(57)【要約】  本発明は、コンフォメーションにより識別するエピトープ（ＣＤＥｓ）を有する新規の免疫原、及び極めて密接に関連したホモログを有するタンパク質を特異的に認識する抗体の産生のための免疫化方法に関する。特に、本発明はＦｃγＲＩＩｂ又はＦｃγＲＩＩａのいずれかに特異的な抗体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然のコンフォメーションにおいてコンフォメーションにより識別するエピトープ（ＣＤＥ）を有する人工ペプチド又はポリペプチドであって、その際前記ＣＤＥが環化により構造的に安定化されている人工ペプチド又はポリペプチド。
【請求項２】
人工の及び／又はグルコシル化したアミノ酸を有する、請求項１記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項３】
担体分子にコンジュゲートされている、請求項１又は２記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項４】
ＦｃレセプターのＣＤＥを有する、請求項１から３までのいずれか１項記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項５】
ＦｃγＲＩＩｂ又はＦｃγＲＩＩａのＣＤＥを有し、前記ＣＤＥがＦｃγＲＩＩｂ又はＦｃγＲＩＩａのいずれかに特有である少なくとも１つの残基を有する、請求項４記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項６】
前記ＣＤＥが配列番号２に従ったＦｃγＲＩＩｂのアミノ酸２７〜３０、及び／又はアミノ酸１２７〜１３５、及び／又は１６０〜１７１、又は配列番号１に従ったＦｃγＲＩＩａのこの相応するアミノ酸、又は配列番号３に従ったアミノ酸を有する、請求項５記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項７】
ＦｃγＲＩＩｂ又はＦｃγＲＩＩａにコンジュゲートされている、請求項４から６までのいずれか１項記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項８】
コンフォメーションにより識別するエピトープ（ＣＤＥ）を有するペプチドを、かかるエピトープを有する関心のあるタンパク質を特異的に認識する抗体の産生のために製造するための方法であって、その際この方法が：
（ａ）関心のあるタンパク質を提供、
（ｂ）前記タンパク質上のＣＤＥを同定、
（ｃ）前記ＣＤＥの配列を有するペプチドを産生、
（ｄ）前記ＣＤＥがその天然のコンフォメーションにあるように前記ペプチドを構造的に安定化
を含む方法。
【請求項９】
前記ペプチドの環化が、擬ペプチドを形成する、システイン架橋の産生、アミノ酸側鎖の架橋により達成される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチドが、関心のあるタンパク質に存在するグリコシル化部分を有するアミノ酸を使用して産生される、請求項８又は９記載の方法。
【請求項１１】
工程：
（ｅ）前記ペプチドの、ハプテン、ポリペプチド、ペプチド及び関心のあるタンパク質から選択された担体分子へのコンジュゲート
を含む、請求項８から１０までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
請求項８から１１までのいずれか１項記載の方法により得られた、ＣＤＥを有するペプチド又はポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１から７までのいずれか１項記載のペプチド又はポリペプチドの、ＣＤＥをその天然の環境において特異的に認識する、免疫学的に調節性の物質の産生のための免疫原としての使用。
【請求項１４】
ヒトのＦｃγＲＩＩａ又はＦｃγＲＩＩｂを発現する動物又はトランスジェニック動物の免疫化のための請求項１から７までのいずれか１項記載のペプチド又はポリペプチドの使用。
【請求項１５】
１３１位のＦｃγＲＩＩａ  Ａｒｇ／Ｈｉｓ多形性又は１５５位のＦｃγＲＩＩａ  Ｖａｌ／Ｐｈｅ多形性の対立遺伝子を特異的に認識できる抗体の産生のための、請求項１から７までのいずれか１項記載のペプチド又はポリペプチドの使用。
【請求項１６】
関心のある抗原と緊密に関連した抗原とを識別することができる物質の産生方法であって、その際前記方法が、動物を請求項１から７までのいずれか１項記載のペプチド又はポリペプチドで、及び／又はＦｃγＲＩＩｂ又はＦｃγＲＩＩａに由来する正確に折りたたまれたペプチドで免疫化し、かつこの生じる抗体を単離し、かつ場合により前記抗体を組み換えの免疫学的に調節性の物質を産生するために使用することを含む方法。
【請求項１７】
請求項１から７までのいずれか１項記載のペプチド又はポリペプチドに特異的に結合する能力により特徴付けられる物質。
【請求項１８】
Ｆｃレセプターの天然の環境においてヒトのＦｃγＲＩＩｂ又はＦｃγＲＩＩａに特異的に結合する、抗体又はその断片又は誘導体。
【請求項１９】
ＦｃγＲＩＩａに対するよりもＦｃγＲＩＩｂにより高い親和性で、有利には少なくとも１０倍、より有利には少なくとも１００倍、更により有利には少なくとも１０００倍、一層有利には少なくとも１００００倍、より有利には少なくとも１０００００倍、より有利には少なくとも１００００００倍、ＦｃγＲＩＩａに対するよりもＦｃγＲＩＩｂにより高い親和性で結合する、請求項１８記載の抗体。
【請求項２０】
ＦｃγＲＩＩｂに対するよりもＦｃγＲＩＩａにより高い親和性で、有利には少なくとも１０倍、より有利には少なくとも１００倍、更により有利には少なくとも１０００倍、一層有利には少なくとも１００００倍、より有利には少なくとも１０００００倍、より有利には少なくとも１００００００倍、ＦｃγＲＩＩｂに対するよりもＦｃγＲＩＩａにより高い親和性で結合する、請求項１８記載の抗体。
【請求項２１】
ヒトのＦｃγＲＩＩｂ又はＦｃγＲＩＩａに対するＩｇＧの結合を特異的に遮断することが可能である、請求項１８、１９、又は２０のいずれか１項記載の請求項の抗体又はその断片又は誘導体。
【請求項２２】
免疫複合体がＦｃγＲＩＩｂ又はＦｃγＲＩＩａに結合することに干渉しない、請求項１８から２１までのいずれか１項記載の請求項の抗体又はその断片又は誘導体。
【請求項２３】
ヒトのＦｃγＲＩＩｂ又はＦｃγＲＩＩａの生理学的な機能を抑制することができる、請求項１８、１９、２０、又は２１記載の抗体又はその断片又は誘導体。
【請求項２４】
ヒトのＦｃγＲＩＩｂ又はＦｃγＲＩＩａの生理学的な機能を活性化することができる、請求項１８、１９、２０、又は２２記載の抗体又はその断片又は誘導体。
【請求項２５】
ヒトのＦｃγＲＩＩｂ又はＦｃγＲＩＩａに特異的に架橋することができる、請求項１８、１９、２０、２２、又は２４記載の抗体又はその断片又は誘導体。
【請求項２６】
単量体又は多量体の状態で生じる、請求項１８から２５までのいずれか１項記載の抗体又はその断片又は誘導体。
【請求項２７】
ＦｃγＲＩＩｂ又はＦｃγＲＩＩａのＣＤＥに結合することができる、請求項１８から２６までのいずれか１項記載の抗体又その断片又は誘導体。
【請求項２８】
配列番号１又は配列番号２に従ったＦｃγＲＩＩｂ又はＦｃγＲＩＩａのアミノ酸配列のアミノ酸、１２、２７、２９、３０、１０４、１２７、１３２、１３５、１６０及び１７１の少なくとも１つを有する、ヒトのＦｃγＲＩＩｂ又はＦｃγＲＩＩａのエピトープに結合することができる、請求項２７記載の抗体又はその断片又は誘導体。
【請求項２９】
配列番号１又は配列番号２に従ったＦｃγＲＩＩｂ又はＦｃγＲＩＩａのアミノ酸配列のアミノ酸２７〜３０、及び／又は１２７〜１３５、及び／又は１６０〜１７１を有する、ＦｃγＲＩＩｂ又はＦｃγＲＩＩａのエピトープに結合することができる、請求項２８記載の抗体又はその断片又は誘導体。
【請求項３０】
ＦｃγＲＩＩｂに特異的な相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するポリペプチドである、請求項１８から２９までのいずれか１項記載の抗体又はその断片又は誘導体。
【請求項３１】
配列番号５、７、９及び１１に従ったＣＤＲ配列を１つ以上有するポリペプチドである、請求項３０記載の抗体又はその断片又は誘導体。
【請求項３２】
ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＡのクラスである、請求項１８から３１までのいずれか１項記載の抗体又はその断片又は誘導体。
【請求項３３】
単鎖抗体、二官能性、及び三官能性、又は多官能性の抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆｖ断片及びｓｃｖ断片から選択される、請求項１８から３２までのいずれか１項記載の抗体又はその断片又は誘導体。
【請求項３４】
配列番号５及び７に従った抗体ＧＢ３の可変軽鎖領域及び／又は可変重鎖領域、又は特異性を有するその一部；又は配列番号９及び１１に従った抗体ＣＥ５の可変軽鎖領域及び／又は可変重鎖領域、又は特異性を有するその一部を有することを特徴とする、請求項１８から３３までのいずれか１項記載の抗体又はその一部。
【請求項３５】
請求項１から７までのいずれか１項記載のペプチドをコードする核酸配列、又は請求項１８から３４までのいずれか１項記載の抗体又はその断片又は誘導体。
【請求項３６】
配列番号４、６、８及び１０に従ったモノクローナル抗体ＣＥ５又はＧＢ３の配列又はその一部をコードする請求項３５記載の核酸。
【請求項３７】
請求項３５又は３６記載の核酸配列を有する核酸ベクター。
【請求項３８】
請求項３７記載のベクターでトランスフェクションした宿主細胞。
【請求項３９】
Ｆｃレセプターが媒介したシグナル伝達に関連した疾病、特に関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、Ｒｉｅｔｅｒ’ｓ症候群、乾癬、又はエリテマトーデスの治療及び／又は診断のために利用できる医薬組成物及び／又は診断組成物であって、請求項１８から３４までのいずれか１項記載の抗体又はその断片又は誘導体の有効量及び医薬的に許容可能なキャリアー物質を含む医薬組成物及び／又は診断組成物。
【請求項４０】
自己免疫疾患及び／又は癌の検出のための診断キットであって、請求項１８から３４までのいずれか１項記載の抗体又はその断片又は誘導体及び／又は、請求項１から７までのいずれか１項記載の組み換えペプチド又はポリペプチドを含む診断キット。
【請求項４１】
ＦｃγＲＩＩａ／ＩｇＧ相互作用又はＦｃγＲＩＩｂ／ＩｇＧ相互作用の抑制剤又は活性化剤の製造のための請求項１８から３４までのいずれか１項記載の抗体又はその断片又は誘導体の使用。
【請求項４２】
自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、免疫性の血小板減少性紫斑病又は多発性硬化症の診断及び／又は治療のための医薬組成物及び／又は診断組成物の製造のための請求項１８から３４までのいずれか１項記載の抗体又はその断片又は誘導体の使用。
【請求項４３】
癌、特にリンパ腫又は白血病の診断及び／又は治療のための医薬組成物及び／又は診断組成物の製造のための請求項１８から３４までのいずれか１項記載の抗体又はその断片又は誘導体の使用。
【請求項４４】
癌の治療及び／又は診断のための、その他の生物学的治療薬と共にアジュバントとしての、請求項１８から３４までのいずれか１項記載の抗体又はその断片又は誘導体の使用。
【請求項４５】
抗体、ハーセプチン（Ｒ）、リツキサン（Ｒ）、ＩＣ１４、ＰＡＮＯＲＥＸＴＭ，ＩＭＣ−２２５、ＶＩＴＡＸＩＮＴＭ、Ｃａｍｐａｔｈ  １Ｈ／ＬＤＰ−０３、ＬＹＭＰＨＯＣＩＤＥＴＭ、及びＺＥＶＬＩＮＴＭ、及び以下の癌の抗原：ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、ｐ１５、β−カテニン、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ−４、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ヒトパピローマウィルスＥ６、ヒトパピローマウィルスＥ７及びＭＵＣ−１に結合する抗体を含む群からその他の治療薬が選択される、請求項４４記載の使用。
【請求項４６】
アレルギーの診断及び／又は治療のための医薬組成物及び／又は診断組成物の製造のための、請求項１８から３４までのいずれか１項記載の抗体又はその断片又は誘導体の使用。
【請求項４７】
活性化した樹状細胞及び／又はマクロファージに関連した疾病の治療のための医薬組成物及び／又は診断組成物の製造のための、請求項１８から３４までのいずれか１項記載の抗体又はその断片又は誘導体の使用。
【請求項４８】
宿主対移植片疾病の治療のための医薬組成物及び／又は診断組成物の製造のための、請求項１８から３４までのいずれか１項記載の抗体又はその断片又は誘導体の使用。
【請求項４９】
アミロイドに関連した疾病の治療のための医薬組成物及び／又は診断組成物の製造のための、請求項１８から３４までのいずれか１項記載の抗体又はその断片又は誘導体の使用。
【請求項５０】
請求項１８から３４までのいずれか１項記載の抗体又はその断片又は誘導体の使用であって、その際前記抗体又はその断片又は誘導体が、抗原を血小板による輸送及び／又は肝臓及び脾臓の食作用系による取り込みに向けて指向するための、二重特異性の抗体中の特異的な抗ＦｃγＲＩＩａ断片を含む、抗体又はその断片又は誘導体の使用。
【請求項５１】
請求項１８から３４までのいずれか１項の抗体又はその断片又は誘導体の使用であって、その際ＩＴＰの診断及び／又は治療のための医薬組成物及び／又は診断組成物の製造のために、前記抗体又はその断片又は誘導体は特異的な抗ＦｃγＲＩＩａ抗体又はその断片である、使用。
【請求項５２】
ワクチン接種の効果を増加させるための医薬組成物の製造のための請求項１８から３４までのいずれか１項記載の抗体又はその断片又は誘導体の使用。
【請求項５３】
請求項１８から３４までのいずれか１項記載の抗体又はその断片又は誘導体であって、その際これらはこのＦｃ断片において、グリコシル化の修飾及び／又は突然変異により、前記Ｆｃレセプターのサブセットに対する結合を促進すべく改変されている、抗体又はその断片又は誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の詳細な説明
本発明は、コンフォメーションにより識別するエピトープ（ＣＤＥｓ）を有する新規の免疫原、及び極めて密接に関連したホモログを有するタンパク質を特異的に認識する抗体の産生のための免疫化方法に関する。特に、本発明はＦｃγＲＩＩｂ又はＦｃγＲＩＩａのいずれかに特異的な抗体に関し、かつこれらは自己免疫疾患、感染症、腫瘍及びその他の免疫系が関連する症状の診断及び治療のために有利である。
【０００２】
Ｆｃレセプター（ＦｃＲｓ）は、感染症に対する人体の防御において重要な役割を果たす。病原体が血液循環に到達すると、これらは抗体（免疫グロブリン、Ｉｇｓ）によってオプソニン化される。これにより免疫複合体の形成を生じる。前記抗体のＦｃ部はＦｃレセプターに結合でき、前記レセプターは免疫系の実質的に全ての細胞上に存在する。特異的なＦｃＲｓは、全てのＩｇクラスに対して存在する。ギリシャ文字は、前記レセプターが結合するＩｇクラスを示し、例えばＦｃγレセプターはＩｇＧを認識するなどである。
【０００３】
何年もの間、ＩｇＧに対する前記Ｆｃレセプター（ＦｃγＲ）はエフェクター応答を引き起こすことにおいて重要な役割を果たすことが知られている（Metzger, 1992A）。これらは、発現したＦｃγＲ及び細胞の種類に依存して、病原体の中和及び抗原の提示を生じるエンドサイトーシス及び食作用、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、好中球活性化、前記抗体産生の調節、又は炎症性の媒介体の分泌を含む（Fridman et al., 1992 ; van de Winkel及びCapel,1993 ; Ravetch及びBolland, 2001）。
【０００４】
健康な個人におけるＦｃＲｓが果たす利点のある役割とは対照的に、ＦｃＲｓはまたこの免疫系の刺激を、アレルギー（例えば、ＦｃεＲＩａにより媒介される）又は自己免疫疾患へと伝達する。更に、いくつかのウィルスはＦｃγＲｓを使用して、細胞に到達するか、例えばＨＩＶ（Homsy et al., 1989）及びデング（Littaua et al., 1990）等、又はエボラ（Yang et al., 1998）及び麻疹（Ravanel et al., 1997）の場合のようにＦｃγＲｓを遮断することで免疫応答を減速させる。
【０００５】
ＩｇＧのためのＦｃレセプター（ＦｃγＲ）はＦｃレセプターファミリーのうちで最も普及したものであり、かつ定義されたパターンで全ての免疫学的に活性のある細胞上に発現する。ＦｃγＲＩは単球及びマクロファージ上に構成的に発現し、好中球及び好酸球上に誘導されてよい。ＦｃγＲＩの生理学的な役割は未だ未知であり、というのは単球上での発現は不可欠ではないからである（Ceuppens et al., 1988）。ＦｃγＲＩＩＩ（ＦｃγＲＩＩＩｂ）のグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）によりアンカーした形態は顆粒球にのみに発現する。この細胞質部が欠損しているために、細胞中へのこのシグナル伝達はその他の膜貫通タンパク質、例えば３型補体レセプター（ＣＲ３）を介してのみ生じ、前記レセプターは少なくともＦｃγＲＩＩｂと結合できる（Zhou et al., 1993; Poo et al., 1995）。ＦｃγＲＩＩａは単球及びマクロファージ上に主に発現するが、γ−鎖と呼ばれる関連したタンパク質と組み合わせてのみ発現する。ＦｃγＲＩＩａは、免疫性の能力のある細胞に対して最も広い分布を有するレセプターであり、主に免疫複合体のエンドサイトーシスに関連する。ＦｃＲＩＩｂは、ＦｃＲＩＩｂが唯一のＩｇＧレセプターであるＢ細胞上に、及びエフェクター細胞、例えばマクロファージ、好中球、及びマスト細胞上に発現し、しかしＮＫ細胞及びＴ細胞には発現しない。
【０００６】
構造的には、前記ＦｃγＲｓの細胞外部は、３つ（ＦｃγＲＩ、ＣＤ６４）又は２つ（ＦｃεＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＣＤ３２及びＦｃγＲＩＩＩ、ＣＤ１６）のＩｇ様のドメイン（約１０ｋＤａ／ドメイン）からなり、従って免疫グロブリンスーパーファミリーに属する。これらの細胞外ドメインに加えて、ＦｃＲｓは膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを有する（ＧＰＩにアンカーしたＦｃγＲＩＩｂを除く）。これらのレセプターは相互に相同性があり、かつＦｃγＲｓ及びＦｃεＲＩａのうちでのアミノ酸配列におけるこの全体的な同一性は、これらの細胞外領域において４０％を超える。ＦｃγＲＩＩａ及びＦｃγＲＩＩｂはその細胞外領域において、このアミノ酸残基の６％のみが相違する。それにも関わらず、両者の形態は、ヒト及びマウスのＩｇＧサブクラスに対するその結合特性（van de Winkel及びCapel, 1993）、及びヒトＩｇＧｓに対するこれらの異なる親和性により区別されることが可能である（Sondermann et al ., 1999A）。
【０００７】
ＦｃＲｓは高度にグリコシル化されている。多数のＦｃレセプターのｃＤＮＡ配列は既知であり、幾つかの可溶性の組み換えＦｃＲが産生されている。可溶性の組み換えＦｃレセプターは、膜貫通領域の非存在により特徴付けられていて、シグナルペプチド及びグルコシル化がＷＯ００／３２７６７に開示されている。
【０００８】
ＦｃγＲｓは、様々なアイソフォーム（ＦｃγＲＩａ、ｂ１、ｂ２、ｃ；ＦｃγＲＩＩａ１−２、ｂ１−３、ｃ）及び対立遺伝子（ＦｃγＲＩＩａ１−ＨＲ、ＦｃγＲＩＩａ１−ＬＲ；ＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１、ＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ２）（ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ及びＣａｐｅｌ，  １９９３）で生じる。前記の全体的に相同性のある細胞外部と比べて、この膜にまたがる及び細胞質のドメインは８ｋＤａの大きさまで相違する。
【０００９】
前記ＦｃγＲｓは、活性性又は抑制性であるその機能に従って、２つの一般的なクラスに区分することができる。この活性性レセプターは、細胞質の１６つのアミノ酸免疫系レセプターチロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）に関連し、前記モチーフは、コンセンサス配列Ｙ−Ｘ２−Ｌ／Ｉ−Ｘ８−Ｙ−Ｘ２−Ｌ／Ｉを有する(Isakov, 1997)。前記モチーフは、例えばＦｃγＲＩＩａ中で見出される。ＦｃＲｓのその他のクラスは抑制性レセプターであり、これらは細胞質の６つのアミノ酸の抑制性のモチーフ（ＩＴＭ）を有し、これはコンセンサス配列、Ｖ／Ｉ−Ｘ−Ｙ−Ｘ２−Ｖ／Ｌを有する（Isakov, 1997）。かかる抑制性のＦｃＲの例はＦｃＲＩＩｂである。
【００１０】
ＩＴＡＭ及びＩＴＩＭのモチーフを介した活性化及び抑制化はチロシンのリン酸化により作用される。その特定の細胞の種類（前記Ｆｃレセプターにより活性化される）に依存して、異なるチロシンキナーゼがこれらのシグナル伝達経路に関与する（Amigorena et al., 1992）。活性性の及び抑制性のＦｃγＲｓの両者は、同じ細胞上に発現されてよく、これにより免疫応答の良好な調整のために協調した、活性化及び抑制性のレセプターの機能化が可能になる。
【００１１】
ＦｃγＲＩＩｂは２つの抑制性の活性を有する。これらのうちの１つはＩＴＩＭモチーフに依存性であり、ＦｃγＲＩＩｂがＩＴＡＭを有するレセプター（例えばＦｃγＲＩＩａ）に連結する場合に生じ、これによりＩＴＡＭにより誘発されたカルシウム動員及び細胞の増殖の抑制を導く。この意味するものは、カルシウム依存性の経過、例えば脱顆粒、食作用、ＡＤＣＣ、サイトカイン放出及び炎症誘発性の活性化、及びまたＢ細胞の増殖がＦｃγＲIIｂにより遮断されることである。ＦｃγＲＩＩｂの第２の抑制性の活性は、レセプターの同族凝集（ＦｃγＲＩＩｂクラスター化）を伴い、これはアポトーシス促進性のシグナルを細胞質へと配送する。前記のアポトーシス促進性のシグナルはＢ細胞においてのみ報告されていて、かつ、ＦｃγＲＩＩｂのＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）への連結によって遮断されることが可能である。ｉｎ  ｖｉｖｏ研究では、ＦｃγＲＩＩｂは末梢性寛容で役割を果たすことを示し、というのはＦｃγＲＩＩｂノックアウトマウスは、自然発生的な自己免疫疾患を発達させるからである。その一方で、ＦｃγＲＩＩｂは腫瘍に対する細胞毒性を下方調節することも報告されている（Clynes etal., 2000）。ＦｃγＲＩＩｂ欠失であってかつ抗腫瘍性の抗体で処置したマウスは促進したＡＤＣＣを示し、腫瘍転移の減少を生じる一方で、Ｆｃレセプターの活性化を欠失したマウスは、同じ抗体で処置した場合に腫瘍成長を停止させることができなかった。
【００１２】
免疫原としてタンパク質又はペプチドで動物を免疫化させることによる抗体の産生は、この分野で既知である。従来の免疫化プロトコルは、免疫原として線形のペプチドを使用し、前記ペプチドは関心のある抗原に由来する。かかる方法の不利な点は、このエピトープの三次元的な構造がしばしば完全に失われるために、この生じる抗体が高度には特異的ではないこと、又は前記抗体が関心のあるエピトープ以外のエピトープに指向する大きい割合の抗体を含んでいることである。
【００１３】
過去十年の間に、Ｆｃレセプターを発現する細胞又は変性したＦｃレセプターを使用する免疫化プロトコルは、単に変性したＦｃレセプターを特異的に検出することが可能である（ウェスタンブロット）か、又は細胞系（例えばＵ−９３７、ラジ）又は血液細胞上のこの関連したＦｃγＲＩＩａとＦｃγＲＩＩｂとを識別できない抗体を生じたに過ぎない。遡ると、選択的にかつ特異的にＦｃγＲＩＩｂに、その天然のコンフォメーション及び／又はその天然の環境において結合する抗体又はその他の結合物質は存在しない。
【００１４】
ペプチド又は組み換えタンパク質を抗原として伴う従来の免疫化プロトコルは、極めて高い配列同一性を有するホモログが存在するタンパク質に特異的な抗体を産生するためには良好に適するものでない。一般的に、抗体は小さい線形のペプチドを免疫原として用いて産生される。かかるペプチドは、タンパク質（エピトープが由来するタンパク質）上のエピトープの天然のコンフォメーションを代表するものでない。加えて、この免疫化した動物により産生される抗体の大多数は、この抗原がコンジュゲートする担体タンパク質のエピトープに対して、又はホモログに共通する組み換え抗原上のエピトープに対して指向する。結果として、この産生された抗体は、特異的でないか、かつ／又はこの天然のコンフォメーションにある抗原を検出することが可能でない。更に、グルコシル化部位は、関心のあるエピトープ内に局所し、これらの部位を遮閉する可能性がある。これらのエピトープをこの標的分子に見出されるそれぞれの天然のグリコシル化なしに使用する従来の免疫化プロトコルは、その天然のコンフォメーションにある抗原を認識することができない抗体を生じる。
【００１５】
本発明の１つの目的は、免疫原として使用できる組み換えペプチド又はポリペプチドを、関心のある抗原と緊密に関連した抗原とを識別することができる抗体を産生するために提供すること、及びかかるポリペプチド及び相応する抗体及び免疫学的な特異性を有するその他の物質を製造する方法を提供することである。
【００１６】
本発明の更なる目的は、Ｆｃレセプターサブタイプに選択的に結合でき、かつこれらを識別することができる物質であって、従って免疫疾患、特に自己免疫疾患の治療及び診断に利用できるＦｃレセプター結合物質として、及び腫瘍細胞に対してＡＤＣＣを促進する療法の効率を促進する抗腫瘍剤として作用する物質を提供することである。
【００１７】
本発明の更なる目的は、かかるＦｃγＲＩＩｂ結合物質、特に抗体、特に上述の特異性を有するモノクローナル抗体の産生を可能にする免疫化プロトコルを提供することである。
【００１８】
本発明の発明者は、極めて緊密に関連したタンパク質及び／又はタンパク質と高い相同性を有する抗原とを識別することが可能である物質、特に抗体を開発するための新規でありかつ発明性のあるアプローチを見出した。
【００１９】
意外にもいわゆるコンフォメーションにより識別するエピトープ（ＣＤＥｓ）を、抗体を産生する抗原として使用する場合に、関心のあるタンパク質に対して特異的な抗体を産生することが可能であることが見出された。
【００２０】
本発明は従って、天然のコンフォメーションにおいてコンフォメーションにより識別するエピトープ（ＣＤＥ）を有する人工ペプチド又はポリペプチドに関し、その際前記ＣＤＥは環化により構造的に安定化されている。
【００２１】
本発明の目的のために、人工ペプチド又はポリペプチドは、任意の技術的な方法、例えば組み換え技術、又は有利にはペプチド合成により製造された人工ペプチド又はポリペプチドである。
【００２２】
ＣＤＥはタンパク質中のエピトープであって、前記タンパク質において特異的なコンフォメーションを有するエピトープである。かかるエピトープに特異的な抗体は、タンパク質と極めて緊密に関連したホモログとを識別できる。前記ＣＤＥは、前記ＣＤＥが存在するタンパク質と、このタンパク質のホモログとで相違する少なくとも１つのアミノ酸を有する（特有残基）。前記特有残基は、この同じエピトープの一部であるべく前記タンパク質の線形の配列において緊密に近接するには及ばない。本発明の利点は、本発明のペプチドがこれらエピトープの線形の配列を有するのみでなく、しかしこれら構造をも模倣することである。前記ＣＤＥは少なくとも１つの、有利には少なくとも２つのかかる特有残基を、より有利にはかかる特有残基２つ以上を含む。ＣＤＥは抗体のための結合部位を提示する。
【００２３】
本発明のペプチドは有利には、５つ〜、より有利には約８つ〜、より一層有利には約１０つ〜、約３０つまでの、より有利には２０つまでの、より一層有利には約１８つまでの、極めて有利には約１５つまでのアミノ酸の長さを有する。
【００２４】
本文脈における構造的安定化は、前記ペプチドが安定化されているので、このＣＤＥは可能な限りこの本来のタンパク質におけるほぼ天然の三次元コンフォメーションで存在することを意味する。構造的安定化は、種々の手段によって達成されてよい。特に、前記ペプチドは安定な三次元構造、例えばループを形成するように環化されている。前記ペプチドの安定化は、Ｎ−末端のＣ−末端へのカップリング、システイン架橋の形成により、又はアミノ酸側鎖の架橋により達成されてよい。擬ペプチドが形成される。
【００２５】
有利には、本発明のペプチド又はポリペプチドは、グリコシル化部分をも有する。前記ペプチドは有利には、グリコシル化したアミノ酸が、このＣＤＥが由来する天然のタンパク質においてグリコシル化される同じ部位で組み込まれるように産生される。有利には、このグルコシル化したアミノ酸は、Ｎ−アセチル−グルコサミン、フコース、キシロース、マンノース、及びガラクトースのコンジュゲートから選択されるが、このリストは網羅するものでない。この識別するエピトープがＮ−グリコシル化部位を有する場合には、この天然のグルコシル化した基質が、成功した免疫化ののちに生じる抗体により認識される可能性を促進するために、Ｎ−アセチル−グルコサミンを有するアスパラギン残基の人工コンジュゲートを前記ペプチド中に組み込んでよい。従って、Ｏ−グリコシル化部位に関しては、セリン又はトレオニン残基は、マンノース、フコース、キシロース、ガラクトース、又はＮ−アセチル−ガラクトサミン残基とそれぞれコンジュゲートされていてよい。
【００２６】
本発明のペプチド及びポリペプチドは更に、担体分子にカップリングされていてよい。かかる担体分子は有利には、ハプテン、ペプチド、ポリペプチド及びその他の免疫原から選択される。本発明のペプチドは、その他のペプチド及びタンパク質、更にはこのＣＤＥが由来する同じタンパク質又はその一部に接合されていてよい。
【００２７】
本発明の有利な実施態様は、ＦｃレセプターからのＣＤＥを有するペプチドである。本発明の発明者は意外にも、ＦｃγＲＩＩｂの細胞外部上に特異的なエピトープが存在することを見出し、これによりＦｃγＲＩＩｂに特異的に結合する抗体の産生を可能にする。これは特に有利であり、というのはＦｃレセプターのファミリーは、従来の抗体を用いて識別することが困難な、尋常でなく緊密に関連したホモログを有するからである。特に、本発明は、ＦｃγＲＩＩｂに結合するがＦｃγＲＩＩａに結合しない物質及びこの逆も同様である物質を製造することを可能にする。同様に、このエピトープは、ＦｃγＲＩＩａが特異的に認識されるように選択されてよい。
【００２８】
特に、本発明によるペプチド又はポリペプチドは、少なくとも１つの、有利には少なくとも２つの、更に有利には少なくとも３つの、図１及び配列番号２に従ったヒトＦｃγＲＩＩｂのアミノ酸配列の以下のアミノ酸：Ｇｌｎ１２、Ａｒｇ２７、Ｔｈｒ２９、Ｈｉｓ３０、Ｖａｌ１０４、Ｌｙｓ１２７、Ｓｅｒ１３２、Ａｓｎ１３５、Ｔｙｒ１６０及びＡｌａ１７１、又は配列番号１に従ったＦｃγＲＩＩａのこの相応するアミノ酸を有するエピトープを有する。より有利には、本発明の目的のために有利なエピトープは、ＦｃγＲＩＩｂ（図１、配列番号２）のアミノ酸配列のアミノ酸２７〜３０、及び／又は１２７〜１３５、及び／又は１６０〜１７１又はＦｃγＲＩＩａのこの相応するアミノ酸（図１）を有する。これらのペプチドは、適当な方法で、例えば図２において例示したように、環化により構造的に安定化している場合には、ＦｃγＲＩＩｂに特異的なコンフォメーションにより識別するエピトープ（ＣＤＥｓ）を表してよい。また、ＦｃγＲＩＩａの相応するエピトープはＦｃＲＩＩａのみに特異的に結合する抗体を産生するために使用されてよい。
【００２９】
とりわけ、アミノ酸配列１２７−ＫＫＦＳＲＳＤＰＮ−１３５及び隣接アミノ酸を有するペプチドが有利であり、というのはこれらのペプチドは、Ｆｃ断片に対するＦｃレセプターの結合領域内においてＦｃγＲＩＩｂに特異的なコンフォメーションのエピトープを表すからである(WO00/32767, Sondermann et al., 2000; Sondermann et al., 2001)。更に、アミノ酸配列２８−ＲＧＴＨ−３１及び隣接残基を有するペプチドは有利であり、というのはこれらがＦｃ断片に対する結合領域を別にした結合エピトープを表すからである。また更に、このエピトープは更に、環化及び１３５位のグリコシル化したアスパラギン残基の組み込みにより天然の構造に適合されてよい。
【００３０】
従って、本発明の有利な実施態様は、配列番号３に従ったＣＤＥを有するペプチド又はポリペプチドである。有利には、１３５位のアスパラギン（配列番号２番に従って）は、Ｎ−アセチル−グルコサミンによってグリコシル化されている。有利には、図７に示したようにペプチドは、図７に示したような配列のこの最初の及び最後のアミノ酸を連結することで環化されている。
【００３１】
これらの人工ペプチドは次いで、動物の免疫化のための直接的に使用できるか、又は担体タンパク質、例えばハプテン、又はペプチド又はポリペプチドに、又は理想的にはその標的タンパク質自体にカップリングしていてよい。有利な実施態様において、ＦｃγＲＩＩｂ又はＦｃγＲＩＩａからのＣＤＥ、又はかかるＣＤＥを有するペプチドは、ＦｃγＲＩＩｂ又はＦｃγＲＩＩａにコンジュゲートされている。
【００３２】
本発明のペプチド及びポリペプチドは有利には、動物を免疫化するための免疫原として、特異的な抗体、及びこれらの特異的な抗体の配列の助けにより、更に免疫学的に特異的な物質を産生するために使用される。ＣＤＥｓ及びこれらを有するペプチドは、前記ＣＤＥを特異的に認識する、免疫学的に調節性の物質の産生のために使用されてよい。これは特に、ＦｃレセプターのＣＤＥｓが選択される場合に有利であり、というのはこれらはホモログのファミリーの個々のメンバーに特異的な抗体の産生を可能にするからである。特に、ＦｃγＲＩＩｂ又はＦｃγＲＩＩａのいずれかを認識するが、しかし両者を同時には認識しない抗体及びその他の免疫学的に調節性の物質が産生されることが可能である。本発明は、ＦｃγＲＩＩｂ又はＦｃγＲＩＩａを特異的に認識し、かつ、これら２つのＦｃレセプターを識別することが可能であるだけでなく、このＦｃレセプターがその天然の環境中に、例えば細胞培地中に又はｉｎ  ｖｉｖｏ、例えば血液流中に存在する場合にも同様にすることが可能である抗体の産生を可能にする。
【００３３】
ＣＤＥを、これが由来するタンパク質にカップリングさせることで、この担体タンパク質に対する背景の免疫反応は減少する。共有結合によりカップリングしたＣＤＥによる人工的な修飾は、増加した免疫応答を生じる。これは特に、この免疫化した動物が、この免疫系により寛容されうる同様のタンパク質を発現する場合に重要である。  従って、本発明のペプチドがＦｃγＲＩＩｂ又はＦｃγＲＩＩａのＣＤＥを有する場合には、前記ＣＤＥは有利にはこのそれぞれのＦｃレセプター自体にカップリングしている。これにより抗原性を上昇させる。このカップリングは、化学的な結合又はその他の適した手段により生じてよい。
【００３４】
この方法は有利には高密度のＣＤＥｓを有する免疫原を産生し、これによりこれらを異なる、即ち免疫原性の環境において提示する。この最初の免疫応答はこの標的領域（ＣＤＥ）に対して指向していて、前記領域は、これらがカップリングされたこの天然の構造と交差反応する抗体を産生する。これらの交差反応する抗体は、この天然の環境においてＣＤＥをも認識する、より高度な親和性へと成熟する。
【００３５】
本発明のペプチド及びＣＤＥｓは、結合する分子のための分子ライブラリー（例えば、ペプチド、有機分子、ペプチドメティックス（ｐｅｐｔｉｄｏｍｅｔｉｃｓ）その他）、又は遺伝子によりコードされたライブラリー（例えば、抗体可変ドメインのファージディスプレー又はその他のフレームワーク、例えばリポカリン）のスクリーニングにおいても、ＦｃγＲＩＩｂ（又はＦｃγＲＩＩａ）に特異的に結合する物質を見出すために使用されてよい。前記ペプチドは、ヒト細胞上のＦｃγＲＩＩａ又はＦｃγＲＩＩｂのいずれかに特異的に結合する分子のライブラリーをスクリーニングするために使用されてよい。
【００３６】
本発明による同様のペプチドは、その他のタンパク質の、例えばレセプターの構造から抽出されてよく、前記タンパク質は相互に関連があるが、異なる機能を有するか（例えばヒトのＦｃγＲＩＩａに特異的な抗体は、ＦｃγＲＩＩｂを認識しないように開発されることができ、前記抗体はＤｉａｂｏｄｙ又はＴｒｉａｂｏｄｙ中に、ＦｃγＲＩＩｂよりむしろＦｃγＲＩＩａにより媒介されるＡＤＣＣを促進するために組み込まれてよい）、又は異なる対立遺伝子において生じる（例えば１３１位のＦｃγＲＩＩａ  Ａｒｇ／Ｈｉｓ−多形性、又は１５５位のＦｃγＲＩＩａ  Ｐｈｅ／Ｖａｌ多形性）。
【００３７】
本発明の新規ペプチドのその他の使用は、免疫学的な機能のプロモーターの抑制剤としての直接的な使用である。本発明によるペプチドは、免疫療法のために直接的に使用されてよい。
【００３８】
本発明の上述したペプチドは、新規の方法により製造されてもよく、その際この方法は以下を含む：
（ａ）関心のあるタンパク質を提供、
（ｂ）前記タンパク質上のＣＤＥを同定、
（ｃ）前記ＣＤＥの配列を有するペプチドを産生、
（ｄ）前記ＣＤＥがその天然のコンフォメーションにあるように前記ペプチドを構造的に安定化。
【００３９】
前記ペプチドは環化、有利にはＮ末端のＣ末端へのカップリング、システイン架橋の形成、及び／又はアミノ酸側鎖の架橋により構造的に安定化され、擬ペプチドを形成する。上述したように、前記ペプチドは有利には、関心のあるタンパク質に存在するグリコシル化部分を有するアミノ酸を使用して産生される。前記方法は有利には、付加的な工程、前記ペプチドの担体分子へのコンジュゲートを含み、前記分子は任意の上述した分子から選択される。本発明のその他の観点は、本発明の方法により得られるＣＤＥを有するペプチド又はポリペプチドである。
【００４０】
特異的に結合する抗体の画分を著しく上昇させるために、本発明は、関心のある抗原と緊密に関連した抗原とを識別することができる特異的に結合する物質を産生するための方法であって、その際前記方法が、動物を本発明によるペプチド又はポリペプチドで、及び／又は、関心のある抗原の正確に折りたたまれた一部で、特にＦｃレセプター、例えばＦｃγＲＩＩｂ又はＦｃγＲＩＩａに由来するペプチドで免疫化し、かつこの生じる抗原を単離し、かつ場合により前記抗体を組み換えの免疫学的に調節性の物質を産生するために使用することを含む以下の方法を提供する。
【００４１】
抗原Ａと、Ａとの高い配列同一性を有する抗原Ｂとを識別する抗体を産生するために、この相違するアミノ酸はＡの構造又はＡのそれぞれの構造モデルにマッピングされる。この最初の配列において複数のアミノ酸により隔てられている相違するアミノ酸は、空間的に近接していてよい。これらの相違するアミノ酸が、この天然の構造において溶媒から易到達性である場合には、これらの表面領域はコンフォメーションにより識別するエピトープ（ＣＤＥ）であると見なされてよい。かかるエピトープは、環式ペプチド又はペプチドアナログにより人工的に構築されてよく、かつ極めて関連した抗原を識別する抗体の産生のためにとりわけ有利である。
【００４２】
この方法の変形において、トランスジェニック動物を免疫化のために使用し、前記動物は緊密なホモログを発現すべく操作されていて、かつ後にこの標的抗原で免疫化される。ヒトＦｃγＲＩＩｂを発現する動物は、ヒトＦｃγＲＩＩａで免疫化されているか、又はその逆も同様である。
【００４３】
特に有利な観点において、本発明は、Ｆｃレセプターの天然の環境においてＦｃγＲＩＩｂに又はＦｃγＲＩＩａに特異的に結合することが可能である、ＦｃγＲＩＩｂに結合する抗体又はその断片又は誘導体を提供する。かかる抗体断片又は誘導体は、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩａの緊密に関連したホモログを天然の環境で、例えば細胞培地中で、又はｉｎ  ｖｉｖｏで識別できる。
【００４４】
有利な実施態様において、前記ＦｃγＲＩＩｂ結合抗体又はその断片又は誘導体（又はＦｃγＲＩＩａ結合抗体又はその断片又は誘導体）は、ＦｃγＲＩＩｂ（又はＦｃγＲＩＩａ）に特異的に結合するのみでなく、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩａ）の天然の結合パートナー、例えばＩｇＧ抗体が結合することをも妨げる。
【００４５】
本発明のその他の有利な実施態様において、この特異的な抗ＦｃγＲＩＩｂ（又は抗ＦｃγＲＩＩａ）抗体は、非遮断性であり、かつＦｃレセプター／Ｆｃ断片相互作用部位から遠位のエピトープ（例えば、アミノ酸２８〜３１の付近のＮ末端ドメインのエピトープ）を認識する。遮断性の抗体とは対照的にこれらの抗体は、レセプターの免疫複合体へのレセプターの結合が損なわれないという利点を有する。これにより、免疫複合体による前記レセプターの活性化が完全なままであり、かつ付加的なレセプターはこの活性化を促進するために動員されることが可能である。
【００４６】
従って、ＩｇＧ結合に依存せずにこれらのＦｃレセプターの天然の機能を調節することが可能である。例えば、前記抗体又はその断片又は誘導体は、前記Ｆｃレセプターに架橋することが可能であるように選択されてよい。かかる方法により、前記レセプターは活性化される。有利には、本発明の前記抗体又はその断片又は誘導体は、免疫複合体がＦｃγＲＩＩｂ又はＦｃγＲＩＩａに結合することに干渉しない。
【００４７】
その一方で、前記抗体又はその断片又は誘導体は、これがヒトＦｃγＲＩＩａ又はＦｃγＲＩＩｂの生理学的な機能を抑制するように選択されてよい。
【００４８】
本発明の抗体又はその誘導体又は断片は有利には、ＦｃＲＩＩａに対するよりもＦｃＲＩＩｂに対してより高い親和性で結合する。前記抗体又はその断片又は誘導体は、ＦｃγＲＩＩｂに、少なくとも５倍、有利には少なくとも１０倍、より有利には少なくとも１００倍、更により有利には少なくとも１０００倍、一層有利には少なくとも１００００倍、最も有利には少なくとも１０００００倍、より有利には少なくとも１０６倍、より有利には少なくとも１０７倍、より有利には少なくとも１０８倍、より有利には少なくとも１０９倍、より有利には少なくとも１０１０倍、より有利には少なくとも１０１１倍、より有利には少なくとも１０１２倍、ＦｃγＲＩＩａに対するよりもより高い親和性で結合する。又は、前記抗体又はその断片又は誘導体は、ＦｃγＲＩＩａに、少なくとも５倍、有利には少なくとも１０倍、より有利には少なくとも１００倍、更により有利には少なくとも１０００倍、一層有利には少なくとも１００００倍、最も有利には少なくとも１０００００倍、より有利には少なくとも１０６倍、より有利には少なくとも１０７倍、より有利には少なくとも１０８倍、より有利には少なくとも１０９倍、より有利には少なくとも１０１０倍、より有利には少なくとも１０１１倍、より有利には少なくとも１０１２倍、ＦｃγＲＩＩｂに対するよりもより高い親和性で結合する。特異的なＦｃレセプターに対する５、１０、１００、１００又は更には１００００００倍より密な結合が、ＦｃγＲＩＩｂを超えて血小板上でのＦｃγＲＩＩａの十分により高い発現レベルを克服するために必要である。
【００４９】
前記抗体又はその断片又は誘導体は、単量体又は多量体の状態で生じてよい。
【００５０】
前記抗体又はその断片又は誘導体は、Ｆｃレセプター分子に、この細胞表面上でのこれらに対する架橋あり又はなしで結合することが可能であってよい。有利には、前記抗体又はその断片又は誘導体は、ＦｃγＲＩＩａ又はＦｃγＲＩＩｂに架橋できるように多量体である。又は、前記抗体又はその断片又は誘導体は単量体であり、ヒトＦｃγＲＩＩｂに対するＩｇＧの結合を遮断できるか、しかし有利にはＦｃγＲＩＩｂに架橋することが可能ではない。
【００５１】
本発明の前記抗体又はその断片又は誘導体は、このＦｃ断片において、グリコシル化の修飾及び／又は突然変異により、前記Ｆｃレセプターのサブセットに対する結合を促進すべく改変されていてもよい。
【００５２】
本発明の前記抗体又はその断片又は誘導体は、有利には、上述のＣＤＥ及び／又はペプチド、特に図１及び配列番号２に従ったヒトＦｃγＲＩＩｂのアミノ酸であって、以下から選択されたアミノ酸：Ｇｌｎ１２、Ａｒｇ２７、Ｔｈｒ２９、Ｈｉｓ３０、Ｖａｌ１０４、Ｌｙｓ１２７、Ｓｅｒ１３２、Ａｓｎ１３５、Ｔｙｒ１６０及びＡｌａ１７１、又は配列番号１に従ったＦｃγＲＩＩａのこの相応するアミノ酸の１つ又はそれ以上を有するＣＤＥ及び／又はペプチドに結合することができる。より有利には、前記物質は、ＦｃγＲＩＩｂのアミノ酸配列（図１、配列番号２）のアミノ酸２７〜３０及び／又は１２７〜１３５及び／又は１６０〜１７１を含むエピトープ又はＦｃγＲＩＩａの相応するエピトープに結合する。
【００５３】
同様に、ＦｃγＲＩＩｂを認識しないヒトのＦｃγＲＩＩａに特異的な抗体が開発されることができ、これはＤｉａｂｏｄｙ又はＴｒｉａｂｏｄｙ中に、ＦｃγＲＩＩｂよりむしろＦｃγＲＩＩａにより媒介されるＡＤＣＣを促進するために組み込まれてよい。
【００５４】
前記抗体又はその断片又は誘導体は、任意の天然の、人工の、又は組み換えにより産生された、ＦｃγＲＩＩｂの上述のエピトープに結合できる領域を有する物質であってよい。有利には、この領域は特異的にＦｃγＲＩＩｂに結合する抗体の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）有する。より有利には、前記ＣＤＲは図５及び６に描写した配列を有する。
【００５５】
この記載したＣＤＲｓは、その他の選択されたＦｃレセプター又はレセプター群のためのこれらの特異性又は新規の特異的な又は汎抗体（ｐａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）（又は結合分子）の設計を更に改善するための変形のベースであってよい。無作為の又は部位特異的突然変異、関連した配列のスクリーニング、及び知識又は構造に基づいた設計を含む方法が既知である。
【００５６】
有利には、前記抗体又はその断片又は誘導体は、１つの又は両方の、配列番号５及び配列番号７に従った可変軽鎖領域及び可変重鎖領域、及び／又は配列番号９及び１１に従った可変軽鎖領域及び可変重鎖領域を含む。最も有利には、前記抗体はＣＥ５、又はＧＢ３である。
【００５７】
モノクローナル抗体が有利である。有利には、これは、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＡのアイソタイプを有する抗体又はその断片又は誘導体である。有利には、前記抗体はヒトの又はヒト化しているか、しかしその他の起源、例えば動物起源、特にマウス又はラクダ起源であってもよい。前記抗体は様々な形態、例えば単鎖抗体、二官能性、又は三官能性、又は多官能性の抗体、Ｆａｂ断片又はＦａｂ２断片、又は抗体全体として存在してよく、前記抗体においてこのＦｃ断片はＦｃレセプター又は補体に対して改変した親和性を有する。これはＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、又はＦｖ断片、又はｓｃｖ断片であってもよい。
【００５８】
前記抗体又はその断片又は誘導体は、ＣＤＲｓの配列、又はこの提供された配列に対して５０％より高く、有利には７０％より高く、より有利には９０％より高く、更に有利には９５％より高く関連している、同様の配列を含む特異的な結合領域を有する、組み換えにより産生されたポリペプチド又はポリペプチドアナログであってよい。これらの配列は、Ｆｃレセプターの抑制剤の設計のための開始点であってもよい。従って、ペプチド模倣体もまた、この提供されたＣＤＲｓの配列モチーフを使用するか又は模倣する本発明の一部である。
【００５９】
その他の有利な実施態様において、前記抗体又はその断片又は誘導体は、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎｅ）又はリポカリン変異体又はその他の抗体の代理物である。
【００６０】
この得られた抗体又はその断片又は誘導体は、エフェクター分子、例えば関心のある抗原、抗体、抗体断片、マーカー分子、細胞毒性物質、立体的にかさばっている遮断物質及び連結分子及び連結物質にカップリングされていてよい。
【００６１】
本発明のその他の観点は、核酸、上述した本発明のペプチド及び／又は抗体又はその断片又は誘導体をコードする核酸を含有するベクター及び宿主細胞である。
【００６２】
本発明による抗体又はその断片又は誘導体から、このタンパク質をコードする核酸配列が得られる。有利には、前記配列は可変領域、有利には上述の、ＦｃγＲＩＩｂのエピトープに結合するＣＤＲｓをコードする。最も有利には、前記核酸配列は、図５及び６に従った配列の１つ又はそれ以上に従ったＣＤＲｓをコードする。有利には、前記核酸は、モノクローナル抗体、ＣＥ５又はＧＢ３の配列をコードする。
【００６３】
前記核酸配列は、図５及び６に従ったタンパク質の発現のためのベクター中に挿入されていてよく、このベクターも本発明の観点の１つである。前記ベクターは、上述の核酸配列が配置されたベクターの制御下にあるプロモーターを有する。前記ベクターは、原核生物又は真核生物の発現ベクターであってよく、その際前記組み換え核酸は単独で、又はその他のペプチド又はタンパク質又はＤＮＡ−ワクチン接種に適したベクターに融合して発現される。
【００６４】
本発明は上述したベクターでトランスフェクションされた宿主細胞をも提供する。前記宿主細胞は任意の細胞、原核細胞又は真核細胞であってよい。
【００６５】
本発明は更に、Ｆｃレセプターが媒介したシグナル伝達に関連した疾病の治療のために利用できる医薬組成物であって、本発明による抗体又はその断片又は誘導体の有効量及び医薬的に許容可能なキャリアー物質を含む医薬組成物を提供する。
【００６６】
本発明は更に、自己免疫疾患及び／又は癌の検出のための診断キットであって、本発明による抗体又はその断片又は誘導体及び／又は、本発明において説明されたエピトープの１つを含むか又は示す本発明による組み換えペプチド又はポリペプチド、及び場合によりマーカー試薬、キャリアー試薬及び／又は適した容器を含む診断キットを提供する。
【００６７】
グリコシル化されていない正確に折りたたまれたＦｃ−レセプター、例えば大腸菌に由来しかつ説明したエピトープで修飾されたＦｃレセプターでの免疫化は意外にも、血液細胞上及び細胞培地中で発現した、天然のＦｃレセプターを特異的に認識する抗体を生じる（図３及び図４）。
【００６８】
本発明のその他の観点は、ＦｃγＲＩＩｂに特異的に結合する能力により特徴付けられた抗体の産生方法であって、その際前記方法は：
（ａ）正確に折りたたまれたＦｃγＲＩＩｂ分子又はその一部を、少なくとも一部の細胞外ドメイン（コンフォメーションエピトープ）、そのコンジュゲート体、又はその他の担体分子（例えばＫＬＨ、ＢＳＡ）とのコンジュゲート体を含む免疫原として提供し、
（ｂ）哺乳類を（ａ）の免疫原で免疫化し、公知の方法により抗体を産生し、
（ｃ）この生じる抗体又はこの抗体を産生する細胞を単離する
ことを含む抗体の産生方法である。
【００６９】
前記抗体は有利にはモノクローナル抗体である。
【００７０】
ＣＤＲｓはその他の免疫グロブリンクラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１〜ＩｇＧ４）又はその他の足場（例えばリポカリン変異体、ラクダ抗体）、又は突然変異したか又は誘導体化された分子（例えば、改変されたＦｃ断片を有する操作された抗体）に接合されていてよい。
【００７１】
上述の方法は、動物の免疫化のためのビヒクルを製造するために使用されてよく、ＦｃγＲＩＩｂに対する増加した特異性の抗血清を生じ、前記抗血清は、単離したＢ細胞と骨髄腫細胞との融合後、ＦｃγＲＩＩｂに特異的な抗体を産生する増加した割合を有するハイブリドーマ細胞を生じる。
【００７２】
本発明による抗体又はその断片又は誘導体は、免疫系に関連する症状の治療及び／又は診断のための医薬品の製造のために利用できる。有利には、これらの症状は自己免疫疾患又は癌である。
【００７３】
本発明の薬物により治療されてよい疾患は、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、Ｒｉｅｔｅｒ’ｓ症候群、乾癬、多発性硬化症、エリテマトーデスを含むがこれらに限定されない。
【００７４】
本発明の物質を使用して診断されるか又は治療されることが可能な自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、多発性硬化症、特発性血小板減少性紫斑病及び宿主対移植片疾患を含むがこれらに限定されない。
【００７５】
意外にも、本発明者らにより、ある特定の免疫学的な経過をＦｃγＲＩＩｂに結合する物質を使用することでｉｎ  ｖｉｖｏで促進することが可能であることが見出された。特に、本発明のかかる物質を、細胞に対するＦｃγＲＩＩＢのシグナル伝達の特異的に遮断するために使用することが可能でありそしてこれにより個人の免疫応答を増加させる。これは使用細胞に対するＡＤＣＣの増加のために使用されてよい。実施においては、前記のＦｃγＲＩＩｂ結合物質を、治療性の抗体と共にアジュバントとして与える。前記の治療性の抗体によりオプソニン化された抗原（例えば腫瘍細胞）により活性化したマクロファージ又はＢ細胞へと伝達される抑制性シグナルは遮断され、この宿主の免疫系は標的の抗原の戦いにおいてより有効である。これは、直接的に、ＦｃγＲＩＩｂを発現する腫瘍細胞（例えばＢ細胞リンパ腫）をラベル化することによる、又はこのＦｃγＲＩＩｂに結合する物質をアジュバントとして用いることによる、既知の治療性の抗体を使用する全てのアプローチにおいてであってよく、従って宿主のＡＤＣＣに依存する。
【００７６】
この既知の治療性の抗体は、ハーセプチン（Ｒ）、リツキサン（Ｒ）、ＩＣ１４、ＰＡＮＯＲＥＸＴＭ，ＩＭＣ−２２５、ＶＩＴＡＸＩＮＴＭ、Ｃａｍｐａｔｈ  １Ｈ／ＬＤＰ−０３、ＬＹＭＰＨＯＣＩＤＥＴＭ、及びＺＥＶＬＩＮＴＭを含むがこれらに限定されない。これらはまた、以下の癌の抗原：ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、ｐ１５、β−カテニン、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ−４、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ヒトパピローマウィルスＥ６、ヒトパピローマウィルスＥ７及びＭＵＣ−１に結合する抗体をも含む。
【００７７】
特定のリンパ腫においてＢ細胞又はマスト細胞は変換される。前記抗体又はその断片又はその誘導体はこれら細胞の表面上でＦｃγＲＩＩｂに架橋することが可能であり、これらは排除のために前記細胞をラベル化するが、しかし付加的に抑制性の及びアポトーシス促進性のシグナルをこれら細胞に伝達する。この効果はこれまでの治療性の抗体のアプローチの改良であり、前記アプローチはこの宿主のＡＤＣＣに完全に依存する（例えばリツキサン）。
【００７８】
Ｆｃレセプターに架橋するか又は遮断する同じ抗体は、宿主対移植片疾病又はアミロイドに関連した疾病の治療のために使用されてよい。
【００７９】
同じＦｃγＲＩＩｂを遮断及び／又は架橋する構築体は、アレルギー治療のためマスト細胞を抑制するために使用してよい。
【００８０】
前記抗体又はその断片又は誘導体は、ＩｇＥにカップリングされていてよい（例えば、ＩｇＥ分子に図５又は６に示したＣＤＲｓを移すことにより）。この場合には前記ＩｇＥはマスト細胞が発現したＦｃεＲにより結合し、そしてＦｃγＲＩＩｂに特異的なＣＤＲｓはＦｃεＲＩのＩＴＡＭに、ＦｃγＲＩＩｂのＩＴＩＭで架橋する。再度、抑制性の及び／又はアポトーシス性のシグナルがマスト細胞に伝達され、これはアレルギーの治療において利用できる。
【００８１】
前記抗体又はその断片又は誘導体（例えば、図５及び６に示された配列の誘導体）は、自己免疫疾患の治療のために使用されてよい。
【００８２】
かかる物質はＢ細胞、樹状細胞及び活性化した顆粒球（例えばマクロファージ）を抑制し、これにより免疫刺激性の媒介体の減少した産生、及び抗体産生と同様に抗原提示の減少を生じる（例えば樹状細胞及びマクロファージに対して、Ｔ細胞動員の減少を生じる）。まとめると、抗体産生及び前記免疫系の再刺激のフィードバックループは抑制される。
【００８３】
有利には、この抗ＦｃγＲＩＩｂ又はＦｃγＲＩＩａは、前記レセプターのＦｃ断片の結合に干渉しない。このようにして、Ｆｃレセプターの通常の機能は、抗体の遮断とは対照的に維持され、かつ更なるレセプターの付加的な動員による細胞の活性化を促進する。
【００８４】
その一方で、特異的な抗ＦｃγＲＩＩａ抗体又はその断片は、抗原をこのレセプターに向けて指向させるためにｄｉａｂｏｄｙにおいて使用されてよいか、又はこれらの抗体の断片は免疫複合体の取り込みを抑制するために、例えばＩＴＰの治療のために使用されてよい。
【００８５】
前記ＣＤＲｓは単独で又は組み合わせて、ＦｃγＲＩＩａ／ＩｇＧ相互作用又はＦｃγＲＩＩｂ／ＩｇＧ相互作用の特異的な抑制剤の産生のために使用されてよい。かかる抑制剤の産生のために、誘導体又はペプチド模倣体と同様に非天然アミノ酸を使用してよい。
【００８６】
前記抑制剤は次いで、結晶構造の産生のために、又は構造に基づいた設計のために、又は進化的手法のための対象のために使用されてよい。更なる使用は、進化的手法による図５又は６に示された配列からの改変した配列の産生である（例えば無作為の又は部位特異的突然変異又は構造に基づいた設計）。
【００８７】
特に、Ｆｃレセプターの抑制剤は、この選択したＦｃレセプターに関する上述の特異性を減少させるか又は促進させるために使用してよい。この終わりに、前記の特異的な抗体、特にＧＢ３及びＣＥ５のＣＤＲｓにおいてＦｃγＲＩＩｂに対するこれらの特異性を促進するか低めるために改変を実施してよい。
【００８８】
本発明のペプチド及びポリペプチド及び物質、特に抗体又はその断片又は誘導体は、免疫系に関わる症状、特に自己免疫疾患、有利には、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、免疫性の血小板減少性紫斑病又は多発性硬化症から選択された症状の治療及び／又は診断のための医薬品の製造のために利用できる。更に、本発明のペプチド及び抗体又はその断片又は誘導体は、癌及び／又はアレルギーの診断及び／又は治療において利用できる。ｍＡｂｓ  ＣＥ５又はＧＢ３又はその誘導体又は断片は特に、自己免疫疾患、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、特発性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ、及び癌、特にリンパ腫又は白血病の治療のために利用できる。
【００８９】
ｍＡｂｓ  ＣＥ５又はＧＢ３又はその誘導体又は断片は、癌の治療のために、その他の治療薬、有利には生物学的治療薬（例えば、抗体）との組み合わせにおいて使用されてもよい。
【００９０】
本発明により産生された抗体又はその誘導体又は断片は、癌の治療及び／又は診断のために、有利にはその他の治療薬、有利には生物学的治療薬（例えば、更なる抗体）との組み合わせにおいて使用できる。前記抗体又はその断片又は誘導体は次いで有利にはアジュバントとして使用される。
【００９１】
本発明の抗体又はその断片又は誘導体の更なる使用は、宿主対移植片疾病の治療のための、アミロイドに関連した疾病の治療のための、又はワクチン接種の効果を増加させるため、又は活性化した樹状細胞及び／又はマクロファージに関連した疾病の治療のための医薬組成物及び／又は診断組成物の製造のための使用を含む。
【００９２】
二重特異性の抗体中の特異的な抗ＦｃγＲＩＩａ断片を含む抗体又はその断片又は誘導体を、抗原を血小板による輸送及び／又は肝臓及び脾臓の食作用系による取り込みに向けて指向させるために使用することも可能である。有利には、前記抗体又はその断片又は誘導体は、ＩＴＰの治療のための特異的な抗ＦｃγＲＩＩａ抗体又はその断片である。
【００９３】
図及び配列表の説明
図１：
ヒトＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩａの細胞外ドメインの配列アラインメント。相違するアミノ酸を囲った。
【００９４】
図２：
リボン表示におけるＦｃγＲＩＩｂの構造。特有残基を、ボール及び棒で示し、可能性のあるグリコシル化部位をより大きな球として示した。矢印は可能性のある抽出可能な副次構造（エピトープ１及び２）を指し示し、特異的なＦｃＲＩＩｂ−抗血清に向けた免疫化プロトコルの改善のために及び引き続きアイソフォームに特異的なモノクローナル抗体の産生のためにハットは人工的に産生されていてよい。
【００９５】
図３：
左図：ラジ細胞（ＦｃγＲＩＩｂ陽性及びＦｃγＲＩＩａ陰性）の、マウスの免疫前血清（マイナス）、免疫化工程後に得られた抗血清（抗血清）及び汎性のＦｃγＲＩＩ−ｍＡｂ  ＡＴ１０（Greenman et al., 1991）を用いたＦＡＣＳ測定の図。右図：Ｕ−９３７細胞（ＦｃγＲＩＩａ陽性及びＦｃγＲＩＩｂ陰性）に対する蛍光ラベル。この抗血清は、特異的な抗体の存在を示す細胞とわずかに反応するだけである。
【００９６】
図４：
通常の血清（ネガティブコントロール）、ＦｃγＲＩＩｂ−ＣＤＥ（１２６〜１３７）で免疫化したマウスの抗血清、ｍＡｂ  ＡＴ１０、又は本発明を用いて産生した特異的なモノクローナル抗体ＧＢ３のいずれかで、インキュベーションしたヒトの血液のＦＡＣＳ分析。ａ）：細胞の大きさ（ＦＳＣ−Ｈ）及び細分性（ＳＳＣ−Ｈ）の観点における血液試料のドットブロット分析。観察した領域、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はそれぞれリンパ球（Ｂ細胞及びＴ細胞）、単球及び顆粒球を含む。ｂ）前記細胞の蛍光強度は、リンパ球を代表する領域Ｒ１において見出された。汎性のＦｃγＲＩＩｂ  ｍＡｂ  Ａｔ１０、ｍＡｂ  ＧＢ３及び抗血清は、前記ＦｃγＲＩＩｂ陽性のＢ細胞を染色したが、ＦｃγＲＩＩ陰性のＴ細胞は認識されなかった。ｃ）前記細胞の蛍光強度は、単球／マクロファージを代表する領域Ｒ２において見出された。ポジティブコントロールとは対照的にｍ  Ａｂ  ＡＴ１０及び抗血清ｍＡｂ  ＧＢ３はＦｃγＲＩＩａ陽性の単球を認識しなかった。ｄ）前記細胞の蛍光強度は、顆粒球を代表する領域Ｒ３において見出された。ポジティブコントロールとは対照的にｍＡｂ  ＡＴ１０及び抗血清ｍＡｂ  ＧＢ３はＦｃγＲＩＩａ陽性の顆粒球を認識しなかった。
【００９７】
図５：
クローニングされた抗体ＧＢ３の可変領域。囲み枠の領域はＣＤＲｓを示す一方で、下線を引いた末端部はプライマーによって導入されるクローニング人為産物のために異なるかもしれない。ａ）軽鎖の可変領域；ｂ）重鎖の可変領域。
【００９８】
図６：
クローニングされた抗体ＣＥ５の可変領域。囲み枠の領域はＣＤＲｓを示す一方で、下線を引いた末端部はプライマーによって導入されるクローニング人為産物のために異なるかもしれない。ａ）軽鎖の可変領域；ｂ）重鎖の可変領域。
【００９９】
図７：
免疫化及びＦｃγＲＩＩｂに特異的な抗体の産生のために使用したグリコペプチドＣＤＥ（１２６〜１３７）。
【０１００】
図８：
特異的な抗マウスＦｃγＲＩＩｂ抗体でのＳＪＬマウスの免疫化。ＳＪＬｊを２００μｇのＭＯＧで、０日目に免疫化した。抗ＦｃγＲＩＩ抗体での処置（５０μｇ／週の用量）を５日目に開始した。この臨床スコアを毎日観察し、一群につき８匹のマウスの平均として示す。
【０１０１】
配列番号１  ＦｃγＲＩＩａのアミノ酸配列（図１に示したとおり）。
【０１０２】
配列番号２  ＦｃγＲＩＩｂのアミノ酸配列（図１に示したとおり）。
【０１０３】
配列番号３  グリコペプチドＣＤＥ（１２６−１３７）の配列。
【０１０４】
配列番号４  ｍＡｂ  ＧＢ３の可変軽鎖領域の核酸配列。
【０１０５】
配列番号５  ｍＡｂ  ＧＢ３の可変軽鎖領域の相応するアミノ酸配列。
【０１０６】
配列番号６  ｍＡｂ  ＧＢ３の可変重鎖領域の核酸配列。
【０１０７】
配列番号７  ｍＡｂ  ＧＢ３の可変重鎖領域の相応するアミノ酸配列。
【０１０８】
配列番号８  ｍＡｂ  ＣＥ５の可変軽鎖領域の核酸配列。
【０１０９】
配列番号９  ｍＡｂ  ＣＥ５の可変軽鎖領域の相応するアミノ酸配列。
【０１１０】
配列番号１０  ｍＡｂ  ＣＥ５の可変重鎖領域の核酸配列。
【０１１１】
配列番号１１  ｍＡｂ  ＣＥ５の可変重鎖領域の相応するアミノ酸配列。
【０１１２】
実施例
実施例１
シクロ−［Ｎ−β−（２−アセチルアミノ−デオキシ−２−β−グルコピラノシル）−Ａｓｎ１３８，Ｇｌｙ１４１］−（１２９−１４１）−ＦｃγＲＩＩｂ２，ＣＤＥ（１２６−１３７）の合成。
標準的なアミノ酸誘導体はＡｌｅｘｉｓ（Laeufelfingen, Switzerland）から、Ａｓｎ（Ｎ−β−３，４，６，−トリ−Ｏ−アセチル−２−アセチルアミノ−デオキシ−２−β−グルコピラノシル）−ＯＨのフルオレニルメトキシカルボニル誘導体（Ｆｍｏｃ）はMerck-Novabiochem(Darmstadt, Germany)から、及び予備負荷したクロロトリチル樹脂はPepchem(Tuebingen, Germany)からである。試薬及び溶媒は市販で入手可能な最高品質のものであり、更なる精製なしに使用した。分析逆相ＨＰＬＣを、対称Ｃ１８カラム（５μＭ、３．９×１５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）を用いてＷａｔｅｒｓ装置（Eschborn, Germany）において直線勾配溶出により実施した：（１）０〜１００％のＡ１５分間、又は（２）０〜３０％のＡ２０分間、５０％までのＡ５分間、及び１００％のＡ更に５分間、（１．５ｍｌ／分の流速及び２１０ｎｍでのＵＶ検出）。この一対の溶出系は（Ａ）アセトニトリル／２％Ｈ３ＰＯ４（９０：１０）及び（Ｂ）アセトニトリル／２％Ｈ３ＰＯ４（５：９５）。分取逆相ＨＰＬＣを、Abimed装置（Langenfeld, Germany）で、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  Ｃ１８  ＰＰＮ  （５μｍ，  １００Å，１０ｘ２５０ｍｍ， Macherey-Nagel, Dueren, Germany)及びアセトニトリロ中の０．０８％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（Ａ）及び水中の０．１％のＴＦＡの勾配を使用して、１０ｍｌ／分の流量で実施した。２％のＡに７分間、４０％までのＡ５０分間、及び７０％までのＡ更に５分間。ＥＳＩ−ＭＳスペクトルをPerkin-Elmer SCIEX API 165 三重四重極スペクトロメーターで記録した。ＬＣ−ＭＳを、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  Ｃ１８  ｃｏｌｕｍｎ  （５μｍ，１００Å，１ｘ２５０ｍｍ， Macherey-Nagel)で、水中の０．１％ＴＦＡ及びアセトニトリル中の０．０８％のＴＦＡの線形勾配を用いて（流量：３０μｌ／分；２１０ｎｍでの検出）実施した。
【０１１３】
ａ）固相ペプチド合成
線形ペプチド前駆体を、手法によりＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−クロロトリチル樹脂（２３２ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）で、Ｆｍｏｃ／ｔｅｒｔ−ブチル（ｔＢｕ）化学の標準的な方法に従い合成した。前記Ｆｍｏｃ基を、各工程で２回の連続した処理（３及び２０分間）により、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）中の２０％のピペリジンで開裂した。Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＰＨに関しては二重カップリング（２×１ｈ）を、ＮＭＰ中のＦｍｏｃ−アミノ酸／２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）／Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）／Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（４：４：４：８ｅｑ）で適用し、この際前記グリコシル化Ａｓｎ誘導体を、ＮＭＰ中のＦｍｏｃ−アミノ酸（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）−トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢＯＰ）／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ（２：２：２：５ｅｑ）を用いて一重カップリングにより導入した。この反応は、カイザー試験により確認して５時間後に完了した。無水酢酸／ＤＩＥＡ（１：１．３ｅｑ）でのキャッピング工程を、鎖伸長の前に１０分間実施した。残りのアミノ酸誘導体（Ａｒｇを、Ａｒｇ−２，２，４，６，７−ペンタメチル−ジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル［Ｐｂｆ］誘導体として導入した）でのアシル化のために、再度二重カップリング（２×１．５ｈ）を、ＮＭＰ中のＦｍｏｃ−アミノ酸／ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ（６：６：６：１２ｅｑ）で使用した。
【０１１４】
ｂ）側鎖保護ペプチドの開裂
側鎖保護した線形ペプチドを樹脂から、前記ペプチド樹脂を５ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ）中の１％ＴＦＡで３分間処理することで開裂した。この濾過物を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（ＣＨ３Ｃｌ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ，８：３：１）により、１ｍｌのメタノール中の１０％ピリジンの添加の前に分析した。このＴＦＡ処理を、前記濾過物に対するＴＬＣコントロールがネガティブになるまで繰り返した（全体で４つの処理）。最後に、前記樹脂をＤＣＭ及びトリフルオロエタノールで洗浄し、ペプチド回収を向上させた。このペプチド含有濾過物及び最後の洗浄物を一緒にして、低体積に濃縮した。この残留物をＭｅＯＨで希釈し、この生成物を氷冷水で沈殿させた。この粗生成物を濾過により回収し（２７０ｍｇ、８０％収率）、分析ＨＰＬＣ（勾配１）及びＥＳＩ−ＭＳにより特性決定した。７５：２０の比にある主ピーク（ｔＲ  ９．５分間；ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝２５２０［Ｍ＋Ｈ］＋；Ｍｒ  ２５１９．０  Ｃ１２０Ｈ１８８Ｎ２０Ｏ３６Ｓに対し計算）及び副ピーク（ｔＲ  ９．３分間；ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝２４７８［Ｍ−４２＋Ｈ］＋）はそれぞれ、期待した生成物及び副生成物に相応することが見出された。この質量差は、１つのアセチル保護基の、Ａｓｎ（Ａｃ3ＡｃＮＨ−β−Ｇｌｎ）からの欠失のためであった。
【０１１５】
ｃ）環化
骨格環化を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の０．９ｍＭのペプチド濃度で、ＰｙＢＯＰ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ（１．５：１．５；３．５ｅｑ）の存在下で達成した。この塩基を、１時間にわたり一部ずつ添加した。この線形ペプチドから環形への変換は、分析ＨＰＬＣにより観察され、２．５ｈ後に完了した。この反応混合物を乾燥させ、この残留物を破砕し、氷冷したジエチルエーテルで洗浄して、ＤＭＦの痕跡量をＴＦＡ開裂の前に除去した。
【０１１６】
ｄ）前記側鎖保護基の開裂
酸不安定性の側鎖保護基を、前記環式ペプチドを氷冷した１０ｍｌのＴＦＡ／トリイソプロピルシラン（ＴＩＳＨ）／Ｈ２０（９０：５：５）中に溶解することで除去した。２ｈの振盪後、前記ＴＦＡを減圧下で除去し、この油性残留物を、少量のＭｅＯＨで希釈し、この粗生成物を氷冷したジエチルエーテルで沈殿させた。この沈殿物を遠心分離により回収し、複数回氷冷したエーテルで洗浄し、最後に水を除いて凍結乾燥させた。前記粗グリコペプチドは、このトリアセチル化の形態に加えＬＣ−ＭＳによればジアセチル誘導体及びモノアセチル誘導体により汚染されているが、これをＭｅＯＨ中に懸濁し、ＮａＯＭｅを有する部分量で見かけｐＨ＞１０に達するまで３０分間処理した。前記反応をＨＰＬＣにより観察し、３．５時間後に、氷酢酸の添加によりｐＨ＜５になるまで急冷した。この混合物を乾燥させ、この固形物をＭｅＯＨ中に懸濁し、氷冷したジエチルエーテルで再沈殿させた。この沈殿物を濾過により回収し、かつ水を除いて凍結乾燥させた。この粗生成物を分取ＨＰＬＣにより精製し、この環式グリコペプチドを凍結乾燥物として単離した；収率：２０％収率（０．１３ｍｍｏｌの開始樹脂負荷に基づいて）；ＨＰＬＣ：＞９５％（ｔＲ  勾配２で７．３７分間）；ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝１６４２．８［Ｍ＋Ｈ］＋；Ｍ＝１６４１．８Ｄａ（Ｃ７１Ｈ１０８Ｎ２０Ｏ２５に対して計算して）。
【０１１７】
ＦｃγＲＩＩｂ−ＣＤＥ（１２６〜１３７）を産出するためのＣＤＥ（１２６〜１３７）の、ＦｃγＲＩＩｂに対するカップリング
１００μｌのヒトの可溶性ＦｃγＲＩＩｂ（１０．６ｍｇ／ｍｌ）を１４９０μｌの５０ｍＭのホウ酸（ｐＨ１０）及び４１０μｌの前記グリコペプチドＣＤＥ（１２６〜１３７）（２ｍｇ／ｍｌ）に添加し、室温で緩やかに撹拌した。１００μｌの０．３％グルタルアルデヒド溶液をゆっくりと添加し、１００μｌの１Ｍグリシンを添加する前にこの全体の混合物をまた２時間ＲＴで撹拌した。この生じるＦｃγＲＩＩｂ−ＣＤＥ（１２６〜１３７）をまた３０分間攪拌し、次いでＰＢＳで透析し濃縮した。
【０１１８】
実施例２
ＦｃγＲＩＩｂ−ＣＤＥ（１２６〜１３７）での免疫化
メスの六週齢のＣ５７Ｂ１／６マウスを腹腔内で、２週間毎に、１００μｌの完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ、Sigma/Deisenhofen, Germany）中の５０μｇのＦｃγＲＩＩｂ−ＣＤＥ（１２６〜１３７）のエマルションで３回免疫化した。この最後の免疫化後３週間マウスは、５０μｇのＦｃγＲＩＩｂ−ＣＤＥ（１２６〜１３７）でブーストさせた：３日後、脾臓をこの動物から除去し、この抽出した細胞と骨髄腫細胞との融合を、Bazin, 及びLemieux, 1989に従って実施した。
【０１１９】
実施例３
前記ハイブリドーマのＦｃγＲＩＩｂ−ＣＤＥ（１２６〜１３７）特異性に関するスクリーニング
ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンの存在下で成長できるクローンを単離し、この上清をＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験し、その際ＦｃγＲＩＩｂ−ＣＤＥ（１２６〜１３７）を、マイクロタイタープレート上で１ウェルにつき１２０ｎｇのｓＦｃγＲＩＩａ／ｂでプレコートした（１００μｌのＰＢＳ中で、２０℃、１２時間）。このプレートを洗浄し、ＰＢＳ／Ｔ（ＰＢＳ／０．２％のＴｗｅｅｎ２０、３０分間）でインキュベートした。１００μｌのそれぞれのハイブリドーマを、前記ウェルに添加した（１００μｌ、９０分間）。このプレートをブロッキングバッファーで、ＰＢＳ／Ｔ中で希釈した１００μｌのペルオキシダーゼラベル化ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体（Dianova, Hamburg/Germany）を添加する前に３回洗浄した。９０分間のインキュベーション及びＰＢＳ／Ｔでの引き続く洗浄後、１００μｌの基質バッファー（０．２Ｍクエン酸／リン酸バッファー、ｐＨ５．２、４ｍｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミン、０．０２４％（ｖ／ｖ）の過酸化水素）を前記ウェルに添加した。この反応を５０μｋの８Ｎ硫酸の添加により停止させ、４９０ｎｍでの吸光度をＥＬＩＳＡリーダーで測定した。
【０１２０】
このアッセイにおいて陽性であったクローンをフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で、１試料当たり１０５のラジ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８６）を用いて試験し、前記細胞はヒトＦｃγＲＩＩｂを強力に発現する。１００μｌのハイブリドーマ上清での３０分間の氷上でのインキュベーション後、前記細胞を１ｍｌのＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳで洗浄し、遠心分離（４００×ｇ、４℃、５分間）により沈殿させた。１００μｌのＦＩＴＣラベル化したヤギ抗ヒト抗体（Dianova, Hamburg/Germany）を添加した。３０分間の氷上でのインキュベーション後前記細胞を洗浄し（ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ）、フローサイトメトリー（FACSort, Becton Dickinson, Heidelberg/Germany）にかけた。この蛍光の中央値を、５０００個のカウントした細胞に対して、各試料に対して決定した。前記アッセイにおいて陽性であったハイブリドーマ上清を同様のアッセイに、ＦｃγＲＩＩａを強力に発現するＵ−９３７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５９３．２）を用いて受けさせ、前記ハイブリドーマのＦｃγＲＩＩｂ特異性を決定する。この両方の細胞系に対するポジティブコントロールとして、汎性のＦｃγＲＩＩ−ｍＡｂ  ＡＴ１０（Greenman et al., 1991）を使用した。
【０１２１】
実施例４
特異的な抗マウスＦｃγＲＩＩ抗体を用いたＳＪＬマウスの免疫化
ＳＪＬマウスを、２００μｇのＭＯＧで免疫化し、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）、多発性硬化症の樹立した動物モデルを誘発させた。特異的な抗マウスＦｃγＲＩＩ抗体（５０μｇ／週）を用いた一群につき８匹のマウスの予防性の、また同様に治療性の（データ示さず）処置は、この疾病の症状（臨床スコア）を著しく減少させた（０＝健康、１＝軽い麻痺、２＝中間的な麻痺、３＝強力に麻痺、４＝完全に麻痺、５＝死）。この結果は図８に示した。
【０１２２】
参考文献
【０１２３】
【表１】
2008502312.tif 000002
【０１２４】
【表２】
2008502312.tif 000003
【０１２５】
【表３】
2008502312.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】図１はヒトＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩａの細胞外ドメインの配列アラインメントを示す図である。
【図２】図２はリボン表示におけるＦｃγＲＩＩｂの構造を示す図である。
【図３】図３はラジ細胞（ＦｃγＲＩＩｂ陽性及びＦｃγＲＩＩａ陰性）（左図）又はＵ−９３７細胞（ＦｃγＲＩＩａ陽性及びＦｃγＲＩＩｂ陰性）（右図）のＦＡＣＳ測定を示す図である。
【図４】図４は通常の血清（ネガティブコントロール）、ＦｃγＲＩＩｂ−ＣＤＥ（１２６〜１３７）で免疫化したマウスの抗血清、ｍＡｂ  ＡＴ１０、又は特異的なモノクローナル抗体ＧＢ３のいずれかで、インキュベーションしたヒトの血液のＦＡＣＳ分析を示す図である。
【図５】図５はクローニングされた抗体ＧＢ３の可変領域を示す図である。
【図６】図６はクローニングされた抗体ＣＥ５の可変領域を示す図である。
【図７】図７は免疫化及びＦｃγＲＩＩｂに特異的な抗体の産生のために使用したグリコペプチドＣＤＥ（１２６〜１３７）を示す図である。
【図８】図８は特異的な抗マウスＦｃγＲＩＩｂ抗体でのＳＪＬマウスの免疫化を示す図である。
【図１】
2008502312.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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