に類似のアミノ酸を与える保存的置換の表が、本分野において周知である。このような保存的に修飾されたバリアントは、さらに、本発明の多型バリアント、種間相同体、及び対立遺伝子であり、これらを除外するものではない。
【０１３４】
以下の８つの群は、それぞれ、互いに保存的な置換であるアミノ酸を含有する。
【０１３５】
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ  Ｈ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．；  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９９３）参照）。
【０１３６】
「同一」又はパーセント「同一」という用語は、２以上の核酸又はポリペプチド配列に関して、同じである２以上の配列又はサブ配列を指す。以下の配列比較アルゴリズムの一つを用いて、又は手で整列し、目で調べることによって測定された場合に、比較ウィンドウ又は指定された領域にわたり、最大の一致度を比較し、並列したときに、当該配列が、同一であるアミノ酸残基又はヌクレオチドの一定パーセント（すなわち、指定された領域にわたって、約６０％、必要に応じて約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の同一性）を有すれば、配列は「実質的に同一」である。この定義は、試験配列の相補物も表す。同一性は、少なくとも約５０アミノ酸若しくはヌクレオチド長である領域にわたって、又は７５ないし１００アミノ酸若しくはヌクレオチド長である領域にわたって存在し、又は、明記されていない場合には、ポリヌクレオチド若しくはポリペプチドの配列全体、又は５０アミノ酸若しくはヌクレオチド未満の長にわたって存在することが可能である。
【０１３７】
配列比較の場合、典型的には、ある配列が基準配列として作用し、該配列に対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び基準配列をコンピュータに入力し、必要であれば、サブ配列座標を指定し、及び配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。初期設定プログラムパラメータを使用することが可能であり、又は別のパラメータを指定することが可能である。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、基準配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
【０１３８】
本明細書において使用される「比較ウィンドウ」には、２０から６００まで、通常は約５０から２００まで、より一般的には約１００から１５０までからなる群から選択される連続する位置の数の任意の一つのセグメントを表し、その中で、２つの配列は最適に配列された後に、配列は同数の連続位置の基準配列に対して比較され得る。比較のための配列の整列方法は、本分野において周知である。以下に限定されないが、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似法の検索、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）における、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）又は手動でのアラインメント及び目視（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５、付録）を含む方法により、比較のための配列の最適アラインメントを行うことができる。
【０１３９】
パーセント配列同一性及び配列同一性を決定するのに適したアルゴリズムの一例は、それぞれ、「Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：  ３３８９−３４０２」及び「Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：  ４０３−４１０」に記載されているＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、「Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ」を通じて公に頒布されている。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ及びＸは、整列の感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、１１のワード長（Ｗ；ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）、１０の予測値（Ｅ；ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を初期設定として使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期設定として、３のワード長、及び１０の期待値（Ｅ）及び５０のＢＬＯＳＵＭ６２採点マトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を使用する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、通常、「低複雑度」のフィルターをオフにして行う。
【０１４０】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、典型的に、「低複雑度」フィルターのスイッチを切って行われる。
【０１４１】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７を参照。）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の一指標は、最少合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間で一致が偶発的に生じ得る確率の指標を与える。例えば、基準核酸に対して試験核酸を比較した場合に、最少合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満であれば、核酸は基準配列と類似していると考えれる。
【０１４２】
「選択的に（又は特異的に）ハイブリダイズする」という用語は、その配列が複雑な混合物中に存在する場合には（全細胞又はライブラリーＤＮＡ若しくはＲＮＡを含むが、これらに限定されない。）、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、分子が、あるヌクレオチド配列のみに結合し、二重鎖を形成し、又はハイブリダイズすることを表す。
【０１４３】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、本分野で公知であるように、低いイオン強度と高い温度の条件を表す。典型的には、ストリンジェントな条件下では、プローブは、核酸の複雑な混合物（全細胞又はライブラリーＤＮＡ若しくはＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。）中のその標的サブ配列にハイブリダイズするが、複雑な混合物中の他の配列にはハイブリダイズしないであろう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる状況では異なり得る。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての詳しい手引きは、「Ｔｉｊｓｓｅｎ，  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ，  “Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ”（１９９３）」に見出される。一般的に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度ｐＨで、特異的な配列に対する熱融解点（Ｔｍ）より約５ないし１０℃低いように選択される。Ｔｍとは、（標的配列は過剰に存在するので、Ｔｍにおいて、５０％のプローブが平衡状態で占有されるので）標的に対して相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度下での）温度である。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０ないし８．３で、約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には約０．０１ないし１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（又は他の塩）であり、短いプローブ（１０ないし５０ヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。）の場合、温度が少なくとも約３０℃、長いプローブの場合（５０ヌクレオチド超を含むが、これらに限定されない。）の場合、温度が少なくとも約６０℃である条件であり得る。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成され得る。選択的又は特異的なハイブリダイゼーションの場合、陽性信号は、バックグラウンドの少なくとも２倍、必要に応じてバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍であり得る。典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、４２℃でインキュベートする５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び１％ＳＤＳ、又は６５℃でインキュベートし、０．２×ＳＳＣ中で洗浄し、６５℃の０．１％ＳＤＳ中で洗浄する５×ＳＳＣ、及び１％ＳＤＳとすることができる。このような洗浄は、５、１５、３０、６０、１２０分以上行うことが可能である。
【０１４４】
本明細書において使用される、「真核生物」という用語は、動物（哺乳動物、昆虫、爬虫類、鳥類などを含むが、これらに限定されない。）、繊毛虫類、植物（単子葉植物、双子葉植物、藻類などを含むが、これらに限定されない。）、真菌、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物などの系統発生学的ドメインで真核生物（Ｅｕｃａｒｙａ）に属する生物を表す。
【０１４５】
本明細書中で使用する場合、「非真核生物」という用語は、非真核の生物を指す。例えば、非真核生物は、真正細菌（以下に限定されないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（エスケリチア・コリ、大腸菌）、Ｔｈｅｒｍｉｔｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（サーミス・サーモフィルス）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（バシラス・ステロサーモフィルス、好熱性細菌）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（シュードモナス・フルオレセンス、蛍光菌）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（シュードモナス・エルギノーサ、緑膿菌）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ（シュードモナス・プチダ、プチダ菌）などが含まれる。）系統発生ドメイン又は古細菌（以下に限定されないが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（メタノコッカス・ジャナシ）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（好熱性メタン菌）、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ（ハロフェラクス・ボルカニ）及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ハロバクテリウム）種ＮＲＣ−１などのＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ハロバクテリウム）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ（アルケログロブス・フルギドゥス）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（ピロコッカス・フリオサス）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（ピロコッカス・ホリコシ）、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ（ユーロピルム・ペルニクス）系統発生ドメインなどを含む。）に属することが可能である。
【０１４６】
本明細書において使用される「対象」という用語は、治療、観察又は実験の対象である動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを表す。
【０１４７】
「有効量」という用語は、本明細書中で使用する場合、治療されている、疾病、症状又は疾患の症候の１又は複数をある程度緩和する、投与される（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドの量を指す。本明細書に記載されている（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドを含有する組成物は、予防的、強化的及び／又は治療的処置のために投与することが可能である。
【０１４８】
「強化する」又は「強化すること」という用語は、所望の効果の強度又は持続時間の何れかを増加又は延長させることを意味する。このため、治療薬の効果を促進するということに関して、「強化すること」という用語は、系において他の治療薬、の強度又は持続時間、効果を増大又は延長させる能力を意味する。本明細書において使用される「強化有効量」とは、所望の系において、別の治療剤の効果を強化するのに十分な量を表す。患者に使用される場合、この使用に対して有効な量は、疾病、疾患又は症状の重度及び経過、以前の治療、患者の健康状態及び薬物に対する応答、並びに担当医の判断に依存するであろう。
【０１４９】
本明細書において使用される「修飾された」という用語は、ポリペプチドの長さ、アミノ酸配列、アミノ酸組成、化学的構造に対する変化、ポリペプチドの翻訳時修飾又は翻訳後修飾など、あるポリペプチドに対して施された任意の変化を表す。「（修飾された）」という形式の用語は、論述されているポリペプチドが必要に応じて修飾されていること、すなわち、論述されているポリペプチドは修飾されてもよく、又は修飾されなくてもよいことを意味する。
【０１５０】
「翻訳後修飾された」という用語は、天然又は非天然アミノ酸がポリペプチド鎖に組み込まれた後、このようなアミノ酸に起こる、天然又は非天然アミノ酸のあらゆる修飾を指す。この用語は、一例に過ぎないが、インビボ翻訳時修飾、インビトロ翻訳時修飾（無細胞翻訳系など）、インビボ翻訳後修飾及びインビトロ翻訳後修飾を包含する。
【０１５１】
予防的な適用では、（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドを含有する組成物は、ある疾病、疾患又は症状が発生しやすく、又はその他該疾病、疾患又は症状に対してリスクがある患者に投与される。このような量は、「予防的有効量」であると定義される。この使用において、正確な量は、患者の健康状態、体重などにも依存する。このような予防的有効量を定型的な実験作業（例えば、用量漸増臨床試験）によって決定することは、当業者の能力の範囲内に十分属すると考えられる。
【０１５２】
「保護された」という用語は、ある一定の反応条件下で化学反応官能基の反応を防ぐ、「保護基」又は部分の存在を指す。保護基は、保護されている化学的反応基の種類に応じて、変化し得る。例えば、化学的反応基がアミン又はヒドラジドであれば、保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）及び９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）の群から選択することが可能である。化学的反応基がチオールであれば、保護基は、オルトピリジルジスルフィドとすることが可能である。化学的反応基が、酪酸若しくはプロピオン酸などのカルボン酸又はヒドロキシル基であれば、保護基は、ベンジルとすることができ、又はメチル、エチル若しくはｔｅｒｔ−ブチルなどのアルキル基とすることが可能である。本分野で公知の他の保護基は、本明細書に記載されている方法及び組成物中で、又は該組成物とともに使用することもできる。
【０１５３】
単なる例示として、ブロッキング／保護基は、
【０１５４】
【化４】
2008507280.tif 000005
から選択され得る。
【０１５５】
他の保護基は、「Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ３ｒｄ  Ｅｄ．  ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  １９９９」に記載されている、その内容全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。
【０１５６】
治療的な適用では、（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドを含有する組成物は、疾病、症状又は疾患に既に罹患している患者に、該疾病、疾患又は症状の症候を治癒し、又は少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で投与される。このような量は、「治療的有効量」であると定義され、疾病、疾患又は症状の重度及び経過、以前の治療、患者の健康状態及び薬物に対する応答、並びに担当医の判断に依存するであろう。このような治療的有効量を定型的な実験作業（例えば、用量漸増臨床試験）によって決定することは、当業者の能力の範囲内に十分属すると考えられる。
【０１５７】
「治療する」という用語は、予防的及び／又は治療的処置の何れかを表すために使用される。
【０１５８】
別段の記載がなければ、当業者の通常の技術知識の範疇に属する、質量分析計、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術及び薬理学の慣用法が使用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１５９】
Ｉ．序論
本発明において有用であり得るＢＳＰ又はこれらの断片の非限定的な例には、以下のものが含まれる。特定のＢＳＰ又は任意のタンパク質の活性の一部又は全部を保持する他のバリアント、類縁体、断片及び／又は類縁体断片も、本発明の実施形態に有用であり得ることを理解すべきである。
【０１６０】
本発明において有用なポリペプチドの代表的な非限定的クラスには、以下の治療的カテゴリーに属するものが含まれる。：副腎皮質刺激ホルモンペプチド、アドレノメデュリンペプチド、アラトスタチンペプチド、アミリンペプチド、アミロイドβタンパク質断片ペプチド、アンギオテンシンペプチド、抗生物質ペプチド、抗原性ポリペプチド、抗微生物ペプチド、アポトーシス関連ペプチド、心房性ナトリウム利尿ペプチド、嚢細胞ペプチド、ボンベシンペプチド、骨ＧＬＡペプチド、ブラジキニンペプチド、脳ナトリウム利尿ペプチド、Ｃ−ペプチド、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド、カルシトニンペプチド、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、ＣＡＲＴペプチド、キャスモルフィンペプチド、走化性ペプチド、コレシストキニンペプチド、コロニー刺激因子ペプチド、コルチコトロピン放出因子ペプチド、コルチスタチンペプチド、サイトカインペプチド、デルモルフィンペプチド、ダイノルフィンペプチド、エンドルフィンペプチド、エンドセリンペプチド、ＥＴａ受容体アンタゴニストペプチド、ＥＴｂ受容体アンタゴニストペプチド、エンケファリンペプチド、フィブロネクチンペプチド、ガラニンペプチド、ガストリンペプチド、グルカゴンペプチド、Ｇｎ−ＲＨ関連ペプチド、成長因子ペプチド、成長ホルモンペプチド、ＧＴＰ結合タンパク質断片ペプチド、グアニリンペプチド、インヒビンペプチド、インシュリンペプチド、インターロイキンペプチド、ラミニンペプチド、レプチンペプチド、ロイコキニンペプチド、乳汁分泌ホルモン放出ホルモンペプチド、マストパランペプチド、肥満細胞脱顆粒ペプチド、メラニン細胞刺激ホルモンペプチド、モルフィセプチンペプチド、モチリンペプチド、ニューロペプチド、ニューロペプチドＹペプチド、神経向性因子ペプチド、オレキシンペプチド、オピオイドペプチド、オキシトシンペプチド、ＰＡＣＡＰペプチド、パンクレアスタチンペプチド、膵臓ポリペプチド、副甲状腺ホルモンペプチド、副甲状腺ホルモン関連ペプチド、ペプチドＴペプチド、プロラクチン放出ペプチド、ペプチドＹＹペプチド、レニン基質ペプチド、セクレチンペプチド、ソマトスタチンペプチド、サブスタンスＰペプチド、タキキニンペプチド、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンペプチド、トキシンペプチド、バソアクティブ・インテスティナル・ペプチド、バソプレッシンペプチド及びウイルス関連ペプチド、（米国特許第６，８５８，５８０号参照）。
【０１６１】
ポリペプチドの例には、バソプレッシン、オキシトシン、メラニン細胞刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、成長ホルモンなどの下垂体ホルモン；成長ホルモン放出因子、コルチコトロピン放出因子、プロラクチン放出ペプチド、生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン及びその関連ペプチド、黄体形成ホルモン放出ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、オレキシン及びソマトスタチンなどの視床下部ホルモン；カルシトニン、カルシトニン前駆体及びカルシトニン遺伝子関連ペプチドなどの甲状腺ホルモン；副甲状腺ホルモン及びそれらの関連タンパク質；インシュリン及びインシュリン様ペプチド、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド、アミリン、ペプチドＹＹ及びニューロペプチドＹなどの膵臓ホルモン；ガストリン、ガストリン放出ペプチド、ガストリン抑制ペプチド、コレシストキニン、セクレチン、モチリン及バソアクティブ・インテスティナル・ペプチドなどの消化ホルモン；心房性ナトリウム利尿ペプチド、脳ナトリウム利尿ペプチド及びＣ型ナトリウム利尿ペプチドなどのナトリウム利尿ペプチド；ニューロキニンＡ、ニューロキニンＢ及びサブスタンスＰなどのニューロキニン；レニン基質及び阻害剤並びにアンギオテンシンなどのレニン関連ペプチド；ビッグエンドセリン、エンドセリンＡ受容体アンタゴニスト及びサラフォトキシンペプチドを含むエンドセリン；並びにアドレノメデュリンペプチド、アラトスタチンペプチド、アミロイドβタンパク質断片、抗生物質及び抗微生物ペプチド、アポトーシス関連ペプチド、嚢細胞ペプチド、ボンベシン、骨Ｇｌａタンパク質ペプチド、ＣＡＲＴペプチド、走化性ペプチド、コルチスタチンペプチド、フィブロネクチン断片及びフィブリン関連ペプチド、ＦＭＲＦ及び類縁体ペプチド、ガラニン及び関連ペプチド、成長因子及び関連ペプチド、Ｇ治療ペプチド結合タンパク質断片、グアニリン及びウログアニリンインヒビンペプチドインターロイキンおよびインターロイキン受容体タンパク質、ラミニン断片、レプチン断片ペプチド、ロイコキニン、肥満細胞脱顆粒ペプチド、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド、パンクレアスタチン、ペプチドＴ、ポリペプチド、ウイルス関連ペプチド、シグナル伝達試薬、トキシンなどのその他のペプチド並びにアジュバントペプチド類縁体、α接合因子、抗不整脈ペプチド、抗凍結ポリペプチド、食欲減退ペプチド、ウシ松果体抗生殖ペプチド、ブルシン（ｂｕｒｓｉｎ）、Ｃ３ペプチドＰ１６、腫瘍壊死因子、カドヘリンペプチド、クロモグラニンＡ断片、避妊（ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｖｅ）テトラペプチド、コナントキンＧ、コナントキンＴ、甲殻類心臓作用ペプチド、Ｃ−テロペプチド、シトクロムｂ５８８ペプチド、デコルシン、美味ペプチド（ｄｅｌｉｃｉｏｕｓ  ｐｅｐｔｉｄｅ）、デルタ睡眠誘発ペプチド、ジアゼンパム結合阻害剤断片、酸化窒素合成酵素遮断ペプチド、ＯＶＡペプチド、血小板カルパイン阻害剤（Ｐ１）、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１、リジン（ｒｉｇｉｎ）、統合失調症関連ペプチド、血清胸腺因子、ナトリウムカリウムＡ治療ペプチダーゼ阻害剤−１、スペルアクト、精子活性化ペプチド、システミン、トロンビン受容体アゴニスト、胸腺液性γ２因子、チモペンチン、チモシンα１、胸腺因子、タフトシン、脂質動員ホルモン、尿毒性ペンタペプチド、グルコース依存性インシュリン分泌刺激ポリペプチド（ＧＩＰ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−１）エキセンディン−３、エキセンディン−４及びその他の治療用ペプチド又はその断片などの分離不能なペプチド。ペプチドのさらなる例には、グレリン、オピオイドペプチド（キャソモルフィンペプチド、デモルフィン、エンドルフィン、エンケファリン、デルトルフィン、ダイノルフィン並びにこれらの類縁体及び誘導体）、胸腺ペプチド（チモポエチン、チムリン、チモペンチン、チモシン、胸腺液性因子（ＴＨＦ）、細胞付着ペプチド、補体阻害剤、トロンビン阻害剤、トリプシン阻害剤、α−１アンチトリプシン、ウニ精子活性化ペプチド、ＳＨＵ−９１１９  ＭＣ３−Ｒ及びＭＣ４−Ｒアンタゴニスト、グラスピモド（細菌感染、真菌感染、免疫不全免疫疾患、白血球減少症に対して有用な免疫刺激因子）、ＨＰ−２２８（化学療法によって誘導される嘔吐、毒性、痛み、糖尿病炎症、関節リウマチ、肥満に対して有用なメラノコルチン）、α２−プラスミン阻害剤（プラスミン阻害剤）、ＡＰＣ腫瘍抑制因子（ネオプラズムに対して有用な腫瘍抑制因子）、初期妊娠因子（免疫抑制物質）、エンドゼピンジアゼパム結合阻害剤（受容体ペプチド）、γインターフェロン（白血病に対して有用）、腺カリクレイン−１（免疫刺激因子）、胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤、サルコレシン（ｓａｒｃｏｌｅｃｉｎ）結合タンパク質、界面活性剤プロテインＤ、ウィルムの腫瘍抑制因子、ＧＡＢＡＢ  １ｂ受容体ペプチド、プリオン関連ペプチド（ｉＰｒＰ１３）、コリン結合タンパク質断片（細菌関連ペプチド）、テロメラーゼ阻害剤、カルジオスタチンペプチド、エンドスタチン由来ペプチド（血管新生阻害剤）、プリオン阻害ペプチド、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体アンタゴニスト、Ｃ−ペプチド類縁体（糖尿病合併症に対して有用）、ＲＡＮＴＥＳ、ＮＴＹ受容体、ＮＰＹ２−Ｒ（ニューロペプチドＹ２型受容体）リガンド、ＮＣ４Ｒペプチド又はこれらの断片が含まれる。米国特許第６，８４９，７１４号（参照によって本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。
【０１６２】
インシュリン分泌を制御するホルモンは、腸内での栄養素の存在及び吸収に応じて胃腸粘膜から放出され、インシュリンの早期及び強化された放出を促進するホルモン群を表す、いわゆる腸膵島軸（ｅｎｔｅｒｏｉｎｓｕｌａｒ  ａｘｉｓ）に属する。インシュリン分泌に対する強化効果（いわゆるインクレチン効果）は、おそらく、正常な耐糖能にとって不可欠である。ガストリン及びセクレチンを含む胃腸ホルモンの多く（コレシストキニンは、ヒトでは、インシュリン分泌促進性でない。）は、インシュリン分泌促進性であるが、生理的に重要な唯一のもの（インクレチン効果にとって必要なもの）は、グルコース依存性インシュリン分泌促進ポリペプチド、ＧＩＰ及びグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）である。
【０１６３】
ＧＩＰは、１５３アミノ酸前駆体からプロセッシングされる４２アミノ酸から構成される（Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ（１９８７）８４：７００５−７００８）。ＧＩＰは、炭水化物及び脂質含有食物に応答して、十二指腸中及び小腸粘膜中に存在するＫ細胞によって分泌される（Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｎ．  ＮＹ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（２０００）  ９２１：４６９−４７２）。膵島、副腎皮質、腸、心臓、脂肪組織、脳の幾つかの領域及び下垂体中で、ＧＩＰ受容体の発現が示されている（Ｕｓｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３３：２８６１−２８７０）。
【０１６４】
そのインシュリン分泌促進効果のため、１９７３年に単離されたＧＩＰ（Ｐｅｄｅｒｓｏｎ  ＲＡ．Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，  Ｉｎ  Ｗａｌｓｈ  ＪＨ，  Ｄｏｃｋｒａｙ  ＧＪ（ｅｄｓ．）  Ｇｕｔ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９４，  ｐｐ．  ２１７−２５９）は、糖尿病学者の間で、直ちに大きな関心を集めた。しかしながら、後年実施された数多くの調査によって、ＧＩＰの分泌欠損がインシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）又は非インシュリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の発病に関わっていないことが明確に示された（Ｋｒａｒｕｐ  Ｔ．，  Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ  １９８８；  ９：１２２−１３４）。さらに、インシュリン分泌促進ホルモンとして、ＧＩＰは、ＮＩＤＤＭにおいてほとんど効果がないことが明らかとなった（Ｋｒａｒｕｐ  Ｔ．，  Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ  １９８８；  ９：１２２−１３４）。他のインクレチンホルモンＧＬＰ−１は、知られている最も強力なインシュリン分泌促進物質である（Ｏ’ｒｓｋｏｖ  Ｃ，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  １９９２；  ３５：７０１−７１１）。ＧＩＰとは異なり、ＮＩＤＤＭ患者においてインシュリン分泌を刺激する上で驚くほど効果的である。さらに、他のインシュリン分泌促進ホルモンとは異なり（おそらく、セクレチンは例外である。）、ＧＩＰは、グルカゴン分泌も強力に阻害する。これらの作用のために、ＧＩＰは、特に、ＮＩＤＤＭ患者において、顕著な血糖低下効果を有する。
【０１６５】
ＧＬＰ−１（プログルカゴン遺伝子の産物（Ｂｅｌｌ  ＧＩ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  １９８３；  ３０４：３６８−３７１）は、ペプチドのセクレチン−ＶＩＰファミリーのメンバーの１つであり、グルコース代謝並びに胃腸分泌及び代謝において制御機能を有する重要な腸ホルモンとして確立されている（Ｈｏｉｓｔ  ＪＪ．，  １９９４；  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １９９４  Ｄｅｃ；１０７（６）：１８４８−５５）。グルカゴン遺伝子は、膵臓と腸では、異なるプロセッシングを受ける。膵臓では（Ｈｏｉｓｔ  ＪＪ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  １９９４；  ２６９：１８８２７−１８８３３）、プロセッシングが、１）グルカゴンそのもの（プログルカゴン（ＰＧ）の３３−６１位を占める。）；２）しばしば、グリセンチン関連膵臓ペプチドＧＲＰＰと称される３０アミノ酸のＮ末端ペプチド（ＰＧ（１−３０））（Ｍｏｏｄｙ  ＡＪ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  １９８１；  ２８９：５１４−５１６；  Ｔｈｉｍ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９８２；  ７０３：１３４−１４１）；３）ＰＧ（６４−６９）に対応するヘキサペプチド；４）最後に、２つのグルカゴン様配列が埋め込まれているいわゆる主要プログルカゴン断片（ＰＧ（７２−１５８））（Ｈｏｉｓｔ  ＪＪ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  １９９４；  ２６９：１８８２７−１８８３３）の形成及び平行する分泌をもたらす。グルカゴンは、唯一の生物活性産物であるように思われる。これに対して、腸粘膜では、より大きな分子中に埋め込まれているのはグルカゴンであるが、２つのグルカゴン様ペプチドは別個に形成される（Ｏ’ｒｓｋｏｖ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １９８６；  １１９：１４６７−１４７５）。以下の産物が、平行して、形成され、分泌される。１）グリセンチン、ＰＧ（１−６９）に対応し、グルカゴン配列が残基３３−６１を占め（Ｔｈｉｍ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｇｕｌ  Ｐｅｐｔ  １９８１；２：１３９−１５１）；２）ＧＬＰ−ｌ（７−３６）アミド（ＰＧ（７８−１０７））アミド（Ｏ’ｒｓｋｏｖ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９８９；  ２６４：１２８２６−１２８２９）、当初考えられていた不活性なＰＧ（７２−１０７）アミド又は１０８ではない。Ｃ末端がグリシン伸長されているが同様に生物活性なＧＬＰ−１（７−３７）（ＰＧ（７８−１０８））の少量も形成される（Ｏ’ｒｓｋｏｖ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １９９１；  ４３：５３５−５３９）；３）介在ペプチド−２（ＰＧ（１１１−１２２）アミド（Ｂｕｈｌ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９８８；２６３：８６２１−８６２４）；及び４）ＧＬＰ−２（ＰＧ（１２６−１５８））（Ｂｕｈｌ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９８８；  ２６３：８６２１−８６２４；  Ｏ’ｒｓｋｏｖ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ，  １９８９；  ２４７：１９３−１０６）。グリセンチンの一部は、さらに、ＧＲＰＰ（ＰＧ（１−３０））及びオキシントモデュリン（ＰＧ（３３−６９））へと切断される（Ｈｏｉｓｔ  ＪＪ��  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  １９８０；  １８７：３３７−３４３；  Ｂａｔａｉｌｌｅ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  １９８２；  １４６：７９−８６）。これらのペプチドのうち、ＧＬＰ−１が、最も顕著な生物活性を有する。
【０１６６】
グリセンチン／エンテログルカゴンと平行して分泌されるので、エンテログルカゴン分泌の多くの研究（Ｈｏｌｓｔ  ＪＪ．，  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １９８３；  ８４：１６０２−１６１３；  Ｈｏｉｓｔ  ＪＪ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｌｕｃａｇｏｎ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｐｒｏｇｌｕｃａｇｏｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  Ｉｎ  Ｗａｌｓｈ  ＪＨ，  Ｄｏｃｋｒａｙ  ＧＪ，  ｅｄｓ．  Ｇｕｔ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．  ３０５−３４０，  １９９３）は、ある程度、ＧＬＰ−１分泌にも当てはまるが、ＧＬＰ−１は、より迅速に代謝され、ヒトでの血漿半減期は２分である（Ｏ’ｒｓｋｏｖ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １９９３；  ４２：６５８−６６１）。炭水化物又は脂質が豊富な食物は、おそらく、未吸収の栄養素が腸粘膜の開放型Ｌ細胞の微絨毛と直接相互作用する結果として、分泌を刺激する（Ｅｌｌｉｏｔｔ  ＲＭ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １９９３；  １３８：１５９−１６６）。ＧＬＰ−１分泌を促進する内分泌又は神経機序が存在し得るが、ヒトでは、未だ実証されていない。
【０１６７】
ＧＬＰ−１（２９−３１）のインクレチン機能は、ＧＬＰ−１受容体アンタゴニストであるエキセンディン３−３９（ラットで、経口グルコースによって惹起されるインクレチン効果を劇的に抑制する。）を用いた実験で明確に示されている（Ｋｏｌｌｉｇｓ  Ｆ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １９９５  ４４：１６−１９  ；  Ｗａｎｇ  Ｚ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  １９９５  ９５：４１７−４２１）。ホルモンは、Ｇタンパク質共役型７回膜貫通受容体のグルカゴン／ＶＩＰ／カルシトニンファミリーに属するＧＬＰ−１受容体を介して、β細胞と直接相互作用する（Ｔｈｏｒｅｎｓ  Ｂ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １９９２；  ８９：８６４１−４６４５、米国特許第５，６７０，３６０号及び第６，０５１，６８９号、参照により、本明細書に組み込まれる。）。ＧＬＰ−１受容体遺伝子の標的化された破壊がマウスで行われた最近の実験で、インシュリン分泌制御におけるＧＬＰ−１受容体の重要性が示された。この破壊に対してホモ接合の動物は、大幅に損なわれた耐糖能及び絶食時高血糖を有し、ヘテロ接合動物でさえ、耐糖能障害であった（Ｓｃｒｏｃｃｈｉ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １９９６；  ４５：２１Ａ）。シグナル伝達機序（Ｆｅｈｍａｎｎ  ＨＣ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  １９９５；  １６：３９０−４１０）は、主に、アデニル酸シクラーゼの活性化を伴うが、細胞内Ｃａ２＋の上昇も不可欠である（Ｆｅｈｍａｎｎ  ＨＣ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  １９９５；  １６：３９０−４１０；  Ｇｒｏｍａｄａ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １９９５；  ４４：７６７−７７４）。ＧＬＰ−１受容体−リガンド相互作用のモデルは、「Ｌｏｐｅｚ  ｄｅ  Ｍａｔｕｒａｎａ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８，  １０１９５−１０２００」中に示されている。Ｌｏｐｅｚ  ｄｅ  Ｍａｔｕｒａｎａらは、受容体のＮ末端ドメインが、エキセンディン−４、ＧＬＰ−１及びエキセンデｌン（９−３９）の中央螺旋の保存された面に結合する。エキセンディン−４及びＧＬＰ−１のＮ末端領域は、ＧＬＰ−１Ｒの細胞外ループ及び／又は膜貫通領域と相互作用する。受容体のＮ末端ドメインも、エキセンディン−４及びエキセンディン（９−３９）のＴｒｐケージ部分と相互作用する。「Ｎｅｉｄｉｇｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）  ９（６）：４２５−４３０」は、エキセンディン−４及びその変異体のＴｒｐケージ構造を記載している。
【０１６８】
このホルモンの作用は、グルコースによって刺激されたインシュリン放出の強化として最も詳しく記載されているが（Ｆｅｈｍａｎｎ  ＨＣ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  １９９５；  １６：３９０−４１０）、グルコースとＧＬＰ−１刺激を連結させる機序は不明である。この機序は、カルシウムによって誘導されるカルシウム放出（Ｇｒｏｍａｄａ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １９９５；  ４４：７６７−７７４；  ＨｏＩｚ  ＧＧ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  １９９６；  ２７０：１７７４９−１７７５９）を伴う可能性がある。既に述べたように、ＧＬＰ−１のインシュリン分泌促進作用は、糖尿病Ｐ細胞中に保持されている。単離されたインシュリン分泌細胞に「グルコース応答能（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ）」を伝える能力に対する後者の関係（Ｇｒｏｍａｄａ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １９９５，  ４４：７６７−７７４；  ＨｏＩｚ  ＧＧ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  １９９３，  ３６１：３６２−３６５）（グルコース又はＧＬＰ−１単独に対する応答は乏しいが、両者の組み合わせに対しては完全に応答する。）も、不明である。しかしながら、同等に重要なことに、このホルモンは、グルカゴン分泌も強力に阻害する（Ｏ’ｒｓｋｏｖ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １９８８；  １２３：２００９−２０１３）。この機序は不明であるが、隣接するインシュリン又はソマトスタチン細胞を介した、傍分泌であるように思われる（Ｆｅｈｍａｎｎ  ＨＣ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  １９９５；  １６：３９０−４１０）。グルカゴン静止作用は、血中グルコースが減少するにつれて阻害効果が減少するように、グルコース依存性である。この二重効果のために、血漿ＧＬＰ−１濃度が、増加した分泌又は外来注入の何れかによって増加すれば、門脈循環を介して肝臓に到達する血中グルカゴンに対するインシュリンのモル比は大幅に増加し、これにより、肝臓のグルコース産生が減少する（Ｈｖｉｄｂｅｒｇ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  １９９４；  ４３：１０４−１０８）。その結果、血中グルコース濃度が減少する。インシュリン分泌促進及びグルカゴン静止作用のグルコース依存性のために、グルコース低下効果は自己限定的であり、従って、ホルモンは、用量にかかわらず、低血糖を引き起こさない（Ｑｕａｌｍａｎｎ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔａ  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉｃａ，  １９９５；  ３２：１３−１６）。代謝調節の不良及びスルホニル尿素に対する二次的不全に関わらず、ＧＬＰ−１の僅かに生理的用量を上回る用量の注入が血中グルコース値を完全に正常化し得る糖尿病患者では（Ｎａｕｃｋ  ＭＡ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  １９９３；  ３６：７４１−７４４）、効果が保全される（Ｎａｕｃｋ  ＭＡ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９３；  ９１：３０１−３０７）。グルカゴン静止効果の重要性は、ＧＬＰ−１も、残存Ｐ細胞分泌能を持たないＩ型糖尿病患者で血中グルコースを低下させるという知見によって示されている（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ  Ｗ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄ��ａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  １９９６；  １９：５８０−５８６）。
【０１６９】
ＧＬＰ−１は、β細胞塊の増加並びにβ細胞分化、β細胞増殖及びβ細胞生存の制御に関わっており（Ｓｔｏｆｆｅｒｓ  ＤＡ，  Ｈｏｒｍ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｓ．２００４  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；３６（ｌ１−１２）：８１１−２１）、プロインシュリン遺伝子転写及び生合成を増加させる役割を有する。
【０１７０】
膵島に対するその効果に加えて、ＧＬＰ−１は、胃腸管に対して強力な作用を有する。生理的量で注入されると、ＧＬＰ−１は、ペンタガストリンによって誘導される胃酸分泌及び食物によって誘導される胃酸分泌を強力に阻害する（Ｓｃｈｊｏｌｄａｇｅｒ  ＢＴＧ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｇ．  Ｄｉｓ．  Ｓｃｉ．  １９８９；  ３５：７０３−７０８；  Ｗｅｔｔｅｒｇｒｅｎ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｇ  Ｄｉｓ  Ｓｃｉ  １９９３；  ３８：６６５−６７３）。ＧＬＰ−１は、胃内容排出速度及び膵臓酵素分泌も阻害する（Ｗｅｔｔｅｒｇｒｅｎ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｇ  Ｄｉｓ  Ｓｃｉ  １９９３；  ３８：６６５−６７３）。胃及び膵臓分泌及び運動に対する同様の阻害効果は、炭水化物含有又は脂質含有溶液で回腸を灌流すると、ヒトで惹起され得る（Ｌａｙｅｒ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｇ  Ｄｉｓ  Ｓｃｉ  １９９５；  ４０：１０７４−１０８２；  Ｌａｙｅｒ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  １９９３；  ５４：３８５−３８６）。同時に、ＧＬＰ−１分泌は大幅に刺激され、ＧＬＰ−１は、このいわゆる「理想的ブレーキ」効果にとって少なくとも部分的に必要であり得ると推測されている（Ｌａｙｅｒ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  １９９３；  ５４：３８５−３８６）。実際、最近の研究は、生理的に、ＧＬＰ−１の理想的ブレーキ効果が膵島に対するその効果よりさらに重要であり得ることを示唆している。このように、用量応答研究では、ＧＬＰ−１は、膵島分泌に影響を与えるのに必要とされる注入速度より少なくとも遅い注入速度で、胃内容排出速度に影響を及ぼす（Ｎａｕｃｋ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｕｔ  １９９５；  ３７（ｓｕｐｐｌ．  ２）：Ａ１２４）。
【０１７１】
ＧＬＰ−１は、食物摂取に対する効果を有するように思われる、ＧＬＰ−１の室内投与は、ラットにおける食物摂取を顕著に阻害する（Ｓｃｈｉｃｋ  ＲＲ，  ｖｏｒｍ  Ｗａｌｄｅ  Ｔ，  Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ＪＰ，  Ｓｃｈｕｓｄｚｉａｒｒａ  Ｖ，  Ｃｌａｓｓｅｎ  Ｍ．  Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  １−  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｂｒａｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｉｔｓｃｈｕｎｅｉｔ  Ｈ，  Ｇｒｉｅｓ  ＦＡ，  Ｈａｕｎｅｒ  Ｈ，  Ｓｃｈｕｓｄｚｉａｒｒａ  Ｖ，  Ｗｅｃｈｓｌｅｒ  ＪＧ（ｅｄｓ．）  Ｏｂｅｓｉｔｙ  ｉｎ  Ｅｕｒｏｐｅ．  Ｊｏｈｎ  Ｌｉｂｂｅｙ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｔｄ．，  １９９４；  ｐｐ．  ３６３−３６７；  ４２）。この効果は、高度に特異的であるように思われる。このため、Ｎ末端が伸長されたＧＬＰ−１（ＰＧ７２−１０７）アミドは不活性であり、ＧＬＰ−１アンタゴニスト、エキセンディン９−３９の適切な量はＧＬＰ−１の効果を消失させる。ＧＬＰ−１の急性末梢投与は、ラットにおいて、即時に食物摂取を阻害しない（Ｔｕｒｔｏｎ  ＭＤ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  １９９６；  ３７９：６９−７２）。しかしながら、腸のＬ細胞から分泌されたＧＬＰ−１は、飽満シグナルとしても作用し得る可能性が残る。
【０１７２】
ＧＬＰ−１のインシュリン分泌促進効果のみならず、胃腸管に対するＧＬＰ−１の効果は、糖尿病患者において保存されており（Ｗｉｌｌｍｓ  Ｂ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  １９９４；  ３７，  ｓｕｐｐｌ．１：Ａｌ１８）、食物によって誘導されるグルコースの逸脱を削減するのに役に立ち得るが、より重要なことには、食物摂取に対しても影響を与え得る。１週間連続して、４ｎｇ／ｋｇ／分で、ＧＬＰ−１が静脈内投与されると、著しい副作用なしに、ＮＩＤＤＭ患者で、血糖調節を劇的に改善することが示されている（Ｌａｒｓｅｎ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １９９６；  ４５，  ｓｕｐｐｌ．  ２：２３３Ａ）。ペプチドは、皮下投与後に完全に活性であるが（Ｒｉｔｚｅｌ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  １９９５；  ３８：７２０−７２５）、主に、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ様酵素による分解のために急速に分解される（Ｄｅａｃｏｎ  ＣＦ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  １９９５；  ８０：９５２−９５７；  Ｄｅａｃｏｎ  ＣＦ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４４：１１２６−１１３１）。
【０１７３】
ＧＬＰ−１のアミノ酸配列は、「Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ２８  ７０４−７０７（１９８５）」に開示されている。ヒトＧＬＰ−１は、とりわけ、遠位回腸、膵臓及び脳内のＬ細胞中で合成される、プレプログルカゴンから生じる３０−３１アミノ酸残基のペプチドである。プレプログルカゴンの、ＧＬＰ−１（７−３６）アミド、ＧＬＰ−１（７−３７）及びＧＬＰ−２のプロセッシングは、主に、Ｌ細胞中で起こる。ＧＬＰ−１（７−３７）及びその類縁体の興味深い薬理学的特性が、近年、大きな注意を惹きつけてきたが、これらの分子の構造についてはほとんど知られていない。ミセル中でのＧＬＰ−１の二次構造が、「Ｔｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：３５３２−３５３９（１９９４））によって記載されているが、通常の溶液中では、ＧＬＰ−１は、極めて柔軟な分子であると考えられている。この比較的小さく、極めて柔軟な分子の誘導化は、その血漿特性が極めて延長され、保持された活性をなお有する化合物をもたらした。
【０１７４】
ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−１の類縁体並びにこれらの断片は、特に、１型糖尿病及び２型糖尿病並びに肥満の治療において有用である。
【０１７５】
ＷＯ８７／０６９４１号は、ＧＬＰ−１（７−３７）を含むＧＬＰ−１断片及びその機能的誘導体並びにインシュリン分泌促進剤としてのこれらの使用を開示する。ＧＬＰ−１（７−３７）、そのある種の誘導体及び哺乳動物における糖尿病を治療するためのこれらの使用は、米国特許第５，１２０，７１２号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に開示されている。
【０１７６】
ＷＯ９０／１１２９６号は、ＧＬＰ−１（７−３６）を含むＧＬＰ−１断片及びＧＬＰ−１（１−３６）又はＧＬＰ−１（１−３７）のインシュリン分泌促進活性を超えるインシュリン分泌促進活性を有するこれらの機能的誘導体、並びにインシュリン分泌促進剤としてのこれらの使用を開示する。
【０１７７】
ＧＬＰ−１（７−３６）及びＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ酸配列は、（配列番号１及び配列番号２）：Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｘ（ＧＬＰ−１（７−３６）の場合、ＸはＮＨ２であり、ＧＬＰ−１（７−３７）の場合、ＸはＧｌｙである。）。
【０１７８】
ＷＯ９１／１１４５７号は、ＧＬＰ−１部分としても有用であり得る活性なＧＬＰ−１ペプチド７−３４、７−３５、７−３６及び７−３７の類縁体を開示している。
【０１７９】
ＥＰ０７０８１７９−Ａ２（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ＆Ｃｏ．）は、Ｎ末端イミダゾール基を含み、３４位のリジン残基に付着された非分岐Ｃ６−Ｃ１０アシル基を必要に応じて含むＧＬＰ−１類縁体及び誘導体を開示している。
【０１８０】
ＥＰ０６９９６８６−Ａ２（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ＆Ｃｏ．）は、生物活性であると報告されている、ある種のＧＬＰ−１のＮ末端切断断片を開示している。
【０１８１】
ペプチドの別の例は、ＨＩＶ−１ＬＡＩ膜貫通タンパク質（ＴＭ）ｇｐ４１のアミノ酸６３８ないし６７３に対応するペプチド（ｇｐ４１の細胞外部分のカルボキシ末端ヘリックスセグメント）であるＴ−２０（ＤＰ−１７８）である。ｇｐ４１の細胞外部分は、提案されたアミノ末端ジッパードメインであるＤＰ−１０７である別のαヘリックス領域を有する。ＤＰ−１０７は、ウイルス融合を阻害することによって、強力な抗ウイルス活性を示す。ＤＰ−１０７は、ＨＩＶ−１ＬＡＩ膜貫通ｇｐ４１タンパク質の残基５５８ないし５９５に対応する３８アミノ酸ペプチドである。ＤＰ−１０７を用いた研究は、インビトロ研究及び動物の何れにおいても無毒であることを証明した。米国特許第５，６５６，４８０号（参照により、本明細書に組み込まれる。）は、ＤＰ−１０７及びその抗ウイルス活性を記載している。
【０１８２】
Ｔ−２０は、ウイルス融合阻害剤として作用することによって、ＨＩＶの細胞中への侵入を阻害する。ＨＩＶの融合プロセスは、十分に特徴付けられている。ＨＩＶは、ｇｐ１２０を介してＣＤ４受容体に結合し、その受容体に結合すると、ｇｐ１２０は一連の立体構造の変化を経て、この構造変化によって、ｇｐ１２０はその共受容体ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４に結合することが可能となる。受容体及び共受容体の両方に結合した後、ｇｐ１２０は、ｇｐ４１を露出して、融合プロセスを開始する。ｇｐ４１は、ヘプタッドリピート１及び２（ＨＲ１及び２）と名付けられた２つの領域を有する。ＨＲ１として同定された細胞外ドメインは、提案されたジッパードメインのアミノ末端であるαヘリックス領域である。ＨＲ１は、ｇｐ４１のＨＲ２と一緒になって、ヘアピンを形成する。形成される構造は、ＨＩＶエンベロープを細胞膜の近くに配置して、２つの膜の間に融合を引き起こす６−ヘリックスバンドルである。Ｔ−２０は、ｇｐ４１膜貫通糖タンパク質の第一のヘプタッドリピート（ＨＲ１）を結合することによってウイルス融合に必要とされる立体構造の変化を妨げる。このため、６−ヘリックスバンドルの形成は、Ｔ−２０がｇｐ４１のＨＲ１領域に結合することによって妨害される。ＨＩＶ  ｇｐ４１タンパク質のＤＰ１０７及びＤＰ１７８ドメイン（すなわち、ＨＲ１及びＨＲ２ドメイン）の互いに非共有結合的な複合体及びこれらの相互作用が、ウイルスの正常な感染性のために必要とされる。ＤＰ１０７とＤＰ１７８間及び／又はＤＰ１０７様とＤＰ１７８様ペプチド間の相互作用を破壊する化合物は、融合抑制性である（抗ウイルスを含む。）。
【０１８３】
ＤＰ−１７８は、ＨＩＶ−１によって媒介されるＣＤ４＋細胞−細胞融合（すなわち、合胞体の形成）及び無細胞ウイルスによるＣＤ４＋細胞の感染の強力な阻害剤として作用する。このような抗レトロウイルス活性には、未感染ＣＤ４＋細胞へのＨＩＶ伝達の阻害が含まれるが、これに限定されない。ＤＰ−１７８は低濃度で作用し、インビトロ研究及び動物の何れにおいても無毒であることが明らかとなっている。ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２の対応する領域であるＤＰ−１７８内のアミノ酸保存が記載されている。
【０１８４】
ＨＩＶ伝達に伴う融合現象の阻害で使用するために、ＤＰ−１７８ペプチドを使用する可能性が、米国特許第５，４６４，９３３号及び第６，１１３，４１８号並びに米国特許第６，７５０，００８号及び第６，８２４，７８３号に記載されている（全て、参照により、本明細書中に組み込まれる。）。
【０１８５】
抗ウイルス活性を示し、及び／又は抗膜融合能力を示し、若しくはＨＩＶ−１以外のレトロウイルス及びレトロウイルスでないウイルス中でコイルドコイルペプチド構造を伴う細胞内プロセスを調節する能力を示すＤＰ１７８及びＤＰ−１０７の一部、相同体及び類縁体並びにＤＰ１７８／ＤＰ１０７、ＤＰ１７８様／ＤＰ１０７様又はＨＲ１／ＨＲ２相互作用の調節物質が調査されている。このような研究におけるウイルスには、サル免疫不全ウイルス（米国特許第６，０１７，５３６号）、呼吸器合胞体ウイルス（米国特許第６，２２８，９８３号；第６，４４０，６５６号；第６，４７９，０５５号；第６，６２３，７４１号）、エプシュタイン−バールウイルス（米国特許第６，０９３，７９４号；第６，５１８，０１３号）、パラインフルエンザウイルス（米国特許第６，３３３，３９５号）、インフルエンザウイルス（米国特許第６，０６８，９７３号；第６，０６０，０６５号），及び麻疹ウイルス（米国特許第６，０１３，２６３号）が含まれる。これらは全て、参照により、本明細書に組み込まれる。
【０１８６】
ＤＰ−１７８の市販形態は、Ｆｕｚｅｏｎ（Ｒ）（エンフビルチド（ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ）、Ｒｏｃｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．及びＴｒｉｍｅｒｉｓ  ｉｎｃ．）である。Ｆｕｚｅｏｎ（Ｒ）は、アセチル化されたＮ末端を有し、Ｃ末端としてカルボキサミドを有し、以下の一次アミノ酸配列ＣＨ３ＣＯ−ＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦ−ＮＨ２によって記載されている。Ｆｕｚｅｏｎ（Ｒ）は、抗レトロウイルス治療が行われているにもかかわらず、ＨＩＶ−１複製を示すＨＩＶ−１患者中での他の抗ウイルス剤と組み合わせて使用される。
【０１８７】
米国特許第５，４６４，９３３号及び第６，８２４，７８３号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）は、ＤＰ−１７８、ＤＰ−１７８断片、類縁体及び相同体（アミノ及びカルボキシ末端の末端切断、置換、挿入、欠失、付加又は巨大分子担体基を有する分子を含むが、これらに限定されない。）並びにＤＰ−１７８分子のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端に存在する疎水性基などの化学基を有するＤＰ−１７８分子を記載する。さらなるバリアントには、米国特許第６，８３０，８９３号中に記載されているバリアント及び米国特許第６，８６１，０５９号に開示されているＤＰ−１７８の誘導体が含まれているが、これらに限定されない。Ｔ−２０ハイブリッドポリペプチドの群が、米国特許第６，６５６，９０６号、第６，５６２，７８７号、第６，３４８，５６８号及び第６，２５８，７８２号に記載されており、ＤＰ−１７８−トキシン融合物が米国特許第６，６２７，１９７号に記載されている。
【０１８８】
ＨＡＡＲＴ（高活性抗レトロウイルス療法；Ｈｉｇｈｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ａｎｔｉ−Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ）は、ウイルス負荷を減らすために、抗レトロウイルス剤の数クラスから得られる薬物を組み合わせるＨＩＶ治療の標準である。米国特許第６，８６１，０５９号（参照により、本明細書に組み込まれる。）は、逆転写酵素阻害剤（例えば、ＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄＣ、ｄｄＡ、ｄ４Ｔ、３ＴＣ又は他のジデオキシヌクレオチド又はジデオキシフルオロヌクレオシド）又はＨＩＶ−１プロテアーゼの阻害剤（例えば、インジナビル；リトナビル）などの少なくとも１つの他の抗ウイルス治療剤と組み合わせてＤＰ−１７８若しくはＤＰ−１０７又はこれらの誘導体を使用して、ＨＩＶ−１感染を治療し、ＨＩＶ−１複製を阻害する方法を開示する。他の抗ウイルス剤には、サイトカイン（例えば、ｒＩＦＮα、ｒＩＦＮβ、ｒＩＦＮγ）、ウイルスｍＲＮＡキャッピングの阻害剤（例えば、リバビリン）、ＨＩＶプロテアーゼの阻害剤（例えば、ＡＢＴ−５３８及びＭＫ−６３９）、抗ＨＩＶ活性を有する脂質結合分子としてのアムホテリシンＢ及び糖タンパク質プロセッシングの阻害剤としてのキャスタノスペルミンが含まれる。逆転写酵素阻害剤、インテグラーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、サイトカインアンタゴニスト及びケモカイン受容体調節物質を含む（これらに限定されない。）他の抗ウイルス剤の、Ｔ−２０との可能な組み合わせ療法は、米国特許第６，８５５，７２４号；第６，８４４，３４０号；第６，８４１，５５８号；第６，８３３，４５７号；第６，８２５，２１０号；第６，８１１，７８０号；第６，８０９，１０９号；第６，８０６，２６５号；第６，７６８，００７号；第６，７５０，２３０号；第６，７０６，７０６号；第６，６９６，４９４号；第６，６７３，８２１号；第６，６７３，７９１号；第６，６６７，３１４号；第６，６４２，２３７号；第６，５９９，９１１号；第６，５９６，７２９号；第６，５９３，３４６号；第６，５８９，９６２号；第６，５８６，４３０号；第６，５４１，５１５号；第６，５３８，００２号；第６，５３１，４８４号；第６，５１１，９９４号；第６，５０６，７７７号；第６，５００，８４４号；第６，４９８，１６１号；第６，４７２，４１０号；第６，４３２，９８１号；第６，４１０，７２６号；第６，３９９，６１９号；第６，３９５，７４３号；第６，３５８，９７９号；第６，２６５，４３４号；第６，２４８，７５５号；第６，２４５，８０６号；及び第６，１７２，１１０号を含む、数多くの参考文献に記載されている。
【０１８９】
ＤＰ−１７８に対する送達系となり得るものには、米国特許第６，８４４，３２４号及び第６，７０６，８９２号に記載されているものが含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、封入体中でＴ−２０を製造する方法が、米国特許第６，８５８，４１０号に記載されていた。
【０１９０】
Ｔ２０／ＤＰ１７８、Ｔ２１／ＤＰ１０７及びこれらの断片は、Ｎホルミルペプチド受容体（ＦＰＲのメンバー）と相互作用することも見出されている。Ｔ−２０は、ヒト貪食細胞中に存在するＮ−ホルミルペプチド受容体を活性化し（Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｂｌｏｏｄ  ９３（ｌｌ）：３８８５−３８９２）、単球及び好中球の化学誘引物質及び活性化因子である（米国特許第６，８３０，８９３号参照）。ＦＰＲクラス受容体は、化学誘引物質ｆＭＬＰ（Ｎ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン）を結合するＧタンパク質共役ＳＴＭ受容体であり、単球の走化性及び病原体に対する宿主免疫応答の誘導に関与している。プロトタイプＦＰＲクラス受容体ＦＰＲは、ｆＭＬＰに高い親和性で結合し、ｆＭＬＰの低濃度によって活性化される。ｆＭＬＰによるＦＰＲの結合は、Ｇタンパク質媒介シグナル伝達現象のカスケードを誘導して、貪食細胞の接着、走化性、酸素中間体の放出、増強された貪食作用及び細菌の殺傷並びにＭＡＰキナーゼ活性化及び遺伝子転写を引き起こす。（Ｋｒｕｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：９３７（１９９７）；  Ｐｒｏｓｓｎｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  ７４：７３（１９９７）；  Ｍｕｒｐｈｙ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  ｍｉｍｕｎｏ．  １２：５９３（１９９４）；及びＭｕｒｐｈｙ，  Ｔｈｅ  Ｎ−ｆｏｒｍｙｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，  Ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ｐ．  ２６９（１９９６））。別のＦＰＲクラス受容体は、ＦＰＲＬ１（ＦＰＲＨ２及びＬＸＡ４Ｒとも称される。）と命名されたＦＰＲの高度に相同なバリアントである。ＦＰＲＬ１は、当初、オーファン受容体としてクローニングされたが（Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６７：７６３７−７６４３（１９９２）；  Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  １８４：５８２−５８９（１９９２）；  Ｂａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  １３：４３７−４４０（１９９２）；  Ｇａｏ，  Ｊ．  Ｌ．  ａｎｄ  Ｐ．  Ｍ．  Ｍｕｒｐｈｙ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６８：２５３９５−２５４０１（１９９３）；  ａｎｄ  Ｎｏｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ５：１２３９−１２４９（１９９３））、その後、ｆＭＬＰの高濃度に応答して、Ｃａ２＋動員を媒介することが見出された。（Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  １８４：５８２−５８９（１９９２）；  ａｎｄ  Ｇａｏ，  Ｊ．  Ｌ．  ａｎｄ  Ｐ．  Ｍ．  Ｍｕｒｐｈｙ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６８：２５３９５−２５４０１（１９９３））。
【０１９１】
ケモカイン受容体ＣＣＲ５は、別のＧタンパク質共役ＳＴＭ受容体であり、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）の多くの初代単離株によって利用される主要な融合補因子である。（Ａｌ  Ｋｈａｔｉｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９６，  ２７２：１９５５；  Ｄｏｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １９９６，  ８５：１１４９；  Ｄｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  １９９６，  ３８１：６６１；  Ｄｒａｇｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  １９９６；  ３８１  ：６６７；  Ｈｏｒｕｋ，  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ，  ２０：８９（１９９９）；  Ｄｉｍｉｔｒｏｖ  ａｎｄ  Ｂｒｏｄｅｒ，  “ＨＩＶ  ａｎｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，”  ＨＩＶ  ａｎｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ：Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ  Ｕｎｉｔ，  Ｌａｎｄｅｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ａｕｓｔｉｎ，  Ｔｅｘ．，  １９９７：９９；  ａｎｄ  Ｂｅｒｇｅｒ，  ＡＩＤＳ  １１，  Ｓｕｐｐｌ  Ａ：Ｓ３（１９９７））。ＣＣＲ５を発現できない個体は、ＨＩＶ−１感染に対して極めて耐性がある。（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １９９６，  ８６：３６７−７７；  Ｈｕａｎｇ，  Ｙ，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９６，  ２：１２４０；  Ｄｅａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７３：１８５６（１９９６））。ＨＩＶ融合及び侵入におけるその重要な役割のため、研究者は、ＨＩＶ−１エンベロープとＣＣＲ５の間の相互作用を崩壊させる分子の開発に対して多くの研究を集中させてきた。例えば、ＣＣＲ５に対して特異的なケモカインリガンド及び抗体は、ＨＩＶ−１侵入及び複製を阻害することが示されている。（Ｃｏｃｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７０：１８１１（１９９５）；  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，  １８６：３７３（１９９７）；  Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２７１：２５９９（１９９６）；  Ａｒｅｎｚａｎａ−Ｓｅｉｓｄｅｄｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３８３：４００（１９９６）；  Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２７３：４２８９（１９９８））。米国特許第６，８０８，８７７号は、ＣＣＲ５のリン酸化及び下方制御及び／又はリガンドとしてＮ−ホルミルペプチド受容体に作用することによるＨＩＶ感染の阻害におけるＤＰ−１７８及びその役割について論述している。
【０１９２】
ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）は、最初、ブタの腸組織から単離され、主に、腸の内分泌細胞中に局在する３６アミノ酸長のペプチドである。ＰＰＹは、遠位胃腸管の内分泌細胞によって、食後に分泌され、視床下部シグナル伝達の飽和に作用する。「Ｂａｔｔｅｒｈａｍ，  Ｒ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：６５０−６５４（２００２）」を参照されたい（参照により、本明細書に組み込まれる。）。ＰＰＹは、消化系内での幅広い活性及び腸の電解質及び液体分泌の強力な阻害など、多くの生物活性を有する。その同類であるニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）及び膵臓ポリペプチド（ＰＰ）と同様、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）は、ヘアピン立体構造へと折り曲げられ、ヘアピン立体構造は、受容体への結合のために、分子の遊離末端を集結させる上で重要である。
【０１９３】
最近の研究は、絶食及び食後のＰＹＹレベルは肥満対象中では低いことを示しており、これは、彼らの食欲及び食物摂取が高いことを説明し得る。ＰＰＹを静脈内に投与すると、ＰＰＹは、痩せた対象と肥満対象の両方で、食欲と食物摂取を抑制する（Ｂａｔｔｅｒｈａｍ，  Ｒ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４９：９４１−９４８（２００３））。ペプチドＹＹ断片（例えば、ＰＹＹ［３−３６］）のような膵臓ペプチド（ＰＰ）ファミリーから得られる他のペプチド及びＰＹＹアゴニスト（ＰＰファミリーに属さないものも含む。）も、食欲を抑制する。しかしながら、胃腸管での低い吸収と迅速な分解のために、ＰＹＹの経口活性は無視できるものである。ＰＹＹ［３−３６］は、ＷＯ０２／４７７１２号及び米国特許公開２００２／０１４１９８５号；  Ｅｂｅｒｌｅｉｎ，  Ｅｙｓｓｅｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １０：７９７−８０３（１９８９）；及びＧｒａｎｄｙ，  Ｓｃｈｉｍｉｃｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．  ，  Ｒｅｇｕｌ  Ｐｅｐｔ  ５１：１５１−９（１９９４）の配列番号３として同定されている（参照により、本明細書中に組み込まれる。）。
【０１９４】
ＰＹＹ［３−３６］は、アミノ酸３ないし３６にわたって、ＰＹＹと同一の配列を有する。ＰＹＹ［３−３６］は、ヒト及びイヌの腸抽出物中に、総ペプチドＹＹ様免疫反応性の約４０％を含有し、絶食時には、総血漿ペプチドＹＹ免疫反応性の約３６％を含有して、食後には５０％を僅かに上回る。ＰＹＹ［３−３６］は、明らかに、ペプチドＹＹのジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ（ＤＰＰ４）切断産物である。ペプチドＹＹ［３−３６］は、報告によれば、Ｙ２及びＹ５受容体に対する選択的リガンドであり、Ｎ末端が切断されたニューロペプチドＹ類縁体（すなわち、ニューロペプチドＹ類縁体のＣ末端断片）を好むという点で薬理学的に特有であるように見受けられる。ＰＹＹアゴニストは、より高い親和性又はより低い親和性を有するＰＹＹ受容体に結合することができ、インビボ若しくはインビトロで、より長い又はより短い半減期を示すか、又は、多かれ少なかれ、元のＰＹＹより有効である。
【０１９５】
現在の肥満抑制薬は、効力が限られており、多数の副作用を有している。Ｃｒｏｗｌｅｙ，  Ｖ．  Ｅ．，  Ｙｅｏ，  Ｇ．  Ｓ．  ＆  Ｏ’Ｒａｈｉｌｌｙ，  Ｓ．，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  １，  ２７６−８６（２００２）。世界で、肥満が大流行するにつれて、この分野で、十分な治療薬を開発することに対して急迫した必要性が存在する。近年では、ＰＹＹなど、食欲、身体エネルギー消費及び脂肪塊蓄積の制御に関与するホルモン及び神経ペプチドが、肥満抑制薬の候補として浮上している。ＭｃＭｉｎｎ，  Ｊ．  Ｅ．，  Ｂａｓｋｉｎ，  Ｄ．  Ｇ．  ＆  Ｓｃｈｗａｒｔｚ，  Ｍ．  Ｗ．，  Ｏｂｅｓ  Ｒｅｖ  １  ：３７−４６（２０００），  Ｄｒａｚｅｎ，  Ｄ．  Ｌ．  ＆  Ｗｏｏｄｓ，  Ｓ．  Ｃ，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  Ｍｅｔａｂ  Ｃａｒｅ  ６：６２１−６２９（２００３）を参照（参照により、本明細書に組み込まれる。）。
【０１９６】
「Ｂａｔｔｅｒｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：６５０−６５４（２００２）」（参照により、本明細書に組み込まれる。）によれば、ペプチドＹＹ［３−３６］系は、肥満の治療に対する治療的標的を提供し得る。国際公開ＷＯ０２／４７７１２号及び米国特許出願公開２００２／０１４１９８５号は、ペプチドＹＹ及びペプチドＹＹアゴニスト（ペプチドＹＹ［３−３６］など）を用いて、肥満及び糖尿病を治療する方法を開示している。米国特許出願公開２００５０００２９２７号は、肥満など、哺乳動物対象中の様々な疾病及び症状を治療するための、ペプチドＹＹ、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）又は膵臓ペプチド（ＰＰ）などの少なくとも１つのＹ２受容体結合ペプチドの使用を記載している。
【０１９７】
鼻内ＰＹＹ（３−３６）（Ｍｅｒｃｋ，Ｎａｓｔｅｃｈ）は、肥満の治療として臨床開発段階にある。開発中の他のＰＹＹ（３−３６）化合物には、経口ＰＹＹ（３−３６）（Ｅｍｉｓｐｈｅｒｅ）及びＡＣ１６２３５２（Ａｍｙｌｉｎ）が含まれる。
【０１９８】
さらに、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を用いた治療は、潰瘍、刺激性腸疾患及び炎症性腸疾患などの胃腸症状に関連しているペプチドＹＹの分解を抑制する。ペプチドＹＹ及びその類縁体又はアゴニストは、細胞増殖、栄養素の輸送並びに腸の水及び電解質分泌の内分泌制御を操作するために使用されている。（米国特許第５，６０４，２０３号；ＷＯ９８２０８８５Ａ１；ＥＰ６９２９７１Ａ１；米国特許第５，９１２，２２７号、参照によって本明細書に組み込まれる。）。腸の運動、分泌、及び血流の制御におけるペプチドＹＹの役割並びに吸収不良疾患の治療におけるペプチドＹＹの使用も示唆されている。ＰＹＹの類縁体は、膵臓癌の治療における、天然ペプチドの持続時間、効果、生物活性及び選択性に匹敵し、これらを増強すると報告されている（米国特許第５，５７４，０１０号を参照。参照により、本明細書に組み込まれる。）。
【０１９９】
他の適切なＰＹＹアゴニストには、国際公開ＷＯ９８／２０８８５号に記載されているＰＹＹアゴニストが含まれ、参照により、本明細書に組み込まれる。
【０２００】
一局面では、本発明は、ＰＹＹ、ＰＹＹアゴニスト又はこれらの混合物の治療的有効量を、少なくとも１つの送達剤化合物とともに投与することによって、肥満又は過剰体重動物の肥満を治療する方法を提供する。「肥満」は、一般的には、３０を超える肥満度指数として定義されるが、本開示において、体重を減らすことが必要であり、又は体重を減らすことを望む、３０未満の肥満度指数を有する対象を含む全ての対象が、「肥満」の範囲に含まれる。インシュリン抵抗性、耐糖能障害であり、又は糖尿病の任意の形態（例えば、１型、２型又は妊娠性糖尿病）を有する対象は、本方法が有益であり得る。
【０２０１】
他の局面において、本発明は、ＰＹＹ、ＰＹＹアゴニスト又はこれらの混合物の治療的有効量を、少なくとも１つの送達剤化合物とともに対象に投与することを含む、食物摂取を減少し、糖尿病を治療し、脂質プロファイル（ＬＤＬコレステロール及びトリグリセリドレベルを減少すること、及び／又はＨＤＬコレステロールレベルを変化させることを含む。）を改善する方法に関する。  好ましい実施形態において、本発明の方法は、ＰＹＹ、ＰＹＹアゴニスト又はこれらの混合物の有効量を、少なくとも１つの送達剤化合物とともに対象に投与することを含み、栄養素の利用可能性を減少することによって緩和可能な症状又は疾患の治療を必要としている対象において、前記症状又は疾患を治療するために使用される。このような症状及び疾患には、高血圧、異脂肪血症、心血管疾患、摂食障害、インシュリン抵抗性、肥満及びあらゆる種類の糖尿病が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２０２】
好ましいＰＹＹアゴニストは、ＷＯ０２／４７７１２号及び米国特許公開２００２／１４１９８５号に記載されているアッセイの１つ（好ましくは、食物摂取、胃内容排出、膵臓分泌又は体重減少アッセイ）において、同じアッセイにおけるＮＰＹの効力より大きな効力を有し得る。ＰＹＹ及びＰＹＹアゴニストは、送達剤化合物とともに、米国特許公開２００５０００９７４８号に記載されているように、アミリン若しくはアミリンアゴニスト、コレシストキニン（ＣＣＫ）若しくはＣＣＫアゴニスト、レプチン（ＯＢタンパク質）若しくはレプチンアゴニスト、エキセンディン若しくはエキセンディンアゴニスト又はＧＬＰ−１若しくはＧＬＰ−１アゴニストを含む他の化合物及び組成物など（これらに限定されない。）、栄養素の利用可能性を減少させる長期又は短期作用を惹起する１又は複数の他の化合物及び組成物と別々に又は一緒に投与してもよい。適切なアミリンアゴニストには、例えば、［２５，２８，２９Ｐｒｏ−］−ヒトアミリン（「プラムリンチド」としても知られ、米国特許第５，６８６，５１１号及び第５，９９８，３６７号に記載されている。）、米国特許第５，７３９，１０６号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているものなどを含むカルシトニン（例えば、サケのカルシトニン）が含まれる。使用されるＣＣＫは、好ましくは、ＣＣＫオクトペプチド（ＣＣＫ−８）である。レプチンは、例えば、「Ｐｅｌｌｅｙｍｏｕｎｔｅｒ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：５４０−５４３（１９９５），  Ｈａｌａａｓ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：５４３−６（１９９５）」及び「Ｃａｍｐｆｉｅｌｄ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：５４６−５４９（１９９５）」に論述されている。適切なＣＣＫアゴニストには、米国特許第５，７３９，１０６号に記載されているＣＣＫアゴニストが含まれ、参照により、本明細書に組み込まれる。適切なエキセンディンには、エキセンディン−３及びエキセンディン−４が含まれ、エキセンディンアゴニスト化合物には、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／０７４０４号、ＷＯ９９／２５７２７号及びＷＯ９９／２５７２８号（全て、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているものが含まれる。一実施形態によれば、本発明の組成物には、少なくとも１つの送達剤化合物、ＰＹＹ、ＰＹＹアゴニスト、又はこれらの混合物、少なくとも１つのアミリンアゴニスト及びＣＣＫアゴニストが含まれる。アミリンアゴニストとＣＣＫアゴニストの適切な組み合わせには、米国特許第５，７３９，１０６号に記載されているＣＣＫアゴニストが含まれ（これらに限定されない。）、参照により、本明細書に組み込まれる。
【０２０３】
副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）ペプチドには、ＡＣＴＨ、ヒト；ＡＣＴＨ１−１０；ＡＣＴＨ１−１３、ヒト；ＡＣＴＨ１−１６、ヒト；ＡＣＴＨ１−１７；ＡＣＴＨ１−２４、ヒト；ＡＣＴＨ４−１０；ＡＣＴＨ４−１１；ＡＣＴＨ６−２４；ＡＣＴＨ７−３８、ヒト；ＡＣＴＨ１８−３９、ヒト；ＡＣＴＨラット；ＡＣＴＨ１２−３９、ラット；β細胞トロピン（ＡＣＴＨ２２−３９）；ビオチニル−ＡＣＴＨ１−２４、ヒト；ビオチニル−ＡＣＴＨ７−３８、ヒト；コルチコスタチン、ヒト；コルチコスタチン、ウサギ；［Ｍｅｔ（０２）４，ＤＬｙｓ８，Ｐｈｅ９］ＡＣＴＨ４−９、ヒト；［Ｍｅｔ（０）４，ＤＬｙｓ８，Ｐｈｅ９］ＡＣＴＨ４−９、ヒト；Ｎ−アセチル、ＡＣＴＨ１−１７ヒト；及びエビラチド（ｅｂｉｒａｔｉｄｅ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０４】
アドレノメジュリンペプチドには、アドレノメジュリン、アドレノメジュリン１−５２、ヒト；アドレノメジュリン１−１２、ヒト；アドレノメジュリン１３−５２、ヒト；アドレノメジュリン２２−５２、ヒト；プロアドレノメジュリン４５−９２、ヒト；プロアドレノメジュリン１５３−１８５、ヒト；アドレノメジュリン１−５２、ブタ；プロアドレノメジュリン（Ｎ−２０）、ブタ；アドレノメジュリン１−５０、ラット；アドレノメジュリン１１−５０、ラット；及びプロＡＭ−Ｎ２０（プロアドレノメジュリンＮ末端２０ペプチド）、ラットが含まれるが、これらに限定されない。
【０２０５】
アラトスタチンペプチドには、アラトスタチンＩ；アラトスタチンＩＩ；アラトスタチンＩＩＩ；及びアラトスタチンＩＶが含まれるが、これらに限定されない。
【０２０６】
アミリンペプチドには、アセチルアミリン８−３７、ヒト；アセチル化されたアミリン８−３７、ラット；ＡＣ１８７アミリンアンタゴニスト；ＡＣ２５３アミリンアンタゴニスト；ＡＣ６２５アミリンアンタゴニスト；アミリン８−３７、ヒト；アミリン（ＩＡＰＰ）、ネコ；アミリン（インシュリノーマ又は膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ））；アミリンアミド、ヒト；アミリン１−１３（糖尿病関連ペプチド１−１３）ヒト；アミリン２０−２９（ＩＡＰＰ２０−２９）ヒト；ＡＣ６２５アミリンアンタゴニスト；アミリン８−３７ヒト；アミリン（ＩＡＰＰ）、ネコ；アミリン、ラット；アミリン８−３７、ラット；ビオチニル−アミリン、ラット；及びビオチニル−アミリンアミド、ヒトが含まれるが、これらに限定されない。
【０２０７】
アミロイドβタンパク質断片ペプチドには、アルツハイマー病βタンパク質１２−２８（ＳＰ１７）；アミロイドβタンパク質２５−３５；アミロイドβ／Ａ４−タンパク質前駆体３２８−３３２；アミロイドβ／Ａ４タンパク質前駆体（ＡＰＰ）３１９−３３５；アミロイドβタンパク質１−４３；アミロイドβタンパク質１−４２；アミロイドβタンパク質１−４０；アミロイドβタンパク質１０−２０；アミロイドβタンパク質２２−３５；アルツハイマー病βタンパク質（ＳＰ２８）；βアミロイドペプチド１−４２、ラット；βアミロイドペプチド１−４０、ラット；βアミロイド１−１１；βアミロイド３１−３５；βアミロイド３２−３５；βアミロイド３５−２５；βアミロイド／Ａ４タンパク質前駆体９６−１１０；βアミロイド前駆体タンパク質６５７−６７６；βアミロイド１−３８；［Ｇｌｎ１］−アルツハイマー病βタンパク質；［ＧＩｎ１１］−βアミロイド１−４０；［Ｇｌｎ２２］−βアミロイド６−４０；アルツハイマー病アミロイドの非Ａβ成分（ＮＡＣ）；Ｐ３，（Ａβ１７−４０）アルツハイマー病アミロイドβ−ペプチド；及びＳＡＰ（血清アミロイドＰ成分）１９４−２０４が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０８】
アンギオテンシンペプチドには、Ａ−７７９；Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−アンギオテンシンＩＩ；［Ｉｌｅ３，Ｖａｌ５］−アンギオテンシンＩＩ；アンギオテンシンＩＩＩアンチペプチド；アンギオゲニン断片１０８−１２２；アンギオゲニン断片１０８−１２３；アンギオテンシンＩ変換酵素阻害剤；アンギオテンシンＩ、ヒト；アンギオテンシンＩ変換酵素基質；アンギオテンシンＩ１−７、ヒト；アンギオペプチン；アンギオテンシンＩＩ、ヒト；アンギオテンシンＩＩアンチペプチド；アンギオテンシンＩＩ１−４、ヒト；アンギオテンシンＩＩ３−８、ヒト；アンギオテンシンＩＩ４−８、ヒト；アンギオテンシンＩＩ５−８、ヒト；アンギオテンシンＩＩＩ（［Ｄｅｓ−Ａｓｐ１］−アンギオテンシンＩＩ）、ヒト；アンギオテンシンＩＩＩ阻害剤（［Ｉｌｅ７］−アンギオテンシンＩＩＩ）；アンギオテンシン−変換酵素阻害剤（Ｎｅｏｔｈｕｎｎｕｓ  ｍａｃｒｏｐｔｅｒｕｓ）；［Ａｓｎ１，Ｖａｌ５］−アンギオテンシンＩ、アンコウ；［Ａｓｎ１，Ｖａｌ５，Ａｓｎ９］−アンギオテンシンＩ、サケ；［Ａｓｎ１，Ｖａｌ５，Ｇｌｙ９］−アンギオテンシンＩ、ウナギ；［Ａｓｎ１，Ｖａｌ５］−アンギオテンシンＩ１−７、ウナギ、アンコウ、サケ；［Ａｓｎ１，Ｖａｌ５］−アンギオテンシンＩＩ；ビオチニル−アンギオテンシンＩ、ヒト；ビオチニル−アンギオテンシンＩＩ、ヒト；ビオチニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−アンギオテンシンＩＩ；［Ｄｅｓ−Ａｓｐ１］−アンギオテンシンＩ、ヒト；［ｐ−アミノフェニルアラニン６］−アンギオテンシンＩＩ；レニン基質（アンギオテンシノーゲン１−１３）、ヒト；プレアンギオテンシノーゲン１−１４（レニン基質テトラデカペプチド）、ヒト；レニン基質テトラデカペプチド（アンギオテンシノーゲン１−１４）、ブタ；［Ｓａｒ１］−アンギオテンシンＩＩ，［Ｓａｒ１］−アンギオテンシンＩＩ１−７アミド；［Ｓａｒ１，Ａｌａ８］−アンギオテンシンＩＩ；［Ｓａｒ１，Ｉｌｅ８］−アンギオテンシンＩＩ；［Ｓａｒ１，Ｔｈｒ８］−アンギオテンシンＩＩ；［Ｓａｒ１，Ｔｙｒ（Ｍｅ）４］−アンギオテンシンＩＩ（Ｓａｒｍｅｓｉｎ）；［Ｓａｒ１，Ｖａｌ５，Ａｌａ８］−アンギオテンシンＩＩ；［Ｓａｒ１，Ｉｌｅ７］−アンギオテンシンＩＩＩ；合成テトラデカペプチドレニン基質（Ｎｏ．２）；［Ｖａｌ４］−アンギオテンシンＩＩＩ；［Ｖａｌ５］−アンギオテンシンＩＩ；［Ｖａｌ５］−アンギオテンシンＩ、ヒト；［Ｖａｌ５］−アンギオテンシンＩ；［Ｖａｌ５，Ａｓｎ９］−アンギオテンシンＩ、ウシガエル；及び［Ｖａｌ５，Ｓｅｒ９］−アンギオテンシンＩ、家禽が含まれ、これらに限定されない。
【０２０９】
抗生物質ペプチドには、Ａｃ−ＳＱＮＹ；バクテネシン、ウシ；ＣＡＰ３７（２０−４４）；カルボルメトキシカルボニル−ＤＰｒｏ−ＤＰｈｅ−ＯＢｚｌ；ＣＤ３６ペプチドＰ１３９−１５５；ＣＤ３６ペプチドＰ９３−１１０；セクロピンＡ−メリチンハイブリッドペプチド［ＣＡ（Ｉ−７）Ｍ（２−９）ＮＨ２］；セクロピンＢ，遊離酸；ＣＹＳ（Ｂｚｌ）８４ＣＤ断片８１−９２；デフェンシン（ヒト）ＨＮＰ−２；デルマセプチン；免疫刺激ペプチド、ヒト；ラクトフェリシン、ウシ（ＢＬＦＣ）；及びマガイニンスペーサーが含まれるが、これらに限定されない。
【０２１０】
以下の疾病及び／又は病原因子に対して強化された免疫反応を惹起し、免疫応答を強化し、及び／又は免疫的に有効な応答を引き起こすことができる抗原性ポリペプチド。アデノウイルス；炭疽菌；百日咳菌；ボツリヌス中毒症；ウシ鼻気管炎；ブランハメラ・カタラリス（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）；イヌ肝炎；イヌジステンパー；クラミジア；コレラ；コクシジオイデス症；牛痘；サイトメガロウイルス；デング熱；デングトキソプラズマ症；ジフテリア；脳炎；腸管毒素原性大腸菌；エプスタイン・バールウイルス；ウマ脳炎；ウマ感染性貧血；ウマインフルエンザ；ウマ肺炎；ウマライノウイルス；大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）；ネコ白血病；フラビウイルス；グロブリン；ヘモフィラス・インフルエンザ菌タイプＢ；ヘモフィラス・インフルエンザ菌；ヘモフィラス百日咳；ヘリコバクターピロリ；ヘモフィラス；肝炎；Ａ型肝炎；Ｂ型肝炎；Ｃ型肝炎；ヘルペスウイルス；ＨＩＶ；ＨＩＶ−１ウイルス；ＨＩＶ−２ウイルス；ＨＴＬＶ；インフルエンザ；日本脳炎；クラブシエラ種；レジオネラ・ニューモフィラ；リーシュマニア；ハンセン病；ライム病；マラリア免疫原；はしか；髄膜炎；髄膜炎菌；髄膜炎菌多糖グループＡ；髄膜炎菌多糖グループＣ；流行性耳下腺炎；流行性耳下腺炎ウイルス；ミコバクテリア；ミコバクテリウム・チュバキュロシス；ナイセリア；ナイセリア・ゴノリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）；ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）；ヒツジ青舌病；ヒツジ脳炎；乳頭腫；パラインフルエンザ；パラミクソウイルス；百日咳；ペスト；肺炎球菌；ニューモシスティス・カリニ；肺炎；ポリオウイルス；プロテウス種；シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）；狂犬病；呼吸器合胞体ウイルス；ロタウイルス；風疹；サルモネラ；住血吸虫症；赤痢菌；サル免疫不全症ウイルス；天然痘；黄色ブドウ球菌；ブドウ球菌種；肺炎連鎖球菌；化膿連鎖球菌；連鎖球菌種；ブタインフルエンザ；破傷風；トレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）；腸チフス；ワクシニア；水痘帯状ウイルス；ビブリオ・コレラエ（ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１１】
抗微生物ペプチドには、ブフォリンＩ；ブフォリンＩＩ；セクロピンＡ；セクロピンＢ；セクロピンＰｌ、ブタ；ガエグリン（ｇａｅｇｕｒｉｎ）２（Ｒａｎａ  ｒｕｇｏｓａ）；ガエグリン（ｇａｅｇｕｒｉｎ）５（Ｒａｎａ  ｒｕｇｏｓａ）；インドリシジン（ｉｎｄｏｌｉｃｉｄｉｎ）；プロテグリン−（ＰＧ）−Ｉ；マガイニン１；及びマガイニン２；及びＴ−２２［Ｔｙｒ５，１２，Ｌｙｓ７］−ポリ−フェムシンＩＩペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【０２１２】
アポトーシス関連ペプチドには、アルツハイマー病β−タンパク質（ＳＰ２８）；カルパイン阻害剤ペプチド；カプサーゼ（ｃａｐｓａｓｅ）−１阻害剤Ｖ；カプサーゼ（ｃａｐｓａｓｅ）−３、基質ＩＶ；カスパーゼ−１阻害剤Ｉ、細胞透過可能；カスパーゼ−１阻害剤ＶＩ；カスパーゼ−３基質ＩＩＩ、蛍光発生；カスパーゼ−１基質Ｖ，蛍光発生；カスパーゼ−３阻害剤Ｉ、細胞透過可能；カスパーゼ−６ＩＣＥ阻害剤ＩＩＩ；［Ｄｅｓ−Ａｃ、ビオチン］−ＩＣＥ阻害剤ＩＩＩ；ＩＬ−ＩＢ変換酵素（ＩＣＥ）阻害剤ＩＩ；ＩＬ−ＩＢ変換酵素（ＩＣＥ）基質ＩＶ；ＭＤＬ２８１７０；及びＭＧ−１３２が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１３】
心房性ナトリウム利尿ペプチドには、α−ＡＮＰ（α−ｃｈＡＮＰ）、ニワトリ；アナンチン；ＡＮＰ１−１１、ラット；ＡＮＰ８−３０、カエル；ＡＮＰ１１−３０、カエル；ＡＮＰ−２１（ｆＡＮＰ−２１）、カエル；ＡＮＰ−２４（ｆＡＮＰ−２４）、カエル；ＡＮＰ−３０、カエル；ＡＮＰ断片５−２８、ヒト、イヌ；ＡＮＰ−７−２３、ヒト；ＡＮＰ断片７−２８、ヒト、イヌ；α−心房性ナトリウム利尿ポリペプチド１−２８、ヒト、イヌ；Ａ７１９１５、ラット；心房性ナトリウム利尿因子８−３３、ラット；心房性ナトリウム利尿ポリペプチド３−２８、ヒト；心房性ナトリウム利尿ポリペプチド４−２８、ヒト、イヌ；心房性ナトリウム利尿ポリペプチド５−２７；ヒト；心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、ウナギ；アトリオペプチンＩ（ａｔｒｉｏｐｅｐｔｉｎＩ）、ラット、ウサギ、マウス；アトリオペプチンＩＩ、ラット、ウサギ、マウス；アトリオペプチンＩＩ、ラット、ウサギ、マウス；心房性ナトリウム利尿因子（ｒＡＮＦ）、ラット、アウリキュリン（ａｕｒｉｃｕｌｉｎ）Ａ（ラットＡＮＦ１２６−１４９）；アウリキュリンＢ（ｒａｔＡＮＦ１２６−１５０）；β−ＡＮＰ（１−２８、二量体、アンチパラレル）；β−ｒＡＮＦ１７−４８；ビオチニル−α−ＡＮＰ１−２８、ヒト、イヌ；ビオチニル−心房性ナトリウム利尿因子（ビオチニル−ｒＡＮＦ）、ラット；カルジオジラチン（ｃａｒｄｉｏｄｉｌａｔｉｎ）１−１６、ヒト；Ｃ−ＡＮＦ４−２３、ラット；Ｄｅｓ−［Ｃｙｓ１０５，Ｃｙｓ１２１］−心房性ナトリウム利尿因子１０４−１２６、ラット；［Ｍｅｔ（Ｏ）１２］ＡＮＰ１−２８、ヒト；［Ｍｐｒ７，ＤＡｌａ９］ＡＮＰ７−２８，アミド、ラット；プレプロＡＮＦ１０４−１１６、ヒト；プレプロＡＮＦ２６−５５（プロＡＮＦ１−３０）、ヒト；プレプロＡＮＦ５６−９２（プロＡＮＦ３１−６７）、ヒト；プレプロＡＮＦ１０４−１２３、ヒト；［Ｔｙｒ０］−アトリオペプチンＩ、ラット、ウサギ、マウス；［Ｔｙｒ０］−アトリオペプチンＩＩ、ラット，ウサギ、マウス；［Ｔｙｒ０］−プレプロＡＮＦ１０４−１２３、ヒト；ウロディラチン（ｕｒｏｄｉｌａｔｉｎ）（ＣＤＤ／ＡＮＰ９５−１２６）；心室性ナトリウム利尿ペプチド（ＶＮＰ）、ウナギ；及び心室性ナトリウム利尿ペプチド（ＶＮＰ）、ニジマスが含まれるが、これらに限定されない。
【０２１４】
嚢細胞ペプチドには、α嚢細胞ペプチド；α−嚢細胞ペプチド１−９；α−嚢細胞ペプチド１−８；α−嚢細胞ペプチド１−７；β−嚢細胞因子及びγ−嚢細胞因子が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１５】
ボンベシンペプチドには、α−ｓ１カゼイン１０１−１２３（牛乳）；ビオチニル−ボンベシン；ボンベシン８−１４；ボンベシン；［Ｌｅｕ１３−ｐｓｉ（ＣＨ２ＮＨ）Ｌｅｕ１４］−ボンベシン；［Ｄ−Ｐｈｅ６，Ｄｅｓ−Ｍｅｔ１４］−ボンベシン６−１４エチルアミド；［ＤＰｈｅ１２］ボンベシン；［ＤＰｈｅ１２，Ｌｅｕ１４］−ボンベシン；［Ｔｙｒ４］−ボンベシン；及び［Ｔｙｒ４，ＤＰｈｅ１２］−ボンベシンが含まれ、これらに限定されない。
【０２１６】
骨ＧＬＡペプチド（ＢＧＰ）には、骨ＧＬＡタンパク質；骨ＧＬＡタンパク質４５−４９；［ＧＩｕ１７，Ｇｌａ２１，２４］−オステオカルシン１−４９、ヒト；ミクロペプチド−２（ＭＰ−２）；オステオカルシン１−４９ヒト；オステオカルシン３７−４９、ヒト；及び［Ｔｙｒ３８，Ｐｈｅ４２，４６］骨ＧＬＡタンパク質３８−４９、ヒトが含まれるが、これらに限定されない。
【０２１７】
ブラジキニンペプチドには、［Ａｌａ２，６，ｄｅｓ−Ｐｒｏ３］−ブラジキニン；ブラジキニン；ブラジキニン（Ｂｏｗｆｉｎ．Ｇａｒ）；ブラジキニン強化ペプチド；ブラジキニン１−３；ブラジキニン１−５；ブラジキニン１−６；ブラジキニン１−７；ブラジキニン２−７；ブラジキニン２−９；［ＤＰｈｅ７］ブラジキニン；［Ｄｅｓ−Ａｒｇ９］−ブラジキニン；［Ｄｅｓ−Ａｒｇ１０］−Ｌｙｓ−ブラジキニン（［Ｄｅｓ−Ａｒｇ１０］−カリジン）；［Ｄ−Ｎ−Ｍｅ−Ｐｈｅ７］−ブラジキニン；［Ｄｅｓ−Ａｒｇ９，Ｌｅｕ８］−ブラジキニン；Ｌｙｓ−ブラジキニン（カリジン）；Ｌｙｓ−（Ｄｅｓ−Ａｒｇ９，Ｌｅｕ８］−ブラジキニン（［Ｄｅｓ−Ａｒｇ１０，Ｌｅｕ９］−カリジン）；［Ｌｙｓ０−Ｈｙｐ３］−ブラジキニン；オボキニン；［Ｌｙｓ０，Ａｌａ３］−ブラジキニン；Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−ブラジキニン；ペプチドＫ１２ブラジキニン強化ペプチド；［（ｐＣｌ）Ｐｈｅ５，８］−ブラジキニン；Ｔ−キニン（Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−ブラジキニン）；［Ｔｈｒ５，８，Ｄ−Ｐｈｅ７］−ブラジキニン；［Ｔｙｒ０］−ブラジキニン；［Ｔｙｒ５］−ブラジキニン；［Ｔｙｒ８］−ブラジキニン；及びカリクレインが含まれるが、これらに限定されない。
【０２１８】
脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）には、ＢＮＰ３２、イヌ；ＢＮＰ様ペプチド、ウナギ；ＢＮＰ−３２、ヒト；ＢＮＰ−４５、マウス；ＢＮＰ−２６、ブタ；ＢＮＰ−３２、ブタ；ビオチニル−ＢＮＰ−３２、ブタ；ＢＮＰ−３２、ラット；ビオチニル−ＢＮＰ−３２、ラット；ＢＮＰ４５（ＢＮＰ５１−９５，５Ｋ心臓ナトリウム利尿ペプチド）、ラット；及び［Ｔｙｒ０］−ＢＮＰ１−３２、ヒトが含まれるが、これらに限定されない。
【０２１９】
Ｃ−ペプチドには、Ｃ−ペプチド；及び［Ｔｙｒ０］−Ｃ−ペプチド、ヒトが含まれるが、これらに限定されない。
【０２２０】
Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）には、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド、ニワトリ；Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド−２２（ＣＮＰ−２２）、ブタ、ラット、ヒト；Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド−５３（ＣＮＰ−５３）、ヒト；Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド−５３（ＣＮＰ−５３）、ブタ、ラット；Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド−５３（ブタ、ラット）１−２９（ＣＮＰ−５３  １−２９）；プレプロＣＮＰ１−２７、ラット；プレプロＣＮＰ３０−５０、ブタ、ラット；バソナトリンペプチド（ＶＮＰ）；及び［Ｔｙｒ０］−Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド−２２（［Ｔｙｒ０］−ＣＮＰ−２２）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２２１】
カルシトニンペプチドには、ビオチニル−カルシトニン、ヒト；ビオチニル−カルシトニン、ラット；ビオチニル−カルシトニン、サケ；カルシトニン、ニワトリ；カルシトニン、ウナギ；カルシトニン、ヒト；カルシトニン、ブタ；カルシトニン、ラット；カルシトニン、サケ；カルシトニン１−７、ヒト；カルシトニン８−３２、サケ；カタカルシン（ｋａｔａｃａｌｃｉｎ）（ＰＤＮ−２１）（Ｃ−プロカルシトニン）；及びＮ−プロＣＴ（アミノ末端プロカルシトニン切断ペプチド）、ヒトが含まれるが、これらに限定されない。
【０２２２】
カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）には、アセチル−α−ＣＧＲＰ１９−３７、ヒト；α−ＣＧＲＰ１９−３７、ヒト；α−ＣＧＲＰ２３−３７、ヒト；ビオチニル−ＣＧＲＰ、ヒト；ビオチニル−ＣＧＲＰＩＩ、ヒト；ビオチニル−ＣＧＲＰ、ラット；β−ＣＧＲＰ、ラット；ビオチニル−β−ＣＧＲＰ、ラット；ＣＧＲＰ、ラット；ＣＧＲＰ、ヒト；カルシトニンＣ末端隣接ペプチド；ＣＧＲＰ１−１９、ヒト；ＣＧＲＰ２０−３７、ヒト；ＣＧＲＰ８−３７、ヒト；ＣＧＲＰＩＩ、ヒト；ＣＧＲＰ、ラット；ＣＧＲＰ８−３７、ラット；ＣＧＲＰ２９−３７、ラット；ＣＧＲＰ３０−３７、ラット；ＣＧＲＰ３１−３７、ラット；ＣＧＲＰ３２−３７、ラット；ＣＧＲＰ３３−３７、ラット；ＣＧＲＰ３１−３７、ラット；（［Ｃｙｓ（Ａｃｍ）２，７］−ＣＧＲＰ；エルカトニン（ｅｌｃａｔｏｎｉｎ）；［Ｔｙｒ０］−ＣＧＲＰ、ヒト；［Ｔｙｒ０］−ＣＧＲＰＩＩ、ヒト；［Ｔｙｒ０］−ＣＧＲＰ２８−３７、ラット；［Ｔｙｒ０］−ＣＧＲＰ、ラット；及び［Ｔｙｒ２２］−ＣＧＲＰ２２−３７、ラットが含まれるが、これらに限定されない。
【０２２３】
ＣＡＲＴペプチドには、ＣＡＲＴ、ヒト；ＣＡＲＴ５５−１０２、ヒト；ＣＡＲＴ、ラット；及びＣＡＲＴ５５−１０２、ラット、が含まれるが、これらに限定されない。
【０２２４】
キャソモルフィンペプチドには、β−キャソモルフィン、ヒト；β−キャソモルフィン１−３；β−キャソモルフィン１−３，アミド；β−キャソモルフィン、ウシ；β−キャソモルフィン１−４、ウシ；β−キャソモルフィン１−５、ウシ；β−キャソモルフィン１−５，アミド、ウシ；β−キャソモルフィン１−６、ウシ；［ＤＡｌａ２］−β−キャソモルフィン１−３，アミド、ウシ；［ＤＡｌａ２，Ｈｙｐ４，Ｔｙｒ５］−β−キャソモルフィン１−５アミド；［ＤＡｌａ２，ＤＰｒｏ４，Ｔｙｒ５］−β−キャソモルフィン１−５，アミド；［ＤＡｌａ２，Ｔｙｒ５］−β−キャソモルフィン１−５，アミド、ウシ；［ＤＡｌａ２，４，Ｔｙｒ５］−β−キャソモルフィン１−５，アミド、ウシ；［ＤＡｌａ２，（ｐＣｌ）Ｐｈｅ３］−β−キャソモルフィン，アミド、ウシ；［ＤＡｌａ２］−β−キャソモルフィン１−４，アミド、ウシ；［ＤＡｌａ２］−β−キャソモルフィン１−５、ウシ；［ＤＡｌａ２］−β−キャソモルフィン１−５，アミド、ウシ；［ＤＡｌａ２，Ｍｅｔ５］−β−キャソモルフィン１−５、ウシ；［ＤＰｒｏ２］−β−キャソモルフィン１−５，アミド、ウシ；［ＤＡｌａ２］−β−キャソモルフィン１−６、ウシ；［ＤＰｒｏ２］−β−キャソモルフィン１−４、アミド；［Ｄｅｓ−Ｔｙｒ１］−β−キャソモルフィン、ウシ；［ＤＡｌａ２，４，Ｔｙｒ５］−β−キャソモルフィン１−５，アミド、ウシ；［ＤＡｌａ２，（ｐＣｌ）Ｐｈｅ３］−β−キャソモルフィン，アミド、ウシ；［ＤＡｌａ２］−β−キャソモルフィン１−４，アミド、ウシ；［ＤＡｌａ２］−β−キャソモルフィン１−５、ウシ；［ＤＡｌａ２］−β−キャソモルフィン１−５、アミド、ウシ；［ＤＡｌａ２，Ｍｅｔ５］−β−キャソモルフィン１−５、ウシ；［ＤＰｒｏ２］−β−キャソモルフィン１−５，アミド、ウシ；［ＤＡｌａ２］−β−キャソモルフィン１−６、ウシ；［ＤＰｒｏ２］−β−キャソモルフィン１−４，アミド；［Ｄｅｓ−Ｔｙｒ１］−β−キャソモルフィン、ウシ；及び［Ｖａｌ３］−β−キャソモルフィン１−４，アミド、ウシが含まれるが、これらに限定されない。
【０２２５】
走化性ペプチドには、デフェンシン（ｄｅｆｅｎｓｉｎ）１（ヒト）ＨＮＰ−１（ヒト好中球ペプチド−１）；及びＮ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅが含まれるが、これらに限定されない。
【０２２６】
コレシストキニン（ＣＣＫ）ペプチドには、ケルレイン（ｃａｅｒｕｌｅｉｎ）；コレシストキニン（ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ）；コレシストキニン−パンクレオザイミン；ＣＣＫ−３３、ヒト；コレシストキニンオクタペプチド１−４（非硫酸化）（ＣＣＫ２６−２９、非硫酸化）；コレシストキニンオクタペプチド（ＣＣＫ２６−３３）；コレシストキニンオクタペプチド（非硫酸化）（ＣＣＫ２６−３３，非硫酸化）；コレシストキニンヘプタペプチド（ＣＣＫ２７−３３）；コレシストキニンテトラペプチド（ＣＣＫ３０−３３）；ＣＣＫ−３３、ブタ；ＣＲ１４０９，コレシストキニンアンタゴニスト；ＣＣＫ隣接ペプチド（非硫酸化）；Ｎ−アセチルコレシストキニン、ＣＣＫ２６−３０、硫酸化；Ｎ−アセチルコレシストキニン、ＣＣＫ２６−３１、硫酸化；Ｎ−アセチルコレシストキニンＣＣＫ２６−３１、非硫酸化；プレプロＣＣＫ断片Ｖ−９−Ｍ；及びプログルミドが含まれるが、これらに限定されない。
【０２２７】
コロニー刺激因子ペプチドには、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＧＭＣＳＦ；ＭＣＳＦ；及びＧ−ＣＳＦが含まれるが、これらに限定されない。
【０２２８】
コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）ペプチドには、アストレッシン；α−ヘリカルＣＲＦ１２−４１；ビオチニル−ＣＲＦ、ヒツジ；ビオチニル−ＣＲＦ、ヒト、ラット；ＣＲＦ、ウシ；ＣＲＦ、ヒト、ラット；ＣＲＦ、ヒツジ；ＣＲＦ、ブタ；［Ｃｙｓ２１］−ＣＲＦ、ヒト、ラット；ＣＲＦアンタゴニスト（α−ヘリカルＣＲＦ９−４１）；ＣＲＦ６−３３、ヒト、ラット；［ＤＰｒｏ５］−ＣＲＦ、ヒト、ラット；［Ｄ−Ｐｈｅ１２，Ｎｌｅ２１，３８］−ＣＲＦ１２−４１、ヒト、ラット；好酸球遊走ペプチド；［Ｍｅｔ（０）２１］−ＣＲＦ、ヒツジ；［Ｎｌｅ２１，Ｔｙｒ３２］−ＣＲＦ、ヒツジ；プレプロＣＲＦ１２５−１５１、ヒト；ソーバジン（ｓａｕｖａｇｉｎｅ）、カエル；［Ｔｙｒ０］−ＣＲＦ、ヒト、ラット；［Ｔｙｒ０］−ＣＲＦ、ヒツジ；［Ｔｙｒ０］−ＣＲＦ３４−４１、ヒツジ；［Ｔｙｒ０］−ウロコルチン；ウロコルチンアミド、ヒト；ウロコルチン、ラット；ウロコルチンＩ（Ｃａｔｏｓｔｏｍｕｓｃｏｍｍｅｒｓｏｎｉ）；ウロテンシンＩＩ；及びウロテンシンＩＩ（Ｒａｎａｒｉｄｉｂｕｎｄａ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２２９】
コルチスタチンペプチドには、コルチスタチン２９；コルチスタチン２９（１−１３）；［Ｔｙｒ０］−コルチスタチン２９；プロコルチスタチン２８−４７；及びプロコルチスタチン５１−８１が含まれるが、これらに限定されない。
【０２３０】
サイトカインペプチドには、腫瘍壊死因子；及び腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦ−β）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２３１】
デルモルフィンペプチドには、デルモルフィン及びデルモルフィン類縁体１−４が含まれるが、これらに限定されない。
【０２３２】
ダイノルフィンペプチドには、ビッグダイノルフィン（プロダイノルフィン２０９−２４０）、ブタ；ビオチニル−ダイノルフィンＡ（ビオチニル−プロダイノルフィン２０９−２２５）；［ＤＡｌａ２，ＤＡｒｇ６］−ダイノルフィンＡ１−１３、ブタ；［Ｄ−Ａｌａ２］−ダイノルフィンＡ、ブタ；［Ｄ−Ａｌａ２］−ダイノルフィンＡアミド、ブタ；［Ｄ−Ａｌａ２］−ダイノルフィンＡ１−１３、アミド、ブタ；［Ｄ−Ａｌａ２］−ダイノルフィンＡ１−９、ブタ；［ＤＡｒｇ６］−ダイノルフィンＡ１−１３、ブタ；［ＤＡｒｇ８］−ダイノルフィンＡ１−１３、ブタ；［Ｄｅｓ−Ｔｙｒ１］−ダイノルフィンＡ１−８；［Ｄ−プロ１０］−ダイノルフィンＡ１−１１、ブタ；ダイノルフィンＡアミド、ブタ；ダイノルフィンＡ１−６、ブタ；ダイノルフィンＡ１−７、ブタ；ダイノルフィンＡ１−８、ブタ；ダイノルフィンＡ１−９、ブタ；ダイノルフィンＡ１−１０、ブタ；ダイノルフィンＡ１−１０アミド、ブタ；ダイノルフィンＡ１−１１、ブタ；ダイノルフィンＡ１−１２、ブタ；ダイノルフィンＡ１−１３、ブタ；ダイノルフィンＡ１−１３アミド、ブタ；ＤＡＫＬＩ（ダイノルフィンＡ−類縁体κリガンド）；ＤＡＫＬＩ−ビオチン（［Ａｒｇ１１，１３］−ダイノルフィンＡ（１−１３）−Ｇｌｙ−ＮＨ（ＣＨ２）５ＮＨ−ビオチン）；ダイノルフィンＡ２−１７、ブタ；ダイノルフィン２−１７，アミド、ブタ；ダイノルフィンＡ２−１２、ブタ；ダイノルフィンＡ３−１７，アミド、ブタ；ダイノルフィンＡ３−８、ブタ；ダイノルフィンＡ３−１３、ブタ；ダイノルフィンＡ３−１７、ブタ；ダイノルフィンＡ７−１７、ブタ；ダイノルフィンＡ８−１７、ブタ；ダイノルフィンＡ６−１７、ブタ；ダイノルフィンＡ１３−１７、ブタ；ダイノルフィンＡ（プロダイノルフィン２０９−２２５）、ブタ；ダイノルフィンＢ１−９；［ＭｅＴｙｒ１，ＭｅＡｒｇ７，Ｄ−Ｌｅｕ８］−ダイノルフィン１−８エチルアミド；［（ｎＭｅ）Ｔｙｒ１］ダイノルフィンＡ１−１３、アミド、ブタ；［Ｐｈｅ７］−ダイノルフィンＡ１−７、ブタ；［Ｐｈｅ７］−ダイノルフィンＡ１−７、アミド、ブタ；及びプロダイノルフィン２２８−２５６（ダイノルフィンＢ２９）（リューモルフィン）、ブタが含まれるが、これらに限定されない。
【０２３３】
エンドルフィンペプチドには、α−ネオ−エンドルフィン、ブタ；β−ネオエンドルフィン；Ａｃ−β−エンドルフィン、ラクダ、ウシ、ヒツジ；Ａｃ−β−エンドルフィン１−２７、ラクダ、ウシ、ヒツジ；Ａｃ−β−エンドルフィン、ヒト；Ａｃ−β−エンドルフィン１−２６、ヒト；Ａｃ−β−エンドルフィン１−２７、ヒト；Ａｃ−γ−エンドルフィン（Ａｃ−β−リポトロピン６１−７７）；アセチル−α−エンドルフィン；α−エンドルフィン（β−リポトロピン６１−７６）；α−ネオ−エンドルフィン類縁体；α−ネオ−エンドルフィン１−７；［Ａｒｇ８］−α−ネオエンドルフィン１−８；β−エンドルフィン（β−リポトロピン６１−９１）、ラクダ、ウシ、ヒツジ；β−エンドルフィン１−２７、ラクダ、ウシ、ヒツジ；β−エンドルフィン、ウマ；β−エンドルフィン（β−リポトロピン６１−９１）、ヒト；β−エンドルフィン（ｌ−５）＋（１６−３１）、ヒト；β−エンドルフィン１−２６、ヒト；β−エンドルフィン１−２７、ヒト；β−エンドルフィン６−３１、ヒト；β−エンドルフィン１８−３１、ヒト；β−エンドルフィン、ブタ；β−エンドルフィン、ラット；β−リポトロピン１−１０、ブタ；β−リポトロピン６０−６５；β−リポトロピン６１−６４；β−リポトロピン６１−６９；β−リポトロピン８８−９１；ビオチニル−β−エンドルフィン（ビオチニル−β−リポトロピン６１−９１）；ビオシチン−β−エンドルフィン、ヒト；γ−エンドルフィン（β−リポトロピン６１−７７）；［ＤＡｌａ２］−α−ネオ−エンドルフィン１−２，アミド；［ＤＡｌａ２］−β−リポトロピン６１−６９；［ＤＡｌａ２］−γ−エンドルフィン；［Ｄｅｓ−Ｔｙｒ１］−β−エンドルフィン、ヒト；［Ｄｅｓ−Ｔｙｒ１］−γ−エンドルフィン（β−リポトロピン６２−７７）；［Ｌｅｕ５］−β−エンドルフィン、ラクダ、ウシ、ヒツジ；［Ｍｅｔ５，Ｌｙｓ６］−α−ネオ−エンドルフィン１−６；［Ｍｅｔ５，Ｌｙｓ６，７］−α−ネオ−エンドルフィン１−７；及び［Ｍｅｔ５，Ｌｙｓ６，Ａｒｇ７］−α−ネオ−エンドルフィン１−７が含まれるが、これらに限定されない。
【０２３４】
エンドセリンペプチドには、エンドセリン−１（ＥＴ−Ｉ）；エンドセリン−［ビオチン−Ｌｙｓ９］；エンドセリン−１（１−１５）、ヒト；エンドセリン−１（１−１５），アミド、ヒト；Ａｃ−エンドセリン−１（１６−２１）、ヒト；Ａｃ−［ＤＴｒｐ１６］−エンドセリン−ｌ（１６−２１）、ヒト；［Ａｌａ３，１１］−エンドセリン−ｌ；［Ｄｐｒ１，Ａｓｐ１５］−エンドセリン−１；［Ａｌａ２］−エンドセリン−３、ヒト；［Ａｌａ１８］−エンドセリン−１、ヒト；［Ａｓｎ１８］−エンドセリン−１、ヒト；［Ｒｅｓ−７０１−１］−エンドセリンＢ受容体アンタゴニスト；Ｓｕｃ−［Ｇｌｕ９，Ａｌａ１１，１５］−エンドセリン−１（８−２１），ＩＲＬ−１６２０；エンドセリン−Ｃ−末端ヘキサペプチド；［Ｄ−Ｖａｌ２２］−ビッグエンドセリン−１（１６−３８）、ヒト；エンドセリン−２（ＥＴ−２）、ヒト、イヌ；エンドセリン−３（ＥＴ−３）、ヒト、ラット、ブタ、ウサギ；ビオチニル−エンドセリン−３（ビオチニル−ＥＴ−３）；プレプロエンドセリン−１（９４−１０９）、ブタ；ＢＱ−５１８；ＢＱ−６１０；ＢＱ−７８８；上皮依存性弛緩アンタゴニスト；ＦＲ１３９３１７；ＩＲＬ−１０３８；ＪＫＣ−３０１；ＪＫＣ−３０２；ＰＤ−１４５０６５；ＰＤ−１４２８９３；サラホトキシンＳ６ａ（ａｔｒａｃｔａｓｐｉｓ  ｅｎｇａｄｄｅｎｓｉｓ）；サラホトキシンＳ６ｂ（ａｔｒａｃｔａｓｐｉｓ  ｅｎｇａｄｄｅｎｓｉｓ）；サラホトキシンＳ６ｃ（ａｔｒａｃｔａｓｐｉｓ  ｅｎｇａｄｄｅｎｓｉｓ）；［Ｌｙｓ４］−サラホトキシンＳ６ｃ；サラホトキシンＳ６ｄ；ビッグエンドセリン−１、ヒト；ビオチニル−エンドセリン−１、ヒト；ビッグエンドセリン−１（１−３９）、ブタ；ビッグエンドセリン−３（２２−４１）、アミド、ヒト；ビッグエンドセリン−１（２２−３９）、ラット；ビッグエンドセリン−１（１−３９）、ウシ；ビッグエンドセリン−１（２２−３９）、ウシ；ビッグエンドセリン−１（１９−３８）、ヒト；ビッグエンドセリン−１（２２−３８）、ヒト；ビッグエンドセリン−２、ヒト；ビッグエンドセリン−２（２２−３７）、ヒト；ビッグエンドセリン−３、ヒト；ビッグエンドセリン−１、ブタ；ビッグエンドセリン−１（２２−３９）（プレプロエンドセリン−１（７４−９１））；ビッグエンドセリン−１、ラット；ビッグエンドセリン−２（１−３８）、ヒト；ビッグエンドセリン−２（２２−３８）、ヒト；ビッグエンドセリン−３、ラット；ビオチニル−ビッグエンドセリン−１、ヒト；及び［Ｔｙｒ１２３］−プレプロエンドセリン（１１０−１３０），アミド、ヒトが含まれるが、これらに限定されない。
【０２３５】
ＥＴａ受容体アンタゴニストペプチドには、［ＢＱ−１２３］；［ＢＥ１８２５７Ｂ］；［ＢＥ−１８２５７Ａ］／［Ｗ−７３３８Ａ］；［ＢＱ−４８５］；ＦＲ１３９３１７；ＰＤ−１５１２４２；及びＴＴＡ−３８６が含まれるが、これらに限定されない。
【０２３６】
ＥＴｂ受容体アンタゴニストペプチドには、［ＢＱ−３０２０］；［ＲＥＳ−７０１−３］；及び［ＩＲＬ−１７２０］が含まれるが、これらに限定されない。
【０２３７】
エンケファリンペプチドには、アドレノルフィン（ａｄｒｅｎｏｒｐｈｉｎ）、遊離酸；アミドルフィン（プロエンケファリンＡ（１０４−１２９）−ＮＨ２）、ウシ；ＢＡＭ−１２Ｐ（ウシ副腎髄質ドデカペプチド）；ＢＡＭ−２２Ｐ（ウシ副腎髄質ドコサペプチド）；ベンゾイル−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ；エンケファリン；［Ｄ−Ａｌａ２，Ｄ−Ｌｅｕ５］−エンケファリン；［Ｄ−Ａｌａ２，Ｄ−Ｍｅｔ５］−エンケファリン；［ＤＡｌａ２］−Ｌｅｕ−エンケファリン，アミド；［ＤＡｌａ２，Ｌｅｕ５，Ａｒｇ６］−エンケファリン；［Ｄｅｓ−Ｔｙｒ１，ＤＰｅｎ２，５］−エンケファリン；［Ｄｅｓ−Ｔｙｒ１，ＤＰｅｎ２，Ｐｅｎ５］−エンケファリン；［Ｄｅｓ−Ｔｙｒ１］−Ｌｅｕ−エンケファリン；［Ｄ−Ｐｅｎ２，５］−エンケファリン；［ＤＰｅｎ２，Ｐｅｎ５］−エンケファリン；エンケファリナーゼ基質；［Ｄ−Ｐｅｎ２，ｐＣＩ−Ｐｈｅ４，Ｄ−Ｐｅｎ５］−エンケファリン；Ｌｅｕ−エンケファリン；Ｌｅｕ−エンケファリン，アミド；ビオチニル−Ｌｅｕ−エンケファリン；［Ｄ−Ａｌａ２］−Ｌｅｕ−エンケファリン；［Ｄ−Ｓｅｒ２］−Ｌｅｕ−エンケファリン−Ｔｈｒ（δ−受容体ペプチド）（ＤＳＬＥＴ）；［Ｄ−Ｔｈｒ２］−Ｌｅｕ−エンケファリン−Ｔｈｒ（ＤＴＬＥＴ）；［Ｌｙｓ６］−Ｌｅｕ−エンケファリン；［Ｍｅｔ５，Ａｒｇ６］−エンケファリン；［Ｍｅｔ５，Ａｒｇ６−エンケファリン−Ａｒｇ；［Ｍｅｔ５，Ａｒｇ６，Ｐｈｅ７］−エンケファリン，アミド；Ｍｅｔ−エンケファリン；ビオチニル−Ｍｅｔ−エンケファリン；［Ｄ−Ａｌａ２］−Ｍｅｔ−エンケファリン；［Ｄ−Ａｌａ２］−Ｍｅｔ−エンケファリン，アミド；Ｍｅｔ−エンケファリン−Ａｒｇ−Ｐｈｅ；Ｍｅｔ−エンケファリン，アミド；［Ａｌａ２］−Ｍｅｔ−エンケファリン，アミド；［ＤＭｅｔ２，プロ５］−エンケファリン，アミド；［ＤＴｒｐ２］−Ｍｅｔ−エンケファリン，アミド，メトルフィンアミド（アドレノルフィン）；ペプチドＢ、ウシ；３２００ダルトン副腎ペプチドＥ、ウシ；ペプチドＦ、ウシ；プレプロエンケファリンＢ１８６−２０４、ヒト；スピノルフィン、ウシ；及びチオルファン（Ｄ，Ｌ，３−メルカプト−２−ベンジルプロパノイル−グリシン）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２３８】
フィブロネクチンペプチドには、血小板因子−４（５８−７０）、ヒト；エチスタチン（ｅｃｈｉｓｔａｔｉｎ）（Ｅｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ）；Ｅ，Ｐ，Ｌセレクチン保存された領域；フィブロネクチン類縁体；フィブロネクチン−結合タンパク質；フィブリノペプチドＡ、ヒト；［Ｔｙｒ０］−フィブリノペプチドＡ、ヒト；フィブリノペプチドＢ、ヒト；［ＧＩｕ１］−フィブリノペプチドＢ、ヒト；［Ｔｙｒ１５］−フィブリノペプチドＢ、ヒト；２４−４２のフィブリノーゲンβ鎖断片；フィブリノーゲン結合阻害剤ペプチド；フィブロネクチン関連ペプチド（コラーゲン結合断片）；繊維素溶解阻害因子；ＦＮ−Ｃ／Ｈ−１（フィブロネクチンヘパリン結合断片）；ＦＮ−Ｃ／Ｈ−Ｖ（フィブロネクチンヘパリン結合断片）；ヘパリン結合ペプチド；ラミニンペンタペプチド，アミド；Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−ＮＨ２（ＬＤＶ−ＮＨ２）、ヒト、ウシ、ラット、ニワトリ；ネクロフェブリン、ヒト；ネクロフィブリン、ラット；及び血小板膜糖タンパク質ＩＩＢペプチド２９６−３０６が含まれるが、これらに限定されない。
【０２３９】
ガラニンペプチドには、ガラニン、ヒト；ガラニン１−１９、ヒト；プレプロガラニン１−３０、ヒト；プレプロガラニン６５−８８、ヒト；プレプロガラニン８９−１２３、ヒト；ガラニン、ブタ；ガラニン１−１６、ブタ、ラット；ガラニン、ラット；ビオチニル−ガラニン、ラット；プレプロガラニン２８−６７、ラット；ガラニン１−１３−ブラジキニン２−９，アミド；Ｍ４０，ガラニンｌ−１３−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−（Ａｌａ−Ｌｅｕ）２−Ａｌａ−アミド；Ｃ７，ガラニン１−１３−スパンチド−アミド；ＧＭＡＰ１−４１，アミド；ＧＭＡＰ１６−４１，アミド；ＧＭＡＰ２５−４１，アミド；ガランチド；及びエンテロ−カシニンが含まれるが、これらに限定されない。
【０２４０】
ガストリンペプチドには、ガストリン、ニワトリ；胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）、ヒト；ガストリンＩ、ヒト；ビオチニル−ガストリンＩ、ヒト；ビッグガストリン−１、ヒト；ガストリン放出ペプチド、ヒト；ガストリン放出ペプチド１−１６、ヒト；胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）、ブタ；ガストリン放出ペプチド、ブタ；ビオチニル−ガストリン放出ペプチド、ブタ；ガストリン放出ペプチド１４−２７、ブタ、ヒト；リトルガストリン、ラット；ペンタガストリン；胃抑制ペプチド１−３０、ブタ；胃抑制ペプチド１−３０、アミド、ブタ；［Ｔｙｒ０−胃抑制ペプチド２３−４２、ヒト；及び胃抑制ペプチド、ラットが含まれるが、これらに限定されない。
【０２４１】
グルカゴンペプチドには、［Ｄｅｓ−Ｈｉｓ１，Ｇｌｕ９］−グルカゴン、エキセンディン−４、グルカゴン、ヒト；ビオチニル−グルカゴン、ヒト；グルカゴン１９−２９、ヒト；グルカゴン２２−２９、ヒト；［Ｄｅｓ−Ｈｉｓ１−Ｇｌｕ９］−グルカゴン，アミド；グルカゴン様ペプチド１，アミド；グルカゴン様ペプチド１、ヒト；グルカゴン様ペプチド１（７−３６）；グルカゴン様ペプチド２、ラット；ビオチニル−グルカゴン様ペプチド−１（７−３６）（ビオチニル−プレプログルカゴン７８−１０７、アミド）；グルカゴン様ペプチド２、ヒト；介在ペプチド−２；オキシントモデュリン／グルカゴン３７；及びバロシン（ペプチドＶＱＹ）、ブタが含まれるが、これらに限定されない。
【０２４２】
Ｇｎ−ＲＨ関連ペプチド（ＧＡＰ）には、Ｇｎ−ＲＨ関連ペプチド２５−５３、ヒト；Ｇｎ−ＲＨ関連ペプチド１−２４、ヒト；Ｇｎ−ＲＨ関連ペプチド１−１３、ヒト；Ｇｎ−ＲＨ関連ペプチド１−１３、ラット；生殖腺刺激ホルモン放出ペプチド，甲状腺濾胞腺癌、ヒト；［Ｔｙｒ０］−ＧＡＰ（［Ｔｙｒ０］−Ｇｎ−ＲＨ前駆体ペプチド１４−６９）、ヒト；及びプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）前駆体２７−５２、ブタが含まれるが、これらに限定されない。
【０２４３】
成長因子ペプチドには、細胞成長因子；上皮成長因子；腫瘍成長因子；α−ＴＧＦ；β−ＴＦ；α−ＴＧＦ３４−４３、ラット；ＥＧＦ、ヒト；酸性繊維芽細胞成長因子；塩基性繊維芽細胞成長因子；塩基性繊維芽細胞成長因子１３−１８；塩基性繊維芽細胞成長因子１２０−１２５；脳由来酸性繊維芽細胞成長因子１−１１；脳由来塩基性繊維芽細胞成長因子１−２４；脳由来酸性繊維芽細胞成長因子１０２−１１１；［Ｃｙｓ（Ａｃｍ２０，３１）］−上皮成長因子２０−３１；上皮成長因子受容体ペプチド９８５−９９６；インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ニワトリ；ＩＧＦ−Ｉ、ラット；ＩＧＦ−Ｉ、ヒト；Ｄｅｓ（１−３）ＩＧＦ−Ｉ、ヒト；Ｒ３  ＩＧＦ−Ｉ、ヒト；Ｒ３  ＩＧＦ−Ｉ、ヒト；ロングＲ３  ＩＧＦ−Ｉ、ヒト；アジュバントペプチド類縁体；食欲減退ペプチド；Ｄｅｓ（１−６）ＩＧＦ−ＩＩ、ヒト；Ｒ６  ＩＧＦ−ＩＩ、ヒト；ＩＧＦ−Ｉ類縁体；ＩＧＦＩ（２４−４１）；ＩＧＦＩ（５７−７０）；ＩＧＦＩ（３０−４１）；ＩＧＦＩＩ；ＩＧＦＩＩ（３３−４０）；［Ｔｙｒ０］−ＩＧＦＩＩ（３３−４０）；肝細胞成長因子；ミッドカイン；ミッドカイン６０−１２１、ヒト；Ｎ−アセチル，α−ＴＧＦ３４−４３、メチルエステル、ラット；神経細胞成長因子（ＮＧＦ）、マウス；血小板由来成長因子；血小板由来成長因子アンタゴニスト；形質転換成長因子−α、ヒト；及び形質転換成長因子−Ｉ、ラットに含まれるが、これらに限定されない。
【０２４４】
成長ホルモンペプチドには、成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト；成長ホルモン１−４３、ヒト；成長ホルモン６−１３、ヒト；成長ホルモン放出因子、ヒト；成長ホルモン放出因子、ウシ；成長ホルモン放出因子、ブタ；成長ホルモン放出因子１−２９，アミド、ラット；成長ホルモン放出促進因子、ヒト；ビオチニル−成長ホルモン放出因子、ヒト；成長ホルモン放出因子１−２９，アミド、ヒト；［Ｄ−Ａｌａ２］−成長ホルモン放出因子１−２９、アミド、ヒト；［Ｎ−Ａｃ−Ｔｙｒ１，Ｄ−Ａｒｇ２］−ＧＲＦ１−２９、アミド；［Ｈｉｓ１，Ｎｌｅ２７］−成長ホルモン放出因子１−３２，アミド；成長ホルモン放出因子１−３７、ヒト；成長ホルモン放出因子１−４０、ヒト；成長ホルモン放出因子１−４０，アミド、ヒト；成長ホルモン放出因子３０−４４，アミド、ヒト；成長ホルモン放出因子、マウス；成長ホルモン放出因子、ヒツジ；成長ホルモン放出因子、ラット；ビオチニル−成長ホルモン放出因子、ラット；ＧＨＲＰ−６（［Ｈｉｓ１，Ｌｙｓ６Ｊ−ＧＨＲＰ）；ヘキサレリン（成長ホルモン放出ヘキサペプチド）；及び［Ｄ−Ｌｙｓ３］−ＧＨＲＰ−６が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４５】
ＧＴＰ結合タンパク質断片ペプチドには、［Ａｒｇ８］−ＧＴＰ−結合タンパク質断片，Ｇｓα；ＧＴＰ結合タンパク質断片、Ｇβ；ＧＴＰ結合タンパク質断片，Ｇα；ＧＴＰ結合タンパク質断片、Ｇｏα；ＧＴＰ結合タンパク質断片、Ｇｓα；及びＧＴＰ結合タンパク質断片，Ｇαｉ２が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４６】
グアニリンペプチドには、グアニリン、ヒト；グアニリン、ラット；及びウログアニリンが含まれるがこれらに限定されない。
【０２４７】
インヒビンペプチドには、インヒビン、ウシ；インヒビン、α−サブユニット１−３２、ヒト；［Ｔｙｒ０］−インヒビン，α−サブユニット１−３２、ヒト；精漿インヒビン様ペプチド、ヒト；［Ｔｙｒ０］−精漿インヒビン様ペプチド、ヒト；インヒビン，α−サブユニット１−３２、ブタ；及び［Ｔｙｒ０］−インヒビン，α−サブユニット１−３２、ブタが含まれるが、これらに限定されない。
【０２４８】
インシュリンペプチドには、インシュリン、ヒト；インシュリン、ブタ；ＩＧＦ−Ｉ、ヒト；インシュリン様成長因子ＩＩ（６９−８４）；プロインシュリン様成長因子ＩＩ（６８−１０２）、ヒト；プロインシュリン様成長因子ＩＩ（１０５−１２８）、ヒト；［ＡｓｐＢ２８］−インシュリン、ヒト；［ＬｙｓＢ２８］−インシュリン、ヒト；［ＬｅｕＢ２８］−インシュリン、ヒト；［ＶａｌＢ２８］−インシュリン、ヒト；［ＡｌａＢ２８］−インシュリン、ヒト；［ＡｓｐＢ２８，ＰｒｏＢ２９］−インシュリン、ヒト；［ＬｙｓＢ２８，ＰｒｏＢ２９］−インシュリン、ヒト；［ＬｅｕＢ２８，ＰｒｏＢ２９］−インシュリン、ヒト；［ＶａｌＢ２８，ＰｒｏＢ２９］−インシュリン、ヒト；［ＡｌａＢ２８，ＰｒｏＢ２９］−インシュリン、ヒト；［ＧｌｙＡ２１］−インシュリン；［ＧｌｙＡ２１，ＧｌｎＢ３］−インシュリン、ヒト；［ＡｌａＡ２１］−インシュリン、ヒト；［ＡｌａＡ２１Ｇｌｎ．ｓｕｐ．Ｂ３］インシュリン、ヒト；［ＧｌｎＢ３］−インシュリン、ヒト；［ＧｌｎＢ３０］−インシュリン、ヒト；［ＧｌｙＡ２１，ＧｌｕＢ３０］−インシュリン、ヒト；［ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０］−インシュリン、ヒト；［ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３°］−インシュリン、ヒト；Ｂ２２−Ｂ３０インシュリン、ヒト；Ｂ２３−Ｂ３０インシュリン、ヒト；Ｂ２５−Ｂ３０インシュリン、ヒト；Ｂ２６−Ｂ３０インシュリン、ヒト；Ｂ２７−Ｂ３０インシュリン、ヒト；Ｂ２９−Ｂ３０インシュリン、ヒト；ヒトインシュリンのＡ鎖及びヒトインシュリンのＢ鎖が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４９】
インターロイキンペプチドには、インターロイキン−１β１６５−１８１、ラット；及びインターロイキン−８（ＩＬ−８，ＣＩＮＣ／ｇｒｏ）、ラットが含まれるが、これらに限定されない。
【０２５０】
ラミニンペプチドには、ラミニン；α（Ｉ）−ＣＢ３  ４３５−４３８、ラット；及びラミニン結合阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０２５１】
レプチンペプチドには、レプチン９３−１０５、ヒト；レプチン２２−５６、ラット；Ｔｙｒ−レプチン２６−３９、ヒト；及びレプチン１１６−１３０、アミド、マウスが含まれるが、これらに限定されない。
【０２５２】
ロイコキニンペプチドには、ロイコミオサプレッシン（ｌｅｕｃｏｍｙｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎ）（ＬＭＳ）；ロイコピロキニン（ＬＰＫ）；ロイコキニンＩ；ロイコキニンＩＩ；ロイコキニンＩＩＩ；ロイコキニンＩＶ；ロイコキニンＶＩ；ロイコキニンＶＩＩ；及びロイコキニンＶＩＩＩが含まれるが、これらに限定されない。
【０２５３】
黄体形成ホルモン−放出ホルモンペプチドには、アンチド（ａｎｔｉｄｅ）；Ｇｎ−ＲＨＩＩ、ニワトリ；黄体形成ホルモン−放出ホルモン（ＬＨ−ＲＨ）（ＧｎＲＨ）；ビオチニル−ＬＨ−ＲＨ；セトロレリックス（ｃｅｔｒｏｒｅｌｉｘ）（Ｄ−２０７６１）；［Ｄ−Ａｌａ６］−ＬＨ−ＲＨ；［Ｇｌｎ８］−ＬＨ−ＲＨ（ニワトリＬＨ−ＲＨ）；［ＤＬｅｕ６，Ｖａｌ７］ＬＨ−ＲＨ１−９、エチルアミド；［Ｄ−Ｌｙｓ６］−ＬＨ−ＲＨ；［Ｄ−Ｐｈｅ２，Ｐｒｏ３，Ｄ−Ｐｈｅ６］−ＬＨ−ＲＨ；［ＤＰｈｅ２，ＤＡｌａ６］ＬＨ−ＲＨ；［Ｄｅｓ−Ｇｌｙｌｏ］−ＬＨ−ＲＨ，エチルアミド；［Ｄ−Ａｌａ６，Ｄｅｓ−Ｇｌｙ１０］−ＬＨ−ＲＨ、エチルアミド；［ＤＴｒｐ６］−ＬＨ−ＲＨ、エチルアミド；［Ｄ−Ｔｒｐ６，Ｄｅｓ−Ｇｌｙ１０］−ＬＨ−ＲＨ、エチルアミド（Ｄｅｓｌｏｒｅｌｉｎ）；［ＤＳｅｒ（Ｂｕｔ）６，Ｄｅｓ−Ｇｌｙ１０］−ＬＨ−ＲＨ，エチルアミド；エチルアミド；ロイプロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）；ＬＨ−ＲＨ  ４−１０；ＬＨ−ＲＨ  ７−１０；ＬＨ−ＲＨ、遊離酸；ＬＨ−ＲＨ、ヤツメウナギ（ｌａｎｐｒｅｙ）；ＬＨ−ＲＨ、サケ；［Ｌｙｓ８］−ＬＨ−ＲＨ；［Ｔｒｐ７，Ｌｅｕ８］ＬＨ−ＲＨ、遊離酸；及び［（ｔ−Ｂｕ）ＤＳｅｒ６，（Ａｚａ）Ｇｌｙｌｏ］−ＬＨ−ＲＨが含まれるが、これらに限定されない。
【０２５４】
マストパランペプチドには、マストパラン；ｍａｓ７；ｍａｓ８；ｍａｓ１７；及びマストパランＸが含まれるが、これらに限定されない。
【０２５５】
肥満細胞脱顆粒ペプチドには、肥満細胞脱顆粒ペプチドＨＲ−１；及び肥満細胞脱顆粒ペプチドＨＲ−２が含まれるが、これらに限定されない。
【０２５６】
メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）ペプチドには、［Ａｃ−Ｃｙｓ４，ＤＰｈｅ７，Ｃｙｓ１０］α−ＭＳＨ４−１３，アミド；α−メラニン細胞刺激ホルモン；α−ＭＳＨ，遊離酸；β−ＭＳＨ、ブタ；ビオチニル−α−メラニン細胞刺激ホルモン；ビオチニル−［Ｎｌｅ４，Ｄ−Ｐｈｅ７］α−メラニン細胞刺激ホルモン；［Ｄｅｓ−アセチル］−α−ＭＳＨ；［ＤＰｈｅ７］−α−ＭＳＨ、アミド；γ−１−ＭＳＨ、アミド；［Ｌｙｓ０］−γ−１−ＭＳＨ，アミド；ＭＳＨ放出阻害因子アミド；［Ｎｌｅ４］−α−ＭＳＨ、アミド；［ＮＩｅ４，Ｄ−Ｐｈｅ７］−α−ＭＳＨ；Ｎ−アセチル，［Ｎｌｅ４，ＤＰｈｅ７］α−ＭＳＨ  ４−１０、アミド；β−ＭＳＨ、ヒト；及びγ−ＭＳＨが含まれるが、これらに限定されない。
【０２５７】
モルフィセプチンペプチドには、モルフィセプチン（β−キャソモルフィン１−４アミド）；［Ｄ−プロ４］−モルフィセプチン；及び［Ｎ−ＭｅＰｈｅ３，Ｄ−Ｐｒｏ４］−モルフィセプチンが含まれるが、これらに限定されない。
【０２５８】
モチリンペプチドには、モチリン、イヌ；モチリン、ブタ；ビオチニル−モチリン、ブタ；及び［Ｌｅｕ１３］−モチリン、ブタが含まれるが、これらに限定されない。
【０２５９】
ニューロペプチドには、Ａｃ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ；メノウアフリカマイマイ（ａｃｈａｔｉｎａ）心臓興奮ペプチド−１（ＡＣＥＰ−Ｉ）（Ａｃｈａｔｉｎａ  ｆｕｌｉｃａ）；脂質動員ホルモン（ＡＫＨ）（Ｌｏｃｕｓｔ）；脂質動員ホルモン（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｚｅａ及びＭａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ）；アリテシン（ａｌｙｔｅｓｉｎ）；Ｔａｂａｎｕｓ  ａｔｒａｔｕｓ脂質動員ホルモン（Ｔａａ−ＡＫＨ）；脂質動員ホルモンＩＩ（Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ）；脂質動員ホルモンＩＩ（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒａ  ｇｒｅｇａｒｉａ）；脂質動員ホルモンＩＩＩ（ＡＫＨ−３）；脂質動員ホルモンＧ（ＡＫＨ−Ｇ）（Ｇｒｙｌｌｕｓ  ｂｉｍａｃｕｌａｔｕｓ）；アラトトロピン（ＡＴ）（Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ）；アラトトロピン６−１３（Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ）；ＡＰＧＷアミド（Ｌｙｍｎａｅａ  ｓｔａｇｎａｌｉｓ）；ブッカリン（ｂｕｃｃａｌｉｎ）；セレベリン（ｃｅｒｅｂｅｌｌｉｎ）；［Ｄｅｓ−Ｓｅｒ１］−セレベリン；コラゾニン（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｃｋｒｏａｃｈ  Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）；甲殻類心臓作用ペプチド（ＣＣＡＰ）；甲殻類赤色素胞；ＤＦ２（プロｃａｍｂａｒｕｓ  ｃｌａｒｋｉｉ）；ジアゼパム結合阻害剤断片、ヒト；ジアゼパム結合阻害剤断片（ＯＤＮ）；エレドイシン（ｅｌｅｄｏｉｓｉｎ）関連ペプチド；ＦＭＲＦアミド（軟体動物心臓興奮ニューロペプチド）；Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（ＧＰＥ）、ヒト；グラニュリベリン（ｇｒａｎｕｌｉｂｅｒｉｎ）Ｒ；頭部活性化因子（ｈｅａｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）ニューロペプチド；［Ｈｉｓ７］−コラゾニン；ナナフシ高トレハロース血症因子ＩＩ；Ｔａｂａｎｕｓ  ａｔｒａｔｕｓ低トレハロース血症ホルモン（Ｔａａ−ＨｏＴＨ）；イソグバシン塩酸塩（ｉｓｏｇｕｖａｃｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；ビククリンメチオダイド（ｂｉｃｕｃｕｌｌｉｎｅ  ｍｅｔｈｉｏｄｉｄｅ）；ピペリジン−４−スルホン酸；プロオピオメラノコルチンの接合ペプチド（ＰＯＭＣ）、ウシ；接合ペプチド、ラット；ＫＳＡＹＭＲＦアミド（Ｐ．ｒｅｄｉｖｉｖｕｓ）；カッシニン（ｋａｓｓｉｎｉｎ）；キネテンシン（ｋｉｎｅｔｅｎｓｉｎ）；レビチド（ｌｅｖｉｔｉｄｅ）；リトリン（ｌｉｔｏｒｉｎ）；ＬＵＱ８１−９１（Ａｐｌｙｓｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）；ＬＵＱ８３−９１（Ａｐｌｙｓｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）；筋肉作用ペプチドＩ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔｉｎ  ＣＣ−１）（ニューロホルモンＤ）；筋肉作用ペプチドＩＩ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔｉｎ  ＣＣ−２）；ミオモジュリン；神経細胞特異的ペプチド；神経細胞特異的エノラーゼ４０４−４４３、ラット；ニューロペプチドＦＦ；ニューロペプチドＫ、ブタ；ＮＥＩ（プレプロＭＣＨ  １３１−１４３）ニューロペプチド、ラット；ＮＧＥ（プレプロ−ＭＣＨ１１０−１２８）ニューロペプチド、ラット；ＮＦｌ（Ｐｒｏｃａｍｂａｒｕｓ  ｃｌａｒｋｉｉ）；ＰＢＡＮ−Ｉ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）；Ｈｅｚ−ＰＢＡＮ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｚｅａ）；ＳＣＰＢ（アメフラシ由来の心臓作用ペプチド）；セクレトニューリン、ラット；ウペロレイン；ウレキスタキキニンＩ；��レキスタキキニンＩＩ；ゼノプシン（ｘｅｎｏｐｓｉｎ）関連ペプチドＩ；ゼノプシン関連ペプチドＩＩ；ペダルペプチド（Ｐｅｐ）、アメフラシ；ペプチドＦｌ、イセエビ、フィロメデュシン；ポリステスマストパラン；プロクトリン；ラナテンシン；Ｒｏ  Ｉ（Ｌｕｂｂｅｒ  Ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ，Ｒｏｍａｌｅａ  ｍｉｃｒｏｐｔｅｒａ）；Ｒｏ  ＩＩ（Ｌｕｂｂｅｒ  Ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ，Ｒｏｍａｌｅａ  ｍｉｃｒｏｐｔｅｒａ）；ＳＡＬＭＦアミド１（Ｓｌ）；ＳＡＬＭＦアミド２（Ｓ２）；及びＳＣＰＡが含まれるが、これらに限定されない。
【０２６０】
ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）ペプチドには、［Ｌｅｕ３１，プロ３４］−ニューロペプチドＹ、ヒト；ニューロペプチドＦ（Ｍｏｎｉｅｚｉａ  ｅｘｐａｎｓａ）；Ｂ１ＢＰ３２２６  ＮＰＹアンタゴニスト；Ｂｉｓ（３１／３１’）｛［Ｃｙｓ３１，Ｔｒｐ３２，Ｎｖａ３４］ＮＰＹ３１−３６｝；ニューロペプチドＹ、ヒト、ラット；ニューロペプチドＹ１−２４アミド、ヒト；ビオチニル−ニューロペプチドＹ；［Ｄ−Ｔｙｒ２７，３６，Ｄ−Ｔｈｒ３２］−ＮＰＹ２７−３６；Ｄｅｓ１０−１７（シクロ７−２１）［Ｃｙｓ７，２１，Ｐｒｏ３４］−ＮＰＹ；Ｃ２−ＮＰＹ；［Ｌｅｕ３１，Ｐｒｏ３４］ニューロペプチドＹ、ヒトニューロペプチドＹ、遊離酸、ヒト；ニューロペプチドＹ、遊離酸、ブタ；プレプロＮＰＹ６８−９７、ヒト；Ｎ−アセチル−［Ｌｅｕ２８，Ｌｅｕ３１］ＮＰＹ２４−３６；ニューロペプチドＹ、ブタ；［Ｄ−Ｔｒｐ３２］−ニューロペプチドＹ、ブタ；［Ｄ−Ｔｒｐ３２］ＮＰＹ１−３６、ヒト；［Ｌｅｕ１７，ＤＴｒｐ３２］ニューロペプチドＹ、ヒト；［Ｌｅｕ３１，Ｐｒｏ３４］−ＮＰＹ、ブタ；ＮＰＹ２−３６、ブタ；ＮＰＹ３−３６、ヒト；ＮＰＹ３−３６、ブタ；ＮＰＹ１３−３６、ヒト；ＮＰＹ１３−３６、ブタ；ＮＰＹ１６−３６、ブタ；ＮＰＹ１８−３６、ブタ；ＮＰＹ２０−３６；ＮＦＹ２２−３６；ＮＰＹ２６−３６；［Ｐｒｏ３４］−ＮＰＹ１−３６、ヒト；［Ｐｒｏ３４］−ニューロペプチドＹ、ブタ；ＰＹＸ−Ｉ；ＰＹＸ−２；Ｔ４−［ＮＰＹ（３３−３６）］４；及びＴｙｒ（ＯＭｅ）２１］−ニューロペプチドＹ、ヒトが含まれるが、これらに限定されない。
【０２６１】
神経栄養因子ペプチドには、膠細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；及び繊毛神経栄養因子（ＣＮＴＦ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２６２】
オレキシンペプチドには、オレキシンＡ；オレキシンＢ、ヒト；オレキシンＢ、ラット、マウスが含まれるが、これらに限定されない。
【０２６３】
オピオイドペプチドには、α−カゼイン断片９０−９５；ＢＡＭ−１８Ｐ；キャソモキニン（ｃａｓｏｍｏｋｉｎｉｎ）Ｌ；キャソキシン（ｃａｓｏｘｉｎ）Ｄ；クリスタリン（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ）；ＤＡＬＤＡ；デルムエンケファリン（ｄｅｒｍｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ）（デルトルフィン）（Ｐｈｙｌｏｍｅｄｕｓａ  ｓａｕｖａｇｅｉ）；［Ｄ−Ａｌａ２］−デルトルフィンＩ；［Ｄ−Ａｌａ２］−デルトルフィンＩＩ；エンドモルフィン−１；エンドモルフィン−２；キョートルフィン；［ＤＡｒｇ２］−キョートルフィン；モルヒネ耐性ペプチド；モルヒネ調節ペプチド，Ｃ末端断片；モルヒネ調節ニューロペプチド（Ａ−１８−Ｆ−ＮＨ２）；ノイセプチン［オルファニンＦＱ］（ＯＲＬｌアゴニスト）；ＴＩＰＰ；Ｔｙｒ−ＭＩＦ−１；Ｔｙｒ−Ｗ−ＭＩＦ−１；バロルフィン；ＬＷ−ヘモルフィン−６、ヒト；Ｌｅｕ−バロルフィン−Ａｒｇ；及びＺ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｅｕが含まれるが、これらに限定されない。
【０２６４】
オキシトシンペプチドには、［Ａｓｕ６］−オキシトシン；オキシトシン；ビオチニル−オキシトシン；［Ｔｈｒ４，Ｇｌｙ７］−オキシトシン；及びトシノイン酸（ｔｏｃｉｎｏｉｃａｃｉｄ）（［Ｉｌｅ３］−プレシノイン酸（ｐｒｅｓｓｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ））が含まれるが、これらに限定されない。
【０２６５】
ＰＡＣＡＰ（下垂体アデニル化シクラーゼ活性化ペプチド；ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ａｄｅｎｙｌａｔｉｎｇ  ｃｙｃｌａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）ペプチドには、ＰＡＣＡＰ１−２７、ヒト、ヒツジ、ラット；ＰＡＣＡＰ（ｌ−２７）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ２、ヒト；［Ｄｅｓ−Ｇｌｎ１６］−ＰＡＣＡＰ６−２７、ヒト、ヒツジ、ラット；ＰＡＣＡＰ３８、カエル；ＰＡＣＡＰ２７−ＮＨ２、ヒト、ヒツジ、ラット；ビオチニル−ＰＡＣＡＰ２７−ＮＨ２、ヒト、ヒツジ、ラット；ＰＡＣＡＰ６−２７、ヒト、ヒツジ、ラット；ＰＡＣＡＰ３８、ヒト、ヒツジ、ラット；ビオチニル−ＰＡＣＡＰ３８、ヒト、ヒツジ、ラット；ＰＡＣＡＰ６−３８、ヒト、ヒツジ、ラット；ＰＡＣＡＰ２７−ＮＨ２、ヒト、ヒツジ、ラット；ビオチニル−ＰＡＣＡＰ２７−ＮＨ２、ヒト、ヒツジ、ラット；ＰＡＣＡＰ６−２７、ヒト、ヒツジ、ラット；ＰＡＣＡＰ３８、ヒト、ヒツジ、ラット；ビオチニル−ＰＡＣＡＰ３８、ヒト、ヒツジ、ラット；ＰＡＣＡＰ６−３８、ヒト、ヒツジ、ラット；ＰＡＣＡＰ３８  １６−３８、ヒト、ヒツジ、ラット；ＰＡＣＡＰ３８  ３１−３８、ヒト、ヒツジ、ラット；ＰＡＣＡＰ３８  ３１−３８、ヒト、ヒツジ、ラット；ＰＡＣＡＰ−関連ペプチド（ＰＲＰ）、ヒト；及びＰＡＣＡＰ−関連ペプチド（ＰＲＰ）、ラットが含まれるが、これらに限定されない。
【０２６６】
パンクレアスタチンペプチドには、クロモスタチン、ウシ；パンクレアスタチン（ｈＰＳＴ−５２）（クロモグラニンＡ２５０−３０１，アミド）；パンクレアスタチン２４−５２（ｈＰＳＴ−２９）、ヒト；クロモグラニンＡ２８６−３０１，アミド、ヒト；パンクレアスタチン、ブタ；ビオチニル−パンクレアスタチン、ブタ；［Ｎｌｅ８］−パンクレアスタチン、ブタ；［Ｔｙｒ０，Ｎｌｅ８］−パンクレアスタチン、ブタ；［Ｔｙｒ０］−パンクレアスタチン、ブタ；パラスタチン１−１９（クロモグラニンＡ３４７−３６５）、ブタ；パンクレアスタチン（クロモグラニンＡ２６４−３１４−アミド、ラット；ビオチニル−パンクレアスタチン（ビオチニル−クロモグラニンＡ２６４−３１４−アミド；［Ｔｙｒ０］−パンクレアスタチン、ラット；パンクレアスタチン２６−５１、ラット；及びパンクレアスタチン３３−４９、ブタが含まれるが、これらに限定されない。
【０２６７】
膵臓ポリペプチドには、膵臓ポリペプチド、トリ；膵臓ポリペプチド、ヒト；Ｃ−断片膵臓ポリペプチド酸、ヒト；Ｃ−断片膵臓ポリペプチドアミド、ヒト；膵臓ポリペプチド（Ｒａｎａ  ｔｅｍｐｏｒａｒｉａ）；膵臓ポリペプチド、ラット；及び膵臓ポリペプチド、サケが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２６８】
副甲状腺ホルモンペプチドには、［Ａｓｐ７６−副甲状腺ホルモン３９−８４、ヒト；［Ａｓｐ７６］−副甲状腺ホルモン５３−８４、ヒト；［Ａｓｎ７６］−副甲状腺ホルモン１−８４，ホルモン；［Ａｓｎ７６］−副甲状腺ホルモン６４−８４、ヒト；［Ａｓｎ８，Ｌｅｕ１８］−副甲状腺ホルモン１−３４、ヒト；［Ｃｙｓ５，２８］−副甲状腺ホルモン１−３４、ヒト；高カルシウム血症悪性腫瘍因子１−４０；［Ｌｅｕ１８］−副甲状腺ホルモン１−３４、ヒト；［Ｌｙｓ（ビオチニル）１３，Ｎｌｅ８，１８，Ｔｙｒ３４］−副甲状腺ホルモン１−３４アミド；［Ｎｌｅ８，１８，Ｔｙｒ３４］−副甲状腺ホルモン１−３４アミド；［Ｎｌｅ８，１８，Ｔｙｒ３４］−副甲状腺ホルモン３−３４アミド、ウシ；［Ｎｌｅ８，１８，Ｔｙｒ３４］−副甲状腺ホルモン１−３４、ヒト；［Ｎｌｅ８，１８，Ｔｙｒ３４］−副甲状腺ホルモン１−３４アミド  ヒト；［Ｎｌｅ８，１８，Ｔｙｒ３４］−副甲状腺ホルモン３−３４アミド、ヒト；［Ｎｌｅ８，１８，Ｔｙｒ３４］−副甲状腺ホルモン７−３４アミド、ウシ；［Ｎｌｅ８，２１，Ｔｙｒ３４］−副甲状腺ホルモン１−３４アミド、ラット；副甲状腺ホルモン４４−６８、ヒト；副甲状腺ホルモン１−３４、ウシ；副甲状腺ホルモン３−３４、ウシ；副甲状腺ホルモン１−３１アミド、ヒト；副甲状腺ホルモン１−３４、ヒト；副甲状腺ホルモン１３−３４、ヒト；副甲状腺ホルモン１−３４、ラット；副甲状腺ホルモン１−３８、ヒト；副甲状腺ホルモン１−４４、ヒト；副甲状腺ホルモン２８−４８、ヒト；副甲状腺ホルモン３９−６８、ヒト；副甲状腺ホルモン３９−８４、ヒト；副甲状腺ホルモン５３−８４、ヒト；副甲状腺ホルモン６９−８４、ヒト；副甲状腺ホルモン７０−８４、ヒト；［Ｐｒｏ３４］−ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、ヒト；［Ｔｙｒ０］−高カルシウム血症悪性腫瘍因子１−４０；［Ｔｙｒ０］−副甲状腺ホルモン１−４４、ヒト；［Ｔｙｒ０］−副甲状腺ホルモン１−３４、ヒト；［Ｔｙｒ１］−副甲状腺ホルモン１−３４、ヒト；［Ｔｙｒ２７］−副甲状腺ホルモン２７−４８、ヒト；［Ｔｙｒ３４］−副甲状腺ホルモン７−３４アミド、ウシ；［Ｔｙｒ４３］−副甲状腺ホルモン４３−６８、ヒト；［Ｔｙｒ５２，Ａｓｎ７６］−副甲状腺ホルモン５２−８４、ヒト；及び［Ｔｙｒ６３］−副甲状腺ホルモン６３−８４、ヒトが含まれるが、これらに限定されない。
【０２６９】
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）−関連ペプチドには、ＰＴＨｒＰ（［Ｔｙｒ３６］−ＰＴＨｒＰ１−３６アミド）、ニワトリ；ｈＨＣＦ−（ｌ−３４）−ＮＨ２（液性高カルシウム血症因子）、ヒト；ＰＴＨ関連タンパク質１−３４、ヒト；ビオチニル−ＰＴＨ関連タンパク質１−３４、ヒト；［Ｔｙｒ０］−ＰＴＨ関連タンパク質１−３４、ヒト；［Ｔｙｒ３４］−ＰＴＨ関連タンパク質１−３４アミド、ヒト；ＰＴＨ関連タンパク質１−３７、ヒト；ＰＴＨ関連タンパク質７−３４アミド、ヒト；ＰＴＨ関連タンパク質３８−６４アミド、ヒト；ＰＴＨ関連タンパク質６７−８６アミド、ヒト；ＰＴＨ関連タンパク質１０７−１１１、ヒト、ラット、マウス；ＰＴＨ関連タンパク質１０７−１１１遊離酸；ＰＴＨ関連タンパク質１０７−１３８、ヒト；及びＰＴＨ−関連タンパク質１０９−１１１、ヒトが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２７０】
ペプチドＴペプチドには、ペプチドＴ；［Ｄ−Ａｌａ１］−ペプチドＴ；及び［Ｄ−Ａｌａ１］−ペプチドＴアミドが含まれるが、これらに限定されない。
【０２７１】
プロラクチン−放出ペプチドには、プロラクチン−放出ペプチド３１、ヒト；プロラクチン−放出ペプチド２０、ヒト；プロラクチン−放出ペプチド３１、ラット；プロラクチン−放出ペプチド２０、ラット；プロラクチン−放出ペプチド３１、ウシ；及びプロラクチン−放出ペプチド２０、ウシが含まれるが、これらに限定されない。
【０２７２】
ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）ペプチドには、ＰＹＹ、ヒト；ＰＹＹ３−３６、ヒト；ビオチニル−ＰＹＹ、ヒト；ＰＹＹ、ブタ、ラット；及び［Ｌｅｕ３１，Ｐｒｏ３４］−ＰＹＹ、ヒトが含まれるが、これらに限定されない。
【０２７３】
レニン基質ペプチドには、アセチル、アンギオテンシノーゲン１−１４、ヒト；アンギオテンシノーゲン１−１４、ブタ；レニン基質ペプチド、ラット；［Ｃｙｓ８］−レニン基質テトラデカペプチド、ラット；［Ｌｅｕ８］−レニン基質テトラデカペプチド、ラット；及び［Ｖａｌ８］−レニン基質テトラデカペプチド、ラットが含まれるが、これらに限定されない。
【０２７４】
セクレチンペプチドには、セクレチン、イヌ；セクレチン、ニワトリ；セクレチン、ヒト；ビオチニル−セクレチン、ヒト；セクレチン、ブタ；及びセクレチン、ラットが含まれるが、これらに限定されない。
【０２７５】
ソマトスタチン（ＧＩＦ）ペプチドには、ＢＩＭ−２３０２７；ビオチニル−ソマトスタチン；ビオチニル化されたコルチスタチン１７、ヒト；コルチスタチン１４、ラット；コルチスタチン１７、ヒト；［Ｔｙｒ０］−コルチスタチン１７、ヒト；コルチスタチン２９、ラット；［Ｄ−Ｔｒｐ８］−ソマトスタチン；［ＤＴｒｐ８，ＤＣｙｓ１４］−ソマトスタチン；［ＤＴｒｐ８，Ｔｙｒ１１］−ソマトスタチン；［Ｄ−Ｔｒｐ１１］−ソマトスタチン；ＮＴＢ（ナルトリベン（Ｎａｌｔｒｉｂｅｎ））；［Ｎｌｅ８］−ソマトスタチン１−２８；オクトレチド（ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ）（ＳＭＳ２０１−９９５）；プロソマトスタチン１−３２、ブタ；［Ｔｙｒ０］−ソマトスタチン；［Ｔｙｒ１］−ソマトスタチン；［Ｔｙｒ１］−ソマトスタチン２８（１−１４）；［Ｔｙｒ１１］−ソマトスタチン；［Ｔｙｒ０，Ｄ−Ｔｒｐ８］−ソマトスタチン；ソマトスタチン；ソマトスタチンアンタゴニスト；ソマトスタチン−２５；ソマトスタチン−２８；ソマトスタチン２８（１−１２）；ビオチニル−ソマトスタチン−２８；［Ｔｙｒ０］−ソマトスタチン−２８；［Ｌｅｕ８，Ｄ−Ｔｒｐ２２，Ｔｙｒ２５］−ソマトスタチン−２８；ビオチニル−［Ｌｅｕ８，Ｄ−Ｔｒｐ２２，Ｔｙｒ２５］−ソマトスタチン−２８；ソマトスタチン−２８（１−１４）；及びソマトスタチン類縁体、ＲＣ−１６０が含まれるが、これらに限定されない。
【０２７６】
サブスタンスＰペプチドには、Ｇタンパク質アンタゴニスト−２；Ａｃ−［Ａｒｇ６，Ｓａｒ９，Ｍｅｔ（０２）１１］−サブスタンスＰ６−１１；［Ａｒｇ３］−サブスタンスＰ；Ａｃ−Ｔｒｐ−３，５−ビス（トリフルオロメチル）ベンジルエステル；Ａｃ−［Ａｒｇ６，Ｓａｒ９，Ｍｅｔ（Ｏ２）１１］−サブスタンスＰ６−１１；［Ｄ−Ａｌａ４］−サブスタンスＰ４−１１；［Ｔｙｒ６，Ｄ−Ｐｈｅ７，Ｄ−Ｈｉｓ９］−サブスタンスＰ６−１１（センダイド（ｓｅｎｄｉｄｅ））；ビオチニル−サブスタンスＰ；ビオチニル−ＮＴＥ［Ａｒｇ３］−サブスタンスＰ；（Ｔｙｒ８］−サブスタンスＰ；［Ｓａｒ９，Ｍｅｔ（Ｏ２）１１］−サブスタンスＰ；［Ｄ−Ｐｒｏ２，ＤＴｒｐ７，９］−サブスタンスＰ；［Ｄ−Ｐｒｏ４，Ｏ−Ｔｒｐ７，９］−サブスタンスＰ４−１１；サブスタンスＰ４−１１；［ＤＴｒｐ２，７，９］−サブスタンスＰ；［（デヒドロ）Ｐｒｏ２，４，Ｐｒｏ９］−サブスタンスＰ；［デヒドロ−Ｐｒｏ４］−サブスタンスＰ４−１１；［Ｇｌｐ５，（Ｍｅ）Ｐｈｅ８，Ｓａｒ９］−サブスタンスＰ５−１１；［Ｇｌｐ５，Ｓａｒ９］−サブスタンスＰ５−１１；［Ｇｌｐ５］−サブスタンスＰ５−１１；ヘプタ−サブスタンスＰ（サブスタンスＰ５−１１）；ヘキサ−サブスタンスＰ（サブスタンスＰ６−１１）；［ＭｅＰｈｅ８，Ｓａｒ９］−サブスタンスＰ；［Ｎｌｅ１１］−サブスタンスＰ；オクタ−サブスタンスＰ（サブスタンスＰ４−１１）；［ｐＧｌｕ１］−ヘキサ−サブスタンスＰ（［ｐＧｌｕ６］−サブスタンスＰ６−１１）；［ｐＧｌｕ６，Ｄ−Ｐｒｏ９］−サブスタンスＰ６−１１；［（ｐＮＯ２）Ｐｈｅ７ＮＩｅ１１−サブスタンスＰ；ペンタ−サブスタンスＰ（サブスタンスＰ７−１１）；［Ｐｒｏ９］−サブスタンスＰ；ＧＲ７３６３２，サブスタンスＰ７−１１；［Ｓａｒ４］−サブスタンスＰ４−１１；［Ｓａｒ９］−サブスタンスＰ；セプチド（［ｐＧｌｕ６，Ｐｒｏ９］−サブスタンスＰ６−１１）；スパンチドＩ；スパンチドＩＩ；サブスタンスＰ；サブスタンスＰ、タラ；サブスタンスＰ、マス；サブスタンスＰアンタゴニスト；サブスタンスＰ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ；サブスタンスＰ１−４；サブスタンスＰ１−６；サブスタンスＰ１−７；サブスタンスＰ１−９；デカ−サブスタンスＰ（サブスタンスＰ２−１１）；ノナ−サブスタンスＰ（サブスタンスＰ３−１１）；サブスタンスＰテトラペプチド（サブスタンスＰ８−１１）；サブスタンストリペプチド（サブスタンスＰ９−１１）；サブスタンスＰ、遊離酸；サブスタンスＰメチルエステル及び［Ｔｙｒ８，Ｎｌｅ１１］サブスタンスＰが含まれるが、これらに限定されない。
【０２７７】
タキキニンペプチドには、［Ａｌａ５，β−Ａｌａ８］ニューロキニンＡ４−１０；エレドイシン；ロカスタタキキニンＩ（Ｌｏｍ−ＴＫ−Ｉ）（Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ）；ロカスタタキキニンＩＩ（Ｌｏｍ−ＴＫ−ＩＩ）（Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ）；ニューロキニンＡ４−１０；ニューロキニンＡ（ニューロメディンＬ、サブスタンスＫ）；ニューロキニンＡ、タラ及びマス；ビオチニル−ニューロキニンＡ（ビオチニル−ニューロメディンＬ，ビオチニル−サブスタンスＫ）；［Ｔｙｒ０］−ニューロキニンＡ；［Ｔｙｒ６］−サブスタンスＫ；ＦＲ６４３４９；［Ｌｙｓ３，Ｇｌｙ８−（Ｒ）−γ−ラクタム−Ｌｅｕ９］−ニューロキニンＡ３−１０；ＧＲ８３０７４；ＧＲ８７３８９；ＧＲ９４８００；［β−Ａｌａ８］−ニューロキニンＡ４−１０；［Ｎｌｅ１０］−ニューロキニンＡ４−１０；［Ｔｒｐ７，β−Ａｌａ８］−ニューロキニンＡ４−１０；ニューロキニンＢ（ニューロメディンＫ）；ビオチニル−ニューロキニンＢ（ビオチニル−ニューロメディンＫ）；［ＭｅＰｈｅ７］−ニューロキニンＢ；［Ｐｒｏ７］−ニューロキニンＢ；［Ｔｙｒ０］−ニューロキニンＢ；ニューロメディンＢ、ブタ；ビオチニル−ニューロメディンＢ、ブタ；ニューロメディンＢ−３０、ブタ；ニューロメディンＢ−３２、ブタ；ニューロメディンＢ受容体アンタゴニスト；ニューロメディンＣ、ブタ；ニューロメディンＮ、ブタ；ニューロメディン（Ｕ−８）、ブタ；ニューロメディン（Ｕ−２５）、ブタ；ニューロメディンＵ、ラット；ニューロペプチド−γ（γ−プレプロタキキニン７２−９２）；ＰＧ−ＫＩＩ；フィロリトリン；［Ｌｅｕ８］−フィロリトリン（Ｐｈｙｌｌｏｍｅｄｕｓａ  ｓａｕｖａｇｅｉ）；フィサラエミン；フィサラエミン１−１１；シリオリニンＩＩ、アミド、サメ；センクチド、選択的ニューロキニンＢ受容体ペプチド；［Ｓｅｒ２］−ニューロメディンＣ；β−プレプロタキキニン６９−９１、ヒト；β−プレプロタキキニン１１１−１２９、ヒト；タキプレシンＩ；ゼノプシン；及びゼノプシン２５（ｘｅｎｉｎ２５）、ヒトが含まれるが、これらに限定されない。
【０２７８】
甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）ペプチドには、ビオチニル−甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン；［Ｇｌｕ１］−ＴＲＨ；Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−ジケトピペラジン；［３−Ｍｅ−Ｈｉｓ２］−ＴＲＨ；ｐＧｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−アミド；ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ；［Ｐｈｅ２］−ＴＲＨ；プレプロＴＲＨ５３−７４；プレプロＴＲＨ８３−１０６；プレプロＴＲＨ１６０−１６９（Ｐｓ４，ＴＲＨ−強化ペプチド）；プレプロ−ＴＲＨ１７８−１９９、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）；ＴＲＨ、遊離酸；ＴＲＨ−ＳＨプロ；及びＴＲＨ前駆体ペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【０２７９】
トキシンペプチドには、ω−アガトキシンＴＫ；アゲレニン（クモ、Ａｇｅｌｅｎａ  ｏｐｕｌｅｎｔａ）；アパミン（ミツバチ、Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）；カルシキュディン（ｃａｌｃｉｃｕｄｉｎｅ）（ＣａＣ）（グリーンマンバ、Ｄｅｄｒｏａｓｐｉｓ  ａｎｇｕｓｔｉｃｅｐｓ）；カルシセプチン（ブラックマンバ、Ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ  ｐｏｌｙｌｅｐｉｓ  ｐｏｌｙｌｅｐｉｓ）；カリブドトキシン（ＣｈＴＸ）（サソリ、Ｌｅｉｕｒｕｓ  ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ  ｖａｒ．  ｈｅｂｒａｅｕｓ）；クロロトキシン；コノトキシンＧＩ（ウミカタツムリ，Ｃｏｎｕｓ  ｇｅｏｇｒａｐｈｕｓ）；コノトキシンＧＳ（ウミカタツムリ，Ｃｏｎｕｓ  ｇｅｏｇｒａｐｈｕｓ）；コノトキシンＭＩ（Ｍａｒｉｎｅ  Ｃｏｎｕｓ  ｍａｇｕｓ）；α−コノトキシンＥＩ，Ｃｏｎｕｓ  ｅｒｍｉｎｅｕｓ；α−コノトキシンＳＩＡ；α−コノトキシンＩｍＩ；α−コノトキシンＳＩ（イモ貝，Ｃｏｎｕｓ  ｓｔｒｉａｔｕｓ）；ミクロ−コノトキシンＧＩＩＩＢ（ウミカタツムリ、Ｃｏｎｕｓ  ｇｅｏｇｒａｐｈｕｓ）；ω−コノトキシンＧＶＩＡ（ウミカタツムリ，Ｃｏｎｕｓ  ｇｅｏｇｒａｐｈｕｓ）；ω−コノトキシンＭＶＩＩＡ（Ｃｏｎｕｓ  ｍａｇｕｓ）；ω−コノトキシンＭＶＩＩＣ（Ｃｏｎｕｓ  ｍａｇｕｓ）；ω−コノトキシンＳＶＩＢ、（イモ貝、Ｃｏｎｕｓ  ｓｔｒｉａｔｕｓ）；エンドトキシン阻害剤；ジオグラフトキシンＩ（ＧＴＸ−Ｉ）（μ−コノトキシンＧＩＩＩＡ）；イベリオトキシン（ＩｂＴＸ）（サソリ，Ｂｕｔｈｕｓ  ｔａｍｕｌｕｓ）；カリオトキシン１−３７；カリオトキシン（サソリ、Ａｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓ  ｍａｕｒｅｔａｎｉｃｕｓ  ｍａｕｒｅｔａｎｉｃｕｓ）；肥満細胞脱顆粒ペプチド（ＭＣＤ−ペプチド、ペプチド４０１）；マルガトキシン（ＭｇＴＸ）（サソリ、Ｃｅｎｔｒｕｒｉｏｄｅｓ  Ｍａｒｇａｒｉｔａｔｕｓ）；ニューロトキシンＮＳＴＸ−３（パプアニューギニアスパイダー、Ｎｅｐｈｉｉｌｉａ  ｍａｃｕｌａｔａ）；ＰＬＴＸ−ＩＩ（クモ、Ｐｌｅｃｔｒｅｕｒｙｓ  ｔｒｉｓｔｅｓ）；シラトキシン（ｓｃｙｌｌａｔｏｘｉｎ）（レイウロトキシンＩ）；及びスチコダクチラトキシン（ＳｈＫ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２８０】
バソアクティブ・インテスティナル・ペプチド（ＶＩＰ／ＰＨＩ）には、ＶＩＰ、ヒト、ブタ、ラット、ヒツジ；ＶＩＰ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＮＨ２；ビオチニル−ＰＨＩ（ビオチニル−ＰＨＩ−２７）、ブタ；［ＧＩｐ１６］ＶＩＰ１６−２８、ブタ；ＰＨＩ（ＰＨＩ−２７）、ブタ；ＰＨＩ（ＰＨＩ−２７）、ラット；ＰＨＭ−２７（ＰＨＩ）、ヒト；プレプロＶＩＰ８１−１２２、ヒト；プレプロＶＩＰ／ＰＨＭ１１１−１２２；プレプロＶＩＰ／ＰＨＭ１５６−１７０；ビオチニル−ＰＨＭ−２７（ビオチニル−ＰＨＩ）、ヒト；バソアクティブ・インテスティナル・コントラクター（エンドセリンβ）、バソアクティブ・インテスティナル・オクタコサ−ペプチド、ニワトリ；バソアクティブ・インテスティナル・ペプチド、モルモット；ビオチニル−ＶＩＰ、ヒト、ブタ、ラット；バソアクティブ・インテスティナル・ペプチド１−１２、ヒト、ブタ、ラット；バソアクティブ・インテスティナル・ペプチド１０−２８、ヒト、ブタ、ラット；バソアクティブ・インテスティナル・ペプチド１１−２８、ヒト、ブタ、ラット、ヒツジ；バソアクティブ・インテスティナル・ペプチド（タラ、Ｇａｄｕｓｍｏｒｈｕａ）；バソアクティブ・インテスティナル・ペプチド６−２８；バソアクティブ・インテスティナル・ペプチドアンタゴニスト；バソアクティブ・インテスティナル・ペプチドアンタゴニスト（［Ａｃ−Ｔｙｒ１，Ｄ−Ｐｈｅ２］−ＧＨＲＦ１−２９アミド）；バソアクティブ・インテスティナル・ペプチド受容体アンタゴニスト（４−Ｃｌ−Ｄ−Ｐｈｅ６，Ｌｅｕ１７］−ＶＩＰ）；及びバソアクティブ・インテスティナル・ペプチド受容体結合阻害剤、Ｌ−８−Ｋが含まれるが、これらに限定されない。
【０２８１】
バソプレッシン（ＡＤＨ）ペプチドには、バソプレッシン；［Ａｓｕ１，６，Ａｒｇ８］−バソプレッシン；バソトシン（ｖａｓｏｔｏｃｉｎ）；［Ａｓｕ１，６，Ａｒｇ８］−バソトシン；［Ｌｙｓ８］−バソプレッシン；プレシオン酸；［Ａｒｇ８］−デスアミノバソプレッシンデスグリシンアミド；［Ａｒｇ８］−バソプレッシン（ＡＶＰ）；［Ａｒｇ８］−バソプレッシンデスグリシンアミド；ビオチニル−［Ａｒｇ８］−バソプレッシン（ビオチニル−ＡＶＰ）；［Ｄ−Ａｒｇ８］−バソプレッシン；デスアミノ−［Ａｒｇ８］−バソプレッシン；デスアミノ−［Ｄ−Ａｒｇ８］−バソプレッシン（ＤＤＡＶＰ）；［デアミノ−［Ｄ−３−（３’−ピリジル−Ａｌａ）］−［Ａｒｇ８］−バソプレッシン；［１−（β−メルカプト−β，β−シクロペンタメチレンプロピオン酸）、２−Ｏ−メチル）チロシン］−［Ａｒｇ８］−バソプレッシン；バソプレッシン代謝物ニューロペプチド［ｐＧｌｕ４，Ｃｙｓ６］；バソプレッシン代謝物ニューロペプチド［ｐＧｌｕ４，Ｃｙｓ６］；［Ｌｙｓ８］−デアミノバソプレッシンデスグリシンアミド；［Ｌｙｓ８］−バソプレッシン；［Ｍｐｒ１，Ｖａｌ４，ＤＡｒｇ８］−バソプレッシン；［Ｐｈｅ２，Ｉｌｅ３，Ｏｒｎ８］−バソプレッシン（［Ｐｈｅ２，Ｏｒｎ８］−バソトシン）；［Ａｒｇ８］−バソトシン；及び［ｄ（ＣＨ２）５，Ｔｙｒ（Ｍｅ）２，Ｏｒｎ８］−バソトシンが含まれるが、これらに限定されない。
【０２８２】
ウイルス関連ペプチドには、ウイルス膜融合タンパク質、蛍光発生ヒトＣＭＶプロテアーゼ基質；ＨＣＶコアタンパク質５９−６８；ＨＣＶ  ＮＳ４Ａタンパク質１８−４０（ＪＴ株）；ＨＣＶ  ＮＳ４Ａタンパク質２１−３４（ＪＴ株）；Ｂ型肝炎ウイルス受容体結合断片；Ｂ型肝炎ウイルスプレＳ領域１２０−１４５；［Ａｌａ１２７］−Ｂ型肝炎ウイルスプレＳ領域１２０−１３１；ヘルペスウイルス阻害剤２；ＨＩＶエンベロープタンパク質断片２５４−２７４；ＨＩＶｇａｇ断片１２９−１３５；ＨＩＶ基質；Ｐ１８ペプチド；ペプチドＴ；［３，５ジヨ−ド−Ｔｙｒ７］ペプチドＴ；Ｒ１５Ｋ  ＨＩＶ−１阻害ペプチド；Ｔ２０；Ｔ２１；Ｖ３デカペプチドＰ１８−１１０；及びウイルス複製阻害ペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【０２８３】
ヒトホルモングルカゴンは、膵臓のＡ細胞中で産生される２９アミノ酸のペプチドホルモンである。該ホルモンは、セクレチン、胃抑制ペプチド、バソアクティブ・インテスティナル・ペプチド及びグリセンチンを含む構造的に関連するペプチドの多遺伝子ファミリーに属する。これらのペプチドは、炭水化物代謝、胃腸運動及び分泌プロセッシングを様々に制御する。しかしながら、膵臓グルカゴンの認知されている主な作用は、肝臓のグリコ−ゲン分解及び糖新生を促進して、血糖レベルの上昇をもたらすことである。この点で、グルカゴンの作用は、インシュリンの作用に対する相反的制御であり、糖尿病を伴う高血糖に寄与し得る［（Ｌｕｎｄ，  Ｐ．  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ７９：３４５−３４９（１９８２）］。
【０２８４】
グルカゴンは、インシュリン産生細胞の表面上に存在する特異的受容体に結合できることが見出されている。グルカゴンは、これらの受容体に結合すると、これらの細胞によるｃＡＭＰの迅速な合成を刺激する。次いで、ｃＡＭＰは、インシュリン発現を刺激することが見出されている［Ｋｏｒｍａｎ，  Ｌ．  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  ３４：７１７−７２２（１９８５）］。インシュリンは、グルカゴン合成を阻害するように作用する［Ｇａｎｏｎｇ，  Ｗ．  Ｆ．，  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  Ｌａｎｇｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ，  Ｃａｌｉｆ，  ｐ．  ２７３（１９７９）］。このように、グルカゴンの発現は、インシュリンによって注意深く制御され、究極的には、血清グルコースレベルによって注意深く制御される。
【０２８５】
グルカゴン遺伝子は、まず、３６０塩基対の前駆体から翻訳されて、ポリペプチド、プレプログルカゴンを形成する［Ｌｕｎｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ７９：３４５−３４９（１９８２）］。続いて、このポリペプチドは、プロセッシングを受けて、プログルカゴンを形成する。「Ｐａｔｚｅｌｔ，  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２８２：２６０−２６６（１９７９）」は、続いて、プログルカゴンが、グルカゴン及び第２のポリペプチドへと切断されることを実証した。Ｌｕｎｄ，  Ｐ．  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．上記、Ｌｏｐｅｚ  Ｌ．  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８０：５４８５−５４８９（１９８３）及びＢｅｌｌ，  Ｇ．  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３０２：７１６−７１８（１９８３）によるその後の研究は、プログルカゴン分子が、リジン−アルギニン二ペプチド残基の直後で切断されることを実証した。ブチナマズ（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ  ｐｕｎｃｔａｔａ）によって産生されるプログルカゴンの研究は、この動物から得られるグルカゴンも、隣接するリジン−アルギニン二ペプチド残基の後でタンパク質分解によって切断されることを示した［Ａｎｄｒｅｗｓ  Ｐ．  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６０：３９１０−３９１４（１９８５），  Ｌｏｐｅｚ，  Ｌ．  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８０：５４８５−５４８９（１９８３）］。Ｂｅｌｌ，Ｇ．Ｌ．ら（上記）は、哺乳類のプログルカゴンが、リジン−アルギニン又はアルギニン−アルギニン二ペプチドで切断されることを発見し、プログルカゴン分子が、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）及びグルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）と表記される高度に相同的な別個の３つのペプチド分子を含有することを示した。Ｌｏｐｅｚらは、グルカゴン様ペプチド１が３７アミノ酸残基長であること、及びグルカゴン様ペプチド２が３４アミノ酸残基長であると結論付けた。ラットのプレプログルカゴンの構造に関する類似の研究によって、隣接するリジン−アルギニン又はアルギニン−アルギニン二ペプチド残基間のタンパク質分解の類似パターンを明らかにし、グルカゴン、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ２が形成される［Ｈｅｉｎｒｉｃｈ，  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，  １１５：２１７６−２１８１（１９８４）］。
【０２８６】
グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）は、多面的グルカゴン遺伝子から、組織特異的な様式で発現される３３アミノ酸ペプチドである。ＧＬＰ−２は、アミノ酸配列が、グルカゴン及びグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）に対して顕著な相同性を示す。さらに、ＧＬＰ−２の異なる哺乳動物形態は、高度に保存されている。ヒトＧＬＰ−２の配列は、以下のとおりである。Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｈｉ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ。さらに、１９９７年４月１１日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＣＡ９７／００２５２に、多数のアゴニストＧＬＰ−２ペプチド記載されている。
【０２８７】
類縁体が米国特許第６，０５１，５５７号に記載されており、ＧＬＰ−２バリアントの例が、米国特許第５，９９０，０７７号及び第６，１８４，２０１号に認められる。
【０２８８】
最近、ＧＬＰ−２が腸指向性（ｉｎｔｅｓｔｉｎｏｔｒｏｐｈｉｃ）ペプチドホルモンであることが実証された（Ｄｒｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）  ＰＮＡＳ，９３：７９１１−７９１６）。外来的に与えられると、ＧＬＰ−２は、明白に、望ましくない副作用なしに、試験マウスの小腸上皮の増殖を顕著に増加させることが可能である。続いて、ペプチド配列に対するある種の修飾を有する固有ＧＬＰ−２のペプチド類縁体が増強された腸指向性活性を有することが示された（米国特許出願０８／６６９，７９１号）。さらに、ＧＬＰ−２は、腸の基底外側膜を横切るＤ−グルコース最大輸送速度を増加させることも示された（Ｃｈｅｅｓｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｔｓｅｎｇ（１９９６）  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２７１：Ｇ４７７−Ｇ４８２）。
【０２８９】
構造的にＧＬＰ−２と無関係の多数のペプチドホルモン（ＩＧＦ−２、ＩＧＦ−１、ＧＨ）が、腸指向性活性の様々な程度を有することが実証されている（米国特許第５，４８２，９２６号、ＷＯ９１／１２０１８、米国特許第５，２８８，７０３号）。しかしながら、上記ペプチドホルモンは何れも、腸上皮の増殖を促進する上でＧＬＰ−２の効力又は特異性を有しない。ＧＬＰ−２は、ペプチドホルモンＩＧＦ−１及び／又はＧＨと相乗的に作用して、大腸中の細胞の増殖を促進する。さらに、この組み合わせ療法の小腸及び大腸に対する腸指向性効果は、何れか１つ単独を用いたときに見られる効果より大きい。小腸及び／又は大腸組織の増殖を促進するためにＧＬＰ−２をＩＧＦ−２と同時投与することは、米国特許第５，９５２，３０１号に論述されている。
【０２９０】
ＧＬＰ−２受容体をコードする核酸が単離されており、ＧＬＰ−２受容体アゴニストを同定する方法が記載されている（米国特許出願第０８／７６７，２２４号及び米国特許出願第０８／８４５，５４６号）。食道及び胃が関与する疾病、上部胃腸管の機能不全を発症するリスクがある患者の補助、及び上部胃腸管中での組織増殖の増加におけるＧＬＰ−２の役割が論述されてきた（米国特許第６，０５１，５５７号参照）。ＧＬＰ−２受容体アゴニストは、大腸の機能を増強するように作用する。（米国特許第６，２９７，２１４号）。ＧＬＰ−２及びＧＬＰ−２のペプチドアゴニストは、大腸の組織の増殖を引き起こすことが可能である。ＧＬＰ−２は、炎症性腸疾患を含む大腸の炎症性症状を治療又は予防するのにも有用であり得る（米国特許第６，５８６，３９９号）。
【０２９１】
ヒト、ラット、ウシ及びハムスタ−のＧＬＰ−１の配列は同一であることが明らかとなっている［Ｇｈｉｇｌｉｏｎｅ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，  ２７：５９９−６００（１９８４）］。ＧＬＰ−１のサイズに関してＬｏｐｅｚらが到達した結論は、Ｕｔｔｅｎｔｈａｌ，  Ｌ．  Ｏ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂｏｌ，  ６１：４７２−４７９（１９８５）の研究によって確認された。Ｕｔｔｅｎｔｈａｌらは、ヒト膵臓中に存在するＧＬＰ−１の分子形態を調べた。彼らの研究は、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２が、それぞれ、３７アミノ酸及び３４アミノ酸ペプチドとして、膵臓中に存在することを示している。
【０２９２】
ＧＬＰ−１とグルカゴンの類似性は、初期の研究者に、ＧＬＰ−１が生物活性を有している可能性があることを示唆した。ＧＬＰ−１がラット脳細胞にｃＡＭＰを合成するように誘導できることを見出した研究者もあるが［Ｈｏｏｓｅｉｎ，  Ｎ．  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、  １７８：８３−８６（１９８４）］他の研究者は、ＧＬＰ−１に対して生理的役割を同定することができなかった（Ｌｏｐｅｚ，Ｌ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．）。ＧＬＰ−１に対して生理的役割を同定できないことは、一部の研究者に、ＧＬＰ−１が実際にホルモンであるかどうか、グルカゴンとＧＬＰ−１間の関連性は人工的なものであり得るかどうかという疑問を抱かせた。
【０２９３】
ＧＬＰ−１（７−３７）のバリアント及びこれらの類縁体も開示されている。これらのバリアント及び類縁体には、例えば、ＧＩｎ９−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｄ−ＧＩｎ９−ＧＬＰ−１（７−３７）、アセチル−Ｌｙｓ９−ＧＬＰ−１（７−３７），Ｔｈｒ１６−Ｌｙｓ１８−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｌｙｓ１８−ＧＬＰ−１（７−３７）など、及び、例えば、酸付加塩、カルボン酸塩、低級アルキルエステル及びアミドを含むこれらの誘導体が含まれる［例えば、ＷＯ９１／１１４５７；ＥＰ０７３３，６４４（１９９６）；及び米国特許第５，５１２，５４９号（１９９６）、参照により組み込まれる。］。一般的に、ＧＬＰ−１の様々な開示された形態は、インシュリン分泌（インシュリン分泌促進作用）及びｃＡＭＰ形成を刺激することが示されている（例えば、Ｍｏｊｓｏｖ，  Ｓ．  ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ４０：３３３−３４３（１９９２）参照）。
【０２９４】
より重要なことに、複数の著者が、研究室での実験と、ＧＬＰ−１、特にＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２及びＧＬＰ−１（７−３７）の外来投与に対する哺乳動物、特にヒトのインシュリン分泌促進応答との関連性を実証した［例えば、Ｎａｕｃｋ，  Ｍ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，  ３６：７４１−７４４（１９９３）；  Ｇｕｔｎｉａｋ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ３２６（２０）：１３１６−１３２２（１９９２）；  Ｎａｕｃｋ，  Ｍ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ  ｉｎｖｅｓｔ，  ９１：３０１−３０７（１９９３）；  及びＴｈｏｒｅｎｓ，  Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  ４２：１２１９−１２２５（１９９３）参照］。
【０２９５】
より具体的には、老年期に発生する糖尿病で高血糖を引き起こすとして同定された基本的な欠陥は、内在性インシュリンの損傷を受けた分泌並びに筋肉及び肝臓によるインシュリンの効果に対する抵抗性である［Ｇａｌｌｏｗａｙ，  Ｊ．  Ｓ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，  １３：１２０９−１２３９，（１９９０）］。後者の欠陥は、グルコースの肝臓からの過剰産生をもたらす。このため、正常な個体は、約２ｍｇ／ｋｇ／分の速度でグルコースを放出するのに対して、老年期に発生する糖尿病を有する患者では、この量は、通常、２．５ｍｇ／ｋｇ／分を超え、正味で少なくともグルコース７０ｇ／２４時間を超過する。糖ヘモグロビン測定によって示されるように、肝臓グルコース産生、絶食時血中グルコース及び総合的代謝調節の間に極めて高い相関が存在するという事実から［Ｇａｌｌｏｗａｙ，  Ｊ．  Ａ．，  ｓｕｐｒａ；  ａｎｄ  Ｇａｌｌｏｗａｙ，  Ｊ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒａｐ．，  １２：４６０−４７２（１９９０）］、絶食時血中グルコースの調節は、高血糖の合併症を予防するのに十分な代謝の総合的正常化を達成するのに不可欠であることが自明である。インシュリンの現在の形態は、著しい高インシュリン血症及び低血糖を引き起こさずに、肝臓グルコース産生をめったに正常化しないという事実に照らせば（Ｇａｌｌｏｗａｙ，  Ｊ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｇａｌｌｏｗａｙ，  Ｊ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，上記）、別のアプローチが必要とされる。
【０２９６】
しかしながら、ＧＬＰ−１、特に、哺乳動物に投与するための薬学的組成物の成分としてのＧＬＰ−１の長期的な安定性には疑問が持たれる。実際、４℃の低温で保存すると、試料の調製から早くも１１ヶ月後に、ＧＬＰ−１（７−３７）の副産物が認められる（Ｍｏｊｓｏｖ，Ｓ．，上記）。このため、このような処置を必要とする哺乳動物へ安全に投与できる、より安定なＧＬＰ−１化合物に対する必要性が存在する。
【０２９７】
さらに、ＧＬＰ−１分子、特に、ジペプチジル−ペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ  ＩＶ）の活性によって影響を受けた分子の生物学的半減期は極めて短い。例えば、ＧＬＰ−１（７−３７）の生物学的半減期は、３ないし５分に過ぎず（米国特許第５，１１８，６６６号）、哺乳動物に非経口投与した後のその迅速な吸収によってさらに影響を受ける。このため、このような投与後の吸収を遅延させるＧＬＰ−１化合物に対する必要性も存在する。
【０２９８】
グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は、食物摂取に応答して、腸のＬ細胞によって分泌される３７アミノ酸のペプチドである。インシュリン分泌を刺激し（インシュリン分泌促進作用）、これにより、細胞によるグルコースの取り込み及び減少した血清グルコースレベルをもたらす［例えば、Ｍｏｊｓｏｖ，  Ｓ．，（１９９２）  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ４０：３３３−３４３を参照］。しかしながら、ＧＬＰ−１の活性は乏しい。その後、６位と７位の間での内因性切断によって、生物学的に活性な、より強力なＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨペプチドが産生される。多数のＧＬＰ−１類縁体及び誘導体が公知であり、本明細書では、「ＧＬＰ−１化合物」と称される。これらのＧＬＰ−１類縁体には、ＧＩＬＡ−モンスタ−の毒の中に見出されるペプチドであるエキセンディンが含まれる。エキセンディンは、固有のＧＬＰ−１に対して配列相同性を有し、ＧＬＰ−１受容体を結合することが可能であり、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨに起因する多数の活性の原因となるシグナル伝達カスケ−ドを開始することができる。
【０２９９】
米国特許第６，５６９，８３２号は、β細胞の退化、β細胞機能の喪失、β細胞の機能不全及び／又はβ細胞の死（β細胞の壊死又はアポトーシスなど）を調節、阻害又は減少又は予防するために、ＧＬＰ−１アゴニストを投与することを論述している。アポトーシスは、通常の発育中に起こる外在及び内在信号によって制御される細胞の自己破壊の能動的プロセスである。アポトーシスは、膵臓の内分泌β細胞の制御において主要な役割を果たすことが多くの文献に記載されている。哺乳動物成体では、β細胞の塊が動的な変化を受けて、特に妊娠及び肥満などの状態で正常血糖を維持するためにインシュリン産生に適合するという証拠が増大している（Ｊ．  Ｄｅｖ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ５：３７３，  １９８３  ａｎｄ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３０：１４５９，  １９９２）。β細胞塊の調節は、細胞増殖、成長及び細胞死（アポトーシス）間の微小なバランスに依存する。このバランスの破壊は、グルコース恒常性の損傷をもたらし得る。例えば、β細胞の複製速度が低下すると、老化につれて、耐糖能障害が発症し（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３２：１４，１９８３）、ヒト剖検研究は、非糖尿病被験者と比べて、非インシュリン依存性糖尿病患者では、β細胞塊が４０−６０％減少していることを繰り返して示したこと（Ａｍ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ７０：１０５，  １９８１  ａｎｄ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ．  ９：１５１，  １９８８）は注目に値する。一般的に、インシュリン抵抗性は、不可避的に肥満に伴うが、β細胞がインシュリンに対する増大した要求を満たすことができなくなるまで（この時点で、２型糖尿病が始まる。）、補償的な高インシュリン血症によって正常血糖が維持されることが一般に同意されている。ＧＬＰ−１及び膵島細胞増殖及び膵島細胞分化を調べる他の研究が行われている。
【０３００】
ＧＬＰ−１化合物は、生理的に重要な様々な活性を有する。例えば、ＧＬＰ−１は、インシュリン放出を刺激し、グルカゴン分泌を低下し、胃内容排出を阻害し、グルコース使用を増強することが示されている［Ｎａｕｃｋ，  Ｍ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ３６：７４１−７４４；  Ｇｕｔｎｉａｋ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．  ｏｆ  Ｍｅｄ．  ３２６：１３１６−１３２２；  Ｎａｕｃｋ，  Ｍ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ  ｉｎｖｅｓｔ．  ９１：３０１−３０７］。
【０３０１】
ＧＬＰ−１は、非インシュリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）に対する治療として有望性を示す。ＮＩＤＤＭを伴うインシュリン耐性を治療するために、多数の経口薬物が市場に存在する。しかしながら、疾病が進行するにつれて、患者は、インシュリンの放出を刺激する治療、最終的には、インシュリンの注射を伴う治療に移行しなければならない。しかしながら、インシュリンの放出を刺激する現在の薬物は、インシュリンの実際の投与と同様に低血糖も引き起こし得る。しかしながら、ＧＬＰ−１活性は、血中グルコースレベルによって調節される。血中グルコースレベルが一定の閾値レベルまで低下すると、ＧＬＰ−１は活性でなくなる。このため、ＧＬＰ−１を伴う治療には、低血糖のリスクが付随しない。
【０３０２】
しかしながら、ＧＬＰ−１ペプチドを用いる治療の有用性は、これらの素早いクリアランスと短い半減期によって制限される。例えば、ＧＬＰ−１（７−３７）は、僅か３ないし５分の血清半減期を有する（米国特許第５，１１８，６６６号）。ＧＬＰ−１（７−３６）アミドは、皮下に投与されると、約５０分の時間作用を有する。内在性プロテアーゼ切断に対して耐性である類縁体及び誘導体でさえ、２４時間にわたって、反復投与を避けるために十分長い半減期を有しない。その後反復投与が必要となり得るので、長期間にわたって治療剤の高い血中レベルを維持したい場合には、治療剤のクリアランスが速いことは不都合である。さらに、過去の治療計画が経口医薬のみの服用を伴う糖尿病患者にとって、長期に作用する化合物は特に重要である。これらの患者は、医薬の複数注射を伴う治療計画への移行が極めて困難であることが多い。
【０３０３】
本発明は、短い血漿半減期を有するＧＬＰ−１などのＢＳＰの送達に関連する問題を克服する。本発明の化合物は、免疫グロブリンのＦｃ部分又はアルブミンなどの長期循環半減期を有する別のタンパク質に融合されたＢＳＰを包含する。
【０３０４】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は病原性レトロウイルスであり、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及び関連疾患の原因因子である（Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｓｓｉ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２０：８６８−８７０；  Ｇａｌｌｏ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：５００−５０３）。ＨＩＶ−１（Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｓｓｉ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２０：８６８−８７０；  Ｇａｌｌｏ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：５００−５０３）及びＨＩＶ−２（Ｃｌａｖｅｌ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：３４３−３４６；  Ｇｕｙａｄｅｒ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２６：６６２−６６９）というＨＩＶの少なくとも２つの異なる種類が記載されている。さらに、多数の遺伝的非均一性が、これらの各種類の集団内に存在する。ヒトＣＤ−４＋Ｔリンパ球がＨＩＶウイルスに感染することによって、細胞種が枯渇し、最終的には、日和見感染、神経の機能不全、新生物の増殖がもたらされ、最終的には死に至る。
【０３０５】
ＨＩＶは、レトロウイルスのレンチウイルス科の一員である（Ｔｅｉｃｈ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４；ＲＮＡ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，  Ｗｅｉｓｓ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  ＣＳＨ−ｐｒｅｓｓ，  ｐｐ．  ９４９−９５６）。レトロウイルスは、二倍体の一本鎖ＲＮＡゲノムを含有する、エンベロープで被覆された小さなウイルスであり、ウイルスによってコードされた逆転写酵素であるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって産生されるＤＮＡ中間体を介して複製する（Ｖａｒｍｕｓ，  Ｈ．，  １９８８，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１４２７−１４３９）。例えば、他のレトロウイルスには、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ、−ＩＩ、−ＩＩＩ）及びネコ白血病ウイルスなどの発癌ウイルスが含まれる。ＨＩＶウイルス粒子は、ｐ２４及びｐ１８と表記されるタンパク質から構成されるウイルスのコアからなる。ウイルスのコアは、ウイルスのＲＮＡゲノム及び複製現象にとって必要とされる酵素を含有する。ミリスチル化されたｇａｇタンパク質は、ウイルスコアの周囲に外側ウイルス殻を形成し、次いで、これは、感染された細胞膜に由来する脂質膜エンベロープによって包まれる。ＨＩＶエンベロープ表面糖タンパク質は、ウイルスが２つの糖タンパク質ｇｐ４１及びｇｐ１２０へと出芽する間に、細胞プロテアーゼによって切断される単一の１６０ｋＤ前駆体タンパク質として合成される。ｇｐ４１は膜貫通タンパク質であり、ｇｐ１２０は細胞外タンパク質である。ｇｐ１２０は、おそらくは、三量体又は多量体形態で、非共有結合的にｇｐ４１と会合した状態を保つ（Ｈａｍｍｅｒｗｓｋｊｏｌｄ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｒｅｋｏｓｈ，  Ｄ．，  １９８９，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  ９８９：２６９−２８０）。
【０３０６】
ＣＤ−４表面タンパク質がＨＩＶ−１ウイルスに対する細胞受容体として作用するので、ＨＩＶは、ＣＤ−４＋Ｔリンパ球へと標的誘導される（Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６７−７６８，  Ｍａｄｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  Ｃｅｌｌ  ４７：３３３−３４８）。細胞内へのウイルスの侵入は、ｇｐ１２０の細胞ＣＤ−４＋受容体分子への結合に依存するのに対して、ｇｐ４１は、ウイルス膜中のエンベロープ糖タンパク質複合体を固着し（ＭｃＤｏｕｇａｌ，  Ｊ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３１：３８２−３８５；  Ｍａｄｄｏｎ，  Ｐ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  Ｃｅｌｌ  ４７：３３３−３４８）、このため、ＨＩＶのＣＤ−４＋細胞に対する指向性を説明する。
【０３０７】
ウイルス生活環の幾つかの段階は、治療的介入に対する標的と考えられている（Ｍｉｔｓｕｙａ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ５：２３６９−２３８１）。介入は、ＨＩＶの細胞膜への結合、ＨＩＶ  ＲＮＡゲノムのＤＮＡへの逆転写、又は宿主細胞からのウイルスの脱出及び新しい細胞標的の感染を阻害できる可能性を秘めている。
【０３０８】
ＨＩＶ感染の最も初期の段階である、ウイルスの細胞内への侵入を阻害することができる薬物を開発することが試みられてきた。ここでは、ＨＩＶに対する細胞表面受容体であるＣＤ−４＋に対して焦点が当てられてきた。例えば、組換え可溶性ＣＤ−４は、ウイルス粒子が細胞膜中に埋め込まれたＣＤ−４分子に遭遇する前にウイルス粒子に結合することによって、ＨＩＶの感染性を遮断することが示されている（Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ，  １９８７，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１７０４−１７０７）。ある種の初代ＨＩＶ−１単離株は、組換えＣＤ−４による阻害に対して、相対的に感受性が低い（Ｄａａｒ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ａｎｎ  ｉｎｔ．  Ｍｅｄ．  １１２:２４７−２５３）。さらに、組換え可溶性ＣＤ−４臨床試験は、不確定的な結果を与えた（Ｓｃｈｏｏｌｅｙ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ａｎｎ  Ｉｎｔ．  Ｍｅｄ．  １１２：２４７−２５３；  Ｋａｈｎ，  Ｊ．  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ａｎｎ  Ｉｎｔ．  Ｍｅｄ．  １１２：２５４−２６１；  Ｙａｒｃｈｏａｎ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｐｒｏｃ．  Ｖｔｈ  Ｉｎｔ．  Ｃｏｎｆ．  ｏｎ  ＡＩＤＳ，  ｐ５６４，  ＭＣＰ  １３７）。
【０３０９】
ＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄＣ及びｄ４Ｔなどの２’，３’−ジデオキシヌクレオシド類縁体など、ウイルスによってコードされる逆転写酵素を標的とする薬物が開発されており、これらも、ＨＩＶに対して活性であることが示されている（Ｍｉｔｓｕｙａ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５３３−１５４４）。これらのヌクレオシド類縁体は、有益ではあるが、おそらく薬物耐性ＨＩＶ変異体が急速に出現するために、病気を治すことはできない（Ｌａｎｄｅｒ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１７３１−１７３４）。さらに、薬物は、しばしば、骨髄抑制、嘔吐および肝機能異常などの有毒な副作用を示す。
【０３１０】
ある種のウイルスタンパク質のウイルス特異的な重要な二次的プロセッシングを伴うＨＩＶ複製の後期段階も、抗ＨＩＶ薬物標的の候補としても示唆されている。最終段階のプロセッシングは、ウイルスプロテアーゼの活性に依存しており、このプロテアーゼを阻害する薬物が開発されている（Ｅｒｉｋｓｏｎ，  Ｊ．，  １９９０，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：５２７−５３３）。
【０３１１】
ＨＩＶ感染の治療のためのワクチンが開発中である。ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質（ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１）は、ＡＩＤＳ患者中に存在する抗ＨＩＶ抗体に対する主な抗原であることが示されている（Ｂａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１０９４−１０９６）。これまでのところ、これらのタンパク質は、抗ＨＩＶ開発のための抗原として作用する最も有望な候補であるように思われる。幾つかのグループが、宿主免疫系に対する免疫原性標的として、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０及び／又はｇｐ４１の様々な部分の使用を開始した。例えば、Ｉｖａｎｏｆｆ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，１４１，８６７号；  Ｓａｉｔｈ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ  ９２／２２，６５４；Ｓｃｈａｆｆｅｒｍａｎ，  Ａ．，  ＷＯ  ９１／０９，８７２；  Ｆｏｒｍｏｓｏ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＷＯ  ９０／０７，１１９を参照されたい。
【０３１２】
最近、ウイルス感染症を治療するために、インターフェロン、ＡＺＴ及びホスホノホルマ−トなどの抗ウイルス剤と組み合わせて全身的な免疫応答を惹起する二本鎖ＲＮＡが使用されている。Ｃａｒｔｅｒ，Ｗ．，米国特許第４，９５０，６５２号を参照。さらに、ＨＩＶの治療のために、ピリミジンヌクレオシド類縁体とウリジンホスホリラ−ゼ阻害剤を組み合わせる治療が開発されている（Ｓｏｍｍａｄｏｓｓｉ，  Ｊ．  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  米国特許第５，０７７，２８０号）。これらの具体的な治療は有益であると判明する場合があり得るが、アジドチミジン（ＡＺＴ）及びリバビリンを用いてインビトロで示されるように、一般に、組み合わせ療法は、拮抗に対する可能性を秘めている。米国特許第４，９５０，６５２号を参照。さらに、多くの抗ＨＩＶ治療薬の高い毒性及びそれらの有効性の低いレベルに鑑みると、組み合わせ療法は、問題を生じる可能性がある。
【０３１３】
Ｔ−２０は、ＨＩＶ−１のＣＤ４＋細胞への融合の阻害剤として作用し、他の抗ウイルス治療薬とは異なる機序でＨＩＶを標的とする。米国特許第６，８６１，０５９号は、逆転写酵素阻害剤（例えば、ＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄＣ、ｄｄＡ、ｄ４Ｔ、３ＴＣ又は他のジデオキシヌクレオチド又はジデオキシフルオロヌクレオシド）又はＨＩＶ−１プロテアーゼの阻害剤（例えば、インジナビル；リトナビル）などの少なくとも１つの他の抗ウイルス治療剤と組み合わせてＤＰ−１７８又はＤＰ−１０７又はこれらの誘導体を使用して、ＨＩＶ−１感染を治療し、又はＨＩＶ−１複製を阻害する方法を開示する。他の抗ウイルス剤には、サイトカイン（例えば、ｒＩＦＮα、ｒＩＦＮβ、ｒＩＦＮγ）、ウイルスｍＲＮＡキャッピングの阻害剤（例えば、リバビリン）、ＨＩＶプロテアーゼの阻害剤（例えば、ＡＢＴ−５３８及びＭＫ−６３９）、抗ＨＩＶ活性を有する脂質結合分子としてのアムホテリシンＢ及び糖タンパク質プロセッシングの阻害剤としてのキャスタノスペルミンが含まれる。
【０３１４】
現在の肥満抑制薬は、効力が限られており、多数の副作用を有している。Ｃｒｏｗｌｅｙ，  Ｖ．  Ｅ．，  Ｙｅｏ，  Ｇ．  Ｓ．  ＆  Ｏ’Ｒａｈｉｌｌｙ，  Ｓ．，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  １，  ２７６−８６（２００２）。世界中で肥満が広がるにつれて、この分野で、十分な治療薬を開発することに対して急迫した必要性が存在する。近年では、ＰＹＹ及びＰＹＹ（３−３６）など、食欲、身体エネルギー消費及び脂肪塊蓄積の制御に関与するホルモン及び神経ペプチドが、特に、肥満抑制薬の候補として浮上している。ＭｃＭｉｎｎ，  Ｊ．  Ｅ．，  Ｂａｓｋｉｎ，  Ｄ．  Ｇ．  ＆  Ｓｃｈｗａｒｔｚ，  Ｍ．  Ｗ．，  Ｏｂｅｓ  Ｒｅｖ  １  ：３７−４６（２０００），  Ｄｒａｚｅｎ，  Ｄ．  Ｌ．  ＆  Ｗｏｏｄｓ，  Ｓ．  Ｃ．，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  Ｍｅｔａｂ  Ｃａｒｅ  ６：６２１−６２９（２００３）。
【０３１５】
一般的には、構造の僅かな変化が安定性及び／又は生物活性に影響を与え得るので、小さな治療用ペプチドは取り扱いが困難である。これは、特に、主としてαヘリックス構造から主としてβシート構造への立体構造変化を生じ得るＧＬＰ−１化合物についても当てはまる。このβシート形態は、不活性であると考えられている凝集された物質をもたらす。しかしながら、増加した半減期を有する生物学的に活性なＧＬＰ−１融合タンパク質が開発されている。ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨのみを用いた作業の困難さと、付着される小さなＧＬＰ−１ペプチドに比べた融合対の大きなサイズのために、これは極めて予想外のことであった。同様に、血清半減期を増加させ、又は他の所望の特性を有する分子を作り出すために、他のＢＳＰ融合物を作製し得る。
【０３１６】
本発明の化合物には、Ｎ末端とＣ末端を有する第二のポリペプチドに融合された、Ｎ末端とＣ末端を有する第一のポリペプチドを含む異種融合タンパク質が含まれ、第一のポリペプチドはＧＬＰ−１化合物などのＢＳＰであり、第二のポリペプチドは、ａ）ヒトアルブミン；ｂ）ヒトアルブミン類縁体；及びｃ）ヒトアルブミンの断片からなる群から選択され、第一のポリペプチドのＣ末端は第二のポリペプチドのＮ末端に融合されている。
【０３１７】
本発明の化合物には、Ｎ末端とＣ末端を有する第二のポリペプチドに融合された、Ｎ末端とＣ末端を有する第一のポリペプチドを含む異種融合タンパク質も含まれ、第一のポリペプチドはＧＬＰ−１化合物などのＢＳＰであり、第二のポリペプチドは、ａ）ヒトアルブミン；ｂ）ヒトアルブミン類縁体；及びｃ）ヒトアルブミンの断片からなる群から選択され、第一のポリペプチドのＣ末端は、ペプチドリンカー、プロドラッグリンカー又は水溶性ポリマーを介して、第二のポリペプチドのＮ末端に融合されている。ペプチドリンカーは、ａ）グリシン豊富なペプチド；ｂ）配列［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎ（ｎは、１、２、３、４、５、６以上である。）を有するペプチド；及び配列［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］３を有するペプチドからなる群から選択され得る。
【０３１８】
本発明のさらなる化合物には、Ｎ末端とＣ末端を有する第二のポリペプチドに融合された、Ｎ末端とＣ末端を有する第一のポリペプチドを含む異種融合タンパク質が含まれ、第一のポリペプチドはＧＬＰ−１化合物などのＢＳＰであり、第二のポリペプチドは、ａ）免疫グロブリンのＦｃ部分；ｂ）免疫グロブリンのＦｃ部分の類縁体；及びｃ）免疫グロブリンのＦｃ部分の断片からなる群から選択され、第一のポリペプチドのＣ末端は第二のポリペプチドのＮ末端に融合されている。ＧＬＰ−１化合物などのＢＳＰは、ペプチドリンカー、プロドラッグリンカー又は水溶性ポリマーを介して、第二のポリペプチドに融合され得る。ペプチドリンカーは、ａ）グリシン豊富なペプチド；ｂ）配列［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎ（ｎは、１、２、３、４、５、６以上である。）を有するペプチド；及び配列［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］３を有するペプチドからなる群から選択され得る。
【０３１９】
異種融合タンパク質の一部であるＧＬＰ−１化合物は、複数のアミノ酸置換を有することができ、ＧＬＰ−１（７−３６）、ＧＬＰ（７−３７）、エキセンディン−４又はエキセンディン−３とは異なる６、５、４、３、２又は１より多いアミノ酸を有し得る。好ましくは、異種融合タンパク質の一部であるＧＬＰ−１化合物は、８位にグリシン又はバリンを有する。
【０３２０】
本発明には、本明細書に記載されている異種融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドを含むベクター及び本明細書に記載されているベクターが形質移入され、又は形質転換された宿主細胞も含まれる。異種融合タンパク質が検出可能な量で発現される条件下で、本明細書に記載されているポリヌクレオチドを転写及び翻訳する工程を含む異種融合タンパク質を作製する方法も含まれる。
【０３２１】
少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むＢＳＰ分子が、本発明において提供される。本発明のある実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸を有するＢＳＰは、少なくとも１つの翻訳後修飾を含む。ある実施形態において、少なくとも１つの翻訳後修飾は、特定の反応基に適切であることが当業者に公知である化学の方法を利用した、標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋リンカー、放射性核種、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、レジン、第二のタンパク質又はポリペプチドもしくはポリペプチド類縁体、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害性リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピンラベル、蛍光プローブ、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合又は非共有結合により相互作用する基、フォトケージ（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）部分、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチンの誘導体、ビオチン類似体、重原子を組み込む部分、化学的切断可能な基、光切断可能な基、伸長側鎖、炭素結合型糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光性の基、化学発光基、高電子密度基、磁性の基、インターカレートする基、発色団、エネルギー移動剤、生物活性剤、検出可能標識、小分子又は上記又は、第一の反応基を含む少なくとも１個の非天然アミノ酸に対する第二の反応基を含むその他の何らかの所望の化合物もしくは物質のあらゆる組合せを含む（これらに限定されない。）、分子の連結を含む。例えば、第一の反応性基はアルキニル部分（非天然アミノ酸ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン（プロパルギル基は、アセチレン部分と称される場合もある。）を含むが、これに限定されない。）であり、前記第二の反応性基はアジド部分であり、［３＋２］環状付加化学方法が使用される。別の例では、前記第一の反応性基はアジド部分（非天然アミノ酸ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンを含むが、これに限定されない。）であり、第二の反応性基はアルキニル部分である。本発明の修飾されたＢＳＰのある種の実施形態では、少なくとも一つの翻訳後修飾を含む少なくとも一つの非天然アミノ酸（ケト官能基を含有する非天然アミノ酸を含むが、これに限定されない。）が使用され、この場合、少なくとも一つの翻訳後修飾は糖質部分を含む。ある種の実施形態では、翻訳後修飾は、真核細胞又は非真核細胞中、インビボで行われる。
【０３２２】
ある種の実施形態では、タンパク質は、ある宿主細胞によってインビボで作製される少なくとも一つの翻訳後修飾を含み、該翻訳後修飾は別の宿主細胞の種類によって通常作製されない。ある種の実施形態では、タンパク質は、ある真核細胞によってインビボで作製される少なくとも一つの翻訳後修飾を含み、該翻訳後修飾は非真核細胞によって通常作製されない。翻訳後修飾の例には、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミチン酸付加、リン酸化、糖脂質結合修飾などが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、翻訳後修飾は、ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン結合（オリゴ糖が（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃなどを含むが、これらに限定されない。）によって、オリゴ糖をアスパラギンに付着させることを含む。別の実施形態では、翻訳後修飾は、オリゴ糖（Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃなどを含むが、これらに限定されない。）を、ＧａｌＮＡｃ−セリン、ＧａｌＮＡｃ−スレオニン、ＧｌｃＮＡｃ−セリン又はＧｌｃＮＡｃ−スレオニン結合によってセリン又はスレオニンに付着させることを含む。ある種の実施形態において、本発明のタンパク質又はポリペプチドは、分泌又は局在化配列又はペプチド、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴ融合物などを含むことが可能である。本発明において使用され得るタグ又はリンカーの例には、ポリペプチド、ポリマー、アフィニティータグ、抗原、検出タグ、画像化タグ、複数要素結合複合体の要素及び放射性同位体タグが含まれるが、これらに限定されない。アフィニティータグ及び検出タグの例には、ポリ−Ｈｉｓタグ、ビオチン、アビジン、プロテインＡ、プロテインＧ及び免疫グロブリンエピトープなどの（これらに限定されない。）抗原が含まれるが、これらに限定されない。画像化タグの例には、金属、放射性核種及び磁気分子が含まれるが、これらに限定されない。複数要素結合複合体タグの例には、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、プロテインＡ及びプロテインＧが含まれるが、これらに限定されない。
【０３２３】
「局在化ペプチド」という用語は、以下に限定されないが、分泌シグナル配列の例が含まれる。分泌シグナル配列の例としては、以下に限定されないが、原核生物分泌シグナル配列、真核生物分泌シグナル配列、細菌発現のために５’−最適化された真核生物分泌シグナル配列、新規分泌シグナル配列、ペクチン酸リアーゼ分泌シグナル配列、Ｏｍｐ  Ａ分泌シグナル配列及びファージ分泌シグナル配列が挙げられる。分泌シグナル配列の例としては、以下に限定されないが、ＳＴＩＩ（原核生物）、Ｆｄ  ＧＩＩＩ及びＭ１３（ファージ）、Ｂｇｌ２（酵母）及びトランスポゾン由来のシグナル配列ｂｌａが挙げられるが、これらに限定されない。分泌シグナル配列には、細菌の分泌シグナル配列、酵母の分泌シグナル配列、昆虫のシグナル分泌配列、哺乳動物の分泌シグナル配列及びユニーク分泌シグナル配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。「局在化配列」の別の例には、ＴｒｐＬＥ配列が含まれるが、これに限定されるものではない。
【０３２４】
目的のタンパク質又はポリペプチドは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個又は１０個以上の非天然アミノ酸を含有することが可能である。非天然アミノ酸は、同一又は別異とすることができ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０以上の異なる非天然アミノ酸を含むタンパク質中に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の異なる部位が存在することが可能である。ある種の実施形態では、タンパク質の天然のバージョン中に存在する少なくとも１個、但し、全部より少ないアミノ酸が、非天然アミノ酸と置換される。
【０３２５】
本発明において、治療活性を有する全てのＢＳＰ又はこれらの断片を使用し得る。本発明において使用し得るＢＳＰの例が数多く記載されている。しかしながら、記載されているリストは網羅的なものではなく、本発明において使用され得るＢＳＰの数又は種類を決して限定するものではない。このため、本発明に従って、あらゆるＢＳＰ及び／又は新規ＢＳＰを含むあらゆるＢＳＰから作製される断片を修飾することができ、治療的に使用することができる。
【０３２６】
本発明は、少なくとも１つの非天然コードアミノ酸を含むＢＳＰを基礎とする方法及び組成物を提供する。少なくとも１つの非天然コードアミノ酸をＢＳＰ中に導入することによって、１又は複数の非天然コードアミノ酸など（これに限定されない。）との特異的化学反応を伴うが、一般に存在する２０アミノ酸とは反応しない抱合化学の適用が可能となる。幾つかの実施形態において、非天然コードアミノ酸を含むＢＳＰ（ＧＬＰ−１、Ｔ−２０又はＰＹＹなど）は、非天然コードアミノ酸の側鎖を介して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水溶性ポリマーに連結されている。本発明は、ケトン、アジド又はアセチレン部分など（これらに限定されない。）、天然に取り込まれる２０個のアミノ酸中に見出されたない官能基又は置換基を含有するアミノ酸など（これらに限定されない。）、遺伝的にコードされていないアミノ酸を、セレクターコドンに応答してタンパク質中に、選択的に取り込み、それらのアミノ酸を適切に反応性を有するＰＥＧ誘導体でその後修飾することを含む、ＰＥＧ誘導体を用いてタンパク質を選択的に修飾する極めて効率的な方法を提供する。一旦取り込まれれば、次いで、このアミノ酸側鎖は、非天然コードアミノ酸中に存在する官能基又は置換基に適していることが当業者に公知の化学方法を使用することによって修飾することができる。多様な公知の化学方法は、水溶性ポリマーをタンパク質中に取り込むために本発明において使用するのに適している。このような方法には、それぞれ、アセチレン又はアジド誘導体など（これらに限定されない。）とのＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］環化付加反応（例えば、Ｐａｄｗａ，  Ａ．  ｉｎ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｖｏｌ．  ４，（１９９１）  Ｅｄ．  Ｔｒｏｓｔ，  Ｂ．  Ｍ．  ，  Ｐｅｒｇａｍｏｎ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ｐ．  １０６９−１１０９  ；  ａｎｄ，  Ｈｕｉｓｇｅｎ，  Ｒ．  ｉｎ  １，３−Ｄｉｐｏｌａｒ  Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｖ，（１９８４）  Ｅｄ．  Ｐａｄｗａ，  Ａ．  ，  Ｗｉｌｅｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐ．１−１７６）が含まれるが、これに限定されない。
【０３２７】
Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］環化付加方法は、求核置換反応ではなく、環化付加を含むので、タンパク質は、極めて高い選択性で修飾することが可能である。該反応は、Ｃｕ（Ｉ）塩の触媒量を反応混合物に添加することによって、優れた立体選択性（１，４＞１，５）を有する水性条件において、室温で実施することが可能である。例えば、「Ｔｏｒｎｏｅ，  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈａｍ．  ６７：３０５７−３０６４；  ａｎｄ，  Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ，  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ４１  ：２５９６−２５９９」；及びＷＯ  ０３／１０１９７２を参照されたい。［３＋２］環化付加を通じて本発明のタンパク質に付加され得る分子には、アジド又はアセチレン誘導体など（これらに限定されない。）の適切な官能基又は置換基を有する実質的に全ての分子が含まれる。これらの分子は、それぞれ、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンなど（これに限定されない。）、アセチレン基を有する非天然アミノ酸、又は、ｐ−アジド−フェニルアラニンなど（これに限定されない。）、アジド基を有する非天然アミノ酸に付加されることが可能である。
【０３２８】
Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化から得られる五員環は、還元環境では、一般に可逆的でなく、水性環境中では長期間、加水分解に対して安定である。従って、様々な物質の物理的及び化学的特性は、本発明の活性なＰＥＧ誘導体を用いて、要求度の高い水性条件下で修飾することができる。さらに重要なことに、アジドとアセチレン部分は互いに対して特異的であるので（及び、例えば、遺伝子によってコードされた２０の共通アミノ酸の何れとも反応しない。）、タンパク質は、極めて高い選択性で、一又は複数の特異的な部位において修飾されることが可能である。
【０３２９】
本発明は、ＰＥＧ誘導体の水溶性且つ加水分解に対して安定な誘導体及び一又は複数のアセチレン又はアジド部分を有する関連の親水性ポリマーも提供する。アセチレン部分を含有するＰＥＧポリマー誘導体は、セレクターコドンに応答して、タンパク質中に選択的に導入されたアジド部分との結合に対して高度に選択的である。同様に、アジド部分を含有するＰＥＧポリマー誘導体は、セレクターコドンに応答し、タンパク質中に選択的に導入されるアセチレン部分との結合に対して高度に選択的である。
【０３３０】
より具体的には、アジド部分は、アルキルアジド、アリールアジド及びこれらのアジドの誘導体を含むが、これらに限定されない。アルキル及びアリールアジドの誘導体は、アセチレン特異的反応性が維持される限り、他の置換基を含むことが可能である。アセチレン部分は、アルキル及びアリールアセチレン並びにそれぞれの誘導体を含む。アルキル及びアリールアセチレンの誘導体は、アジド特異的反応性が維持される限り、他の置換基を含むことが可能である。
【０３３１】
本発明は、様々な官能基、置換基又は部分を有する物質の、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；放射性核種；細胞毒性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第二のタンパク質若しくはポリペプチド若しくはポリペプチド類縁体；抗体若しくは抗体断片の；金属キレート剤；補因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；水溶性デンドリマー；シクロデキストリン；阻害的リボ核酸；生体材料；ナノ粒子；スピンラベル；フルオロフォア；金属含有部分；放射性部分；新しい官能基；他の分子と共有結合的に若しくは非共有結合的に相互作用する基；光ケ−ジ（ｐｈｏｔｏ  ｃａｇｅ）化された部分；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの誘導体；ビオチン類縁体；重原子を取り込む部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長された側鎖；炭素結合された糖；酸化還元活性剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識された部分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；電子密度が高い基；磁性基；インターカレート基；発色団；エネルギー移動剤；生物活性剤；検出可能な標識；小分子；又は上記若しくはその他の任意の望ましい化合物若しくは物質の組み合わせなどの（これらに限定されない）他の物質との抱合体を提供する。本発明は、アジド又はアセチレン部分を有する物質の、対応するアセチレン又はアジド部分を有するＰＥＧポリマー誘導体との抱合体も含む。例えば、アジド部分を含有するＰＥＧポリマーは、アセチレン官能基を有する、遺伝子によってコードされていないアミノ酸を含有するタンパク質中の位置において生物活性分子に結合させることが可能である。ＰＥＧ及び生物活性分子が結合される結合には、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化産物が含まれるが、これに限定されない。
【０３３２】
ＰＥＧは、生物材料の表面を修飾するために使用できることが本分野では十分に確立されている（例えば、米国特許第６，６１０，２８１号、Ｍｅｈｖａｒ，  Ｒ．，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．，  ３（１）：１２５−１３６（２０００）参照、これらは、参照により、本明細書に組み込まれる。）。本発明には、一又は複数の反応性アジド又はアセチレン部分を有する表面と、Ｈｕｉｓｇｅん［３＋２］付加環化結合を介して、該表面に結合された本発明の一又は複数のアジド又はアセチレン含有ポリマーとを含む生物材料も含まれる。生物材料及び他の物質は、その後の反応に利用可能なアジド又はアセチレン部分を残すために、カルボン酸、アミン、アルコール又はチオール部分を含む結合を介してなど、アジド又はアセチレン結合以外の結合を介して、アジド又はアセチレン活性化されたポリマー誘導体に結合することも可能である。
【０３３３】
本発明は、本発明のポリマーを含有するアジド及びアセチレンを合成する方法も含まれる。アジド含有ＰＥＧ誘導体の場合には、アジドは、ポリマーの炭素原子に直接結合することが可能である。あるいは、アジド含有ＰＥＧ誘導体は、得られたポリマーがその末端にアジド部分を有するように、一つの末端にアジド部分を有する連結剤を、活性化された慣用ポリマーに付着させることによって調製することが可能である。アセチレン含有ＰＥＧ誘導体の場合には、アセチレンは、ポリマーの炭素原子に直接結合することが可能である。あるいは、アセチレン含有ＰＥＧ誘導体は、得られたポリマーがその末端にアセチレン部分を有するように、一つの末端にアセチレン部分を有する連結剤を、活性化された慣用ポリマーに付着させることによって調製することが可能である。
【０３３４】
より具体的には、アジド含有ＰＥＧ誘導体の場合には、少なくとも一つの活性なヒドロキシル部分を有する水溶性ポリマーは反応を行って、より反応性の高い部分（メシラート、トレシラート、トシラート又はハロゲン脱離基など）をその上に有する置換されたポリマーを生成する。スルホニル酸ハロゲン化物、ハロゲン原子及び他の脱離基を含有するＰＥＧ誘導体の調製及び使用は、当業者に周知である。得られた置換されたポリマーは、次いで、反応を行って、ポリマーの末端にあるアジド部分を、さらに反応性の高い部分に置換する。あるいは、少なくとも一つの活性な求核又は求電子部分を有する水溶性ポリマーは、ＰＥＧポリマーと連結剤の間に共有結合が形成され、且つアジド部分がポリマーの末端に位置するように、一つの末端にアジドを有する連結剤と反応を行う。アミン、チオール、ヒドラジド、ヒドラジン、アルコール、カルボキシラート、アルデヒド、ケトン、チオエステルなどの求核及び求電子部分は、当業者に周知である。
【０３３５】
より具体的には、アセチレン含有ＰＥＧ誘導体の場合には、少なくとも一つの活性なヒドロキシル部分を有する水溶性ポリマーは反応を行って、アセチレン部分を含有する前駆体からハロゲン又は他の活性化された脱離基を除去する。あるいは、少なくとも一つの活性な求核又は求電子部分を有する水溶性ポリマーは、ＰＥＧポリマーと連結剤の間に共有結合が形成され、且つアセチレン部分がポリマーの末端に位置するように、一つの末端にアセチレンを有する連結剤と反応を行う。有機合成におけるハロゲン部分、活性化された脱離基、求核及び求電子部分の使用並びにＰＥＧ誘導体の調製及び使用は、当業者にとって十分に確立されている。
【０３３６】
本発明は、ＰＥＧ及びアジド又はアセチレン部分を含有するＰＥＧ誘導体などの水溶性ポリマーを含む（これらに限定されない。）他の物質を修飾されたタンパク質に付加するために、タンパク質を選択的に修飾する方法も提供する。アジド及びアセチレン含有ＰＥＧ誘導体は、生体適合性、安定性、溶解度及び免疫原性の欠如が重要である、一方、同時に、本分野で既に公知であるタンパク質にＰＥＧ誘導体を付着するさらに選択的な手段を与えながら、表面及び分子の特性を修飾するために使用することが可能である。
【０３３７】
ＩＩ．ペプチド及びポリペプチド
本発明の方法を用いて作製され得るＢＳＰは、天然に存在するか、又は天然にコードされていないか否かを問わず、あらゆる長さ又は配列のアミノ酸のあらゆる組み合わせであり得る。唯一の要件は、ＢＳＰ鎖中のアミノ酸の少なくとも一つが非天然コードアミノ酸であることである。ポリペプチドが生合成によって作製されるのであれば、非天然コードアミノ酸は、少なくとも１つのセレクターコドンを含むｍＲＮＡから翻訳されるにつれて、ペプチド鎖に取り込まれる。化学合成によって作製され得る本発明の新規ＢＳＰは、合成プロセスの間に、少なくとも１つの非天然コードアミノ酸を取り込み得る。非天然コードアミノ酸は、アミノ酸鎖中の任意の位置に配置してもよく、生物活性ペプチド、リンカー又は融合対（アルブミン又はＦｃなど）の中などを含む（これらに限定されない。）、最終ＢＳＰの任意の部分に位置することもできる。
【０３３８】
本願におけるＧＬＰ−１ポリペプチドという表記は、本発明において使用するのに適したペプチド又はポリペプチドの例として、ＧＬＰ−１を使用するものとする。このため、ＧＬＰ−１に関して本明細書で記載された修飾及び化学反応は、本明細書に具体的に列記されているものを含む（これに限定されない。）あらゆる他のＢＳＰのに等しく適用することが可能である。
【０３３９】
食物に応答して腸のＬ−細胞から放出されたＧＬＰ−１は、門脈循環に入る。ＧＬＰ−１は、ＤＰＰ  ＩＶ（ＣＤ２６）によって迅速に切断されて、ＧＬＰ−１（９−３７）又はＧＬＰ−１（９−３６）アミドを放出し、ともに、ＧＬＰ−１Ｒに対する活性はＧＬＰ−１より弱い。幾つかの報告によれば、これらは、ＧＬＰ−１Ｒ及び胃腸の運動に対するＧＬＰ−１の効果のアンタゴニストとして作用し得る。循環するＧＬＰ−１の半減期は、約４分であることが見出された（Ｋｒｅｙｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７  Ｌａｎｃｅｔ．  Ｄｅｃ  ５；２（８５７１）：１３００−４）。ＣＤ２６と表記されるジペプチジル−ペプチダーゼ（ＤＰＰ  ＩＶ，  ＥＣ  ３．４．１４．５，  ＣＤ２６）は、幾つかの細胞種、特にＣＤ４＋Ｔ細胞の表面上、ならびに腎臓、胎盤、血漿、肝臓及び腸細胞上に発現される細胞外膜結合酵素である。Ｔ細胞上では、ＤＰＰ  ＩＶは、抗原ＣＤ２６と同一であることが示されている。ＣＤ２６は、静止しているＴ細胞上の一部に、低密度で発現されているが、Ｔ細胞の活性化後に強く上方制御される（Ｇｏｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  Ｓｅｐ；５４（３）：２４９−６４）。ＣＤ２６は、Ｔ細胞及び全体的な免疫系調節において、重要な機能的役割を果たしている可能性がある多機能性分子である。ＣＤ２６は、タンパク質チロシンホスファターゼＣＤ４５及びアデノシンデアミナ−ゼ（ＡＤＡ）などの細胞表面上に見出される免疫学的に重要な他の受容体に付随する。ＤＰＰ  ＩＶは、ＧＬＰ−１及びＧＩＰを分解することによって、グルコース処理の負の制御を惹起するため、膵臓のβ細胞に対するインクレチン効果を低下させる。
【０３４０】
ＤＰＰ  ＩＶは、ヒトＧＬＰ−１（ヒトＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２：Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−  Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＮＨ２）（配列番号１）の主な循環形態のＡｌａ−Ｇｌｕ結合を切断して、Ｎ末端ジペプチドを放出する。Ａｌａを、Ｇｌｙ（Ｄｅａｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，  ４１  ：２７１−２７８；  Ｂｕｒｃｅｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，  ４８（２）：２５２−２５８）、Ｌｅｕ、Ｄ−Ａｌａ及びその他のアミノ酸で置換することによって、ＧＬＰ−１をＤＰＰ  ＩＶの分解から保護し、そのインビトロ及びインビボでのインシュリン分泌促進作用を強化する（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０：２８６０−２８６９）ことが示された。アミノ末端ヒスチジンの欠失又はＨｉｓ７のＮＨ２基の欠失は、類縁体の受容体親和性と効力を減少させた（Ａｄｅｌｈｏｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６９（９）：６２７５−６２７８；  Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．２００１，  ｓｕｐｒａ；  Ｓｉｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｒｅｇ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  ７９：９３−１０２）。米国特許第５，５４５，６１８号は、アルキル及びアシル修飾を用いたＮ末端修飾も、ＤＰＰ  ＩＶ耐性類縁体を与えることも教示する。より具体的には、Ｎ−アルキル化された（Ｃ１−Ｃ６）又はＮ−アシル化された（Ｃ１−Ｃ６）Ｌ−／Ｄ−アミノ酸によるＨｉｓ７置換は、ＤＰＰ  ＩＶ耐性を有する類縁体をもたらした。トランス−３−ヘキセン酸などの不飽和有機酸の共有結合も、ＤＰＰ  ＩＶ耐性ＧＬＰ−１類縁体を与え、このＤＰＰ  ＩＶ耐性ＧＬＰ−１類縁体は、マウスでの経口糖負荷試験（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．２００１，上記）で、高血糖を強力に低減する。さらに、Ｈｉｓ７は、α置換されたカルボン酸（置換基の１つは５員又は６員環構造（例えば、イミダゾ−ル））によって置換されて、ＤＰＰ  ＩＶ耐性を付与することが可能である（ＷＯ９９／４３７０７を参照（参照により、本明細書に組み込まれる。））。Ｈｉｓ７後に６−アミノヘキサン酸（ＡＨＡ）を挿入すると、受容体親和性及びインビボでのインシュリン分泌促進効果を保持しながら、ＤＰＰ  ＩＶ耐性を付与することが示された（Ｄｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ．，１４２（１０）；４４６２−４４６８）。
【０３４１】
インシュリン分泌促進作用を示す数多くのＧＬＰ−１類縁体が本分野において公知である。これらのバリアント及び類縁体には、例えば、ＧＬＰ−１（７−３６）、Ｇｌｎ９−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｄ−Ｇｌｎ９−ＧＬＰ−ｌ（７−３７）、アセチル−Ｌｙｓ９−ＧＬＰ−ｌ（７−３７）、Ｔｈｒｌ６−Ｌｙｓｌ８−ＧＬＰ−ｌ（７−３７）及びＬｙｓｌ８−ＧＬＰ−  １（７−３７）が含まれる。ＧＬＰ−１の誘導体には、例えば、酸付加塩、カルボキシラート塩、低級アルキルエステル及びアミドが含まれる（ＷＯ  ９１／１１４５７（１９９１）；  ＥＰ  ０  ７３３，６４４（１９９６）；及び米国特許第５，５１２，５４９号（１９９６）参照）。Ｎ末端ヒスチジン残基（Ｈｉｓ７）は、ＧＬＰ−１のインシュリン分泌促進活性にとって極めて重要であることも示されている（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ＸＩＩＩ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ，  ５（Ｓｕｐｐｌ．  ｌ）：Ｓ３０（ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．  ＯＲＡ−００７−００７））。
【０３４２】
本発明での使用に適したＧＬＰ−１化合物の群が、ＷＯ９１／１１４５７（米国特許第５，５４５，６１８号）に開示されており（参照により、本明細書に組み込まれる。）、（ａ）２６位及び／又は３４位のリジンを、グリシン、セリン、システイン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、アルギニン若しくはＤ−リジンに置換；又は３６位のアルギニンを、グリシン、セリン、システイン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、リジン若しくはＤ−アルギニンに置換；（ｂ）３１位のトリプトファンを、酸化耐性アミノ酸に置換；（ｃ）１６位のバリンをチロシンに置換、１８位のセリンをリジンに置換、２１位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換、２２位のグリシンをセリンに置換；２３位のグルタミンをアルギニンに置換；２４位のアラニンをアルギニンに置換、及び２６位のリジンをグルタミンに置換のうち少なくとも１つ；並びに（ｄ）８位のアラニンをグリシン、セリン又はシステインに置換；９位のグルタミン酸を、アスパラギン酸、グリシン、セリン、システイン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、又はフェニルアラニンに置換；１０位のグリシンをセリン、システイン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン又はフェニルアラニンに置換；及び１５位のアスパラギン酸をグルタミン酸に置換の少なくとも１つ；並びに（ｅ）７位のヒスチジンを、グリシン、セリン、システイン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、若しくはフェニルアラニン、又はヒスチジンのＤ−若しくはＮ−アシル化又はアセチル化された形態に置換；からなる群から選択される少なくとも１つの置換を有する、ＧＬＰ−１（７−３４）、ＧＬＰ−１（７−３５）、ＧＬＰ−１（７−３６）又はＧＬＰ−１（７−３７）又はこれらのアミド形態と、薬学的に許容されるこれらの塩から実質的になり、置換（ａ）、（ｂ）、（ｄ）及び（ｅ）では、置換されたアミノ酸は、必要に応じてＤ型であることが可能であり、７位で置換されたアミノ酸は、必要に応じて、Ｎ−アシル化された形態又はＮ−アルキル化された形態であることが可能である。
【０３４３】
酵素ジペプチジル−ペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ  ＩＶ）は、投与されたＧＬＰ−１の観察される迅速なインビボ不活化の原因となり得るので［例えば、Ｍｅｎｔｌｅｉｎ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２１４：８２９−８３５（１９９３）を参照］、融合タンパク質に関してＤＰＰ  ＩＶの活性から保護されるＧＬＰ−１類縁体及び誘導体が適切であり、ＧＬＰ−１化合物がＧｌｙ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、α−メチル−Ａｌａ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ又はＧｌｙ８−Ｇｌｙ２１−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨも適切である。
【０３４４】
本発明において使用するためのＧＬＰ−１化合物の別の好ましい群は、米国特許第５，５１２，５４９号（参照により、本明細書に明示的に組み込まれる。）に開示されている化合物からなる。
【０３４５】
本発明のＧＬＰ−１化合物は、エキセンディン化合物も包含する。エキセンディン−３及びエキセンディン−４は、ヘロデルマチダエ・リザード（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａｔｉｄａｅ  ｌｉｚａｒｄ）の毒から最初に単離された生物学的に活性なペプチドであり、ＧＬＰ−１受容体を結合し、哺乳類の傍細胞中でｃＡＭＰ依存性Ｈ＋産生を刺激することが示されている。エキセンディン−３及びエキセンディン−４は、何れも、ＧＬＰ−１と約５３％相同である３９アミノ酸のペプチドである。図２は、ＧＬＰ−１及びエキセンディン−４構造の螺旋の比較である。保存されている残基は、アスタリスクでマ−クされている。図３は、エキセンディン−４及びＧＬＰ−１の間で保存された面の性質が主に疎水性であるのに対して、保存されていない面が主として親水性であることを示している。
【０３４６】
それらは、ＧＬＰ−１活性の強力なアゴニストとして作用する。注目すべきことに、エキセンディンのＮ末端切断された誘導体（エキセンディン（９−３９アミノ酸）として知られる。）は、エキセンディン−３、エキセンディン−４及びＧＬＰ−１の阻害剤である（Ｇｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８（２６）１９６５０−１９６５５）。
【０３４７】
エキセンディン化合物は、典型的には、エキセンディン−３、エキセンディン−４又はこれらの類縁体若しくは断片のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。エキセンディン３及びエキセンディン−４は、米国特許第５，４２４，２８６号に開示されている。エキセンディン−３は、Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号２１）のアミノ酸配列を有する。エキセンディン−４は、Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号３）のアミノ酸配列を有する。
【０３４８】
ＧＬＰ−１化合物には、エキセンディン又はエキセンディン類縁体のＮ末端及び／又はＣ末端から得られる１又は複数のアミノ酸の末端切断後に得られるポリペプチドであるエキセンディン断片も含まれる。さらに、ＧＬＰ−１化合物には、エキセンディン又はその断片のＮ末端及び／又はＣ末端に１又は複数のアミノ酸が付加されたエキセンディンポリペプチドが含まれる。この種類のエキセンディン化合物は、最大約４５のアミノ酸を有する。
【０３４９】
ＧＬＰ−１化合物には、「エキセンディン類縁体」も含まれる。エキセンディン類縁体は、類縁体がインシュリン分泌促進活性を有するように、エキセンディン−４、エキセンディン−３−又はこれらの断片に対して十分な相同性を有する。エキセンディン断片及び／又は類縁体の活性は、ＥＰ６１９，３２２号及び米国特許第５，１２０，７１２号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているものなどのインビトロアッセイを用いて評価することが可能である。本発明において有用であるさらなるエキセンディン類縁体が、ＰＣＴ特許公開ＷＯ９９／２５７２８号（Ｂｅｅｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．）、ＷＯ９９／２５７２７号（Ｂｅｅｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．）、ＷＯ９８／０５３５１号（Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、ＷＯ９９／４０７８８号（Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、ＷＯ９９／０７４０４（Ｂｅｅｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．）及びＷＯ９９／４３７０８号（Ｋｎｕｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。本発明の中に含められるべきエキセンディン並びにその類縁体、誘導体及び断片の例は、ＷＯ９７／４６５８４号及び米国特許第５，４２４，２８６号に開示されているものである。
【０３５０】
異種のＦｃ融合タンパク質
上記ＧＬＰ−１化合物などのＢＳＰは、直接又はペプチドリンカーを介して、免疫グロブリンのＦｃ部分に融合され得る。免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって一緒になったポリペプチド鎖を含有する分子であり、典型的には、２つの軽鎖と２つの重鎖を有する。各鎖中に、１つのドメイン（Ｖ）は、分子の抗体特異性に応じて、可変的なアミノ酸配列を有する。他のドメイン（Ｃ）は、同じクラスの分子に共通な比較的一定の配列を有する。ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合化合物の一例は、図１に示されている。
【０３５１】
本明細書において使用される、免疫グロブリンのＦｃ部分は、免疫学の分野で本用語に対して一般的に与えられる意味を有する。具体的には、本用語は、抗体から得られる２つの抗原結合領域を除去することによって得られる抗体断片（Ｆａｂ断片）を表す。Ｆａｂ断片を除去する１つの方法は、パパインプロテアーゼを用いて免疫グロブリンを消化することである。このように、Ｆｃ部分は、非共有相互作用とジスルフィド結合を介して会合する両重鎖から得られる定常領域のほぼ同じサイズの断片から形成される。Ｆｃ部分は、ヒンジ領域を含むことができ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを通じて、抗体のＣ末端まで広がることが可能である。ヒト及びマウス免疫グロブリンに対する代表的なヒンジ領域は、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，  Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，  Ｃ．  Ａ．  Ｋ．，  ｅｄ．，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，  １９９２」（その教示は、参照により、本明細書に組み込まれる。）に見出すことができる。Ｆｃ部分は、さらに１又は複数のグリコシル化部位を含むことができる。ヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン及び１つのＮ−グリコシル化部位を含有する数多くの代表的なＦｃタンパク質のアミノ酸配列が、本分野において周知である。
【０３５２】
異なるエフェクター機能及び薬物動態特性を有するヒト免疫グロブリンＦｃ領域の５つの種類：ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥが存在する。ＩｇＧは、血清中に最も豊富に存在する免疫グロブリンである。また、ＩｇＧは、あらゆる免疫グロブリンの中で、最も長い血中半減期を有する（２３日）。他の免疫グロブリンとは異なり、ＩｇＧは、Ｆｃ受容体への結合後、効率的に再循環される。４つのＩｇＧサブクラスＧ１、Ｇ２、Ｇ３及びＧ４が存在し、その各々が異なるエフェクター機能を有する。Ｇ１、Ｇ２及びＧ３は、Ｃ１ｑを結合し補体を固定できるが、Ｇ４はできない。Ｇ３はＣ１ｑをＧ１より効果的に結合できるとしても、Ｇ１は、補体によって誘導される細胞融解の媒介に関してより効果的である。Ｇ２は、極めて非効率的に補体を固定する。ＩｇＧ中のＣ１ｑ結合部位は、ＣＨ２ドメインのカルボキシ末端領域に位置する。
【０３５３】
全てのＩｇＧサブクラスは、Ｆｃ受容体（ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４）に結合することが可能であり、Ｇ１及びＧ３は、Ｇ２及びＧ４より効果的である。ＩｇＧのＦｃ受容体結合領域は、ＣＨ２ドメインのヒンジ及びカルボキシ末端領域の両方に位置する残基によって形成される。
【０３５４】
ＩｇＡは、単量体及びＪ鎖によって一つになった二量体形態の両方で存在することが可能である。ＩｇＡは、血清中に２番目に豊富に存在するＩｇであるが、僅か６日の半減期を有する。ＩｇＡは、３つのエフェクター機能を有する。ＩｇＡは、それぞれ、食作用及び脱顆粒を誘導する、マクロファージ及び好酸球上のＩｇＡ特異的受容体に結合する。ＩｇＡも、未知の別の経路を介して、補体を固定することが可能である。
【０３５５】
ＩｇＭは、五量体又は六量体（何れも、Ｊ鎖によって一つになる。）の何れかとして発現される。ＩｇＭは、５日の血清半減期を有する。ＩｇＭは、そのＣＨ３ドメイン中に位置する結合部位を介してＣ１ｑに弱く結合する。ＩｇＤは、３日の血清半減期を有する。どのようなエフェクター機能がこのＩｇに割り当てられるのかは明確でない。ＩｇＥは、単量体のＩｇであり、２．５日の血清半減期を有する。ＩｇＥは、脱顆粒を誘導し、炎症促進剤の放出をもたらす２つのＦｃ受容体に結合する。
【０３５６】
所望のインビボ効果に応じて、本発明の異種融合タンパク質は、上記イソタイプの何れかを含有し得るか、又は補体及び／又はＦｃ受容体結合機能が改変された変異を受けたＦｃ領域を含有し得る。このように、本発明の異種融合タンパク質は、ＧＬＰ−１化合物に融合された、免疫グロブリンのＦｃ部分全体、免疫グロブリンのＦｃ部分の断片又はこれらの類縁体を含有し得る。
【０３５７】
本発明の融合タンパク質は、一本鎖タンパク質からなり、又は複数鎖ポリペプチドからなり得る。２以上のＦｃ融合タンパク質は、Ｆｃ領域間を自然に形成するジスルフィド結合を通じてそれらが相互作用するように作製することが可能である。これらの多量体は、ＧＬＰ−１化合物に関して均一であることができ、又は、これらの多量体は、融合タンパク質のＦｃ部分のＮ末端に融合された異なるＧＬＰ−１化合物を含有し得る。
【０３５８】
融合タンパク質の最終構造に関わらず、Ｆｃ又はＦｃ様領域は、Ｎ末端に融合されたＧＬＰ−１化合物のインビボ血漿半減期を延長する役割を果たし得る。また、融合タンパク質化合物のＧＬＰ−１成分は、ＧＬＰ−１の少なくとも１つの生物活性を保持すべきである。治療又は循環半減期の増加は、本明細書に記載された方法又は本分野で公知の方法を用いて示すことが可能であり、融合タンパク質の半減期は、ＧＬＰ−１化合物単独の半減期と比較される。生物活性は、本分野で公知のインビトロ及びインビボ方法によって決定することが可能である。
【０３５９】
タンパク質分解によって産生されるＩｇＧのＦｃ領域は、完全な状態のＩｇＧ分子と同じインビボ半減期を有し、Ｆａｂ断片は急速に分解されるので、半減期を延長するための関連する配列は、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメイン中に存在すると考えられている。さらに、高親和性Ｆｃ受容体又はｃ１ｑを結合しないＩｇＧバリアントの異化速度は、親野生型抗体のクリアランスの速度とは区別できないことが文献に示されており、異化部位は、Ｆｃ受容体又はＣ１ｑ結合に関与する部位とは異なることが示唆される。［Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２９：２２１］。マウスＩｇＧ１  Ｆｃ領域を用いた部位特異的突然誘発研究は、異化速度を調節するＩｇＧ１  Ｆｃ領域の部位がＣＨ２−ＣＨ３ドメインインターフェ−スに位置することを示唆した。融合タンパク質の半減期を最適化するために、Ｆｃ領域の異化部位を修飾することが可能である。本発明の融合タンパク質に対して使用されるＦｃ領域は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域に由来することができ、ヒンジ領域を含むＣＨ２とＣＨ３領域の両方を含有し得る。
【０３６０】
異種アルブミン融合タンパク質
本明細書に記載されているＧＬＰ−１化合物などのＢＳＰは、直接に、又はペプチドリンカー、水溶性リンカー若しくはプロドラッグリンカーを介して、アルブミン又はその類縁体、断片若しくは誘導体に融合され得る。一般的には、本発明の融合タンパク質の一部であるアルブミンタンパク質は、ヒトを含むあらゆる種からクローニングされたアルブミンに由来し得る。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、６６，５００の公式分子量を有する５８５アミノ酸の単一非グリコシル化ポリペプチド鎖からなる。ヒトＨＳＡのアミノ酸配列は公知である［Ｍｅｌｏｕｎ，  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８：１３６；  Ｂｅｈｒｅｎｓ，  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）  Ｆｅｄ．  Ｐｒｏｃ．  ３４：５９１；  Ｌａｗｎ，  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９：６１０２−６１１４；  Ｍｉｎｇｈｅｔｔｉ，  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６１：６７４７を参照。それぞれ、参照により、本明細書に組み込まれる。］。アルブミンの様々な多型バリアント並びに類縁体及び断片が記載されている。［Ｗｅｉｔｋａｍｐ，  ｅｔ  ａｌ．，（１９７３）  Ａｎｎ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  ３７：２１９］を参照。例えば、ＥＰ３２２，０９４には、ＨＳＡの様々なより短い形態がある。ＨＳＡ（１−３７３）、ＨＳＡ（１−３８８）、ＨＡＳ（１−３８９）、ＨＳＡ（１−３６９）及びＨＳＡ（１−４１９）並びに１−３６９と１−４１９の間の断片を含む、ＨＳＡのこれらの断片の幾つかが開示されている。ＥＰ３９９，６６６は、ＨＳＡ（１−１７７）及びＨＳＡ（１−２００）並びにＨＳＡ（１−１７７）とＨＳＡ（１−２００）の間の断片を含むアルブミン断片を開示している。
【０３６１】
本発明の異種融合タンパク質には、あらゆるアルブミンタンパク質（断片、類縁体及び誘導体を含む。）に結合されたＧＬＰ−１化合物が含まれ、このような融合タンパク質は生物学的に活性であり、ＧＬＰ−１化合物単独より長い血漿半減期を有する。このため、融合タンパク質のアルブミン部分は、固有のヒトアルブミンと等しい血漿半減期を有する必要は必ずしもない。固有のヒトアルブミンより長い半減期を有し、又は固有のヒトアルブミンと目的のＧＬＰ−１化合物の中間の半減期を有する断片、類縁体及び誘導体は公知であり、又は作製することができる。
【０３６２】
本発明の異種融合タンパク質は、ＧＬＰ−１化合物及び／又は融合タンパク質のＦｃ又はアルブミン部分中に保存的アミノ酸置換を有するタンパク質を包含する。「保存的置換」とは、あるアミノ酸を、同じ正味電荷を有し、概ね同じサイズと形状を有する別のアミノ酸と交換することである。脂肪族又は置換された脂肪族アミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、それらの側鎖中の炭素及び複素原子の総数の差が約４以下である場合に、概ね同一のサイズを有する。それらは、それらの側鎖中の分岐の数が最大１つ異なる場合に、概ね同じ形状を有する。それらの側鎖中にフェニル又は置換されたフェニル基を有するアミノ酸は、概ね同じサイズと形状を有すると考えられる。本明細書中に具体的に別段の記載がなされている場合を除き、保存的置換は、好ましくは、天然に存在するアミノ酸を用いて行われる。
【０３６３】
野生型アルブミン及び免疫グロブリンタンパク質は、様々な取得源から取得することができる。例えば、これらのタンパク質は、目的のｍＲＮＡを検出可能なレベルで発現する組織又は細胞から調製されたｃＤＮＡライブラリ−から取得することが可能である。ライブラリ−は、目的のタンパク質について公開されたＤＮＡ又はタンパク質配列を用いて設計されたプローブを用いてスクリーニングすることが可能である。例えば、免疫グロブリンの軽鎖又は重鎖定常領域は、「Ａｄａｍｓ，  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９：２７１１−２７１９；  Ｇｏｕｇｈｅｔ，  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９：２７０２−２７１０；  Ｄｏｌｂｙ，  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：６０２７−６０３１；  Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７９：７８６２−７８６２；  Ｆａｌｋｎｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）  Ｎａｔｕｒｅ  ２９８：２８６−２８８；  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２：２３９−２５６」に記載されている。アルブミンのタンパク質及びＤＮＡ配列を開示している幾つかの参考文献には、「Ｍｅｌｏｕｎ，  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８：１３６；  Ｂｅｈｒｅｎｓ，  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）  Ｆｅｄ．  Ｐｒｏｃ．  ３４：５９１；  Ｌａｗｎ，  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９：６１０２−６１１４；  ａｎｄ  Ｍｉｎｇｈｅｔｔｉ，  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６１：６７４７」が含まれる。
【０３６４】
合成非固有アミノ酸、置換されたアミノ酸、又は１若しくは複数のＤアミノ酸を含む非天然アミノ酸の、本発明の異種融合タンパク質中への取り込みは、多数の異なる面で有利であり得る。Ｄアミノ酸含有ペプチドなどは、対応するＬアミノ酸含有ペプチドに比べて、インビトロ又はインビボで増加した安定性を示す。このため、Ｄアミノ酸を取り込むペプチドなどの構築は、より大きな細胞内安定性が望まれ又は必要とされる場合には、特に有用であり得る。より具体的には、Ｄペプチドなどは、内在性ペプチダーゼ及びプロテアーゼに対して耐性であることにより、このような特性が望ましい場合には、分子の改善された生物学的利用性及び延長されたインビボでの寿命を与える。さらに、Ｄペプチドなどは、主要組織適合性複合体クラスＩＩによって拘束されたＴヘルバー細胞への提示のために、効率的にプロセッシングを受けることができないので、生物体の中で液性免疫応答を誘導する可能性がより少ない。
【０３６５】
他のペプチドは、Ｔ−２０（ＤＰ−１７８）、ＰＹＹ（３−３６）及びＲＡＮＴＥＳを含む（これらに限定されない。）非天然コードアミノ酸で修飾され得る。
【０３６６】
ＲＡＮＴＥＳとして知られるポリペプチドは、ケモカインとして知られるサイトカインの巨大ファミリーの一員であり、β−ケモカインとして分類される。ＲＡＮＴＥＳは、６８アミノ酸の配列を有する。最近、ＲＡＮＴＥＳに対する受容体がクローニングされ（Ｇａｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７７：１４２１−７（１９９３）；  Ｎｅｏｔｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ７２：４１５−２５（１９９３））、ＭＩＰ−１α＞ＲＡＮＴＥＳの効力の順序で、ケモカインを結合することが示された。
【０３６７】
ケモカインは、様々な炎症促進性細胞種を動員し、活性化する能力を有しており、ＲＡＮＴＥＳは、インビボで炎症性応答を惹起することが示されている。ＲＡＮＴＥＳは、ＣＣＲ５ケモカイン受容体に対する天然のリガンド、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βとともに、ヒト免疫不全ウイルス１型（「ＨＩＶ−１」）感染を阻害することが明らかとされており（Ｃｏｃｃｈｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：１８１１−１８１５（１９９５））、ＣＣＲ５がＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２及びＳＩＶ−１の初代単離株に対する主な共受容体として同定されるに至った（Ｄｅｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３８１：６６１−６６６（１９９６）；  Ｄｏｒａｎｚ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ８５：１１４９−１１５８（１９９６）；  Ｃｈｏｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ８５：１１３５−１１４８（１９９６）；  Ｃｈｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７１：２７０５−２７１４（１９９７）；  ａｎｄ  Ａｌｋｈａｔｉｂ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：１９５５−１９５８（１９９６））。しかしながら、ＲＡＮＴＥＳは、末梢血単核細胞中でのＨＩＶ−１複製を一貫して阻害するが、初代マクロファージ培養物の感染を遮断しないので、ＲＡＮＴＥＳは非リンパ球細胞種でのＨＩＶ複製には影響を与えないことが推測される。
【０３６８】
ＲＡＮＴＥＳのＮ末端修飾は、カルシウム流動をシグナル伝達せずに、ＨＩＶ−１感染を遮断することが可能なアンタゴニストをもたらす（Ｍａｃｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８７：１２１５−１２２４（１９９８）  ａｎｄ  Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１：２５９９−２６０３（１９９６））。これらの修飾には、Ｎ末端切断［ＲＡＮＴＥＳ  ９−６８］（Ａｒｅｎｚａｎａ−Ｓｅｉｓｄｅｄｏｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３８３：４００（１９９６））及びＲＡＮＴＥＳのＮ末端への、メチオニンの付加（「Ｍｅｔ−ＲＡＮＴＥＳ」）又はアミノオキシペンタンの付加（「ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ」）が含まれる（Ｍａｃｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａ  ａｎｄ  Ｓｉｍｍｏｎｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：２７６−２７９（１９９７））。Ｍｅｔ−ＲＡＮＴＥＳ及びＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ誘導体は、ＲＡＮＴＥＳのアンタゴニストであることが報告されている。さらに、Ｎ末端が修飾されたＲＡＮＴＥＳ（固有のＲＡＮＴＥＳよりＣＣＲ５に対してより高い親和性を有する。）は、感染を遮断する上で、固有のＲＡＮＴＥＳより強力である（Ｓｉｍｍｏｎｓ，  ｅｔ  ａｌ．，上記）。
【０３６９】
強力で、選択的であり、受容体を完全に占有するケモカイン受容体アンタゴニストは、感染した個体中のＨＩＶ−１の治療に明らかに有用である。驚くべきことに、この活性スペクトルを有する化合物が発見されている。これらの誘導体は、マクロファージ及びリンパ球を含む様々な多くの細胞種の感染を阻害した。さらに、ＲＡＮＴＥＳのアンタゴニストは、その炎症効果を効果的に遮断し、このため、喘息、アレルギ−性鼻炎、アトピー性皮膚炎、ウイルス疾患、動脈アテローム／アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ及び臓器移植拒絶の治療に有用である。ＲＡＮＴＥＳのある種の誘導体が、Ｗｅｌｌｓらの国際出願ＷＯ  ９６／１７９３５号に開示されている。米国特許第６，１６８，７８４号（参照により、本明細書に組み込まれる。）は、化学合成によって産生された、Ｎ末端修飾されたＲＡＮＴＥＳ誘導体を記載している。１又は複数の非天然コードアミノ酸を含むＲＡＮＴＥＳポリペプチドは、同様又は改善された治療活性を与え得る。
【０３７０】
ＩＩＩ．本発明とともに使用するための一般的な組み換え核酸方法
本発明の多くの実施形態において、関心のあるＢＳＰをコードする核酸を単離し、クローニングし、多くの場合は、組み換え法を用いて変更を施す。以下に限定されないが、タンパク質発現に対して、又はバリアント、誘導体、発現カセットもしくはＢＳＰ由来のその他の配列の生成中に、このような実施形態を使用する。ある実施形態において、本発明のポリペプチドをコードする配列を異種プロモーターに操作可能に連結させる。ＧＬＰ−１の単離及び宿主細胞中でのＧＬＰ−１の産生は、例えば、米国特許第５，１１８，６６６号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）に記載されている。
【０３７１】
親ポリペプチド（配列番号１、２、３、２１（ＧＬＰ−１）、配列番号２２、２４（Ｔ−２０）又は配列番号２３（ＰＹＹ（３−３６）に示されているアミノ酸配列を有するが、これらに限定されない。）のアミノ酸配列に基づき、次いで、適切なアミノ酸残基の導入（即ち取り込み又は置換）又は除去（即ち欠失又は置換）が為されるようにヌクレオチド配列を変化させて、非天然コードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を合成し得る。従来の方法に従い、部位特異的突然変異誘発法により、ヌクレオチド配列を都合よく修飾し得る。あるいは、以下に限定されないが、オリゴヌクレオチド合成装置を用いることによるもの（所望するポリペプチドのアミノ酸配列に基づきオリゴヌクレオチドを設計し、好ましくは、組み換えポリペプチドを産生させる宿主細胞において好適であるコドンを選択する。）を含む化学合成により、ヌクレオチド配列を調製し得る。例えば、所望するポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成し、ＰＣＲ、ライゲーション又はライゲーション連鎖反応により組み立て得る。例えば、Ｂａｒａｎｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ８８：１８９−１９３（１９９１）；米国特許第６，５２１，４２７号（これらを本明細書中に参照により組み込む。）を参照のこと。
【０３７２】
本発明は、遺伝子組み換えの分野での通常の技術を利用する。本発明で役立つ一般的方法を開示する基礎的な教科書としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４）が挙げられる。
【０３７３】
分子生物学技術を記載する一般的教科書としては、Ｂｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）、Ｖｏｌ．１−３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ．ＩｎｃとＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との合同出版（１９９９まで補充あり。）（「Ａｕｓｂｅｌ」）が挙げられる。これらの教科書は、突然変異誘発法、ベクターの使用、プロモーター及び、以下に限定されないが、非天然アミノ酸、オルソゴナルｔＲＮＡ、オルソゴナルシンテターゼ及びそれらの組合せなどのタンパク質産生のためのセレクターコドンを含む遺伝子生成など、多くのその他の関連のある話題を記載している。プロモーターには、原核生物のプロモーター、真核生物のプロモーター、細菌のプロモーター、酵母のプロモーター、昆虫のプロモーター、哺乳動物のプロモーター、ユニークプロモーター及び誘導可能なプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
【０３７４】
様々な目的のために（以下に限定されないが、ｔＲＮＡライブラリの作製、シンテターゼのライブラリの作製、セレクターコドンの作製、関心のあるタンパク質又はポリペプチドにおける非天然アミノ酸をコードするセレクターコドンの挿入のために、など。）、様々なタイプの突然変異誘発法を本発明において使用する。これらには、以下に限定されないが、部位特異的、ランダムポイント突然変異誘発法、相同的組み換え、ＤＮＡシャッフル又はその他の繰り返し用いられる突然変異誘発法、キメラ構築、ウラシル含有テンプレートを用いた突然変異誘発法、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発法、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発法、ギャップのある二本鎖ＤＮＡなどを用いた突然変異誘発法又はそれらの何らかの組合せが含まれる。さらなる適切な方法としては、ポイントミスマッチ修復（ｐｏｉｎｔ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ）、修復欠損宿主株を用いた突然変異誘発法、制限選択及び制限精製、欠失突然変異誘発法、トータル遺伝子合成による突然変異誘発法、二本鎖切断修復などが挙げられる。以下に限定されないがキメラ構築を含むものなどの、突然変異誘発法もまた本発明に含まれる。ある実施形態において、天然分子又は変更もしくは突然変異を施された天然分子の既知の情報（以下に限定されないが配列、配列比較、物理特性、結晶構造などを含む。）により、突然変異誘発を導くことができる。
【０３７５】
本明細書中で見出される教科書及び例は、これらの手段を記載する。さらなる情報は、以下の文献中で引用される次の刊行物及び参考文献において見出すことができる：Ｌｉｎｇら、Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４（２）：１５７−１７８（１９９７）；Ｄａｌｅら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７：３６９−３７４（１９９６）；Ｓｍｉｔｈ，ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３−４６２（１９８５）；Ｂｏｔｓｔｅｉｎ及びＳｈｏｒｔｌｅ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：１１９３−１２０１（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１−７（１９８６）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．及びＬｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．Ｊ．編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）（１９８７）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｕｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら、Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４、３６７−３８２（１９８７）；Ｂａｓｓら、Ｍｕｔａｎｔ  Ｔｒｐ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｗｉｔｈ  ｎｅｗ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：２４０−２４５（１９８８）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０（１９８７）；Ｚｏｌｌｅｒ及びＳｍｉｔｈ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｎｙ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００（１９８２）；Ｚｏｌｌｅｒ及びＳｍｉｔｈ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｌｏｎｅｄ  ｉｎｔｏ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８３）；Ｚｏｌｌｅｒ及びＳｍｉｔｈ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ｔｗｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｍｐｌａｔｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０（１９８７）；Ｔａｙｌｏｒら、Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｐｒｅｐａｒｅ  ｎｉｃｋ  ＤＮＡ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：８７４９−８７６４（１９８５）；Ｔａｙｌｏｒら、Ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：８７６５−８７８７（１９８５）；Ｎａｋａｍａｙｅ及びＥｃｋｓｔｅｉｎ，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＮｃｉＩ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｂｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｇｒｏｕｐｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９６７９−９６９８（１９８６）；Ｓａｙｅｒｓら、５’−３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７９１−８０２（１９８８）；Ｓａｙｅｒｓら、Ｓｔｒａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ，（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８０３−８１４；Ｋｒａｍｅｒら、Ｔｈｅ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：９４４１−９４５６（１９８４）；Ｋｒａｍｅｒ及びＦｒｉｔｚ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｖｉａ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３５０−３６７（１９８７）；Ｋｒａｍｅｒら、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７２０７（１９８８）；Ｆｒｉｔｚら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６９８７−６９９９（１９８８）；Ｋｒａｍｅｒら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｂａｓｅ／ｂａｓｅ  ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ  ａｒｅ  ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｍｅｔｈｙｌ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ＤＮＡ  ｍｉｓｍａｔｃｈ−ｒｅｐａｉｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｃｅｌｌ  ３８：８７９−８８７（１９８４）；Ｃａｒｔｅｒら、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３８２−４０３（１９８７）；Ｅｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｌａｒｇｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：５１１５（１９８６）；Ｗｅｌｌｓら、Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ，Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ３１７：４１５−４２３（１９８６）；Ｎａｍｂｉａｒら、Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９−１３０１（１９８４）；Ｓａｋｍａｒ及びＫｈｏｒａｎａ，Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｅｈｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｒｏｄ  ｏｕｔｅｒ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６３６１−６３７２（１９８８）；Ｗｅｌｌｓら、Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｉｔｅｓ，Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３（１９８５）；Ｇｒｕｎｄｓｔｏｍら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ  「ｓｈｏｔ−ｇｕｎ」ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３３０５−３３１６（１９８５）；Ｍａｎｄｅｃｋｉ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８３：７１７７−７１８１（１９８６）；Ａｒｎｏｌｄ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：４５０−４５５（１９９３）；Ｓｉｅｂｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９：４５６−４６０（２００１）；Ｗ．Ｐ．Ｃ．Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７０，３８９−９１（１９９４）；及びＩ．Ａ．Ｌｏｒｉｍｅｒ，Ｉ．Ｐａｓｔａｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，３０６７−８（１９９５）。上記の方法の多くにおけるさらなる詳細は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第１５４巻（これも、様々な突然変異誘発法に伴うトラブルシュ−ティング問題に対する有用なコントロールについて述べている。）。で見出すことができる。
【０３７６】
本発明はまた、真核宿主細胞、非真核宿主細胞及びオルソゴナルｔＲＮＡ／ＲＳペアを介した非天然アミノ酸のインビボ取り込みのための生物に関する。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチド又は、以下に限定されないが本発明のベクター（例えば、クローニングベクター又は発現ベクターであり得る。）などの、本発明のポリヌクレオチドを含むコンストラクトを用いて遺伝子操作（以下に限定されないが、形質転換、形質導入又はトランスフェクションなど。）されている。ベクターは、例えば、プラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又は共役ポリヌクレオチドの形態であり得る。エレクトロポレーション（Ｆｒｏｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２、５８２４（１９８５））、ウイルスベクターによる感染、小さなビーズもしくは粒子のマトリクス内又は表面上の何れかに核酸を有する小粒子による高速弾丸貫入（Ｋｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２７、７０−７３（１９８７））を含む標準的方法により、細胞及び／又は微生物にベクターを導入する。
【０３７７】
例えばスクリーニング段階、プロモーター活性化又は形質転換細胞の選択などの作業に対して適切なように改変した従来の栄養培地中で、操作した宿主細胞を培養することができる。トランスジェニック生物中においてこれらの細胞を場合によっては培養することができる。その他の有用な参考文献としては（以下に限定されないが細胞単離及び培養に関する（例えば続く核酸単離に関する）ものなどを含む。）、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ及びそこで引用されている文献；Ｐａｙｎｅら、（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ及びＰｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）ならびに、Ａｔｌａｓ及びＰａｒｋｓ（編）Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ．が挙げられる。
【０３７８】
標的核酸を細胞に導入するいくつかの周知の方法を利用可能であり、そのいずれも本発明で使用することができる。これらには、ＤＮＡを含有する細菌プロトプラストとの受容細胞の融合、エレクトロポレーション、発射体射撃法（ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）及びウイルスベクターによる感染（下記でさらに述べる。）などが含まれる。本発明のＤＮＡコンストラクトを含有するプラスミド数を増幅するために、細菌細胞を使用することができる。対数増殖期まで細菌を増殖させ、細菌内のプラスミドを当技術分野で公知の様々な方法により単離することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと。）。さらに、細菌からのプラスミド精製のために、多くのキットが市販されている（例えば、ＥａｓｙＰｒｅｐＴＭ、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐＴＭ、両方とも、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈより；ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＳｔｒａｔａＣｌｅａｎＴＭ；及びＱｉａｇｅｎからのＱＩＡｐｒｅｐＴＭ）。次に、単離され精製されたプラスミドをさらに操作して、他のプラスミドを生成させ、細胞に対してトランスフェクションを行うか、又は生物に感染させるために関連ベクターに組み込むために使用する。一般的なベクターは、転写及び翻訳ターミネーター、転写及び翻訳開始配列、ならびに、特定の標的核酸の発現制御に有用なプロモーターを含有する。ベクターは、場合によっては、少なくとも１個の独立したターミネーター配列、真核もしくは原核細胞又は両方においてカセットの複製を可能にする配列（以下に限定されないが、シャトルベクターを含む。）及び原核生物及び真核細胞系両方に対する選択マーカーを含有する一般的発現カセットを含む。ベクターは、原核細胞、真核細胞又は好ましくはこの両方での複製及び組み込みに適切である。Ｇｉｌｉｍａｎ及びＳｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ  ８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ，ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６（１）１０−１４：１０（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｂｅｒｇｅｒ（全て先述）を参照のこと。クローニングに有用な、細菌及びバクテリオファージのカタログは、例えば、ＡＴＣＣにより与えられている（例えば、Ｔｈｅ  ＡＴＣＣ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ（１９９２）Ｇｈｅｒｎａら（編）、ＡＴＣＣにより出版。）。配列決定、クローニング及び分子生物学のその他の局面に対するさらなる基本的手段ならびに基礎となる理論的考察はまた、Ｗａｔｓｏｎら（１９９２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  第２版、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，ＮＹで見出すことができる。さらに、基本的にあらゆる核酸（及び標準的又は非標準的であれ、実際にはあらゆる標識された核酸）を、Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ、ｍｃｒｃ．ｃｏｍのＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂで利用可能。）、Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒａｍｏｎａ，ＣＡ、ｇｅｎｃｏ．ｃｏｍのＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂで利用可能。）、Ｅｘｐｒ���ｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ、ｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍのＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂで利用可能。）、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）及びその他の多くの業者などの、あらゆる様々な市販ソースからカスタム注文又は通常注文することができる。
【０３７９】
セレクターコドン
本発明のセレクターコドンは、タンパク質生合成機構の遺伝子コドンフレームワークを広げる。例えば、セレクターコドンには、以下に限定されないが、ユニークな３個の塩基コドン、非センスコドン、例えば、停止コドン（以下に限定されないが、アンバーコドン（ＵＡＧ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）などを含む。）、非天然コドン、４以上の塩基コドン、レアコドンなどが含まれる。当業者にとって当然のことながら、少なくともＢＳＰの一部をコードする１つのポリヌクレオチド中に、以下に限定されないが、１又は複数、２以上、３を超える、４、５、６、７、８、９、１０以上、所望する遺伝子に導入することができる、様々な数のセレクターコドンが存在する。
【０３８０】
ある実施形態において、本発明は、真核細胞でのインビボの非天然アミノ酸の組み込みのための停止コドンであるセレクターコドンの使用を含む。例えば、以下に限定されないが、ＵＡＧを含む停止コドンを認識するＯ−ｔＲＮＡを作製し、所望する非天然アミノ酸を用いてＯ−ＲＳによりアミノアシル化する。このＯ−ｔＲＮＡは、天然の宿主アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼにより認識されない。以下に限定されないがＴＡＧを含む停止コドンを関心のあるポリペプチドの関心のある部位に導入するために、従来の部位特異的突然変異誘発法を使用することができる。例えば、Ｓａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．ら、（１９８８）、５’，３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，７９１−８０２。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ及び関心のあるポリヌクレオチドをコードする核酸をインビボで組み合せる場合、非天然アミノ酸をＵＡＧコドンに反応して取り込み、特定の位置に非天然アミノ酸を含有するポリペプチドを与える。
【０３８１】
真核宿主細胞を顕著に撹乱することなく、インビボでの非天然アミノ酸の取り込みを行うことができる。例えば、ＵＡＧコドンに対する抑制効率は、Ｏ−ｔＲＮＡ（以下に限定されないが、アンバーサプレッサーｔＲＮＡを含む。）と真核放出因子（以下に限定されないが、ｅＲＦ）（これは、停止コドンに結合し、リボソームからの伸長ペプチドの放出を開始させる。）との間の競合に依存するので、以下に限定されないが、Ｏ−ｔＲＮＡ及び／又はサプレッサーｔＲＮＡの発現レベルを向上させることなどにより、抑制効率を調節することができる。
【０３８２】
セレクターコドンはまた、延長したコドン（以下に限定されないが、４以上の塩基コドン、例えば、４、５、６以上の塩基コドンを含む。）も含有する。４塩基コドンの例としては、以下に限定されないが、ＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、ＣＣＣＵなどが挙げられる。５個の塩基コドンの例としては、以下に限定されないが、ＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、ＵＡＧＧＣなどが挙げられる。本発明の特性には、フレームシフト抑制に基づく、延長されたコドンを用いることが含まれる。４以上の塩基コドンは、以下に限定されないが１又は複数の非天然アミノ酸などを同じタンパク質に挿入する。例えば、以下に限定されないがアンチコドンループ（例えば少なくとも８−１０ｎｔのアンチコドンループ）を有する特別なフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを含む、突然変異が入っているＯ−ｔＲＮＡの存在下で、４以上の塩基コドンを１個のアミノ酸として読む。他の実施形態において、以下に限定されないが、少なくとも４塩基のコドン、少なくとも５塩基のコドン又は少なくとも６塩基以上のコドンなどの、アンチコドンループを解読できる。２５６個の可能な四塩基コドンがあるので、４以上の塩基コドンを用いて、同じ細胞において複数の非天然アミノ酸をコードすることができる。Ａｎｄｅｒｓｏｎら、（２００２）Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｌｉｍｉｔｓ  ｏｆ  Ｃｏｄｏｎ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ  Ｓｉｚｅ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９：２３７−２４４；Ｍａｇｌｉｅｒｙ，（２００１）Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｏｆ  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  「Ｓｈｉｆｔｙ」Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７：７５５−７６９を参照のこと。
【０３８３】
例えば、インビトロ生合成法を用いて非天然アミノ酸をタンパク質に取り込むために、四塩基コドンが使用されてきた。例えば、Ｍａら、（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：７９３９；及びＨｏｈｓａｋａら、（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：３４を参照のこと。ＣＧＧＧ及びＡＧＧＵを使用して、２個の化学的にアシル化したフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを用いて、インビトロでストレプトアビジンに２−ナフチルアラニン及びリジンのＮＢＤ誘導体を同時に取り込ませた。例えば、Ｈｏｈｓａｋａら、（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：１２１９４を参照のこと。インビボ実験において、Ｍｏｏｒｅらは、ＮＵＣＡアンチコドンを伴うｔＲＮＡ  Ｌｅｕ誘導体がＵＡＧＮコドンを抑制する能力を調べ（Ｎは、Ｕ、Ａ、Ｇ又はＣであり得る。）、０又は−１フレームでの解読がほとんどなく、１３％から２６％の効率で、クアドルプレット（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ）ＵＡＧＡが、ＵＣＵＡアンチコドンを伴うｔＲＮＡ  Ｌｅｕにより解読され得ることが分かった。Ｍｏｏｒｅら、（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９８：１９５を参照のこと。ある実施形態において、本発明にて、レアコドン又はナンセンスコドンに基づく延長コドンを使用することができ、他の不必要な部位で、ミスセンス、リ−ドスル−及びフレームシフト抑制を減少させることができる。
【０３８４】
ある一定の系に対して、セレクターコドンはまた、天然の３塩基コドンのうち１個を含み得、内在性の系は、天然塩基コドンを使用しない（又は稀にしか使用しない。）。例えば、これには、天然の３塩基コドンを認識するｔＲＮＡを欠いている系及び／又は３塩基コドンがレアコドンである系が含まれる。
【０３８５】
セレクターコドンは、場合によっては、非天然塩基対を含む。これらの非天然塩基対はさらに、既存の遺伝子アルファベットを拡張する。１つの余分な塩基対により、６４から１２５にトリプレットコドン数が増加する。第三の塩基対の特性には、安定かつ選択的な塩基対形成、ポリメラーゼによる、ＤＮＡへの高性能の効率的な酵素的取り込み及び新生非天然塩基対の合成後の効率的な連続したプライマー伸長が含まれる。方法及び組成物に対して適応させることができる非天然塩基対の記述としては、例えば、Ｈｉｒａｏら（２００２）  Ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｆｏｒ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：１７７−１８２が挙げられる。その他の適切な刊行物は下記で挙げる。
【０３８６】
インビボ利用の場合、非天然ヌクレオシドは膜透過性であり、リン酸化されて対応する三リン酸を形成する。さらに、さらに多くの遺伝情報は安定であり、細胞性酵素により破壊されない。Ｂｅｎｎｅｒら及びその他による以前の研究は、標準的なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋペアにおけるものとは異なる水素結合パターンを利用しており、最も価値ある例は、Ｃ：ｉｓｏ−Ｇペアである。例えば、Ｓｗｉｔｚｅｒら、（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：８３２２；及びＰｉｃｃｉｒｉｌｌｉら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ、３４３：３３；Ｋｏｏｌ、（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２を参照のこと。これらの塩基は通常、ある程度天然塩基と誤対合し、酵素的に複製することはできない。Ｋｏｏｌ及び共同研究者らは、塩基間の疎水性パッキング相互作用が水素結合を置換して、塩基対の形成を推進できることを明らかにした。Ｋｏｏｌ（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２；及びＧｕｃｋｉａｎ及びＫｏｏｌ、（１９９８）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３６，２８２５を参照のこと。上記の要求全てを満足させる非天然塩基対を開発する目的で、Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ及び共同研究者らは、一連の非天然疎水性塩基を体系的に合成し、研究を行った。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対合が、天然塩基対よりも安定で、Ｅ．コリ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（ＫＦ）のＫｌｅｎｏｗ断片により、ＤＮＡに効率的に取り込まれ得ることが分かっている。例えば、ＭｃＭｉｎｎら、（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２１：１１５８６；及びＯｇａｗａら、（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２２：３２７４を参照のこと。ＫＦにより、生物機能に十分効率的かつ選択的に、３ＭＮ：３ＭＮ自己対合を合成することができる。例えば、Ｏｇａｗａら、（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２２：８８０３を参照のこと。しかし、両塩基とも、さらなる複製に対して連鎖停止剤として作用する。突然変異ＤＮＡポリメラーゼは最近、ＰＩＣＳ自己対合を複製するために使用できることが分かった。さらに、７ＡＩ対合を複製することができる。例えば、Ｔａｅら、（２００１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２３：７４３９を参照。Ｃｕ（ＩＩ）を結合した際に安定なペアを形成する、新規メタロ塩基対、Ｄｉｐｉｃ：Ｐｙもまた開発された。Ｍｅｇｇｅｒｓら、（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２２：１０７１４を参照のこと。延長コドン及び非天然コドンは、天然コドンに対して本質的にオルソゴナルなので、本発明の方法は、それらに対するオルソゴナルｔＲＮＡを生成させるためにこの特性の長所を利用することができる。
【０３８７】
所望するポリペプチドにおいて非天然アミノ酸を取り込むために、翻訳回避系を使用することもできる。翻訳回避系において、長い配列を遺伝子に取り込むが、タンパク質に翻訳されない。この配列は、リボソームがその配列を跳び越すよう誘発し、挿入の下流で翻訳を開始するきっかけとして働く構造を含有する。
【０３８８】
ある一定の実施形態において、本発明の方法及び／又は組成物における、関心のあるタンパク質又はポリペプチド（又はその一部）が核酸によりコードされる。通常、核酸は、少なくとも１個のセレクターコドン、少なくとも２個のセレクターコドン、少なくとも３個のセレクターコドン、少なくとも４個のセレクターコドン、少なくとも５個のセレクターコドン、少なくとも６個のセレクターコドン、少なくとも７個のセレクターコドン、少なくとも８個のセレクターコドン、少なくとも９個のセレクターコドン、１０個以上のセレクターコドンを含有する。
【０３８９】
当業者にとって周知であり、本明細書中に記載の方法を用いて、関心のあるタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子に対して突然変異誘発を行い、例えば、非天然アミノ酸の取り込みのための１又は複数のセレクターコドンを含むようにすることができる。例えば、関心のあるタンパク質に対する核酸に対して突然変異誘発を行い、１又は複数のセレクターコドンを含むようにし、それにより１又は複数の非天然アミノ酸が取り込まれるようにする。本発明は、あらゆるこのようなバリアント（以下に限定されないが、突然変異体、例えば少なくとも１個の非天然アミノ酸を含むあらゆるタンパク質の型など。）を含む。同様に、本発明はまた、対応する核酸、即ち、１又は複数の非天然アミノ酸をコードする１又は複数のセレクターコドンを有する何らかの核酸も含む。
【０３９０】
ＧＬＰ−１、Ｔ−２０又はＰＹＹ（３−３６）などのＢＳＰをコードする核酸分子に対して容易に突然変異誘発を行い、ポリペプチドの何れかの所望の位置にシステインを導入し得る。反応性分子、水溶性ポリマー、タンパク質又は多岐にわたるその他の分子を関心のあるタンパク質に導入するために、システインが広く使用されている。ポリペプチドの所望の位置にシステインを取り込むのに適切な方法は、米国特許第６，６０８，１８３号（本明細書中に参照により組み込む。）に記載のもの及び標準的突然変異誘発技術など、当技術分野で周知である。
【０３９１】
ＩＶ．非天然コードアミノ酸
非常に多岐にわたる非天然コードアミノ酸が本発明における使用に適切である。あらゆる数の非天然コードアミノ酸をＢＳＰに導入することができる。一般に、導入された非天然コードアミノ酸は、２０種類の一般的な遺伝子コードアミノ酸（即ち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン）に対して実質的に化学的に不活性である。ある実施形態において、非天然コードアミノ酸は、効率的かつ選択的に２０種類の一般的なアミノ酸では見られない官能基（以下に限定されないが、アジド、ケトン、アルデヒド及びアミノオキシ基）と反応し、安定な抱合体を形成する側鎖官能基を含む。例えば、アジド官能基を含有する非天然コードアミノ酸を含むＢＳＰは、ポリマー（以下に限定されないが、ポリ（エチレングリコール）又はアルキン部分を含有する第二のポリペプチドを含む。）と反応し、アジド及びアルキン官能基の選択的反応を引き起こす安定な抱合体を形成し、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化生成物を形成することができる。
【０３９２】
α−アミノ酸の一般構造を以下に示す（式Ｉ）：
【０３９３】
【化５】
2008507280.tif 000006
【０３９４】
非天然コードアミノ酸は、通常、上記で挙げた式（式中、Ｒ基は、２０種類の天然アミノ酸で使用されるもの以外の何らかの置換基であり、本発明での使用に適切であり得る。）を有するあらゆる構造である。本発明の非天然コードアミノ酸は通常、側鎖の構造のみが天然アミノ酸と異なるので、非天然コードアミノ酸は、天然ポリペプチドにおいてアミド結合が形成されるのと同様にして、以下に限定されないが天然又は非天然コードのものを含む他のアミノ酸とアミド結合を形成する。しかし、非天然コードアミノ酸は、天然アミノ酸と非天然アミノ酸とを区別する側鎖基を有する。例えば、Ｒは、場合によっては、アルキル−、アリール−、アシル−、ケト−、アジド−、ヒドロキシル−、ヒドラジン、シアノ−、ハロ−、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ−、スルホニル−、ホウ酸塩、ボロン酸塩、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミノ基など又はこれらの組合せを含む。本発明での使用に適切であり得る関心のあるその他の非天然アミノ酸には、以下に限定されないが、光活性化架橋を含有するアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有又は非共有相互作用するアミノ酸、フォトケージ（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）及び／又は光異性化アミノ酸、ビオチン又はビオチン類似体を含有するアミノ酸、糖置換セリンなどグリコシル化アミノ酸、その他の炭水化物修飾アミノ酸、ケト含有アミノ酸、ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含有するアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学切断可能及び／又は光切断可能なアミノ酸、天然アミノ酸と比較して長い側鎖を有するアミノ酸（以下に限定されないが、ポリエーテル又は、約５を超える、又は約１０炭素を超える（これらに限定されない。）長鎖炭化水素など。）、炭素結合糖含有アミノ酸、酸化還元活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸及び１又は複数の毒性部分を含有するアミノ酸が含まれる。
【０３９５】
本発明における使用に適切であり得、水溶性ポリマーとの反応に有用である非天然コードアミノ酸の例としては、以下に限定されないが、カルボニル、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド、セミカルバジド、アジド及びアルキン反応基を有するものが挙げられる。ある実施形態において、非天然コードアミノ酸は、糖部分を含む。このようなアミノ酸の例としては、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ガラクトサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−スレオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−アスパラギン及びＯ−マンノサミニル−Ｌ−セリンが挙げられる。このようなアミノ酸の例としては、また、アミノ酸と糖との間の天然Ｎ−又はＯ−結合が、一般に天然では見られない共有結合（以下に限定されないが、アルケン、オキシム、チオエーテル、アミドなどを含む。）により置換されている例が挙げられる。このようなアミノ酸の例としてはまた、天然タンパク質では一般に見られない糖、例えば、２−デオキシ−グルコース、２−デオキシガラクトースなどが挙げられる。
【０３９６】
本明細書中で与えられる非天然コードアミノ酸の多くは、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ＥＭＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ部門、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）又はＰｅｐｔｅｃｈ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から市販されている。場合によっては、本明細書中で与えるように、又は当業者にとって公知の標準的方法を用いて、市販されていないものを合成する。有機合成技術に関しては、例えば、Ｆｅｓｓｅｄｏｎ及びＦｅｓｓｅｄｏｎによるＯｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２、第二版、Ｗｉｌｌａｒｄ  Ｇｒａｎｔ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．）；ＭａｒｃｈによるＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第三版、１９８５、Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；及びＣａｒｅｙ及びＳｕｎｂｅｒｇによるＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第三版、パ−トＡ及びＢ、１９９０、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと。また、米国特許出願公開２００３／００８２５７５及び２００３／０１０８８８５（本明細書中に参照により組み込む。）も参照のこと。新規側鎖を含有する非天然アミノ酸に加えて、本発明での使用に適切であり得る非天然アミノ酸もまた、場合によっては、以下に限定されないが、式ＩＩ及びＩＩＩの構造で示されるような修飾骨格構造を含む：
【０３９７】
【化６】
2008507280.tif 000007
（式中、Ｚは、通常、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’又はＳ−Ｒ’を含み；Ｘ及びＹは、同じ又は異なり得、通常、Ｓ又はＯを含み、Ｒ及びＲ’は、場合によっては同じ又は異なり得、通常、式Ｉを有する非天然アミノ酸に対して上記で述べたＲ基に対する構成成分の同じ一覧ならびに水素から選択される。）。例えば、本発明の非天然アミノ酸は場合によっては、式ＩＩ及びＩＩＩにより示されるように、アミノ又はカルボキシル基において置換を含む。このタイプの非天然アミノ酸には、以下に限定されないが、α−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシレ−トが含まれ、以下に限定されないが、一般的な２０種類の天然アミノ酸に対応する側鎖又は非天然側鎖などを有する。さらに、α炭素における置換には、場合によっては、以下に限定されないが、Ｄ−グルタメート、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、アミノ酪酸などの、Ｌ、Ｄ又はα−α−２置換アミノ酸が含まれる。他の構造的代替物には、プロリン類似体ならびに、３、４、６、７、８及び９員環のプロリン類似体などの環状アミノ酸、置換β−アラニン及びγ−アミノ酪酸などのβ及びγアミノ酸が含まれる。
【０３９８】
多くの非天然アミノ酸は、チロシン、グルタミン、フェニルアラニンなどの天然アミノ酸に基づいており、本発明での使用に適切である。チロシン類似体としては、以下に限定されないが、パラ−置換チロシン、オルト−置換チロシン及びメタ置換チロシンが挙げられ、置換チロシンとしては、以下に限定されないが、ケト基（以下に限定されないが、アセチル基など）、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６−Ｃ２０直鎖もしくは分枝炭化水素、飽和もしくは不飽和炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基、アルキニル基などが挙げられる。さらに、多置換アリール環ももくろまれる。本発明での使用に適切であり得るグルタミン類似体としては、以下に限定されないが、α−ヒドロキシ誘導体、γ−置換誘導体、環状誘導体及びアミド置換グルタミン誘導体が挙げられる。本発明での使用に適切であり得るフェニルアラニン類似体の例としては、以下に限定されないが、パラ−置換フェニルアラニン、オルト−置換フェニルアラニン及びメタ−置換フェニルアラニンが挙げられ、置換基としては、以下に限定されないが、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、アジド、ヨ−ド、ブロモ、ケト基（以下に限定されないがアセチル基を含む。）、ベンゾイル、アルキニル基などが挙げられる。本発明での使用に適切であり得る非天然アミノ酸の具体例としては、以下に限定されないが、α−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−ド−パ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニ、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨ−ド−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン及びｐ−プロパルギルオキシ−フェニルアラニンなどが挙げられる。本発明での使用に適切であり得る様々な非天然アミノ酸の構造の例は、例えば、ＷＯ２００２／０８５９２３（題名「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ」を参照のこと。また、さらなるメチオニン類似体について、Ｋｉｉｃｋら、（２００２）Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｚｉｄｅｓ  ｉｎｔｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ  ｌｉｇａｔｉｏｎ，ＰＮＡＳ９９：１９−２４も参照のこと。
【０３９９】
ある実施形態において、非天然アミノ酸（ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニンなど。）を含むＢＳＰの組成物を提供する。ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニン及び、以下に限定されないが、タンパク質及び／又は細胞などを含有する様々な組成物も提供する。ある局面において、ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニン非天然アミノ酸を含む組成物は、さらにオルソゴナルｔＲＮＡを含む。以下に限定されないが、オルソゴナルｔＲＮＡに対してアミノアシル結合を介して共有結合で、オルソゴナルｔＲＮＡの末端リボ−ス糖の３’ＯＨ又は２’ＯＨに対して共有結合で、など、オルソゴナルｔＲＮＡに非天然アミノ酸を（以下に限定されないが、共有結合により）結合させることができる。
【０４００】
タンパク質に取り込むことができる非天然アミノ酸を介した化学部分は、様々な長所があり、これによりタンパク質の様々な操作が可能となる。例えば、ケト官能基はユニークな反応性を有するので、これによりヒドラジン−又はヒドロキシルアミン含有物質のあらゆる数を用いて、タンパク質をインビトロ及びインビボで選択的に修飾することができるようになる。重原子非天然アミノ酸は、例えば、Ｘ線構造データを位相整合するのに有用であり得る。非天然アミノ酸を用いた重原子の部位特異的導入によっても、重原子の位置を選択的かつ柔軟に選択できる。光反応性非天然アミノ酸（以下に限定されないが、ベンゾフェノン及びアリールアジド（以下に限定されないがフェニルアジドなど。）側鎖を有するアミノ酸など。）により、例えば、タンパク質の効率的なインビボ及びインビトロ光架橋連結が可能になる。光反応性非天然アミノ酸の例としては、以下に限定されないが、ｐ−アジド−フェニルアラニン及びｐ−ベンゾイル−フェニルアラニンが挙げられる。次に、光反応基を与える時間的制御の励起により、光反応性非天然アミノ酸を有するタンパク質を任意に架橋することができる。ある実施形態において、以下に限定されないが、核磁気共鳴及び振動分光法などを使用した、局所構造及びダイナミクスのプローブとして、同位体標識したもの（以下に限定されないがメチル基など）で、非天然アミノのメチル基を置換することができる。アルキニル又はアジド官能基により、例えば、［３＋２］付加環化反応を介して、分子を用いてタンパク質を選択的に修飾できるようになる。
【０４０１】
アミノ末端でポリペプチドに組み込まれる非天然アミノ酸は、２０種類の天然アミノ酸において使用されるもの以外の何れかの置換基であるＲ基及び、α−アミノ酸に通常存在するＮＨ２基とは異なる第二の反応基から構成され得る（式Ｉ参照。）。同様の非天然アミノ酸を、α−アミノ酸に通常存在するＣＯＯＨ基とは異なる第二の反応基とともに、カルボキシル末端で取り込むことができる（式Ｉ参照。）。
【０４０２】
非天然アミノ酸の化学合成
本発明での使用に適切な非天然アミノ酸の多くは、例えば、Ｓｉｇｍａ（ＵＳＡ）又はＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，ＵＳＡ）から市販されている。市販されていないものは、本明細書中で与えるようにして、又は様々な刊行物で与えるようにして、当業者にとって公知の標準的方法を用いて、場合によっては合成する。有機合成技術に関しては、例えば、Ｆｅｓｓｅｄｏｎ及びＦｅｓｓｅｄｏｎによるＯｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２、第二版、Ｗｉｌｌａｒｄ  Ｇｒａｎｔ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．）；ＭａｒｃｈによるＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第三版、１９８５、Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；及びＣａｒｅｙ及びＳｕｎｂｅｒｇによるＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第三版、パ−トＡ及びＢ、１９９０、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと。非天然アミノ酸の合成について述べているさらなる刊行物としては、例えばＷＯ２００２／０８５９２３（題名「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ」；Ｍａｔｓｕｏｋａら、（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８，４６６０−４６６９；Ｋｉｎｇ，Ｆ．Ｅ．及びＫｉｄｄ，Ｄ．Ａ．Ａ．（１９４９）Ａ  Ｎｅｗ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｏｆ  γ−Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｃ  Ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  Ｐｈｔｈｙｌａｔｅｄ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３３１５−３３１９；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｏ．Ｍ．及びＣｈａｔｔｅｒｒｊｉ，Ｒ．（１９５９）Ｓｙｎｔｅｈｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ  Ａｇｅｎｔｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，３７５０−３７５２；Ｃｒａｉｇ，Ｊ．Ｃ．ら、（１９８８）Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ  ｏｆ  ７−Ｃｈｌｏｒｏ−４［［４−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−１−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５３、１１６７−１１７０；Ａｚｏｕｌａｙ，Ｍ．，Ｖｉｌｍｏｎｔ，Ｍ．及びＦｒａｐｐｉｅｒ，Ｆ．（１９９１）Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ａｓ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｓ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６，２０１−５；Ｋｏｓｋｉｎｅｎ，Ａ．Ｍ．Ｐ．及びＲａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．（１９８９）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ｐｒｏｌｉｎｅｓ  ａｓ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４、１８５９−１８６６；Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，Ｂ．Ｄ．及びＲａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．（１９８５）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ  Ｐｕｒｅ  Ｐｉｐｅｃｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ（＋）−Ａｐｏ���ｉｎｃａｍｉｎｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  Ｄｅｃａｒｂｏｎｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｉｎｉｕｍ  Ｉｏｎ  Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５０：１２３９−１２４６；Ｂａｒｔｏｎら、（１９８７）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  ａ−Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｌ−ａｎｄ  Ｄ−ａ−Ａｍｉｎｏ−Ａｄｉｐｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｌ−ａ−ａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ  Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４３：４２９７−４３０８；及びＳｕｂａｓｉｎｇｈｅら、（１９９２）Ｑｕｉｓｑｕａｌｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ：ｓｙｎｔｅｈｓｉｓ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  ２−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｔ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ  ｓｉｔｅ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：４６０２−７が挙げられる。また、特許出願、題名「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｒａｙｓ」２００３年１２月２２日提出、第１０／７４４，８９９号及び２００２年１２月２２日出願の第６０／４３５，８２１号も参照のこと。
【０４０３】
Ａ．カルボニル反応基
カルボニル反応基を有するアミノ酸により、特に求核付加又はアルド−ル縮合を介して分子（以下に限定されないが、ＰＥＧ又はその他の水溶性分子など。）を連結する様々な反応が可能となる。
【０４０４】
典型的なカルボニル含有アミノ酸は、次のように表すことができる：
【０４０５】
【化７】
2008507280.tif 000008
（式中、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル又は置換アリールであり；Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキル及び置換アリールであり；Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、Ｒ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）。ある実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、Ｒ２は単純アルキル（即ち、メチル、エチル又はプロピル）であり、ケトン部分がアルキル側鎖に対してパラ位に位置する。ある実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、Ｒ２は単純アルキル（即ち、メチル、エチル又はプロピル）であり、ケトン部分がアルキル側鎖に対してメタ位に位置する。
【０４０６】
ｐ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニン及びｍ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンの合成は、Ｚｈａｎｇ，Ｚ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：６７３５−６７４６（２００３）に記載されている（本明細書中に参照により組み込む。）。当業者は、その他のカルボニル含有アミノ酸を同様に調製することができる。
【０４０７】
ある実施形態において、非天然コードアミノ酸を含有するポリペプチドを化学的に修飾して、反応性カルボニル官能基を生じさせる。例えば、隣接アミノ及びヒドロキシル基を有する官能基から、共役反応に有用なアルデヒド官能基を生じさせることができる。生物活性分子がポリペプチドである場合、例えば、Ｎ末端セリン又はスレオニン（通常存在するか、化学的もしくは酵素的消化により曝露され得る。）を使用し、過ヨウ素酸を用いて穏やかな酸化的開裂条件下で、アルデヒド官能基を生じさせることができる。例えば、Ｇａｅｒｔｎｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：２６２−２６８（１９９２）；Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ，Ｋ．及びＳｔｒｏｈ，Ｊ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６（１９９２）；Ｇａｅｒｔｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：７２２４−７２３０（１９９４）を参照のこと。しかし、当技術分野で公知の方法は、ペプチド又はタンパク質のＮ末端のアミノ酸に限定されている。
【０４０８】
本発明において、隣接ヒドロキシル及びアミノ基を有する非天然コードアミノ酸を「マスクされた」アルデヒド官能基として、ポリペプチドに取り込むことができる。例えば、５−ヒドロキシリジンは、εアミンに隣接したヒドロキシル基を有する。アルデヒドを生成させるための反応条件は、通常、ポリペプチド内の他の部位で酸化を避けるために穏やかな条件下でメタ過ヨウ素酸ナトリウムの過剰モルを添加することを含む。酸化反応のｐＨは、通常、約７．０である。典型的な反応は、ポリペプチドの緩衝化溶液にメタ過ヨウ素酸ナトリウム約１．５モル濃度過剰量を添加し、続いて、暗所で約１０分間インキュベートすることを含む。例えば、米国特許第６，４２３，６８５号（本明細書中に参照により組み込む。）を参照のこと。
【０４０９】
水溶液中で、穏やかな条件下にて、カルボニル官能基を選択的にヒドラジン−、ヒドラジド−、ヒドロキシルアミン−又はセミカルバジド含有物質と反応させて、生理的条件下で安定な、対応するヒドラゾン、オキシム又はセミカルバゾン結合をそれぞれ形成させることができる。例えば、Ｊｅｎｃｋｓ，Ｗ．Ｐ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，４７５−４８１（１９５９）；Ｓｈａｏ，Ｊ．及びＴａｍ，Ｊ．Ｐ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８９３−３８９９（１９９５）を参照のこと。さらに、カルボニル基のユニークな反応性により、他のアミノ酸側鎖の存在下での選択的な修飾が可能となる。例えば、Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｖ．Ｗ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：８１５０−８１５１（１９９６）；Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ，Ｋ．Ｆ．及びＳｔｒｏｈ，Ｊ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６（１９９２）；Ｍａｈａｌ，Ｌ．Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：１１２５−１１２８（１９９７）を参照のこと。
【０４１０】
Ｂ．ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド反応基
ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジドなどの求核基を含有する非天然コードアミノ酸により、（以下に限定されないが、ＰＥＧ又はその他の水溶性ポリマーを用いたものなど）抱合体を形成させるための様々な求電子基による反応が可能となる。
【０４１１】
ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド含有アミノ酸の例は、以下のように表すことができる：
【０４１２】
【化８】
2008507280.tif 000009
（式中、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキルもしくは置換アリールであるか、又は存在せず；Ｘは、Ｏ、ＮもしくはＳであるか、又は存在せず；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）。
【０４１３】
ある実施形態において、ｎは４であり、Ｒ１存在せず、ＸはＮである。ある実施形態において、ｎは２であり、Ｒ１は存在せず、Ｘは存在しない。ある実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、この酸素原子は、アリール環のアルファティック（ａｌｐｈａｔｉｃ）基に対してパラ位にある。
【０４１４】
ヒドラジド−、ヒドラジン−及びセミカルバジド含有アミノ酸が市販されている。例えば、Ｌ−グルタメート−γ−ヒドラジドは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能である。当業者は、市販のものを購入できないその他のアミノ酸を調製することができる。例えば、米国特許第６，２８１，２１１号（本明細書中に参照により組み込む。）を参照のこと。
【０４１５】
アルデヒド又は同様の化学反応性を有する他の官能基を含有する様々な分子と、ヒドラジド、ヒドラジン又はセミカルバジド官能基を有する非天然コードアミノ酸を含有するポリペプチドと、を効率的かつ選択的に反応させることができる。例えば、Ｓｈａｏ，Ｊ．及びＴａｒｎ，Ｊ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８９３−３８９９（１９９５）を参照のこと。ヒドラジド、ヒドラジン及びセミカルバジド官能基のユニークな反応性により、２０種類の一般的アミノ酸に存在する求核基（以下に限定されないが、セリンもしくはスレオニンのヒドロキシル基又はリジンのアミノ基及びＮ末端を含む。）と比較して、アルデヒド、ケトン及びその他の求電子基に対するそれらの反応性が顕著に高くなる。
【０４１６】
Ｃ．アミノオキシ含有アミノ酸
アミノオキシ（ヒドロキシルアミンとも呼ばれる。）基を含有する非天然コードアミノ酸により、（以下に限定されないが、ＰＥＧはその他の水溶性ポリマーなどとの）抱合体を形成するための、様々な求電子基との反応が可能となる。ヒドラジン、ヒドラジド及びセミカルバジドのように、アミノオキシ基の求核性が高まることにより、アルデヒド又は同様の化学反応性を有する他の官能基を含有する様々な分子と効率的かつ選択的に反応できるようになる。例えば、Ｓｈａｏ，Ｊ．及びＴａｒｎ，Ｊ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８３９−３８９９（１９９５）；Ｈ．Ｈａｎｇ及びＣ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ．Ａｃｅ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３４：７２７−７３６（２００１）を参照のこと。しかし、ヒドラジン基との反応により生じるものが対応するヒドラゾンである一方、オキシムは、通常、ケトンなどのカルボニル含有基とアミノオキシ基との反応に由来するものである。
【０４１７】
典型的なアミノ酸含有アミノオキシ基は、次のように表すことができる：
【０４１８】
【化９】
2008507280.tif 000010
（式中、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル又は置換アリールであるか又は存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか又は存在せず；ｍは０から１０であり；Ｙ＝Ｃ（Ｏ）であるか又は存在せず；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。ある実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは１であり、Ｙは存在する。ある実施形態において、ｎは２であり、Ｒ１及びＸは存在せず、ｍは０であり、Ｙは存在しない。
【０４１９】
容易に入手できるアミノ酸前駆体（ホモセリン、セリン及びスレオニン）からアミノオキシ含有アミノ酸を調製することができる。例えば、Ｍ．Ｃａｒｒａｓｃｏ及びＲ．Ｂｒｏｗｎ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６８：８８５３−８８５８（２００３）。Ｌ−２−アミノ−４−（アミノオキシ）酪酸などのある一定のアミノオキシ含有アミノ酸が天然源から単離された（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｇ．ら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６０：１６３５−１６４１（１９９７）。当業者は、その他のアミノオキシ含有アミノ酸を調製することができる。
【０４２０】
Ｄ．アジド及びアルキン反応基
アジド及びアルキン官能基のユニークな反応性により、ポリペプチド及び他の生物分子の選択的修飾にこれらの官能基が非常に有用となる。有機アジド、特にアルファティック（ａｌｐｈａｔｉｃ）アジド及びアルキンは、通常、通常の反応化学状態に対して安定である。特に、アジド及びアルキン官能基の両者とも、天然に生じるポリペプチドで見られる２０種類の一般的アミノ酸の側鎖（即ちＲ基）に対して不活性である。しかし、近接近させた場合、アジド及びアルキン基の「バネ仕掛け」のような性質が現れ、それらは、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応を介して選択的かつ効率的に反応し、対応するトリアゾ−ルを生成させる。例えば、Ｃｈｉｎ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：９６４−７（２００３）；Ｗａｎｇ，Ｑ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５、３１９２−３１９３（２００３）；Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６−９０２７（２００２）を参照のこと。
【０４２１】
Ｈｕｉｓｇｅｎの付加環化反応は、求核置換ではなく、選択的付加環化反応を含むので（例えば、Ｐａｄｗａ，Ａ．，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｖｏｌ．４，（Ｔｒｏｓｔ，Ｂ．Ｍ．，ら編、１９９１）、ｐ．１０６９−１１０９；Ｈｕｉｓｇｅｎ，Ｒ．，１，３−Ｄｉｐｏｌａｒ  Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｐａｄｗａ，Ａ．編、１９８４）、ｐ．１−１７６）、アジド及びアルキン含有側鎖を有する非天然コードアミノ酸の取り込みによって、生じるポリペプチドが非天然コードアミノ酸の位置で選択的に修飾を受けることができるようになる。アジド又はアルキン含有ＢＳＰを含む付加環化反応は、Ｃｕ（ＩＩ）をＣｕ（Ｉ）に還元するための還元剤存在下で、インシトゥ、触媒量で、Ｃｕ（ＩＩ）（以下に限定されないが、ＣｕＳＯ４の触媒量の形態など）を添加することにより、室温にて、水性条件下で行うことができる。例えば、Ｗａｎｇ，Ｑ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５、３１９２−３１９３（２００３）；Ｔｏｒｎｏｅ，Ｃ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：３０５７−３０６４（２００２）；Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：２５９６−２５９９（２００２）を参照のこと。典型的な還元剤としては、以下に限定されないが、アスコルビン酸塩、金属銅、キニン、ヒドロキノン、ビタミンＫ、グルタチオン、システイン、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋及び加電圧が挙げられる。
【０４２２】
ある場合においては、アジドとアルキンとの間のＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応が必要とされる場合、ＢＳＰは、アルキン部分を含有する非天然コードアミノ酸を含有し、アミノ酸に連結させる水溶性ポリマーは、アジド部分を含有する。あるいは、逆の反応を行うこともできる（即ち、アミノ酸上のアジド部分及び水溶性ポリマー上に存在するアルキン部分を用いる。）。
【０４２３】
アリールエステルを含有し、アリールホスフィン部分で適切に官能化された水溶性ポリマーとアジド官能基とを選択的に反応させて、アミド結合を生成させることもできる。アリールホスフィン基は、インシトゥでアジドを還元し、次に、生じたアミンが隣接するエステル結合と効率的に反応し、対応するアミドを生成させる。例えば、Ｅ．Ｓａｘｏｎ及びＣ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７、２００７−２０１０（２０００）を参照のこと。アジド含有アミノ酸は、アルキルアジド（以下に限定されないが、２−アミノ−６−アジド−Ｌ−ヘキサン酸を含む。）又はアリールアジド（ｐ−アジド−フェニルアラニン）の何れかであり得る。
【０４２４】
アリールエステル及びホスフィン部分を含有する典型的な水溶性ポリマーの例は、次のように表すことができる：
【０４２５】
【化１０】
2008507280.tif 000011
（式中、Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか又は存在しない場合もあり、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは、水溶性ポリマーであり、ＲはＨ、アルキル、アリール、置換アルキル及び置換アリール基であり得る。）。Ｒ基の例としては、以下に限定されないが、−ＣＨ２、−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＣＮ及び−ＮＯ２が挙げられる。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’はそれぞれ独立に、水素、置換もしくは非置換へテロアルキル、置換もしくは非置換アリール（以下に限定されないが、１−３個のハロゲンで置換されたアリールを含む。）、置換もしくは非置換アルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ基又はアリールアルキル基を指す。本発明の化合物が、複数のＲ基を含む場合、例えば、各Ｒ基は、これらの基の複数が存在する場合、それぞれ、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’基であるとして独立に選択される。Ｒ’及びＲ’’が同じ窒素原子に結合する場合、これらは、窒素原子と一緒になって５、６又は７員環を形成し得る。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、以下に限定されないが１−ピロリジニル及び４−モルホリニルを含むものとする。置換基の上記考察から、「アルキル」という用語が、ハロアルキル（以下に限定されないが、−ＣＦ３及び−ＣＨ２ＣＦ３を含む。）及びアシル（以下に限定されないが、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などを含む。）など、水素基以外の基に結合した炭素原子を含む基を含むものであることを当業者は理解するであろう。
【０４２６】
チオエステルを含有し、アリールホスフィン部分で適切に官能化されている水溶性ポリマーとアジド官能基を選択的に反応させて、アミド結合を生成させることもできる。アリールホスフィン基は、インシトゥでアジドを還元し、次に、生じたアミンがチオエステル結合と効率的に反応し、対応するアミドを生成させる。チオエステル及びホスフィン部分を含有する典型的な水溶性ポリマーは、次のように表すことができる：
【０４２７】
【化１１】
2008507280.tif 000012
（式中、ｎは１から１０であり；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか又は存在しない場合もあり、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは、水溶性ポリマーである。）。
【０４２８】
典型的なアルキン含有アミノ酸は、次のように表すことができる：
【０４２９】
【化１２】
2008507280.tif 000013
（式中、ｎは０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキルもしくは置換アリールであるか又は存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか又は存在せず；ｍは０から１０であり、Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）。ある実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり；Ｘは存在せず、ｍは０であり、アセチレン部分は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置する。ある実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは１であり、プロパルギルオキシ基は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置する（即ち、Ｏ−プロパルギル−チロシン）。ある実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１及びＸは存在せず、ｍは０である（即ち、プロパリルグリシン）。
【０４３０】
アルキン含有アミノ酸は市販されている。例えば、プロパルギルグリシンは、Ｐｅｐｔｅｃｈ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から市販されている。あるいは、アルキン含有アミノ酸を標準的方法に従い調製することができる。例えば、Ｄｅｉｔｅｒｓ，Ａ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：１１７８２−１１７８３（２００３）に記載のようにして、例えば、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンを合成することができ、Ｋａｙｓｅｒ，Ｂ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５３（７）：２４７５−２４８４（１９９７）に記載のようにして、４−アルキニル−Ｌ−フェニルアラニンを合成することができる。当業者は、その他のアルキン含有アミノ酸を調製することができる。
【０４３１】
典型的なアジド含有アミノ酸は、次のように表すことができる：
【０４３２】
【化１３】
2008507280.tif 000014
（式中、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、置換アリールであるか、又は存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか又は存在せず；ｍは０から１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）。ある実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１は、フェニルであり、Ｘは存在せず、ｍは０であり、アジド部分はアルキル側鎖に対してパラ位に位置する。ある実施形態において、ｎは０から４であり、Ｒ１及びＸは存在せず、ｍ＝０である。ある実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは２であり、β−アジドエトキシ部分は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置する。
【０４３３】
アジド含有アミノ酸は市販されている。例えば、Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ，ＩＬ）から４−アジドフェニルアラニンを入手することができる。市販されていないアジド含有アミノの場合、以下に限定されないが、適切な脱離基（以下に限定されないが、ハロゲン化物、メシラート、トシラートなど。）の置換を介するか、又は適切に保護化ラクトンの開環を介するなど、当業者にとって公知の標準的方法を用いて、比較的容易にアジド基を調製することができる。例えば、ＭａｒｃｈによるＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第三版、１９８５、Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと。
【０４３４】
Ｅ．アミノチオール反応基
β−置換アミノチオール官能基のユニークな反応性により、チアゾリジンの形成を介した、ポリペプチド及びアルデヒド基を含有する他の生物分子の選択的修飾に、これらの官能基が非常に有用となる。例えば、Ｊ．Ｓｈａｏ及びＪ．Ｔａｍ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９５，１１７（１４）３８３９−３８９９を参照のこと。ある実施形態において、β−置換アミノチオールアミノ酸をＢＳＰポリペプチドに取り込み、次いで、アルデヒド官能基を含有する水溶性ポリマーと反応させることができる。ある実施形態において、チアゾリジンの形成を介して、水溶性ポリマー、薬物抱合体又はその他のペイロードをβ−置換アミノチオールアミノ酸を含むＢＳＰポリペプチドにカップリングさせることができる。
【０４３５】
非天然アミノ酸の細胞性取り込み
真核細胞による非天然アミノ酸取り込みは、以下に限定されないが、タンパク質への取り込みなど、非天然アミノ酸を設計し選択する際に通常考慮される１つの問題である。例えば、α−アミノ酸の電荷密度が高いことから、これらの化合物が細胞透過性であろうことが示唆される。天然アミノ酸は、タンパク質を利用した輸送系の回収を介して真核細胞に取り込まれる。もしあれば、どの非天然アミノ酸が細胞により取り込まれるかを評価するスクリーニングを迅速に行うことができる。例えば、題名「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｒｒａｙｓ」（２００３年１２月２２日提出）、第１０／７４４，８９９号及び第６０／４３５，８２１号（２００２年１２月２２日提出）における毒性アッセイ；及びＬｉｕ，Ｄ．Ｒ．及びＳｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（１９９９）Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ．ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ９６：４７８０−４７８５を参照のこと。様々なアッセイで取り込みを容易に分析できるが、細胞への取り込み経路に反応しやすい非天然アミノ酸の設計に対する代替手段は、インビボでアミノ酸を生成させるために生合成経路を与えることである。
【０４３６】
非天然アミノ酸の生合成
アミノ酸及び他の化合物の産生に対して、多くの生合成経路が細胞において既に存在する。特定の非天然アミノ酸に対する生合成法が天然には（以下に限定されないが、真核細胞においてなど。）存在し得ないが、本発明はこのような方法を提供する。例えば、新しい酵素を添加するか、又は既存の宿主経路を改変することにより、場合によっては非天然アミノ酸に対する生合成経路を宿主細胞において生じさせる。さらなる新しい酵素は、場合によっては天然酵素又は人工的に生じさせた酵素である。例えば、ｐ−アミノフェニルアラニンの生合成（ＷＯ２００２／０８５９２３、題名「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ」における実施例で与えられるように。）は、他の生物からの既知の酵素の組合せの添加に依存する。これらの酵素の遺伝子を含有するプラスミドを用いて細胞の形質転換を行い、これらの酵素の遺伝子を真核細胞に導入することができる。細胞中で発現させる場合、遺伝子は、所望する化合物を合成するための酵素的経路を与える。場合によっては添加されるこのタイプの酵素の例は、下記の実施例で与える。例えばＧｅｎｂａｎｋにおいて、さらなる酵素の配列が記載されている。人工的に生じさせた酵素もまた、場合によっては同様に細胞へ添加する。このようにして、細胞の機構及び細胞のリソースを操作して非天然アミノ酸を産生させる。
【０４３７】
生合成経路での使用のための、又は既存経路を進化させるための新規酵素を産生させるために、様々な方法を利用できる。例えば、以下に限定されないが、Ｍａｘｙｇｅｎ，Ｉｎｃ．（ｍａｘｙｇｅｎ．ｃｏｍのＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂで利用可能）により開発されたものなど、繰り返して用いられる組み換えを場合によっては使用して、新規酵素及び経路を開発する。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）、Ｒａｐｉｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７０（４）：３８９−３９１；及びＳｔｅｍｍｅｒ（１９９４）、ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒａｎｄｏｍ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９１：１０７４７−１０７５１を参照のこと。同様に、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ（ｇｅｎｅｎｃｏｒ．ｃｏｍのＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂで利用可能）により開発されたＤｅｓｉｇｎＰａｔｈＴＭを、場合によっては、以下に限定されないが、細胞でＯ−メチル−Ｌ−チロシンを生成させるために経路を操作することなど、代謝経路操作のために使用する。この技術により、以下に限定されないが機能的ゲノム科学により同定されたものなどの新しい遺伝子及び分子進化ならびに設計などの組合せを用いて、宿主生物において既存の経路を再構築する。Ｄｉｖｅｒｓａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ｄｉｖｅｒｓａ．ｃｏｍのＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂで利用可能）もまた、以下に限定されないが新しい経路を作るためなど、遺伝子ライブラリ及び遺伝子経路の迅速なスクリーニングのための技術を提供する。
【０４３８】
通常、操作を行った本発明の生合成経路を用いて産生される非天然アミノ酸は、効率的なタンパク質生合成に十分な濃度（以下に限定されないが、天然の細胞量など。）であるが、他のアミノ酸の濃度に影響を与えない、又は細胞リソースを枯渇させない程度に産生される。このようにしてインビボで産生される通常の濃度は、約１０ｍＭから約０．０５ｍＭである。特定の経路に必要な酵素を産生させるのに使用される遺伝子を含有するプラスミドを用いて細胞を形質転換し、非天然アミノ酸が生成されたら、リボソームタンパク質合成及び細胞増殖の両方に対して非天然アミノ酸の産生をさらに最適化するために、インビボ選択を場合によっては使用する。
【０４３９】
非天然アミノ酸を有するポリペプチド
以下に限定されないが、タンパク質構造及び／又は機能におけるテ−ラリング変更、サイズ、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼ標的部位の接近可能性の変更、部分（以下に限定されないが、タンパク質アレイに対してなど。）への標的化、生物活性分子の付加、ポリマーの結合、放射性核種の結合、血清半減期の調節、組織浸透性の調節（例えば腫瘍）、能動輸送の調節、組織、細胞又は器官特異性又は分布の調節、免疫原性の調節、プロテアーゼ抵抗性の調節など、様々な目的で非天然アミノ酸の取り込みを行うことができる。非天然アミノ酸を含むタンパク質は、触媒又は生物物理学的特性が向上しているか、又は完全に新しい触媒又は生物物理学的特性を有し得る。例えば、タンパク質に非天然アミノ酸を取り込ませることにより、次の特性を場合によっては変更する：毒性、生体内分布、構造特性、分光学的特性、化学及び／又は光化学的特性、触媒能、半減期（以下に限定されないが、血清半減期など。）、他の分子との反応能（以下に限定されないが、共有又は非共有的な反応など。）など。少なくとも１個の非天然アミノ酸を含むタンパク質を含む組成物は、以下に限定されないが、新規治療、診断、触媒酵素、工業用酵素、結合タンパク質（以下に限定されないが、抗体など。）及び、以下に限定されないが、タンパク質構造及び機能の研究などに有用である。例えば、Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，（２０００）Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｓ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：６４５−６５２を参照のこと。
【０４４０】
本発明のある局面において、組成物は、少なくとも１個の、以下に限定されないが、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個又は少なくとも１０以上などの、非天然アミノ酸を有する少なくとも１個のタンパク質を含む。非天然アミノ酸は、同じ又は異なるものであり得、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の異なる非天然アミノ酸を含有するタンパク質において、以下に限定されないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の異なる部位があり得る。別の局面において、組成物は、少なくとも１個の、しかし、総数より少ない、タンパク質に存在する特定のアミノ酸が非天然アミノ酸で置換されているタンパク質を含む。複数の非天然アミノ酸を有するある一定のタンパク質の場合、非天然アミノ酸は、同じ又は異なるものであり得る（以下に限定されないが、タンパク質は、２以上の異なる型の非天然アミノ酸を含むか、又は同じ非天然アミノ酸２個を含み得る。）。２以上の非天然アミノ酸を有するある一定のタンパク質の場合、非天然アミノ酸は、同じもの、異なるもの、又は、同じ種の複数の非天然アミノ酸と少なくとも１個の異なる非天然アミノ酸との組合せであり得る。
【０４４１】
少なくとも１個の非天然アミノ酸を有する目的のタンパク質又はポリペプチドは、本発明の特徴である。本発明はまた、本発明の組成物及び方法を用いて産生された少なくとも１個の非天然アミノ酸を有する、ポリペプチド又はタンパク質も含む。賦形剤（以下に限定されないが、医薬適合性の賦形剤を含む。）もまた、タンパク質とともに存在し得る。
【０４４２】
少なくとも１個の非天然アミノ酸を有する関心のあるタンパク質又はポリペプチドを真核細胞において産生させることにより、タンパク質又はポリペプチドは通常、真核翻訳後修飾を含む。ある一定の実施形態において、タンパク質は、少なくとも１個の非天然アミノ酸及び真核細胞によりインビボで為された少なくとも１つの翻訳後修飾を含み、この翻訳後修飾は、原核生物細胞では行われない。例えば、翻訳後修飾には、以下に限定されないが、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミテ−ト付加、リン酸化、糖脂質結合修飾、グリコシル化などが含まれる。ある局面において、翻訳後修飾は、ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン結合によるオリゴ糖（以下に限定されないが、（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ）など。）のアスパラギンへの結合を含む。真核タンパク質のＮ−結合オリゴ糖のいくつかの例を挙げた表１を参照のこと（さらなる残基も存在し得るが、示さない。）。別の局面において、翻訳後修飾は、ＧａｌＮＡｃ−セリン又はＧａｌＮＡｃ−スレオニン結合による、又はＧｌｃＮＡｃ−セリン又はＧｌｃＮＡｃ−スレオニン結合による、オリゴ糖（以下に限定されないが、Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｕＮＡｃなどを含む。）のセリン又はスレオニンへの結合を含む。
【０４４３】
【表１】
2008507280.tif 000015
【０４４４】
さらに別の局面において、翻訳後修飾は、前駆体（以下に限定されないが、カルシトニン前駆体、カルシトニン遺伝子関連ペプチド前駆体、プレプロ副甲状腺ホルモン、プレプロインスリン、プロインスリン、プレプロ−オピオメラノコルチン、プロオピオメラノコルチンなど。）のタンパク質分解プロセシング、マルチサブユニットタンパク質へのアセンブリーもしくは巨大分子アセンブリー、細胞の別の部位（以下に限定されないが、小胞体、ゴルジ装置、核、リソソーム、ペルオキシソーム、ミトコンドリア、葉緑体、液胞などの細胞小器官へ、又は分泌経路を通じて、などを含む。）への変換を含む。ある一定の実施形態において、タンパク質は、分泌又は局在化配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴ融合などを含む。
【０４４５】
非天然アミノ酸のある長所は、これが、さらなる分子を付加するために使用できるさらなる化学部分を与えることである。真核又は非真核細胞においてインビボで、又はインビトロで、これらの修飾を行い得る。したがって、ある一定の実施形態において、翻訳後修飾は、非天然アミノ酸によるものである。例えば、翻訳後修飾は、求核−求電子反応によるものであり得る。タンパク質の選択的修飾のために現在使用されている殆どの反応は、以下に限定されないが、ヒスチジン又はシステイン側鎖とのα−ハロケトンの反応など、求核反応パートナーと求電子反応パートナーとの間での共有結合形成を含む。これらの場合の選択性は、タンパク質中の求核残基の数及び接近可能性により決定される。本発明のタンパク質において、非天然ケト−アミノ酸とヒドラジド又はアミノオキシ化合物とのインビトロ及びインビボでの反応など、選択性のより高い他の反応を使用することができる。例えば、Ｃｏｒｎｉｓｈら、（１９９６）Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８：８１５０−８１５１；Ｍａｈａｌら、（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１１２５−１１２８；Ｗａｎｇら、（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００；Ｃｈｉｎら、（２００２）Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２４：９０２６−９０２７；Ｃｈｉｎら、（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：１１０２０−１１０２４；Ｗａｎｇら、（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１００：５６−６１；Ｚｈａｎｇら、（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２：６７３５−６７４６；及びＣｈｉｎら、（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：９６４−７を参照のこと。これにより、蛍光プローブ、架橋剤、糖誘導体及び細胞毒性分子を含む物質のホストによる、事実上あらゆるタンパク質の選択的標識が可能となる。米国特許仮出願第６０／４１９，２６５号（２００２年１０月１６日提出）、米国特許仮出願第６０／４２０，９９０号（２００２年１０月２３日提出）及び米国特許仮出願第６０／４４１，４５０号（２００３年１月１６日提出）に基づく、米国特許出願第１０／６８６，９４４号（題名「Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、２００３年１０月１５日提出も参照のこと（これらは、本明細書中に参照により組み込む。）。Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーションにより（以下に限定されないが、トリアリールホスフィン試薬を用いて。）、以下に限定されないが、アジドアミノ酸によるものなどの翻訳後修飾を為すことができる。例えば、Ｋｉｉｃｋら、（２００２）Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｚｉｄｅｓ  ｉｎｔｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ  ｌｉｇａｔｉｏｎ，ＰＮＡＳ９９：１９−２４を参照のこと。
【０４４６】
本発明は、タンパク質の選択的修飾のための別の高効率の方法を提供するが、この方法は、以下に限定されないが、セレクターコドンに反応してアジド又はアルキニル部分をタンパク質に含有させるなど、非天然アミノ酸の遺伝子による取り込みを含む。次に、以下に限定されないが、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応（例えば、Ｐａｄｗａ，Ａ．，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｖｏｌ．４，（１９９１）Ｔｒｏｓｔ，Ｂ．Ｍ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ，ｐ．１０６９−１１０９；及びＨｕｉｓｇｅｎ，Ｒ．，１，３−Ｄｉｐｏｌａｒ  Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８４）Ｐａｄｗａ，Ａ．編、Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐ．１−１７６を参照。）などにより、以下に限定されないが、アルキニル又はアジド誘導体などをそれぞれ用いて、これらのアミノ酸側鎖を修飾することができる。この方法は、求核置換ではなく付加環化を含むので、非常に高い選択性でタンパク質を修飾することができる。Ｃｕ（Ｉ）塩の触媒量を反応混合物に添加することにより、優れた位置選択性（１，４＞１，５）で、水性条件下、室温にてこの反応を行うことができる。例えば、Ｔｏｒｎｏｅら、（２００２）Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：３０５７−３０６４；及びＲｏｓｔｏｖｔｓｅｖら、（２００２）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：２５９６−２５９９を参照のこと。使用できる別の方法は、テトラシステインモチーフを用いた、ビスヒ素化合物における配位子交換である（例えば、Ｇｒｉｆｆｉｎら、（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：２６９−２７２を参照のこと。）。
【０４４７】
［３＋２］付加環化により本発明のタンパク質に付加できる分子には、事実上、アジド又はアルキニル誘導体を有するあらゆる分子が含まれる。分子には、以下に限定されないが、色素、蛍光、架橋剤、糖誘導体、ポリマー（以下に限定されないが、ポリエチレングリコールの誘導体など。）、光架橋リンカー、細胞毒性化合物、親和性標識、ビオチンの誘導体、レジン、ビーズ、第二のタンパク質又はポリペプチド（又はさらなるもの。）、ポリヌクレオチド（以下に限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡなど。）、金属キレート剤、共同因子、脂肪酸、炭水化物などが含まれる。アルキニル基を有する非天然アミノ酸（以下に限定されないが、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンなど。）及びアジド基を有する非天然アミノ酸（以下に限定されないが、ｐ−アジド−フェニルアラニンなど。）に、これらの分子をそれぞれ付加することができる。
【０４４８】
Ｖ．非遺伝子コードアミノ酸を含むＢＳＰのインビボ生成
修飾ｔＲＮＡ及びｔＲＮＡシンテターゼを用いて本発明のＢＳＰをインビボで生成させ、天然の系でコードされていないアミノ酸を付加又はこのようなアミノ酸で置換することができる。
【０４４９】
天然の系でコードされていないアミノ酸を使用する、ｔＲＮＡ及びｔＲＮＡシンテターゼを生成させるための方法は、例えば、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号（第１０／１２６，９２７号）及び同第２００３／０１０８８８５号（第１０／１２６，９３１号）（これらを本明細書中に参照により組み込む。）で述べられている。これらの方法は、翻訳系に対して内在性である、シンテターゼ及びｔＲＮＡを独立に機能させる（したがって、「オルソゴナル」と呼ばれることがある。）翻訳機構を生成させることを含む。通常、この翻訳系は、オルソゴナルｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及びオルソゴナルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。通常、Ｏ−ＲＳは、この翻訳系において少なくとも１個の非天然アミノ酸を有するＯｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化し、ＯｔＲＮＡは、この系において他のｔＲＮＡにより認識されない少なくとも１個のセレクターコドンを認識する。したがって、この翻訳系は、コードされたセレクターコドンに反応して、この系で産生されたタンパク質に非天然コードアミノ酸を挿入し、それにより、コードされたポリペプチドの位置においてアミノ酸の「置換」が起こる。
【０４５０】
特定の合成アミノ酸をポリペプチドに挿入するために、多岐にわたるオルソゴナルｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが当技術分野で述べられており、これらは一般に本発明での使用に適切である。例えば、ケト特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼが、Ｗａｎｇ，Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：５６−６１（２００３）及びＺｈａｎｇ，Ｚ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．４２（２２）：６７３５−６７４６（２００３）で述べられている。代表的なＯ−ＲＳ又はその一部はポリヌクレオチド配列によりコードされ、米国特許第出願公開第２００３／００８２５７５号及び２００３／０１０８８８５号（それぞれ、本明細書中に参照により組み込む。）に記載のアミノ酸配列を含む。Ｏ−ＲＳとの使用のための対応するＯ−ｔＲＮＡ分子もまた、米国特許願公開第２００３／００８２５７５（第１０／１２６，９２７号）及び同第２００３／０１０８８８５号（第１０／１２６，９３１号）（本明細書中に参照により組み込む。）に記載されている。
【０４５１】
アジド特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ系の例は、Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６−９０２７（２００２）に記載されている。ｐ−アジド−Ｌ−Ｐｈｅに対するＯ−ＲＳ配列の代表例としては、米国特許第出願公開第２００３／０１０８８８５（第１０／１２６，９３１号）（本明細書中に参照により組み込む。）で記載されているように、以下に限定されないが、ヌクレオチド配列、配列番号：１４から１６及び２９から３２、及びアミノ酸配列、配列番号：４６から４８及び６１から６４が挙げられる。本発明での使用に適切なＯ−ｔＲＮＡ配列の代表例としては、米国特許第出願公開第２００３／０１０８８８５（第１０／１２６，９３１号）（本明細書中に参照により組み込む。）で記載されているように、以下に限定されないが、ヌクレオチド配列、配列番号：１から３が挙げられる。特定の非天然コードアミノ酸に特異的なＯ−ｔＲＮＡ／アミノアシルＬ−ｔＲＮＡシンテターゼペアのその他の例は、米国特許願公開第２００３／００８２５７５（第１０／１２６，９２７号）（本明細書中に参照により組み込む。）で記載されている。Ｓ．セレビシエにおいてケト及びアジド両方を含有するアミノ酸を取り込む、Ｏ−ＲＳ及びＯ−ｔＲＮＡは、Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：９６４−９６７（２００３）に記載されている。
【０４５２】
Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの使用は、非天然コードアミノ酸をコードする特定のコドンの選択を含む。あらゆるコドンを使用できるが、通常、Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼが発現される細胞において殆ど使用されないか、又は全く使用されないコドンを選択することが望ましい。例えば、代表的なコドンには、停止コドン（アンバー、オーカー及びオパール）などのナンセンスコドン、４以上の塩基のコドン及び、殆ど使用されないか又は全く使用されないその他の天然の３塩基コドンが含まれる。
【０４５３】
当技術分野で公知の突然変異誘発法（以下に限定されないが、部位特異的突然変異誘発法、カセット突然変異誘発法、制限選択突然変異誘発法などを含む。）を用いて、配列をコードするＧＬＰ−１ポリヌクレオチドにおいて、適切な位置に特異的セレクターコドンを導入することができる。
【０４５４】
非天然コードアミノ酸を取り込むために使用できる、Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ及びオルソゴナルＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアなどのタンパク質生合成機構の成分を生成させるための方法は、Ｗａｎｇ，Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００（２００１）；Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６−９０２７（２００２）；Ｚｈａｎｇ，Ｚ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：６７３５−６７４６（２００３）に記載されている。非天然コードアミノ酸のインビボ取り込みのための方法及び組成物は、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５（第１０／１２６，９２７号）（本明細書中に参照により組み込む。）に記載されている。生物のインビボ翻訳系での使用のためのオルソゴナルｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼペアを選択する方法もまた、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５（第１０／１２６，９２７号）及び同第２００３／０１０８８８５（第１０／１２６，９３１号）（本明細書中に参照により組み込む。）に記載されている。
【０４５５】
少なくとも１つの組み換えオルソゴナルアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を作製する方法は、（ａ）以下に限定されないが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（メタノコッカス・ジャナシ）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｏｒｏｐｈｉｃｕｍ（メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム）、ハロバクテリウム、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（エスケリチア・コリ）、Ａ．フルギドゥス、Ｐ．フリオサス、Ｐ．ホリコシ、Ａ．ペルニクス、Ｔ．サーモフィリスなどの原核生物又は真核生物などを含む、第一の生物から、少なくとも１つのアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）由来の（場合によっては突然変異体）ＲＳのライブラリを作製することと、（ｂ）非天然コードアミノ酸及び天然アミノ酸の存在下で、オルソゴナルｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化するメンバーに対してＲＳ（場合によっては突然変異体ＲＳ）のライブラリを選択（及び／又はスクリーニング）し、それにより活性のある（場合によっては突然変異体）ＲＳのプールを提供することと；及び／又は（ｃ）（場合によってはネガティブ選択によって）非天然コードアミノ酸の非存在下でＯ−ｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化する活性ＲＳ（以下に限定されないが、突然変異体ＲＳを含む。）に対するプールを選択して、それにより少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳを提供することと、を含み；少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳが非天然コードアミノ酸を伴うＯ−ｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化する。
【０４５６】
ある実施形態において、ＲＳは、不活性ＲＳである。活性ＲＳに対して突然変異誘発を行うことにより、不活性ＲＳを生成させることができる。例えば、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６又は少なくとも約１０以上のアミノ酸に対して、以下に限定されないがアラニンなどの、異なるアミノ酸へと突然変異誘発を行うことにより不活性ＲＳを生成させることができる。
【０４５７】
以下に限定されないが、タンパク質三次元ＲＳ構造に基づいた合理的設計又は、無作為もしくは合理的設計技術でのＲＳヌクレオチドの突然変異誘発などの当技術分野で公知の様々な技術を用いて、突然変異体ＲＳのライブラリを作製することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、多様性を生成する組み換え突然変異誘発、キメラ構築、合理的設計により、及び本明細書中に記載の、又は当技術分野で公知のその他の方法により、突然変異体ＲＳを生成させることができる。
【０４５８】
ある実施形態において、以下に限定されないが、非天然コードアミノ酸及び天然アミノ酸の存在下でオルソゴナルｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化するものなど、活性のあるメンバーに対してＲＳ（場合によっては突然変異体ＲＳ）のライブラリを選択（及び／又はスクリーニング）することには、ポジティブ選択及びスクリーニングマーカー（以下に限定されないが抗生物質耐性遺伝子など。）、ＲＳ（場合によっては突然変異体）のライブラリを複数の細胞に導入することと（ポジティブ選択及びスクリーニングマーカーは、少なくとも１個の、以下に限定されないがアンバー、オーカー又はオパールコドンなどの、セレクターコドンを含有する。）；選択物質の存在下で複数の細胞を増殖させることと；ポジティブ選択もしくはスクリーニングマーカーにおいて少なくとも１個のセレクターコドンを抑制することにより、セレクション及び／又はスクリーニング物質存在下で生存している（又は特異的反応を示す）細胞を同定することと（これにより、活性（場合によっては突然変異体）ＲＳのプールを含有するポジティブ選択細胞のサブセットを提供する。）を含む。場合によっては、選択及び／又はスクリーニング物質濃度を変化させることができる。
【０４５９】
ある局面において、ポジティブ選択マーカーは、クロラムフェニコ−ルアセチルトランスフェラ−ゼ（ＣＡＴ）遺伝子であり、セレクターコドンは、ＣＡＴ遺伝子におけるアンバー停止コドンである。場合によっては、ポジティブ選択マーカーは、β−ラクタマ−ゼ遺伝子であり、セレクターコドンは、β−ラクタマ−ゼ遺伝子におけるアンバー停止コドンである。別の局面において、正のスクリーニングマーカーは、蛍光又は発光性のスクリーニングマーカー又は親和性を利用したスクリーニングマーカー（以下に限定されないが、細胞表面マーカーなど。）を含む。
【０４６０】
ある実施形態において、非天然コードアミノ酸の非存在下でＯ−ｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化する活性ＲＳ（場合によっては突然変異体）に対するプールのネガティブ選択又はスクリーニングは、ネガティブ選択又はスクリーニングマーカーを、ポジティブ選択又はスクリーニングからの活性（場合によっては突然変異体）ＲＳのプールとともに、第二の生物の複数の細胞に導入することと（このネガティブ選択又はスクリーニングマーカーは、少なくとも１個のセレクターコドンを含有する（以下に限定されないが抗生物質耐性遺伝子（以下に限定されないが、クロラムフェニコ−ルアセチルトランスフェラ−ゼ（ＣＡＴ）遺伝子など。）を含む。）。）；非天然コードアミノ酸及びスクリーニング又は選択物質を添加した第一の培地において生存しているか又は特異的スクリーニング反応を示すが、非天然コードアミノ酸及びスクリーニング又は選択物質を添加しない第二の培地中で生存できないか又は特異的反応を示さない細胞を同定することと、を含み、それにより、少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳを伴う、生存細胞又はスクリーニング済み細胞を与える。例えば、適切なＯ−ＲＳ組み換え体の決定において、ＣＡＴ同定プロトコールは、場合によっては、ポジティブ選択及び／又はネガティブスクリーニングとして機能する。例えば、１又は複数の非天然コードアミノ酸の存在下、又は非存在下の何れかで、場合によっては、ＣＡＴを含有する（少なくとも１個のセレクターコドンを含有する。）クロ−ンのプールを増殖プレ−ト上に複製する。したがって、非天然コードアミノ酸を含有するプレ−ト上で独占的に増殖するコロニ−は、組み換えＯ−ＲＳを含有するとみなす。ある局面において、選択（及び／又はスクリーニング）物質の濃度が変化する。ある局面において、第一及び第二の生物は異なる。したがって、第一及び／又は第二の生物には、場合によっては、原核、真核、哺乳動物、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（エスケリチア・コリ、大腸菌）、真菌、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などが含まれる。他の実施形態において、スクリーニングマーカーは、蛍光もしくは発光性スクリーニングマーカー又は親和性に基づくスクリーニングマーカーを含む。
【０４６１】
別の実施形態において、活性（場合によっては突然変異体）ＲＳに対するプールをスクリーニング又は選択（以下に限定されないが、ネガティブ選択など。）することは、活性のある突然変異体ＲＳのプールをポジティブ選択段階（ｂ）から単離することと；ネガティブ選択又はスクリーニングマーカー（ネガティブ選択又はスクリーニングマーカーは、少なくとも１個のセレクターコドンを含有する（以下に限定されないが、毒性マーカー遺伝子（以下に限定されないが、少なくとも１個のセレクターコドンを含む、リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子など。）を含む。）。）及び活性のある（場合によっては突然変異体）ＲＳのプールを第二の生物の複数の細胞に導入することと；非天然コードアミノ酸を添加していない第一の培地中で生存しているか又は特異的スクリーニング反応を示すが、非天然コードアミノ酸添加している第二の培地中で生存できないか又は特異的スクリーニング反応を示さない細胞を同定することと、を含み、それにより、少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳ（この少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳは、非天然コードアミノ酸に特異的である。）を伴う、生存細胞又はスクリーニング済み細胞を提供する。ある局面において、少なくとも１個のセレクターコドンとは、約２以上のセレクターコドンを含む。このような実施形態には、場合によっては、少なくとも１個のセレクターコドンが２以上のセレクターコドンを含む場合及び第一及び第二の生物が異なる（以下に限定されないが、各生物には、場合によっては、原核、真核、哺乳動物、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（エスケリチア・コリ、大腸菌）、真菌、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などが含まれる。）場合が含まれ得る。また、いくつかの局面には、ネガティブ選択マーカーがリボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子を含む（少なくとも１個のセレクターコドンを含有する。）場合も含まれる。他の局面には、スクリーニングマーカーが、場合によっては、蛍光もしくは発光性スクリーニングマーカー又は親和性に基づくスクリーニングマーカーを含む場合が含まれる。本明細書中の実施形態において、スクリーニング及び／又は選択には、場合によっては、スクリーニング及び／又は選択ストリンジェンシーの変更が含まれる。
【０４６２】
ある実施形態において、少なくとも１つの組み換えオルソゴナルアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を生成させるための方法はさらに、（ｄ）少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳを単離することと；（ｅ）少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳ由来の第二のＯ−ＲＳのセット（場合によっては突然変異）を生成させることと；（ｆ）Ｏ−ｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化する能力を含む突然変異Ｏ−ＲＳが得られるまで段階（ｂ）及び（ｃ）を繰り返すことと、を含み得る。場合によっては、以下に限定されないが少なくとも約２回など、段階（ｄ）−（ｆ）を繰り返す。ある局面において、以下に限定されないがランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、組み換え又はそれらの組合せなどの、突然変異誘発により、少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳ由来の第二の突然変異Ｏ−ＲＳのセットを生成させることができる。
【０４６３】
上述の方法における、以下に限定されないが、ポジティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）、ネガティブ選択／スクリーニング段階（ｃ）又は正及びネガティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）及び（ｃ）の両方などの、選択／スクリーニング段階のストリンジェンシーは、場合によっては、選択／スクリーニングストリンジェンシーを変更することを含む。別の実施形態において、ポジティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）、ネガティブ選択／スクリーニング段階（ｃ）又は正及びネガティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）及び（ｃ）の両方は、受容体を使用することを含み、この場合、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）により受容体を検出するか、又は発光により受容体を検出する。場合によっては、ファージディスプレイなどで、受容体を細胞表面に表示し、非天然コードアミノ酸又は類似体に関する親和性又は触媒活性に基づき、選択する。ある実施形態において、ファージディスプレイなどで、突然変異シンテターゼを細胞表面に表示する。
【０４６４】
組み換えオルソゴナルｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を生成させるための方法は、（ａ）第一の生物から、以下に限定されないがサプレッサーｔＲＮＡなどの少なくとも１つのｔＲＮＡ由来の突然変異体ｔＲＮＡのライブラリを作製することと；（ｂ）第一の生物からのＲＳの非存在下で、第二の生物由来のアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される（場合によっては突然変異体）ｔＲＮＡに対してライブラリの、選択（以下に限定されないが、ネガティブ選択）又はスクリーニングを行うことと（これにより、ｔＲＮＡ（場合によっては突然変異体）のプールが与えられる。）；（ｃ）導入されたオルソゴナルＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーに対してｔＲＮＡ（場合によっては突然変異体）のプールを選択又はスクリーニングすることと（これにより、少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡが与えられる。）を含み；この少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡは、セレクターコドンを認識し、第二の生物由来のＲＳにより効率的に認識されず、Ｏ−ＲＳにより選択的にアミノアシル化される。ある実施形態において、少なくとも１つのｔＲＮＡは、サプレッサーｔＲＮＡであり、及び／又は、天然及び／又は非天然塩基のユニークな３塩基コドンを含有しするか、又はナンセンスコドン、レアコドン、非天然コドン、少なくとも４塩基を含有するコドン、アンバーコドン、オーカーコドンもしくはオパール停止コドンである。ある実施形態において、組み換えＯ−ｔＲＮＡは、直行性が向上している。当然のことながら、ある実施形態において、Ｏ−ｔＲＮＡは、改変の必要なく、場合によっては、第二の生物から第一の生物に持ち込まれる。様々な実施形態において、第一及び第二の生物は、同じであるか又は異なり、場合によっては、以下に限定されないが、原核生物（以下に限定されないが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（メタノコッカス・ジャナシ）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（エスケリチア・コリ、大腸菌）、ハロバクテリウムなど。）、真核生物、哺乳動物、真菌、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などを含む。さらに、組み換えｔＲＮＡは、場合によっては、非天然コードアミノ酸によりアミノアシル化され、この場合、この非天然コードアミノ酸は、天然に又は遺伝子操作によりインビボで生合成される。非天然コードアミノ酸は、場合によっては、少なくとも第一又は第二の生物用の増殖培地に添加される。
【０４６５】
ある局面において、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼによりアミノアシル化される（場合によっては突然変異体）ｔＲＮＡに対してライブラリの選択（以下に限定されないが、ネガティブ選択を含む）又はスクリーニングを行うこと（段階（ｂ））は、第二の生物由来の複数の細胞に毒性マーカー遺伝子（この場合、この毒性マーカー遺伝子は、少なくとも１つのセレクターコドン（又は毒性もしくはスタティック（ｓｔａｔｉｃ）物質の産生を導く遺伝子又は生物にとって必須の遺伝子（このようなマーカー遺伝子が少なくとも１個のセレクターコドンを含有する。））を含有する。）及び（場合によっては突然変異体）ｔＲＮＡのライブラリを導入することと；生存細胞を選択することと（この場合、生存細胞は、少なくとも１つのオルソゴナルｔＲＮＡ又は非機能的ｔＲＮＡを含む（場合によっては突然変異体）ｔＲＮＡのプールを含有する。）を含む。例えば、細胞密度比較アッセイを用いて、生存細胞を選択することができる。
【０４６６】
別の局面において、毒性マーカー遺伝子は、２以上のセレクターコドンを含み得る。この方法の別の実施形態において、毒性マーカー遺伝子は、リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子であり、このリボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子は、少なくとも１つのアンバーコドンを含有する。場合によっては、リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子は、２以上のアンバーコドンを含み得る。
【０４６７】
ある実施形態において、導入されたオルソゴナルＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーに対して（場合によっては突然変異体）ｔＲＮＡのプールを選択又はスクリーニングすることは、ポジティブ選択又はスクリーニングマーカー遺伝子（この正のマーカー遺伝子は、薬物耐性遺伝子（以下に限定されないが、Ｏ−ＲＳとともに、少なくとも１つのアンバー停止コドンなどのセレクターコドンの少なくとも１つを含有するβ−ラクタマ−ゼ遺伝子など。）又はその生物に必須の遺伝子又は毒性物質の解毒を導く遺伝子を含有する。）及び（場合によっては突然変異体）ｔＲＮＡのプールを第二の生物由来の複数の細胞に導入することと；以下に限定されないが抗生物質を含む、選択又はスクリーニング物質存在下で増殖させた、生存している又はスクリーニング済み細胞を同定することと（これにより少なくとも１つの組み換えｔＲＮＡを有する細胞のプールを与える。）を含み得、この少なくとも１つの組み換えｔＲＮＡは、Ｏ−ＲＳによりアミノアシル化され、少なくとも１個のセレクターコドンに応答して、正のマーカー遺伝子によりコードされる翻訳産物にアミノ酸を挿入する。別の実施形態において、選択及び／又はスクリーニング物質の濃度が変更される。
【０４６８】
特異的なＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳのペアを生成させるための方法が与えられる。方法は、（ａ）第一の生物からの少なくとも１つのｔＲＮＡ由来の突然変異体ｔＲＮＡのライブラリを作製することと；（ｂ）第一の生物由来のＲＳ非存在下で、第二の生物由来のアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される（場合によっては突然変異体）ｔＲＮＡに対してライブラリをネガティブ選択又はスクリーニングすることと（これにより、（場合によっては突然変異体）ｔＲＮＡのプールが与えられる。）；（ｃ）導入されたオルソゴナルＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーに対して（場合によっては突然変異体）ｔＲＮＡのプールを選択又はスクリーニングすることと（これにより、少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡが与えられる。）を含む。少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡは、セレクターコドンを認識し、第二の生物由来のＲＳにより効率的に認識されず、Ｏ−ＲＳにより選択的にアミノアシル化される。この方法はまた、（ｄ）第三の生物からの少なくとも１つのアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）由来の（場合によっては突然変異体）ＲＳのライブラリを作製することと；（ｅ）非天然コードアミノ酸及び天然アミノ酸の存在下で、少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化するメンバーに対して突然変異体ＲＳのライブラリを選択又はスクリーニングすることと（これにより、活性（場合によっては突然変異体）ＲＳのプールが与えられる。）；（ｆ）非天然コードアミノ酸非存在下で、少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化する活性（場合によっては突然変異体）ＲＳに対して前記プールをネガティブ選択又はスクリーニングすることと（これにより、少なくとも１つの特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアが与えられる。）を含み、少なくとも１つの特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアは、非天然コードアミノ酸に対して特異的な少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳ及び少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡを含有する。この方法により生成された特異的なＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対が含まれる。例えば、特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアには、以下に限定されないが、ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ｍｕｔＴｙｒＲＳペア、例えばｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ＳＳ１２ＴｙｒＲＳペア、ｍｕｔＲＮＡＬｅｕ−ｍｕｔＬｅｕＲＳペア、ｍｕｔＲＮＡＴｈｒ−ｍｕｔＴｈｒＲＳペア、ｍｕｔＲＮＡＧｌｕ−ｍｕｔＧｌｕＲＳペアなどが含まれ得る。さらに、このような方法は、第一及び第三の生物が同じである（以下に限定されないが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（メタノコッカス・ジャナシ）など。）場合を含む。
【０４６９】
第二の生物のインビボでの翻訳系において使用するためのオルソゴナルｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼペアを選択するための方法もまた本発明に含まれる。この方法は、マーカー遺伝子、ｔＲＮＡ及び、第一の生物から単離された、又はこれに由来する、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）を第二の生物由来の細胞の第一のセットに導入することと；マーカー遺伝子及びｔＲＮＡを第二の生物由来のデュプリケートの細胞セットに導入することと；デュプリケートの細胞セットにおいて生存できない第一のセットにおける生存細胞に対する選択を行うか、又はデュプリケートの細胞セットにおいてこのような反応を与えられない、特異的なスクリーニング応答を示す細胞に対するスクリーニングを行うこと、を含み、この場合、第一のセット及びデュプリケートの細胞セットを選択又はスクリーニング物質存在下で増殖させ、生存細胞又はスクリーニング済み細胞は、第二の生物のインビボでの翻訳系での使用のためのオルソゴナルｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼペアを含む。ある実施形態において、比較及び選択又はスクリーニングを行うことは、インビボ相補性試験を含む。選択又はスクリーニング物質の濃度は変更することができる。
【０４７０】
本発明の生物は、様々な生物及び様々な組合せを含む。例えば、本発明の方法の第一及び第二の生物は、同じであるか又は異なる。ある実施形態において、この生物には、場合によっては原核生物（以下に限定されないが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（メタノコッカス・ジャナシ）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム）、ハロバクテリウム、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（エスケリチア・コリ、大腸菌）、Ａ．フルギドゥス、Ｐ．フリオサス、Ｐ．ホリコシ、Ａ．ペルニクス、Ｔ．サーモフィリスなど。）が含まれる。あるいは、この生物には、場合によっては、真核生物（以下に限定されないが、植物（以下に限定されないが、単子葉植物又は双子葉植物などの複雑植物など。）、藻類、原生生物、真菌（以下に限定されないが、酵母など。）、動物（以下に限定されないが、哺乳動物、昆虫、節足毒物など。）などが含まれる。別の実施形態において、第二の生物には、原核生物（以下に限定されないが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（メタノコッカス・ジャナシ）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム）、ハロバクテリウム、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（エスケリチア・コリ、大腸菌）、Ａ．フルギドゥス、Ｐ．フリオサス、Ｐ．ホリコシ、Ａ．ペルニクス、Ｔ．サーモフィリスなど。）が含まれる。あるいは、第二の生物は、真核生物（以下に限定されないが、酵母、動物細胞、植物細胞、真菌、哺乳類細胞など。）であり得る。様々な実施形態において、第一及び第二の生物の生物は様々である。
【０４７１】
ＶＩ．ＢＳＰにおける非天然アミノ酸の位置
本発明は、１又は複数の非天然アミノ酸のＢＳＰへの取り込みをもくろむ。ポリペプチドの活性を妨害しない特定の位置において１又は複数の非天然アミノ酸を取り込み得る。「保存的」置換（以下に限定されないが、疎水性アミノ酸の疎水性アミノ酸による置換、大きなアミノ酸の大きなアミノ酸による置換、親水性アミノ酸の親水性アミノ酸による置換など。）を行うことにより、及び／又は活性に必要のない位置に非天然アミノ酸を位置に挿入することにより、これを遂行することができる。
【０４７２】
様々な生化学的及び構造的アプローチを利用して、ＢＳＰ内で非天然コードアミノ酸を用いた置換を行うための所望の位置を選択することができる。当業者にとって当然のことながら、ポリペプチド鎖のあらゆる位置が、非天然コードアミノ酸を取り込むための選択に適切であり、選択は、合理的設計に基づくか、又は、何らかの所望の目的のための、又は所望の目的なしの、ランダム選択によるものであり得る。所望の部位の選択は、以下に限定されないが、アゴニスト、スーパーアゴニスト、逆アゴニスト、アンタゴニスト、受容体結合調節物質、受容体活性調節物質、結合対への結合の調節物質、結合対活性調節物質、結合対立体構造調節物質、二量体又は多量体形成などの、何らかの所望の特性又は活性を有するが、ネイティブ分子と比較して活性又は特性に変化がないＢＳＰ分子を産生するためのもの、又は、溶解性、凝集又は安定性などのポリペプチドの何らかの物理的又は化学的特性を操作するためのものであり得る。例えば、当技術分野で公知の点変異分析、アラニンスキャニング又はホモローグスキャニング法を用いてＢＳＰの生物活性に必要なポリペプチドにおける位置を同定することができる。ＧＬＰ−１については、「Ａｄｅｌｈｏｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  ｏｆ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．１９９４  ２６９（９）：６２７５−６２７８」を参照。アラニン又はホモローグスキャニング突然変異誘発により生物活性に重要と同定されるもの以外の残基は、ポリペプチドに対して求められる所望の活性に依存した非天然コードアミノ酸による置換に適切な候補であり得る。あるいは、生物活性に重要と同定される部位もまた、ポリペプチドに対して求められる所望の活性に依存した非天然コードアミノ酸による置換に適切な候補であり得る。別の代替法は、ポリペプチド鎖の各位置において非天然コードアミノ酸で単純に連続した置換を行い、ポリペプチドの活性に対する影響を観察することであろう。当業者にとって当然のことながら、何らかのポリペプチドへの非天然アミノ酸による置換を行う位置を選択するための、あらゆる手段、技術又は方法が本発明での使用に適切である。
【０４７３】
非天然コードアミノ酸による置換を許容する可能性があるタンパク質の領域を決定するために、欠失を含有するＢＳＰの天然に存在する変異体の構造及び活性を検討することも可能である。同様に、プロテアーゼ消化及びモノクローナル抗体は、ＢＳＰ受容体又は結合対を結合するために必要とされるＢＳＰの領域を同定するために使用することが可能である。非天然コードアミノ酸による置換基を許容できない可能性がある残基が一旦除去されれば、残りの位置の各々における提案された置換の影響は、ＢＳＰ及びその受容体又は結合対の構造から調べることが可能である。このため、当業者は、非天然コードアミノ酸で置換できるアミノ酸位置を容易に同定できない。
【０４７４】
幾つかの実施形態において、本発明のＢＳＰは、ポリペプチドのヘリックス又はβシート二次構造を破壊しないタンパク質の領域中に位置する１又は複数の天然に存在しないアミノ酸を含む。
【０４７５】
幾つかの実施形態において、ＧＬＰ−１中の任意の位置（最初のアミノ酸（アミノ末端に位置する）の前、カルボキシ末端における付加又はこれらのあらゆる組み合わせ）に、１又は複数の非天然コードアミノ酸が取り込まれる。  幾つかの実施形態では、１又は複数の非天然コードアミノ酸は、以下のように、ＧＬＰ−１中の任意の位置に取り込まれる。７Ｈ、８Ａ、９Ｅ、Ｖ１６、１７Ｓ、１８Ｓ、１９Ｙ、２ＯＬ、２１Ｅ、２２Ｇ、２３Ｑ、２４Ａ、２５  Ａ、２６Ｋ、２７Ｅ、２８Ｆ、２９Ｉ、３０Ａ、３１Ｗ、３２Ｌ、３３Ｖ、３４Ｋ、３５Ｇ、３６Ｒ、３７Ｇ、３８位の（すなわち、カルボキシ末端の）付加又はこれらの任意の組み合わせ。
【０４７６】
幾つかの実施形態において、これら又は他の位置の天然に存在しないアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。以下の位置を含むが、これらに限定されない。７Ｈ、８Ａ、９Ｅ、Ｖ１６、１７Ｓ、１８Ｓ、１９Ｙ、２ＯＬ、２１Ｅ、２２Ｇ、２３Ｑ、２４Ａ、２５  Ａ、２６Ｋ、２７Ｅ、２８Ｆ、２９Ｉ、３０Ａ、３１Ｗ、３２Ｌ、３３Ｖ、３４Ｋ、３５Ｇ、３６Ｒ、３７Ｇ、３８位の（すなわち、カルボキシ末端の）付加又はこれらの任意の組み合わせ。  幾つかの実施形態において、本発明のＧＬＰ−１ポリペプチドは、以下の位置の１又は複数に、１又は複数の天然に存在しないアミノ酸を含み、アンタゴニストを提供する。７、８、９、２２、１８、２９、２５、３２、２１、２８、１７、２４、３１、２０又はこれらの組み合わせ。
【０４７７】
幾つかの実施形態において、Ｔ−２０（ＴＥＸを含む。）中の任意の位置（最初のアミノ酸（アミノ末端に位置する）の前、カルボキシ末端における付加又はこれらのあらゆる組み合わせ）に、１又は複数の非天然コードアミノ酸が取り込まれる。幾つかの実施形態では、１又は複数の非天然コードアミノ酸は、以下のように、Ｔ−２０（ＴＥＸを含む。）中の任意の位置に取り込まれる。Ｗ６３１、Ｄ６３２、Ｉ６３５、Ｎ６３６、Ｎ６３７、Ｙ６３８、Ｔ６３９、Ｓ６４０、Ｌ６４１、Ｌ６４５、Ｎ６５１又はこれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０４７８】
幾つかの実施形態において、ペプチドＹＹ中の任意の位置（最初のアミノ酸（アミノ末端に位置する）の前、カルボキシ末端における付加又はこれらのあらゆる組み合わせ）に、１又は複数の非天然コードアミノ酸が取り込まれる。
【０４７９】
非天然コードアミノ酸の取り込みの典型的な残基は、受容体結合領域又は結合対への結合領域の候補から除外される残基とすることができ、完全に又は部分的に溶媒露出されることができ、近くの残基との水素結合相互作用が最小又は存在しないことができ、近くの反応性残基に最小に露出されることができ、ＢＳＰの露出された面の１又は複数の上に存在することができ、ＢＳＰの三次元、二次構造、三次構造又は四次構造によって予測されるように、高度に柔軟であり、又は構造的に堅固な領域中存在し、その受容体又は結合対に結合し、若しくは結合しないことができ、又はＢＳＰ又は他の生物活性分子に結合され、又は結合されないことができ、又は所望のように完全な構造の柔軟性又は堅固性を変化することによって、１又は複数のＢＳＰを含むＢＳＰそのもの又は二量体若しくは多量体の立体構造を調節することができる。
【０４８０】
幾つかの実施形態において、ＧＬＰ−１アンタゴニストは、ＧＬＰ−１分子の受容体結合領域中に存在する水溶性ポリマーに連結された、非天然コードアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーは、以下のアミノ酸位置の１又は複数において、ＧＬＰ−１ポリペプチドに連結される。７、８、９、２２、１８、２９、２５、３２、２１、２８、１７、２４、３１及び２０（配列番号１、２、３、２１又は任意の他のＧＬＰ−１配列）。
【０４８１】
非天然コード様々なアミノ酸を、又はＢＳＰ中の所定位置において置換し又は取り込むことが可能である。一般に、非天然コードアミノ酸は、その受容体又は結合対を伴う又は伴わないＢＳＰの構造の調査、保存的アミノ酸に対する選好性（すなわち、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ又はＴｒｐを置換するｐ−アセチルフェニルアラニン又はＯ−プロパルギルチロシンなど、アリールをベースとした非天然コードアミノ酸）及びＢＳＰ中への導入を希望する特異的な抱合化学（例えば、アルキン部分を有する水溶性ポリマーを用いたＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］環化付加、又はアリールエステルを有し、続いて、ホスフィン部分を取り込む水溶性ポリマーを用いたアミド結合形成を実施することを望む場合には、４−アジドフェニルアラニンの導入）に基づいて、取り込みのために選択される。
【０４８２】
ある実施形態において、本発明はさらに、タンパク質に非天然アミノ酸を取り込むことと（この非天然アミノ酸は、第一の反応基を含む。）；第二の反応基を含有する分子（以下に限定されないが、標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋リンカー、放射性核種、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、レジン、第二のタンパク質又はポリペプチドもしくはポリペプチド類似体、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、共同因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びアンチセンスポリヌクレオチド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピンラベル、蛍光プローブ、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合又は非共有結合により相互作用する基、フォトケージ（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）部分、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチン誘導体、ビオチン誘導体、ビオチン類似体、重原子を組み込む部分、化学的切断可能な基、光切断可能な基、伸長側鎖、炭素結合型糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光性の基、化学発光基、高電子密度基、磁性の基、挿入基、発色団、エネルギー移動剤、生物活性剤、検出可能標識、小分子又は、上記もしくは何らかのその他の所望の化合物もしくは物質の組み合わせを含む。）とそのタンパク質を接触させることと、を含む。第一の反応基が第二の反応基と反応し、［３＋２］付加環化を介して非天然アミノ酸に分子を連結させる。ある実施形態において、第一の反応基は、アルキニル又はアジド部分であり、第二の反応基はアジド又はアルキニル部分である。例えば、第一の反応基は、アルキニル部分（以下に限定されないが、非天然アミノ酸、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンにおいて、など。）であり、第二の反応基はアジド部分である。別の例において、第一の反応基はアジド部分であり（以下に限定されないが、非天然アミノ酸、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンにおいて、など。）、第二の反応基はアルキニル部分である。
【０４８３】
ある場合において、非天然コードアミノ酸置換を抗原結合ポリペプチド内の他の置換もしくは欠失と組み合わせて、ＢＳＰの他の生物学的特性に影響を与える。ある場合において、他の、付加、置換又は欠失により、ＢＳＰの安定性（以下に限定されないが、タンパク質分解性の分解に対する抵抗性など。）が向上するか、又はＢＳＰ受容体又は結合対に対するＢＳＰの親和性が向上し得る。ある場合において、他の、付加、置換又は欠失により、ＢＳＰの溶解性（以下に限定されないが、Ｅ．コリ又はその他の宿主細胞で発現させた場合など。）が向上し得る。ある実施形態において、付加、置換又は欠失により、Ｅ．コリ又はその他の組み換え宿主細胞での発現後、ポリペプチド溶解性が向上し得る。ある実施形態において、Ｅ．コリ又はその他の組み換え宿主細胞での発現後、ポリペプチド溶解性が向上する非天然アミノ酸取り込みのための別の部位に加えて、天然コードアミノ酸又は非天然アミノ酸での置換のために部位を選択する。ある実施形態において、ＢＳＰは、ＢＳＰ受容体又は結合対に対する親和性を調節する、受容体二量体化を調節する（以下に限定されないが、向上又は低下など。）、受容体二量体を安定化する、結合対の立体構造又は１若しくは複数の生物活性を調節する、循環半減期を調節する、放出もしくはバイオアベイラビリティを調節する、精製を促進するか、又は特定の投与経路を改善するかもしくは変更する、別の付加、置換又は欠失を含む。同様に、ＢＳＰは、化学的又は酵素切断配列、プロテアーゼ切断配列、反応基、抗原結合ドメイン（以下に限定されないが、ＦＬＡＧ又はポリ−Ｈｉｓなど）又はその他の親和性ベースの配列（以下に限定されないが、ＦＬＡＧ、ポリ−Ｈｉｓ、ＧＳＴなど。）又は、検出（以下に限定されないが、ＧＦＰなど。）、精製、組織もしくは細胞膜を介した輸送、プロドラッグ放出もしくは活性化、ＢＳＰサイズの縮小又はポリペプチドのその他の特性を促進する連結分子（以下に限定されないが、ビオチンなど。）を含有し得る。
【０４８４】
ある実施形態において、非天然コードアミノ酸の置換によってＢＳＰアンタゴニストが形成される。非天然コードアミノ酸の取り込みのための代表的な部位の一部としては、ＧＬＰ−１の７、８、９、２２、１８、２９、２５、３２、２１、２８、１７、２４、３１及び２０がある。他の実施形態において、上記の置換はＧＬＰ−１ポリペプチドをＧＬＰ−１アンタゴニストに変えるさらなる置換と結びつく。ある実施形態においては、ＧＬＰ−１アンタゴニストはＧＬＰ−１分子の受容体結合領域に存在する水溶性ポリマーに結びついた非天然コードアミノ酸を含む。
【０４８５】
ある場合において、１又は複数の非天然コードアミノ酸で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のアミノ酸を置換する。ある場合において、ＢＳＰはさらに、天然アミノ酸に対する、１又は複数の非天然コードアミノ酸の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の置換を含む。例えば、ある実施形態において、ＧＬＰ−１の次の領域における少なくとも２つの残基を１又は複数の以下の非天然コードアミノ酸で置換する：７位の最初のアミノ酸の前（すなわち、Ｎ末端）、７Ｈ、８Ａ、９Ｅ、Ｖ１６、１７Ｓ、１８Ｓ、１９Ｙ、２０Ｌ、２１Ｅ、２２Ｇ、２３Ｑ、２４Ａ、２５Ａ、２６Ｋ、２７Ｅ、２８Ｆ、２９Ｉ、３０Ａ、３１Ｗ、３２Ｌ、３３Ｖ、３４Ｋ、３５Ｇ、３６Ｒ、３７Ｇ、３８位の（すなわち、カルボキシ末端の）付加又はこれらの任意の組み合わせ。幾つかの実施形態において、Ｔ−２０ポリペプチドの少なくとも２つの残基は、Ｗ６３１、Ｄ６３２、Ｉ６３５、Ｎ６３６、Ｎ６３７、Ｙ６３８、Ｔ６３９、Ｓ６４０、Ｌ６４１、Ｌ６４５、Ｎ６５１を含む（これらに限定されるものではない。）非天然コードアミノ酸で置換される。幾つかの実施形態において、ペプチドＹＹ中の任意の位置（最初のアミノ酸（アミノ末端に位置する）の前、カルボキシ末端における付加又はこれらのあらゆる組み合わせ）に、１又は複数の非天然コードアミノ酸が取り込まれる。
【０４８６】
ある場合において、１又は複数の非天然コード残基を１又は複数のより低分子量の、直鎖状又は分枝状ＰＥＧ（質量でおよそ５から２０ｋＤａ以下）に連結させる（それにより、１個のより高分子量のＰＥＧと連結する種と比較して、結合親和性が高まり、血清半減期は同程度となる。）。
【０４８７】
ＶＩＩ．非真核生物及び真核生物における発現
クローニングしたＢＳＰポリヌクレオチドを高レベルで発現させるために、通常、転写、転写／翻訳ターミネーターを支配するための強力なプロモーターを含有し、タンパク質をコードする核酸に対する場合は、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含有する発現ベクターに本発明のＢＳＰをコードするポリヌクレオチドをサブクローニングする。適切な細菌プロモーターは、当技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、及びＡｕｓｂｅｌｌらの教科書に記載されている。
【０４８８】
本発明のＢＳＰを発現させるための細菌発現系は、以下に限定されないが、Ｅ．コリ、バチルス種及びサルモネラなどにおいて利用可能である（Ｐａｌｖａら、Ｇｅｎｅ  ２２：２２９−２３５（１９８３）；Ｍｏｓｂａｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ３０２：５４３−５４５（１９８３））。このような発現系のためのキットが市販されている。哺乳動物細胞、酵母及び昆虫細胞のための真核発現系は当技術分野で周知であり、これも市販されている。オルソゴナルｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（上述）を使用して本発明のＢＳＰを発現させる場合、オルソゴナル成分を宿主細胞が使用する能力に基づいて発現用の宿主細胞を選択する。代表的な宿主細胞としては、グラム陽性細菌（以下に限定されないが、Ｂ．ブレビス、Ｂ．サブチリス又はストレプトマイセスなど）及びグラム陰性細菌（Ｅ．コリ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（シュードモナス・フルオレセンス、蛍光菌）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（シュードモナス・エアルギノサ、緑膿菌）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ（シュードモナス・プチダ、プチダ菌）など。）、ならびに酵母及び他の真核細胞が挙げられる。本明細書中で記載のようにして、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアを含有する細胞を使用することができる。
【０４８９】
本発明の真核宿主細胞又は非真核宿主細胞により、大量の有用な量で非天然アミノ酸を含有するタンパク質を合成することができるようになる。ある局面において、この組成物は、場合によっては、以下に限定されないが、非天然アミノ酸を含有するタンパク質を少なくとも１０マイクログラム、少なくとも５０マイクログラム、少なくとも７５マイクログラム、少なくとも１００マイクログラム、少なくとも２００マイクログラム、少なくとも２５０マイクログラム、少なくとも５００マイクログラム、少なくとも１ミリグラム、少なくとも１０ミリグラム、少なくとも１００ミリグラム、少なくとも１グラム以上含むか、又はインビボタンパク質産生方法により達成され得る量を含む（組み換えタンパク質産生及び精製に対する詳細は本明細書中で与える。）。別の局面において、このタンパク質は、場合によっては、以下に限定されないが、細胞溶解液、緩衝液、医薬緩衝液又はその他の懸濁液などの中で（以下に限定されないが、約１ｎＬから約１００Ｌなどの何れかの体積で）、以下に限定されないが、少なくとも１Ｌあたりタンパク質１０マイクログラム、少なくとも１Ｌあたりタンパク質５０マイクログラム、少なくとも１Ｌあたりタンパク質７５マイクログラム、少なくとも１Ｌあたりタンパク１００マイクログラム、少なくとも１Ｌあたりタンパク質２００マイクログラム、少なくとも１Ｌあたりタンパク質２５０マイクログラム、少なくとも１Ｌあたりタンパク質５００マイクログラム、少なくとも１ミリグラム又は少なくとも１Ｌあたりタンパク質１０ミリグラム以上の濃度で、組成物中に存在する。少なくとも１個の非天然アミノ酸を含む真核細胞でのタンパク質の大量産生（以下に限定されないが、他の方法（以下に限定されないが、インビトロ翻訳など。）で通常可能なものを超える量など。）は、本発明の特徴である。
【０４９０】
本発明の真核宿主細胞又は非真核宿主細胞により、大量の有用な量で非天然アミノ酸を含有するタンパク質の生合成が可能となる。例えば、細胞抽出液、細胞溶解液、培養液、緩衝液などの中で、以下に限定されないが、少なくとも、タンパク質、１０μｇ／リットル、少なくとも５０μｇ／リットル、少なくとも７５μｇ／リットル、少なくとも１００μｇ／リットル、少なくとも２００μｇ／リットル、少なくとも２５０μｇ／リットル又は少なくとも５００μｇ／リットル、少なくとも１ｍｇ／リットル、少なくとも２ｍｇ／リットル、少なくとも３ｍｇ／リットル、少なくとも４ｍｇ／リットル、少なくとも５ｍｇ／リットル、少なくとも６ｍｇ／リットル、少なくとも７ｍｇ／リットル、少なくとも８ｍｇ／リットル、少なくとも９ｍｇ／リットル、少なくとも１０ｍｇ／リットル、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００ｍｇ／リットル、１ｇ／リットル、５ｇ／リットル、１０ｇ／リットル以上のなどの濃度で、非天然アミノ酸を含有するタンパク質を産生させることができる。
【０４９１】
Ｉ．発現系、培養及び単離
例えば、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞及び細菌を含む多くの適切な発現系においてＢＳＰを発現させ得る。代表的な発現系の説明を下記で行う。
【０４９２】
酵母
本明細書中で使用する場合、「酵母」という用語は、ＢＳＰをコードする遺伝子を発現することができるあらゆる様々な酵母を含む。このような酵母としては、以下に限定されないが、有子嚢酵母（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、エンドミケス）、担子胞子酵母及び、不完全菌類（分芽菌）に属する酵母が挙げられる。有子嚢酵母は、Ｓｐｅｒｍｏｐｈｔｈｏｒａｃｅａｅ（スペルモフトラセア）及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ（サッカロミケス）の２種類の科に分けられる。後者は、４種類の亜科、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｉｄａｅ（シゾサッカロミコイデ）（例えばシゾサッカロミセス属）、Ｎａｄｓｏｎｉｏｉｄｅａｅ（ナドソニオイデ）、Ｌｉｐｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ（リポミコイデ）及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ（サッカロミコイデ）（例えば、ピチア属、クリベロミセス属及びサッカロミセス属）からなる。担子胞子酵母は、Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ（ロイコスポリジウム）、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ（ロドスポリジウム）、Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ（スポリジオボルス）、Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ（フィロバシディウム）及びＦｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ（フィロバシディエラ）属を含む。不完全菌類（分芽菌）に属する酵母は、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ（スポロボロミセタセア）（例えば、スポロボロミセス属及びブレラ属）及びＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ（クリプトコッカセア）（例えばカンジダ属）の２種類の科に分けられる。
【０４９３】
本発明との使用に特に興味深いのは、ピチア属、クリベロミセス属、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ハンセヌラ属、トルロプシス属及びカンジダ属（以下に限定されないが、Ｐ．パストリス、Ｐ．グイレリモンディ、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．カルルスベルゲンシス、Ｓ．ディアスタチクス、Ｓ．ダグラシ、Ｓ．クリベリ、Ｓ．ノルベンシス、Ｓ．オビフォルミス、Ｋ．ラクチス、Ｋ．フラギリス、Ｃ．アルビカンス、Ｃ．マルトーサ、及びＨ．ポリモルファなど。）内の種である。
【０４９４】
ＢＳＰの発現に適切な酵母の選択は、当業者の技術の範囲内である。発現のための酵母宿主の選択において、適切な宿主は、例えば、優れた分泌能、低タンパク質分解活性、優れた可溶タンパク質産生及び全体的なロバスト性を有することを示すものを含み得る。酵母は通常、以下に限定されないが、Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）及びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）などの様々なソースから入手可能である。
【０４９５】
「酵母宿主」「酵母宿主細胞」という用語は、組み換えベクター又はその他のトランスファーＤＮＡに対するレシピエントとして使用することができる、又は使用されてきた酵母を含む。この用語は、組み換えベクター又はその他のトランスファーＤＮＡを受容したオリジナルの酵母宿主細胞の子孫を含む。偶然又は意図的な突然変異のために、１個の親細胞の子孫は、オリジナルの親に対して形態もしくはゲノムＤＮＡもしくはトータルＤＮＡ相補体が必ずしも完全に同一である必要はない事を理解されたい。ＢＳＰをコードするヌクレオチド配列の存在など適切な特性を特徴とする親と十分に類似している親細胞の子孫は、この定義により意図される子孫に含まれる。
【０４９６】
多くの酵母宿主への形質転換のために、染色体外レプリコン又は組み込みベクターを含む発現及び形質転換ベクターが開発されてきた。例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓｉｋｏｒｓｋｉら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９８）１１２：１９；Ｉｔｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８３）１５３：１６３；Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１９２９）；Ｃ．アルビカンス（Ｋｕｒｔｚら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８６）６：１４２）；Ｃ．マルトーサ（Ｋｕｎｚｅら、Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８５）２５：１４１）；Ｈ．ポリモルファ（Ｇｌｅｅｓｏｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８６）１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら、ＭＯＬ．  ＧＥＮＥＴＩＣＳ  ＡＮＤ  ＧＥＮＯＭＩＣＳ（１９８６）２０２：３０２）；Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（Ｄａｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８４）１５８：１１６５）；Ｋ．ラクチス（Ｄｅ  Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８３）１５４：７３７；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９０）８：１３５）；Ｐ．ギレリモンディ（Ｋｕｎｚｅら、Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８５）２５：１４１）；Ｐ．パストリス（米国特許第５，３２４，６３９号；同第４，９２９，５５５号；及び同第４，８３７，１４８号；Ｃｒｅｇｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ（１９８５５：３３７６）；Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ（Ｂｅａｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８２）３００：７０６）；及びＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｄａｖｉｄｏｗら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８５）１０：３８０（１９８５）；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８６）１０：４９）；Ａ．ニドゥランス（Ｂａｌｌａｎｃｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｏｎ．（１９８３）１１２：２８４−８９；Ｔｉｌｂｕｒｎら、Ｇｅｎｅ（１９８３）２６：２０５−２１１；及びＹｅｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１：１４７０−７４）；Ａ．ニガー（Ｋｅｌｌｙ及びＨｙｎｅｓ，ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８５）４：４７５４７９）；Ｔ．レーシア（ＥＰ０２４４２３４）；及び糸状菌、例えば、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラディウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）（ＷＯ９１／００３５７）など（それぞれ本明細書中に参照により組み込む。）に対して発現ベクターが開発された。
【０４９７】
酵母ベクターに対する制御配列は当業者にとって周知であり、以下に限定されないが、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（ＥＰ０２８４０４４）；エノラーゼ；グルコキナーゼ；グルコース−６−リン酸イソメラーゼ；グリセルアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ又はＧＡＰＤＨ）；ヘキソキナーゼ；ホスホフルクトキナーゼ；３−ホスホグリセレートムターゼ；及びピルベートキナーゼ（ＰｙＫ）（ＥＰ０３２９２０３）などの遺伝子からのプロモーター領域が挙げられる。酸性ホスファターゼをコードする酵母ＰＨＯ５遺伝子もまた、有用なプロモーター配列を提供し得る（Ｍｙａｎｏｈａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０：１）。酵母宿主との使用に適切なその他のプロモーター配列は、３−ホスホグリセレートキナーゼに対するプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：２０７３）；及びその他の糖分解酵素、例えばピルベートデカルボキシラ−ゼ、トリオ−スリン酸イソメラーゼ及びホスホグルコースイソメラーゼ（Ｈｏｌｌａｎｄら、ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ（１９７８）１７：４９００；Ｈｅｓｓら、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．（１９６８）７：１４９）が挙げられる。増殖条件により調節される転写のさらなる長所を有する誘導型酵母プロモーターには、アルコールデヒドロゲナーゼ２；イソチトクロムＣ；酸性ホスファターゼ；メタロチオネイン；グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ；窒素代謝に関与する分解酵素；及びマルトース及びガラクトース利用に関与する酵素に対するプロモーター領域が含まれる。酵母発現での使用に適切なベクター及びプロモーターはさらにＥＰ００９３６５７に記載されている。
【０４９８】
酵母エンハンサーを酵母プロモーターと一緒に使用することもできる。さらに、合成プロモーターも酵母プロモーターとして機能し得る。例えば、酵母プロモーターの上流活性化配列（ＵＡＳ）を別の酵母プロモーターの転写活性領域と連結させることができ、これにより合成ハイブリッドプロモーターを作製できる。このようなハイブリッドプロモーターの例としては、ＧＡＰ転写活性化領域に連結させられたＡＤＨ制御配列が挙げられる。米国特許第４，８８０，７３４号及び同第４，８７６，１９７号（本明細書中に参照により組み込む。）を参照のこと。ハイブリッドプロモーターのその他の例としては、ＧＡＰ又はＰｙＫなどの糖分解酵素遺伝子の転写活性化領域と組み合わせた、ＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０又はＰＨＯ５遺伝子の制御配列からなるプロモーターが挙げられる。ＥＰ０１６４５５６号を参照のこと。さらに、酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼと結合し、転写を開始させる能力を有する非酵母由来の天然プロモーターを含む。
【０４９９】
酵母発現ベクターの一部を含み得る他の制御エレメントには、ターミネーター、例えば、ＧＡＰＤＨ又はエノラーゼ遺伝子由来のものが含まれる（Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８１）２５６：１３８５）。さらに、２μプラスミドオリジンからの複製起点は、酵母に適切である。酵母での使用に適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドに存在するｔｒｐ１遺伝子である。Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、（Ｇｅｎｅ（１９８０）１０：１５７；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ（１９７９）７：１４１を参照のこと。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中での増殖能を欠く酵母の突然変異株に対する選択マーカーを与える。同様に、Ｌｅｕ−２欠失酵母株（ＡＴＣＣ２０，６２２又は３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドにより補完される。
【０５００】
外来性ＤＮＡを酵母宿主に導入する方法は当業者にとって周知であり、一般に、以下に限定されないが、アルカリ陽イオンで処理された、スフェロプラスト又はインタクトな酵母宿主細胞の何れかの形質転換が含まれる。例えば、Ｈｓｉａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．（１９７９）７６：３８２９及びＶａｎ  Ｓｏｌｉｎｇｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔ．（１９７７）１３０：９４６に記載の方法に従い、酵母の形質転換を行うことができる。しかし、核注入、エレクトロポレーション又はプロトプラスト融合など、細胞にＤＮＡを導入するためのその他の方法も、一般にＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂ．Ｍａｎｕａｌ（２００１）に記載のように使用し得る。次いで、当業者にとって公知の標準的技術を用いて、酵母宿主細胞を培養し得る。
【０５０１】
酵母宿主細胞において異種タンパク質を発現させるためのその他の方法は、当業者にとって周知である、一般に、米国特許公開第２００２００５５１６９号、米国特許第６，３６１，９６９号、同第６，３１２，９２３号；同第６，１８３，９８５号；同第６，０８３，７２３号；同第６，０１７，７３１号；同第５，６７４，７０６号；同第５，６２９，２０３号；同第５，６０２，０３４号及び同第５，０８９，３９８号；米国再審査特許第ＲＥ３７，３４３号及び同第ＲＥ３５，７４９号；ＰＣＴ公開特許出願ＷＯ９９／０７８６２；ＷＯ９８／３７２０８；及びＷＯ９８／２６０８０；欧州特許出願ＥＰ０９４６７３６；ＥＰ０７３２４０３；ＥＰ０４８０４８０；ＥＰ０４６００７１；ＥＰ０３４０９８６；ＥＰ０３２９２０３；ＥＰ０３２４２７４；及びＥＰ０１６４５５６を参照のこと。また、Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎら、Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ（１９９２）６２（１−２）：７９−９３；Ｒｏｍａｎｏｓら、Ｙｅａｓｔ（１９９２）８（６）：４２３−４８８；Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９９０）１８５：３−７（それぞれを本明細書中に参照により組み込む。）も参照のこと。
【０５０２】
当業者にとって周知である標準的なフィードバッチ発酵法を用いて、増幅段階の際、発酵装置中で酵母宿主株を増殖させ得る。この発酵法を採用して、特定の酵母宿主の炭素利用経路又は発現制御方式の違いを明らかにすることができる。例えば、サッカロミセス酵母宿主の発酵には、１つのグルコース供給、複合窒素源（例えばカゼイン加水分解物）及び複数ビタミンの供給が必要であり得る。対して、メチロトローフ酵母、Ｐ．パストリスは、グリセロール、メタノール及び微量元素の供給を必要とするが、最適な増殖及び発現のために、単純なアンモニウム（窒素）塩のみが必要である。例えば、米国特許第５，３２４，６３９号；Ｅｌｌｉｏｔｔら、Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ（１９９０）９：９５及びＦｉｅｓｃｈｋｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｂｉｏｅｎｇ．（１９８７）２９：１１１３（本明細書中に参照により組み込む。）を参照のこと。
【０５０３】
しかし、このような発酵法は、使用する酵母宿主と無関係なある一定の一般的な特徴を有し得る。例えば、最大限に増殖させるために、増幅期の際に、増殖制限栄養、通常は炭素、を発酵装置に添加し得る。さらに、発酵法は通常、炭素、窒素、基本的塩、リン及びその他の微量栄養素（ビタミン、微量元素及び塩など。）の適正な量を含有するように設定された発酵培地を用いる。ピチアとともに使用するのに適切な発酵の例は、米国特許第５，３２４，６３９号及び同第５，２３１，１７８号（本明細書中に参照により組み込む。）に記載されている。
【０５０４】
バキュロウイルス感染昆虫細胞
「昆虫宿主」又は「昆虫宿主細胞」という用語は、組み換えベクター又はその他のトランスファーＤＮＡに対するレシピエントとして使用することができる、又は使用されてきた昆虫を指す。この用語は、トランスフェクトされたオリジナルの昆虫宿主細胞の子孫を含む。偶然又は意図的な突然変異のために、１個の親細胞の子孫は、オリジナルの親に対して形態又はゲノムＤＮＡもしくはトータルＤＮＡ相補体が必ずしも完全に同一である必要はないことを理解されたい。ＢＳＰをコードするヌクレオチド配列の存在など、適切な特性を特徴とする親と十分に類似している親細胞の子孫は、この定義により意図される子孫に含まれる。
【０５０５】
ＢＳＰの発現に適切な昆虫細胞の選択は、当業者にとって周知である。ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、スポドプテラ・フルギペルタ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｈｒｕｇｉｐｅｒｄａ）及びイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）など、いくつかの昆虫種が当技術分野で詳しく記載されており、市販されている。発現のための昆虫宿主の選択において、適切な宿主は、例えば、優れた分泌能、低タンパク質分解活性及び全体的なロバスト性を有することを示すものを含み得る。昆虫は通常、以下に限定されないが、Ｉｎｓｅｃｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）及びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）などの様々なソースから入手可能である。
【０５０６】
一般に、バキュロウイルス感染昆虫発現系の成分には、トランスファーベクター、通常は、バキュロウイルスゲノムの断片及び発現させる異種遺伝子の挿入のための従来の制限部位の両方を含有する細菌プラスミド；トランスファーベクター中のバキュロウイルス特異的断片と相同な配列を有する野生型バキュロウイルス（これにより、バキュロウイルスゲノムへの異種遺伝子の相同組み換えが可能となる。）；及び適切な昆虫宿主細胞ならびに増殖培地が含まれる。ベクターの構築、細胞のトランスフェクション、プラークの回収、培養での細胞増殖などで使用される、材料、方法及び技術は、当技術分野で公知であり、これらの技術を記載するマニュアルが利用可能である。
【０５０７】
トランスファーベクターに異種遺伝子を挿入した後、ベクター及び野生型ウイルスゲノムを、ベクター及びウイルスゲノムの組み換えを行う昆虫宿主細胞にトランスフェクトする。パッケージングされた組み換えウイルスを発現させ、組み換えプラークを同定し、精製する。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系に対する材料及び方法は、キット形態で、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から市販されている。これらの技術は通常、当業者にとって公知であり、Ｓｕｍｍｅｒｓ及びＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）に詳しく記載されている（参照により本明細書中に組み込む。）。また、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，３９  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（１９９５）；Ａｕｓｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６．９−１６．１１（１９９４）；Ｋｉｎｇ及びＰｏｓｓｅｅ，Ｔｈｅ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ（１９９２）；及びＯ’Ｒｅｌｌｙら、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９２）も参照のこと。
【０５０８】
実際に、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系を用いた様々な異種タンパク質産生が当技術分野で周知である。例えば、米国特許第６，３６８，８２５号；同第６，３４２，２１６号；同第６，３３８，８４６号；同第６，２６１，８０５号；同第６，２４５，５２８号、同第６，２２５，０６０号；同第６，１８３，９８７号；同第６，１６８，９３２号；同第６，１２６，９４４号；同第６，０９６，３０４号；同第６，０１３，４３３号；同第５，９６５，３９３号；同第５，９３９，２８５号；同第５，８９１，６７６号；同第５，８７１，９８６号；同第５，８６１，２７９号；同第５，８５８，３６８号；同第５，８４３，７３３号；同第５，７６２，９３９号；同第５，７５３，２２０号；同第５，６０５，８２７号；同第５，５８３，０２３号；同第５，５７１，７０９号；同第５，５１６，６５７号；同第５，２９０，６８６号；ＷＯ０２／０６３０５；ＷＯ０１／９０３９０；ＷＯ０１／２７３０１；ＷＯ０１／０５９５６；ＷＯ００／５５３４５；ＷＯ００／２００３２；ＷＯ９９／５１７２１；ＷＯ９９／４５１３０；ＷＯ９９／３１２５７；ＷＯ９９／１０５１５；ＷＯ９９／０９１９３；ＷＯ９７／２６３３２；ＷＯ９６／２９４００；ＷＯ９６／２５４９６；ＷＯ９６／０６１６１；ＷＯ９５／２０６７２；ＷＯ９３／０３１７３；ＷＯ９２／１６６１９；ＷＯ９２／０３６２８；ＷＯ９２／０１８０１；ＷＯ９０／１４４２８；ＷＯ９０／１００７８；ＷＯ９０／０２５６６；ＷＯ９０／０２１８６；ＷＯ９０／０１５５６；ＷＯ８９／０１０３８；ＷＯ８９／０１０３７；ＷＯ８８／０７０８２（本明細書中に参照により組み込む。）を参照のこと。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系に有用なベクターは、当技術分野で公知であり、例えば、ヘルバー非依存性のウイルス発現ベクターである、バキュロウイルス、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ（オ−トグラファカリフォルニカ）多角体病ウイルス核（ＡｃＮＰＶ）由来の、昆虫発現及びトランスファーベクターを含む。この系由来のウイルス発現ベクターは通常、強力なウイルスポリへドリン遺伝子プロモーターを使用して異種遺伝子の発現を駆動する。一般的に、Ｒｅｉｌｌｙら、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９２）を参照のこと。
【０５０９】
バキュロウイルスゲノムに外来遺伝子を挿入する前に、プロモーター、リーダー（必要に応じて）、関心のあるコード配列及び転写終結配列を含む上述の成分を、通常、中間移行（ｔｒａｎｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）コンストラクト（トランスファーベクター）に集める。中間移行（ｔｒａｎｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）コンストラクトは、細菌などの宿主において安定した維持が可能な染色体外エレメント（例えばプラスミド）など、レプリコンにおいて維持されることが多い。レプリコンは複製系を有し、したがって、これにより、クローニング及び増幅に適切な宿主において維持されるようになる。とりわけ、プラスミドは、ポリへドリンポリアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８８）４２：１７７）及び原核生物アンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子及びＥ．コリでの選択及び増殖のための複製起点を含有し得る。
【０５１０】
外来遺伝子をＡｃＮＰＶに導入するための、よく使用されるあるトランスファーベクターは、ｐＡｃ３７３である。例えば、ｐＶＬ９８５（ポリへドリン開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに変更し、ＡＴＴから３２塩基対下流にＢａｍＨＩクローニング部位を導入する。）をはじめ、当業者にとって公知である、多くのその他のベクターもまた設計されてきた。Ｌｕｃｋｏｗ及びＳｕｍｍｅｒｓ、１７  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３１（１９８９）を参照のこと。その他の市販ベクターとしては、例えば、ＰＢｌｕｅＢａｃ４．５／Ｖ５−Ｈｉｓ；ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２；ｐＭｅｌＢａｃ；ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が挙げられる。
【０５１１】
異種遺伝子の挿入後、トランスファーベクター及び野生型バキュロウイルスゲノムを昆虫細胞宿主に共トランスフェクションする。異種ＤＮＡをバキュロウイルスの所望の部位に導入するための方法は、当技術分野で公知である。Ｓｕｍｍｅｒｓ及びＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）；Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８３）３：２１５６；Ｌｕｃｋｏｗ及びＳｕｍｍｅｒｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７：３１を参照のこと。例えば、相同二重交叉組み換えにより、ポリへドリン遺伝子などの遺伝子に挿入し得、所望のバキュロウイルス遺伝子に組み込んだ制限酵素部位にも挿入し得る。Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ（１９８９）４：９１も参照のこと。
【０５１２】
エレクトロポレーションによりトランスフェクションを遂行し得る。Ｔｒｏｔｔｅｒ及びＷｏｏｄ，３９  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：（１９９５）；Ｍａｎｎ及びＫｉｎｇ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８９）７０：３５０１を参照のこと。あるいは、リポソ−ムを使用して、昆虫細胞に組み換え発現ベクター及びバキュロウイルスをトランスフェクションし得る。例えば、Ｌｉｅｂｍａｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９９）２６（１）：３６；Ｇｒａｖｅｓら、ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ（１９９８）３７：６０５０；Ｎｏｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）２７３（２２）：１３５７０；Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（１９９８）１２：３２３；Ｓｉｆｆｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９８）１８：４５；Ｔｉｌｋｉｎｓら、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  １４５−１５４（１９９８）；Ｃａｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（１９９７）１０：２６３；Ｄｏｌｐｈｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７）１７：４９１；Ｋｏｓｔら、Ｇｅｎｅ（１９９７）１９０：１３９；Ｊａｋｏｂｓｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）２７１：２２２０３；Ｒｏｗｌｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）２７１（３７）：２２３７６；Ｒｅｖｅｒｓｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）２７１（３９）：２３６０７−１０；Ｓｔａｎｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）２７０：４１２１；Ｓｉｓｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８（２）：７６６；及びＰｅｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９３）１４．２：２７４を参照のこと。市販のリポソ−ムとしては、例えば、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（Ｒ）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（Ｒ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が挙げられる。さらに、リン酸カルシウムトランスフェクションを使用し得る。Ｔｒｏｔｔｅｒ及びＷｏｏｄ、３９  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：（１９９５）；Ｋｉｔｔｓ，ＮＡＲ（１９９０）１８（１９）：５６６７；及びＭａｎｎ及びＫｉｎｇ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８９）７０：３５０１を参照のこと。
【０５１３】
バキュロウイルス発現ベクターは通常、バキュロウイルスプロモーターを含有する。バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスＲＮＡポリメラーゼに結合し、コード配列（例えば構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始することができる何らかのＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接して置かれる転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位及び転写開始部位を含む。バキュロウイルスプロモーターはまた、エンハンサーと呼ばれる第二のドメインを有し得、これは、存在する場合、通常、構造遺伝子の遠位にある。さらに、発現が制御されるか又は構造的である。
【０５１４】
感染サイクルの後期に非常によく転写される構造遺伝子は、特に有用なプロモーター配列を与える。例としては、ウイルス性ポリへドロンタンパク質をコードする遺伝子（Ｆｒｉｅｓｅｎら、Ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（１９８６）；ＥＰ０１２７８３９及び０１５５４７６）及びｐ１０タンパク質をコードする遺伝子（Ｖｌａｋら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６９；７６５）由来の配列が挙げられる。
【０５１５】
新たに形成されたバキュロウイルス発現ベクターを感染性組み換えバキュロウイルスにパッケージングし、続いて、増殖させたプラークを当業者にとって公知の技術で精製し得る。Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏａｓｓｅｙｓ（１９８９）４：９１；Ｓｕｍｍｅｒｓ及びＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）を参照のこと。
【０５１６】
いくつかの昆虫細胞への感染のために、組み換えバキュロウイルス発現ベクターが開発されてきた。例えば、とりわけ、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１２５）、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−８９１０）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ＡＴＣＣ番号１９６３）、スポドプテラ・フルギペルタ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｈｒｕｇｉｐｅｒｄａ）及びイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）に対して組み換えバキュロウイルスが開発されている。ＷＯ８９／０４６，６９９；Ｗｒｉｇｈｔ、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１：７１８；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８５）５６：１５３；Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８３）３：２１５６を参照のこと。一般的に、Ｆｒａｓｅｒら、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．（１９８９）２５：２２５を参照のこと。とりわけ、バキュロウイルス発現ベクター系に対して使用する細胞株としては、一般に、以下に限定されないが、Ｓｆ９（スポドプテラ・フルギペルタ）（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１７１１）、Ｓｆ２１（スポドプテラ・フルギペルタ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、カタログ番号１１４９７−０１３（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、Ｔｒｉ−３６８（イラクサギンウワバ）及びＨｉｇｈ−ＦｉｖｅＴＭＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（イラクサギンウワバ）が挙げられる。
【０５１７】
バキュロウイルス／発現における異種ポリペプチドの直接及び融合発現両方に対して、細胞及び培養用培地が市販されており、細胞培養技術は一般に当業者にとって公知である。
【０５１８】
Ｅ．コリ、緑膿菌種ならびにその他の原核生物
細菌発現技術は、当技術分野で周知である。細菌宿主での使用に対して多岐にわたるベクターが利用可能である。ベクターは、シングルコピー又は低コピーもしくは高多コピーベクターであり得る。ベクターは、クローニング及び／又は発現に役立ち得る。ベクターに関する豊富な文献、多くのベクターが市販されていること、及びベクターならびにそれらの制限地図及び特性を記載するマニュアルを考慮すると、本明細書中で幅広い考察を行う必要はない。周知のとおり、ベクターは通常、選択を可能にするマーカーを含み、このマーカーは、細胞毒性物質耐性、原栄養性又は免疫性を規定し得る。しばしば、複数のマーカーが存在し、これらが様々な特性を規定する。
【０５１９】
細菌性プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合し、コード配列（例えば構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始することができる何らかのＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接して置かれる転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位及び転写開始部位を含む。細菌プロモーターはまた、オペレーターと呼ばれる第二のドメインも有し得、これは、ＲＮＡ合成が開始される隣接するＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重複し得る。遺伝子リプレッサ−タンパク質がオペレーターに結合し得、それにより特異的遺伝子の転写が抑制されるので、オペレーターにより、負に制御された（誘導型）転写が可能となる。オペレーターなどの負の制御エレメントの非存在下で構造性発現が起こり得る。さらに、遺伝子活性化タンパク質結合配列により、正の制御を行い得、これは、存在する場合、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列に対して近位（５’）にある。遺伝子活性化タンパク質の一例は、カタボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）であり、これは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．コリ、大腸菌）におけるｌａｃオペロンの転写開始を促進する（Ｒａｉｂａｕｄら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ／Ｇｅｎｅｔ．（１９８４）１８：１７３）。したがって、制御発現は、正又は負の何れかのものであり得、それにより、転写が促進されるか又は抑制させる。
【０５２０】
代謝経路酵素をコードする配列は、特に、有用なプロモーター配列を与える。一例として、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）１９８：１０５６）及びマルトースなどの糖代謝酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。さらなる例としては、トリプトファン（ｔｒｐ）（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８０）８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８１）９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；ＥＰ公開第０３６７７６号及び同第１２１７７５号（本明細書中に参照により組み込む。））などの生合成酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。β−ガラクトシダ−ゼ（ｂｌａ）プロモーター系（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）「Ｔｈｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｍｉｓｔａｋｅｓ．」Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編））、バクテリオファージλＰＬ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：１２８）及びＴ５（米国特許第４，６８９，４０６号（本明細書中に参照により組み込む。））プロモーター系もまた有用なプロモーター配列を与える。本発明の好ましい方法は、Ｔ７プロモーターなどの強力なプロモーターを利用して、高レベルでＢＳＰを誘導する。このようなベクターの例は当技術分野で周知であり、これには、ＮｏｖａｇｅｎからのｐＥＴ２９シリ−ズ及びＷＯ９９／０５２９７（本明細書中に参照により組み込む。）に記載のｐＰＯＰベクターが含まれる。このような発現系は、宿主細胞生存能又は増殖パラメ−タ−に影響を与えることなく宿主において高レベルのＢＳＰを産生する。
【０５２１】
さらに、天然にはない合成プロモーターもまた、細菌プロモーターとして機能する。例えば、ある細菌又はバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列を別の細菌又はバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と連結させて、合成ハイブリッドプロモーターを作製し得る（米国特許第４，５５１，４３３号（本明細書中に参照により組み込む。））。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーターと、ｌａｃリプレッサ−により制御されるｌａｃオペロン配列の両方からなる、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターである（Ａｍａｎｎら、Ｇｅｎｅ（１９８３）２５：１６７；ｄｅ  Ｂｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８３）８０：２１）。さらに、細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合し、転写を開始させることができる非細菌由来の天然プロモーターを含み得る。原核生物におけるいくつかの遺伝子を高レベルで発現させるために、非細菌由来の天然プロモーターを適合するＲＮＡポリメラーゼと組み合わせることもできる。バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、組合せプロモーター系の一例である（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８６）１８９：１１３；Ｔａｂｏｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８５）８２：１０７４）。さらに、ハイブリッドプロモーターはまた、バクテリオファージプロモーター及びＥ．コリオペレーター領域から構成され得る（ＥＰ公開第２６７８５１）。
【０５２２】
機能するプロモーター配列に加え、原核細胞での外来遺伝子の発現に対しては効率的なリボソーム結合部位も有用である。Ｅ．コリにおいて、リボソーム結合部位は、Ｓｈｉｈｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドン（ＡＴＧ）及び開始コドンの３から１１ヌクレオチド上流に位置する３−９ヌクレオチド長の配列を含む（Ｓｈｉｈｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５４：３４）。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とＥ．コリ１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端との間の塩基の対合によりｍＲＮＡのリボソームへの結合を促進すると考えられる（Ｓｔｅｉｔｚら、「Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｉｇｎａｌｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｅｌｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｓｅｓ  ｉｎ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ」、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ編、１７９７））。弱いリボソーム結合部位により真核遺伝子及び原核遺伝子を発現させるために（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．１９８９）。
【０５２３】
「細菌宿主」又は「細菌宿主細胞」という用語は、組み換えベクター又はその他のトランスファーＤＮＡに対するレシピエントとして使用することができる、又は使用されてきた細菌を指す。この用語は、トランスフェクトされたオリジナルの細菌宿主細胞の子孫を含む。偶然又は意図的な突然変異のために、１個の親細胞の子孫は、オリジナルの親に対して形態又はゲノムＤＮＡもしくはトータルＤＮＡ相補体が必ずしも完全に同一である必要はないことを理解されたい。ＢＳＰをコードするヌクレオチド配列の存在など適切な特性を特徴とする親と十分に類似している親細胞の子孫は、この定義により意図される子孫に含まれる。
【０５２４】
ＢＳＰの発現に適切な宿主細菌の選択は、当業者にとって周知である。発現のための細菌宿主の選択において、適切な宿主は、とりわけ、優れた封入体形成能、低タンパク質分解活性及び全体的なロバスト性を有することを示すものを含み得る。細菌宿主は通常、以下に限定されないが、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）及びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）などの様々なソースから入手可能である。工業的／製薬的発酵は通常、Ｋ株（例えばＷ３１１０）由来の細菌又はＢ株（例えばＢＬ２１）由来の細菌を使用する。これらの株は、その増殖パラメ−タ−が非常によく知られておりロバストなので、特に有用である。さらに、これらの株は、非病原性であり、安全性及び環境面の理由で商業上重要である。本発明の方法のある実施形態において、Ｅ．コリ宿主は、ＢＬ２１の株である。本発明の方法の別の実施形態において、Ｅ．コリ宿主は、以下に限定されないがＯＭＰ−及びＬＯＮ−などの、プロテアーゼマイナス株である。本発明の方法の別の実施形態において、宿主細胞株は、以下に限定されないが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（シュードモナス・フルオレセンス）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓ（シュードモナス・エアルギノサ）及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ（シュードモナス・プチダ）などの緑膿菌種である。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（シュードモナス・フルオレセンス）次亜種１（ＭＢ１０１株と呼ばれる。）は、組み換え産生に有用であることが知られており、治療用タンパク質産生過程で利用可能である。緑膿菌発現系の例としては、宿主株として、Ｔｈｅ  Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ、ｄｏｗ．ｃｏｍにおいてＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂで利用可能。）から入手可能な系が挙げられる。米国特許第４，７５５，４６５号及び同第４，８５９，６００号（本明細書中に参照により組み込む。）は、ｈＧＨ産生のための宿主細胞としての緑膿菌株の使用について述べている。
【０５２５】
組み換え宿主細胞株を確立（即ち、発現コンストラクトを宿主細胞に導入し、正しい発現コンストラクトを有する宿主細胞を単離する。）した後、ＢＳＰ産生に適切な条件下でその組み換え宿主細胞株を培養する。当業者にとって当然のことながら、組み換え宿主細胞株の培養方法は、利用する発現コンストラクトの性質及び宿主細胞が何であるかに依存する。当業者にとって周知である方法を用いて組み換え宿主株を普通に培養する。組み換え宿主細胞は通常、炭素、窒素及び無機塩の同化可能なソースを含有し、場合によっては、当業者にとって周知である、ビタミン、アミノ酸、増殖因子及びその他のタンパク性の培地補助物質を含有する液体培地中で培養する。宿主細胞培養用の液体培地は、望ましくない微生物の増殖を防ぐために抗生物質又は抗真菌剤を場合によっては含有し得、及び／又は、発現ベクターを含有する宿主細胞を選択するために、以下に限定されないが抗生物質などの化合物を含有し得る。
【０５２６】
組み換え宿主細胞をバッチ又は連続様式の何れかで培養し、細胞を回収するか（ＢＳＰが細胞内に蓄積する場合。）、又はバッチ又は連続様式で培養上清を回収し得る。原核生物宿主細胞で産生を行う場合、バッチ培養及び細胞回収が好ましい。
【０５２７】
組み換え系での発現後、本発明のＢＳＰを通常精製する。当業者にとって公知の様々な方法により、宿主細胞からＢＳＰを精製し得る。通常、細菌宿主細胞中で産生されたＢＳＰは、溶解性が低いか、又は不溶性であり得る（封入体形態において）。本発明のある実施形態において、本明細書中で開示する、ならびに当業者にとって公知の方法を利用して、組み換え産生されたタンパク質の溶解性を高める目的で選択したアミノ酸置換をＢＳＰにおいて容易に行い得る。不溶性タンパク質の場合、遠心分離により宿主細胞細胞溶解液からタンパク質を回収し得、さらに続いて、細胞のホモジェナイズを行い得る。溶解性の乏しいタンパク質の場合、化合物（以下に限定されないが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。）を添加して、ある程度可溶性のタンパク質の沈殿を誘導し得る。次に、沈殿したタンパク質を従来どおり遠心分離により回収し得る。当業者にとって周知である様々な方法を用いて、組み換え宿主細胞を破壊又はホモジェナイズして細胞内から封入体を放出させ得る。以下に限定されないが、酵素的細胞破壊、超音波破砕、ダウンス型ホモジェナイズ又は高圧放出破壊法などの周知の技術を用いて、宿主細胞破壊又はホモジェナイズを行い得る。本発明の方法のある実施形態において、高圧放出破壊法を使用して、Ｅ．コリ宿主細胞を破壊し、ＢＳＰの封入体を放出させ得る。ＢＳＰの封入体を扱う場合、可溶化、機械的せん断又はタンパク質分解などの要素による喪失なく封入体の回収率を最大にするために、繰り返しでのホモジェナイズ時間を最短にすることが有利であり得る。封入体の形成の傾向は、ある種の他のタンパク質（ＴｒｐＬＥなど［Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，  Ｇ．（１９９６）  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｃｌｅｌａｎｄ，  Ｊ．  Ｌ．  ａｎｄ  Ｃｒａｉｋ，  Ｃ．  Ｓ．，  ｅｄｓ．），  ｐｐ．  １０１−１２７，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｆｏｒｄ，  Ｃ．  Ｆ．，  Ｓｕｏｍｉｎｅｎ，  Ｉ．  ａｎｄ  Ｇｌａｔｚ，  Ｃ．  Ｅ．（１９９１）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｕｒｉｆ．  ２，  ９５−１０７］）に標的タンパク質を融合することによって、上昇した温度又は７．０以外のｐＨで培養することによって増強され得る。
【０５２８】
次に、当技術分野で公知の多くの適切な可溶化剤の何れかを用いて、不溶性又は沈殿ＢＳＰを可溶化し得る。好ましくは、尿素又は塩酸グアニジンを用いてＢＳＰを可溶化する。都合よく操作できるバッチサイズを用いて大量に産生できるように、可溶化ＢＳＰの体積は最少に抑えるべきである。数千リットルもの体積であるバッチにおいて組み換え宿主を増殖させ得る大規模な工業的設定において、この要素は重要であり得る。さらに、大規模な工業的設定でＢＳＰを製造する場合、特にヒトの医薬品の用途の場合、機械類もしくは容器類又はタンパク質産物そのものに損傷を与え得る強い化学物質の回避は、可能であれば避けるべきである。本発明の方法においては、強い変性剤である塩酸グアニジンの代わりにより穏やかな変性剤である尿素を使用してＢＳＰ封入体を可溶化できることが分かっている。尿素を使用することにより、ＢＳＰ封入体を効率的に可溶化しながら、ＢＳＰの製造及び精製過程で利用するステンレス鋼の設備に損傷を与えるリスクが顕著に低下する。
【０５２９】
可溶性ＢＳＰの場合、ペリプラスム間隙又は培地にＢＳＰを分泌させ得る。さらに、宿主細胞の細胞質に可溶性ＢＳＰが存在し得る。精製段階を行う前に、可溶性ＢＳＰを濃縮することが望ましいものであり得る。当技術分野で公知の標準的技術を用いて、例えば、細胞溶解液又は培地から、可溶性ＢＳＰを濃縮し得る。さらに、当業者にとって公知の標準的技術を用いて、宿主細胞を破壊し、宿主細胞の細胞質又はペリプラスム間隙から可溶性ＢＳＰを放出させ得る。
【０５３０】
融合タンパク質としてＢＳＰを産生させる場合、融合配列を好ましくは除去する。酵素的又は化学的切断などによって、多数の異なる条件下で、融合配列の除去を行い得る。当業者にとって周知の方法を用いて、融合配列の酵素的除去を行い得る。融合配列を除去するための酵素は、融合物が何であるかによって決まり、当業者にとって当然のことながら、反応条件は選択した酵素によって決まる。化学的切断は、当業者に周知の試薬を用いて行い得る。１つのこのような試薬は、メチオニン残基を切断する臭化シアンである。切断したＢＳＰを好ましくは切断融合配列から周知の方法により精製する。当業者にとって当然のことながら、融合配列及びＢＳＰが何であるか及びそれらの特性により、このような方法が決定される。精製方法には、以下に限定されないが、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーもしくは透析又はそれらの何らかの組合せが含まれ得る。
【０５３１】
タンパク質溶液からＤＮＡを除去するために、ＢＳＰも好ましくは精製する。沈殿又はイオン交換クロマトグラフィーなど、何らかの適切な当技術分野で公知の方法により、ＤＮＡを除去し得るが、好ましくは、以下に限定されないが硫酸プロタミンなどの、核酸沈殿剤を用いた沈殿により除去する。以下に限定されないが遠心分離又はろ過などの、標準的な周知の方法を用いて、沈殿したＤＮＡからＢＳＰを分離し得る。ヒトを治療するためにＢＳＰを使用すべき場合、宿主核酸分子の除去は重要な要素であり、本発明の方法により、宿主細胞ＤＮＡが医薬適合性のレベルに低下する。
【０５３２】
小規模又は大規模発酵の方法はまた、以下に限定されないが、発酵槽、振盪フラスコ、流動層バイオリアクター、中空糸バイオリアクター、ローラーボトル培養系及び撹拌タンクバイオリアクター系など、タンパク質発現において使用することもできる。バッチ、半回分又は連続様式過程において、これらの方法それぞれを行うことができる。
【０５３３】
本発明のヒトＢＳＰは通常、当技術分野で標準的な方法を用いて回収し得る。例えば、培地又は細胞溶解液を遠心分離又はろ過して、細胞残屑を除去することができる。上清を所望の体積に濃縮もしくは希釈するか、又はさらなる精製に適切な状態にするための適切な緩衝液に調製物をダイアフィルトレーションすることができる。本発明のＢＳＰのさらなる精製には、インタクト形態からのＢＳＰバリアントの脱アミド化及び短縮型を分離することが含まれる。
【０５３４】
次の代表的な手段の何れかを本発明の抗原結合ポリペプチドの生成に用いることができる：アフィニティークロマトグラフィー；陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー以下に限定されないが、ＤＥＡＥ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥなどを用いる。）；シリカにおけるクロマトグラフィー；逆相ＨＰＬＣ；ゲルろ過（以下に限定されないが、ＳＥＰＨＡＤＥＸ  Ｇ−７５などを用いる。）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー；限外ろ過／ダイアフィルトレーション；エタノール沈殿；硫酸アンモニウム沈殿；等電点電気泳動；置換クロマトグラフィー；電気泳動法（以下に限定されないが、分取等電点電気泳動を含む。）、異なる溶解性（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）（以下に限定されないが、硫酸アンモニウム沈殿を含む。）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又は抽出。
【０５３５】
当業者にとって公知であり当業者により使用されている標準的手段に従い、以下に限定されないが非天然アミノ酸を含むタンパク質、非天然アミノ酸を含むペプチド、非天然アミノ酸を含むタンパク質に対する抗体、非天然アミノ酸を含むタンパク質に対する結合パートナーなどを含む、本発明のタンパク質を、部分的に又は実質的に均一になるように精製することができる。したがって、以下に限定されないが硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸もしくは塩基抽出、カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法などを含む、当技術分野で周知の多くの方法の何れかにより、本発明のポリペプチドを回収し、精製することができる。正しくフォールディングされた成熟タンパク質の生成にいおて、要望どおり、タンパク質リフォールディング段階を使用することができる。高純度が望まれる最終精製段階において、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー又はその他の適切な方法を利用することができる。ある実施形態において、以下に限定されないが、１又は複数の非天然アミノ酸を含むタンパク質又はペプチドの親和性を利用した精製のためなど、非天然アミノ酸（又は非天然アミノ酸を含有するタンパク質）に対して作製された抗体を精製剤として使用する。望みどおり、ある程度又は均一になるまで精製した後、以下に限定されないがアッセイ成分、治療剤、予防剤、診断薬、実験用試薬及び／又は抗体産生のための免疫原などとして、ポリペプチドを多岐にわたる用途に場合によっては使用する。
【０５３６】
本明細書で示した他の参考文献に加えて、様々な精製／タンパク質フォールディング法が当技術分野で周知であり、これには、以下に限定されないが、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｎｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｓａｎｄａｎａ、（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｏｌｌａｇら、（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．第２版  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ、（１９９６）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，Ｈａｒｒｉｓ及びＡｎｇａｌ、（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ、Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｈａｒｒｉｓ及びＡｎｇａｌ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ、Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ、（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  第３版  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．；Ｊａｎｓｏｎ及びＲｙｄｅｎ、（１９８８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第２版、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、ＮＹ；及びＷａｌｋｅｒ（１９８８）、ＣＤ−ＲＯＭの、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ；及び上記文献で引用されている参考文献が含まれる。
【０５３７】
真核宿主細胞又は非真核宿主細胞での、非天然アミノ酸を有する関心のあるタンパク質又はポリペプチドの産生の長所の１つは、通常、ネイティブの立体構造においてタンパク質又はポリペプチドがフォールディングされているであろうことである。しかし、本発明のある一定の実施形態において、合成、発現及び／又は精製後、タンパク質又はペプチドが、適切なポリペプチドの所望の立体構造とは異なる立体構造を有し得ることを当業者は認識するであろう。本発明のある局面において、発現されたタンパク質又はポリペプチドを場合によっては変性させ、次いで再生する。以下に限定されないが、関心のあるタンパク質又はポリペプチドへのシャペロニンの添加によるもの、グアニジンＨＣｌなどのカオトロピック剤中でタンパク質を可溶化することによるもの、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼを利用することなど、当技術分野で公知の方法を利用してこれを行う。
【０５３８】
一般に、発現されたポリペプチドを変性させ還元し、次いで好ましい立体構造にポリペプチドをリフォールディングすることが望ましい場合がある。例えば、グアニジン、尿素、ＤＴＴ、ＤＴＥ及び／又はシャペロニンを関心のある翻訳産物に添加することができる。タンパク質を還元、変性及び再生する方法は、当業者にとって周知である（上記の参考文献及び、Ｄｅｂｉｎｓｋｉら、（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１４０６５−１４０７０；Ｋｒｅｉｔｍａｎ及びＰａｓｔａｎ（１９９３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，４：５８１−５８５；及びＢｕｃｈｎｅｒら、（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：２６３−２７０を参照のこと。）。例えば、Ｄｅｂｉｎｓｋｉらは、グアニジンＤＴＥ中での封入体タンパク質の変性及び還元を記載している。以下に限定されないが、酸化されたグルタチオン及びＬ−アルギニンなどを含有するレドックス緩衝液中でタンパク質をリフォールディングすることができる。リフォールディング剤を循環させるか、あるいは１もしくは複数のポリペプチド又はその他の発現産物と接触させるように移動させるか、又はその逆を行うことができる。
【０５３９】
ＢＳＰの原核生物産物の場合、このように産生されたＢＳＰをミスフォールディングさせて、生物活性を失わせるか又は低下させることができる。「リフォールディング」することにより、タンパク質の生物活性を復元し得る。一般に、例えば１又は複数のカオトロピック剤（例えば尿素及び／又はグアニジン）及びジスルフィド結合を還元することができる還元剤（例えば、ジチオスレイトール、ＤＴＴ又は２−メルカプトエタノール、２−ＭＥ）を用いて、ポリペプチド鎖を可溶化し（ＢＳＰがまた不溶性である場合）、フォールディングを解き、還元することにより、ミスフォ−ルドされたＢＳＰをリフォールディングする。カオトロ−プの中程度の濃度において、次いで酸化剤（例えば、酸素、シスチン又はシスタミン）を添加し、これにより、ジスルフィド結合を再形成させる。米国特許第４，５１１，５０２号、同第４，５１１，５０３号及び同第４，５１２，９２２号（本明細書中に参照により組み込む。）に記載の方法などの、当技術分野で公知の標準的方法を用いて、ＢＳＰをリフォールディングし得る。ＢＳＰを他のタンパク質と共フォールディングさせて、ヘテロ二量体又はヘテロ多量体を形成させることもできる。リフォールディング又は共フォールディング後、好ましくはＢＳＰをさらに精製する。
【０５４０】
一般的な精製方法
ＢＳＰを含む細胞溶解液に対して、又は何らかの単離段階（以下に限定されないが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）、逆相ＨＰＬＣ（「ＲＰ−ＨＰＬＣ」）、膨張層吸着又はそれらの何らかの組合せ及び／又は繰り返し（あらゆる適切な順番で）など。）の結果生じるあらゆるＢＳＰ混合物に対して、様々な単離段階のうち何れかを行い得る。
【０５４１】
本明細書中に記載の技術を行う際に使用する装置及びその他の必要な材料は市販されている。ポンプ、フラクションコレクター、モニター、レコーダー及びシステム全体は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）及びＡｍｅｒｓｈａｍ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手できる。以下に限定されないが、交換マトリックス材料、溶液及び緩衝液を含むクロマトグラフィーの材料もまた、このような会社から入手可能である。
【０５４２】
ポンプなどの特別に設計された装置を用いて、平衡化及び、洗浄及び溶出などの本明細書中に記載のカラムクロマトグラフィー過程におけるその他の段階をより迅速に行うことができる。市販のポンプとしては、以下に限定されないが、ＨＩＬＯＡＤ（Ｒ）ポンプＰ−５０、Ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ  Ｐｕｍｐ  Ｐ−１、Ｐｕｍｐ  Ｐ−９０１及びＰｕｍｐ  Ｐ−９０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。
【０５４３】
フラクションコレクターの例としては、ＲｅｄｉＦｒａｃフラクションコレクター、ＦＲＡＣ−１００及びＦＲＡＣ−２００フラクションコレクター及びＳＵＰＥＲＦＲＡＣ（Ｒ）フラクションコレクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。ミキサーはまた、ｐＨ及び直線的な濃度勾配を形成するために利用できる。市販されているミキサーとしては、Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｍｉｘｅｒ  ＧＭ−１及びＩｎ−Ｌｉｎｅ  Ｍｉｘｅｒｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。
【０５４４】
何らかの市販のモニターを使用してクロマトグラフィー過程をモニタリングし得る。このようなモニターを使用して、ＵＶ、ｐＨ及び伝導度などの情報を収集し得る。検出器の例としては、Ｍｏｎｉｔｏｒ  ＵＶ−１、ＵＶＴＣＯＲＤ（Ｒ）Ｓ  ＩＩ、Ｍｏｎｉｔｏｒ  ＵＶ−Ｍ  ＩＩ、Ｍｏｎｉｔｏｒ  ＵＶ−９００、Ｍｏｎｉｔｏｒ  ＵＰＣ−９００、Ｍｏｎｉｔｏｒ  ｐＨ／Ｃ９００及びＣｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。実際に、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）からの様々なＡＫＴＡ（Ｒ）システムをはじめ、全体的なシステムが市販されている。
【０５４５】
本発明のある実施形態において、例えば、得られた精製ＢＳＰを尿素中で最初に変性させ、次いで、適切なｐＨにて還元剤（ＤＴＴなど）を含むＴＲＩＳ緩衝液で希釈することにより、ＢＳＰを還元し、変性させ得る。別の実施形態において、約２Ｍから約９Ｍの間の濃度範囲の尿素中でＢＳＰを変性させ、次いで、約５．０から約８．０の範囲のｐＨにてＴＲＩＳ緩衝液中で希釈する。次に、この実施形態のリフォールディング混合液をインキュベートする。ある実施形態において、室温にて４時間から２４時間、リフォールディング混合液をインキュベートする。次いで、還元され変性したＢＳＰ混合液をさらに単離するか又は精製することができる。
【０５４６】
本明細書中で述べるように、何らかの以降の単離段階を行う前に、第一のＢＳＰ混合液のｐＨを調整し得る。さらに、当技術分野で公知の技術を用いて、第一のＢＳＰ混合液又は何らかのその後のそれらの混合物を濃縮し得る。さらに、当業者にとって周知である技術を用いて、第一のＢＳＰ混合物又は何らかのその後のそれらの混合物を含有する溶出緩衝液を、次の単離段階に適切な緩衝液に交換し得る。
【０５４７】
イオン交換クロマトグラフィー
ある実施形態において、及び任意のさらなる段階として、第一のＢＳＰ混合液に対してイオン交換クロマトグラフィーを行い得る。全般的に、Ｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８−１１１４−２１、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を参照のこと。市販されているイオン交換カラムとしては、ＨＩＴＲＡＰ（Ｒ）、ＨＩＰＲＥＰ（Ｒ）及びＨＩＬＯＡＤ（Ｒ）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。このようなカラムは、Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ及びＱ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）ＸＬなどの強力な陰イオン交換体；ＳＰ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＳＰ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ及びＳＰ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）ＸＬなどの強力な陽イオン交換体；ＤＥＡＥ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗなどの弱い陰イオン交換体；及びＣＭ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗなどの弱い陽イオン交換体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を利用する。精製段階の何れかの段階でＢＳＰに対して陰イオン又は陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを行い、実質的に精製されたＢＳＰを単離し得る。何らかの適切な陽イオン交換マトリクスを用いて、陽イオン交換クロマトグラフィー段階を行い得る。有用な陽イオン交換マトリクスとしては、以下に限定されないが、繊維状、多孔性、非多孔性、微小顆粒、ビーズ状又は架橋陽イオン交換マトリクス材料が挙げられる。このような陽イオン交換マトリクス材料としては、以下に限定されないが、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリスチレン、シリカ、ポリエーテル又は前出のものの何れかの混合物が挙げられる。
【０５４８】
陽イオン交換マトリクスは、強及び弱陽イオン交換体を含む、何らかの適切な陽イオン交換体であり得る。強い陽イオン交換体は、広範囲のｐＨにわたりイオン化したままであり、したがって、広範囲のｐＨにわたり、ＢＳＰを結合することが可能であり得る。しかし、弱い陽イオン交換体は、ｐＨに応じて、イオン化性を失い得る。例えば、弱い陽イオン交換体は、ｐＨが約４又は５以下に低下した場合、電荷を失い得る。適切な強い陽イオン交換体としては、以下に限定されないが、スルホプロピル（ＳＰ）、メチルスルホネ−ト（Ｓ）又はスルホエチル（ＳＥ）などの荷電した官能基が挙げられる。陽イオン交換マトリクスは、強い陽イオン交換体であり得、好ましくは、約２．５から約６．０のＢＳＰ結合ｐＨ範囲を有するものであり得る。あるいは、この強い陽イオン交換体は、約２．５から約５．５のＢＳＰ結合ｐＨ範囲を有し得る。この陽イオン交換マトリクスは、約３．０でＢＳＰ結合ｐＨ範囲をする強い陽イオン交換体であり得る。あるいは、この陽イオン交換マトリクスは、強い陽イオン交換体であり得、好ましくは、約６．０から約８．０のＢＳＰ結合ｐＨ範囲を有するものであり得る。この陽イオン交換マトリクスは、強い陽イオン交換体であり得、好ましくは、約８．０から約１２．５のＢＳＰ結合ｐＨ範囲を有するものであり得る。あるいは、強い陽イオン交換体は、約８．０から約１２．０のＢＳＰ結合ｐＨ範囲を有し得る。
【０５４９】
ＢＳＰを載せる前に、例えば、希釈弱酸の数カラム体積、例えば２０ｍＭ酢酸、ｐＨ３の４カラム体積を用いて、陽イオン交換マトリクスを平衡化し得る。平衡化した後、ＢＳＰを添加し得、実質的に精製されたＢＳＰを溶出する前に、また弱い酢酸などの弱酸溶液又はリン酸溶液を用いて、カラムを１回から数回洗浄し得る。例えば、２０ｍＭ酢酸、ｐＨ３のおよそ２から４カラム体積を使用して、カラムを洗浄し得る。例えば０．０５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５又は、０．１Ｍ塩化ナトリウムと混合した０．０５Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．５の２から４カラム体積を使用して、さらなる洗浄を行うことができる。あるいは、当技術分野で公知の方法により、希釈した弱塩基数カラム体積を用いて、陽イオン交換マトリクスを平衡化し得る。
【０５５０】
あるいは、十分に低いｐＨ又はイオン強度の緩衝液と陽イオン交換マトリクスを接触させてマトリクスからＢＳＰを排除することにより、実質的に精製されたＢＳＰを溶出し得る。溶出緩衝液のｐＨは、約ｐＨ２．５から約ｐＨ６．０であり得る。とりわけ、溶出緩衝液のｐＨは、約ｐＨ２．５から約ｐＨ５．５、約ｐＨ２．５から約ｐＨ５．０の範囲であり得る。溶出緩衝液のｐＨは、約３．０であり得る。さらに、溶出緩衝液の量は様々であり得、一般に、約２から約１０カラム体積の範囲である。
【０５５１】
ＢＳＰを陽イオン交換マトリクスに吸着させた後、十分に高いｐＨ又はイオン強度の緩衝液とそのマトリクスを接触させてマトリクスからＢＳＰを排除することにより、実質的に精製されたＢＳＰポリペプチドを溶出し得る。十分に精製されたＢＳＰの高ｐＨ溶出での使用に適切な緩衝液としては、以下に限定されないが、少なくとも約５ｍＭから少なくとも約１００ｍＭの濃度範囲の、クエン酸、リン酸、ギ酸、酢酸、ＨＥＰＥＳ及びＭＥＳ緩衝液が含まれ得る。
【０５５２】
逆相クロマトグラフィー
当業者にとって公知の適切なプロトコールに従い、ＲＰ−ＨＰＬＣを行って、タンパク質を精製し得る。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８２）１２４：２１７−２３０（１９８２）；Ｒｉｖｉｅｒら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．（１９８３）２６８：１１２−１１９；Ｋｕｎｉｔａｎｉら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．（１９８６）３５９：３９１−４０２を参照のこと。ＢＳＰに対してＲＰ−ＨＰＬＣを行って、実質的に精製されたＢＳＰを単離し得る。この場合、以下に限定されないが、少なくとも約Ｃ３から少なくとも約Ｃ３０、少なくとも約Ｃ３から少なくとも約Ｃ２０又は少なくとも約Ｃ３から少なくとも約Ｃ１８など、様々な長さのアルキル官能基によるシリカ誘導体化樹脂を使用し得る。あるいは、ポリマー性樹脂を使用し得る。例えば、ＴｏｓｏＨａａｓ  Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ  ＣＧ１０００ｓｄ樹脂を使用し得る（これは、スチレンポリマー樹脂である。）。様々なアルキル鎖長を有するシアノ又はポリマー性樹脂も使用し得る。さらに、エタノールなどの溶媒を用いて、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムを洗浄し得る。ＳｏｕｒｃｅＲＰカラムは、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムの別の例である。
【０５５３】
イオン対合剤及びメタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、アセトニトリル又はエタノールなどの有機変性剤を含有する適切な溶出緩衝液を使用して、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムからＢＳＰを溶出し得る。最も一般的に使用されるイオン対合剤としては、以下に限定されないが、酢酸、ギ酸、過塩素酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、ヘプタフルオロ酪酸、トリエチルアミン、テトラメチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム及び酢酸トリエチルアンモニウムが挙げられる。分離時間を短くし、ピーク幅を狭めるのに好ましい勾配条件を用い、１又は複数の勾配もしくは定組成条件を用いて、溶出を行い得る。別の方法は、異なる溶媒濃度範囲の２種類の勾配を使用することを含む。本明細書中での使用に適切な溶出緩衝液の例としては、以下に限定されないが、酢酸アンモニウム及びアセトニトリル溶液が挙げられる。
【０５５４】
疎水性相互作用クロマトグラフィー精製技術
ＢＳＰに対して疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を行い得る。全般的に、Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８−１０２０−９０、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））を参照のこと（本明細書中に参照により組み込む。）。適切なＨＩＣマトリクスとしては、以下に限定されないが、アガロース、架橋アガロース、セファロース、セルロース、シリカ、デキストラン、ポリスチレン、ポリ（メタクリレート）マトリクス及び混合形態の樹脂（以下に限定されないが、ポリエチレンアミン樹脂又はブチルもしくはフェニル置換ポリ（メタクリレート）マトリクスなど。）を含む、アルキル又はアリール置換マトリクス、例えばブチル、ヘキシル、オクチル又はフェニル置換マトリクスなどがある。疎水性相互作用カラムクロマトグラフィーのための市販ソースとしては、以下に限定されないが、ＨＩＴＲＡＰ（Ｒ）、ＨＩＰＥＲ（Ｒ）及びＨＩＬＯＡＤ（Ｒ）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。
【０５５５】
簡単に述べると、酢酸／塩化ナトリウム溶液又は硫酸アンモニウム含有ＨＥＰＥＳなどの、当業者にとって公知の標準的緩衝液を用いて、試料添加前にＨＩＣカラムを平衡化し得る。ＢＳＰを添加した後、次に、標準的緩衝液及び条件を用いてカラムを洗浄し、不必要な物質を除去（しかし、ＢＳＰはＨＩＣカラムに保持し続ける。）する。特に、ＥＤＴＡ及び硫酸アンモニウム（平衡化緩衝液より低濃度）を含有するＨＥＰＥＳ緩衝液又は酢酸／塩化ナトリウム緩衝液などの標準的緩衝液約３から約１０カラム体積でＢＳＰを溶出し得る。例えばリン酸カリウム勾配を用いて、塩濃度を直線的に低下させる勾配を使用して、ＢＳＰ分子を溶出することもできる。次に、例えばダイアフィルトレーション又は限外ろ過などのろ過により、溶出物を濃縮する。ダイアフィルトレーションを利用して、ＢＳＰを溶出するために用いた塩を除去し得る。
【０５５６】
他の精製技術
例えば、ゲルろ過（Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８−１０２２−１８、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）（本明細書中に参照により組み込む。）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（以下に限定されないが、ＨＡ−Ｕｌｔｒｏｇｅｌ、Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ＣＨＴ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ（ＢｉｏＲａｄ）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  ＨＴＰヒドロキシアパタイト（ＢｉｏＲａｄ）などの、適切なマトリクス）、ＨＰＬＣ、膨張層吸着、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、凍結乾燥などを用いて、第一のＢＳＰ混合物又は何らかのその後のそれらの混合物に対してさらに別の単離段階を行い、あらゆる過剰な塩を除去し、緩衝液を次の単離段階もしくは最終製剤の処方にも適した緩衝液で置換することができる。
【０５５７】
当業者にとって公知の技術を用いて、本明細書中で記載の各段階で、実質的に精製されたＢＳＰを含むＢＳＰの収率をモニタリングし得る。最後の単離段階後に、このような技術を用いて、実質的に精製されたＢＳＰの収率を評価することもできる。例えば、シアノＲＰ−ＨＰＬＣ、Ｃ１８ＲＰ−ＨＰＬＣ；ならびに陽イオン交換ＨＰＬＣ及びゲルろ過ＨＰＬＣなどの、様々なアルキル鎖長を有する種々の逆相高圧液体クロマトグラフィーカラムの何れかを用いて、ＢＳＰの収率をモニタリングし得る。
【０５５８】
本発明の具体的な実施形態において、各精製段階後のＢＳＰの収率は、各精製段階の出発物質中のＢＳＰの、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％又は少なくとも約９９．９９％であり得る。
【０５５９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの標準的技術を用いて、又はウェスタンブロット及びＥＬＩＳＡアッセイを用いてＢＳＰを測定することにより、純度を決定し得る。例えば、ネガティブ対照の酵母発酵及び陽イオン交換回収から単離したタンパク質に対してポリクローナル抗体を生成させ得る。この抗体を使用して、混入宿主細胞タンパク質の存在を調べることもできる。
【０５６０】
ＲＰ−ＨＰＬＣ物質、Ｖｙｄａｃ  Ｃ４（Ｖｙｄａｃ）は、シリカゲル粒子、Ｃ４−アルキル鎖を有する表面からなる。疎水性相互作用の強度の相違に基づき、ＢＳＰがタンパク質性不純物から分離される。希釈トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配を用いて溶出を行う。ステンレス鋼カラムを用いて分取ＨＰＬＣを行う（Ｖｙｄａｃ  Ｃ４シリカゲル２．８から３．２Ｌで満たす。）。トリフルオロ酢酸を添加することにより、Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｕｌｔｒｏｇｅｌ溶出液を酸性化し、Ｖｙｄａｃ  Ｃ４カラムに添加する。洗浄及び溶出のために、希釈トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配を用いる。分画を回収し、すぐにリン酸緩衝液で中和する。ＩＰＣ限界内のＢＳＰ分画をプールする。
【０５６１】
ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）物質は、セファロースビーズの表面に共有結合するジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基から構成される。ＤＥＡＥ基へのＢＳＰの結合は、イオン性相互作用を介する。保持されることなく、アセトニトリル及びトリフルオロ酢酸がカラムを通過する。これらの物質を洗い流した後、低ｐＨの酢酸緩衝液でカラムを洗浄することにより、微量の不純物を除去する。次に、このカラムを中性リン酸緩衝液で洗浄し、イオン強度が上昇していく緩衝液を用いてＢＳＰを溶出する。カラムにＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  ｆｌｏｗを充填する。３から１０ｍｇＢＳＰポリペプチド／ｍｌゲルの範囲でＢＳＰを添加することができるようにするために、カラム体積を調整する。水及び平衡化緩衝液（リン酸ナトリウム／カリウム）でカラムを洗浄する。ＨＰＬＣ溶出の分画を集めたものを添加し、カラムを平衡化緩衝液で洗浄する。次に、カラムを洗浄緩衝液（酢酸ナトリウム緩衝液）で洗浄し、続いて平衡化緩衝液で洗浄する。続いて、溶出緩衝液（塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム／カリウム）を用いてカラムからＢＳＰを溶出し、主たる溶出プロファイルに従い、１個の分画において回収を行う。ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムの溶出液を指定の伝導度に調整する。得られた製剤原料をろ過滅菌してＴｅｆｌｏｎボトルに入れ、−７０℃で保管する。
【０５６２】
利用し得るさらなる方法としては、以下に限定されないが、エンドトキシンを除去する段階が挙げられる。エンドトキシンは、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．コリ、大腸菌）などのグラム陰性宿主細胞の外膜に位置するリポ多糖類（ＬＰＳ）である。エンドトキシンレベルを低下させる方法は当業者にとって公知であり、これには、以下に限定されないが、シリカ支持体、ガラス粉末又はヒドロキシアパタイトを用いた精製技術、逆相、アフィニティー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、これらの方法の組合せなどが含まれる。一緒に移動したタンパク質などの不純物を関心のあるポリペプチドから除去するために、変法又はさらなる方法が必要である可能性がある。
【０５６３】
以下に限定されないが、ブラッドフォードアッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、マススペクトロメトリー（以下に限定されないが、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを含む。）及び当業者にとって公知の、タンパク質の特徴を調べるためのその他の方法など、多岐にわたる方法及び手段を使用して、１又は複数の非天然コードアミノ酸を含有するＢＳＰの収率及び純度を評価することができる。
【０５６４】
本発明の異種融合タンパク質の特性決定
本発明の融合タンパク質を特製するために、数多くの方法が存在する。これらの方法の幾つかには、タンパク質染色法又は抗ＩｇＧ又は抗ＨＳＡ抗体を用いたイムノブロッティングと組み合わせたＳＤＳ−ＰＡＧＥが含まれるが、これらに限定されない。他の方法には、例えば、マトリックス支援レ−ザ−脱離／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、液体クロマトグラフィー／質量分析、等電点電気泳動、分析的陰イオン交換、クロマトフォ−カシング及び円二色性が含まれる。
【０５６５】
ＶＩＩＩ．代替系での発現
非組み換え宿主細胞、突然変異誘発宿主細胞又は細胞を使用しない系においてタンパク質に非天然アミノ酸を導入するために、いくつかのストラテジーが利用されてきた。これらの系はまた、本発明のＢＳＰの作製での使用にも適切である。Ｌｙｓ、Ｃｙｓ及びＴｙｒなどの反応性側鎖によるアミノ酸の誘導体化により、リジンがＮ２−アセチル−リジンに変換される。化学合成によっても、非天然アミノ酸を取り込む直接的な方法が得られる。ペプチド断片の、酵素的ライゲーション及びネイティブ化学ライゲーションの最近の開発により、より大きなタンパク質を調製することが可能である。例えば、Ｐ．Ｅ．Ｄａｗｓｏｎ及びＳ．Ｂ．Ｈ．Ｋｅｎｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６９：９２３（２０００）。１００を超える非天然アミノ酸を実際にあらゆるサイズの様々なタンパク質へ部位特異的に取り込むために、所望の非天然アミノ酸により化学的にアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを、タンパク質生合成に対応可能なインビトロ抽出物に添加するという一般的なインビトロ生合成法が使用されてきた。例えば、Ｖ．Ｗ．Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｄ．Ｍｅｎｄｅｌ及びＰ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，１９９５、３４：６２１（１９９５）；Ｃ．Ｊ．Ｎｏｒｅｎ，ＳＪ．Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｍ．Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１８２−１８８（１９８９）；及びＪ．Ｄ．Ｂａｉｎ、ＣＧ．Ｇｌａｂｅ，Ｔ．Ａ．Ｄｉｘ，Ａ．Ｒ．Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ，Ｅ．Ｓ．Ｄｉａｌａ、Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：８０１３−８０１４（１９８９）を参照のこと。タンパク質安定性、タンパク質フォールディング、酵素機構及びシグナル伝達の研究のために、様々な官能基がタンパク質に導入されてきた。
【０５６６】
野生型シンテターゼの乱雑性（ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ）を利用するために、選択圧取り込みと呼ばれるインビボ法が開発された。例えば、Ｎ．Ｂｕｄｉｓａ、Ｃ．Ｍｉｎｋｓ、Ｓ．Ａｌｅｆｅｌｄｅｒ、Ｗ．Ｗｅｎｇｅｒ、Ｆ．Ｍ．Ｄｏｎｇ、Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒ及びＲ．Ｈｕｂｅｒ、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，１３：４１（１９９９）を参照のこと。天然アミノ酸の限定濃度を含有する最小培地で、特定の天然アミノ酸を細胞に供給する関連代謝経路のスイッチがオフになっている栄養要求性株を増殖させ、同時に標的遺伝子の転写を抑制する。定常増殖期の開始時に、天然アミノ酸をなくし、非天然アミノ酸類似体で置き換える。組み換えタンパク質発現の誘発により、非天然類似体を含有するタンパク質の蓄積が起こる。例えば、このストラテジーを用いて、ｏ、ｍ及びｐ−フルオロフェニルアラニンをタンパク質に取り込み、容易に同定できる、ＵＶスペクトルの２つの特徴的な肩が示され（例えば、Ｃ．Ｍｉｎｋｓ、Ｒ．Ｈｕｂｅｒ，Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒ及びＮ．Ｂｕｄｉｓａ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２８４：２９（２０００）を参照。）；トリフルオロメチオニンを使用して、バクテリオファージＴ４ライソザイムにおいてメチオニンを置換し、１９Ｆ  ＮＭＲによりチトオリゴ糖リガンドとのその相互作用が調べられ（例えば、Ｈ．Ｄｕｅｗｅｌ，Ｅ．Ｄａｕｂ，Ｖ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ及びＪ．Ｆ．Ｈｏｎｅｋ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：３４０４（１９９７）；及びトリフルオロロイシンをロイシンの代わりに取り込み、その結果、ロイシンジッパータンパク質の温度及び化学安定性が高まった。例えば、Ｙ．Ｔａｎｇ、Ｇ．Ｇｈｉｒｌａｎｄａ、Ｗ．Ａ．Ｐｅｔｋａ、Ｔ．Ｎａｋａｊｉｍａ、Ｗ．Ｆ．ＤｅＧｒａｄｏ及びＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，４０：１４９４（２００１）を参照のこと。さらに、セレノメチオニン及びテルロメチオニンを様々な組み換えタンパク質に取り込み、Ｘ線結晶解析での相の溶解を促進させる。例えば、Ｗ．Ａ．Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ、Ｊ．Ｒ．Ｈｏｒｔｏｎ及びＤ．Ｍ．Ｌｅｍａｓｔｅｒ，ＥＭＢＯ  Ｊ．，９：１６６５（１９９０）；Ｊ．Ｏ．Ｂｏｌｅｓ，Ｋ．Ｌｅｗｉｎｓｋｉ、Ｍ．Ｋｕｎｋｅｌ、Ｊ．Ｄ．Ｏｄｏｍ、Ｂ．Ｄｕｎｌａｐ、Ｌ．Ｌｅｂｉｏｄａ及びＭ．Ｈａｔａｄａ、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１：２８３（１９９４）；Ｎ．Ｂｕｄｉｓａ、Ｂ．Ｓｔｅｉｐｅ、Ｐ．Ｄｅｍａｎｇｅ、Ｃ．Ｅｃｋｅｒｓｋｏｒｎ、Ｊ．Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ及びＲ．Ｈｕｂｅｒ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３０：７８８（１９９５）；及びＮ．Ｂｕｄｉｓａ、Ｗ．Ｋａｒｎｂｒｏｃｋ、Ｓ．Ｓｔｅｉｎｂａｃｈｅｒ、Ａ．Ｈｕｍｍ、Ｌ．Ｐｒａｄｅ、Ｔ．Ｎｅｕｅｆｅｉｎｄ、Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒ及びＲ．Ｈｕｂｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：６１６（１９９７）を参照のこと。アルケン又はアルキン官能基を有するメチオニン類似体もまた効率的に取り込まれ、これにより、化学的手段によるタンパク質のさらなる修飾が可能となった。例えば、。Ｊ．Ｃ．ｖａｎ  Ｈｅｓｔ及びＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ、ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．，４２８：６８（１９９８）；Ｊ．Ｃ．Ｍ．ｖａｎＨ���ｓｔ、Ｋ．Ｌ．Ｋｉｉｃｋ及びＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：１２８２（２０００）；及びＫ．Ｌ．Ｋｉｉｃｋ及びＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５６：９４８７（２０００）；米国特許第６，５８６，２０７号；米国特許公開２００２／００４２０９７（本明細書中に参照により組み込む。）を参照のこと。
【０５６７】
この方法の成功は、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼによる非天然アミノ酸類似体の認識に依存し、一般に、これにはタンパク質翻訳の忠実度を確実にする高い選択性が必要である。本方法の範囲を広げるある方法は、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの基質特異性を緩めることであり、これが遂行されたのは限られたケ−スである。例えば、Ｅ．コリのフェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＰｈｅＲＳ）においてＡｌａ２９４をＧｌｙで置換することにより、基質結合ポケットが大きくなり、その結果、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン（ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ）によるｔＲＮＡＰｈｅのアシル化が起こる。Ｍ．Ｉｂｂａ、Ｐ．Ｋａｓｔ及びＨ．Ｈｅｎｎｅｃｋｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３：７１０７（１９９４）を参照のこと。この突然変異ＰｈｅＲＳを有するＥ．コリ株により、フェニルアラニンの代わりに、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン又はｐ−Ｂｒ−フェニルアラニンの取り込みが可能となる。例えば、Ｍ．Ｉｂｂａ及びＨ．Ｈｅｎｎｅｃｋｅ、ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．３６４：２７２（１９９５）；及びＮ．Ｓｈａｒｍａ、Ｒ．Ｆｕｒｔｅｒ、Ｐ．Ｋａｓｔ及びＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ、ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．，４６７：３７（２０００）を参照のこと。同様に、Ｅ．コリのチロシル−ｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合部位付近の点突然変異Ｐｈｅ１３０Ｓｅｒにより、アザチロシンがチロシンよりも効率的に取り込まれることが分かった。Ｆ．Ｈａｍａｎｏ−Ｔａｋａｋｕ、Ｔ．Ｉｗａｍａ、Ｓ．Ｓａｉｔｏ−Ｙａｎｏ、Ｋ．Ｔａｋａｋｕ、Ｙ．Ｍｏｎｄｅｎ、Ｍ．Ｋｉｔａｂａｔａｋｅ、Ｄ．Ｓｏｉｌ及びＳ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：４０３２４（２０００）を参照のこと。
【０５６８】
非天然アミノ酸をタンパク質にインビボで取り込むための別のストラテジーは、校正機構を有するシンテターゼを改変することである。これらのシンテターゼは選別することができず、したがって、同種の天然アミノ酸と構造的に類似のアミノ酸を活性化する。このエラーは別の部位で補正され、タンパク質翻訳の忠実度を維持するために、ｔＲＮＡからのミスチャージアミノ酸が脱アシル化される。シンテターゼの校正活性が機能しない場合、間違って活性化された構造類似体が校正機能を逃れ、取り込まれる。バリル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＶａｌＲＳ）により、このアプローチが近年明らかにされた。Ｖ．Ｄｏｒｉｎｇ、Ｈ．Ｄ．Ｍｏｏｔｚ、Ｌ．Ａ．Ｎａｎｇｌｅ、Ｔ．Ｌ．Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ、Ｖ．ｄｅ  Ｃｒｅｃｙ−Ｌａｇａｒｄ、Ｐ．Ｓｃｈｉｍｍｅｌ及びＰ．Ｍａｒｌｉｅｒｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９２：５０１（２００１）を参照のこと。ＶａｌＲＳは、ｔＲＮＡＶａｌをＣｙｓ、Ｔｈｒ又はアミノブチレート（Ａｂｕ）で間違ってアミノアシル化し得；続いて、校正ドメインによりこれらの非同種アミノ酸を加水分解する。Ｅ．コリ染色体のランダム突然変異誘発後、ＶａｌＲＳの校正部位に突然変異のある突然変異Ｅ．コリ株を選択する。この校正機能欠失ＶａｌＲＳは、ＣｙｓによりｔＲＮＡＶａｌを不正確に処理する。Ａｂｕは立体的にＣｙｓに類似しているので（Ｃｙｓの−ＳＨ基はＡｂｕにおいて−ＣＨ３に置き換えられる。）、この突然変異Ｅ．コリ株をＡｂｕ存在下で増殖させた場合、突然変異ＶａｌＲＳもまたタンパク質にＡｂｕを取り込む。マススペクトロメトリー分析から、ネイティブタンパク質中の各バリン位置においてバリンの約２４％がＡｂｕにより置換されることが示される。
【０５６９】
固相合成及び半合成法によってもまた、新規アミノ酸を含有する多くのタンパク質の合成が可能となる。例えば、次のようなものである、次の刊行物及びそこで引用されている参考文献を参照のこと：Ｃｒｉｃｋ，Ｆ．Ｊ．Ｃ．，Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｌ．，Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ．，Ｗａｔｔｓ−Ｔｏｂｉｎ，Ｒ．，Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ、１９２：１２２７−１２３２（１９６１）；Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｋ．，Ｂｏｈｎ，Ｈ．Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＸＸＸＶＩ．Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｙｒａｚｏｌｅ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓ−ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ａｎ  Ｓ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．８８（２４）：５９１４−５９１９（１９６６）；Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ，Ａｃｅ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ，２２：４７−５４（１９８９）；Ｎａｋａｔｓｕｋａ，Ｔ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．，Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ  ｔｈｉｏｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９：３８０８−３８１０（１９８７）；Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍ．，Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｄｏｖｅｔａｉｌｉｎｇ  ｕｎｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｂａｃｋｂｏｎｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＨＩＶ  ｐｒｏｔｅａｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６（５０５４）：２２１−２２５（１９９２）；Ｃｈａｉｋｅｎ，Ｉ．Ｍ．Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１（３）：２５５−３０１（１９８１）；Ｏｆｆｏｒｄ，Ｒ．Ｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｙ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅａｎｓ？ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，１（３）：１５１−１５７（１９８７）；及びＪａｃｋｓｏｎ，Ｄ．Ｙ．，Ｂｕｒｎｉｅｒ，Ｊ．Ｑｕａｎ，Ｃ．，Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｍ．，Ｔｏｍ，Ｊ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．Ａ  Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｓｅｆｏｒ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｅｈｓｉｓ  ｏｆ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ａ  ｗｉｔｈ  ｎｏｎｎａｔｕｒａｌ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６（５１８３）：２４３（１９９４）
インビトロでタンパク質に共同因子、スピン標識及びオリゴヌクレオチドなどの様々な非天然側鎖を導入するために、化学修飾が使用されてきた。例えば、Ｃｏｒｅｙ，Ｄ．Ｒ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｙｂｒｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８（４８３２）：１４０１−１４０３（１９８７）；Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｄ．Ｓ．，Ｒｏｋｉｔａ，Ｓ．Ｅ．Ｔｈｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，５４：５６５−５９５（１９８５）；Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｄ．Ｓ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２６（４６７４）：５０５−５１１（１９８４）；Ｎｅｅｔ，Ｋ．Ｅ．，Ｎａｎｃｉ  Ａ，Ｋｏｓｈｌａｎｄ，Ｄ．Ｅ．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｉｏｌ−ｓｕｂｓｔｉｌｉｓｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３（２４）：６３９２−６４０１（１９６８）；Ｐｏｌｇａｒ，Ｌ．Ｂ．，Ｍ．Ｌ．Ａ  ｎｅｗ  ｅｎｚｙｍｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｌｌｙ  ｆｏｒｍｅｄ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ．Ｔｈｉｏｌ−ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ．Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，８８：３１５３−３１５４（１９６６）；及びＰｏｌｌａｃｋ，Ｓ．Ｊ．，Ｎａｋａｙａｍａ，Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅｓ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎｔｏ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２（４８８１）：１０３８−１０４０（１９８８）を参照のこと。
【０５７０】
あるいは、いくつかの生物物理学的プローブをインビトロで合成されたタンパク質に取り込むために、化学的修飾アミノアシル−ｔＲＮＡを用いる生合成法が使用されてきた。例えば、次のようなものである、次の刊行物及びそこで引用されている参考文献を参照のこと：Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｊ．Ｎｅｗ  Ｐｈｏｔｏｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｉｏｃｈｅｍ，６２：４８３−５１４（１９９３）；及びＫｒｉｅｇ，Ｕ．Ｃ．，Ｗａｌｔｅｒ，Ｐ．，Ｈｏｈｎｓｏｎ，Ａ．Ｅ．Ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｎａｓｃｅｎｔ  ｐｒｅｐｒｏｌａｃｔｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ５４−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８３（２２）：８６０４−８６０８（１９８６）。
【０５７１】
以前、所望のアンバーナンセンス突然変異を含有する遺伝子を用いてプログラムされたタンパク質合成反応に化学的アミノアシル化サプレッサーｔＲＭＡを加えることにより、非天然アミノ酸がインビトロでタンパク質に部位特異的に取り込まれ得ることが示された。これらのアプローチを用いて、特定のアミノ酸に対して栄養要求性である株を使用し、多くの一般的な２０種類のアミノ酸を構造が近いホモローグで、例えばフェニルアラニンに対してフルオロフェニルアラニンで、置換することができる。例えば、Ｎｏｒｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｍ．Ｃ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１８２−１８８（１９８９）；Ｍ．Ｗ．Ｎｏｗａｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６８：４３９−４２（１９９５）；Ｂａｉｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｇｌａｂｅ，Ｃ．Ｇ．，Ｄｉｘ，Ｔ．Ａ．，Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ，Ａ．Ｒ．，Ｄｉａｌａ、Ｅ．Ｓ．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，１１１：８０１３−８０１４（１９８９）；Ｎ．Ｂｕｄｉｓａら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１３：４１−５１（１９９９）；Ｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｍｅｎｄｅｌ，Ｄ．，Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｓ．，Ｎｏｒｅｎ，ＣＪ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚ．，ｖｏｌ．２０２  ３０１−３３６（１９９２）；及びＭｅｎｄｅｌ，Ｄ．，Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｖ．Ｗ．及びＳｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．２４、４３５−６２（１９９５）を参照のこと。
【０５７２】
例えば、停止コドンＵＡＧを認識するサプレッサーｔＲＮＡを調製し、非天然アミノ酸を用いて化学的にアミノアシル化した。従来の部位特異的突然変異誘発を使用して、タンパク質遺伝子の関心のある部位に停止コドンＴＡＧを導入した。例えば、Ｓａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｗ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．５’，３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１６（３）：７９１−８０２（１９８８）を参照のこと。アシル化サプレッサーｔＲＮＡ及び突然変異遺伝子をインビトロ転写／翻訳系において組合せた場合、指定の位置にそのアミノ酸を含有するタンパク質を与えるＵＡＧコドンに反応して非天然アミノ酸が取り込まれた。［３Ｈ］−Ｐｈｅを用いた実験及びα−ヒドロキシ酸を用いた実験から、所望するアミノ酸のみがＵＡＧコドンにより指定された位置に取り込まれ、このアミノ酸がタンパク質の他の何れの位置にも取り込まれないことが分かった。例えば、Ｎｏｒｅｎら、前出；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０（６）：４２５−４３２；及びＥｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｍｅｎｄｅｌ，Ｄ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５（５０４１）：１９７−２００（１９９２）を参照のこと。
【０５７３】
非天然アミノ酸をタンパク質に取り込むために、マイクロインジェクション技術も使用されてきた。例えば、Ｍ．Ｗ．Ｎｏｗａｋ、Ｐ．Ｃ．Ｋｅａｒｎｅｙ、Ｊ．Ｒ．Ｓａｍｐｓｏｎ、Ｍ．Ｅ．Ｓａｋｓ、Ｃ．Ｇ．Ｌａｂａｒｃａ、Ｓ．Ｋ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ、Ｗ．Ｇ．Ｚｈｏｎｇ、Ｊ．Ｔｈｏｒｓｏｎ、Ｎ．Ｊ．Ａｂｅｌｓｏｎ、Ｎ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ、Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ及びＨ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：４３９（１９９５）；及びＤ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６４５（２０００）を参照のこと。インビトロで調製した２種類のＲＮＡ種（関心のあるアミノ酸位置にＵＡＧ停止コドンを有する標的タンパク質をコードするｍＲＮＡ及び所望の非天然アミノ酸でアミノアシル化したアンバーサプレッサーｔＲＮＡ）をアフリカツメガエル卵母細胞に同時に注入した。次に、卵母細胞の翻訳機構は、ＵＡＧにより指定される位置に非天然アミノ酸を挿入する。この方法により、膜内在性タンパク質のインビボ構造−機能研究が可能となった（これは、通常、インビトロ発現系に反応しない。）。一例としては、蛍光共鳴エネルギー移動により距離を測定するための蛍光アミノ酸のタキキニンニューロキニン−２受容体への取り込み（例えば、Ｇ．Ｔｕｒｃａｔｔｉ、Ｋ．Ｎｅｍｅｔｈ、Ｍ．Ｄ．Ｅｄｇｅｒｔｏｎ、Ｕ．Ｍｅｓｅｔｈ、Ｆ．Ｔａｌａｂｏｔ、Ｍ．Ｐｅｉｔｓｃｈ、Ｊ．Ｋｎｏｗｌｅｓ、Ｈ．Ｖｏｇｅｌ及びＡ．Ｃｈｏｌｌｅｔ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１９９９１（１９９６）を参照。）；イオンチャネルにおいて表面で曝露された残基を同定するためのビオチン化アミノ酸の取り込み（例えば、Ｊ．Ｐ．Ｇａｌｌｉｖａｎ、Ｈ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ及びＤ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：７３９（１９９７）を参照。）；イオンチャネルにおける立体構造変化をリアルタイムでモニタリングするためのケ−ジドチロシン類似体の使用（例えば、Ｊ．Ｃ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ｓ．Ｋ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｍ．Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ及びＨ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ、Ｎｅｕｒｏｎ、２０：６１９（１９９８）；及びそれらのゲ−ティング機構を調べるためにイオンチャネル骨格を変化させるためのαヒドロキシアミノ酸の使用が挙げられる。例えば、Ｐ．Ｍ．Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｙ．Ｚｈａｎｇ，Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ及びＨ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ，Ｃｅｌｌ、９６：８９（１９９９）；及びＴ．Ｌｕ、Ａ．Ｙ．Ｔｉｎｇ、Ｊ．Ｍａｉｎｌａｎｄ、Ｌ．Ｙ．Ｊａｎ、Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ及びＪ．Ｙａｎｇ、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，４：２３９（２００１）を参照のこと。
【０５７４】
インビボでタンパク質に非天然アミノ酸を直接取り込むことができることから、突然変異タンパク質の収率が高くなること、技術が容易であること、及び細胞もしくは可能であれば生きている生物での突然変異タンパク質の研究の可能性、ならびに、治療処置でのこれらの突然変異タンパク質の使用といった長所が得られる。様々な大きさ、酸性度、求核性、疎水性及びその他の特性を有する非天然アミノ酸をタンパク質に含有させることができれば、タンパク質機能を調べ、かつ新規の特性を有する新しいタンパク質又は生物を作製するための、タンパク質構造に対する合理的かつ体系的な操作能が飛躍的に拡大し得る。しかし、タンパク質翻訳における忠実度を高くするために必要とされるｔＲＮＡ−シンテターゼ相互作用の複雑な特性のために、このプロセスは困難である。
【０５７５】
部位特異的にパラ−Ｆ−Ｐｈｅを取り込むある試みにおいて、ｐ−Ｆ−Ｐｈｅ耐性の、Ｐｈｅ栄養要求性Ｅ．コリ株で、酵母アンバーサプレッサーｔＲＮＡ  ＰｈｅＣＵＡ／フェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼペアが使用された。例えば、Ｒ．Ｆｕｒｔｅｒ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，７：４１９（１９９８）を参照のこと。
【０５７６】
細胞を使用しない（インビトロ）翻訳系を用いて本発明のＢＳＰの発現を達成することも可能である。テンプレートとしてのｍＲＭＡ（インビトロ翻訳）又はテンプレートとしてのＤＮＡ（インビトロ転写及び翻訳の組合せ）の何れかを含み得るこれらの系において、インビトロ合成はリボソームにより導かれる。細胞を使用しないタンパク質発現系の開発に対して多大な努力が行われてきた。例えば、Ｋｉｍ，Ｄ．−Ｍ．及びＪ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７４：３０９−３１６（２００１）；Ｋｉｍ，Ｄ．−Ｍ．及びＪ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２２，１５３７−１５４２（２０００）；Ｋｉｍ，Ｄ．−Ｍ．及びＪ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，１６，３８５−３９０（２０００）；Ｋｉｍ，Ｄ．−Ｍ．及びＪ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、６６，１８０−１８８（１９９９）；及びＰａｔｎａｉｋ，Ｒ．及びＪ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４、８６２−８６８（１９９８）；米国特許第６，３３７，１９１号；米国特許公開２００２／００８１６６０；ＷＯ００／５５３５３；ＷＯ９０／０５７８５（本明細書中に参照により組み込む。）を参照のこと。非天然コードアミノ酸を含有するＢＳＰの発現に対して適用し得る別のアプローチとしては、ｍＲＮＡ−ペプチド融合技術が挙げられる。例えば、Ｒ．Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＪ．Ｓｚｏｓｔａｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９４：１２２９７−１２３０２（１９９７）；Ａ．Ｆｒａｎｋｅｌら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：１０４３−１０５０（２００３）を参照のこと。このアプローチにおいて、ピュ−ロマイシンに連結しているｍＲＮＡテンプレートがリボソーム上でペプチドに翻訳される。１又は複数のｔＲＮＡ分子が改変されている場合、その上非天然アミノ酸をそのペプチドに取り込ませることができる。最後のｍＲＮＡコドンが読まれた後、ピュ−ロマイシンがペプチドのＣ末端を捕獲する。生じたｍＲＮＡ−ペプチド抱合体が関心のある特性を有することがインビトロアッセイにおいて分かった場合、ｍＲＮＡ配列からそれが何であるかを容易に明らかにすることができる。このようにして、１又は複数の非天然コードアミノ酸を含有するＢＳＰのライブラリをスクリーニングして、所望の特性を有するポリペプチドを同定し得る。さらに最近、精製された成分を用いたインビトロリボソーム翻訳により、非天然コードアミノ酸で置換されたペプチドの合成が可能となることが報告された。例えば、Ａ．Ｆｏｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１００：６３５３（２００３）を参照のこと。
【０５７７】
ＩＸ．ＢＳＰにカップリングした巨大分子ポリマー
本明細書に記載の組成物、方法、技術及びストラテジーを用いて、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドに対する様々な修飾を為すことができる。これらの修飾には、ポリペプチドの非天然アミノ酸成分へのさらなる官能基の取り込み（以下に限定されないが、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋リンカー、放射性核種、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、レジン、第二のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、共同因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びアンチセンスポリヌクレオチド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピンラベル、蛍光プローブ、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合又は非共有結合により相互作用する基、フォトケージ（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）部分、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチン誘導体、ビオチン類似体、重原子を組み込む部分、化学的切断可能な基、光切断可能な基、伸長側鎖、炭素結合型糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光性の基、化学発光基、高電子密度基、磁性の基、挿入基、発色団、エネルギー移動剤、生物活性剤、検出可能標識、小分子又は上記もしくはその他の何らかの所望の化合物の組合せなど。）が含まれる。本明細書に記載の、組成物、方法、技術及びストラテジーの説明目的の非限定例として、本明細書に記載の組成物、方法、技術及びストラテジーがまた、他の官能基（以下に限定されないが上記で挙げたものなど。）を添加するのに適用可能（必要に応じて適切な改変を行い、当業者が本明細書中での開示を思いつき得る。）であるという了解のもと、以下の記述は、非天然アミノ酸ポリペプチドに巨大分子ポリマーを添加することに焦点を当てる。
【０５７８】
本発明のＢＳＰに多岐にわたる巨大分子ポリマー及びその他の分子を連結してＢＳＰの生物学的特性を調節する、及び／又はＢＳＰ分子に新しい生物学的特性を与えることができる。天然コードアミノ酸を介して、非天然コードアミノ酸を介して、又は天然もしくは非天然アミノ酸の何らかの官能置換基又は、天然もしくは非天然アミノ酸に付加されている何らかの置換基もしくは官能基を介して、これらの巨大分子ポリマーをＢＳＰに連結することができる。このポリマーの分子量は、広範囲にわたり、それは、以下に限定されないが、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間、又はそれ以上である。
【０５７９】
本発明は、ポリマー：タンパク質抱合体の実質的に均一な調製物を与える。「実質的に均一な」とは、本明細書中で使用する場合、ポリマー：タンパク質抱合体分子がタンパク質全体の半分よりも多いことが観察されることを意味する。ポリマー：タンパク質抱合体は、生物活性を有し、本明細書中で提供される本発明の「実質的に均一な」ＰＥＧ化ＢＳＰ調製物は、均一な調製物の長所（例えば、ロットの異なるものの薬物動態の予測可能性において臨床適用が容易であるなど。）を示すよう十分均一であるものである。
【０５８０】
ポリマー：タンパク質共役分子の混合物を調製するという選択肢を選択することもでき、それにより与えられる長所とは、混合物に含めるためのモノポリマー：タンパク質抱合体の比を選択し得るということである。したがって、必要に応じて、様々な数の結合ポリマー部分を有する（即ち、ジ−、トリ−、テラ−など。）様々なタンパク質の混合物を調製し、本発明の方法を用いて調製したモノ−ポリマー：タンパク質抱合体と前記抱合体を組み合わせ、モノ−ポリマー：タンパク質抱合体の前もって決定された比率を有する混合物を得ることができる。
【０５８１】
選択したポリマーは、それを結合させるタンパク質が水性環境（生理的環境など）で沈殿しない程度に水溶性であり得る。このポリマーは、分枝又は非分枝であり得る。好ましくは、最終産物調製物の治療用途に対しては、このポリマーは医薬適合性である。
【０５８２】
反応混合物中の濃度により、タンパク質分子に対するポリエチレングリコール分子の比率は変化する。一般に、最適な比率（過剰な非反応タンパク質又はポリマーが最小限となる反応効率の観点で。）は、選択したポリエチレングリコールの分子量により、及び利用可能な反応基の数において決定され得る。分子量に関連して、通常、ポリマーの分子量が高いほど、タンパク質に結合させ得るポリマー分子の数は少なくなる。同様に、これらのパラメ−タ−を最適化する場合、ポリマーの分枝を考慮すべきである。一般に、分子量が高いほど（又は分枝が多いほど）、ポリマータンパク質の比率が高くなる。
【０５８３】
本明細書中で使用する場合、及びＰＥＧ化されたＢＳＰ抱合体をもくろむ場合、「治療的有効量という用語は、患者に対して所望の有効性を与える量を指す。例えば、「治療的有効量」という用語は、ＢＳＰがＧＬＰ−１であれば、患者に利益を与える血中グルコースの減少を与える量を表す。例えば、「治療的有効量」という用語は、ＢＳＰがＴ−２０であれば、患者に利益を与えるウイルスレベルを調節する量を表す。この量は、個々の患者により変化し、患者の全体的な健康状態及び治療を行うべき状態（ＢＳＰがＧＬＰ−１である場合には、低血糖）の根本的な原因を含む、多くの要因に依存する。治療に使用するＢＳＰの量は、許容可能な速度で変化を促し、有用なレベルで所望の応答を維持する。本発明組成物の治療的有効量は、公に入手可能な物質及び手段を用いて当業者により容易に確定され得る。
【０５８４】
水溶性ポリマーは、以下に限定されないが、直鎖状、フォーク状又は分枝状を含む、あらゆる構造形態であり得る。通常、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレングリコール）、例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などであるが、その他の水溶性ポリマーも利用できる。一例として、ＰＥＧを使用して、本発明のある一定の実施形態を説明する。
【０５８５】
ＰＥＧは、市販されている周知の水溶性ポリマーであるか、又は、当技術分野で周知の方法に従い、エチレングリコールの開環ポリマー化により調製することができる（Ｓａｎｄｌｅｒ及びＫａｒｏ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３、１３８−１６１頁）。「ＰＥＧ」という用語は、大きさ又はＰＥＧの末端の修飾に関わらずあらゆるポリエチレングリコール分子を包含するように広く使用され、ＢＳＰに連結する場合、式：
ＸＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｙ
により表すことができる（式中、ｎは、２から１０，０００であり、ＸはＨ又は、以下に限定されないがＣ１−４アルキルなどの末端修飾である。）。
【０５８６】
ある場合において、本発明で使用するＰＥＧは、一方の末端がヒドロキシ又はメトキシで終わっている（即ち、Ｘは、Ｈ又はＣＨ３（「メトキシＰＥＧ」）である。）。あるいは、ＰＥＧは反応基で終わり得、これにより、二官能性ポリマーが形成される。通常の反応基には、２０種類の一般的アミノ酸で見られる官能基（以下に限定されないが、マレイミド基、活性化カーボネート（以下に限定されないが、ｐ−ニトロフェニルエステルなど。）、活性化エステル（以下に限定されないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルエステルなど。）及びアルデヒドなど。）ならびに、２０種類の一般的アミノ酸に対して不活性であるが非天然コードアミノ酸中に存在する相補的官能基と特異的に反応する官能基（以下に限定されないが、アジド基、アルキン基など。）と反応させるために一般に使用される反応基が含まれ得る。ＰＥＧの他方の末端（上記式中でＹで示される。）は、天然又は非天然コードアミノ酸を介して、ＢＳＰに直接又は間接的に結合することに留意されたい。例えば、Ｙは、アミド、カルバメート又は、ポリペプチドのアミノ基（以下に限定されないが、リジンのεアミン又はＮ末端など。）への尿素結合であり得る。あるいは、Ｙは、チオール基（以下に限定されないが、システインのチオール基など。）へのマレイミド結合であり得る。あるいは、Ｙは、２０種類の一般的アミノ酸を介して通常は接近可能ではない残基への結合であり得る。例えば、ＰＥＧ上のアジド基をＢＳＰ上のアルキン基と反応させて、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化産物を形成させることができる。あるいは、ＰＥＧ上のアルキン基を非天然コードアミノ酸中に存在するアジド基と反応させて、同様の産物を形成させることができる。ある実施形態において、強い求核試薬（以下に限定されないが、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、セミカルバジドなど。）を非天然コードアミノ酸中に存在するアルデヒド又はケトン基と反応させて、ヒドラゾン、オキシム又はセミカルバゾンを形成させることができ、規定どおりに、ある場合においては、適切な還元剤を用いた処理によりそれをさらに還元することができる。あるいは、非天然コードアミノ酸を介して強い求核試薬をＢＳＰに取り込み、これを使用して水溶性ポリマーに存在するケトン又はアルデヒド基と選択的に反応させることができる。
【０５８７】
実際に所望する場合は、以下に限定されないが、要望どおり、約１００ダルトン（Ｄａ）から１００，０００Ｄａ以上（以下に限定されないが、しばしば、０．１から５０ｋＤａ又は１０から４０ｋＤａなど。）など、ＰＥＧに対するあらゆる分子量を使用することができる。以下に限定されないが、各鎖が１から１００ｋＤａの範囲のＭＷを有する（以下に限定されないが、１から５０ｋＤａ又は５から２０ｋＤａなど。）ＰＥＧ分子を含む分枝鎖ＰＥＧもまた使用することができる。以下に限定されないが、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．カタログ、ＮｅｋｔａｒＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓカタログ（本明細書中に参照により組み込む。）などに、多岐にわたるＰＥＧ分子が記載されている。
【０５８８】
一般に、非天然コードアミノ酸との反応に、少なくとも１つのＰＥＧ分子の末端を利用できる。例えば、アミノ酸側鎖との反応のためのアルキン及びアジド部分を有するＰＥＧ誘導体を使用して、本明細書に記載のとおり、非天然コードアミノ酸にＰＥＧを連結させることができる。非天然コードアミノ酸がアジドを含有する場合、ＰＥＧは通常、［３＋２］付加環化産物の形成を実現するためのアルキン部分又は、アミド結合の形成を実現するためのホスフィン基を含有する活性化ＰＥＧ種（即ち、エステル、カーボネート）の何れかを含有する。あるいは、非天然コードアミノ酸がアルキンを含有する場合、ＰＥＧは通常、［３＋２］Ｈｕｉｓｇｅｎ付加環化環化産物の形成を実現するためのアジド部分を含有する。非天然コードアミノ酸がカルボニル基を含有する場合、ＰＥＧは通常、対応するヒドラゾン、オキシム及びオキシム及びセミカルバゾン結合の形成をそれぞれ実現するために、強力な求核試薬（以下に限定されないが、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン又はセミカルバジド官能基など。）を含有する。あるいは、上述の反応基の方向が逆であるものを使用することができ、即ち、アルキンを含有するＰＥＧ誘導体と非天然コードアミノ酸中のアジド部分を反応させることができる。
【０５８９】
ある実施形態において、ＰＥＧ誘導体を有するＢＳＰバリアントは、非天然コードアミノ酸の側鎖上に存在する化学官能基と反応性がある化学官能基を含有する。
【０５９０】
本発明は、ある実施形態において、平均分子量が約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａである水溶性ポリマー骨格を含有する、アジド−及びアセチレン−含有ポリマー誘導体を提供する。水溶性ポリマーのポリマー骨格は、ポリ（エチレングリコール）であり得る。しかし、以下に限定されないが、ポリ（エチレン）グリコール及びその他の関連ポリマーを含む（ポリ（デキストラン）及びポリ（プロピレングリコール）など）多岐にわたる水溶性ポリマーもまた、本発明の実施における使用に適切であり、ＰＥＧ又はポリ（エチレングリコール）という用語の使用は、このような分子全てを包含し含むものとすることを理解されたい。ＰＥＧという用語は、以下に限定されないが、そのあらゆる形態でのポリ（エチレングリコール）（二官能性ＰＥＧ、分岐ＰＥＧ、誘導体化ＰＥＧ、フォーク状ＰＥＧ、分枝ＰＥＧ、懸垂ＰＥＧ（即ち、ポリマー骨格に垂れ下がった、１又は複数の官能基を有する、ＰＥＧ又は関連ポリマー）又はその中に分解性の結合を有するＰＥＧなど。）を含む。
【０５９１】
ＰＥＧは通常、透明で無色、無臭、水溶性、熱安定性、多くの化学物質に対して不活性であり、加水分解又は分解せず、通常は無毒性である。ポリ（エチレングリコール）は、生体適合性であるとみなされ、つまり、ＰＥＧは、害を与えることなく生体組織又は器官と共存可能である。より具体的には、ＰＥＧは、実質的に非免疫原性であり、つまり、ＰＥＧは、身体において免疫反応を生じさせる傾向がない。生物活性物質など、身体においてあるいくつかの必要な機能を有する分子に連結させる場合、ＰＥＧは、その物質をマスクする傾向があり、生物がその物質の存在に対して寛容性を示すことができるように、あらゆる免疫反応を低下させるか、又は取り除くことができる。ＰＥＧ抱合体は実質的な免疫反応を引き起こさないか、又は凝固もしくはその他の不必要な影響を生じさせない傾向がある。式：−−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−−を有するＰＥＧ（式中、ｎは約３から約４０００、通常は約２０から２０００である。）は、本発明での使用に適切である。分子量が約８００Ｄａから約１００，０００ＤａであるＰＥＧは、本発明のある実施形態において、ポリマー骨格として特に有用である。
【０５９２】
ポリマー骨格は、直鎖状又は分枝ポリマーであり得る。分枝ポリマー骨格は通常当技術分野で公知である。通常、分枝ポリマーは、中央分枝コア部分を有し、直鎖状ポリマー鎖の複数が中央分枝コアに連結している。ＰＥＧは一般に、グリセロール、グリセロールオリゴマー、ペンタエリスリトール及びソルビトールなどの様々なポリオールへのエチレンオキシドの添加により調製することができる分枝形態で使用される。中央分枝部分はまた、リジンなどのいくつかのアミノ酸由来であり得る。Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍ（式中、Ｒはグリセロール、グリセロールオリゴマー又はペンタエリスリトールなどのコア部分由来であり、ｍは腕部分の数を表す。）のような一般式で分枝ポリ（エチレングリコール）を表すことができる。米国特許第５，９３２，４６２号、同第５，６４３，５７５号；同第５，２２９，４９０号；同第４，２８９，８７２号；米国特許公開２００３／０１４３５９６；ＷＯ９６／２１４６９；及びＷＯ９３／２１２５９（本明細書中にその全体を参照により組み込む。）に記載のものなどの、分岐したＰＥＧ分子もまたポリマー骨格として使用できる。
【０５９３】
分枝ＰＥＧは、ＰＥＧ（−−ＹＣＨＺ２）ｎ（式中、Ｙは、連結基であり、Ｚは指定された長さの原子鎖によりＣＨに連結された活性化末端基である。）で表されるフォーク状ＰＥＧの形態であり得る。
【０５９４】
さらに別の分枝形態である懸垂ＰＥＧは、ＰＥＧ鎖の末端ではなく、ＰＥＧ骨格とともにカルボキシルなどの反応基を有する。
【０５９５】
ＰＥＧのこれらの形態に加えて、骨格中の弱い又は分解性結合を用いて、ポリマーを調製することもできる。例えば、加水分解に供されるポリマー骨格中のエステル結合を用いてＰＥＧを調製できる。下記で示すように、この加水分解の結果、ポリマーがより低分子量の断片に切断される：
−ＰＥＧ−ＣＯ２−ＰＥＧ−＋Ｈ２Ｏ→ＰＥＧ−ＣＯ２Ｈ＋ＨＯ−ＰＥＧ−
ポリ（エチレングリコール）又はＰＥＧという用語が、以下に限定されないが、本明細書中で開示するものなど、当技術分野で公知の形態全てを表すか又は含むことは、当業者により理解される。
【０５９６】
多くの他のポリマーもまた本発明での使用に適切であり得る。ある実施形態において、水溶性であり、２から約３００末端であるポリマー骨格は本発明において特に有用である。適切なポリマーの例としては、以下に限定されないが、その他のポリ（アルキレングリコール）、例えばポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）など、そのコポリマー（以下に限定されないが、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマーなど。）、そのターポリマー、それらの混合物などが挙げられる。ポリマー骨格の各鎖の分子量は様々であり得るが、通常は、約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａ、多くの場合、約６，０００Ｄａから約８０，０００Ｄａの範囲である。
【０５９７】
実質的に水溶性の骨格に対する前述の一覧は、他のものを除外するものではなく、ただ説明を目的としたものであり、上述の質を有する全てのポリマー性物質が本発明での使用に適切なものとしてもくろまれることを、当業者は認識するであろう。
【０５９８】
本発明のある実施形態において、ポリマー誘導体は、「多官能性」であり、これは、つまり、ポリマー骨格が少なくとも２つの末端を有し、官能基により官能化又は活性化された、約３００末端にのぼる末端を有する可能性があることを意味する。多機能性ポリマー誘導体としては、以下に限定されないが、２つの末端（各末端に同じもしくは異なり得る官能基が結合している。）を有する直鎖状ポリマーが挙げられる。
【０５９９】
ある実施形態において、ポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−Ａ−ポリ−Ｂ−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
（式中、Ｎ＝Ｎ＝Ｎはアジド部分であり、Ｂは連結部分（存在してもよく存在しなくてもよい。）であり、ポリは、水溶性の非抗原性ポリマーであり、Ａは、連結部分（存在してもよく存在しなくてもよく、Ｂと同じか異なっていてもよい。）であり、Ｘは第二の官能基である。）を有する。Ａ及びＢに対する連結部分の例としては、以下に限定されないが、１８個以下、より好ましくは１個から１０個の炭素原子を含有する多官能性アルキル基が挙げられる。窒素、酸素又はイオウなどのヘテロ原子がこのアルキル鎖に含まれ得る。アルキル鎖はまた、ヘテロ原子において分枝され得る。Ａ及びＢに対する連結部分のその他の例としては、以下に限定されないが、１０個以下、より好ましくは５個から６個の炭素原子を含有する多官能性のアリール基が挙げられる。このアリール基は、もう１つの炭素原子、窒素、酸素又はイオウ原子により置換され得る。適切な連結基のその他の例としては、米国特許第５，９３２，４４６２号；同第５，６４３，５７５号；及び米国特許公開２００３／０１４３５９６（それぞれを本明細書中に参照により組み込む。）に記載の連結基が挙げられる。連結部分に対する前述の一覧は、他のものを除外するものではなく、ただ説明を目的としたものであり、上述の質を有する全ての連結部分が本発明での使用に適切なものとしてもくろまれることを、当業者は認識するであろう。［５９９］
Ｘとしての使用に適切な官能基の例としては、以下に限定されないが、ヒドロキシル、保護化ヒドロキシル、アルコキシル、活性エステル、例えばＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステル及び１−ベンゾトリアゾリルエステルなど、活性カーボネート、例えばＮ−ヒドロキシスクシニミジルカーボネート及び１−ベンゾトリアゾリルカーボネートなど、アセタ−ル、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護化アミン、ヒドラジド、保護化ヒドラジド、保護化チオール、カルボン酸、保護化カルボン酸、イソシアネ−ト、イソチオシアネ−ト、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨウ化アセトアミド、エポキシド、グリオキサ−ル、ジオン、メシラート、トシラート、トレシラート、アルケン、ケトン及びアジドが挙げられる。当業者により理解されるように、選択されたＸ部分は、アジド基との反応が起こらないよう、アジド基と適合可能であるべきである。アジド含有ポリマー誘導体は、ホモ二官能性であり得、これは、第二の官能基（即ちＸ）もアジド部分であることを意味するか、又はヘテロ二官能性であり、つまり、第二の官能基が異なる官能基であることを意味する。
【０６００】
「保護化」という用語は、ある一定の反応条件下で、化学的に反応性のある官能基の反応を妨げる、保護基又は部分の存在を指す。保護基は、保護する化学的に反応性のある反応基のタイプにより異なる。例えば、化学的に反応性のある基がアミン又はヒドラジドである場合、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）及び９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）の群から保護基を選択することができる。化学的に反応性のある基がチオールである場合、保護基は、オルトピリジルジスルフィドであり得る。化学的に反応性のある基が酪酸もしくはプロピイオン酸などのカルボン酸又はヒドロキシル基である場合、保護基は、ベンジル又はアルキル基（例えば、メチル、エチル又はｔｅｒｔ−ブチルなど。）であり得る。当技術分野で公知のその他の保護基もまた、本発明において使用し得る。
【０６０１】
文献中の末端官能基の具体例としては、以下に限定されないが、Ｎ−スクシニミジルカーボネート（例えば、米国特許第５，２８１，６９８号、同第５，４６８，４７８号を参照。）、アミン（例えば、Ｂｕｃｋｍａｎｎら、Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８２：１３７９（１９８１）、Ｚａｐｌｉｐｓｋｉら、Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．１９：１１７７（１９８３）を参照。）、ヒドラジド（例えば、Ａｎｄｒｅｚら、Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７９：３０１（１９７８）を参照。）、スクシニミジルプロピオネ−ト及びスクシニミジルブタノア−ト（例えば、Ｏｌｓｏｎら、Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ｐｐ．１７０−１８１、Ｈａｒｒｉｓ及びＺａｐｌｉｐｓｋｙ編、ＡＣＳ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９９７を参照。；米国特許第５，６７２，６６２号も参照のこと。）、スクシニミジルスクシネ−ト（例えば、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，７：１７５（１９８４）及びＪｏｐｐｉｃｈら、Ｍａｃｒｏｌｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８０：１３８１（１９７９）を参照。）、スクシニミジルエステル（例えば、米国特許第４，６７０，４１７号参照。）、ベンゾトリアゾ−ルカーボネート（例えば、米国特許第５，６５０，２３４号参照。）、グリシジルエーテル（例えば、Ｐｉｔｈａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９４：１１（１９７９）、Ｅｌｌｉｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３：３５４（１９９１）を参照。）、オキシカルボニルイミダゾ−ル（例えば、Ｂｅａｕｃｈａｍｐら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３１：２５（１９８３）、Ｔｏｎｄｅｌｌｉら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １：２５１（１９８５）を参照。）、ｐ−ニトロフェニルカーボネート（例えば、Ｖｅｒｏｎｅｓｅら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１１：１４１（１９８５）；及びＳａｒｔｏｒｅら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２７：４５（１９９１）を参照。）、アルデヒド（例えば、Ｈａｒｒｉｓら、Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄ．２２：３４１（１９８４）、米国特許第５，８２４，７８４号、米国特許第５，２５２，７１４号を参照。）、マレイミド（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：３４３（１９９０）、Ｒｏｍａｎｉら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ２：２９（１９８４）及びＫｏｇａｎ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｃｏｍｍ．２２：２４１７（１９９２）を参照。）、オルトピリジル−ジスルフィド（例えば、Ｗｏｇｈｉｒｅｍら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．４：３１４（１９９３）を参照。）、アクリロ−ル（例えば、Ｓａｗｈｎｅｙら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２６：５８１（１９９３）を参照。）、ビニルスルホン（例えば、米国特許第５，９００，４６１号を参照。）（上記の参考文献及び特許の全てを本明細書中に参照により組み込む。）が挙げられる。
【０６０２】
本発明のある一定の実施形態において、本発明のポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
（式中、Ｘは、上述のような官能基であり、ｎは約２０から約４０００である。）を有するポリマー骨格を含有する。別の実施形態において、本発明のポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｗ−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ（式中、Ｗは、１個から１０個の炭素原子を含有する、脂肪族又は芳香族リンカー部分であり；ｎは約２０から約４０００であり；Ｘは上述のような官能基であり、ｍはｍは１から１０である。）を有するポリマー骨格を含有する。
【０６０３】
当技術分野で公知及び／又は本明細書中で開示されている様々な方法により、本発明のアジド含有ＰＥＧ誘導体を調製することができる。下記で示すある方法において、平均分子量が約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａである水溶性ポリマー骨格（第一の官能基に第一の末端が結合し、適切な脱離基に第二の末端が結合するポリマー骨格）をアジド陰イオン（ナトリウム、カリウム、ｔｅｒｔ−ブチルアンモニウムなどの適切な対イオンの何れかの数と対合し得る。）と反応させる。脱離基は求核置換され、アジド部分により置換され、これにより、所望のアジド含有ＰＥＧポリマーが生じる。
【０６０４】
Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ＋Ｎ３−→Ｘ−ＰＥＧ−Ｎ３
示されるように、本発明での使用に適切なポリマー骨格は、式：Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ（式中、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、Ｘは、アジド基と反応しない官能基であり、Ｌは適切な脱離基である。）を有する。適切な官能基の例としては、以下に限定されないが、ヒドロキシル、保護化ヒドロキシル、アセタ−ル、アルケニル、アミン、アミノオキシ、保護化アミン、保護化ヒドラジド、保護化チオール、カルボン酸、保護化カルボン酸、マレイミド、ジチオピリジン及びビニルピリジンならびにケトンが挙げられる。適切な脱離基の例としては、以下に限定されないが、塩化物、臭化物、ヨウ化物、メシレ−ト、トレシレ−ト及びトシレ−トが挙げられる。
【０６０５】
本発明のアジド含有ポリマー誘導体の調製のための別の方法において、アジド官能基を含有する連結剤を平均分子量が約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａである水溶性ポリマー骨格（ここで、この連結剤は、連結基によりアジドがポリマー骨格から離されているアジド含有ポリマー誘導体産物を形成するために、ＰＥＧポリマー上の化学官能基と選択的に反応する化学官能基を有する。）に接触させる。
【０６０６】
例となる反応スキ−ムを以下に示す：
Ｘ−ＰＥＧ−Ｍ＋Ｎ−リンカー−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ→ＰＧ−Ｘ−ＰＥＧ−リンカー−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ（式中、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、Ｘは、アルコキシなどのキャッピング基又は上述のような官能基であり；Ｍは、アジド官能基と反応性がないが、Ｎ官能基と効率的かつ選択的に反応する官能基である。）
適切な官能基の例としては、以下に限定されないが、Ｎがアミンである場合、Ｍが、カルボン酸、カーボネート又は活性エステルである；Ｎがヒドラジド又はアミノオキシ部分である場合、Ｍがケトンである；Ｎが求核試薬である場合、Ｍが脱離基であるものが挙げられる。
【０６０７】
以下に限定されないが、生成物の沈殿とその後のクロマトグラフィー（必要に応じて）など、公知の方法により、粗製生成物の精製を行い得る。
【０６０８】
ＰＥＧジアミンの場合のより具体的な例を下記に示すが、この場合、アミンのうち１個がｔｅｒｔ−ブチル−Ｂｏｃなどの保護基部分により保護され、アジド官能基を有する連結部分と、生じたモノ保護化ＰＥＧジアミンとを反応させる：
ＢｏｃＨＮ−ＰＥＧ−ＮＨ２＋ＨＯ２Ｃ−（ＣＨ２）３−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
この例において、塩化チオニル又はカルボジイミド剤及びＮ−ヒドロキシスクンイミド又はＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾ−ルなどの様々な活性化剤を用いて、アミン基をカルボン酸基とカップリングさせ、モノアミンＰＥＧ誘導体とアジド含有リンカー部分との間にアミド結合を形成させることができる。アミド結合をうまく形成させた後、生じたＮ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｂｏｃ−保護化アジド含有誘導体を直接用いて、生物活性分子を修飾するか、又はこれをさらに変化させて、その他の有用な官能基を取り込むことができる。例えば、強酸での処理によりＮ−ｔ−Ｂｏｃ基を加水分解して、オメガ−アミノ−ＰＥＧ−アジドを生成させることができる。生じたアミンを合成ハンドルとして使用して、有用なヘテロ二官能性物質を生成させるための、マレイミド基、活性化ジスルフィド、活性化エステルなどのその他の有用な官能基を取り込むことができる。ヘテロ二官能性誘導体は、ポリマーの各末端に異なる分子を結合させたい場合、特に有用である。例えば、オメガ−Ｎ−アミノ−Ｎ−アジドＰＥＧにより、ＰＥＧの一方の末端への、アルデヒド、ケトン、活性化エステル、活性化カーボネートなどの活性化された求電子基を有する分子の結合及びＰＥＧの他方の末端へのアセチレン基を有する分子の結合が可能となる。
【０６０９】
本発明の別の実施形態において、ポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−Ａ−ポリ−Ｂ−Ｃ≡Ｃ−Ｒ（式中、Ｒは、Ｈ又はアルキル、アルケン、アルキオキシ又はアリールもしくは置換アリール基の何れかであり得；Ｂは連結部分（存在してもよく存在しなくてもよい。）であり；ポリは、水溶性非抗原性ポリマーであり；Ａは連結部分（存在してもよく存在しなくてもよく、Ｂと同じか異なっていてもよい。）であり、Ｘは第二の官能基である。）を有する。
【０６１０】
Ａ及びＢに対する連結部分の例としては、以下に限定されないが、１８個以下、より好ましくは１個から１０個の炭素原子を含有する多官能性アルキル基が挙げられる。窒素、酸素又はイオウなどのヘテロ原子がこのアルキル鎖に含まれ得る。アルキル鎖はまた、ヘテロ原子において分枝し得る。Ａ及びＢに対する連結部分のその他の例としては、以下に限定されないが、１０個以下、より好ましくは５個から６個の炭素原子を含有する多官能性のアリール基が挙げられる。このアリール基は、もう１つの炭素原子、窒素、酸素又はイオウ原子により置換され得る。適切な連結基のその他の例としては、米国特許第５，９３２，４６２号；同第５，６４３，５７５号；及び米国特許公開２００３／０１４３５９６（それぞれを本明細書中に参照により組み込む。）に記載の連結基が挙げられる。連結部分に対する前述の一覧は、他のものを除外するものではなく、ただ説明を目的とするものであり、上述の質を有する多岐にわたる連結部分が本発明において有用に適切であることがもくろまれることを、当業者は認識するであろう。
【０６１１】
Ｘとしての使用に適切な官能基の例としては、以下に限定されないが、ヒドロキシル、保護化ヒドロキシル、アルコキシル、活性エステル、例えばＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステル及び１−ベンゾトリアゾリルエステルなど、活性カーボネート、例えばＮ−ヒドロキシスクシニミジルカーボネート及び１−ベンゾトリアゾリルカーボネートなど、アセタ−ル、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護化アミン、ヒドラジド、保護化ヒドラジド、保護化チオール、カルボン酸、保護化カルボン酸、イソシアネ−ト、イソチオシアネ−ト、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨウ化アセトアミド、エポキシド、グリオキサ−ル、ジオン、メシレ−ト、トシレ−ト、トレシレ−ト、アルケン、ケトン及びアセチレンが挙げられる。当業者により理解されるように、選択されるＸ部分は、アセチレン基との反応が起こらないよう、アセチレン基と適合可能であるべきである。アセチレン含有ポリマー誘導体は、ホモ二官能性であり得、これは、第二の官能基（即ちＸ）もアセチレン部分であることを意味するか、又はヘテロ二官能性であり、つまり、第二の官能基が異なる官能基であることを意味する。
【０６１２】
本発明の別の実施形態において、ポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ（式中、Ｘは、上述のような官能基であり、ｎは約２０から約４０００であり、ｍは１から１０である。）を有するポリマー骨格を含有する。ヘテロ二官能性ＰＥＧポリマーのそれぞれの具体例を下記に示す。
【０６１３】
当業者にとって公知の方法及び／又は本明細書中で開示する方法を用いて、本発明のアセチレン−含有ＰＥＧ誘導体を調製することができる。ある方法において、平均分子量が約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａである水溶性ポリマー骨格（第一の官能基に第一の末端が結合し、適切な求核基に第二の末端が結合するポリマー骨格）を、アセチレン官能基と、ＰＥＧ上の求核基との反応に適切な脱離基と、の両方を有する化合物と反応させる。求核部分を有するＰＥＧポリマー及び脱離基を有する分子を組み合わせた場合、脱離基において求核置換が起こり、求核部分により置換され、これにより、所望のアセチレン含有ＰＥＧポリマーが生じる。
【０６１４】
Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕ＋Ｌ−Ａ−Ｃ→Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕ−Ａ−Ｃ≡ＣＲ’
示されるように、本反応での使用に適切なポリマー骨格は、式：Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕ（式中、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、Ｎｕは求核部分であり、Ｘは、Ｎｕ、Ｌ又はアセチレン官能基と反応しない官能基である。）を有する。
【０６１５】
Ｎｕの例としては、以下に限定されないが、アミン、アルコキシ、アリールオキシ、スルフヒドリル、イミノ、カルボキシレ−ト、ヒドラジド、アアミンオキシ基（主にＳＮ２型の機構を介して反応する。）が挙げられる。Ｎｕ基のさらなる例としては、求核付加反応を介して主に反応する官能基が挙げられる。Ｌ基の例としては、塩化物、臭化物、ヨウ化物、メシレ−ト、トレシレ−ト及びトシレ−ト及び、求核置換が行われると予想されるその他の基ならびに、ケトン、アルデヒド、チオエステル、オレフィン、α−β−不飽和カルボニル基、カーボネート及び、求核試薬により付加が起こると予想されるその他の求電子基が挙げられる。
【０６１６】
本発明の別の実施形態において、Ａは、１個から１０個の間の炭素原子の脂肪族リンカー又は６個から１４個の間の炭素原子の置換アリール環である。Ｘは、アジド基と反応しない官能基であり、Ｌは、脱離基である。
【０６１７】
本発明のアセチレン含有ポリマー誘導体の調製のための別の方法において、平均分子量が約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａであり、一方の末端に保護化官能基又はキャッピング剤の何れかを有しており、他方の末端に適切な脱離基を有するＰＥＧポリマーをアセチレ陰イオンと接触させる。
【０６１８】
典型的な反応スキ−ムを以下に示す：
Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ＋−Ｃ≡ＣＲ’→Ｘ−ＰＥＧ−Ｃ≡ＣＲ’（式中、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、Ｘは、アルコキシなどのキャッピング基又は上述のような官能基であり；Ｒ’は、Ｈ又は、アルキル、アルコキシ、アリール又はアリールオキシ基もしくは置換アルキル、アルコキシ、アリールもしくはアリールオキシ基の何れかである。）。
【０６１９】
上記の例において、脱離基Ｌは、十分な濃度のアセチレン陰イオンと接触させた場合に、ＳＮ２型の置換を起こすよう十分に反応性があるべきである。アセチレン陰イオンによる脱離基のＳＮ２型の置換を遂行するのに必要な反応条件は、当技術分野で周知である。
【０６２０】
以下に限定されないが、生成物の沈殿とその後のクロマトグラフィー（必要に応じて）など、公知の方法により、粗製生成物の精製を行い得る。
【０６２１】
水溶性ポリマーを本発明のＢＳＰに連結させることができる。ＢＳＰに取り込まれた非天然コードアミノ酸、又は非天然コードもしくは天然コードアミノ酸の何れかの官能基もしくは置換基、又は非天然コードもしくは天然コードアミノ酸に付加された何れかの官能基もしくは置換基を介して水溶性ポリマーを連結し得る。あるいは、天然アミノ酸（以下に限定されないが、システイン、リジン又はＮ末端残基のアミン基など。）を介して非天然コードアミノ酸を取り込んでいるＢＳＰに水溶性ポリマーを連結させる。ある場合において、本発明のＢＳＰは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の非天然アミノ酸を含有し、１又は複数の非天然コードアミノ酸が水溶性ポリマー（以下に限定されないが、ＰＥＧ及び／又はオリゴ糖など。）に連結している。ある場合において、本発明のＢＳＰはさらに、水溶性ポリマーに連結している、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の天然コードアミノ酸を含有する。ある場合において、本発明のＢＳＰは、水溶性ポリマーに連結している１又は複数の非天然コードアミノ酸及び、水溶性ポリマーに連結している１又は複数の天然のアミノ酸を含有する。ある実施形態において、本発明で使用される水溶性ポリマーは、非共役形態と比較してＢＳＰの血清半減期を延長させる。
【０６２２】
本発明の、ＢＳＰに連結している水溶性ポリマーの数（即ち、ＰＥＧ化又はグリコシル化の程度）を調節して、インビボ半減期などの、薬理学的、薬物動態学的又は薬力学的特徴を変更（以下に限定されないが、増加又は減少など。）することができる。ある実施形態において、非修飾ポリペプチドよりも、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％、２倍、５倍、１０倍、５０倍又は少なくとも約１００倍、ＢＳＰの半減期を延長させる。
【０６２３】
強い求核基（即ち、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン又はセミカルバジド）を含有するＰＥＧ誘導体
本発明のある実施形態において、カルボニル含有非天然コードアミノ酸を含有するＢＳＰをＰＥＧ骨格と直接連結される、末端ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジド又はセミカルバジド部分を含有するＰＥＧ誘導体で修飾する。
【０６２４】
ある実施形態において、ヒドロキシルアミン末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である（即ち、平均分子量は５から４０ｋＤａの間である。）。）を有する。
【０６２５】
ある実施形態において、ヒドラジン含有又はヒドラジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００であり、Ｘは場合によっては、存在しても存在しなくてもよい、カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である。）を有する。
【０６２６】
ある実施形態において、セミカルバジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である。）を有する。
【０６２７】
本発明の別の実施形態において、アミド結合によりＰＥＧ骨格に連結している、末端ヒドロキシルアミン、ヒドラジド、ヒドラジン又はセミカルバジド部分を含有するＰＥＧ誘導体により、カルボニル含有アミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドを修飾する。
【０６２８】
ある実施形態において、ヒドロキシルアミン末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である（即ち、平均分子量は５から４０ｋＤａの間である。）。）を有する。
【０６２９】
ある実施形態において、ヒドラジン又はヒドラジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００であり、Ｘは場合によっては、存在しても存在しなくてもよい、カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である。）を有する。
【０６３０】
ある実施形態において、セミカルバジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である。）を有する。
【０６３１】
本発明の別の実施形態において、末端ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジド又はセミカルバジド部分を含有し、分枝ＰＥＧの各鎖が１０から４０ｋＤａ、より好ましくは５から２０ｋＤａの範囲のＭＷを有する分枝ＰＥＧ誘導体により、カルボニル含有アミノ酸を含有するＢＳＰを修飾する。
【０６３２】
本発明の別の実施形態において、分枝構造を有するＰＥＧ誘導体により非天然のコードアミノ酸を含有するＢＳＰを修飾する。例えば、ある実施形態において、ヒドラジン−又はヒドラジド−末端ＰＥＧ誘導体は、次の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００であり、Ｘは、場合によっては、存在しても存在しなくてもよい、カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である。）を有する。
【０６３３】
ある実施形態において、セミカルバジド基を含有するＰＥＧ誘導体は、次の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２］２ＣＨ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、Ｘは場合によってはＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）であるか又は存在せず、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である。）を有する。
【０６３４】
ある実施形態において、ヒドロキシルアミン基を含有するＰＥＧ誘導体は、次の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２］２ＣＨ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、Ｘは場合によってはＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）であるか又は存在せず、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である。）を有する。
【０６３５】
水溶性ポリマーがＢＳＰに連結している程度及び部位により、ＢＳＰ受容体又は結合対へのＢＳＰの結合を調節することができる。幾つかの実施形態において、平衡結合アッセイによって測定された場合に、ＢＳＰが、約４００ｎＭ以下のＫｄで、約４００ｎＭ以下のＫｄで、幾つかの事例では、約１００ｎＭ以下のＫｄで、ＢＳＰ受容体を結合するように、結合が用意される。
【０６３６】
ポリマーの活性化のための、ならびに、ペプチドの共役のための、方法及び化学反応は、文献中に記載されており、当技術分野で公知である。ポリマーの活性化のために一般に使用される方法としては、以下に限定されないが、臭化シアン、過ヨウ素酸塩、グルタ−ルアルデヒド、ビエポキシド、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、カルボジイミド、ハロゲン化スルホニル、トリクロロトリアジンなどによる官能基の活性化が挙げられる。（Ｒ．Ｆ．Ｔａｙｌｏｒ、（１９９１）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ，（１９９２）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ；Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら、（１９９３）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；Ｄｕｎｎ，Ｒ．Ｌ．ら、編、Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｖｏｌ．４６９，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９９１を参照。）。
【０６３７】
ＰＥＧの官能化及び共役のいくつかの概説及び論文が利用可能である。例えば、Ｈａｒｒｉｓ，Ｍａｃｒｏｎｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃ２５：３２５−３７３（１９８５）；Ｓｃｏｕｔｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３５：３０−６５（１９８７）；Ｗｏｎｇら、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８６６−８７４（１９９２）；Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ９：２４９−３０４（１９９２）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．６：１５０−１６５（１９９５）を参照のこと。
【０６３８】
ポリマーの活性化のための方法はまた、ＷＯ９４／１７０３９、米国特許第５，３２４，８４４号、ＷＯ９４／１８２４７、ＷＯ９４／０４１９３、米国特許第５，２１９，５６４号、米国特許第５，１２２，６１４号、ＷＯ９０／１３５４０、米国特許第５，２８１，６９８号及びＷＯ９３／１５１８９においても、及び、活性化ポリマーと、以下に限定されないが、凝固因子ＶＩＩＩ（ＷＯ９４／１５６２５）、ヘモグロビン（ＷＯ９４／０９０２７）、酸素運搬分子（米国特許第４，４１２，９８９）、リボヌクレアーゼ及び超酸化物ジムスタ−ゼ（Ｖｅｒｏｎｅｓｅら、Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１１：１４１−４５（１９８５））を含む酵素との間の共役に対するものも見出すことができる。引用する参考文献及び特許を全て、本明細書中に参照により組み込む。
【０６３９】
何らかの従来法により、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンなどの非天然コードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドのＰＥＧ化（即ち、何らかの水溶性ポリマーの付加）を行う。例えば、アルキン末端ＰＥＧ誘導体によりＢＳＰをＰＥＧ化する。簡潔に述べると、室温にて、撹拌しながら、ｐ−アジド−Ｌ−Ｐｈｅ−含有ＢＳＰの水溶液に固体ｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨの過剰量を添加する。通常、反応を行うｐＨ付近（通常約ｐＨ４から１０）のｐＫａを有する緩衝液で水溶液を緩衝化する。ｐＨ７．５でのＰＥＧ化のための適切な緩衝液の例としては、例えば、以下に限定されないが、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩、ホウ酸塩、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ＥＰＰＳ及びＴＥＳが挙げられる。ｐＨを連続してモニタリングし、必要に応じて調整する。反応は通常、約１時間から４８時間連続して行う。
【０６４０】
続いて反応産物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供して、フリ−のｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ及び、ブロックされていないＰＥＧが分子の両末端で活性化されている場合に形成され得、それによりＢＳＰバリアント分子を架橋する、ＰＥＧ化ＢＳＰの全ての高分子量複合体から、ＰＥＧ化ＢＳＰバリアントを分離する。疎水性相互作用クロマトグラフィーの際の条件は、フリ−のｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨがカラムから流出し、一方であらゆる架橋ＰＥＧ化ＢＳＰバリアント複合体が、１又は複数のＰＥＧ基と共役させられている１個のＢＳＰバリアント分子を含有する所望の形態の後に、溶出するようなものである。適切な条件は、架橋複合体対所望の抱合体の相対サイズにより異なり、当業者は容易にこれを決定する。所望の抱合体を含有する溶出物を限外ろ過により濃縮し、ダイアフィルトレーションにより脱塩する。
【０６４１】
必要に応じて、以下に限定されないが、アフィニティークロマトグラフィー；陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー（以下に限定されないが、ＤＥＡＥ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥなどを使用する。）；シリカでのクロマトグラフィー；逆相ＨＰＬＣ；ゲルろ過（以下に限定されないが、ＳＥＰＨＡＤＥＸ  Ｇ−７５などを使用する。）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー；限外ろ過／ダイアフィルトレーション；エタノール沈殿；  硫酸アンモニウム沈殿；クロマト分画；置換クロマトグラフィー；電気泳動法（以下に限定されないが、分取等電点電気泳動など。）、異なる溶解性（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）（以下に限定されないが、硫酸アンモニウム沈殿を含む。）又は抽出などの、当業者にとって公知の１又は複数の手段により、疎水性クロマトグラフィーから得たＰＥＧ化ＢＳＰをさらに精製する。球状タンパク質標準（Ｐｒｅｎｅｔａ，ＡＺ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｈａｒｒｉｓ及びＡｎｇａｌ編）ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９，２９３−３０６）と比較することによるＧＰＣによって、見かけの分子量を推定し得る。タンパク質分解（以下に限定されないが、トリプシン切断など。）を行い、次いでマススペクトロメトリー分析を行うことにより、ＢＳＰ−ＰＥＧ抱合体の純度を評価することができる。Ｐｅｐｉｎｓｋｙ  Ｂ．，ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ＆  Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９７（３）：１０５９−６６（２００１）。
【０６４２】
制限なしで、本発明のＢＳＰのアミノ酸に連結している水溶性ポリマーをさらに誘導体化するか置換することができる。
【０６４３】
アジド含有ＰＥＧ誘導体
本発明の別の実施形態において、非天然コードアミノ酸の側鎖に存在するアルキン部分と反応するアジド部分を含有するＰＥＧ誘導体により、ＢＳＰを修飾する。一般に、ＰＥＧ誘導体は、１から１００ｋＤａの平均分子量を有し、ある実施形態においては、１０から４０ｋＤａの平均分子量を有する。
【０６４４】
ある実施形態において、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｎ３（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である（即ち、平均分子量は５から４０ｋＤａの間である。）。）を有する。
【０６４５】
別の実施形態において、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−Ｎ３（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｐは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である（即ち、平均分子量は５から４０ｋＤａの間である。）。）を有する。
【０６４６】
本発明の別の実施形態において、末端アジド部分を含有し、分枝ＰＥＧの各鎖が１０から４０ｋＤａ、より好ましくは５から２０ｋＤａの範囲のＭＷを有する分枝ＰＥＧ誘導体により、アルキン含有アミノ酸を含有するＢＳＰを修飾する。例えば、ある実施形態において、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、次の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐ−Ｎ３（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｐは２から１０であり、ｎは１００から１，０００であり、Ｘは、場合によっては、各場合において、Ｏ、Ｎ、Ｓ又はカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である（存在してもよいし、存在しなくてもよい。）。）を有する。
【０６４７】
アルキン含有ＰＥＧ誘導体
本発明の別の実施形態において、非天然コードアミノ酸の側鎖に存在するアジド部分と反応するアルキン部分を含有するＰＥＧ誘導体により、ＢＳＰを修飾する。
【０６４８】
ある実施形態において、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、次の構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である（即ち、平均分子量は５から４０ｋＤａの間である。）。）を有する。
【０６４９】
本発明の別の実施形態において、アミド結合によりＰＥＧ骨格に連結している末端アジド又は末端アルキン部分を含有するＰＥＧ誘導体により、アルキン含有非天然コードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドを修飾する。
【０６５０】
ある実施形態において、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、次の構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−Ｃ≡ＣＨ（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｐは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である。）を有する。
【０６５１】
本発明の別の実施形態において、末端アルキン部分を含有し、分枝ＰＥＧの各鎖が１０から４０ｋＤａ、より好ましくは５から２０ｋＤａの範囲のＭＷを有する分枝ＰＥＧ誘導体により、アジド含有アミノ酸を含有するＢＳＰを修飾する。例えば、ある実施形態において、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、次の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐ−Ｃ≡ＣＨ（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｐは２から１０であり、ｎは１００から１，０００であり、Ｘは、場合によっては、Ｏ、Ｎ、Ｓ又はカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）であるか、又は存在しない。）を有する。
【０６５２】
ホスフィン含有ＰＥＧ誘導体
本発明の別の実施形態において、非天然コードアミノ酸の側鎖に存在するアジド部分と反応するアリールホスフィン基をさらに含む活性化官能基（以下に限定されないが、エステル、カーボネートなど。）を含有するＰＥＧ誘導体により、ＢＳＰを修飾する。一般に、ＰＥＧ誘導体は、１から１００ｋＤａの平均分子量、ある実施形態においては、１０から４０ｋＤａの平均分子量を有する。
【０６５３】
ある実施形態において、ＰＥＧ誘導体は、構造：
【０６５４】
【化１４】
2008507280.tif 000016
（式中、ｎは１から１０であり、ＸはＯ、Ｎ、Ｓであり得るか、又は存在しなくてもよく、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは水溶性ポリマーである。）を有する。
【０６５５】
ある実施形態において、ＰＥＧ誘導体は、構造：
【０６５６】
【化１５】
2008507280.tif 000017
（式中、Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであり得るか、又は存在しなくてもよく、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは水溶性ポリマーであり、Ｒは、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキル及び置換アリール基であり得る。）を有する。Ｒ基の例としては、以下に限定されないが、−ＣＨ２、−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＣＮ及び−ＮＯ２が挙げられる。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’はそれぞれ独立に、水素、置換もしくは非置換へテロアルキル、置換もしくは非置換アリール（以下に限定されないが、１個から３個のハロゲンで置換されているアリールを含む。）、置換もしくは非置換アルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ基又はアリールアルキル基を指す。本発明の化合物が複数のＲ基を含む場合、例えば、各Ｒ基は、これらの基の複数が存在する場合であれば、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’基それぞれとして独立に選択される。Ｒ’及びＲ’’が同じ窒素原子に結合する場合、これらは、窒素原子と一緒になって５、６又は７員環を形成し得る。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、以下に限定されないが、１−ピロリジニル及び４−モルホリニルを含むものとする。置換基の上記考察から、「アルキル」という用語が、ハロアルキル（以下に限定されないが、−ＣＦ３及び−ＣＨ２ＣＦ３を含む。）及びアシル（以下に限定されないが、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などを含む。）など、水素基以外の基に結合した炭素原子などの基を含むものであることを当業者は理解するであろう。
【０６５７】
その他のＰＥＧ誘導体及び一般的なＰＥＧ化技術
抗原結合ポリペプチドに連結させ得るその他の代表的なＰＥＧ分子ならびに、ＰＥＧ化の方法には、次の文献に記載のものが含まれる。例えば、米国特許公開２００４／０００１８３８；２００２／００５２００９；２００３／０１６２９４９；２００４／００１３６３７；２００３／０２２８２７４；２００３／０２２０４４７；２００３／０１５８３３３；２００３／０１４３５９６；２００３／０１１４６４７；２００３／０１０５２７５；２００３／０１０５２２４；２００３／００２３０２３；２００２／０１５６０４７；２００２／００９９１３３；２００２／００８６９３９；２００２／００８２３４５；２００２／００７２５７３；２００２／００５２４３０；２００２／００４００７６；２００２／００３７９４９；２００２／０００２２５０；２００１／００５６１７１；２００１／００４４５２６；２００１／００２７２１７；２００１／００２１７６３；米国特許第６，６４６，１１０号；同第５，８２４，７７８号；同第５，４７６，６５３号；同第５，２１９，５６４号；同第５，６２９，３８４号；同第５，７３６，６２５号；同第４，９０２，５０２号；同第５，２８１，６９８号；同第５，１２２，６１４号；同第５，４７３，０３４号；同第５，５１６，６７３号；同第５，３８２，６５７号；同第６，５５２，１６７号；同第６，６１０，２８１号；同第６，５１５，１００号；同第６，４６１，６０３号；同第６，４３６，３８６号；同第６，２１４，９６６号；同第５，９９０，２３７号；同第５，９００，４６１号；同第５，７３９，２０８号；同第５，６７２，６６２号；同第５，４４６，０９０号；同第５，８０８，０９６号；同第５，６１２，４６０号；同第５，３２４，８４４号；同第５，２５２，７１４号；同第６，４２０，３３９号；同第６，２０１，０７２号；同第６，４５１，３４６号；同第６，３０６，８２１号；同第５，５５９，２１３号；同第５，７４７，６４６号；同第５，８３４，５９４号；同第５，８４９，８６０号；同第５，９８０，９４８号；同第６，００４，５７３号；同第６，１２９，９１２号；ＷＯ９７／３２６０７、ＥＰ２２９，１０８、ＥＰ４０２，３７８、ＷＯ９２／１６５５５、ＷＯ９４／０４１９３、ＷＯ９４／１４７５８、ＷＯ９４／１７０３９、ＷＯ９４／１８２４７、ＷＯ９４／２８０２４、ＷＯ９５／００１６２、ＷＯ９５／１１９２４、ＷＯ９５／１３０９０、ＷＯ９５／３３４９０、ＷＯ９６／０００８０、ＷＯ９７／１８８３２、ＷＯ９８／４１５６２、ＷＯ９８／４８８３７、ＷＯ９９／３２１３４、ＷＯ９９／３２１３９、ＷＯ９９／３２１４０、ＷＯ９６／４０７９１、ＷＯ９８／３２４６６、ＷＯ９５／０６０５８、ＥＰ４３９５０８、ＷＯ９７／０３１０６、ＷＯ９６／２１４６９、ＷＯ９５／１３３１２、ＥＰ９２１１３１、ＷＯ９８／０５３６３、ＥＰ８０９９９６、ＷＯ９６／４１８１３、ＷＯ９６／０７６７０、ＥＰ６０５９６３、ＥＰ５１０３５６、ＥＰ４００４７２、ＥＰ１８３５０３及びＥＰ１５４３１６（これらを本明細書中に参照により組み込む。）。本明細書に記載のＰＥＧ分子の何れも、以下に限定されないが、１本鎖、分枝鎖、分岐鎖、一官能性、二官能性、多官能性又はそれらのあらゆる組合せを含む、あらゆる形態で使用することができる。
【０６５８】
血清アルブミンに対する親和性の促進
様々な分子を本発明のＢＳＰに融合させて、血清中のＢＳＰの半減期を調節することもできる。ある実施形態において、分子を本発明のＢＳＰと連結又は融合させて、動物における内在性血清アルブミンに対する親和性を促進する。
【０６５９】
例えば、ある場合において、ＢＳＰの組み換え融合物及びアルブミン結合配列を作製する。代表的なアルブミン結合配列には、以下に限定されないが、連鎖球菌タンパク質Ｇからのアルブミン結合ドメイン（例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｉｔｅｒ．２７７：５３４−５４２（１９９６）及びＳｊｏｌａｎｄｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１：１１５−１２３（１９９７）参照。）又は例えばＤｅｎｎｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３５０３５−３５０４３（２００２）に記載のものなどのアルブミン結合ペプチドが含まれる。
【０６６０】
他の実施形態において、本発明のＢＳＰを脂肪酸でアシル化する。ある場合において、脂肪酸は血清アルブミンへの結合を促進する。例えば、Ｋｕｒｔｚｈａｌｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１２：７２５−７３１（１９９５）を参照のこと。
【０６６１】
他の実施形態において、本発明のＢＳＰを血清アルブミンに直接融合させる（以下に限定されないが、ヒト血清アルブミンなど。）。多岐にわたるその他の分子を本発明におけるＢＳＰに連結させて、血清アルブミン又はその他の血清成分への結合を調節することもできることを、当業者は認識するであろう。
【０６６２】
Ｘ．ＢＳＰのグリコシル化  
本発明は、糖残基を有する１又は複数の非天然コードアミノ酸を取り込んでいるＢＳＰを含む。糖残基は、天然（以下に限定されないが、Ｎ−アセチルグルコサミンなど。）又は非天然（以下に限定されないが、３−フルオロガラクトースなど。）の何れかであり得る。糖はＮ−又はＯ−結合型グリコシド結合（以下に限定されないが、Ｎ−アセチルガラクトース−Ｌ−セリンなど。）又は非天然結合（以下に限定されないが、オキシム又は対応するＣ−もしくはＳ−結合型グリコシドなど。）の何れかにより、非天然コードアミノ酸に連結し得る。
【０６６３】
糖（以下に限定されないが、グリコシルなど。）部分をインビボ又はインビトロの何れかでＢＳＰに付加し得る。本発明のある実施形態において、アミノオキシ基により誘導体化された糖を用いてカルボニル含有非天然コードアミノ酸を含有するＢＳＰを修飾し、オキシム結合を介して連結された対応するグリコシル化ポリペプチドを生成させる。非天然コードアミノ酸に連結させた後、グリコシルトランスフェラ−ゼ及びその他の酵素を用いて処理を行って、ＢＳＰに結合したオリゴ糖を生成させることにより、糖をさらに変化させ得る。例えば、Ｈ．Ｌｉｕら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：１７０２−１７０３（２００３）を参照のこと。
【０６６４】
本発明のある実施形態において、アミノオキシ誘導体として調製された規定される構造を有するグリカンを用いて、カルボニル含有非天然コードアミノ酸を含有するＢＳＰを直接修飾する。アジド、アルキン、ヒドラジド、ヒドラジン及びセミカルバジドなどの他の官能基を使用して、非天然コードアミノ酸に糖を連結させることができることを、当業者は認識するであろう。
【０６６５】
本発明のある実施形態において、以下に限定されないが、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応（以下に限定されないが、アルキニル又はアジド誘導体それぞれなどを用いて。）などにより、アジド又はアルキニル含有非天然コードアミノ酸を含むＢＳＰを修飾することができる。この方法により、タンパク質を非常に高い選択性で修飾することができるようになる。
【０６６６】
ＸＩ．ＢＳＰ含有二量体及び多量体
本発明はまた、以下に限定されないが、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体又はヘテロ多量体（即ち、三量体、四量体など。）などの、ＢＳＰの組み合わせ（ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−１類縁体、Ｔ−２０及びＴ−２０類縁体、ＰＹＹ及びＰＹＹ類縁体を含むが、これらに限定されない。）を提供するが、この場合、１又は複数の非天然コードアミノ酸を含有するＢＳＰは、ポリペプチド骨格に直接、又はリンカーを介しての何れかで、別のＢＳＰ、類縁体、もしくはそれらのバリアント又は非ＧＬＰ−１（又は非Ｔ−２０若しくは非ＰＹＹ）である何らかの他のポリペプチドと結合している。単量体と比較してその分子量が大きいことから、（ＧＬＰ−１、Ｔ−２０又はＰＹＹなどの）ＢＳＰ二量体又は多量体抱合体は、以下に限定されないが、異なる薬理学的、薬物動態的特性、単量体ＢＳＰと比べて、調節された治療半減期又は調節された血漿半減期など、新しい、又は所望する特性を示し得る。幾つかの実施形態において、本発明の抱合体又は融合物は、ＢＳＰの受容体又は結合対とのＢＳＰの相互作用を調節する。他の実施形態において、本発明のＢＳＰ抱合体、融合物、二量体又は多量体は、受容体アンタゴニスト、アゴニスト、スーパーアゴニスト又は調節物質として作用する。
【０６６７】
ある実施形態において、ＢＳＰ含有二量体又は多量体に存在するＢＳＰの１又は複数は、受容体結合領域又は結合対に結合するための領域中に存在する水溶性ポリマーに連結している非天然コードアミノ酸を含有する。ある実施形態において、以下に限定されないが、Ａｓｎ−Ｌｙｓアミド結合又はＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合などを介して、ＢＳＰは直接連結している。ある実施形態において、連結されたＢＳＰは、抱合、融合、二量体化又は多量体化を促進するために、異なる非天然コードアミノ酸を含有し、以下に限定されないが、第一のＢＳＰの１つの非天然コードアミノ酸中のアルキン及び第二のＢＳＰの第二の非天然コードアミノ酸中のアジドなどは、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化により抱合される。あるいは、ヒドロキシルアミン含有非天然コードアミノ酸を含有する第二のＢＳＰポリペプチドに、第一のＢＳＰ及び／又は、ケトン含有非天然コードアミノ酸を含有する連結非ＢＳＰポリペプチドを抱合させ、対応するオキシムの形成を介してそのポリペプチドを反応させる。
【０６６８】
あるいは、２個のＢＳＰが、リンカーを介して連結される。何らかのヘテロ又はホモ二官能性リンカーを使用して、２個のＢＳＰ（同じ又は異なる一次配列を有し得る。）を連結させることができる。ある場合において、ＢＳＰを一緒に連結するために使用するリンカーは、二官能性ＰＥＧ物質であり得る。リンカーは、幅広い分子量又は分子長を有し得る。より大きい又はより小さい分子量のリンカーを使用して、ＢＳＰと連結された物体との間に、又はＢＳＰとその結合対の間に、又は連結された物体とその結合対との間に、所望の空間的関係又は立体構造を与え得る。より長い又はより短い分子長のリンカーを使用して、ＢＳＰと連結された物体の間に、又はＢＳＰとその結合対の間に、又は連結された物体とその結合対との間に、所望の空間又は柔軟性を与えることもできる。同様に、特定の形又は立体構造を有するリンカーを利用して、ＢＳＰがその標的に到達する前又は後の何れかに、ＢＳＰ又は連結物体に特定の形又は立体構造を与え得る。ＢＳＰと連結物体との間の空間的関係をこのように最適化することにより、新しい、調節された、又は所望の特性を分子に対して与え得る。
【０６６９】
ある実施形態において、本発明は、亜鈴構造を有する水溶性二官能性リンカーを提供するが、この構造は以下のものを含む：ａ）ポリマー骨格の少なくとも第一の末端における、アジド、アルキン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン又はカルボニル含有部分；及びｂ）ポリマー骨格の第二の末端における少なくとも第二の官能基。第二の官能基は、第一の官能基と同じ又は異なり得る。第二の官能基は、ある実施形態において、第一の官能基と反応性がない。本発明は、ある実施形態において、分枝状分子構造の少なくとも１つのア−ムを含有する水溶性化合物を提供する。例えば、分枝状分子構造は、樹状であり得る。
【０６７０】
ある実施形態において、本発明は、構造：
Ｒ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ（式中、ｎは約５から３，０００であり、ｍは２から１０であり、Ｘは、アジド、アルキン、ヒドラジン、ヒドラジド、アミノオキシ基、ヒドロキシルアミン、アセチル又はカルボニル含有部分であり得、Ｒは、Ｘと同じもしくは異なリ得る、キャッピング基、官能基又は脱離基である。）を有する水溶性活性化ポリマーとの反応により形成された、１又は複数のＧＨスーパー遺伝子ファミリーの要素（ＢＳＰなど）を含む多量体を提供する。Ｒは、例えば、ヒドロキシル、保護化ヒドロキシル、アルコキシ、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステル、１−ベンゾトリアゾリルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルカーボネート、１−ベンゾトリアゾリルカーボネート、アセタ−ル、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護化アミン、ヒドラジド、保護化ヒドラジド、保護化チオール、カルボン酸、保護化カルボン酸、イソシアネ−ト、イソチオシアネ−ト、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨウ化アセトアミド、エポキシド、グリオキサ−ル、ジオン、メシレ−ト、トシレ−ト及びトレシレ−ト、アルケン及びにケトンからなる群から選択される官能基であり得る。
【０６７１】
ＸＩＩ．ＢＳＰ活性及びＢＳＰ受容体もしくはＢＳＰ結合対に対するＢＳＰの親和性の測定
標準的なインビトロ又はインビボアッセイを用いて、ＢＳＰ活性を測定することができる。
【０６７２】
本発明のＧＬＰ−１ポリペプチドの活性をモニターするために、多数のアッセイを使用し得る。ＧＬＰ−１などのペプチドホルモンは、特異的Ｇタンパク質共役受容体を活性化するため、本発明のＧＬＰ−１ポリペプチドは、ＧＬＰ−１受容体依存性ｃＡＭＰ形成を検出するアッセイによって評価され得る。下流の細胞内ｃＡＭＰ産生は、発色、発光、時間分解蛍光又はＦＰ法を含む様々な方法（これらに限定されない。）によって測定することが可能である。ラットのインシュリノ−マ由来ＲＩＮ−ｍ５Ｆは、アデニル酸シクラ−ゼに共役された内在性ＧＬＰ−１受容体を有し、（Ｆｅｈｍａｎｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＭｏＩ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ８５：Ｃ３９−Ｃ４４；  Ｇｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｓ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ（Ｂｅｒｌ）．１９８９；  １８９（４）  ：２５７−６４）、受容体活性化後に、ｃＡＭＰを測定するために使用することができる。同様に、ハムスタ−ＨＩＴ−ＴＩ５細胞（ＡＴＣＣ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）又はラットＢＲＩＮ−ＢＤＩＩβ細胞（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  ＭｏＩ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ２００３  Ｄｅｃ；３１（３）：  ５２９−４）を使用し得る。
【０６７３】
あるいは、組換えｈＧＬＰ−１受容体が形質移入された細胞（ＣＨＯ（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．）  ２００３  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５２：７５１−５９）、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ；  Ｋｎｕｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ４３：１６６４−１６６９）、ＣＨＬ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｌｕｎｇ）細胞を含むが、これらに限定されない。）、又はラット、マウス若しくはハムスタ−から単離された膵島細胞などの初代細胞中でｃＡＭＰ産生を測定し得る。ＧＬＰ−１受容体は、「Ｔｈｏｒｅｎｓ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９９２，  ８９（１８）：８６４１−５」又は米国特許第５，６７０，３６０号及び第６，０５１，６８９号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているとおり調製することが可能である。フォルスコリン（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）、アデニル酸シクラ−ゼ活性化因子及びアデニル酸シクラ−ゼの阻害剤、ＰＩ３Ｋ、ＭＡＰＫ又はｐ３８を、アッセイ対照として使用し得る。アゴニスト対照には、ＧＬＰ−１（７−３７）及びエキセンディン−４、強力なＧＬＰ−１アゴニスト及びアンタゴニスト対照には、ＧＬＰ−１受容体アンタゴニストエキセンディン（９−３９）（Ｂａｃｈｅｍ  ＡＧから入手可能）が含まれる。Ｇｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  １９９３  Ｓｅｐ  １５；２６８（２６）：１９６５０−５を参照。検査される各化合物に対して用量応答曲線をプロットし、ＥＣ５０値を計算する。あるいは、ｃＡＭＰは、他のアッセイによって測定し得る。一般的には、これらのアッセイは、本分野において周知である。
【０６７４】
インシュリン分泌は、本発明のＧＬＰ−１ポリペプチドの生物活性の指標でもある。インシュリン分泌のインビトロ研究は、インシュリンＲＩＡ又はＥＬＩＳＡを介して、ＧＬＰ−１ポリペプチド及びグルコースの幅広い濃度とともにインキュベートした後の細胞中で計算することができる。Ｇｒｅｅｎら上記は、ラットＢＲＩＮ−ＢＤ１１β細胞中で、ＧＬＰ−１ポリペプチドの上昇したインシュリン分泌促進効果を評価した。ラット膵島は、あるいは、インシュリン分泌研究において使用し得る（Ｇｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９３  ２６８（２６）１９６５０−１９６５５）。
【０６７５】
あるいは、β膵島細胞の増殖は、ＣＲＥレポ−タ−アッセイとともに、ＸＴＴ又はＢｒｄＵ又はＣＲＥＢ（環状ＡＭＰ応答要素結合タンパク質）転写因子などの試薬を用いて測定し得る。
【０６７６】
その受容体に対する、非天然アミノ酸を含むＧＬＰ−１ポリペプチドの親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭバイオセンサ−（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用することによって測定することが可能である。ＧＬＰ−１受容体結合をモニターするために、成長を調節し、又はＧＬＰ−１を結合する細胞又は細胞株（ヒト細胞などの活性なＧＬＰ−１受容体を含有する細胞又は組換えＧＬＰ−１受容体生成細胞が含まれるが、これらに限定されない。）を使用することが可能である。例えば、ＧＬＰ−１受容体結合をモニターするために、成長を調節し、又はＧＬＰ−１を結合する細胞又は細胞株（ヒト細胞などの活性なＧＬＰ−１受容体を含有する細胞又は組換えＧＬＰ−１受容体産生細胞が含まれるが、これらに限定されない。）を使用することが可能である。
【０６７７】
あるいは、組換えｈＧＬＰ−１受容体が形質移入された細胞（ＣＨＯ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）及びＣＨＬ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｌｕｎｇ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）細胞を含むが、これらに限定されない。）を用いて、結合を測定することも可能である。形質移入されたＣＨＯ細胞での結合研究ついては、上記Ｋｉｍらを、形質移入されたＣＨＬ細胞での研究については、「Ｊ  ＭｏＩ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ２００３  Ｄｅｃ；３１（３）：５２９−４０」を参照。ＧＬＰ−１受容体は、Ｔｈｏｒｅｎｓ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９９２，  ８９（１８）：８６４１−５又は米国特許第５，６７０，３６０号及び第６，０５１，６８９号に記載されているとおりに調製することが可能である。
【０６７８】
ＤＰＰ  ＩＶ又はヒト血漿による本発明のＧＬＰ−１ポリペプチドの分解は、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）又は他の方法によってモニターし得る。本発明のＧＬＰ−１ペプチドは、ＤＰＰ  ＩＶ又はプールされたヒト血漿の何れかとともに、０、６又は１２時間インキュベートし、分析の前に、酵素反応を終了させるためにＴＦＡなどの試薬を添加することができる。引用されている全ての参考文献は、参照により、本明細書に組み込まれる。
【０６７９】
ＧＬＰ−１活性を検査するためのインビボ動物モデルおよびヒト臨床試験には、米国特許出願公開２００４００８２５０７Ａ１；及び２００３０２３２７５４Ａ１（参照により、本明細書中に組み込まれる。）に記載されているものが含まれる。
【０６８０】
本発明のＴ−２０（ＤＰ−１７８）ポリペプチドの活性をモニターするために、多数のアッセイを使用し得る。ＤＰ−１７８ポリペプチドが合胞体形成を阻害する能力又は無細胞ウイルスんいよる感染を阻害する能力を検査するインビトロアッセイは、米国特許第５，４６４，９３３号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているように使用し得る。測定されるパラメ−タは、ペプチドの、ウイルスのある株に対して示される相対的抗ウイルス活性及び／又は株特異的活性が含まれる。細胞融合アッセイは、ＨＩＶによって誘導される合胞体形成をインビトロで阻害するペプチドの能力を検査するために使用し得る。このようなアッセイは、慢性的にＨＩＶ感染された細胞及びアッセイされるべきペプチドの様々な濃度の存在下で、非感染ＣＤ−４＋細胞（Ｍｏｌｔ又はＣＥＭ細胞など（これらに限定されない。））を培養することを含み得る。適切な期間のインキュベ−ション後、細胞融合及び合胞体形成の指標である多核巨大細胞の存在について、培養物が顕微鏡的に調べられる。
【０６８１】
逆転写酵素（ＲＴ）アッセイは、無細胞ＨＩＶによるＣＤ−４＋細胞の感染を阻害するペプチドの能力を検査するために使用し得る。このようなアッセイは、検査すべきペプチドの存在下で、ウイルス及びＣＤ−４＋細胞の適切な濃度（すなわち、ＴＣＩＤ５０）を培養することを含み得る。当業者に周知の培養条件が使用される。ペプチドが添加されていない対照培養物に加えて、幅広いペプチド濃度を使用し得る。培養の適切な期間（例えば、７日）のインキュベ−ション後、標準的な手順を用いて、無細胞上清を調製し、首尾よく感染したことの指標として、ＲＴ活性の存在について検査する。ＲＴ活性は、例えば、Ｇｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｏｆｆ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ，  １９８１，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ３８：２３９−２４８）及び／又はＷｉｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｗｉｌｌｅｙ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６２：１３９−１４７）によって記載されているような標準的な技術を用いて検査し得る。これらの参考文献は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。抗ウイルス活性を測定する他のアッセイが、当業者に公知である。別の抗ウイルス剤との組み合わせ療法を検査するためのこれらのアッセイに対する修飾も、当業者に公知である。
【０６８２】
当業者に周知である標準的な方法は、非レトロウイルス活性をアッセイするために使用し得る。例えば、呼吸器合胞体ウイルス及びパラインフルエンザウイルス活性アッセイ技術の考察については、「Ｐｒｉｎｇｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｉｎｇｌｅ，  Ｃ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ｊ．  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７：３７７−３８６）」を参照されたい。さらに、例えば、このような技術の一般的な総説については、「“Ｚｉｎｓｓｅｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ”，  １９８８，  Ｊｏｋｌｉｋ，  Ｗ．  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，  Ｎｏｒｗａｌｋ，  Ｃｏｎｎ．，  １９ｔｈ  ｅｄ．」を参照されたい。これらの参考文献は、その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。
【０６８３】
好ましいＰＹＹアゴニストは、ＷＯ０２／４７７１２号及び米国特許公開第２００２／０１４１９８５号に記載されているアッセイの１つ（好ましくは、食物摂取、胃内容排出、膵臓分泌又は体重減少アッセイ）において、同じアッセイにおけるＮＰＹの効力を上回る効力を有し得る。
【０６８４】
ＢＳＰ類縁体を作製するためにどの方法を用いるかに関わらず、生物活性に対するアッセイに類縁体を供する。一般に、生物活性に対する試験は、生物活性の増加もしくは低下（非改変ＢＳＰと比較した場合）、異なる生物活性（非改変ＢＳＰと比較した場合）、受容体若しくは結合対親和性分析、ＢＳＰ自体若しくは結合対の立体構造的もしくは構造的変化（非改変ＢＳＰと比較した場合）又は血清半減期分析などの、所望の結果に対する分析を与えるはずである。
【０６８５】
アッセイ法に対する上記の参考例をまとめたものは網羅的ではなく、他のアッセイも所望の最終結果に対する試験に有用であることを当業者は認識するであろう。
【０６８６】
ＸＩＩＬ．効力、機能的インビボ半減期及び薬物動態学的パラメ−タ−の測定
本発明の重要な局面は、水溶性ポリマー部分へのＢＳＰの抱合あり又は無しで、ＢＳＰの構築により得られる生物学的半減期の延長である。ＢＳＰ血清濃度が急激に低下することにより、抱合及び非抱合ＢＳＰ及びそれらのバリアントを用いた治療に対する生物学的反応を評価することが重要となる。好ましくは、本発明の、抱合及び非抱合ＢＳＰならびにそれらのバリアントの血清半減期は、静脈内投与後も長く、これにより、例えばＥＬＩＳＡ法により、又は一次スクリーニングアッセイにより測定することが可能となる。本明細書に記載のとおりにインビボ生物学的半減期の測定を行う。ＧＬＰ−１又はそのバリアントのインビボ半減期を測定するためのアッセイの別の例が、米国特許第５，１１８，６６６号；米国特許出願公開２００４００８２５０７Ａ１；及び２００３０２３２７５４Ａ１に記載されており、参照により、本明細書に組み込まれる。インビボ生物学的半減期の測定は、本明細書に記載されているとおりに実施される。
【０６８７】
非天然コードアミノ酸を含むＧＬＰ−１ポリペプチドの効力及び機能的インビボ半減期は、米国特許第５，１１８，６６６号；米国特許出願公開２００４００８２５０７Ａ１；及び２００３０２３２７５４Ａ１に記載されているプロトコールに従って決定することが可能である。
【０６８８】
非天然コードアミノ酸を含むＧＬＰ−１ポリペプチドに対する薬物動態学的パラメ−タは、正常なＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄ラット（Ｎ＝５動物／処置群）において評価することが可能である。動物は、２５μｇ／ラット静脈内又は５０μｇ／ラット皮下の単回投与の何れかを受け、予め確定された時間（一般に、水溶性ポリマーに抱合されていない、非天然コードアミノ酸を含むＧＬＰ−１ポリペプチドの場合には、約６時間、非天然コードアミノ酸を含み、水溶性ポリマーに抱合されているＧＬＰ−１ポリペプチドの場合には、約４日に及ぶ。）に従って、約５−７個の血液試料を採取する。ＧＬＰ−１に対する薬物動態データは、幾つかの種において詳しく研究されており、非天然コードアミノ酸を含むＧＬＰ−１に対して得られたデータに対して直接比較することが可能である。
【０６８９】
本発明のＧＬＰ−１ペプチドを評価するために使用し得る動物モデルには、脂肪Ｚｕｃｋｅｒ（ｆａ／ｆａ；ＺＤＦ）ラット、ｏｂ／ｏｂマウス及びｄｂ／ｄｂマウスが含まれるが、これらに限定されない。これらのモデルは、単一遺伝子の劣性遺伝によって生じる（Ｂｒａｙ，  Ｇ．  Ａ．  １９７７．  Ｆｅｄ  Ｐｒｏｃ．  ３６：１４８−１５３；  Ｂｒａｙ，  Ｇ．  Ａ．  ａｎｄ  Ｄ．  Ａ．  Ｙｏｒｋ．  １９７９．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ５１：５９８−６４６；  Ｋａｓｉｓｋｅ，  Ｂ．．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  １９９２．  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  １９  Ｓｕｐｐｌ．  １：１１１０−１１１５；  Ｂｒａｙ，  Ｇ．  Ａ．  １９９２．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎｕｔｒ．  ５５  Ｓｕｐｐｌ．  ４８８Ｓ−４９４Ｓ）。ＧＬＰ−１受容体ノックアウト（ＧＬＰ−１Ｒ−／−）マウスは、本発明のＧＬＰ−１分子のグルコース低下効果が機能的ＧＬＰ−１受容体に依存することを示す動物研究において使用することもできる。（米国特許第５，８４６，９３７号、Ｓｃｒｏｃｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  １９９６  Ｎｏｖ；２（ｌｌ）：１２５４−８，  Ｓｃｒｏｃｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １９９６  ４５：２１  Ａ）。ｄｂ／ｄｂマウスは、遺伝的に肥満且つ糖尿病のマウス株である。ｄｂ／ｄｂマウスは、その肥満の発症と同時に、高血糖と高インシュリン血症を発症し、このため、肥満２型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）のモデルとして役に立つ。ｄｂ／ｄｂマウスは、例えば、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｍａｉｎｅ）から購入できる。「Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １９９９  ４８：１０２６−１０３４」は、脂肪Ｚｕｃｋｅｒ（ｆａ／ｆａ）ラット、ｏｂ／ｏｂマウス、ｄｂ／ｄｂマウス及び糖尿病アカゲザルにおいて、非修飾ＧＬＰ−１を、エキセンディン−４と比較する研究を記載している。Ｚｕｃｋｅｒ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｆａｔｔｙ  ｆａ／ｆａ（ＺＤＦ）ラットはインシュリン抵抗性であるが、生まれたときから正常血糖であり、約７週から１０週齢までに糖尿病を発症する。移行期の間、動物は、耐糖能障害状態を経験する。糖尿病が発症する前および糖尿病の初期段階の間、動物は高インシュリン血症であるが、後に、グルコース刺激されたインシュリン分泌を喪失し、最後に、ほぼ完全にインシュリン欠乏状態となる。
【０６９０】
ｄｂ／ｄｂ又はｏｂ／ｏｂマウスは、非天然コードアミノ酸又はエキセンディン−４を、比較測定因子として含むＧＬＰ−１ペプチドを投薬する。化合物は、０．１μｇ／投薬皮下で投与され、血漿グルコース、グルカゴン及び血中インシュリン、体重減少及び食欲減退効果のレベルが、２つの集団間で比較される。  結果は、本発明のＧＬＰ−１ペプチドの投薬頻度が、エキセンディン−４に比べて、より少なく、且つ半減期が延長するという優れた結果を示す。ＧＬＰ−１受容体ノックアウトマウスでの研究は、「Ｂａｇｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ（２００４）  ５３：２４９２−２５００」に記載されているとおりに実施し得る。
【０６９１】
ＧＬＰ−１活性並びにＧＬＰ−１融合物及び類縁体の活性を検出するために、数多くの方法が存在する。Ｇｅｌｆａｎｄらに付与されたＥＰ  ６１９，３２２及び米国特許第５，１２０，７１２号に記載されているアッセイなどのアッセイは、インビトロでのＧＬＰ−１活性を検査するために使用し得る。米国特許公開ＵＳ２００４００５３３７０  Ａ１（参照により、本明細書に組み込まれる。）は、ＧＬＰ−１類縁体及び融合タンパク質並びにペプチドのインビボ半減期に対する効果も記載している。インビボ研究から得られる血清ＧＬＰ−１濃度は、ＥＬＩＳＡによって測定され得る（Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏ．）。
【０６９２】
ＤＰ−１７８が、ＢＴＶの細胞内への侵入を阻害する能力は、インビトロ（例えば、合胞体アッセイ、感染性アッセイ）又はインビボで（例えば、適切な動物モデル又はヒトで）評価することが可能である。ＨＩＶ感染したヒトへ静脈内投与されたＤＰ−１７８の安全性、薬物動態及び抗ウイルス活性は、「Ｋｉｌｂｙ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９８）  ４（ｌｌ）：１３０２−１３０７」に記載されている。同様の研究は、本発明のＤＰ−１７８を用いて実施し得る。
【０６９３】
血清、中枢神経系（ＣＮＳ）組織若しくは流体、脳脊髄液（ＣＳＦ）又は哺乳類対象の他の組織若しくは流体中のペプチドＹＹの濃度を測定するための手順は、ペプチドＹＹに対する免疫アッセイによって決定し得る。例えば、ペプチドＹＹに対するラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）及び免疫組織化学又は免疫蛍光のための抗体試薬を使用し得る。ＰＹＹ活性を検査するためにインビボ動物モデル及びヒト臨床試験には、米国特許出願公開２００５０００２９２７号に記載されているものが含まれている。
【０６９４】
当技術分野で公知の様々なアッセイにより、本発明によるＢＳＰの比活性を調べることができる。本明細書中に記載の、又は本明細書中で参照した、又は当業者にとって公知の方法により、本発明に従い調製し精製した、ＢＳＰ突然変異体又はそれらの断片の生物活性を試験することができる。
【０６９５】
ＸＩＶ．投与及び医薬組成物
以下に限定されないが、適切な製薬担体と組み合わせるなどして、治療用途のために、本発明の、ポリペプチド又はタンパク質（以下に限定されないが、ＢＳＰ、シンテターゼ、１又は複数の非天然アミノ酸を含有するタンパク質など。）を場合によっては使用することができる。このような組成物は、例えば、化合物の治療的有効量と医薬適合性の担体又は賦形剤とを含有する。このような担体又は賦形剤としては、以下に限定されないが、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロ−ス、水、グリセロール、エタノール及び／又はそれらの組合せが挙げられる。投与様式に適切となるように処方物を調製する。一般に、タンパク質の投与方法は、当技術分野で周知であり、本発明のポリペプチドの投与に適用することができる。
【０６９６】
当技術分野で周知の方法に従い、本発明の１又は複数のポリペプチドを含有する治療用組成物を、場合によっては１又は複数の適切なインビトロ及び／又はインビボ疾患動物モデルにおいて試験し、有効性、組織代謝を確認し、投与量を推定する。特に、投与量は最初、天然アミノ酸ホモローグに対する本明細書中の非天然物（以下に限定されないが、天然アミノ酸ＢＳＰに対する、１又は複数の非天然アミノ酸を含むように修飾されたＢＳＰの比較など。）の、活性、安定性又はその他の適切な指標により、即ち、適切なアッセイにおいて、決定することができる。
【０６９７】
投与は、血液又は組織細胞と最終的に接触するように分子を導入するために通常使用されるあらゆる経路による。何らかの適切な様式で、場合によっては１又は複数の医薬適合性の担体とともに、本発明の非天然アミノ酸ポリペプチドを投与する。本発明の関連におけるこのようなポリペプチドを患者に投与する適切な方法が利用可能であるが、複数の経路を用いて特定組成物を投与することができ、特定経路によって、別の経路よりも迅速かつ効果的な作用又は応答を得られることが多い。
【０６９８】
一部、投与する特定の組成物によって、ならびに、組成物を投与するのに使用する特定の方法によって、医薬適合性の担体を決定する。したがって、本発明の医薬組成物の多岐にわたる適切な処方がある。
【０６９９】
以下に限定されないが、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、皮下、局所、舌下又は直腸手段などの多くの経路により、ポリペプチド組成物を投与することができる。リポソ−ムを介して修飾又は非修飾の非天然アミノ酸ポリペプチドを含有する組成物を投与することもできる。このような投与経路及び適切な処方は通常、当業者にとって公知である。
【０７００】
単独又はその他の適切な成分と組み合わせて非天然アミノ酸を含有するＢＳＰをエアロゾル製剤に調製して（即ち、これらは「霧状」にすることができる。）、吸入により投与することもできる。加圧された許容可能なプロペラント（ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など。）にエアロゾル製剤を入れることができる。
【０７０１】
例えば、関節内投与（関節中に）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内及び皮下経路などの非経口投与に適切な処方としては、水性及び非水性の等張滅菌注射溶液（抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬及び、処方物を投与する受容者の血液と等張にする溶質を含有し得る。）及び、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤及び保存料を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。アンプル及びバイアルなど、単位用量又は複数回用量の密封容器において、パッケ−ジ化ＢＳＰの調合物を提供することができる。
【０７０２】
非経口投与及び静脈内投与は好ましい投与方法である。特に、現在使用されている処方物とともに、天然アミノ酸ホモローグ治療薬に対して既に使用されている投与経路（以下に限定されないが、ＧＬＰ−１、ＤＰ−１７８、ＰＹＹ、ＥＰＯ、ＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ、インターロイキン、抗体及び／又は何らかの他の医薬として送達されるタンパク質に対して通常使用されるものなど。）は、本発明のポリペプチドに対する好ましい投与経路及び処方を与える。
【０７０３】
本発明に関連して、患者へ投与する用量は、時間とともに患者において有効な治療応答を有するのに十分なものであるか、又は、適用に依存して、以下に限定されないが病原体による感染又はその他の適切な活性を阻害するためなどに十分なものである。特定のベクターもしくは処方の効率及び使用する非天然アミノ酸ポリペプチドの活性、安定性もしくは血清半減期及び患者の状態、ならびに処置する患者の、体重もしくは表面積により、用量を決定する。特定の患者における、特定のベクター、処方などの投与に付随する何らかの不都合な副作用の、存在、性質及び程度によっても、用量サイズが決定される。
【０７０４】
疾患（以下に限定されないが、癌、遺伝性疾患、糖尿病、ＡＩＤＳなど。）の治療又は予防において投与するベクター又は処方の有効量を決定する場合、医師は、循環血漿レベル、処方の毒性、疾患の進行及び／又は適切な場合は、抗非天然アミノ酸ポリペプチド抗体の産生を評価する。
【０７０５】
例えば、７０ｋｇの患者に投与する用量は、通常、現在使用されている治療用タンパク質の投与量と等しい範囲であり、関連組成物の活性又は血清半減期の変化に対して調節される。本発明のベクターは、抗体投与、ワクチン投与、細胞毒性物質、天然アミノ酸ポリペプチド、核酸、ヌクレオチド類似体、生物反応調節物質などの投与をはじめ、何らかの公知の従来の治療による治療状態を補完することができる。
【０７０６】
投与に対して、以下に限定されないが大部分及び全体的な患者の健康に対して適用する場合を含め、関連処方のＬＤ−５０又はＥＤ−５０及び／又は様々な濃度での非天然アミノ酸の何らかの副作用の観察により決定した速度で本発明の処方物を投与する。単回投与又は分割投与で投与を行うことができる。
【０７０７】
処方物の注入を行っている患者が発熱、悪寒又は筋肉痛を発症した場合、その患者にアスピリン、イブプロフェン、アセトアミドフェン又はその他の疼痛／発熱制御薬の適量を与える。発熱、筋肉痛及び悪寒など、注入に対する反応が出たことがある患者には、それ以降の注入の３０分前に、アスピリン、アセトアミドフェン又は以下に限定されないがジフェンヒドラミンなどの何れかを前もって与える。解熱剤及び抗ヒスタミン剤に対して迅速に応答しないより重度の悪寒及び筋肉痛には、メペリジンを使用する。反応の重症度によって、細胞注入の速度を遅くするか、又は中断する。
【０７０８】
動物対象に、本発明のヒトＢＳＰを直接投与することができる。投与は、ＢＳＰを対象に導入するために通常使用される何れかの経路による。本発明の実施形態によるＢＳＰ組成物には、経口、直腸、局所、吸入（以下に限定されないが、エアロゾルを介したものなど。）、口腔内（以下に限定されないが、舌下など。）、膣内、非経口（以下に限定されないが、皮下、筋肉内、皮内、関節内、胸膜内、腹腔内、脳内、動脈内又は静脈内など。）、局所（即ち、皮膚及び粘膜表面の両方、気道表面を含む。）及び経皮投与に適切なものが含まれるが、いかなる場合も、最適な経路は、治療する状態の性質及び重症度に依存する。投与は局所又は全身投与の何れかであり得る。アンプル及びバイアルなどの、単位用量又は複数回用量の密封容器において化合物の処方物を与え得る。単位用量の注射用形態（以下に限定されないが、溶液、懸濁液又はエマルジョンなど。）での医薬適合性の担体との混合物において本発明のＢＳＰを調製することができる。持続注入（以下に限定されないが、浸透圧ポンプなどのミニポンプなどを用いる。）、単一ボ−ラス又は徐放デポ−製剤により、本発明のＢＳＰを投与することもできる。
【０７０９】
投与に適切な処方としては、水性及び非水性の溶液、等張滅菌注射溶液（抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬及び、等張にする溶質を含有し得る。）及び、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤及び保存料を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。既に述べられた種類の、滅菌粉末、顆粒及び錠剤から、溶液及び懸濁液を調製し得る。
【０７１０】
本発明の医薬組成物は、医薬適合性の担体を含有し得る。一部、投与する特定の組成物によって、ならびに、組成物を投与するのに使用する特定の方法によって、医薬適合性の担体を決定する。したがって、様々な、本発明の医薬組成物の適切な処方がある（任意の医薬適合性の担体、賦形剤又は安定化剤を含む。）（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、１９８５を参照。）。
【０７１１】
適切な担体には、リン酸塩、ホウ酸塩、ＨＥＰＥＳ、クエン酸塩及びその他の有機酸を含有する緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノ−ス又はデキストリンを含む、単糖類、二糖類及びその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；亜鉛、コバルト又は銅などの二価金属イオン；マンニト−ル又はソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／又はＴｗｅｅｎＴＭ、ＰｌｕｒｏｎｉｃｓＴＭなどの非イオン性界面活性剤又はＰＥＧが含まれる。
【０７１２】
徐放システムにより、又は徐放システムの一部として、ＰＥＧなどの水溶性ポリマーに連結しているものを含む、本発明のＢＳＰを投与することもできる。徐放組成物としては、以下に限定されないがフィルム又はマイクロカプセルなどの、造形品の形態の半透性ポリマーマトリクスが挙げられる。徐放マトリクスには、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２）、エチレンビニルアセテ−ト（Ｌａｎｇｅｒら、前出）又はポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）、ポリラクチド（ポリ乳酸）（米国特許第３，７７３，９１９号；ＥＰ５８，４８１）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチド共グリコリド（乳酸とグリコール酸とのコポリマー）ポリ無水物、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｕ．Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、２２、５４７−５５６（１９８３）、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラ−ゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖類、核酸、ポリアミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシンなどのアミノ酸、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドン及びシリコ−ンなどの生体適合性の物質由来のものが含まれる。徐放組成物にはまた、リポソ−ムに封入された化合物が含まれる。それ自身公知の方法により、化合物を含有するリポソ−ムを調製する：ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本特許公開８３−１１８００８；米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号；及びＥＰ１０２，３２４。引用した参考文献及び特許は全て本明細書中に参照により組み込む。
【０７１３】
例えばＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願８３−１１８００８；米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号；及びＥＰ１０２，３２４に記載の方法により、リポソ−ム中に封入されたＢＳＰを調製することができる。組成物及びリポソ−ムサイズは周知であるか、又は当業者により実験的に容易に決定可能である。リポソ−ムのいくつかの例が、例えばＰａｒｋ  ＪＷら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：１３２７−１３３１（１９９５）；Ｌａｓｉｃ  Ｄ及びＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ  Ｄ（編）：Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｌｙｐｏｓｏｍｅｓ（１９９８）；Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ＤＣら、Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｔｅｉｃｈｅｒ  Ｂ（編）：Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２００２）；Ｐａｒｋ  ＪＷら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．８：１１７２−１１８１（２００２）；Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＵＢら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １５９１（１−３）：１０９−１１８（２００２）；Ｍａｍｏｔ  Ｃら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：３１５４−３１６１（２００３）に記載されている。引用した参考文献及び特許は全て本明細書中に参照により組み込む。
【０７１４】
本発明に関連して、患者へ投与する用量は、時間とともに患者において有効な応答を生じさせるのに十分なものである。一般に、非経口投与する本発明のＢＳＰの、投与あたりの総医薬的有効量は、約０．０１μｇ／ｋｇ／日から約１００μｇ／ｋｇ、又は約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇ（患者体重）の範囲であるが、これは治療での判断に委ねられる。投与頻度もまた、治療での判断に委ねられ、ヒトでの使用が認可されている市販のＢＳＰ製品よりも多い又は少ない頻度であり得る。一般に、上述の何れかの投与経路により、本発明のＰＥＧ化ＢＳＰを投与することができる。
【０７１５】
ＸＶ．本発明のＢＳＰの治療的使用
本発明のＢＳＰは、多岐にわたる疾患を治療するのに有用である。
【０７１６】
本発明のＢＳＰ製品の投与は、ヒトにおける他のＢＳＰ調製物によって示される活性の何れかをもたらす。ＢＳＰアゴニスト又はアンタゴニストによって影響を受け得る疾患（単独で、又は症状もしくは疾患の一部としての何れか。）に罹患しているヒト患者への様々な手段による投与に効果的な強度で、ＢＳＰ製品を含有する医薬組成物を処方し得る。ＢＳＰの平均量は変化し得、特に、有資格の医師の推奨及び指示に基づくものであるべきである。ＢＳＰの正確な量は、治療する正確な状態のタイプ、治療する患者の状態ならびに組成物中の他の成分などの因子に対する選択性の問題である。本発明はまた、別の活性剤の治療的有効量を投与することを提供する。与える量は、ＢＳＰを用いた治療に基づき、当業者により容易に決定し得る。
【０７１７】
本発明のポリペプチド及び融合タンパク質は、多様な疾病及び症状を治療するために使用することが可能である。本発明のＧＬＰ−１ポリペプチド及び融合タンパク質は、主として、「ＧＬＰ−１受容体」と称される受容体に作用することによってそれらの生物学的効果を発揮する。ＧＬＰ−１受容体刺激に対して、又はＧＬＰ−１化合物の投与に対して好ましく応答する疾病及び／又は症状を有する被験者は、従って、本発明のＧＬＰ−１ポリペプチド及び融合体タンパク質で治療することが可能である。これらの対象は、「ＧＬＰ−１化合物での治療を必要としている」又は「ＧＬＰ−１受容体刺激を必要としている」と称される。包含されるのは、非インシュリン依存性糖尿病、ンシュリン依存性糖尿病、発作（ＷＯ００／１６７９７号）、心筋梗塞（ＷＯ９８／０８５３１）、肥満（ＷＯ９８／１９６９８）、手術後の異化の変化（米国特許第６，００６，７５３号）、機能的消化不良及び刺激性腸症候群（ＷＯ９９／６４０６０号）を有する対象である。ＧＬＰ−１化合物を用いた予防的処置を必要とする対象、例えば、非インシュリン依存性糖尿病を発症するリスクがある対象も含まれる（ＷＯ００／０７６１７号を参照）。耐糖能障害又は空腹時血糖異常又を有する対象、当該対象の身長と体格に対して、その体重が正常な体重を約２５％上回る対象、部分的膵臓切除術を受けた対象、非インシュリン依存性糖尿病を有する１人又は複数の親を持つ対象、妊娠性糖尿病を有したことのある対象、及び急性又は慢性膵炎を有したことのある対象が、非インシュリン依存性糖尿病を発症するリスクを有する。
【０７１８】
本発明は、アルブミンタンパク質、アルブミン断片、アルブミン類縁体、Ｆｃタンパク質、Ｆｃ断片、Ｆｃ類縁体、水溶性ポリマー又は脂肪酸に融合されているために、改善された生化学的及び生物物理学的特性を有するＧＬＰ−１化合物を含む。これらの異種タンパク質は、宿主細胞中で首尾よく発現され、ＧＬＰ−１受容体の活性化を伴うシグナル伝達活性を保持し、延長された半減期を有し得る。
【０７１９】
ＤＰ−１７８の治療的使用には、ＨＩＶ−１感染を治療すること又はＨＩＶ−１複製を阻害することが含まれるが、これらに限定されない。本発明のＤＰ−１７８ペプチドは、好ましくは抗ウイルス活性を示す。このため、ＤＰ−１７８ペプチドは、ヒト及び非ヒトウイルス及びレトロウイルス、特にＨＩＶの非感染細胞への伝達の阻害剤として使用し得る。本発明のペプチドによってその伝達が阻害され得るヒトレトロウイルスウイルスには、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２及びヒトＴリンパ球ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ及びＩＩ）の全ての株が含まれるが、これらに限定されない。本発明のペプチドによってその伝達が阻害され得る非ヒトレトロウイルスには、ウシロイコ−シスウイルス、ネコ肉腫及び白血病ウイルス、ネコ免疫不全症、肉腫及び白血病ウイルス、並びにヒツジ進行性肺炎ウイルスが含まれるが、これらに限定されない。本発明のペプチドによってその伝達が阻害され得る非レトロウイルスウイルスには、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、イヌジステンパ−ウイルス、ニュ−キャッスル病ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス及びインフルエンザウイルスが含まれるが、これらに限定されない。本発明は、さらに、少なくとも１つの他の治療剤（抗ウイルス剤を含むが、これに限定されない。）を用いた組み合わせ療法において、前記ペプチドを用いて上記レトロウイルス及び非レトロウイルスウイルスを治療することを包含する。
【０７２０】
ＰＹＹの治療的使用には、肥満、糖尿病、潰瘍、刺激性腸疾患及び炎症性腸疾患などの胃腸症状又は細胞増殖、栄養素の輸送並びに腸の水及び電解質分泌の内分泌制御を伴う任意の症状が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＰＹＹの治療的使用には、代謝的症状又は疾患、特に、カロリ−の利用性を低減することによって緩和できる代謝的症状又は疾患、例えば、摂食障害、インシュリン抵抗性症候群（シンドロ−ムＸ）、耐糖能障害、異脂肪血症及び心血管疾患の治療も含まれる。
【実施例】
【０７２１】
次の実施例は、説明のために与えるものであり、主張する発明を制限するものではない。
【０７２２】
（実施例１）
この実施例は、非天然コードアミノ酸をＧＬＰ−１に取り込むのに好ましい部位の選択に対する、総低可能な多くの一連の基準のうちの幾つかを説明する。
【０７２３】
本実施例は、非天然コードアミノ酸の導入にために、どのようにＧＬＰ−１ポリペプチド内の好ましい部位を選択するかを示す。本実施例で使用される配列の付番は、配列番号２に示されているＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ酸配列に従う。引用されている位置番号は、別段の記載がなければ、ペプチドの位置７−３７に基づいている。例えば、８位は、配列番号２の２番目のアミノ酸に対応する。当業者であれば、配列番号１、２、３又は他の任意のＧＬＰ−１分子中に容易に特定できる、配列番号２中の位置に対応するアミノ酸位置を容易に理解できるであろう。ＧＬＰ−１の潜在的なαヘリックス構造のモデル構築は、「Ｎｅｉｄｉｇｆｃｕ  Ｊ．  Ｗ．  Ｆｅｓｉｎｍｅｙｅｒ．  Ｒ．  Ｍ．，  Ｐｒｉｃｋｅｔｔ  Ｋ．  Ｓ．，  Ａｎｄｅｒｓｅｎ，  Ｎ．  Ｈ．：Ｅｘｅｎｄｉｎ−４  ａｎｄ  Ｇｌｕｃａｇｏｎ−Ｌｉｋｅ−Ｐｅｐｔｉｄｅ−１：ＮＭＲ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｉｃｅｌｌｅ−  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０  ｐｐ．  １３１８８（２００１）」から得られるＰＤＢ  ＩＤ  １ＪＲＪに基づいて行った。次の基準を使用して、非天然コードアミノ酸の導入のためのＧＬＰ−１の各位置を評価する：残基は、（ａ）アラニンスキャニング突然変異誘発により影響を受けるべきでなく（Ａｄｅｌｈｏｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  ｏｆ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９４  ２６９（９）：６２７５−６２７８）、（ｂ）表面に曝露されており、周囲の残基と、最小のファンデルワ−ルス力もしくは水素結合相互作用を示すべきであり、（ｃ）ＧＬＰ−１バリアント中の活性に影響を与えずに変化可能であることができ、又は非必須であることができ、（ｄ）非天然コードアミノ酸での置換において保存的置換をもたらし、（ｅ）非常に柔軟性の高い領域又は構造的に剛直な領域の何れかで見出され得る。さらに、モデル構造に基づいて、Ｃｘプログラム（Ｐｉｎｔａｒら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１８、ｐｐ。９８０）を利用してＧＬＰ−１分子に対してさらなる計算を行い、ペプチドの各タンパク質原子に対する突出の程度を調べた。その結果、ある実施形態において、
ＧＬＰ−１の以下の位置のうちの１又は複数（配列番号２及び他のＧＬＰ−１中の対応するアミノ酸のように）において（これらに限定されない）非天然コードアミノ酸が置換される。７位（すなわち、Ｎ末端）の前、１９、２３、２６、２７、２８、２９、３０又は３３。幾つかの実施形態において、本発明のＧＬＰ−１ポリペプチドは、以下の位置の１又は複数に、１又は複数の天然に存在しないアミノ酸を含み、アンタゴニストを提供する。
２２、１８、２９、２５、３２、２１、２８、１７、２４、３１及び２０。
ＧＬＰ−１融合タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ部分を含み得る。
図１は、ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質を含むＧＬＰ−１二量体ポリペプチドのダイアグラムである。２つのＧＬＰ−１ポリペプチドが、リンカー配列を介して、ヒトＩｇＧＩに連結されている。各ＧＬＰ−１ポリペプチドのＣ末端は、ＩｇＧＩのＦｃ部分に融合されているリンカー配列（Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）に融合されている。ＧＬＰ−１ポリペプチドは、１、２又は３位（１位＝ＧＬＰ−１（配列番号２）の第１のアミノ酸）に非天然コードアミノ酸を含む。ＧＬＰ−１に対するさらなる修飾は、８−１２、１６位のＡｌａの置換又はＡｒｇの欠失を含む（１位＝ＧＬＰ−１の第一のアミノ酸）。
【０７２４】
図４は、エクセンディン又はＧＬＰ−１類縁体の設計戦略のダイアグラムを示している。１つの戦略は、ＧＬＰ−１のヘリックスの核生成をエントロピ−的に捕捉するために、ＧＬＰ−１中に取り込まれた非天然コードアミノ酸を使用することである。
非天然アミノ酸を用いた置換には、ヘリックス機能を最適化するために、αヘリックスの保存されていない領域に沿った残基が含まれるが、これに限定されない。別の戦略は、ヘリックス形成を固定固定するために、ＧＬＰ−１中に存在する２以上の非天然アミノ酸を連結することである。非天然アミノ酸を用いた置換には、αヘリックスの保存されていない領域に沿った残基が含まれるが、これに限定されない。生じ得る免疫原性を調節するために、連結部位近くへのポリ（エチレングリコール）の付加を行い得る。図５−特定の構造的特徴を有するＧＬＰ−１類縁体の設計戦略のダイアグラムが示されている。生合成経路：利点−Ｃｙｓ抱合のためのフォ−マットにおける費用、均一性、柔軟性。重要な観察：１）エキセンディン−４は、Ａ８Ｇを除き、ＧＬＰ−１と最初の１０アミノ酸を共有する；２）Ａ８Ｇ置換は、ＧＬＰ−１では、ＤＰＰＩＶに対して感受性があるが、エキセンディン−４では感受性がない；３）エキセンディン−４は、Ｙ２８、Ｗ３３位への芳香族の積層に基づくヘリックス構造を有するが、ＧＬＰ−１には見られない。結論：ヘリックス構造を促進するための非天然アミノ酸置換は、安定性を保持するとともに、効力を増強することが可能である．．．Ｙ２８の好ましい部位。
【０７２５】
代謝的安定性の改善、ヘリックス構造の安定化、発生し得る分子の凝集の減少及び受容体結合親和性の調節への寄与に関して、残基を評価した。ＧＬＰ−１受容体−リガンド相互作用のモデルは、「Ｌｏｐｅｚ  ｄｅ  Ｍａｔｕｒａｎａ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８，  １０１９５−１０２００」中に示されている。
【０７２６】
幾つかの実施形態において、ＧＬＰ−１中の任意の位置（最初のアミノ酸（アミノ末端に位置する）の前、カルボキシ末端における付加又はこれらのあらゆる組み合わせ）に、１又は複数の非天然コードアミノ酸が取り込まれる。幾つかの実施形態において、本発明のＧＬＰ−１ポリペプチドは、以下の位置に、１又は複数の非天然コードアミノ酸を含む。７Ｈ、８Ａ、９Ｅ、Ｖ１６、１７Ｓ、１８Ｓ、１９Ｙ、２ＯＬ、２１Ｅ、２２Ｇ、２３Ｑ、２４Ａ、２５Ａ、２６Ｋ、２７Ｅ、２８Ｆ、２９Ｉ、３０Ａ、３１Ｗ、３２Ｌ、３３Ｖ、３４Ｋ、３５Ｇ、３６Ｒ、３７Ｇ、３８位の（すなわち、カルボキシ末端の）付加又はこれらの任意の組み合わせ。幾つかの実施形態において、本発明のＧＬＰ−１ポリペプチドは、以下の位置に、１又は複数の非天然コードアミノ酸を含む。１８Ｓ、１９Ｙ、２０Ｌ、２２Ｇ、２３Ｑ、２５Ａ、２６Ｋ、２７Ｅ、３０Ａ、アミノ酸Ｗ３１ないしＧ３７の何れか、３８位（すなわち、カルボキシ末端）への付加又はこれらの任意の組み合わせ。好ましい実施形態では、ＧＬＰ−１ポリペプチドは、１９Ｙ、２３Ｑ、２６Ｋ、２７Ｅ、３０Ａ又は３８位（すなわち、カルボキシ末端）に、非天然コードアミノ酸を含む。幾つかの実施形態において、前記非天然コードアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。幾つかの実施形態において、水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分である。幾つかの実施形態において、非天然コードアミノ酸は、リンカーを用いて、水溶性ポリマーに連結されている。幾つかの実施形態において、非天然コードアミノ酸は、生物分解可能なリンカーを用いて、水溶性ポリマーに連結されている。幾つかの実施形態において、生物分解可能なリンカーは、ＢＳＰを含むプロドラッグを形成するために使用することが可能である。このプロドラッグアプローチの一例では、水溶性ポリマーがＧＬＰ−１活性を遮断し、リンカーの分解が活性なＧＬＰ−１を放出する。幾つかの実施形態において、非天然コードアミノ酸は、リンカーによって、アシル部分又はアシル鎖に連結されている。幾つかの実施形態において、非天然コードアミノ酸は、ポリ（エチレングリコール）リンカー又はプロドラッグによって、アシル部分又はアシル鎖に連結されている。幾つかの実施形態において、前記非天然コードアミノ酸は、血清アルブミンに連結されている。幾つかの実施形態において、非天然コードアミノ酸は、リンカーによって、血清アルブミンに連結されている。幾つかの実施形態において、リンカーは、ポリ（エチレングリコール）又はプロドラッグである。幾つかの実施形態において、リンカーは二重切断プロドラッグであり、二重切断プロドラッグでは、段階１がアルブミンなどの分子の制御された放出であり、段階２がリンカー又はその一部を放出する第二の放出である。
【０７２７】
ＧＬＰ−１ポリペプチドに対する別の戦略は、ＧＬＰ−１分子中に存在する非天然コード２つのアミノ酸の間に分子内架橋を形成することを含む。架橋は、分子のαヘリックス構造を強化し、ペプチダーゼ又はプロテアーゼ消化を抑制し、溶解度を増加し、及び／又はポリペプチドのＰＫ／ＰＤプロファイルを改善するために形成され得る。ＧＬＰ−１分子は、１又は複数の非天然コードアミノ酸を含む。２つの架橋された残基のうち１つは、非天然コードアミノ酸又は天然にコードされるアミノ酸としてもよい。非天然コード２つのアミノ酸又は非天然コードアミノ酸と天然にコードされているアミノ酸は、リンカー、ポリマー又は生物学的に活性な分子によって連結されることができる。２つのアミノ酸間の連結は、２つのアミノ酸間の共有結合を通じて行い得る。架橋に関与するリンカー又はポリマーは、二官能性リンカー又は二官能性ポリマーであり得る。  幾つかの実施形態では、前記非アミノ酸が、親水性架橋（ミニＰＥＧ）によって連結される。図６は、分子内架橋によって連結され得る多数の潜在的残基の一群を示している。幾つかの実施形態では、分子内架橋は、１６と１９又は２０、又は１６及び２３；１９及び２３又は１９及び２６；２０及び２７；２３及び２６又は２７、又は２３及び３０；２７及び３０又は３１又は２７及び３３又は３４；３０及び３４の間に形成される。残基１７−３３は、αヘリックス構造を形成する。分子内架橋に対して想定され得る化学的戦略が、図７として示されている。非天然コードＧＬＰ−１中のアミノ酸は、リンカー、ポリマー又は生物学的に活性な分子によって、同じポリペプチド中に存在する非天然コードアミノ酸に連結される。リンカー、ポリマー又は生物学的に活性な分子に付着される、天然にコードされるアミノ酸は、アミノ酸置換の結果であり得る。
【０７２８】
上記戦略の何れかと組み合わせて、ＧＬＰ−１ポリペプチドは、１又は複数のアミノ酸置換を含み得る。幾つかの実施形態では、ＧＬＰ−１ポリペプチドは、以下の置換の１又は複数を含む。８ＡをＧに；１６ＶをＦ又はＬに；２２ＧをＥに；３０ＡをＥに；３４ＫをＲに。幾つかの実施形態において、ＧＬＰ−１ポリペプチドは、以下の置換の１つを含む。８ＡをＶに、又は８ＡをＳに。幾つかの実施形態において、ＧＬＰ−１ポリペプチドは、システインによる１又は複数の置換を含む。幾つかの実施形態において、ＧＬＰ−１ポリペプチドは、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３位における１若しくは複数のシステイン置換又はこれらの任意の組み合わせを含む。  幾つかの実施形態において、化学的に反応性のあるシステインは、水溶性ポリマー又はアシル部分に抱合されている。幾つかの実施形態において、ＧＬＰ−１ポリペプチドは、ヘリックスの保存されていない表面内の残基に、１又は複数の親水性アミノ酸置換を含む。
【０７２９】
（実施例２）
本実施例は、Ｅ．コリ中での、非天然コードアミノ酸を含むＢＳＰの発現について詳述する。宿主細胞中のＧＬＰ−１の単離及びＧＬＰ−１の産生は、例えば、米国特許第５，１１８，６６６号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
【０７３０】
オルソゴナルｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及びオルソゴナルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＯＲＳ）を含有する、導入した翻訳系を使用して、非天然コードアミノ酸を含有するＢＳＰを発現させる。Ｏ−ＲＳは、非天然コードアミノ酸を有するＯ−ｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化する。次に、この翻訳系は、コードされたセレクターコドンに反応して、ＢＳＰに非天然コードアミノ酸を挿入する。
【０７３１】
【表２】
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【０７３２】
改変されたＢＳＰ遺伝子を含有するプラスミド及びオルソゴナルアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡペア（所望の非天然コードアミノ酸に特異的。）を用いたＥ．コリの形質転換により、非天然コードアミノ酸のＢＳＰへの部位特異的取り込みが可能となる。特定の非天然コードアミノ酸０．０１から１００ｍＭを含有する培地中、３７℃にて増殖させた形質転換したＥ．コリは、高い忠実度かつ効率で修飾ＢＳＰを発現する。Ｅ．コリ宿主細胞により、封入体又は凝集体として、非天然コードアミノ酸を含有するＨｉｓタグ付加ＢＳＰが産生される。凝集体を可溶化し、６ＭグアニジンＨＣｌの変性条件下でアフィニティー精製を行う。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、４０μＭ  ＣｕＳＯ４及び２％（ｗ／ｗ）サルコシル中で４℃にて一晩透析することにより、リフォールディングを行う。次に、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２に対して物質を透析し、次いでＨｉｓタグを除去する。Ｂｏｉｓｓｅｌら、（１９９３）２６８：１５９８３−９３を参照のこと。ＢＳＰの精製方法は当技術分野で周知であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット分析又はエレクトロスプレ−イオン化法イオントラップマススペクトロメトリーなどにより確認する。
【０７３３】
図８は、ＧＬＰ−１発現のための構築物を示している。隣接するＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位を有するＧＬＰ−１挿入物を得るために、プライマー対を設計した。ＧＬＰ−１プライマーをアニ−ルし、ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで消化された発現ベクター中に連結した。発現ベクターは、Ｔ７プロモーター、Ｎ末端Ｈｉｓタグ、及びＧＬＰ−１挿入物の上流にあるＴｒｐＬＥリーダーポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む。ＴｒｐＬＥリーダーポリペプチド配列は、図８に、配列番号２５として示されている。ポリヌクレオチド挿入物は、ＧＬＰ−１配列のＮ末端のアミノ酸メチオニンをコードしてもよく、又はコードしなくてもよい。構築物には、位置：Ｙ１９、Ｑ２３、Ｋ２６、Ｅ２７又はＡ３０に、非天然コードアミノ酸置換をコードするＧＬＰ−１ポリヌクレオチド配列を含むが、これらに限定されない。ＧＬＰ−１ポリペプチドは、１又は複数の天然アミノ酸置換も含み得る。
【０７３４】
（実施例３）
この実施例は、カルボニル含有アミノ酸の導入及び、それに続く、アミノオキシ含有ＰＥＧとの反応について詳述する。
【０７３５】
この実施例は、ケトン含有非天然コードアミノ酸（続いて、およそ５，０００ＭＷのアミノオキシ含有ＰＥＧと反応する。）を取り込むＢＳＰの生成のための方法を示す。例えば、次の構造を有する非天然コードアミノ酸を用いて、ＧＬＰ−１については実施例１又はＴ−２０については実施例３２の基準に従い同定された残基それぞれを個別に置換する：
【０７３６】
【化１６】
2008507280.tif 000019
【０７３７】
ＧＬＰ−１へのｐ−アセチル−フェニルアラニンの部位特異的取り込みに利用される配列は、実施例１及び配列番号４（ｍｕｔｔＲＮＡ、Ｍ．ジャナシ  ｍｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡ）及び上記実施例２に記載の１６、１７又は１８（ＴｙｒＲＳ  ＬＷ１、５又は６）である。Ｔ−２０中へのｐ−アセチル−フェニルアラニンの部位特異的取り込みのために使用される配列は、実施例３２及び配列番号４（ｍｕｔｔＲＮＡ、Ｍ．ジャナシ  ｍｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡ）及び上記実施例２に記載の１６、１７又は１８（ＴｙｒＲＳ  ＬＷ１、５又は６）である。
【０７３８】
修飾後、形態：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２（式中、Ｒはメチルであり、ｎは３であり、Ｎはおよそ５，０００ＭＷである。）のアミノオキシ含有ＰＥＧ誘導体と、カルボニル含有アミノ酸を含有するＢＳＰバリアントとを反応させる。２５ｍＭ  ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）ｐＨ６．０、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）ｐＨ７．０又は１０ｍＭ  酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）ｐＨ４．５中で１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解させた、ｐ−アセチル−フェニルアラニンを含有する精製されたＢＳＰを、アミノオキシ含有ＰＥＧの１０倍から１００倍過剰量と反応させ、次いで室温にて１０時間から１６時間撹拌する（Ｊｅｎｃｋｓ，Ｗ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５９、８１、ｐｐ４７５）。次いで、すぐに精製及び分析を行うために、ＰＥＧ−ＢＳＰを適切な緩衝液に希釈する。
【０７３９】
（実施例４）
アミド結合を介してＰＥＧに連結しているヒドロキシルアミン基からなるＰＥＧとの共役
実施例３に記載の手段を用いて、次の構造を有するＰＥＧ物質をケトン含有非天然コードアミノ酸とカップリングさせる：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）−Ｏ−ＮＨ２（式中、Ｒ＝メチル、ｎ＝４、Ｎはおよそ２０，０００ＭＷである。）。反応、精製及び分析条件は実施例３に記載のとおりである。
【０７４０】
（実施例５）
この実施例は、２個の個別の非天然コードアミノ酸のＢＳＰへの導入について詳述する。
【０７４１】
この実施例は、実施例１に従い同定した残基のうちの２箇所でケトン官能基を含有する非天然コードアミノ酸を取り込むＧＬＰ−１ポリペプチドを生成させるための方法を示す（Ｘ＊は、非天然コードアミノ酸を表す。）。セレクターコドンを核酸中の異なる２箇所に導入することを除き、実施例１及び２に記載のようにしてＧＬＰ−１ポリペプチドを調製する。本実施例は、実施例３２に従って同定された残基のうちの２つの位置にケトン官能基を含む非天然コードアミノ酸を取り込むＴ−２０ポリペプチドの生成方法を示す（Ｘ＊は、非天然コードアミノ酸を表す。）。Ｔ−２０ポリペプチドは、セレクターコドンが、核酸内の２つの別個の部位に導入されることを除き、実施例３２及び３３に記載されているとおり調製される。
【０７４２】
（実施例６）
この実施例は、ヒドラジド含有ＰＥＧへのＢＳＰの共役及び続くインシトゥ還元について詳述する。
【０７４３】
実施例２及び３に記載されている手段に従い、カルボニル含有アミノ酸を取り込むＧＬＰ−１ポリペプチドを調製し、又は実施例３２及び３３に記載されている手順に従いカルボニル含有アミノ酸を取り込むＴ−２０ポリペプチドを調製する。修飾後、次の構造を有するヒドラジド含有ＰＥＧをＧＬＰ−１又はＴ−２０ポリペプチドに抱合させる：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２（式中、Ｒ＝メチル、ｎ＝２、Ｎ＝１０，０００ＭＷであり、Ｘはカルボニル（Ｃ＝Ｏ）基である。）。ｐ−アセチルフェニルアラニンを含有する精製されたＧＬＰ−１を２５ｍＭ  ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）ｐＨ６．０、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）ｐＨ７．０又は１０ｍＭ  酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）ｐＨ４．５中で０．１から１０ｍｇ／ｍＬに溶解させ、ヒドラジド含有ＰＥＧの１倍から１００倍過剰量と反応させ、１０から５０ｍＭの最終濃度になるようにＨ２Ｏ中に溶解している保存１Ｍ  ＮａＣＮＢＨ３（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加することにより、対応するヒドラゾンをインシトゥで還元する。４℃からＲＴにて１８時間から２４時間、暗所で反応を行う。約ｐＨ７．６の１Ｍ  Ｔｒｉｓ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を５０ｍＭの最終Ｔｒｉｓ濃度になるように添加することにより、又はすぐに精製するために適切な緩衝液中に希釈することによって、反応を停止させる。
【０７４４】
（実施例７）
この実施例は、アルキン含有アミノ酸のＢＳＰへの導入及びｍＰＥＧ−アジドによる誘導体化について詳述する。
【０７４５】
実施例１（ＧＬＰ−１）又は実施例３２（Ｔ−２０）に従い同定した残基の何れかを、それぞれ、次の非天然コードアミノ酸で置換する：
【０７４６】
【化１７】
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【０７４７】
ｐ−プロパルギル−チロシンをＧＬＰ−１中に部位特異的に取り込むために使用される配列は、配列番号２（ＧＬＰ−１）、配列番号４（ｍｕｔｔＲＮＡ、Ｍ．ジャナシｍｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡ）及び上記実施例２に記載されている９、１０又は１１である。プロパルギルチロシンを含有するＧＬＰ−１ポリペプチドをＥ．コリで発現させ、実施例３に記載の条件を用いて精製する。ｐ−プロパルギルチロシンのＴ−２０中への部位特異的取り込みのために使用された配列は、上記実施例２に記載されている配列番号２２又は２４、並びに配列番号４（ｍｕｔｔＲＮＡ，Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｍｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡ）及び９、１０又は１１である。プロパルギルチロシンを含有するＴ−２０ポリペプチドは、実施例３に記載されている条件を用いて、Ｅ．コリ中で発現され、精製される。
【０７４８】
プロパルギル−チロシンを含有する精製されたＧＬＰ−１又はＴ−２０を０．１から１０ｍｇ／ｍＬになるように、ＰＢ緩衝液（１００ｍＭ  リン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ＝８）中で溶解させ、アジド含有ＰＥＧの１０倍から１００倍過剰量を反応混合物に添加する。次に、ＣｕＳＯ４及び銅細線の触媒量を反応混合物に添加する。混合物をインキュベートした後（以下に限定されないが、室温もしくは３７℃にて約４時間又は４℃にて一晩など。）、Ｈ２Ｏを添加し、透析膜に通して混合物をろ過する。以下に限定されないが、実施例３に記載の同様の手段によるなど、その添加に対して試料を分析することができる。
【０７４９】
この実施例において、ＰＥＧは、次の構造を有する：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｎ３（式中、Ｒはメチルであり、ｎは４であり、Ｎは１０，０００ＭＷである。）。
【０７５０】
（実施例８）
この実施例は、ＢＳＰにおける、大きな疎水性アミノ酸の、プロパルギルチロシンでの置換について詳述する。
【０７５１】
実施例７に記載のようにして、ＧＬＰ−１又はＴ−２０内に存在するＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ残基を次の非天然コードアミノ酸で置換する。
【０７５２】
【化１８】
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【０７５３】
修飾後、アルキン含有アミノ酸を含有するＢＳＰバリアントにＰＥＧを結合させる。ＰＥＧは、次の構造を有し：
Ｍｅ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ３
カップリング手段は実施例７の手段に従う。これにより、天然の大きな疎水性アミノ酸の１つとほぼ等比体積であり、ポリペプチド内の別の部位でＰＥＧ誘導体により修飾される非天然のコードアミノ酸を含有するＢＳＰバリアントが生成する。
【０７５４】
（実施例９）
この実施例は、１又は複数のＰＥＧリンカーにより分けられる、ＢＳＰホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体又はヘテロ多量体の生成について詳述する。
【０７５５】
実施例７で作製したアルキン含有ＢＳＰバリアントを、
Ｎ３−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ３（式中、ｎは４であり、ＰＥＧは、およそ５，０００の平均ＭＷを有する。）の形態の二官能性ＰＥＧ誘導体と反応させ、２個のＢＳＰ分子がＰＥＧにより物理的に離されている対応するＢＳＰホモ二量体を生成させる。同様の方法において、ＢＳＰを１又は複数の他のポリペプチドとカップリングさせて、ヘテロ二量体、ホモ多量体又はヘテロ多量体を形成することができる。実施例７及び３に従い、カップリング、精製及び分析を行う。
【０７５６】
（実施例１０）
この実施例は、ＢＳＰへの糖部分のカップリングについて詳述する。
【０７５７】
以下の１つの残基は、実施例３に記載されているように、以下の非天然コードアミノ酸：１９、２３、２６、２７、２８、２９、３０又は３３（配列番号１、２、３、２１又は他のＧＬＰ−１ポリペプチドの対応するアミノ酸のように）で置換される。あるいは、Ｔ−２０の１つの残基は、実施例３に記載されているように、以下の非天然コードアミノ酸で置換される。
【０７５８】
【化１９】
2008507280.tif 000022
【０７５９】
修飾後、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）のβ結合アミノオキシ類似体と、カルボニル含有アミノ酸を含有するＢＳＰバリアントとを反応させる。ＢＳＰバリアント（１０ｍｇ／ｍＬ）及びアミノオキシ糖（２１ｍＭ）を１００ｍＭ酢酸ナトリウム水性緩衝液（ｐＨ５．５）中で混合し、３７℃で７時間から２６時間インキュベートする。１５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で、ＵＤＰ−ガラクトース（１６ｍＭ）及びβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラ−ゼ（０．４ユニット／ｍＬ）とともに糖共役ＢＳＰ（５ｍｇ／ｍＬ）を周囲温度にて４８時間インキュベートすることにより、酵素を用いて第一の糖に第二の糖をカップリングさせる（Ｓｃｈａｎｂａｃｈｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７０、２４５、５０５７−５０６１）。
【０７６０】
（実施例１１）
この実施例は、ＰＥＧ化ＢＳＰアンタゴニストの生成について詳述する。
【０７６１】
実施例３に記載されているとおりに、ＧＬＰ−１の以下の残基１９、２３、２６、２７、２８、２９、３０又は３３の１つを次の非天然コードアミノ酸により置換する。
【０７６２】
【化２０】
2008507280.tif 000023
【０７６３】
修飾後、形態：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２（式中、Ｒはメチルであり、ｎは４であり、Ｎは２０，０００ＭＷである。）のアミノオキシ−含有ＰＥＧ誘導体と、カルボニル含有アミノ酸を含むＢＳＰとを反応させ、ポリペプチド中の１箇所でＰＥＧ誘導体により修飾されている非天然のコードアミノ酸を含有するＢＳＰアンタゴニストを生成させる。実施例３に従い、カップリング、精製及び分析を行う。
【０７６４】
（実施例１２）
ＢＳＰ分子が直接連結している、ＢＳＰホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体又はヘテロ多量体の生成
アジド含有アミノ酸を含有する別のＧＬＰ−１バリアントにアルキン含有アミノ酸を含有するＧＬＰ−１バリアントを直接カップリングさせることができる（それらのそれぞれが、以下に限定されないが実施例１に記載の部位で非天然コードアミノ酸により置換されている。）。同様の方法において、１又は複数の他のポリペプチドにＧＬＰ−１ポリペプチドをカップリングさせて、ヘテロ二量体、ホモ多量体又はヘテロ多量体を形成させ得る。実施例３、６及び７に従い、カップリング、精製及び分析を行う。
【０７６５】
アルキン含有アミノ酸を含むＴ−２０バリアントは、アジド含有アミノ酸を含む別のＴ−２０バリアントに直接結合することが可能であり、その各々が、実施例３２に記載されている部位に（これに限定されない。）、非天然コードアミノ酸置換を含む。同様に、Ｔ−２０ポリペプチドは、ヘテロ二量体、ホモ多量体又はヘテロ多量体を形成するために、１又は複数の他のポリペプチドに結合され得る。結合、精製及び分析は、実施例３、６及び７のとおりに実施する。
【０７６６】
（実施例１３）
【０７６７】
【化２１】
2008507280.tif 000024
【０７６８】
ポリアルキレングリコール（Ｐ−ＯＨ）をハロゲン化アルキルと反応させ（Ａ）、エーテルを形成させる（Ｂ）。これらの化合物において、ｎは、１から９の整数であり、Ｒ’は、直鎖もしくは分枝鎖、飽和もしくは不飽和のＣ１からＣ２０アルキル又はヘテロアルキル基であり得る。Ｒ’はまた、Ｃ３からＣ７の飽和もしくは不飽和の環状アルキル又は環状へテロアルキル、置換もしくは非置換アリールもしくはヘテロアリール基又は置換もしくは非置換アルクアリール（アルキルは、Ｃ１からＣ２０の飽和もしくは不飽和アルキルである。）又はヘテロアルクアリール基でもあり得る。通常、ＰＥＧ−ＯＨは、８００から４０，０００ダルトン（Ｄａ）の分子量の、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である。
【０７６９】
（実施例１４）
ｍＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
２０，０００Ｄａの分子量のｍＰＥＧ−ＯＨ（ｍＰＥＧ−ＯＨ  ２０ｋＤａ；２．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ、Ｓｕｎｂｉｏ）をＴＨＦ（３５ｍＬ）中のＮａＨ（１２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）で処理した。次に、キシレン中８０重量％溶液として溶解している臭化プロパルギルの溶液（０．５６ｍＬ、５ｍｍｏｌ、５０当量、Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＫＩの触媒量を溶液に添加し、生じた混合物を２時間加熱還流した。次いで水（１ｍＬ）を添加し、溶媒を真空除去した。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を添加し、有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、体積をおよそ２ｍＬまで減少させた。このＣＨ２Ｃｌ２溶液をジエチルエーテル（１５０ｍＬ）に滴下添加した。生じた沈殿物を回収し、冷ジエチルエーテル数部で洗浄し、乾燥させ、プロパルギル−Ｏ−ＰＥＧを得た。
【０７７０】
（実施例１５）
ｍＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−（ＣＨ２）３−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｃ≡ＣＨ
２０，０００Ｄａの分子量のｍＰＥＧ−ＯＨ（２０ｋＤａ；２．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ、Ｓｕｎｂｉｏ）をＴＨＦ（３５ｍＬ）中のＮａＨ（１２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）で処理した。次に、５−ブロモ−Ｌ−ペンチン（０．５３ｍＬ、５ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）の５０当量及びＫＩの触媒量を混合物に添加した。生じた混合物を１６時間加熱還流した。次いで水（１ｍＬ）を添加し、溶媒を真空除去した。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を添加し、有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、体積をおよそ２ｍＬまで減少させた。このＣＨ２Ｃｌ２溶液をジエチルエーテル（１５０ｍＬ）に滴下添加した。生じた沈殿を回収し、冷ジエチルエーテル数部で洗浄し、乾燥させ、対応するアルキンを得た。同様の反応において５−クロロ−１−ペンチンを使用できる。
【０７７１】
（実施例１６）
（１）ｍ−ＨＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ＋ＮａＯＨ＋Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ→ｍ−ＨＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
（２）ｍ−ＨＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ＋ＭｓＣｌ＋Ｎ（Ｅｔ）３→ｍ−ＭｓＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
（３）ｍ−ＭｓＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ＋ＬｉＢｒ→ｍ−Ｂｒ−ＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
（４）ｍＰＥＧ−ＯＨ＋ｍ−Ｂｒ−ＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
ＴＨＦ（５０ｍＬ）及び水（２．５ｍＬ）中の３−ヒドロキシベンジルアルコール（２．４ｇ、２０ｍｍｏｌ）の溶液に、粉状の水酸化ナトリウム（１．５ｇ、３７．５ｍｍｏｌ）を最初に添加し、次いでキシレン中８０重量％溶液として溶解している臭化プロパルギルの溶液（３．３６ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を還流温度で６時間加熱した。この混合物に１０％クエン酸（２．５ｍＬ）を添加し、溶媒を真空除去した。残渣を酢酸エチル（３ｘ１５ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層をＮａＣｌ飽和溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濃縮し、３−プロパルギルオキシベンジルアルコールを得た。
【０７７２】
０℃にて、塩化メタンスルホニル（２．５ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２．８ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２中の化合物３（２．０ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、反応物を１６時間冷蔵庫に置いた。通常の処理により、淡黄色の油状物質としてメシレ−トを得た。この油状物質（２．４ｇ、９．２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）中で溶解させ、ＬｉＢｒ（２．０ｇ、２３．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１時間加熱還流し、次いで室温に冷却した。この混合物に水（２．５ｍＬ）を添加し、溶媒を真空除去した。酢酸エチル（３ｘ１５ｍＬ）で残渣を抽出し、合わせた有機層をＮａＣｌ飽和溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮し、所望の臭化物を得た。
【０７７３】
ｍＰＥＧ−ＯＨ  ２０ｋＤａ（１．０ｇ、０．０５ｍｍｏｌ、Ｓｕｎｂｉｏ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）中で溶解させ、溶液を氷浴中で冷却した。数分間にわたり激しく撹拌しながらＮａＨ（６ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を添加し、次に、上記で得た臭化物（２．５５ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）及びＫＩの触媒量を添加した。冷却槽を取り外し、生じた混合物を１２時間加熱還流した。この混合物に水（１．０ｍＬ）を添加し、溶媒を真空除去した。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を添加し、有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、体積をおよそ２ｍＬまで減少させた。エーテル溶液（１５０ｍＬ）に滴下添加し、それにより、白色の沈殿が生じ、これを回収し、ＰＥＧ誘導体を得た。
【０７７４】
（実施例１７）
ｍＰＥＧ−ＮＨ２＋Ｘ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）Ｎ−Ｃ≡ＣＲ’→ｍＰＥＧ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＲ’
上記で示すとおり、末端官能基を含有するポリ（エチレングリコール）ポリマーをアルキン官能基含有反応性分子とカップリングさせることにより、末端アルキン含有ポリ（エチレングリコール）ポリマーを得ることもできる。ｎは、１から１０である。Ｒ’はＨ又はＣ１からＣ４の小さいアルキル基であり得る。
【０７７５】
（実施例１８）
（１）ＨＯ２Ｃ−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ＋ＮＨＳ＋ＤＣＣ→ＮＨＳＯ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ
（２）ｍＰＥＧ−ＮＨ２＋ＮＨＳＯ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ
４−ペンチン酸（２．９４３ｇ、３．０ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）中で溶解させた。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（３．８０ｇ、３．３ｍｍｏｌ）及びＤＣＣ（４．６６ｇ、３．０ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を室温にて一晩撹拌した。生じた粗製ＮＨＳエステル７をさらに精製せずに次の反応において使用した。
【０７７６】
５，０００Ｄａの分子量のｍＰＥＧ−ＮＨ２（ｍＰＥＧ−ＮＨ２、１ｇ、Ｓｕｎｂｉｏ）をＴＨＦ（５０ｍＬ）中で溶解させ、混合物を４℃に冷却した。激しく撹拌しながら、ＮＨＳエステル７（４００ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を分割して添加した。室温に温めながら、混合物を３時間撹拌した。次に、水（２ｍＬ）を添加し、溶媒を真空除去した。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）を添加し、有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、体積をおよそ２ｍＬまで減少させた。このＣＨ２Ｃｌ２溶液をエーテル（１５０ｍＬ）に滴下添加した。生じた沈殿物を回収し、真空下で乾燥させた。
【０７７７】
（実施例１９）
この実施例は、ポリ（エチレングリコール）のメタンスルホニルエステル（これはまた、ポリ（エチレングリコール）のメタンスルホネ−ト又はメシレ−トとも呼ばれ得る。）の調製を示す。同様の手段により、対応するトシレ−ト及びハロゲン化物を調製することができる。
【０７７８】
ｍＰＥＧ−ＯＨ＋ＣＨ３ＳＯ２Ｃｌ＋Ｎ（Ｅｔ）３→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＳＯ２ＣＨ３→ｍＰＥＧ−Ｎ３
トルエン１５０ｍＬ中のｍＰＥＧ−ＯＨ（ＭＷ＝３，４００、２５ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）を窒素下で２時間共沸蒸留し、溶液を室温に冷却した。この溶液に、無水ＣＨ２Ｃｌ２４０ｍＬ及び無水トリエチルアミン（１５ｍｍｏｌ）２．１ｍＬを添加した。溶液を氷浴中で冷却し、蒸留した塩化メタンスルホニル（１５ｍｍｏｌ）１．２ｍＬを滴下添加した。溶液を窒素下で室温にて一晩撹拌し、無水エタノール２ｍＬを添加することにより、反応を停止させた。混合物を真空蒸発させて、主にトルエン以外の溶媒を除去し、ろ過し、再び真空下で濃縮し、次いでジエチルエーテル１００ｍＬ中で沈殿させた。ろ過液を冷ジエチルエーテル数部で洗浄し、真空乾燥させ、メシレ−トを得た。
【０７７９】
メシレ−ト（２０ｇ、８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ７５ｍＬ中で溶解させ、溶液を４℃に冷却した。冷却溶液にアジ化ナトリウム（１．５６ｇ、２４ｍｍｏｌ）を添加した。窒素下で２時間、反応物を加熱還流した。次に、溶媒を蒸発させ、残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）で希釈した。有機画分をＮａＣｌ溶液で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。体積を２０ｍＬまで減少させ、冷無水エーテル１５０ｍＬを添加することにより生成物を沈殿させた。
【０７８０】
（実施例２０）
（１）Ｎ３−Ｃ６Ｈ４−ＣＯ２Ｈ→Ｎ３−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＯＨ
（２）Ｎ３−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＯＨ→Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３
（３）ｍＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３
米国特許第５，９９８，５９５号（本明細書中に参照により組み込む。）に記載の方法を用いて、４−アジドベンジルアルコールを生成させることができる。０℃にて、ＣＨ２Ｃｌ２中の４−アジドベンジルアルコール（１．７５ｇ、１１ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化メタンスルホニル（２．５ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２．８ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を１６時間冷蔵庫に置いた。通常の処理により、淡黄色の油状物質としてメシレ−トを得た。この油状物質（９．２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）中で溶解させ、ＬｉＢｒ（２．０ｇ、２３．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１時間加熱還流し、次いで室温に冷却した。この混合物に水（２．５ｍＬ）を添加し、溶媒を真空除去した。酢酸エチル（３ｘ１５ｍＬ）で残渣を抽出し、合わせた有機層をＮａＣｌ飽和溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮し、所望の臭化物を得た。
【０７８１】
ｍＰＥＧ−ＯＨ  ２０ｋＤａ（２．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ、Ｓｕｎｂｉｏ）をＴＨＦ（３５ｍＬ）中のＮａＨ（１２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）で処理し、臭化物（３．３２ｇ、１５ｍｍｏｌ）をＫＩの触媒量とともに混合物に添加した。生じた混合物を１２時間加熱還流した。この混合物に水（１．０ｍＬ）を添加し、溶媒を真空除去した。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を添加し、有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、体積をおよそ２ｍＬまで減少させた。エーテル溶液（１５０ｍＬ）に滴下添加したところ沈殿物が生じ、これを回収し、ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３を得た。
【０７８２】
（実施例２１）
ＮＨ２−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ＋Ｎ３−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２−ＮＨＳ→Ｎ３−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ
ＮＨ２−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ（ＭＷ３，４００Ｄａ、２．０ｇ）をＮａＨＣＯ３（１０ｍＬ）の飽和水溶液中で溶解させ、溶液を０℃に冷却した。激しく撹拌しながら３−アジド−１−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドプロピオネ−ト（５当量）を添加した。３時間後、Ｈ２Ｏ  ２０ｍＬを添加し、さらに４５分間室温で混合物を撹拌した。０．５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を用いてｐＨを３に調整し、およそ１５重量％の濃度までＮａＣｌを添加した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬｘ３）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。冷ジエチルエーテルにより沈殿させた後、生成物をろ過により回収し、真空下で乾燥させ、オメガ−カルボキシ−アジドＰＥＧ誘導体を得た。
【０７８３】
（実施例２２）
ｍＰＥＧ−ＯＭｓ＋ＨＣ≡ＣＬｉ→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ≡Ｃ−Ｈ
当技術分野で公知のように調製し、−７８℃に冷却した、ＴＨＦ中のリチウムアセチリド（４当量）の溶液に、ＴＨＦ中で溶解させたｍＰＥＧ−ＯＭｓの溶液を激しく撹拌しながら滴下添加した。３時間後、反応物を室温に温め、ブタノ−ル１ｍＬを添加することで反応停止させた。次に、Ｈ２Ｏ  ２０ｍＬを添加し、さらに４５分間室温にて混合物を撹拌した。０．５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を用いてｐＨを３に調整し、およそ１５重量％の濃度までＮａＣｌを添加した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬｘ３）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。冷ジエチルエーテルにより沈殿させた後、生成物をろ過により回収し、真空下で乾燥させ、１−（ブト−３−イニルオキシ）−メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）を得た。
【０７８４】
（実施例２３）
Ｌ．Ｗａｎｇら、（２００１）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２９２：４９８−５００、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３０１：９６４−７（２００３））、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎら、（２００２）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２４：９０２６−９０２７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ及びＰ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ、（２００２）、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ  ３（１１）：１１３５−１１３７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎら、（２００２）、ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９９：１１０２０−１１０２４；及びＬ．Ｗａｎｇ及びＰ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ（２００２）、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，１：１−１１に記載の方法を用いて、タンパク質へ部位選択的にアジド−及びアセチレン−含有アミノ酸を取り込ませた。アミノ酸を取り込ませた後、２ｍＭ  ＰＥＧ誘導体、１ｍＭ  ＣｕＳＯ４及び〜１ｍｇ銅細線存在下で、３７℃にて４時間、リン酸緩衝液（ＰＢ）、ｐＨ８中の０．０１ｍＭタンパク質を用いて付加環化反応を行った。
【０７８５】
（実施例２４）
本実施例は、非天然コードアミノ酸を含むＧＬＰ−１及びＰＥＧ化ＧＬＰ−１のインビトロ及びインビボ活性を測定する方法を述べる。
【０７８６】
本発明のＧＬＰ−１ポリペプチドの活性をモニターするために、多数のアッセイを使用し得る。ＧＬＰ−１などのペプチドホルモンは、特異的Ｇタンパク質共役受容体を活性化するため、本発明のＧＬＰ−１ポリペプチドは、ＧＬＰ−１受容体依存性ｃＡＭＰ形成を検出するアッセイによって評価され得る。下流の細胞内ｃＡＭＰ産生は、発色、発光、時間分解蛍光又はＦＰ法を含む様々な方法（これらに限定されない。）によって測定することが可能である。ラットのインシュリノ−マ由来ＲＩＮ−ｍ５Ｆは、アデニル酸シクラ−ゼに共役された内在性ＧＬＰ−１受容体を有し、Ｒｅｓ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ（Ｂｅｒｌ）．１９８９；  １８９（４）  ：２５７−６４）、受容体活性化後に、ｃＡＭＰを測定するために使用することができる。同様に、ハムスタ−ＨＩＴ−ＴＩ１５細胞（ＡＴＣＣ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）又はラットＢＲＩＮ−ＢＤＩＩβ細胞（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  ＭｏＩ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ２００３  Ｄｅｃ；３１（３）：５２９−４）を使用し得る。
【０７８７】
あるいは、組換えｈＧＬＰ−１受容体が形質移入された細胞（ＣＨＯ（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．）  ２００３  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５２：７５１−５９）、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ；  Ｋｎｕｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ４３：１６６４−１６６９）、ＣＨＬ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｌｕｎｇ）細胞を含むが、これらに限定されない。）、又はラット、マウス若しくはハムスタ−から単離された膵島細胞などの初代細胞中でｃＡＭＰ産生を測定し得る。ＧＬＰ−１受容体は、「Ｔｈｏｒｅｎｓ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９９２，  ８９（１８）：８６４１−５」又は米国特許第５，６７０，３６０号及び第６，０５１，６８９号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているとおり調製することが可能である。フォルスコリン（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）、アデニル酸シクラ−ゼ活性化因子及びアデニル酸シクラ−ゼの阻害剤、ＰＩ３Ｋ、ＭＡＰＫ又はｐ３８を、アッセイ対照として使用し得る。アゴニスト対照には、ＧＬＰ−１（７−３７）及びエキセンディン−４、強力なＧＬＰ−１アゴニスト及びアンタゴニスト対照には、ＧＬＰ−１受容体アンタゴニストエキセンディン（９−３９）（Ｂａｃｈｅｍ  ＡＧから入手可能）が含まれる。検査される各化合物に対して用量応答曲線をプロットし、ＥＣ５０値を計算する。あるいは、ｃＡＭＰは、他のアッセイによって測定し得る。一般的には、これらのアッセイは、本分野において周知である。
【０７８８】
インシュリン分泌は、本発明のＧＬＰ−１ポリペプチドの生物活性の指標でもある。  インシュリン分泌のインビトロ研究は、インシュリンＲＩＡ又はＥＬＩＳＡを介して、ＧＬＰ−１ポリペプチド及びグルコースの幅広い濃度とともにインキュベ−ションを行った後、細胞中で計算し得る。Ｇｒｅｅｎら上記は、ラットＢＲＩＮ−ＢＤ１１β細胞中で、ＧＬＰ−１ポリペプチドの上昇したインシュリン分泌促進効果を評価した。ラット膵島は、あるいは、インシュリン分泌研究において使用し得る（Ｇｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９３  ２６８（２６）１９６５０−１９６５５）。
【０７８９】
あるいは、β膵島細胞の増殖は、ＸＴＴ又はＢｒｄＵなどの試薬を用いて測定し得る。ＣＲＥレポ−タ−アッセイを用いてＣＲＥＢ（環状ＡＭＰ応答要素結合タンパク質）転写因子を測定するインビトロアッセイも行い得る。
【０７９０】
その受容体に対する、非天然アミノ酸を含むＧＬＰ−１ポリペプチドの親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭバイオセンサ−（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用することによって測定することが可能である。ＧＬＰ−１受容体結合をモニターするために、成長を調節し、又はＧＬＰ−１を結合する細胞又は細胞株（ヒト細胞などの活性なＧＬＰ−１受容体を含有する細胞又は組換えＧＬＰ−１受容体産生細胞が含まれるが、これらに限定されない。）を使用することが可能である。例えば、ＧＬＰ−１受容体結合をモニターするために、成長を調節し、又はＧＬＰ−１を結合する細胞又は細胞株（ヒト細胞などの活性なＧＬＰ−１受容体を含有する細胞又は組換えＧＬＰ−１受容体産生細胞が含まれるが、これらに限定されない。）を使用することが可能である。
【０７９１】
あるいは、組換えｈＧＬＰ−１受容体が形質移入された細胞（ＣＨＯ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）及びＣＨＬ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｌｕｎｇ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）細胞を含むが、これらに限定されない。）を用いて、結合を測定することも可能である。形質移入されたＣＨＯ細胞中での結合研究については、Ｋｉｍらを、形質移入されたＣＨＬ細胞での研究については、「Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  ＭｏＩ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ２００３  Ｄｅｃ；３１（３）：５２９−４０」を参照されたい。ＧＬＰ−１受容体は、「Ｔｈｏｒｅｎｓ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９９２，  ８９（１８）：８６４１−５」又は米国特許第５，６７０，３６０号及び第６，０５１，６８９号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているとおり調製することが可能である。
【０７９２】
ＤＰＰ  ＩＶ又はヒト血漿による本発明のＧＬＰ−１ポリペプチドの分解は、液体クロマトグラフィー／質量分析／（ＬＣ／ＭＳ）又は他の方法によってモニターし得る。本発明のＧＬＰ−１ポリペプチドは、０、６又は１２時間、ＤＰＰ  ＩＶ又はプールされたヒト血漿とともにインキュベートし、分析の前に、全ての酵素反応を停止するためにＴＦＡなどの試薬を添加し得る。全ての引用文献は、参照により、本明細書に組み込まれる。
【０７９３】
細胞結合アッセイ
０℃にて９０分間、非標識ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１又はＧＬＰ−１類縁体の様々な濃度の（体積１０μＬ）の非存在下又は存在下で、及び、１２５Ｉ−ＧＬＰ−１（およそ１００，０００ｃｐｍ又は１ｎｇ）存在下で、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ（１００μＬ）中で、各２測定試料ずつ、細胞（３ｘ１０６）をインキュベートする（総体積：１２０μＬ）。次に細胞を再懸濁し、３５０μＬプラスチック遠沈管中の２００μＬ氷冷ＦＣＳ上に重ねるように添加し、遠心分離する（１０００ｇ、１分間）。管の端を切ってペレットを回収し、ペレット及び上清を個別にガンマカウンタ−（Ｐａｃｋａｒｄ）でカウントする。
【０７９４】
競合物の非存在下での総結合（２測定の平均）から非標識ＧＬＰ−１（非特異的結合）の１００倍過剰量存在下での結合（ｃｐｍ）を差し引いたものとして特異的結合（ｃｐｍ）を決定する。使用した細胞タイプのそれぞれに対して非特異的結合を測定する。１２５Ｉ−ＧＬＰ−１の同じ調製物を用いて別の日に実験を行い、内部均一性を示すべきである。１２５Ｉ−ＧＬＰ−１は、細胞への結合を示す。非標識の天然ＧＬＰ−１又はＧＬＰ−１により容量依存的に結合が阻害されるが、ネガティブ対照により阻害されない。天然のＧＬＰ−１と同様に、天然１２５Ｉ−ＧＬＰ−１の結合に対するＧＬＰ−１の競合能から、受容体が両方の形態を同じようによく認識することが示唆される。
【０７９５】
ＰＥＧ化ＧＬＰ−１のインビボ実験
ＰＥＧ−ＧＬＰ−１、非修飾ＧＬＰ−１及び緩衝溶液をマウス又はラットに投与する。この結果は、非修飾ＧＬＰ−１と比較して、本発明のＰＥＧ化ＧＬＰ−１の活性が高く、半減期が長くなっている（著しく減少した血糖によって示される。）ことを示している。
【０７９６】
ＧＬＰ−１活性を検査するためのインビボ動物モデルには、米国特許出願公開２００４００８２５０７Ａ１及び２００３０２３２７５４Ａ１（参照により、本明細書中に組み込まれる。）に記載されているインビボ動物モデルが含まれる。
【０７９７】
抱合及び非抱合ＧＬＰ−１ならびにそれらのバリアントのインビボ半減期の測定
雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（約７週齢）を使用する。投与日に、各動物の体重を測定する。非抱合及び抱合ＧＬＰ−１試料を１００μｇ／ｋｇ体重、それぞれこれらのラットの尾静脈に静脈内投与する。投与から１分、３０分、１、２、４、６及び２４時間後に、ＣＯ２麻酔下で各ラットから血液５００μＬを採取する。血液試料を室温で１．５時間保存し、次いで、遠心分離（４℃、１８０００ｘｇで５分間）により血清を分離する。分析する日まで血清試料を−８０℃で保存する。氷上で試料を凍結融解した後、ＧＬＰ−１インビトロ活性分析により血清試料中の活性ＧＬＰ−１の量を定量する。
【０７９８】
動物モデル
本発明のＧＬＰ−１ペプチドを評価するために使用し得る動物モデルには、脂肪Ｚｕｃｋｅｒ（ｆａ／ｆａ；ＺＤＦ）ラット、ｏｂ／ｏｂマウス及びｄｂ／ｄｂマウスが含まれるが、これらに限定されない。これらのモデルは、単一遺伝子の劣性遺伝によって生じる（Ｂｒａｙ，  Ｇ．  Ａ．  １９７７．  Ｆｅｄ  Ｐｒｏｃ．  ３６：１４８−１５３；  Ｂｒａｙ，  Ｇ．  Ａ．  ａｎｄ  Ｄ．  Ａ．  Ｙｏｒｋ．  １９７９．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ５１：５９８−６４６；  Ｋａｓｉｓｋｅ，  Ｂ．．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  １９９２．  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  １９  Ｓｕｐｐｌ．  １：１１１０−１１１５；  Ｂｒａｙ，  Ｇ．  Ａ．  １９９２．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎｕｔｒ．  ５５  Ｓｕｐｐｌ．  ４８８Ｓ−４９４Ｓ）。ＧＬＰ−１受容体ノックアウト（ＧＬＰ−１Ｒ−／−）マウスは、本発明のＧＬＰ−１分子のグルコース低下効果が機能的ＧＬＰ−１受容体に依存することを示す動物研究において使用し（米国特許第５，８４６，９３７号、Ｓｃｒｏｃｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  １９９６  Ｎｏｖ；２（ｌｌ）：１２５４−８，  Ｓｃｒｏｃｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １９９６  ４５：２１  Ａ）、耐糖能を測定するために、野生型マウスと比較することができる。「Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １９９９  ４８：１０２６−１０３４」は、脂肪Ｚｕｃｋｅｒ（ｆａ／ｆａ）ラット、ｏｂ／ｏｂマウス、ｄｂ／ｄｂマウス及び糖尿病アカゲザルにおいて、非修飾ＧＬＰ−１を、エキセンディン−４と比較する研究を記載している。
【０７９９】
ｄｂ／ｄｂマウスは、遺伝的に肥満且つ糖尿病のマウス株である。ｄｂ／ｄｂマウスは、その肥満の発症と同時に、高血糖と高インシュリン血症を発症し、このため、肥満２型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）のモデルとして役に立つ。これらもマウスの主な表現型的特徴は、それらが肥満、高血糖、高インシュリン血症及びインシュリン抵抗性であることである。ｄｂ／ｄｂマウスは、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｍａｉｎｅ）から購入できる。Ｚｕｃｋｅｒ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｆａｔｔｙ  ｆａ／ｆａ（ＺＤＦ）ラットはインシュリン抵抗性であるが、生まれたときから正常血糖であり、約７週から１０週齢までに糖尿病を発症する。移行期の間、動物は、耐糖能障害状態を経験する。糖尿病が発症する前および糖尿病の初期段階の間、動物は高インシュリン血症であるが、後に、グルコース刺激されたインシュリン分泌を喪失し、最後に、ほぼ完全にインシュリン欠乏状態となる。これらもラットの主な表現型的特徴は、それらが肥満、高脂血症、高インシュリン血症及びインシュリン抵抗性であることである。
【０８００】
ｄｂ／ｄｂ又はｏｂ／ｏｂマウスは、非天然コードアミノ酸を含むＧＬＰ−１ペプチドを投薬され、又は、修飾されていないＧＬＰ−１を対照として、又はエキセンディン−４を比較測定因子として投薬される。化合物は、０．１μｇ／投薬皮下で投与され、血漿グルコース、グルカゴン及び血中インシュリン、体重減少及び食欲減退効果のレベルが、２つの集団間で比較される。結果は、エキセンディン−４に比べて、本発明のＧＬＰ−１ペプチドの優れた活性と延長された半減期を示す。
【０８０１】
Ｚｕｃｋｅｒ脂肪ラットは、急性及び慢性研究において、非天然コードアミノ酸を含むＧＬＰ−１ペプチドを、又は対照として修飾されていないＧＬＰ−１を、又は比較測定因子としてエキセンディン−４を投薬される。急性研究では、グルコース及びインシュリンレベルに対する効果の持続時間が測定される。慢性研究では、低下した食物摂取、体重及びＨｂＡ１ｃのレベルについて、これらのラットをモニターする。結果は、エキセンディン−４に比べて、本発明のＧＬＰ−１ペプチドのより少ない頻度での投薬と延長された半減期を示す。
【０８０２】
（実施例３１）
非天然コードアミノ酸を含有するＰＥＧ化ＧＬＰ−１の安全性及び／又は有効性のヒト臨床試験
目的  エキセンディン−４とともに、皮下投与された非天然のコードアミノ酸を含むＰＥＧ化された組み換えヒトＧＬＰ−１の安全性及び薬物動態学的を、同じ標的抗原に特異的な市販の製品（例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｒ）、Ｂｅｘｘａｒ（Ｒ）、Ｃａｍｐａｔｈ（Ｒ）、ＣＥＡ−Ｓｃａｎ（Ｒ）、Ｅｎｂｒｅｌ（Ｒ）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（Ｒ）、Ｈｕｍｉｒａ（Ｒ）、Ｍｙｏｓｃｉｎｔ（Ｒ）、Ｐｒｏｓｔａｓｃｉｎｔ（Ｒ）、Ｒａｐｔｉｖａ（Ｒ）、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（Ｒ）、ＲｅｏＰｒｏ（Ｒ）、Ｒｉｔｕｘａｎ（Ｒ）、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（Ｒ）、Ｓｙｎａｇｉｓ（Ｒ）、Ｖｅｒｌｕｍａ（Ｒ）、Ｘｏｌａｉｒ（Ｒ）、Ｚｅｎａｐａｘ（Ｒ）、Ｚｅｖａｌｉｎ（Ｒ）又はＡｖａｓｔｉｎ（Ｒ）。）と比較すること。
【０８０３】
患者  ２０歳から４０歳で、体重６０ｋｇから９０ｋｇの１８名の健康なボランティアを本試験に登録する。対象者は、血液学又は血清化学における重大な異常臨床検査値がなく、尿毒性スクリーニング、ＨＩＶスクリーニング及びＢ型肝炎表面抗原検査の結果が陰性である。これら対象者は、次の徴候の何れも有してはならない：高血圧；何らかの原発性血液疾患の病歴；重度の、肝臓、腎臓、心血管、胃腸管、尿生殖器、代謝性、神経性の疾患の病歴；貧血又は発作性疾患の病歴；細菌もしくは哺乳動物由来産物、ＰＥＧ又はヒト血清アルブミンに対する既知の感受性；カフェイン含有飲料の習慣的消費及び大量消費；何らかの他の臨床試験への参加又は試験エントリ−３０日以内の輸血もしくは献血；試験エントリ−３ヶ月以内のＧＬＰ−１への曝露；試験エントリ−７日以内の病気；及び試験前健康診断又は試験エントリ−１４日以内の臨床検査評価での顕著な異常。全対象者が安全性に関して評価可能であり、スケジュ−ルどおりに、薬物動態学的分析のために全ての採血試料を回収する。試験は全て、研究所の倫理委員会の承認及び患者の同意を得て行う。
【０８０４】
試験計画
これは、健康な男性ボランティアにおける、フェ−ズＩの、１ヶ所の施設での非盲検の無作為化２期クロスオ−バ−試験である。１８名の対象者を無作為に２つの処置順序群の１つに割り当てる（各群９名）。２回の別個の投与期間にわたり、非天然コードアミノ酸を含むＰＥＧ化ＧＬＰ−１及びエキセンディン−４の同等の投与量を用いて、大腿上方にボ−ラスｓ．ｃ．注射としてＧＬＰ−１を投与する。市販製品の投与の用量及び頻度は、包装のラベルに指示されている通りである。さらなる対象者の群を加えることにより、必要に応じて、市販製品を用いた、さらなる投与、投与頻度又はその他のパラメ−タ−をこの試験に付け加え得る。各投与期間は、１４日間のウォッシュアウト期間を置くことにより分けられる。２回の投与期間それぞれに対して、少なくとも１２時間前から投与後７２時間まで、被験者を試験施設に収容するが、投与期間と投与期間の間は収容しない。ＰＥＧ化ＧＬＰ−１に対して同じように試験する、さらなる投与、頻度又はその他のパラメ−タ−を加える場合は、さらなる被験者群を付け加え得る。ヒトへの使用について承認されたＧＬＰ−１の複数の調合物を、本研究において使用し得る。ＧＬＰ−１の実験処方物は、非天然コードアミノ酸を含有するＰＥＧ化ＧＬＰ−１である。
【０８０５】
採血
ＧＬＰ−１投与前及び後に静脈に針を直接刺し、連続血液を採取する。血清ＧＬＰ−１濃度を調べるための静脈血液試料（５ｍＬ）を投与前約３０、２０及び１０分（３種類のベースライン試料）及び投与からおよそ３０分ならびに、１、２、５、８、１２、１５、１８、２４、３０、３６、４８、６０及び７２時間後に採取する。各血清試料を２つに分注する。血清試料を全て−２０℃で保存する。血清試料をドライアイス上で発送する。第１日の最初の投与直前、第４日の午前及び第１６日の投与直前、第１９日の午前に、絶食臨床検査（血液学、血清化学及び尿検査）を行う。
【０８０６】
生物分析法
血清ＧＬＰ−１濃度を測定するために、ＥＬＩＳＡキット法（Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏ．）を用いる。
【０８０７】
安全性試験  各投与直前（第１日及び第１６日）、各投与後６、２４、４８及び７２時間に、バイタルサインを記録する。安全性試験は、有害事象の発生及びタイプ、及びベースラインからの臨床検査値の変化に基づく。さらに、血圧を含む、試験前からのバイタルサイン測定値の変化及び健康診断の結果を評価する。
【０８０８】
データ解析  投与後値のそれぞれから、投与前３０分、２０分及び１０分に回収した３つの試料からＧＬＰ−１レベルの平均値を出すことから決定した平均ベースラインＧＬＰ−１濃度を差し引くことにより、投与後の血清濃度値を投与前ベースラインＧＬＰ−１濃度に対して補正する。投与前ＧＬＰ−１濃度は、それらがアッセイの定量レベル以下である場合は、平均値の計算に含めない。ベースラインＧＬＰ−１濃度に対して補正した血清濃度データから薬物動態学的パラメ−タ−を調べる。ＢＩＯＡＶＬソフトウェアの最新版を用いて、Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ＶＡＸ  ８６００コンピュ−タシステムにおいて、モデル非依存的方法により薬物動態学的パラメ−タ−を計算する。次の薬物動態学的パラメ−タ−を調べる：ピーク血清濃度（Ｃｍａｘ）；ピーク血清濃度までの時間（ｔｍａｘ）；線形台形法を用いて計算する、時間ゼロから最終採血時までの（ＡＵＣ０−７２）の濃度−時間曲線下の面積（ＡＵＣ）；及び、消失速度定数から計算した、最終消失半減期（ｔ１／２）。対数線形濃度−時間プロットの最終線形領域における連続したデータ点の直線回帰により、消失速度定数を推定する。薬物動態学的パラメ−タ−の、平均、標準偏差（ＳＤ）及び変動係数（ＣＶ）を各処置に対して計算する。パラメ−タ−平均の比率（保存処方物／非保存処方物）を計算する。
【０８０９】
安全性の結果  有害事象の発生は、治療群にまたがり等しく分布する。ベースライン又は試験前の臨床検査もしくは血圧からの臨床的に顕著な変化及び、健康診断結果及びバイタルサイン測定値における試験前からの顕著な変化はない。２つの治療群に対する安全性プロファイルは同じであると思われる。
【０８１０】
薬物動態学的結果  測定した各時点において、利用可能なＧＬＰ−１の１又は複数を単回投与した後の、１８名の全対象者における平均血清ＧＬＰ−１濃度−時間プロファイル（ベースラインＧＬＰ−１レベルに対する補正なし。）を、非天然コードアミノ酸を含有するＰＥＧ化ＧＬＰ−１と比較する。全対象者が正常な生理的範囲内の投与前ベースラインＧＬＰ−１濃度を有するべきである。投与前平均ベースラインＧＬＰ−１濃度に対して補正した血清データから薬物動態学的パラメ−タ−を決定し、Ｃｍａｘ及びｔｍａｘを決定する。選択した臨床比較物に対する平均ｔｍａｘは、非天然コードアミノ酸を含むＰＥＧ化ＧＬＰ−１に対するｔｍａｘよりも有意に短い。ＧＬＰ−１に対する最終半減期値は、非天然のコードアミノ酸を含有するＰＥＧ化ＧＬＰ−１に対する最終半減期と比較して、有意に短い。
【０８１１】
この試験を健康な男性被験者において行うが、同様の吸収特性及び安全性プロファイルが他の患者集団、例えば男性もしくは女性の癌もしくは慢性腎不全患者、小児腎不全患者、前貯蔵式自己血液プログラムの患者又は待機手術の予定がある患者などにおいて予想される。
【０８１２】
結論として、非天然コードアミノ酸を含有するＰＥＧ化ＧＬＰ−１の皮下単回投与は安全であり、健康な男性被験者においては良好な耐容性を示す。有害事象の相対的な発生率、臨床検査値、バイタルサイン及び健康診断の結果に基づき、ＧＬＰ−１の市販の形態及び非天然コードアミノ酸含有ＰＥＧ化ＧＬＰ−１の安全性プロファイルは同等である。非天然コードアミノ酸を含有するＰＥＧ化ＧＬＰ−１は、患者及びヘルスケア関係者に対して大きな臨床的有用性を提供する可能性がある。
【０８１３】
（実施例３２）
本実施例は、非天然コードアミノ酸をＴ−２０に取り込ませる好ましい部位を選択するために使用し得る多くの基準のうちいくつかについて記載する。
【０８１４】
本実施例は、非天然コードアミノ酸を導入するために、Ｔ−２０ポリペプチド内の好ましい部位をどのようにして選択するかについて示す。本実施例において使用される配列の付番は、Ｔ−２０（配列番号２２）及びＴＥＸ（配列番号２４）のアミノ酸配列に従う。ＴＥＸは、Ｔ−２０のＮ末端伸長されたポリペプチドである。別段の記載がない限り、引用されている位置番号は、Ｔ−２０ペプチドの６３８−６３７位及びＴＥＸペプチドの６３０−６７３に基づいている。例えば、６３９位は、配列番号２２の２番目のアミノ酸に対応する。当業者であれば、配列番号２２中の位置に対応するアミノ酸位置は、配列番号２４又は他の任意のＴ−２０分子中に容易に特定できることが理解できるであろう。
【０８１５】
Ｔ−２０の潜在的なαヘリックス構造のモデル構築は、「Ｗ．  Ｓｈｕ，  Ｊ．  Ｌｉｕ，  Ｈ．  Ｊｉ，  Ｌ．  Ｒａｄｉｎｇ，  Ｓ．  Ｊｉａｎｇ，  Ｍ．  Ｌｕ，  Ｈｅｌｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＨＩＶ−Ｉ  ｇｐ４１  Ｃｏｒｅ  Ｒｅｖｅａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｇｐ４１  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：１６３４（２０００））」から得られるＰＤＢ  ＩＤＬＢに基づいて行った。次の基準を使用して、非天然コードアミノ酸の導入のためのＴ−２０の各位置を評価する：残基は、（ａ）三次元構造又はＴ−２０の二次、三次もしくは四次構造の構造解析に基づいて何れのＴ−２０の結合も妨害せず、ｂ）アラニン又はホモローグスキャニング突然変異誘発により影響を受けず、（ｃ）表面に曝露されており、周囲の残基と、最小のファンデルワ−ルス力もしくは水素結合相互作用を示し、（ｄ）Ｔ−２０の曝露面の１又は複数上にあり得、（ｅ）第二のＴ−２０又はその他分子もしくはそれらの断片に並列される、Ｔ−２０の部位又は複数の部位であり得、（ｆ）Ｔ−２０変異型において欠失があるか又は可変であるかの何れかであり、（ｇ）その結果、非天然コードアミノ酸での置換において保存的変化が得られ、（ｈ）所望のように、完全構造の柔軟性又は剛直性を変化させることにより、Ｔ−２０そのもの又は１もしくは複数のＴ−２０を含有する二量体もしくは多量体の立体構造を調整し得、（ｉ）非常に柔軟性の高い領域又は構造的に剛直な領域の何れかで見られ得、（ｊ）相補性決定領域（ＣＤＲ）で見られるか又は見られない。さらに、Ｃｘプログラム（Ｐｉｎｔａｒら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１８、ｐｐ。９８０）を利用してＴ−２０分子においてさらなる計算を行い、各タンパク質原子に対する突出の程度を調べた。結果として、ある実施形態において、以下に限定されないがＴ−２０の１又は複数の位置で、非天然コードアミノ酸が置換される。
【０８１６】
幾つかの実施形態において、Ｔ−２０（ＴＥＸを含む。）中の任意の位置（最初のアミノ酸、カルボキシ末端における付加又はこれらのあらゆる組み合わせ）に、１又は複数の非天然コードアミノ酸が取り込まれる。  幾つかの実施形態では、１又は複数の非天然コードアミノ酸は、以下のように、Ｔ−２０（ＴＥＸを含む。）中の任意の位置に取り込まれる。Ｗ６３１、Ｄ６３２、１６３５、Ｎ６３６、Ｎ６３７、Ｙ６３８、Ｔ６３９、Ｓ６４０、Ｌ６４１、Ｌ６４５、Ｎ６５１又はこれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０８１７】
（実施例３３）
Ｔ−２０及びＴＥＸを生合成的に生産するためのクローニング戦略
図９Ａは、非天然コードアミノ酸を、Ｔ−２０ポリペプチド中に、及びＮ末端が伸長されたＴ−２０のポリペプチド（ＴＥＸ）中に取り込むように設計された構築物の模式図を示している。Ｔ−２０及びＴＥＸをコードする配列（ペプチド産物のＮ末端のメチオニンを含む。）を増幅するために、ＨＩＶプロウイルスＤＮＡを使用した。ＨＩＶプロウイルスＤＮＡからＴ−２０配列を増幅するために使用したプライマーは、Ｆ−Ｔ２０  ５’ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＡＴＧ  ＴＡＣ  ＡＣＡ  ＡＧＴ  ＴＴＡ  ＡＴＡ  ＣＡＣ  ＴＣＣ３’（配列番号２６）及びＲ−Ｔ２０  ５’ＧＣＧ  ＧＡＴ  ＣＣＣ  ＡＴＴ  ＡＡＡ  ＡＣＣ  ＡＡＴ  ＴＣＣ  ＡＣＡ  ＡＡＣ  ＴＴＧ  Ｃ３’（配列番号２７）であった。ＨＩＶプロウイルスＤＮＡからＴＥＸ配列を増幅するために使用したプライマーは、Ｆ−ＥＸＴ２０  ５’  ＣＧ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＧＡＴ  ＡＧＡ  ＧＡＡ  ＡＴＴ  ＡＡＣ  ＡＡＴ  ＴＡＣ  ＡＣＡ  ＡＧＴ  ＴＴＡ  ＡＴＡ  ＣＡＣ  ＴＣＣ３’（配列番号２８）及びＲ−Ｔ２０（配列番号２７）であった。Ｆ−Ｔ２０及びＦ−ＥＸＴ２０は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含有し、Ｒ−Ｔ２０はクローニングのためにＢａｍＨＩ部位を含有していた。
【０８１８】
ＴｒｐＬＥ融合対（ＦＰ）及び融合対のＮ末端に存在する９個のヒスチジンタグを含有する発現ベクター中に、Ｔ−２０及びＴＥＸ配列を、インフレームにクローニングした。
【０８１９】
図１０は、野生型Ｔ−２０及びＴＥＸ配列の比較を示している。ペプチドＴ−２０の伸長した様式（ＴＥＸ）は、ｇｐ４１ヘプタッドリピ−ト２（ＨＲ２）の対応するＤＮＡ領域を増幅するために、上記プライマーを用いて生成した。ＴＥＸのＮ末端は、Ｔ−２０より８アミノ酸長く、４４アミノ酸長のポリペプチドを与える。ＴＥＸは、ＨＩＶＮＬ４−３膜貫通タンパク質（ＴＭ）のアミノ酸６３０ないし６７３に対応する。Ｔ−２０は、ＨＩＶＮＬ４−３膜貫通タンパク質（ＴＭ）のアミノ酸６３８ないし６７３に対応する。
【０８２０】
生合成的に産生されたＴ２０及びＴＥＸペプチド類縁体の精製
得られた融合ペプチドは、細菌中で生合成的に産生された。Ｔ−２０又はＴＥＸ構築物の抑制を行うために、オルソゴナルＲＮＡ及びその特異的なオルソゴナルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を発現した。細菌の細胞質中でのタンパク質分解を避けるために、融合ペプチドを封入体（ＩＢ）中に誘導することによって発現を行った。融合ペプチドを含有するＩＢは、１００μｇ／ｍＬリゾチ−ム及び１０μｇ／ｍＬ  ＤＮア−ゼを含有する封入体再懸濁緩衝液（ＩＢＲＢ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に再懸濁した。再懸濁液の音波処理を６回行った後、ペレットを沈降させるために、試料を遠心した。１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加えた封入体洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）との音波処理及び洗浄間の遠心によって残存する莢雑物を除去するために、ＩＢペレットを４回洗浄した。次いで、封入体洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）との音波処理及び洗浄間の遠心によって、ＩＢペレットを２回洗浄した。グアニジニウム結合緩衝液、ｐＨ７．８（６ＭグアニジンＨＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＰＯ４，ｐＨ  ７．８、５００ｎＭ  ＮａＣｌ）中にペレットを可溶化し、融合ペプチドのＨｉｓタグ精製のために、平衡化されたＰｒｏＢｏｎｄ樹脂に結合させた。グアニジニウム結合緩衝液、ｐＨ７．８で２回、グアニジニウム洗浄緩衝液、ｐＨ６．０（６ＭグアニジンＨＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＰＯ４，ｐＨ６．０、５００ｎＭ  ＮａＣｌ）で２回、グアニジニウム洗浄緩衝液、ｐＨ５．３（６ＭグアニジンＨＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＰＯ４，ｐＨ５．３、５００ｎＭ  ＮａＣｌ）で２回、樹脂を洗浄した。グアニジニウム溶出緩衝液、ｐＨ４．０（６ＭグアニジンＨＣｌ、２００ｍＭ酢酸、２０ｍＭ  ＮａＰＯ４，ｐＨ４、５００ｎＭ  ＮａＣｌ）を用いて、Ｈｉｓ−Ｔａｇが結合された融合ペプチドを溶出した。
【０８２１】
試料の凍結乾燥の前に、ＤＰ−１０脱塩カラムを用いて、１０％ギ酸でグアニジニウム溶出緩衝液との緩衝液交換を行った。凍結乾燥後、次いで、一晩の臭化シアン（ＣＮＢｒ）切断のために、７０％ギ酸中に再懸濁した。ＣＮＢｒは、メチオニンのＣ末端を特異的に切断するので、ＣＮＢｒを用いた切断によって、Ｔ−２０又はＴＥＸをその融合対から分離し、抗ウイルス活性アッセイでの検査のために、さらに精製して純粋なペプチドを得ることが可能となる。図９のレ−ン４、パネルＢは、ＣＮＢｒ処理の切断産物を示している。Ｔ−２０及び融合対（ＦＰ）は、矢印によって示されている。他のレ−ンは、以下のようにロ−ドされた。レ−ン１−マーカー、レ−ン２−誘導前、レ−ン３−誘導後。
【０８２２】
ＣＮＢｒによる切断後、試料を凍結乾燥し、８Ｍ尿素中に再懸濁し、調製用ＨＰＬＣを通じて分離した。残存するＣＮＢｒを精製除去するために、Ｃ８プレップＨＰＬＣカラム上に試料を走行させた。産物を凍結乾燥した後、グアニジニウム結合緩衝液、ｐＨ７．８中に再懸濁した。平衡化されたＰｒｏＢｏｎｄ樹脂に可溶化された産物を結合させ、非結合流出物を集めた。次いで、Ｔ−２０又はＴＥＸを精製するために、Ｃ８プレップＨＰＬＣカラム上に試料を走行させ、凍結乾燥した。次いで、精製されたペプチドを、以下の緩衝液中に再懸濁した。２２．５ｍｇ／ｍＬマニト−ル、２．３９ｍｇ／ｍＬ炭酸ナトリウム、ｐＨ９。
【０８２３】
Ｔ２０及びＴＥＸを修飾するための変異
指定の保存された位置に、非天然コードアミノ酸を取り込むために、Ｔ−２０及びＴＥＸ類縁体ペプチドの両方をコードするポリヌクレオチド中にセレクターコドンを導入した。ＨＩＶ融合中に６−ヘリックスバンドルの公表された結晶構造に基づいて、各セレクターコドンの位置を選択した。製造者の説明書（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に従って、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ突然変異導入によって、セレクターコドンを導入し、各変異体の配列決定によって確認した。
【０８２４】
非天然コードアミノ酸を用いた置換をコードするセレクターコドンを用いて、Ｔ−２０の５つの異なる構築物を生成した。図１０は、アンバーコドン：Ｔ２０  ６３９として表記されるスレオニン；セリンＴ２０  ６４０；ロイシンＴ２０  ６４１；ロイシンＴ２０  ６４５及びアスパラギンＴ２０  ６５１で置換されたコドンによってコードされるＴ−２０の５つの残基のマップを示している。
【０８２５】
非天然コードアミノ酸を用いた置換をコードするセレクターコドンを用いて、ＴＥＸの１１の異なる構築物を生成した。図１０は、アンバーコドン：ＴＥＸ６３１として表記されるトリプトファン；ＴＥＸ６３２として表記されるアスパラギン酸；ＴＥＸ６３５として表記されるイソロイシン；ＴＥＸ６３６として表記されるアスパラギン；ＴＥＸ６３７として表記されるアスパラギン；、ＴＥＸ６３７として表記されるアスパラギン、ＴＥＸ６３８として表記されるチロシン；ＴＥＸ６３９として表記されるトレオニン；ＴＥＸ６４０として表記されるセリン；ＴＥＸ６４１として表記されロイシン；ＴＥＸ６４５として表記されるロイシン；及びＴＥＸ６５１として表記されるアスパラギンによって置換されたコドンによってコードされるＴＥＸの１１残基のマップを示している。図１２は、Ｔ２０  ６５１（パネルＡ）及びＴＥＸ  ６３６（パネルＢ）の両方に生じた抑制を示している。ｓｕｐは、抑制の略号である。図１２、パネルＣ及びＤは、図１２、パネルＡ及びＢ中で走行されている試料のウェスタンブロットを示している。パネルＥは、Ｔ−２０（Ｔ−２０−Ｍｕｔ６５１）及びＴＥＸ（ＴＥＸ−Ｍｕｔ６３６）中のアスタリスクが付された、ｐ−アセチル−フェニルアラニンで置換された残基を示している。
【０８２６】
（実施例３４）
本実施例は、非天然コードアミノ酸を含むＴ−２０の生物活性を測定するための方法を記載している。
【０８２７】
Ｔ２０及びＴＥＸ抗ウイルス活性を検査するためのインビトロアッセイ
Ｔ２０又はＴＥＸ抗ウイルス活性を評価するために、融合アッセイは、単一サイクルの感染性に基づいて使用される。アッセイの模式図は、図１１に示されている。要約すれば、２９３−Ｔ細胞は、２つのプラスミドで共同形質移入される。ＨＩＶエンベロープ遺伝子（ＪＲＦＬ又はＪＣ２  ｅｎｖ）のみを発現する１つのプラスミド及びＨＩＶ  Ｎｅｆ遺伝子の代わりにルシフェラ−ゼ遺伝子を有し、その内在のエンベロープ遺伝子（ｐＨＴＶ．Ｌｕｃ）を発現しない修飾されたＨＩＶプロウイルスＤＮＡを発現する第二のプラスミド。このような偽型化されたｅｎｖ  ＨＩＶ−Ｌｕｃウイルスは、感染の１ラウンドのみによって標的細胞を感染することが可能である。ＨＩＶは、形質移入から４８時間後に産生され、形質移入された細胞の上清中に集められる。ウイルスの定量は、ＥＬＩＳＡによって、ｐ２４ｇａｇを測定することによって行われる。ＨＩＶ濃度を測定すれば、ヒトＣＤ４受容体及び２つのヒト共受容体ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４の何れか１つを発現しているヒト標的細胞を、Ｔ２０、ＴＥＸ及びそれらの対応する変異体の存在下又は非存在下で、異なるＭＯＩで感染される。感染から３日後に、細胞を溶解し、発光測定器によって測定されるルシフェラ−ゼ活性を測定するために基質を負荷される。このアッセイは定量的であり、異なるペプチドのＨＩＶ融合の阻害レベルを評価する。
【０８２８】
あるいは、当業者に公知のウイルス侵入又はウイルス融合を測定するアッセイなどの（これに限定されない。）抗ウイルス活性を測定する他のアッセイを含む（これに限定されない。）多数の他のアッセイを使用して、本発明のＴ−２０又はＴＥＸポリペプチドの活性をモニターするために使用することができる。別の抗ウイルス剤との組み合わせ療法を検査するためのこれらのアッセイに対する修飾も、当業者に公知である。
【０８２９】
また、当業者に周知である標準的な方法を、非レトロウイルス活性をアッセイするために使用し得る。  呼吸器合胞体ウイルス及びパラインフルエンザウイルス活性アッセイ技術の考察については、例えば、「Ｐｒｉｎｇｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｉｎｇｌｅ，  Ｃ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ｊ．  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７：３７７−３８６）」を参照されたい。さらに、例えば、このような技術の総説については、「“Ｚｉｎｓｓｅｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ”，  １９８８，  Ｊｏｋｌｉｋ，  Ｗ．  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，  Ｎｏｒｗａｌｋ，  Ｃｏｎｎ．，  １９ｔｈ  ｅｄ．，」を参照されたい。これらの参考文献は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０８３０】
本発明のＴ−２０ポリペプチドを用いて、動物実験を行うことができる。このような実験には、毒性研究が含まれるが、これに限定されない。
【０８３１】
本明細書に記載の実施例及び実施形態は、ただ説明を目的とするものであり、それらに照らして、様々な変形及び変更が当業者に対して示唆され、これらが、本願の精神及び範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるものとすることを理解されたい。本明細書中で引用した、全ての刊行物、特許及び特許明細書は、あらゆる目的のために、その全体を本明細書中に参照により組み込む。
【０８３２】
【表３】
2008507280.tif 000025
【０８３３】
本発明のさらなる及び別の実施形態
１．  ＬＴ−Ｐ−Ｔ’（式中（ＬＴ）は、局在化ペプチド（Ｌ）、タグ又はリンカー（Ｔ）任意の順序の局在化ペプチド（Ｌ）及びタグ又はリンカー（Ｔ）、メチオニン及び不存在からなる群から選択され；Ｐは、ＢＳＰ配列を含み；並びにＴ’は、タグ若しくはリンカーを含み、又は不存在であり、Ｌ、Ｔ、Ｐ又はＴ’は、１又は複数の非天然コードアミノ酸を含む。）を含むポリペプチド。
２．  Ｌが、ＴｒｐＬＥ配列、原核生物の分泌シグナル配列、真核生物の分泌シグナル配列、細菌の発現のために５’最適化された真核生物分泌シグナル配列、細菌の分泌シグナル配列、酵母分泌シグナル配列、昆虫の分泌シグナル配列、哺乳動物の分泌シグナル配列、新規分泌シグナル配列、ユニークな分泌シグナル配列、ペクタ−トリアーゼ分泌シグナル配列、ＯｍｐＡ分泌シグナル配列及びファージ分泌シグナル配列からなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
３．  Ｔ又はＴ’が、ポリペプチド、ポリマー、アフィニティータグ、抗原、検出タグ、画像化タグ、複数要素結合複合体の要素及び放射性同位体タグからなる群から選択されるタグ又はリンカーである、請求項１に記載のポリペプチド。
４．  Ｔ又はＴ’が、ポリ−Ｈｉｓタグ、ビオチン、アビジン、プロテインＡ、プロテインＧ及び抗原からなる群から選択されるアフィニティータグである、請求項３に記載のポリペプチド。
５．  Ｔ又はＴ’が、ポリ−Ｈｉｓタグ、ビオチン、アビジン、プロテインＡ、プロテインＧ及び抗原からなる群から選択される検出タグである、請求項３に記載のポリペプチド。
６．  Ｔ又はＴ’が、免疫グロブリンエピトープからなる群から選択される抗原である、請求項３に記載のポリペプチド。
７．  Ｔ又はＴ’が、金属、放射性核種及び磁気分子からなる群から選択される画像化タグである、請求項３に記載のポリペプチド。
８．  Ｔ又はＴ’が、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、プロテインＡ及びプロテインＧからなる群から選択される複数要素結合複合体タグの要素である、請求項３に記載のポリペプチド。
９．  非天然コードアミノ酸は、光活性化される官能基、ｐＨ活性化される官能基、温度活性化される官能基、触媒を必要とする官能基、プロテアーゼ、酵素又は別の化学官能基によって認識される官能基からなる群から選択される選択された条件下でペプチド結合を切断するように決定された官能基を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
１０．  選択された条件が、フォトンエネルギーへの曝露、増加された温度、減少された温度、増加されたｐＨ、減少されたｐＨ、素粒子への曝露、触媒の添加、酵素とのインキュベ−ション及び別の化学官能基との接触からなる群から選択される、請求項９に記載のポリペプチド。
１１．  前記ＢＳＰがＧＬＰ−１である、請求項１に記載のポリペプチド。
１２．  前記ＢＳＰがＴ−２０である、請求項１に記載のポリペプチド。
１３．  式：
Ｆ−（ＬＴ）−Ｐ−Ｔ−Ｆ’（式中、Ｆはポリペプチド配列を含み、又は不存在であり、（ＬＴ）は、局在化ペプチド（Ｌ）、タグ又はリンカー（Ｔ）任意の順序の局在化ペプチド（Ｌ）及びタグ又はリンカー（Ｔ）からなる群から選択され；
Ｐは、最大１００個のアミノ酸を有する所望のポリペプチド配列を含み、Ｆ又はＦ’とは異なり；Ｔ’は、タグ若しくはリンカーを含み、又は不存在であり、Ｆ’は、ポリペプチド配列を含み、又は不存在であり、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｐ、Ｔ’又はＦ’は、１又は複数の非天然コードアミノ酸を含む。）を含むポリペプチド。
１４．  Ｔ又はＴ’が、ポリペプチド、ポリマー、アフィニティータグ、抗原、検出タグ、画像化タグ、複数要素結合複合体の要素及び放射性同位体タグからなる群から選択されるタグ又はリンカーである、請求項１３に記載のポリペプチド。
１５．  Ｔ又はＴ’が、ポリ−Ｈｉｓタグ、ビオチン、アビジン、プロテインＡ、プロテインＧ及び抗原からなる群から選択されるアフィニティータグである、請求項１４に記載のポリペプチド。
１６．  Ｆ又はＦ’がＰに融合されているポリペプチドである、請求項１３に記載のポリペプチド。
１７．  Ｆ又はＦ’が、Ｆｃ、アルブミン及びアルブミン結合タンパク質からなる群から選択される、請求項１６に記載のポリペプチド。
１８．  Ｆが１又は複数の非天然コードアミノ酸を含む、請求項１３に記載のポリペプチド。
１９．  Ｆ’が１又は複数の非天然コードアミノ酸を含む、請求項１３に記載のポリペプチド。
２０．  Ｐが１又は複数の非天然コードアミノ酸を含むＢＳＰをさらに含む、請求項１３に記載ポリペプチド。
２１．  ＢＳＰ中の非天然コードアミノ酸は、光活性化される官能基、ｐＨ活性化される官能基、温度活性化される官能基、触媒を必要とする官能基、プロテアーゼ、酵素又は別の化学官能基によって認識される官能基からなる群から選択される選択された条件下でペプチド結合を切断するように決定された官能基を有する、請求項２０に記載のポリペプチド。
２２．  選択された条件が、フォトンエネルギーへの曝露、増加された温度、減少された温度、増加されたｐＨ、減少されたｐＨ、素粒子への曝露、触媒の添加、酵素とのインキュベ−ション及び別の化学官能基との接触からなる群から選択される、請求項２１に記載のポリペプチド。
２２．  前記ＢＳＰがＧＬＰ−１である、請求項２０に記載のポリペプチド。
２３．  前記ＢＳＰがＴ−２０である、請求項２０に記載のポリペプチド。
２４．ポリペプチドコード配列に作用可能に連結されたプロモーター配列を含み、前記ポリペプチドコード配列が式（ＷＸ）−Ｚを有し、（ＷＸ）は、  局在化ペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ｗ）、タグ又はリンカーをコードするヌクレオチド配列（Ｘ）任意の順序の局在化ペプチドを−コードするヌクレオチド配列（Ｗ）及びタグ又はリンカーをコードするヌクレオチド配列（Ｘ）、及び不存在からなる群から選択され、Ｚは所望のＢＳＰをコードするヌクレオチド配列を含み、Ｗ、Ｘ又はＺをコードするヌクレオチド配列はセレクターコドンを含む、核酸分子。
２５．  プロモーターが、原核生物のプロモーター、真核生物のプロモーター、細菌のプロモーター、酵母のプロモーター、昆虫のプロモーター、哺乳動物のプロモーター、ユニークプロモーター及び誘導可能なプロモーターからなる群から選択される、請求項２４に記載の核酸分子。
２６．  Ｗが、ＴｒｐＬＥ配列、原核生物の分泌シグナル配列、真核生物の分泌シグナル配列、細菌の発現のために５’最適化された真核生物分泌シグナル配列、細菌の分泌シグナル配列、酵母分泌シグナル配列、昆虫の分泌シグナル配列、哺乳動物の分泌シグナル配列、新規分泌シグナル配列、ユニークな分泌シグナル配列、ペクタ−トリアーゼ分泌シグナル配列、ＯｍｐＡ分泌シグナル配列及びファージシグナル配列をコードする、請求項２４に記載の核酸分子。
２７．  Ｘが、ポリペプチド、ポリマー、アフィニティータグ、抗原、検出タグ、画像化タグ、複数要素結合複合体の要素及び放射性同位体タグからなる群から選択されるタグをコードする、請求項２４に記載の核酸分子。
２８．  前記セレクターコドンが、アンバーコドン、オパールコドン、オクレコドン、四塩基コドン及びユニークコドンからなる群から選択される、請求項２４に記載の核酸分子。
２９．  Ｚに作用可能に連結されたＹ’をさらに含み、Ｙ’がタグをコードするヌクレオチド配列を含み、前記タグをコードする前記ヌクレオチド配列が必要に応じてセレクターコドンを含む、請求項２４に記載の核酸分子。
３０．  Ｙ’が、ポリペプチド、ポリマー、アフィニティータグ、抗原、検出タグ、画像化タグ、複数要素結合複合体の要素及び放射性同位体タグからなる群から選択されるタグをコードする、請求項２９に記載の核酸分子。
３１．  請求項２４又は２９の核酸分子を含む発現ベクター。
３２．  請求項３１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
３３．  前記宿主細胞が、原核生物、真核生物、昆虫、酵母、細菌、哺乳動物又は植物細胞からなる群から選択される、請求項３２に記載の植物細胞。
３４．  ａ）式：
ＬＴ−Ｐ−Ｔ’（式中（ＬＴ）は、局在化ペプチド（Ｌ）、タグ又はリンカー（Ｔ）、任意の順序の局在化ペプチド（Ｌ）及びタグ又はリンカー（Ｔ）、メチオニン及び不存在からなる群から選択され；
Ｐは、ＢＳＰ配列を含み；並びに
Ｔは、タグ若しくはリンカーを含み、又は不存在であり、Ｌ、Ｔ、Ｐ又はＴ’は、選択された条件下で１又は複数のペプチド結合を切断するように決定された官能基を有する１又は複数の非天然コードアミノ酸を含み、
ｂ）１又は複数のペプチド結合を少なくとも部分的に切断するのに十分な時間にわたって、選択された条件下で、前記ポリペプチドを反応すること、
ｃ）Ｐを含むペプチドを、反応産物から回収すること、を含む方法。
３５．  工程ｃ）のＰを含む回収されたペプチドが、Ｎ末端又はＣ末端に位置する所望の官能基を含む、請求項３４に記載の方法。
３６．  Ｎ末端の所望の官能基が、光活性化される官能基、ｐＨ活性化される官能基、温度活性化される官能基、触媒を必要とする官能基、プロテアーゼ、酵素又は別の化学官能基によって認識される官能基からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
３７．  Ｃ末端の所望の官能基が、光活性化される官能基、ｐＨ活性化される官能基、温度活性化される官能基、触媒を必要とする官能基、プロテアーゼ、酵素又は別の化学官能基によって認識される官能基からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
３８．  選択された条件が、フォトンエネルギーへの曝露、増加された温度、減少された温度、増加されたｐＨ、減少されたｐＨ、素粒子への曝露、触媒の添加、酵素とのインキュベ−ション及び別の化学官能基との接触からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
３９．  １又は複数の非天然コードアミノ酸を含む、ＢＳＰ。
４０．  ＢＳＰが１又は複数の翻訳後修飾を含む、請求項３９に記載のＢＳＰ。
４１．  ポリペプチドがリンカー、ポリマー又は生物学的に活性な分子に連結されている、請求項３９に記載のＢＳＰ。
４２．  前記ポリペプチドが水溶性ポリマーに連結されている、請求項４１に記載のＢＳＰ。
４３．  ポリペプチドがリンカー、二官能性ポリマー、二官能性リンカー又は少なくとも一つのさらなるＢＳＰに連結されている、請求項３９に記載のＢＳＰ。
４４．  前記ニ機能性リンカーが第二のポリペプチドに連結されている、請求項４３に記載のＢＳＰ。
４５．  第二のポリペプチドがＢＳＰである、請求項４４に記載のＢＳＰ。
４６．  水溶性ポリマーがポリ（エチレングリコール）部分を含む、請求項４２に記載のＢＳＰ。
４７．  前記水溶性ポリマーがリンカー、前記ＢＳＰ中に存在する非天然コードアミノ酸に連結されている、請求項４２に記載のＢＳＰ。
４８．  非天然コードアミノ酸が、配列番号２（ＧＬＰ−１）から得られる７位に（すなわち、Ｎ末端に）存在する最初のアミノ酸の前の残基、７Ｈ、８Ａ、３９Ｅ、Ｖ１６、１７Ｓ、１８Ｓ、１９Ｙ、２ＯＬ、２１Ｅ、２２Ｇ、２３Ｑ、２４Ａ、２５  Ａ、２６Ｋ、２７Ｅ、２８Ｆ、２９Ｉ、３０Ａ、３１Ｗ、３２Ｌ、３３Ｖ、３４Ｋ、３５Ｇ、３６Ｒ、３７Ｇ、３８位の（すなわち、カルボキシ末端の）付加及びこれらの任意の組み合わせから選択される位置において置換されている、請求項３９に記載のＢＳＰ。
４９．  非天然コードアミノ酸が、配列番号２２又は２４（Ｔ−２０）から得られるＷ６３１、Ｄ６３２、１６３５、Ｎ６３６、Ｎ６３７、Ｙ６３８、Ｔ６３９、Ｓ６４０、Ｌ６４１、Ｌ６４５、Ｎ６５１及びこれらの任意の組み合わせから選択される位置において置換されている、請求項３９に記載のＢＳＰ。
５０．  ＢＳＰポリペプチドが、ＢＳＰ受容体又は結合対に対するＢＳＰの親和性を調節する一又は複数のアミノ酸置換、付加又は欠失を含む、請求項１、２０、２４又は３４に記載のＢＳＰ。
５１．  ＢＳＰが、ＢＳＰの安定性又は溶解度を増加させる一又は複数のアミノ酸置換、付加又は欠失を含む、請求項１、２０、２４又は３４に記載のＢＳＰ。
５２．  ＢＳＰが、組換え宿主細胞中でのＢＳＰの発現又はインビトロで合成されるＢＳＰを増加する一又は複数のアミノ酸置換、付加又は欠失を含む、請求項１、２０、２４又は３４に記載のＢＳＰ。
５３．  ＢＳＰが、ＢＳＰのプロテアーゼ耐性を増加させる一又は複数のアミノ酸置換、付加又は欠失を含む、請求項１、２０、２４又は３４に記載のＢＳＰ。
５４．  前記非天然コードアミノ酸が、該アミノ酸がなければポリペプチド中の２０の共通アミノ酸の何れとも反応しないリンカー、ポリマー又は生物学的に活性な分子に対して反応性を示す、請求項１、２０、２４又は３４に記載のＢＳＰ。
５５．  前記非天然コードアミノ酸が、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基又はアルキン基を含む、請求項１、２０、２４又は３４に記載のＢＳＰ。
５６．  前記非天然コードアミノ酸がカルボニル基を含む、請求項５５に記載のＢＳＰ。
５７．  前記非天然コードアミノ酸が、構造：
【０８３４】
【化２２】
2008507280.tif 000026
（ｎは、０ないし１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキル又は置換されたアリールであり；Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換されたアルキル及び置換されたアリールであり；Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり；Ｒ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）を有する、請求項５６に記載のＢＳＰ。
５８．  非天然コードアミノ酸がアミノオキシ基を含む、請求項５５に記載のＢＳＰ。
５９．  非天然コードアミノ酸がヒドラジド基を含む、請求項５５に記載のＢＳＰ。
６０．  非天然コードアミノ酸がヒドラジン基を含む、請求項５５に記載のＢＳＰ。
６１．  非天然コードアミノ酸残基がセミカルバジド基を含む、請求項５５に記載のＢＳＰ。
６２．  非天然コードアミノ酸残基がアジド基を含む、請求項５５に記載のＢＳＰ。
６３．  前記非天然コードアミノ酸が、構造：
【０８３５】
【化２３】
2008507280.tif 000027
（ｎは、０ないし１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキル、置換されたアリール、又は不存在であり；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであり、又は存在せず；ｍは、０−１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり；Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）を有する、請求項６２に記載のＢＳＰ。
６４．  非天然コードアミノ酸がアルキン基を含む、請求項５５に記載のＢＳＰ。
６５．  前記非天然コードアミノ酸が、構造：
【０８３６】
【化２４】
2008507280.tif 000028
（ｎは、０ないし１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換されたアルキル又は置換されたアリールであり；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであり、又は存在せず；ｍは、０−１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり；Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）を有する、請求項６４に記載のＢＳＰ。
６６．  水溶性ポリマーが約０．１ｋＤａないし約１００ｋＤａの分子量を有する、請求項４２に記載のＢＳＰ。
６７．  水溶性ポリマーが約０．１ｋＤａないし約５０ｋＤａの分子量を有する、請求項６６に記載のＢＳＰ。
６８．  カルボニル含有アミノ酸を含むＢＳＰを、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド基を含む水溶性ポリマーと反応させることによって作製される、請求項４２に記載のＢＳＰ。
６９．  アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド基が、アミド結合を通じて、前記水溶性ポリマーに連結されている、請求項６８に記載のＢＳＰ。
７０．  カルボニル基を水溶性ポリマーを、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド基を含む非天然コードアミノ酸と反応させることによって作製される、請求項４２に記載のＢＳＰ。
７１．  アルキン含有アミノ酸を含むＢＳＰを、アジド部分を含む水溶性ポリマーと反応させることによって作製される、請求項４２に記載のＢＳＰ。
７２．  アジド含有アミノ酸を含むＢＳＰを、アルキン部分を含む水溶性ポリマーと反応させることによって作製される、請求項４２に記載のＢＳＰ。
７３．  アジド又はアルキン基が、アミド結合を通じて、水溶性ポリマーに連結されている、請求項５５に記載のＢＳＰ。
７４．  水溶性ポリマーが分岐された又はマルチア−ムのポリマーである、請求項４２に記載のＢＳＰ。
７５．  水溶性ポリマーの各分岐が約１ｋＤａないし約１００ｋＤａの分子量を有する、請求項７４に記載のＢＳＰ。
７６．  ポリペプチドがアンタゴニストである、請求項３９に記載のＢＳＰ。
７７．  ポリペプチドが、一又は複数の、翻訳後修飾、リンカー、ポリマー又は生物学的に活性な分子を含む、請求項７６に記載のＢＳＰ。
７８．  ポリマーが水溶性ポリマー及びポリ（エチレングリコール）からなる群から選択される部分を含む、請求項７７に記載のＢＳＰ。
７９．  前記非天然コードアミノ酸が糖部分を含む、請求項３９に記載のＢＳＰ。
８０．  前記リンカー、ポリマー又は生物学的に活性な分子が、糖部分を介してポリペプチドに連結されている、請求項４１に記載のＢＳＰ。
８１．  ストリンジェントな条件下で配列番号２１、２２、２６、２７、３１、３２、３３、３４、４０、４１、２３又は２４にハイブリダイズし、少なくとも一つのセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを含む単離された核酸。
８２．  セレクターコドンが、アンバーコドン、オクレコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン及び四塩基コドンからなる群から選択される、請求項８１に記載の単離された核酸。
８３．  非天然コードアミノ酸を含む単離されたＢＳＰポリペプチドを、前記非天然コードアミノ酸と反応する部分を含むリンカー、ポリマー又は生物学的に活性な分子と接触させることを含む、請求項４１に記載のＢＳＰを製造する方法。
８４．  ポリマーが水溶性ポリマー及びポリ（エチレングリコール）からなる群から選択される部分を含む、請求項８３に記載の方法。
８５．  非天然コードアミノ酸が、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基又はアルキン基を含む、請求項８３に記載の方法。
８６．  非天然コードアミノ酸がカルボニル部分を含み、及び前記リンカー、ポリマー又は生物学的に活性な分子がアミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド部分を含む、請求項８３に記載の方法。
８７．  アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド部分が、アミド結合を通じて、前記リンカー、ポリマー又は生物学的に活性な分子に連結されている、請求項８６に記載の方法。
８８．  非天然コードアミノ酸がアルキン部分を含み、及び前記リンカー、ポリマー又は生物学的に活性な分子がアジド部分を含む、請求項８３に記載の方法。
８９．  非天然コードアミノ酸がアジド部分を含み、及び前記リンカー、ポリマー又は生物学的に活性な分子がアルキン部分を含む、請求項８３に記載の方法。９０．  アジド又はアルキン部分が、アミド結合を通じて、リンカー、ポリマー又は生物学的に活性な分子に連結されている、請求項８５に記載の方法。
９１．  前記ポリ（エチレングリコール）部分が、約０．１ｋＤａないし約１００ｋＤａの平均分子量を有する、請求項８４に記載の方法。
９２．  前記ポリ（エチレングリコール）部分が分岐された又はマルチア−ムのポリマーである、請求項８４に記載の方法。
９３．  請求項３９に記載のＢＳＰと薬学的に許容される担体とを含む組成物。
９４．  前記非天然コードアミノ酸が水溶性ポリマーに連結されている、請求項９３に記載の組成物。
９５．  請求項９３に記載の組成物の治療的有効量を患者に投与することを含む、ＢＳＰによって調節される疾患を有する患者を治療する方法。
９６．  請求項８１に記載の核酸を含む細胞。
９７．  前記細胞がオルソゴナルｔＲＮＡシンテターゼ又はオルソゴナルｔＲＮＡを含む、請求項９６に記載の細胞。
９８．  ＢＳＰポリペプチドをコードする一又は複数のポリヌクレオチドを含み、並びにセレクターコドン、オルソゴナルＲＮＡシンテターゼ及びオルソゴナルｔＲＮＡを含む細胞を、非天然コードアミノ酸を含むＢＳＰポリペプチドの発現を可能とする条件下で培養することと；及び前記ＢＳＰポリペプチドを精製することとを含む、非天然コードアミノ酸を含むＢＳＰポリペプチドを作製する方法。
９９．  ＢＳＰ中の天然に存在するアミノ酸を一又は複数の非天然コードアミノ酸に置き換えることを含む、ＢＳＰの血清半減期又は循環時間を調節する方法。
１００．  セレクターコドンを含み、且つ少なくとも一つの非天然コードアミノ酸を含むポリペプチドによってコードされるＢＳＰ。
１０１．  非天然コードアミノ酸が、リンカー、ポリマー、水溶性ポリマー又は生物学的に活性な分子に連結されている、請求項１００に記載のＢＳＰ。
１０１．  水溶性ポリマーがポリ（エチレングリコール）部分を含む、請求項１０１に記載のＢＳＰ。
１０２．  非天然コードアミノ酸が、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基又はアルキン基を含む、請求項１００に記載のＢＳＰ。
１０３．  前記ポリ（エチレングリコール）部分が、約０．１ｋＤａないし約１００ｋＤａの分子量を有する、請求項１０１に記載のＢＳＰ。
１０４．  ポリ（エチレングリコール）部分が分岐された又はマルチア−ムのポリマーである、請求項１０１に記載のＢＳＰ。
１０５．  ポリ（エチレングリコール）部分が、約０．１ｋＤａないし約１００ｋＤａの分子量を有する、請求項１０４に記載のＢＳＰ。
１０６．  請求項１００に記載のＢＳＰと薬学的に許容される担体とを含む組成物。
１０７．  ＢＳＰの単一のアミノ酸に、共有結合によって連結された水溶性ポリマーを含むＢＳＰ。
１０８．  水溶性ポリマーがポリ（エチレングリコール）部分を含む、請求項１０７に記載のＢＳＰ。
１０９．  前記水溶性ポリマーに共有結合されたアミノ酸が前記非天然コードアミノ酸である、請求項１０７に記載のＢＳＰ。
１１０．  前記非天然コードアミノ酸がポリ（エチレングリコール）分子に連結されている、請求項４８に記載のＢＳＰ。
１１１．  前記非天然コードアミノ酸がポリ（エチレングリコール）分子に連結されている、請求項４９に記載のＢＳＰ。
１１２．  少なくとも一つのリンカー、ポリマー、又は生物学的に活性な分子を含み、リンカー、ポリマー、又は生物学的に活性な分子が、リボソームによってポリペプチド中に取り込まれた非天然コードアミノ酸の官能基を通じてポリペプチドに結合されている、ＢＳＰ。
１１３．  前記ＢＳＰがモノＰＥＧ化されている、請求項１１２に記載のＢＳＰ。
１１４．  一又は複数の非天然コードアミノ酸に結合された、リンカー、ポリマー又は生物学的に活性な分子を含み、前記非天然コードアミノ酸が、予め選択されたポリペプチドの部位中にリボ−ソ−ムによって取り込まれる、ＢＳＰ。
１１５．  ＢＳＰが１つの前記リンカー、ポリマー又は生物学的に活性な分子を含む、請求項１１４に記載のＢＳＰ。
１１６．  ＢＳＰが、ＢＳＰの免疫原性を調節する一又は複数のアミノ酸置換、付加又は欠失を含む、請求項１、２０、２４又は３４に記載のＢＳＰ。
１１７．  ＢＳＰが、ＢＳＰの血清半減期又は循環時間を調節する一又は複数のアミノ酸置換、付加又は欠失を含む、請求項１、２０、２４又は３４に記載のＢＳＰ。
１１８．  ＢＳＰ中の１又は複数の天然に存在するアミノ酸を、一又は複数の非天然コードアミノ酸に置き換えることを含む、ＢＳＰの免疫原性を調節する方法。
１１９．  ポリペプチドが配列番号１、２、３、２１、２２、２３、２４及びこれらの断片からなる群から選択されるＢＳＰ。
【図面の簡単な説明】
【０８３７】
【図１】ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質を含むＧＬＰ−１二量体ポリペプチドのダイアグラムが示されている。
【図２】ＧＬＰ−１及びエキセンディン４のヘリックス比較のダイアグラムが示されている。
【図３】ＧＬＰ−１及びエキセンディン４の構造の比較のダイアグラムが示されている。
【図４】エキセンディン又はＧＬＰ−１類縁体の設計戦略のダイアグラムが示されている。
【図５】特定の構造的特徴を有するＧＬＰ−１類縁体の設計戦略のダイアグラムが示されている。
【図６】分子内架橋を有するＧＬＰ−１ポリペプチドの設計戦略のダイアグラムが示されている。
【図７】ＧＬＰ−１中の分子内架橋に対して使用し得る化学的戦略が示されている。
【図８】ＧＬＰ−１発現のための構築物が示されている。
【図９】Ｔ−２０及びＴＥＸ中に、非天然コードアミノ酸を取り込むための構築物が示されている（図９、パネルＡ）。図９、パネルＢは、ＣＮＢｒ切断前及び切断後のＴ−２０ポリペプチドを示している。
【図１０】図１０には、野生型Ｔ−２０とＴＥＸ配列の比較が示されており、アンバーコドンで置換されたコドンによってコードされた残基がアスタリスクでマ−クされている。
【図１１】Ｔ−２０及びＴＥＸ抗ウイルス活性を検査するためのインビトロ融合アッセイが示されている。
【図１２】Ｔ２０  ６５１抑制（図１２、パネルＡ）及びＴＥＸ６３６抑制（図１２、パネルＢ）のクマシ−染色されたポリアクリルアミドゲルが示されている。パネルＡ及びＢに示されている試料のウェスタン（抗Ｈｉｓ）が、図１２のパネルＣ及びＤに示されている。図１２、パネルＥは、Ｔ−２０（Ｔ−２０−Ｍｕｔ６５１）及びＴＥＸ（ＴＥＸ−Ｍｕｔ６３６）中のアスタリスクが付された、ｐ−アセチル−フェニルアラニンで置換された残基を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１２】
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【配列表】
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