(57)【要約】  医療装置の部位において局在化した繊維症を減らすための医療装置及び方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材;及び
基材と結合した活性剤、
を含んで成る医療装置であって、ここで当該活性剤はコラーゲン-生産細胞生産中でのTLH 酵素の生産及び/又は活性を抑制する装置。
【請求項２】
前記活性剤がTLH阻害物質、PLOD2阻害物質、又はその両方である、請求項１に記載の医療装置。
【請求項３】
前記活性剤が小有機分子である、請求項１に記載の医療装置。
【請求項４】
前記活性剤が、ミノキシジル、硫酸ヘパラン、及びそれらの擬態からなる群から選択される小有機分子である、請求項3に記載の医療装置。
【請求項５】
前記活性剤が、ミノキシジル又は硫酸ミノキシジルである、請求項４に記載の医療装置。
【請求項６】
移植可能装置である請求項１に記載の医療装置。
【請求項７】
体外装置である請求項１に記載の医療装置。
【請求項８】
ステント、ステントグラフト、 吻合コネクター、リード、針、ガイドワイヤ、カテーテル、センサー、外科的器具、血管形成術葉バルーン、創傷ドレイン、シャント、管、尿道挿入物、ペレット、移植物、血液酸素発生器、ポンプ、代用血管、血管アクセスポート、心臓弁、縫合糸、外科用クリップ、外科用ステープル、ペースメーカー、整形外科装置、髄核のための代替装置、及び眼内レンズからなる群から選択される請求項１に記載の医療装置。
【請求項９】
前記基材がポリヌクレオチドデリバリーマトリクスを含んで成る、請求項１に記載の医療装置。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドデリバリーマトリクスが、アンチセンス、リボザイムPLOD2遺伝子と干渉し且つTLH酵素の翻訳を阻害するsiRNA分子をコードするDNAを含んで成る、請求項９に記載の医療装置。
【請求項１１】
対象者へ活性剤をデリバリーするための方法であって、当該方法は：
基材；及び
基材と連結した活性剤、
を含んで成る医療装置を提供し、ここで当該活性剤は、コラーゲン生産細胞中TLH酵素の生産及び/又は活性を抑制し；そして
当該医療装置をコラーゲン生産細胞と接触するように対象者中へ配置する方法。
【請求項１２】
前記活性剤がTLH阻害物質、PLOD2阻害物質、又はその両方である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記活性剤が小有機分子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記活性剤が、ミノキシジル、硫酸ヘパラン、及びそれらの擬態からなる群から選択される小有機分子である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記活性剤が、ミノキシジル又は硫酸ミノキシジルである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
移植可能装置である請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
体外装置である請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記医療装置が、ステント、ステントグラフト、吻合コネクター、リード、針、ガイドワイヤ、カテーテル、センサー、外科的器具、血管形成術葉バルーン、創傷ドレイン、シャント、管、尿道挿入物、ペレット、移植物、血液酸素発生器、ポンプ、代用血管、血管アクセスポート、心臓弁、縫合糸、外科用クリップ、外科用ステープル、ペースメーカー、整形外科装置、髄核のための代替装置、イヤーチューブ、及び眼内レンズから選択される請求項１１に記載の医療装置。
【請求項１９】
前記基材がポリヌクレオチドデリバリーマトリクスを含んで成る、請求項１１に記載の医療装置。
【請求項２０】
前記ポリヌクレオチドデリバリーマトリクスがアンチセンス、リボザイム、又はPLOD2遺伝子と干渉し且つTLH酵素の翻訳を阻害するsiRNA分子をコードするDNAを含んで成る、請求項１９に記載の医療装置。
【請求項２１】
活性剤を含むマトリクス中に埋め込まれた医療装置であって、当該活性剤が、コラーゲン生産細胞中のTHL酵素の生産及び/又は活性を抑制する装置。
【請求項２２】
前記活性剤を含むマトリクスがポリヌクレオチドデリバリーマトリクスである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリヌクレオチドデリバリーマトリクスが、アンチセンス、リボザイム、又はPLOD2遺伝子と干渉し且つTLH酵素の翻訳を阻害するsiRNA分子をコードするDNAを含んで成る、請求項２２に記載の医療装置。
【請求項２４】
前記ポリヌクレオチドデリバリーマトリクスが、PLOD2遺伝子と干渉し且つTLH酵素の翻訳を阻害するsiRNA分子をコードするDNAを含んで成る、請求項２３に記載の医療装置。
【請求項２５】
前記ポリヌクレオチドデリバリーマトリクスが、PLOD2遺伝子と干渉し且つTLH酵素の翻訳を阻害するsiRNA分子を含んで成る、請求項２２に記載の医療装置。
【請求項２６】
対象者において医療装置の部位で繊維症組織形成を低減する方法であって、当該医療装置の部位における局在化した組織領域へ、コラーゲン-生産細胞生産中のTLH酵素の生産 及び/又は活性を抑制する活性剤を投与することを含んで成る方法。
【請求項２７】
前記医療装置が活性剤をデリバリーする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記活性剤を医療装置上にコーティングする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記医療装置を活性剤を含むマトリクス中に埋め込む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記活性剤を含むマトリクスがポリヌクレオチドデリバリーマトリクスである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記ポリヌクレオチドデリバリーマトリクスが、アンチセンス、リボザイム、PLOD2遺伝子と干渉し且つTLH酵素の翻訳を阻害するsiRNA分子をコードするDNAを含んで成る、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ポリヌクレオチドデリバリーマトリクスが、PLOD2遺伝子と干渉し且つTLH酵素の翻訳を阻害するsiRNA分子をコードするDNAを含んで成る、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ポリヌクレオチドデリバリーマトリクスがPLOD2遺伝子と干渉し且つTLH酵素の翻訳を阻害するsiRNA分子を含んで成る、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記活性剤が小有機分子である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
前記活性剤が、ミノキシジル、ヘパラン硫酸及びそれらの混合物から選択される小有機分子である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記医療装置が移植可能装置又は体外装置である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
前記医療装置が、ステント、ステントグラフト、吻合コネクター、リード、針、ガイドワイヤ、カテーテル、センサー、外科的器具、血管形成術葉バルーン、創傷ドレイン、シャント、管、尿道挿入物、ペレット、移植物、血液酸素発生器、ポンプ、代用血管、血管アクセスポート、心臓弁、弁形成リング、縫合糸、外科用クリップ、外科用ステープル、ペースメーカー、整形外科装置、髄核のための代替装置、及び眼内レンズから選択される請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、米国仮出願第60/589,700号（2004年７月21日に提出され、その全体は本願明細書中、参照によって組み込まれている）の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
背景
医療装置の移植は、移植の失敗につながりうる、血管形成に乏しい繊維性被膜の形成をもたらす。移植により、宿主の好中球、マクロファージ、及びリンパ球は装置表層へ移動してサイトカイン及び他のタンパク質を放出する。これらの分子の放出により、局所細胞によるコラーゲン生産及び周囲組織から物質を囲い込む物質周辺の繊維性被膜形成をもたらすプロセスのカスケードを促す。このプロセスは、ほぼ全ての移植された物質に反応して発生する外来高原としても知られている。様々な、可能性のある治療法が提案され且つ調査されているが、有効な治療法はない。
【０００３】
従って、繊維性取り込みを低減し且つ予防さえもする適切な他の方法を発見することが望まれている。
【発明の開示】
【０００４】
発明の概要
本発明は、医療装置及びその使用に関連する。本発明の医療装置には、対象者においてコラーゲン生産細胞中でのテロペプチドリシルヒドロキシラーゼ (TLH)酵素(好適に、ヒトTLH酵素)の生産及び/又は活性を抑制する活性剤を有する基材を含む。かかる医療装置は、TLH酵素活性の結果である、コラーゲンの異常な架橋(及び結果的に繊維症組織の形成)を低減すること、及び好適に除去することをともなう。かかる架橋は典型的に、医療装置と対象者の組織が接触する部位で生ずる。
【０００５】
従って、本発明は、TLH酵素の生産及び/又は組織に対する活性を組織の直面(immediate interface)で抑制する活性剤並びに医療装置(活性剤の源であってもなくても良い)を提供する。
【０００６】
本発明の一つの実施態様において、医療装置であって、基材及び基材と結合した活性剤を含む装置を提供し、ここで当該活性剤は、コラーゲン-生産細胞生産中でのTLH酵素の生産及び/又は活性を抑制する。活性剤は、医療装置の表層及び周囲組織へ直接、当該活性剤を局所デリバリーすることを可能にする態様で「基材と結合している」。
【０００７】
本発明はまた、活性剤を対象者へデリバリーする方法を供し、当該方法は:基材並びに当該基材と結合しているコラーゲン-生産細胞生産中でのTLH酵素の生産及び/又は活性を抑制する活性剤を提供し;当該医療装置をコラーゲン-生産細胞との接触するよう対象者中へ配置することを含んで成る。
【０００８】
従って、本発明の所定の方法において、活性剤を含む組成物が医療装置自体(活性剤は医療装置と結合している)を使用することで医療装置の部位へデリバリーされて良い。代替的に、活性剤は、様々な他の方法を使用することで医療装置の部位へデリバリーできうる。しかし、活性剤は、当該活性剤が、コラーゲン生産細胞と局在化した組織領域内で医療装置と接触するようにデリバリーされる。すなわち、活性剤は、医療装置の表層及び周囲組織へデリバリーされる。
【０００９】
一つの実施態様において、本発明は、対象者において医療装置の部位での繊維症組織形成を低減する方法を供する。当該方法は、医療装置の部位で局在化した組織領域へ、コラーゲン-生産細胞生産中でのTLH酵素の生産及び/又は活性を抑制する活性剤をデリバリーすることを含む。医療装置は活性剤をデリバリーすることができる又は当該活性剤は、代替装置(例えば、スポンジ、フィルム、シート、パッチ、又はカフ、及びポンプ、カテーテル)又は組成物を使用することで所定の部位へデリバリーされて良い。本明細書中、医療装置の部位へデリバリーすることとは、活性剤を医療装置の表層及び周囲組織へデリバリーすることを意味する。
【００１０】
一つの実施態様において、活性剤を含むマトリクス中に埋め込まれた医療装置を提供し、ここで活性剤はコラーゲン-生産細胞生産中でのTLH酵素の生産及び/又は活性を抑制する。所定の実施態様において、活性剤を含むマトリクスはポリヌクレオチドデリバリーマトリクスである。所定の実施態様において、ポリヌクレオチドデリバリーマトリクスとしては、PLOD2遺伝子(好適に、ヒトPLOD2遺伝子)と干渉し且つTLH酵素の翻訳を阻害するsiRNA分子、リボザイム、アンチセンスをコードするDNA又はTLH酵素の生産又はプロセシングにかかわるタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。
【００１１】
表現「TLH酵素の生産及び/又は活性を抑制する活性剤」とは、THL酵素の生産を予防又は低減する物質(例えば、小有機化合物、DNA、RNAなど)、もしくはTLH酵素の活性を予防又は低減する、もしくはTLH酵素の活性及び生産の両方に影響を与える物質を意味する。これは、TLH酵素もしくTLH酵素をコードするPLOD2遺伝子を又はTLH酵素の生産もしくはプロセシングにかかわるタンパク質もしくは遺伝子を直接ターゲッティングすることによって生ずる。
【００１２】
本明細書中、PLOD2遺伝子又はTLH酵素を参照される場合、参照は典型的にヒト遺伝子及び酵素の配列に対してなされるが、他の種のPLOD2遺伝子及びTLH 酵素の配列も適宜含まれる。かかる配列は、World Wide Web ncbi.nlm.nig.govのNCBI データベースに開示されており、詳細には、ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=Display&DB=nucleotideに開示されている。
【００１３】
表現「基材と結合した活性剤」とは、一又は複数の活性剤が、医療装置の一部を形成する基材と混合されている、結合している、さもなければ親密に関連していることを意味する。活性剤が医療装置と結合する手段とは、活性剤がコラーゲン-生産細胞へ溶出され且つ暴露し、コラーゲンの異常な架橋を減少させる又は予防することを提供する限り限定されない。
【００１４】
「対象者」とは、本発明の活性剤が投与されて良い生物を意味する。好適に、対象者は哺乳動物又は哺乳類細胞の例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、猿人類、サル、ブタ、イヌ、ネコなどが挙げられる。一層好適に、対象者はヒトである。
【００１５】
本明細書中で使用された場合、「細胞」とはその通常の生物学的な意味において使用されており、そして多細胞生物全体を意味するのではない。細胞は、ヒト中に存在していて良いが、哺乳類の例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、猿人類、サル、ブタ、イヌ、ネコなどであって良い有機体である。しかし、小干渉RNA、アンチセンス、又はリボザイム分子を生産するいくつかの段階は、原核細胞(例えば、細菌細胞)又は真核細胞(例えば、哺乳類細胞)を使用することが必要となり、従って、用語「細胞」をも含む。
【００１６】
用語「相補的」とは、一又は複数のポリヌクレオチド(DNA又はRNA)が、一又は複数の ポリヌクレオチドなど他の分子と典型的な Watson-Crick対合又は他の典型的なタイプの対合によって水素結合(即ち、ハイブリダイズして且つ二倍体を形成する)を形成できることである。相補的ヌクレオチド配列には、完全相補的ヌクレオチド配列に加えて、参照配列に比較して一又は複数の塩基の欠失又は付加を含む実質上相補的ヌクレオチド配列を含み、与えられた相補的ヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列とハイブリダイズする能力を維持していることも理解できるだろう。
【００１７】
用語「発現」とは、遺伝子がRNAへ書き換えられ(転写);当該RNAは更に成熟小干渉RNA、アンチセンス、又はリボザイム分子へとプロセシングされて良い。
【００１８】
用語「発現ベクター」は、宿主中へと形質転換され挿入された配列を 発現できるようにするために設計されたベクター又はビヒクルを規定する。クローン化された遺伝子(挿入配列)は通常、例えばプロモーター配列としてコントロールエレメント配列のコントロール下に配置される。クローン化された遺伝子のかかるコントロール配列下の配置は往々にして、コントロールエレメント又は配列に対して作用可能式に結合していることに言及される。
【００１９】
用語「阻害」又は「阻害性」とは、標的遺伝子の活性もしくはmRNAの量又は同等の標的遺伝子をコードするRNAの量が、提供された小干渉RNA、リボザイム、又はアンチセンス分子の不在下で確認されるよりも減ったことを意味する。好適に、阻害率は、小干渉RNA、リボザイム、又はアンチセンス分子の不在よりも少なくとも10%少ない、25%少ない、50%少ない、又は75%少ない、85%少ない、95%少ないことを意味する。
【００２０】
用語「ポリヌクレオチド」とは、本明細書中で使用した場合、任意の長さのヌクレオチドを有する分子、リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドを意味する。この用語は、往々にして核酸又は核酸分子と同義的に使用される。ポリヌクレオチドは、一本、二本又は複数の鎖であって良く且つ修飾もしくは未修飾ヌクレオチドもしくは非ヌクレオチドもしくはそれらの様々な混合物及び組み合わせであって良い。それにはDNA又はRNAが含まれる。本発明のポリヌクレオチドの例は、それがタンパク質の産物をコードするための複数の共通する手段を有するための必ずしも必要でなくとも、小干渉RNAをコードする遺伝子を意味する。
【００２１】
「RNA」とは、リボ核酸、リン酸塩-リボース(糖)骨格により連結したリボヌクレオチドからなる分子を意味する。「リボヌクレオチド」とは、グアニン、シトシン、ウラシル、もしくはアデニン又はβ-D-リボ-フラノース成分の2'位においてヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。当業者に周知のように、遺伝暗号はチミヂンをDNA配列中の塩基として、そしてウラシルをRNA中の塩基として使用する。当業者は、記載のポリヌクレオチド中、ウラシルでチミジンを置換して記載のDNA配列を記載のRNA配列へどのようにして転換するか、又はその逆を知っている。
【００２２】
「小干渉RNA」とは、基材結合領域中、所定の遺伝子標的に対して相補性を有し、宿主細胞中、酵素を特異的に誘導して標的RNAを解裂させる働きをするポリヌクレオチドを意味する。すなわち、小干渉RNAとは、その配列に対する特異性及びそのRNA標的に対するその相同性が理由で、RNA鎖の解裂をもらし且つそれによってRNA分子がもはや転写できなくなるのでそれを不活性化することができる。これら相補的領域は、小干渉RNAの標的RNAへの十分なハイブリダイゼーションを可能にし、従って解裂を可能にする。100％相補性が生物活性のために必要であり且つ好まれるが、90%程度の低さの相補性も本発明において有用でありうる。本願に記載の特異的小干渉RNAは、限定されることなく且つ当業者は小干渉RNAにおいて重要なことは、それが一又は複数の標的核酸領域に対して相補的である特異的基材結合部位を有するということを理解するだろう。
【００２３】
小干渉RNAは、標的RNA(一般にメッセンジャーRNA)の一部に対する相補性（即ち、塩基を形成できる）を有す二本鎖RNA剤である。一般に、かかる相補性は100%であるが、もし望まれれば、例えば少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%を意味する。例えば、21塩基中19塩基が塩基対を形成して良い。いくつかの場合、様々なアレル変異体間での選択が望まれる場合、標的遺伝子に対しての100%相補性は、他のアレル配列から標的配列を効率的に区別するために必要となる。アレル標的間で選択する場合、長さの選択も重要な因子であり、名座ならそれは％相補性に関連する他の因子であり且つアレルの違いを区別する尾能力に関連するからである。
【００２４】
小干渉RNA配列は、相補的塩基対合反応により小干渉RNAと標的RNAを一緒にもたらすのに十分な長さのものである必要がある。本発明の小干渉RNAは、様々な長さであって良い。小干渉RNAの長さは、好適に10ヌクレオチド以上であり且つ標的RNAとの安定な反応に十分な長さ;詳細に、15〜30ヌクレオチド;一層詳細に、任意の整数の15〜30ヌクレオチド、例えば15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、及び30であって良い。「十分な長さ」とは、予期された条件したで目的の機能を提供するために十分な長さのものである15ヌクレオチド以上のポリヌクレオチドを意味する。用語「安定に反応する」とは、小干渉RNAと標的ポリヌクレオチド(例えば、生理条件下で標的中、相補的ヌクレオチドと水素結合を形成する)の相互作用を意味する。
【００２５】
用語「含んで成る」及びそれの変形は、詳細な説明及び特許請求の範囲で使用された場合、限定的な意味を有さない。本明細書中で使用した場合、「a」、「an」、「the」、「少なくとも一つ」及び「一又は複数の」は同義的に使用されている。
【００２６】
従って、例えば、活性剤を含んで成る組成物は、「一又は複数の」活性剤を含む組成物と解することができる。類似して、基材を含んで成る医療装置は、「一又は複数の」基材を含む組成物を意味すると解することができる。更に、「組成物」とは、本明細書中で使用した場合、任意の他の成分(例えば、医薬的に許容できる担体)を伴わず、たった一つの活性剤からなることができる。
【００２７】
そしてまた、本明細書中、端点における数値範囲の引用は、その範囲内で従属する全ての数を含む(例えば、1〜5は、1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5を含むなど)。
【００２８】
本発明の上記概要は、本発明の開示された実施態様又は全ての実施を意味するものではない。以下の記載は、一層詳細に例示となる実施態様を例示する。本願のいくつかの場合において、教示は様々な組み合わせにおいて使用されて良い例の列挙を通じて提供されている。各場合、引用されたリストは、代表的な集団としてのみ働き且つ絶対的なリストとして解されるべきではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明は、医療装置及びその使用に関連する。本発明の医療装置は、TLH 酵素の生産及び/又は活性(好適に,ヒトTLH)を対象者(好適に、ヒト)のコラーゲン生産細胞中で抑制する活性剤と関連して有する基材を含む。一又は複数の活性剤は、多くの手段によって基材「と連結している」。例えば、活性剤は、ポリマー基材中に組み込まれて良く且つ医療装置上にコーティングされてよいかあるいは、活性剤は、医療装置の本体を形成するマトリクス中に組み込まれて良いかあるいは、医療装置の一部を形成する基材へ結合させられていて良い。従って、活性剤が医療装置と連結する手段は、医療装置の一部を形成する様々なコーティング、パウチ、スポンジなどにおよぶ。活性剤が医療装置と連結する装置は、活性剤が溶解してコラーゲン-生産細胞へ暴露し、従ってコラーゲンの異常な架橋を減らす又は予防する限り限定されない。かかる接触は、医療装置がコラーゲン-生産細胞と接触するとすぐに又は幾分遅れて(例えば、初期ラグタイムの後、活性剤が装置から溶出する)生ずる。医療装置と活性剤の連結の様々なかかる手段が当業者に周知であり、そして当業者に容易に理解されるだろう。
【００３０】
所定の実施態様において、医療装置は、そこに連結した活性剤を有しても有さなくても良い。例えば、所定の代替的な実施態様において、活性剤は、医療装置の直接の一部でなくて良い。かかる実施態様において、活性剤を含む組成物は、医療装置局在化した組織領域内で医療装置(即ち、医療装置内に局在化した組織領域が位置する)と接触しているコラーゲン-生産細胞と接触するように、医療装置の部分へデリバリーされて良い。従って、活性剤は、医療装置の表層及び周囲組織へ、直接又は間接的のいずれかにデリバリーされる。
【００３１】
コラーゲンにおいて、架橋は、テロペプチドの特異的なリシン(Lys)又はヒドロキシリシン(Hyl)残基がリシリルオキシダーゼによって細胞外でアルデヒドアリジン及びヒドロキシアリシンへそれぞれ転換された後にのみ開始される。これらのアルデヒドは続いて、三重らせんのLys、Hyl、又はヒスチジル残基と反応する。
【００３２】
テロペプチド中の残基がLys(アリシン経路)であるかあるいはHyl(ヒドロキシアリシン経路)に依存して、架橋の形成の経路が２通りある。アルデヒドは、近接する隣接分子上の特異的Lys又はHyl残基において三重らせん領域で反応して３官能性架橋へと成熟する二官能性中間体を形成する。この２つの経路は異なる種類の架橋をもたらす。ヒドロキシアリシン経路に由来する二官能性架橋のみが三官能性架橋HP及びLPへと成熟することができる。
【００３３】
コラーゲンの異常な架橋、即ち、アリシン誘導架橋を犠牲にしたヒドロキシアリシン-誘導架橋の増加が繊維組織の形成において生じ、例えば皮膚の異常な治癒、例えば、多量のヒドロキシアリシン誘導架橋を含む肥大性の瘢痕において確認されるメカニズムである。
【００３４】
これらの種類の架橋が優勢であることは、角膜基質の損傷後に生産されたコラーゲン中にも発見され;生ずる瘢痕は、異常に増加した量のヒドロキシアリシン誘導架橋をアリシン 架橋を犠牲にして有することが発見された。異常な瘢痕における増加したヒドロキシアリシン-誘導架橋の研究により確認され、しかる後に他の疾患におけるヒドロキシアリシン誘導架橋の増加が(主に繊維)疾患の、例えば、様々な肺疾患(呼吸窮迫症候群、突発性肺繊維症、呼吸細気管支炎及びブレオマイシン誘導肺繊維症)、慢性アドリアマイシン腎症(非免疫性糸球体硬化症及び間質性繊維症をもたらす実験モデル)、心筋の梗塞瘢痕、間接硬縮、血管狭窄、脂肪皮膚狭窄（lipodermatosclerosis）、輪状大動脈拡張症、Dupuytren疾患の繊維性病変、脂肪タンパク質症を伴う患者の皮膚、糖尿病、クロモブラストミコーシス感染症による皮膚繊維症、骨格筋損傷、腱肥大症及び様々な肝臓疾患の、例えば、多方条虫症(濃厚且つ付加逆性繊維症)、血球細胞がん、アルコール性肝硬変もしくはウィルス性肝炎により誘導された肝硬変又はマンソン住血吸虫による肝硬変における肝臓疾患について報じられた。このようなコラーゲンの異常な架橋並びにTLH酵素及びPLOD2遺伝子が関係するメカニズムはU.S. Pat. Pub. 2003/0219852 (Bank et al.)に記載されている。
【００３５】
ヒドロキシアリシン経路により架橋したコラーゲンは、アリシン経路により架橋したコラーゲンよりも分解するのが難しく、何故なら、ヒドロキシアリシンに基づく架橋は、アリシンに基づく残基によって架橋したコラーゲンよりもタンパク質分解に対して感受性が少ないからである。従って、テロペプチドリシンをテロペプチドヒドロキシルリシンの変わりに含むコラーゲンの生産、又は代替的にテロペプチドリシルヒドロキシラーゼを、ヒドロキシアリシン架橋を代償にしてアリシン架橋の形成を増強するに応じて阻害することが、対象者において医療装置の部位で医療装置の繊維組織による包み込みの形成を減らす本発明の目的である。Bank et al. in U.S. Pat. Pub. 2003/0219852は、繊維性病変の一つの特徴は、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼ(TLH)の上方制御であると結論付けた。PLOD2、テロペプチドリシルヒドロキシラーゼをコードする遺伝子は、様々な繊維性疾患に関連して細胞において発現していることが示された。様々な種に由来するPLOD2遺伝子の配列がWorld Wide Web ncbi.nlm.nig.gov. NCBI データベースに開示されている。
【００３６】
しかし、Bankらは、PLOD2の上方制御のメカニズム及びTLHが一連の主に繊維性疾患でオペラントであることを記載するが、彼らは移植した医療装置に関連した繊維による包み込みに関して記載していない。医療装置の移植に関連する傷を治癒する反応は(FBR)とよばれるが、通常の傷を治癒する反応と特徴を多く共有している、又はBankらが述べた位置又は複数の繊維性疾患に関連した治癒反応について、それは様々な特徴的な観点を有する。
【００３７】
移植手順により傷害に対する反応が始まり且つ治癒を生み出すためにメカニズムが活性化される。移植される物質のサイズ、形状並びに化学的及び物理的特長は、炎症及び傷治癒過程の様々な強度及び持続時間の原因となる(例えば、Andersonら, Cardiovasc. Pathol., 2:33S-41S, (1993)を参照のこと)。局所及び全身因子は、移植された物質に対する傷治癒反応において重要な役割を果たしうる。局所因子には、移植の部位(組織又は器官)、十分な血液供給、及び感染の可能性が挙げられる。全身因子としては、栄養、血液学的及び免疫学的異常、グルココルチカルステロイド(glucocortical steroids)、及び既存の疾患の例えば、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、及び感染症が挙げられる。移植される物質のサイズ、形状及び化学的及び物理的特長が、治癒反応の結果に影響を及ぼす強力な結果は、 S.D. ElekとP.E. Conen in 1957 (Elek et al., Br. J. Exp. Pathol., 38:573-586, (1957))によって刊行された古典的な論文によって説明されて良く、それは、縫合部のう胞モデルにおけるシルク縫合糸によるスタフィロコッカス感染症の強力な増強を示した。シルク縫合糸の不在下で1億の黄色ブドウ球菌(S. aureus)微生物が皮下に注射されても感染症を引き起こさなかっただろうし、100微生物程度の少なさの初期細菌接種は、縫合糸の存在下では、巨大な膿瘍を十分に形成できただろう。感染症に焦点が集まる一方で、古典的な論文は、移植された物質が存在することが、どのようにして、移植された物質の存在下で生ずるものとは有意に異なる異物反応を引き起こす局所微生物環境に影響をあたえるのかを劇的に示す。
【００３８】
従って、例えば, 肝硬変、皮膚繊維症、腎繊維症に関連した繊維症の発生のメカニズムは、最終的に、装置に関連した繊維症の発生とオペラントであっただろうと予測することができない。概して、生体材料介在炎症反応(例えば、装置に関連した繊維症)に内在するメカニズムは、依然として大部分が未知のままである。一般に、装置移植に対する炎症反応の主たる引き金は、タンパク質の瞬間的な沈着であることが受け入れられている。沈着したタンパク質層の性質は、物質表層の化学的及び物理的特長に依存する。吸着されたタンパク質が食細胞の誘引の引き金となり、そして沈着したタンパク質層の性質が、前記食作用によって放出されるサイトカインの濃度と種類を決定する。放出されたサイトカインの組成が、生物材料に関連した炎症反応の最終的な結果及び医療装置が有害な反応の例えば、炎症反応(いわゆる異物巨大細胞-主要な顕著なFBR証明を含んで成る)又は繊維による囲い込みに関連する程度を決定する。
【００３９】
従って、装置に関連した組織反応が、正常な傷治癒の典型的な段階における一般的な意味を共有しない一方で、内在するコントロールメカニズム、即ち、傷ついた床（wound bed）において放出されるプロ-及び抗-炎症性サイトカインの型及び量は、全く異なって良く且つ異なるようだ。
【００４０】
しかしながら意外にも、本明細書中で提示された結果は、コラーゲン-生産細胞生産中でのTLH酵素の生産及び/又は活性を抑制する活性剤の使用は、医療装置及び周囲組織の表層において繊維症の形成を予防及び/又は減少させることにおいて有用でありうる。従って、医療装置の表層におけるコラーゲン生産細胞がヒドロキシルリシンの代わりにテロペプチドリシンを含むコラーゲンを生産する、又はテロペプチドリシルヒドロキシラーゼの生産及び/又は活性を阻害すること、ヒドロキシアリシン誘導架橋の代償としてアリシン誘導架橋の形成を増強することを達成することが本発明の目的である。このことは、医療装置を囲い込む繊維組織の形成を減らす又は予防することをもたらす。これは、TLH阻害物及び/又はPLOD2阻害物の使用により達成されて良い。
【００４１】
従って、本発明の好適な実施態様は、対象者において医療装置の部位で繊維組織の形成(即ち、移植された医療装置の繊維による取り囲み)を減らす又は予防する方法を供する。医療装置の部位で局在化した組織領域へ、コラーゲン-生産細胞中でTLH酵素の生産を抑制する活性剤をデリバリーすることを含む。医療装置は活性剤をデリバリーすることができるかあるいは活性剤は、所定の部位へ、代替装置(例えば、スポンジ、フィルム、シート、パッチ、又はカフ、及びポンプ、カテーテル)又は組成物を使用することでデリバリーされる。本明細書中、医療装置の所定の部位へのデリバリーとは、医療装置の表層及び周囲組織へのデリバリーを意味する。
【００４２】
活性剤
コラーゲン-生産細胞中でTLH酵素(好適に、ヒトTLH 酵素)の生産及び/又は活性を抑制する活性剤は、TLH阻害物もしくはPLOD2阻害、又はその両方であって良い。即ち、活性剤は、様々なメカニズムにより、活性部位などを遮断することによって、TLH酵素の生産及び/又は活性を阻害する働きができる。これは、TLH酵素の生産又はプロセシングに関連するタンパク質の生産及び/又は活性を阻害することを含む。代替的に、活性剤は、アンチセンス, RNA干渉、及びリボザイム技術などの様々な「遺伝子サイレンシング」技術で生ずるものにより、PLOD2遺伝子の活性を阻害することによって機能できる。これは、TLH酵素の生産又はプロセシングに関連するタンパク質をコードする遺伝子の活性を阻害することを含む。
【００４３】
この活性剤は、巨大生物タンパク質に対する小有機分子、ペプチド、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンなどであって良い。適切な小有機分子は、典型的に、分子量1000Daltonsより下、好適に500Daltonsより下であろう。かかる化合物の例としては、限定されないが、ミノキシジル及びそれらの擬態(即ち、ミノキシジルと同じ又は類似する態様で機能する化合物)が挙げられ、その類似物(例えば、Muradら, Arch. Biochem. Biophys., 308(1):42-7, (1994)を参照のこと)及び代謝産物(例えば、リン酸ミノキシジル;Parishら, Br. J. Plast. Surg., 48(3):154-60, (1995)を参照のこと)が挙げられる。
【００４４】
代替的に、活性剤は、巨大な生物学的タンパク質、ペプチド、プロテオグリカン, グリコサミノグリカンなどであって良い。かかる化合物の例としては、限定されないが、リン酸ヘパリン及びその擬態(例えば、Alexakisら, FASEB J., May 7, 2004を参照のこと)が挙げられる。
【００４５】
更なる代替の実施態様は、「活性剤」として「遺伝子サイレンシング」技術において使用される場合のポリヌクレオチド、例えば、アンチセンス、RNA干渉、の使用及びリボザイム技術での使用を含む。これらのうちでRNA干渉が特に好適な技術であり、それはmRNAの破壊によってPLOD2遺伝子の発現を抑制するために使用できる。RNA干渉は、siRNAと命名された小二本鎖RNA分子の使用を伴い、当該分子は、特異的mRNA標的を解裂するエンドヌクレアーゼと複合体を形成する。
【００４６】
小干渉RNA(siRNA)
本願明細書中に記載されている小干渉RNA(又はsiRNA)は、15〜30ヌクレオチド長である二本鎖RNAのセグメントである。それはRNA干渉として知られる細胞反応の引き金を引く。RNA干渉において、二本鎖RNAは、siRNA二本鎖を生産する、Dicerとして知られる細胞内酵素によって消化される。siRNA 二本鎖は、他の細胞内酵素複合体へ結合し、それは、そのことによってsiRNA配列に対して相同的(又は相補的)なmRNAを標的化するように活性化する。活性化された酵素複合体は、標的化されたmRNAを解裂し、それを破壊して、それが対応するタンパク質産物の合成に直接使用されるのを妨げる。最近の証拠は、RNA干渉が、ウィルス感染症(多くのウィルスは外来RNAを細胞中に持ち込む)を防御するだけでなく基本的なレベルにおいて遺伝子を制御するための、古い、固有のメカニズムであることを示唆する。RNA干渉は、植物、昆虫、下等動物、及び哺乳動物で生ずることが発見されており、他の遺伝子サイレンシング技術、例えば、アンチセンス又はリボザイム技術よりも劇的に有効であることが発見されている。
【００４７】
生物学的な方法として使用されるsiRNA法は、細胞中へ(又は細胞に生産させるために)侵入する二本鎖RNAウィルス由来のDicer酵素によって生産されるだろうモノに類似するRNAの短い、二本鎖分を導入することを伴う。次いで人工的に標的化されたRNA干渉法は、その時点から続く。小干渉RNAを対象者へデリバリーするために、 好適な方法は、siRNA分子それら自体ではなく、siRNAをコードするDNAを標的細胞中へ導入することを伴う。特定の治療siRNAをコードするRNA配列は、(a)標的mRNAの小及びアクセス可能部分(公的なヒト ゲノムデータベース、特にNCBIデータベースにおいて入手可能な）に関する公知の一又は複数の配列、並びに(b)DNAが細胞によって転写される場合、対応するRNA配列の生産をもたらすDNAを特定するための公知の科学法則により特定されて良い。DNA配列は、一度特定されれば、ラボサプライヤーからオーダーされた合成分子よりラボにおいて構築し、そしてDNAを細胞へデリバリーするためのいくつかの代替的なベクターの一つへ入れる標準的な生物学的方法を使用することで挿入される。標的細胞へ、一度導入されれば、それら細胞は、挿入されたDNAをRNAへ転写することにより、治療siRNAとなるRNAを生産する。結果は、細胞それら自身が、標的化された遺伝子(例えば、PLOD2遺伝子又はTLH酵素の生産又はプロセシングに関連するタンパク質をコードする遺伝子)をサイレンシングするsiRNAを生産することにつながるだろう。この結果は、細胞によって生産される標的化されるタンパク質(例えば、TLH酵素又はTLH酵素の生産又はプロセシングにかかわるタンパク質)の量の減少につながるだろう。
【００４８】
本発明によれば、標的化された細胞中で生産される特異的mRNAに対する小干渉RNAは、TLH酵素の生産を予防する。従ってまた、本発明の範囲内において、小干渉RNAを標的化された細胞に対して直接的にデリバリーするために特異的にあつらえたベクターの使用がある。設計された小干渉RNAの成功は、それらの標的細胞中への首尾良いデリバリーにより予測される。小干渉RNA分子は、ヒト細胞において特異的mRNA分子を標的化できることが示されている。小干渉RNAベクターは、ヒト細胞をトランスフェクション、そして標的RNAの解裂を生じることによってコードされるタンパク質の生産を阻害するような小干渉RNAを生産することができる。
【００４９】
本発明の小干渉RNAベクターは、TLH酵素自体の生産を抑制することによって又はTLH酵素の生産又はプロセッシングに関連するタンパク質の生産を抑制することによって病原性タンパク質の生産を予防するだろう。治療剤を対象者へ繰り返し投与することは、所望のゴールに達成するために要求されうる。例となるsiRNA配列には、実施例の節で開示されたものが挙げられる。
【００５０】
本発明において、小干渉RNAは、実際のタンパク質コーディング配列内でかあるいは5'非翻訳領域又は3'非翻訳領域のいずれかにおいて、生産標的タンパク質(例えば、TLH酵素又はTLH酵素の生産又はプロセシングにかかわるタンパク質)の生産をコードするmRNA配列における相補的配列を標的化させられる。ハイブリダイゼーション後、siRNAによって導かれた宿主酵素は、mRNA配列の解裂をすることができる。完全又は非常に高い程度の相補性は、典型的に、小干渉RNAが有効であるために必要とされる。％相補性とは、水素結合(例えば、Watson-Crick塩基対合)を第二のポリヌクレオチドと形成できるポリヌクレオチドにおける連続的な残基の％(例えば、10個のうち5、6、7、8、9、10個は、50%、60%、70%、80%、90%及び100%相補的である)を示す。「完全に相補的」とは、ポリヌクレオチドの連続する残基全てが第二のポリヌクレオチド中の同数の連続する残基と水素結合をするだろうことを意味する。しかし、siRNA配列内の単一のミスマッチ、又は塩基置換は実質上、小干渉RNAの遺伝子サイレンシング活性を減らしうる。
【００５１】
本発明の好適な実施態様において、小干渉RNAは、15〜30ヌクレオチド長である。特定の実施態様において、ポリヌクレオチドは、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、又は30ヌクレオチド長である。好適な実施態様において、siRNA配列の長さは、19〜30塩基対、及び一層好適に21〜25塩基対、そして一層好適に21〜23塩基対である。
【００５２】
好適な実施態様において、所望の標的のRNAに対して高い程度の特異性を示すある種類の核酸ベースの遺伝子阻害剤を生産する方法を供する。siRNAは、は適切な転写酵素又は発現ベクターを使用することで構築できうる。
【００５３】
外来DNAを哺乳類細胞へデリバリーするためのベクターの例としては、当業者に周知の、例えばプラスミド又はウィルスベクター、特にアデノ及びアデノ類縁ウィルスベクターが挙げられる。他の周知の技術、例えば、エレクトロポレーションも使用できうる。
【００５４】
SiRNAは、DNAオリゴヌクレオチドを使用することで構築できうる。これらオリゴヌクレオチドは、サイレンサーsiRNA(Ambion Construction Kit 1620)に含まれるT7プロモータープライマーの5'末端に対して相補的な8塩基を含むように構築できうる。各々の遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、供給されたT7プロモータープライマーへアニーリングされ、そしてKlenow断片による補足反応が、RNAへと転写するための完全長DNA鋳型を生ずる。２つのin vitro転写されたRNA(一つは他のものに対するアンチセンス)は、転写反応によって生じ且つ二本鎖RNAを生産するために互いにハイブリダイズさせられる。二本鎖RNAは、DNase(DNA 転写鋳型を除去するために)及びRNase(二本鎖RNAの末端を磨くため)により処理され、そして細胞中へデリバリーされて試験されるsiRNAを提供するためにカラム精製される。
【００５５】
哺乳類細胞内でsiRNAを発現するsiRNAベクターの構築は、典型的に、siRNAの構造を模擬する短いヘアピンRNAの発現を誘導するRNAポリメラーゼIIIプロモーターを使用する。このヘアピン構造をコードする挿入体は、短いスペーサー配列によって分離された２つの逆反復配列を有するように設計されている。一つの逆反復はsiRNAが標的化するmRNAと相補的である。3'末端へ付加された6つの連続するチミジンの紐(string)は、pol III転写終結部位として働く。ベクターは、細胞内に一度入れば、連続的にヘアピンRNAを発現する。ヘアピンRNAは、プロセシングされて標的遺伝子の発現のサイレンシング(それはRNA干渉(RNAi)とよばれる)を誘導するsiRNAになる。現在、大部分のsiRNA 発現ベクターにおいて、3つの異なるRNAポリメラーゼIII(pol III)プロモーターが、小ヘアピンsiRNAの発現を誘導するために使用されている。これらのプロモーターは、非常に良く特性決定されたヒト及びマウスU6プロモーター及びヒトH1プロモーターである。
【００５６】
アンチセンス分子
本発明の所定の実施態様において、アンチセンス技術は、TLH酵素をコードするポリヌクレオチド分子の機能を阻害し且つ最終的に、生産されるTLH酵素の量を調節するために使用することができる。TLH酵素の発現を阻害するための他の技術は、調節エレメント、コントロール配列、因子、補因子の生物活性、TLH酵素及び/又はTLH酵素の生産又はプロセシングにかかわるタンパク質をコードする遺伝子の発現の阻害などを遺伝学的に又は生化学的に操作することを伴うことができる。
【００５７】
TLH酵素の発現の阻害は、アンチセンス分子を提供することによって達成されて良い。本明細書中で使用した場合、「アンチセンス分子」とは、TLH酵素をコードするmRNA又はDNAを特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。mRNAとのかかるハイブリダイゼーションがmRNAの通常の役割に干渉し且つその機能の修飾をもたらす。干渉されるmRNAの機能は、例えばウィルスの機能の、例えば、タンパク質翻訳の部位へのRNAの転移、RNAからのタンパク質の翻訳、RNAをスプライシングして一又は複数のmRNA物質を獲得すること、及びRNAによって行われうる触媒活性が挙げられる。mRNA機能のかかる干渉の全体的な効果は、TLHの発現の修飾である。本発明の背景において、「修飾」とは、遺伝子の発現の増加(刺激)又は減少(阻害)を意味する。本発明の背景において、阻害は、遺伝子発現の調節の好適な形態である。
【００５８】
本発明の「アンチセンス分子」は、TLH酵素をコードする内因性遺伝子の少なくとも一部に対して「アンチセンス」又は「センス」である少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。「遺伝子に対してアンチセンス」であるポリヌクレオチドは、遺伝子のコード鎖の少なくとも一部に対して相補的であるポリヌクレオチド配列、又は遺伝子のプロセッシングされたかあるいはされていないRNA転写産物の少なくとも一部に対して相補的である。遺伝子のコード鎖の少なくとも一部に対して相補的であるアンチセンスポリヌクレオチドの場合、アンチセンスヌクレオチド配列は、RNA転写産物を獲得するために配列の転写を促すために欠かせないコントロール配列と作用可能式に結合されていて良い。遺伝子のコーディング鎖の一部に対して相補的であるアンチセンスポリヌクレオチドは、プロセシングされていないRNA転写産物の一部に対して相補的であることが確認されるだろう。プロセシングされていないRNA転写産物は、往々にして、 前駆体RNA又は「プレRNA」に言及される。プロセシングされたRNA転写産物には、例えば、mRNAが挙げられる。
【００５９】
類似して、遺伝子に対してセンス方向にあるポリヌクレオチドには、遺伝子の非コーディング又は「テンプレート」鎖の少なくとも一部に対して相補的である、又は遺伝子のmRNA転写産物に由来するcDNAの少なくとも一部に対して相補的であるヌクレオチド配列を含む。コーディング鎖として供給された「センス」ヌクレオチド配列の転写産物は、内在性遺伝子の転写産物(プロセシングされたかあるいはプロセシングされていない、選択されたヌクレオチド配列に依存して)の全部又は一部と本質的に同一である。
【００６０】
当業者によって、本発明がTLH酵素又はTLH酵素の生産又はプロセシングにかかわるDNA又はmRNAセンス鎖に結合できるアンチセンス分子を広く含むことをことが理解されるだろう。mRNAは、タンパク質をコードするヌクレオチド配列のみならず、5'-非翻訳領域、3'-非翻訳領域、5'-キャップ領域及びイントロン/エキソン連結領域などの領域をも含むことを理解するだろう。干渉されるDNAの機能は、複製及び転写である。干渉されるRNAの機能は、全ての重要な機能の例えば、タンパク質翻訳の部位に対するRNAの転移、RNAからのタンパク質の翻訳、RNAが行うかあるいはRNAにより促される一又は複数のmRNA物質及び触媒活性を獲得するためのRNAのスプライシングが挙げられる。標的ポリヌクレオチド機能のかかる干渉の全体的な効果は、TLHの発現の調節である。
【００６１】
アンチセンス分子はオープンリーディングフレーム(ORF)又は「コーディング領域」（翻訳開始コドンと翻訳終結コドンの間の領域に言及されることが当業界で知られており、それはまた有効に標的化される領域でもありうる）に対して相補的でありうる。他の標的としては、5'非翻訳領域(5'UTR)（当業界で、翻訳開始コドンから5'方向におけるmRNAの一部に言及することが知られており、従って、mRNAの5'キャップ部位と翻訳開始コドン又は遺伝子上の対応するヌクレオチドの間のヌクレオチドを含む）、及び3' 非翻訳領域 (3'UTR)(翻訳終結コドンから3'方向におけるmRNAの一部に研究されることが知られており、従ってmRNAの翻訳終結コドンと3'末端の間のヌクレオチド又は遺伝子上の対応するヌクレオチドを含む）を含む。mRNAの5'キャップは、5'-5'三リン酸結合を介して5'-最大残基(most residue)に連結したmRNAのN7-メチル化グアノシン残基である。mRNAの5'キャップは、5'キャップ構造自体並びに当該キャップに隣接した最初の50ヌクレオチドを含むと考えられる。5'キャップ領域は、相補的アンチセンス分子のための好適な標的領域であって良い。
【００６２】
いくつかの真核mRNA転写産物は直接翻訳されるが、多くは、「イントロン」(翻訳される前に切り出される）として知られる一又は複数の領域を含む。残りの(従って翻訳される)領域は、「エキソン」として知られ且つ連続するmRNA配列を形成するために一緒にスプライシングされる。mRNAスプライス部位、即ち、イントロン-エキソン連結部も好適な標的領域であり、特に疾患において、異常なスプライシングが行われる場合、又は疾患において、特定のmRNAスプライス産物の過剰な生産が行われる場合に有効である。再配置又は欠失が理由の異常な融合結合も好適な標的である。イントロンは有効であり、ゆえに、例えば、DNA又はプレmRNAを標的とするアンチセンス化合物のための標的領域が好適である。
【００６３】
一又は複数のPLOD2配列に対して標準的な条件下でハイブリダイズすることに加え、例えば、本発明のアンチセンス分子は、一又は複数のTLH酵素の発現を阻害する。本発明のアンチセンス分子は、一又は複数のTLH酵素又はTLH酵素の生産もしくはプロセシングにかかわるタンパク質の発現を阻害する能力のために選択される。従って、本発明のアンチセンス分子は、既知の配列のより長い選択された部分を含んで良く、かかる選択される部分は、それらが有効にTLH発現及び/又は活性を阻害するそれらの能力のために選択される。
【００６４】
本発明のアンチセンス分子は、長さ100〜3000ヌクレオチドでありうる。長さ100ヌクレオチドであるアンチセンス分子、及び長さ3000ヌクレオチドであるアンチセンス分子に加えて、全ての中間サイズ化合物も本発明の実施において有用であると考えられている。従って、本発明の例えば、長さ2500ヌクレオチド、長さ2000ヌクレオチド、長さ1500ヌクレオチド、長さ1000ヌクレオチド、長さ900ヌクレオチド、長さ800ヌクレオチド、長さ700ヌクレオチド、長さ600ヌクレオチド、長さ500ヌクレオチド、長さ400ヌクレオチド、長さ300ヌクレオチド、及び長さ200ヌクレオチドであるアンチセンス分子も本発明の範囲内で熟考されている。
【００６５】
同様に、100ヌクレオチドより短いアンチセンス分子も も本発明の範囲内で熟考されている。本発明のアンチセンス分子は、8〜99ヌクレオチドを含みうる。長さ8ヌクレオチドであるアンチセンス分子、長さ99ヌクレオチドであるアンチセンス分子に加え、全中間サイズ 化合物も本発明の範囲内で有用であると熟考されている。従って、長さ9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98,及び/又は99ヌクレオチド であるアンチセンス分子も本発明の範囲内で熟考されている。
【００６６】
アンチセンス分子がTLH mRNA上の標的配列に対して確かに100%相補的であるという絶対の要請はない。実際に、例えば、アンチセンス分子はTLH酵素をコードする遺伝子又はmRNAに対して十分な相同性を有し、従って、相補的領域へハイブリダイズすることにより、TLH遺伝子の転写の減少及び/又はmRNAからのTLH酵素の翻訳の減少が確認されることが唯一の要請である。
【００６７】
アンチセンス分子には、分子の例えば、リボザイム、外因性ガイド配列(EGS)オリゴヌクレオチド(オリゴザイム)、及び標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズしてその発現を調節する他の短い触媒性RNA又は触媒性オリゴヌクレオチドが含まれうる。本発明のアンチセンス分子は、アンチセンス分子のin vivo合成を支持するように設計された生物学的オリジン及び遺伝子ベクター構築体の分子が含まれる。本明細書中に記載のように使用するためにアンチセンス分子 は、当業者に公知の方法によってin vitroで合成されて良い。例えば、本発明のアンチセンス分子は、固層合成の周知技術によって調製されて良い。かかる合成のための装置は、いくつかの業者の例えばApplied Biosystems(Foster City, CA)などによって市販されている。かかる合成のための任意の他の手段が、更に又は代替的に使用されて良い。
【００６８】
オリゴヌクレオチドの例えば、フォスフォロチオエート及びアルキル化誘導体を調製するために類似の技術を使用することも知られている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは典型的に、結合剤の例えば、フォスフォロチオエート、メチルフォスフォネート、スルホン、スルフェート、ケチル、フォスフォロジチオエート、フォスホラミデート、リン酸エステル、並びに当業者に周知の他の結合剤を使用することで、内在性核酸分解酵素による分解に耐性なように設計されている。 
【００６９】
他の好適なオリゴヌクレオチド擬態において、糖及びヌクレオシド結合、即ち、ヌクレオチド単位の骨格は、新たな基で置換されている。塩基単位は、適切なポリヌクレオチド標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持されている。一つのかかるオリゴマー化合物、優れたハイブリダイゼーション特性を有することを示すオリゴヌクレオチド擬態は、ペプチドポリヌクレオチド(PNA)に言及される。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、骨格、詳細には、アミノエチルグリシン骨格を含むアミドで置換されている。核酸塩基は、維持され且つ当該骨格のアミド部分のアザ窒素原子へ直接的又は間接的に結合させられている。
【００７０】
本発明のキメラアンチセンス化合物は、上記のように2以上のオリゴヌクレオチド, 修飾したオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及び/又はオリゴヌクレオチド擬態の複合構造として形成されて良い。かかる化合物はまた当業界においてハイブリッド又はギャップマーに言及されている。
【００７１】
リボザイム
本発明の活性剤は、リボザイムをも含む。リボザイムは、特異的にRNA基材、例えばmRNAを解裂し、細胞増殖もしくは発現を阻害もしくは干渉するRNA分子である。RNA鎖の解裂及び/又はライゲーションに関連する公知の種類のリボザイムが少なくとも5つある。リボザイムは、当業者に周知のように、全てのRNA転写産物を標的としてよく且つかかる転写産物を触媒的に解裂させる。本発明のリボザイムには、TLH酵素をコードするRNA転写産物をリボザイムの標的にするために記載したアンチセンスヌクレオチド配列がある。リボザイムは、真核プロモーター、例えば真核ウィルスプロモーター又は真核組織特異的プロモーターへ結合したリボソームをコードするDNAによって、標的化された細胞へデリバリーされ、核の中へ導入されることにより、リボザイムは直接転写されるだろう。かかる場合、構築体は、核転移配列を、一般にリガンドの一部として又はリガンドとポリヌクレオチド 結合ドメインの間のリンカーの一部として含むだろう。
【００７２】
医療装置及びデリバリー組成物
医療装置は、移植可能装置又は体外装置であって良い。装置は、短期間一次的な使用の装置又は長期間の常設移植（それは典型的にそこでの繊維組織の形成と関連する）の装置であって良い。所定の実施態様において、適切な装置は、心拍障害、心臓障害、弁疾患、血管疾患、糖尿病、神経疾患及び障害、整形外科、神経外科、がん、眼科及びENT手術における医療治療及び/又は診断を供するために使用されるものである。医療装置の適切な例としては、限定されないが、ステント、ステントグラフト、 吻合コネクター、合成パッチ、リード(lead)、電極、針、ガイドワイヤ、カテーテル、センサー、外科的器具、血管形成術葉バルーン、創傷ドレイン、シャント、管、還流スリーブ、尿道挿入物、ペレット、移植物、血液酸素発生器、ポンプ、代用血管、血管アクセスポート、心臓弁、弁形成リング、縫合糸、外科用クリップ、外科用ステープル、ペースメーカー、移植可能除細動器、神経刺激装置、整形外科装置、脊髄流体シャント、移植可能薬物ポンプ、スピナルケージ、人工椎間板、髄核のための代替装置、イヤーチューブ、及び眼内レンズが挙げられる。
【００７３】
医療装置は、デリバリーマトリクス内に埋め込まれて良い、又はさもなくば連結されて良い。このようなデリバリーマトリクスは、活性剤の例えば、PLOD2 阻害物及び/又はTLH阻害物をコードする一又は複数のポリヌクレオチドを局所デリバリーのために含む任意のマトリクス材料であって良い。システムは、例えば米国特許No. 5,962,427 (Goldsteinら)、並びにKyriakidesら, Molecular Therapy, 2, 842 (2001),及びBonadioら, Nature Medicine, 5, 753 (1999)に記載されている。ポリヌクレオチドは、PLOD2遺伝に干渉する、例えばTLH タンパク質、又はTLHタンパク質の生産又はプロセシングに関連タンパク質の翻訳を阻害するアンチセンスもしくはリボザイムもしくはsiRNA分子であって良い。
【００７４】
代替的に、ポリヌクレオチドは、アンチセンス、リボザイム、又はsiRNA分子をコードするためであって良い。次いで、例えば、PLOD2遺伝子の干渉は、及び例えばTLH酵素の翻訳の阻害は、ポリヌクレオチドがデリバリーマトリクスから放出され且つ前記ポリヌクレオチドが発現され且つコードされたアンチセンス、リボザイム、又はsiRNA分子が細胞及び医療装置を取り囲む前記組織によってデリバリーされる。輸送されたDNAは、この種類の系を使用することにより可能であるように、標的細胞のゲノムへ導入されうる又はされない。
【００７５】
デリバリーマトリクス内に医療装置を埋め込むことに加えて、デリバリーマトリクスは本来、医療装置、例えば、補助的な移植物(例えば、スポンジ、ロッドなど)、デポット注入物(例えば、ポリマーミクロスフィア)もしくは液体製剤もしくはエマルション注入物(例えば、リポソーム)と連結していて良い。
【００７６】
この場合、活性剤は、装置の移植の間に対象者へ投与されて良いが、装置に結合してはいない。ポリヌクレオチドデリバリーマトリクスを形成する物質、医療装置上のコーティングを形成する物質、又はさもなければ医療装置(例えば、パウチ、パッチ、スポンジなど)の一部を形成する物質、又は医療装置の部位に対して活性剤をデリバリーする組成物中に含まれている物質は、典型的に生物的合成である。物質は一般に、哺乳類宿主へ投与した場合、有害な、アレルギー性、又は他の不都合な反応を生み出さなければ「生物的適合性である」。かかる物質は、天然又は合成物質から形成されて良い。
【００７７】
かかる物質としては、限定されないが、例えば、細胞接着及び成長を支持する足場中へと処方される生物分解性又は非生物分解性物質が挙げられる。かかる物質には、合成ポリマー又は天然に生ずるタンパク質、例えばコラーゲン、もしくは他の細胞外マトリクスタンパク質、もしくは他の構造マクロ分子が挙げられる。物質は、体内の常在構造を離れることが望まれる場合;又は活性剤が短い時間のためにのみ必要とされる場合、非生物分解性であって良い。
【００７８】
所定の実施態様において、例えば、ポリヌクレオチドデリバリーマトリクスに関して、これらの物質は、コーティング、スポンジ、フィルム、シート、カフ、インプラント、チューブ、カフ、ロッド、マイクロビーズ、凍結乾燥成分、ゲル、パッチ、粉末、又はナノ粒子の形態をとって良い。加えて、所定の実施態様に関して、例えば、ポリヌクレオチドデリバリーマトリクスに関して、本明細書中で記載の活性剤のデリバリーにおいて使用される物質は、長期に渡り持続放出(例えば、活性剤の)を可能にするために設計できうる。
【００７９】
物理及び化学的特性、例えば、生物的合成、生体利用可能性、強度、剛性、界面特性及び更に外観は、それが使用される実施態様に依存して、当業者に周知のように、かかる物質を選択することが検討される。有用なポリマーの多くの例が当業界で周知である。活性剤の持続放出又はコントロールされた放出に適することが知られている又は後に開発されるだろうそれが本発明において使用されて良い。所定の実施態様のために、非分解性ポリマーの例としては、シリコーン、ポリウレタン、シリコーン-ウレタンコポリマー、ポリアミド、ポリスルホン、ポリアリール、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルケトンケトン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリブチルメタクリレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエーテル、ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリエンカビニル、及びエポキシドが挙げられる。
【００８０】
生物分解性物質(例えば、体内へ再吸収できるもの）が所望される所定の実施態様において、適切な物質の例えば、合成有機ポリマーの例えば、ポリエステル、ポリ無水物、ポリエーテル、ポリ(オルトエステル)、ポリ(エーテル-エステル)、ポリフォスファゼン、ポリ(アミノ酸)、ポリペプチド、及びポリエステルアミドが挙げられる。一層詳細に、適切な生物分解性ポリマー物質としては、モノポリマーから前記列挙のホモポリマー及びコポリマーへポリマー化されて良いポリ乳酸、ポリグリコライド、ポリ乳酸ポリグリコール酸コポリマー(「PLGA」)、ポリカプロラクトン(「PCL」)、ポリ(ジオキサン)、ポリ(トリメチレンカーボネート)コポリマー、ポリグリコネート、ポリ(プロピレンフマレート)、ポリ(エチレンテレフタラート)、ポリブチレンテレフタラート、ポリエチレングリコール、ポリカプロラクトンコポリマー、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシバレレート、チロシン誘導ポリカーボネート及び任意のランダム又は(マルチ-)ブロックコポリマー、例えば、二元重合体、三元重合体、四元重合体などが挙げられる。
【００８１】
適切な物質の他の特定の集団は天然のポリマーを包含する。この集団としては、例えば、多糖類、タンパク質及びポリペプチド、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、キチン、キトサン、ペクチン、(修飾された)デキストラン、(修飾された)デンプン及び修飾物、それらの混合物又は組成物が挙げられる。特に適切な物質は、繊維性コラーゲンであり、それは組織からの抽出及び精製及び滅菌後に凍結乾燥させられて良い。加えて、コラーゲン及びグリコサミノグリカン(GAG)からなる格子は、本発明の実施において使用されて良い。少なくとも20の異なるコラーゲンの形態が同定されており且つこれらのコラーゲンの各々は本発明の実施において使用されて良い。組み換えコラーゲンは、コラーゲン発現組み換え宿主細胞、例えば、細菌、酵母、哺乳類、植物及び昆虫細胞から獲得された場合、使用されて良い。本発明において使用されるコラーゲンは、もし所望渇適用可能であれば、更なる鉱物の、例えば、リン酸カルシウムの形態においてカルシウムが補足されて良い。天然及び組み換え型のコラーゲンが、このような方法において更なる物質と混合、吸着又は結合させることによって補足されて良い。
【００８２】
本発明の好適な実施態様は、医療装置上のコーティングを含み、ここでコーティングは活性剤を含む。他の好適な実施態様は、マトリクス内に埋め込まれた, 例えば、スポンジ、又はスポンジ又は医療装置移植の部位において補助療法を供する他の移植可能物質を含む。
【００８３】
デリバリー
それが医療装置の一部であるかあるいは医療装置の部位でコラーゲン-生産細胞と組成物が接触するようデリバリーされているかどうか、本発明は、一又は複数の活性剤(例えば、PLOD2阻害又はTLH阻害又はその両方)を、所望の局在化した組織領域に対して、様々な活性剤在留半減期、一般に少なくとも24で提供する。例えば、活性剤の在留半減期は、少なくとも1日、少なくとも3日、少なくとも1週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも5週間、少なくとも6週間又はそれより長くても良い。
【００８４】
活性剤組成物は、医療装置の部位における局在化した組織領域へ一定又は脈動的に到達するように設計されている。脈動的デリバリーは、局所組織領域へ長時間に渡り活性剤を間欠に投与するために望ましい。例えば、生分解性ポリマーの組み合わせは、異なる分解速度を有し、従って活性剤放出速度が異なるように使用できうる。組成物は、様々な生分解性ポリマーの混合物を含む、又はポリマーは、複合体分解プロファイルを達成する態様にセグメント化されて使用されうる。組成物は、0次、1次、又は他の放出を達成するために様々なポリマーをも含む。そしてまた、活性剤放出のタイミングは、規則的（例えば、最初及び数週間に渡り週1回）又は不規則的(例えば、最初及び3日、2週、及び2月離れて）のいずれかでありうる。
【００８５】
もし活性剤が医療装置の一部でなければ、一又は複数の活性剤を含む組成物は、任意の適切な経路、例えば、限定されないが、皮下、皮内、筋内、髄腔内、器官内、腫瘍内、病巣内及び腹腔内経路により、医療装置の部位における局在化した領域へデリバリーされて良い。「局在化した組織領域」は、一般に、医療装置が配置されている、体内の比較的小さな部分、例えば、体積で10%未満、そして往々にして体積で1%未満であろう。これには、医療装置の表層及び周囲組織が含まれる。
【００８６】
例えば、局在化した組織領域は、典型的に500立方センチメーター(cm3)以下、往々にして100cm3以下であり、そして多くの場合、10cm3以下である。いくつかの用途のために、局在化した組織領域は、1cm3以下であろう。しかし、所定の場合、局在化した組織領域は、最大で数リッターにいたる特定の巨大領域であろう。組成物は、例えば、針注射、手術、腹腔鏡、又はカテーテル移植物、ニードルアレイ（needle array)、高速粒子移植、又は任意の他の組成物を使用することで局在化した組織領域へと導入する方法を使用することでデリバリーされて良い。医療装置自体は、活性剤が医療装置の一部でないとしても、一又は複数の 活性剤を含む組成物をデリバリーする手段を供することができうる。局在化した組織領域へのデリバリーは、画像誘導技術の例えば、超音波、MRI、リアルタイムX線(透視)などを使用する技術と組み合わされて良い。
【００８７】
本発明はまた、医療装置、活性剤、並びに医療装置と活性剤の組み合わせを作るための他の成分を含むきっとを提供する。例えば、いくつかの場合、キットは、予め形成されたポリヌクレオチドデリバリーマトリクスを含み、それにより医者が直接、当該マトリクスを医療装置の部位における体内へ投与するだろう。代替的に、例えば、キットはポリヌクレオチドデリバリーマトリクスの形成に必要な成分を含む。かかる場合、医者は、成分をポリヌクレオチドデリバリーマトリクス(それは、体内に配置することによって治療用に使用されうる）形成するために）を形成するために成分を組み合わせうる。本発明の一つの実施態様において、ポリヌクレオチドデリバリーマトリクスは、外科用装置の例えば、縫合糸材料又は他の医療装置の例えば移植物をコーティングするために使用されて良い。本発明の他の実施態様において、スポンジは、キット中で提供されており、それは次いで、体内へ配置される前に、医療関係者により活性剤に浸されて良い。
【実施例】
【００８８】
実施例
本発明の目的と及び対象は以下の例により更に説明されて良いが、それら例において引用されている特定の物質及び量、並びに他の条件及び詳細は、本発明を不当に限定すると解されるべきではない。
【００８９】
実施例１:移植されたヒトリード上の繊維コラーゲン組織における架橋の同定
移植された１０個のリードを回収して分析に委ねた。これらのうち6つのリードには分析のために十分な量の繊維性被膜組織を入れた。ヒドロキシリシルピロジノリン(HP)架橋をRP-HPLC (Bank et al., J. Chromatogr. B, 703:37-44, (1997))により減少しなかったサンプルの酸加水分解物において定量化した。ヒドロキシリシルピリジノリン(HP)架橋レベルの特性決定に加え、移植されたリード上のいくつかの繊維性被膜組織も、リシルピロジノリン(LP)架橋レベル、ヒドロキシルリシン残基の数/コラーゲン分子及びヒドロキシププロリン:プロリン比の決定などを含め一層十分に特性決定した。後者は、繊維組織におけるコラーゲン性タンパク質対非コラーゲン性タンパク質の基準である。100%繊維性コラーゲンについて、Hyp/Pro比は0.81である。コラーゲン架橋は、テロペプチドの特異的Lysine(Lys)又はヒドロキシルリシン(Hyl)残基がリシリルオキシダーゼによって細胞外でアルデヒドアリシン及びヒドロキシアリシンへそれぞれ転換された後にのみ開始される。これらアルデヒドはその後、三重らせんのLys、Hyl、又はヒスチジル残基と反応する。
【００９０】
これらは、テロペプチド中の残基がLys(アリシン経路)又はHyl(ヒドロキシアリシン経路)であるかどうかに依存して、架橋の形成の経路が２つある(図1及び図2を参照のこと)。アルデヒドは、隣接分子に近接する三重らせんドメインにおける特定のLys又はHyl残基と三重らせん領域で反応して三官能性架橋へと成熟する二官能性中間体を形成する。２つの経路は異なる種類の架橋を導く。ヒドロキシアリシン経路から生ずる二官能性架橋のみが成熟して三官能性架橋HP及びLPになることができる。
【００９１】
下の表１から、繊維性被膜組織は1.7±0.9HP架橋/コラーゲン分子を含んだことがわかる。決定された、ヒドロキシルリシン残基の数/コラーゲン分子は、十分に典型的な生理学的範囲内であり且つ繊維性被膜組織におけるコラーゲンの異常なプロセシングに関する証拠も、三重らせんアリシンのヒドロキシル化の増加に関する証拠もなんら提供しない。
【００９２】
【表１】
2008507341.tif 000002
【００９３】
獲得した結果が示すように、移植されたリードと結合したHP型架橋の繊維性嚢の濃度は、表２に列挙した典型的な組織特異的レベルと比較した場合に非常に高い。これは、テロペプチド-ヒドロキシリシル-架橋経路、及びテロペプチドリシルヒドロキシラーゼ(TLH)酵素の関連した上方制御への切り替えの明らかな現れである。
【００９４】
【表２】
2008507341.tif 000003
【００９５】
実施例2:ヒト繊維芽細胞におけるPLOD2発現の定量化
繊維芽細胞は、繊維芽細胞がコラーゲンの主たる生産者である事実によって移植物の繊維による囲い込みの進行において中心的な役割を果たす。活性剤がTLH酵素の生産及び/又は活性を抑制する、抗繊維による囲い込み療法を設計する際、それは従って、活性剤の活性及び繊維芽細胞を使用する効果を証明するために有意に重要であると認められる。この実験において、PLOD2を標的にする3つの異なるsiRNA設計物を、ヒト繊維芽細胞を使用することで試験した。トランスフェクションしたヒト繊維芽細胞から単離したRNAをリアルタイムRT-PCRを使用することで定量化し、そして非トランスフェクション細胞から単離したRNAと比較した。
【００９６】
材料と方法:
siRNA #1:センス配列      5'GGUCCUUGGUCAAGGAGAAtt3'(配列番号:1)
アンチセンス配列      5'UUCUCCUUGACCAAGGACCtt3'(配列番号:2)
siRNA #2:センス配列      5'GGAGAAGAAUGGAGAGGUGtt3'(配列番号:3)
アンチセンス配列      5'CACCUCUCCAUUCUUCUCCtt3'(配列番号:4)
siRNA #3:センス配列      5'GGUACAAUUGCUCUAUUGAtt3'(配列番号:5)
アンチセンス配列      5'UCAAUAGAGCAAUUGUACCtt3'(配列番号:6)
【００９７】
細胞培養:ヒト繊維芽細胞(CCD-1077Sk細胞,ATCC)をIscoves改変Dulbecco's培地(10%ウシ血清、1%PSN抗体、1%Fungizone 抗真菌剤を補った)(Gibco)を、37℃及び5%CO2下で行った。
【００９８】
トランスフェクション: 2×105繊維芽細胞を25平方センチメーター(cm2)の培養フラスコ(7ミリリッター(mL)の増殖培地が抗生物質を伴わずに入っている）で、トランスフェクションの１日前に、トラスフェクション時、それらが50%コンフルエントになるように培養した。細胞へ840ピコモル(pmol)のsiRNA(最終濃度：100ナノモル(nM))を14マイクロリッター(μL)のリポフェクタミン2000 トランスフェクション試薬及び700μLのOpti-MEM I(Invitrogen)を使用することでトランスフェクションした。増殖培地を12時間後に変え、そしてRNAをインキュベーションの36時間後に単離した。
【００９９】
半定量化:細胞を培養フラスコから1mlのトリプシン-EDTA(0.25% トリプシン、1ミリモル(mM)EDTA-4Na, Gibco)により収穫した。全RNAをRNeasyミニキット(Qiagen)を使用することで細胞から単離し且つgDNAをカラムDNase処理(30分(min))を使用することで除去した。単離後、gDNAの不在をMCP-1 プライマーセットを使用することでPCRによって確認した。A260を、RNAの量を補正するために測定した。iScript cDNA合成キット(Bio-Rad)を使用することで逆転写を行った。引き続き、２つのリアルタイムPCRを' iQ SYBRグリーンスーパーミックス(Bio-Rad)を使用することで行い、ひとつはPLOD2プライマーセットを伴い、そして一つはGAPDHプライマーセット（内部コントロールとして使用する）を伴い行った。GAPDH標準曲線を、DNAコントロール分子(三重に)を25μLの反応中で増幅させることにより生じさせた:1×1010、1×109、1×108〜1×103。DNAコントロール分子を、化学的にサイズ合成し(Life 技術)且つPCR産物と同じ配列を有する。PLOD2標準曲線を、使用した非トランスフェクションコントロールサンプル（未希釈）、10×希釈、100×希釈及び1000×希釈のcDNAを増幅することによって行った。未希釈のサンプルを100%発現に、ほかのものをそれぞれ10%、1%、及び0.1%発現に設定した。
【０１００】
リアルタイムPCRをLOX及びCOL1A2に対して、PLOD2に対するリアルタイムPCRと同じように行った。
【０１０１】
結果:
ゲル電気泳動:RNAの量を電気泳動によりチェックした。多量のRNAが2つのバンド、28S rRNAバンド及び18S rRNAバンドを有した。高品質RNAについて、これらのバンド強度は、2:1であるべきであり;これは実際に確認された。
【０１０２】
コントロールPCR:gDNAの不在を確かめるために、リアルタイムPCRをSYBR Greenを使用することで行った。ポジティブコントロールに加えて、一つのサンプルは閾値を越え且つ有意なシグナルを与えた。これは反応中非常に遅く生じたので(38サイクル)、有意ではないとして無視した。
【０１０３】
逆転写反応:全RNAサンプルを、RT-反応を続ける前に、同じ濃度へ希釈した。全体で40μLの希釈したサンプル(3マイクログラム(μg)RNA)を60μLの反応中で逆転写させた。
【０１０４】
全siRNAは、PLOD2発現の優れた減少を示した。全RNAサンプルは、表3及び4、図3に示したように、PLOD2発現をヒト繊維芽細胞中で90%(ΔCt約4サイクル)を有する。
【０１０５】
【表３】
2008507341.tif 000004
【０１０６】
結果をRT-PCR閾値サイクルの数として表した。コントロールと比較して、非トランスフェクション繊維芽細胞は、閾値サイクル(ΔCt)約4サイクルで異なる。
【０１０７】
【表４】
2008507341.tif 000005
【０１０８】
表3で列挙した結果を変換して表4中で、パーセント(%)相対PLOD2発現において表した。コントロールと比べて、PLOD2発現の非トランスフェクションコントロール減少は90%であった。図3は、表3及び4に列挙した結果をグラフで示す。
【０１０９】
使用したsiRNAの抗-PLOD2活性はコラーゲン合成に関連する他の酵素に対する阻害効果を誘導し且つ特異的に有効であったことを証明するために、３つのsiRNAについても同じ繊維芽細胞において、それらの以下の遺伝子に対する効果を試験した:LOX(リシルオキシダーゼ)及びCOL1A2 (コラーゲンI型、α2)。結果を表5及び6に示す。
【０１１０】
【表５】
2008507341.tif 000006
【０１１１】
表5に示すデータは、治療集団とコントロール集団の間でのRT-PCR閾値で確認された違いがない事実から誘導されて良いように、繊維芽細胞のsiRNA治療により、LOX発現の有意な違いが無かったことを示す。
【０１１２】
【表６】
2008507341.tif 000007
【０１１３】
表6に示すデータは、治療群とコントロール群の間で確認されるRT-PCR閾値の差がない事実から導かれうるように、繊維芽細胞のsiRNA処理によるCOLD2発現において有意な違いがなかったことを示す。
【０１１４】
結論:
リシリルオキシダーゼ(LOX)及びコラーゲン,I型、α2(COL1 A2)の発現は、PLOD2を標的化するsiRNAによって影響を受けなかった。これは、PLOD2遺伝子のサイレンシングのために調製した3つのsiRNAの設計の特異性を裏付ける。
【０１１５】
実施例3:ヒト繊維芽細胞におけるPLOD2抑制のsiRNA特異性
この実験において、3つの異なるsiRNA設計物をヒト繊維芽細胞を使用することで試験した。PLOD2を標的とする2つのsiRNA設計物(「siRNA#1」及び「siRNA #3」)は予めPLOD2 発現を強力に抑制することが証明されていた。第三のsiRNA設計物(「スクランブル化した」)はスクランブルsiRNAである。後者を、PLOD2の前記si-RNAが誘導した抑制の特異性を証明するために含ませた。トランスフェクションしたヒト繊維芽細胞に由来するRNAをリアルタイムRT-PCRを使用することで定量化し且つトランスフェクションしていない細胞から単離したRNAと比較した。
【０１１６】
材料と方法：
siRNA #1 :センス配列        5'GGUCCUUGGUCAAGGAGAAtt3'(配列番号:1)
アンチセンス配列        5'UUCUCCUUGACCAAGGACCtt3'(配列番号:2)
siRNA #3: センス配列        5'GGUACAAUUGCUCUAUUGAtt3'(配列番号:5)
アンチセンス配列        5'UCAAUAGAGCAAUUGUACCtt3'(配列番号:6)
【０１１７】
スクランブル化:スクランブル化したsiRNAをAmbion Inc(カタログNo.4611)にオーダーした。配列は未知である。スクランブル化したsiRNAを、マウス、ラット、又はヒトに由来する任意の既知の遺伝子配列といかなる相同性を有さないように請求した。
【０１１８】
細胞培養:ヒト繊維芽細胞(CCD-1077Sk細胞,ATCC)を、Iscoves modified Dulbeccoの培地（10%ウシ胎児血清、1%PSN抗体、1%Fungizone antimycotics (Gibco)を補足した）中37℃で5%CO2において培養した。
【０１１９】
トランスフェクション:2×105個の繊維芽細胞を25cm2の培養フラスコ(7mlの増殖培地が、抗体を伴わずに入っている)に、それらがトランスフェクション時に50％コンフルエントになるようにトランスフェクションの1日前に配置した。細胞に840pmolのsiRNA(最終濃度:100nM)(700μLのOpti-MEMI中、14μLのLipofectamine 2000トランスフェクション試薬（他の700μLのOpti-MEMI(Invitrogen)で希釈した)を使用することで希釈した）をトランスフェクションした。増殖培地を12時間後に取り替え、そしてRNAをインキュベーションの36時間後に取り替えた。
【０１２０】
半定量化:細胞を培養フラスコから1mLのトリプシン-EDTA(0.25%トリプシン、1mM EDTA-4Na, Gibco)により収穫した。全てのRNAを細胞からRNeasy ミニキット(Qiagen)を使用することで収穫し且つgDNAをカラムDNase処理(30分)を使用することで取り除いた。単離後、gDNAの不在、MCP-1プライマーセットを使用することでPCRによって確かめた。A260を、RNAの量を補正するために測定した。逆転写をiScript cDNA合成キット(Bio-Rad)を使用することで行った。引き続き、リアルタイムPCRを2つ、iQ SYBR Green supermix (Bio-Rad)を使用することで行い、1つは、PLOD2プライマーにより、そして１つはGAPDH プライマー（コントロールとして使用した）により行った。GAPDH標準曲線を、25μLの反応中、以下の数のDNAコントロール分子(3重に)を増幅することによって生じさせた:1×1010、1×109、1×108〜1×103。DNAコントロール分子を科学的に合成し(Life Technologies)そしてPCR産物と同じ配列を有した。PLOD2標準曲線を非トランスフェクションコントロールサンプル（未希釈、10×希釈、100×希釈及び1000×希釈）のcDNAを増幅することによって作成した。希釈したサンプルを100%発現に設定して、ほかをそれぞれ10%、1%、及び0.1%の発現にした。
【０１２１】
結果:
ゲル電気泳動:
RNAの量を、ゲル電気泳動によって調べた。高質RNAは2つのバンド28S rRNAバンド及び18S rRNAバンドを有する。高質RNAに関して、これらのバンドの強度は、2:1であり;これは確かに確認された。
【０１２２】
コントロールPCR:gDNAの不在を確認するために、リアルタイムPCRをSYBR Greenを使用することで行った。ポジティブコントロールに加えて、1つのサンプルは閾値を越え且つ有意なシグナルを与えた。これは、反応中、非常遅く生じた(サイクル38)ので、有意ではないとして無視した。
【０１２３】
逆転写反応:全RNAをRT-反応を続ける前に同じ濃度へ希釈した。全体で40μLの希釈した(3μg RNA)を60μL反応において逆転写させた。
【０１２４】
設計したsiRNAは、PLOD2発現の有意な減少を示した。siRNA #1及びsiRNA#3は、ヒト 繊維芽細胞において90%(ΔCt 約4サイクル)PLOD2発現を減少させた。対照的に、スクランブルsiRNA設計物は、図4及び5に示すように、PLOD2 発現に対して何ら効果を示さなかった。
【０１２５】
実施例 4:トランスフェクションしたヒト 皮膚繊維芽細胞におけるPLOD2の定量化
材料と方法:
siRNA #1:センス配列        5'GGUCCUUGGUCAAGGAGAAtt3'(配列番号:1)
アンチセンス配列        5'UUCUCCUUGACCAAGGACCtt3'(配列番号:2)
siRNA #2:センス配列        5'GGAGAAGAAUGGAGAGGUGtt3'(配列番号:3)
アンチセンス配列        5'CACCUCUCCAUUCUUCUCCtt3'(配列番号:4) 
siRNA #3:センス配列        5'GGUACAAUUGCUCUAUUGAtt3'(配列番号:5)
アンチセンス配列        5'UCAAUAGAGCAAUUGUACCtt3'(配列番号:6)
【０１２６】
細胞培養:ヒト繊維芽細胞(10継代;ドナー30/9)を皮膚組織から単離した(Slotら, J. Biol. Chem., 278(42) :40967-72 (2003))。培地は、4500ミリグラムパーリッター(mg/L)のグルコース、ピルビン酸塩及びグルタマックス(GIBCO, ref31966-021)(10%熱不活性化ウシ胎児血清を補足した)、及び1%ペニシリン/ストレプトマイシン抗生物質、37℃且つ5%CO2を伴う。
【０１２７】
トランスフェクション: 2×105個の細胞を、トランスフェクションの1日前に、抗生物質を伴わない3mLの培地が入っている6ウェルプレートに播いた。トランスフェクション時、細胞は80〜90%コンフルエントであった。細胞に840 pmolのsiRNAをトランスフェクションするかあるいは14μLのLipofectamine 2000及び700μLのOpti-MEM I(Invitrogen)を使用することで3.4mLの培地（最終濃度:250nM)中block-it-蛍光オリゴ(Invitrogen)をトランスフェクションした。培地を14時間後に替えてRNAをインキュベーションの40時間後に単離した。
【０１２８】
定量化:細胞をPBSで洗浄し且つ350μLのRLTバッファーで洗浄した。全RNA(30μl)をRNeasyミニキット(カタログNo.74106;Qiagen)を使用することで単離した。RNA(8.2μL)を20μL cDNA(First Strand cDNA合成キット; Roche ref. 1483188)へ逆転写し、ミリQ水で10回洗浄してリアルタイムPCR増幅に委ねた。cDNA 配列のリアルタイムPCR増幅を10μLの希釈したcDNA により、1型コラーゲン(Col1A2)のPlod 1、2b、3、α2鎖、3型コラーゲン(Col3A1)のα1鎖、リシリルオキシダーゼ(Lox)、プロリン4- ヒドロキシラーゼI(P4HA-1)及びβ-2-ミクログロブリン(B2M)についてcDNAの総量の違いを標準化するために行った。各cDNAを、総反応体積25μLで特異的プライマー及び特異的分子ビーコンを使用することで増幅した(Slot et al., J. Biol. Chem., 278(42) :40967-72 (2003))。PCRをABI PRISM 7700配列検出系で行い且つデータを配列ディテクターバージョン1.7ソフトウェアを使用することで解析した。
【０１２９】
【表７】
2008507341.tif 000008
【０１３０】
そしてまた、一次ヒト皮膚繊維芽細胞において、全siRNAは、表7及び図6及び7で確認されるように、全てのsiRNAは、繊維芽細胞において90%以上、PLOD発現を減少させた。
【０１３１】
治療群とコントロール群で、RT-PCRサイクル閾値における違いがないという事実から導かれうるように、ヒト皮膚繊維芽細胞のsiRNA処理による、他の遺伝子において発現における有意な差はなかった(表7及び図6、7、8)
【０１３２】
図6及び7は、siRNAが誘導したPLOD2の抑制は、COL1A2の発現だけではなく、他のコラーゲン修飾酵素を干渉することがなかった。
【０１３３】
結論:siRNA分子のPLOD2対する効果は、非常に特異的であり且つコラーゲンのPLOD2-誘導ヒドロキシアリシン架橋を予防する新たな方法を約束する。
【０１３４】
実施例5:トランスフェクションしたラット皮膚繊維芽細胞におけるPLOD2の定量化
この実験のねらいは、ラット繊維芽細胞中でのPLOD2siRNAの性能を試験することである。
【０１３５】
材料と方法:siRNAをラットPLOD2に対するAmbion Inc. siRNA配列によって合成した:
Nr1:siRNA ID:47463  センス配列: 5'GCAGAUAAGUUAUUAGUCAtt3'(配列番号:7)
アンチセンス 5'UGACUAAUAACUUAUCUGCtg3'(配列番号:8)
Nr2:siRNA ID:47549  センス配列: 5'GAAAACGAUGGAUUCCACAtt3'(配列番号:9)
アンチセンス 5'UGUGGAAUCCAUCGUUUUCtt3'(配列番号:10)
Nr3:siRNA ID:47630  センス配列: 5'GAUUUAUGAAUUCAGCCAAtt3'(配列番号:11)
アンチセンス 5'UUGGCUGAAUUCAUAAAUCtg3'(配列番号:12)
【０１３６】
細胞培養:
Rat繊維芽細胞(継代+6; ATCC 1213-CRL)を4500ミリグラムパーリッター(mg/L)のグルコース、ピルビン酸塩及びグルタマックス(GIBCO, ref 31966-021)（10%熱不活性化ウシ胎児血清を補足した）、及び1%ペニシリン/ストレプトマイシン抗生物質を伴うDMEM培地中37℃且つ5%CO2で培養した。
【０１３７】
トランスフェクション:
5×105個の細胞を、トランスフェクションの1日前に、抗生物質を伴わない3mLの培地が入っている6ウェルプレートに播いた。トランスフェクション時、細胞は80〜90%コンフルエントであった。細胞に840pmolのsiRNAをトランスフェクションするかあるいは14μLのLipofectamine 2000及び700μLのOpti-MEM I(Invitrogen)を使用することで3.4mLの培地（最終濃度:250(nM)中block-it-蛍光オリゴ(Invitrogen)をトランスフェクションした。培地を8時間後に替えてRNAをインキュベーションの40時間後に単離した。
【０１３８】
定量化:細胞をPBSで洗浄し且つ350μLのRLTバッファーで洗浄した。全RNA(30μl)をRNeasyミニキット(カタログNo.74106;Qiagen)を使用することで単離した。RNA(8.2μL)を20μL cDNA(First Strand cDNA合成キット; Roche ref. 1483188)へ逆転写し、ミリQ水で10回洗浄してリアルタイムPCR増幅に委ねた。cDNA配列のリアルタイムPCR増幅を10μLの希釈したcDNAにより、I型コラーゲン(Col1A2)のPOLD 1、2b、3、α2鎖、III型コラーゲン(Col3A1)のα1鎖、リシリルオキシダーゼ(Lox)、プロリン4-ヒドロキシラーゼ1(P4HA-1)及びβ2-ミクログロブリン(B2M)についてcDNAの総量の違いを標準化するために行った。後者の遺伝子を、cDNAにおける合計量の違いを標準化するために使用した。各cDNAを、総反応体積25μLで特異的プライマー及び特異的分子ビーコンを使用することで増幅した(Slot et al., J. Biol. Chem., 278(42) :40967-72 (2003))。リアルタイムPCRをABI PRISM 7700配列検出系で行い且つデータを配列ディテクターバージョン1.7ソフトウェアを使用することで解析した。
【０１３９】
【表８】
2008507341.tif 000009
【０１４０】
【表９】
2008507341.tif 000010
ラット皮膚繊維芽細胞PLOD2発現は、表8及び図9及び10で確認されるように、全3つのsiRNAオリゴヌクレオチドにより強力に抑制されていた。
【０１４１】
結論:
全3つのsiRNA配列をともなうPLODのmRNAレベルは良好に抑制されている。PLOD1、PLOD3、リシリルオキシダーゼ(LOX)、プロピル-4-ヒドロキシラーゼ-1(P4HA-1)、Ｉ型コラーゲン(COL1A2)及びIII型コラーゲン(COL3A1)のmRNAレベルに対してsiRNAは効果を有さなかった。
【０１４２】
全ての本願明細書中で参照によって組み込まれている、特許、特許出願、刊行物、並びに核酸及びタンパク質データベース実体、例えば、GenBankアクセスNo.及びEMBL アクセスNo.は、個別に参照によって組み込まれている。さ本発明の様々な変形及び変更は、本発明の精神を逸脱することなく当業者に明らかであり、そして本願明細書中に開示された代表的な実施態様に限定されるものではない。 
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】アリシン経路により架橋したコラーゲンは、(ヒドロキシ)リシノノルレウシン架橋を供し、そして典型的に、皮膚、角膜、及び所定の腱中のI型コラーゲンで発見される。
【図２】ヒドロキシアリシン経路により架橋したコラーゲンにより(ヒドロキシ)リシルピロジノリン(HP及びLP、それぞれ)架橋、並びに典型的に骨中のI型コラーゲン及び軟骨中のII型コラーゲン中に発見される。
【図３】ヒト繊維芽細胞におけるPLOD2発現のsiRNA-ベースの減少に基づく2つの評価研究（A及びB）の結果のグラフによる説明。結果は、%相対PLOD2発現として表されている。コントロールに比較して、PLOD2発現の非トランスフェクションコントロールの減少は90%である。
【図４】ヒト繊維芽細胞中でのハウスキーピング遺伝子GAPDHの発現に対するスクランブルsiRNAを使用することでの研究の結果のグラフによる説明である。
【図５】ヒト繊維芽細胞中でのPLOD2発現に対するハウスキーピング遺伝子GAPDHの発現に対するスクランブルsiRNAを使用することでの研究の結果のグラフによる説明である。
【図６】6A)一次ヒト皮膚繊維芽細胞におけるハウスキーピング遺伝子B2Mに関するsiRNAに基づくPOLD2発現のグラフによる説明である。6B)一次ヒト皮膚繊維芽細胞におけるハウスキーピング遺伝子B2Mに関連するsiRNAベースのCOL1A2のグラフによる説明である。
【図７】7A)一次ヒト皮膚繊維芽細胞におけるCOL1A2 発現に関連するsiRNA-ベースのPLOD発現のグラフによる説明である。7B)一次ヒト皮膚繊維芽細胞におけるCOL1A２発現に関連するsiRNAベースのPLOD1発現のグラフによる説明である。7C)一次ヒト皮膚繊維芽細胞におけるCOL1A2発現に関連するsiRNAに基づくPOLD3発現のグラフによる説明である。
【図８】8A)一次ヒト皮膚繊維芽細胞におけるCOL1A2発現に関連するCOL3A1発現のグラフによる説明である。8B)一次ヒト皮膚繊維芽細胞におけるCOL1A2発現に関連するsiRNAベースLOX発現のグラフによる説明である。8C)一次ヒト皮膚繊維芽細胞におけるCOL1A2発現に関連するsiRNAに基づくP4HA-1発現のグラフによる説明である。
【図９】9A)ラット皮膚繊維芽細胞におけるハウスキーピング遺伝子におけるB2Mに関連するsiRNAベースのPLOD2発現のグラフによる説明である。9B)ラット皮膚繊維芽細胞中のハウスキーピング遺伝子に関連するB2MにおけるsiRNAに基づくPLOD1発現に関するグラフによる説明である。9C)ラット皮膚繊維芽細胞中のハウスキーピング遺伝子B2Mに関連するsiRNAに基づくPOLD3のグラフによる説明である。9D)ラット皮膚繊維芽細胞中のハウスキーピング遺伝子 B2Mに関連するsiRNAに基づくCOL1A2発現のグラフによる説明である。9E)ラット皮膚繊維芽細胞中のハウスキーピング遺伝子B2Mに関連するsiRNAに基づくCOL3A1発現のグラフによる説明である。9F)ハウスキーピング遺伝子B2Mラット皮膚繊維芽細胞中のsiRNAに基づくLOX発現のグラフによる説明である。9G)ラット皮膚繊維芽細胞中のハウスキーピング遺伝子B2Mに関するsiRNAに基づくP4HA-1発現のグラフによる説明である。
【図１０】10A)ラット皮膚繊維芽細胞中のCOL1A2発現に関連するsiRNAベースのPLOD2発現のグラフによる説明である。10B)ラット皮膚繊維芽細胞中のCOL1A2 発現に関連するsiRNAに基づくPLOD1発現のグラフによる説明である。10C)ラット皮膚繊維芽細胞中のCOL1A2 発現に関連するsiRNAに基づくCOL3A1発現のグラフによる説明である。10D)COL1A2発現ラット皮膚繊維芽細胞中のsiRNAに基づくLOX発現のグラフによる説明である。10E)ラット皮膚繊維芽細胞中のCOL1A2発現に関連するsiRNAに基づくP4HA-1発現のグラフによる説明である。
【図１】
2008507341.tif 000011
【図２】
2008507341.tif 000012
【図３】
2008507341.tif 000013
【図４】
2008507341.tif 000014
【図５】
2008507341.tif 000015
【図６】
2008507341.tif 000016
【図７】
2008507341.tif 000017
【図８】
2008507341.tif 000018
【図９】
2008507341.tif 000019
【図１０】
2008507341.tif 000020
【国際調査報告】
2008507341.tif 000021
2008507341.tif 000022
2008507341.tif 000023
2008507341.tif 000024