(57)【要約】  ポリヌクレオチド配列が提供され、配列番号１に対して少なくとも７５％の同一性を有する核酸配列であって、組換え炭疽菌防御抗原（ｒＰＡ）をコードする核酸配列；または、該核酸配列のフラグメントであって、組換え炭疽菌防御抗原（ｒＰＡ）のフラグメントをコードするフラグメントを含む。また、本発明のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターおよび宿主細胞、ならびにｒＰＡまたはそのフラグメントを製造する方法が提供される。本発明はさらに、抗原性組成物および免疫応答を誘発するための対応する方法および使用を提供する。
2008504019.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に対して少なくとも７５％の同一性を有する核酸配列であって、組換え炭疽菌防御抗原（ｒＰＡ）をコードする核酸配列；または
該核酸配列のフラグメントであって、組換え炭疽菌防御抗原（ｒＰＡ）のフラグメントをコードするフラグメント
を含む、ポリヌクレオチド配列。
【請求項２】
前記核酸配列が、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項３】
前記核酸配列が、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する、請求項２に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項４】
前記組換え炭疽菌防御抗原（ｒＰＡ）のフラグメントが、配列番号５の少なくとも２００、好ましくは少なくとも３００、および最も好ましくは少なくとも４００のアミノ酸残基を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項５】
前記核酸配列のフラグメントが、請求項１に記載の核酸配列の少なくとも６００、好ましくは少なくとも９００、および最も好ましくは少なくとも１２００のヌクレオチドを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項６】
分泌配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１から５のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項７】
前記分泌配列が、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＴ、ｏｍｐＦ、ｐｅｌＢ、ｐｈｏＡ、ｌａｍＢ、βラクタマーゼ、黄色ブドウ球菌プロテインＡ、枯草菌エンドグルカナーゼ、マウスＲＮＡｓｅ、ヒト成長ホルモン、エンテロトキシンＳＴ−ＩＩ、ＬＴ−ＡもしくはＬＴ−Ｂ、およびｃｐｇ２（ｃｐｇ）から選択される、請求項６に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項８】
前記分泌配列が、発現されたポリペプチドの細菌宿主細胞の細胞質からのペリプラズム転位のためである、請求項６または請求項７に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項９】
前記分泌配列が、発現されたポリペプチドの細菌宿主細胞の細胞質からの細胞外転位のためである、請求項６または請求項７に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１０】
前記分泌配列が、ペリプラズム転位の間に前記発現されたポリペプチドから切り離され得る、請求項８に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１１】
前記分泌配列が、細胞外転位の間に前記発現されたポリペプチドから切り離され得る、請求項９に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１２】
前記分泌配列が、配列番号３によりコードされるｃｐｇ２（ｃｐｇ）リーダー配列である、請求項６から１１のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１３】
前記核酸またはそのフラグメントが３’末端および５’末端を有し、そして該核酸またはそのフラグメントが該５’末端に対してクローニングされたメチオニン残基をコードするコドンを有する、請求項１から１２のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１４】
前記核酸が配列番号７またはそのフラグメントであり、該フラグメントが配列番号７の５’末端コドンを含む、請求項１３に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１６】
ｒＰＡポリペプチドまたはそのフラグメントが高度に発現されることを確実にするように選択されるプロモーターを含む、請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
選択マーカーをさらに含む、請求項１５または請求項１６に記載の発現ベクター。
【請求項１８】
前記ベクターが、ｐＥＴベクター、ｐＴｒＫＨｉｓベクター、およびｐＭＴＬベクターから選択される、請求項１５から１７のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項１９】
前記プロモーターが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）プロモーターである、請求項１６から１８のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項２０】
前記ベクターが、化学誘導因子の不在下で前記ポリヌクレオチドを発現する、請求項１５から１９のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項２１】
前記発現ベクターが、配列番号３によりコードされるｃｐｇ２（ｃｐｇ）リーダー配列を含む、請求項１５から２０のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項２２】
前記ベクターが、配列番号４によりコードされるプラスミドｐＭＴＬ１０１５である、請求項１６から２１のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項２３】
前記ベクターが、ＥＣＡＣＣ番号０４０６１４０１で寄託されている、請求項１６から２１のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項２４】
請求項１５から２３のいずれかに記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２５】
前記宿主が大腸菌細胞である、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
前記大腸菌細胞が大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ番号３１６０８）である、請求項２５に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
ｒＰＡまたはそのフラグメントを製造する方法であって、請求項１から１４のいずれかに記載のポリヌクレオチドを発現させる工程を含む、方法。
【請求項２８】
前記ポリヌクレオチドが宿主細胞で発現される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡであり、そして必要に応じてインビトロにてＲＮＡにまず転写され、次いで該ＲＮＡが宿主細胞で翻訳される、請求項２７または請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記宿主細胞が大腸菌宿主細胞である、請求項２８または請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記大腸菌宿主細胞が大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ番号３１６０８）である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１５から２３のいずれかに記載の発現ベクターからｒＰＡを発現させる工程を含む、請求項２７から３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記発現ベクターが、配列番号３によりコードされるｃｐｇ２（ｃｐｇ）リーダー配列を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ベクターが、配列番号４によりコードされるプラスミドｐＭＴＬ１０１５である、請求項３２または請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ベクターが、大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ番号３１６０８）で発現される、請求項３２から３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記発現ベクターを宿主細胞に形質転換する工程、および増殖培地で該形質転換した宿主細胞を培養する工程の初期工程をさらに含む、請求項２８から３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記増殖培地が、動物製品を実質的に含まない、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記形質転換した宿主細胞を低温で培養する工程を含む、請求項３６または請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記宿主細胞を回収する工程をさらに含む、請求項３６から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記宿主細胞からｒＰＡを抽出する工程をさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
分離工程をさらに含む、請求項２７から４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記分離工程が、１つ以上のクロマトグラフィー工程および１つ以上の濾過工程から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記濾過工程の少なくとも１つがダイアフィルトレーション工程である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記クロマトグラフィー工程の少なくとも１つがイオン交換クロマトグラフィー工程および疎水性電荷クロマトグラフィー工程から選択される、請求項４２または請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
請求項２８から４４のいずれかに記載の方法であって、
（ａ）請求項１から１４のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは請求項１５から２３のいずれかに記載の発現ベクターを発現する宿主細胞を得る工程；
（ｂ）該宿主細胞から発現されたｒＰＡを抽出する工程；
（ａ）該抽出されたｒＰＡをダイアフィルトレーション工程に供する工程；
（ｂ）該ダイアフィルトレートされたｒＰＡを、アニオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性電荷クロマトグラフィーから選択される少なくとも１つのクロマトグラフィー工程に供する工程；および
（ｃ）さらなるダイアフィルトレーション工程を実施する工程
を含む、方法。
【請求項４６】
請求項２７から４５のいずれかに記載の方法により製造されたポリペプチドまたはそのフラグメント。
【請求項４７】
請求項１３または請求項１４に記載のポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドまたはそのフラグメント。
【請求項４８】
請求項１から１４のいずれかに記載のポリヌクレオチド；請求項１５から２３のいずれかに記載の発現ベクター；請求項２４から２６のいずれかに記載の宿主細胞；および請求項４６または請求項４７に記載のポリペプチド；の１つ以上を含むキット。
【請求項４９】
請求項４６または請求項４７に記載のポリペプチドを含む抗原性組成物。
【請求項５０】
炭疽菌による感染に対して免疫応答を誘発する方法であって、請求項４６または請求項４７に記載のポリペプチドまたは請求項４９に記載の抗原性組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項５１】
炭疽菌による感染に対して防御するための、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
炭疽菌による感染に対して免疫応答を誘発するための医薬の製造のための、請求項４６または請求項４７に記載のポリペプチドの使用。
【請求項５３】
炭疽菌による感染に対して防御するための、請求項５２に記載の使用。
【請求項５４】
配列番号４の配列を有するベクター。
【請求項５５】
ＥＣＡＣＣ番号０４０６１４０１またはＥＣＡＣＣ番号０４０５２５０１で寄託されたベクター。
【請求項５６】
実施例および図面を参照して本明細書中に実質的に記載される、ポリヌクレオチド。
【請求項５７】
実施例および図面を参照して本明細書中に実質的に記載される、ポリペプチド。
【請求項５８】
実施例および図面を参照して本明細書中に実質的に記載される、ベクター。
【請求項５９】
実施例および図面を参照して本明細書中に実質的に記載される、宿主細胞。
【請求項６０】
実施例および図面を参照して本明細書中に実質的に記載される、ｒＰＡを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え炭疽菌防御抗原（ｒＰＡ）をコードするポリヌクレオチドおよびベクター、ｒＰＡを製造する方法、および抗原性組成物（例えば、ワクチン）におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
炭疽菌（Bacillus anthracis）はグラム陽性胞子形成細菌であり、そして炭疽病の原因菌である。炭疽病は、家畜および陸生動物の疾患であり、感染動物製品との接触を通してヒトを罹患させ得る。肺においては、炭疽病は、大量の体液蓄積、組織腐敗、毒性ショック、および死亡を引き起こし得る。
【０００３】
炭疽ワクチンは、４０年にわたる間、本出願人によって製造されており、そして１９７９年以来、保健大臣により保持されるＵＫ薬品認可（ＰＬ１５１１／００３７）の主題である。しかし、その間に、製品の発展またはその製造プロセスの進展はほとんどなかった。
【０００４】
上記ワクチン調製物をここにより詳細に記載する。毒素産生性非莢膜形成炭疽菌34F2「Sterne」株の培養物［Sterne, M. (1939). Onderstepoort J. of Veterinary Science and Animal Industry, 13, 307-312頁を参照のこと］を、３７℃にてThompsonボトル中の部分限定培地で多数の５００ｍＬ容量にて、選択された培養ボトルのｐＨがｐＨ７．４を下回るまで増殖させる。
【０００５】
増殖期（約２４〜２８時間）の終わりに、これらの培養物を吸引により回収し、そしてこのプールされた上清液を濾過により滅菌する。硫酸アルミニウムカリウム溶液を添加し、そして得られた溶液を混合する。次いで、ｐＨを５．８〜６．２に調整し、そして生じた凝集物（「ミョウバン沈降」）を５℃にて１週間まで重力下で静置させる。
【０００６】
次いで、この沈降物を吸引により２０倍（容量）濃縮し、そして生理食塩溶液で１：４希釈して、炭疽ワクチン沈降物（ＡＶＰ）の「５倍」濃縮物を提供する。これは、ワクチン処方に用いられる抗原性組成物である。このワクチンは、ヒトに使用する前に力価および安全性について動物試験に供しているが、別個の日常的な生化学特徴づけを行っていない。
【０００７】
１つのさらなる無細胞炭疽ワクチンがヒトへの使用のために利用可能である。このワクチンは、米国で製造され、そして異なる炭疽菌株を用いて嫌気的に増殖していることを除いて、ＰＬ１５１１／００３７で利用可能なものと広く類似している。このプロセスは発酵槽ベースであり、そして培養濾液を水酸化アルミニウム懸濁液に対して吸着させる。
【０００８】
他の利用可能なワクチンは、弱毒化した生胞子懸濁液を含む。しかし、弱毒化した病原体に伴う固有の危険性のために、これらのワクチンは、通常、非ヒト使用に制限される。
【０００９】
炭疽菌毒素は、防御抗原（ＰＡ）、浮腫因子（ＥＦ）、および致死因子（ＬＦ）として公知の３つの異なるポリペプチドからなる。毒素成分は、ＰＡおよびＥＦの特定の二成分組合せで作用して浮腫毒素（ＥＴ）を形成し、組織浮腫を引き起こし、そしてＰＡおよびＬＦの特定の二成分組合せで作用して致死毒素（ＬＴ）を形成し、実験動物に対して致死となり、単球およびマクロファージ細胞の溶解を引き起こす。致死毒素は、末梢マクロファージおよび他の細胞に対するその細胞傷害性効果の結果として炭疽病関連死の主要な原因であるとみなされている。
【００１０】
ＰＡは、標的細胞結合部分として作用し、そして細胞会合プロテアーゼ（フリン）による部位特異的Ｎ末端活性化後、オリゴマー化して、ＥＦおよびＬＦが競合する高親和性結合成分を提供する。活性化されたＰＡへのＥＦまたはＬＦの結合後、生じるＥＴまたはＬＴの複合体は、酸性エンドソームコンパートメントによって内在化されるようになり、そして毒素因子ＥＦおよびＬＦは、それにより標的細胞のサイトゾルに送達される。
【００１１】
ＥＦは、カルシウム依存性およびカルモジュリン依存性アデニリルシクラーゼであり、これは、細胞内ＡＴＰからｃＡＭＰへの変換を触媒する。ＥＦは、種々の細胞内シグナル伝達経路で活性であり、そしてそれにより種々の細胞プロセスを中断し得る。
【００１２】
ＬＦは、Ｚｎ２＋依存性メタロプロテアーゼである。二重特異性のマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼＭＡＰＫＫ／１および２、ＭＥＫ−１およびＭＥＫ−２ならびにおそらく他のタンパク質を切り離しそして不活性化する。
【００１３】
ヒトへの使用のための炭疽ワクチンに関するインビトロまたはインビボにて公開されたデータの概括は、以下の通りである：
１．これまで、全ての有効な炭疽ワクチンはＰＡ（すなわち、８３ｋＤａプロ型またはその活性化された６３ｋＤａ誘導体のいずれか）を含むかまたは生産する。実際、現行の定説は、有効な炭疽ワクチンの製造のためにＰＡが必要であり、それのみで十分であるというものであり、このようなワクチンを開発する試みが進行中である［例えば、Baillie, L.(2001), 91, 609-613頁を参照のこと］；
２．非莢膜形成毒素産生性生胞子ワクチンは、認可された無細胞ワクチンよりも、これまで試験された全ての炭疽菌株に対してより高い程度の防御を引き起こす［Little, S. F. (1986) Inf. and Immunol. 52巻, 2号, 509-512頁を参照のこと］；
３．現行の無細胞ワクチンは、一般に定義が不十分であり、バッチ毎で有効性が大きく変動し得る。したがって、各バッチが、ヒトへの使用の前に動物モデルにおける効力について個々に試験されなければならない；
４．現行の無細胞炭疽ワクチン製造プロセスは、製造プロセスおよび最終製品の梱包の完了時にのみ評価される。したがって、ワクチン材料のいずれか１つのバッチが検証試験基準に合わない場合、寄与因子は容易に同定できない。このような因子は、製造バッチ間で異なり得、そしてこの理解に欠けることにより、製造プロセスで遭遇する困難性が悪化される；
５．現行の無細胞ワクチンのあまり十分に定義されていない性質の結果として、これらのワクチンは、ＬＦおよび／またはＥＦと共に多量のＰＡを含有し得る。このことにより、６３ｋＤａ型へのＰＡのインビボ（もしくはインビトロ）での活性化に際して、ＬＴおよびＥＴを形成してワクチンの受容者に副作用を生じさせ得る。もちろん、このようなワクチンはまた、他の炭疽菌タンパク質（分泌産物および溶解産物ともに）、ペプチドグリカン、核酸および炭水化物を含み得、これらは、防御効力を損ない得る；
６．現行の無細胞ワクチン組成物は、ＬＦ、ＰＡ、およびＥＦ濃度が非常に変動し得、そのためいくつかの調製物からＥＦがなくなり得る；および
７．現行の無細胞組成物は、総タンパク質含有量が非常に変動し得る。したがって、所定の組成物中に存在する毒素成分の濃度は、顕著に変動し得る。したがって、これにより、ヒトでの効力および潜在毒性に影響を及ぼし得る。
【００１４】
最近の数年にわたって、炭疽病分野で目立った学術的研究があった。Sharmaら(1996)は、大腸菌からの天然型ＰＡの発現を記載している。外膜タンパク質Ａ（ＯｍｐＡ）のシグナル配列をＰＡ遺伝子の５’末端に付加し、そして大腸菌ペリプラズム腔からのタンパク質の精製を可能にした。さらなる研究により、ＰＡの天然型結合部位および転位ドメインの同定が可能になった［Bhatnagas, R. (2001) Critical Rev. in Microbiol., 27 (3), 167-200頁；およびBatra, S. (2001) Biochem. and Biophys. Res. Comm., 281, 186-192頁を参照のこと］。したがって、ＰＡの構造および結合／転位ドメインは十分に記載されている。
【００１５】
近年、第二世代「組換え」炭疽ワクチンが、The Ohio State University Research Foundationによって提唱されている［ＷＯ０１／４５６３９；およびPrice, B.M. (2001) Inf. and Immun., 69巻, 7号, 4509-4515頁を参照のこと］。記載のワクチンは、ＰＡおよびＬＦに基づいており、ＬＦ分子は、亜鉛メタロプロテアーゼ陰性であるように改変されている。したがって、記載のＰＡおよびＬＦ成分は、互いに十分に結合してＬＴ分子を形成し得るが、生じるＬＴ分子は、ＬＦ成分と共に存在する活性亜鉛メタロプロテアーゼ機能がないので、細胞傷害性ではない。
【００１６】
Ahuja Nidhiら, Biochem. and Biophys. Research Communications, 287巻, 2号, 2001年9月21日, 542-549頁は、オリゴマー化が損なわれているＰＡ変異体、およびそれらのワクチン候補体としての潜在性を記載している。
【００１７】
Batra Smritiら, Biochem. and Biophys. Research Communications, 281巻, 1号, 2001年2月16日, 186-192頁は、ＰＡの膜挿入および／またはサイトゾルへのＬＦ／ＥＦの転位に役割を有し得る変異した残基を有するＰＡ変異体を記載している。
【００１８】
ＷＯ０２／０４６４６は、免疫応答を生じ得るＰＡポリペプチドドメインを記載している。ＰＡポリペプチドは、大腸菌で生産され、そして封入体の形態で蓄積する。
【００１９】
ＤＮＡベースの炭疽ワクチン組成物が、ＷＯ２００４／０２４０６７に記載されている。このワクチン組成物は、真核生物宿主（例えば、ワクチン組成物が投与される患者）での発現を最適化するように改変された炭疽菌核酸を含む。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
バイオテロリズムおよび生物戦の脅威が増大しつつあることを考慮して、代替の炭疽ワクチン、および上記課題の１つ以上を解決したワクチンが必要である。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
したがって、本発明の第一の局面によれば、配列番号１に対して少なくとも７５％の同一性を有する核酸配列であって、組換え炭疽菌防御抗原（ｒＰＡ）をコードする核酸配列；または該核酸配列のフラグメントであって、組換え炭疽菌防御抗原（ｒＰＡ）のフラグメントをコードするフラグメントを含む、ポリヌクレオチド配列が提供される。
【００２２】
この点において、配列番号１は、ｒＰＡをコードする改変型核酸を表している。配列番号１の配列は、本明細書中で配列番号２として提供される、ＰＡをコードする野生型炭疽菌核酸配列に対して約７０％同一である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明者らは、野生型ＰＡ核酸配列（配列番号２）を改変することにより、ｒＰＡタンパク質の発現レベルが顕著に改善され得ることを見出した。したがって、本発明は、ｒＰＡポリペプチドをコードする非天然核酸配列に関する。特に、非天然核酸配列は、異種系、例えば、異種細菌系、例えば、大腸菌で発現されるｒＰＡの発現レベルを増大するように選択される。好ましくは、本発明の改変型非天然核酸配列（またはそのフラグメント）から発現される、ｒＰＡポリペプチドまたはそのフラグメントは、等しい条件下で野生型核酸配列から発現されるよりも少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％高いレベルで発現される。
【００２４】
本発明のポリヌクレオチドは、ｒＰＡ（またはそのフラグメント）をコードする核酸配列（またはそのフラグメント）を含む。このｒＰＡをコードする核酸配列（またはそのフラグメント）を、本明細書中ではｒＰＡ核酸（またはそのフラグメント）という。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、ｒＰＡ核酸と加えて他のコード配列および／または非コード配列を含み得る。例として、本発明のポリヌクレオチドに含まれ得る非コード配列は、プロモーター配列および転写／翻訳開始および終結配列を含む。
【００２５】
この点において、本発明のｒＰＡ核酸配列は、コードされたポリペプチドの同じ翻訳アミノ酸配列を生じる多数の改変を包含し得る。核酸配列を改変する場合に多数の因子が考慮されるべきである。例えば、利用可能な縮重度、コドン用法、および推定ＲＮＡ二次構造の考慮。例えば、多くのアミノ酸が、遺伝暗号の「縮重」によって、１つより多くのコドンによって指定される。より詳細には、アラニンは４つの異なるトリプレットによってコードされ、セリンは６つの異なるトリプレットによってコードされる。この縮重は、ＤＮＡ塩基組成が、ＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく広範囲にわたって変動することを可能にする。
【００２６】
炭疽菌ＵＭ４４  ＰＡの野生型ポリペプチド配列が配列番号５に提供される（Vodkin, M.ら, Cell, 34: 693 (1983)；およびWelkos, S.ら, Gene, 69 (2): 287 (1988)もまた参照のこと）。
【００２７】
配列比較のために、代表的には、１つの配列を参照配列として、次いでこれに対して試験配列を比較し得る。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列をコンピューターに入力し、引き続き必要であれば座標を指定し、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定したプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一パーセントを算定する。
【００２８】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、SmithおよびWatermanの局所相同性アラインメントアルゴリズム［Adv. Appl. Math. 2: 484 (1981)］、NeedlemanおよびWunschのアルゴリズム［J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)］、PearsonおよびLipmanの類似性方法の検索［Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)］、これらのアルゴリズムのコンピューター実行（GAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA - Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705）、または可視検査［Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubelら編, Current Protocols, Greene Publishing Associates, In.およびJohn Wiley & Sons, Inc.の間の共同事業 (1995補遺) Ausubelを参照のこと］によって実施され得る。
【００２９】
配列類似性パーセントを決定するのに適したアルゴリズムの例は、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムである［Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410頁；および「http://www.ncbi.nlm.nih.gov/」、National Center for Biotechnology Informationを参照のこと］。
【００３０】
ポリペプチド相同性比較の１つの実施態様では、同一性は、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは少なくとも２０アミノ酸、より好ましくは少なくとも３５アミノ酸長である配列の領域にわたって存在する。好ましいポリペプチド相同性比較においては、同一性は、少なくとも１００アミノ酸、好ましくは少なくとも２００アミノ酸、より好ましくは少なくとも３５０アミノ酸長である配列の領域にわたって存在する。
【００３１】
本明細書全体にわたって用語「ペプチド」または「ポリペプチド」は、用語「タンパク質」と同義であり、産物の特定の長さをいうわけではない。これらの用語は、グリコシル化、アセチル化、およびリン酸化のような翻訳後改変を包含し得る。
【００３２】
本願を通してｒＰＡポリペプチド、ポリヌクレオチド、および核酸と呼ぶ場合、それらのフラグメント、改変体、および誘導体を包含する。
【００３３】
ポリペプチドの「フラグメント」との用語は、問題のポリヌクレオチドの産物である全長ポリペプチドの少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０、そして最も好ましくは少なくとも３５のアミノ酸残基からなるペプチドを意味する。フラグメントは、好ましくは、対応する全長ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープを含む。フラグメントは、対応する全長ポリペプチドの酵素分解から生じ得る。あるいは、対応する全長ポリペプチドのフラグメントは、対応する全長ポリヌクレオチドのフラグメントであるポリヌクレオチドを発現させることにより生産され得る。
【００３４】
好ましい実施態様では、ポリペプチド「フラグメント」は、対応する全長ポリペプチドのアミノ酸配列の長さの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、そしてより好ましくは少なくとも８０％であるアミノ酸長を有する。例えば、ポリペプチドフラグメントは、野生型ＰＡポリペプチド配列（配列番号５）の少なくとも２００、好ましくは少なくとも３００、最も好ましくは少なくとも４００のアミノ酸残基を含み得る。
【００３５】
本発明は、「改変体」を包含する。「改変体」の一例は、アミノ酸の１つ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸）または置換連結を含むペプチドまたはペプチドフラグメントである。さらなる実施態様では、「改変体」は、ペプチドまたはペプチドフラグメントの模倣物であり得、その模倣物は、ペプチドまたはペプチドフラグメントの少なくとも１つのエピトープを再生している。模倣物は、例えば、核酸模倣物、好ましくはＤＮＡ模倣物であり得る。
【００３６】
本発明はまた、「誘導体」を包含し、これは、問題のペプチド（またはフラグメント、またはそれらの改変体）を含むタンパク質を意味する。したがって、誘導体は、問題のペプチド、および１つ以上の付加エピトープを導入し得るさらなるペプチド配列を含み得る。このさらなる配列は、好ましくは、基本の折り畳みに干渉せず、したがって問題のペプチドの立体構造に干渉すべきでない。
【００３７】
「誘導体」の例は、融合タンパク質、結合体、およびグラフトである。したがって、２つ以上のペプチド（またはフラグメント、または改変体）が一緒に接合されて誘導体を形成し得る。あるいは、ペプチド（またはフラグメント、または改変体）が、関連のない分子（例えば、第二の関連のないペプチド）に接合され得る。誘導体は、化学合成され得るが、代表的には、組換え核酸方法によって調製される。脂質、および／または多糖、および／またはポリケチド成分のような付加成分が誘導体に含まれ得る。
【００３８】
「フラグメント」、「改変体」、および「誘導体」の分子の全ては、それらが由来する問題のポリヌクレオチドの産物と共通の抗原交差反応性および／または実質的に同じインビトロもしくはインビボでの生物学的活性を有する。例として、フラグメント、改変体、または誘導体に結合し得る抗体もまた、問題のポリヌクレオチドの産物に結合し得る。
【００３９】
フラグメント、改変体、または誘導体は各々、問題のペプチドの活性部位を有することが好ましい特徴である。あるいは、本発明のペプチドの上記実施態様の全てが、炭疽菌感染の抗原性成分に以前に曝露されたＴリンパ球の「リコール応答」を誘発する共通の能力を有している。
【００４０】
ｒＰＡペプチドフラグメント、改変体、または誘導体は、好ましくは、以下の特性の１つ以上を有する：ａ）細胞膜上のＰＡレセプターに結合し得る；ｂ）ＥＦおよび／またはＬＦに結合し得る；およびｃ）フリンプロテアーゼにより切断され得る。したがって、１つの実施態様では、本発明のペプチドのフラグメント、改変体、または誘導体は、ＷＯ０３／０３７３７０（本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、上記特性について簡易試験を実施することにより同定され得る。
【００４１】
本願において使用される用語ＤＮＡ「フラグメント」、ポリヌクレオチド「フラグメント」、および核酸「フラグメント」は、通常少なくとも約５のコドン（１５ヌクレオチド）、より通常には少なくとも約７〜１５のコドン、および最も好ましくは少なくとも約３５のコドンを含むポリヌクレオチドをいう。このヌクレオチド数は、通常、このような配列と（例えば、選択的なハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズがうまくいくプローブに必要とされるほぼ最小限の長さである。
【００４２】
好ましい実施態様では、ＤＮＡ「フラグメント」は、対応する遺伝子のコード配列の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、およびより好ましくは少なくとも８０％であるヌクレオチド長を有する。例えば、フラグメントは、本発明の全長ｒＰＡ核酸配列の少なくとも６００、好ましくは少なくとも９００、最も好ましくは少なくとも１２００のヌクレオチドを含み得る。
【００４３】
本発明は、ＤＮＡ「改変体」を包含する。ＤＮＡ改変体は、参照配列、例えば、対応する野生型（天然）遺伝子のコード配列（またはそのフラグメント）、に対して実質的な相同性または実質的な類似性を有するＤＮＡ配列である。核酸またはそのフラグメントは、他方の核酸（またはその相補鎖）と（適宜ヌクレオチド挿入または欠失を含めて）最適にアラインされる場合に、ヌクレオチド塩基の少なくとも約６０％、通常少なくとも約７０％、より通常には少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、およびより好ましくはヌクレオチド残基の少なくとも約９５〜９９％でヌクレオチド配列同一性がある場合、もう一方に対して「実質的に相同」（または「実質的に類似」）である。相同性決定は、ペプチドに対して上述したように実施される。
【００４４】
あるいは、ＤＮＡ「改変体」は、それが選択的ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る場合に、野生型（天然）遺伝子のコード配列（またはそのフラグメント）と実質的に相同（または実質的に類似）である。核酸ハイブリダイゼーションは、当業者によって容易に理解されるように、塩基組成、相補鎖の長さ、およびハイブリダイズ核酸間のヌクレオチド塩基ミスマッチ数に加えて、塩濃度（例えばＮａＣｌ）、温度、または有機溶媒のような条件によって影響される。好ましくは、ストリンジェントな温度条件が用いられ、そして一般に３０℃を超える温度、代表的には３７℃を超える温度、および好ましくは４５℃を超える温度を含む。ストリンジェントな塩条件は、通常１０００ｍＭ未満、代表的には５００ｍＭ未満、および好ましくは２００ｍＭ未満である。ｐＨは、代表的には７．０と８．３との間である。しかし、パラメーターの組合せが、任意の１つのパラメーターの基準よりもずっとより重要である。例えば、WetmurおよびDavidson (1968) J. Mol. Biol. 31:349-370を参照のこと。
【００４５】
ハイブリダイゼーションの選択性は、特異性が全体的に欠如するというよりも実質的に選択的であるハイブリダイゼーションが生じる場合に存在する。代表的には、選択的ハイブリダイゼーションは、少なくとも約１４ヌクレオチドのストレッチ（伸長部）にわたって少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約７５％、および最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性がある場合に生じる（Kanehisa (1984) Nuc. Acids Res. 12: 203-213を参照のこと）。記載のような相同性比較の長さは、より長い伸長部にわたり得、そして特定の実施態様では、しばしば、少なくとも約１７ヌクレオチド、通常には少なくとも約２０ヌクレオチド、より通常には少なくとも約２４ヌクレオチド、代表的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より代表的には少なくとも約３２ヌクレオチド、および好ましくは少なくとも約３６以上のヌクレオチドの伸長部にわたる。好ましい実施態様では、相同性比較の長さは、少なくとも約１７０ヌクレオチド、通常には少なくとも約２００ヌクレオチド、より通常には少なくとも約２４０ヌクレオチド、代表的には少なくとも約２８０ヌクレオチド、より代表的には少なくとも約３２０ヌクレオチド、および好ましくは少なくとも約３６０以上のヌクレオチドの伸長部にわたる。
【００４６】
本発明は、ＤＮＡ「誘導体」を包含し、これは、参照遺伝子（例えば、野生型炭疽菌ＰＡ遺伝子）のコード配列に対応するＤＮＡ配列（またはフラグメント、またはそれらの改変体）と、コード配列に対応するＤＮＡ配列に天然には付随していない付加ＤＮＡ配列とを含むＤＮＡポリヌクレオチドを意味する。上記ペプチド誘導体に関する説明はまた、ＤＮＡ「誘導体」にも適用される。「誘導体」は、例えば、オペロンの２つ以上のコード配列を含み得る。したがって、コード配列間の非コード領域の存在または不在に依存して、このような「誘導体」の発現産物は、融合タンパク質、または個々のコード領域によりコードされる別個のペプチド産物であり得る。
【００４７】
上の用語ＤＮＡ「フラグメント」、「改変体」、および「誘導体」は、得られるペプチド産物が、対応する野生型ペプチドと実質的に同じである交差反応抗原特性を有する点で互いに共通している。好ましくは、本発明の上記ＤＮＡ分子実施態様のペプチド産物の全てが、これもまた野生型ペプチドに結合する抗体に結合する。あるいは、上記ペプチド産物の全てが、炭疽菌感染の抗原性成分に以前に曝露されたＴリンパ球の「リコール応答」を誘発し得る。
【００４８】
したがって、ＤＮＡフラグメント、改変体、または誘導体は、例えば、上述の（およびＷＯ０３／０３７３７０に記載の）簡易試験を実施することにより、そのコードされたペプチド産物によって同定され得る。
【００４９】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１に対して少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および最も好ましくは９９％もしくは１００％の同一性を有する核酸；または当該核酸のフラグメントを含む。
【００５０】
１つの実施態様では、本発明のポリヌクレオチド配列は、分泌配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。分泌配列をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、ｒＰＡ核酸配列またはそのフラグメントの上流にクローニングされ、そして最も好ましくは、当該核酸配列またはそのフラグメントに作動可能に連結される。
【００５１】
分泌配列は、コードされたタンパク質を、細胞膜を横断させるおよび／または細胞膜に固着させて、これによりその機能的トポロジーを達成させるかまたは宿主細胞から分泌させ得る。この点において、分泌配列は、発現されたポリペプチドの宿主細胞（例えば、細菌宿主細胞）から細胞外環境への細胞外転位のためであり得る。あるいは、分泌配列は、発現されたポリペプチドの細菌宿主細胞の細胞質からペリプラズム腔へのペリプラズム転位のためであり得る。
【００５２】
分泌配列は、ペリプラズム転位の間または細胞外転位の間に発現されたポリペプチドから切り離され得ることが特に好ましい。これらの場合、ペリプラズム／細胞外ポリペプチドは、この配列を含まない。このような「切り離され得る」配列の一例は、シュードモナスカルボキシペプチダーゼＧ２リーダー配列（本明細書中、以降ではｃｐｇ２またはｃｐｇと称する）であり、これは配列番号３によりコードされる。
【００５３】
配列番号３に示すｃｐｇ２リーダー配列は、それがＮｄｅＩ部位で発現ベクターに挿入するための５’−ＮｄｅＩ制限部位およびｒＰＡ核酸配列またはそのフラグメント（好ましくは、同様のＭｓｃＩ部位が作製されている）との融合のための３’−ＭｓｃＩ部位を有するように設計されている。したがって、ｃｐｇ２リーダーは、発現されたｒＰＡタンパク質（またはそのフラグメント）が宿主細胞膜を通過するにつれてそれから切り離され、したがって、「トリミングされた」成熟ｒＰＡタンパク質またはそのフラグメントを細胞外環境またはペリプラズム腔に放出させる。
【００５４】
本発明に使用される他の適切な分泌配列は、Watson (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 12巻: 5145；およびMakrides (1996) Microbiological Reviews 60: 512-538に記載されており、そして該分泌配列には、ｏｍｐＡ（Denefleら (1989) Gene 85: 4990-510；およびGhrayebら (1984) EMBO J. 3: 2437-2442.）；ｐｅｌＢ（Betterら (1988) Science 240: 1041-1043；およびLeiら (1987) J. Bacteriol. 169: 4379-4383）；それらの縮重型を含む−Le Calvezら (1996) Gene 170: 51-55を参照のこと；ｐｈｏＡ（Denefleら (1989) Gene 85: 499-510；およびOkaら (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 82: 7212-7216）；ｏｍｐＴ（Johnsonら (1996) Protein Expression Purif. 7: 104-1123）；ｌａｍＢ（HoffmanおよびWright (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 82: 5107-5111）；ｏｍｐＦ（HoffmanおよびWright (1985)）；βラクタマーゼ（Kadonagaら (1984) J. Biol. Chem. 259: 2149-2154；およびVilla-Komaroffら (1977) Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 75: 3727-3731）；黄色ブドウ球菌プロテインＡ（Abrahmsen (1986) Nucl. Acids Res. 14: 7487-7500；およびMacyntyreおよびHenning (1990) Biochimmie 72: 157-167）；枯草菌エンドグルカナーゼ（Proudfootら (1996) J. Biol. Chem. 271: 2599-2603）；マウスＲＮＡｓｅ（Scheinら (1992) Biochem. J. 283: 137-144)；ヒト成長ホルモン（Grayら (1985) Gene 39: 247-254）；およびエンテロトキシンＳＴ−ＩＩ、ＬＴ−ＡおよびＬＴ−Ｂ（Fujimotoら (1988) J. Biotechnol. 8: 77-86；およびMorioka-Fujimotoら (1991) J. Biol. Chem. 266: 1728-1732）が含まれる。
【００５５】
１つの実施態様では、本発明のポリヌクレオチド配列は、３’末端および５’末端を有する、本発明の核酸またはそのフラグメントを含み、そして当該核酸またはそのフラグメントは、５’末端に対してクローニングされたメチオニン残基をコードするコドンを有する。例として、当該核酸は、配列番号７（または配列番号５の５’末端のｍｅｔをコードするコドンを含む配列番号７のフラグメント）であり得る。このメチオニンをコードするコドンは、大腸菌で発現される場合に最終の（シグナルのない）タンパク質の安定性を増大させるために付加される。したがって、本発明のこの特定の実施態様のポリヌクレオチドによりコードされるｒＰＡタンパク質は、Ｎ末端に追加のメチオニン残基を付加することにより、炭疽菌で天然に生産される野生型ＰＡタンパク質と区別される。
【００５６】
したがって、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントも提供する。したがって、本発明のポリペプチドは、ｒＰＡアミノ酸配列のＮ末端に付加された追加のメチオニン残基を有する、ｒＰＡをコードするアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み得る。
【００５７】
関連した局面では、本発明はまた、本発明のＤＮＡポリヌクレオチド配列または当該ＤＮＡ配列のフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体によりコードされる単離されたＲＮＡ分子を提供する。
【００５８】
本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターもまた、本発明の範囲内であると理解される。発現ベクターは、宿主細胞における異種核酸配列の発現に有用である。本明細書中で使用される用語「異種」は、目的のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が細胞中に天然には存在しないが、その細胞に例えば形質転換、トランスフェクション、注入などによって導入されていることを意味する。
【００５９】
発現ベクターは、一般には、適切な転写および翻訳調節エレメントに作動可能に連結された、ペプチドのコード領域を含む複製可能なポリヌクレオチド構築物である。発現ベクター中に通常含まれる調節エレメントの例は、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、ならびに転写および翻訳開始および終結配列である。これらの調節エレメントは、翻訳されるべき配列に作動可能に連結されている。核酸配列は、別の核酸配列と機能的に関係するように配置される場合、作動可能に連結されている。例えば、プロモーターは、そのプロモーターがその転写または発現に影響する場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結」とは、連結されているそれぞれのＤＮＡ配列が連続していること、および２つのタンパク質コード領域を接続することが必要である場合は、連続しておりかつ読み枠内にあることを意味する。ビルレンス因子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで用いられる調節エレメントは、発現のために使用される宿主細胞で機能的である。
【００６０】
発現ベクターは、化学誘導因子の不在下でポリヌクレオチドを発現すること、すなわち、化学誘導因子が発現ベクターからの発現の誘導に必要ではないことが好ましい。１つの実施態様では、ベクターは、ポリヌクレオチドを構成的に発現し、遺伝子発現の誘導は必要とされない。別の実施態様では、ベクターは、環境上の刺激（１つまたは複数）に応答してポリヌクレオチドを発現する。このような刺激は、例えば、飢餓または栄養素もしくは酸素の制限であり、例えば、１つまたは複数の成分が増殖培地で消尽されるようになる場合である。
【００６１】
用語「プロモーター」は当該分野で周知であり、比較的単純な最小限のプロモーターから、上流エレメントおよびエンハンサーを有する複雑なプロモーターまでを包含する。原核生物および真核生物宿主細胞における発現に適切なプロモーターは当該分野で周知であり、そして例えば、Molecular Cloning. A laboratory Manual（Sambrookら, 第２版, 1989）およびCurrent Protocols in Molecular Biology（Ausubelら編, 1994）に記載されている。
【００６２】
適切なプロモーターおよび他の必要なベクター配列が、宿主において機能的であるように選択される。例として、ｔｒｐ、ｌａｃ、およびファージプロモーター（例えばＴ７、Ｔ４、ラムダ、ｆｄ）、ｔＲＮＡプロモーター、および解糖酵素プロモーターのようなプロモーターが原核生物宿主において用いられ得る。発現ベクターは、「強力」なプロモーター、すなわち、コードされるｒＰＡポリペプチド（またはそのフラグメント）が高度に発現されることを確実にするように選択されるプロモーター、を含むことが好ましい。強力なプロモーターの例は、ｒｅｃＡ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、Ｔ７、ｔａｃなどを含む。この点において、ポリペプチドは、総宿主細胞可溶性タンパク質の２０％を上回る、好ましくは３０％を上回る、より好ましくは４０％を上回る、および最も好ましくは５０％を上回る総宿主細胞可溶性タンパク質のレベルで発現される場合に「高度に発現」されるといわれる。本発明に従って使用される好ましい「強力なプロモーター」は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）プロモーター（ＣＡＭＲ所有；米国特許第５，６７０，３３３号）である。
【００６３】
発現ベクターは、選択マーカー、すなわち、ベクターで形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。この遺伝子の存在は、所望のベクターを含みそして選択マーカーを発現している宿主細胞のみが選択培地上で増殖することを確実にする。代表的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒性物質、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、ネオマイシン、メトトレキセートなど、に対する耐性を付与するタンパク質；（ｂ）栄養要求性欠乏を補充するタンパク質；または（ｃ）複合培地から利用できない必須栄養素を供給するタンパク質をコードする。適切なベクターおよび適切な選択マーカーの選択は、宿主細胞に依存し、そして当業者の能力の範囲内で十分に行われる。
【００６４】
発現ベクターは、代表的には、宿主細胞における核酸の効率的な発現に必要である付加エレメントの全てを含む。細菌における異種タンパク質の発現に適切なベクターの例は、ｐＥＴベクター（例えば、pET26b-Novagen）およびｐＴｒＫＨｉｓ（Invitrogen）を含む。これらのベクターの両方ともが、大腸菌での核酸の高レベルの発現を達成する。
【００６５】
ｐＭＴＬ発現ベクターは、それらが高レベルの組換えタンパク質を生じ得、そして抗生物質を用いる選択圧がない場合でさえ非常に安定であり得るので有利である。さらに、非常に強力な大腸菌リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）プロモーターに基づくｐＭＴＬベクターは、外因性誘導化学物質を用いる発現の誘導を必要としない（Alldreadら (1992) Gene 14: 139-143）ので特に有利である。調節のために外因性化学誘導因子を必要としないことは有利である。なぜなら、いかなる化学誘導因子も、患者への投与前に最終産物から厳密にかつ首尾よく取り除かれねばならないからである。
【００６６】
特に好ましい実施態様では、発現ベクターは、高コピー数プラスミドでもあり、例えば、ｐＭＴＬ１０１５（Chambersら (1988) Gene 68: 139-149）である。ｐＭＴＬ１０１５は、ｐＭＴＬ４の誘導体であり、それはＣｏｌＥ１レプリコンの変異体から複製し（１細胞当たり６００コピー；Mintonら (1988) Focus 10: 56）、そして配列番号４によりコードされている。プラスミドｐＭＴＬ１０１５は、Brehmら (1991) Appl. Microbiol Biotechnol 36: 358-363により記載されるようにｐＭＴＬ１００３に対して本質的に同一であり、そして多数の有利な特徴を有する。例として、ｐＭＴＬ１０１５は、ｔｒｐプロモーターが非常に強力なｍｄｈプロモーター（Alldreadら(1992) Gene 14: 139-143）と置換されておりそしてアンピシリン耐性遺伝子がｐＢＲ３２２のテトラサイクリン耐性遺伝子（Bolivarら (1977) Gene 2: 95）と置換されている点でｐＭＴＬ１００３とは異なる。このプラスミドはまた、ｐＳＣ１０１分配機能（ｐａｒ；Millerら (1983) Gene 24: 309-315）、ｒｒｎＢ二重終結因子（Brosiusら (1981) J. Mol. Biol. 148: 107-127）およびｐＭＴＬ２０ポリリンカークローニング領域（Chambersら, 1988）もまた組み込んでいる。ｐａｒ遺伝子座は、プラスミドに良好な分離安定性を与え、プラスミドを欠損することなく抗生物質非含有発酵を可能にし、そしてテトラサイクリン耐性マーカーは、生物薬剤学的に受容可能な薬物である。
【００６７】
本発明での使用に適した発現ベクターの例は、ＥＣＡＣＣ番号０４０６１４０１で寄託されているべクターである。
【００６８】
本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターの例は、ｐＭＴＬ１０１５−ｃｐｇ−ＰＡ−ｓｙｎｔ（ＥＣＡＣＣ番号０４０５２５０１で寄託）である。
【００６９】
目的の核酸を含むベクターがインビトロで転写されて、そして生じるＲＮＡが宿主細胞に（例えば、注入により）導入され得るか、あるいはベクターは、細胞宿主のタイプに依存して変動する方法によって宿主細胞に直接導入され得、この方法には、エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を用いるトランスフェクション； マイクロプロジェクタイルボンバードメント；リポフェクション；感染（ベクターが感染因子（例えば、レトロウイルスゲノム）である場合）が含まれる。用語「宿主細胞」は、このような細胞の子孫を包含することが意図される。
【００７０】
したがって、本発明はまた、上記のような発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。宿主細胞は、細菌細胞、特に大腸菌細胞、例えば、大腸菌株ＤＨ５、ＢＬ２１、およびＨＭＳ１７４（Invitrogen）であることが好ましい。
【００７１】
細菌細胞（例えば、大腸菌株）がプロテアーゼ欠損株であることが特に好ましい。なぜなら、ｒＰＡタンパク質は、プロテアーゼ感受性タンパク質であると一般に考えられているからである。大腸菌のプロテアーゼ欠損株の一例は、大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ番号３１６０８）である。
【００７２】
また、本発明によって、ｒＰＡを製造する方法が提供され、この方法は、本発明のポリヌクレオチドを発現させる工程を含む。
【００７３】
１つの実施態様では、ポリヌクレオチドは、宿主細胞において発現、すなわち、転写および翻訳される。別の実施態様では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであり、これがインビトロでＲＮＡに転写され、次いでこのＲＮＡが宿主細胞でタンパク質に翻訳される。宿主細胞は、細菌細胞であり得、例えば、大腸菌宿主細胞であり得る。大腸菌宿主細胞は、好ましくは、プロテアーゼ欠損株であり、例えば、大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ番号３１６０８で寄託）である。
【００７４】
好ましい実施態様では、ｒＰＡは、上記のような本発明の発現ベクターから宿主細胞で発現される。この実施態様では、本方法は、以下の特徴の少なくとも１つ、好ましくは２つ、最も好ましくは全てを組み込み得る：（ｉ）発現ベクターは、配列番号３によりコードされるｃｐｇ２リーダー配列を含む；（ii）ベクターはプラスミドｐＭＴＬ１０１５（配列番号４によりコードされる）である；および（iii）ベクターは、大腸菌宿主細胞、例えば大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ番号３１６０８）で発現される。
【００７５】
１つの実施態様では、本方法は、目的のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主細胞、例えば、大腸菌宿主細胞に形質転換する工程、および適切な増殖培地で該形質転換した宿主細胞を培養する工程の初期工程を含む。
【００７６】
必要に応じて、培養は、選択圧下で実施され、例えば、抗生物質（例えば、テトラサイクリン）の存在下で実施され、この場合、発現ベクターが抗生物質に対する耐性を付与する選択マーカーを含むことが有利である。
【００７７】
培養物中の栄養素、ｐＨ、および／または酸素レベル（溶存酸素圧−ＤＯＴ）を調節するために、培養パラメーターは調節され得る。例えば、ＤＯＴは、攪拌、逆圧、スパージング気流、および／または酸素補充によって調節され得る。ＤＯＴが４０％を上回るように維持されることが好ましい。
【００７８】
宿主細胞が増殖される温度は、培養物から精製され得るタンパク質のレベルに関して効果を有し得る。例えば、タンパク質発現速度およびタンパク質分解速度（例えばプロテアーゼ活性に起因する）はともに、抽出され得るタンパク質の量に影響し得る。本願のポリヌクレオチドを含む培養宿主細胞を低温（例えば、４０℃よりも低い）で増殖させることにより、ｒＰＡ発現および安定性の受容可能なレベルが生じることが見出された。したがって、本発明の１つの実施態様では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、発現ベクター）を含む宿主細胞を、４０℃未満；好ましくは３７℃未満；より好ましくは３５℃未満；より好ましくは約３０℃；および最も好ましくは２５〜３０℃、例えば、２９℃、２８℃、２７℃、２６℃、および２５℃で培養する。これらの低温で宿主細胞を培養することは、ｒＰＡ発現の速度を低下させ得るが、これは、高レベル発現ベクター（例えば、プラスミドｐＭＴＬ１０１５）を発現に用いる場合に有用であり得る。
【００７９】
動物製品（すなわち、動物に由来する製品）を含まない増殖培地が用いられることが好ましい。なぜなら、これが、注射用製品の規制に適合するために有利であるからである。適切な培地の例は、フィトンペプトンベースのTerrific Broth、およびダイズペプトンベースのＬ−ブロスを含む。
【００８０】
増殖培地へのポリペプチドの細胞外分泌を可能にする分泌配列が用いられる場合、ポリペプチドを抽出するために、増殖培地が回収されて、そしてさらなる精製工程に供され得る。
【００８１】
あるいは、分泌配列が細菌ペリプラズムへのポリペプチドの分泌を可能にする場合、ポリペプチド産物は細胞内である。この場合、細胞からポリペプチドを抽出するためには、細胞が培養培地から回収されて（例えば、遠心分離により細胞ペーストとして）、そしてさらなるプロセシングに供されなければならない。ポリペプチドの精製のために細胞培養物（例えば、細菌培養物）を回収するための適切なプロトコルは、当該分野で周知であり、そしてSambrookら (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press；およびSambrookおよびRussell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第３版, Cold Spring Harbor Laboratory Pressのような一般の実験書に見出され得る。
【００８２】
代表的には、細菌細胞が、核酸またはポリペプチドのいずれかの抽出のために、遠心分離により回収され得る。タンパク質精製のために、遠心分離により培養細胞を回収するために選択される条件は、標的タンパク質を損傷しないように、一般に、核酸の抽出よりも穏やかである。例えば、標的ポリペプチドの抽出のための細菌細胞の回収は、４，０００〜５，０００ｇでの１０〜１５分間の遠心分離により４℃にて実施され得る。
【００８３】
本方法は、必要に応じて、さらなるプロセシングの前に、所望のポリペプチドの存在および／または収量を確認する試験工程をさらに含む。１つの実施態様では、ＥＬＩＳＡベースの試験が実施される。
【００８４】
発酵（細菌増殖および回収）および任意の試験プロトコルに従って、本方法は、単離精製されたｒＰＡタンパク質を得るために、下流プロセシング工程をさらに含み得る。
【００８５】
本発明において使用される下流プロセシング工程は、好ましくは、以下の目的の１つ以上を達成する：
先行技術の方法と比較して、必要とされるクロマトグラフィー工程の数を減少する；
いくつかの（好ましくは全ての）クロマトグラフィー工程でグラジエント溶出ではなく段階溶出を使用する；
先行技術の方法と比較して、クロマトグラフィー前の一次プロセシングのレベルを増大させる；
可能であれば条件剤（例えば、ヌクレアーゼ）の添加の必要性を取り除く；
少なくとも１００Ｌの発酵スケールにまでスケールアップし得る技術を用いる；および
ｃＧＭＰと適合する技術を用いる。
【００８６】
精製手順は、先行技術の方法に比較して、プロセスの時間および容量を減少させ、そして／またはプロセスの効率を増大させていることが好ましい。本発明では、透析／緩衝液交換工程の数が、好ましくは、例えば、高伝導度のプロセス流れを生じる工程と高伝導度出発材料を必要とする工程とを連結する（例えば、硫酸アンモニウム沈殿またはイオン交換クロマトグラフィー後に疎水性相互作用クロマトグラフィーを行い得る）ことにより、最小限にされる。
【００８７】
下流プロセシングプロトコルは、ｒＰＡポリペプチドを含有する粗混合物を用いて出発する。ｒＰＡポリペプチドが宿主細胞内（例えば、細菌宿主細胞ペリプラズム内）に位置する場合、細胞は、ｒＰＡポリペプチドを抽出するために処理されなければならない（例えばホモジナイゼーションによる）。
【００８８】
本方法は、抽出されたｒＰＡポリペプチドで実施される、少なくとも１つの分離工程をさらに含むことが好ましい。本方法に含まれ得る分離工程の例は、濾過工程（例えば、ダイアフィルトレーション工程）およびクロマトグラフィー工程である。１つの実施態様では、本方法は、少なくとも１つのクロマトグラフィー工程および少なくとも１つの濾過工程を含む。
【００８９】
本方法の特に好ましい実施態様では、抽出されたｒＰＡポリペプチド（核酸、他のタンパク質、および細胞破片のような望ましくない成分と共に）がダイアフィルトレーション（例えば、接線フローダイアフィルトレーション）に供される。この工程の目的は、続く分離工程（例えば、クロマトグラフィー工程）の準備において、荷電分子の負荷を変更することである。ダイアフィルターは、特定の分子量を上回る分子（例えば、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、または５０ｋＤａを上回る）を保持し、そして溶解した物質および特定分子量を下回る物質はフィルターを通過させる。したがって、本方法は、ダイアフィルトレーション工程である少なくとも１つの濾過工程を含むことが好ましい。
【００９０】
クロマトグラフィー工程は、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｑ−セファロースアニオン交換カラムを用いる）および疎水性電荷クロマトグラフィー（例えば、メルカプロエチルピリジンハイパーセルカラムを用いる）を含み得る。適切なクロマトグラフィー技術の他の例は、当該分野で公知であり、そして当業者に日常的に利用され得る。したがって、本方法は、少なくとも１つのイオン交換クロマトグラフィー工程および少なくとも１つの疎水性電荷クロマトグラフィー工程を含み得る。
【００９１】
１つの実施態様では、ｒＰＡポリペプチドが大腸菌宿主細胞で発現されている場合、ｒＰＡポリペプチドと付随した大腸菌エンドトキシンが残存し得、そしてこれは、必要に応じて、（さらなる）分離工程によってｒＰＡポリペプチドから分離され得る。１つの実施態様では、エンドトキシンの分離は、毒素が付着する荷電フィルターを用いて、濾過によって達成され得る。
【００９２】
したがって、特定の実施態様では、ｒＰＡを製造する方法は、本発明のポリペプチドを発現する宿主細胞を得る工程；該宿主細胞から発現されたｒＰＡを抽出する工程；該抽出されたｒＰＡをダイアフィルトレーション工程（例えば、３０ｋＤａでの接線フローダイアフィルトレーション）に供する工程；続いて、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性電荷クロマトグラフィーから選択される少なくとも１つのクロマトグラフィー工程；次いでさらなるダイアフィルトレーション工程（これは、より高い分子量カットオフ（例えば、４０ｋＤａまたは５０ｋＤａ）であり得る）；および必要に応じてさらなる濾過工程で残渣タンパク質および／または細菌エンドトキシンを除去する工程を含む。
【００９３】
本発明の１つの実施態様では、高レベル遺伝子発現（強力プロモーターを含むプラスミド）、ペリプラズム転位（分泌配列）、核酸配列改変（ｒＰＡ核酸配列）、および効率的な下流プロセシングを組み合わせることにより、先行技術で以前に得られた収量よりも１０〜２０倍上回るｒＰＡタンパク質収量の増大が得られる。
【００９４】
さらに、本発明の下流のプロセシング工程により、７０％より高い、好ましくは８０％より高い、９０％より高い、または９５％より高い、およびより好ましくは９８％より高い純度を有するｒＰＡタンパク質が得られ得る。
【００９５】
ポリペプチドの純度または均一性は、例えば、タンパク質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動、引き続きゲルを染色した際の単一のポリペプチドバンドの可視化によって示され得る。あるいは、より高い分離度が、例えば、ＨＰＬＣを用いることにより、提供され得る。
【００９６】
所望であれば、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列は、タンパク質配列決定方法によって決定され得る。
【００９７】
したがって、本発明は、本発明の方法によって製造されたｒＰＡポリペプチドまたはそのフラグメントもまた提供する。１つの実施態様では、ポリペプチドは、炭疽菌により生産される野生型ＰＡと同一であり得る。別の実施態様では、上記のように、ポリペプチドまたはそのフラグメントは、ｒＰＡアミノ酸配列のＮ末端の追加の残基（例えば、メチオニン残基）の存在によって、野生型ＰＡ（またはそのフラグメント）とは区別され得る。例えば、ポリペプチドは、配列番号６または配列番号６のＮ末端メチオニン残基を含むそのフラグメントであり得る。
【００９８】
また、本発明によって、本発明のポリヌクレオチド、発現ベクター、宿主細胞、およびポリペプチドの１つ以上を含み得るキットも予期され得る。
【００９９】
また、本発明によって、本発明のポリペプチドを含む抗原性組成物、例えば、ワクチン組成物も提供され得る。
【０１００】
本発明はまた、炭疽菌による感染に対して免疫応答を誘発する方法を提供し、この方法は、本発明のポリペプチドまたは本発明の抗原性組成物を投与する工程を含む。
【０１０１】
また、本発明によって、炭疽菌による感染に対して免疫応答を誘発するための医薬の製造のための、本発明のポリペプチドの使用も提供され得る。
【０１０２】
この点において、「免疫応答を誘発する」は、炭疽菌による感染に対して防御することを包含し得る。本発明の方法および／または使用によって付与される防御は、１００％であり得るか、または１００％未満であり得る。好ましくは、「炭疽菌による感染に対して防御する」は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の炭疽菌感染に対して防御を提供する。好ましくは、「炭疽菌による感染に対して防御する」は、炭疽菌感染に対して、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％有効なレベルでの防御を提供する。
【０１０３】
さらに、用語「感染に対して防御する」は、感染を予防することおよび感染を治療することを包含し得る。この点において、用語「予防する」は、炭疽菌感染の重篤度／強度を低下させること、または炭疽菌感染の開始を低減することを含む。用語「治療する」は、炭疽菌感染の感染後治療および改善を含む。
【０１０４】
抗原性組成物は、当該分野で周知の方法を用いて、従来の経路（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、および粘膜経路）によって投与され得る。
【０１０５】
代表的には、このような抗原性組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして注射可能製品として調製され得る。注射前に液体中に入れて溶液とするかまたは懸濁液とするのに適切な固体形態もまた調製され得る。調製物はまた乳化され得るか、またはペプチドがリポソームまたはマイクロカプセル中にカプセル化され得る。
【０１０６】
活性な免疫原性成分が、しばしば、賦形剤と混合される。この賦形剤は、薬学的に受容可能であり、そして活性成分と適合し得る。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せである。さらに、所望であれば、ワクチンは、少量の補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤、および／またはアジュバント（これは、ワクチンの有効性を増強する））を含み得る。有効であり得るアジュバントの例は、以下を含むが、これらに限定されない：水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ノル−ＭＤＰともいう）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥともいう）、およびＲＩＢＩ、これは、細菌から抽出された３つの成分、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレート、および細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルジョン中に含有する。
【０１０７】
活性成分は、中性または塩形態でワクチン中に処方され得る。薬学的に受容可能な塩は、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基と共に形成される）を含み、これは、無機酸（例えば、塩酸もしくはリン酸のような）と共に、または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸など）と共に形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩もまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄）および有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導され得る。
【０１０８】
抗原性組成物は、注射（例えば、皮下もしくは筋肉内のいずれか）によって、従来通りに非経口投与される。
【０１０９】
抗原性組成物は、投薬処方と適合され得る様式で、予防および／または治療に有効であるような量での投与用である。投与されるべき量は、一般には、一用量当たり５μｇから２５０μｇの抗原の範囲であり、好ましくは、一用量当たり約５０μｇから１００μｇであり、これは、処置されるべき被験体、被験体の免疫系の抗体合成能、および所望の防御度に依存する。投与されることが必要な活性成分の正確な量は、主治医の判断に依存し得、各被験体に対して特有であり得る。
【０１１０】
抗原性組成物は、単回投薬スケジュール、または必要に応じて複数回投薬スケジュールでで与えられ得る。複数回投薬スケジュールは、ワクチン接種初回経過は１〜６回の個別投薬であり、引き続き、免疫応答の維持およびまたは強化に必要な後続期間の間隔で、例えば、２回目の投薬のために１〜４ヶ月で、別の投薬が与えられ、そして必要であれば数ヶ月後に引き続き投薬され得るというものである。投薬レジメはまた、少なくとも部分的には、個体の必要性によって決定され、そして主治医の判断に依存する。
【０１１１】
さらに、免疫原性抗原を含む抗原性組成物は、他の免疫調節剤（例えば、免疫グロブリン）ならびに抗生物質と合わせて投与され得る。
【０１１２】
他の投与態様に適したさらなる処方物としては、マイクロカプセル、坐薬、およびいくつかの場合には、経口処方物またはエアロゾルとしての分散に適した処方物が挙げられる。坐薬について、従来の結合剤およびキャリアは、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含み得る；このような坐薬は、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲で活性成分を含む混合物から形成され得る。
【０１１３】
経口処方物は、例えば、薬剤等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような、通常用いられる賦形剤を含む。これらの組成物は、溶剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性処方物または散剤の形態をとり、そして活性成分を１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％含む。
【０１１４】
１つの実施態様では、医薬は、鼻腔内投与（ｉ．ｎ．）され得る。鼻腔内組成物は、１００〜５０００μｍの範囲のおよその直径を有する、容量換算では、０．００１〜１００μｌのおよその範囲の小滴サイズを有する小滴形態で投与され得る。
【０１１５】
鼻腔内投与は、点鼻剤の適用によりまたは鼻噴霧を介して達成され得る。点鼻剤の場合、小滴は、代表的には、約１０００〜３０００μｍの直径および／または１〜２５μｌの容量を有し得る。一方、鼻噴霧の場合、小滴は、代表的には、約１００〜１０００μｍの直径および／または０．００１〜１μｌの容量を有し得る。
【０１１６】
抗体の鼻腔内送達後、それらの肺への輸送は、粘膜分泌の逆流によって促進され得ると考えられる。
【０１１７】
異なる実施態様では、医薬は、エアロゾル処方物で送達され得る。エアロゾル処方物は、散剤、懸濁剤、または溶剤の形態をとり得る。
【０１１８】
エアロゾル粒子のサイズは、エアロゾルの送達能に関連する一要因である。したがって、粒子が小さい方が、より大きな粒子よりも肺胞に向かって気道をさらに移動し得る。１つの実施態様では、エアロゾル粒子は、気管支、細気管支、および肺胞までの全長に沿った送達を促進するような直径の分布を有する。あるいは、粒子サイズ分布は、気道の特定の部分（例えば、肺胞）を標的するように選択され得る。
【０１１９】
エアロゾル粒子は、噴霧吸入器または鼻噴霧によって送達され得る。
【０１２０】
医薬のエアロゾル送達の場合、粒子は、０．１〜５０μｍ、好ましくは１〜５μｍのおよその範囲の直径を有し得る。
【０１２１】
本発明の医薬のエアロゾル処方物は、必要に応じて、推進剤および／または界面活性剤を含み得る。
【０１２２】
患者に投与される小滴のサイズを本発明の所定の範囲内に調節することにより、肺胞への不慮の抗原送達を回避／最小限にし、したがって、肺胞に関連した病理上の問題点（例えば、肺の炎症および線維症瘢痕形成）を回避することができる。
【０１２３】
鼻腔内ワクチン接種は、他の粘膜関連リンパ系組織とは異なる鼻および気管支に関連した粘膜組織で、Ｔ細胞媒介エフェクター機構およびＢ細胞媒介エフェクター機構の両方を呼び起こす。
【０１２４】
抗原の鼻腔内送達は、呼吸系の粘膜下Ｂ細胞への抗原の標的化を可能にする。これらのＢ細胞は、哺乳動物における主要な局所ＩｇＡ産生細胞であり、そして鼻腔内送達は、炭疽菌抗原に対してこれらの細胞によるＩｇＡの産生の急速な増加を促進する。
【０１２５】
１つの実施態様では、炭疽菌抗原を含む医薬の投与はＩｇＡ抗体産生を刺激し、そしてＩｇＡ抗体は炭疽菌抗原に結合する。別の実施態様では、粘膜および／またはＴｈ２免疫応答が刺激される。
【０１２６】
１つの実施態様では、ワクチン組成物は、AlhydrogelＴＭアジュバントに吸着されたｒＰＡタンパク質を含む。１つの実施態様では、ワクチンは、筋肉内注射によって送達される。
【０１２７】
本発明はまた、配列番号４の配列を有するベクターを提供する。
【０１２８】
本発明はまた、ＥＣＡＣＣ番号０４０６１４０１で寄託されたベクターを提供する。
【０１２９】
本発明はまた、ＥＣＡＣＣ番号０４０５２５０１で寄託された、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【０１３０】
本願の図面を説明する。
【０１３１】
図１は、ＨＰＡクローンｐＭＴＬ１０１５−ｃｐｇ−ｒＰＡ−ｓｙｎｔ、すなわち、ｐＭＴＬ１０１５（ＴｃＲ）中のｃｐｇ２リーダーに融合した改変型ｒＰＡ核酸配列を図示する。このプラスミドの作製に必要な操作は以下の通りである：（１）合成「成熟」ｒＰＡ配列を配列検証されたＰＣＲ産物ＴＯＰＯベクター（すなわち、リーダーなし）からＨＰＡ  ｐＥＴ２２ｂｃｐｇベクターにサブクローニングする；（２）ｃｐｇ−ＳｙｎＰＡをｐＥＴ２２ｂｃｐｇＳｙｎＰＡからｐＭＴＬ１０１５にサブクローニングする。
【０１３２】
図２は、フィトンペプトンベースのTerrific Brothでの１６時間振盪フラスコ培養後にｒＰＡを発現しているｐＭＴＬ１０１５クローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。数字は以下の通りである：
１．ブランク
２．ｒＰＡ標準（ＤＥＶ０３０ＩＰ；１００μｇ／ｍＬ）
３．ｐＭＴＬ１０１５ベクターのみ
４．ｐＭＴＬ１０１５−ｏｍｐＡ−ＰＡ−ｗｔ
５．ｐＭＴＬ１０１５−ｃｐｇ−ＰＡ−ｗｔ
６．ｐＭＴＬ１０１５−ｐｅｌＢ−ＰＡ−ｗｔ
７．ｐＭＴＬ１０１５−ｏｍｐＡ−ＰＡ−ｓｙｎｔ
８．ｐＭＴＬ１０１５−ｃｐｇ−ＰＡ−ｓｙｎｔ
９．ｐＭＴＬ１０１５−ｐｅｌＢ−ＰＡ−ｓｙｎｔ
１０．分子量マーカー。
【０１３３】
図３は、フィトンペプトンベースのTerrific Brothでの１６時間振盪フラスコ培養後にｒＰＡを発現しているｐＭＴＬ１０１５クローンのウェスタンブロットを示す。数字は図２について上で記載した通りである。
【０１３４】
図４は、フィトンペプトンベースのTerrific Brothで大腸菌（ｐＭＴＬ１０１５−ｃｐｇ−ＰＡ−ｓｙｎｔ）の振盪フラスコ培養からの試料の（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび（Ｂ）ウェスタンブロットによる経時分析を示す。陰性コントロールは大腸菌ＲＶ３０８（ｐＭＴＬ１０１５）であった。
【０１３５】
図５は、バッフル付フラスコ中（ＡおよびＢ）またはバッフルなしのフラスコ（Ｃ）中でのフィトンペプトンベースのTerrific Brothの振盪フラスコ培養の大腸菌ＲＶ３０８  ｐＭＴＬ１０１５−ｏｍｐＡ−ＰＡ−ｓｙｎｔの増殖曲線を示す。
【０１３６】
図６は、Ｈｙ−ｓｏｙベースの半限定培地の振盪フラスコ培養の大腸菌ＲＶ３０８  ｐＭＴＬ１０１５−ｏｍｐＡ−ＰＡ−ｗｔ（ＡおよびＢ）およびｐＭＴＬ１０１５−ｏｍｐＡ−ＰＡ−ｓｙｎｔ（ＣおよびＤ）の増殖曲線を示す。
【０１３７】
図７は、Ｈｙ−ｓｏｙベースの半限定培地の振盪フラスコ培養の大腸菌ＲＶ３０８  ｐＭＴＬ１０１５−ｐｅｌＢ−ＰＡ−ｗｔ（ＡおよびＢ）およびｐＭＴＬ１０１５−ｐｅｌＢ−ＰＡ−ｓｙｎｔ（ＣおよびＤ）の増殖曲線を示す。
【０１３８】
図８は、Ｈｙ−ｓｏｙベースの半限定培地の振盪フラスコ培養の大腸菌ＲＶ３０８  ｐＭＴＬ１０１５−ｃｐｇ−ＰＡ−ｗｔ（ＡおよびＢ）およびｐＭＴＬ１０１５−ｃｐｇ−ＰＡ−ｓｙｎｔ（ＣおよびＤ）の増殖曲線を示す。
【０１３９】
図９は、Ｈｙ−ｓｏｙベースの半限定培地を用いる振盪フラスコ培養でｒＰＡを発現しているｐＭＴＬ１０１５クローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％  ＰＨＡＳＴ−ＧＥＬ）を示す。数字は以下の通りである：
１：分子量マーカー
２：ＲＶ３０８  ｐＭＴＬ１０１５  ｏｍｐＡ−ＰＡ−ｓｙｎｔ
３：ＲＶ３０８  ｐＭＴＬ１０１５  ｏｍｐＡ−ＰＡ−ｗｔ
４：ＲＶ３０８  ｐＭＴＬ１０１５  ｐｅｌＢ−ＰＡ−ｓｙｎｔ
５：ＲＶ３０８  ｐＭＴＬ１０１５  ｐｅｌＢ−ＰＡ−ｗｔ
６：ＲＶ３０８  ｐＭＴＬ１０１５  ｃｐｇ−ＰＡ−ｓｙｎｔ
７：ＲＶ３０８  ｐＭＴＬ１０１５  ｃｐｇ−ＰＡ−ｗｔ
８：参照ＤＥＶ０３０３ＩＰ（１００μｇ／ｍＬ）。
【０１４０】
図１０は、生産培地（フィトンペプトン１２ｇ／Ｌ、バクト酵母エキス６０ｇ／Ｌ、グルコース２５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  １２．５４ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ２．３１ｇ／Ｌ、およびテトラサイクリン１．５ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．０〜７．２）での大腸菌ＲＶ３０８  ｐＭＴＬ１０１５−ｃｐｇ−ＰＡ−ｓｙｎｔの増殖を示す。酵母エキスのレベルを以下のように変化させた：
Ａ  １×酵母エキス
Ｂ  １．５×酵母エキス
Ｃ  ２×酵母エキス
Ｄ  ２．５×酵母エキス。
【０１４１】
図１１は、生産培地における大腸菌ＲＶ３０８  ｐＭＴＬ１０１５−ｃｐｇ−ＰＡ−ｓｙｎｔの増殖曲線（Ａ）およびｒＰＡ生産曲線（Ｂ）を示す。
【０１４２】
図１２は、ｒＰＡの単離のための下流プロセシング工程を示すフローチャートである。
【０１４３】
図１３（Ａ〜Ｄ）は、配列番号８−「DVC.Synthetic.rP」（すなわち、野生型ＰＡ遺伝子配列（配列番号２）およびメチオニン残基をコードする５’コドン）と配列番号７−「AP.PA.wt.Sequenc」（すなわち、本発明の改変型ｒＰＡ遺伝子配列（配列番号１）およびメチオニン残基をコードする５’コドン）との間の配列アラインメントを示す。配列同一性は７１．２％である。
【０１４４】
本発明を、以下の実施例を参照してここに記載する。
【実施例】
【０１４５】
（実施例１−ｒＰＡ発現系）
以下のいずれかの発現を指向するｐＭＴＬ発現ベクター構築物を生成した：野生型ＰＡ遺伝子配列または改変型ｒＰＡ遺伝子配列（エルウィニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）ｐｅｌＢまたはシュードモナスカルボキシペプチダーゼＧ２（ｃｐｇ２またはｃｐｇ）リーダー配列のいずれかに融合させた）。後者の配列は、欧州特許０  １２１  ３５２に記載されており、大腸菌で効率的にプロセシングされて、可溶性タンパク質をペリプラズム腔に方向付けることが示されている。これらのｒＰＡ発現構築物を、評価のために、Dynport Vaccine Company（ＤＶＣ）のｐＥＴ２６ｂおよびInvitrogenのｐＴｒｋベクターベースの構築物と比較した。
【０１４６】
新規ｒＰＡ  ｐＭＴＬベースの発現クローンの作製は、以下の通りであった：
１．ともにｐｅｌＢ、ｏｍｐＡ、およびｃｐｇ２リーダー配列に融合させた２つのＰＡをコードするヌクレオチド配列（野生型および改変型）をＰＣＲ増幅する。このことにより、６つのｒＰＡ配列選択肢が生じた；
２．ＰＣＲ産物クローニングベクター系（例えば、Invitrogen TAクローニング）で一次クローンを構築した；
３．一次クローンをＰＡ／リーダー配列複合体のＤＮＡ配列分析によって確認した；
４．６つのｒＰＡ配列をｐＭＴＬ１０１５発現ベクターにサブクローニングし、そして組換えプラスミドを確認した；
５．４つの確認したクローンに由来するプラスミドＤＮＡを用いて、プロテアーゼ欠損発現株である大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ３１６０８）を形質転換した。
【０１４７】
（１．１  ｒＰＡ発現系の比較に関するストラテジー）
ｐＭＴＬ発現プラスミドに基づく６つのクローンを、現行の生産培地での振盪フラスコ培養で評価した。既存のＤＶＣ生産生物をコントロールとして用いた。増殖条件および誘導開始／持続期間（適用可能な場合）は、所与の実験条件下での発現レベルの真の比較をすることが可能になるように、可能な限りで標準化した。例えば、接種のために標準細胞密度を用いた。生産レベルを、増殖の全期間にわたって培養物をサンプリングし、そして回収した細胞のBugBusterＴＭ（Novagen）を用いる化学的細胞溶解に供することにより、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのデンシトメトリー分析により、比較した。ウェスタンブロッティングを用いて、ｒＰＡタンパク質バンドの同一性を確認した。
【０１４８】
（１．２  培地選択ストラテジー）
遺伝子操作によりｒＰＡの発現レベルを増大させることに加え、より高い栄養素レベルを含む培地を用いて培養物をより高い細胞密度にまで増殖させることにより、産物の最終収量を上昇させた。
【０１４９】
現行の生産培地でｒＰＡ生産レベルに関して最も有望性を示している株を、まず種々の可能な生産培地を用いて振盪フラスコ培養で、さらに試験した。ＤＶＣにより用いられた分析技術（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて、増殖の全期間にわたっておよび収集時の産物レベルを評価した。
【０１５０】
（実施例２−ｒＰＡ発現の振盪フラスコ比較）
（２．１  フィトンペプトンベースのTerrific Broth）
振盪フラスコ培養を用いて、フィトンペプトンベースのTerrific Brothでの６つのｐＭＴＬ１０１５クローンによるｒＰＡの発現を比較する実験を行った。ＣＡＭＲでのｐＭＴＬ１０１５発現系を用いる以前の研究は、低い酸素添加速度が産物の発現に好ましいものであり得ることを示したので、培養をバッフル付フラスコ（高酸素添加）およびバッフルなしのフラスコ（低酸素添加）の両方で設定した。
【０１５１】
細胞バンクのための一次種培養物として調製した１０ｍＬ培養物を用いて、本研究のための種培養物を調製した。１０ｍＬ培養物の５０μＬアリコートを用いて、２５０ｍＬのバッフル付フラスコ中の５０ｍＬのフィトンペプトンベースのTerrific Brothに接種した。
【０１５２】
これらの種培養物を３０℃にて１５０ｒｐｍで１７時間インキュベートし、次いで１０００ｍＬのバッフル付フラスコ中の同じ培地の二連の２００ｍＬ培養物および５００ｍＬのバッフルなしのフラスコ中の２５０ｍＬの１つの培養物に接種した。各培養物の接種材料を算定し、出発ＯＤ６００は０．１〜０．２であった。培養物を３０℃にて１５０ｒｐｍで２４時間インキュベートした。ＯＤ６００が５〜７に達したときに、ｒＰＡアッセイのために試料（２．５ｍＬ）を２時間間隔で取り出した。試料をClandon T-52卓上遠心分離機で４，０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離し、上清を捨て、そしてペレットを−２０℃にて凍結保存した。２４時間増殖後、この二連のバッフル付フラスコの培養物を１つにし、そして細胞塊を遠心分離（Sorvall RC-3、５０００ｒｐｍにて１５分間）によって回収し、そして細胞ペーストを−２０℃にて凍結保存した。
【０１５３】
図２および図３は、高い酸素添加（バッフル付フラスコ）の条件下でフィトンペプトンベースのTerrific Broth中で増殖したｐＭＴＬ１０１５クローンの各々からの１６時間試料のBugBusterＴＭでの処理後のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析を示す。合成遺伝子産物を発現する３つのクローンについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの推定ｒＰＡ分子量の位置に強いタンパク質バンドが存在しており、野生型遺伝子を発現するクローンについては、より弱いバンドがあることが分かり得る（図２）。存在するｒＰＡの量をｒＰＡ標準の強度と比較することにより概算し、ＥＬＩＳＡによって確認した（表１）。ウェスタンブロット分析は、ｒＰＡよりも低い分子量にいくつかの免疫反応性物質の存在を示した（図３）。インタクトなｒＰＡに対するこの物質の量は、全てのクローンについて同様であった。これが、タンパク質分解産物を表すのかまたは短縮型発現を表すのかは、現時点では不明である。
【０１５４】
【表１】
2008504019.tif 000003
【０１５５】
ｐＭＴＬ１０１５−ｃｐｇ−ＰＡ−ｓｙｎｔクローンからの経時試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Phast-gel）、ウェスタンブロット（図４）およびＥＬＩＳＡ（表２）により分析して、以下を決定した；（ａ）ｒＰＡ発現が最大であった時点、および（ｂ）インキュベーションの延長がタンパク質分解活性に起因して産物の損失を生じたか否か。ＥＬＩＳＡによるｒＰＡ発現は、１４〜１６時間のインキュベーション後に最適であり、そして２４時間までのさらなるインキュベーションで目立った変化はなかったことが理解され得る（表２）。ウェスタンブロット分析（図４）は、インタクトなｒＰＡに対する低分子量免疫反応性物質のレベルにはインキュベーション時間の延長によって顕著な変化がないことを示した。
【０１５６】
【表２】
2008504019.tif 000004
【０１５７】
図５は、バッフル付フラスコ（高酸素添加）およびバッフルなしのフラスコ（低酸素添加）を用いてフィトンペプトンベースのTerrific Brothで増殖させた場合の大腸菌ＲＶ３０８（ｐＭＴＬ１０１５−ｏｍｐＡ−ＰＡ−ｓｙｎｔ）について得られた増殖曲線を示す。増殖はバッフル付フラスコで実質的に良好であったことが理解され得る。バッフルなしのフラスコで増殖させた培養物では、バッフル付フラスコ培養と比較してずっとより低い最終細胞密度となった。ｒＰＡ発現は、バッフルなしのフラスコで増殖させた培養物ではかなり低かった（データは示さず）。
【０１５８】
（２．２  Ｈｙ−ｓｏｙベースの半限定培地）
上記の実験（実施例２．１）を、バッフル付フラスコのみでＨｙ−ｓｏｙベースの半限定培地を用いて繰り返した。増殖曲線（図６、７および８）は、この培地で、Terrific Brothに比較して低い増殖速度および最終細胞密度が得られたこと、および合成遺伝子を発現しているクローンについて８時間までの停滞期があったことを示している。ｒＰＡ発現レベルは、一般に、フィトンペプトンベースのTerrific Brothで観察されるよりも低かった。しかし、野生型遺伝子と比較して合成遺伝子を発現するクローンによる優れた発現レベルの同様のパターンが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図９）およびＥＬＩＳＡ（表３）によって観察された。
【０１５９】
【表３】
2008504019.tif 000005
【０１６０】
（実施例３−ｒＰＡ発現の発酵レベル比較）
発酵培養における以下の４つのさらに選択したクローンについて評価を続けた：
大腸菌ＲＶ３０８  ｐＭＴＬ１０１５−ｃｐｇ−ＰＡ−ｓｙｎｔ
大腸菌ＲＶ３０８  ｐＭＴＬ１０１５−ｏｍｐＡ−ＰＡ−ｓｙｎｔ
大腸菌ＲＶ３０８  ｐＭＴＬ１０１５−ｏｍｐＡ−ＰＡ−ｗｔ
大腸菌ＤＨ５  ｐＴｒｃＫ−ｐｅｌＢ−ＰＡ−ｓｙｎｔ。
【０１６１】
（３．１  培地選択）
前に記載したような条件下で各培地において、ＤＯＴおよびｐＨを調節しながら、８Ｌ発酵を実施した。
【０１６２】
得られた増殖曲線は、同じ培地で以前に見られた増殖曲線と同様であった（図１０を参照のこと）が、生産培地（生産番号（Run No）ＰＲＥＣＲＶ００３４：表４）からのｒＰＡ収量は、ＥＬＩＳＡによれば２５００μｇ／ｍＬであった。この培養物に、培養物中のグルコース涸渇前に８０ｍＬの５０％グルコース溶液を供給した。ｒＰＡ生産を示すＰＲＥＣＲＶ００３４についての増殖曲線が図１１に見られ得るが、データは、培養物を回収した時に収量が最大に達していたか否かを示していない。
【０１６３】
生産に培養した場合に大腸菌ＲＶ３０８  ｐＭＴＬ１０１５−ｃｐｇ−ＰＡ−ｓｙｎｔについて得られたｒＰＡ収量の改善がまた、他の２つのさらに選択したｐＭＴＬ１０１５クローンでも生じたか否かを決定するために、これらの条件下で３つの株全てについて並行発酵を設定した。しかし、前の培養物に供給した８０ｍＬの５０％グルコースを出発時から含ませて、初期グルコース濃度を２５ｇ／Ｌに増やした。
【０１６４】
大腸菌ＲＶ３０８  ｐＭＴＬ１０１５−ｃｐｇ−ＰＡ−ｓｙｎｔは再度、２５００μｇ／ｍＬの収量を得、そして大腸菌ＲＶ３０８  ｐＭＴＬ１０１５−ｏｍｐＡ−ＰＡ−ｓｙｎｔは２０００μｇ／ｍＬを生じた（ＰＲＥＣＲＶ００３８および００３７を参照のこと、表４）。
【０１６５】
大腸菌ＤＨ５α  ｐＴｒｃＫ−ｐｅｌＢ−ＰＡ−ｓｙｎｔを、誘導時のＯＤ６００が１５に上昇したことを除いて、８ＬスケールにてＰＰＴＢｇｌｙで増殖させた（表４のＰＲＥＣＤＨ００１３を参照のこと）。ｒＰＡ収量は、前の結果よりも顕著な改善を示さなかったが、より多くのバイオマスが生産され、ＩＰＴＧでの誘導４時間後に２６というより高い最終ＯＤ６００が得られた。
【０１６６】
（３．２  増殖温度の影響）
大腸菌ＲＶ３０８  ｐＭＴＬ１０１５−ｃｐｇ−宿主／ベクター系を組み込んでいる前の開発プログラムは、産物の発現が２５〜３０℃の間の温度で最も効率的であることを示していた。
【０１６７】
大腸菌ＲＶ３０８  ｐＭＴＬ１０１５−ｃｐｇ−ＰＡ−ｓｙｎｔのより低い温度での増殖の収量および産物安定性に関する影響の評価を、３０℃、２８℃、および２５℃にて上記条件下、生産培地で株を培養することにより行った（表４のＰＲＥＣＲＶ００３９、００４０および００４１のそれぞれを参照のこと）。
【０１６８】
より低い温度での生産からの収量は、３０℃で増殖した場合よりも低かった。生産された物質の質は、温度の低下では改善されることなく、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロットにおける微量の不純物バンドの減少はほとんどまたは全くなかった。
【０１６９】
（３．３  抗生物質濃度の影響）
抗生物質減少による選択圧下でのプラスミドの安定性の確認として、大腸菌ＲＶ３０８  ｐＭＴＬ１０１５−ｃｐｇ−ＰＡ−ｓｙｎｔを、培地中のテトラサイクリン濃度レベルを変更させながら、上記条件下、生産培地で培養した（表４のＰＲＥＣＲＶ００４２〜００４４を参照のこと）。テトラサイクリン濃度は、１５μｇ／ｍＬ（１００％）、１．５μｇ／ｍＬ（１０％）および０であった。第二の種培養物はそれぞれ１５、１．５、および１５μｇ／ｍＬを含んだ。したがって、種増殖の間のテトラサイクリンの分解がないと仮定すると、抗生物質を添加していない発酵槽は、選択圧を供給するために第二の種からのキャリーオーバーに頼った。発酵槽に移した種の容量は１２４ｍＬであり、接種時の発酵培地に名目上０．２３μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを与えた。
【０１７０】
最終ＯＤ６００およびバイオマスについての収量は予想範囲内であったが、ｒＰＡの収量は、１５μｇ／ｍＬコントロールについて予想されるよりもわずかに低かった。抗生物質減少培養物でのレベルは、わずかに高かった。ｐＭＴＬ１０１５−ｃｐｇ−ＰＡ−ｓｙｎｔプラスミドの安定性は、選択培地（１５μｇ／ｍＬテトラサイクリンを添加したＬ−寒天）および非選択培地上の最終発酵試料コロニー単離物を爪楊枝で掬い取ることにより確認した。１５、１．５、および０μｇ／ｍＬテトラサイクリンの発酵のそれぞれについて選択培地上で１００、９８、および９６％増殖したという結果は、用いた条件下での良好な安定性を示している。ＰＰＴＢｇｌｕｃ２．５×ＹＥ発酵についての生存数の結果は、２×１０１０〜５×１０１０ｃｆｕ／ｍＬの範囲にある。
【０１７１】
【表４】
2008504019.tif 000006
【０１７２】
（３．４  生産株の選択）
初期のダウン選択後に調べたクローンについてこれまで得られた結果は、４つのうち、大腸菌ＲＶ３０８  ｐＭＴＬ１０１５−ｃｐｇ−ＰＡ−ｓｙｎｔが、等しい条件下で他のｐＭＴＬ１０１５クローンと比較した場合、ほとんどの場合において最も高い収量を示したことを示していた。
【０１７３】
発酵およびＤＳＰ開発の両方について生じた情報の大部分が大腸菌ＲＶ３０８  ｐＭＴＬ１０１５−ｃｐｇ−ＰＡ−ｓｙｎｔクローンからのものであり、生産培地を用いた場合に１．５〜２．５ｍｇ／ｍＬの範囲の収量であった。このことにより、本出願人は、続きの全ての研究について、好ましい生産生物としてこのクローンを選択することにした。
【０１７４】
表５は、生産培地でこれまでに増殖した全ての培養物の概要を示す。数値は、２５００μｇ／ｍＬも達成され得るが、収量についてのより実際的な値は２０００μｇ／ｍＬであることを示している。
【０１７５】
【表５】
2008504019.tif 000007
【０１７６】
（実施例４−ｒＰＡ生産についての上流のプロセス）
（４．１  大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ  ３１６０８）に形質転換した目的のクローン［クローンｐＭＴＬ１０１５−ｃｐｇ−ＰＡ−ｓｙｎｔ］のシードバンク）
配列確認後、研究用シードバンクを、ダイズペプトンベースのＬ−ブロス（フィトンペプトン１５ｇ／Ｌ、バクト酵母エキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８〜７．０）でのテトラサイクリン（１５ｍｇ／Ｌ）の選択圧下での増殖によって調製した。テトラサイクリンを含む栄養寒天プレートからの１つのコロニーを、５００ｍＬバッフル付振盪フラスコ中の１００ｍＬ培地に接種し、そしてＯＤ６００が１．５になるまで振盪インキュベーター中で３０℃にて１５０ｒｐｍでインキュベートした。次いで、この培養物を増殖培地（上記を参照のこと）中で滅菌５０％グリセロールと混合して１０％の最終グリセロール濃度とし、そして１．８ｍＬ凍結バイアル中に１ｍＬアリコートとして−８０℃で凍結保存した。
【０１７７】
２５０バイアルの実験研究用細胞バンク（ＷＲＣＢ）を、同じ条件および増殖用培地を用いて上記シードバンクから調製したが、２５０μＬの融解したバイアル内容物を１０００ｍＬバッフル付振盪フラスコ中で２００ｍＬ培地に接種した。
【０１７８】
（４．２  一次種菌培養）
１バイアルのＷＲＣＢを溶解し、そして１００μＬを、２５ｍＬユニバーサルボトル中の１５ｍｇ／Ｌでテトラサイクリンを含む１０ｍＬのダイズペプトンベースのＬ−ブロス（上記を参照のこと）に接種し、１５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃にて７〜９時間インキュベートした。これは、生物が生存していることを確実にし、そしてより一貫した種菌生産プロセスを得る回収工程であった。この工程の最終ＯＤ６００は０．７〜１．０であった。
【０１７９】
（４．３  二次種菌培養）
この工程は、発酵用の接種材料を生産し、そして合理的な大きさの振盪インキュベーターを用いて、振盪フラスコ中での５〜２５０Ｌの培養に十分な接種材料を製造し得る。５０Ｌスケールでは、２００μＬの一次種菌を、５×１０００ｍＬバッフル付振盪フラスコの各々の中の２００ｍＬの生産培地に接種した。この培養物を、１５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃にて１１〜１２時間インキュベートし、１３〜１６の最終ＯＤ６００を得た。
【０１８０】
オートクレーブによる滅菌の間にいくつかの成分の沈殿およびカラメル化を防ぐために、生産培地を、複合成分をバルクとして滅菌し、次いでそれらの成分の温度が２５℃より低い温度に下がった時点でグルコース、リン酸塩、マグネシウム、およびテトラサイクリンを滅菌溶液として無菌的に添加することによって調製する。
【０１８１】
（４．４  生産発酵）
次いで、種菌培養物をひとまとめにして、発酵槽中で出発ＯＤ６００が０．２となるのに十分な容量を、７２ＬのApplikon攪拌発酵タンク中の５０Ｌ生産培地（上記を参照のこと）に接種した。複合培地成分を、４０Ｌバルクとして、１２１〜１２３℃にて３０分間インサイチュで滅菌し、２５℃を下回るまで冷却し、次いで残りの成分を補充して総容量を５０Ｌとした。
【０１８２】
次いで、培養物を、水酸化ナトリウムおよびリン酸を添加することにより調節したｐＨ７．０にて、３０（±０．５）℃の温度で、バッチで増殖させた。記載した順に以下のパラメーターのカスケード段階調節により、溶存酸素圧を＞４０％に維持した：攪拌（２００〜８００ｒｐｍ）、逆圧（３〜７ｐｓｉ）、スパージング気流（２５〜５０Ｌｐｍ）および酸素補充（０〜２０Ｌｐｍ）。
【０１８３】
ＯＤによる測定（ＯＤ６００  ６０〜６５）により増殖が停止した時点で（１２〜１４時間）、培養物を１５℃を下回るまで冷却し、そしてバッチ遠心分離（Sorvall RC-3B、H6000Aローター、５０００ｒｐｍで１５分間）により回収した。回収した細胞ペーストを、下流プロセシングに必要となるまで−２０℃にて保存した。培養物から１時間ごとに取り出した試料から、ＥＬＩＳＡアッセイによって、産物の発現を評価した。
【０１８４】
（実施例５−下流プロセシング工程）
（５．１  細胞破壊）
約４．５ｋｇの凍結細胞ペースト回収物を、まず最小容量の２０ｍＭトリス／１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．５によって懸濁し、滑らかなペーストとした。さらなる緩衝液を添加して１６Ｌの総懸濁液容量を得た。
【０１８５】
懸濁細胞を、７０００ｐｓｉの圧で「APV Gaulin」高圧ホモジナイザーに２回通すことにより破壊した。次いで、このホモジネートを「Sorval」ＲＣ３遠心分離機中で５０００ｒｐｍにて１時間遠心分離した。ペレットを捨て、そして上清（約１６Ｌ）を保持した。
【０１８６】
（５．２  ダイアフィルトレーション）
遠心分離したホモジネートを、２つの「Pall」OS030F07 0.5m２「Centrasette 2 Omega」懸架式スクリーンチャンネル３０ｋＤａ膜が取り付けられた「Millipore Pellicon」濃縮器を用いて、その容量の３倍の精製水でダイアフィルトレートした。この濃縮器を、１．６バールの膜透過圧で１７Ｌ／分の流速で操作した。ｐＨを８．０に調整し、そして伝導度を２ｍＳ／ｃｍに調整した。
【０１８７】
（５．３  アニオン交換およびクロマトグラフィー）
２５ｃｍ直径のクロマトグラフィーカラムに５Ｌの「Amersham」「Ｑ−セファロースファストフロー（Q-Sepharose Fast Flow）」アニオン交換体を充填して１０ｃｍのベッド高とした。次いで、工業用ＵＶモニターを流出ラインに接続した。カラムを全体にわたって３３０ｍＬ／分の流速で操作した。充填カラムを１０Ｌの水、次いで５Ｌの０．５Ｍ水酸化ナトリウム、引き続き精製水で洗浄した。１０Ｌの０．５Ｍトリス、ｐＨ８．０をポンプで注入し、次いでカラムを開始緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）で平衡化した。
【０１８８】
ダイアフィルトレート液を流し、次いでこの流したカラムを開始緩衝液でベースライン分離度まで洗浄した。結合したｒＰＡを、開始緩衝液中の１０、２０、および６５ｍＭの塩化ナトリウムの塩濃度を段階で増大させながら溶出し、そして溶出したピークを、別々の適切なサイズの容器中に収集した。溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣによってアッセイし、そして＞４０％の純度でｒＰＡを含む画分を保持した。
【０１８９】
カラムを、１０Ｌの２Ｍ塩化ナトリウム、引き続き１０Ｌの１Ｍ酢酸ナトリウム、１０Ｌの０．５Ｍ水酸化ナトリウム、次いで１０Ｌの５０ｍＭ水酸化ナトリウムを連続的に通過させることにより再生し、保存した。
【０１９０】
（５．４  疎水性電荷誘導クロマトグラフィー）
ＵＶモニターに接続した３０ｃｍ直径のカラムに、７Ｌ／分の流速で２０Ｌの「Ciphergen」「ＭＥＰハイパーセル（HyperCel）」を充填した。充填すると、さらに続く全ての工程を８００ｍＬ／分で実施した。カラムを、４０分以下の接触時間で５Ｌの１Ｍ水酸化ナトリウムで洗浄した。次いで、カラムを水で洗浄し、次いで２０Ｌのローディング緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）で平衡化した。Ｑプール（すなわち、前のＱクロマトグラフィー工程からのプール）を流し、カラムをローディング緩衝液でベースラインまで洗浄し、次いで結合したｒＰＡを精製水で溶出させた。収集した産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣによってアッセイした。ＭＥＰプール（すなわち、ＭＥＰハイパーセルカラムからのプール）を０．２２μｍの２０００ｃｍ２のPall「ポジダイン（Posidyne）」フィルターを通して濾過した。カラムを１０Ｌの１Ｍ水酸化ナトリウムで再生し、精製水で洗浄し、次いで０．２μｍ濾過した５０ｍＭ水酸化ナトリウム中に保存した。
【０１９１】
（５．５  ダイアフィルトレーションおよび処方）
精製したｒＰＡを、「Pall Centramate」媒体スクリーン「Omega」５０ｋＤａカートリッジ（部品番号ＯＳ０３５０Ｃ１２、０．０９３ｍ２)を用いてダイアフィルトレートした。８００ｍＬ／分の流速および１．６バールの膜透過圧を用いた。ダイアフィルトレーションを、５Ｌの処方緩衝液；２５ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０に対して実施した。５０００ｃｍ２面積の０．２２μｍ Pall「ポジダイン」フィルターを用いてさらなる濾過を実施し、次いで最終産物を適切なバイアル中に分配した。
【０１９２】
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【図面の簡単な説明】
【０１９３】
【図１】ＨＰＡクローンｐＭＴＬ１０１５−ｃｐｇ−ｒＰＡ−ｓｙｎｔ、すなわち、ｐＭＴＬ１０１５（ＴｃＲ）中のｃｐｇ２リーダーに融合した改変型ｒＰＡ核酸配列を図示する。
【図２】フィトンペプトンベースのTerrific Brothでの１６時間振盪フラスコ培養後にｒＰＡを発現しているｐＭＴＬ１０１５クローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図３】フィトンペプトンベースのTerrific Brothでの１６時間振盪フラスコ培養後にｒＰＡを発現しているｐＭＴＬ１０１５クローンのウェスタンブロットを示す。
【図４Ａ】フィトンペプトンベースのTerrific Brothで大腸菌（ｐＭＴＬ１０１５−ｃｐｇ−ＰＡ−ｓｙｎｔ）の振盪フラスコ培養からの試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる経時分析を示す。
【図４Ｂ】フィトンペプトンベースのTerrific Brothで大腸菌（ｐＭＴＬ１０１５−ｃｐｇ−ＰＡ−ｓｙｎｔ）の振盪フラスコ培養からの試料のウェスタンブロットによる経時分析を示す。
【図５】バッフル付フラスコ中（ＡおよびＢ）またはバッフルなしのフラスコ（Ｃ）中でのフィトンペプトンベースのTerrific Brothの振盪フラスコ培養の大腸菌ＲＶ３０８  ｐＭＴＬ１０１５−ｏｍｐＡ−ＰＡ−ｓｙｎｔの増殖曲線を示す。
【図６】Ｈｙ−ｓｏｙベースの半限定培地の振盪フラスコ培養の大腸菌ＲＶ３０８  ｐＭＴＬ１０１５−ｏｍｐＡ−ＰＡ−ｗｔ（ＡおよびＢ）およびｐＭＴＬ１０１５−ｏｍｐＡ−ＰＡ−ｓｙｎｔ（ＣおよびＤ）の増殖曲線を示す。
【図７】Ｈｙ−ｓｏｙベースの半限定培地の振盪フラスコ培養の大腸菌ＲＶ３０８  ｐＭＴＬ１０１５−ｐｅｌＢ−ＰＡ−ｗｔ（ＡおよびＢ）およびｐＭＴＬ１０１５−ｐｅｌＢ−ＰＡ−ｓｙｎｔ（ＣおよびＤ）の増殖曲線を示す。
【図８】Ｈｙ−ｓｏｙベースの半限定培地の振盪フラスコ培養の大腸菌ＲＶ３０８  ｐＭＴＬ１０１５−ｃｐｇ−ＰＡ−ｗｔ（ＡおよびＢ）およびｐＭＴＬ１０１５−ｃｐｇ−ＰＡ−ｓｙｎｔ（ＣおよびＤ）の増殖曲線を示す。
【図９】Ｈｙ−ｓｏｙベースの半限定培地を用いる振盪フラスコ培養でｒＰＡを発現しているｐＭＴＬ１０１５クローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％  ＰＨＡＳＴ−ＧＥＬ）を示す。
【図１０】生産培地（フィトンペプトン１２ｇ／Ｌ、バクト酵母エキス６０ｇ／Ｌ、グルコース２５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  １２．５４ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ２．３１ｇ／Ｌ、およびテトラサイクリン１．５ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．０〜７．２）での大腸菌ＲＶ３０８  ｐＭＴＬ１０１５−ｃｐｇ−ＰＡ−ｓｙｎｔの増殖を示す。
【図１１】生産培地における大腸菌ＲＶ３０８  ｐＭＴＬ１０１５−ｃｐｇ−ＰＡ−ｓｙｎｔの増殖曲線（Ａ）およびｒＰＡ生産曲線（Ｂ）を示す。
【図１２】ｒＰＡの単離のための下流プロセシング工程を示すフローチャートである。
【図１３Ａ１】配列番号８−「DVC.Synthetic.rP」（すなわち、野生型ＰＡ遺伝子配列（配列番号２）およびメチオニン残基をコードする５’コドン）と配列番号７−「AP.PA.wt.Sequenc」（すなわち、本発明の改変型ｒＰＡ遺伝子配列（配列番号１）およびメチオニン残基をコードする５’コドン）との間の配列アラインメントを示す。
【図１３Ａ２】配列番号８−「DVC.Synthetic.rP」（すなわち、野生型ＰＡ遺伝子配列（配列番号２）およびメチオニン残基をコードする５’コドン）と配列番号７−「AP.PA.wt.Sequenc」（すなわち、本発明の改変型ｒＰＡ遺伝子配列（配列番号１）およびメチオニン残基をコードする５’コドン）との間の配列アラインメントを示す。
【図１３Ａ３】配列番号８−「DVC.Synthetic.rP」（すなわち、野生型ＰＡ遺伝子配列（配列番号２）およびメチオニン残基をコードする５’コドン）と配列番号７−「AP.PA.wt.Sequenc」（すなわち、本発明の改変型ｒＰＡ遺伝子配列（配列番号１）およびメチオニン残基をコードする５’コドン）との間の配列アラインメントを示す。
【図１３Ｂ１】配列番号８−「DVC.Synthetic.rP」（すなわち、野生型ＰＡ遺伝子配列（配列番号２）およびメチオニン残基をコードする５’コドン）と配列番号７−「AP.PA.wt.Sequenc」（すなわち、本発明の改変型rPA遺伝子配列（配列番号１）およびメチオニン残基をコードする５’コドン）との間の配列アラインメントを示す。
【図１３Ｂ２】配列番号８−「DVC.Synthetic.rP」（すなわち、野生型ＰＡ遺伝子配列（配列番号２）およびメチオニン残基をコードする５’コドン）と配列番号７−「AP.PA.wt.Sequenc」（すなわち、本発明の改変型ｒＰＡ遺伝子配列（配列番号１）およびメチオニン残基をコードする５’コドン）との間の配列アラインメントを示す。
【図１３Ｂ３】配列番号８−「DVC.Synthetic.rP」（すなわち、野生型ＰＡ遺伝子配列（配列番号２）およびメチオニン残基をコードする５’コドン）と配列番号７−「AP.PA.wt.Sequenc」（すなわち、本発明の改変型ｒＰＡ遺伝子配列（配列番号１）およびメチオニン残基をコードする５’コドン）との間の配列アラインメントを示す。
【図１３Ｃ１】配列番号８−「DVC.Synthetic.rP」（すなわち、野生型ＰＡ遺伝子配列（配列番号２）およびメチオニン残基をコードする５’コドン）と配列番号７−「AP.PA.wt.Sequenc」（すなわち、本発明の改変型ｒＰＡ遺伝子配列（配列番号１）およびメチオニン残基をコードする５’コドン）との間の配列アラインメントを示す。
【図１３Ｃ２】配列番号８−「DVC.Synthetic.rP」（すなわち、野生型ＰＡ遺伝子配列（配列番号２）およびメチオニン残基をコードする５’コドン）と配列番号７−「AP.PA.wt.Sequenc」（すなわち、本発明の改変型ｒＰＡ遺伝子配列（配列番号１）およびメチオニン残基をコードする５’コドン）との間の配列アラインメントを示す。
【図１３Ｃ３】配列番号８−「DVC.Synthetic.rP」（すなわち、野生型ＰＡ遺伝子配列（配列番号２）およびメチオニン残基をコードする５’コドン）と配列番号７−「AP.PA.wt.Sequenc」（すなわち、本発明の改変型ｒＰＡ遺伝子配列（配列番号１）およびチオニン残基をコードする５’コドン）との間の配列アラインメントを示す。
【図１３Ｄ１】配列番号８−「DVC.Synthetic.rP」（すなわち、野生型ＰＡ遺伝子配列（配列番号２）およびメチオニン残基をコードする５’コドン）と配列番号７−「AP.PA.wt.Sequenc」（すなわち、本発明の改変型ｒＰＡ遺伝子配列（配列番号１）およびメチオニン残基をコードする５’コドン）との間の配列アラインメントを示す。
【図１３Ｄ２】配列番号８−「DVC.Synthetic.rP」（すなわち、野生型ＰＡ遺伝子配列（配列番号２）およびメチオニン残基をコードする５’コドン）と配列番号７−「AP.PA.wt.Sequenc」（すなわち、本発明の改変型ｒＰＡ遺伝子配列（配列番号１）およびメチオニン残基をコードする５’コドン）との間の配列アラインメントを示す。
【図１】
2008504019.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ１】
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【図１３Ａ２】
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【図１３Ａ３】
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【図１３Ｂ１】
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【図１３Ｂ２】
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【図１３Ｂ３】
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【図１３Ｃ１】
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【図１３Ｃ２】
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【図１３Ｃ３】
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【図１３Ｄ１】
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【図１３Ｄ２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年2月28日(2006.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に対して少なくとも８５％の同一性を有する核酸配列であって、組換え炭疽菌防御抗原（ｒＰＡ）をコードする核酸配列
を含む、ポリヌクレオチド配列。
【請求項２】
前記核酸配列が、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項３】
炭疽菌防御抗原（配列番号５）の少なくとも３５アミノ酸残基をコードする核酸配列であって、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列
を含む、ポリヌクレオチド配列。
【請求項４】
前記防御抗原が、配列番号５の少なくとも２００、好ましくは少なくとも３００、および最も好ましくは少なくとも４００のアミノ酸残基を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項５】
前記核酸配列が、請求項１に記載の核酸配列の少なくとも６００、好ましくは少なくとも９００、および最も好ましくは少なくとも１２００のヌクレオチドを含む、請求項３または請求項４に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項６】
分泌配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１から５のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項７】
前記分泌配列が、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＴ、ｏｍｐＦ、ｐｅｌＢ、ｐｈｏＡ、ｌａｍＢ、βラクタマーゼ、黄色ブドウ球菌プロテインＡ、枯草菌エンドグルカナーゼ、マウスＲＮＡｓｅ、ヒト成長ホルモン、エンテロトキシンＳＴ−ＩＩ、ＬＴ−ＡもしくはＬＴ−Ｂ、およびｃｐｇ２（ｃｐｇ）から選択される、請求項６に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項８】
前記分泌配列が、発現されたポリペプチドの細菌宿主細胞の細胞質からのペリプラズム転位のためである、請求項６または請求項７に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項９】
前記分泌配列が、発現されたポリペプチドの細菌宿主細胞の細胞質からの細胞外転位のためである、請求項６または請求項７に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１０】
前記分泌配列が、ペリプラズム転位の間に前記発現されたポリペプチドから切り離され得る、請求項８に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１１】
前記分泌配列が、細胞外転位の間に前記発現されたポリペプチドから切り離され得る、請求項９に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１２】
前記分泌配列が、配列番号３によりコードされるｃｐｇ２（ｃｐｇ）リーダー配列である、請求項６から１１のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１３】
前記核酸配列が３’末端および５’末端を有し、そして該核酸配列が該５’末端に対してクローニングされたメチオニン残基をコードするコドンを有する、請求項１から１２のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１４】
前記核酸が配列番号７またはそのフラグメントであり、該フラグメントが配列番号７の５’末端コドンを含む、請求項１３に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１６】
ｒＰＡポリペプチドまたはそのフラグメントが高度に発現されることを確実にするように選択されるプロモーターを含む、請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
選択マーカーをさらに含む、請求項１５または請求項１６に記載の発現ベクター。
【請求項１８】
前記ベクターが、ｐＥＴベクター、ｐＴｒＫＨｉｓベクター、およびｐＭＴＬベクターから選択される、請求項１５から１７のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項１９】
前記プロモーターが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）プロモーターである、請求項１６から１８のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項２０】
前記ベクターが、化学誘導因子の不在下で前記ポリヌクレオチドを発現する、請求項１５から１９のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項２１】
前記発現ベクターが、配列番号３によりコードされるｃｐｇ２（ｃｐｇ）リーダー配列を含む、請求項１５から２０のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項２２】
前記ベクターが、配列番号４によりコードされるプラスミドｐＭＴＬ１０１５である、請求項１６から２１のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項２３】
前記ベクターが、ＥＣＡＣＣ番号０４０６１４０１で寄託されている、請求項１６から２１のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項２４】
請求項１５から２３のいずれかに記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２５】
前記宿主が大腸菌細胞である、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
前記大腸菌細胞が大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ番号３１６０８）である、請求項２５に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
ｒＰＡまたはそのフラグメントを製造する方法であって、請求項１から１４のいずれかに記載のポリヌクレオチドを発現させる工程を含む、方法。
【請求項２８】
前記ポリヌクレオチドが宿主細胞で発現される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡであり、そして必要に応じてインビトロにてＲＮＡにまず転写され、次いで該ＲＮＡが宿主細胞で翻訳される、請求項２７または請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記宿主細胞が大腸菌宿主細胞である、請求項２８または請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記大腸菌宿主細胞が大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ番号３１６０８）である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１５から２３のいずれかに記載の発現ベクターからｒＰＡを発現させる工程を含む、請求項２７から３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記発現ベクターが、配列番号３によりコードされるｃｐｇ２（ｃｐｇ）リーダー配列を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ベクターが、配列番号４によりコードされるプラスミドｐＭＴＬ１０１５である、請求項３２または請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ベクターが、大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ番号３１６０８）で発現される、請求項３２から３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記発現ベクターを宿主細胞に形質転換する工程、および増殖培地で該形質転換した宿主細胞を培養する工程の初期工程をさらに含む、請求項２８から３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記増殖培地が、動物製品を実質的に含まない、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記形質転換した宿主細胞を低温で培養する工程を含む、請求項３６または請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記宿主細胞を回収する工程をさらに含む、請求項３６から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記宿主細胞からｒＰＡを抽出する工程をさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
分離工程をさらに含む、請求項２７から４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記分離工程が、１つ以上のクロマトグラフィー工程および１つ以上の濾過工程から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記濾過工程の少なくとも１つがダイアフィルトレーション工程である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記クロマトグラフィー工程の少なくとも１つがイオン交換クロマトグラフィー工程および疎水性電荷クロマトグラフィー工程から選択される、請求項４２または請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
請求項２８から４４のいずれかに記載の方法であって、
（ａ）請求項１から１４のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは請求項１５から２３のいずれかに記載の発現ベクターを発現する宿主細胞を得る工程；
（ｂ）該宿主細胞から発現されたｒＰＡを抽出する工程；
（ｃ）該抽出されたｒＰＡをダイアフィルトレーション工程に供する工程；
（ｄ）該ダイアフィルトレートされたｒＰＡを、アニオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性電荷クロマトグラフィーから選択される少なくとも１つのクロマトグラフィー工程に供する工程；および
（ｅ）さらなるダイアフィルトレーション工程を実施する工程
を含む、方法。
【請求項４６】
請求項２７から４５のいずれかに記載の方法により製造されたポリペプチドまたはそのフラグメント。
【請求項４７】
請求項１３または請求項１４に記載のポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドまたはそのフラグメント。
【請求項４８】
請求項１から１４のいずれかに記載のポリヌクレオチド；請求項１５から２３のいずれかに記載の発現ベクター；請求項２４から２６のいずれかに記載の宿主細胞；および請求項４６または請求項４７に記載のポリペプチド；の１つ以上を含むキット。
【請求項４９】
請求項４６または請求項４７に記載のポリペプチドを含む抗原性組成物。
【請求項５０】
炭疽菌による感染に対して免疫応答を誘発する方法であって、請求項４６または請求項４７に記載のポリペプチドまたは請求項４９に記載の抗原性組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項５１】
炭疽菌による感染に対して防御するための、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
炭疽菌による感染に対して免疫応答を誘発するための医薬の製造のための、請求項４６または請求項４７に記載のポリペプチドの使用。
【請求項５３】
炭疽菌による感染に対して防御するための、請求項５２に記載の使用。
【請求項５４】
配列番号４の配列を有するベクター。
【請求項５５】
ＥＣＡＣＣ番号０４０６１４０１またはＥＣＡＣＣ番号０４０５２５０１で寄託されたベクター。
【請求項５６】
実施例および図面を参照して本明細書中に実質的に記載される、ポリヌクレオチド。
【請求項５７】
実施例および図面を参照して本明細書中に実質的に記載される、ポリペプチド。
【請求項５８】
実施例および図面を参照して本明細書中に実質的に記載される、ベクター。
【請求項５９】
実施例および図面を参照して本明細書中に実質的に記載される、宿主細胞。
【請求項６０】
実施例および図面を参照して本明細書中に実質的に記載される、ｒＰＡを製造する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
Batra Smritiら, Biochem. and Biophys. Research Communications, 281巻, 1号, 2001年2月16日, 186-192頁は、ＰＡの膜挿入および／またはサイトゾルへのＬＦ／ＥＦの転位に役割を有し得る変異体残基を有するＰＡ変異体を記載している。
組換え炭疽菌ＰＡの改変体および組換え炭疽菌ＬＦの改変体が、ＵＳ２００４／００２８６９５に記載されている。これらのタンパク質は炭疽菌の無毒株で発現されており、動物宿主において免疫応答を惹起するために使用されている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
ＤＮＡベースの炭疽ワクチン組成物が、ＷＯ２００４／０２４０６７に記載されている。このワクチン組成物は、真核生物宿主（例えば、ワクチン組成物が投与される患者）での発現を最適化するように改変された炭疽菌核酸を含む。
ＷＯ２００４／００３１３９は、原核生物系でポリペプチド配列を発現する際に用いられる改変型シャイン−ダルガノ配列、これらの配列を含むベクター、およびこれらのベクターで形質転換された細胞を記載している。
【国際調査報告】
2008504019.tif 000046
2008504019.tif 000047
2008504019.tif 000048
2008504019.tif 000049