(57)【要約】【課題】長期の保存期間、より優れた回収率、及び注入されたＲＢＣの生理的な性能の向上を可能にするような優れたＲＢＣ保存のための組成物を提供する。【解決手段】本発明は、赤血球の保存のための水性組成物を提供する。前記組成物は、本質的には、アデニンと、デキストロースと、少なくとも１つの膜保護糖と、具体的に定義されたｐＨ緩衝系を提供する。また、赤血球を保存するためのより優れた方法、並びに保存された赤血球のアポトーシス、溶血、及び再注入後のクリアランスを抑制すると同時に生存率、膜維持、及び回収率を増大させる方法をも提供する。これらの方法には、本発明の新規の組成物が使用される。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤血球を約１〜６℃で保存するための水性組成物であって、
前記組成物は、アデニンと、デキストロースと、少なくとも１つの非代謝性の膜保護糖と、ｐＨ緩衝系とを本質的に含んでおり、
前記ｐＨ緩衝系は、重炭酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質と、リン酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質と、ナトリウムカチオンを提供する少なくとも１つの物質とを含む生理学的に許容される緩衝剤の組み合わせを有し、
前記ｐＨ緩衝系は、１，３−ＤＰＧからの２，３−ジホスホグリセレート（ＤＰＧ）の合成よりも解糖を優先する赤血球内の反応平衡を保存期間中に確立及び維持するのに十分な量の前記組成物が加えられる赤血球（ＲＢＣ）懸濁液のｐＨを前記組成物が維持する働きをするのに十分な量で存在し、それによって、保存期間中に反応平衡でアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）合成が発生することを特徴とする水性組成物。
【請求項２】
赤血球を約１〜６℃で保存するための水性組成物であって、
前記組成物は、アデニンと、デキストロースと、少なくとも１つの非代謝性の膜保護糖と、ｐＨ緩衝系とを本質的に含んでおり、
前記ｐＨ緩衝系は、重炭酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質と、リン酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質と、ナトリウムカチオンを提供する少なくとも１つの物質とを含む生理学的に許容される緩衝剤の組み合わせを有し、
前記ｐＨ緩衝系は、１，３−ＤＰＧからの２，３−ジホスホグリセレート（ＤＰＧ）の合成よりも解糖を優先する赤血球内の反応平衡を保存期間中に確立及び維持するのに十分な量の前記組成物が加えられる赤血球懸濁液（ＲＢＣ）のｐＨを前記組成物が維持する働きをするのに十分な量で存在し、それによって、保存期間中に反応平衡でアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）合成が発生し、
前記組成物は、外部由来の塩化物イオンを実質的に含まないことを特徴とする水性組成物。
【請求項３】
赤血球の懸濁液であって、
請求項１に記載の組成物を含むことを特徴とする懸濁液。
【請求項４】
請求項３に記載の懸濁液であって、
前記赤血球の懸濁液の直接注入を必要とする患者への直接注入に適切であることを特徴とする懸濁液。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物であって、
前記ナトリウムカチオンを提供する少なくとも１つの物質は、重炭酸ナトリウムと、リン酸２ナトリウムと、それらの組み合わせとから成る群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の組成物であって、
前記重炭酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質は、重炭酸ナトリウムであること特徴とする組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の組成物であって、
前記リン酸イオンを提供する少なくとも１つの物質は、リン酸ナトリウムと、リン酸２ナトリウムと、リン酸３ナトリウムと、それらの組み合わせとから成る群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の組成物であって、
前記リン酸イオンを提供する少なくとも１つの物質は、リン酸２ナトリウムであることを特徴とする組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の組成物であって、
前記生理学的に許容される緩衝剤の組み合わせは、水素と、カリウムと、アンモニウムと、マグネシウムと、それらの組み合わせとから成る群から選択される生理学的に許容されるカチオンを提供する少なくとも１つの物質をさらに含むことを特徴とする組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の組成物であって、
前記少なくとも１つの非代謝性の膜保護糖は、マンニトールであることを特徴とする組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の組成物であって、
約２００〜３１０ｍＯｓｍのオスモル濃度を有することを特徴とする組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組成物であって、
前記オスモル濃度は、約２２１〜２８０ｍＯｓｍであることを特徴とする組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の組成物であって、
前記オスモル濃度は、約２７０ｍＯｓｍであることを特徴とする組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の組成物であって、
約８〜９のｐＨを有することを特徴とする組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組成物であって、
前記組成物のｐＨは、約８．２〜８．８であることを特徴とする組成物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の組成物であって、
前記組成物のｐＨは、約８．４〜８．６であることを特徴とする組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組成物であって、
前記組成物のｐＨは、約８．５であることを特徴とする組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載の組成物であって、
前記緩衝系は、６週間の保存期間中に６．５〜７．２の間のｐＨで少なくとも２ｍＥｑ増加する組成物が加えられる前記赤血球（ＲＢＣ）懸濁液において緩衝能力を有することを特徴とする組成物。
【請求項１９】
請求項１に記載の組成物であって、
前記組成物が加えられた前記赤血球（ＲＢＣ）懸濁液のｐＨを約６．４〜７．４の間に維持する働きがあること特徴とする組成物。
【請求項２０】
請求項１に記載の組成物であって、
前記組成物が加えられた前記赤血球（ＲＢＣ）懸濁液のｐＨを約７．０〜７．２未満の間に維持する働きがあること特徴とする組成物。
【請求項２１】
請求項１に記載の組成物であって、
前記組成物が加えられた前記赤血球（ＲＢＣ）懸濁液のｐＨを約７．１よりも高く、７．２よりも低い値に維持する働きがあることを特徴とする組成物。
【請求項２２】
請求項５に記載の組成物であって、
約１〜３ｍＭのアデニンと、約２０〜１１５ｍＭのデキストロースと、約１５〜６０ｍＭの非代謝性の膜保護糖と、約２０〜１３０ｍＭの重炭酸ナトリウムと、約４〜２０ｍＭのリン酸２ナトリウムとを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の組成物であって、
約２ｍＭのアデニンと、約６０〜１００ｍＭのデキストロースと、約４０〜６０ｍＭの非代謝性の膜保護糖と、約２２〜４０ｍＭの重炭酸ナトリウムと、約７〜１５ｍＭのリン酸２ナトリウムとを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２４】
請求項２３に記載の組成物であって、
約２ｍＭのアデニンと、約８０ｍＭのデキストロースと、約５５ｍＭの非代謝性の膜保護糖と、約２６ｍＭの重炭酸ナトリウムと、約１２ｍＭのリン酸２ナトリウムとを含み、さらに、約８．５のｐＨを有することを特徴とする組成物。
【請求項２５】
赤血球（ＲＢＣ）を保存期間中に保存する方法であって、
（ａ）保存するＲＢＣと血漿とを含む採取された全血のサンプルを抗凝固液と混合し、それによって、採取された全血の懸濁液を作成するステップと、（ｂ）血漿を除去し、ＲＢＣを濃縮するために前記採取された全血を処理し、それによって、濃厚ＲＢＣを作成するステップと、（ｃ）前記濃厚ＲＢＣを、約３５〜７０容量％のＲＢＣを有するＲＢＣ懸濁液を作成するのに十分な量の水性組成物と混合するステップと、（ｄ）前記ＲＢＣ懸濁液を約１〜６℃に冷却するステップと、（ｅ）前記冷却したＲＢＣ懸濁液を血液銀行の標準的な方法にしたがって保存するステップとを含み、
前記水性組成物は、アデニンと、デキストロースと、少なくとも１つの非代謝性の膜保護糖と、ｐＨ緩衝系とを本質的に含んでおり、
前記ｐＨ緩衝系は、重炭酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質と、リン酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質と、ナトリウムカチオンを提供する少なくとも１つの物質とを含む生理学的に許容される緩衝剤の組み合わせを有し、
前記ｐＨ緩衝系は、１，３−ＤＰＧからの２，３−ジホスホグリセレート（ＤＰＧ）の合成よりも解糖を優先する赤血球内の反応平衡を保存期間中に確立及び維持するのに十分な量の前記組成物が加えられる前記赤血球（ＲＢＣ）懸濁液のｐＨを前記組成物が維持する働きをするのに十分な量で存在し、それによって、保存期間中に反応平衡でＡＴＰ合成が発生することを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記ＲＢＣ懸濁液は、前記ＲＢＣ懸濁液の直接注入を必要とする患者への直接注入に適切であることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２５に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記少なくとも１つの非代謝性の膜保護糖は、マンニトールであることを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２５に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記ナトリウムカチオンを提供する少なくとも１つの物質は、重炭酸ナトリウムと、リン酸２ナトリウムと、及びそれらの組み合わせとから成る群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２５に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記重炭酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質は、重炭酸ナトリウムであることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２５に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記リン酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質は、リン酸ナトリウムと、リン酸２ナトリウムと、リン酸３ナトリウムと、及びそれらの組み合わせからと成る群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項２５に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記リン酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質は、リン酸２ナトリウムであることを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項２５に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記生理学的に許容される緩衝剤の組み合わせは、Ｈ＋と、カリウムと、アンモニウムと、マグネシウムと、それらの組み合わせとから成る群から選択される生理学的に許容されるカチオンを提供する少なくとも１つの物質をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項２５に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記組成物は、約２００〜３１０ｍＯｓｍのオスモル濃度を有することを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記オスモル濃度は、約２２１〜２８０ｍＯｓｍであることを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記オスモル濃度は、約２７０ｍＯｓｍであることを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項２５に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記組成物は、約８〜９のｐＨを有することを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記組成物のｐＨは、約８．２〜８．８であることを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項３６に記載のＲＢＣを保存するための方法であって、
前記組成物のｐＨは、約８．４〜８．６であることを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項３６に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記組成物のｐＨは、約８．５であることを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項２５に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記緩衝系は、６週間の保存期間中に６．５〜７．２の間のｐＨで少なくとも２ｍＥｑ増加する前記組成物が加えられる赤血球（ＲＢＣ）懸濁液において緩衝能力を有することを特徴とする方法。
【請求項４１】
請求項２５に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記組成物は、前記組成物が加えられた赤血球（ＲＢＣ）懸濁液のｐＨを約６．４〜７．４の間に維持する働きがあること特徴とする方法。
【請求項４２】
請求項２５に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記組成物は、前記組成物が加えられた赤血球（ＲＢＣ）懸濁液のｐＨを約７．０〜７．２未満の間に維持する働きがあること特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項２５に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記組成物は、前記組成物が加えられた赤血球（ＲＢＣ）懸濁液のｐＨを約７．１よりも高く、７．２よりも低い値に維持する働きがあることを特徴とする方法。
【請求項４４】
請求項２８に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記組成物は、約１〜３ｍＭのアデニンと、約２０〜１１５ｍＭのデキストロースと、約１５〜６０ｍＭの非代謝性の膜保護糖と、約２０〜１３０ｍＭの重炭酸ナトリウムと、約４〜２０ｍＭのリン酸２ナトリウムとを含むことを特徴とする方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記組成物は、約２ｍＭのアデニンと、約６０〜１００ｍＭのデキストロースと、約４０〜６０ｍＭの非代謝性の膜保護糖と、約２２〜４０ｍＭの重炭酸ナトリウムと、約７〜１５ｍＭのリン酸２ナトリウムとを含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記組成物は、約２ｍＭのアデニンと、約８０ｍＭのデキストロースと、約５５ｍＭの非代謝性の膜保護糖と、約２６ｍＭの重炭酸ナトリウムと、約１２ｍＭのリン酸２ナトリウムとを含み、さらに、約８．５のｐＨを有することを特徴とする方法。
【請求項４７】
請求項４５に記載のＲＢＣを保存するの方法であって、
前記組成物と前記採取された全血との比は、それぞれ約１：４．５であることを特徴とする方法。
【請求項４８】
請求項４５に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記組成物の容量は約１１０ｍＬであり、前記採取された全血の容量は５００ｍＬであることを特徴とする方法。
【請求項４９】
保存期間中に赤血球（ＲＢＣ）の膜維持を向上する、及びＲＢＣのアポトーシスを抑制する方法であって、
前記ＲＢＣを、請求項１に記載の組成物が加えられた懸濁液に保存期間中に保存するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項５０】
保存期間中に赤血球（ＲＢＣ）の膜維持を向上する、及びＲＢＣのアポトーシスを抑制する方法であって、
前記膜維持の指標は、保存期間終了の際のＲＢＣにおける微小胞の濃度の測定値であり、前記微小胞の濃度は、約５０〜７５％減少することを特徴とする方法。
【請求項５１】
保存期間中に赤血球（ＲＢＣ）の脆弱性を低下させる、及びＲＢＣの溶血を抑制する方法であって、
前記ＲＢＣを、請求項１に記載の組成物が加えられた懸濁液に保存期間中に保存するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項５２】
保存期間後及びＲＢＣ注入を必要とする患者への注入後の赤血球（ＲＢＣ）の生存能力を増大させる、並びに前記患者による前記ＲＢＣの注入後のクリアランスの程度を低下させる方法であって、
保存期間中に前記ＲＢＣを、請求項１に記載の組成物が加えられた懸濁液に保存するステップを含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本件の一部は、米国軍との契約（契約番号ＤＡＭＤ１７−９５−Ｃ−５０２９）に基づいて行われたので、米国政府が本発明の所有権を有し得る。
【０００２】
本発明は、一般的には、赤血球（red blood cell：ＲＢＣ）の保存に関する組成物及び方法に関連する。具体的には、本発明は、改善されたＲＢＣの保存組成物及び方法、及びそれらの利用法に関連する。
【背景技術】
【０００３】
患者へ再注入するための赤血球（ＲＢＣ）の保存方法は、現代手術の先駆けであり、比較的最近開発された技術である。この赤血球保存は科学的には困難であり、長期の保存期間の達成及び再注入される良質の赤血球の獲得のためのステップは追加されてきた。赤血球は、ドナーから採取されるとすぐに凝固し、栄養不足となり、ＡＴＰ、２，３−ＤＰＧ、膜の表面積及び完全性、並びにヘモグロビン（hemoglobin：Ｈｂ）を失い、死に始める。１９１６年にRous及びTurner、並びに１９１７年にRobertsonが初めて全血の保存に成功した。その後、抗凝固剤としてのクエン酸と赤血球に使用される唯一の栄養素であるデキストロースとを含む酸−クエン酸−デキストロース（Acid-citrate-dextrose：ＡＣＤ，１９４３）、並びに代謝物質としての及び膜の維持のためのリン酸をさらに含むクエン酸−リン酸−デキストロース溶液（Citrate-phosphate-dextrose solution：ＣＰＤ，１９５７）の使用が全血の２１日間の保存に承認された。その後、アデニンを有するＣＰＤ（ＣＰＤＡ−１，１９７９）が全血及び濃厚ＲＢＣの保存期間を最大５週間までに延長するのに導入され、使用された。
【０００４】
当初は、最終生産工程に行われる熱滅菌の際にグルコースがキャラメル化するのを防止するために、保存組成物は酸性になるように設計されていた。１９５０年代にアデニンが添加物として有用であることが判明した。アデニンは、脱アミノ反応によって損失したアデニンを補う。１９７０年代には、血小板の除去及び血漿製剤の作成のために、採取された全血から血漿を除去することが望ましくなった。しかし、これにより、得られる「濃厚ＲＢＣ」の回収率が減少した。
【０００５】
これを回避するために、添加液（additive solutions：ＡＳ）として当該技術分野で公知の組成物が、ＲＢＣ保存液の容量、栄養素及び他の有用なＲＢＣの安定剤を再構築する目的で開発された。全血液から単離された赤血球（ＲＢＣ）を保存するための添加液の組成は、ＲＢＣの必要性に合わせて作成される。１９８１年には、開発されたある添加液でＲＢＣを６週間までに保存することが可能となった。しかしながら、これらの溶液に保存された赤血球（ＲＢＣ）は、６週間後には常に劣化した。これは、人間のドナーへ再注入された赤血球の７５％が２４時間以内に循環系において生存できないことにより断定された。赤血球の冷蔵保存を継続すると、グルコースの消費が低下し、代謝廃棄物（すなわち、乳酸及び水素イオン）が増加することが確認された。このようなグルコースの代謝低下により、アデノシン三リン酸（adenosine tri phosphate：ＡＴＰ）が枯渇する。ＡＴＰは、循環系に戻される際のＲＢＣの回収率に直接関連する。Ａｄｓｏｌ．ＲＴＭ（ＡＳ−１）、Ｎｕｔｒｉｃｅｌ．ＲＴＭ（ＡＳ−３）、Ｏｐｔｉｓｏｌ．ＲＴＭ（ＡＳ−５）、及びＥｒｙｔｈｒｏＳｏｌ．ＲＴＭなどの添加液は、１〜６℃でのＲＢＣの保存を延長するように考案されている。米国で認可された３つの全てのＡＳ（ＡＳ−１，ＡＳ−３、及びＡＳ−５）は、食塩水、アデニン、グルコース、並びに「細胞膜の保護剤」としての少量のクエン酸及び／又はマンニトールを含む。また、ＡＳ−３は、モノナトリウムリン酸塩をも含む。米国で認可されたそれぞれのＡＳは、ＲＢＣの６週間保存への使用のための認可の必要条件を満たすが、ＲＢＣを７週間保存することはできない。現在認可されているＲＢＣ添加液の組成物は、保存損傷（storage lesion）（ここでは、ＲＢＣの生存及び／又は機能を制限する保存の総合効果として定義する）がアポトーシス過程であると判明する以前に開発された。
【０００６】
現在、採取される全血は各成分に分けられ、ＲＢＣ画分は濃厚ＲＢＣとして保存される。添加液系に取り込まれる血液に関しては、遠心分離によってＲＢＣが濃縮され、ＲＢＣが容量の８０％を構成するように血漿が除去され、１００ｍｌの添加液が無菌的に加えられる。得られる懸濁液のＲＢＣの容量分率は、約５５％である。ＲＢＣは、ＦＤＡに認可された従来の添加液では６週間のみ保存可能であり、その期間中には許容されるインビボ回収率（体内に注入された２４時間後）を示す。
【０００７】
保存期間後に患者に再注入されるＲＢＣの許容されるインビボ回収率の程度を増大させるために、添加液及び保存方法を改善する試みが行われた。「Studies In Red blood cell Preservation-7. In vivo and in vitro Studies With A Modified Phosphate-Ammonium Additive Solution（Greenwalt et al., Vox. Sang. 65:87-94, 1993）」では、著者らは、２０ｍＭのＮＨ４ＣＬ、３０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２ｍＭのアデニン、１１０ｍＭのデキストロース、５５ｍＭのマンニトールを含む実験的な添加液（ＥＡＳ−２）（ｐＨ＝７．１５）が人間のＲＢＣの保存期間を現行基準である５〜６週間から８〜９週間に延長するのに有用であると断定した。しかしながら、ＥＡＳ−２に存在するアンモニウムにより、この添加液に保存された濃厚ＲＢＣを直接注入することはできず、輸血の前に洗浄工程で上精を除去する必要がある。
【０００８】
「Studies in Red blood cell Preservation-8; Liquid Storage of Red Cells in Glycerol-Containing Additive Solution（Greenwalt et al., Vox. Sang. 67:139-143, 1994）」では、著者らは、９週間後において７３％の濃厚赤血球の回収率を可能にする添加液（ＥＡＳ−２５）を示した。しかしながら、得られるＲＢＣ液は、約１パーセントのグリセロールを含む。したがって、人間にこのＲＢＣ液を大量に注入するのは安全ではない。
【０００９】
「Extending the Storage of Red Cells at 4.degree. C.（Meryman et al., Transfus. Sci. 15:105-115, 1994）」では、非常に希薄な懸濁液に低へマトクリット値で２７週間ほど保存されたＲＢＣは、許容範囲の生存率を示した。しかしながら、このように保存されたＲＢＣは、カリウム及びアンモニアの高い含量並びにＲＢＣの低い容量分率により、直接注入できない。この有効性を実現するためには、２００ｍＬのＲＢＣに対して５Ｌの添加溶液が必要であり、これは、臨床的に実施できない。
【００１０】
認可及び市販されている製品に関しては、米国で現在認可されている添加液は、約６週間のみ保存効果があり、約８０％のＲＢＣ回収率を示す。現在ヨーロッパで認可されている２つの添加液は、約７週間の保存効果があり、平均して７７％の回収率（Baxter Healthcare（La Chatre, France）市販のErythroSol）及び７５％の回収率（Maco Pharma市販のPAGGSマンニトール）を示す。Kurupら（Vox Sang 2003: 85:253-261）によって示された新規の添加液は、低濃度のＡＴＰにより、保存期間はより短いと思われる。
【００１１】
従来の発見の欠点に対応するために、本発明者らは、低量のリン酸２ナトリウムを含み、採取される血液に対するＣＰＤ（citrate-phosphate-dextrose：クエン酸塩−リン酸−デキストロース）などの酸性抗凝固液の効果を中和したアルカリ性の試験的な添加液（experimental additive solution：ＥＡＳ）を開発した。これらのＥＡＳは、ＲＢＣのＡＴＰの濃度を改善し、溶血を減少させ、ＲＢＣ膜の形態変化及び損失を減少させた（米国特許第６，１５０，０８５号及び第６，４４７，９８７号（Hess 及び Greenwalt）を参照（参照により本明細書に組み込まれるものとする））。様々なＥＡＳが９〜１２週間の保存に有効であることが判明した。これらのＥＡＳは、より優れた性能結果を示したが、塩化ナトリウムを含むと共に比較的大量に使用されるように構成されている。その結果、保存されるＲＢＣは著しく希釈されるので、大量に輸血される患者の血液が希釈される危険性が高まる。また、塩化ナトリウムを含んでいることにより、望ましい量で溶液系に溶解できるはずの緩衝塩及びリン酸の溶解度が制限される。
【００１２】
輸血可能な血液の需要が高いが、断続的である期間（戦時中など）、及び輸血可能な血液が必要だが、その需要が非一貫的及び散発的である地域では、ＲＢＣ保存期間の延長は重要である。実際には、一般的な需要を把握する以前に安全な保存期間の終了のために多くのＲＢＣ製剤が無駄に廃棄されていると報告されており、それを考えると、ＲＢＣを安全に保存できる保存期間の延長は普遍的な課題である。
【００１３】
したがって、従来の添加液の量と同様に低量でＲＢＣの回収率及び性能を維持又は高めるように構成されたＲＢＣの保存組成物が必要である。長期の保存期間、より優れた回収率、及び注入されたＲＢＣの生理的な性能の向上を可能にするような優れたＲＢＣ保存のための血液保存及び輸血の技術が常に必要である。したがって、より優れたＲＢＣ保存組成物及びその作成方法が必要になってくる。また、添加組成物が加えられたＲＢＣ懸濁液を人間に直接注入できるようにし、かつＲＢＣの生理的な機能を高め、そのクリアランスの程度を低下させ、許容範囲の回収率を可能にする添加組成物も常に必要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって、本発明は、採取された赤血球の保存に適切な新規の組成物を提供する。従来、塩化ナトリウムは、保存組成物の適切な作用に必要であると考えられた。しかし、本発明者らは、このような組成物から塩化ナトリウムを実質的に除去すると、組成物の性質が向上し、ｐＨ緩衝液系の機能が高まることを発見した。このｐＨ緩衝液系の機能の高まりにより、保存及び再注入される赤血球の完全性及び機能性質の点、並びに必要な回収率を維持した状態及び認可のために規制法が制限するレベルを越えない溶血レベルを有する状態でＲＢＣが保存される保存期間の点に関する利点が得られる。また、本発明の組成物は、従来の量において優れた性能を維持するので、とりわけ大量の輸血を必要とする患者に注入される赤血球の保存に適切である。
【００１５】
本発明のある実施形態は、約１〜６℃における赤血球の保存のための組成物を提供する。組成物は、本質的には、アデニンと、デキストロースと、少なくとも１つの非代謝性の膜保護糖と、ｐＨ緩衝液系とを含む。ｐＨ緩衝液系は、重炭酸ナトリウムとリン酸２ナトリウムとを含み、組成物が約８〜９のｐＨを有するのに十分な量で存在する。ｐＨ緩衝系は、１，３−ＤＰＧからの２，３−ジホスホグリセレート（ＤＰＧ）の合成よりも解糖を優先する赤血球内の反応平衡を保存期間中に確立及び維持するのに十分な量の組成物が加えられる赤血球懸濁液のｐＨを前記組成物が維持する働きをするのに十分な量で存在し、それによって、保存期間中に反応平衡でＡＴＰ合成が発生する。本発明の他の実施形態では、組成物は塩化ナトリウムを実質的に有しない。
【００１６】
本発明に係る組成物のより具体的な実施形態は、特定の組成物及びその量と、組成物のオスモル濃度及びｐＨの範囲とを対象にしている。他の具体的な実施形態は、赤血球のｐＨを特定の値の範囲で維持する働きのある本発明に係る組成物を対象にする。
【００１７】
本発明のさらなる実施形態は、本発明に係る組成物を含む赤血球の懸濁液を対象にする。
【００１８】
また、本発明の方法の実施形態も提供される。このような実施形態の１つは、保存期間に赤血球（ＲＢＣ）を保存する方法を対象にする。前記方法は、（ａ）保存するＲＢＣと血漿とを含む採取された全血のサンプルを抗凝固液と混合し、それによって、採取された全血の懸濁液を作成するステップと、（ｂ）血漿を除去し、ＲＢＣを濃縮するために前記採取された全血を処理し、それによって、濃厚ＲＢＣを作成するステップと、（ｃ）前記濃厚ＲＢＣを、約３５〜７０容量％のＲＢＣを有するＲＢＣ懸濁液を作成するのに十分な量の組成物と混合するステップと、（ｄ）前記ＲＢＣ懸濁液を１〜６℃に冷却するステップと、（ｅ）前記冷却したＲＢＣ懸濁液を血液銀行の標準的な方法にしたがって保存するステップとを含む。組成物は、本質的には、アデニンと、デキストロースと、少なくとも１つの非代謝性の膜保護糖と、ｐＨ緩衝液系とを含む。ｐＨ緩衝液系は、重炭酸ナトリウムとリン酸２ナトリウムとを含み、組成物が約８〜９のｐＨを有するのに十分な量で存在する。ｐＨ緩衝系は、１，３−ＤＰＧからの２，３−ジホスホグリセレート（ＤＰＧ）の合成よりも解糖を優先する赤血球内の反応平衡を保存期間中に確立及び維持するのに十分な量の組成物が加えられる赤血球懸濁液のｐＨを前記組成物が維持する働きをするのに十分な量で存在し、それによって、保存期間中に反応平衡でＡＴＰ合成が発生する。さらに具体的な実施形態を示す。
【００１９】
さらなる実施形態は、赤血球（ＲＢＣ）膜の維持の向上及び保存期間中のＲＢＣのアポトーシスの抑制と、赤血球（ＲＢＣ）の脆弱性を低下させ、保存期間中の溶血を抑制することと、保存期間後及び赤血球（ＲＢＣ）の注入を必要とする患者への注入後の赤血球（ＲＢＣ）の生存能力を増大させ、注入後のＲＢＣの患者によるクリアランスの比率を減少させることとのために本発明に係る組成物を使用する方法を対象にする。
【００２０】
本発明にしたがって作成された組成物及びＲＢＣ懸濁液は、注入後に十分な治療量のＲＢＣが回収される保存期間を提供する。また、ＲＢＣ注入のために確立及び承認されている公知の標準的な処理を行うことなく、ＲＢＣ懸濁液を直接注入することができる。
【００２１】
本発明のこれらの及びさらなる実施形態及び態様は、下記の図面、発明を実施するための最良の形態、及び実施例により、さらに理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、一般的に、赤血球（ＲＢＣ）の保存に関する組成物及び方法に関連する。とりわけ、本発明は、新規の添加液と、クエン酸塩−リン酸−デキストロース（citrate phosphate dextrose：ＣＰＤ）溶液、その溶液の異種型、クエン酸塩−リン酸−デキストロース２デキストロース（citrate phosphate double dextrose：ＣＰ２Ｄ）溶液、又はアフェレーシス（患者又はドナーからの全血液の除去）で酸−クエン酸−デキストロース（acid citrate dextrose：ＡＣＤ）溶液若しくは同様な溶液に採取された全血から分離されたＲＢＣの保存に関する方法とに関連する。
【００２３】
本発明の目的上、「回収」という用語は、保存されたＲＢＣの一部分が人間に再注入された後の２４時間の間に循環系に留まることを示す意味で本明細書で使用されている。
【００２４】
本明細書で使用されている「塩化物」は、アニオン性塩化物を意味する。したがって、「塩化物」という用語は、アニオン性塩化物及びそれらの塩（塩素アニオンと生理学的に許容されるカチオンとから作成される塩など）を含む。「塩化物」という用語は、塩素原子が共有結合している化合物（例えば、炭素原子と塩素とが共有結合した有機分子）を意味するものではない。
【００２５】
本明細書に使用されている「生理学的に許容される緩衝剤」は、人間の血液、血漿、若しくは血清に存在する、又は人間の体内に導入される際に耐容されるカチオン及びアニオンを発生させる緩衝剤を意味する。適切なカチオンとしては、陽子、アンモニウムカチオン、及び金属カチオンがある。適切な金属カチオンとしては、これらに限定されるものではないが、例えば、カチオン型のナトリウム、カリウム、カルシウム、及びマグネシウムがある。尚、ナトリウム及びカリウムの方が好ましく、その中でもナトリウムのカチオンが最も好ましい。アンモニウムカチオン（つまり、一般式Ｒ４Ｎ＋の化合物（尚、Ｒは水素又は有機基である）は、生理学的に許容される限り使用され得る。好ましい実施形態では、カチオンは、水素（すなわち、水素イオン）と、カリウムと、アンモニウムと、マグネシウムと、それらの組み合わせとから選択される。本明細書で使用される「緩衝剤」は、組成物のｐＨを調整及び制御する物質を意味する。
【００２６】
本明細書に開示されている本発明に係る組成物は、水性である（つまり、水で調製されている）。本発明に係る好ましい水は、発熱物質（pyrogen）を本質的に含まないように処理されている（つまり、無菌である）。
【００２７】
本明細書に使用されている「ｍＥｑ／Ｌ」は、水の量に比例して存在する特定の化合物（溶質）の濃度を意味する。さらに具体的には、ｍＥｑ／Ｌは、１リットルの水当たりの溶質のミリ当量を意味する。１リットル当たりのミリ当量は、１リットル当たりの溶質のモル数に荷電種（群）の価数を掛け、それに１０００を掛けたものである。
【００２８】
本発明のある実施形態は、赤血球を約１〜６℃で保存するための水性組成物を提供する。前記組成物は、本質的には、アデニンと、デキストロースと、少なくとも１つの非代謝性の膜保護糖と、ｐＨ緩衝系とを含む。ｐＨ緩衝系は、生理学的に許容される緩衝剤の組み合わせを含み、重炭酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質と、リン酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質と、ナトリウムカチオンを提供する少なくとも１つの物質とを含む必要がある。本発明では、ある単一の緩衝塩がこれらの要求の２つ以上を満たすことができると考えられる。
【００２９】
赤血球の保存技術では、赤血球の懸濁液系におけるＡＴＰの濃度が系の健全性に最も関連するものであることがよく知られている。赤血球は、解糖でｄ−グルコース（デキストロース）を最終的に乳酸に変換することでＡＴＰを生成する。したがって、乳酸の濃度曲線は、ＡＴＰ合成に対しても良い指標になる。系の保存能力に関わらず、赤血球は限られた寿命を有する。採取された赤血球は様々な年齢を有し、その中には、自然死に近いものもある。保存系に新しいＲＢＣが入ることがないので、再注入後の必要な回収率を維持できる保存期間には限度がある。したがって、系のＡＴＰ産出能力全体は時間と共に減少する。しかし、添加液を加えると、その添加液が自然の濃度よりも高い濃度の栄養物質を提供するので、最初はＡＴＰが増加することがよくある。また、ＲＢＣは、最初は「膨張」する。これは、ＡＴＰの使用の減少にも関連する。
【００３０】
ＲＢＣを本発明に係る添加液に保存すると、理論的制約にとらわれずに、栄養溶液の容量の増加によって基質の供給が許容される濃度内で増加し、代謝廃棄物が希釈されるので、グルコース代謝に対するフィードバック阻害が減少すると考えられる。さらに、本発明に係る添加液は、初期にＲＢＣの膨張を引き起こす特徴があると考えられる。その後の保存の間にＲＢＣの容量は次第に減少する。
このような工程は、「調節性容量減少」と呼ばれる。この工程の間にＲＢＣに存在するチロシンホスファターゼ活性が阻害される、又はチロシン・キナーゼが活性化されると考えられる。これらの酵素は、ＲＢＣの膜に大量に存在することが示された（Zipser, Y. and Kosower, N. S. (1996) Biochem. J. 314:881; Mallozzi C. et al. (1997) FASEB J. 11 :1281）。ＲＢＣ膜のバンド３タンパクのリン酸化反応により、バンド３タンパクに結合しているホスホフルクトキナーゼ、アルドラーゼ、及びグリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼが細胞質に放出されると考えられる（Harrison, M. L. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:4106; Cossins, A. R. and Gibson J. S. (1997) J. Exper. Biol. 200:343; Low, P. S. et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:14627; Low, P. S. et al. (1995) Protoplasma 184:1961）。解凍経路にこれらの３つの酵素が作用すると、ＲＢＣによるグルコースの代謝が増加し、それにより、ＡＴＰの合成が増大し、ＲＢＣ内のＡＴＰの濃度が増加すると考えられる。したがって、添加液組成物の調製の目的は、ＡＴＰの合成ができる限り高い率でできる限り長く維持されることである。
【００３１】
本発明者らは、ＡＴＰ合成を最大限にするための手掛かりがＲＢＣの細胞内のｐＨを７．２に到達させることなく、できる限りその近くに維持することであると発見した。ＡＴＰの濃度は、保存の初期には一定に維持する又は一時的に増加さえするが、その後、減少する。ＲＢＣのＡＴＰ濃度が２μｍｏｌ／ｇ Ｈｂよりも低下すると、ＲＢＣの回収率は通常、７５％未満になる。ＲＢＣは、保存の初期に２，３−ＤＰＧを失う。一般的に、ＡＴＰの初濃度は、約１５μｍｏｌ／ｇ Ｈｂ又は約１．１ｍｏｌ／ｍｏｌ Ｈｂである。７〜１０日目には、濃度は通常、初濃度の１０分の１に低下する。２，３−ＤＰＧの合成速度は、ｐＨに比例する。ｐＨが７．２よりも高い場合は、前記合成は著しく行われるが、それよりも低い場合は、低下する。保存系のｐＨを上昇させることで２，３−ＤＰＧ合成を増大させると、２，３−ＤＰＧ分子が合成されるごとにＡＴＰ合成が１モルずつ減少するので、この試みには限界がある。したがって、従来望ましいと考えられたＲＢＣの２，３−ＤＰＧ濃度の上昇は、実際には、ＲＢＣの保存期間を減少させる。
【００３２】
保存系の環境が酸性になればなるほど、ＲＢＣの代謝は低下する。ｐＨが７．２のときには、ラパポート・シャント（Rappaport shunt）（「Alkaline CPD and the preservation of red blood cell ２，３−ＤＰＧ（Hess et al, (2002) Transfusion, 42:747-752」を参照（参照により本明細書に含まれるものとする））として知られる機構が起きる。この機構では、１，３−ＤＰＧから２，３−ＤＰＧが合成され、ＡＴＰ合成に必要なリン酸が消費され、解糖的に２分子のＡＴＰを合成する解糖ステップが回避される。系に対するこの機構の正味の影響は、ＡＴＰの枯渇である。細胞内ｐＨが７．２未満である場合は、シャントは効果的に遮断され、ＡＴＰ合成が最大限になる。自然状態では、シャントはある程度機能し、２，３−ＤＰＧは他の細胞機構に対して重要である。しかしながら、本発明者らは、インビボ環境外での保存期間中に赤血球を保存するためには、シャント作用の最小化が望ましいと発見した。
【００３３】
したがって、本発明に係る組成物の実施形態では、ｐＨ緩衝系は、１，３−ＤＰＧからの２，３−ジホスホグリセレート（ＤＰＧ）の合成よりも解糖を優先する赤血球内の反応平衡を保存期間中に確立及び維持するのに十分な量の組成物が加えられる赤血球懸濁液のｐＨを前記組成物が維持する働きをするのに十分な量で存在し、それによって、保存期間中に反応平衡でＡＴＰ合成が発生する。本発明に係る組成物のある具体的な実施形態では、組成物は、その組成物が加えられた赤血球（ＲＢＣ）懸濁液のｐＨを約６．４〜７．４の間に維持する働きがある。さらに具体的な実施形態では、組成物は、その組成物が加えられた赤血球（ＲＢＣ）懸濁液のｐＨを約７．０〜７．２の間に維持する働きがある。さらに具体的な実施形態では、組成物は、その組成物が加えられた赤血球（ＲＢＣ）懸濁液のｐＨを約７．１よりも高く、約７．２よりも低い値に維持する働きがある。
【００３４】
本発明者らは、塩化物を実質的に含まない添加液を作成した。意外なことに、塩化物の不在は系に対して悪影響を及ぼすことなく、むしろそれにより、緩衝効果を増大させるために緩衝系をさらに追加することができる。本発明のある実施形態は、約１〜６℃での赤血球の保存のための水性組成物をも対象にしている。この組成物は、アデニンと、デキストロースと、少なくとも１つの非代謝性の膜保護糖と、ｐＨ緩衝液系とを含む。ｐＨ緩衝系は、重炭酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質と、リン酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質と、及びナトリウムカチオンを提供する少なくとも１つの物質とを含む生理学的に許容される緩衝剤の組み合わせを含む。ｐＨ緩衝系は、１，３−ＤＰＧからの２，３−ジホスホグリセレート（ＤＰＧ）の合成よりも解糖を優先する赤血球内の反応平衡を保存期間中に確立及び維持するのに十分な量の組成物が加えられる赤血球懸濁液のｐＨを前記組成物が維持する働きをするのに十分な量で存在し、それによって、保存期間中に反応平衡でＡＴＰ合成が発生する。組成物は、外部由来の塩化物イオンを実質的に含まない。本明細書に使用されている「外部由来の塩化物イオンを実質的に含まない」は、組成物に塩化物イオンを発生させる物質が一切加えられていないことを意味する。
【００３５】
さらなる実施形態は、本発明に係るいずれかの組成物を含み、かつ患者に直接注入するのに適切な赤血球の懸濁液を対象にしている。
【００３６】
本発明に係る組成物のさらなる実施形態では、ナトリウムカチオンを提供する少なくとも１つの物質は、重炭酸ナトリウムと、リン酸２ナトリウムと、それらの組み合わせとから成る群から選択される。さらに具体的な実施形態では、重炭酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質は、重炭酸ナトリウムである。さらなる実施形態では、リン酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質は、リン酸ナトリウムと、リン酸２ナトリウムと、リン酸３ナトリウムと、それらの組み合わせとから成る群から選択される。さらに具体的な実施形態では、リン酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質は、リン酸２ナトリウムである。本発明に係る組成物の他の実施形態では、生理学的に許容される緩衝剤の組み合わせは、Ｈ＋と、カリウムと、アンモニウムと、マグネシウムと、それらの組み合わせとから成る群から選択される生理学的に許容されるカチオンを提供する少なくとも１つの物質をさらに含む。
【００３７】
本発明に係る組成物のさらなる実施形態では、少なくとも１つの非代謝性の膜保護糖は、マンニトールである。幾つかの糖アルコールは、特に単糖由来の糖アルコール（例えば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール）は、親水性の低分子であり、脂質バリアを介して容易に拡散し、細胞の安定性に重要な働きをし得る。特にマンニトールは、インビボでヒドロキシルラジカルのスカベンジャーとして作用する抗酸化物質として知られている。マンニトールは、細胞膜の完全性の維持に重要な役割を担い、膜保護糖として見なされている。他の低分子のポリオールもまた、膜保護糖として機能する。グルコース及びマンニトールが同じ分子量（１８０ｇ／モル）を有することを留意されたい。糖アルコールは、赤血球によって代謝されることはない。
【００３８】
本明細書に使用されているオスモル濃度は、実験的に求められる値である。オスモル濃度は、溶液によって完全な半透過性膜（水を通過させるが、溶質を通過させない）にかかる浸透圧の純水と比較した測定値である。オスモル濃度は、溶液中の溶質の数に依存するが、溶質の特性に依存しない。単純な溶液のオスモル濃度は、１分子の解離するパーティクルの数をモル濃度に掛けたものに等しい。実際の溶液に関しては、オスモル濃度の求め方は、より複雑である。１Ｌ当たりの当量が大きいタンパクは、「大きなパーティクル」を少量しか含まないのでオスモル濃度に少ししか寄与しないことがある。溶液中では、全ての分子が解離しているわけではない。カチオンは、他のアニオン又はタンパクに結合していることがある。溶液の容量全てが水に由来するものではない。正確に測定するためには、これらの要因を計算に加える必要がある。
【００３９】
張度は、オスモル濃度に非常に関連し、かつ生物細胞の状態を説明するのにより有用な値であり、物質によって細胞膜に発生する浸透圧の血漿と比較した測定値である。オスモル濃度は、浸透圧物質を完全な非透過性と過程した際の水の有効勾配を測定した値である。オスモル濃度は、単純に溶解した「パーティクル」の数である。例えば、３００ｍＭのグルコース溶液と１５０ｍＭのＮａＣＬ溶液は同じオスモル濃度を示す。しかしながら、これらの溶液に置かれた細胞は、非常に異なる作用をする。張度は、溶液が細胞内容量の膨張を抵抗する傾向を示す機能的用語である。
【００４０】
さらなる実施形態では、本発明に係る組成物のオスモル濃度は、約２００〜３１０ｍＯｓｍの間である。さらに具体的な実施形態では、本発明に係る組成物のオスモル濃度は、約２２１〜２８０ｍＯｓｍの間である。非常に具体的な実施形態では、オスモル濃度は、約２７０ｍＯｓｍである。
【００４１】
上記に説明したように、ＲＢＣはグルコース（ｄ−グルコース＝「デキストロース」）を代謝し、ＡＴＰを合成する。廃棄物は、乳酸及び水素イオンである。水素イオンは次第に蓄積し、ｐＨを下げ、さらなる代謝を阻害する。重炭酸塩は、水素イオンと結合し、ＲＢＣの炭酸脱水酵素によって水及び二酸化炭素に変換される緩衝系として示された。二酸化炭素の放散（diffusion）を可能にする保存容器では、逆反応は防止され、反応はＣＯ２の形成へと進行する。重炭酸塩系の緩衝系は、非常に有用である。添加液において生理的濃度で存在する重炭酸は、ｐＣＯ２を発生させる。このｐＣＯ２により、６００ｍＬの塩化ビニル袋から一週間に１〜２ｍｍｏｌのＣＯ２が放散される。しかしながら、重炭酸を用いたＲＢＣ保存添加液作成の以前の試みは、ＡＴＰ合成の増加及び保存期間の延長という点では失敗した。例えば、Beutler（BAG-PM）は、ＲＢＣ保存液に重炭酸を添加したが、高ｐＨを制御することができず、それにより、ＡＴＰが枯渇した。
【００４２】
ＲＢＣ添加液の組成物に食塩水が不要であることと、ＡＴＰ合成に悪影響を及ぼすことなくデキストロースの濃度を低下させることができることとを発見したことにより、本発明者は、溶液パラメータに生じた「余裕」を利用して、ｐＨ緩衝系を増加及び微調整することができた。本明細書に開示されている緩衝液系は、添加液組成物に対して適切な初期ｐＨをもたらすだけでなく、ＲＢＣのＡＴＰ合成を最大限にする細胞内ｐＨを調整するｐＨをもたらす。緩衝系は、保存期間中にこれらのｐＨ制御を行うことができる。したがって、ｐＨ緩衝系の緩衝能力は意図的に調整されている。本発明に係る組成物のある実施形態では、組成物のｐＨは、約８〜９である。さらに具体的な実施形態では、組成物のｐＨは、約８．２〜８．８である。なおさらに具体的な実施形態では、組成物のｐＨは、約８．４〜８．６である。非常に具体的なある実施形態では、組成物のｐＨは、約８．５である。他の実施形態は、６週間の保存期間中に６．５〜７．２の間のｐＨで少なくとも２ｍＥｑ増加する組成物が加えられる赤血球（ＲＢＣ）懸濁液において緩衝能力を示す緩衝系の前記組成物を対象にしている。本明細書に開示している緩衝系は、少なくともこの値の緩衝能力を示すが、ＲＢＣ懸濁液に対してさらに大きな緩衝能力を示すことができる。それにより、保存期間はさらに延長する。
【００４３】
本発明者らは、本明細書で開示されている利点を可能にするために、組成物の必要な成分の範囲を決定した。本発明に係る組成物のある実施形態では、組成物は、約１〜３ｍＭのアデニンと、約２０〜１１５ｍＭのデキストロースと、約１５〜６０ｍＭの非代謝性の膜保護糖と、約２０〜１３０ｍＭの重炭酸ナトリウムと、約４〜２０ｍＭのリン酸２ナトリウムとを含む。さらに具体的な実施形態では、組成物は、約２ｍＭのアデニンと、約６０〜１００ｍＭのデキストロースと、約４０〜６０ｍＭの非代謝性の細胞膜保護糖と、約２２〜４０ｍＭの重炭酸ナトリウムと、約７〜１５ｍＭのリン酸２ナトリウムとを含む。なおさらに具体的な実施形態では、組成物は、約２ｍＭのアデニンと、約８０ｍＭのデキストロースと、約５５ｍＭの非代謝性の膜保護糖と、約２６ｍＭの重炭酸ナトリウムと、約１２ｍＭのリン酸２ナトリウムとを含み、約８．５のｐＨを有する。
【００４４】
また、本発明は、方法の実施形態をも提供する。ある実施形態では、保存期間中に赤血球（ＲＢＣ）を保存する方法が提供される。前記方法は、（ａ）保存するＲＢＣと血漿と含む採取された全血のサンプルを抗凝固液と混合し、それによって、採取した全血の懸濁液を作成するステップと、（ｂ）血漿を除去し、ＲＢＣを濃縮するために前記採取された全血を処理し、それによって、濃厚ＲＢＣを作成するステップと、（ｃ）前記濃厚ＲＢＣを、約３５〜７０容量％のＲＢＣを有するＲＢＣ懸濁液を作成するのに十分な量の組成物と混合するステップと、（ｄ）前記ＲＢＣ懸濁液を１〜６℃に冷却するステップと、（ｅ）前記冷却したＲＢＣの懸濁液を、当該技術分野で公知の血液銀行の標準的な方法にしたがって保存するステップとを含む。水性組成物は、本質的には、アデニンと、デキストロースと、少なくとも１つの非代謝性の膜保護糖と、ｐＨ緩衝液系とを含む。ｐＨ緩衝系は、重炭酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質と、リン酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質と、ナトリウムカチオンを提供する少なくとも１つの物質とを含む生理学的に許容される緩衝剤の組み合わせを含む。ｐＨ緩衝系は、１，３−ＤＰＧからの２，３−ジホスホグリセレート（ＤＰＧ）の合成よりも解糖を優先する赤血球内の反応平衡を保存期間中に確立及び維持するのに十分な量の組成物が加えられる赤血球懸濁液のｐＨを前記組成物が維持する働きをするのに十分な量で存在し、それによって、保存期間中に反応平衡でＡＴＰ合成が発生する。製造中には、滅菌工程の間にデキストロースとリン酸と重炭酸とを分離するように溶液は分けられる。
【００４５】
本発明に有用なＲＢＣは、血漿から分離され、通常の成分製造の過程で抗凝固液に再懸濁されたＲＢＣである。簡単に説明すると、ＲＢＣと血漿とを含む標準の全血サンプル（４５０±４５ｍｌ）を約６３ｍｌの抗凝固液と混合し、全血の懸濁液を作成する。ドナーの血液量に応じて、溶液量を比例的に増加又は減少させることができる（４００±４０ｍｌ〜５００±５０ｍｌ）。その後、濃厚ＲＢＣを作成するために、ＲＢＣを血漿から分離し、全血の懸濁液を遠心分離する。従来の技術を用いて白血球を減少させると、全工程の結果がさらに向上する。
【００４６】
適切な凝固剤として、ＲＢＣの保存に使用される従来の凝固剤がある。好ましくは、抗凝固剤は、クエン酸を含み、５．５〜８．０のｐＨを有する。（例えば、ＣＰＤ、２倍に希釈されたＣＰＤなど）。最も好ましい抗凝固剤は、ＣＰＤである。
【００４７】
その後にＲＢＣ懸濁液は、通常、収集バッグ又は分割量に応じた様々な大きさのＰＶＣトランスファーパックを使用してポリ塩化ビニル（polyvinyl chloride：ＰＶＣ）の標準血液保存バッグに保存する。ＲＢＣ懸濁液は、「Clinical-Practice of Blood Transfusion（editors: Petz & Swisher, Churchill-Livingston publishers, N. Y., 1981）」に記載されている血液銀行の標準的な方法にしたがって、約１〜６℃で保存される。本明細書で引用されている全ての文献は、参照により、本明細書に組み込まれるものとする。本発明に係る方法のある具体的な実施形態では、ＲＢＣの懸濁液は、その直接注入を必要とする患者への直接注入に適切である。ＰＶＣ血液保存バッグは本業界で承認された標準規格だが、本発明では、ＲＢＣ懸濁液の保存に適切な様々なバッグ（例えば、必要な可塑剤などを含んだもの）での保存も考えられる。本明細書では、ＲＢＣの保存技術に関するバッグ又は容器に関連する成分についての説明はないが、本発明を実施するために様々な容器技術が使用され得ることは当業者に明白になるであろう。
【００４８】
凍結乾燥されたＲＢＣを再水和する、又は保存された凍結血液又は血液成分（例えば、ＲＢＣ）を解凍するためにも本発明に係る添加液を使用することができる。
【００４９】
本発明に係るＲＢＣ保存方法の具体的な実施形態では、少なくとも１つの非代謝性の膜保護糖は単糖由来のアルコール糖であり、さらに具体的な実施形態では、非代謝性の膜保護糖はマンニトールである。本発明に係る方法のさらなる実施形態では、ナトリウムカチオンを提供する少なくとも１つの物質は、重炭酸ナトリウムと、リン酸２ナトリウムと、それらの組み合わせとから成る群から選択される。具体的な実施形態では、重炭酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質は、重炭酸ナトリウムである。ＲＢＣの保存方法に関するさらなる実施形態では、リン酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質は、リン酸ナトリウムと、リン酸２ナトリウムと、リン酸３ナトリウムと、それらの組み合わせとから成る群から選択される。さらに具体的な実施形態では、リン酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質は、リン酸２ナトリウムである。本発明に係る方法の他の実施形態では、生理学的に許容される緩衝剤の組み合わせは、Ｈ＋と、カリウムと、アンモニウムと、マグネシウムと、それらの組み合わせとから成る群から選択される生理学的に許容されるカチオンを提供する少なくとも１つの物質をさらに含む。
【００５０】
ＲＢＣの保存方法に関するさらなる実施形態では、組成物は、約２００〜３１０ｍＯｓｍのオスモル濃度を有する。具体的な実施形態では、オスモル濃度は約２２１〜２８０ｍＯｓｍであり、さらに具体的な実施形態では、オスモル濃度は約２７０ｍＯｓｍである。本発明に係る方法の他の実施形態では、組成物は、約８〜９のｐＨを有する。具体的な実施形態では、組成物のｐＨは約８．２〜８．８であり、他のさらに具体的な実施形態では、組成物のｐＨは約８．４〜８．６である。なおさらに具体的な実施形態では、組成物のｐＨは約８．５である。本発明に係るＲＢＣ保存方法のさらなる実施形態では、緩衝系は、６週間の保存期間中に６．５〜７．２の間のｐＨで少なくとも２ｍＥｑ増加する組成物が加えられる赤血球（ＲＢＣ）懸濁液において緩衝能力を示す。
【００５１】
本発明に係るＲＢＣ保存方法のある実施形態では、組成物は、前記組成物が加えられた赤血球（ＲＢＣ）懸濁液のｐＨを約６．４〜７．４の間に維持する働きがある。具体的な方法の実施形態では、組成物は、前記組成物が加えられた赤血球（ＲＢＣ）懸濁液のｐＨを７．０以上約７．２未満に維持する働きがある。また、なおさらに具体的な方法の実施形態では、組成物は、前記組成物が加えられた赤血球（ＲＢＣ）懸濁液のｐＨを７．１よりも高く、７．２よりも低い値に維持する働きがある。
【００５２】
組成物に必要な成分の量の具体的な範囲を対象にする本発明に係る方法をも提供する。ある実施形態では、組成物は、約１〜３ｍＭのアデニンと、約２０〜１１５ｍＭのデキストロースと、約１５〜６０ｍＭの非代謝性の膜保護糖と、約２０〜１３０ｍＭの重炭酸ナトリウムと、約４〜２０ｍＭのリン酸２ナトリウムとを含む。さらに具体的な実施形態では、組成物は、約２ｍＭのアデニンと、約６０〜１００ｍＭのデキストロースと、約４０〜６０ｍＭの非代謝性の細胞膜保護糖と、約２２〜４０ｍＭの重炭酸ナトリウムと、約７〜１５ｍＭのリン酸２ナトリウムとを含む。なおさらに具体的な実施形態では、組成物は、約２ｍＭのアデニンと、約８０ｍＭのデキストロースと、約５５ｍＭの非代謝性の膜保護糖と、約２６ｍＭの重炭酸ナトリウムと、約１２ｍＭのリン酸２ナトリウムとを含み、８．５のｐＨを有する。
【００５３】
本発明に係る方法では、添加液は、治療効果のあるＲＢＣ回収量を提供するのに必要な量で濃厚ＲＢＣ懸濁液に加えられる。添加液は、好ましくは約６０ｍ〜４００ｍｌ、さらに好ましくは約１００ｍｌ〜１５０ｍｌ、最も好ましくは約１１０ｍｌの量で加えられる。溶液は、通常、採取された全血に対して１：４．５の容量比で使用される（４５０ｍＬの全血に対して１００ｍＬ、５００ｍＬの全血に対して１１１ｍＬなど）。本発明に係るＲＢＣ保存方法の具体的な実施形態では、組成物と全血との容量比は、それぞれ約１：４．５である。さらに具体的な実施形態では、組成物の容量は約１１０ｍＬであり、採取された全血の容量は５００ｍＬである。
【００５４】
ＲＢＣ懸濁液におけるＲＢＣの容積率（すなわち、添加液の添加後）は、全懸濁液の約２７〜７０％である。より好ましくは、細胞懸濁液におけるＲＢＣの容積率は、約３５〜５０％である。最も好ましくは、細胞懸濁液におけるＲＢＣの容積率は、全懸濁液の約４３％である。
【００５５】
本発明者らは、保存期間中に赤血球の健康状態に関するデータをモニター及び回収した。図１及び２で示されているように、本発明に係る保存方法により、より長期間の間により少量の液体量で赤血球の性質を向上させることができた。上記で説明したように、血液保存「損傷」は、アポトーシス事象であり、赤血球の膜は、プログラム化された細胞死にしたがって生理的及び形態的な変化をする。保存期間中の間に、赤血球膜表面積が減少することが知られている。その結果、赤血球の形状が、容量当たりの最大表面積を可能にし、それによりガス及び栄養物の拡散を可能にする両凹の形状から死ぬ脆弱な細胞の特徴である球状に変化する。赤血球の膜は、初期には柔軟であり、変形可能なので、毛細血管を通過できる。この形状の全体的な変化の間には、赤血球の膜が摘まれたようになり、外面に針状体が形成される。この工程の終期には、観察上、細胞はハリネズミ（urchin）のような形状になる（したがって、この工程は、エキノサイト変化（echinocytic change）と呼ばれ、リーシス前の最終形状は、エキノサイトと呼ばれる）。その結果、細胞は脆弱になり、リーシス及び死を迎える。溶血度を測定することにより、この細胞死の比率及び重度を示すことができる。これらの形態的な変化は、保存中に許容できない程度の溶血を引き起こすだけでなく、この保存された赤血球を注入された患者でクリアランス機構を引き起こし、注入後の赤血球の回収率及び輸血の効率を低下させる。
【００５６】
本発明のある実施形態は、保存期間中に赤血球（ＲＢＣ）の膜維持の向上及びＲＢＣアポトーシスを抑制する方法を提供する。その方法は、保存期間中に、本発明に係る組成物が加えられた懸濁液にＲＢＣを保存するステップを含む。ある具体的な実施形態では、ＡＳ−３を含むＲＢＣ懸濁液で同じ保存期間中に保存された赤血球よりも、微小胞濃度（microvesicular concentration）が７５％減少した。
【００５７】
本発明の他の実施形態は、保存期間中に赤血球（ＲＢＣ）の脆弱性を低下する方法及びＲＢＣの溶血を抑制する方法を提供する。その方法は、保存期間中に、本発明に係る組成物が加えられた懸濁液にＲＢＣを保存するステップを含む。さらなる実施形態は、保存期間後及び患者への注入後の赤血球の生存率を増加させる方法、並びに患者による注入後の赤血球のクリアランスを減少させる方法を対象にしている。その方法は、保存期間中に、本発明に係る組成物が加えられた懸濁液にＲＢＣを保存するステップを含む。
【００５８】
本発明に係る添加液組成物は、従来技術の添加液よりも幾つかの点で優れている。赤血球を本発明に係る添加液に保存すると、現在認可されている添加液で保存するときよりも、さらに長く保存することができる（少なくとも８週間）。その際、放射性クロムで標識したＲＢＣを使用して注入の２４時間後におけるインビボ回収率を測定したところ、従来の添加液で保存したＲＢＣのものよりも優れていた。本発明に係る組成物を使用すると、明らかに保存損傷の比率及び重度を減少させることができる。保存期間中、本発明に係る添加液に懸濁した赤血球は、許容範囲の溶血を示す。その溶血は、６週間目には、０．２％であり、８週間目には、０．４％である。これら全ては、ＦＤＡの制限値である１％（認められた保存期間終了の際）よりも低い。本発明に係る添加液で保存された赤血球が微小胞体膜の濃度の低さ及び浸透圧脆弱性の低さを示すことから、保存期間中でのその膜の損失が低いことが示される。
【００５９】
保存中に膜が維持されたＲＢＣは、膜をほとんど失ったものよりもより優れた流動性を有すると考えられる。膜の通常の生理機能を保持することによって、赤血球を注入された患者の体内での、赤血球の循環系からのクリアランス及び破壊を引き起こす機構をも抑制することができる。それによって、再注入された赤血球は患者の体内でさらに長く留まり、その長期的な回収率はさらに高まる。また、注入された赤血球の長期的な生存率が高まることにより、輸血の繰り返しが減少し、輸血に伴う患者に対する危険性が低下する。また、本発明に係る添加液により、保存期間の後期にＲＢＣのＡＴＰを高濃度に保つことが可能となり、これにより、ＲＢＣのＡＴＰの分泌が向上する。したがって、体内に注入された後の赤血球の流動性及び寿命が向上する。実践的には、本発明に係る添加液は、新鮮凍結血漿及びランダムドナー由来の血小板の製造又は緊急時の新鮮全血の採取のための従来の採取方法（ＣＰＤ又はＣＰ２Ｄに全血を採取する）と共に使用する際には有用である。
【００６０】
下記の実施例は、例示するためであって、特許請求の範囲によって定義されている本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
【実施例】
【００６１】
表１：試験された添加液の組成物
2008529550.tif 000002
【００６２】
［実施例１］
この実施例は、ＥＡＳ−８１（表１を参照）として表す本発明に係る添加液のある実施形態の性能の分析結果及び利点を説明するためである。ＥＡＳ−８１及びその比較対象であるＡＳ−３（Nutricel, Pal Biomedical製造）は従来の容量で使用されており、一方、比較対象ＥＡＳ−６１及びＥＡＳ−７６ｖ６は希釈された状態及びさらに大きな容量で使用されている。ＥＡＳ−８１及びＥＡＳ−７６ｖ６は、両方とも重炭酸塩を含む。図１では、重炭酸塩を含む組成物は丸印で表されており、重炭酸塩を含まないものはダイアモンド印で表されている。容量の大きい組成物は塗りつぶされた印で表されており、従来と同じ容量の組成物は中空の印で表されている。本明細書で開示されている添加液の全ての容量は全血５００ｍＬ当たりであり、添加液と全血との比は１：４．５である。
【００６３】
第１の実施例は、ＰＶＣバッグでの１０週間に及ぶ保存の際の、ＲＢＣ代謝及び完全性に対する保存液成分の効果を評価するためのプーリング研究（pooling study）として行われた。プーリングにより、従来の血液保存研究における相違の最大の原因（異なるドナーから採取されたＲＢＣの本来の違い）を減少させることができる。プーリングでは、各ドナーから採取された細胞の一部が従来のユニット容量（unit size）で研究の各群に使用される。間接抗グロブリン試験（indirect antiglobulin test：ＩＡＴ）に反応しないＲＢＣユニットを４つのＡＢＯ式血液型ユニットのセットに分類する。次に、それぞれのセットをプール及び混合し、同一の４つのプール・ユニットに等分する。各プールの１ユニットを本研究のぞれぞれの４つの群に使用する。
【００６４】
ＡＳ−３及びＥＡＳの組成物は、表１に開示されている。「The effects of phosphate, pH, and AS volume on ＲＢＣ stored in saline-adenine-glucose-mannitol solutions（Hess et al., Transfusion, vol. 40: 1000-1006, Aug. 2000）」（参照により本明細書に組み込まれるものとする）に示されているように、ＥＡＳは、USP市販のアデニンと、Sigma Chemicals社（St. Louis, MO）市販の糖及び塩とから作成し、１リットルの保存バッグ（Code 4R2032, Baxter Healthcare, Deerfield, IL）に無菌的にフィルターする。保存バッグを３７℃で２週間静置する。次に、溶液をさらに２週間インキュベートする。７日目及び１４日目に細菌及びカビの不在で無菌性を確認する（SeptiCheck, Becton-Dickinson Microbiology Systems, Sparks, MD）。次に、溶液を６００ｍＬのＰＶＣバッグ（品目番号 4R2023, Baxter Healthcare Corp, Deerfield, IL）に重量で等分する。全ての連結部には、無菌の連結器具を使用する（SCD 312, Terumo Medical Corp, Elkton, MD）。
【００６５】
ＲＢＣユニットの作成：
トリプルバッグ回収システム（triple-bag collection system）（品目番号 #127-23, Pall Corporation, East Hills, NY）内の７０ｍＬのＣＰ２Ｄ溶液に標準ユニットの血液（５００±５５ｍＬ）を回収した。それぞれのユニットの白血球を内部白血球フィルターで除去した。遠心分離を５分間行い、血漿を６５ｍＬだけ残し、それ以外の血漿を除去し、表示した容量のＡＳ又はＥＡＳを無菌的に加える。各ユニットを直立状態で１０週間に１〜６℃で保存する（毎週の混合及び１５ｍＬのサンプル採取のときを除いて）。
【００６６】
インビトロ測定：
白血球除去（全血からの白血球の除去）は、フローサイトメトリー法で確認する。全ヘモグロビン（Ｈｂ）濃度は、血液分析装置（Hematology Cell Counter System Series 9110+, Baker, Allentown, PA）で測定する。細胞の平均容積（Mean cell volume：ＭＣＶ）は、ＲＢＣの数の測定及び保存懸濁液のミクロへマトクリット値で求める。「A micromodification of the Drabkin hemoglobin assay for measuring plasma hemoglobin in the range of 5 to 2000 mg/dl（Moore et al., Biochem Med 26:167-173, 1981）」（参照により本明細書に組み込まれるものとする）で記載されているように、上精Ｈｂは、分光光度法を用いて改良ドラブキン・アセイ（modified Drabkin assay）で測定する。溶血のパーセンテージは、全Ｈｂに対する遊離のＨｂの比及びヘマトクリット値を測定することによって求める。
【００６７】
ＲＢＣのＡＴＰの濃度は、脱タンパクしたＰＲＢＣの上精から測定する。細胞のアリコートを冷却した１０％のトリクロロ酢酸と混合し、血液タンパクを沈澱させ、２７００ｘｇで１０分間遠心分離する。次に、タンパクの無い上精を測定するときまでに−８０℃で冷凍する。市販の測定キット（Procedures 366-UV, Sigma Diagnostics, St. Louis, MO）を使用してＡＴＰを酵素的に分析する。
【００６８】
血液ガス、重炭酸、及びｐＨは、血液ガス測定装置（Corning 855, Ithica, NY）を使用して測定する。したがって、ｐＨを３７℃で測定する。細胞外ナトリウム、塩化物、リン酸、乳酸、及びグルコースは、プログラム可能な化学分析器（Hitachi 902 Analyzer, Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN）を使用して測定する。「Morphology of stored, rejuvenated human erythrocytes（Usry, Moore, and Manolo, Vox Sang 28:176-183, 1975）」（参照により本明細書に含まれるものとする）に記載の方法したがって、円盤状〜ウニ状〜球状のＲＢＣの形状変化の平均度を測定する。微小胞は、保存期の後期に上精から測定する。血漿を超遠心分離し、微小胞の沈澱を食塩水で３回洗浄し、ブラッドフォード法（BioRad, Richmond, CA）を使用して全タンパク量を測定する。
【００６９】
４つのＲＢＣ保存溶液の比較試験の結果は、図１及び２に示されている。全ての保存溶液では、１週目にＲＢＣのＡＴＰの濃度が上昇した（図１（Ａ））。ＥＡＳでは、ＡＴＰ濃度は、２週目にも上昇し続け、本試験の全期間中にはＡＳ−３のＡＴＰ濃度よりも高い状態を維持した。ＥＡＳ−８１は、８週目及びそれ以降には、それよりも容量の大きいＥＡＳ６１と同じ濃度のＡＴＰを有していた。一方、重炭酸の緩衝系を有する容量のより大きいＥＡＳ−７８では、ＡＴＰの濃度は少し高かった。
【００７０】
全ての保存溶液では、溶血（赤血球の破壊）は、保存期間と共に増加する（図１（Ｂ））。しかしながら、ＡＳ−３は、全ての時間において他の溶液よりも高い溶血率を示した。溶血は、ＥＡＳ８１でわずかに減少し、他のＥＡＳでさらに減少した。容量がより大きい溶液では、重炭酸の存在で溶血がさらに減少することはなかった。予想通りに、容量がより少ない溶液のヘマトクリット値は他の溶液のものよりも高かった（図１（Ｃ））。また、ＲＢＣは、保存期間中には全ての溶液で容積を失った。
【００７１】
全ての時点において、重炭酸を含むＥＡＳにおける乳酸の濃度は、より高かった（図１（Ｄ））。８週間の保存期間で合成された全乳酸は、ＡＳ−３で９ｍＭであり、ＥＡＳ−６１で１２ｍＭであり、ＥＡＳ−８１で１３ｍＭであり、ＥＡＳ−７８で１５ｍＭであった。ＲＢＣ外のｐＨ及びＲＢＣ内のｐＨに関しても同様に、全ての時点において、重炭酸を含むＥＡＳの方が高かったが、ＲＢＣ内ｐＨの違いには統計的有意性は無い（図１（Ｅ）及び図１（Ｆ））。緩衝能力の原因となる、重炭酸の損失並びにＰＣＯ２の増加及び減少は、図１（Ｇ）で示されている。
【００７２】
一般的に本発明に係るＥＡＳ−８１で保存された細胞は、ＡＳ−３で保存された細胞と比較して、エネルギー利用が優れており、それによりＡＴＰ濃度が高く、溶血の程度が低く、形態が優れており、微小胞が少なく、ｐＨがわずかに高かった。ＥＡＳ−８１よりも古いＥＡＳ、特にＥＡＳ−７６ｖ６は、幾つかの点において、より優れた作用をするが、使用される容量が多いために、保存ＲＢＣがさらに希釈され、大量に輸血される患者に対して血液希釈を引き起こしかねない。
【００７３】
［実施例２］
本実施例は、従来の容量でＥＡＳ製剤を使用することでＲＢＣを８週間保存することができ、かつその際には６週間の保存に使用される従来の溶液よりも、ＲＢＣの回収率が良く、溶血率が低く、ＲＢＣの膜がさらに維持されることを示すものである。
【００７４】
米国食品医薬品局（United States Food and Drug Administration：ＦＤＡ）及びアメリカ血液銀行協会（American Association of Blood Banks）のドナー基準を満たす１２人のボランティアのドナーを選択した。ドナーらは５００ｍＬ（１ユニット）の全血を提供した。提供された全血をＣＰ２Ｄバッグ（品目番号 #127-23, Pall Corporation, East Hills, NY）に回収し、白血球を除去し、６５ｍＬの血漿だけを残し、その残りの血漿を除去した。１１０ｍＬのＥＡＳ−８１を加え、濃厚ＲＢＣ溶液のサンプルの半分（ｎ＝６）を６週間、残りの半分（ｎ＝６）を８週間１〜６℃で保存した。保存終了の１週間前に一定ユニットを無菌的にサンプリングし、培養した。細菌の生育が示されなかった場合には、少量のＲＢＣを５１−Ｃｒ標識し、ドナーに戻し、モーオフ・プロトコル（Moroff protocol）を使用して単標識測定（single label measurement）を行うことでＲＢＣ回収率を測定した。
【００７５】
表計算プログラムソフトウエア（Excel, Microsoft, Redmond, WA）を使用して、平均グラフ及び標準誤差を作成し、保存群の記述統計を計算した。各保存系の乳酸合成を最初から測定し、ヘモグロビン及び血清タンパクの含有量を測定するために乳酸の最終濃度及び保存系の容量の差異を調節した。SyStat Ver. 6（SPSS Inc., Chicago, IL）を使用してＲＢＣの回収値の箱髭図を作成した。
【００７６】
ＣＰ２Ｄ／ＥＡＳ−８１で６週間保存した白血球除去済みのＲＢＣの２４時間（再注入後）におけるインビボ自己回収率は８５±５％であり、８週間保存したものの回収率は８７±２％である（図２）。保存期間がより長かったＲＢＣの回収率がさらに高かったわけだが、この回収率の異常な増加は、本試験の規模が小さいため、及び異なるドナーから採取された血液が異なる維持能力を有するためであろう。しかしながら、これらの回収率は、現在認可されている全ての保存溶液のものよりも高く、米国及びヨーロッパでの認可のための基準を満たす（つまり、米国の回収率基準である７５％を越える回収率及び米国の溶血率の制限基準である１％よりも低い溶血率を示し、ヨーロッパの回収率基準である７５％を越える回収率及びヨーロッパの溶血率の制限基準である０．８％よりも低い溶血率を示す）。本試験でのＲＢＣ溶血率は、６週間目で０．２±０．２であり、８週間目で０．４±０．２であった。ＲＢＣの微小胞タンパクの濃度は、６週間目で８±４ｍｇ／ｄＬであり、８週間目で１２±６ｍｇ／ｄＬであり、わずか約５％のＲＢＣヘモグロビン損失に相当する。
【００７７】
保存期間及び注入される赤血球のより優れた生理機能に関して、本発明に係るＥＡＳ−８１の優れた保存能力は、幾つかの点に由来すると思われる。第１に、新規のｐＨ制御系は、細胞内の反応平衡がＡＴＰを消費する２，３−ＤＰＧ合成を回避し、解糖に向かうのに必要な細胞内ｐＨを維持するのに必要な懸濁液ｐＨを保存期間中に維持することができる。また、高濃度の細胞外リン酸によって細胞外Ｃａ＋＋濃度が制限されるので、リン脂質のスクランブリング並びに膜変形及び損失などのアポトーシス工程が抑制される。これにより、注入後のＲＢＣの回収率が向上し、ＲＢＣ膜の質がさらに良くなる。したがって、注入された患者での急速なインビボ・クリアランスの発生が減少し、注入後の長期間における回収可能なＲＢＣのパーセンテージが高くなる。ＥＡＳ−８１製剤は、ＮａＣｌを含まずにその代わりに特定の緩衝化合物をさらに多く含み、適切なオスモル濃度を保持する。このＥＡＳ−８１製剤により、ＲＢＣ懸濁液のｐＨはより効果的なものとなり、その制御もより長く存続し、Ｃａ＋＋濃度の上昇及びＡＴＰ濃度の低下に関連する細胞の有害な反応を最小限にするのに必要なリン酸が生じる。また、ＥＡＳ−８１を従来の量で使用できるので、大量の輸血を必要とする患者への使用に適切である。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】プーリング研究のグラフ表示図であり、下記の４つの溶液におけるＲＢＣの保存効果を時間（週）の関数として示す。１）１１０ｍＬのＡＳ−３（−◇−）、１７０ｍＬのＥＡＳ−６１（−◆−）、１７０ｍＬのＥＡＳ−７８（−●−）、及び１１０ｍＬのＥＡＳ−８１（−○−）。パネルＡで示されているように、重炭酸を含む組成物（丸印）は、重炭酸を含まない同量の組成物（ダイアモンド印）よりも高いＡＴＰ濃度を示した。また、重炭酸を含む組成物は、乳酸（パネルＤ）、細胞外及び細胞内のｐＨ（パネルＥ及びＦ）、並びに重炭酸及びＰＣＯ２濃度（パネルＥ及びＦ）に関してもより高い値を示した。容量のより大きな組成物は（塗りつぶされた印）では、溶血率及びヘマトクリット値が低下した（それぞれパネルＢ及びＣ）
【図２】体内への再注入から２４時間後に抽出された赤血球のインビボ回収率を示す図である。尚、ＲＢＣは、再注入前にＥＡＳ−８１で６週間（ｎ＝６）及び８週間（ｎ＝６）で保存され、その回収率の結果は歴史的対象と比較（１９８５年にSimonらに報告されたＡＳ−３に関する研究）される。各試験では、５１Ｃｒ単標識の方法が使用された。
【図１】
2008529550.tif 000003
【図２】
2008529550.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成19年12月26日(2007.12.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤血球を約１〜６℃で保存するための水性組成物であって、
前記組成物は、アデニンと、デキストロースと、少なくとも１つの非代謝性の膜保護糖と、ｐＨ緩衝系とを本質的に含んでおり、
前記ｐＨ緩衝系は、重炭酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質と、リン酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質と、ナトリウムカチオンを提供する少なくとも１つの物質とを含む生理学的に許容される緩衝剤の組み合わせを有し、
前記ｐＨ緩衝系は、１，３−ＤＰＧからの２，３−ジホスホグリセレート（ＤＰＧ）の合成よりも解糖を優先する赤血球内の反応平衡を保存期間中に確立及び維持するのに十分な量の前記組成物が加えられる赤血球（ＲＢＣ）懸濁液のｐＨを前記組成物が維持する働きをするのに十分な量で存在し、それによって、保存期間中に前記反応平衡でアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）合成が発生することを特徴とする水性組成物。
【請求項２】
赤血球を約１〜６℃で保存するための水性組成物であって、
前記組成物は、アデニンと、デキストロースと、少なくとも１つの非代謝性の膜保護糖と、ｐＨ緩衝系とを本質的に含んでおり、
前記ｐＨ緩衝系は、重炭酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質と、リン酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質と、ナトリウムカチオンを提供する少なくとも１つの物質とを含む生理学的に許容される緩衝剤の組み合わせを有し、
前記ｐＨ緩衝系は、１，３−ＤＰＧからの２，３−ジホスホグリセレート（ＤＰＧ）の合成よりも解糖を優先する赤血球内の反応平衡を保存期間中に確立及び維持するのに十分な量の前記組成物が加えられる赤血球懸濁液（ＲＢＣ）のｐＨを前記組成物が維持する働きをするのに十分な量で存在し、それによって、保存期間中に前記反応平衡でアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）合成が発生し、
前記組成物は、外部由来の塩化物イオンを実質的に含まないことを特徴とする水性組成物。
【請求項３】
赤血球の懸濁液であって、
請求項１に記載の組成物を含むことを特徴とする懸濁液。
【請求項４】
請求項３に記載の懸濁液であって、
前記赤血球の懸濁液の直接注入を必要とする患者への直接注入に適切であることを特徴とする懸濁液。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物であって、
前記ナトリウムカチオンを提供する少なくとも１つの物質は、重炭酸ナトリウムと、リン酸２ナトリウムと、それらの組み合わせとから成る群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の組成物であって、
前記重炭酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質は、重炭酸ナトリウムであること特徴とする組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の組成物であって、
前記リン酸イオンを提供する少なくとも１つの物質は、リン酸ナトリウムと、リン酸２ナトリウムと、リン酸３ナトリウムと、それらの組み合わせとから成る群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の組成物であって、
前記リン酸イオンを提供する少なくとも１つの物質は、リン酸２ナトリウムであることを特徴とする組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の組成物であって、
前記生理学的に許容される緩衝剤の組み合わせは、水素と、カリウムと、アンモニウムと、マグネシウムと、それらの組み合わせとから成る群から選択される生理学的に許容されるカチオンを提供する少なくとも１つの物質をさらに含むことを特徴とする組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の組成物であって、
前記少なくとも１つの非代謝性の膜保護糖は、マンニトールであることを特徴とする組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の組成物であって、
約２００〜３１０ｍＯｓｍのオスモル濃度を有することを特徴とする組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組成物であって、
前記オスモル濃度は、約２２１〜２８０ｍＯｓｍであることを特徴とする組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の組成物であって、
前記オスモル濃度は、約２７０ｍＯｓｍであることを特徴とする組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の組成物であって、
約８〜９のｐＨを有することを特徴とする組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組成物であって、
前記組成物のｐＨは、約８．２〜８．８であることを特徴とする組成物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の組成物であって、
前記組成物のｐＨは、約８．４〜８．６であることを特徴とする組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組成物であって、
前記組成物のｐＨは、約８．５であることを特徴とする組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載の組成物であって、
前記緩衝系は、６週間の保存期間中に６．５〜７．２の間のｐＨで少なくとも２ｍＥｑ増加する組成物が加えられる前記赤血球（ＲＢＣ）懸濁液において緩衝能力を有することを特徴とする組成物。
【請求項１９】
請求項１に記載の組成物であって、
前記組成物が加えられた前記赤血球（ＲＢＣ）懸濁液のｐＨを約６．４〜７．４の間に維持する働きがあること特徴とする組成物。
【請求項２０】
請求項１に記載の組成物であって、
前記組成物が加えられた前記赤血球（ＲＢＣ）懸濁液のｐＨを約７．０〜７．２未満の間に維持する働きがあること特徴とする組成物。
【請求項２１】
請求項１に記載の組成物であって、
前記組成物が加えられた前記赤血球（ＲＢＣ）懸濁液のｐＨを約７．１よりも高く、７．２よりも低い値に維持する働きがあることを特徴とする組成物。
【請求項２２】
請求項５に記載の組成物であって、
約１〜３ｍＭのアデニンと、約２０〜１１５ｍＭのデキストロースと、約１５〜６０ｍＭの非代謝性の膜保護糖と、約２０〜１３０ｍＭの重炭酸ナトリウムと、約４〜２０ｍＭのリン酸２ナトリウムとを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の組成物であって、
約２ｍＭのアデニンと、約６０〜１００ｍＭのデキストロースと、約４０〜６０ｍＭの非代謝性の膜保護糖と、約２２〜４０ｍＭの重炭酸ナトリウムと、約７〜１５ｍＭのリン酸２ナトリウムとを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２４】
請求項２３に記載の組成物であって、
約２ｍＭのアデニンと、約８０ｍＭのデキストロースと、約５５ｍＭの非代謝性の膜保護糖と、約２６ｍＭの重炭酸ナトリウムと、約１２ｍＭのリン酸２ナトリウムとを含み、さらに、約８．５のｐＨを有することを特徴とする組成物。
【請求項２５】
赤血球（ＲＢＣ）を保存期間中に保存する方法であって、
（ａ）保存するＲＢＣと血漿とを含む採取された全血のサンプルを抗凝固液と混合し、それによって、採取された全血の懸濁液を作成するステップと、（ｂ）血漿を除去し、ＲＢＣを濃縮するために前記採取された全血を処理し、それによって、濃厚ＲＢＣを作成するステップと、（ｃ）前記濃厚ＲＢＣを、約３５〜７０容量％のＲＢＣを有するＲＢＣ懸濁液を作成するのに十分な量の水性組成物と混合するステップと、（ｄ）前記ＲＢＣ懸濁液を約１〜６℃に冷却するステップと、（ｅ）前記冷却したＲＢＣ懸濁液を血液銀行の標準的な方法（standard blood bank procedures）にしたがって保存するステップとを含み、
前記水性組成物は、アデニンと、デキストロースと、少なくとも１つの非代謝性の膜保護糖と、ｐＨ緩衝系とを本質的に含んでおり、
前記ｐＨ緩衝系は、重炭酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質と、リン酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質と、ナトリウムカチオンを提供する少なくとも１つの物質とを含む生理学的に許容される緩衝剤の組み合わせを有し、
前記ｐＨ緩衝系は、１，３−ＤＰＧからの２，３−ジホスホグリセレート（ＤＰＧ）の合成よりも解糖を優先する赤血球内の反応平衡を保存期間中に確立及び維持するのに十分な量の前記組成物が加えられる前記赤血球（ＲＢＣ）懸濁液のｐＨを前記組成物が維持する働きをするのに十分な量で存在し、それによって、保存期間中に前記反応平衡でＡＴＰ合成が発生することを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記ＲＢＣ懸濁液は、前記ＲＢＣ懸濁液の直接注入を必要とする患者への直接注入に適切であることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２５に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記少なくとも１つの非代謝性の膜保護糖は、マンニトールであることを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２５に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記ナトリウムカチオンを提供する少なくとも１つの物質は、重炭酸ナトリウムと、リン酸２ナトリウムと、それらの組み合わせとから成る群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２５に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記重炭酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質は、重炭酸ナトリウムであることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２５に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記リン酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質は、リン酸ナトリウムと、リン酸２ナトリウムと、リン酸３ナトリウムと、それらの組み合わせからと成る群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項２５に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記リン酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質は、リン酸２ナトリウムであることを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項２５に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記生理学的に許容される緩衝剤の組み合わせは、Ｈ＋と、カリウムと、アンモニウムと、マグネシウムと、それらの組み合わせとから成る群から選択される生理学的に許容されるカチオンを提供する少なくとも１つの物質をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項２５に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記組成物は、約２００〜３１０ｍＯｓｍのオスモル濃度を有することを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記オスモル濃度は、約２２１〜２８０ｍＯｓｍであることを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記オスモル濃度は、約２７０ｍＯｓｍであることを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項２５に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記組成物は、約８〜９のｐＨを有することを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記組成物のｐＨは、約８．２〜８．８であることを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項３６に記載のＲＢＣを保存するための方法であって、
前記組成物のｐＨは、約８．４〜８．６であることを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項３６に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記組成物のｐＨは、約８．５であることを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項２５に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記緩衝系は、６週間の保存期間中に６．５〜７．２の間のｐＨで少なくとも２ｍＥｑ増加する前記組成物が加えられる赤血球（ＲＢＣ）懸濁液において緩衝能力を有することを特徴とする方法。
【請求項４１】
請求項２５に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記組成物は、前記組成物が加えられた赤血球（ＲＢＣ）懸濁液のｐＨを約６．４〜７．４の間に維持する働きがあること特徴とする方法。
【請求項４２】
請求項２５に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記組成物は、前記組成物が加えられた赤血球（ＲＢＣ）懸濁液のｐＨを約７．０〜７．２未満の間に維持する働きがあること特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項２５に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記組成物は、前記組成物が加えられた赤血球（ＲＢＣ）懸濁液のｐＨを約７．１よりも高く、７．２よりも低い値に維持する働きがあることを特徴とする方法。
【請求項４４】
請求項２８に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記組成物は、約１〜３ｍＭのアデニンと、約２０〜１１５ｍＭのデキストロースと、約１５〜６０ｍＭの非代謝性の膜保護糖と、約２０〜１３０ｍＭの重炭酸ナトリウムと、約４〜２０ｍＭのリン酸２ナトリウムとを含むことを特徴とする方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記組成物は、約２ｍＭのアデニンと、約６０〜１００ｍＭのデキストロースと、約４０〜６０ｍＭの非代謝性の膜保護糖と、約２２〜４０ｍＭの重炭酸ナトリウムと、約７〜１５ｍＭのリン酸２ナトリウムとを含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記組成物は、約２ｍＭのアデニンと、約８０ｍＭのデキストロースと、約５５ｍＭの非代謝性の膜保護糖と、約２６ｍＭの重炭酸ナトリウムと、約１２ｍＭのリン酸２ナトリウムとを含み、さらに、約８．５のｐＨを有することを特徴とする方法。
【請求項４７】
請求項４５に記載のＲＢＣを保存するの方法であって、
前記組成物と前記採取された全血との比は、それぞれ約１：４．５であることを特徴とする方法。
【請求項４８】
請求項４５に記載のＲＢＣを保存する方法であって、
前記組成物の容量は約１１０ｍＬであり、前記採取された全血の容量は５００ｍＬであることを特徴とする方法。
【請求項４９】
保存期間中に赤血球（ＲＢＣ）の膜維持を向上する、及びＲＢＣのアポトーシスを抑制する方法であって、
前記ＲＢＣを、請求項１に記載の組成物が加えられた懸濁液に保存期間中に保存するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項５０】
保存期間中に赤血球（ＲＢＣ）の膜維持を向上する、及びＲＢＣのアポトーシスを抑制する方法であって、
前記膜維持の指標は、保存期間終了の際のＲＢＣにおける微小胞の濃度の測定値であり、前記微小胞の濃度は、約５０〜７５％減少することを特徴とする方法。
【請求項５１】
保存期間中に赤血球（ＲＢＣ）の脆弱性を低下させる、及びＲＢＣの溶血を抑制する方法であって、
前記ＲＢＣを、請求項１に記載の組成物が加えられた懸濁液に保存期間中に保存するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項５２】
保存期間後及びＲＢＣ注入を必要とする患者への注入後の赤血球（ＲＢＣ）の生存能力を増大させる、並びに前記患者による前記ＲＢＣの注入後のクリアランスの程度を低下させる方法であって、
保存期間中に前記ＲＢＣを、請求項１に記載の組成物が加えられた懸濁液に保存するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項５３】
赤血球（ＲＢＣ）を保存期間中に保存するための方法であって、
（ａ）保存するＲＢＣと血漿とを含む採取された全血のサンプルを抗凝固液と混合し、それによって、採取された全血の懸濁液を作成するステップと、（ｂ）血漿を除去し、ＲＢＣを濃縮するために前記採取された全血を処理し、それによって、濃厚ＲＢＣを作成するステップと、（ｃ）前記濃厚ＲＢＣを、約２７〜７０容量％のＲＢＣを有するＲＢＣ懸濁液を作成するのに十分な量の水性組成物と混合するステップと、（ｄ）前記ＲＢＣ懸濁液を約１〜６℃に冷却するステップと、（ｅ）前記冷却したＲＢＣ懸濁液を血液銀行の標準的な方法にしたがって保存するステップとを含み、
前記水性組成物は、アデニンと、デキストロースと、少なくとも１つの非代謝性の膜保護糖と、ｐＨ緩衝系とを本質的に含んでおり、
前記ｐＨ緩衝系は、重炭酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質と、リン酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質と、ナトリウムカチオンを提供する少なくとも１つの物質とを含む生理学的に許容される緩衝剤の組み合わせを有し、
前記ｐＨ緩衝系は、１，３−ＤＰＧからの２，３−ジホスホグリセレート（ＤＰＧ）の合成よりも解糖を優先する赤血球内の反応平衡を保存期間中に確立及び維持するのに十分な量の前記組成物が加えられる前記赤血球懸濁液のｐＨを前記組成物が維持する働きをするのに十分量で存在し、それによって、保存期間中に前記反応平衡でＡＴＰ合成が発生することを特徴とする方法。
【請求項５４】
赤血球（ＲＢＣ）を保存期間中に保存するための方法であって、
（ａ）保存するＲＢＣと血漿とを含む採取された全血のサンプルを抗凝固液と混合し、それによって、採取された全血の懸濁液を作成するステップと、（ｂ）血漿を除去し、ＲＢＣを濃縮するために前記採取された全血を処理し、それによって、濃厚ＲＢＣを作成するステップと、（ｃ）前記濃厚ＲＢＣを、血液銀行の標準的な方法で得られる範囲内の容量パーセントのＲＢＣを有するＲＢＣ懸濁液を作成するのに十分な量の水性組成物と混合するステップと、（ｄ）前記ＲＢＣ懸濁液を約１〜６℃に冷却するステップと、（ｅ）前記冷却したＲＢＣ懸濁液を血液銀行の標準的な方法にしたがって保存するステップとを含み、
前記水性組成物は、アデニンと、デキストロースと、少なくとも１つの非代謝性の膜保護糖と、ｐＨ緩衝系とを本質的に含んでおり、
前記ｐＨ緩衝系は、重炭酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質と、リン酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質と、ナトリウムカチオンを提供する少なくとも１つの物質とを含む生理学的に許容される緩衝剤の組み合わせを有し、
前記ｐＨ緩衝系は、１，３−ＤＰＧからの２，３−ジホスホグリセレート（ＤＰＧ）の合成よりも解糖を優先する赤血球内の反応平衡を保存期間中に確立及び維持するのに十分な量の前記組成物が加えられる前記赤血球懸濁液のｐＨを前記組成物が維持する働きをするのに十分量で存在し、それによって、保存期間中に前記反応平衡でＡＴＰ合成が発生することを特徴とする方法。
【請求項５５】
赤血球（ＲＢＣ）を保存期間中に保存するための方法であって、
（ａ）保存するＲＢＣと血漿とを含む採取された全血のサンプルを抗凝固液と混合し、それによって、採取された全血の懸濁液を作成するステップと、（ｂ）血漿を除去し、ＲＢＣを濃縮するために前記採取された全血を処理し、それによって、濃厚ＲＢＣを作成するステップと、（ｃ）前記濃厚ＲＢＣを、約６０〜４００ｍＬの範囲内の水性組成物と混合するステップと、（ｄ）前記ＲＢＣ懸濁液を約１〜６℃に冷却するステップと、（ｅ）前記冷却したＲＢＣ懸濁液を血液銀行の標準的な方法にしたがって保存するステップとを含み、
前記水性組成物は、アデニンと、デキストロースと、少なくとも１つの非代謝性の膜保護糖と、ｐＨ緩衝系とを本質的に含んでおり、
前記ｐＨ緩衝系は、重炭酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質と、リン酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質と、ナトリウムカチオンを提供する少なくとも１つの物質とを含む生理学的に許容される緩衝剤の組み合わせを有し、
前記ｐＨ緩衝系は、１，３−ＤＰＧからの２，３−ジホスホグリセレート（ＤＰＧ）の合成よりも解糖を優先する赤血球内の反応平衡を保存期間中に確立及び維持するのに十分な量の前記組成物が加えられる前記赤血球懸濁液のｐＨを前記組成物が維持する働きをするのに十分量で存在し、それによって、保存期間中に前記反応平衡でＡＴＰ合成が発生することを特徴とする方法。
【請求項５６】
請求項１に記載の組成物を含む組み合わせであって、
約６０〜４００ｍＬの容量の添加液と約２７０〜２５５０ｍＬの容量の全血とを含むのに十分な容量を有する血液保存バッグに入れらていることを特徴とする組み合わせ。
【請求項５７】
請求項５６に記載の組み合わせであって、
前記血液保存バッグの容量は、約５５０ｍＬであり、約１００ｍＬの添加液と約４５０ｍＬの全血とを含むことを特徴とする組み合わせ。
【請求項５８】
２７０ｍＯｓｍのオスモル濃度を有する、赤血球を約８週間約１〜６℃で保存するための水性組成物であって、
２ｍＭのアデニンと、８０ｍＭのデキストロースと、５５ｍＭのマンニトールなどの少なくとも１つの非代謝性の膜保護糖と、ｐＨ緩衝系とを含み、
前記ｐＨ緩衝系は、重炭酸ナトリウムを介して重炭酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質と、リン酸２ナトリウムを介してリン酸アニオンを提供する少なくとも１つの物質と、ナトリウムカチオンを提供する少なくとも１つの物質（重炭酸ナトリウム又はリン酸２ナトリウム）とを含む生理学的に許容される緩衝剤の組み合わせを有し、
前記ｐＨ緩衝系は、１，３−ＤＰＧからの２，３−ジホスホグリセレート（ＤＰＧ）の合成よりも解糖を優先する赤血球内の反応平衡を保存期間中に確立及び維持するのに十分な量の前記組成物が加えられる前記赤血球懸濁液のｐＨを前記組成物が維持する働きをするのに十分量で存在し、それによって、保存期間中に前記反応平衡でＡＴＰ合成が発生することを特徴とする水性組成物。
【国際調査報告】
2008529550.tif 000005
2008529550.tif 000006
2008529550.tif 000007
2008529550.tif 000008
2008529550.tif 000009