(57)【要約】  本発明は、糖新生遺伝子の炭素異化代謝産物抑制（ＣＣＲ）を媒介する新規遺伝子に関する。さらに、前記遺伝子によってコードされたポリペプチドおよび標的発酵産物の製造のための方法における前記遺伝子の使用が提供される。かかる微生物を発生させるための方法も本発明によって提供される。本発明は、遺伝子操作された微生物および標的発酵産物の製造のためのその使用にも関するが、糖新生遺伝子は前記微生物内のＣＣＲから解放される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）糖新生遺伝子の炭素異化代謝産物抑制を媒介するタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列、
（ｂ）（ａ）の生物学的活性の断片、誘導体、変異体、およびオルソログより成る群から選択されるＤＮＡ配列、
（ｃ）（ａ）と実質的に相同であるＤＮＡ配列、
（ｄ）配列番号２または配列番号４によって表されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、
（ｅ）ストリンジェントなハイブリダイジング条件下に（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）のＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができるＤＮＡ配列
より成る群から選択されるＤＮＡ配列を含んで成るポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記遺伝子が配列番号１または配列番号３から選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
ｐｃｋＡおよびｇａｐＢの炭素異化代謝産物抑制が媒介される、先行請求項のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
ｙｑｚＢ遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログを含有する微生物から得られる、先行請求項のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から得られる、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
少なくとも１つの突然変異を有する先行請求項のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドであって、前記突然変異が、野生型対立遺伝子の代わりに微生物において存在する場合に糖新生遺伝子の炭素異化代謝産物抑制からの解放をもたらすポリヌクレオチド。
【請求項７】
先行請求項のいずれか一項のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド。
【請求項８】
配列番号２もしくは４または少なくとも７０％相同であるポリペプチドによって表される、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
少なくとも１つの突然変異を含んで成る遺伝子操作された微生物であって、前記突然変異が前記微生物における糖新生遺伝子の炭素異化代謝産物抑制からの解放をもたらす、遺伝子操作された微生物。
【請求項１０】
請求項６に記載の突然変異ポリヌクレオチドを含んで成る、請求項９に記載の遺伝子操作された微生物。
【請求項１１】
ｐｃｋＡおよびｇａｐＢ遺伝子が炭素異化代謝産物抑制から解放される、請求項９または１０に記載の遺伝子操作された微生物。
【請求項１２】
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、スタヒロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、およびストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属より成る群から選択される、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。
【請求項１３】
Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、請求項１２に記載の遺伝子操作された微生物。
【請求項１４】
糖新生遺伝子の炭素異化代謝産物抑制の媒介のための請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドが、糖新生遺伝子の炭素異化代謝産物抑制からの解放をもたらす少なくとも１つの突然変異を有する、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
微生物における糖新生遺伝子の炭素異化代謝産物抑制のメディエータをコード化する破壊内在性遺伝子の製造のための方法であって、前記微生物が請求項１に記載のポリヌクレオチドを含んで成り、前記方法が、糖新生遺伝子の炭素異化代謝産物抑制からの解放をもたらすようにして前記ポリヌクレオチドを変化させるステップを含んで成る方法。
【請求項１７】
前記微生物が炭素異化代謝産物抑制媒介活性の減少した前記ポリペプチドを産生し、前記微生物内で糖新生遺伝子の炭素異化代謝産物抑制からの解放をもたらすように前記微生物を変化させるステップを含んで成る、微生物における請求項７に記載のポリペプチドの製造のための方法。
【請求項１８】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含んで成る内在性遺伝子を含有する微生物の製造のための方法であって、前記内在性遺伝子が発現されずまたは破壊され、糖新生遺伝子の炭素異化代謝産物抑制からの解放をもたらすように前記微生物を変化させるステップを含んで成る方法。
【請求項１９】
前記糖新生遺伝子ｐｃｋＡおよびｇａｐＢが、遺伝子産物ｙｑｚＢによって媒介される炭素異化代謝産物抑制から解放される、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
請求項９〜１３のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物、または請求項１８の方法によって製造される微生物を使用する標的発酵産物の調製のための方法。
【請求項２１】
前記標的発酵産物がリボフラビン、パントテン酸、ビオチン、チアミン、葉酸、ピリドキシン、およびアミノ酸より成る群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記微生物がＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記微生物がＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＲＢ５０：：［ｐＲＦ６９］である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）請求項９〜１３のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物、または請求項１８の方法によって製造される微生物を提供するステップと、
（ｂ）標的発酵産物の発生を可能にする条件下に（ａ）の微生物を培養するステップと、
（ｃ）標的発酵産物の単離と
を含んで成る、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、新規ヌクレオチド配列、形質転換微生物、および標的発酵産物の調製のための前記ヌクレオチド配列の使用に関する。かかる微生物を発生させるための方法も本発明によって提供される。
【０００２】
より具体的には、本発明は、新規遺伝子、すなわち、例えば、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子（ｐｃｋＡ）またはＮＡＤＰ＋依存グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇａｐＢ）などの糖新生遺伝子の発現に関与するｙｑｚＢおよびｙｑｆＬ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｌｉｓｔ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ＳｕｂｔｉＬｉｓｔ）に関するが、ｙｑｚＢおよびｙｑｆＬ遺伝子産物が糖新生遺伝子の炭素異化代謝産物抑制を媒介する。炭素異化代謝産物抑制（ＣＣＲ）は、炭素源の取込みおよび異なる炭素源のアベイラビリティに反応したさらなる代謝に関与する多数の遺伝子の発現を制御する細菌における重要な調節機序である。Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における公知のＣＣＲ調節因子がＣｃｐＡおよびその共調節因子ＨＰｒおよびＣｒｈ、ＣｃｐＢ、およびＣｃｐＣである。
【０００３】
糖新生遺伝子は、糖新生と呼ばれる主要な代謝経路に関与するが、ここで糖新生多素源、例えば、コハク酸塩またはリンゴ酸塩は、限定された数の前駆体代謝産物に変換される。かかる前駆体代謝産物の例は、グルコース−６−リン酸、フルクトース−６−リン酸、リボース−５−リン酸、エリトロース−４−リン酸、トリオースリン酸、３−ホスホグリセリン酸塩、およびホスホエノールピルビン酸である。前駆体代謝産物からアミノ酸、ヌクレオチド、または脂肪酸などバイオマス産生の重要な構成要素が生成される。糖新生経路の第１の特定ステップは、オキシロ酢酸をホスホエノールピルビン酸に脱カルボキシル化するｐｃｋＡによってコードされたホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼによって触媒される。別の酵素がバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における糖新生に関与し、おそらく多くの他の細菌が１，３−ビスホスホグリセリン酸塩の３−ホスホグリセルアルデヒドへのＮＡＤＰＨ／Ｈ＋依存変換を触媒するｇａｐＢ遺伝子産物である。糖新生経路の他の酵素は、グルコース、フルクトース、およびソルビトールなどの解糖炭素源による成長条件下に活性である、解糖経路の対応する酵素と共有される。ｐｃｋＡおよびｇａｐＢ合成はＣＣＲにさらされ、すなわち、ｐｃｋＡおよびｇａｐＢ合成は解糖炭素源による成長条件下にきわめて低いが、糖新生中に強く活性化される。
【０００４】
ｙｑｚＢおよびｙｑｆＬ遺伝子は、ｐｃｋＡおよびｇａｐＢなど糖新生遺伝子のＣＣＲに関与することがわかっている。
【０００５】
具体的には、本発明は、（ａ）糖新生遺伝子の炭素異化代謝産物抑制を媒介するタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列と、（ｂ）（ａ）の生物学的活性の断片、誘導体、変異体、およびオルソログより成る群から選択されるＤＮＡ配列と、（ｃ）（ａ）と実質的に相同であるＤＮＡ配列と、（ｄ）配列番号２または配列番号４によって表されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と、（ｅ）ストリンジェントなハイブリダイジング条件下に（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）のＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができるＤＮＡ配列とより成る群から選択されるＤＮＡ配列を含んで成るポリヌクレオチドに関する。
【０００６】
１つの実施形態において、上記のポリヌクレオチドは、配列番号２によって表されるタンパク質をコード化する配列番号１によって表されるｙｑｚＢ遺伝子を含んで成る。
【０００７】
別の実施形態において、上記のポリヌクレオチドは、配列番号４によって表されるタンパク質をコード化する配列番号３によって表されるｙｑｆＬ遺伝子を含んで成る。
【０００８】
両方の遺伝子ｙｑｚＢおよびｙｑｆＬは、例えば、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における共通のオペロンの一部であり、または独立して異なるプロモーターから転写されうる。
【０００９】
糖新生遺伝子は、糖新生経路、すなわち、糖新生基質の前駆体代謝産物への変換に関与するタンパク質をコードする遺伝子でありうる。かかる遺伝子の例がｐｃｋＡおよびｇａｐＢである。
【００１０】
本明細書で使用される「糖新生遺伝子の炭素異化代謝産物抑制を媒介する」タンパク質をコード化する遺伝子は、前記タンパク質が、例えば、糖新生遺伝子の発現のレプレッサーとして作用するなど、直接または間接的に糖新生遺伝子の発現に影響を及ぼすことを意味する。ｙｑｚＢ遺伝子産物は、糖新生に関与する遺伝子、例えば、ｐｃｋＡおよびｇａｐＢの発現のレプレッサーとして作用することによってＣＣＲを媒介する。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、好ましくは、単離された形で提供され、かつ好ましくは、同種に精製される。「単離された」という語は、物質がその最初の環境（例えば、それが天然起源である場合には天然環境）から除去されていることを意味する。例えば、生体内に存在する天然起源のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然系において共存する物質の一部または全部から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。かかるポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり、かつ／またはかかるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部でありうるが、それでもかかるベクターまたは組成物がその天然環境の一部でないという点で単離されうる。
【００１１】
ポリペプチドの生物学的活性の断片または誘導体は、本発明のかかるポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性、すなわち、糖新生遺伝子のメディエータとしての機能を保持するポリペプチドを意味する。ポリヌクレオチドの生物学的活性の断片または誘導体は、かかるポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを意味する。
【００１２】
本明細書で使用される「相同」は、２つのポリマー分子間、例えば、２つの核酸分子、例えば、２つのＤＮＡまたはＲＮＡ分子、または２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列類似性を指す。２つの分子の両方におけるサブユニット位置が同じモノマーサブユニットによって占められていると、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々における位置がアデニンによって占められている場合は、それらはその位置で相同である。配列のアラインメントを調節することのよって「ベストフィット」相同を達成することができる。２つの配列間の相同は、マッチングまたは相同位置の数の関数であり、例えば、２つの化合物の配列における位置の半分（例えば、長さがポリマー１０個のサブユニットにおける５つの位置）が相同である場合は、２つの配列は５０％相同であり、位置の９０％、例えば、１０のうち９つがマッチし、または相同である場合は、２つの配列は９０％の相同を共有する。相同配列間に非相同配列のギャップがありうる。「実質的に相同」である配列は、保存位置によってのみ互いに異なる配列である。例えば、置換が核酸配列にある場合、置換はその位置でアミノ酸の変化を誘発せず、または置換は結果として保存アミノ酸置換をもたらす。「保存アミノ酸置換」は、例えば、同じクラスの別のものに対する１つのアミノ酸の置換（例えば、疎水性、電荷、ｐＫａ、または他の配座または化学特性の特徴を共有するアミノ酸、例えば、ロイシンに対するバリン、リシンに対するアルギニン）、または（上記の）ポリペプチドの生物学的活性を破壊することがないアミノ酸配列の位置に配置された１つもしくはそれ以上の非保存アミノ酸置換、欠失、または挿入によるものである。多重ドメインタンパク質の１つのドメインの生物学的活性を削減または変化させるが、タンパク質の第２のドメインにおける第２の生物学的活性を保存する修飾によって、それが異なる場合は、アミノ酸配列が本発明の範囲に含まれる。
【００１３】
一般に、例えば、配列番号１または３によって表されるＤＮＡなど本発明のタンパク質をコード化するＤＮＡ配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、かつ最も好ましくは少なくとも９８％相同である場合には、核酸配列が本発明の範囲内であるとみなされる。例えば、配列番号２または４によって表されるポリペプチドなど本発明のポリヌクレオチド配列によってコード化されたポリペプチドと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、かつ最も好ましくは少なくとも９８％相同である場合には、ポリペプチドが本発明の範囲内にあるとみなされる。
【００１４】
本発明は、例えば、配列番号２または４によって表されるポリペプチドなど、本発明のポリヌクレオチド配列によってコード化されたポリペプチドと少なくとも２５％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、かつ最も好ましくは少なくとも９８％同一であるポリペプチドも包含する。
【００１５】
２つのポリペプチドは、２つの配列におけるアミノ酸残基の配列が、下記の通り最大限一致のために整列して同じである場合には「同一」であると言われる。２つもしくはそれ以上のポリペプチド配列の文脈で「同一」または「同一性」率という語は、当業界で周知の配列比較アルゴリズム使用し、またはマニュアルのアラインメントおよび目視点検によって測定される比較ウィンドウに対して最大限の一致のために比較され整列されると、同じである、または同じである特定の割合のアミノ酸残基を有する２つもしくはそれ以上の配列またはサブ配列を指す。
【００１６】
本明細書で使用される「比較ウィンドウ」は、２０〜６００、通常、約５０〜約２００、より通常、約１００〜約１５０より成る群から選択される隣接位置の数のいずれか１つの部分への言及を含むが、ここで２つの配列が最適に整列した後に隣接位置の同じ数の基準配列と配列が比較されうる。
【００１７】
本明細書で使用される本発明のポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然起源の対立遺伝子変異体またはポリヌクレオチドの非天然起源変異体でありうる。当業界で周知の通り、対立遺伝子変異体は、コードされたポリペプチドの機能を実質的に変化させることがない、１つもしくはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失、または付加を有するポリヌクレオチド配列の別の形である。
【００１８】
本発明のポリヌクレオチドの変異体および相同体に対応するポリヌクレオチドは、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に標準ハイブリダイゼーション法に記載のハイブリダイゼーションプローブとして本明細書に開示されているＤＮＡ配列またはそれの適切な断片を使用し、本明細書に開示されている核酸とのその相同に基づき単離されうる。
【００１９】
「ストリンジェントな条件」下に本明細書で識別されたポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし、同じ機能、すなわち、糖新生遺伝子の炭素異化代謝産物抑制の媒介を保持する核酸は、本発明の範囲内である。「ストリンジェントな条件」は当業界で周知であり、例えば、その両方が参照により本明細書で援用される、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、１９８９年、およびＳｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、オーズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編を参照。ストリンジェントな条件は配列依存であり、異なる環境下に異なる。長い配列は特異的に高温でハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの広範囲に及ぶ手引きがチッセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ、「ハイブリダイゼーションの原理の概観および核酸アッセイの方法（Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ）」（１９９３年）において見られる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度ｐＨで特定の配列に対する熱融点（Ｔｍ）より低い約５−１０℃であるように選択される。Ｔｍは、標的を補完するプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度（規定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下）である（標的配列がＴｍで過剰に存在すると、プローブの５０％は平衡状態で占められる）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、通常、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）、および温度が短いプローブ（例えば、１０〜５０個のヌクレオチド）で少なくとも約３０℃、かつ長いプローブ（例えば、５０個を超えるヌクレオチド）で少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の付加でも達成されうる。この開示の目的のために、かかるハイブリダイゼーションのための適切な「ストリンジェントな条件」は、３７℃下、４０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の緩衝液中のハイブリダイゼーション、および少なくとも約５０℃、通常、約５５℃〜約６０℃の温度で２０分間、または平衡条件で０．２Ｘ  ＳＳＣ中での少なくとも１回の洗浄を含むものである。陽性ハイブリダイゼーションが背景のレベルの少なくとも２倍以上である。当業者は、別のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が使用され、高いストリンジェンシーおよび洗浄条件を含む同様のストリンジェンシーの条件を提供できることを容易に認識するであろう。
【００２０】
本発明の単離ポリヌクレオチドは、多くの細菌において確認されうるように、ｙｑｚＢ遺伝子またはそれのホモログもしくはオルソログを含有する微生物から獲得されうる。かかる微生物の非限定的例は、例えば、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、ゲオバシラス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、Ｂ．アントラシス（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）などのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えばＳ．オレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓ．エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）などのスタフィロコッカス属、例えば、Ｃ．ジフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、Ｃ．パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、Ｃ．テタニ（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）などのクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、Ｅ．フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）などのエンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、サーモアナエロバクター・テングコンジェンシス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、フソバクテリウム・ヌクレアツム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、またはリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）から選択される。好ましくは、微生物はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、より好ましくは、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
【００２１】
本発明はさらに少なくとも１つの突然変異を有するポリヌクレオチドおよびかかる突然変異を有する遺伝子操作された微生物に関し、ここで前記突然変異は前記微生物における糖新生遺伝子の炭素異化代謝産物抑制からの解放をもたらす。
【００２２】
１つの実施形態において、少なくとも１つの突然変異を有するポリヌクレオチドは、配列番号１もしくは３によって表されるポリヌクレオチド、または配列番号１もしくは３と少なくとも７０％相同であり、野生型対立遺伝子の代わりに微生物中に存在すると糖新生遺伝子の炭素異化代謝産物抑制からの解放をもたらすポリヌクレオチド由来である。好ましくは、少なくとも１つの突然変異はｙｑｚＢ遺伝子へ導入される。
【００２３】
本明細書で使用される突然変異は、非機能的ポリペプチド、例えば、ｙｑｚＢおよび／またはｙｑｆＬの非機能的遺伝子産物をもたらす突然変異でありうる、すなわち、前記遺伝子産物の活性は削減または無効にされ、糖新生遺伝子がＣＣＲから解放されるようになっている。これには、例えば、微生物のゲノムにおける変化が含まれうるが、これはｙｑｚＢおよび／またはｙｑｆＬの合成に干渉し、または変化していないアミノ酸配列を有する野生型対応物と比較したその機能が完全または部分的に破壊されている変化したアミノ酸配列を有するｙｑｚＢおよび／またはｙｑｆＬコード化タンパク質の発現をもたらす。干渉は、転写、翻訳、または翻訳後レベルで起こりうる。
【００２４】
さらに、その発現がｙｑｚＢおよび／またはｙｑｆＬの遺伝子産物によって影響される、例えば、ｐｃｋＡおよびｇａｐＢなど糖新生遺伝子のオペレーター部位に突然変異が導入されうる。遺伝子のオペレーター部位は多くの場合、プロモーターおよび遺伝子の転写開始部位の周りに配置され、調節因子タンパク質の結合部位として使用される。オペレーター部位内の突然変異が、ｙｑｚＢなどの調節因子タンパク質のオペレーターとの結合を阻止し、タンパク質が遺伝子の転写に対する調節効果を有することを防ぐ。
【００２５】
さらに、糖新生遺伝子のＣＣＲからの解放が、その調節因子、例えば、ｙｑｚＢおよび／またはｙｑｆＬの遺伝子産物によって影響されない構成的プロモーターと糖新生遺伝子を機能的に連結することによっても獲得されうる。
【００２６】
当業者は、本発明の糖新生遺伝子、好ましくは、ｙｑｚＢおよび／またはｙｑｆＬの遺伝子産物のＣＣＲを媒介するかかるタンパク質の活性を削減または無効にするやり方を承知している。これは例えば、野生型生物よりも糖新生遺伝子、好ましくは、ｙｑｚＢおよび／またはｙｑｆＬの遺伝子産物のＣＣＲを媒介する前記タンパク質のコピーをほとんど、またはまったく生じさせないやり方で宿主生物を遺伝子組換えすることによって、または糖新生遺伝子、好ましくは、ｙｑｚＢおよび／またはｙｑｆＬの遺伝子産物のＣＣＲを媒介する前記タンパク質の特定の活性を減少または無効にすることによって達成されうる。
【００２７】
次の説明において、この目標、すなわち、糖新生遺伝子、好ましくは、ｙｑｚＢおよび／またはｙｑｆＬの遺伝子産物のＣＣＲを媒介する前記タンパク質の活性を削減または無効にすることによってＣＣＲからの解放を達成する方法が詳述される。
【００２８】
生物が糖新生遺伝子、好ましくは、ｙｑｚＢおよび／またはｙｑｆＬ遺伝子の遺伝子産物、および／またはそれの遺伝子のＣＣＲを媒介するタンパク質のコピーをほとんど、またはまったく生じさせないための組換えは、弱いプロモーター、または前記遺伝子の（一部の）突然変異（例えば、挿入、欠失、または点突然変異）、もしくはそれぞれの調節因子要素の使用を含みうる。かかるタンパク質の特定の活性を減少させ、または無効にすることも当業界で周知の方法によって達成されうる。
【００２９】
また、糖新生遺伝子のＣＣＲを媒介するタンパク質を特定の阻害剤、または糖新生遺伝子のＣＣＲを媒介するタンパク質と特異的に相互作用する他の物質と接触させることによって所定のタンパク質の活性を削減または無効にする方法も当業界で周知である。かかる特定の阻害剤を同定するために、糖新生遺伝子のＣＣＲを媒介するタンパク質は発現され、前記タンパク質の活性を抑制することが疑われる化合物の存在下に活性について試験されうる。潜在的な阻害化合物は、例えば、糖新生遺伝子のＣＣＲを媒介するタンパク質に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体でありうる。かかる抗体は適切な実験動物のルーチンの免疫プロトコールによって獲得されうる。
【００３０】
別の好ましい実施形態において、例えば、配列番号１または３で示される本発明の核酸またはそれの相補体は、修飾機能／活性を有する遺伝子産物をもたらす少なくとも１つの突然変異を含有する。少なくとも１つの突然変異は本明細書に記載された方法によって導入されうる。１つの態様において、少なくとも１つの突然変異は、野生型対応物と比較するとその機能が完全または部分的に破壊されている糖新生遺伝子のＣＣＲを媒介するタンパク質をもたらす。かかる突然変異を導入するための方法は当業界で公知である。
【００３１】
本明細書で使用される活性の「削減」という語は、次いで本明細書に記載された対応するポリヌクレオチドによってコードされる生産生物における１つもしくはそれ以上のポリペプチドの活性の減少を包含する。所定のタンパク質、この場合、糖新生遺伝子のＣＣＲを媒介するタンパク質の活性の削減を達成する多くの方法が当業界で利用可能である。一般に、タンパク質の特定の活性は減少され、またはタンパク質のコピー数は減少されうる。
【００３２】
かかる減少を促進するために、本明細書に記載されたポリヌクレオチドに対応する遺伝子のコピー数は減少されうる。あるいは、弱いプロモーターを使用し、ポリヌクレオチドの発現を導くことができる。別の実施形態において、プロモーター、調節領域、および／または遺伝子の上流のリボソーム結合部位は変化され、発現低下を達成しうる。発現はメッセンジャーＲＮＡの相対半減期を減少させることによっても削減されうる。別の実施形態において、ポリペプチドそのものの活性は、活性を減少させるポリペプチドアミノ酸配列における１つもしくはそれ以上の突然変異を使用することによって減少されうる。例えば、その対応する基質に対するポリペプチドのアフィニティーの変化は結果として活性の削減をもたらす。同様に、ポリペプチドの相対半減期は減少されうる。遺伝子発現が削減され、または活性が削減されるいずれかのシナリオにおいて、削減は細胞培養培地の組成物、および／または培養のために使用される方法を変化させることによって達成されうる。本明細書で使用される「発現の削減」または「活性の削減」は、野生型タンパク質、ポリヌクレオチド、遺伝子と比べ、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、または１００％の減少を、またはポリヌクレオチドもしくはポリペプチドが削減される前に存在するタンパク質の活性および／または濃度を意味する。糖新生遺伝子、好ましくは、ｙｑｚＢおよび／またはｙｑｆＬの遺伝子産物のＣＣＲを媒介するタンパク質の活性は、その活性の特定または一般の阻害剤とタンパク質を接触させることによっても削減されうる。
【００３３】
微生物のゲノムにおける変化は、例えば、変化を含有するＤＮＡ配列による野生型ＤＮＡ配列の単一または二重交叉型組換えによる置換によって獲得されうる。そのゲノムにおける変化を有する微生物の形質変換体の便利な選択のために、変化は、例えば、抗生物質耐性マーカーをコード化するＤＮＡ配列、または微生物の可能な要求性を補足する遺伝子でありうる。突然変異としては、欠失挿入突然変異が挙げられるが、これに限定されない。
【００３４】
非機能的ポリペプチドをもたらす微生物のゲノムにおける変化が、例えば、化学的突然変異誘発要因、照射、またはトランスポゾンを使用する微生物のゲノムをランダムに突然変異させることによって、および解糖成長条件下に糖新生遺伝子を発現させることができる突然変異の選択またはスクリーニングによっても獲得されうる。便利な選択またはスクリーニングのために、例えば、β−ガラクトシダーゼまたは抗生物質耐性マーカーをコード化する適切なレポーター遺伝子に融合したｐｃｋＡプロモーターまたはｇａｐＢプロモーターをゲノム中に含有する細菌の培養が突然変異されうる。
【００３５】
ｙｑｚＢおよび／またはｙｑｆＬの発現は、アンチセンス機序による成分の発現を阻止または削減するために、微生物の遺伝子座で成分をコード化するＤＮＡ配列を補完するＤＮＡ配列の導入によっても阻止または削減されうる。
【００３６】
糖新生遺伝子、好ましくは、ｙｑｚＢおよび／またはｙｑｆＬタンパク質のＣＣＲ媒介するタンパク質の上記突然変異生成方法は結果として、例えば、ｐｃｋＡおよび／またはｇａｐＢなどＣＣＲまたは糖新生遺伝子からの解放をもたらす。このリストは限定的であることは意味せず、これらの突然変異生成方法における変形は当業者には容易に明らかとなるであろう。これらの機序によって、本発明の核酸およびタンパク質分子を使用し、糖新生遺伝子のＣＣＲが解放されるように、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）などの微生物または核酸およびタンパク質分子を媒介する突然変異ＣＣＲを発現する細菌の関連株を生成することができる。
【００３７】
ＣＣＲを媒介するタンパク質の活性は、例えば、ｐｃｋＡまたはｇａｐＢなどの糖新生遺伝子のプロモーターおよびｌａｃＺ遺伝子をコード化するβ−ガラクトシダーゼを含有する構成物のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定することによって、当業者に周知の方法によって測定されうる。β−ガラクトシダーゼ活性はＣＣＲを媒介するタンパク質の活性の減少とともに増大する。かかる方法は実施例２において詳細に記載されている。
【００３８】
本発明は、上記の突然変異ポリヌクレオチド／ポリペプチドを含んで成る遺伝子操作された微生物を提供する。かかる微生物の例は、上記の微生物から選択されうる。好ましい微生物が、上記の少なくとも１つの突然変異を有するポリヌクレオチドで形質転換されたバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主菌株である。標準組換えＤＮＡ技術をポリヌクレオチド配列および組換え菌株の構成のために使用されうる。
【００３９】
例えば、欠失挿入突然変異など突然変異に対して陽性の形質転換体が、標準選択プロトコールを使用して選択される。例えば、微生物を形質転換するために使用されるポリヌクレオチド配列としては、例えば抗生物質耐性マーカーを含むさまざまな選択マーカー、発色マーカー等が挙げられる。好ましくは、マーカーはカナマイシンまたはフレオマイシン耐性マーカーであり、所望の形質転換のための選択としては、カナマイシンまたはフレオマイシンを補充した発酵培地において成長ができる微生物の同定が挙げられる。
【００４０】
したがって、本発明は、ｙｑｚＢによって媒介される糖新生遺伝子のＣＣＲからの解放されるバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主菌株を提供する。
【００４１】
本発明はさらに、上記のポリヌクレオチドによってコード化されたポリペプチドに関する。好ましくは、ポリペプチドは配列番号２もしくは４または相同配列によって表されるアミノ配列から選択される。
【００４２】
１つの態様において、本発明は、糖新生遺伝子の炭素異化代謝産物抑制の媒介のための上記のポリヌクレオチドの使用に関する。
【００４３】
本発明の別の態様において、糖新生遺伝子の炭素異化代謝産物抑制からの解放が微生物の標的発酵産物を産生する能力を増大させることが意外にも見出されている。
【００４４】
したがって、本発明は、上記の遺伝子操作された、すなわち、少なくとも１つの突然変異を有する微生物の使用に関するが、ここで前記突然変異は、標的発酵産物の製造のために糖新生遺伝子の炭素異化代謝産物抑制からの解放、および標的発酵産物の製造の方法をもたらす。
【００４５】
本明細書で使用される「標的発酵産物」は、例えば、リボフラビン、パントテン酸、ビオチン、チアミン、葉酸、ピリドキシン、またはアミノ酸などの発酵によって生成される化合物を意味する。好ましい標的産物がリボフラビンである。
【００４６】
１つの態様において、本発明は、かかる産物を生成する上記の遺伝子操作された微生物の培養を含んで成る標的発酵産物の調製の方法を提供する。
【００４７】
したがって、本発明は、（ａ）上記の遺伝子操作された微生物を提供するステップと、（ｂ）（ａ）の微生物を標的発酵産物の発生を可能にする条件下に培養するステップと、（ｃ）標的発酵産物の単離とを含んで成る標的発酵産物の製造の方法に関する。
【００４８】
培養は、微生物が、前記微生物の成長および発酵産物の製造に必要な基質のすべてを補充した発酵培地へ接種されることを意味する。接種発酵培地は、最適なバイオマス成長および産物蓄積を可能にする温度、ｐＨ、および曝気など特定の物理化学パラメータにさらされる。これらのパラメータは培養される微生物の型によって、かつ生成される化合物によって変動する。これらのパラメータを実験的に決定する方法は当業者に公知であり、要因計画または複合設計を含む。発酵産物の蓄積をさらに増大させるために、バイオマス成長または産物形成に必要な基質を微生物の培養の経過中に発酵ブロスに供給されうる。例えば、本発明に記載の方法では、微生物はバッチ培養、指数関数的および一定の供給プロフィールによるフェドバッチ培養、またはケモスタットにおける培養にかけられうる。この方法は、連続的または半連続的培養として、または大規模工業用発酵槽におけるバッチまたはフェドバッチ法として、希釈率を０．３ｌ／ｌ＊ｈ〜０．００１  ｌ／ｌ＊ｈに変動させ、発酵培地における成分の濃度を増大させ、またはグルコース濃度を４００ｇ／ｌまで増大させて実行されうる。
【００４９】
発酵方法に引き続き方法パラメータを分析的に測定することができる。例えば、細胞乾燥重量（ｃｄｗ）を、例えば、遠心分離によって回収され、蒸留水で洗浄し、例えば、１１０℃で２４時間乾燥させ、一定の重量にする細胞懸濁液から測定することができる。生物反応器の供給および流出ガスにおける二酸化炭素および酸素の濃度は、例えば、質量分析計（例えば、Ｐｒｉｍａ６００、フィソンズ・インスツルメンツ（Ｆｉｓｏｎｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））で測定されうる。グルコース濃度は、例えば、酵素的に、例えば、市販のキット（例えば、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ））で測定されうる。培養上清中の有機酸、アセトイン、およびジアシルの濃度は、例えば、ダイオードアレイ検出器（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ））とともに、例えば、Ｓｕｐｅｌｃｏｇｅｌ  Ｃ６１０Ｈカラム（４．６×２５０ｍｍ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ））でのＨＰＬＣによって測定されうる。０．２Ｎリン酸を移動相として０．３ｍｌ  分−１の流速および４０℃Ｃで使用されうる。標的発酵産物濃度は、標準方法によって測定され、例えば、リボフラビン濃度は、例えば、細胞を含まない培養ブロスにおける４４０ｎｍ（Ａ４４０）での吸収として測定されうる。Ａ４４０が０．６を超える場合は、ブロスを、例えば、０．５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で希釈することができる。Ａ４４０が１．８を超える場合は、例えば、ブロス０．８ｍｌを０．２Ｍ  ＮａＯＨ  ０．２ｍｌと混合し、０．５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で適切な濃度に希釈することができる。
【００５０】
標的発酵産物は、微生物および／または培地から単離されうる。本明細書で使用される「単離される」という語は、標的発酵産物が精製され、または、例えば、ろ過、遠心分離、および／または抽出を含む方法によって少なくとも部分的に精製されることを意味する。標的発酵産物は、水性または有機溶媒からの再結晶化、または、例えば、イオン交換、サイズ排除、または疎水性相互作用クロマトグラフィーなど当業界で周知の他の方法の適用によってさらに精製されうる。例えば、発酵ブロスからのリボフラビンの単離および精製の方法の詳細な説明については、例えば、参照により本明細書で援用される、欧州特許第７３００３４号明細書を参照。
【００５１】
標的発酵産物の製造のために使用される適切な微生物が、上記の微生物から選択されうる。好ましくは、糖新生遺伝子の発現がｙｑｚＢ媒介ＣＣＲから解放される遺伝子操作された微生物は、リボフラビンを過剰産生する組換え生成された微生物である。
【００５２】
本明細書で使用される「過剰産生」という語は、微生物が、少なくとも０．１％（ｗ／ｗ）超の収量、好ましくは、１％（ｗ／ｗ）超の収量、例えば、４％（ｗ／ｗ）超の収量で炭素源として使用される基質から標的発酵産物を産生することを意味する。
【００５３】
本発明の目的のためにかかる好ましい微生物の例が、ＲＢ５０：：［ｐＲＦ６９］ｎと呼ばれるリボフラビン産生Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＲＢ５０菌株であり、これは多重（ｎ）コピー（例えば、約５〜約２０コピー）のｒｉｂ遺伝子の転写を強化する強いファージＳＰＯ１プロモーター（Ｐ１５）で修飾されたｒｉｂオペロンをコード化するｐＲＦ６９を含有する。この組換え産生微生物は野生型微生物よりもはるかに多くのリボフラビンを産生する。
【００５４】
Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＲＢ５０は、アグリカルチュラル・リサーチ・カルチャー・コレクション（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＮＲＲＬ）、Ｐｅｏｒｉａ、イリノイ州（ＩＬ）、米国により１９８９年５月２３日のブダペスト条約に従って寄託され、登録番号Ｂ１８５０２が割り当てられた。プラスミドｐＲＦ６９は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、メリーランド州（ＭＤ）、米国により１９９０年６月６日に寄託され、登録番号ＡＴＣＣ６８３３８が割り当てられた。
【００５５】
本発明は、ＲＢ５０：：［ｐＲＦ６９］の誘導体を含む。本明細書で使用されるＲＢ５０：：［ｐＲＦ６９］の「誘導体」は、ｐＲＦ６９の遺伝子操作されたｒｉｂオペロンと少なくとも２５％、好ましくは、ｐＲＦ６９の遺伝子操作されたｒｉｂオペロンと少なくとも５０％同一であるｐＲＦ６９またはポリヌクレオチド配列の遺伝子操作されたｒｉｂオペロンを含有するＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株、およびリボフラビン生合成遺伝子の発現における変化をもたらす他の遺伝子修飾である。本発明において、ポリヌクレオチド配列の同一性率は、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、メリーランド州（ＭＤ）、米国）におけるＢＬＡＳＴプログラムおよびサーバーを使用して測定される。ＲＢ５０：：［ｐＲＦ６９］の「誘導体」は、リブフラビン生合成の前駆体化合物として必要とされる化合物の生合成に影響を及ぼすＲＢ５０：：［ｐＲＦ６９］のゲノムにおける変化をも含有しうる。さらに、栄養要求性ＲＢ５０：：［ｐＲＦ６９］突然変異体もＲＢ５０：：［ｐＲＦ６９］の「誘導体」とみなされる。栄養要求性突然変異体という語は、例えば、突然変異によって修飾されており、突然変異前に微生物がそれ自身で産生しうる、成長のために外因性化合物の付加を必要とする微生物を指す。
【００５６】
次の実施例は、本発明の方法、ポリヌクレオチド、および宿主細胞を説明するために記載されている。これらの実施例は単に例示的であり、本発明の範囲を何らかの形で限定することは意図されていない。例えば、本発明は、微生物で標的発酵産物を生成する発酵方法を実行することによって変動しうるが、ここで微生物において糖新生のｙｑｚＢ媒介抑制が阻止される。
【実施例】
【００５７】
実施例１：ｇａｐＢ’−ｌａｃＺおよびｐｃｋＡ’−ｌａｃＺ受容体融合で提供されるＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｙｑｚＢおよび／またはｙｑｆＬ突然変異体の構成
ポリヌクレオチド配列の構成のために標準組換えＤＮＡ技術を使用した。例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）（１９８９年）を参照。ＤＮＡ形質転換またはＰＢＳ１ファージ形質導入によるさまざまなバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株の構成を、ハーウッド（Ｈａｒｗｏｏｄ）とカッティング（Ｃｕｔｔｉｎｇ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）（１９９０年）に従って行った。
【００５８】
ｇａｐＢ遺伝子のプロモーターの活性を報告する遺伝子融合を有するバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＧＭ１５１４ＰｇａｐＢ：：ｌａｃＺの構成のために、プライマーＧＡＰＢＰ５（配列番号５）およびＧＡＰＢＰ３（配列番号６）および９５℃下３０秒間の２５サイクルの変性、５５℃下３０秒間のアニーリング、および７２℃下４５秒間の伸長のＰＣＲ反応条件を使用してＤＮＡ断片をＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８のＤＮＡから増幅した（クンスト（Ｋｕｎｓｔ）ら（１９９７年）Ｎａｔｕｒｅ３９０：２４９−２５６頁）。ＰＣＲ産物をウィザード（Ｗｉｚａｒｄ）ＰＣＲ精製キット（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．））を使用して精製した。ＰＣＲ産物をｐＤＧ１６６１ベクターへライゲートし（ゲロット・フレリー（Ｇｕｅｒｏｔ−Ｆｌｅｕｒｙ）ら（１９９６年）Ｇｅｎｅ１８０：５７−６１頁）、結果としてプラスミドｐＳＦ１１４を得た。プラスミドｐＳＦ１１４をＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）野生型菌株１６８に形質転換し、最終濃度を５ｍｇ×Ｌ−１にしたクロラムフェニコールを含有するＬＢプレート上で選択した。アミラーゼマイナス表現型およびスペクチノマイシンに対する感度についてチェックした１つの形質転換体クローンをＧＭ１５１４と新たに命名した。
【００５９】
ｐｃｋＡ遺伝子のプロモーターの活性を報告する遺伝子融合を有するバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＰＳ１６４９ＰｐｃｋＡ：：ｌａｃＺの構成のために、プライマーＰＣＫＡＰ５（配列番号７）およびＰＣＫＡＰ３（配列番号８）および上記と同じＰＣＲ反応条件を使用してＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８のＤＮＡからＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ産物をウィザード（Ｗｉｚａｒｄ）ＰＣＲ精製キット（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．））を使用して精製した。ＰＣＲ産物をｐＤＧ１６６１ベクターへライゲートし（ゲロット・フレリー（Ｇｕｅｒｏｔ−Ｆｌｅｕｒｙ）ら（１９９６年）Ｇｅｎｅ１８０：５７−６１頁）、結果としてプラスミドｐＰＳ１９を得た。プラスミドｐＰＳ１９をＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）野生型菌株１６８に形質転換し、最終濃度を５ｍｇ×Ｌ−１にしたクロラムフェニコールを含有するＬＢプレート上で選択した。アミラーゼマイナス表現型およびスペクチノマイシンに対する感度についてチェックした１つの形質転換体クローンをＰＳ１６４９と新たに命名した。
【００６０】
バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＰＳ１７２２ＰｇａｐＢ：：ｌａｃＺ  ΔｙｑｚＢの構成のために、プライマーＹＱＺＢＵＰ５（配列番号９）およびＹＱＺＢＵＰ３（配列番号１０）および上記と同じＰＣＲ反応条件を使用してＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）微生物１６８のＤＮＡからＤＮＡ断片を増幅した。さらなるＰＣＲ反応において、プライマーＹＱＺＢＤＯＷＮ５（配列番号１１）およびＹＱＺＢＤＯＷＮ３（配列番号１２）および上記と同じＰＣＲ反応条件を使用してＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）微生物１６８のＤＮＡから別のＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ産物をウィザード（Ｗｉｚａｒｄ）ＰＣＲ精製キット（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．））を使用して精製し、いっしょにライゲートし、さらにｐＲＮ５１０１ベクターへライゲートし（ポンセット（Ｐｏｎｃｅｔ）ら（１９９７年）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：４４１３−４４２０頁）、結果としてプラスミドｐＰＳ６５を得た。プラスミドｐＰＳ６５をＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＧＭ１５１４へ形質転換し、最終濃度を０．５ｍｇ×Ｌ−１にしたエリスロマイシンを含有するＬＢプレート上で４２℃下に選択した。次いで、形質転換体を２８℃下にＬＢプレート上に伸ばした。一部のクローンをグルコース最小培地プレート上でβ−ガラクトシダーゼ活性ついて試験し、ＬＢエリスロマイシンプレート上で成長について試験した。β−ガラクトシダーゼ陽性およびエリスロマイシン感受性クローンをＰＳ１７２２と新たに命名した。
【００６１】
バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＰＳ１６３３ＰｇａｐＢ：：ｌａｃＺ  ΔｙｑｆＬの構成のために、プライマーＹＱＦＬＵＰ５（配列番号１３）およびＹＱＦＬＵＰ３（配列番号１４）および上記と同じＰＣＲ反応条件を使用してＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）微生物１６８のＤＮＡからＤＮＡ断片を増幅した。プライマーＹＱＦＬＤＯＷＮ５（配列番号１５）およびＹＱＦＬＤＯＷＮ３（配列番号１６）および上記と同じＰＣＲ反応条件を使用してＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）微生物１６８のＤＮＡから別のＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ産物をウィザード（Ｗｉｚａｒｄ）ＰＣＲ精製キット（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．））を使用して精製し、ｐＩＣ２２のフレオマイシン耐性遺伝子を有するＸｂａＩ−ＢａｍＨＩＤＮＡ断片とライゲートし（シュタインメッツ（Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ）とリヒター（Ｒｉｃｈｔｅｒ）（１９９４年）Ｇｅｎｅ１４２：７９−８３頁）、次いでｐＪＨ１０１プラスミドベクターヘライゲートし（フェラーリ（Ｆｅｒｒａｒｉ）ら（１９８３年）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：１５１３−１５１５頁）、結果としてプラスミドｐＰＳ１３を得た。次いで、プラスミドｐＰＳ１３をＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＧＭ１５１４へ形質転換し、最終濃度を０．２５ｍｇ×Ｌ−１にしたフレオマイシンを含有するＬＢプレート上で選択し、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）微生物ＰＳ１６３３を得た。
【００６２】
バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＰＳ１７２３ＰｇａｐＢ：：ｌａｃＺ  ΔｙｑｚＢ−ｙｑｆＬの構成のために、プライマー５ＹＱＺＢＥ（配列番号１７）およびＡＴＧＹＱＺＢＸ（配列番号１８）および上記と同じＰＣＲ反応条件を使用してＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）微生物１６８のＤＮＡからＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ産物をウィザード（Ｗｉｚａｒｄ）ＰＣＲ精製キット（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．））を使用して精製し、ＸｂａｌＩおよびＥａｇＩで線状化したプラスミドｐＰＳ１３とライゲートし、結果としてプラスミドｐＰＳ３０を得た。次いで、プラスミドｐＰＳ３０をＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＧＭ１５１４へ形質転換し、最終濃度を０．２５ｍｇ×Ｌ−１にしたフレオマイシンを含有するＬＢプレート上で選択し、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）微生物ＰＳ１７２３を得た。
【００６３】
バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＰＳ１６２１ｙｑｚＢ：：ｐＥＣ２３の構成のために、プライマー５ＹＱＺＢＭＵＴ（配列番号１９）および３ＹＱＺＢＭＵＴ（配列番号２０）および上記と同じＰＣＲ反応条件を使用してＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）微生物１６８のＤＮＡからＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ産物をウィザード（Ｗｉｚａｒｄ）ＰＣＲ精製キット（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．））を使用して精製し、ｐＭＵＴＩＮ２ベクターへライゲートした（バグナー（Ｖａｇｎｅｒ）ら（１９９８年）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４４：３０９７−３１０４頁）、結果としてプラスミドｐＭＵＴＹＱＺＢを得た。プラスミドｐＭＵＴＹＱＺＢはＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）微生物１６８へ形質転換され、最終濃度を０．５ｍｇ×Ｌ−１にしたエリスロマイシンを含有するＬＢプレート上で選択され、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）微生物ＳＡ１６２０を得る。ｌａｃＺおよびエリストマイシン耐性遺伝子のカナマイシン耐性カセットの相同組換えによるＳＡ１６２０のゲノムにおけるインビボ置換が、ｐＥＣ２３を使用して獲得される（ドアン（Ｄｏａｎ）とエイムリッチ（Ａｙｍｅｒｉｃｈ）（２００３年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ４７：１７０９−１７２１頁）。プラスミドｐＥＣ２３は、クロラムフェニコール耐性カセットと、ｌａｃＺ遺伝子の５’末端に対応するＤＮＡ断片とｐＭＵＴＩＮ２のエリスロマイシン遺伝子の３’末端に対応する断片との間に、カナマイシン耐性カセットとを含有するｐＢＲ３２２誘導体である。ｐＥＣ２３によるＳＡ１６２０の形質転換と同時に得られる結果として生じるカナマイシン（１０ｍｇ×Ｌ−１）耐性およびクロラムフェニコールおよびエリスロマイシン感受性形質転換体の１つが選択され、ＰＳ１６２１と新たに命名される。
【００６４】
バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＰＳ１６５０ＰｐｃｋＡ：：ｌａｃＺ  ｙｑｚＢ：：ｐＥＣ２３の構成のために、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＰＳ１６２１から精製された総ＤＮＡをＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＰＳ１６４９へ形質転換し、最終濃度を１０ｍｇ×Ｌ−１にしたカナマイシンを含有するＬＢプレート上で選択し、ＰＳ１６５０を得る。
【００６５】
バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＰＳ１６５１ＰｐｃｋＡ：：ｌａｃＺ  ΔｙｑｆＬの構成のために、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＰＳ１６３３から精製された総ＤＮＡをＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＰＳ１６４９へ形質転換し、最終濃度を０．２５ｍｇ×Ｌ−１にしたフレオマイシンを含有するＬＢプレート上で選択し、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）微生物ＰＳ１６５０を得る。
【００６６】
実施例２：解糖または糖新生炭素源で培養したさまざまなＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）突然変異体におけるｇａｐ−ｌａｃＺおよびｐｃｋＡ−ｌａｃＺレポーター融合の発現
糖新生遺伝子のｙｑｚＢ媒介ＣＣＲからの解放が、ｙｑｚＢ遺伝子の発現を阻止または削減することによって達成される。これは、野生型または欠失ｙｑｚＢ遺伝子を含有するＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を比較することによって本実施例で示されており、ｌａｃＺ遺伝子をコード化するβ−ガラクトシダーゼとのｇａｐＢまたはｐｃｋＡプロモーターのレポーター融合が提供されうる。プロモーター／ｌａｃＺ融合はしばしば、その標的遺伝子の発現に対する転写レプレッサーまたは活性化因子の調節活性を明らかにするために使用される（ゲロット・フレリー（Ｇｕｅｒｏｕｔ−Ｆｌｅｕｒｙ）ら（１９９６年）Ｇｅｎｅ１８０：５７−６１頁）。
【００６７】
実施例１に従って得られたＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）突然変異体株を、ＣＱＴＨＣ培地（Ｃミネラル培地［７０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、３０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．０１ｍＭ  ＭｎＳＯ４、１リットル当り２２ｍｇのクエン酸第二鉄アンモニウム］トリプトファン０．００５％（ｗ／ｖ）、グルタミン０．１５％（ｗ／ｖ）およびカゼイン加水分解物０．０５％（ｗ／ｖ）を補充）中で、解糖としてグルコース（１０ｇ／ｌ）および糖新生炭素源としてコハク酸塩（１０ｇ／ｌ）＋グルタミン酸塩（１０ｇ／ｌ）とともに培養した。指数関数的に成長する細菌を遠心分離によって回収した。β−ガラクトシダーゼ活性をミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）の方法（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）（１９７２年）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州（ＮＹ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を使用し、リゾチーム処理および遠心分離によって調製した回収細菌の抽出物で測定した。結果は表１に示されている。ｇａｐＢ−ｌａｃＺレポーター融合で提供された菌株ＧＭ１５１４およびｐｃｋＡ−ｌａｃＺレポーター融合で提供されたＰＳ１６４９におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の発現は、糖新生培養条件が解糖炭素源としてグルコースによる培養条件と比較して適用された場合は、それぞれ７０倍および３４倍増大した。結果は、糖新生遺伝子ｇａｐＢおよびｐｃｋＡの発現がＣＣＲにさらされていることを示す。ｙｑｚＢ欠失突然変異ＰＳ１７２２およびＰＳ１６５０において、β−ガラクトシダーゼ活性の発現がさらに増大し、糖新生炭素源で培養されたｙｑｚＢ野生型菌株において測定されたレベルの約５倍であったレベルに達した。ｙｑｚＢ欠失突然変異体において、β−ガラクトシダーゼ活性の発現は培養培地における炭素源によってほとんど影響を受けなかった。明らかに、糖新生培養条件下でも、糖新生に対するｙｑｚＢ媒介ＣＣＲが部分的にのみ阻止された。ｙｑｚＢ媒介抑制からの完全な解放は、遺伝子の欠失と同時に達成されうる。糖新生培養条件下でのｙｑｆＬ欠失突然変異体ＰＳ１６３３およびＰＳ１６５１におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の発現が、対応する野生型菌株ＰＳ１５１４およびＰＳ１６４９と比べ大幅に削減された。しかし、同様のβ−ガラクトシダーゼ活性が、ｙｑｚＢ突然変異のみを有するｙｑｚＢ−ｙｑｆＬに重突然変異体ＰＳ１７２３およびＰＳ１７２２において確認された。これらの結果は、ｙｑｚＢ欠失がｙｑｆＬ突然変異に対して優位であることを示し、かつｙｑｆＬ遺伝子産物がｙｑｚＢ遺伝子産物の阻害活性に干渉することを示す。
【００６８】
【表１】
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【００６９】
実施例３：Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＲＢ５０：：ｐＲＦ６９のｙｑｚＢ欠失変異体の構成
実施例１のＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）微生物ＰＳ１６２１をＰＢＳ１ファージ溶解物の調製のためのドナー微生物として使用する。この溶解物は、修飾リボフランビンオペロンｐＲＦ６９で提供されるリボフラビン産生微生物を形質導入する。ＲＢ５０はＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の宿主微生物を指し、これはヌクレオチドおよびリボフラビンの産生を改善するために導入されたいくつかの突然変異を含有する。プラスミドｐＲＦ６９は、ｐＲＦ５０のリブ位置で導入されている強いファージプロモーターの導入によって修飾されたリブオペロンを指す。微生物ＲＢ５０および修飾リブオペロンｐＲＦ６９の詳細な説明が欧州特許第４０５３７０号明細書に示されている。ＰＳ１６２１由来ＰＢＳ１溶解物によるバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＲＢ：：ｐＲＦ６９の形質導入に起因するカナマイシン耐性コロニーの１つが、標準ＰＣＲによって、破壊ｙｑｚＢ遺伝子を含有することが確認され、ＲＢ５０：：［ｐＲＦ６９］ΔｙｑｚＢと新たに命名された。
【００７０】
実施例４：ＲＢ５０：：［ｐＲＦ６９］ΔｙｑｚＢおよび親株ＲＢ５０：：［ｐＲＦ６９］の培養
播種培養の調製のために、凍結ＲＢ５０：：［ｐＲＦ６９］またはＲＢ５０：：［ｐＲＦ６９］ΔｙｑｚＢ培養物を解凍し、培養物３μｌを１ｍｌ  ＶＹ培地に接種する（ＶＹ培地：ジフコ（Ｄｉｆｃｏ）仔ウシ輸液２５ｇ／ｌ＋５ｇ／ｌ酵母抽出物＋１５ｇ／ｌグルコース）。培養物を濁度変化が視認可能になるまで３７℃下約１０時間インキュベートする。ＶＹ培養から１０μｌを除去し、５ｇ／ｌグルコース、５ｇ／ｌラフィノース、または５ｇ／ｌリンゴ酸塩のいずれかを補充した最小培地Ｍ９（ｄｄＨ２Ｏ  １リットル当り：１２．８ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、３．０ｇ  ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ  ＮａＣｌ、１．０ｇ  ＮＨ４Ｃｌ、１ｍｌ  １Ｍ  ＭｇＳＯ４、１ｍｌ  ０．１Ｍ  ＣａＣｌ２、１２５．０ｍｇ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、５．５ｍｇ  ＣａＣｌ２、１３．５ｍｇ  ＦｅＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１．０ｍｇ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１．７ｍｇ  ＺｎＣｌ２、０．４３ｍｇ  ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．６ｍｇ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．６ｍｇ  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ）の培養物１ｍｌを接種する。培養を一夜、３７℃下に行う。主要なバッチ培養を５ｇ／ｌの適切な炭素源を補充したＭ９  １ｍｌへの一夜培養物１０μｌのインキュベーションによって開始する。ラフィノースを炭素源として使用する場合、０．５ｇ／ｌ酵母抽出物を培養に添加する。各々の培養条件を深いウェルプレートにおいて３０時間３７℃下にトリプリケートで行う。リボフラビン濃度を測定するために、培養ブロスを１０分間、５’０００ｒｐｍで４℃下に遠心分離する。上清をＮａＯＨで希釈し、４４０ｎｍ（Ａ４４０）での吸収を直ちに測定する。希釈液を調節し、０．１〜１．０の吸収単位の読取りを行う。リボフラビン濃度は、試料の吸収をリボフラビン標準（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ｓｔ．Ｌｕｉｓ、ミズーリ州（ＭＯ）、米国（ＵＳＡ））のものと比較することによって計算される。表２に示されているように、ｙｑｚＢ挿入突然変異を含有する菌株ＲＢ５０：：［ｐＲＦ６９］は、野生型ｙｑｚＢ遺伝子を有する親株ＲＢ５０：：［ｐＲＦ６９］と比べリボフラビン産生に関して優れている。リボフラビンタイターの増大は、適用された３つの炭素源のすべてで確認される。
【００７１】
【表２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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