(57)【要約】本発明は、ポリペプチドＦｃ領域変異体及びＦｃ領域をコードするオリゴヌクレオチドを提供する。具体的には、本発明は、新規なＦｃ領域変異体を含む組成物、有用なＦｃ領域変異体を同定する方法、及びＦｃ領域変異体を疾患の治療に使用する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
親ヒト由来のＦｃ領域の変異体又はその部分を含み、該変異体は親Ｆｃ領域と比べ少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換を含むのは、ヒト由来のＦｃ配列に対応する、２４７位、２５１位、２５６位、２６８位、２８０位、３３０位、３３２位、３３９位、３７８位、及び４４０位からなる群より選ばれる位置である抗体。
【請求項２】
該置換が、２４７Ｌ、２４７Ｈ、２４７Ｉ、２５１Ｆ、２５６Ｍ、２５６Ｐ、２５８Ｅ、２６８Ｄ、２８０Ａ、２８０Ｋ、３３０Ｋ、３３０Ｒ、３３２Ｅ、３３２Ｄ、３３２Ｋ、３３２Ｒ、３３９Ｔ、３７８Ｄ及び４４０Ｙよりなる群から選ばれる、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
変異性Ｆｃ領域における、該少なくとも１つのアミノ酸置換を、ヒト由来のＦｃ領域の３３２位に対応する位置に含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
該置換が、３３２Ｅ、３３２Ｄ、３３２Ｋ及び３３２Ｒからなる群より選ばれる、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
該変異性Ｆｃ領域における少なくとも１つのアミノ酸置換が３７８Ｄである、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
該親ヒト由来のＦｃ領域の変異体を含む抗体は、抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を、エフェクター細胞の存在下で、親Ｆｃ領域よりも効率的に媒介する、請求項１から５のいずれか記載の抗体。
【請求項７】
該親ヒト由来のＦｃ領域の変異体を含む抗体は、親Ｆｃ領域を含む抗体が、同じアッセイを行った場合に相対ＡＤＣＣ特異的活性値１００を示す場合に、１００よりも大きい相対ＡＤＣＣ特異的活性値を示す、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
該親ヒト由来のＦｃ領域の変異体を含む抗体は、親Ｆｃ領域を含む抗体が、同じアッセイを行った場合に相対ＡＤＣＣ特異的活性値１００を示す場合に、１００未満の相対ＡＤＣＣ特異的活性値を示す、請求項６に記載の抗体。
【請求項９】
該親ヒト由来のＦｃ領域の変異体を含む抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を、親Ｆｃ領域よりも効率的に媒介する、請求項１から５のいずれか記載の抗体。
【請求項１０】
該親ヒト由来のＦｃ領域の変異体を含む抗体は、親Ｆｃ領域を含む抗体が、同じアッセイを行った場合に相対ＣＤＣ特異的活性値１００を示す場合に、１００よりも大きい相対ＣＤＣ特異的活性値を示す、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
該親ヒト由来のＦｃ領域の変異体を含む抗体は、親Ｆｃ領域を含む抗体が、同じアッセイを行った場合に相対ＣＤＣ特異的活性値１００を示す場合に、１００未満の相対ＣＤＣ特異的活性値を示す、請求項９に記載の抗体。
【請求項１２】
該親Ｆｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥよりなる群から選ばれるクラスに属する、請求項１から１１のいずれか記載の抗体。
【請求項１３】
該親Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４よりなる群から選ばれるサブクラスに属する、請求項１から１２のいずれか記載の抗体。
【請求項１４】
該抗体がモノクローナル抗体である、請求項１から１３のいずれか記載の抗体。
【請求項１５】
該モノクローナル抗体が、２つの同一の重鎖ポリペプチド及び２つの同一の軽鎖ポリペプチドを含む、請求項１４に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１６】
該抗体が、ヒト由来ＣＤ２０に特異的に結合する、請求項１から１５のいずれか記載の抗体。
【請求項１７】
軽鎖ポリペプチドを含み、該軽鎖ポリペプチドは、配列番号５７に示される配列を有するポリペプチドを含む、モノクローナル抗体。
【請求項１８】
さらに重鎖ポリペプチドを含み、該重鎖ポリペプチドは、配列番号５８に示される配列を有するポリペプチドを含む、請求項１７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１９】
請求項１から１８記載の抗体のいずれか１を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドＦｃ領域変異体及びＦｃ領域変異体をコードするオリゴヌクレオチドに関する。具体的には、本発明は、新規なＦｃ領域変異体を含む組成物、有用なＦｃ領域変異体を同定する方法、及びＦｃ領域変異体を（例えば、疾患の治療に）使用する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトには、５つのタイプの免疫グロブリンが存在することが知られている。これらの群はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥとして知られており、重鎖遺伝子のアイソタイプ（γ、μ、δ、α、及びε）に基づいて区別される。最も一般的なアイソタイプはＩｇＧであり、２つの同一な重鎖ポリペプチド及び２つの同一な軽鎖ポリペプチドよりなる（図１参照）。２つの重鎖はジスルフィド結合により互いに共有結合しており、それぞれの軽鎖はジスルフィド結合により重鎖に結合している（図１参照）。重鎖はそれぞれ約４４５のアミノ酸残基を含んでおり、軽鎖はそれぞれ約２１５アミノ酸残基を含んでいる。
【０００３】
重鎖はそれぞれ、通常可変領域（ＶＨ）、重鎖定常領域１（ＣＨ１）、重鎖定常領域２（ＣＨ２）、及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）と呼ばれる４つの異なるドメインを含んでいる（図１参照）。ＣＨ１及びＣＨ２ドメインは、Ｉｇに柔軟性をもたらすヒンジ領域（ドメイン間領域）によって結合されている。軽鎖はそれぞれ、軽鎖可変（ＶＬ）領域及び軽鎖定常（ＣＬ）領域と呼ばれる２つの異なるドメインを含んでいる。
【０００４】
重鎖及び軽鎖の可変領域は、直接抗原に結合し、Ｉｇの多様性及び特異性に関与している。ＶＬ及びＶＨはそれぞれ、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ、超可変領域とも呼ばれる）を有する。ＶＬ及びＶＨが、重鎖及び軽鎖の相互作用により集合すると、ＣＤＲは抗原に接触する結合表面を形成する。
【０００５】
可変領域は、抗原との結合に関与するが、重鎖定常領域、主としてＣＨ２及びＣＨ３は、抗原との結合以外の機能に関与している。この領域は、通常Ｆｃ領域として知られており、多くの重要な機能を有している。例えば、Ｆｃ領域は補体と結合し、食作用又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘発することができる。Ｆｃ領域はまたＦｃ領域レセプターに結合し、食作用又は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発することができる。Ｆｃ領域は、免疫グロブリンの循環及び免疫グロブリンの精製に広く用いられるプロテインＡとの結合を維持する重要な役割を果たしている。
【０００６】
近年、免疫グロブリンの品質及び抗体の抗原結合特性を向上させるための努力がなされてきた。例えば、モノクローナル抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体が、免疫療法のために開発されてきた。ヒトの免疫療法のために使用が承認されてきた抗体、及び対応する疾患の例としては、ＲＩＴＵＸＡＮ（リンパ腫）、ＳＹＮＡＧＩＳ（感染症）、ＺＥＮＥＰＡＸ（生体腎移植）、ＲＥＭＩＣＡＤＥ（クローン病及び関節リウマチ）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（乳ガン）、及びＥＤＲＥＣＯＬＯＭＡＢ（大腸ガン）等が挙げられる。しかし、臨床試験に供されてきたが、有効性の欠如又は関連する他の問題により承認を受けることができなかった抗体が多数存在する。
【０００７】
有効性を増大させ、さらに治療用抗体についての承認を加速させるために必要なことは、Ｆｃ領域を改変させ、改善された性質を有する多様なポリペプチドを生成するための組成物及び方法を提供することである。
(発明の要約)
【０００８】
本発明は、ポリペプチドＦｃ領域変異体及びＦｃ領域変異体をコードするオリゴヌクレオチド、並びにそれらの部分を提供する。具体的には、本発明は、新規なＦｃ領域変異体を含む組成物、有用なＦｃ領域変異体を同定する方法、及びＦｃ領域変異体を使用する方法を提供する。
【０００９】
ある実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体（又は該変異体をコードする核酸配列）を含む組成物を提供し、該変異体は、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の少なくとも１つ、２４７位におけるアミノ酸の修飾を有している。特定の実施形態において、変異体は、抗体（例えば、抗ＣＤ２０抗体）を有している。好ましい実施形態において、アミノ酸の修飾は、Ｐ２４７Ｌである。
【００１０】
他の実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体（又は該変異体をコードする核酸配列）を含む組成物を提供し、該変異体は、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の少なくとも１つ、２５１位におけるアミノ酸の修飾を有している。特定の実施形態において、変異体は、抗体（例えば、抗ＣＤ２０抗体）を有している。好ましい実施形態において、アミノ酸の修飾は、Ｌ２５１Ｆである。
【００１１】
他の実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体（又は該変異体をコードする核酸配列）を含む組成物を提供し、該変異体は、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の少なくとも１つ、２５６位におけるアミノ酸の修飾を有している。特定の実施形態において、変異体は、抗体（例えば、抗ＣＤ２０抗体）を有している。好ましい実施形態において、アミノ酸の修飾は、Ｔ２５６Ｍである。
【００１２】
他の実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体（又は該変異体をコードする核酸配列）を含む組成物を提供し、該変異体は、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の少なくとも１つ、２６８位におけるアミノ酸の修飾を有している。特定の実施形態において、変異体は、抗体（例えば、抗ＣＤ２０抗体）を有している。好ましい実施形態において、アミノ酸の修飾は、Ｈ２６８Ｅである。
【００１３】
他の実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体（又は該変異体をコードする核酸配列）を含む組成物を提供し、該変異体は、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の少なくとも１つ、２８０位におけるアミノ酸の修飾を有している。特定の実施形態において、変異体は、抗体（例えば、抗ＣＤ２０抗体）を有している。好ましい実施形態において、アミノ酸の修飾は、Ｄ２８０Ａである。
【００１４】
他の実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体（又は該変異体をコードする核酸配列）を含む組成物を提供し、該変異体は、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の少なくとも１つ、３３０位におけるアミノ酸の修飾を有している。特定の実施形態において、変異体は、抗体（例えば、抗ＣＤ２０抗体）を有している。好ましい実施形態において、アミノ酸の修飾は、Ａ３３０Ｋである。
【００１５】
他の実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体（又は該変異体をコードする核酸配列）を含む組成物を提供し、該変異体は、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の少なくとも１つ、３３２位におけるアミノ酸の修飾を有している。特定の実施形態において、変異体は、抗体（例えば、抗ＣＤ２０抗体）を有している。好ましい実施形態において、アミノ酸の修飾は、Ｉ３３２Ｅである。
【００１６】
他の実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体（又は該変異体をコードする核酸配列）を含む組成物を提供し、該変異体は、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の少なくとも１つ、３３９位におけるアミノ酸の修飾を有している。特定の実施形態において、変異体は、抗体（例えば、抗ＣＤ２０抗体）を有している。好ましい実施形態において、アミノ酸の修飾は、Ａ３３９Ｔである。
【００１７】
他の実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体（又は該変異体をコードする核酸配列）を含む組成物を提供し、該変異体は、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の少なくとも１つ、３７８位におけるアミノ酸の修飾を有している。特定の実施形態において、変異体は、抗体（例えば、抗ＣＤ２０抗体）を有している。好ましい実施形態において、アミノ酸の修飾は、Ａ３７８Ｄである。
【００１８】
他の実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体（又は該変異体をコードする核酸配列）を含む組成物を提供し、該変異体は、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の少なくとも１つ、４４０位におけるアミノ酸の修飾を有している。特定の実施形態において、変異体は、抗体（例えば、抗ＣＤ２０抗体）を有している。好ましい実施形態において、アミノ酸の修飾は、Ｓ４４０Ｙである。
【００１９】
ある実施形態において、本発明は、配列番号１５に示した配列を有するペプチド（アミノ酸の修飾Ｐ２４７Ｌを含む）を提供する。他の実施形態において、本発明は、改変Ｐ２４７Ｌを有するＣＨ２領域をコードする核酸配列（例えば、配列番号４０）を提供する。ある実施形態において、本発明は修飾Ｐ２４７Ｌを有し、配列番号１５を含む、ＣＨ２領域をコードするアミノ酸配列を提供する。ある実施形態において、本発明は、配列番号１６に示した配列を有するペプチド（アミノ酸の修飾Ｌ２５１Ｆを含む）を提供する。他の実施形態において、本発明は、修飾Ｌ２５１Ｆを有するＣＨ２領域をコードする核酸配列（例えば、配列番号４１）を提供する。ある実施形態において、本発明は改変Ｌ２５１Ｆを有し、配列番号１６を含む、ＣＨ２領域をコードするアミノ酸配列を提供する。
【００２０】
ある実施形態において、本発明は、配列番号１７に示した配列を有するペプチド（アミノ酸の修飾Ｔ２５６Ｍを含む）を提供する。他の実施形態において、本発明は、改変Ｔ２５６Ｍを有するＣＨ２領域をコードする核酸配列（例えば、配列番号４２）を提供する。ある実施形態において、本発明は修飾Ｔ２５６Ｍを有し、配列番号１７を含む、ＣＨ２領域をコードするアミノ酸配列を提供する。ある実施形態において、本発明は、配列番号２０に示した配列を有するペプチド（アミノ酸の修飾Ｈ２６８Ｅを含む）を提供する。追加の実施形態において、本発明は、修飾Ｈ２６８Ｅを有するＣＨ２領域をコードする核酸配列（例えば、配列番号４５）を提供する。さらなる実施形態において、本発明は改変Ｈ２６８Ｅを有し、配列番号２０を含む、ＣＨ２領域をコードするアミノ酸配列を提供する。
【００２１】
ある実施形態において、本発明は、配列番号２１に示した配列を有するペプチド（アミノ酸の修飾Ｄ２８０Ａを含む）を提供する。他の実施形態において、本発明は、改変Ｄ２８０Ａを有するＣＨ２領域をコードする核酸配列（例えば、配列番号４６）を提供する。ある実施形態において、本発明は修飾Ｄ２８０Ａを有し、配列番号２１を含む、ＣＨ２領域をコードするアミノ酸配列を提供する。ある実施形態において、本発明は、配列番号２３に示した配列を有するペプチド（アミノ酸の修飾Ａ３３０Ｋを含む）を提供する。他の実施形態において、本発明は、修飾Ａ３３０Ｋを有するＣＨ２領域をコードする核酸配列（例えば、配列番号４８）を提供する。ある実施形態において、本発明は改変Ａ３３０Ｋを有し、配列番号２３を含む、ＣＨ２領域をコードするアミノ酸配列を提供する。
【００２２】
ある実施形態において、本発明は、配列番号２６に示した配列を有するペプチド（アミノ酸の修飾Ｉ３３２Ｅを含む）を提供する。他の実施形態において、本発明は、改変Ｉ３３２Ｅを有するＣＨ２領域をコードする核酸配列（例えば、配列番号５１）を提供する。ある実施形態において、本発明は修飾Ｉ３３２Ｅを有し、配列番号２６を含む、ＣＨ２領域をコードするアミノ酸配列を提供する。ある実施形態において、本発明は、配列番号２９に示した配列を有するペプチド（アミノ酸の修飾Ａ３３９Ｔを含む）を提供する。追加の実施形態において、本発明は、修飾Ｌ２５１Ｆを有するＣＨ２領域をコードする核酸配列（例えば、配列番号５４）を提供する。追加の実施形態において、本発明は改変Ａ３３９Ｔを有し、配列番号２９を含む、ＣＨ２領域をコードするアミノ酸配列を提供する。
【００２３】
ある実施形態において、本発明は、配列番号３０に示した配列を有するペプチド（アミノ酸の修飾Ａ３７８Ｄを含む）を提供する。他の実施形態において、本発明は、改変Ａ３７８Ｄを有するＣＨ２領域をコードする核酸配列（例えば、配列番号５５）を提供する。ある実施形態において、本発明は修飾Ｓ４４０Ｙを有し、配列番号３０を含む、ＣＨ２領域をコードするアミノ酸配列を提供する。
【００２４】
ある実施形態において、本発明は、配列番号３１に示した配列を有するペプチド（アミノ酸の修飾Ｓ４４０Ｙを含む）を提供する。他の実施形態において、本発明は、改変Ｓ４４０Ｙを有するＣＨ２領域をコードする核酸配列（例えば、配列番号５６）を提供する。ある実施形態において、本発明は修飾Ｓ４４０Ｙを有し、配列番号３１を含む、ＣＨ２領域をコードするアミノ酸配列を提供する。
【００２５】
ある実施形態において、本発明は、少なくともＦｃ領域の部分を有する親ポリペプチドの変異体（又は該変異体をコードする核酸配列）を含む組成物を提供し、該変異体は、Ｆｃ領域の２４７位において、Ｐ２４７Ｈ、Ｐ２４７Ｉ及びＰ２４７Ｌから選ばれるアミノ酸の修飾を有する。他の実施形態において、本発明は、少なくともＦｃ領域の部分を有する親ポリペプチドの変異体（又は該変異体をコードする核酸配列）を含む組成物を提供し、該変異体は、Ｆｃ領域の２５１位において、Ｌ２５１Ｆから選ばれるアミノ酸の修飾を有する。他の実施形態において、本発明は、少なくともＦｃ領域の部分を有する親ポリペプチドの変異体（又は該変異体をコードする核酸配列）を含む組成物を提供し、該変異体は、Ｆｃ領域の２５６位において、Ｔ２５６Ｍ及びＴ２５６Ｐから選ばれるアミノ酸の修飾を有する。他の実施形態において、本発明は、少なくともＦｃ領域の部分を有する親ポリペプチドの変異体（又は該変異体をコードする核酸配列）を含む組成物を提供し、該変異体は、Ｆｃ領域の２６８位において、Ｈ２６８Ｄ及びＨ２６８Ｅから選ばれるアミノ酸の修飾を有する。他の実施形態において、本発明は、少なくともＦｃ領域の部分を有する親ポリペプチドの変異体（又は該変異体をコードする核酸配列）を含む組成物を提供し、該変異体は、Ｆｃ領域の２８０位において、Ｄ２８０Ａ及びＤ２８０Ｋから選ばれるアミノ酸の修飾を有する。他の実施形態において、本発明は、少なくともＦｃ領域の部分を有する親ポリペプチドの変異体（又は該変異体をコードする核酸配列）を含む組成物を提供し、該変異体は、Ｆｃ領域の３３０位において、Ａ３３０Ｋ及びＡ３３０Ｒから選ばれるアミノ酸の修飾を有する。他の実施形態において、本発明は、少なくともＦｃ領域の部分を有する親ポリペプチドの変異体（又は該変異体をコードする核酸配列）を含む組成物を提供し、該変異体は、Ｆｃ領域の３３２位において、Ｉ３３２Ｄ及びＩ３３２Ｅから選ばれるアミノ酸の修飾を有する。他の実施形態において、本発明は、少なくともＦｃ領域の部分を有する親ポリペプチドの変異体（又は該変異体をコードする核酸配列）を含む組成物を提供し、該変異体は、Ｆｃ領域の３３９位において、Ａ３３９Ｔから選ばれるアミノ酸の修飾を有する。他の実施形態において、本発明は、少なくともＦｃ領域の部分を有する親ポリペプチドの変異体（又は該変異体をコードする核酸配列）を含む組成物を提供し、該変異体は、Ｆｃ領域の３７８位において、Ａ３７８Ｄから選ばれるアミノ酸の修飾を有する。他の実施形態において、本発明は、少なくともＦｃ領域の部分を有する親ポリペプチドの変異体（又は該変異体をコードする核酸配列）を含む組成物を提供し、該変異体は、Ｆｃ領域の４４０位において、Ｓ４４０Ｙから選ばれるアミノ酸の修飾を有する。
【００２６】
ある実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体を含む組成物を提供し、該変異体は、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の少なくとも１つ、２４７位におけるアミノ酸の修飾を有している。他の実施形態において、本発明は、ａ）ｉ）Ｆｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体を含み、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の少なくとも１つ、２４７位におけるアミノ酸の修飾を有する組成物、及びｉｉ）１又は複数の疾患の症状を有する被験者を提供すること、並びにｂ）組成物を、症状のうち少なくとも１つが改善されるような条件下で被験者に投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態において、変異体は抗体又はイムノアドヘシンを有し、被験者は抗体又はイムノアドヘシン応答性疾患の症状を有している。
【００２７】
ある実施形態において、Ｆｃ領域の少なくとも部分（例えば、アミノ酸の修飾を有するＦｃ領域の４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％）を有している。ある実施形態において、ポリペプチド変異体はＣＨ２又はＣＨ３領域を有している。さらなる実施形態において、組成物は配列番号１３を有するアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、組成物は配列番号１４を有するアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、組成物は配列番号１５を有するアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、組成物は配列番号３８及び／又は配列番号３９及び／又は配列番号４０を有する核酸配列又はそれらに相補的な核酸配列、又は配列番号３８、３９、又は４０の配列に高ストリンジェンシーな条件下で結合する核酸配列を有する。さらなる実施形態において、本発明は宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）、及び配列番号３８及び／又は配列番号３９及び／又は配列番号４０を有するベクターを提供する。特定の実施形態において、本発明はコンピューターで読み取り可能な媒体を提供し、該コンピューターで読み取り可能な媒体は配列番号１３、１４、３８、３９、又は４０の表現をコードしている。
【００２８】
ある実施形態において、ポリペプチド変異体は、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する。ある実施形態において、ポリペプチド変異体は抗体又は抗体のフラグメント（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はＦｃフラグメント）を有する。ある実施形態において、親ポリペプチドはヒトＩｇＧのＦｃ領域を有する。さらなる実施形態において、親ポリペプチドはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＦｃ領域を有する。他の実施形態において、親ポリペプチドは配列番号１〜１２から選ばれるアミノ酸配列を有する。
【００２９】
好ましい実施形態において、アミノ酸の修飾は、Ｐ２４７Ｈ、Ｐ２４７Ｉ、又はＰ２４７Ｌである。ある実施形態において、ポリペプチド変異体は、Ｆｃ領域に第２、第３、第４その他のアミノ酸の修飾を有する（表１参照）。ある実施形態において、変異体はＣＨＯにおいて発現したポリペプチドである。
【００３０】
ある実施形態において、本発明はＦｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体を有する組成物を提供し、該変異体は、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の２５１位において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有する。他の実施形態において、本発明は、ａ）ｉ）Ｆｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体を有し、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の２５１位において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有する組成物、及びｉｉ）１又は複数の疾患の症状を有する被験者を提供すること、及びｂ）組成物を、症状のうち少なくとも１つが改善されるような条件下で被験者に投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態において、変異体は抗体又はイムノアドヘシンを有し、被験者は抗体又はイムノアドヘシン応答性疾患の症状を有している。
【００３１】
ある実施形態において、Ｆｃ領域の少なくとも部分（例えば、アミノ酸の修飾を有するＦｃ領域の４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％）を有している。ある実施形態において、ポリペプチド変異体はＣＨ２又はＣＨ３領域を有している。さらなる実施形態において、組成物は配列番号１６を有するアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、組成物は配列番号４１を有する核酸配列又はそれらに相補的な核酸配列、又は配列番号４１の配列に高ストリンジェンシーな条件下で結合する核酸配列を有する。さらなる実施形態において、本発明は宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）、及び配列番号４１を有するベクターを提供する。特定の実施形態において、本発明はコンピューターで読み取り可能な媒体を提供し、該コンピューターで読み取り可能な媒体は配列番号１６、又は４１の表現をコードしている。
【００３２】
ある実施形態において、ポリペプチド変異体は、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する。ある実施形態において、ポリペプチド変異体は抗体又は抗体のフラグメント（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はＦｃフラグメント）を有する。ある実施形態において、親ポリペプチドはヒトＩｇＧのＦｃ領域を有する。さらなる実施形態において、親ポリペプチドはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＦｃ領域を有する。他の実施形態において、親ポリペプチドは配列番号１〜１２から選ばれるアミノ酸配列を有する。
【００３３】
好ましい実施形態において、アミノ酸の修飾は、Ｌ２５１Ｆである。ある実施形態において、ポリペプチド変異体は、Ｆｃ領域に第２、第３、第４その他のアミノ酸の修飾を有する（表１参照）。ある実施形態において、変異体はＣＨＯにおいて発現したポリペプチドである。
【００３４】
ある実施形態において、本発明はＦｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体を有する組成物を提供し、該変異体は、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の２５６位において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有する。他の実施形態において、本発明は、ａ）ｉ）Ｆｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体を有し、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の２５６位において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有する組成物、及びｉｉ）１又は複数の疾患の症状を有する被験者を提供すること、及びｂ）組成物を、症状のうち少なくとも１つが改善されるような条件下で被験者に投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態において、変異体は抗体又はイムノアドヘシンを有し、被験者は抗体又はイムノアドヘシン応答性疾患の症状を有している。
【００３５】
ある実施形態において、Ｆｃ領域の少なくとも部分（例えば、アミノ酸の修飾を有するＦｃ領域の４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％）を有している。ある実施形態において、ポリペプチド変異体はＣＨ２又はＣＨ３領域を有している。さらなる実施形態において、組成物は配列番号１７を有するアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、組成物は配列番号１８を有するアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、組成物は配列番号４２及び／又は配列番号４３を有する核酸配列又はそれらに相補的な核酸配列、又は配列番号４２又は４３の配列に高ストリンジェンシーな条件下で結合する核酸配列を有する。さらなる実施形態において、本発明は宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）、及び配列番号４２及び／又は配列番号４３を有するベクターを提供する。特定の実施形態において、本発明はコンピューターで読み取り可能な媒体を提供し、該コンピューターで読み取り可能な媒体は配列番号１７、１８、４２、又は４３の表現をコードしている。
【００３６】
ある実施形態において、ポリペプチド変異体は、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する。ある実施形態において、ポリペプチド変異体は抗体又は抗体のフラグメント（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はＦｃフラグメント）を有する。ある実施形態において、親ポリペプチドはヒトＩｇＧのＦｃ領域を有する。さらなる実施形態において、親ポリペプチドはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＦｃ領域を有する。他の実施形態において、親ポリペプチドは配列番号１〜１２から選ばれるアミノ酸配列を有する。
【００３７】
好ましい実施形態において、アミノ酸の修飾は、Ｔ２５６Ｐである。ある実施形態において、ポリペプチド変異体は、Ｆｃ領域に第２、第３、第４その他のアミノ酸の修飾を有する（表１参照）。ある実施形態において、変異体はＣＨＯにおいて発現したポリペプチドである。
【００３８】
ある実施形態において、本発明はＦｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体を有する組成物を提供し、該変異体は、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の２６８位において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有する。他の実施形態において、本発明は、ａ）ｉ）Ｆｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体を有し、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の２６８位において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有する組成物、及びｉｉ）１又は複数の疾患の症状を有する被験者を提供すること、及びｂ）組成物を、症状のうち少なくとも１つが改善されるような条件下で被験者に投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態において、変異体は抗体又はイムノアドヘシンを有し、被験者は抗体又はイムノアドヘシン応答性疾患の症状を有している。
【００３９】
ある実施形態において、Ｆｃ領域の少なくとも部分（例えば、アミノ酸の修飾を有するＦｃ領域の４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％）を有している。ある実施形態において、ポリペプチド変異体はＣＨ２又はＣＨ３領域を有している。さらなる実施形態において、組成物は配列番号１９を有するアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、組成物は配列番号２０を有するアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、組成物は配列番号４４及び／又は配列番号４５を有する核酸配列又はそれらに相補的な核酸配列、又は配列番号４４又は４５の配列に高ストリンジェンシーな条件下で結合する核酸配列を有する。さらなる実施形態において、本発明は宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）、及び配列番号４４及び／又は配列番号４５を有するベクターを提供する。特定の実施形態において、本発明はコンピューターで読み取り可能な媒体を提供し、該コンピューターで読み取り可能な媒体は配列番号１９，２０、４４、又は４５の表現をコードしている。
【００４０】
ある実施形態において、本発明はＦｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体を有する組成物を提供し、該変異体は、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の３３２位において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有する。特定の実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸の修飾は、Ｉ３３２Ｋ又はＩ３３２Ｒである。
【００４１】
ある実施形態において、ポリペプチド変異体は、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する。ある実施形態において、ポリペプチド変異体は抗体又は抗体のフラグメント（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はＦｃフラグメント）を有する。ある実施形態において、親ポリペプチドはヒトＩｇＧのＦｃ領域を有する。さらなる実施形態において、親ポリペプチドはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＦｃ領域を有する。他の実施形態において、親ポリペプチドは配列番号１〜１２から選ばれるアミノ酸配列を有する。
【００４２】
好ましい実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸の修飾は、Ｈ２６８Ｄ又はＨ２６８Ｅである。ある実施形態において、ポリペプチド変異体は、Ｆｃ領域に第２、第３、第４その他のアミノ酸の修飾を有する（例えば、表１参照）。ある実施形態において、変異体はＣＨＯにおいて発現したポリペプチドである。
【００４３】
ある実施形態において、本発明はＦｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体を有する組成物を提供し、該変異体は、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の２８０位において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有する。他の実施形態において、本発明は、ａ）ｉ）Ｆｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体を有し、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の２８０位において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有する組成物、及びｉｉ）１又は複数の疾患の症状を有する被験者を提供すること、及びｂ）組成物を、症状のうち少なくとも１つが改善されるような条件下で被験者に投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態において、変異体は抗体又はイムノアドヘシンを有し、被験者は抗体又はイムノアドヘシン応答性疾患の症状を有している。
【００４４】
ある実施形態において、Ｆｃ領域の少なくとも部分（例えば、アミノ酸の修飾を有するＦｃ領域の４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％）を有している。ある実施形態において、ポリペプチド変異体はＣＨ２又はＣＨ３領域を有している。さらなる実施形態において、組成物は配列番号２１を有するアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、組成物は配列番号２２を有するアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、組成物は配列番号４６及び／又は配列番号４７を有する核酸配列又はそれらに相補的な核酸配列、又は配列番号４６又は４７の配列に高ストリンジェンシーな条件下で結合する核酸配列を有する。さらなる実施形態において、本発明は宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）、及び配列番号４６及び／又は配列番号４７を有するベクターを提供する。特定の実施形態において、本発明はコンピューターで読み取り可能な媒体を提供し、該コンピューターで読み取り可能な媒体は配列番号２１、２２、４６、又は４７の表現をコードしている。
【００４５】
ある実施形態において、ポリペプチド変異体は、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する。ある実施形態において、ポリペプチド変異体は抗体又は抗体のフラグメント（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はＦｃフラグメント）を有する。ある実施形態において、親ポリペプチドはヒトＩｇＧのＦｃ領域を有する。さらなる実施形態において、親ポリペプチドはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＦｃ領域を有する。他の実施形態において、親ポリペプチドは配列番号１〜１２から選ばれるアミノ酸配列を有する。
【００４６】
好ましい実施形態において、アミノ酸の修飾は、Ｄ２８０Ａ、又はＤ２８０Ｋである。ある実施形態において、ポリペプチド変異体は、Ｆｃ領域に第２、第３、第４その他のアミノ酸の修飾を有する（例えば、表１参照）。ある実施形態において、変異体はＣＨＯにおいて発現したポリペプチドである。
【００４７】
ある実施形態において、本発明はＦｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体を有する組成物を提供し、該変異体は、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の３３０位において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有する。他の実施形態において、本発明は、ａ）ｉ）Ｆｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体を有し、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の３３０位において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有する組成物、及びｉｉ）１又は複数の疾患の症状を有する被験者を提供すること、及びｂ）組成物を、症状のうち少なくとも１つが改善されるような条件下で被験者に投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態において、変異体は抗体又はイムノアドヘシンを有し、被験者は抗体又はイムノアドヘシン応答性疾患の症状を有している。
【００４８】
ある実施形態において、Ｆｃ領域の少なくとも部分（例えば、アミノ酸の修飾を有するＦｃ領域の４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％）を有している。ある実施形態において、ポリペプチド変異体はＣＨ２又はＣＨ３領域を有している。さらなる実施形態において、組成物は配列番号２３を有するアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、組成物は配列番号２４を有するアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、組成物は配列番号４８及び／又は配列番号４９を有する核酸配列又はそれらに相補的な核酸配列、又は配列番号４８又は４９の配列に高ストリンジェンシーな条件下で結合する核酸配列を有する。さらなる実施形態において、本発明は宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）、及び配列番号４８及び／又は配列番号４９を有するベクターを提供する。特定の実施形態において、本発明はコンピューターで読み取り可能な媒体を提供し、該コンピューターで読み取り可能な媒体は配列番号２３、２４、４８、又は４９の表現をコードしている。
【００４９】
ある実施形態において、ポリペプチド変異体は、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する。ある実施形態において、ポリペプチド変異体は抗体又は抗体のフラグメント（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はＦｃフラグメント）を有する。ある実施形態において、親ポリペプチドはヒトＩｇＧのＦｃ領域を有する。さらなる実施形態において、親ポリペプチドはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＦｃ領域を有する。他の実施形態において、親ポリペプチドは配列番号１〜１２から選ばれるアミノ酸配列を有する。
【００５０】
好ましい実施形態において、アミノ酸の修飾は、Ａ３３０Ｋ、又はＡ３３０Ｒである。ある実施形態において、ポリペプチド変異体は、Ｆｃ領域に第２、第３、第４その他のアミノ酸の修飾を有する（例えば、表１参照）。ある実施形態において、変異体はＣＨＯにおいて発現したポリペプチドである。
【００５１】
ある実施形態において、本発明はＦｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体を有する組成物を提供し、該変異体は、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の３３２位において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有する。他の実施形態において、本発明は、ａ）ｉ）Ｆｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体を有し、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の３３２位において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有する組成物、及びｉｉ）１又は複数の疾患の症状を有する被験者を提供すること、及びｂ）組成物を、症状のうち少なくとも１つが改善されるような条件下で被験者に投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態において、変異体は抗体又はイムノアドヘシンを有し、被験者は抗体又はイムノアドヘシン応答性疾患の症状を有している。
【００５２】
ある実施形態において、Ｆｃ領域の少なくとも部分（例えば、アミノ酸の修飾を有するＦｃ領域の４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％）を有している。ある実施形態において、ポリペプチド変異体はＣＨ２又はＣＨ３領域を有している。さらなる実施形態において、組成物は配列番号２５を有するアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、組成物は配列番号２６を有するアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、組成物は配列番号５０及び／又は配列番号５１を有する核酸配列又はそれらに相補的な核酸配列、又は配列番号５０又は５１の配列に高ストリンジェンシーな条件下で結合する核酸配列を有する。さらなる実施形態において、本発明は宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）、及び配列番号５０及び／又は配列番号５１を有するベクターを提供する。特定の実施形態において、本発明はコンピューターで読み取り可能な媒体を提供し、該コンピューターで読み取り可能な媒体は配列番号２５、２６、５０、又は５１の表現をコードしている。
【００５３】
ある実施形態において、ポリペプチド変異体は、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する。ある実施形態において、ポリペプチド変異体は抗体又は抗体のフラグメント（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はＦｃフラグメント）を有する。ある実施形態において、親ポリペプチドはヒトＩｇＧのＦｃ領域を有する。さらなる実施形態において、親ポリペプチドはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＦｃ領域を有する。他の実施形態において、親ポリペプチドは配列番号１〜１２から選ばれるアミノ酸配列を有する。
【００５４】
好ましい実施形態において、アミノ酸の修飾は、Ｉ３３２Ｄ、又はＩ３３２Ｅである。ある実施形態において、ポリペプチド変異体は、Ｆｃ領域に第２、第３、第４その他のアミノ酸の修飾を有する（例えば、表１参照）。ある実施形態において、変異体はＣＨＯにおいて発現したポリペプチドである。
【００５５】
ある実施形態において、本発明はＦｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体を有する組成物を提供し、該変異体は、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の３３９位において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有する。他の実施形態において、本発明は、ａ）ｉ）Ｆｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体を有し、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の３３９位において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有する組成物、及びｉｉ）１又は複数の疾患の症状を有する被験者を提供すること、及びｂ）組成物を、症状のうち少なくとも１つが改善されるような条件下で被験者に投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態において、変異体は抗体又はイムノアドヘシンを有し、被験者は抗体又はイムノアドヘシン応答性疾患の症状を有している。
【００５６】
ある実施形態において、Ｆｃ領域の少なくとも部分（例えば、アミノ酸の修飾を有するＦｃ領域の４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％）を有している。ある実施形態において、ポリペプチド変異体はＣＨ２又はＣＨ３領域を有している。さらなる実施形態において、組成物は配列番号２９を有するアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、組成物は配列番号５４を有する核酸配列又はそれらに相補的な核酸配列、又は配列番号５４の配列に高ストリンジェンシーな条件下で結合する核酸配列を有する。さらなる実施形態において、本発明は宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）、及び配列番号５４を有するベクターを提供する。特定の実施形態において、本発明はコンピューターで読み取り可能な媒体を提供し、該コンピューターで読み取り可能な媒体は配列番号２９、又は５４の表現をコードしている。
【００５７】
ある実施形態において、ポリペプチド変異体は、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する。ある実施形態において、ポリペプチド変異体は抗体又は抗体のフラグメント（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はＦｃフラグメント）を有する。ある実施形態において、親ポリペプチドはヒトＩｇＧのＦｃ領域を有する。さらなる実施形態において、親ポリペプチドはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＦｃ領域を有する。他の実施形態において、親ポリペプチドは配列番号１〜１２から選ばれるアミノ酸配列を有する。
【００５８】
好ましい実施形態において、アミノ酸の修飾は、Ａ３３９Ｔである。ある実施形態において、ポリペプチド変異体は、Ｆｃ領域に第２、第３、第４その他のアミノ酸の修飾を有する（例えば、表１参照）。ある実施形態において、変異体はＣＨＯにおいて発現したポリペプチドである。
【００５９】
ある実施形態において、本発明はＦｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体を有する組成物を提供し、該変異体は、親ポリペプチドよりも効率的に全血アッセイにおける標的細胞の消失を媒介し、Ｆｃ領域の３７８位において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有する。他の実施形態において、本発明は、ａ）ｉ）Ｆｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体を有し、親ポリペプチドよりも効率的に全血アッセイにおける標的細胞の消失を媒介し、Ｆｃ領域の３７８位において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有する組成物、及びｉｉ）１又は複数の疾患の症状を有する被験者を提供すること、及びｂ）組成物を、症状のうち少なくとも１つが改善されるような条件下で被験者に投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態において、変異体は抗体又はイムノアドヘシンを有し、被験者は抗体又はイムノアドヘシン応答性疾患の症状を有している。
【００６０】
ある実施形態において、Ｆｃ領域の少なくとも部分（例えば、アミノ酸の修飾を有するＦｃ領域の４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％）を有している。ある実施形態において、ポリペプチド変異体はＣＨ２又はＣＨ３領域を有している。さらなる実施形態において、組成物は配列番号３０を有するアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、組成物は配列番号５５を有する核酸配列又はそれらに相補的な核酸配列、又は配列番号５５の配列に高ストリンジェンシーな条件下で結合する核酸配列を有する。さらなる実施形態において、本発明は宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）、及び配列番号５５を有するベクターを提供する。特定の実施形態において、本発明はコンピューターで読み取り可能な媒体を提供し、該コンピューターで読み取り可能な媒体は配列番号３０、又は５５の表現をコードしている。
【００６１】
ある実施形態において、ポリペプチド変異体は、親ポリペプチドよりも効率的に全血アッセイにおける標的細胞の消失を媒介する。ある実施形態において、ポリペプチド変異体は抗体又は抗体のフラグメント（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はＦｃフラグメント）を有する。ある実施形態において、親ポリペプチドはヒトＩｇＧのＦｃ領域を有する。さらなる実施形態において、親ポリペプチドはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＦｃ領域を有する。他の実施形態において、親ポリペプチドは配列番号１〜１２から選ばれるアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態において、アミノ酸の修飾は、Ａ３７８Ｄである。ある実施形態において、ポリペプチド変異体は、Ｆｃ領域に第２、第３、第４その他のアミノ酸の修飾を有する（例えば、表１参照）。ある実施形態において、変異体はＣＨＯにおいて発現したポリペプチドである。
【００６２】
ある実施形態において、本発明はＦｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体を有する組成物を提供し、該変異体は、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の４４０位において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有する。他の実施形態において、本発明は、ａ）ｉ）Ｆｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体を有し、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の４４０位において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有する組成物、及びｉｉ）１又は複数の疾患の症状を有する被験者を提供すること、及びｂ）組成物を、症状のうち少なくとも１つが改善されるような条件下で被験者に投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態において、変異体は抗体又はイムノアドヘシンを有し、被験者は抗体又はイムノアドヘシン応答性疾患の症状を有している。
【００６３】
ある実施形態において、Ｆｃ領域の少なくとも部分（例えば、アミノ酸の修飾を有するＦｃ領域の４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％）を有している。ある実施形態において、ポリペプチド変異体はＣＨ２又はＣＨ３領域を有している。さらなる実施形態において、組成物は配列番号３１を有するアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、組成物は配列番号５６を有する核酸配列又はそれらに相補的な核酸配列、又は配列番号５６の配列に高ストリンジェンシーな条件下で結合する核酸配列を有する。さらなる実施形態において、本発明は宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）、及び配列番号５６を有するベクターを提供する。特定の実施形態において、本発明はコンピューターで読み取り可能な媒体を提供し、該コンピューターで読み取り可能な媒体は配列番号３１、又は５６の表現をコードしている。
【００６４】
ある実施形態において、ポリペプチド変異体は、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する。ある実施形態において、ポリペプチド変異体は抗体又は抗体のフラグメント（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はＦｃフラグメント）を有する。ある実施形態において、親ポリペプチドはヒトＩｇＧのＦｃ領域を有する。さらなる実施形態において、親ポリペプチドはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＦｃ領域を有する。他の実施形態において、親ポリペプチドは配列番号１〜１２から選ばれるアミノ酸配列を有する。
【００６５】
好ましい実施形態において、アミノ酸の修飾は、Ｓ４４０Ｙである。ある実施形態において、ポリペプチド変異体は、Ｆｃ領域に第２、第３、第４その他のアミノ酸の修飾を有する（例えば、表１参照）。ある実施形態において、変異体はＣＨＯにおいて発現したポリペプチドである。
【００６６】
さらなる実施形態において、本発明はＦｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体を有する組成物を提供し、該変異体は、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の２４７、２５１、２５６、２６８、２８０、３３０、３３２、３３９、３７８、又は４４０位、及びこれらの組み合わせにおいて少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有する。ある実施形態において、本発明は、エフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する変異性Ｆｃポリペプチドをコードする核酸配列を提供し、該変異性Ｆｃポリペプチドは、２４７、２５１、２５６、２６８、２８０、３３０、３３２、３３９、３７８、又は４４０位、及びこれらの組み合わせにおいて少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有する。
【００６７】
さらなる実施形態において、本発明はＦｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体を有する組成物を提供し、該変異体は、親ポリペプチドよりも効率的に全血アッセイにおける標的細胞の消失を媒介し、Ｆｃ領域の２４７、２５１、２５６、２６８、２８０、３３０、３３２、３３９、３７８、又は４４０位、及びこれらの組み合わせにおいて少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有する。ある実施形態において、本発明は、親ポリペプチドよりも効率的に全血アッセイにおける標的細胞の消失を媒介する変異性Ｆｃポリペプチドをコードする核酸配列を提供し、該変異性Ｆｃポリペプチドは、２４７、２５１、２５６、２６８、２８０、３３０、３３２、３３９、３７８、若しくは４４０位、又はこれらの組み合わせにおいて少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有する。
【００６８】
ある実施形態において、本発明の変異体及び変異体をコードする核酸配列は、キットにおいて少なくとも１つの他の成分と共に提供される。例えば、キットは少なくとも１種類の変異体及び変異体を使用するための取扱説明書を有していてよい。キットはまた、バッファー及び他の有用な試薬を含んでいてもよい。
【００６９】
ある実施形態において、本発明は、ａ）ｉ）標的抗原（例えば、ＣＤ２０）、ｉｉ）Ｆｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体を有し、Ｆｃ領域において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有する組成物、及びｉｉｉ）エフェクター細胞（例えば、ヒトドナー由来の濃縮ＰＢＭＣ（末梢血単核球））を提供すること、及びｂ）標的細胞を、変異体が標的細胞に結合するような条件下（例えば、細胞表面に発現したリガンドを介して）で標的細胞に接触させること、及びｃ）標的細胞の殺害率を測定すること（例えば、ＬＤＨ又はクロム５１の放出）を含む方法を提供する。
【００７０】
他の実施形態において、本発明は、ａ）ｉ）標的抗原を発現した細胞（例えば、ＣＤ２０を発現したＢ細胞）を含む全血サンプル、ｉｉ）Ｆｃ領域の少なくとも部分を有する親ポリペプチドの変異体を有し、Ｆｃ領域において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有する組成物、及びｉｉｉ）エフェクター細胞（例えば、ヒトドナー由来の濃縮ＰＢＭＣ（末梢血単核球））を提供すること、及びｂ）標的細胞を、変異体が標的細胞に結合するような条件下（例えば、細胞表面に発現したＣＤ２０リガンドを介して）で標的細胞に接触させること、及びｃ）標的細胞の消滅率を測定すること（例えば、ＣＤ１９等の他のＢ細胞マーカーを用いたＦａｃｓ（蛍光抗体法）分析）を含む方法を提供する。
【００７１】
ある実施形態において、本発明は、ａ）ｉ）標的細胞、ｉｉ）Ｆｃ領域を有する親ポリペプチドの候補変異体を有し、候補変異体はＦｃ領域において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有し、候補変異体は、第１の種のエフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に標的細胞に対する細胞傷害を媒介する組成物、及びｉｉｉ）第２の種のエフェクター細胞を提供すること、及びｂ）組成物を、候補変異体が標的細胞と結合することによって候補変異体が結合した標的細胞を生成するような条件下で標的細胞とインキュベートすること、ｃ）第２の種のエフェクター細胞を候補変異体が結合した標的細胞と混合すること、ｄ）標的細胞に対する（例えば、候補変異体に媒介された）細胞傷害を測定すること、ｅ）候補変異体が第２の種のエフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に標的細胞に対する細胞傷害を媒介するか否かを決定することを含む、複数種拡張変異体を同定する方法を提供する。ある実施形態において、該方法は第２の種のエフェクター細胞と同様の手法により親ポリペプチドをスクリーニングすることをさらに含んでいてもよい。さらなる実施形態において、工程ｂ）及びｃ）は同時に行われる。特定の実施形態において、該方法はさらに、工程ｆ）候補変異体を、第２の種のエフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に標的細胞に対する細胞傷害を媒介する複数種拡張変異体として同定することを含んでいてもよい。特定の実施形態において、該方法はさらに、工程ｆ）候補変異体を、第２の種のエフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも約１．２倍（又は１．５倍、５倍、又は約１０倍）効率的に標的細胞に対する細胞傷害を媒介する（例えば、約１．２倍の標的細胞のよう怪物が観察される）複数種拡張変異体として同定することを含んでいてもよい。
【００７２】
他の実施形態において、本発明は、ａ）ｉ）標的細胞、ｉｉ）Ｆｃ領域を有する親ポリペプチドの候補変異体を有する組成物、ｉｉｉ）第１の種のエフェクター細胞、及びｉｖ）第２の種のエフェクター細胞を提供すること、及びｂ）組成物を候補変異体が標的細胞と結合することにより、候補変異体が結合した標的細胞を生成するような条件下で標的細胞とインキュベートすること、ｃ）第１の種のエフェクター細胞を候補変異体が結合した標的細胞と混合すること、ｄ）標的細胞に対する（例えば、候補変異体に媒介された）細胞傷害を測定すること、ｅ）候補変異体が第１の種のエフェクター細胞の存在下で親ポリペプチドより効率的に標的細胞に対する細胞傷害を媒介することを決定すること、ｆ）第２の種のエフェクター細胞を（例えば、工程ｂにおいて生成させた）候補変異体と結合した標的細胞と混合させること、ｇ）標的細胞に対する（例えば、候補変異体に媒介された）細胞傷害を測定すること、ｈ）候補変異体が第２の種のエフェクター細胞の存在下で親ポリペプチドより効率的に標的細胞に対する細胞傷害を媒介するか否かを決定することを含む、複数種拡張変異体を同定する方法を提供する。
【００７３】
特定の実施形態において、該方法は、親ポリペプチドが第１の種及び／又は第２の種の存在下で標的細胞に対する細胞傷害を媒介する能力を決定することをさらに含む。例えば、該方法は、第１及び第２の種のエフェクター細胞を親ポリペプチドが結合した標的細胞と混合後、標的細胞に対する細胞傷害を（例えば、変異体と比較する価値があるか否かを決定できるように）測定することをさらに含んでいてもよい。
【００７４】
ある実施形態において、該方法は、工程ｇ）複数種拡張変異体を第２の種に属する実験動物に投与することをさらに含んでいてもよい。他の実施形態において、該方法は、工程ａ）の前に、Ｆｃ領域レセプター（ＦｃＲ）結合アッセイにより候補変異体をスクリーニングする工程をさらに含んでいてもよい。ある実施形態において、ＦｃＲ結合アッセイは、新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）結合アッセイである。
【００７５】
ある実施形態において、該方法は、工程ａ）の前に、ＣＤＣアッセイ（例えば、下記セクションＩＶ参照）により候補変異体をスクリーニングする工程をさらに含んでいてもよい。ある実施形態においては、第１の種のエフェクター細胞は、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。他の実施形態において、第１の種のエフェクター細胞は、マウスＰＢＭＣ又はラットＰＢＭＣである。特定の実施形態において、第２の種のエフェクター細胞はヒトＰＢＭＣである。
【００７６】
ある実施形態において、本発明は、ａ）ｉ）Ｆｃ領域を有する親ポリペプチドの候補変異体を含み、候補変異体はＦｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸配列を有し、候補変異体は親ポリペプチドよりも効率的にＣＤＣを媒介する組成物ｉｉｉ）相補体の供給源となる第２の種を提供すること、及びｂ）組成物を相補対の供給源となる第２の種とインキュベートすること、及びｃ）候補変異体が親ポリペプチドよりも効率的にＣＤＣを媒介するか否かを決定することを含む、複数種拡張変異体を同定する方法を提供する。特定の実施形態において、該方法は工程ｄ）候補変異体を複数種拡張変異体として同定することをさらに含む。
【００７７】
ある実施形態において、標的細胞は（例えば、以下に示すガン関連抗原：ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ６３、ＥＧＦレセプター、ｈｅｒ−２レセプター、前立腺特異的膜抗原、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ糖質、ＧＤ2及びＧＤ3ガングリオシド、ｌａｍｐ−１、ＣＯ−０２９、Ｌ６、及びｅｐｈＡ２が過剰に発現した）ヒト細胞である。ある実施形態において、変異体は標的細胞に特異的な抗体又はその部分を含む。他の実施形態において、候補変異体は、第１の種のエフェクター細胞の存在下において親ポリペプチドよりも約１．２倍効率的に標的細胞に対する細胞傷害を媒介する。ある実施形態において、工程ｅ）は親ポリペプチドとの対照反応を行うことを含む。さらなる実施形態においては、測定は標的細胞の死又は標的細胞の溶解を定量することを含む。他の実施形態において、標的細胞はウィルス（例えば、ＨＩＶ、ＣＭＶ、Ｂ型肝炎、又はＲＳＶ）又は微生物（例えば、ブドウ球菌、連鎖球菌、緑膿菌等）に感染している。ある実施形態において、標的細胞は微生物（例えば、ブドウ球菌、連鎖球菌、緑膿菌等）に感染している。ある実施形態において、標的細胞はウィルス（例えば、ＨＩＶ、ＣＭＶ、Ｂ型肝炎、又はＲＳＶ）に感染している。
【００７８】
ある実施形態において、本発明は、ＣＤ２０に結合する分子、又はＣＤ２０に結合する分子をコードする核酸配列を含む組成物を提供し、該ＣＤ２０に結合する分子は軽鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は配列番号５７に示すアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、本発明はＣＤ２０に結合する分子、又はＣＤ２０に結合する分子をコードする核酸配列を含む組成物を提供し、該ＣＤ２０に結合する分子は重鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は配列番号５８に示すアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、本発明はＣＤ２０に結合する分子、又はＣＤ２０に結合する分子をコードする核酸配列（例えば、図１６参照）を含む組成物を提供し、ＣＤ２０に結合する分子は軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を有し、軽鎖可変領域は配列番号５７で示されるアミノ酸配列を有し（図１５参照）、重鎖可変領域は配列番号５８で表されるアミノ酸配列を有する（図１５参照）。
ある実施形態において、本発明はポリペプチドを含む組成物を提供し、ポリペプチドはｉ）未修飾のヒトフレームワーク（例えば、改変を行っていないヒトフレームワーク）及びｉｉ）Ｆｃ領域変異体を含んでいる。ある実施形態において、該未修飾のヒトフレームワークは、ヒト生殖細胞系フレームワークである。他の実施形態において、本発明はポリペプチドを含む組成物を提供し、ポリペプチドは、ｉ）少なくとも１つのランダム化したＣＤＲ配列及びｉｉ）変異性Ｆｃ領域を含む。さらなる実施形態において、本発明はポリペプチドを含む組成物を提供し、該ポリペプチドは、ｉ）未修飾のヒトフレームワーク（例えば、ヒト生殖細胞系フレームワーク）、ｉｉ）少なくとも１つのランダム化したＣＤＲ配列、及びｉｉｉ）変異性Ｆｃ領域を含む。
図面の説明
図１は、種々の領域及び区分を表示したＩｇＧ分子の略図を示す。
図２は、ヒトＩｇＧ１（非ａ型（配列番号１）及びアロタイプを示す）、ヒトＩｇＧ２（配列番号２）、ヒトＩｇＧ３（配列番号３）、ヒトＩｇＧ４（配列番号４）、マウスＩｇＧ１（配列番号５）、マウスＩｇＧ２Ａ（配列番号６）、マウスＩｇＧ２Ｂ（配列番号７）、マウスＩｇＧ３（配列番号８）を含む、親Ｆｃアミノ酸配列のアラインメントを示す。
図３は、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２領域（配列番号９）、及びＣＨ３領域（配列番号１０）、同じくｆアロタイプ（配列番号１１）、及びａ、ｚアロタイプ（配列番号１２）の配列を含む、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域を含むヒトＩｇＧ１の種々のアミノ酸配列を示す。
図４は、局所周辺配列のコンテキスト中の変異体の変更されたアミノ酸配列を示す。
図５は、親ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
図６は、局所周辺核酸配列のコンテキスト中の変異体の変更された核酸酸配列を示す。
図７Ａは、Ａ３３０Ｋ、Ａ３３０Ｒ、Ｉ３３２Ｅ、及び３３０及び３３２位の両方に変異の組み合わせを有する変異体を野生型Ｆｃ領域と比較した、ＡＤＣＣアッセイの結果を示す。
図７Ｂは、Ｆｃ領域アミノ酸変異体Ｉ３３２Ｄ及びＩ３３２Ｅを、Ｆｃ領域グリカン変異体３３（ＧｎＴＩＩＩ）及びアミノ酸＋グリカンの改変が３３（Ｉ３３２Ｅ＋ＧｎＴＩＩＩ）のＡＤＣＣ活性に及ぼす影響を比較するためのＡＤＣＣアッセイの結果を示す。
図８は、生成した変異性ＩｇＧを用いて得られたＡＤＣＣの代表的データを示す。
図９は、ＣＤ２０抗原に対し低い親和性（６Ｆ１）及び比較的高い親和性（３３及び５）を示す可変領域変異体のＷｉｌ−２（Ａ）又はＳＫＷ６．４（Ｂ）標的細胞系に対するＡＤＣＣ活性を示す。
図１０は、ＦｃγＲＩのＦｃ領域変異性ＩｇＧへの結合の滴定曲線を示す。
図１１Ａ〜Ｃは、ヒト補体及びＲａｍｏｓ標的細胞を用いたＦｃ領域変異体の滴定から得られたＣＤＣの代表的データを示す。
図１２は、ＶＶ（高親和性）遺伝子型のＦｃγＲＩＩＩレセプターを含む全血サンプルを使用した、ＡＭＥ−１３３（Ｉ３３２Ｅ変異配列を有する可変領域３３）、ＲＩＴＵＸＡＮ、及び非特異性ＩｇＧによるＢ細胞の消失の代表的データを示す。
図１３は、ＦＦ（低親和性）遺伝子型のＦｃγＲＩＩＩレセプターを含む全血サンプルを使用した、ＡＭＥ−１３３（Ｉ３３２Ｅ変異配列を有する可変領域３３）、ＲＩＴＵＸＡＮ、及び非特異性ＩｇＧによるＢ細胞の消失の代表的データを示す。
図１４は、全血サンプルを使用した、ＲＩＴＵＸＡＮ、非特異性ＩｇＧ、及び変異体Ａ３７８Ｄ及びＴ２５６Ｐ、Ｉ３３２ＥによるＢ細胞の消失の代表的データを示す。
図１５は、ＡＭＥ−１３３（Ｉ３３２Ｅ変異配列を有する可変領域３３）の軽鎖（配列番号５７）及び重鎖（配列番号５８）のアミノ酸配列を示す。
図１６は、ＡＭＥ−１３３（Ｉ３３２Ｅ変異配列を有する可変領域３３）の軽鎖（配列番号５９）及び重鎖（配列番号６０）の核酸配列を示す。
【００７９】
(定  義)
本発明の理解を助けるために、いくつかの用語について下記のように定義する。
【００８０】
本明細書で使用される場合において、「被験者」及び「患者」という用語は、イヌ、ネコ等の哺乳類、鳥類、家畜類等の任意の動物を意味し、好ましくはヒト（例えば、疾患にかかったヒト）である。
【００８１】
本明細書で使用される場合において、「〜をコードする核酸」、「〜をコードするＤＮＡ配列」、及び「〜をコードするＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸鎖上のデオキシリボヌクレオチドの順序又は配列を意味する。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、ポリペプチド（プロテイン）鎖上のアミノ酸の順序を決定する。したがって、ＤＮＡ配列は、アミノ酸配列をコードする。
【００８２】
モノヌクレオチドは、１つのモノヌクレオチドのペントース環の５’位のリン酸が、隣接するモノヌクレオチドの３’位の酸素に、リン酸ジエステル結合を介して一方向に結合するように反応してオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを形成するため、ＤＮＡ分子は「５’末端」及び「３’末端」を有すると言われる。したがって、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの末端は、５’位のリン酸がモノヌクレオチドのペントース環の３’位の酸素と結合していない場合には「５’末端」と、３’位の酸素が、１つ手前のモノヌクレオチドのペントース環の５’位のリン酸と結合していない場合には「３’末端」と呼ばれる。本明細書で使用される場合において、核酸配列が、より分子量の大きなオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの内部にある場合であっても、５’及び３’末端を有すると言われる場合がある。直鎖状又は環状のいずれのＤＮＡ分子についても、別個の要素が、「下流」又は３’位側の要素の「上流」側又は５’位端側にあると呼ばれる。この呼び方は、転写が、ＤＮＡ鎖に沿って５’位側から３’位側へ進行するという事実を反映している。結合した遺伝子の転写を誘導するプロモーター又はエンハンサー要素は、通常コード領域の５’位側又は上流側に位置する。しかし、エンハンサー要素は、プロモーター要素及びコード領域の３’位側に位置した場合にも効果を発揮することができる。終止及びポリアデニル化シグナルは、コード領域の３’位側又は下流側に位置している。
【００８３】
本明細書で使用される場合において、「コドン」又は「トリプレット」という用語は、ポリペプチドの生合成において天然に見られる２０のアミノ酸のうちの１つを特定する３つの隣接するヌクレオチドの連なりを意味する。この用語には、アミノ酸を特定しないノンセンスコドンも含まれる。
【００８４】
本明細書で使用される場合において、「ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド」、「ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド」、及び「ポリペプチドをコードする核酸配列」という用語は、特定のポリペプチドのコード領域を有する核酸配列を意味する。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はＲＮＡのいずれの形で存在していてもよい。ＤＮＡの形で存在する場合、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、一本鎖（センス鎖）又は二本鎖のいずれであってもよい。適切な転写の開始及び／又は一次ＲＮＡ転写物の修正プロセシングを可能にする必要がある場合には、エンハンサー／プロモーター、スプライス部位、ポリアデニル化シグナル等の適当な制御要素が遺伝子のコード領域の近傍に位置していてもよい。あるいは、本発明の発現ベクターとして用いられるコーディング領域は、内因性のエンハンサー／プロモーター、スプライス部位、介在配列、ポリアデニル化シグナル等の制御要素、又は内因性及び外因性の制御要素の組み合わせを含んでいてもよい。
【００８５】
本明細書で使用される場合において、「相補的」又は「相補性」という用語は、塩基対合則にしたがう関係にあるポリヌクレオチド（ヌクレオチドの配列）に関して用いられる。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」に関しては、配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に相補的である。相補性は核酸塩基のいくつかのみが塩基対合則にしたがい適合している「部分的」なものであってもよい。または、核酸の間に「完全（ｃｏｍｐｌｅｔｅ又はｔｏｔａｌ）」な相補性が存在してもよい。核酸分子鎖間の相補性の程度は、核酸分子鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強さに対し有意な効果を有する。このことは、核酸間の結合による検出法と同様に、増幅反応においても特に重要である。
【００８６】
本明細書で使用される場合において、ある配列の「補体」という用語は、全長にわたって該配列に対し完全に相補的である配列について用いられる。例えば、配列Ａ−Ｇ−Ｔ−Ａは、配列Ａ−Ｇ−Ｔ−Ａの「補体」である。
【００８７】
「相同性」という用語は、（核酸配列について用いる場合）相補性の程度を意味する。部分的な相同性及び完全な相同性（同一性）のどちらも存在しうる。部分的に相補的な配列は、完全に相補的な配列が標的核酸とハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害するものであり、機能を表す用語を用いて「ほぼ相同」と呼ばれる。「結合の阻害」という用語は、核酸の結合について用いられる場合には、標的核酸への結合について相同な配列との競合により起こる結合の阻害を意味する。完全に相補的な配列の標的配列へのハイブリダイゼーションの阻害は、ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロット又はノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーション等）により、低ストリンジェンシーな条件下で調べることができる。ほぼ相同な配列又はプローブは、完全に相同な配列の標的への結合（ハイブリダイゼーション）を、低ストリンジェンシーな条件下で拮抗又は阻害する。このことは、低ストリンジェンシーな条件において、非特異的な結合が許容されていることを意味するわけではなく、低ストリンジェンシーな条件は、２つの配列の結合が互いに特異的（選択的）な相互作用であることを必要とする。非特異的な結合が存在しないことは、部分的な相補性も存在しない（例えば、同一性が約３０％未満の）第２の標的を用いてテストすることができ、非特異的な結合が存在しない場合、プローブは第２の非相補的な標的にはハイブリダイズしない。
【００８８】
低ストリンジェンシーな条件を構成するために多くの同等な条件を用いうることはよく知られている。プローブの長さ及び性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）並びに標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成、溶液中に存在するか固定化されているか、等）、並びに塩濃度及び他の成分（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコールの有無）等の因子が考慮され、上に列挙した条件とは異なるが同等である低ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件を作り出すために、ハイブリダイゼーション溶液を変更してもよい。さらに、高ストリンジェンシーな条件下でハイブリダイゼーションを促進する条件（例えば、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄工程の温度を上げる、ハイブリダイゼーション溶液中にホルムアミドを使用する、等）が知られている。
【００８９】
（例えば、変異性Ｆｃ領域又はその部分をコードする）核酸配列は、一次ＲＮＡ転写物の異なるスプライシングにより生成される多数のＲＮＡ種を生成してもよい。同一遺伝子のスプライス変異体であるｃＤＮＡは、配列の同一性又は完全な相補性を有する領域（両方のｃＤＮＡに、同一のエクソン又は同一のエクソンの部分が存在することを示す）、及び全く同一でない領域（例えば、ｃＤＮＡ１にはエクソン「Ａ」が存在し、ｃＤＮＡ２には代わりにエクソン「Ｂ」が存在することを示す）を含んでいる。２つのｃＤＮＡは配列の同一性を有する領域を含んでいるため、両者は共に、両方のｃＤＮＡにおいて見られる配列を含む遺伝子全体又は該遺伝子の部分から誘導されたプローブにハイブリダイズする。したがって、２つのスプライス変異体は、そのようなプローブに対し、及び互いにほぼ相同である。
【００９０】
一本鎖核酸の配列に関して用いられる場合において、「ほぼ相同」という用語は、低ストリンジェンシーな条件下で該一本鎖核酸の配列にハイブリダイズすることができる（相補体である）任意のプローブを指す。
【００９１】
本明細書で使用される場合において、「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的な核酸の対形成に関して用いられる。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強度（核酸間の会合の強さ）は、核酸同士の相同性の程度、用いる条件のストリンジェンシーさ、形成されたハイブリッドのＴm、及び核酸内のＧ：Ｃ比等の要因により影響される。
【００９２】
本明細書で使用される場合において、「Ｔm」という用語は、「融解温度」について用いられる。融解温度は、二本鎖核酸分子の集団の半数が解離して一本鎖になる温度である。核酸のＴmを計算する数式はよく知られている。標準的な参考文献に示されているように、核酸が１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液中に存在する場合のＴmの簡単な推定値は、次の数式で計算することができる。Ｔm＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ及びＹｏｕｎｇ，“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”（１９８５年）中のＱｕｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）。他の参考文献には、構造及び配列の特徴を、Ｔmの計算について考慮に入れたより洗練された計算式が含まれているが、ある場合には、Ｔmの計算値から出発して、温度をわずかに増減させ核酸分子の集団に及ぼす効果を検討することにより経験的にＴmを決定することができる。
【００９３】
本明細書で使用される場合において、「ストリンジェンシー」という用語は、核酸のハイブリダイゼーションが行われる、温度、イオン強度、及び有機溶媒等の他の物質の存在の条件について用いられる。当業者は、「ストリンジェンシーな」条件を、上に述べたような条件を単独で又は同時に変化させることにより変化させることができる。「高ストリンジェンシーな」条件では、核酸塩基対の形成は、高い頻度で相補的な塩基配列を有する核酸フラグメントの間でのみ起こる（例えば、「高ストリンジェンシーな」条件下でのハイブリダイゼーションは、約８５〜１００％の同一性、好ましくは約７０〜１００％の同一性を有する同族体の間で起こる）。「中ストリンジェンシーな」条件では、核酸塩基対の形成は、中程度の頻度で相補的な塩基配列を有する核酸フラグメントの間でのみ起こる（例えば、「中ストリンジェンシーな」条件下でのハイブリダイゼーションは、約５０〜７０％の同一性を有する同族体の間で起こる）。したがって、遺伝的多様性を有する生体から誘導された核酸は、相補的配列の現れる頻度が通常より低いため、「弱」又は「低」ストリンジェンシーさが必要とされる場合が多い。
【００９４】
核酸のハイブリダイゼーションに使用される場合において、「高ストリンジェンシーな条件」は、約５００ヌクレオチド長のプローブを用いる場合、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ及び１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ＮａＯＨによりｐＨ７．４に調整）、０．５％ＳＤＳ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬及び１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中４２℃で結合又はハイブリダイズした後、０．１×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む溶液により４２℃で洗浄するのと同等の条件を含む。
【００９５】
核酸のハイブリダイゼーションに使用される場合において、「中ストリンジェンシーな条件」は、約５００ヌクレオチド長のプローブを用いる場合、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ及び１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ＮａＯＨによりｐＨ７．４に調整）、０．５％ＳＤＳ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬及び１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中４２℃で結合又はハイブリダイズした後、１．０×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む溶液により４２℃で洗浄するのと同等の条件を含む。
【００９６】
核酸のハイブリダイゼーションに使用される場合において、「低ストリンジェンシーな条件」は、約５００ヌクレオチド長のプローブを用いる場合、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ及び１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ＮａＯＨによりｐＨ７．４に調整）、０．１％ＳＤＳ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬［５０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬は、５００ｍｌあたり、５ｇのＦｉｃｏｌｌ（タイプ４００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、５ｇのＢＳＡ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ、Ｓｉｇｍａ社製）を含む］及び１００ｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中４２℃で結合又はハイブリダイズした後、５×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを含む溶液により４２℃で洗浄するのと同等の条件を含む。
【００９７】
以下の用語「参照配列」、「配列の同一性」、及び「配列の同一性の割合」は、２つ又はそれ以上のポリヌクレオチドの間の配列の関係を記述するのに用いられる。「参照配列」は、配列の比較において基準として用いられる明確な配列であり、参照配列は、例えば、配列リストに示された全長ｃＤＮＡ配列の部分のような、より大きな配列のサブセットであってもよく、あるいは完全な遺伝子配列を含んでいてもよい。一般に、参照配列は少なくとも２０ヌクレオチドの長さであり、少なくとも２５ヌクレオチドの長さを有することも頻繁にあえい、少なくとも５０ヌクレオチドの長さを有することもしばしばある（例えば、配列番号３２〜３７のうち任意のものを参照配列として用いることができる）。２つのポリヌクレオチドはそれぞれ（１）２つのヌクレオチドの間で同一な配列（完全なポリペプチド配列の部分）を含んでいてよく、（２）さらに２つのポリペプチドの間で相違する配列をさらに含んでいてもよく、２つ（又はそれ以上）のポリヌクレオチドの配列の比較は、通常、２つのポリヌクレオチドを「比較ウインドウ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）」にわたって比較することにより、配列の同一性を有する部位の同定及び比較を行う。本明細書で使用される場合において、「比較ウインドウ」とは、連続する少なくとも２０ヌクレオチドよりなる概念上の部分を意味し、ここでポリヌクレオチド配列を、連続する少なくとも２０ヌクレオチドよりなる参照配列と比べもよく、ここで、比較ウインドウ内のポリヌクレオチド配列の部分に、２つの配列の最適化アラインメントに対する参照配列と比べ２０％以下の付加又は欠失（ギャップ）を含んでいてもよい。比較ウインドウを整列するための配列の最適アラインメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０））、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１））によって、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの相同性検索法（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４（１９８８））によって、これらのアルゴリズムのコンピューター上での実行（ウィスコンシン遺伝学ソフトウェアパッケージ  リリース７．０中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ（遺伝学コンピューターグループ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．））によって、又は検査によって行うことができ、いくつかの方法により生成された最良のアラインメント（比較ウインドウにわたって相同性の割合最も高くする）が選ばれる。「配列の相同性」という用語は、２つのポリヌクレオチド配列が比較ウインドウにわたって同一（ヌクレオチド対ヌクレオチド基準で）であることを意味する。「配列の相同性の割合」という用語は、２つの最適アラインメントされた配列を比較ウインドウにわたって比較することによって計算され、両者の配列において同一の塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、又はＩ）が存在する位置の���を決定することにより一致した位置の数を求め、一致した位置の数を比較ウインドウ中の位置の数の合計（比較ウインドウのサイズ）で割り、商を１００倍することにより、配列の同一性の割合が得られる。本出願で用いる場合、比較ウインドウは、列挙された参照配列の全長である（配列番号３３が参照配列として列挙されている場合、配列の同一性の割合は、配列番号３３の全長にわたり比較される）。
【００９８】
本明細書で使用される場合において、「プローブ」という用語は、オリゴヌクレオチド（ヌクレオチドの配列）を意味し、精製された制限酵素消化物中に存在するような天然由来のものであれ、又は合成的、組み換え若しくはＰＣＲ増幅によって産生されたものであれ、対象となる他のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができるものをいう。プローブは一本鎖であっても二本鎖であってもよい。プローブは、特定の遺伝子配列を検出、同定及び単離するのに有用である。本発明で使用される任意のプローブは、任意の「リポーター分子」で標識され、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ及び酵素に基づく従来のアッセイ法）、蛍光、放射性、及び免疫系を含むがこれらに限定されない任意の検出系で検出できるようにされることが意図されている。本発明を特定の検出系又は標識のいずれかに限定することは意図されていない。
【００９９】
本明細書で使用される場合において、「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」という用語は、本明細書に参照として組み込まれる、ゲノムＤＮＡの混合物に含まれる標的配列の部分の濃度を、クローニングや精製を行うことなく増大させることについて記載された、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，１９５号、及び第１，９６５，１８８号明細書に記載の方法を意味する。標的配列を増幅するためのこの方法は、大過剰量の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、所望の標的配列を含むＤＮＡ混合物に加え、その後ＤＮＡポリメラーゼの存在下で温度サイクリングの正確な手順を行うことを含む。２つのプライマーは、二本鎖の標的核酸中のそれぞれの分子鎖に相補的である。増幅を行うためには、混合物を変性させ、プライマーを、標的分子内のそれらに相補的な配列とアニーリングする。アニーリングの後に、プライマーを伸長させ、相補的な分子鎖の新たな対を形成させる。変性、プライマーのアニーリング、及びポリメラーゼによる伸長は、何度も繰り返すことができ（変性、アニーリング、及び伸長は「サイクル」を構成し、多数回の「サイクル」を行うことができる）、高濃度に増幅された所望の標的配列のフラグメントが得られる。増幅された所望の標的配列のフラグメントの長さは、それぞれのプライマーの相対的な位置から決定され、そのため、この長さは制御可能な要因である。この方法の反復的な側面より、この方法は「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」と呼ばれる。所望の増幅された標的配列のフラグメントは混合物における（濃度に関して）主要な配列となるので、「ＰＣＲ増幅された」と言われる。
【０１００】
ＰＣＲ法により、ゲノムＤＮＡ中の１コピーの特定の配列を、いくつかの異なる方法（例えば、標識プローブとの結合、ビオチン化されたプライマーを導入後、アビジン−酵素コンジュゲートによる検出、増幅されたフラグメントへの、32Ｐで標識したｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ等のデオキシヌクレオチド三リン酸の取り込み）により検出可能なレベルまで増幅することができる。ゲノムＤＮＡに加え、適当なプライマー分子の組み合わせを用いることにより、任意のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを増幅することもできる。特に、ＰＣＲ法によって増幅されたフラグメントそれ自身が、以後のＰＣＲ増幅における効率的なテンプレートである。
【０１０１】
「単離された」という用語は、核酸に関して「単離されたオリゴヌクレオチド」又は「単離されたポリヌクレオチド」のように用いられる場合、同定され、通常天然供給源に関連する少なくとも１つの混入核酸から分離された核酸配列を意味する。単離された核酸は天然において見られるのとは異なる型及び環境に存在する。単離された核酸分子は、したがって、天然の細胞中に存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子は、通常、例えば、核酸分子が染色体中の天然細胞とは異なる位置でポリペプチドを発現する、細胞中に含まれる核酸分子を含む。単離された核酸、オリゴヌクレオチド、又はポリヌクレオチドは、一本鎖及び二本鎖のいずれの状態でも存在しうる。単離された核酸、オリゴヌクレオチド、又はポリヌクレオチドを、タンパク質の発現に使用する場合、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、最低限センス又はコード鎖を含む（オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは一本鎖でもよい）が、センス鎖及びアンチセンス鎖の両者を含んでもよい（オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは二本鎖でもよい）。
【０１０２】
本明細書で使用される場合において、「部分」という用語はヌクレオチド配列に関連して（「ある核酸配列の部分」のように）用いられる場合、該配列のフラグメントを意味する。フラグメントは、１０ヌクレオチドから（全長ヌクレオチド配列−１）ヌクレオチドの大きさにわたる（例えば、１０ヌクレオチド、２０、３０、４０、５０、１００、２００、等）。
【０１０３】
本明細書で使用される場合において、「部分」という用語はアミノ酸配列に関連して（「あるアミノ酸配列の部分」のように）用いられる場合、該配列のフラグメントを意味する。フラグメントは、６アミノ酸から（全長アミノ酸配列−１）アミノ酸の大きさにわたる（例えば、６アミノ酸、１０、２０、３０、４０、７５、２００、等）。
【０１０４】
本明細書で使用される場合において、「精製された」又は「精製する」という用語は、サンプルからの混入物の除去を意味する。例えば、抗原特異的な抗体は、混入している非免疫グロブリンタンパク質を除去することにより精製することができ、また、それらは同一の抗原に結合しない免疫グロブリンを除去することにより精製することができる。非免疫グロブリンタンパク質及び／又は特定の抗原に結合しない免疫グロブリンを除去することにより、サンプル中の抗原特異的な免疫グロブリンの割合が増大する。他の例では、組み換え抗原に特異的なポリペプチドを、細菌の宿主細胞中で発現させ、宿主細胞のタンパク質を除去することによりポリペプチドを精製することにより、サンプル中の組み換え抗原に特異的なポリペプチドの割合が増大する。
【０１０５】
本明細書で使用される場合において、「組み換えＤＮＡ分子」という用語は、分子生物学的手法により結合させたＤＮＡのフラグメントよりなるＤＮＡ分子を意味する。
【０１０６】
本明細書で使用される場合において、「組み換えタンパク質」又は「組み換えポリペプチド」という用語は、組み換えＤＮＡ分子から発現させたタンパク質分子を意味する。
【０１０７】
本明細書で使用される場合において、「天然タンパク質」という用語は、ベクター配列にコードされたアミノ酸残基を含まないタンパク質を意味する。すなわち、天然タンパク質は、広く天然に存在するタンパク質において見られるアミノ酸のみを含む。天然タンパク質は、組み換え法によって製造してもよく、天然の供給源から単離してもよい。
【０１０８】
「サザンブロット」という用語は、アガロース又はアクリルアミドゲルでＤＮＡをサイズにより分離後、ニトロセルロース又はナイロン（登録商標）膜等の固体担体に転写するＤＮＡの分析法を意味する。固定化されたＤＮＡは、標識されたプローブにより探索され、使用したプローブに相補的なＤＮＡ種が検出される。電気泳動の前に制限酵素によりＤＮＡはを分解してもよく、固体担体に転写する前又は転写時に、ＤＮＡを部分的に脱プリン化及び変性してもよい。サザンブロットは、分子生物学者にとって標準的なツールである（J. Sambrook他，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, pp 9.31-9.58 [1989]）。
【０１０９】
「ノーザンブロット」という用語は、アガロースゲル上でのＲＮＡの電気泳動によりＲＮＡをサイズにより分離後、ゲルからニトロセルロース又はナイロン（登録商標）膜等の固体担体に転写するＲＮＡの分析法を意味する。固定化されたＲＮＡは、標識されたプローブにより探索され、使用したプローブに相補的なＲＮＡ種が検出される。電気泳動の前に制限酵素によりＲＮＡを分解してもよい。ノーザンブロットは、分子生物学者にとって標準的なツールである（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ他，上掲，ｐｐ  ７．３９−７．５２［１９８９］）。
【０１１０】
「ウェスタンブロット」という用語は、ニトロセルロース又は膜等の担体に固定化されたタンパク質（又はポリペプチド）の分析法を意味する。タンパク質を、アクリルアミドゲル上に流して分離し、その後タンパク質をゲルからニトロセルロース又はナイロン（登録商標）膜等の固体担体に転写する。次いで、固定化されたタンパク質を、対象となる抗原に対し反応性を有する抗体と接触させる。抗体の結合は、放射線標識された抗体の使用等を含む種々の方法により検出することができる。
【０１１１】
本明細書で使用される場合において、「抗原決定基」という用語は、特定の抗体との接触を起こさせる抗原の部分（エピトープ）を意味する。タンパク質又はタンパク質のフラグメントを、宿主動物を免疫するのに用いると、タンパク質の多くの領域が、タンパク質のある領域又は三次元構造に対して特異的に結合する抗体の生成を誘導するが、これらの領域又は構造が抗原決定基と呼ばれる。抗原決定基は、抗体との結合について無傷な抗原（免疫応答を引き起こす場合「免疫原」という用語を用いる）と拮抗しうる。
【０１１２】
本明細書で使用される場合において、「トランス遺伝子」という用語は、新しく受精した卵又は早期胚に遺伝子を導入することにより生体内に取り込まれた外来、外因性又は自己遺伝子を意味する。「外来遺伝子」という用語は、実験操作により動物のゲノム内に導入された任意の核酸（例えば核酸配列）を意味し、導入した遺伝子が、天然に存在する遺伝子のように同じ位置にとどまらない限り、当該動物において見られる遺伝子配列を含んでいてもよい。「自己遺伝子」という用語は、天然に存在する遺伝子の変異体（例えば、多型又は突然変異体）を包含することが意図される。このように、トランス遺伝子という用語は、遺伝子の変異体と共に天然に存在する遺伝子の代替物を包含する。
【０１１３】
本明細書で使用される場合において、「ベクター」という用語は、ＤＮＡのフラグメントをある細胞から他の細胞へ移す核酸分子に関して用いられる。「媒介物（ｖｅｈｉｃｌｅ）」という用語が、「ベクター」と同義的に用いられることがある。
【０１１４】
本明細書で使用される場合において、「発現ベクター」という用語は、所望のコード配列及び特定の宿主生体での作動可能に結合されたコード配列の発現に必要な適当な核酸配列を含む組み換えＤＮＡ分子を意味する。原核生物での発現に必要な核酸配列は、通常プロモーター、オペレータ（任意）、及びリボソーム結合部位を含み、しばしば他の配列を共に含む。真核細胞では、プロモーター、エンハンサー、並びに終止及びポリアデニル化シグナル配列が用いられることが知られている。
【０１１５】
本明細書で使用される場合において、「宿主細胞」という用語は、インビトロ又はインビボのいずれかに存在する、任意の真核細胞及び原核細胞（例えば、大腸菌等の細菌、ＣＨＯ細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞、及び昆虫細胞）を意味する。例えば、宿主細胞はトランスジュニック動物中に存在するものでもよい。
【０１１６】
本明細書で使用される場合において、「トランスフェクション」又は「形質転換」という用語は、外来遺伝子の細胞（例えば、真核細胞及び原核細胞）中への導入を意味する。トランスフェクションは、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈法、ＤＥＡＥ−デキストランに媒介されるトランスフェクション、ポリブレンに媒介されるトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、原形質融合、レトロウィルス感染、及び遺伝子銃を含む種々の公知の方法により達成することができる。
【０１１７】
「安定トランスフェクション」又は「安定にトランスフェクトされた」という用語は、トランスフェクトされた細胞のゲノムに外来遺伝子が導入され組み込まれたことを意味する。「安定形質転換体」という用語は、外来ＤＮＡがゲノムＤＮＡに安定に組み込まれた細胞を意味する。
【０１１８】
「一時的トランスフェクション」又は「一時的にトランスフェクトされた」という用語は、外来ＤＮＡがトランスフェクトされた細胞のゲノムにうまく組み込まれない細胞への外来遺伝子の導入を意味する。外来遺伝子は、トランスフェクトされた細胞の核内に数日間存在する。その間に、外来遺伝子は、染色体において内在遺伝子の発現を支配する調節管理を受ける。「一次形質転換体」という用語は、外来遺伝子を取り込んだが、このＤＮＡを組み込むことができなかった細胞を意味する。
【０１１９】
「リン酸カルシウム共沈法」という用語は、核酸を細胞に導入する手法を意味する。核酸がリン酸カルシウム−核酸共沈殿として存在する場合には、細胞による核酸の取り込みは促進される。Ｇｒａｈａｍ及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂによる元の手法（Ｇｒａｈａｍ及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌ．，５２：４５６［１９７３］）は、いくつかのグループによって、条件の最適化及び特定の型の細胞に対する改良が施されている。当業者は、これらの多数の改良について十分認識している。
【０１２０】
本明細書で使用される場合において、「所定のポリペプチド配列を含む組成物」とは、広く所定のポリペプチド配列を含む任意の組成物を意味する。組成物は水溶液を構成してもよい。例えば、変異性Ｆｃ領域又はそのフラグメントをコードするポリペプチド配列を含む組成物を、ハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。この場合、変異性Ｆｃ領域をコードするポリヌクレオチド配列は、通常、塩（例えばＮａＣｌ）、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）、及び他の成分（例えば、Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、乾燥乳、サケ精子ＤＮＡ等）を含む水溶液として用いられる。
【０１２１】
「供試化合物」又は「候補化合物」という用語は、任意の化学物質、薬剤、薬物等の、疾患、疾病、又は身体機能の失調の治療又は予防、あるいはサンプルの生理的又は細胞状態を変化させるために用いることができる。供試化合物は、公知及び可能性のある治療化合物の両者を含む。供試化合物は、本発明のスクリーニング法を用いてスクリーニングすることにより、治療効果を決定することができる。「公知の治療化合物」とは、それらの治療及び予防に効果があることが示された（例えば、動物実験又はヒトへの投与を含む予備実験により）治療化合物を意味する。
【０１２２】
本明細書で使用される場合において、「応答」という用語は、アッセイに関して使用される場合、検出可能なシグナル（例えば、レポータータンパク質の蓄積、イオン濃度の増大、検出可能な化学生成物の蓄積）の生成を意味する。
【０１２３】
本明細書で使用される場合において、「レポーター遺伝子」という用語は、アッセイすることができるタンパク質をコードする遺伝子を意味する。レポーター遺伝子の例としては、ルシフェラーゼ（例えば、ｄｅＷｅｔ他，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：７２５［１９８７］及び米国特許第６，０７４，８５９号明細書を参照。これらは参照として本明細書に組み込まれる）、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｕ４３２８４；多くのＧＦＰ変異体が、ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡより市販されている）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及び西洋ワサビペルオキシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２４】
本明細書で使用される場合において、「コンピューターメモリー」又は「コンピューター記憶装置」という用語は、コンピュータープロセッサーで読み取り可能な任意の記録媒体を意味する。コンピューターメモリーの例としては、ＲＡＭ、ＲＯＭ、コンピューターチップ、デジタルビデオディスク（ＤＶＤ）、コンパクトディスク（ＣＤ）、ハードディスクドライブ（ＨＤＤ）、及び磁気テープが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２５】
本明細書で使用される場合において、「コンピューターで読み取り可能な媒体」という用語は、情報（例えば、データ及び指令）を保存し、コンピュータープロセッサーに提供するための任意の装置又はシステムを意味する。コンピューターで読み取り可能な媒体の例としては、ＤＶＤ、ＣＤ、ハードディスクドライブ、磁気テープ、及びネットワーク上のストリーミングメディアのためのサーバが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
本明細書で使用される場合において、核酸又はアミノ酸配列の「表現をコードするコンピューターで読み取り可能な媒体」という語句は、プロセッサーに送られた場合に、一連の核酸又はアミノ酸配列がユーザに対し表示（例えば、プリントアウト又はディスプレイスクリーン上に表示される）される情報を記録したコンピューターで読み取り可能な媒体を意味する。
【０１２７】
本明細書で使用される場合において、「プロセッサー」及び「中央処理ユニット」又は「ＣＰＵ」という用語は同義的に用いられ、コンピューターメモリー（例えば、ＲＯＭ又は他のコンピューターメモリー）からプログラムを読み込み、プログラムにしたがって一連のステップを実行する装置を意味する。
【０１２８】
本明細書で使用される場合において、免疫グロブリン中の重鎖のアミノ酸残基に対する番号づけには、明示的に参照として本明細書に組み込まれる、Ｋａｂａｔ他，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）により、ＥＵインデックスフォーマットを用いる。「ＫａｂａｔによるＥＵインデックスフォーマット」とは、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体における残基の番号づけを意味する。
【０１２９】
本明細書で使用される場合において、「親ポリペプチド」とは、変異体を生成するために変更又は改変（例えば、アミノ酸の置換、付加、又は欠失がなされること）されてもよいアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。好ましい実施形態において、親ポリペプチドは、天然に存在するＦｃ領域の少なくとも部分又はアミノ酸配列の修飾（例えば、付加、欠失、及び／又は置換）を伴うＦｃ領域を含む。ある実施形態において、親ポリペプチドよりも長い、あるいは短い変異体が特に意図される。特に好ましい実施形態において、親ポリペプチドは、変異体と比べ機能（例えば、エフェクター機能、結合等）の点で相違している。
【０１３０】
本明細書で使用されている場合において、「親ポリペプチドの変異体」という用語は、少なくとも１つのアミノ酸が改変されたことにより、親ポリペプチドと異なるアミノ酸配列を含むペプチドを意味する。ある実施形態において、変異体はＦｃ領域の少なくとも部分（例えば、Ｆｃ領域の少なくとも４０％、５０％、６０％、７５％、又は９０％）を含む。好ましい実施形態において、変異体は、少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有する親ポリペプチドのＦｃ領域を含む。
【０１３１】
本明細書で使用される場合において、「Ｆｃ領域」という用語は、（例えば、図１に示したような）免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を意味する。「Ｆｃ領域」は、Ｆｃ領域の天然配列であってもよく、又は変異性Ｆｃ領域であってもよい。広く受け入れられている免疫グロブリン重鎖におけるＦｃ領域の境界は変動しうるが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、通常２２６位のＣｙｓ又は２３０位のＰｒｏから、カルボキシル末端まで及ぶと定義されている。ある実施形態において、変異体はＦｃ領域の部分のみを含み、カルボキシル末端は含んでも含まなくてもよい。免疫グロブリンのＦｃ領域は、例えば、図１に示すように通常２つの定常領域、ＣＨ２及びＣＨ３を含んでいる。ある実施形態において、１又は複数の定常領域を含む変異体が意図されている。他の実施形態において、そのような定常領域を含まない（又はそのような定常領域の部分しか含まない）変異体が意図されている。
【０１３２】
本明細書で使用される場合において、「ＣＨ２領域」（「Ｃγ２」領域とも呼ばれる）は、一般にＦｃ領域（例えば、ヒトＩｇＧのＦｃ領域）の２３１位付近のアミノ酸から３４０位付近のアミノ酸に至る一連の残基を含む。ＣＨ２領域は、他の領域と緊密に対形成していない点で際立っている。むしろ、２つのＮ結合性分岐糖鎖が、正常なＩｇＧ分子の２つのＣＨ２領域の間に介在している。
【０１３３】
本明細書で使用される場合において、「ＣＨ３領域」（「Ｃγ３」領域とも呼ばれる）は、一般にＦｃ領域（例えば、ヒトＩｇＧのＦｃ領域）の３４１位付近のアミノ酸から４４７位付近のアミノ酸に至る一連の残基を含む。
【０１３４】
本明細書で使用される場合において、Ｆｃ領域は、（例えば、被験者における）生物学的活性を活性化又は減退に関与する「エフェクター機能」を有していてもよい。エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑへの結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター、ＢＣＲ）の下方制御等が挙げられるが、これらに限定されない。そのようなエフェクター効果は、Ｆｃ領域の結合領域（例えば、抗体の可変領域）への結合を必要とする場合もあり、種々のアッセイ（例えば、Ｆｃ結合アッセイ、ＡＤＣＣアッセイ、ＣＤＣアッセイ、全血又は部分血サンプルからの標的細胞の消失等）により評価することができる。
【０１３５】
本明細書で使用される場合において、「天然配列Ｆｃ領域」又は「野生型Ｆｃ領域」という用語は、広く天然において見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を意味する。ヒトＦｃ領域の例を図２に示すが、これらには、天然配列ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域（ｆ及びａ，ｚアロタイプ）、天然配列ヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域、及び天然配列ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域並びに天然に存在するこれらの変異体が含まれる。天然配列マウスＦｃ領域も図２に示す。他の配列も意図され、それらは種々のウェブサイト（例えば、ＮＣＢＩのウェブサイト）から容易に入手可能である。
【０１３６】
本明細書で使用される場合において、「変異性Ｆｃ領域」という用語は、少なくとも１つのアミノ酸の修飾（例えば、置換、挿入又は欠失）により天然配列Ｆｃ領域（又はその部分）と異なるアミノ酸配列を意味し、重鎖サブユニットが互いに異なっていてもよいヘテロ代マー変異体が含まれる。好ましい実施形態において、変異性Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域と比べて少なくとも１つのアミノ酸置換（例えば、天然配列Ｆｃ領域において、約１〜約１０のアミノ酸置換、好ましくは約１〜約５のアミノ酸置換）を有する。好ましい実施形態において、変異性Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域と少なくとも約８０％の相同性、好ましくは少なくとも約９０％の相同性、さらに好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有する。
【０１３７】
本明細書で使用される場合において、「相同性」という用語は、アミノ酸配列に関して用いられる場合、配列を整列し、必要ならば相同性の割合を最大化するためにギャップを導入した後の、アミノ酸配列変異体における天然アミノ酸配列と同一な残基の割合を意味する。
【０１３８】
「Ｆｃ領域を含むポリペプチド」という用語は、Ｆｃ領域を含む、抗体又はイムノアドヘシン（定義は下記を参照）等のポリペプチドを意味する。
【０１３９】
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」という用語は、Ｆｃ領域（例えば、抗体又は抗体の
フラグメントのＦｃ領域）に結合するレセプターを意味する。これらの用語は、親のＩｇＧの胎児への移動に関与する新生児レセプター（ＦｃＲｎ）を含む。
【０１４０】
本明細書で使用される場合において、「抗体依存細胞性細胞傷害」及び「ＡＤＣＣ」という語句は、ＦｃＲを発現した（例えば、非特異的な）細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、標的細胞の溶解を起こす細胞に媒介された反応を意味する。ＡＤＣＣを媒介する細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。
【０１４１】
本明細書で使用される場合において、「エフェクター細胞」という語句は、１種又は吹く数種のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を果たす白血球を意味する。好ましくは、エフェクター細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを媒介する白血球の例としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、親性Ｔ細胞及び好中球が挙げられる。エフェクター細胞は、天然供給源から（例えば、血液から）単離されてもよい。
【０１４２】
本明細書で使用される場合において、「全血」という語句は、分画されていない血液サンプルを意味する。
【０１４３】
本明細書で使用される場合において、「改変した（ａｌｔｅｒｅｄ）」ＦｃＲ結合親和性又はＡＤＣＣ活性を有するポリペプチド変異体は、親ポリペプチド又は天然配列Ｆｃ領域を有するポリペプチドと比べてＦｃＲ結合親和性及び／又はＡＤＣＣ活性が、強化された（増大した）もの又は減退した（減少した）ものであってもよい。ＦｃＲに対し「増大した結合性を示す」ポリペプチド変異体は、少なくとも１つのＦｃＲと親ポリペプチドよりも高い親和性で結合する。ＦｃＲに対し「減少した結合性を示す」ポリペプチド変異体は、少なくとも１つのＦｃＲと親ポリペプチドよりも低い親和性で結合する。ＦｃＲに対し減少した結合性を示す変異体は、検知できる結合性をほとんど又は全く有さず、例えば、親ポリペプチドに比べ、０〜２０％の結合性を有する。ＦｃＲに対し「より高い親和性」で結合するポリペプチド変異体は、上述のＦｃＲのうち任意の１種又は複数種と、結合アッセイにおいてポリペプチド変異体と親ポリペプチドの量がほぼ同一で、その他の条件も同一な場合、親抗体よりも高い結合親和性で結合する。例えば、より高いＦｃＲ結合親和性を有するポリペプチド変異体は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＦｃＲ結合親和性において、親ポリペプチドと比べ、約１．１０倍〜１００倍（より典型的には約１．２倍〜約５０倍）の改善（増大）を示す。
【０１４４】
本明細書で使用される場合において、「アミノ酸の修飾」とは、あるアミノ酸配列におけるアミノ酸配列の変更を意味する。修飾の例としては、アミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、アミノ酸の修飾は（例えば、親ポリペプチドのＦｃ領域における）置換である。
【０１４５】
本明細書で使用される場合において、特定の位置（例えば、Ｆｃ領域）「におけるアミノ酸の修飾」とは、特定の残基の置換若しくは欠失、又は特定の残基の隣への少なくとも１つのアミノ酸残基の挿入を意味する。挿入に関して、特定の残基の「隣に」とは、その１又は２残基以内への挿入を意味する。挿入は、特定の残基のＮ末端側でもＣ末端側でもよい。
【０１４６】
本明細書で使用される場合において、「アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸配列中に存在する少なくとも１つのアミノ酸残基を、他の「代替」アミノ酸残基に置き換えることを意味する。代替残基は、「天然に存在する（遺伝子によりコードされた）アミノ酸残基」であり、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（ｌｌｅ）ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びバリン（Ｖａｌ）から選択されてもよい。１又は複数の天然に存在しないアミノ酸残基による置換も、本明細書におけるアミノ酸置換の定義に包含される。「天然に存在しないアミノ酸残基」とは、上に挙げた天然に存在するアミノ酸残基以外の残基を意味し、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基と共有結合することができる。天然に存在しないアミノ酸の例としては、ノルロイシン、オルニチン、ホモセリン、及び本明細書に参照として組み込まれるＥｌｌｍａｎ他，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１−３３６（１９９１）に記載のもの等の他のアミノ酸残基アナローグが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４７】
本明細書で使用される場合において、「アミノ酸の挿入」という用語は、あるアミノ酸配列に少なくとも１つのアミノ酸を取り込むことを意味する。好ましい実施形態において、挿入は通常１又は複数のアミノ酸残基の挿入である。他の実施形態において、挿入はより大きな（例えば、約３〜５、さらには約１０以内のアミノ酸残基の挿入）ペプチドの挿入を含む。
【０１４８】
本明細書で使用される場合において、「アミノ酸の欠失」という用語は、あるアミノ酸配列から少なくとも１つのアミノ酸残基を除去することを意味する。
【０１４９】
「アッセイシグナル」という用語は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出する任意の方法からの出力を意味し、比色アッセイからの吸光度、蛍光強度、又は１分あたりの分解速度が含まれるが、これらに限定されない。アッセイのフォーマットとして、ＥＬＩＳＡ、ｆａｃｓ、又は他の方法を含んでいてもよい。「アッセイシグナル」の変化は、細胞の生存率及び／又は解離速度、結合速度、若しくは両者の変化を反映することができる。「より高いアッセイシグナル」とは、測定された出力の値が他の値よりも高いこと（例えば、変異体は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、親ポリペプチドに比べてより高い（大きい）値を示すことがある）を意味する。「より低い」アッセイシグナルとは、測定された出力の値が他の値よりも低いこと（例えば、変異体は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、親ポリペプチドに比べてより低い（小さい）値を示すことがある）を意味する。
【０１５０】
「結合親和性」という用語は、個々のＦｃレセプター−Ｆｃ結合相互作用に関する解離平衡定数（濃度の単位で示される）を意味する。結合親和性は、解離速度（通常、秒-1等の時間の逆数の単位で示される）を結合速度（通常、モル／秒等の、濃度／単位時間の谷で示される）で割った比に直接関係する。一般に、解離平衡定数の変化が、結合速度、解離速度、又は両者の変化によるものであるかについては、それらの値を（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ又はＳＡＰＩＤＹＮＥ測定によって）実験的に決定しないと、明確にすることはできない。
【０１５１】
本明細書で使用される場合において、「ヒンジ領域」という用語は、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０にわたる、ヒトＩｇＧ１における一連のアミノ酸を意味する。他のＩｇＧ１アイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間Ｓ−Ｓ結合を同じ位置で形成する最初と最後のシステイン残基の位置を決定することにより、ＩｇＧ１配列について整列することができる。
【０１５２】
本明細書で使用される場合において、Ｆｃ領域の「下流側ヒンジ領域」という用語は、ヒンジ領域のＣ末端側直近の一連のアミノ酸残基（例えば、ＩｇＧ１のＦｃ領域の２３３〜２３９位の残基）を意味する。
【０１５３】
「Ｃ１ｑ」とは、免疫グロブリンのＦｃ領域に対する結合部位を含むポリペプチドを意味する。Ｃ１ｑと２つのセリンプロテアーゼＣ１ｒ及びＣ１ｓは、共に、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）経路の第１成分である、複合体Ｃ１を形成する。
【０１５４】
本明細書で使用される場合において、「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多特異的（例えば、二特異的）抗体、及び所望の生物学的活性を示す任意の抗体のフラグメントを包含する。
【０１５５】
本明細書で使用される場合において、「抗体のフラグメント」という用語は、完全な抗体の部分を意味する。抗体のフラグメントの例としては、直鎖抗体、一本鎖抗体分子、Ｆｃ又はＦｃ’ペプチド、Ｆａｂ及びＦａｂフラグメント、及び抗体のフラグメントから形成される多特異的抗体が挙げられるが、これらに限定されない。抗体のフラグメントは、好ましくはヒンジ領域の少なくとも部分及び必要に応じてＩｇＧ重鎖のＣＨ１領域を保持している。他の好ましい実施形態において、抗体のフラグメントはＣＨ２領域の少なくとも部分又はＣＨ２領域全体を含む。
【０１５６】
本明細書で使用される場合において、「機能性フラグメント」という用語は、モノクローナル抗体に関して使用される場合、機能的活性を保持しているモノクローナル抗体の部分を意味することが意図される。機能的活性は、例えば、抗原結合又は特異性である。モノクローナル抗体の機能性フラグメントとしては、重鎖又は軽鎖単独及び、ＶＬ、ＦＨ及びＦＤ等のそれらのフラグメント、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦａｂ’等の一価フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2等の二価フラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、及びＦｃフラグメント等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの用語は、例えば、Ｈａｒｌｏｗｅ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｍｙｅｒｓ，Ｒ．Ａ．（ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，Ｉｎｃ．）；Ｈｕｓｔｏｎ他，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，２２：１８９−２２４（１９９３）；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１７８：４９７−５１５（１９８９）及び、Ｄａｙ，Ｅ．Ｄ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９０）に記載されており、これらは全て参照として本明細書に組み込まれる。機能性フラグメントという用語は、例えば、プロテアーゼによるモノクローナル抗体の消化又は短縮、及び公知の組み換えＤＮＡ法により生成されたフラグメントを含むことが意図される。
【０１５７】
本明細書で使用される場合において、非ヒト（マウス等）抗体の「ヒト化」体とは、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最低限の配列を含む、あるいは全く含まない抗体を意味する。大部分、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエント由来の超可変領域が、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類等の非ヒト種由来のの、所望の特異性、親和性及び能力を有する超可変領域由来の残基（ドナー抗体）で置換されている。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が対応する非ヒト由来の残基で置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体において見出されない残基を含んでいてもよい。これらの改変は、一般に抗体の特性をさらに改善するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、通常は２つの可変領域のほぼ全体を含んでおり、超可変ループの全体又はほぼ全体は、非ヒト免疫グロブリンの同一部位に対応しており、ＦＲ領域の全体又はほぼ全体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒト化抗体はまた、通常ヒト免疫グロブリン由来の、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも部分を含む。ヒト免疫グロブリンを生成する方法の例は、Ｗｉｎｔｅｒらによる米国特許第５，２２５，５３９号明細書（参照として本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１５８】
本明細書で使用される場合において、「超可変領域」という用語は、抗原との結合に関与している、抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」（軽鎖可変領域中の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）及び８９〜９７（Ｌ３）、並びに重鎖可変領域中の残基３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、及び９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ他，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））由来、及び／又は「超可変ループ」（軽鎖可変領域中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）及び９１〜９６（Ｌ３）、並びに重鎖可変領域由来の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）及び９６〜１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））由来のアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基とは、本明細書において定義された超可変領域以外の可変領域の残基である。
【０１５９】
本明細書で使用される場合において、「イムノアドヘシン」という用語は、外因性の「アドヘシン」タンパク質（例えば、レセプター、リガンド又は酵素）の結合領域を、免疫グロブリンの定常領域に結合させた抗体類似の分子を表す。構造的に、イムノアドヘシンは、所望の結合特性を有し、抗体の抗原認識及び結合部位（抗原結合部位）とは異なる（「外因性の」）アドヘシンのアミノ酸配列と免疫グロブリン定常領域配列とが融合した構造を含む。
【０１６０】
本明細書で使用される場合において、「リガンド結合ドメイン」という用語は、任意の天然レセプター又は少なくとも対応する天然レセプターの定性的なリガンド結合能を保持したその誘導体を意味する。ある実施形態において、レセプターは、免疫グロブリンの超遺伝子族のメンバーと相同な細胞外ドメインを有する細胞表面ポリペプチドに由来する。特にこの定義に含まれる、免疫グロブリン超遺伝子族に属しない他のレセプターとして、特にチロシンキナーゼ活性を有するサイトカインレセプター（チロシンキナーゼレセプター）、ヘマトポイエチン及び神経成長因子スーパーファミリー、及び細胞接合分子（例えば、Ｅ−、Ｌ−、及びＰ−セレクチン）がある。
【０１６１】
本明細書で使用される場合において、「レセプター結合ドメイン」という用語は、任意のレセプターに対する天然のリガンドを意味し、細胞接合分子、又は、対応する天然のリガンドの少なくとも定性的な結合能を保持した、そのような天然のリガンドの任意の領域又は誘導体を意味する。
【０１６２】
本明細書で使用される場合において、「抗体−イムノアドヘシンキメラ」という用語は、抗体の少なくとも１つの結合ドメインに少なくとも１つのイムノアドヘシンで結合する分子を含む。例としては、Ｂｅｒｇ他，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）  ８８：４７２３−４７２７（１９９１）及びＣｈａｒｎｏｗ他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５３：４２６８（１９９４）（共に参照として本明細書に組み込まれる）に記載の二特異性ＣＤ４−ＩｇＧキメラを含むが、これらに限定されない。
【０１６３】
本明細書で使用される場合において、「単離された」ポリペプチドとは、同定及び分離され、かつ／又はその天然環境下での成分から回収されたものである。天然環境での混入成分は、ポリペプチドの診断又は治療用途への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質、又は非タンパク質性の溶質が含まれる。ある実施形態において、単離されたポリペプチドは、（１）Ｌｏｗｒｙ法により決定された場合にポリペプチドの９５重量％、好ましくは９９重量％を上回るまで、（２）スピニングカップシークエネーターを用いて、少なくとも１５のＮ末端又は内部のアミノ酸配列を得るのに適当な程度に、又は（３）還元又は非還元条件下で、クマシーブルー又は銀染色を用いたＳＤＳ−ｐａｇｅで単一性を示すまで精製される。単離されたポリペプチドは、ポリペプチドの天然環境の少なくとも１つの成分を含まないため、そのままでは組み換え細胞内のポリペプチドを含んでいる。しかし、通常単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程を経て調製される。
【０１６４】
本明細書で使用される場合において、「治療」という用語は、治療上の処置及び予防又は防止活性の測定の両者を意味する。治療を必要とする人には、すでに病気を発病している人と同時に病気を予防する必要がある人が含まれる。
【０１６５】
本明細書で使用される場合において、「病気（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」という用語は、ポリペプチド変異体を用いた治療により利益を享受することができる任意の状態を意味し、慢性及び急性の病気又は疾患（例えば、患者が特定の病気にかかりやすくなるような病的状態）を含む。ある実施形態において、病気はガンである。
【０１６６】
本明細書で使用される場合において、「ガン」及び「ガン性の」という用語は、典型的には、無秩序な細胞成長によって特徴づけられる哺乳類の生理学的状態を意味し、記述する。ガンの例としては、上皮性悪性腫瘍、リンパ腫、芽細胞種、肉腫、及び白血病が挙げられるが、これらに限定されない。より具体的には、それらのガンとしては、扁平上皮ガン、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、肺腺ガン、肺扁平上皮ガン、腹膜ガン、肝細胞ガン、胃ガン、膵臓ガン、グリア芽腫、子宮頸ガン、卵巣ガン、肝ガン、膀胱ガン、肝ガン、乳ガン、大腸ガン、結腸直腸ガン、子宮内膜又は子宮ガン、唾液腺ガン、腎臓ガン、肝臓ガン、前立腺ガン、外陰部ガン、甲状腺ガン、肝腫瘍、及び数種の頭部及び頸部ガンが挙げられる。
【０１６７】
本明細書で使用される場合において、「ＨＥＲ２を発現したガン」という語句は、細胞表面にＨＥＲ２レセプタータンパク質（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｘ０３３６３）を有する細胞を含み、抗ＨＥＲ２抗体がガンに結合することができるガンをいう。
【０１６８】
本明細書で使用される場合において、「標識」という用語は、ポリペプチドと直接又は間接的に結合している検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識は、それ自身が検出可能なもの（例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識）であってもよく、酵素標識の場合には、検出可能な基質又は組成物の化学変化を触媒するものであってもよい。
【０１６９】
本明細書で使用される場合において、「調節因子」、「調節配列」及び「制御因子」という用語は、核酸配列の発現のある側面を制御する遺伝要素を意味する。例えば、プロモーターは、作動可能に結合されたコード領域の転写開始を促進する制御因子である。他の制御因子としては、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終止シグナル等が含まれる。原核細胞に適した制御因子は、例えば、プロモーター、必要に応じてオペレータ配列、及びリボソーム結合部位である。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを使用していることが知られている。
【０１７０】
本明細書で使用される場合において、核酸は、他の核酸配列と機能的な関係におかれた場合に、「作動可能に結合」されている。例えば、先行連鎖又は分泌のリーダーＤＮＡは、発現すればポリペプチドの分泌に関与する前駆体タンパク質となるポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に結合しており、配列の転写に影響する場合には、プロモーター又はエンハンサーが、コード領域に作動可能に結合しており、あるいは、転写を促進するように位置する場合には、リボソーム結合部位が、コード領域に作動可能に結合されている。好ましい実施形態において、「作動可能に結合可能に」とは、結合されたＤＮＡ配列が連続しており、分泌のリーダー配列の場合には、連続しておりリーディングフレームに存在する。しかし、例えばエンハンサーの場合には、連続している必要はない。結合は、例えば、従来の制限部位により達成される。そのような部位が存在しない場合には、従来の方法に従い、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを用いてもよい。
【０１７１】
本明細書で使用される場合において、「細胞」、「細胞系」、及び「細胞培養」という表現は、同義的に用いられ、それらの表現は子孫を含む。したがって、「形質転換体」及び「形質転換細胞」は、形質転換の回数に関係なくそれらから誘導される基礎細胞及び培養物を含む。全ての子孫は、故意又は偶発的な変異により、ＤＮＡコンストラクトにおいて、正確に同一である必要がないことは理解されるであろう。スクリーニングした場合に、最初に形質転換した細胞と同一な機能的又は生物学的活性を有する変異を有する子孫も含まれる。制限酵素による消化が意図されることは、文脈から明白である。
【０１７２】
本明細書で使用される場合において、「分析物」とは、分析対象となる物質を意味する。好ましい分析物は、Ｆｃ領域への結合能を分析するためのポリペプチドを含むＦｃ領域である。
【０１７３】
本明細書で使用される場合において、「レセプター」という用語は、少なくとも１つのリガンドに結合することが可能なポリペプチドを意味する。好ましいレセプターは、細胞外リガンド結合ドメイン、及び、必要に応じて、他のドメイン（例えば、膜貫通ドメイン、細胞間ドメイン及び／又は膜アンカー）を有する細胞表面又は可溶性のレセプターである。本明細書に記載のアッセイにより評価されるレセプターは、完全なレセプターでもよく、そのフラグメント又は誘導体（例えば、１又は複数の外因性ポリペプチドに融合した、レセプターの結合ドメインを有する融合タンパク質）でもよい。さらに、結合能が評価されるレセプターは、細胞内にあってもよく、又は単離され、必要に応じてアッセイプレート又は他の固相に塗布されていてもよく、又は直接標識されプローブとして使用されてもよい。
【０１７４】
本明細書で使用される場合において、「ＣＨＯ発現ポリペプチド」という語句は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で組み換えにより発現されたポリペプチドを意味する。
【０１７５】
本明細書で使用される場合において、「抗体応答性疾患」という用語は、抗体療法により少なくとも部分的に治療が可能であることが示された任意の疾患又は病状を意味する。そのような疾患又は病状の例としては、リンパ腫（ＲＩＴＵＸＡＮにより治療可能であることが示されている）、感染症（ＳＹＮＡＧＩＳで治療可能であることが示されている）、腎臓移植（ＺＥＮＡＰＡＸが有効であることが示されている）、クローン病及び関節リウマチ（ＲＥＭＩＣＡＤＥで治療可能であることが示されている）、乳ガン（ＨＥＲＣＡＰＴＩＮにより治療可能であることが示されている）、及び大腸ガン（ＥＤＲＥＣＯＬＯＭＡＢにより治療可能であることが示されている）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合において、「イムノアドヘシン応答性疾患」という用語は、アドヘシン療法により少なくとも部分的に治療が可能であることが示された任意の疾患又は病状を意味する。
【０１７６】
本明細書で使用される場合において、親ポリペプチドよりも「ヒトエフェクター細胞の存在下で抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）をより効率的に媒介する」ポリペプチド変異体とは、インビトロ又はインビボにおいて、アッセイに用いたポリペプチド変異体及び親抗体の量がほぼ同じである場合に、ＡＤＣＣの媒介が顕著に有効なポリペプチドである。例えば、そのような変異体は、同一のＡＤＣＣアッセイにおいて、親ポリペプチドよりもあるＡＤＣＣアッセイにおいてより多くの標的細胞の溶解を起こす。そのような変異体は、例えばＡＤＣＣアッセイにより同定することができるが、ＡＤＣＣ活性を決定する他のアッセイ又は方法（例えば、動物モデル）を用いてもよい。好ましい実施形態において、ポリペプチド変異体は、親ポリペプチドよりも、ＡＤＣＣの媒介において約１．２倍、１．５倍、５０倍、１００倍、約５００倍、又は約１０００倍以上有効である。
【０１７７】
本明細書で使用される場合において、親ポリペプチドよりも「全血サンプルから抗体依存性のＢ細胞の消失をより効果的に媒介する」ポリペプチド変異体とは、インビトロ又はインビボにおいて、アッセイに用いたポリペプチド変異体及び親抗体の量がほぼ同じである場合に、Ｂ細胞の消失が顕著に有効なポリペプチドである。例えば、そのような変異体は、同一のアッセイにおいて、親ポリペプチドよりも高い割合でＢ細胞の消失を起こす。また、そのような変異体は、同一のアッセイにおいて親ポリペプチドの必要量よりも低い濃度で同程度のＢ細胞を消失させることができる。そのような変異体は、例えばＡＤＣＣアッセイにより同定することができるが、ＡＤＣＣ活性を決定する他のアッセイ又は方法（例えば、動物モデル）を用いてもよい。好ましい実施形態において、親ポリペプチドに対する消失効果の増大は、１５８位におけるＦｃＲＩＩＩａの遺伝子型（Ｖ又はＦ）及び１３１位におけるＦｃＩＩａの遺伝子型（Ｈ又はＲ）に無関係であり、ポリペプチド変異体は、親ポリペプチドよりも、Ｂ細胞の消失の媒介において約１．２倍、１．５倍、５０倍、１００倍、約５００倍、又は約１０００倍以上有効である。
【０１７８】
「抗体又はイムノアドヘシン応答性疾患の症状」という用語は、通常特定の疾患に関連するそれらの症状を意味する。例えば、症状は通常クローン病に関連する症状であり、腹痛、下痢、直腸出血、体重の減少、発熱、食欲の減退、脱水、貧血、膨張、線維症、腸管の炎症、及び栄養失調を含む。
【０１７９】
症状が軽減するような条件下で」という語句は、任意の抗体又はイムノアドヘシン応答性疾患の検知可能な症状における、任意の定性的又は定量的な減少を意味し、疾病からの回復速度における検出可能な影響（例えば、体重の増加）、又は、通常特定の疾患に関連する少なくとも１つの症状の減少（例えば、抗体又はイムノアドヘシン応答性疾患がクローン病の場合には、以下の症状：腹痛、下痢、直腸出血、体重の減少、発熱、食欲の減退、脱水、貧血、膨張、線維症、腸管の炎症、及び栄養失調のうち少なくとも１つの軽減）を含むが、それらに限定されない。
【０１８０】
本発明の説明
本発明は、ポリペプチドＦｃ領域変異体及びＦｃ領域変異体をコードするオリゴヌクレオチドを提供する。具体的には、本発明は、新規なＦｃ領域変異体を含む組成物、有用なＦｃ領域変異体を同定する方法、及びＦｃ領域変異体を疾患の治療に使用する方法を提供する。以下、本発明の説明は、下記のセクションにおいてなされる。Ｉ）抗体Ｆｃ領域、ＩＩ）変異性Ｆｃ領域、ＩＩＩ）複合変異体、ＩＶ）変異体ポリペプチドのアッセイ、Ｖ）変異性Ｆｃ領域を含む分子の例、ＶＩ）Ｆｃ領域変異体をコードする核酸配列、ＶＩＩ）治療への応用及び製剤、ＶＩＩＩ）Ｆｃ領域変異体の他の利用。
【０１８１】
Ｉ．抗体Ｆｃ領域
上述したように、抗体には主としてＣＨ２及びＣＨ３領域が存在し、非抗原性の結合機能に関与している。また、これらの領域は通常Ｆｃ領域として知られており、エフェクター分子の結合により媒介されるいくつかのエフェクター効果を有している。
【０１８２】
抗体のＦｃ領域に媒介されるエフェクター機能は、（１）抗体が抗原に結合した後に作用するエフェクター効果（これらの効果は、例えば、補体カスケード又はＦｃレセプター（ＦｃＲ）を有する細胞に関与する）、及び（２）抗原への結合とは無関係に作用するエフェクター効果（これらの効果は、循環し続けること及びトランスサイトーシスにより細胞間障壁を越えて輸送される能力によりもたらされる）の２つのカテゴリーに分類することができる。例えば、補体のＣ１成分の抗体への結合により補体系が活性化される。オプソニン化に続いて、補体の活性化が細胞病原体の溶解にとって重要である。補体の活性化はまた、炎症応答を刺激し、自己免疫過敏にも関与しているかもしれない。さらに、抗体はＦｃ領域を介して、抗体のＦｃ領域上のＦｃレセプター結合部位で、細胞上のＦｃレセプター（ＦｃＲ）に結合することにより細胞に結合している。ＩｇＧ（γレセプター）、ＩｇＥ（εレセプター）、ＩｇＡ（αレセプター）、及びＩｇＭ（μレセプター）を含む種々の抗体に特異的な多くのＦｃレセプターが存在する。本発明は、いずれかの特定のメカニズムに限定されないが、細胞表面におけるＦｃレセプターへの抗体の結合は、抗体に覆われた粒子の呑食及び破壊、免疫複合体の除去、キラー細胞による抗体で覆われた標的細胞の溶解（抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）と呼ばれる）、炎症性メディエータ、胎盤通過及び免疫グロブリンの産生の制御を含む多くの重要で多様な生物学的応答を引き起こす。
【０１８３】
いくつかの抗体のエフェクター機能は、抗体のＦｃ領域に結合するＦｃレセプター（ＦｃＲ）に媒介される。ＦｃＲは、免疫グロブリンのアイソタイプに対する特異性によって定義され、ＩｇＧ抗体に対するＦｃレセプターはＦｃγＲ、ＩｇＥに対するものはＦｃεＲ、ＩｇＡに対するものはＦｃαＲ等と呼ばれる。ＦｃγＲの３つのサブクラス、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）が同定されている。
【０１８４】
ＦｃγＲのそれぞれのサブクラスは２つ又は３つの遺伝子によりコードされており、選択的ＲＮＡスプライシングにより多重転写が起こり、ＦｃγＲアイソフォームの幅広い多様性が存在する。ＦｃγＲＩサブクラスをコードする３つの遺伝子（ＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＢ及びＦｃγＲＩＣ）は、第１染色体長腕の１ｑ２１．１領域に一団となって存在しており、ＦｃγＲＩＩサブクラスをコードする３つの遺伝子（ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃγＲＩＩＣ）及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスをコードする２つの遺伝子（ＦｃγＲＩＩＩＡ、及びＦｃγＲＩＩＩＢ）は全て領域１ｑ２２に一団となって存在する。これらの異なるＦｃＲサブタイプは、異なる細胞種において発現する（例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）参照）。例えば、ヒトにおいて、ＦｃγＲＩＩＩＢは好中球のみにおいて見られるが、ＦｃγＲＩＩＩＡはマクロファージ、単球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びＴ細胞の亜集団において見られる。特に、ＦｃγＲＩＩＩＡは、ＡＤＣＣに関与する細胞種の一つであるＮＫ細胞に存在する。
【０１８５】
ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）レセプターは、細胞外ドメインの１５８位に、この位置にフェニルアラニン又はバリンをコードする共通の多型を有している。ＦｃγＲＩＩＩのＶ型対立遺伝子は、ヒトＩｇＧ１に対しＦ型対立遺伝子よりも高い親和性を有する。Ｖ１５８対立遺伝子はまた、ＡＤＣＣをより効率的に媒介する。臨床データは、ＲＩＴＵＸＡＮによる治療を行っている患者におけるＦｃγＲＩＩＩＡの遺伝子型と、処置及び治療に対する応答との間に相関を示した。臨床及び分子レベルでの応答並びに進行時間は、ＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖ遺伝子型（人口の約２０％）と同型の患者が優れていることが示された。それに対して、異型又はより親和性の低いＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｆ遺伝子型（人口の約８０％）の患者の応答はより鈍い。これらのデータは、ＡＤＣＣを促進する１５８ＦのＦｃ変異キャリアはガンの抗体治療の臨床での有効性を高めるかもしれないことを示唆している。遺伝子多型は、ヒトＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）レセプターの、細胞外ドメインの１３１位にも存在し、ヒスチジン（Ｈ）又はアルギニン（Ｒ）のいずれかをコードしている。１３１位における多型は、ヒトＩｇＧに対する結合に影響を与えることが見出されている。最近のデータによれば、ＦｃγＲＩＩＩＡの１３１位における多型とＲＩＴＵＸＡＮに対する臨床応答との間に相関が存在することが示されている。Ｈ１３１対立遺伝子と同型である患者は、他の２つの群よりも優位に高い応答速度を有する。
【０１８６】
ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩは、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）レセプターであり、ＦｃγＲＩは細胞外ドメインに３つのＩｇＳＦドメインを有している一方、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩは、細胞外ドメインに２つのＩｇＳＦドメインしか有しない。
【０１８７】
他のタイプのＦｃレセプターは新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）である。ＦｃＲｎは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）と構造的に同一であり、β２−マイクログロブリンと非共有結合したα鎖を含む。
【０１８８】
ＩＩ．変異性Ｆｃ領域
本発明は、ポリペプチド変異体、ポリペプチド変異体をコードする核酸配列、及びポリペプチド変異体を精製する方法を提供する。好ましくは、本発明のポリペプチド変異体は、親ポリペプチドと少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有する点で異なる。「親」、「野生型」、「出発物質となる」又は「非変異体」ポリペプチドは、好ましくは抗体Ｆｃ領域の少なくとも部分を含み、抗体Ｆｃ領域又はその部分を含むポリペプチドを生成するための当業者が用いることのできる手法を用いて調製することができる。好ましい実施形態において、親ポリペプチドは抗体である。しかし、親ポリペプチドは、少なくともＦｃ領域の部分を含む他のポリペプチド（例えば、イムノアドヘシン）であってもよい。ある実施形態において、変異性Ｆｃ領域は（例えば、本明細書に記載の方法によって）生成することができ、抗体の可変領域又はレセプター若しくはリガンドの結合ドメイン等の選択した外因性のポリペプチドに融合させてもよい。
【０１８９】
好ましい実施形態において、親ポリペプチドは、Ｆｃ領域又はその機能部位を含む。一般的に、親ポリペプチドのＦｃ領域は天然配列Ｆｃ領域、及び好ましくはヒト天然配列Ｆｃ領域を含む。しかし、親ポリペプチドのＦｃ領域は、１又は複数のすでに存在する天然配列Ｆｃ領域からのアミノ酸配列の変更又は修飾を有していてもよい。例えば、Ｆｃ領域のＣ１ｑ結合活性がすでに変更させられていてもよく、またＦｃ領域のＦｃγＲ結合親和性が変更を受けていてもよい。さらなる実施形態において、親ポリペプチドのＦｃ領域は仮想的（例えば、思考上のもの又はコンピューター若しくは紙面上に可視的に表現されたもの）であり、それは物理的に存在しないが、抗体技術者は所望の変異性Ｆｃ領域のアミノ酸配列を決定し、その配列又は所望の変異性Ｆｃ領域のアミノ酸配列のＤＮＡコーディングを含むポリペプチドを生成することができる。しかし、好ましい実施形態において、親ポリペプチドのＦｃ領域をコードする核酸配列を得ることができ、この核酸配列を変更してＦｃ領域変異体をコードする変異性核酸配列を生成する。
【０１９０】
親ポリペプチドの変異体をコードする核酸は、具体的な配列についての本明細書の教示を用いて、公知の方法により調製することができる。これらの方法には、ポリペプチドをコードするすでに調製された核酸への部位特異的（又はオリゴヌクレオチド介在性）突然変異誘発法、ＰＣＲ突然変異誘発法、及びカセット式突然変異誘発法が含まれるが、それらに限定されない。部位特異的突然変異誘発法は、変異体を調製するための好ましい方法である。この手法は当業者によく知られている（例えば、Ｃａｒｔｅｒ他，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３（１９８５）及びＫｕｎｋｅｌ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８（１９８７）を参照。これらは共に参照として本明細書に組み込まれる）。要約すると、ＤＮＡに対する部位特異的突然変異誘発法では、出発物質となるＤＮＡの変更のために、まず所望の変異をコードする１又は複数のオリゴヌクレオチドを、出発物質となるＤＮＡの一本鎖にハイブリダイズさせる。ハイブリダイズの後、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ＤＮＡポリメラーゼにより第２鎖の全体を合成し、ＤＮＡリガーゼを用いて第２鎖を結合させ、環状の二本鎖ＤＮＡを形成させる。このようにして、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドを、得られる二本鎖ＤＮＡに導入することができる。
【０１９１】
ＰＣＲ突然変異誘発法もまた出発物質となるポリペプチドのアミノ酸配列変異体を作るのに適している（例えば、Ｖａｌｌｅｔｔｅ他，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７２３−７３３（１９８９）（参照として本明細書に組み込まれる）を参照）。要約すると、少量のテンプレートＤＮＡをＰＣＲの出発物質として用い、テンプレートＤＮＡの対応する領域とわずかに配列が異なるプライマーを用いることにより、プライマーとテンプレートが相違する点のみでテンプレート配列と相違する、相対的に大量の特定のＤＮＡフラグメントを生成することができる。
【０１９２】
変異体を調製する他の方法であるカセット式突然変異誘発法は、参照として本明細書に組み込まれるＷｅｌｌｓ他，Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３（１９８５）に記載の方法に基づくものである。出発物質は、変異の対象となる出発物質であるポリペプチドＤＮＡを含むプラスミド（又は他のベクター）である。出発物質であるＤＮＡの変異対象となるコドンを同定する。同定された変異箇所の両端には、唯一の制限エンドヌクレアーゼ反応部位が存在しなければならない。そのような制限部位が存在しない場合には、上述のオリゴヌクレオチド介在性突然変異誘発法により、出発物質となるポリペプチドＤＮＡの適当な位置に生成させることができる。プラスミドＤＮＡは、これらの位置で切断され直鎖状となる。制限部位の間のＤＮＡ配列をコードするが所望の変異を含む二本鎖オリゴヌクレオチドは、標準的な方法により合成され、オリゴヌクレオチドの２つの分子鎖は別個に合成され、その後標準的な手法によりハイブリダイズされる。二本鎖オリゴヌクレオチドはカセットと呼ばれる。このカセットは、直鎖状になったプラスミドの両端に適合する５’及び３’末端を有し、直接プラスミドと結合可能なようにデザインされる。このプラスミドは、今や変異ＤＮＡ配列を含む。
【０１９３】
あるいは、又はさらに、ポリペプチド変異体をコードする所望のアミノ酸配列を決定することができ、そのようなアミノ酸配列変異体をコードする核酸配列を合成的に生成することができる。
【０１９４】
親ポリペプチドのアミノ酸配列は、インビトロ及び／又はインビボで変更された結合親和性又は活性を有し、かつ／又はインビトロ及び／又はインビボで変更された抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有する変異性Ｆｃ領域を生成するために改変されてもよい。また、親ポリペプチドのアミノ酸配列は、変更された補体結合特性及び／又は循環半減期を有する変異性Ｆｃ領域を生成するために改変されてもよい。
【０１９５】
Ｆｃ領域の生物学的性質の実質的な改変は、（ａ）置換された領域のポリペプチド骨格の、例えば、シート又はヘリックスコンホメーション等の構造、（ｂ）標的部位における分子、又は側鎖全体における電荷又は疎水性、（ｄ）糖質との相互作用、又は（ｅ）ドメインの運動柔軟性を変化させる効果の点で有意に異なる置換を選択することにより達成される。天然に存在するアミノ酸残基は、共通の側鎖の性質に基づき、下記のように分類される。
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性かつ親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）配向に影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
非保存的置換により、これらの分類の１つに属するアミノ酸の他の分類に属するアミノ酸への交換が起こる。保存的置換により、これらの分類の１つに属するアミノ酸の同一の分類に属するアミノ酸への交換が起こる。
【０１９６】
以下の実施例で示されるように、変更された活性（エフェクター機能及び薬物動態）を有するＦｃ領域変異体を設計することができる。例えば、Ｆｃ領域の１又は複数のアミノ酸残基を、ＡＤＣＣ活性を変更（例えば、増大又は減少）するために修飾することができる。好ましい実施形態において、修飾は本明細書で特定したＦｃ領域の１又は複数の残基を含む（例えば、実施例２、及びＷＯ００／４２０７２号国際公開公報（あらゆる目的のために参照として本明細書に組み込まれる）を参照）。一般的に、ＡＤＣＣ活性に影響することを本明細書で確認したＦｃ領域の残基について、そのようなＦｃ領域変異体を生成するために１又は複数のアミノ酸置換を行う。好ましい実施形態において、１〜約１０以下のＦｃ領域の残基を欠失又は置換する。ここで、１又は複数のアミノ酸の修飾（例えば置換）を有するＦｃ領域は、好ましくは、親Ｆｃ領域の配列又はヒトＦｃ領域の天然配列の少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％を保持している。
【０１９７】
アミノ酸挿入Ｆｃ領域変異体を作ることができ、変異体は変更されたエフェクター機能を有する。例えば、少なくとも１つのアミノ酸残基（例えば、１又は２のアミノ酸残基で、通常１０以下の残基）を、本明細書においてＦｃＲとの結合に影響することが確認されたＦｃ領域の１又は複数の位置に隣接する位置に導入することができる。「隣接する」とは、本明細書で特定したＦｃ領域の残基の１又は２残基以内を意味する。そのようなＦｃ領域変異体は、親分子に対して増大又は減退したＦｃＲ結合及び／又はＡＤＣＣ活性を示すことができる。そのような挿入変異体を生成するために、ＦｃＲの結合領域（例えば、対象となるＦｃＲの細胞外ドメイン）及び、例えば、ＦｃＲ結合特性が改善されたＦｃ領域を合理的にデザインするためにアミノ酸残基を挿入するＦｃ領域（例えば、Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ他，Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：２６７（２０００）；Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０（９）：２３６１−２３７０（１９８１）；及びＢｕｒｍｅｉｓｔｅｒ他，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：３７９−３８３，（１９９４）（これらは全て参照として本明細書に組み込まれる）を参照）を含むポリペプチドの共結晶構造を評価することができる。好ましい実施形態において、それらの挿入は、Ｆｃ領域のループに対して行われるが、Ｆｃ領域の２次構造（例えば、β−ストランド）に対しては行われない。
【０１９８】
親Ｆｃ領域に適当なアミノ酸配列の修飾を導入することにより、（ａ）抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）をヒトエフェクター細胞の存在下でより効率的又は非効率に媒介し、かつ／又は、（ｂ）補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をヒトエフェクター細胞の存在下でより効率的又は非効率に媒介し、かつ／又は、（ｃ）Ｆｃガンマレセプター（ＦｃγＲ）又は新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）に、親ポリペプチドとは異なるｐＨで所望の親和性で結合する変異性Ｆｃ領域を生成することができる。そのようなＦｃ領域変異体は、通常少なくとも１つのアミノ酸の修飾をＦｃ領域に含む。
【０１９９】
好ましい実施形態において、親ポリペプチドのＦｃ領域は、ヒトＦｃ領域、例えば、天然ヒトＦｃ領域ＩｇＧ１（ｆ及びａ,ｚアロタイプ）、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、及び任意の種について知られている又は発見された全てのアロタイプである。そのような領域は図２（配列番号１〜８）、図３（配列番号９〜１２）、及び図５（配列番号３２〜３７）に示した配列を有する。
【０２００】
ある実施形態において、改善されたＡＤＣＣ活性を有するＦｃ領域を生成するために、親ポリペプチドは、ＡＤＣＣをすでに有しているもの（例えば、親ポリペプチドはヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ３のＦｃ領域を含む）であることが好ましい。ある実施形態において、改善されたＡＤＣＣ活性を有する変異体は、天然配列を有するＦｃ領域（例えば、Ｐ２４７Ｌ及びＩ３３２Ｅ変異体）よりもはるかに効率的にＡＤＣＣを媒介する。
【０２０１】
好ましい実施形態において、アミノ酸の修飾はＦｃ領域のＣＨ２及び／又はＣＨ３領域に導入される。ＡＤＣＣ活性の変化した変異性ＩｇＧ  Ｆｃ領域を生成するための有用なアミノ酸修飾の位置は、Ｆｃ領域の２４７、２５１、２５６、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３００、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３３９、３４０、３６０、３７３、３７６、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８、４３９、又は４４０位である。好ましい実施形態において、これらの変異体を生成するためのテンプレートとして用いた親ポリペプチドは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域を含む。
【０２０２】
ある実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域を有する親ポリペプチドの変異体を含む組成物を提供し、該変異体は、エフェクター細胞の存在下で、抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の２４７位において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有している。ある実施形態において、アミノ酸の修飾は、Ｐ２４７Ｌである。他の実施形態において、アミノ酸の修飾は、Ｐ２４７Ｉ又はＰ２４７Ｈである。
【０２０３】
ある実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域を有する親ポリペプチドの変異体を含む組成物を提供し、該変異体は、エフェクター細胞の存在下で、抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の２５１位において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有している。ある実施形態において、アミノ酸の修飾は、Ｌ２５１Ｆである。
【０２０４】
特定の実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域を有する親ポリペプチドの変異体を含む組成物を提供し、該変異体は、エフェクター細胞の存在下で、抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の２５６位において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有している。ある実施形態において、アミノ酸の修飾は、Ｔ２５６Ｍ又はＴ２５６Ｐである。
【０２０５】
特定の実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域を有する親ポリペプチドの変異体を含む組成物を提供し、該変異体は、エフェクター細胞の存在下で、抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の２６８位において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有している。ある実施形態において、アミノ酸の修飾は、Ｈ２６８Ｄ又はＨ２６８Ｅである。
【０２０６】
特定の実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域を有する親ポリペプチドの変異体を含む組成物を提供し、該変異体は、エフェクター細胞の存在下で、抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の２８０位において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有している。ある実施形態において、アミノ酸の修飾は、Ｄ２８０Ａ又はＤ２８０Ｋである。
【０２０７】
特定の実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域を有する親ポリペプチドの変異体を含む組成物を提供し、該変異体は、エフェクター細胞の存在下で、抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の３３０位において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有している。ある実施形態において、アミノ酸の修飾は、Ａ３３０Ｋ又はＡ３３０Ｒである。
【０２０８】
特定の実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域を有する親ポリペプチドの変異体を含む組成物を提供し、該変異体は、エフェクター細胞の存在下で、抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の３３２位において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有している。ある実施形態において、アミノ酸の修飾は、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｋ又はＩ３３２Ｒである。
【０２０９】
特定の実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域を有する親ポリペプチドの変異体を含む組成物を提供し、該変異体は、エフェクター細胞の存在下で、抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の３３９位において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有している。ある実施形態において、アミノ酸の修飾は、Ａ３３９Ｔである。
【０２１０】
特定の実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域を有する親ポリペプチドの変異体を含む組成物を提供し、該変異体は、エフェクター細胞の存在下で、抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の３７８位において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有している。ある実施形態において、アミノ酸の修飾は、Ａ３７８Ｄである。
【０２１１】
特定の実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域を有する親ポリペプチドの変異体を含む組成物を提供し、該変異体は、エフェクター細胞の存在下で、抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し、Ｆｃ領域の４４０位において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を有している。ある実施形態において、アミノ酸の修飾は、Ｓ４４０Ｙである。
【０２１２】
上述のポリペプチド変異体には、望ましい又は意図されるポリペプチドの使用に応じてさらに修飾を行ってもよい。そのような修飾には、例えば、アミノ酸配列のさらなる変更（アミノ酸配列の置換、挿入及び／又は欠失）、糖質の改変、外因性ポリペプチドとの融合及び／又は共有結合による修飾が含まれる。そのようなさらなる改変は、Ｆｃレセプターとの結合及び／又はＡＤＣＣ活性の変更をもたらす、上に開示したアミノ酸の修飾の前に、改変と同時に、又は改変の後に行うことができる。
【０２１３】
あるいは、又はさらに、アミノ酸の修飾をＣ１ｑとの結合及び／又はＦｃ領域の補体依存性細胞傷害機能を変化させる１又は複数のさらなるアミノ酸の修飾と組み合わせることが有用な場合がある。ここで特に対象となる出発物質となったポリペプチドは、Ｃ１ｑに結合し補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を示すポリペプチドである。本明細書に記載のアミノ酸の修飾は、出発物質となったポリペプチドのＣ１ｑへの結合能及び／又は補体依存性細胞傷害を変化させる（例えば、これらのエフェクター機能を減少、好ましくは消失させる）ことができる。しかし、上述の位置の１又は複数に置換を含み、Ｃ１ｑへの結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）機能が改善されたポリペプチドも本発明において意図される。例えば、出発物質となったポリペプチドは、Ｃ１ｑに結合することができず、かつ／又はＣＤＣを媒介できないが、本明細書の教示にしたがい、これらのさらなるエフェクター機能を獲得するように改変することができる。さらに、すでにＣ１ｑ結合能を有し、必要に応じてＣＤＣ媒介能をもさらに有するポリペプチドを、これらの活性の一方又は両方を増大させるように改変することもできる。Ｃ１ｑを変化させ、かつ／又は補体依存性細胞傷害を改変するアミノ酸の修飾については、例えば、ＷＯ００／４２０７２号国際公開公報（参照として本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０２１４】
上に開示したように、Ｆｃ領域又はその部分を、例えば、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性を改変することにより、エフェクター機能を変化させるようにデザインすることができる。例えば、改善されたＣＤＣ活性及び改善されたＡＤＣＣ活性を有する（例えば、改善されたＡＤＣＣ活性及び改善されたＣＤＣ活性の両者を有する）変異性Ｆｃ領域を生成することができる。あるいは、エフェクター機能を減少させ、あるいは除去したい場合には、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性が減少した変異性Ｆｃ領域を設計することができる。他の実施形態において、これらの活性のうち一方を増大させ、必要に応じて他方の活性を減少させ、例えば、増大したＡＤＣＣ活性を有するがＣＤＣ活性が減少したＦｃ領域変異体、及びその逆のＦｃ領域変異体を生成することができる。さらに、ＦｃＲｎ、プロテインＡ、及び／又は他のＦｃ結合性タンパク質に対する結合親和性が改変された変異性Ｆｃ領域を設計することができる。
【０２１５】
他のタイプのアミノ酸置換により、ポリペプチドのグリコシル化パターンを変化させることができる。これは、例えば、ポリペプチドにおいて見られる１又は複数の糖質残基の欠失、及び／又はポリペプチドに存在しない１又は複数の糖質結合部位を付加することにより達成される。あるいは、これは、グリコシル化部位以外のアミノ酸を変化させるか、細胞を設計することにより間接的に達成される。ポリペプチドのグリコシル化は、通常Ｎ結合性又はＯ結合性のいずれかである。Ｎ結合性とは、糖質残基がアスパラギン残基の側鎖に結合していることを意味する。アスパラギン−Ｘ−セリン、及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここでＸはプロリン以外の任意のアミノ酸である）のペプチド配列が、アスパラギン側鎖に糖質残基が酵素的に結合される際に認識される配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのペプチド配列のいずれかが、可能性のあるグリコシル化部位を形成する。Ｏ結合性グリコシル化とは、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースのうち１つの糖質が、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンを用いることもできるが、大部分の場合セリン又はスレオニンに結合することを意味する。
【０２１６】
ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を１又は複数の上述のトリペプチド配列（Ｎ結合性グリコシル化部位の場合）を含むように変化させることにより達成される。変化は、１又は複数のセリン又はスレオニンの元のポリペプチドへの付加、又は置換（Ｏ結合性グリコシル化部位の場合）によっても行うことができる。例示的なグリコシル化変異体は、重鎖のＡｓｎ２９７残基にアミノ酸置換を有する。
【０２１７】
ある実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域を有する親ポリペプチドの変異体を含む組成物を提供し、該変異体は、少なくとも１つの表面残基のアミノ酸の修飾を含む（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８；２０（９）：２３６１−７０，１９８１，及びＷＯ００／４２０７２号国際公開公報。両者は、参照として本明細書に組み込まれる）。他の実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域を有する親ポリペプチドの変異体を含む組成物を提供し、該変異体は少なくとも１つの非表面残基のアミノ酸の修飾を含む。さらなる実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域を有する親ポリペプチドの変異体を含む組成物を提供し、該変異体は、少なくとも１つの表面残基のアミノ酸の修飾及び少なくとも１つの非表面残基のアミノ酸の修飾を含む。
【０２１８】
ＩＩＩ．複合変異体
ある実施形態において、本発明の変異体は、２又はそれ以上のアミノ酸の修飾（例えば置換）を含む。そのような複合変異体は、例えば、２又はそれ以上の上で詳述したアミノ酸の修飾を選択することにより産生することができる。下記の表１に、２又はそれ以上のアミノ酸の修飾の組み合わせの例を示す。例えば、表１の第１行は、Ｐ２４７Ｈと、２５１、２５６、２６８、２８０、３３０、３３２、３３９、３７８及び４４０位におけるアミノ酸の修飾との可能な組み合わせを示す（例えば、この行は、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０アミノ酸の修飾の可能な組み合わせを示す）。
【０２１９】
【表１】
2008502590.tif 000002
【０２２０】
表１に示した複合変異体及び他の複合変異体（ＷＯ００／４２０７２号国際公開公報に開示されたもの等）は、所定の活性（例えば、ＦｃγＲ結合活性、ＡＤＣＣ活性、及びＣＤＣ活性）について、種々のアッセイ（下記のセクションＩＶを参照）によりテストすることができる。こうして、有用な複合変異体を同定することができる。
【０２２１】
ある好ましい実施形態において、本発明の複合変異体はＡＤＣＣ活性を増大させる１つのアミノ酸の修飾、及び新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）への結合親和性（例えば、ｐＨ６．０における結合親和性、しかし、ｐＨ７．０又は７．４における結合親和性を含まない）を増大させる１つのアミノ酸の修飾を有する。他の実施形態において、本発明の複合変異体は、少なくとも１つの表面残基のアミノ酸の修飾及び少なくとも１つの非表面残基のアミノ酸の修飾を含む。さらなる複合変異体は、本明細書に記載の２又はそれ以上のアミノ酸の修飾、又は本明細書に記載の少なくとも１つのアミノ酸の修飾、及びＷＯ００／４２０７２号国際公開公報に記載のアミノ酸の修飾を組み合わせることにより生成することができる。
【０２２２】
ＩＶ．変異性ポリペプチドのアッセイ
本発明は、Ｆｃ領域変異体をスクリーニングするための種々のアッセイを提供する。スクリーニングアッセイを、有用な変異体の発見及び検証のために用いることができる。例えば、複合変異体（表１参照）をスクリーニングし、ＦｃＲへの結合が変化した、かつ／又はＡＤＣＣ活性が変化した、かつ／又はＣＤＣ活性が変化した（例えば、ＡＤＣＣ又はＣＤＣ活性が増大又は減少した）、かつ／又は全血からの標的細胞（例えば、Ｂ細胞）の除去能が改変を受けた変異体を見出すことができる。また、以下に述べるように、本発明のアッセイを用いて、（例えば、抗体又はイムノアドヘシン応答性疾患の症状を有するヒト等の）被験者に対する有用な治療効果を有する変異体を発見し検証することができる。種々のアッセイのタイプを用いて、変異体における親ポリペプチドに対する任意の変更を評価することができる（ＷＯ００／４２０７２号国際公開公報（参照として本明細書に組み込まれる）に記載のスクリーニングアッセイを参照）。他のアッセイの例は以下に示す。
【０２２３】
好ましい実施形態において、本発明の変異体は、非変異体（親）ポリペプチド（例えば、結合能は、好ましくは非変異体ポリペプチドの約２０倍又は５倍程度である）と比べ（未改変の抗原結合領域又は改変を受けた抗原結合領域を介した）抗原結合能をほぼ保持している抗体である。ポリペプチド変異体の抗原への結合能は、例えばＥＬＩＳＡ、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析、又は放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）等の手法により決定することができる。
【０２２４】
Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）結合アッセイを用いて、本発明の変異体の評価を行うことができる。例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃＲｎ等のＦｃレセプターへの結合は、ポリペプチド変異体を滴定し、結合したポリペプチド変異体を、ＥＬＩＳＡのフォーマット（下記の実施例を参照）において特異的にポリペプチド変異体に結合する抗体を用いて測定することにより決定することができる。例えば、抗体を含む変異体について標準的なＥＬＩＳＡアッセイによりスクリーニングを行い、ｐＨ６．０及びｐＨ７．０又は７．４におけるＦｃＲｎを決定する。ストレプトアビジン又はニュートラアビジンを塗布した固体表面を用いてビオチン標識したＦｃＲｎを、マウス又はヒト等の他の種から捕捉することができる。ブロッキングを行った後、捕捉したレセプターを変異性ポリペプチド（抗体）を、バッファー中ｐＨ６．０又はｐＨ７．０で希釈し、インキュベートすることができる。次の工程において、ヒト抗体に特異的な分子（例えば、ヤギ（Ｆａｂ’）2抗ヒトＦａｂ抗体と酵素のコンジュゲート）を加える。その後、基質を加え、ｐＨ６．０又はｐＨ７．０又は０Ｈ７．４での固定化されたＦｃＲｎへの変異性ポリペプチドの結合量を決定する。本アッセイの結果を親（非変異体）ポリペプチドの同一のＦｃＲへの結合能と比較することができる。他の好ましい実施形態において、（例えば、ＦｃＲｎとの）ＥＬＩＳＡを行い変異体のスクリーニングを行うための成分は、キットとして（例えば、取扱説明書と共に）包装されている。
【０２２５】
抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイは、本発明の変異体のスクリーニングに用いることもできる。ＡＤＣＣアッセイはインビトロ及び／又はインビボで行うことができる。ポリペプチド変異体のＡＤＣＣ活性の評価を行うために、ＡＤＣＣアッセイを種々のエフェクター：標的比で行ってもよい。例示的なＡＤＣＣアッセイにおいて、次の標的抗原：ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ６３、ＥＧＦレセプター、ｈｅｒ−２レセプター、前立腺特異的膜抗原、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ糖質、ＧＤ2及びＧＤ3ガングリオシド、ｌａｍｐ−１、ＣＯ−０２９、Ｌ６、及びｅｐｈＡ２のいずれかが発現した標的細胞系を用いることができる。エフェクター細胞は健康なドナーから（例えば、実験当日に）得ることができ、ＰＢＭＣは、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて精製することができる。その後、標的細胞をＩｇＧ変異体と、エフェクター細胞と、例えば、４０：１、２０：１、及び１０：１のエフェクター：標的比で混合する前に、例えば０．１〜１０００ｎｇ／ｍｌで３０分間プレインキュベートする。その後、ＡＤＣＣ活性を、損傷を受けた細胞の細胞質から上澄中に放出された乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性の測定に基づき、細胞の死及び溶解の定量を行うためのＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を用いて、比色定量法により測定する。ＡＤＣＣ活性は、クロム５１を導入した標的細胞のアッセイにより、細胞の死又は溶解の結果放出されたクロム５１を測定することによっても測定することができる。抗体非依存性細胞傷害は、抗体の非存在下で標的細胞及びエフェクター細胞由来のＬＤＨ活性を測定することにより決定することができる。全放出量は、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを標的細胞及びエフェクター細胞に添加した後で測定することができる。標的細胞及びエフェクター細胞のインキュベーションは、最適化された時間（０．５４〜１８時間）、３７℃、５．０％ＣＯ2中で行い、次いでアッセイプレートの遠心分離を行うことにより行うことができる。その後上澄を９６ウェルプレートに移し、ＬＤＨ検出試薬を加え、３０分間２５℃でインキュベートする。資料の吸光度は、４９０ｎｍでマイクロプレートリーダーを用いて測定することができる。細胞傷害の割合は、下式により計算することができる。
（細胞傷害の割合（％））＝{（実験値−低対照値）／（高対照値−低対照値）}×１００
抗ＣＤ−２０及び変異体における細胞傷害の割合は、同量のＲＩＴＵＸＡＮと直接比較することができ、相対有効性の測定値が得られる。例示的なＡＤＣＣアッセイにおいては、ＣＤ２０抗原を過剰発現したＳＫＷ６．４細胞（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入）を、標的細胞源として用いることができる。このアッセイの多くの変形が知られている（例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ他，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １９７８；７（１）：１−２６（参照として本明細書に組み込まれる）を参照）。
【０２２６】
このようなアッセイに有用な細胞としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、及び他の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、又はさらには、本発明のポリペプチド変異体のＡＤＣＣ活性は、インビボで、Ｃｌｙｎｅｓ他，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）（参照として本明細書に組み込まれる）に開示されたような動物モデル等を用いて評価することができる。
【０２２７】
本発明の変異体は、補体の活性化によってもスクリーニングすることができる。補体の活性化を評価するために、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイを行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０２：１６３（１９９６）（参照として本明細書に組み込まれる）を参照。）例えば、種々の濃度のポリペプチド変異体及びヒト補体をバッファーで希釈してもよい。ポリペプチド変異体が結合する抗原が発現した細胞を、約１×１０6個／ｍｌの密度まで希釈することができる。ポリペプチド変異体、希釈されたヒト補体、及び抗原を発現した細胞の混合物を、平底の組織培養用９６ウェルプレートに加え、２時間、３７℃、５％ＣＯ2中でインキュベートし、補体依存性細胞溶解を促進する。その後、５０μｌのアラマーブルー（Ａｃｃｕｍｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）をそれぞれのウェルに加え、３７℃で州やインキュベートする。吸光度を９６ウェル蛍光光度計を用いて、励起波長５３０ｎｍ、発光波長５９０ｎｍで測定を行うことができる。結果は、相対蛍光単位（ＲＦＵ）によって表される。サンプルの濃度は標準曲線により計算することができ、非変異性ポリペプチドと比較した活性の割合を、対象となるポリペプチド変異体について求めることができる。
【０２２８】
ある実施形態において、本発明の変異体は補体を活性化しない。例えば、ポリペプチド変異体は、本アッセイにおいて、変異を有しないＩｇＧ１  Ｆｃ領域を有する対照抗体と比べ約０〜１０％のＣＤＣ活性を示す。好ましくは、変異体は上述のＣＤＣアッセイにおいて全くＣＤＣ活性（例えば、バックグラウンドレベル以上の）を示さないように見える。他の実施形態において、本発明の変異体は親ポリペプチドと比べ増強されたＣＤＣを示す（例えば、ＩＣ50値の比較において、インビトロ又はインビボで約２〜約１００倍（又はそれ以上）に増大したＣＤＣ活性を示す）ことが見出される。
【０２２９】
本発明の変異体は、全血サンプルにおける標的細胞の消失によってもスクリーニングすることができる。例えば、種々の濃度のＣＤ２０標的特異性を有するポリペプチド変異体を、全血サンプルにおけるＢ細胞の消失についてｆａｃｓを用いてスクリーニングすることができる（Ｖｕｇｍｅｙｓｔｅｒ他，２００３  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ５２Ａ，１０１−１０９）。新たに採取した血液を種々の濃度のポリペプチド変異体と３７℃、５％ＣＯ2中で４時間（時間は変化させてもよい）インキュベートする。インキュベート後、赤血球を製造者の説明書にしたがい、塩化アンモニウム試薬（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号５５５８９９）により溶解し、蛍光標識を有するＢ細胞特異的な抗体（抗ＣＤ１９抗体等）を用いて、ｆａｃｓ法によりＢ細胞を検出する。結果は、未処理のサンプル又は無関係な（非消失性の）抗体とインキュベートしたサンプルのいずれかに対するＢ細胞の消失率（％）として表される。
【０２３０】
好ましい実施形態において、変異体はＢ細胞を親ポリペプチドよりも効率的に消失させることができる。変異体は、Ｂ細胞を、例えば、約２倍以上、好ましくは約５倍以上消失させることができる。また、変異体は、Ｂ細胞の消失についてより高い能力を示すことができる。例えば、変異体は、親ポリペプチドと同じ割合のＢ細胞を消失させるが、約１／５、好ましくは約１／１０の抗体しか用いる必要がない。変異体に媒介される標的細胞の消失は、親ポリペプチドと比べ、約５倍〜約１００倍、好ましくは約５倍〜約１０００倍に増大している。
【０２３１】
本発明の変異体は、インビボでもスクリーニングすることができる。任意のタイプのインビボアッセイを用いることができる。１つのタイプのアッセイの具体例について以下に示す。本例に示したアッセイにより、Ｆｃ変異体のインビボでの臨床前評価が可能になる。テストされる変異体は、何らかの活性を有することが知られている特定の抗体のＦｃ領域に取り込まれていてもよい。例えば、変異体を抗ＣＤ２０  ＩｇＧのＦｃ領域に、変異誘発法により組み込むことができる。これにより、親ＩｇＧ及びＦｃ変異性ＩｇＧをＲＩＴＵＸＡＮ（腫瘍の縮小を促進することが知られている）と直接比較することが可能になる。臨床前評価は、２つのフェーズ（薬物動態フェーズ及び薬力学フェーズ）により行うことができる。第１フェーズの薬物動態試験の目標は、Ｆｃ領域変異性ＩｇＧ及びインビボ活性が既知の抗体（例えば、ＲＩＴＵＸＡＮ）との間で、排出速度が相違するか否かを決定することである。排出速度が異なると、血清中のＩｇＧの定常状態レベルが異なる。かくして、定常状態濃度の相違が検出された場合には、正確な比較が可能なように規格化しなければならない。第２フェーズの薬力学試験の目標は、Ｆｃ変異体の、この場合には腫瘍の成長に及ぼす効果を決定することである。ＲＩＴＵＸＡＮを用いた過去の試験では、単回投与が用いられ腫瘍の成長を完全に阻害した。この試験では定量的な違いを測定できないため、容量範囲を用いる必要がある。
【０２３２】
第１フェーズでのＦｃ変異体、野生型の親Ｆｃ、及びＲＩＴＵＸＡＮの薬物動態の比較は、次の方法により行われる。まず、動物１頭あたり４０μｇを静脈注射し、ＩｇＧの血漿中濃度を、０、０．２５、０．５、１、２４、４８、７２、９６、１２０、１６８、及び３３６時間後に定量する。データを、例えば、ゼロ遅延２−コンパートメント薬物動態モデル薬物動態プログラム（ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ）によりフィッティングし、排出速度を用いることができる。排出速度を用いて、次の式により定常状態での血漿内濃度を定義することができる。
Ｃ＝（投与量）／（排出速度×τ）
ここで、τは投与間隔、Ｃは定常状態での血漿内濃度を表す。薬物動態実験は、腫瘍を有しないマウスを、例えば、１つの時間ポイントあたり少なくとも５頭のマウスを用いて行うことができる。
【０２３３】
次のフェーズのために、下記の方法により動物モデルを用いることができる。ＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスの右脇腹の皮下に、１０6個のＲａｊｉ細胞を埋め込む。Ｆｃ変異体、野生型Ｆｃ、及びＲＩＴＵＸＡＮの静脈注入を、埋め込み後すぐに開始し、腫瘍のサイズが直径２ｃｍを超えるまで続行する。毎週月、水、金曜日に、腫瘍の長さ、幅、及び高さをノギスで測定することにより、腫瘍の体積を決定する（腫瘍の体積＝Ｗ×Ｌ×Ｄ）。腫瘍の体積−時間プロットより、薬力学計算のための腫瘍成長速度が得られる。各群毎に、少なくとも約１０頭の動物を用いる必要がある。
【０２３４】
第２フェーズでのＦｃ変異体、野生型の親Ｆｃ、及びＲＩＴＵＸＡＮの薬力学の比較は、次の方法により行われる。文献値に基づき、毎週１０μｇ／ｇのＲＩＴＵＸＡＮは、インビボで完全に腫瘍の成長を阻害する（Ｃｌｙｎｅｓ他，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０００  Ａｐｒ；６（４）：４４３−６，２０００、参照として本明細書に組み込まれる）。したがって、週当たりの用量範囲１０μｇ／ｇ、５μｇ／ｇ、１μｇ／ｇ、０．５μｇ／ｇ、及び０μｇ／ｇについてテストすることができる。腫瘍の成長を５０％阻害する定常状態での血漿中濃度を、定常状態での血漿中濃度及び効果の関係からグラフを用いて決定する。定常状態での血漿中濃度を、上述のように計算することができる。必要ならば、τをそれぞれのＦｃ変異体及びＦｃ野生株について、薬物動態特性に応じて調節し、ＲＩＴＵＸＡＮと同程度の定常状態での血漿中濃度を達成することができる。親ポリペプチド（例えば、Ｆｃ野生株）と比較したＦｃ変異体及びＲＩＴＵＸＡＮの統計的に改善された薬力学値は、一般的にＦｃ変異体の方がインビボで改善された活性を示す。
【０２３５】
Ｆｃ変異体、野生型Ｆｃ、及びＲＩＴＵＸＡＮのさらなる薬力学的比較は、カニクイザルを用いて文献記載の方法（Ｒｅｆｆ他，Ｂｌｏｏｄ，８３，４３５−４４５，１９９４）により行うことができる。末梢Ｂ細胞及びリンパ節Ｂ細胞の消失における用量反応を用いて、静脈投与及び／又は皮下投与されたＦｃ変異体と、野生型Ｆｃ及びＲＩＴＵＸＡＮの相対効果を比較することができる。親ポリペプチド（例えば、Ｆｃ野生株）と比較したＦｃ変異体及びＲＩＴＵＸＡＮの統計的に改善された薬力学値は、一般的にＦｃ変異体の方がインビボで改善された活性を示す。
【０２３６】
さらなる実施形態において、本発明の変異体は、少なくとも２種類の種に対して治療的に有用な変異体が同定されるようにスクリーニングされる。そのような変異体は、本明細書で「複数種拡張変異体」と呼ばれ、特にヒトに対する治療効果を有する変異体の同定に有用であり、動物モデルにおいても有効性を示す（又は有効性を示す傾向がある）。この点で、本発明は、動物モデルのデータが政府の監督官庁（例えば、米国食品医薬品局）に提出した全てのヒトに対する試験結果を強く支持するため、ヒトに対する臨床試験で承認される見通しの高い変異体を同定する方法を提供する。
【０２３７】
ある実施形態において、複数種拡張変異体は、まずヒトエフェクター細胞を用いたＡＤＣＣアッセイを行い、改善された変異体を見出し、次いでマウス、ラット又は非ヒト霊長類エフェクター細胞を用いた第２のＡＤＣＣアッセイを行い、複数種拡張変異体である改善された変異体のサブセットを見出すことにより同定される。ある実施形態において、本発明は、ａ）ｉ）標的細胞、ｉｉ）少なくともＦｃ領域の部分を有する親ポリペプチドの候補変異体で、候補変異体は、Ｆｃ領域において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を含み、候補変異体は、標的細胞に対する細胞傷害を、第１の種（例えばヒト）のエフェクター細胞の存在下で親ポリペプチドよりも効率的に媒介する候補変異体、及びｉｉｉ）第２の種（例えば、マウス、ラット又は非ヒト霊長類）のエフェクター細胞を提供すること、及びｂ）組成物を候補変異体が標的細胞と結合することにより標的細胞に結合した候補変異体を生成させる条件下で標的細胞とインキュベートすること、ｃ）第２の種のエフェクター細胞を、候補変異体が結合した標的細胞を混合すること、及びｄ）候補変異体に媒介された標的細胞に対する細胞傷害を測定することを含む、複数種拡張変異体を同定する方法を提供する。ある実施形態において、該方法は、工程ｅ）候補変異体が第２の種のエフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に標的細胞に対する細胞傷害を媒介するか否かを決定することをさらに含む。ある実施形態において、該方法は、工程ｆ）候補変異体を、第２の種のエフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に標的細胞に対する細胞傷害を媒介する複数種拡張変異体として同定することをさらに含む。好ましい実施形態において、同定された複数種拡張変異体は、その後１又は複数種での動物アッセイによりスクリーニングされる。
【０２３８】
ある実施形態において、複数種拡張変異体は、まずヒトの血液を用いた全血アッセイを行い、改善された変異体を見出し、次いでマウス、ラット又は非ヒト血液を用いた第２の全血アッセイを行い、複数種拡張変異体である改善された変異体のサブセットを見出すことにより同定される。ある実施形態において、本発明は、ａ）ｉ）標的細胞、ｉｉ）少なくともＦｃ領域の部分を有する親ポリペプチドの候補変異体で、候補変異体は、Ｆｃ領域において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を含み、候補変異体は、標的細胞の消失を、第１の種（例えばヒト）のエフェクター細胞の存在下で親ポリペプチドよりも効率的に媒介する候補変異体、及びｉｉｉ）第２の種（例えば、マウス、ラット又は非ヒト霊長類）のエフェクター細胞を提供すること、及びｂ）組成物を候補変異体が標的細胞と結合することにより標的細胞に結合した候補変異体を生成させる条件下で標的細胞とインキュベートすること、ｃ）第２の種のエフェクター細胞を、候補変異体が結合した標的細胞を混合すること、及びｄ）候補変異体に媒介された標的細胞の消失を測定することを含む、複数種拡張変異体を同定する方法を提供する。ある実施形態において、該方法は、工程ｅ）候補変異体が第２の種のエフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に標的細胞の消失を媒介するか否かを決定することをさらに含む。ある実施形態において、該方法は、工程ｆ）候補変異体を、第２の種のエフェクター細胞の存在下で、親ポリペプチドよりも効率的に標的細胞の消失を媒介する複数種拡張変異体として同定することをさらに含む。好ましい実施形態において、同定された複数種拡張変異体は、その後１又は複数種での動物アッセイによりスクリーニングされる。
【０２３９】
ある実施形態において、複数種拡張変異体は、ヒトの成分（例えば、ヒト細胞、ヒトＦｃレセプター）を用いた上述のいずれかのアッセイを行うことにより同定され、改善された変異体を同定し、その後、ヒト以外の成分（例えば、マウス細胞、マウスＦｃレセプター）を用いた同様のアッセイ（あるいは異なるアッセイ）を行う。このようにして、ヒトに基づくアッセイ及び第２の種に基づくアッセイの両者において、上記の基準によくしたがい機能する変異体のサブセットを同定することができる。
【０２４０】
複数種拡張変異体を同定するための方法の例は下記のとおりである。まず、ＩｇＧのＦｃ領域の少なくとも部分をコードする核酸配列を、発現されたアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸が変化するように変異させ、それにより変異体を生成する。この発現されたＩｇＧ変異体は、次いでヒトＰＢＭＣ又はサブセット（例えば、ＮＫ細胞又はマクロファージ）を用いたＡＤＣＣアッセイにより評価される。増大したＡＤＣＣ活性が観測されると、変異体は、マウス又はラットＰＢＭＣを用いた第２のＡＤＣＣアッセイによりスクリーニングされる。あるいは、又はさらに、クローニングされたげっ歯類レセプター又は細胞系に結合する変異体を用いてアッセイを行うことができる。最後に、変異体について、複数種拡張変異体であることを特徴づける、第２のアッセイにおける改善が観測された場合、変異体はマウス又はラットにおいてインビボでスクリーニングされる。
【０２４１】
Ｖ．変異性Ｆｃ領域を含む分子の例
本発明の変異性Ｆｃ領域は、より大きな分子の部分であってもよい。より大きな分子は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二特異性抗体、イムノアドヘシン等であってもよい。このように、本発明の変異性Ｆｃ領域は、広汎な用途を有することは明らかである。
【０２４２】
Ａ．抗体を含む変異性Ｆｃ領域
好ましい実施形態において、変異性Ｆｃ領域を含む分子（例えば、ポリペプチド）は抗体である。抗体を生成する手法は、以下に述べるとおりである。
【０２４３】
（ｉ）抗原の選択及び調製
通常、変異性Ｆｃ領域を含む分子が抗体である場合、抗体は、対象となる抗原に対するものとされる。好ましくは、抗原はポリペプチドであり、疾患又は病気にかかっている哺乳類への抗体の投与は、該哺乳類に対する治療の利益をもたらす。しかし、非ポリペプチド抗原（ガンに関連する糖脂質抗原等；米国特許第５，０９１，１７８号明細書を参照。参照として本明細書に組み込まれる）に対する抗体を用いることもできる。
【０２４４】
抗原の例としては、レニン、ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモン等の成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、リポタンパク質、α−１−アンチトリプシン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、卵胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子（ＴＦ）、及びフォンウィレブラント等の凝固因子、タンパク質Ｃ等の抗凝固因子、心房性ナトリウム利尿因子、肺サーファクタント、ウロキナーゼ又はヒト尿又は組織型プラスミノーゲン活性化因子等（ｔ−ＰＡ）のプラスミノーゲン活性化因子、ボンベシン、トロンビン、造血成長因子、腫瘍壊死因子−α及び−β、エンケファリナーゼ、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｎｏｒｍａｌｌｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−α）、ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン、ミュラー管抑制物質、リラクシンＡ鎖、リラクシンＢ鎖、プロリラクシン、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、β−ラクタマーゼ等の微生物タンパク質、ＤＮａｓｅ、ＩｇＥ、ＣＴＬＡ−４等の細胞傷害Ｔ−リンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ホルモン又は成長因子のレセプター、タンパク質Ａ又はＤ、リウマチ因子、骨誘導性神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニュートロフィン−３、−４、−５、又は−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、又はＮＴ−６）、又は神経成長因子等の神経栄養因子、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）、αＦＧＦ及びβＦＧＦ等の繊維芽細胞増殖因子、内皮成長因子（ＥＧＦ）、ＴＧＦ−１、ＴＧＦ−２、ＴＧＦ−３、ＴＧＦ−４、又はＴＧＦ−５等のＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β、等の形質転換成長因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子−Ｉ及び−ＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）、ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９及びＣＤ２０等のＣＤタンパク質、エリスロポイエチン、骨誘導因子、イムノトキシン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インターフェロン−α、−β、及び−γ等のインターフェロン、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ等のコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＩＬ−１からＩＬ−１０までのインターロイキン（ＩＬ）、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｔ−細胞レセプター、表面膜タンパク質、分解促進因子、例えばＡＩＤＳエンベロープの部分等のウィルス性抗原、輸送タンパク質、ホーミングレセプター、アドレシン、調節タンパク質、ＣＤ１１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４及びＶＣＡＭ等のインテグリン、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４レセプター等のガン関連抗原、アポトーシス経路の構成分子、及び上述のポリペプチドのフラグメント等の分子を含むがこれらに限定されない。
【０２４５】
好ましい抗原としては、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ３４及び等のＣＤタンパク質、ＥＧＦレセプター、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４レセプター等のＥｒｂＢレセプターファミリー、ＬＦＡ−１、Ｍａｃ１、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、ａ４／ｐ７インテグリン、及びサブユニットの一方又は両方（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、又は抗ＣＤ１１ｂ抗体）を含むＸｖ／ｐ３インテグリン等の細胞接着分子、ＶＥＧＦ等の成長因子、組織因子（ＴＦ）、αインターフェロン（α−ＩＦＮ）、ＩＬ−８等のインターロイキン、ＩｇＥ、血液型抗原、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプター、肥満（ＯＢ）レセプター、ｍｐｌレセプター、ＣＴＬＡ−４、タンパク質Ｃ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４６】
必要に応じて他の分子と結合した可溶性の抗原又はそのフラグメントを、抗体を形成するための抗原として用いることができる。レセプター、それらのフラグメント（例えば、レセプターの膜貫通領域）等の膜貫通分子を抗原として用いることができる。あるいは、膜貫通分子を発現している細胞を抗原として用いることができる。そのような細胞は、天然の供給源（例えば、ガン細胞系）から誘導することであってもよく、又は組み換え手法により膜貫通タンパク質を発現させてもよい。抗体を調製するのに有用な他の抗原及びその型は、当業者にとって明らかである。
【０２４７】
（ｉｉ）ポリクローナル抗体
本発明は、変異性Ｆｃ領域を有するポリクローナル抗体を提供する。例えば、改変されたＧ１定常領域を含むヒト免疫グロブリンレパートリーを、免疫グロブリンを不活性化されたマウスに移植し、改変されたＦｃ領域を含むＩｇＧレパートリーを発現したマウスを得ることができる（例えば、Ｍｅｎｄｅｚ，ＭＪ他，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６（１９９７）（参照として本明細書に組み込まれる）を参照）。ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連抗原及びアジュバントの頻回皮下注射（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射により動物内で発現する。関連抗原を、免疫する種に対する免疫原性を有するタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビター）に、二官能性又は誘導化剤（例えば、システイン残基で結合させる場合のマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル、リジン残基で結合させる場合のＮ−ヒドロキシスクシンイミド、グルタルアルデヒド、スクシニルアルデヒド、ＳＯＣｌ2、又はＲ1Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ及びＲ1は異なるアルキル基を表す））を用いて結合させることは有用である。
【０２４８】
一般的なウサギ又はマウスに対する免疫のプロトコルは、以下のとおりである。動物を抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して、例えば、１００μｇ又は５μｇ（それぞれ、ウサギ及びマウスに対する量）のタンパク質又はコンジュゲートを３倍容の完全フロインドアジュバントと混合し、腹腔内の複数個所に注射することにより免疫する。１ヵ月後、動物を、元の量の１／５又は１／１０の完全フロインドアジュバント中のタンパク質又はコンジュゲートを腹腔内の複数個所に注射し免疫性を高める。７〜１４日後に動物から採血し、血清を抗体力価によりアッセイする。力価が一定値に達するまで動物の免疫性を高める。好ましくは、動物は同一の抗原のコンジュゲートであるが、異なるタンパク質及び／又は異なるクロスリンク試薬により結合させたコンジュゲートにより抗原性を高められる。コンジュゲートは、組み換え細胞の培養により、融合タンパク質として製造することもできる。さらに、ミョウバン等の凝集剤を、免疫応答を高めるために好適に用いることができる。
【０２４９】
（ｉｉｉ）モノクローナル抗体
本発明は、変異性Ｆｃ領域を有するモノクローナル抗体を提供する。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ他，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５，１９７５（参照として本明細書に組み込まれる）に記載の方法）又は組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書（参照として本明細書に組み込まれる）を参照）を含む種々の方法により製造することができる。ハイブリドーマ法では、マウス又はハムスター又はマカクザル等の適当な宿主動物を免疫し、免疫に用いるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する又は産生能を有するリンパ球を誘導する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫してもよい。その後リンパ球を、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する。このようにして調製したハイブリドーマ細胞を接種し、好ましくは未融合の親骨髄腫細胞の生存を阻害する１又は複数の物質を含む適当な培地で培養する。例えば、親骨髄腫細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合には、ハイブリドーマの培地には通常ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻害する。
【０２５０】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、抗体産生細胞を選択することにより、安定した高レベルの抗体の産生を支え、ＨＡＴ培地等の培地に感受性を有する。これらの中で、好ましい骨髄腫細胞系は、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス、の腫瘍から誘導されたもの、及びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２又はＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞等のマウス骨髄腫系である。ヒト骨髄腫細胞及びマウス−ヒトへテロミエローマ細胞系も、ヒトモノクローナル抗体の製造について記載されている（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、参照として本明細書に組み込まれる）。
【０２５１】
ハイブリドーマ細胞を培養する培地は、抗原に対するモノクローナル抗体の産生のためにアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法、又は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）若しくは酵素共役免疫結合アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等のインビトロ結合アッセイによって決定される。ハイブリドーマ細胞が、所望の特異性、親和性及び／又は活性を有する抗体を産生することが同定されると、クローンは、限界希釈法によりサブクローンし、標準培地で培養することができる。この目的に好適な培地は、例えば、Ｄ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地である。さらに、ハイブリドーマ細胞は、インビボで、動物の腹水ガン細胞として培養することができる。サブクローンから分泌されるモノクローナル抗体は、培地、腹水、又は血清から、例えば、プロテインＡセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製法により好適に分離される。
【０２５２】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来法（例えば、モノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブの使用）により容易に単離及び配列決定することができる。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源としての機能を果たす。一旦単離されると、ＤＮＡを発現ベクターに組み込むことができ、その後、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞等の、他の免疫グロブリンを産生しない宿主細胞にトランスフェクトし、組み換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成物を得る。組み換え法による抗体の産生については、以下により詳細に説明する。
【０２５３】
ある実施形態において、抗体又は抗体のフラグメントは、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ他，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載の手法を用いて生成された抗体ファージライブラリーから単離される。Ｃｌａｃｋｓｏｎ他，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ他，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）には、それぞれ、マウス及びヒト抗体のファージライブラリーを用いた単離について記載されている。下記の文献には、チェーンシャフリング（Ｍａｒｋｓ他，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２））、また、組み合わせ感染及びインビボ組み換えを、非常に大きいファージライブラリーを構築するための戦略として用いた高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生（例えば、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ他，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３））について記載されている。このように、これらの手法及び同様の手法は、モノクローナル抗体の単離のための従来の抗体ハイブリドーマ法の、実行可能な代替技術である。
【０２５４】
また、ＤＮＡは、例えば、相同なマウスの配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常領域をコードする配列を用いること（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書及びＭｏｒｒｉｓｏｎ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４）、これらは共に参照として本明細書に組み込まれる）、又は免疫グロブリンをコードする配列に、非免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列の全部又は部分を共有結合させることにより修飾することができる。
【０２５５】
通常、そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常領域の代わりに用いられ、又は、それらは、抗体の１つの抗原結合部位の可変領域の代わりに用いられ、キメラ抗原及び異なる抗原に対する特異性を有する他の抗原結合部位に対する特異性を有する１つの抗原結合部位を含む二価抗体が生成される。
【０２５６】
（ｉｖ）ヒト化抗体及びヒト抗体
本発明は、変異性Ｆｃ領域を有するヒト化抗体及びヒト抗体を提供する。好ましい実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列と共にヒト抗体由来でないアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、ヒト化抗体中のヒト配列はフレームワーク領域（ＦＲ）を含み、ヒト配列由来でない配列又は残基は、１又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【０２５７】
ＦＲ及びＣＤＲは、重鎖及び軽鎖可変領域におけるアミノ酸残基の番号づけに基づいて定義可能であることは注目すべきである。「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」という用語は、重鎖及び軽鎖の両者のポリペプチドの可変領域においてみられる非連続な抗原結合部位を意味する。これらの領域は、Ｋａｂａｔら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９−６６１６（１９７７）及びＫａｂａｔ他，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９９１）；以下「Ｋａｂａｔ」という）、Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；以下「Ｃｈｏｔｈｉａ」という）、及びＭａｃＣａｌｌｕｍら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６）；以下「ＭａｃＣａｌｌｕｍ」という）により定義され、これらの定義を互いに比較すると、重複やアミノ酸残基のサブセットが含まれる。それでもなお、これらの全ての定義を、単独で（例えば、Ｋａｂａｔの定義を）、あるいは組み合わせて（あくまで例示であるが、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせ）用いることにより、抗体（ヒト化抗体を含む）のＣＤＲを定義することは、本明細書での用語の定義及び使用の範囲内に含まれる。上述のそれぞれの参照によって定義される、ＣＤＲに含まれるアミノ酸残基を、比較のために表６に示す。
【０２５８】
2008502590.tif 000003
【０２５９】
また、「フレームワーク」という用語は、抗体可変領域について使用される場合、抗体可変領域内に含まれるがＣＤＲの外にある全てのアミノ酸残基を意味する。したがって、可変領域フレームワークは、約１００〜１２０アミノ酸の長さを有するが、ＣＤＲの外に存在するアミノ酸のみを指す。「フレームワーク領域」という用語は、ＣＤＲにより隔てられたそれぞれのフレームワークのドメインを意味する。したがって、Ｋａｂａｔの定義による重鎖可変領域及びＣＤＲの具体例として、フレームワーク領域１（ＦＲ１）は、アミノ酸１〜３０を含む可変領域のドメインに相当し、フレームワーク領域２（ＦＲ２）は、アミノ酸３６〜４９を含む可変領域のドメインに相当し、フレームワーク領域３（ＦＲ３）は、アミノ酸６６〜９４を含む可変領域のドメインに相当し、フレームワーク領域４（ＦＲ４）は、アミノ酸１０３から可変領域のＣ末端までを含む可変領域のドメインに相当する。軽鎖可変領域ぬおけるフレームワーク領域も、同じようにそれぞれの軽鎖可変領域のＣＤＲによって隔てられている。同様に、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＭａｃＣａｌｌｕｍによるＣＤＲの定義又はそれらのＣＤＲの定義の任意の組み合わせを用いて、フレームワークの境界はＣＤＲによって上述のようにして区分される。ＣＤＲについて複数の定義が存在するが、Ｋａｂａｔの定義によりＣＤＲを定義するのが好ましい。
【０２６０】
ヒト化抗体中のヒト抗体に由来しない残基は、他の種（マウスが含まれるが、これに限定されない）から導入された、又は派生したものであってよく、あるいは、これらの配列は（例えば、ランダム化された核酸配列から生成された）ランダムアミノ酸配列であってもよく、これらは、ヒト化抗体配列に挿入される。上述したように、ヒト化抗体中のヒトアミノ酸配列は、好ましくは、フレームワーク領域であり、ヒト抗体由来でない残基は、（他の種から誘導されたものであれ、ランダムアミノ酸配列であれ）好ましくは、ＣＤＲに相当する。しかし、ある実施形態において、１又は複数のフレームワーク領域は、１又は複数の非ヒト由来アミノ酸配列を含んでいてもよい。他のヒトフレームワークへの改変又は修飾（例えば、非ヒト由来残基の導入）の場合、改変又は修飾されたフレームワーク領域を、他の種由来の修飾されたＣＤＲ又はランダムＣＤＲ配列に隣接させることが可能であるが、他の実施形態において、改変されたフレームワーク領域は、他の種由来の改変されたＣＤＲ配列又はランダムＣＤＲ配列に隣接しない。ある実施形態において、ヒト化抗体のフレームワーク配列は、完全にヒト由来（ヒトフレームワークに対するフレームワークの変更は行われない）である。好ましい実施形態において、ヒト化抗体のフレームワーク配列は、完全にヒト生殖細胞系由来（ヒト生殖細胞系フレームワークに対するフレームワークの変更は行われない）である。
【０２６１】
他の種由来の非ヒトアミノ酸残基、又はランダム配列は、しばしば「インポート」残基と呼ばれ、通常「インポート」可変領域から取り込まれる。ヒト化は、基本的にＷｉｎｔｅｒらの方法（例えば、Ｊｏｎｅｓ他，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ他，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）、これらは全て参照として本明細書に組み込まれる）にしたがい、ヒト抗体の対応するＣＤＣ配列を、げっ歯類（又は他の哺乳類）のＣＤＲ又はＣＲＣ配列に置換することにより行われる。また、完全なヒト可変領域よりもはるかに短い部分が、非ヒト種由来の対応する配列によって置換された抗体を生成することもできる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書、参照として本明細書に組み込まれる）。実際に、ヒト化抗体は、通常、いくつかのＣＤＲ残基及び可能ならばいくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体の対応する部位によって置換され、又は、上述のように、ＣＤＲ配列がランダム配列によって置換されたヒト抗体である。非限定的な例示に過ぎないが、ドナーＣＤＲの抗体アクセプター可変領域フレームワークへの結合親和性を比較する方法が、ＷＯ０１／２７１６０号国際公開広報（参照として本明細書に組み込まれる）、及び米国特許出願０９／４３４，８７０及び０９／９８２，４６４号明細書に記載されている。これらは全て参照として本明細書に組み込まれる。
【０２６２】
ヒト可変領域（重鎖及び軽鎖）を、ヒト化抗体の作成のために選択することは、免疫原性の減少のために重要である。いわゆる「ベストフィット」法によると、ヒト化するげっ歯類抗体の可変領域の配列は、既知のヒト可変領域配列の全ライブラリーに対してスクリーニングされる。げっ歯類配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク（ＦＲ）として採用する（例えば、Ｓｉｍｓ他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３），及びＣｈｏｔｈｉａ他，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７）、これらは全て参照として本明細書に組み込まれる）。他の方法においては、特定の軽鎖及び重鎖のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列から誘導された特定のフレームワークを用いる。同一のフレームワーク法を、いくつかの異なるヒト化抗体に用いることができる（例えば、Ｃａｒｔｅｒ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）、これらは共に参照として本明細書に組み込まれる）。
【０２６３】
他の実施形態において、特定のヒト抗体フレームワークを「予備選択」する必要はない（最も相同性が高いヒトフレームワーク又はヒト化のある候補抗体と配列の同一性を有する配列を選択する必要がない）。これらの実施形態において、共通又は万能ヒトフレームワークを、１又は複数の非ヒトＣＤＲを受容するために用いることができる。好ましい実施形態において、１つの普遍的完全ヒトフレームワークを、候補抗体のフレームワーク配列との相同性に関わりなく、ヒト化される全ての抗体のフレームワークとして用いられる。このように、フレームワーク領域に改変を施さずにヒト化抗体を生成させることができる。この普遍的完全ヒトフレームワークは、１又は複数のＣＤＲ配列を受容することができる。１つの実施形態において、１又は複数のＣＤＲ配列は、他の種に由来する完全な抗体中の対応するＣＤＲと比べ修飾されている他の種（例えば、マウス又はネコ）に由来する抗体のＣＤＲ配列である（ＣＤＲの導入及び普遍的ヒトフレームワークに導入されたＣＤＲの修飾が同時である）。１又は複数のアミノ酸に対応する修飾は、他の種に由来する完全な抗体中の対応するＣＤＲと比べて（修飾されたＣＤＲにおいて）変化する。１つの実施形態において、ＣＤＲ中の全てのアミノ酸残基はライブラリーに含まれるが、他の実施形態においては、ＣＤＲのアミノ酸残基の全てがライブラリーに含まれるわけではない。他の実施形態において、１又は複数のＣＤＲ配列は、ＣＤＲ配列を置換するランダム配列である。
【０２６４】
好ましい実施形態において、抗体は、抗原に対する高い親和性及び他の好ましい生物学的性質を保持したままヒト化される。ある実施形態において、ヒト化抗体の抗原に対する親和性は、対応する非ヒト化抗体、完全抗体又はそれらのフラグメント又は部分（例えば、げっ歯類候補抗体）の親和性よりも高い。この点において、ある実施形態において、ヒト化抗体は親配列の分析の過程で、親配列及びヒト化配列の３次元モデルを用いた種々の仮想的なヒト化抗体により調製される。３次元免疫グロブリンモデルは広く入手可能であり、当業者によく知られている。可能性のある候補免疫グロブリン配列のコンホメーションの３次元構造を図示し表示するコンピュータープログラムが入手可能である。これらの表示を検討することにより、候補免疫グロブリン配列の機能において残基が果たす可能性のある役割の解析、例えば、候補免疫グロブリンが抗原に結合する能力に影響を与える残基の解析が可能になる。このようにして、ＦＲ残基をレシピエントから選択し、組み合わせることができ、標的に対する増大した親和性等の所望の抗体特性インポート配列が得られる。一般的に、ＣＤＲ残基は直接的及び最も実質的に、抗原への結合に関与している。
【０２６５】
当業者によく知られた種々の具体的な方法を用いて、抗体ＣＤＲ（又は抗体ＣＤＲの代わりにランダム配列）を抗体フレームワークに導入することができる（例えば、米国特許出願０９／４３４，８７９号及び０９／９８２，４６４号参照）。ある実施形態において、重複オリゴヌクレオチドを抗体遺伝子又はその部分（例えば、ヒト化抗体をコードする遺伝子）の合成に用いることができる。他の実施形態において、抗体テンプレートの変異発現は、Ｋｕｎｋｅｌらの方法（上掲）により、例えば、修飾ＣＤＲ又はランダム配列をＣＤＲの代わりに用いることにより行うことができる。ある実施形態において、軽鎖及び重鎖可変領域を別個にヒト化し、その後ヒト化可変領域として共発現させる。他の実施形態において、ヒト化可変領域は、完全抗体の可変領域を形成する。ある実施形態において、ヒト化可変領域を含む完全抗体のＦｃ領域は修飾を受けている（例えば、少なくとも１つのアミノ酸の修飾をＦｃ領域において受けている）。例えば、ランダム化ＣＤＲによってヒト化され、フレームワークについて改変を受けていない抗体は、Ｆｃ領域において少なくとも１つのアミノ酸の修飾を含んでいてもよい。
【０２６６】
他の実施形態において、内在性の免疫グロブリン産生能を有しておらず、免疫するとヒト抗体の完全なレパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物（マウス等）を用いる。例えば、キメラマウス又は生殖細胞系変異マウスにおいて、抗体の重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子の同型欠失により、内在性抗体の産生は完全に阻害されることが記述されている。ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイをそのような生殖細胞系変異マウスに導入すると、抗原の攻撃に対しヒト抗体を産生する（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３），及びＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ他，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５-２５８（１９９３），これらは共に参照として本明細書に組み込まれる）。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーからも誘導することができる。（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ他，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１），及びＶａｕｇｈａｎ他，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １４：３０９（１９９６），これらは共に参照として本明細書に組み込まれる。
【０２６７】
本発明は、少なくとも１つのアミノ酸の修飾を（親Ｆｃ領域を有するポリペプチドと比べて）Ｆｃ領域に含むヒト化抗体（及び抗体のフラグメント）を産生する方法を提供する。そのようなヒト化抗体を生成する他の方法について以下に述べる。本発明はまた、これらの方法により生成された抗体及び抗体のフラグメント組成物を提供する。以下に述べるヒト化方法、及び（例えば、上述の）他のヒト化方法を本発明のＦｃ変異体と組み合わせることができることは重要である。こうして、改変された独自のＦｃ領域を有するヒト化抗体が、本発明にしたがって構築される。
【０２６８】
ある実施形態において、改変された重鎖可変領域をコードする核酸の集団を構築する方法が提供され、該方法は、Ａ）ドナーの重鎖可変領域の配列を含み、該ドナーの可変領域はｉ）フレームワーク領域、及びｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される３つの相補性決定領域を含む、第１の参照配列、及びフレームワーク領域を含むアクセプターの重鎖可変領域の配列を含む第２の参照配列について、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供すること、Ｂ）ａ）アクセプターの重鎖可変領域中のフレームワーク領域の部分をコードする第１のオリゴヌクレオチドで、該フレームワーク領域の部分は、第２の参照配列と比較すると修飾を受けていない、第１のオリゴヌクレオチド、及びｂ）第２のオリゴヌクレオチドの集団で、それぞれ、ｉ）修飾された第１の相補性決定領域の少なくとも部分で、該第１の相補性決定領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３よりなる群から選択され、該修飾された第１の相補性決定領域は、第１の参照配列中の対応するドナーの相補性決定領域と比べて、１又は複数の部位に異なるアミノ酸を含む、及びｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、フレームワーク領域の１又は複数の修飾を受けていない部分をコードする、第２のオリゴヌクレオチドの集団、を合成すること、Ｃ）第１のオリゴヌクレオチドを第２のオリゴヌクレオチドの集団と混合し、重複オリゴヌクレオチドを生成させること、及びＤ）重複オリゴヌクレオチドを、改変された重鎖可変領域の集団をコードする核酸が構築され、該改変された重鎖可変領域をコードする核酸にコードされたフレームワーク領域は、第２の参照配列に対して修飾を受けていないような条件下で処理することを含む。
【０２６９】
ある実施形態において、第１及び第２の参照配列の表現は、電子的な形態をとる。ある実施形態において、該方法は、さらに工程Ｅ）改変された重鎖可変領域をコードする核酸の集団を、軽鎖可変領域をコードする核酸と共発現させ、改変されたヘテロメリックな可変領域の多様な集団を産生することをさらに含む。ある実施形態において、合成は化学合成を含む。ある実施形態において、アクセプターはヒトである。ある実施形態において、工程Ｄ）における処理は、ポリメラーゼによる伸長を含む。
【０２７０】
他の実施形態において、改変された軽鎖可変領域をコードする核酸の集団を構築する方法が提供され、該方法は、Ａ）ドナーの軽鎖可変領域の配列を含み、該ドナーの可変領域はｉ）フレームワーク領域、及びｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される３つの相補性決定領域を含む、第１の参照配列、及びフレームワーク領域を含むアクセプターの軽鎖可変領域の配列を含む第２の参照配列について、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供すること、Ｂ）ａ）アクセプターの軽鎖可変領域中のフレームワーク領域の部分をコードする第１のオリゴヌクレオチドで、該フレームワーク領域の部分は、第２の参照配列と比較すると修飾を受けていない、第１のオリゴヌクレオチド、及びｂ）第２のオリゴヌクレオチドの集団で、それぞれ、ｉ）修飾された第１の相補性決定領域の少なくとも部分で、該第１の相補性決定領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３よりなる群から選択され、該修飾された第１の相補性決定領域は、第１の参照配列中の対応するドナーの相補性決定領域と比べて、１又は複数の部位に異なるアミノ酸を含む、及びｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、フレームワーク領域の１又は複数の修飾を受けていない部分をコードする、第２のオリゴヌクレオチドの集団、を合成すること、Ｃ）第１のオリゴヌクレオチドを第２のオリゴヌクレオチドの集団と混合し、重複オリゴヌクレオチドを生成させること、及びＤ）重複オリゴヌクレオチドを、改変された軽鎖可変領域の集団をコードする核酸が構築され、該改変された軽鎖可変領域をコードする核酸にコードされたフレームワーク領域は、第２の参照配列に対して修飾を受けていないような条件下で処理することを含む。
【０２７１】
ある実施形態において、第１及び第２の参照配列の表現は、電子的な形態をとる。ある実施形態において、該方法は、さらに工程Ｅ）改変された軽鎖可変領域をコードする核酸の集団を、重鎖可変領域をコードする核酸と共発現させ、改変されたヘテロメリックな可変領域の多様な集団を産生することをさらに含む。ある実施形態において、合成は化学合成を含む。ある実施形態において、アクセプターはヒトである。ある実施形態において、工程Ｄ）における処理は、ポリメラーゼによる伸長を含む。
【０２７２】
ある実施形態において、改変された重鎖可変領域をコードする核酸の集団を構築する方法が提供され、該方法は、Ａ）ドナーの重鎖可変領域の配列を含み、該ドナーの可変領域はｉ）フレームワーク領域、及びｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される３つの相補性決定領域を含む、第１の参照配列、及びフレームワーク領域を含むアクセプターの重鎖可変領域の配列を含む第２の参照配列について、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供すること、Ｂ）ａ）それぞれ、修飾された第１の相補性決定領域の少なくとも部分をコードする第１のオリゴヌクレオチドの集団で、該第１の相補性決定領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３よりなる群から選択され、該修飾された第１の相補性決定領域は、第１の参照配列中の対応するドナーの相補性決定領域と比べて、１又は複数の部位に異なるアミノ酸を含む、第１のオリゴヌクレオチドの集団、及びｂ）第２のオリゴヌクレオチドで、ｉ）アクセプターの重鎖可変領域中のフレームワーク領域の部分で、該フレームワーク領域の部分は、第１の参照配列と比較すると修飾を受けていない、及びｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、フレームワーク領域の１又は複数の修飾を受けていない部分をコードする、第２のオリゴヌクレオチド、を合成すること、Ｃ）第１のオリゴヌクレオチドの集団を第２のオリゴヌクレオチドと混合し、重複オリゴヌクレオチドを生成させること、及びＤ）重複オリゴヌクレオチドを、改変された重鎖可変領域の集団をコードする核酸が構築され、該改変された重鎖可変領域をコードする核酸にコードされたフレームワーク領域は、第２の参照配列に対して修飾を受けていないような条件下で処理することを含む。
【０２７３】
ある実施形態において、第１及び第２の参照配列の表現は、電子的な形態をとる。ある実施形態において、該方法は、さらに工程Ｅ）改変された重鎖可変領域をコードする核酸の集団を、軽鎖可変領域をコードする核酸と共発現させ、改変されたヘテロメリックな可変領域の多様な集団を産生することをさらに含む。ある実施形態において、合成は化学合成を含む。ある実施形態において、アクセプターはヒトである。ある実施形態において、工程Ｄ）における処理は、ポリメラーゼによる伸長を含む。
【０２７４】
他の実施形態において、改変された軽鎖可変領域をコードする核酸の集団を構築する方法が提供され、該方法は、Ａ）ドナーの軽鎖可変領域の配列を含み、該ドナーの可変領域はｉ）フレームワーク領域、及びｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される３つの相補性決定領域を含む、第１の参照配列、及びフレームワーク領域を含むアクセプターの軽鎖可変領域の配列を含む第２の参照配列について、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供すること、Ｂ）ａ）それぞれ、修飾された第１の相補性決定領域の少なくとも部分をコードする第１のオリゴヌクレオチドの集団で、該第１の相補性決定領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３よりなる群から選択され、該修飾された第１の相補性決定領域は、第１の参照配列中の対応するドナーの相補性決定領域と比べて、１又は複数の部位に異なるアミノ酸を含む、第１のオリゴヌクレオチドの集団、及びｂ）第２のオリゴヌクレオチドで、ｉ）アクセプターの軽鎖可変領域中のフレームワーク領域の部分で、該フレームワーク領域の部分は、第１の参照配列と比較すると修飾を受けていない、及びｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、フレームワーク領域の１又は複数の修飾を受けていない部分をコードする、第２のオリゴヌクレオチド、を合成すること、Ｃ）第１のオリゴヌクレオチドの集団を第２のオリゴヌクレオチドと混合し、重複オリゴヌクレオチドを生成させること、及びＤ）重複オリゴヌクレオチドを、改変された軽鎖可変領域の集団をコードする核酸が構築され、該改変された軽鎖可変領域をコードする核酸にコードされたフレームワーク領域は、第２の参照配列に対して修飾を受けていないような条件下で処理することを含む。
【０２７５】
ある実施形態において、第１及び第２の参照配列の表現は、電子的な形態をとる。ある実施形態において、該方法は、さらに工程Ｅ）改変された軽鎖可変領域をコードする核酸の集団を、重鎖可変領域をコードする核酸と共発現させ、改変されたヘテロメリックな可変領域の多様な集団を産生することをさらに含む。ある実施形態において、合成は化学合成を含む。ある実施形態において、アクセプターはヒトである。ある実施形態において、工程Ｄ）における処理は、ポリメラーゼによる伸長を含む。
【０２７６】
他の実施形態において、改変された重鎖可変領域をコードする核酸の集団を構築する方法が意図され、該方法は、ａ）ドナーの重鎖可変領域の配列を含み、該ドナーの可変領域はｉ）フレームワーク領域、及びｉｉ）３つの相補性決定領域を含む、第１の参照配列、及びフレームワーク領域を含むアクセプターの軽鎖可変領域の配列を含む第２の参照配列について、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供すること、ｂ）改変された重鎖可変領域抗体遺伝子配列の集団で、該改変された重鎖可変領域のフレームワーク領域は、第２の参照配列のフレームワーク領域と同一であり、改変された重鎖可変領域の少なくとも第１のＣＤＲは修飾されており、該修飾された第１のＣＤＲは、対応するドナーの第１の参照配列中のＣＤＲと比較した場合、１又は複数の位置に異なるアミノ酸を含む、可変領域抗体遺伝子配列の集団を合成することを含む。
【０２７７】
ある実施形態において、第１及び第２の参照配列の表現は、電子的な形態をとる。ある実施形態において、該方法は、さらに工程Ｅ）改変された重鎖可変領域をコードする核酸の集団を、軽鎖可変領域をコードする核酸と共発現させ、改変されたヘテロメリックな可変領域の多様な集団を産生することをさらに含む。ある実施形態において、アクセプターはヒトである。ある実施形態において、合成は重複オリゴヌクレオチドを使用することを含む。ある実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの定義により定義される。
【０２７８】
ある実施形態において、改変された軽鎖可変領域をコードする核酸の集団を構築する方法が意図され、該方法は、ａ）ドナーの軽鎖可変領域の配列を含み、該ドナーの可変領域はｉ）フレームワーク領域、及びｉｉ）３つの相補性決定領域を含む、第１の参照配列、及びフレームワーク領域を含むアクセプターの軽鎖可変領域の配列を含む第２の参照配列について、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供すること、ｂ）改変された軽鎖可変領域抗体遺伝子配列の集団で、該改変された重鎖可変領域のフレームワーク領域は、第２の参照配列のフレームワーク領域と同一であり、改変された軽鎖可変領域の少なくとも第１のＣＤＲは修飾されており、該修飾された第１のＣＤＲは、対応するドナーの第１の参照配列中のＣＤＲと比較した場合、１又は複数の位置に異なるアミノ酸を含む、可変領域抗体遺伝子配列の集団を合成することを含む。
【０２７９】
ある実施形態において、第１及び第２の参照配列の表現は、電子的な形態をとる。ある実施形態において、該方法は、さらに工程Ｅ）改変された軽鎖可変領域をコードする核酸の集団を、重鎖可変領域をコードする核酸と共発現させ、改変されたヘテロメリックな可変領域の多様な集団を産生することをさらに含む。ある実施形態において、アクセプターはヒトである。ある実施形態において、合成は重複オリゴヌクレオチドを使用することを含む。
【０２８０】
さらに他の実施形態において、改変された重鎖可変領域をコードする核酸の集団を構築する方法が意図され、該方法は、参照アミノ酸配列の表現で、該参照配列は、フレームワーク領域を含むアクセプターの重鎖可変領域の配列を含む、参照アミノ酸配列の表現を提供すること、ｂ）改変された重鎖可変領域抗体遺伝子配列の集団で、該改変された重鎖可変領域のフレームワーク領域は、参照配列のフレームワーク領域と同一であり、改変された抗体重鎖可変領域の少なくとも第１のＣＤＲはランダムアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域抗体遺伝子配列の集団を合成することを含む。
【０２８１】
ある実施形態において、参照配列の表現は、電子的な形態をとる。ある実施形態において、該方法は、さらに工程Ｅ）改変された重鎖可変領域をコードする核酸の集団を、軽鎖可変領域をコードする核酸と共発現させ、改変されたヘテロメリックな可変領域の多様な集団を産生することをさらに含む。ある実施形態において、アクセプターはヒトである。ある実施形態において、合成は重複オリゴヌクレオチドを使用することを含む。ある実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの定義により定義される。
【０２８２】
他の実施形態において、改変された軽鎖可変領域をコードする核酸の集団を構築する方法が意図され、該方法は、参照アミノ酸配列の表現で、該参照配列は、フレームワーク領域を含むアクセプターの軽鎖可変領域の配列を含む、参照アミノ酸配列の表現を提供すること、ｂ）改変された軽鎖可変領域抗体遺伝子配列の集団で、該改変された軽鎖可変領域のフレームワーク領域は、ヒト参照配列のフレームワーク領域と同一であり、改変された抗体軽鎖可変領域の少なくとも第１のＣＤＲはランダムアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域抗体遺伝子配列の集団を合成することを含む。
【０２８３】
ある実施形態において、参照配列の表現は、電子的な形態をとる。ある実施形態において、該方法は、さらに工程Ｅ）改変された軽鎖可変領域をコードする核酸の集団を、重鎖可変領域をコードする核酸と共発現させ、改変されたヘテロメリックな可変領域の多様な集団を産生することをさらに含む。ある実施形態において、アクセプターはヒトである。ある実施形態において、合成は重複オリゴヌクレオチドを使用することを含む。ある実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの定義により定義される。
【０２８４】
さらに他の実施形態において、改変された重鎖可変領域をコードする核酸の集団を構築する方法が意図され、該方法は、参照アミノ酸配列の表現で、該参照配列は、フレームワーク領域を含むヒトアクセプターの重鎖可変領域の配列を含む、参照アミノ酸配列の表現を提供すること、ｂ）改変された重鎖可変領域抗体遺伝子配列の集団で、該改変された重鎖可変領域のフレームワーク領域は、参照配列のフレームワーク領域と同一であり、改変された抗体重鎖可変領域の少なくとも第１のＣＤＲはランダムアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域抗体遺伝子配列の集団を合成することを含む。ある実施形態において、参照配列の表現は、電子的な形態をとる。ある実施形態において、該方法は、さらに工程Ｅ）改変された重鎖可変領域をコードする核酸の集団を、軽鎖可変領域をコードする核酸と共発現させ、改変されたヘテロメリックな可変領域の多様な集団を産生することをさらに含む。ある実施形態において、合成は重複オリゴヌクレオチドを使用することを含む。ある実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの定義により定義される。
【０２８５】
他の実施形態において、改変された軽鎖可変領域をコードする核酸の集団を構築する方法が意図され、該方法は、ａ）参照アミノ酸配列の表現で、該参照配列は、フレームワーク領域を含むヒトアクセプターの軽鎖可変領域の配列を含む、参照アミノ酸配列の表現を提供すること、ｂ）改変された軽鎖可変領域抗体遺伝子配列の集団で、該改変された軽鎖可変領域のフレームワーク領域は、ヒト参照配列のフレームワーク領域と同一であり、改変された抗体軽鎖可変領域の少なくとも第１のＣＤＲはランダムアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域抗体遺伝子配列の集団を合成することを含む。
【０２８６】
ある実施形態において、参照配列の表現は、電子的な形態をとる。ある実施形態において、該方法は、さらに工程Ｅ）改変された軽鎖可変領域をコードする核酸の集団を、重鎖可変領域をコードする核酸と共発現させ、改変されたヘテロメリックな可変領域の多様な集団を産生することをさらに含む。ある実施形態において、合成は重複オリゴヌクレオチドを使用することを含む。ある実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの定義により定義される。
【０２８７】
ある実施形態において、１又は複数のフレームワーク領域は、１又は複数の修飾されたＣＤＲの導入により同時に修飾されている。他の実施形態において、修飾されたフレームワークは修飾されたＣＤＲに隣接する。
【０２８８】
ある実施形態において、本発明は、改変された重鎖可変領域をコードする核酸の集団を構築する方法を提供し、該方法は、ａ）ドナーの重鎖可変領域の配列を含み、該ドナーの可変領域はｉ）フレームワーク領域、及びｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される３つの相補性決定領域を含む、第１の参照配列、及びフレームワーク領域を含むアクセプターの重鎖可変領域の配列を含む第２の参照配列について、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供すること、ｂ）ａ）修飾された重鎖可変領域中のフレームワーク領域又はその部分をコードする第１のオリゴヌクレオチドの集団で、該フレームワーク領域又はその部分は、アクセプターのフレームワーク領域の参照配列と比較すると１又は複数の位置に複数の変更されたアミノ酸を含み、変更されたフレームワークの位置は、第１のドナーフレームワークの位置と比較した場合の対応する位置で異なる、参照配列の対応する位置第２の参照配列中のアクセプターのフレームワークの位置から選ばれる、第１のオリゴヌクレオチドの集団、及びｂ）第２のオリゴヌクレオチドの集団で、それぞれ、ｉ）少なくとも１つの修飾された第１の相補性決定領域又はその部分で、該修飾された相補性決定領域又はその部分は、対応するドナーの相補性決定領域のアミノ酸配列と比較すると、１又は複数の位置に異なるアミノ酸を含む、少なくとも１つの修飾された第１の相補性決定領域又はその部分、及びｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドの集団にハイブリダイズすることができる、隣接するフレームワーク領域の１又は複数の部分をコードする、第２のオリゴヌクレオチドの集団を合成すること、ｃ）第１及び第２のオリゴヌクレオチドの集団を混合し、重複オリゴヌクレオチドを生成させること、及びｄ）重複オリゴヌクレオチドを、改変された重鎖可変領域の集団をコードする核酸が構築されるような条件下で処理することを含む。ある実施形態において、第１及び第２の参照配列の表現は、電子的な形態をとる。他の実施形態において、該方法は、さらに工程Ｅ）改変された重鎖可変領域をコードする核酸の集団を、軽鎖可変領域をコードする核酸と共発現させ、改変されたヘテロメリックな可変領域の多様な集団を産生することをさらに含む。さらなる実施形態において、合成は化学合成を含む。ある実施形態において、アクセプターはヒトである。好ましい実施形態において、１又は複数の改変されたヘテロメリックな可変領域の多様な集団は、Ｆｃ領域を含む抗体の部分であり、該Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域を有する親ポリペプチドと比較すると、少なくとも１つのアミノ酸の修飾を含む。
【０２８９】
他の実施形態において、本発明は、改変された軽鎖可変領域をコードする核酸の集団を構築する方法を提供し、該方法は、ａ）ドナーの軽鎖可変領域の配列を含み、該ドナーの可変領域はｉ）フレームワーク領域、及びｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される３つの相補性決定領域を含む、第１の参照配列、及びフレームワーク領域を含むアクセプターの軽鎖可変領域の配列を含む第２の参照配列について、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供すること、ｂ）ａ）修飾された軽鎖可変領域中のフレームワーク領域又はその部分をコードする第１のオリゴヌクレオチドの集団で、該軽鎖可変領域のフレームワーク領域又はその部分は、アクセプターのフレームワーク領域の参照配列と比較すると１又は複数の位置に複数の変更されたアミノ酸を含み、変更されたフレームワークの位置は、第１のドナーフレームワークの位置と比較した場合の対応する位置で異なる、参照配列の対応する位置第２の参照配列中のアクセプターのフレームワークの位置から選ばれる、第１のオリゴヌクレオチドの集団、及びｂ）第２のオリゴヌクレオチドの集団で、それぞれ、ｉ）少なくとも１つの修飾された第１の相補性決定領域又はその部分で、該修飾された相補性決定領域又はその部分は、対応するドナーの相補性決定領域のアミノ酸配列と比較すると、１又は複数の位置に異なるアミノ酸を含む、少なくとも１つの修飾された第１の相補性決定領域又はその部分、及びｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドの集団にハイブリダイズすることができる、隣接するフレームワーク領域の１又は複数の部分をコードする、第２のオリゴヌクレオチドの集団を合成すること、ｃ）第１及び第２のオリゴヌクレオチドの集団を混合し、重複オリゴヌクレオチドを生成させること、及びｄ）重複オリゴヌクレオチドを、改変された軽鎖可変領域の集団をコードする核酸が構築されるような条件下で処理することを含む。他の実施形態において、第１及び第２の参照配列の表現は、電子的な形態をとる。さらなる実施形態において、該方法は、さらに工程ｅ）改変された軽鎖可変領域をコードする核酸の集団を、重鎖可変領域をコードする核酸と共発現させ、改変されたヘテロメリックな可変領域の多様な集団を産生することをさらに含む。
【０２９０】
ある実施形態において、該方法は、ａ）ドナーの重鎖可変領域の配列を含み、該ドナーの可変領域はｉ）フレームワーク領域、及びｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される３つの相補性決定領域を含む、第１の参照アミノ酸配列、及びフレームワーク領域を含むアクセプターの重鎖可変領域の配列を含む第２の参照アミノ酸配列について、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供すること、ｂ）ａ）修飾された重鎖可変領域中のフレームワーク領域又はその部分をコードする第１のオリゴヌクレオチドの集団で、該重鎖可変領域のフレームワーク領域又はその部分は、アクセプターのフレームワーク領域の参照配列と比較すると１又は複数の位置に複数の変更されたアミノ酸を含み、変更されたフレームワークの位置は、第１の参照配列におけるドナーのフレームワークと比較すると、対応する位置で異なっている第２の参照配列におけるアクセプターにおけるフレームワークの位置から選ばれる、第１のオリゴヌクレオチドの集団、及びｂ）第２のオリゴヌクレオチドの集団で、それぞれ、ｉ）少なくとも１つの修飾された第１の相補性決定領域又はその部分で、該修飾された相補性決定領域又はその部分は、対応するドナーの相補性決定領域のアミノ酸配列と比較すると、１又は複数の位置に異なるアミノ酸を含む、少なくとも１つの修飾された第１の相補性決定領域又はその部分、及びｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドの集団にハイブリダイズすることができる、隣接するフレームワーク領域の１又は複数の部分をコードする、第２のオリゴヌクレオチドの集団を合成すること、ｃ）第１及び第２のオリゴヌクレオチドの集団を混合し、重複オリゴヌクレオチドを生成させること、及びｄ）重複オリゴヌクレオチドを、改変された重鎖可変領域の集団をコードする核酸が構築されるような条件下でＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長することを含む。
【０２９１】
さらに他の実施形態において、本発明は、改変された軽鎖可変領域をコードする核酸の集団を構築する方法を提供し、該方法は、ａ）ドナーの軽鎖可変領域の配列を含み、該ドナーの可変領域はｉ）フレームワーク領域、及びｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される３つの相補性決定領域を含む、第１の参照アミノ酸配列、及びフレームワーク領域を含むアクセプターの軽鎖可変領域の配列を含む第２の参照アミノ酸配列について、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供すること、ｂ）ａ）修飾された軽鎖可変領域中のフレームワーク領域又はその部分をコードする第１のオリゴヌクレオチドの集団で、該軽鎖可変領域のフレームワーク領域又はその部分は、アクセプターのフレームワーク領域の参照配列と比較すると１又は複数の位置に複数の変更されたアミノ酸を含み、変更されたフレームワークの位置は、第１の参照配列におけるドナーのフレームワークと比較すると、対応する位置で異なっている第２の参照配列におけるアクセプターにおけるフレームワークの位置から選ばれる、第１のオリゴヌクレオチドの集団、及びｂ）第２のオリゴヌクレオチドの集団で、それぞれ、ｉ）少なくとも１つの修飾された第１の相補性決定領域又はその部分で、該修飾された相補性決定領域又はその部分は、対応するドナーの相補性決定領域のアミノ酸配列と比較すると、１又は複数の位置に異なるアミノ酸を含む、少なくとも１つの修飾された第１の相補性決定領域又はその部分、及びｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドの集団にハイブリダイズすることができる、隣接するフレームワーク領域の１又は複数の部分をコードする、第２のオリゴヌクレオチドの集団を合成すること、ｃ）第１及び第２のオリゴヌクレオチドの集団を混合し、重複オリゴヌクレオチドを生成させること、及びｄ）重複オリゴヌクレオチドを、改変された重鎖可変領域の集団をコードする核酸が構築されるような条件下でＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長することを含む。
【０２９２】
ある実施形態において、１又は複数のフレームワーク領域は、１又は複数の修飾されたＣＤＲの導入により同時に修飾されている。修飾されたＣＤＲは、参照配列中の対応するＣＤＲと比べ１又は複数のアミノ酸の修飾を含んでいてよい。ある実施形態において、改変された重鎖可変領域をコードする核酸の集団を構築する方法は、ａ）ドナーの重鎖可変領域の配列を含み、該ドナーの可変領域はｉ）フレームワーク領域、及びｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される３つの相補性決定領域を含む、第１の参照アミノ酸配列、及びフレームワーク領域を含むアクセプターの重鎖可変領域の配列を含む第２の参照アミノ酸配列について、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供すること、ｂ）ｉ）それぞれ、少なくとも１つの修飾された相補性決定領域をコードする第１のオリゴヌクレオチドの集団で、該修飾された相補性決定領域は、ドナーの相補性決定領域の参照配列と比較すると１又は複数の位置に異なるアミノ酸を含む、第１のオリゴヌクレオチドの集団、及びｉｉ）第２のオリゴヌクレオチドの集団で、重鎖可変領域フレームワークの修飾された部分をコードするオリゴヌクレオチドを含み、修飾を受けた部分は、複数の変更されたアミノ酸をアクセプターフレームワーク参照配列と比べ１又は複数の位置に含み、変更されたフレームワークの位置は、第１の参照配列におけるドナーのフレームワークと比較すると、対応する位置で異なっている第２の参照配列におけるアクセプターにおけるフレームワークの位置から選ばれる、第２のオリゴヌクレオチドの集団を合成すること、ｃ）第１及び第２のオリゴヌクレオチドの集団を、オリゴヌクレオチドの少なくとも部分がハイブリダイズするような条件下で混合し、重複オリゴヌクレオチドを生成させること、及びｄ）重複オリゴヌクレオチドを、改変された重鎖可変領域の集団をコードする核酸が構築されるような条件下で処理することを含む。ある実施形態において、第１及び第２の参照配列の表現は、電子的な形態をとる。さらなる実施形態において、該方法は、さらに工程Ｅ）改変された重鎖可変領域をコードする核酸の集団を、軽鎖可変領域をコードする核酸と共発現させ、改変されたヘテロメリックな可変領域の多様な集団を産生することをさらに含む。さらなる実施形態において、アクセプターはヒトである。
【０２９３】
他の実施形態において、本発明は、改変された軽鎖可変領域をコードする核酸の集団を構築する方法を提供し、該方法は、ａ）ドナーの軽鎖可変領域の配列を含み、該ドナーの可変領域はｉ）フレームワーク領域、及びｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される３つの相補性決定領域を含む、第１の参照アミノ酸配列、及びフレームワーク領域を含むアクセプターの軽鎖可変領域の配列を含む第２の参照アミノ酸配列について、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供すること、ｂ）ｉ）それぞれ、少なくとも１つの修飾された相補性決定領域をコードする第１のオリゴヌクレオチドの集団で、該修飾された相補性決定領域は、ドナーの相補性決定領域の参照配列と比較すると１又は複数の位置に異なるアミノ酸を含む、第１のオリゴヌクレオチドの集団、及びｉｉ）第２のオリゴヌクレオチドの集団で、軽鎖可変領域フレームワークの修飾された部分をコードするオリゴヌクレオチドを含み、修飾を受けた部分は、複数の変更されたアミノ酸をアクセプターフレームワーク参照配列と比べ１又は複数の位置に含み、変更されたフレームワークの位置は、第１の参照配列におけるドナーのフレームワークと比較すると、対応する位置で異なっている第２の参照配列におけるアクセプターにおけるフレームワークの位置から選ばれる、第２のオリゴヌクレオチドの集団を合成すること、ｃ）第１及び第２のオリゴヌクレオチドの集団を、オリゴヌクレオチドの少なくとも部分がハイブリダイズするような条件下で混合し、重複オリゴヌクレオチドを生成させること、及びｄ）重複オリゴヌクレオチドを、改変された軽鎖可変領域の集団をコードする核酸が構築されるような条件下で処理することを含む。
【０２９４】
ある実施形態において、Ｆｃ変異体及び改変された変異領域を含む抗体又は抗体のフラグメントを生成することができる。例えば、ある実施形態において、本発明は、改変された重鎖可変領域をコードする核酸の集団を構築する方法を提供し、該方法は、ａ）ドナーの重鎖可変領域の配列を含み、該ドナーの可変領域はｉ）フレームワーク領域、及びｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される３つの相補性決定領域を含む、第１の参照配列、及びフレームワーク領域を含むアクセプターの軽鎖可変領域の配列を含む第２の参照配列について、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供すること、ｂ）Ａ）アクセプター重鎖可変領域中のフレームワーク領域の部分をコードする第１のオリゴヌクレオチドの集団で、該フレームワーク領域の部分は、第２の参照配列と比較すると修飾を受けていない、第１のオリゴヌクレオチドの集団、及びＢ）第２のオリゴヌクレオチドの集団で、それぞれ、ｉ）修飾された第１の相補性決定領域の少なくとも部分で、該第１の相補性決定領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３よりなる群から選択され、該修飾された第１の相補性決定領域は、第１の参照配列中の対応するドナーの相補性決定領域と比べて、１又は複数の部位に異なるアミノ酸を含む、及びｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、フレームワーク領域の１又は複数の修飾を受けていない部分をコードする、第２のオリゴヌクレオチドの集団、を合成すること、ｃ）第１のオリゴヌクレオチドを第２のオリゴヌクレオチドの集団と混合し、重複オリゴヌクレオチドを生成させること、及びｄ）重複オリゴヌクレオチドを、改変された重鎖可変領域の集団をコードする核酸が構築され、該改変された重鎖可変領域をコードする核酸にコードされたフレームワーク領域は、第２の参照配列に対して修飾を受けていないような条件下で処理することを含む。ある実施形態において、該方法は、さらに工程Ｅ）改変された重鎖可変領域をコードする核酸の集団を、軽鎖可変領域をコードする核酸と共発現させ、改変されたヘテロメリックな可変領域の多様な集団を産生することをさらに含む。
【０２９５】
他の実施形態において、本発明は、改変された軽鎖可変領域をコードする核酸の集団を構築する方法を提供し、該方法は、ａ）ドナーの軽鎖可変領域の配列を含み、該ドナーの可変領域はｉ）フレームワーク領域、及びｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される３つの相補性決定領域を含む、第１の参照配列、及びフレームワーク領域を含むアクセプターの軽鎖可変領域の配列を含む第２の参照配列について、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供すること、ｂ）ａ）アクセプター軽鎖可変領域中のフレームワーク領域の部分をコードする第１のオリゴヌクレオチドの集団で、該フレームワーク領域の部分は、第２の参照配列と比較すると修飾を受けていない、第１のオリゴヌクレオチドの集団、及びＢ）第２のオリゴヌクレオチドの集団で、それぞれ、ｉ）修飾された第１の相補性決定領域の少なくとも部分で、該第１の相補性決定領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３よりなる群から選択され、該修飾された第１の相補性決定領域は、第１の参照配列中の対応するドナーの相補性決定領域と比べて、１又は複数の部位に異なるアミノ酸を含む、及びｂ）第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、フレームワーク領域の１又は複数の修飾を受けていない部分をコードする、第２のオリゴヌクレオチドの集団、を合成すること、ｃ）第１のオリゴヌクレオチドを第２のオリゴヌクレオチドの集団と混合し、重複オリゴヌクレオチドを生成させること、及びｄ）重複オリゴヌクレオチドを、改変された重鎖可変領域の集団をコードする核酸が構築され、該改変された重鎖可変領域をコードする核酸にコードされたフレームワーク領域は、第２の参照配列に対して修飾を受けていないような条件下で処理することを含む。
【０２９６】
他の実施形態において、本発明は、改変された重鎖可変領域をコードする核酸の集団を構築する方法を提供し、該方法は、Ａ）ドナーの重鎖可変領域の配列を含み、該ドナーの可変領域はｉ）フレームワーク領域、及びｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される３つの相補性決定領域を含む、第１の参照配列、及びフレームワーク領域を含むアクセプターの軽鎖可変領域の配列を含む第２の参照配列について、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供すること、Ｂ）ａ）それぞれ、修飾された第１の相補性決定領域の少なくとも部分をコードする第１のオリゴヌクレオチドの集団で、該第１の相補性決定領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３よりなる群から選択され、該修飾された第１の相補性決定領域は、第１の参照配列中の対応するドナーの相補性決定領域と比べて、１又は複数の部位に異なるアミノ酸を含む、第１のオリゴヌクレオチドの集団、及びｂ）第２のオリゴヌクレオチドで、ｉ）アクセプターの重鎖可変領域中のフレームワーク領域の部分で、該フレームワーク領域の部分は、第１の参照配列と比較すると修飾を受けていない、及びｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、フレームワーク領域の１又は複数の修飾を受けていない部分をコードする、第２のオリゴヌクレオチド、を合成すること、Ｃ）第１のオリゴヌクレオチドの集団を第２のオリゴヌクレオチドと混合し、重複オリゴヌクレオチドを生成させること、及びＤ）重複オリゴヌクレオチドを、改変された重鎖可変領域の集団をコードする核酸が構築され、該改変された重鎖可変領域をコードする核酸にコードされたフレームワーク領域は、第２の参照配列に対して修飾を受けていないような条件下で処理することを含む。ある実施形態において、該方法は、さらに工程Ｅ）改変された軽鎖可変領域をコードする核酸の集団を、重鎖可変領域をコードする核酸と共発現させ、改変されたヘテロメリックな可変領域の多様な集団を産生することをさらに含む。
【０２９７】
他の実施形態において、本発明は、改変された軽鎖可変領域をコードする核酸の集団を構築する方法を提供し、該方法は、Ａ）ドナーの軽鎖可変領域の配列を含み、該ドナーの可変領域はｉ）フレームワーク領域、及びｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される３つの相補性決定領域を含む、第１の参照配列、及びフレームワーク領域を含むアクセプターの軽鎖可変領域の配列を含む第２の参照配列について、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供すること、Ｂ）ａ）それぞれ、修飾された第１の相補性決定領域の少なくとも部分をコードする第１のオリゴヌクレオチドの集団で、該第１の相補性決定領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３よりなる群から選択され、該修飾された第１の相補性決定領域は、第１の参照配列中の対応するドナーの相補性決定領域と比べて、１又は複数の部位に異なるアミノ酸を含む、第１のオリゴヌクレオチドの集団、及びｂ）第２のオリゴヌクレオチドで、ｉ）アクセプターの重鎖可変領域中のフレームワーク領域の部分で、該フレームワーク領域の部分は、第１の参照配列と比較すると修飾を受けていない、及びｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、フレームワーク領域の１又は複数の修飾を受けていない部分をコードする、第２のオリゴヌクレオチド、を合成すること、Ｃ）第１のオリゴヌクレオチドの集団を第２のオリゴヌクレオチドと混合し、重複オリゴヌクレオチドを生成させること、及びＤ）重複オリゴヌクレオチドを、改変された軽鎖可変領域の集団をコードする核酸が構築され、該改変された軽鎖可変領域をコードする核酸にコードされたフレームワーク領域は、第２の参照配列に対して修飾を受けていないような条件下で処理することを含む。
【０２９８】
他の実施形態において、本発明は、変異を有するヒト化抗体可変領域の結合親和性を向上させる方法を提供し、該方法は、ａ）第１の変異を有するヒト化抗体可変領域をコードする核酸配列で、該変異可変領域は（ｉ）野生型ヒト抗体フレームワーク、（ｉｉ）３つの非ヒト重鎖相補性決定領域、及び（ｉｉｉ）３つの非ヒト軽鎖相補性決定領域を含み、該相補性決定領域は、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義され、少なくとも１つの軽鎖相補性決定領域は、対応する野生型非ヒト相補性決定領域と比べ少なくとも１つの異なるアミノ酸を少なくとも１つの位置に含む、変異を含む軽鎖相補性決定領域であり、第１の変異を有する抗体可変領域は、対応する変異を有しない抗体可変領域よりも高い結合親和性を有する、第１の変異ヒト化抗体を提供すること、ｂ）第１の変異を有する抗体可変領域コードする核酸配列を、第２の変異を有するヒト化抗体可変領域がコードされるような条件下で変異させることを含み、第２の変異を有するヒト化抗体可変領域は、少なくともさらに１つの異なるアミノ酸を、変異を含む軽鎖相補性決定領域の少なくとも１つの位置に含み、さらなる変異は、最初の変異と共に、より高い結合親和性をもたらす。ある実施形態において、第１の変異を有するヒト化可変領域における変異を含む軽鎖可変領域は、相補性決定領域（ＬＣＤＲ３）である。他の実施形態において、第１の変異を有するヒト化抗体可変領域における少なくとも１つの非ヒト重鎖相補性決定領域は、異なるアミノ酸が、対応する野生型非ヒト相補性決定領域と比べ少なくとも１つの位置でコードされているような変異を含む。さらなる実施形態において、重鎖相補性決定領域はＨＣＤＲ３に存在する。
【０２９９】
ある実施形態において、本発明は、改変された重鎖可変領域をコードする核酸を構築する際に、少なくとも1つの相補性決定領域（ＣＤＲ）及び少なくとも１つのフレームワーク領域（ＦＲ）を同時に修飾する方法を提供し、該方法は、ａ）ドナーの重鎖可変領域の配列を含み、該ドナーの可変領域はｉ）４つのフレームワーク領域、及びｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される３つの相補性決定領域を含む、第１の参照アミノ酸配列、及びＫａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される４つのフレームワーク領域を含むアクセプターの重鎖可変領域の配列を含む第２の参照配列について、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供すること、ｂ）ｉ）修飾を行う全てのフレームワーク領域に対して、それぞれ、修飾されたフレームワーク領域の又はその部分をコードするオリゴヌクレオチドの集団で、該修飾されたフレームワーク領域の又はその部分は、アクセプターの重鎖可変領域参照配列中の対応するフレームワーク領域と比べて、１又は複数の部位に複数の異なるアミノ酸を含む、変更を受けたフレームワーク領域の位置は、第１の参照配列におけるドナーフレームワーク領域の位置に比べ、対応する位置において異なっている第２の参照配列におけるアクセプターのフレームワークの位置から選ばれる、オリゴヌクレオチドの集団、及びｉｉ）修飾を行う全ての相補性決定領域に対して、それぞれ、修飾された相補性決定領域又はその部分をコードするオリゴヌクレオチドの集団で、該修飾された相補性決定領域は、ドナーの対応する相補性決定領域と比べて、１又は複数の部位に複数の異なるアミノ酸を含む、オリゴヌクレオチドの集団、及びｉｉｉ）残りの及び未修飾のフレームワークのいずれかのそれぞれについて、第２の参照配列のアクセプター配列の対応するフレームワーク領域と同一の配列を有する、フレームワーク領域をコードするオリゴヌクレオチド又はその部分、及びｉｖ）残りの及び未修飾の相補性決定領域のいずれかのそれぞれについて、第１の参照配列のアクセプター配列の対応するフレームワーク領域と同一の配列を有する、相補性決定領域をコードするオリゴヌクレオチド又はその部分で、それぞれ重鎖可変領域の隣接する部分をコードするオリゴヌクレオチドｉ）〜ｉｖ）は、それらの末端において重複を有する、オリゴヌクレオチドｉ）〜ｉｖ）を合成すること、及びｃ）工程ｂ）で合成したオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの集団を、それぞれのオリゴヌクレオチドの重複した配列がハイブリダイズし、重複オリゴヌクレオチドを生成するような条件下で混合すること、及びｄ）重複オリゴヌクレオチドを、改変された重鎖可変領域の集団をコードする核酸が構築されるような条件下で処理することを含む。ある実施形態において、参照配列の表現は、電子的な形態をとる。さらなる実施形態において、修飾を受けるフレームワーク領域は、ＨＦＲ１、ＨＦＲ２及びＨＦＲ３からなる群より選ばれる。他の実施形態において、修飾を受ける相補性決定領域はＨＣＤＲ３である。他の実施形態において、該方法は、さらに工程Ｅ）改変された重鎖可変領域をコードする核酸の集団を、軽鎖可変領域をコードする核酸��共発現させ、改変されたヘテロメリックな可変領域の多様な集団を産生することをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、さらに工程Ｅ）改変された重鎖可変領域をコードする核酸の集団を、軽鎖可変領域をコードする核酸の集団と共発現させ、改変されたヘテロメリックな可変領域の多様な集団を産生することをさらに含む。
【０３００】
他の実施形態において、本発明は、改変された軽鎖可変領域をコードする核酸を構築する際に、少なくとも1つの相補性決定領域（ＣＤＲ）及び少なくとも１つのフレームワーク領域（ＦＲ）を同時に修飾する方法を提供し、該方法は、ａ）ドナーの重鎖可変領域の配列を含み、該ドナーの可変領域はｉ）４つのフレームワーク領域、及びｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される３つの相補性決定領域を含む、第１の参照アミノ酸配列、及びＫａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせにより定義される４つのフレームワーク領域を含むアクセプターの軽鎖可変領域の配列を含む第２の参照配列について、第１及び第２の参照アミノ酸配列の表現を提供すること、ｂ）ｉ）修飾を行う全てのフレームワーク領域に対して、それぞれ、修飾されたフレームワーク領域の又はその部分をコードするオリゴヌクレオチドの集団で、該修飾されたフレームワーク領域の又はその部分は、アクセプターの軽鎖可変領域参照配列中の対応するフレームワーク領域と比べて、１又は複数の部位に複数の異なるアミノ酸を含む、変更を受けたフレームワーク領域の位置は、第１の参照配列におけるドナーフレームワーク領域の位置に比べ、対応する位置において異なっている第２の参照配列におけるアクセプターのフレームワークの位置から選ばれる、オリゴヌクレオチドの集団、及びｉｉ）修飾を行う全ての相補性決定領域に対して、それぞれ、修飾された相補性決定領域又はその部分をコードするオリゴヌクレオチドの集団で、該修飾された相補性決定領域は、ドナーの対応する相補性決定領域と比べて、１又は複数の部位に複数の異なるアミノ酸を含む、オリゴヌクレオチドの集団、及びｉｉｉ）残りの及び未修飾のフレームワークのいずれかのそれぞれについて、第２の参照配列のアクセプター配列の対応するフレームワーク領域と同一の配列を有する、フレームワーク領域をコードするオリゴヌクレオチド又はその部分、及びｉｖ）残りの及び未修飾の相補性決定領域のいずれかのそれぞれについて、第１の参照配列のアクセプター配列の対応するフレームワーク領域と同一の配列を有する、相補性決定領域をコードするオリゴヌクレオチド又はその部分で、それぞれ軽鎖可変領域の隣接する部分をコードするオリゴヌクレオチドｉ）〜ｉｖ）は、それらの末端において重複を有する、オリゴヌクレオチドｉ）〜ｉｖ）を合成すること、及びｃ）工程ｂ）で合成したオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの集団を、それぞれのオリゴヌクレオチドの重複した配列がハイブリダイズし、重複オリゴヌクレオチドを生成するような条件下で混合すること、及びｄ）重複オリゴヌクレオチドを、改変された軽鎖可変領域の集団をコードする核酸が構築されるような条件下で処理することを含む。ある実施形態において、該方法は、さらに工程Ｅ）改変された重鎖可変領域をコードする核酸の集団を、軽鎖可変領域をコードする核酸の集団と共発現させ、改変されたヘテロメリックな可変領域の多様な集団を産生することをさらに含む。
【０３０１】
（ｖ）多特異性抗体
本発明は、変異性Ｆｃ領域を含む多特異性抗体を提供する。多特異性抗体は、少なくとも２種類の異なる抗原に対し結合特異性を有する。そのような分子は通常２種類の抗原にしか結合しないが（二特異性抗原、ＢｓＡｂ）、三特異性抗原等のさらなる特異性を有する抗体も、本明細書で使用される場合においてこの表現に包含される。ＢｓＡｂの例としては、一方のアームがガン細胞抗原を対象とし、他方のアームが細胞傷害誘発分子を対象とする、抗ＦｃγＲＩ／抗ＣＤ１５、抗ｐ１８５ＨＥＲ２／ＦｃｙＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、抗ＣＤ３／抗悪性Ｂ−細胞（１Ｄ１０）、抗ＣＤ３／抗ｐ１８５ＨＥＲ２、抗ＣＤ３／抗ｐ９７、抗ＣＤ３／抗腎細胞ガン、抗ＣＤ３／抗ＯＶＣＡＲ−３、抗ＣＤ３／Ｌ−Ｄ１（抗大腸ガン）、抗ＣＤ３／抗メラニン細胞刺激ホルモンアナローグ、抗ＥＧＦレセプター／抗ＣＤ３、抗ＣＤ３／抗ＣＡＭＡ１、抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３／ＭｏＶ１８、抗神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）／抗ＣＤ３、抗葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）／抗ＣＤ３、抗ｐａｎｃａｒｃｉｎｏｍａ関連抗原（ＡＭＯＣ−３１）／抗ＣＤ３；腫瘍抗原に特異的に結合する１本のアームとトキシンに特異的に結合する１本のアームを有する抗サポリン／抗ｉｄ−１等のＢｓＡｂｓ、抗ＣＤ２２／抗サポリン、抗ＣＤ７／抗サポリン、抗ＣＤ３８／抗サポリン、抗ＣＥＡ／抗リシンＡ鎖、抗インターフェロン−ａ（ＩＦＮ−ａ）／抗ハイブリドーマイデオタイプ、抗ＣＥＡ／抗ビンカアルカロイド酵素により活性化されたプロドラッグを変換するための抗ＣＤ３０／抗アルカリホスファターゼ（リン酸マイトマイシンプロドラッグのマイトマイシンアルコールへの変換を触媒する）等のＢｓＡｂ；線維素溶解剤として使用可能な抗フィブリン／抗組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）等のＢｓＡｂ、抗フィブリン／抗ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ細胞表面レセプターに対する免疫複合体を標的にする抗低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）／抗Ｆｃレセプター（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ又はＦｃγＲＩＩＩ）等のＢｓＡｂ；感染症の治療に用いられる抗ＣＤ３／抗単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）、抗Ｔ−細胞レセプター：ＣＤ３複合体／抗インフルエンザ、抗ＦｃｙＲ／抗ＨＩＶ等のＢｓＡｂ；インビトロ又はインビボでの腫瘍の検出のための抗ＣＥＡ／抗ＥＯＴＵＢＥ、抗ＣＥＡ／抗ＤＰＴＡ、抗ｐ１８５ＨＥＲ２／抗ハプテン等のＢｓＡｂ；ワクチンのアジュバントとして用いられるＢｓＡｂ；及び治療のツールとして用いられる抗ウサギＩｇＧ／抗フェリチン、抗西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／抗ホルモン、抗ソマトスタチン／抗物質Ｐ、抗ＨＲＰ／抗ＦＩＴＣ、抗ＣＥＡ／抗ｐ−ガラクトシダーゼ等のＢｓＡｂが挙げられるが、これらに限定されない。三特異性抗体の例としては、抗ＣＤ３／抗ＣＤ４／抗ＣＤ３７、抗ＣＤ３／抗ＣＤ５／抗ＣＤ３７及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ８／抗ＣＤ３７が挙げられるが、これらに限定されない。二特異性抗体は、全長抗体又は抗体のフラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）2二特異性抗体）として調製することができる。
【０３０２】
二特異性抗体を作成する方法は公知である。従来法による全長二特異性抗体の製造は、２つの分子鎖が異なる特異性を有する、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現によるものである（例えば、Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ他，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３）。参照として本明細書に組み込まれる）。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の配列のランダムさにより、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０の可能な異なる抗体分子の混合物を生成し、そのうち１つだけが正しい二特異性構造を有している。正しい分子の精製はアフィニティークロマトグラフィー工程により行うことができる。同様の方法は、ＷＯ９３／０８８２９号国際公開公報及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ他，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）（これらは共に参照として本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【０３０３】
他のアプローチにおいて、所望の結合特異性を有する抗体の可変領域（抗体−抗原結合部位）を、免疫グロブリンの定常領域配列に融合させる。融合体は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域の少なくとも部分を含む免疫グロブリンの重鎖定常領域を有する。軽鎖との結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を、融合体の少なくとも１つに有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、及び、所望に応じて、免疫グロブリンの軽鎖をコードするＤＮＡは、別個の発現ベクター中に挿入され、適当な宿主生物中に共にトランスフェクションされる。このことにより、構築の際に３つのポリペプチドの割合が等しくない場合に最適の収率が得られる実施形態において、３つのポリペプチドの相互の割合を調節する上で多大な柔軟性がもたらされる。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の同じ割合での発現の結果高い収率が得られる場合、又は発言の割合が顕著な影響を及ぼさない場合には、２つ又は３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクターに導入することができる。このアプローチの好ましい実施形態において、二特異性抗体は、一方のアームに存在する第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、及び他方のアームに存在するハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性をもたらす）よりなる（例えば、ＷＯ９４／０４６９０号国際公開公報参照（参照として本明細書に組み込まれる））。ＷＯ９６／２７０１１号国際公開公報（参照として本明細書に組み込まれる）に記載の他のアプローチによると、一対の抗体分子の間のインターフェースを、組み換え培養細胞から回収されるヘテロダイマーの割合を最大化するように設計することができる。二特異性抗体はまた、架橋又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体の一方はアビジンに、他方はビオチンに結合していてもよい。
【０３０４】
Ｂ．イムノアドヘシン分子
本発明はまた、変異性Ｆｃ領域を含むイムノアドヘシン分子を提供する。イムノアドヘシンをデザインする１つの方法は、アドヘシンの結合領域（例えば、レセプターの細胞外ドメイン（ＥＣＤ））を免疫グロブリンの重鎖のＦｃ領域（例えば、変異性Ｆｃ領域）と結合させることである。通常、本発明のイムノアドヘシンを調製する場合、アドヘシンの結合ドメインをコードする核酸は、Ｃ末端で免疫グロブリンの定常領域配列のＮ末端をコードする核酸と融合しているが、Ｎ末端側での融合も可能である。
【０３０５】
通常、そのような融合体において、コードされたキメラポリペプチドは、少なくとも免疫グロブリンの重鎖定常領域中の機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を保持している。融合は、定常領域中のＦｃ領域のＣ末端部分、又は重鎖ＣＨ１領域のＮ末端付近若しくは軽鎖の対応する領域において行うこともできる。融合が行われた正確な位置は決定的に重要ではないが、イムノアドヘシンの生物学的活性、分泌、又は結合特性を最適化することができる特定の位置はよく知られており、その位置を選択することができる。
【０３０６】
ある実施形態において、アドヘシン配列は、免疫グロブリンＧ1の変異性Ｆｃ領域のＮ末端に融合している。重鎖定常領域の全体がアドヘシン配列に融合することが可能である。しかし、好ましい実施形態において、ＩｇＧのＦｃ領域を化学的に定義するパパイン切断部位（重鎖定常領域の最初の残基を１１４位とした場合における２１６位の残基）の丁度上流側であるヒンジ領域から開始される配列、又は他の免疫グロブリンの相同な部位が、融合において用いられる。ある好ましい実施形態において、アドヘシンアミノ酸配列は、ＩｇＧ重鎖の、（ａ）ヒンジ領域及びＣＨ２及びＣＨ３、又は（ｂ）ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域に融合している。ある実施形態において、イムノアドヘシンは二特異性である。
【０３０７】
あるいは、アドヘシン配列は、キメラ重鎖を含む免疫グロブリンが得られるように、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖配列の間に挿入されていてもよい。そのような実施形態において、アドヘシン配列は、免疫グロブリンの各アームにおいて、ヒンジ領域及びＣＨ２領域の間、又はＣＨ２及びＣＨ３領域の間のいずれかで、免疫グロブリン重鎖の３’末端に融合していてもよい（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ他，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：１０２７−１０３７（１９９１）参照（参照として本明細書に組み込まれる））。
【０３０８】
本発明のイムノアドヘシンにおいて、免疫グロブリンの軽鎖の存在は必要とされていないが、免疫グロブリン軽鎖は、アドヘシン−免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合していてもよく、又は直接アドヘシンに融合していてもよい。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、通常アドヘシン−免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡと共発現される。分泌されると、ハイブリッド重鎖及び軽鎖は共有結合し、２つのジスルフィド結合を有する免疫グロブリン重鎖−軽鎖対を含む免疫グロブリン様構造を提供する。このような構造の調製に適した方法は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書（参照として本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【０３０９】
好ましい実施形態において、イムノアドヘシンは、アドヘシンの部分をインフレームにコードするｃＤＮＡ配列を免疫グロブリンｃＤＮＡ配列に融合させることにより構築される。しかし、ゲノムの免疫グロブリンフラグメントへの融合も用いることができる。一般に、後者のタイプの融合体は、発現のためにＩｇ制御配列を必要とする。ＩｇＧ重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡは、脾臓又は末梢血リンパ球から誘導されたｃＤＮＡライブラリーより公開された配列に基づいて、ハイブリダイゼーション又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手法により単離することができる。イムノアドヘシンの「アドヘシン」及び免疫グロブリン部位をコードするｃＤＮＡは、選択した宿主細胞において有効な発現を目的とするプラスミドベクターに連続的に挿入することができる。
【０３１０】
ＶＩ．Ｆｃ領域変異体をコードする核酸配列
本発明はまた、Ｆｃ領域変異体をコードする核酸配列と同様、Ｆｃ領域変異体をコードする核酸配列を含む組成物、ベクター、及び宿主細胞を提供する。本発明はまた、Ｆｃ領域変異体を生成するための組み換え方法を提供する。
【０３１１】
一般に、組み換え法による変異体の生成のためには、変異体をコードする核酸配列を単離し、ベクターに挿入する。宿主細胞に、ベクターを用いてトランスフェクトすることができ、それにより核酸配列を増幅させ、かつ／又は変異体ペプチドを製造させることができる。本発明のペプチド変異体をコードする核酸配列を、従来法（例えば、変異体をコードする配列に特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドプローブの使用）により単離し、整列することができる。一般に、変異体をコードする核酸配列は、シグナル配列（例えば、分泌性シグナル配列）、複製起点、少なくとも１つのマーカー遺伝子、エンハンサー、プロモーター、又は転写ターミネーター等の他の要素に作動可能に結合される。ある実施形態において、宿主細胞は変異体をコードする核酸により安定にトランスフェクトされ、特定の変異体を発現する細胞系を生成する。好ましい実施形態において、変異体は、ＣＨＯ，ＮＳＯ、Ｓｐ２／０、ＰＥＲ．Ｃ６、又はＨＥＫ２９３細胞内で発現される。組み換え方法は、周知の技術である。
【０３１２】
核酸配列は、変異性Ｆｃ領域が生成されるように変異をしていてもよい。例えば、親Ｆｃ領域をコードする核酸配列（例えば、配列番号３２）は、核酸配列が発現した場合に少なくとも１つのアミノ酸の改変が生じるように変異していてもよい。また、親Ｆｃ領域の少なくとも部分をコードする核酸配列は、少なくともＦｃ領域の変異体の部分を含むアミノ酸配列を産生するように変異していてもよい。例えば、配列番号３２は、少なくとも１つのアミノ酸配列（例えば、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、及び配列番号５６を参照）が得られるように変異していてもよい。
【０３１３】
ある実施形態において、コドンを用いた合成を用いて変異を有する配列を生成する。コドンを用いた合成の例としては、例えば、米国特許第５，２６４，５６３、５，５２３，３８８及び５，８０８，０２２号明細書（これらは全て参照として本明細書に組み込まれる）に記載の方法が挙げられる。要約すると、コドンを用いた合成は、別個の担体の上でモノマーを順次カップリングさせ、少なくとも２つの異なる連続配列（ｔｕｐｌｅｔ）を生成する。カップリングは、別個の反応容器中で行うことができ、その後反応容器から担体を混合し、混合した担体を２つ以上の別個の反応容器に分別し、カップリング、混合及び分別工程を反応容器中で１又は複数回反復し、混合又は分別工程で修了する。さらに、オリゴヌクレオチドを、担体から切り離すことができる。 
【０３１４】
ＶＩＩ．治療への使用及び製剤
ある実施形態において、本発明は変異体を含む治療用の製剤を提供する。本発明は、治療用組成物の特定の性質に限定されるものではない。例えば、そのような組成物はポリペプチド変異体（又はその部分）を含むことができ、生理学的に許容される液体、ゲル、固体担体、希釈剤、アジュバント及び賦型剤、並びにこれらの組み合わせと共に提供される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）（参照として本明細書に組み込まれる）を参照）。
【０３１５】
さらに、ポリペプチド変異体は、サリチル酸塩、ステロイド、免疫抑制剤、抗体又は抗生物質を含むがこれらに限定されない他の治療剤と共に用いることができる。本発明の変異体と共に用いることができる具体的な治療剤としては、アゾベンゼン化合物（米国特許第４，３１２，８０６号明細書、参照として本明細書に組み込まれる）、ベンジル置換ローダミン誘導体（米国特許第５，２１６，００２号明細書、参照として本明細書に組み込まれる）、Ｌ−カルノシン亜鉛塩（米国特許第５，２３８，９３１号明細書、参照として本明細書に組み込まれる）、３−フェニル−５−カルボキシピラゾール及びイソチアゾール（米国特許第５，２９４，６３０号明細書、参照として本明細書に組み込まれる）、ＩＬ−１０（米国特許第５，３６８，８５４号明細書、参照として本明細書に組み込まれる）、キノリンロイコトリエン合成阻害剤（米国特許第５，３９１，５５５号明細書、参照として本明細書に組み込まれる）、２’−ハロ−２’−デオキシアデノシン（米国特許第５，５０６，２１３号明細書、参照として本明細書に組み込まれる）、フェノール及びベンズアミド化合物（米国特許第５，５４２，４３９号明細書、参照として本明細書に組み込まれる）、トリブチリン（米国特許第５，５６９，６８０号明細書、参照として本明細書に組み込まれる）、ある種のペプチド（米国特許第５，７５６，４４９号明細書、参照として本明細書に組み込まれる）、ω−３ポリ不飽和酸（米国特許第５，７９２，７９５号明細書、参照として本明細書に組み込まれる）、ＶＬＡ−４ブロッカー（米国特許第５，９３２，２１４号明細書、参照として本明細書に組み込まれる）、メタスルホ安息香酸プレドニソロン（米国特許第５，８３４，０２１号明細書、参照として本明細書に組み込まれる）、サイトカイン抑制剤（米国特許第５，８８８，９６９号明細書、参照として本明細書に組み込まれる）、及びニコチン（米国特許第５，８８９，０２８号明細書、参照として本明細書に組み込まれる）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０３１６】
ポリペプチド変異体は、細胞の生存率又は増殖能力を減少させる薬剤と共に用いることができる。細胞の生存率又は増殖能力を減少させる薬剤は、例えば、ＤＮＡ合成の阻害、細胞分裂の阻害、アポトーシスの誘導、又は非アポトーシス誘導性の細胞の殺傷等の種々の経路により機能を果たすものであってもよい。細胞傷害薬及び細胞増殖抑制剤の具体例としては、ヨウシュヤマゴボウ抗菌タンパク質、アブリン、リシン、及びそれらのＡ鎖、ドキソルビシン、シスプラチン、ヨウ素１３１、イットリウム９０、レニウム１８８、ビスマス２１２、タキソール、５−フルオロウラシル、ＶＰ−１６、ブレオマイシン、メトトレキセート、ビンデシン、アドリアマイシン、ビンクリスチン、ＢＣＮＵ、マイトマイシン、及びシクロホスファミド、及び、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β等のある種のサイトカインが挙げられるが、これらに限定されない。このように、細胞傷害薬及び細胞増殖抑制剤は、例えば、放射性元素、化学療法剤、タンパク質、及びレクチンを含んでいてもよい。
【０３１７】
治療用の組成物は、例えば、バインダー、充填剤、担体、保存料、安定化剤、乳化剤、緩衝剤、及び賦型剤等として、例えば、医薬品グレードのマニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の通常用いられる添加物を含んでいてもよい。これらの組成物は、通常、１〜９５％の有効成分、好ましくは、２〜７０％の有効成分を含む。
【０３１８】
本発明のポリペプチド変異体はまた、適用可能で生理学的に許容される希釈剤又は賦型剤と混合することもできる。好適な希釈剤又は賦型剤は、例えば、水、生理的食塩水、デキストロース、グリセロール等、及びこれらの組み合わせである。さらに、所望により、組成物は保湿剤又は乳化剤、安定化剤又はｐＨ調整剤等の微量の補助剤を含んでいてもよい。
【０３１９】
ある実施形態において、本発明の治療用組成物は、液体状の溶液又は懸濁液として、スプレーとして、又は固形剤のいずれかとして調製される。経口製剤は、通常、例えば、バインダー、充填剤、担体、保存料、安定化剤、乳化剤、緩衝剤、及び賦型剤等として、例えば、医薬品グレードのマニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の通常用いられる添加物を含む。これらの組成物生物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放剤、又は粉末の形態をとり、通常、１〜９５％の有効成分、好ましくは、２〜７０％の有効成分を含む。本発明の治療用の組成物を投与するのに有用な経口用組成物の一例は、米国特許第５，６４３，６０２号明細書（参照として本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０３２０】
局所投与等の他の形態での投与に適した他の製剤としては、軟膏、チンキ剤、クリーム、ローション、経皮パッチ、及び座薬が挙げられる。軟膏及びクリームには、従来のバインダー、担体及び賦型剤は、例えば、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドを含んでいてもよい。全身投与法の一例は、米国特許第５，８３４，０１６号明細書（参照として本明細書に組み込まれる）に記載されている。他のリポソームを用いた投与法（例えば、米国特許第５，８５１，５４８及び５，７１１，９６４号明細書を参照（いずれも参照として本明細書に組み込まれる））を用いてもよい。
【０３２１】
製剤はまた、特定の治療への適応に対する、必要に応じて２種以上の活性化合物を含んでいてもよく、好ましくは、それらは相補的な活性を有しており互いに悪影響を及ぼさない。そのような分子は、意図した目的に有効な量で好適に共存する。
【０３２２】
徐放調剤を調製することも可能である。徐放調剤の好適な例としては、ポリペプチド変異体を含む固体の疎水性ポリマーよりなる半透性マトリックスが挙げられ、マトリックスは、例えばフィルム、マイクロカプセル等の成型体の構造をとる。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド、Ｌ−グルタミン酸及びＬ−グルタミン酸エチルのコポリマー、非分解性のエチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドよりなる注射可能なマイクロスフェア）生分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられるが、これらに限定されない。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸等のポリマーは、１００日以上にわたり分子の放出を行うことを可能にするが、ある種のヒドロゲルはタンパク質をより短期間しか放出することができない。
【０３２３】
本発明のポリペプチド変異体は、被験者の治療に用いることができる。そのような治療剤は、疾患にかかった被験者に投与してもよく、被験者（例えば、疾患にかかりやすい被験者）に予防的に投与してもよい。治療することができる健康状態の例としては、ガン（ポリペプチド変異体が、例えば、ＨＥＲ２レセプター、ＣＤ２０、又は血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に結合する）、喘息等のアレルギー症状（抗ＩｇＥ抗体に結合する）、及びＬＦＡ−１介在性の病気（ポリペプチド変異体は、例えば、抗ＬＦＡ−１又は抗ＩＣＡＭ−１抗体である）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３２４】
好ましい実施形態において、被験者の治療に用いられる変異体は、抗体又はイムノアドヘシンを含む。また、好ましい実施形態において治療される疾患は、抗体又はイムノアドヘシンに応答する疾患である。抗体に応答する疾患及び医学的状態の例としては、リンパ腫（抗ＣＤ２０抗体であるＲＩＴＵＸＡＮにより治療可能であることが示されている）、感染症（呼吸器合胞体ウィルスのＦタンパク質を対象とする抗体であるＳＹＮＡＧＩＳにより治療可能であることが示されている）、腎移植（抗ＩＬ−２レセプター抗体であるＺＥＮＡＰＡＸが有効であることが示されている）、クローン病及び関節リウマチ（抗ＴＮＦα抗体であるＲＥＭＩＣＡＤＥにより治療可能であることが示されている）、乳ガン（抗ＨＥＲ２抗体であるＨＥＲＣＥＰＴＩＮにより治療可能であることが示されている）、及び大腸ガン（抗１７−１Ａ抗体であるＥＤＲＥＣＯＬＯＭＡＢにより治療可能であることが示されている）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３２５】
ある実施形態において、改善されたＡＤＣＣ活性を有するポリペプチド変異体（例えば、Ｐ２４７Ｌ又はＩ３３２Ｅ変異体）は、組織又は外来微生物の破壊又は除去が望ましい疾患又は病気の治療に用いられる。例えば、変異体はガン、炎症性疾患、感染（例えば、細菌、ウィルス、真菌又はイーストの感染）、及び組織の除去が望ましい他の健康状態（甲状腺腫等）の治療に用いることができる。他の実施形態において、ポリペプチド変異体は、ＡＤＣＣ活性が減退している（例えば、Ｉ３３２Ｒ又はＩ３３２Ｋ変異体）。そのような変異体は、長い半減期を有するＦｃ領域を含むポリペプチドが望ましいが、ポリペプチドが望ましくないエフェクター機能を有しない方が好ましい場合における疾患又は病気の治療に用いることができる。例えば、Ｆｃ領域を含むポリペプチドは、抗組織因子（ＴＦ）抗体、抗ＩｇＥ抗体、及び抗インテグリン抗体（例えば、抗α４β７抗体）であってもよい。そのようなＦｃ領域を含むポリペプチドの望ましい作用機構は、リガンド−レセプター結合対をブロックすることであってもよい。さらに、ＡＤＣＣ活性が減退したＦｃ領域を含むポリペプチドは、アゴニスト抗体であってもよい。
【０３２６】
本発明のポリペプチド変異体は、非経口、皮下、局所、腹膜内、肺内、及び鼻腔内、並びに病巣内投与（例えば、局所免疫抑制治療のため）等の任意の適当な方法により投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、及び皮下投与が含まれる。さらに、ポリペプチド変異体は、特に、ポリペプチド変異体の用量を減少させる場合にはパルス注入により好適に投与される。好ましくは、投与は注射により行われ、最も好ましくは、部位や投与が短期化長期化に応じて静脈又は皮下注射により行われる。
【０３２７】
疾患の予防又は治療のためのポリペプチド変異体の適切な用量は、疾病のタイプ、重篤度及び経過、ポリペプチド変異体の投与が予防目的か治療目的か、これまでの治療、患者の病歴及びポリペプチド変異体に対する応答、並びに担当する医師の判断に依存する。ポリペプチド変異体は、患者に対し、１度だけ又は一連の治療期間を通して適切に投与される。
【０３２８】
例えば、疾患のタイプ及び重篤度にもよるが、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１２０ｍｇ／ｋｇ）のポリペプチド変異体が、患者に対し、例えば、１回又は複数回に分けて、又は連続注入によって投与される初期試験用量である。通常の１日用量は、上述の条件にもよるが、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲内である。数日間又はそれ以上にわたる反復投与については、病状にもよるが、治療は症状が充分減少するか消失するまで継続される。この治療の進展は、従来の手法及びアッセイにより簡単にモニターすることができ、治療効果を達成するための用量の調節に利用することができる。
【０３２９】
治療上有効なポリペプチド変異体の投与量は、患者が治療を受けている疾患の症状を軽減させるために必要とされる用量レベルである。ポリペプチド変異体は、必ずしも必要ではないが、対象となる病気の治療に近年使用されている１又は複数の薬剤と共に必要に応じて調剤される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在するポリペプチド変異体の量、病気又は治療のタイプ、及び上述の他の因子に依存する。
【０３３０】
ＶＩＩＩ．変異性Ｆｃ領域の他の利用
本発明の変異体、及び変異体をコードする核酸配列は、多くの方法で使用することができる。例えば、本発明の変異体を薬剤のスクリーニングアッセイに使用することができる。例えば、候補化合物を、変異体を候補化合物と接触させ、候補化合物の変異体に対する結合能を決定することにより、Ｆｃ領域のエフェクター機能を改変又は阻害する能力を評価することができる。変異体は、ＧＳＴ−変異体融合タンパク質を、グルタチオンを含むポリマービーズの表面に結合させる等の周知の方法により固定化することができる。ＧＳＴ融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡは、対象となる変異体をコードするＤＮＡをＧＳＴのカルボキシル末端をコードするＤＮＡに融合させることにより構築される（例えば、Ｓｍｉｔｈ他，Ｇｅｎｅ，６７：３１（１９８８））。融合コンストラクトは、その後、ＧＳＴ融合タンパク質の発現がイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＴＰＧ）により誘導される適当な発現系（例えば、大腸菌ＸＡ９０）に移される。ＩＴＰＧによる誘導により、融合タンパク質が可溶性の細胞性タンパク質の主成分として得られる。融合タンパク質は、グルタチオンアフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法により精製することができる。候補化合物の変異体への結合は、該化合物が１又は複数のエフェクター機能を阻害する能力と相関する。
【０３３１】
他のスクリーニング方法において、変異体又は選択したＦｃＲのいずれかが、プラスチック製マイクロタイタープレート上への吸着又はＧＳＴ融合タンパク質のグルタチオンを含むポリマービーズ上への特異的な結合等の公知の方法により固定化される。例えば、ＧＳＴ−変異体は、グルタチオン−セファロースビーズ上に結合している。固定化された変異体を、その後Ｆｃ領域レセプター及び候補化合物と接触させる。結合していないペプチドを除去し、複合体を可溶化後分析して、結合した標識ペプチドの量を決定する。結合量の減少は、候補化合物が変異体とＦｃ領域レセプターとの相互作用を阻害していることを意味する。このスクリーニング方法は、Ｆｃレセプターへの結合の程度が増大している本発明の変異体を用いると（例えば、親Ｆｃレセプターの多くは、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃγＲＩＩｂ、及びＦｃγＲＩＩａ等の低親和性レセプターであるため）特に有用である。この方法の変形法は、先に形成した変異体／Ｆｃレセプター複合体を分解することが可能な化合物のスクリーニングを可能にする。例えば、ある実施形態において、Ｆｃレセプターに結合した変異体を含む複合体を上述のように固定化し、候補化合物と接触させる。候補化合物による複合体の分解は、化合物がテストする変異体とＦｃレセプターとの相互作用を破壊又は阻害する能力と相関する。このようにして、（例えば、ヒトに対する）治療能力を有する化合物（例えば、自己免疫疾患等のヒトの疾患を治療するのに有用な化合物）を同定することができる。
【０３３２】
薬剤をスクリーニングするための他の手法は、変異体ペプチドに対する好適な結合親和性を有する化合物に対する高スループットのスクリーニング方法を提供し、ＷＯ８４／０３５６４号国際公開公報（参照として本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。要約すると、多くの異なる小ペプチド供試化合物を、プラスチックのピン又は他の表面等の固体担体上で合成する。ペプチド供試化合物を変異体ペプチドと反応させ、洗浄する。結合したペプチドは、その後周知の方法により検出される。
【０３３３】
他の手法では、変異体ペプチドを対象とする抗体を用いる。変異体ペプチドに特異的に結合することができるそのような抗体は、ある変異体との結合について供試化合物と拮抗する。このようにして、変異体ペプチドと１又は複数の抗原性決定基を共有する任意のペプチドの存在を、抗体を用いて検出することができる。
【０３３４】
本発明は、化合物をスクリーニングする他の多くの方法を意図する。上述の実施例は、単に用いることが可能な手法の範囲を説明するために示される。当業者は、多くの他のスクリーニング方法を用いることができることを認識するであろう。
【０３３５】
特に、本発明は、少なくとも１つのＦｃ領域変異体をコードする核酸がトランスフェクトされた細胞系の化合物の活性をスクリーニングするための使用を意図し、特に、高スループットの化合物の組み合わせライブラリー（例えば、１０4以上の化合物を含むライブラリー）からのスクリーニングを意図する。本発明の細胞系は、多くのスクリーニング方法において使用することができる。
【０３３６】
本発明の変異体は、アフィニティー精製剤として使用することができる。例えば、変異体をセファデックス又はろ紙等の固相上に、公知の方法を用いて固定することができる。固定化された変異体を、精製しようとする抗原を含むサンプルと接触させ、その後、サンプル中に含まれる、固定化されたポリペプチド変異体に結合した精製しようとする抗原以外のほぼ全ての物質を除去する適当な溶媒で担体を洗浄する。最後に、担体を、ｐＨ５．０のグリシンバッファー等の他の適当な溶媒で洗浄すると、ポリペプチド変異体から抗原が切り離される。
【０３３７】
ポリペプチド変異体はまた、診断アッセイ（例えば、細胞、組織、又は血清における、対象となる抗原の発現の検出）にも有用である。診断への応用のためには、変異体は通常検出可能な残基で標識されている（そのような標識は、上述のＦｃ領域のアッセイにおいても有用である）。放射性同位体（例えば、35Ｓ、14Ｃ、125Ｉ、3Ｈ、及び131Ｉ）、蛍光標識（例えば、希土類キレート（ユーロピウムキレート）又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ、フィコエリスリン、並びにテキサスレッド）、及び種々の酵素−基質標識（例えば、米国特許第４，２７５，１４９号明細書参照（参照として本明細書に組み込まれる））、及びルシフェラーゼ、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸脱水素酵素、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）等のペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸脱水素酵素）、ヘテロ環オキシダーゼ（ウリカーゼ、キサンチンオキシダーゼ等）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ等）を含むがこれらに限定されない多くの標識が利用可能である。酵素−基質の組み合わせとしては、例えば、（ｉ）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）と基質としての過酸化水素で、ここで過酸化水素は染料の前駆体（例えば、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）又は３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化する；（ｉｉ）アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と、発色性基質としてリン酸ｐ−ニトロフェニル；及び（ｉｉｉ）−Ｄ−ガラクトシダーゼ（Ｒ−Ｄ−Ｇａｉ）と、発色性基質又は蛍光性基質が挙げられる。
【０３３８】
本発明の変異体は、インビボでの診断アッセイにも使用することができる。例えば、ポリペプチド変異体は、抗原又はそれを発現している細胞の位置を、免疫シンチグラフィーで特定できるように放射性元素で標識されている。
【実施例】
【０３３９】
実験
以下の実施例は、本発明の一つの好ましい実施形態及び側面を示し、より詳しく説明するためのものであり、それらの範囲を何ら限定するものではない。
【０３４０】
以下の実験結果の開示において、以下の略語を適用する。Ｎ（規定濃度）、Ｍ（モル）、ｍＭ（ミリモル）、μＭ（マイクロモル）、ｍｏｌ（モル（グラム分子））、ｍｍｏｌ（ミリモル（グラム分子））、μｍｏｌ（マイクロモル（グラム分子））、ｎｍｏｌ（ナノモル（グラム分子））、ｐｍｏｌ（ピコモル（グラム分子））、ｇ（グラム）、ｍｇ（ミリグラム）、μｇ（マイクログラム）、ｎｇ（ナノグラム）、ｌ又はＬ（リットル）、ｍｌ（ミリリットル）、μｌ（マイクロリットル）、ｃｍ（センチメートル）、ｍｍ（ミリメートル）、μｍ（マイクロメートル）、ｎｍ（ナノメートル）、ＤＳ（硫酸デキストラン）、及びＣ（摂氏温度）。
【０３４１】
実施例１
ＡＤＣＣアッセイにおける変異体のスクリーニング
本実施例では、ＡＤＣＣアッセイにおいてどのように変異体をスクリーニングするかについて述べる。スクリーニングを行った変異体は全て抗ＣＤ２０抗体（可変領域の特異性に基づく）であった。
【０３４２】
ｉ．ＰＢＭＣ（抹消血単核細胞）の単離
約５０ｍＬの抹消血を健康なドナーから採取し、ｐＨ７．０リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１：２に希釈する。チューブを穏やかに回転させることにより溶液を混合する。約１２ｍＬのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ社カタログ番号１０７７−１）を希釈血液サンプルの下に注意深く加え層状にした後、Ｓｏｒｖｏｌｌ社製ＲＴ６０００Ｂ遠心器中で、バケットローターを、ブレーキをオフにして１０００ｒｐｍで１０分間回転させ遠心分離する。グラジエントの上相を吸引して廃棄し、白色のＰＢＭＣを含む界面相を回収し、Ｈａｎｋｓ’  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｇｉｂｃｏ社カタログ番号１４０２５−０９２）で３回洗浄する。洗浄した細胞ペレットを約２０ｍＬの、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社カタログ番号ＦＢ−０１）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁させる。再懸濁させたＰＢＭＣを２つのＴ−１７５培養フラスコに分注し、３０ｍＬの、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩをそれぞれに加え、３７℃  ５％ＣＯ2インキュベーター中で終夜インキュベートする。翌日、非接着性のＰＢＭＣを５０ｍＬファルコンチューブ中に回収後、上と同様に遠心分離し、１％ＦＢＳを含むフェノールレッド欠損ＲＰＭＩ中に再懸濁させる。少量の再懸濁細胞を１０倍に希釈し、血球計でカウントする。残りのＰＢＭＣは、必要となるまでインキュベーター中に保存する。
【０３４３】
ｉｉ．標的細胞系（抗ＣＤ２０ＡＤＣＣアッセイに特有）
ＣＤ２０を発現した、Ｗｉｌ．２及びＳＫＷ６．４  Ｂ細胞系は、ＡＴＣＣより入手し、推奨される条件で培養した。使用する１日前に細胞を２等分する。翌日、細胞数を４×１０5個／ｍＬに調節し、５０μＬずつ９６ウェル組織培養プレートに加える。
【０３４４】
ｉｉｉ．ＩｇＧ希釈液
スクリーニングの前に、ＩｇＧ変異体を発現させ、標準的な酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて定量する。一点法によるＡＤＣＣ一次スクリーニングのために、ＩｇＧ変異体を、１％ＰＢＳを含むフェノールレッド欠損ＲＰＭＩ培地中で４０ｍｇ／ｍＬに希釈する。アッセイに用いられるＩｇＧの最終濃度は、４倍に希釈される（最終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）。５０μＬのＩｇＧ希釈液を標的細胞に加え、１５分間３７℃でインキュベートした後、オプソニン化された標的細胞にエフェクター細胞を加える。
【０３４５】
ＩｇＧの滴定を行うと、ＩｇＧ濃度は、約０．００１〜１μｇ／ｍＬの範囲で変化する。ＩｇＧ希釈液を、９６ウェルマイクロタイタープレート中で、１％ＰＢＳを含むフェノールレッド欠損ＲＰＭＩ中のサンプルを希釈することにより調製する。希釈したＩｇＧサンプルを、標的細胞を含むアッセイプレートに加える。
【０３４６】
ｉｖ．エフェクター細胞
ＰＢＭＣの濃度を、エフェクター細胞：標的細胞比が、１０〜２０：１（２〜４×１０6個／ｍＬ）の範囲内となるよう調節する。１００μＬの再懸濁したＰＢＭＣをそれぞれのウェルのオプソニン化された標的細胞に加える。プレートを、５％ＣＯ２の存在下３７℃で３〜４時間インキュベートする。
【０３４７】
ｖ．乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出の検出
標的細胞の溶解を、損傷を受けた細胞の細胞質から上澄への乳酸脱水素酵素の放出を検出することにより測定する。オプソニン化した標的細胞をエフェクター細胞とインキュベートした後、アッセイプレートを２０００ｒｐｍで５分間遠心する。ペレット化した細胞及び破砕物を避けつつ、約７５μＬの細胞培養液の上澄を注意深く取り去る。この上澄を直接マイクロタイタープレートに加え、これに７５μＬのＬＤＨ検出試薬（Ｒｏｃｈｅ社カタログ番号１６４４７９３）を加える。その後、プレートを約１５〜３０分間インキュベートし、４９０ｎｍにおける吸光度を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｖｍａｘ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒにより読み取る。
【０３４８】
ｖｉ．データの解析
一点法によるＡＤＣＣスクリーニングアッセイは、全て２回行った。それぞれのアッセイプレートは、自然溶解、ＩｇＧ非存在下でのエフェクター細胞及び標的細胞の溶解、及び標的細胞の完全溶解のコントロール群を含む。標的細胞の完全溶解は、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を標的細胞に加えることにより達成される。３つの野生型コントロール群をそれぞれのアッセイプレートに含めておき、得られるＡＤＣＣシグナルを平均する。自然分解コントロール群から得られるバックグラウンド値を、それぞれのサンプルから差し引く。希釈ＩｇＧ液から得られるバックグラウンド値をそれぞれのサンプルから差し引く。データを、吸光度から、自然溶解及び完全溶解に対する特異的溶解の割合に変換する。特異的溶解の割合は、次の式により計算される。
（％特異的溶解）＝（測定値Ａ４９０−バックグラウンドＡ４９０）／（最大Ａ４９０−バックグラウンドＡ４９０）×１００
ここで、バックグラウンドＡ４９０は、ＩｇＧ非存在下でのエフェクター及び標的細胞、及び粗製ＩｇＧ上澄中に存在するＬＤＨ混入物によるＩｇＧバックグラウンドの和である。Ｆｃ変異体の活性の割合は、野生型コントロールの平均値に対して規格化される。２度のアッセイについての規格化された活性の割合は平均され、個々のサンプルについてそれぞれのアッセイプレート間の標準偏差を計算する。
【０３４９】
ｖｉｉ．結果
相対ＡＤＣＣ特異性活性を表２に示す。この表に示したＣＤＣの値は、実施例４の記載にしたがい得られたものであり、この表に示したＦｃＲｎ結合アッセイの値は、実施例５の記載にしたがい得られたものである。
【０３５０】
【表２】
2008502590.tif 000004
【０３５１】
図７Ａは、ＩｇＧ変異体の滴定後に得られた代表的なＡＤＣＣデータを示す。この実験においては、ＳＫＷ６．４細胞を、Ｆｃ領域ＩｇＧの１又は２アミノ酸変異体を用いた後、ＰＢＭＣを１５：１の比で加えることによりオプソニン化する。アッセイプレートを、３７℃で５％ＣＯ2の存在下約３時間インキュベート後、遠心分離する。上澄の部分を回収し、マイクロタイタープレートに移し、同容のＬＤＨ基質を加えることにより、上澄中のＬＤＨ活性を検出する。発色させた後、４９０ｎｍにおける吸光度を測定する。粗製ＩｇＧ上澄へのＬＤＨの混入によるバックグラウンドを測定し、これらのバックグラウンド値を、Ａ４９０の生データから差し引くと、図７Ａに示したデータが得られる。これらのデータは、野生型抗ＣＤ２０抗体と比べ、Ａ３３０Ｋ、Ａ３３０Ｒ及びＩ３３２Ｅ単一アミノ酸変異体のＡＤＣＣ活性が増大していることを示す。Ａ３３０Ｋ又はＡ３３０ＲとＩ３３２Ｅとの組み合わせ変異体では、さらにＡＤＣＣ活性が増大している。非特異的ＩｇＧは、これらのアッセイ条件下では特異性を示さない。グリコシル化を改変した同様のアッセイの結果を図７Ｂに示す。特に、７Ｂ（ＧｎＴＩＩＩと標識したサンプル）は、Ｉ３３２変異体の活性が、糖化の改変（例えば、二分岐ＧｌｕＮＡｃの含有率の増大）によりさらに増大することを示している。
【０３５２】
図８は、精製したＩｇＧを用いて得られた代表的なＡＤＣＣデータを示す。プロットは、非特異性ＩｇＧ、野生型抗ＣＤ２０及びＦｃ領域変異体Ｉ３３２Ｄ及びＩ３３２ＥについてのＩｇＧの濃度に対する細胞傷害の割合を示すものである。細胞傷害の割合は、次の式により計算される。
（％細胞傷害）＝（測定値Ａ４９０−バックグラウンドＡ４９０）／（最大Ａ４９０−バックグラウンドＡ４９０）×１００
ここで、バックグラウンドＡ４９０は、ＩｇＧ非存在下でのエフェクター及び標的細胞から得られる。データは、Ｉ３３２Ｄ及びＩＩ３３２Ｅ変異体のＡＤＣＣ活性が野生型に比べ増大していることを示す。この実験で用いた標的細胞はＳＫＷ６．４であり、エフェクター細胞：標的細胞比１５：１を、標準的な３時間ＡＤＣＣアッセイにおいて用いた。
【０３５３】
図９は、低親和性の可変領域を用いた（ＡＭＥ３３の代わりにＡＭＥ６Ｆ１）以外は同じタイプのＡＤＣＣ活性を示す。この図は、この特定の抗ＣＤ２０特異性を有するＡＤＣＣ活性と、Ｗｉｌ−２及びＳＫＷ６．４細胞系は、可変領域の親和性に無関係であることを示している。
【０３５４】
図１０は、ＦｃγＲＩレセプターとの結合を示す。推定膜貫通ドメインの代わりに、Ｃ末端に６−ｈｉｓタグを有するヒトＦｃγＲＩレセプター（ＣＤ６４）をＨＥＫ−２９３Ａ細胞中で発現させ、Ｎｉカラムを用いて精製した。レセプターをＥＬＩＳＡプレート上に塗布し、４℃で終夜放置後、プレートを、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋを用いてブロックした。ブロッキング及び洗浄後に、ＩｇＧ希釈液を調製しレセプターを塗布したプレートに加え、３７℃で２時間インキュベートした。結合していないＩｇＧを洗浄により除去し、結合した抗体を、１：１０００の、アルカリホスファターゼをコンジュゲートした抗ヒトκ型二次抗体を用いて検出した。洗浄後、ホスファターゼ基質（一リン酸フェノールフタレイン）（ＰＰＭＰ）（ＪＢＬ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を加え、５６０ｎｍにおける吸光度を、ＶＭＡＸ  マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ社、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて比色定量法により決定することにより、結合したＩｇＧを検出した。
【０３５５】
実施例２
全血アッセイにおけるＢ細胞の消失に対する変異体のスクリーニング
本実施例では、全血アッセイにおけるＢ細胞の消失に対する変異体のスクリーニングについて述べる。
【０３５６】
ｉ．ＦｃγＲＩＩＡの遺伝子型の決定
ゲノムＤＮＡを、ＱｉａＡｍｐキット（Ｑｉａｇｅｎ社製、カタログ番号５１１０４）を用いて末梢血サンプルから単離した。ＦｃγＲＩＩＡを、プライマー（５’  ＧＧＡＡＡＡＴＣＣＣＡＧＡＡＡＴＴＣＴＣＧＣ  ３’−配列番号６１）及び（５’  ＣＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＣ  ＴＡＣＣＴＡＴＴＡＣＧＣＧＧＧ  ３’−配列番号６２）を用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ生成物を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社、カタログ番号２８００６）を用いて精製し、制限酵素ＢｓｔＵＩにより、６０℃で１２時間消化した。消化したサンプルを３％アガロースゲル上で分析した。ＰＣＲ生成物は全て、Ｈ遺伝子型であるかＲ遺伝子型であるかに関係なく、内部のＢｓｔＵＩ切断部位で切断されていた。Ｒ対立遺伝子を有する生成物は、さらにもう１箇所のＢｓｔＵＩ切断部位で切断されていた。この結果、Ｈ／Ｈ遺伝子型は、３３７ｂｐを有する１種類のフラグメントにより同定され、Ｈ／Ｒは、３３７ｂｐ及び３１６ｂｐを有する２種類のフラグメントにより同定され、Ｒ／Ｒは、３１６ｂｐを有する１種類のフラグメントにより同定される。
【０３５７】
ｉｉ．ＦｃγＲＩＩＩＡの遺伝子型の決定
ゲノムＤＮＡを、ＱｉａＡｍｐキット（Ｑｉａｇｅｎ社製、カタログ番号５１１０４）を用いて末梢血サンプルから単離した。ＦｃγＲＩＩＩＡを、プライマー（５’  ＡＴＡＴＴＴＡＣＡＧＡＡＴＧＧＣＡ  ３’−配列番号６３）及び（５’  ＧＧＴＧＡＴＧＴ  ＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＣＡＣＡＴＴＴＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡ  ３’−配列番号６４）を用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ生成物を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社、カタログ番号２８００６）を用いて精製し、制限酵素ＨｉｎｃＩＩにより、３７℃で１６時間消化した。消化したサンプルを３％Ｎｕｓｉｅｖｅアガロースゲル上で分析した。ＨｉｎｃＩＩはＶ対立遺伝子は切断するが、Ｆ対立遺伝子は切断しない。したがって、Ｆ／Ｆは１４８ｂｐの１種類のフラグメントを生じ、Ｆ／Ｖは、１４８、１０９、及び３９ｂｐの３種類のフラグメントを生じ、Ｖ／Ｖは、１０９、及び３９ｂｐの２種類のフラグメントを生じる。
【０３５８】
ｉｉｉ．Ｂ細胞消失アッセイ（全血を使用）
ヘパリン添加末梢血を健康なボランティアから採取した。血液を、変異体、ＦＡＣＳバッファー（リン酸緩衝生理食塩水＋２％ウシ胎児血清）で希釈したＲＩＴＵＸＡＮ又は非特異的ＩｇＧ（ネガティブコントロール）と混合した。チューブを４時間３７℃でインキュベートし、その後フルオレセイン−抗ＣＤ４５（白血球の同定用）（ＢＤ、カタログ番号５５５４８２）、及びフィコエリスリン−抗ＣＤ１９（Ｂ細胞の同定用）（ＢＤ、カタログ番号５５５４１３）により、室温で３０分間染色した。赤く染色された細胞を、ＢＤ  ＰｈａｒｍＬｙｓｅ（ＢＤ、カタログ番号５５５８９９）を加えて溶解させ、サンプルを洗浄後、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製ＦＡＣＳｏｒｔフローサイトメーターで分析するためにＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。分析の直前に、生きている細胞と死んだ細胞を区別するためにヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（最終濃度０．１μｇ／ｍＬ）をサンプルに加えた。コントロールは、ＦＡＣＳバッファーとインキュベートした細胞のみ、未染色及び一色で染色されたサンプルを含む。それぞれのサンプルを３つずつ作成し、白血球の前方／側方散乱光（ＦＳＣＳＳＣ）ゲートの範囲内にあるＰＩ−ネガティブな事象を集めた。データは、ＷｉｎＭＤＩソフトウェアを用いて解析した。分析のために、生きた白血球を、ＣＤ４５によるポジティブ染色、ＰＩで染色されないこと、及びＦＳＣ／ＳＳＣ特性に基づいて同定した。それぞれのサンプルにおいて、これらの特性を有するＣＤ１９＋細胞の割合を同定した。データを、（％ＣＤ１９＋の平均値）±（標準偏差）という形式で表した。あるいは、ドナー間の比較を容易にするために、データを、最初のＣＤ１９＋細胞のうち生存しているものの割合（％）、すなわち、（％処理後に生存しているＣＤ１９＋白血球）／（％ＦＡＣＳバッファー中で処理したＣＤ１９＋白血球）×１００％という形式で表した。
【０３５９】
図１２は、Ｂ細胞の消失についての代表的データを表し、Ｉ３３２Ｅ変異体が、ＶＶ（高親和性）遺伝子型のＦｃγＲＩＩＩａレセプターを含む全血サンプル中で、ＲＩＴＵＸＡＮよりもより強力かつより大きな割合でＢ細胞を消失させることを示している。
【０３６０】
図１３は、Ｂ細胞の消失についての代表的データを表し、Ｉ３３２Ｅ変異体が、ＦＦ（低親和性）遺伝子型のＦｃγＲＩＩＩａレセプターを含む全血サンプル中で、ＲＩＴＵＸＡＮよりもより強力かつより大きな割合でＢ細胞を消失させることを示している。アッセイを、ＶＦ（異型）遺伝子型を示すＦｃγＲＩＩＩａレセプター又はＦｃγＲＩＩａレセプターのＨＨ、ＨＲ又はＲＲ遺伝子型を有する全血について行った場合にも、同様の結果が得られた（表３）。
【０３６１】
【表３】
2008502590.tif 000005
【０３６２】
図１４は、Ｂ細胞の消失についての代表的データを表し、Ａ３７８Ｄ変異体が、インビトロでのＡＤＣＣ及びＣＤＣアッセイにおいて同等又はより大きな活性を有する変異体よりも、期待に反してＢ細胞をより強力かつより大きな割合でＢ細胞を消失させることを示している。
【０３６３】
実施例３
変異体の親和性の決定
本実施例は、どのようにしてＦｃγＲＩＩＩａ（遺伝子型ＦＦ）と、野生型（又は親）Ｆｃ及びＩ３３２Ｅ変異体との相互作用の親和性（Ｋｄ）を決定したかを示す。
【０３６４】
ｉ．ＦｃγＲＩＩＩａ／ＩｇＧのＫｄ分析
ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（１５８Ｆ）可溶性細胞外ドメインを２９３細胞中で発現し、分子設計された６−ヒスチジンタグに結合するＮｉ−ＴＦＡカラムにより精製した。
【０３６５】
チューブ１本分のアズラクトンビーズ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ社製）を、炭酸水素ナトリウムバッファー（ｐＨ９．３）中で１ｍｇのＦｃγＲＩＩＩ（１５８Ｆ）と結合させた。スラリーを４℃で終夜撹拌し、ＰＢＳで２回洗浄後ブロッキングバッファー（１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４＋１％ＰＢＡ）により１時間室温でブロッキングした。ビーズをＰＢＳで３回洗浄し、０．０１％のアジ化物を含む５０ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。全て７．５ｎＭのＩｇＧ及び４μＭから１．９５ｎＭまで漸減させたＦｃγＲＩＩＩを含む１２の平衡物を反応バッファー（ＰＢＳ  ｐＨ７．４、０．１％ＢＳＡ、０．０１％アジ化物）中で調製し、１６時間室温下で平衡に到達させた。実験は全て、反応バッファー中、室温で流速０．５ｍｌ／分で行った。ＦｃγＲＩＩＩビーズをフローセルにパッキングした後、遊離のＩｇＧを最初の平衡物から捕捉した。その後ビーズを洗浄し、結合したＩｇＧを、ヤギ抗ヒトＦｃ（Ｆａｂ’）2−ＦＩＴＣコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を用いて検出した。この工程を残りの１１の平衡物についても繰り返し、Ｋｉｎｅｘａ  Ｐｒｏソフトウェアを用いた解析によりＫｄを決定した。このアプローチを用いて、ＦｃγＲＩＩＩ（遺伝子型ＦＦ）と、野生型（又は親）Ｆｃ及びＩ３３２Ｅ変異体との相互作用の親和性（Ｋｄ）が３８７ｎＭであり、変異体Ｉ３３２Ｅの親和性が５２ｎＭであると決定した。糖鎖修飾を行った抗体（ＧｎＴＩＩＩ）は８３ｎＭのＫｄを示し、組み合わせ変異体（Ｌ２５６Ｐ、Ｉ３３２Ｅ）は、２１ｎＭのＫｄ値を示した。
【０３６６】
実施例４
変異体のＣＤＣ活性の評価
本実施例では、どのようにして種々のＦｃ領域のＣＤＣ活性を決定したかについて述べる。
【０３６７】
ｉ．アッセイ
本アッセイは、Ｒａｍｏｓ（ＲＡ＃１）細胞（ＡＴＣＣ社カタログ番号ＣＲＬ−１５９６）上のヒト補体（Ｑｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐ．，カタログ番号Ａ１１３）を用いて行った。Ｒａｍｏｓ細胞を、１０％ＦＢＳを含むＧｉｂｃｏ社製ＲＰＭＩ１６４０培地中３７℃、５％ＣＯ2中で培養した。アッセイの前日に、Ｔ１７５フラスコ中に細胞を１×１０6個接種した。翌日、細胞を、１％ＦＢＳを含むフェノールレッド欠損ＲＰＭＩ１６４０中に、３．５７×１０5個／ｍｌとなるよう再懸濁した。Ｃｏｓｔｅｒ社製３９１７平底プレート中に、７０μｌ／ウェルずつ細胞を分注した。滴定曲線を得るために、変異性ＩｇＧをＲＰＭＩ１６４０培地中３倍連続希釈法により調製した。一点法ライブラリースクリーニングアッセイを行うために、一時的に培地の上澄中で発現させたＩｇＧ変異体を、ｍｏｃｋ培地で１μｇ／ｍｌに規格化した。３０μｌの変異性ＩｇＧ（最終濃度２００ｎｇ／ｍｌ）及び、ＲＭＰＩ１６４０＋１％ＦＢＳで１:５に希釈したヒト補体（Ｑｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐ．，カタログ番号Ａ１１３）５０μｌを、標的細胞に加え、穏やかにピペッティングすることにより混合した。プレートを３７℃、５％ＣＯ2存在下で１．５時間インキュベートした。１５μｌ／ウェルのアラマーブルー（Ｓｅｒｏｔｅｃ社カタログ番号ＢＵＦ０１２Ｂ）を加えた後、インキュベーションを終夜継続した。翌朝、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製ＥｎＶｉｓｉｏｎ２１００多標識リーダーを用いて、励起波長５６０ｎｍ、発光波長５９０ｎｍにおいて蛍光シグナルを測定した。
【０３６８】
ｉｉ．データの解析
一点法によるアッセイは、全て２回行った。それぞれのアッセイプレートは、ＩｇＧ非存在下でのヒト補体による標的細胞の自然溶解、及び１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００存在下での標的細胞の完全溶解のコントロール群を含む。３つの野生型コントロール群をそれぞれのアッセイプレートに含めておき、得られるＣＤＣシグナルを平均する。自然分解コントロール群から得られるバックグラウンド値を、それぞれのサンプルから差し引く。データを、蛍光シグナルから、自然溶解及び完全溶解コントロール群に対する特異的溶解の割合に変換した。特異的溶解の割合は、次の式により計算される。
（％特異的溶解）＝（蛍光シグナルの測定値−自然分解シグナル）／（最大分解シグナル−自然分解シグナル）×１００
３つの野生型コントロール群の平均値に対するＦｃ変異体の活性の割合を計算した。野生型コントロール群の平均値に対する２つのアッセイプレートについての活性の割合を平均し、それぞれのアッセイプレート間の標準偏差を計算した。
【０３６９】
図１１Ａ、Ｂ，及びＣは、ＩｇＧ変異体の滴定により得られた代表的ＣＤＣデータを示す。この実験において、Ｒａｍｏｓ細胞はＦｃ領域ＩｇＧの１アミノ酸又は２アミノ酸変異体並びにヒト補体の両者を用いて溶解された。アッセイプレートを３７℃、５％ＣＯ2の存在下で１．５時間インキュベートし、その後１５μｌのアラマーブルーを加え終夜インキュベートした。蛍光シグナルを測定し、ＩｇＧ濃度に対してプロットした。これらのデータより、野生型抗ＣＤ２０抗体に比べ、１アミノ酸変異体Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅの場合においてわずかにＣＤＣ活性が増加し（図１１Ａ）、Ｔ２５６Ｐ及びＳ４４０Ｙ（図１１Ｂ）、及びＴ２５６Ｐ及びＩ３３２Ｅの組み合わせ（図１１Ｃ）の場合には顕著に増加したことがわかった。変異体Ａ３７８Ｄの場合には、ＣＤＣ活性が減少した（図１１Ｃ及び表３）。
【０３７０】
実施例５
ＦｃＲｎの結合の評価
本実施例では、Ｆｃ新生児レセプター（ＦｃＲｎ）への変異性ＩｇＧの結合に対するアッセイについて述べる。丸底９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ）を、５０μｌ／ウェルの２μｇ／ｍｌニュートラビジン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社カタログ番号３１０００）５０ｍＭ炭酸バッファー（ｐＨ９．３）溶液を用いて、４℃で終夜コートした。結合していないニュートラビジンを除去し、プレートをＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。ビオチン標識した可溶性ＦｃＲｎの２．５μｇ／ｍｌＰＢＳ溶液を、５０μｌ／ウェルずつ加え、室温で１時間インキュベートした。その後、７５μｌのカゼインブロッキングバッファー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社カタログ番号３７５２８）をプレートに１時間加えた。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで洗浄し、５０μｌ／ウェルの変異性ＩｇＧでインキュベートした。
滴定曲線を得るために、変異性ＩｇＧをＦｃＲｎ結合バッファー（１００ｍＭ  ＮａＰＯ4、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、種々のｐＨ（６．０〜７．４））中で３倍連続希釈法により調製した。一点法スクリーニングを行うために、一時的に培地の上澄中で発現させた変異性ＩｇＧを、最終濃度５０ｎｇ／ｍｌ（ｐＨ７．４での結合については２００ｎｇ／ｍｌ）に規格化し、ｐＨを、ＦｃＲｎ結合バッファーを用いて６．０に調整した。以下のステップにおいて、同様のｐＨのＦｃＲｎ結合バッファーを用いてプレートの洗浄及び試薬の希釈を行った。結合反応を室温で１時間行った。３回洗浄後、結合したＩｇＧを、ヤギ（Ｆａｂ’）２抗ヒトＦａｂ−ＨＲＰコンジュゲートを用いて１時間で検出した。ＨＲＰ活性は、Ｐｉｅｒｃｅ’ｓ  ＨＲＰ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｕｒｂｏ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ、カタログ番号３４０２２）を用いて、５〜３０分で明らかにした。５０μｌの２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4を加えて反応を停止させ、４５０ｎｍにおける吸光度を、ＶＭＡＸマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。
【０３７１】
実施例６
抗ＣＤ２０−Ｉ３３２Ｅ  Ｆｃ変異体によるヒトの治療
インビトロでの研究及びマウス腫瘍モデル（Ｃｌｙｎｅｓ  ＲＡ他，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．６：４４３（２０００））より、ＡＤＣＣが、ＲＩＴＵＸＡＮ等の抗ＣＤ２０抗体の抗ガン効果において役割を果たしている証拠が得られた。ヒト患者を、抗ＣＤ２０−Ｉ３３２ＥＦｃ変異体抗体（図１５及び１６）、又はＲＩＴＵＸＡＮを用いて、Ｃａｒｔｏｏｎ他，Ｂｌｏｏｄ  ９９：７５４（２００２）（参照として本明細書に組み込まれる）に開示された方法と同様の方法により治療することができるかもしれない。例えば、Ａｎｎ−Ａｒｂｏｒの分類でステージＩＩ〜ＩＶの疾患を発症しており、少なくとも１つの測定可能な病巣を有し、ＧＥＬＦの基準による全身腫瘍組織量の低い患者には、４回の総用量が約３７５ｍｇ／ｍ2の、抗ＣＤ２０−Ｉ３３２Ｅ  Ｆｃ変異体又はＲＩＴＵＸＡＮを、静脈内注射により投与（１日、８日、１５日、及び２２日間）することができる。一次有効性エンドポイントは、客観的奏功率、すなわち、国際専門化委員会により最近提案された基準による完全寛解（ＣＲ）、未確認完全寛解（Ｃｒｕ）、又は部分寛解（ＰＲ）に至った患者の割合である。臨床反応は、２月目（Ｍ２）に評価することができる。患者の経過について１年経過時（Ｍ１２）において評価してもよい。
【０３７２】
Ｉ３３２Ｅ変異体によりもたらされる増大されたＡＤＣＣを定量できるように、効果Ｍ２及びＭ１２における、ＲＩＴＵＸＡＮ又は抗ＣＤ２０−Ｉ３３２Ｅ  Ｆｃ変異体患者の客観的奏功率を比較してもよい。同様の実施例を、他の抗ＣＤ２０変異体（例えば、Ｉ３３２Ｄ、Ｐ２４７Ｌ、Ａ３３０Ｋ、Ａ３３９Ｔ、Ａ３７８Ｄ、又は表１に示した組み合わせ）について繰り返すこともできる。
【０３７３】
さらに、変異体の向上した能力により、他の投与経路、注射の回数の減少、及び／又は少容量の投与が可能になる。
【０３７４】
本明細書において言及した全ての刊行物及び特許公報は、本明細書に参照として組み込まれる。記載された本発明の方法及びシステムの種々の改変及び変形は、当業者にとって、本発明の範囲及び精神から逸脱することのない明白なものであろう。本発明について特に好ましい実施形態と関連づけて記載したが、特許請求の範囲に記載の発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきものではないことは理解されるだろう。実際、記載された本発明の実施形式に対する、化学、及び分子生物学又は関連する分野の当業者にとって明白な改変は、特許請求の範囲内であることが意図される。
【配列表】
2008502590000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年6月12日(2006.6.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008502590000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年12月20日(2006.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親ヒト由来Ｆｃ領域の変異体又はその部分を含む抗体であって、該変異体が親Ｆｃ領域と比べ少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換がヒトＦｃ領域の２４７位にある抗体。
【請求項２】
該置換が、２４７Ｌ、２４７Ｈ及び２４７Ｉよりなる群から選ばれる、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
該変異性Ｆｃ領域の少なくとも１つのアミノ酸置換が２４７Ｉである、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
親Ｆｃ領域の変異体を含む抗体が、抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を、エフェクター細胞の存在下で、親Ｆｃ領域を含む抗体よりも効率的に媒介する、請求項１〜３のいずれか記載の抗体。
【請求項５】
該変異性Ｆｃ領域を含む抗体が、親Ｆｃ領域を含む抗体が同じアッセイを行った場合に相対ＡＤＣＣ特異的活性値１００を示す場合に、１００よりも大きい相対ＡＤＣＣ特異的活性値を示す、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
該親Ｆｃ領域の変異体を含む抗体が、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を、親Ｆｃ領域を含む抗体よりも効率的に媒介する、請求項１〜５のいずれか記載の抗体。
【請求項７】
該親Ｆｃ領域の変異体を含む抗体が、親Ｆｃ領域を含む抗体が同じアッセイを行った場合に相対ＣＤＣ特異的活性値１００を示す場合に、１００未満の相対ＣＤＣ特異的活性値を示す、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
該親Ｆｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥよりなる群から選ばれるクラスに属する、請求項１〜７のいずれか記載の抗体。
【請求項９】
該親Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４よりなる群から選ばれるサブクラスに属する、請求項１〜８のいずれか記載の抗体。
【請求項１０】
モノクローナル抗体である、請求項１〜８のいずれか記載の抗体。
【請求項１１】
２つの同一の重鎖ポリペプチド及び２つの同一の軽鎖ポリペプチドを含む、請求項１０に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１２】
ヒトＣＤ２０に特異的に結合する、請求項１〜１１のいずれか記載の抗体。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の抗体を含む、医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
ヒトには、５つのタイプの免疫グロブリンが存在することが知られている。これらの群はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥとして知られており、重鎖遺伝子のアイソタイプ（γ、μ、δ、α、及びε）に基づいて区別される。最も一般的なアイソタイプはＩｇＧであり、２つの同一な重鎖ポリペプチド及び２つの同一な軽鎖ポリペプチドよりなる。２つの重鎖はジスルフィド結合により互いに共有結合しており、それぞれの軽鎖はジスルフィド結合により重鎖に結合している。重鎖はそれぞれ約４４５のアミノ酸残基を含んでおり、軽鎖はそれぞれ約２１５アミノ酸残基を含んでいる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
重鎖はそれぞれ、通常可変領域（ＶＨ）、重鎖定常領域１（ＣＨ１）、重鎖定常領域２（ＣＨ２）、及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）と呼ばれる４つの異なるドメインを含んでいる。ＣＨ１及びＣＨ２ドメインは、Ｉｇに柔軟性をもたらすヒンジ領域（ドメイン間領域）によって結合されている。軽鎖はそれぞれ、軽鎖可変（ＶＬ）領域及び軽鎖定常（ＣＬ）領域と呼ばれる２つの異なるドメインを含んでいる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
ある実施形態において、本発明はポリペプチドを含む組成物を提供し、ポリペプチドはｉ）未修飾のヒトフレームワーク（例えば、改変を行っていないヒトフレームワーク）及びｉｉ）Ｆｃ領域変異体を含んでいる。ある実施形態において、該未修飾のヒトフレームワークは、ヒト生殖細胞系フレームワークである。他の実施形態において、本発明はポリペプチドを含む組成物を提供し、ポリペプチドは、ｉ）少なくとも１つのランダム化したＣＤＲ配列及びｉｉ）変異性Ｆｃ領域を含む。さらなる実施形態において、本発明はポリペプチドを含む組成物を提供し、該ポリペプチドは、ｉ）未修飾のヒトフレームワーク（例えば、ヒト生殖細胞系フレームワーク）、ｉｉ）少なくとも１つのランダム化したＣＤＲ配列、及びｉｉｉ）変異性Ｆｃ領域を含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３１】
本明細書で使用される場合において、「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を意味する。「Ｆｃ領域」は、Ｆｃ領域の天然配列であってもよく、又は変異性Ｆｃ領域であってもよい。広く受け入れられている免疫グロブリン重鎖におけるＦｃ領域の境界は変動しうるが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、通常２２６位のＣｙｓ又は２３０位のＰｒｏから、カルボキシル末端まで及ぶと定義されている。ある実施形態において、変異体はＦｃ領域の部分のみを含み、カルボキシル末端は含んでも含まなくてもよい。免疫グロブリンのＦｃ領域は、通常２つの定常領域、ＣＨ２及びＣＨ３を含んでいる。ある実施形態において、１又は複数の定常領域を含む変異体が意図されている。他の実施形態において、そのような定常領域を含まない（又はそのような定常領域の部分しか含まない）変異体が意図されている。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３５】
本明細書で使用される場合において、「天然配列Ｆｃ領域」又は「野生型Ｆｃ領域」という用語は、広く天然において見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を意味する。天然ヒトＦｃ領域の例には、天然配列ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域（ｆ及びａ，ｚアロタイプ）、天然配列ヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域、及び天然配列ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域並びに天然に存在するこれらの変異体が含まれる。他の配列も意図され、それらは種々のウェブサイト（例えば、ＮＣＢＩのウェブサイト）から容易に入手可能である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９９】
好ましい実施形態において、親ポリペプチドのＦｃ領域は、ヒトＦｃ領域、例えば、天然ヒトＦｃ領域ＩｇＧ１（ｆ及びａ,ｚアロタイプ）、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、及び任意の種について知られている又は発見された全てのアロタイプである。そのような領域は配列番号１〜８、配列番号９〜１２、及び配列番号３２〜３７に示した配列を有する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５１】
この実験においては、ＳＫＷ６．４細胞を、Ｆｃ領域ＩｇＧの１又は２アミノ酸変異体を用いた後、ＰＢＭＣを１５：１の比で加えることによりオプソニン化する。アッセイプレートを、３７℃で５％ＣＯ２の存在下約３時間インキュベート後、遠心分離する。上澄の部分を回収し、マイクロタイタープレートに移し、同容のＬＤＨ基質を加えることにより、上澄中のＬＤＨ活性を検出する。発色させた後、４９０ｎｍにおける吸光度を測定する。粗製ＩｇＧ上澄へのＬＤＨの混入によるバックグラウンドを測定し、これらのバックグラウンド値を、Ａ４９０の生データから差し引いて得られるデータは、野生型抗ＣＤ２０抗体と比べ、Ａ３３０Ｋ、Ａ３３０Ｒ及びＩ３３２Ｅ単一アミノ酸変異体のＡＤＣＣ活性が増大していることを示す。Ａ３３０Ｋ又はＡ３３０ＲとＩ３３２Ｅとの組み合わせ変異体では、さらにＡＤＣＣ活性が増大している。非特異的ＩｇＧは、これらのアッセイ条件下では特異性を示さない。Ｉ３３２変異体の活性は、糖化の改変（例えば、二分岐ＧｌｕＮＡｃの含有率の増大）によりさらに増大し得る。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５２】
細胞傷害の割合は、次の式により計算される。
（％細胞傷害）＝（測定値Ａ４９０−バックグラウンドＡ４９０）／（最大Ａ４９０−バックグラウンドＡ４９０）×１００
ここで、バックグラウンドＡ４９０は、ＩｇＧ非存在下でのエフェクター及び標的細胞から得られる。データは、Ｉ３３２Ｄ及びＩＩ３３２Ｅ変異体のＡＤＣＣ活性が野生型に比べ増大していることを示す。この実験で用いた標的細胞はＳＫＷ６．４であり、エフェクター細胞：標的細胞比１５：１を、標準的な３時間ＡＤＣＣアッセイにおいて用いた。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５３】
この特定の抗ＣＤ２０特異性を有するＡＤＣＣ活性と、Ｗｉｌ−２及びＳＫＷ６．４細胞系は、可変領域の親和性に無関係である。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５４】
推定膜貫通ドメインの代わりに、Ｃ末端に６−ｈｉｓタグを有するヒトＦｃγＲＩレセプター（ＣＤ６４）をＨＥＫ−２９３Ａ細胞中で発現させ、Ｎｉカラムを用いて精製した。レセプターをＥＬＩＳＡプレート上に塗布し、４℃で終夜放置後、プレートを、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋを用いてブロックした。ブロッキング及び洗浄後に、ＩｇＧ希釈液を調製しレセプターを塗布したプレートに加え、３７℃で２時間インキュベートした。結合していないＩｇＧを洗浄により除去し、結合した抗体を、１：１０００の、アルカリホスファターゼをコンジュゲートした抗ヒトκ型二次抗体を用いて検出した。洗浄後、ホスファターゼ基質（一リン酸フェノールフタレイン）（ＰＰＭＰ）（ＪＢＬ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を加え、５６０ｎｍにおける吸光度を、ＶＭＡＸ  マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ社、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて比色定量法により決定することにより、結合したＩｇＧを検出した。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５９】
Ｉ３３２Ｅ変異体は、ＶＶ（高親和性）遺伝子型のＦｃγＲＩＩＩａレセプターを含む全血サンプル中で、ＲＩＴＵＸＡＮよりもより強力かつより大きな割合でＢ細胞を消失させる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６０】
Ｉ３３２Ｅ変異体は、ＦＦ（低親和性）遺伝子型のＦｃγＲＩＩＩａレセプターを含む全血サンプル中で、ＲＩＴＵＸＡＮよりもより強力かつより大きな割合でＢ細胞を消失させる。アッセイを、ＶＦ（異型）遺伝子型を示すＦｃγＲＩＩＩａレセプター又はＦｃγＲＩＩａレセプターのＨＨ、ＨＲ又はＲＲ遺伝子型を有する全血について行った場合にも、同様の結果が得られた（表３）。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６２】
Ａ３７８Ｄ変異体は、インビトロでのＡＤＣＣ及びＣＤＣアッセイにおいて同等又はより大きな活性を有する変異体よりも、期待に反してＢ細胞をより強力かつより大きな割合でＢ細胞を消失させる。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６９】
ＩｇＧ変異体の滴定により代表的ＣＤＣデータを得た。この実験において、Ｒａｍｏｓ細胞はＦｃ領域ＩｇＧの１アミノ酸又は２アミノ酸変異体並びにヒト補体の両者を用いて溶解された。アッセイプレートを３７℃、５％ＣＯ２の存在下で１．５時間インキュベートし、その後１５μｌのアラマーブルーを加え終夜インキュベートした。蛍光シグナルを測定し、ＩｇＧ濃度に対してプロットした。これらのデータより、野生型抗ＣＤ２０抗体に比べ、１アミノ酸変異体Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅの場合においてわずかにＣＤＣ活性が増加し、Ｔ２５６Ｐ及びＳ４４０Ｙ、及びＴ２５６Ｐ及びＩ３３２Ｅの組み合わせの場合には顕著に増加したことがわかった。変異体Ａ３７８Ｄの場合には、ＣＤＣ活性が減少した。
【国際調査報告】
2008502590.tif 000027
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2008502590.tif 000029
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