(57)【要約】  本発明は、基質、例えば、ペプチド、糖ペプチド、脂質などと、水溶性ポリマー、治療的部分または生体分子などの修飾基を担持する修飾糖断片との間の結合体を提供する。該結合体は、間に置かれ、該基質および修飾基に共有結合しているグリコシル結合基への活性化修飾糖断片の酵素的変換を介して結合している。該結合体は、糖転移酵素、例えば、グリコシルトランスフェラーゼの作用によって基質から形成される。例えば、該基質がペプチドである場合、該酵素は、修飾糖断片部分を、該ペプチドのアミノ酸残基またはグリコシル残基に結合する。該結合体を含む製薬製剤もまた提供する。該結合体の調製方法もまた本発明の範囲内に入る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2008526864.tif 000066
によって表される部分を含んでなる化合物であって、
式中、
Ｘ１は、置換または非置換アルキル、ＯおよびＮＲ８から選択されるメンバーであり、
Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであり；
Ｙは、ＣＨ２、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２、ＣＨ、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨまたはＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ、ＣＨ（ＯＨ）、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）、およびＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）から選択されるメンバーであり；
Ｙ２は、置換または非置換アルキル、Ｒ６、置換または非置換ヘテロアルキル
【化２】
2008526864.tif 000067
から選択されるメンバーであり；
Ｒ６およびＲ７は、Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｒ６ｂ、−Ｌａ−Ｒ６ｂ、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから独立して選択されるメンバーであり；
Ｌａは、結合およびリンカー基から選択されるメンバーであり；および
Ｒ６ｂは、ＨおよびＲ６ａから選択されるメンバーであり；
Ｒ６ａは、修飾基であり、
Ｒ１は、ＯＲ９、ＮＲ９Ｒ１０、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであり、
Ｒ９およびＲ１０は、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキル、およびＣ（Ｏ）Ｒ１１から独立して選択されるメンバーであり、
Ｒ１１は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリールおよび置換または非置換ヘテロシクロアルキルから選択され；
Ｒ２は、ヌクレオチド、活性部分、ぺプチドのアミノ酸残基、ぺプチドのアミノ酸残基に結合した炭水化物部分、少なくとも第２の炭水化物部分を含んでなるリンカーを介してぺプチドのアミノ酸残基に結合した炭水化物部分から選択されるメンバーであり；
Ｒ３は、Ｈ、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであり；
Ｒ３’およびＲ４は、Ｈ、ＯＨ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルおよびＮＨＣ（Ｏ）Ｒ１２から独立して選択されるメンバーであり；
Ｒ１２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換ヘテロシクロアルキルおよびＮＲ１３Ｒ１４から選択されるメンバーであり；
Ｒ１３およびＲ１４は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルから独立して選択されるメンバーである、化合物。
【請求項２】
Ｙ２が、少なくとも１つの修飾基を含んでなる請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ３’が、Ｈである請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ６およびＲ７の少なくとも１つが、修飾基を含んでなる請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
前記修飾基が、線状および分枝状ポリ（エチレングリコール）から選択されるメンバーである請求項２に記載の化合物。
【請求項６】
前記ＰＥＧ部分が、線状ＰＥＧであり、前記線状ＰＥＧが、以下の式：
【化３】
2008526864.tif 000068
で表される構造を有し、
式中、
Ｒ１８は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、例えば、アセタール、ＯＨＣ−、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−、ＨＳ−ＣＨ２ＣＨ２−、および−（ＣＨ２）ｑＣ（Ｙ１）Ｚ２；−糖−ヌクレオチド、およびタンパク質から選択されるメンバーであり；
ｃは、１〜２５００から選択される整数であり；
ｄ、ｏおよびｑは、０〜２０から独立して選択される整数であり；
Ｚは、ＯＨ、ＮＨ２、ハロゲン、Ｓ−Ｒ１９、活性化エステルのアルコール部分、−（ＣＨ２）ｄｌＣ（Ｙ３）Ｖ、−（ＣＨ２）ｄｌＵ（ＣＨ２）ｇＣ（Ｙ３）Ｖ、糖−ヌクレオチド、タンパク質、および脱離基、例えば、イミダゾール、ｐ−ニトロフェニル、ＨＯＢＴ、テトラゾール、およびハロゲン化物から選択されるメンバーであり；
Ｘ、Ｙ１、Ｙ３、ＷおよびＵは、Ｏ、Ｓ、Ｎ−Ｒ２０から独立して選択され；
Ｖは、ＯＨ、ＮＨ２、ハロゲン、Ｓ−Ｒ２１、活性化エステルのアルコール構成要素、活性化アミドのアミン構成要素、糖−ヌクレオチド、およびタンパク質から選択されるメンバーであり；
ｄｌ、ｇおよびｖは、０〜２０から独立して選択される整数であり；および
Ｒ１９、Ｒ２０およびＲ２１は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロシクロアルキルおよび置換または非置換ヘテロアリールから独立して選択される、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
前記線状ＰＥＧが、前記ぺプチドのアミノ酸残基に結合した炭水化物部分、少なくとも第２の炭水化物部分を含んでなるリンカーを介して前記ぺプチドのアミノ酸残基に結合した炭水化物部分から選択されるメンバーに結合される請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
前記部分が、式Ｖ：
【化４】
2008526864.tif 000069
で表される構造を有し、
Ｌａは、結合、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるリンカーであり；
Ｒ１６およびＲ１７は、独立して選択されたポリマーアームであり；
Ｘ２およびＸ４は、ポリマー部分Ｒ１６およびＲ１７をＣに結合させる独立して選択された結合断片であり；および
Ｘ５は、非反応性基である、請求項５に記載の化合物。
【請求項９】
式：
【化５】
2008526864.tif 000070
で表される請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｙ２が、Ｎ（Ｒ６）−Ｌａ−（ｍ−ＰＥＧ）ｓであり、
Ｌａは、アミノ酸残基およびペプチジル残基から選択されるメンバーであるリンカー部分であり；
ｓは、１から３の整数である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
修飾糖断片と、グリコシル化または非グリコシル化ペプチドとの間の共有結合を形成する方法であって、前記修飾糖断片を、活性化修飾糖断片から前記ペプチド上の受容体部分に酵素的に移すことを含んでなる方法。
【請求項１２】
前記修飾糖断片が、前記ペプチドに共有結合されたグリコシル残基に共有結合される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記修飾糖断片が、前記ペプチドのアミノ酸残基に共有結合される請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素が、シアリルトランスフェラーゼ、トランス−シアリダーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、およびマンノシルトランスフェラーゼから選択されるメンバーであるグリコシルトランスフェラーゼである請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記グリコシルトランスフェラーゼが、組換え体である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法が、無細胞環境下で実施される請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
製薬的に許容できる担体と、グリコシル化または非グリコシル化ペプチドに共有結合された修飾糖断片を含んでなる結合体とを含んでなる製薬組成物。
【請求項１８】
ペプチドと修飾糖断片との間の結合体を形成する組成物であって、前記組成物が活性化修飾糖断片、前記活性化修飾糖断片が基質である酵素、およびペプチド受容体基質の混合物を含んでなり、前記修飾糖断片が、水溶性ポリマー、治療的部分および生体分子から選択されるメンバーに共有結合されている、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、全ての目的に関して参照としてその全体が援用されている、２００５年１月６日出願の米国仮特許出願第６０／６４１，９５６号明細書に関連している。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、生体関連基質（例えば、グリコシル化または非グリコシル化ペプチドまたは脂質）と修飾基を含む糖断片（「修飾断片」）との間に形成される結合体に関する。該基質と修飾断片は、該修飾断片と該基質上の受容体部分との間に酵素的に形成された結合を通して結合している。
【背景技術】
【０００３】
背景
特定の生理的応答を生じさせるためのグリコシル化および非グリコシル化治療薬の投与は医薬業界でよく知られている。例えば、ｈＧＨ欠損による病態および疾患、例えば、小児の小人症の治療に、精製および組換え双方のｈＧＨが用いられている。インターフェロンは公知の抗ウィルス活性を有しており、顆粒球コロニー刺激因子は白血球の産生を促進する。
【０００４】
治療用ペプチドの使用を制限してきた主要な因子は、野生型ペプチドのグリコシル化パターンを有するペプチドを発現させる発現系操作の固有の難しさである。不適切にまたは不完全にグリコシル化されたペプチドは、免疫原性になり得；患者において、投与されたペプチドに対する免疫原性応答が該ペプチドを中和し得、および／または患者にアレルギー性応答の発現を導き得る。組換え生産された糖ペプチドの他の欠損としては、効力が最適以下であることおよびクリアランス速度の高さが挙げられる。ペプチド治療薬に固有の問題は当業界で認識されており、これらの問題を解消する種々の方法が研究されてきた。
【０００５】
発現後インビトロ修飾は、グリカン構造の修飾または新規部位へのグリカンの導入双方を含む発現系ペプチドの操作によるグリコシル化制御に依存する方法の欠陥を修正する魅力的な戦略である。組換え真核生物グリコシルトランスフェラーゼの包括的ツールボックスが入手可能になってきており、慣例的にデザインされたグリコシル化パターンおよびグリコシル構造を有する哺乳動物の糖結合体をインビトロ酵素的に合成することが可能になりつつある。例えば、米国特許第５，８７６，９８０号明細書；第６，０３０，８１５号明細書；第５，７２８，５５４号明細書；第５，９２２，５７７号明細書；ならびに国際公開第９８／３１８２６号パンフレット；米国特許出願公開第２００３１８０８３５号明細書；および国際公開第０３／３１４６４号パンフレットを参照されたい。
【０００６】
酵素ベースの合成は、位置選択性および立体選択性の利点を有する。さらに、酵素的合成は非保護基質を用いて実施される。炭水化物の合成には、２つの主要な酵素クラス、グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、シアリルトランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）、およびグリコシダーゼが用いられる。グリコシダーゼはさらに、エキソグリコシダーゼ（例えば、β−マンノシダーゼ、β−グルコシダーゼ）とエンドグリコシダーゼ（例えば、Ｅｎｄｏ−Ａ、Ｅｎｄｏ−Ｍ）に分類される。これらのクラスの酵素の各々が、炭水化物の調製のため、首尾よく合成的に用いられている。全般的なレビューに関しては、クラウト（Ｃｒｏｕｔ）ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：９８−１１１頁（１９９８）を参照されたい。
【０００７】
グリコシルトランスフェラーゼは、糖ペプチド上のオリゴ糖構造を修飾する。グリコシルトランスフェラーゼは、立体化学および位置化学の良好に制御された特定の生成物の製造に有効である。グリコシルトランスフェラーゼは、特に、哺乳動物細胞において産生される糖ペプチド上のオリゴ糖の調製、および末端Ｎ結合およびＯ結合の炭水化物構造の修飾に用いられている。例えば、糖ペプチドの末端オリゴ糖は、完全にシアリル化および／またはフコシル化されて、より一貫性のある糖構造を提供し、糖ペプチドの薬物動態および他の種々の生物学的性質を改善している。例えば、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、炭水化物の合成におけるグリコシルトランスフェラーゼ利用の一例であるラクトサミンの合成に用いられた（例えば、ウォン（Ｗｏｎｇ）ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４７：５４１６−５４１８頁（１９８２）を参照）。さらに、シアル酸をシチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸からガラクトースの３−ＯＨまたは６−ＯＨに転移させるために、多数の合成手法がα−シアリルトランスフェラーゼを利用している（例えば、ケビン（Ｋｅｖｉｎ）ら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２：１３５９−１３６２頁（１９９６）を参照）。フコシルトランスフェラーゼは、フコースユニットを、グアノシン−５’−ジホスホフコースから糖受容体の特定のヒドロキシルへ転移するために、合成経路において用いられる。例えば、イチカワ（Ｉｃｈｉｋａｗａ）は、クローン化フコシルトランスフェラーゼを用いた、シアリル化ラクトサミンのフコシル化を含む方法によるシアリルルイス−Ｘを調製した（イチカワ（Ｉｃｈｉｋａｗａ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２８３−９２９８頁（１９９２））。治療に使用するための糖結合体合成における最近の発展の検討に関しては、ケラー（Ｋｏｅｌｌｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：８３５−８４１頁（２０００）を参照されたい。また、米国特許第５，８７６，９８０号明細書；第６，０３０，８１５号明細書；第５，７２８，５５４号明細書；第５，９２２，５７７号明細書；および国際公開第９８／３１８２６号パンフレットを参照されたい。
【０００８】
糖の調製には、グリコシダーゼもまた使用できる。グリコシダーゼは通常、グリコシド結合の加水分解を触媒する。しかし、適切な条件下では、これらをこの結合の形成のために使用できる。炭水化物の合成に使用される多くのグリコシダーゼはエキソグリコシダーゼであり；グリコシルの転移は、基質の非還元末端に生じる。グリコシダーゼはグリコシル−酵素中間体のグリコシル供与体を取り上げるが、これは、水によって妨げられて加水分解産物を与えるか、または受容体によって妨げられて、新たなグリコシドもしくはオリゴ糖を与える。エキソグリコシダーゼを用いる典型的な経路は、β−マンノシダーゼの作用により形成された困難なβ−マンノシド結合を含む、全てのＮ結合糖ペプチドのコアの三糖の合成である（シング（Ｓｉｎｇｈ）ら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．９９３−９９４頁（１９９６））。
【０００９】
グリコシド結合形成のためにグリコシダーゼを用いる他の典型的な適用において、変異グリコシダーゼが調製されるが、ここでは、活性部位内の通常の求核性アミノ酸が非求核性アミノ酸に変換される。該変異酵素は、グリコシド結合を加水分解しないが、それらを形成することはできる。変異グリコシダーゼは、α−グリコシルフルオリド供与体およびグリコシド受容体分子を用いてオリゴ糖を調製するために用いられる（ウィザース（Ｗｉｔｈｅｒｓ）ら、米国特許第５，７１６，８１２号明細書）。変異グリコシダーゼは遊離オリゴ糖の形成に有用ではあるが、このような酵素はグリコシル化または非グリコシル化ペプチド上にグリコシル供与体を付加することもできないし、これらの酵素が非活性化グリコシル供与体と共に用いられることもなかった。
【００１０】
エキソグリコシダーゼの利用よりは一般的でないが、エンドグリコシダーゼもまた、炭水化物の調製に利用できる。エンドグリコシダーゼの利用に基づく方法は、単糖ではなくオリゴ糖が転移されるという利点を有する。オリゴ糖断片は、エンドＦ、エンドＭなどのエンドβ−Ｎ−アセチルグルコサミンを用いて基質に付加されている（ワング（Ｗａｎｇ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７：１９７５−１９７８頁）；およびハネダ（Ｈａｎｅｄａ）ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２９２：６１−７０頁（１９９６））。
【００１１】
炭水化物調製における使用に加えて、上記に検討した酵素は、糖ペプチドの合成に適用される。リボヌクレアーゼＢの均一糖形態の合成が出版されている（ウィッテＫ．（Ｗｉｔｔｅ  Ｋ．）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：２１１４−２１１８頁（１９９７））。リボヌクレアーゼＢの高マンノースコアは、該糖ペプチドをエンドグリコシダーゼＨで処理することによって開裂させた。この開裂は、２つのコアＧｌｃＮＡｃ残基の間に特異的に生じた。次いで、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびα−１，３−フコシルトランスフェラーゼＶの連続的使用により、均一タンパク質上の残りのＧｌｃＮＡｃアンカー部位上に、四糖シアリルルイスＸが酵素的に再築された。酵素的触媒ステップの各々は優れた収率で進行した。
【００１２】
化学的合成要素と酵素的合成要素双方を組み合わせる方法もまた知られている。例えば、ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）および共同研究者（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３０５：４１５−４２２（１９９８））は、エンドグリオシダーゼを用いて、糖ペプチド、グリコシル化ペプチドＴの化学酵素的合成を報告している。Ｎ−アセチルグルコサミニルペプチドは、純粋に化学的手段で合成された。引き続いて、該ペプチドはヒトトランスフェリン糖ペプチドのオリゴ糖によって酵素的に合成された。糖部分は、それをエンドβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによって処理することによって該ペプチドに付加した。得られたグリコシル化ペプチドは、ペプチドＴおよびＮ−アセチルグルコサミニルペプチドＴに比較して、安定性が高く、タンパク質分解に抵抗性であった。
【００１３】
レポーター基によりペプチド構造を修飾するためのグリコシルトランスフェラーゼの使用が開発されている。例えば、ブロスマー（Ｂｒｏｓｓｍｅｒ）ら（米国特許第５，４０５，７５３号明細書）は、シアル酸の蛍光標識化シチジンモノホスフェート（「ＣＭＰ」）誘導体の形成、ならびにシアリルトランスフェラーゼ活性に関する、および細胞表面、糖タンパク質およびガングリオシドの蛍光標識に関するアッセイにおける蛍光グリコシドの使用を開示している。グロス（Ｇｒｏｓｓ）ら（Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８６：１２７（１９９０））は、類似したアッセイを記載している。ビーン（Ｂｅａｎ）ら（米国特許第５，４３２，０５９号明細書）は、グリコシル化欠損タンパク質の再グリコシル化を利用して、グリコシル化欠損障害に関するアッセイを開示している。該欠損タンパク質は、蛍光標識ＣＭＰグリコシドにより再グリコシル化される。蛍光シアル酸誘導体の各々は、シアル酸の９位または通常アセチル化されているアミンのいずれかにおいて、蛍光部分によって置換される。蛍光シアル酸誘導体を用いる方法は、グリコシル化トランスフェラーゼまたは非グリコシル化もしくは不適切にグリコシル化された糖タンパク質の存在に関するアッセイである。該アッセイは、生物学的出所のサンプルにおける少量の酵素または糖タンパク質に対して実施される。修飾シアル酸を用いた、予備的規模および工業的規模でのグリコシル化または非グリコシル化ペプチドの酵素的誘導体化は開示も提案もされていない。
【００１４】
細胞表面によって提示されたグリコシル残基の変更による細胞表面の修飾に対して相当な努力が払われてきた。例えば、フクダ（Ｆｕｋｕｄａ）および共同研究者は、細胞表面に確定された構造のグリコシドを付加する方法を開発している。該方法は、多様なグリコシル基質を生み出すフコースおよびフコース類縁体を転移できるフコシルトランスフェラーゼの緩い基質特異性を利用している（ツボイ（Ｔｓｕｂｏｉ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２７２１３（１９９６））。
【００１５】
グリコシル化または非グリコシル化ペプチドを修飾するための、細胞表面を修飾する該方法は、細胞の不在下では適用されていない。さらに、ペプチド内への、予備形成された修飾グリコシル供与体部分の酵素的組み込みに、細胞表面修飾の方法は利用されない。また、工業的規模でのグリコシル修飾ペプチドの製造のために実用化された細胞表面修飾方法は無い。
【００１６】
酵素的方法はまた、糖ペプチド上のグリコシル残基を引き続く化学的合成に向けて活性化するためにも用いられている。グリコシル残基は典型的に、末端のガラクト−ス残基を対応するアルデヒドに変換するガラクトースオキシダーゼを用いて活性化される。引き続き該アルデヒドをアミン含有修飾基に結合させる。例えば、カサレス（Ｃａｓａｒｅｓ）ら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：１４２頁（２００１））は、組換えＭＨＣＩＩ−ペプチドキメラの酸化ガラクトース残基にドキソルビシンを結合させている。
【００１７】
ポリペプチド上のグリコシル基の構造操作に加えて、水溶性ポリマーなどの、１つまたは複数の非糖修飾基によって修飾されている糖ペプチドの調製における関心が大きくなっている。ポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）は、ポリペプチドに結合した典型的なポリマーである。ペプチド治療薬を誘導体化するためにＰＥＧを使用することにより、ペプチドの免疫原性の減少が示されている。例えば、米国特許第４，１７９，３３７号明細書（デイビス（Ｄａｖｉｓ）ら）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコールに結合させた酵素およびペプチドホルモンなどの非免疫原性ポリペプチドを開示している。１モルのポリペプチド当たり、１０モルから１００モルの間のポリマーが使用される。該結合体のインビボクリアランス時間は、ポリペプチドのそれに比較して延長されるが、生理学的活性の約１５％が保持されるのみである。したがって、循環半減期の延長効果は、ペプチド効力の劇的減少によって相殺される。
【００１８】
ペプチド活性の損失は、水溶性ポリマーの結合に利用された化学作用の非選択的性質に直接起因し得る。ペプチドに対するＰＥＧおよびその誘導体の付加の主要な様式は、ペプチドアミノ酸残基を介する非特異的結合である。例えば、米国特許第４，０８８，５３８号明細書は、ＰＥＧに共有結合した酵素の酵素的に活性なポリマー−酵素結合体を開示している。同様に、米国特許第４，４９６，６８９号明細書は、ＰＥＧまたはメトキシポリ（エチレングリコール）（「（ｍ−）ＰＥＧ」）などのポリマーと共有結合したα−１プロテイナーゼ阻害剤の複合体を開示している。アブチョウスキ（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ）ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：３５７８頁（１９７７））は、ウシ血清アルブミンのアミン基に対する（ｍ−）ＰＥＧの共有結合を開示している。米国特許第４，４１４，１４７号明細書は、インターフェロンをポリ（エチレン無水コハク酸）などのジカルボン酸の無水物に結合することにより、インターフェロンをより疎水性にする方法を開示している。ＰＣＴ国際公開第８７／０００５６号パンフレットは、インターフェロン−β、インターロイキン−２および免疫毒素などのタンパク質に対するＰＥＧおよびポリ（オキシエチル化）ポリオールの結合を開示している。欧州特許第１５４，３１６号明細書は、リンフォカインの少なくとも１つの第一級アミノ基に直接結合したＰＥＧを含有するＩＬ−２などの化学的に修飾したリンフォカインを開示し権利請求の対象としている。米国特許第４，０５５，６３５号明細書は、多糖などのポリマー物質に共有結合したタンパク質分解性酵素の水溶性複合体の製薬組成物を開示している。
【００１９】
ペプチドにＰＥＧを結合させる他の様式は、糖ペプチド上のグリコシル残基の非特異的酸化によるものである。酸化された糖は、ペプチドにＰＥＧ部分を結合させる座として利用される。例えば、Ｍ’チムクル（Ｍ’Ｔｉｍｋｕｌｕ）（国際公開第９４／０５３３２号パンフレット）は、糖タンパク質にＰＥＧを付加させるための、アミノ−ＰＥＧの利用を開示している。該グリコシル部分は対応するアルデヒドへとランダムに酸化され、これが引き続きアミノ−ＰＥＧへと結合される。
【００２０】
上記の方法の各々において、ポリ（エチレングリコール）は、ペプチド主鎖上の反応性残基に、ランダムで非特異的様式で付加される。治療用ペプチドの製造では、特異的に標識化された、特性化が容易な、本質的に均一な産物をもたらす誘導体化法を利用することが明らかに望ましい。特異的に標識化されたペプチドを調製する有望な経路は、ペプチド上に修飾糖部分を付加するグリコシルトランスフェラーゼなどの酵素の使用によるものである。
【００２１】
グリコシル残基はまた、ケトン基を有するように修飾されている。例えば、マハル（Ｍａｈａｌ）および共同研究者（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：１１２５頁（１９９７））は、天然の基質で通常はアセチル基によって占められている位置にケトン官能性を有するＮ−レブリノイルマンノサミン（「ＭａｎＬｅｖ」）を調製した。細胞をＭａｎＬｅｖによって処理することによって、ケトン基が細胞表面に組み込まれた。サクソン（Ｓａｘｏｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：２００７頁（２０００）；ハン（Ｈａｎｇ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：１２４２頁（２００１）；ヤレマ（Ｙａｒｅｍａ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３１１６８頁（１９９８）；およびチャーター（Ｃｈａｒｔｅｒ）ら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０：１０４９頁（２０００）もまた参照されたい。
【００２２】
ペプチドまたは糖ペプチドに修飾糖を特異的に結合させるための酵素的結合を利用する工業的に関連する方法に加えて、糖ペプチド上のグリコシル化の位置を制御および操作するための方法がきわめて望ましい。
【００２３】
炭水化物はいくつかの方法で糖ペプチドに付加されるが、その中で、アスパラギンに結合したＮならびにセリンおよびトレオニンに結合したムチンタイプのＯは、組換え糖タンパク質治療薬にもっとも関連性がある。タンパク質のグリコシル化開始の一決定因子は、一次的配列関係ではあるが、タンパク質領域およびコンホメーションなどの他の因子が役割を演じていることは明らかである。Ｎ結合グリコシル化はコンセンサス配列、ＮＸＳ／Ｔで生じ、ここでＸは、プロリン以外の任意のアミノ酸であり得る。
【００２４】
Ｏ結合グリコシル化は、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼ）と称される約２０個の同族酵素のファミリーによって開始される。Ｏ結合グリコシル化は、単一のコンセンサス配列に支配されているように見えないが、Ｏ結合グリコシル化を開始させるＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼ酵素の研究は、それらの受容体特異性が一次配列関係によって駆動されるという考えを支持している。これらの酵素の各々は、セリンおよびトレオニン残基に単一の単糖ＧａｌＮＡｃを転移するが、それらは異なるペプチド配列に転移する。ただし、それらは機能における重なりの程度が高いことを示している。各ＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼの基質特異性は、主に線状の短い受容体コンセンサス配列によって支配されていることが予想される。
【００２５】
最近、エステル結合した炭水化物−ペプチド結合体を製造する方法がデイビス（Ｄａｖｉｓ）（２００３年２月２０日に刊行された国際公開第０３／０１４３７１号パンフレット）に記載された。この刊行物において、プロテアーゼ（セリンプロテアーゼ）、リパーゼ、エステラーゼまたはアシラーゼなどの酵素の存在下、ビニルエステルアミノ酸基が炭水化物アシル受容体と反応している。しかし、この時点では、これらの条件下、他の基質、例えば、糖ペプチド、糖脂質が炭水化物アシル受容体に結合することは知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
本発明は、ペプチドおよび他の生体活性種、例えば、糖脂質、スフィンゴシン、セラミドなどのＮ結合またはＯ結合グリコシル化部位上に修飾グリコシル部分が結合する修飾治療種に対する必要性に応えるものである。本発明は、新規治療用結合体への経路を提供し、より安定で治療上有効な種に対する必要性に取り組んでいる。さらに、糖構造の酵素的合成に向けられた努力に関わらず、治療薬の修飾、例えば、水溶性ポリマー、治療的部分、生体分子などの修飾基を有するペプチド、糖ペプチドおよび脂質、のための工業的に実用的な代替方法に対する必要性は依然として残っている。修飾されたペプチドが治療薬または診断薬としての使用を増強させる性質を改善する方法は特に興味深い。本発明は、これらおよび他の必要を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
発明の簡単な概要
糖治療薬（例えば、糖ペプチドおよび糖脂質）は、治療薬の組換え生産のための魅力的な標的となっている。例えば、特定の炭水化物部分は、糖ペプチド治療薬の機能および好ましい薬理学的性質にとってしばしば不可欠である。しかし、大抵の強固な発現系の多くは、非ヒトグリコシル化パターンを有する糖ペプチドを生じる。不正確なグリコシル化により、不活性な、凝集化した、抗原性の、および／または好ましくない薬物動態を有するペプチドが生じ得る。したがって、生物学的に適切な炭水化物構造を有する糖ペプチドを産生することができる組換え発現細胞系を開発するために相当な努力が払われている。このアプローチは、費用、ならびにグリカン構造における不均一性および限界などの多数の短所によって阻まれている。
【００２８】
糖治療薬、例えば糖ペプチド、の発現後のインビトロ糖修飾は、グリカン構造の修飾または新規部位へのグリカンの導入双方を含む発現系の操作によるグリコシル化の制御に頼る方法の欠点を改善する魅力的な方法である。組換え真核生物グルコシルトランスフェラーゼの包括的ツールボックスが入手できるようになってきており、カスタムデザインされたグリコシル化パターンおよびグリコシル構造を有する糖結合体のインビトロ酵素的合成を可能にしている。例えば、米国特許第５，８７６，９８０号明細書；第６，０３０，８１５号明細書；第５，７２８，５５４号明細書；および第５，９２２，５７７号明細書；ならびに国際公開第９８／３１８２６号パンフレット；米国特許第０３／１８０８３５号明細書；および国際公開第０３／０３１４６４号パンフレットを参照されたい。
【００２９】
インビトログリコシル化は、糖タンパク質の組換え発現に比較して多くの利点を提供し、その中でも例として、グリコシル部分のカスタムデザインおよび高程度の均一性がある。糖治療薬の細菌による発現とグリコシル残基のインビトロ修飾（または配置）との組み合わせによって、伝統的な組換え発現技法よりも、外来性薬剤への曝露可能性の減少、製品の均一性増大、および費用の減少などの多数の利点が提供される。
【００３０】
ペプチドおよび脂質などの治療種の結合体を、再現性のある予測可能な様式で該結合体を提供する方法を用いて得ることが理想的である。さらに、該結合体の形成において、その修飾により、該治療種の有益な性質、例えば、活性、特異性、低抗原性、低毒性などが有害な影響を受けないように、治療種と修飾基との間の結合部位が選択されることが一般に好ましい。
【００３１】
本発明は、選択された基質（例えば、（糖）ペプチド、（糖）脂質など）のグリコシル残基、アミノ酸またはアグリコン部分と水溶性または水不溶性のポリマー、治療的部分または診断薬などの修飾基との間の結合体を形成する方法を提供する。本発明は、糖類、例えばシアル酸を、予測できる、再現性のある様式で酸化でき、第一級または第二級のヒドロキシル部分を、アルデヒドまたはケトンに変換できるという認識を利用している。カルボニル部分はアミン含有修飾基によって容易に修飾されてシッフ塩基を生じ、これは、対応するアミン修飾糖断片へと還元される。該断片はグリコシル部分を基質上へ転移することのできる１つまたは複数の酵素によって、基質として認識される。
【００３２】
典型的な一実施形態において、該修飾糖断片は、グリコシル供与体部分をグリコシル受容体へと転移する酵素にとっての基質である。典型的な一実施形態において、該酵素は、トランスフェラーゼ、例えば、該修飾断片を酵素媒介グリコシル化反応における糖供与体として利用するシアリルトランスフェラーゼである。他の実施形態において、該酵素は、エキソグリコシダーゼまたはエンドグリコシダーゼ、アミダーゼなどの分解系酵素の変異体である。
【００３３】
他の実施形態において、該修飾糖断片は、完全な糖残基に結合する。例えば、ガラクトースへのＳｉａ＊−（修飾基）の結合により、Ｇａｌ−Ｓｉａ＊−（修飾基）が生じ、これが、基質、例えば、ペプチド、脂質、アグリコンなどに付加されるグリコシル供与体として働く。
【００３４】
本発明は、シアル酸の側鎖が酸化されて、生じたカルボニル部分（アルデヒド）が、アンモニアまたはアミン含有修飾基を用いる還元的アミノ化によってアミンへ変換される修飾糖断片を参照することによって例示される。基としての糖は、本明細書に提供された本発明の例示の変型において容易に利用される豊富な酸化化学を有していることを、当業者は認識されるであろう。
【００３５】
典型的な一態様において、本発明は、式Ｉ：
【化１】
2008526864.tif 000002
【００３６】
で表されるサブユニットを含む生体活性種、例えば、ペプチド、ヌクレオチド、活性化部分、炭水化物、脂質（例えば、セラミドまたはスフィンゴシン）の結合体を提供する。
【００３７】
式Ｉにおいて、記号Ｘ１は、置換または非置換アルキル、ＯまたはＮＲ８を表す。Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーである。適切なＲ１基は、ＯＲ９、ＮＲ９Ｒ１０、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択される。記号Ｒ９およびＲ１０は独立して、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルおよびＣ（Ｏ）Ｒ１１を表す。Ｒ１１は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、および置換または非置換ヘテロシクロアルキルなどの基である。
【００３８】
記号Ｒ２は、ヌクレオチド、活性化部分、ペプチドのアミノ酸残基、ペプチドのアミノ酸残基に結合した炭水化物部分、リンカーを介してペプチドのアミノ酸残基に結合した炭水化物部分および少なくとも第２の炭水化物部分を含んでなるリンカーを介してペプチドのアミノ酸残基に結合した炭水化物部分から選択されるメンバーである。典型的なリンカーは、Ｒ２の炭水化物部分に加えて、１つまたは複数のさらなる炭水化物部分を含む。Ｒ３は、Ｈ、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーである。記号Ｒ４およびＲ３’は独立して、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、ＯＨ、ＯＲ４’およびＮＨＣ（Ｏ）Ｒ１２を表す。Ｒ４’は、Ｈ、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーである。Ｒ１２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換ヘテロシクロアルキルおよびＮＲ１３Ｒ１４から選択されるメンバーであり、Ｒ１３およびＲ１４は、Ｈ、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから独立して、選択されるメンバーである。
【００３９】
Ｙは、カルボニルへの酸化および引き続くカルボニル部分と求核性基との反応、あるいは、それに続くさらなる修飾の後に残留しているシアル酸側鎖の残基である。Ｙとして典型的な基としては、酸化によってアルデヒドが形成され、それが引き続き還元的にアミノ化される場合、ＣＨ２、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２が挙げられる。アルデヒドがイミン種に変換されるか、亜リン酸イリドと反応する場合、Ｙは典型的に、ＣＨ、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨまたはＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨである。アルデヒドがグリニヤール試薬またはリチウム試薬と反応する場合、典型的なＹ基としては、ＣＨ（ＯＨ）、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）またはそれらの脱離生成物、例えば、脱水生成物が挙げられる。
【００４０】
記号Ｙ２は、該断片のカルボニル部分への付加により形成された基を表す。Ｙ２は、少なくとも１つの修飾性の基、例えば、生体分子、治療的部分、診断的部分、および用語Ｒ６ａで例示されるポリマー性修飾基を含む。Ｙ２に当たるものとしては、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル（例えば、ウィッティヒ、グリニヤールまたは他の適切な化学作用によって形成された）、Ｒ６、および窒素含有種、例えば、
【化２】
2008526864.tif 000003
【００４１】
が挙げられる。典型的な一実施形態において、Ｙ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、Ｒ６、および窒素含有種から選択されるメンバーである。Ｒ６およびＲ７は独立して、Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｒ６ｂ、または−Ｌａ−Ｒ６ｂであり、Ｒ６ｂは、ＨまたはＲ６ａであり、Ｌａは、結合およびリンカー基から選択される。
【００４２】
Ｙ２が置換または非置換アルキル、例えば、ウィティッヒ反応によって形成されたアルケン種、またはグリニヤールまたはリチウムの化学作用によって形成された飽和種である場合、Ｙ２は、用語Ｒ６ａで例示される、少なくとも１つの修飾性の基（水溶性または水に不溶性のポリマー）を含む。
【００４３】
本明細書で検討されるとおり、Ｒ６ａは、ポリマー性修飾基であり得る。好ましいポリマー性修飾基としては、ＰＥＧが挙げられる。本発明の結合体に使用されるＰＥＧは、線状または分枝状であり得る。本発明のこの実施形態によるペプチド結合体を含有する分枝状ＰＥＧを形成するために使用される典型的な前駆体は、式：
【化３】
2008526864.tif 000004
【００４４】
で表される。この式による分枝状ポリマー種は、本質的に純粋なポリマー性修飾基である。Ｘ３’は、イオン化可能な（例えば、ＯＨ、ＣＯＯＨ、Ｈ２ＰＯ４、ＨＳＯ３、ＮＨ２、およびそれらの塩など）または他の反応性の官能基、例えば、後出のもの、を含む部分である。Ｃは炭素である。Ｘ５、Ｒ１６およびＲ１７は、非反応性基（例えば、Ｈ、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル）およびポリマーアーム（例えばＰＥＧ）から独立して選択される。Ｘ２およびＸ４は、生理的条件下で好ましくは本質的に非反応性であり、同一であっても異なっていてもよい。典型的なリンカーは、芳香族部分もエステル部分も含まない。あるいは、これらの結合は、生理的関連条件下で分解するようにデザインされている１つまたは複数の部分、例えば、エステル、ジスルフィドなどを含み得る。Ｘ２およびＸ４は、ポリマーアームＲ１６およびＲ１７をＣに結合する。Ｘ３’がリンカー上の相補的反応性を有する反応性官能基、糖またはリンカー−糖カセットと反応する場合、Ｘ３’は、結合断片Ｘ３の構成部分に変換される。
【００４５】
典型的な一実施形態において、修飾性ポリマー基は、リンカーＬａを介してグリコシル結合基に結合しており、この場合、Ｒ６およびＲ７は独立して、下記に示される：
【化４】
2008526864.tif 000005
【００４６】
Ｒ６ａは、ポリマー性修飾基であり、Ｌａは、結合および結合基から選択される。指数ｗは、１〜６から、好ましくは１〜３から、より好ましくは１〜２から選択される整数を表す。典型的な結合基としては、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキル部分が挙げられる。リンカー基の典型的な構成部分は、アシル部分である。他の典型的な結合基は、アミノ酸（例えば、システイン、セリン、リシン、および短いオリゴペプチド、例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｃｙｓ−Ｌｙｓ、Ｓｅｒ−Ｌｙｓなど）である。
【００４７】
Ｌａが結合である場合、それは、Ｒ６ａの前駆体上の反応性官能基とグリコシル結合基の前駆体上の相補的反応性を有する反応性官能基との反応によって形成される。Ｌａが非ゼロ位数の結合基である場合、ＬはＲ６ａ前駆体との反応前にグリコシル部分上に配置できる。あるいは、Ｒ６ａおよびＬａの前駆体を予備形成されたカセット内に組み込むことができ、それを引き続きグリコシル部分に結合する。本明細書に記載されるとおり、適切な反応性官能基を有する前駆体の選択および調製は当業者の能力内にある。さらに、前駆体の結合は、当業界で十分に認識されている化学によって進行する。
【００４８】
他の態様において、本発明は、本発明の方法に使用される活性化グリコシル結合基を提供する。典型的な一実施形態において、この態様により、グリコシル結合基は、式Ｉによる構造を有し、式中、Ｒ２は、ヌクレオチド糖を形成するヌクレオチドであり、ここで糖部分は、糖断片であるか、または糖断片を含む。Ｒ２はまた、ハロゲン、スルホン酸エステルなどの脱離基（活性化基）であり得る。
【００４９】
第３の態様において、本発明は、式Ｉによる部分を含むグリコシル結合基を介してペプチド結合体または脂質結合体に共有結合した水溶性ポリマー部分の集団を有するペプチド結合体または脂質結合体を提供する。本発明の結合体において、本質的には、該集団の各メンバーが、式Ｉによるサブユニットを含むグリコシル結合基を介して、該ペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基に結合しており、結合基が結合している各アミノ酸またはグリコシル残基は同一の構造を有している。
【００５０】
第４の態様において、本発明は、ポリマー、例えば水溶性ポリマーと、グリコシル化ペプチドもしくはグリコシル化脂質、または非グリコシル化ペプチドもしくは非グリコシル化脂質である糖受容体との間の共有結合体を形成する方法を提供する。該ポリマーは、式Ｉによる部分を含むグリコシル結合基を介して受容体に結合している。グリコシル結合基は、間に置かれ、受容体とポリマーの双方に、直接的または間接的に共有結合している。該方法は、一般にヌクレオチド誘導体として活性化された修飾糖断片および該修飾糖断片が基質となっている酵素を含有する混合物と該受容体とを接触させることを含む。該混合物はまた、糖残基を転移する酵素であって、該修飾糖断片が基質であるところの酵素を含む。該反応は、該結合体を形成する上で適切な条件下で実施される。例えば、国際公開第０３／０３１４６４号パンフレットおよび関連の米国出願およびＰＣＴ出願を参照されたい。
【００５１】
第５の態様において、本発明は、修飾糖断片が治療的または診断的部分と共に誘導体化される、上記のものに類縁の結合体を提供する。典型的な一実施形態において、修飾基は、治療的または診断的薬剤であり得る生体分子である。
【００５２】
さらなる態様において、本発明は、ペプチドまたは脂質と修飾糖断片との間の結合体を形成する組成物を提供する。該組成物は一般に、式Ｉに記載された糖断片の活性化類縁体、活性化グリコシル結合基が基質である酵素、および（糖）ペプチドまたは（糖）脂質受容体基質を含む。該グリコシル結合基は、水溶性ポリマー、治療的部分および生体分子から選択されるメンバーを、それに共有結合させている。
【００５３】
製薬組成物もまた提供される。該組成物は、製薬的に許容できる担体および製薬的に許容できる担体と混合させた本発明の結合体を含む。
【００５４】
他の目的および利点は、以下の詳細な説明から当業者に明らかになろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
発明および好ましい実施形態の詳細な説明
略号
ｍ−ＰＥＧ、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）を含めて、分枝状または非分枝状ＰＥＧ、ポリ（エチレングリコール）；分枝状または非分枝状ＰＰＧ、ポリ（プロピレングリコール）；ｍ−ＰＰＧ、メトキシ−ポリ（プロピレングリコール）；Ｆｕｃ、フコシル；Ｇａｌ、ガラクトシル；ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルガラクトサミニル；Ｇｌｃ、グルコシル；ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコサミニル；Ｍａｎ、マンノシル；ＭａｎＡｃ、マンノサミニルアセテート；Ｓｉａ、シアル酸；ＮｅｕＡｃ、Ｎ−アセチルノイラミニル；およびＳＡ＊−Ｙ、ＳＡ＊が分子のグリコシドコアまたは環状構造であり、Ｙが修飾シアル酸側鎖の部分であるシアル酸断片。
【００５６】
定義
別に定義しない限り、本明細書に用いられる専門用語および科学用語は全て、本発明が属する通常の当業者に一般に認識されているものと同じ意味を一般に有する。一般に、本明細書に用いられる命名法、および細胞培養、分子遺伝学、有機化学および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションにおける操作は、当業界に周知で、一般に用いられているものである。核酸およびペプチド合成に関しては、標準的な技法が用いられている。これらの技法および操作は一般に、当業界における慣例的方法ならびに本文書を通して提供されている種々の一般的参考文献（一般的には、参照として本明細書に援用されている、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）コールドスプリングハーバー  ラボラトリー出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、を参照）に従って、実施される。本明細書に用いられる命名法および分析化学における実験操作、ならびに下記の有機合成は当業界に周知で、一般に用いられているものである。化学合成および化学分析には、標準的技法およびそれらの変法が用いられる。
【００５７】
用語の「アルキル」は、それ自体で、または他の置換基の一部として、別に記述しない限り、直鎖または分枝鎖、または環状の炭水化物基を意味し、これらは完全に飽和していてもよいし、モノまたはポリ不飽和であってもよく、指定された数の炭素原子を有する（すなわち、Ｃ１−Ｃ１０は１から１０の炭素を意味する）二価および多価の基であり得る。飽和炭水化物基の例としては、限定はしないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどの相同体および異性体、などの基が挙げられる。不飽和アルキル基は、１つまたは複数の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例としては、限定はしないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、およびより高級の相同体ならびに異性体が挙げられる。用語の「アルキル」はまた、別に記述しない限り、「ヘテロアルキル」などの、下記により詳細に定義されたアルキルの誘導体を含むことも意味する。炭水化物基に限定されたアルキル基は、「ホモアルキル」と称される。
【００５８】
用語の「アルキレン」は、それ自体で、または他の置換基の一部として、限定はしないが、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−により示されるアルカンから誘導された二価の基を意味し、下記に「ヘテロアルキレン」と記述される基をさらに含む。典型的に、アルキル（またはアルキレン）基は、１から２４の炭素原子を有し、１０以下の炭素原子を有する基が本発明に好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、一般に８以下の炭素原子を有するより短い鎖のアルキル基またはアルキレン基である。
【００５９】
用語の「アルコキシ」、「アルキルアミノ」および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）は、従来の意味で用いられ、それぞれ、酸素原子、アミノ基、またはイオウ原子を介して分子の残部に結合しているアルキル基を指す。
【００６０】
用語の「ヘテロアルキル」は、それ自体で、または他の用語との組み合わせにおいて、別に記述しない限り、記述した数の炭素原子およびＯ、Ｎ、ＳｉおよびＳよりなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子からなる安定な直鎖または分枝鎖、または環状炭水化物基、またはそれらの組み合わせを意味し、該窒素原子およびイオウ原子は、任意に酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は任意に四級化されていてもよい。ヘテロ原子のＯ、Ｎ、およびＳならびにＳｉは、該ヘテロアルキル基の任意の内部位置に配置されていてもよいし、アルキル基が該分子の残部に結合している位置に配置されていてもよい。例としては、限定はしないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられる。例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３および−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３など、２つまでのヘテロ原子が連続的であってもよい。同様に、用語の「ヘテロアルキレン」は、それ自体で、または他の置換基の一部として、限定はしないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−により示されるヘテロアルキルから誘導された二価の基を意味する。ヘテロアルキレン基では、ヘテロ原子が、鎖端の一端または両端を占めることもできる（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。さらに、アルキレンおよびヘテロアルキレン結合基では、結合基の方向は、結合基の式が書かれている方向を意味するわけではない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−と −Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−の双方を表す。
【００６１】
一般に、「アシル置換基」もまた、上記の群から選択される。本明細書に用いられる用語の「アシル置換基」とは、本発明の化合物の多環核に直接的または間接的に結合しているカルボニル炭素に結合した、またはその原子価数を満たしている基を指す。
【００６２】
用語の「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」は、それら自体で、または他の用語との組み合わせにおいて、別に記述しない限り、それぞれ、「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環式型を表す。また、ヘテロシクロアルキルでは、ヘテロ原子はヘテロ環が該分子の残部に結合している位置を占めることができる。シクロアルキルの例としては、限定はしないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキルの例としては、限定はしないが、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられる。
【００６３】
用語の「ハロ」または「ハロゲン」は、それら自体で、または他の置換基の一部として、別に記述しない限り、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子を意味する。また、「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルを含むことを意味している。例えば、用語の「ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル」は、限定はしないが、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピルなどを含むことを意味している。
【００６４】
用語の「アリール」は、共に融合しているか共有結合している単環または多環（好ましくは、１つから３つの環）であり得る、ポリ不飽和で芳香族の炭水化物置換基を意味する。用語の「ヘテロアリール」とは、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１つから４つのヘテロ原子を含有するアリール基（または環）を言い、該窒素原子およびイオウ原子は任意に酸化されており、該窒素原子は、任意に四級化されている。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して該分子の残部に結合できる。アリール基およびヘテロアリール基の非限定的例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、および６−キノリルが挙げられる。上記のアリール環系およびヘテロアリール環系の各々の置換基は、下記の許容できる置換基の群から選択される。
【００６５】
簡潔にするため、用語の「アリール」は、他の用語（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）と組み合わせて用いられる場合、上記で定義したアリール環およびヘテロアリール環の双方を含む。したがって、用語の「アリールアルキル」は、炭素原子（例えば、メチレン基）が、例えば、酸素原子によって置換されたアルキル基（例えば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）などのアルキル基にアリール基が結合している基（ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）を意味する。
【００６６】
上記用語の各々（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」および「ヘテロアリール」）は、指示された基の置換体および非置換体の双方を含む。各タイプの基の好ましい置換基は下記に提供されている。
【００６７】
アルキルおよびヘテロアルキル基（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルとしばしば称される基を含めて）に関する置換基は一般に、それぞれ、「アルキル置換基」および「ヘテロアルキル置換基」と称され、それらは、限定はしないが：−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２から選択される種々の基の１つまたは複数であり得、その数はゼロから（２ｍ’＋１）の範囲であり、ｍ’は、このような基の炭素原子の総数である。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は各々好ましくは独立して、水素、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、例えば、１〜３のハロゲンにより置換されたアリール、置換または非置換のアルキル、アルコキシ、もしくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を表す。本発明の化合物が１つ超の、例えばＲ基を含む場合、Ｒ基の各々は、各々Ｒ’基、Ｒ’’基、Ｒ’’’基およびＲ’’’’基として、これらの基の１つ超が存在する場合、独立して選択される。Ｒ’とＲ’’が同一の窒素原子に結合している場合、それらは該窒素原子と合わさって、５員環、６員環、または７員環を形成できる。例えば、ＮＲ’Ｒ’’は、限定はしないが、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むことが意味されている。置換基についての上記の検討から、「アルキル」の用語は、ハロアルキル（例えば、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３）およびアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など）などの水素基以外の基に結合した炭素原子を含む基を含むことが意味されている。
【００６８】
アルキル基に関して記述された置換基と同様に、アリール置換基およびヘテロアリール置換基は一般に、それぞれ、「アリール置換基」および「ヘテロアリール置換基」と称され、種々のものがあり、例えば：ハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、およびフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから選択され、その数はゼロから芳香族環系上の開放原子価の総数までであり、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は、好ましくは独立して、水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルおよびヘテロアルキル、非置換のアリールおよびヘテロアリール、（非置換アリール）−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、および（非置換アリール）オキシ−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから選択される。本発明の化合物が１つ超の、例えば、Ｒ基を含む場合、Ｒ基の各々は、各々Ｒ’基、Ｒ’’基、Ｒ’’’基およびＲ’’’’基として、これらの基の１つ超が存在する場合、独立して選択される。
【００６９】
アリール環またはヘテロアリール環の隣接原子上のアリール置換基のうちの２つは、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）ｑ−Ｕ−の置換基によって任意に置換でき、式中、ＴおよびＵは独立して、−ＮＲ−，−Ｏ−，−ＣＲＲ’−または単結合であり、ｑは、０から３の整数である。あるいは、アリール環またはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基のうちの２つは、式−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−の置換基によって任意に置換でき、式中、ＡおよびＢは独立して、−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−または単結合であり、ｒは１から４の整数である。このように形成された新たな環の単結合の１つは任意に、二重結合によって置換できる。あるいは、アリール環またはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基のうちの２つは、式−（ＣＲＲ’）ｓ−Ｘ−（ＣＲ’’Ｒ’’’）ｄ−の置換基によって任意に置換でき、式中、ｓおよびｄは独立して、０から３の整数であり、Ｘは、−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は、好ましくは独立して、水素、または置換もしくは非置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択される。
【００７０】
本明細書に用いられる用語の「ヘテロ原子」としては、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、イオウ（Ｓ）およびケイ素（Ｓｉ）が挙げられる。
【００７１】
用語の「核酸」または「ポリヌクレオチド」とは、一本鎖または二本鎖の形態におけるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）およびそれらのポリマーを指す。特に限定しない限り、該用語は、関連核酸と同様の結合性を有し、天然ヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの公知の類縁体を含有する核酸を包含する。別に指示しない限り、特定の核酸配列はまた、それらの保存的に修飾された変異体（例えば、縮退コドン置換体）、対立形質体、オルトローグ、ＳＮＰ、および相補的配列、ならびに明白に指示された配列を包含することが含意されている。具体的に、縮退コドン置換体は、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基によって置換されている配列を作出することによって得ることができる（バッチャー（Ｂａｔｚｅｒ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；オオツカら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８頁（１９８５）；およびロッソリーニ（Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８頁（１９９４））。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によってコードされたｍＲＮＡと交換可能に用いられる。
【００７２】
用語の「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡの区域を意味する。それは、コード領域の前後の領域（リーダーおよびトレーラー）ならびに個々のコード区域（エキソン）の間に介在している配列（イントロン）を含み得る。
【００７３】
用語の「アミノ酸」とは、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様な様式で機能するアミノ酸類縁体およびアミノ酸模倣物を指す。天然アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされたもの、ならびに後に修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類縁体とは、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素に結合したα炭素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類縁体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。「アミノ酸模倣物」とは、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様な様式で機能する化学的化合物を指す。
【００７４】
アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨された、一般に知られている三文字記号によって、または一文字記号によって表すことができる。同様にヌクレオチドは、それらの一般に認められている一文字コードによって表すことができる。
【００７５】
「保存的に修飾した変異体」は、アミノ酸および核酸配列の双方に適用される。特定の核酸配列に関しては、「保存的に修飾した変異体」とは、同一の、または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指すか、または該核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一の配列を指す。遺伝子コードの縮退のため、多数の機能的に同一の核酸が任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドン、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全て、アミノ酸、アラニンをコードする。したがって、アラニンがあるコドンによって規定されている全ての位置において、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変えることなく、記載された対応するコドンのいずれかに変えることができる。このような核酸変異体は、保存的に修飾した変異体の１種である「サイレント変異体」である。ポリペプチドをコードする本明細書における全ての核酸配列もまた、核酸の全ての可能なサイレント変異体を表す。核酸における各コドン（メチオニンに対する通常、唯一のコドンであるＡＵＧ、およびトリプトファンに対する通常、唯一のコドンであるＴＧＧを除いて）を修飾して、機能的に同一の分子を得ることができることを、当業者は認識するであろう。したがって、あるポリペプチドをコードする核酸の各々のサイレント変異体が、表された各配列に含意されている。
【００７６】
アミノ酸配列に関して、コードされた配列における単一のアミノ酸または少パーセンテージのアミノ酸を変化させるか、付加するか、または欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加が「保存的に修飾した変異体」であり、この変更により、化学的に類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換が生じることを、当業者は認識するであろう。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は当業界に周知である。このような保存的に修飾した変異体は、本発明の多型性変異体、種間相同体、および対立形質体に追加して存在し、それらを除外しない。
【００７７】
アミノ酸配列に関して、コードされた配列における単一のアミノ酸または少パーセンテージのアミノ酸を変化させるか、付加するか、または欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加が「保存的に修飾した変異体」であり、この変更により、化学的に類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換が生じることを、当業者は認識するであろう。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は当業界に周知である。このような保存的に修飾した変異体は、本発明の多型性変異体、種間相同体、および対立形質体に追加して存在し、それらを除外しない。
【００７８】
以下の８つの群は各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、クレイトン（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照）。
【００７９】
アミノ酸は本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨された、一般的な三文字記号によって、または一文字記号によって表すことができる。同様にヌクレオチドは、それらの一般に認められている一文字コードによって表すことができる。
【００８０】
野生型酵素の構造または酵素活性の変更の文脈において用いられる用語の「変異の」または「変異」とは、生じる酵素のアミノ酸配列が１つまたは複数のアミノ酸残基において変化するように、野生型酵素のその酵素またはアミノ酸配列それぞれをコードするポリヌクレオチド配列における、化学的、酵素的、または他の任意の手段による任意のヌクレオチドの欠失、挿入、または置換を指す。このような活性変更変異の部位は、該酵素における任意の場所に位置できるが、該酵素の活性部位内に位置することが好ましい。
【００８１】
「ペプチド」とは、モノマーがアミノ酸であって、アミド結合を介して共に結合しているポリマーを言い、替わりに、ポリペプチドと称される。また、非天然アミノ酸、例えば、β−アラニン、フェニルグリシンおよびホモアルギニンもまた含まれる。遺伝子コードされていないアミノ酸もまた本発明に使用できる。さらに、反応基、グリコシル化部位、ポリマー、治療的部分、生体分子などを含むように修飾されたアミノ酸もまた本発明に使用できる。本発明に使用される全てのアミノ酸は、Ｄ異性体またはＬ異性体のいずれかであり得る。Ｌ異性体が一般に好ましい。また、他のペプチド模倣物も本発明に有用である。本明細書に用いられる「ペプチド」とは、グリコシル化ペプチドと非グリコシル化ペプチドの双方を指す。また、ペプチドを発現する系によって不完全にグリコシル化されているペプチドも含まれる。一般的レビューに関しては、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．ヴァインスタイン（Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ）編、マーセル  デッカー（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ）、ニューヨーク、２６７頁（１９８３）におけるスパトーラ  Ａ．Ｆ．（Ｓｐａｔｏｌａ  Ａ．Ｆ．）を参照されたい。
【００８２】
用語の「ペプチド結合体」とは、糖残基を介してペプチドに結合しているアシル含有基にペプチドが結合している本発明の化学種を指す。
【００８３】
用語の「シアル酸」とは、９つの炭素のカルボキシル化糖のファミリーの任意のメンバーを指す。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノス−１−オン酸（しばしば、Ｎｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、またはＮＡＮＡと略記される）である。該ファミリーの第２のメンバーは、ＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基がヒドロキシル化されているＮ−グリコリル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）である。第３のシアル酸ファミリーメンバーは、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（ＫＤＮ）である（ナダノら（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１１５５０−１１５５７頁；カナモリ（Ｋａｎａｍｏｒｉ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２１８１１−２１８１９頁（１９９０））。また、９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃまたは９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃおよび９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃのような９−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ６アシル−Ｎｅｕ５Ａｃなどの９−置換シアル酸も含まれる。シアル酸ファミリーのレビューに関しては、例えば、ヴァルキー（Ｖａｒｋｉ）、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２：２５−４０頁（１９９２）；Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｎ、Ｒ．シャウアー（Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ）編、（スプリンガー−フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、ニューヨーク（１９９２））を参照されたい。シアリル化法におけるシアル酸化合物の合成および使用法は、１９９２年１０月１日公開の国際公開第９２／１６６４０号パンフレットに開示されている。
【００８４】
本明細書に用いられる用語の「修飾糖断片」とは、修飾基を付加するための座を作り出すために、典型的には酸化的に修飾された、天然または非天然の炭水化物の断片を指す。典型的な一実施形態において、糖断片は、側鎖が酸化的分解によって変化しているシアル酸断片である。この酸化によって、カルボニル部分が生じ、これが引き続き修飾基のアミン類縁体によって還元的にアミノ化される。他の典型的実施形態において、糖の環構造は還元的変換によってアルジトールへと線状化され（例えば、マンノースからマンニトールへ）、例えば、１つまたは複数の第一級ヒドロキシル部分において誘導体化される。有用な修飾基としては、限定はしないが、水溶性ポリマー、水不溶性ポリマー、治療的部分、診断的部分、生体分子などが挙げられる。
【００８５】
用語の「水溶性」とは、水に検知可能な程度の溶解度を有する部分を指す。水への溶解度を検知および／または定量化する方法は当業界に十分知られている。典型的な水溶性ポリマーとしては、ペプチド、糖、ポリ（エーテル）、ポリ（アミン）、ポリ（カルボン酸）などが挙げられる。ペプチドは、単一アミノ酸からなる混合配列、例えば、ポリ（リシン）、ポリ（アスパラギン酸）、およびポリ（グルタミン酸）を有し得る。典型的な多糖はポリ（シアル酸）である。典型的なポリ（エーテル）は、ポリ（エチレングリコール）、例えば、ｍ−ＰＥＧである。ポリ（エチレンイミン）は、典型的なポリアミンであり、ポリ（アクリル）酸は、代表的なポリ（カルボン酸）である。
【００８６】
水溶性ポリマーのポリマー主鎖は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、例えば、ｍ−ＰＥＧであり得る。しかし、他の関連ポリマーもまた、本発明の実践における使用に好適であること、およびＰＥＧまたはポリ（エチレングリコール）という用語の使用は、この点で包含的であって排他的でないことが意図されていることを認識する必要がある。ＰＥＧという用語は、アルコキシＰＥＧ、アルキルＰＥＧ（例えば、ｍＰＥＧ）、二官能性ＰＥＧ、多アームＰＥＧ、二又ＰＥＧ、分枝状ＰＥＧ、懸垂型（ｐｅｎｄｅｎｔ）ＰＥＧ（すなわち、ポリマー主鎖に対して懸垂している１つまたは複数の官能基を有するＰＥＧまたは関連ポリマー）、またはその中に分解性結合を有するＰＥＧなどの任意の形態におけるポリ（エチレングリコール）を含む。
【００８７】
該ポリマー主鎖は、線状または分枝状であり得る。分枝状ポリマー主鎖が当業界で一般に知られている。分枝状ポリマーは典型的に、１つの中心分枝コア部分およびその中心分枝コア部分に結合した複数の線状ポリマー鎖を有する。ＰＥＧは一般に、グリセロール、ペンタエリトリトールおよびソルビトールなどの種々のポリオールへエチレンオキシドを付加することによって調製できる分枝状形態で用いられる。中心分枝コア部分は、リシンなどのいくつかのアミノ酸由来でもあり得る。分枝状ポリ（エチレングリコール）は、Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍの一般式で表すことができ、式中、Ｒは、グリセロール、ペンタエリトリトール、アミノ酸（例えば、システイン、セリン、ジ−リシン、トリ−リシンなど）などのコア部分を表し、ｍは、アームの数を表す。米国特許第５，９３２，４６２号明細書；第５，６４３，５７５号明細書；欧州特許出願公開第０４７３，０８４Ａ２号明細書；国際公開第９６／４１８１３号パンフレット（およびその優先権書類）に記載されているものなどの多アームＰＥＧ分子もまた、ポリマー主鎖として使用できる。
【００８８】
多くの他のポリマーもまた本発明に好適である。２から約３００の端を有する非ペプチドで水溶性のポリマー主鎖が、本発明に特に有用である。好適なポリマーの例としては、限定はしないが、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）などの他のポリ（アルキレングリコール）、エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのコポリマー、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、参照としてその全体が本明細書に援用されてる米国特許第５，６２９，３８４号明細書に記載されたものなどのポリ（N−アクリロイルモルフォリン）ならびにそれらのコポリマー、ターポリマー、および混合物が挙げられる。ポリマー主鎖の各鎖の分子量は様々であるが、典型的には、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａの範囲にあり、約６，０００Ｄａから約８０，０００Ｄａであることが多い。
【００８９】
用語の「大規模」および「工業的規模」は、交換可能に用いられ、単一反応サイクルの終了時に、少なくとも約２５０ｍｇ、好ましくは少なくとも約５００ｍｇ、より好ましくは少なくとも約１グラムの糖結合体を生産する反応サイクルを指す。
【００９０】
本明細書に用いられる用語の「グリコシル結合基」とは、親糖上での１つまたは複数の第一級または第二級ヒドロキシル部分の酸化によって一般に調製される、親糖の断片であるグリコシル残基を指す。典型的なグリコシル結合基は、下記の式Ｉに記載されている。式Ｉに示されるように、グリコシル結合基は、それが結合している分子に、修飾基（例えば、ＰＥＧ部分、治療的部分、生体分子）を共有結合させる。本発明の方法において、「グリコシル結合基」は、試剤をペプチド上のアミノ酸および／またはグリコシル残基に結合させる、酵素的グリコシル化反応による共有的修飾によって形成される。グリコシル結合基は、修飾基の付加前に分解される、または分解して修飾される（例えば、酸化→シッフ塩基形成→還元）糖由来の構造であり得る。あるいは、グリコシル結合基の一部は無傷であり得る。例えば、グリコシル結合基が、ペプチドまたは脂質にＧａｌを結合させたＧａｌ−ＳＡ＊（ＳＡ＊は糖断片）である場合、Ｇａｌは無傷であり得る。本発明のグリコシル結合基は、グリコシルユニットを付加することまたは親の糖構造から１つまたは複数のグリコシルユニットを除去することに引き続いて、本発明の糖断片を新たに配置された、または曝露されたグリコシル残基に結合させることによって、糖から誘導できる。
【００９１】
本明細書に用いられる用語の「標的部分」とは、身体の特定の組織または領域に選択的に局在化させる化学種を指す。この局在化は、分子決定因子の特異的認識、標的剤または結合体の分子サイズ、イオンの相互作用、疎水性相互作用などによって媒介される。試剤を特定の組織または領域に標的化する他の機構も当業者に知られている。典型的な標的部分としては、抗体、抗体断片、トランスフェリン、ＨＳ−糖タンパク質、凝集因子、血清タンパク質、β−糖タンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯなどが挙げられる。
【００９２】
本明細書に用いられる「治療的部分」は、限定はしないが、抗生物質、抗炎症剤、抗腫瘍薬、細胞毒素、および放射性薬剤などの、療法に有用な任意の薬剤を意味する。「治療的部分」としては、生物活性剤のプロドラッグ、１つ超の治療的部分が担体に結合している構築体、例えば、多価薬剤が挙げられる。治療的部分としてはまた、タンパク質およびタンパク質を含む構築体が挙げられる。典型的なタンパク質としては、限定はしないが、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、−β、−γ）、インターロイキン（例えば、インターロイキンＩＩ）、血清タンパク質（例えば、因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、およびＸ）、ヒト絨毛性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）ならびに抗体融合タンパク質（例えば、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）／Ｆｃドメイン融合タンパク質））が挙げられる。
【００９３】
本明細書に用いられる「抗腫瘍薬」は、限定はしないが、抗代謝剤、アルキル化剤、アントラサイクリン、抗生物質、有糸分裂阻害剤、プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、アスパラギナーゼ、副腎皮質ステロイド、インターフェロンおよび放射性薬剤などの細胞毒素および薬剤などの、癌と戦うのに有用な任意の薬剤を意味する。「抗腫瘍薬」という用語の範囲にはまた、抗腫瘍活性を有するペプチドの結合体、例えば、ＴＮＦ−αが包含される。結合体としては、限定はしないが、治療的タンパク質と本発明の糖タンパク質との間に形成されたものが挙げられる。代表的な結合体は、ＰＳＧＬ−１とＴＮＦ−αとの間に形成されたものである。
【００９４】
本明細書に用いられる「細胞毒素または細胞毒性剤」は、細胞に対して有害な任意の薬剤を意味する。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシネジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびプロマイシンおよびそれらの類縁体または相同体が挙げられる。他の毒素としては、例えば、ヒマ毒、ＣＣ−１０６５および類縁体、デュオカルマイシンが挙げられる。さらに他の毒素として、ジフテリア毒素、および蛇毒（例えば、コブラ毒）が挙げられる。
【００９５】
本明細書に用いられる「放射性薬剤」は、腫瘍の診断または破壊に有効な任意の放射性同位体を含む。例としては、限定はしないが、インジウム１１１、コバルト６０が挙げられる。さらに、典型的には、放射性同位体の混合物として表れるウラニウム、ラジウム、およびトリウムなどの天然の放射性元素放射性薬剤の好適な例である。該金属イオンは典型的には、有機キレート化部分によってキレート化されている。
【００９６】
多くの有用なキレート群、クラウンエーテル、クリプタンドなどが当業界に知られており、本発明の化合物に組み込むことができる（例えば、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＮＴＡ、ＨＤＴＡなど、およびそれらの、ＤＴＰＰ、ＥＤＴＰ、ＨＤＴＰ、ＮＴＰなどのホスホネート類縁体など）。例えば、ピット（Ｐｉｔｔ）ら、Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｎｅにおける「Ｔｈｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｒｏｎ  Ｏｖｅｒｌｏａｄ」；マーテル（Ｍａｒｔｅｌｌ）編；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、ワシントンＤ．Ｃ．、１９８０年２７９−３１２頁；リンドイ（Ｌｉｎｄｏｙ）、Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｏｆ  Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ；ケンブリッジ大学出版、ケンブリッジ、１９８９年；デュガス（Ｄｕｇａｓ）、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；スプリンガー−フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、ニューヨーク、１９８９年、ならびにそれらに含まれる参考文献を参照されたい。
【００９７】
また、キレート化剤、クラウンエーテルおよびシクロデキストリンを他の分子に結合させることを可能にする多数の経路が、当業者に入手可能である。例えば、Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｏｄ，Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ，Ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓにおけるミーレス（Ｍｅａｒｅｓ）ら、「Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｃｈｅｌａｔｅ−Ｔａｇｇｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」；フィーニー（Ｆｅｅｎｅｙ）ら編、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、ワシントンＤ．Ｃ．、１９８２年、３７０−３８７頁；カシナ（Ｋａｓｉｎａ）ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．９：１０８−１１７頁（１９９８）；ソン（Ｓｏｎｇ）ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．８：２４９−２５５頁（１９９７）を参照されたい。
【００９８】
本明細書に用いられる「製薬的に許容できる担体」は、該結合体を組み合わせた場合、該結合体の活性を保持し、対象の免疫系に非反応性である任意の材料を含む。例としては、限定はしないが、リン酸緩衝生理食塩溶液、水、油／水乳液などの乳液、および種々のタイプの湿潤剤などの標準的な製薬的担体のいずれかが挙げられる。他の担体としてはまた、滅菌溶液、コーティング錠を含む錠剤およびカプセル剤を挙げることができる。典型的に、これらの担体は、澱粉、ミルク、糖、一定のタイプのクレー、ゼラチン、ステアリン酸またはその塩、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウム、タルク、植物脂肪または植物油、ゴム、グリコール類、または他の公知の賦形剤などの賦形剤を含有する。これらの担体はまた、芳香剤および着色添加物または他の成分を含み得る。このような担体を含んでなる組成物は、周知の慣例的方法によって製剤化される。
【００９９】
本明細書に用いられる「投与」は、経口投与、座薬としての投与、局所接触、静脈内、腹腔内、筋肉内、病巣内、もしくは皮下投与、吸入による投与、または対象への徐放デバイス、例えば、ミニ浸透圧ポンプの移植を意味する。投与は、非経口および経粘膜（例えば、口腔、鼻腔、経膣、経直腸、または経皮）、特に吸入など、任意の経路による。非経口投与としては、例えば、静脈内、筋肉内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、および頭蓋内が挙げられる。さらに、注射が腫瘍を治療する、例えば、アポトーシスを誘導するための場合、投与は腫瘍および／または腫瘍の周囲の組織内への直接的であり得る。他の送達様式としては、限定はしないが、リポソーム製剤の使用、静脈内注入、経皮パッチなどが挙げられる。
【０１００】
用語の「単離した」とは、該物質を生成させるために使用される成分が実質的にまたは本質的に無い物質について指す。本発明の結合体に関して、用語の「単離した」とは、通常は、該結合体を調製するために使用される混合物中の該物質に付随する成分が実質的にまたは本質的に無い物質について指す。「単離した」と「純粋な」は、交換可能に用いられる。典型的に、本発明の単離結合体は、好ましくは、ある範囲で表される程度の純度を有する。該結合体に関する純度範囲の下端は、約６０％、約７０％または約８０％であり、該範囲の上端は、約７０％、約８０％、約９０％または約９０％超である。
【０１０１】
該結合体が約９０％超の純度である場合、これらの純度はまた、ある範囲として表されることが好ましい。純度範囲の下端は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％または約９８％である。該純度範囲の上端は約９２％、約９４％、約９６％、約９８％または約１００％である。
【０１０２】
純度は業界で認められた任意の分析方法（例えば、銀染色ゲル上のバンド強度、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、または類似の手段）によって決定される。
【０１０３】
本明細書に用いられる「集団の本質的に各々のメンバー」とは、あるペプチドに付加された修飾糖断片の選択されたパーセンテージが、該ペプチド上の複数の同一の受容体部位に付加される、本発明のペプチド結合体の集団の特徴を指す。「集団の本質的に各々のメンバー」とは、修飾糖断片に結合したペプチド上の部位の「均一性」を言い、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％均一である本発明の結合体を指す。
【０１０４】
「均一性」とは、修飾糖断片が結合している受容体部分の、集団にわたる構造的一貫性を指す。したがって、各々の修飾糖断片部分が結合している部位が、他の全ての修飾糖断片が結合している部位と同一の構造を有しているペプチドにおいて、該ペプチド結合体は、約１００％均一であると言われる。均一性は典型的に、ある範囲として表される。該ペプチド結合体に関する均一性の範囲の下端は、約６０％、約７０％または約８０％であり、純度範囲の上端は、約７０％、約８０％、約９０％または約９０％超である。
【０１０５】
該ペプチド結合体が約９０％以上の純度である場合、これらの純度はまた、ある範囲として表されることが好ましい。均一性範囲の下端は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％または約９８％である。純度範囲の上端は約９２％、約９４％、約９６％、約９８％または約１００％の均一性である。該ペプチド結合体の純度は当業者に知られている１つまたは複数の方法、例えば、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、飛行分光分析のマトリクス補助レーザー脱離質量時間（ＭＡＬＤＩＴＯＦ）、キャピラリー電気泳動などによって典型的に決定される。
【０１０６】
糖結合体化学種について述べる場合、「実質的に均一な結合体」または「実質的に均一な結合体パターン」とは、修飾糖断片によって直接、またはグリコシルリンカーを介して、官能化されているペプチドグリコシル化部位のパーセンテージについて指す。修飾糖断片を担持することが意図されたグリコシル化部位集団の実質的に全ての（下記に定義するとおり）メンバーが、その断片によって、直接的または間接的に官能化されている場合、実質的に均一な結合体パターンが存在する。
【０１０７】
「実質的に均一な」の上記定義における「実質的に」という用語は一般に、特定の修飾糖断片に対する受容体部分の少なくとも約４０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、またはより好ましくは少なくとも約９０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％がその断片によって修飾されていることを意味する。
【０１０８】
用語の「（糖）ペプチド」および「（糖）脂質」とは、それぞれ、ペプチドおよび糖ペプチド；ならびに脂質および糖脂質を指す。用語の「ペプチド」および「脂質」は、総称的に、これらの化学種のグリコシル化と非グリコシル化類縁体の双方を指す。
【０１０９】
序文
本発明は、１つまたは複数の修飾糖断片部分を担持する結合体を提供する。該修飾断片は、基質の受容体部分、例えば、ペプチドまたは糖ペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基に、または糖脂質（例えば、スフィンゴシン、セラミドなど）のアグリコンもしくはグリコシル残基上に結合している。また、本発明の結合体を製造するための酵素的媒介法、および該方法で使用される活性化修飾糖断片が提供される。本発明はまた、本発明の方法によって形成された結合体を含む製薬製剤を提供する。
【０１１０】
本発明の結合体は、治療的コア分子、例えば、（糖）ペプチド、（糖）脂質と、水溶性ポリマー、治療的部分、診断的部分、標的部分などの様々な修飾基との間に形成される。該修飾基は糖断片を介して治療種と結合している。リンカーアームを介して共に結合した２種以上のペプチドを含む結合体、すなわち、多官能結合体もまた提供される。本発明の多官能結合体は、同一ペプチドの２つ以上のコピー、または異なる構造および／または性質を有する様々なペプチドの集合を含み得る。この実施形態による典型的な結合体において、２種のペプチド間のリンカーは、本明細書に記載された少なくとも１種の糖断片、または修飾糖断片を含む。
【０１１１】
本発明の結合体は、治療的基質への活性化修飾糖断片の酵素的結合によって調製される。本発明の結合体が糖ペプチド結合体である場合、修飾糖断片は、グリコシル化部位のアミノ酸に直接結合するか、またはグリコシル化部位に直接的または間接的に結合した（例えば、１つまたは複数のグリコシル残基を介して）グリコシル残基に結合する。
【０１１２】
また、本発明は、修飾糖断片が、脂質のアグリコン部分に、または糖脂質のグリコシル残基に結合している脂質結合体を提供する。
【０１１３】
修飾糖断片がペプチド（またはグリコシル残基）と修飾基との間に置かれている場合、それは、本明細書において「グリコシル結合基」と称されるものになる。グリコシルトランスフェラーゼ、アミダーゼ、エンドグリカナーゼ、エンドグリコセラミダーゼなどの酵素の優れた選択性を用いて、本発明は１つまたは複数の特定の位置に所望の基を担持するペプチドおよび脂質を提供する。したがって、本発明による典型的な結合体において、修飾糖断片は、ペプチド鎖上の選択された座に直接結合されるか、あるいは、修飾糖断片は糖ペプチドの炭水化物部分に付加される。修飾糖断片が糖ペプチド炭水化物、および直接、ペプチド主鎖のアミノ酸残基の双方に結合しているペプチドもまた、本発明の範囲内にある。
【０１１４】
本発明の方法は、実質的に均一な誘導体化パターンを有する修飾糖ペプチドおよび糖脂質を組立てることを可能にし；本発明に用いられる酵素は、特定のグリコシル残基に関して、またはグリコシル残基上の特定の置換基、もしくは置換基パターンに関して一般に選択的である。本法はまた、修飾糖ペプチドおよび糖脂質結合体の大規模生産にとって実用的である。一実施形態において、本発明の方法は、予備選択された均一な誘導体化パターンを有する糖ペプチドおよび糖脂質結合体の大規模調製のための実用的手段を提供する。該方法は、限定はしないが、細胞培養の細胞（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、または原核生物細胞）または形質転換植物もしくは形質転換動物における製造中に不完全にグリコシル化している糖ペプチドなどの治療的ペプチドの修飾に特に十分好適である。
【０１１５】
また、本発明の方法は、例えば、クリアランス速度の低下、または免疫系もしくは細網内皮系（ＲＥＳ）による取り込み速度の低下によって治療半減期の増加したグリコシル化および非グリコシル化のペプチドならびに糖脂質の結合体を提供する。さらに、本発明の方法は、ペプチド上の抗原性決定因子をマスクするための手段を提供し、したがって、該ペプチドに対する宿主の免疫応答を減少または排除する。特定の標的薬剤に特異的な特定の組織または細胞表面の受容体に対して、該ペプチドまたは糖脂質を標的化するために、適切な修飾糖断片を用いた、ペプチドまたは糖脂質に対する標的薬剤の選択的結合もまた用いることができる。さらに、グリコシル結合基を介して結合した治療的部分により特異的に修飾されたペプチドおよび糖脂質のクラスが提供される。
【０１１６】
実施形態
組成物：糖結合体
本発明は、修飾基によって官能化された糖断片を含む糖結合体を提供する。糖断片が糖、例えば、シアル酸の酸化によって形成される場合、酸化された糖断片に修飾基を結合させるために用いられる試薬は一般に、酸化時に形成されたカルボニル部分と反応する基を含む。
【０１１７】
修飾糖断片
本発明は、受容体基質に無傷のグリコシル部分を転移できる酵素は、該受容体に修飾糖断片もまた転移できるという発見に基づいた化合物および方法を提供する。したがって、本発明は、得られる適切な糖断片または修飾糖断片の構造または方法に限定されない。
【０１１８】
典型的な一実施形態において、糖断片は、親糖の酸化的分解によって調製される。糖群を選択的に酸化する方法は当業界に十分知られている。例えば、過ヨウ素酸イオンが、近接ジオールを開裂して対応するジアルデヒドを形成するために使用される。シアル酸の側鎖の制御された過ヨウ素酸酸化により、アルデヒドを担持する、酸化された、または酸化されて切断された側鎖の形成が導かれる。適切な条件を選択することにより、１つから３つの炭素原子を含有する側鎖が生成する。例えば、チャイ（Ｃｈａｉ）ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２３９：１０７−１１５頁（１９９３）；およびムレー（Ｍｕｒｒａｙ）ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１８６：１０７−１１５頁（１９８９）を参照されたい。
【０１１９】
糖断片に導入されたカルボニル部分は、カルボニル部分の修飾に一般に用いられる反応を受ける。例えば、アミンを含む修飾基は、イミン、例えば、ヒドラジン、セミカルバジンなどを形成するものであるため使用される。他の典型的な反応としては、カルボニル部分とイリド（例えば、イオウおよび亜リン酸）、およびカルボニル部分とグリニヤール試薬およびリチウム試薬の反応が挙げられる。
【０１２０】
本発明の典型的な修飾糖断片は、シアル酸の側鎖の酸化的分解によって形成される。この酸化によって、対象となっている修飾基のアミン誘導体によって還元的にアミノ化されるカルボニル部分の形成が導かれる。したがって、この実施形態において、本発明は、式Ｉ：
【化５】
2008526864.tif 000006
【０１２１】
で表される構造を有する修飾糖断片を提供する。
【０１２２】
式Ｉにおいて、記号Ｘ１は、ＯまたはＮＲ８を表す。Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーである。適切なＲ１基は、ＯＲ９、ＮＲ９Ｒ１０、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択される。記号Ｒ９およびＲ１０は独立して、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルおよびＣ（Ｏ）Ｒ１１を表す。Ｒ１１は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、および置換または非置換ヘテロシクロアルキルなどの基である。
【０１２３】
記号Ｒ２は、ペプチドのアミノ酸残基、ペプチドのアミノ酸残基に結合した炭水化物部分、リンカーを介してペプチドのアミノ酸残基に結合した炭水化物部分、またはリンカーを介してペプチドのアミノ酸残基に結合した炭水化物部分から選択されるメンバーである。典型的なリンカーは、Ｒ２の炭水化物部分に加えて、１つまたは複数のさらなる炭水化物部分を含む。Ｒ３は、Ｈ、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーである。Ｒ３’は、Ｈ、ＯＲ４’、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーである。Ｒ４およびＲ４’は独立して、Ｈ、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキル、ＯＨおよびＮＨＣ（Ｏ）Ｒ１２から選択されるメンバーである。Ｒ１２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換ヘテロシクロアルキルおよびＮＲ１３Ｒ１４から選択され、Ｒ１３およびＲ１４は独立して、Ｈ、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーである。典型的な一実施形態において、Ｒ３’はＨである。
【０１２４】
Ｙは、酸化およびさらなる化学修飾の後に残留しているシアル酸側鎖の残基である。Ｙとして典型的な基としては、酸化によってアルデヒドが形成され、それが引き続き還元的にアミノ化される場合、ＣＨ２、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２が挙げられる。アルデヒドがイミン種に変換されるか、または亜リン酸もしくはイオウイリドの付加から生成物が生じる場合、Ｙは典型的に、ＣＨ、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨまたはＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨである。アルデヒドがグリニヤール試薬またはリチウム試薬と反応する場合、典型的なＹ基としては、ＣＨ（ＯＨ）、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）またはそれらの脱離生成物、例えば、脱水生成物が挙げられる。
【０１２５】
記号Ｙ２は、該断片のカルボニル部分への付加により形成された基を表す。Ｙ２は、少なくとも１つの修飾性の基、例えば、生体分子、治療的部分、診断的部分、および用語Ｒ６ａで例示されるポリマー性修飾基を含む。Ｙ２に当たるものとしては、置換アルキル、（例えば、ウィッティヒ、グリニヤールまたは他の適切な化学作用によって形成された）、Ｒ６、および窒素含有種、例えば、ＮＲ６Ｒ７またはＲ６Ｒ７Ｎ−Ｎ＝が挙げられる。Ｒ６およびＲ７は独立して、Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｒ６ｂまたは−Ｌａ−Ｒ６ｂであり、Ｒ６ｂは、ＨまたはＲ６ａであり、Ｌａは、結合およびリンカー基から選択される。典型的な一実施形態において、Ｙ２は、Ｎ（Ｒ６）−Ｌａ−（ｍ−ＰＥＧ）ｓであり、Ｌａは、アミノ酸残基およびペプチジル残基から選択されるメンバーであるリンカー部分であり；指数ｓは、１から３の整数である。
【０１２６】
Ｙ２が置換または非置換アルキル、例えば、ウィティッヒ反応によって形成されたアルケン種、またはグリニヤールまたはリチウムの化学作用によって形成された飽和種である場合、Ｙ２は、用語Ｒ６ａで例示される、少なくとも１つの修飾性の基（水溶性または水に不溶性のポリマー）を含む。
【０１２７】
典型的な一実施形態において、修飾糖断片は、カルボニル含有糖断片を、その構造内に水溶性ポリマーを含むウィティッヒ試薬、例えば、ｍ−ＰＥＧと反応させることによって調製する。ｍ−ＰＥＧのウィティッヒ試薬は、クロロ−ｍ−ＰＥＧをＰＰＨ３と反応させ、生じた付加体を塩基で処理してイリドを形成することによって容易に形成される。本発明の化合物の形成に使用される他のイリドは、アルブゾフ反応によってアルキルホスホネートを脱プロトンし、ホーナー−エモンズ反応にとって適切な条件下で、糖断片のカルボニル部分をこのイリドと反応させることによって調製する。
【０１２８】
本発明に用いられるグリニヤール試薬、例えば、ｍ−ＰＥＧＭｇＢｒは、当業界で認められている方法によって容易に調製される。例えば、ｍ−ＰＥＧ−Ｂｒを無水条件下でＭｇと反応させる。
【０１２９】
他の典型的な実施形態において、カルボニル含有糖断片をアンモニアによって還元的にアミノ化する。生じたアミンを、選択された修飾基、例えば、ｍ−ＰＥＧまたは分枝状ｍ−ＰＥＧによってアルキル化またはアシル化する。
【０１３０】
典型的には、糖断片は単糖であるが、シアル酸の側鎖は他の糖の近接ジオールの存在下で選択的に酸化されるため、本発明は修飾シアル酸の使用に限定されず、同様に、シアル酸断片含有オリゴ糖および多糖も使用される。
【０１３１】
他の態様において、本発明は、本発明の方法に使用される活性化修飾糖断片を提供する典型的な活性化修飾糖断片は活性化脱離基を含む。本明細書に用いられる用語の「活性化脱離基」とは、酵素調節求核性置換反応において容易に置換される部分を指す。多くの活性化糖が当業界に知られている。例えば、ＣＡＲＢＯＨＹＤＲＡＴＥ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＬＯＧＹ、第２巻、エルンスト（Ｅｒｎｓｔ）ら編、ウィリー−ＶＣＨフェアラーク（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ）：ワインハイム、ドイツ国、２０００年におけるヴォカドロ（Ｖｏｃａｄｌｏ）ら；コダマら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３４：６４１９頁（１９９３）；ラフィード（Ｌｏｕｇｈｅｅｄ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３７７１７（１９９９）を参照されたい。
【０１３２】
この態様による典型的な一実施形態において、糖断片は、式Ｉによる構造を有し、式中、Ｒ２は活性化基である。典型的な活性化基はヌクレオチドであり、糖部分が糖断片であるヌクレオチド糖を形成する。Ｒ２はまた、ハロゲン、スルホネートエステルなどの脱離基（活性化基）であり得る。
【０１３３】
典型的な脱離基は、修飾糖断片を基質上の受容体部分に付加するために利用できるヌクレオチドである。本発明の化合物に存在する典型的な糖ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドモノ、ジ、またはトリホスフェ−トまたはそれらの類縁体が挙げられる。好ましい一実施形態において、修飾糖断片ヌクレオチドは、ＵＤＰ−グリコシド、ＣＭＰ−グリコシド、またはＧＤＰ−グリコシドから選択される。さらにいっそう好ましくは、修飾糖断片ヌクレオチドは、糖部分（ヌクレオチドリボース以外）が修飾基を担持する糖断片であるＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−ガラクトサミン、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−グルコサミン、ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−フコース、ＣＭＰ−シアル酸またはＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの類縁体から選択される。
【０１３４】
典型的な実施形態において、１つまたは複数の糖ヌクレオチドまたは修飾糖ヌクレオチドがグリコシルトランスフェラーゼと関連させて用いられる。
【０１３５】
他の実施形態において、活性化部分は、ヌクレオチド以外の活性化脱離基である。非ヌクレオチド活性化基の例としては、フルオロ、クロロ、ブロモ、トシレートエステル、メシレートエステル、トリフレートエステルなどが挙げられる。本発明に使用される好ましい受容体へのグリコシドの酵素的転移を立体的に有意に妨げないものである。したがって、活性化グリコシル誘導体の好ましい実施形態は、グリコシルフルオリドおよびグリコシルメシレートを含み、グリコシルフルオリドが特に好ましい。グリコシルフルオリドの中でも、α−ガラクトシルフルオリド、α−マンノシルフルオリド、α−グリコシルフルオリド、α−フコシルフルオリド、α−キシロシルフルオリド、α−シアリルフルオリド、α−Ｎ−アセチルグルコサミニルフルオリド、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニルフルオリド、β−ガラクトシルフルオリド、β−マンノシルフルオリド、β−グルコシルフルオリド、β−フコシルフルオリド、β−キシロシルフルオリド、β−シアリルフルオリド、β−Ｎ−アセチルグルコサミニルフルオリドおよびβ−Ｎ−アセチルガラクトサミニルフルオリド、が最も好ましい。
【０１３６】
例えば、グリコシルフルオリドは、糖断片または修飾糖断片から、まず、糖をアセチル化し、次いでそれを、ＨＦ／ピリジンにより処理することによって調製できる。これによって、保護された（アセチル化された）グリコシルフルオリド（すなわち、α−グリコシルフルオリド）の熱力学的に最も安定したアノマーが生成する。より安定性の低いアノマー（すなわち、β−グリコシルフルオリド）が所望の場合は、過アセチル化糖をＨＢｒ／ＨＯＡｃまたはＨＣｌによって変換させて、アノマーの臭化物または塩化物を生成させることによって調製できる。この中間体をフッ化銀などのフッ素の塩と反応させて、グリコシルフルオリドを生成させる。アセチル化グリコシルフルオリドは、メタノール中、緩和な（触媒的）塩基（例えば、ＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ）との反応によって脱保護できる。また、多くのグリコシルフルオリドが市販されている。
【０１３７】
他の活性化グリコシル誘導体は、当業者に知られている慣例的方法を用いて調製できる。例えば、グリコシルメシレートは、完全にベンジル化したヘミアセタール形態の糖をメシルクロライドによって処理し、引き続き、触媒的水素化を行ってベンジル基を徐仔することによって調製できる。
【０１３８】
典型的な一実施形態において、上記のものなどの１つまたは複数の活性化グリコシル誘導体を、分解酵素の変異体である酵素と関連させて用いるが、該酵素は、グリコシド結合またはアミノ−グリコシド結合を優先的に開裂する野生型の活性に比較して、グリコシド結合またはアミノ−グリコシド結合を形成する活性を増強させるように変異させてある。この実施形態に用いられる酵素としては、国際公開第０３／０４６１５０号パンフレット、国際公開第０３／０４５９８０号パンフレット、およびそれらの対応米国特許出願に記載されているものが挙げられる。
【０１３９】
式Ｉによる部分を含むことに加えて、本発明の結合体は、該結合体のアミノ酸、アグリコンまたはグリコシル残基に付加した１つまたは複数のさらなる修飾糖断片を含み得る。本発明の修飾糖断片と組み合わせて使用される典型的な修飾糖断片の構造および調製は、国際公開第０３／０３１４６４号パンフレットおよび関連した米国出願およびＰＣＴ出願にも開示されている。
【０１４０】
糖
本発明の修飾糖断片結合体の糖コアとして任意の糖が使用できる。本発明の組成物の形成に有用な典型的な糖コアとしては、限定はしないが、シアル酸、グルコース、ガラクトース、およびマンノース、ならびにこれらの糖のＮ−アセチル類縁体が挙げられる。また、フコース、キシロース、リボース、およびアラビノースもまた使用される。糖コアが二糖、オリゴ糖または多糖である化学種もまた本発明に包含される。
【０１４１】
本発明は、式：
【化６】
2008526864.tif 000007
【０１４２】
で表されるグリコシル結合基を含むペプチド結合体または脂質結合体を提供する。
【０１４３】
他の実施形態において、グリコシル結合基は、式：
【化７】
2008526864.tif 000008
【０１４４】
で表され、式中、指数ｔは０または１である。
【０１４５】
さらなる典型的な実施形態において、グリコシル結合基は、式：
【化８】
2008526864.tif 000009
【０１４６】
で表され、式中、指数ｔは０または１である。
【０１４７】
さらに他の実施形態において、グリコシル結合基は、式：
【化９】
2008526864.tif 000010
【０１４８】
で表され、式中、指数ｐは１から１０の整数を表し；ａは０または１である。
【０１４９】
典型的な一実施形態において、本発明は、以下に記載された式：
【化１０】
2008526864.tif 000011
【０１５０】
から選択されるグリコＰＥＧ化ペプチド結合体を提供する。
【０１５１】
上記の式において、指数ｔは０から１の整数であり、指数ｐは１から１０の整数である。記号Ｒ１５’は、Ｈ、ＯＨ（例えば、Ｇａｌ−ＯＨ）、修飾糖断片（Ｍｓｆ）、−Ｌａ−Ｒ６ａを含んでなるＭｓｆ、Ｒ６ａを含んでなるＭｓｆを表し、Ｒ６ａはポリマー性修飾基であるか、または−Ｌａ−Ｒ６ａを含んでなる修飾糖断片に結合しているシアリル部分（例えば、Ｓｉａ−Ｍｓｆ−Ｌａ−Ｒ６ａ）、またはＲ６ａを含んでなる修飾糖断片に結合しているシアリル部分（例えば、Ｓｉａ−Ｍｓｆ−Ｒ６ａ）（「Ｓｉａ−Ｍｓｆｐ」）である。典型的なポリマー性修飾糖部分は、式Ｉによる構造を有する。本発明の典型的なペプチド結合体式Ｉによる構造を含むＲ１５’を有する少なくとも１つのグリカンを含む。さらなる典型的な一実施形態において、ガラクトース残基の３位の炭素に酸素が結合している。典型的一実施形態において、修飾シアル酸がガラクトース残基に対してα２，３に結合している。他の典型的な実施形態において、シアル酸がガラクトース残基に対してα２，６に結合している。
【０１５２】
典型的な一実施形態において、Ｒ１５’は、−Ｌａ−Ｒ６ａまたはＲ６ａを含んでなる修飾糖断片が結合しているシアリル部分（例えば、Ｓｉａ−Ｍｓｆ−Ｌａ−Ｒ６ａ）（「Ｓｉａ−Ｍｓｆｐ」）である。ここで、グリコシル結合基は、シアリル部分を介してガラクトシル部分に結合している：
【化１１】
2008526864.tif 000012
【０１５３】
このモチーフによる典型的な化学種は、Ｓｉａ−Ｓｉａ結合を形成する酵素、例えば、ＣＳＴ−ＩＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩＩおよびＳＴ８Ｓｉａ−ＩＶを用いて、Ｍｓｆ−Ｌａ−Ｒ６ａをグリカンの末端のシアル酸に結合することによって調製される。
【０１５４】
他の典型的な実施形態において、ペプチド結合体上のグリカンは、群：
【化１２】
2008526864.tif 000013
【０１５５】
およびそれらの組み合わせから選択される式で表される。
【０１５６】
上記の式の各々において、Ｒ１５’は上記のとおりである。さらに、本発明の典型的なペプチド結合体は、式による構造を有するＲ１５’部分を有する少なくとも１つのグリカンを含む。
【０１５７】
他の典型的な実施形態において、グリコシル結合基は、
【化１３】
2008526864.tif 000014
【０１５８】
による式で表され、式中、Ｒ１５は、修飾糖断片を含み；指数ｐは１から１０より選択される整数である。
【０１５９】
典型的な一実施形態において、修飾糖断片は式：
【化１４】
2008526864.tif 000015
【０１６０】
で表され、式中、ｂは０から１の整数である。指数ｓは１から１０の整数を表し；指数ｆは１から２５００の整数を表す。
【０１６１】
他の典型的な実施形態において、ペプチド結合体は、式：
【化１５】
2008526864.tif 000016
【化１６】
2008526864.tif 000017
【化１７】
2008526864.tif 000018
【化１８】
2008526864.tif 000019
【化１９】
2008526864.tif 000020
【化２０】
2008526864.tif 000021
【化２１】
2008526864.tif 000022
【０１６２】
から選択されるグリコシル部分を含んでなり、式中、指数ｐは１から１０の整数である。指数のｔおよびａは独立して、０または１から選択される。指数のｍおよびｎは、０から５０００より独立して選択される整数である。指数のｊおよびｋは、０から２０より独立して選択される整数である。Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、Ａ１０およびＡ１１は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、および置換または非置換ヘテロアリール、ＮＡ１２Ａ１３、−ＯＡ１２および−ＳｉＡ１２Ａ１３から独立して選択されるメンバーである。Ａ１２およびＡ１３は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリールから独立して選択されるメンバーである。ＡＡはペプチドのアミノ酸残基である。これらの基の各々は、上記のモノ、バイ、トリおよびテトラ触角の糖構造の構成部分として含めることができる。Ｌａは、ポリマー性修飾基部分と修飾された糖断片との反応から生じるリンカーである。典型的な結合基としては、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキル部分が挙げられる。リンカーの典型的な構成部分は、アシル部分である。他の典型的な結合基は、アミノ酸（例えば、システイン、セリン、リシン、および短鎖オリゴペプチド、例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｃｙｓ−Ｌｙｓ、Ｓｅｒ−Ｌｙｓなど）である。
【０１６３】
修飾基
本発明のペプチド結合体は修飾基を含んでなる。この基は、アミノ酸またはグリコシル結合基を介してペプチドに共有結合できる。「修飾基」は、標的部分、治療的部分、生体分子などの種々の構造を包含し得る。また、「修飾基」は、ペプチドの生物学的利用能または体内におけるその半減期など、ペプチドの性質を変化させることができるポリマー性修飾基を含む。
【０１６４】
典型的な一実施形態において、該修飾基は、該結合体の構成部分としての標的薬剤の存在により、特定の組織における選択性を局所化する修飾基である。典型的な一実施形態において、標的薬剤はタンパク質である。典型的なタンパク質としては、トランスフェリン（脳、血液プール）、ＨＳ−糖タンパク質（骨、脳、血液プール）、抗体（脳、抗体特異的抗原を有する組織、血液プール）、凝集因子Ｖ〜ＸＩＩ（損傷組織、凝血塊、癌、血液プール）、血清タンパク質、例えば、α−酸糖タンパク質、フェチュイン、α−胎児タンパク質（脳、血液プール）、β２−糖タンパク質（肝臓、アテローム硬化症プラーク、脳、血液プール）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、およびＥＰＯ（免疫刺激、癌、血液プール、赤血球過剰産生、神経保護）、アルブミン（半減期の増加）、およびリポタンパク質Ｅが挙げられる。
【０１６５】
利便性を目的にして、この節の残りの修飾基は主に、水溶性および水不溶性ポリマーなどのポリマー性修飾基に基づいている。しかし、標的部分、治療的部分および生体分子などの他の修飾基がポリマー性修飾基の替わりに使用できることを、当業者は認識されるであろう。
【０１６６】
修飾基のリンカー
修飾基のリンカーは、グリコシル結合基への修飾基（すなわち、ポリマー性修飾基、標的部分、治療的部分および生体分子）の結合に役立つ。典型的な一実施形態において、ポリマー性修飾基は、下記に示すように、リンカーＬａを介して、一般にコア上のヘテロ原子、例えば窒素を介して、グリコシル結合基に結合している：
【化２２】
2008526864.tif 000023
【０１６７】
Ｒ６ａは、ポリマー性修飾基であり、Ｌａは結合および結合基から選択される。指数ｗは、１〜６、好ましくは１〜３、より好ましくは１〜２から選択される整数である。典型的な結合基としては、置換または非置換アルキル部分および置換または非置換ヘテロアルキル部分が挙げられる。リンカーの典型的な構成部分は、アシル部分である。
【０１６８】
典型的な一実施形態において、本発明は、上記の式Ｉによる構造を有し、式中、Ｙ２は、式：
【化２３】
2008526864.tif 000024
【０１６９】
から選択される。
【０１７０】
他の典型的な実施形態において、該化合物はウィティッヒ反応の生成物であり、Ｙ２は式：
【化２４】
2008526864.tif 000025
【０１７１】
で表される。
【０１７２】
他の典型的な実施形態において、該化合物は修飾糖結合断片とグリニヤール試薬またはリチウム試薬との反応から形成され、Ｙ２は式：
【化２５】
2008526864.tif 000026
【０１７３】
から選択される構造を有する。
【０１７４】
さらに他の典型的な実施形態において、グリコシル結合基とポリマー性修飾基は、ジアミンを介して結合している。本発明のこの態様による典型的な一化合物において、Ｙ２は式：
【化２６】
2008526864.tif 000027
【０１７５】
で表される。
【０１７６】
他の典型的な実施形態において、グリコシル結合基と修飾基は、アミノカルボン酸を介して結合している。本発明のこの態様による典型的な一化合物において、Ｙ２は式：
【化２７】
2008526864.tif 000028
【０１７７】
で表される。
【０１７８】
さらに他の典型的な実施形態において、アルデヒド含有グリコシル結合基は、アンモニアにより還元的にアミノ化され、生じたアミンを、ポリマー性修飾基の結合に用い、それによって、アミド結合を形成する。本発明のこの態様において、Ｙ２は式：
【化２８】
2008526864.tif 000029
【０１７９】
から選択され、式中、指数ｓは、０から２０の整数である。
【０１８０】
典型的な一実施形態において、ポリマー性修飾基−リンカー構築体は、中心部分に結合した２つ以上のポリマー鎖を含む分枝状構造である。この実施形態において、該構築体は、式：
【化２９】
2008526864.tif 000030
【０１８１】
で表され、式中、Ｒ６ａおよびＬａは上記のとおりであり、ｗ’は２から６、好ましくは、２から４、より好ましくは、２から３の整数である。
【０１８２】
Ｌａが結合の場合、それはＲ６ａの前駆体上の反応性官能基と糖コア上の相補的反応性の反応性官能基との間に形成される。Ｌａが非ゼロ位数のリンカーである場合、Ｌａの前駆体は、Ｒ６ａの前駆体との反応前にグリコシル部分上に置かれ得る。あるいは、Ｒ６ａとＬａの前駆体を予備形成されたカセット内に組み込むことができ、これを引き続きグリコシル部分に結合させる。本明細書に記載された適切な反応性官能基による前駆体の選択および調製は、当業者の能力内にある。さらに、前駆体の結合は、当業界で十分に認識されている化学によって進行する。
【０１８３】
典型的な一実施形態において、Ｌａはアミノ酸から形成される結合基であるか、またはポリマー性修飾基が置換アルキルリンカーを介して結合している修飾糖を提供する小型ペプチド（例えば、１〜４のアミノ酸残基）である。典型的なリンカーとしては、グリシン、リシン、セリンおよびシステインが挙げられる。ＰＥＧ部分は、アミド結合またはウレタン結合を介してリンカーのアミン部分に結合できる。ＰＥＧはシステインおよびセリンのイオウ原子または酸素原子に、それぞれ、チオエーテル結合またはエーテル結合を介して結合している。
【０１８４】
水溶性ポリマー
多くの水溶性ポリマーが当業者に知られており、本発明の実施に有用である。水溶性ポリマーという用語は、糖（例えば、デキストラン、アミロース、ヒアルロン酸、ポリ（シアル酸）、ヘパラン、ヘパリンなど）；ポリ（アミノ酸）、例えば、ポリ（アスパラギン酸）およびポリ（グルタミン酸）；核酸；合成ポリマー、例えば、ポリ（アクリル）酸、ポリ（エーテル）、例えば、ポリ（エチレングリコール）；ペプチド、タンパク質などの化学種を包含する。本発明は、該水溶性ポリマーが該結合体の残部が結合できる点を含まなければならないという１つの限定だけを有して、任意の水溶性ポリマーによって実施できる。
【０１８５】
ポリマーを活性化する方法はまた、国際公開第９４／１７０３９号パンフレット、米国特許第５，３２４，８４４号明細書、国際公開第９４／１８２４７号パンフレット、国際公開第９４／０４１９３号パンフレット、米国特許第５，２１９，５６４号明細書、米国特許第５，１２２，６１４号明細書、国際公開第９０／１３５４０号パンフレット、米国特許第５，２８１，６９８号明細書、およびさらに、国際公開第９３／１５１８９号パンフレットに、活性化ポリマーとペプチドとの間の結合体に関して、例えば、凝集因子ＶＩＩＩ（国際公開第９４／１５６２５号パンフレット）、ヘモグロビン（国際公開第９４／０９０２７号パンフレット）、酸素担持分子（米国特許第４，４１２，９８９号明細書）、リボヌクレアーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ（ベロネーゼ（Ｖｅｒｏｎｅｓｅ）ら、Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１１：１４１−４５頁（１９８５）に関して見ることができる。
【０１８６】
典型的な水溶性ポリマーは、ポリマーサンプル中のかなり大きな部分のポリマー分子がほぼ同じ分子量を有するものであり、このようなポリマーは、「均一分散」である。
【０１８７】
本発明はポリ（エチレングリコール）結合体を参照としてさらに例示される。ＰＥＧの官能化および結合についてのレビューおよびモノグラフが入手可能である。例えば、ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）、Ｍａｃｒｏｎｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃ２５：３２５−３７３頁（１９８５）；スクーテン（Ｓｃｏｕｔｅｎ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３５；３０−６５頁（１９８７）；ウォン（Ｗｏｎｇ）ら、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８６６−８７４頁（１９９２）；ザリプスキー（Ｚａｌｉｐｓｋｙ）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．６：１５０−１６５頁（１９９５）；およびブハドラ（Ｂｈａｄｒａ）ら、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ、５７：５−２９頁（２００２）を参照されたい。反応性ＰＥＧ分子を調製するための、および反応分子を用いて結合体を形成するための経路は、当業界に知られている。例えば、米国特許第５，６７２，６６２号明細書は、線状または分枝状のポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、およびポリ（アクリロモルホリン）から選択されるポリマー酸の活性エステルの水溶性で単離可能な結合体を開示している。
【０１８８】
米国特許第６，３７６，６０４号明細書は、有機溶媒中、ポリマーの末端ヒドロキシルをジ（１−ベンゾトリアゾリル）カルボネートと反応させることによって、水溶性で非ペプチドポリマーの水溶性１−ベンゾトリアゾイルカルボネートエステルを調製する方法を記載している。該活性エステルは、タンパク質またはペプチドなどの生物学的活性剤による結合体の形成に用いられる。
【０１８９】
国際公開第９９／４５９６４号パンフレットは、生物学的活性剤および安定な結合を介してポリマー主鎖に結合した少なくとも１つの末端を有するポリマー主鎖を含んでなる活性化水溶性ポリマーを含んでなる結合体であって、少なくとも１つの末端が、分枝状部分に結合した近位反応性基を有する分枝状部分を含んでなり、該生物学的活性剤が少なくとも１つの近位反応性基に結合している結合体を記載している。他の分枝状ポリ（エチレングリコール）が、国際公開第９６／２１４６９号パンフレットに記載されており、米国特許第５，９３２，４６２号明細書は、反応性官能基を含む分枝状末端を含む分枝状ＰＥＧ分子によって形成された結合体を記載している。遊離の反応性基を、タンパク質またはペプチドなどの生物学的活性種と反応させて、ポリ（エチレングリコール）と生物学的活性種との間の結合体を形成するために利用できる。米国特許第５，４４６，０９０号明細書は、二官能性ＰＥＧリンカーおよびＰＥＧリンカー末端の各々にペプチドを有する結合体形成におけるその使用を記載している。
【０１９０】
分解可能な結合を含む結合体は、国際公開第９９／３４８３３号パンフレット；および国際公開第９９／１４２５９号パンフレット、ならびに米国特許第６，３４８，５５８号明細書に記載されている。このような分解可能な結合は本発明に適用できる。
【０１９１】
上記に記載したポリマー活性化の当業界に認められた方法は、本明細書に記載された分枝状ポリマーの形成において、および他の化学種、例えば、糖、糖ヌクレオチドなどへのこれらの分枝状ポリマーの結合のために、本発明の文脈において使用される。
【０１９２】
典型的な水溶性ポリマーはポリ（エチレングリコール）、例えば、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）である。本発明に用いられるポリ（エチレングリコール）は、いずれかの特定の形態または分子量範囲に限定されない。非分枝状ポリ（エチレングリコール）分子では、分子量は５００から１００，０００の間であることが好ましい。２０００〜６０，０００の分子量が好ましく用いられ、好ましくは、約５，０００から約４０，０００である。
【０１９３】
典型的な一実施形態において、本発明のポリ（エチレングリコール）は、限定はしないが、下記に記載された化学種である。
【化３０】
2008526864.tif 000031
【０１９４】
式中、Ｒ１８は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、例えば、アセタール、ＯＨＣ−、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−、ＨＳ−ＣＨ２ＣＨ２−および−（ＣＨ２）ｑＣ（Ｙ１）Ｚ２；糖−ヌクレオチド、またはタンパク質である。指数「ｃ」は、１から２５００の整数を表す。指数ｄ、ｏ、およびｑは独立して、０から２０の整数を表す。記号Ｚ１は、ＯＨ、ＮＨ２、ハロゲン、Ｓ−Ｒ１９、活性化エステルのアルコール部分、−（ＣＨ２）ｄｌＣ（Ｙ３）Ｖ、−（ＣＨ２）ｄｌＵ（ＣＨ２）ｇＣ（Ｙ３）ｖ、糖−ヌクレオチド、タンパク質、および脱離基、例えば、イミダゾール、ｐ−ニトロフェニル、ＨＯＢＴ、テトラゾール、ハライドを表す。記号Ｘ、Ｙ１、Ｙ３、Ｗ、Ｕは独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ−Ｒ２０の部分を表す。記号Ｖは、ＯＨ、ＮＨ２、ハロゲン、Ｓ−Ｒ２１、活性化エステルのアルコール部分、活性化アミドのアミン部分、糖−ヌクレオチド、およびタンパク質を表す。指数ｄｌ、ｇおよびｖは、０から２０の整数から独立して選択されるメンバーである。記号Ｒ１９、Ｒ２０およびＲ２１は独立して、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロシクロアルキルおよび置換または非置換ヘテロアリールを表す。
【０１９５】
他の典型的実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、以下：
【化３１】
2008526864.tif 000032
【０１９６】
から選択される。
【０１９７】
他の実施形態において、ポリ（エチレングリコール）は、結合した１つ超のＰＥＧ部分を有する分枝状ＰＥＧである。分枝状ＰＥＧの例は、米国特許第５，９３２，４６２号明細書、米国特許第５，３４２，９４０号明細書；米国特許第５，６４３，５７５号明細書；米国特許第５，９１９，４５５号明細書；米国特許第６，１１３，９０６号明細書；米国特許第５，１８３，６６０号明細書；国際公開第０２／０９７６６号パンフレット；コデラ  Ｙ．（Ｋｏｄｅｒａ  Ｙ．）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５：２８３−２８８頁（１９９４）；およびＹａｍａｓａｋｉら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５２：２１２５−２１２７頁、１９９８年に記載されている。好ましい一実施形態において、分枝状ＰＥＧの各ポリ（エチレングリコール）の分子量は、４０，０００ダルトン以下である。
【０１９８】
代表的なポリマー性修飾部分は、側鎖含有アミノ酸、例えば、セリン、システイン、リシン、および小型ペプチド、例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓに基づいた構造を含む。典型的な構造としては：
【化３２】
2008526864.tif 000033
【０１９９】
が挙げられる。ジ−リシン構造における遊離アミンもまた、ＰＥＧ部分により、アミド結合またはウレタン結合を介してＰＥＧ化できることを当業者は認識されるであろう。
【０２００】
さらに他の実施形態において、ポリマー性修飾基は、トリ−リシンペプチドに基づく分枝状ＰＥＧ部分である。トリ−リシンは、モノ、ジ、トリ、またはテトラ−ＰＥＧ化したものであり得る。この実施形態による典型的な化学種は、式：
【化３３】
2008526864.tif 000034
【０２０１】
で表され、式中、したがって、指数ｅ、ｆおよびｆ’は独立して、１から２５００の整数から選択され；指数ｑ、ｑ’、ｑ’’は独立して、１から２０の整数から選択される。
【０２０２】
当業者には明らかであろうが、本発明に用いられる分枝状ポリマーは、上記のテーマに関して変型を含む。例えば、上記に示されたジ−リシン−ＰＥＧ結合体は、３つのポリマーサブユニットを含み得、第３のものはα−アミンに結合しており、上記の構造において非修飾として示される。同様に、所望の様式におけるポリマー性修飾部分により標識化された３つまたは４つのポリマーサブユニットを有する官能化したトリ−リシンの使用は本発明の範囲内にある。
【０２０３】
本明細書に検討されているとおり、本発明の結合体に用いられるＰＥＧは、線状であっても分枝状であってもよい。本発明のこの実施形態による分枝状ＰＥＧ含有ペプチド結合体を形成するために使用される典型的な前駆体は、式：
【化３４】
2008526864.tif 000035
【０２０４】
で表される。本発明のこの実施形態による分枝状ＰＥＧ含有ペプチド結合体を形成するために使用される他の典型的な前駆体は、式：
【化３５】
2008526864.tif 000036
【０２０５】
で表され、式中、指数ｍおよびｎは、０から５０００より独立して選択される整数である。指数ｔおよびａは、０から１より独立して選択される。指数ｊおよびｋは、０から２０より独立して選択される整数である。Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、Ａ１０およびＡ１１は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、−ＮＡ１２Ａ１３、−ＯＡ１２および−ＳｉＡ１２Ａ１３から独立して選択されるメンバーである。Ａ１２およびＡ１３は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリールから独立して選択されるメンバーである。
【０２０６】
この式による分枝状ポリマー種は、本質的に純粋な水溶性ポリマーである。Ｘ３’は、イオン化可能な基（例えば、ＯＨ、ＣＯＯＨ、Ｈ２ＰＯ４、ＨＳＯ３、ＮＨ２、およびそれらの塩など）または他の反応性官能基、例えば、下記のものを含む部分である。Ｃは炭素である。Ｘ５、Ｒ１６およびＲ１７は、非反応性基（例えば、Ｈ、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル）およびポリマー性アーム（例えばＰＥＧ）から独立して選択される。Ｘ２およびＸ４は、生理的条件下で本質的に非反応性であることが好ましい結合断片であり、同一であっても異なっていてもよい。典型的なリンカーは、芳香族部分もエステル部分も含まない。あるいは、これらの結合は、生理的関連条件下で分解するようにデザインされている１つまたは複数の部分、例えば、エステル、ジスルフィドなどを含んでもよい。Ｘ２およびＸ４は、ポリマーのアームＲ１６およびＲ１７をＣに結合させる。Ｘ３’が、リンカー、糖またはリンカー−糖カセット上の相補的反応性の反応性官能基と反応する場合、Ｘ３’は結合断片Ｘ３の構成部分に変換される。
【０２０７】
Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４に関する典型的な結合断片は独立して選択され、Ｓ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、（Ｏ）ＣＮＨおよびＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ならびにＯＣ（Ｏ）ＮＨ、ＣＨ２Ｓ、ＣＨ２Ｏ、ＣＨ２ＣＨ２Ｏ、ＣＨ２ＣＨ２Ｓ、（ＣＨ２）ｏＯ、（ＣＨ２）ｏＳまたは（ＣＨ２）ｏＹ’−ＰＥＧが挙げられ、Ｙ’は、Ｓ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）ＮＨ、またはＯであり、ｏは、１から５０の整数である。典型的な一実施形態において、結合断片Ｘ２およびＸ４は、異なる結合断片である。
【０２０８】
典型的な一実施形態において、前駆体（式ＩＩ）、またはその活性化誘導体は、Ｘ３’と糖部分上の相補的反応性の基、例えばアミンとの間の反応によって、糖、活性化糖または糖ヌクレオチドと反応し、それによってそれと結合する。あるいは、Ｘ３’は、リンカー、Ｌへ前駆体上の反応性官能基と反応する。
【０２０９】
典型的な一実施形態において、該部分：
【化３６】
2008526864.tif 000037
【０２１０】
はリンカーアーム、Ｌである。この実施形態において、典型的なリンカーは、天然または非天然アミノ酸、アミノ酸類縁体もしくはアミノ酸模倣物、または１つまたは複数のこのような化学種から形成された小型ペプチドから誘導される。例えば、本発明の化合物に見られる一定の分枝状ポリマーは、式：
【化３７】
2008526864.tif 000038
【０２１１】
で表される。
【０２１２】
Ｘａは、分枝状ポリマー性修飾部分の前駆体上の反応性官能基、例えばＸ３’と、糖上の反応性修飾基、またはリンカーへの前駆体との反応によって形成される結合断片である。例えば、Ｘ３’がカルボン酸の場合、それは活性化されて、アミノ糖（例えば、Ｓｉａ、ＧａｌＮＨ２、ＧｌｃＮＨ２、ＭａｎＮＨ２など）から懸垂しているアミン基に直接結合し、アミドであるＸａを形成する。さらなる典型的な反応性官能基および活性化前駆体は、本明細書の下記に記載されている。指数ｃは１から１０の整数を表す。他の記号は、上記で検討されたものと同一性を有する。
【０２１３】
他の典型的な実施形態において、Ｘａは他のリンカーによって形成された結合部分である：
【化３８】
2008526864.tif 000039
【０２１４】
式中、Ｘｂは第２の結合断片であり、Ｘａに関して記載された基から独立して選択され、Ｌａと同様に、Ｌ１は結合、置換または非置換アルキルもしくは置換または非置換ヘテロアルキルである。
【０２１５】
ＸａおよびＸｂに関する典型的な化学種としては、Ｓ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨおよびＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ならびにＯＣ（Ｏ）ＮＨが挙げられる。
【０２１６】
他の典型的な実施形態において、Ｘ４は、アミノ酸、ジペプチド（例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）またはトリペプチド（例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）である、Ｒ１７に対するペプチド結合であり、アルファアミン部分および／または側鎖ヘテロ原子がポリマー性修飾部分によって修飾されている。
【０２１７】
さらなる一実施形態において、本発明のペプチド結合体は、ある部分、例えば、以下：
【化３９】
2008526864.tif 000040
【０２１８】
から選択される式を有するＲ１５’を含み、式中、種々の記号によって表された基の当体は、本明細書の上記で検討されたものと同じである。Ｌａは、ＬおよびＬ１に関して上記で検討された結合またはリンカーであり、例えば、置換または非置換アルキル部分または置換または非置換ヘテロアルキル部分である。典型的な一実施形態において、Ｌａは、示されたようなポリマー性修飾部分によって官能化されている部分である。典型的なＬａ部分は、置換または非置換アルキル鎖、ＮＨおよびＮＲ６を含む。
【０２１９】
さらに他の実施形態において、本発明は、ある部分、例えば、式：
【化４０】
2008526864.tif 000041
【０２２０】
で表されるＲ１５’部分を有する。種々の記号によって表された基の当体は、本明細書の上記で検討されたものと同じである。当業者は認識されるであろうが、式ＶＩＩにおけるリンカーアームは、本明細書に記載された他の修飾糖に等しく適応できる。典型的な一実施形態において、式ＶＩＩの化学種は、本明細書に説明されたグリカン構造に結合されたＲ１５部分である。
【０２２１】
典型的な一実施形態において、グリコシル結合基は、以下の式：
【化４１】
2008526864.tif 000042
【０２２２】
で表される構造を有する。
【０２２３】
上記に記載された本発明の実施形態は、該ポリマーが水溶性ポリマー、特にポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）、例えば、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）である化学種を参照してさらに例示される。以下の節における焦点は、例示ポリマーとしてＰＥＧを使用して記載された説明および種々のモチーフを明確化することであるが、これらはＰＥＧ以外のポリマーを利用する化学種に等しく適用できることを、当業者は認識するであろう。
【０２２４】
任意の分子量、例えば、１ｋＤａ、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、５５ｋＤａ、６０ｋＤａ、６５ｋＤａ、７０ｋＤａ、７５ｋＤａおよび８０ｋＤａを有するＰＥＧが本発明に用いられる。
【０２２５】
典型的な実施形態において、ペプチド結合体は：
【化４２】
2008526864.tif 000043
【０２２６】
から選択されるＲ１５’部分を含む。
【０２２７】
上記式の各々において、指数ｅおよびｆは、１から２５００までの整数から独立して選択される。さらに典型的な実施形態において、ｅおよびｆは、約１ｋＤａ、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、５５ｋＤａ、６０ｋＤａ、６５ｋＤａ、７０ｋＤａ、７５ｋＤａおよび８０ｋＤａであるＰＥＧ部分を提供するために選択される。記号Ｑは、置換または非置換アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、例えば、メチル）、置換または非置換ヘテロアルキルまたはＨを表す。
【０２２８】
他の分枝状ポリマーは、ジ−リシン（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）ペプチド、例えば：
【化４３】
2008526864.tif 000044
【０２２９】
およびトリ−リシン（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）ペプチド、例えば：
【化４４】
2008526864.tif 000045
【０２３０】
に基づく構造を有する。上記図の各々において、指数ｅ、ｆ、ｆ’およびｆ’’は、１〜２５００から独立して選択される整数を表す。指数ｑ、ｑ’およびｑ’’は、１〜２０から独立して選択される整数を表す。
【０２３１】
別の典型的な実施形態において、Ｙ２は：
【化４５】
2008526864.tif 000046
【０２３２】
から選択されるメンバーである式で表され、
式中Ｑは、Ｈおよび置換または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルから選択されるメンバーである。指数ｅおよびｆは、１〜２５００から独立して選択される整数であり、指数ｑは、０〜２０から選択される整数である。
【０２３３】
別の典型的な実施形態において、Ｙ２は：
【化４６】
2008526864.tif 000047
【０２３４】
から選択されるメンバーである式をで表され、
式中、Ｑは、Ｈおよび置換または非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルから選択されるメンバーである。指数ｅ、ｆおよびｆ’は、１〜２５００から独立して選択される整数であり、指数ｑおよびｑ’は、１〜２０から独立して選択される整数である。
【０２３５】
別の典型的な実施形態において、分枝状ポリマーは、以下の式：
【化４７】
2008526864.tif 000048
【０２３６】
で表される構造を有し、
式中、指数ｍおよびｎは、０〜５０００から独立して選択される整数である。指数ｔおよびａは、０または１から独立して選択される。指数ｊおよびｋは、０〜２０から独立して選択される整数である。Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、Ａ１０およびＡ１１は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、−ＮＡ１２Ａ１３、−ＯＡ１２および−ＳｉＡ１２Ａ１３から独立して選択されるメンバーである。Ａ１２およびＡ１３は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリールから独立して選択されるメンバーである。
【０２３７】
式ＩＩａは、式ＩＩのサブセットである。式ＩＩａにより記載される構造は、式ＩＩによっても包含される。
【０２３８】
上記式で表される別の典型的な実施形態において、分枝状ポリマーは、以下の式：
【化４８】
2008526864.tif 000049
【０２３９】
で表される構造を有する。典型的な実施形態において、Ａ１およびＡ２は、各々−ＯＣＨ３またはＨである。
【０２４０】
典型的な実施形態において、修飾糖断片は、酸化シアリル側鎖のアルデヒド基を、グリニャール試薬またはウィッティヒ試薬または適切なアミン含有試薬と反応させることによってポリマー性修飾基に結合させ、それによってイミンを形成し、あるいは還元される。本実施形態に従った式としては：
【化４９】
2008526864.tif 000050
【０２４１】
が挙げられる。
【０２４２】
別の典型的な実施形態において、修飾糖断片を、ジアミノアルキルリンカーまたはアミノカルボン酸リンカーを介してポリマー修飾基に結合させる。本実施形態に従った式としては：
【化５０】
2008526864.tif 000051
【０２４３】
が挙げられ、式中、指数ｈは、０から２０までの整数であり、指数ｑ、ｑ’、ｅおよびｆは、上記に定義されたとおりである。
【０２４４】
例示的実施形態において、修飾糖断片の酸化シアリル側鎖のアルデヒド基は、修飾基により官能化される。たとえば、アルデヒドは、アンモニアにより還元的にアミノ化される。生じた第一級アミンは、本発明による化合物を提供するために官能化される。本実施形態に従った式としては：
【化５１】
2008526864.tif 000052
【０２４５】
が挙げられる。指数ｈ、ｉおよびｌは、０から２０までの整数である。指数ｒは、１から２５００までの整数である。上記に説明された構造は、Ｒ１５’の構成部分であり得る。
【０２４６】
当業者が認識するように、本発明は、ＰＥＧに関して前述の節に例示されるが、ポリマー修飾部分のアレーは、本明細書に説明された化合物および方法に使用のものである。
【０２４７】
選択された実施形態において、Ｒ６ａまたはＬ−Ｒ６ｂは、分枝状ＰＥＧ、例えば、上記に説明された種の１つである。典型的な実施形態において、分枝状ＰＥＧ構造は、システインペプチドに基づいている。本実施形態に従った例示的修飾糖断片としては：
【化５２】
2008526864.tif 000053
【０２４８】
が挙げられ、式中、Ｘ４は、結合またはＯである。上記構造の各々において、アリキルアミンリンカー−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｈ−は、存在しても存在しなくてもよい。上記に説明された構造は、Ｒ１５／Ｒ１５’の構成部分であり得る。
【０２４９】
本明細書に検討されるように、本発明に使用のポリマー性修飾基はまた、線状構造であり得る。したがって、本発明は：
【化５３】
2008526864.tif 000054
【０２５０】
などの構造から誘導される修飾糖断片を含む結合体を提供し、式中、指数ｑおよびｅは、上記に検討されたとおりである。
【０２５１】
典型的な修飾された糖類は、水溶性また水不溶性ポリマーにより修飾される。有用なポリマーの例としては、さらに下記に例示される。
【０２５２】
別の典型的な実施形態において、ペプチドは、ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌを、マンノースコアに添加することによりリモデル化され、および線状ＰＥＧ部分を担持するシアル酸を用いて糖ＰＥＧ化された昆虫細胞に由来し、式：
【化５４】
2008526864.tif 000055
【０２５３】
で表される少なくとも１つの部分を含んでなるペプチド結合体を与え、式中、指数ｔは、０から１までの整数であり；指数ｓは、１から１０までの整数を表し；および指数ｆは、１から２５００までの整数を表す。
【０２５４】
水不溶性ポリマー
上記に検討されたものと類似した別の実施形態において、修飾糖は、水溶性ポリマーよりも水不溶性ポリマーを含む。本発明の結合体はまた、１つまたは複数の水不溶性ポリマーを含むことができる。本発明の実施形態は、制御された様式で治療用ペプチドを送達させるための媒体として結合体の使用によって例示される。ポリマー性薬物送達系は、当業界に公知である。例えば、ダン（Ｄｕｎｎ）ら編集、ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ  ＤＲＵＧＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ、ＡＣＳシンポジウムシリーズ４６９巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、ワシントンＤ．Ｃ．１９９１年を参照されたい。当業者は、実質的に任意の薬物送達系が、本発明の結合体に適用可能であることを認識するであろう。
【０２５５】
Ｒ６ａ、Ｌａ−Ｒ６ｂ、Ｒ１５、Ｒ１５’および他の基に関して上記に説明されたモチーフは、当業者に容易に到達できる化学を利用して、限定しないで線状および分枝状構造に取り込むことができる水不溶性ポリマーに等しく適用可能である。同様に、本明細書に検討された任意の修飾糖にこれらの種の取り込みは、本発明の範囲内にある。したがって、本発明は、シアル酸および線状または分枝状水不溶性ポリマーで修飾された他の糖部分、修飾シアル酸種（例えば、ＣＭＰ−Ｓｉａ−（水溶性ポリマー））の活性化類縁体を含有する結合体、および調製されるこのような結合体の使用を提供する。
【０２５６】
代表的な水不溶性ポリマー類としては、限定はしないが、ポリホスファジン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハロゲン化物、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（ビニルアセテート）、塩化ポリビニル、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、プルロニックならびにポリビニルフェノールおよびそれらのコポリマー類が挙げられる。
【０２５７】
本発明の結合体の使用における合成的に修飾された天然ポリマー類としては、限定はしないが、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、およびニトロセルロースが挙げられる。広いクラスの合成的に修飾された天然ポリマー類の特に好ましいメンバーとしては、限定はしないが、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシメチルセルロース、セルローストリアセテート、硫酸セルロースナトリウム塩、およびアクリル酸エステルおよびメタクリル酸エステルのポリマー類ならびにアルギニン酸が挙げられる。
【０２５８】
これらおよび本明細書に検討された他のポリマー類は、シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）（セントルイス、ミズーリ州）、ポリサイエンシズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）（ワレントン、ペンシルバニア州）、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）、フルカ（Ｆｌｕｋａ）（ロンコンコーマ、ニューヨーク州）、およびバイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）（リッチモンド、カリフォルニア州）、または他に標準技法を用いてこれらの供給元から得られたモノマー類から合成できる。
【０２５９】
本発明の結合体の使用における代表的な生分解性ポリマー類としては、限定はしないが、ポリラクチド、ポリグリコリドおよびそれらのコポリマー類、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリアンヒドリド、ポリオルトエステル、ブレンドおよびそれらのコポリマー類が挙げられる。コラーゲン、プルロニックなどを含むものなど、ゲルを形成する組成物が特に使用される。
【０２６０】
本発明に使用のポリマー類としては、少なくとも一部のそれらの構造内に有する水不溶性材料、生体再吸収性分子を含む「ハイブリッド」ポリマーが挙げられる。このようなポリマーの例は、生体再吸収性領域、親水性領域およびポリマー鎖当り複数の架橋可能な官能基を有する水不溶性コポリマーを含むものである。
【０２６１】
本発明の目的のために、「水不溶性材料」としては、水または水含有環境において実質的に不溶性である材料が挙げられる。したがって、コポリマーのある一定の領域またはセグメントは、親水性またはさらに水溶性であり得るが、全体として該ポリマー分子は、任意の実質的な手段で水に溶解しない。
【０２６２】
本発明の目的ために、用語の「生体再吸収性分子」は、代謝できるか、または分解できるか、再吸収できるか、および／または身体による正常な排泄経路により排泄できる領域を含む。このような代謝物または分解産物は、実質的に身体に非毒性であることが好ましい。
【０２６３】
該生体再吸収性領域は、全体としてコポリマー組成物が水溶性にさせない限り、疎水性または親水性のいずれかであり得る。したがって、該生体再吸収性領域は、全体として該ポリマーが水不溶性のままである優先度に基づいて選択される。したがって、関連する特性、すなわち、生体再吸収性領域および親水性領域の相対的比率により含まれる官能基の種類は、有用な生体再吸収性組成物が水不溶性のままであることを確実にするために選択される。
【０２６４】
典型的な再吸収性ポリマー類としては、例えば、ポリ（α−ヒドロキシ−カルボン酸）／ポリ（オキシアルキレン）の合成的に製造される再吸収性ブロックコポリマー類が挙げられる（コーン（Ｃｏｈｎ）ら、米国特許第４，８２６，９４５号明細書を参照）。これらのコポリマー類は、架橋されず、身体は、該分解性ブロックコポリマー組成物を排出できるように水溶性である。ユーンズ（Ｙｏｕｎｅｓ）ら、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２１：１３０１−１３１６頁（１９８７）；およびコーン（Ｃｏｈｎ）ら、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２２：９９３−１００９頁（１９８８）を参照されたい。
【０２６５】
現在、好ましい生体再吸収性ポリマー類としては、ポリ（エステル）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（ラクトン）、ポリ（アミド）、ポリ（エステル−アミド）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（アンヒドリド）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（カーボネート）、ポリ（ホスファジン）、ポリ（ホスホエステル）、ポリ（チオエステル）、多糖類およびそれらの混合物から選択される１つまたは複数の構成部分が挙げられる。さらにより好ましくは、生体再吸収性ポリマーとしては、ポリ（ヒドロキシ）酸の構成部分が挙げられる。ポリ（ヒドロキシ）酸の中で、ポリ酢酸、ポリグリコール酸、ポリカプロン酸、ポリ酪酸、ポリ吉草酸ならびにそれらのコポリマー類および混合物が好ましい。
【０２６６】
インビボで吸収される（「生体吸収される」）断片の形成に加えて、本発明の方法に使用するために好ましいポリマー性コーティングはまた、排出性および／または代謝性断片を形成できる。
【０２６７】
高次コポリマー類もまた、本発明に使用できる。例えば、１９８４年３月２０日に発行されたケーシー（Ｃａｓｅｙ）らの米国特許第４，４３８，２５３号明細書は、ポリ（グリコール酸）とヒドロキシル−末端ポリ（アルキレングリコール）とのエステル交換から製造されたトリ−ブロックコポリマー類を開示している。このような組成物は、再吸収性モノフィラメントスーチャーとして使用のために開示されている。このような組成物の可撓性は、テトラ−ｐ−トリルオルトカーボネートなどの芳香族オルトカーボネートのコポリマー構造への取り込みにより制御される。
【０２６８】
乳酸／またはグリコール酸に基づく他のポリマー類もまた利用できる。例えば、１９９３年４月１３日に発行されたスピヌ（Ｓｐｉｎｕ）の米国特許第５，２０２，４１３号明細書は、オリゴマージオール残基またはジアミン残基上のラクチドおよび／またはグリコリドの開環重合化、次いでジイソシアネート、ジアシルクロリドまたはジクロロシランなどの二官能性化合物による鎖伸長により製造され、順次配列されたポリアクチドおよび／またはポリグリコリドのブロックを有する生分解性マルチブロックコポリマー類を開示している。
【０２６９】
本発明に有用なコーティングの生体再吸収性領域は、加水分解的におよび／または酵素的に開裂できるようにデザインできる。本発明の目的のために、「加水分解的に開裂できる」とは、コポリマー、特に生体再吸収性領域の、水または水含有環境における加水分解に対する感受性を称す。同様に、本明細書に用いられる「酵素的に開裂できる」とは、コポリマー、特に生体再吸収性領域の、内因性または外因性酵素により開裂に対する感受性を称す。
【０２７０】
体内に置かれる場合、親水性領域は、排出性断片および／または代謝性断片に処理できる。したがって、親水性領域としては、例えば、ポリエーテル、ポリアルキレンオキシド、ポリオール、ポリ（ビニルピロリジン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アルキルオキサゾリン）、多糖類、炭水化物、ペプチド、タンパク質およびコポリマーならびにそれらの混合物を挙げることができる。さらに、親水性領域はまた、例えば、ポリ（アルキレン）オキシドであり得る。このようなポリ（アルキレン）オキシド類としては、例えば、ポリ（エチレン）オキシド、ポリ（プロピレン）オキシドおよびそれらの混合物ならびにコポリマー類を挙げることができる。
【０２７１】
ヒドロゲルの構成部分であるポリマー類もまた、本発明に有用である。ヒドロゲルは、比較的大量の水を吸収できるポリマー材料である。化合物を形成するヒドロゲルの例としては、限定はしないが、ポリアクリル酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、カラゲナンおよび他の多糖類、ヒドロキシエチレンメタクリル酸（ＨＥＭＡ）、ならびにそれらの誘導体などが挙げられる。安定な生分解性の生体再吸収性ヒドロゲルを製造できる。さらに、ヒドロゲル組成物は、１つまたは複数のこれらの特性を示すサブユニットを含むことができる。
【０２７２】
保全性が架橋により制御できる生体適合性ヒドロゲル組成物は、公知であり、現在、本発明の方法の使用に好ましい。例えば、１９９５年４月２５日に発行されたハッベル（Ｈｕｂｂｅｌｌ）らの米国特許第５，４１０，０１６号明細書および１９９６年６月２５日に発行された米国特許第５，５２９，９１４号明細書は、２つの加水分解的に不安定な伸長部分の間にサンドイッチされた水溶性中心ブロックセグメントを有する架橋ブロックコポリマーである水溶性系を開示している。このようなコポリマー類は、さらに光重合成性アクリレート官能基によりエンドキャップされる。架橋された場合、これらの系はヒドロゲルになる。このようなコポリマー類の水溶性中心ブロックとしては、ポリ（エチレングリコール）を挙げることができ；一方、加水分解的に不安定な伸長部分は、ポリグリコール酸またはポリ酢酸などのポリ（α−ヒドロキシ酸）であり得る。ソーニー（Ｓａｗｈｎｅｙ）ら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２６：５８１−５８７頁（１９９３）を参照されたい。
【０２７３】
別の好ましい実施形態において、該ゲルは、熱可逆性ゲルである。プルロニックス、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、多糖類、ポリウレタンヒドロゲル、ポリウレタン−尿素ヒドロゲルおよびそれらの組合せなどの構成部分を含む熱可逆性ゲルは、現在、好ましい。
【０２７４】
さらに別の典型的な実施形態において、本発明の結合体は、リポソームの構成部分を含む。リポソームは、例えば、エップスタイン（Ｅｐｐｓｔｅｉｎ）などの米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載されている、当業者に公知の方法に従って調製できる。例えば、リポソーム製剤は、適切な脂質（ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジルコリン、およびコレステロールなど）を、無機溶媒に溶解し、次いで蒸発させ、容器の表面に乾燥脂質の薄膜を残すことによって調製できる。次に、活性化合物またはその製薬的に許容できる塩の水溶液を、該容器に導入する。この容器を、容器の側から遊離の脂質材料に手により渦巻かせ、脂質凝集体を分散させることによってリポソーム懸濁液を形成する。
【０２７５】
上記に説明された微粒子および微粒子を調製する方法は、例として提供され、それらは、本発明に使用の微粒子の範囲を規定する意図はない。種々の方法により製造される微粒子のアレイは、本発明に使用されることが当業者にとって明らかになるであろう。
【０２７６】
水溶性ポリマー類の文脈において上記に検討された構造的フォーマットである、直鎖および分枝鎖双方は、一般に水不溶性ポリマー類に関してさらに適用可能である。したがって、例えば、システイン、セリン、ジリシン、およびトリリシンの分枝コアは、２つの水不溶性ポリマー部分により官能化できる。これらの化学種を製造するために使用される方法は一般に、水溶性ポリマー類を製造するために使用されるものと密接に類似している。
【０２７７】
生体分子
別の典型的な実施形態において、修飾糖断片は、生体分子を担持する。よりさらに好ましい実施形態において、該生体分子は、機能性タンパク質、酵素、抗原、抗体、ペプチド、核酸（例えば、１本鎖ヌクレオチドまたはヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよび１本鎖および高次鎖核酸）、レクチン、受容体またはそれらの組合せである。
【０２７８】
目下のところ好ましい実施形態において、修飾基はビオチンである。典型的な実施形態において、選択的ビオチン化ペプチドは、１つまたは複数の修飾基を担持するアビジンまたはストレプトアビジン部分の結合により合成される。好ましい生体分子は、本質的に非蛍光であるか、またはアッセイにおいて蛍光マーカーとしての使用に不適切である、このような最少量の蛍光を放出する。さらに、一般に糖でない生体分子を使用することが好ましい。この優先度に対する例外は、別の構成要素（例えば、ＰＥＧ、生体分子、治療用部分、診断用部分など）の共有結合により修飾される別の天然糖の使用である。典型的な実施形態において、生体分子である糖部分は、リンカーアームに結合され、引き続き、糖リンカーアームカセットは、本発明の方法によりペプチドに結合される。
【０２７９】
本発明の実施に有用な生体分子は、任意の供給源に由来できる。該生体分子は、天然供給源から単離できるか、またはそれらは、合成法により製造できる。ペプチドは、天然ペプチド類であっても、変異ペプチド類であってもよい。変異は、当業者に公知の化学変異誘発、部位特異的変異誘発または他の変異誘導手段により実施できる。本発明の実施に有用なペプチド類としては、例えば、酵素、抗原、抗体および受容体が挙げられる。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。
【０２８０】
天然由来ペプチドおよび合成ペプチド並びに核酸双方は、本発明に関連して使用される；これらの分子は、任意の入手できる反応性基により糖残基構成部分または架橋剤に結合できる。例えば、ペプチド類は、反応性アミン、カルボキシル、スルフヒドリル、またはヒドロキシル基により結合できる。該反応性基は、ペプチド末端に、またはペプチド鎖内の部位に存在し得る。核酸は、塩基（例えば、環外アミン）上の反応性基または糖部分上の利用できるヒドロキシル基（例えば、３’−または５’−ヒドロキシル）を介して結合できる。ペプチド鎖および核酸鎖は、該鎖上の適切な反応性基の結合を可能にするために１つまたは複数の部位でさらに誘導体化できる。クリセイ（Ｃｈｒｉｓｅｙ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：３０３１−３０３９頁（１９９６）を参照されたい。
【０２８１】
さらに好ましい実施形態において、該生体分子は、本発明の方法により修飾されたペプチドを、特定の組織に指向させるために選択され、それによって組織に送達される非誘導体化ペプチドの量に比してその組織に対するペプチドの送達を増強させる。よりさらに好ましい実施形態において、選択された時間内で特定の組織に送達された誘導体化ペプチド量は、少なくとも約２０％、さらに好ましくは、少なくとも約４０％、さらにより好ましくは、少なくとも約１００％による誘導体化により増強される。現在、適用を目標にする好ましい生体高分子としては、抗体、ホルモンおよび細胞表面受容体に関するリガンドが挙げられる。
【０２８２】
ＩＩ．Ｄ．ｖ．ポリマー性修飾基を製造する方法
ポリマー性修飾基は、グリコシルまたは糖部分、アミノ酸部分、アミンとの反応または他の求核試薬との反応に関して活性化できる。活性種（例えば、カーボネートおよび活性エステル）の典型的な構造としては：
【化５５】
2008526864.tif 000056
【０２８３】
が挙げられる。
【０２８４】
本明細書に説明された化合物を調製する上で使用する、線状および分枝状ＰＥＧ類の活性化に適切な他の活性基または脱離基としては、限定はしないが、化学種：
【化５６】
2008526864.tif 000057
【０２８５】
が挙げられる。これらおよび他の化学種により活性化されるＰＥＧ分子ならびに活性化ＰＥＧ類を作製する方法は、国際公開第０４／０８３２５９号パンフレットに説明されている。
【０２８６】
上記に示された分枝状ポリマー類の１つまたは複数のｍ−ＰＥＧアームは、種々の末端、例えば、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、Ｃ２〜Ｃ１０−アルキルなどとＰＥＧ部分により置換できることを当業者は認識するであろう。さらに、上記の構造は、アミノ酸側鎖のα−炭素原子と官能基との間にアルキルリンカーを挿入する（または炭素原子を取外す）ことによって容易に修飾される。したがって、「ホモ」誘導体および高級同族体、ならびに低級同族体は、本発明に使用の分枝状ＰＥＧ類に関するコアの範囲内に入る。
【０２８７】
本明細書に説明された分枝状ＰＥＧ化学種は、下記のスキームに説明されているような方法により容易に調製される：
【化５７】
2008526864.tif 000058
【０２８８】
Ｘｄは、ＯまたはＳであり、ｒは、１から５までの整数である。指数ｅおよびｆは、１から２５００までの独立して選択された整数である。典型的な実施形態において、これらの指数のうちの１つまたは双方は、分子量が約１ｋＤａ、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、５５ｋＤａ、６０ｋＤａ、６５ｋＤａ、７０ｋＤａ、７５ｋＤａまたは８０ｋＤａであるように選択される。
【０２８９】
したがって、このスキームによれば、天然または非天然アミノ酸は、活性化ｍ−ＰＥＧ誘導体、この場合はトシレート体と接触させて、側鎖へテロ原子Ｘｄをアルキル化することにより１を形成する。モノ官能化ｍ−ＰＥＧアミノ酸は、反応性ｍ−ＰＥＧ誘導体を用いてＮ−アシル化条件に供されることによって、分枝状ｍ−ＰＥＧ２を組立てる。当業者が認識するように、トシレート脱離基は、任意の好適な脱離基、例えば、ハロゲン、メシレート、トリフレートなどにより置換できる。同様に、アミンをアシル化するために利用される反応性カーボネートは、活性エステル、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどにより置換できるか。または該酸は、ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾールなどの脱水剤を用いてインサイチュで活性化できる。
【０２９０】
他の典型的な実施形態において、尿素部分は、アミドなどの基により置換される。
【化５８】
2008526864.tif 000059
【０２９１】
ＩＩ．Ｅ．物質のホモ分散ペプチド結合体組成物
化学的にまたは酵素的に添加されたグリコシル結合基を介して形成されるペプチド結合体を提供することに加えて、本発明は、置換パターンにおいて高度に均質性であるペプチド結合体を含んでなる物質の組成物を提供する。本発明の方法を用いて、グリコシル結合基とペプチド結合体の集団を渡るグリコシル部分との実質的な割合を構造的に同一のアミノ酸残基またはグリコシル残基に結合させる、ペプチド結合体を形成することは可能である。したがって、別の態様において、本発明は、グリコシル結合基、例えば、修飾糖断片を介してペプチドに共有結合される水溶性ポリマー部分の集団を有するペプチド結合体を提供する。本発明の典型的なペプチド結合体において、水溶性ポリマー集団の各メンバーは、本質的に修飾糖断片を介してペプチドのグリコシル残基に結合され、修飾糖断片が結合されるペプチドの各グリコシル残基は、同じ構造を有する。
【０２９２】
本発明はまた、修飾糖断片などのグリコシル結合基を介して、ペプチドが、修飾基、例えば、治療用部分、診断用部分、標的部分、毒性部分などに結合される上記のものに類似の結合体を提供する。上記に説明された修飾基の各々は、小型分子、天然ポリマー（例えば、ポリペプチド）または合成ポリマーであり得る。修飾基が、シアル酸に結合される場合、一般に修飾基は、実質的に非蛍光性であることが好ましい。
【０２９３】
典型的な実施形態において、本発明のペプチド類は、ポリマー修飾基、例えば、ＰＥＧ部分を含む修飾糖によりグリコシル化される少なくとも１つのＯ−結合またはＮ−結合グリコシル化部位を含む。典型的な実施形態において、ＰＥＧは、修飾糖断片などの無処理のグリコシル結合基を介して、または非グリコシルリンカー、例えば、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルを介してペプチドに共有結合される。グリコシル結合基は、ペプチドのアミノ酸残基またはグリコシル残基のいずれかに共有結合される。あるいは、グリコシル結合基は、糖ペプチドの１つまたは複数のグリコシル単位に結合される。本発明はまた、グリコシル結合基がアミノ酸残基およびグリコシル残基の双方に結合される結合体を提供する。
【０２９４】
ＩＩ．Ｆ．ヌクレオチド糖類
本発明の別の態様において、本発明はまた、糖ヌクレオチドを提供する。本実施形態による典型的な種としては：
【化５９】
2008526864.tif 000060
【０２９５】
が挙げられ、式中、指数ｙは、０、１および２から選択される整数である。塩基は、アデニン、チミン、グアニン、シチジンおよびウリジンなどの核酸塩基である。Ｙ、Ｘ１、Ｙ２、Ｒ１、Ｒ３およびＲ４は、上記のとおりである。典型的な実施形態において、Ｙ２またはＬａ−（Ｒ６ａ）ｗは、
【化６０】
2008526864.tif 000061
【０２９６】
から選択されるメンバーであり、式中、変数は、上記のとおりである。
【０２９７】
典型的な実施形態において、Ｙ２またはＬ−（Ｒ６ａ）ｗは、以下の式：
【化６１】
2008526864.tif 000062
【０２９８】
で表される構造を有する。典型的な実施形態において、Ａ１およびＡ２は、各々−ＯＣＨ３である。
【０２９９】
別の典型的な実施形態において、ヌクレオチド糖は、以下の式：
【化６２】
2008526864.tif 000063
【０３００】
で表される構造を有する。
【０３０１】
方法
上記に検討された組成物に加えて、本発明は、修飾糖断片およびこれらの断片を取り込む糖結合体を調製する方法を提供する。典型的な方法は、修飾糖断片、例えば、修飾ガラクトース、修飾フコース、および修飾シアル酸を用いて修飾ペプチドまたは脂質を合成することを含む。修飾シアル酸が使用される場合、シアリルトランスフェラーゼまたはトランス−シアリダーゼ（α２，３−結合シアル酸のみに関して）のいずれかは、基質の受容体上に修飾断片を移すために使用できる。
【０３０２】
本発明の方法は、修飾糖断片を活性化修飾糖断片から基質の受容体部分上に移すことを含む。典型的な基質としては、治療適合性のペプチドおよび脂質が挙げられる。典型的な受容体部分としては、アミノ酸残基、アグリコン残基およびアミノ酸残基またはアグリコン残基に直接的または間接的に結合されたグリコシル部分が挙げられる。
【０３０３】
説明を明瞭にするために、本発明は、（糖）ペプチドと、水溶性ポリマーを含む活性化修飾糖断片から（糖）ペプチド上の受容体部分に移される修飾糖断片との間で形成された結合体に関して例示される。本発明は、水溶性ポリマーにより修飾された糖断片により（糖）脂質の結合体を形成する方法、および（糖）ペプチドおよび（糖）脂質と、水溶性ポリマー以外の修飾基を担持する糖断片との間で結合体を形成する方法を等しく包含することを当業者は認識するであろう。
【０３０４】
典型的な実施形態において、結合体は、水溶性ポリマー、治療用部分、標的部分または生体分子と、グリコシル化ペプチドとの間で形成される。ポリマー、治療用部分または生体分子は、ペプチド（直接または介在するグリコシルリンカーを介して）および修飾基（例えば、水溶性ポリマー）双方の間に挿入されて共有結合されるグリコシル結合基を介してペプチドに結合される。グリコシル結合基は、修飾糖断片を含む。該方法は、糖ペプチドを、活性化修飾糖断片および活性化修飾糖断片が基質である酵素と接触させることを含む。反応混合物の構成部分は、活性化修飾糖断片から糖ペプチド上の受容体部分に酵素的に移すのに適切な条件下で結合され、それによって結合体を調製する。
【０３０５】
受容体ペプチドは、典型的に新規に合成されるか、または原核細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞）あるいは哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、真菌細胞または植物細胞などの真核細胞中、組換えして発現される。該ペプチドは、完全長タンパク質または断片のいずれかであり得る。さらに、該ペプチドは、野生型または変異ペプチドであり得る。典型的な実施形態において、該ペプチドは、１つまたは複数のＮ−結合またはＯ−結合グリコシル化部位をペプチド配列に付加させる変異を含む。
【０３０６】
本発明の方法はまた、組換えして生産される不完全グリコシル化ペプチド類の修飾を提供する。多くの組換え生産糖タンパク質は、不完全にグリコシル化され、望ましくない性質、例えば、免疫原生、ＲＥＳによる認識を有し得る炭水化物残基を露出する。不完全グリコシル残基は、水溶性ポリマーを用いてマスクできる。
【０３０７】
本発明の方法を用いて修飾できる典型的なペプチド類は、図１に説明される。
【０３０８】
本発明の方法により修飾されたペプチド類は、合成または野生型ペプチド類であり得るか、または部位特異的変異誘発など、当業界に公知の方法により生産された変異ペプチド類であり得る。ペプチド類のグリコシル化は、典型的にはＮ−結合またはＯ−結合のいずれかである。典型的なＮ−結合は、修飾糖断片のアスパラギン残基の側鎖への結合である。Ｘがプロイン以外の任意のアミノ酸であるトリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニンは、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素的結合に関する認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を創製する。Ｏ−結合グリコシル化は、１つの糖（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、マンノース、ＧｌｃＮＡｃ、グルコース、フコースまたはキシロース）の、ヒドロキシアミノ酸、好ましくはセリンまたはトレオニンのヒドロキシ側鎖への結合に関係するが、異常または非天然アミノ酸、例えば、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンもまた使用できる。
【０３０９】
さらに、ペプチド類に加えて、本発明の方法は、他の生物学的構造（例えば、糖脂質、脂質、スフィンゴイド、セラミド、全細胞など）を用いて実施できる。一般に基質構造に対する唯一の限界は、グリコシル化部位を含むことである。
【０３１０】
グリコシル化部位を欠く基質に関して、またはさらにグリコシル化部位を加えることが望ましい基質に関して、信頼できる方法が当業界に知られている。例えば、ペプチドまたは他の構造に対するグリコシル化部位の付加は、所望のグリコシル化部位を含むようにアミノ酸配列を変えることによって好適に達成される。その付加は、変異またはペプチドの完全化学合成により成すことができる。ペプチドアミノ酸配列は、所望のアミノ酸に翻訳するコドンが作出されるように、特に予め選択された塩基でペプチドをコードするＤＮＡを変異させることによって、ＤＮＡレベルでの変化により改変させることが好ましい。ＤＮＡ変異は、当業界に公知の方法を用いて成されることが好ましい。Ｏ−結合またはＮ−結合グリコシル化部位の双方を、ペプチドに操作できる。
【０３１１】
典型的な実施形態において、グリコシル化部位は、ポリヌクレオチドをシャフリングすることにより付加される。候補ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡ混合プロトコルにより調節できる。ＤＮＡシャフリングは、関連遺伝子のプールの無作為断片化、次いでポリメラーゼ連鎖反応様の過程により断片の再組立により実施される再帰的組換えおよび変異の過程である。例えば、ステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１０７４７−１０７５１頁（１９９４）；ステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）、Ｎａｔｕｒｅ３７０：３８９−３９１頁（１９９４）；および米国特許第５，６０５，７９３号明細書、米国特許第５，８３７，４５８号明細書、米国特許第５，８３０，７２１号明細書および米国特許第５，８１１，２３８号明細書を参照されたい。
【０３１２】
本発明はまた、１つまたは複数の選択されたグリコシル残基をペプチドに付加させ（または除去し）、その後、修飾糖断片を、ペプチドの選択されたグリコシル残基の少なくとも１つに結合させる手段を提供する。本実施形態は、例えば、修飾糖断片を、ペプチド上に存在しないか、または所望の量で存在しない選択されたグリコシル残基に結合させることが望ましい場合に有用である。したがって、修飾糖断片をぺプチドに結合させる前に、選択されたグリコシル残基を、酵素的または化学的結合によりペプチドに結合させる。別の実施形態において、糖ペプチドのグリコシル化パターンを、糖ペプチドから炭水化物残基の除去により修飾糖断片の結合前に変える。例えば、国際公開第９８／３１８２６号パンフレットを参照されたい。
【０３１３】
糖ペプチド上に存在する任意の炭水化物部分の付加または除去は、化学的または酵素的に達成される。好ましくは、化学的な脱グリコシル化は、ポリペプチド変異体を化合物トリフルオロメタンスルホン酸、またはその等価化合物に曝露させることによって達成される。この処理は、ペプチドを無傷のままで結合糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外の大部分の糖または全ての糖の開裂をもたらす。化学的な脱グリコシル化は、ハキムッジン（Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ）ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２頁（１９８７）およびエッジ（Ｅｄｇｅ）ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１頁（１９８１）により記載される。ポリペプチド変異体上の炭水化物部分の酵素的開裂は、トータクラ（Ｔｈｏｔａｋｕｒａ）ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０頁（１９８７）により記載された種々のエンド−およびエキソ−グリコシダーゼの使用により達成できる。
【０３１４】
グリコシル部分の化学的付加は、任意の認定技法により実施される。糖部分の酵素的付加は、本明細書に説明された方法の修飾を用い、天然グリコシル単位を、本発明に使用される修飾糖断片に置換して達成されることが好ましい。糖部分を付加させる他の方法は、米国特許第５，８７６，９８０号明細書、米国特許第６，０３０，８１５号明細書、米国特許第５，７２８，５５４号明細書および米国特許第５，９２２，５７７号明細書に開示されている。
【０３１５】
選択されたグリコシル残基に関する典型的な結合点としては、限定はしないが、以下のものが挙げられる：（ａ）Ｎ−結合グリコシル化に関するコンセンサス部位、およびＯ−結合グリコシル化に関する部位；（ｂ）グリコシルトランスフェラーゼに関して受容体である末端グリコシル部分；（ｃ）アルギニン、アスパラギンおよびヒスチジン；（ｄ）遊離カルボキシル基；（ｅ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基；（ｆ）セリン、トレオニン、またはヒドロキシプロリンのものなど遊離ヒドロキシル基；（ｇ）フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンのものなどの芳香族残基；または（ｈ）グルタミンのアミド基。本発明に使用の典型的な方法は、１９８７年９月１１日に公開された国際公開第８７／０５３３０号パンフレット、およびアプリン（Ａｐｌｉｎ）およびリストン（Ｗｒｉｓｔｏｎ）、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．ＢＩＯＣＨＥＭ、２５９−３０６頁（１９８１）に記載されている。
【０３１６】
一実施形態において、本発明は、結合基を介して２つ以上のペプチドを結合する方法を提供する。該結合基は、任意の有用な構造のものであり、直鎖および分枝鎖構造から選択できる。ペプチドに結合されるリンカーの各末端は、修飾糖断片を含むことが好ましい。
【０３１７】
本発明の典型的方法において、２つのペプチドは、ポリマーを含むリンカー部分（例えば、ＰＥＧリンカー）を介して一緒に結合される。２つのグリコシル基を含むＰＥＧリンカーに対する焦点は、明瞭にする目的のためであり、本発明の実施形態に使用のリンカーアームの本性を限定するものとして解釈すべきではない。本実施形態の一例において、ジアミノ−ＰＥＧは、２つの糖断片、例えば、シアル酸アルデヒドとの反応により二官能性結合基に変換される。次いで該二官能性結合基は、各ペプチドに酵素的に結合される。当業者により認識されるように、ＰＥＧ部分に結合された糖断片は、同じであっても異なっていてもよい。
【０３１８】
本発明が実施できる典型的なペプチド類、グリコシル化部位の付加または除去方法、グリコシル構造または下部構造の付加または除去方法は、国際公開第０３／０３１４６４号パンフレット、関連米国出願およびＰＣＴ出願に詳細に記載されている。
【０３１９】
修飾糖断片の調製
一般に、糖断片および修飾基は、典型的に結合処理により新規な有機官能基または未反応化学種により変換される。糖断片上の反応性基は一般に、分解処理、例えば、酸化を介して形成される。本発明において、修飾糖断片は、一般に修飾基のアミノ類縁体と、糖ヒドロキシル部分の酸化により生成したアルデヒド部分またはケトン部分とを組合せることによって作製される。
【０３２０】
典型的な実施形態において、該方法は、修飾糖断片とグリコシル化または非グリコシル化ペプチドとの間で共有結合体の形成を提供する。該方法は、修飾糖断片を、活性化修飾糖断片からペプチド上の受容体部分に酵素的に移すことを含む。別の典型的な実施形態において、修飾糖断片は、ペプチドに共有結合されているグリコシル残基に共有結合される。別の典型的な実施形態において、修飾糖断片は、ペプチドのアミノ酸残基に共有結合される。別の典型的な実施形態において、酵素は、シアリルトランスフェラーゼ、トランス−シアリダーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、およびマンノシルトランスフェラーゼから選択されるグリコシルトランスフェラーゼである。別の典型的な実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは組換え体である。別の典型的な実施形態において、該方法は、無細胞環境下で実施される。
【０３２１】
糖ヒドロキシル部分をカルボニル含有化合物に変換する方法は、当業界に周知である。シアル酸の側鎖の選択的酸化により例示されるように、制御および再生可能の様式で酸化糖前駆体を調製する条件が一般に利用される。
【化６３】
2008526864.tif 000064
【０３２２】
例えば、上記スキームにおいて、シアル酸側鎖の第一級ヒドロシキシルの選択的酸化、次いでｍ−ＰＥＧ−ＮＨ２による還元的アミノ化は、ルート（ｉｉｉ）に従った対応する糖ＰＥＧアミン断片を提供する。
【０３２３】
さらに、ルート（ｉ）に従った緩和な過ヨウ素酸酸化（例えば、１ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム、０℃）は、ルート（ｉｉ）のより苛酷な酸化条件から生じる断片に比して不完全に酸化されるシアル酸断片を生成する。アルデヒドを還元条件下で、修飾基、例えば、アミノ−ｍ−ＰＥＧと結合させ、それによって典型的なシアル酸断片−ｍ−ＰＥＧ結合体を形成する。
【０３２４】
ルート（ｉｖ）に示されるように、酸化シアル酸は、ウィッテイヒ試薬、グリニャール試薬またはリチウム試薬とも反応でき、水溶性ポリマーおよび糖断片が、リンカー基、Ｌｄを介して結合される化学種を形成できる。アルケン部分は、認定技術条件を用いて還元でき、Ｌｄが、飽和Ｃ−Ｃ結合を介して糖断片の残部に結合される化学種を形成する。典型的なリンカーとしては、置換または非置換アルキル部分および置換または非置換ヘテロアルキル部分が挙げられる。
【０３２５】
ルート（ｖ）は、アルデヒドがアミンにより還元的にアミノ化され、生じたアミンは、活性ｍ−ＰＥＧ誘導体、例えば、活性エステルによりアシル化される。
【０３２６】
（ｉｖ）および（ｖ）の両ルートが、スキームに説明された酸化シアル酸断片の任意の側鎖を用いて実施できることを当業者は容易に認識するであろう。
【０３２７】
上記の化学種に加えて、Ｒ１〜Ｒ４はまた、保護基または保護された基を表すか、または含むことができる。当業者は、選択されたセットの反応条件を妨害しないように特定の官能基を保護する方法を理解している。有用な保護基の例に関して、例えば、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら、ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、ジョーン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク、１９９１年を参照されたい。
【０３２８】
修飾基のアミン類縁体の使用を参照にして上記に例示されたが、糖類のアルデヒド基またはケトン基は、例えば、イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾンまたはオキシムなどのカルボニル誘導体の形成を経て、またはグリニャール付加またはアルキルリチウム付加などの機構を経ることにより容易に修飾されることが解される。したがって、本発明は、修飾糖断片、結合基および１つまたは複数のこれらの誘導体を含む結合体を包含し、特定の糖断片または該断片を形成する方法に限定されない。
【０３２９】
本明細書に開示された結合体に結合された典型的な部分としては、限定はしないが、ＰＥＧ誘導体（例えば、アシル−ＰＥＧ、アシル−アルキル−ＰＥＧ、アルキル−アシル−ＰＥＧカルバモイル−ＰＥＧ、アリール−ＰＥＧ）、ＰＰＧ誘導体（例えば、アシル−ＰＰＧ、アシル−アルキル−ＰＰＧ、アルキル−アシル−ＰＰＧカルバモイル−ＰＰＧ、アリール−ＰＰＧ）、治療用部分、診断用部分、マンノース−６−ホスフェート、ヘパリン、ヘパラン、ＳＬｅｘ、マンノース、マンノース−６−ホスフェート、シアリルルイスＸ、ＦＧＦ、ＶＦＧＦ、タンパク質、コンドロイチン、ケラタン、デルマタン、アルブミン、インテグリン、触角オリゴ糖類、ペプチドなどが挙げられる。種々の修飾基を糖類部分に結合させる方法は、当業者に容易にアクセスできる（ＰＯＬＹ（ＥＴＨＹＬＥＮＥ  ＧＬＹＣＯＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ：ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＣＡＬ  ＡＮＤ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、Ｊ．ミルトン・ハリス（Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ）編集、プレナム・パブ・コープ（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂ．Ｃｏｒｐ．）、１９９２年；ＰＯＬＹ（ＥＴＨＹＬＥＮＥ  ＧＬＹＣＯＬ）ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＡＮＤ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、Ｊ．ミルトン・ハリス（Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ）編集、ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．６８０，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９９７年；ハーマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）、ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、サンディエゴ、１９９６年；およびダン（Ｄｕｎｎ）ら編集、ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ  ＤＲＵＧＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ、ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．４６９，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、ワシントン、Ｄ．Ｃ．１９９１年）。
【０３３０】
架橋基
本発明の方法に使用するための修飾糖断片の調製は、修飾の糖残基への結合およびグリコシルトランスフェラーゼに対する基質である安定な付加体を形成することを含む。したがって、修飾基および糖を結合させるために、しばしば架橋剤を使用することが好ましい。修飾基を炭水化物部分に結合させるために使用できる典型的な二官能性化合物としては、限定はしないが、二官能性ポリ（エチレングリコール）、ポリアミド、ポリエーテル、ポリエステルなどが挙げられる。炭水化物を他の分子に結合させるための一般的なアプローチは、文献に知られている。例えば、リー（Ｌｅｅ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２８：１８５６（１９８９）；バチア（Ｂｈａｔｉａ）ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７８：４０８頁（１９８９）；ジャンダ（Ｊａｎｄａ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：８８８６頁（１９９０）およびベドナルスキ（Ｂｅｄｎａｒｓｋｉ）ら、国際公開第９２／１８１３５号パンフレットを参照されたい。以下の検討において、反応性基は、新生修飾糖断片の糖部分上に良性として処理される。この検討の焦点は、説明を明瞭にするためのものである。この検討は、さらに修飾基上の反応性基に関連することを当業者は認識するであろう。
【０３３１】
修飾糖断片の構成部分を分子内化学的架橋により修飾するために種々の試薬が用いられる（架橋剤および架橋方法のレビューに関して、ウォールド，Ｆ．（Ｗｏｌｄ，Ｆ．）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５：６２３−６５１頁、１９７２年；ウィートール，Ｈ．Ｈ．（Ｗｅｅｔａｌｌ，Ｈ．Ｈ．）およびクーニイ，Ｄ．Ａ．（Ｃｏｏｎｅｙ，Ｄ．Ａ．）、Ｉｎ：ＥＮＺＹＭＥＳ  ＡＳ  ＤＲＵＧＳ．（ホルセンバーグ（Ｈｏｌｃｅｎｂｅｒｇ）、およびロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）編集）３９５−４４２頁、ワイリー（Ｗｉｌｅｙ）、ニューヨーク、１９８１年；ジー，Ｔ．Ｈ．（Ｊｉ，Ｔ．Ｈ．）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９１：５８０−６０９頁、１９８３年；マットソン（Ｍａｔｔｓｏｎ）ら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１７：１６７−１８３頁、１９９３年を参照されたく、これら全ては参照として本明細書に援用されている）。好ましい架橋剤は、種々のゼロ長、ホモ二官能性、およびヘテロ二官能性架橋剤から誘導される。ゼロ長架橋剤は、外因性の物質導入をすることなく２つの内因性化学基の直接的結合を含む。ジスルフィド結合の形成を触媒する試剤は、この分類に属する。別の例は、カルボキシル基と第一級アミノ基との縮合を誘導する試薬であり、カルボジイミド、エチルクロロホルメート、ウッドワード（Ｗｏｏｄｗａｒｄ）試薬Ｋ（２−エチル−５−フェニルイソキサゾリウム−３’−スルホネート）、およびカルボニルジイミダゾールなどによりアミド結合を形成する。これらの化学試薬に加えて、酵素のトランスグルタミナーゼ（グルタミル−ペプチド−γ−グルタミルトランスフェラーゼ；ＥＣ  ２．３．２．１３）は、ゼロ長架橋剤として使用できる。この酵素は、タンパク質結合グルタミニル残基のカルボキサミド基において、通常、基質として第一級アミノ基とで、アシル転移反応を触媒する。好ましいホモ二官能性およびヘテロ二官能性試薬は、アミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドール、または非特異的基に反応性であり得る、それぞれ２つの同一部位または２つの異なる部位を含む。
【０３３２】
典型的な架橋部分には、糖ケトン部分またはアルデヒド部分と反応する反応性官能基（例えば、アミン、ヒドラジンなど）を含む。反応性官能基は、修飾基上の部分と反応する第２の反応性官能基に繋がれ、糖断片および修飾基の双方に共有結合されたリンカーを形成する。
【０３３３】
本発明に使用の典型的な架橋基は、国際公開第０３／０３１４６４号パンフレットおよび関連米国出願ならびにＰＣＴ出願に説明されている。
【０３３４】
ペプチドに対する修飾糖断片の結合
修飾糖断片は、結合を媒介するために適切な酵素を用いてグリコシル化または非グリコシル化ペプチドに結合される。好ましくは、修飾ドナー糖、酵素および受容体ペプチドの濃度は、受容体が消費されるまでグリコシル化が進行するように選択される。シアリルトランスフェラーゼの文脈において説明されると同時に、下記に検討された理由により、一般に他のグリコシルトランスフェラーゼ反応に適用可能である。
【０３３５】
所望のオリゴ糖構造を合成するためにグリコシルトランスフェラーゼを用いる多くの方法が公知であり、一般に本発明に適用できる。典型的な方法は、例えば、国際公開第９６／３２４９１号パンフレット、イトウ（Ｉｔｏ）ら、Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６５：７５３頁（１９９３）、および米国特許第５，３５２，６７０号明細書、米国特許第５，３７４，５４１号明細書、および米国特許第５，５４５，５５３号明細書に記載されている。
【０３３６】
本発明は、単一のグリコシルトランスフェラーゼまたは複数のグリコシルトランスフェラーゼの組合せを用いて実施される。例えば、シアリルトランスフェラーゼおよびガラクトシルトランスフェラーゼの組合せを使用できる。２つ以上の酵素を用いるこれらの実施形態において、酵素および基質は、好ましくは、最初の反応混合物に組合せるか、または第１の酵素反応が、終了またはほぼ終了したら、第２の酵素反応用の酵素および試薬を反応媒体に加える。２つの酵素反応を単一の容器で順番に実施することにより、中間体の化学種が単離される手法よりも全収率が改善される。さらに、余分の溶媒および副産物のクリーンアップおよび処理を減少させる。
【０３３７】
好ましい実施形態において、第１の酵素および第２の酵素の各々は、グリコシルトランスフェラーゼである。別の好ましい実施形態において、１つの酵素は、エンドグリコシダーゼである。さらに好ましい実施形態において、３つ以上の酵素は、本発明の修飾糖タンパク質を組立てるために使用される。該酵素は、修飾糖断片のペプチドへの添加前後のいずれかの任意の時点で、ペプチド上の糖構造を変えるために使用される。
【０３３８】
別の好ましい実施形態において、本発明の結合体を製造するために利用される各々の酵素は、触媒量で存在する。特定の酵素の触媒量は、その酵素の基質濃度ならびに温度、時間およびｐＨ値などの反応条件によって変わる。予め選択された基質濃度および反応条件下で、所与の酵素に関する触媒量を判定する手段は、当業者によく知られている。
【０３３９】
上記方法が実施される温度は、凍結寸前から最も感受性の酵素が変性する温度までの範囲であり得る。好ましい温度範囲は、約０℃から約４５℃まで、より好ましくは、約２０℃から約３０℃までである。別の典型的な実施形態において、本法の１つまたは複数の構成部分は、好熱性酵素を用いて高温で実施される。
【０３４０】
反応混合物は、グリコシル化される受容体にとって十分な時間維持され、それによって所望の結合体を形成する。幾らかの結合体は、２、３時間後にしばしば検出でき、通常、２４時間以内で回収可能な量が得られる。この反応速度は、選択された系で最適化される変動要因数（例えば、酵素濃度、ドナー濃度、受容体濃度、温度、溶媒量）に依存することを当業者は理解する。
【０３４１】
本発明はまた、修飾ペプチドの工業スケール製造を提供する。
【０３４２】
以下の検討において、本発明は、グリコシル化ペプチドへの修飾シアル酸断片の結合により例示される。典型的な修飾シアル酸断片は、ＰＥＧにより標識される。ＰＥＧ修飾シアル酸断片およびグリコシル化ペプチドの使用に対する以下の検討の焦点は、説明を明瞭にするためのものであり、本発明が、これら２つのパートナーの結合に限定することを意味していない。この検討により、一般にシアル酸断片以外の修飾グリコシル断片の付加に適用できることを当業者は理解する。さらに、この検討により、他の水溶性ポリマー、治療用部分、および生体分子など、ＰＥＧ以外の作用物質による糖断片の修飾に等しく適用できる。
【０３４３】
酵素的アプローチは、ＰＥＧ化またはＰＰＧ化炭水化物をペプチドまたはグリコペプチド上への選択的な導入に使用できる。該方法は、ＰＥＧ、ＰＰＧ、またはマスクされた反応性官能基を含有する修飾糖断片を利用し、適切なグリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシンターゼにより組合される。所望の炭水化物結合を作製するグリコシルトランスフェラーゼを選択し、ドナー基質として修飾糖断片を利用することにより、ＰＥＧまたはＰＰＧは、ペプチド主鎖に、グリコペプチドの存在する糖残基に、またはペプチドに加えられた糖残基に直接導入できる。
【０３４４】
シアリルトランスフェラーゼに関する受容体は、天然構造または組換え的に、酵素的にまたは化学的にそこに置かれる構造として本発明の方法により修飾されるペプチド上に存在する。好適な受容体としては、例えば、ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１、４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１、４ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１、３ＧａｌＮＡｃ、ラクト−Ｎ−テトラオーゼ、Ｇａｌβ１、３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１、３Ａｒａ、Ｇａｌβ１、６ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１、４Ｇｌｃ（ラクトース）などのガラクトシル受容体、および当業者に知られた他の受容体（例えば、ポールソン（Ｐａｕｌｓｏｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：５６１７−５６２４頁（１９７８））が挙げられる。
【０３４５】
一実施形態において、シアリルトランスフェラーゼに関する受容体は、糖ペプチドのインビボ合成の際に修飾される糖ペプチド上に存在する。このような糖ペプチドは、糖ペプチドのグリコシル化パターンの事前修飾なしで権利請求された方法を用いてシアリル化できる。あるいは、本発明の方法は、好適な受容体を含まないペプチドをシアリル化するために使用でき；受容体を含むペプチドを、当業者に公知の方法により最初に修飾する。典型的な実施形態において、ＧａｌＮＡｃ残基は、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの作用により付加される。
【０３４６】
典型的な実施形態において、修飾シアル酸断片に関する受容体は、ガラクトース残基を、ペプチドに結合された適切な受容体、例えば、ＧｌｃＮＡｃに結合させることにより組み立てられる。該方法は、修飾されるペプチドと、好適な量のガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、ｇａｌβ１，３またはｇａｌβ１，４）、および好適なガラクトシルドナー（例えば、ＵＤＰ−ガラクトース）を含有する反応混合物とをインキュベートすることを含む。この反応は、実質的に完了まで進行させるか、あるいは、この反応は、予め選択された量のガラクトース残基が付加された場合に終了する。選択された糖受容体を組立てる他の方法は、当業者にとって明らかであろう。
【０３４７】
さらに別の実施形態において、グリコペプチド結合オリゴ糖は最初に，全体的または部分的に「切断」されて、シアリルトランスフェラーゼに関する受容体または１つまたは複数の適切な残基は、好適な受容体を得るために付加できる部分を露出させる。グリコシルトランスフェラーゼおよびエンドグリコシダーゼなどの酵素（例えば、米国特許第５，７１６，８１２号明細書を参照）は、結合反応および切断反応に有用である。
【０３４８】
以下の検討において、本発明の方法は、修飾糖断片に結合された水溶性ポリマーを有する修飾糖断片の使用により例示される。検討の焦点は、説明を明瞭にするためのものである。この検討は、修飾糖断片が治療用部分、生体分子などを担持するこれらの実施形態に等しく関連することを当業者は認識するであろう。
【０３４９】
別の典型的な実施形態において、水溶性ポリマーは、末端マンノース残基上に付加されたＧｌｃＮＡｃ残基に結合されるガラクトース残基を有する修飾糖断片を介して二触角構造の１つまたは双方の末端マンノース残基に付加される。あるいは、非修飾Ｇａｌを、１つまたは双方の末端ＧｌｃＮＡｃ残基に付加できる。
【０３５０】
よりさらなる例において、水溶性ポリマーは、修飾シアル酸断片を用いてＧａｌ残基に付加される。
【０３５１】
上記に説明された例は、本明細書に説明された方法の能力に関する説明を提供する。本発明の方法を用いて、実質的に任意の所望の構造の炭水化物残基を「切断する」および組立てることが可能である。修飾糖断片を、上記に説明されたように炭水化物部分の末端に付加できるか、または、それはペプチドコアと炭水化物の末端との間の中間に存在し得る。
【０３５２】
典型的な実施形態において、既存のシアル酸を、シアリダーゼを用いて糖ペプチドから除去されることによって、全てまたは大部分の基礎をなすガラクトシル残基をアンマスキングする。あるいは、ペプチドまたは糖ペプチドは、ガラクトース残基、またはガラクトース残基の末端にあるオリゴ糖残基により標識される。ガラクトース残基の曝露または付加後、修飾シアル酸を付加させるために適切なシアリルトランスフェラーゼが使用される。このアプローチは、スキーム２に要約される。
【化６４】
2008526864.tif 000065
【０３５３】
式中、ＳＡ＊は糖断片であり、Ｙは上記のとおりである（式Ｉ）。
【０３５４】
代替の実施形態において、修飾糖断片は、糖残基をペプチド主鎖に転移させることが知られているグリコシルトランスフェラーゼを用いてペプチド主鎖に直接付加される。このアプローチの使用により、炭水化物を欠くペプチド上、あるいは既存の糖ペプチド上の修飾糖断片の直接付加を可能にする。両方の場合において、化学的方法を用いてタンパク質のペプチド主鎖の修飾中に生じる無作為様式ではなくて、グリコシルトランスフェラーゼの基質特異性により規定されるペプチド主鎖上の特異的位置に修飾糖断片の付加が生じる。作用物質の配列は、適切なアミノ酸配列をポリペプチド鎖に操作することによりグリコシルトランスフェラーゼの基質ペプチド配列を欠くタンパク質または糖ペプチドに導入できる。
【０３５５】
上記に説明された典型的な各実施形態において、１つまたは複数のさらなる化学的または酵素的修飾ステップを、ペプチドへの修飾糖断片の結合後に利用できる。典型的な実施形態において、酵素（例えば、フコシルトランスフェラーゼ）は、グリコシル単位（例えば、フコース）を、ぺプチドに結合された末端修飾糖断片上に付加させるために使用される。別の例において、酵素反応は、修飾糖断片が結合できなかった「キャップ」部位に利用される。あるいは、結合された修飾糖断片の構造を変えるために化学反応が利用される。例えば、結合された修飾糖断片を、修飾糖断片を結合するペプチド構成部分との結合を安定化するか、または不安定化する作用物質と反応させる。別の例において、修飾糖断片の構成部分は、ペプチドへのその結合後に脱保護される。修飾糖断片がペプチドに結合された後の段階で本発明の方法に有用である一連の酵素的および化学的手法があることを当業者は認識するであろう。修飾糖断片−ペプチド結合体のさらなる合成は、本発明の範囲内に入る。
【０３５６】
別の典型的な各実施形態において、本発明は、ペプチドと修飾糖断片との間の結合体を形成するための組成物を提供する。この組成物は、活性化修飾糖断片、活性化修飾糖断片が基質である酵素、およびペプチド受容体基質の混合物を含み、該修飾糖断片は、水溶性ポリマー、治療用部分および生体分子から選択されるメンバーと共有結合する。
【０３５７】
酵素
糖ドナーを受容体に転移させる酵素を用いてペプチドおよび脂質をリモデリングする一般的な方法は、２００３年４月１７日に公表された国際公開第０３／０３１４６４Ａ２号パンフレットに詳細に検討されている。本法に使用の選択された酵素の要旨は、下記に説明される。
【０３５８】
グリコシルトランスフェラーゼ類
グリコシルトランスフェラーゼ類は、ステップごとの様式で、活性化糖（ドナーＮＤＰ−糖類）のタンパク質、糖ペプチド、脂質または糖脂質または成長オリゴ糖の非還元末端への付加を触媒する。Ｎ−結合糖ペプチド類は、トランスフェラーゼおよび脂質結合オリゴ糖ドナーＤｏｌ−ＰＰ−ＮＡＧ２Ｇｌｃ３Ｍａｎ９を介してエン・ブロック（ｅｎ  ｂｌｏｃｋ）転移、次いでコアの切断により合成される。この場合、「コア」糖の性質は、その後の結合とは幾らか異なる。非常に多数のグリコシルトランスフェラーゼ類が当業界に公知である。
【０３５９】
本明細書に使用されるグリコシルトランスフェラーゼは、糖ドナーとして修飾糖断片を触媒できる限り任意であり得る。このような酵素の例としては、ガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、グルクロノニルトランスフェラーゼなどのレロイル（Ｌｅｌｏｉｒ）経路のグリコシルトランスフェラーゼが挙げられる。
【０３６０】
グリコシルトランスフェラーゼ反応に関与する酵素的糖合成に関して、グリコシルトランスフェラーゼをクローン化できるか、または任意の供給源から単離できる。多くのクローン化グリコシルトランスフェラーゼ類は、それらのポリヌクレオチド配列が知られている。例えば、「Ｔｈｅ  ＷＷＷ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ」、タニグチ（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ）ら、２００２年、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｇｅｎｅｓ、スプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）、東京、を参照されたい。グリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列およびアミノ酸配列が推論され得るグリコシルトランスフェラーゼ類をコードするヌクレオチド配列は、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、ＥＭＢＬ、およびその他を含む種々の公的に利用できるデータベースにも見られる。
【０３６１】
本発明の方法に使用できるグリコシルトランスフェラーゼ類としては、限定はしないが、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルクロン酸トランスフェラーゼ、ガラクツロン酸トランスフェラーゼ、およびオリゴ糖トランスフェラーゼが挙げられる。好適なグリコシルトランスフェラーゼ類としては、真核生物ならびに原核生物から得られるものが挙げられる。酵素は、野生型であっても、あるいは変異型であってもよい。変異型グリコシルトランスフェラーゼ類を調製する方法およびこれらの種の特性化は、当業界に知られている。
【０３６２】
フコシルトランスフェラーゼ類
幾つかの実施形態において、本発明の方法に使用されるグリコシルトランスフェラーゼは、フコシルトランスフェラーゼである。フコシルトランスフェラーゼ類は、当業者に公知である。典型的なフコシルトランスフェラーゼ類としては、Ｌ−フコースを、ＧＤＰ−フコースから受容体糖のヒドロキシ位置に転移させる酵素が挙げられる。非ヌクレオチド糖類を受容体に転移させるフコシルトランスフェラーゼ類もまた、本発明に使用される。
【０３６３】
幾つかの実施形態において、受容体糖は、例えば、オリゴ糖グリコシドにおけるＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ−基のＧｌｃＮＡｃである。この反応に好適なフコシルトランスフェラーゼ類としては、ヒトミルクから最初に特性化されたＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ１−α（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＩＩ  Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．６５）（パルシ（Ｐａｌｃｉｃ）ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．１９０：１−１１頁（１９８９）；プリールス（Ｐｒｉｅｅｌｓ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１０４５６−１０４６３頁（１９８１）；およびヌネズ（Ｎｕｎｅｚ）ら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．５９：２０８６−２０９５（１９８１）を参照）およびヒト血清に見られるＧａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＡｃβ−αフコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＶ、ＦＴＶ、ＦＴＶＩ）が挙げられる。ＦＴＶＩＩ（Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．６５）、シアリルα（２→３）Ｇａｌβ（１→３）ＧｌｃＮＡｃβフコシルトランスフェラーゼもまた特性化されている。Ｇａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ−α（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼもまた特性化されている（デュマス（Ｄｕｍａｓ）ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｌｅｔｔｅｒｓ１：４２５−４２８頁（１９９１）およびクコウスカ−ラタロ（Ｋｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏ）ら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ４：１２８８−１３０３頁（１９９０）を参照）。他の典型的なフコシルトランスフェラーゼ類としては、例えば、α１，２フコシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．６９）が挙げられる。酵素的フコシル化は、モリコーン（Ｍｏｌｌｉｃｏｎｅ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９１：１６９−１７６頁（１９９０）または米国特許第５，３７４，６５５号明細書により記載された方法により実施できる。フコシルトランスフェラーゼを製造するために使用される細胞はまた、ＧＤＰ−フコースを合成するための酵素系を含む。
【０３６４】
ガラクトシルトランスフェラーゼ類
別の実施形態のグループにおいて、グリコシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼである。典型的なガラクトシルトランスフェラーゼ類としては、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．１５１、例えば、ダブコウスキー（Ｄａｂｋｏｗｓｋｉ）ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．２５：２９２１頁（１９９３）およびヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら、Ｎａｔｕｒｅ３４５：２２９−２３３頁（１９９０）、ウシ（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ｊ０４９８９、ジョジアッセ（Ｊｏｚｉａｓｓｅ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４２９０−１４２９７頁（１９８９））、マウス（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ｍ２６９２５；ラーゼン（Ｌａｒｓｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：８２２７−８２３１頁（１９８９））、ブタ（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）Ｌ３６１５２；ストラハン（Ｓｔｒａｈａｎ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ４１：１０１−１０５頁（１９９５））を参照）が挙げられる。別の好適なα１，３ガラクトシルトランスフェラーゼは、血液型Ｂ抗原の合成に関与するものである（ＥＣ  ２．４．１．３７、ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１１４６−１１５１頁（１９９０）（ヒト））。よりさらなるガラクトシルトランスフェラーゼは、コアＧａｌ−Ｔ１である。
【０３６５】
また、本発明の方法の使用に好適なものは、β（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼであり、これには、例えば、ＥＣ  ２．４．１．９０（ＬａｃＮＡｃシンセターゼ）およびＥＣ  ２．４．１．２２（ラクトースシンセターゼ）（ウシ（ディー’アゴスタロ（Ｄ’Ａｇｏｓｔａｒｏ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８３：２１１−２１７頁（１９８９））、ヒト（マスリ（Ｍａｓｒｉ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５７：６５７−６６３頁（１９８８））、マウス（ナカザワ（Ｎａｋａｚａｗａ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４：１６５−１６８頁（１９８８））、ならびにＥ．Ｃ．２．４．１．３８およびセラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．４５、スタール（Ｓｔａｈｌ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｌ．Ｒｅｓ．３８：２３４−２４２頁（１９９４））が挙げられる。他の好適なガラクトシルトランスフェラーゼとしては、例えば、α１，２ガラクトシルトランスフェラーゼが挙げられる（例えば、分裂酵母ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、チャペル（Ｃｈａｐｅｌｌ）ら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ５：５１９−５２８頁（１９９４））。
【０３６６】
シアリルトランスフェラーゼ類
シアリルトランスフェラーゼ類は、組換え細胞および本発明の反応混合物に有用である別のタイプのグリコシルトランスフェラーゼである。組換えシアリルトランスフェラーゼ類を産生する細胞はまた、シアリルトランスフェラーゼ類に関するシアル酸ドナーであるＣＭＰ−シアル酸を産生する。本発明の使用に好適であるシアリルトランスフェラーゼ類の例としては、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩ（例えば、ラットまたはヒトのＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩ）、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＶ、ＳＴ３Ｇａｌ  Ｉ、ＳＴ６Ｇａｌ  Ｉ、ＳＴ３Ｇａｌ  Ｖ、ＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ  Ｉ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ  ＩＩ、およびＳＴ６ＧａｌＮＡｃ  ＩＩＩ（本明細書に用いられるシアリルトランスフェラーゼの命名は、ツジ（Ｔｓｕｊｉ）ら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６：ｖ−ｘｉｖ（１９９６）に記載されているとおりである）が挙げられる。α（２，３）シアリルトランスフェラーゼと称される典型的なα（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．９９．６）は、シアル酸をＧａｌβ１→３Ｇｌｃ二糖またはグリコシドの非還元末端Ｇａｌに転移させる。ファン・デン・アイジンデン（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１５９頁（１９８１）、ウェインスタイン（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３８４５頁（１９８２）およびウェン（Ｗｅｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１０１１頁（１９９２）を参照されたい。別の典型的なα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．９９．４）は、シアル酸を二糖またはグリコシドの非還元末端Ｇａｌに転移させる。リアリック（Ｒｅａｒｉｃｋ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：４４４４頁（１９７９）およびギレスピー（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１００４頁（１９９２）を参照されたい。さらに典型的な酵素としては、Ｇａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃ  α−２，６−シアリルトランスフェラーゼが挙げられる（クロサワ（Ｋｕｒｏｓａｗａ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：３７５−３８１（１９９４）を参照）。
【０３６７】
本発明に使用のシアリルトランスフェラーゼ類のリストは、図２に提供される。
【０３６８】
ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ類
Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ類は、本発明を実施する上で、特にＧａｌＮＡｃ部分を、ペプチドのＯ−結合グリコシル化部位のアミノ酸に結合させるために使用される。好適なＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ類としては、限定はしないが、α（１，３）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β（１，４）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ナガタ（Ｎａｇａｔａ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２０８２−１２０８９頁（１９９２）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１５１６２頁（１９９４））およびポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ホーマ（Ｈｏｍａ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２６０９頁（１９９３））が挙げられる。また、一般にＷ．ワカーチュク（Ｗａｋａｒｃｈｕｋ）の研究および米国特許第６，７２３，５４５号明細書；および公開された米国特許出願公開第２００３／０１８０９２８号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１５７６５８号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１５７６５７号明細書；および米国特許出願公開第２００３／０１５７６５６号明細書を参照されたい。
【０３６９】
遺伝子操作によりクローン化遺伝子から酵素ＧａｌＮＡｃ  ＴＩ−ＸＸなどのタンパク質の製造は、よく知られている。例えば、米国特許第４，７６１，３７１号明細書を参照されたい。１つの方法は、十分なサンプルの採集を含み、次いで酵素のアミノ酸配列は、Ｎ末端配列決定により決定される。この情報は次に、昆虫細胞系Ｓｆ９における発現の際に十分に活性な酵素の合成に生じた完全長（結合膜）トランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡクローンを単離するために使用される。次に酵素の受容体特異性は、１６種のタンパク質における公知のグリコシル化部位を囲むアミノ酸の半定量的分析、次いで合成ペプチドのインビトログリコシル化試験を用いて判定される。この研究により、一定のアミノ酸残基が、グリコシル化ペプチドセグメントにおいて過剰発現され、グリコシル化セリン残基およびトレオニン残基を囲む特定の位置の残基が、他のアミノ酸部分よりも効率的に受容体に著しい影響を有し得ることを立証した。
【０３７０】
細胞結合グリコシルトランスフェラーゼ類
別の実施形態において、本発明の方法に利用される酵素は、細胞結合グリコシルトランスフェラーゼである。多くの可溶性グリコシルトランスフェラーゼは知られているが（例えば、米国特許第５，０３２，５１９号明細書を参照）、細胞と結合する場合、グリコシルトランスフェラーゼは一般に膜結合形態である。このように大いに研究された多くの膜結合酵素は、内因性のタンパク質であると考えられており；すなわちそれらは、音波処理により膜から放出されず、可溶化のために界面活性剤を必要とする。表面グリコシルトランスフェラーゼは、脊椎動物細胞および無脊椎動物細胞の表面に確認されており、これらの表面トランスフェラーゼ類は、生理的条件下で触媒活性を維持することが認められている。しかしながら、細胞表面グリコシルトランスフェラーゼのさらに認識された機能は、細胞内認識用である（ロス（Ｒｏｔｈ）、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＰＰＲＯＡＣＨＥＳ  ＴＯ  ＳＵＰＲＡＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＰＨＥＮＯＭＥＮＡ、１９９０年）。
【０３７１】
細胞により発現されるグリコシルトランスフェラーゼを変えさせる方法が開発されている。例えば、ラーセン（Ｌａｒｓｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２２７−８２３１頁（１９８９）は、細胞表面のオリゴ糖構造およびそれらの同族グリコシルトランスフェラーゼの発現を測定するクローン化ｃＤＮＡ配列を単離するために遺伝子アプローチを報告している。ＵＤＰ−ガラクトース：β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニドα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼを発現することが知られているマウス細胞系より単離されたｍＲＮＡから作出されたｃＤＮＡライブラリーを、ＣＯＳ−１細胞に形質移入させた。次に形質移入された細胞を培養し、α１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ活性に関してアッセイした。
【０３７２】
フランシスコ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）らのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２７１３−２７１７頁（１９９２）は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の外面にβ−ラクタマーゼを係留する方法を開示している。（ｉ）外膜タンパク質のシグナル配列、（ｉｉ）外膜タンパク質の膜スパニングセクション、および（ｉｉｉ）完全成熟β−ラクタマーゼ配列、からなる三者構成融合による結果、活性表面結合β−ラクタマーゼ分子が産生される。しかしながら、フランシスコ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）法は、著者により認められるように原核細胞系にのみに限定され、適切な機能のために完全三者構成融合を必要とする。
【０３７３】
スルホトランスフェラーゼ類
本発明はまた、例えば、ヘパリン、硫酸ヘパリン、カラゲナン（ｃａｒｒａｇｅｎｅｎ）、および関連化合物などの硫酸化多糖類など、硫酸化分子を含むペプチド類を製造する方法を提供する。好適なスルホトランスフェラーゼ類としては、例えば、コンドロイチン−６−スルホトランスフェラーゼ（フクタ（Ｆｕｋｕｔａ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１８５７５−１８５８０頁（１９９５）により記載されているニワトリｃＤＮＡ；ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号Ｄ４９９１５）、グリコサミノグリカンＮ−アセチルグルコサミンＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ１（ディクソン（Ｄｉｘｏｎ）ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ２６：２３９−２４１（１９９５）；ＵＬ１８９１８）、およびグリコサミノグリカンＮ−アセチルグルコサミンＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２（オレラナ（Ｏｒｅｌｌａｎａ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２２７０−２２７６頁（１９９４）およびエリクソン（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１０４３８−１０４４３頁（１９９４）により記載されているマウスｃＤＮＡ；ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号Ｕ２３０４に記載されているヒトｃＤＮＡ）が挙げられる。
【０３７４】
グリコシダーゼ類
本発明はまた、野生型および変異グリコシダーゼ類の使用を包含する。変異β−ガラクトシダーゼ酵素は、ガラクトシル受容体分子にフッ化α−グリコシルの結合を介して二糖類の形成を触媒することが立証されている（ウィザース（Ｗｉｔｈｅｒｓ）、米国特許第６，２８４，４９４号明細書；２００１年９月４日に発行）。本発明に使用の他のグリコシダーゼ類としては、例えば、β−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−マンノシダーゼ、β−アセチルグルコサミニダーゼ、β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、β−キシロシダーゼ、β−フコシダーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ガラクタナーゼ、マンナナーゼ、ヘミセルラーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−マンノシダーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトース−アミニダーゼ、α−キシロシダーゼ、α−フコシダーゼ、およびノイラミニダーゼ／シアリダーゼが挙げられる。
【０３７５】
固定化酵素
本発明はまた、固体および／または可溶性支持体上に固定化される酵素の使用を提供する。典型的な実施形態において、本発明の方法に従った無処置のグリコシルリンカーを介してＰＥＧに結合されているグリコシルトランスフェラーゼが提供される。ＰＥＧリンカー酵素結合体は、固体支持体に任意に結合される。本発明の方法において固体支持酵素の使用は、反応混合物の仕上げおよび反応生成物の精製を簡便にし、また酵素の回収を容易にできる。グリコシルトランスフェラーゼ結合体を、本発明の方法に利用する。酵素と支持体との他の組合せは、当業者にとって明らかとなろう。
【０３７６】
ペプチド結合体の精製
上記方法により製造された製造物は、精製しないで使用できる。しかしながら、通常、生成物を回収することが好ましい。薄層または厚層クロマトグラフィ、カラムクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、または膜ろ過など、修飾ペプチドの回収のために標準的な周知の方法を使用できる。膜ろ過を使用することが好ましく、以下および本明細書に引用された文献に検討されている回収のための逆浸透膜、あるいは１つまたは複数のカラムクロマトグラフィ技術を利用することがより好ましい。例えば、膜が、約３０００から約１０，０００の分子量カットオフを有する膜ろ過は、グリコシルトランスフェラーゼなどのタンパク質を除去するために使用できる。次にナノろ過または逆浸透法は、塩類を除去するため、および／または結合体を精製するために使用できる（例えば、国際公開第９８／１５５８１号パンフレットを参照）。ナノフィルター膜は、一価の塩類を通過させるが、使用される膜に依って約１００ダルトンから約２，０００ダルトンよりも大きな多価塩類および非電荷溶質を保持する。したがって、典型的な適用において、本発明の方法により調製された結合体は、膜に保持され、不純物の塩類は通過するであろう。
【０３７７】
第１のステップとして修飾糖タンパク質が、細胞内で産生される場合、微粒子細片、宿主細胞または溶解断片は、例えば、遠心分離または超音波処理により除去され；任意に、タンパク質は、市販のタンパク質濃縮フィルターにより濃縮でき、次いでイムノアフィニティークロマトグラフィ、イオン交換カラム分画（例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）またはカルボキシメチル基またはスルホプロピル基を含有するマトリックス上で）、ブルー−セファロース上のクロマトグラフィ、ＣＭブルー−セファロース、ＭＯＮＯ−Ｑ、ＭＯＮＯ−Ｓ、レンチルレクチン−セファロース、ＷＧＡ−セファロース、Ｃｏｎ  Ａ−セファロース、エーテル・トヨパール（Ｅｔｈｅｒ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）、ブチル・トヨパール（Ｂｕｔｙｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）、フェニル・トヨパール（Ｐｈｅｎｙｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）、またはタンパク質Ａセファロース、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィ、シリカクロマトグラフィ、等電点電気泳動、逆相ＨＰＬＣ（例えば、脂肪族基で補足されたシリカゲル）、例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）モレキュラーシーブを用いるゲルろ過またはサイズ排除クロマトグラフィ、選択的にポリペプチドに結合するカラムクロマトグラフィ、およびエタノールまたは硫化アンモニウム沈殿、から選択される１つまたは複数のステップにより他の不純物からポリペプチド変異体を分離できる。
【０３７８】
培養で製造された修飾糖ペプチド類は、通常、細胞、酵素などから最初の抽出、次いで１回または複数回の濃縮、塩析、水性イオン交換、またはサイズ排除クロマトグラフィステップにより単離される。さらに、修飾糖タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィにより精製できる。最後に、最終精製ステップにＨＰＬＣを使用できる。
【０３７９】
プロテアーゼ阻害剤、例えば、メチスルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を任意の前述のステップに含んで、タンパク質分解を阻止でき、抗生物質を含んで外来性の汚染菌の増殖を防止できる。
【０３８０】
別の方法において、本発明の修飾糖ペプチドを製造する系からの上澄液を、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）またはミリポア・ペリコン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）超音波ユニットを用いて最初に濃縮する。濃縮ステップ後、この濃縮物を、好適な精製マトリックスに適用できる。例えば、好適なアフィニティーマトリックスは、ペプチドに対するリガンド、レシチンまたは好適な支持体に結合された抗体分子を含むことができる。あるいは、アニオン交換樹脂は、例えば、ペンダントＤＥＡＥ基を有するマトリックスまたは基質を使用できる。好適なマトリックスとしては、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、または通常、タンパク質精製に使用される他のタイプが挙げられる。あるいは、カチオン交換ステップを使用できる。好適なカチオン交換体としては、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含んでなる種々の不溶性マトリックスが挙げられる。スルホプロピル基が、特に好ましい。
【０３８１】
最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えば、ペンダントメチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルを使用する１つまたは複数のＲＰ−ＨＰＬＣステップは、ポリペプチド変異体組成物をさらに精製するために使用できる。種々の組合せで前述の精製ステップの幾つかまたは全てはまた、均質な修飾糖タンパク質を提供するために使用できる。
【０３８２】
大スケール発酵から生じる本発明の修飾糖ペプチドは、ウルダル（Ｕｒｄａｌ）ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６：１７１頁（１９８４）により開示されたものと類似の方法により精製できる。この引用文献は、分取ＨＰＬＣカラム上の組換えヒトＩＬ−２の精製に関して２つの連続ＲＰ−ＨＰＬＣステップを記載している。あるいは、アフィニティークロマトグラフィなどの技術は、修飾糖タンパク質を精製するために利用できる。
【０３８３】
製薬組成物
別の態様において、本発明は、製薬組成物を提供する。該製薬組成物には、製薬的に許容できる担体およびグリコシル化または非グリコシル化ペプチドと、水溶性または水不溶性ポリマー、治療用部分または生体分子に共有結合した修飾糖断片との間の結合体を含む。該ポリマー、治療用部分または生体分子は、該ペプチドおよび該ポリマーの双方の間に挿入され、共有結合される無処置のグリコシル結合基、治療用部分または生体分子を介してペプチドに結合される。
【０３８４】
本発明の製薬組成物は、種々の薬物送達系の使用に好適である。本発明の使用に好適な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、メースパブリッシング社（Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、フィラデルフィア、ペンシルバニア州、第１７版（１９８５）に見られる。薬物送達法の簡潔なレビューに関して、ランジャー（Ｌａｎｇｅｒ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７−１５３３頁（１９９０）を参照されたい。
【０３８５】
該製薬組成物は、例えば、局所、経口、経鼻、静脈内、頭蓋内、腹腔内、経皮または筋肉内投与など、任意の適切な投与様式用に製剤化できる。皮下注射などの非経口投与に関して、担体は、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックスまたは緩衝液を含んでなることが好ましい。経口投与に関して、マンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルカム（ｔａｌｃｕｍ）、セルロース、グルコース、ショ糖、および炭酸マグネシウムなど、任意の上記担体または固形担体を使用できる。生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリラクテートポリグリコレート）もまた、本発明の製薬組成物用の担体として使用できる。好適な生分解性ミクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号明細書および米国特許第５，０７５，１０９号明細書に開示されている。
【０３８６】
一般に、該製薬組成物は、非経口的、例えば、静脈内に投与される。したがって、本発明は、許容できる担体、好ましくは、水性担体、例えば、水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳなどに溶解または懸濁された化合物を含んでなる非経口投与用組成物を提供する。該組成物には、ｐＨ調製および緩衝剤、等張調整剤、湿潤化剤、界面活性剤など、凡そ生理条件に必要な製薬的に許容できる補助剤を含むことができる。
【０３８７】
これらの組成物は、従来の滅菌技術により滅菌できるか、または滅菌ろ過できる。生じた水溶液は、そのまま使用か、または凍結乾燥して包装し、凍結乾燥製剤は、投与前に滅菌水担体と組み合わされる。該製剤のｐＨは、典型的に３と１１との間、より好ましくは５から９、最も好ましくは、７および８である。
【０３８８】
幾つかの実施形態において、本発明の糖ペプチドは、標準的な媒体形成脂質から形成されるリポソームに取り込むことができる。例えば、スゾカ（Ｓｚｏｋａ）ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７頁（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号明細書、米国特許第４，５０１，７２８号明細書および米国特許第４，８３７，０２８号明細書に記載されるように、種々の方法がリポソームの調製に利用できる。種々の標的化剤（例えば、本発明のシアリルガラクトシド類）を用いるリポソームの標的化は、当業界に周知である（例えば、米国特許第４，９５７，７７３号明細書および米国特許第４，６０３，０４４号明細書を参照）。
【０３８９】
標的化剤をリポソームに結合させるための標準的な方法が使用できる。これらの方法は、一般にホスファチジルエタノールアミンなどの脂質構成部分のリポソームへの取り込みを含み、これは、標的化剤の結合のために活性化できるか、または本発明の脂質誘導化糖ペプチドなどの親油性化合物を誘導化できる。
【０３９０】
標的化機構は一般に、標的部分が、標的、例えば、細胞表面受容体との相互作用のために利用できるような様式でリポソームの表面に、標的化剤が配置されることを必要とする。リポソームが、当業者に公知の方法を用いて形成される前に（例えば、それぞれ、長鎖ハロゲン化アルキルまたは脂肪酸による、炭水化物上に存在するヒドロキシル基のアルキル化またはアシル化）、本発明の炭水化物を脂質分子に結合できる。あるいは、リポソームは、膜を形成する時間でコネクター部分が、最初に膜に取り込まれるような方法で作製することができる。該コネクター部分は、膜内にしっかりと埋め込まれ、係留される親油性部分を持たなければならない。それはまた、リポソームの水性表面上に化学的に利用できる反応性部分も持たなければならない。後で付加される標的化剤または炭水化物により安定な化学結合を形成するために、化学的に好適であるように反応性部分が選択される。幾つかの場合において、標的化剤をコネクター分子に直接結合させることが可能であるが、大抵の場合、化学的な架橋として作用する第３の分子を使用することがより好適であり、したがって、膜内にあるコネクター分子は、媒体表面から離れて三次元的に拡張する標的剤または炭水化物と結合する。
【０３９１】
本発明の方法により調製された化合物は、診断試薬としても使用できる。例えば、標識された化合物は、炎症を有する疑いのある患者において炎症領域または腫瘍転移領域の位置を見つけるために使用できる。この使用に関して、化合物は、１２５Ｉ、１４Ｃ、またはトリチウムにより標識化できる。
【０３９２】
さらに、本発明は、疾患発症の危険性にある対象または疾患を有する対象に、本発明の結合体を投与することにより疾患状態を防止し、治療し、または寛解する方法を提供する。該結合体は、治療的有効量で投与される。多くの結合体、特にポリマー性修飾基を含むものは、増強されたインビボ滞留時間を示すことが予想されるので、治療的有効投与量は、典型的に投与される非結合治療剤の投与量から容易に判定できる。
【０３９３】
本明細書に記載された例および実施形態は、あくまで説明のためのものであり、それを考慮して変更および変形は、当業者に示唆され、本出願の趣旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることが解される。本明細書に引用された全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的のために参照としてそれらの全体が本明細書に援用されている。
【図面の簡単な説明】
【０３９４】
【図１】修飾糖断片が結合できるペプチドの表である。
【図２】本発明の実施に使用されるシアリルトランスフェラーゼの表である。
【図１Ａ】
2008526864.tif 000071
【図１Ｂ】
2008526864.tif 000072
【図１Ｃ】
2008526864.tif 000073
【図１Ｄ】
2008526864.tif 000074
【図１Ｅ】
2008526864.tif 000075
【図１Ｆ】
2008526864.tif 000076
【図１Ｇ】
2008526864.tif 000077
【図１Ｈ】
2008526864.tif 000078
【図１Ｉ】
2008526864.tif 000079
【図１Ｊ】
2008526864.tif 000080
【図１Ｋ】
2008526864.tif 000081
【図１Ｌ】
2008526864.tif 000082
【図１Ｍ】
2008526864.tif 000083
【図１Ｎ】
2008526864.tif 000084
【図１Ｏ】
2008526864.tif 000085
【図１Ｐ】
2008526864.tif 000086
【図１Ｑ】
2008526864.tif 000087
【図１Ｒ】
2008526864.tif 000088
【図１Ｓ】
2008526864.tif 000089
【図１Ｔ】
2008526864.tif 000090
【図１Ｕ】
2008526864.tif 000091
【図１Ｖ】
2008526864.tif 000092
【図１Ｗ】
2008526864.tif 000093
【図１Ｘ】
2008526864.tif 000094
【図１Ｙ】
2008526864.tif 000095
【図１Ｚ】
2008526864.tif 000096
【図１ＡＡ】
2008526864.tif 000097
【図１ＢＢ】
2008526864.tif 000098
【図１ＣＣ】
2008526864.tif 000099
【図２Ａ】
2008526864.tif 000100
【図２Ｂ】
2008526864.tif 000101
【図２Ｃ】
2008526864.tif 000102
【図２Ｄ】
2008526864.tif 000103
【図２Ｅ】
2008526864.tif 000104
【図２Ｆ】
2008526864.tif 000105
【図２Ｇ】
2008526864.tif 000106
【図２Ｈ】
2008526864.tif 000107
【図２Ｉ】
2008526864.tif 000108
【図２Ｊ】
2008526864.tif 000109
【図２Ｋ】
2008526864.tif 000110
【図２Ｌ】
2008526864.tif 000111
【図２Ｍ】
2008526864.tif 000112
【図２Ｎ】
2008526864.tif 000113
【国際調査報告】
2008526864.tif 000114