(57)【要約】  本発明は、抗体の生産性を改善するための、信頼性があり、再現性のある方法に関する。より具体的には、本発明は、該抗体の重鎖を改変して真核細胞における抗体の生産性を改善する方法を提供する。さらに、本発明の方法は、抗体の生産性および1種以上の抗原結合特性の両方を改善することができる。本発明はさらに、より多く産生され、かつその抗原結合特性における変化を示さないか、または改善された抗原結合特性を示す改変抗体を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1個のアミノ酸残基置換を有する抗体であって、該抗体の産生レベルが該置換を含まない抗体と比較して増加している、前記抗体。
【請求項２】
前記置換が、Kabatに記載された番号付けシステムによる40H、60H、および61Hからなる群より選択される残基にある、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
(a)位置40Hもしくは60Hのアミノ酸残基がアラニンで置換されているか、もしくは位置61Hのアミノ酸がアスパラギン酸で置換されている、または
(b)位置40Hおよび60Hのアミノ酸残基が両方ともアラニンで置換されている、または
(c)位置40Hのアミノ酸残基がアラニンで置換され、位置61Hのアミノ酸残基がアスパラギン酸で置換されている、または
(d)位置60Hのアミノ酸残基がアラニンで置換され、位置61Hのアミノ酸残基がアスパラギン酸で置換されている、または
(e)位置40Hおよび60Hのアミノ酸残基がアラニンで置換され、位置61Hのアミノ酸残基がアスパラギン酸で置換されている、
請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
前記産生レベルが少なくとも1.5倍に増加している、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記産生レベルが少なくとも1.5〜25倍に増加している、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体の1種以上の抗原結合特性が、少なくとも1〜25％改善している、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体の1種以上の抗原結合特性が、少なくとも25〜100％改善している、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体のいずれの抗原結合特性にも変化がない、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体の抗原結合の減少が5％未満である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体の1種以上の抗原結合特性の減少が5〜60％未満である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
請求項１に記載の抗体の製造方法。
【請求項１２】
前記方法が、下記工程：
(a)Kabatに記載の番号付けシステムによる位置40H、60H、または61Hからなる群に由来する1個以上のアミノ酸残基を、それぞれアラニン、アラニンおよびアスパラギン酸で、またはそれらの保存的置換で置換する工程；および
(b)得られる置換抗体が宿主細胞により発現される条件下で、該宿主細胞を培養する工程、
を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
真核宿主からの抗体の産生を少なくとも1.5倍に増加させる方法であって、下記工程：
(a)Kabatに記載の番号付けシステムによる位置40H、60H、および61Hからなる群より選択される1個以上のアミノ酸残基を、それぞれアラニン、アラニンおよびアスパラギン酸で、またはそれらの保存的置換で置換する工程；および
(b)得られる置換抗体が宿主細胞により発現される条件下で、該宿主細胞を培養する工程、
を含む、前記方法。
【請求項１４】
位置40Hがアラニンで置換される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
位置60Hがアラニンで置換される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
位置41Hがアスパラギン酸で置換される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
位置40Hおよび60Hがそれぞれアラニンで置換される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
位置40Hおよび61Hがそれぞれアラニンおよびアスパラギン酸で置換される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
位置60Hおよび61Hがそれぞれアラニンおよびアスパラギン酸で置換される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
位置40H、60および61Hがそれぞれアラニン、アラニンおよびアスパラギン酸で置換される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
抗体産生が少なくとも1.5〜15倍に増加する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
抗体産生が少なくとも15〜50倍に増加する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
前記置換抗体の1種以上の抗原結合特性が少なくとも1〜25％改善される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
前記置換抗体の1種以上の抗原結合特性が少なくとも25〜100％改善される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
前記置換抗体のいずれの抗原結合特性にも変化がない、請求項１３に記載の方法。
【請求項２６】
前記置換抗体の抗原結合の減少が5％未満である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２７】
前記置換抗体の1種以上の抗原結合特性の減少が5〜60％未満である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２８】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２９】
前記宿主細胞が、
(a)HEK293細胞、
(b)NS0細胞、
(c)CHO細胞、
(d)COS細胞、
(e)SP/20細胞、および
(f)PERC6細胞
からなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１３に記載の方法により製造された置換抗体。
【請求項３１】
その軽鎖可変領域が配列番号1〜6のアミノ酸配列のいずれか1つを含み、その重鎖可変領域が配列番号14〜19のアミノ酸配列のいずれか1つを含む、請求項１３に記載の方法により製造された抗体。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
外来および／または内因性ポリペプチドの活性を阻止するための抗体の使用は、疾患の根本原因を治療するための有効かつ選択的な戦略を提供する。特に、FDAにより認可されたSynagis (Saez-Llorens, X.E.ら、1998, Pediat. Infect. Dis. J. 17:787-91)、すなわちMedimmune社により製造された抗呼吸器合胞体ウイルスMAb；ReoPro (Glaser, V., 1996, Nat. Biotechnol. 14: 1216-17)、すなわちCentocor社から入手可能な抗血小板Fab抗体フラグメント；およびHerceptin (Weiner, L.M., 1999, Semin. Oncol. 26:43-51)、すなわちGenentech社から入手可能な抗Her2/neu MAbなどの、組換えモノクローナル抗体(MAb)および抗体フラグメントの使用は治療剤として有効である。
【０００２】
候補タンパク質標的に対するMAbを作製するための標準的な方法は当業者には公知である。簡単に述べると、マウスまたはラットなどのげっ歯類に、アジュバントの存在下で精製された抗原を注入して、免疫応答を生じさせる(Shield, C.F.ら、1996, Am. J Kidney Dis. 27: 855-64)。陽性の免疫血清を有するげっ歯類を犠牲にし、脾臓細胞を単離する。単離された脾臓細胞をメラノーマと融合させて、不死化細胞系を作製した後、それを抗体産生についてスクリーニングする。陽性の細胞系を単離し、抗体産生について特性評価する。しかしながら、ヒト治療剤としてのげっ歯類MAbの直接的な使用は、ヒト抗げっ歯類抗体(HAMA)応答の産生をもたらし得る(Khazaeli, M.B.ら、1994, J Immunother. 15:42-52)。この応答は、結合活性を中和することにより、および体内の循環から抗体を迅速に除去することにより、抗体の有効性を減少させる。HAMA応答はまた、げっ歯類抗体のその後の投与により深刻な毒性を引き起こし得る。
【０００３】
HAMA応答を減少させるためには、キメラまたはハイブリッド抗体を産生させるためにマウスの重鎖および軽鎖可変領域をコードする遺伝子をヒトの重鎖および軽鎖定常領域の遺伝子に結合させたヒト-マウスキメラ抗体の産生が一般的に用いられる。いくつかの事例においては、マウスCDRを、マウスのフレームワークアミノ酸のいくつかを対応する位置のヒトのアミノ酸に置換したヒト定常領域およびフレームワーク領域に移植して、「ヒト化」抗体を作製した。キメラおよび／またはヒト化抗体の産生を詳述する例は、Jordanら、米国特許第6,652,863号；Winterら、米国特許第5,225,539号；Queenら、米国特許第5,693,761号および同第5,693,762号；ならびにAdairら、米国特許第5,859,205号に見出すことができ、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０００４】
ヒト免疫グロブリン配列から誘導されたファージ展示抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより、ヒト抗体を作製し、「成熟」させることもできる。そのようなライブラリーに由来する抗体フラグメントを作製し、増殖させ、スクリーニング(パン)し、および使用するのに必要とされる技術およびプロトコルは最近実施されてきている(例えば、Barbasら、2001, Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory PressおよびKayら(編), 1996, Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, Inc.、また、Winterら、米国特許第6,225,447号およびKnappikら、米国特許第6,300,064号；Kuferら、PCT公開WO 98/46645；Barbasら、米国特許第6,096,551号；およびKangら、米国特許第6,468,738号(それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい)。典型的には、ファージ展示された抗体フラグメントはscFvフラグメントまたはFabフラグメントである；必要に応じて、完全長抗体は、展示しているファージから可変領域を完全な抗体中にクローニングし、原核または真核宿主細胞中で該完全長抗体を発現させることにより、製造することができる。
【０００５】
糖タンパク質と同様、抗体は、典型的には特定のアミノ酸残基でタンパク質に付加されたオリゴ糖鎖(糖鎖)を含む。タンパク質上のその糖付加の数、種類、および位置は、クリアランス速度、免疫原性、生物学的比活性、可溶性およびタンパク質分解に対する安定性などの市販の生物医薬品の重要な特性に影響を与え得る。ヒトは、通常は特定の種類の糖付加を有するそのような生物治療剤のみを許容し、非哺乳動物のオリゴ糖付加を含む糖タンパク質を拒絶することが多い。結果として、酵母および哺乳動物細胞系(例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、ベビーハムスター腎臓(BHK)、ヒト胚性腎臓293(HEK-293))などの真核細胞が、グリコフォームを生成し、ヒト患者により許容される他の翻訳後プロセッシングパターンを実施するその能力のために、これらの糖タンパク質治療剤の大多数の製造に用いられる。あいにく、哺乳動物細胞における生物治療剤の製造は、費用の高い細胞培養環境下でこれらの細胞を増殖させる必要があるため、そして哺乳動物細胞はこのタンパク質を低量で産生することが多いことから、高価である。かくして、遺伝子操作された抗体の発現および産生が、臨床材料としての分子の製造のために克服しなければならない次のハードルである。
【０００６】
培養条件を操作することにより、より大量のモノクローナル抗体を製造する方法が報告されている。例えば、McCormackら(1988, Cell immunol. 115: 325-33)は、ヒト抗体を産生するハイブリドーマをインターロイキン2を補給した培地中で培養する場合、抗体産生が増加することを報告し、Grunbergら(2003, Biotechniques 34: 968-72)は、酪酸ナトリウムの添加により、HEK-293細胞からの組換え抗体フラグメントの発現を増加させることができることを証明したが、Knibbsら(2003, Biotechnol Prog. 19: 9-13)は、COS-7細胞からの抗体の収量を増加させるためのへリックス微小担体ビーズの使用を記載している。しかしながら、これらのように培地に基づく方法は、抗体の安定性および可溶性、抗体発現に影響する決定的な因子ならびに産生量の問題に対処できない。
【０００７】
抗体のフォールディング効率および抗体フラグメントの安定性はしばしば実際の産生レベルを厳しく制限する。かくして、抗体分子を直接遺伝子操作して、これらの特性を改善することにより発現量を増加させることが望ましい。しかしながら、抗体の安定性および発現に影響する因子は依然としてわずかしか理解されていない。
【０００８】
細菌系においてはいくらかの進歩がなされてきた。例えば、Ulrichら(1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 11907-11)は、相補性決定領域(CDR)中の点突然変異が細菌におけるFabフラグメントの生産量を増加させることができることを見出した。同様に、Pluckthumおよびその同僚(Knappikら、1995, Protein Engng. 8: 81-9; Wallら、1999, Protein Engng. 12: 605-11; Ewertら、2003, Biochemistry 42: 1517-28および欧州特許第0938506号)は、大腸菌においては、一次アミノ酸配列がフォールディング効率、およびかくして、免疫グロブリン(Ig)フラグメントの産生に影響し得ることを示した。さらに、Plueckthumら(欧州特許第0938506号およびEwertら、2003, Biochemistry 42: 1517-28)は、ドメイン境界をより親水性にすることにより、細菌系におけるIgドメインの可溶性および生産を改善する方法を開示している。しかしながら、この方法は非常に時間がかかる。さらに、この手順はIgドメインの3次元構造に関する詳細な知識および理解を必要とし、また安定化されたIgドメインをもたらし得る変化を予測するための高価なコンピューターモデリングプログラムの使用を含む。
【０００９】
上記の研究は全て、Igフラグメントの発現に限定されており、当業者は同様の点突然変異が無傷の抗体のフォールディング、安定性または発現に対して同様の効果を有することを予測できないであろう。さらに、記載された突然変異の多くがCDR内にあり、抗体の親和性を減少させるか、またはその特異性を変化させることさえ期待され得る。さらに、上記の研究は細菌系、特に、大腸菌における免疫グロブリンフラグメントの発現に限定されている。ヒト細胞および他の真核細胞は、細菌とは異なり、膜により多くの機能的に異なる区画に分割され、膜により取り囲まれた単一の区画として存在する。真核細胞は、特定の細胞内器官にタンパク質を標的化させる、タンパク質内に存在するアミノ酸モチーフである「選別シグナル」を使用する。シグナル配列と呼ばれる1つの種類の選別シグナルは、タンパク質を膜へ、および／または小胞体(ER)と呼ばれるオルガネラへの分泌へと運命付けるように誘導する。抗体は、シャペロンと呼ばれる特別なクラスのタンパク質(例えば、Hsp70(BiP)、Hsp90(GRP94)(Melnickら、1994, Nature 370: 373-5)およびErp72(Wiestら、1990, J. Cell Biol. 110: 1501-11))による助けの下に、それらがERへと誘導された後、折り畳まれ、組み立てられる。さらに、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)は安定化するジスルフィド結合の生成に関与する。対照的に、細菌の細胞周辺腔のシャペロン含量ははるかに少量であり、この区画におけるATPに関する証拠はない。実際、Plueckthumは、一次タンパク質構造が大腸菌において最も重要な因子であるが、真核生物におけるフォールディング、およびかくして産生に影響を及ぼす重要な因子はシャペロンタンパク質であることを示している(Knappikら、1995, Protein Engng. 8: 81-9の考察の小節を参照)。かくして、細菌系(例えば、大腸菌)におけるIgドメイン産生を増加させるタンパク質改変を、真核細胞における完全長抗体の発現および産生に適用可能であると期待することはできなかった。
【００１０】
Parkら(米国特許第6,455,677号)は、FAPα特異的抗体の生産性を改善する、この抗体の特定のフレームワーク改変を開示している。しかしながら、用いられる方法は多くの突然変異ならびに軽鎖および重鎖の組合せをスクリーニングすることを必要とし、時間がかかるものであった。さらに、彼らは為された改変が他の抗体に広く適用可能であることを証明しなかった。
【００１１】
Steipeら(米国特許第6,262,238号)は、軽鎖および／または重鎖の可変ドメイン中でのアミノ酸置換を伴う抗体安定化のための異なる手法を開示している。しかしながら、この手法は、多くのアミノ酸の置換を必要とするが、それが抗体の安定化にとって重要であることを明確に示していない。さらに、抗体の可変ドメインの改変は、改変抗体の結合特異性および／または親和性に対して有害な効果を有し得る。抗体の結合特異性を変化させるか、または親和性を低下させる突然変異は、それを臨床的に、および従って商業的に無価値なものにし得る。かくして、この手法は、結合親和性または特異性に負の影響を及ぼすことなく抗体を安定化させるそのような突然変異を同定するために、労力を要するスクリーニングを伴う。
【００１２】
多くの例においては、哺乳動物細胞培養系における天然、キメラおよび／またはCDR移植抗体の組換え発現は、不適切なフォールディングおよび分泌の減少のため、少ない。不適切なフォールディングは、重鎖および軽鎖の不十分な構築、または一方もしくは両方の鎖の分泌を妨げる輸送不能なコンフォメーションをもたらし得る。一般的には、軽鎖は、それがBiPからの重鎖の放出にとって必要であることから、真核細胞中で構築されたタンパク質の分泌能を付与するものとされている(Leeら、1999, Mol Biol Cell., 10:2209-19; Vanhoveら、2001, Immunity 15:105-14)。抗体の構築および分泌における軽鎖の重要な役割を考慮すれば、重鎖における置換のみで哺乳動物細胞における抗体産生が劇的に増加することは予測できなかったであろう。
【００１３】
モノクローナル抗体に関する市場は年に30％成長し、2010年までにほぼ240億ドルの売り上げに達すると見積もられているが、抗体の製造能力は深刻に不足している(Garber, 2001, Nat Biotech. 19: 184-5)。抗体の商業的使用に関する別の深刻な制限は大量生産性である。治療的または商業的将来性を有する多くの抗体は、効率的に発現されず、固有の生産限界のために開発することができない。抗体の生産性は、限定されるものではないが、用いる宿主細胞、増殖条件、遺伝子発現のレベル、メッセンジャーRNAの安定性、翻訳される抗体タンパク質の安定性、タンパク質のフォールディング、タンパク質凝集のレベル、および宿主細胞に対するその抗体の毒性などの多くの因子により決定される。これらの因子のいくつかが抗体の全体的な生産性にどのように影響するかの理解は進歩してきたが、任意の抗体の生産性の信頼性の高い、または再現性のある増加をもたらす方法はほとんど開発されていない。かくして、臨床開発および医薬品製造の両方のために組換え抗体の生産性を増加させる迅速かつ再現性のある方法が本当に必要である。
【００１４】
本発明は、改変された抗体の結合特性に対して有意な負の影響をもたらすことなく、真核細胞(例えば、哺乳動物細胞系)における抗体産生を再現性良く増加させるであろう抗体工学法を初めて提供する。本発明の方法は、結合親和性および／または特異性が変化した抗体をもたらし、真核細胞からの抗体産生を信頼性よく増加させることができるものであり、費用が高く時間のかかるランダム突然変異誘発技術の必要性を排除するものである。
【００１５】
本明細書に記載の参考文献の引用または考察は、そのようなものが本発明に対する先行技術であることの自白として解釈されるべきではない。
【発明の開示】
【００１６】
発明の概要
本発明者らは、免疫グロブリン重鎖の特定の残基が、真核生物系での抗体の生産性(例えば、生産レベル、収量、発現レベル)において重要な役割を果たすという驚くべき発見を為した。本発明者らはさらに、これらのアミノ酸残基の置換が、未改変の抗体よりも有意に高いレベルで産生される抗体をもたらすことを決定した。いかなる作用機構にも束縛されることを意図するものではないが、本発明のアミノ酸残基置換は、限定されるものではないが、遺伝子発現のレベル、mRNAの代謝回転および／もしくは翻訳、抗体安定性、抗体の折り畳み、抗体分泌、抗体凝集、ならびに宿主細胞に対する抗体の毒性などの抗体の生産性に影響することが知られるいくつかの因子のいずれか、または全てを変化させることにより、抗体の生産性の増加をもたらすことができる。
【００１７】
CDRの突然変異は、抗体の抗原結合特性に対して有害な影響を有し得るが、本発明者らは予想外にも、生産性を増強するCDR中の特定の置換が抗原結合に負に影響せず、改変された抗体の抗原結合特性を実際に増強することができることを見出した。いかなる特定の理論によっても束縛されることを望むものではないが、本発明のアミノ酸残基置換は、限定されるものではないが、抗原結合に対してほとんど効果がないか、または全く効果がないもの、抗原結合における許容可能な減少をもたらすもの、および抗原結合における改善をもたらすものを包含するコンフォメーションの変化をもたらし得る。
【００１８】
従って、本発明は、抗体または抗体フラグメントの生産性を増加させるための新規方法を提供し、また同じものの新規な抗体配列を提供する。また、本発明は、少なくとも1個のアミノ酸残基置換を有する抗体であって、この置換された抗体の生産性がその置換を含まない抗体と比較して改善されている前記抗体を提供する。
【００１９】
本発明の方法は、生産の有意な増加をもたらし、また抗体の抗原結合特性をも改善することができる、目的の抗体の重鎖の少なくとも1個の残基の変化を伴う。
【００２０】
本発明は、抗体または抗体フラグメントの生産性を増加させるための方法であって、(a)目的の抗体の、Kabat中に記載された番号付けシステムによる位置40H、60H、および61Hのアミノ酸残基を、それぞれアラニン、アラニンおよびアスパラギン酸に置換する工程；ならびに(b)改変された抗体ポリペプチドが宿主細胞により発現される条件下で、該宿主細胞を培養する工程を含む、前記方法を提供する。
【００２１】
当業者であれば、目的の抗体の位置40H、60Hおよび61Hのアミノ酸の性質を、これらの位置における任意の置換を施す前に、選択して分析できることが特に意図される。
【００２２】
好ましい実施形態においては、宿主細胞は酵母などの真核微生物を含む真核生物である。より好ましい実施形態においては、宿主細胞は哺乳動物である。そのような哺乳動物宿主細胞としては、限定されるものではないが、CHO、BHK、HeLa、COS、MDCK、NIH3T3、W138、NS0、SP/20および他のリンパ球細胞、ならびにPERC6、HEK293などのヒト細胞が挙げられる。
【００２３】
好ましい実施形態においては、位置40H、60Hおよび61Hのアミノ酸残基を、上記のように置換する。
【００２４】
他の実施形態においては、位置40Hおよび60H、または40Hおよび61H、または60Hおよび61Hのアミノ酸残基を、上記のように置換する。
【００２５】
さらに他の実施形態においては、位置40Hまたは60Hまたは61Hのアミノ酸残基を、上記のように置換する。
【００２６】
好ましい実施形態においては、本発明の方法は宿主細胞からの発現レベルおよび／または精製収量が増加した抗体をもたらす。
【００２７】
より好ましい実施形態においては、本発明の方法は抗原結合特性に負の影響を及ぼすことなく、発現レベルおよび／または精製収量が増加した抗体をもたらす。
【００２８】
より好ましい実施形態においては、本発明の方法は発現レベルおよび／または精製収量が増加し、かつ抗原結合特性が改善した抗体をもたらす。
【００２９】
本発明はまた、未改変の抗体と比較して改善された生産性をもたらす重鎖の改変を有する新規な抗体ポリペプチドも提供する。
【００３０】
好ましい実施形態においては、本発明の抗体は、改善された生産性を有し、抗原結合の減少がほとんどないか、または全くない。より好ましくは、本発明の抗体は改善された生産性および改善された抗原結合特性の両方を有する。
【００３１】
別の実施形態においては、本発明の抗体の重鎖改変は残基40H、60H、および61Hに対するものである。特に、位置40H、60H、および61Hを、必要に応じて、それぞれアラニン、アラニンおよびアスパラギン酸により置換する。
【００３２】
発明の詳細な説明
本発明は、抗体の重鎖の特定のアミノ酸残基の置換が、真核宿主細胞における該抗体の生産性の劇的な増加をもたらすという発見に基づく。さらに、本発明者らはまた、予想外にも、本発明のアミノ酸置換が抗原結合に負の影響を及ぼさず、改変された抗体の抗原結合特性を実際に増強することができることを見出した。かくして、本発明は、結合親和性は減少するが、依然として有用なレベルであるか、未変化であるか、または増加しているような、増加した生産性を示す抗体を含む。
【００３３】
従って、本発明は、改善された生産性を示す抗体または抗体フラグメント、および重鎖を改変することにより抗体または抗体フラグメントの生産性を改善する方法に関する。本発明の方法により作製された抗体または抗体フラグメントは、改善されているか、未変化であるか、または許容可能な程度に変化した抗原結合特性を有する。本明細書に記載され、意図された方法を用いて、本発明は、改善された生産性、および改善されているかもしくは未変化の抗原結合特性を有する改変された重鎖を含む抗体または抗体フラグメントも提供する。
【００３４】
任意の特定の理論により束縛されることを望まないが、本発明のアミノ酸置換は、限定されるものではないが、遺伝子発現のレベル、メッセンジャーRNAの安定性、翻訳された抗体タンパク質の安定性、タンパク質のフォールディング、タンパク質凝集のレベル、および宿主細胞に対する抗体の毒性などを含む、細胞における抗体の産生を制限する1つ以上の因子を変化させることにより、抗体または抗体フラグメントの生産性を改善する。
【００３５】
本明細書で言及される抗体の残基番号は、上掲のKabatらのものであることが理解されるであろう。さらに、任意の所与のKabatによる部位番号の特定の個々の残基が何であるかは、種間または対立遺伝子の分岐により抗体鎖の間で様々であり得る。しかしながら、明確性および単純性のために、KabatのヒトIgG重鎖配列における残基番号およびその残基種類を本明細書で用いるものとする。相補性決定領域(CDR)は抗体間でかなり変化する(かつ明らかにKabatの共通配列との相同性を示さないであろう)ことに留意されたい。フレームワーク残基の最大アラインメントは、Fv領域に用いられる、番号付けシステムにおいて「スペーサー」残基の挿入を必要とすることが多い。本明細書に記載のCDRは、上掲のKabatらのものであることが理解されるであろう。
【００３６】
当技術分野内で使用され、および／または許容されている用語に2個以上の定義が存在する場合、本明細書で用いられる用語の定義は、異なることが明確に記述されていない限り、そのような意味を全て含むと意図される。特定の例は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見出される非連続的抗原結合部位を説明するための用語「CDR」の使用である。この特定の領域は、Kabatら(1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA)およびChothiaら(1987, J. Mol. Biol. 196: 901-17)により、およびさらにMacCallumら(1996, J. Mol. Biol. 262: 732-45)により記載されており、これらの各々は参照により本明細書に組み入れられるものとする。ここでその定義は、互いに比較した場合、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。にもかかわらず、抗体のCDRまたはその変異体に言及するためのいずれかの定義の適用は、本明細書で定義され、使用される用語の範囲内にあることが意図される。上記で引用された参考文献の各々により定義されたCDRを含む好適なアミノ酸残基を、比較として以下の表1に記載する。特定のCDRを包含する正確な残基番号はCDRの配列および大きさに依存して様々であろう。
【００３７】
当業者であれば、どの残基が、所与の抗体の可変領域アミノ酸配列中に特定のCDRを含むかを日常的に決定することができる。
【表１】
2008504289.tif 000003
【００３８】
一実施形態においては、本発明の抗体は、置換された抗体が該置換を含まない抗体と比較して産生レベルが増加した少なくとも1個のアミノ酸置換を有するであろう。
【００３９】
特定の実施形態においては、本発明の抗体を、Kabatに記載の番号付けシステムによる40H、60H、および61Hからなる群より選択される1個以上の位置で置換する。より具体的には、アミノ酸残基40H、60Hおよび61Hのうち1個以上を、それぞれアラニン、アラニンおよびアスパラギン酸で置換する。
【００４０】
別の実施形態においては、本発明は、産生レベルが増加した置換抗体を製造する方法を提供する。
【００４１】
好ましい実施形態においては、本発明は、抗体または抗体フラグメントの生産性を増加させる方法であって、(a)必要に応じて、Kabatに記載の番号付けシステムによる目的の抗体の位置40H、60H、および61Hのアミノ酸残基を、それぞれアラニン、アラニンおよびアスパラギン酸で置換する工程；ならびに(b)改変抗体ポリペプチドが宿主細胞により発現される条件下で該宿主細胞を培養する工程を含む、前記方法を提供する。
【００４２】
当業者であれば、位置40H、60H、および61Hのアミノ酸の性質を、任意の置換を行う前に、選択して分析することができることが特に意図される。
【００４３】
当業者であれば、時には目的の抗体が上記の位置の1個以上に好適な配列を既に有することを理解できるであろう。この状況では、置換は、残りの一致していない位置(例えば、位置40H/60H、40H/61H、60H/61H、40H、60H、または61H)にだけ導入されるであろう。
【００４４】
好ましい実施形態においては、位置40H、60Hおよび61Hのアミノ酸残基を、それぞれアラニン、アラニンおよびアスパラギン酸で置換する。
【００４５】
他の好ましい実施形態においては、位置40Hおよび60Hのアミノ酸残基をアラニンで置換するか、または40Hおよび61Hをそれぞれアラニンおよびアスパラギン酸で置換するか、または60Hおよび61Hをそれぞれアラニンおよびアスパラギン酸で置換する。
【００４６】
さらに他の好ましい実施形態においては、位置40Hもしくは60Hのアミノ酸残基をアラニンで置換するか、または61Hをアスパラギン酸で置換することができる。
【００４７】
保存的アミノ酸置換を、目的の抗体の位置40H、60Hおよび／または61Hの前記アミノ酸置換のために作製しうることが特に意図される。「保存的アミノ酸置換」は、機能的に等価なアミノ酸を置換するアミノ酸置換を指すことは当技術分野で周知である。保存的なアミノ酸変化は、得られるペプチドのアミノ酸配列においてサイレントな変化をもたらす。例えば、類似する極性をもつ1種以上のアミノ酸は機能的等価物として機能し、該ペプチドのアミノ酸配列内にサイレントな変化をもたらす。また、電荷的に中性であり、ある残基をより小さい残基で置き換える置換は、たとえその残基同士が異なる群に含まれる場合でも、「保存的置換」であると考えられ得る(例えば、フェニルアラニンのより小さいイソロイシンでの置換)。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定義されている。保存的アミノ酸置換のいくつかのファミリーを表2に示す。
【表２】
2008504289.tif 000004
【００４８】
用語「保存的アミノ酸置換」はまた、アミノ酸類似体または変異体の使用も指す。表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製する方法に関する指針はBowieら、「タンパク質配列におけるメッセージの解読：アミノ酸置換に対する寛容(Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions)」(1990, Science 247: 1306-10)に提供されている。
【００４９】
さらに別の好ましい実施形態においては、本発明の方法は発現レベルおよび／または精製収量が増加した抗体をもたらすことができる。
【００５０】
より好ましい実施形態においては、本発明の方法は、ELISAにより決定されるような粗培地サンプル中の抗体発現レベルおよび／または精製抗体量の、前記置換を含まない抗体と比較した場合の少なくとも2倍、または少なくとも4倍、または少なくとも5倍、または少なくとも10倍、または少なくとも25倍、または少なくとも50倍、または少なくとも100倍の増加をもたらし得る。
【００５１】
当業者であれば、抗体のアミノ酸置換および他の改変が、その抗原結合特性(結合特性の例としては、限定されるものではないが、結合特異性、平衡解離定数(KD)、解離速度および結合速度(それぞれKoffおよびKon)、結合親和性および／もしくはアビディティーが挙げられる)を変化させ得ること、ならびにその特定の変化は多かれ少なかれ望ましいものであることを理解できるであろう。例えば、抗原結合を減少させるか、または変化させる改変よりも、抗原結合を保存するかまたは増強する改変がより好ましい。標的抗原に関する抗体の結合特性を、限定されるものではないが、例えば、平衡法(例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)もしくはラジオイムノアッセイ(RIA))、または反応速度論(例えば、BIACORE(登録商標)解析；実施例2を参照)などの様々な方法により決定することができる。抗体の結合特性を試験するための他の一般的に用いられる方法が、Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Harrowら、1999およびAntibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlowら、1989に記載されている。
【００５２】
平衡解離定数(KD)がkoff/konとして定義されることは当業界で周知である。低いKDを有する抗体が高いKDを有する抗体よりも好ましいと一般的に理解されている。しかしながら、いくつかの例においては、konまたはkoffの値がKDの値よりも適切である。当業者であれば、どの反応速度論的パラメーターが所与の抗体および用途にとって最も重要であるかを決定することができるであろう。好ましい実施形態においては、本発明の方法は、改善された生産性、および前記置換を含まない抗体の反応速度論的パラメーターと比較して少なくとも2％、または少なくとも5％、または少なくとも10％、または少なくとも20％、または少なくとも30％、または少なくとも40％、または少なくとも50％、または少なくとも60％、または少なくとも70％、または少なくとも80％改善された、1つ以上の抗原結合特性(例えば、結合特異性、KD、Koff、Kon、結合親和性および／もしくはアビディティー)を有する抗体をもたらし得る。
【００５３】
別の実施形態においては、本発明の方法は、発現レベルおよび／もしくは精製収量を増加させるが、抗体の抗原結合を実質的に減少させない、少なくとも1個のアミノ酸残基置換を有する抗体をもたらし得る。例えば、本発明の方法は、発現レベルおよび／または精製収量の増加を示すが、好ましくは、いかなる抗原結合特性(例えば、結合特異性、KD、Koff、Kon、結合親和性および／もしくはアビディティー)の減少も示さないか、または前記置換を含まない抗体の抗原結合と比較して1％未満、もしくは5％未満、もしくは10％未満、もしくは20％未満、もしくは30％未満、もしくは40％未満、もしくは50％未満、もしくは60％未満、もしくは70％未満、もしくは80％未満減少した1種以上の抗原結合特性を有する抗体を、作製することができる。
【００５４】
当業者であれば、本発明の方法を他の方法と組合わせて、抗体の生産性を増加させることもできることをさらに理解できるであろう。そのような方法としては、限定されるものではないが、増殖培地および／もしくは条件の操作、宿主細胞の改変、追加のアミノ酸置換または抗体の重鎖および／もしくは軽鎖への突然変異の導入、ならびに該抗体の他の改変が挙げられる。さらに、本発明の方法をさらなる方法と組合わせて、限定されるものではないが、増加した血清半減期、増加した結合親和性、減少した免疫原性、増加した生産、および変化した結合特異性(例えば、以下を参照)などの他の好ましい特性を示す抗体を作製することができる。
【００５５】
本発明はまた、置換を含まない抗体と比較して、宿主細胞における改善された生産性をもたらす少なくとも1個のアミノ酸残基置換を有する新規な抗体ポリペプチドも提供する。
【００５６】
本発明はさらに、置換を含まない抗体と比較して、宿主細胞における改善された生産性および1種以上の抗原結合特性(例えば、結合特異性、KD、Koff、Kon、結合親和性および／またはアビディティー)の改善をもたらす少なくとも1個のアミノ酸残基置換を有する新規な抗体ポリペプチドを提供する。
【００５７】
好ましい実施形態においては、本発明は、ELISAにより決定される粗培地サンプル中の発現レベルおよび／または精製された抗体収量が、置換を含まないキメラ抗体の発現レベルおよび／または精製収量の少なくとも100倍、もしくは少なくとも50倍、もしくは少なくとも25倍、もしくは少なくとも10倍、もしくは少なくとも5倍、もしくは少なくとも4倍、もしくは少なくとも2倍を超えることを特徴とする、少なくとも1個のアミノ酸残基置換を有する抗体ポリペプチドに関する。
【００５８】
好ましい実施形態においては、本発明の抗体は、改善された生産性、ならびに前記置換を含まない抗体の反応速度論的パラメーターと比較して少なくとも2％、もしくは少なくとも5％、もしくは少なくとも10％、もしくは少なくとも20％、もしくは少なくとも30％、もしくは少なくとも40％、もしくは少なくとも50％、もしくは少なくとも60％、もしくは少なくとも70％、もしくは少なくとも80％改善された1種以上の抗原結合特性(例えば、結合特異性、KD、Koff、Kon、結合親和性および／またはアビディティー)の両方を有する。
【００５９】
別の実施形態においては、本発明の抗体は、増加した発現レベルおよび／または精製収量を示すが、好ましくは任意の抗原結合特性(例えば、結合特異性、KD、Koff、Kon、結合親和性および／またはアビディティー)の減少を示さないか、または前記置換を含まない抗体の抗原結合と比較した場合に1％未満、もしくは5％未満、もしくは10％未満、もしくは20％未満、もしくは30％未満、もしくは40％未満、もしくは50％未満、もしくは60％未満、もしくは70％未満、もしくは80％未満減少した1種以上の抗原結合特性を有するであろう。
【００６０】
また、本発明の改変された抗体が、限定されるものではないが、増加した血清半減期、増加した結合親和性、減少した免疫原性、増加した生産、および結合特異性(例えば、下記参照)などの好ましい特性を有する抗体をもたらす、特に追加のアミノ酸残基置換、突然変異および／または改変を含み得ることが特に意図される。
【００６１】
一実施形態においては、本発明の改変された抗体を遺伝子工学的に操作して、Fc領域内に改変を含むようにし、典型的には、血清半減期、補体固定、Fc受容体結合、および／または抗原依存的細胞傷害活性などの、該抗体の1種以上の機能特性を変化させることができる。さらに、本発明の抗体を化学的に修飾(例えば、1つ以上の化学的成分を抗体に付加することができる)するか、またはそのグリコシル化を変化させて、同様に該抗体の1種以上の機能特性を変化させるように改変することができる。これらの実施形態の各々を以下にさらに詳細に説明する。Fc領域中の残基の番号付けはKabatのEU指標のものである。
【００６２】
一実施形態においては、Fc領域のアミノ酸配列を、少なくともアミノ酸残基を欠失、付加および／または置換することにより改変して、上記の抗体の1種以上の機能特性を変化させる。この手法は、Duncanら、1988, Nature 332: 563-564; Lundら、1991, J. Immunol 147: 2657-2662; Lundら、1992, Mol Immunol 29: 53-59; Alegreら、1994, Transplantation 57: 1537-1543; Hutchinsら、1995, Proc Natl. Acad Sci USA 92: 11980-11984; Jefferisら、1995, Immunol Lett. 44:111-117; Lundら、1995, Faseb J9:115-119; Jefferisら、1996, Immunol Lett 54:101-104; Lundら、1996, J Immunol 157:4963-4969; Armourら、1999, Eur J Immunol 29:2613-2624; Idusogieら、2000, J Immunol 164:4178-4184; Reddyら、2000, J Immunol 164:1925-1933; Xuら、2000, Cell Immunol 200:16-26; Idusogieら、2001, J Immunol 166:2571-2575; Shieldsら、2001, J BIol Chem 276:6591-6604; Jefferisら、2002, Immunol Lett 82:57-65; Prestaら、2002, Biochem Sco Trans 30:487-490; 米国特許第5,624,821号；5,885,573号；5,677,425号；6,165,745号；6,277,375号；5,869,046号；6,121,022号；5,624,821号；5,648,260号；6,194,551号；6,737,056号、米国特許出願第10/370,749号およびPCT公開WO 94/2935; WO 99/58572; WO 00/42072; WO 04/029207にさらに記載されており、その各々はその全体が参照に
より本明細書に組み入れられるものとする。
【００６３】
さらに別の実施形態においては、本発明の改変された抗体のグリコシル化を改変する。例えば、非グリコシル化（aglycosylated）抗体を作製することができる(すなわち、グリコシル化を欠く抗体)。グリコシル化を変化させて、例えば、抗原に関する抗体の親和性を増加させることができる。そのような糖鎖改変を、例えば、抗体配列内のグリコシル化部位の1個以上を変化させることにより達成することができる。例えば、1個以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の排除をもたらし、それによってその部位でのグリコシル化を排除する1個以上のアミノ酸置換を作製することができる。そのような非グリコシル化は抗原に関する抗体の親和性を増加させることができる。そのような手法は、米国特許第5,714,350号および6,350,861号にさらに詳細に記載されており、その各々はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【００６４】
さらに、またはあるいは、減少した量のフコシル残基を有するヒポフコシル化抗体、もしくは増加した分岐GlcNAc構造を有する抗体などの、変化したタイプのグリコシル化を有する本発明の改変抗体を作製することができる。そのような変化したグリコシル化パターンは抗体のADCC能力を増加させることが証明された。そのような糖鎖改変を、例えば、変化したグリコシル化機構を有する宿主細胞中で前記抗体を発現させることにより達成することができる。変化したグリコシル化機構を有する細胞は当技術分野で報告されており、本発明の組換え抗体を発現させることによって変化したグリコシル化を有する抗体をその細胞内で産生させるための宿主細胞として使用することができる。例えば、Shileds, R.L.ら(2002) J. Biol. Chem. 277: 26733-26740; Umanaら(1999) Nat. Biotech. 17: 176-1、ならびに欧州特許第EP 1,176,195号；PCT公開WO 03/035835; WO 99/54342 80(その各々はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。
【００６５】
本発明の好ましい抗体
本発明の方法により改変され、本発明の方法により作製された抗体としては、限定されるものではないが、合成抗体、モノクローナル抗体、組換え的に産生された抗体、細胞内抗体、多特異性抗体、二特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、合成抗体、一本鎖Fv(scFv)、Fabフラグメント、F(ab')フラグメント、ジスルフィド結合Fv(sdFv)、および抗イディオタイプ(抗Id)抗体、ならびに上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられる。特に、本発明の方法において用いられる抗体としては、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分が挙げられる。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の種類(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)、またはサブクラスのものであってよい。
【００６６】
本発明の方法により改変され、本発明の方法により作製される抗体または抗体フラグメントは、鳥および哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ)などの任意の動物起源由来であってよい。好ましくは、前記抗体はヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である。本明細書で用いる「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体またはヒト遺伝子由来の抗体を発現するマウスから単離された抗体を含む。
【００６７】
本発明の方法により改変され、本発明の方法により作製される抗体または抗体フラグメントは、単一特異性、二特異性、三特異性またはそれより多い多特異性のものであってよい。多特異性抗体は所望の標的分子の異なるエピトープに免疫特異的に結合するか、または標的分子、ならびに異種ポリペプチドなどの異種エピトープもしくは固相支持材料の両方に免疫特異的に結合することができる。例えば、国際特許公開WO 93/17715、WO 92/08802、WO 91/00360、およびWO 92/05793; Tuttら、1991, J. Immunol. 147: 60-69;米国特許第4,474,893号、4,714,681号、4,925,648号、5,573,920号、および5,601,819号；ならびにKostelnyら、1992, J. Immunol. 148: 1547-1553を参照されたい。
【００６８】
本発明の方法および抗体は、ラクダ化一本鎖抗体などの一本鎖ドメイン抗体を包含する(例えば、Muyldermansら、2001, Trends Biochem. Sci. 26:230; Nuttallら、2000, Cur. Pharm. Biotech. 1:253; ReichmannおよびMuyldermans, 1999, J. Immunol. Meth. 231:25;国際特許公開WO 94/04678およびWO 94/25591；米国特許第6,005,079号(これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい)。
【００６９】
本発明の方法および抗体はまた、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、15日を超える、好ましくは20日を超える、25日を超える、30日を超える、35日を超える、40日を超える、45日を超える、2ヶ月を超える、3ヶ月を超える、4ヶ月を超える、または5ヶ月を超える半減期(例えば、血清半減期)を有する抗体またはそのフラグメントの使用をも包含する。哺乳動物、好ましくはヒトにおける本発明の抗体もしくはそのフラグメントの半減期の増加は、該哺乳動物において該抗体もしくは抗体フラグメントのより高い血清力価をもたらし、かくして、該抗体もしくは抗体フラグメントの投与の頻度を減少させ、および／または投与される該抗体もしくは抗体フラグメントの濃度を減少させる。in vivoでの半減期が増加した抗体またはそのフラグメントを、当業者には公知の技術により作製することができる。例えば、in vivoでの半減期が増加した抗体またはそのフラグメントを、FcドメインとFcRn受容体との間の相互作用に関与するとして同定されたアミノ酸残基(例えば、国際特許公開WO 97/34631および米国特許出願第10/020,354号(両方ともその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい)を改変(例えば、置換、欠失または付加)することにより作製することができる。
【００７０】
本発明の方法および抗体はまた、本発明の改変抗体、またはその抗原結合部分を含む二特異性である抗体であって、本発明のその抗体またはその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第2の機能性成分に連結された前記抗体をも包含する。さらなる実施形態においては、本発明は、多特異性である抗体であって、その抗体分子がさらに、本発明のその抗体またはその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第3、第4、またはそれ以上の機能性成分を含む前記抗体を、包含する。
【００７１】
特定の実施形態においては、本発明の方法および抗体は、二特異性T細胞エンゲージャー(engager)(BiTE)である。二特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)は、標的の抗原特異的排除のためにT細胞を方向付け直すことができる二特異性抗体である。BiTE分子は、該分子の一方の末端にT細胞抗原(例えば、CD3)に結合する抗原結合ドメインを、そして標的細胞上の抗原に結合する抗原結合ドメインを、有する。BiTE分子は最近WO 99/54440(参照により本明細書に組み入れられるものとする)に記載された。この刊行物は、CD19およびCD3抗原に対する結合部位(CD19xCD3)を含む新規な一本鎖多官能性ポリペプチドを記載している。この分子は、B細胞上のCD19に結合するものおよびT細胞上のCD3に結合する抗体の2つの抗体から誘導されたものである。これらの異なる抗体の可変領域を、ポリペプチド配列により連結し、かくして、単一の分子を作製する。また、一本鎖の二特異性抗体を作製するための可撓性(flexible)リンカーによる特異的結合ドメインの可変重鎖(VH)および軽鎖(VL)の連結も記載されている。
【００７２】
別の実施形態においては、BiTE分子は他のT細胞抗原(CD3以外)に結合する分子を含んでもよい。例えば、CD2、CD4、CD8、CD11a、TCR、およびCD28などのT細胞抗原に免疫特異的に結合するリガンドおよび／または抗体は、本発明の一部であると意図される。この列挙は網羅的なものであることを意味せず、T細胞抗原に免疫特異的に結合することができる他の分子をBiTE分子の一部として用いることができることを例示するものに過ぎない。これらの分子は前記抗体のVHおよび／もしくはVL部分または天然のリガンド(例えば、その天然のリガンドがCD3であるLFA3)を含んでもよい。
【００７３】
抗体の作製方法
本発明の方法により改変され、本発明により作製される抗体または抗体フラグメントを、抗体の合成に関する当業界で公知の任意の方法により、特に、化学的合成または好ましくは、組換え発現技術により作製することができる。
【００７４】
本発明の方法により改変されたモノクローナル抗体を、ハイブリドーマの使用、組換え技術、およびファージ展示技術、またはその組合せなどの当業界で公知の様々な技術を用いて調製することができる。例えば、モノクローナル抗体を、当業界で公知であり、例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, E. HarlowおよびD. Lane(編), Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY, 1988)；およびHammerlingら、Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)(この参考文献はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に教示されたものなどのハイブリドーマ技術を用いて製造することができる。本明細書で用いる用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術により製造された抗体に限定されるものではない。用語「モノクローナル抗体」は、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンなどの単一のクローンから誘導される抗体を指し、それを製造する方法を指すものではない。
【００７５】
ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を製造し、スクリーニングする方法は日常的なものであり、当業界で周知である。簡単に述べると、マウスを目的の抗原で免疫すればよく、常にではないが一般的には完全長タンパク質またはそのドメイン(例えば、細胞外ドメイン)などのポリペプチドを用いることができ、そして一度免疫応答を検出すれば、例えば、目的の抗原に対して特異的な抗体をマウス血清中で検出し、マウス脾臓を採取し、脾臓細胞を単離する。次いで、脾臓細胞を、任意の好適なミエローマ細胞、例えば、ATCCから入手可能な細胞系SP20由来の細胞に、周知の技術により融合する。ハイブリドーマを選択し、限界希釈によりクローン化する。さらに、RIMMS(反復免疫、複数部位)技術を用いて、動物を免疫することができる(Kilpatrickら、1997, Hybridoma  16: 381-9(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする))。次いで、ハイブリドーマクローンを、本発明のポリペプチドに結合することができる抗体を分泌する細胞について当業界で公知の方法によりアッセイする。一般的に高レベルの抗体を含む腹水液を、陽性のハイブリドーマクローンでマウスを免疫することにより作製することができる。
【００７６】
従って、モノクローナル抗体を、目的の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することにより作製することができ、ここで、好ましくは、目的のポリペプチドまたはその断片で免疫したマウスから単離された脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させた後、目的のポリペプチドに結合することができる抗体を分泌するハイブリドーマクローンについて、融合物から得られるハイブリドーマをスクリーニングすることにより、ハイブリドーマを作製する。
【００７７】
本発明の抗体フラグメントを、当業者には公知の任意の技術により作製することができる。例えば、本発明のFabおよびF(ab')2フラグメントを、パパイン(Fabフラグメントを製造するため)またはペプシン(F(ab')2フラグメントを製造するため)などの酵素を用いて、免疫グロブリン分子のタンパク質分解切断により製造することができる。F(ab')2フラグメントは、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のCH1ドメインを含む。さらに、本発明の抗体を、当業界で公知の様々なファージ展示法を用いて作製することもできる。
【００７８】
ファージ展示法においては、機能的抗体ドメインを、それらをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面上に展示する。特に、VHおよびVLドメインをコードするDNA配列を、動物cDNAライブラリー(例えば、リンパ系組織のヒトまたはマウスcDNAライブラリー)から増幅する。VHおよびVLドメインをコードするDNAを、PCRによりscFvリンカーと共に再結合し、ファージミドベクター(例えば、pCANTAB 6またはpComb 3 HSS)中にクローニングする。このベクターを大腸菌中にエレクトロポレーションし、その大腸菌をヘルパーファージに感染させる。これらの方法において用いられるファージは、典型的にはfdおよびM13などの繊維性ファージであり、VHおよびVLドメインを通常、ファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIのいずれかに組換え的に融合する。目的の抗原エピトープに結合する抗原結合ドメインを発現するファージを、抗原を用いて、例えば、標識抗原、または固相表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉された抗原を用いて、選択または同定することができる。本発明の抗体を作製するのに用いることができるファージ展示法の例としては、Brinkmanら、1995, J. Immunol. Methods 182:41-50; Amesら、1995, J. Immunol. Methods 184:177; Kettleboroughら、1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persicら、1997, Gene 187:9; Burtonら、1994, Advances in Immunology 57:191-280；国際特許出願PCT/GB91/01134；国際特許公開WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401、およびWO 97/13844；ならびに米国特許第5,698,426号、5,223,409号、5,403,484号、5,580,717号、5,427,908号、5,750,753号、5,821,047号、5,571,698号、5,427,908号、5,516,637号、5,780,225号、5,658,727号、5,733,743号および5,969,108号(各々はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に開示されたものが挙げられる。
【００７９】
好ましい実施形態においては、ファージ選択後、ファージ由来の抗体コード領域を単離し、これを用いて上記の参考文献に記載のようにヒト抗体などの全抗体を作製する。別の好ましい実施形態においては、本発明の再構成された抗体を、細菌、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および特に、哺乳動物細胞(例えば、以下に記載のもの)などの任意の所望の宿主において発現させる。国際特許公開WO 92/22324; Mullinaxら、1992, BioTechniques 12:864; Sawaiら、1995, AJRI 34:26;およびBetterら、1988, Science 240:1041(この参考文献はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に開示されたものなどの当業界で公知の方法を用いてFab、Fab'およびF(ab')2フラグメントを組換え的に製造する技術を使用することもできる。
【００８０】
本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列を、ハイブリドーマクローンDNAを配列決定することから取得することができる。特定の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントをコードする核酸を含むクローンが入手可能でないが、該抗体分子またはそのエピトープ結合フラグメントの配列が公知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸を化学的に合成するか、または好適な起源(例えば、抗体cDNAライブラリー、または抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞などの抗体を発現する任意の組織もしくは細胞から作製されたcDNAライブラリー、またはその組織もしくは細胞から単離された核酸、好ましくはポリA+RNA)から、該配列の3'および5'末端にハイブリダイズする合成プライマーを用いるPCR増幅によるかまたは特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いてクローニングして、例えば、該抗体をコードするcDNAクローンをcDNAライブラリーから同定することにより、取得することができる。次いで、PCRにより作製された増幅核酸を、当業界で周知の任意の方法を用いて、複製可能なクローニングベクター中にクローニングすることができる。
【００８１】
一度、抗体のヌクレオチド配列が決定されれば、該抗体のヌクレオチド配列を、例えば、組換えDNA技術、部位特異的突然変異誘発、PCRなどの、ヌクレオチド配列の操作に関する当業界で周知の方法(例えば、Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubelら(編), John Wiley & Sons (Chichester, England, 1998); Molecular Cloning: A Laboratory Manual(第3版), J. Sambrookら(編), Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY, 2001); Antibodies: A Laboratory Manual, E. HarlowおよびD. Lane(編), Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY, 1988)；ならびにUsing Antibodies: A Laboratory Manual, E. HarlowおよびD. Lane(編), Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Spring Harbor, NY, 1999)に記載の技術を参照、これらの文献はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を用いて操作して、例えば、抗体の所望の領域に欠失および／または挿入を導入することにより、異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製することができる。
【００８２】
好ましい実施形態においては、本発明の抗体は、位置41H、60Hおよび61Hがそれぞれアラニン、アラニンおよびアスパラギン酸により置換されるように、重鎖の可変領域中にアミノ酸置換を含む。
【００８３】
より好ましい実施形態においては、VHおよびVLヌクレオチド配列をクローニングし、これを用いて全抗体を作製する。当業者には公知のクローニング技術を用いて、VHまたはVLヌクレオチド配列、制限部位、および該制限部位を保護するためのフランキング配列などのPCRプライマーを用いて、scFv中のVHまたはVL配列を増幅する。PCR増幅されたVHドメインを、VH定常領域、例えば、ヒトγ4定常領域を発現するベクター中にクローニングし、またPCR増幅されたVLドメインを、VL定常領域、例えば、ヒトκまたはλ定常領域を発現するベクター中にクローニングする。このVHおよびVLドメインも、必須の定常領域を発現する1つのベクター中にクローニングする。次いで、その重鎖変換ベクターおよび軽鎖変換ベクターを細胞系中に同時トランスフェクトして、当業者には公知の技術を用いて、完全長抗体、例えばIgGを発現する安定な、または一過性の細胞系を作製する。
【００８４】
ヒトにおける抗体のin vivoでの使用およびin vitroでの検出アッセイなどの、一部の使用のためには、本発明の抗体はヒトまたはキメラ抗体であるのが好ましいことが特に意図される。完全なヒト抗体がヒト被験者の治療的処置のためには特に望ましい。ヒト抗体を、ヒト免疫グロブリン配列から得られた抗体ライブラリーを用いて、上記のファージ展示法などの当業界で公知の様々な方法により作製することができる。また、米国特許第4,444,887号および4,716,111号；ならびに国際公開WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735、およびWO 91/10741(各々その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)も参照されたい。
【００８５】
機能的な内因性免疫グロブリンを発現することができないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて、ヒト抗体を製造することもできる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を、マウス胚性幹細胞中に無作為に導入するか、または相同的組換えにより導入することができる。あるいは、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域を、マウス胚性幹細胞中に導入することができる。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を、相同的組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入により、別々にまたは同時に非機能的にすることができる。特に、JH領域のホモ接合性欠失は内因性抗体産生を阻止する。改変された胚性幹細胞を増殖させ、胚盤胞中にマイクロインジェクトしてキメラマウスを作製する。次いで、キメラマウスを育種して、ヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を作製する。トランスジェニックマウスを、選択された抗原、例えば、本発明のポリペプチドの全部または一部を用いて、通常の様式で免疫する。この抗原に対するモノクローナル抗体を、従来のハイブリドーマ技術を用いて、免疫されたトランスジェニックマウスから取得することができる。このトランスジェニックマウスにより担持されるヒト免疫グロブリン導入遺伝子はB細胞分化の間に再配列し、それに続いてクラススイッチングおよび体細胞突然変異を受ける。かくして、そのような技術を用いて、治療上有用なIgG、IgA、IgMおよびIgE抗体を製造することができる。ヒト抗体を製造するためのこの技術の総論については、LonbergおよびHuszar(1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93)を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を製造するためのこの技術の詳細な考察ならびにそのような抗体を製造するためのプロトコルについては、例えば、国際公開WO 98/24893、WO 96/34096、およびWO 96/33735；ならびに米国特許第5,413,923号、5,625,126号、5,633,425号、5,569,825号、5,661,016号、5,545,806号、5,814,318号および5,939,598号(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。さらに、Abgenix, Inc. (Freemont, CA)、Genpharm (San Jose, CA)およびMedarex (Princeton, NJ)などの会社に、上記のものと同様の技術を用いて、選択された抗体に対するヒト抗体を供給するように従事してもらうことができる。
【００８６】
キメラ抗体は、例えば非ヒト抗体由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体などの、抗体の異なる部分が異なる免疫グロブリン分子に由来する分子である。キメラ抗体を製造する方法は当業界で公知である。例えば、Morrison, 1985, Science 229:1202; Oiら、1986, BioTechniques 4:214; Gilliesら、1989, J. Immunol. Methods 125:191-202;ならびに米国特許第5,807,715号、4,816,567号、および4,816,397号、CDR移植(EP 239,400;国際公開WO 91/09967;ならびに米国特許第5,225,539号、5,530,101号、および5,585,089号)、化粧張りまたは再表面化(EP 592,106；EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4.5):489-498; Studnickaら、1994, Protein Engineering 7:805;およびRoguskaら、1994, PNAS 91:969)、ならびに鎖シャッフリング(米国特許第5,565,332号)を参照されたい(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)。
【００８７】
抗体の発現方法
抗体の組換え発現は、該抗体をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターの構築を必要とする。一度、抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、またはそれらの一部(好ましくは、重鎖もしくは軽鎖の可変領域を含む)をコードするヌクレオチド配列を取得すれば、該抗体分子の産生のためのベクターを、当業界で周知の技術を用いる組換えDNA技術により作製することができる。かくして、抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの発現によりタンパク質を調製する方法は本明細書に記載されている。当業者には周知である方法を用いて、抗体をコードする配列ならびに好適な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、in vitro組換えDNA技術、合成技術、およびin vivo遺伝子組換えが挙げられる。
【００８８】
かくして、本発明は、重鎖のアミノ酸残基40H、60Hおよび61Hに1個以上の改変を有する改変された抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖および軽鎖の両方の可変領域、重鎖および／もしくは軽鎖可変領域のエピトープ結合フラグメント、または1個以上の相補性決定領域(CDR)をコードするヌクレオチド配列を、そのような発現用ベクター中にクローニングすることができる。
【００８９】
抗体発現ベクターを、従来の技術により宿主細胞に導入した後、トランスフェクトされた細胞を従来の技術により培養して、改善された生産性を有する置換された抗体を製造する。様々な宿主発現ベクター系を用いて、本発明の抗体分子を発現させることができる。そのような宿主発現系は、目的のコード配列を作製させ、次いで精製するための媒体であるが、好適なヌクレオチドコード配列を用いて形質転換またはトランスフェクトされた場合、本発明の抗体分子をin situで発現することができる細胞でもある。
【００９０】
好ましい実施形態においては、本発明の方法により作製された抗体を、真核宿主細胞中で発現させる。より好ましい実施形態においては、宿主細胞は哺乳動物である。哺乳動物細胞系としては、限定されるものではないが、CHO、BHK、HeLa、COS、MDCK、NIH 3T3、W138、NS0、SP/20および他のリンパ球細胞、ならびに哺乳動物細胞のゲノムから誘導されたプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳動物ウイルスから誘導されたプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含む組換え発現構築物を担持するPERC6、HEK293などのヒト細胞が挙げられる。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要な即時型初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと組合わせたチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)などの哺乳動物細胞は、抗体のための有効な発現系である(Foeckingら、1986, Gene, 45:101;およびCockettら、1990, BioTechnology, 8:2)。
【００９１】
哺乳動物宿主細胞においては、多くのウイルスに基づく発現系を用いて、本発明の抗体分子を発現させることができる。発現ベクターとしてアデノウイルスを用いる場合、目的の抗体コード配列を、アデノウイルスの転写／翻訳制御複合体(例えば、後期プロモーターおよび三部分リーダー配列)に連結することができる。次いで、このキメラ遺伝子を、in vitroまたはin vivo組換えにより、アデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、領域E1またはE3)中への挿入は、感染した宿主において生存可能であり、抗体分子を発現することができる組換えウイルスをもたらすであろう(例えば、Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1: 355-59を参照)。挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳のためには、特定の開始シグナルも必要である。これらのシグナルは、ATG開始コドンおよび隣接配列を含む。さらに、この開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために所望のコード配列の読み枠と一致しなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、様々な起源のものであってよく、天然および合成の両方であってよい。発現効率を、好適な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることにより増強することができる(例えば、Bitterら、1987, Methods in Enzymol., 153:516-44)。
【００９２】
さらに、抗体配列の発現をモジュレートするか、または所望の特定の様式で抗体を修飾し、プロセシングする宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のそのような修飾(例えば、グリコシル化)およびプロセシング(例えば、切断)は前記抗体の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞はタンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴的で特有の機構を有する。好適な細胞系または宿主系を選択して、発現される抗体の正確な修飾およびプロセシングを確実にすることができる。この目的のために、一次転写物の正確なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を用いることが特に意図される。そのような哺乳動物宿主細胞としては、限定されるものではないが、CHO、BHK、HeLa、COS、MDCK、NIH3T3、W138、NS0、SP/20および他のリンパ球細胞、ならびにPERC6、HEK293などのヒト細胞が挙げられる。
【００９３】
組換え抗体の長期間、高収量の製造のためには、安定な発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定に発現する細胞系を遺伝子工学的に作製することができる。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを用いるよりも、宿主細胞を、好適な発現制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、-85ポリアデニル化部位など)により制御されるDNAおよび選択マーカーを用いて形質転換することができる。外来DNAの導入後、遺伝子工学的に作製された細胞を富化培地中で1〜2日間増殖させた後、選択培地に切り替えることができる。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞が該プラスミドをその染色体中に安定に組込み、増殖して遺伝子座を形成することができるようにし、次いでこれをクローニングし、細胞系へと増殖させることができる。この方法を有利に用いて、前記抗体分子を発現する細胞系を遺伝子工学的に作製することができる。そのような遺伝子工学的に作製された細胞系は、前記抗体分子と直接的または間接的に相互作用する組成物のスクリーニングおよび評価において特に有用である。
【００９４】
様々な選択系を用いることができ、例えば、限定されるものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wiglerら、1977, Cell, 11:223)、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48:202)、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowyら、1980, Cell, 22:8-17)の遺伝子は、それぞれtk-、hgprt-またはaprt-細胞中で用いることができる。また、抗代謝物耐性を、以下の遺伝子：メトトレキサートに対する耐性を付与するdhfr(Wiglerら、1908, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:357およびO'Hareら、1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1527)、ミコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt(Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072)；アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与するneo(WuおよびWu, 1991, Biotherapy, 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:573-96; Mulligan, 1993, Science, 260:926-32;ならびにMorganおよびAnderson, 1993, Ann. Rev. Biochem., 62:191-217;およびMay, 1993, TIB TECH, 11(5):155-2)；ならびにヒグロマイシンに対する耐性を付与するhygro(Santerreら、1984, Gene, 30:147)に対する選択の基礎として用いることができる。組換えDNA技術の技術分野で一般的に公知の方法を日常的なかたちで適用して、所望の組換えクローンを選択することができ、そのような方法は、例えば、Ausubel, F.M.ら、1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & SonsおよびSambrookら、2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(第3版)(これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に記載されている。
【００９５】
抗体分子の発現レベルを、ベクター増幅によりさらに増加させることができる(総論については、BebbingtonおよびHentschel, 1987,「DNAクローニングにおける哺乳動物細胞におけるクローン化された遺伝子の発現のための遺伝子増幅に基づくベクターの使用(The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning)」、Vol.3. Academic Press, New Yorkを参照されたい)。抗体を発現するベクター系中のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルの増加は該マーカー遺伝子のコピー数を増加させるであろう。増幅領域は抗体遺伝子を伴うため、該抗体の産生も増加するであろう(Crouseら、1983, Mol. Cell. Biol., 3:257)。
【００９６】
前記宿主細胞を、本発明の2つの発現ベクター、すなわち重鎖由来ポリペプチドをコードする第1のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第2のベクターを用いて、同時トランスフェクトすることができる。この2つのベクターは重鎖および軽鎖ポリペプチドの同等な発現を可能にする同一の選択マーカーを含んでもよい。
【００９７】
あるいは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、かつこれらを発現することができる単一のベクターを用いることもできる。そのような状況では、軽鎖を重鎖の前方に置いて、毒性の遊離重鎖が過剰になることを回避するべきである(Proudfoot, 1986, Nature, 322:52;およびKohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:2 197)。重鎖および軽鎖のコード配列はcDNAまたはゲノムDNAを含んでもよい。
【００９８】
一実施形態においては、全組換え抗体分子を発現させる。別の実施形態においては、免疫グロブリン分子のフラグメント(例えば、Fabフラグメント、F(ab')フラグメント、およびエピトープ結合フラグメント)を発現させる。
【００９９】
いったん組換え発現により本発明の抗体分子を製造すれば、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性、特に、プロテインA精製後の特異的抗原に関する親和性によるもの、およびサイズ分画カラムクロマトグラフィー)、遠心分離、示差的溶解性により、またはタンパク質の精製に関する任意の他の標準的な技術により、免疫グロブリン分子の精製に関して当業界で公知の任意の方法によりそれを精製することができる。さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントを、本明細書に記載されている異種性ポリペプチド配列、またはさもなければ当業界で公知の異種性ポリペプチド配列に融合させて、精製を容易にすることができる。
【０１００】
抗体誘導体
本発明の方法により改変され、本発明の方法により作製された抗体には、改変された誘導体を包含する(すなわち、共有結合となるような抗体への任意の種類の分子の共有結合による)。例えば、限定されるものではないが、抗体誘導体としては、例えば、グリコシル化、アセチル化、PEG付加、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結などにより改変された抗体が挙げられる。多くの化学的修飾の任意のものを、限定されるものではないが、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などの公知の技術により実行することができる。さらに、この誘導体は1個以上の非古典的アミノ酸を含んでもよい。
【０１０１】
in vivoにおける半減期が増加した抗体またはそのフラグメントを、該抗体または抗体フラグメントに、高分子量ポリエチレングリコール(PEG)などのポリマー分子を付加させることにより作製することができる。PEGを、前記抗体もしくは抗体フラグメントのNもしくはC末端へのPEGの部位特異的結合による、またはリジン残基上に存在するεアミノ基による多官能性リンカーを用いるか、または用いずに前記抗体もしくは抗体フラグメントに付加することができる。生物学的活性の喪失を最小限の喪失を最小限にする直鎖状または分枝状ポリマー誘導体化を用いることができる。結合の程度をSDS-PAGEおよび質量分析により密接にモニターして、前記抗体へのPEG分子の正しい結合を確実にすることができる。未反応のPEGを、例えば、サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーにより、抗体-PEG結合物から分離することができる。
【０１０２】
本発明は、本発明の方法により改変され、本発明の方法により作製された抗体(またはそのフラグメント)であって、異種ポリペプチド(またはその一部。好ましくは少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個もしくは少なくとも100個のアミノ酸のポリペプチド)に組換え的に融合されるか、または化学的に結合(共有および非共有結合の両方を含む)されて融合タンパク質を生成したものを包含する。この融合物は、必ずしも直接的なものである必要はないが、リンカー配列を介して生じるものであってよい。例えば、抗体を、特定の細胞表面受容体に特異的な抗体に融合するかまたは結合することにより、in vitroまたはin vivoで、特定の細胞型に対して異種ポリペプチドを標的化させるために、前記抗体を用いることができる。異種ポリペプチドに融合されるかまたは結合された抗体を、当業界で公知の方法を用いるin vitro免疫アッセイおよび精製方法において用いることもできる。例えば、国際公開WO 93/21232; EP 439,095; Naramuraら、1994, Immunol. Lett. 39: 91-99;米国特許第5,474,981号；Gilliesら、1992, PNAS 89:1428-1432;およびFellら、1991, J. Immunol. 146: 2446-2452(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。
【０１０３】
本発明はさらに、抗体フラグメントに融合されたかまたは結合された異種ポリペプチドを含む組成物を包含する。例えば、異種ポリペプチドを、Fabフラグメント、Fdフラグメント、Fvフラグメント、F(ab)2フラグメント、またはそれらの一部に融合するかまたは結合することができる。抗体の一部にポリペプチドを融合するかまたは結合する方法は当業界で公知である。例えば、米国特許第5,336,603号、5,622,929号、5,359,046号、5,349,053号、5,447,851号、および5,112,946号；EP 307,434；EP 367,166；国際公開WO 96/04388およびWO 91/06570; Ashkenaziら、1991, PNAS 88: 10535-10539; Zhengら、1995, J. Immunol. 154: 5590-5600;ならびにVilら、1992, PNAS 89: 11337-11341(前記参考文献はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。
【０１０４】
DNAシャッフリングを用いて、本発明の抗体またはそのフラグメントの活性を変化させることができる(例えば、より高い親和性およびより低い解離速度を有する抗体またはそのフラグメント)。一般的には、米国特許第5,605,793号；5,811,238号；5,830,721号；5,834,252号；および5,837,458号、ならびにPattenら、1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16:76; Hanssonら、1999, J. Mol. Biol. 287:265;ならびにLorenzoおよびBlasco, 1998, BioTechniques 24:308(これらの特許および刊行物の各々はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。抗体もしくはそのフラグメント、またはコードされた抗体もしくはそのフラグメントを、組換えの前に、エラープローンPCR、ランダムなヌクレオチド挿入または他の方法によるランダム突然変異誘発にかけることにより変化させることができる。
【０１０５】
さらに、前記抗体またはそのフラグメントを、ペプチドなどのマーカー配列に融合させて、精製を容易にすることができる。好ましい実施形態においては、マーカーアミノ酸配列は、特に、pQEベクター(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311)中に提供されるタグなどのヘキサ-ヒスチジンペプチドであり、その多くは商業的に入手可能である。Gentzら、1989, PNAS 86:821に記載のように、例えば、ヘキサ-ヒスチジンは前記融合タンパク質の便利な精製を提供する。精製にとって有用な他のペプチドタグとしては、限定されるものではないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに相当するヘマグルチニン「HA」タグ(Wilsonら、1984, Cell 37:767)および「フラッグ」タグが挙げられる。
【０１０６】
他の実施形態においては、本発明の方法により改変され、本発明の方法により作製された抗体、またはそのフラグメントもしくは変異体を、診断剤または検出可能な薬剤に結合することができる。そのような抗体は、特定の治療の有効性の決定などの、臨床試験手順の一部として、癌の発達もしくは進行をモニターするかまたは予知するのに有用であり得る。そのような診断および検出を、限定されるものではないが、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、もしくはアセチルコリンエステラーゼなどの様々な酵素；限定されるものではないが、ストレプトアビジン／ビオチン、およびアビジン／ビオチンなどの補欠分子団；限定されるものではないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドもしくはフィコエリトリンなどの蛍光物質；限定されるものではないが、ルミノールなどのルミネッセンス物質；限定されるものではないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなどの生物発光物質；限定されるものではないが、ビスマス(213Bi)、炭素(14C)、クロム(51Cr)、コバルト(57Co)、フッ素(18F)、ガドリニウム(153Gd、159Gd)、ガリウム(68Ga、67Ga)、ゲルマニウム(68Ge)、ホルミウム(166Ho)、インジウム(115In、113In、112In、111In)、ヨウ素(131I、125I、123I、121I)、ランタン(140La)、ルテニウム(177Lu)、マンガン(54Mn)、モリブデン(99Mo)、パラジウム(103Pd)、リン(32P)、プラセオジミウム(142Pr)、プロメチウム(149Pm)、レニウム(186Re、188Re)、ロジウム(105Rh)、ルテミウム(97Ru)、サマリウム(153Sm)、スカンジウム(47Sc)、セレニウム(75Se)、ストロンチウム(85Sr)、硫黄(35S)、テクネチウム(99Tc)、タリウム(201Ti)、スズ(113Sn、117Sn)、トリチウム(3H)、キセノン(133Xe)、イッテルビウム(169Yb、175Yb)、イットリウム(90Y)、亜鉛(65Zn)などの放射活性物質；種々の陽電子放出トモグラフィーを用いる陽電子放出金属、ならびに非放射性常磁性金属イオンなどの検出可能な物質に、前記抗体を結合させることにより達成することができる。
【０１０７】
本発明はさらに、治療剤に結合された本発明の改変された抗体またはそのフラグメントの使用を包含する。
【０１０８】
抗体またはそのフラグメントを、細胞毒素、例えば、細胞増殖抑制剤もしくは殺細胞剤、治療剤もしくは放射活性金属イオン、例えば、α放射体などの治療成分に結合することができる。細胞毒素または細胞傷害剤としては、細胞にとって有害な任意の薬剤が挙げられる。例としては、パクリタキセル、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、エピルビシン、およびシクロホスファミドならびにその類似体または相同体が挙げられる。治療剤としては、限定されるものではないが、代謝拮抗剤(例えば、メトトレキサート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン)、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BCNU)およびロムスチン(CCNU)、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、ならびにシスジクロロジアミン白金(II)(DDP)シスプラチン)、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン(以前はダウノマイシンと呼ばれた)およびドキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(以前はアクチノマイシンと呼ばれた)、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン(AMC))、ならびに分裂抑制剤(例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン)が挙げられる。
【０１０９】
さらに、抗体またはそのフラグメントを、所与の生物学的応答を改変する治療剤または薬剤成分に結合させることができる。治療剤または薬剤成分は、古典的な化学的治療剤に限定されるものとして解釈されるべきではない。例えば、この薬剤成分は所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってよい。そのようなタンパク質としては、例えば、アブリン、リシンA、オンコナーゼ(もしくは別の細胞傷害性RNase)、シュードモナス外毒素、コレラ毒素、もしくはジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、α-インターフェロン、β-インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス剤、例えば、TNF-α、TNF-β、AIM I(国際公開WO 97/33899を参照)、AIM II(国際公開WO 97/34911を参照)、Fasリガンド(Takahashiら、1994, J. Immunol., 6:1567)、およびVEGI(国際公開WO 99/23105を参照)、血栓剤もしくは抗血管新生剤、例えば、アンギオスタチンもしくはエンドスタチンなどのタンパク質；または、例えば、リンホカイン(例えば、インターロイキン-1(「IL-1」)、インターロイキン-2(「IL-2」)、インターロイキン-6(「IL-6」)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(「GM-CSF」)、および顆粒球コロニー刺激因子(「G-CSF」) 、もしくは増殖因子(例えば、成長ホルモン(「GH」))などの生物反応修飾物質が挙げられる。
【０１１０】
さらに、抗体を、放射性金属イオンを結合させるのに有用な放射活性物質または大環状キレート剤などの治療成分に結合させることができる(放射活性物質の例については上記を参照されたい)。特定の実施形態においては、前記大環状キレート剤は、リンカー分子を介して前記抗体に結合させることができる1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N'',N''-四酢酸(DOTA)である。そのようなリンカー分子は当業界では一般的に知られており、Denardoら、1998, Clin Cancer Res. 4:2483-90; Petersonら、1999, Bioconjug. Chem. 10:553;およびZimmermanら、1999, Nucl. Med. Biol. 26:943-50(各々その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に記載されている。
【０１１１】
治療成分を抗体に結合させるための技術は周知であり、例えば、Arnonら、「癌治療における薬剤の免疫標的化のためのモノクローナル抗体(Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy)」、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeldら(編)、pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstromら、「薬剤送達のための抗体(Antibodies For Drug Delivery)」、Controlled Drug Delivery(第2版)、Robinsonら(編)、pp. 623-53(Marcel Dekker, Inc. 1987)；Thorpe、「癌治療における細胞傷害剤の抗体担体：総論(Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review)」、Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pincheraら(編)、pp. 475-506(1985); 「癌治療における放射標識抗体の治療的使用の分析、結果、および有望な将来(Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabelled Antibody In Cancer Therapy)」、Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwinら(編)、pp. 303-16(Academic Press 1985)、ならびにThorpeら、1982, Immunol. Rev. 62:119-58を参照されたい。
【０１１２】
あるいは、抗体を第2の抗体に結合させて、米国特許第4,676,980号(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)においてSegalにより記載されたような抗体ヘテロコンジュゲートを形成させることができる。
【０１１３】
抗体は固相支持体に結合させることもでき、これは標的抗原の免疫アッセイまたは精製にとって特に有用である。そのような固相支持体としては、限定されるものではないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、塩化ポリビニルまたはポリプロピレンが挙げられる。
【実施例】
【０１１４】
ここで、本発明を以下の実施例を参照して説明する。これらの実施例は、単に例示の目的で提供されるものであり、本発明はこれらの実施例により限定されるものとして解釈されるべきではなく、むしろ本明細書に提供される教示の結果として明らかとなる任意の、および全ての変更を包含するものと解釈されるべきである。
【０１１５】
実施例1
種々の抗体構築物の作製および発現
6種のヒト化モノクローナル抗体(G5、10D3、12G3、1E11、4C10、4B11)および1種のヒト／マウスキメラ抗体(EA5)を、共通の抗原EphA2に対して作製した。これらの抗体は全て、哺乳動物細胞においてはほとんど発現されなかった(表3を参照)。哺乳動物細胞中でよく発現される、別のヒト化抗体MEDI-522(表3を参照)も、これらの研究において用いた。位置40、60および／または61での1個以上の重鎖置換をこれらの抗体のそれぞれにおいて作製して、これらの位置での1個以上の好ましいアミノ酸残基の存在による生産性に対する効果を決定した。6種のヒト化抗体は、位置H40にアラニンを含んでおり、これらの抗体を、それぞれ位置H60およびH61においてアラニンおよびアスパラギン酸で置換した。最後のヒト化抗体MEDI-522は、H40およびH61の両方に好ましいアミノ酸を有しており、ここで位置H60をアラニンに置換した。同じ抗原に対するキメラ抗体EA5は、位置H40、H60またはH61に好ましいアミノ酸をいずれも含んでいなかった。一方は位置60および61に置換を含み、他方は位置H40、H60およびH61に置換を含む2つの別々の重鎖をEA5について作製した。改変された重鎖の具体的なアミノ酸残基(図1Bを参照)を以下に記載する。全ての事例において、位置40、60および61での1個以上の好ましい重鎖残基をもたらす置換は生産性の改善をもたらした(表3を参照)。興味深いことに、好ましいアミノ酸を含まないEA5の場合、重鎖A60/D61の組合せ(EA5/M'配列番号31)はそれだけで生産量が有意に増加した。
【０１１６】
材料および方法
抗原特異的抗体の作製、特性評価およびクローニング：
抗体を作製し、スクリーニングし、クローニングし、および発現させるための一般的な方法は当業者には公知である。例えば、Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubelら(編)、John Wiley & Sons (Chichester, England, 1998); Molecular Cloning: A Laboratory Manual(第3版), J. Sambrookら(編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY, 2001); Antibodies: A Laboratory Manual, E. HarlowおよびD. Lane(編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY, 1988)；およびUsing Antibodies: A Laboratory Manual, E. HarlowおよびD. Lane(編)、Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Spring Harbor, NY, 1999)(これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。
【０１１７】
重鎖置換の作製：
抗体クローンG5、10D3、12G3、1E11、4C10、4B11、MEDI522およびEA5の軽鎖の可変領域(それぞれ、配列番号1〜8)ならびに抗体クローンG5、10D3、12G3、1E11、4C10、4B11、MEDI522およびEA5の重鎖の可変領域(それぞれ、配列番号9〜16)を、ヒトサイトメガロウイルス主要即時型初期(hCMVie)エンハンサー、プロモーターおよび5'非翻訳領域(Boshartら、1985, Cell 41: 521-30)をコードする哺乳動物発現ベクター中に個別にクローニングした。この系においては、ヒトγ1鎖はヒトκ鎖と共に分泌される(Johnsonら、1997, J. Infect. Dis. 176: 1215-24)。この重鎖置換は全て、Quick Change Multi Mutagenesis Kit (Stratagene, CA)を、製造業者の使用説明書に従って用いる部位特異的突然変異誘発により導入されたものである。具体的には、S60A/A61Dを、プライマー：5'-ACACAACAGAGTACGCTGACTCTGTGAAGGGTAGAGTCACCATT-3'(配列番号17)を用いて、クローンG5、10D3、12G3、1E11、4C10および4B11中に導入した。これにより重鎖抗体クローンG5/M、10D3/M、12G3/M、1E11/M、4C10/Mおよび4B11/M(配列番号24〜29)を作製した。L60Aを、プライマー：5'-GGTGGTGGTAGCACCTACTATGCAGACACTGTGCAGGGCCGATTCACC-3'(配列番号18)および5'-GGTGAATCGGCCCTGCACAGTGTCTGCATAGTAGGTGCTACCACCACC-3'(配列番号19)を用いてMEDI522中に導入して、MEDI522/M(配列番号30)を作製した。N60A/Q61Dを、プライマー：5'-GTTACAATGGTGTTACTAGCTACGCCGACAAGTTCAAGGGCAAGGCCAC-3'(配列番号20)および5'-GTGGCCTTGCCCTTGAACTTGTCGGCGTAGCTAGTAACACCATTGTAAC-3'(配列番号21)を用いてEA5中に導入して、EA5/M'(配列番号31)を作製した。そしてS40A/N60A/Q61Dを、プライマー：5'-CTACATGCACTGGGTCAAGCAGGCCCATGGAAAGAGCCTTGAG-3'(配列番号22)、5'-CTCAAGGCTCTTTCCATGGGCCTGCTTGACCCAGTGCATGTAG-3'(配列番号23)、5'-GTTACAATGGTGTTACTAGCTACGCCGACAAGTTCAAGGGCAAGGCCAC-3'(配列番号20)および5'-GTGGCCTTGCCCTTGAACTTGTCGGCGTAGCTAGTAACACCATTGTAAC-3'(配列番号21)を用いてEA5中に導入して、EA5/M(配列番号32)を作製した。その軽鎖は変化しないままであり、依然として配列番号1〜8により表されることに留意されたい(図1A)。この配列をABI3100配列決定装置を用いて確認した。次いで、ヒト胚性腎臓(HEK)293細胞を、リポフェクタミンおよび標準的なプロトコルを用いて、35 mmの6ウェルディッシュ中で種々の抗体構築物を用いて一過性トランスフェクトした。上清を、トランスフェクションの72時間および144時間後の2回、採取した(それぞれ、1回目および2回目の採取と呼ぶ)。次いで、分泌された、可溶性のヒトIgG1を生産量および元の抗原への結合に関してアッセイした(以下を参照)。
【０１１８】
発現量の測定
抗体クローンG5、G5/M、10D3、10D3/M、12G3、12G3/M、1E11、1E11/M、4C10、4C10/M、4B11および4B11/Mutの発現量をELISAにより測定した。3日間隔で2回回収されたトランスフェクション上清(上記を参照)を、抗ヒトIgG ELISAを用いて抗体産生についてアッセイした。簡単に述べると、ヤギ抗ヒトIgGで被覆した96ウェルのBiocoatプレート(BD Biosciences, San Jose, CA)の個々のウェルを、サンプル(上清)または標準物(ヒトIgG、0.5〜100 ng/ml)と共にインキュベートした後、ヤギ抗ヒトIgG抗体の西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲートと共にインキュベートした。3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンを用いてペルオキシダーゼ活性を検出し、その反応を0.2 M H2SO4でクエンチした。プレートを450 nmで読み取った。その結果を表3にまとめる。
【表３】
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【０１１９】
実施例2
改変抗体の結合特性の分析
2つの重鎖置換(位置60Hおよび61H；Kabatの番号付け)はKabatにより定められるCDRの範囲内に含まれるため、置換された抗体の全体的な結合特性が変化している可能性があった。注目すべきことに、この改変は、6つの抗体の各々について、その結合特異性を有意に変化させることなく収量を改善した(図2A-Cを参照)。2つの改変抗体を、より広範な分析のために選択した。驚くべきことに、一方の結合定数は少なくとも20％改善したが、他方は実質的に未変化のままであった(表4を参照)。
【０１２０】
材料および方法
BIAcore分析による結合特異性：
固定化されたEphA2-Fcまたはαvβ3と、クローンG5、G5/M、10D3、10D3/M、12G3、12G3/M、1E11、1E11/M、4C10、4C10/M、4B11および4B11/M(図2A)、EA5/EA5M'(図2B)ならびにMEDI522/MEDI522M(図2C)に対応するIgGを含有するトランスフェクション上清との相互作用に加えて、無関係な抗体が含まれていた。この抗体を、BIAcore 3000装置(Pharmacia Biosensor, Uppsala, Sweden)を用いて表面プラスモン共鳴検出によりモニターした。EphA2-Fcおよびαvβ3は、それぞれ図2Aおよび2Bに、EphA2-Fcについて4539 RUおよび4995 RUの表面密度で、記載のようにして(Johnsonら、1991, Anal. Biochem. 198:268-77)アミンカップリングキットを用いて、CM5センサーチップ(Pharmacia Biosensor)のデキストランマトリックスに結合させた。αvβ3は4497 RUの表面密度で結合させた(図2C)。250μlの各トランスフェクション上清(図2A中のものについては2回目のトランスフェクション、2回目の採取、図2B-C中のものについては2回目のトランスフェクション、1回目の採取)を、それぞれの表面上に注入した。全ての結合実験を、75μL／分の流速で25℃にて行った。データを約20分間収集し、1回の1M NaCl、50 mM NaOHの1分間のパルスを用いて、前記表面を再生させた。全ての抗体に関する結合データを図2A-2Cに示す。
【０１２１】
BIAcoreによる反応速度論的分析
可溶性12G3、4C10、12G3/Mutおよび4C10/Mutと、固定化EphA2-Fcとの相互作用を、BIAcore 3000装置(Pharmacia Biosensor, Uppsala, Sweden)を用いる表面プラスモン共鳴検出によりモニターした。EphA2-Fcを、162 RUの表面密度で、記載(Johnssonら、上掲)のようにしてアミンカップリングキットを用いてCM5センサーチップ(Pharmacia Biosensor)のデキストランマトリックスに結合させた。IgGを、0.15 M NaCl, 3 mM EDTAおよび0.005％ P20を含む0.01 M HEPES pH 7.4中に希釈した。その後の希釈物は全て、同じバッファー中に調製した。全ての結合実験を、75μL／分の流速で、典型的には100 nM〜0.2 nMの範囲のIgG濃度を用いて25℃にて行った。データを約20分間収集し、1回の1 M NaCl、50 mM NaOHの1分間のパルスを用いて前記表面を再生した。また、IgGを、非被覆細胞上に流し、これらのブランク泳動に由来するセンサーグラムを、EphA2-Fcが結合したチップを用いて得られたものから差し引いた。データを1：1 Langmuir結合モデルに適合させた。このアルゴリズムは、KonおよびKoffの両方を算出し、見かけの平衡解離定数KDを、2つの速度定数の比率(Koff/Kon)として推定する。そのデータを表4に提供する。
【表４】
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【０１２２】
考察
組換え抗体の作製および生産が進歩したにも拘らず、所与の抗体の発現レベルは期待外れであることが多い。抗体重鎖のアミノ酸配列を直接改変することにより任意の抗体の生産性を増加させるための再現性のある方法は、いくつかの治療用抗体の製造についても大幅な利点を有するであろう。
【０１２３】
本発明者らは、1〜3個の重鎖残基の特定の置換が、前記抗体の生産性の劇的な増加をもたらし、生産量の改善をもたらすことを初めて証明した。驚くべきことに、これらの同じ3個の置換は、7種の異なる抗体の生産性を再現性をもって改善したが、これは、これらの3個の重鎖残基が何であるかが抗体の生産性にとって重要であることを示している。さらに、本発明者らは、これらの重鎖残基の置換が、改変された抗体の抗原結合を悪く変化させず、抗原結合特性の改善さえもたらすことができることを示す。さらに、本発明者らは、位置H40、H60およびH61での特定の好ましいアミノ酸残基の存在が、ヒト化抗体およびヒト-マウスキメラ抗体などの複数の起源に由来する可変ドメインを含む抗体の生産性を増加させることを示す。同時に、これらの結果は、抗体の生産性を改善するための、位置40、60および61での1個以上の重鎖残基の特定の置換、または特定の遺伝子操作が幅広く適用可能であり、これを用いて実質的にいずれの抗体の収量をも増加させることができることを実証している。
【０１２４】
本明細書で引用される各々および全ての特許、特許出願、ならびに刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。さらに、2004年6月25日に出願された米国仮出願第60/583,184号および2004年11月2日に提出された同第60/624,153号の開示はあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０１２５】
本発明を特定の実施形態を参照して開示してきたが、当業者であれば、本発明の他の実施形態および変更を、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく考え付くことができることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのような実施形態および等価な変更を全て含むと解釈されるべきであると意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１Ａ】図1は、本発明の種々の抗体の軽鎖(VL)(A)および重鎖(VH)(B)の可変領域のアミノ酸配列である。影付き：位置40H、60Hおよび61H(Kabatの番号付け)。囲み：CDR(Kabatの定義)。各配列は、A40/A60/D61のアミノ酸の組合せが対応する重鎖中に存在する場合、その名称の後ろに「/M」を付けた表記で特定される。注：EA5/M'については、位置A60/D61のみが存在する。
【図１Ｂ】図1は、本発明の種々の抗体の軽鎖(VL)(A)および重鎖(VH)(B)の可変領域のアミノ酸配列である。影付き：位置40H、60Hおよび61H(Kabatの番号付け)。囲み：CDR(Kabatの定義)。各配列は、A40/A60/D61のアミノ酸の組合せが対応する重鎖中に存在する場合、その名称の後ろに「/M」を付けた表記で特定される。注：EA5/M'については、位置A60/D61のみが存在する。
【図２Ａ】図2は、BIAcore 1000装置を用いる表面プラスモン共鳴検出により測定された本発明の抗体の結合特異性である。抗体G5、1E11、4C10、10D3、12G3および4B11ならびに対応する置換抗体に関する結果をパネルAに示し、一方、EA5、MEDI-522およびそれらの対応する置換抗体に関する結果をそれぞれパネルBおよびCに示す。
【図２Ｂ】図2は、BIAcore 1000装置を用いる表面プラスモン共鳴検出により測定された本発明の抗体の結合特異性である。抗体G5、1E11、4C10、10D3、12G3および4B11ならびに対応する置換抗体に関する結果をパネルAに示し、一方、EA5、MEDI-522およびそれらの対応する置換抗体に関する結果をそれぞれパネルBおよびCに示す。
【図２Ｃ】図2は、BIAcore 1000装置を用いる表面プラスモン共鳴検出により測定された本発明の抗体の結合特異性である。抗体G5、1E11、4C10、10D3、12G3および4B11ならびに対応する置換抗体に関する結果をパネルAに示し、一方、EA5、MEDI-522およびそれらの対応する置換抗体に関する結果をそれぞれパネルBおよびCに示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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