(57)【要約】  遺伝子発現解析に基づいて、パーツズマブなどのＨＥＲ阻害剤を用いた治療のための患者を選択するための方法を記載する。遺伝子発現解析により生物学的試料中のＨＥＲのリン酸化または活性化を評定するための方法も記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガンを処置するための方法であって、該方法が、該ガンを処置するために有効量のＨＥＲ阻害剤を患者に投与することを含み、該患者由来の腫瘍試料が、二つ以上のレセプターＨＥＲと一つまたは複数のＨＥＲリガンドとを発現している方法。
【請求項２】
レセプターＨＥＲが、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ３からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
レセプターＨＥＲがＥＧＦＲおよびＨＥＲ２である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
レセプターＨＥＲがＨＥＲ２およびＨＥＲ３である、請求項２記載の方法。
【請求項５】
ＨＥＲリガンドがベータセルリン、アンフィレグリン、エピレグリン、およびＴＧＦ−αからなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
ＨＥＲリガンドがベータセルリンである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＨＥＲリガンドがアンフィレグリンである、請求項５記載の方法。
【請求項８】
腫瘍試料が、ＨＥＲ２と、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ３と、ベータセルリンまたはアンフィレグリンとを発現している、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
腫瘍試料が、ＨＥＲ２およびＥＧＦＲならびにベータセルリンを発現している、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ＨＥＲ阻害剤がＨＥＲ二量体化阻害剤である、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
ＨＥＲ阻害剤がＨＥＲ抗体である、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
ＨＥＲ抗体がＨＥＲ２抗体である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ＨＥＲ２抗体がＨＥＲ２細胞外ドメインのドメインＩＩに結合する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ＨＥＲ２抗体がパーツズマブである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ＨＥＲ抗体がネイキッドな抗体である、請求項１１〜１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
ＨＥＲ抗体がインタクトな抗体である、請求項１１〜１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
ＨＥＲ２抗体が、抗原結合領域を含む抗体フラグメントである、請求項１１〜１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
発現が、レセプターＨＥＲまたはＨＥＲリガンドをコードしているｍＲＮＡを定量することにより決定される、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
ｍＲＮＡがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して定量される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ＰＣＲが定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
腫瘍試料が固定腫瘍試料である、請求項１〜２０のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
腫瘍試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍試料である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
腫瘍試料が凍結腫瘍試料である、請求項１〜２０のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
レセプターＨＥＲおよびＨＥＲリガンドの発現が中央値以上である、請求項１〜２３のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
ガンが、卵巣ガン、腹膜ガン、または卵管ガンである、請求項１〜２４のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
ガンが転移性乳ガン（ＭＢＣ）である、請求項１〜２４のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
ガンが、非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）である、請求項１〜２４のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
患者に化学療法剤を投与することをさらに含む、請求項１〜２７のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
化学療法剤が代謝拮抗化学療法剤である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
代謝拮抗化学療法剤がゲムシタビンである、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
ガンを処置するための方法であって、該方法が、該ガンを処置するために有効量のＨＥＲ阻害剤を患者に投与することを含み、該患者由来の腫瘍試料がベータセルリンまたはアンフィレグリンを発現している方法。
【請求項３２】
ＨＥＲ阻害剤が、ＨＥＲ２とＥＧＦＲまたはＨＥＲ３とのヘテロ二量体化を阻害する、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
ガンを処置するための方法であって、該方法が、該ガンを処置するために有効量の、ＨＥＲ２のドメインＩＩに結合するＨＥＲ２抗体を患者に投与することを含み、該患者由来の腫瘍試料が、ＨＥＲ２と、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ３と、ベータセルリンまたはアンフィレグリンとを発現している方法。
【請求項３４】
ＨＥＲ２のドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩの間の結合部に結合する、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
生物学的試料中のＨＥＲのリン酸化または活性化を評定する方法であって、該方法が、該試料中の二つ以上のレセプターＨＥＲと一つまたは複数のＨＥＲリガンドとの発現を決定することを含み、該二つ以上のレセプターＨＥＲと一つまたは複数のＨＥＲリガンドとの発現が、該試料中のＨＥＲのリン酸化または活性化を示す方法。
【請求項３６】
試料がパラフィン包埋ホルマリン固定腫瘍試料である、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
生物学的試料中のＨＥＲのリン酸化または活性化を評定する方法であって、該方法が、該試料中のベータセルリンまたはアンフィレグリンの発現を決定することを含み、ベータセルリンまたはアンフィレグリンの発現が、該試料中のＨＥＲのリン酸化または活性化を示す方法。
【請求項３８】
ＨＥＲ二量体化阻害剤を用いた治療のための患者を同定する方法であって、該方法が、該患者由来の試料中の二つ以上のレセプターＨＥＲと一つまたは複数のＨＥＲリガンドとの発現を決定することを含み、該レセプターＨＥＲおよびＨＥＲリガンドの発現が、該患者が該ＨＥＲ二量体化阻害剤を用いた治療に応答する見込みのあることを示す方法。
【請求項３９】
患者がガン患者である、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
卵巣ガンを処置するための方法であって、該方法が、該卵巣ガンを処置するために有効量のＨＥＲ阻害剤を患者に投与することを含み、該患者由来の腫瘍試料がベータセルリンまたはアンフィレグリンを発現している方法。
【請求項４１】
腫瘍試料が二つ以上のレセプターＨＥＲをさらに発現している、請求項４０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パーツズマブなどのＨＥＲ阻害剤を用いた治療のために遺伝子発現解析に基づいて患者を選択するための方法に関するものである。本発明は、遺伝子発現解析によって生物学的試料中のＨＥＲのリン酸化または活性化を評定するための方法にも関するものである。
【背景技術】
【０００２】
レセプターＨＥＲおよびそれに対する抗体
ＨＥＲファミリーのレセプターチロシンキナーゼは、細胞の成長、分化、および生存の重要な仲介物質である。このレセプターファミリーには、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１、またはＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２またはｐ１８５ｎｅｕ）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４またはｔｙｒｏ２）を含めた四つの異なるメンバーがある。
【０００３】
ｅｒｂＢ１遺伝子によってコードされるＥＧＦＲは、ヒトの悪性疾患の原因となると関係づけられている。特に、ＥＧＦＲの発現増加が乳ガン、膀胱ガン、肺ガン、頭部ガン、頚部ガン、および胃ガン、ならびに神経膠芽腫で観察されている。レセプターＥＧＦＲの発現増加は、同じ腫瘍細胞によるＥＧＦＲリガンドであるトランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）の産生増加としばしば関連し、その結果として自己分泌刺激経路によるレセプター活性化が生じる。Baselga and Mendelsohn, Pharmac. Ther. 64: 127-154 (1994)。ＥＧＦＲまたはそのリガンドであるＴＧＦ−αおよびＥＧＦに対するモノクローナル抗体は、当該悪性疾患の処置における治療薬として評価されている。例えば、Baselga and Mendelsohn、上記；Masui et al. Cancer Research 44: 1002-1007 (1984)；およびWu et al. J. Clin. Invest. 95: 1897-1905 (1995)を参照されたい。
【０００４】
ＨＥＲファミリーの第２のメンバーであるｐ１８５ｎｅｕは、化学処置されたラットの神経芽細胞腫由来のトランスフォーミング遺伝子産物としてもともと同定された。ｎｅｕプロトオンコジーンの活性化型は、コードされているタンパク質の膜貫通領域における（バリンからグルタミン酸への）点突然変異に起因する。ｎｅｕのヒトホモログの増幅は、乳ガンおよび卵巣ガンで観察され、予後不良と相関する（Slamon et al., Science, 235: 177-182 (1987); Slamon et al., Science, 244: 707-712 (1989);および米国特許第４，９６８，６０３号）。これまで、ｎｅｕプロトオンコジーン中の点突然変異に類似した点突然変異は、ヒト腫瘍については報告されていない。ＨＥＲ２の過剰発現（遺伝子増幅が原因で頻繁であるが一様ではない）は、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状腺、膵臓、および膀胱のガン腫を含めたその他のガン腫でも観察されている。数ある中で、King et al., Science, 229: 974 (1985)；Yokota et al., Lancet 1: 765-767 (1986)；Fukushige et al., Mol Cell Biol., 6: 955-958 (1986)；Guerin et al., Oncogene Res., 3: 21-31 (1988)；Cohen et al., Oncogene, 4: 81-88 (1989)；Yonemura et al., Cancer Res., 51: 1034 (1991)；Borst et al., Gynecol. Oncol., 38: 364 (1990)；Weiner et al., Cancer Res., 50: 421-425 (1990)；Kern et al., Cancer Res., 50: 5184 (1990)；Park et al., Cancer Res., 49: 6605 (1989)；Zhau et al., Mol. Carcinog., 3: 254-257 (1990)；Aasland et al. Br. J. Cancer 57: 358-363 (1988)；Williams et al. Pathobiology 59: 46-52 (1991)；およびMcCann et al., Cancer, 65: 88-92 (1990)を参照されたい。ＨＥＲ２は前立腺ガンで過剰発現していることがある（Gu et al. Cancer Lett. 99: 185-9 (1996); Ross et al., Hum. Pathol. 28: 827-33 (1997); Ross et al. Cancer 79: 2162-70 (1997);およびSadasivan et al. J. Urol. 150: 126-31 (1993)）。
【０００５】
ラットｐ１８５ｎｅｕおよびヒトＨＥＲ２タンパク質産物に対する抗体が記載されている。
【０００６】
Drebinおよび共同研究者らは、ラットｎｅｕ遺伝子産物であるｐ１８５ｎｅｕに対する抗体を産生させた。例えば、Drebin et al., Cell 41: 695-706 (1985); Myers et al., Meth. Enzym. 198: 277-290 (1991);およびＷＯ９４／２２４７８を参照されたい。Drebin et al. Oncogene 2: 273-277 (1988)は、ｐ１８５ｎｅｕの二つの異なる領域と反応する抗体の混合物が、ｎｅｕでトランスフォーメーションされヌードマウスに移植されたＮＩＨ−３Ｔ３細胞に相乗的な抗腫瘍効果を招くと報告している。１９９８年１０月２０日に発行された米国特許第５，８２４，３１１号も参照されたい。
【０００７】
Hudziak et al., Mol. Cell. Biol. 9(3): 1165-1172 (1989)は、ヒト乳房腫瘍細胞系ＳＫ−ＢＲ−３を用いて特徴付けられたＨＥＲ２抗体の一団の発生を記載している。抗体に曝露した後に、７２時間後に単層をクリスタルバイオレットで染色することによって、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の相対的な細胞増殖が決定された。このアッセイを用いて、細胞増殖を５６％阻害した４Ｄ５と呼ばれる抗体で最大阻害が得られた。この一団のその他の抗体は、このアッセイではより少ない程度に細胞増殖を低減させた。この抗体４Ｄ５は、ＨＥＲ２を過剰発現している乳房腫瘍細胞系を、ＴＮＦ−αの細胞毒性作用に対して感作することがさらに見出された。１９９７年１０月１４日に発行された米国特許第５，６７７，１７１号も参照されたい。Hudziakらに論じられたＨＥＲ２抗体は、Fendly et al. Cancer Research 50: 1550-1558 (1990)；Kotts et al. In Vitro 26(3): 59A (1990)；Sarup et al. Growth Regulation 1: 72-82 (1991)；Shepard et al. J. Clin. Immunol. 11(3): 117-127 (1991)；Kumar et al. Mol. Cell. Biol. 11(2): 979-986 (1991)；Lewis et al. Cancer Immunol. Immunother. 37: 255-263 (1993)；Pietras et al. Oncogene 9: 1829-1838 (1994)；Vitetta et al. Cancer Research 54: 5301-5309 (1994)；Sliwkowski et al. J. Biol. Chem. 269(20): 14661-14665 (1994)；Scott et al. J. Biol. Chem. 266: 14300-5 (1991)；D'souza et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 7202-7206 (1994)；Lewis et al. Cancer Research 56: 1457-1465 (1996)；およびSchaefer et al. Oncogene 15: 1385-1394 (1997)にさらに特徴付けられている。
【０００８】
リコンビナントヒト化バージョンのマウスＨＥＲ２抗体４Ｄ５（ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８、ｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２、トラスツズマブ、またはＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）；米国特許第５，８２１，３３７号）は、以前に大規模な抗ガン治療を受けた、ＨＥＲ２過剰発現転移性乳ガンを有する患者に臨床的に活性である（Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14: 737-744 (1996））。トラスツズマブは、腫瘍がＨＥＲ２タンパク質を過剰発現している転移性乳ガン患者の処置に、１９９８年９月２５日に食品医薬品局から販売許可を受けた。
【０００９】
種々の特性を有するその他のＨＥＲ２抗体は、Tagliabue et al. Int. J. Cancer 47: 933-937 (1991)；McKenzie et al. Oncogene 4: 543-548 (1989)；Maier et al. Cancer Res.51: 5361-5369 (1991)；Bacus et al. Molecular Carcinogenesis 3: 350-362 (1990)；Stancovski et al. PNAS (USA) 88: 8691-8695 (1991)；Bacus et al. Cancer Research 52:2580-2589 (1992)；Xu et al. Int. J. Cancer 53: 401-408 (1993)；ＷＯ９４／００１３６；Kasprzyk et al. Cancer Research 52: 2771-2776 (1992)；Hancock et al. Cancer Res.51: 4575-4580 (1991)；Shawver et al. Cancer Res. 54: 1367-1373 (1994)；Arteaga et al. Cancer Res. 54: 3758-3765 (1994)；Harwerth et al. J. Biol. Chem. 267: 15160-15167 (1992)；米国特許第５，７８３，１８６号；およびKlapper et al. Oncogene 14: 2099-2109 (1997)に記載されている。
【００１０】
ホモロジースクリーニングの結果として、レセプターＨＥＲファミリーの二つの他のメンバー、すなわちＨＥＲ３（米国特許第５，１８３，８８４号および第５，４８０，９６８号、ならびにKraus et al. PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)）およびＨＥＲ４（ＥＰ特許出願第５９９，２７４号；Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750 (1993)；およびPlowman et al., Nature, 366:473-475 (1993)）の同定が生じた。これらのレセプターの両方は、少なくとも一部の乳ガン細胞系上で増加した発現を示す。
【００１１】
これらのレセプターＨＥＲは、一般に、細胞に様々な組合せで見出され、ヘテロ二量体化は、多様なＨＥＲリガンドに対する細胞応答の多様性を増加させると考えられる（Earp et al. Breast Cancer Research and Treatment 35: 115-132 (1995)）。ＥＧＦＲは、六つの異なるリガンド、すなわち上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）、アンフィレグリン、ヘパリン結合性上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ベータセルリン、およびエピレグリンによって結合される（Groenen et al. Growth Factors 11: 235-257 (1994)）。単一の遺伝子の選択的スプライシングに起因するヘレグリンタンパク質ファミリーは、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４に対するリガンドである。このヘレグリンファミリーには、アルファヘレグリン、ベータヘレグリン、およびガンマヘレグリン（Holmes et al., Science, 256: 1205-1210 (1992)；米国特許第５，６４１，８６９号；およびSchaefer et al., Oncogene 15: 1385-1394 (1997)）;ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、グリア成長因子（ＧＧＦ）；アセチルコリンレセプター誘導活性（ＡＲＩＡ）；ならびに感覚および運動神経細胞由来因子（ＳＭＤＦ）がある。総説については、Groenen et al. Growth Factors 11: 235-257 (1994); Lemke, G. Molec. & Cell. Neurosci. 7: 247-262 (1996)、およびLee et al. Pharm. Rev. 47: 51-85 (1995)を参照されたい。最近、三つの追加のＨＥＲリガンドが同定された。それらは、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４のいずれかと結合することが報告されているニューレグリン−２（ＮＲＧ−２）（Chang et al. Nature 387 509-512 (1997);およびCarraway et al. Nature 387: 512-516 (1997)）；ＨＥＲ４と結合するニューレグリン−３（Zhang et al. PNAS (USA) 94(18): 9562-7 (1997)）；およびＨＥＲ４と結合するニューレグリン−４（Harari et al. Oncogene 18: 2681-89 (1999)）である。ＨＢ−ＥＧＦ、ベータセルリン、およびエピレグリンもまたＨＥＲ４に結合する。
【００１２】
ＥＧＦおよびＴＧＦαはＨＥＲ２と結合しないが、ＥＧＦは、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２を刺激してヘテロ二量体を形成させ、このヘテロ二量体はＥＧＦＲを活性化して、その結果としてこのヘテロ二量体中のＨＥＲ２のリン酸基転移が生じる。二量体化および／またはリン酸基転移は、チロシンキナーゼＨＥＲ２を活性化するようである。Earpら、上記を参照されたい。同様に、ＨＥＲ３がＨＥＲ２と同時発現すると、活性なシグナル伝達複合体が形成し、ＨＥＲ２に対する抗体はこの複合体を破壊することができる（Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994)）。追加的に、ＨＥＲ２と同時発現すると、ヘレグリン（ＨＲＧ）に対するＨＥＲ３の親和性はより高い親和性状態に増大する。ＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体に関しては、Levi et al., Journal of Neuroscience 15: 1329-1340 (1995); Morrissey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1431-1435 (1995);およびLewis et al., Cancer Res., 56: 1457-1465 (1996)もまた参照されたい。ＨＥＲ３と同様に、ＨＥＲ４はＨＥＲ２と共に活性なシグナル伝達複合体を形成する（Carraway and Cantley, Cell 78: 5-8 (1994)）。
【００１３】
卵巣ガン
卵巣ガンは、女性生殖器の悪性疾患による死亡の最もよくみられる原因である。米国で１年に推定２４０００人が新しく診断され、この疾患により約１３０００人が死亡する。進行した卵巣ガンを有する患者は、プラチナ系化学療法をしばしばタキサンと組合せて処置されることが多い。これらの薬剤が作用しなくなった後には、治療の選択肢はほとんどない。プラチナ感受性疾患を有する患者はプラチナで再処置されることが多いが、かなりの率の患者が再処置後に短い応答持続期間を有する。プラチナ耐性疾患を有する患者については転帰はあまり良好ではない。トポテカンは、初回またはその後の化学療法に失敗した患者のために食品医薬品局（ＦＤＡ）により認可されており、リポソームドキソルビシンは、プラチナ系およびパクリタキセル系化学療法方式の両方に抗療性である卵巣ガンを有する患者のためにのみ認可されている。トポテカンおよびリポソームドキソルビシンは、プラチナ耐性疾患を有する患者のそれぞれ６％および１２％の部分奏功を示し、１４〜１８週間という無増悪生存の中央値を有した。最近になって、プラチナ耐性卵巣ガンに部分奏功１６％を伴う有望な結果がゲムシタビンで報告され、第２選択療法としてこの薬剤の使用が増加するに至った。しかし、現存する治療法が失敗した、進行卵巣ガンを有する患者のための新しく改善された治療選択肢の必要性が明らかに存在する。
【００１４】
ＨＥＲファミリーのレセプターチロシンキナーゼは、卵巣ガンの病因に関係づけられている。ＨＥＲシグナル伝達経路をターゲティングするために、パーツズマブ（ｒｈｕＭＡｂ  ２Ｃ４）が、ＨＥＲ２とその他のレセプターＨＥＲとの二量体化を阻害することにより、リガンド駆動リン酸化および活性化、ならびにＲＡＳおよびＡＫＴ経路の下流の活性化を阻害するヒト化抗体として開発された。
【００１５】
ゲムシタビンは、多様な腫瘍に使用されており、膵臓ガンおよび肺ガンへの使用の適応がある。ゲムシタビン単剤の使用に伴う最も一般的な毒性には、貧血および好中球減少症の発生率それぞれ６８％および６３％を有する血球減少症がある。別の一般的な毒性は悪心および嘔吐であり、同時発生率は６９％であり、グレードＩＩＩの発生率は１３％、グレードＩＶの発生率は１％である。下痢は、それよりも低頻度の１９％に起こる。発疹は、さらに一般的に３０％に起こり、グレードＩＩＩの発生率はわずか１％である。ゲムシタビンは、重大な増加も予期されない毒性も全く有さずに、タキサン、アントラサイクリン、およびプラチナ類などの多くのその他の化学療法剤と組合されている。
【００１６】
トラスツズマブは、第ＩＩ相試験で異なる化学療法のいくつかの組合せでゲムシタビンと組合されており、心臓毒性も予期せぬ毒性も観察されずに十分に耐容もされた。Safran et al. Proc Am. Soc. Clin. Oncol. 20: 130a (2001)、Miller et al. Oncology 15(2): 38-40 (2001)。トラスツズマブおよびゲムシタビンの組合せに関しては、Zinner et al. Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 20: 328a (2001), Nagourney et al. Breast Cancer Res. Treat. 57: 116, Abstract 475 (1999)、Bun et al. Proc. Am. Assoc. Canc. Res. 41: 719, Abstract #4571 (2000)、Konecny et al. Breast Cancer Res Treat 57: 114, Abstract 467 (1999)、O'Shaugnessy et al. Sem. Oncol 2(suppl3): 22-26 (2004)、Sledge et al. Sem. Oncol. 2(suppl3): 19-21 (2003)、Zinner et al. Lung Cancer 44(1): 99-110 (2004)、Gatzemeier et al. Ann of Oncol. 15: 19-27 (2004)も参照されたい。
【００１７】
固形腫瘍を処置するための単剤としてのＯｍｎｉｔａｒｇの第Ｉ相試験において、進行卵巣ガンを有する被験者３人をパーツズマブで処置した。１人は持続的な部分奏功を有し、追加の被験者１人は１５週間安定病態を有した。Agus et al. Proc Am Soc Clin Oncol 22: 192, Abstract 771 (2003)。
【００１８】
診断
ＨＥＲ２抗体であるトラスツズマブで処置された患者は、ＨＥＲ２の過剰発現／増幅に基づく治療のために一般的に選択される。例えば、ＷＯ９９／３１１４０（Paton et al.）、ＵＳ２００３／０１７０２３４Ａ１（Hellmann, S.）、およびＵＳ２００３／０１４７８８４（Paton et al.）、ならびにＷＯ０１／８９５６６、ＵＳ２００２／００６４７８５、およびＵＳ２００３／０１３４３４４（Mass et al.）を参照されたい。ＨＥＲ２の過剰発現および増幅を検出するための免疫組織化学（ＩＨＣ）および蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）についてはＵＳ２００３／０１５２９８７、Cohenらもまた参照されたい。
【００１９】
ＷＯ２００４／０５３４９７（Bacus et al.）は、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）療法に対する応答を決定または予測することに言及している。ＵＳ２００４／０１３２９７Ａ１（Bacus et al.）は、ＡＢＸ０３０３  ＥＧＦＲ抗体療法に対する応答を決定または予測することに関するものである。ＷＯ２００４／００００９４（Bacus et al.）は、低分子性ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２チロシンキナーゼ阻害剤であるＧＷ５７２０１６に対する応答を決定することを対象とする。ＷＯ２００４／０６３７０９、Amlerらは、ＥＧＦＲ阻害剤であるエルロチニブＨＣｌに対する感受性を決定するためのバイオマーカおよび方法に言及している。ＵＳ２００４／０２０９２９０、Cobleighらは、乳ガンの予後のための遺伝子発現マーカに関するものである。
【００２０】
パーツズマブおよびそれを用いた治療のための患者選択に関する特許出願には以下が挙げられる：ＷＯ０１／００２４５（Adams et al.）；ＵＳ２００３／００８６９２４（Sliwkowski, M.）；ＵＳ２００４／００１３６６７Ａ１（Sliwkowski, M.）；およびＷＯ２００４／００８０９９Ａ２、およびＵＳ２００４／０１０６１６１（Bossenmaier et al.）。
【００２１】
Cronin et al. Am. J. Path. 164(1): 35-42 (2004)は、保存用パラフィン包埋組織での遺伝子発現の測定を記載している。Ma et al. Cancer Cell 5: 607-616 (2004)は、保存用初回生検から採取された腫瘍組織切片から単離されたＲＮＡを使用した遺伝子オリゴヌクレオチドマイクロアレイによる遺伝子プロファイリングを記載している。
【００２２】
発明の概要
本発明は、少なくとも部分的には、ある遺伝子の発現プロファイリングがＨＥＲのリン酸化または活性化を決定する代理として役立つことができるという発見に関するものである。これは、被験試料が固定標本である場合に特に好都合である。それは、固定組織試料または固定腫瘍試料でのＨＥＲ２リン酸化を信頼度高く評定する技術的な難題が存在するからである。所望の発現プロファイリングを示す患者のスクリーニングは、パーツズマブなどのＨＥＲ阻害剤からより大きい臨床上の利益を得ることができる患者亜集団の同定に導くであろう。
【００２３】
したがって第１の態様では、本発明はガンを処置するための方法を提供し、その方法は、そのガンを処置するために有効量のＨＥＲ阻害剤を患者に投与することを含み、ここで、その患者由来の腫瘍試料は、二つ以上のレセプターＨＥＲと、一つまたは複数のＨＥＲリガンドとを発現している。
【００２４】
さらに、本発明はガンを処置するための方法を提供し、その方法は、そのガンを処置するために有効量のＨＥＲ阻害剤を患者に投与することを含み、ここで、その患者由来の腫瘍試料はベータセルリンまたはアンフィレグリンを発現している。
【００２５】
別の態様では、本発明はガンを処置するための方法に関するものであり、その方法は、そのガンを処置するために有効量の、ＨＥＲ２のドメインＩＩに結合するＨＥＲ２抗体を患者に投与することを含み、ここで、その患者からの腫瘍試料は、ＨＥＲ２と、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ３と、ベータセルリンまたはアンフィレグリンとを発現している。
【００２６】
本発明は、生物学的試料中のＨＥＲのリン酸化または活性化を評定する方法にも関するものであり、その方法は、その試料中の二つ以上のレセプターＨＥＲと一つまたは複数のＨＥＲリガンドとの発現を決定することを含み、ここで、その二つ以上のレセプターＨＥＲと一つまたは複数のＨＥＲリガンドとの発現は、その試料中のＨＥＲのリン酸化または活性化を示す。
【００２７】
同様に、本発明は、生物学的試料中のＨＥＲのリン酸化または活性化を標定する方法に関するものであり、その方法は、試料中のベータセルリンまたはアンフィレグリンの発現を決定することを含み、ここで、ベータセルリンまたはアンフィレグリン発現は、試料中のＨＥＲのリン酸化または活性化を示す。
【００２８】
なお別の態様では、本発明は、ＨＥＲ二量体化阻害剤を用いた治療のための患者を同定する方法を提供し、その方法は、患者からの試料中の二つ以上のレセプターＨＥＲと一つまたは複数のＨＥＲリガンドとの発現を決定することを含み、ここで、レセプターＨＥＲとＨＥＲリガンドとの発現は、その患者がＨＥＲ二量体化阻害剤を用いた治療に応答する見込みのあることを示す。
【００２９】
なお別の局面では、本発明は、卵巣ガンを処置するための方法にも関するものであり、その方法は、その卵巣ガンを処置するために有効量のＨＥＲ阻害剤を患者に投与することを含み、ここで、その患者からの腫瘍試料はベータセルリンまたはアンフィレグリンを発現する。
【００３０】
好ましい態様の詳細な説明
Ｉ．定義
「レセプターＨＥＲ」は、レセプターＨＥＲファミリーに属するレセプタータンパク質チロシンキナーゼであり、レセプターＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４を含む。レセプターＨＥＲは、ＨＥＲリガンドと結合でき、かつ／または別のレセプターＨＥＲ分子と二量体化する細胞外ドメイン；親油性膜貫通ドメイン；保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン；およびリン酸化されうるいくつかのチロシン残基を保有するカルボキシル末端シグナル伝達ドメインを一般的に含むものである。レセプターＨＥＲは、「ネイティブな配列の」レセプターＨＥＲまたはその「アミノ酸配列変異体」でありうる。好ましくは、レセプターＨＥＲはネイティブな配列のヒトレセプターＨＥＲである。
【００３１】
用語「ＥｒｂＢ１」、「ＨＥＲ１」、「上皮成長因子レセプター」、および「ΕＧＦＲ」は、本明細書において相互交換可能に使用され、例えばCarpenter et al. Ann. Rev. Biochem. 56: 881-914 (1987)に開示されたようなＥＧＦＲを、その天然突然変異体形態（例えば、Humphrey et al. PNAS (USA) 87: 4207-4211 (1990)におけるような欠失突然変異ＥＧＦＲ）を含めて指す。ｅｒｂＢ１は、ＥＧＦＲタンパク質産物をコードしている遺伝子を指す。
【００３２】
表現「ＥｒｂＢ２」および「ＨＥＲ２」は、本明細書において相互交換可能に使用され、例えばSemba et al., PNAS (USA) 82: 6497-6501 (1985)およびYamamoto et al. Nature 319:230-234 (1986)に記載されたヒトＨＥＲ２タンパク質（ＧｅｎｅｂａｎｋアクセッションナンバーＸ０３３６３）を指す。用語「ｅｒｂＢ２」は、ヒトＥｒｂＢ２をコードしている遺伝子を指し、「ｎｅｕ」は、ラットｐ１８５ｎｅｕをコードしている遺伝子を指す。好ましいＨＥＲ２はネイティブな配列のヒトＨＥＲ２である。
【００３３】
ＨＥＲ２の細胞外ドメインは以下の四つのドメインを含む：「ドメインＩ」（アミノ酸残基約１〜１９５、配列番号１９）、「ドメインＩＩ」（アミノ酸残基約１９６〜３１９、配列番号２０）、「ドメインＩＩＩ」（アミノ酸残基約３２０〜４８８、配列番号２１）、および「ドメインＩＶ」（アミノ酸残基約４８９〜６３０、配列番号２２）（シグナルペプチドを除いて残基に付番）。Garrett et al. Mol. Cell. 11: 495-505 (2003)、Cho et al. Nature 421: 756-760 (2003)、Franklin et al. Cancer Cell 5: 317-328(2004)、およびPlowman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 1746-1750 (1993)、ならびに本明細書の図１を参照されたい。
【００３４】
「ＥｒｂＢ３」および「ＨＥＲ３」は、例えば、米国特許第５，１８３，８８４号および第５，４８０，９６８号、ならびにKraus et al. PNAS (USA) 86: 9193-9197 (1989)に開示されたようなレセプターポリペプチドを指す。
【００３５】
本明細書における用語「ＥｒｂＢ４」および「ＨＥＲ４」は、例えば、ＥＰ特許出願第５９９，２７４号；Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750 (1993)；およびPlowman et al., Nature, 366: 473-475 (1993)に開示されたようなレセプターポリペプチドを、例えば、１９９９年４月２２日に公開されたＷＯ９９／１９４８８に開示されたようなそのアイソフォームを含めて指す。
【００３６】
「ＨＥＲリガンド」により、レセプターＨＥＲに結合し、かつ／またはそれを活性化するポリペプチドを意味する。本明細書において特に関心対象であるＨＥＲリガンドは、上皮成長因子（ＥＧＦ）（Savage et al., J. Biol. Chem. 247: 7612-7621 (1972)）；トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）（Marquardt et al., Science 223:1079-1082 (1984)）；神経鞘腫またはケラチン細胞の自己分泌成長因子としても公知であるアンフィレグリン（Shoyab et al. Science 243: 1074-1076 (1989)；Kimura et al. Nature 348:257-260 (1990)；およびCook et al. Mol. Cell. Biol. 11: 2547-2557 (1991)）；ベータセルリン（Shing et al., Science 259: 1604-1607 (1993)；およびSasada et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 190: 1173 (1993)）；ヘパリン結合性上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）（Higashiyama et al., Science 251: 936-939 (1991)）；エピレグリン（Toyoda et al., J. Biol. Chem. 270: 7495-7500 (1995)；およびKomurasaki et al. Oncogene 15: 2841-2848 (1997)）；ヘレグリン（下記参照）；ニューレグリン−２（ＮＲＧ−２）（Carraway et al., Nature 387: 512-516 (1997)）；ニューレグリン−３（ＮＲＧ−３）（Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 9562-9567 (1997)）；ニューレグリン−４（ＮＲＧ−４）（Harari et al. Oncogene 18: 2681-89 (1999)）；およびクリプト（cripto）（ＣＲ−１）（Kannan et al. J. Biol. Chem. 272(6):3330-3335 (1997））などのネイティブな配列のヒトＨＥＲリガンドである。ＥＧＦＲと結合するＨＥＲリガンドには、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレグリン、ベータセルリン、ＨＢ−ＥＧＦ、およびエピレグリンがある。ＨＥＲ３と結合するＨＥＲリガンドには、ヘレグリンがある。ＨＥＲ４と結合することができるＨＥＲリガンドには、ベータセルリン、エピレグリン、ＨＢ−ＥＧＦ、ＮＲＧ−２、ＮＲＧ−３、ＮＲＧ−４、およびヘレグリンがある。
【００３７】
本明細書に使用される場合、「ヘレグリン」（ＨＲＧ）は、米国特許第５，６４１，８６９号またはMarchionni et al., Nature, 362: 312-318 (1993)に開示されたようなヘレグリン遺伝子産物にコードされているポリペプチドを指す。ヘレグリンの例には、ヘレグリン−α、ヘレグリン−β１、ヘレグリン−β２、およびヘレグリン−β３（Holmes et al., Science, 256: 1205-1210 (1992)；および米国特許第５，６４１，８６９号）；ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）（Peles et al. Cell 69: 205-216 (1992)）；アセチルコリンレセプター誘導活性（ＡＲＩＡ）（Falls et al. Cell 72: 801-815 (1993)）；グリア細胞成長因子（ＧＧＦ）（Marchionni et al., Nature, 362: 312-318 (1993)）；感覚および運動神経駆動因子（ＳＭＤＦ）（Ho et al. J. Biol. Chem. 270: 14523-14532 (1995)）；γ−ヘレグリン（Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997)）がある。
【００３８】
タンパク質の「発現」は、遺伝子にコードされている情報のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への、次にタンパク質への変換を指す。
【００３９】
本明細書において、関心対象のタンパク質（レセプターＨＥＲまたはＨＥＲリガンド）を「発現している」試料または細胞は、そのタンパク質をコードしているｍＲＮＡまたはそのタンパク質がその試料または細胞中に存在すると決定されたものである。
【００４０】
遺伝子を基準化するために使用することができる「ハウスキーピング」遺伝子の例は、グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、Ｂ−アクチン、およびＰＲＬ１９であり、本明細書における被験試料にわたり最小の発現変動を示すことからＧＵＳが好ましい。
【００４１】
本明細書に使用される「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」という技法は、核酸、ＲＮＡ、および／またはＤＮＡの微量の特異的断片が、１９８７年７月２８日に発行された米国特許第４，６８３，１９５号に記載されたように増幅される手順を一般的に指す。一般的に、オリゴヌクレオチドプライマーを設計できるように関心対象の領域の末端からの、またはそれを超えた配列情報が入手できる必要がある。これらのプライマーは、鋳型に対向する増幅される鎖と配列が同一または類似しているものである。これら２本のプライマー５’末端ヌクレオチドは、増幅された物質の末端と一致することがある。ＰＣＲを使用して、特異的ＲＮＡ配列、全ゲノムＤＮＡからの特異的ＤＮＡ配列、および全細胞性ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、バクテリオファージ配列またはプラスミド配列などを増幅することができる。一般的に、Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263 (1987)；Erlich, ed., PCR Technology（Stockton Press, NY, 1989）を参照されたい。本明細書に使用されるＰＣＲは、プライマーとして公知の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の使用を含む、核酸被験試料を増幅するための核酸ポリメラーゼ反応法の一例であるが、唯一の例ではないとみなされ、核酸の特異的断片を増幅もしくは生成するために、または特定の核酸に相補的な核酸の特異的断片を増幅もしくは生成するために核酸ポリメラーゼを利用する。
【００４２】
「定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応」または「ｑＲＴ−ＰＣＲ」は、ＰＣＲ産物の量がＰＣＲ反応の各段階で測定されるＰＣＲの一形態を指す。この技法は、Croninら、上記およびMaら、上記を含めた様々な刊行物に記載されている。
【００４３】
用語「マイクロアレイ」は、基板上でのハイブリダイゼーション可能なアレイエレメント、好ましくはポリヌクレオチドプローブの規則正しい配置を指す。
【００４４】
用語「ポリヌクレオチド」は、単数形または複数形で使用される場合、一般的に未改変ＲＮＡもしくはＤＮＡ、または改変ＲＮＡもしくはＤＮＡでありうる任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。このように、例えば本明細書に定義されるポリヌクレオチドには、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域を含むＲＮＡ、一本鎖もしくはさらに典型的には二本鎖でありうるか、または一本鎖および二本鎖領域を含むＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子があるが、それに限定されるわけではない。さらに、本明細書に使用される用語「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。当該領域の鎖は、同じ分子または異なる分子由来のことがある。この領域は、一つまたは複数の分子の全てを含むことがあるが、さらに典型的には分子の一部の領域だけに波及する。三重らせん領域の分子の一つはオリゴヌクレオチドであることが多い。用語「ポリヌクレオチド」はｃＤＮＡを特異的には含む。この用語は、一つまたは複数の改変された塩基を有する（ｃＤＮＡを含めた）ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。このように、安定性または他の理由のために改変された主鎖を有するＤＮＡまたはＲＮＡは「ポリヌクレオチド」であり、これは、その用語が本明細書において意図される通りである。さらに、イノシンなどの異常な塩基またはトリチウムラベルされた塩基などの改変された塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書に定義される用語「ポリヌクレオチド」に含まれる。一般に、用語「ポリヌクレオチド」は、全ての化学的、酵素的、および／または代謝的に改変された形態または未改変のポリヌクレオチド、ならびにウイルスと、単細胞および複合細胞を含めた細胞とに特徴的な化学的形態のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。
【００４５】
用語「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖または二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドおよび二本鎖ＤＮＡを非限定的に含めた相対的に短いポリヌクレオチドを指す。一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、例えば市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置を使用して化学法により合成されることが多い。しかし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏリコンビナントＤＮＡ介在性技法を含めた多様な他の方法により、ならびに細胞および生物でのＤＮＡ発現によりオリゴヌクレオチドを作成することができる。
【００４６】
句「遺伝子増幅」は、特定の細胞または細胞系で多コピーの遺伝子または遺伝子フラグメントが形成される工程を指す。複製された領域（増幅されたＤＮＡのストレッチ）は「アンプリコン」と称されることが多い。通常は、産生するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量も、発現した特定の遺伝子からできたコピー数の割合が増加する。
【００４７】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者により容易に決定されることができ、一般的にプローブ長、洗浄温度、および塩濃度に依存する経験的計算である。一般に、プローブが長いと適切なアニーリングに高温を要し、プローブが短いと低温が必要である。一般的に、相補鎖がその融解温度未満の環境に存在する場合、ハイブリダイゼーションは変性ＤＮＡが再アニーリングする能力に依存する。プローブおよびハイブリダーゼーション可能な配列の間の所望の相同性の程度が高いほど、使用することのできる相対温度は高い。結果として、高い相対温度は反応条件をよりストリンジェントにする傾向にあるということになるが、一方で低温ではあまりそうではない。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの追加の詳細および説明については、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照されたい。
【００４８】
本明細書に定義される「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、典型的には：（１）洗浄に低イオン強度および高温、例えば０．０１５M塩化ナトリウム／０．００１５Mクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを５０℃で採用するか；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミドなどの変性剤、例えば、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を有する５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを、７５０mM塩化ナトリウム、７５mMクエン酸ナトリウムと共に４２℃で採用するか；または（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５M ＮａＣｌ、０．０７５Mクエン酸ナトリウム）、５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０&gr;g/ml）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを４２℃で採用して、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中で４２℃で、および５０％ホルムアミド中で５５℃で洗浄し、続いてＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を５５℃で行うものである。
【００４９】
「中程度のストリンジェントな条件」は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されたように同定することができ、この条件は、上記条件よりストリンジェントではない洗浄溶液およびハイブリダーゼーション条件（例えば温度、イオン強度、および％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェントな条件の例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０mM ＮａＣｌ、１５mMクエン酸三ナトリウム）、５０mMリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０mg/ml変性破砕サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での３７℃で一晩のインキュベーションに続く、１×ＳＳＣ中の約３７〜５０℃でのフィルター洗浄である。当業者は、プローブ長などの要因を適応させるのに必要に応じて、温度、イオン強度などをどのように調整するかを認識しているものである。
【００５０】
本明細書における「ＨＥＲ二量体」は、少なくとも二つの異なるレセプターＨＥＲを含む非共有的に会合した二量体である。このような複合体は、二つ以上のレセプターＨＥＲを発現している細胞がＨＥＲリガンドに曝露されたときに形成することがあり、この複合体を免疫沈降により単離して、例えばSliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994)に記載されているようなＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析することができる。当該ＨＥＲ二量体の例には、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３、およびＨＥＲ３−ＨＥＲ４ヘテロ二量体がある。さらに、ＨＥＲ二量体は、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、またはＥＧＦＲなどの異なるレセプターＨＥＲと組合せられた二つ以上のレセプターＨＥＲ２を含みうる。サイトカインレセプターサブユニット（例えばｇｐ１３０）などのその他のタンパク質がその二量体と会合していることがある。
【００５１】
「ＨＥＲ阻害剤」は、ＨＥＲの活性化または機能を妨害する薬剤である。ＨＥＲ阻害剤の例には、ＨＥＲ抗体（例えばＥＧＦＲ抗体、ＨＥＲ２抗体、ＨＥＲ３抗体、またはＨＥＲ４抗体）；ＥＧＦＲターゲット薬；小分子性ＨＥＲアンタゴニスト；ＨＥＲチロシンキナーゼ阻害剤；アンチセンス分子（例えば、ＷＯ２００４／８７２０７参照）；および／またはＭＡＰＫもしくはＡｋｔなどの下流のシグナル伝達分子に結合するか、もしくはその機能を妨害する薬剤がある（図５参照）。好ましくは、ＨＥＲ阻害剤はレセプターＨＥＲに結合する抗体または小分子である。
【００５２】
本明細書に使用される用語「ＥＧＦＲターゲット薬」は、ＥＧＦＲに結合して、場合によりＥＧＦＲの活性化を阻害する治療剤を指す。当該薬剤の例には、ＥＧＦＲに結合する抗体および小分子がある。ＥＧＦＲに結合する抗体の例には、ＭＡｂ５７９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ＨＢ８５０６）、ＭＡｂ４５５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ＨＢ８５０７）、ＭＡｂ２２５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ８５０８）、ＭＡｂ５２８（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ８５０９）（米国特許第４，９４３，５３３号、Mendelsohn et al.参照）、ならびにキメラ化２２５（Ｃ２２５またはセツキシマブ；ＥＲＢＵＴＩＸ（登録商標））および再形状化ヒト２２５（Ｈ２２５）（ＷＯ９６／４０２１０、Imclone Systems Inc.参照）などのその変異体；ＩＩ型突然変異ＥＧＦＲと結合する抗体（米国特許第５，２１２，２９０号）；米国特許第５，８９１，９９６号に記載されているような、ＥＧＦＲと結合するヒト化抗体およびキメラ抗体；ならびにＡＢＸ−ＥＧＦなどの、ＥＧＦＲと結合するヒト抗体（ＷＯ９８／５０４３３、Abgenix参照）；ＥＭＤ５５９００（Stragliotto et al. Eur. J. Cancer 32A: 636-640 (1996)）；ならびにｍＡｂ８０６またはヒト化ｍＡｂ８０６（Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29): 30375-30384 (2004)）がある。抗ＥＧＦＲ抗体を細胞毒性薬とコンジュゲーションすることにより、免疫コンジュゲートを作成することができる（例えば、ＥＰ６５９，４３９Ａ２、Merck Patent GmbH参照）。ＥＧＦＲに結合する小分子の例には、ＺＤ１８３９すなわちゲフィチニブ（IRESSA（商標）;AstraZeneca）；ＣＰ−３５８７７４すなわちエルロチニブＨＣＬ（TARCEVA（商標）;Genentech/OSI）；およびＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ５２７１;Sugen）がある。
【００５３】
「チロシンキナーゼ阻害剤」は、レセプターＨＥＲなどのチロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性を阻害する分子である。当該阻害剤の例には、前項で言及されたＥＧＦＲターゲット薬；武田から入手可能なＴＡＫ１６５などの小分子ＨＥＲ２チロシンキナーゼ阻害剤；選択的にＥＧＦＲと結合するが、ＨＥＲ２を過剰している細胞およびＥＧＦＲを過剰発現している細胞の両方を阻害するＥＫＢ−５６９（Wyethから入手できる）などの二重ＨＥＲ阻害剤；経口ＨＥＲ２およびＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤であるＧＷ５７２０１６（Glaxoから入手できる）；ＰＫＩ−１６６（Novartisから入手できる）；カネルチニブ（ＣＩ−１０３３；Pharmacia）などの汎ＨＥＲ阻害剤；Ｒａｆ−１シグナル伝達を阻害する、ISIS Pharmaceuticalsから入手できるアンチセンス剤ＩＳＩＳ−５１３２などのＲａｆ−１阻害剤；Glaxoから入手できるメシル酸イマチニブ（Gleevac（商標））などの非ＨＥＲターゲットＴＫ阻害剤；ＭＡＰＫ細胞外調節キナーゼＩ阻害剤ＣＩ−１０４０（Pharmaciaから入手できる）；ＰＤ１５３０３５、４−（３−クロロアニリノ）キナゾリンなどのキナゾリン；ピリドピリミジン；ピリミドピリミジン；ＣＧＰ５９３２６、ＣＧＰ６０２６１、およびＣＧＰ６２７０６などのピロロピリミジン；ピラゾロピリミジン、４−（フェニルアミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン；クルクミン（ジフェルロイルメタン、４，５−ビス（４−フルオロアニリノ）フタルイミド）；ニトロチオフェン部分含有チルホスチン；ＰＤ−０１８３８０５（Warner-Lamber）；アンチセンス分子（例えば、ＨＥＲをコードしている核酸に結合するもの）；キノキサリン（米国特許第５，８０４，３９６号）；トリホスチン（米国特許第５，８０４，３９６号）；ＺＤ６４７４（Astra Zeneca）；ＰＴＫ−７８７（Novartis/Schering AG）；ＣＩ−１０３３（Pfizer）などの汎ＨＥＲ阻害剤；アフィニタック（ＩＳＩＳ３５２１；Isis/Lilly）；メシル酸イマチニブ（Gleevac; Novartis）；ＰＫＩ１６６（Novartis）；ＧＷ２０１６（Glaxo SmithKline）；ＣＩ−１０３３（Pfizer）；ＥＫＢ−５６９（Wyeth）；セマキシニブ（Sugen）；ＺＤ６４７４（AstraZeneca）；ＰＴＫ−７８７（Novartis/Schering AG）；ＩＮＣ−１Ｃ１１（Imclone）；または以下の特許公報のいずれかに記載されているものがある：米国特許第５，８０４，３９６号；ＷＯ９９／０９０１６（American Cyanimid）；ＷＯ９８／４３９６０（American Cyanamid）；ＷＯ９７／３８９８３（Warner Lambert）；ＷＯ９９／０６３７８（Warner Lambert）；ＷＯ９９／０６３９６（Warner Lambert）；ＷＯ９６／３０３４７（Pfizer, Inc）；ＷＯ９６／３３９７８（Zeneca）；ＷＯ９６／３３９７（Zeneca）；およびＷＯ９６／３３９８０（Zeneca）。
【００５４】
「ＨＥＲ二量体化阻害剤」は、ＨＥＲ二量体の形成を阻害する薬剤である。好ましくは、ＨＥＲ二量体化阻害剤は、抗体、例えばＨＥＲ２にそのヘテロ二量体結合部位で結合する抗体である。本明細書における最も好ましい二量体化阻害剤は、パーツズマブまたはＭＡｂ  ２Ｃ４である。ＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位への２Ｃ４の結合を図４に示す。ＨＥＲ二量体化阻害剤のその他の例には、ＥＧＦＲに結合して、それと一つまたは複数のその他のレセプターＨＥＲとの二量体化を阻害する抗体（例えば、活性化ＥＧＦＲまたは「繋ぎ止められていない（untethered）」ＥＧＦＲに結合するＥＧＦＲモノクローナル抗体８０６（ＭＡｂ８０６）；Johns et al., J. Biol. Chem. 279 (29): 30375-30384 (2004)参照）；ＨＥＲ３に結合して、それと一つまたは複数のその他のレセプターＨＥＲとの二量体化を阻害する抗体；ＨＥＲ４に結合して、それと一つまたは複数のその他のレセプターＨＥＲとの二量体化を阻害する抗体；ペプチド二量体化阻害剤（米国特許第６，４１７，１６８号）;アンチセンス二量体化阻害剤などがある。
【００５５】
ＨＥＲ２上の「ヘテロ二量体結合部位」は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４と二量体を形成するときにそれらの細胞外ドメイン中の領域と接触または連結するＨＥＲ２の細胞外ドメイン中の領域を指す。その領域はＨＥＲ２のドメインＩＩに見出される。Franklin et al. Cancer Cell 5: 317-328(2004)。
【００５６】
「ＨＥＲ活性化」は、任意の一つまたは複数のレセプターＨＥＲの活性化、またはリン酸化を指す。一般的に、（例えば、レセプターＨＥＲまたは基質ポリペプチド中のチロシン残基をリン酸化しているレセプターＨＥＲの細胞内キナーゼドメインによって起こる）ＨＥＲ活性化はシグナル伝達を招く。ＨＥＲ活性化は、関心対象のレセプターＨＥＲを含むＨＥＲ二量体に結合するＨＥＲリガンドによって仲介されうる。ＨＥＲ二量体に結合するＨＥＲリガンドは、二量体中の一つまたは複数のレセプターＨＥＲのキナーゼドメインを活性化することにより、一つもしくは複数のレセプターＨＥＲのチロシン残基リン酸化および／またはＡｋｔもしくはＭＡＰＫ細胞内キナーゼなどの追加の基質ポリペプチドのチロシン残基リン酸化を生じうる。例えば、図５を参照されたい。
【００５７】
「リン酸化」は、レセプターＨＥＲまたはその基質などのタンパク質への一つまたは複数のリン酸基の付加を指す。
【００５８】
「ネイティブな配列の」ポリペプチドは、天然由来のポリペプチド（例えばレセプターＨＥＲまたはＨＥＲリガンド）と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドである。当該ネイティブな配列のポリペプチドを天然から単離でき、また、リコンビナント手段もしくは合成手段により産生させることができる。このように、ネイティブな配列のポリペプチドは、天然ヒトポリペプチド、マウスポリペプチド、または任意のその他の哺乳動物種由来のポリペプチドのアミノ酸配列を有しうる。
【００５９】
本明細書における用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、具体的には、所望の生物学的活性を示す限りはインタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも二つのインタクトな抗体から形成された多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および抗体フラグメントにわたる。
【００６０】
本明細書に使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、モノクローナル抗体の産生時に生じる可能性のある変異体を除いて、その集団を構成する個別の抗体は同一であり、かつ／または同じエピトープと結合する。当該変異体は一般的に少量存在する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対するものである。 その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンが混入していない点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるとしてのその抗体の性質を表し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈してはならない。例えば、本発明により使用されるモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法により作成することができるし、また、リコンビナントＤＮＡ法によって作成することもできる（例えば米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。「モノクローナル抗体」は、例えばClackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)に記載された技法を使用したファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００６１】
本明細書におけるモノクローナル抗体には、その抗体が所望の生物学的活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖の部分が、特定の種由来の抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるが、その鎖の残りが、別の種由来の抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体、ならびに当該抗体のフラグメントが具体的に含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；およびMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)）。本明細書において関心対象のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば旧世界ザル、類人猿など）由来の可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常部配列を含む「霊長類化（primatized）」抗体がある。
【００６２】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の部分を含み、その部分は好ましくはその抗原結合部を含む。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；二特異性抗体（diabody）；線状抗体（linear antibody）；一本鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体がある。
【００６３】
本明細書における「インタクトな抗体」は、二つの抗原結合領域とＦｃ部とを含む抗体である。好ましくは、インタクトな抗体は一つまたは複数のエフェクター機能を有する。
【００６４】
インタクトな抗体の重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、それらの抗体を異なる「クラス」に割り当てることができる。インタクトな抗体には五つの主クラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかをさらに「サブクラス」（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２に分けることができる。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。
【００６５】
抗体の「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ部（ネイティブな配列のＦｃ部またはアミノ酸配列変異体のＦｃ部）に起因しうる生物学的活性を指す。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑとの結合；補体依存性細胞傷害作用；Ｆｃレセプターとの結合；抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面レセプターのダウンレギュレーション（例えばＢ細胞レセプター；ＢＣＲ）などがある。
【００６６】
「抗体依存性細胞性細胞傷害作用」および「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）がターゲット細胞上に結合した抗体を認識して、その後にターゲット細胞の溶解を起こす細胞介在性反応を指す。ＡＤＣＣを仲介するための一次細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲの発現を要約したものは、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)の４６４頁の表３である。関心対象の分子のＡＤＣＣ活性を評定するために、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されているようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイを行うことができる。当該アッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞がある。または、もしくは追加的に、関心対象の分子のＡＤＣＣ活性を、例えばClynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されたような動物モデルでｉｎ  ｖｉｖｏ評定することができる。
【００６７】
「ヒトエフェクター細胞」は、一つまたは複数のＦｃＲを発現してエフェクター機能を果たす白血球である。好ましくは、これらの細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現してＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを仲介するヒト白血球の例には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、および好中球があり、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、そのネイティブな起源から、例えば本明細書に記載されたように血液またはＰＢＭＣから単離することができる。
【００６８】
用語「Ｆｃレセプター」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ部に結合するレセプターを記述するために使用される。好ましいＦｃＲはネイティブな配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体と結合するもの（ガンマレセプター）であり、好ましいＦｃＲには、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターが、これらのレセプターのアレル変異体および選択的スプライシングされた形態を含めて挙げられる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化レセプター」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害レセプター」）があり、それらは、細胞質ドメインが主に異なる類似したアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインにＩＴＡＭ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif）を有する。阻害レセプターＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインにＩＴＩＭ（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif）を有する（Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)の総説Ｍを参照されたい）。ＦｃＲは、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)；Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994)；およびde Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)に総説されている。将来同定されるものを含めたその他のＦｃＲは、本明細書において用語「ＦｃＲ」によって包含される。この用語は、胎児への母体ＩｇＧの輸送を担う新生児レセプターＦｃＲｎも含む（Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976)およびKim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)）。
【００６９】
「補体依存性細胞傷害作用」または「ＣＤＣ」は、分子が補体の存在下でターゲットを溶解する能力を指す。補体活性化経路は、コグネイト抗原と複合体を形成した分子（例えば抗体）への補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）の結合により開始する。補体活性化を評定するために、例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)に記載されているようなＣＤＣアッセイを行うことができる。
【００７０】
「ネイティブな抗体」は、通常は２本の同一の軽（Ｌ）鎖および２本の同一の重（Ｈ）鎖から構成される約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合する一方で、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で多様である。各重鎖および軽鎖は、規則的に間隔のあいた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、続いていくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）と、そのもう一方の末端に定常ドメインとを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖可変ドメインは、重鎖可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられる。
【００７１】
用語「可変」は、可変ドメインのある部分が、抗体間で広範囲に配列が異なり、それぞれ特定の抗体の、その特定の抗原に対する結合および特異性に使用されるという事実を指す。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたり均等に分布しているわけではない。可変性は、軽鎖および重鎖両方の可変ドメインにおける超可変部と呼ばれる三つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク部（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブな重鎖および軽鎖の可変ドメインそれぞれは、四つのＦＲを含み、それらのＦＲは大部分がβシート立体配置を採り、三つの超可変部により連結され、これらの超可変部は、βシート構造を連結するループを形成して、場合によりこのβシート構造の一部を形成する。各鎖中の超可変部は、ＦＲによって一緒に近接して保持されて、もう一方の鎖由来の超可変部と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)を参照されたい）。定常ドメインは、抗原に抗体を結合させることに直接には関与していないが、抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）への抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。
【００７２】
本明細書に使用される場合、用語「超可変部」は、抗原との結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変部は、一般的に「相補性決定部」すなわち「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、残基５０〜５６（Ｌ２）、および残基８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の残基３１〜３５（Ｈ１）、残基５０〜６５（Ｈ２）、および残基９５〜１０２（Ｈ３）；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）ならびに／または「超可変ループ」由来の残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、および残基９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｈ１）、残基５３〜５５（Ｈ２）および残基９６〜１０１（Ｈ３）；Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)）を含む。「フレームワーク部」または「ＦＲ」残基は、本明細書において定義されるような超可変部残基以外の可変ドメインの残基である。
【００７３】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる、それぞれ単一の抗原結合部位を有する２本の同一の抗原結合フラグメントと、名前が容易に結晶化できる能力を反映している残りの１「Ｆｃ」フラグメントとを産生する。ペプシン処理は、二つの抗原結合部位を有するＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じ、このフラグメントは、依然として抗原と架橋できる。
【００７４】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識抗原結合部位を有する、最小限の抗体フラグメントである。この領域は、密接に非共有的に会合した、一つの重鎖可変ドメインと一つの軽鎖可変ドメインとの二量体からなる。各可変ドメインの三つの超可変部が相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を規定するのは、この立体配置である。まとめると、六つの超可変部は、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（すなわち抗原に対して特異的な三つの超可変部のみを含む、Ｆｖの半分）でさえも、結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識してその抗原と結合する能力を有する。
【００７５】
Ｆａｂフラグメントもまた、軽鎖の定常ドメインと、重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）とを有する。Ｆａｂ’フラグメントは、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、抗体のヒンジ部由来の一つまたは複数のシステインを含む数残基が付加していることが、Ｆａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書において定常ドメインのシステイン残基が少なくとも一つの遊離チオール基を有するＦａｂ’についての呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメント対として本来産生された。抗体フラグメントのその他の化学的カップリングも公知である。
【００７６】
任意の脊椎動物種由来抗体の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる二つの明らかに別個の型のうちの一つに割り当てることができる。
【００７７】
「一本鎖Ｆｖ」抗体フラグメントまたは「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、このＦｖポリペプチドは、このｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの総説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)を参照されたい。ＨＥＲ２抗体のｓｃＦｖフラグメントは、ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および米国特許第５，５８７，４５８号に記載されている。
【００７８】
用語「二特異性抗体」は、二つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを指し、このフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中で可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）に連結した可変重鎖ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上のこれら二つのドメイン間で対形成させるには短すぎるリンカーを用いることによって、これらのドメインに別の鎖の相補的ドメインと対形成することを強いて、二つの抗原結合部位を生み出す。二特異性抗体は、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)に、さらに完全に記載されている。
【００７９】
「ヒト化」形態の非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を有するキメラ抗体である。ヒト化抗体は、通例レシピエントの超可変部由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変部由来の残基に置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。時には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク部（ＦＲ）の残基が、対応する非ヒト残基に置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にもドナー抗体中にも見出されない残基を含むことがある。これらの改変は、抗体の性能をさらに精密化するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、超可変ループのうちの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含むものである。ヒト化抗体は、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常部である免疫グロブリン定常部（Ｆｃ）の少なくとも一部も場合により含むものである。さらなる詳細については、Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988)；およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)を参照されたい。
【００８０】
ヒト化ＨＥＲ２抗体には、参照により本明細書に特に組み入れられる米国特許第５，８２１，３３７号の表３に記載されるｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７、およびｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８またはトラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））；ヒト化５２０Ｃ９（ＷＯ９３／２１３１９）；ならびに本明細書に記載されるヒト化２Ｃ４抗体がある。
【００８１】
本明細書の目的で、「トラスツズマブ」、「ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）」、および「ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８」は、それぞれ配列番号１５および１６の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を含む抗体を指す。
【００８２】
本明細書において、「パーツズマブ」および「ＯＭＮＩＴＡＲＧ（商標）」は、それぞれ配列番号１３および１４の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を含む抗体を指す。
【００８３】
トラスツズマブおよびパーツズマブの間の機能の差を図６に示す。
【００８４】
「ネイキッドな抗体」は、細胞毒性部分または放射性ラベルなどの異種分子とコンジュゲーションしていない抗体である。
【００８５】
「単離された」抗体は、その天然環境の構成要素から同定されて、分離および／または回収された抗体である。その天然環境の混入構成要素は、その抗体についての診断的用途または治療的用途を妨害するであろう物質であり、それらには、酵素、ホルモン、およびその他のタンパク質様または非タンパク質様の溶質が含まれうる。好ましい態様では、抗体は、（１）ローリー法によって決定したときに、抗体の９５重量％を超えるまで、最も好ましくは９９重量％を超えるまで精製されるか、（２）スピニングカップ（spinning cup）シークエネーターの使用により、少なくとも１５残基のＮ末端アミノ酸配列もしくは内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度に精製されるか、または（３）クマシーブルー染色もしくは好ましくは銀染色を用いた、還元条件もしくは非還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで精製されるであろう。単離された抗体には、リコンビナント細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕ抗体が含まれる。それは、その抗体の天然環境の少なくとも一つの構成要素が存在しないものであるからである。しかし、通常、単離された抗体は、少なくとも１回の精製段階によって調製されるものである。
【００８６】
「親和性成熟した」抗体は、変更を有さない親抗体に比べて、抗原に対する抗体の親和性に改善を生じる一つまたは複数の変更を、その一つまたは複数の超可変部に有する抗体である。好ましい親和性成熟した抗体は、ターゲット抗原に対してナノモル濃度またはピコモル濃度の親和性さえ有するであろう。親和性成熟した抗体は、当技術分野で公知の手順によって産生される。Marksら、Bio/Technology 10: 779-783 (1992)は、ＶＨおよびＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟を記載している。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813 (1994)；Schier et al. Gene 169: 147-155 (1995)；Yelton et al. J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7): 3310-9 (1995);およびHawkins et al, J. Mol. Biol. 226: 889-896 (1992)に記載されている。
【００８７】
「トラスツズマブよりも効果的にＨＥＲの二量体化を阻害する」ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブよりも効果的に（例えば少なくとも約２倍効果的に）ＨＥＲ二量体を低減または除去する抗体である。好ましくは、当該抗体は、マウスモノクローナル抗体２Ｃ４、マウスモノクローナル抗体２Ｃ４のＦａｂフラグメント、パーツズマブ、およびパーツズマブのＦａｂフラグメントからなる群より選択される抗体と少なくとも同じくらい効果的にＨＥＲ２の二量体化を阻害する。ＨＥＲ二量体を直接研究することにより、またはＨＥＲの二量体化を招くＨＥＲの活性化もしくは下流のシグナル伝達を評価することにより、および／または抗体のＨＥＲ２結合部位を評価することなどにより、ＨＥＲ二量体化の阻害を評価することができる。トラスツズマブよりも効果的にＨＥＲ二量体化を阻害する能力を有する抗体についてスクリーニングするためのアッセイは、Agus et al., Cancer Cell 2: 127-137 (2002)およびＷＯ０１／００２４５（Adams et al.）に記載されている。ほんの例として、例えばＨＥＲ二量体の形成阻害（例えば、Agus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002)の図１Ａ〜Ｂ；およびＷＯ０１／００２４５を参照されたい）；ＨＥＲリガンドによるＨＥＲ二量体を発現している細胞の活性化の低減（例えばＷＯ０１／００２４５およびAgus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002)の図２Ａ〜Ｂ）；ＨＥＲ二量体を発現している細胞に対するＨＥＲリガンドの結合の遮断（例えばＷＯ０１／００２４５およびAgus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002)の図２Ｅ）；ＨＥＲリガンドの存在下（または不在下）でＨＥＲ二量体を発現しているガン細胞（例えばＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＤ−１３４、ＺＲ−７５−１、ＭＤ−ＭＢ−１７５、Ｔ−４７Ｄ細胞）の細胞成長阻害（例えばＷＯ０１／００２４５およびAgus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002)の図３Ａ〜Ｄ）；下流のシグナル伝達の阻害（例えば、ＨＲＧ依存性ＡＫＴリン酸化の阻害またはＨＲＧもしくはＴＧＦα依存性ＭＡＰＫリン酸化の阻害）（例えばＷＯ０１／００２４５およびAgus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002)の図２Ｃ〜Ｄを参照されたい）を評定することによってＨＥＲ二量体化の阻害をアッセイすることができる。抗体−ＨＥＲ２結合部位を研究することによって、例えばＨＥＲ２に結合した抗体の結晶構造などの構造またはモデルを評価することによっても、その抗体がＨＥＲ二量体化を阻害するかどうか評定することができる（例えば、Franklin et al. Cancer Cell 5: 317-328 (2004)を参照されたい）。
【００８８】
ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブよりも効果的に（例えば少なくとも２倍効果的に）「ＨＲＧ依存性のＡＫＴリン酸化を阻害」し、かつ／または「ＨＲＧもしくはＴＧＦα依存性のＭＡＰＫリン酸化」を阻害しうる（例としてAgus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002)およびＷＯ０１／００２４５を参照されたい）。
【００８９】
ＨＥＲ２抗体は、「ＨＥＲ２エクトドメインの開裂を阻害しない」抗体でありうる（Molina et al. Cancer Res. 61: 4744-4749 (2001)。
【００９０】
ＨＥＲ２の「ヘテロ二量体結合部位に結合する」ＨＥＲ２抗体は、ドメインＩＩの残基に結合して（場合によりドメインＩおよびＩＩＩなどの、ＨＥＲ２細胞外ドメインのその他のドメインの残基にも結合して）、ＨＥＲ２−ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３、またはＨＥＲ２−ＨＥＲ４ヘテロ二量体の形成を少なくともある程度立体的に妨害することができる。Franklin et al. Cancer Cell 5: 317-328 (2004)は、ＲＣＳＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＩＤコードＩＳ７８）に寄託されたＨＥＲ２−パーツズマブの結晶構造を特徴づけ、その構造はＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位に結合する抗体の一例を示している。
【００９１】
ＨＥＲ２の「ドメインＩＩに結合する」抗体は、ドメインＩＩの残基、および場合によりドメインＩおよびドメインＩＩＩなどのＨＥＲ２のその他のドメインの残基に結合する。好ましくは、ドメインＩＩに結合する抗体は、ＨＥＲ２のドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩの間の結合部に結合する。
【００９２】
本明細書における用語「主要種抗体」は、その組成物中の抗体構造を指し、その抗体は組成物中の量的に優占的な抗体分子である。一態様では、主要種抗体は、ＨＥＲ２のドメインＩＩに結合する抗体、ＨＥＲの二量体化をトラスツズマブよりも効果的に阻害する抗体、および／またはＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位に結合する抗体などのＨＥＲ２抗体である。本明細書における主要種抗体の好ましい態様は、配列番号３および４の可変軽鎖および可変重鎖アミノ酸配列を含む抗体であり、最も好ましくは配列番号１３および１４の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を含む抗体（パーツズマブ）である。
【００９３】
本明細書における「アミノ酸配列変異体」抗体は、主要種抗体と異なるアミノ酸配列を有する抗体である。通常、アミノ酸配列変異体は、主要種抗体と少なくとも約７０％の相同性を有するものであり、好ましくは、主要種抗体と少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約９０％相同なものである。このアミノ酸配列変異体は、主要種抗体のアミノ酸配列内の、またはそれに隣接したある位置に置換、欠失、および／または付加を有する。本明細書におけるアミノ酸配列変異体の例には、酸性変異体（例えば、脱アミド化抗体変異体）、塩基性変異体、１本または２本の軽鎖にアミノ末端リーダー伸長（例えばＶＨＳ−）を有する抗体、１本または２本の重鎖にＣ末端リシン残基を有する抗体などがあり、重鎖および／または軽鎖のアミノ酸配列に対する変異の組合せがある。本明細書において特に関心対象の抗体変異体は、その１本または２本の軽鎖にアミノ末端リーダー伸長を含み、場合により主要種抗体と比べてその他のアミノ酸配列および／またはグリコシル化の差異をさらに含む抗体である。
【００９４】
本明細書における「グリコシル化変異体」抗体は、主要種抗体に付着した一つまたは複数の糖質部分とは異なる一つまたは複数の糖質部分が付着した抗体である。本明細書におけるグリコシル化変異体の例には、Ｇ０オリゴ糖構造の代わりにＧ１またはＧ２オリゴ糖構造がＦｃ部に付着した抗体、一つまたは二つの糖質部分が１本または２本の軽鎖に付着した抗体、糖質が抗体の１本または２本の重鎖に付着していない抗体など、およびグリコシル化変更の組合せがある。
【００９５】
抗体がＦｃ部を有する場合、本明細書の図９に示されたようなオリゴ糖構造を、その抗体の１本または２本の重鎖に、例えば残基２９９（残基のＥｕ付番では２９８）で付着させることができる。パーツズマブについては、Ｇ０は主要なオリゴ糖構造であり、Ｇ０−Ｆ、Ｇ−１、Ｍａｎ５、Ｍａｎ６、Ｇ１−１、Ｇ１（１−６）、Ｇ１（１−３）、およびＧ２などのその他のオリゴ糖構造は、パーツズマブ組成物中にさらに少量見出された。他に示さない限り、本明細書における「Ｇ１オリゴ糖構造」にはＧ−１、Ｇ１−１、Ｇ１（１−６）、およびＧ１（１−３）構造が含まれる。
【００９６】
本明細書における「アミノ末端リーダー伸長」は、抗体の任意の１本または複数本の重鎖または軽鎖のアミノ末端に存在する、アミノ末端リーダー配列の一つまたは複数のアミノ酸残基を指す。アミノ末端リーダー伸長の例は、抗体変異体の一方もしくは両方の軽鎖に存在する三つのアミノ酸残基ＶＨＳを含むか、またはそれからなる。
【００９７】
「脱アミド化」抗体は、その抗体の一つまたは複数のアスパラギン残基が、例えばアスパラギン酸、スクシンイミド、またはイソアスパラギン酸に誘導体化された抗体である。
【００９８】
「相同性」は、配列をアライメントして、必要ならばギャップを導入して最大の相同率を実現した後で同一である、アミノ酸配列変異体における残基の率として定義される。アライメントのための方法およびコンピュータプログラムは、当技術分野で周知である。当該コンピュータプログラムの一つは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｋ，  Ｉｎｃ．によって著作された「Ａｌｉｇｎ２」であり、このプログラムは１９９１年１２月１０日に米国著作権局、Washington, DC 20559にユーザー文書と共に提出された。
【００９９】
本明細書のために、「陽イオン交換分析」は、二つ以上の化合物を含む組成物が陽イオン交換体を用いて電荷の差に基づき分離される任意の方法を指す。陽イオン交換体は、共有結合した負荷電基を一般的に含む。好ましくは、本明細書における陽イオン交換体は弱陽イオン交換体であり、かつ／またはＤｉｏｎｅｘにより販売されるＰＲＯＰＡＣ  ＷＣＸ−１０（商標）陽イオン交換カラムなどの、カルボン酸官能基を含む。
【０１００】
「卵巣」は、女性において子宮の両側に位置する二つの小さなアーモンド型の器官の一つである。
【０１０１】
「卵管」または「輸卵管」は、雌性哺乳動物の卵巣から子宮に至る２本の細い管の１本である。
【０１０２】
「腹膜」は、腹部などの体腔の上皮裏装である。
【０１０３】
用語「ガン」および「ガン性」は、無秩序な細胞成長によって典型的には特徴づけられる、哺乳類における生理的状態を指すか、または記述する。ガンの例には、ガン腫、リンパ腫、芽細胞腫（髄芽腫および網膜芽腫を含む）、肉腫（脂肪肉腫および滑膜細胞肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍（カルチノイド腫瘍、ガストリノーマ、および膵島細胞ガンを含む）、中皮腫、神経鞘腫（聴神経腫を含む）、髄膜腫、腺ガン、黒色腫、および白血病またはリンパ系悪性疾患があるが、それに限定されるわけではない。当該ガンのさらに特定の例には、扁平上皮ガン（例えば上皮性扁平上皮ガン）；小細胞肺ガン（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）、肺腺ガン、および肺扁平上皮ガンを含む肺ガン；腹膜ガン；肝細胞ガン；消化管ガンを含む胃ガン；膵臓ガン；神経膠芽腫；子宮頚がん；卵巣ガン；肝臓ガン；膀胱ガン；ヘパトーマ；乳ガン（転移性乳ガンを含む）；結腸ガン；直腸ガン；直腸結腸ガン；子宮内膜ガンまたは子宮ガン；唾液腺ガン；腎ガン；前立腺がん；外陰部ガン；甲状腺ガン；肝ガン；肛門ガン；陰茎ガン；精巣ガン；食道ガン；胆道腫瘍；および頭頚部ガンがある。
【０１０４】
「卵巣ガン」は、一方または両方の卵巣に発生する、潜在的に生命を危うくする悪性疾患である。卵巣ガンの症状が出現するときまでに、卵巣腫瘍は腹部全体にガン細胞を播種するのに十分なほど大きく成長していることがある。卵巣の外側に拡大した卵巣ガン細胞は、転移性卵巣ガンと呼ばれる。卵巣腫瘍は、横隔膜、腸、および／または網（腹部の器官を覆い、間隙を埋める脂肪層）に拡大する傾向にある。ガン細胞はリンパのチャネルおよび血流を介して他の器官に拡大することもある。本明細書において処置される卵巣ガンには、三つの原発性クラスの悪性卵巣腫瘍、すなわち上皮性腫瘍、胚細胞性腫瘍、および間質性腫瘍がある。
【０１０５】
「原発性腹膜ガン」は、腹膜に発生するガンを指す。原発性腹膜ガンは、顕微鏡像、症状、拡大パターン、および予後からみて上皮性卵巣ガンに非常に類似していることがある。卵巣を除去された女性は、依然として原発性腹膜ガンに冒されるおそれがある。
【０１０６】
「卵管ガン」は、卵管および／または広間膜のガンを指す。
【０１０７】
「上皮性腫瘍」は、卵巣の外側を取り囲む胚上皮として公知である立方体形の細胞層に発生する。上皮性腫瘍は全卵巣ガンの最大９０％を占める。
【０１０８】
「胚細胞性腫瘍」は、卵巣の卵成熟細胞に見出される。全ての卵巣ガンの約３％を占める胚細胞性腫瘍は、ティーンエイジャーおよび若い女性に生じることが最も多い。
【０１０９】
「間質性腫瘍」は、卵巣を一緒にまとめて、女性ホルモンであるエストロゲンおよびプロゲステロンを産生する結合組織細胞から発生する。間質性腫瘍は全卵巣ガンの６％を占める。
【０１１０】
本明細書において、「患者」はヒト患者である。患者は「ガン患者」、すなわちガンの一つもしくは複数の症状に苦しむか、またはそのリスクのある患者、あるいはＨＥＲ二量体化阻害剤を用いた治療から利益を受けうるその他の患者である。
【０１１１】
「生物学的試料」は、生物学的起源由来の試料、一般的に細胞または組織を指す。
【０１１２】
「患者試料」は、ガン患者などの患者から得られた試料を指す。
【０１１３】
本明細書における「腫瘍試料」は、患者の腫瘍由来の試料であるか、またはその腫瘍由来の腫瘍細胞を含む試料である。本明細書における腫瘍試料の例には、腫瘍生検、循環している腫瘍細胞、循環している血漿タンパク質、腹水、腫瘍由来の、または腫瘍様性質を示す初代細胞培養物または細胞系、およびホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍試料または凍結腫瘍試料などの保存処理された腫瘍試料があるが、それらに限定されるわけではない。
【０１１４】
「固定」腫瘍試料は、固定剤を用いて組織学的に保存処理された試料である。
【０１１５】
「ホルマリン固定」腫瘍試料は、固定剤としてホルムアルデヒドを用いて保存処理された試料である。
【０１１６】
「包埋」腫瘍試料は、パラフィン、ろう、セロイジン、または樹脂などの堅固で一般的に硬い媒質により囲まれた試料である。包埋は、顕微鏡検査用または組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）作成用の薄切片を切り出すことを可能にする。
【０１１７】
「パラフィン包埋」腫瘍試料は、石油由来固体炭化水素の精製混合物に囲まれた試料である。
【０１１８】
本明細書において、「凍結」腫瘍試料は、凍結しているか、または凍結された腫瘍試料を指す。
【０１１９】
本明細書に使用される場合の「成長阻害剤」は、細胞、特にＨＥＲ発現ガン細胞の成長をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで阻害する化合物または組成物を指す。このように、成長阻害剤は、Ｓ期のＨＥＲ発現細胞の率を有意に低減する薬剤でありうる。成長阻害剤の例には、Ｇ１停止およびＭ期停止を誘導する薬剤などの、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）遮断する薬剤がある。古典的Ｍ期遮断薬には、ビンカ（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキサン、ならびにドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンなどのトポＩＩ阻害剤がある。Ｇ１で停止させる薬剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、およびａｒａ−ＣなどのＤＮＡアルキル化剤は、Ｓ期停止にも波及する。さらなる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds.の、Murakamiらによる「Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs」(WB Saunders: Philadelphia, 1995)という標題の第１章、特に１３頁に見出すことができる。
【０１２０】
「成長阻害」抗体の例は、ＨＥＲ２に結合し、ＨＥＲ２を過剰発現しているガン細胞の成長を阻害する抗体である。好ましい成長阻害ＨＥＲ２抗体は、約０．５から３０μg/mlの抗体濃度で、細胞培養でのＳＫ−ＢＲ−３乳房腫瘍細胞の成長を２０％よりも大きく、好ましくは５０％よりも大きく（例えば、約５０％から約１００％）阻害する。ここで、抗体にＳＫ−ＢＲ−３細胞を曝露した６日間後に、この成長阻害は決定される（１９９７年１０月１４日に発行された米国特許第５，６７７，１７１号を参照されたい）。このＳＫ−ＢＲ−３細胞成長阻害アッセイは、その特許および本明細書の下記にさらに詳細に記載されている。好ましい成長阻害抗体は、マウスモノクローナル抗体４Ｄ５のヒト化変異体、例えばトラスツズマブである。
【０１２１】
「アポトーシスを誘導する」抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡのフラグメント化、細胞収縮、小胞体の拡大、細胞のフラグメント化、および／または膜小胞（アポトーシス小体と呼ばれる）の形成によって決定されるようなプログラム細胞死を誘導する抗体である。この細胞は、通常、レセプターＨＥＲ２を過剰発現する細胞である。好ましくは、この細胞は、腫瘍細胞、例えば、乳房細胞、卵巣細胞、胃細胞、子宮内膜細胞、唾液腺細胞、肺細胞、腎臓細胞、結腸細胞、甲状腺細胞、膵臓細胞、または膀胱細胞である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、この細胞は、ＳＫ−ＢＲ−３細胞、ＢＴ４７４細胞、Ｃａｌｕ３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞、またはＳＫＯＶ３細胞でありうる。アポトーシスに関連する細胞事象を評価するために様々な方法が利用できる。例えば、アネキシンの結合によってホスファチジルセリン（ＰＳ）の移行を測定でき；ＤＮＡラダー生成によってＤＮＡのフラグメント化を評価することができ；低二倍体細胞の任意の増加によってＤＮＡのフラグメント化と同時に核／クロマチンの凝縮を評価することができる。好ましくは、アポトーシスを誘導する抗体は、ＢＴ４７４細胞を用いたアネキシン結合アッセイにおいて、未処理細胞と比較して約２から５０倍、好ましくは約５から５０倍、最も好ましくは約１０から５０倍のアネキシン結合の誘導を招く抗体である（以下参照）。アポトーシスを誘導するＨＥＲ２抗体の例は、７Ｃ２および７Ｆ３である。
【０１２２】
「エピトープ２Ｃ４」は、抗体２Ｃ４が結合する、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン中の領域である。２Ｃ４エピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されているような日常的な交差遮断アッセイを行うことができる。好ましくは、この抗体は、ＨＥＲ２に対する２Ｃ４の結合を約５０％以上遮断する。または、 エピトープマッピングを行って、その抗体がＨＥＲ２の２Ｃ４エピトープに結合するかどうかを評定することができる。エピトープ２Ｃ４は、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン中のドメインＩＩ由来残基を含む。２Ｃ４およびパーツズマブは、ドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩの結合部でＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合する。Franklin et al. Cancer Cell 5: 317-328 (2004)。
【０１２３】
「エピトープ４Ｄ５」は、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン中の、抗体４Ｄ５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１０４６３）およびトラスツズマブが結合する領域である。このエピトープはＨＥＲ２の膜貫通ドメインに近接しており、ＨＥＲ２のドメインＩＶ内に存在する。４Ｄ５エピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane(1988)に記載されているような日常的な交差遮断アッセイを行うことができる。または、エピトープマッピングを行って、その抗体がＨＥＲ２の４Ｄ５エピトープ（例えば、ＨＥＲ２  ＥＣＤの約５２９番残基から約６２５番残基まで、両端の残基を含めた領域における任意の一つまたは複数の残基、残基の付番にシグナルペプチドを含める）に結合するかどうかを評定することができる。
【０１２４】
「エピトープ７Ｃ２／７Ｆ３」は、７Ｃ２抗体および／または７Ｆ３抗体（それぞれＡＴＣＣに寄託、以下参照）が結合する、ＨＥＲ２の細胞外ドメインのドメインＩ内のＮ末端の領域である。７Ｃ２／７Ｆ３エピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane(1988)に記載されているような日常的な交差遮断アッセイを行うことができる。または、その抗体がＨＥＲ２上の７Ｃ２／７Ｆ３エピトープ（例えば、ＨＥＲ２  ＥＣＤの約２２番残基から約５３番残基までの領域中の任意の一つまたは複数の残基、残基の付番にシグナルペプチドを含める）に結合するかどうかを確認するために、エピトープマッピングを行うことができる。
【０１２５】
「処置」は、治療的処置および予防措置または阻止措置の両方を指す。処置を必要とする者には、すでにその疾患を有する者およびその疾患が予防されるべき者が含まれる。従って、本明細書において処置される患者は、その疾患を有すると診断されたこともあるし、また、その疾患の素因があるか、もしくはその疾患に感受性なこともある。
【０１２６】
用語「有効量」は、患者におけるガンを処置するために有効な薬物の量を指す。薬物の有効量は、ガン細胞数を低減し；腫瘍の大きさを低減し；末梢器官へのガン細胞の浸潤を阻害し（すなわちある程度減速させて、好ましくは停止させ）；腫瘍の転移を阻害し（すなわちある程度減速させて、好ましくは停止させ）；腫瘍の成長をある程度阻害し；かつ／またはガンに関連した一つもしくは複数の症状をある程度軽減することができる。薬物が成長を阻止して、かつ／または現存するガン細胞を殺滅できる程度に、有効量は細胞増殖抑制性および／または細胞毒性でありうる。有効量は、（例えば固形腫瘍効果判定基準（ＲＥＣＩＳＴ）もしくはＣＡ−１２５の変化によって測定されるような）無増悪生存を延長し、（部分奏効（ＰＲ）もしくは完全奏効（ＣＲ）を含めた）奏効を招き、全生存期間を増大させ、かつ／または（ＦＯＳＩによって評定されるような）ガンの一つもしくは複数の症状を改善することができる。
【０１２７】
「全生存」は、例えば診断または処置の時点から１年間、５年間などの所定の期間生存を維持した患者を指す。
【０１２８】
「無増悪生存」は、ガンが増悪せずに生存を維持している患者を指す。
【０１２９】
「奏効」は、完全奏効（ＣＲ）または部分奏効（ＰＲ）を含めた測定可能な応答を指す。
【０１３０】
「完全奏効」または「完全寛解」によって、処置に応答してガンの全ての徴候が消失したことを意図する。これは、ガンが治癒したことを必ずしも意味しない。
【０１３１】
「部分奏効」は、処置に応答した、一つもしくは複数の腫瘍もしくは病変の大きさの減少、または体内のガンの程度の減少を指す。
【０１３２】
「レセプターＨＥＲの過剰発現または増幅」を有するガンは、同じ組織型の非ガン性細胞に比べて、有意に高レベルのレセプターＨＥＲタンパク質または遺伝子を有するガンである。当該過剰発現は、遺伝子増幅によって、または転写もしくは翻訳の増加によって起こることがある。レセプターＨＥＲの過剰発現または増幅を、細胞表面に存在するＨＥＲタンパク質のレベル増加を評価することによって、診断または予後アッセイで（例えば免疫組織化学アッセイ（ＩＨＣ）により）決定することができる。または、もしくは追加的に、例えば、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に公開されたＷＯ９８／４５４７９参照）、サザンブロット、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法（リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）など）によって、細胞中のＨＥＲをコードしている核酸のレベルを測定することができる。血清などの生体液中の分断された（shed）抗原（例えばＨＥＲ細胞外ドメイン）を測定することによって、レセプターＨＥＲの過剰発現または増幅を研究することもできる（例えば、１９９０年６月１２日に発行された米国特許第４，９３３，２９４号；１９９１年４月１８日に公開されたＷＯ９１／０５２６４；１９９５年３月２８日に発行された米国特許第５，４０１，６３８号;およびSias et al. J. Immunol. Methods 132: 73-80 (1990)を参照されたい）。上記アッセイの他に様々なｉｎ  ｖｉｖｏアッセイが当業者に利用できる。例えば検出可能なラベル、例えば放射性同位体で場合によりラベルされた抗体に、患者の体内の細胞を曝露して、例えば放射能を外部スキャンすることにより、またはその抗体に以前に曝露された患者から採取した生検を分析することにより、その患者における細胞に対する抗体の結合を評価することができる。
【０１３３】
逆に、「レセプターＨＥＲ２を過剰発現も増幅もしない」ガンは、同じ組織型の非ガン性細胞に比べて正常レベルよりも高いレセプターＨＥＲ２タンパク質または遺伝子を有さないガンである。
【０１３４】
本明細書で使用される用語「細胞毒性薬」は、細胞の機能を阻害もしくは阻止し、かつ／または細胞の破壊を起こす物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２およびＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、および細菌、真菌、植物、または動物起源の小分子毒素または酵素的に活性な毒素などの毒素を、そのフラグメントおよび／または変異体を含めて含むことを意図する。
【０１３５】
「化学療法剤」は、ガンの処置に有用な化学化合物である。化学療法剤の例には、チオテパおよびシクロホスファミド（CYTOXAN（登録商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドーパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドーパ（meturedopa）、およびウレドーパ（uredopa）などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、およびトリメチロールメラミン（trimethylolomelamine）を含めたエチレンイミンおよびメチルメラミン（methylamelamine）；ＴＬＫ２８６（TELCYTA（商標））；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン（bullatacinone））；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、MARINOL（登録商標））；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成アナログであるトポテカン（HYCAMTIN（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、CAMPTOSAR（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン（scopolectin）、および９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸（podophyllinic acid）；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ズオカルマイシン（合成アナログＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビキン（novembichin）、フェネステリン（phenesterine）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン（ranimnustine）などのニトロソ尿素；クロドロネートなどのビスホスホン酸塩；エンジイン抗生物質など（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１（例えば、Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)参照））およびアンナマイシンなどのアントラサイクリン、ＡＤ３２、アルカルビシン（alcarubicin）、ダウノルビシン、デキストラゾキサン（dexrazoxane）、ＤＸ−５２−１、エピルビシン、ＧＰＸ−１００、イダルビシン、ＫＲＮ５５００、メノガリル、ジネマイシン（ジネマイシンＡを含む）、エスペラマイシン、ネオカルジノスタチン発色団および関係する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（carabicin）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含めた）ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）（ドキソルビシン）、エソルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、およびゾルビシンなどの抗生物質；デノプテリン、プテロプテリン、およびトリメトレキサートなどの葉酸アナログ；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、およびチオグアニンなどのプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、およびフロクスウリジンなどのピリミジンアナログ；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、およびトリロスタンなどの抗副腎剤（anti-adrenal）；ホリニン酸（ロイコボリン）などの葉酸補給剤；アセグラトン；ＡＬＩＭＴＡ（登録商標）（ＬＹ２３１５１４、ペメトレキセド）、メトトレキサートなどのジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗物質およびＵＦＴなどのそのプロドラッグ、Ｓ１およびカペシタビン、ならびにラルチトレキセド（TOMUDEX（商標）、ＴＤＸ）などのチミジル酸シンターゼ阻害剤およびグリシンアミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ阻害剤などの抗葉酸抗腫瘍剤；エニルウラシルなどのジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ阻害剤；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（edatraxate）；デホファミン（defofamine）；デメコルシン；ジアジクオン；エルホルニチン（elfornithine）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシンおよびアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール（mopidanmol）；ニトラエリン（nitraerine）；ペントスタチン；フェナメット（phenamet）；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（JHS Natural Products, Eugene, OR）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリン（verracurin）Ａ、ロリジンＡ、およびアングイジン（anguidine））；ウレタン；ビンデシン（ELDISINE（登録商標）、FILDESIN（登録商標））：ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；パクリタキセル（TAXOL（登録商標））(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)、パクリタキセルの無Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒアルブミン加工ナノ粒子製剤であるＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）（American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois）、およ���ドセタキセル（TAXOTERE（登録商標））（Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）などのタキソイドおよびタキサン；クロランブシル；ゲムシタビン（GEMZAR（登録商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；プラチナ；シスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチンなどのプラチナアナログまたはプラチナ系アナログ；ビンブラスチン（VELBAN（登録商標））；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ONCOVIN（登録商標））；ビンカアルカロイド；ビノレルビン（NAVELBINE（登録商標））；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；前記いずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体；ならびにＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの併用療法についての略語）およびＦＯＬＦＯＸ（オキサリプラチン（ELOXATIN（商標））を５−ＦＵおよびロイコボリンと組合せて用いた処置方式についての略語）などの、前記のうち二つ以上の組合せがある。
【０１３６】
腫瘍に及ぼすホルモンの作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤も本定義に含まれる。それらには、例えば、タモキシフェン（タモキシフェン（NOLVADEX（登録商標））を含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（FARESTON（登録商標））を含めた抗エストロゲンおよび選択的エストロゲンレセプターモデュレーター（ＳＥＲＭ）；例えば４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール（MEGASE（登録商標））、エキセメスタン（AROMASIN（登録商標））、ホルメスタン、ファドロゾール、ボロゾール（RIVISOR（登録商標））、レトロゾール（FEMARA（登録商標））、およびアナストロゾール（ARIMIDEX（登録商標））などの、副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤；フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン；ならびにトロキサシタビン（troxacitabine）（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に例えばＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、および上皮成長因子レセプター（ＥＧＦ−Ｒ）などの、接着性細胞増殖に関係づけられているシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド；遺伝子治療ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチンなどのワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ならびに前記いずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体がある。
【０１３７】
「代謝拮抗化学療法剤」は、代謝物に構造的に類似しているが、生産的方法で身体によって使用されることができない薬剤である。多くの代謝拮抗化学療法剤は、核酸、すなわちＲＮＡおよびＤＮＡの産生を妨害する。代謝拮抗化学療法剤の例には、ゲムシタビン（GEMZAR（登録商標））、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、カペシタビン（XELODA（登録商標））、６‐メルカプトプリン、メトトレキサート、６−チオグアニン、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、アラビノシルシトシン（ＡＲＡ−Ｃ、シタラビン）（CYTOSAR-U（登録商標））、ダカルバジン（DTIC-DOME（登録商標））、アゾシトシン（azocytosine）、デオキシシトシン、ピリドミデン（pyridmidene）、フルダラビン（FLUDARA（登録商標））、クラドラビン、２−デオキシ−Ｄ−グルコースなどがある。好ましい代謝拮抗化学療法剤は、ゲムシタビンである。
【０１３８】
「ゲムシタビン」または「２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロシチジン一塩酸塩（ｂ−異性体）」は、抗腫瘍活性を示すヌクレオシドアナログである。ゲムシタビンＨＣｌの実験式はＣ９Ｈ１１Ｆ２Ｎ３Ｏ４・ＨＣｌである。ゲムシタビンＨＣｌは、ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）の商標でEli Lillyにより販売されている。
【０１３９】
「プラチナ系化学療法剤」は、分子の構成部分としてプラチナを有する有機化合物を含む。プラチナ系化学療法剤の例には、カルボプラチン、シスプラチン、およびオキサリプラチンがある。
【０１４０】
「プラチナ系化学療法」により、一つまたは複数のプラチナ系化学療法剤を、場合により一つまたは複数のその他の化学療法剤と組合せて用いた治療を意図する。
【０１４１】
「プラチナ耐性」ガンにより、プラチナ系化学療法を受けている間に、そのガン患者が進行した（すなわち、その患者は「プラチナ抗療性」である）か、またはその患者がプラチナ系化学療法方式を完了した後１２か月以内（例えば、６か月以内）に進行したことを意味する。
【０１４２】
「抗血管形成剤」は、血管の発生をある程度遮断または妨害する化合物を指す。抗血管形成因子は、例えば、血管形成の促進に関与する成長因子または成長因子レセプターに結合する、小分子または抗体でありうる。本明細書における好ましい抗血管形成因子は、ベバシズマブ（AVASTIN（登録商標））などの、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体である。
【０１４３】
用語「サイトカイン」は、ある細胞集団によって放出され、細胞間仲介物質として別の細胞に作用するタンパク質についての総称である。当該サイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホルモンである。これらのサイトカインの中に含まるのは、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子αおよび腫瘍壊死因子β；ミュラー管抑制物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−βなどの神経成長因子；血小板成長因子；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βなど）；インスリン様成長因子−Ｉおよびインスリン様成長因子−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−α、インターフェロン−β、およびインターフェロン−γなどのインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）など）；インターロイキン（ＩＬ）（ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２など）；ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βなどの腫瘍壊死因子；ならびにＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含めたその他のポリペプチド因子である。本明細書に使用される用語サイトカインには、天然起源由来またはリコンビナント細胞培養物由来のタンパク質、およびネイティブな配列のサイトカインの生物学的活性等価物が含まれる。
【０１４４】
本明細書における「自己免疫疾患」は、個体自体の組織もしくは同時隔離物に起因し、それに対する疾患もしくは障害、またはその症状もしくはその結果として生じる状態である。自己免疫疾患または障害の例には、関節炎（リウマチ様関節炎、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎、および強直性脊椎炎）、乾癬、アトピー性皮膚炎を含む皮膚炎、慢性自己免疫性蕁麻疹を含む慢性特発性蕁麻疹、多発筋炎／皮膚筋炎、中毒性表皮壊死症、（全身性強皮症を含む）強皮症、進行性全身性硬化症などの硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、自己免疫性炎症性腸疾患）、壊疽性膿皮症、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、上強膜炎、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む呼吸窮迫症候群、髄膜炎、アナフィラキシーおよびアレルギー性鼻炎およびアトピー性鼻炎などのＩｇＥ介在性疾患、ラスムッセン脳炎などの脳炎、ブドウ膜炎または自己免疫性ブドウ膜炎、顕微鏡的大腸炎および膠原性大腸炎などの大腸炎、糸球体腎炎（ＧＮ）（膜性ＧＮ（膜様ネフロパシー）、特発性膜性ＧＮ、Ｉ型およびＩＩ型を含む膜性増殖性ＧＮ（ＭＰＧＮ）、および急速進行性ＧＮなど）、アレルギー状態、アレルギー反応、湿疹、喘息、Ｔ細胞浸潤および慢性炎症性応答を伴う状態、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性心筋炎、白血球接着不全症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）（皮膚ＳＬＥ、亜急性皮膚エリテマトーデス、ループス（腎炎、脳炎、小児、非腎症、円板状、脱毛を含む）など）、小児インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）を含む若年型（Ｉ型）糖尿病、成人発症型糖尿病（ＩＩ型糖尿病）、多発性硬化症（ＭＳ）（脊髄視覚ＭＳなど）、サイトカインおよびＴリンパ球に仲介される急性および遅延型過敏症に関連する免疫応答、結核、サルコイドーシス、リンパ腫様肉芽腫症を含む肉芽腫症、ヴェーゲナー肉芽腫症、無顆粒球症、血管炎（大血管炎（リウマチ性多発性筋痛および巨細胞性（高安）動脈炎を含む）、中血管血管炎（川崎病および結節性多発動脈炎を含む）、ＣＮＳ血管炎、全身性壊死性血管炎、およびチャーグ−ストラウス血管炎または症候群（ＣＳＳ）などのＡＮＣＡ関連血管炎を含む）、側頭動脈炎、再生不良性貧血、クームス陽性貧血、ダイアモンド−ブラックファン（Diamond Blackfan）貧血、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）を含む溶血性貧血または免疫性溶血性貧血、悪性貧血、赤芽球ろう（ＰＲＣＡ）、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、血友病Ａ、自己免疫性好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球漏出を伴う疾患、ＣＮＳ炎症性障害、多臓器傷害症候群、抗原−抗体複合体介在性疾患、抗糸球体基底膜病、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病、カストルマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス−ジョンソン症候群、水疱性類天疱瘡などの類天疱瘡、天疱瘡（尋常性、落葉状、および天疱瘡粘膜性類天疱瘡を含む）、自己免疫性多発性内分泌障害、ライター病、免疫複合体性腎炎、ＩｇＭ多発性ニューロパシーまたはＩｇＭ介在性ニューロパシーなどの慢性ニューロパシー、（例えば心筋梗塞患者が発生する）血小板減少症（血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＰＰ）お��び特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）（慢性または急性ＩＴＰを含む）などの自己免疫性または免疫介在性の血小板減少を含む）、自己免疫性睾丸炎および卵巣炎を含む睾丸および卵巣の自己免疫疾患、原発性甲状腺機能低下症、上皮小体機能低下症、自己免疫性内分泌疾患（自己免疫性甲状腺炎、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、または亜急性甲状腺炎などの甲状腺炎、自己免疫性甲状腺疾患、特発性甲状腺機能低下症、アジソン病、グレーヴズ病、自己免疫性多腺性症候群（または多腺性内分泌障害症候群）などの多腺性症候群を含む）、ランバート−イートン筋無力症症候群またはイートン−ランバート症候群などの神経系腫瘍随伴症候群を含む腫瘍随伴症候群、スティフマン症候群、アレルギー性脳脊髄炎などの脳脊髄炎、重症筋無力症、小脳変性、辺縁系脳炎および／または脳幹脳炎、神経ミオトニー、眼球クローヌスまたは眼球クローヌスミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、および感覚性ニューロパシー、シーハン症候群、自己免疫性肝炎、慢性肝炎、ルポイド肝炎、慢性活動性肝炎または自己免疫性慢性活動性肝炎、リンパ球様間質性肺炎、閉塞性細気管支炎（非移植）対ＮＳＩＰ、ギラン−バレー症候群、バージャー病（ＩｇＡ腎症）、原発性胆汁性肝硬変、セリアックスプルー（グルテン腸症）、不応性スプルー、疱疹状皮膚炎、クリオグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー−ゲーリック病）、冠状動脈疾患、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）または自己免疫性聴力損失、眼球クローヌスミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、不応性多発性軟骨炎などの多発性軟骨炎、肺胞タンパク症、アミロイドーシス、巨細胞性肝炎、強膜炎、非ガン性リンパ球増加症、単クローン性Ｂ細胞性リンパ球増加症（例えば、良性単クローン性高ガンマグロブリン血症および意味不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症、ＭＧＵＳ）を含む原発性リンパ球増加症、末梢性ニューロパシー、腫瘍随伴症候群、（てんかん、片頭痛、不整脈、筋障害、難聴、失明、周期性四肢麻痺、およびＣＮＳのチャネル病などの）チャネル病、自閉症、炎症性ミオパシー、巣状分節状糸球体硬化（ＦＳＧＳ）、内分泌性眼症、ブドウ膜網膜炎、自己免疫性肝障害、線維筋痛、多発性内分泌腺不全症、シュミット症候群、副腎炎、胃の萎縮症、初老性認知症、脱髄疾患、ドレスラー症候群、円形脱毛症、クレスト症候群（石灰沈着症、レイノー現象、食道運動障害、手指硬化症、および毛細血管拡張症）、男性および女性自己免疫性不妊症、強直性脊椎炎、混合性結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、再発流産、農夫肺、多形性紅疹、心術後症候群、クッシング症候群、鳥飼育者肺、アルポート症候群、アレルギー性肺胞炎および線維性肺胞炎などの肺胞炎、間質性肺疾患、輸血反応、らい、マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、住血吸虫症、回虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、シャルマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア症、（慢性毛様体炎、異時性毛様体炎、またはフックス毛様体炎などの）毛様体炎、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩ��）感染症、エコーウイルス感染症、心筋症、アルツハイマー病、パルボウイルス感染症、風疹ウイルス感染症、ワクチン接種後症候群、先天性風疹感染症、ＥＢウイルス感染症、流行性耳下腺炎、エヴァンズ症候群、自己免疫性性腺機能不全、シデナム舞踏病、連鎖球菌感染後腎炎、閉塞性血栓性血管炎、甲状腺中毒症、脊髄ろう、ならびに巨細胞多発性筋痛があるが、それに限定されるわけではない。
【０１４５】
「良性過増殖性障害」は、細胞増殖に関係する患者における、医学界のメンバーにより異常と認識される状態を意味する。異常な状態は、その障害に冒されていない生物で観察されるレベルと統計的に異なるある性質のレベルを特徴とする。細胞増殖は、細胞の倍加による成長または伸長を指し、細胞分裂を含む。細胞増殖速度を、所与の単位時間に産生された細胞数を計数することにより測定することができる。良性過増殖性障害の例には乾癬およびポリープがある。
【０１４６】
「呼吸器疾患」は呼吸器系に波及し、呼吸器疾患には、慢性気管支炎、急性喘息およびアレルギー喘息を含む喘息、嚢胞性線維症、気管支拡張症、アレルギー性またはその他の鼻炎または副鼻腔炎、α１−アンチトリプシン欠損症、咳、肺気腫、肺線維症または反応亢進性気道、慢性閉塞性肺疾患、および慢性閉塞性肺障害がある。
【０１４７】
「乾癬」は、限局、孤立、および融合性で赤色調を呈し、銀色の鱗屑を伴う斑丘疹の発生を特徴とする状態である。乾癬の病変は、一般的に肘、膝、頭皮、および胴に主に発生し、顕微鏡的には特徴的な錯角化および乳頭間隆起の延長を示す。この用語は、この疾患の紅皮症形態、膿胞性形態、中−重度形態、および難治性形態を含む様々な形態の乾癬を含む。
【０１４８】
「子宮内膜症」は、変質した血液を有する嚢胞をしばした形成している子宮内膜組織の異所性発生を指す。
【０１４９】
本明細書における用語「血管疾患または障害」は、心血管系を含めた血管系に影響を与える多様な疾患または障害を指す。当該疾患の例には、動脈硬化症、血管再閉塞、アテローム性動脈硬化症、術後血管狭窄、再狭窄、血管閉塞または頚動脈閉塞性疾患、冠状動脈疾患、アンギナ、小血管疾患、高コレステロール血症、高血圧症、および血管上皮細胞の異常増殖または異常機能を伴う状態がある。
【０１５０】
用語「狭窄」は、体内の中空路（例えば管路または管）の狭小化または狭窄を指す。
【０１５１】
用語「血管狭窄」は、血管の閉塞または狭小化を指す。血管狭窄は、（アテローム性動脈硬化症の場合のように）脂肪沈着または血管平滑筋細胞および内皮細胞の過剰な遊走および増殖に起因することが多い。動脈は狭窄に特に感受性である。本明細書に使用される用語「狭窄」は、最初の狭窄および再狭窄を具体的に含む。
【０１５２】
用語「再狭窄」は、最初の狭窄の処置が外見上成功した後で狭窄が再発生することを指す。例えば、血管狭窄との関連の「再狭窄」は、例えば血管形成術（例えば経皮的経管冠動脈形成術）、方向性冠動脈アテレクトミー、またはステントなどによる脂肪沈着除去によりその狭窄が処置され外見上成功した後の血管狭窄の再発生を指す。再狭窄に寄与する要因の一つは内膜過形成である。「新生内膜過形成」および「新生内膜形成」と相互交換可能に使用される用語「内膜過形成」は、血管平滑筋細胞および内皮細胞の過剰増殖および遊走の結果としての血管最内層である内膜の肥厚を指す。再狭窄の間に起こる様々な変化は、まとめて「血管壁リモデリング」と呼ばれることが多い。
【０１５３】
用語「バルーン血管形成術」および「経皮的経管冠動脈形成術」（ＰＴＣＡ）は相互交換可能に使用されることが多く、冠動脈からのプラークの除去のための非外科的カテーテル性処置を指す。狭窄または最狭窄は、血流に対する抵抗増加の結果として高血圧に至ることが多い。
【０１５４】
用語「高血圧」は、異常に高い血圧、すなわち正常範囲の上限値を超えた血圧を指す。
【０１５５】
「ポリープ」は、正常表面水準から外側または上方に隆起または突出している組織集塊を指し、それにより比較的広い基部または細い茎から成長した肉眼的に半球状、球状、または不規則な丸い形の構造として見える。例には、結腸、直腸、および鼻ポリープがある。
【０１５６】
「線維腺腫」は、増殖性の線維芽細胞および結合組織エレメントの顕著な間質が内部に存在する腺上皮由来の良性腫瘍を参照する。これは通常、乳房組織に発生する。
【０１５７】
「喘息」は、呼吸困難を招く状態である。気管支喘息は、広範囲に気道が狭小化した肺の状態を指す。その狭小化は平滑筋の収縮（痙攣）、粘膜浮腫、または気管支および細気管支内腔の粘液が原因のことがある。
【０１５８】
「気管支炎」は、気管支粘膜の炎症を指す。
【０１５９】
ＩＩ．遺伝子発現解析
本発明は、ＨＥＲ阻害剤で治療するための患者を選択するための方法を提供し、その方法では、二つ以上の（好ましくはＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ３より選択される）レセプターＨＥＲと一つまたは複数の（好ましくはベータセルリン、アンフィレグリン、エピレグリン、およびＴＧＦ−αより選択され、最も好ましくはベータセルリンまたはアンフィレグリンである）ＨＥＲリガンドとの発現について患者由来の試料を試験する。例えば、その二つ以上のレセプターＨＥＲは、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２、またはＨＥＲ２およびＨＥＲ３でありうる。一態様では、ＨＥＲ２とＥＧＦＲまたはＨＥＲ３との発現およびベータセルリンまたはアンフィレグリンを決定する。ベータセルリンもしくはアンフィレグリンの発現について単独で、または二つ以上のレセプターＨＥＲの発現についての試験と組合せて試料を試験することができる。同定された遺伝子の発現陽性は、その患者がＨＥＲ阻害剤、ＨＥＲ二量体化阻害剤、またはパーツズマブを用いた治療の候補であることを示す。さらに、遺伝子の発現陽性は、その患者がそのような陽性発現を有さない患者よりもＨＥＲ阻害剤を用いた治療に対して奏効する見込みが高いことを示す。
【０１６０】
試料は、ＨＥＲ阻害剤を用いた治療の必要のある患者から得ることができる。その被験者がガンを有する場合、その試料は腫瘍試料である。好ましい態様では、腫瘍試料は、卵巣ガン、腹膜ガン、卵管ガン、転移性乳ガン（ＭＢＣ）、非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）の腫瘍試料である。しかし、ＨＥＲ阻害剤についての様々なその他の非悪性疾患の治療適応が利用でき、本明細書に記載されている。それらの非悪性疾患の適応について患者が処置される場合、本明細書に記載される遺伝子発現解析のために患者から適切な試料を得て、分析することができる。
【０１６１】
本明細書における生物学的試料は、好ましくは固定試料、例えばホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料、または凍結試料である。
【０１６２】
好ましくは、ＨＥＲ阻害剤は、ＨＥＲ二量体化阻害剤および／またはＨＥＲ抗体（例えばＨＥＲ２のドメインＩＩに結合するＨＥＲ２抗体、例えばパーツズマブなどのＨＥＲ２抗体）である。
【０１６３】
ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を決定するための様々な方法が下記にさらに詳細に記載される。好ましくはｍＲＮＡが定量される。そのようなｍＲＮＡの分析は、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の技術を使用して、またはマイクロアレイ解析により行われる。ＰＣＲが採用される場合、好ましい形態のＰＣＲは定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）である。一態様では、上に言及した一つまたは複数の遺伝子の発現は、例えば同じ腫瘍型のその他の試料に比べて中央値以上であれば陽性発現と考えられる。中央値の発現レベルは、遺伝子発現の測定と本質的に同時に決定することもできるし、また、以前に決定されていることもある。
【０１６４】
この遺伝子発現解析は、ＨＥＲのリン酸化または活性化の代理として役立つ。試料が、ＨＥＲリン酸化を信頼性高く定量することが困難なおそれのある固定試料（例えば、パラフィン包埋ホルマリン固定腫瘍試料）の場合に、これは特に有用である。このように、本発明は生物学的試料中のＨＥＲのリン酸化または活性化を評定する方法を提供し、その方法は、試料中の二つ以上のレセプターＨＥＲと一つまたは複数のＨＥＲリガンドとの発現を決定することを含む。ここで、その二つ以上のレセプターＨＥＲと一つまたは複数のＨＥＲリガンドとの発現は、その試料における陽性のＨＥＲのリン酸化または活性化を示す。本発明は、生物学的試料中のＨＥＲのリン酸化または活性化を評定する方法も提供し、その方法は、試料中のベータセルリンおよび／またはアンフィレグリンの発現を決定することを含み、ここで、ベータセルリンおよび／またはアンフィレグリンの発現は試料における陽性のＨＥＲのリン酸化または活性化を示す。
【０１６５】
本発明は、ＨＥＲ阻害剤を用いた治療のための患者を同定する方法を提供し、その方法は、その患者由来の試料中での二つ以上のレセプターＨＥＲと一つまたは複数のＨＥＲリガンドとの発現を決定することを含み、ここで、レセプターＨＥＲおよびＨＥＲリガンドの発現は、その患者がＨＥＲ阻害剤を用いた治療に応答する見込みのあることを示す。その患者は、二つ以上のレセプターＨＥＲと一つまたは複数のＨＥＲリガンドとを発現していない患者に比べて、ＨＥＲ阻害剤に対して応答する見込みが高いと同定されうる。別の態様では、ＨＥＲ阻害剤を用いた治療のための患者を同定する方法は、試料中のベータセルリンまたはアンフィレグリンの発現を単独で、または二つ以上のレセプターＨＥＲの発現決定と組合せて決定することを含む。
【０１６６】
本発明は、さらに患者由来の卵巣ガン試料中のベータセルリンまたはアンフィレグリンの発現を単独で、または二つ以上のレセプターＨＥＲの発現決定と組合せて決定することによる、ＨＥＲ阻害剤を用いた治療のための卵巣ガン患者を選択するための方法を提供する。
【０１６７】
遺伝子発現を決定するための様々な例示的な方法をこれからさらに詳細に記載する。
【０１６８】
（ｉ）遺伝子発現プロファイリング
一般に、遺伝子発現プロファイリングの方法を二つの大きな群、すなわちポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析に基づく方法およびポリヌクレオチドの配列解析に基づく方法に分けることができる。試料中のｍＲＮＡ発現を定量するための当技術分野で公知の最も一般的に使用される方法には、ノーザンブロットおよびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Parker & Barnes, Methods in Molecular Biology 106: 247-283 (1999)）；ＲＮＡｓｅ保護アッセイ（Hod, Biotechniques 13: 852-854 (1992)）；およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Weis et al., Trends in Genetics 8: 263-264 (1992)）がある。または、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含めた特異的二重鎖を認識することができる抗体を採用することができる。配列解析に基づく遺伝子発現解析のための代表的な方法には、連続遺伝子発現解析（ＳＡＧＥ）および超並列シグネチャー配列解析（massively parallel signature sequencing）（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現解析がある。
【０１６９】
（ｉｉ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
上に挙げた技法のうち、高感度で柔軟な定量法はＰＣＲであり、ＰＣＲを使用して、異なる試料集団中の、正常組織および腫瘍組織中の、薬物処置の存在下または不在下でのｍＲＮＡレベルを比較して、遺伝子発現パターンを特徴付けて、密接に関係するｍＲＮＡの間で識別することができ、ＲＮＡの構造を分析することができる。
【０１７０】
第１段階は、ターゲット試料からのｍＲＮＡ単離である。出発物質は、典型的にはヒト腫瘍または腫瘍細胞系、およびそれぞれ対応する正常組織または正常細胞系から単離された総ＲＮＡである。このように、乳房、肺、結腸、前立腺、脳、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、子宮腫瘍などの多様な原発性腫瘍または腫瘍細胞系からＲＮＡを単離することができ、プールＤＮＡを健康なドナーから単離することができる。ｍＲＮＡの起源が原発性腫瘍である場合、例えば凍結組織試料から、または保存用パラフィン包埋固定（例えばホルマリン固定）組織試料からｍＲＮＡを抽出することができる。
【０１７１】
ｍＲＮＡ抽出のための一般法は当技術分野で周知であり、Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997)を含めた分子生物学の標準的な教科書に開示されている。パラフィン包埋組織からのＲＮＡ抽出方法は、例えばRupp and Locker, Lab Invest. 56: A67 (1987)およびDe Andres et al., BioTechniques 18: 42044 (1995)に開示されている。特に、精製キット、緩衝液セット、およびＱｉａｇｅｎなどの商業製造業者からのプロテアーゼを使用して、製造業者の説明書通りにＲＮＡの単離を行うことができる。例えば、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニカラムを使用して培養細胞由来の総ＲＮＡを単離することができる。その他の市販されているＲＮＡ単離キットには、ＭＡＳＴＥＲＰＵＲＥ（登録商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（EPICENTRE（登録商標）, Madison, Wis.）およびＰａｒａｆｆｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ambion, Inc.）がある。ＲＮＡ  Ｓｔａｔ−６０（Tel-Test）を使用して組織試料由来の総ＲＮＡを単離することができる。例えば塩化セシウム密度勾配遠心分離により、腫瘍から調製されたＲＮＡを単離することができる。
【０１７２】
ＲＮＡはＰＣＲ用のテンプレートとして役立つことができないので、ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングの第１段階は、ＲＮＡテンプレートのｃＤＮＡへの逆転写に続くＰＣＲ反応でのそれの対数増幅である。二つの最も一般的に使用される逆転写酵素は、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）およびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。逆転写段階は、典型的には発現プロファイリングの状況および目標に応じて特異的プライマー、ランダムヘキサマー、またはオリゴ−ｄＴプライマーを使用してプライミングされる。例えば、ＧＥＮＥＡＭＰ（商標）ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Perkin Elmer, Calif., USA）を製造業者の説明書に従って、抽出されたＲＮＡを逆転写することができる。続くＰＣＲ反応では、得られたｃＤＮＡを次にテンプレートとして使用することができる。
【０１７３】
ＰＣＲ段階は多様な熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用することができるが、ＰＣＲ段階は、典型的には５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するが３’−５’校正エンドヌクレアーゼ活性を欠如するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを採用する。このように、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＰＣＲは、典型的にはターゲットアンプリコンに結合したハイブリダイゼーションプローブを加水分解するためにＴａｑポリメラーゼまたはＴｔｈポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を利用するが、同等の５’ヌクレアーゼ活性を有する任意の酵素を使用することができる。二つのオリゴヌクレオチドプライマーが使用されて、ＰＣＲ反応に典型的なアンプリコンが作成される。第３のオリゴヌクレオチドまたはプローブを設計して、二つのＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出する。そのプローブはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素により伸長することができず、レポーター蛍光色素および消光剤蛍光色素でラベルされる。レポーター色素からの任意のレーザ誘導性発光は、その二つの色素がプローブ上にあるため一緒に密接して位置する場合に、消光色素により消光される。増幅反応の間に、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素はテンプレート依存的にプローブを開裂する。結果として生じるプローブのフラグメントは溶液中で解離し、放出されたレポーター色素からのシグナルは第２の発蛍光団の消光作用を免れる。合成された新しい分子毎に１分子のレポーター色素が遊離され、未消光のレポーター色素の検出はデータの定量的判断の基礎を提供する。
【０１７４】
例えばＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００（登録商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, Calif., USA）、またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany）などの市販されている装置を使用してＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＰＣＲを行うことができる。好ましい態様では、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００（登録商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍなどのリアルタイム定量ＰＣＲデバイスで５’ヌクレアーゼ手順を実行する。このシステムは、サーモサイクラー、レーザ、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラ、およびコンピュータからなる。このシステムは、サーモサイクラー上の９６ウェル形式の試料を増幅する。増幅の間に、全９６ウェルについて、光ファイバーケーブルを通してレーザ誘導性蛍光シグナルをリアルタイムで収集し、ＣＣＤで検出する。このシステムは、機器の運転およびデータ解析のためのソフトウェアを含む。
【０１７５】
５’ヌクレアーゼアッセイのデータを最初にＣｔ、すなわち閾値サイクルとして表現する。上に論じたように、各サイクルの間に蛍光値を記録し、その値は、増幅反応でその点までに増幅された産物の量を表す。蛍光シグナルが統計的に有意であるとして最初に記録された点が閾値サイクル（Ｃｔ）である。
【０１７６】
試料間変動の誤差および効果を最小にするために、ＰＣＲは内部標準を使用して通常行われる。理想的な内部標準は種々の組織の間で一定レベル発現され、実験処理に影響されない。遺伝子発現パターンを基準化するために最も頻繁に使用されるＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびＰ−アクチンについてのｍＲＮＡである。
【０１７７】
ＰＣＲ技法のさらに新しい変形は、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）であり、これは、二重ラベルされた蛍光発生プローブ（すなわちＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ）によりＰＣＲ産物の蓄積を測定する。リアルタイムＰＣＲは、各ターゲット配列についての内部競合物を基準化のために使用する定量競合ＰＣＲと、試料中に含有される基準化遺伝子またはハウスキーピング遺伝子をＰＣＲのために使用する定量比較ＰＣＲ（quantitative comparative PCR）との両方に適合性である。さらなる詳細については、例えばHeld et al., Genome Research 6: 986-994 (1996)を参照されたい。
【０１７８】
ＲＮＡ起源として固定パラフィン包埋組織を使用して遺伝子発現をプロファイリングするための、ｍＲＮＡの単離、精製、プライマー伸長、および増幅を含めた代表的なプロトコールの段階は、公表された様々な雑誌論文（例えばGodfrey et al, J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)）に示されている。簡潔には、代表的な工程は、パラフィン包埋腫瘍組織試料の約１０μg厚の切片を切り出すことに始まる。次に、ＲＮＡを抽出し、タンパク質およびＤＮＡを除去する。ＲＮＡ濃度を分析した後に、ＲＮＡの修復および／または増幅段階を必要ならば含めることができ、遺伝子特異的プロモータを使用してＲＮＡを逆転写し、続いてＰＣＲを行う。
【０１７９】
本発明の一局面によると、ＰＣＲプライマーおよびＰＣＲプローブは、増幅される遺伝子中に存在するイントロン配列に基づき設計される。この態様では、プライマー／プローブ設計の第１段階は、遺伝子内のイントロン配列の描写である。これを、Kent, W., Genome Res. 12(4): 656-64 (2002)により開発されたＤＮＡ  ＢＬＡＴソフトウェアなどの公的に入手できるソフトウェアまたはＢＬＡＳＴソフトウェア（その変形を含む）により行うことができる。続く段階は、ＰＣＲプライマーおよびＰＣＲプローブ設計の確立した方法に従う。
【０１８０】
非特異的シグナルを避けるために、プライマーおよびプローブを設計する場合にイントロン内の繰り返し配列をマスクすることが重要である。これは、Baylor College of Medicineからオンラインで入手できるＲｅｐｅａｔ  Ｍａｓｋｅｒプログラムを使用することによって容易に実現することができる。このプログラムは、ＤＮＡ配列を繰り返しエレメントのライブラリーに対してスクリーニングし、繰り返しエレメントがマスクされたクエリ配列を返すものである。次に、マスクされたイントロン配列を使用して、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Applied Biosystems）；ＭＧＢ計画的アッセイ（Applied Biosystems）；Ｐｒｉｍｅｒ３（Rozen and Skaletsky (2000) Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ., pp365-386）などの任意の市販またはさもなければ公的に入手できるプライマー／プローブ設計パッケージを使用してプライマーおよびプローブの配列を設計することができる。
【０１８１】
ＰＣＲプライマーの設計に考慮される要因には、プライマー長、融解温度（Ｔｍ）、Ｇ／Ｃ含量、特異性、相補的プライマー配列、および３’末端配列がある。一般に、最適なＰＣＲプライマーは一般的に１７〜３０塩基長であり、約２０〜８０％の、例えば約５０〜６０％などのＧ＋Ｃ塩基を有する。５０から８０℃、例えば約５０から７０℃のＴｍが典型的には好まれる。
【０１８２】
ＰＣＲプライマーおよびＰＣＲプローブの設計のためのさらなるガイドラインについては、例えばDieffenbach et al, "General Concepts for PCR Primer Design" in: PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1995, pp.133-155；Innis and Gelfand, "Optimization of PCRs" in: PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, CRC Press, London, 1994, pp.5-11；およびPlasterer, T. N. Primerselect: Primer and probe design. Methods Mol. Biol. 70: 520-527 (1997)を参照されたい。これら文献の開示全体は、参照により本明細書に特に組み入れられる。
【０１８３】
（ｉｉｉ）マイクロアレイ
遺伝子発現の差もまた、マイクロアレイ技法を使用して同定または確認することができる。このように、マイクロアレイ技法を使用して新鮮腫瘍組織またはパラフィン包埋腫瘍組織のいずれかでの乳ガン関連遺伝子の発現プロファイルを測定することができる。この方法では、関心対象の（ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含めた）ポリヌクレオチド配列をマイクロチップ基板上に施すか、またはアレイを形成させることができる。次に、アレイを形成した配列を、関心対象の細胞または組織由来の特異的ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせる。ＰＣＲ法とちょうど同じように、ｍＲＮＡの起源は、典型的にはヒト腫瘍または腫瘍細胞系と、対応する正常組織または正常細胞系とから単離された総ＲＮＡである。このようにＲＮＡを多様な原発腫瘍または腫瘍細胞系から単離することができる。ｍＲＮＡの起源が原発腫瘍ならば、例えば凍結組織試料または保存用パラフィン包埋固定（例えばホルマリン固定）組織試料からｍＲＮＡを抽出することができる。それらの組織試料は、毎日の臨床診療で日常的に調製および保存される。
【０１８４】
マイクロアレイ技法の特定の態様では、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅された挿入部を密なアレイ状に基板に適用する。好ましくは、少なくとも１００００ヌクレオチド配列をその基板に適用する。各１００００エレメントでマイクロチップ上に固定化された、マイクロアレイを形成した遺伝子は、ストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーションに適する。蛍光ラベルされたｃＤＮＡプローブを、関心対象の組織から抽出されたＲＮＡの逆転写による蛍光ヌクレオチドの組み込みにより作成することができる。チップに適用されたラベルされたｃＤＮＡプローブは、そのアレイ上のＤＮＡの各スポットに特異的にハイブリダイズする。ストリンジェントな洗浄を行って非特異的に結合したプローブを除去した後で、共焦点レーザ顕微鏡またはＣＣＤカメラなどの別の検出方法によりチップをスキャンする。アレイを形成した各エレメントのハイブリダイゼーションの定量は、対応するｍＲＮＡの存在量の評定を考慮に入れている。二色蛍光を用いて、二つのＲＮＡ起源から作成された別々にラベルされたｃＤＮＡプローブをそのアレイに二つ一組でハイブリダイズさせる。このように、各特異的遺伝子に対応する、二つの起源からの転写体の相対存在量が同時に決定される。規模が小型化されたハイブリダイゼーションは多数の遺伝子についての発現パターンの便利で迅速な評価を与える。当該方法は、細胞あたり少数のコピーで発現しているまれな転写体を検出するのに要求される感度を有し、かつ発現レベルの少なくとも約２倍の差を再現性をもって検出することが示された（Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(2): 106-149 (1996)）。市販されている装置により、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧＥＮＣＨＩＰ（商標）技法またはＩｎｃｙｔｅマイクロアレイ技法を例えば使用して、製造業者の説明書に従ってマイクロアレイ解析を行うことができる。
【０１８５】
遺伝子発現の大規模分析のためのマイクロアレイ法の開発は、多様な腫瘍型でのガン分類および転帰予測の分子マーカーを系統的に検索することを可能にしている。
【０１８６】
（ｉｖ）連続遺伝子発現解析（ＳＡＧＥ）
連続遺伝子発現解析（ＳＡＧＥ）は、多数の遺伝子転写体の同時定量解析を許し、各転写体について個別のハイブリダイゼーションプローブを提供する必要のない方法である。まず、転写体を独自に同定するのに足る情報を有する短い配列タグ（約１０〜１４ｂｐ）を作成する。但し、そのタグは各転写体内の独自の位置から得られる。次に、多数の転写体を一緒に連結させて長い連続分子を形成させる。その連続分子を配列解析して多数のタグの独自性を同時に明らかにすることができる。個別のタグの存在量を決定すること、および各タグに対応する遺伝子を同定することによって、任意の転写体集団の発現パターンを定量的に評価することができる。さらなる詳細については、例えばVelculescu et al., Science 270: 484-487 (1995)；およびVelculescu et al., Cell 88: 243-51 (1997)を参照されたい。
【０１８７】
（ｖ）ＭａｓｓＡＲＲＡＹ技法
ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（Sequenom, San Diego, Calif.）技法は、検出に質量分析（ＭＳ）を使用した遺伝子発現解析の自動高スループット法である。この方法により、ＲＮＡの単離、逆転写、およびＰＣＲ増幅後にｃＤＮＡをプライマー伸長に供する。ｃＤＮＡから得られたプライマー伸長産物を精製し、ＭＡＬＴＩ−ＴＯＦ  ＭＳ用試料の調製に必要な構成要素を予めロードされたチップアレイ上に分配する。得られた質量スペクトルでのピーク面積を分析することにより、反応物に存在する様々なｃＤＮＡを定量する。
【０１８８】
（ｖｉ）超並列シグネチャー配列解析（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現解析
Brennerら、Nature Biotechnology 18: 630-634 (2000)に記載されているこの方法は、非ゲル系シグネチャー配列解析を、直径５μgの別々のマイクロビーズ上での数百万のテンプレートのｉｎ  ｖｉｔｒｏクローニングと組合せた配列解析アプローチである。まず、ＤＮＡテンプレートのマイクロビーズライブラリーをｉｎ  ｖｉｔｒｏクローニングにより構築する。これに続いて、フローセル中に高密度（典型的には３×１０６マイクロビーズ/cm2を超える）でテンプレート含有マイクロビーズの平面アレイを組み立てる。ＤＮＡフラグメントの分離を要さない蛍光系シグネチャー配列解析法を使用して、各マイクロビーズ上のクローニングされたテンプレートの自由端を同時に分析する。この方法は、１回の操作で酵母ｃＤＮＡライブラリーから数十万の遺伝子シグネチャー配列を同時に正確に提供することが示された。
【０１８９】
（ｖｉｉ）免疫組織化学
免疫組織化学法もまた、本発明の予後マーカーの発現レベルを検出するために適する。このように、各マーカーに特異的な抗体または抗血清、好ましくはポリクローナル抗血清、最も好ましくはモノクローナル抗体が発現を検出するために使用される。その抗体自体を、例えば放射性ラベル、蛍光ラベル、ビオチンなどのハプテンラベル、またはホースラディッシュペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼなどの酵素で直接ラベルすることにより、その抗体を検出することができる。または、ラベルされていない一次抗体を、その一次抗体に特異的な抗血清、ポリクローナル抗血清、またはモノクローナル抗体を含むラベルされた二次抗体と共に使用する。免疫組織化学のプロトコールおよびキットは当技術分野で周知であり、市販されている。
【０１９０】
（ｖｉｉｉ）プロテオミクス
用語「プロテオーム」は、ある時点で試料（例えば組織、生物、または細胞培養物）中に存在するタンパク質全体として定義される。プロテオミクスには、とりわけ試料中のタンパク質発現の全体的変化の研究を含む（「発現プロテオミクス」とも称される）。プロテオミクスは、典型的には以下の段階：（１）２−Ｄゲル電気泳動（２−Ｄ  ＰＡＧＥ）による試料中の個別のタンパク質の分離；（２）ゲルから回収された個別のタンパク質の同定、例えば質量分析またはＮ−末端分析による；および（３）生物情報学を使用したデータ解析を含む。プロテオミクス法は、遺伝子発現プロファイリングのその他の方法の価値ある補足物であり、単独またはその他の方法と共に使用して、本発明の予後マーカーの産物を検出することができる。
【０１９１】
（ｉｘ）ｍＲＮＡの単離、精製、および増幅の一般的な記述
固定パラフィン包埋組織をＲＮＡ起源として使用した、遺伝子発現をプロファイリングするための、ｍＲＮＡ単離、精製、プライマー伸長、および増幅を含めた代表的なプロトコールの段階は、様々な公表された雑誌文献（例えば、Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000)；Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)）に示されている。簡潔には、代表的な工程は、パラフィン包埋腫瘍組織試料の約１０μg厚の切片を切り出すことに始まる。次に、ＲＮＡを抽出し、タンパク質およびＤＮＡを除去する。ＲＮＡ濃度を分析した後に、ＲＮＡの修復および／または増幅段階を必要ならば含めることができ、遺伝子特異的プロモータを使用してＲＮＡを逆転写し、続いてＰＣＲを行う。最後に、データを解析して、検査された腫瘍試料で同定された特徴的な遺伝子発現パターンに基づいて患者に利用できる最良の処置選択肢を同定する。
【０１９２】
ＩＩＩ．抗体の産生
好ましい態様では、ＨＥＲ阻害剤はＨＥＲ抗体である。本発明により使用される抗体の産生のための例示的な技法に関しての説明が続く。抗体の産生のために使用されるＨＥＲ抗原は、所望のエピトープを有する可溶性形態のＨＥＲ細胞外ドメインまたはその部分でありうる。または、細胞表面にＨＥＲを発現している細胞（例えばＨＥＲ２を過剰発現するように形質転換されたＮＩＨ−３Ｔ３細胞；またはＳＫ−ＢＲ−３細胞などのガン細胞系、Stancovski et al. PNAS (USA) 88: 8691-8695 (1991)参照）を使用して抗体を作成することができる。抗体を作成するために有用なその他の形態のレセプターＨＥＲは、当業者に明らかであろう。
【０１９３】
（ｉ）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連抗原およびアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）注射または腹腔内（ｉｐ）注射によって動物に産生される。二官能剤または誘導化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介したコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である）を使用して、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、またはダイズトリプシン阻害剤などの、免疫処置される種に免疫原性であるタンパク質と関連抗原をコンジュゲーションすることが有用なことがある。
【０１９４】
例えば、（それぞれウサギまたはマウスに対して）１００μgまたは５μgのタンパク質またはコンジュゲートを３倍量のフロイント完全アジュバントと混合し、複数の部位にその溶液を皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、または誘導体に対して動物を免疫処置する。１か月後、フロイント完全アジュバントに入れた初回量の１／５から１／１０のペプチドまたはコンジュゲートを用いて複数の部位で皮下注射することにより、その動物に追加免疫する。７日から１４日後、その動物から採血し、そしてその血清の抗体力価をアッセイする。力価がプラトーになるまで動物に追加免疫する。好ましくは、同抗原のコンジュゲートであるが、異なるタンパク質と、および／または異なる架橋試薬を介してコンジュゲーションしたものを用いて、その動物を追加免疫する。タンパク質融合体としてリコンビナント細胞培養でコンジュゲートを作成することもできる。また、ミョウバンなどの凝集剤を適切に使用して、免疫応答を増強させる。
【０１９５】
（ｉｉ）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体を作成するための様々な方法を当技術分野で利用することができる。例えば、Kohlerら、Nature, 256: 495 (1975)に最初に記載されたハイブリドーマ法を使用して、リコンビナントＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によりモノクローナル抗体を作成することができる。
【０１９６】
ハイブリドーマ法では、マウス、またはハムスターなどのその他の適切な宿主動物を、本明細書の前述のように免疫処置して、免疫処置のために使用されたタンパク質に特異的に結合するであろう抗体を産生するか、または産生できるリンパ球を誘発させる。または、リンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫処置することができる。次に、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いて、リンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成させる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)）。
【０１９７】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、未融合の親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する一つまたは複数の物質を好ましくは含有する適切な培地に接種し、成長させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素であるヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠如しているならば、ハイブリドーマ用の培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含むものであり（ＨＡＴ培地）、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻止する。
【０１９８】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの産生を支持し、かつＨＡＴ培地などの培地に感受性の細胞である。これらのうち好ましい骨髄腫細胞系は、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USAから入手できるＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍由来の細胞系、ならびにAmerican Type Culture Collection, Rockville, Maryland USAから入手できるＳＰ−２細胞またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞などのマウス骨髄腫系である。ヒト骨髄腫細胞系およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系も、ヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されている（Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984);およびBrodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
【０１９９】
その抗原に対するモノクローナル抗体の産生について、ハイブリドーマ細胞が中で成長している培地をアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降により、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイにより決定する。
【０２００】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980)のスキャッチャード解析によって決定することができる。
【０２０１】
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後で、限界希釈手順によりそのクローンをサブクローニングして、標準的な方法により成長させることができる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)）。この目的に適切な培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地がある。さらに、このハイブリドーマ細胞を、動物における腹水腫瘍としてｉｎ  ｖｉｖｏで成長させることができる。
【０２０２】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体を、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の抗体精製手順によって培地、腹水、または血清から適切に分離する。
【０２０３】
モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離されて、配列解析される。ハイブリドーマ細胞は、当該ＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離されると、そのＤＮＡを発現ベクターの中に配置することができ、次にＥ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または他の状況では抗体タンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にその発現ベクターをトランスフェクションして、リコンビナント宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を得ることができる。抗体をコードしているＤＮＡを細菌にリコンビナント発現させることに関する総説論文には、Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993)およびPluckthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992)がある。
【０２０４】
さらなる態様では、モノクローナル抗体または抗体フラグメントを、McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990)に記載されている技法を使用して作成された抗体ファージライブラリーから単離することができる。Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)は、ファージライブラリーを使用した、それぞれマウス抗体およびヒト抗体の単離を記載している。その後の刊行物は、鎖シャッフリング（chain chuffling）（Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)）による高親和性（nM範囲）ヒト抗体の産生ならびに非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染およびｉｎ  ｖｉｖｏリコンビネーション（Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)）について記載している。このように、これらの技法は、モノクローナル抗体を単離するための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技法に対する実行可能な代替法である。
【０２０５】
例えば、相同マウス配列に代わり、ヒト重鎖および軽鎖の定常ドメインについてのコード配列に置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；およびMorrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81: 6851 (1984)）、または免疫グロブリンのコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列の全てもしくは一部を共有結合的に繋ぐことによっても、ＤＮＡを改変することができる。
【０２０６】
典型的には、抗体の定常ドメインの代わりに当該非免疫グロブリンポリペプチドに置換するか、または、抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりにそれらに置換して、抗原に対する特異性を有する一つの抗原結合部位と、異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を生み出す。
【０２０７】
（ｉｉｉ）ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化するための方法は当技術分野で記載されている。好ましくは、ヒト化抗体は、非ヒトである起源からその抗体に導入された一つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「輸入（import）」残基と称される。この残基は、典型的には「輸入」可変ドメインから取り入れられる。ヒト化は、ヒト抗体の対応配列の代わりに超可変部配列に置換することによって、Winterおよび共同研究者らの方法（Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)）に従って本質的に行うことができる。したがって、当該「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインよりも実質的に小さな配列が非ヒト種由来の対応する配列に置換されたキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際にはヒト化抗体は、典型的には一部の超可変部残基と、可能性があることには一部のＦＲ残基とが、げっ歯動物抗体の類似部位由来の残基に置換されているヒト抗体である。
【０２０８】
ヒト化抗体を作成する際に使用される、軽鎖および重鎖両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減するために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法により、げっ歯動物抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に、そのげっ歯動物の配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体についてのヒトフレームワーク部（ＦＲ）として受け入れる（Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol, 196: 901 (1987)）。別の方法は、特定亜群の軽鎖または重鎖の全ヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク部を使用する。同フレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体に使用することができる（Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993)）。
【０２０９】
抗体が抗原に対する高い親和性およびその他の好都合な生物学的性質を保持してヒト化されることは、さらに重要である。この目標を実現するために、好ましい方法により、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用した親配列および様々な概念上のヒト化産物の分析プロセスによりヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルが、一般に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の有望な三次元コンフォメーション構造を図解して表示するコンピュータプログラムを利用することができる。これらの表示の調査により、候補免疫グロブリン配列の機能発揮にこれらの残基が果たしそうな役割を分析すること、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原と結合する能力に影響する残基を分析することが可能になる。このように、ＦＲ残基を、レシピエント配列および輸入配列より選択して組合せることができ、それにより、ターゲット抗原に対する親和性増大などの所望の抗体特性が実現される。一般に、超可変部残基は、抗原結合に影響することに直接的かつ最も実質的に関与している。
【０２１０】
ＷＯ０１／００２４５は、ＨＥＲ２と結合してレセプターＨＥＲのリガンド活性化を遮断する例示的なヒト化ＨＥＲ２抗体の産生を記載している。本明細書において特に関心対象のヒト化抗体は、マウスモノクローナル抗体２Ｃ４（もしくはそのＦａｂフラグメント）と本質的に同程度効果的にＥＧＦ、ＴＧＦ−α、および／もしくはＨＲＧが仲介するＭＡＰＫ活性化を遮断し、かつ／またはマウスモノクローナル抗体２Ｃ４（もしくはそのＦａｂフラグメント）と本質的に同程度効果的にＨＥＲ２と結合する。本明細書におけるヒト化抗体は、例えば、ヒト可変重鎖ドメインに組み込まれた非ヒト超可変部残基を含むことができ、 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に記述されている可変ドメイン付番システムを利用した６９Ｈ、７１Ｈ、および７３Ｈからなる群より選択される位置でのフレームワーク部（ＦＲ）置換をさらに含むことができる。一態様では、ヒト化抗体は、位置６９Ｈ、７１Ｈ、および７３Ｈの二つまたは全てにＦＲ置換を含む。
【０２１１】
本明細書において関心対象の例示的なヒト化抗体は、可変重鎖ドメイン相補性決定部残基ＧＦＴＦＴＤＹＴＭＸ（Ｘは好ましくはＤまたはＳ）（配列番号７）；ＤＶＮＰＮＳＧＧＳＩＹＮＱＲＦＫＧ（配列番号８）；および／またはＮＬＧＰＳＦＹＦＤＹ（配列番号９）を含み、場合により、それらのＣＤＲ残基にアミノ酸改変を含む（例えばその改変がその抗体の親和性を本質的に維持または改善する場合）。例えば、関心対象の抗体変異体は、約１個から約７個または約５個のアミノ酸置換を上記可変重鎖ＣＤＲ配列に有することがある。例えば下記のような親和性成熟によって、当該抗体変異体を調製することができる。最も好ましいヒト化抗体は、配列番号４の可変重鎖ドメインアミノ酸配列を含む。
【０２１２】
ヒト化抗体は、例えば前節の可変重鎖ドメインＣＤＲ残基に追加して、可変軽鎖ドメイン相補性決定部残基  ＫＡＳＱＤＶＳＩＧＶＡ（配列番号１０）；ＳＡＳＹＸ１Ｘ２Ｘ３（Ｘ１は好ましくはＲもしくはＬ、Ｘ２は好ましくはＹもしくはＥ、Ｘ３は好ましくはＴもしくはＳ）（配列番号１１）；および／またはＱＱＹＹＩＹＰＹＴ（配列番号１２）を含むことがある。当該ヒト化抗体は、場合により、上記ＣＤＲ残基のアミノ酸改変を含む（例えばその改変がその抗体の親和性を本質的に維持または改善する場合）。例えば、関心対象の抗体変異体は、約１個から約７個または約５個のアミノ酸置換を上記可変軽鎖ＣＤＲ配列に有することがある。例えば下記のような親和性成熟によって、当該抗体変異体を調製することができる。最も好ましいヒト化抗体は、配列番号３の可変軽鎖ドメインアミノ酸配列を含む。
【０２１３】
本出願は、ＨＥＲ２と結合して、リガンドによるレセプターＨＥＲの活性化を遮断する、親和性成熟した抗体も考えている。親抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体、例えば配列番号３および４の可変軽鎖配列および／または可変重鎖配列をそれぞれ含む抗体（すなわち変異体５７４）でありうる。親和性成熟した抗体は、好ましくはマウス２Ｃ４または変異体５７４よりも優れた親和性で（例えば、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）ＥＬＩＳＡを用いて評定するとき、例えば約２または約４倍から約１００倍または約１０００倍向上した親和性で）レセプターＨＥＲ２に結合する。置換のための例示的な可変重鎖ＣＤＲ残基には、Ｈ２８、Ｈ３０、Ｈ３４、Ｈ３５、Ｈ６４、Ｈ９６、Ｈ９９、または二つ以上の組合せ（例えば、これらの残基の２、３、４、５、６、または７個）がある。変更のための可変軽鎖ＣＤＲ残基の例には、Ｌ２８、Ｌ５０、Ｌ５３、Ｌ５６、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、Ｌ９６、Ｌ９７、または二つ以上の組合せ（例えば、これらの残基の２から３、４、５、または最大約１０個）がある。
【０２１４】
様々な形態のヒト化抗体または親和性成熟した抗体が考えられている。例えば、ヒト化抗体または親和性成熟した抗体は、Ｆａｂなどの抗体フラグメントでありうるが、このフラグメントは、免疫コンジュゲートを作成するために、場合により一つまたは複数の細胞毒性薬とコンジュゲーションしている。または、ヒト化抗体もしくは親和性成熟した抗体は、インタクトなＩｇＧ１抗体などのインタクトな抗体でありうる。好ましいインタクトなＩｇＧ１抗体は、配列番号１３の軽鎖配列および配列番号１４の重鎖配列を含む。
【０２１５】
（ｉｖ）ヒト抗体
ヒト化の代替として、ヒト抗体を作成することができる。例えば、免疫処置した際に、内因性免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体の全レパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を生み出すことが今や可能である。例えば、キメラおよび生殖細胞系突然変異マウスにおける抗体重鎖Ｊ部（ＪＨ）遺伝子の同型接合型欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害を招くことが記載されている。当該生殖細胞系突然変異マウスにヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイを導入する結果として、抗原による攻撃に応答したヒト抗体の産生が生じるであろう。例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993)；Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993)；Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)；ならびに米国特許第５，５９１，６６９号、第５，５８９，３６９号,および第５，５４５，８０７号を参照されたい。
【０２１６】
または、ファージディスプレイ技法（McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990)）を使用して、免疫処置されていないドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからヒト抗体およびヒト抗体フラグメントをｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生することができる。この技法によると、抗体Ｖドメイン遺伝子を、Ｍ１３またはｆｄなどの糸状バクテリオファージの主または副コートタンパク質遺伝子のいずれかのフレーム内にクローニングして、ファージ粒子の表面上に機能的な抗体フラグメントとして提示させる。糸状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを有することから、その抗体の機能的性質に基づく選択は、それらの性質を示す抗体をコードしている遺伝子の選択も招く。このように、そのファージは、Ｂ細胞の性質の一部を模倣している。ファージディスプレイを様々な形式で行うことができる；それらの総説については、例えばJohnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993)を参照されたい。いくつかの起源のＶ遺伝子セグメントをファージディスプレイのために使用することができる。Clacksonら、Nature, 352: 624-628 (1991)は、免疫処置されたマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリーから抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。免疫処置されていないヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、（自己抗原を含む）多様なアレイの抗原に対する抗体を、Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)、またはGriffith et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993)によって記載されている技法に本質的に従って単離することができる。米国特許第５，５６５，３３２号および第５，５７３，９０５号も参照されたい。
【０２１７】
上記のように、ヒト抗体を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化したＢ細胞により作成することもできる（米国特許第５，５６７，６１０号および第５，２２９，２７５号参照）。
【０２１８】
ヒトＨＥＲ２抗体は、１９９８年６月３０日に発行された米国特許第５，７７２，９９７号および１９９７年１月３日に公開されたＷＯ９７／００２７１に記載されている。
【０２１９】
（ｖ）抗体フラグメント
種々の技法が、一つまたは複数の抗原結合領域を含む抗体フラグメントの産生のために開発されている。伝統的には、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解消化を介して誘導された（例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992)；およびBrennan et al., Science, 229:81 (1985)を参照されたい）。しかし、これらのフラグメントを、今やリコンビナント宿主細胞によって直接産生することができる。例えば、その抗体フラグメントを、上記の抗体ファージライブラリーから単離することができる。または、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収して、化学的に結合させてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成させることができる（Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)）。別のアプローチにより、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを、リコンビナント宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体フラグメントの産生のためのその他の技法は、当業者に明白であろう。他の態様では、選択された抗体は一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および第５，５８７，４５８号を参照されたい。この抗体フラグメントは、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に例えば記載された「線状抗体」でもありうる。当該線状抗体フラグメントは、単一特異性または二重特異性でありうる。
【０２２０】
（ｖｉ）二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＨＥＲ２タンパク質の二つの異なるエピトープに結合することができる。その他の当該抗体は、ＨＥＲ２結合部位と、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、および／またはＨＥＲ４に対する結合部位とを組合せることができる。または、細胞防御メカニズムをＨＥＲ２発現細胞に集中させるために、Ｔ細胞レセプター分子（例えば、ＣＤ２もしくはＣＤ３）のような、またはＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）などの、ＩｇＧに対するＦｃレセプター（ＦｃγＲ）のような、白血球上のトリガー分子に結合するアームとＨＥＲ２アームを組合せることができる。ＨＥＲ２を発現する細胞に細胞毒性薬を局在化させるために、二重特異性抗体を使用することもできる。これらの抗体は、ＨＥＲ２結合アームと、細胞毒性薬（例えば、サポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシン（ricin）Ａ鎖、メトトレキサート、または放射性同位体ハプテン）と結合するアームとを有する。二重特異性抗体を、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。
【０２２１】
ＷＯ９６／１６６７３は、二重特異性ＨＥＲ２／ＦｃγＲＩＩＩ抗体を記載し、米国特許第５，８３７，２３４号は、二重特異性ＨＥＲ２／ＦｃγＲＩ抗体ＩＤＭ１（Osidem）を開示している。二重特異性ＨＥＲ２／Ｆｃα抗体は、ＷＯ９８／０２４６３に示されている。米国特許第５，８２１，３３７号は、二重特異性ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体を教示している。ＭＤＸ−２１０は、二重特異性ＨＥＲ２−ＦｃγＲＩＩＩ Ａｂである。
【０２２２】
二重特異性抗体を作成するための方法は、当技術分野において公知である。全長二重特異性抗体の従来の産生は、二つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づく。ここで、その二つの鎖は異なる特異性を有する（Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)）。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな取り合わせが原因で、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生し、そのうち、一つだけが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、普通はアフィニティークロマトグラフィー工程によってなされるが、かなり煩雑であり、その産物の収率は低い。類似の手順がＷＯ９３／０８８２９およびTraunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991)に開示されている。
【０２２３】
異なるアプローチにより、所望の結合特異性（抗体−抗原の結合部位）を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。この融合体は、好ましくは、ヒンジ部の少なくとも一部、ＣＨ２部、およびＣＨ３部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインを有する。軽鎖の結合に必要な部位を有する第一重鎖定常部（ＣＨ１）を、これら融合体の少なくとも一つに存在させることが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体をコードしているＤＮＡと、所望ならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡとを、別々の発現ベクターに挿入して、適切な宿主生物に同時トランスフェクションする。これは、構築に使用される等しくない比率の３本のポリペプチド鎖が最適な収率を提供する態様において、それら３本のポリペプチドフラグメントの相互比率の調整に大きな柔軟性を提供する。しかし、少なくとも２本のポリペプチド鎖が等しい比で発現することが高収率を招く場合、またはその比が特に重要ではない場合に、２本または３本全てのポリペプチド鎖についてのコード配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０２２４】
このアプローチの好ましい態様では、二重特異性抗体は、一方のアームでの第１結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームでのハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２結合特異性を提供する）とから構成される。この非対称構造は、望まれていない免疫グロブリン鎖の組合せから所望の二重特異性化合物の分離を容易にすることが見出された。それは、二重特異性分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖が存在することが、分離の容易な方法に備えるからである。このアプローチは、ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体を作成するさらなる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986)を参照されたい。
【０２２５】
米国特許第５，７３１，１６８号に記載されている別のアプローチによると、抗体分子対の間の界面を加工して、リコンビナント細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の率を最大にすることができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部分を含む。この方法では、第１抗体分子の界面由来の一つまたは複数の小型アミノ酸側鎖を、より大型の側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）に交換する。その大型側鎖に同一または類似の大きさの代償的な「空洞」は、大型アミノ酸側鎖をより小型のアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）に交換することによって、第２抗体分子の界面に生み出される。これは、ホモ二量体などのその他の望まれない最終産物に比べてヘテロ二量体の収率を増加させるためのメカニズムを提供する。
【０２２６】
二重特異性抗体には、架橋抗体または「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体のうちの一方をアビジンと、他方をビオチンと結合させることができる。当該抗体は、例えば、望まれていない細胞に免疫系細胞をターゲティングするために（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の処置のために（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、およびＥＰ０３０８９）提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体を、任意の好都合な架橋方法を用いて作成することができる。適切な架橋剤は当技術分野において周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に、いくつかの架橋技法と共に開示されている。
【０２２７】
抗体フラグメントから二重特異性抗体を作成するための技法は、文献にも記載されている。例えば、化学的結合を用いて二重特異性抗体を調製することができる。Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)は、インタクトな抗体がタンパク質分解的に開裂されてＦ（ａｂ’）２フラグメントを発生する手順を記載している。これらのフラグメントを、ジチオール錯化剤である亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接するジチオールを安定化して、分子間ジスルフィド形成を阻止する。次に、発生したＦａｂ’フラグメントをチオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次に、メルカプトエチルアミンを用いた還元により、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一つをＦａｂ’−チオールに再変換し、等モル量のその他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を形成させる。産生した二重特異性抗体を、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用することができる。
【０２２８】
最近の進歩により、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＦａｂ’−ＳＨフラグメントを直接回収することが容易になった。このＦａｂ’−ＳＨフラグメントを、化学的に結合させて、二重特異性抗体を形成させることができる。Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)は、完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生を記載している。各々のＦａｂ’フラグメントが、Ｅ．ｃｏｌｉから別々に分泌され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ定方向化学的結合に供されて、二重特異性抗体を形成した。このように形成した二重特異性抗体は、レセプターＨＥＲ２を過剰発現している細胞および正常なヒトＴ細胞に結合することができ、かつヒト乳房腫瘍ターゲットに対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性をトリガーすることができた。
【０２２９】
リコンビナント細胞培養物から二重特異性抗体フラグメントを直接作成して単離するための様々な技法も記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて産生された。Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドが、遺伝子融合によって二つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結された。その抗体ホモ二量体は、ヒンジ部で還元されて単量体を形成し、次に、再び酸化されて抗体へテロ二量体を形成した。この方法を、抗体ホモ二量体産生のためにも利用することができる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)によって記載された「二特異性抗体」技法は、二重特異性抗体フラグメントを作成するための代替メカニズムを提供した。このフラグメントは、同じ鎖上の二つのドメイン間で対形成させるには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、一つのフラグメントのＶＨドメインおよびＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的なＶＬドメインおよびＶＨドメインと対形成することを強いられ、それによって、二つの抗原結合部位を形成する。二重特異性抗体フラグメントを単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用によって作成するための別の戦略も報告されている。Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994)を参照されたい。
【０２３０】
二つを超える結合価を有する抗体が考えられている。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)。
【０２３１】
（ｖｉｉ）その他のアミノ酸配列の改変
本明細書に記載された抗体のアミノ酸配列の改変が考えられている。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的性質を改善することが望ましいことがある。適切なヌクレオチド変化を抗体の核酸に導入することにより、またはペプチド合成により、抗体のアミノ酸配列変異体を調製する。当該改変には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失および／またはそれへの挿入および／またはその置換がある。欠失、挿入、および置換の任意の組合せは、最終構築物に達するように作成されるが、但し、その最終構築物は所望の性質を有する。そのアミノ酸変化は、グリコシル化部位の数または位置を変化させることなどの、抗体の翻訳後プロセスを変更することもできる。
【０２３２】
突然変異誘発についての好ましい位置である、抗体のある残基または領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)に記載された「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、複数のターゲット残基の中から一つの残基または基（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電した残基）が同定され、中性または陰性に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）に交換されて、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を与える。次に、置換に対する機能的感受性を実証しているアミノ酸位置を、置換部位に、または置換部位の代わりにさらなる変異体またはその他の変異体を導入することによって精密化する。このように、アミノ酸配列変異を導入するための部位が予め決定されているが、その突然変異自体の性質は予め決定されている必要はない。例えば、所与の部位での突然変異の性能を分析するために、ａｌａスキャニングまたはランダム突然変異誘発が、ターゲットコドンまたはターゲット領域に施され、発現した抗体変異体が所望の活性についてスクリーニングされる。
【０２３３】
アミノ酸配列挿入には、長さが１個の残基から１００個以上の残基を有するポリペプチドまでの範囲のアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合体、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入体がある。末端挿入体の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体、または細胞毒性ポリペプチドに融合した抗体がある。抗体分子のその他の挿入変異体には、抗体のＮ末端またはＣ末端と酵素（例えば、ＡＤＥＰＴ用）との、または抗体の血清半減期を増大させるポリペプチドとの融合体がある。
【０２３４】
別の型の変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子中の少なくとも一つのアミノ酸残基が異なる残基に交換されている。置換突然変異誘発について最も関心対象の部位には超可変部があるが、ＦＲの変更も考えられている。保存的置換を、表１の「好ましい置換」の見出しの下に示す。当該置換が生物学的活性の変化を招くならば、表１に「例示的置換」と称するか、またはアミノ酸クラスを参照して以下にさらに記載されるさらに実質的な変化を導入して、その産物をスクリーニングすることができる。
【０２３５】
【表１】
2008523073.tif 000002
【０２３６】
抗体の生物学的性質における実質的な改変は、（ａ）例えば、シートもしくはヘリカルコンフォメーションのような、置換域におけるポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）ターゲット部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ高さを維持することに及ぼす効果が有意に異なる置換を選択することによって実現される。側鎖の性質の類似性により、アミノ酸を以下の群に分けることができる（A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp.73-75, Worth Publishers, New York (1975)）：
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）無荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。
【０２３７】
または、天然残基を、共通の側鎖の性質に基づいて以下の群に分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０２３８】
非保存的置換は、これらのクラスのうち一つのクラスのメンバーを別のクラスに交換することを必要とするであろう。
【０２３９】
抗体の適切なコンフォメーションの維持に関与しない任意のシステイン残基を、一般にセリンに置換して、その分子の酸化に対する安定性を改善して、異常な架橋を阻止することもできる。逆に、システイン結合をその抗体に付加して、（特に、その抗体がＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合）その安定性を改善することができる。
【０２４０】
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の一つまたは複数の超可変部残基を置換することを伴う。一般的に、さらなる開発のために選択された、結果として生じた変異体は、それらの変異体が作成された元の親抗体に比べて、改善された生物学的性質を有するであろう。当該置換変異体を作成するための簡便法は、ファージディスプレイを使用した親和性成熟を伴う。簡潔には、いくつかの超可変部部位（例えば、６から７個の部位）を突然変異させて全ての可能なアミノ置換を各部位に作成する。このように作成された抗体変異体は、糸状ファージ粒子から一価の様式で、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合体として提示される。次に、ファージディスプレイされた変異体を、本明細書に開示されたように、それらの生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングする。改変のための候補となる超可変部部位を同定するために、アラニンスキャニング変異誘発を行って、抗原結合に重大に寄与する超可変部残基を同定することができる。または、もしくは追加的に、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体とヒトＨＥＲ２との間の接触点を同定することが有益でありうる。そのような接触残基および隣接する残基は、本明細書に詳細に述べられた技法による置換のための候補である。当該変異体がいったん発生すると、一団の変異体を本明細書に記載されたスクリーニングに供し、一つまたは複数の関連するアッセイで優れた性質を有する抗体を、さらなる開発のために選択することができる。
【０２４１】
この抗体の別の型のアミノ酸変異体は、この抗体の本来のグリコシル化パターンを変更したものである。変更によって、抗体に見出される一つもしくは複数の糖質部分を欠失させること、および／またはその抗体には存在しない一つもしくは複数のグリコシル化部位を付加することを意味する。
【０２４２】
抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ−結合またはＯ−結合のいずれかである。Ｎ−結合は、アスパラギン残基の側鎖に糖質部分が付着していることを指す。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に糖質部分を酵素的に付着させるための認識配列である。このように、これらのトリペプチド配列のいずれかがポリペプチド中に存在することで、潜在的なグリコシル化部位が生み出される。Ｏ−結合型グリコシル化は、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの一つがヒドロキシアミノ酸に付着していることを指し、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用されうるが、そのヒドロキシアミノ酸は最も一般的にはセリンまたはトレオニンである。
【０２４３】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、好都合には、アミノ酸配列を変更することにより、そのアミノ酸配列が（Ｎ−結合型グリコシル化部位のための）上記の一つまたは複数のトリペプチド配列を有するようにすることによって実現される。本来の抗体の配列に（Ｏ−結合型グリコシル化部位のための）一つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基を付加するか、またはこれらに置換することによっても変更を行うことができる。
【０２４４】
抗体がＦｃ部を含む場合、それに付着している糖質を変更することができる。例えば、抗体のＦｃ部に付着したフコースを欠如した成熟糖質構造を有する抗体が米国特許出願ＵＳ２００３／０１５７１０８Ａ１、Presta, L.に記載されている。ＵＳ２００４／００９３６２１Ａ１（Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd）も参照されたい。糖質中の二分岐型Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が抗体のＦｃ部に付着した抗体がＷＯ０３／０１１８７８、Jean-Mairetらおよび米国特許第６，６０２，６８４号、Umanaらに参照されている。オリゴ糖中の少なくとも一つのガラクトース残基が抗体のＦｃ部に付着した抗体がＷＯ９７／３００８７、Patelらに報告されている。変更された糖質がＦｃ部に付着した抗体に関するＷＯ９８／５８９６４（Raju, S.）およびＷＯ９９／２２７６４（Raju, S.）も参照されたい。
【０２４５】
例えば、抗体の抗原依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を増強するためのエフェクター機能に関して、本発明の抗体を改変することが望ましいことがある。これは、抗体のＦｃ部に一つまたは複数のアミノ酸置換を導入することによって実現することができる。または、もしくは追加的に、システイン残基をＦｃ部に導入することによって、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させることができる。このように作成されたホモ二量体抗体は、改善したインターナリゼーション能ならびに／または増大した補体介在性細胞殺滅および抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を有することがある。Caron et al., J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992)およびShopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)を参照されたい。増強した抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体を、Wolff et al. Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されているようなヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製することもできる。または、二つのＦｃ部を有する抗体を加工することができ、それによって、その抗体は増強した補体溶解およびＡＤＣＣ能を有しうる。Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)を参照されたい。
【０２４６】
ＷＯ００／４２０７２（Presta, L.）は、ヒトエフェクター細胞の存在下で改善したＡＤＣＣ機能を有する抗体を記載している。ここで、その抗体は、そのＦｃ部にアミノ酸置換を含む。好ましくは、改善されたＡＤＣＣを有する抗体はＦｃ部の位置２９８、３３３、および／または３３４に置換を含む。好ましくは、変更されたＦｃ部は、これらの位置の一つ、二つ、または三つに置換を含むか、またはその置換からなるヒトＩｇＧ１のＦｃ部である。
【０２４７】
Ｃ１ｑとの結合性および／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）の変更を有する抗体が、ＷＯ９９／５１６４２、米国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号、米国特許第６，２４２，１９５Ｂ１号、米国特許第６，５２８，６２４Ｂ１号、および米国特許第６，５３８，１２４号（Idusogie et al.）に記載されている。この抗体は、そのＦｃ部のアミノ酸位置２７０、３２２、３２６、３２７、３２９、３１３、３３３、および／または３３４のうち一つまたは複数にアミノ酸置換を含む。
【０２４８】
抗体の血清半減期を増大させるために、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載されているように、サルベージレセプター結合エピトープを抗体（特に抗体フラグメント）に組み込むことができる。本明細書中で使用される用語「サルベージレセプター結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のｉｎ  ｖｉｖｏ血清半減期の増大を担う、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ部のエピトープを指す。
【０２４９】
新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）との結合性が改善し、半減期が増大した抗体は、ＷＯ００／４２０７２（Presta, L.）に記載されている。これらの抗体は、その中にＦｃ部とＦｃＲｎとの結合性を改善する一つまたは複数の置換を有するＦｃ部を含む。例えば、Ｆｃ部は位置２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、または４３４のうち一つまたは複数に置換を有しうる。ＦｃＲｎとの改善した結合性を有する好ましいＦｃ部含有抗体変異体は、そのＦｃ部の位置３０７、３８０、および４３４のうち一つ、二つ、または三つにアミノ酸置換を含む。
【０２５０】
三つ以上（好ましくは四つ）の機能的抗原結合部位を有する加工された抗体も考えられている（米国出願番号ＵＳ２００２／０００４５８７Ａ１、Miller et al.）。
【０２５１】
抗体のアミノ酸配列変異体をコードしている核酸分子は、当技術分野で公知の様々な方法により調製される。これらの方法には、天然起源からの単離（天然アミノ酸配列変異体の場合）または初期調製変異体もしくは非変異体バージョンの抗体のオリゴヌクレオチド介在性（もしくは部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、およびカセット突然変異誘発による調製があるが、それに限定されるわけではない。
【０２５２】
（ｖｉｉｉ）  所望の性質を有する抗体についてのスクリーニング
抗体を作成するための技法は、上に記載されている。所望により、ある種の生物学的特性を有する抗体をさらに選択することができる。
【０２５３】
レセプターＨＥＲのリガンド活性化を遮断する抗体を同定するために、その抗体が、（例えば、別のレセプターＨＥＲとコンジュゲーションしたレセプターＨＥＲであって、その別のレセプターＨＥＲと関心対象のレセプターＨＥＲがＨＥＲヘテロオリゴマーを形成する）レセプターＨＥＲを発現している細胞に対するＨＥＲリガンドの結合を遮断する能力を決定することができる。例えば、ＨＥＲヘテロオリゴマーのレセプターＨＥＲを自然発現しているか、またはそれを発現するようにトランスフェクションされた細胞を、その抗体と共にインキュベーションして、次にラベルされたＨＥＲリガンドに曝露することができる。次に、その抗体が、ＨＥＲヘテロオリゴマー中のレセプターＨＥＲに対するリガンドの結合を遮断する能力を評価することができる。
【０２５４】
例えば、ＨＥＲ２抗体によるＭＣＦ７乳房腫瘍細胞系へのＨＲＧ結合の阻害を、本質的にＷＯ０１／００２４５に記載されたように２４ウェルプレート形式での氷冷単層ＭＣＦ７培養物を用いて行うことができる。ＨＥＲ２モノクローナル抗体を各ウェルに加え、３０分間インキュベーションすることができる。次に、１２５ＩラベルされたｒＨＲＧβ１１７７−２２４（２５pm）を加え、インキュベーションを４から１６時間続けることができる。用量反応曲線を準備することができ、関心対象の抗体についてＩＣ５０値を算出することができる。一態様では、レセプターＨＥＲのリガンド活性化を遮断する抗体は、このアッセイにおいてＭＣＦ７細胞とのＨＲＧ結合の阻害についての約５０nM以下の、より好ましくは約１０nM以下のＩＣ５０を有するであろう。抗体が、Ｆａｂフラグメントなどの抗体フラグメントである場合、このアッセイにおけるＭＣＦ７細胞とのＨＲＧ結合の阻害についてのＩＣ５０は、例えば約１００nM以下、より好ましくは５０nM以下でありうる。
【０２５５】
または、もしくは追加的に、抗体がＨＥＲヘテロオリゴマーに存在するレセプターＨＥＲのＨＥＲリガンド刺激性チロシンリン酸化を遮断する能力を評定することができる。例えば、レセプターＨＥＲを内因性発現しているか、またはそれを発現するようにトランスフェクションされた細胞を、抗体と共にインキュベーションして、次に、ＨＥＲリガンド依存性チロシンリン酸化活性について抗ホスホチロシンモノクローナル抗体（場合により検出可能なラベルとコンジュゲーションされたもの）を用いてアッセイすることができる。米国特許第５，７６６，８６３号に記載されているキナーゼレセプター活性化アッセイも、レセプターＨＥＲの活性化と抗体によるその活性の遮断とを決定するために利用できる。
【０２５６】
一態様では、本質的にＷＯ０１／００２４５に記載されたように、ＭＣＦ７細胞でのＨＲＧによるｐ１８０チロシンリン酸化の刺激を阻害する抗体についてスクリーニングすることができる。例えば、ＭＣＦ７細胞を２４ウェルプレートに蒔き、ＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体を各ウェルに加え、室温で３０分間インキュベーションし、次に、最終濃度０．２nMまでｒＨＲＧβ１１７７−２４４を各ウェルに加えることができ、インキュベーションを８分間続けることができる。培地を各ウェルから吸引し、ＳＤＳ試料緩衝液（５％ＳＤＳ、２５mM  ＤＴＴ、および２５mMトリス-ＨＣｌ、ｐＨ６．８）１００μlを加えることによって反応を停止させることができる。各試料（２５μl）を、４〜１２％の勾配ゲル（Novex）で電気泳動して、次にポリビニリデンジフルオリド膜に電気泳動的に移行させることができる。抗ホスホチロシン（１μg/ml）免疫ブロットを展色させて、Ｍｒ約１８００００での顕著な反応性バンドの強度を反射率デンシトメトリーにより定量することができる。選択された抗体は、好ましくはこのアッセイにおける対照の約０〜３５％まで、ＨＲＧによるｐ１８０チロシンリン酸化の刺激を有意に阻害するであろう。反射率デンシトメトリーによって決定された、ＨＲＧによるｐ１８０チロシンリン酸化の刺激の阻害についての用量反応曲線を準備することができ、関心対象の抗体についてのＩＣ５０を算出することができる。一態様では、レセプターＨＥＲのリガンド活性化を遮断する抗体は、このアッセイにおいて約５０nM以下の、より好ましくは約１０nM以下の、ＨＲＧによるｐ１８０チロシンリン酸化の刺激の阻害についてのＩＣ５０を有するであろう。抗体が、Ｆａｂフラグメントなどの抗体フラグメントである場合、このアッセイにおける、ＨＲＧによるｐ１８０チロシンリン酸化の刺激の阻害についてのＩＣ５０は、例えば約１００nM以下、より好ましくは５０nM以下でありうる。
【０２５７】
例えば、本質的にSchaefer et al. Oncogene 15: 1385-1394 (1997)に記載されているように、ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞に及ぼす抗体の成長阻害効果を評定することもできる。このアッセイによると、ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞を、ＨＥＲ２モノクローナル抗体（１０μg/mL）で４日間処理して、クリスタルバイオレットで染色することができる。ＨＥＲ２抗体とのインキュベーションにより、モノクローナル抗体２Ｃ４によって示される効果に類似した、この細胞系に及ぼす成長阻害効果が示されうる。さらなる態様では、外因性ＨＲＧはこの阻害を有意には逆転しないであろう。好ましくは、この抗体は、外因性ＨＲＧの存在下および不在下の両方で、モノクローナル抗体４Ｄ５よりも大きな程度（および場合によりモノクローナル抗体７Ｆ３よりも大きな程度）ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞の細胞増殖を阻害することができるであろう。
【０２５８】
一態様では、関心対象のＨＥＲ２抗体は、モノクローナル抗体４Ｄ５よりも実質的に効果的に、好ましくはモノクローナル抗体７Ｆ３よりも実質的に効果的にＷＯ０１／００２４５に記載された実験などの共免疫沈降実験で決定された、ＭＣＦ７細胞およびＳＫ-ＢＲ-３細胞の両方におけるＨＥＲ２とＨＥＲ３とのヘレグリン依存性会合を遮断することができる。
【０２５９】
増殖阻害性ＨＥＲ２抗体を同定するために、ＨＥＲ２を過剰発現するガン細胞の成長を阻害する抗体についてスクリーニングすることができる。一態様では、えり抜きの成長阻害性抗体は、細胞培養におけるＳＫ−ＢＲ−３細胞の成長を、約０．５から３０μg/mlの抗体濃度で約２０〜１００％、好ましくは約５０〜１００％阻害することができる。当該抗体を同定するために、米国特許第５，６７７，１７１号に記載されているＳＫ−ＢＲ−３アッセイを行うことができる。このアッセイによると、ＳＫ−ＢＲ−３細胞を、１０％ウシ胎仔血清、グルタミン、およびペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＦ１２とＤＭＥＭ培地との１：１混合物中で成長させる。ＳＫ−ＢＲ−３細胞を、３５mmの細胞培養皿に細胞２００００個（３５mmの皿に２ml）で蒔く。皿１枚あたり０．５から３０μg/mlのＨＥＲ２抗体を添加する。６日後に、未処理の細胞と比較した細胞数を、電子ＣＯＵＬＴＥＲ（商標）細胞計数機を用いて計数する。ＳＫ−ＢＲ−３細胞の成長を約２０〜１００％または約５０〜１００％阻害する抗体を、成長阻害抗体として選択することができる。４Ｄ５および３Ｅ８などの成長阻害抗体についてスクリーニングするアッセイに関しては、米国特許第５，６７７，１７１号を参照されたい。
【０２６０】
アポトーシスを誘導する抗体を選択するために、ＢＴ４７４細胞を用いたアネキシン結合アッセイを利用できる。ＢＴ４７４細胞を培養して、前項に論じたように皿に接種する。次に、培地を取り除き、新鮮培地単独または１０μg/mlのモノクローナル抗体を含有する培地に交換する。３日間のインキュベーション期間の後に、単層をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理により剥離する。次に、細胞を遠心分離して、Ｃａ２＋結合緩衝液に再懸濁して、細胞死アッセイについて上に論じたように試験管に分取する。次に、試験管にラベルしたアネキシン（例えばアネキシンＶ-ＦＴＩＣ）（１μg/ml）を入れる。ＦＡＣＳＣＡＮ（商標）フローサイトメータおよびＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ（商標）ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Becton Dickinson）を使用して試料を分析できる。対照に比べて統計的に有意なレベルのアネキシン結合を誘導する抗体を、アポトーシス誘導抗体として選択する。アネキシン結合アッセイに追加して、ＢＴ４７４細胞を使用したＤＮＡ染色アッセイを利用することができる。このアッセイを行うために、前の２項に記載されたように関心対象の抗体で処理されたＢＴ４７４細胞を、９μg/mlのＨＯＥＣＨＳＴ３３３４２（商標）と共に３７℃で２時間インキュベーションし、次に、ＥＰＩＣＳ  ＥＬＩＴＥ（商標）フローサイトメータ（Coulter Corporation）でＭＯＤＦＩＴ  ＬＴ（商標）ソフトウェア（Verity Software House）を使用して分析する。このアッセイを使用して、未処理細胞（最大１００％のアポトーシス細胞）よりも２倍以上（好ましくは３倍以上）というアポトーシス細胞率の変化を誘導する抗体を、アポトーシス促進性抗体として選択することができる。７Ｃ２および７Ｆ３などの、アポトーシスを誘導する抗体についてスクリーニングするためのアッセイに関してはＷＯ９８／１７７９７を参照されたい。
【０２６１】
関心対象の抗体によって結合されるＨＥＲ２上のエピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されているような日常的な交差遮断アッセイを実施して、その抗体が２Ｃ４またはパーツズマブなどの抗体がＨＥＲ２に結合するのを交差遮断するかどうかを評定することができる。または、もしくは追加的に、当技術分野で公知の方法によってエピトープマッピングを行うことができ、かつ／または抗体−ＨＥＲ２構造を研究して（Franklin et al. Cancer Cell 5: 317-328 (2004)）ＨＥＲ２のどのドメインがその抗体によって結合されるかを知ることができる。
【０２６２】
（ｉｘ）パーツズマブ組成物
一態様では、ＨＥＲ２抗体組成物は主要種パーツズマブ抗体とその一つまたは複数の変異体との混合物を含む。本明細書におけるパーツズマブ主要種抗体の好ましい態様は、配列番号３および４の可変軽鎖および可変重鎖アミノ酸配列を含む抗体であり、最も好ましくは配列番号１３および１７より選択される軽鎖アミノ酸配列と、配列番号１４および１８より選択される重鎖アミノ酸配列（これらの配列の脱アミド化および／または酸化変異体を含む）とを含む抗体である。一態様では、この組成物は主要種パーツズマブ抗体と、アミノ末端リーダー伸長を含むそのアミノ酸配列変異体との混合物を含む。好ましくは、アミノ末端リーダー伸長は抗体変異体の軽鎖上（例えば抗体変異体の１本または２本の軽鎖上）に存在する。主要種ＨＥＲ２抗体または抗体変異体は全長抗体または抗体フラグメント（例えばＦ（ａｂ’）２フラグメントのＦａｂ）のことがあるが、好ましくは両方が全長抗体である。本明細書における抗体変異体は、その任意の一つまたは複数の重鎖または軽鎖上にアミノ末端リーダー伸長を含むことがある。好ましくは、アミノ末端リーダー伸長は、抗体の１本または２本の軽鎖上に存在する。アミノ末端リーダー伸長は、好ましくはＶＨＳ−を含むか、またはそれからなる。非限定的にＮ末端配列解析、電荷不均一性についてのアッセイ（例えば陽イオン交換クロマトグラフィーまたはキャピラリーゾーン電気泳動）、質量分析などを含めた様々な分析技法により、組成物中のアミノ末端リーダー伸長の存在を検出することができる。組成物中の抗体変異体の量は、一般的にその変異体を検出するために使用される任意のアッセイ（好ましくはＮ末端配列解析）の検出限界を構成する量から、主要種抗体の量未満の量までの範囲である。一般的に、組成物中の抗体分子の約２０％以下（例えば約１％から約１５％、例えば５％から約１５％）は、アミノ末端リーダー伸長を含む。そのようなパーセント量は、好ましくは定量的Ｎ末端配列解析または陽イオン交換分析を使用して（好ましくは、ＰＲＯＰＡＣ  ＷＣＸ−１０（商標）陽イオン交換カラムなどの高分解能弱陽イオン交換カラムを使用して）決定される。アミノ末端リーダー伸長変異体の他に、主要種抗体および／または変異体のさらなるアミノ酸配列の変更が考えられており、それらには一つまたは両方の重鎖にＣ末端リシン残基を含む抗体、脱アミド化抗体変異体などが非限定的に含まれる。
【０２６３】
さらに、主要種抗体または変異体は、さらにグリコシル化変異を含むことがあり、その非限定的な例には、Ｆｃ部に付着したＧ１もしくはＧ２オリゴ糖構造を含む抗体、軽鎖に付着した糖質部分（例えば、抗体の１本もしくは２本の軽鎖に付着した、例えば一つもしくは複数のリシン残基に付着したグルコースもしくはガラクトースなどの一つもしくは二つの糖質部分）を含む抗体、１本もしくは２本の非グリコシル化重鎖を含む抗体、または１本もしくは２本の重鎖に付着したシアリデート化（sialidated）オリゴ糖を含む抗体などがある。
【０２６４】
この組成物を、遺伝子操作された細胞系、例えばＨＥＲ２抗体を発現しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系から回収することができ、またペプチド合成により調製することができる。
【０２６５】
（ｘ）免疫コンジュゲート
本発明は、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の小分子毒素または酵素活性毒素であって、そのフラグメントおよび／もしくは変異体を含む）、または放射性同位体（すなわち放射性コンジュゲート）などの細胞毒性薬にコンジュゲーションされた抗体を含む免疫コンジュゲートにも関するものである。
【０２６６】
当該免疫コンジュゲートの作成に有用な化学療法剤は上に記載されている。抗体と、カリケアミシン、メイタンシン（米国特許第５，２０８，０２０号）、トリコテン（trichothene）、およびＣＣ１０６５などの一つまたは複数の小分子毒素とのコンジュゲートも本明細書において考えられている。
【０２６７】
本発明の好ましい一態様では、抗体は、一つまたは複数のメイタンシン分子（例えば、抗体１分子あたり約１から約１０個のメイタンシン分子）とコンジュゲーションされる。メイタンシンを、例えばＭａｙ−ＳＳ−Ｍｅに変換することができ、それをＭａｙ−ＳＨ３に還元して改変抗体と反応させ（Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)）、メイタンシノイド−抗体免疫コンジュゲートを作成することができる。
【０２６８】
別の関心対象の免疫コンジュゲートは、一つまたは複数のカリケアミシン分子とコンジュゲーションされた抗体を含む。カリケアミシンファミリーの抗生物質は、サブピコモル濃度で２本鎖ＤＮＡ切断を産生することができる。使用されうるカリケアミシンの構造アナログには、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ、およびθＩ１（Hinman et al. Cancer Research 53: 3336-3342 (1993)およびLode et al. Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)）があるが、それに限定されるわけではない。参照により本明細書に特に組み入れられる米国特許第５，７１４，５８６号；第５，７１２，３７４号；第５，２６４，５８６号；および第５，７７３，００１号も参照されたい。
【０２６９】
使用することができる酵素活性毒素およびそのフラグメントには、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Pseudomonas aeruginosa由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（modeccin）Ａ鎖、アルファ−サルシン（sarcin）、Aleurites fordiiタンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、Phytolaca americanaタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ-Ｓ）、momordica charantia阻害剤、クルシン、クロチン、sapaonaria officinalis阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）、およびトリコテセンがある。例えば、１９９３年１０月２８日に公開されたＷＯ９３／２１２３２を参照されたい。
【０２７０】
本発明は、抗体と核分解活性を有する化合物（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）などのリボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ）との間に形成される免疫コンジュゲートをさらに考えている。
【０２７１】
放射性コンジュゲーションされたＨＥＲ２抗体の産生に種々の放射性同位体を利用できる。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、およびＬｕの放射性同位体がある。
【０２７２】
抗体と細胞毒性薬とのコンジュゲートを、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジポイミデートＨＣＬなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トリエン（tolyene）−２，６−ジイソシアネートなど）、および二活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）のような多様な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作成することができる。例えば、Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987)に記載されているように、リシン免疫毒素を調製することができる。炭素１４でラベルされた１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲーションするための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。リンカーは、細胞内で細胞毒性薬物の放出を容易にする「開裂可能なリンカー」でありうる。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)）を使用することができる。
【０２７３】
または、その抗体および細胞毒性薬を含む融合タンパク質を、例えばリコンビナント技法またはペプチド合成によって作成することができる。
【０２７４】
その他の免疫コンジュゲートが本明細書において考えられている。例えば、多様な非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーのうちの一つに抗体を連結することができる。例えばコアセルベーション技法もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルもしくはゼラチンマイクロカプセルおよびポリメタクリル酸メチルマイクロカプセル）に、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）に、またはマクロエマルションに、抗体を捕捉することもできる。このような技法は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)に開示されている。
【０２７５】
本明細書において開示された抗体を、免疫リポソームとして処方することもできる。抗体を有するリポソームを、Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688 (1985)；Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77: 4030 (1980)；米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号；ならびに１９９７年１０月２３日に公開されたＷＯ９７／３８７３１に記載されているような、当技術分野で公知の方法により調製する。循環時間が高まったリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０２７６】
特に有用なリポソームを、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ−誘導化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって作成することができる。所定の孔径のフィルターを通過させてリポソームを押出して、所望の直径を有するリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントを、ジスルフィド交換反応を介して、Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているようにリポソームにコンジュゲーションすることができる。場合により、化学療法剤がリポソーム内に包含される。Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)を参照されたい。
【０２７７】
ＩＶ．薬学的製剤
本発明により使用される抗体の治療用製剤は、所望の純度を有する抗体を、任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）と、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で混合することによって、保存用に調製される。許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、採用される投薬量および濃度でレシピエントに対して無毒性であり、これらには、リン酸塩、クエン酸塩、およびその他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコール、またはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含めた単糖類、二糖類、およびその他の糖質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン界面活性剤がある。凍結乾燥抗体製剤は、参照により本明細書に特に組み入れられるＷＯ９７／０４８０１に記載されている。治療用途に好ましいパーツズマブ製剤は、２０mM酢酸ヒスチジン、１２０mMスクロース、０．０２％ポリソルベート２０（ｐＨ６．０）中に３０mg/mLパーツズマブを含む。代替のパーツズマブ製剤は、２５mg/mLパーツズマブ、１０mMヒスチジンＨＣｌ緩衝液、２４０mMスクロース、０．０２％ポリソルベート２０（ｐＨ６．０）を含む。
【０２７８】
本明細書における製剤は、処置される特定の適応に必要な一つを超える活性化合物、好ましくは相互に有害な影響を及ぼさない相補的活性を有する化合物も含有することがある。ＨＥＲ阻害剤と組合せることのできる様々な薬物は下記の処置方法の節に記載されている。そのような分子は、好適には、意図された目的に有効な量で組合されて存在する。
【０２７９】
例えばコアセルベーション技法もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルもしくはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリメタクリル酸メチルマイクロカプセルに、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）に、またはマクロエマルションに、活性成分を捕捉することもできる。このような技法はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed.,(1980)に開示されている。
【０２８０】
持続性放出製剤を調製することができる。持続性放出製剤の適切な例には、抗体を含有する固体疎水性重合体の半透過性マトリックスがあり、このマトリックスは、造形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続性放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、またはポリビニルアルコール、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸とのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なミクロスフェア）などの分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸がある。
【０２８１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために使用される製剤は無菌でなければならない。これは、無菌濾過膜を通して濾過することにより容易に実現される。
【０２８２】
Ｖ．ＨＥＲ阻害剤を用いた処置
上に言及したような発現プロファイルを有する患者は、パーツズマブなどのＨＥＲ阻害剤を用いた治療の候補である。処置されうる様々なガンの例を上の定義の節に挙げる。この方法は、卵巣ガン、腹膜ガン、または卵管ガン；転移性乳ガン（ＭＢＣ）、非ＨＥＲ２過剰発現乳ガンを含めた乳ガン；および非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）の治療に特に適用することができるとみなされる。一態様では、処置されるガンは化学療法剤耐性ガンまたはプラチナ耐性ガンである。発現プロファイルを有する患者の処置は、ガンの徴候または症状の改善を招くであろう。例えば、そのような治療は、その発現プロファイルを有さない患者に比べて生存（全生存および／または無増悪生存）の改善を招くことができ、かつ／または客観的臨床奏効（部分または完全奏効）を招くことができる。
【０２８３】
ガンの他に、ＨＥＲ阻害剤を使用して、上に言及した発現プロファイルを有する様々な非悪性疾患または障害を処置することができる。当該非悪性疾患または障害には、自己免疫疾患（例えば乾癬、上記定義参照）；子宮内膜症；強皮症；再狭窄；結腸ポリープ、鼻ポリープ、または胃腸管ポリープなどのポリープ；線維腺腫；呼吸器疾患（上記定義参照）；胆嚢炎；神経線維腫症；多発性嚢胞腎；炎症性疾患；乾癬および皮膚炎を含む皮膚障害；血管疾患（上記定義参照）；血管上皮細胞の異常増殖を伴う状態；胃腸潰瘍；メネトリエー病、分泌性腺腫またはタンパク喪失症候群；腎障害；血管形成障害；加齢黄斑変性、推定眼ヒストプラスマ症候群、増殖糖尿病網膜症による網膜血管新生、網膜血管形成、糖尿病性網膜症、または加齢黄斑変性などの眼疾患；骨関節炎、くる病、および骨粗しょう症などの骨関連病態；脳虚血イベント後の損傷；肝硬変、肺線維症、サルコイドーシス、甲状腺炎、全身性過粘稠度症候群、オースラーウェーバー−ランデュ病、慢性閉塞性肺疾患、または熱傷、外傷、放射線、脳卒中、酸素欠乏症、もしくは虚血後の浮腫などの線維疾患または浮腫疾患；皮膚過敏反応；糖尿病性網膜症および糖尿病性ネフロパシー；ギラン−バレー症候群；移植片対宿主疾患または移植拒絶反応；ページェット病；骨または関節の炎症；光老化（例えばヒト皮膚のＵＶ照射により起こる）；良性前立腺肥大；アデノウイルス、ハンタウイルス、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐｐ．およびＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓより選択される微生物病原体を含めた、ある種の微生物感染；血小板凝集により起こる血栓；子宮内膜症、卵巣過剰刺激症候群、子癇前症、機能不全性子宮出血、または機能性子宮出血などの生殖器の状態；滑膜炎；アテローム；急性および慢性ネフロパシー（増殖性糸球体腎炎および糖尿病誘導腎疾患を含む）；湿疹；肥厚性瘢痕形成；内毒素性ショックおよび真菌感染；家族性腺腫ポリポーシス；神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、エイズ関連認知症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、脊髄性筋萎縮症、および小脳変性）；骨髄異形成症候群；再生不良性貧血；虚血傷害；肺、腎臓、または肝臓の線維症；Ｔ細胞媒介過敏性疾患；乳児肥大型幽門狭窄症；尿管閉塞症候群；乾癬性関節炎；ならびに橋本甲状腺炎がある。本明細書における治療のための好ましい非悪性適応には、乾癬、子宮内膜症、強皮症、血管疾患（例えば、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、もしくは高血圧症）、結腸ポリープ、線維腺腫、または呼吸器疾患（例えば、喘息、慢性気管支炎、気管支拡張、もしくは嚢胞性線維症）がある。
【０２８４】
好ましくは、投与される抗体はネイキッドな抗体である。しかし、投与される抗体を細胞毒性薬とコンジュゲーションすることができる。好ましくは、その細胞毒性薬が結合している免疫コンジュゲートおよび／または抗原は、細胞によってインターナリゼーションされ、その免疫コンジュゲートが結合するガン細胞の殺滅に及ぼすその免疫コンジュゲートの治療有効性の増大を招く。好ましい態様では、細胞毒性薬はガン細胞中の核酸をターゲティングまたは妨害する。当該細胞毒性薬の例には、メイタンシノイド、カリケアミシン、リボヌクレアーゼ、およびＤＮＡエンドヌクレアーゼがある。
【０２８５】
ＨＥＲ２阻害剤は、例えばボーラスとしての、もしくはある時間にわたる連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、動脈内、滑膜内、鞘内、経口、局所、または吸入経路などの公知の方法により、ヒト患者に投与される。抗体の静脈内投与が好ましい。
【０２８６】
疾患の予防または処置のためのＨＥＲ阻害剤の適切な投薬量は、上に定義されたような処置される疾患の型、疾患の重症度および経過、その薬物が予防または治療目的のために投与されるかどうか、以前の治療、患者の臨床歴およびその薬物に対する応答、ならびに担当の医師の判断に依存するであろう。ＨＥＲ阻害剤は一度にまたは一連の処置にわたり患者に適切に投与される。疾患の型および重症度に応じて、約１μg/kgから５０mg/kg（例えば０．１〜２０mg/kg）のＨＥＲ阻害剤が、患者に対する投与の候補となる初期投薬量であり、それは例えば１回もしくは複数回の個別の投与、または連続注入のいずれかによる。ＨＥＲ抗体の好ましい投薬量は、約０．０５mg/kgから約１０mg/kgの範囲内であろう。このように、約０．５mg/kg、２．０mg/kg、４．０mg/kg、または１０mg/kgの１回または複数回の用量（またはその任意の組合せ）を患者に投与することができる。（患者がＨＥＲ抗体の約２から約２０回、例えば約６回の投与を受けるように）間欠的、例えば毎週または３週間毎に当該用量を投与することができる。初回の高いローディング用量の後で、１回または複数回の低用量を投与することができる。一態様では、ＨＥＲ抗体を約８４０mgのローディング用量として投与し、続いて約４２０mgを約３週間毎に投与する。別の態様では、約３週間毎に投与される約１０５０mgの用量として、ＨＥＲ抗体を投与する。
【０２８７】
疾患がガンの場合、患者は、好ましくはＨＥＲ阻害剤と一つまたは複数の化学療法剤との組合せで処置される。好ましくは、少なくとも一つの化学療法剤はゲムシタビンなどの代謝拮抗化学療法剤である。組合せ投与には別々の製剤または単一の薬学的製剤を使用した同時投与または併行投与、およびいずれかの順序の連続投与があり、ここで、好ましくは両方の（または全ての）活性薬剤がそれらの生物学的活性を同時に発揮する期間が存在する。このように、代謝拮抗化学療法剤を、ＨＥＲ阻害剤の投与前または投与後に投与することができる。本態様では、代謝拮抗化学療法剤の少なくとも１回の投与と、ＨＥＲ阻害剤の少なくとも１回の投与との間のタイミングは、好ましくは約１か月以内であり、最も好ましくは約２週間以内である。または、代謝拮抗化学療法剤およびＨＥＲ阻害剤を単一の製剤または別々の製剤として患者に同時投与する。化学療法剤（例えばゲムシタビンなどの代謝拮抗化学療法剤）およびＨＥＲ阻害剤（例えばパーツズマブ）の組合せを用いた処置により、患者に対して相乗的な、または相加的よりも大きい治療上の利益が生じうる。
【０２８８】
代謝拮抗化学療法剤は、投与されるならば、それについての公知の投薬量で通常投与されるか、または代謝拮抗化学療法剤の投与に原因があるとされる薬物の組合せ作用または負の副作用が原因で場合により減量される。当該化学療法剤のための製剤および投薬スケジュールを製造業者の説明書により、または当業者により経験的に決定されたように使用することができる。代謝拮抗化学療法剤がゲムシタビンである場合、好ましくは、ゲムシタビンは約６００mg/m2から１２５０mg/m2の間（例えば約１０００mg/m2）の用量で、例えば３週間サイクルの１日目および８日目に投与される。
【０２８９】
ＨＥＲ阻害剤および代謝拮抗化学療法剤の他に、他の治療方式をそれに組合せることができる。例えば、第２（第３、第４など）の化学療法剤を投与することができ、ここで、第２化学療法剤は、別の異なる代謝拮抗化学療法剤または代謝拮抗物質ではない化学療法剤のいずれかである。例えば、第２化学療法剤は、(パクリタキセルもしくはドセタキセルなどの）タキサン、カペシタビン、またはプラチナ系化学療法剤（カルボプラチン、シスプラチン、またはオキサリプラチンなど）、アントラサイクリン（リポソームドキソルビシンを含めたドキソルビシンなど）、トポテカン、ペメトレキセド、ビンカアルカロイド（ビノレルビンなど）、およびＴＬＫ２８６でありうる。異なる化学療法剤の「カクテル」を投与してもよい。
【０２９０】
ＨＥＲ２抗体と組合せることができるその他の治療剤には、第２の異なるＨＥＲ阻害剤（例えば、トラスツズマブなどの成長阻害性ＨＥＲ２抗体、またはＨＥＲ２過剰発現細胞のアポトーシスを誘導する、７Ｃ２、７Ｆ３、もしくはそのヒト化変異体などのＨＥＲ２抗体）；ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４などの異なる腫瘍関連抗原に対する抗体；抗ホルモン化合物、例えばタモキシフェンなどの抗エストロゲン化合物、またはアロマターゼ阻害剤；（治療に関連する任意の心筋機能不全を阻止または低減するための）心臓保護剤；サイトカイン；ＥＧＦＲターゲット薬（TARCEVA（登録商標）、IRESSA（登録商標）、またはセツキシマブなど）；抗血管形成剤（特にAVASTIN（商標）の商標でGenentechによって販売されているベバシズマブ）；チロシンキナーゼ阻害剤；ＣＯＸ阻害剤（例えばＣＯＸ−１阻害剤またはＣＯＸ−２阻害剤）；非ステロイド系抗炎症薬であるセレコキシブ（CELEBREX（登録商標））；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、Johnson and Johnsonから入手できるチピファルニブ（Tipifarnib）／ZARNESTRA（登録商標）Ｒ１１５７７７、またはSchering-Ploughから入手できるロナファルニブ（Lonafarnib）ＳＣＨ６６３３６）；オレゴボマブ（Oregovomab）（ＭｏＡｂ  Ｂ４３．１３）などの、ガン胎児タンパク質ＣＡ１２５と結合する抗体；ＨＥＲ２ワクチン（PharmexiaからのＨＥＲ２ AutoVacワクチン、またはDendreonからのＡＰＣ８０２４タンパク質ワクチン、またはGSK/CorixaからのＨＥＲ２ペプチドワクチン）；別のＨＥＲターゲティング療法（例えば、トラスツズマブ、セツキシマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ＣＩ１０３３、ＧＷ２０１６など）；Ｒａｆおよび／またはｒａｓ阻害剤（例えばＷＯ２００３／８６４６７参照）；ドキシル；トペテカン（Topetecan）；タキサン；ＧＷ５７２０１６；ＴＬＫ２８６；ＥＭＤ−７２００；セロトニン拮抗薬、ステロイド、またはベンゾジアゼピンなどの、悪心を処置する薬；局所もしくは経口抗生物質を含めた、皮疹を予防もしくは処置する薬、または標準的なざ瘡治療法；アセトアミノフェン、ジフェンヒドラミン、またはメペリジンなどの解熱薬；造血成長因子などのうち任意の一つまたは複数が含まれる。
【０２９１】
同時投与された任意の上記薬剤についての適切な投薬量は、現在使用されている投薬量であり、その薬剤およびＨＥＲ阻害剤の組合せ作用（相乗作用）が原因でその投薬量を減量することができる。
【０２９２】
上記治療方式以外に、ガン細胞の外科的除去および／または放射線療法に患者を供することができる。
【０２９３】
患者への抗体タンパク質の投与の他に、本出願は、遺伝子療法による抗体またはタンパク質阻害剤の投与を考えている。例えば、１９９６年３月１４日に公開された、細胞内抗体を作成するための遺伝子療法の使用に関するＷＯ９６／０７３２１を参照されたい。
【０２９４】
（場合によりベクターに含まれる）核酸を患者の細胞内にｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏで至らせるために、二つの主なアプローチがある。ｉｎ  ｖｉｖｏ送達のために、患者に直接、通常はその抗体が必要とされる部位に核酸を注射する。ｅｘ  ｖｉｖｏ処置のために、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入して、改変された細胞をその患者に直接投与するか、または例えば多孔性膜内に封入して、その多孔性膜をその患者に植込む（例えば米国特許第４，８９２，５３８号および第５，２８３，１８７号参照）かのいずれかとする。生存可能な細胞に核酸を導入するために利用できる様々な技法がある。これらの技法は、核酸が培養細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで、または意図された宿主の細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで導入されるかどうかに応じて変動する。哺乳動物細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで核酸を導入するのに適した技法には、リポソームの使用、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などがある。遺伝子のｅｘ  ｖｉｖｏ送達用に通例使用されているベクターはレトロウイルスである。
【０２９５】
現在好ましいｉｎ  ｖｉｖｏ核酸導入技法には、（アデノウイルス、Herpes simplex Iウイルス、またはアデノ随伴ウイルスなどの）ウイルスベクターおよび脂質に基づく系を用いたトランスフェクションがある（遺伝子の脂質介在性導入に有用な脂質は、例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、およびＤＣ−Ｃｈｏｌである）。いくつかの状況では、核酸の供給源に、細胞表面膜タンパク質またはターゲット細胞に特異的な抗体、ターゲット細胞上のレセプターに対するリガンドなどの、ターゲット細胞をターゲティングする薬剤を提供することが理想的である。リポソームが採用された場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型に親和性のキャプシドタンパク質またはそのフラグメント、サイクリングにおいてインターナリゼーションを受けるタンパク質に対する抗体、および細胞内局在をターゲティングして細胞内半減期を高めるタンパク質を、ターゲティングに、および／または取込みを促進するために使用することができる。レセプター介在性エンドサイトーシスの技法は、例えば、Wu et al., J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987)；およびWagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3410-3414 (1990)に記載されている。現在公知の遺伝子マーカー作成および遺伝子治療プロトコールの総説については、Anderson et al., Science 256: 808-813 (1992)を参照されたい。ＷＯ９３／２５６７３および本明細書に引用された参考文献も参照されたい。
【０２９６】
ＶＩ．材料の寄託
以下のハイブリドーマ細胞系は、American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA  （ＡＴＣＣ）に寄託された:
抗体の名称    ＡＴＣＣ番号                  寄託日
７Ｃ２        ＡＴＣＣ  ＨＢ−１２２１５    １９９６年１０月１７日
７Ｆ３        ＡＴＣＣ  ＨＢ−１２２１６    １９９６年１０月１７日
４Ｄ５        ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１０４６３    １９９０年５月２４日
２Ｃ４        ＡＴＣＣ  ＨＢ−１２６９７    １９９９年４月８日
【０２９７】
本発明のさらなる詳細は、以下の非限定的な実施例によって例示される。本明細書における全ての引用の開示は、参照により本明細書に特に組み入れられる。
【０２９８】
実施例１
ＨＥＲ２リン酸化に関連する遺伝子発現プロファイル
選択された遺伝子のサブセットについてＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（登録商標）マイクロアレイ解析を使用して、パーツズマブで処置された卵巣ガン患者由来の新鮮卵巣腫瘍検体を遺伝子発現についてプロファイリングした。ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（登録商標）マイクロアレイ解析を製造業者の説明書に従って行った。
【０２９９】
マイクロアレイ発現データを解析して、ＨＥＲ２リン酸化状態に関連するであろう遺伝子パターンを同定した。顕著には、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およびＨＥＲリガンドであるベータセルリンの比較的高レベルの発現を有する腫瘍は、ＨＥＲ２リン酸化についても陽性であるパターンが現れた。図１０は、前記遺伝子を用いた腫瘍の教師なしクラスタリングの結果として、６個のリン酸化陽性腫瘍のうち６個が一緒にクラスタリングしたことを示す。図１１は、中央値以上にベータセルリンおよびＨＥＲ２発現を有し、かつ／または中央値以上にＥＧＦＲおよび／もしくはＨＥＲ３発現を有する試料が陽性と予測されるアルゴリズムを使用することにより、卵巣腫瘍のリン酸化状態を予測することができることを示す。そのアルゴリズムの基礎としてマイクロアレイ発現データを使用して、ＨＥＲ２リン酸化陽性６例のうち６例で相関は陽性であり、ＨＥＲ２リン酸化陰性例のうち１例も陽性と予測されなかった。
【０３００】
第２の分析では、単一遺伝子だけ、すなわちベータセルリンを使用することによりＨＥＲ２リン酸化状態の予測を実現した。図１２は、再びマイクロアレイ発現データを使用して合計６個のＨＥＲ２リン酸化陽性腫瘍が中央値を超えるベータセルリン発現を有したことを示す。
【０３０１】
実施例２
遺伝子発現を測定するためのマイクロアレイ解析およびｑＲＴ−ＰＣＲの比較
この実施例では、遺伝子発現を定量するための２番目の方法である定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用してマイクロアレイデータを確認し、それをマイクロアレイデータと比較した。ｑＲＴ−ＰＣＲは、臨床環境で入手できる典型的な患者試料中の遺伝子発現を測定するための好ましい方法であろう。この方法についての診断技法のプラットフォームは、すでに確立されている。
【０３０２】
ｑＲＴ−ＰＣＲを、Cronin et al., Am. J. Pathol. 164(1): 35-42 (2004)；およびMa et al., Cancer Cell 5: 607-616 (2004)に記載されているように行った。Qiagen, Valencia, Californiaから市販されている試薬を使用して凍結卵巣腫瘍からＲＮＡを抽出した。ＴＡＱＭＡＮ（商標）ｑＲＴ−ＰＣＲ解析用のプライマーおよびプローブを設計して、約１００塩基以下のアンプリコン長を得た。ＴＡＱＭＡＮ（商標）装置（Applied BioSystems）を使用したｑＲＴ−ＰＣＲにより転写体を定量し、被験遺伝子の発現レベルを参照遺伝子のレベルに対して基準化した。図１３は、確立されたｑＲＴ−ＰＣＲアッセイの基本的特徴を示す。変動性が低く発現が高いことから、「ハウスキーピング」遺伝子であるＧＵＳを対照遺伝子として選択した。
【０３０３】
マイクロアレイ測定を最初に確認するために、ｑＲＴ−ＰＣＲの結果をマイクロアレイにより得られた結果と比較して、密接な相関が存在するかどうかを評価し、この代替法によってもＨＥＲ２リン酸化を予測できるかどうかを決定した。上に論じた遺伝子の全ての比較に関して、良好な相関が実現された。
【０３０４】
図１４は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびベータセルリンを有する腫瘍の教師なしクラスタリングを示す。ｑＲＴ−ＰＣＲデータを使用して６個のリン酸化陽性腫瘍のうち５個が一緒にクラスタリングした。
【０３０５】
図１５は、ベータセルリンおよびＨＥＲ２の発現を中央値以上に有し、かつ／またはＥＧＦＲおよび／もしくはＨＥＲ３の発現を中央値以上に有する試料が陽性と予測されるアルゴリズムを使用することにより、卵巣腫瘍のリン酸化状態を予測できることを示す。ＨＥＲ２リン酸化陽性６例のうち４例で相関は陽性であった。アルゴリズムの基礎としてｑＲＴ−ＰＣＲ発現データを使用して、ＨＥＲ２リン酸化陰性１９例のうち５例だけが陽性と予測された。
【０３０６】
図１６に示された第２の分析では、単一の遺伝子のみ、すなわちベータセルリンを使用してＨＥＲ２リン酸化状態の予測が実現された。この図に示すように、再びｑＲＴ−ＰＣＲ発現データを使用して、ＨＥＲ２リン酸化陽性腫瘍６個のうち５個が中央値を超えるベータセルリン発現を有した。
【０３０７】
さらなるＨＥＲリガンド、すなわちエピレグリン、アンフィレグリン、およびＴＧＦ−アルファを評価することにより、ＨＥＲ２リン酸化状態との相関においてベータセルリンと同様の有用性を有する第２のリガンドとして、アンフィレグリンが同定された。図１７を参照されたい。
【０３０８】
実施例３
ＨＥＲ２リン酸化に関連する遺伝子発現プロファイルを有する患者の治療
上記実施例１および２は、ＨＥＲ２リン酸化の代用として遺伝子発現プロファイルを使用することができることを実証している。この実施例では、ＨＥＲ２リン酸化に関連する特異的遺伝子発現プロファイルを有する腫瘍を有する患者を、ＨＥＲ阻害剤であるパーツズマブで処置する。
【０３０９】
ｑＲＴ−ＰＣＲを、Cronin et al., Am. J. Pathol. 164(1): 35-42 (2004)；およびMa et al., Cancer Cell 5: 607-616 (2004)に記載されているように行う。Qiagen, Valencia, Californiaから市販されている試薬を使用して凍結卵巣腫瘍からＲＮＡを抽出する。ＴＡＱＭＡＮ（商標）ｑＲＴ−ＰＣＲ解析用のプライマーおよびプローブを設計して、約１００塩基以下のアンプリコン長を得る。ＴＡＱＭＡＮ（商標）装置（Applied BioSystems）を使用したｑＲＴ−ＰＣＲにより転写体を定量し、被験遺伝子の発現レベルを参照遺伝子のレベルに対して基準化する。
【０３１０】
ＥＬＩＳＡにより公知のＨＥＲ２リン酸化状態を有する実施例１および２における腫瘍の遺伝子発現プロファイリングデータに基づいてアルゴリズムを開発した。ベータセルリンもしくはアンフィレグリンとＨＥＲ２との発現を中央値以上に有し、かつ／またはＥＧＦＲおよび／もしくはＨＥＲ３の発現を中央値以上に有するＨＥＲ２リン酸化に関連する腫瘍は、遺伝子発現プロファイルについて陽性とみなされる。または、ベータセルリンまたはアンフィレグリン単独の発現をｑＲＴ−ＰＣＲにより測定して、予測されたＨＥＲ２リン酸化を有する腫瘍を同定することができる。
【０３１１】
プラチナ系化学療法方式を受けている間に進行した患者、またはプラチナ系方式が完了してから６か月以内に進行した患者がこの研究に適格であろう。患者を無作為化して、パーツズマブと組合せたゲムシタビン、またはプラセボと組合せたゲムシタビンのいずれかの投与を行う。
【０３１２】
２１日のサイクルの１日目および８日目に１０００mg/m2で、最大８サイクルの間ゲムシタビンを投与する。ゲムシタビンを最初に３０分間かけて注入する。毒性に関して用量低減を許可する。２１日のサイクルの１日目にプラセボまたはパーツズマブを投与する。パーツズマブの投与を受けるように無作為化された被験者に初回ローディング用量８４０mg（サイクル１）に続いてサイクル２以降に４２０mgを投与する。プラセボの投与を受けるように無作為化された被験者に、サイクル１およびサイクル２以降についてパーツズマブ群で投与したのと同容積のプラセボを投与する。８サイクルのゲムシタビンの後で、パーツズマブまたはプラセボを追加的に最長９サイクル継続する（合計１年）。
【０３１３】
患者は、血球減少の結果としてゲムシタビンの標準用量の低減を行われ、投与を停止される。停止された任意の１日目のゲムシタビン投与について、パーツズマブもまた停止される。その後の投与は、低減した用量で行われ、増加されない。用量低減もしくは投薬停止が４回を超えて必要ならば、または投与が３週間を超えて停止されるならば、ゲムシタビンを中止し、担当の医師および医療モニターの承認を得て、疾患が増悪するまで盲験化した薬物を継続することができる。８日目のゲムシタビンの投与が停止されたならば、８日目の投与は省略され、その後の処置は次のサイクルと共に開始する（以前のサイクルの２２日目）。
【０３１４】
以下の表に推奨されるようにゲムシタビンを停止し、用量を低減する：
【０３１５】
【表２】
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【０３１６】
用量低減を必要とする任意の患者についてのその後の投与は、低減した用量で行われる。投与が血球減少の結果として３週間を超えて停止されるならば、患者は許容されない毒性を受けていると推測され、ゲムシタビンを中止する。その他の追加のグレードＩＩＩまたはＩＶの毒性がないならば、盲験化した薬物の継続は医師および医療モニターの判断次第である。ゲムシタビンの血液毒性は、投与速度と関係していた。合計用量にかかわらず、ゲムシタビンを３０分間かけて与える。ＮＣＩ−ＣＴＣグレード２血球減少に対するコロニー刺激剤の使用は、担当の医師の判断次第で使用することができる。単剤パーツズマブとのクロスオーバーの選択肢が供される。ローディング用量８４０mgを次のサイクルの期日に投与し、２１日毎のその後のサイクルで４２０mgを継続する。
【０３１７】
サイクル３、５、７、９、１３、および１７で応答を評定する。固形腫瘍効果判定基準（ＲＥＣＩＳＴ）を使用して、臨床評価およびＣＴスキャンまたは同等物により測定可能な疾患を評定する。評価可能な疾患を有する被験者についての応答を、ＣＡ−１２５に対する変化ならびに疾患の臨床的および放射線学的根拠により評定する。最初に応答を記録した４〜８週間後に応答を確認すべきである。
【０３１８】
以下の転帰尺度を評定する。
【０３１９】
主要有効性評価項目
ＲＥＣＩＳＴまたはＣＡ−１２５の変化を用いて研究者の評定によって決定された、各群の全被験者の割り付けられた研究処置開始後の無増悪生存。
【０３２０】
第２次有効性評価項目
客観的奏効（部分奏効（ＰＲ）または完全奏効（ＣＲ））
奏効期間
生存期間
４か月目での無増悪
ＦＯＳＩにより評定される症状改善までの時間
【０３２１】
可能性のある悪心および嘔吐を予防または処置するために、セロトニン拮抗薬、ステロイド、および／またはベンゾジアゼピンを患者に予備投薬することができる。可能性のある発疹を予防または処置するために、局所および／または経口抗生物質を含めた標準的なざ瘡治療法を使用できる。その他の可能性のある同時投薬は、１日目の７日前に開始して追跡期間の最終日にかけて継続する期間に被験者によって使用される、任意の処方薬または一般用医薬製剤の投薬である。輸液に関連する＞３８．５℃の発熱またはその他の輸液関連症状を経験する被験者を、アセトアミノフェン、ジフェンヒドラミン、またはメペリジンで対症的に処置することができる。非実験的造血成長因子をＮＣＩ−ＣＴＣグレード２の血球減少のために投与することができる。
【０３２２】
上記のように処置された患者は、主要有効性評価項目または第２次有効性評価項目の任意の一つまたは複数により評価された、卵巣ガン、原発性腹膜ガン、または卵管ガンの徴候または症状に改善を示すであろう。ＨＥＲ２リン酸化に関連する遺伝子発現プロファイルを有する患者は、この発現プロファイルを有さない患者に比べて、パーツズマブを用いた処置から大きい臨床上の利益を示すであろう。
【図面の簡単な説明】
【０３２３】
【図１】ＨＥＲ２タンパク質の構造の概略図、およびその細胞外ドメインのドメインＩ〜ＩＶ（それぞれ配列番号１９〜２２）に関するアミノ酸配列を提供する図である。
【図２Ａ】マウスモノクローナル抗体２Ｃ４の可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン（図２Ａ）および可変重鎖（ＶＨ）ドメイン（図２Ｂ）（それぞれ配列番号１および２）、ヒト化２Ｃ４バージョン５７４のＶＬおよびＶＨドメイン（それぞれ配列番号３および４）、ならびにヒトＶＬおよびＶＨコンセンサスフレームワーク（ｈｕｍκ１（軽鎖カッパ亜群Ｉ）；ｈｕｍＩＩＩ（重鎖亜群ＩＩＩ））（それぞれ配列番号５および６）のアミノ酸配列のアライメントを示す図である。星印はヒト化２Ｃ４バージョン５７４とマウスモノクローナル抗体２Ｃ４との間、またはヒト化２Ｃ４バージョン５７４とヒトフレームワークとの間の差を識別するものである。相補性決定部（ＣＤＲ）を括弧で囲む。
【図２Ｂ】マウスモノクローナル抗体２Ｃ４の可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン（図２Ａ）および可変重鎖（ＶＨ）ドメイン（図２Ｂ）（それぞれ配列番号１および２）、ヒト化２Ｃ４バージョン５７４のＶＬおよびＶＨドメイン（それぞれ配列番号３および４）、ならびにヒトＶＬおよびＶＨコンセンサスフレームワーク（ｈｕｍκ１（軽鎖カッパ亜群Ｉ）；ｈｕｍＩＩＩ（重鎖亜群ＩＩＩ））（それぞれ配列番号５および６）のアミノ酸配列のアライメントを示す図である。星印はヒト化２Ｃ４バージョン５７４とマウスモノクローナル抗体２Ｃ４との間、またはヒト化２Ｃ４バージョン５７４とヒトフレームワークとの間の差を識別するものである。相補性決定部（ＣＤＲ）を括弧で囲む。
【図３Ａ】パーツズマブの軽鎖および重鎖のアミノ酸配列（それぞれ配列番号１３および１４）を示す図である。ＣＤＲを太字で示す。軽鎖および重鎖の計算された分子量は、２３５２６．２２Daおよび４９２１６．５６Daである（システインは還元形態）。糖質部分は重鎖のＡｓｎ２９９に付着している。
【図３Ｂ】パーツズマブの軽鎖および重鎖のアミノ酸配列（それぞれ配列番号１３および１４）を示す図である。ＣＤＲを太字で示す。軽鎖および重鎖の計算された分子量は、２３５２６．２２Daおよび４９２１６．５６Daである（システインは還元形態）。糖質部分は重鎖のＡｓｎ２９９に付着している。
【図４】ＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位に２Ｃ４が結合することによって、活性化ＥＧＦＲまたはＨＥＲ３とのヘテロ二量体化が阻止されることを概略的に示す図である。
【図５】ＭＡＰＫ経路およびＡｋｔ経路へのＨＥＲ２／ＨＥＲ３のカップリングを示す図である。
【図６】トラスツズマブおよびパーツズマブの様々な活性を比較する図である。
【図７Ａ】トラスツズマブ軽鎖のアミノ酸配列（図７Ａ；配列番号１５）および重鎖のアミノ酸配列（図７Ｂ；配列番号１６）をそれぞれ示す図である。
【図７Ｂ】トラスツズマブ軽鎖のアミノ酸配列（図７Ａ；配列番号１５）および重鎖のアミノ酸配列（図７Ｂ；配列番号１６）をそれぞれ示す図である。
【図８Ａ】変異パーツズマブ軽鎖の配列（図８Ａ；配列番号１７）および変異パーツズマブ重鎖の配列（図８Ｂ；配列番号１８）をそれぞれ示す図である。
【図８Ｂ】変異パーツズマブ軽鎖の配列（図８Ａ；配列番号１７）および変異パーツズマブ重鎖の配列（図８Ｂ；配列番号１８）をそれぞれ示す図である。
【図９Ａ】ＩｇＧ抗体で通常観察されるオリゴ糖構造を示す図である。
【図９Ｂ】ＩｇＧ抗体で通常観察されるオリゴ糖構造を示す図である。
【図１０】ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（登録商標）マイクロアレイ発現プロファイリングにより決定されたＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、およびベータセルリンのｍＲＮＡ発現値を使用した、公知のＨＥＲ２リン酸化状態を有する卵巣ガン患者由来の腫瘍２５個の階層的クラスタリングを示す図である。
【図１１】ＨＥＲ２リン酸化状態を予測するための、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（登録商標）マイクロアレイ発現プロファイリングにより決定されたＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、およびベータセルリンのｍＲＮＡ発現の使用を示す図である。
【図１２】ＨＥＲ２リン酸化状態との、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（登録商標）マイクロアレイ発現プロファイリングにより決定されたベータセルリンｍＲＮＡ発現の相関を示す図である。
【図１３】ｑＲＴ−ＰＣＲ測定についてのアッセイ特性を示す図である。サイクル閾値（ＣＴ）は絶対的ｍＲＮＡ発現を定量する。
【図１４】ｑＲＴ−ＰＣＲにより決定されたＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、およびベータセルリンのｍＲＮＡ発現値を使用した、公知のＨＥＲ２リン酸化状態を有する卵巣ガン患者由来の腫瘍２５個の階層的クラスタリングを示す図である。
【図１５】ＨＥＲ２リン酸化状態を予測するためにｑＲＴ−ＰＣＲにより決定されたＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、およびベータセルリンのｍＲＮＡ発現の使用を示す図である。
【図１６】ＨＥＲ２リン酸化状態との、ｑＲＴ−ＰＣＲにより決定されたベータセルリンｍＲＮＡ発現の相関を示す図である。
【図１７】ＨＥＲ２リン酸化状態との、ｑＲＴ−ＰＣＲにより決定されたアンフィレグリンｍＲＮＡ発現の相関を示す図である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年1月31日(2008.1.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
「チロシンキナーゼ阻害剤」は、レセプターＨＥＲなどのチロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性を阻害する分子である。当該阻害剤の例には、前項で言及されたＥＧＦＲターゲット薬；武田から入手可能なＴＡＫ１６５などの小分子ＨＥＲ２チロシンキナーゼ阻害剤；選択的にＥＧＦＲと結合するが、ＨＥＲ２を過剰している細胞およびＥＧＦＲを過剰発現している細胞の両方を阻害するＥＫＢ−５６９（Wyethから入手できる）などの二重ＨＥＲ阻害剤；経口ＨＥＲ２およびＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤であるＧＷ５７２０１６（Glaxoから入手できる）；ＰＫＩ−１６６（Novartisから入手できる）；カネルチニブ（ＣＩ−１０３３；Pharmacia）などの汎ＨＥＲ阻害剤；Ｒａｆ−１シグナル伝達を阻害する、ISIS Pharmaceuticalsから入手できるアンチセンス剤ＩＳＩＳ−５１３２などのＲａｆ−１阻害剤；Glaxoから入手できるメシル酸イマチニブ（Gleevac（商標））などの非ＨＥＲターゲットＴＫ阻害剤；ＭＡＰＫ細胞外調節キナーゼＩ阻害剤ＣＩ−１０４０（Pharmaciaから入手できる）；ＰＤ１５３０３５、４−（３−クロロアニリノ）キナゾリンなどのキナゾリン；ピリドピリミジン；ピリミドピリミジン；ＣＧＰ５９３２６、ＣＧＰ６０２６１、およびＣＧＰ６２７０６などのピロロピリミジン；ピラゾロピリミジン、４−（フェニルアミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン；クルクミン（ジフェルロイルメタン、４，５−ビス（４−フルオロアニリノ）フタルイミド）；ニトロチオフェン部分含有チルホスチン；ＰＤ−０１８３８０５（Warner-Lamber）；アンチセンス分子（例えば、ＨＥＲをコードしている核酸に結合するもの）；キノキサリン（米国特許第５，８０４，３９６号）；トリホスチン（米国特許第５，８０４，３９６号）；ＺＤ６４７４（Astra Zeneca）；ＰＴＫ−７８７（Novartis/Schering AG）；ＣＩ−１０３３（Pfizer）などの汎ＨＥＲ阻害剤；アフィニタック（ＩＳＩＳ３５２１；Isis/Lilly）；メシル酸イマチニブ（Gleevac; Novartis）；ＰＫＩ１６６（Novartis）；ＧＷ２０１６（Glaxo SmithKline）；ＣＩ−１０３３（Pfizer）；ＥＫＢ−５６９（Wyeth）；セマキシニブ（Sugen）；ＺＤ６４７４（AstraZeneca）；ＰＴＫ−７８７（Novartis/Schering AG）；ＩＮＣ−１Ｃ１１（Imclone）；または以下の特許公報のいずれかに記載されているものがある：米国特許第５，８０４，３９６号；ＷＯ９９／０９０１６（American Cyanimid）；ＷＯ９８／４３９６０（American Cyanamid）；ＷＯ９７／３８９８３（Warner Lambert）；ＷＯ９９／０６３７８（Warner Lambert）；ＷＯ９９／０６３９６（Warner Lambert）；ＷＯ９６／３０３４７（Pfizer, Inc）；ＷＯ９６／３３９７８（Zeneca）；ＷＯ９６／３３９７９（Zeneca）；およびＷＯ９６／３３９８０（Zeneca）。
【国際調査報告】
2008523073.tif 000026
2008523073.tif 000027
2008523073.tif 000028
2008523073.tif 000029
2008523073.tif 000030
2008523073.tif 000031
2008523073.tif 000032
2008523073.tif 000033