(57)【要約】【課題】ＭＴＰ活性を阻害するが、リポタンパク質の分泌には顕著な影響を与えない化合物の、主としてＭＴＰの脂質輸送活性の阻害能に基づいたスクリ−ニング方法の提供。特に自動化やハイスル−プットスクリ−ニングに適した、簡便、迅速かつ高感度なＭＴＰ活性のアッセイ方法の提供。【解決手段】ミクロソ−ムのトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）のアッセイ法であって、自動化及びハイスル−プットのスクリ−ニングに適する方法。上記方法は、細胞及び組織のホモジェネ−トにおけるＭＴＰ活性並びに精製ＭＴＰの活性の測定に使用可能である。ＭＴＰにより輸送される脂質のレベルの測定法もまた提供される。また、ＭＴＰの脂質輸送活性を調節する化合物の同定法が提供される。更に、ＭＴＰの脂質輸送活性又はＭＴＰによる正味の脂質輸送を測定するキットも提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）の脂質輸送活性を定量する方法であり、以下の段階、すなわち：
（ａ）蛍光標識脂質を内部に含有するドナー小胞を調製し；
（ｂ）アクセプター小胞を調製し；
（ｃ）ＭＴＰを含有する細胞ホモジェネート又は単離されたＭＴＰを、前記アクセプター小胞及び標識された前記ドナー小胞と、標識された脂質が前記ドナー小胞から前記アクセプター小胞へと輸送される間、前記蛍光標識脂質がＭＴＰと結合するのに十分な時間及び条件の下でインキュベートし；
（ｄ）ＭＴＰに結合した前記蛍光標識脂質の蛍光を測定する；
段階を含む方法。
【請求項２】
前記細胞ホモジェネートが、ＭＴＰを発現する動物細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞ホモジェネートが、ＭＴＰを発現する昆虫又は微生物由来の細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記の蛍光標識脂質が、トリグリセリド、コレステロールエステル（ＣＥ）又はリン脂質である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記トリグリセリドが、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記の蛍光標識されたＴＡＧが、ＴＡＧのいずれかの位置で少なくとも一つのＮＢＤを含み、その他の位置に脂肪酸が位置する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記の蛍光標識されたトリアシルグリセロールが、１，２−ジオレオイル−３−ＮＢＤグリセロール（ＮＢＤ−ＴＡＧ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記の蛍光標識されたＣＥが、ＮＢＤ−ＣＥである、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記の蛍光標識されたリン脂質が、ＮＢＤ−ＰＥである、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記アクセプター小胞が、小型の単層小胞、多層小胞、ａｐｏＢ−リポタンパク質小胞又はホスファチジルコリン（ＰＣ）小胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ドナー小胞が、ＮＢＤ標識された脂質を含むホスファチジルコリン（ＰＣ）小胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＭＴＰにより輸送される脂質の正味の輸送の測定方法であり、以下の段階、すなわち：
（ａ）蛍光標識脂質を内部に含有する、負に荷電したドナー小胞を調製し；
（ｂ）アクセプター小胞を調製し；
（ｃ）ＭＴＰを含有する細胞ホモジェネート又は単離されたＭＴＰを、前記アクセプター小胞及び標識された前記ドナー小胞と、標識された脂質が前記ドナー小胞から前記アクセプター小胞へと輸送される間、前記蛍光標識脂質がＭＴＰと結合するのに十分な時間及び条件の下でインキュベートし；
（ｄ）ステップ（ｃ）にてインキュベートされた混合液から、負に荷電したドナー小胞及びＭＴＰを除去し；
（ｅ）アクセプター小胞に輸送された蛍光標識脂質を測定する；
段階を含む方法。
【請求項１３】
前記の負に荷電したドナー小胞及びＭＴＰが、陰イオン交換樹脂との混合及びそれに続く沈降により除去される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記トリグリセリドが、ＮＢＤを含むトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）である、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項１５】
前記リン脂質が、ＮＢＤを含むいずれかのリン脂質である、請求項４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アクセプター小胞が、小型の単層小胞、ａｐｏＢ−リポタンパク質小胞又はホスファチジルコリン（ＰＣ）小胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ドナー小胞が、ＮＢＤ標識された脂質を含む小型の単層小胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞ホモジェネートが、ＭＴＰを発現する動物細胞を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞ホモジェネートが、ＭＴＰを発現する昆虫又は微生物由来の細胞を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記蛍光標識脂質が、トリグリセリド、コレステロールエステル又はリン脂質である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記トリグリセリドが、ＮＢＤ標識されたいずれかのトリアシルグリセロールである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記リン脂質が、ホスファチジルエタノールアミンである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記アクセプター小胞が、小型の単層小胞、多層小胞、ａｐｏＢ−リポタンパク質小胞又はホスファチジルコリン（ＰＣ）小胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ドナー小胞が、ホスファチジルコリン（ＰＣ）小胞、小型の単層小胞又は多層小胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２５】
ＭＴＰにより輸送された脂質の正味の輸送を測定するためのキットであり、アクセプター小胞及び負に荷電した蛍光標識されたドナー小胞を含むキット。
【請求項２６】
蛍光標識されたドナー小胞が、トリグリセリド、コレステロールエステル又はリン脂質を含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記のトリグリセリドが、ＮＢＤ標識を含むいずれかのトリアシルグリセロールである、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記トリアシルグリセロールが、１，２−ジオレオイル−３−ＮＢＤグリセロール（ＮＢＤ−ＴＡＧ）である、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記リン脂質が、ホスファチジルエタノールアミンである、請求項２６に記載のキット。
【請求項３０】
前記アクセプター小胞が、小型の単層小胞、多層小胞、ａｐｏＢ−リポタンパク質小胞又はホスファチジルコリン（ＰＣ）小胞である、請求項２５に記載のキット。
【請求項３１】
前記ドナー小胞が、小型の単層小胞、多層小胞、ａｐｏＢ−リポタンパク質小胞又はホスファチジルコリン（ＰＣ）小胞である、請求項２５に記載のキット。
【請求項３２】
前記の小胞が、ＢＳＡの添加により安定化されている、請求項２５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミクロソームのトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）のアッセイ法であって、自動のハイスループットスクリーニングに適する方法に関する。また、ＭＴＰにより輸送される脂質のレベルのアッセイ法に関する。また、ＭＴＰの脂質輸送活性を調節する化合物の同定法に関する。更に、ＭＴＰの脂質輸送活性又はＭＴＰによる正味の脂質輸送を測定するキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）は、アポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）リポタンパク質の会合に専ら必要なシャペロンである（総説については非特許文献１から６を参照）。ＭＴＰは、小胞体内の新生ａｐｏＢに脂質を輸送して始原リポタンパク質粒子を形成することにより、ａｐｏＢを分泌可能にすると言われている（総説については非特許文献１から９を参照）。ａｐｏＢ分泌におけるＭＴＰの脂質輸送活性の重要性は、三つの独立した方法により明らかにされている。すなわち、第一に、ＭＴＰの突然変異が、無β−リポタンパク質血症（低比重β−リポタンパク欠損症）におけるａｐｏＢリポタンパク質の欠如に関係していたこと（非特許文献１０、１１）；第二に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＭＴＰの脂質輸送活性を阻害するアンタゴニストが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてもａｐｏＢの分泌を減少させることが示されたこと（非特許文献１２から１４）；第三に、ＭＴＰとａｐｏＢの共発現が、ａｐｏＢとＭＴＰを発現しない細胞においてａｐｏＢの分泌を促進することが証明されたこと（非特許文献１５、１６）、である。ＭＴＰは、その脂質輸送活性に加えて、ａｐｏＢと物理的に相互作用することが知られている（非特許文献１、２）。また最近、ＭＴＰは細胞質から小胞体内腔へのトリアシルグリセロール類（ＴＡＧｓ）の移入に関連することが示唆されている（非特許文献１７から１９）。以上より、ＭＴＰは、細胞内小器官内おけるＴＡＧの輸送及びその細胞からの分泌に重要な役割を演じる多機能タンパク質（非特許文献２）であると考えられる。
【０００３】
ＭＴＰは放射性同位体アッセイにより、ＷｅｔｔｅｒａｕとＺｉｌｖｅｒｓｍｉｔ（非特許文献２０、２１）により同定、精製された。このアッセイにおいては、放射線標識ＴＡＧが、ホスファチジルコリン（ＰＣ）及びカルジオリピンからなるドナー小胞に取り込まれている。これらの小胞は、ＭＴＰの存在下にアクセプター小胞とインキュベートされる。更に１時間から３時間のインキュベート後に、カルジオリピンを含有するドナー小胞をＤＥ５２に結合させ、遠心分離により除去される。上清に残存する放射線をシンチレーションカウンターにより定量する。ただしこの方法は多大な労力と時間を要する。また、カルジオリピンのような負荷電の脂質は、ＭＴＰの脂質輸送活性を阻害することが知られている（非特許文献２２）。また、この方法には多くの工程が含まれるため、自動化が困難である。したがって、簡便かつ一段階工程によるＭＴＰ活性の測定方法は有用である。このような方法は、例えば、ＭＴＰの活性を部分的に阻害し、それによりリポタンパク質の会合及び分泌を減少させる化合物の同定に有用である。同定された化合物は、血漿のコレステロール及び細胞内のトリグリセリドのレベルを低下させる薬剤として望ましい。
【０００４】
製薬企業数社が、ＭＴＰ活性を阻害するアンタゴニストを同定している（非特許文献１２から１４、及び２３）。これらの企業により採られた一般的な手法は、ＨｅｐＧ２細胞によるａｐｏＢ分泌を減少させる化合物を同定し、次いでそれらのＭＴＰ活性の阻害能を測定する手法である（非特許文献３、２３）。ここで、ａｐｏＢ分泌の阻害による一次スクリーニングが、複数段階の放射線アッセイを用いてＭＴＰ活性を阻害する多数の化合物を評価する際、困難性の原因となっていることが示唆された（非特許文献２０、２１）。この二段階スクリーニングにより、ＭＴＰ活性を阻害してａｐｏＢ分泌を減少させる化合物が同定されている。ただし、驚くべきことに、種々の企業により同定されたそれぞれの化合物が構造的に非常に類似していることが明らかとなった（非特許文献２３）。また、不運にもこれらの化合物は、細胞内にＴＡＧの顕著な蓄積を引き起こし、ゆえにその選抜された化合物がａｐｏＢ分泌の潜在的阻害剤ともなり得る。
【非特許文献１】Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｍ．ら、２００３．Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ−ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４４：２２−３２．
【非特許文献２】Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｍ．ら、２００３．Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ａ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：Ｓ５００−Ｓ５０６．
【非特許文献３】Ｂａｋｉｌｌａｈ，Ａ．ら、２００３．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ：ａｎ  ｕｐｄａｔｅ．Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：Ｄ２９４−Ｄ３０５．
【非特許文献４】Ｓｈｅｌｎｅｓｓ，Ｇ．Ｓ．ら、２００１．Ｖｅｒｙ−ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．１２：１５１−１５７．
【非特許文献５】Ｇｏｒｄｏｎ，Ｄ．Ａ．ら、２０００．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ａｐｏｌｉｐｏ−ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｂ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４８６：７２−８３．
【非特許文献６】Ｗｅｔｔｅｒａｕ，Ｊ．Ｒ．ら、１９９７．Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３４５：１３６−１５０．
【非特許文献７】Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｍ．Ｍ．ら、２０００．Ａ  ｐｒｏｐｏｓｅｄ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｃｈｙｌｏｍｉｃｒｏｎｓ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．１４８：１−１５．
【非特許文献８】Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ａ．ら、１９９９．Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４４０：１−３１．
【非特許文献９】Ｆｉｓｈｅｒ，Ｅ．Ａ．ら、２００２．Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ：  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１７３７７−１７３８０．
【非特許文献１０】Ｗｅｔｔｅｒａｕ，Ｊ．Ｒ．ら、１９９２：Ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ  ｗｉｔｈ  ａｂｅｔａｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｅｍｉａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５８：９９９−１００１．
【非特許文献１１】Ｓｈｏｕｌｄｅｒｓ，Ｃ．Ｃ，ら、１９９３．Ａｂｅｔａｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｅｍｉａ  ｉｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ９７  ｋＤａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ａ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２：２１０９−２１１６．
【非特許文献１２】Ｊａｍｉｌ，Ｈ．ら、１９９６．Ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ａｐｏＢ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ＨｅｐＧ２  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３：１１９９１−１１９９５．
【非特許文献１３】Ｈａｇｈｐａｓｓａｎｄ，Ｍ．ら、１９９６．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ  ａｎｄ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  （ＨｅｐＧ２）．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．３７：１４６８−１４８０．
【非特許文献１４】Ｂｅｎｏｉｓｔ，Ｆ．ら、１９９７．Ｃｏ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ１００  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｉｓ  ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ＨｅｐＧ２  ｃｅｌｌｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２０４３５−２０４４２．
【非特許文献１５】Ｇｏｒｄｏｎ，Ｄ．Ａ．ら、１９９４．Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ＨｅＬａ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ  ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１：７６２８−７６３２．
【非特許文献１６】Ｌｅｉｐｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら、１９９４．Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ｔｈｅ  ａｂｅｔａｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｅｍｉａ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ，  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２１９５１−２１９５４．
【非特許文献１７】Ｒａａｂｅ，Ｍ．ら、１９９９．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：１２８７−１２９８．
【非特許文献１８】Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｗ．ら、１９９９．Ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｗｉｔｈｉｎ  ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ＭｃＡ−ＲＨ７７７７  ｃｅｌｌｓ  −  ａ  ｕｎｉｆｉｅｄ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｖｅｒｙ  ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２１Ａ：２７７９３−２７８００．
【非特許文献１９】Ｋｕｌｉｎｓｋｉ，Ａ．ら、２００２．Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｌｕｍｅｎａｌ  ａｃｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｎｏｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ａｐｏ  Ｂ，  ａｓ  ｗｅｌｌ  ａｓ  ｆｏｒ  Ａｐｏ  Ｂ  ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３１５１６−３１５２５．
【非特許文献２０】Ｗｅｔｔｅｒａｕ，Ｊ．Ｒ．ら、１９８４．Ａ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ａｎｄ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ  ｅｓｔｅｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｌｉｖｅｒ  ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１０８６３−１０８６６．
【非特許文献２１】Ｗｅｔｔｅｒａｕ，Ｊ．Ｒ．ら、１９８５．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ａｎｄ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ  ｅｓｔｅｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｌｉｖｅｒ  ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ．３８：２０５−２２２．
【非特許文献２２】Ｊａｍｉｌ，Ｈ．ら、１９９５．Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：６５４９−６５５４．
【非特許文献２３】Ｃｈａｎｇ，Ｇ．ら、２００２．Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＴＰ）  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｐａｒａｄｉｇｍｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖ．５：５６２−５７０．
【非特許文献２４】Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｍ．Ｍ．ら、１９９７．Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｌｅｎｇｔｈ  ａｎｄ  ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｏ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３６：１３０６０−１３０６７．
【非特許文献２５】Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｍ．Ｍ．ら、１９９８．Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ４３０−５７０  ｉｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ  ａｒｅ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２５６１２−２５６１５．
【非特許文献２６】Ｂａｋｉｌｌａｈ，Ａ．ら、１９９８．Ｌｙｓｉｎｅ  ａｎｄ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  １８％  ｏｆ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ  ａｒｅ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３７：３７２７−３７３４．
【非特許文献２７】Ｂａｋｉｌｌａｈ，Ａ．ら、２０００．Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏＢ  ｆｏｌｌｏｗｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏＢ−ＭＴＰ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｙ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３９：４８９２−４８９９．
【非特許文献２８】Ｂａｋｉｌｌａｈ，Ａ．ら、２００１．Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｏ  ｌｉｐｉｄｓ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｓｔａｂｌｅ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ＭＴＰ−ｌｉｐｉｄ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３１４６６−３１４７３．
【非特許文献２９】Ｔｉｅｔｇｅ，Ｕ．Ｊ．Ｆ．ら、１９９９．Ｈｅｐａｔｉｃ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＭＴＰ）  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ＶＬＤＬ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ  ａｎｄ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４０：２１３４−２１３９．
【非特許文献３０】Ｗｅｔｔｅｒａｕ，Ｊ．Ｒ．ら、１９９１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ−ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３０：４４０６−４４１２．
【非特許文献３１】Ａｔｚｅｌ，Ａ．ら、１９９３．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３２：１０４４４−１０４５０．
【非特許文献３２】Ａｔｚｅｌ，Ａ．ら、１９９４．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｃｌａｓｓｅｓ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３３．１５３８２−１５３８８．
【非特許文献３３】Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．１９７６．Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｇｒａｍ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４．
【非特許文献３４】Ｃｈａｎｇ，Ｔ．Ｙ．ら、１９８１．Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｇｒｏｗｎ  ｉｎ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６：２９８−３０２．
【非特許文献３５】Ａｔｈａｒ，Ｈ．ら、２００４．Ａ  ｓｉｍｐｌｅ，ｒａｐｉｄ，ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４５：７６４−７７２．
【非特許文献３６】Ｒｏｕｔｔ，Ｓ．Ｍ．ら、２００４．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｐｉ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８２：２５４−２６２．
【非特許文献３７】Ｗｅｔｔｅｒａｕ，Ｊ．Ｒ．ら、１９８６．Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ  ａｎｄ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ  ｅｓｔｅｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｒａｔ  ｔｉｓｓｕｅ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ８７５：６１０−６１７．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ゆえに、ＭＴＰ活性を阻害するが、リポタンパク質の分泌には顕著な影響を与えない化合物が望ましい。そのためには、主としてＭＴＰの脂質輸送活性の阻害能に基づいた、化合物のスクリ−ニング方法を開発することが望ましい。本発明は、自動化やハイスル−プットスクリ−ニングに適した、簡便、迅速かつ高感度なＭＴＰ活性のアッセイ方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ＭＴＰ活性を測定するための方法及び組成物を提供する。本発明の一態様において、（ａ）蛍光標識脂質を内部に含有するドナ−小胞を調製し；（ｂ）アクセプタ−小胞を調製し；（ｃ）ＭＴＰを含有する細胞ホモジェネ−ト又は単離されたＭＴＰを、標識された脂質がドナ−からアクセプタ−小胞へと輸送される間、上記蛍光標識脂質がＭＴＰと結合するのに十分な時間及び条件の下で、上記アクセプタ−小胞及び標識された上記ドナ−小胞をインキュベ−トし；（ｄ）上記ＭＴＰに結合した上記蛍光標識脂質の蛍光を測定する；段階からなる、ＭＴＰレベルの測定法が提供される。上記の細胞ホモジェネ−トには、ＭＴＰを発現する肝細胞、腸細胞、心臓細胞又は他のいずれかの細胞が含まれ、動物（ヒトを含む）、昆虫及び微生物の細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０００７】
本発明に使用される蛍光標識脂質は、トリグリセリド、コレステロ−ルエステル（ＣＥ）又はリン脂質を含むが、これらに限定されるものではない。蛍光標識のトリアシルグリセロ−ルの一例は、１，２−ジオレイル−３−ＮＢＤグリセロ−ル（ＮＢＤ−ＴＡＧ）である。小胞は、望ましくは小型の単層の小胞、多層の小胞、ａｐｏＢリポタンパク質の小胞、他のリポタンパク質若しくはホスファチジルコリン（ＰＣ）の小胞である。
【０００８】
本発明はまた、ＭＴＰの脂質輸送活性を調節する化合物の同定法を提供する。その方法は、（ａ）蛍光標識脂質をドナ−小胞に取り込む段階、（ｂ）アクセプタ−小胞を調製する段階、（ｃ）上記アクセプタ−小胞と標識された前記ドナ−小胞の一定量を、既知又は未知のＭＴＰ調節物質である試験化合物と混合する段階、（ｄ）ＭＴＰを含む細胞のホモジェネ−ト又は単離されたＭＴＰを、上記ドナ−小胞、上記アクセプタ−小胞及び上記試験化合物を含有する混合物に添加する段階、（ｅ）上記アクセプタ−小胞、上記標識ドナ−小胞、上記試験化合物及び上記ＭＴＰ（第一試薬）を、上記ドナ−小胞から上記アクセプタ−小胞への標識脂質の輸送の間に、上記蛍光標識脂質がＭＴＰと結合するのに十分な時間と条件下にてインキュベ−トする段階、（ｆ）上記アクセプタ−小胞、上記標識ドナ−小胞及び上記ＭＴＰ（第二試薬）を、上記ドナ−小胞から上記アクセプタ−小胞への上記標識脂質の輸送の間に、上記蛍光標識脂質がＭＴＰと結合するのに十分な時間と条件下にてインキュベ−トする段階、（ｇ）上記の段階（ｅ）及び段階（ｆ）において得られた、ＭＴＰに結合した上記蛍光標識脂質の蛍光を測定する段階、並びに、（ｈ）上記の段階（ｅ）で得られた蛍光の増加と段階（ｆ）で得られた蛍光とを比較し、それをＭＴＰの脂質輸送活性を増加する化合物の指標として関連付け、一方、段階（ｅ）で得られた蛍光の減少と段階（ｆ）で得られた蛍光とを比較し、ＭＴＰの脂質輸送活性を減少させる化合物の指標として関連付ける段階からなる。
【０００９】
本発明はまた、ミクロソ−ムのトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）の脂質輸送活性の定量法を提供する。本法は、（ａ）蛍光標識脂質を内部に含有するドナ−小胞を調製する段階、（ｂ）アクセプタ−小胞を調製する段階、（ｃ）ＭＴＰを含む細胞のホモジェネ−ト又は単離されたＭＴＰを、上記アクセプタ−小胞及び上記の標識ドナ−小胞と、上記標識脂質が上記ドナ−小胞から上記アクセプタ−小胞に輸送される間、上記蛍光標識された脂質がＭＴＰと結合するのに十分な時間及び条件下にてインキュベ−トする段階、並びに、（ｄ）ＭＴＰと結合した上記蛍光標識脂質の蛍光を測定する段階からなる。
【００１０】
本発明はまた、ＭＴＰにより輸送される脂質レベルの測定法（すなわち、ＭＴＰによる脂質の正味の輸送の測定法）を提供する。上記の方法は、（ａ）蛍光標識脂質を内部に含有する負荷電のドナ−小胞を調製する段階、（ｂ）アクセプタ−小胞を調製する段階、（ｃ）ＭＴＰを含む細胞のホモジェネ−ト又は単離されたＭＴＰを、上記アクセプタ−小胞及び上記の標識ドナ−小胞と、上記標識脂質が上記ドナ−小胞から上記アクセプタ−小胞に輸送される間に、上記蛍光標識脂質がＭＴＰと結合するのに十分な時間及び条件下にてインキュベ−トする段階、（ｄ）上記の負荷電のドナ−小胞及びＭＴＰを、上記段階（ｃ）のインキュベ−ト混合物から除去する段階、並びに、（ｅ）上記アクセプタ−小胞に輸送された上記蛍光標識脂質を測定する段階、からなる。
【００１１】
本発明はまた、ＭＴＰの脂質輸送活性及び／又はＭＴＰにより輸送された脂質（脂質の正味の輸送）のレベルを測定するキットを提供する。上記キットは、アクセプタ−小胞及び蛍光標識されたドナ−小胞からなる。望ましくは、上記キットの蛍光標識されたドナ−小胞は、トリグリセリド、コレステロ−ルエステル又はリン脂質からなる。上記キットに包まれる小胞は、小型の単層小胞、多層小胞、ａｐｏＢリポタンパク質の小胞又はホスファチジルコリン（ＰＣ）の小胞であってもよい。上記キットに含まれる小胞は、適切な緩衝液と混合されることが望ましく、またＢＳＡのような安定剤を含んでもよい。上記キット内のＭＴＰによる脂質の正味の輸送を測定するためのドナ−小胞は、負電荷を有することが望ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
ＭＴＰ活性の測定は、従来、精製ＭＴＰ又は細胞ホモジェネ−トを放射性標識脂質を含むドナ−小胞と１〜３時間インキュベ−トし、ドナ−小胞を沈降させ、アクセプタ−小胞に輸送された放射線を測定することにより行われる。
【００１３】
本発明により、新規、簡便、迅速かつ高感度のＭＴＰのアッセイ法が提供される。本発明の第一の実施態様において、ＭＴＰのレベルを測定する方法及び／又はＭＴＰの脂質輸送活性を定量する方法が提供される。本発明のもう一つの実施形態において、ＭＴＰにより輸送される脂質のレベル（すなわち、脂質の正味の輸送）を測定する方法が提供される。これらの方法は、個々の脂質輸送活性に対する特異的阻害剤の同定、これらの脂質の輸送に関与する種々のドメインの特徴付け、及び脂質を結合するが輸送をすることができない変異体の単離に有用である。
【００１４】
第一の実施形態において、アクセプタ−小胞の存在下で、脂質と結合し更にその脂質を膜から抽出するＭＴＰの活性が測定される。脂質が単層（単一のリン脂質二重層）膜の小胞内にある場合、蛍光が消失する。そこでＭＴＰと会合すると、脂質の蛍光標識試薬は消失せず、蛍光光度計により検出される。このアッセイ法によるＭＴＰ活性の測定は、時間及び濃度依存的であるため、この方法が他のアンタゴニストの同定にも利用可能であることを示唆する。
【００１５】
更なる実施形態において、蛍光脂質のアクセプタ−小胞への正味の輸送が測定される。この方法において、アクセプタ−小胞に蓄積した蛍光脂質は、陰イオン交換樹脂によるＭＴＰ及びドナ−小胞の除去後に定量される。本発明のこの実施形態は、アクセプタ−小胞をドナ−小胞及びＭＴＰから分離する段階が追加されている。加えて、負荷電の脂質がドナ−小胞内に取り込まれると、上記アッセイの感度が低下する。そのため、このアッセイ法は脂質の正味の輸送の測定が必要な場合に望ましい。ル−チンとしてのＭＴＰ活性の測定には、ここで開示される、ＭＴＰのレベルを測定、又はＭＴＰの脂質輸送活性を定量する方法が望ましい。
【００１６】
上記アッセイにおいては、単離及び／若しくは精製されたＭＴＰ、又は細胞ホモジェネ−トを、消光された蛍光標識脂質（例えば、トリグリセリド、コレステロ−ルエステル、及び／又はリン脂質）を含むドナ−小胞及び種々のタイプのアクセプタ−小胞とインキュベ−トする。上記の細胞ホモジェネ−トは、ＭＴＰを発現するいずれかの細胞から調製可能である。望ましくは、上記細胞は動物の肝細胞、腸細胞又は心臓細胞である。上記動物細胞はラット、マウス、サル又はヒトのような動物由来が望ましい。あるいは、上記の細胞ホモジェネ−トは昆虫又は微生物由来の細胞でもよい。
【００１７】
本発明において、蛍光標識脂質にはトリグリセリド、コレステロ−ルエステル（ＣＥ）又はリン脂質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明に使用されるトリグリセリドの一例は、トリアシルグリセロ−ル（ＴＡＧ）である。本発明に使用されるリン脂質の一例は、ホスファチジルエタノ−ルアミンである。
【００１８】
上記脂質の標識に使用される可能性のある種々のタイプの蛍光化合物の例には、７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾ−ル（ＮＢＤ）、ピレン又はＢＯＤＩＰＹ（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの蛍光化合物を用いて脂質を標識する方法は当業者に公知であり、調製済の蛍光標識脂質もまた容易に入手可能である。本発明での使用にあたり、上記の脂質は少なくとも一つの蛍光標識をいずれの位置に含んでもよい。例えば、トリアシルグリセリドは少なくとも一つのＮＢＤをいずれかの位置に含み、一方でその他の位置に脂肪酸を含んでもよい。
【００１９】
ピレンにより標識された脂質の例として、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社（ユ−ジン、ＯＲ）から以下のものが入手可能であり、以下のとおりオンラインカタログに一覧が示されている：
Ｂ−３７８２
１，２−ビス−（１−ピレネデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン
Ｃ−２１２
コレステリル−１−ピレネブチレ−ト
Ｄ−６５６２
１，２−ジオレオイル−３−（１−ピレネドデカノイル）−ｒａｃ−グリセロ−ル
Ｈ−３６１
１−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレネデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（β−ｐｙ−Ｃ１０−ＨＰＣ）
Ｈ−３７８４
１−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレネデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノ−ルアミン（β−ｐｙ−Ｃ１０−ＨＰＥ）
Ｈ−３８０９
１−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレネデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロ−ル、アンモニウム塩（β−ｐｙ−Ｃ１０−ＰＧ）
Ｈ−３８１０
１−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレネデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホメタノ−ル、ナトリウム塩（β−ｐｙ−Ｃ１０−ＨＰＭ）
Ｈ−３８１８
１−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレネヘキサノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（β−ｐｙ−Ｃ６−ＨＰＣ）
Ｐ−５８
Ｎ−（１−ピレネスルホニル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノ−ルアミン、トリエチルアンモニウム塩（ｐｙＳ  ＤＨＰＥ）
【００２０】
ＢＯＤＩＰＹ標識された脂質の例には以下のものが存在し、それらはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社から入手可能であり、以下のとおりオンラインカタログに一覧が示されている：
Ｂ−７７０１
１，２−ビス−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ウンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ビス−ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ＦＬ  Ｃ１１−ＰＣ）
Ｂ−３７９４
２−（５−ブチル−４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ノナノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（β−Ｃ４−ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ５００／５１０  Ｃ９−ＨＰＣ）
Ｃ−３９２７
コレステリル−４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノエ−ト（コレステリル  ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ＦＬ  Ｃ１２）
Ｃ−１２６８０
コレステリル−４，４−ジフルオロ−５−（４−メトキシフェニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ウンデカノエ−ト（コレステリル  ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ５４２／５６３  Ｃ１１）
Ｃ−１２６８１
コレステリル−４，４−ジフルオロ−５−（２−ピロリル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ウンデカノエ−ト（コレステリル  ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ５７６／５８９  Ｃ１１）
Ｄ−３７９２
２−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（β−ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ＦＬ  Ｃ１２−ＨＰＣ）
Ｄ−３８０３
２−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ペンタノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（β−ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ＦＬ  Ｃ５−ＨＰＣ）
Ｄ−３８００
Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノ−ルアミン、トリエチルアンモニウム塩（ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ＦＬ  ＤＨＰＥ）
Ｐ−１２６５６
Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−１，２−ジヘキサノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノ−ルアミン、トリエチルアンモニウム塩（ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ＦＬ  ジカプロイル  ＰＥ）
Ｄ−３８１３
２−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノ−ルアミン（β−ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ５３０／５５０  Ｃ１２−ＨＰＥ）
Ｄ−３８１５
２−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ペンタノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（β−ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ５３０／５５０  Ｃ５−ＨＰＣ）
Ｄ−３７９９
Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノ−ルアミン、トリエチルアンモニウム塩（ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ５３０／５５０  ＤＨＰＥ）
Ｄ−３７９３
２−（４，４−ジフルオロ−５−メチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（β−ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ５００／５１０  Ｃ１２−ＨＰＣ）
Ｄ−３７９５
２−（４，４−ジフルオロ−５−オクチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ペンタノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（β−Ｃ８−ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ５００／５１０  Ｃ５−ＨＰＣ）
Ｄ−３８０６
２−（４，４−ジフルオロ−５−（４−フェニル−１，３−ブタジエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ペンタノイル）−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（β−ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ５８１／５９１  Ｃ５−ＨＰＣ）
【００２１】
ＮＢＤ標識脂質はまた、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社によりカスタム合成されたものが使用可能であり、例えばＤ−１６４０８：１，３−ジオレイン，２−ＮＢＤ−Ｘエステルの注文合成、又はＢ−１８００：ＮＢＤ標識コレステロ−ルオレイン酸エステル（コレステロ−ルエステル）のカスタム合成がその例である。
【００２２】
更に、以下の化合物はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社から購入可能であり、注文合成の必要はない：
Ｎ−００３６０（ＮＢＤ−ＰＥ）  Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾ−ル−４−イル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−ル−３−ホスホエタノ−ルアミン、トリエチルアンモニウム；
Ｎ−０３７８６（ＮＢＤ  Ｃ６−ＨＰＣ）  ２−（６−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾ−ル−４−イル）アミノ）ヘキサノイル−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；及び
Ｎ−０３７８７（ＮＢＤ  Ｃ１２−ＨＰＣ）  ２−（１２−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾ−ル−４−イル）アミノ）ドデカノイル−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン。
【００２３】
本発明に使用可能な小胞の例としては、小型の単層小胞、多層小胞、ａｐｏＢリポタンパク質の小胞又はホスファチジルコリン（ＰＣ）の小胞が挙げられる。本明細書において、また当業者に公知のように、「単層小胞」は、一つのリン脂質二重層を有する小胞（リポソ−ム）を意味する。「多層小胞」は、数個のリン脂質二重層を有する小胞（リポソ−ム）を意味する。図８は、二重の脂質層膜に埋め込まれた標識トリグリセリドであるＮＢＤ−ＴＧを含有する、単層小胞を模式的に示した図である。アクセプタ−小胞の製法は公知であり、例えば非特許文献２０、２１及び３０から３２に記載が存在する。ドナ−小胞の製法も公知であり、例えば非特許文献２０、２１及び３０から３２に記載が存在する。本発明において、主題のドナ−小胞を調製する場合、カルジオリピンを除外してもよく、また、放射線標識ＴＡＧを蛍光標識ＴＡＧで置換することも可能である。
【００２４】
ドナ−小胞及びアクセプタ−小胞のいずれも、トリス−塩酸（ｐＨ約７．４）のような適切な緩衝液と混合されることが望ましい。ドナ−小胞及びアクセプタ−小胞は別々に保存することが可能である。他の方法として、これらの小胞を一緒に保存し、ドナ−小胞／アクセプタ−小胞の混合物を直接本発明のアッセイ又はキットに使用してもよい。ドナ−小胞及びアクセプタ−小胞が一緒に保存される場合、ドナ−小胞：アクセプタ−小胞の比は約１：４〜約１：１０の範囲であることが望ましい。最も望ましくは、ドナ−小胞：アクセプタ−小胞の比は約１：６である。調製された小胞は、ＮａＣｌ及びＢＳＡをそれぞれ最終濃度約１５０ｍＭ及び１ｍｇ／ｍｌにて添加することにより、更に安定化させることが可能である。
【００２５】
ＭＴＰは、公知の方法を用いて種々の供給源から分離・精製することが可能であり、例えば非特許文献２０及び２１に記載が存在する。例えば、ＭＴＰは前述のようにウシの肝臓から単離可能である（非特許文献２０及び２１）。また、ヒトのＭＴＰは、非特許文献１５に記載のように培養細胞をＭＴＰのコ−ド配列を含む発現ベクタ−で培養細胞をトランスフェクションすることにより調製が可能である。これらの非特許文献及び全ての他の非特許文献は、参照により全ての内容が本明細書に援用される。
【００２６】
本発明において、ＭＴＰにより仲介される脂質輸送による蛍光の増加は、短時間経過の後に測定可能である。本明細書において提供される方法を用い、ＭＴＰ発現プラスミドでトランスフェクションされたＨｅｐＧ２、Ｃａｃｏ−２細胞及びＣＯＳ細胞において、ＭＴＰ活性の測定が可能となった。更に本発明により提供される方法は、細胞内ＭＴＰ及び精製ＭＴＰの、そのアンタゴニストによる阻害を解析する際に有用である。これらの方法は自動化に適しており、容易にハイスル−プットスクリ−ニングに適用することができる。
【００２７】
更に本発明は、例えば同定、調節、診断等の種々の目的で、特定のサンプルにおけるＭＴＰのアッセイを可能にする方法を提供する。例えば、これらの方法は、精製ＭＴＰサンプルの活性や、細胞株、組織等に存在するＭＴＰをアッセイするのに使用可能である。本発明により提供されるアッセイは非常に用途が広く、蛍光標識を含む何らかの脂質のＭＴＰによる輸送が測定可能である。更に、本明細書に提供されるＭＴＰ測定方法は簡便かつ迅速である。これらの方法は、ドナ−小胞とアクセプタ−小胞間の脂質輸送の間に生じる、蛍光標識試薬とＭＴＰとの結合に起因する蛍光の増加を測定することに基づく。
【００２８】
本発明の方法は、ＭＴＰの発現が確認されている細胞において、活性を正確に測定するが、ＭＴＰを発現しない細胞においては活性が測定されない（表１）。更に、これらの方法は、先行技術における放射性同位元素によるアッセイを用いて同定されたアンタゴニストと同様の阻害特性を表す（図７）。ＭＴＰはアクセプタ−小胞の存在下で、有意に高い活性を示す（図４）。アクセプタ−小胞の非存在下でのＭＴＰの低い脂質結合活性は、脂質輸送過程における種々のアクセプタ−小胞の機能を理解するための特徴的な機会を提供する。
【００２９】
本明細書により提供される、ＭＴＰにより輸送される脂質のレベル（脂質の正味の輸送）を測定する方法において、上記方法はＭＴＰによる、実際にアクセプタ−小胞における蛍光標識脂質の正味の蓄積を測定する。
【００３０】
このように本発明は、ＭＴＰ活性を測定するための簡便かつ迅速な蛍光アッセイ法を提供する。この新規方法の利点としては、簡便性、迅速性、高感度、負荷電脂質使用の回避、精製されたＭＴＰ及び細胞のＭＴＰによる種々の脂質輸送活性の解析における汎用性、アンタゴニストの阻害活性の測定への応用及び放射線使用の未然防止、等が挙げられる。本発明により提供される蛍光アッセイは自動化が容易であり、大規模のハイスル−プットスクリ−ニングに使用可能である。この方法は、部分的にＭＴＰ活性を阻害し、かつ細胞におけるＴＡＧ蓄積に結びつく望ましくない副作用を最小にする候補化合物の同定に有用である。ＭＴＰは、リポタンパク質構築シャペロン以外の機能を有する多機能タンパク質であると考えられる。本明細書において提供される蛍光アッセイ法に基づくスクリ−ニングにより同定される化合物は、ＭＴＰが有する、リポタンパク質の構築及び分泌とは無関係の他の機能の同定に有用と考えられる。
【００３１】
本発明におけるＭＴＰのアッセイ法は、基本的に三つの成分、すなわちドナ−小胞、アクセプタ−小胞及びＭＴＰからなる。本発明により提供される方法は、アッセイ混合物の上記三成分全て、及び時間との間で直線的な関係を示す（図１から４）。
【００３２】
典型的なアッセイは、以下に概説するとおり実施される。以下に列挙される種々の化合物の量は、これら化合物間の比率が相対的に同一に保たれる限り当然ながら変更可能である。各アッセイにおいては４種の異なる条件（ブランク試験区、総蛍光区、陽性対照区及び試験区）の採用が推奨される。全てのアッセイにおいて、反応は最終的なＭＴＰ源の添加により開始される。約３μｌずつのアクセプタ−小胞及びドナ−小胞を、蛍光マイクロタイタ−（黒）プレ−トにピペットで添加する。２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）を約１０μｌ、及び１％ＢＳＡの１．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液１０μｌを添加する。本明細書に記載のアッセイに使用する小胞の正確な数を、ル−チン的に定量することは困難である。しかしながら、種々の調製済み小胞に存在するリン脂質及びトリグリセリドを測定することにより、小胞のより容易な定量が可能となる。すなわち、上記３μｌのドナ−小胞は、１ｍｌ当たり約４５０ｎｍｏｌのホスファチジルコリン（ＰＣ）及び約１４ｎｍｏｌのトリグリセリドに相当する。ドナ−小胞は、ある一定の濃度範囲で使用することが可能である。望ましい範囲は、例えば、約２００〜約６００ｎｍｏｌのホスファチジルコリン（ＰＣ）、及び７〜２０ｎｍｏｌのトリグリセリドの範囲のいずれかである。上記の３μｌのアクセプタ−小胞は、約２，４００ｎｍｏｌ  ＰＣ／ｍｌに対応する。しかしながら、小胞の濃度範囲は、例えば約１，４００〜約３，４００ｎｍｏｌ  ＰＣ／ｍｌの範囲でよい。
【００３３】
ブランク試験においては、必要量の対照緩衝液（陽性対照区及び試験区においてはＭＴＰ源を含む）を添加し、更に水を添加して液量を約１００μｌにする。陽性対照においては、所定量のＭＴＰ源を添加して、更に水を添加して液量を約１００μｌにする。試験試料においては、未知の試料を添加して最終アッセイ液量にする。総蛍光アッセイの混合物については、約３μｌのドナ−小胞及び９７μｌのイソプロパノ−ルのみを添加する。上記混合物を約３７℃において約３０分間インキュベ−トする。蛍光単位を、それぞれ、４６０から４７０ｎｍ及び５３０から５５０ｎｍの励起及び発光波長を用いて測定する。輸送活性が低い場合、インキュベ−トの時間を増加してもよい。実際は、同じタイタ−プレ−トを数回使用して蛍光の増加を経時的に測定してもよい。しかしながら、上記フルオロフォア（蛍光標識試薬）は、イソプロパノ−ル中では長期間安定に維持することが困難である。したがって、３０分以上のときは、３０分又はそれ以前に測定された数値を使用すべきである。アッセイにて使用される構成成分は、小胞及び陽性対照を含め、本明細書に記載のとおり調製することが可能であり、又はＣｈｙｌｏｓ社（ウッドベリ−、ニュ−ヨ−ク州）からも入手可能である。
【００３４】
本発明の望ましい実施形態において、ドナ−小胞及びアクセプタ−小胞は共に、貯蔵又は上記のように混合して使用することが可能である。この実施態様においてアッセイを行う場合、これらの小胞（ドナ−及びアクセプタ−の両方）の必要なピペット操作は１回のみである。
【００３５】
上記小胞は、トリス塩酸（ｐＨ約７．４）のような適切な緩衝液と混合するのが望ましい。またリン酸緩衝液又はＨＥＰＥＳのような他の緩衝液を使用してもよい。望ましい実施態様においては、ＮａＣｌを最終濃度約１５０ｍＭまで添加する。ＮａＣｌの原液（例えば３Ｍ）を調製し、その後希釈して最終濃度にしてもよい。ＫＣｌ又はＭｇＣｌ２のような他の塩類もまた使用可能である。ＢＳＡを最終濃度約１ｍｇ／ｍｌとなるように添加して上記小胞を安定化するのが望ましい。原液（例えば、２０ｍｇ  ＢＳＡ／ｍｌ）を作成し、その後希釈して最終濃度にしてもよい。なお、更なる実施態様において、インキュベ−トを室温で行ってもよい。
【００３６】
蛍光脂質を含むドナ−小胞及びアクセプタ−小胞は、実施例１に記載のよう調製が可能である。望ましい実施態様においては、同液量のドナ−小胞及びアクセプタ−小胞を混合する。典型的なアッセイ方法を以下に記す。
（ｉ）下表記載のように、蛍光マイクロタイタ−（黒）プレ−トにピペットで小胞を３回添加する。
（ｉｉ）水、試料等を添加する。約５分間、これらの成分が室温に達するまで静置する。
（ｉｉｉ）対照区及び試験区にＭＴＰを加えて反応を開始させ、またイソプロパノ−ルを総蛍光区に加える。
（ｉｖ）室温で３０分間インキュベ−トする。
【表１】
2008504523.tif 000002
ＭＴＰ活性の測定：４６０〜４７０ｎｍの励起波長、及び５３０〜５５０ｎｍの発光波長をそれぞれ用い、蛍光単位（ＦＵ）を測定する。
ＭＴＰ活性の計算：
対照区における輸送％（Ｃ）：（対照区のＦＵ−ブランク試験区のＦＵ）／（総蛍光区のＦＵ−ブランク試験区のＦＵ）×１００
試験区における輸送％（Ｄ）：（試験区のＦＵ−ブランク試験区のＦＵ）／（総蛍光区のＦＵ−ブランク試験区のＦＵ）×１００
【００３７】
本発明により、ＭＴＰの脂質輸送活性を調節する化合物の同定法もまた提供される。上記の方法は、以下の段階から構成される：（ａ）蛍光標識脂質をドナ−小胞に取り込む段階；（ｂ）アクセプタ−小胞を調製する段階；（ｃ）アクセプタ−小胞と標識ドナ−小胞の一定量を、既知又は未知のＭＴＰ調節剤である試験化合物と混合する段階；（ｄ）ＭＴＰを含む細胞のホモジェネ−ト又は分離されたＭＴＰを、ドナ−小胞、アクセプタ−小胞及び試験化合物を含む上記の混合物に添加する段階；（ｅ）アクセプタ−小胞、標識ドナ−小胞、試験化合物及びＭＴＰの混合液（第一試薬）を、ドナ−小胞からアクセプタ−小胞への標識脂質輸送の間に蛍光標識脂質がＭＴＰと結合するのに十分な時間及び条件下でインキュベ−トする段階；（ｆ）アクセプタ−小胞、標識ドナ−小胞及びＭＴＰの混合液（第二試薬）を、ドナ−小胞からアクセプタ−小胞への標識脂質輸送の間に蛍光標識脂質がＭＴＰと結合するのに十分な時間及び条件下でインキュベ−トする段階；（ｇ）上記（ｅ）と（ｆ）において得られた、ＭＴＰに結合した蛍光標識脂質の蛍光を測定する段階；並びに、（ｈ）上記（ｅ）で得られたＭＴＰに結合する蛍光標識脂質の蛍光の増加を、上記（ｆ）で得られたＭＴＰに結合する蛍光標識脂質の蛍光と比較し、ＭＴＰの脂質輸送活性を増加する化合物の指標として関連付け、一方、段階（ｅ）で得られたＭＴＰに結合する蛍光標識脂質の蛍光の減少を、段階（ｆ）で得られたＭＴＰに結合する蛍光標識脂質の蛍光と比較し、ＭＴＰの脂質輸送活性を減少させる化合物の指標として関連付ける段階；である。
【００３８】
本発明の他の実施態様において、ＭＴＰの脂質輸送活性測定用のキットが提供される。上記キットは上記のように、アクセプタ−小胞及び蛍光標識ドナ−小胞を含む。上記蛍光標識ドナ−小胞は、トリグリセリド、コレステロ−ルエステル、又はリン脂質からなることが望ましい。別の望ましい実施形態において、上記トリグリセリドは、１，２−ジオレイル−３−ＮＢＤグリセロ−ル（ＮＢＤ−ＴＡＧ）のようなＮＢＤ標識を含むいずれかのトリアシルグリセロ−ルである。他の望ましい実施形態において、上記リン脂質はホスファチジルエタノ−ルアミンである。
【００３９】
上記小胞は、トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４付近）のような適切な緩衝液と混合されることが望ましい。リン酸緩衝液又はＨＥＰＥＳのような他の緩衝液もまた使用可能である。
【００４０】
キットの構成物であるアクセプタ−小胞及び／又はドナ−小胞は、小さな単層小胞、多層小胞、ａｐｏＢ−リポタンパク質の小胞、又はホスファチジルコリン（ＰＣ）の小胞を含んでもよい。これらの小胞は、ＢＳＡの添加により安定化させることが可能である。
【００４１】
本発明はまた、ミクロソ−ムのトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）の脂質輸送活性の定量法を提供する。上記方法は、（ａ）蛍光標識脂質を内部に含有するドナ−小胞を調製する段階；（ｂ）アクセプタ−小胞を調製する段階；（ｃ）ＭＴＰを含む細胞ホモジェネ−ト又は単離されたＭＴＰを、アクセプタ−小胞及び標識ドナ−小胞と、標識脂質がドナ−小胞からアクセプタ−小胞へと輸送される間に蛍光標識脂質がＭＴＰと結合するのに十分な時間及び条件下でインキュベ−トする段階；並びに、（ｄ）ＭＴＰに結合した蛍光標識脂質の蛍光を測定する段階；からなる。
【００４２】
本発明により、ＭＴＰにより輸送される脂質のレベルの測定法（すなわち、ＭＴＰによる脂質の正味の輸送を測定する方法）も提供される。上記の方法は、（ａ）蛍光標識脂質を内部に含有する負荷電のドナ−小胞を調製する段階；（ｂ）アクセプタ−小胞を調製する段階；（ｃ）ＭＴＰを含む細胞ホモジェネ−ト又は単離されたＭＴＰを、アクセプタ−小胞及び標識ドナ−小胞と、蛍光標識脂質がＭＴＰと結合し、ドナ−小胞からアクセプタ−小胞への蛍光標識脂質の輸送が行われるのに十分な時間及び条件下にてインキュベ−トする段階；（ｄ）段階（ｃ）のインキュベ−ト混合物から負荷電のドナ−小胞及びＭＴＰを除去する段階；並びに、（ｅ）アクセプタ−小胞に輸送された蛍光標識脂質を測定する段階；からなる。
【００４３】
ドナ−小胞は、実施例に記載のように、カルジオリピンのような負荷電の脂質の添加により負に荷電することが可能である。他の負荷電の脂質を使用してもよく、ホスファチジルセリン又はホスファチジルイノシト−ルが含まれるが、これらに限定されない。負荷電のドナ−小胞及びＭＴＰは遠心分離により沈降させ、除去することが可能である。例えば、段階（ｃ）の混合物を約１０，０００から１２，０００ｒｐｍで遠心するのが望ましい。アクセプタ−小胞は上清に残存する。
【００４４】
本発明はまた、ＭＴＰにより輸送される脂質の正味の輸送の測定に有用なキットを提供する。上記キットは、アクセプタ−小胞及び負荷電の蛍光標識ドナ−小胞を含む。上記蛍光標識ドナ−小胞は、トリグリセリド、コレステロ−ルエステル又はリン脂質から構成されるのがよい。上記キットに含まれるトリグリセリドの一例は、ＮＢＤ標識を含むいずれかのトリアシルグリセロ−ルである。例えば、上記トリアシルグリセロ−ルは１，２−ジオレオイル３−ＮＢＤグリセロ−ル（ＮＢＤ−ＴＡＧ）が使用可能である。ドナ−小胞を構成するリン脂質の一例は、ホスファチジルエタノ−ルアミンである。上記キットに使用されるアクセプタ−小胞は、小型の単層小胞、多層小胞、ａｐｏＢ−リポタンパク質の小胞又はホスファチジルコリン（ＰＣ）の小胞であってよい。上記キットに含まれる小胞を、ＢＳＡの添加により安定化させることが可能である。
【００４５】
以下の実施例により本発明を更に説明するが、本発明の範囲をいささかも限定するものではない。
【実施例１】
【００４６】
材料及び方法
材料
ＭＴＰを、放射線アッセイ（非特許文献２０、２１）を用いてウシの肝臓から精製した。この方法は上記の文献（非特許文献２４から２９）においても使用されている。ＰＣ及びＴＡＧは、Ａｖａｎｔｉ  Ｌｉｐｉｄｓ社（アラバスタ−、アラバマ州）から購入した。蛍光（ニトロベンゾキサジアゾ−ル）標識ＴＡＧは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社（ユ−ジン、オレゴン州）から入手した。蛍光標識コレステリルエステル（ＣＥ）及びリン脂質（ＰＬ）は、それぞれＲｏａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社（ニュ−ヨ−ク、ニュ−ヨ−ク州）及びＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｔａｒｇｅｔ社（ニュ−ヨ−ク、ニュ−ヨ−ク州）から購入した。イソプロパノ−ル及び他の化合物は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（セントルイス、ミズ−リ州）から購入した。アクセプタ−小胞は、Ｗｅｔｔｅｒａｕらによる文献（非特許文献２０、２１、３０から３２）に記載のとおり調製した。ドナ−小胞もまた、カルジオリピンを用いず、放射線標識ＴＡＧを蛍光標識ＴＡＧで置換した以外は彼らの方法に従って調製した。既知量の蛍光脂質をイソプロパノ−ルで希釈して標準曲線を作成し、イソプロパノ−ルで小胞を破砕した後に小胞内の標識脂質の量を測定した。小胞中のトリオレインの量を、比色アッセイ（Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（商標）トリグリセリド試薬キット、Ｓｉｇｍａ社）により定量した。ＭＴＰ阻害剤であるＢＭＳ２００１５０（ジフェニル−プロピル−ピペリジニル−ジヒドロイソ−インド−ル）については非特許文献１２に記載が存在し、ブリストルマイヤ−ズ  スクイブ社（プリンストン、ニュ−ジャ−ジ−州）のＨａｒｉｓ  Ｊａｍｉｌ博士から寄贈された。
【００４７】
輸送アッセイ
アッセイを、ミクロフルオ−ル（登録商標）２黒「Ｕ」型底マイクロタイタ−プレ−ト（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社、フランクリン、マサチュ−セッツ州）にて行った。ウエルに、３μｌのドナ−小胞（１ｍｌ当たり４５０ｎｍｏｌのＰＣ及び１４ｎｍｏｌのＴＡＧ）、３μｌのアクセプタ−小胞（２，４００ｎｍｏｌ  ＰＣ／ｍｌ）、１０μｌの１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液、最終アッセイ液量を１００μｌにするための蒸留水、及び精製ＭＴＰ（０．１〜１．５μｇ）を、３回、添加した。いくつかの実験において、ＮａＣｌ及びＢＳＡを添加して最終濃度をそれぞれ１５０ｍＭ及び１ｍｇ／ｍｌにした。プレ−トを３７℃又は室温で異なる時間インキュベ−トし、蛍光プレ−トリ−ダ−（７６２０蛍光マイクロプレ−トリ−ダ−、ケンブリッジテクノロジ−社、ウオ−タ−タウン、マサチュ−セッツ州）を用い、４６０ｎｍの励起波長及び５３０ｎｍの発光波長にて測定した。ブランク値を決定するときはＭＴＰをウエルから省いた。ドナ−小胞における総蛍光量は、９７μｌのイソプロパノ−ルを３μｌのドナ−小胞に添加したものを用い決定した。ＭＴＰ阻害を解析する際、ＭＴＰ添加前に種々の濃度のＢＭＳ２００１５０を反応混合物に添加した。ＭＴＰ活性（輸送の％表示）を次の式により計算した：輸送パ−セント＝（アッセイウエルの任意の蛍光単位−ブランク試験値）／（総蛍光単位−ブランク試験値）×１００。比活性を１μｇ当たり、１時間当たりの輸送パ−セントとして表わす。
【００４８】
Ｃｏｓ−７細胞のトランスフェクション
Ｃｏｓ−７細胞は、１０％のウシ胎児血清と１％の抗生物質−抗真菌剤（ライフテクノロジ−ズ社、ロックビル、ミズ−リ州）を添加したＤＭＥＭ培地（セルグロメディアテック社、ヘ−ンドン、ヴァ−ジニア州）中で培養した（３７℃、５％ＣＯ２、加湿インキュベ−タ−内）。トランスフェクションの２４時間前に、細胞を７５ｃｍ２のフラスコに１×１０６個ずつ分注した。トランスフェクション時に細胞は約５０〜６０％の集密状態であった。ＭＴＰ発現ベクタ−（非特許文献１５）ｐＲｃ−ｈＭＴＰ（７μｇ、サイトメガロウイルスプロモ−タ−の制御下にてヒトのＭＴＰを発現する）を、２１μｌのＦｕＧＥＮＥ−６トランスフェクション試薬（ロッシュダイアグノスティックス社、インディアナポリス、インディアナ州）とコンジュゲ−トし、Ｃｏｓ−７細胞に導入した。細胞を、７ｍｌの培地中で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で約７２時間培養した。またＣｏｓ−７細胞をＦｕＧＥＮＥ−６のみでも処理し（模擬トランスフェクション）、対照区として使用した。
【００４９】
細胞ホモジェネ−ト中のＭＴＰ活性の測定
細胞ホモジェネ−ト中のＭＴＰ活性を、Ｊａｍｉｌら（非特許文献２１）に記載の方法により決定した。集密細胞の単層を氷冷した無菌のＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄し、５ｍｌのＰＢＳ中に懸濁させ、１５ｍｌの円錐管に移し、遠心分離（２，５００ｒｐｍ、１０分、室温）によりペレット状に沈降させた。この段階で、細胞ペレットは７０℃で保存することが出来る。７５０μｌのホモジェネ−トバッファ−（５０ｍＭのトリス−塩酸、ｐＨ７．４、５０ｍＭ  ＫＣｌ、及び５ｍＭ  ＥＤＴＡ）及び７．５μｌのプロテア−ゼ阻害剤カクテル（カタログ番号Ｐ２７１４、シグマ社）を上記細胞ペレットに添加し、ホモジェネ−トした。次に細胞を３ｍｌのシリンジに装着された注射針（２９Ｇ、１．５インチ（３．８１ｃｍ））を通して反復吸引して懸濁させ、氷冷下にてボ−ルベアリング付きホモジナイザ−（間隙０．２５３インチ（０．６４ｃｍ）、１０回通過）内でホモジナイズした。細胞ホモジェネ−トを氷上に置き、タンパク質濃度をブラッドフォ−ド法（非特許文献３３）によりクマシ−プラス試薬（ピア−ス社、ロックフォ−ド、イリノイ州）を用い、ＢＳＡを標準物質として測定した。細胞ホモジェネ−トをホモジェネ−トバッファ−により１．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度まで希釈した。ＭＴＰをミクロソ−ムからデオキシコ−ル酸処理（非特許文献１２）により放出させた。ここにおいて、上記細胞ホモジェネ−トに、その１０分の１容の０．５４％デオキシコ−ル酸ナトリウム（ｐＨ７．４）を添加して０．０５４％デオキシコ−ル酸塩濃度に調整し、時折混合しながら氷上に３０分間放置した。続いて細胞膜をＳＷ５５  Ｔｉロ−タ−を用い５０，０００ｒｐｍ、１時間、１０℃にて遠心除去した。上清を１２〜１４ｋＤａ除去の透析バッグに充填し、１５ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．４）、４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．０２％  ＮａＮ３溶液により透析し、１時間後に１回目の透析液交換を、２時間後に２回目を行い、更に一晩透析した。細胞ホモジェネ−トを透析バッグから取り出し、タンパク質測定とＭＴＰアッセイに使用した。阻害の解析の際は、ＨｅｐＧ２細胞を種々の濃度のＭＴＰ阻害剤であるＢＭＳ２００１５０と２４時間インキュベ−トし、上記細胞から得られた細胞ホモジェネ−トをＭＴＰアッセイに使用した。
【００５０】
細胞のＭＴＰをアッセイするより迅速な方法を開発するため、Ｃｈａｎｇ、Ｌｉｍａｎｅｋ及びＣｈａｎｇ（非特許文献３４）に記載の方法を、細胞破砕を行うために評価した。この方法においては、先ず細胞を低張の緩衝液に浸し、次いでプレ−トからかき取る。低張の緩衝液への浸漬の結果、上記細胞は膨潤し、かき取りによりこれらの細胞が破砕される。細胞の単層を氷冷ＰＢＳで２回、５ｍｌの１ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭ  ＥＧＴＡ及び１ｍＭ  ＭｇＣｌ２溶液により４℃で１回洗浄した。次いで細胞を５ｍｌの氷冷１ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．６）、１ｍＭ  ＥＧＴＡ及び１ｍＭ  ＭｇＣｌ２溶液に添加し、室温で２分間インキュベ−トした。緩衝液を吸引し、０．５ｍｌの同じ緩衝液を細胞に添加した。細胞をかき取り、氷冷チュ−ブに集め、ボルテックスし、遠心分離（ＳＷ５５  Ｔｉロ−タ−、５０，０００ｒｐｍ、１０℃、１時間）し、その上清をＭＴＰ活性のアッセイ及びタンパク質測定に使用した。
【００５１】
ラットの肝ミクロソ−ムにおけるＭＴＰ活性の測定
ラットの肝ミクロソ−ムを、Ｗｅｔｔｅｒａｕ及びＺｉｌｖｅｒｓｍｉｔ（非特許文献２０、２１）に記載の方法に若干の修正を加えた方法にて調製した。その概要は以下のとおりである。２ｇのラット肝を小片に切断し、氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。これらの小片を次いで２ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５０ｍＭショ糖及び０．０２％のアジ化ナトリウム中で、ポリトロンホモジナイザ−を用いてホモジナイズして遠心した（ベックマン社の微量遠心機、１０，９００ｒｐｍ、３０分、４℃）。上清を回収し、濃塩酸でｐＨ５．１に調整し、冷所で３０分間撹拌して遠心した（ベックマン社の微量遠心機、１３，０００ｒｐｍ、３０分、４℃）。ペレットを２ｍｌの１ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭ  ＥＧＴＡ及び１ｍＭ  ＭｇＣｌ２溶液に懸濁し、振とう撹拌し、超遠心（ＳＷ５５  Ｔｉロ−タ−、５０，０００ｒｐｍ、１０℃、１時間）を行い、得られた上清をＭＴＰアッセイ及びタンパク質測定に使用した。
【実施例２】
【００５２】
アッセイ条件の最適化
ＭＴＰの蛍光アッセイを標準化するために、ＴＡＧを小さな単層のＰＣ小胞（ドナ−小胞）に取り込んだ。上記の封入の結果、フルオロフォア（蛍光標識試薬）が消光することが期待された。実際、イソプロパノ−ルによりドナ−小胞の破砕の量が増加した結果、蛍光の測定値が増加した（図１Ａ、総蛍光）。これは上記小胞に存在するフルオロフォア（蛍光標識試薬）の総蛍光量を表す。破砕前には、この蛍光は小胞内で消光されるために検出されない。ドナ−小胞が安定で、ＭＴＰの非存在下ではフルオロフォア（蛍光標識試薬）を放出しないこともまた予測された。上記安定性を測定するため、ドナ−小胞をアクセプタ−小胞と混合し、ＭＴＰ非存在下で３０分後に蛍光を測定した（図１Ａ、ブランク試験）。ブランク試験の蛍光値の範囲は、総蛍光量の１３％と１９％の間であった（１５．７±２．７％（平均値±ＳＤ、ｎ＝３））。ブランク試験の蛍光値は、おそらくフルオロフォア（蛍光標識試薬）の小規模な漏出によるものと考えられる。ゆえに、輸送の際の、ＭＴＰによるドナ−小胞からのＴＡＧの抽出は、蛍光の検出値の増加として表れると仮定される。一定量のＭＴＰとアクセプタ−小胞を、漸増量のドナ−小胞とインキュベ−トした結果、蛍光の検出量が増加し、ＭＴＰによるＴＡＧの輸送が示唆された（図１Ａ、輸送）。「輸送」は、小胞間でＭＴＰによりＴＡＧが輸送された量を表す。輸送の間、ＭＴＰに結合したフルオロフォア（蛍光標識試薬）はおそらく水性環境に曝され、それにより蛍光測定器により検出される。蛍光単位はブランク試験値よりも４０〜４７％高かった。次に、上記デ−タを用いてＴＡＧの輸送パ−セントを計算した（図１Ｂ）。輸送パ−セントにより表される活性は、ドナ−小胞（２８ｐｍｏｌのＴＡＧ）が２μｌとなるまで増加し、その後飽和したと思われる。次に、種々の濃度のアクセプタ−小胞の効果を検討した。これらの試験において、一定量のＭＴＰとドナ−小胞を、種々の量のアクセプタ−小胞とインキュベ−トした（図１Ｃ）。輸送されるＴＡＧの量は、アクセプタ−小胞の量の増加と共に増加し、２μｌで飽和した。アクセプタ−小胞のより低濃度における輸送の増加は、これらの小胞がそのアッセイ条件において律速となることを示した。しかしながら、２μｌ以上において、アッセイ結果はアクセプタ−小胞の濃度に依存しなくなった。アクセプタ−小胞の濃度をそれ以上増加させても、蛍光の減少が検出されないことに留意すべきである。このことは、ＭＴＰはこれら小胞間で脂質を輸送するが、アクセプタ−小胞内への一方的な脂質の蓄積が生じないことを示している。このような条件下では、ＭＴＰはドナ−小胞内に存在する総ＴＡＧの２０％を輸送する反応に関与していた（図１Ｄ）。以後の試験においては、３μｌのアクセプタ−小胞を使用した。
【００５３】
アッセイ内での変動係数（ＣＶ）を決定するため、輸送アッセイを、０．５ｇのＭＴＰ、３μｌのドナ−小胞、及び３μｌのアクセプタ−小胞を用いて１０本の試験管内で行った。観察された輸送パ−セントは、１９．９±１．８（平均値±標準偏差、ｎ＝１０）であり、アッセイ内ＣＶは０．０９であった。同様に、アッセイ間変動を評価した。１μｇのＭＴＰを使用して３回行われた７つの異なる独立した測定を比較し、０．１９のアッセイ間変動係数（ＣＶ）が得られた。これらの実験において観察された輸送パ−セントは、３４．５±３．０であった。
【００５４】
図１は、種々の量のドナ−小胞及びアクセプタ−小胞の、ミクロソ−ムのトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）によるトリアシルグリセロ−ル（ＴＡＧ）の輸送に及ぼす効果を示す。
Ａ：総蛍光量。種々の表示された量のドナ−小胞が１００μｌのイソプロパノ−ルの添加により破砕され、蛍光単位が直ちに測定された。この値は上記小胞に存在する蛍光標識試薬の総蛍光量を表し、「ブランク試験」及び「輸送アッセイ」の蛍光値の単純和ではないことに留意すべきである。
ブランク：種々の量のドナ−小胞と３μｌのアクセプタ−小胞を、実施例１の材料及び方法の項目に記載されるようにアッセイバッファ−（１００μｌ）中でインキュベ−トし、３７℃で３０分のインキュベ−ト後に蛍光単位を測定した。
輸送：これらの試料が更に０．５ｇの精製ＭＴＰを含むこと以外は、そのインキュベ−トは上記のブランク試験と同様であった。ここにおいて、所定の時点でＭＴＰにより脂質が輸送された量を表す。輸送の間、ＭＴＰに結合した蛍光標識脂質は、おそらく水性の環境に曝され、蛍光測定器により検出される。
Ｂ：Ａからのデ−タを用い、材料及び方法の項に記載のようにＴＡＧの輸送パ−セントを計算した。ドナ−小胞内のＴＡＧ濃度は１４ｐｍｏｌ／ｍｌであった。
Ｃ：ドナ−小胞（３μｌ）を、０．５ｇの精製ＭＴＰと共に種々の量のアクセプタ−小胞とインキュベ−トした（３０分、３７℃）。蛍光単位を、アッセイチュ−ブにおいて観察された単位からブランク試験の蛍光単位を減算することにより得た。
Ｄ：Ｃからのデ−タを用い、実施例１の材料及び方法の項に記載のように輸送パ−セントを計算した。ここにおいて、ブランク試験及び総蛍光量の蛍光単位を、実施例１の材料及び方法の項に記載のように３回で同時に測定した。線グラフと誤差バ−は、平均値±標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【００５５】
次の試験では、ＭＴＰ活性に必要な時間、温度及びＮａＣｌ濃度の効果を測定した（図２）。種々の表示された量のＭＴＰを、実施例１の材料及び方法の項に記載のようにドナ−小胞及びアクセプタ−小胞とインキュベ−トした。適切な総蛍光量アッセイ及びブランク試験も、実施例１の材料及び方法の項に記載のように含まれる。蛍光強度を、表示の時点において３回、マイクロプレ−トリ−ダ−を用いて測定した。ＴＡＧの輸送パ−セントを時間に対してプロットした。
Ｂ：温度。二枚の異なるマイクロタイタ−プレ−ト上で試験を行った。精製ＭＴＰ（０．２５ｇ／ウエル）をドナ−及びアクセプタ−の小胞と３回、インキュベ−トした。一方のプレ−トは３７℃でインキュベ−トし、他方のプレ−トは室温に静置した。種々の時点で、室温（２２℃）にて蛍光強度を測定した。
Ｃ：ＮａＣｌの効果。ドナ−小胞（３μｌ）、アクセプタ−小胞（３μｌ）及びＭＴＰ（１μｇ）を、３回、３０分間、１ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．４）及び２ｍＭのＥＤＴＡを含む溶液中で種々の表示された濃度のＮａＣｌの存在下にてインキュベ−トした。線グラフ及び誤差バ−は、平均値±標準偏差を表す。
【００５６】
使用されたＭＴＰの種々の濃度の全てにおいて、ＴＡＧ輸送活性は、試験開始後３０分までは時間と共に増加した（図２Ａ）。その時間経過後、輸送活性は飽和し始めた。輸送活性に及ぼす温度の効果を検討した（図２Ｂ）。ＭＴＰの脂質輸送活性は、室温（２２℃）と３７℃において同等であり、活性に対して何ら有意の温度効果を示さなかった。これらの結果は、ＭＴＰが２２℃が活性にとって最適なことを示すと考えられる。また、ＭＴＰ活性に及ぼすＮａＣｌの効果も測定した（図２Ｃ）。ＮａＣｌ濃度を１５０ｍＭまで増加させて添加した結果、ＭＴＰの活性が増加した。また、これより高濃度のＮａＣｌは輸送活性を阻害すると考えられる。以上より、３０分間のインキュベ−ト及び１５０ｍＭのＮａＣｌがＭＴＰ活性の測定に最適であると決定した。
【００５７】
次に、ＴＡＧ輸送に関する、種々の濃度の精製ＭＴＰ及びＢＳＡを用い、アッセイの特異性を解析した（図３）。ドナ−小胞（３μｌ、１ｍｌ当たり４５０ｎｍｏｌのホスファチジルコリン（ＰＣ）及び１４ｎｍｏｌのＴＡＧ）及びアクセプタ−小胞（３μｌ、２，４００ｎｍｏｌのＰＣ／ｍｌ）を、表示された種々の量のＭＴＰ又はＢＳＡと、３回、３０分間インキュベ−トして、得られた結果を図３Ａに示す。蛍光単位を、アッセイチュ−ブの値からブランク試験の値を差し引いて算出した。これらのＭＴＰに関する結果デ−タを用い（図３Ａ）、輸送パ−セント活性が決定された。ＢＳＡについてはこれらの値は負であり、プロットされなかった。また、ＢＳＡ（０．１％）の非存在下又は存在下にて、表示された種々の量の精製ＭＴＰによりアッセイを行った（図３Ｃ）。線グラフ及び誤差バ−は平均値±標準偏差（ＳＤ）を表す。
【００５８】
ＭＴＰ添加量を増加させた結果、蛍光の増加が検出された（図３Ａ）。対照的に、ＢＳＡの存在により蛍光の検出量が減少し、これは放出された蛍光のＢＳＡによる消光、又はＢＳＡによるドナ−小胞の安定化による基礎的な蛍光標識試薬の漏出の防止効果を表すと考えられる。図３Ｂにおいて、デ−タを変換して小胞間で受けるＴＡＧの輸送パ−セントを測定した。これらの実験条件下において、輸送されるＴＡＧの量は２μｇのＭＴＰで飽和に達した。飽和状態において、総ＴＡＧの４０％は輸送過程にあり、これは、ＭＴＰの最大結合活性を表すと考えられる。
【００５９】
ブランク試験試料において、ＢＳＡにより蛍光単位が減少したため、ＢＳＡはＭＴＰアッセイに対してプラス効果を発揮する可能性があると推論された。更に、ＢＳＡの存在により、ＭＴＰ及び小胞のチュ−ブの表面への付着による損失が減少すると考えられる。この仮説を検証するために、ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）を用いたアッセイを行った。図３Ｃに示されるように、ＢＳＡの存在下で測定された活性は、ＢＳＡの非存在下で観察された活性のちょうど２倍であった。これは主に、ＢＳＡの存在下におけるブランク試験値の減少によるものであった。ＢＳＡの存在下又は非存在下におけるブランク試験値は、総蛍光量の１２．５±０．７％及び１８．５±０．５％（ｎ＝３）であった。すなわち、ＢＳＡを添加するとアッセイの感度が改善され、おそらくドナ−小胞からの蛍光標識試薬の漏出が防止されることによると考えられる。
【００６０】
続いて、放射線標識アッセイ及び蛍光アッセイにより測定されたＭＴＰの比活性を比較した。放射線標識アッセイを用いた種々の調製品における比活性（１ｍｇ当たり１時間の輸送パ−セント）は１２．５±２．４（ｎ＝２７）であった。ＢＳＡの非存在下における蛍光法による比活性は９２．６±１９．７（ｎ＝２０）であったが、一方、ＢＳＡの存在下において測定された比活性は２０４．４±３３．１（ｎ＝７）であった。このように、蛍光アッセイにより測定された比活性は、放射線標識アッセイを用いて観察された比活性よりも高かった。この高い比活性は、本アッセイの高い感度によると考えられる。この差異のもう一つの理由は、これら二つのアッセイにおいて使用された異なるパラメ−タ−であると考えられる。放射線標識アッセイにおいては、アクセプタ−小胞に輸送されたＴＡＧの量が測定されるが、一方で本実施例に記載の蛍光アッセイは、ＭＴＰにより輸送されるＴＡＧの量が測定される。
【表２】
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【００６１】
アクセプタ−小胞の役割
ＭＴＰアッセイは３種の構成成分、すなわちドナ−小胞、アクセプタ−小胞及びＭＴＰから構成される。言うまでもなく、ドナ−小胞とＭＴＰは必要である。ＭＴＰは脂質をドナ−小胞間で輸送することができるため、アクセプタ−小胞は活性の測定には必要ではない可能性が考えられた。この仮説を検証するため、種々の量のドナ−小胞（１ｍｌ当たり４５０ｎｍｏｌのＰＣ及び１４ｎｍｏｌのＴＡＧ）を、アクセプタ−小胞及びＭＴＰ無し（ＤＶのみ）、０．５ｇの精製ＭＴＰ添加（ＤＶ＋ＭＴＰ）、３μｌのアクセプタ−小胞添加（ＤＶ＋ＡＶ）、又は３μｌのアクセプタ−小胞（２，４００ｎｍｏｌのＰＣ／ｍｌ）及び０．５μｇの精製ＭＴＰ添加（ＤＶ＋ＡＶ＋ＭＴＰ）の条件により、アッセイ緩衝液（１００μｌ）中でインキュベ−トした。蛍光単位を、３７℃、３０分間のインキュベ−トの後に測定した。デ−タを図４Ａのとおりプロットした。
【００６２】
図４Ａに示されたデ−タを使用し、材料及び方法の項に記載のように輸送パ−セントを算出した。線グラフ及び誤差バ−は、平均値±ＳＤ（標準偏差）を表す。
【００６３】
ドナ−小胞の量を増加させつつ、アクセプタ−小胞と（ＤＶ＋ＡＶ）、又はアクセプタ−小胞なしで（ＤＶのみ）インキュベ−トした結果、同様の蛍光測定値が得られ、ＭＴＰの非存在下ではＴＡＧの輸送がほとんど生じないことが示された（図４Ａ）。これらのデ−タは、図１Ａにおけるブランク試験と一致している。ドナ−小胞の量を増加させつつＭＴＰとインキュベ−ト（ＤＶ＋ＭＴＰ）した結果、蛍光が若干増加し、脂質の若干の輸送が示された。一方、アクセプタ−小胞が反応混合物に包含される場合（ＤＶ＋ＡＶ＋ＭＴＰ）、蛍光の有意な増加が観察された。次に、これらのデ−タを用いてＴＡＧの輸送パ−セントを算出した（図４Ｂ）。アクセプタ−小胞の非存在下（ＤＶ＋ＭＴＰ）において、ＴＡＧ輸送は４％と１６％の間の範囲であった。しかしながら、アクセプタ−小胞の存在下（ＤＶ＋ＡＶ＋ＭＴＰ）において、ＭＴＰはドナ−小胞に存在するＴＡＧの約４０％の輸送を媒介した。これらのデ−タにより、アクセプタ−小胞の存在が、輸送プロセスに大きな役割を果たすことが明らかとなった。
【００６４】
ＭＴＰによる、種々のアクセプタ−への異なる脂質の輸送
ＭＴＰによる、種々の脂質の輸送に対する、種々のアクセプタ−小胞の効果を検討した。先ず、ＰＣ又はＰＣ／ＴＡＧ小胞をアクセプタ−として使用した。これらのアクセプタ−を用い、３度、輸送パ−セントを解析した結果、それぞれ３３±２．６及び３０．９±１．３であり、アクセプタ−小胞にＴＡＧが存在しなくても輸送活性に何ら有意の効果として表れないことが示された。
【００６５】
ＭＴＰはＴＡＧ以外の他の脂質を輸送することが知られている（非特許文献２０）。そこで、ＴＡＧ以外にもＣＥ類及びＰＬ類の輸送を解析する試験を行い、本アッセイ法の適性を評価した（図５）。この試験において、小さな単層の小胞（ＰＣ／ＴＡＧ小胞）、ａｐｏＢリポタンパク質（ＶＬＤＬ及びＬＤＬの両方を含有）、及びＨＤＬをアクセプタ−として使用し、脂質輸送を４時間にわたり解析した。この試験は、図２に記載の条件の最適化の前に行われた。この予備試験において、輸送活性を測定する前にインキュベ−トを長時間行った。
【００６６】
ＴＡＧ（ＡからＣ）、コレステリルエステル（ＤからＦ）、又はリン脂質（ＧからＩ）を含む３種の異なるタイプのドナ−小胞（３μｌ）を使用した。アクセプタ−小胞（３μｌ、２，４００ｎｍｏｌ  ＰＣ／ｍｌ）には、小さな単層の小胞（ＰＣ／ＴＡＧ小胞；Ａ、Ｄ及びＧ）、アポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）（ＶＬＤＬ及びＬＤＬ；Ｂ、Ｅ、及びＨ）、並びにＨＤＬ類（１０ｍｇタンパク質／ｍｌ；Ｃ、Ｆ、及びＩ）を使用した。種々のドナ−小胞及びアクセプタ−小胞を、１μｇの精製ＭＴＰを含まない（対照）又は含む（ＭＴＰ）条件において３度、表示された時間インキュベ−トし、材料及び方法の項に記載のように蛍光を測定した。線グラフ及び誤差バ−は平均値±ＳＤ（標準偏差）を表す。
【００６７】
試験の結果、ＭＴＰは、ドナ−小胞を、小さな単層のＰＣ／ＴＡＧ小胞（図５Ａ）及びａｐｏＢリポタンパク質（図５Ｂ）とインキュベ−トした場合にＴＡＧを輸送するが、ＨＤＬとインキュベ−トした場合には輸送しないことを示した。この輸送の結果、４時間のインキュベ−ト後に蛍光単位が１０９から１７２％に増加した（図５Ａ、Ｂ）。同様に、ＭＴＰはＰＣ／ＴＡＧ小胞（図５Ｄ）及びａｐｏＢリポタンパク質（図５Ｅ）の存在下でＣＥを輸送したが、ＨＤＬの存在下では輸送しなかった（図５Ｆ）。ＭＴＰは、ドナ−小胞がＰＣ／ＴＡＧ小胞とインキュベ−トされた場合にＰＬ類を輸送することが可能となり、蛍光の増加は４時間後の時点で１８６％となった（図５Ｇ）。しかしながら、アクセプタ−としてａｐｏＢリポタンパク質を存在させた場合は、ＭＴＰによるＰＬ輸送については解釈が困難であった（図５Ｈ）。なぜなら、ＭＴＰの非存在下でドナ−小胞がａｐｏＢリポタンパク質とインキュベ−トされた場合のバックグラウンドの蛍光が、有意に大きかったためである（図５Ｇ、Ｈの対照と比較のこと。並びにこれらのパネルにおけるｙ値の相違に留意すべきである。）。予想通り、ＨＤＬがアクセプタ−として使用された場合には、ＭＴＰはＰＬを輸送しなかった（図５Ｉ）。これらの結果は、小さな単層小胞及びａｐｏＢリポタンパク質がアクセプタ−として使用される場合、ＭＴＰの活性により、ＴＡＧ又はＣＥのような中性脂質が輸送されることを示す。
【００６８】
細胞におけるＭＴＰ活性の測定
次に、本アッセイが細胞におけるＭＴＰ活性の測定に使用可能か否かを解析した（表１）。ミクロソ−ムのＭＴＰは、Ｊａｍｉｌら（非特許文献１２）に記載のデオキシコ−ル酸塩処理により放出された。Ｃｏｓ−７細胞へのＭＴＰ発現ベクタ−によるトランスフェクションの有無により、ＭＴＰアッセイの特異性を解析した（表１）。予想どおり、モックをトランスフェクトしたＣｏｓ−７細胞においてはＭＴＰ活性が検出できなかった。しかしながら、ＭＴＰ発現ベクタ−によるトランスフェクションの結果、Ｃｏｓ−７細胞におけるＭＴＰ活性が増加し、他の報告と一致した（非特許文献１５、２９）。同様に、ＭＴＰ活性はＨｅｐＧ２細胞又は分化したＣａｃｏ−２細胞の細胞ホモジェネ−トにおいても測定することができた。これらの結果により、本新規の方法が細胞のＭＴＰ活性の測定に使用可能であることが示された。デオキシコ−ル酸法は簡便でなく、数段階を経るため、少なくとも２日を要する。この方法を簡便にするため、Ｃｈａｎｇ、Ｌｉｍａｎｅｋ及びＣｈａｎｇの方法（非特許文献３４）を評価した。この方法は低張の緩衝液による細胞破砕の工程を含み、アッセイ用の細胞抽出液の調製に要する時間は遥かに少ない。
【００６９】
ラット肝のミクロソ−ムを低張の緩衝液処理に浸漬し、放出された内容物をＭＴＰ活性測定に使用した。肝ミクロソ−ム内容物におけるＭＴＰの比活性（１μｇ当たり、１時間における輸送パ−セント）は、０．４９８±０．０９（平均値±標準偏差、ｎ＝９）であった。
【００７０】
４０〜５０ｇの細胞タンパク質を使用し１時間、３度、輸送アッセイにより活性を測定した。図６及び１０に示すように、両方法とも同様のＭＴＰ活性が観察された。以上より、低張処理は所要時間が短く、かつ必要となる操作が少ないため、細胞のＭＴＰ活性の測定に適する方法である。
【００７１】
ＭＴＰ活性の阻害
次に、ＭＴＰ活性に対するＭＴＰアンタゴニストの効果を測定する試験を行った（図７）。ここにおいて、Ｊａｍｉｌらにより報告されたＭＴＰ阻害剤、ＢＭＳ２００１５０（非特許文献１２）を使用した。精製ＭＴＰ（１ｇ）を、ドナ−小胞及びアクセプタ−小胞と共に、表示された濃度のＭＴＰ阻害剤ＢＭＳ２００１５０の存在下で３０分間インキュベ−トした。図７Ａに示すように、ＢＭＳ２００１５０の濃度を増加した結果、精製ＭＴＰの活性が用量依存的に阻害された。ＩＣ５０は０．０８Ｍであり、他の研究者により報告された範囲内であった（非特許文献１２）。
【００７２】
次に、ＨｅｐＧ２細胞を、種々の濃度の上記阻害剤と２４時間インキュベ−トし、そのホモジェネ−トをデオキシコ−ル酸法（非特許文献１２）を用いて調製し、ＭＴＰ活性を測定した。細胞を洗浄し、細胞溶解物を材料及び方法の項に記載されたデオキシコ−ル酸法を用いて調製した。輸送アッセイには、４０〜５０ｇの細胞タンパク質が、３度、使用された。図７Ｂに示すように、ＢＭＳ２００１５０の濃度を増加すると、細胞のＭＴＰ活性を減少させる結果となった。約１．３Ｍに及ぶＩＣ５０値は、公表された先行技術（非特許文献１２）と一致する。精製ＭＴＰと細胞溶解物にて得られるＩＣ５０値に差異が生じたが、これは細胞溶解物中に他のタンパク質が存在し、それが上記阻害剤と相互作用してその効力を減少させることが原因と考えられる。以上の試験により、上記アッセイがＭＴＰ活性及びアンタゴニストによるその阻害の測定に有用であることが示される。
【実施例３】
【００７３】
材料及び方法
材料：
放射性同位元素アッセイ（非特許文献７、１９）を用い、ウシの肝臓からＭＴＰを精製し、またキット（Ｃｈｙｌｏｓ社、ウッドベリ−、ニュ−ヨ−ク州）を用いてラットの肝臓からも精製した。蛍光（ニトロベンゾキサジアゾ−ル）で標識されたホスファチジルコリン（ＰＣ）及び非標識のＰＣは、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社（アラバスタ−、アラバマ州）から購入した。ニトロベンゾキサジアゾ−ルで標識されたＣＥ、ＰＥ並びにＴＡＧはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社（ユ−ジン、オレゴン州）から購入した。黒色の９６ウエルのマイクロタイタ−プレ−トは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ（フランクリン、マサチュ−セッツ州）から供給されたものを使用した。イソプロパノ−ル及び他の化学薬品はシグマケミカル社（セントルイス、ミズ−リ州）から購入した。
【００７４】
蛍光ＰＥ及びＣＥを含むリン脂質小胞の調製：
ホスファチジルコリン（ＰＣ）のアクセプタ−小胞を、Ｗｅｔｔｅｒａｕらによる記載（非特許文献２０から２２、３１）に従い調製した。同様にしてドナ−小胞も上記文献（非特許文献２０から２２、３１、３５）に従い、音波処理により調製した。大まかには以下のとおりである。非標識のホスファチジルエタノ−ルアミン（ＰＥ）及び蛍光ＰＥを蒸発させ、４℃、窒素気流中にて４５分間で超音波処理した。ＣＥドナ−小胞も同様に蛍光標識ＣＥ及び非標識のＰＣを用いて調製した。遠心（約１２，０００ｒｐｍ、１０分、卓上遠心機）分離により回収された小胞は１ヶ月間安定であることが判明した。所定量の蛍光標識脂質をイソプロパノ−ルで希釈して標準曲線を作成し、ドナ−小胞に取り込まれた蛍光脂質のモル数を測定した。
【００７５】
脂質輸送活性の測定：
黒色の９６ウエルのマイクロタイタ−プレ−トを用い、３度、アッセイを行った（非特許文献３５）。最終反応混合物（１００μｌ）は、１０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、０．１％  ＢＳＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液中に、３μｌのドナ−小胞（種々の蛍光脂質を含む１．２ｎｍｏｌのＰＣ又はＰＥ）、３μｌのアクセプタ−小胞（７．２ｎｍｏｌのＰＣ）及びＭＴＰ源を添加して調製した。上記マイクロタイタ−プレ−トを３７℃でインキュベ−トし、所定の時点にて試料を、Ｖｉｃｔｏｒ３複合蛍光／発光測定装置（パ−キンエルマ−社）を用い、４８５ｎｍで励起して蛍光発光を５５０ｎｍにおいて測定した。脂質輸送パ−セントの測定は、ＭＴＰ源を含まない（ブランク試験）対照アッセイから得られた蛍光値を試料アッセイの蛍光値から差し引いた数値を、小胞に存在する総蛍光値からブランク値（ブランク試験値）を減じた数値で割って算出した。ブランクの値は、種々の調製品において総蛍光値の１０〜２５％の範囲であった。総蛍光値は、３μｌのドナ−小胞を９７μｌのイソプロパノ−ルと５分間インキュベ−トして測定した。
【００７６】
正味の脂質蓄積の測定：
正味の脂質蓄積を測定するために、蛍光標識−ＴＡＧを含む負荷電のドナ−小胞が調製された（非特許文献２３）。負の電荷を導入するため、音波処理の前に６７．５ｎｍのカルジオリピン（総脂質の約７％まで）を添加した（非特許文献２０から２２、３１）。種々の量のＭＴＰ、並びに３μｌのドナ−小胞及び３μｌのアクセプタ−小胞を上記のようにインキュベ−トした。所定の時点で蛍光の測定値を記録し、ＴＡＧの輸送を定量した。次に、上記反応混合物を１００μｌのＤＥ５２（１：１（ｖ：ｖ）にて１５ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．０２％のアジ化ナトリウムからなる緩衝液で平衡化）溶液を含む微量遠心管に移し、４℃で５分間遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、５分、４℃）した。アクセプタ−小胞のみを含む上清（１０μｌ）をマイクロタイタ−プレ−トに移し、９０μｌのイソプロパノ−ルを添加後、蛍光を５分間隔で測定した。２０分の時点で得られた測定値を算出に用いた。ＭＴＰの非存在下で得られたブランク値を試料の測定値から差し引いた数値を、ブランク値を引いた総蛍光値で割り、１００を掛けることにより、アクセプタ−小胞に蓄積した脂質のパ−セントを決定した。
【００７７】
細胞及び組織におけるＭＴＰ活性の測定：
Ｔ１７５フラスコに集密状態にまで生育したＨｅｐＧ２細胞をＰＢＳで洗浄し、次に低張の緩衝液（１ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び１ｍＭ  ＥＧＴＡ）（非特許文献３４、３５）中、室温で２分間インキュベ−トして膨潤させた。上記緩衝液を吸引し、細胞を７５０μｌのプロテア−ゼ阻害剤を含む氷冷低張緩衝液中にかき取り、ホモジナイズ（２１ゲ−ジの注射針を２０回通す）し、細胞溶解物を遠心分離（５０，０００ｒｐｍ、４℃、１時間、ＳＷ５５  Ｔｉロ−タ−）し、得られた上清を脂質輸送アッセイとタンパク質測定（非特許文献２５）に使用した。肝ミクロソ−ムの調製には、マウスの肝臓小片をＰＢＳで洗浄し、ポリトロンホモジナイザ−を用いて５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５０ｍＭスクロ−ス（ショ糖）、及び０．０２％アジ化ナトリウムからなる緩衝液中でホモジナイズし、遠心分離（１０，９００ｒｐｍ、３０分、４℃、ベックマン微量遠心機）した。上清を濃塩酸でｐＨ５．１に調整し、冷却下にて３０分間混合し、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、３０分、４℃、ベックマン微量遠心機）した。ペレットを１ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、及び１ｍＭ  ＭｇＣｌ２に再懸濁し、振とう撹拌し、４℃で３０分間インキュベ−トし、超遠心（ＳＷ５５  Ｔｉロ−タ−、５０，０００ｒｐｍ、４℃、１時間）を行い、得られた上清を脂質輸送アッセイ及びタンパク質測定に使用した。
【実施例４】
【００７８】
結果
リン脂質輸送活性
実施例１及び２は、ＭＴＰのＴＡＧ輸送活性（非特許文献３５）を測定するための簡便、迅速でかつ高感度のアッセイ法を例示したものである。実施例３においては、同じ方法がＭＴＰのリン脂質（ＰＬ）輸送活性の定量に使用し得るか否かを解析した（図９Ａ、９Ｂ）。種々の量のＭＴＰを、蛍光標識ＰＥを含むドナ−小胞及びアクセプタ−小胞とインキュベ−トした結果、蛍光は時間依存的に増加し、更に飽和した（図９Ａ）。各濃度においてＭＴＰ依存的な蛍光の増加を示す特異的な曲線が形成され、このことは、種々のＭＴＰ量に関する１時間のデ−タをプロットすることにより確認された（図９Ｂ）。ＰＬの輸送は、ＭＴＰが０．１から０．３μｇの間で直線的に増加し、それより高い量で飽和に達した。本アッセイの再現性は、アッセイ内及びアッセイ間の変動係数を決定することにより確認された。０．３μｇのＭＴＰを用いた６つの独立して測定した試料により得られた輸送活性は１１．９±１．４％であり、変動係数は０．１２であった。０．２５μｇのＭＴＰを用いた三つの独立した試験における平均活性は９．９±０．９６％であり、変動係数は０．０９７であった。これらの結果は、精製ＭＴＰのＰＬ輸送活性が本アッセイ法を用いて測定可能であることを示す。
【００７９】
コレステロ−ルエステル輸送活性
ＣＥ輸送を解析するため、蛍光ＣＥを含むドナ−ＰＣ小胞を、アクセプタ−小胞及び精製ＭＴＰとインキュベ−トした（図１０Ａ〜１０Ｃ）。ＣＥの輸送は、使用されたＭＴＰの各濃度につき、最初は時間の経過と共に増加し、次いで飽和に達した（図１０Ａ）。また、この濃度依存的かつ直線的なＣＥ輸送の増加及びそれに続く飽和は、ＭＴＰの量を増加させた場合にも観察された（図１０Ｂ）。０．２μｇのＭＴＰを使用したアッセイ内での変動係数は０．０９（ｎ＝６）であり、この条件において観察された１時間当たりの輸送％は、１７．４±１．６％であった。０．１５μｇのＭＴＰを用いて三つの独立した試験のデ−タを比較たところ、輸送は１５．０±１．９％（ｎ＝９）であり、アッセイ間の変動係数は０．１２７であることが判明した。これらの結果は、上記測定方法が精製ＭＴＰのＣＥ輸送活性の決定に適していることを示すものである。
【００８０】
細胞ホモジェネ−ト及び肝ミクロソ−ムにおいて測定された蛍光脂質の輸送
次に、これらのアッセイ法を用い、細胞及び組織のホモジェネ−トにおける脂質輸送活性を解析した。全ての脂質の輸送活性（ＴＡＧ、ＣＥ及びＰＬ）が、ＨｅｐＧ２細胞のホモジェネ−トにおいて測定できた（図１１Ａ）。脂質輸送活性は、時間依存的な増加を示し、２０から３０分のインキュベ−トの間に最高値に達した。ＣＥが輸送される速度及びＣＥが輸送される最大値は、ＴＡＧにおいて観察された速度や最大値よりも低かった。ＰＬ輸送のプロファイルはＣＥ及びＴＡＧ輸送のプロファイルに類似していた。主な違いは、ＰＬ輸送活性の場合、最大輸送値が有意に低いことであった。
【００８１】
次いで、マウスの肝ミクロソ−ムに存在する脂質輸送活性を測定した（図１１Ｂ）。３種の全ての脂質輸送活性は、これらのアッセイ法を用いてミクロソ−ム試料において測定することが出来た。ここでも主要な活性が観察されたのはＴＡＧの輸送であり、ＣＥ及びＰＬの輸送活性がこれに続いた。ＴＡＧが輸送される初速度及び最大量はＣＥ及びＰＬの初速度及び最大量よりも有意に高かった。これらの結果は、マウスの肝ミクロソ−ムにおいて、脂質輸送の効率がＴＡＧに対して最大であり、ＣＥ及びＰＬの輸送効率がこれに続くことを示している。
【００８２】
ＭＴＰによる脂質輸送の相対活性
続いて、ＭＴＰ精製品並びに細胞及び組織のホモジェネ−トにおいて測定された、ＴＡＧ、ＣＥ及びＰＬの輸送活性について、それらの間の関係を比較した（表２）。精製されたウシ及びラットのＭＴＰ製品において、ＣＥ及びＰＬの輸送活性は、それぞれＴＡＧ輸送活性に対して５９〜６０％及び６〜５％であった。これらの活性は、Ｗｅｔｔｅｒａｕらにより精製されたウシのＭＴＰにおいて放射線アッセイを用いて記録された相対活性と同様であった（非特許文献２０、２１）。ＨｅｐＧ２細胞の溶解物及び肝ミクロソ−ムにおいては、ＣＥ及びＰＬの（輸送）活性は、ＴＡＧ輸送活性と比較し、それぞれ４２〜５５％及び１３〜２７％であった。このように、マウスの肝ミクロソ−ムにおける相対的なＣＥ輸送活性は、精製（ＭＴＰ）タンパク質と同等であったが、一方ＨｅｐＧ２細胞の溶解物は、精製ＭＴＰ調製品と比較して小さいＣＥ輸送活性を示した。これは、細胞又は組織におけるタンパク質又は他の可溶性因子が、この輸送に干渉する可能性を示唆している。対照的に、ＨｅｐＧ２細胞及び肝ミクロソ−ムにおいて観察された相対的ＰＬ輸送活性は、精製ＭＴＰ製品において認められた活性よりも２倍から４倍高かった。これは、細胞又は組織に、ホスファチジルコリン及びホスファチジルイノシト−ルの輸送タンパク質（非特許文献３６）のような他のリン脂質輸送タンパク質が存在し、これらが蛍光ＰＥの輸送に関与していることによると考えられる。
【００８３】
正味の脂質蓄積の測定
アクセプタ−小胞における脂質の正味の蓄積を測定するため、アッセイ混合物に存在するドナ−小胞及びＭＴＰからアクセプタ−小胞を分離する方法が必要となった。Ｗｅｔｔｅｒａｕらはこれを行うため、彼らの放射線標識アッセイ（非特許文献２０から２２、３１）においてカルジオリピン及びＤＥ５２を使用した。まず、カルジオリピンの付加がドナ−小胞におけるＴＡＧの取り込みに影響しないことを確認した。取り込まれた総蛍光量は、カルジオリピンの有無で、ドナ−小胞に対してそれぞれ１７，８２１±１１２及び１７，２０２±１，１６２であった。第二に、ドナ−小胞及びＭＴＰの９９％以上が、ＤＥ５２とのインキュベ−ト後に反応混合物から除外され得ることを確認した。第三に、ＭＴＰのＴＡＧ輸送活性に及ぼす、ドナ−小胞内に存在するカルジオリピン存在の効果を測定した。ここにおいて、カルジオリピンの有無による、ドナ−小胞によるＴＡＧ輸送の測定を並行して行った（図１２Ａ）。両アッセイとも、同量のアクセプタ−小胞及びドナ−小胞、並びにＭＴＰを含有するにも拘わらず、ＭＴＰによるカルジオリピンを含むドナ−小胞からのＴＡＧ輸送は、カルジオリピンを含まないドナ−小胞により得られるＴＡＧ輸送と比較して５０％少なく、公知の試験結果と一致していた（非特許文献６、２０、３７）。
【００８４】
次に、アクセプタ−小胞への正味の脂質蓄積を測定した。ここにおいて、ドナ−小胞及びアクセプタ−小胞、並びにＭＴＰを種々の時間インキュベ−トし、蛍光の測定値からＴＡＧの輸送を測定した。次に反応を停止させ、ドナ−小胞及びＭＴＰをＤＥ５２の添加により沈降させ、アクセプタ−小胞に蓄積したＴＡＧを定量した。ＴＡＧ輸送は時間と共に徐々に増加し（図１２Ｂ）、カルジオリピン存在下で観察されたＴＡＧ輸送（図１２Ａ）に類似していた。蛍光ＴＡＧのアクセプタ−小胞への正味の蓄積は１２０分間増加し、そこから１８０分まで変化しなかった。飽和点において、上記ＴＡＧの約５０％から６０％までがアクセプタ−小胞に蓄積していた。
【００８５】
次に、アクセプタ−小胞への種々の脂質の正味の脂質蓄積を測定した。蛍光ＴＡＧ、ＣＥ又はＰＥ、並びにカルジオリピンを含むドナ−小胞を調製した（図１２Ｃ）。アクセプタ−小胞への正味の蓄積は、ドナ−小胞及びＭＴＰの除去後に測定された。相対的活性は、ＴＡＧ、ＣＥ及びＰＣに関して、それぞれ１００±４．８％、７１．０±８．５％、及び１３．５±５．２％であった。これらの相対値は、脂質輸送測定に基づく数値（表３）と類似している。以上より、両アッセイは、脂質輸送の相対活性に関して同様の結果を与えるものであった。
【表３】
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【００８６】
図２から４と同様に、蛍光脂質を用いて脂質輸送アッセイを行った。次に、各アッセイ値が直線状となる時点について、特異的活性（輸送パ−セント／ｍｇタンパク質／時間）を算出した。脂質輸送の絶対速度（輸送された脂質のｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質／時間）を、蛍光を標準曲線と比較することにより決定した。問題となる脂質輸送の特異的活性をＴＡＧ輸送の特異的活性で割り、１００を掛けることにより、相対的活性（括弧内）を算出した。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１Ａから１Ｄは、ミクロソ−ムのトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）によるトリアシルグリセロ−ル（ＴＡＧ）の輸送に及ぼす、ドナ−小胞及びアクセプタ−小胞の量による影響を示すグラフである。線グラフ及び誤差バ−は平均値±ＳＤ（標準偏差）（ｎ＝３）を表す。
【図２】図２Ａから２Ｃは、ＭＴＰのＴＡＧ輸送活性に及ぼす時間、温度及びＮａＣｌの影響を表すグラフである。線グラフと誤差バ−は平均値±ＳＤ（標準偏差）を表す。
【図３】図３Ａから３Ｃは、ＴＡＧ輸送活性の特異性を示すグラフである。
【図４】図４Ａと４Ｂは、ＭＴＰによる脂質輸送におけるアクセプタ−小胞の役割を表すグラフである。線グラフと誤差バ−は平均値±ＳＤ（標準偏差）を表す。
【図５】図５Ａから５Ｉは、異なるアクセプタ−の存在下における種々の脂質の輸送を示すグラフである。線グラフと誤差バ−は平均値±ＳＤ（標準偏差）を表す。
【図６】図６Ａと６Ｂは、細胞のホモジェネ−トにおけるＭＴＰの活性を測定する二つの方法を比較するグラフである。線グラフと誤差バ−は平均値±ＳＤ（標準偏差）を表す。
【図７】図７Ａと７Ｂは、ＢＭＳ２００１５０によるＭＴＰ活性の阻害を示すグラフである。線グラフと誤差バ−は平均値±ＳＤ（標準偏差）を表す。
【図８】図８は、脂質二重膜に埋め込まれた標識されたトリグリセリド（ＮＢＤ−ＴＡＧ）を含有する単層の小胞の模式図である。
【図９】図９Ａは、経時的に脂質輸送パ−セントとして表現されたＭＴＰのリン脂質輸送活性を示すグラフである。種々の量のウシの精製ＭＴＰを、３度、０．１％のＢＳＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び２ｍＭのＥＤＴＡを含む１００μｌの１０ｍＭのトリス−塩酸中でドナ−小胞（１．２ｎｍｏｌのＰＥと１００ｐｍｏｌの蛍光ＰＥ）及びアクセプタ−小胞（７．２ｎｍｏｌのＰＣ）と３７℃にてインキュベ−トした。５５０ｎｍにおける蛍光を経時的にモニタ−した。図９Ｂは、ＭＴＰのリン脂質輸送活性を示すグラフであり、図１０Ａの６０分時点からのデ−タを再プロットし、プリズムを用いて非線形回帰分析を行った（ｒ２＝０．９４５９）。
【図１０】図１０Ａは、ＭＴＰのコレステロ−ルエステル輸送活性を表すグラフである。種々の表示量の精製ＭＴＰを、図１０Ａに記載のようにドナ−小胞（１．２ｎｍｏｌのＰＣと１００ｐｍｏｌの蛍光ＣＥ）及びアクセプタ−小胞とインキュベ−トした。５５０ｎｍにおける蛍光の増加を、表示された時間間隔で記録した。図１０Ｂもまた、ＭＴＰのコレステロ−ルエステル輸送活性を表すグラフであり、種々の量のＭＴＰをドナ−小胞及びアクセプタ−小胞と３０分間インキュベ−トし、輸送された蛍光ＣＥの量を算出した。プリズムを用いて非線形回帰分析曲線（ｒ２＝０．９８４２）を作成した。線グラフと誤差バ−は平均値±ＳＤ（標準偏差）を表し、ｎ＝３である。
【図１１】図１１Ａは、ＨｅｐＧ２細胞における脂質輸送活性を表すグラフである。ＨｅｐＧ２細胞溶解物は、実施例３に記載のように調製され、脂質輸送アッセイに、３度、用いられた。各アッセイにおいて、４２μｇのタンパク質を使用した。得られたデ−タをそれぞれ平均値と標準偏差を表す線グラフ及び誤差バ−として表す。図１１Ｂは、肝ミクロソ−ムにおける脂質輸送活性を表すグラフである。マウスのミクロソ−ム内容物は、実施例３に記載のように調製した。ＴＡＧ、ＣＥ又はＰＥ脂質輸送活性は、２１μｇのタンパク質を用い、３度、測定した。平均値を線グラフとして、標準偏差を誤差バ−として表す。プリズムを用い、非線形回帰曲線を作成した。
【図１２】図１２Ａは、ＭＴＰのトリアシルグリセロ−ル輸送活性に及ぼすカルジオリピンの効果を表すグラフである。カルジオリピンを含む（又は含まない）ドナ−小胞を使用した。３回のアッセイ液は、図１０Ａに記載のように、０．２５μｇのウシの精製ＭＴＰ、３μｌのドナ−小胞（１００ｐｍｏｌの蛍光ＴＡＧ、０．０８１ｎｍｏｌのカルジオリピンを含む（又は含まない）１．２ｎｍｏｌのＰＣ）と３μｌのアクセプタ−小胞を含む。マイクロタイタ−プレ−トを３７℃でインキュベ−トし、蛍光を経時的にモニタ−して前記のように輸送パ−セントを算出した。図１２Ｂは、ＭＴＰによる脂質の正味の蓄積を表すグラフである。輸送アッセイは図１２Ａのように３度行われ、１００μｌのアッセイ液中に０．２５μｇのＭＴＰ、３μｌのドナ−小胞及び３μｌのアクセプタ−小胞を含む。脂質輸送パ−セントは、図１０Ａに記載のように測定した。脂質蓄積を測定するため、１００μｌのＤＥ５２陰イオン交換樹脂を所定の時点で反応液に添加した。遠心後、１０μｌの上清を９６ウエルの黒色マイクロタイタ−プレ−トに移した。９０μｌのイソプロパノ−ルの添加後、蛍光を測定した。図１２Ｃは、ＭＴＰによる相対的な正味の脂質蓄積を表すグラフである。正味の脂質輸送アッセイを、図１２Ｂに記載のように３度行った。アッセイには、０．２５μｇのウシの精製ＭＴＰ、ドナ−小胞（１００ｐｍｏｌの種々の蛍光脂質）、ドナ−小胞（１００ｐｍｏｌの種々の蛍光基質、１．２ｎｍｏｌのＰＣ及び０．０８１ｎｍｏｌのカルジオリピン）及びアクセプタ−小胞を使用した。正味の脂質蓄積のパ−セントは、ＴＡＧ並びにＣＥについては１時間の時点で、ＰＥについては１．５時間の時点で測定した。その後、特異的活性（輸送パ−セント／ｍｇタンパク質／時間）を算出した。個々の特異的活性をＴＡＧの脂質輸送の特異的活性で割って更に１００を掛けることにより、相対的な正味の脂質輸送活性を得た。棒グラフと誤差バ−は平均値±標準偏差を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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