(57)【要約】  本発明は、インシリコ分析に基づく菌株の改良方法に係り、さらに具体的には、ゲノム情報を比較する方法であって、有用物質の過量生産に不要な遺伝子を１次的にスクリーニングし、代謝フラックスの分析技術を利用した仮想シミュレーションを通じて欠失対象遺伝子を２次的にスクリーニングすることを特徴とするインシリコ菌株の改良方法に関する。  本発明によれば、代謝工学的な接近方法及び遺伝工学的な方法を利用して、有用物質を生産しようとする対象菌株と、有用物質を多量生産する菌株との遺伝子ゲノム上の遺伝子を比較分析することにより候補遺伝子をスクリーニングし、前記スクリーニングされた遺伝子から構成できる多様な欠失対象遺伝子の組合せを対象としてインシリコ・シミュレーションを行い、有用物質の生産性の改善された変異菌株を効率的に選定することができ、その結果、実際のウェット実験にかかる手間やコストを大福的に削減することができる。
2008527991.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のステップを含む有用物質生産菌株の改良方法であって
（ａ）有用物質を生産しようとする対象菌株及び有用物質の過量生産菌株を選定し、２つの菌株の代謝フラックスの分析モデルシステムを構築するステップ；
（ｂ）有用物質を生産しようとする対象菌株に存在し、細胞の成長に必須ではない遺伝子や妨害になる遺伝子のうち、有用物質を過量生産する菌株には存在しない遺伝子をスクリーニングするステップ；
（ｃ）前記スクリーニングされた遺伝子から欠失対象遺伝子の組合せを構成するステップ；
（ｄ）前記ステップ（ａ）で構築された代謝フラックスの分析モデルシステムを利用するが、前記有用物質を生産しようとする対象菌株から前記ステップ（ｃ）で構成された遺伝子の組合せをそれぞれ欠失させた変異菌株を対象としてインシリコ・シミュレーションを行うステップ；
（ｅ）前記シミュレーション結果から比増殖速度に対する有用物質の生産収率に優れた欠失対象遺伝子の組合せを選別するステップ；及び
（ｆ）前記選別された遺伝子の組合せを欠失させた変異菌株を製作するステップ、
を含む前記方法。
【請求項２】
前記インシリコ・シミュレーションは、生産物の形成速度及び比増殖速度のトレード・オフ・カーブ（trade off curve）を作成し、変異菌株の比増殖速度及び有用物質の収率を比較することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記有用物質を生産しようとする対象菌株は大腸菌であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ｇ）前記製作された変異菌株を培養して、有用物質の生産性を実験的に確認するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
コハク酸生産菌株の改良方法であって
（ａ）コハク酸を生産しようとする対象菌株及びコハク酸の過量生産菌株を選定し、２つの菌株の代謝フラックスの分析モデルシステムを構築するステップ；
（ｂ）コハク酸を生産しようとする対象菌株に存在し、細胞の成長に必須ではない遺伝子や妨害になる遺伝子のうち、コハク酸を過量生産する菌株には存在しない遺伝子をスクリーニングするステップ；
（ｃ）前記スクリーニングされた遺伝子から欠失対象遺伝子の組合せを構成するステップ；
（ｄ）前記ステップ（ａ）で構築された代謝フラックスの分析モデルシステムを利用するが、前記コハク酸を生産しようとする対象菌株から前記ステップ（ｃ）で構成された遺伝子の組合せをそれぞれ欠失させた変異菌株を対象としてインシリコ・シミュレーションを行うステップ；
（ｅ）前記シミュレーション結果から比増殖速度に対するコハク酸の生産収率に優れた欠失対象遺伝子の組合せを選別するステップ；及び
（ｆ）前記選別された遺伝子の組合せを欠失させた変異菌株を製作するステップ、
を含む前記方法。
【請求項６】
前記インシリコ・シミュレーションは、コハク酸の形成速度及び比増殖速度のトレード・オフ・カーブ（trade off curve）を作成し、変異菌株の比増殖速度及びコハク酸の収率を比較することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記コハク酸を過量生産する生産菌株は、マンヘミア（Mannheimia）属であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記コハク酸を過量生産する生産菌株は、マンヘミア・サクシニシプロデュセンス（Mannheimia succiniciproducens MBEL55E：KCTC 0769BP）であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記コハク酸を生産しようとする対象菌株は大腸菌であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステップ（ｂ）でスクリーニングされた遺伝子は、ｐｔｓＧ、ｐｙｋＦ、ｐｙｋＡ、ｍｑｏ、ｓｄｈＡ、ｓｄｈＢ、ｓｄｈＣ、ｓｄｈＤ、ａｃｅＢ及びａｃｅＡからなる群から選択されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記ステップ（ｅ）で選別された欠失対象遺伝子の組合せは、ｐｔｓＧ、ｐｙｋＦ及びｐｙｋＡであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
（ｇ）前記製作された変異菌株を培養して、コハク酸の生産性を実験的に確認するステップをさらに含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
ｐｔｓＧ、ｐｙｋＦ及びｐｙｋＡ遺伝子が欠失されており、コハク酸の高生成能を有する変異菌株。
【請求項１４】
請求項１３の変異菌株を嫌気条件下で培養することを特徴とするコハク酸の製造方法。
【請求項１５】
ｐｔｓＧ、ｐｙｋＦ及びｐｙｋＡ遺伝子が欠失された突然変異大腸菌。
【請求項１６】
請求項１５の突然変異大腸菌を嫌気条件下で培養することを特徴とするコハク酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インシリコ（in-silico）分析に基づく菌株の改良方法に係り、より具体的には、ゲノム情報を比較する方法によって有用物質の過量生産に不要な遺伝子を１次的にスクリーニングし、代謝フラックスの分析技術を利用した仮想シミュレーションを通じて、欠失対象の遺伝子を２次的にスクリーニングすることを特徴とするインシリコの菌株の改良方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
代謝フラックスについての研究は、遺伝子の組換え技術に関連した分子生物学技術を利用して新たな代謝経路を導入するか、または既存の代謝経路を除去、増幅または変更させることにより、細胞や菌株の代謝特性を所望の方向に変えるのに必要な多様な情報を提供する。このような代謝フラックスについての研究は、既存の代謝産物の過量生産、新規な代謝産物の生産、所望しない代謝産物の生産の阻害、安価な基質の利用などの生物工学全般の内容を含んでいる。これと共に、生物情報学が新たに開発されて発達するに伴い、多様な種のゲノム情報を利用して、各代謝ネットワークについてのモデルの構築が可能になった。このような代謝ネットワークの情報と代謝フラックスの分析技術とを結合することにより、現在、多様な１次代謝産物及び有用蛋白質の生産の産業的な応用が可能になった（Hong et al., Biotech. Bioeng, 83：854, 2003；US2002/0168654）。
【０００３】
一般に、細胞の代謝を分析する数学的なモデルは２つに分けられる。動的及び調節メカニズム情報の含まれたモデルと、単純に生化学反応式の係数のみを考慮した静的モデルがある。動的モデルは、時間による細胞内部の変化を予測して細胞の動的状態を描写する。しかし、この動的モデルは、多くの動的媒介変数を必要とするので、実際の細胞内部の正確な予測に問題点を有している。
【０００４】
一方、静的数学モデルは、代謝フラックスを単に生化学反応式の質量バランス及び細胞組成の情報のみを利用して、細胞の到達可能な理想的な代謝フラックスの空間を求める。このような代謝フラックスの分析（Metabolic flux analysis：MFA）は、動的な情報を必要としないにも拘わらず、細胞の理想的な代謝フラックスを表し、実際的に細胞の挙動を正確に描写することが知られている（Varma et al., Bio-Technol, 12：994, 1994；Nielsen et al., Bioreaction Engineering Principles, Plenum Press, 1994；Lee et al., Metabolic Engineering, Marcel Dekker, 1999）。
【０００５】
代謝フラックスの分析は、代謝反応式の係数及び各種代謝産物の生産及び消耗量を測定することにより、内部の代謝フラックスの変化を把握する技術である。代謝フラックスの分析は、準定常状態を仮定することを基盤としている。すなわち、外部環境の変化による内部の代謝産物の濃度の変化は極めて即時的に発生するので、通常その変化を無視し、内部の代謝産物の濃度が変化しないと仮定するのである。
【０００６】
全ての代謝物質及び代謝経路、そして経路での化学量論マトリックス（stoichiometric matrix）（SijT, metabolite i in the j reaction）が知られていれば、代謝フラックスベクトル（vj, flux of j pathway）を計算できるが、時間による代謝産物Ｘの変化は、あらゆる代謝反応フラックスの合計で表すことができる。そして、Ｘの経時的変化量が一定であると仮定すれば、すなわち、準定常状態という仮定下において、下記式で定義される。
【０００７】
STv＝dX/dt＝０
【０００８】
しかし、経路のみが知られており、量論値（stoichiometric value for each metabolite and pathway）及び代謝フラックス（vj）が部分的に知られた場合が多いため、前記式は、次の通りに拡張される。
【０００９】
STv＝Smvm＋Suvu＝０
【００１０】
前記式で、実験的に知られた量論値（Sm（I×M）、Ｉ＝total metabolite number, M＝total stoichiometrically−known reaction number）及びフラックス（vm（M×I））の積の内的に定義された行列と、知られていない量論値（Su（I×M））とフラックス（vu（M×I））との積の行列とに分けられる。このとき、ｍは、測定値であり、ｕは、測定不可の値についての添字である。
【００１１】
ここで、知られていない流れベクトル（Su）のランク（ｒａｎｋ）（Su）がｕ以上であれば（すなわち、変数の数が方程式以下であれば）単純な行列計算によって流れが求められる。但し、変数の数が方程式より大きければ（二重方程式が存在すれば）、さらに正確な値の計算のために、全体方程式の一貫性、代謝フラックスの測定値についての正確度、及び準正常状態の妥当性についての検証作業が行われる。
【００１２】
万一、変数の数が方程式よりも大きければ、特定の代謝反応の流れの値は、特定の範囲に限定される可能性があるなど、種々の物理化学的な制限式及び特定の目的関数を利用する線形計画法（linear programming）を用いて最適の代謝フラックスの分布を求める。これは、下記のように計算できる。
【００１３】
minimize/maximize：Z＝Σcivi
s.t.STv＝0 and αmin,ｉ≦vi≦αmax,i
ｃｉは、加重値であり、vｉは、代謝フラックスである。
【００１４】
一般に、生体組成形成速度（biomass formation rate）、すなわち、比増殖速度（specific growth rate）の最大化、代謝産物の生産最大化、副産物の生産最小化などが目的関数として使用されている。αmax,ｉ及びαmin,ｉは、各代謝フラックスが有することができる制限値であって、各代謝フラックスが許容する最大値及び最小値を指定することができる。
【００１５】
今まで有用代謝産物を最大限生産するために、菌株の改良方法が多様に提示されてきたが、遺伝子をスクリーニングし、生産性に優れた菌株を確認する過程が面倒であるため、菌株の改良に難があった。前述の代謝フラックスの分析は、菌株の改良によって所望の代謝産物の最大生産収率の計算などのために使用され、これを利用して菌株内部の代謝経路の特性を把握することができる。このような代謝経路の特性を把握することにより、操作を要するとする代謝経路を把握し、代謝回路の操作のための戦略を樹立することにより、最も効率的な方法で代謝フラックスを操作し、所望の代謝産物を生産することができる。
【００１６】
これにより、本発明者らは、実際の有用物質を生産しようとする菌株と、有用物質を過量生産する菌株の中心代謝経路上のゲノム情報を比較して、有用物質を過量生産する菌株に存在せずに、実際に操作しようとする対象菌株に存在する遺伝子に対して、細胞の成長に必須ではない遺伝子や妨害になる遺伝子を１次的にスクリーニングし、このような欠失対象候補遺伝子の多様な組合せを対象として、代謝フラックスの分析技術を利用して比増殖速度と有用物質の形成速度とを同時に考慮して、最終的に欠失させる遺伝子を選定することにより菌株を簡単に改良できるということを確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の主な目的は、ゲノム情報と代謝フラックスの分析技術を利用して有用物質を生産しようとする対象菌株を改良するインシリコ分析による対象菌株の改良方法を提供することにある。
【００１８】
本発明の他の目的は、インシリコ分析による対象菌株の改良方法を利用してコハク酸を生産しようとする対象菌株を改良する方法を提供することにある。
【００１９】
本発明のさらに他の目的は、前記方法によって改良されたコハク酸の多量生産の変異菌株及びこれを利用したコハク酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
前記目的を達成するために、本発明は、（ａ）有用物質を生産しようとする対象菌株及び有用物質の過量生産菌株を選定し、２つの菌株の代謝フラックスの分析モデルシステムを構築するステップ；（ｂ）有用物質を生産しようとする対象菌株に存在し、細胞の成長に必須ではない遺伝子や妨害になる遺伝子のうち、有用物質を過量生産する菌株には存在しない遺伝子をスクリーニングするステップ；（ｃ）前記スクリーニングされた遺伝子から欠失対象遺伝子の組合せを構成するステップ；（ｄ）前記ステップ（ａ）で構築された代謝フラックスの分析モデルシステムを利用するが、前記有用物質を生産しようとする対象菌株から前記ステップ（ｃ）で構成された遺伝子の組合せをそれぞれ欠失させた変異菌株を対象としてインシリコ・シミュレーションを行うステップ；（ｅ）前記シミュレーション結果から比増殖速度に対する有用物質の生産収率に優れた欠失対象遺伝子の組合せを選別するステップ；及び（ｆ）前記選別された遺伝子の組合せを欠失させた変異菌株を製作するステップを含む有用物質生産菌株の改良方法を提供する。
【００２１】
本発明に係る有用物質生産菌株の改良方法は、（ｇ）前記製作された変異菌株を培養して、有用物質の生産性を実験的に確認するステップをさらに含むことを特徴とし、前記インシリコ・シミュレーションは、生産物の形成速度及び比増殖速度のトレード・オフ・カーブ（trade off curve）を作成し、変異菌株の比増殖速度及び有用物質の収率を比較することを特徴とすることができる。
【００２２】
本発明は、また、（ａ）コハク酸を生産しようとする対象菌株及びコハク酸の過量生産菌株を選定し、２つの菌株の代謝フラックスの分析モデルシステムを構築するステップ；（ｂ）コハク酸を生産しようとする対象菌株に存在し、細胞の成長に必須ではない遺伝子や妨害になる遺伝子のうち、コハク酸を過量生産する菌株には存在しない遺伝子をスクリーニングするステップ；（ｃ）前記スクリーニングされた遺伝子から欠失対象遺伝子の組合せを構成するステップ；（ｄ）前記ステップ（ａ）で構築された代謝フラックスの分析モデルシステムを利用するが、前記コハク酸を生産しようとする対象菌株から前記ステップ（ｃ）で構成された遺伝子の組合せをそれぞれ欠失させた変異菌株を対象としてインシリコ・シミュレーションを行うステップ；（ｅ）前記シミュレーション結果から比増殖速度に対するコハク酸の生産収率に優れた欠失対象遺伝子の組合せを選別するステップ；及び（ｆ）前記選別された遺伝子の組合せを欠失させた変異菌株を製作するステップを含むコハク酸生産菌株の改良方法を提供する。
【００２３】
本発明に係るコハク酸の生産菌株の改良方法において、前記ステップ（ｂ）でスクリーニングされた遺伝子は、ｐｔｓＧ、ｐｙｋＦ、ｐｙｋＡ、ｍｑｏ、ｓｄｈＡ、ｓｄｈＢ、ｓｄｈＣ、ｓｄｈＤ、ａｃｅＢ及びａｃｅＡより構成された群から選択され、前記ステップ（ｅ）で選別された欠失対象遺伝子の組合せは、ｐｔｓＧ、ｐｙｋＦ及びｐｙｋＡであることを特徴とすることができる。
【００２４】
本発明に係るコハク酸の生産菌株の改良方法は、（ｇ）前記製作された変異菌株を培養して、コハク酸の生産性を実験的に確認するステップをさらに含むことを特徴とし、前記インシリコ・シミュレーションは、コハク酸の形成速度及び比増殖速度のトレード・オフ・カーブを作成し、変異菌株の比増殖速度及びコハク酸の収率を比較することを特徴とすることができる。
【００２５】
本発明において、コハク酸を過量生産する生産菌株は、マンヘミア（Mannheimia）属であることを特徴とし、前記マンヘミア属菌株は、マンヘミア・サクシニシプロデュセンス（Mannheimia succiniciproducens MBEL55E：KCTC 0769BP）であることを特徴とし、コハク酸を生産しようとする対象菌株は、大腸菌であることを特徴とすることができる。
【００２６】
本発明は、また、ｐｔｓＧ、ｐｙｋＦ及びｐｙｋＡ遺伝子が欠失されており、コハク酸の高生成能を有する変異菌株、及び前記変異菌株を嫌気条件下で培養することを特徴とするコハク酸の製造方法を提供する。本発明において、前記変異菌株は、ｐｔｓＧ、ｐｙｋＦ及びｐｙｋＡ遺伝子が欠失された大腸菌であることを特徴とすることができる。
【００２７】
本発明で、遺伝子“欠失”とは、遺伝子の塩基配列のうち、全部あるいは一部を除去または変更させるなどの特定の遺伝子が作動しないようにするあらゆる操作を含む。
【００２８】
本発明では、人為的に細胞内の代謝経路を変えるために、特定の遺伝子を欠失させた結果について、インシリコで予測できる新たな目的遺伝子をスクリーニングして菌株を改良する方法を開発した。
【００２９】
本発明に係る菌株の改良のために、有用物質を過量生産する菌株には存在せず、有用物質を生産しようとする対象菌株には存在するし、細胞の成長に必須ではない遺伝子や妨害になる遺伝子を１次的にスクリーニングする。
【００３０】
その後、前記スクリーニングされた遺伝子の一つまたはそれ以上の組合せを製作し、このような候補遺伝子を代謝フラックスの分析プログラムを利用して有用物質を生産しようとする対象菌株で欠失させたとき、比増殖速度に対する有用物質の形成収率の高い遺伝子を２次的にスクリーニングする。
【００３１】
前記２次的にスクリーニングされた遺伝子の組合せを、有用物質を生産しようとする対象菌株で欠失させた変異菌株を製作し、製作された変異菌株を培養して有用物質の生産性を確認する。
【００３２】
図１は、前記方法によってコハク酸を多量生産する菌株を選別する方法の全体的な過程を示す。すなわち、コハク酸の経路に対して有用物質を過量生産する菌株に存在せずに、有用物質を生産しようとする対象菌株に存在し、細胞成長に必須ではない遺伝子や妨害になる遺伝子を１次的にスクリーニングした後、代謝フラックスの分析技術を利用して比増殖速度及びコハク酸の生産曲線を比較した後、前記候補遺伝子の組合せによって変異菌株を製作する。
【００３３】
図２は、有用物質の生産菌株を改良するために、ゲノム情報を利用して候補遺伝子を１次的にスクリーニングする方法を示す。すなわち、１次スクリーニングでは、遺伝子の有無を菌株によって比較して遺伝子変異を起こしたとき、特別な変化を見せない遺伝子を選別する。
【００３４】
本発明では、そのような遺伝子として、有用物質の過量生産菌株と、有用物質を直接的に生産しようとする対象菌株とで、有用物質を過量生産する菌株に存在せずに、有用物質を生産しようとする対象菌株に存在し、細胞成長に必須ではない遺伝子や妨害になる遺伝子をスクリーニングした。
【００３５】
前記スクリーニングされた遺伝子を利用して、有用物質を生産しようとする対象菌株の突然変異を製作してインシリコ・シミュレーションを行い、有用物質の生産性が改善された菌株を選別した後、それを実際の培養実験によって生産性を最終的に確認した。
【００３６】
本発明では、前記方法を適用するためのモデルシステムとして大腸菌の変異菌株及び組換え大腸菌を選定してコハク酸の生産に適用した。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明に係る菌株の改良方法の過程を示す図である
【図２】本発明によって有用物質の生産菌株を改良するための候補遺伝子のスクリーニング方法を示す図である。
【図３】本発明によってコハク酸の生産菌株を改良するための候補遺伝子をスクリーニングし、変異大腸菌を製作する過程を示す図である。
【図４】コハク酸を多量生産する菌株のマンヘミア（Ａ）と、有用物質を実際に生産しようとする対象菌株の大腸菌（Ｂ）との代謝経路を比較した図である。
【図５】コハク酸の生成と比増殖速度間のトレード・オフ・カーブを示す図であって、図５Ａは、一つの遺伝子の欠失によるトレード−オフカーブ（−○−：ｐｔｓＧ；−■−：ΔａｃｅＢＡ；−△−：ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ／ｐｙｋＦＡ／ｓｄｈＡ／ｍｑｏ）であり、図５Ｂは、二つの遺伝子の欠失による可能な全ての１０個の組合せに対するトレード−オフカーブ（−○−：ΔｐｔｓＧΔｐｙｋＡＦ；−■−：ΔｐｔｓＧΔｍｑｏ／ΔｐｔｓＧΔｓｄｈＡ／ΔｐｔｓＧΔａｃｅＢＡ；−△−：ΔｐｙｋＡＦΔｍｑｏ／ΔｐｙｋＡＦΔｓｄｈＡ／ΔｐｙｋＡＦΔａｃｅＢＡ／ΔｍｑｏΔｓｄｈＡ／ΔｍｑｏΔａｃｅＢＡ／ΔｓｄｈＡΔａｃｅＢＡ）である。
【図６】メタフラックスネットを利用したトレード・オフ・カーブの作成例を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲は、これらの実施例により限定されるものではない。
【００３９】
特に、下記実施例では、コハク酸の過量生産菌株であるマンヘミア・サクシニシプロデュセンスを利用して、コハク酸の生産菌株として大腸菌の改良方法を例示したが、コハク酸を過量生産菌株として他の菌株を使用することと、コハク酸の生産菌株として大腸菌以外の菌株を使用することは、本発明の記載事項から当業者にとっては明らかなことである。また、下記実施例では、有用物質としてコハク酸を例示したが、コハク酸以外の有用物質を生産する菌株を改良することも、本発明の記載事項から当業者にとっては明らかなことである。
【００４０】
実施例１：モデルシステムの構築
モデルシステムとしては、大腸菌の変異菌株、組換え大腸菌、及び大腸菌以外のコハク酸の生産菌株である野生のマンヘミア・サクシニシプロデュセンスを選定した。そのために、大腸菌及びマンヘミアの新たな代謝フラックスの分析システムを構築した。
【００４１】
Ａ．大腸菌
大腸菌の場合、新たな代謝経路は、９７９個の生化学反応によって構成されており、８１４個の代謝産物を代謝経路上に考慮した。このシステムは、大腸菌のほとんどの代謝経路を含んでおり、代謝フラックスの分析において、目的関数として使用する菌株の生体組成の形成速度（biomass formation）式を構成するための大腸菌の生体組成は、次の通りである（Neidhardt et al., Escherichia coli and Salmonella：Cellular and Molecular Biology, 1996）：
【００４２】
５５％蛋白質；２０．５％ＲＮＡ；３．１％ＤＮＡ；９．１％脂質（lipids）；３．４％リポ多糖類（lipopolysaccharides）；２．５％ペプチドグリカン（peptidoglycan）；２．５％グリコーゲン（glycogen）；０．４％ポリアミン（polyamines）；３．５％その他の代謝産物；補酵素（cofactors）；及びイオン。
【００４３】
Ｂ．マンヘミア
ゲノムの全体的な解読及び機能分析の行われた菌株であるマンヘミア・サクシニシプロデュセンス（Mannheimia succiniciproducens MBEL55E：KCTC 0769BP）は、韓国の牛の反すう胃から直接的に分離した韓国現地の菌株であって、多方面の産業分野で広く使用されているコハク酸を大量に生産できる能力をもっている。
【００４４】
マンヘミアゲノムは、２，３１４，０７８個の塩基から構成されており（Hong et al., Nat. Biotechnol., 22：1275, 2004）、２，３８４個の遺伝子候補を保有しているということを、生物情報学的技術を通じて明るみにした。マンヘミアの遺伝子は、円形のゲノム全体にわたって分布されており、細胞内で作用する機能別に分類されて、全体的なゲノムが保有している特性の予測に利用された。
【００４５】
ゲノム情報の全体的な分析を通じて、コンピュータ上にマンヘミアの仮想的な細胞モデルを構成した。３７３個の酵素反応式及び３５２個の代謝物質から代謝ネットワークを構成し、その結果に基づいて、細胞内の代謝経路の変化を比較することができた。
【００４６】
実施例２：目的遺伝子のスクリーニング
コハク酸を過量生産するマンヘミアの中心代謝経路と大腸菌の中心代謝経路とを構築したＢｉｏＳｉｌｉｃｏ（http：//biosilico．kaist．ac．kr）のデータベースを利用してシミュレーションのためのモデルを構成した。
【００４７】
代謝の比較のために、まず、コハク酸の経路に対して、有用物質を過量生産する菌株であるマンヘミア（Ａ）と、コハク酸を生産しようとする対象菌株上の遺伝子である大腸菌（Ｂ）との代謝経路を比較して図４に示した。次いで、中心代謝経路上の遺伝子を比較したとき、コハク酸の生産に当って大腸菌に不要となる遺伝子や妨害になる遺伝子を選択した。
【００４８】
マンヘミアのコハク酸の生産のための中心代謝経路上の遺伝子と、大腸菌のコハク酸の生産のための中心代謝経路上の遺伝子とを比較した結果、大腸菌にのみ存在する遺伝子は、ｐｔｓＧ、ｐｙｋＦ、ｐｙｋＡ、ｍｑｏ、ｓｄｈＡＢＣＤ、ａｃｅＢＡ、ｐｏｘＢ及びａｃｓである。前記遺伝子のうち、嫌気条件下で作動しないと知られているｐｏｘＢ及びａｃｓを除いた遺伝子を、コハク酸の生産において不要となる遺伝子や妨害になる遺伝子の候補遺伝子として１次的にスクリーニングした。ｐｔｓＧ、ｐｙｋＦ、ｐｙｋＡ、ｍｑｏ、ｓｄｈＡＢＣＤ及びａｃｅＢＡがそれらである。
【００４９】
実施例３：変異菌株のスクリーニング
一般に、微生物を利用して特定の産物を生産するためには、単に収率の他に細胞の比増殖速度も考慮せねばならない。一般に、菌株は、有用産物を形成するために成長せず、細胞の構成成分を最大にするために成長し、これは、比増殖速度と表現される。したがって、ある遺伝子を欠失させたとき、有用産物を極大化しつつ比増殖速度に優れるか否かを予測するために、代謝フラックスの分析技術を利用した。
【００５０】
１次的に考慮された候補遺伝子について、一つの遺伝子の欠失及び二つの組合せによる遺伝子の欠失による収率及び比増殖速度を同時に考慮するために、２つの目的関数、すなわち、有用産物の形成速度及び比増殖速度を選択して、ｘ軸を比増殖速度とし、ｙ軸を有用産物の形成速度としてその結果を示した（図５ａ及び図５ｂ）。すなわち、菌株の比増殖速度に対して最適の生産物の収率が得られるカーブを選択し、目的の代謝経路に該当する遺伝子の組合せを選択する。
【００５１】
Ａ．複合遺伝子変異菌株のシミュレーション
各遺伝子の組合せに対して複合遺伝子変異菌株（multi-gene mutant）を製作するためには、多様な組合せの突然変異を製作しなければならない。現実的に、このような多様な突然変異を実際の実験によって製作することは非常に難しいので、突然変異のそれぞれについて構築した生産物の形成速度及び比増殖速度のトレード・オフ・カーブ（trasde off curve）を求めるシミュレーションシステムを踏まえてインシリコ・シミュレーションを実行した。シミュレーションは、http://mbel.kaist.ac.kr/を通じてダウンロードできるＭｅｔａＦｌｕｘＮｅｔ１．６（商標）を用いて行われた（Lee et al., Bioinformatics, 19：2144, 2003）。
【００５２】
シミュレーションにおいて炭素源として葡萄糖を利用し、周知の葡萄糖の摂取速度である１０ｍｍｏｌ／ｇＤＣＷ／ｈ及び嫌気条件を考慮するために、酸素摂取速度を０とし、考慮される遺伝子の欠失については該当する生化学反応式の速度を０とした。
【００５３】
トレード・オフ・カーブを作成するために、先行技術により提案されているアルゴリズム（Burgard et al., Biotechnol. Bioeng., 84：647, 2003）を変形した。前記先行文献の場合、トレード・オフ・カーブを通じて候補遺伝子を探す方法が正確に記述されていない一方、本発明で使用した方法では、当該遺伝子の欠失された変異菌株の有用物質の生産速度と、バイオマスの形成速度との関係を調査し、有用物質の生産速度が低下してもバイオマスが低下しない曲線を有する候補遺伝子の組合せを選択できるので、当該変異菌株の有用物質の生産能を比較することができた。
【００５４】
すなわち、優先的に有用産物の形成速度を最大化したときの値と、最小化したときの値とを求めて、許容する有用産物の形成速度の範囲を求めた後、許容範囲内で比増殖速度を最大化して、二つの目的関数間のトレード・オフ・カーブを作成する方式を採用した。図６は、メタフラックスネットを利用したトレード・オフ・カーブの作成例を示す。
【００５５】
比増殖速度を考慮して有用産物の収率を確認するために、代謝フラックスの調節技術を適用するのに必要な２つの目的関数を考慮して、生産物の形成速度と比増殖速度とのトレード・オフ・カーブを求めた（図５ａ及び図５ｂ）。
【００５６】
図５Ｂに示すように、目的の代謝経路に該当する遺伝子の組合せを調べた結果、他の遺伝子の組合せによる欠失菌株の場合とは異なり、ｐｔｓＧ、ｐｙｋＦ及びｐｙｋＡ遺伝子を同時に欠失させた変異菌株の場合、比増殖速度に対して最適の生産収率が得られるカーブが生成された。すなわち、当該遺伝子の場合、一般的に有用物質の生産速度が低下したとき、比増殖速度が上昇する傾向と異なる曲線が得られ、この場合、コハク酸の生産速度も最も優れているということが分かった。
【００５７】
この結果を数値的に見れば、大腸菌でｐｔｓＧ、ｐｙｋＦ及びｐｙｋＡを同時に欠失させて嫌気的条件下で培養する場合、野生菌株及び他の遺伝子の組合せによる欠失菌株に比べて、コハク酸が過量生産されるということが確認された（表１）。
【００５８】
【表１】
2008527991.tif 000003
【００５９】
ａ計算式：（変異菌株のコハク酸の生産速度×最大バイオマスの形成速度）／（野生型コハク酸の生産速度×最大バイオマスの形成速度）
【００６０】
Ｂ．実際実験結果
シミュレーション結果に基づいて大腸菌の変異菌株を製作するために、ＤＮＡ操作標準プロトコルを使用し、ラムダ・バクテリオファージ（lambda bacteriophage）のレッドオペロン（red operon）に存在するレッド組換え酵素を利用した（Sambrook et al., Molecular Cloning：a Laboratory Manual, 3rd edition, 2001；Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97：6640, 2000）。先ず、抗生剤の耐性遺伝子が含まれているＤＮＡを鋳型とし、欠失させようとする標的遺伝子の上流及び下流に位置するオリゴヌクレオチドを含むプライマー（表２を参照）を製作してＰＣＲを２回行った。
【００６１】
【表２】
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【００６２】
前記得られたＰＣＲ産物を親株に形質転換させて、二重相同組換え（double homologous recombination）によって標的遺伝子を抗生剤の耐性遺伝子に置き代えさせることにより、標的遺伝子の除去された遺伝子の欠失菌株を製作した。製作された菌株を下記表３に示す。
【００６３】
表３において、Ｓｐｒは、スペクチノマイシン抵抗性（spectinomycin resistance）、Ｔｃｒは、テトラサイクリン抵抗性（tetracycline resistance）、Ｃｍｒは、クロラムフェニコール抵抗性（クロラムフェニコール resistance）、Ｋｍｒは、カナマイシン抵抗性（カナマイシン resistance）を意味し、Ｐｍｒ：フレオマイシン抵抗性（phleomycin resistance）を意味する。
【００６４】
【表３】
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【００６５】
前記方法によって得られた各変異菌株を初期葡萄糖の濃度６０ｍＭ及び２４時間嫌気条件下で培養し、残留葡萄糖の濃度、コハク酸、乳酸、ギ酸、酢酸及びエタノールの濃度を調べた。その結果、表４に示すように、ｐｔｓＧ、ｐｙｋＦ及びｐｙｋＡ欠失変異菌株（W3110GFA）の場合、野生菌株（W3110）に比べて、他の有機酸に対するコハク酸の比率（S/Aratio）が８．２９倍上昇した。
【００６６】
【表４】
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【００６７】
ａ２４時間の嫌気培養。
ｂ測定された残留葡萄糖の濃度（初期葡萄糖の濃度：５０ｍＭ）。
ｃ計算式：コハク酸／（コハク酸＋乳酸＋ギ酸＋酢酸＋エタノール）。
ｄ計算式：コハク酸の比率／０．０１７（野生型のコハク酸の比率）。
【００６８】
前記結果により、有用物質の生産のための代表的な対象菌株である大腸菌を、コハク酸を過量生産するマンヘミア菌株及びゲノム情報によって比較・分析し、シミュレーションプログラムを利用することにより、コハク酸を多量生産する変異菌株に改良する代謝工学的且つ遺伝工学的な接近方法が、本発明により提供できるということが確認された。
【００６９】
以上、本発明の特定の部分を詳細に説明したが、当業者にとっては、このような具体的な技術は、単に好適な実施様態に過ぎないものであり、これにより本発明の範囲が制限されないということは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、本明細書に付随する請求項およびその等価物によって定義されるものである。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
以上説明したように、本発明によれば、代謝工学的及び遺伝工学的なアプローチ方法を利用して、有用物質を生産しようとする対象菌株と、有用物質を多量生産する菌株との遺伝子ゲノム上の遺伝子とを比較分析することにより候補遺伝子をスクリーニングし、それを対象としてインシリコ・シミュレーションを行い、有用物質の生産性が改善された欠失対象遺伝子の組合せを選定することにより、改良された菌株を効率的に製作することができ、その結果、実際のウェット(wet)実験にかかる手間やコストを大幅に削減することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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