(57)【要約】  本発明は、ｍＲＮＡ前駆体のエクソンをスキップし、そこから産生されるｍＲＮＡから上記エクソンを排除するためのオリゴヌクレオチドの製造方法を提供する。さらに、ＳＲタンパク質の結合および／またはｍＲＮＡ二次構造のいずれかまたは両方を改変してスプライシング過程に干渉する方法、ならびに上記オリゴヌクレオチドおよび上記方法を用いた疾病の治療方法も提供する。また、ｍＲＮＡ前駆体中の複数のエクソンのスキッピングを誘導するための医薬組成物、方法および手段も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドの製造方法であって、
エクソンに対応するＲＮＡの中からＳＲ（Ser−Arg）タンパク質の（推定）結合部位を決定し、そして
該ＲＮＡに相補的であり、且つ少なくとも一部が該（推定）結合部位と重なることを特徴とするオリゴヌクレオチドを製造する
ことを包含する方法。
【請求項２】
該ＲＮＡについて、該ＲＮＡの一部分が該ＲＮＡ中の他の部分にハイブリダイズしている領域からなるクローズド構造と、ハイブリダイズしていない領域からなるオープン構造とを該ＲＮＡの二次構造から決定する工程をさらに包含し、そして少なくとも一部が該（推定）結合部位と重なるオリゴヌクレオチドを製造する際に、該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部が該ＲＮＡのクローズド構造と重なり、且つ他の少なくとも一部が該ＲＮＡのオープン構造と重なるように設計することを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
該ＲＮＡのオープン構造とクローズド構造が互いに隣接していることを特徴とする、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
該オリゴヌクレオチドが、該ＲＮＡの連続した１４〜５０ヌクレオチドからなる部分に相補的であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
該オリゴヌクレオチドがＲＮＡを含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
該オリゴヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、全長ホスホロチオエート骨格を有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
該エクソンを含むｍＲＮＡ前駆体が、対象生物において望ましくないスプライシングを示すことを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
該ｍＲＮＡ前駆体から生じるｍＲＮＡ中に該エクソンが存在しない場合に、タンパク質のコード領域が生じることを特徴とする、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
該エクソンを含む該ＲＮＡが転写された遺伝子は、異常型のデュシェンヌ型筋ジストロフィー遺伝子（ＤＭＤ）、コラーゲンＶＩα１遺伝子（ＣＯＬ６Ａ１）、筋細管ミオパシー１遺伝子（ＭＴＭ１）、ジスフェリン遺伝子（ＤＹＳＦ）、ラミニン−α２遺伝子（ＬＡＭＡ２）、エメリー−ドレイファス型筋ジストロフィー遺伝子（ＥＭＤ）およびカルパイン３遺伝子（ＣＡＰＮ３）からなる群より選ばれる少なくとも１種をコードすることを特徴とする、請求項７または８に記載の製造方法。
【請求項１０】
該遺伝子が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー遺伝子であることを特徴とする、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
該ＳＲタンパク質が、ＳＦ２／ＡＳＦ、ＳＣ３５またはＳＲｐ４０であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１２】
該エクソンが、エクソン８、４６、４８、５２、５４〜５６、５８、６０〜６３または７１〜７８を含むことを特徴とする、請求項１０または１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかの製造方法によって得られるオリゴヌクレオチドまたはその同等物。
【請求項１４】
表２に示した塩基配列を含むオリゴヌクレオチドまたはその同等物。
【請求項１５】
請求項１３または１４のオリゴヌクレオチドまたはその同等物を用いた、ｍＲＮＡ前駆体内のエクソンに対する認識を少なくとも部分的に改変する方法。
【請求項１６】
請求項１３または１４のオリゴヌクレオチドまたはその同等物を用いた、医薬の製造方法。
【請求項１７】
請求項１３または１４のオリゴヌクレオチドまたはその同等物を包含する医薬用製剤。
【請求項１８】
請求項１３または１４のオリゴヌクレオチドまたはその同等物を用いた、伝達性遺伝疾患の治療用医薬の製造方法。
【請求項１９】
請求項１３または１４のオリゴヌクレオチドまたはその同等物を用いた、ｍＲＮＡ前駆体にエクソンスキッピングを誘導する方法。
【請求項２０】
請求項１３または１４のオリゴヌクレオチドまたはその同等物を用いた、ｍＲＮＡ前駆体に対するエクソン認識を改変する方法。
【請求項２１】
スプライシング機構がｍＲＮＡ前駆体内のエクソンを認識する効率を改変する方法であって、ｍＲＮＡ前駆体は少なくとも２個のエクソンと少なくとも１個のイントロンを含む遺伝子によってコードされるものであり、該改変方法は以下の工程を包含する。
スプライシング機構と該遺伝子を包含する転写系に、請求項１３または１４のオリゴヌクレオチドまたはその同等物を第１成分として提供し、但し、該第１成分として用いるオリゴヌクレオチドまたはその同等物は、該少なくとも２個のエクソンの内の少なくとも１個にハイブリダイズし得るものであり、そして
該転写系において転写とスプライシングを実施せしめる。
【請求項２２】
該遺伝子が、少なくとも３個のエクソンを含むことを特徴とする、請求項２１に記載の改変方法。
【請求項２３】
請求項１３または１４のオリゴヌクレオチドまたはその同等物であって、該少なくとも２個のエクソン内の他の１個にハイブリダイズし得るものを第２成分として該転写系に提供することを特徴とする、請求項２１または２２に記載の改変方法。
【請求項２４】
該第１成分として用いるオリゴヌクレオチドまたはその同等物と、該第２成分として用いるオリゴヌクレオチドまたはその同等物とが、互いに物理的に結合していることを特徴とする、請求項２３に記載の改変方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学および医薬の分野に関する。より詳細には、本発明はｍＲＮＡ前駆体から産生するｍＲＮＡの再構成およびその治療用途に関する。
【０００２】
生物学のセントラルドグマとは、遺伝情報は細胞のＤＮＡに存在し、この遺伝情報の発現に際しては、まず転写された後、コードされたタンパク質が細胞の翻訳機構により産生されるというものである。遺伝情報の流れ方に関するこのような見解は、細胞に含まれるタンパク質に干渉するための主としてＤＮＡに基づくアプローチの発展を促進した。この見解は徐々に変わってきており、ＤＮＡレベルでの干渉に代わるものが要求されている。
【０００３】
高等真核生物においては、細胞内ＤＮＡのタンパク質に関する遺伝情報は、イントロン配列によって互いに隔てられているエクソンによってコードされている。このようなイントロンは非常に長い場合もある。転写機構によってエクソンとイントロンの両方を含むｍＲＮＡ前駆体が産生し、スプライシング機構は、しばしばｍＲＮＡ前駆体の産生時に、早くもｍＲＮＡ前駆体に存在する複数のエクソンを１つにスプライシングし、タンパク質の実際のコード領域を産生する。
【０００４】
ｍＲＮＡ前駆体からｍＲＮＡを生じるための実際の工程については明らかになっていることも多いが、不明な点もまた多い。本発明では、スプライシング工程に影響を与えることで異なるｍＲＮＡの産生が可能であることを開示する。この工程は、スプライシング機構の産生するｍＲＮＡの予測通りで且つ再現性のある再構成を可能とする。成熟したｍＲＮＡに通常は含まれるエクソンに対応するｍＲＮＡ前駆体内の位置にハイブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチドは、このように標的としたエクソンまたはその一部の除外を誘導することができる（以下、エクソンスキッピング（exon-skipping）と称する）。
【０００５】
本発明は、エクソンスキッピング機構に適したオリゴヌクレオチドを選択する過程に用いるもう１つの方法を提供する。本発明はさらに、とりわけ、従来はスキッピングを行うことができなかったエクソンのスキッピングさえ行うことのできるオリゴヌクレオチドを提供する。我々は既に、ヒト対照培養筋管において１４種のデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）のスキッピングを誘導する３７種のエクソン内部アンチセンスオリゴヌクレオチド（exon-internal antisense oligonucleotide、ＡＯＮ）を同定した。今回、我々は、合計３５個のエクソンのスキッピングを誘導することができる新しいＡＯＮを開示する。
【０００６】
本発明者らの先の特許出願であるＷＯ ２００４／０８３４３２号においては、オリゴヌクレオチドの製造方法であって、エクソンから転写したＲＮＡについて、ＲＮＡの一部分が該ＲＮＡ中の他の部分にハイブリダイズしている領域からなるクローズド構造と、ハイブリダイズしていない領域からなるオープン構造とを該ＲＮＡの（予測した）二次構造から決定し、そして少なくとも一部が該ＲＮＡのクローズド構造に相補的であり、且つ他の少なくとも一部が該ＲＮＡのオープン構造に相補的であることを特徴とするオリゴヌクレオチドを製造することを包含する方法を開示した。
【０００７】
今回、我々は、所望によりＷＯ ２００４／０８３４３２号の方法と組み合わせることのできる、オリゴヌクレオチドを設計し製造するためのもう１つの方法を開示する。
【０００８】
我々は、実施例において、エクソン内部アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）がエクソンスキッピングを誘導する有効性と、ＡＯＮのｍＲＮＡ前駆体標的部位に（例えば ESEfinderで）予測したＳＲ結合部位が存在することとの間に相関関係が存在することを開示する。その結果、我々は、本願においてオリゴヌクレオチドを製造するためのもう１つの方法であって、エクソンに対応するＲＮＡの中からＳＲ（Ser−Arg）タンパク質の（推定）結合部位を決定し、そして該ＲＮＡに相補的であり、且つ少なくとも一部が該（推定）結合部位と重なることを特徴とするオリゴヌクレオチドを製造することを包含する方法を開示する。本願において「少なくとも一部が重なる」という表現は、該結合部位との完全な重なりのみならず、ＳＲ結合部位とのたった１塩基の重なりも、複数の塩基の重なりも包含する。本発明の好ましい態様においては、該ＲＮＡについて、該ＲＮＡの一部分が該ＲＮＡ中の他の部分にハイブリダイズしている領域からなるクローズド構造と、ハイブリダイズしていない領域からなるオープン構造とを該ＲＮＡの二次構造から決定する工程をさらに包含し、そして少なくとも一部が該（推定）結合部位と重なるオリゴヌクレオチドを製造する際に、該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部が該ＲＮＡのクローズド構造と重なり、且つ他の少なくとも一部が該ＲＮＡのオープン構造と重なるように設計することを特徴とする。こうすることで、ｍＲＮＡ前駆体からｍＲＮＡが産生される際のエクソンの包含に干渉することができるオリゴヌクレオチドを得る確率を高めることができる。最初に選択したＳＲ結合領域が必要なオープン−クローズド構造を有していない可能性があり、この場合は、別の（第２の）ＳＲタンパク質結合部位を選択し、続いてオープン−クローズド構造の存在について試験すればよい。ＳＲ結合部位と共に、（少なくとも一部が重なる）オープン−クローズド構造を含有する配列を同定するまでこの工程を繰り返す。その後、同定した配列を用いて、該配列に相補的なオリゴヌクレオチドを設計する。
【０００９】
このようなオリゴヌクレオチドの製造方法は、上述した工程の順番を入れ替えてもよい。具体的には、初めに、エクソンから転写したＲＮＡについて、ＲＮＡの一部分が該ＲＮＡ中の他の部分にハイブリダイズしている領域からなるクローズド構造と、ハイブリダイズしていない領域からなるオープン構造とを該ＲＮＡの二次構造から決定し、そして少なくとも一部が該ＲＮＡのクローズド構造に相補的であり、且つ他の少なくとも一部が該ＲＮＡのオープン構造に相補的であることを特徴とするオリゴヌクレオチドを製造することを包含する方法によって、オリゴヌクレオチドを製造する。続いて、ＳＲタンパク質結合部位の少なくとも一部がオープン／クローズド構造と重なっているか否かを決定する。こうすることによって、ＷＯ ２００４／０８３４３２号の方法を改良する。さらに別の態様においては、２つの工程を同時に実施する。
【００１０】
本明細書で「相補性」という用語は、生理的条件下において、核酸伸長鎖が他の核酸伸長鎖にハイブリダイズ可能な性質を意味する。従って、相補性を示す領域内の全ての塩基が、対立鎖の塩基と対を形成し得ることが絶対的に必要なわけではない。例えば、オリゴヌクレオチドを設計する場合、相補鎖の塩基と対を形成しない残基などを組み込むことができる。細胞内においてヌクレオチド伸長鎖が相補的な部分にハイブリダイズすることができるかぎり、ミスマッチはある程度まで許容される。好ましい態様においては、相補的な部分は少なくとも３個、さらに好ましくは少なくとも４個の連続したヌクレオチドを含む。相補性領域は、それらを組み合わせた時に、ｍＲＮＡ前駆体のエクソンに特異的になるように設計することが好ましい。特異性は転写系の他のｍＲＮＡ（前駆体）の実際の配列に依存するので、種々の長さの相補性領域が上述のような特異性を発揮する。１個以上の他のｍＲＮＡ前駆体がオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする危険性は、オリゴヌクレオチドが大きくなるほど減少する。相補性領域にミスマッチを有していても、ｍＲＮＡ前駆体の標的領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドであれば、本発明で使用可能なことは明らかである。しかしながら、少なくとも相補的な部分にはこのようなミスマッチを持たないものが好ましく、これは１個以上の相補性領域にミスマッチを有するオリゴヌクレオチドよりもこのようなオリゴヌクレオチドの方が一般的に高い効率と高い特異性を有するためである。より高いハイブリダイゼーション強度（即ち、対立鎖との相互作用の数が増加すること）は、転写系のスプライシング機構に干渉する工程の効率を上昇させるのに都合がよいと考えられる。
【００１１】
相補性は、好ましくは９０〜１００％である。通常この程度の相補性は、約２０ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドにおいて、１つまたは２つ程度のミスマッチの存在を許容する。
【００１２】
二次（オープン−クローズド）構造は、ｍＲＮＡ前駆体のエクソンが存在する領域に関して分析するのが最もよい。このような二次構造の解析に実際のＲＮＡを用いてもよいが、しかしながら、最近では、構造モデリングプログラムを用いてＲＮＡ分子の二次構造を（最低のエネルギーコストで）かなり正しく予測することが可能になった。適当なプログラムの例としては、RNA mfold version 3.1 というサーバー（Mathews et al., 1999, J. Mol. Biol. 288: 911-940）が挙げられるが、これに限定されるものではない。当業者は、ヌクレオチド配列を与えられれば、適当な再現性をもってエクソンの妥当な構造を予測することができる。最もよい予測結果は、このようなモデリングプログラムにエクソンと隣接するイントロンの両方の配列を導入した時に得られる。全長ｍＲＮＡ前駆体の構造を予測することは一般的には必要ではない。
【００１３】
ＳＲタンパク質結合部位の存在または不在についても同様である。本発明を限定することのない適切なプログラムの一例はESEfinderである。
【００１４】
オリゴヌクレオチドが対応するオープン構造とクローズド構造は、互いに隣接していることが好ましい。このような構造であれば、オープン構造へのオリゴヌクレオチドのアニーリングはクローズド構造の開環を誘導し、その結果、アニーリングがクローズド構造内に進行すると考えられる。このような作用を介して、これまで閉じていた構造は異なる立体配座をとる。異なる立体配座はエクソン包含シグナルの破壊をもたらす。しかしながら、潜在的な（隠蔽された）スプライス受容部位配列および／またはスプライス供与部位配列が標的エクソン内に存在する場合には、時には異なる（ネオ (neo)）エクソン（即ち、異なる５’末端、異なる３’末端またはその両方を有するエクソン）を定義する新たなエクソン包含シグナルが生じる。この種の活性は標的エクソンをｍＲＮＡから除外するので、本発明の範囲に含まれる。標的エクソンの一部を含む新たなエクソンがｍＲＮＡに存在することは、標的エクソンそのものが除外されるという事実を変えるものではない。ネオエクソンの包含は、時たま生じる副効果と考えられる。変異の結果として破壊したオープンリーディングフレーム（の一部）を修復するのにエクソンスキッピングを用いた場合には、２つの可能性がある。一方は、ネオエクソンがオープンリーディングフレームの修復に機能するのに対し、他方ではオープンリーディングフレームは修復されない。エクソンスキッピングによってリーディングフレームを修復するためのオリゴヌクレオチドの選択において、（ネオエクソンを含んでいるか含んでいない）オープンリーディングフレームを修復するエクソンスキッピングを確実にもたらすオリゴヌクレオチドのみを選択することは、このような条件下では当然のことながら明らかである。
【００１５】
論理にに拘束されるものではないが、現在では、ＳＲ結合部位に対応するオリゴヌクレオチドを使用すると、ＳＲタンパク質結合部位へのＳＲタンパク質の結合が（少なくとも部分的に）損なわれ、その結果としてスプライシングの妨害または欠陥が生じると考えられている。
【００１６】
オープン／クローズド構造とＳＲタンパク質結合部位が部分的に重なることが好ましく、オープン／クローズド構造がＳＲタンパク質結合部位に完全に重なるか、ＳＲタンパク質結合部位がオープン／クローズド構造に完全に重なることがより好ましい。こうすることでエクソン包含機構の破壊を促進させることができる。
【００１７】
ｍＲＮＡ前駆体は種々のスプライシング事象、例えば選択的スプライシングに付される。このような事象は、細胞のおかれた環境または人工的なスプライシング系によって誘導または触媒される。従って、同一のｍＲＮＡ前駆体から、いくつかの異なるｍＲＮＡが産生されることもある。このような異なるｍＲＮＡはいずれもエクソン配列を含有するが、これこそがエクソンの定義である。しかしながら、ｍＲＮＡの内容の流動性故に、本発明においてはエクソンという用語の定義づけが必要となる。本発明においてエクソンとは、ｍＲＮＡ前駆体とそれから生じるｍＲＮＡの両方に存在する配列であって、ｍＲＮＡに含まれる配列は、ｍＲＮＡ前駆体においては、その片側（１番目と最後のエクソンの場合）またはその両側（１番目と最後のエクソン以外のエクソンの場合）に、ｍＲＮＡには存在しない配列が隣接しているものである。原則的に、ｍＲＮＡ前駆体から生じるいかなるｍＲＮＡもこの定義にかなうものである。しかしながら、本発明においては、いわゆる優勢ｍＲＮＡ（dominant mRNA's）、即ち、所定の条件下でｍＲＮＡ前駆体から生じるｍＲＮＡの少なくとも５％を構成するｍＲＮＡが好ましい。特にヒト免疫不全ウイルスは、選択的スプライシングを極端に使用する。いくつかの非常に重要なタンパク質産物が、このウイルスから調製した全ｍＲＮＡの５％にも満たないｍＲＮＡから産生される。レトロウイルスのゲノムＲＮＡは、そこから誘導される全てのスプライシング産物のｍＲＮＡ前駆体であると捉えることができる。選択的スプライシングは細胞種により異なるので、エクソンは、その転写系で用いられるスプライシング条件下におけるエクソンと定義する。仮定的な例においては、筋細胞のｍＲＮＡは、神経細胞の同一のｍＲＮＡ前駆体から生じたｍＲＮＡには存在しないエクソンを含んでいることもある。同様に、癌細胞のｍＲＮＡは、同じｍＲＮＡ前駆体から産生した正常細胞のｍＲＮＡには存在しないエクソンを含んでいることもある。
【００１８】
選択的スプライシングは、同一のｍＲＮＡ前駆体からのスプライシングによって起こる。しかしながら、選択的スプライシングは、ｍＲＮＡ前駆体の変異、例えば、さらなるスプライス受容部位配列および／またはスプライス供与部位配列を生じる変異によって起こる場合もある。このような選択的スプライス部位配列を、「潜在的スプライス受容部位配列／供与部位配列」としばしば称する。このような潜在的スプライス部位は新たなエクソン（ネオエクソン）をもたらすことがある。本発明の方法を用いることで、産生されたｍＲＮＡにネオエクソンが包含されるのを、少なくとも部分的に妨げることができる。ネオエクソンに潜在的且つ「正常な」スプライス供与部位配列／受容部位配列が隣接している場合には、ネオエクソンは古い（パレオ (paleo)）エクソンを含む。このような場合、潜在的なスプライス供与部位／受容部位が取って代わった元のスプライス供与部位配列／受容部位配列が未だにｍＲＮＡ前駆体に存在すると、元の配列はネオエクソンのエクソン認識シグナルに干渉することによってパレオエクソンを含むｍＲＮＡの産生を増幅することができる。このような干渉は、パレオエクソンに対応するネオエクソンの部分と、ネオエクソンに追加された部分との両方に作用し得る。この種のエクソンスキッピングは、スプライス補正（splice correction）と捉えることができる。
【００１９】
好ましい態様においては、製造したオリゴヌクレオチドは１４〜５０ヌクレオチドからなる連続した部位に対して相補的であり、より好ましくは、オリゴヌクレオチドはＲＮＡを包含し、さらに好ましくは、オリゴヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、完全なホスホロチオエート骨格を有する。オリゴヌクレオチドの長さについては、典型的な例を表１および／または表２から導くことができるが、それは１５〜２４ヌクレオチドである。２’−Ｏ−メチルＲＮＡとは、それが相補的なＤＮＡやＲＮＡに対して示す際立ったハイブリダイゼーション特性のみならず、天然の核酸と比べて酵素分解に対して安定性が高いという特性によって特徴付けられるヌクレオチドアナログである。臨床的発展過程に現在あるアンチセンスオリゴヌクレオチドの大部分は、ヌクレーアゼに対する抵抗性を促進すると共に、リボヌクレーアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ｈによる標的ｍＲＮＡの開裂を高める能力を保持するように、ホスホロチオエート骨格の修飾を有する。
【００２０】
エクソンスキッピング技術は多種多様な目的のために用いることができる。しかしながら、対象生物において望ましくないスプライシングを示すｍＲＮＡ前駆体から生じるｍＲＮＡを再構成するのに用いることが好ましい。このような再構成は、細胞によって産生されるタンパク質の量を減少させるのに用いることができる。これは、細胞が特定の望ましくないタンパク質を産生する場合に有用である。しかしながら、好ましい態様においては、細胞による機能性タンパク質の産生を促進するために再構成を用いる、即ち、再構成が機能性タンパク質コード領域の産生をもたらす。後者の態様は、変異によって失われたオープンリーディングフレームを修復するために好ましく用いられる。好ましい遺伝子には、デュシェンヌ型筋ジストロフィー遺伝子（ＤＭＤ）、コラーゲンＶＩα１遺伝子（ＣＯＬ６Ａ１）、筋細管ミオパシー１遺伝子（ＭＴＭ１）、ジスフェリン遺伝子（ＤＹＳＦ）、ラミニン−α２遺伝子（ＬＡＭＡ２）、エメリー−ドレイファス型筋ジストロフィー遺伝子（ＥＭＤ）および／またはカルパイン３遺伝子（ＣＡＰＮ３）が含まれる。さらに、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）遺伝子を例に挙げて本発明を詳細に説明する。ＤＭＤ遺伝子は本発明の特に好ましい遺伝子を構成するが、本発明はこの遺伝子に限定されるものではない。
【００２１】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）およびベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）はいずれも、Ｘ染色体に位置し、ジストロフィンをコードするＤＭＤ遺伝子の変異によってもたらされる（文献１〜６）。ＤＭＤの発生率は、新生男児で１：３，５００である。患者は進行性の筋衰弱に苦しみ、１３歳未満で車椅子生活を余儀なくされ、３０代を迎えずに亡くなることが多い（文献７）。一般により軽症のＢＭＤの場合、発生率は１：２０，０００である。ＢＭＤ患者は４０歳を過ぎても歩行可能であり、ＤＭＤ患者よりも余命が長い（文献８）。
【００２２】
ジスロトフィンはジストロフィン−糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）の必須成分であり、特に筋繊維の膜安定性の維持に関与する（文献９、１０）。ＤＭＤ遺伝子のフレームシフト変異は、筋細胞のジストロフィン欠乏をもたらす。このような現象は他のＤＧＣタンパク質の低減を伴い、ＤＭＤ患者に見られる重度な表現型をもたらす（文献１１、１２）。ＤＭＤ遺伝子のリーディングフレームをそのまま維持する変異は、重症度の低いＢＭＤに関与する、短いが部分的に機能性を有するジストロフィンを生じる（文献１３、１４）。
【００２３】
広範囲にわたる努力にもかかわらず、ＤＭＤ患者のための臨床で適用可能且つ効果的な療法は未だ開発されていない（文献１５）。しかし、疾病の発症および／または症状の進行は糖質コルチコイド療法によって遅らせることができる（文献１６）。ＭｄｘモデルマウスとＤＭＤ患者から得た細胞におけるジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のリーディングフレームの修復を目的とした遺伝子治療について、本発明者らを含む研究者らによって有望な結果が近年報告されている（文献１７〜２３）。特定のエクソンを標的としたスキッピングによって、ＤＭＤ表現型を軽症のＢＭＤ表現型に変換することができる。エクソンのスキッピングは、スプライス部位のいずれかまたは両方、あるいはエクソン内部配列を標的とするアンチセンスオリゴリボヌクレオチド（ＡＯＮ）の結合によって誘導することができる。エクソンは両側のスプライス部位がスプライソソーム複合体によって認識された場合にのみｍＲＮＡに包含されるので、スプライス部位はＡＯＮの明らかな標的である。効力および効率が変動するものの、この方法が有効であることは明かになっている（文献１７、１８、２０、２１）。
【００２４】
コンセンサススプライス配列の他に、（全てでなくとも）多くのエクソンは、スプライソソームによる真性スプライス部位の認識を容易にするために、エクソンスプライシングエンハンサー（exonic splicing enhancer、（ＥＳＥ））配列などのスプライシング調節配列を含有する（Cartegni, Chew, and Krainer 285-98）。ＳＲタンパク質と呼ばれるスプライシング因子のサブグループは上述したＥＳＥに結合し、他のスプライシング因子（例えばＵ１やＵ２ＡＦ）を（わずかにしか定義されていない）スプライス部位に誘導する。最も多く存在する４種のＳＲタンパク質（ＳＦ２／ＡＳＦ、ＳＣ３５、ＳＲｐ４０とＳＲｐ５５）の結合部位は詳細に検討されており、検討結果は、これらＳＲタンパク質に対する結合部位となりうる配列を予測するためのウエブ上のプログラムであるESEfinderに蓄積されている（Cartegni et al. 3568-71）。本願明細書の実施例に開示したように、ＡＯＮの有効性と、ＳＦ２／ＡＳＦ、ＳＣ３５およびＳＲｐ４０結合部位の存在／不在の間には相関関係が存在する。従って、好ましい態様においては、本発明は上述した方法であって、該ＳＲタンパク質がＳＦ２／ＡＳＦ、ＳＣ３５またはＳＲｐ４０であることを特徴とする方法を提供する。より好ましくは、ＳＲタンパク質はＤＭＤのエクソン８、４６、４８、５２、５４〜５６、５８、６０〜６３または７１〜７８をコードするｍＲＮＡに結合する。
【００２５】
本発明の要件を満たすいかなるオリゴヌクレオチドもＤＭＤ遺伝子のエクソンスキッピングの誘導に用いることができる。本発明は、上述の方法で製造されるオリゴヌクレオチドまたはその同等物、もしくは表２に示したエクソンスキッピングを誘導することができるオリゴヌクレオチドまたはその同等物を提供する。さらに本発明は、ヒトＤＭＤ遺伝子のエクソン８、４６、４８、５２、５４〜５６、５８、６０〜６３または７１〜７８に相補的な、表２に示したオリゴヌクレオチドを提供する。同等物は、オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションの種類が似ている、好ましくは同じであるが、その強度は必ずしも同じでなくてもよい。例えば、該オリゴヌクレオチドの断片、点変異や欠失を有するオリゴヌクレオチド、さらにはヌクレオチドの付加を有するオリゴヌクレオチドやこれらの組み合わせが挙げられる。
【００２６】
本発明の方法で製造した相補的オリゴヌクレオチドは、本発明で用いるエクソンＲＮＡの連続した１３〜５０ヌクレオチドからなる部分に相補的であることが好ましい。他の１つの態様においては、本発明の方法で製造した相補的オリゴヌクレオチドは、上記エクソンＲＮＡの連続した１６〜５０ヌクレオチドからなる部分に相補的である。オリゴヌクレオチドは、上記エクソンＲＮＡの連続した１３〜２５ヌクレオチドからなる部分に相補的であることが好ましく、連続した１４〜２５ヌクレオチドからなる部分に相補的であることがより好ましい。種々の核酸をオリゴヌクレオチドの製造に用いることができる。ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは非常に安定なので、オリゴヌクレオチドはＲＮＡを含むことが好ましい。エクソンスキッピング技術の目的の一つは対象生物においてスプライシングを促すことなので、オリゴヌクレオチドＲＮＡは、ＲＮＡにさらなる特性、例えば、エンドヌクレアーゼやＲＮａｓｅ Ｈに対する耐性、さらなるハイブリダイゼーション強度、（例えば体液中での）安定性の向上、可とう性の向上または低減、毒性の低下、細胞内輸送性の向上、組織特異性などを付与する修飾を有することが好ましい。このような修飾は、２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオエートオリゴリボヌクレオチド修飾を含むことが好ましい。また、このような修飾は、２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオエートオリゴデオキシリボヌクレオチド修飾を含むことが好ましい。本発明の１つの態様においては、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴ（デオキシ）リボヌクレオチド修飾と構造的にロックされた核酸とを有するオリゴヌクレオチドを含む、ハイブリッドオリゴヌクレオチドを提供する。このような特定の組み合わせは、構造的にロックされた核酸のみからなる同等物と比べて高い配列特異性を示し、２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオエートオリゴ（デオキシ）リボヌクレオチド修飾のみを含むオリゴヌクレオチドと比べて有効性が向上している。
【００２７】
核酸模倣技術の出現と共に、核酸そのものとハイブリダイゼーション特性の種類が似ている、好ましくは同じであるが、その強度が必ずしも同等ではない分子を製造することが可能となった。当然のことながら、このような同等物も本発明の一部である。このような模倣同等物の例としては、ペプチド核酸、構造的にロックされた核酸および／またはモルフォリノ−ホスホロジアミデートが挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドの同等物として適切なものは以下の文献に挙げられているが、これらに限定されるものではない： Wahlestedt, C. et al. (2000)、Elayadi, A.N. & Corey, D.R. (2001)、Larsen, H.J., Bentin, T. & Nielsen, P.E. (1999)、Braasch, D.A. & Corey, D.R. (2002) および Summerton, J. & Weller, D. (1997)。１個以上の同等物どうしのハイブリッド、および／または同等物と核酸とのハイブリッドも、当然のことながら本発明の一部である。好ましい態様においては、同等物は構造的にロックされた核酸を含み、これは構造的にロックされた核酸が高い標的親和性と低い毒性を示し、故にエクソンスキッピングの効率が高いからである。
【００２８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、通常はエクソンのスプライス供与部位またはスプライス受容部位との重なりを有する必要はない。
【００２９】
スプライシング系を含有する転写系を in vitro で作製することができる。適当な転写系やスプライシング系が当業界では入手可能である。しかしながら、ｍＲＮＡの再構成を必要とするのは、当然ながら、主として生細胞の操作の場面である。好ましい細胞は、ｍＲＮＡの再構成により所望の効果が達成される細胞である。再構成するｍＲＮＡの好ましい例は上述した。筋細胞中で活性を有する遺伝子を本発明で用いることが好ましい。筋細胞（即ち、筋管）は、全てではないが多くの筋細胞特異的遺伝子が長いｍＲＮＡ前駆体を経て転写される多核細胞である。長いｍＲＮＡ前駆体から産生されるｍＲＮＡの再構成が特に効率的に行われるので、このような長いｍＲＮＡ前駆体は本発明で用いるのに好ましい。必ずしもそうとはいえないが、全長ｍＲＮＡ前駆体の製造に比較的長い時間が必要であるということは、再構成工程の進行に費やすことのできる時間が多くなるので、本発明の方法や手段を用いた再構成の効率を促進すると考えられる。本発明の方法で好ましく再構成することのできるｍＲＮＡに対応する遺伝子としては、次の好ましい遺伝子群が挙げられる：ベスレム（Bethlem）型ミオパシーをもたらすＣＯＬ６Ａ１、筋細管ミオパシーをもたらすＭＴＭ１、三好型ミオパシーとＬＧＭＤをもたらすＤＹＳＦ（ジスフェリン）、メロシン欠乏型筋ジストロフィーをもたらすＬＡＭＡ２（ラミニン−α２）、エメリー−ドレイファス型筋ジストロフィーをもたらすＥＭＤ（エメリン）、デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよびベッカー型筋ジストロフィーをもたらすＤＭＤ、ならびにＬＧＭＤ２ＡをもたらすＣＡＰＮ３（カルパイン）。いかなる細胞も用いることができるが、上記の通り、好ましい細胞はＤＭＤ患者由来の細胞である。細胞は in vitro、即ち、対象生物の体外で操作することができる。しかしながら、in vivo で再構成を行う能力を細胞に賦与することが理想的である。本発明のオリゴヌクレオチドまたはその同等物を細胞に与えるための適当な手段が当業界に存在する。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、該オリゴヌクレオチドを含む転写産物をコードしている発現ベクターの形態で細胞に提供することができる。発現ベクターは、遺伝子送達ベヒクルを介して細胞に導入することが好ましい。好ましい送達ベヒクルはアデノウイルスベクターなどのウイルスベクターであり、さらに好ましくはアデノ随伴ウイルスベクターである。従って本発明は、このような発現ベクターおよび送達ベヒクルも提供する。適当な転写産物を設計することは当業者の技術の範囲内である。本発明で用いるのに好ましい転写産物は、Pol III によって誘導された転写産物であり、好ましくはＵ１転写産物またはＵ７転写産物との融合転写産物である。このような融合物は文献５３と５４の記載に基づいて産生することができる。
【００３０】
オリゴヌクレオチドまたはその同等物を細胞に与えるための手段におけるこれまでの発展を考えると、さらなる改良が期待される。このような将来的な改良も、本発明の方法を用いたｍＲＮＡの再構成によって得られる上記の効果を達成するために、当然のことながら、本発明に組み込まれる。現在、本発明のオリゴヌクレオチド、同等物または化合物を細胞に in vivo で送達するための適当な手段としては、核酸のトランスフェクションに適したポリエチレンイミン（ＰＥＩ）や合成両親媒性化合物（ＳＡＩＮＴ−１８）が挙げられる。両親媒性化合物は、in vivo での送達に用いた場合にも、向上した送達性と低減した毒性を示す。好ましい化合物としては、次の文献に記載の化合物が挙げられる：Smisterova, J. et al, (2001)。好ましく用いられる合成両親媒性化合物は、合成品が容易に入手可能な、「長いテール」を有するピリジニウム頭部基をベースとした材料である。多数の合成された両親媒性化合物からなる群の中には、優れたトランスフェクション能と共に、全体的な細胞生存率から見て低下した毒性を示すものがある。構造的修飾が容易であることは、さらなる修飾および（in vivo）核酸輸送特性と毒性の解析を可能とする。
【００３１】
本発明のオリゴヌクレオチドまたはその同等物は、ｍＲＮＡ前駆体内のエクソンの認識を少なくとも部分的に改変するために用いることができる。このような態様においては、スプライシング機構がエクソンの境界を結合してｍＲＮＡを調製するのを少なくとも部分的に妨げる。本発明のオリゴヌクレオチドまたはその同等物は、ｍＲＮＡ前駆体内のエクソン認識を少なくとも部分的に改変することができる。従って、この用途も本発明は提供する。ｍＲＮＡ前駆体のエクソンスキッピングを少なくとも部分的に刺激するための用途として、標的エクソンがｍＲＮＡに包含されるのを妨げる方法も提供する。前述の通り、標的エクソンは得られるｍＲＮＡに包含されない。しかしながら、エクソンの一部（ネオエクソン）が産生されるｍＲＮＡに保持されることもある。これは、標的エクソンが潜在的なスプライス受容部位配列および／または供与部位配列を含む場合に時折起こる。このような態様においては、スプライシング機構がこれまでスプライス受容部位配列／供与部位配列ではなかったもの（またはあまり利用されていなかったもの）を使用するように再度誘導し、新たなエクソン（ネオエクソン）を産生する。ネオエクソンはパレオエクソンと同じ末端を１つ有する場合があるが、必ずしもそうではない。従って、１つの態様においては、スプライシング機構によるスプライス供与部位またはスプライス受容部位の利用効率を改変するために、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその同等物を用いる。
【００３２】
本発明の別の態様においては、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその同等物を用いた医薬用製剤の製造方法を提供する。
【００３３】
前述の通り、ｍＲＮＡの再構成を行うことが好ましい遺伝子はＤＭＤ遺伝子である。ＤＭＤ遺伝子は大きな遺伝子であり、多くの異なるエクソンを有する。この遺伝子がＸ染色体に位置することを考慮すると、この病気に罹患するのは男児がほとんどであるが、二親の両方から遺伝子の悪いコピーを受け継いだり、筋細胞における特に偏ったＸ染色体の不活性化による、機能性対立遺伝子の特に偏った不活性化を患ったりすることによって、女児もこの病気に罹患し得る。タンパク質は、少なくとも２．６Ｍｂにわたる複数のエクソンによってコードされている（文献７９）。欠陥はＤＭＤ遺伝子のいかなる部分でも生じ得る。１個以上の特定のエクソンのスキッピングは、ほとんどの場合、正常のものよりも短いが、少なくとも部分的に機能性を有するジストロフィンタンパク質をコードする再構成ｍＲＮＡをもたらす。エクソンスキッピング技術に基づく医薬の開発における実用上の問題は、細胞中の機能性ジストロフィンタンパク質を欠乏させ得る変異が複数存在することである。既に多数の異なる変異が１個のエクソンのスキッピングによって補正可能であるという事実にもかかわらず、このように複数の変異が存在するということは、異なる変異に対して異なるエクソンをスキップする必要があるので、多数の異なる薬剤の製造が必要となる。
【００３４】
本発明のより好ましい態様においては、１個を超えるエクソンを１つの薬剤でスキップできるように、複数（少なくとも２種）の本発明のオリゴヌクレオチドを用いて薬剤を調製する。このような特性は、種々のデュシェンヌ型またはベッカー型の変異を治療するために製造しなければならない薬剤の数が限られるという点で、実用上、非常に有用である。今や当業者には、特に機能性の高い再構成ジストロフィンタンパク質を選択し、この好ましいジスロトフィンタンパク質を産生することのできる化合物を製造するという選択肢も与えられている。このような好ましい最終産物を「軽症表現型ジストロフィン（mild phenotype dystrophins）」と称する。正常なジストロフィンタンパク質の構造を模式的に示すと、構造的機能を有する２つの端点（ビーズ部）が長いが少なくとも部分的に可とう性を有するロッド部で互いに繋がれたものである。このロッド部は、多くのベッカー患者で短くなっている。特に好ましい態様においては、本発明は表３に記載した変異を有するＤＭＤ患者の治療方法であって、第１列に示したエクソンのエクソンスキッピングを誘導するのに有効なオリゴヌクレオチドまたはその同等物を患者に提供することを包含する方法を提供する。好ましい態様においては、該オリゴヌクレオチドは、表２に記載したエクソンスキッピングの誘導に有効なオリゴヌクレオチドまたはその同等物を含むものである。
【００３５】
上記説明を鑑みると、本発明はさらに、本発明のオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物を用いた、医薬の製造方法を提供する。さらに、本発明の医薬用製剤を提供する。本発明のオリゴヌクレオチドまたはその同等物を、伝達性遺伝疾患（inherited disease）（例えば、ＤＭＤ）の治療用医薬の製造に用いることができる。同様に、スプライシング機構によるｍＲＮＡ前駆体内のエクソンの認識効率を改変する方法が提供され、ｍＲＮＡ前駆体は少なくとも２個のエクソンと少なくとも１個のイントロンを含む遺伝子によってコードされるものであり、該改変方法は以下の工程を包含する：スプライシング機構と該遺伝子を包含する転写系に、本発明のオリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物を提供し、但し、該オリゴヌクレオチド、その同等物、または化合物は、該少なくとも２個のエクソンの内の少なくとも１個にハイブリダイズし得るものであり、そして該転写系において転写とスプライシングを実施せしめる。上記遺伝子は、少なくとも３個のエクソンを含むことが好ましい。
【００３６】
本発明のオリゴヌクレオチドまたはその同等物は、当然のことながら、ｍＲＮＡの構造に干渉するための他の方法と組み合わせることができる。例えば、ある方法で使用するオリドヌクレオチドに、ｍＲＮＡ前駆体の他のエクソンの少なくとも１個に相補的な、他のオリゴヌクレオチドを少なくとも１個加えることができる。この方法は、ｍＲＮＡ前駆体から産生されるｍＲＮＡに、ｍＲＮＡ前駆体の２個以上のエクソンが包含されるのを防ぐために用いることができる。好ましい態様においては、少なくとも１個の他のオリゴヌクレオチドは、本発明の方法により製造したオリゴヌクレオチドまたはその同等物である。本発明のこのような態様を、「ダブルエクソンスキッピング」または「マルチエクソンスキッピング」と称する。多くの場合、ダブルエクソンスキッピングは、ｍＲＮＡ前駆体から２個の標的とした（相補的）エクソンのみを除外する。しかしながら、他の場合には、２個の標的エクソンの間に他のエクソン（即ち、介在エクソン）が存在しても、ｍＲＮＡ前駆体の２個の標的エクソンとこれらエクソンの間の全領域が産生されたＲＮＡに存在しないことがわかった。このようなマルチスキッピングは、ＤＭＤ遺伝子から誘導したオリゴヌクレオチドの組み合わせ、具体的にはエクソン４５に対するオリゴヌクレオチドとエクソン５１に対するオリゴヌクレオチドとを、ＤＭＤ遺伝子を転写する細胞に加えた際に顕著であった。このような設定の結果、産生されたｍＲＮＡはエクソン４５〜５１を含んでいなかった。この結果から明らかなように、上述のオリゴヌクレオチドの存在下におけるｍＲＮＡ前駆体の構造は、スプライシング機構がエクソン４４とエクソン５２を互いに繋ぐように促進されたものであった。
【００３７】
２個の相補的なオリゴヌクレオチドの間に結合を設けることによっても、介在エクソンのスキッピングを特異的に促進することが可能であることがわかった。従って、本発明は、遺伝子にコードされているｍＲＮＡ前駆体内の少なくとも２個のエクソンにハイブリダイズし得る化合物を提供する。該化合物は第１の部分と第２の部分の少なくとも２つの部分を含み、第１の部分は該少なくとも２個のエクソンの内の第１のエクソンに相補的な連続した少なくとも８個のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを含み、第２の部分は該ｍＲＮＡ前駆体内の第２のエクソンに相補的な連続した少なくとも８個のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを含み、該化合物中の少なくとも２つの部分は、１つの分子を形成するように結合されている。結合はいかなる手段によるものでもよいが、ヌクレオチドの結合によって形成されたものが好ましい。後者の場合、一方または他方の相補的エクソンとは重ならないヌクレオチドの数は０であってもよいが、４〜４０ヌクレオチドであることが好ましい。このような連結成分は、オリゴヌクレオチドを連結することができればいかなる種類の成分であってもよい。近年、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性を模倣する種々の化合物が入手可能である。このような同等物が、同種であるが強度が必ずしも同等ではないハイブリダイゼーション特性を有する場合、本発明で用いる化合物として適当である。適当な同等物は既に本明細書に記載した。化合物中の１個、好ましくは複数のオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドを製造するための本発明の方法によって製造する。前述の通り、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的エクソンとのハイブリダイゼーションに寄与するオリゴヌクレオチドのみからなる必要はない。さらなる材料および／またはヌクレオチドが付加されていてもよい。
【００３８】
本発明はさらに、遺伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体のエクソンにハイブリダイズし得る本発明の第１のオリゴヌクレオチドまたはその同等物、および遺伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体の他の１つのエクソンにハイブリダイズし得る本発明の少なくとも第２のオリゴヌクレオチドまたはその同等物を含む組成物を提供する。好ましい態様においては、第１のオリゴヌクレオチドまたはその同等物と、少なくとも第２のオリゴヌクレオチドまたはその同等物は、同じｍＲＮＡ前駆体の異なるエクソンにハイブリダイズし得るものである。この組成物は、対応するそれぞれのエクソンのエクソンスキッピングを誘導するのに用いることができる。組成物がヒトＤＭＤ遺伝子のエクソン４５とエクソン５１、またはエクソン４２とエクソン５５に対するオリゴヌクレオチドまたはその同等物を含む場合、得られるｍＲＮＡからは標的エクソンのみが除外されるという規則に反して、標的エクソンとそれらの間の介在領域の全てが除外されたｍＲＮＡが得られることが観察された。本発明においては、ＤＭＤ遺伝子を衰弱化する種々の異なる変異を補正するためにこのような特性を用いる。従って、本発明の１つの態様においては、ヒトＤＭＤ遺伝子に変異を有し、該変異の結果、ＤＭＤ遺伝子の機能性ジストロフィンタンパク質への翻訳が適当に行われていない患者の治療方法であって、患者に上記の組成物を提供することを包含する方法を提供する。このようにして補正され得る変異の典型例は、標的エクソンの内部またはそれに隣接して存在するか、介在領域に存在する変異である。しかしながら、上記のエクソンと介在領域からかなり離れた外部に存在するフレームシフト変異を補正することも可能である。
【００３９】
以下の説明によって本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００４０】
材料と方法
ＡＯＮ、形質転換とＲＴ−ＰＣＲ解析 
ＡＯＮは、ｍ−フォールドプログラム（m-fold program）（Mathews et al. 911-40）で予測した、標的ＲＮＡの（部分的に）重なりを有する予測オープン二次構造に基づいて設計した。いくつかの既に発表されているＡＯＮ（表１）についてはゲル移動度シフトアッセイ（van Deutekom et al. 1547-54、Aartsma-Rus et al. S71-S77）でさらに解析した。
【００４１】
全てのＡＯＮ（表１参照）をEurogentec（ベルギー国）で合成した。合成したＡＯＮはいずれも２’−Ｏ−メチルＲＮＡと全長ホスホロチオエート骨格を有していた。対照となるヒトから誘導した培養筋管を公知の方法（van Deutekom et al. 1547-54）で形質転換した。各ＡＯＮは、１μｇのＡＯＮに対して２μｌ〜３．５μｌのExGen 500（MBI Fermentas製）を使用して、種々の濃度（２００ｎＭ〜１μＭ）で少なくとも２回の形質転換を行った。５’フルオレセインで標識した対照ＡＯＮを至適形質転換効率（通常は９０％超）の確認のために使用した。ＲＮＡの単離とＲＴ−ＰＣＲ解析は、Transcriptor逆転写酵素（Roche diagnostics製）を製造者のマニュアルに従って用い、公知の方法（Aartsma-Rus et al. S71-S77）で実施した。ＰＣＲプライマー（ベルギー国、Eurogentec製）は、公知の配列（Aartsma-Rus et al. S71-S77）を使用するか、またはＡＯＮが標的とするエクソンに隣接するエクソンから選択した（配列は要求があれば開示する）。
【００４２】
統計解析 
統計解析は、Ｒソフトウエアと exactRank試験パッケージ（exactRankTests package）（R Development Core Team製、Hothorn and Hornik）を用いて実施した。２つの群のＡＯＮの比較によって有意に高い値を求めるためには、ウィルコクソンの順位和検定を用いた。３つの群のうちの１群が有意差を示すか否かを決定するためにクラスカル・ウォリスの符号順位和検定を用いた。
【００４３】
結果
新規ＡＯＮの有効性 
新たに設計した７７個のＡＯＮの有効性については未だ報告されていない。これらのＡＯＮは異なる濃度で少なくとも２回試験し、その有効性はＲＴ−ＰＣＲ解析で決定した。全てのＡＯＮの特性とその有効性を表１に示した。配列の解析（データは示さない）によって確認したところ、７７個の新規なＡＯＮの内の５１個（６６％）がそれぞれ試験した濃度で特異的なエクソンスキッピングを誘導した。未だにスキップすることができないエクソン４７とエクソン５７を除くと、各標的エクソンについて少なくとも１個のＡＯＮが効果的であった。
【００４４】
さらに我々は、エクソンスキッピングを誘導したＡＯＮを２つのグループ、即ち、転写産物の２５％未満でエクソンスキッピングを誘導するＡＯＮ（表１に１つの「プラス」で示したもの）、および転写産物の２５％超でエクソンスキッピングを誘導するＡＯＮ（表１に２つの「プラス」で示したもの）に分けた。エクソン４６の色々なスキッピングレベルを図１に例示した。誘導したスキッピングレベルが２５％未満のＡＯＮが合計で２５個であり、誘導したスキッピングレベルが２５％超のＡＯＮは２６個だった。
【００４５】
有効なＡＯＮの大部分が標的エクソンのみのスキッピングを誘導した。注目すべきことに、エクソン８を標的とするＡＯＮはエクソン８と読み枠内のエクソン９のダブルエクソンスキッピングを常に誘導し、エクソン８の単一スキッピングを誘導することはなかった（データは示さない）。さらにエクソン４０、５８と７３の単一のスキッピングにおいては、エクソン４０、５８または７３を標的とするＡＯＮは、それぞれエクソン４０と４１、エクソン５８と５９およびエクソン７３と７４のスキッピングを時々誘導した（データは示さない）。エクソン５１特異的ＡＯＮに関する以前の報告（Aartsma-Rus et al. S71-S77、Aartsma-Rus et al. 907-14）と同様に、我々の設計した新規なエクソン５１特異的ＡＯＮに応答してエクソン５１内の潜在的なスプライス部位が使用されることがあった。
【００４６】
ＡＯＮの評価 
これまでに我々は合計１１４個のＡＯＮ（表１に示した）を試験してきた。そのうち７６個（６７％）はエクソンスキッピングを誘導し（転写産物の２５％超で誘導したものが４１個、そして転写産物の２５％未満で誘導したものが３５個）、３８個（３３％）は効果なしであった。有効性とＡＯＮの特徴との間に相関関係が存在するか否かを見るために、我々は有効なＡＯＮと効果なしのＡＯＮの各群について、種々のパラメーターを評価した。閾値を設けずにESEfinderソフトウエアを用いて、各エクソンの潜在的なＳＲ結合部位を計算した。ＡＯＮ標的部位と重なる全ての結合部位について、各ＳＲタンパク質の最も高い予測値のみを表１に示した。エクソン４６に存在する推定ＳＲ結合部位の一例を図２に示した（分りやすくするために、ソフトウエアが提供する標準的な閾値を超える部位のみを示した）。ＡＯＮによって一部しかカバーされない潜在的なＳＲ結合部位（例えば、図２のＡＯＮ２０とＡＯＮ２５および第２推定ＳＲｐ４０部位）は考慮しなかった。さらにＡＯＮの長さ、利用可能なヌクレオチドの割合およびＧＣ含量を比較した（表１）。利用可能なヌクレオチドの割合は、予測したＲＮＡ二次構造中の未結合のヌクレオチドを標的とするヌクレオチドの量を、ＡＯＮの長さで除した値である（図３）。
【００４７】
種々の変数に対する有効なＡＯＮと効果なしのＡＯＮの箱ひげ図を図４Ａに示した。驚くべきことに、ESEfinderの予測したＳＦ２／ＡＳＦとＳＣ３５の値は、効果なしのＡＯＮよりも有効なＡＯＮに対して顕著に高かった。その差はウィルコクソンの順位和検定で計算したＳＦ２／ＡＳＦとＳＣ３５のそれぞれのｐ値が＜０．１と＜０．０５であり、統計的に有意だった。予測したＳＲｐ４０値とＳＲｐ５５値のそれぞれとの間には有意差は見られなかった。ＡＯＮの長さ、利用可能なヌクレオチドの割合およびＧＣ含量はいずれもＡＯＮの有効性と相関しなかった。
【００４８】
我々は、さらに有効なＡＯＮを２つのサブグループ（転写産物の２５％超または未満でスキッピングを誘導するもの）に分け、それに基づいて箱ひげ図を作成した（図４Ｂ）。クラスカル・ウォリスの符号順位和検定を用いても、いかなる変数において群間の統計的有意差を見つけることはできなかった。しかし、２つのグループのみをウィルコクソンの順位和検定で比較した場合、＞２５％スキッピング群のＳＦ２／ＡＳＦ値の統計的増加が効果なしの群（ｐ値は＜０．０５）や＜２５％スキッピング群（ｐ値は＜０．１）との比較で観察された。ＳＣ３５値については、効果なしの群と＜２５％スキッピング群との間にのみ有意差（ｐ値は＜０．０５）が観察された。ＳＲｐ４０値については、＞２５％スキッピング群の予測値は、効果なしの群と＜２５％スキッピング群のいずれに対しても有意に高い値（ｐ値は＜０．１）を示した。最後に、＞２５％スキッピング群のＧＣ含量は効果なしの群よりも高かった（ｐ値は＜０．１）。
【００４９】
５’スプライス部位またはエクソン内部配列のいずれかを標的とするＡＯＮによって効果的にエクソンスキッピングを誘導することができる（Wilton et al. 330-8、Dunckley et al. 1083-90、Mann et al. 42-7、De Angelis et al. 9456-61、Mann et al. 644-54、Lu et al. 6、Goyenvalle et al. 1796-99、Lu et al. 198-203）（Takeshima et al. 515-20、van Deutekom et al. 1547-54、Takeshima et al. 788-90、Aartsma-Rus et al. S71-S77、Aartsma-Rus et al. 907-14、Aartsma-Rus et al. 83-92、Takeshima）。しかし、エクソン内部ＡＯＮにはスプライス部位ＡＯＮよりも有利な点もある。第１に、エクソン内部ＡＯＮは、コンセンサス配列によって一部が決定されるスプライス部位ではなく、コード配列を標的とするため、通常、より特異的である。これは全てのスプライス部位に該当することではない。例えば、ｍｄｘマウスを用いたエクソンスキッピング研究の大部分において標的とするマウスＤＭＤのエクソン２３の５’スプライス部位は、コンセンサススプライス部位とは大きく異なるものである。しかし、平均的には、スプライス部位特異的ＡＯＮの少なくとも一部がコンセンサス配列からなるため、他のエクソンに対して不利なターゲティングを生じる可能性を有する。さらにMannらのグループは、スプライス部位ＡＯＮの設計において最も重要な変数は標的配列であると結論付けている（Mann et al. 644-54、Mann et al. 42-7）。マウスエクソン２３に対して有効な５’スプライス部位ＡＯＮの発見には、広範にわたる最適化が必要だった（Mann et al. 644-54）。一方、標的配列の間口が広いため、エクソン内部ＡＯＮの設計はより単純であることが証明されている。予測したｍＲＮＡ前駆体のオープン構造を標的とする、ＤＭＤに対するＡＯＮについては、平均して３個の内の２個が有効である。このことは、本願に記載した１１４個のエクソン内部ＡＯＮの内、７６個が有効であり、これらは全体として３７個の標的ＤＭＤエクソンのうちの合計３５個のスキッピングを誘導するという知見によって強調されている。
【００５０】
近年、ESEfinderが一般に入手可能となったため、我々のＡＯＮが、予測したＳＦ２／ＡＳＦ結合部位、ＳＣ３５結合部位、ＳＲｐ４０結合部位またはＳＲｐ５５結合部位を標的とするか否かを調べた。興味深いことに、効果なしのＡＯＮとの比較において有効なＡＯＮは、最も豊富に存在する２種のＳＲタンパク質（即ち、ＳＦ２／ＡＳＦとＳＣ３５）について有意に高い値を示しが、予測したＳＲｐ４０結合部位とＳＲｐ５５結合部位に関しては有意差を検出することはできなかった。しかし、有効なＡＯＮを効率的なＡＯＮ（＜２５％スキッピング）と非常に効率的なＡＯＮ（＞２５％スキッピング）とに分け、効果なしの群と効果的な群との比較を行うと、非常に効率的な群のＳＲｐ４０値は有意に高かった。あまり有効ではないＡＯＮもＳＲタンパク質については高い値を示し、一方、効果なしのＡＯＮのいくつかも高い値を示した点に着目されたい。ESEfinderの値は推定ＥＳＥ部位の予測を反映する点を忘れてはならない。にもかわらず、有効なＡＯＮは高いＳＲ値を示すという有意な傾向が存在するので、我々は主として予測したＳＦ２／ＡＳＦ結合部位、ＳＣ３５結合部位およびＳＲｐ４０結合部位に基づいて将来のＡＯＮを設計する。それに比べて、長さ、利用可能なヌクレオチドの割合およびＧＣ含量については、有効なＡＯＮと効果なしのＡＯＮとの間で有意差は見られなかった。にもかわらず、２５％超のスキッピングレベルを誘導するＡＯＮのＧＣ含量は、効果なしのＡＯＮよりも有意に高かった。これは、高いＧＣ含量を有するＡＯＮほど融解温度が高いので、標的ＲＮＡに結合する可能性が高いという事実によって説明することができる。
【００５１】
我々のＡＯＮの６７％が効果的であるという事実は印象的なことであり、これは、長さが２．４Ｍｂであり、通常、３０ｋｂを超える長さのイントロンを含有するＤＭＤ遺伝子の複雑さによるものかもしれない。従って、この遺伝子のスプライシングは既に問題を含んでおり、他の遺伝子よりもエクソン由来のスプライシングエンハンサーに強く依存しているのかもしれない。さらに、非常に大きなイントロン（＞１００ｋｂ）が出現することから、遺伝子が連続的にスプライスされるとは考えにくい。例えば、イントロン７は１１０ｋｂであるが、イントロン８はたった１１１３ｂｐである。我々と他の研究グループ（Dr. Steve Wilton、個人的な連絡による；Luis Garcia、個人的な連絡による）は、エクソン８単一のターゲティングの後にエクソン８と９の同時スキッピングのみが観察されることを見出したことから、ＤＭＤ転写産物の大部分においては、巨大なイントロン７よりも前にイントロン８のスプライシングが生じる傾向にある。同様に、エクソン４０、５８と７３のそれぞれを標的とするＡＯＮについても、時には標的エクソンのスキッピングに加えて、隣接するエクソンのスキッピングも観察された。これは、転写産物の一部においては、内部のイントロンよりも先に末端のイントロンがスプライシングされることを示し、これらイントロンのスプライシングの遅延を示唆している。
【００５２】
ＤＭＤ患者には広いスペクトルにわたる変異が存在するので、いくつもの個別の内部エクソン（即ち、エクソン２〜６３と７１〜７８）に特異的なＡＯＮが必要である。エクソン６４〜７０はジストロフィン機能に必須なシステインに富んだ領域をコードしているので、この範囲のリーディングフレームをエクソンスキッピングによって修正しても、機能的なタンパク質がもたらされることはない。予測したｍＲＮＡ前駆体二次標的構造および／またはＳＲタンパク質結合部位（好ましくはＳＦ２／ＡＳＦ結合部位またはＳＣ３５結合部位）の存在／不在の予測を用いてＤＭＤエクソン内部ＡＯＮを設計することは非常に効果的である。
【００５３】
表１：  使用したＡＯＮの特徴
【００５４】
【表１−ａ】
2008538500.tif 000002
【００５５】
【表１−ｂ】
2008538500.tif 000003
【００５６】
【表１−ｃ】
2008538500.tif 000004
【００５７】
＋＋ 正常な対照培養筋管における転写産物の２５％超でエクソンスキッピングが検出された；＋ 転写産物の２５％未満でエクソンスキッピングが検出された；− エクソンスキッピングの検出なし。
2 各ＡＯＮについて、各ＳＲタンパク質の最も高い値を示した。
3 予測したＲＮＡ二次構造においてＡＯＮが標的として利用可能なヌクレオチドの数を、ＡＯＮの全長で除した値。
4 このＡＯＮは、Kobe型欠失では欠失しているＥＳＥの一部を標的とする（Matsuo et al. 963-7、Matsuo et al. 2127-31）。
5 既に発行済み（van Deutekom et al. 1547-54）。
6 既に発行済み（Aartsma-Rus et al. S71）。
7 既に発行済み（Aartsma-Rus et al. 83-92）。
【００５８】
表２：  新規ＡＯＮの選択
【００５９】
【表２】
2008538500.tif 000005
【００６０】
＋＋ 正常な対照培養筋管における転写産物の２５％超でエクソンスキッピングが検出された；＋ 転写産物の２５％未満でエクソンスキッピングが検出された；− エクソンスキッピングの検出なし。
2 各ＡＯＮについて、各ＳＲタンパク質の最も高い値を示した。
3 予測したＲＮＡ二次構造においてＡＯＮが標的として利用可能なヌクレオチドの数を、ＡＯＮの全長で除した値。
4 このＡＯＮは、Kobe型欠失では欠失しているＥＳＥの一部を標的とする（Matsuo et al. 963-7、Matsuo et al. 2127-31）。
【００６１】
表３：  現在では、ＡＯＮ誘導性単一エクソンスキッピングによって回復することのできるリーディングフレームの変異の概要
【００６２】
【表３】
2008538500.tif 000006
【００６３】
1スキップすることが可能であると示されたエクソンのみを示した。
2エクソン８を標的とするＡＯＮは枠内のエクソン９のスキッピングも誘導するので、これらＡＯＮは、エクソン８−９が重複する患者のｃＤＮＡを回復するためにも用いることができることを示す。
【００６４】
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51.  WO 2004/083432 
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】有効なＡＯＮと効果なしのＡＯＮの代表的な比較解析。種々のエクソン４６ＡＯＮで処理した対照培養筋管ジストロフィンｍＲＮＡ断片のＲＴ−ＰＣＲ解析。ＡＯＮ８、２２、２３と２６については、全転写産物の２５％超という明確なエクソンスキッピングレベルが観察された（２つのプラスで示した）。ＡＯＮ４、６、２０、２４と２５の誘導したスキッピングレベルは２５％未満であり（１つのプラスで示した）、ＡＯＮ６と２４はわずかなスキッピングしか誘導しなかった。ＡＯＮ９と２１による処理の後では、スキッピングは観察されなかった（マイナスで示した）。
【図２】エクソン４６とエクソン４６特異的ＡＯＮの模式図。エクソン４６の配列を、ＡＯＮの位置を示す線と共に図示した。ＳＦ２／ＡＳＦ、ＳＣ３５、ＳＲｐ４０とＳＲｐ５５のそれぞれについて、ESEfinderで予測した結合位置とその値の中で閾値を超えるものを棒で示した。ESEfinderの用いた各ＳＲタンパク質の閾値をカッコ内に示した。最も有効なＡＯＮ（＃８、２２、２３と２６）は推定ＥＳＥ部位をカバーするが、効果なしのＡＯＮ＃２５は推定ＥＳＥ部位と完全には重ならない。しかし、効果なしのＡＯＮ＃９は潜在的なＳＲｐ４０結合部位とＳＲｐ５５結合部位も標的とする。
【図３】ｍ−フォールドプログラムで予測したエクソン４６と隣接配列のｍＲＮＡ前駆体の二次構造の一例。３’と５’スプライス部位の位置を示した。二次構造は、標的ＲＮＡ内でヌクレオチドが他のヌクレオチドに結合したクローズド構造と、未結合のヌクレオチドからなるオープン構造からなる。２つのエクソン４６特異的ＡＯＮ（即ち、＃６と＃２６）の位置を示した。２０量体である＃６は３つの未結合ヌクレオチドを標的とするので、利用可能な塩基対の割合は３／２０（０．１５）である。ＡＯＮ＃２６は１９量体であり、その中の１５個のヌクレオチドは未結合のヌクレオチドを標的とするので、利用可能な塩基対の割合は１５／１９（０．７９）である。
【図４Ａ】ＳＦ２／ＡＳＦ、ＳＣ３５、ＳＲｐ４０とＳＲｐ５５の予測値、並びにＡＯＮの長さ、利用可能なヌクレオチドの割合およびＧＣ含量に関する種々のグループのＡＯＮの箱ひげ図。有効なＡＯＮと効果なしのＡＯＮとの比較。ＳＦ２／ＡＳＦとＳＣ３５の値は、効果なしのＡＯＮよりも有効なＡＯＮの方が有意に高い（ウィルコクソンの順位和検定）。他の変数について有意差は見られなかった。群間の差が有意であり、ｐ値が＜０．１を「＊」、ｐ値が＜０．０５を「＊＊」で示した。
【図４Ｂ】ＳＦ２／ＡＳＦ、ＳＣ３５、ＳＲｐ４０とＳＲｐ５５の予測値、並びにＡＯＮの長さ、利用可能なヌクレオチドの割合およびＧＣ含量に関する種々のグループのＡＯＮの箱ひげ図。効果なしのＡＯＮ、転写産物の２５％未満でスキッピングを誘導するＡＯＮ（＜２５％）、および転写産物の２５％超でスキッピングを誘導するＡＯＮ（＞２５％）の比較。全ての変数について、ある個別の群が他の群に対して有意差を示すことはなかった（クラスカル・ウォリスの符号順位検定）。２群間のみで比較を行った場合には、＞２５％群におけるＳＦ２／ＡＳＦの値とＳＲｐ４０の値は、効果なしの群と＜２５％群の両方に対して有意に高かった。＜２５％群は効果なしの群よりもＳＣ３５について有意に高い値を含有し、＞２５％群のＧＣ含量は効果なしの群よりも有意に高かった。
【配列表フリーテキスト】
【００６６】
配列番号１：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h2AON3
配列番号２：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h8AON1
配列番号３：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h8AON3
配列番号４：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h17AON1
配列番号５：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h17AON2
配列番号６：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h19AON
配列番号７：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h29AON4
配列番号８：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h29AON6
配列番号９：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h29AON9
配列番号１０：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h29AON10
配列番号１１：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h29AON11
配列番号１２：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h43AON3
配列番号１３：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h43AON4
配列番号１４：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h45AON3
配列番号１５：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h45AON4
配列番号１６：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h45AON9
配列番号１７：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h46AON20
配列番号１８：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h46AON21
配列番号１９：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h46AON22
配列番号２０：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h46AON23
配列番号２１：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h46AON24
配列番号２２：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h46AON25
配列番号２３：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h46AON26
配列番号２４：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h47AON3
配列番号２５：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h47AON4
配列番号２６：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h47AON5
配列番号２７：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h47AON6
配列番号２８：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h48AON3
配列番号２９：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h48AON4
配列番号３０：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h48AON6
配列番号３１：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h48AON7
配列番号３２：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h48AON8
配列番号３３：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h48AON9
配列番号３４：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h48AON10
配列番号３５：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h51AON24
配列番号３６：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h51AON27
配列番号３７：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h51AON29
配列番号３８：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h52AON1
配列番号３９：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h52AON2
配列番号４０：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h54AON1
配列番号４１：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h54AON2
配列番号４２：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h55AON1
配列番号４３：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h55AON2
配列番号４４：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h55AON3
配列番号４５：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h55AON5
配列番号４６：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h55AON6
配列番号４７：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h56AON1
配列番号４８：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h56AON2
配列番号４９：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h56AON3
配列番号５０：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h57AON1
配列番号５１：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h57AON2
配列番号５２：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h57AON3
配列番号５３：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h58AON1
配列番号５４：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h58AON2
配列番号５５：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h59AON1
配列番号５６：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h59AON2
配列番号５７：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h60AON1
配列番号５８：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h60AON2
配列番号５９：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h61AON1
配列番号６０：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h61AON2
配列番号６１：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h62AON1
配列番号６２：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h62AON2
配列番号６３：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h63AON1
配列番号６４：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h63AON2
配列番号６５：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h71AON1
配列番号６６：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h71AON2
配列番号６７：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h72AON1
配列番号６８：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h72AON2
配列番号６９：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h73AON1
配列番号７０：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h73AON2
配列番号７１：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h74AON1
配列番号７２：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h74AON2
配列番号７３：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h75AON1
配列番号７４：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h75AON2
配列番号７５：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h76AON1
配列番号７６：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h76AON2
配列番号７７：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h77AON1
配列番号７８：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h77AON2
配列番号７９：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h78AON1
配列番号８０：  アンチセンスオリゴヌクレオチド h78AON2
【図１】
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【図２】
2008538500.tif 000008
【図３】
2008538500.tif 000009
【図４Ａ】
2008538500.tif 000010
【図４Ｂ】
2008538500.tif 000011
【配列表】
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【国際調査報告】
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2008538500.tif 000013
2008538500.tif 000014
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