(57)【要約】  本発明は、リン酸カルシウム材料の骨誘導性の改善の方法、改善された骨誘導性を有するリン酸カルシウム材料及びそこから製造される骨（再）発生の足場、並びに治療の方法におけるそのような材料及び足場の使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸カルシウム材料の骨誘導性を改善する方法であって、リン酸カルシウム材料に有効量の微量元素を備えることを含み、該リン酸カルシウム材料が該微量元素を放出することができる上記方法。
【請求項２】
該リン酸カルシウム材料が吸収可能なリン酸カルシウム材料である、請求項１に従う方法。
【請求項３】
該リン酸カルシウム材料がリン酸カルシウムのセラミック、セメント若しくは被覆、又はリン酸カルシウムを含有するガラス若しくは複合物である、請求項１又は２に従う方法。
【請求項４】
該リン酸カルシウムセラミックが二相性リン酸カルシウム（ＢＣＰ）又はリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）、好ましくは吸収可能なＴＣＰである、請求項３に従う方法。
【請求項５】
該微量元素がＦ、Ｓｉ、Ｃｕ、Ｌｉ、Ａｌ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｇｅ、Ｓｒの水溶性の塩及びそれらの組み合わせから成る群から選ばれる、請求項１〜４のいずれか１項に従う方法。
【請求項６】
該微量元素がＦ及び／又はＬｉであり、好ましくはＮａＦ及び／又はＬｉＣｌとして用意される、請求項１〜５のいずれか１項に従う方法。
【請求項７】
該生体活性材料が更に、１以上の骨成長因子、脱ミネラル化された骨マトリックス（ＤＢＭ）及び／又はミネラル化された骨粒子を含む、請求項１〜６のいずれか１項に従う方法。
【請求項８】
骨（再）発生の足場の用途のためのリン酸カルシウム材料であって、該材料が微量元素を含み、かつ該微量元素を放出できるリン酸カルシウム材料。
【請求項９】
該リン酸カルシウム材料が吸収可能なリン酸カルシウム材料である、請求項８に従うリン酸カルシウム材料。
【請求項１０】
骨（再）発生の足場の形態を有する、請求項８又は９に従うリン酸カルシウム材料。
【請求項１１】
該リン酸カルシウム材料がリン酸カルシウムのセラミック、セメント若しくは被覆、又はリン酸カルシウムを含有するガラス若しくは複合物の形態にある、請求項８〜１０のいずれか１項に従うリン酸カルシウム材料。
【請求項１２】
該リン酸カルシウムセラミックが二相性リン酸カルシウム（ＢＣＰ）又はリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）、好ましくは吸収可能なＴＣＰである、請求項１１に従うリン酸カルシウム材料。
【請求項１３】
該微量元素がＦ、Ｓｉ、Ｃｕ、Ｌｉ、Ａｌ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｇｅ、Ｓｒの水溶性の塩及びそれらの組み合わせから成る群から選ばれる、請求項８〜１２のいずれか１項に従うリン酸カルシウム材料。
【請求項１４】
該微量元素がＦ及び／又はＬｉであり、好ましくはＮａＦ及び／又はＬｉＣｌとして用意される、請求項１３に従うリン酸カルシウム材料。
【請求項１５】
該生体活性材料が更に、１以上の骨成長因子、脱ミネラル化された骨マトリックス（ＤＢＭ）及び／又はミネラル化された骨粒子を含む、請求項８〜１４のいずれか１項に従うリン酸カルシウム材料。
【請求項１６】
請求項８〜１５のいずれか１項に従うリン酸カルシウム材料を含む、骨（再）発生の足場。
【請求項１７】
更に、幹細胞、骨原性細胞、及び／又は骨前駆細胞を含む、請求項１６に従う骨（再）発生の足場。
【請求項１８】
足場に含まれる材料として、請求項８〜１５のいずれか１項に従うリン酸カルシウム材料を用意すること、及びそこに含まれる微量元素の放出を生じさせることを含む、移植された組織（再）発生の足場において骨形成を促進する方法。
【請求項１９】
骨の（再）発生が必要である対象において骨を（再）発生する方法であって、該対象に請求項１６又は１７に従う骨（再）発生の足場を備えることを含む、骨を（再）発生する方法。
【請求項２０】
骨欠損の修復のための医療用品の製造のために、請求項８〜１５のいずれか１項に従うリン酸カルシウム材料を使用する方法。
【請求項２１】
リン酸カルシウム材料の骨誘導性を改善するために、微量元素の水溶性の塩を使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、リン酸カルシウム材料の骨誘導性を改善する方法、改善された骨誘導性を有するリン酸カルシウム材料及びそれから製造される骨（再）発生の足場、並びに治療の方法におけるそのような材料及び足場の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
或るサブクラスのリン酸カルシウム、具体的には表面の微細孔性及び微細構造の特定の配置を含むものは、骨誘導的であるとして記載され、ここでその語は骨細胞の成長を誘導し、かつそれにより非骨の組織における新規の骨形成を開始する材料の能力を言う。そのような骨の形成は、材料表面上での細胞の付着及び集合化ならびに増殖及び分化を含み、成熟骨を形成するための、材料表面上での骨マトリックス形成、骨ミネラル化、及び骨再形成が続く。リン酸カルシウム材料の骨誘導的能力は、骨形成が起こる最も早い時及び誘導された骨の量により示されるように、種々である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
骨誘導的リン酸カルシウム材料が、骨欠陥の外科的修復の間に、インプラント材料中に用いられる場合に、新規の骨が、既存の骨の近くでの骨伝導性により及び既存の骨から離れての骨誘導により、形成される。同時に、骨誘導的リン酸カルシウム材料は、成長因子を集め、かつ骨形成性細胞を引きつける故に、骨伝導的骨形成を促進するだろう。それ故に、骨修復における骨誘導性リン酸カルシウム材料の使用は、非骨誘導的リン酸カルシウム材料と比べて、より早い骨形成の開始、増加された量での骨形成、及び既存の骨から離れての骨形成を結果する。概して、材料の骨誘導的能力が高ければ高いほど、骨欠損の修復を目的とした、より効果的な処置が実施されうる。それ故に、吸収可能なリン酸カルシウム材料の骨誘導性を改善する継続的な必要が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の概略
本発明者らは、リン酸カルシウム材料に有効量の微量元素を備え、すると該微量元素が長期にわたりその材料から放出されることにより、リン酸カルシウム材料の骨誘導性がかなり改善されうることを発見した。本質的に、その材料は、骨誘導的能力が効果的に改善されるために、微量元素を放出できなければならない。それ故に、非常に適当なリン酸カルシウム材料でありかつ微量元素を放出する能力を内在的に示すものは、吸収可能なリン酸カルシウム材料であり、なぜならそのような材料は、分解されかつ吸収されながら、そこに含まれる微量元素を放出することができるからである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
第１の面では、本発明は、有効量の微量元素をリン酸カルシウム材料に備えることを含む、リン酸カルシウム材料の骨誘導性を改善する方法であって、該材料は該微量元素を放出することができるものである方法を提供する。
【０００６】
好ましくは、リン酸カルシウム材料は、該微量元素を放出できる能力を、それが吸収可能であるという事実から引き出す。従って、一の好ましい実施態様では、本発明は、有効量の微量元素を吸収可能なリン酸カルシウム材料に備えることを含む、リン酸カルシウム材料の骨誘導性を改善する方法に関する。
【０００７】
好ましい他の実施態様では、リン酸カルシウム材料は、リン酸カルシウムのセラミック、セメントあるいは被覆の形態であり、又はリン酸カルシウムを含有するガラスあるいは複合物の形態を有する。好ましくは、リン酸カルシウムセラミックは吸収可能な二相性リン酸カルシウム（BCP)又は吸収可能なリン酸三カルシウム（TCP)であり、最も好ましくは吸収可能なTCPである。リン酸カルシウム材料は好ましくは多孔性であり、かつより好ましくは骨形成性細胞による材料の進入を許すのに十分大きい孔径を有する。
【０００８】
別の好ましい他の実施態様では、微量元素はF、Si、Cu、Li、Al、Mg、Mn、Zn、Ge、Srの水溶性の塩及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる。より好ましくは、微量元素はF及び／又はLiの水溶性の塩であり、最も好ましくはFのナトリウム塩及び／又はLiの塩化物塩である。
【０００９】
本発明は、他の面において、骨（再）発生足場における使用のためのリン酸カルシウム材料を提供し、該材料は有効量の微量元素を含みかつ該微量元素を放出できるものである。やはり、リン酸カルシウム材料は好ましくは、該微量元素を放出できる能力を、それが吸収可能であるという事実から引き出す。それ故に、好ましい実施態様では、本発明は、骨（再）発生における使用のための吸収可能なリン酸カルシウム材料に関し、該材料は有効量の微量元素を含む。
【００１０】
本発明に従うリン酸カルシウム材料は骨（再）発生足場において又は骨（再）発生足場として重要な有用性を有し、そしてそれ故に本発明は本発明に従うリン酸カルシウム材料を含む骨（再）発生足場にも関する。この面においても、リン酸カルシウム材料は好ましくは吸収可能であり、かつ好ましくはリン酸カルシウムのセラミック、セメントあるいは被覆の形態又はリン酸カルシウムを含有するガラスあるいは複合物の形態にあり、かつリン酸カルシウムセラミックは好ましくは吸収可能な二相性リン酸カルシウム（BCP）あるいは吸収可能なリン酸三カルシウム（TCP)、最も好ましくはTCPである。微量元素は、好ましくはF、Si、Cu、Li、Al、Mg、Mn、Zn、Ge、Srの水溶性の塩及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれ、より好ましくはF及びLiの水溶性の塩から選択され、最も好ましくはFのナトリウム塩及び／又はLiの塩化物塩である。
【００１１】
好ましい実施態様では、骨（再）発生足場はさらに幹細胞、骨原性細胞、及び／又は骨前駆細胞を含む。
【００１２】
更に追加的な面では、本発明は移植された組織（再）発生足場での骨形成を促進する方法であって、本発明のリン酸カルシウム材料を、該足場に含まれる材料として備えることを含む方法を提供する。
【００１３】
更に追加的な面では、骨再発生の必要がある対象において骨を再発生する方法であって、対象に本発明に従う骨（再）発生足場を備えることを含む方法を本発明は提供する。
【００１４】
更に追加的な面では、骨欠損の修復のための医療用品の製造のために、本発明に従う吸収可能なリン酸カルシウム材料を使用する方法を本発明は提供する。
【００１５】
更に追加的な面では、リン酸カルシウム材料、好ましくは骨誘導的なリン酸カルシウム材料、より好ましくは吸収可能かつ骨誘導的なリン酸カルシウム材料の骨誘導性を改善するために微量元素の水溶性塩を使用する方法を本発明は提供する。
【００１６】
図１は、用量依存的な様式で、リン酸三カルシウムセラミック（TCP）の骨誘導的能力に対するフッ化ナトリウムの影響を示す顕微鏡写真を示す（１〜３mmの粒径を有する１．０cc粒子のインプラント、ヤギ中の筋肉内の移植後１２週間、カルシウム除去されなかった区画、実施例１に示されるようなメチレンブルー及び塩基性フクシン染色）。パネルAは、TCP単独による、制限された骨誘導を示す；パネルBは８mmolのＮａＦ／１００ｇTCPを含むTCPによる、わずかに促進された骨誘導を示す；パネルCは１６mmolのＮａＦ／１００ｇ  ＴＣＰを含むTCPによる、かなり促進された骨誘導を示す；パネルDは２４mmolのＮａＦ／１００ｇ  ＴＣＰを含むTCPによる、骨誘導の制限された促進を示す。
【００１７】
図２は、実施例１に記載されている組織形態計測学的な方法により決定された、インプラントの利用可能な空間における骨のパーセンテージに対するNaFの用量依存的な影響を示す棒グラフを示す。F00（TCP単独のセラミックのみのインプラント）では、骨は組織学的に観察されうるが、形成された骨の量は限定され、少なすぎて定量的に測定され得ない。F08（８mmolのNaF／100gを含むTCP）では、より多くの骨がインプラント中で形成されたが、利用可能な空間（粒子中の孔により形成された空間及び造骨細胞にとって利用可能なセラミック粒子の間の空間）において形成された骨の量は１％未満である。５％の骨がF16（１６mmolのNaF／100gを含むTCP）の利用可能な空間において形成された。F24（２４mmolのNaF／100gを含むTCP）において示されるようなさらにより高い濃度のNaFを用いると、再び１％未満の骨が形成された。
【００１８】
図３は、用量依存的な様式で、リン酸三カルシウムセラミック（TCP）の骨誘導的能力における塩化リチウムの影響を示す顕微鏡写真を示す（１〜３ｍｍの粒径を有する１．０ccの粒子のインプラント、ヤギ中の筋肉内への移植後１２週間、カルシウム除去されなかった区画、実施例２に示されるようなメチレンブルー及び塩基性フクシン染色）。パネルA及びBは、TCP(L00)及び５mmol  LiCl/100gTCPを伴うTCP(L05)のインプラントの吸収を示し、骨は観察されなかった；パネルCは１５mmol  LiCl/100gTCPを含むTCPによる、促進された骨誘導を示す；パネルDは４５mmol  LiCl/100gTCPを含むTCPによる、骨誘導の制限された促進を示す。
【００１９】
図４は、実施例２に記載される組織形態計測学的な方法により決定された、インプラントの利用可能な空間における骨のパーセンテージに対する塩化リチウムの用量依存的な影響を示す棒グラフを示す。L00はTCP単独のインプラントであり、そしてL05は５mmolのLiCl／100gを有するTCPであり、骨は計測されなかった。約３％の骨が、１５mmolのLiCl／100gを含むTCPであるL15の利用可能な空間に形成された。より高い濃度のLiClを用いると、４５mmolのLiCl／100gを有するTCPであるL45において１％未満の骨が形成された。
【００２０】
発明の詳細な説明
定義
本明細書中で用いられる語「吸収可能な骨誘導的リン酸カルシウム材料」は、哺乳動物の体内に置かれた場合に、化学的な溶解及び細胞を介しての吸収を示す骨誘導的リン酸カルシウム材料を云い、そして最も重要なことには骨誘導的リン酸カルシウム材料は非骨部位に骨形成を与える。
【００２１】
本明細書中で用いられる語「有効量の微量元素」は、その量がリン酸カルシウムに改善された骨誘導性を備えることの所望の効果を有するのに十分に高いと同時に、骨形成性細胞に対する微量元素の何らかの毒性効果を回避するべく十分に低い、材料に含まれ又は備えられた、或る量の微量元素を云う。当業者は、この定義に従う、夫々の微量元素のための有効量を、例えばその微量元素の濃度−応答関係の測定により、評価又は決定するために利用可能な種々の方法をよく知っている。NaF及びLiClのための適当な方法が、例えば以下実施例（実施例１及び２）において提供される。
【００２２】
本発明は、微量元素がリン酸カルシウムの骨誘導性及びそれによる骨発生能力を改善する能力を有するという発見に基づく。特に、骨代謝に効果を有する又は影響するような微量元素が念頭に置かれる。
【００２３】
理論に制約されることを望まないが、本発明により考慮されるようなリン酸カルシウム材料の骨誘導性の改善は、リン酸カルシウム材料から吸収（又は分解）により放出されたイオンが、細胞集合、細胞増殖若しくは細胞分化又は細胞の代謝に有利に影響することにより骨形成プロセスに有利な影響を有する、又は骨ミネラル化若しくは骨の再形成に有利に影響する、という事実に基づくと考えられる。これら有利な影響の結果は、骨がより早く、より速くかつより高程度に（より多くの骨が形成される）形成されることである。この故に、微量元素、好ましくは骨代謝に影響する微量元素の、骨誘導的リン酸カルシウム材料への導入は、一方でリン酸カルシウム材料の骨誘導的能力を改善し、かつ異所においてより迅速かつより精巧な骨形成を引き起こし、他方では整形外科的な部位においてより効果的な骨修復を結果する。
【００２４】
微量元素の有効量は、微量元素及び用いられるリン酸カルシウムの両方に依存する。例えばフッ化ナトリウム（NaF）とTCPの場合、有効量は８〜２４  mmol  NaF/100gの範囲にあり、約１６  mmol  NaF/100g  TCPが最適条件である。それ故に、TCPの場合におけるNaFのための好まれる範囲は、１０〜２２、より好ましくは１２〜２０、さらにより好ましくは１４〜１８、さらにより好ましくは１５〜１７、及び最も好ましくは約１６  mmol  NaF/100g  TCPである。LiClのときには、有効量は５〜４５  LiCl/100gの範囲にあり、約１５  mmol  LiCl/100g  TCPが最適条件である。それ故に、TCPの場合におけるLiClのための好まれる範囲は、１０〜２２、より好ましくは１２〜２０  mmol/100gである。
【００２５】
微量元素の毒性は体内及びその部分における濃度に依存することが考慮されるべきである。それ故に、有毒にならない、リン酸カルシウム材料中に含まれうる有効量は、多くの場合で体内における放出速度及び従ってリン酸カルシウムマトリックスの安定性に依存する。より安定でないリン酸カルシウムマトリックスはより迅速に分解し、単位時間当たりでより多くの量の微量元素を放出し、そしてより安定なマトリックスよりもより少ない有効量の微量元素を保持しうる。種々の安定性を有する化合物の比率を有するセラミックの場合の利点は、様々な化合物の量を変化させることによりセラミックの安定性が変化されうることである。これは、リン酸カルシウム材料からの微量元素の所望の放出速度の調節を許す。
【００２６】
本発明に従うリン酸カルシウム材料の骨誘導性の改善の方法は特に、リン酸カルシウム材料の骨誘導的能力及びその後の骨発生能力を改善するように意図されている。改善された骨発生能力を伴うそのようなリン酸カルシウム材料は、骨組織の修復、増加、及び交換のために、成長因子のキャリアとして、遺伝子のキャリアとして及び骨組織エンジニアリングの足場として、単独で用いられうる。
【００２７】
本方法は、有効量の微量元素をリン酸カルシウム材料に備えることを含む。
【００２８】
本発明の方法を適用するために適当なリン酸カルシウムを選択することにおいて、骨欠陥の修復に関する限りで好まれるものは骨誘導的リン酸カルシウムとなるだろうが、低い骨誘導的能力を有するリン酸カルシウムの骨誘導性が本発明により改善されうる故に、これは必須の要求ではない。しかしながら、外科的インプラントの骨誘導性は好ましくは可能な限り高く、かつそれ故に骨誘導的なリン酸カルシウム材料が好まれる。大抵のリン酸カルシウムはある程度骨誘導的であるが、特に表面の微細孔性及び微細構造の特定の配置を含むものが骨誘導的であるとして記載されている。そのような物理的特徴を有するリン酸カルシウム材料がそれ故に好まれる。化学的には、リン酸カルシウムは好ましくは二相性リン酸カルシウム（BCP)又はリン酸三カルシウム（TCP)、より好ましくはTCPである。
【００２９】
好ましい実施態様における本発明は、吸収可能なリン酸カルシウムの骨誘導性の改善を意図する。この特別なリン酸カルシウム材料の選択は、その環境によるリン酸カルシウムの吸収の間における、その材料中に含まれる水溶性微量元素の放出の内在的能力にある。
【００３０】
リン酸カルシウム材料の（生体）吸収能力は、それらの化学的／結晶的組成、”材料”としてのそれらの構造に依存し、かつ移植部位における周囲環境に依存するように思われる。二つの異なる生物学的吸収経路の存在が提案され、一つは溶液に媒介された（化学的）過程（生理的溶液中でのインプラントの溶解性）に関するものであり、そして第２は細胞に媒介された過程（ファゴサイトーシス）に関するものである。予想に反して、体自身の硬組織成分、ヒドロキシアパタイト、により密接に類似する材料が、もし類似のセラミック構造及び類似の純度が用いられるならば、骨内で自然に生じないリン酸三カルシウムよりもはるかにゆっくりと溶解することが発見された。結晶性HAの高密度インプラントは、それらの化学的性質及びそれらの小さな表面積の故に、吸収へのより小さい傾向を持つことが、述べられうる。密なリン酸三カルシウムインプラントは測定可能な分解速度を示す。β−TCPの多孔性セラミックは概して、HAでできたセラミックよりもはるかにより迅速に（生物的に）分解をする（より速い速度での分解）と見える。さらに、リン酸三カルシウムインプラントは、類似構造のリン酸四カルシウムインプラントよりも、はるかに迅速に吸収する。
【００３１】
本発明の局面のために、リン酸カルシウムマトリックスからの微量元素の放出または遊離が好ましくは、１日乃至１年の期間、より好ましくは１から２０週の期間、さらにより好ましくは４から８週の期間継続することが意図される。吸収可能なリン酸カルシウム材料の場合に、リン酸カルシウム材料はその期間内に完全に吸収され、又はもしそうでなければ微量元素が分解の結果として材料から完全に遊離される。放出はいわゆる持続された（又は管理された）放出の形態にあってよく、それにより微量元素は長期間にわたり材料から安定的に放出され、従ってどの時点においても遊離される投与量を減じ、そして実質的に継続的なゆっくりとした遊離を実現する。放出は、例えばリン酸カルシウム材料中の高濃度の”ポケット”中に微量元素を備えることによって成される、断続的な放出であってもよい。あるいは、放出はバースト放出であってよく、微量元素は高濃度で短時間で実質的に放出される。あらゆる放出の形態のうち、持続される放出が好まれる。
【００３２】
好ましくは、本発明の局面で用いられる微量元素は、F、Si、Cu、Li、Al、Mg、Mn、Zn、Ge、Sr及びそれらの組み合わせから成る群から選ばれる。より好ましくは、微量元素はF及び／又はLiである。
【００３３】
本発明の方法において採用される、又は本発明のリン酸カルシウムに含まれる微量元素は好ましくは、水溶性の形態にあり、すなわち水溶性の塩としてある。これは、リン酸カルシウムマトリックスからそれらが放出されると、それらがイオンの形態で骨形成過程に対しそれらの効果を発揮しうるという利点を有する。原則として、いずれの対イオンもそのような水溶性の塩で用いられうる。Fの場合は、水溶性の塩は好ましくはNaFとして用意され、そしてLiの場合は水溶性の塩はLiClである。
【００３４】
微量元素を放出できるリン酸カルシウム材料への有効量の該微量元素の供給は、微量元素とリン酸カルシウム材料のための構成成分を予備混合すること、及び混合物を本発明のリン酸カルシウムの材料及び／又は足場へと形成することにより、実施されうる。
【００３５】
例えば、微量元素を含むリン酸カルシウムセラミックは、
−リン酸カルシウム粉（例えば、TCP粉）
−リン酸カルシウム粉１００ｇ当たり約１００〜１５０ｍｌの水溶液の比率にある（最終産物において有効量の微量元素を生じるために十分な量の）微量元素を含む水溶液中における１．０〜２．０％のH2O2、及び
−１００ｇのリン酸カルシウム粉当たり約３０〜５０ｇのナフタレン粒子の比率にあるナフタレン粒子（５００〜１４００μｍ）
を一緒に混合すること、及び混合物を５０〜７０℃で泡立てて多孔性の素地を形成することにより、調製されうる。乾燥後、ナフタレンは８０〜１００℃で蒸発され得、そして素地は１１００℃で８時間焼結され得る。セラミックはその後、任意の形状又は形態、例えば粒子（１．０〜３．０ｍｍ）の形態に形成されて良く、その後、例えばアセトン、エタノール及び水により超音波的に、清潔にされ、その後８０℃で乾燥されうる。
【００３６】
あるいは、リン酸カルシウム材料は既製であり、例えば微量元素の水溶液にリン酸カルシウム材料を浸し、任意的にこのように含浸されたリン酸カルシウム材料の乾燥が続くことにより、微量元素が充填されてよい。
【００３７】
すなわち、微量元素は、既製のリン酸カルシウム材料中へ浸漬により充填されてよく、又はあらかじめ構成成分を予備混合することによるリン酸カルシウム材料の製造中にリン酸カルシウム材料へ組み込まれてよい。好ましくは、リン酸カルシウム材料の骨誘導性の改善の方法は、リン酸カルシウム材料の製造に先立つ構成成分の予備混合を包含する。
【００３８】
原則として、本発明の局面におけるリン酸カルシウム材料はいずれの形状又は形態であてよい。例えば、ブロック、発泡体、スポンジ、顆粒、セメント、インプラントコーティング、複合物構成成分の形態にあってよい。例えばそれはリン酸カルシウムを含有するガラス又は複合物であってよい。語「リン酸カルシウムを含有する複合物」は本明細書では、リン酸カルシウムを含有する高分子材料を指すことを意味される。材料は例えば、有機／無機材料又はセラミックと組み合わされてよく、種々の原料から、天然、生物学的、又は合成的な原料でよい。種々の形態は、例えば材料の押出、射出成形、溶剤注型、特定の浸出方法、圧縮成形、並びに３Dプリンティング、多相ジェット固化及び溶融堆積モデリング（FDM)のようなラピッドプロトタイピングにより得られる。特定の材料の選択は、もちろん予定される適用に依存する。
【００３９】
適当なセメントは例えば、注入可能な（骨）足場材料として用いられてよく、かつ硬化してから細胞を充填されてよい。そのようなセメントは例えばヒドロキシアパタイト（HA）微小粒子を含んでよく、その微小粒子はそれらの製造方法に依存して、緻密度又は微細孔性であってよい。適当な粒径は、１０〜１０００μｍ、好ましくは２００〜３００μｍの範囲の直径を有する粒子の粒径である。
【００４０】
リン酸カルシウム材料は、直接的に足場材料として用いられ得、若しくは成形、硬化、（型）硬化、焼結、架橋、微粉砕、のこ引き、積層、艶出、塗布、エッチング、含浸のような製造後処理により又はその表面を化学的に改質することにより、適当な足場材料に更に改質又は形成されうる。
【００４１】
本発明のリン酸カルシウム材料は、その中に含まれる微量元素の放出をすることができる。本明細書中用いられる語「放出」は、管理された様式で、すなわち長期にわたり適当な濃度パターンで、有効量の微量元素を局所的に放出することを云う。
【００４２】
放出は一方では、吸収可能な材料をリン酸カルシウムとして選択することにより達成され、吸収可能な材料は材料のマトリックスからの微量元素の放出の所望の結果を内在的に生じる。他方では、微量元素がそこから、例えば持続的な様式で、放出されうるようにリン酸カルシウム材料を改質（例えば、混合、被覆、含浸）することを選択しうる。そのような放出系はたとえば、ポリマー的放出により微量元素を引き渡しうるポリマー的生物材料により改質されたリン酸カルシウム材料を採用してよく、該微量元素はポリマーから放出される。ポリマー的放出のために、微量元素はポリマー的放出被覆材料によりリン酸カルシウム材料中に閉じ込められ又はリン酸カルシウム材料上に吸着され、そしてインプラントの部位で放出され、典型的には放出は、表面脱着、拡散及びポリマー分解の組み合わせを通じて起こりうる。ポリマー的放出被覆材料は例えば、リン酸カルシウム材料から微量元素を放出するために、インプランテーションの部位で（ゆっくりと）溶解してよい。ポリマー的放出被覆材料は微量元素、好ましくはF、Si、Cu、Li、Al、Mg、Mn、Zn、Ge、Sr及びそれらの組み合わせから成る群から選ばれる微量元素、より好ましくはF及びLiの吸着にとって適当ないずれの材料であってよい。イオン交換能を有しかつイオン放出をできる材料は、ポリマー的放出被覆材料として非常に適当である。
【００４３】
次に、足場は全体的にリン酸カルシウム材料から調製されてよく、あるいは（任意的に改質された）リン酸カルシウム材料による被覆を有するコアから成ってよい。リン酸カルシウム材料は、次に、微量元素の管理された放出をすることができるポリマーを含み、かつそのポリマーは微量元素を充填された被覆の形態を採り、該被覆は有効量の微量元素を管理された様式で局所的に放出することが可能である。
【００４４】
述べられたように、リン酸カルシウム材料から又はそこに含まれるポリマー的材料からの微量元素の放出は、微量元素放出性ポリマー若しくは吸収可能なリン酸カルシウム材料の、表面脱着、拡散、及び／若しくは材料分解、又はこれらの組み合わせを通じて起こりうる。この目的のために、リン酸カルシウム材料は微量元素の放出に適当な種々の天然又は合成のポリマーを含んでよく、ポリマーは疎水性ポリマー[例えばラクチド／グリコライド共重合体（PLG）、ポリアンハイドライド]又は親水性ポリマー[例えばヒアルロン酸（HA）、コラーゲン、ポリ（エチレングリコール）（PEG）]に分類されうる。PLG及びポリアンハイドライドのような合成的なポリマーは、それらの分解を調節するための共重合比率の範囲で生態的合成でありかつ入手可能である故、本発明に従う微量元素の管理された放出にとって非常に適している。
【００４５】
リン酸カルシウム材料は更に、材料の骨発生的性質を支持することができるサイトカイン及び成長因子を含んでよい。
【００４６】
適当なサイトカイン及び成長因子は、上皮成長因子（EGF）、線維芽細胞成長因子（ｂFGF、FGF-1、及びFGF-2）、インターフェロン−（IFN-）、インターロイキン（IL-1、IL-4、IL-6、IL-10及びIL-11）、血小板由来成長因子（PDGF）、形質転換成長因子（TGF-及びTGF−β）、腫瘍壊死因子−（TNF-）、インシュリン様成長因子（IGF-I、IGF-II）、破骨細胞分化因子（ODF、またOPGL（オステオプロテジェリンリガンド）、ＲＡＮＫＬ（ＮＦＢリガンドの受容体アクチベーター）及びＴＲＡＮＣＥ（ＴＮＦ関連の活性化誘発性サイトカイン）としても知られる）、及びマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を含む。ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＴＮＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−２、ＰＤＧＦ、及びＭ−ＣＳＦのような、これらの多くは骨吸収を刺激する。ＩＧＦ−I及びＩＧＦ−II、ＦＧＦ−２並びにＴＧＦ−３のようないくつかは骨形成を促進し、一方で他（ＰＤＧＦ及びＴＧＦ−β）もコラーゲン合成をする細胞の増殖及び分化を刺激する（Watkins  BA,  Li  Y,  Lippman  HE,  Seifert  MF  (2001)  Omega-3  Polyunsaturated  Fatty  Acids  and  Skeletal  Health.  Experimental  Biology  and  Medicine  226:485-97)。好ましい成長因子はＢＭＰ、ＩＧＦ、ＰＴＨ及びＰＤＧＦを含む。
【００４７】
あるいは、本発明に従う骨（再）発生の足場が幹細胞、骨原性細胞、及び／又は骨前駆細胞を備えられるべきである場合には、そのような細胞はＢＭＰのための遺伝子のような骨形成を刺激する遺伝子を有しうる。
【００４８】
骨（再）発生の足場又は生体活性材料は更に、当技術分野で既知の脱ミネラル化された骨マトリックス（ＤＢＭ）及び／又はミネラル化された骨粒子を含んでよい。
【００４９】
移植された本発明に従う組織（再）発生の足場で骨形成を促進する方法は、足場材料としての本発明に従うリン酸カルシウム材料の用意を含み、そしてそこに含まれる微量元素の放出を生じさせる。微量元素の放出は上述のように、例えばインプランテーション部位での足場材料の分解を許容することにより行われうる。標準的には、化学的な溶解及び細胞性の分解が、長期間にわたる吸収可能な材料の分解という結果をもたらすだろう。あるいは、インビボ状況下で、より安定であるか又は非常にゆっくりとだけ吸収するリン酸カルシウム材料については、微量元素を含むリン酸カルシウム材料の部分の分解が、微量元素の放出を達成するように促進されうる。促進は例えば、より高い量のＴＣＰをリン酸カルシウムに備えることにより、又は一般的にはより高い速度の分解を材料に備えることにより達成されうる。あるいは、リン酸カルシウム材料の組成は、材料が微量元素を充填されることができるように、かつ、その後移植されたら、例えばポリマー放出により、微量元素を放出をすることができるように改質されうる。
【００５０】
必要がある対象における骨を（再）発生する方法は、対象に本発明に従う骨（再）発生足場を備える工程を含む。足場は一般的には外科により移植されるだろう。足場を移植するための外科的処置は、他の種類の足場を移植する際に熟練した外科医により標準的に用いられる処置に類似してよい。
【００５１】
例として、かつ制限されず、本発明の実施例がここで与えられるだろう。
【００５２】
実施例
実施例１
フッ化ナトリウムを用いる吸収可能な骨誘導的リン酸三カルシウムセラミックの骨誘導的能力の改善
【００５３】
１．１材料と方法
１．１．１．材料の調製
リン酸三カルシウムセラミック
ＴＣＰ粉（Plasma  Biotal,  イギリス）がＨ２Ｏ２溶液（水中で１．０〜２．０％、１００〜１５０ｍｌ／１００ｇ  ＴＣＰ粉）及びナフタレン粒子（５００〜１４００μｍ、３５〜５０ｇ／１００ｇ粉）と混合され、そして５０〜７０℃で泡立たせられて多孔性の素地を得た。８０〜１００℃での乾燥及びナフタレンの蒸発の後、素地は１１００℃で８時間焼結された。セラミック粒子（１．０〜３．０ｍｍ）がすり鉢粉砕及びふるい分けにより調製され、アセトン、エタノール及び水により超音波的に清潔にされ、そして最終的に８０℃で乾燥された。
【００５４】
フッ化ナトリウムを伴うリン酸三カルシウム
同じ手順が、ＴＣＰセラミックそのものを調製するために用いられるＨ２Ｏ２溶液中にフッ化ナトリウムを溶解することにより、フッ化ナトリウムを伴うＴＣＰセラミックを調製するために用いられた（量について表１参照）。
【００５５】
【表１】
2008538721.tif 000002
【００５６】
１．１．２．動物研究
フッ化ナトリウムが充填されたＴＣＰセラミックの骨誘導的能力が、ヤギの筋肉における予備的な研究において試験された。殺菌後（１２１℃で３０分のオートクレーブ）、ＴＣＰ単独、８ｍｍｏｌ  ＮａＦ／１００ｇを伴うＴＣＰ、１６ｍｍｏｌ  ＮａＦ／１００ｇを伴うＴＣＰ、および２４ｍｍｏｌ  ＮａＦ／１００ｇを伴うＴＣＰそれぞれの１〜３ｍｍ  セラミック粒子（顆粒）の体積１．０ｃｃが、４頭のヤギの背面の筋肉内に１２週間埋め込まれた（４頭のヤギそれぞれに全４のインプラント）。
【００５７】
１．１．３．組織像
移植の１２週間後に動物は殺され、そしてインプラントは周辺組織とともに回収され、そして０．１４Ｍカコジル酸塩バッファー中の１．５％グルタルアルデヒド中に固定された。固定されたサンプルは、段階的な一連の水性エタノール溶液（７０％、８０％、９０％、９６％及び１００％×２）中で脱水され、最終的にはメタクリル酸メチル（ＭＭＡ）中に埋め込まれた。標準的な手順を用いて、脱灰されなかった切片（１０〜２０μｍ）が作成されそして、骨形成に関する組織学的な観察及び組織形態計測学的な分析のためにメチレンブルー及び塩基性フクシンにより染色された。
【００５８】
１．１．４．組織形態計測
組織形態計測が、インプラントの中間を横切る切片について行われ、そして利用可能な空間に形成された骨のパーセンテージにが像分析を用いて測定された。
【００５９】
１．２．結果
それらの全体大きさにより測定されたインプラントの体積は、１２週間のヤギ筋肉における筋肉内インプランテーション後、１ｃｃ未満に減少し、これは、任意的に種々の濃度のフッ化ナトリウムを充填された、ＴＣＰ材料が吸収されたことを示す。材料の吸収は組織学的にも観察された。顕微鏡検査を用いると、ＴＣＰは確かに大いに吸収されたこと、及び実際に残りの量のＴＣＰだけが動物から回収されたことが明らかとなった。組織学的切片において観察されたように、多くの多孔性ＴＣＰセラミック粒子はより小さな粒子へと断片化された。フッ化ナトリウムを充填されたＴＣＰの再吸収も同様に観察されたが、移植されたセラミック粒子はより損なわれていなかった。
【００６０】
ＴＣＰ単独（ＮａＦを充填されていない）は４頭のヤギのうち２頭に骨形成を与えた。ＴＣＰ単独のインプラントにおいて骨形成を与えたこれら２頭のヤギにおいて、フッ化ナトリウムを充填されたＴＣＰではより多くの骨さえが見られた。一方で、１６ｍｍｏｌ  ＮａＦ／１００ｇＴＣＰを伴うＴＣＰにおいて、８ｍｍｏｌ  ＮａＦ／１００ｇＴＣＰ及び２４ｍｍｏｌ  ＮａＦ／１００ｇＴＣＰにおいてよりも、より多くの骨が形成された（図１及び図２を参照）。
【００６１】
考察及び結論
非骨組織において骨形成を与える能力は個々のヤギごとに異なるが、本明細書における結果は、吸収可能なＴＣＰがヤギ筋肉内に骨形成を与えるならば、骨形成は或る濃度のフッ化ナトリウム（本研究では１６ｍｍｏｌ  ＮａＦ／１００ｇＴＣＰ）において更に改善されることを示す。本研究において示されたフッ化ナトリウムによる骨誘導的能力の改善は、骨代謝において正の影響を有する微量元素を伴う吸収可能なリン酸カルシウム材料の骨誘導的能力及びそれによる骨原性能力を改善するための手法を提供する。
【００６２】
実施例２
塩化リチウムによる吸収可能な骨誘導的リン酸三カルシウムの骨誘導的能力の改善
【００６３】
２．１．材料及び方法
２．１．１．材料の調製
リン酸三カルシウム
ＴＣＰ粉（Plasma  Biotal,  イギリス）がＨ２Ｏ２溶液（水中で１．０〜２．０％、１００〜１５０ｍｌ／１００ｇ  ＴＣＰ粉）及びナフタレン粒子（５００〜１４００μｍ、３５〜５０ｇ／１００ｇ粉）と混合され、そして５０〜７０℃で泡立たせられて多孔性の素地を得た。８０〜１００℃での乾燥及びナフタレンの蒸発の後、素地は１１００℃で８時間焼結された。セラミック粒子（１．０〜３．０ｍｍ）が上記のように調製され、アセトン、エタノール及び水により超音波的に清潔にされ、そして最終的に８０℃で乾燥された。
【００６４】
塩化リチウムを伴うリン酸三カルシウム
同じ手順が、ＴＣＰセラミックそのものを調製するために用いられるＨ２Ｏ２溶液中に塩化リチウムを溶解することにより、塩化リチウムを伴うＴＣＰセラミックを調製するために用いられた（量について表２参照）。
【００６５】
【表２】
2008538721.tif 000003
【００６６】
２．１．２．動物研究
塩化リチウムを充填されたＴＣＰセラミックの骨誘導的能力がヤギの筋肉内における予備的な研究において試験された。殺菌後（１２１℃で３０分のオートクレーブ）、ＴＣＰ単独、５ｍｍｏｌ  ＬｉＣｌ／１００ｇを伴うＴＣＰ、１５ｍｍｏｌ  ＬｉＣｌ／１００ｇを伴うＴＣＰ、４５ｍｍｏｌ  ＬｉＣｌ／１００ｇを伴うＴＣＰそれぞれの１〜３ｍｍ  セラミック粒子（顆粒）の体積１．０ｃｃが、４頭のヤギの背面の筋肉内に１２週間埋め込まれた（４頭のヤギそれぞれに全４のインプラント）。
【００６７】
２．１．３．組織像
移植の１２週間後に動物は殺され、そしてインプラントは周辺組織とともに回収され、そして０．１４Ｍカコジル酸塩バッファー中の１．５％グルタルアルデヒド中に固定された。固定されたサンプルは、段階的な一連の水性エタノール溶液（７０％、８０％、９０％、９６％及び１００％×２）中で脱水され、最終的にはＭＭＡ中に埋め込まれた。脱灰されなかった切片（１０〜２０μｍ）が調製されそして、骨形成に関する組織学的な観察及び組織形態計測学的な分析のためにメチレンブルー及び塩基性フクシンにより染色された。
【００６８】
２．１．４．組織形態計測
組織形態計測が、利用可能な空間に形成された骨のパーセンテージに関して、インプラントの中間を横切る切片について行われた。
【００６９】
２．２．結果
それらの全体大きさにより測定されたインプラントの体積は、１２週間のヤギ筋肉における筋肉内インプランテーション後で１ｃｃ未満に減少し、これは、任意的に種々の濃度の塩化リチウムを充填された、ＴＣＰ材料が吸収されたことを示す。材料の吸収は組織学的にも観察された。組織学的切片に見られるように、ＴＣＰはほとんど吸収され、残りのＴＣＰだけが動物から回収され、そして多くのＴＣＰセラミックは小さな粒子へと壊れた。塩化リチウムが与えられたＴＣＰの吸収は同様に観察されたが、より多くの損なわれていないセラミック体が残された。
【００７０】
ＴＣＰ単独が４頭ヤギのうち２頭に骨形成を与えた。ＴＣＰ単独の場合に骨形成を与えたこれら２頭のヤギにおいて、１５ｍｍｏｌ  ＬｉＣｌ／１００ｇ  ＴＣＰを充填されたＴＣＰでは、より多くの骨形成さえが観察された（図３及び４）。
【００７１】
考察及び結論
非骨組織における骨形成を与える能力は個々のヤギごとに異なるが、本明細書における結果は、ヤギの筋肉内で骨形成が起こるならば、骨形成は或る濃度の塩化リチウム（本研究では１５ｍｍｏｌ  ＬｉＣｌ／１００ｇＴＣＰ）により更に改善されることを示す。本研究において示された塩化リチウムによる骨誘導的能力の改善はやはり、骨代謝において正の影響を有する微量元素を伴う吸収可能なリン酸カルシウム材料の骨誘導的能力及びそれによる骨原性能力を改善するための手法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】リン酸三カルシウムセラミックの骨誘導的能力に対するフッ化ナトリウムの影響を示す顕微鏡写真である。
【図２】インプラントの利用可能な空間における骨のパーセンテージに対するNaFの用量依存的な影響を示すグラフである。
【図３】リン酸三カルシウムセラミックの骨誘導的能力における塩化リチウムの影響を示す顕微鏡写真である。
【図４】インプラントの利用可能な空間における骨のパーセンテージに対する塩化リチウムの用量依存的な影響を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2008538721.tif 000009
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