(57)【要約】本発明は、フラビウイルス、特に、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）の１種または複数種の抗原に免疫特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを含む組成物、およびその組成物を用いて、フラビウイルス、特に、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）感染に関連した症状を、予防、治療、寛解するための方法に関する。特に、本発明は、ＷＮＶ感染に関連した症状を予防、治療、寛解するための方法であって、ＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する有効量の１種または複数種の抗体またはそれらのフラグメントを、ヒト被験体に投与する工程を包含する方法に関する。また、本発明は、ＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する抗体またはそれらのフラグメントを含む、検出可能または診断用の組成物、およびその組成物を用いて、ＷＮＶ感染を検出または診断する方法に関する。
2008504029.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
西ナイルウイルス抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記抗原が、構造タンパク質である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗原が、非構造タンパク質である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記構造タンパク質が、Ｅタンパク質である、請求項２に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が、前記Ｅタンパク質のドメインＩＩＩに結合する、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
前記非構造タンパク質が、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５よりなる群から選択される、請求項３に記載の抗体。
【請求項７】
ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、またはＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有するクローンＥ１６、クローンＥ２４、またはクローンＥ３４により産生される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、またはＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有するクローンＥ１６、クローンＥ２４、またはクローンＥ３４により産生されるモノクローナル抗体との結合に関して競合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、またはＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有するクローンＥ１６、クローンＥ２４、またはクローンＥ３４により産生されるモノクローナル抗体のヒト化体またはキメラ体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、またはＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有する、ハイブリドーマ細胞株Ｅ１６、ハイブリドーマ細胞株Ｅ２４、またはハイブリドーマ細胞株Ｅ３４。
【請求項１２】
異種プロモーターに作動可能に連結された請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖または軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
【請求項１３】
請求項１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１４】
重鎖をコードする第１のヌクレオチド配列および軽鎖をコードする第２のヌクレオチド配列を含むベクターであって、該重鎖または軽鎖が、請求項１に記載の抗体または抗原結合フラグメントのものである、ベクター。
【請求項１５】
発現ベクターである、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
請求項１４に記載のベクターを含有する、宿主細胞。
【請求項１７】
異種プロモーターに作動可能に連結された第１のヌクレオチド配列を含む第１の核酸、ならびに同じかまたは異なる異種プロモーターに作動可能に連結された第２のヌクレオチド配列を含む第２の核酸を含有する宿主細胞であって、該第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は、請求項１に記載の抗体の重鎖および軽鎖をそれぞれコードし、該宿主細胞は、適切な条件下で該抗体を発現する、宿主細胞。
【請求項１８】
西ナイルウイルス特異的モノクローナル抗体を組換え産生する方法であって、
（ｉ）該抗体の発現に好適な条件下で、培地中で請求項１７に記載の宿主細胞を培養する工程；および
（ｉｉ）該培地から該抗体を回収する工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
配列番号４、配列番号８、または配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＨ鎖を含む、西ナイルウイルス抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２０】
配列番号２、配列番号６、または配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ鎖を含む、西ナイルウイルス抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２１】
患者における西ナイルウイルス感染の症状を治療、予防、または寛解する方法であって、請求項１、請求項１９、または請求項２０に記載のモノクローナル抗体の治療的有効量を該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２２】
前記抗体が、構造タンパク質である西ナイルウイルス抗原に特異的に結合する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体が、非構造タンパク質である西ナイルウイルス抗原に特異的に結合する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記構造タンパク質が、Ｅタンパク質である請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体は、Ｅタンパク質のドメインＩＩＩに結合する請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記非構造タンパク質が、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５よりなる群から選択される請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体が、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、またはＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有するクローンＥ１６、クローンＥ２４、またはクローンＥ３４により産生される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
非構造タンパク質である西ナイルウイルス抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの治療的有効量を、前記患者に投与する工程をさらに包含する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
抗ウイルス剤を前記患者に投与する工程をさらに包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗ウイルス剤が、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、およびヌクレオシドアナログよりなる群から選択される，請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗ウイルス剤が、ジドブジン、アシクロビル、ガングシクロビル、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルリジン、リバビリン、フォスカーネット、アマンタジン、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、アンプレナビル、ロピナビル、リトナビル、α−インターフェロン、アデフォビル、クレバジン、エンテカビル、およびプレコナリルよりなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記患者がヒトである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗体が、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗体が、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、またはＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有するクローンＥ１６、クローンＥ２４、またはクローンＥ３４により産生されるモノクローナル抗体のヒト化体またはキメラ体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３５】
被験体における西ナイルウイルス感染の診断法であって：
（ａ）  該被験体由来の生物学的サンプルを、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントの有効量と接触させる工程；および
（ｂ）  該抗体またはその抗原結合フラグメントの結合を検出する工程、
を包含し、
該抗体またはその抗原結合フラグメントの結合の検出が背景レベルまたは基準レベルを超えていることにより、該被験体が西ナイルウイルス感染を有することが示される、方法。
【請求項３６】
（ｉ）治療的有効量の請求項１に記載の抗体；および（ｉｉ）薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項３７】
前記抗体が、構造タンパク質である西ナイルウイルス抗原に特異的に結合する、請求項３６に記載の薬学的組成物。
【請求項３８】
前記抗体が、非構造タンパク質である西ナイルウイルス抗原に特異的に結合する、請求項３６に記載の薬学的組成物。
【請求項３９】
前記構造タンパク質が、Ｅタンパク質である、請求項３７に記載の薬学的組成物。
【請求項４０】
前記抗体が、Ｅタンパク質のドメインＩＩＩに結合する、請求項３９に記載の薬学的組成物。
【請求項４１】
前記非構造タンパク質が、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５よりなる群から選択される、請求項３８に記載の薬学的組成物。
【請求項４２】
前記抗体が、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、またはＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有するクローンＥ１６、クローンＥ２４、またはクローンＥ３４により産生される、請求項３６に記載の薬学的組成物。
【請求項４３】
前記抗体が、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体である、請求項３６に記載の薬学的組成物。
【請求項４４】
前記抗体が、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、またはＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有するクローンＥ１６、クローンＥ２４、またはクローンＥ３４により産生される抗体のヒト化体またはキメラ体である、請求項３６に記載の薬学的組成物。
【請求項４５】
さらに、非構造タンパク質である西ナイルウイルス抗原に特異的に結合する治療的有効量のモノクローナル抗体を含む、請求項４０に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００４年６月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／５８１，８１９号（これは、本明細書中に参考として援用される）の利益を主張する。
【０００２】
（１．本発明の分野）
【０００３】
本発明は、フラビウイルス、特に、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）の１種または複数種の抗原に免疫特異的に結合する抗体またはそれらのフラグメントを含む組成物、および該組成物を用いて、フラビウイルス、特に、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）感染に関連した症状を、予防、治療、寛解するための方法に関する。特に、本発明は、ＷＮＶ感染に関連した症状を予防、治療、寛解するための方法であって、ＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する有効量の１種または複数種の抗体またはそれらのフラグメントを、ヒト被験体に投与する工程を包含する方法に関する。また、本発明は、ＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する抗体またはそれらのフラグメントを含む、検出可能または診断用の組成物、および該組成物を用いて、ＷＮＶ感染を検出または診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
（２．発明の背景）
【０００５】
ＷＮＶは、蚊と鳥類との間を循環するが、ヒト、ウマ、および他の脊椎動物種にも感染する。ＷＮＶは、アフリカ、ヨーロッパ、中東、およびアジアの一部における風土病であり、過去４年間における全米にわたる発生により、西半球において、その存在を確立したことが示されている。ヒトは、急速に髄膜炎または脳炎症状へと進行し得る熱性病を発現し（非特許文献１）、ヒトに使用するための特異的な療法またはワクチンはまだ承認されていない。
【０００６】
（ウイルス学）
フラビウイルス科のフラビウイルス属のメンバーであるＷＮＶは、一本鎖、正極性、１１キロ塩基のＲＮＡゲノムを有する神経親和性エンベロープウイルスである。それは、ポリタンパク質として、細胞質中で翻訳され、ウイルス、および宿主コードのプロテアーゼによって、構造（Ｃ、Ｍ、およびＥ）ならびに非構造（ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、およびＮＳ５）タンパク質へと切断される。構造タンパク質には、キャプシドタンパク質（Ｃ）、ウイルスと宿主膜との融合を調節する膜貫通タンパク質（Ｍ）、受容体結合、膜融合、およびウイルス組み立てにおいて機能するエンベロープタンパク質（Ｅ）が含まれる。非構造タンパク質の役割は十分に叙述されてはいないが、これらのタンパク質は、ウイルスプロテアーゼ（ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３）、ＮＴＰアーゼ（ＮＳ３）、ＲＮＡヘリカーゼ（ＮＳ３）、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＳ５）を形成する（非特許文献２）。未特性化細胞の表面受容体へ、ＷＮＶのＥタンパク質が結合後、受容体媒介エンドサイトーシスによって、ウイルス取り込みが生じると考えられる（非特許文献２）。エンドソーム中、Ｅにおける酸に触媒された立体配置の変化（非特許文献３；非特許文献４）により、ヌクレオキャプシドが細胞質中に放出される。小胞体（ＥＲ）膜において、構造タンパク質およびＮＳ１は、同時翻訳的転座、グリコシル化、および膜結合開裂を受け、一方、他の非構造タンパク質は細胞質中で翻訳される。（非特許文献５；非特許文献６）。組み立てはＥＲで生じ、ウイルス粒子はエキソサイトーシスされる。
【０００７】
（ＷＮＶ免疫学）
免疫状態などの宿主因子は、ヒトにおけるＷＮＶ疾患の発現に影響を及ぼす（非特許文献７）。幼児、高齢者、および免疫系の障害を有する患者は、重篤な神経系疾患の危険性が最も大きい（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。ＷＮＶ感染および防御的な免疫系の応答を解明するための研究が始まっている。免疫系の成熟は、ＷＮＶ感染に対する抵抗性に関連している（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）。マクロファージの減損により、神経浸潤性および弱毒化株の病原性が増加する（非特許文献１４）。ＳＣＩＤおよびＲＡＧＩマウスが一様にＷＮＶ感染されるように、ＷＮＶ感染に対する防御にとって、リンパ球は重要である（非特許文献１５；非特許文献１６）。いくつかの研究により、体液性免疫の成分（ＩｇＭ、ＩｇＧ、および補体）は、感染過程の早期に重要な機能を有し、中枢神経系（ＣＮＳ）への伝播を防止することが示されている（非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０）。ＷＮＶに対する免疫の細胞的基礎が叙述され始めている。いくつかの研究により、細胞毒性およびヘルパーＴ細胞に関する保護的役割が神経細胞されている。インビトロで、Ｔ細胞は、ＷＮＶ感染細胞への曝露後、炎症性サイトカインを標的化し、増殖させ、放出する（非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４）。インビボで、ＷＮＶの候補ワクチン株の投与後、マウスにおいて、抗原特異的ヘルパーおよび細胞毒性Ｔ細胞応答が生じる（非特許文献２５）。ウイルスクリアランスおよび長期免疫に対するインビボでのＴ細胞媒介免疫の正確な寄与は、まだ確立されていないが、最近の研究により、ＷＮＶ感染制御におけるＴ細胞の重要な役割が示されている。ＣＤ８＋Ｔ細胞または古典的クラスＩのＭＨＣ分子を欠如しているマウスは、死亡率およびウイルス負荷の増加、ならびにＷＮＶ感染後のＣＮＳにおける長期ウイルス残存率を示し（非特許文献２６）、また、γδＴ細胞の不在により、ＷＮＶ感染後の死亡率増加がもたらされる（非特許文献２７）。
【０００８】
（抗ウイルス）
現在、ＷＮＶを含めた全てのフラビウイルス感染に対する治療は支持的である。リバビリンは、細胞におけるＷＮＶ感染を阻止するため、候補薬剤として提案されてきた（非特許文献２８）；しかし、その活性は、ＣＮＳで達成可能な濃度において、あまり良くなかった（非特許文献２９；非特許文献３０）。フラビウイルスに対するリバビリンによる限定されたインビボ経験は、マウスにおいて（非特許文献３１）およびサルにおいて（非特許文献３２）、ごく近縁のデング（ＤＥＮ）ウイルス感染の弱化ができなかったことから、有望ではなかった。予備細胞培養試験に基づき、（非特許文献３３）、最近、インターフェロン（ＩＦＮ）α２ｂが、ＷＮＶに対する可能な療法として提案されている。インビボ試験は、ＷＮＶで実施されてはいないが、近縁のフラビウイルスを用いた実験に基づくと、ＩＦＮはＷＮＶの伝播を阻止し得る（非特許文献３４）。ＩＦＮα、β、およびγ受容体を欠損したマウスは、ＤＥＮ（非特許文献３５）またはマリーバレー脳炎（非特許文献３６）ウイルス感染を受け、ＩＦＮγを欠損したマウスは、黄熱病ウイルスに感染後、高ウイルス負荷を生じた（非特許文献３７）。ＩＦＮαは、マウスにおけるセントルイス脳炎に対する予防および治療法として有効であった（非特許文献３８）が、臨床上の利益は、感染の２４時間以内に療法が開始された場合にのみ達成された。実際、血清学的に確認された日本脳炎ウイルスを有する患者での臨床試験では、ＩＦＮ療法の利益は示されなかった（非特許文献３９）。したがって、ＷＮＶ感染に対するＩＦＮα療法に関するオポチュニティーのウィンドーは、臨床に関連づけるには狭すぎると考えられる。
【非特許文献１】Ｈｂａｌｅｋら、Ｅｍｅｒｇ  ＩｎｆＤｉｓ、１９９９年、５：６４３−６５０頁
【非特許文献２】Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９０年、４４：６４９−６８８頁
【非特許文献３】Ｇｏｌｌｉｎｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９８６年、６７：１９４１−１９５０頁
【非特許文献４】Ｋｉｍｕｒａら、Ｔ．、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ、１９８６年、６７：２４２３−３３頁
【非特許文献５】Ｆａｌｇｏｕｔら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、１９９５年、６９：７２３２−４３頁
【非特許文献６】Ｍａｒｋｏｆｆら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９４年、２０４：５２６−４０頁
【非特許文献７】Ｃａｍｅｎｇａら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ、１９７４年、１３０：６３４−４１頁
【非特許文献８】Ａｓｎｉｓら、Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ、２０００年、３０：４１３−４１８頁
【非特許文献９】Ｈｕｂａｌｅｋら、Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆ  Ｄｉｓ、１９９９年、５：６４３−６５０頁
【非特許文献１０】Ｔｓａｉら、Ｌａｎｃｅｔ、１９９８年、３５２：７６７−７１頁
【非特許文献１１】Ｅｌｄａｄａｈら、Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ、１９６７年、８６：７７６−９０頁
【非特許文献１２】Ｅｌｄａｄａｈら、Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ、１９６７年、８６：７６５−７５頁
【非特許文献１３】Ｗｅｉｎｅｒら、Ｊ  Ｈｙｇ（Ｌｏｎｄ）、１９７０年、６８：４３５−４６頁
【非特許文献１４】Ｂｅｎ−Ｎａｔｈａｎら、Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ、１９９６年、１４１：４５９−６９頁
【非特許文献１５】Ｄｉａｍｏｎｄら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、２００３年、７７：２５７８−２５８６頁
【非特許文献１６】Ｈａｌｅｖｙら、Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ、１９９４年、１３７：３５５−７０頁
【非特許文献１７】Ｄｉａｍｏｎｄら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、２００３年、７７：２５７８−２５８６頁
【非特許文献１８】Ｄｉａｍｏｎｄら、Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００３年、１６：２５９−２７８頁
【非特許文献１９】Ｄｉａｍｏｎｄら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００３年、１９８：１８５３−６２頁
【非特許文献２０】Ｅｎｇｌｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、２００３年、７７：１２９４１−９頁
【非特許文献２１】Ｄｏｕｇｌａｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９４年、８２：５６１−７０頁
【非特許文献２２】Ｋｅｓｓｏｎら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ、１９８７年、６８：２００１−２００６頁
【非特許文献２３】Ｋｕｌｋａｒｎｉら、Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９１年、４：７３−８２頁
【非特許文献２４】Ｌｉｕら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ、１９８９年、７０：５６５−７３頁
【非特許文献２５】Ｙｏｕｎｇら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ、２００１年、１８４：８０９−１６頁
【非特許文献２６】Ｓｈｒｅｓｔｈａら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、２００４年、７８：８３１２−２１頁
【非特許文献２７】Ｗａｎｇら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００３年、１７１：２５２４−２５３１頁
【非特許文献２８】Ｊｏｒｄａｎら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ、２０００年、１８２：１２１４−１７頁
【非特許文献２９】Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ、２００２年、８：１０７−８頁
【非特許文献３０】Ｊｏｒｄａｎら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ、２０００年、１８２：１２１４−７頁
【非特許文献３１】Ｋｏｆｆら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、１９８３年、２４：１３４−６頁
【非特許文献３２】Ｍａｌｉｎｏｓｋｉら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ、１９９０年、１３：１３９−４９頁
【非特許文献３３】Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ、２００２年、８：１０７−８頁
【非特許文献３４】Ｈａｒｉｎａｓｕｔａら、Ｓｏｕｔｈｅａｓｔ  Ａｓｉａｎ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ、１９８５年、１６：３３２−６頁
【非特許文献３５】Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、１９９９年、７３：７８３−６頁
【非特許文献３６】Ｌｏｂｉｇｓら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ、２００３年、８４：５６７−７２頁
【非特許文献３７】Ｌｉｕら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、２００１年、７５：２１０７−１８頁
【非特許文献３８】Ｂｒｏｏｋｓら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ、１９９９年、４１：５７−６４頁
【非特許文献３９】Ｓｏｌｏｍｏｎら、Ｌａｎｃｅｔ、２００３年、３６１：８２１−６頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、フラビウイルス、特にＷＮＶの感染に対する現在の予防的および治療的方法の懸念および不足に対処することを目指している。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書に引用した全ての文献は、個々の刊行物または特許もしくは特許出願が、具体的に、個々に、全ての目的に関して、参照として、その全体が組み込まれているのと同じ程度に、全ての目的に関して、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【００１１】
（３．発明の概要）
【００１２】
本発明は、フラビウイルス感染、特に西ナイルウイルス（ＷＮＶ）感染に対する予防的および／または治療的に有効な応答を達成または誘導するための方法の開発に、部分的に基づいている。本発明は、限定はしないが、日本脳炎（ＪＥ、例えば、ＪＥ  ＳＡ１４−１４−２）、デング熱（ＤＥＮ、例えば、デング熱血清型１〜４のいずれか）、マレーバレー脳炎、セントルイス脳炎、西ナイル、ダニ脳炎、Ｃ型肝炎ウイルス、クンジン（Ｋｕｎｊｉｎ）ウイルス、ポワッサン（Ｐｏｗａｓｓａｎ）ウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、黄熱病ウイルス、およびオムスク出血熱ウイルスなどのフラビウイルス感染に対する予防的および／または治療的に有効な応答を達成または誘導するための方法を包含する。本発明の方法は、限定はしないが、免疫血清または精製ポリクローナル抗体の受動的投与、γグロブリンの投与、インターフェロンαの投与、および静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）療法などのフラビウイルス感染、特にＷＮＶ感染の治療または予防の従来様式に比較して、予防的および治療的により有効である。本発明は、ＷＮＶの構造的、例えばＥタンパク質、および非構造的、例えば、ＮＳＩタンパク質の異なる機能的および構造的ドメインに免疫特異的に結合するモノクローナル抗体の、本発明者による発見に部分的に基づいている。本発明の抗体は、確証された感染の阻止に有効であり、したがって、ＷＮＶ感染し易い宿主の罹患率および死亡率を有意に制限する。
【００１３】
本発明の方法および組成物は、フラビウイルス感染の危険性が増大しているヒト集団におけるフラビウイルス感染に対する予防にとって特に有効である。特定の好ましい実施形態において、本発明の方法および組成物は、限定はしないが、ヒトの幼児、高齢者、免疫系の障害を有するヒト患者などのＷＮＶ感染の危険性が増大しているヒト集団に対して特に有用である。
【００１４】
本発明は、本発明の１種または複数種の抗体を投与することによってフラビウイルス感染を治療、予防、または寛解するための方法を提供する。特定の作用機構に拘束される意図はないが、本発明の最適化されたモノクローナル抗体は、例えば、高中和力価を有するドナーの、ＷＮＶ感染に対するＩＶＩＧを用いる治療などのフラビウイルス感染に対する現在の治療よりも有効である。ＩＶＩＧはヒト血漿から作製されるため、感染性物質を伝達する危険性を本質的に有している。ＨＩＶなどのウイルスを不活化するために、血漿源ドナーはスクリーニングされ、血漿は溶媒／界面活性剤処理されるが、事前対策として、多種多様の物質を除去するために、ウイルス除去および不活化を検証しなければならず；また、血液によって伝達され得る物質のリストは、感染の各出現ごとに増大する。これは特に、たいていの市販の不活化法に抵抗性である非エンベロープウイルス（例えば、パルボウイルスＢ１９）およびプリオン類に当てはまる（例えば、Ａｚｚｉら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．１９９９年、１３：１９４−２０４頁；Ｂｌｕｍｅｌら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．２００２年、４２：１４７３−１４８１頁を参照）。これら最近の研究により、感染性物質の除去に関して１００％の保証はないことが確認されている。最後に、大抵の製剤は、ヒトアルブミン、他の血液製品、およびスクロースなどの賦形剤を有しており、これによって有害事象の危険性が増大し得る。ＩＶＩＧの他の制限は、特に、心臓または腎臓の同時罹患を有する患者において、大容量が必要であることであり得る。ワクチン化ドナーからの特定の免疫グロブリン使用において、標的物質に対する抗体の濃度を高める時、多くの製剤は非関連抗体を含有する。本発明は、現行のＩＶＩＧ療法の欠点を解決する。本発明の抗体は、ＷＮＶに起因するフラビウイルス感染などのフラビウイルス感染の予防および治療のための、本質的により安全で、より有効となる可能性を有する代替法を提供する。本発明の抗体のさらなる利点としては、限定はしないが、動物またはヒト由来のタンパク質を添加しない化学的に規定された培地を用い、規定された条件下で組織培養物中で増殖させられる能力；ポリクローナル血清とは異なって、エピトープ特異性、親和性および中和化能力、低用量にできることなど、所望の性質に関して、それらを選択できること；およびそれらを高濃度で製剤化でき、投与容量を減少させることができることが挙げられる。
【００１５】
本発明は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、好ましくはＷＮＶ抗原に、免疫特異的に結合する単離抗体、好ましくはモノクローナル抗体（ハイブリドーマによって産生された抗体のヒト化または他の改変物など）またはそれらのフラグメントを提供する。本発明の該単離抗体またはそれらのフラグメントは、１種または複数種のフラビウイルス抗原、好ましくはＷＮＶ抗原に、該ウイルス株に関係なく免疫特異的に結合することが好ましい。いくつかの実施形態において、本発明の単離抗体は、同様の親和性および／または結合力で、系列ＩおよびＩＩ株および北米の、例えば、１９９９年、ニューヨーク循環病原性株など、全てのＷＮＶ株に結合する。
【００１６】
多くの好ましい実施形態において、本発明は、哺乳動物におけるＷＮＶ感染の予防および／または治療のために、ＷＮＶの構造タンパク質、例えばＥタンパク質に、免疫特異的に結合する単離抗体、好ましくはモノクローナル抗体を提供する。特定の一実施形態において、本発明の単離抗体は、当業者に公知の標準的な方法によって判定し、本明細書において、例えば、精製Ｅタンパク質を用いるＥＬＩＳＡ、免疫沈降、免疫ブロット法で例示したとおり、ＷＮＶ  Ｅタンパク質の外部ドメインに結合する。他の特定の実施形態において、本発明の単離抗体は、当業者に公知の標準的な方法によって判定し、本明細書において、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、免疫ブロット法で例示したとおり、アミノ酸２９０から４１５を含むＷＮＶ  Ｅタンパク質のドメインＩＩＩに結合する（例えば、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、１９９０年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉおｌ。４４：６４９−８８頁を参照）。
【００１７】
本発明は、本発明の１種または複数種の抗体を投与することにより、フラビウイルス感染を治療、予防、または寛解するための方法を提供する。特定の一実施形態において、本発明は、ＷＮＶの構造タンパク質、例えばＥタンパク質に免疫特異的に結合する第１の抗体、およびＷＮＶの非構造タンパク質、例えばＮＳ１タンパク質に結合する第２の抗体を投与する工程を包含する、ＷＮＶ感染を治療、予防、または寛解するための方法を包含する。特定の作用機構に拘束される意図はないが、このような組み合わせ療法は、単独の抗体治療法よりも、有効である。なぜならば、ＷＮＶのＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼは、エラー率が高く、したがって、免疫優性残基を急速に変化させる可能性を有するからである。他の特定の実施形態において、本発明は、ＷＮＶの構造タンパク質、例えばＥタンパク質のエピトープに免疫特異的に結合する第１の抗体、およびＷＮＶの同じ構造タンパク質の異なる部位に結合する第２の抗体を含む、ＷＮＶ感染を治療、予防、または寛解するための方法を包含する。
【００１８】
他の好ましい実施形態において、本発明は、哺乳動物におけるＷＮＶ感染を予防および／または治療するための、フラビウイルスタンパク質、特にＥＮＶの非構造タンパク質、例えばＮＳ１タンパク質に免疫特異的に結合する単離モノクローナル抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ＷＮＶの構造タンパク質の１つまたは複数のエピトープおよび／または非構造タンパク質の１つまたは複数のエピトープに結合する。他の実施形態において、本発明はまた、フラビウイルスの１つの株のフラビウイルス抗原に、他の株に対し、差異的にまたは優先的に結合する抗体またはそれらのフラグメントを提供する。
【００１９】
好ましい実施形態において、本発明は、それぞれ、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、およびＰＴＡ−６０５２を有するハイブリドーマクローンＥ１６Ｃ４Ｅ４（「Ｅ１６」）、Ｅ２４Ｄ８Ｃ１（「Ｅ２４」）、およびＥ３４Ｄ５Ｅ２（「Ｅ３４」）により産生されたモノクローナル抗体、それらの変異体、または抗原結合フラグメント、例えば、ヒト化体またはキメラ化体、Ｆａｂフラグメントなどを包含する。いくつかの実施形態において、本発明は、１種または複数種のＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはそれらのフラグメントを提供し、前記抗体または抗体フラグメントは、配列番号４、８、および１２に記載されたＶＨドメインのいずれか１つのアミノ酸配列を有する可変重鎖（「ＶＨ」）を含む。本発明はまた、１種または複数種のＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはそれらのフラグメントを提供し、前記抗体または抗体フラグメントは、配列番号２、６、および１０に記載されたＶＬドメインのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む。本発明はまた、１種または複数種のＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはそれらのフラグメントを提供し、前記抗体または抗体フラグメントは、表１に記載された配列番号１６〜１７、２０〜２２、または２６〜２８に記載されたＶＨ  ＣＤＲのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。本発明はまた、１種または複数種のＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはそれらのフラグメントを提供し、前記抗体または抗体フラグメントは、表１に記載された配列番号３３、３７、または４０〜４１に記載されたＶＬ  ＣＤＲのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【００２０】
【表１】
2008504029.tif 000003
最も好ましい実施形態において、本発明は、例えば、当該分野に公知の標準的方法を用い、本明細書の実施例６．４で、例えば、インビトロプラーク減少中和力価（ＰＲＮＴ）アッセイにおいて測定される、強力な中和活性を有する抗体（例えば抗Ｅ抗体）またはそれらのフラグメントを包含する。特定の作用機構に拘束される意図はないが、本発明の抗体は、ウイルスを直接中和化でき、細胞内へのウイルスの進入を阻止するか、または細胞内でのウイルスの融合および脱殻を阻止でき、したがって、ウイルス感染を治療または予防できる。いくつかの実施形態において、本発明は、１ｍｇ／ｍＬの濃度で、ＰＲＮＴ５０値が、少なくとも１／５００、少なくとも１／７５０、少なくとも１／１０００、少なくとも１／１５００、少なくとも１／２０００、少なくとも１／２５００、少なくとも１／３０００、少なくとも１／３５００、少なくとも１／４０００、少なくとも１／４５００、少なくとも１／５０００、少なくとも１／５５００、少なくとも１／６０００、少なくとも１／６５００、少なくとも１／７０００、少なくとも１／７５００、少なくとも１／８０００、少なくとも１／８５００、少なくとも１／９０００、少なくとも１／９５００、または少なくとも１／１０，０００、好ましくは、少なくとも１／１０，０００で、ＷＮＶ−Ｅタンパク質に免疫特異的に結合する抗体を包含する。本発明の抗ＮＳ１抗体は、開示された方法を用いて決定された中和活性を有さない。特定の作用機構に拘束される意図はないが、本発明の抗ＮＳ１抗体の中和活性の欠如は、ウイルス感染した細胞の補体溶解によって、部分的に説明できる。
【００２１】
さらに他の好ましい実施形態において、当該分野に公知であり、本明細書に例示された標準的方法を用いて判定されるように、本発明の抗体では、ＷＮＶ感染ウイルスの抗体依存性補体媒介中和が増強する。抗体は、補体の存在下、ウイルス粒子に添加される。引き続き、ウイルス活性の阻害が、プラーク減少アッセイによって判定される。補体依存性細胞溶解に関しては、補体の存在下、感染細胞に抗体が添加される。引き続き、細胞溶解が、標準的方法（例えば、ヨウ化プロピジウム染色および流動細胞計測法）によって評価される。特定の作用機構に拘束される意図はないが、本発明の抗体は、増強したエフェクター機能を有し、ウイルス結合を中和し、補体媒介溶解を引き起こし、循環系からのクリアランスを促進し、ウイルス耐性の出現を防ぐため、治療的に、および予防的に、臨床的有効性が増強する。本発明の抗体は、強力なインビボ阻害活性を有することが好ましく、すなわち、ＷＮＶ感染に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％、ＷＮＶ感染を防止することが好ましい。本明細書に用いられるインビボ阻害活性とは、例えば、ウイルスのライフサイクルにおけるあるステップ、例えばウイルス結合を阻害することによって、ウイルス活性を中和する、本発明の抗体の活性を言う。インビボ阻害活性とはまた、感染動物モデルにおける罹患率および死亡率を減少させる、抗体の能力を言う。
【００２２】
本発明は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合し、サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した時に、１００ｎｇ／ｍＬ未満の明確な解離定数を有する抗体またはそれらのフラグメントを提供する。本発明は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合し、ＢＩＡＣＯＲＥセンサーを用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した時、約１〜１０ｎＭの明確な解離定数を有する抗体またはそれらのフラグメントを提供する。本発明は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合し、ＢＩＡＣＯＲＥセンサーを用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した時、約１×１０４、約５×１０４、約１×１０５、約５×１０５、約１×１０６のオン速度（ｏｎ  ｒａｔｅ）、約１×１０−３、約５×１０−４、約１×１０−４、約５×１０−５、約１×１０−５、約５×１０−６、約１×１０−６のオフ速度（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）を有する抗体またはそれらのフラグメントを提供する。
【００２３】
本発明は、ＥＣ５０）を有する抗体またはそれらのフラグメントを提供する。インビトロマイクロ中和アッセイにおいて、１００ｎｇ／ｍＬ未満の中央有効濃度（ＥＣ５０）を有する抗体またはそれらのフラグメントを提供する。特に、本発明は、フラビウイルス感染に関連した１つまたは複数の症状の予防、治療または寛解に使用される組成物を提供し、この組成物は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合し、インビトロマイクロ中和アッセイにおいて、０．０１ｎＭ未満、０．０２５ｎＭ未満、０．０５ｎＭ未満、０．１ｎＭ未満、０．２５ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．７５ｎＭ未満、１ｎＭ未満、１．２５ｎＭ未満、１．５ｎＭ未満、１．７５ｎＭ未満、または２ｎＭ未満のＥＣ５０を有する抗体またはそれらのフラグメントを提供する。
【００２４】
本発明はまた、１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合し、公知の抗体に比較して増加したインビボ半減期、例えば、３０日増加したインビボ半減期を有する抗体を提供する。特に、本発明は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合し、公知の抗体に比較して増加したインビボ半減期を有し、前記増加したインビボ半減期が、前記抗体のＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との相互作用に関与していることが確認されているアミノ酸残基における１つまたは複数の改変（例えば、置換、欠失、または挿入）から生じる抗体を包含する。また、本発明は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合し、公知の抗体に比較して増加したインビボ半減期を有するペギル化抗体およびそれらのフラグメントを包含する。１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する抗体およびそれらのフラグメントの増加したインビボ半減期により、被験体に対する前記抗体またはそれらのフラグメントの投与量および／または投与回数が減少する。
【００２５】
本発明は、１種または複数種のＷＮＶ抗原に対する特異性を有する新規なモノクローナル抗体の製造を包含する。特に、本発明は、１種または複数種のＷＮＶ抗原に、特異的に結合するモノクローナル抗体を製造する方法を提供し、この方法は：（ａ）炭水化物および脂質ベースのアジュバントを用い、精製ＷＮＶタンパク質、例えばＮＳ１、Ｅタンパク質、またはそれらの免疫原性フラグメントによって、１匹または複数匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化する工程；（ｂ）固相ＥＬＩＳＡベースのアッセイを用いて、ポリクローナル抗体応答を測定する工程；（ｃ）１匹または複数匹のマウスの脾臓細胞からハイブリドーマ細胞株を作製する工程；（ｄ）特定のＷＮＶタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する１種または複数種のハイブリドーマ細胞株に関して、そのハイブリドーマ細胞株をスクリーニングする工程；（ｅ）候補免疫マウスを選択する工程；（ｆ）静脈内精製ＥまたはＮＳ１タンパク質により、高力価ポリクローナル（例えば１／１０，０００）応答を単一マウスに起こさせる工程；（ｇ）脾臓細胞を採集してから、標準的プロトコル（Ｈａｒｌｏｗら、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールドスプリングハーバー）にしたがって、非分泌Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６．５．３骨髄腫に融合させる工程、を包含する。本発明は、この方法によって産生された任意の抗体を包含する。
【００２６】
好ましい実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、およびＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有するクローンＥ１６、クローンＥ２４、またはクローンＥ３４によって産生されたモノクローナル抗体を提供する。他の実施形態において、本発明は、クローンＥ１６、クローンＥ２４、またはクローンＥ３４によって産生されたモノクローナル抗体と、結合について競合する単離抗体またはそのフラグメントを提供する。さらに、本発明は、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ０６０５０、ＰＴＡ−６０５１、およびＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有するハイブリドーマ細胞株Ｅ１６、ハイブリドーマ細胞株Ｅ２４、またはハイブリドーマ細胞株Ｅ３４を提供する。他の好ましい実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ０６０５０、ＰＴＡ−６０５１、およびＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有するハイブリドーマクローンＥ１６、ハイブリドーマクローンＥ２４、またはハイブリドーマクローンＥ３４によって産生されたモノクローナル抗体、それらの変異体、または抗原結合フラグメント（例えば、ヒト化体またはキメラ化体、Ｆａｂフラグメントなど）を包含する。
【００２７】
また、本発明の方法は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを包含する。一実施形態において、本発明は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に特異的に結合する抗体およびそのフラグメントの重鎖または軽鎖をコードする単離核酸配列を提供する。また、本発明は、前記核酸を含むベクターに関する。特定の実施形態において、本発明は、配列番号１、５、９、３、７、または１１のヌクレオチドのいずれかを包含する。本発明はさらに、重鎖をコードする第１の核酸分子および軽鎖をコードする第２の核酸分子を含むベクターを提供し、前記重鎖および軽鎖は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントのものである。特定の一実施形態において、前記ベクターは発現ベクターである。本発明は、本発明の抗体のベクター、または本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞をさらに提供する。本発明は、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ０６０５０、ＰＴＡ−６０５１、およびＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有する寄託ハイブリドーマクローンによって産生された抗体の重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチド、またはそれらの部分、例えばＣＤＲ、可変ドメインなど、およびそれらのヒト化体を包含することが好ましい。
【００２８】
本発明は、本発明の抗体またはそれらのフラグメントを製造するための方法をさらに提供する。本発明の抗体またはそれらのフラグメントは、抗体を製造するための、当該分野に公知の任意の方法によって、特に、培養ハイブリドーマ細胞からの分泌、化学的合成によって、または当該分野に公知の組換え発現法によって製造することができる。特定の一実施形態において、本発明は、フラビウイルス抗原特異的抗体を組換え的に製造する方法に関するものであり、前記方法は：（ｉ）培地中での前記抗体の発現に好適な条件下での培養であって、宿主細胞は、異種プロモーターに作動可能に結合した第１の核酸分子および同一のまたは異なる異種プロモーターに作動可能に結合した第２の核酸分子を含有し、前記第１の核酸および第２の核酸は、１種または複数種のフラビウイルス抗原に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントの、それぞれ、重鎖および軽鎖をコードする培養；および（ｉｉ）前記培地からの前記抗体の回収、を含む。
【００２９】
好ましくは、本発明の抗体はモノクローナル抗体であり、ヒト化抗体またはヒト抗体であることがより好ましい。特定の好ましい一実施形態において、本発明の抗体は、ＷＮＶ  Ｅタンパク質に結合する。他の特定の実施形態において、本発明の抗体は、ＷＮＶ  Ｅタンパク質の１つまたは複数のエピトープを特異的または選択的に認識する。本発明の他の実施形態は、ＷＮＶ  Ｅタンパク質に対する本発明の抗体の親和性を高めるために、ファージ表示法、ＤＮＡシャッフリング、または当該分野に知られた他の方法の使用を包含する。特定の好ましい一実施形態において、本発明の抗体は、ＷＮＶ  ＮＳ１タンパク質に結合する。他の特定の実施形態において、本発明の抗体は、ＷＮＶ  ＮＳ１タンパク質の１つまたは複数のエピトープを特異的または選択的に認識する。本発明の他の実施形態は、ＷＮＶ  ＮＳ１タンパク質に対する本発明の抗体の親和性を高めるために、ファージ表示法、ＤＮＡシャッフリング、または当該分野に公知の他の方法の使用を包含する。ＷＮＶ  Ｅタンパク質に対する結合活性の増加した変異抗体を同定するために、当該分野に公知の任意のスクリーニング法（例えばＥＬＩＳＡ）を使用することができる。他の特定の実施形態において、本発明の抗体は、ＢＩＡＣＯＲＥセンサーを用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した時、約１×１０−３、約５×１０−４、約１×１０−４、約５×１０−５、約１×１０−５、約５×１０−６、約１×１０−６のＫｏｆｆ速度を有する抗体を同定するために、当該分野に周知の抗体スクリーニングアッセイ（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥアッセイ）を用いてスクリーニングされる。
【００３０】
本発明は、生物学的サンプル中、具体的に、１種または複数種のフラビウイルス抗原の存在を検出するために、本発明の抗体の使用を包含する。
【００３１】
本発明は、高親和性および／または高結合性で１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する１種または複数種の抗体またはそれらのフラグメントを被験体に投与する工程を包含する、該被験体におけるフラビウイルス感染、特にＷＮＶ感染に関連した１つまたは複数の症状を予防、治療および寛解する方法を提供する。本発明の抗体は、例えば、一実施形態において、単独薬剤療法として、フラビウイルス感染の予防または治療に有用である。あるいは、本発明の抗体は、利用可能になった新薬によるフラビウイルス感染の予防処置のための併用療法における使用であり得る。
【００３２】
本発明は、（ｉ）１種または複数種のフラビウイルス抗原、例えばＷＮＶ抗原に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントの治療的または予防的に有効な量；および（ｉｉ）薬学的に受容可能なキャリア、を含む薬学的組成物をさらに提供する。
【００３３】
本発明は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、例えばＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する１種または複数種の抗体またはそれらのフラグメントを、フラビウイルス感染の部位に直接送達する方法を包含する。
【００３４】
本発明は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合し、少なくとも１×１０４、約５×１０４、約１×１０５、約５×１０５、約１×１０６、または約５×１０６の結合速度定数またはｋｏｎ速度（抗体（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）ｋｏｎ→Ａｂ−Ａｇ）を有する抗体またはそれらのフラグメントを提供する。特に、本発明は、フラビウイルス感染に関連した１つまたは複数の症状の予防、治療または寛解に使用される組成物を提供し、前記組成物は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合し、少なくとも１×１０４、約５×１０４、約１×１０５、約５×１０５、約１×１０６、または約５×１０６のｋｏｎ速度を有する１種または複数種の抗体またはそれらのフラグメントを含む。
【００３５】
他の実施形態において、本発明は：（ｉ）被験体からの生物学的サンプルを、本発明の抗体の有効量に接触させる工程；および（ｉｉ）前記抗体またはそのフラグメントの結合を検出する工程であって、背景または標準レベル以上での検出可能マーカーの検出により、その被験体がフラビウイルス感染を有することを示す工程、を包含する、被験体におけるフラビウイルス感染の診断法を提供する。
【００３６】
（３．１定義）
本明細書に用いられる用語の「フラビウイルス抗原に特異的に結合する」および類似の用語は、フラビウイルス抗原またはそのフラグメントに特異的に結合し、他のウイルス抗原には特異的に結合しない抗体またはそれらのフラグメントを言う。フラビウイルス抗原の例としては、限定はしないが、構造タンパク質、例えば、Ｃ、Ｍ、およびＥ、ならびに非構造タンパク質、例えば、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５が挙げられる。フラビウイルス抗原またはそのフラグメントに特異的に結合する抗体は、例えば、免疫アッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ、または当該分野に知られた他のアッセイによって判定した時、より低い親和性で、他のペプチドまたはポリペプチドに結合し得る。フラビウイルス抗原またはそのフラグメントに特異的に結合する抗体またはフラグメントは、他の抗原に交差反応しないことが好ましい。フラビウイルス抗原またはそのフラグメントに特異的に結合する抗体またはフラグメントは、例えば、免疫アッセイ、ＢＩＡＣＯＲＥ、または当業者に公知の他の方法によって同定することができる。抗体またはそのフラグメントは、ウェスタンブロット、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの実験的方法を用いて測定した時、いずれの交差反応抗原に対するよりも高い親和性で、フラビウイルス抗原またはそのフラグメントに特異的に結合する。抗体特異性に関する考察については、例えば、Ｐａｕｌ編、１９８９年、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、３３２−３３６頁を参照されたい。
【００３７】
本明細書に用いられる用語の「抗体」および「抗体類」とは、モノクローナル抗体、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ラクダ化抗体、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、内部抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体および抗抗Ｉｄ抗体など）、二重特異的抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを言う。特に、抗体類には、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性フラグメント、すなわち、抗原結合部位を含有する分子が含まれる。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであり得る。
【００３８】
本明細書に用いられる用語の「アナログ」とは、ＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチド、ＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチドのフラグメント、抗体、または抗体フラグメントと同様または同一の機能を有するが、ＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチド、ＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチドのフラグメント、抗体、または抗体フラグメントと同様または同一のアミノ酸配列を必ずしも含まないポリペプチドを言う。同様のアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、以下の少なくとも１つを満たすポリペプチドを言う：（ａ）ＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチド、ＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチドのフラグメント、本明細書に記載された抗体、または抗体フラグメントのアミノ酸配列に少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド；（ｂ）少なくとも５アミノ酸残基、少なくとも１０アミノ酸残基、少なくとも１５アミノ酸残基、少なくとも２０アミノ酸残基、少なくとも２５アミノ酸残基、少なくとも３０アミノ酸残基、少なくとも４０アミノ酸残基、少なくとも５０アミノ酸残基、少なくとも６０アミノ酸残基、少なくとも７０アミノ酸残基、少なくとも８０アミノ酸残基、少なくとも９０アミノ酸残基、少なくとも１００アミノ酸残基、少なくとも１２５アミノ酸残基、または少なくとも１５０アミノ酸残基のＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチド、ＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチドのフラグメント、本明細書に記載された抗体、または抗体フラグメントをコードするヌクレオチド配列に、ストリンジェントな条件下、ハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードするされるポリペプチド；および（ｃ）ＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチド、ＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチドのフラグメント、本明細書に記載された抗体、または抗体フラグメントをコードするヌクレオチド配列に、ＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチド、ＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチドのフラグメント、本明細書に記載された抗体、または抗体フラグメントに、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド。ＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチド、ＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチドのフラグメント、本明細書に記載された抗体、または抗体フラグメントと同様な構造を有するポリペプチドとは、ＷＮＶポリペプチド、ＷＮＶなどのフラビウイルスのフラグメント、本明細書に記載された抗体、または抗体フラグメントと同様の二次、三次または四次構造を有するポリペプチドを言う。ポリペプチドの構造は、限定はしないが、Ｘ線結晶構造解析、核磁気共鳴、および結晶学的電子顕微鏡法などの当業者に公知の方法によって決定することができる。
【００３９】
本明細書に用いられる用語の「誘導体」とは、ＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチド、ＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチドのフラグメント、ＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体、またはＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体のフラグメントのアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸残基の置換、欠失または付加の導入によって変化したポリペプチドを言う。用語の「誘導体」とはまた、改変、すなわち、該ポリペプチドに対する任意のタイプの分子の共有結合によって改変した、ＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチド、ＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチドのフラグメント、ＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体、またはＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体のフラグメントを言う。例えば、しかし、限定はしないが、ＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチド、ＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチドのフラグメント、抗体、または抗体フラグメントは、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペギル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク分解性開裂、細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合などによって改変することができる。ＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチド、ＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチドのフラグメント、抗体、または抗体フラグメントの誘導体は、限定はしないが、特異的な化学的開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などの当業者に公知の方法を用いた化学的改変によって改変できる。さらに、ＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチド、ＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチドのフラグメント、抗体、または抗体フラグメントの誘導体は、１つまたは複数の非古典的アミノ酸を含有し得る。ポリペプチド誘導体は、ＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチド、ＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチドのフラグメント、本明細書に記載された抗体、または抗体フラグメントと同様の、または同一の機能を有する。
【００４０】
本明細書に用いられる用語の「有効中和力価」とは、臨床的に有効な（ヒトにおいて）またはウイルスを、例えばマウスにおいて、５０％、８０％、９０％または９９％減少させることが示された、動物の血清中に存在する量に相当する抗体の量を言う。９９％減少は、フラビウイルス、例えばＷＮＶの例えば、１０３ｐｆｕ、１０４ｐｆｕ、１０５ｐｆｕ、１０６ｐｆｕ、１０７ｐｆｕ、１０８ｐｆｕ、または１０９ｐｆｕの特定の誘発により、または治療介入前後の動物の血液中に存在するウイルスの相対量により定義される。用語の「有効中和力価」または「中和力価」はまた、インビトロアッセイで、ＢＨＫ２１細胞またはＶｅｒｏ細胞において、感染を５０％阻止（ＰＲＮＴ５０）または９０％阻止（ＰＲＮＴ９０）する抗体の所与の濃度の能力を評価するプラーク減少アッセイを用いて、感染性ウイルスを産生する細胞の数において、所与の（例えば９０％）減少をもたらす抗体の力価を言う。
【００４１】
本明細書に用いられる用語の「エピトープ」とは、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおける抗原性または免疫原活性を有するＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチドの一部を言う。免疫原活性を有するエピトープは、動物において抗体応答を誘発するＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチドの一部である。抗原活性を有するエピトープは、当該分野で周知の任意の方法、例えば、本明細書に記載されている免疫アッセイによって判定した時、抗体が免疫特異的に結合するＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチドの一部である。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。
【００４２】
本明細書に用いられる用語の「フラグメント」とは、ＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチド、またはＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体のアミノ酸配列の少なくとも５連続アミノ酸残基、少なくとも１０連続アミノ酸残基、少なくとも１５連続アミノ酸残基、少なくとも２０連続アミノ酸残基、少なくとも２５連続アミノ酸残基、少なくとも３０連続アミノ酸残基、少なくとも３５連続アミノ酸残基、少なくとも４０連続アミノ酸残基、少なくとも５０連続アミノ酸残基、少なくとも６０連続アミノ酸残基、少なくとも７０連続アミノ酸残基、少なくとも８０連続アミノ酸残基、少なくとも９０連続アミノ酸残基、少なくとも１００連続アミノ酸残基、少なくとも１２５連続アミノ酸残基、少なくとも１５０連続アミノ酸残基、少なくとも１７５連続アミノ酸残基、少なくとも２００連続アミノ酸残基、少なくとも２５０連続アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを言う。一定の実施形態において、フラグメントとは、ＷＮＶの構造または非構造タンパク質の少なくとも５連続アミノ酸残基、少なくとも１０連続アミノ酸残基、少なくとも１５連続アミノ酸残基、少なくとも２０連続アミノ酸残基、少なくとも２５連続アミノ酸残基、少なくとも４０連続アミノ酸残基、少なくとも５０連続アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを言う。他の実施形態において、フラグメントとは、ＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体のＶＨおよび／またはＶＬドメインの少なくとも５連続アミノ酸残基、少なくとも１０連続アミノ酸残基、少なくとも１５連続アミノ酸残基、少なくとも２０連続アミノ酸残基、少なくとも２５連続アミノ酸残基、少なくとも３０連続アミノ酸残基、少なくとも３５連続アミノ酸残基、少なくとも４０連続アミノ酸残基、または少なくとも５０連続アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを言う。ＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチドのフラグメント、またはＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体のフラグメントは、前記ＷＮＶなどのフラビウイルスのポリペプチドまたは抗体の少なくとも１つの機能を保持していることが好ましい。
【００４３】
「単離された」または「精製された」抗体またはそのフラグメントには、そのタンパク質が由来する細胞または組織源からの細胞物質または他の混入タンパク質が実質的に無いか、または化学合成された場合は、化学的前駆体または他の化学物質が実質的に無い。「細胞物質が実質的に無い」という用語には、抗体または抗体フラグメントが単離または組換え産生された細胞の細胞成分から抗体または抗体フラグメントが分離された、抗体または抗体フラグメントの調製物が含まれる。したがって、細胞物質が実質的に無い抗体または抗体フラグメントには、乾燥重量で約３０重量％、２０重量％、１０重量％、または５重量％未満の異種タンパク質（本明細書では、「混入タンパク質」とも称される）を有する抗体または抗体フラグメントの調製物が含まれる。抗体または抗体フラグメントが組換え産生される場合、それにはまた、培養培地が実質的に無いことが好ましい。すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の容量の約２０％、１０％、または５％未満であることが好ましい。抗体または抗体フラグメントが化学的合成によって生産される場合、それには、化学的前駆体または他の化学物質が実質的に無いことが好ましい。すなわち、それは、該タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離される。したがって、抗体または抗体フラグメントのこのような調製物は、被験体となっている抗体または抗体フラグメント以外に、約３０％、２０％、１０％、または５％未満の化学的前駆体または化合物を有する。好ましい実施形態において、本発明の抗体またはそれらのフラグメントは、単離または精製される。
【００４４】
「単離」核酸分子は、該核酸分子の天然源に存在する他の核酸分子から分離されているものである。さらに、ｃＤＮＡ分子などの「単離」核酸分子は、組換え法によって生産された場合、他の細胞物質、または培養培地が実質的に無いか、または化学合成された場合、化学的前駆体または他の化学物質が実質的に無いようにすることができる。好ましい実施形態において、本発明の抗体またはそれらのフラグメントをコードする核酸分子は、単離されるかまたは精製されることが好ましい。
【００４５】
本明細書に用いられる用語の「融合タンパク質」とは、ＷＮＶなどのフラビウイルスの抗原に免疫特異的に結合する抗体またはそのフラグメントのアミノ酸配列および異種ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列を含むペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をいう。一定の実施形態において、融合タンパク質は、ＷＮＶなどのフラビウイルスの抗原に免疫特異的に結合する能力を保持していない。
【００４６】
本明細書に用いられる用語の「ヒト化抗体」とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最少配列を含有するキメラ抗体である非ヒト（例えばマウス）抗体の形態を言う。たいていの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変性領域残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種の高頻度可変性領域残基（ドナー抗体）によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であるいくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。さらん、ヒト化抗体は、レシピエントの抗体において、またはドナー抗体において見られない残基を含んでなり得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに改良するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含んでなり、超可変領域の全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンの超可変領域に対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲに対応する。ヒト化抗体は、また、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）、典型的には、アミノ酸残基の置換、欠失または付加の導入（すなわち、変異）によって変化した１種または複数のフラビウイルス抗原に免疫特異的に結合するヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を任意に含む。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、誘導体である。このようなヒト化抗体は、１つまたは複数の非ヒトＣＤＲにおけるアミノ酸残基の置換、欠失または付加を含む。該ヒト化抗体誘導体は、非誘導体ヒト化抗体に比較した場合、実質的に、同じ結合性、より良好な結合性、またはより不良な結合性を有し得る。特定の実施形態において、ＣＤＲの１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのアミノ酸残基が、置換、欠失または付加されている（変異している）。抗体のヒト化におけるさらなる詳細に関しては、欧州特許第２３９，４００号、第５９２，１０６号、および第５１９，５９６号；国際公開第９１／０９９６７号および第９３／１７１０５号；米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号、第５，５６５，３３２号、第５，５８５，０８９号、第５，７６６，８８６号、および第６，４０７，２１３号；ならびにＰａｄｌａｎ、１９９１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８頁；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、１９９４年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４頁；Ｒｏｇｕｓｋａら、１９９４年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：９６９−９７３頁；Ｔａｎら、２００２年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９−２５頁；Ｃａｌｄａｓら、２０００年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１３：３５３−６０頁；Ｍｏｒｅａら、２０００年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０：２６７−７９頁；Ｂａｃａら、１９９７年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−８４頁；Ｒｏｇｕｓｋａら、１９９６年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９：８９５−９０４頁；Ｃｏｕｔｏら、１９９５年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２３補遺）：５９７３ｓ−５９７７ｓ頁；Ｃｏｕｔｏら、１９９５年、Ｃａｎ���ｅｒ  Ｒｅｓ．５５：１７１７−２２頁；Ｓａｎｄｈｕ、１９９４年、Ｇｅｎｅ  １５０：４０９−４１０頁；Ｐｅｄｅｒｓｏｎら、１９９４年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５：９５９−７３頁；Ｊｏｎｅｓら、１９８６年、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５頁；Ｒｅｉｃｈｍａｎら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９頁；およびＰｒｅｓｔａ、１９９２年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６頁を参照のこと。
【００４７】
本明細書に用いられる用語の「超可変領域」とは、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を言う。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」のアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインにおける残基３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、および９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、メリーランド州（１９９１））および／または「超可変ループ」（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインにおける残基２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）おび９６〜１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、１９８７年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７頁）を含む。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、本明細書に定義された超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
本明細書に用いられる用語の「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」とは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体フラグメントを言い、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合にとって所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨとＶＬ間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖのレビューに関しては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  ＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、２６９−３１５頁（１９９４）を参照されたい。特定の実施形態において、ｓｃＦｖには、二重特異的なｓｃＦｖおよびヒト化ｓｃＦｖが含まれる。
【００４８】
本明細書に用いられる用語の「核酸」および「核酸配列」には、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、ＤＮＡ分子とＲＮＡ分子の組み合わせまたはハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子、およびＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子のアナログが含まれる。このようなアナログは、例えば、限定はしないが、イノシンまたはトリチル化塩基などのヌクレオチドアナログを用いて作製することができる。このようなアナログは、例えば、ヌクレアーゼ抵抗性または細胞膜を通過する能力の増大などの、該分子に有益な属性を与える主鎖の改変を含むＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子もまた含み得る。該核酸またはヌクレオチド配列は、一本鎖、二本鎖であり得、一本鎖部分と二本鎖部分の双方を含有し得、また、三本鎖部分を含有し得るが、二本鎖ＤＮＡであることが好ましい。
【００４９】
本明細書に用いられる用語の「宿主」とは、哺乳動物、好ましくはヒトを言う。
【００５０】
本明細書に用いられる用語の「宿主細胞」とは、核酸分子を形質移入された特定被験体の細胞およびこのような細胞の後代または後代の可能性を有するものを言う。このような細胞の後代は、世代の継続またはや宿主細胞ゲノム内への核酸分子の組込みにおいて生じ得る変異または環境の影響により、該核酸分子を形質移入された親細胞と同一ではないことがあり得る。
【００５１】
本明細書に用いられる用語の「患者」とは、哺乳動物（例えば、ウマ、ウシ、ブタ、イヌまたはネコ）、好ましくは霊長類、最も好ましくはヒトを言う。
【００５２】
本明細書に用いられる語句の「本発明の抗体の可変領域または超可変領域を含むペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質」、「本発明の抗体のＶＨまたはＶＬドメインを含むペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質」、表１に掲載された１つまたは複数のＣＤＲのアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＣＤＲを含むペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質」、および類似の語句は、融合タンパク質を言う。
【００５３】
本発明の一定の実施形態において、「予防的に有効な血清力価」は、哺乳動物、好ましくはヒトにおけるフラビウイルス感染の発生を減少させる、前記哺乳動物における血清力価である。予防的に有効な血清力価は、フラビウイルス感染に起因する合併症の可能性が最も大きいヒト（例えば、免疫無防備状態のヒト、ヒト幼児、または高齢のヒト）におけるフラビウイルス感染の発生を減少させる。本発明の一定の他の実施形態において、「予防的に有効な血清力価」は、フラビウイルス抗原に免疫特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを投与されなかったマウスモデルにおける１０３ｐｆｕのフラビウイルスによる誘発３日後のフラビウイルス力価より９９％低い、１０３ｐｆｕの誘発３日後のフラビウイルス力価を生じさせる同じマウス株における血清力価である。
【００５４】
本発明の一定の実施形態において、「治療的に有効な血清力価」は、哺乳動物、好ましくはヒトにおけるフラビウイルス感染に関連した重症度、持続時間、および／または症状を減少させる前記哺乳動物における血清力価である。治療的に有効な血清力価は、フラビウイルス感染に起因する合併症の可能性が最も大きいヒト（例えば、ヒト幼児、または高齢のヒト）におけるフラビウイルス感染に関連した重症度、持続時間、および／または症状の数を減少させることが好ましい。本発明の他の一定の実施形態において、「治療的に有効な血清力価」は、フラビウイルス抗原に免疫特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを投与されなかったマウスモデルにおける１０２ｐｆｕ、１０３ｐｆｕまたは１０４ｐｆｕのフラビウイルスによる誘発３日後のフラビウイルス力価より９９％低い、１０２ｐｆｕ、１０３ｐｆｕまたは１０４ｐｆｕによる誘発３日後のフラビウイルス力価を生じさせる同じマウス株における血清力価である。
【００５５】
用語の「フラビウイルス抗原」とは、抗体または抗体フラグメントが免疫特異的に結合するフラビウイルスのポリペプチドまたはそのフラグメントを言う。フラビウイルス抗原はまた、抗体または抗体フラグメントが免疫特異的に結合するフラビウイルスのポリペプチドまたはそのフラグメントのアナログまたは誘導体を言う。好ましい一実施形態において、フラビウイルス抗原は、抗体または抗体フラグメントが免疫特異的に結合するＷＮＶ  ＥまたはＮＳ１タンパク質、そのフラグメント、アナログまたは誘導体である。
【００５６】
本明細書に用いられる用語の「フラビウイルス抗原に免疫特異的に結合する抗体またはそれらのフラグメント」とは、フラビウイルスのポリペプチドまたはフラビウイルスのポリペプチドのフラグメントに特異的に結合し、他のポリペプチドには非特異的に結合しない抗体またはそれらのフラグメントを言う。フラビウイルスのポリペプチドまたはそのフラグメントに免疫特異的に結合する抗体またはフラグメントは、他の抗原との交差反応性を有し得る。フラビウイルスのポリペプチドまたはそのフラグメントに免疫特異的に結合する抗体またはフラグメントは、他の抗原と交差反応しないことが好ましい。フラビウイルスのポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体またはフラグメントは、例えば、免疫アッセイまたは当業者に公知の他の方法によって同定することができる。
【００５７】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントを判定するためには、この配列をまず最適な比較を目的として配置する（例えば、第２のアミノ酸配列または核酸配列との最適な配置のために、第１のアミノ酸配列または核酸配列内にギャップを導入できる）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列におけるある位置が、第２の配列における対応する位置の同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められていれば、その分子はその位置において同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、その配列が共有する同一性位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一性の重なり位置数／位置総数×１００％）。一実施形態において、２つの配列は同じ長さである。２つの配列間の同一性パーセントの判定は、数学的演算を用いても達成できる。２つの配列の比較に利用される数学的演算の好ましい非限定的一例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７：２２６４−２２６８頁であり、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３−５８７７頁において改変されている。このような演算は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３頁のＮＢＬＡＳＴならびにＸＢＬＡＳＴに組み込まれている。本発明の核酸分子に対するヌクレオチド配列の相同性を得るためには、例えば、スコア＝１００、ワード長＝１２に設定したＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメータを用いて、ＢＬＡＳＴヌクレオチド探索が実施できる。本発明のタンパク質分子に対するアミノ酸配列の相同性を得るためには、例えば、スコア＝５０、ワード長＝３に設定したＸＢＬＡＳＴプログラムパラメータを用いて、ＢＬＡＳＴタンパク質探索が実施できる。比較目的でギャップ配置を得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２頁に記載されているギャップＢＬＡＳＴが利用できる。あるいは、分子間の遠隔関連性（同一性）を検出する累次探索を実施するためには、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴが利用できる。ＢＬＡＳＴ、ギャップＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合は、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用できる。配列比較に利用される他の好ましい、非限定的一例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ、１９８８年、ＣＡＢＩＯＳ４：１１−１７頁の演算である。このような演算は、ＧＣＧ配列配置ソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためのＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用できる。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップを考慮して、または考慮せずに、上記に記載した方法と同様の方法を用いて判定できる。同一性パーセントの算出においては、典型的に、正確な対合のみを数える。
【００５８】
本明細書に用いられる用語の「治療的有効量」とは、フラビウイルス感染を治療または管理する上で、または他の療法、例えば、治療用抗体、ワクチン療法などの治療的有効性を増強させる上で十分な治療薬の量を言う。治療的有効量は、疾病の発症を遅延化するかまたは最少化する上で十分な治療薬の量を言い得る。治療的有効性はまた、疾病の治療または管理において、治療的利益を提供する治療薬の量を言い得る。さらに、本発明の治療薬に関して、治療的有効量とは、疾病の治療または管理において、例えば、疾病の治療または管理に十分な治療用抗体の治療的有効性を増強させる上で十分な治療的利益を提供する治療薬単独の、または他の療法と組み合わせた量を意味する。本発明の抗体の量と関連させて用いられた該用語は、療法全体を改善するか、望ましくない作用を減少させるかもしくは回避するか、または他の治療薬の治療的有効性または他の治療薬との相乗作用を増強させる量を包含できる。
【００５９】
本明細書に用いられる用語の「予防的因子」および「予防的因子類」とは、疾患の予防、または疾患の再発もしくは伝播の防止に使用できる任意の因子を言う。予防的有効量とはまた、疾病の防止において、予防的利益を提供する予防的因子の量を言い得る。さらに、本発明の予防薬に関して、予防的有効量とは、疾病の防止において予防的利益を提供する予防薬単独の、または他の薬剤と組み合わせた量を意味する。本発明の抗体の量と関連させて用いられた該用語は、予防法全体を改善するか、または、限定はしないが、治療用抗体などの他の予防薬予防的有効性または他の治療薬との相乗作用を増強させる量を包含できる。
【００６０】
本明細書に用いられる用語の「管理する」、「管理すること」および「管理」とは、被験体が予防薬または治療薬の投与から引き出す有利な作用をいう。これは、疾病の治癒はもたらさない。一定の実施形態において、被験体は、疾病の進行または悪化を防ぐ目的で、その疾病を「管理する」ために、１種または複数種の予防薬または治療薬を投与される。
【００６１】
本明細書に用いられる用語の「防止する」、「防止すること」および「防止」とは、予防薬または治療薬の投与からもたらされる、被験体における疾患の１つまたは複数の症状の再発または発症の防止をいう。
【００６２】
本明細書に用いられる用語の「組み合わせて」とは、１種超の予防薬および／または治療薬の使用を言う。用語「組み合わせて」の使用は、疾患、例えば、過剰増殖疾患、特に癌に罹患している被験体に予防薬および／または治療薬を投与する順序を制限しない。疾患に罹患していた、罹患している、または罹患しやすい被験体に、第１の予防薬または治療薬を、第２の予防薬または治療薬を投与する前（例えば、１分前、５分前、１５分前、３０分前、４５分前、１時間前、２時間前、４時間前、６時間前、１２時間前、２４時間前、４８時間前、７２時間前、９６時間前、１週間前、２週間前、３週間前、４週間、５週間前、６週間前、８週間前、または１２週間前）に、同時に、または後（例えば、１分後、５分後、１５分後、３０分後、４５分後、１時間後、２時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、８週間後、または１２週間後）に投与できる。本発明の薬剤が他の薬剤と一緒に作用して、それらが他の方法で投与される場合よりも利益の増大を提供できるように、予防薬または治療薬は、連続的して、かつある時間間隔内で、被験体に投与される。任意の追加の予防薬または治療薬を、他の追加の予防薬または治療薬と共に、任意の順序で投与できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
（５．発明の詳細な説明）
本発明はフラビウイルス感染、特に西ナイルウイルス（ＷＮＶ）感染に対する予防的および／または治療的に有効な応答を達成または誘導するための方法の開発に、部分的に基づいている。本発明は、限定はしないが、日本脳炎（ＪＥ、例えば、ＪＥ  ＳＡ１４−１４−２）、デング熱（ＤＥＮ、例えば、デング熱血清型１〜４）、マレー谷脳炎、セントルイス脳炎、西ナイル、ダニ脳炎、Ｃ型肝炎ウイルス、クンジン（Ｋｕｎｊｉｎ）ウイルス、ポワッサン（Ｐｏｗａｓｓａｎ）ウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、黄熱病ウイルス、およびオムスク出血熱ウイルスなどのフラビウイルス感染に対する予防的および／または治療的に有効な応答を達成または誘導するための方法を包含する。本発明の方法は、限定はしないが、免疫血清または精製ポリクローナルの受動的投与、γグロブリンの投与、インターフェロンα療法およびＩＶＩＧ療法などのフラビウイルス感染、特にＷＮＶ感染の治療または予防の従来の様式に比較して、予防的におよび治療的により有効である。本発明の方法および組成物は、フラビウイルス感染の危険性が増大しているヒト集団におけるフラビウイルス感染に対する予防に特に有効である。特定の好ましい実施形態において、本発明の方法および組成物は、限定はしないが、ヒト幼児、高齢者、免疫系の障害を有するヒトなどの、ＷＮＶ感染の危険性が増大しているヒト集団に特に有用である。
【００６４】
本発明は、本発明の１種または複数の抗体の投与によって、フラビウイルス感染を治療、予防、または寛解するための方法を提供する。特定の作用機構に拘束される意図はないが、本発明の抗体は、例えば、高中和力価を有するドナーの、ＷＮＶ感染に対するＩＶＩＧを用いる治療などのフラビウイルス感染に対する現在の治療よりも有効である。ＩＶＩＧはヒト血漿から作製されるため、感染性物質を伝達する危険性を本質的に有している。ＨＩＶなどのウイルスを不活化するために、血漿源ドナーはスクリーニングされ、血漿は溶媒／界面活性剤処理されるが、事前対策として、多種多様の物質を除去するために、ウイルス除去および不活化を検証しなければならず；また、血液によって伝達され得る物質のリストは、感染の各出現ごとに増大する。これら全ての事前対策を行ったとしても、感染性物質の除去に関して１００％の保証はない。最後に、大抵の製剤は、ヒトアルブミン、他の血液製品、およびスクロースなどの賦形剤を有しており、これによって有害な事象の危険性が増大し得る。ＩＶＩＧの他の制限は、特に、心臓または腎臓の同時罹患を有する患者において、大容量が必要であることであり得る。ワクチン化ドナーからの特定の免疫グロブリン使用において、標的物質に対する抗体の濃度を高める時、多くの製剤は非関連抗体を含有する。本発明は、現行のＩＶＩＧ療法の欠点を解決する。本発明の抗体は、ＷＮＶに起因するフラビウイルス感染などのフラビウイルス感染の予防および治療のための、本質的により安全で、より有効となる可能性を有する、ＩＶＩＧの代替法を提供する。本発明の抗体のさらなる利点としては、限定はしないが、動物またはヒト由来のタンパク質を添加しない化学的に規定された培地を用い、規定された条件下で組織培養物中で増殖させられる能力；ポリクローナル血清とは異なって、エピトープ特異性、親和性および中和化能力、低用量にできることなど、所望の性質に関して、それらを選択できること；およびそれらを高濃度で製剤化でき、投与容量を減少させることができることが挙げられる。
【００６５】
本発明は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、好ましくはＷＮＶ抗原に、免疫特異的に結合する単離抗体、好ましくはモノクローナル抗体（ハイブリドーマによって産生された抗体のヒト化または他の改変物など）またはそれらのフラグメントを提供する。本発明の該単離抗体またはそれらのフラグメントは、１種または複数のフラビウイルス抗原、好ましくはＷＮＶ抗原に、該ウイルス株に関係なく免疫特異的に結合することが好ましい。いくつかの実施形態において、本発明の単離抗体は、同様の親和性および／または結合力で、系列ＩおよびＩＩ株および１９９９年のニューヨーク株などの北米ウェストナイル株など、全てのＷＮＶ株に結合する。
【００６６】
最も好ましい実施形態において、本発明は、哺乳動物におけるＷＮＶ感染の予防および／または治療のために、ＷＮＶの構造タンパク質、例えばＥタンパク質に、免疫特異的に結合する単離抗体、好ましくはモノクローナル抗体を提供する。特定の一実施形態において、本発明の単離抗体は、当業者に公知の標準的な方法によって判定し、本明細書において、例えば、酵母二ハイブリッド系で例示したとおり、ＷＮＶＥタンパク質の外部ドメインに結合する。他の特定の実施形態において、本発明の単離抗体は、当業者に公知の標準的な方法によって判定し、本明細書において、例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、免疫ブロット法で例示したとおり、アミノ酸２９０から４１５を含むＷＮＶ  Ｅタンパク質のドメインＩＩＩに結合する。他の特定の実施形態において、本発明の単離抗体は、アミノ酸９８〜１０９を含むドメインＩＩにおけるウイルス融合ペプチド、またはドメインＩにおける他の領域（例えば、アミノ酸１〜５２、１３２〜１９３、および２８０〜２９０）、またはドメインＩＩ（例えば、アミノ酸５２〜１３２および１９３〜２８０）に結合する。
【００６７】
本発明は、本発明の１種または複数の抗体を投与することによるフラビウイルス感染の治療、予防、または寛解のための方法を提供する。特定の一実施形態において、本発明は、ＷＮＶの構造タンパク質、例えばＥタンパク質に免疫特異的に結合する第１の抗体、およびＷＮＶの非構造タンパク質、例えばＮＳ１タンパク質に結合する第２の抗体を投与する工程を包含する、ＷＮＶ感染を治療、予防、または寛解するための方法を包含する。他の特定の実施形態において、本発明は、ＷＮＶの構造タンパク質、例えばＥタンパク質のエピトープに免疫特異的に結合する第１の抗体、およびＷＮＶの同じ構造タンパク質の異なる部位に結合する第２の抗体を含む、ＷＮＶ感染を治療、予防、または寛解するための方法を包含する。
【００６８】
他の好ましい実施形態において、本発明は、哺乳動物におけるＷＮＶ感染を予防および／または治療するための、フラビウイルスタンパク質、特にＥＮＶの非構造タンパク質、例えばＮＳ１タンパク質に免疫特異的に結合する単離モノクローナル抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ＷＮＶの構造タンパク質の１つまたは複数のエピトープおよび／または非構造タンパク質の１つまたは複数のエピトープに結合する。他の実施形態において、本発明はまた、フラビウイルスの１つの株のフラビウイルス抗原に、他の株に対し、差異的にまたは優先的に結合する抗体またはそれらのフラグメントを提供する。
【００６９】
好ましい実施形態において、本発明は、それぞれ、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、およびＰＴＡ−６０５２を有するハイブリドーマクローンＥ１６、ハイブリドーマクローンＥ２４、およびハイブリドーマクローンＥ３４により産生されたモノクローナル抗体、それらの変異体、または抗原結合フラグメント、例えば、ヒト化体またはキメラ化体、Ｆａｂフラグメントなどを包含する。いくつかの実施形態において、本発明は、１種または複数種のＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはそれらのフラグメントを提供し、前記抗体または抗体フラグメントは、配列番号４、８、および１２に記載されたＶＨドメインのいずれか１つのアミノ酸配列を有する可変重（「ＶＨ」）鎖を含む。本発明はまた、１種または複数種のＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはそれらのフラグメントを提供し、前記抗体または抗体フラグメントは、配列番号２、６、または１０に記載されたＶＬドメインのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む。本発明はまた、１種または複数のＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはそれらのフラグメントを提供し、前記抗体または抗体フラグメントは、配列番号１６〜１７、２０〜２２、または２６〜２８に記載されたいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＨ相補性決定領域（「ＣＤＲ」）含む。本発明はまた、１種または複数のＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはそれらのフラグメントを提供し、前記抗体または抗体フラグメントは、配列番号３３、３７、または４０〜４１に記載されたいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＬ相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を含む。
【００７０】
最も好ましい実施形態において、本発明は、例えば、当該分野に知られた標準的方法を用い、本明細書の実施例６．４で、例えば、インビトロプラーク減少中和力価（ＰＲＮＴ）アッセイにおいて測定される、強力な中和活性を有する抗体またはそれらのフラグメントを包含する。特定の作用機構に拘束される意図はないが、本発明の抗体は、ウイルスを直接中和化できるか、細胞内へのウイルスの進入を阻止でき、したがって、ウイルス感染を治療または予防できる。いくつかの実施形態において、本発明は、１ｍｇ／ｍＬの濃度で、ＰＲＮＴ５０値が、少なくとも１／５００、少なくとも１／７５０、少なくとも１／１０００、少なくとも１／１５００、少なくとも１／２０００、少なくとも１／２５００、少なくとも１／３０００、少なくとも１／３５００、少なくとも１／４０００、少なくとも１／４５００、少なくとも１／５０００、少なくとも１／５５００、少なくとも１／６０００、少なくとも１／６５００、少なくとも１／７０００、少なくとも１／７５００、少なくとも１／８０００、少なくとも１／８５００、少なくとも１／９０００、少なくとも１／９５００、または少なくとも１／１０，０００、好ましくは、少なくとも１／１０，０００で、ＷＮＶ−Ｅタンパク質に免疫特異的に結合する抗体を包含する。ＰＲＮＴアッセイは、参照としてその全体が本明細書に組み込まれている、Ｄｉａｍｏｎｄら、２００３年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：２５７８−２５８６頁に記載されているものなどの当業者に知られた任意の方法を用いて実施できる。
【００７１】
さらに他の好ましい実施形態において、当該分野に公知であり、本明細書に例示された、補体固定および細胞生存度アッセイなどの標準的方法を用いて判定されるように、本発明の抗体では、ＷＮＶ感染ビリオンの抗体依存性補体媒介中和が増強し、ＷＮＶ感染細胞の溶解が、より有効に引き起こされる。特定の作用機構に拘束される意図はないが、本発明の抗体は、増強したエフェクター機能を有し、ウイルス結合を中和し、補体媒介溶解を引き起こし、循環系からのクリアランスを促進し、ウイルス耐性の出現を防ぐため、治療的に、および予防的に、臨床的有効性が増強する。本発明の抗体は、強力なインビボ阻害活性を有することが好ましく、すなわち、ＷＮＶ感染に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％、ＷＮＶ感染を防止することが好ましい。
【００７２】
本発明は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合し、サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した時に、約１〜１０ｎＭの明確な解離定数を有する抗体またはそれらのフラグメントを提供する。本発明は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合し、ＢＩＡＣＯＲＥセンサーを用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した時、約１×１０ｅ４、約５×１０４、約１×１０５、約５×１０５、約１×１０６または約５×１０６のＫｏｎ速度、および約１×１０−３、約５×１０−４、約１×１０−４、約５×１０−５、約１×１０−５、約５×１０−６、または約１×１０−６のＫｏｆｆ速度を有する抗体またはそれらのフラグメントを提供する。
【００７３】
本発明は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合し、インビトロマイクロ中和アッセイにおいて、１μｇ／ｍｌ未満の中央有効濃度（ＥＣ５０）を有する抗体またはそれらのフラグメントを提供する。特に、本発明は、フラビウイルス感染に関連した１つまたは複数の症状の予防、治療または寛解に使用される組成物を提供し、前記組成物は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合し、インビトロマイクロ中和アッセイにおいて、０．０１ｎＭ未満、０．０２５ｎＭ未満、０．０５ｎＭ未満、０．１ｎＭ未満、０．２５ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．７５ｎＭ未満、１ｎＭ未満、１．２５ｎＭ未満、１．５ｎＭ未満、１．７５ｎＭ未満、または２ｎＭ未満のＥＣ５０を有する抗体またはそれらのフラグメントを提供する。
【００７４】
本発明はまた、１種または複数のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合し、公知の抗体に比較してインビボ半減期が増加した（例えば、３０日増加した）抗体を提供する。特に、本発明は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合し、公知の抗体に比較してインビボ半減期が増加しており、前記インビボ半減期の増加が、前記抗体のＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との相互作用に関与していることが確認されているアミノ酸残基における１つまたは複数の改変（例えば、置換、欠失、または挿入）から生じる抗体を包含する。また、本発明は、１種または複数のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合し、公知の抗体に比較してインビボ半減期が増加したペギル化抗体およびそれらのフラグメントを包含する。１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する抗体およびそれらのフラグメントのインビボ半減期増加により、被験体に対する前記抗体またはそれらのフラグメントの投与量および／または投与回数が減少する。
【００７５】
本発明は、１種または複数種のＷＮＶ抗原に対する特異性を有する新規なモノクローナル抗体の製造を包含する。特に、本発明は、１種または複数種のＷＮＶ抗原に、特異的に結合するモノクローナル抗体を製造する方法を提供し、この方法は：（ａ）炭水化物および脂質ベースのアジュバントを用い、精製ＷＮＶタンパク質、例えばＮＳ１、Ｅタンパク質、またはそれらの免疫原性フラグメントによって、１匹または複数匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化する工程；（ｂ）固相ＥＬＩＳＡベースのアッセイを用いて、ポリクローナル抗体応答を測定する工程；（ｃ）前記１匹または複数匹のマウスの脾臓細胞からハイブリドーマ細胞株を作製する工程；（ｄ）特定のＷＮＶタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する１種または複数のハイブリドーマ細胞株に関して、前記ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングする工程；（ｅ）候補免疫マウスを選択する工程；（ｆ）静脈内精製ＥまたはＮＳ１タンパク質により、高力価ポリクローナル（例えば１／１０，０００）応答を単一マウスに起こさせる工程；（ｇ）脾臓細胞を採集してから、標準的プロトコル（Ｈａｒｌｏｗら、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールドスプリングハーバー）にしたがって、非分泌Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６．５．３骨髄腫に融合させる工程、を包含する。本発明は、その方法によって産生された任意の抗体を包含する。
【００７６】
好ましい実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ０６０５０、ＰＴＡ−６０５１、およびＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有するクローンＥ１６、クローンＥ２４、またはクローンＥ３４によって産生されたモノクローナル抗体を提供する。他の実施形態において、本発明は、クローンＥ１６、クローンＥ２４、またはクローンＥ３４によって産生されたモノクローナル抗体と、結合について競合する単離抗体またはそのフラグメントを提供する。さらに、本発明は、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ０６０５０、ＰＴＡ−６０５１、およびＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有するハイブリドーマ細胞株Ｅ１６、ハイブリドーマ細胞株Ｅ２４、またはハイブリドーマ細胞株Ｅ３４を提供する。他の好ましい実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、およびＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有するハイブリドーマクローンＥ１６、Ｅ２４、またはＥ３４によって産生されたモノクローナル抗体、それらの変異体、または抗原結合フラグメント、例えば、ヒト化体またはキメラ化体、Ｆａｂフラグメントなどを包含する。
【００７７】
また、本発明の方法は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを包含する。一実施形態において、本発明は、１種または複数のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に特異的に結合する抗体およびそのフラグメントの重鎖または軽鎖をコードする単離核酸配列を提供する。また、本発明は、前記核酸を含むベクターに関する。本発明はさらに、重鎖をコードする第１の核酸分子および軽鎖をコードする第２の核酸分子を含むベクターを提供し、前記重鎖および軽鎖は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントのものである。特定の一実施形態において、前記ベクターは発現ベクターである。本発明は、本発明の抗体のベクター、または本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞をさらに提供する。本発明は、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、およびＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有する寄託ハイブリドーマクローンによって産生された抗体の重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチド、またはそれらの部分、例えばＣＤＲ、可変ドメインなど、およびそれらのヒト化体を包含することが好ましい。
【００７８】
本発明は、本発明の抗体またはそれらのフラグメントを製造するための方法をさらに提供する。本発明の抗体またはそれらのフラグメントは、抗体を製造するための、当該分野に知られた任意の方法によって、特に、培養ハイブリドーマ細胞からの分泌、化学的合成によって、または当該分野に知られた組換え発現法によって製造することができる。特定の一実施形態において、本発明は、フラビウイルス抗原特異的抗体を組換え的に製造する方法に関するものであり、前記方法は：（ｉ）培地中での前記抗体の発現に好適な条件下での培養であって、宿主細胞は、異種プロモーターに作動可能に結合した第１の核酸分子および同一のまたは異なる異種プロモーターに作動可能に結合した第２の核酸分子を含有し、前記第１の核酸および第２の核酸は、１種または複数種のフラビウイルス抗原に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントの、それぞれ、重鎖および軽鎖をコードする培養；および（ｉｉ）前記培地からの前記抗体の回収、を含む。
【００７９】
好ましくは、本発明の抗体はモノクローナル抗体であり、ヒト化抗体またはヒト抗体であることがより好ましい。特定の好ましい一実施形態において、本発明の抗体は、ＷＮＶ  Ｅタンパク質に結合する。他の特定の実施形態において、本発明の抗体は、ＷＮＶ  Ｅタンパク質の１つまたは複数のエピトープを特異的または選択的に認識する。本発明の他の実施形態は、ＷＮＶ  Ｅタンパク質に対する本発明の抗体の親和性を高めるために、ファージ表示法、ＤＮＡシャッフリング、または当業者に知られた他の同様な方法の使用を包含する。特定の好ましい一実施形態において、本発明の抗体は、ＷＮＶ  ＮＳ１タンパク質に結合する。他の特定の実施形態において、本発明の抗体は、ＷＮＶ  ＮＳ１タンパク質の１つまたは複数のエピトープを特異的または選択的に認識する。本発明の他の実施形態は、ＷＮＶ  ＮＳ１タンパク質に対する本発明の抗体の親和性を高めるために、ファージ表示法の使用を包含する。ＷＮＶ  Ｅタンパク質に対する結合活性の増加した変異抗体を同定するために、当該分野に知られた任意のスクリーニング法（例えばＥＬＩＳＡ）を使用することができる。他の特定の実施形態において、本発明の抗体を、当該分野に周知の抗体スクリーニングアッセイ（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥアッセイ）を用いてスクリーニングし、約１×１０−３、約５×１０−４、約１×１０−４、約５×１０−５、約１×１０−５、約５×１０−６、または約１×１０−６のＫｏｆｆ速度を有する抗体を同定する。
【００８０】
本発明は、生物学的サンプル中、具体的に、１種または複数種のフラビウイルス抗原の存在を検出するための、本発明の抗体の使用を包含する。
【００８１】
本発明は、高親和性および／または高結合性で１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する１種または複数種の抗体またはそれらのフラグメントを被験体に投与する工程を包含する、該被験体におけるフラビウイルス感染、特にＷＮＶ感染に関連した１つまたは複数の症状を予防、治療および寛解する方法を提供する。本発明の抗体は、例えば、一実施形態において、単独薬剤療法として、フラビウイルス感染の予防または治療に有用である。
【００８２】
本発明は、（ｉ）１種または複数種のフラビウイルス抗原、例えばＷＮＶ抗原に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントの治療的または予防的に有効な量；および（ｉｉ）薬学的に受容可能なキャリア、を含む薬学的組成物をさらに提供する。
【００８３】
本発明は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、例えばＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する１種または複数種の抗体またはそれらのフラグメントを、フラビウイルス感染の部位に直接送達する方法を包含する。
【００８４】
本発明は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合し、少なくとも１×１０４、約５×１０４、約１×１０５、約５×１０５、約１×１０６、または約５×１０６の結合速度定数またはｋｏｎ速度（抗体（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）ｋｏｎ→Ａｂ−Ａｇ）を有する抗体またはそれらのフラグメントを提供する。特に、本発明は、フラビウイルス感染に関連した１つまたは複数の症状の予防、治療または寛解に使用される組成物を提供し、前記組成物は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合し、少なくとも１×１０４、約５×１０４、約１×１０５、約５×１０５、約１×１０６、または約５×１０６のｋｏｎ速度を有する１種または複数種の抗体またはそれらのフラグメントを含む。
【００８５】
他の実施形態において、本発明は：（ｉ）前記被験体からの生物学的サンプルを、本発明の抗体の有効量に接触させること；および（ｉｉ）前記抗体またはそのフラグメントの結合を検出することであって、背景または標準レベル以上での該検出可能マーカーの検出は、前記被験体がフラビウイルス感染を有することを示す検出、を含む、被験体におけるフラビウイルス感染の診断法を提供する。
【００８６】
（５．１抗体）
本発明は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、好ましくはＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する単離抗体、好ましくはモノクローナル抗体またはそれらのフラグメントを提供する。本発明の単離抗体またはそれらのフラグメントは、ウイルスの株に関わりなく、１種または複数種のフラビウイルス抗原、好ましくはＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合することが好ましい。いくつかの実施形態において、本発明の単離抗体は、同様の親和性および／または結合力で、北米株（例えば、ニューヨーク１９９９および関連株）などの系統Ｉ株およびＩＩ株などの全てのＷＮＶ株に結合する。
最も好ましい実施形態において、本発明は、鳥類または哺乳動物、特にヒトにおけるＷＮＶ感染の予防および／または治療のために、ＷＮＶの構造単、例えば、Ｅタンパク質に免疫特異的に結合する単離抗体、好ましくはモノクローナル抗体を提供する。特定の一実施形態において、本発明の単離抗体は、当業者に公知の標準的な方法によって判定し、本明細書において、例えば、ＥＬＩＳＡ、流動細胞計測法、免疫沈降、免疫ブロット法で例示したとおり、ＷＮＶ  Ｅタンパク質の外部ドメインに結合する。他の特定の実施形態において、本発明の単離抗体は、当業者に公知の標準的な方法によって判定し、本明細書において、例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、免疫ブロット法で例示したとおり、アミノ酸２９０から４１５を含むＷＮＶ  Ｅタンパク質のドメインＩＩＩに結合する。
【００８７】
他の好ましい実施形態において、本発明は、哺乳動物におけるＷＮＶ感染を予防および／または治療するための、ＥＮＶの非構造タンパク質、例えばＮＳ１タンパク質に免疫特異的に結合する単離抗体、好ましくはモノクローナル抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ＷＮＶの構造タンパク質の１つまたは複数のエピトープおよび／または非構造タンパク質の１つまたは複数のエピトープに結合する。他の実施形態において、本発明はまた、フラビウイルスの１つの株のフラビウイルス抗原に、他の株に対し、差異的にまたは優先的に結合する抗体またはそれらのフラグメントを提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、１種または複数のＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはそれらのフラグメントを提供し、前記抗体または抗体フラグメントは、配列番号４、８、および１２に記載されたＶＨドメインのいずれか１つのアミノ酸配列を有する可変重（「ＶＨ」）鎖を含む。本発明はまた、１種または複数種のＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはそれらのフラグメントを提供し、前記抗体または抗体フラグメントは、配列番号２、６、または１０に記載されたＶＬドメインのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む。本発明はまた、１種または複数種のＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはそれらのフラグメントを提供し、前記抗体または抗体フラグメントは、表１に記載された配列のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【００８８】
本発明はまた、１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する抗体またはそれらのフラグメントを提供ｓ、前記抗体または抗体フラグメントは、１つまたは複数のＶＬ  ＣＤＲおよび／または１つまたは複数のＶＨ  ＣＤＲにおいて、１つまたは複数のアミノ酸残基の置換を有する配列番号１３〜４３、４、８、１２、２、６、または１０のいずれかに記載されたアミノ酸配列を含む。この実施形態によれば、アミノ酸残基の置換は、保存的または非保存的であり得る。本発明の抗体のＶＨドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ、ＶＬドメインおよび／またはＶＬ  ＣＤＲにおける置換導入によって作製された抗体または抗体フラグメントは、例えば、フラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に結合するその能力に関して、フラビウイルス、特にＷＮＶを中和するその能力に関して、またはフラビウイルス、特に、ＷＮＶ感染に関連した１つ以上の症状を予防、治療または寛解するその能力に関して、インビトロまたはインビボで試験し得る。
【００８９】
本発明の一実施形態において、抗体またはそれらのフラグメントは、配列番号１６〜１７のいずれかのアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１を含む。他の実施形態において、抗体またはそれらのフラグメントは、配列番号２０〜２２のいずれかのアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２を含む。他の実施形態において、抗体またはそれらのフラグメントは、配列番号２６〜２８のいずれかのアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む。
【００９０】
本発明の一実施形態において、抗体またはそれらのフラグメントは、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１を含む。他の実施形態において、抗体またはそれらのフラグメントは、配列番号３７のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２を含む。他の実施形態において、抗体は、配列番号４０〜４１のいずれかのアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【００９１】
また、本発明は、１種または複数種のＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する抗体またはそれらのフラグメントを提供し、前記抗体または抗体フラグメントは、本明細書に開示されたＶＬドメイン、または他のＶＬドメインと組み合わせた、本明細書に開示されたＶＨドメインを含む。さらに本発明は、１種または複数種のＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する抗体またはそれらのフラグメントを提供し、前記抗体または抗体フラグメントは、本明細書に開示されたＶＨドメイン、または他のＶＨドメインと組み合わせた、本明細書に開示されたＶＬドメインを含む。
【００９２】
また本発明は、配列番号１６〜１７、２０〜２２、２６〜２８、３３、３７、または４０〜４１に記載された１つまたは複数のＶＨ  ＣＤＲおよび１つまたは複数のＶＬ  ＣＤＲを含む抗体またはそれらのフラグメントを提供する。特に、本発明は、配列番号１６〜１７、２０〜２２、２６〜２８、３３、３７、または４０〜４１に記載されたＶＨ  ＣＤＲ１とＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ１とＶＬ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ１とＶＬ  ＣＤＲ３、ＶＨ  ＣＤＲ２とＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２とＶＬ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ２とＶＬ  ＣＤＲ３、ＶＨ  ＣＤＲ３とＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ３とＶＬ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３とＶＬ  ＣＤＲ３、またはＶＨ  ＣＤＲ類とＶＬ  ＣＤＲ類のそれら任意の組み合わせを含む抗体またはそのフラグメントを提供する。また本発明は、配列番号１６〜１７、２０〜２２、２６〜２８、３３、３７、または４０〜４１に記載されたＶＨ  ＣＤＲ１とＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ１とＶＬ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ１とＶＬ  ＣＤＲ３、ＶＨ  ＣＤＲ２とＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２とＶＬ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ２とＶＬ  ＣＤＲ３、ＶＨ  ＣＤＲ３とＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ３とＶＬ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３とＶＬ  ＣＤＲ３、またはＶＨ  ＣＤＲ類とＶＬ  ＣＤＲ類のそれら任意の組み合わせを含む抗体またはそのフラグメントを提供する。また本発明は、配列番号１６〜１７、２０〜２２、２６〜２８、３３、３７、または４０〜４１に記載されたＶＨ  ＣＤＲ１とＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ１とＶＬ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ１とＶＬ  ＣＤＲ３、ＶＨ  ＣＤＲ２とＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２とＶＬ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ２とＶＬ  ＣＤＲ３、ＶＨ  ＣＤＲ３とＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ３とＶＬ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３とＶＬ  ＣＤＲ３、またはＶＨ  ＣＤＲ類とＶＬ  ＣＤＲ類のそれら任意の組み合わせを含む抗体またはそのフラグメントを提供する。
【００９３】
他の実施形態において、ＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する抗体またはそのフラグメントは、配列番号４、８または１２に記載されたＶＨドメインのいずれかに、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一なＶＨドメインのアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、ＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する抗体またはそのフラグメントは、配列番号１６〜１７、２０〜２２、または２６〜２８に記載されたＶＨ  ＣＤＲのいずれかに、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一な１つまたは複数のＶＨ  ＣＤＲのアミノ酸配列を含む。
【００９４】
他の実施形態において、ＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する抗体またはそのフラグメントは、配列番号２、６または１０に記載されたＶＬドメインのいずれかに、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一なＶＬドメインのアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、ＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する抗体またはそのフラグメントは、配列番号３３、３７、または４０〜４１に記載されたＶＬ  ＣＤＲのいずれかに、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一な１つまたは複数のＶＬ  ＣＤＲのアミノ酸配列を含む。
【００９５】
最も好ましい実施形態において、本発明は、例えば、当該分野に知られ、本明細書において、例えば、インビボプラーク減少中和力価（ＰＲＮＴ）アッセイで例示された標準的な方法を用いて測定された時、強力な中和活性を有する抗体またはそれらのフラグメントを包含する。特定の作用機構に拘束される意図はないが、本発明の抗体は、ウイルスを直接中和できるか、または細胞内へのウイルスの進入を阻止でき、したがって、ウイルス感染を防止できる。いくつかの実施形態において、本発明は、１ｍｇ／ｍＬの濃度で、ＰＲＮＴ５０値が、少なくとも１／５００、好ましくは少なくとも１／１０，０００であるように、ＷＮＶ−Ｅタンパク質に免疫特異的に結合する抗体を包含する。
【００９６】
さらに他の好ましい実施形態において、本発明の抗体は、ＷＮＶに感染したウイルス粒子の増強した抗体依存性補体媒介中和を有し、当該分野に知られており、本明細書において例示された、補体固定および生存度アッセイなどの標準的方法を用いて測定した時、ＷＮＶ感染細胞の溶解をより有効に引き起こす。特定の作用機構に拘束される意図はないが、本発明の抗体は、それらのエフェクター機能が増強しており、ウイルス結合を中和し、補体媒介溶解を引き起こし、循環系からのクリアランス促進し、ウイルス耐性の発現を防止するため、治療的におよび予防的に、増大した臨床的有効性を有する。本発明の抗体は、強力なインビボ阻害活性を有すること、すなわち、ＷＮＶ感染を、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％防ぐことが好ましい。
【００９７】
本発明は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合し、サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した時、約１〜１０ｎＭの明白な解離定数を有する抗体またはそれらのフラグメントを提供する。本発明は、１種または複数のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合し、ＢＩＡＣＯＲＥセンサーを用い、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した時、約１〜１０ｎＭの明白な解離定数を有する抗体またはそれらのフラグメントを提供する。
【００９８】
本発明は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合し、１０−１ｓ−１未満、５×１０−１ｓ−１未満、１０−２ｓ−１未満、５×１０−２ｓ−１未満、１０−３ｓ−１未満、５×１０−３ｓ−１未満、１０−４ｓ−１未満、５×１０−４ｓ−１未満、１０−５ｓ−１未満、５×１０−５ｓ−１未満、１０−６ｓ−１未満、５×１０−６ｓ−１未満、１０−７ｓ−１未満、５×１０−７ｓ−１未満、１０−８ｓ−１未満、５×１０−８ｓ−１未満、１０−９ｓ−１未満、５×１０−９ｓ−１未満、または１０−１０ｓ−１未満のｋｏｆｆ速度（抗体（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）Ｋｏｆｆ→Ａｂ−Ａｇ）を有する抗体またはそれらのフラグメントを提供する。本発明は、１種または複数のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合し、約１×１０−３、約５×１０−４、約１×１０−４、約５×１０−５、約１×１０−５、約５×１０−６、または約１×１０−６のｋｏｆｆ速度（抗体（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）Ｋｏｆｆ→Ａｂ−Ａｇ）を有する抗体またはそれらのフラグメントを提供する。本発明は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合し、約１×１０４、約５×１０４、約１×１０５、約５×１０５、約１×１０６、または約５×１０６のｋｏｎ速度を有する抗体またはそれらのフラグメントを提供する。
本発明は、インビトロマイクロ中和アッセイにおいて、１μｇ／ｍｌ未満の中央有効濃度（ＥＣ５０）を有する抗体またはそれらのフラグメントを提供する。特に、本発明は、フラビウイルス感染に関連した１つまたは複数の症状の予防、治療または寛解に使用される組成物を提供し、前記組成物は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合し、インビトロマイクロ中和アッセイにおいて、０．０１ｎＭ未満、０．０２５ｎＭ未満、０．０５ｎＭ未満、０．１ｎＭ未満、０．２５ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．７５ｎＭ未満、１ｎＭ未満、１．２５ｎＭ未満、１．５ｎＭ未満、１．７５ｎＭ未満、または２ｎＭ未満のＥＣ５０を有する１種または複数種の抗体またはそれらのフラグメントを含む。
【００９９】
特定の一実施形態において、Ｅ１６、Ｅ２４、またはＥ３４該抗体は、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、ＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有するクローンＥ１６、クローンＥ２４、またはクローンＥ３４によって産生されたマウスモノクローナル抗体である。本発明のハイブリドーマ産生抗体、すなわち、Ｅ１６、Ｅ２４、またはＥ３４は、特許手続きに関する微生物預託の国際公認についてのブタペスト条約の条項下、２００４年６月４日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（バージニア州、マサチューセッツ、１０８０１Ｂｌｖｄ大学、２０１１０〜２２０９）に寄託されており、参照として、本明細書に組み込まれている。特定の一実施形態において、本発明は、配列番号４、８、または１２のアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号２、６、または１０のアミノ酸配列を有する重鎖を有する抗体を包含する。好ましい一実施形態において、本発明の抗体は、ヒトの、またはヒト化されている、好ましくはクローンＥ１６、クローンＥ２４、またはクローンＥ３４によって産生された抗体のヒト化体である。
【０１００】
また本発明は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合し、公知の抗体に比較して、インビボ半減期の増加した抗体を提供する。１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する抗体およびそれらのフラグメントの増加したインビボ半減期により、被験体に対する前記抗体またはそれらのフラグメントの投与量および／または投与回数が減少する。。特に、本発明は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合し、公知の抗体に比較して増加したインビボ半減期を有し、前記増加したインビボ半減期が、前記抗体のＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との相互作用に関与していることが確認されているアミノ酸残基における１つまたは複数の改変（例えば、置換、欠失、または挿入）から生じる抗体を包含する。また、本発明は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合し、公知の抗体に比較して増加したインビボ半減期を有するペギル化抗体およびそれらのフラグメントを包含する。１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する抗体およびそれらのフラグメントの増加したインビボ半減期により、被験体に対する前記抗体またはそれらのフラグメントの投与量および／または投与回数が減少する。
【０１０１】
本発明の抗体としては、限定はしないが、モノクローナル抗体、合成抗体、組換え産生抗体、二重特異的抗体、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ラクダ化抗体、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、内部抗体、およびこれらのいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられる。特に、本発明の方法に用いられる抗体としては、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち、１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子が挙げられる。本発明の抗体は、フラビウイルス抗原の１つまたは複数の異なる部位に結合できる。
【０１０２】
本発明の方法に用いられる抗体は、鳥類および哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ）などの任意の動物源からのものであり得る。該抗体は、ヒトの抗体、またはヒト化モノクローナル抗体であることが好ましい。本明細書に用いられる「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、また、ヒト免疫グロブリンライブラリーまたは配列をコードする合成ヒト免疫グロブリンのライブラリーから、またはヒト遺伝子からの抗体を発現するマウスから単離された抗体が含まれる。
【０１０３】
本発明の方法に用いられる抗体は、単一特異的、二重特異的抗体、三重特異的であり得るか、またはより多くの特異性を有するものであり得る。多重特異的抗体は、フラビウイルス抗原、例えば、ＷＮＶ抗原の異なるエピトープに免疫特異的に結合できるか、フラビウイルス抗原のエピトープならびに異種ポリペプチドなどの異種エピトープの双方、または固体支持体物質に免疫特異的に結合できる。例えば、国際公開第９３／１７７１５号、第９２／０８８０２号、第９１／００３６０号、および第９２／０５７９３号；Ｔｕｔｔら、１９９１年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９頁；米国特許第４，４７４，８９３号、第４，７１４，６８１号、４，９２５，６４８号、５，５７３，９２０号、および５，６０１，８１９号；およびＫｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３頁；Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａら、２００１年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４８：４７−６６頁を参照されたい。これら全ては、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０１０４】
特定の一実施形態において、本発明の方法に用いられる抗体は、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、ＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有するクローンＥ１６、クローンＥ２４、またはクローンＥ３４によって産生された抗体の抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）、好ましくは６つ全てのＣＤＲを含む）である。他の実施形態において、本発明の方法に用いられる抗体は、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、ＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有するクローンＥ１６、クローンＥ２４、またはクローンＥ３４によって産生されたマウスモノクローナル抗体と同じエピトープに結合し、および／またはＥＬＩＳＡアッセイまたは他の適切な競合的免疫アッセイにおいて判定した時、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、ＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有するクローンＥ１６、クローンＥ２４、またはクローンＥ３４によって産生されたマウスモノクローナル抗体と競合する。
【０１０５】
本発明の方法に用いられる抗体には、修飾されている（すなわち、共有結合のように）抗体への任意のタイプの分子の共有結合により、修飾されている誘導体が含まれる。例えば、限定はしないが、そのような抗体誘導体としては、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペギル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク分解的開裂、細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合などによって修飾された抗体が挙げられる。限定はしないが、特異的化学的開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などの公知の方法により、多数の化学的修飾のいずれかを実施し得る。さらに、該誘導体は、１種または複数の非古典的アミノ酸を含有し得る。
【０１０６】
ヒトにおける抗体のインビボ使用およびインビトロ検出アッセイなどのいくつかの使用には、ヒト抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体を使用することが好ましいと考えられる。ヒト被験体の治療処置には、完全なヒト抗体が特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いて、上記のファージ表示法などの当該分野に知られた種々の方法により作製することができる。米国特許第４，４４４，８８７号および第４，７１６，１１１号；ならびに国際公開第９８／４６６４５号、第９８／５０４３３号、第９８／２４８９３号、第９８／１６６５４号、第９６／３４０９６号、第９６／３３７３５号、および第９１／１０７４１号もまた参照されたい。これらの各々は、参考として、その全体が本明細書中に援用される。
【０１０７】
また、ヒト抗体は、機能的内因性免疫グロブリンを発現できないが、ヒトの免疫グロブリン遺伝子を発現できる遺伝子導入マウスを用いて作製することもできる。例えば、ヒトの重鎖および軽鎖の免疫グロブリン遺伝子複合体を、無作為に、または相同的組換えにより、マウスの胚性幹細胞に導入できる。あるいは、ヒトの重鎖および軽鎖の遺伝子に加えて、ヒトの可変領域、定常領域、および多様性領域をマウスの胚性幹細胞に導入できる。マウスの重鎖および軽鎖の免疫グロブリン遺伝子は、相同的組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別に、または同時に、非官能性にすることができる。特に、ＪＨ領域のホモ接合性の欠失により、内因性抗体の産生が防がれる。修飾した胚性幹細胞を増やし、胚盤胞内へマイクロインジェクションし、キメラマウスを作製する。次いでこのキメラマウスを飼育して、ヒト抗体を発現するホモ接合性の子孫を作る。選択された抗原、例えば、本発明のポリペプチドの全体または部分により、従来の方法論を用いて、そのような遺伝子導入マウスを免疫化する。従来のハイブリドーマ技法を用いて、免疫化した遺伝子導入マウスから、その抗原に特異的なモノクローナル抗体を得ることができる。遺伝子導入マウスに導入されているヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の間に再編成し、引き続き、クラススィッチングおよび体細胞変異を受ける。したがって、このような方法を用いて、治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧ抗体を作製することが可能である。ヒト抗体を作製するためのこの技法のレビューについては、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（１９９５年、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３頁）（これは、その全体が参考として本明細書中に援用されている）を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製するこの技法の詳細な検討およびこのような抗体を作製するためのプロトコルに関しては、例えば、国際公開第９８／２４８９３号、第９６／３４０９６号、第９６／３３７３５号；ならびに米国特許第５，４１３，９２３号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，５６９，８２５号、第５，６６１，０１６号、第５，５４５，８０６号、第５，８１４，３１８号、および第５，９３９，５９８号を参照されたい。これらは、その全体が参考として本明細書中に援用される。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ社（カリフォルニア州フリーモント）およびＭｅｄａｒｅｘ（ニュージャージー州プリンストン）などの会社が、上記と同様の技法を用いて、選択された抗原に特異的なヒト抗体を提供し得る。
【０１０８】
キメラ抗体は、その抗体の異なる部分が非ヒト抗体に由来する可変領域抗体およびヒト免疫グロブリンの定常領域を有する抗体など、異なる免疫グロブリン分子に由来する分子である。キメラ抗体を作製する方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２頁；Ｏｉら、１９８６年、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４頁；Ｇｉｌｌｉｅｓら、１９８９年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２頁；および米国特許第６，３１１，４１５号、第５，８０７，７１５号、第４，８１６，５６７号、および第４，８１６，３９７号（これらは、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照されたい。非ヒト種からの１つまたは複数のＣＤＲおよびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を含むキメラ抗体は、例えば、ＣＤＲ移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）（欧州特許第２３９，４００号；国際公開第９１０９９６７号；および米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号、および第５，５８５，０８９号）、化粧張り（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）または付け替え（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号、；欧州特許第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、１９９１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８頁；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、１９９４年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：８０５；およびＲｏｇｕｓｋａら、１９９４年、ＰＮＡＳ  ９１：９６９頁）、および鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）などの当該分野に公知の種々の方法を用いて作製することができる。上記で指示された文献の各々は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０１０９】
フレームワーク領域のフレームワーク残基は、抗原結合性を変化させるために、好ましくは改善するために、ＣＤＲドナー抗体の対応する残基によって置換されることが多い。これらのフレームワーク置換を、当該分野に周知の方法により、例えば、ＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用のモデリングにより同定し、抗原結合および配列比較に重要なフレームワーク領域を同定し、特定の位置における特異なフレームワーク領域を同定する（例えば、その全体が参考として本明細書中に援用される米国特許第５，５８５，０８９号；およびＲｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３頁を参照）。
【０１１０】
ヒト化抗体は、予め決められた抗原に結合することができ、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域および非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するＣＤＲを含む抗体、その変異体またはフラグメントである。ヒト化抗体は、全ての、または実質的に全てのＣＤＲ領域が、非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）のＣＤＲ領域に対応しており、全ての、または実質的に全てのフレームワーク領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。通常、該抗体は、軽鎖ならびに重鎖の少なくとも可変ドメインの双方を含有する。該抗体は、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４領域もまた含み得る。ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥなどの免疫グロブリンの任意のクラス、およびＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４などの任意のアイソタイプから選択できる。通常、定常ドメインは、ヒト化抗体が細胞毒活性を示すことが望まれる補体固定定常ドメインであり、クラスは典型的にはＩｇＧ１である。そのような細胞毒活性が望ましくない場合、定常ドメインはＩｇＧ２クラスであり得る。ヒト化抗体は、１つ超のクラスまたはアイソタイプの配列を含むことができ、所望のエフェクター機能を最適化するための特定の定常ドメインの選択は通常の当業者の範囲内にある。ヒト化抗体のフレームワークおよびＣＤＲ領域は、親配列、例えばドナーＣＤＲに正確に対応する必要は無いか、またはコンセンサスフレームワークが、少なくとも１つの残基の置換、挿入または欠失により変異誘発されて、その結果、その部位におけるＣＤＲまたはフレームワーク残基が、コンセンサスもしくは移入抗体のいずれかに、対応しないことがあり得る。しかし、このような変異は、広範囲にわたるものではない。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも７５％、より多くの場合、９０％、最も好ましくは９５％超が、親フレームワーク領域（ＦＲ）およびＣＤＲ配列の残基に対応する。ヒト化抗体は、限定はしないが、ＣＤＲ移植（欧州特許第２３９，４００号；国際公開第９１０９９６７号；および米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号、および第５，５８５，０８９号）、化粧張りまたは付け替え（欧州特許第５９２，１０６号、；欧州特許第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、１９９１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８頁；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、１９９４年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：８０５；およびＲｏｇｕｓｋａら、１９９４年、ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３頁）、および鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）、ならびに、例えば、米国特許第６，４０７，２１３号、第５，７６６，８８６号、第５，５８５，０８９号、国際公開第９３１７１０５号、Ｔａｎら、２００２年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９−１１２５頁；Ｃａｌｄａｓら、２０００年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１３：３５３−３６０頁；Ｍｏｒｅａら、２０００年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０：２６７−２７９頁；Ｂａｃａら、１９９７年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−１０６８４頁；Ｒｏｇｕｓｋａら、１９９６年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９：８９５−９０４頁；Ｃｏｕｔｏら、１９９５年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２３補遺）：５９７３ｓ−５９７７ｓ頁；Ｃｏｕｔｏら、１９９５年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５１７１７−１７２２頁；Ｓａｎｄｈｕ、１９９４年、Ｇｅｎｅ  １５０：４０９−４１０頁；Ｐｅｄｅｒｓｏｎら、１９９４年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５：９５９−９７３頁；Ｊｏｎｅｓら、１９８６年、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５頁；Ｒｅｉｃｈｍａｎら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３頁；およびＰｒｅｓｔａ、１９９２年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６頁に開示された方法などの当該分野に知られた種々の方法を用いて作製することができる。フレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、抗原結合性を変化させるために、好ましくは改善するために、ＣＤＲドナー抗体の対応する残基によって置換されることが多い。これらのフレームワーク置換を、当該分野に周知の方法により、例えば、ＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用のモデリングにより同定し、抗原結合および配列比較に重要なフレームワーク領域を同定し、特定の位置における特異なフレームワーク領域を同定する（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号；およびＲｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３頁を参照。これらは、その全体が参考として本明細書中に援用される）。
【０１１１】
さらに、本発明の抗体は、次に、当業者に周知の方法を用いて、抗イディオタイプ抗体を作製するために利用することができる。（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ、１９８９年、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７：４３７−４４４頁；およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ、１９９１年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２４２９−２４３８頁）。本発明は、本発明の抗体またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの使用を採用する方法を提供する。
【０１１２】
本発明は、ラクダ化単一ドメイン抗体などの単一ドメイン抗体を包含する（例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、２００１年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６：２３０；Ｎｕｔｔａｌｌら、２０００年、Ｃｕｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１：２５３頁；ＲｅｉｃｈｍａｎおよびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、１９９９年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２３１：２５頁；国際公開第９４／０４６７８号および第９４／２５５９１号；米国特許第６，００５，０７９号を参照。これらは、その全体が参考として本明細書中に援用される）。一実施形態において、本発明は、単一ドメイン抗体が形成されるような修飾を有する２つのＶＨドメインを含む単一ドメイン抗体を提供する。
【０１１３】
また、本発明の方法は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける１５日超、好ましくは２０日超、２５日超、３０日超、３５日超、４０日超、４５日超、２ヵ月超、３ヵ月超、４ヵ月超、または５ヵ月超の半減期（例えば、血清半減期）を有する抗体またはそれらのフラグメントの使用を包含する。哺乳動物、好ましくはヒトにおける本発明の抗体またはそれらのフラグメントの半減期の増加により、哺乳動物におけるその抗体またはそれらのフラグメントのより高い血清力価がもたらされ、したがって、前記抗体または抗体フラグメントの投与回数が減少し、および／または投与される抗体または抗体フラグメントの濃度が減少する。インビボ半減期の増加した抗体またはそれらのフラグメントは、当業者に公知の方法により作製することができる。例えば、インビボ半減期の増加した抗体またはそれらのフラグメントは、ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との間の相互作用に関与していることが確認されたアミノ酸残基を修飾（例えば、置換、欠失または付加）することによって作製できる。本発明の抗体は、生物学的半減期を増加させるために、Ｗａｒｄらに記載された方法によって操作できる。（参照として、全体が本明細書に組み込まれている米国特許第６，２７７，３７５号を参照）。例えば、本発明の抗体は、インビボまたは血清半減期を増加させるために、Ｆｃ−ヒンジドメインにおいて操作できる。
【０１１４】
インビボ半減期の増加した抗体またはそれらのフラグメントは、その抗体またはそれらのフラグメントに、高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー分子を結合させることによって作製できる。前記抗体または抗体フラグメントのＮまたはＣ末端に対するＰＥＧの部位特異的結合によるか、またはリジン残基に存在するε−アミノ基によって、ＰＥＧを、多官能性リンカーを有する、または有さない前記抗体またはそれらのフラグメントに結合することができる。生物学的活性の最少の損失を生じる、線状または分枝状ポリマー誘導体化が用いられる。結合の度合いは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析によって綿密にモニターされ、抗体に対するＰＥＧ分枝の適切な結合が確認される。未反応のＰＥＧは、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーによって、抗体−ＰＥＧ結合体から分離できる。また、実質的に免疫原性応答なしに、哺乳動物の循環系に注入できる組成物を提供するために、本発明の抗体は、Ｄａｖｉｓらによって記載された方法およびカップリング剤によって修飾することもできる（参照として、全体が本明細書に組み込まれている米国特許第４，１７９，３３７号を参照）。
【０１１５】
本発明はまた、フレームワーク領域または可変領域に変異（例えば、１つまたは複数のアミノ酸置換）を有する本発明の抗体のいずれかのアミノ酸配列を含む抗体またはそれらのフラグメントの使用を包含する。これらの抗体における変異は、それらが免疫特異的に結合する特定の抗原に対する該抗体の結合性および／または親和性を維持または増強することが好ましい。当業者に公知の標準的方法を用いて、特定抗原に対する抗体の親和性をアッセイできる。
【０１１６】
本発明は、修飾、好ましくは１つまたは複数のＦｃγＲに対する抗体の結合親和性を改変するＦｃ領域における修飾を含む抗体を包含する。１つまたは複数のＦｃγＲに対する結合性を改変した抗体を修飾する方法は、当該分野に知られており、例えば、ＰＣＴ国際公開第９９／０７０８９号、第９９／５１６４２号、第９８／２３２８９号、第８９／０７１４２号、第８８／０７０８９８号、および米国特許第５，８４３，５９７号および第５，６４２，８２１号を参照されたい。これらの各々は、その全体が参考として本明細書中に援用される。いくつかの実施形態において、本発明は、補体カスケード、例えばＣｌｑにおけるタンパク質に対する親和性を変化させた抗体を包含する。このような修飾はまた、変化したＦｃ媒介エフェクター機能を有することが好ましい。Ｆｃ媒介エフェクター機能に影響を与える修飾は当該分野に十分知られている（参照として全体が本明細書に組み込まれている、米国特許第６，１９４，５５１号を参照）。本発明の方法によって修飾できるアミノ酸としては、限定はしないが、プロリン３２９、プロリン３３１、およびリジン３２２が挙げられる。プロリン３２９、３３１、およびリジン３２２は、アラニンによって置換されることが好ましいが、多能性任意のアミノ酸による置換が考慮される。参照として全体が本明細書に組み込まれている、国際公開第００／４２０７２号および米国特許第６，１９４，５５１号を参照されたい。本発明は、限定はしないが、各々参照として全体が本明細書に組み込まれている、米国特許第６，５２８，６２４号（Ｉｄｕｓｏｇｉｅら）；６，５３５，１２４号（Ｉｄｕｓｏｇｉｅら）；および６，２４２，１９５号（Ｉｄｕｓｏｇｉｅら）；ならびに国際公開第９９／５１６４２号に開示されたものなど、Ｃｌｑ結合性、補体依存性細胞毒活性などの修飾されたエフェクター機能に関して当該分野に公知の任意の変異を包含する。
【０１１７】
特定の一実施形態において、Ｆｃ領域の修飾は、Ｆｃ領域における１つまたは複数の変異を含む。Ｆｃ領域における１つまたは複数の変異によって、抗体媒介エフェクター機能の変化した、他のＦｃ受容体（例えばＦｃ活性化受容体）に対する結合性の変化した、ＡＤＣＣ活性の変化した、またはＣｌｑ結合活性の変化した、または補体依存性細胞毒活性の変化した、またはそれらの任意の組み合わせの抗体が生じる。
【０１１８】
また本発明は、オリゴ糖含量の変化した抗体を提供する。本明細書に用いられるオリゴ糖とは、２つ以上の単糖を含有する炭水化物を言い、両用語は本明細書において、交換可能に使用できる。本発明の炭水化物部分は、当該分野において一般的に用いられる命名法に関して記載される。炭水化物化学のレビューに関しては、例えば、参照として全体が本明細書に組み込まれている、Ｈｕｂｂａｒｄら、１９８１年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０：５５５−５８３頁を参照されたい。この命名法には、例えば、マンノースを表すＭａｎ；２−Ｎ−アセチルグルコサミンを表すＧｌｃＮＡｃ；ガラクトースを表すＧａｌ；フコースに対するＦｕｃおよびグルコースに対するＧｌｃが含まれる。シアリン酸は簡潔な表記によって記載し、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸に対してＮｅｕＮＡｃ、および５−グリコールノイラミニック（ｇｌｙｃｏｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ）に対してＮｅｕＮＧｃである。
【０１１９】
一般に、抗体は、重鎖の定常領域における保存位置に炭水化物部分を含有し、ヒトＩｇＧの３０％までがグリコシル化Ｆａｂ領域を有する。ＩｇＧは、ＣＨ２ドメインにあるＡｓｎ２９７に、単一のＮ結合二触覚炭水化物構造を有する（Ｊｅｆｆｅｒｉｓら、１９９８年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１６３：５９−７６頁；Ｗｒｉｇｈｔら、１９９７年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １５：２６−３２頁）。ヒトＩｇＧは典型的に、以下の構造の炭水化物を有する：ＧｌｃＮＡｃ（フコース）−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ−（ＭａｎＧｌｃＮＡｃ）２。しかし、ＩｇＧの中でも、炭水化物含量の変化が生じ、それが機能の変化へと至る。例えば、Ｊａｓｓａｌら、２００１年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８８：２４３−２４９頁；Ｇｒｏｅｎｉｎｋら、１９９６年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：１４０４−７頁；Ｂｏｙｄら、１９９５年、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１３１１−１８頁Ｋｕｍｐｅｌら、１９９４年、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５：１４３−５１頁を参照されたい。
【０１２０】
本発明は、２９７位に１つまたは複数の修飾を含む抗体を包含する。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体には、１つまたは複数の選択された糖基、例えば、１つまたは複数のシリアル酸残基、１つまたは複数のガラクトース残基、１つまたは複数のフコース残基が実質的に無い。１つまたは複数の選択された糖基が実質的に無い抗体は、例えば、該組成物中の抗体の約９０〜１００％が炭水化物部分に結合した選択糖残基を欠くように、該抗体の炭水化物部分への選択糖残基の付加の欠失している宿主細胞において、本発明の抗体を組換え的に製造することなど、当業者に公知の一般的方法を用いて調製できる。このような抗体を調製するための代替法としては、例えば、１つまたは複数の選択糖基の付加を防ぐか、または減少させる条件下での細胞培養、または１つまたは複数の選択糖基の翻訳後除去などが挙げられる。
【０１２２】
特定の一実施形態において、本発明は、該組成物中の約８０％〜１００％の抗体が、そのＦｃ領域上のその炭水化物部分にフコースを欠く実質的に相同な抗体調製物を製造する方法を包含する。該抗体は、例えば、（ａ）宿主細胞がその中で発現されるタンパク質をフコシル化する能力が減少するような、フコース代謝に欠いた改変宿主細胞の使用；（ｂ）フコシル化を防ぐか、または減少させる条件下での細胞培養；（ｃ）例えばフコシダーゼ酵素による、フコースの翻訳後除去；または（ｄ）フコシル化されていない生成物を選択するための該抗体の精製、により調製できる。宿主細胞中に発現された抗体をフコシル化する能力の減少した該宿主細胞中に、所望の抗体をコードする核酸を発現させることが最も好ましい。該宿主細胞は、好ましくは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠失チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、例えば、Ｌｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（レクチン耐性ＣＨＯ変異株細胞系；ＲｉｂｋａおよびＳｔａｎｌｅｙ、１９８６年、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  ＆  Ｍｌｅｃ．Ｇｅｎ．１２（１）：５１−６２頁；Ｒｉｐｋａら、１９８６年、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９（２）：５３３−４５頁）、ＣＨＯ−Ｋ１、ＤＵＸ−Ｂ１１、ＣＨＯ−ＤＰ１２または、抗体が実質的にフコシル化されないように修飾されたＣＨＯ−ＤＧ４４である。したがって、該細胞は、フコシルトランスフェラーゼ酵素、またはＮ結合オリゴ糖へのフコース付加に関与する他の酵素または基質に関する発現および／または活性の変化を示し得、その結果、該酵素は、該細胞中で、活性が減少および／または発現レベルが減少する。フコース含量の変化した抗体を製造する方法に関しては、例えば、国際公開第０３／０３５８３５号およびＳｈｉｅｌｄｓら、２００２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（３０）：２６７３３−４０頁を参照されたい。双方とも、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、炭水化物変化の修飾により、以下の１つまたは複数が調節される：抗体の可溶性、細胞下輸送および抗体分泌の促進、抗体組み立ての促進、コンホメーションの完全性、および抗体媒介エフェクター機能。特定の一実施形態において、炭水化物変化の修飾により、炭水化物修飾を欠く抗体に比較して、抗体媒介エフェクター機能が増強する。抗体媒介エフェクター機能の変化を導く炭水化物修飾は、当該分野に十分に知られている（例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ  Ｒ．Ｌ．ら、２００１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（３０）：２６７３３−２６７４０頁；Ｄａｖｉｅｓ  Ｊ．ら、２００１年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７４（４）：２８８−２９４頁を参照）。本発明の方法による炭水化物変化の修飾には、例えば、該抗体の炭水化物含量の増大または該抗体の炭水化物含量の減少が含まれる。炭水化物含量を変化させる方法は、当業者に知られており、例えば、Ｗａｌｌｉｃｋら、１９８８年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８（３）：１０９９−１１０９頁；Ｔａｏら、１９８９年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１４３（８）：２５９５−２６０１頁；Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅら、１９９５年、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、６０（８）：８４７−８５３頁；Ｅｌｌｉｏｔら、２００３年；Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１：４１４−２１頁；Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００２年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７７（３０）：２６７３３−４０頁を参照されたい。これらは全て、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、本発明は、１つまたは複数の炭水化物部分が該抗体に共有結合するように、１つまたは複数のグリコシル化部位を含む抗体を包含する。他の実施形態において、本発明は、上記の開示されたものおよび当業者に公知のものなどの、１つまたは複数のグリコシル化部位およびＦｃ領域における１つまたは複数の修飾を含む抗体を包含する。好ましい実施形態において、Ｆｃ領域における１つまたは複数の修飾により、ＦｃγＲ、例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡの活性化に関し、野生型Ｆｃ領域を含む抗体に比較して、該抗体の親和性が増強する。１つまたは複数のグリコシル化部位および／またはＦｃ領域における１つまたは複数の修飾を有する本発明の抗体は、抗体媒介エフェクター機能が増強し、例えば、補体活性が増強する。いくつかの実施形態において、本発明は、限定はしないが、２４１位、２４３位、２４４位、２４５位、２４５位、２４９位、２５６位、２５８位、２６０位、２６２位、２６４位、２６５位、２９６位、２９９位、および３０１位におけるアミノ酸などの、該抗体の炭水化物部分と、直接的にまたは間接的に相互作用することが知られているアミノ酸の１つまたは複数の修飾を含む抗体をさらに含む。抗体の炭水化物部分と、直接的にまたは間接的に相互作用するアミノ酸は、当該分野に知られており、その全体が参考として本明細書中に援用されるＪｅｆｆｅｒｉｓら、１９９５年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４４：１１１−７頁を参照されたい。
【０１２５】
本発明は、１つまたは複数のグリコシル化部位を、該抗体の機能性、例えば、フラビウイルス抗原に対する結合活性を、好ましくは変化させることなく、該抗体の１つまたは複数の部位に導入することによって修飾された抗体を包含する。グリコシル化部位は、本発明の抗体の可変領域および／または定常領域に導入できる。本明細書に用いられている「グリコシル化部位」には、オリゴ糖（すなわち、共に結合した２つ以上の単糖を含有する炭水化物）が特異的および共有的に結合する、抗体における任意の特定のアミノ酸配列が含まれる。オリゴ糖の側鎖は、典型的に、Ｎ結合またはＯ結合を介して抗体の主鎖に結合している。Ｎ結合グリコシル化とは、アスパラギン残基の側鎖に対するオリゴ糖部分の結合を言う。Ｏ結合グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、例えば、セリン、トレオニンに対するオリゴ糖部分の結合を言う。本発明の抗体は、Ｎ結合およびＯ結合グリコシル化部位などの１つまたは複数のグリコシル化部位を含んでなり得る。当該分野に知られたＮ結合またはＯ結合グリコシル化部位に関する任意のグリコシル化部位を、本発明にしたがって使用できる。本発明の方法により有用なＮ結合グリコシル化部位の一例は、アミノ酸配列：Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒであり、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸でよく、Ｔｈｒ／Ｓｅｒは、トレオニンまたはセリンを示している。このような１つまたは複数の部位を、本発明が属する業界に十分知られた方法を用いて、本発明の抗体に導入することができる。例えば、その全体が参考として本明細書中に援用される「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ：Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ、Ｊ．Ｄ．Ｗａｔｓｏｎら、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク、１９８３年、第８章、１０６−１１６頁を参照されたい。本発明の抗体にグリコシル化部位を導入する代表的方法は：所望のＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ配列が得られるように、該抗体のアミノ酸配列を改変する、または変異させること、を含み得る。
【０１２６】
抗体の炭水化物含量を改変する方法は、当該分野に十分知られており、本発明内に包含され、例えば、米国特許第６，２１８，１４９号；欧州特許第０３５９０９６号；米国特許出願公開第２００２／００２８４８６号；国際公開第０３／０３５８３５号；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号：米国特許第６，２１８，１４９号；米国特許第６，４７２，５１１号を参照されたい。これら全ては、その全体が参考として本明細書中に援用される。他の実施形態において、本発明は、本発明の抗体の内在性炭水化物の１つまたは複数の部分を欠失させることにより、該抗体の炭水化物含量を改変する方法を包含する。
【０１２７】
本発明は、本発明の抗体のエフェクター機能を改変する方法をさらに包含し、この方法は、本明細書に開示された方法、または当該分野で公知の方法を用いて、その抗体の炭水化物含量を改変することを含む。
【０１２８】
抗体またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列に変異を誘導するために、例えば、アミノ酸置換がもたらされる部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発などの、当業者に公知の標準的方法を使用できる。該誘導体は、元の抗体またはそのフラグメントに比較して、１５未満のアミノ酸置換、１０未満のアミノ酸置換、５未満のアミノ酸置換、４未満のアミノ酸置換、３未満のアミノ酸置換、または２未満のアミノ酸置換を含むことが好ましい。好ましい一実施形態において、該誘導体は、１つまたは複数の予想された非必須アミノ酸残基になされた保存的アミノ酸置換を有する。
【０１２９】
また、本発明は、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、およびＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有するクローンＥ１６、クローンＥ２４、またはクローンＥ３４によって産生されたマウスモノクローナル抗体の可変重鎖および／または軽鎖のアミノ酸配列に、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である可変重鎖および／または軽鎖のアミノ酸配列を含む抗体またはそれらのフラグメントを包含する。また、本発明は、配列番号２、６、１０、４、８、または１２を有するマウスモノクローナル抗体の可変重鎖および／または軽鎖のアミノ酸配列に、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である可変重鎖および／または可変軽鎖のアミノ酸配列を含む抗体またはそれらのフラグメントを包含する。
【０１３０】
本発明は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、好ましくは、１種または複数種のＷＮＶ抗原に、特異的に結合する抗体またはそれらのフラグメントをさらに包含し、前記抗体または抗体フラグメントは、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、およびＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有するクローンＥ１６、クローンＥ２４、またはクローンＥ３４によって産生されたマウスモノクローナル抗体の１つまたは複数のＣＤＲのアミノ酸配列に、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である１つまたは複数のＣＤＲのアミノ酸配列を含む。２つのアミノ酸配列の同一性パーセントの判定は、ＢＬＡＳＴタンパク質探索などの当業者に公知の任意の方法によって判定できる。
【０１３１】
本発明はまた、１種または複数種のフラビウイルス抗原、好ましくは、１種または複数種のＷＮＶ抗原に、特異的に結合する抗体またはそれらのフラグメントをさらに包含し、前記抗体または抗体フラグメントは、ストリンジェントな条件下、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、およびＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有するクローンＥ１６、クローンＥ２４、またはクローンＥ３４によって産生されたマウスモノクローナル抗体のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる。好ましい一実施形態において、本発明は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、好ましくは、１種または複数種のＷＮＶ抗原に、特異的に結合する抗体またはそれらのフラグメントを提供し、前記抗体または抗体フラグメントは、ストリンジェントな条件下、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、およびＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有するクローンＥ１６、クローンＥ２４、またはクローンＥ３４によって産生されたマウスモノクローナル抗体の可変軽鎖および／または可変重鎖のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる可変軽鎖および／または可変重鎖を含む。他の好ましい実施形態において、本発明は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、好ましくは、１種または複数種のＷＮＶ抗原に、特異的に結合する抗体またはそれらのフラグメントを提供し、前記抗体または抗体フラグメントは、ストリンジェントな条件下、ＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、およびＰＴＡ−６０５２をそれぞれＡ有するクローンＥ１６、クローンＥ２４、またはクローンＥ３４によって産生されたマウスモノクローナル抗体の１つまたは複数のＣＤＲのヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされた１つまたは複数のＣＤＲを含む。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、限定はしないが、約４５℃における６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、フィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーションに引き続き、約６０℃における０．１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄、または当業者に公知の他の任意のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（例えば、参照として本明細書に組み込まれている、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．ら編、１９８９年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社、およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ社、ニューヨーク、６．３．１から６．３．６頁および２．１０．３頁を参照）が挙げられる。
【０１３２】
（５．１．１．抗体結合体）
本発明は、融合タンパク質を作製するために、異種ポリペプチド（またはその一部、好ましくは、該ポリペプチドの少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００のアミノ酸）に、組換え的に融合した、または化学的に結合した（共有的および非共有的結合の双方を含む）抗体またはそれらのフラグメントを包含する。この融合は、必ずしも直接的である必要はないが、リンカー配列を介して生じ得る。例えば、特定の細胞表面受容体に特異的な抗体に、抗体を融合または結合させることによって、インビトロまたはインビボのいずれかで、特定の細胞型（例えば、気道上皮細胞）に、異種ポリペプチドを標的化するために、抗体を使用できる。また、異種ポリペプチドに融合または結合させた抗体は、当該分野に公知の方法を用いて、インビトロ免疫アッセイおよび精製法に使用することもできる。例えば、その全体が参考として本明細書中に援用される、ＰＣＴ国際公開第９３／２１２３２号；欧州特許第４３９，０９５号；Ｎａｒａｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１−９９頁（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１４２８−１４３２頁（１９９２）；およびＦｅｌｌら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２頁（１９９１）を参照されたい。
【０１３３】
一実施形態において、本発明の融合タンパク質は、配列番号２、６、１０、４、８、１２、または１３〜４３に記載されたアミノ酸配列および異種ポリペプチドを含む抗体を含む。他の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、配列番号２、６、１０、４、８、１２に記載されたアミノ酸配列および異種ポリペプチドを有する抗体の抗原結合フラグメントを含む。他の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、配列番号４、８または１２に記載されたＶＨドメインのいずれか１つのアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＶＨドメインまたは配列番号２、６、または１０に記載されたＶＬドメインのいずれか１つのアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＶＬドメインおよび異種ポリペプチドを含む。
【０１３４】
他の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、配列番号１６〜１７、２０〜２２、または２６〜２８に記載されたＶＨ  ＣＤＲのいずれか１つのアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＶＨ  ＣＤＲおよび異種ポリペプチドを含む。他の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号３３、３７、または４０〜４１に記載されたＶＬ  ＣＤＲのいずれか１つのアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＶＬ  ＣＤＲおよび異種ポリペプチドを含む。他の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、配列番号１６〜１７、２０〜２２、２６〜２８、３３、３７、または４０〜４１に記載された少なくとも１つのＶＨドメインおよび少なくとも１つのＶＬドメインおよび異種ポリペプチドを含む。さらに他の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、配列番号１６〜１７、２０〜２２、２６〜２８、３３、３７、または４０〜４１に記載された少なくとも１つのＶＨ  ＣＤＲおよび少なくとも１つのＶＬ  ＣＤＲドメインおよび異種ポリペプチドを含む。
【０１３５】
本発明は、抗体フラグメントに融合または結合させた異種ポリペプチドを含む組成物をさらに含む。例えば、異種ポリペプチドは、Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント，Ｆ（ａｂ）２フラグメント、またはその一部に融合または結合させることができる。抗体の部分にポリペプチドを融合または結合させるための方法は、当該分野に知られている。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号、第５，６２２，９２９号、第５，３５９，０４６号、第５，３４９，０５３号、第５，４４７，８５１号、および第５，１１２，９４６号；欧州特許第３０７，４３４号；欧州特許第３６７，１６６号；ＰＣＴ国際公開第９６／０４３８８号および第９１／０６５７０号；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０５３５−１０５３９頁（１９９１）；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００頁（１９９５）；およびＶｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１１３３７−１１３４１頁（１９９２）を参照されたい（これらの文献は、その全体が参考として本明細書中に援用される）。
【０１３６】
本発明のさらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（まとめて、「ＤＮＡシャッフリング」と称される）の方法によって作製できる。本発明の抗体またはそれらのフラグメントの活性を変化させるために（例えば、より高い親和性およびより低い解離速度を有する抗体またはそれらのフラグメント）ＤＮＡシャッフリングを使用できる。一般的には、米国特許第５，６０５，７９３号；第５，８１１，２３８号、第５，８３０，７２１号、第５，８３４，２５２号、および第５，８３７，４５８号、ならびにＰａｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−３３頁（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６−８２頁（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５−７６頁（１９９９）；およびＬｏｒｅｎｚｏとＢｌａｓｃｏ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４（２）：３０８−１３頁（１９９８）を参照されたい（これらの特許および刊行物の各々は、その全体が参考として本明細書中に援用される）。一実施形態において、抗体またはそれらのフラグメント、またはコードされた抗体またはそれらのフラグメントを、組換え前に、誤りがちなＰＣＲ、無作為ヌクレオチド挿入または他の方法による無作為変異誘発に供することによって、変化させることができる。他の実施形態において、フラビウイルス抗原に免疫特異的に結合する、抗体または抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドの１つまたは複数の部分を、１種または複数の異種分子の１つまたは複数の成分、モチーフ、セクション、パート、ドメイン、フラグメントなどと組換えることができる。
【０１３７】
さらに、本発明の抗体またはそれらのフラグメントを、精製を助けるために、ペプチドなどのマーカー配列に融合させることができる。好ましい実施形態において、該マーカーアミノ酸配列は、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ社、９１３１１  カリフォルニア州チャッツワース、イートン通り、９２５９）において提供されるタグなどのヘキサヒスチジンペプチドであり、その他の中でも、多くのものが市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、１９８９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４頁に記載されているとおり、ヘキサヒスチジンによって、融合タンパク質の簡便な精製が提供される。精製に有用な他のペプチドタグとしては、限定はしないが、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに相当する赤血球凝集素「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、１９８４年、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７頁）および「フラッグ」タグが挙げられる。
【０１３８】
本発明はさらに、診断薬または治療薬に結合させた抗体またはそれらのフラグメントを包含する。例えば、与えられた治療法の有効性を判定する目的で、臨床試験手順の一部として、例えば、フラビウイルス感染の発現または進行をモニターするために、該抗体を診断的に使用できる。該抗体またはそのフラグメントを、検出可能物質に結合することによって、検出を容易にすることができる。検出可能物質の例としては、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、陽電子放出金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。検出可能物質は、当該分野に公知の方法を用いて、該抗体（またはそのフラグメント）に直接的に、または中間体（例えば、当該分野に公知のリンカーなど）を介して間接的にカップリングまたは結合できる。例えば、本発明による診断上の使用のために、抗体に結合できる金属イオンに関する米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。検出可能物質の例としては、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、陽電子放出金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。検出可能物質は、当該分野に公知の方法を用いて、該抗体（またはそのフラグメント）に直接的に、または中間体（例えば、当該分野に公知のリンカーなど）を介して間接的にカップリングまたは結合できる。例えば、本発明による診断上の使用のために、抗体に結合できる金属イオンに関する米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。このような診断および検出は、該抗体を、限定はしないが、種々の酵素、限定はしないが、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどの酵素；限定はしないが、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどの補欠分子団複合体；限定はしないが、ウンベリフェロン、フロレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリスリンなどの蛍光物質；限定はしないが、ルミノールなどの発光物質；限定はしないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなどの生物発光物質；限定はしないが、ビスマス（２１３Ｂｉ）、炭素（１４Ｃ）、クロム（５１Ｃｒ）、コバルト（５７Ｃｏ）、フッ素（１８Ｆ）、ガドリニウム（１５３Ｇｄ、１５９Ｇｄ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、ゲルマニウム（６８Ｇｅ）、ホルミウム（１６６Ｈｏ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、ランタニウム（１４０Ｌａ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、マンガン（５４Ｍｎ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、リン（３２Ｐ）、プラセオジム（１４２Ｐｒ）、プロメチウム（１４９Ｐｍ）、レニウム（１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ）、ロジウム（１０５Ｒｈ）、ルテミウム（９７Ｒｕ）、サマリウム（１５３Ｓｍ）、スカンジウム（４７Ｓｃ）、セレニウム（７５Ｓｅ）、ストロンチウム（８５Ｓｒ）、イオウ（３５Ｓ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、スズ（１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ）、トリチウム（３Ｈ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、イッテルビウム（１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ）、イッテリウム（９０Ｙ）、亜鉛（６５Ｚｎ）などの放射性物質；種々の陽電子射出断層撮影法を用いた陽電子射出金属、および非放射性常磁性金属イオンなどの検出可能物質に該抗体を結合させることによって達成できる。
【０１３９】
抗体またはそのフラグメントを、細胞毒などの治療部分、例えば、細胞分裂抑制剤または細胞致死剤、治療薬または放射性金属イオン、例えば、α放射体に結合させることができる。細胞毒素または細胞毒性剤には、細胞にとって有害な任意の薬剤が含まれる。例としては、パクリタキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−ジヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびプロマイシン、ならびにそれらのアナログまたは相同体が挙げられる。治療薬としては、限定はしないが、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）ならびにロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）、ならびにドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、ならびにアントラマイシン（ＡＭＣ））、および抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられる。
【０１４０】
さらに、抗体またはそのフラグメントを、所与の生物学的応答を改変する治療薬または薬剤部分に結合できる。治療薬または薬剤部分は、古典的化学療法剤に限定されると考えるべきではない。例えば、該薬剤部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。このようなタンパク質としては、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、αインターフェロン、βインターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノゲン活性化因子、アポトーシス因子、例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ  Ｉ（国際公開第９７／３３８９９号を参照）、ＡＩＭ  ＩＩ（国際公開第９７／３４９１１号を参照）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９４年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１５６７−１５７４頁を参照）、およびＶＥＧＩ（国際公開第９９／２３１０５号を参照）、血栓性因子または抗血管形成因子、例えば、アンギオスタチンまたはエンドスタチンなｄのタンパク質；または、例えば、リンホカイン（例えば、インターロイキン（「ＩＬ−１」）、インターロイキン２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、および顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または成長因子（例えば、成長ホルモン（「ＧＨ」）などの生物学的応答調節剤を挙げることができる。
【０１４１】
このような治療的部分を抗体に結合させるための方法は、十分に知られており、例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  ＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３−５６頁（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ社、１９８５年）におけるＡｒｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３−５３頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ社、１９８７年）におけるＨｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５−５０６頁（１９８５年）におけるＴｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  ＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎＡｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３０３−１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５年）、およびＴｈｏｒｐｅら、１９８２年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８頁における「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」を参照されたい。
【０１４２】
単独で、または細胞毒性因子および／またはサイトカインと組み合わせて投与された、抗体またはそのフラグメントに結合させた治療的部分を有する、または有さない抗体またはそのフラグメントを、治療薬として使用できる。あるいは、抗体を、第２の抗体に結合させて、参照としてその全体が本明細書に組み込まれている米国特許第４，６７６，９８０号において、Ｓｅｇａｌにより記載されている抗体異種結合体を形成することができる。
【０１４３】
抗体はまた、免疫アッセイまたは標的抗原の精製に特に有用な固体支持体に結合させることもできる。このような固体支持体としては、限定はしないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、塩化ポリビニルまたはポリプロピレンが挙げられる。
【０１４４】
（５．２  抗体の免疫化、スクリーニング、同定ならびに特徴付け）
本発明は、１種または複数種のフラビウイルス抗原、例えば、ＷＮＶ抗原に対する抗体、好ましくは、モノクローナル抗体を作製する方法を包含する。ＥおよびＮＳ１タンパク質上の特定の決定因子に対する個々の抗体は、複数の機構によってＷＮＶ感染を阻止する。いくつかの抗体は、受容体結合および進入などのウイルスのライフサイクルにおいて重要な段階を直接的に中断するが、他の抗体は、補体媒介オプソニン化および感染細胞の溶解を介した免疫媒介除去または食作用細胞による抗体依存性内在化を引き起こすことによって、間接的に阻止する。本発明は、種々の結合特異性、結合力、アイソタイプ、およびエフェクター機能を有する一群の防御的モノクローナル抗体を作製するために、精製ＥおよびＮＳ１タンパク質などのＷＮＶタンパク質によるマウスの免疫化、ならびに全ウイルスを包含する。ＷＮＶに対するモノクローナル抗体の機能的および構造的特性化により、個別の構造エピトープを認識し、ＷＮＶ感染を防御するための異なる手段を有するｍＡｂの組み合わせを利用する、本明細書に開示された治療的アルゴリズムの情報が与えられる。
ヒトγグロブリンによる治療は、ＷＮＶ感染に対する有効な予防法および治療法であり得るが、非防御的市販バッチから防御的なものを識別するためには、特殊な試験が必要となり、また、ＷＮＶの大発生により、ある地域におけるγグロブリンの供給が、急速に枯渇する可能性があることに、本発明者は気がついた。さらに、製品の出所の異種性のため、該製品のロットによって、かなりのばらつきがあり得る。プールしたヒトγグロブリンの他の２つの潜在的弱点は、有害な感染性物質（特に、現行の不活化方式にとって困難な非エンベロープウイルスまたはプリオン）の危険性および自己反応性または病原性作用を有する非ＷＮＶ抗体を投与する可能性である。より永続的で、有効で、安全な抗体源を創製するために、本発明は、ＷＮＶのＥおよびＮＳ１タンパク質に対する、阻害活性を有する一群のモノクローナル抗体を提供する。特定の作用機構に拘束される意図はないが、これらのタンパク質に対するｍＡｂが、関連フラビウイルスの感染を阻止するため、ＥおよびＮＳ１は特に有用である。
【０１４５】
ハイブリドーマ、組換え体、およびファージ表示法の使用、またはこれらの組み合わせなどの当該分野に公知の多種多様の方法を用いて、モノクローナル抗体を調製することができる。例えば、当該分野に公知の、また、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８年）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、５６３−６８１頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ニューヨーク、１９８１年）におけるＨａｍｍｅｒｌｉｎｇら（双方ともその全体が参考として本明細書中に援用される）に教示されたものなどのハイブリドーマ法を用いて、モノクローナル抗体を作製することができる。本明細書に用いられている用語の「モノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ法によって作製された抗体に限定されない。用語の「モノクローナル抗体」とは、任意の真核、原核、またはファージクローンなどの単一クローンに由来する抗体を言い、それが作製される方法を言うものではない。
【０１４６】
ハイブリドーマ法を用いて特定の抗体を作製およびスクリーニングする方法は、ルーチンであり、当該分野に周知である。非限定的な一例において、被験体となっている抗原またはそのような抗原を発現する細胞によって、マウスを免疫化できる。免疫応答が検出されたら、例えば、該抗原に特異的な抗体が、マウス血清中に検出されたら、該マウスの脾臓を採取し、脾臓細胞を単離する。次いで、該脾臓細胞を、周知の方法により、任意の好適な骨髄腫細胞に融合させる。ハイブリドーマを選択し、限界希釈によってクローン化する。次いで、該抗原に結合できる抗体を分泌する細胞に関し、当該分野に公知の方法によって、ハイブリドーマクローンをアッセイする。陽性ハイブリドーマクローンをマウスに腹腔内接種することによって、一般に高濃度の抗体を含有する腹水を生成させることができる。
【０１４７】
本発明は、精製ＷＮＶタンパク質（ＥおよびＮＳ１）および／または完全ウイルスによる免疫化後、ＷＮＶに対するモノクローナル抗体の作製を包含する。Ｅタンパク質は、細胞結合の原因であるビリオン結合タンパク質であり、インビボで、大多数の中和および非中和抗体を誘発する。マウスはまた、感染した細胞から分泌されるが、ビリオンには存在しないタンパク質であるＮＳ１によっても免疫化される。ビリオンに不在であるにも関わらず、ＹＦおよびＤＥＮウイルスＮＳ１を認識するｍＡｂ類は、致命的なウイルス誘発に対してマウスを防御する（Ｈｅｎｃｈａｌら、１９８８年、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ６９（Ｐｔ８）：２１０１−２１０７頁；Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒら、１９８６年、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６０：１１５３−５頁）。可溶性ＮＳ１が分泌後、細胞表面に結合するため、この防御の性質についての理解は不完全だが、ＮＳ１に対するｍＡｂ類の防御に関する根拠として、感染細胞の補体媒介細胞溶解が提案されている（Ｆａｌｇｏｕｔら、１９９０年、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６４：４３５６−６３頁；Ｐｕｔｎａｋら、１９９０年、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７１（Ｐｔ８）：１６９７−７０２頁；Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒら、１９９０年、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７１（Ｐｔ３）：５９３−９頁）。あるいは、ＮＳ１に対するｍＡｂ類は、重要な免疫調節機能を直接阻害し得る（Ｄｉａｍｏｎｄ、２００３年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８１：１９６−２０６頁）。ＮＳ１は、極めて高濃度でフラビウイルスに感染した患者の血清中に存在し（例えば、１μｇ／ｍｌから５０１μｇ／ｍｌ）（Ａｌｃｏｎら、２００２年、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４０：３７６−８１頁；Ｙｏｕｎｇら、２０００年、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３８：１０５３−７頁）、病因における直接的な、しかし未知の役割を有していると推測されている（Ｌｉｂｒａｔｙら、２００２年、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １８６：１１６５−８頁）。ＮＳ１タンパク質およびＥタンパク質双方に対するｍＡｂを生成させることによって、本発明は、独立した機構によるＷＮＶ感染に対する阻害活性を有する一群の試剤を提供する。特定の作用機構に拘束される意図はないが、精製タンパク質による免疫化では抗体のレパートリーが限定されることがあり得、その結果、生成される防御的抗体は少数であるため、ｍＡｂ類は、完全ウイルスによる免疫化の後にも生成される。エピトープの多様性を保証するために、本発明は、いずれのタンパク質に対しても、少なくとも１００種の異なるｍＡｂの生成を包含する。
【０１４８】
特定の一実施形態において、本発明は、１種または複数種のＷＮＶ抗原に対して、特異性を有する新規なモノクローナル抗体の作製を包含する。特に、本発明は、１種または複数種のＷＮＶ抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を作製する方法を提供し、前記方法は、（ａ）炭水化物および脂質ベースのアジュバントを用い、精製ＷＮＶタンパク質、例えばＮＳ１、Ｅタンパク質、またはそれらの免疫原性フラグメントによって、１匹または複数匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化すること；（ｂ）固相ＥＬＩＳＡベースのアッセイを用いて、ポリクローナル抗体応答を測定すること；（ｃ）前記１匹または複数匹のマウスの脾臓細胞からハイブリドーマ細胞株を作製すること；（ｄ）特定のＷＮＶタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する１種または複数種のハイブリドーマ細胞株に関して、前記ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングすること；（ｅ）候補免疫マウスを選択すること；（ｆ）静脈内精製ＥまたはＮＳ１タンパク質により、高力価ポリクローナル（例えば１／１０，０００）応答を単一マウスに起こさせること；（ｇ）脾臓細胞を採集してから、標準的プロトコル（Ｈａｒｌｏｗら、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールドスプリングハーバー）にしたがって、非分泌Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６．５．３骨髄腫（またはＳＰ２／０−Ａｇ１４、Ｓｐ２／０およびＰ３骨髄腫などの他の細胞）に融合させること、を含む。本発明は、前記方法によって産生された任意の抗体を包含する。本発明の一実施形態において、免疫応答を増強させるために、当該分野に公知のアジュバントと混合した精製ＷＮＶ抗原によって、前記マウスを免疫化する。本発明の方法に使用できるアジュバントとしては、限定はしないが、タンパク質アジュバント；細菌アジュバント、例えば、細菌全体（ＢＣＧ、コリネバクテリウムパルブム、サルモネラミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ））細胞壁骨格、トレハロースミコーレート、モノホスホリル脂質Ａ、結核菌のメタノール抽出可能残基（ＭＥＲ）、完全または不完全フロインドアジュバントなどの細菌成分；ウイルスアジュバント；化学アジュバント、例えば、水酸化アルミニウム、ヨードアセテートおよびコレステリルヘミスクシネートまたは；裸のＤＮＡアジュバントが挙げられる。本発明の方法に使用できるアジュバントとしては、コレラ毒素、パロポックスタンパク質、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ社；また、参照として本明細書に組み込まれているＢｉｅｇら、１９９９年、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ、３１（１）：１５−２４頁を参照）、ＭＰＬ（登録商標）（Ｃｏｒｉｘａ社；また、全てがその全体が参考として本明細書中に援用されるＬｏｄｍｅｌｌ  Ｄ．Ｉ．ら、２０００年、Ｖａｃｃｉｎｅ、１８：１０５９−１０６６頁；Ｕｌｒｉｃｈら、２０００年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２７３−２８２頁；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９９年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４２：４６４０−４６４９頁；Ｂａｌｄｒｉｄｇｅら、１９９９年、Ｍｅｔｈｏｄｓ���１９：１０３−１０７頁も参照）、ＲＣ−５２９アジュバント（Ｃｏｒｉｘａ社；Ｃｏｒｉｘａ社のアミノアルキルグルコサミニド４−ホスフェート（ＡＧＰ）化学ライブラリーの鉛化合物、また、ｗｗｗ．ｃｏｒｉｘａ．ｃｏｍを参照）、ならびにＤＥＴＯＸ（商標）アジュバント（Ｃｏｒｉｘａ社；ＤＥＴＯＸ（商標）アジュバントには、ＭＰＬ（登録商標）アジュバント（モノホスホリルリピドＡ）およびミコバクテリア細胞壁骨格；また、Ｅｔｏｎら、１９９８年、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、４（３）：６１９−２７頁；およびＧｕｂｔａら、１９９５年、Ｖａｃｃｉｎｅ、１３（１４）：１２６３−７６頁を参照。これらは双方とも、その全体が参考として本明細書中に援用される）が挙げられる
本発明は、精製ＥおよびＮＳ１タンパク質に対するＭＡｂ類生成のための方法を包含する。本発明は、例えば、本明細書に開示されたものなどのバキュロウイルス発現系および関連フラビウイルスに関して先に記載された方法（Ｄｅｌｅｎｄａら、１９９４年、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７５：１５６９−１５７８頁；Ｄｅｓｐｒｅｓら、１９９１年、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７２（Ｐｔ１１）：２８１１−６頁）を用いて、昆虫細胞に組換え発現されたグリコシル化ＥおよびＮＳ１タンパク質の使用を包含する。代表的な一方法において、ＷＮＶ（ニューヨーク１９９９株）のＥおよびＮＳ１タンパク質を、感染性ｃＤＮＡ  ＷＮＶクローンの高フィデリティーＴａｑポリメラーゼによって増幅する。Ｅタンパク質では、Ｎ末端の４３０のアミノ酸（ヌクレオチド９６７〜２２５６）を利用し、膜結合ドメインをコードするＣ末端の７０のアミノ酸を欠失させて、分泌を促進させる（Ｄｅｌｅｎｄａら、１９９４年、Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  １３９：１９７−２０７頁；Ｄｅｌｅｎｄａら、１９９４年、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７５：１５６９−７８頁）。ＮＳ１では、完全長遺伝子（ヌクレオチド２４７０〜３５２５）が用いられる。双方の遺伝子とも、ポリヘドリンプロモーターおよびそれらの内因性シグナル配列の下流（Ｅ：ｐｒＭの最後の１５のアミノ酸、ＮＳ１：Ｅの最後の２２のアミノ酸）およびＣ末端ヒスチジン反復部の上流に挿入し、昆虫細胞における発現、細胞外媒体内への分泌、および精製を促進させる。ニッケル親和性およびゲルろ過クロマトグラフィーによりタンパク質を精製し、ＥまたはＮＳ１に対するＭａｂを用いたＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによって分析する。精製組換えＷＮＶ  ＥまたはＮＳ１タンパク質（２５μｇ）を、アジュバント（ＲＩＢＩ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ、マサチューセッツ州ハミルトン）と複合化し、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、腹腔内接種する。接種３週間目、マウスをブーストする。３週間後、血清サンプルを採取し、固相精製ＥまたはＮＳ１タンパク質に対する免疫活性を試験する。最高力価を有するマウスを、ＥまたはＮＳ１のより低用量で静脈内ブーストし、３日後、脾臓細胞を採取して、公表された操作（Ｄｉａｍｏｎｄら、１９９３年、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２０：１０３１−４３頁；Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、１９７９年、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：３０１−３０６頁）にしたがって、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞に融合させ、ハイブリドーマを生成させる。
【０１４９】
本発明は、レパートリーを拡張するため、およびＥタンパク質上のさらなるエピトープに対する防御的ｍＡｂを作製するために、完全ウイルスに対するＭＡｂ類を作製する方法を包含する。特定の作用機構に拘束される意図はないが、完全ウイルスによる免疫化によって、ウイルスの進入または融合を阻止するＥタンパク質の膜近位ステムループ領域を認識するｍＡｂ類が作製される。この領域は、組換えＥタンパク質から欠失している。さらに、完全ウイルスは、別個の一群の防御的な抗ＥｍＡｂ類を作製できる。代表的な一方法において、成体ＢＡＬＢ／ｃマウスに、生きたＷＮＶ（約１０４ＰＦＵ）を感染させ；これらのマウスを、３週間後、完全ウイルスでブーストし；高力価抗ＷＮＶ応答（例えば、＞１０，０００）を有するマウスを、ＵＶ不活化ウイルスで静脈内ブーストし、融合およびｍＡｂ作製に利用する。さらに、高度免疫プロトコルも利用される：複数の誘発に抵抗するマウスは、防御に寄与し得るそれらの抗体応答に質的な差異を有し得る。
【０１５０】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントを、公知の方法によって作製し得る。例えば、パパイン（Ｆａｂフラグメントを作製するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを作製するため）などの酵素を用いて、免疫グロブリン分子のタンパク質分解性開裂により、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントを作製できる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、完全軽鎖、および重鎖の可変領域、ＣＨ１領域およびヒンジ領域を含有する。
【０１５１】
例えば、当該分野に公知の種々のファージ表示法を用いて、抗体を作製することもできる。ファージ表示法においては、機能的抗体ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面に、機能的抗体ドメインが表示される。特定の一実施形態において、あるレパートリーまたは組み合わせ抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現させたＦａｂおよびＦｖまたはジスルフィド結合安定化Ｆｖなどの抗原結合ドメインを表示するために、このようなファージを利用することができる。対象となっている抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、例えば、標識抗原または固体表面またはビーズに結合または捕捉させた抗原を用いて、抗原により選択または同定することができる。これらの方法に用いられるファージは、典型的には、ｆｄおよびＭ１３などの繊維状ファージである。抗原結合ドメインは、ファージの遺伝子ＩＩＩタンパク質または遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかへの組換え融合タンパク質として発現される。本発明の免疫グロブリンまたはそれらのフラグメントを作製するために使用できるファージ表示法の例としては、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８２：４１−５０頁、１９９５年；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８４：１７７−１８６頁、１９９５年；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：９５２−９５８頁、１９９４年；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ、１８７：９−１８頁、１９９７年；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５７：１９１−２８０頁、１９９４年；ＰＣＴ国際公開第ＰＣＴ／英国９１／０１１３４号；ＰＣＴ国際公開第９０／０２８０９号；第９１／１０７３７号、第９２／０１０４７号、第９２／１８６１９号、第９３／１１２３６号、第９５／１５９８２号、第９５／２０４０１号；および米国特許第５，６９８，４２６号、第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５，５８０，７１７号、第５，４２７，９０８号、第５，７５０，７５３号、第５，８２１，０４７号、第５，５７１，６９８号、第５，４２７，９０８号、第５，５１６，６３７号、第５，７８０，２２５号、第５，６５８，７２７号、第５，７３３，７４３号、および第５，９６９，１０８号に開示されたものが挙げられ、これらの各々は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０１５２】
上記文献に記載されているとおり、ファージ選択後、ファージの抗体コード領域を単離でき、ヒト抗体などの抗体全体、または他の任意の所望のフラグメントを生成させるために使用でき、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌、例えば、下記に詳述したものなどの任意の所望の宿主に発現させることができる。例えば、ＰＣＴ国際公開第９２／２２３２４号；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１２（６）：８６４−８６９頁、１９９２年；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲＩ、３４：２６−３４頁、１９９５年、ならびにＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：１０４１−１０４３頁、１９８８年（これらの各々は、その全体が参考として本明細書中に援用される）に開示されたものなど、当該分野に公知の方法を用いて、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に作製するための方法を用いることもできる。一本鎖Ｆｖ類および抗体を作製するために用いることのできる方法の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２０３：４６−８８頁、１９９１年、；Ｓｈｕら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９０：７９９５−７９９９頁、１９９３年；およびＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：１０３８−１０４０頁、１９８８年に記載されたものが挙げられる。
【０１５３】
本発明の抗体の同源抗原、例えば、フラビウイルス抗原に対する本発明の抗体の親和性を増加させるために、ファージ表示法を用いることができる。この方法は、本発明の組み合わせ法に使用し得る高親和性抗体を得る上で有用となる。親和性成熟と称される方法では、最初の抗体または親抗体に比較して、該抗原により高い親和性で結合する抗体を同定するために、フラビウイルス抗原またはその抗原フラグメントを用いて、変異誘発またはＣＤＲウオーキングおよび再選択が用いられる（例えば、Ｇｌａｓｔｅｒら、１９９２年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４９：３９０３頁を参照）。単一ヌクレオチドではなく、コドン全体の変異誘発により、アミノ酸変異の準無作為化レパートリーがもたらされる。各々が、単一のＣＤＲにおいて、単一のアミノ酸変化で異なっており、各ＣＤＲ残基に関して、各々が可能なアミノ酸置換を表している変異体を含有する変異体クローンのプールからなるライブラリーを構築することができる。該抗原に対して、結合親和性の増加した変異体は、固定化した変異体を、標識抗原に接触させることによって、スクリーニングすることができる。該抗原に対し、結合性の増加した変異抗体を同定するために、当該分野に公知のスクリーニング法を用いることができる（例えば、ＥＬＩＳＡ）（Ｗｕら、１９９８年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６０３７頁；Ｙｅｌｔｏｎら、１９９５年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５５：１９９４頁を参照）。軽鎖を無作為化するＣＤＲウオーキングもまた可能である（Ｓｃｈｉｅｒら、１９９６年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２６３：５５１頁を参照）。
【０１５４】
本発明の抗体は、ＷＮＶ抗原、例えば、Ｅタンパク質、またはＮＳ１タンパク質に対して、最も大きな特異性を有する抗体が選択されるように、エピトープマッピングによってさらに特徴付けできる。抗体のエピトープマッピング法は、当該分野に十分知られており、本発明の方法に包含される。一定の実施形態において、ＷＮＶ抗原の１つまたは複数の領域を含む融合タンパク質を、本発明の抗体のエピトープマッピングに使用できる。本発明は、ＷＮＶタンパク質、例えば、ＷＮＶのＥタンパク質上に存在する異なる構造エピトープを確定するために、ＥＬＩＳＡおよび／またはＬａｎｃｉｏｔｔｉら、２０００年、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏ  ３８：４０６６−７１頁；およびＭｏｄｉｓら、２００３年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：６９８６−９１頁に開示されたものなどの表面プラズモン共鳴ベースのアッセイを用いた競合結合試験を包含する。
【０１５５】
ＥＬＩＳＡベースのアッセイは、当該分野に十分に知られており、本発明に包含される。このようなアッセイは、ルーチンであり、当該分野に十分に知られている（例えば、その全体が参考として本明細書中に援用される、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社、ニューヨークを参照）。代表的なアッセイにおいて、ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて、個々の精製モノクローナル抗体の少量を、ビオチンで標識化する。マイクロタイタープレートにおいて、競合性未標識モノクローナル抗体を、組換えＥタンパク質に結合させる。引き続き、ビオチン化モノクローナル抗体を加え、洗浄後、ペルオキシダーゼに結合させたストレプトアビジンによって検出する。ビオチン化モノクローナル抗体プラス競合性モノクローナル抗体の結合性を、ビオチン化モノクローナル抗体単独の結合性と比較した後、複数の実験を通しての平均ＯＤ４５０における＞４０％減少として、個々の構造エピトープに関する競合性を確定する。
【０１５６】
表面プラズモン共鳴ベースのアッセイは、当該分野に公知であり、本発明に包含される。ＳＰＲベース技法のレビューに関しては、Ｍｕｌｌｅｔら、２０００年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２：７７−９１頁；Ｄｏｎｇら、２００２年、Ｒｅｖｉｅｗ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．８２：３０３−２３頁；Ｆｉｖａｓｈら、１９９８年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：５４−６１頁を参照されたい。これらは全て、その全体が参考として本明細書中に援用される。さらに、米国特許第６，３７３，５７７号；第６，２８９，２８６号；第５，３２２，７９８号；第５，３４１，２１５号；第６，２６８，１２５号に記載されたタンパク質−タンパク質相互作用を測定するためのＳＰＲ機器およびＳＰＲベースの方法のいずれも、本発明の方法において考慮されており、これら全てが、その全体が参考として本明細書中に援用される。代表的アッセイにおいて、ＢＩＡＣＯＲＥフォーマットで、モノクローナル抗体は、抗原ＷＮＶ  Ｅタンパク質が結合した表面に連続的に反応し、ＳＰＲシグナルを増加させる。第１の抗体により、利用可能部位全てが飽和された後は、競合性モノクローナル抗体を加えても、ＳＰＲシグナルはあまり増加しない。一方、非競合性モノクローナル抗体は、達成された第１の結合レベルとは独立して、全体のシグナルを増加させる。異なるｍＡｂによって得られた最高シグナルは変動するため、モノクローナル抗体の添加順序を逆にして、各アッセイを反復する。得られた一群のｍＡｂ類を用いて機能的エピトープマップを確定するために、本発明は、ＥＬＩＳＡおよびＢＩＡＣＯＲＥベースアッセイの双方を用いた本発明の抗体の特徴付けを包含することが好ましい。
【０１５７】
本発明は、以下の３つの方法の１つまたは複数を用いたエピトープマッピングを包含する：（１）ＷＮＶ抗原、例えば、酵母表面上のＥタンパク質の指向的展開；（２）合成ペプチド；および（３）ＷＮＶタンパク質キメラ。本発明のＷＮＶ特異的抗体のエピトープマッピングのための酵母表示系の一例は、以下を含み得る：酵母表面に、ＷＮＶ  Ｅタンパク質の外部ドメイン全体またはドメインＩＩＩ単独を発現させること；ドメインＩＩＩ特異的なモノクローナル抗体を同定するために、これらのタンパク質を表示する酵母を用いること；およびアミノ酸レベルで抗体エピトープをマップ化するために、誤りがちなＰＣＲによって作製したＥ変異体の組み合わせライブラリーを用いること。誤りがちなＰＣＲによって、ＷＮＶ  Ｅタンパク質の外部ドメイン全体またはドメインＩＩＩに変異誘発する；Ｅタンパク質表面発現を独立に追跡するため、Ｎ末端Ｘｐｒｅｓｓ（商標）ペプチドタグを付加することが重要である。Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８３頁）に開示された方法などの方法を用いて、およそ０．５％のヌクレオチド誤り率を得るために、最初のＰＣＲ反応液中のＭｇ２＋Ｍｎ２＋比を変化させる（約６．６：１へ）ことによって、または一変異体当たり、アミノ酸を平均１個変化させるによって、変異誘発が達成される。およそ１０５の独立した形質転換体の創製を目標にして、これらの変異体を、酵母発現ベクター、例えば、ｐＹＤ１にクローン化する。酵母細胞における親ベクター、高多様性のライブラリーを生じさせる方法を用い、ＰＣＲ変異誘発セグメントのクローニングまたは相同的組換えにより、ライブラリーが構築される（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３頁；Ｈｏｌｇａｔｅら、２００１年、Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｏｐｉｎ  １７：２３３−４０頁を参照）。特定のｍＡｂエピトープを失った変異体を単離するためには、Ｐｏｇｏｄｉｎａらに開示された方法（１９８３年、Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  ７５：７１−８６頁）を用いて、タンパク質Ｇコーティング磁気ビーズにより、最初の欠失ステップが実施される。Ｘｐｒｅｓｓタグに直接結合したｍＡｂおよびマップされるＥタンパク質に対する個々の抗体を用いて、残りの酵母細胞を、二色サイトメトリーによって選別する。ＸｐｒｅｓｓＨＩであり、抗Ｅの低いまたは無い酵母細胞を採集し、培養し、反復選別に供してから、他の抗Ｅ  ｍＡｂ類により免疫染色して、大規模な構造変化が生じていないことを確認する。最後に個々のクローンからのＥタンパク質変異体を配列決定し；プラスミドは、市販のキット（例えば、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カリフォルニア州、オレンジ）を用いて、大腸菌レスキューにより、酵母から回収できる。最適なスクリーニング条件下、流動細胞計測法選別により、抗体特異性の変化した変異体間の精密な区別が可能になるはずである。いくつかの例で、単一のアミノ酸変化では、ｍＡｂ認識を抑止するのに十分であり得ない。最初のスクリーニング後、減少はするが、検出できる発現を示すｍＡｂ類に関して、連続的変異誘発が行われる。
【０１５８】
他の実施形態において、本発明は、合成ペプチドまたは組換えＥタンパク質フラグメントに対する結合性の分析により、ｍＡｂ結合部位がマップ化される方法を包含する。最初に、約３０のオーバーラップペプチド（例えば、１５〜２０アミノ酸長）を合成し；関連ＤＥＮ（例えば、Ｋｕｌｋａｒｎｉら、１９９１年、Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ４：７３−８２頁；Ｋｕｒａｎｅら、１９８４年、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ５２：２２３−３０頁を参照）およびマレー谷脳炎ウイルス（例えば、Ｋｕｒａｎｅら、１９９２年、Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４：１２１−７頁を参照）ならびにＤＥＮ（例えば、Ｋａｃａｎｉら、２００１年、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３８：２４１−７頁を参照）、ダニ媒介脳炎（例えば、Ｋｒａｍｅｒら、２００１年、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ９５１：８４−９３頁を参照）の三次元結晶構造、およびＷＮＶ  Ｅタンパク質による先のマッピング試験に基づいて、これらのペプチドをデザインする。標準的ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、マイクロタイタープレートに吸着したペプチドに結合する能力に基づいて、ｍＡｂ類をマップ化する。
一部のｍＡｂ類は、非線状エピトープまたは該酵母細胞によって正しく表示されていないエピトープに結合し得るため、本発明はさらに、Ｅタンパク質の組換え誘導されたフラグメントを用いる代替法を包含する。哺乳動物の発現ベクター（例えば、ｐＣＤＮＡ３．１）を用いて、哺乳動物細胞（ＨＥＫ−２９３）中に、ＤＥＮおよびＥタンパク質の細胞外ドメインを各々発現させ、分泌させる。ＷＮＶ  Ｅタンパク質のサブドメインがＤＥＮの等価領域に置き換わるように、Ｅタンパク質キメラを作製する。最後に、ドメインＩＩＩの特定の区域またはアミノ酸残基が置換されている、ＷＮＶとＤＥＮ  Ｅタンパク質のキメラを作製する。これらタンパク質の各々に対する抗体の結合性を、ＥＬＩＳＡにより判定し、精密な構造マッピングに用いる。
【０１５９】
抗体とフラビウイルスとの相互作用の定量化など、特徴付けに関して当該分野に公知の任意の免疫学的または生化学的ベースの方法を用いて、本発明の抗体を、フラビウイルス抗原に対する特異的結合に関して特徴付けできる。フラビウイルス抗原に対する本発明の抗体の特異的結合性は、例えば、限定はしないが、ＥＬＩＳＡアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降アッセイ、親和性クロマトグラフィー、および平衡透析などの免疫学的または生化学的ベースの方法を用いて判定できる。本発明の抗体の免疫特異的結合性および交差反応性を分析するために使用できる免疫アッセイとしては、限定はしないが、少数を挙げれば、ウェスタンブロット、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、タンパク質Ａ免疫アッセイなどの方法を用いた競合的および非競合的アッセイ系が挙げられる。このようなアッセイは、ルーチンであり、当該分野に十分知られている（例えば、その全体が参考として本明細書中に援用される、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社、ニューヨークを参照）。
【０１６０】
また、本発明の抗体は、抗体とフラビウイルスとの相互作用の速度論的パラメータを特徴付けするために、当該分野に公知の任意の表面プラズモン共鳴ベースのアッセイを用いてアッセイできる。限定はしないが、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ（スウェーデン国ウプサラ）から入手できるＢＩＡｃｏｒｅ機器；Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｅｎｓｏｒｓ（マサチューセッツ州フランクリン）から入手できるＩＡｓｙｓ機器；Ｗｉｎｄｓｏｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（英国バークス）から入手できるＩＢＩＳ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｌａｓｅｒ  ａｎｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｌａｂ（日本国北海道）から入手できるＳＰＲ−ＣＥＬＬＩＡ  ｓｙｓｔｅｍｓ、およびＴｅｘａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（テキサス州ダラス）から入手できるＳＰＲ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｐｒｅｅｔａなどの任意の市販の機器が本発明に使用できる。ＳＰＲベース技法のレビューに関しては、Ｍｕｌｌｅｔら、２０００年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２：７７−９１頁；Ｄｏｎｇら、２００２年、Ｒｅｖｉｅｗ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、８２：３０３−２３頁；Ｆｉｖａｓｈら、１９９８年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９７−１０１頁；Ｒｉｃｈら、２０００年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：５４−６１頁を参照されたい。これらは全て、その全体が参考として本明細書中に援用される。また、米国特許第６，３７３，５７７号、第６，２８９，２８６号、第５，３２２，７９８号、第５，３４１，２１５号、第６，２６８，１２５号に記載されているタンパク質−タンパク質相互作用を測定するためのいずれのＳＰＲ機器およびＳＰＲベースの方法も、本発明の方法に考慮されており、これらは全て、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０１６１】
本発明は、インビトロおよびインビボアッセイを用いて、本発明の抗体の機能、特に、フラビウイルス感染を阻止する活性を同定するための一定の特徴付けアッセイを用いる、本発明の方法によって作製された抗体の特徴付けを包含する。本発明は、細胞ベースの、および無細胞アッセイを包含する。
【０１６２】
本発明は、定性ベースのスクリーニング、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイを、好ましくは、本発明の抗体を特徴付けする第一次スクリーニングとして用いる、本発明の抗体の特徴付けを包含する。本発明は、第一次スクリーニングとして、吸着された精製ＥまたはＮＳ１タンパク質に対する抗体を検出するＥＬＩＳＡを提供する。本発明の抗体を特徴付けするための代表的なＥＬＩＳＡベースのアッセイは、以下を含む：免疫原として、完全ウイルスが用いられる場合、ＷＮＶ感染ＢＨＫ２１細胞のライセートを置換して、スクリーニング時に、さらなるＥタンパク質エピトープが存在することを保証する；陽性クローンを、流動細胞計測法により、ＷＮＶ感染細胞との免疫活性に関して確認する。保存されたＷＮＶエピトープを認識するｍＡｂ類を得るために、他の（系統ＩおよびＩＩ）ＷＮＶ株との免疫活性を確認する。フラビウイルスの交差反応抗体（例えば、異種フラビウイルス感染に関連したＡＤＥ）に関連した可能な複雑化を避けるために、ＷＮＶタンパク質との反応が陽性の候補ｍＡｂ類を、ＤＥＮ、黄熱病、またはセントルイス脳炎のウイルスに感染させたＶｅｒｏ細胞への結合性に関して試験し、ＷＮＶに特異的なｍＡｂのみを、さらなる試験に用いる。異なるｍＡｂアイソタイプは、インビボで、異なるエフェクター機能を示すため、市販のＥＬＩＳＡキットを用いて、アイソタイプを判定する。
【０１６３】
他の実施形態において、本発明は、ＷＮＶ感染のｍＡｂ媒介阻止の可能性のある機構を特徴付けするための定量的機能的スクリーニングを包含する。各アッセイから、スコアリングシステムを作製して、最も大きな阻止活性を有するｍＡｂ類を同定する。本発明は、当該分野に公知であり、本明細書に包含された方法を用いるウイルス中和アッセイを用いた本発明の抗体の特徴付けを包含する。代表的なアッセイにおいて、細胞培養液中で、ＢＨＫ２１細胞によるプラーク減少中和アッセイ（ＰＲＮＴ）を用いて、ＷＮＶ感染を中和する能力を判定する。特定の作用機構に拘束される意図はないが、ＮＳ１は、ビリオン中に存在しないため、ＮＳ１に対するｍＡｂ類は、ウイルスの結合または内在化を直接阻止してはいないはずである。抗ＥｍＡｂ類に関して、中和指数を作成する。精製抗体の標準的濃度（例えば、１００μｇ／ｍｌ）を用いて、ＰＲＮＴ５０値：＜１／１０＝０点、１／１０〜１／１００＝１点、＞１／１００＝２点から、点数尺度を帰属する。本発明は、当該分野に公知であり、本明細書に包含された方法を用いる補体媒介細胞溶解アッセイを用いた本発明の抗体の特徴付けを包含する。ＷＮＶ感染細胞の補体媒介溶解を引き起こす抗体の能力を、標準的標的細胞溶解アッセイによって評価する（例えば、Ｓｔａｎｌｅｙら、１９８６年、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ５８：１０７−１１５頁を参照）。ＢＨＫ２１細胞を、ＷＮＶに２４時間感染させ、５１Ｃｒで標識化する。洗浄した細胞を、精製ｍＡｂ類およびモルモット補体と共にインキュベートする（３７℃で１時間）。上澄み液を採取し、抗体依存性補体媒介細胞溶解を、シンチレーション計数により測定する。ｍＡｂおよび補体によって特異的に溶解した細胞のパーセンテージに基づいて、点数尺度を帰属する：＜１０％＝０点、１０〜４０％＝１点、＞４０％＝２点。さらに他の実施形態において、本発明は、ウイルス上補体固定を用いた本発明の抗体の特徴付けを包含する。ウイルスに結合し、溶液中、直接的に補体を固定するｍＡｂ類の能力を、Ｍａｎｄｅｒｓｏｎら、２００１年、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９４：７４７−５６頁に開示された方法などの当該分野に公知の方法を用いて、固定後に生じるＣ３の開裂産物の検出により評価する。野生型マウスの血清存在下、ＷＮＶまたはＤＥＮウイルス（陰性対照）を、Ｅに対する抗ＷＮＶ  ｍＡｂ類と共に、３７℃でインキュベートし、Ｃ３結合させる。サンプルを、界面活性剤により変性させ、ヤギ抗マウスＣ３により免疫沈降させ、Ｃ３に対するウサギポリクローナル抗体によってウェスタンブロット分析に供する。補体固定が生じた場合は、Ｃ３α鎖（１００のＭｒ）が開裂し、増加したＣ３ｄ（４０のＭｒ）濃度が検出される。追加対照として、ｍＡｂ類とＷＮＶはまた、因子Ｂ−／−およびＣｌｑ−／−血清と共にインキュベートする。ウイルス上の補体固定に抗体が必要な（および補体活性化の古典的経路を用いる）場合は、因子Ｂではなく、Ｃｌｑの欠失により、Ｃ３からＣ３ｄへの変換が防止される。これらの補体欠失血清の使用により、抗体結合が、直接Ｃ３活性化を引き起こすことが確認され、溶液中で自然に生じる（Ｍａｎｄｅｒｓｏｎら、２００１年、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９４：��４７−５６頁）または代替経路によるＣ３活性化が排除される。ｍＡｂ類がＷＮＶ上の直接的補体固定を促進するかどうかに基づいて、点数尺度を帰属する：Ｃ３固定なし＝０点、Ｃ３固定＝２点。
【０１６４】
さらに他の実施形態において、本発明は、当該分野に公知であり、本明細書に包含された抗体依存性細胞媒介細胞毒（ＡＤＣＣ）アッセイを用いた、本発明の抗体の特徴付けを包含する。ＷＮＶ感染細胞のＡＤＣＣを促進するｍＡｂ類の能力を、先に記載されたアッセイ（Ｋｕｒａｎｅら、１９８４年、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ５２：２２３−３０頁；Ｍｅｇｕｒｏら、１９７９年、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２２：２５２１−６頁；Ｚｈａｎｇら、１９９２年、Ａｃｔａ  Ｖｉｒｏｌ  ３６：５３３−４０頁）にしたがって評価する。ＭＣ５７ＧＬマウスを、ＷＮＶに２４時間感染させ、５１Ｃｒで標識化し、精製抗ＷＮＶまたは対照ｍＡｂ類と共にインキュベートし、ＷＮＶ未処置マウスから単離した、種々の濃度の洗浄した同系末梢血単核細胞と混合した。インキュベーション（３７℃で１２時間から１６時間）後、上澄み液を採取し、シンチレーション計数によりＡＤＣＣ活性を測定する。５０：１のエフェクター：標的比で、ｍＡｂの存在下、特異的に溶解される細胞のパーセテージに基づいて、点数尺度を帰属する：＜１０％＝０点、１０〜４０％＝１点、＞４０％＝２点。（ｅ）結合活性。高親和性非中和ｍＡｂ類の受動的投与により、シンドビスウイルスによって生じる致命的な脳炎を防止できるため（Ｓｃｈｍａｌｊｏｈｎら、１９８２年、Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：７０−２頁）、ｍＡｂ類は、それらの相対的結合アッセイに関しても評価される。結合活性は、定常抗原変動抗体法（Ｔｙｌｅｒら、１９９３年、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６７：３４４６−５３頁；Ｖｉｒｇｉｎら、１９９１年、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６５：６７７２−８１頁）により評価される。組換えＥおよびＮＳ１タンパク質の一定の量を、マイクロタイターウェルに吸着させ、種々の濃度のＩ１２５標識精製ｍＡｂｔｏ共にインキュベートし、シンチレーション計数により反応性に関して評価する。ＫＤがＳｃａｔｈａｒｄ解析によって決定できるように、１００倍過剰の未標識抗体で、競合試験を実施する。精製ＷＮＶタンパク質に対する二価ｍＡｂ類の相対的結合活性に基づき、点数尺度を帰属する：＞１０−６Ｍ＝０点、１０−６〜１０−８Ｍ＝１点、＜１０−８Ｍ＝２点。
【０１６５】
記載したとおり、点数システムは、３つのカテゴリーの中で最も大きな阻害活性を有する可能性のあるｍＡｂ類の順位付けおよび選択を助けるためにデザインされ、さらなる競合結合およびインビボ試験のために選択される。
【０１６６】
（５．３  抗体をコードするポリヌクレオチド）
また、本発明は、本発明の抗体（例えば、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、ＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有するクローンＥ１６、Ｅ２４、またはＥ３４から作製されたマウスモノクローナル抗体）をコードするポリヌクレオチド、または本発明の免疫化法によって作製された他のモノクローナル抗体、およびそれらのヒト化体、ならびにそれらを作製する方法を含む。
【０１６７】
また、本発明は、配列番号１、５、または９で開示されているＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、ＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有する抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを包含する。本発明は、配列番号３、７、または１１で開示されているＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、ＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有する抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドを包含する。
【０１６８】
本発明の方法はまた、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド類に対して、種々のストリンジェンシー下、例えば、高ストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシーまたは低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド類を包含する。該ハイブリダイゼーションは、種々のストリンジェンシー条件下で実施できる。限定はしないが、例えば、低ストリンジェンシー条件を用いる方法は以下のとおりである（また、Ｓｈｉｌｏ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、１９８１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８、６７８９−６７９２頁を参照）。ＤＮＡを含有するフィルタを、３５％のホルムアミド、５ＸのＳＳＣ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＰＶＰ、０．１％のＦｉｃｏｌｌ、１％のＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、４０℃で６時間予め処理する。ハイブリダイゼーションは、以下の変更を施して同じ溶液中で実施する：０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のＦｉｃｏｌｌ、０．２％のＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）硫酸デキストラン、および５〜２０Ｘ１０６ｃｐｍの３２Ｐ−標識プローブを用いる。フィルタを、ハイブリダイゼーション混合物中、５０℃で１８〜２０時間インキュベートしてから、２ＸのＳＳＣ、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、および０．１％のＳＤＳを含有する溶液中で５５℃で１．５時間洗浄する。この洗浄液を、新鮮な溶液と置き換えて、６０℃でさらに１．５時間インキュベートする。フィルタを乾燥ブロットし、オートラジオグラフィーに曝露させる。必要ならば、フィルタを６５〜６８℃で３回洗浄し、フィルムに再曝露させる。使用され得る低ストリンジェンシーの他の条件は、当該分野に周知である（例えば、交差種ハイブリダイゼーションに使用されるもの）。限定はしないが、例えば、高ストリンジェンシー条件を用いる方法は以下のとおりである。ＤＮＡを含有するフィルタの前ハイブリダイゼーションを、６ＸのＳＳＣ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のＦｉｃｏｌｌ、０．０２％のＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中、６５℃で８時間から一晩実施する。フィルタを、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡおよび５〜２０Ｘ１０６ｃｐｍの３２Ｐ−標識プローブを含有する前ハイブリダイゼーション混合物中、６５℃で４８時間ハイブリダイズする。フィルタの洗浄は、２ＸのＳＳＣ、０．０１％のＰＶＰ、０．０１％のＦｉｃｏｌｌ、および０．０１％のＢＳＡを含有する溶液中、３７℃で１時間行う。これを次に、オートラジオグラフィー前に０．１ＸのＳＳＣ中、５０℃で４５分間洗浄する。使用できる他の高ストリンジェンシー条件は、当該分野に周知である。このようなストリンジェンシーに対する適切な条件の選択は、当該分野に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒ���ｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーを参照；また、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｍａｎｕａｌｓにおいて、版権１９８７〜１９９７年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、版権１９９４〜１９９７年Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ社を参照；特に、Ｄｙｓｏｎ、１９９１年、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ中の「Ｉｍｍｏ  ｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ」、２巻、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ編集、１１１−１５６頁、オックスフォード大学プレスのＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、英国オックスフォードを参照）。
【０１６９】
上記ポリヌクレオチドを得ることでき、そのポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列は、当該分野に公知の任意の方法により決定できる。
【０１７０】
抗体をコードするポリヌクレオチドは、Ｉｇ特異的プローブとのハイブリダイゼーションおよび／または該配列の３’および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマー類を用いるＰＣＲ増幅により、または例えば、該抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンを確認するために特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いてクローン化することにより、好適な供給源（例えば、本発明の抗体を発現させるために選択されるハイブリドーマ細胞など、該抗体を発現する任意の組織または細胞から生成されたｃＤＮＡライブラリー、または単離された核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）の核酸から生成できる。次いでＰＣＲにより生成された増幅核酸類を、当該分野に周知の任意の方法を用いて複製可能なクローニングベクターにクローン化できる。
【０１７１】
該抗体のオリゴヌクレオチド配列が決定されたら、該抗体のオリゴヌクレオチド配列を、当該分野に周知のヌクレオチド配列の操作、例えば、組換えＤＮＡ技法、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、参照として双方ともそれら全体が本明細書に組み込まれている、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーおよびＡｕｓｕｂｅｌら編集、１９９８年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州を参照）を用いて操作し、例えば、アミノ酸置換体、欠失体、および／または挿入体を創製するために、異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製する。
【０１７２】
具体的な実施形態において、１つ以上のＣＤＲが、ルーチンの組換えＤＮＡ技法を用いるフレーム構造領域内に挿入される。そのフレーム構造領域は、天然またはコンセンサスフレーム構造領域、好ましくはヒトフレーム構造領域であり得る（例えば、ヒトフレーム構造領域のリスト化に関してＣｈｏｔｈｉａら、１９９８年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９頁を参照）。そのフレーム構造領域とＣＤＲ類との組合わせにより生成されたポリヌクレオチドは、フラビウイルス抗原に特異的に結合する抗体をコードすることが好ましい。上記に考察されたように、１つ以上のアミノ酸置換体が、フレーム構造領域内で作製できることが好ましく、該アミノ酸置換体は、本発明の抗体のフラビウイルス抗原への結合性を改善することが好ましい。別の実施形態において、当該分野に利用できるヒトライブラリーまたは任意の他のライブラリーを、当該分野に公知の標準的技法によりスクリーニングして、本発明の抗体をコードする核酸類をクローン化できる。
【０１７３】
（５．４  抗体類の組換え発現）
本発明の抗体をコードする核酸配列が得られたら、抗体生産のためのベクターを、当該分野に周知の技法を用いて組換えＤＮＡ技術により生産できる。抗体のコード化配列および適切な転写ならびに翻訳制御シグナルを含有する発現ベクター類を構築するために、当業者に周知である方法を使用できる。これらの方法としては、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技法、合成技法、およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーおよびＡｕｓｕｂｅｌら編集、１９９８年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州を参照）。
【０１７４】
抗体のヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、従来の技法により宿主細胞に移入でき（例えば、電気穿孔、リポソームトランスフェクション、およびリン酸カルシウム沈殿）、次いで形質移入された細胞を、従来の技法により培養して本発明の抗体を生産する。具体的な実施形態において、抗体の発現は、構成的で誘導性の、または組織特異的プロモーターにより調節される。
【０１７５】
本発明の組換え抗体を発現するために用いられる宿主細胞は、特に組換え免疫グロブリン分子全体の発現のために大腸菌、または好ましくは、真核細胞などの細菌細胞であり得る。特に、ヒトサイトメガロウイルスからの主要中間初期遺伝子プロモーター成分などのベクターと関連させたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞は、免疫グロブリンに関して有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、１９９８年、Ｇｅｎｅ  ４５：１０１頁；Ｃｏｃｋｅｔｔら、１９９０年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２頁）。
【０１７６】
種々の宿主発現ベクター系を、本発明の抗体を発現するために利用できる。このような宿主発現系は、抗体のコード化配列を産生し、引き続き精製できる媒体となるが、また、適切なヌクレオチドコード化配列により形質転換されるか、または形質移入される場合、インサイチュで本発明の抗体を発現できる細胞でもある。これらには、限定はしないが、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたは免疫グロブリンコード化配列を含有するコスミドＤＮＡ発現ベクター類により形質転換された細菌（例えば、大腸菌および枯草菌）；免疫グロブリンコード化配列を含有する組換えウイルス発現ベクター類（例えば、バキュロウイルス）により感染された昆虫細胞系；免疫グロブリンコード化配列を含有する組換えウイルス発現ベクター類（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）およびタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））に感染したか、または組換えプラスミド発現ベクター類（例えば、Ｔｉプラスミド）により形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプロモーター）あるいは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター類（アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築体を担持する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３細胞、リンパ球細胞（米国特許第５，８０７，７１５号を参照）、Ｐｅｒ  Ｃ．６細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌにより開発されたラット網膜細胞））が含まれる。
【０１７７】
細菌系において、多数の発現ベクター類が、発現される抗体に関して意図される使用に依って有利に選択できる。例えば、抗体の薬学的組成物を作製するためにこのようなタンパク質を大量に生産しようとする場合、容易に精製される融合タンパク質製造物の高レベルの発現を指向するベクター類が望ましいと考えられる。このようなベクター類として、限定はしないが、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、１９８３年、ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１頁）が挙げられ、融合タンパク質が生産されるようにｌａｃ  Ｚコード化領域を有するフレーム内のベクター；ｐＩＮベクター類（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、１９８５年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９頁；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｈｕｓｔｅｒ、１９８９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９頁）などに抗体コード化配列を個々に結合できる。ｐＧＥＸベクター類もまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を有する融合タンパク質としての異種ポリペプチド類を発現するために使用できる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合により、次いで遊離のグルタチオン存在下で溶出することにより溶解細胞から容易に精製できる。クローン化された標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から遊離できるように、ｐＧＥＸベクター類は、トロンビンまたは因子Ｘａプロテアーゼ開裂部位を含むようにデザインされる。
【０１７８】
昆虫系において、オウトグラファカリフォルニア核多汗症ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、異種遺伝子を発現するためのベクターとして用いられる。このウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞中で増殖する。抗体コード化配列を、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個々にクローン化して、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。
【０１７９】
哺乳動物の宿主細胞において、多数のウイルスベースの発現系を利用できる。アデノウイルスが、発現ベクターとして用いられる場合、対象の抗体コード化配列を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三連リーダー配列に結合できる。次いでこのキメラ遺伝子を、インビトロまたはインビボでの組換えによりアデノウイルスゲノム中に挿入できる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）中への挿入により、生存可能な組換えウイルスが生じ、感染宿主において免疫グロブリン分子を発現できる（例えば、Ｌｏｇａｎ  ＆  Ｓｈｅｎｋ、１９８４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３５５−３５９頁を参照）。特異的開始シグナルもまた、挿入された抗体コード化配列の効率的な翻訳に必要であり得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。さらに、開始コドンは、挿入体全体の翻訳を確保するために所望のコード化配列のリーディングフレームと同じ相内になければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドン類は、天然および合成双方の種々の出所であり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどの包含により増強できる（Ｂｉｔｔｎｅｒら、１９８７年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４頁を参照）。
【０１８０】
さらに、挿入配列の発現を調節し、または望ましい特異的様式で遺伝子産物を修飾し、処理する宿主細胞株を選択できる。タンパク質産物のこのような修飾（例えば、グリコシル化）および処理（例えば、開裂）は、タンパク質の機能にとって重要となり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後の処理および修飾に関する特徴的かつ特異的機構を有する。発現される異種タンパク質の正しい修飾および処理を確保するために適切な細胞系または宿主系が選択できる。最後に、遺伝子産物の一次転写体の適切な処理、グリコシル化、およびリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用できる。このような哺乳動物宿主細胞としては、限定はしないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３、ＷＩ３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＹ２０およびＴ４７Ｄ、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔが挙げられる。
【０１８１】
組換えタンパク質の長期高収率生産のために、安定な発現が好ましい。例えば、本発明の抗体を安定に発現する細胞系を操作できる。ウイルス起源の複製を含有する発現ベクター類を用いずに、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択可能なマーカーによって制御されるＤＮＡにより形質転換できる。異種ＤＮＡの導入後、操作される細胞を、濃縮培地中で１〜２日間増殖させることができ、次いで選択的培地に切り替える。組換えプラスミドにおける選択可能なマーカーにより、耐選択性が付与され、細胞にプラスミドを染色体に安定に組み込ませ、増殖させて増殖巣を形成させ、次いで細胞系へのクローン化および拡張ができる。この方法は、本発明の抗体を発現する細胞系を操作するために有利に使用できる。このように操作された細胞系は、本発明の抗体と直接または間接的に相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価に特に有用であり得る。
【０１８２】
限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、１９７７年、Ｃｅｌｌ  １１：２２３頁）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２頁）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、１９８０年、Ｃｅｌｌ  ２２：８１７頁）など多くの選択系が使用でき、遺伝子は、それぞれｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞、またはａｐｒｔ細胞において使用できる。また、代謝拮抗剤耐性が、以下の遺伝子選択のベースとして使用できる：耐メトトレキサートを付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら、１９８０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５７頁；Ｏ’Ｈａｒｅら、１９８１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７頁）；耐ミコフェノール酸を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ、１９８１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２頁）；耐アミノグリコシドＧ−４１８を付与するｎｅｏ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５頁；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ、１９９１年、３：８７−９５頁；Ｔｏｌｏｓｔｏｓｈｅｖ、１９９３年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６頁；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、１９９３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２頁；およびＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ、１９９３年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７頁；１９９３年５月、ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５頁）；および耐ヒグロマイシンを付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、１９８４年、Ｇｅｎｅ  ３０：１４７頁）。使用できる組換えＤＮＡ技術の当該分野における周知の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら編集、１９９３年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州；Ｋｒｉｅｇｅｒ、１９９０年、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州；Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら編集、１９９４年、１２章および１３章、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州；およびＣｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、１９８１年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１頁に記載されている。
【０１８３】
本発明の抗体の発現レベルは、ベクター増幅により増加させることができる（レビューに関して、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ  ｉｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ、３巻、（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８７年）を参照）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーを増幅できる場合、宿主細胞の培養物に存在する阻害剤濃度が増大すると、マーカー遺伝子のコピー数が増加する。増幅領域が、抗体のヌクレオチド配列と関連することから、抗体の生産も増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、１９８３年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７頁）。
【０１８４】
宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター、すなわち重鎖由来ポリペプチドをコードする第一のベクターおよび軽鎖由来ポリペプチドをコードする第二のベクターにより同時形質移入できる。２つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの発現を等しくできる同一の選択可能なマーカーを含有できる。あるいは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの双方をコードする単独のベクターを使用できる。このような状況において、該軽鎖は、過剰の無毒性重鎖を避けるために重鎖前に配置するべきである（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ。１９８６年、Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５２頁；Ｋｏｈｌｅｒ、１９８０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２１９７頁）。重鎖および軽鎖に関するコード化配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含んでなり得る。
【０１８５】
本発明の抗体が組換え発現したら、それを、抗体精製のための当該分野に公知の任意の方法により、例えば、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティー、特にタンパク質Ａに次ぐ特定の抗原に対するアフィニティークロマトグラフィにより、およびサイジングカラムクロマトグラフィ）、遠心分離、溶解性差、またはタンパク質精製のための任意の他の標準的方法により精製できる。
【０１８６】
（５．５  抗体の予防的使用および治療的使用）
本発明は、フラビウイルス感染、特にＷＮＶ感染と関連する１つまたは複数の症状を予防し、治療し、または寛解するために、本発明の抗体類またはそれらのフラグメントを、哺乳動物、好ましくはヒトに投与する工程を包含する抗体ベース治療に関する。本発明の予防用および治療用化合物としては、限定はしないが、本発明の抗体類（本明細書に記載されたフラグメント、アナログおよびそれらの誘導体を含む）および本発明の抗体類をコードする核酸類（本明細書に記載されたフラグメント、アナログおよびそれらの誘導体ならびに抗イディオタイプ抗体を含む）が挙げられる。本発明の抗体類またはそれらのフラグメントは、当該分野に公知のまたは本明細書に記載された薬学的に受容可能な組成物において提供できる。
【０１８７】
フラビウイルス感染のアンタゴニストとして機能する本発明の抗体類またはそれらのフラグメントを、フラビウイルス感染と関連する１つまたは複数の症状を治療し、予防し、または寛解するために哺乳動物、好ましくはヒトに投与できる。例えば、フラビウイルス抗原とその宿主細胞受容体との間の相互作用を破壊するか、または防止する抗体類またはそれらのフラグメントを、フラビウイルス感染と関連する１つまたは複数の症状を治療し、予防し、または寛解するために哺乳動物、好ましくはヒトに投与できる。
【０１８８】
本発明は、本発明の１種または複数種の抗体の投与によりフラビウイルス感染を治療し、予防し、または改善する方法を提供する。具体的な実施形態において、本発明は、ＷＮＶの構造タンパク質、例えばＥタンパク質に免疫特異的に結合する第１の抗体、およびＷＮＶの非構造タンパク質、例えばＮＳ１タンパク質に結合する第２の抗体を投与する工程を包含するＷＮＶ感染を治療し、予防し、または寛解する方法を包含する。特定の作用機構により拘束される意図はないが、このような併用措置は、ＷＮＶのＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼが高い誤り率があり、したがって免疫優性残基を迅速に変える可能性があるため、単一抗体治療措置よりも有効である。他の具体的な実施形態において、本発明は、ＷＮＶの構造タンパク質、例えばＥタンパク質のエピトープに免疫特異的に結合する第１の抗体、およびＷＮＶの同じ構造タンパク質に結合するが、異なるエピトープに結合する第２の抗体を投与する工程を包含するＷＮＶ感染を治療し、予防し、または改善する方法を包含する。
【０１８９】
具体的な実施形態において、抗体またはそのフラグメントは、フラビウイルス、例えば、ＷＮＶのその宿主細胞受容体に対する結合を、前記抗体類またはそれらのフラグメントの不在下でその宿主細胞受容体に対するフラビウイルス結合に比して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、少なくとも１０％防止する。別の実施形態において、抗体類の併用、抗体フラグメント類の併用、または抗体類および抗体フラグメント類の併用は、フラビウイルスの宿主細胞受容体に対する結合を、前記抗体類および／または抗体フラグメント類の不在下でその宿主細胞受容体に対するＷＮＶ結合に比して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、少なくとも１０％防止する。
【０１９０】
１種または複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する本発明の１種または複数種の抗体またはそれらのフラグメントは、治療剤として体内の局所的または全身に使用できる。本発明の抗体類またはそれらのフラグメントはまた、他のモノクローナル抗体またはキメラ抗体と併用するか、または例えば、該抗体類と相互作用するエフェクターの細胞数または活性を増加させるために寄与するリンフォカイン類または造血成長因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ−７など）と併用して有利に利用できる。本発明の抗体類またはそれらのフラグメントはまた、他のモノクローナル抗体またはキメラ抗体と併用するか、または例えば、免疫反応を増加させるために寄与するリンフォカイン類または造血成長因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ−７）と併用して有利に利用できる。本発明の抗体類またはそれらのフラグメントはまた、フラビウイルス感染、特にＷＮＶ感染を治療するために用いられる１種または複数種の薬物、例えば、抗ウイルス剤などと併用して有利に利用できる。抗ウイルス剤の例としては、限定はしないが、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、およびヌクレオシドアナログ、ジドブジン、アシクロビル、ガングシクロビル、ビダラビン、イドクスリジン、トリフルリジン、およびリバビリン、ならびにフォスカーネット、アマンタジン、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、アンプレナビル、ロピナビル、リトナビル、α−インターフェロン類；アデフォビル、クレバジン、エンテカビル、およびプレコナリルが挙げられる。本発明は開発段階にある、当業者に公知の他の抗ウイルス剤も包含する。
【０１９１】
本発明の抗体は、単独または他のタイプの治療法（例えば、ホルモン療法、免疫療法、および抗炎症剤）と併用して投与できる。一般に、患者と同じ種である種起源または種反応性（抗体の場合）の製品の投与が好ましい。したがって、好ましい実施形態において、ヒトまたはヒト化抗体、フラグメント、アナログ、または核酸類を、治療または予防のためにヒト患者に投与する。
【０１９２】
フラビウイルス感染、特にＷＮＶ感染予防、フラビウイルス感染、特にＷＮＶ感染治療のために、フラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的結合する、高親和性および／またはインビボで阻害効力のある抗体類、および／または中和する抗体類を使用することが好ましい。また、ＷＮＶに関する免疫アッセイおよびＷＮＶ感染治療の双方のために、フラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異的結合する、高親和性であり、および／またはインビボで阻害効力のある抗体類をコードするポリヌクレオチド類を使用することが好ましい。このような抗体類またはそれらのフラグメントは、ＷＮＶ  Ｅタンパク質およびＮＳ１タンパク質に対する親和性があることが好ましい。具体的な実施形態において、フラビウイルス感染、特にＷＮＦ感染と関連する１つまたは複数の症状の治療、予防または寛解のために、本発明の１種または複数種の抗体またはそれらのフラグメントを含む治療剤または薬学的組成物を、哺乳動物、好ましくは、ヒトに投与する。
【０１９３】
本発明の抗体類と併用して使用できる予防用および治療用化合物としては、限定はしないが、翻訳後に修飾されたタンパク質、抗体などを含むペプチド類、ポリペプチド類、タンパク質類などのタンパク質様分子；無機または有機化合物の小型分子（１０００ダルトン未満）；限定はしないが、二本鎖または一本鎖ＤＮＡ、二本鎖または一本鎖ＲＮＡ、ならびに三重らせん核酸分子などの核酸分子、が挙げられる。予防用および治療用化合物は、任意の公知の生物（限定はしないが、動物、植物、細菌、真菌、および原生生物、またはウイルス）または合成分子のライブラリーから誘導できる。
【０１９４】
一定の実施形態において、本発明の１種または複数種の抗体を、フラビウイルス感染、特にＷＮＶ感染の治療または予防に有用な１種または複数種の治療剤、例えば、抗ウイルス剤と共同して哺乳動物、好ましくは、ヒトに投与する。用語の「共同して」とは、厳密に同時に予防剤または治療剤の投与に限定されず、本発明の抗体類が、他の方法で投与される場合よりも他の薬剤と一緒に作用して利益の増加を提供できるように、本発明の抗体類および他の薬剤が連続して、ある時間間隔内で被験体に投与されることを意味する。例えば、予防剤または治療剤の各々は、同時にまたは異なる時点で任意の順序で連続的に投与できるが；同時に投与されない場合、それらは、所望の治療効果または予防効果を提供するために時間を十分近接させて投与すべきである。各治療剤を、任意の適切な形態で、また任意の好適な経路により別々に投与できる。
【０１９５】
種々の実施形態において、予防剤または治療剤を、１時間未満離して、約１時間から約２時間離して、約２時間から約３時間離して、約３時間から約４時間離して、約時間４から約５時間離して、約５時間から約６時間離して、約６時間から約７時間離して、約７時間から約８時間離して、約８時間から約９時間離して、約９時間から約１０時間離して、約１０時間から約１１時間離して、２４時間以下または４８時間以下離して投与する。好ましい実施形態において、２つ以上の成分を、患者の同じ来院内で投与する。
【０１９６】
本明細書に提供された投与量および投与回数は、治療的に有効な期間および予防的に有効な期間包含される。投与量および回数はさらに、投与される具体的な治療剤または予防剤、癌の重症度およびタイプ、投与経路、ならびに患者の年令、体重、応答、および過去の医療歴に依って各患者に特定の因子によって典型的に変わる。好適な措置は、このような因子を考慮することにより、また、例えば、文献に報告され、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓＤｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（５６版、２００２年）に推奨された投与量に従うことによって、当業者により選択できる。
【０１９７】
（５．６  抗体類の投与方法）
本発明は、本発明の抗体またはそのフラグメント、または本発明の抗体またはそのフラグメントを含む薬学的組成物の有効量を、被験体に投与することによって、フラビウイルス感染、特にＷＮＶ感染と関連する１つまたは複数の症状の治療、予防、および寛解を提供する。好ましい態様において、抗体またはそのフラグメントは、実質的に精製される（すなわち、その効果を制限するか、または望ましくない副作用を生じる物質が実質的に無い）。該被験体は、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）および霊長類（例えば、カニクイザルなどのサルおよびヒト）などの哺乳類であることが好ましい。好ましい実施形態において、該被験体は、ヒト、特にフラビウイルス感染、特にＷＮＶ感染の危険性が増大しているヒトである。別の好ましい実施形態において、該被験体は、ヒト小児、ヒト高齢者、または免疫系の障害を有するヒトである。
【０１９８】
本発明は、抗体類を含む方法および薬学的組成物を提供する。本発明はまた、有効量の本発明の融合タンパク質もしくは複合化分子または本発明の融合タンパク質もしくは複合化分子を含む製薬製剤を、被験体に投与することによって、フラビウイルス感染に関連する１つまたは複数の症状の治療方法、予防方法、および寛解方法を提供する。好ましい態様において、抗体または融合タンパク質または複合化分子は、実質的に精製され（すなわち、その効果を制限するか、または望ましくない副作用を生じる物質が実質的に無い）。具体的な実施形態において、該被験体は、動物、すなわち非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）および霊長類（例えば、カニクイザルなどのサルおよびヒト）などの哺乳類であることが好ましい。好ましい実施形態において、被験体はヒトである。
【０１９９】
種々の送達システムが公知であり、本発明の抗体類を含む組成物を投与するために使用できる。例えば、リポソーム中のカプセル化、ミクロ粒子、ミクロカプセル、抗体または融合タンパク質を発現できる組換え細胞、受容体媒介飲食作用（例えば、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ、１９８７年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２頁を参照）、レトロウイルスまたは他のベクターなどの部分として核酸の構築物である。
【０２００】
幾つかの実施形態において、本発明の抗体は、本発明の抗体類の標的送達のためにリポソーム類中に製剤化される。リポソーム類は、水相を封入化する同心状に配列されたリン脂質二層を含む小胞である。リポソーム類は、典型的に種々のタイプの脂質、リン脂質、および／または界面活性剤を含む。リポソーム類の成分は、生体膜の脂質配列と同様の二層構造で配列される。リポソーム類は、それらの生体適合性、低免疫原生、および低毒性が、ある程度原因となって、特に好ましい送達媒体である。リポソーム類の調製法は、当該分野に公知であり、本発明内に包含される。例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら、１９８５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８頁；Ｈｗａｎｇら、１９８０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０−４頁；米国特許第４，４８５，０４５号および米国特許第４，５４４，５４５号を参照されたい；それらは全て、参照としてその全体が本明細書に組み込まれている。
【０２０１】
本発明はまた、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されたものなど、血清中半減期の延長、すなわち、循環時間の増加を有するリポソーム類を調製する方法を包含する。本発明の方法に用いられる好ましいリポソーム類は、循環から急速に排除されず、すなわち、単核食細胞系（ＭＰＳ）内に取り込まれない。本発明は、当業者に公知の通常の方法を用いて調製される立体的に安定化されたリポソーム類を包含する。特定の作用機構により拘束される意図はないが、立体的に安定化されたリポソーム類は、リポソーム類と血清蛋白質との望ましくない反応を減少させ、オプソニン作用の促進（ｏｐｏｓｏｎｉｚａｔｉｏｎ）を減少させ、ＭＰＳによる認識を減少させる、かさ高く高可撓性親水性部分を有する脂質成分を含有する。立体的に安定化されたリポソーム類は、ポリエチレングリコールを用いて調製することが好ましい。リポソーム類および立体的に安定化されたリポソーム類の調製に関して、例えば、Ｂｅｎｄａｓら、２００１年ＢｉｏＤｒｕｇｓ、１５（４）：２１５−２２４頁；Ｂｌｕｍら、１９９０年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１０２９：９１−７頁；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎら、１９９６年、Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．６：９９−１１６頁；Ｌｉｔｚｉｎｇｅｒら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１１９０：９９−１０７頁；Ｍａｒｕｙａｍａら、１９９１年、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、３９：１６２０−２頁；Ｋｌｉｎａｎｏｖら、１９９１年、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、１０６２：１４２−８頁；Ａｌｌｅｎら、１９９４年、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ、１３：２８５−３０９頁を参照されたい；これらは全て、参照としてその全体が本明細書に組み込まれている。本発明はまた、特定の標的臓器に適応されるリポソーム類を包含する。例えば、米国特許第４，５４４，５４５号を参照されたい。本発明の組成物および方法に使用に特に有用なリポソーム類は、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物との逆相蒸発法により生成できる。リポソーム類は、規定のポアサイズのフィルタを通して押出し、所望の直径を有するリポソーム類を生じさせる。幾つかの実施形態において、本発明の抗体のフラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ’）を、以前に記載された方法を用いてリポソーム類に複合化できる。例えば、参照としてその全体が本明細書に組み込まれているＭａｒｔｉｎら、１９８２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８頁を参照されたい。
【０２０２】
本発明の抗体類はまた、免疫リポソーム類として製剤化できる。免疫リポソーム類とは、本発明の抗体またはそのフラグメントが、リポソーム表面に共有結合または非共有結合されるリポソーム組成物を称す。抗体のリポソーム表面に対する結合化学は、当該分野に公知であり、また本発明内に包含されており、例えば、参照としてその全体が本明細書に組み込まれているＡｌｌｅｎら、１９９５年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１２３９：１３３−１３４頁を参照されたい。最も好ましい実施形態において、本発明の方法および組成物に使用するための免疫リポソーム類は、立体的にさらに安定化される。本発明の抗体は、リポソームの脂質二層内に安定に固定させた疎水性アンカーに共有結合または非共有結合されることが好ましい。疎水性アンカーの例としては、限定はしないが、リン脂質、例えば、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）が挙げられる。抗体と疎水性アンカーとの間の共有結合を達成させるために、当該分野に公知の任意の生化学的方法を使用でき、例えば、参照としてその全体が本明細書に組み込まれているＪ．Ｔｈｏｍａｓ  Ａｕｇｕｓｔ編集、１９９７年、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、４０巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴ、３９９−４３５頁を参照されたい。例えば、抗体分子上の官能基は、リポソーム関連疎水性アンカー上の活性基と反応でき、例えば、抗体上のリジン側鎖アミノ基は、水溶性カルボジイミドにより活性化されたリポソームＮ−グルタリル−ホスファチジルエタノールアミンに結合でき；または還元抗体のチオール基は、ピリジルチオプロピオニル−ホスファチジルエタノールアミンなどのチオール反応性アンカーを介してリポソーム類に結合できる。例えば、Ｄｉｅｔｒｉｃｈら、１９９６年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５：１１００−１１０５頁；Ｌｏｕｇｈｒｅｙら、１９８７年、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、９０１：１５７−１６０頁；Ｍａｒｔｉｎら、１９８２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８頁；Ｍａｒｔｉｎら、１９８１年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０：４４２９−３８頁を参照されたい。これらは全て、参照としてその全体が本明細書に組み込まれている。
【０２０３】
本発明は、本発明の抗体またはそのフラグメントを含む免疫リポソーム類を包含する。幾つかの実施形態において、免疫リポソーム類は、本明細書に開示されるものなど、１種または複数種のさらなる治療剤をさらに含む。
【０２０４】
本発明の免疫リポソーム組成物は、１つまたは複数の小胞形成脂質、本発明の抗体またはそのフラグメントあるいは誘導体、および任意に疎水性ポリマーを含む。小胞形成脂質は、アシル鎖などの２本の炭化水素鎖および極性頭部を有する脂質であることが好ましい。小胞形成脂質の例としては、リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、および糖脂質、例えば、セレブロシド類、ガングリオシド類が挙げられる。本発明の製剤に有用なさらなる脂質は、当該分野に知られており、また本発明内に包含されている。幾つかの実施形態において、免疫リポソーム組成物は、リポソームの血清中半減期を増加させる親水性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、およびガングリオシドＧＭ１をさらに含む。親水性ポリマー類をリポソーム類に結合する方法は、当該分野に周知であり、また本発明内に包含されている。免疫リポソーム類およびそれらを調製する方法のレビューに関して、例えば、ＰＣＴ国際公開第９７／３８７３１号、Ｖｉｎｇｅｒｈｏｅａｄｓら、１９９４年、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４：２５９−７２頁；Ｍａｒｕｙａｍａ、２０００年、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２３（７）：７９１−７９９頁；Ａｂｒａら、２００２年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２（１＆２）：１−３頁；Ｐａｒｋ、２００２年、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、２２（２）：２６７−２８１頁；Ｂｅｎｄａｓら、２００１年ＢｉｏＤｒｕｇｓ、１４（４）２１５−２２４頁、Ｊ．Ｔｈｏｍａｓ  Ａｕｇｕｓｔ編集、１９９７年、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、４０巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴ、３９９−４３５頁を参照されたい。それらは全て、参照としてその全体が本明細書に組み込まれている。
【０２０５】
本発明の抗体を投与する方法としては、限定はしないが、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下）、硬膜外、および粘膜（例えば、鼻腔内経路および経口経路）が挙げられる。具体的な実施形態において、本発明の抗体は、筋肉内投与、静脈内投与、または皮下投与される。該組成物は、任意の好適な経路により、例えば、輸液またはボーラス注入により、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、口内粘膜、直腸および腸管粘膜など）を介する吸収により投与でき、他の生物学的活性剤と一緒に投与できる。投与は、全身または局所であり得る。さらに、肺投与は、例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアロゾル化剤による製剤によっても使用できる。例えば、米国特許第６，０１９，９６８号；米国特許第５，９８５，２０号；米国特許第５，９８５，３０９号；米国特許第５，９３４，２７２号；米国特許第５，８７４，０６４号；米国特許第５，８５５，９１３号；米国特許第５，２９０，５４０号；ならびに米国特許第４，８８０，０７８号、および国際公開第９２／１９２４４号；国際公開第９７／３２５７２号；国際公開第９７／４４０１３号；国際公開第９８／３１３４６号；ならびに国際公開第９９／６６９０３号を参照されたい。それらの各々は、参照としてその全体が本明細書に組み込まれている。
【０２０６】
本発明はまた、抗体量を示しているアンプルまたはサッシェなどの気密密閉された容器に本発明の抗体を充填して提供される。一実施形態において、本発明の抗体は、気密密閉された容器に乾燥滅菌の凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給され、被験体への投与のため、例えば、水または生理食塩水により適切な濃度に再構成できる。本発明の抗体は、気密密閉された容器中に滅菌凍結乾燥粉末として、好ましくは少なくとも５ｍｇ、より好ましくは少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくと２５もｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも７４ｍｇの単位用量で供給される。本発明の凍結乾燥抗体類は、それらの元の容器内で２℃から８℃の間で保存されるべきであり、再構成後、１２時間以内、好ましくは６時間以内、５時間以内、３時間以内、または１時間以内で投与されるべきである。代わりの実施形態において、本発明の抗体類は、抗体、融合タンパク質、または複合化分子の量と濃度を示して気密密閉容器内の液体形態で供給される。抗体の液体形態は、気密密閉容器中に好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも２．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２００ｍｇ／ｍｌの抗体で供給される。
【０２０７】
フラビウイルス感染、特にＷＮＶ感染に関連する１つまたは複数の症状の治療、予防、および寛解に有効である本発明の組成物量は、標準的な臨床方法により決定できる。製剤に使用される正確な量はまた、投与経路、および病態の重症度に依存し、医師の判定および各患者の状況により決めるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から誘導された用量応答曲線から外挿できる。
【０２０８】
本発明により包含される抗体に関して、患者に投与される投薬量は、典型的に５ｍｇ／患者の体重１ｋｇから２５ｍｇ／ｋｇの間である。一般に、ヒト抗体は、異種ポリペプチド類に対する免疫応答のために他の種からの抗体よりも体内において長い半減期を有する。したがって、多くの場合、ヒト抗体は、より少ない投薬量およびより少ない投与回数が可能である。さらに、本発明の抗体類またはそれらのフラグメントの投薬量および投与回数は、例えば、脂質化などの修飾による抗体の取込みおよび組織透過性を増強させることにより減少し得る。
【０２０９】
一実施形態において、患者に投与される本発明の抗体の投薬量は、単独の薬剤療法として使用される場合、０．０１ｍｇから１０００ｍｇである。別の実施形態において、本発明の抗体類は、他の治療用組成物と併用して使用され、患者に投与される投薬量は、前記抗体類が単独薬剤療法として使用されるよりも少ない。
【０２１０】
具体的な実施形態において、治療の必要な領域に局所的に本発明の薬学的組成物を投与することが望ましいと考えられ；これは、例えば、限定はしないが、局所輸液、注射、または移植によって達成でき、前記移植は、シアラスチック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜、または繊維などの膜などの、多孔性、非多孔性、ゼラチン状材料のものである。本発明の抗体を投与する際、好ましくは、抗体または融合タンパク質が吸収されない材料を使用するように注意する必要がある。
【０２１１】
別の実施形態において、該粗製物は、小胞、特にリポソームで送達できる（Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３頁（１９９０）；Ｔｒｅａｔら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ、Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ編集、Ｌｉｓｓ、ニューヨーク、３５３−３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ、同文献、３１７−３２７頁を参照；同文献全体を参照）。
【０２１２】
さらに別の実施形態において、該組成物は、制御放出系または徐放性系で送達できる。当業者に公知の任意の方法が、本発明の１種または複数種抗体を含む徐放性製剤を製造するために使用できる。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号；ＰＣＴ国際公開第９１／０５５４８号；ＰＣＴ国際公開第９６／２０６９８号；Ｎｉｎｇｒａ，１９９６年、「Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｇｅｌ」Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ＆  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３９：１７９−１８９頁、Ｓｏｎｇら、１９９５年、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｌｕｎｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｌｏｎｇ−Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎ」、ＰＤＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｒｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５０：３７２−３９７頁；Ｃｌｅｅｋら、１９９７年、「Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｆｏｒ  ａ  ｂＦＧＦ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｐｒｏ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：８５３−８５４頁；およびＬａｍら、１９９７年、「Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｌｏｃａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｐｒｏ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：７５９−７６０頁を参照されたい。それらの各々は、参照としてその全体が本明細書に組み込まれている。一実施形態において、ポンプが、制御放出系において使用できる（Ｌａｎｇｅｒ、上記文献；Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７年、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０頁；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、１９８０年、Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７頁；およびＳａｕｄｅｋら、１９８９年、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４頁を参照）。別の実施形態において、ポリマー材料が、抗体の制御放出を達成させるために使用できる（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ編集、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．、フロリダ州Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ、Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ編集、Ｗｉｌｅｙ、ニューヨーク（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ、１９８３年、Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１頁を参照；またＬｅｖｙら、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０頁；Ｄｕｒｉｎｇら、１９８９年、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１頁；Ｈｏｗａｒｄら、１９８９年、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５頁；米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号��米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；ＰＣＴ国際公開第９９／１５１５４号；およびＰＣＴ国際公開第９９／２０２５３号を参照）。徐放性製剤に用いられるポリマー類の例としては、限定はしないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コ−ビニルアセテート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド類（ＰＬＧ）、ポリアンヒドリド類、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド類（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド類）（ＰＬＧＡ）、およびポリオルトエステル類が挙げられる。さらに別の実施形態において、制御放出系を、近接した治療標的内に置くことができ、したがって必要とするのは、全身用量の一部だけである（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、上記文献、２巻巻１１５−１３８頁（１９８４）を参照）。別の実施形態において、制御放出インプラントとして有用なポリマー材料が、Ｄｕｎｎら（米国特許第５，９４５，１５５号を参照）に従って用いられる。この特定の方法は、ポリマー系から生物活性物質をインサイチュで制御放出する治療効果に基づいている。この埋め込みは、一般に治療処置が必要な患者体内のどこにでも生じさせることができる。別の実施形態において、被験体の体内の非ポリマーインプラントが薬物送達系として使用される非ポリマー徐放送達系が用いられる。体内の埋め込みの際、インプラントの有機溶媒を、組成物から周囲の組織体液に放散、分散、または浸出させ、非ポリマー材料を徐々に凝固させるか、または沈殿させて固形の微孔性マトリックスを形成させる（米国特許第５，８８８，５３３号を参照）。
【０２１３】
制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３頁）によるレビューに考察されている。当業者に公知の任意の方法が、本発明の１種または複数種の治療剤を含む徐放性製剤を製造するために使用できる。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号；国際公開第９１／０５５４８号および国際公開第９６／２０６９８号；Ｎｉｎｇら、１９９６年、Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ＆  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３９：１７９−１８９頁；Ｓｏｎｇら、１９９５年、ＰＤＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５０：３７２−３９７頁；Ｃｌｅｅｋら、１９９７年、Ｐｒｏ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ、２４：８５３−８５４頁；およびＬａｍら、１９９７年、Ｐｒｏ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ、２４：７５９−７６０頁を参照されたい。それらの各々は、参照としてその全体が本明細書に組み込まれている。
【０２１４】
本発明の組成物が抗体をコードする核酸である具体的な実施形態において、適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、例えば、レトロウイルスベクター（米国特許第４，９８０，２８６号を参照）の使用、あるいは直接注射、または微小粒子衝撃の使用（例えば、遺伝子ガン；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）、または脂質または細胞表面受容体あるいは形質移入剤によるコーティング、または核に進入することが知られているホメオボックス様ペプチドに結合して投与すること（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら、１９９１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８６４−１８６８頁を参照）により、細胞内に入るように投与することにより、核酸をインビボ投与して、そのコード化抗体の発現を促進できる。あるいは、核酸は、細胞内に導入して、相同的組換えによる発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。
【０２１５】
抗体類に関して、被験体に投与される治療的または予防的有効投薬量は、典型的に０．１ｍｇ／ｋｇ（被験体の体重）から２００ｍｇ／ｋｇである。被験体に投与される投薬量は、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ（被験体の体重）から２０ｍｇ／ｋｇの間であり、被験体に投与される投薬量は、より好ましくは１ｍｇ／ｋｇ（被験体の体重）から１０ｍｇ／ｋｇの間であり、最も好ましくは５ｍｇ／ｋｇ（被験体の体重）から２５ｍｇ／ｋｇの間である。本発明の抗体類の投薬量および投与回数は、例えば、脂質化などの修飾により、抗体類または融合タンパク質の取込みおよび組織透過を増強させることによっても減少できる。
【０２１６】
本発明の抗体類の治療的または予防的有効量による被験体の治療は、単一治療を含み得るか、または、好ましくは、一連の治療を含み得る。好ましい例において、被験体は、約０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）から３０ｍｇ／ｋｇの間の範囲で、約１週から１０週の間、好ましくは２週から８週の間、より好ましくは３週から７週の間、さらにより好ましくは約４週、５週、または６週の間、週１回、本発明の抗体類により治療を受ける。他の実施形態において、本発明の薬学的組成物は、１日１回、１日２回、または１日３回投与される。具体的な好ましい実施形態において、被験体は、約５ｍｇ／ｋｇ（体重）から２５ｍｇ／ｋｇの間の範囲で７日間、本発明の抗体により治療を受ける。他の実施形態において、薬学的組成物は、週１回、週２回、２週毎に１回、月１回、６週毎に１回、２ヵ月毎に１回、年２回または年１回投与される。また、治療に用いられる抗体類の有効投薬量は、特定の治療過程にわたって増加または減少できることは認識されるであろう。
【０２１７】
（５．６．１  薬学的組成物）
本発明の組成物としては、薬学的組成物の製造に有用なバルク薬物組成物（例えば、不純または非滅菌組成物）および単位剤形の調製に使用できる薬学的組成物（すなわち、被験体または患者への投与に好適な組成物）を挙げることができる。このような組成物は、予防的または治療的有効量の、本明細書に開示された予防的薬剤および／または治療的薬剤またはこれらの薬剤と薬学的に受容可能なキャリアとの組合わせを含む。本発明の組成物は、予防的または治療的有効量の本発明の抗体類および薬学的に受容可能なキャリアを含むことが好ましい。
【０２１８】
特定の一実施形態において、薬学的組成物は、１つまたは複数種のフラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に結合する治療的有効量の抗体またはそのフラグメントおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む。別の実施形態において、前記薬学的組成物は、１種または複数種のさらなる予防的薬剤または治療的薬剤をさらに含む。
【０２１９】
具体的な実施形態において、用語の「薬学的に受容可能な」とは、動物、より特にヒトにおける使用に関して、連邦または州政府の規制当局により認可されているか、米国薬局方または他の一般的に認定された薬局方に掲載されていることを意味する。用語の「キャリア」とは、アジュバント、例えば、フロインドアジュバント（完全または不完全）、賦形剤、または治療剤が投与される媒体を称す。このような製薬用キャリアは、水およびピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などの石油、動物、植物または合成起源のものを含む油類など、滅菌液体であり得る。水は、薬学的組成物が静脈内に投与される場合の好ましいキャリアである。生理食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液はまた、液体キャリアとして、特に注射可能な溶液に関して使用できる。好適な製薬用賦形剤としては、澱粉、グルコース、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。所望ならば、組成物は、少量の加湿剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、液剤、懸濁液剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態をとることができる。
【０２２０】
一般に、本発明の組成物の成分は、活性剤の量を示しているアンプルまたはサッシェなどの気密密閉された容器中、例えば、凍結乾燥粉末または無水濃縮物として単位剤形で別々にまたは一緒に混合されて供給される。組成物を輸液により投与しようとする場合、滅菌製薬グレードの水または生理食塩水を含有する輸液用ボトルにより小出しすることができる。組成物が注射により投与される場合、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルは、投与前に成分を混合できるように提供できる。
【０２２１】
本発明の組成物は、中性または塩形態で製剤化できる。薬学的に受容可能な塩類としては、限定はしないが、塩酸、リン酸、酢酸、蓚酸、酒石酸などから誘導されたものなどのアニオン類で形成されたもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されたものなどのカチオン類で形成されたものが挙げられる。
【０２２２】
（５．７  抗体の特徴付けおよび治療的または予防的有用性の実証）
本発明の抗体類またはそれらのフラグメントは、種々の方法で特徴付けできる。特に、本発明の抗体類またはそれらのフラグメントは、ＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する能力に関してアッセイできる。このようなアッセイは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、１９９２年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１頁）、ビーズ上で（Ｌａｍ、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４頁）、チップ上で（Ｆｏｄｏｒ、１９９３年、ｎＡＴＵＲＥ  ３６４：５５５−５５６頁）、細菌上で（米国特許第５，２２３，４０９号）、スポア上で（米国特許第５，５７１，６９８号；米国特許第５，４０３，４８４号；および米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド上で（Ｃｕｌｌら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９頁）またはファージ上で（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０頁；Ｄｅｖｌｉｎ、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９；４０４−４０６頁；Ｃｗｉｒｌａら、１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６３７８−６３８２頁；およびＦｅｌｉｃｉ、１９９１年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０頁）（これら引用文献の各々は、参照としてその全体が本明細書に組み込まれている）実施できる。フラビウイルス抗原またはそのフラグメントに免疫特異的に結合された抗体類またはそれらのフラグメントを、次にフラビウイルス抗原に対する特異性および親和性に関してアッセイできる。
【０２２３】
本発明の抗体類またはそれらのフラグメントは、フラビウイルス抗原、特にＷＮＶ抗原に免疫特異性結合、および当該分野に公知の任意の方法による他の抗原との交差反応性に関してアッセイできる。免疫特異性結合および交差反応性を分析するために使用できる免疫アッセイとしては、限定はしないが、その少数を挙げると、ウェスタンブロット、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ免疫アッセイ、免疫沈澱アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定化アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光免疫アッセイ、タンパク質Ａ免疫アッセイなどの方法を用いた競合的および非競合的アッセイ系が挙げられる。このようなアッセイは、ルーチンであり、当該分野に周知である（例えば、参照としてその全体が本明細書に組み込まれているＡｕｓｕｂｅｌら編集、１９９４年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ社、ニューヨークを参照されたい）。代表的な免疫アッセイは、下記に手短に記載されている（限定する意図はないが）。
【０２２４】
免疫沈澱プロトコルは一般に、タンパク質ホスファターゼおよび／またはプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）で補足されたＲＩＰＡ緩衝液（１％のＮＰ−４０またはトリトンＸ−１００、１％トラシロール）などの細胞溶解緩衝液中に細胞集団を溶解し、タンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｇセファロースビーズを細胞溶解物に加えて４０℃で約１時間以上インキュベートし、細胞溶解緩衝液中でビーズを洗浄し、このビーズをＳＤＳ／サンプル緩衝液中に再懸濁することを含む。対象の抗体が特定の抗原を免疫沈澱させる能力は、例えば、ウェスタンブロット解析により評価できる。当業者は、抗体の抗原への結合を増加させ、バックグラウンドを減少させるために変更できるパラメータに関して認識できるであろう（例えば、細胞溶解物をセファロースビーズで予め除去すること）。さらに免疫沈澱プロトコルに関する考察について、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編集、１９９４年、１０．１６．１におけるＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社、ニューヨークを参照されたい。
【０２２５】
ウェスタンブロット解析は、一般にタンパク質サンプルの調製、ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質サンプルの電気泳動（例えば、抗原の分子量に依って８％〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、タンパク質サンプルのポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロンなどの膜への移動、  ブロッキング溶液（例えば、３％ＢＳＡとのＰＢＳまたは無脂肪ミルク）中での膜のブロッキング、洗浄緩衝液（例えば、ＰＢＳ−ツイーン２０）中での膜洗浄、ブロッキング緩衝液に希釈された一次抗体（対象の抗体）による膜のブロッキング、洗浄緩衝液中での膜洗浄、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）または放射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）に結合させた二次抗体（一次抗体、例えば、抗ヒト抗体を認識する）による膜のブロッキング、洗浄緩衝液中で膜の洗浄、および抗原の存在検出を含む。当業者は、シグナル検出を増加させバックグラウンドノイズを減少させるために変更できるパラメータに関して認識できるであろう。さらにウェスタンブロットプロトコルに関する考察について、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編集、１９９４年、１０．８．１におけるＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社、ニューヨークを参照されたい。
【０２２６】
ＥＬＩＳＡｓは、抗原の調製、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルの抗原によるコーティング、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）などの検出可能な化合物に結合させた対象の抗体の該ウェルへの添加および１時間のインキュベーション、抗原存在の検出を含む。ＥＬＩＳＡにおいて、対象の抗体は、検出可能な化合物に結合させる必要はなく；その代わり、検出可能な化合物に結合した二次抗体（対象の抗体を認識する）を該ウェルに添加できる。さらに該ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体をウェルにコーティングできる。この場合、対象の抗原のコーティングされたウェルに添加後、検出可能な化合物に結合した二次抗体を添加できる。当業者は、シグナル検出ならびに当該分野に公知のＥＬＩＳＡｓの他の変種を増加させ変更できるパラメータに関して認識できるであろう。さらにＥＬＩＳＡｓに関する考察について、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編集、１９９４年、１１．２．１におけるＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社、ニューヨークを参照されたい。
【０２２７】
抗体の抗原に対する結合親和性および抗体−抗原相互作用のオフ速度は、競合的結合アッセイにより判定できる。競合的結合アッセイの一例は、未標識抗原の増加量存在下で標識抗原（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）と対象の抗体とのインキュベーションおよび標識抗原に結合した抗体の検出を含む放射免疫アッセイである。ＷＮＶ抗原および結合オフ速度に関する本発明の抗体またはそのフラグメントの親和性は、スキャッチャードプロット解析によるデータから判定できる。二次抗体との競合はまた、放射免疫アッセイを用いて判定できる。この場合、ＷＮＶ抗原を、未標識二次抗体の増加量存在下で標識化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）に結合させた本発明の抗体およびそのフラグメントと共にインキュベートする。
【０２２８】
好ましい実施形態において、本発明の抗体類またはそれらのフラグメントのＷＮＶ抗原に対する結合およびオフ速度を判定するために、ＢＩＡＣＯＲＥの動態学的解析が使用される。ＢＩＡＣＯＲＥの動態学的解析は、チップからのＷＮＶ抗原とそれらの表面上に固定化された抗体類またはそれらのフラグメントとの結合および解離を解析することを含む。
【０２２９】
本発明の抗体類またはそれらのフラグメントはまた、当業者に公知で本明細書に例示された方法を用いて、フラビウイルス抗原のその宿主細胞受容体への結合を阻害する能力に関してアッセイできる。例えば、ＷＮＶに対する受容体を発現する細胞は、抗体またはそのフラグメントの存在下または不在下でＷＮＶと接触でき、抗体またはそのフラグメントがＷＮＶ結合を阻害する能力は、例えば、流動細胞計測法またはシンチレーションアッセイにより測定できる。ＷＮＶ（例えば、Ｅタンパク質などのＷＮＶ抗原）または抗体もしくはそのフラグメントは、放射標識（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、および１２５Ｉ）または蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒドおよびフルオレスカミン）などの検出可能化合物により標識でき、ＷＮＶとその宿主細胞受容体との間の相互作用の検出が可能になる。あるいは、無細胞アッセイにおいて、抗体類またはそれらのフラグメントが、その受容体への結合からＷＮＶを阻害する能力を判定できる。例えば、ＷＮＶまたはＷＮＶ抗原は、抗体またはそのフラグメントと接触でき、抗体または抗体フラグメントが、その宿主細胞受容体への結合からＷＮＶまたはＷＮＶ抗原を阻害する能力を判定できる。抗体または抗体フラグメントは、固体支持体上に固定化されることが好ましく、ＷＮＶまたはＷＮＶ抗原は、検出可能な化合物により標識される。あるいは、ＷＮＶまたはＷＮＶ抗原は、固体支持体上に固定化され、抗体またはそのフラグメントは、検出可能な化合物により標識される。ＷＮＶまたはＷＮＶ抗原を、部分的または完全に精製できるか（例えば、部分的または完全に他のポリペプチド類が無い）、または細胞溶解物の一部を精製できる。さらに、ＷＮＶ抗原は、ＷＮＶ抗原およびグルタチオニン−Ｓ−トランスフェラーゼなどのドメインを含む融合タンパク質であり得る。あるいは、ＷＮＶ抗原は、当業者に周知の方法を用いてビオチン化できる（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；イリノイ州ロックフォード）。
【０２３０】
本発明の抗体類またはそれらのフラグメントは、ヒトに使用する前に所望の治療活性または予防活性に関してインビトロ、次いでインビボで試験することが好ましい。例えば、本発明の特定の抗体または組成物の投与が適応されるかどうかを判定するために使用できるインビトロアッセイは、対象の組織サンプルを培養で増殖させ、本発明の抗体または組成物に曝露させるか、あるいは投与するインビトロ細胞培養アッセイを含み、組織サンプルに対するこのような本発明の抗体または組成物の効果が観察する。種々の具体的な実施形態において、本発明の抗体または組成物が、このような細胞タイプに対して所望の効果を有するかどうかを判定するために、ＷＮＶ感染に関与する細胞タイプのうちで代表的な細胞により、インビトロアッセイが実施できる。本発明の抗体類または組成物はまた、ヒトへの投与前にインビトロアッセイおよび動物モデル系で試験されることが好ましい。具体的な実施形態において、１００ｐｆｕから１００ｐｆｕのＷＮＶで誘発されたマウスに、本発明の抗体またはそのフラグメント、あるいは本発明の組成物を投与し、４日後またはそれ以後にマウスを殺処理し、ＷＮＶ力価および抗ＷＮＶ抗体の血清中力価を測定する。
【０２３１】
本発明によれば、本発明の抗体類またはそれらのフラグメントの予防的有効性および／または治療的な有効性を立証するために、ヒト被験体での臨床試験を実施する必要はない。抗体類またはそれらのフラグメントを用いるインビトロおよび動物モデル試験はヒトに外挿でき、前記抗体類または抗体フラグメントの予防的および／または治療的有用性を立証する上で十分である。
【０２３２】
治療に使用のために本発明の抗体類または組成物を、限定はしないが、ラット、マウス、ウシ、サル、およびラビットなど、好適な動物モデル系におけるそれらの毒性に関して試験できる。抗体または組成物の毒性のインビボ試験をするために、当該分野に公知の任意の動物モデル系を使用できる。
【０２３３】
ウイルス感染の治療または予防における有効性は、ウイルスの複製を阻害し、伝染を阻止し、またはウイルスがその宿主においてそれ自体を確立することを防ぎ、ＷＮＶ感染の発生率を減少させ、またはＷＮＶ感染に関連する１つまたは複数の症状を予防し、寛解し、または改善する本発明の抗体または組成物の能力を検出することにより立証できる。この治療は、例えば、ウイルス負荷の減少、１つまたは複数の症状の寛解、ＷＮＶ感染継続期間の減少、または本発明の抗体または組成物の投与後の死亡率および／または罹患率の減少がある場合に治療的であると考えられる。さらに、この治療は、１つまたは複数種のＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する１種または複数種の抗体またはフラグメントの投与後の免疫応答の増大がある場合に治療的であると考えられる。
【０２３４】
本発明の抗体類または組成物は、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５などのサイトカイン類の発現を誘導する能力に関してインビトロおよびインビボで試験できる。サイトカイン類の発現レベルを測定するために、当業者に公知の方法を使用できる。例えば、サイトカイン類の発現レベルは、サイトカイン類のＲＮＡレベルを分析することにより、例えば、ＲＴ−ＰＣＲおよびノーザンブロット解析により、またサイトカイン類の濃度を分析することにより、例えば、免疫沈澱に次いでウェスタンブロット解析およびＥＬＩＳＡにより測定できる。
【０２３５】
本発明の抗体類または組成物は、免疫細胞、好ましくはヒト免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞）の生物活性を調節する能力に関してインビトロおよびインビボで試験できる。免疫細胞の生物活性を調節するための本発明の抗体または組成物の能力は、抗原発現の検出、免疫細胞の増殖の検出、シグナル化分子の活性の検出、免疫細胞のエフェクター機能の検出、または免疫細胞分化の検出により評価できる。これらの活性を測定するために、当業者に公知の方法を使用できる。例えば、細胞増殖は、３Ｈ−チミジン組み込みアッセイおよびトリパンブルー細胞数により評価できる。抗原発現は、例えば、限定はしないが、ウェスタンブロット、免疫組織化学放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈澱アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、タンパク質Ａ免疫アッセイおよびＦＡＣＳ解析などの方法を用いる競合的および非競合的アッセイ系などの免疫アッセイにより評価できる。シグナル化分子の活性化は、例えば、キナーゼアッセイおよび電気穿孔シフトアッセイ（ＥＭＳＡｓ）によりアッセイできる。
【０２３６】
本発明の抗体類または組成物は、ウイルス複製を阻害するか、またはインビトロ、エキソビボおよびインビボアッセイでウイルス負荷を減少させるそれらの能力に関しても試験できる。本発明の抗体類または組成物は、ＷＮＶ感染の時間経過を減少させる能力に関しても試験できる。本発明の抗体類または組成物は、ＷＮＶ感染を患っているヒトの生存期間を、少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％増加させる能力に関しても試験できる。さらに本発明の抗体類または組成物は、ＷＮＶ感染を患っているヒトの入院期間を、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％減少させる能力に関しても試験できる。当業者に公知の方法は、本発明の抗体類または組成物をインビボで分析するために使用できる。
【０２３７】
（５．８  抗体の診断利用）
ＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する標識抗体、それらのフラグメントならびに誘導体およびアナログは、ＷＮＹ感染を検出し、診断し、またはモニターするための診断目的に関して使用できる。本発明は：（ａ）ＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する１種または複数種の抗体またはそれらのフラグメントを用いて対象の細胞または組織サンプル中のＷＮＶ抗原の発現をアッセイすること；および（ｂ）ＷＮＶ抗原の対照濃度と比較して、アッセイされたＷＮＶ抗原濃度の増加がＷＮＶ感染を示すことから、対照レベル、例えば、ＷＮＶで感染されていない正常組織サンプル中の濃度とＷＮＶ抗原濃度とを比較すること、を含むＷＮＶ感染の検出を提供する。
【０２３８】
本発明は：（ａ）ＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する１種または複数種の抗体またはそれらのフラグメントを用いて個人の細胞または組織サンプル中のＷＮＶ抗原濃度をアッセイすること；および（ｂ）ＷＮＶ抗原の対照濃度と比較してアッセイされたＷＮＶ抗原濃度の増加がＷＮＶ感染を示すことから、対照濃度、例えば、ＷＮＶで感染されていない正常組織サンプル中の濃度とＷＮＶ抗原濃度とを比較すること、を含むＷＮＶ感染を診断するための診断アッセイを提供する。ＷＮＶ感染のより決定的な診断により、保険専門医が予防手段または早期攻撃的治療を使用でき、それによってＷＮＶ感染の発生またはさらなる進行を防止できる。
【０２３９】
本発明の抗体類またはそれらのフラグメントは、本明細書に記載されているか、または当業者に公知である古典的な免疫組織学的方法（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎら、１９８５年、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５頁；およびＪａｌｋａｎｅｎら、１９８７年、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６頁を参照）を用いて生物学的サンプル中のＷＮＶ抗原濃度をアッセイするために使用できる。タンパク遺伝子発現を検出するのに有用な他の抗体ベースの方法としては、酵素結合の免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）などの免疫アッセイが挙げられる。好適な抗体アッセイ標識は、当該分野に公知であり、グルコースオキシダーゼなどの酵素標識；ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチュウム（３Ｈ）、インジウム（１２１Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ）などの放射性同位元素；ルミノールなどの発光標識；フルオレセインならびにローダミンなどの蛍光標識、およびビオチンが挙げられる。
【０２４０】
本発明の一態様は、ヒトにおけるＷＮＶ感染の検出および診断である。一実施形態において、診断は：（ａ）ＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する有効量の標識抗体またはそのフラグメントを対照に投与すること（例えば、非経口的に、皮下的に、または腹腔内的に）；（ｂ）ＷＮＶ抗原が発現される対象の部位に優先的に集中させるために、標識抗体またはそのフラグメントを、投与後、ある時間間隔、待機させること（未結合の標識分子をバックグラウンド濃度まで取り除くために）；（ｃ）バックグラウンド濃度を決定すること；（ｄ）バックグラウンド濃度を超える標識抗体またはそのフラグメントの検出により、対象がＷＮＶ感染を有することを示すように、対象における標識抗体またはそのフラグメントを検出すること、を含む。バックグラウンド濃度は、特定のシステムに関して以前に決定された基準値に対して検出された標識分子量を比較することなど、種々の方法により決定できる。
【０２４１】
対象のサイズおよび使用される画像システムが、診断画像を生じさせるために必要とされる画像部分量を決定することは当該分野に解されるあろう。ヒト対象に関して放射性同位元素部分の場合、注入される放射活性量は、通常約５ミリキューリーから２０ミリキューリーの範囲の９９Ｔｃとなる。次に標識抗体または抗体フラグメントは、特定のタンパク質を含有する細胞の位置に優先的に蓄積される。インビボ腫瘍画像は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｍｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」、腫瘍画像における１３章：Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌ  ａｎｄ  Ｂ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編集、Ｍａｓｓｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社（１９８２）に記載されている。
【０２４２】
使用される標識タイプおよび投与様式など幾つかの変数に依って、標識部位を対象の部位で優先的に集中させるための、また未結合の標識分子をバックグラウンド濃度まで取り除くための投与後の時間間隔は、６時間から４８時間または６時間から２４時間または６時間から１２時間である。別の実施形態において、投与後の時間間隔は、５日から２０日または５日から１０日である。
【０２４３】
一実施形態において、例えば、最初の診断から１ヵ月後、最初の診断から６ヵ月後、最初の診断から１年後など、ＷＮＶ感染を診断する方法を繰り返すことにより、ＷＮＶ感染のモニタリングを実施する。
【０２４４】
インビボスキャニングに関して当該分野に公知の方法を用いて、対象における標識分子の存在を検出できる。これらの方法は、使用される標識タイプに依存する。熟練技術者は、特定の標識を検出する適切な方法を決めることができるであろう。本発明の診断方法に使用できる方法およびデバイスとしては、限定はしないが、コンピュータ化トモグラフィ（ＣＴ）、ポジトロン放出トモグラフィ（ＰＥＴ）、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、および断層撮影が挙げられる。
【０２４５】
具体的な実施形態において、該分子を、放射性同位元素により標識し、放射応答性外科用器械を用いて患者において検出する（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国特許第５，４４１，０５０号）。別の実施形態において、該分子を、蛍光により標識し、蛍光応答性スキャニング用器械を用いて患者において検出する。別の実施形態において、該分子を、ポジトロン放出金属により標識し、ポジトロン放出トモグラフィを用いて患者において検出する。さらに別の実施形態において、該分子を、常磁性標識により標識し、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）を用いて患者において検出する。
【０２４６】
（５．８．  キット）
本発明はまた、本発明の組成物の１種または複数種の成分を充填した１個または複数個の容器を含むキットを提供する。
【０２４７】
本発明は、上記の方法に使用できるキットを提供する。一実施形態において、キットは、１個または複数個の容器に本発明の抗体、好ましくは、精製抗体を含む。別の実施形態において、キットは、ＷＮＶ抗原に免疫特異的に結合する抗体フラグメントを含む。具体的実施形態において、本発明のキットは、ＷＮＶ抗原と反応しない対照抗体をさらに含むことが好ましい。別の具体的実施形態において、本発明のキットは、抗体のＷＮＶ抗原への結合を検出する手段を含む（例えば、該抗体は、蛍光化合物、酵素基質、放射活性化合物、または発光化合物などの検出可能な基質に結合できるか、または第一の抗体を認識する第二の抗体を、検出可能な基質に結合できる）。具体的実施形態において、キットは、組換え産生または化学合成されたＷＮＶ抗原を含むことができる。キット内に提供されたＷＮＶ抗原は、固形支持体にも結合できる。より具体的実施形態において、上記キットの検出手段は、ＷＮＶ抗原を結合させる固形支持体を含む。このようなキットは、非結合レポーター標識抗ヒト抗体を含むこともできる。この実施形態において、抗体のＷＮＶ抗原への結合は、前記レポーター標識抗体の結合により検出できる。
【０２４８】
さらなる実施形態において、本発明は、ＷＮＶ抗原を含有するスクリーニング血清中での使用のための診断用キットを含む。該診断用キットは、ＷＮＶ抗原と特異的に免疫反応性である実質的に単離された抗体、およびＷＮＶ抗原の該抗体への結合を検出する手段を含む。一実施形態において、該抗体を、固形支持体に結合させる。具体的実施形態において、該抗体は、モノクローナル抗体であり得る。キットの検出手段は、第二の標識モノクローナル抗体を含み得る。あるいは、またはさらに、検出手段は、標識競合的抗原を含み得る。
【０２４９】
一診断形態において、試験血清は、本発明の方法により得られた表面結合ＷＮＶ抗原を有する固相試薬と反応させる。ＷＮＶ抗原を特定の抗体に結合させた後、未結合血清成分を洗浄により除去し、レポーター標識抗ヒト抗体を添加し、未結合抗ヒト抗体を洗浄により除去し、試薬をレポーター標識抗ヒト抗体と反応させて固形支持体上の結合抗ＷＮＶ抗原抗体量に比例してレポーターを試薬に結合させる。典型的に、該レポーターは、好適な蛍光性、発光性または比色基質（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）の存在下、固相をインキュベートすることにより検出される酵素である。
【０２５０】
上記アッセイにおける固体表面試薬は、ポリマービーズ、計量棒、９６ウェルプレートまたはフィルタ材料などの固形支持体材料にタンパク物質を結合させる公知の方法により調製される。これらの結合方法は一般に、例えば、活性化カルボキシル基、ヒドロキシル基、またはアルデヒド基などの固形支持体上の化学的反応基に対する、典型的には遊離アミン基を介した支持体へのタンパク質の非特異的吸着またはタンパク質の共有結合を含む。あるいは、ストレプトアビジンコーティングプレートを、ビオチン化抗原と関連させて使用できる。
【０２５１】
このように本発明は、この診断法を実施するためにアッセイシステムまたはキットを提供する。キットは一般に、表面結合抗ＷＮＶ抗原抗体を検出するために表面結合組換えＷＮＶ抗原、およびレポーター標識抗ヒト抗体を有する支持体を含む。
【０２５２】
当業者にとって明らかであろうが、本発明の多くの修飾体および変化体は、その精神および範囲から逸脱することなく作製できる。本明細書に記載された具体的な実施形態は、例としてのみ提供され、また本発明は、添付の請求項ならびにこのような請求項に与えられる全範囲の等価物に関してのみ限定される。
【０２５３】
科学刊行物、特許出願、および特許などの種々の文献が、本明細書に引用されており、それらの開示は、参考としてその全体が本明細書中に援用される。
【実施例】
【０２５４】
（６．実施例）
（６．１  組換えＷＮＶ  ＥおよびＮＳ１タンパク質の発現）
実験計画は、ＷＮＶの１９９９年のニューヨーク株由来の組換えＥおよびＮＳ１タンパク質を発現するように考案された（図１ＡおよびＢ）。ＷＮＶ  Ｅタンパク質の最初の１２９０のヌクレオチドおよびＷＮＶ  ＮＳ１の完全遺伝子（１０５６のヌクレオチド）を、ＰＣＲにより、それらの内因性分泌シグナル配列にフレーム内融合し、バキュロウイルスシャトルベクター（ｐＦａｓｔＢａｃ）中のポリヘドリンプロモーターの下流、ヒスチジン反復の上流にクローン化した。発現後、切断Ｅタンパク質は、膜ドメインに関連するＣ末端７１のアミノ酸を欠いている（Ｄｅｌｅｎｄａら、１９９４年、Ｊ  ＧｅｎＶｉｒｏｌ  ７５：１５６９−７８頁）。
【０２５５】
ＷＮＶ  ＥまたはＮＳ１遺伝子を含有する組換えバキュロウイルスを生成し、昆虫ＳＦ９またはＨｉ−５細胞を感染させるために用いた。ＳＦ９上澄液を採取し、ニッケル−アフィニティクロマトグラフィ、ゲルろ過およびイオン交換によりＥまたはＮＳ１タンパク質を精製するために用いる（図１ＡおよびＢ）。
【０２５６】
（６．２  ＷＮＶタンパク質に対するｍＡｂの生成）
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、炭水化物および脂質ベースアジュバント（ＲＩＢＩ）を用いて精製ＷＮＶタンパク質により３週間隔で３回免疫化した。固相ＥまたはＮＳ１タンパク質ベースＥＬＩＳＡを用いてポリクローナル抗体応答を測定することにより、候補免疫マウスを確認した。高力価ポリクローナル（１／１０，０００）応答を有するマウスに、精製ＥまたはＮＳ１タンパク質を静脈内注入した。脾細胞を採取し、標準プロトコル（Ｈａｒｌｏｗら、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールドスプリングハーバー）に従って非分泌Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６．５．３に融合させた。凡そ１２００のハイブリドーマを、精製ＥまたはＮＳ１タンパク質に対する結合に関して、またＷＮＶ感染ＢＨＫ２１細胞との免疫反応性に関してスクリーニングした。これらの試験から、ＷＮＶ  Ｅタンパク質に対して３４の抗体およびＷＮＶ  ＮＳ１（ＷＮＶ  ＮＳ１／１、ＩｇＧ１ｋ）に対して２１の抗体を得た。
【０２５７】
さらなる特徴付けを受けたこれらのサブセットの性質（アイソタイプ化、ドメインＩＩＩに対するマッピング、中和活性、感染細胞の補体媒介細胞溶解）を表１Ａおよび１Ｂに示す。
【０２５８】
【表１Ａ】
2008504029.tif 000004
【０２５９】
【表１Ｂ】
2008504029.tif 000005
（６．３  抗体のドメインマッピング）
抗体マッピングアッセイは、ＷＮＶ  Ｅタンパク質の全外部ドメインまたはドメインＩＩＩ単独だけの酵母表面ディスプレーを用いて開発された。酵母細胞壁の外表面上のタンパク質発現は、タンパク質ライブラリー構築に有用な方法であり、タンパク質の定方向進展を可能にする（Ｇｅｓｓｎｅｒら、１９９８年、Ａｎｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ７６：２３１−４８頁；Ｇｏｌｌｉｎｓら、１９８４年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１２６１−１２７２頁）。細菌発現系と対照的に、真核生物の複雑な細胞外タンパク質は、有効なジスルフィド結合を有する酵母表面上および翻訳後修飾によって発現できる。この方法を用いて、ＷＮＶのニューヨーク１９９９年株の外部ドメイン（Ｅ１−Ｅ４１５）またはドメインＩＩＩ（Ｅ２９６−Ｅ４１５）を、酵母ディスプレイベクターｐＹＤ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化して発現させ、予備的抗体マッピング試験を開始した（図１３）。最初の試験により、選択培地への配置２４時間以内に酵母表面上にＥ外部ドメインおよびドメインＩＩＩ双方の高レベル発現が示された。このアッセイを用いて、全ての強中和ｍＡｂｓを含む１４のｍＡｂ類が、ドメインＩＩＩ内の部位に予備的にマップ化された。
【０２６０】
図１４ＡおよびＢは、流動細胞計測法により測定されたＥ１６接触残基の酵母マッピングを示している。一連の流動細胞計測法の分類を、ドメインＩＩＩの変異誘発ｃＤＮＡライブラリーにより実施した。第１の分類前、ドメインＩＩＩ陽性酵母の＜１％は、ＷＮＶ  Ｅ１６陰性であった。第２の分類前、ドメインＩＩＩ陽性酵母の＞８５％は、ＷＮＶ  Ｅ１６ではなくてポリクローナル抗体によって認識された。クローン１７とのＥ１６接触残基の酵母マッピングを図１４Ｂに示してある。ＷＮＶ  Ｅ１６への結合を欠くが、１４の他のドメインＩＩＩ抗体への結合を保持した、酵母クローンを発現する単一ドメインＩＩＩを単離した。ＷＮＶ  Ｅ１６への結合プロフィルおよび４種の他の例示的な抗体を示している。このクローンは、Ｔ３３２Ｍ変異を有しており、したがってＷＮＶ  Ｅ１６に対する接触残基の１つは、３３２位にある。
【０２６１】
（６．４  モノクローナル抗体類によるＷＮＶ感染の中和）
ＭＡＢ類は、ＢＨＫ２１細胞中のプラーク還元中和力価（ＰＲＮＴ）アッセイを用いてＷＮＶ感染を中和する相対能力に関して評価した。モノクローナル抗体類の連続希釈液を、１００ＰＦＵのＷＮＶニューヨーク株と共にインキュベートした。１時間後、ウイルス＋抗体をＢＨＫ細胞に加えた。アガロース上塗り層を加えた後、細胞を３日間インキュベートし、プラークをクリスタルバイオレット溶液で染色し、肉視でスコア化した。注目すべきことに、４種のｍＡｂ類（ＷＮＶ  Ｅ７、ＷＮＶ  Ｅ１６、ＷＮＶ  Ｅ２４、およびＷＮＶ  Ｅ３４）は、凡そ１／１０，０００のプラーク還元中和力価（ＰＲＮＴ５０）値で反映されたように、ウイルス感染を強く阻止した（図１５、データは示していない）。以前の試験では、系列ＩのＷＮＶを中和した一定のｍＡｂ類は、系列ＩＩのＷＮＶ株を効率的に中和しないことが示されていた（Ｂｅａｓｌｅｙら、２００１年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２７９：４４７−５８頁）。新たに単離された中和ｍＡｂ類が、より広い特異性を有するかどうかを評価するために、我々は、ＷＮ９５６Ｄ１１７  ３Ｂ（Ｐｅｉｒｉｓら、１９８１年、Ｎａｔｕｒｅ２８９：１８９−１９１頁；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、２００３年、Ｊａｍａ  ２９０：５２４−８頁）、系列ＩＩのＷＮＶ株を中和する能力を試験した。ＷＮＶ  Ｅ７およびＷＮＶ  Ｅ１６は、双方の系列からのＷＮＶ株を０．１μｇ／ｍｌ（０．７ｎＭ）の範囲のＰＲＮＴ５０値で強力に中和した。
【０２６２】
（６．５  ウイルス粒子の抗体依存補体媒介中和および感染細胞の溶解）
補体固定は中和を増大させ、インビボでの予防を増強させることから、補体を固定し、ウイルスを中和し、または感染細胞を溶解する抗ＷＮＶ  ｍＡｂ類の能力を調べた。補体固定化によってＷＮＶウイルス粒子が直接中和されるかどうかを判定するために、既存のプラーク還元アッセイを改変した。ウサギ補体を、ハムスター腎上皮細胞の単層（ＢＨＫ２１−１５）へ添加する前に、ＷＮＶ  Ｅに対するｍＡｂ類の存在または不在下でＷＮＶビリオンと共に予めインキュベートした。抗体類の不在下で、ウイルスプラークにおける用量依存還元が見られ；感染ウイルスの凡そ６０％が、２５％（ｖ／ｖ）溶液の補体とのインキュベーション後に中和された。ＷＮＶ  Ｅタンパク質に対する１０％（ｖ／ｖ）溶液の補体および中和不十分な補体固定ｍＡｂ（ＷＮＶ  Ｅ１、ＩｇＧ２ａ）の存在下で、ウイルスの感染力を完全に消滅させた（図１６Ａ）。ＷＮＶ（２Ｅ１１、ＳＡＲＳ−ＣｏＶの抗ＯＲＦ７ａ）に対する結合または補体（ＷＮＶ  Ｅ８、ＩｇＧ１）を効率的に固定する能力のいずれかを欠いた対照抗体は、さらなる補体媒介中和化を示さなかった。
【０２６３】
（６．５．２  ＷＮＶ感染細胞の溶解）
補体が直接ＷＮＶを中和する程度を評価することに加えて、我々はまた、流動細胞計測法標的細胞アッセイ（Ｈａｒｉｎａｓｕｔａら、１９８５年、Ｓｏｕｔｈｅａｓｔ  Ａｓｉａｎ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  １６：３３２−６頁）を用いて感染細胞の溶解を開始させるその能力を評価した。ＷＮＶにより感染した細胞は、それらの細胞表面上にＥタンパク質を発現し（データは示していない）、したがって、古典的なレシチン、あるいは補体の活性化経路に関する標的であり得る。ＭＣ５７ＧＬマウス線維芽細胞を、ＷＮＶに偽感染または感染させ、ＷＮＶに対する補体固定ｍＡｂｓの存在または不在下でウサギ補体と共にインキュベートした。２時間後、細胞をヨウ化プロピジウムと共にインキュベートし、死細胞のパーセンテージを、流動細胞計測法により測定した。抗体の不在下で補体が高濃度（２５％溶液）であっても、ＷＮＶ感染細胞の特異的な細胞溶解は見られなかった（図１６Ｂ）。対照的に、補体固定抗ＷＮＶ  ＥｍＡｂ類（それぞれＷＮＶ  Ｅ１およびＷＮＶ  Ｅ１６、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ）の添加により、低濃度（５％溶液）の補体で、ＷＮＶ感染の急速な死滅を生じたが、非感染標的は死滅させなかった。重要なことに、関連性のないウイルス抗原（２Ｅ１１、ＳＡＲＳ  ＣｏＶのＯＲＦ７ａ）に対する補体固定抗体の添加では、感染細胞の溶解は引き起こされなかった。
【０２６４】
（６．６  ＷＮＹ抗体の予防試験）
最初の融合からのｍＡｂのＷＮＶ  Ｅ１およびＷＮＶ  Ｅ２を、致死的ＷＮＶ感染からマウスを防護する能力に関して評価した。インビトロで、ＷＮＶ  Ｅ１は、弱い中和活性を示し、ＷＮＶ  Ｅ２では、中和活性を検出できなかった。インビボでのこれらｍＡｂ類の阻害能力を判定するために、野生型（５週齢）Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、感染前に１ｍｇのＷＮＶ  Ｅ１、ＷＮＶ  Ｅ２、またはＷＮＶ  ＮＳ１のｍＡｂ類により予め処理してから、１０２ＰＦＵのＷＮＶを接種した。陰性対照として、マウスはまた、ＤＥＮタイプ３Ｅタンパク質に対する１ｍｇのｍＡｂにより前処理した。ＷＮＶ  Ｅ１およびＮＳ１は、感染に対して９０％防護および５０％防護を示したが（図２ＡおよびＢ）、一方、ＷＮＶ  Ｅ２または抗ＤＥＮ  ｍＡｂは、防護しなかった。ＷＮＶに対する個々のｍＡｂ類は、感染前に投与された場合、全てではないが幾つかが防護を提供できることが、これらの試験により立証された。
【０２６５】
（６．６．１  用量応答試験）
ＷＮＶ  Ｅ１６およびＥ２４モノクローナル抗体の防護についての用量応答は、図２０に見られる。５週齢のｐｌｄ  Ｃ５７６ＢＬ／６マウスを、１０２ＰＦＵのＷＮＶに感染させた。４８時間後、マウスにモノクローナル抗体またはＰＢＳの単回指定用量を接種してから、生存を追跡した。各マウスの条件で、Ｎ＝２０。
【０２６６】
（６．７  ＷＮＶ  Ｅ１６  ＭＡＢ  ＩＮ  ｓＩｇＭ−／−および野生型マウスによる治療試験）
ＷＮＶに対して中和活性を有するヒト免疫γ−グロブリンを有するマウスの曝露後の治療が、マウスの死亡に対する有意な防護をもたらすことは以前に立証されている（Ｄｉａｍｏｎｄ、２００３年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８１：１９６−２０６頁）。さらに、ＩｇＭ（ｓＩｇＭ−／−マウス）を分泌する能力を欠いたマウスは、完全にＷＮＶ感染感受性（１００ＰＦＵのウイルスによる接種後１００％の死亡率）であり、これが、ＷＮＶに対する中和抗体を含有した血清の受動的移入により防護された（Ｄｅｌｅｎｄａら、１９９４年、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７５：１５６９−７８頁）。ＰＲＮＴアッセイに基づいて、ＷＮＶ  Ｅ１６は、一群において最も効力のある中和性ｍＡｂであり：このｍＡｂは、以前に利用されたヒトγ−グロブリン製剤よりも約１０００倍以上の効力がある。ＷＮＶ  Ｅ１６が、進行中のＷＮＶ感染を治療し得る有効性を評価するために、ｓＩｇＭ−／−マウスにおいて感染を阻止する能力を試験した。最初の感染４８時間後に単回用量を投与すると、ＷＮＶ  Ｅ１６は、全ての動物を死亡から防護したが、一方、非結合アイソタイプ制御ｍＡｂ（抗ＳＡＲＳ  ｍＡｂ）で処置されたものは全て１２日目までに感染で死亡した（図１７、左枠）。野生型マウスにおいて、ＷＮＶ  Ｅ１６は、感染２日または４日後に投与された場合、致死に対する有意な防護を提供した（図１７、右枠）。防護レベルは、イスラエルヒト免疫γ−グロブリンを有する同一のモデルに見られたものよりも優っていた。
【０２６７】
ＷＮＶ  Ｅ１６およびＥ２４のｍＡｂ類の治療試験を、図２１に示してある。５週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、１０２ＰＦＵのＷＮＶを感染させた。感染２日または４日後に、ＰＢＳ、抗ＳＡＲＳ  ７ａ（０．５ｍｇ）、抗ＷＮＶ  Ｅ１６またはＥ２４（０．５ｍｇ）、または抗ＷＮＶ  Ｅ１６＋Ｅ２４（各０．２５ｍｇ）の単回用量を投与した。引き続き、マウスの生存を追跡した。各マウスの条件で、Ｎ＝２０。括弧内は、生理食塩水または陰性ｍＡｂ対照からの有意差（Ｐ＜０．００１）を示している。
【０２６８】
（６．８  野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける西ナイル脳炎のモデル）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＷＮＶ感染モデルは、ヒト疾患に相似している。皮下接種１週後、マウスは、全身的感染およびＣＮＳ感染を発症させ、あるサブセットでは、麻痺または死まで進行する。ヒトと同様、感染マウスは、ＣＮＳにおける高ウイルス負荷を生じる。感染に屈したマウスは、毛の逆立て、体重減少、脊柱後弯姿勢、および四肢の麻痺など、死亡数日前、同様の臨床徴候を示す。動物の齢および免疫応答の成熟度は、ＷＮＶ感染に対する感受性に影響を及ぼす。より若いマウスでは、ＷＮＶ感染後の死亡率が増加した：４週齢未満のマウスは、感染に対して一様に死亡したが、一方、５週齢および８週齢のマウスは、それぞれ８５％と３５％の死亡率を有した（データは示していない）。
【０２６９】
ＷＮＶの病因を明瞭にするために、接種後にＷＮＶがたどる経路を特徴付けした。ウイルスＲＮＡおよび感染性ウイルスを測定するために、組織ホモジネートに対するリアルタイムの蛍光発生的ＲＴ−ＰＣＲおよびウイルスプラークを用いた。実験は、インビボでのウイルス向性を測定するためにＧＦＰマーカータンパク質（未公表観察）を発現するＷＮＶにより開始した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの足蹠接種後、ウイルス複製は、最初、膝窩および鼠径部結節に見られた。感染の２日から４日以内に、ウイルスＲＮＡおよび感染性ウイルスが、血清、脾臓および腎臓に検出された。感染６日後までに、ウイルスは、脳、脊髄下部および上部を含むＣＮＳの幾つかの部位に見られた。その後（８日目およびその後）、ウイルスＲＮＡの極めて高い存在量が、脳および脊髄に検出された（図４）。
【０２７０】
（６．９  免疫不全マウスにおける西ナイル感染）
（６．９．１  ＲＡＧ１マウス）
該免疫系が、ＷＮＶ感染を防ぐ方法を理解するために、遺伝子導入免疫不全マウスを感染させ、最初の実験を、Ｂ細胞およびＴ細胞の双方を欠くＲＡｇ１マウスにおいて実施した。試験された最低用量（１０２ＰＦＵ）でも、感染に対して１００％の成体ＲＡＧ１マウスが急速に死亡した（図５Ａ）。ウイルス学的分析により、感染動物の脳内に極めて高い力価のＷＮＶ（組織の＞１０８ＰＦＵ／ｇ）が示された（データは示していない）。未処置脾細胞ではなくて養子免疫細胞移入は、散在性感染、罹患および致死に対してＲＡＧ１マウスを防護した。興味深いことに、ＷＮＶに対して特異的な抗体を産生し、免疫された野生型マウスから得られたＢ細胞（４ｘ１０６細胞、＞９５％純度）は、養子細胞移入後の致死的ＷＮＶ感染から、かなりのＲＡＧ１マウスを救助した（データは示さず）。
【０２７１】
（６．９．２  Ｂ細胞欠損（μＭＴ）マウス）
ＲＡＧ１マウスは感染し易く、ＷＮＶ感染を制御する上でＢ細胞の役割を判定するために実験を実施した。Ｂ細胞（株μＭＴ）を欠いたＣ５７ＢＬ／６マウスは、致死的感染に対して脆弱性であり：全ての動物は、１０２ＰＦＵまたは１０６ＰＦＵのいずれにおいても感染に対して死亡した（図５Ｂ）。感染に対する脆弱性は、１ＰＦＵ用量で接種後、動物の５０％死亡（ＬＤ５０）によって表された（データは示していない）。以下の幾つかの観察が注目された：（ａ）野生型マウスにおいて、皮下感染後２日目にウイルス血症が検出されたが、６日目までに急速に検出レベル以下に減少した。μＭＴマウスにおいて、感染性ウイルスの同等レベル（約１０２ＰＦＵ／ｍｌ）が、２日目に血清中に測定されたが、次いでこれは、レベルが１０４ＰＦＵ／ｍｌを超えるまで８日目までの間ウイルス血症の増加が持続した。（ｂ）野生型マウスにおいて、感染性ウイルスレベルは、感染後４日目に脾臓でピークに達したが、８日目までに消失した。対照的にμＭＴマウスの脾臓において、感染８日目および９日目においてウイルス（１０４ＰＦＵ／ｇ）が脾臓で持続したので感染後にクリアランス期はなかった。（ｃ）μＭＴマウスのＣＮＳにおいて、感染性ウイルス量の増加は、感染４日目後に脳、脊髄下部および脊髄上部に検出され：８日目までに、脳内で５００倍超のウイルス力価および脊髄で１００倍超のレベルがあった（データは示していない）。
【０２７２】
（６．９．３  ウイルス血症および抗体応答）
野生型マウスと比較した場合、μＭＴマウスにおける血清中のウイルスＲＮＡおよび感染性ウイルスのレベルは、感染２日後にほぼ等しかったが、感染４日後には約５００倍高かった。特異的抗ＷＮＶ免疫グロブリンは、ＷＮＶの散在化を防ぐ上で重要な役割を演じていることが推測された。中和抗体形成の動態を、上記の方法を用いてウイルスプラーク還元アッセイにより調べた（図７Ａ）。予想通り、中和抗体は、μＭＴマウスに検出されなかった。対照的に、中和抗体の低レベル（１／１０から１／４０までの阻害力価）は、野生型マウスにおいて感染後４日目に検出された。体液性応答が成熟した４日目後に阻害力価が増加した。中和抗体は、未処置動物または最初の感染の２日以内の野生型動物から得られた血清中に全く検出されなかった。
【０２７３】
ＩｇＭまたはＩｇＧが中和化をもたらすかどうかを見分けるために、ＥＬＩＳＡは、ＷＮＶに対する特定抗体のアイソタイプを特徴付けするために実施された。手短に言うと、精製Ｅタンパク質またはウイルス溶解物をプラスチックに吸着させた。ＢＳＡ、ツイーン２０およびウマ血清による非特定部位のブロッキング後、感染後の種々の日数で感染マウスから得られた血清の連続希釈液を加えた。引き続き、ＨＲＰ−結合ヤギ抗マウスＩｇＧまたはＩｇＭを加えた。洗浄後、ＴＭＢ基質を加え、９６ウェルプレートＥＬＩＳＡ読取装置を用いて測定した。特異的ＩｇＭは、感染４日後の早期に検出されたが、一方、特異的抗ＷＮＶ  ＩｇＧは、感染８日後まで検出されなかった（図７Ｂ）．ＩｇＭの化学的かつ免疫学的枯渇によりこれを確認した。０．０５Ｍのβ−メルカプトエタノール（ＩｇＧではなくてＩｇＭを破壊（Ｓｃｏｔｔら、１９７０年、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６：３１３−６頁））による処置または抗ＩｇＭアガロースによる前除去により、感染後１０日目ではなくて４日目に得られた血清の中和活性を消滅させた（データは示していない）。したがって、１０日目の血清は、主としてＷＮＶに対するＩｇＧ特異的抗体を含有したが、４日目の血清は、ＷＮＶに対するＩｇＭ特異的抗体を独占的に含有した。
【０２７４】
（６．１０  血清再構成実験）
抗体の保護的性質を直接評価するために、未処置または免疫化した野生型マウスから、または４日間ＷＮＶにより感染され、ＩｇＧではなくて中性ＩｇＭを産生した野生型マウスから採取した熱不活化血清を、未処置マウスに受動的に投与した（図８）。未処置血清のμＭＴマウスへの受動的移入により、致死率または平均生存時間に有意な効果がなかった。感染後４日目の野生型マウスから血清の移入は、中間の表現型を有し；平均生存時間の増加があるが、感染に対してμＭＴマウスの全ては、最後に死亡した。対照的に、未処置野生型マウスに対し、感染後４日目の野生型マウスからの血清の受動的移入は、罹患および致死からの完全防護をもたらした。
【０２７５】
（６．１１  ヒト免疫γ−グロブリンおよびＷＮＶによる予防試験）
抗体類がこの防護に介在したことを確認するために、またＷＮＶに対する抗体療法の開発を探索するために、我々は、マウスにおけるＷＮＶ感染に対する精製ヒト免疫γ−グロブリンの有効性を評価した。ＷＮＶに対する免疫反応性を有するヒトγ−グロブリンは、イスラエルにおいて集団ドナーから入手した。過去数年間にわたり、イスラエルにおいて一連の伝染病が発生し、その結果、集団の１０〜２０％がＷＮＶに対して抗体を有した（Ｓｈｉｍｏｎｉら、２００１年、Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ７：７５９頁）。有意なインビトロ免疫反応性（ＷＮＶ抗原に対して１／９００のＥＬＩＳＡ力価）を有したヒトγ−グロブリンのロットが利用された。非免疫ヒトγ−グロブリンは、非地方病地域から得られ、中和活性または免疫反応性を欠いた。ヒトγ−グロブリンによるインビボ試験は、８週齢野生型でμＭＴ  Ｂ細胞欠損Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて実施された（図９）。０．２ｍｇ（１０ｍｇ／ｋｇ）超の単回用量の免疫γ−グロブリン投与は、１０２ＰＦＵのＷＮＶによる感染に対して野生型マウスを完全に防護した（図９Ａ）。０．０２ｍｇ（１ｍｇ／ｋｇ）および０．００２ｍｇ（０．１ｍｇ／ｋｇ）用量は、有効性が少なかった。対照的に、非免疫γ−グロブリンの投与は、ＷＮＶ感染に対して防護しなかった。サブ中和濃度の抗体類は、骨髄性細胞においてＷＮＶ感染の増強を促進できることから（Ｃａｒｄｏｓａら、１９８６年、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ５７：９５２−９頁；Ｇｏｌｌｉｎｓら、１９８４年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１２６１−１２７２頁；Ｇｏｌｌｉｎｓら、１９８５年、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ６６：１９６９−１９８２頁）、我々は、マウスにおけるＷＮＶ感染に対するごく低用量の免疫γ−グロブリンの効果を調査した。とりわけ野生型マウスの最低用量（０．０００２ｍｇまたはそれ以下）の前処理により、過度の致死は誘導されなかった。一般に、μＭＴマウスに対する免疫γ−グロブリンの受動的移入により、野生型マウスと比較して有意なさらに低レベルの防護を提供した（図９Ｂ）。０．２ｍｇ超の用量は、感染後のμＭＴマウスの平均生存時間を増加させたが、１０ｍｇ（５００ｍｇ／ｋｇ）を投与されたものだけが３０日超生存した。
【０２７６】
（６．１２  γ−グロブリンによる曝露後の治療試験）
ＷＮＶ感染に対する具体的な治療の欠如のため、免疫γ−グロブリンの曝露後の治療可能性を評価した。マウスを、０日目に１０２ＰＦＵのＷＮＶで接種してから、感染後の特定の日に単回用量（１５ｍｇ；７５０ｍｇ／ｋｇ）の免疫または非免疫γ−グロブリンを投与し、臨床的に追跡した。最初の試験を、免疫不全μＭＴマウスを用いて実施した。予想されたとおり、非免疫γ−グロブリンは、ＰＢＳ対照と比較して臨床的改善を示さず：全てのマウスは感染に対して死亡した（図１０Ａ）。対照による免疫γ−グロブリンは、余り大きくない治療効果を有した。感染後１日目または２日目に処置されたμＭＴマウスは、８０％および２０％生存率があった。２日目後の免疫γ−グロブリンによるμＭＴマウスの処置により、生存に対する有意な効果がなかった（図１０Ｂ）。
【０２７７】
γ−グロブリンによる治療試験を、５週齢の野生型マウスを用いて実施した。これらのマウスのうちの１３％だけが、治療剤の不在下でＷＮＶによる感染から生存したことから（図１１Ａ）、致死に対する利益の可能性がより大きかった。ＰＢＳまたは非免疫γ−グロブリンによる５週齢マウスの処置により、平均生存時間または致死率に対して有意な効果はなかった（図１１Ｂ）。対照的に、感染後１日、２日、３日、４日、または５日に免疫γ−グロブリンによる処置により、平均生存時間を増加させ、致死率を減少させた（図１１Ｃおよび表３）。γ−グロブリンによる治療は、５日目でも有利な効果を提供したことから、ＷＮＶ後でも抗体限定疾患がＣＮＳに拡がったことを我々は仮定した。これを確認するために、感染性ウイルスのレベルは、１０２ＰＦＵのＷＮＶによる感染後、５週齢マウスの脳内で測定された（図１１Ｄ）。非免疫γ−グロブリンを投与した場合、感染４日目後および５日目後に、５週齢マウスのうちのそれぞれ３３％および１００％が、脳内に測定可能なウイルス負荷を生じた。対照的に、マウスが免疫γ−グロブリンで前処理された場合、感染４日目後および５日目後に、ウイルスは検出されなかった。これらのデータは、免疫抗体の受動的移入が、ＷＮＶがＣＮＳに散在化した後でも臨床結果を改善することを示唆している。
【０２７８】
【表３】
2008504029.tif 000006
試験のエンドポイントは、感染開始２１日後であった。平均生存時間に関して、Ｐ値は、両側Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて算出された。生存解析に関して、Ｐ値は、ログランク検定を用いて算出された。Ｐ値は、ＰＢＳ生理食塩水対照と比較した。星印は、統計的有意性を示している。
【０２７９】
（６．１３  Ｃ３欠損マウスを用いる実験）
感染を制御する上でＩｇＭに関する重要な役割が、最近立証された（Ｄｉａｍｏｎｄら、２００３年、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９８：１８５３−６２頁）。そのＩｇＭは、中和ウイルスにより直接または補体を固定することにより防護でき、オプソニン作用ウイルスを推測した。ＷＮＶ感染における補体の役割を評価するために、Ｃ３（Ｃ５７ＢＬ／６ｘ１２９Ｆ１ハイブリッドバックグラウンドにおけるＣ３−／−（Ｋａｐａｄｉａら、２００２年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １７：１−２０頁））が欠損したマウスをＷＮＶにより感染させた。Ｃ３欠損は、Ｂ細胞および抗体を欠いたマウスのものと同様な生存曲線により１００％致死率を生じた（図１２ＡおよびＢ、ＡとＢを比較）。同様の結果は、Ｃ４−／−マウスに見られている（Ｅ．Ｍｅｈｌｈｏｐ  ａｎｄ  Ｍ．Ｄｉａｍｏｎｄ、未公表観察）。インビボ感染を阻止するＷＮＶに対する抗体が、補体依存機構により阻止されるかどうかを判定するために、予防試験を実施した。０．５μｌの免疫血清は、野生型マウスの完全防護を提供したが、一方、５０μｌの免疫血清は、遺伝子導入Ｃ３−／−マウスにおける致死を防護するために必要であった。インビボでのＣ３の存在は、ＷＮＶに対する抗体の阻止機能を増加させ；したがって、血清により提供された抗体媒介防護の幾つかは、補体依存経路により媒介されると思われる。
【０２８０】
（６．１４  ＮＳ１抗体）
ＮＳ１抗体は、精製ＮＳ１タンパク質によりマウスを免疫化後に生成した。限定希釈によるクローニング後、抗体類は、系列Ｉおよび系列ＩＩのＷＮＶ株を認識し、感染細胞の表面上のＮＳ１またはウェスタンブロットにより検出し、ＷＮＶ感染細胞の補体媒介溶解を促進する能力に関して、またＷＮＶ感染からマウスを防護する効力に関してアッセイした。
【０２８１】
【表４】
2008504029.tif 000007
【０２８２】
【数１】
2008504029.tif 000008
【数２】
2008504029.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【０２８３】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、可溶性ＷＮＶ  ＥおよびＮＳ１タンパク質の表示である。Ａ．タンパク質。ＷＮＶ  Ｅ遺伝子の最初の４３０のアミノ酸を、Ｎ末端ポリヘドリンプロモーターおよびＣ末端ヒスチジン反復を含有する修飾バキュロウイルスシャトルベクターであるｐＦａｓｔＢａｃ−Ｈｉｓに、ＰＣＲによりクローン化した。ＳＦ９またはＨｉ−５細胞における組換えバキュロウイルスからのヒスチジンタグ化可溶性ＷＮＶウイルスＥタンパク質の発現。タンパク質は、イミダゾールの濃度を増加させる溶出後に、Ｎｉアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および銀染色に供した。分子量マーカーを左に示してある。Ｂ．Ｎ１タンパク質。完全長ＷＮＶ  ＮＳ１位でを、ヒスチジン反復の蒸留のｐＦａｓｔＢａｃにクローン化した。ＳＦ９細胞の上澄み液からＮＳ１を得て、Ｎｉアフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過、およびＭｏｎｏ  Ｑイオン交換によって精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびクーマシー染色に供した。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、ＥおよびＮＳ１に対するＭＡＢＳによる予防試験を示す。Ａ．１０２ＰＦＵのＷＮＶを足裏接種により投与する直前に、１ｍｇの精製非関連ＩｇＧ（抗ＤＥＮタイプ３、陰性ＩｇＧ）、ＷＮＶ  Ｅ１またはＷＮＶ  Ｅ２を、単回投与量として、腹腔内経路により投与した。データには、一条件当たり、少なくとも１０匹のマウスを用いている。Ｂ．１０２ＰＦＵのＷＮＶを足裏接種により投与する直前に、１ｍｇの精製陰性ＩｇＧ（抗ＤＶ３）、ＷＮＶ  Ｅ／１またはＷＮＶ  ＮＳ１／１を、単回投与量として、腹腔内経路により投与した。データには、一条件当たり、少なくとも１０匹のマウスを用いている。
【図３】図３は、ＥＮＶ  Ｅ１６、ＷＮＶ４−ＮＳ１、ＷＮＶ８−ＮＳ１、ＷＮＶ１０−ＮＳ１またはＷＮＶ１７−ＮＳ１による予防試験を示す。０日目、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１０２ＰＦＵのウイルスを投与した。２日後、感染マウスに、０．５ｍｇのＥＮＶ  Ｅ１６、ＷＮＶ４−ＮＳ１、ＷＮＶ８−ＮＳ１、ＷＮＶ１０−ＮＳ１またはＷＮＶ１７−ＮＳ１抗体を、腹腔内経路（矢印）により投与し、生存率を追跡した。データには、一条件当たり、少なくとも１０匹のマウスを用いている。
【図４】図４は、８〜１０週齢成体野生型における末梢およびＣＮＳ組織におけるウイルス負荷を示す。接種後、指定された日数の時点で、組織採取後、ウイルスプラークアッセイを用いて、野生型マウスの血清、腎臓、脾臓、肝臓、脳、および脊髄から、ウイルス濃度を測定した。データは、組織１グラム、または血清１ｍｌ当たりの平均ＰＦＵとして示し、一時点当たり、５匹から１０匹のマウスを用いている。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、ＲＡＧ１およびμＭＴ免疫不全マウスにおけるＷＮＶ感染を示す。Ａ．生存曲線：ＲＡＧ１。ＴおよびＢ細胞欠損または野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１０２または１０６ＰＦＵのＷＮＶを、足裏に接種した。生存曲線は、少なくとも３つの独立した実験から構成した。Ｂ．生存曲線：μＭＴ。Ｂ細胞欠損または野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１０２または１０６ＰＦＵのＷＮＶを、足裏に接種した。生存曲線は、少なくとも３つの独立した実験から構成した。
【図６】図６Ａ〜６Ｉは、ＷＮＶによる感染８日後における、野生型およびμＭＴマウスの脳におけるＷＮＶ抗原発現を示す。野生型（２つの左枠）およびμＭＴ（右枠）マウスの脳を採取し、切片化し、ラット抗ＷＮＶポリクローナル血清または対照の陰性ポリクローナルラット血清によって染色した。小脳、脳幹、および大脳皮質の典型的な切片を示してある。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＷＮＶ抗体産生の動態学を示す。Ａ．ＷＮＶに対する抗体中和の発現。感染後、指定された日数の時点で、野生型またはμＭＴマウスから血清を採取した。プラーク減少中和アッセイにより、抗体中和力価を判定した。データは、プラークの数を５０％減少させる抗体力価である相反ＰＲＮＴ５０として表している。Ｂ．アイソタイプ特異的ＥＬＩＳＡ。血清を吸着対照またはウイルス抗原と共にインキュベート後、アイソタイプ（ＩｇＭまたはＩｇＧ）特異的抗体の発現を判定した。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、８週齢のμＭＴおよび野生型マウスに対する血清の受動投与。未処置、免疫、またはＷＮＶに４日間感染したマウスから血清を採取した。熱不活化後、１０２ＰＦＵのＷＮＶによる感染１日前および１日後に、μＭＴ（枠Ａ）および野生型マウス（枠Ｂ）に、０．５ｍｌの血清を投与した。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、ヒトγグロブリンによる予防試験を示す。Ａ．８週齢の野生型マウスに対するヒト免疫γグロブリンの受動投与。１０２ＰＦＵのＷＮＶを足裏接種により投与する直前に、示された量の精製免疫γグロブリン（ロットＧ１２１０１）（Ｏｍｒｉｘ（商標））を、単回投与量として、腹腔内経路により投与した。データには、一条件当たり、少なくとも２０匹のマウスを用いた。ＰＢＳ対照と比較した統計差は以下のとおりであった。０．２μｇ、２μｇ、および２０μｇ：Ｐ＞０．３；２００μｇ、１０００μｇ、５０００μｇ、および１０，０００μｇ：Ｐ≦０．０００２。Ｂ．８週齢のμＭＴマウスに対するヒト免疫γグロブリンの受動投与。１０２ＰＦＵのＷＮＶを足裏接種により投与する直前に、示された量の精製免疫γグロブリン（ロットＧ１２１０１）を、単回投与量として、腹腔内経路により投与した。ＰＢＳ対照と比較した統計差は以下のとおりであった。免疫ＩｇＧ：２００μｇ、Ｐ＞０．３；１０００μｇ、Ｐ＝０．０００２；５０００μｇ、Ｐ＝０．００９；１０，０００μｇ、Ｐ＜０．０００１、非免疫ＩｇＧ：１０，０００μｇ、Ｐ＞０．７
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、８週齢のμＭＴマウスに対するヒトγグロブリンによる治療試験。１０２ＰＦＵのＷＮＶを足裏接種による投与直前に（０日目）または投与後の示された日数時点（１、２、または３日目）で、精製非免疫（枠Ａ、ロット＃Ｆ４３３１２）または免疫（枠Ｂ、ロット＃Ｇ２４１９１）γグロブリンの１５ｍｇ単回投与量を、腹腔内経路により投与した。データには、一条件当たり、５匹から１０匹の間のマウスを用いている。ＰＢＳ対照と比較した統計差は以下のとおりであった。免疫ＩｇＧ：０日目、Ｐ＜０．００５；２日目、Ｐ＝０．０６、３日目、Ｐ＝０．１２。非免疫ＩｇＧ：０、１、２、および３日目：Ｐ＞０．４。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｄは、５週齢の野生型マウスにおけるヒトγグロブリンによる治療試験を示す。Ａ．１０２ＰＦＵのＷＮＶによる接種後の５週齢野生型マウスの生存曲線。Ｂ．１０２ＰＦＵのＷＮＶを足裏接種による投与直前に（０日目）または投与後の示された日数時点（１、２、３、４、または５日目）で、精製非免疫γグロブリンの１５ｍｇ単回投与量を、５週齢の野生型マウスに腹腔内経路により投与した。データには、一条件当たり、およそ２０匹のマウスを用いている。Ｃ．１０２ＰＦＵのＷＮＶを足裏接種による投与直前に（０日目）または投与後の示された日数時点（１、２、３、４、または５日目）で、精製免疫γグロブリンの１５ｍｇ単回投与量を、５週齢の野生型マウスに腹腔内経路により投与した。データには、一条件当たり、およそ２０匹のマウスを用いている。Ｄ．５週齢野生型マウスにおけるＷＮＶ負荷。５週齢マウスを、１０２ＰＦＵのＷＮＶによる感染直前に、免疫または非免疫ヒトγグロブリンの１５ｍｇ単回投与量により処置した。感染４日目および５日目に、脳を採取し、組織均一化後、プラークアッセイによりウイルス負荷を判定した。データは、１グラム当たりのＰＦＵとして表している。
【図１２】図１２Ａおよび１２Ｂは、野生型およびＣ３−／−マウスに対する免疫血清の受動移行を示す。Ｃ３を不活化するために、４サイクルの凍結−解凍を受けた免疫血清の示された投与量を、８週齢の野生型（Ａ）またはＣ３−／−（Ｂ）遺伝子導入マウスに投与した。１日後、マウスに、１０２ＰＦＵのＷＮＶを接種し、生存率を評価した。データは、各実験群の１群当たり、１０匹から１５匹の間のマウスを用いている。
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、Ｅタンパク質結合に対するＭＡＢ結合の位置決定のための酵母表示の利用を示す。Ａ．抗ＷＮＶ  Ｅ  ｍＡｂが結合した領域をマップ化するため、Ｅタンパク質の完全長細胞外部分またはドメインＩＩＩ単独のいずれかを、Ａｇａ２融合タンパク質として、酵母細胞の表面に発現させた。Ｂ．これらのタンパク質を発現している酵母細胞へのｍＡｂの結合を、ＦＡＣＳ分析によって判定した。ＭＡｂ  ＷＮＶ  Ｅ１６は、表示されている外部ドメインとドメインＩＩＩを表示している酵母細胞の双方に結合する。
【図１４】図１４Ａおび１４Ｂは、Ｅ１６接触残基の酵母マッピングを示す。Ａ．ドメインＩＩＩの変異誘発ｃＤＮＡライブラリーにより、シリアルフロー細胞数測定選別を実施した。第１選別前、＜１％のドメインＩＩＩ陽性酵母がＷＮＶ  Ｅ１６陰性であった。第２選別後、＞８５％のドメインＩＩＩ陽性酵母が、ポリクローナル抗体によって認められたが、ＷＮＶ  Ｅ１６によっては認められなかった。Ｂ．クローン１７によるＥ１６接触残基の酵母マッピング。ＷＮＶ  Ｅ１６に対する結合は欠如しているが、他の１４のドメインＩＩＩ抗体に対する結合を保持している単一のドメインＩＩＩ発現酵母クローンを単離した。ＷＮＶ  Ｅ１６に対する結合プロフィルおよび他の４例の抗体を示してある。このクローンは、Ｔ３３２Ｍ変異を有している；したがって、ＷＮＶ  Ｅ１６に対する接触残基の１つはアミノ酸Ｔ３３２にある。
【図１５】図１５は、ＭＡＢ類によるＷＮＶの中和を示す。１００ＰＦＵのＷＮＶを、ＷＮＶに対する種々の濃度の２つのｍＡｂ（ＷＮＶ抗Ｅ１６またはＷＮＶ抗Ｅ７）またはＳＡＲＳコロナウイルスのタンパク質であるＯＲＦ７に対するｍＡｂと混合し、ＢＨＫ細胞の単層に加えた。アガロースオーバーレイを加えた後、プレートを７２時間インキュベートし、プラークを肉視でスコア化した。双方の抗ＷＮＶ  ｍＡｂで、１ｍｇの保存液の約１／１０，０００希釈液が、感染をおよそ５０％防止した。
【図１６】図１６Ａおよび１６Ｂは、ＷＮＶの抗体依存性補体媒介中和および溶解を示す。Ａ．  ＷＮＶの抗体依存性補体媒介中和。種々の濃度のウサギ補体の存在下、１００ＰＦＵのＷＮＶを、ＷＮＶ  Ｅ（ＷＮＶ  Ｅ、ＩｇＧ２ａ；ＷＮＶ  Ｅ８、ＩｇＧ１）または対照タンパク質（ＳＡＲＥ−ＣｏＶ  ＯＲＦ７ａ２Ｗ１１、ＩｇＧ２ｂ）に対する低中和ｍＡｂ類の２５μｇと、３７℃で１時間混合した。引き続き、ウイルス抗体補体を、ＢＨＫ細胞の単層に加えた。アガロースオーバーレイの添加後、プレートをさらに７２時間インキュベートし、プラークを肉視でスコア化した。Ｂ．ＷＮＶ感染細胞の抗体依存性補体媒介溶解。ＷＮＶ  Ｅタンパク質（ＷＮＶ  Ｅ１、ＩｇＧ２ａ；ＷＮＶ  Ｅ１６，ＩｇＧ２ｂ）またはＳＡＲＳ−コロナウイルス（ＣｏＶ）ＯＲＦ７ａ（２Ｅ１１、ＩｇＧ２ｂ）に対するｍＡｂの存在下または不在下、ＷＮＶに未感染または感染させたＭＣ５７ＧＬ細胞（感染後、５，２４時間のＭＯＩ）に、数種に増加させた濃度のウサギ仔補体を接種した。２時間後、細胞をヨウ化プロピジウムと共にインキュベートし、したがって、死細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって測定した。
【図１７】図１７Ａおよび１７Ｂは、８週齢のｓＩｇＭ−／−マウスおよび５週齢の野生型マウスにおけるＷＮＶ  Ｅ１６による治療試験を示す。Ａ．８週齢のｓＩｇＭ−／−マウスに、０日目、１００ＰＦＵのＷＮＶを皮下経路で接種した。感染４８時間後（矢印）、ＳＡＲＳ  ＯＲＦ７ａ（２Ｅ１１、ＩｇＧ２ｂ）またはＷＮＶ  Ｅ（ＷＮＶ  Ｅ１６，ＩｇＧ２ｂ）タンパク質に対する１ｍｇのｍＡｂを、腹腔内経路によりマウスに投与し、生存率を追跡した。各群に関し、Ｎ＝４。Ｂ．５週齢の野生型マウスに、０日目、１００ＰＦＵのＷＮＶを皮下経路で接種した。感染後、２日目または４日目に、ＳＡＲＳ  ＯＲＦ７ａ（２Ｅ１１、ＩｇＧ２ｂ）またはＷＮＶ  Ｅ（ＷＮＶ  Ｅ１６，ＩｇＧ２ｂ）タンパク質に対する０．５ｍｇの単回投与量のｍＡｂを、腹腔内経路によりマウスに投与し、生存率を追跡した。各群に関し、Ｎ＝１０。括弧は、ＷＮＶ  Ｅ１６により提供された保護を示している。
【図１８】図１８は、特定の実施形態のフローチャートを示す。
【図１９】図１９は、特定の実施形態のフローチャートを示す。
【図２０】図２０は、ＷＮＶ  Ｅ１６およびＥ２４モノクローナル抗体の保護の用量応答を示す。５週ｐｌｄ  Ｃ５７６ＢＬ／６マウスに１０２ＰＦＵのＷＮＶを感染させた。４８時間後（時間）、示された単回投与量のモノクローナル抗体またはＰＢＳを、マウスに接種し、次いで、生存率を追跡した。各マウス条件に関し、Ｎ＝２０。
【図２１】図２１は、ＷＮＶ  Ｅ１６およびＥ２４モノクローナル抗体の治療試験を示す。治療試験ＷＮＶ  Ｅ１６およびＥ２４ｍＡｂ。５週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに１０２ＰＦＵのＷＮＶを感染させた。感染２日目または４日目に、ＰＢＳ、抗ＳＡＲＳ７ａ（０．５ｍｇ）、抗ＷＮＶ  Ｅ１６またはＥ２４（０．５ｍｇ）、または抗ＷＮＶ  Ｅ１６＋Ｅ２４の組み合わせ（各０．２５ｍｇ）をマウスに投与した。引き続き、生存率を追跡した。各条件に関し、Ｎ＝２０匹のマウス。括弧は、生理食塩水または陰性ｍＡｂ対照からの有意な（Ｐ＜０．００１）差を示している。
【図１】
2008504029.tif 000010
【図２】
2008504029.tif 000011
【図３】
2008504029.tif 000012
【図４】
2008504029.tif 000013
【図５】
2008504029.tif 000014
【図６】
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【図７】
2008504029.tif 000016
【図８】
2008504029.tif 000017
【図９】
2008504029.tif 000018
【図１０】
2008504029.tif 000019
【図１１】
2008504029.tif 000020
【図１２】
2008504029.tif 000021
【図１３】
2008504029.tif 000022
【図１４】
2008504029.tif 000023
【図１５】
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【図１６】
2008504029.tif 000025
【図１７】
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【図１８】
2008504029.tif 000027
【図１９】
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【図２０】
2008504029.tif 000029
【図２１】
2008504029.tif 000030
【配列表】
2008504029000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月7日(2007.6.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
西ナイルウイルス抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記抗原が、構造タンパク質である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗原が、非構造タンパク質である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記構造タンパク質が、Ｅタンパク質である、請求項２に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が、前記Ｅタンパク質のドメインＩＩＩに結合する、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
前記非構造タンパク質が、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５よりなる群から選択される、請求項３に記載の抗体。
【請求項７】
ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、またはＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有するクローンＥ１６、クローンＥ２４、またはクローンＥ３４により産生される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、またはＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有するクローンＥ１６、クローンＥ２４、またはクローンＥ３４により産生されるモノクローナル抗体との結合に関して競合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、またはＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有するクローンＥ１６、クローンＥ２４、またはクローンＥ３４により産生されるモノクローナル抗体のヒト化体またはキメラ体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、またはＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有する、ハイブリドーマ細胞株Ｅ１６、ハイブリドーマ細胞株Ｅ２４、またはハイブリドーマ細胞株Ｅ３４。
【請求項１２】
異種プロモーターに作動可能に連結された請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖または軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
【請求項１３】
請求項１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１４】
重鎖をコードする第１のヌクレオチド配列および軽鎖をコードする第２のヌクレオチド配列を含むベクターであって、該重鎖または軽鎖が、請求項１に記載の抗体または抗原結合フラグメントのものである、ベクター。
【請求項１５】
発現ベクターである、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
請求項１４に記載のベクターを含有する、宿主細胞。
【請求項１７】
異種プロモーターに作動可能に連結された第１のヌクレオチド配列を含む第１の核酸、ならびに同じかまたは異なる異種プロモーターに作動可能に連結された第２のヌクレオチド配列を含む第２の核酸を含有する宿主細胞であって、該第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は、請求項１に記載の抗体の重鎖および軽鎖をそれぞれコードし、該宿主細胞は、適切な条件下で該抗体を発現する、宿主細胞。
【請求項１８】
西ナイルウイルス特異的モノクローナル抗体を組換え産生する方法であって、
（ｉ）該抗体の発現に好適な条件下で、培地中で請求項１７に記載の宿主細胞を培養する工程；および
（ｉｉ）該培地から該抗体を回収する工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
配列番号４、配列番号８、または配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＨ鎖を含む、西ナイルウイルス抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２０】
配列番号２、配列番号６、または配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ鎖を含む、西ナイルウイルス抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２１】
患者における西ナイルウイルス感染の症状を治療、予防、または寛解するために使用される医薬の製造における、請求項１、請求項１９、または請求項２０に記載のモノクローナル抗体の使用。
【請求項２２】
前記抗体が、構造タンパク質である西ナイルウイルス抗原に特異的に結合する、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記抗体が、非構造タンパク質である西ナイルウイルス抗原に特異的に結合する、請求項２１に記載の使用。
【請求項２４】
前記構造タンパク質が、Ｅタンパク質である請求項２２に記載の使用。
【請求項２５】
前記抗体は、Ｅタンパク質のドメインＩＩＩに結合する請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記非構造タンパク質が、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５よりなる群から選択される請求項２３に記載の使用。
【請求項２７】
前記抗体が、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、またはＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有するクローンＥ１６、クローンＥ２４、またはクローンＥ３４により産生される、請求項２１に記載の使用。
【請求項２８】
前記医薬が、非構造タンパク質である西ナイルウイルス抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの治療的有効量をさらに含む、請求項２５に記載の使用。
【請求項２９】
前記医薬が、抗ウイルス剤をさらに含む、請求項２１に記載の使用。
【請求項３０】
前記抗ウイルス剤が、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、およびヌクレオシドアナログよりなる群から選択される，請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記抗ウイルス剤が、ジドブジン、アシクロビル、ガングシクロビル、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルリジン、リバビリン、フォスカーネット、アマンタジン、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、アンプレナビル、ロピナビル、リトナビル、α−インターフェロン、アデフォビル、クレバジン、エンテカビル、およびプレコナリルよりなる群から選択される、請求項２９に記載の使用。
【請求項３２】
前記患者がヒトである、請求項２１に記載の使用。
【請求項３３】
前記抗体が、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体である、請求項２１に記載の使用。
【請求項３４】
前記抗体が、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、またはＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有するクローンＥ１６、クローンＥ２４、またはクローンＥ３４により産生されるモノクローナル抗体のヒト化体またはキメラ体である、請求項２１に記載の使用。
【請求項３５】
被験体における西ナイルウイルス感染の診断法であって：
（ａ）  該被験体由来の生物学的サンプルを、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントの有効量と接触させる工程；および
（ｂ）  該抗体またはその抗原結合フラグメントの結合を検出する工程、
を包含し、
該抗体またはその抗原結合フラグメントの結合の検出が背景レベルまたは基準レベルを超えていることにより、該被験体が西ナイルウイルス感染を有することが示される、方法。
【請求項３６】
（ｉ）治療的有効量の請求項１に記載の抗体；および（ｉｉ）薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項３７】
前記抗体が、構造タンパク質である西ナイルウイルス抗原に特異的に結合する、請求項３６に記載の薬学的組成物。
【請求項３８】
前記抗体が、非構造タンパク質である西ナイルウイルス抗原に特異的に結合する、請求項３６に記載の薬学的組成物。
【請求項３９】
前記構造タンパク質が、Ｅタンパク質である、請求項３７に記載の薬学的組成物。
【請求項４０】
前記抗体が、Ｅタンパク質のドメインＩＩＩに結合する、請求項３９に記載の薬学的組成物。
【請求項４１】
前記非構造タンパク質が、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５よりなる群から選択される、請求項３８に記載の薬学的組成物。
【請求項４２】
前記抗体が、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、またはＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有するクローンＥ１６、クローンＥ２４、またはクローンＥ３４により産生される、請求項３６に記載の薬学的組成物。
【請求項４３】
前記抗体が、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体である、請求項３６に記載の薬学的組成物。
【請求項４４】
前記抗体が、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、またはＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有するクローンＥ１６、クローンＥ２４、またはクローンＥ３４により産生される抗体のヒト化体またはキメラ体である、請求項３６に記載の薬学的組成物。
【請求項４５】
さらに、非構造タンパク質である西ナイルウイルス抗原に特異的に結合する治療的有効量のモノクローナル抗体を含む、請求項４０に記載の薬学的組成物。
【請求項４６】
患者における西ナイルウイルス感染の症状を治療、予防、または寛解するための組成物であって、請求項１、請求項１９、または請求項２０に記載のモノクローナル抗体の治療的有効量を含む、組成物。
【請求項４７】
前記抗体が、構造タンパク質である西ナイルウイルス抗原に特異的に結合する、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記抗体が、非構造タンパク質である西ナイルウイルス抗原に特異的に結合する、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４９】
前記構造タンパク質が、Ｅタンパク質である請求項４７に記載の組成物。
【請求項５０】
前記抗体は、Ｅタンパク質のドメインＩＩＩに結合する請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記非構造タンパク質が、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５よりなる群から選択される請求項４８に記載の組成物。
【請求項５２】
前記抗体が、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、またはＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有するクローンＥ１６、クローンＥ２４、またはクローンＥ３４により産生される、請求項４６に記載の組成物。
【請求項５３】
非構造タンパク質である西ナイルウイルス抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの治療的有効量をさらに含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５４】
抗ウイルス剤をさらに含む、請求項４６に記載の組成物。
【請求項５５】
前記抗ウイルス剤が、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、およびヌクレオシドアナログよりなる群から選択される，請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記抗ウイルス剤が、ジドブジン、アシクロビル、ガングシクロビル、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルリジン、リバビリン、フォスカーネット、アマンタジン、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、アンプレナビル、ロピナビル、リトナビル、α−インターフェロン、アデフォビル、クレバジン、エンテカビル、およびプレコナリルよりなる群から選択される、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５７】
前記患者がヒトである、請求項４６に記載の組成物。
【請求項５８】
前記抗体が、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体である、請求項４６に記載の組成物。
【請求項５９】
前記抗体が、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−６０５０、ＰＴＡ−６０５１、またはＰＴＡ−６０５２をそれぞれ有するクローンＥ１６、クローンＥ２４、またはクローンＥ３４により産生されるモノクローナル抗体のヒト化体またはキメラ体である、請求項４６に記載の組成物。
【国際調査報告】
2008504029.tif 000031
2008504029.tif 000032
2008504029.tif 000033