(57)【要約】  少なくとも２つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含み、各々のプロモーターがＲＮＡエフェクター分子をコードする核酸配列に作動可能に連結されている発現構築物が本明細書に開示される。さらに、単一および／または多重フィンガーを含みうるショートヘアピンＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結された多重ポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含む発現構築物が提供される。提供される構築物は、ＨＢＶおよびＨＣＶを含むウイルス遺伝子を含む遺伝子サイレンシングに有効なＲＮＡ分子のｉｎ  ｖｉｖｏ送達に有用である。【選択図】      図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含み、各々のプロモーターが少なくとも１つのＲＮＡエフェクター分子をコードする核酸配列に作動可能に連結されている発現構築物。
【請求項２】
前記少なくとも２つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターがウイルスまたは真核生物由来である、請求項１に記載の発現構築物。
【請求項３】
前記少なくとも２つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが、１型ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、２型ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、および３型ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（Ｈ１、７ＳＫ、Ｕ６、およびＭＲＰを含む）からそれぞれ独立に選択される、請求項１に記載の発現構築物。
【請求項４】
前記少なくとも１つのＲＮＡエフェクター分子がショートヘアピンＲＮＡである、請求項１に記載の発現構築物。
【請求項５】
前記ショートヘアピンＲＮＡが、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１から選択され、ＵがＴと置換されている核酸配列を含み、請求項４に記載の発現構築物。
【請求項６】
前記発現構築物が、３〜８個のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含む、請求項１に記載の発現構築物。
【請求項７】
前記発現構築物が４個のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含む、請求項６に記載の発現構築物。
【請求項８】
７ＳＫおよびＵ６プロモーターを含む、請求項７に記載の発現構築物。
【請求項９】
前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが、Ｈ１、７ＳＫ、およびＵ６から選択される、請求項６に記載の発現構築物。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのＲＮＡエフェクター分子が、標的遺伝子の発現調節能を有する、請求項１に記載の発現構築物。
【請求項１１】
前記標的遺伝子がウイルス遺伝子である、請求項１０に記載の発現構築物。
【請求項１２】
前記ウイルス遺伝子がＨＢＶまたはＨＣＶ遺伝子である、請求項１１に記載の発現構築物。
【請求項１３】
前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの少なくとも２つが、異なるＲＮＡエフェクター分子をコードする配列に作動可能に連結されている、請求項１に記載の発現構築物。
【請求項１４】
各々のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが、同一のＲＮＡエフェクター分子をコードする核酸配列に作動可能に連結されている、請求項１に記載の発現構築物。
【請求項１５】
同一のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが２個コピー以下しか存在しない、請求項１に記載の発現構築物。
【請求項１６】
同一のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが１個コピーしか存在しない、請求項１５に記載の発現構築物。
【請求項１７】
前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの少なくとも１つが配列番号５を含む、請求項１に記載の発現構築物。
【請求項１８】
前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの少なくとも１つが、ヌクレオチド２４１〜２４４がｇｇｇｇを含むことを除いて配列番号５を含む、請求項１に記載の発現構築物。
【請求項１９】
配列番号５を含む単離された核酸配列。
【請求項２０】
ヌクレオチド２４１〜２４４がｇｇｇｇを含むことを除いて配列番号５を含む、請求項１９に記載の単離核酸配列。
【請求項２１】
ヌクレオチド２３５で開始するＳａｌＩ制限部位が、Ａａｔ  ＩＩ、Ａｃｃ６５  Ｉ、Ａｃｉ  Ｉ、Ａｆｌ  ＩＩ、Ａｇｅ  Ｉ、Ａｐａ  Ｉ、ＡｐａＬ  Ｉ、Ａｓｃ  Ｉ、Ａｓｅ  Ｉ、ＡｓｉＳ  Ｉ、Ａｖｒ  ＩＩ、ＢａｍＨ  Ｉ、Ｂｃｌ  Ｉ、ＢｆｒＢ  Ｉ、Ｂｇｌ  ＩＩ、ＢｍｇＢ  Ｉ、ＢｓｅＹ  Ｉ、ＢｓｉＷ  Ｉ、ＢｓｐＤ  Ｉ、ＢｓｐＥ  Ｉ、ＢｓｐＨ  Ｉ、ＢｓｒＢ  Ｉ、ＢｓｒＧ  Ｉ、ＢｓｓＨ  ＩＩ、ＢｓｓＳ  Ｉ、ＢｓｔＢ  Ｉ、ＢｓｔＺ１７  Ｉ、Ｃｌａ  Ｉ、Ｄｒａ  Ｉ、Ｅａｇ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｖ、Ｆｓｅ  Ｉ、Ｆｓｐ  Ｉ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、Ｈｐａ  Ｉ、Ｋａｓ  Ｉ、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｍｆｅ  Ｉ、Ｍｌｕ  Ｉ、Ｍｓｃ  Ｉ、Ｎａｅ  Ｉ、Ｎａｒ  Ｉ、Ｎｃｏ  Ｉ、Ｎｄｅ  Ｉ、ＮｇｏＭ  ＩＶ、Ｎｈｅ  Ｉ、Ｎｏｔ  Ｉ、Ｎｒｕ  Ｉ、Ｎｓｉ  Ｉ、Ｐａｃ  Ｉ、ＰａｅＲ７  Ｉ、Ｐｍｅ  Ｉ、Ｐｍｌ  Ｉ、Ｐｓｔ  Ｉ、Ｐｖｕ  Ｉ、Ｐｖｕ  ＩＩ、Ｓａｃ  Ｉ、Ｓａｃ  ＩＩ、Ｓｂｆ  Ｉ、Ｓｃａ  Ｉ、Ｓｆｏ  Ｉ、Ｓｍａ  Ｉ、ＳｎａＢ  Ｉ、Ｓｐｅ  Ｉ、Ｓｐｈ  Ｉ、Ｓｓｐ  Ｉ、Ｓｔｕ  Ｉ、Ｓｗａ  Ｉ、Ｔｌｉ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉ、Ｘｈｏ  Ｉ、およびＸｍａ  Ｉから成る群から選択される制限部位で置換されていることを除いて配列番号５を含む、請求項１９に記載の単離核酸配列。
【請求項２２】
７ＳＫポリメラーゼＩＩＩプロモーター核酸配列であって、前記配列が３’末端にａａａａまたはｇｇｇｇを含む、配列。
【請求項２３】
２以上のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含み、少なくとも２つの前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターがショートヘアピンＲＮＡ分子をコードする核酸配列に作動可能に連結されている発現構築物。
【請求項２４】
少なくとも２つの前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが、同一のショートヘアピンＲＮＡ分子をコードする核酸配列に作動可能に連結されている、請求項２３に記載の発現構築物。
【請求項２５】
少なくとも２つの前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが、異なるショートヘアピンＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結されている、請求項２３に記載の発現構築物。
【請求項２６】
少なくとも２つの前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが、同一のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである、請求項２３、２４、または２５に記載の発現構築物。
【請求項２７】
前記２以上のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが、少なくとも２つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含む、請求項２３、２４、または２５に記載の発現構築物。
【請求項２８】
前記２以上のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが、３型ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含む、請求項２３に記載の発現構築物。
【請求項２９】
前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの少なくとも１つが、バイフィンガーまたはマルチフィンガーｄｓＲＮＡヘアピンであるショートヘアピンＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結されている、請求項２３に記載の発現構築物。
【請求項３０】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが、Ｈ１、７ＳＫ、およびＵ６から選択される、請求項２３に記載の発現構築物。
【請求項３１】
標的遺伝子の発現調節能を有する請求項２３に記載の発現構築物。
【請求項３２】
前記標的遺伝子がウイルス遺伝子である、請求項３１に記載の発現構築物。
【請求項３３】
前記ウイルス遺伝子がＨＢＶまたはＨＣＶ遺伝子である、請求項３２に記載の発現構築物。
【請求項３４】
標的遺伝子の活性を減少させることを必要とする哺乳類の治療方法であって、
少なくとも２つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含み、各々のプロモーターが前記標的遺伝子の発現を減少させることができる少なくとも１つのＲＮＡエフェクター分子をコードする核酸配列に作動可能に連結されている発現構築物の治療有効量を、それを必要とする哺乳類に投与する工程を含む、方法。
【請求項３５】
標的遺伝子の活性を減少させることを必要とする哺乳類の治療方法であって、
２以上のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含み、該ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの少なくとも２つが前記標的遺伝子の発現を減少させることができるショートヘアピンＲＮＡ分子をコードする核酸配列に作動可能に連結されている発現構築物の治療有効量を、それを必要とする哺乳類に投与する工程を含む、方法。
【請求項３６】
前記標的遺伝子がウイルス遺伝子である、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ウイルス遺伝子がＨＢＶまたはＨＣＶ遺伝子である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記哺乳類がヒトである、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３９】
少なくとも１つの標的遺伝子の発現を調節する方法であって、
前記少なくとも１つの標的遺伝子を含む宿主細胞を、２以上のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含み、該ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの少なくとも２つが前記少なくとも１つの標的遺伝子の発現を調節することができるショートヘアピンＲＮＡ分子をコードする核酸配列に作動可能に連結されている発現構築物でトランスフェクトする工程を含む。
【請求項４０】
少なくとも１つの標的遺伝子の発現を調節する方法であって、
前記少なくとも１つの標的遺伝子を含む宿主細胞を、少なくとも２つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含み、各々のプロモーターが前記少なくとも１つの標的遺伝子の発現を調節することができる少なくとも１つのＲＮＡエフェクター分子をコードする核酸配列に作動可能に連結されている発現構築物でトランスフェクトする工程を含む、方法。
【請求項４１】
前記宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記少なくとも１つの標的遺伝子がウイルス遺伝子である、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記ウイルス遺伝子がＨＢＶまたはＨＣＶ遺伝子である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
少なくとも１つの標的遺伝子を調節するための発現構築物を製造する方法であって、
（ａ）各々の発現構築物が少なくとも１つのＲＮＡエフェクター分子をコードする核酸配列に作動可能に連結された１つのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含む、少なくとも２つの発現構築物を生成する工程と、
（ｂ）少なくとも１つの標的遺伝子の発現の調節における、工程（ａ）の各々の発現構築物の機能性を測定する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の測定に基づき、少なくとも２つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含み、各々のプロモーターが少なくとも１つのＲＮＡエフェクター分子をコードする核酸配列に作動可能に連結されている発現構築物を生成する工程と、を含む方法。
【請求項４５】
工程（ｃ）の発現構築物が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター／ＲＮＡエフェクター分子カセットを前記発現構築物に繰り返し加えることによって生成される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
請求項１または２３に記載の発現構築物を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００４年８月２３日出願の米国仮出願第６０／６０３，６２２号、および２００４年１１月２２日出願の米国仮出願第６０／６２９，９４２号の利益を主張するが、その各々はその全体が参照により本明細書で援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明の分野は、概して、疾患または異常な細胞機能に関係する遺伝子の阻害に有用である小さな人工的に作り出されたＲＮＡ分子の豊富な産生を、効果的に（細胞、組織、または生物内で）方向づける能力を有する新規組換えＤＮＡ分子の使用方法および組成物である。具体的には、本発明は、ヒト治療用に適切なデザインを用いる単一組換えＤＮＡ分子から多量（２、３、４、５もしくはそれ以上）の相異なる小さなＲＮＡ分子の同時の産生のための手段を提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
最近、ＲＮＡｉまたは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）介在遺伝子サイレンシングの現象が認められているが、それによって細胞または生物における標的遺伝子の領域と相補的なｄｓＲＮＡは、標的遺伝子の発現を阻害する（例えば、１９９９年７月１日公開の国際公開第９９／３２６１９号パンフレット、ファイアー（Ｆｉｒｅ）ら、米国特許第６，５０６，５５９号明細書：「二本鎖ＲＮＡによる遺伝子阻害（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｄｏｕｂｌｅ−  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ）」、国際公開第００／６３３６４号パンフレット：  「ポリヌクレオチド配列を阻害するための方法および組成物（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」、パチュック（Ｐａｃｈｕｋ）とサチシュチャンドラン（Ｓａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎ）、および米国仮特許出願第６０／４１９，５３２号明細書、２００２年１０月１８日出願、（国際公開第２００４／０３５７６５号パンフレット、２００４年４月２９日公開：「二本鎖ＲＮＡ構造物および構築物、およびその生成および使用の方法（Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ，ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓａｍｅ）」を参照）。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）遺伝子サイレンシングは、核酸に基づく技術の特に面白い潜在的な応用を提供する。二本鎖ＲＮＡは多くの異なる生物において遺伝子サイレンシングを誘発することが証明されている。遺伝子サイレンシングはさまざまな機序により発生しうるが、その１つは転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）である。転写後遺伝子サイレンシングにおいて、標的遺伝子座の転写は影響されないが、ＲＮＡ半減期は減少する。外因性ｄｓＲＮＡは、線虫、トリパノソーマ、昆虫、および哺乳類を含む植物および動物におけるＰＴＧＳの有力な誘導因子であることが証明されている。転写遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）は、遺伝子発現が調節されうる別の機序である。ＴＧＳにおいて、遺伝子の転写は阻害される。ＰＴＧＳにおいて、細胞の細胞質コンパートメントはサイレンシング複合体の機構の位置である。ＴＧＳにおいて、ｄｓＲＮＡのエフェクターは細胞の核コンパートメントにおける表面上の活性である。調査、治療、および予防的適応に対するｄｓＲＮＡ介在遺伝子サイレンシングを利用する潜在的可能性はきわめて大きい。ＰＴＧＳと関連した標的ｍＲＮＡ分解の優れた配列および体系的な特性は、この現象を機能的ゲノムおよび薬剤開発のために理想的なものにする。
【０００４】
沈黙遺伝子に対する脊椎動物におけるｄｓＲＮＡを使用するための一部の現在の方法は、結果として、インターフェロン反応を含むｄｓＲＮＡ介在ストレス反応による望ましくない非特異的細胞毒性または細胞死をもたらす。初期の報告では、脊椎動物におけるｄｓＲＮＡ介在毒性は、長さが３０ｂｐｓ超のｄｓＲＮＡとのみ関連し、ｓｉＲＮＡ（２１−２３ｂｐの短い合成二本鎖ｄｓＲＮＡ分子）または３０ｂｐｓ未満の他の二本鎖ｄｓＲＮＡとは関連しないことが断定的に述べられている。この独断的な初期の支持にもかかわらず、より最近の報告は、非特異的サイレンシング効果、およびインターフェロン反応など細胞ストレス反応経路の誘導を含む他の毒性も、外因性に誘導されるｓｉＲＮＡ分子とともに発生することを規定している。しかし、出願人は、脊椎動物細胞における毒性を誘発することが報告された長いｄｓＲＮＡを含む、核酸発現構築物からのｄｓＲＮＡ分子の細胞内発現が、ｄｓＲＮＡ介在毒性を誘発することがない条件下に達成されうることを明らかにした。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１５２１１７号明細書、サチシュチャンドラン（Ｓａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎ）、パチュク（Ｐａｃｈｕｋ）、およびジョルダーノ（Ｇｉｏｒｄａｎｏ）を参照。したがって、ｄｓＲＮＡヘアピン分子を含む長短のｄｓＲＮＡ分子が、ｄｓＲＮＡ分子が細胞へ外因性に導入されるのではなく宿主細胞内で発現する場合は、インターフェロンまたは他のｄｓＲＮＡ介在ストレス反応を誘発することなく哺乳類および他の脊椎動物において使用されうる。しかし、かかるｄｓＲＮＡ法の実際の実行にはｄｓＲＮＡ発現構築物からのｄｓＲＮＡ分子の効果的な細胞内産生および送達を必要とするという課題が依然としてある。
【０００５】
ＲＮＡｉ用途および生物活性の他の機序のための核酸の使用には、核酸発現構築物から細胞内に生物的に活性な核酸を発現させることが望ましい場合が多い。かかる方法の有効性は、治療関連性に、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの所望の標的細胞または各細胞へ、所望の細胞内位置または各位置において有効な量および時間で生物活性、非毒性の形で標的宿主細胞において選択核酸を効果的に発現させる能力に依存する。これは、例えば、一次細胞、特定の細胞系、例えば、ヒト白血病細胞系であるＫ５６２５、およびｉｎ  ｖｉｖｏ用途にトランスフェクトが困難である細胞における特定の課題を示す。したがって、改善された発現系、発現構築物、および方法が真核細胞における核酸発現構築物からの核酸の細胞内発現には必要である。好ましくは、これらの方法を使用し、所望のポリペプチドおよび／または所望のＲＮＡエフェクター分子、例えば、リボザイム、アンチセンス、三重鎖形成、および／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの試料、細胞培養、および無傷動物（例えば、ヒトを含む哺乳類など脊椎動物）におけるｄｓＲＮＡの産生を含むそのさまざまな生物学的機能を達成することができる核酸を提供することができる。
【０００６】
バイオテクノロジーの出現から数十年間に、円形プラスミド、線状化プラスミド、コスミド、ウイルスゲノム、組換えウイルスゲノム、人工的染色体等を含む多様なベクター、発現構築物、および発現系が、原核生物および／または真核生物において使用するために開発されている。細菌細胞培養におけるこれら発現系の使用により、インターフェロン（アルファ）、インターフェロン（ベータ）、エリスロポエチン、第ＶＩＩＩ因子、ヒトインスリン、ｔ−ＰＡ、およびヒト成長ホルモンなどの組換えタンパク質が医薬品の標準部品となった。
【０００７】
バイオテクノロジーおよび分子生物学の分野において開発されているきわめて多様な発現ベクターおよび発現系の中には同じベクター上に多重プロモーターを含有する発現系がある。かかる種類の多重プロモーター発現系の１つでは、原核生物において、または真核細胞の同じ細胞内コンパートメントにおいて活性である多重プロモーター（すなわち、２以上のプロモーター）を含有するベクターが使用される。例えば、当業界のかかる多重プロモーター系は、同じ細胞の同じコンパートメントにおける２つ以上の配列（例えば、ｄｓＲＮＡを形成するようにデザインされた２つの明確な配列もしくはセンスおよびアンチセンス配列）の発現を可能にし、またはそれらは異なる細胞もしくは生物（例えば、原核生物および真核生物）内で同じ配列を発現し、または単一の作動可能に連結された配列のより効果的な転写を得るために使用されうる。しばしば確認されるのは、例えば、ＣＭＶおよびＳＶ４０など、例えば、２つのポリメラーゼＩＩプロモーターなど同じプラスミド上の多重ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターまたはバクテリオファージプロモーター、またはバクテリオファージＴ７プロモーターおよびバクテリオファージＳＰ６プロモーターである。
【０００８】
さらに、かかる多重プロモーターは、任意の数の配向および構成のベクター内に配置されうる。例えば、２つのプロモーターは、ベクターの同じ鎖から、または逆鎖からの転写を方向づけることができる。同じ鎖で方向づけされる場合は、それらはベクター内の同じ方向での転写を促進する。あるいは、多重プロモーターが逆鎖でコードされ、同じベクターにおいて互いに対して収束的または分岐的に配置されうるが、その場合、転写はそのベクター内で逆方向に進行する。さらに、さまざまな用語が、単一ベクター内の多重プロモーターの相対位置を記述するために当業界で開発されている。「タンデム」という語は、すべてが、転写される配列の５’末端の存在し、かつすべてがこれに作動可能に連結されている多重プロモーターを記述するために使用されている。タンデムプロモーターは同一または異なるプロモーターでありうる。「フランキング」プロモーターという語により、転写される配列が、各々プロモーターが、転写的に活性である場合、転写される配列の１つの鎖を転写することができるようにしてプロモーターによって５’末端および３’末端でフランキングされる多重プロモーターの配向が記述される。フランキングプロモーターは、同一または異なるプロモーターでありうる。例えば、配列の５’末端および３’末端をフランキングする一連のバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが、別個のセンス鎖およびアンチセンス鎖を発現し、二本鎖ｄｓＲＮＡを形成するための方法である（国際公開第９９／３２６１９号パンフレット、ファイアー（Ｆｉｒｅ）ら、１９９９年７月１日公開）。
【０００９】
多重タンデムプロモーターは、例えば、米国特許第５，５４７，８６２号明細書に記載されているが、これは、異なるＲＮＡポリメラーゼによって認められ、かつ各々がＲＮＡ転写配列の発現を促進することができる２以上のタンデムプロモーターから下流に位置したＲＮＡ転写配列を含むＤＮＡベクターを開示している。
【００１０】
酵母における哺乳類コラーゲンまたはプロコラーゲンを製造するための方法が、逆配向で単一もしくは二重、分岐異種プロモーターに作動可能に連結された２つの哺乳類コラーゲン遺伝子を含む構築物を使用する米国特許第６，４７２，１７１号明細書に開示されている。２つのコラーゲン遺伝子を促進するプロモーターは同じプロモーター、または異なるプロモーターでありうるとともに、２つのコラーゲン遺伝子の、好ましくは同時の発現を調整するために使用されうる。
【００１１】
タンデムで配置され、かつ所望のポリペプチドをコードする異種核酸に作動可能に連結された二重細菌プロモーターを含有する発現ベクターが、米国特許第６，１１７，６５１号明細書に開示されている。二重プロモーターは、ｔａｃ関連プロモーター由来の第１の成分（それ自体、ｌａｃとｔｒｐプロモーターの組合せである）およびガラクトース代謝に関係する酵素をコードする細菌遺伝子またはオペロン由来の第２のプロモーター成分を含む。二重細菌プロモーター系は相乗的に作用し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）など原核細胞における連結配列の高レベルの転写を提供する。
【００１２】
米国特許第５，８７４，２４２号明細書は、真核および原核宿主細胞において挿入されたコード配列の翻訳を提供するベクターを開示している。具体的には、かかるベクターとしては、原核細胞および真核生物における効果的な発現のために二官能性プロモーター（真核生物および原核生物において官能性）または二重プロモーター（真核生物および原核生物において個別に官能性のプロモーター）が挙げられる。
【００１３】
同じベクターで使用される多重プロモーターのテーマでの変動を開示する当技術分野での無数の他の例がある。しかし、ヒトの治療的介入に有用な状況で、さまざまな長さの多重ｄｓＲＮＡヘアピン、例えば、ｓｈＲＮＡ、バイフィンガーおよびマルチフィンガー状のｄｓＲＮＡヘアピン、長いｄｓＲＮＡヘアピン等）を含む多重の小さなＲＮＡエフェクター分子の発現に適切な新しいクラスの発現ベクターが依然として必要である。短いヘアピンｄｓＲＮＡを含むベクター指向発現の短いＲＮＡエフェクター分子が、細胞が自然に通常発生する小さなＲＮＡ分子の発現のために使用する哺乳類プロモーター型の１つの制御下に最も効果的であることは確実である。これらのプロモーターは通常、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターのファミリーを含む。さらに文献ではＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの３つの主なサブクラス、１型、２型、および３型が規定されている。各々のクラスにおけるプロモーターの典型例が、５ｓＲＮＡ（１型）、さまざまなトランスファーＲＮＡ（２型）、およびＵ６小核ＲＮＡ（３型）をコードする遺伝子に見出される。別のプロモーターファミリー（ＲＮＡポリメラーゼＩによって転写）も細胞において小さな構造的ＲＮＡの転写の専用にされ、しかし、このファミリーはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターよりも配列が多様ではないように思われる。最後に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、上記の小さな構造的および調節ＲＮＡと区別されるように、タンパク質コーティングメッセンジャーＲＮＡ分子の転写において使用される。当業界で周知のプロモーター系の大多数ではＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターが使用されるが、これらは小さなＲＮＡの産生に最適ではない。
【００１４】
１つのプロモーターを含有するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターに基づくベクターが当業界で記載されており（例えば、米国特許第５，６２４，８０３号明細書、ヌーンベルグ（Ｎｏｏｎｂｅｒｇ）ら、「ｉｎ  ｖｉｖｏリゴヌクレオチドジェネレータ、およびそれら由来の三重形成オリゴヌクレオチドの結合親和性を試験する方法（Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ，  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｆ  ｔｒｉｐｌｅｘ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｔｈｅｒｅｆｒｏｍ）」）、およびＵ６に基づくベクター系の説明が、リー（Ｌｅｅ）ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５００−０５頁（２００２年）を参照。ユー（Ｙｕ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：６０４７−５２頁（２００２年）は、Ｔ７およぶＵ６プロモーターを含む短い二本鎖ｓｉＲＮＡのための発現系を記載している。ミヤギシ（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ）とタイラ（Ｔａｉｒａ）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４９７−５００頁（２００２年）は、タンデムＵ６プロモーターを含有し、各々がｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかを転写し、これらは次いでアニーリングされ二本鎖ｓｉＲＮＡを形成する発現カセットを含む短い二本鎖ｓｉＲＮＡのための発現プラスミドを記載している。かかるＵ６に基づく２つのｓｉＲＮＡは発現カセットを含む発現プラスミドも記載されている。これらの著者らは、不安定な回文配列を含むカセットを産生するステムループまたはヘアピン型ｄｓＲＮＡと比べその安定性により二本鎖ｓｉＲＮＡ発現カセットを使用したことを述べている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
短いＲＮＡ発現ベクター系の治療有用性を可能にするために、いくつかの基準が構造および機能に関して満たされなければならない。ヒト使用のために、ベクターはベクター配列とゲノム配列との間、およびベクター自体内で発生する組換えイベントの可能性を最小限にするようにデザインされなければならない。これらのイベントは、ベクターと細胞ゲノム配列間またはベクター自体内の要素間の配列同一性（または相同性）の領域によって増強される。本発明のベクターは、多重ＲＮＡ発現カセット、例えば、多重プロモーターからのｓｈＲＮＡおよびバイフィンガーおよび／またはマルチフィンガーｄｓＲＮＡ発現カセットを含むヘアピンｄｓＲＮＡの使用を提供するために開発されている。これらの多重ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターベクターのエンジニアリングは、分子間または分子内の組換えイベントの可能性を最小限にするために組換え発現ベクター内の発現カセットの間隔および配向とともに異なるプロモーター要素の選択によって実行されている。かかる組換えプラスミドの安定性をモニタリングするアッセイが以前に記載されている（例えば、Ｆｏｃｕｓ  １６：７８、１９９４年、ジブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬテクニカル・ブレティン（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）（現インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．））。意外にも、細菌発酵および真核発現中のプラスミドの安定性は、例えば、多重（例えば、２、３、４、５）ヘアピンｄｓＲＮＡ、およびポリメラーゼＩＩＩプロモーター配列の多重コピー、例えば、同じまたは逆配向での７ＳＫおよびその変形に見られる回文またはヘアピン配列の多重コピーの存在にもかかわらず達成されている。
【００１６】
各々のプロモーターが独立したＲＮＡ発現カセット、例えば、ｓｈＲＮＡ発現カセットの発現を制御する本発明の多重プロモーター態様は、例えば、ヒト集団内および一時的に突然変異イベントによる宿主内のウイルス変動の性質により、抗ウイルス治療のデザインにおける重要な特徴である。例えば、本発明の本態様は、いくつかの異なるｄｓＲＮＡウイルス阻害剤分子を含む多剤レジメンを宿主脊椎生物の細胞または組織に送達し、ウイルス阻害のレベルが増強され、ウイルスにおいて生じ、かつウイルス複製のｄｓＲＮＡ阻害を無効にさせる多重の独立した突然変異イベントの可能性がきわめて小さくなるようにするための手段を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
発明の概要
一般に、本発明は、生物活性核酸、具体的には短いＲＮＡエフェクター分子を製造するための新規核酸発現構築物およびそれらの使用する方法に関する。
【００１８】
一態様において、本発明は、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含むショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の発現のための方法および組成物に関するが、ここで多重およびさまざまな形態のこれら分子は、同じベクター内の２、３、４、５、もしくはそれ以上のポリメラーゼＩＩＩプロモーター要素から同時に生成される。ｓｈＲＮＡ（ショートヘアピンＲＮＡ）によって、およそ４００〜５００個未満のヌクレオチド（ｎｔ）、好ましくは、１００〜２００個未満のｎｔのＲＮＡ分子が意味されるが、ここで少なくとも１５〜１００個のヌクレオチド（好ましくは１７〜５０個のｎｔ、より好ましくは、１９〜２９個のｎｔ）の少なくとも１つの伸長が、同じＲＮＡ分子に位置した相補配列と塩基対が作られ、かつ前記配列および相補配列は、塩基相補性の２つの領域によって作られる幹構造上に一本鎖ループを形成する少なくとも約４〜７個のヌクレオチド（好ましくは、約９〜約１５個のヌクレオチド）の不対領域によって分離される。ｓｈＲＮＡ分子は、約１７〜約１００ｂｐ、約１７〜約５０ｂｐ、約４０〜約１００ｂｐ、約１８〜約４０ｂｐ、もしくは約１９〜約２９ｂｐの二本鎖幹領域、阻害される標的配列との相同および相補、および、塩基相補性の２つの領域によって作られる幹構造上に一本鎖ループを形成する、少なくとも約４〜７個のヌクレオチド、好ましくは、約９〜約１５個のヌクレオチドの不対ループ領域を含む少なくとも１つのステムループ構造を含む。含まれるｓｈＲＮＡは、ＲＮＡ分子が一本鎖スペーサー領域によって分離される２以上のかかるステムループ構造物を含む、二重もしくはバイフィンガーおよびマルチフィンガーヘアピンｄｓＲＮＡである。一態様において、本発明は、複数のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、好ましくは、ヒトまたは哺乳類ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含むベクター組成物を提供するが、これらはヒト疾患を引き起こすウイルスからのＲＮＡ配列と相同性を有する多重ｓｈＲＮＡ分子の発現を制御する。複数のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは同じまたは異なってもよい。本発明は、治療的および持続的量の２、３、４、５、もしくはそれ以上の異なる抗ウイルスｄｓＲＮＡヘアピン分子を、ｄｓＲＮＡストレス反応を引き起こすことなく、２、３、４、５、もしくはそれ以上の独立したウイルス配列要素を使用してウイルス複製を阻害する遺伝学的に安定したやり方で宿主細胞に送達する手段を提供する。一態様において、各々のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター配列は、異なるｄｓＲＮＡヘアピン分子をコードする配列に作動可能に連結されている。一態様において、１つもしくはそれ以上の前記ポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、単一鎖領域によって分離される２以上のｓｈＲＮＡ（各々がステムループ構造を含む）を含むバイフィンガーまたは二重ｄｓＲＮＡヘアピン分子を形成するＲＮＡ転写産物を発現する。
【００１９】
一態様において、本発明は、少なくとも２つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含む発現構築物に関するが、ここで各々のプロモーターはＲＮＡエフェクター分子をコードする核酸配列に作動可能に連結されている。ＲＮＡエフェクター分子は、限定されることなく、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、三重形成ＲＮＡ、人工的に選択される高親和性ＲＮＡリガンド（アプタマー）、短いヘアピン二本鎖ＲＮＡ、ミクロＲＮＡ等を含む目的とするＲＮＡでありうる。多重ＲＮＡエフェクター分子は同じまたは異なってもよいが、「少なくとも２つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター」によって、出願人は、少なくとも２つのプロモーターが「異なる」プロモーターを意味し、異なるプロモーターによって、出願人は、構築物の異なる部分に位置した同じプロモーターの２つのコピーを意味することはない。
【００２０】
一態様において、本発明はさらに、本明細書の図４（ｅ）に記載されている新規ポリメラーゼＩＩＩプロモーター配列に関する。
【００２１】
配列の簡単な説明
配列番号１は、ヌクレオチド２３５−２４０の代わりに挿入されたＳａｌ  Ｉ制限部位を有するヒト７ＳＫプロモーターのヌクレオチド１−２４０を表す。
【００２２】
配列番号２は、ヌクレオチド３７６−３８１の代わりに挿入されたＳａｌ  Ｉ制限部位を有するヒトＨ１プロモーターのヌクレオチド２５０−３８１を表す。
【００２３】
配列番号３は、ヌクレオチド３３０−３３５の代わりに挿入されたＳａｌ  Ｉ制限部位を有するヒトＵ６プロモーターのヌクレオチド６５−３３５を表す。
【００２４】
配列番号４は、ヌクレオチド２４５−２５０の代わりに挿入されたＳａｌ  Ｉ制限部位を有するヒト７ＳＫプロモーターのヌクレオチド１−２５０を表す。
【００２５】
配列番号５は、ヌクレオチド２３５−２４０の代わりに挿入されたＳａｌ  Ｉ制限部位、およびＳａｌ  Ｉ制限部位の４つのアデニン残基付加３’を有する新規ヒト７ＳＫプロモーターのヌクレオチド１−２４４を表す。
【００２６】
配列番号６は、ＨｅｐＢに基づくｓｈＲＮＡ２７９１を表す。
【００２７】
配列番号７は、ＨｅｐＢに基づくｓｈＲＮＡ１９０７を表す。
【００２８】
配列番号８は、ＨｅｐＢに基づくｓｈＲＮＡ１７３７を表す。
【００２９】
配列番号９は、ＨｅｐＢに基づくｓｈＲＮＡ７９９を表す。
【００３０】
配列番号１０は、ＨｅｐＢに基づくｓｈＲＮＡ１９９１を表す。
【００３１】
配列番号１１は、ＨｅｐＢに基づくｓｈＲＮＡ１９４３を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
詳細な説明
出願人は、具体的には、すべての引例の全内容を本開示において組込む。さらに、量、濃度、もしくは他の値またはパラメータが、範囲、好ましい範囲、または上限の好ましい値、および下限の好ましい値のリストとして示されると、これは範囲が個別に開示されているか否かに関係なく、上範囲限界もしくは好ましい値と下範囲限界もしくは好ましい値のいずれかの対によって形成されるすべての範囲を具体的に開示していると理解すべきである。数値の範囲が本明細書で挙げられる場合、別段に記載されていない限り、その範囲はそのエンドポイント、およびその範囲内のすべての整数および分数を含むことが意図されている。本発明の範囲は、範囲を規定する場合に開示された特定の値に限定されることは意図されていない。
【００３３】
定義：
本開示において、以下の次の語が、本明細書でより具体的に定義されているように、当業者の通例の理解に従って使用される。
【００３４】
「発現構築物」によって、目的とするＲＮＡ、例えば、目的とする下流遺伝子、コード領域、またはポリヌクレオチド配列（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク質をコードするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片、またはＲＮＡエフェクター分子、例えば、アンチセンスＲＮＡ、三重形成ＲＮＡ、リボザイム、人工的に選択される高親和性ＲＮＡリガンド（アプタマー）、二本鎖ＲＮＡ、例えば、ステムループもしくはヘアピンｄｓＲＮＡ、またはバイフィンガーもしくはマルチフィンガーｄｓＲＮＡまたはミクロＲＮＡ、または目的とするＲＮＡを含むＲＮＡ分子）に作動可能に連結され、または結合されうる少なくとも１つのプロモーターを含有する構築物を転写するようにデザインされた二本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＲＮＡが意味される。「発現構築物」としては、１つもしくはそれ以上のプロモーターを含む二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡが挙げられるが、ここで１つもしくはそれ以上のプロモーターは実際には転写されるポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されていないが、その代わりにプロモーターによって転写される作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の効果的な挿入のためにデザインされている。発現構築物のレシピエント細胞へのトランスフェクションまたは変換は、発現構築物によってコードされたＲＮＡエフェクター分子、ポリペプチド、またはタンパク質を細胞が発現することを可能にする。発現構築物は、遺伝子工学で人工的に作り出されたプラスミド、ウイルス、組換えウイルス、または、例えば、バクテリオファージ、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、もしくはヘルペスウイルス、または以下の「発現ベクター」で記載された別の実施形態由来の人工的染色体でありうる。発現構築物は生細胞において複製され、または合成的に製造されうる。本出願のために、「発現構築物」、「発現ベクター」、「ベクター」、および「プラスミド」という語は、本発明の出願を一般的、説明的な意味で明らかにするために同じ意味で使用され、かつ本発明を特定の種類の発現構築物に限定することは意図されていない。
【００３５】
「発現ベクター」によって、下流遺伝子、コード領域、または転写されるポリヌクレオチド配列に作動可能に連結され、または結合されうる少なくとも１つのプロモーターを含有するＤＮＡ構築物が意味される（例えば、タンパク質をコードし、場合により、コード領域、アンチセンスＲＮＡコード領域の外側にある配列、またはコード領域の外側にあるＲＮＡ配列に作動可能に連結されるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片）。「発現構築物」は、１つもしくはそれ以上のプロモーターを含むＤＮＡ構築物でもありうるが、ここで１つもしくはそれ以上のプロモーターは実際には転写されるポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されていないが、その代わりにプロモーターによって転写される作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の効果的な挿入のためにデザインされている。発現構築物のレシピエント細胞へのトランスフェクションまたは変換は、発現ベクターによってコードされたＲＮＡを細胞が発現することを可能にする。発現ベクターは、遺伝子工学で人工的に作り出されたプラスミド、ウイルス、または、例えば、バクテリオファージ、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、もしくはヘルペスウイルス由来の人工的染色体でありうる。かかる発現ベクターとしては、細菌、ウイルスまたはファージからの配列が挙げられる。かかる発現ベクターとしては、染色体、エピソーム、およびウイルス由来ベクター、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体要素、およびウイルス由来ベクター、および、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子要素、コスミドおよびファージミド由来のものなどその組合せ由来のベクターが挙げられる。したがって、１つの例となるベクターが二本鎖ＤＮＡファージベクターである。別の例となるベクターが二本鎖ＤＮＡウイルスベクターである。一態様において、本発明は、本明細書に記載された発現ベクター、プラスミド、および構築物に関するが、これらはさまざまな用途、例えば、医療および／または予防的医薬目的のためのヒトおよび／または動物使用のための科学的調査の試薬として有用であるために単離され、精製される。
【００３６】
一部の態様において、２以上の発現構築物が、単一組成物として、例えば、医薬組成物、または調査試薬として使用される。一部の態様において、２以上の発現構築物は、真核細胞に送達される各々の構築物の産物間に何らかの機能的または生理的相互作用がある限り、例えば、同時に、または互いに数分間、数時間、もしくは数日間内に、例えば、互いに１日、２日、３日、もしくはさらに１週間内に投与され、一致して使用される。発現構築物は、少なくとも２つ、３つ、４つ、もしくはそれ以上のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、一部の態様においては、少なくとも２つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを集合的に含むが、ここで各々のプロモーターはＲＮＡエフェクター分子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され、または連結されうる。一態様において、発現系は、単一細胞に少なくとも２つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含む１つもしくはそれ以上の発現構築物を提供するのに役立つが、ここで各々のプロモーターはＲＮＡエフェクター分子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される。一態様において、発現系は、単一の発現構築物または２以上の発現構築物、例えば、２、３、４、５、６、７、８つ、もしくはそれ以上を含み、一部の態様においては、少なくとも２つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含む１つもしくは複数のプラスミドであり、ここで各々のプロモーターはＲＮＡエフェクター分子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され、または連結されうる。
【００３７】
「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドとして周知のサブユニットの直鎖状配列で製造されるポリマー化合物を意味し、各々ヌクレオチドは３つの成分を有する。すなわち、糖（例えば、ペントースまたはヘキソース）に結合され、次いでプリン（例えば、アデニンまたはグアニン）由来、またはピリジン（例えば、チミン、シトシン、またはウラシル）由来の窒素含有塩基に連結される１つもしくはそれ以上のリン酸基である。ヌクレオチドは、隣接した糖ユニット間のリン酸塩結合によりポリヌクレオチドへ結合される。ポリヌクレオチド分子は、最も天然由来のＲＮＡ（リボ核酸）分子など一本鎖、または最も天然由来のＤＮＡ（デオキシリボ核酸）分子など二本鎖でありうる。二本鎖核酸分子において、１つの鎖の塩基は相補的に他の鎖で塩基と対が作られる。プリン塩基アデニン（Ａ）はつねにＤＮＡにおけるピリミジン塩基チミン（Ｔ）［またはＲＮＡにおけるウラシル（Ｕ）］と対をなし、プリン塩基シトシン（Ｃ）はつねにピリジン塩基グアニン（Ｇ）と対をなす。各々の塩基対としては１つのプリンおよび１つのプリミジンが挙げられる。他方では１つの鎖上のアデニンがつねにチミン（またはウラシル）と対をなし、シトシンがつねにグアニンと対をなしているため、２つの鎖は互いにに対して相補であると言われ、一方の鎖の配列はその相補体鎖の配列から推定されうる。特定の天然由来の核酸分子としては、ゲノムデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびゲノムリボ核酸（ＲＮＡ）、および後者のいくつかの異なる形態、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、およびリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）のほか、リボザイムなど触媒ＲＮＡ構造物、およびミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）など調節ＲＮＡが挙げられる。また、異なるＲＮＡ分子と相補（ｃＤＮＡ）である異なるＤＮＡ分子も含まれる。合成ＤＮＡ、もしくは天然由来のＤＮＡとのそのハイブリッドのほか、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、およびＰＮＡ分子（ガンバリ（Ｇａｍｂａｒｉ）、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．７：１８３９−６２頁（２００１年）も「核酸分子」の定義の範囲内に含まれる。
【００３８】
所望の核酸分子がＲＮＡである場合、本明細書で提供される配列におけるＴ（チミン）がＵ（ウラシル）で置換されることが考えられる。例えば、ｓｈＲＮＡ２７９１、ｓｈＲＮＡ１９０７、およびｓｈＲＮＡ１７３７が本明細書でＤＮＡ配列として開示されている。前記配列のいずれかからの配列を含むＲＮＡエフェクター分子がＴに置換されるＵを有することが当業者には明らかであろう。
【００３９】
核酸は通常、２以上の共有結合された天然由来もしくは修飾デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを有する。修飾核酸としては、例えば、非天然塩基を有するペプチド核酸およびヌクレオチドが挙げられる。
【００４０】
「作動可能に連結された」という語は、核酸発現制御配列（プロモーター、シグナル配列、エンハンサー、または転写因子結合部位のアレイなど）と第２の核酸配列との間の機能的結合を指し、ここで発現制御配列は、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が発現制御配列に結合されると第２の配列に対応する核酸の転写および／または翻訳に影響を及ぼす。２以上のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含む本発明の発現構築物は、１つ、２つ、もしくは前記プロモーターの各々に作動可能に連結されたｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡヘアピン、またはミクロＲＮＡをコードする核酸配列を含みうるし、または一態様において、本発明は、例えば、選択制限部位を含む、例えば、適切に選択されたクローニング部位を使用して転写される選択配列の各々の発現カセットへの簡便な挿入のためにデザインされた２、３、４、５つ、もしくは多重ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターカセットを含む発現構築物に関する。
【００４１】
本発明の発現構築物またはベクターにおいて、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、例えば、本発明の発現構築物において、７ＳＫプロモーターが７ＳＫ遺伝子に作動可能に連結されておらず、Ｕ６プロモーターがＵ６遺伝子に作動可能に連結されておらず、かつＨ１プロモーターがＨ１遺伝子等に作動可能に連結されていない、それらがその正常な細胞環境下に作動可能に連結されている遺伝子またはＲＮＡ配列に作動可能に連結されていないという意味で「単離」される。
【００４２】
「プロモーター」とは、作動可能に連結された核酸分子の転写を方向づけるのに十分な核酸配列を意味する。この定義には、プロモーター依存遺伝子発現を細胞型特異的、または一時的に特異的な方法で制御可能にするのに十分であり、または外部シグナルもしくは薬剤によって誘導性である転写制御要素（例えば、エンハンサー）も含まれ、かかる要素は、当業者には公知であるが、遺伝子の５’もしくは３’領域またはイントロン内に存在しうる。例えば、その各々が参照により本明細書で援用される、ポリメラーゼＩＩエンハンサー要素を使用する修飾ポリメラーゼＩＩＩプロモーターを対象にした米国特許出願公開第２００５／０１３０１８４Ａ１号明細書、２００５年６月１６日、スー（Ｘｕ）ら、および調節可能なポリメラーゼＩＩＩおよびポリメラーゼＩＩプロモーターを対象にした米国特許出願公開第２００５／０１３０９１９Ａ１号明細書、２００５年６月１６日、スー（Ｘｕ）らを参照。好ましくは、プロモーターが、核酸配列の発現を可能にする方法で、核酸配列、例えば、ｃＤＮＡまたは遺伝子配列、またはエフェクターＲＮＡコード配列に作動可能に連結されており、またはプロモーターが、転写される選択核酸配列を簡便に挿入しる発現カセットにおいて提供される。
【００４３】
「ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター」または「ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター」または「ポリメラーゼＩＩＩプロモーター」または「ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター」は、細胞のその天然の状況において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩと結合または相互作用し、その作動可能に連結された遺伝子を転写する無脊椎動物、脊椎動物、または哺乳類プロモーター、例えば、ヒト、マウス、ブタ、ウシ、霊長類、サル等、または、選択された宿主細胞においてＲＮＡポリメラーゼＩＩＩと相互作用し、作動可能に連結された核酸配列を転写する天然または人工的に作り出されたその変異体を意味する。Ｕ６プロモーター（例えば、ヒトＵ６、マウスＵ６）、Ｈ１プロモーター、または７ＳＫプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩと相互作用し、その同種ＲＮＡ産物、すなわち、それぞれ、Ｕ６  ＲＮＡ、Ｈ１  ＲＮＡ、または７ＳＫ  ＲＮＡを転写する自然に存在する無脊椎動物、脊椎動物、もしくは哺乳類プロモーターまた多型変異体もしくは突然変異体が意味される。一部の用途において好ましいのは、５’フランキング領域に存在し、ＴＡＴＡボックスを含み、かつ内部プロモーター配列を欠くＵ６、Ｈ１、および７ＳＫを含むＩＩＩ型ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターである。内部プロモーターは、ｐｏｌ  ＩＩＩ  ５Ｓ  ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはＶＡ  ＲＮＡ遺伝子で生じる。７ＳＬＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩ遺伝子は弱い内部プロモーターおよび転写に必要な遺伝子の５’フランキング領域における配列を含有する。ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターとしては、脊椎動物または哺乳類、プロモーターを含む高級真核生物が挙げられるが、これらは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩの結合の前記プロモーターとの結合を維持し、または強化するが、無効にすることはなく、かつ、前記プロモーター配列に作動可能に連結されている、天然または人工的に作り出される、天然または実験室で製造される配列の変形または変化を含有する。例えば、魚、鳥、または無脊椎動物ウイルスに対するヘアピンｄｓＲＮＡなどＲＮＡエフェクター分子を発現する特定の用途のための発現構築物において使用するためのｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターが、例えば、西ナイルウイルスまたはトリインフルエンザ（Ｈ５Ｎ１）などトリウイルスに対する複数のヘアピンｄｓＲＮＡを転写するようにデザインされた発現構築物におけるトリｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターを含み、かつその代わりにヒト宿主細胞におけるトリ宿主細胞における西ナイルウイルスまたはトリインフルエンザ（Ｈ５Ｎ１）などトリウイルスに対する複数のヘアピンｄｓＲＮＡを転写するようにデザインされた発現構築物においてヒトまたは他の哺乳類ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターを使用する、宿主細胞ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによる最適な結合および転写のために有利に選択されうる。
【００４４】
「多重ポリメラーゼＩＩＩプロモーターベクター」または「多重ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター発現構築物」もしくは同様の発現とは、少なくとも２つのポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含有するベクター、プラスミド、または発現構築物を意味する。一態様において、多重ポリメラーゼＩＩＩプロモーターベクターは、少なくとも２つの異なるポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含有する。「異なる」ポリメラーゼＩＩＩプロモーターとは、その多型および突然変異体など変異体を含む２つのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを意味するが、これは特定の種において、例えば、３つの「異なる」ポリメラーゼＩＩＩプロモーターとみなされる、ヒト７ＳＫプロモーター、ヒトＵ６プロモーター、およびヒトＨ１プロモーターなど異なる同種転写産物の転写を促進する。また出願人が意図する「異なる」ポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、例えば、ヒトＵ６対マウスＵ６プロモーターが異なるプロモーターであり、ヒトＨ１対マウスプロモーターが異なり、またはヒト７ＳＫプロモーターおよびマウス７ＳＫプロモーターが異なるプロモーターとみされるなど、異なる種からのポリメラーゼＩＩＩプロモーターに対応する。したがって、図４（ａ）、４（ｄ）、および４（ｅ）に記載されているさまざまな７ＳＫプロモーターは、「同じ」プロモーター、７ＳＫプロモーターの変異体とみなされる。一部の態様において、「同じ」ポリメラーゼＩＩＩプロモーターの多重コピーが、「異なる」ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターも含まれる限り本発明の発現構築物に含まれうるが、例えば、３つの７ＳＫプロモーター（例えば、７ＳＫ  ２５６プロモーター、２つの７ＳＫ  ４Ａプロモーター）および１つのＨ１プロモーター、または４つの７ＳＫプロモーター（７ＳＫ  ２５６プロモーター、３つの７ＳＫ  ４Ａプロモーター）および１つのＵ６プロモーターである。一部の態様において、本発明の発現構築物は、「異なる」ポリメラーゼＩＩＩプロモーターなしに同じポリメラーゼＩＩＩプロモーターの多重コピーを含有しうるが、例えば、３、４、５、６つもしくはそれ以上の７ＳＫプロモーターであり、各々がｓｈＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結されている。場合により、一部の実施形態において、他のプロモーターが２以上のポリメラーゼＩＩＩプロモーターに加えて含まれうるが、例えば、１つもしくはそれ以上のポリメラーゼＩプロモーターおよび／または１つもしくはそれ以上のポリメラーゼＩＩプロモーター、１つもしくはそれ以上のミトコンドリアプロモーター等である。一態様において、多重ポリメラーゼＩＩＩプロモーター（２、３、４、５つ、もしくはそれ以上）を含む発現構築物が人工的に作り出され、多重ｄｓＲＮＡヘアピンまたはｓｈＲＮＡを発現するが、この場合、２、３、４、５つ、もしくはそれ以上の同じｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターのコピーが、「異なる」ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターも含まれるかどうかに関係なく使用されうる。
【００４５】
真核細胞におけるＲＮＡ発現のための組換えＤＮＡおよび合成ベクターの一般的な実施および使用において、大多数の工学的努力はタンパク質コードＲＮＡ分子の発現に対して向けられている。アンチセンスＲＮＡの出現、およびより最近では、ＲＮＡ干渉（「ｄｓＲＮＡ」で略される二本鎖ＲＮＡによる）遺伝子サイレンシングの現象とともに、基本的に実際に触媒であるＲＮＡ分子をコードする短い非タンパク質を生成するために適切な発現系を開発する必要が生じている。これには天然の小さなＲＮＡ分子（リボソームＲＮＡ、スプライセオソームＲＮＡ、ＲＮＡｓｅ  Ｐ構造的ＲＮＡ成分その他など）を生成するように進化して天然プロモーターのいくつかのクラスの適合が必要であり、これらのプロモーターは一般にＲＮＡポリメラーゼＩおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（「Ｐｏｌ  ＩＩＩ」）プロモーターとして分類されている。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、長さが最大約４００〜５００個のヌクレオチドまで、かかる短いＲＮＡ転写産物の発現に見事に適用される。ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩファミリー内には、さらに、構造的に明確であるが、それらが利用される細胞内コンパートメントのために特殊化も反映する３つのサブタイプ（１、２、および３）への天然プロモーターの細分がある。例えば、Ｕ６遺伝子は、ＲＮＡスプライシング中の核において機能する小さな核ＲＮＡをコードするが、さまざまなｔＲＮＡ遺伝子はタンパク質合成中に細胞質において機能するｔＲＮＡ分子をコードする。したがって、本発明の一態様は、１つもしくはそれ以上の３型プロモーター（例えば、Ｕ６、Ｈ１、７ＳＫ、および、本明細書に示されており、短いＲＮＡエフェクター分子、例えば、短いｄｓＲＮＡヘアピン分子の優れた発現を提供する７ＳＫ  ４Ａ配列変異体などその配列変異体）の代表、および１型または２型のサブクラスのメンバー（例えば、さまざまなｔＲＮＡ遺伝子プロモーター）を含む多重ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターを含有するベクターの使用および構成である。かかるプロモーターの組合せは、細胞内のｓｈＲＮＡおよび／またはミクロＲＮＡ産物の相対分布（核対細胞質）を調節するための手段を提供する。この局在の実験例はいくつかの刊行物、例えば、ライブズ（Ｌｉｖｅｓ）ら、Ｇｅｎｅ  １７１：２０３−０８頁（１９９６年）、カワサキ（Ｋａｗａｓａｋｉ）とタイラ（Ｔａｉｒａ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：７００−０７頁（２００３年）、およびボーデン（Ｂｏｄｅｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：５０３３−３８頁（２００３年）に記載されている。
【００４６】
本発明の別の態様は、ベクターが多重（少なくとも２つであるが、好ましくは、３、４、５つ、もしくはそれ以上）「ＲＮＡエフェクター分子」を発現するようにデザインされている場合の多重ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの要件に関する。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターによる発現に適切なＲＮＡエフェクター分子は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、ヘアピンｄｓＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、および二本鎖ｄｓＲＮＡ分子を含むがこれらに限定されない、長さが約４００〜５００個までのヌクレオチドの短いＲＮＡ転写産物である。好ましいＲＮＡエフェクター分子は短いヘアピンｄｓＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、三重形成ＲＮＡ、リボザイム、人工的に選択される高親和性ＲＮＡリガンド（アプタマー）、二本鎖ＲＮＡ、例えば、ステムループもしくはヘアピンｄｓＲＮＡ、またはバイフィンガーもしくはマルチフィンガーｄｓＲＮＡまたはミクロＲＮＡ、または目的とする短いＲＮＡ分子を含むＲＮＡである。
【００４７】
「ｓｈＲＮＡ」もしくは「ショートヘアピンＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡヘアピン」が、長さがおよそ４００〜５００個未満のヌクレオチド（ｎｔ）、好ましくは、長さが１００〜２００個未満のｎｔを意味するが、ここで少なくとも約１５〜１００個のヌクレオチド（好ましくは、１７〜５０個のｎｔ、より好ましくは、１９〜２９個のｎｔ）の少なくとも１つの伸長が、同じＲＮＡ分子に位置した相補配列と塩基対が作られ、かつ前記配列および相補配列が、塩基相補性の２つの領域によって生成される幹構造上に一本鎖ループを形成する、少なくとも約４〜７個のヌクレオチド（好ましくは、約９〜約１５個のヌクレオチド）の不対領域によって分離されている。ｓｈＲＮＡ分子は、約１７〜約１００ｂｐ、約１７〜約５０ｂｐ、約４０〜約１００ｂｐ、約１８〜約４０ｂｐ、もしくは約１９〜約２９ｂｐの二本鎖幹、阻害される標的配列との相同および相補、および、塩基相補性の２つの領域によって作られる幹構造上に一本鎖ループを形成する、少なくとも約４〜７個のヌクレオチド、好ましくは、約９〜約１５個のヌクレオチドの不対ループ領域を含む少なくとも１つのステムループ構造を含む。含まれるｓｈＲＮＡは、ＲＮＡ分子が一本鎖スペーサー領域によって分離される２以上のかかるステムループ構造物を含む、二重もしくはバイフィンガーおよびマルチフィンガーヘアピンｄｓＲＮＡである。出願人は、本発明の発現構築物が、同じ、および／または多重の異なるショートヘアピンＲＮＡ分子を含む１つもしくはそれ以上の、多重のコピーを発現しうることを意図している。互いと「同じ」であるとみなされるショートヘアピンＲＮＡ分子は、同じ二本鎖配列のみを含むものであり、かつ互いと「異なる」とみなされるショートヘアピンＲＮＡ分子は、各々の異なる二本鎖配列によって標的化される配列が、例えば、同じ遺伝子のプロモーター領域および転写される領域（ｍＲＮＡ）の配列、または２つの異なる遺伝子の配列など、同じまたは異なる遺伝子の範囲内であるかどうかに関係なく異なる二本鎖配列を含む。
【００４８】
本発明の一実施形態においては、組換えベクターが人工的に作り出され、各々がポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含む異なる発現カセットから発現され、そのすべてを含む、１つもしくはそれ以上が、その他と異なる、多重の、例えば、３、４、５つ、もしくはそれ以上の短いヘアピンｄｓＲＮＡをコードする。本発明の一態様においては、３、４、５つ、もしくはそれ以上異なるｓｈＲＮＡ分子を転写する組換え発現ベクター（各々が保存ＨＢＶ配列と相同および相補の二本鎖「幹」領域を含む）が使用されてＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の複製を阻害し、かつ各々のｓｈＲＮＡ分子はｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター、例えば、７ＳＫ、Ｈ１、およびＵ６の制御下に発現されるが、これらは異なるうちの同一のものでありうる。一態様においては、本発明の組換え発現ベクターが、１つもしくはそれ以上のポリメラーゼＩＩＩプロモーター促進転写ユニットから１つもしくはそれ以上のバイフィンガーまたはマルチフィンガーｄｓＲＮＡヘアピン分子、および１つもしくはそれ以上のポリメラーゼＩＩＩプロモーター促進転写ユニットから１つもしくはそれ以上の単一ヘアピンｄｓＲＮＡ分子を発現しうる。ポリメラーゼＩＩＩプロモーターからヘアピンｄｓＲＮＡを転写する本発明のいずれかの発現構築物において、ヘアピンｄｓＲＮＡは、国際公開第２００４／０３５７６５号パンフレット、２００年４月２９日公開に記載されている単一ヘアピンｄｓＲＮＡ、もしくはバイフィンガー、またはマルチフィンガーｄｓＲＮＡヘアピンであり、または国際公開第２００４／０１１６２４号パンフレット、２００４年２月５日公開に記載されている部分的または強制ヘアピン構造でありうることが理解されうるが、その各々は参照により本明細書で援用される。
【００４９】
「阻害される標的配列」または「標的配列」は、アンチセンス阻害、リボザイム開裂、アプタマー阻害を含む機序により、かつ／またはＲＮＡｉもしくは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）介在遺伝子サイレンシングにより、適切なＲＮＡエフェクター分子の前記宿主細胞における発現によって、配列特異的な方法で阻害され、ダウンレギュレートされ、調節され、抑制され、またはサイレンシングされる宿主細胞におけるヌクレオチド配列を意味する。達成される阻害、調節、またはサイレンシングの程度は、宿主細胞に供給される発現構築物の性質および量、生成されるＲＮＡエフェクター分子の発現の同一性、性質、およびレベル、投与後の時間等によって変動するが、例えば、標的遺伝子発現（ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベル）および／または関連標的または細胞機能における検出可能な減少、または例えば、ウイルス複製等のレベルの減少として明らかとなり、好ましくは、本発明に従って処置されていない細胞と比べ１０％、３３％、５０％、７５％、９０％、９５％、もしくは９９％以上の阻害の程度が達成される。阻害される標的配列は、例えば、特定の癌、ハンチントン病もしくは年齢関連黄斑変性、または宿主細胞に存在する病原体関連ヌクレオチド配列などの疾患または障害と関連したヌクレオチド配列など、阻害され、またはサイレンシングされる内因性配列でありうる。一態様において、標的配列は、ＲＮＡｉまたは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）介在遺伝子サイレンシングにより阻害されるが、ここで細胞または生物における標的遺伝子の領域と相補のｄｓＲＮＡが、標的遺伝子座の転写は影響されないが、ＲＮＡ半減期は減少する転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）、および／または遺伝子の転写が阻害される転写遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）を含む、標的遺伝子の発現を阻害する。（例えば、国際公開第９９／３２６１９号パンフレット、１９９９年７月１日公開、ファイアー（Ｆｉｒｅ）ら、米国特許第６，５０６，５５９号明細書：「二本鎖ＲＮＡによる遺伝子阻害（Ｇｎｅｔｉｃ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ）」、および国際公開第００／６３３６４号パンフレット：「ポリヌクレオチド配列の機能を阻害するための方法および組成物（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）、パチュック（Ｐａｃｈｕｋ）とサチシュチャンドラン（Ｓａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎ）、その中で特定されたさまざまなＲＮＡｉ標的を含む、を参照）。ＴＧＳ誘導のためには、選択されるｄｓＲＮＡ標的配列は、好ましくは、プロモーター配列、プロモーター配列のサブセット、プロモーター配列／転写開始部位配列、または別の調節領域配列、場合により、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的におけるかかるプロモーター／調節領域に作動可能に連結された配列との組合せを含有する。ＰＴＧＳの誘導のためには、選択されたｄｓＲＮＡ標的配列はコードおよび／または３’および／または５’ＵＴＲ配列のみを含有し、または好ましくは、コードおよび／またはＵＴＲ配列および／またはプロモーター配列の組合せを含有しうる。一���様において、標的配列は、病原体、例えば、宿主細胞、例えば、無脊椎動物または脊椎動物宿主細胞、好ましくは、ヒト細胞を含む哺乳類細胞に影響を及ぼすウイルス病原体の配列となる。一態様において、標的配列は、肝炎ウイルス、例えば、ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＨＩＶ、ＳＩＶ等などのウイルスなど選択宿主生物における慢性疾患と関連したウイルス病原体の核酸配列となる。
【００５０】
ＲＮＡ干渉は配列特異的な方法で作用するため、薬剤として使用されるＲＮＡｉ分子はその標的に対して特異的でなければならない。ウイルスゲノムが環境に変化に対する抵抗に適合するように変わりやすいことが当業界で周知である。したがって、ＲＮＡｉを使用するウイルスゲノム複製を分解するために、ウイルスゲノムにおける保存および固有領域を特定する必要がある。本発明に従ってサイレンシングに標的化される保存ウイルス配列が実質的に天然由来の、通常機能する宿主ポリヌクレオチド配列に非相同であることを確実にし、ｄｓＲＮＡ分子が、本発明の方法において使用される場合、実質的な天然由来の宿主ポリヌクレオチド配列の機能に有害に影響を及ぼすことがないようにすることが同じく重要である。かかる天然由来の機能的ポリヌクレオチド配列としては、所望のタンパク質をコードする配列、および非コードであるが、健康な宿主生物において重要な調節配列である配列が挙げられる。
【００５１】
ｓｈＲＮＡデザインのためのＨＢＶおよび／またはＨＣＶ配列の選択に関する方法および組成物は、国際公開第２００５／０１４８０６号パンフレット、２００５年２月１７日公開、および米国仮特許出願第６０／６３８，２９４号明細書、２００４年１２月２２日出願（遺伝子サイレンシングに有用な保存ＨＢＶおよびＨＣＶ配列）のほか、米国仮特許出願第６０／６１３，０６５号明細書、２００４年９月２４日出願（ＲＮＡｉによる一本鎖の逆鎖複製中間物の標的）の参照により本明細書で援用される。多重ｓｈＲＮＡ法の主な治療上の利点は、重要な病原体、特に、ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＨＩＶウイルスなどのウイルスが、それらの宿主または患者において、かつ集団の全体を通じて感染の経過中に突然変異を受けることである。多重の短いヘアピンｄｓＲＮＡに基づく治療において多重配列標的を含むことによって、ウイルスが検出および多重ｓｈＲＮＡによる不活性化から「逃げる」ように突然変異の可能性は事実上ゼロになる。
【００５２】
同じ発現ベクターまたは発現系内への多重プロモーターの包含に関して、工学的代替物をベクターデザインへ組込み、多重プロモーターを使用する際に生じるうる２種類の問題を回避しなければならない。「転写干渉」によって例示される１つの問題は、ＤＮＡプラスミドテンプレート上の多重部位を同時に転写する酵素学およびトポロジーに関する。第２の種類の問題は、同じプラスミド内に相同配列要素の多重コピーを有することによって増強されうる組換えイベントに関連する。本発明の組成物におけるプロモーター要素の選択および配置は、これら有害な可能性の各々を最小限にし、または除去するために実施されている。さらに、これらの現象に関する詳細は以下に示されている。
【００５３】
ＤＮＡ分子からの転写は、成長鎖の前方およびちょうど転写された鎖の後方のテンプレートＤＮＡの超らせん形成に影響を及ぼす（ダナウェイ（Ｄｕｎａｗａｙ）とオストラダー（Ｏｓｔｒａｎｄｅｒ）、Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：７４６−４８頁（１９９３年）、クレブス（Ｋｒｅｂｓ）とダナウェイ（Ｄｕｎａｗａｙ）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．１６：５８２１−５８２９頁（１９９６年））。超らせん形成におけるこれらの変化は、プラスミド全体に影響を及ぼす。超らせん形成における変化は多くのプロモーターの活性に有害な影響を及ぼし、実際に活性を無効にしうる。これは、発現構築物における１つのプロモーターからの活性が別のプロモーターの活性に対してマイナスに影響し、逆もまた同様でありうることを意味する。単一発現構築物における多重プロモーターは、両方が同じコンパートメントで活性であり、かつ同じ方向で実行中である場合、結果としてプロモーターオクルージョンまたはプロモーター干渉が生じうる。プロモーター干渉は、プロモーターが互いに近く（数百個のヌクレオチド内）に位置している場合に起こる。プロモーター上の転写因子および他の因子の核生成は、第２のプロモーター上の因子の核生成を立体的に妨げる。プロモーターオクルージョンは特にターミネーターがシストロンの末端および次のプロモーターの前に位置してない系に対して問題である。ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩは効果的な終結系を有さないため、これは同じ発現構築物での多重ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩプロモーターの使用に対する潜在的な問題である。プロモーターオクルージョンは、シストロンからの転写がシストロンの末端で終結することがない場合に結果として生じ、第２のプロモーターを通過し、そのプロモーターからの転写開始を阻止する。
【００５４】
転写干渉は、同じ細胞内コンパートメントで両方とも活性である２つの活性プロモーターが収束方向で互いに直面する場合に起こる。また、下流プロモーターが上流プロモーターの存在によって抑制される転写干渉も起こりうる（その両方は同じ分子で同時に活性である）。上流プロモーターから開始される伸長転写産物は、伸長転写産物が下流プロモーターを横断すると下流プロモーターからの開始を抑制する。（プラウドフット（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ）、Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５６２−６５（１９８６年））。１つのプロモーターからの転写は、その他のプロモーターからの転写に干渉し、転写産物の早期終結を引き起こしうる。
【００５５】
組換えは、同じプロモーターまたは実質的な相同性を有するプロモーターの多重コピーがプラスミドへ組込まれた場合にはそうであるように、プラスミドベクター内の配列の中で相同性の実質的な伸長の配列特異的認識によって起こりうる。かかる組換えイベントは、プラスミドに基づく治療の有効性に有害な影響を及ぼし（例えば、プラスミドの制御要素を非機能的にすることによって）、かつヒト治療における前記ベクターの安全性に対する否定的な結果も有し得る。プラスミドベクターの細菌発酵中の組換えは別の問題を示す。組換えは、組換えイベントを起こしやすくする逆方向反復または回文配列の存在のためｄｓＲＮＡヘアピンをコードするプラスミドにおける特定の問題として認識されている。ミヤギシ（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ）とタイラ（Ｔａｉｒａ）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：４９８−５００（２０００年）。この潜在的な問題は、２、３、４、５つ、もしくはそれ以上のヘアピン、同じプロモーターの２、３、４つ、もしくはそれ以上のコピーをコードするプラスミドまたは他のベクター、または互いに実質的な相同性を有するプロモーターにおいて増大することだけ予想されうる。したがって、一態様において、本発明は、配列において非同一である多重プロモーター要素の使用を提供する。別の態様において、本発明は多重プロモーター要素を含む発現構築物を提供するが、ここで２つ、３つ、もしくはそれ以上が同じプロモーター要素の配列または変異体配列において同一でありうるが、例えば、２つ、３つ、もしくはそれ以上の７ＳＫ、および／または修飾７ＳＫプロモーター配列が、必要に応じて他の異なるＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターに加えて、単一の発現構築物で利用され、ここで各々のプロモーター配列が、同じまたは異なりうる、選択ｄｓＲＮＡヘアピン配列を転写する。意外にも、配列および配向において同じまたは異なりうる、２、３、４つ、もしくはそれ以上のポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含み、２、３、４、５つ、もしくはそれ以上のｄｓＲＮＡヘアピン分子を転写するプラスミド発現ベクターは、本明細書で開示されているように製造され、使用されうる。
【００５６】
本発明のベクターは、当業者に周知の標準の組換えＤＮＡ技術を使用して構成されうる。これらの構築物を生成するために必要な３つの主な種類の成分がある。すなわち、１）プラスミド「骨格」、２）プロモーター要素、および３）目的とするＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、例えば、ショートヘアピンＲＮＡ配列要素。ベクター骨格は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、バージニア州（ＶＡ）、米国（ＵＳＡ））などのリソースで、プラスミドＤＮＡを細菌培養から単離することによって、寄託のさまざまな細菌株から新に得られる。あるいは、多目的の組換えＤＮＡ工学のために具体的にデザインされたプラスミド骨格は、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州（ＣＡ））、ニューイングランドバイオラブ社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）（Ｂｅｖｅｒｌｙ、マサチューセッツ州（ＭＡ）、またはインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州（ＣＡ））などさまざまな供給元から商業的に購入されうる。プラスミドは、１）複製の細菌由来、２）細菌抗生物質耐性マーカー、および３）他のＤＮＡ要素の挿入のためのクローニング部位の必須の要素を含有する。
【００５７】
本発明で使用されるＲＮＡポリメラーゼプロモーターは当業界で周知であり、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）などの公共の配列データベースを検索することによって得られる。見出されるＰｏｌ  ＩＩＩ、３型プロモーターの例としては、Ｈ１、７ＳＫ、Ｕ６、およびＭＲＰとして周知のものが挙げられる。変異体形態、すなわち、それらが一部分であるこれらのプロモーターおよび遺伝子のコピーは、このデータベースに存在し、同等に、もしくはより有効に本発明において機能しうる。例えば、本発明の組成物および方法において有用な７ＳＫプロモーターの代替の合成変異体形態が本出願において開示されており［図４（ａ）、（ｄ）、および（ｅ）を参照］、これらはジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）データベースに示されているように、標準の７ＳＫプロモーターに関して切断または延長された長さおよび／またはヌクレオチド置換を含む。ヒトまたは他の哺乳類のＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩポリメラーゼ、３型プロモーター、例えば、ヒトまたはマウス７ＳＫ、Ｈ１、およびＵ６が、哺乳類宿主細胞における内因性ＲＮＡ  ＩＩＩポリメラーゼによる発現を含む用途には好ましい。非哺乳類宿主細胞、例えば、鳥、魚、または無脊椎動物宿主細胞における内因性ＲＮＡＩＩＩポリメラーゼによる発現を含む用途には、同種のＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター、例えば、鳥、魚等のプロモーターを選択することが有利でありうる。
【００５８】
ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターが小さな人工的に作り出されたＲＮＡ転写産物の発現に特に望ましい１つの理由は、ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩ終結が、他のタンパク質因子なしに、効果的かつ正確にＤＮＡコード鎖におけるチミン残基の短い走行で起ることであるが、Ｔ４およびＴ５が酵母および哺乳動物における最短のＰｏｌ  ＩＩＩ終結シグナルであり、Ｔ５よりも長いオリゴ（ｄＴ）ターミネーターが哺乳動物においてきわめて稀である。したがって、本発明の多重ポリメラーゼＩＩＩプロモーター発現構築物は、適切なオリゴ（ｄＴ）終結シグナル、すなわち、４、５、６つ、もしくはそれ以上のＴの配列、ＤＮＡコード鎖における各々のＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターに作動可能に連結された３’を含む。例えば、人工的に作り出されたＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、およびＲＮＡエフェクター分子、例えば、転写されるｄｓＲＮＡヘアピン、またはＲＮＡステムループ構造が、次いで、Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターと終結シグナルとの間に挿入されうる。
【００５９】
これらのプロモーター要素に対応するＤＮＡを単離するためには、ＡＴＣＣ、または商業的供給源などＤＮＡ貯蔵所からプラスミドの形で前記配列のクローン化コピーを得るのが通例である。あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用し、配列の小さな部分のみを使用してプロモーターの多重コピーを生成し、「ＰＣＲプライマー」をデザインし、酵素的に増幅し、各々のプロモーターの実質的に純粋な溶体を単離することも通例であり、好都合である。特異的制限酵素および前記プライマーの適切なデザインを用いることにより、これらのプロモーター要素を挿入し（組換え）、プラスミドベクターの一部となることが通例である。当業者は、プロモーターのＤＮＡ骨格プラスミドへの挿入のための方法を実行中に、目的とする要素をさらに正確に挿入するために通常、準備が行われる。本発明の場合には、その要素は、ＰＣＲにより、もしくは合成ＤＮＡ重合法、またはその２つの組合せによって調製されるＤＮＡの短い伸長を構成し（好ましくは、長さが５０、６０、７０、８０、もしくは１００未満の塩基対）、目的とするＲＮＡエフェクター分子をコードし、例えば、一部の態様においては、阻害される標的核酸と実質的に同一および相補の約１９〜約２９ｂｐのｄｓＲＮＡ配列（「幹」）を形成するためにハイブリダイズが可能である約１９〜２９個のヌクレオチド（約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、もしくは２９個のヌクレオチド）の相補伸長を含むｓｈＲＮＡ配列、例えば、細胞、ウイルス、または病原体によって生成されるＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。プロモーター要素のクローニングは、標準のプロモーター配列と発現されるＲＮＡ分子をコードする配列との間に挿入される制限部位または他の短い配列の導入をも含みうる。かかる要素は、プロモーターおよび／または発現ＲＮＡの機能を修飾することができ、機能が維持され、または強化される場合は新規プロモーター配列を構成しうる。例えば、図４（ｅ）における７ＳＫプロモーター配列は、図４（ａ）プロモーターに対する制限部位の４つのヌクレオチド伸長３’の挿入により図４（ａ）７ＳＫ要素（７ＳＫ  ２５６）に対して機能の強化を明らかに示す。この特定の７ＳＫ変異体プロモーター配列では４つの挿入Ａ残基が使用されれるが、４つのＧ残基が代替として使用されうる。
【００６０】
組換えＤＮＡプラスミドのアセンブリと同時に、細菌が「工場」として使用され、大量の最終ベクターを生成する。バクテリア大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）はプラスミド発酵のためにしばしば使用され、このために、例えば、その開示が参照により本明細書で援用される、ブラットナー（Ｂｌａｔｔｅｎｅｒ）ら、米国特許出願公開第２００５／００３２２２５号明細書に記載されているように、削減ゲノムを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を使用することが有利でありうる。このようにして製造され、当業界で周知の方法に従って単離および精製されるベクターは、集合的に「トランスフェクション」として周知のさまざまな方法で生細胞へ導入されうる。いったん細胞内部で、プロモーター要素が遺伝子転写に利用可能な細胞機能によって認識され、ＲＮＡエフェクター分子、例えば、ｓｈＲＮＡが生成される。
【００６１】
本発明のプラスミド発現ベクターを増殖させるために有利でありうる他の細菌株としては、ｉｎ  ｖｉｖｏジーン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州（ＣＡ）から市販されている大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＴ１１６コンピテント細胞があげられる。ＧＴ１１６は、具体的には、ヘアピンＲＮＡである１つもしくはそれ以上のＲＮＡエフェクター分子を発現するように人工的に作り出された本発明のプラスミドなどヘアピン構造物を持っているプラスミドＤＮＡの成長を支持するように人工的に作り出されたｓｂｃＣＤ欠失株である。ヘアピン構造物は、ヘアピンを認識し開裂するＳｂｃＣＤと呼ばれるタンパク質複合体によるその除去により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において不安定であることが周知である（コネリー（Ｃｏｎｎｅｌｌｙ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：７９６９−７４頁（１９８８年））。ｓｂｃＣＤおよびｓｂｃＤ遺伝子は、ヘアピンまたは他の回文含有構造物を有するプラスミドのクローニングのためにその有用性を改善する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＴ１１６において欠失されている。
【００６２】
化学的および物理的にさまざまな手段を使用し、プラスミド発現ベクターを細胞もしくは組織または生きた生物へ導入することができ、かかるものとして、医薬として許容されるビヒクルまたは製剤中にプラスミド発現ベクターを含む組成物が医薬組成物を構成する。医薬組成物としてのプラスミドＤＮＡの調製のために、かかる方法は、ブピカインなどの陽イオン性両親媒性局所麻酔薬、ポリアミン（例えば、スペルミン）などのプラスに帯電した核酸結合剤、または細胞膜によりＤＮＡアップデートを促進する多くのリポソームもしくは脂質含有剤による製剤を含む。これらの発現ベクターを含む医薬組成物の他の成分は、医薬投与に適切な均質溶液中でＤＮＡベクターの化学的安定性および溶解性を確実にする緩衝剤および安定剤などの薬剤を含む。
【００６３】
ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターベクターは、核において作られ、主に核に保持されるＲＮＡ分子（１つもしくはそれ以上のイントロンを有し、またはイントロンを有さず、かつポリＡテールを有し、またはポリＡテールを有さない場合がある）をコードする。これらの核ｄｓＲＮＡエフェクター分子を使用し、転写遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）を導入することができる。しかし、転写されるｄｓＲＮＡの割合は細胞質に達し、したがって、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を誘導しうる。ＴＧＳ誘導のために、ｄｓＲＮＡは、好ましくは、プロモーター配列、プロモーター配列のサブセット、プロモーター配列／転写開始部位配列、または別の調節領域配列（場合により、下記のようにＤＮＡまたはＲＮＡ標的におけるかかるプロモーター／調節領域に作動可能に連結された配列と組合せて）を含有し、かつ核に保持される。あるいは、ｄｓＲＮＡはコードおよび／または３’および／または５’ＵＴＲ配列のみを含有し、または好ましくは、コードおよび／またはＵＴＲ配列および／またはプロモーター配列の組合せを含有しうる。かかる「融合標的」ｄｓＲＮＡは、例えば、同時のＴＧＳおよびＰＴＧＳに標的されるプロモーター配列および結合遺伝子配列をコードする。多重の短いヘアピンｄｓＲＮＡを送達するようにデザインされた本発明のＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩ発現構築物は、理想的には、１つもしくはそれ以上のｄｓＲＮＡ標的プロモーターおよび／または他の調節配列のほか、１つもしくはそれ以上のｄｓＲＮＡ標的コード領域および／または３’ＵＴＲおよび／または５’ＵＴＲの送達に適している。また、本発明の多重コンパートメント発現系を作成するＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２６９９９（国際公開第２００５／０４０３８８号パンフレット）において開示された１つもしくはそれ以上のプロモーターを含むことにより、かかる「融合標的」配列が関連コンパートメント、例えば、細胞質、核、および核小体のすべてにおいて、転写を開始する必要なコンパートメント特異的プロモーターの使用によって発現されることを確実にしうる。ＰＴＧＳのために、ｄｓＲＮＡはＲＮＡ由来の配列を含有し（例えば、ｍＲＮＡからのコードまたはＵＴＲ配列）、かつプロモーター配列を含有する必要はない。また、より効果的なＰＴＧＳが、細胞質転写を可能にするプロモーター（例えば、ミトコンドリアプロモーター）を含むことによって、または結果としてより効果的に細胞質輸送ＲＮＡをもたらすベクターによって、例えば、メイスン・ファイザー（Ｍａｓｏｎ−Ｐｆｉｚｅｒ）サルウイルスまたは別のサルレトロウイルス輸送要素のＣＴＥなどＣＴＥ（構成性輸送要素）の包含によって誘導されるが、例えば、米国特許第５，５８５，２６３号明細書および米国特許第５，８８０，２７６号明細書を参照。必要に応じて、ＰＴＧＳおよびＴＧＳは、本明細書に記載された方法および当業者に周知の方法を使用してこれらベクターを組合せて同時に導入されうる。
【００６４】
他の発現制御配列としては、適切な転写開始、終結（例えば、ポリメラーゼＩＩＩターミネーターとして４または５つのＴの配列）、プロモーター、およびエンハンサー配列、スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなど効果的なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列、翻訳効率を強化する配列（例えば、コザックコンセンサス配列）、タンパク質安定性を強化する配列、および必要に応じて、コード産物の分泌を強化する配列が挙げられる。
【００６５】
本明細書に記載されたベクターのいずれかまたは他の標準ベクターを使用し、本発明の所望の生物活性核酸構造物のいずれか、例えば、ミクロＲＮＡ、ｍＲＮＡ（必要に応じてポリペプチドへ翻訳）、アンチセンスＲＮＡ、およびリボザイムＲＮＡを生成し、本方法で使用することができる。
【００６６】
転写後遺伝子サイレンシングを強化するための方法
ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩによって核で転写されたｄｓＲＮＡによってＰＴＧＳを強化するには、１つもしくはそれ以上のイントロンおよび／またはポリアデニル化シグナルをｄｓＲＮＡに添加し、転写ＲＮＡのプロセッシングを可能にすることができる。このプロセッシングは、スプライシングおよびポリアデニル化が核から細胞質への輸送を促進するため好ましい。また、ポリアデニル化はＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩ転写産物を安定化する。これらの同じ方法は、タンパク質へ翻訳される機能的ｍＲＮＡの発現に有用となる。一部の実施形態において、原核抗生物質耐性遺伝子、例えば、ゼオマイシン発現カセットがイントロンに配置されている。他の例の原核の選択可能なマーカーとしては、米国特許第５，８５１，８０４号明細書のキメラカナマイシン抵抗性遺伝子を含むカナマイシン、アミノグリコシド、テトラサイクリン、およびアンピシリンなど他の抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。ゼオマイシン遺伝子は原核プロモーターの調節制御下にあり、宿主細菌におけるゼオマイシンの翻訳は、開始ＡＴＧの上流の約１０塩基対内に位置したシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列の存在によって確実にされる。あるいは、ゼオマイシン発現カセットは、ヘアピンの逆方向反復配列間（すなわち、サイレンシングされる標的核酸との実質的な同一性を有するセンスとアンチセンス配列間）の位置に配置されうる。
【００６７】
逆方向反復配列は通常、ベクターが細菌内で増殖されるとＤＮＡ組換えによってＤＮＡから欠失されるが、少数の細菌が組換え経路において突然変異を有し、これにより細菌が逆方向反復を有するＤＮＡを安定に維持することを可能にする。これら稀な細菌をスクリーニングするために、ゼオマイシン選択が培養に添加される。逆方向反復を除去することができる望ましくない細菌は、ゼオマイシン発現カセットも組換え中に欠失するため死滅される。無傷ゼオマイシン発現カセットを有する所望の細菌のみが選択を生き延びる。
【００６８】
ＤＮＡが選択細菌から単離され、真核生物（例えば、哺乳類細胞培養）または動物（例えば、哺乳類）へＲＮＡの発現のために挿入された後、イントロンがＲＮＡ転写産物からスプライシングされる。ゼオマイシン発現カセットがイントロンに位置している場合は、このカセットはＲＮＡスプライシングによって除去される。非効率なスプライシングのイベントでは、ゼオマイシン発現カセットは、この遺伝子の転写および翻訳に対する真核シグナルがないため発現されない。抗生物質耐性カセットの除去は、カセットの除去によりｄｓＲＮＡ分子のサイズが減少するため短いｄｓＲＮＡ分子を必要とする用途には望ましい。ゼオマイシンカセットはさらにイントロン内の代わりにイントロンの片側にも配置されうる。この場合、ゼオマイシン発現カセットはイントロンがスプライシングされた後にも残存し、ヘアピンのループ構造に関与するために使用されうる。これらのＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩ転写産物は核で作られ、それらがＰＴＧＳをもたらしうる場合に細胞質に輸送される。しかし、一部のＲＮＡ分子は核に保持されうる。これらの核ＲＮＡ分子はＴＧＳをもたらしうる。ＴＧＳ用途のために、コードされたｄｓＲＮＡは、好ましくは、プロモーター配列またはプロモーター配列のサブセットを含有し、好ましくは、プロモーター／転写開始部位配列を含む。より効果的にＲＮＡを核内に保持するために、イントロンおよび／またはポリアデニル化シグナルは除去されうる。
【００６９】
細胞質および核の局在のための別の方法は、「上流」または内部ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの使用である（例えば、Ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：Ａ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ、第３版、デービッド・ラッチマン（Ｄａｖｉｄ  Ｌａｔｃｈｍａｎ）（編）、スタンリー・トーマス（Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｔｈｏｍｅｓ）：Ｃｈｅｌｔｅｎｈａｍ、英国（ＵＫ）、１９９８年を参照）。これらのプロモーターは結果として核転写ＲＮＡ転写産物をもたらし、その一部は輸送され、かつその一部は核に保持され、したがってＰＴＧＳおよび／またはＴＧＳのために使用されうる。これらのプロモーターを使用し、国際公開第２００４／０１１６２４号パンフレット、２００４年２月５日公開に記載されている部分および強制ヘアピン構造物を含むヘアピン、または収束プロモーターの使用により、または２つのベクターもしくは２つのシストロン系の使用により二本鎖ＲＮＡを生成することができる。通常、遺伝子配列の２つの異なるコピーから、一方のプロモーターによりセンス鎖の合成が方向づけられ、他方のプロモーターによりアンチセンスＲＮＡの合成が方向づけられる。これらのプロモーターによって転写されるＲＮＡの長さは、一般に数百個のヌクレオチド（例えば、２５０−５００個）に制限される。また、転写終結シグナルがこれらのベクターで使用され、効果的な転写終結を可能にしうる。
【００７０】
本出願に必要な用語の多くおよび一般的な実験手順は、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、第１−３巻、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク（Ｎ．Ｙ．）、２０００年において見られる。このマニュアルは以下、「サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら」と呼ばれる。
【００７１】
クローニング、ＤＮＡ単離、増幅、および精製のための、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを含む酵素反応のための標準方法、およびさまざまな分離方法は、例えば、参照により本明細書で援用される、以下の文献の本文におけるように分子生物学の当業者に周知であり、一般的に使用されているものである。すなわち、多くの標準方法が、オーズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（１９９４年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、グリーン・パブリッシング社（Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．）、およびワイリー  アンド  サンズ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）、Ｎｅｗ  Ｔｏｒｋ、ニューヨーク州、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（上記）、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、（１９８２年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ニューヨーク、ウー（Ｗｕ）（編）（１９７９年）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１８、第１部、ウー（Ｗｕ）（編）（１９７９年）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８、ウー（Ｗｕ）ら（編）（１９８３年）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００および１０１、グロスマン（Ｇｒｏｓｓｍａｎ）とモルダブ（Ｍｏｌｄａｖｅ）（編）Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）（編）（１９７２年）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、オールド（Ｏｌｄ）とプリムローズ（Ｐｒｉｍｒｏｓｅ）（１９８１年）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ、カリフォルニア大学プレス（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、シュライフ（Ｓｃｈｌｅｉｆ）とウェンシンク（１９８２年）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、グローバー（Ｇｌｏｖｅｒ）（編）（１９８５年）ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ第ＩおよびＩＩ巻、ＩＲＬプレス（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｏｘｆｏｒｄ、英国（ＵＫ）、ハーメス（Ｈａｍｅｓ）とヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）（編）（１９８５年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＩＲＬプレス（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｏｘｆｏｒｄ、英国（ＵＫ）、およびセットロー（Ｓｅｔｌｏｗ）とホレンダー（Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ）（１９７９年）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、第１−４巻、プレナム・プレス（Ｐｒｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、に記載されている。本明細書で使用される特に有用な方法は、「連鎖反応クローニング」と呼ばれ、米国特許第６，１４３，５２７号明細書、「架橋オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡリガーゼを使用する連鎖反応クローニング（Ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｂｒｉｄｇｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ）」、パチュック（Ｐａｃｈｕｋ）らに記載されている。使用される場合の略語および用語は、当分野で標準とみなされ、本明細書で引用されているものなど専門誌で一般的に使用されている。
【００７２】
医薬組成物
本発明の多重ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター発現系は、本明細書の他の箇所に記載されているようにさまざまな医薬用途に有利に使用されうる。さまざまな実施形態において、医薬組成物は、約１ｎｇ〜約２０ｍｇの核酸、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、プラスミド、ウイルス、ベクター、組換えウイルス、またはその混合物を含むが、これらは所望の量の核酸分子（標的核酸と相同および相補のｄｓＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、三重形成ＲＮＡ等）を提供する。一部の実施形態において、この組成物は、約１０ｎｇ〜約１０ｍｇの核酸、約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇ、約１ｍｇ〜約３５０ｍｇ、約２５ｍｇ〜約２５０ｍｇ、または約１００ｍｇの核酸を含有する。臨床薬理学の当業者は、ルーチンの実験を使用するかかる投与スケジュールに容易に達することができる。
【００７３】
適切な担体としては、食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノール、およびその組合せが挙げられるが、これらに限定されない。組成物は投与様式に適合され、例えば、丸剤、錠剤、カプセル剤、噴霧剤、粉剤、または液体の形でありうる。一部の実施形態において、医薬組成物は、選択経路および投与等式に適切な１つもしくはそれ以上の医薬として許容される添加剤を含有する。これらの組成物は、限定されることなく、静脈内（ＩＶ）、静脈内（ＩＶ）、動脈内、筋内（ＩＭ）、皮下（ＳＣ）、皮内、腹腔内、髄空内を含む非経口経路のほか、局所、経口、および鼻腔内、吸入、直腸、膣、口腔、および舌下など送達の粘膜経路によって投与されうる。一部の実施形態において、本発明の医薬組成物は、脊椎動物（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタを含む哺乳類）対象への投与のために、注射用の滅菌、非発熱性液体を含む液体、乳剤、粉剤、エアロゾル、錠剤、カプセル剤、腸溶性錠剤、または坐剤の形で調製される。
【００７４】
本明細書に記載されているように、例えば、２、３、４つ、もしくはそれ以上のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの制御下に、例えば、標的病原体、例えば、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＨＰＶ、小さなポックスウイルスなどウイルスの１つもしくはそれ以上の遺伝子からの配列、もしくは別の病原体と関連した配列、またはヒト、動物、もしくは農業的利益の他の核酸配列、例えば、炭疽毒素のヒト細胞受容体配列、または哺乳類、脊椎動物、もしくは無脊椎動物の疾患または障害、例えば、黄斑変性と関連したハンチントン病、もしくはＶＥＧＦ、またはヒト、ウマ、もしくはトリ宿主細胞のために人工的に作り出されたトリインフルエンザまたは西ナイルウイルス配列と実質的に相同の２、３、４つ、もしくはそれ以上の短いヘアピンｄｓＲＮＡ分子を発現するＤＮＡプラスミド構築物を含む医薬組成物が調製されうる。発現構築物は、追加のプロモーター配列、例えば、バクテリオファージＴ７プロモーターを含みうるが、その場合、同種ポリメラーゼを共送達または共発現する必要がありうる。例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、適切なプロモーター、例えば、ｈＣＭＶ、サル、ＣＭＶ、またはＳＶ４０などＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下に同じまたは別のプラスミドから共送達および発現されうる。一部の実施形態において、同じまたは別の構築物は標的遺伝子（例えば、標的小ポックス遺伝子）を標的小ポックス遺伝子と相同のｄｓＲＮＡと同時に発現する。医薬組成物は、投与の特定の経路に適切な医薬ビヒクル中に調製される。ＩＭ、ＳＣ、ＩＶ、腹腔内、皮内、髄空内、または投与の他の非経口経路のために、注射用の滅菌水など滅菌、非毒性、発熱物質を含まない水溶液、および、場合により、さまざまな濃度の塩、例えば、ＮａＣｌ、および／またはブドウ糖（例えば、塩化ナトリウム液、リンガー液、ブドウ糖液、ブドウ糖および塩化ナトリウム液、および／または乳酸加リンガー液）が一般的に使用される。場合により、薬剤学の当業者に周知の他の医薬として適切な添加剤、保存剤、または緩衝剤も使用される。注射用に一回量バイアルで提供される場合は、用量は薬理学の当業者によって決定されるように変動するが、通常、５ｍｃｇ〜５００ｍｃｇの活性構築物を含有しうる。必要とみなされる場合は、大幅に大量を毒性なしに、例えば、５−１０ｍｇまで投与されうる。
【００７５】
本発明の、および本発明に従って使用するための医薬組成物は、医薬として許容される賦形剤または担体を含みうる。本明細書で使用される「医薬として許容される担体」という語は、非毒性、不活性固体、半固体、または液体の充填剤、任意の種類のカプセル化材料または製剤補助剤を意味する。医薬として許容される担体として使用される材料の一部の例は、ラクトース、グルコース、およびショ糖などの糖、コーンスターチおよびジャガイモでんぷんなどのでんぷん、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体、トラガント末、モルト、ゲラチン、タルク、カカオバターおよび坐剤用ろうなどの賦形剤、ピーナツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油などの油、プロピレングリコールなどグリコール、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル、寒天、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０などの界面活性剤、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど緩衝剤、アルギン酸、発熱物質を含まない水、等張性食塩水、リンガー液、エチルアルコール、およびリン酸緩衝液のほか、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなど他の非毒性適合性潤滑剤、ならびに着色剤、解除剤、コーティング剤、甘味料、香味料および香料、保存剤、および抗酸化剤も、調製者の判断に従って、組成物中に存在しうる。
【００７６】
注射製剤は、例えば、細菌保持フィルタによるろ過によって、または滅菌水もしくは他の滅菌注射溶剤に溶解または分散されうる滅菌固体組成物の形で滅菌剤を組込むことによって、使用前に滅菌されうる。
【００７７】
直腸または膣投与用の組成物は、好ましくは、周囲温度下に固体であるが体温下で液体であり、したがって直腸および膣腔で融解し、微小粒子を放出するカカオバター、ポリエチレングリコール、または座剤用ろうなど適切な非刺激性賦形剤または担体と発現構築物を混合することによって調製されうる。
【００７８】
経口投与用の固形の剤形としては、カプセル剤、錠剤、丸剤、粉剤、および顆粒剤が挙げられる。かかる固形の剤形では、発現構築物は、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム、および／または、ａ）でんぷん、ラクトース、ショ糖、グルコース、マニトール、およびケイ酸など充填剤または増量剤、ｂ）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ゲラチン、ポリビニルピロリジノン、ショ糖、およびアカシアなど結合剤、ｃ）グリセロールなど保湿剤、ｄ）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカでんぷん、アルギニン酸、一部のケイ酸、および炭酸ナトリムなど崩壊剤、ｅ）パラフィンなど溶液緩染剤、ｆ）四級アンモニウム化合物など吸収促進剤、ｇ）例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなどの湿潤剤、ｈ）カオリンおよびベントナイト粘土などの吸収剤、およびｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびその混合物など潤滑剤などの少なくとも１つの不活性の医薬として許容される賦形剤または担体と混合される。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合には、投与剤形が緩衝剤をも含んでなりうる。
【００７９】
本発明による医薬組成物の局所および経皮投与用の剤形としては、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉剤、溶剤、噴霧剤、吸入剤、またはパッチが挙げられる。発現構築物は、滅菌条件下に、必要に応じて医薬として許容される担体および必要な保存剤または緩衝剤と混合される。眼科用製剤、点耳剤、および点眼剤も本発明の範囲内であると考えられる。
【００８０】
経皮パッチは、体内への化合物の制御された送達を提供する追加の利点を有する。かかる剤形は、発現構築物を適切な溶剤中に溶解または分散することによって製造されうる。吸収増強剤も使用し皮膚上の化合物の流動を増大させることができる。速度は、速度制御膜を提供し、またはポリマーマトリックスもしくはゲルに発現構築物を分散することによって制御されうる。
【００８１】
発現構築物の投与の望ましい方法
本発明のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ構築物は、トランスフェクション促進剤なしに医薬ビヒクル中に調製された「裸の」ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡとして宿主細胞／組織／生物に投与されうる。より効果的な送達は、例えば、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ送達の当業者に周知のかかるポリヌクレオチドトランスフェクション促進剤を使用してＤＮＡおよびＲＮＡ送達の当業者に周知のように達成されうる。以下は例として薬剤である。すなわち、ブピバカイン、陽イオン性脂質、リポソーム、または脂質粒子など局所麻酔剤を含む陽イオン性両親媒性化合物、ポリリシンなどポリカチオン、デンドリマーなど分岐三次元ポリカチオン、糖質、洗剤、または塩化ベンジルコニウムなどベンジルアンモニウム界面活性剤を含む界面活性剤。本発明において有用なかかる促進剤または架橋助剤の非限定的例は、米国特許第５，５９３，９７２号明細書、同第５，７０３，０５５号明細書、同第５，７３９，１１８号明細書、同第５，８３７，５３３号明細書、同第５，９６２，４８２号明細書、同第６，１２７，１７０号明細書、および同第６，３７９，９６５号明細書のほか、国際特許出願第０３／０９３４４９号明細書、２００３年１１月１３日公開（多機能的分子複合体および油／水陽イオン性両親媒性乳剤（ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ａｎｄ  ｏｉｌ／ｗａｔｅｒ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅ  ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ））、および同第９９／２１５９１号明細書１９９９年５月６日公開（「遺伝物質の送達のための組成物および方法（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌ）」に記載されており、その開示は参照により本明細書で援用される。米国特許第５，８２４，５３８号明細書、同第５，６４３，７７１号明細書、および同第５，８７７，１５９号明細書（参照により本明細書で援用）は、ポリヌクレオチド組成物以外の組成物、例えば、本発明の発現構築物を含有するトランスフェクトされたドナー細胞または細菌の送達を開示している。
【００８２】
一部の実施形態において、本発明の発現構築物は、米国特許第４，８９７，３５５号明細書（エプシュタイン（Ｅｐｐｓｔｅｉｎ）ら、１９８７年１０月２９日出願）、米国特許第５，２６４，６１８号明細書（ファイグナー（Ｆｅｉｇｎｅｒ）ら、１９９１年４月１６日出願）、または米国特許第５，４５９，１２７号明細書（ファイグナー（Ｆｅｉｇｎｅｒ）ら、１９９３年９月１６日出願）に開示された組成物など、１つもしくはそれ以上の陽イオン性脂質または陽イオン性両親媒体と複合されている。他の実施形態において、発現構築物は、陽イオン性脂質を含み、かつ場合により、中性脂質など別の成分を含むリポソーム／リポソーム組成物と複合されている（例えば、米国特許第５，２７９，８３３号明細書（ローズ（Ｒｏｓｅ））、米国特許第５，２８３，１８５号明細書（エパンド（Ｅｐａｎｄ））、および米国特許第５，９３２，２４１号明細書（ゴルマン（Ｇｏｒｍａｎ）を参照）。他の実施形態において、発現構築物は、米国特許第５，８３７，５３３号明細書、同第６，１２７，１７０号明細書、および同第６，３７９，９６５号明細書（ブーチン（Ｂｏｕｔｉｎ））の多機能的分子複合体、または、好ましくは、米国仮特許出願第６０／３７８，１９１号明細書、２００２年５月６日出願（国際公開第０３／０９３４４９号パンフレット、２００３年１１月１２日公開、サチシュチャンドラン（Ｓａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎ））の多機能的分子複合体または油／水陽イオン性両親媒性乳剤と複合されているが、その開示は参照により本明細書で援用される。後者の出願は、核酸を含む組成物、コレステロールまたは脂肪酸を含むエンドソーム溶解スペルミン、および細胞表面分子のためのリガンドを含む標的スペルミンを開示している。組成物の正負電荷比は、包括的に０．１〜２．０、好ましくは、０．５〜１．５であり、エンドソーム溶解スペルミンは、組成物における少なくとも２０％のスペルミン含有分子を構成し、標的スペルミンは組成物における少なくとも１０％のスペルミン含有分子を構成する。好ましくは、正負電荷比は、包括的に０．８〜０．９など、包括的に０．８〜１．２である。標的スペルミンは、組成物を目的とする特定の細胞または組織に局在するようにデザインされている。エンドソーム溶解スペルミンは、エンドソーム小胞を崩壊させ、エンドサイオーシス中に組成物をカプセル化し、エンドソーム小胞からおよび細胞の細胞質または核への核酸の放出を促進させる。標的スペルミン／エンドソーム溶解スペルミンのかかる混合物の使用により、トランスフェクションが達成されるだけではなく、発現も増強される。
【００８３】
本発明のＤＮＡ発現ベクターは、国際公開第０３／０９３４４９号パンフレット、２００３年１１月１３日公開に開示されているように、３５％マンノシルスペルミン〜６５％コレステリルスペルミンの混合物と複合され、免疫細胞、例えば、マクロファージの標的トランスフェクションを、マウスにＩＶ投与される場合にはマンノース受容体によって達成されうる。ＨＢＶおよび／またはＨＣＶに対するｄｓＲＮＡの送達のためのｉｎ  ｖｉｖｏでの肝細胞の標的トランスフェクションは、ラクトシルスペルミン（モノまたはトリラクトシル化）とコレステリルスペルミン（０．８の電荷比でＤＮＡに対するスペルミンを含有）の混合物（例えば、３５％／６５％比）と複合された、本明細書に記載されているＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクターを含む組成物のＩＶ注射により達成されうる。かかる組成物は特に医薬用途に有用であり、かつ適切な滅菌、非発熱性ビヒクル、例えば、注射用、非経口投与、例えばＩＶ（ＩＶ注入を含む）、ＩＭ、ＳＣ用、および腹腔内投与用のほか、吸入による肺送達用のエアロゾル化製剤用の緩衝食塩水中に容易に形成されうる。一部の製剤において、本発明のＤＮＡ発現構築物が、標的スペルミンなしにコレステリルスペルミンのみなどエンドソーム溶解スペルミンと複合され、腹腔内注射または注入など投与の一部の経路により、本発明のＤＮＡ構築物の有効な肺送達およびトランスフェクション、およびＲＮＡエフェクト分子、例えば、ＨＢＶおよび／またはＨＣＶに対して有効な多重ｄｓＲＮＡヘアピンの発現が達成される。
【００８４】
本発明のＤＮＡ発現ベクターは、その開示が参照により本明細書で援用される、国際公開第０３／０９３４４９号パンフレット、２００３年１１月１３日公開に開示されているように、ｉｎ  ｖｉｖｏで経口または非経口、例えば、静脈内送達用のマイクロエマルジョンとしても形成されうる。製剤は、好ましくは、局所麻酔剤ブピバカイン、コレステリル、塩化ベンザルコニウム、またはオクチルスペルミンなど両親媒性化合物を含有する。マウスでのｉｎ  ｖｉｖｏ実験は、経口投与が結果として肝への重要な送達をもたらすことを示す。マイクロエマルジョンの静脈内投与は結果として、大きな毛細血管床を有する臓器、例えば、肺、肝、脾、および腎のトランスフェクションをもたらす。
【００８５】
さらに他の実施形態において、発現構築物は、薬剤学および分子生物学の分野の当業者によって送達される他の組成物と複合される。一部の実施形態において、構築物またはベクターは陽イオン性脂質と複合されない。
【００８６】
細胞の変換／トランスフェクションは、リポフェクション、ＤＥＡＥデキストラン介在トランスフェクション、マイクロインジェクション、プロトプラスト融合、リン酸カルシム沈殿、ウイルスまたはレトロウイルス送達、エレクトロポレーション、または微粒子銃変換を含むが、これらに限定されないさまざまな手段によって起りうる。発現構築物（ＤＮＡ）は、裸のＤＮＡまたは局所麻酔複合ＤＮＡでありうる（パチュック（Ｐａｃｈｕｋ）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｖｓ．Ａｃｔａ  １４６８：２０−３０頁（２０００年））。好ましくは、真核細胞、例えば、脊椎動物（例えば、哺乳類）はｉｎ  ｖｉｖｏであり、または少数の継代（例えば、ＡＴＣＣから直接得られている細胞系の３０未満の継代）、または一次細胞のみについて培養されている細胞である。
【００８７】
所望の細胞
本発明の態様のさらに別の実施形態において、細胞は真核植物細胞または動物細胞である。好ましくは、動物細胞は無脊椎動物または脊椎動物細胞（例えば、哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞）である。細胞はエクスビボまたはｉｎ  ｖｉｖｏでありうる。細胞は分化または未分化であり、配偶子、胚幹細胞を含む胚細胞、体細胞、例えば、癌細胞、成人または体幹細胞、免疫系の細胞、ニューロン細胞、平滑筋または心筋細胞を含む筋細胞、ホルモン産生細胞、血液細胞、肝細胞、脂肪細胞等でありうる。一部の実施形態において、ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）またはアルゴノート（Ａｒｇｏｎａｕｔ）など遺伝子サイレンシングに関与する１つもしくはそれ以上のタンパク質が、細胞または動物において過剰発現または活性化され、遺伝子発現の阻害の量を増大する。
【００８８】
哺乳類の複製起点の包含
通常、ヒト医薬用途に望ましいとみなされていないが、ヒトまたは哺乳類の複製起点が、他の用途、例えば、非臨床調査用に本発明の発現構築物に含まれうる。複製起点は、ＤＮＡプラスミドの核局在で複製されることを可能にし、したがって、発現を、発現のレベルおよび持続時間の両方を増強する。その利点は、より多くのプラスミドが核転写のために利用可能であり、したがって、より多くのエフェクター分子が作られることである（例えば、より多くのアンチセンス、ｍＲＮＡ、ｄｓＲＮＡヘアピン、ミクロＲＮＡ、および／またはより多くのｄｓＲＮＡ二本鎖）。多くの起点は種特異的であり、一部の哺乳類種で作用するが、全種で作用するわけではない。例えば、ＳＶ４０Ｔ複製起点（例えば、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からのプラスミドｐＤｓＲｅｄ１−Ｍｉｔｏ由来；米国特許第５，６２４，８２０号明細書）はマウスでは機能的であるが、ヒトでは機能的ではない。したがって、この起点は、マウスで使用され、または試験されるベクター用に使用されうる。ヒト用途に使用されうる他の起点は、例えば、エプスタイン・バー核抗原（ＥＢＮＡ）起点などのものである（例えば、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）からのプラスミドｐＳＥＳ．ＴｋおよびｐＳＥＳ．Ｂ）。これらの要素を含有するＤＮＡベクターは市販されており、起点をコードするＤＮＡ部分は、起点を含有する制限断片を分離し、または起点をＰＣＲ増幅することによって、標準方法を使用して得られる。これらのベクターの制限マップおよび配列は公的に入手可能であり、当業者がこれらの配列を増幅し、または適切な制限断片を単離することを可能にする。これらのベクターは、ＳＶ４０  ＴＡｇおよびＥＢＮＡなど適切な補助因子を発現する細胞の核で複製する。これらの因子の発現は、対応する複製起点を含有する市販ベクターの一部（例えば、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）からのプラスミドｐＳＥＳ．ＴｋおよびｐＳＥＳ．Ｂ）もＳＶ４０  ＴａｇまたはＥＢＮＡを発現するため容易に達成される。複製起点を含有するこれらのＤＮＡ分子は、目的とするベクター（例えば、ヘアピンまたは二本鎖などｄｓＲＮＡを発現するベクター）へ当業者によって容易にクローン化されうる。次いで、これらのベクターは、ＥＢＮＡまたはＴａｇを発現するベクターと共トランスフェクトされ、注入され、または投与され、それぞれ、ＥＢＮＡまたはＴａｇ複製起点を持っているプラスミドの複製を可能にする。あるいは、ＥＢＮＡまたはＴａｇをコードする遺伝子は、標準方法を使用して目的とする細胞、動物、または生物において作用するようにデザインされた別の発現ベクターへクローン化される。ＥＢＮＡおよびＴａｇをコードする遺伝子は複製起点を持っている同じベクターへもクローン化されうる。適切な複製起点は、ＴａｇおよびＥＢＮＡに限定されておらず、例えば、レプリコール社（ＲＥＰＬＩＣｏｒ  Ｉｎｃ．）（Ｍｏｎｔｒｅａｌ、ケベック州（Ｑｕｅｂｅｃ）は、付着されるＤＮＡ配列が複製するのを可能にする３６個の塩基対の哺乳類起点コンセンサス配列を特定した（ＢｉｏＷｏｒｌｄ  Ｔｏｄａｙ、１９９９年、８月１６日、第１０巻、第１５７号で検討）。この配列は、複製を可能にする補助配列の共発現を必要���しない。
【００８９】
本発明の発現構築物を含有する組成物を含むキットも本発明の範囲内に含まれ、かかるキットは多重Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターを含み、転写されるＲＮＡエフェクター分子をコードする配列の易挿入にデザインされ、または、例えば、適切に選択された制限部位の発現ベクター内の配置により、多重Ｐｏｌ  ＩＩＩベクター促進発現カセットの易挿入にデザインされた発現ベクターを含み、かつ場合により、発現構築物の安定性、送達、使用の容易さ、または有効性を補助する溶剤、溶液、および他の組成物を含みうる。
【００９０】
多重ｄｓＲＮＡヘアピンをコードする多重ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含む発現ベクターを使用するＢ型肝炎疾患の治療
ウイルス性肝炎は、それに対する十分な治療が未だ利用可能ではない主な世界の健康上の問題となっている。ワクチンがヒトＢ型肝炎に対する予防として利用可能であるが、ヒトＣ型肝炎、およびＢ型またはＣ型肝炎ウイルス、例えば、ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）またはヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のいずれかの感染に対しては利用可能ではなく、これらは多くの場合、結果として慢性ウイルス性肝疾患をもたらす。
【００９１】
リバビリンおよびインターフェロンを含むＣ型肝炎に対する薬物療法は、部分的にのみ有効である。感染者の７５−８５％は慢性感染を発症することが推定され、慢性感染者の７０％が肝細胞癌を含む慢性肝疾患を発症すると推定される。慢性ＨＣＶ関連肝疾患は肝移植の主要な適応である。
【００９２】
ヒトＢ型肝炎ワクチンが１９８２年以来利用可能であるが、世界中で３億５千万人がＨＢＶの慢性感染者であることが推定される。米国における毎年の新しい感染の数は、１９８０年代の平均２６０，０００から２００１年の約７８，０００に減少したが、６か月超の間、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に対して陽性者と規定されるＢ型肝炎保菌者が推定１２５万人いる。ＨＢＶのかかる保菌者は、肝硬変、肝不全、および肝細胞癌を発症するリスクが増大している。大部分の保菌者は慢性Ｂ型肝炎から肝臓疾患を発症することはないが、１５％〜４０％は生涯中に重篤な続発症を発症し、慢性肝疾患による死亡が慢性感染者の１５−２５％に発生する。したがって、ＨＢＶおよび／またはＨＣＶ感染、特に、世界中の肝疾患の全症例中７５％を占めると推定される慢性感染を患う患者において有効な改善された治療薬の差し迫った必要がある。ＨＶＣに対して有効な予防的方法および薬剤もきわめて必要である。
【００９３】
ＨＢＶおよびＨＣＶはｄｓＲＮＡに基づく治療（ＲＮＡｉ）に対するきわめて望ましいウイルス標的であるが、ウイルスの変動性と変異性およびウイルスの高い転写速度により、ＨＢＶおよびＨＣＶは治療および／または予防的方法に対するきわめて困難な標的となっている。ＲＮＡｉを使用するウイルスゲノム複製を崩壊させるために、ウイルスゲノムにおける保存および独自の領域を特定する必要がある。同時に、毒性を回避するために、遺伝子サイレンシングのために選択される配列がヒトゲノムに不在であることが重要である。本発明の多重ポリメラーゼＩＩＩプロモーター構築物によるｄｓＲＮＡヘアピン発現としての使用に適切な保存ＨＢＶおよびＨＣＶ配列が、国際公開第２００５／０１４８０６号パンフレット、２００５年２月１７日公開、および米国仮特許出願第６０／６３８，２９４号明細書、２００４年１２月２２日出願、「遺伝子サイレンシングに有用な保存ＨＢＶおよびＨＣＶ配列（Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ＨＢＶ  ａｎｄ  ＨＣＶ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｕｓｅｆｕｌ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）」に開示されているが、その開示は参照により本明細書で援用される。
【００９４】
これらのウイルスの複製酵素を阻害するなど、さまざまな小さな分子薬剤が存在するが、疾患は一般に、１）薬剤が継続的にウイルスタンパク質を複製および／または産生しうるウイルス核酸ゲノムを破壊することがなく、かつ２）薬剤は、ウイルスゲノムが突然変異し、阻害剤に対して耐性である変異体複製酵素を産生するため、時間とともに無効にされる、という点で、これらの薬剤によって、治癒されず、通常、一時的にのみ抑制されうる。
【００９５】
ＨＢＶはヘパドナウイルスのファミリーに属する。ＨＢＶゲノムは、およそ３，２００の塩基対の弛緩した円形の部分的に二本鎖のＤＮＡである。エンベロープ（プレ−Ｓ／Ｓ）、コア（プレコア／コア）、ポリメラーゼ、およびＸタンパク質をコードする４つの部分的に重複するオープンリーディングフレームがある。プレ−Ｓ／Ｓオープンリーディングフレームは、大（Ｌ）、中（Ｍ）、小（Ｓ）の表面糖タンパク質をコードする。プレコア／コアオープンリーディングフレームはプレコアポリペプチドへ翻訳されるが、これは可溶性タンパク質、Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）およびヌクレオカプシドタンパク質、Ｂ型肝炎コア抗原へ修飾される。コアプロモーターおよびプレコア領域における突然変異は、ＨＢｅＡｇ産生を減少または無効にすることが証明されている。ポリメラーゼタンパク質は、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼとして機能する。Ｘタンパク質は有力な転写活性化因子であり、肝細胞癌発生における役割を果たしうる。
【００９６】
ＨＢＶの複製周期は、ビリオンの肝細胞への付着で開始する。肝細胞の核内では、プラス鎖ＨＢＶ  ＤＮＡの合成が完了し、ウイルスゲノムが共有結合クローン化環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）へ変換される。これまで試験されている大部分の抗ウイルス剤は、ｃｃｃＤＮＡに対する効果をほとんど示さず、またはまったく示さず、これは抗ウイルス療法の中断後の血清ＨＢＶ  ＤＮＡの急速な再出現の原因である。慢性Ｂ型肝炎の治療の目標は、ＨＶＢ複製および／またはＨＢＶ抗原の発現の持続的な抑制および肝疾患の緩和を達成することである。
【００９７】
本発明の多重ポリメラーゼＩＩＩ発現ベクターは、ウイルス感染細胞に送達されると、ウイルス核酸産物を直接破壊する独自の能力を有する。さらに、これらの多重プロモーターベクター（ウイルスゲノムの異なる部分を標的とする複数の異なる抑制性の短いヘアピンｄｓＲＮＡを発現する）のデザインおよび意図に固有かつ不可欠であるのは、多重の異なるウイルス拮抗薬を同時に生成する性質である。拮抗薬（ｓｈＲＮＡ）は、ウイルスゲノムにおける異なるゲノム配列を標的とする。これら拮抗薬の１つは、おそらくウイルスを無効にするのに十分であるが、ウイルス配列が突然変異し、１つの拮抗薬を不活性にする場合は、２、３、４つ、もしくはそれ以上の追加の拮抗薬が利用可能であるように、過剰性は「バックアップ」機序として役立つ。さらに、ウイルスゲノムにおける多重部位を標的とすることによって、疾患病理において異なる役割を果たすウイルスの異なるＤＮＡまたはＲＮＡ産物が同時に攻撃されうる。
【００９８】
例えばＢ型肝炎の場合、一実施形態において、本発明では、米国仮特許出願第６０／６３８，２９４号明細書、２００４年１２月２２日出願に開示された高度に保存されたＨＢＶ配列を含む、４つ、５つ、もしくはそれ以上のＲＮＡ分子（例えば、図５に記載された「７９９」、「１９０７」、「２７９１」、「１７３７」、「１９９１」、「１９４３」で呼ばれる）が使用される。例えば、「７９９」、「１９０７」、「２７９１」、「１７３７」、「１９９１」、「１９４３」の全部または一部を含む、１９〜２９個のヌクレオチドの配列を含む、本明細書で開示された保存ＨＢＶ配列のその他は、本発明の多重ポリメラーゼＩＩＩ発現ベクターによって発現されるｄｓＲＮＡヘアピンに包含するために選択されうる。ＨＢＶ遺伝子発現および重複転写産物の性質により、多重ＲＮＡ転写産物の標的、およびウイルスタンパク質の１つ以上の複製および発現に干渉するウイルスの複製テンプレートを可能にする。ｓｈＲＮＡ分子の１つ、「１７３７」は独自にＸタンパク質（ＨｂＸ）として周知の産物をコードするＲＮＡを無効にしうる。Ｘタンパク質が肝癌の確立および／または維持において役割を果たす強い証拠が生物医学文献に存在する。ウイルス複製をある程度阻害しうる既存の薬剤は、統合された細胞、またはウイルスの他の残存コピーまたは部分を除去できないため、これらの薬剤は、感染性ＨＢＶの「治癒された」患者においても、ＨｂＸの産生を遮断できず、したがって、休眠ＨｂＸによって介在される癌の発生を直接削減することができない。本発明の多重抗ＨＢＶ  ｄｓＲＮＡヘアピン発現構築物は、ウイルスの複製およびすべてのウイルスタンパク質の発現を攻撃することができるが、その一部は、結果として肝炎をもたらす炎症性発作を引き起こし、ＨｂＸなどその他は、明確であるが完全には理解されていない機序によって肝細胞癌を促進すると考えられている。本明細書で開示された原理を使用し、具体的には、ＨｂＸおよび他の残留性ＨＢＶ抗原に対するｄｓＲＮＡを発現する、かかる「感染後」患者を治療するために適合された本発明の構築物をデザインしうることが認められている。
【実施例】
【００９９】
実施例
本発明はさらに以下の実施例で規定される。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、例示の目的で示されていることを理解すべきである。上記の議論およびこれらの実施例から、当業者は本発明の好ましい特徴を確認することができ、かつその精神および範囲を逸脱せずに、本発明のさまざまな変更および修正を行い、それをさまざまな使用および条件に適合させることができる。
【０１００】
多重Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター発現ベクターの構成および説明
標準の組換えＤＮＡ技術を使用することにより、細菌抗生物質選択マーカーおよび複製起点を含有するプラスミドを、以下の特異的プロモーター／ｓｈＲＮＡの組合せの開始点として選択した。広く利用可能なｐＵＣ１８ベクター（ヤニッシュ−ペロン（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）ら、Ｇｅｎｅ  ３３：１０３−１９頁（１９８５年）、ｅｒｒａｔｕｍ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  １１４：８１−８３頁（１９９２年））のおよそ１ｋｂの断片（アンピシリン耐性遺伝子と多重クローニング部位との間に細菌の複製起点を含有）を最初に米国特許第５，８５１，８０４号明細書で開示されたキメラカナマイシン耐性遺伝子と混合することによってプラスミドを製造した。インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、およびその他など供給元から得られるさまざまな市販のプラスミドベクターをベクター要素の代替源として使用し、または出発原料として使用するための出願人のベクターの代わりにし、以下のベクターの機能的に同等の変異体を製造することができる。ソース配列からベクターをアセンブルするために使用される方法としては、制限酵素消化、ゲル電気泳動、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＤＮＡ配列決定、酵素ライゲーション、および米国特許第６，１４３，５２７号明細書に記載された「連鎖反応クローニング」、「架橋オリゴヌクレオチドを使用する連鎖反応クローニング」、パチュック（Ｐａｃｈｕｋ）ら、および当業者に一般的かつ公知の他の方法が挙げられる。
【０１０１】
出願人は、多重プロモーター構築物を生成する前に単一Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターを調製することが目的にかなっていることを見出した。上記の複製起点制限断片（ｏｒｉ）のキメラカナマイシン耐性遺伝子への、次いで連続工程で所望のＰｏｌ  ＩＩＩプロモーター／ｓｈＲＮＡ発現カセットへの酵素結合によって単一のショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現するための基本の単一プロモーターＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩベクターを生成した。目的とするｓｈＲＮＡ配列を含む短い断片（およそ５０〜６０ｂｐ）とプロモーターを結合することによってプロモーター／ｓｈＲＮＡ発現カセットを製造し、商業的ベンダーから特注によって合成の二本鎖オリゴヌクレオチドとして製造した。多重プロモーターベクターの前駆体として単一プロモーターベクターを構成する目的は、いくつかの有利な態様を具体化することである。第一に、対象のプロモーター／ｓｈＲＮＡペアまたは要素の検出の手段を混乱させうる他のＰｏｌ  ＩＩＩ発現要素またはｓｈＲＮＡの非存在下に各々のプロモーター／ｓｈＲＮＡペアの機能的確認が可能である。第二に、その他の場合には多重プロモーターベクターにおける多重アニーリング部位を有し、その状況下に配列決定を不可能にする配列決定プライマーを使用する各々カセットの全部または一部のＤＮＡ配列決定が可能である。第三に、検証された単一プロモーターカセットは、各々プロモーター要素に特異的であるクローニング制限部位ペアの意図的なデザインによって任意の数の初期多重プロモーターベクターへクローニングのために効果的に移動されうる。
【０１０２】
単一プロモーターベクターの十分な発現レベルおよび遺伝子サイレンシング効果の測定後、多重プロモーターベクターを単一プロモーターベクターのプロモーター／ｓｈＲＮＡから段階的なやり方で構成し、各々が異なるｓｈＲＮＡの発現を促進させる２、３、４、もしくは５つのＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターを含めた。したがって、ｓｈＲＮＡを発現する有効な単一プロモーター構築物を修飾して第２のプロモーターｓｈＲＮＡカセットを加えた。第１のカセットに対する第２のカセットの位置（図８を参照）は、２つのプロモータープラスミドのいくつかの代わりの２プロモーター形態を生成することによって実験的に選択された（他のベクター要素に対して第１および第２のカセットの相対位置によって変動され、かつ転写の方向に対して各々のカセットの配向によって変動される）。当業者によって十分に理解されるように、単一ベクターにおける最適な発現のために２つのカセットを組合わせようとすると、環状ベクターの周りの位置およびカセットの「後方の」または「前方の」転写方向は変動し、すべてが同じ要素を含有する、８つもの異なる種類が生じうる。さらに、このベクターにおける２つの異なるプロモーターから２つの異なるｓｈＲＮＡ要素の発現を試みると、２つのプロモーターの各々とのｓｈＲＮＡ配列の異なる組合せにより、再びすべてが同じ要素を含有するが、異なる配置で、前記ベクターの１６の異なる変異体が生じる。出願人は、これらの異なる構成が結果として各々のｓｈＲＮＡの明らかなレベルの発現で大きな変動が生じうることを確認した。しかし、本発明の多重ポリメラーゼＩＩＩプロモーター構築物は、有効な遺伝子サイレンシング効果のための多重エフェクターＲＮＡ（特にｓｈＲＮＡ）を発現する目的でこれらの要素の比較的最適な構成の効果的な選択が過剰な実験なしに達成されうることを明らかに示す。
【０１０３】
本発明に照らして、少なくとも３、４、５つ、もしくはそれ以上の異なるＲＮＡエフェクター分子（例えば、ｓｈＲＮＡ分子）を１つの発現構築物から効果的に生成すること望ましい。したがって、２プロモーターベクターの前記説明は、前記構築物を加工する場合の組合せ可能性の単純な説明を提供することが意図されている。すべての置換が十分に同等に機能することがなく、かつ３つ以上のｓｈＲＮＡカセットでベクター生成するには、すべての可能な置換が体系的に評価されなければならない場合には多数のベクター置換の試験が必要であると考えると、出願人は、すべての要素が独立して、かつ協調的に哺乳類細胞における遺伝子サイレンシングをもたらすのに十分に強固な形で、すべてのｓｈＲＮＡ要素が発現される多重ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター発現構築物を得るために実践的に使用されうる方法（プロトコール、方式、方法、一連の工程）の確立に努めた。多重プロモーターベクターのすべての可能な置換の一部分のみを生成する工程を含み、以下の実施例で詳細に説明される、反復してプロモーターカセットを加える段階的な方法は、出願人によって、これらの多重プロモーターベクターからｓｈＲＮＡの同時の強固な発現を達成する信頼できる再現可能で効果的な方法であることが明らかにされている。これは、この程度での多重プロモーター要素の組合せが転写干渉（プロモーター間）の問題により受入れ難いという一般的な考えと対照的であるが、この問題はプロモーター間の反復要素およびその中のｓｈＲＮＡ配列における逆方向反復要素により細菌中にこれらのプラスミドを維持する問題によって悪化される。
【０１０４】
Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの選択：
実施例１：Ｂ型肝炎ＲＮＡの産生および複製を削減するｓｈＲＮＡの産生のためのトリシストロンＲＮＡポリメラーゼＩＩＩに基づく発現構築物。
３つの個別のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの独立した制御下にｓｈＲＮＡを標的とする３つの異なるＢ型肝炎を発現するように一連のプラスミドを構成した。Ｕ６および７ＳＫプロモーター／ｓｈＲＮＡカセットをベクターの多重クローニング部位において互いに隣接して配置したが、遠位クローニング部位（カナマイシン耐性遺伝子に隣接）を第３のプロモーター配列（Ｕ６プロモーターまたはＨ１プロモーターの第２のコピーのいずれか）のために使用した。各々のｓｈＲＮＡ要素の５’末端を、便利な制限部位、例えば、プロモーターの３’末端とｓｈＲＮＡ配列の開始との間に６ｎｔを導入することによって人工的に作り出されたＳａｌ  ＩまたはＨｉｎｄＩＩＩを使用して各々のプロモーターの３’末端と結合した。プロモーター要素の各々の配列は図４に示されている。トリシストロンベクターに配置され、２７９１、１９０７、および１７３７で識別された、ＨＢＶ保存領域由来の３つのｓｈＲＮＡ配列が図５に示されている。各々のｓｈＲＮＡｇは、ＨＢＶ配列の２１ｂｐで開始したのち、９個の塩基ループ要素（ＡＧＡＧＡＡＣＴＴ）、次いで第１の２１ｂｐの逆相補体である２１のｂｐ配列が続く。各々のプロモーターカセットは、転写ターミネーターとなる３’末端で５つのチミン残基の伸長を含有する。したがって、ｄｓＲＮＡヘアピンを含む予測転写産物は、実際に、追加の５’および３’配列を含有する。すなわち、６個の塩基から成る５’リーダー（例えば、Ｓａｌ  ＩもしくはＨｉｎｄ  ＩＩＩまたは他の選択認識配列）の後、ｄｓＲＮＡヘアピン配列が続いた後、短い３’末端Ｕ経路が続き、通常、２つ（１、２、３、もしくは４つ）のＵ残基が転写終結中に組込まれる。Ｓａｌ  ＩもしくはＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位の選択は便宜上のことであり、任意の数の他の制限部位、好ましくは、６または８つのカッター（例えば、Ａａｔ  ＩＩ、Ａｃｃ６５  Ｉ、Ａｃｉ  Ｉ、Ａｆｌ  ＩＩ、Ａｇｅ  Ｉ、Ａｐａ  Ｉ、ＡｐａＬ  Ｉ、Ａｓｃ  Ｉ、Ａｓｅ  Ｉ、ＡｓｉＳ  Ｉ、Ａｖｒ  ＩＩ、ＢａｍＨ  Ｉ、Ｂｃｌ  Ｉ、ＢｆｒＢ  Ｉ、Ｂｇｌ  ＩＩ、ＢｍｇＢ  Ｉ、ＢｓｅＹ  Ｉ、ＢｓｉＷ  Ｉ、ＢｓｐＤ  Ｉ、ＢｓｐＥ  Ｉ、ＢｓｐＨ  Ｉ、ＢｓｒＢ  Ｉ  ＢｓｒＧ  Ｉ、ＢｓｓＨ  ＩＩ、ＢｓｓＳ  Ｉ、ＢｓｔＢ  Ｉ、ＢｓｔＺ１７  Ｉ、Ｃｌａ  Ｉ、Ｄｒａ  Ｉ、Ｅａｇ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｖ、Ｆｓｅ  Ｉ、Ｆｓｐ  Ｉ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、Ｈｐａ  Ｉ、Ｋａｓ  Ｉ、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｍｆｅ  Ｉ、Ｍｌｕ  Ｉ、Ｍｓｃ  Ｉ、Ｎａｅ  Ｉ、Ｎａｒ  Ｉ、Ｎｃｏ  Ｉ、Ｎｄｅ  Ｉ、ＮｇｏＭ  ＩＶ、Ｎｈｅ  Ｉ、Ｎｏｔ  Ｉ、Ｎｒｕ  Ｉ、Ｎｓｉ  Ｉ、Ｐａｃ  Ｉ、ＰａｅＲ７  Ｉ、Ｐｍｅ  Ｉ、Ｐｍｌ  Ｉ、Ｐｓｔ  Ｉ、ＰｖｕＩ、Ｐｖｕ  ＩＩ、Ｓａｃ  Ｉ、Ｓａｃ  ＩＩ、Ｓａｌ  Ｉ、Ｓｂｆ  Ｉ、Ｓｃａ  Ｉ、Ｓｆｏ  Ｉ、Ｓｍａ  Ｉ、ＳｎａＢ  Ｉ、Ｓｐｅ  Ｉ、Ｓｐｈ  Ｉ、Ｓｓｐ  Ｉ、Ｓｔｕ  Ｉ、Ｓｗａ  Ｉ、Ｔｌｉ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉ、Ｘｈｏ  Ｉ、Ｘｍａ  Ｉ、好ましくはＡｖｒ  Ｉ（ＣＣＴＡＧＧ）、ＢａｍＨ  Ｉ（ＧＧＡＴＣＣ）、ＥｃｏＲ  Ｉ（ＧＡＡＴＴＣ）、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）、Ｋｐｎ  Ｉ（ＧＧＴＡＣＣ）、Ｎｄｅ  Ｉ（ＣＡＴＡＴＧ）、Ｎｏｔ  Ｉ（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）、Ｐｓｔ  Ｉ（ＣＴＧＣＡＧ）、Ｓａｌ  Ｉ（ＧＴＣＧＡＣ）、またはＸｂａ  Ｉ（ＴＣＴＡＧＡ））が代わりに使用されうるが、その場合、ｄｓＲＮＡヘアピン転写産物は異なる５’リーダー配列を含むことが認められるであろう。ｄｓＲＮＡヘアピンをフランキングする５’および３’転写産物配列の長さおよび組成物のこれらの差は、ｄｓＲＮＡヘアピンのｄｓＲＮＡ介在サイレンシングをもたらす能力に有害な影響を及ぼすようには思われなかったが、これは、合成ｄｓＲＮＡ二本鎖と異なり、外因性に発現されたｄｓＲＮＡヘアピン構築物が、多くの点、例えば、約１９−２９ｂｓ間のｄｓＲＮＡ「幹」の長さ、一本鎖ループの長さおよび組成物、追加の短い５’および／または３’配列の存在または非存在の点で変動にもかかわらず有効であることを示す。標的配列はＨＢＶの多数の異なる単離株（菌株）間で同一であるものを明示的に表すように選択されたが、参照のために、ｓｈＲＮＡ配列は元のＨＢＶ単離株ＡＹＷにマッピングされ、位置７７９で開始し、７９９を通じて伸長する配列を含むｓｈＲＮＡ  ７９９を除く、ｓｈＲＮＡ  ２７９１が単離株ＡＹＷ（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）登録番号Ｖ０１４６０）の位置２７９１で開始し、ｓｈＲＮＡ  １９０７がジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）基準配列等の位置１９０７で開始するようになりうる。保存ＨＢＶおよびＨＣＶ配列の選択については、例えば、国際公開第２００５／０１４８０６号パンフレット、２００５年２月１７日公開、および米国仮特許出願第６０／６３８，２９４号明細書、２００４年１２月２２日出願、「遺伝子サイレンシングのために有用な保存ＨＢＶおよびＨＣＶ配列（Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ＨＢＶ  ａｎｄ  ＨＣＶ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｕｓｅｆｕｌ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）」を参照。好ましくは、１９〜２９個のヌクレオチド、例えば、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９個の連続保存ヌクレオチドのＨＢＶ標的配列が、本明細書で開示されているように発現されるｄｓＲＮＡヘアピンにおいて使用するために選択されうる。本実施例の実験１において、プラスミドベクターは、７ＳＫプロモーター１つのコピーおよび６プロモーターの２つのコピーを含有する。実験２におけるベクターでは、３つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（７ＳＫおよびＵ６に加えてＨ１プロモーター）が使用される。両方の実験において、７ＳＫプロモーターの配向が逆である各々のプラスミドの別の変異体が使用される。本明細書の実施例では基本のＳＫプロモーターが使用されたが（図４Ａ）、しかし、７ＳＫ−ｅおよび７ＳＫ−４Ａ（それぞれ、図４ｄおよび４ｅ）と呼ばれる、７ＳＫプロモーターの２つの変異体の配列は、７ＳＫプロモーターが示されているところで置換されうる。したがって、本実施例で使用される一連のベクターは４つの異なるプラスミドを含み、４つのベクターすべては、ＨＢＶ  ＲＮＡがトランスフェクトされた組織培養細胞で生成される２つの実験系においてＨＢＶ  ＲＮＡ発現の削減における有効性について試験されている。第１の系では、ルシフェラーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡと結合される合成ＲＮＡ分子を生成するために使用される無関係の一連のプラスミド構築物（融合構築物）が使用される。評価段階にあるプラスミドベクターのＨＢＶ  ＲＮＡ融合構築物の発現を削減する能力は、トランスフェクトされた細胞において生成されるルシフェラーゼ酵素活性の量を測定することによって評価される。第２の実験系では、評価段階にあるプラスミドベクターであるＨＢＶレプリコンモデルが、クローン化ＨＢＶで共トランスフェクトされる。ＨＢＶ複製および機能を阻害するプラスミドベクターの能力は、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢＶ  ｓＡｇ）の測定によって評価される。
【０１０５】
ルシフェラーゼ融合アッセイにおけるベクターの評価。各々ベクターのＨＢＶ  ＲＮＡ配列の発現を抑制する能力を評価するために、ルシフェラーゼ酵素に対する完全コード配列の３’末端に付加されたＨＢＶ  ＲＮＡ部分をコードする一連のベクター（「Ｌｕｃ融合」ベクター）とヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞を共トランスフェクトした。融合アッセイにおけるこれらのベクターの調製および使用の方法は、国際公開第２００４／０７６６２９号パンフレット、２００４年９月１０日公開、「ＲＮＡｉ標的およびエフェクター分子の評価のための方法および構築物（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡｉ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」に開示されている。これらの実験において以下の通り５つの異なるｌｕｃ融合ベクターが使用された。Ｌｕｃ−ＡＹＭはＨＢＶのＡＹＷ菌株の完全ゲノム配列を含有し、ＬｕｃはＨＢＶ配列を欠く陰性対照ベクターであり、Ｌｕｃ−２７９１、Ｌｕｃ−１９０７およびＬｕｃ−１７３７は各々、それぞれ、ｓｈＲＮＡ配列２７９１、１９０７、および１７３７の標的を含有する短い（およそ２００ｂｐ）ＨＢＶ部分と融合したルシフェラーゼ遺伝子である。
【０１０６】
共トランスフェクションのために、細胞を６ウェルプレートへ接種し、それらのトランスフェクション時の細胞密集度が８０−９０％になるようにした。すべてのトランスフェクションをリポフェクタミン（商標）ポリ陽イオン性脂質／中性脂質リポソーム製剤（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してメーカの指示に従い行った。この実験では、各々Ｌｕｃ融合プラスミド２００ｎｇおよび実験プラスミド８００ｎｇと細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間に細胞を回収して溶解し、ブライト・グロ（Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ）（登録商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｉｍｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィンスコンシン州（ＷＩ））使用してルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性は、ｍｇ総タンパク質で割った相対発光量（ＲＬＵ）で表されている。
【０１０７】
これらの実験の結果は図３に示されている。ｓｈＲＮＡトリシストロンベクターの４つの形態すべては、ＨＢＶ配列を含有しないプラスミド対ＨＢＶ−ｌｕｃ融合プラスミド（Ｌｕｃ−ａｗｙ）によって得られたルシフェラーゼ活性値を比較すると明らかなようにＨＢＶ  ＲＮＡ発現における大幅な減少を示したが、すべてのｓｈＲＮＡ−プロモーターカセットがベクターのすべてのプロモーター構成において機能的であったわけではない。ｅｉＲＮＡベクターにおいてのみベクター番号４１がすべてルシフェラーゼ融合構築物におけるその同種試験配列をサイレンシングすることができる３つのｓｈＲＮＡであった。ここで留意すべきは、ベクター４０の５０との比較、および４１の５１との比較において、少なくとも１つのプロモーターｓｈＲＮＡカセットがカセットの配向を逆にすることによって修復されうることであるが、しかし、ベクター５０で確認されるように、１７３７ｓｈＲＮＡ機能の修復は、次いで、２７９１ｓｈＲＮＡの機能の喪失に付随して行われる。ベクター要素のすべての可能な置換および組合せは、ベクター４１によって例証される有効な産物を達成するために試験される必要はなかった。すなわち、目標は、３つの異なるプロモーターを使用し、１つもしくはそれ以上のカセットの配向を反復的方法で所望の結果が達成されるまで変化させることによって達成された。結果においてやはり留意すべきは、これらの実験がベクター構築物の各々の相対力を評価する条件下では行われなかったことであり、すなわち、各々のｓｈＲＮＡ産物の固有力およびその産生速度は考慮されなかった。実際に、ルシフェラーゼ活性値は、それらが３つのすべてのｓｈＲＮＡを発現したか、または２つのみを発現したかに関係なく、すべてのベクターによって同様の程度に減少する。しかし、抗ウイルス治療が多重核酸標的配列の（回避突然変異体への）組込みによって優れて提供されている本発明は、示されている他のベクターにおけるよりもベクター４１においてはるかに大規模に実施されている。
【０１０８】
ＨＢＶレプリコンモデルにおけるベクターの評価。この一連の実験では、Ｈｕｈ７細胞（ヒト肝細胞細胞系由来）を、評価される個別のエフェクターＲＮＡ構築物といっしょに、ＨＢＶの感染性分子クローンであるｐＨＢＶ２と共トランスフェクトする。トランスフェクションに使用された総ＤＮＡは２．５μｇであり、全トランスフェクションにおいて２．５μｇを維持するために可変量で、ｐＨＢＶ２  ５０ｎｇ、可変量の試験構築物（図６）、および不活性の「充填」ＤＮＡプラスミド（ｐＧＬ３、プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州（ＷＩ））で構成された。トランスフェクション後５〜６日の時点で、細胞培養培地を回収し、培地へ分泌されたＨＢＶ表面抗原（ｓＡｇ）の量をオースザイム・モノクローナル（Ａｕｓｙｍｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）キット（アボット・ラボラトリーズ社（Ａｂｏｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）製）を使用して測定した。ｓＡｇの定量は、ウイルス複製およびＨＢＶ感染細胞におけるウイルス転写の間接的測定として十分に受入れられる。２つの一連の実験を行ったが、各々は異なる量のｓｈＲＮＡ発現ベクター４０番および５０番の多重トランスフェクションを含む。ＨＢＶレプリコンのみを含有する対照トランスフェクションは、試験プラスミドを含まず、４０番および５０番のベクターの非存在下のｓＡｇ分泌の基準を提供する。簡単な「阻害率」計算が、試験プラスミドの存在下のｓＡｇ発現の比および対照（ＨＢＶレプリコンのみ）トランスフェクションにおけるｓＡｇ発現のレベルを取ることによって行われる。さらにデータの数学的変換およびグラフ表示によって、用量反応阻害曲線を構成し、ＩＣ５０値（５０％の表面抗原分泌が阻害されるベクターの濃度）を計算することが可能であったが、次いで、これにより多重試験におけるさまざまな試験ベクターの有効性の比較の手段の標準化が可能である。曲線、データ変換、およびＩＣ５０値は、ＥｎｚＦｉｔｔｅｒソフトウェア（バイオソフト（Ｂｉｏｓｏｆｔ）、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ、ミズリー州（ＭＯ）、米国（ＵＳＡ））を使用して生成された。
【０１０９】
これらの実験の結果は図６および図７に示されている。明らかに、ｓＡｇ発現の１００％に近い阻害が試験ベクターの中程度の用量（２５ｎｇ）で達成される。さらに、ｓＡｇ発現を大幅に減少させる（約３０〜４０％）にはきわめて少量の、１ｎｇで十分である。これらのプラスミドに対する用量反応のより詳細な分析が図７に示されているが、ここでは阻害効果の飽和が試験ベクターの中程度の用量で達成され、かつＩＣ５０値（阻害の５０％が達成されるベクターの濃度）がおよそ５ｎｇであることが明らかである。
【０１１０】
実施例２：Ｂ型肝炎ＲＮＡ産生および複製を削減するｓｈＲＮＡの生成のための４つのプロモーターＲＮＡポリメラーゼＩＩＩに基づく発現構築物。
図９は、４つのポリメラーゼＩＩＩプロモーターｓｈＲＮＡカセットを含有するベクターｐＨＢ４の図である。図のラベリングは、プロモーター名、関連ｓｈＲＮＡ（ＨＢＶゲノムの標的）、および各々のカセットの転写の方向を示す。ベクターは、ｓｈＲＮＡカセットを段階的に追加する反復法を使用して上記のように構成された。図１０におけるデータ（実施例１で使用されたものと基本的に同様のルシフェラーゼアッセイ）は、ベクターおよび測定可能な物質（ここではｓｈＲＮＡ−７９９構築物を含む、実施例１におけるようにルシフェラーゼ融合構築物）を供給された４つのプロモーター／ｓｈＲＮＡカセットすべてが細胞におけるその標的配列のサイレンシングにおいて活性であったことを示す。図１０における表は、ｐＨＢ４および陽性対照としての三通りの独立した実験を示し、単一ヘアピンベクターからの結果も示されている。図１２におけるデータは、同じ構築物が、試験ベクターおよびＨＢＶレプリコンでトランスフェクトされた細胞、および実施例１で説明されたＩＣ５０測定においてＨＢＶ遺伝子発現をサイレンシングし得たことを示す。図１２は、一連のベクター（図８に示されている１〜４個のｓｈＲＮＡ）の効力および活性が、細胞培養を複製するプラスミドのさまざまなインプット濃度で評価された実験結果を要約している。第一に、ＨＢＶ抗原の産生（表面抗原「ｓＡｇ」または「ｅ」抗原「ｅＡｇ」）は、ＨＢＶレプリコンのみを受ける細胞におけるＥＬＩＳＡイムノアッセイによって測定された。ベクターのいくつかの試験インプット量（濃度）の各々で、産生したＥＬＩＳＡ抗原の量を試験ベクターなしで産生したレベルと比較する。産生した抗原がベクターの供給を受けなかった細胞に対して５０％減少するベクターの濃度はＩＣ５０と定義される（５０％阻害を達成する阻害濃度）。ＩＣ５０値が低いほど薬剤または薬物はより強力である。図は、１つのプロモーター／ｓｈＲＮＡカセットベクターを４つのプロモーター／ｓｈＲＮＡカセットを含有するｐＨＢ４の例に増加させると、ＩＣ５０値が実質的に減少したことを示す。ここで留意すべきは、ＩＣ５０値が各々ｓｈＲＮＡ分子の相対効力および転写レベルによっても影響されうるとともに、ベクターの濃度のみに対する単純な関係を反映することはなかったことであり、これは実際に４つの薬剤が細胞に入り、４つのコードされたｄｓＲＮＡ分子を発現した後に機能した。言い換えれば、効力の増加は、ベクターによって生成された総ｓｈＲＮＡ転写産物が相当に多数であることだけではなく、各々のｓｈＲＮＡが標的ウイルスＲＮＡ分子の分解によってｓＡｇまたはｅＡｇの削減をもたらす必要がある個別の効力も表している。図１２のＩＣ５０データを図１０のルシフェラーゼレポーターデータとともに総括すると、ｓｈＲＮＡカセットの漸進的な追加は明らかに量的な形でベクターの効力を増大させ、さらにＨＢＶ標的の４つの異なった部位を阻害することによってＨＢＶ標的に対して薬理活性を増大させたことが明らかである。しかし、本発明の多重ポリメラーゼＩＩＩ発現構築物の多重の個別の抗ウイルスｄｓＲＮＡヘアピン分子を発現する能力がそれ自体、顕著な値であるが、それが「効力」の関連増加によるものではないことを認めることが重要である。抗ウイルス効果のレベルが高い場合、各々の追加のｄｓＲＮＡ分子で確認されるウイルス阻害における付加的な量的増大は、本質的に、本発明の構築物の、実質的に多剤レジメンを送達する能力よりも重要ではないとみられるが、これはウイルス耐性の発生に高い耐性があるという固有の利点を示す。
【０１１１】
実施例３：単一プロモーターが短いＲＮＡを含有する２ヘアピン（バイフィンガー）を発現する多重ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター。
多重Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターベクターを含む本発明の別の実施形態において、単一プロモーターから２つ以上のｓｈＲＮＡエフェクター分子を発現することが可能であり、したがって、ＲＮＡ配列の数を増大させることにより、プロモーター要素を大節約して標的とすることが可能である。例えば、本発明を使用し、２つのみのＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターを使用して３つのｓｈＲＮＡ分子を発現し、３つのみのＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターを使用して４、５、もしくは６つのｓｈＲＮＡ分子を発現し、４つのＰｏｌ  ＩＩＩプロモーター等を使用して５、６、７、もしくは８つのｓｈＲＮＡ分子を発現することができる。「二重ヘアピン」またはバイフィンガーｄｓＲＮＡの発現は、ここでは、ＨＢＶ標的ｓｈＲＮＡコード配列の２つ（図５）が短いスペーサー要素によって接続され、２つの活性ｓｈＲＮＡ要素を含有する１つの長いＲＮＡ分子（長いスペーサーを使用しておよそ１４０個のヌクレオチド、短いスペーサーを使用しておよそ６０個の塩基の全長）を生成するＵ６プロモーターベクターを作成することによって明らかにされ、この場合に１７３７および２７９１配列を含む。実施例１に記載されたルシフェラーゼ融合標的をこの実験では使用し、結果は図１３の底面に示されている。二重ヘアピン構築物の両方の形態は、ルシフェラーゼ融合アッセイにおける両方の標的配列の大幅な分解の仲介において有効であった。これらの構築物におけるスペーサー配列の役割は表面上、ヘアピン形成配列を２つの異なったドメインへ分離し、一本鎖エンドヌクレアーゼによる開裂を促進することである。当業者は、スペーサーの多くの変異体の長さおよび配列により、適切な二重ヘアピン構造が二重標的配列分解を形成し、これをもたらすことが可能であることを認めるであろう。しかし、それ自体、二次構造を形成し、またはフランキングｓｈＲＮＡの配列と対をなすことが可能である長さおよび組成物のスペーサー配列が、二重ヘアピンの機能に干渉する可能性が高いことも理解されるであろう。
【０１１２】
実施例４：医薬製剤と結合したＤＮＡベクターはマウス肝における取込みおよび遺伝子発現を仲介する。
サイレンシングＨＢＶ遺伝子発現について本明細書で開示された多重プロモーター発明が医薬品として適切である重要な適応が、ＨＢＶ表面抗原ＲＮＡおよびタンパク質を生成したＤＮＡベクターといっしょにマウスの血流へそれらを直接注射することによって明らかにされた。これらの実験では、ｐＨＢ４ベクター（図９を参照）を、具体的には肝におけるＨＢＶ表面抗原を発現したｓＡｇプラスミドといっしょに流体力学的尾静脈注射によってマウスへ送達した（このプラスミドは、アルブミンプロモーターの制御下にｓＡｇを発現し、チサリ（Ｃｈｉｓａｒｉ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６０：８８０−８７頁（１９８６年）によって記載されたプラスミドｐＡｌｂ−ｈＧＨ由来であった）。流体力学的尾静脈注射は当業者によって、生きた動物における外因性薬剤で肝組織を迅速に灌流するために一般的に使用されている。ｓＡｇはこのモデルにおける肝細胞によって分泌されるため、マウスの血清中でＤＮＡの注射後４日間測定された。ＣＭＶプロモーター下にルシフェラーゼを発現する第３のベクターを同時注入し、ｓＡｇ値の肝ルシフェラーゼへの正常化を可能にし、それによって、肝における全ＤＮＡ取込みおよびＤＮＡの発現を制御した。この実験の結果は図１４に示されている。２組のマウスを同時注射のために使用し、それぞれ、０．０７および０．０８ＯＤ単位の血清ｓＡｇの値を得た。ｓｈＲＮＡ  ｐＨＢ４ベクターを含まないｓＡｇ発現ベクターのみの導入により０．４７ＯＤ単位の平均値が得られたため、ｓＡｇのサイレンシングがｐＨＢ４によりｉｎ  ｖｉｖｏで劇的に達成されたことが明らかである。
【０１１３】
実施例５：７ＳＫプロモーター／ｓｈＲＮＡ連結配列の変更がｓｈＲＮＡ発現ベクターの効力を実質的に増大させる。
ヒト７ＳＫプロモーターはその機能のために「上流」配列（転写の開始部位のその５’）に主に依存していることが報告されているが、転写開始部位の下流に位置したヌクレオチド配列もプロモーターの機能を調節しうる（サンドロック（Ｓａｎｄｒｏｃｋ）とベネッケ（Ｂｅｎｅｃｋｅ）、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ．８：１０５−１４頁（１９９９年）およびコパー−エムデ（Ｋｏｐｅｒ−Ｅｍｄｅ）ら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８５：７９１−９４頁（２００４年）を参照。出願人は以前、遺伝子サイレンシングのための配列を標的とするｄｓＲＮＡヘアピン分子が、標的配列に対応しないいくつかの追加のヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写開始部位と標的配列の開始との間に置かれる場合でもしばしば依然として機能的であることを確認した。これにより、制限部位またはスペーサー要素が追加されているＰｏｌ  ＩＩＩプロモーター／ｓｈＲＮＡカセットの改善された機能の維持が可能である。出願人は、天然プロモーターの第１の２３４個の塩基を使用し、次いでＳａｌ  Ｉ制限部位認識配列（または、好ましくは、制限部位認識配列を含む別の６個のヌクレオチド）を含む１０個の合成塩基、および４Ａ残基を使用する新規７ＳＫプロモーター要素（図４ｅ）を作成した。この新規プロモーター配列要素は７ＳＫ４ａと呼ばれ、基本的に転写される配列ＧＴＣＧＡＣＡＡＡＡを挿入し、したがって、図５に示されているｓｈＲＮＡ分子の５’末端に付着されている。図１１に示されているように、３つのｓｈＲＮＡ配列（１７３７、１９４３、および７８９）を３つの異なるプロモーター状況、すなわち、Ｕ６プロモーター（図４ｃ）、７ＳＫプロモーター（図４ａ）、および７ＳＫ４ａプロモーター（図４ｅ）におけるＨＢＶ抗原発現に対するサイレンシング効果について試験した。９つの構築物の効力は、先の実施例で記載されたｓＡｇおよびｅＡｇのＩＣ５０の測定によって評価された。試験された３つのｓｈＲＮＡ配列のすべてにより、７ＳＫ４ａ配置はその他の２つのプロモーターより大幅に低いＩＣ５０値を示した。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】３種類の異なるＨＢＶ由来のショートヘアピンＲＮＡ分子の発現を制御する２つの異なる真核ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含む３つのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含有するトリシストロンプラスミドベクターを示す概略図である。７ＳＫプロモーターは、ｓｈＲＮＡ１７３７の発現を促進し、Ｕ６プロモーターの１つのコピーがｓｈ２７９１を促進し、かつＵ６プロモーターの第２のコピーはｓｈＲＮＡ１９０７の発現を促進する。Ｎｏ．４０のベクターにおいて、７ＳＫ＿１７３７転写ユニットは、Ｕ６＿２７９１およびＵ６＿１９０７転写ユニットと同じ機能的配向で配置されている。５０番のベクターにおいて、７ＳＫ＿１７３７転写ユニットの配向は、その転写の方向がＵ６＿２７９１転写ユニットの方へ配向されるように「フリップ」されている。
【図２】３種類の異なるＨＢＶ由来のショートヘアピンＲＮＡ分子の発現を制御する３つの異なる真核ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含むトリシストロンプラスミドベクターを示す概略図である。７ＳＫプロモーターは、ｓｈＲＮＡ１７３７の発現を促進し、Ｕ６プロモーターがｓｈＲＮＡ２７９１を促進し、かつＨ１プロモーターはｓｈＲＮＡ１９０７の発現を促進する。Ｎｏ．４１のベクターにおいて、７ＳＫ＿１７３７転写ユニットは、Ｕ６＿２７９１およびＨ１＿１９０７転写ユニットと同じ機能的配向で配置されている。Ｎｏ．５１のベクターにおいて、７ＳＫ＿１７３７転写ユニットの配向は、その転写の方向がＵ６＿２７９１転写ユニットの方へ配向されるように「フリップ」されている。
【図３】３種類の異なる短いｄｓＲＮＡヘアピン分子を発現するトリシストロン構築物のトランスフェクションによるＢ型肝炎標的ＲＮＡレベルの特異的削減を示す結果を示す図である。アッセイではＨｅｐＢ配列を機能的ルシフェラーゼｍＲＮＡと融合させる合成ＲＮＡ標的が使用される（詳細については融合アッセイおよび合成構築物に関する本文を参照）。
【図４ａ−４ｅ】それぞれ、本発明のトリシストロン構築物において使用される、ヒト７ＳＫ（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）登録番号Ｘ０４９９２、塩基１−２３４［ａ、ｅ］、塩基１−２４４［ｄ］）、ヒトＨ１（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）登録番号Ｘ１６６１２、塩基２５０−３７５）、およびヒトＵ６（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）登録番号Ｍ１４４８６、塩基６５−３２９）プロモーターの配列を示す図である。ｓｈＲＮＡ配列の挿入のために使用される制限部位（Ｓａｌ  Ｉの例が示されている）が大文字の活字で示されている。他の制限部位配列は要望通りに置換されうる。ａおよびｄにおける７ＳＫプロモーターは、それぞれ、塩基１−２３４および塩基１−２４４からの天然プロモーターの配列を表すが、ｅにおけるプロモーターは新規の合成改善例であり、４Ａ残基は強化機能のための制限部位の付加３’である。
【図５】本出願において開示されているベクターによるＨＢＶに基づくｓｈＲＮＡ発現をコードするＤＮＡ配列（５’〜３’）を示す図である。示されている配列は、高保存ＨＢＶ標的配列に対応する２１個の塩基（ｓｈＲＮＡ１９０７における１９個の塩基）の後、ヘアピンのループ部をコードする９個の塩基、次いで最初の２１個の塩基の逆相補体であり、したがって最初の２１個の塩基と塩基対を作ることによって二本鎖幹領域を形成する２１個の塩基から成る。ｄｓＲＮＡヘアピン分子に存在する追加の５’および３’配列は示されていない。すなわち、制限部位配列または転写開始部位のプロモーター配列下流から転写される５’リーダーヌクレオチド、および転写終結中にＲＮＡ転写産物へ組込まれる標的と相同ではない多重３’末端Ｔ（Ｕ）残基。
【図６】ＨＢＶ複製の細胞培養モデルにおけるトリシストロン構築物によるＨＢＶ表面抗原発現のレプリコンのみの制御にして計算された阻害率（ＩＣ５０値）を示す表である。
【図７】トリシストロンベクター構築物のさまざまな量とＨＢＶ表面抗原発現の阻害との間の用量反応関係を示すグラフである。７ａ）試験ベクター４０によるＨＢＶ  ｓＡｇ阻害に対する用量反応およびＩＣ５０値の測定。７ｂ）試験ベクター５０によるＨＢＶ  ｓＡｇ阻害に対する用量反応およびＩＣ５０値の測定。
【図８】ポリメラーゼＩＩＩプロモーター／ｓｈＲＮＡカセットの数を示す１〜４で番号付けされた段階的一連のｓｈＲＮＡ発現ベクターを示す図である。各々ベクターは、複製の原核ｐＵＣ由来由来、および本文に記載されているキメラカナマイシン耐性遺伝子を含有する。ベクター４に存在する２つの修飾７ＳＫプロモーター（７ＳＫ−４Ａ）は、４ａまたは４Ａ命名法によってｓｈＲＮＡ表記の一部として示されている。
【図９】４つのポリメラーゼＩＩＩプロモーターを使用して４つの短いｄｓＲＮＡヘアピン分子、すなわち、Ｕ６、７ＳＫ、および変形７ＳＫ−４Ａプロモーターの２つのコピーを発現させるｐＨＢ４ベクターを示す図である。５シストロンベクター、ｐＨＢ５も、４つの７ＳＫプロモーター（図４ａに記載されている３つの変形７ＳＫ−４Ａプロモーターおよび１つの７ＳＫプロモーター）および１つのＵ６プロモーターを含む―５つのポリメラーゼＩＩＩプロモーターを使用し、５種類の短いｄｓＲＮＡヘアピン分子を発現させるために構成されたが、各々は高保存ＨＢＶ配列と相同および相補の二本鎖幹領域を含む。
【図１０】ルシフェラーゼレポーター構築物に存在するＨＢＶ配列標的に対するｐＨＢ４ベクターおよび単一ｓｈＲＮＡ発現ベクターの試験結果を示す表である。ｐＨＢ４ベクターについては、３つの独立した実験が示されており、各々の値は３つのトランスフェクション複製の平均を含み、その中の各々の値は３つのルシフェラーゼ測定複製アッセイを含む。示されている値は、１００を乗じた、レポーター構築物のみのトランスフェクションによって生じた発光量値に対するｓｈＲＮＡベクターの存在下に検出された発光量の比である。トランスフェクションは、リポフェクタミン（商標）（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．））で実行され、ルシフェラーゼアッセイ試薬はプロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｉｎｃ）から得られた。
【図１１】ＨＢＶレプリコンを発現する細胞におけるＨＢＶ表面抗原（ｓＡｇ）およびｅ抗原（ｅＡｇ）の発現時に３種類の異なるプロモーター要素、Ｕ６、７ＳＫ、または７ＳＫ−４ａを３種類のＨＢＶ  ｄｓＲＮＡヘアピン配列（１７３７、１９４３、および７９９）と結合する効果を示す表である。ｓＡｇアッセイの説明について本文を参照。ｅＡｇ  ＥＬＩＳＡアッセイは基本的に、ｅＡｇ抗体がｓＡｇ抗体で置換されることを除きｓＡｇアッセイと同様である。ＩＣ５０値はｍｌあたりｎｇで示されている。
【図１２】図８に図示されているベクターに対応する、プラスミドベクターにおけるプロモーター／ＨＢＶ  ｓｈＲＮＡ発現カセットの数の増大（１〜４）とともにｓＡｇおよびｅＡｇ阻害に対するＩＣ５０値の漸進的減少を示す表である。
【図１３】単一Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターから転写される単一ＲＮＡ分子（バイフィンガーおよび二重ヘアピン構築物）２つの異なるｓｈＲＮＡドメインの発現を示す図である。図の上部は、ＲＮＡの短いスペーサーおよび長いスペーサーの図を示す。表は、完全なＨＢＶゲノムを含有するルシフェラーゼレポーターおよび１７３７または２７９１標的配列のみを含有するレポーターの阻害のレベルを示す。短いスペーサーはヘアピン間に１６ｎｔを含有し、長いスペーサーはヘアピン間に４２ｎｔを含有する。データは、１００を乗じた、ルシフェラーゼのみ（非ＨＢＶ配列）レポーター構築物に対する各々レポーター構築物の発光量の比として表されている。一態様において、本発明の発現構築物は、この図１３に示されているように、その中に含まれる１つもしくはそれ以上のポリメラーゼＩＩＩプロモーター転写ユニットからの２つ、３つ、もしくはそれ以上のｄｓＲＮＡヘアピンを発現しうる。
【図１４】４種類の異なるＨＢＶ  ｄｓＲＮＡヘアピン分子を発現する同時注入ｐＨＢ４ベクターの非存在（充実棒）または存在下の肝特異的プロモーターベクターからのＨＢＶ  ｓＡＧのｉｎ  ｖｉｖｏ発現を示す図である。データは、２つの複製群とともに１群３匹のマウスの平均である（実験１および実験２）。値は、ルシフェラーゼ光量に対するｓＡｇ  ＥＬＩＳＡ光学密度値、すなわち同時注入ルシフェラーゼ発現プラスミドに標準化した比として示されている（本文を参照）。ルシフェラーゼ値は、肝細胞から測定されるが、ｓＡｇアッセイはマウス血清で実行された。
【図１５】何百もの利用可能なＨＢＶ単離株のうちの配列の保存領域の位置を示し（本文を参照）、かつ本出願に記載されている選択ＨＢＶ  ｄｓＲＮＡヘアピン標的に対応する配列および領域の位置を示す概略図である。この図は、ＨＢＶの共線的転写産物の性質を示し、かつ各々の転写産物から製造されるタンパク質産物を示す。したがって、例えば、１７３７ｄｓＲＮＡ  ヘアピンのみがＨＢＶ  Ｘタンパク質を標的することができるが、例えば、７９９  ｄｓＲＮＡヘアピンがＨＢＶ  ｅＡｇ発現を阻害しうるが、ＨＢＶ  ｓＡｇ発現に直接干渉することができないことが確認されうる。したがって、ＨＢＶに対するｄｓＲＮＡ分子のさまざまな選択を同時に送達することによって、本発明の発現構築物は、高レベルのウイルス阻害に寄与するだけではなく、ウイルス耐性の発生に対して不利に作用するＨＢＶに対する多剤レジメンを提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ１】
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【図７Ａ２】
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【図７Ｂ１】
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【図７Ｂ２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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