(57)【要約】細胞アッセイを実行する標識フリー光学バイオセンサを使用するための組成物および方法が開示される。特定実施例において、高スループット方法でアッセイが実行され得、多重して行われ得る。
2008538287.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞上の刺激性事象の効果を試験する方法であって、標識フリーバイオセンサを用意し、バイオセンサ上の細胞をインキュベートし、インキュベートされた細胞に刺激性事象を与え、バイオセンサからバイオセンサ出力を集めることからなる方法。
【請求項２】
細胞をインキュベートすることは細胞を培養することを含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
刺激性効果がバイオセンサ出力から同定される請求項１記載の方法。
【請求項４】
細胞が２０−９９％密集度で培養される請求項２記載の方法。
【請求項５】
細胞が３０−８０％密集度で培養される請求項２記載の方法。
【請求項６】
細胞が４０−６５％密集度で培養される請求項２記載の方法。
【請求項７】
細胞が７０−９９％密集度で培養される請求項２記載の方法。
【請求項８】
細胞が８０−９５％密集度で培養される請求項２記載の方法。
【請求項９】
細胞が付着細胞である請求項２記載の方法。
【請求項１０】
細胞がバイオセンサと接触してある請求項１記載の方法。
【請求項１１】
細胞がバイオセンサに付属する請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
刺激性事象が化合物を細胞培養に加えることからなる請求項２記載の方法。
【請求項１３】
化合物が細胞のシグナル伝達経路細胞を調整する請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
転形がシグナル伝達経路細胞を活性化する請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
転形がシグナル伝達経路細胞を抑制する請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
化合物が細胞上の細胞表面受容体を調整する請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
化合物が受容体の作動薬である請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
化合物が受容体の拮抗薬である請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
細胞表面受容体がＧタンパク質共役型受容体、イオンチャネル、受容体チロシンキナーゼ、サイトカイン受容体、インテグリン受容体、Ｎａ＋／Ｈ＋交換体受容体または免疫性の受容体である請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
細胞表面受容体がＧｑ−共役型受容体、Ｇｓ−共役型受容体、Ｇｉ−共役型受容体、Ｇ１２／１３−共役型受容体、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、繊維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦ）または血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）である請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
化合物が細胞内で細胞骨格成分を調整する請求項１２記載の方法。
【請求項２２】
化合物が細胞骨格構造を不安定にする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
化合物が細胞骨格構造を安定させる請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
化合物が細胞内酵素、細胞内のキナーゼ、細胞内小器官、細胞内のタンパク質または細胞間マトリックスを調整する請求項１２記載の方法。
【請求項２５】
化合物が化合物溶液に添加される請求項１２記載の方法。
【請求項２６】
化合物が細胞に対し毒性であるかどうかについて決定することを更に含む請求項１２記載の方法。
【請求項２７】
複数の化合物が細胞に対し毒性である化合物のためのスクリーニング試験される請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
化合物の毒性のレベルがバイオセンサ出力を経てモニタされる請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
細胞が化合物の効果のためのバイオセンサ出力を経てモニタされる請求項１２記載の方法。
【請求項３０】
化合物の生体吸収がバイオセンサ出力を経てモニタされる請求項１２記載の方法。
【請求項３１】
バイオセンサが１００ナノメートルの深度に細胞を通す請求項１記載の方法。
【請求項３２】
バイオセンサが１００ナノメート、２００ナノメートル、３００ナノメートル、または５００ナノメートルルの深度に細胞を通す請求項１記載の方法。
【請求項３３】
バイオセンサが細胞内で侵入の多数の深度からデータを受け取る請求項１記載の方法。
【請求項３４】
侵入の深度が最高５００ナノメートルである請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
細胞の状態がバイオセンサ出力を使用して同定される請求項１記載の方法。
【請求項３６】
刺激性事象が細胞の生存又は増殖に影響を及ぼすかどうかについて決定することを更に含む請求項１記載の方法。
【請求項３７】
複数の化合物が細胞に対し毒性である化合物のためのスクリーニング試験される請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
細胞上の化合物の効果がモニタされる請求項１２記載の方法。
【請求項３９】
化合物が抗癌化合物である請求項１２記載の方法。
【請求項４０】
バイオセンサからバイオセンサ出力を集めることはバイオセンサ出力パラメータを集めることからなる請求項１記載の方法。
【請求項４１】
バイオセンサ出力パラメータがバイオセンサ出力の動態に関連したパラメータである請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
バイオセンサ出力パラメータがバイオセンサ出力の全体的な動態を分析することからなる請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
全体的な動態を分析することは相転移の完成で１つの位相から他の位相への変化率を分析することからなる請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
全体的な動態を分析することはそれがバイオセンサ出力の出力を完了することにかかる時間の長さを分析することからなる請求項４１記載の方法。
【請求項４５】
全体的な動態を分析することはバイオセンサ出力の出力の全体的な位相がいずれをするか時間の長さを分析することからなる請求項４１記載の方法。
【請求項４６】
全体的な動態を分析することはＰ−ＤＭＲ位相の全体の持続期間を分析することからなる請求項４１記載の方法。
【請求項４７】
全体的な動態を分析することはＮ−ＤＭＲ位相の全体の持続期間を分析することからなる請求項４１記載の方法。
【請求項４８】
全体的な動態を分析することはＰ−ＤＭＲの総振幅を獲得するための速度を分析することからなる請求項４１記載の方法。
【請求項４９】
全体的な動態を分析することはＮ−ＤＭＲの総振幅を獲得するための速度を分析することからなる請求項４１記載の方法。
【請求項５０】
全体的な動態を分析することはＮ−ＤＭＲからＰ−ＤＭＲまで行くために速度を分析することからなる請求項４１記載の方法。
【請求項５１】
全体的な動態を分析することは、ネット−ゼロ位相にＰ−ＤＭＲ位相からＮ−ＤＭＲ位相、Ｐ−ＤＭＲ位相に対するネット−ゼロ位相、Ｎ−ＤＭＲ位相に対するネット−ゼロ位相、ネット−ゼロ位相に対するＰ−ＤＭＲ位相またはＮ−ＤＭＲ位相への遷移時間ｔを分析することからなる請求項４１記載の方法。
【請求項５２】
バイオセンサ出力パラメータがバイオセンサ出力の位相を分析することからなる請求項４１記載の方法。
【請求項５３】
位相を分析することは相転移を分析することからなる請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
位相を分析することは正の指向性質量再分布（Ｐ−ＤＭＲ）シグナルを分析することからなる請求項５２記載の方法。
【請求項５５】
位相を分析することは負の指向性質量再分布（Ｎ−ＤＭＲ）シグナルを分析することからなる請求項５２記載の方法。
【請求項５６】
位相を分析することはネット−ゼロ指向性質量再分布（ネット−ゼロＤＭＲ）を分析することからなる請求項５２記載の方法。
【請求項５７】
位相を分析することは正の指向性質量再分布（Ｐ−ＤＭＲ）シグナルの形を分析することからなる請求項５２記載の方法。
【請求項５８】
位相を分析することは正の指向性質量再分布（Ｐ−ＤＭＲ）シグナルの振幅を分析することからなる請求項５２記載の方法。
【請求項５９】
位相を分析することは負の指向性質量再分布（Ｎ−ＤＭＲ）シグナルの形を分析することからなる請求項５２記載の方法。
【請求項６０】
位相を分析することは負の指向性質量再分布（Ｎ−ＤＭＲ）シグナルの振幅を分析することからなる請求項５２記載の方法。
【請求項６１】
バイオセンサ出力パラメータがバイオセンサ出力の全体的な動態からなる請求項４１記載の方法。
【請求項６２】
分析全体的動態がバイオセンサ出力によって産生される完全な曲線の形を分析することからなる請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
バイオセンサ出力パラメータが共鳴ピークに関するパラメータである請求項２５記載の方法。
【請求項６４】
バイオセンサ出力パラメータが光がバイオセンサに結合される入射角対光強度を分析することからなる請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
バイオセンサ出力パラメータが光がバイオセンサに結合される光の波長対光強度を分析することからなる請求項６３記載の方法。
【請求項６６】
バイオセンサ出力パラメータがピーク位置を分析することからなる請求項６３記載の方法。
【請求項６７】
ピーク位置を分析することは最大の強度の位置の前に起こっている最大半減のピーク強度の位置を分析することからなる請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
ピーク位置を分析することは最大の強度の位置の後、起こっている最大半減のピーク強度の位置を分析することからなる請求項６６記載の方法。
【請求項６９】
バイオセンサ出力パラメータが共鳴ピークの位置の強度を分析することからなる請求項６３記載の方法。
【請求項７０】
共鳴ピークの強度を分析することは最大の強度の強度を分析することからなる請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
共鳴ピークの強度を分析することはピーク強度の前に共鳴ピークに起こる最大半減のピーク強度の強度を分析することからなる請求項６９記載の方法。
【請求項７２】
共鳴ピークの強度を分析することはピーク強度の後、共鳴ピークに起こる最大半減のピーク強度の強度を分析することからなる請求項６９記載の方法。
【請求項７３】
第２のバイオセンサ出力パラメータを集めることを更に含む請求項６６記載の方法。
【請求項７４】
第２のバイオセンサ出力パラメータが分析ピーク位置からなる請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
バイオセンサ出力パラメータがピーク形を分析することからなる請求項６３記載の方法。
【請求項７６】
ピーク形を分析することは共鳴ピークの下の領域を決定することからなる請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
共鳴ピークの下の領域が共鳴ピークに起こっている最大半減の強度点の間で引かれるラインより上の領域を含むだけである請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
ピーク形を分析することは最大半減の強度点で共鳴ピークの幅を分析することからなる請求項７５記載の方法。
【請求項７９】
バイオセンサ出力パラメータが共鳴バンド像に関連したパラメータである請求項２５記載の方法。
【請求項８０】
共鳴バンド像は、バイオセンサ全体を光スポットで照射して、バイオセンサ全体の内結合した光強度分布を画像化して得られる請求項７９記載の方法。
【請求項８１】
内結合された光強度分布がＣＣＤカメラによって撮像される請求項８０記載の方法。
【請求項８２】
共鳴バンド像に関連したパラメータがバンド形、バンド位置、バンド強度または光強度分布である請求項７９記載の方法。
【請求項８３】
最大強度の位置と協力した最大半減（ＰＷＨＭ）でのピーク幅が分析される請求項１記載の方法。
【請求項８４】
化合物を有する培養細胞をインキュベートすることを更に含む請求項１記載の方法。
【請求項８５】
化合物が細胞上の刺激性事象の効果に影響を及ぼすかどうかについて決定することを更に含む請求項８４記載の方法。
【請求項８６】
細胞上の刺激性事象の効果上の化合物の効果を決定することを更に含む請求項８４記載の方法。
【請求項８７】
一つ以上の追加の化合物はスクリーニングされ、化合物が細胞上の刺激性事象の効果に影響を及ぼすかどうか決定する請求項８５記載の方法。
【請求項８８】
バイオセンサ出力が１０分、５分、１分、３０秒、１０秒、５秒または１秒未満で集められる請求項１記載の方法。
【請求項８９】
バイオセンサ出力が実質的に生物学的な拡散として同じものは刺激性効果のために制限する１回のために集められる請求項８８記載の方法。
【請求項９０】
検出系を提供することを更に含む請求項１記載の方法。
【請求項９１】
複数の標識フリーバイオセンサが提供され、細胞がバイオセンサのうちの２つ以上の各々に培養され、刺激性事象が２つ以上の標識フリーバイオセンサに与えられ、バイオセンサ出力が２つ以上の標識フリーバイオセンサから集められる請求項１記載の方法。
【請求項９２】
細胞の多数の侵入深さがモニタされる請求項９１記載の方法。
【請求項９３】
各々のバイオセンサが侵入深さのうちの１つを有する請求項９２記載の方法。
【請求項９４】
２つ以上のバイオセンサからのバイオセンサ出力が同時に集められる請求項９１記載の方法。
【請求項９５】
細胞が同時に培養される請求項９１記載の方法。
【請求項９６】
刺激性事象が同時に２つ以上のバイオセンサに提供される請求項９１記載の方法。
【請求項９７】
異なる細胞タイプの多数がバイオセンサの多数にインキュベートされる請求項９１記載の方法。
【請求項９８】
細胞の多数は、細胞のうちの少なくとも１つが遺伝子操作によったので異なる少なくとも２つの細胞からなる請求項９７記載の方法。
【請求項９９】
細胞タイプの多数内の各細胞タイプがバイオセンサの多数の異なるバイオセンサによって検出される請求項９８記載の方法。
【請求項１００】
細胞が少なくとも７０％の密集度で培養される請求項１記載の方法。
【請求項１０１】
細胞が複数の細胞からなる請求項１記載の方法。
【請求項１０２】
細胞のタイプおよび刺激性事象のタイプと互換性を持つ緩衝液を細胞に適用することを更に含む請求項１記載の方法。
【請求項１０３】
バイオセンサ出力を集めることは、入射角を変化させて、光にバイオセンサをさらし、そして、内結合した光の入射角を測定することを含む請求項１記載の方法。
【請求項１０４】
バイオセンサ出力を集めることは、波長を変化させて、光にバイオセンサをさらし、そして、内結合した光の波長を測定することを含む請求項１記載の方法。
【請求項１０５】
細胞は、増殖している状態において、静止性状態において、差別化された状態において、異なるレドックス／酸化された状態において、または、特定の細胞周期状態においてある請求項１記載の方法。
【請求項１０６】
細胞は、細胞増殖培養液を有する細胞を培養することによって増殖している状態においてある請求項１０５記載の方法。
【請求項１０７】
細胞は、スターベーション培地を有する細胞を培養することによって静止性状態においてある請求項１０５記載の方法。
【請求項１０８】
バイオセンサ出力を分析することを更に含む請求項１記載の方法。
【請求項１０９】
モニタリングは、１秒、３秒、５秒、１０秒、２０秒、３０秒、１分または５分のサンプリングレートによって、連続的に起こる請求項１記載の方法。
【請求項１１０】
細胞上の刺激性事象の効果を同定することを更に含む請求項１記載の方法。
【請求項１１１】
刺激効果を同定することは、バイオセンサ出力をシグニチャ出力と比較することからなる請求項記載１１０の方法。
【請求項１１２】
シグニチャ出力が正のＤＭと負のＤＭＲとネット−ゼロＤＭＲ位相のうちの少なくとも１つからなる動的質量再分布応答からなる請求項記載１１１の方法。
【請求項１１３】
細胞が細胞株から起こる請求項１記載の方法。
【請求項１１４】
細胞株が遺伝子操作による変種細胞株である請求項１１３記載の方法。
【請求項１１５】
刺激性事象は、化合物を細胞培養に添加することからなり、刺激性効果が細胞上の化合物の吸収、分配、代謝または毒性に対する影響である請求項１１０記載の方法。
【請求項１１６】
刺激性事象は、化合物を細胞培養に添加することからなり、化合物の刺激性効果を決定することは、化合物の刺激性効果の機能上検査と、吸収、分配、代謝、排出または毒性の細胞に対する影響の同定とからなる請求項１１０記載の方法。
【請求項１１７】
バイオセンサの出力が細胞内で質量再分布の変化に関連する請求項１記載の方法。
【請求項１１８】
バイオセンサの出力がバイオセンサの反射ビームの角度またはスペクトルの変化としての観察可能である請求項１記載の方法。
【請求項１１９】
バイオセンサ出力を集めることは培養細胞の時間に依存している応答をモニタすることからなる請求項１記載の方法。
【請求項１２０】
細胞が少なくとも８０％の密集度に到達した請求項１記載の方法。
【請求項１２１】
バイオセンサがマイクロプレートに埋め込まれる請求項１１９記載の方法。
【請求項１２２】
細胞が少なくとも１時間、５時間、１０時間、１６時間、２４時間、３６時間、１週または２週の間のバイオセンサ上で育てられる請求項１１９記載の方法。
【請求項１２３】
細胞の状態を同定する方法であって、細胞−バイオセンサ組成を形成するために標識フリーバイオセンサの界面上で細胞を培養し、細胞−バイオセンサ組成を分析し、分析が細胞が培養される界面の不均質性を同定することからなる方法。
【請求項１２４】
バイオセンサは、生体細胞と接触したバイオセンサ界面の領域と、刺激性事象によって影響を受けた細胞と接触するバイオセンサ界面の領域と、細胞に接触していないバイオセンサ界面の領域と、間に差異を認める請求項１２３記載の方法。
【請求項１２５】
影響を受けた細胞が一部のその細胞内の成分を放出するかまたは死んでいる細胞である請求項記載１２４の方法。
【請求項１２６】
化合物を有する細胞−バイオセンサ組成をインキュベートすることを更に含む請求項１２３記載の方法。
【請求項１２７】
化合物が化学物質、生化学物質、生体分子、薬剤またはポリマーである請求項１２６記載の方法。
【請求項１２８】
分析が化合物によってインキュベートした後に実行される請求項１２６記載の方法。
【請求項１２９】
分析が６０秒、４５秒、３０秒、１５秒、１０秒、５秒、４秒、３秒、２秒または１秒以下で起こる請求項１２３記載の方法。
【請求項１３０】
不均質性は、バイオセンサ出力が最大強度を有する導波モードの共鳴ピークからなるバイオセンサからのバイオセンサ出力を集めて、最大半減強度（ＰＷＨＭ）で、ピークの幅を比較することによって決定される請求項１２３記載の方法。
【請求項１３１】
導波モードがＴＭモードである請求項１３０記載の方法。
【請求項１３２】
バイオセンサが単一であるか多重化フォーマットにおいてある請求項１２３記載の方法。
【請求項１３３】
バイオセンサが多重化フォーマットにおいてある時、バイオセンサがマイクロプレートの一つ以上のウェルに埋め込まれる請求項１２３記載の方法。
【請求項１３４】
マイクロプレートの１つのウェルに１つのバイオセンサがある請求項１３３記載の方法。
【請求項１３５】
マイクロプレートの１つの空に多数のバイオセンサがあり、バイオセンサはパリアの有無にかかわらず物理的に分離される請求項１３３記載の方法。
【請求項１３６】
バイオセンサがパリアで物理的に分離され、ウェル内で区画を画定するパリアがマイクロプレートのウェルを画定しているパリアより低い請求項１３５記載の方法。
【請求項１３７】
バイオセンサが光導波路バイオセンサである請求項１２３記載の方法。
【請求項１３８】
バイオセンサが光導波路グレーティングバイオセンサである請求項１２３記載の方法。
【請求項１３９】
細胞が各々の２つ以上のウェルで培養され、刺激性事象が２つ以上のウェルに供され、刺激性事象が化合物を２つ以上のウェルに添加することを含み、バイオセンサ出力が２つ以上のウェルつから集められ、ウェルのうちの２つ以上のＰＷＨＭがコントロールウェルと比較され、刺激性事象がコントロールウェルに供されない請求項１記載の方法。
【請求項１４０】
バイオセンサ出力は、ウェル当たり、１秒か、２秒か、３秒か、４秒か、５秒か、１０秒か、１５秒か、３０秒か、４５秒か、または６０秒より大きい速度で集められる請求項１３９記載の方法。
【請求項１４１】
バイオセンサ出力は、１分当たり、６０個か、３０個か、１５個か、１０個か、７個か、５個か、４個か、３個か、２個か、または１  個のウェルより大きい速度である請求項１３９記載の方法。
【請求項１４２】
ウェルのＰＷＨＭは、ウェル当たり、１秒か、２秒か、３秒か、４秒か、５秒か、１０秒か、１５秒か、３０秒か、４５秒か、または６０秒より大きい速度で比較される請求項１３９記載の方法。
【請求項１４３】
ウェルのＰＷＨＭは、１分当たり、６０個か、３０個か、１５個か、１０個か、７個か、５個か、４個か、３個か、２個か、または１  個のウェルより大きい速度で比較される請求項１３９記載の方法。
【請求項１４４】
化合物の毒性が単一のデータポイントを使用して評価され得る請求項１３９記載の方法。
【請求項１４５】
バイオセンサ出力は、時間に依存するＰＷＨＭ変化である請求項１３９記載の方法。
【請求項１４６】
バイオセンサが光学バイオセンサである請求項１３９記載の方法。
【請求項１４７】
バイオセンサが光学型バイオセンサである請求項１３９記載の方法。
【請求項１４８】
バイオセンサが標識フリーバイオセンサである請求項１３９記載の方法。
【請求項１４９】
バイオセンサが細胞を培養するための系に付けられる請求項１３９記載の方法。
【請求項１５０】
系がプレートである請求項１４９記載の方法。
【請求項１５１】
プレートが複数のウェルを有するプレートである請求項１５０記載の方法。
【請求項１５２】
プレートがマイクロプレートである請求項１５１記載の方法。
【請求項１５３】
細胞が各々の２つ以上のウェルで培養され、マイクロプレートがウェルからなり、バイオセンサ出力は、指定された時間での各ウェルの全部のセンサ領域のＴＭ０モード共振角のバンドの像である請求項１記載の方法。
【請求項１５４】
細胞が７０％の密集度に到達する請求項１５３記載の方法。
【請求項１５５】
刺激性事象が化合物をウェルうちの２つ以上に添加することを含み、ＴＭ０モード共振角のバンドの幅は、化合物添加なしでのウェルのＴＭ０モード共振角のバンドに添加された化合物を有するウェルのＴＭ０モード共振角のバンドの幅と比較される請求項１５３記載の方法。
【請求項１５６】
バイオセンサが導波路型バイオセンサである請求項１５３記載の方法。
【請求項１５７】
導波路型バイオセンサがＮｂ２Ｏ５光学型バイオセンサである請求項１５６記載の方法。
【請求項１５８】
細胞が付着細胞である請求項１５３記載の方法。
【請求項１５９】
細胞が３０％、５０％または９０％の密集度で育てられる請求項１５３記載の方法。
【請求項１６０】
バイオセンサ出力は、光導波路光モードスペクトル（ＯＷＬＳ）、導波モードの共鳴ピークまたは導波モードの共鳴バンド像である請求項１５３記載の方法。
【請求項１６１】
最大強度での共鳴ピークの位置の減少は化合物が細胞に対し毒性であることを示す請求項１４０記載の方法。
【請求項１６２】
ＰＷＨＭの広幅化は化合物が細胞に対し毒性であることを示す請求項１４０記載の方法。
【請求項１６３】
ＰＷＨＭの分裂は化合物が細胞に対し毒性であることを示す請求項１４０記載の方法。
【請求項１６４】
共振バンド広がりは化合物が細胞に対し毒性であることを示す請求項１４０記載の方法。
【請求項１６５】
細胞は少なくとも７０％の密集度に到達した請求項１６４記載の方法。
【請求項１６６】
ＰＷＨＭの変化は化合物が細胞に対する影響を有することを示す請求項１４０記載の方法。
【請求項１６７】
バイオセンサがマイクロプレートに付けられる請求項１６６記載の方法。
【請求項１６８】
バイオセンサがマイクロプレートの各ウェルの底に埋め込まれる請求項１６７記載の方法。
【請求項１６９】
バイオセンサが光学型標識フリーバイオセンサである請求項１６６記載の方法。
【請求項１７０】
細胞−バイオセンサが化合物で覆われいる請求項１６６記載の方法。
【請求項１７１】
化合物が溶液においてある請求項１７０記載の方法。
【請求項１７２】
開始細胞数が増殖の増加または増殖の減少の解析を見越す請求項１６６記載の方法。
【請求項１７３】
細胞の数は化合物の非存在下で３０−７０％間の密集度に到達する請求項１７２記載の方法。
【請求項１７４】
細胞の数は４０−６０％間の密集度に到達する請求項１７２記載の方法。
【請求項１７５】
細胞の数は４５−５５％間の密集度に到達する請求項１７２記載の方法。
【請求項１７６】
細胞の数は５０％の密集度に到達する請求項１７２記載の方法。
【請求項１７７】
化合物を有するインキュベーションの前にバイオセンサ上で培養される細胞の数が少なくとも１０００か、２０００か、３０００か、４，０００か、５，０００か、６，０００か、７，０００か、８，０００か、９，０００か、１０，０００か、１１，０００か、１２，０００か、１３，０００か、１４，０００か、１５，０００か、１６，０００か、１７，０００か、１８，０００か、１９，０００か、２０，０００か、２１，０００か、２２，０００か、２３，０００か、２４，０００か、２５，０００か、３０，０００か、３５，０００か、４０，０００か、４５，０００か、５０，０００か、５５，０００か、６０，０００か、６５，０００か７０，０００である請求項１７１記載の方法。
【請求項１７８】
バイオセンサ出力が単一の時間点で集められる請求項１６６記載の方法。
【請求項１７９】
集められるバイオセンサ出力がスペクトルである請求項１６６記載の方法。
【請求項１８０】
集められるバイオセンサ出力が全部の独立のバイオセンサ領域のＴＭ０モード共振角のバンドの像である請求項１６６記載の方法。
【請求項１８１】
集められるバイオセンサ出力が全部の独立のバイオセンサ領域のＴＭ０モード共振角のバンドの像である請求項１７９記載の方法。
【請求項１８２】
バイオセンサ出力が全体の角のシフトを含み、全体の角のシフトの減少が化合物が細胞増殖の阻害物質であることを示す請求項１６６記載の方法。
【請求項１８３】
バイオセンサ出力が全体の角のシフトを含み、全体の角のシフトの増加が化合物が細胞増殖の阻害物質であることを示す請求項１６６記載の方法。
【請求項１８４】
バイオセンサ出力が結合された光の強度を含み、結合された光の強度が光の入射角の関数として、プロットされる請求項１６６記載の方法。
【請求項１８５】
細胞が少なくとも１時間、５時間、１０時間、１６時間、２４時間、３６時間、１週または２週の間のバイオセンサ上で培養される請求項１６６記載の方法。
【請求項１８６】
バイオセンサ出力が結合モードからなる請求項１６６記載の方法。
【請求項１８７】
結合モードがＴＭモード（ＴＭ０）である請求項１８６記載の方法。
【請求項１８８】
ＴＭ０モードが始細胞接種数の関数として、プロットされる請求項１８７記載の方法。
【請求項１８９】
細胞が受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を有し、バイオセンサ界面上の細胞付着および細胞の成長を見越す濃度で血清を含んでいる培地において懸濁され、細胞がバイオセンサ界面に付着する請求項１記載の方法。
【請求項１９０】
３７℃で、細胞をスターベーション培地で培養することによって付着細胞を飢餓させることを更に含み、スターベーション培地が血清の低濃度を含んでいる培地である請求項１８９記載の方法。
【請求項１９１】
培地に少なくとも一回緩衝液を適用することを更に含む請求項１８９記載の方法。
【請求項１９２】
刺激性事象は、ＲＴＫへのリガンドを培地に適用することからなる請求項１８９記載の方法。
【請求項１９３】
培地は、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）、ＥＧＦ、インシュリン、ＴＧＦ−ａ、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）および神経成長因子（ＮＧＦ）を欠いている請求項１８９記載の方法。
【請求項１９４】
スターベーション培地は、血清またはウシ胎児血清（ＦＢＳ）の約０．１％未満の濃度を有する請求項記載１９０の方法。
【請求項１９５】
時間依存応答が少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３６または４８時間に起こる請求項１８９記載の方法。
【請求項１９６】
バイオセンサが複数のウェルを有するマイクロプレートの底において包埋され、細胞で異なるタイプが各々の２つ以上のウェルで培養され、刺激性事象が２つ以上のウェルに提供され、刺激性事象が２つ以上のウェルにリガンドをＲＴＫに加えることを含み、バイオセンサ出力が２つ以上のウェルから集められ、バイオセンサ出力が細胞の異なるタイプの時間依存応答である請求項１８９記載の方法。
【請求項１９７】
細胞の異なるタイプが異なる培養条件を必要とする請求項１９６記載の方法。
【請求項１９８】
ＲＴＫの発現量または細胞表面発現量が測定されるかまたは細胞の異なるタイプにおいて決定される請求項１９６記載の方法。
【請求項１９９】
化合物で培養細胞をインキュベートすること、および化合物がＲＴＫのシグナル伝達を調整するかどうか決定することを更に含む請求項１９６記載の方法。
【請求項２００】
細胞がＲＴＫの比較的高い発現量を有し、バイオセンサが複数のウェルを有するマイクロプレートの底において包埋され、細胞が各々の２つ以上のウェルで培養され、刺激性事象が２つ以上のウェルに提供され、刺激性事象が２つ以上のウェルにリガンドをＲＴＫに添加されることを含み、ＲＴＫに対するリガンドで異なる濃度が２つ以上の細胞に添加され、バイオセンサ出力が２つ以上のウェルから集められ、バイオセンサ出力が異なるウェルの細胞の用量および時間の依存応答である請求項１８９記載の方法。
【請求項２０１】
用量および時間の時間依存応答が比較される請求項２００記載の方法。
【請求項２０２】
リガンドの効力が決定される請求項２００記載の方法。
【請求項２０３】
細胞から生体材料の放出のためのバイオセンサ出力を分析することを更に含み、それによって細胞の細胞骨格の状態が分析される請求項１記載の方法。
【請求項２０４】
細胞からの生体材料の放出は細胞の孔形成試薬−起因性透過性に依存している請求項２０３記載の方法。
【請求項２０５】
孔形成試薬を細胞培養に適用することを更に含む請求項２０３記載の方法。
【請求項２０６】
バイオセンサ出力が時間依存光学応答である請求項２０５記載の方法。
【請求項２０７】
前記孔形成試薬は、細胞表層膜の小孔形成が可能である化学的または生物学的な化合物である請求項２０５記載の方法。
【請求項２０８】
孔形成試薬がサポニン、ジギトニン、フィリピンまたはストレプトリジンＯである請求項記載２０７の方法。
【請求項２０９】
細胞培養に孔形成試薬の適用するに続いて、化合物を細胞培養に適用することを更に含む請求項２０５記載の方法。
【請求項２１０】
一つ以上の追加の化合物がスクリーニングされ、化合物が細胞内で細胞骨格構造を妨げるかどうか決定する請求項２０９記載の方法。
【請求項２１１】
細胞培養に孔形成試薬の適用法の前に化合物を細胞培養に適用することを更に含んでいる請求項２０５記載の方法。
【請求項２１２】
一つ以上の追加の化合物がスクリーニングされ、化合物が細胞内で細胞骨格構造を妨げるかどうか決定する請求項２１１記載の方法。
【請求項２１３】
標識を検出する装置で標識を検出するステップをさらに含んでいる請求項１記載の方法。
【請求項２１４】
標識は蛍光性標識、放射性標識または発光顔料標識である請求項２１３記載の方法。
【請求項２１５】
標識を検出するステップがバイオセンサをモニタするステップと同時に起こる請求項２１３記載の方法。
【請求項２１６】
バイオセンサが２つの領域を有し、第１領域が堆積された材料を含有しない混合物を有し、第２の領域が堆積された材料を含有する混合物を有し、細胞がセンサ上でインキュベートされたとき、第２の領域に堆積された細胞が材料によってトランスフェクションされる請求項１記載の方法。
【請求項２１７】
材料は、標的遺伝子、標的タンパク質、標的タンパク質および標識タンパク質の融合タンパク質、標的に対するＲＮＡｉ、標的に対する抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその派生物、抗原オリゴヌクレオチドおよびその派生物である請求項２１６記載の方法。
【請求項２１８】
標識タンパク質がヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、ＧＦＰタンパク質またはその派生物である請求項２１７記載の方法。
【請求項２１９】
細胞がセンサの材料提示領域の上へ付着するときに細胞が材料を取込むようにして、材料は試薬によって複合体になる請求項２１８記載の方法。
【請求項２２０】
材料を含有する混合物を、グレーティング構造に沿ってセンサ界面の一つの半分の上へ、選択的に堆積させることによって、領域が形成される請求項２１６記載の方法。
【請求項２２１】
生体細胞の状態を決定する方法であって、細胞の内容物の動的質量再分布を観察することを含み、観察するステップが共鳴導波路グレーティングバイオセンサ上で起こる方法。
【請求項２２２】
細胞に対する化合物影響を試験するための方法であって、バイオセンサ上で細胞を培養し、最初に細胞を洗って、細胞を飢餓させて、細胞を有する化合物をインキュベートして、バイオセンサでシグナルを記録することを含む方法。
【請求項２２３】
餓死ステップの後、緩衝液ですすぎするステップをさらに含む請求項２２２記載の方法。
【請求項２２４】
細胞が９０％を超える密集度で育てられる請求項２２２記載の方法。
【請求項２２５】
細胞が二回洗浄される請求項２２２記載の方法。
【請求項２２６】
細胞を飢餓させることはそれらをＤＭＥＭだけで培養することを含む請求項２２２記載の方法。
【請求項２２７】
細胞を飢餓させることは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５または４０時間起こる請求項２２２記載の方法。
【請求項２２８】
細胞を飢餓させることは一晩中起こる請求項２２２記載の方法。
【請求項２２９】
すすぎの緩衝液は、ペーハー７．０、２．５ｍＭのプロベニシドにおいて、１×標準ハンクス均衡塩類溶液、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液を含む請求項２２２記載の方法。
【請求項２３０】
シグナルがカルシウムシグナルである請求項２２２記載の方法。
【請求項２３１】
記録されたカルシウムシグナルは６秒の間隔で記録された６分以上である請求項２２２記載の方法。
【請求項２３２】
バイオセンサはＨＴＳ７０００バイオアッセイリーダを含む請求項２２２記載の方法。
【請求項２３３】
方法が室温で起こる請求項２２２記載の方法。
【請求項２３４】
バイオセンサがコーンイング社Ｒ  ＥｐｉｃＴＭ角度測定システムである請求項２２２記載の方法。
【請求項２３５】
バイオセンサはＴＭモードで使用される請求項２２２記載の方法。
【請求項２３６】
バイオセンサはｐ−偏光を与えられたＴＭ０モードにおいて使われる請求項２２２記載の方法。
【請求項２３７】
化合物がすすぎ緩衝液において薄められる請求項２２２記載の方法。
【請求項２３８】
すすぎ緩衝液が１×標準ハンクス均衡塩類溶液、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液を含み、ペーハー７．０である請求項２２２記載の方法。
【請求項２３９】
細胞を飢餓させることはウシ胎児血清またはウシ胎仔血清を欠いている緩衝液で起こる請求項２２２記載の方法。
【請求項２４０】
化合物が溶液にあり、溶液が０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％または５％未満のジメチルスルホキシドを有する請求項２２２記載の方法。
【請求項２４１】
餓死ステップが３７℃で起こる請求項２２２記載の方法。
【請求項２４２】
更に餓死ステップが空気／５％のＣＯ２の下で起こる請求項２２２記載の方法。
【請求項２４３】
細胞が安定した位相まで、細胞を有する化合物溶液をインキュベートする前に化合物を欠いている化合物溶液によって前処理される請求項２２２記載の方法。に、達する。
【請求項２４４】
バイオセンサが共鳴バンドの中央の位置の画素密度の変化を同定する請求項２２２記載の方法。
【請求項２４５】
バイオセンサが共鳴バンドの角のシフトを測定する請求項２２２記載の方法。
【請求項２４６】
時間の関数として、バイオセンサデータをプロットするステップをさらに含む請求項２２２記載の方法。
【請求項２４７】
増加するシグナル（Ｐ−ＤＭＲ）が検知体積内での生体分子の総計の増加を意味し、かつ減少されたシグナル（Ｎ−ＤＭＲ）が検知体積内での生体分子の総計の減少を意味する請求項２２２記載の方法。
【請求項２４８】
方法が細胞および化合物のためのシグニチャを同定する請求項２２２記載の方法。
【請求項２４９】
シグニチャは、次のＮ−ＤＭＲ位相によってあとに続いたＰ−ＤＭＲ位相を含み、Ｐ−ＤＭＲ位相はＮ−ＤＭＲ位相の崩壊速度より高い速度で起こる請求項２４８記載の方法。
【請求項２５０】
シグニチャは、Ｐ−ＤＭＲ位相が評価プラトーに到達するまでＰ−ＤＭＲ位相を含む請求項２４８記載の方法。
【請求項２５１】
シグニチャが２つの連続的Ｐ−ＤＭＲ現象を含み、高いレベルに対する第１のＰ−ＤＭＲ位相は、第２の高いレベルに対する第２のＰ−ＤＭＲ位相が起こる速度より、大きい速度で起こる請求項２４８記載の方法。
【請求項２５２】
シグニチャが騒音レベルより上にいかなるＤＭＲシグナルも含まない請求項２４８記載の方法。
【請求項２５３】
化合物濃度または化合物種の関数として、バイオセンサからのシグナルをプロットするステップをさらに含む請求項２２２記載の方法。
【請求項２５４】
レドックス／酸化された状態に細胞を所定の期間の間の化合物で処理することによって達する請求項１０５記載の方法。
【請求項２５５】
細胞は、１時間、４時間、８時間、１６時間、２４時間、４８時間または６４時間の化合物で処理される請求項記載２５４の方法。
【請求項２５６】
レドックス／酸化された状態は、外因のオキシダントを細胞に適用して、オキシダント−起因性光出力をモニタすることによって調査される請求項１０５記載の方法。
【請求項２５７】
オキシダントはＨ２Ｏ２、ＭｎＯ４−、ＣｒＯ３、Ｃｒ２Ｏ７２−、ＯｓＯ４から選ばれる請求項２５６記載の方法。
【請求項２５８】
化合物は、化合物または自然発生生物学的製剤のランダムなライブラリから選ばれる請求項記載２５４の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサに関する。
（Ｉ．関連出願の説明）
本出願は、２００５年４月５日に出願された「標識フリーバイオセンサおよび細胞」と称する米国特許出願第６０／６６８，９０８号の優先権を主張し、その内容が参照によりここに引用される。
【背景技術】
【０００２】
（ＩＩ．  背景）
最終的に市場に新薬を出すための薬剤発見および開発プロセスは、複雑かつ高価なプロセスである。伝統的に、薬剤発見の初期では、親和性結合アッセイを利用し、それは一般に試験管内でなされ、関心のある標的効果について潜在的薬剤化合物の機能上の限られた情報を提供するものであった。
前臨床／臨床試験において細胞ベースのアッセイまたは動物モデルベースの確証アッセイで試験されるときに、これらの潜在的な前例試験の多くは失敗して高い消耗の結果となる。
近年、薬剤および生物技術業界において流行しているものは高内容スクリーニング技術を含む革新的な細胞ベースの技術である。
これらのアッセイ技術は、標的と化合物の相互作用の細胞現象上および機能上の運動の細胞ベースの情報を提供する。
得られたデータは、シグナル伝達経路、薬剤作用機構、効能、選択作用および細胞毒性上の情報を含む。
大部分の既存の細胞ベース技術は画像化に基づく検出のため蛍光性標識または発光標識の使用を必要とし、それらは一般に孤立性の細胞内の事象（例えば、Ｃａ２＋フラックス、ｃＡＭＰ生成および蓄積、標的転位、リポータ遺伝子生成、その他）を評価することに集点が当てられている。
細胞機能の複雑性のため、細胞応答は一般に多数シグナルの結合から生じ、そして、所定の単一細胞の応答またはシグナルに基づくアッセイ技術は薬物刺激に対する全体的に統合した細胞応答に関しての情報生成ができない傾向がある。
標識の使用または人工エンハンスメント（例えばトランスフェクションまたはＲＮＡｉノックアウト）またはリポータ遺伝子システムの使用は、たとえば、関心ある標的である実在の細胞生理を解明に有害方法である場合がある。
これらの理由のため、生体細胞上の分子の効果を分析可能とするため持続的要望があり、分析としてたとえば、分子が特定のシグナル伝達経路（例えばＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）または上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ））を遂行するかどうか、あるいは、分子によって細胞に増殖させるかまたは細胞死または停止発育が生じるどうか、がある。
標識フリーまたは標識無依存検出（ＬＩＤ）バイオセンサの使用は望ましい。なぜならバイオセンサがしばしば複雑な標識付加ストラテジおよび検出機構の必要性を回避するからである。
標識フリーバイオセンサは、高スループットスクリーニング方法に、より好適である。
シグナル伝達経路および細胞増殖および死の分析を含む細胞アッセイのいかなるタイプも実行する標識フリーバイオセンサを使用する方法とシステムが、開示される。
【発明の開示】
【課題を解決するための方法】
【０００３】
（ＩＩＩ．  概要）
標識フリーバイオセンサおよび細胞でのそれらの使用に関する方法および組成物が、開示される。
（ＩＶ．  図面の簡単な説明）
添付の図面（これは中で取り入れられて、本明細書の部分を構成する）は、いくつかの実施例を例示して、記述と共に開示された組成物および方法を例示する。
【０００４】
図１は、生体細胞がセンサ界面上の被着した後、光導波路グレーティング（ＯＷＧ）マイクロプレートの特定検出構成の例を示す。
図は、配列された角度測定システムを使用して、得られた約９５％の細胞密集度を有する細胞培養の後における、５列の７センサの共鳴バンドの像を示した。
配列された角度測定システムは、各々がＯＷＧセンサを照らすように光ビームアレーを生成する発光システムと、センサから反射光ビームからの全応答を受信する受信システムと、からなる。
このシステムは、マルチプレックスシステムから付着細胞の同時測定応答を可能とする。
もしセンサ列６×７または７×７を利用できなければ、本例のように５×７でも可能であり、光生成および受信システムによっていかなる構成も可能である。
これらの計測は、たとえば、約３秒の時間分解能でリアルタイムで実行できる。
破線の円は、細胞密度が光顕微鏡画像によって確認できるように、このセンサにわたって平坦でないことを示す。
【０００５】
図２ａは、細胞付着層内で刺激作用起因性指向性質量再分布に基づく細胞アッセイのための光学バイオセンサを示す。
示される例は光導波路グレーティングセンサであり、屈折率ｎｓ＝１．５０のガラス基質上の厚さｄＦ（７５ナノメートル）及び高屈折率（ｎＦ＝２．３６）を有するＮｂ２Ｏ５の薄膜と、全体的な屈折率ｎＡ＝１．３７を有する導波薄膜上の細胞付着層と、屈折率約１．３３（ｎｃ）を有する周囲の培地薄膜と、からなる。
ＯＷＧバイオセンサは、回折格子（グレーティング）によって導波路への光の共振結合に基づくエバネッセント波センサである。
レーザは角度を変化させて導波路を照らされ、そして、光は特定の角度（導波モードの実効屈折率（Ｎ）によって決定される角度）のみで、導波路に結合される。
リガンド起因性標的活性化は、標的への標的相互作用成分の加入、結果の標的複合体の運動、および細胞の細胞骨格構造の潜在的リモデリング（すなわち形態学的変化）を導く。
かかる運動または変化が細胞が培養されるＯＷＧセンサ界面のまさしくその周辺で起こるときに、矢印によって指示したように、ＤＭＲシグナルは特定時間で発生して、リアルタイムでモニタされ得る。
付着細胞層内のリガンド起因性指向性質量再分布は実効屈折率の変化を導き、そして、順に、それは外部被結合光の角度シフトを結果として起こす。
図２ｂは、検知体積内で刺激作用によって媒介された垂直の質量再分布を検出するための３層構成を示す。
細胞の底一部は、多数の等間隔かつ同質の薄層からなるように観察され、各層がそれ自身の屈折率ｎｉ、タンパク質濃度Ｃｉ、距離Ｚｉ  （センサ界面から離間した距離）を有する。
周期Ｌを有するグレーティングは、屈折率ｎＦおよび厚さｄＦを有する導波薄膜によって包埋される。
導波薄膜は、屈折率ｎｓを有する基質の上面に置かれる。
【０００６】
図３は、刺激作用によって媒介された細胞内容物の非対称に横方向再分布の関数としての位相変化を示す。
導波光はプレーナー型導波路を伝搬性するが、これは折れ線波として観察される。
検知体積内の横方向質量分布の不均質性は、所定モードの共鳴ピークの広幅化および平坦分裂を結果として起こす。
【０００７】
図４は、センサ界面から離れてた距離の関数として、センサの導波モードのエバネッセント波の強度を示す。
【０００８】
図５は、ＯＷＧセンサの他の対称性を示す。
このいわゆる逆の対称性導波路構成において、これは概してガラス製の底支持体の有無にかかわらずナノ多孔質シリカの１−１００ミクロン厚層で支えられる導波薄膜（例えばＮｂ２Ｏ５）からなる。
ナノ多孔質シリカは約１．１の実効屈折率を有し、そして、シリカの屈折率はカバー培地の屈折率未満であり、そして、それは一般に我々の本発明の応用例の水溶液である。
【０００９】
図６は、細胞アッセイがＯＷＧバイオセンサを使用して基礎を形成するパラメータを示す。
角度測定システムを使用して得られるように、８ｎＭのＥＧＦに誘導される約９５％密集度の典型的静止Ａ４３１細胞の付着層の典型的な時間に依存する応答は、図６Ａに示される。
図６Ａのグラフに示すように、細胞内で刺激作用−起因性指向性質量再分布の動態を定義する６つのパラメータには、１）全体的な動態（すなわち形状）と、２）応答の位相（例えば、この具体例において、正の指向性質量再分布（Ｐ−ＤＭＲ）、ネット−ゼロ指向性質量再分布（ネット−ゼロＤＭＲ）、および、負の指向性質量再分布（Ｎ−ＤＭＲ）の三位相がある）と、３）各位相の動態と、４）、Ｐ−およびＮ−ＤＭＲ位相の合計持続期間と、５）Ｐ−およびＮ−ＤＭＲ位相の総振幅と、６）Ｐ−からＮ−ＤＭＲ位相への遷移時間ｔと、がある。
図６Ｂは、典型的共鳴ピーク（約９０％密集度の典型的なＡ４３１細胞のＴＭ０モードを使用して得られる）を示し、４つの付加パラメータ、７）ピーク位置、８）強度、９）形、そして、１０）最大半減（ＰＷＨＭ）での幅いわゆる半値幅、を例示する。
図６Ｃは、典型的なＡ４３１細胞が約９５％の密集度によって培養された複数のバイオセンサを有するバイオセンサ＃５などのバイオセンサの典型的ＴＭ０共鳴性バンド像を示す。
データは、アレイ配列された角度測定システムを使用して得られ、５つの追加の特徴、１１）バンド形、１２）位置、１３）強度、１４）分配、そして、１５）幅を例示する。
ここに開示されるように、これらのパラメータの全部がバイオセンサを使用しているいかなる細胞アッセイものいかなる所定の適用法のためにも、独立に、または一緒に使われ得る。
いかなるサブセットまたは組み合わせのパラメータの使用は、例えば細胞受容体アッセイのためのシグニチャ（signature）や、ＥＧＦ受容体ベースのアッセイための特定のシグニチャのような、特定アッセイのためのシグニチまたは特定アッセイ上の所定の変異を生成する。
【００１０】
図７は、ＥＧＦによって誘導された静止Ａ４３１細胞の供与量に依存している応答を示す。
（Ａ）  は、本発明のシステムを使用して並行して得られた、ＥＧＦの異なる濃度によって誘導された細胞応答の実時間動特性である。
ＥＧＦの終濃度は、グラフにおいて示される。
（Ｂ）はＮ−ＤＭＲシグナルの振幅であり、図７Ａに示す遷移位相および端位相間の差分に基づくＥＧＦ濃度の関数として算出したものである。
典型的飽和曲線が得られた。
（Ｃ）は、ＥＧＦ濃度の関数としての、Ｐ−ＤＭＲからＮ−ＤＭＲへ遷移現象のための時間ｔである。
（Ｄ）は、Ｎ−ＤＭＲ現象の非線形回帰法を使用して得られ、ＥＧＦ濃度の関数としてプロットされた値ｋである。
【００１１】
図８は、指向性質量再分布に基づいた特定の標的またはシグナル伝達経路に対して、化合物をスクリーニングおよび分級するのための方法を示す。
この図において、マーカーは指向性質量再分布現象若しくはシグナルを導くかまたは阻害する細胞の特定の標的またはシグナル伝達経路もしくは機能の活性化物質または不活性化物質であってもよい。
破線の矢印は、２つのステップが交換可能かまたは一緒に結合したことを示す。
ステップ８０４および８０６はここに議論される刺激性事象と考えられる。
【００１２】
図９は、さまざまな典型的成分を有する生物学的な細胞の模式図を示す。
細胞は、多数の細胞器官を含んでいる細胞原形質（概して１０〜３０μＭ）からなる。
最大の細胞器官は、大きさが３−１０μｍの間で概して変動する細胞核である。
細胞核はタンパク質で満たされ、そして、最も重要なものがクロマチンである。
ミトコンドリアは、０．５−１．５μｍから概して変動している大きさを有する一連の折られた膜からなる小さい細胞器官である。
他細胞成分は、小胞体（ＥＲ）（概して０．２−１μｍ）、リソソーム（ｌｙｓｏｍｅｓ）（概して０．２−０．５μｍ）、ペルオキシソーム（概して０．２−０．５μｍ）およびエンドソーム（概して約１００ｎｍ）を含む。
【００１３】
図１０は、ここに開示される方法とシステムに従って使用されている光学ＬＩＤシステムが生体細胞内で質量再分布（例えばＧＰＣＲ転位）をモニタすることを示している線図を示す。
【００１４】
図１１は、それぞれ、１００、２００および３００ナノメートルの３つの異なる侵入深さを有する３つのセンサタイプのためのセンサ界面から離れた生物学的標的の距離の関数としてのエバネセント場（すなわち相対感度）を示す。
これは、細胞検出のための変数である侵入深さの重要性を示し、特に細胞内部の運動またはＤＭＲ現象の探測のために重要である。
【００１５】
図１２は、指向性質量再分布に基づく標的の同定および価値判断の方法を示す。
注：（１）この状況において、マーカーは指向性質量再分布現象またはシグナルを導くかまたは阻害する特定の標的の活性化物質または不活性化物質である。（２）得た応答は、特定の細胞の標的のレベルを同定するか、または特定のシグナル伝達経路もしくは疾患細胞の所定タイプにおける標的を評価するために使われる。（３）１２０６はここに開示した刺激性事象と考えられる。
【００１６】
図１３は、指向性質量再分布に基づく標的の同定および価値判断のための代替方式を示す。
注：（１）この状況において、マーカーは指向性質量再分布現象またはシグナルを導くかまたは阻害する特定の標的の活性化物質または不活性化物質である。（２）得た応答は、特定の細胞の標的のレベルを同定するか、または特定のシグナル伝達経路もしくは疾患細胞の所定タイプにおける標的を評価するために使われる。（３）１３０３および１３０４はここに開示した刺激性事象と考えられる。
【００１７】
図１４は、たとえば図１３において示した代替方式で使われる光学ＬＩＤバイオセンサマイクロプレートを示す。
このマイクロプレートは、多区画プレートであって、各ウェル（ｗｅｌｌ）内で光学バイオセンサ包埋多区画を有する。
この９６ウェルマイクロプレートにおいて、各ウェルは、４つの区画を含む。
各々の区画は、１つの基質包埋された導波路グレーティングを有し、細胞の単一のタイプまたは重要な標的のホストをつとめる。
４つの区画は内壁によって分離され、そして、内壁（好ましくは１００ミクロン〜２ミリメータ間）の体高は各ウェルのそれら未満である（典型的には所定のマイクロプレートのもの体高）、そして、４つの区画を有する各ウェルは、たとえどんな異なる標的が各々の区画においてあることができても、細胞の多数の標的または多数タイプ上の１つの薬剤候補物質の効果を同時に検査するために用いることができる。
灰色のラインは、導波路グレーティング型バイオセンサを表す。
【００１８】
図１５は、指向性質量再分布に基づく標的の同定および価値判断のための代替方式を示す。
注：（１）この状況において、マーカーは指向性質量再分布現象またはシグナルを導くかまたは阻害する特定の標的の活性化物質または不活性化物質である。（２）得た応答は、特定の細胞の標的のレベルを同定するか、または特定のシグナル伝達経路もしくは疾患細胞の所定タイプにおける標的を評価するために使われる。（３）１５０３、１５０４、１５０８および１５０９はここに開示した刺激性事象と考えられる。
【００１９】
図１６は、例えば図１０に示した光学ＬＩＤシステムからの時間依存している光学応答出力を分析することによって同定され得る生体細胞内のＧＰＣＲ転位のような刺激性事象によって、細胞転形に関連した異なる状態を示す線図を示す。
【００２０】
図１７は、刺激性事象のリアルタイムのモニタリングのための方法の基本的なステップを例示する流れ図を示し、かかる刺激性事象は例えばここに開示される光学ＬＩＤバイオセンサを用いて生体細胞内でＧＰＣＲ転位を含む細胞受容体の作動薬−起因性質量再分布である。
ここに開示されるように、１７０６および１７０８は刺激性事象と考えられる。
【００２１】
図１８は、指向性質量再分布に基づく標的の同定の例を示す。
注：
（１）このグラフに示される例は、他の細胞株ＣＨＯと比較すると取消細胞株Ａ４３１のＥＧＦ−起因性ＤＭＲ応答である；
（２）図に示す３つの異なる条件の下で培養された約９５％密集度のＡ４３１細胞の付着層のＥＧＦ−起因性ＤＭＲ応答は、２０時間の０．１％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）で培養された約９５％密集度のチャイニーズハムスター卵巣の付着層のそれと比較された。
ＥＧＦ（３２ｎＭ）の５０μｌ  ４倍溶液の添加の前に、１００μｌ培地によってカバーされた細胞は、持続性のネット−ゼロ応答によって示されるように細胞が安定状態となるように、２５μｌ標準ハンクス均衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）が少なくとも二回１５分分離して処理した。
（３）刺激性事象は、指向性質量再分布現象またはシグナルを導く特定の標的（ＥＧＦＲ）の活性化物質（すなわち同族リガンド、ＥＧＦ）である。
そして、（４）Ａ４３１細胞は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）（細胞につき約１，７００，０００コピー）を内生的に過剰発現する。
対照的に、ＣＨＯは内生的にＥＧＦＲを発現しない。
１８０１は、ＣＨＯ細胞の出力データを表す。
１８０２は、２０時間の０．１％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）のＡ４３１細胞の出力データを表す。
１８０３は、１０％のＦＣＳのＡ４３１細胞の出力データを表す。
１８０４は、４時間の０．１％のＦＣＳのＡ４３１細胞の出力データを表す。
【００２２】
図１９は、ここに開示される光学ＬＩＤバイオセンサを使用して、生体細胞内で質量再分布に基づく標的（例えばＧＰＣＲ）に対する刺激性事象（例えば作動薬現象）をスクリーニングする方法の基本的なステップを例示している流れ図を示す。
【００２３】
図２０は、ここに開示される光学ＬＩＤバイオセンサを使用して、生体細胞内で質量再分布に基づく受容体のような細胞の標的（例えばＧＰＣＲ）に対する刺激性事象（例えば作動薬現象）をスクリーニングする方法の基本的なステップを例示している流れ図を示す。
ここに開示されるように、２００６および２００８は刺激性事象と考えられる。
【００２４】
図２１は、ここに開示される方法のいずれにおいても使われる自己参照している光学ＬＩＤバイオセンサを作成する方法の基本的ステップを例示している流れ図を示す。
【００２５】
図２２は、同じセンサ内で空間的に分離された領域で２種類の細胞被着のホストをつとめ、そして、ここに開示される方法のいずれにおいても使われる自己参照している光学ＬＩＤバイオセンサをつくるための他の方法の基本的なステップを例示している流れ図を示す。
ここに開示されるように、２２１２は刺激性事象と考えられる。
【００２６】
図２３は刺激性事象をモニタするための方法の基本的なステップを例示している流れ図を示し、刺激性事象は例えば、ここに開示される光学ＬＩＤバイオセンサを使用する生体細胞の多数タイプ内の質量再分布を経た作動薬−起因性受容体現象（例えばＧＰＣＲ受容体）である。
ここに開示されるように、２３０８は刺激性事象と考えられる。
【００２７】
図２４は、ここに開示される光学ＬＩＤバイオセンサを使用している質量再分布に基づく生体細胞の単一のタイプ内の多数ＧＰＣＲに対するポテンシャル作動薬または特定の受容体のための例えば拮抗薬のような、化合物のパネルをスクリーニングする方法の基本的なステップを例示している流れ図を示す。
２４０６および２４０８は、刺激性事象と考えられる。
【００２８】
図２５は、細胞の細胞骨格構造を妨げるモジュレータをスクリーニングする方法を示す。
２５０６、２５０８および２５１０は、刺激性事象と考えられる。
【００２９】
図２６は、コレステロール流出を妨げるモジュレータをスクリーニングする方法の一例を示す。
２６０６、２６０８および２６１０は、刺激性事象と考えられる。
【００３０】
図２７は、体内の脂質シグナル伝達および運搬を示している略図を示す。
【００３１】
図２８（Ａ）は、静止Ａ４３１細胞の付着層またはＬＩＤセンサ上のヒーラー細胞上のメチル−βシクロデキストリン（ｍβＣＤ）の時間に依存する応答を示す。
図２８（Ｂ）は、静止Ａ４３１細胞のｍβＣＤ−誘導応答上の化合物（２０ｎＭのＥＧＦまたは１０００ｎＭのＨ７）の効果を示す。
静止Ａ４３１細胞は、ｍβＣＤ溶液の導入の前に少なくとも４０分間、対応する化合物によって前処理された。
【００３２】
図２９は、導波路ベースバイオセンサ上のＣＨＯ細胞付着層のＤＭＳＯ−起因性用量応答および時間依存応答に示す。
２０％のＤＭＳＯで、４つの現象、次のシグナルが観察される：
（Ａ）ＤＭＳＯ溶液の導入の直後のバルク屈折率変化による大きい応答シグナル；
（Ｂ）おそらくウェル内の２つの流体の混合による小さい減少シグナル；
（Ｃ）おそらくＤＭＳＯが細胞内部で通してバイオ流体を交換するためによる、緩慢かつ安定に増加したシグナル；並びに、
（Ｄ）ＤＭＳＯの高濃度毒性によって生じる細胞のタンパク質または他生体分子の減失による延長した減少されたシグナル。
【００３３】
図３０は、導波路型バイオセンサ上被着のＡ４３１細胞層剤のＤＭＳＯ−起因性用量応答および時間依存応答に示す。
観察された応答は、ＣＨＯ細胞層上のそれらに対するものと同様であった。
【００３４】
図３１Ａは、Ｎｂ２Ｏ５ベースの光導波路バイオセンサ上で培養された異なる密集度（３０％、５０％および９０％）を有するＣＨＯ細胞層に対する入射角の関数として、内結合（in-coupled）された光の強度を示す。
結合モードは、横磁気波（ＴＭ０）モードである。
図３１Ｂは、ＣＨＯ細胞密集度の関数として、算出されプロットされたＴＭ０モードを使用している最大半減（ＰＷＨＭ）でのピークの幅を示す。
【００３５】
図３２Ａおよび図３２Ｂは、それぞれ、導波路グレーティングセンサ上で培養された２つの異なる密集度、５％および７５％を有するＣＨＯ細胞の層のＴＭ０モード共鳴ピークを示す。
図３２Ｂは、ＤＭＳＯ（１８％の終濃度を有する）の添加の後、異なる時間で記録された共鳴ピークスペクトルを示す。
右グラフの破線の矢印は、ＤＭＳＯ処理の後、２５分の時点で共振ピークの広幅化および分裂を示す。
【００３６】
図３３は全部のセンサのＴＭ０モード共振バンド像を示し、各々のセンサは異なる密集度（図に示す）でＣＨＯ細胞の層によってカバーされた。
像は、緩衝液（カラム２）および１８％のＤＭＳＯ（カラム１）での２５分処理の後、取られた。
【００３７】
図３４は全部のセンサのＴＭ０モード共振バンド像を示し、各々のセンサは同じ密集度（約９５％）で、ＣＨＯ細胞の層によってカバーされた。
像は、緩衝液（カラム２）およびＤＭＳＯ（カラム１およびカラム３を図に示す）の異なる濃度での２５分処理の後、取られた。
円は、ＣＨＯ細胞上の約１５％のＤＭＳＯの毒性に起因するピーク分割を示す。
【００３８】
図３５Ａおよび図３５Ｂは、それぞれ、導波路グレーティングセンサ領域上およびセンサ領域外側で培養されたＣＨＯ細胞の位相造影像を示す。
【００３９】
図３６Ａは、３６時間のＮｂ２Ｏ５ベースの光導波路バイオセンサ上で培養された後、ＣＨＯ細胞への入射角の関数として、ＴＭ０モードの結合された光の強度を示す。
細胞の異なる初期の接種数は、ＣＨＯ細胞の増殖速度を研究するために用いる。
結合モードは、横磁気波（ＴＭ０）モードである。
図３６Ｂは、ＣＨＯ細胞の初期の接種数の関数として、ＴＭ０モードを使用して算出されプロットされた最大半減（ＰＷＨＭ）でのピーク幅を示す。
【００４０】
図３７は、導波路グレーティングセンサ上の異なる初期の接種数でのＣＨＯ細胞増殖のモニタリングを示す。
全センサのＴＭ０モード共振像の形および位置は初期の接種細胞数に依存しているように観察され、ＣＨＯ細胞の増殖速度が初期の接種細胞数に依存することを示した。
【００４１】
図３８は、シグナル伝達経路上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を示す。受容体チロシンキナーゼの上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリが、４つの受容体、ＥＧＦ−Ｒ（ＥｒｂＢ１）、ＥｒｂＢ２（Ｎｅｕ）、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４からなる。
ＥＧＦＲファミリの構成メンバは、細胞質のチロシンキナーゼドメイン、単一の膜貫通領域およびリガンド結合および受容体二量体化に関係している細胞外のドメインを含む。
ＥＧＦＲに対するリガンドの結合は、ホモダイマの発生または他のファミリを有する受容体のヘテロダイマにを導く。
各ダイマの受容体複合体は、エフェクタタンパク質を含む異なるＳｒｃ相同２（ＳＨ２）を入れることによって異なるシグナル伝達経路を始める。
二量体化は、下流の細胞のシグナル伝達経路の多種多様アレーを始める自動的リン酸化（ａｕｔｏｐｈｙｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）の結果となる。
接着体タンパク質（Ｇｒｂ）を有する活性ＥＧＦ−Ｒダイマー複合体は、解離因子（ＳＯＳ）をグアニンヌクレオチドに結合した。
Ｇｒｂ−ＳＯＳ複合体は、受容体のホスホチロシン部位に直接的にまたはＳｈｃを介して間接的に結合する。
これらのタンパク質相互作用はＲａｓに近い接近にＳＯＳをもたらし、Ｒａｓ活性化を許容する。
その後、これはＥＲＫおよびＪＮＫシグナル伝達経路を活性化して、すなわち、順番に、転写因子（例えばｃ−ｆｏｓ、ＡＰ−１およびＥｌｋ−１）を活性化して、遺伝子形質発現を促進し、細胞増殖に貢献する。
ＥＧＦ  ＝上皮増殖因子、
ＥＧＦＲ  ＝上皮増殖因子受容体、
Ｓｈｃ＝ｓｒｃ相同ドメインコンセンサス、
ｇｒｂ２  ＝生長因子受容体−境界タンパク質２、
ＳＯＳ  ＝哺乳動物  （son of sevenless）、
Ｒａｆ＝ＲａｓII活性化因子、
ＭＥＫ＝ＭＡＰキナーゼキナーゼ、
ＭＡＰＫ  ＝マイトジェン活性タンパク質キナーゼ、
ＰＩ３Ｋ  ＝ホスファチジルイノシトール３’キナーゼ、
ＰＩＰ２  ＝フォスファチジルイノシトール３，４−ジホスフェート、
ＰＩＰ３  ＝フォスファチジルイノシトール３，４，５トリホスフェート、
ＰＬＣγ＝フォスフォリパーゼγ、
ＤＡＧ  ＝ジアシルグリセリン、
ＩＰ３  ＝イノシトール３，４，５トリホスフェート、
ＰＫＣ  ＝タンパク質キナーゼＣ））。
【００４２】
図３９は、静止性ＣＨＯ細胞（ＣＨＯとして指示した）と比較して、増殖するＥＧＦ−誘導応答（Ａ４３１として指示した）および静止Ａ４３１細胞（Ａ４３１−Ｓとして指示した）のために観察されるＰ−ＤＭＲてＮ−ＤＭＲ現象のネット応答を示す。
【００４３】
図４０は、１６ｎＭのＥＧＦの添加の後、時間依存応答上の異なる化合物での餓死Ａ４３１細胞の層の３０分の前処理の効果を示す。
化合物の終濃度は、成長ホルモン（ＧＨ）、ＰＤ９８０５９、ＰＰ１、ウオルトマニン（ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ）およびダイナミン（ｄｙｎａｍｉｎ）抑制ペプチド（ＤＩＰ）に対して、それぞれ、０．５μｇ／ｍｌ、０．１ｍＭ、１μＭ、０．１μＭおよび５０μＭである。
【００４４】
図４１は、導波路バイオセンサ上で培養され、１６ｎＭのＥＧＦを有する刺激作用に応答した餓死Ａ４３１細胞の層のためのＰ−ＤＭＲおよびＮ−ＤＭＲシグナルのネット応答を示す。
【００４５】
図４２は、ＡＧ１４７８によって誘導された静止Ａ４３１細胞のＥＧＦ−誘導応答の供与量に依存している抑制を示す。
（Ａ）  ＡＧ１４７８の異なる濃度を有する静止Ａ４３１細胞の前処理は、３２ｎＭのＥＧＦによって誘導された応答の供与量に依存している交互変化を示した。
（Ｂ）ＡＧ１４７８濃度の関数としてのＮ−ＤＭＲシグナルの振幅を示した。
【００４６】
図４３は、静止Ａ４３１細胞のＥＧＦ−起因性ＤＭＲ応答上のＳｒｃキナーゼ阻害物質ＰＰ１の効果を示す。
【００４７】
図４４は、静止Ａ４３１細胞の３２ｎＭのＥＧＦ−誘導応答上のＲａｓ／ＭＡＰＫ経路モジュレータの効果を示す。
【００４８】
図４５は、静止Ａ４３１細胞の３２ｎＭのＥＧＦ−誘導応答上のタンパク質キナーゼ阻害物質の効果を示す。
【００４９】
図４６は、静止Ａ４３１細胞の３２ｎＭのＥＧＦ−誘導応答上の細胞骨格モジュレータの効果を示す。
【００５０】
図４７は、静止Ａ４３１細胞の３２ｎＭのＥＧＦ−誘導応答上のホスホジエステラーゼおよび他阻害物質の効果を示す。
【００５１】
図４８は、光学バイオセンサを使用して観察した静止Ａ４３１細胞のＥＧＦにより誘導された全体的なＤＭＲシグナルの２つの主な誘因を示す。
ＥＧＦは、室温（２２℃）で、Ａ４３１細胞において、ＥＧＦＲ内部移行、細胞形態変化および指向性質量再分布を誘導した。
（Ａ）８ｎＭテトラメチルローダミン標識ＥＧＦ（ＴＭＲ−ＥＧＦ）での染色と４℃の酸性液での界面−境界ＴＭＲ−ＥＧＦ除去との後の増殖Ａ４３１（１０％ＦＢＳ）の蛍光像。
（Ｂ）ＴＭＲ−ＥＧＦでの染色後のＡ４３１（０．１％のＦＢＳ）の蛍光像。
（Ｃ）染色と４℃の酸性液での界面−境界ＴＭＲ−ＥＧＦを除去との後の静止Ａ４３１（０．１％ＦＢＳ）  蛍光像。
（Ｄ）示された時間の間で１６ｎＭのＥＧＦで処理された静止Ａ４３１細胞は、定着及びテキサス赤標識ファロイジン（Texas red-labeled phalloidin）染色の後、３２倍拡大の蛍光−顕微鏡法を使用して、検査された。
【００５２】
図４９は、ＥＧＦ−起因性ＤＭＲシグナル−受容体エンドサイトーシスのための可能な機構の一例の略図を示す。
【００５３】
図５０は、ＬＩＤセンサ界面の付着した、サポニンの添加の前後におけるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）の供与量依存応答を示す。
【００５４】
図５１は、異なる化合物での前処理および続くサポニン処理後のＣＨＯ細胞のリアルタイム応答を示す。
【００５５】
図５２は、化合物添加の前後におけるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の時間依存ＬＩＤ応答を示す。
【００５６】
図５３は、作動薬−起因性ＧＰＣＲ活性化による質量再分布の異なる動態を示す。
【００５７】
図５４は、図１６において強調されたステージ３の作動薬−起因性質量変化の化合物依存全体応答を示す。
【００５８】
図５５は、化合物添加の前後におけるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の時間依存ＬＩＤ応答を示す。
使用した化合物濃度は、全化合物で１０μＭである。
【００５９】
図５６は、化合物添加の前後における、過剰発現したラットムスカリン（ｍｕｓｃａｒｎｉｃ）受容体亜タイプ１（なお、この細胞株はＭ１ＣＨＯと呼ばれる）で遺伝子操作されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の時間依存ＬＩＤ応答を示す。
使用する化合物濃度は、全ての化合物のための１０μＭである。
【００６０】
図５７は、２つの異なる細胞株のために図１６において強調されるステージ３の化合物依存合計応答を比較することを示す。
【００６１】
図５８は、オキソトレモリンＭ（１０μＭ）の添加の前後で、２種類の細胞（ＣＨＯおよびＭ１ＣＨＯ）の時間依存ＬＩＤ応答を示す。
化合物添加の前に、ＨＢＳＳ緩衝液（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））（「ＤＩＰなしで」と呼ぶ）、または、４５分間、５０μＭ濃度でのダイナミン抑制のペプチド（ＤＩＰ）で細胞が予めインキュベートされる。
【００６２】
図５９は、クロニジン（１０μＭ）の添加の前後で、２種類の細胞（ＣＨＯおよびＭ１ＣＨＯ）の時間依存ＬＩＤ応答を示す。
化合物添加の前に、ＨＢＳＳ緩衝液（インビトロジェン）（「ＤＩＰなしで」と呼ぶ）、または、４５分間、５０μＭ濃度でのダイナミン抑制のペプチド（ＤＩＰ）で細胞が予めインキュベートされる。
【００６３】
図６０は、ＮＥＣＡ（１０μＭ）の添加の前後で、２種類の細胞（ＣＨＯおよびＭ１ＣＨＯ）の時間に依存するＬＩＤ応答を示す。
化合物添加の前に、ＨＢＳＳ緩衝液（インビトロジェン）（「ＤＩＰなしで」と呼ぶ）、または、４５分間、５０μＭ濃度でのダイナミン抑制のペプチド（ＤＩＰ）で細胞が予めインキュベートされる。
【００６４】
図６１は、静止Ａ４３１細胞の付着層内でのＧＰＣＲ作動薬−起因性指向性質量再分布を示す。
３つのＧＰＣＲ作動薬、ブラジキニン（１００ｎＭ）、カルバコール（１０μＭ）およびクロニジン（１μＭ）は、ＥＧＦ（８ｎＭ）により誘導されたものと比較すると、静止Ａ４３１細胞の時間依存応答を誘導した。
（Ｆ）  ＧＰＣＲ  作動薬−およびＥＧＦ−誘導応答上の１０μＭ  ＡＧ１４７８を有するＡ４３１の前処理。
【００６５】
図６２は、ＥＧＦ−起因性ＥＧＦＲ活性化の機構およびＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）作動薬起因性ＥＧＦＲトランスアクチベーションの１つの可能な機構を示す模式図を示す。
ＧＰＣＲ作動薬−起因性ＥＧＦＲトランスアクチベーションは、例えばタンパク質キナーゼＣ経路またはＰＩ３Ｋ経路などの他機構を通ることもあり得る。
図６１において示したように静止Ａ４３１細胞のブラジキニン−起因性ＤＭＲ応答はタンパク質キナーゼＣ経路を通ることもあり得る。
【００６６】
図６３は、ＧＰＣＲ作動薬によって誘導された光学シグニチャの４つのクラス（ｃｌａｓｓ）を示す。
共鳴性導波路グレーティングバイオセンサでリアルタイムにモニタされたように、光学シグニチャは、静止Ａ４３１細胞の底一部内で、動的質量再分布に関係する。
（ａ）  Ｇｑ−タイプＤＭＲシグナル、トロンビン（４０ユニット／ｍｌ）によって例示される。
（ｂ）Ｇｓ−タイプＤＭＲシグナル、エピネフリン（２５ｎＭ）によって例示される。
（ｃ）Ｇｉ−タイプＤＭＲシグナルａ−ＭＳＨ（ホルモンを刺激しているａ−メラノサイト）（４０ｎＭ）によって例示される。
（ｄ）ニューロテンシン（４０ｎＭ）によって例示されるように、ネットワーク−ゼロＤＭＲシグナル。
作動薬溶液が導かれるときに、実線矢印（残りの図において同じ）は時間を示した。
【００６７】
図６４は、アデニル酸シクラーゼ活性化物質フォルスコリンおよびＮＫＨ４４７によって誘導された静止Ａ４３１細胞の光学シグニチャを示す。
【００６８】
図６５はフォルスコリンを有する静止Ａ４３１細胞の前処理を示し、ＮＫＨ４４７は２５ｎＭ  エピネフリンによって媒介されたＤＭＲ応答完全にを破壊した。
ＨＢＳＳでの細胞の前処理は正の制御として使われるだけだった。
【００６９】
図６６は、Ｇｑ−タイプシグニチャの引き起こす作動薬の効能を示す。
用量依存動態力学的応答および対応する飽和曲線は、それぞれ、ＡＴＰ  （ａ，  ｂ），  ＳＬＩＧＬＲ−アミド  （ｃ，ｄ），トロンビン（ｅ，ｆ），およびＳＬＩＧＫＶ−アミド  （ｇ，ｈ）のためにプロットされた。
終濃度は、グラフにおいて示された。
【００７０】
図６７は、Ｇｓ−タイプシグニチャの引き起こす作動薬の効能を示す。
用量依存動態力学的応答および対応する飽和曲線は、それぞれ、エピネフリン  （ａ，  ｂ），  アデノシンアミン  ｃｏｇｅｎｅｒ  （ＡＤＣＡ）  （ｃ，  ｄ），  およびＮＥＣＡ  （ｅ，  ｆ）のためにプロットされた。
【００７１】
図６８は、ａ−ＭＳＨ（ａ−メラノサイト刺激ホルモン）によって誘導された静止Ａ４３１細胞の用量依存動態力学的応答および飽和曲線を示す。
【００７２】
図６９は、低薬量（ａ）から高用量（ｂ）までのＬＰＡ（オレオイル−Ｌ−リゾホスファチジン酸）によって誘導された光学シグニチャのスイッチングを示す。
【００７３】
図７０は、低薬量（ａ）から高用量（ｂ）までのＨＴＭＴによって誘導された光学シグニチャのスイッチングを示す。
スイッチングを視覚化するために、Ｐ−ＤＭＲシグナルの総振幅は、ＨＴＭＴ濃度（ｃ）の関数として、プロットされた。
【００７４】
図７１は、Ｆｌｕｏ−３によって得られたＣａ２＋の蛍光強度によって測られた細胞内Ｃａ２＋レベルにおける最大パーセンテージ増加に示し、ＰＡＲ作動薬の関数として、プロットされた。
【００７５】
図７２は、１００ｎＭトリプシン（ａ）および４０ユニット／ｍｌトロンビン（ｂ）によって媒介されたＤＭＲシグナル上の細胞骨格モジュレータの効果を示す。
細胞を前処理するために用いたモジュレータは、ラトランキュリンＡ、サイトカラシンＢ、ファロイジンおよびノコダゾールを含み、各々１０μＭである。
媒介体（すなわちＨＢＳＳ）だけによって前処理された細胞がコントロールとして使用された。
【００７６】
図７３は、２００ｎＭトリプシン（ａ）および４０ユニット／ｍｌトロンビン（ｂ）によって媒介されたＤＭＲシグナル上のキナーゼ阻害物質の効果を示す。
キナーゼ阻害物質は、ＧＦ１０９２０３ｘ（１０μＭ）およびＫＮ−６２（１０μＭ）であった。
【００７７】
図７４はトロンビン（４０ユニット／ｍｌ）、ＳＦＦＬＲ−アミド（２０μＭ）およびＳＬＩＧＫＶ−アミド（２０μＭ）によって媒介されたＤＭＲ応答上のＹＦＦＬＮＲＰの効果を示し、ＹＦＦＬＮＲＰ濃度の関数としてのＰ−ＤＭＲ現象の振幅としてプロットされた。
【００７８】
図７５は、ＰＡＲｓによって媒介されたＣａ２＋シグナル伝達の交差脱感作を示す。
トリプシンでの処理に先行した後に、Ａ４３１細胞は、トロンビン（ａ）、ＳＦＦＬＲ−アミド（ｂ）、ＳＬＩＧＫＶ−アミド（ｃ）およびブラジキニン（ｄ）によって刺激された。
他方、Ａ４３１細胞は、トリプシンで刺激される前に、予めトロンビン（ｅ）、ＳＦＦＬＲ−アミド（ｆ）、ＳＬＩＧＫＶ−アミド（ｇ）およびブラジキニン（ｈ）によって刺激された。
終濃度は、トロンビン、トリプシン、ＳＦＦＬＲ−アミド、ＳＬＩＧＫＶ−アミドおよびブラジキニンで、それぞれ４０ユニット／ｍｌ、２００ｎＭ、２０μＭ、２０μＭおよび１００ｎＭであった。
２つの刺激作用間の時間的間隔は約６分である。、実線矢印が溶液が加えられた時の時間（他図でも同じ）を示した。
【００７９】
図７６は、ＰＡＲによって媒介された動的質量再分布シグナルの交差脱感作を示す。
トリプシンでの処理に先行した後に、Ａ４３１細胞は、トロンビン（ａ）、ＳＦＦＬＲ−アミド（ｂ）、ＳＬＩＧＫＶ−アミド（ｃ）およびブラジキニン（ｄ）によって刺激された。
一方、Ａ４３１細胞は、トリプシンによって刺激される前に予めトロンビン（ｅ）、ＳＦＦＬＲ−アミド（ｆ）、ＳＬＩＧＫＶ−アミド（ｇ）およびブラジキニン（ｈ）によって刺激された。
終濃度は、トロンビン、トリプシン、ＳＦＦＬＲ−アミド、ＳＬＩＧＫＶ−アミドおよびブラジキニンのため、それぞれ、４０ユニット／ｍｌ、２００ｎＭ、２０μＭ、２０μＭおよび１００ｎＭであった。
２つの刺激作用間の時間的間隔は、約１時間であった。
【００８０】
図７７は、４０ユニット／ｍｌトロンビン（ａ）および２００ｎＭトリプシン（ｂ）によって媒介されたＰ−およびＮ−ＤＭＲシグナルの振幅上のｍβＣＤによるコレステロール欠損の効果を示す。
比較において、αＣＤ（α−シクロデキストリン）の効果も含まれた。
【００８１】
図７８は、ＰＡＲシグナル伝達の機能上の回収を示す。
細胞表面コレステロールがｍβＣＤにより除去され、細胞が洗浄されたあと、トロンビン溶液は特定時間で別に各ウェルに添加された。
ＤＭＲシグナルは、リアルタイムで記録された。
各々のグラフは、７つの独立応答の平均である。
【００８２】
図７９は、ＰＡＲシグナル伝達上の先行するＥＧＦ刺激作用の効果を示す。
（ａ）トリプシン媒介Ｃａ２＋可動化。
（ｂ）トリプシン媒介ＤＭＲシグナル。
（ｃ）トロンビン媒介ＤＭＲ応答。
終濃度は、１００ｎＭのＥＧＦ、１００ｎＭトリプシンおよび４０ユニット／ｍｌトロンビンであった。
ＨＢＳＳ緩衝液の前処理での細胞応答は、また、コントロールとして含まれるだけだった。
【００８３】
図８０は、時間の関数として、１ｍＭの過酸化水素に応答した静止Ａ４３１細胞の多数パラメタを示す。
（Ａ）入射角度のシフト；
（Ｂ）正規化されたＰＷＨＭ；
（Ｃ）正規化されたピーク；
（Ｄ）正規化されたピーク領域。
矢印は溶液が加えられは時間を示した。
【００８４】
図８１は、そして、過酸化水素の添加の前後における、ＬＩＤセンサ界面上の静止Ａ４３１細胞付着層の供与量依存応答を示す。
【００８５】
図８２は、１ｍＭのＨ２Ｏ２によって媒介された静止Ａ４３１細胞のＤＭＲシグナル上のｓｒｃ阻害物質の効果を示す。
【００８６】
図８３は、４ｍＭのＨ２Ｏ２によって媒介されたＤＭＲ応答上の静止状態細胞の異なるレドックス状態の効果を示す。
【００８７】
図８４は、ＥＧＦ刺激作用に対する静止Ａ４３１細胞応答を示す。
（Ａ）時間の関数としての入射角における動的シフト。
（Ｂ）時間の関数としての正規化されたＰＷＨＭ。
（Ｃ）ＴＲ−ｐｈａｌｌｏｉｄの未処置のＡ４３１のアクチンフィラメントの着色パターン。
（Ｄ）１５分間、１６ｎＭのＥＧＦでの既処理後のテキサス赤標識ファロイジンで着色したＡ４３１のアクチンフィラメントの着色パターン。
バーは、４０μＭを表す。
【００８８】
図８５は、ブラジキニンによってブラジキニンＢ２受容体シグナル伝達で媒介された静止Ａ４３１細胞の光学シグニチャ：ＴＭ０モードの共鳴ピークのＰＷＨＭ（Ａ）および強度（Ｂ）を示す。
矢印はブラジキニン溶液が加えられた時間を示した。
【００８９】
図８６は、化合物の関数として、アッセイ中の２つの時間点間の波長シフトを示す。
２つの時間点は、化合物添加（ベースライン点）前の右側と、化合物添加（測定された点）の後の５分であった。
２つの終末点間の差分は、ブラジキニン（ブラジキニンＢ２受容体作用薬）によって媒介されたＰ−ＤＭＲ現象の総振幅を反映する。
Ｂ２受容体は、Ａ４３１細胞において内生的に発現される。
細胞は、ブラジキニン刺激の前の静止状態になる。
この例では、３８４ウェルＣｏｒｉｎｇＥｐｉｃバイオセンサプレートが、使われた。
各ウェルは、約９０％の密集度でＡ４３１細胞を含む。
ウェルの半分は１００ｎＭでブラジキニンによって処理された一方、ウェルの他半分は緩衝液ＨＢＳＳだけで処理された。
【００９０】
図８７は、化合物の関数として、アッセイ中の２つの時間点間の波長シフトを示す。
２つの時間点は、化合物添加（ベースライン点）前の右側と、化合物添加（測定された点）の後の５分であった。
２つの終末点間の差分は、トロンビン（ＰＡＲ１受容体作用薬）によって媒介されたＰ−ＤＭＲ現象の総振幅を反映する。
ＰＡＲ１受容体は、ＣＨＯ細胞において内生的に発現される。
細胞は、トロンビン促進の前に細胞を４時間のＤＭＥＭ培地で培養することによる部分的に静止状態になる。
この例では、３８４ウェルＣｏｒｉｎｇＥｐｉｃバイオセンサプレートが、使われた。
各ウェルは、約９０％の密集度でＣＨＯ細胞を含む。
ウェルの半分は４０ユニット／ｍｌでトロンビンによって処理された一方、ウェルの他半分は緩衝液ＨＢＳＳだけで処理された。
【００９１】
図８８は、トロンビン濃度の関数として、アッセイ中の２つの時間点間の波長シフトを示す。
２つの時間点は、化合物添加（ベースライン点）前の右側と、化合物添加（測定された点）の後の５分であった。
ＣＨＯ細胞は、異なる供与量でトロンビンで処理された。
（Ｖ．詳細な説明）
【００９２】
本化合物、組成物、物品、装置および／または方法が開示されて、記載される前に、それらが特に明記しない限り、特定の合成の方法または特定のバイオテクノロジ方法に限定されていないと理解されるべきであり、または、特定の試薬は特に明記しない限り、限定されず、もちろん、変化する。
ここに用いられる専門用語は、かかる実施例だけを記載するためにあって、限定であることを目的としないことは、また、理解されるべきである。
（Ｉ．定義）
【００９３】
明細書および添付の請求の範囲において用いられている「１つ」、「ある」、「その」では、文脈が明らかに別意を取らせる以外、複数が生ずる場合がある。
たとえば、「あるマーカーまたは刺激性事象」の場合は、２つ以上のマーカーまたは刺激性事象を含む。
【００９４】
範囲は、１つの特定の値から、特定の他の値まで、などと表現するが、それぞれ「約」として表現され得ることある。
かかる範囲が表されるときに、他の実施例は１つのかかる特定の値からおよび／または他の特定の値までを含む。
値が近似として表されるときに、同様に「約」を用いて、それは特定の値が他の実施例を形成するために、理解され得る。
各々の範囲の終末点は、他の終末点に関して、そして、他の終末点に独立して両方とも有意であると理解される。
また、ここに開示される多くの値があるが、その値自体に加えてその値の「約」も含むと理解される。
たとえば、値「１０」が開示される場合、「約１０」もまた、開示される。
また、ある値が値「以下」、「値以上」と開示されるとき、当業者によってよく理解されている様に、値間ので可能な範囲と開示されたと理解れる。
たとえば「１０」が開示されて値である場合、「１０以下」同様に「１０以上」も開示される。
また、出願全体にわたって、データが多くの異なるフォーマットで提供され、このデータが、終末点および開始点を表し、データポイントのいかなる組み合わせのために変動すると、理解される。
たとえば特定のデータポイント「１０」および特定のデータポイント１５が開示される場合、１０および１５について、越える、以上、未満、以下、そして、等しい、が開示されると考慮され、また、１０および１５間も同様に理解される。
また、１０および１５間で、１０、１１、１２、１３、１４および１５が開示されるように、その範囲を作るその範囲間のいずれの数が開示されると理解される。
【００９５】
「任意の」、または、「任意に」は、その後に記載されている現象または状況が起こるかまたは起こらないこと、そして、説明が前記現象または状況が起こる例およびそれを否定をする例を、を意味する。
【００９６】
「付着する」および「被着」またはこの単語の他形態は、２つのアイテムがお互いに対し親和性（例えば粘着）を有するような接触に入っている２つのアイテムに関連する。
基質上の細胞の付着層は、たとえば、界面に付着される細胞の層であり、穏やかに緩衝液によって洗浄されるときに、細胞が非付着にならない。
接触またはこの単語の他形態は２以上のアイテムがそれらがさわっていると考えられるほど互いに近接していると、理解される。
接触は、概して粘着を必要としない。
接触は、たとえば、粘着を有さずに起こる。
付属する、または、この単語の他形態は、付着するより、永久的である２つ以上のアイテム間の状態に関連する。
それは、たとえば共有結合的付着を要求しない。
このように、２つ以上のアイテム間の結合の必須の強度の順においては、接触は、付属するより弱い付着より弱い。
反対の明確な指示、または、当業者が明らかに反対であるとそれを理解しない限り、それらがこの明細書の記述内でやりとりされ得る、これらの単語がはっきりした意味を有すると理解される。
たとえば、文がもしも「そして、細胞は付着されたバイオセンサ」含む場合、「そして、細胞はバイオセンサに接触された」こと、「そして、細胞はバイオセンサに付けられた」ことが、開示されたと理解される。
また、様々な付着、接触、付属、付けられたアイテム（例えば細胞またはタンパク質）があることも理解される。
【００９７】
「振幅」は、特定の応答の量または大きさに関連する。
たとえば、バイオセンサからの出力データは、特定の振幅（例えば強度）を有する共鳴ピークを産生する。
【００９８】
「制限される生物学的拡散」は、溶液中の分子の拡散および／または細胞への分子の侵入若しくは取込み、続いての標的に到達する前の細胞内部の拡散によって制限されるプロセスに関連する。
例えば、化合物または刺激含有溶液がバイオセンサ界面上の細胞被着をカバーするために先に存在される培地に導かれるとき、化合物または刺激分子が結果の混合物（培地および溶液）において拡散し、特定時間かかって細胞に到達するはずである。
その後、化合物または刺激分子が相互に作用する標的上の依存して、化合物または刺激分子は、延長された時間をかけて、侵入によって決定されまたは分子によって細胞の取込まれた標的に到達するかもしれない。
【００９９】
「バルク屈折率」は溶液または培地の絶対屈折率に関連する、そして、溶液または培地の組成物によって決定される。
２つの溶液が一緒に混ぜられるときに、「バルク屈折率変化」は混合溶液の屈折率の結果として変化し、または、溶液は培地または他の溶液と添加されて、混ぜ合わせられる。
【０１００】
「導波モード」または「結合モード」は、導波路基質に結合される光の特定のモードに関連する。
プレーナー型導波路の被きょう導波（またはモード）の２つの基本的なタイプがある：
ＴＥｍ（横電気波またはｓ−偏光）およびＴＭｍ（横磁気波またはｐ−偏光）である。ここでｍ＝０、１、２、…はモード次数である。
光導波路グレーティング（ＯＷＧ）バイオセンサはエバネッセント波センサであって、回折グレーティングによって導波路に光の共振結合に基づくものである。
各基本モードには、たとえばＴＭ０，ＴＭ１，ＴＭ２…およびＴＥ０，ＴＥ１，ＴＥ２，…の異なる若干の数のモードがある。
導波路基質に結合され得る特定のモードは導波路構成および所定モードの実効屈折率に依存し、それはそのモードのエバネッセントテイルにある細胞形質成分およびバルク溶液の屈折率によって決定される。
【０１０１】
「用量依存的応答」は、化合物添加のような刺激性事象の供与量（総計）における変化で変化するバイオセンサ出力またはバイオセンサパラメータでの通常応答に関連する。
【０１０２】
「結合された光」は、バイオセンサを照射するために使われ、導波薄膜に結合される特定のバンド幅の光に関連する。
【０１０３】
「標識フリーバイオセンサ」が、開示された組成物、方法および技術の多くの形態の、標識フリーバイオセンサの使用を含む。
ここで使用しているように、標識フリーバイオセンサは、蛍光分子のような標識を必要とせずに結果から検出することができ、および／またはシグナルを生成するいかなるセンサ、または細胞の現象または変化（例えば質量再分布）に関連する。
標識フリーバイオセンサは、一般に定量化シグナルに細胞の現象を変換する光変換器からなる。
かかるシグナル生成は、さまざまな方法で完成し得る。
たとえば、直接表層検知方法は、表面プラスモン共振（ＳＰＲ）  (Jordan & Corn, "Surface Plasmon Resonance Imaging Measurements of Electrostatic Biopolymer Adsorption onto Chemically Modified Gold Surfaces", Anal.Chem., 1997, 69:1449-1456)、グレーティングカプラ(Morhard et al., "Immobilization of Antibodies in Micropatterns for Cell Detection by Optical Diffraction," Sensors and Actuators B, 2000, 70, 232-242)、エリフ゜ソメトリ(Jin et al., "A Biosensor Concept Based on Imaging Ellipsometry for Visualization of Biomolecular Interactions", Analytical Biochemistry, 1995, 232, 69-72)、エバネッセント波装置(Huber et al., "Direct Optical Immunosensing (Sensitivity and Selectivity)," Sensors and Actuators B, 1992, 6, 122-126)、反射計測(Brecht & Gauglitz, "Optical Probes and Transducers," Biosensors and Bioelectronics, 1995, 10, 923-936)、を含む。
測定ＳＰＲまたは導波路グレーティングセンサに概して使用された計測は、適当なスペクトルまたは角の内容を有する光ビームを利用し、このビームが検知界面によって反射されるときに、共鳴する角度または波長応答は出力応答の主要なものになる。
【０１０４】
多くの標識フリーバイオセンサは他で記載されているように、周知の例である。
標識フリーバイオセンサの例は、非接触のバイオセンサ、標識無依存検出バイオセンサ、標識フリー光学バイオセンサ、光学非接触のバイオセンサ、光学ベースのバイオセンサ、光学バイオセンサ、光学標識無依存検出バイオセンサ、導波路グレーティング−型バイオセンサ、光導波路光モード分光学バイオセンサ、エバネッセント波装置を含む。
さまざまな標識フリーバイオセンサおよびそれらの使用は、ここに記載されて関連される。
標識フリーバイオセンサのより特定の例およびそれらの使用を提供するために、標識フリーバイオセンサの使用の特定の若干の方法およびモードは、標識フリーバイオセンサの説明に記載されている。
不必要な重複を避けるために、かかる説明が、標識フリーバイオセンサのすべてのタイプのために、繰り返されるというわけではない。
しかし、かかる特定の方法または態様の特定のバイオセンサの使用が記載されるときに、使用の環境または状態が標識フリーバイオセンサの一つ以上のタイプを除外しない限り、かかる使用がかかる方法およびモードのいかなる標識フリーバイオセンサもの使用を図示すると理解されるべきである。
方法およびモードがここに記載した（使用の環境または状態が標識フリーバイオセンサの一つ以上のタイプを除外しない限り）いずれでもおよび全てのいずれでもおよび全てのバイオセンサのかかる使用は、具体的には、熟慮されて、具体的には、考慮されなければならない。
このように、たとえば、特定のグレーティング結合器バイオセンサを使用して細胞におけるＥＧＦ−起因性ＥＧＦＲシグナル伝達の解析が説明されている場合、他のいかなる適当な標識フリーバイオセンサも使用した細胞におけるＥＧＦ−起因性ＥＧＦＲシグナル伝達の解析が開示されていると考えるべきである。
このように、たとえば、表面プラスモン共振−型バイオセンサを使用した細胞におけるＥＧＦ−起因性ＥＧＦＲシグナル伝達の解析が、開示されていると考えるべきである。
【０１０５】
「時間依存応答」は通常、バイオセンサ出力またはバイオセンサパラメータの応答であり、時間に沿ったその変化の応答である。
【０１０６】
「スターベーション培地」は、細胞の培養の増殖容量を減少させるいかなる培地でもある。
スターベーション培地が細胞をインキュベートするかまたは細胞を培養するために使われるときに、結果として得られた細胞は静止状態になる。
【０１０７】
本出願の全体にわたって、さまざまな記載した文献は引用される。
これらの文献の開示内容は、より充分にこれが付随する最高水準の技術を記載するために全体として本出願の明細書に援用したものとする。
開示される引用はまた、それらに含まれる材料のためにここに個々に、そして、特に引用したものとする。そして、引用が依存される文において、議論される。
（ＩＩ．  組成物および方法）
【０１０８】
開示された組成物、方法および技術は、細胞ベースのアッセイおよび技術のための導波路グレーティング型バイオセンサを含む標識フリー光学バイオセンサ分野に関する。
方法とシステムは一般に直接光学バイオセンサ分野に関し、そして、具体的には、光学標識非依存検出（ＬＩＤ）バイオセンサ（例えば導波路グレーティング−型バイオセンサ）を使用して、たとえば、生体細胞内の化合物−起因性質量再分布をリアルタイムでモニタするためのシステムと方法に関係し、これは、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）活性現象ｓおよび抗作用を含み、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ活性、細胞骨格再構成、細胞死および細胞増殖、同じく、細胞シグナル伝達、脱感作および生体細胞内の転位、同じく、付着細胞の形態学的変化、細胞接着、細胞運動およびバイオセンサ上で培養される細胞に関係する。
直接の光学センサ（ＤＯＳ）技術は、蛍光または発光の標識を励起せずに、分子同定または細胞現象を測量可能シグナルへ変換するために光変換器を利用するものに関連する。
励起および続く発光またはかかる標識の発光に依存する技術は、間接的な光学技術と称され、それがまた、開示された方法の或る実施例において使われる。
また、例えばＧＰＣＲまたはＥＧＦＲまたはＰＤＧＦＲまたはサイトカイン受容体のような細胞上の受容体など、細胞活性に対する化合物のスクリーニングする方法が、開示される。
【０１０９】
モニタリングおよび測定指向性質量再分布（ＤＭＲ）のための標識フリーバイオセンサ（例えば導波路グレーティング型バイオセンサ）を利用して、このＤＭＲを特定の細胞状態または細胞現象または細胞活性に結合する組成物および方法が、開示される。
ここに開示される組成において組み合わせのいずれも可能で、「細胞−バイオセンサ」および「細胞−バイオセンサ試薬」組成物であると理解される。
たとえば、Ａ４３１細胞、バイオセンサおよびＥＧＦからなる細胞−バイオセンサ試薬組成物が、開示される。
【０１１０】
たとえば、特定の開示されたアッセイにおいて、標識フリー光学バイオセンサは、細胞増殖またはに細胞対する化合物または化合物の毒性の効果を分析するとともに、たとえば、例えば受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫｓ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、生長因子受容体（ＰＤＧＦ）またはＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）のような細胞表面受容体で媒介した細胞シグナル伝達現象の発生、あるいは、（例えばさまざまなシグナル伝達経路または細胞骨格再配列現象）での発生を測定することに使用できる。
ここに開示される標識フリーバイオセンサは、タンパク質標的または基質加入の刺激作用によって媒介された転位を分析することに使用でき、たとえば、細胞核に対するまたは膜に対するまたは細胞質ゾルに対するまたは他細胞器官に対するもの（たとえば、（エンドソーム、小胞体（ＥＲ）、または、ゴギリ（ｇｏｇｌｉ）または核）、或いは、細胞外空間（例えばリガンド結合、遺伝子トランスフェクションまたはタンパク質トランスダクション、ファゴサイトーシス、エンドサイトーシス、その他）からのさまざまなリサイクリング経路または取込みの全体にわたるものに使用できる。
他の例では、標識フリー光学バイオセンサが異なる機能上の区画の中の特定の標的または標的複合体のおよび／または刺激作用に応答する画定された微小環境の中の再分布をモニタするかまたは特定の標的の新規合成を測定するために使われること、または、特定の区画または局所（例えば作動薬−起因性Ｇｑ−共役型受容体のためのＣａ可動化またはＣａイオノフォア）から刺激作用によって媒介された放出を検査すること。
この文脈において、標的は、分子または細胞成分として使われ、追跡されるべきまたはアッセイの部分であるべきものである。
他の例において、標識フリー光学バイオセンサは標的分子または標的複合体（例えばバクテリアまたはウィルスまたはファージまたは脂質粒子またはエキソゾーム粒子、その他）の移動をモニタすることに使用でき、かかる移動はある細胞から他の細胞へ（例えば、ギャップジャンクションまたはイオンチャネルによる）、あるいは、細胞から周囲の生育環境へ（たとえばエクソサイトーシスとして公知のプロセスまたはコントロール放出プロセス（例えば細胞表層膜での人工のウェルによるアポトーシスまたは拡散））、または、どちらでも、である。
或る実施例のこれらの組成物および方法は、たとえば刺激性事象により生じることが可能であるモニタリング間に起こっている細胞現象のタイプの予言となるデータの分離した点のたとえば１、２または３だけの収集によってできるので、データ収集中のポイントの適用および同定による高スループット方法に適している。
【０１１１】
実施例において、開示された組成物、方法および技術は、モニタリング吸着、分配および／またはバイオセンサ上の生体細胞被着に作用している化合物の毒性のための導波路グレーティング−型バイオセンサの使用および使用方法に関する。
【０１１２】
或る実施例においてが、開示された組成物、方法および技術は、光導波路光モード分光学（ＯＷＬＳ）または共鳴ピークスペクトルを使用する方法、または、細胞増殖の阻害物質または活性化物質に対しスクリーニングするための角度もしくは波長測定と協力する所定導波モードの共鳴バンド画像化方法に関する。
この方法は、高スループットスクリーニングに適用できる。
【０１１３】
或る実施例において、開示された組成物、方法および技術は、光導波路光モード分光学（ＯＷＬＳ）を使用する方法に関し、また、ここに開示される他の方法と同様に、化合物毒性を高いスループットでスクリーニングすることに適用でき、所定モードの所定モードまたは共鳴バンド画像化の共鳴ピーク分光学に関する。
【０１１４】
開示された組成物、方法および技術は、吸着、分配および／または光学バイオセンサ上の被着した生体細胞層に作用している化合物の毒性をモニタするために光学型バイオセンサを使用する。
もう一つの実施例でが、開示された組成物、方法および技術は、スクリーニングまたはモニタリングのための方法に吸着、分配および／または多数の種類の光学センサの空間的にアドレス指定可能な領域または単一のウェル内で位置する多数バイオセンサ上の細胞被着に作用している化合物の毒性を提供する。
【０１１５】
開示された組成物、方法および技術は、、化合物吸着、分配および／または毒性スクリーニングおよびプロフィーリングのためのリアルタイム標識フリーアッセイを開示する。
これらの方法が、多数の異なるアッセイ（例えば、ＡＤＭＥ／Ｔｏｘ（機能的アッセイ））において使われることができて、事実多数の異なるアッセイを単一のアッセイフォーマットに組み込む。
【０１１６】
或る実施例において、開示された組成物、方法および技術は、細胞増殖上の化合物の効果の高いスループットのスクリーニングに適している標識フリー計測を提供する。
或る実施例において、開示された組成物、方法および技術は、細胞増殖の阻害物質または活性化物質のる高いスループットスクリーニングのために、波長または角のシフト単独でよりむしろ、光導波路光モード分光学（ＯＷＬＳ）すなわち所定モードの共鳴ピーク分光学または所定の導波モードの共鳴バンド画像化を利用する。
この方法は、細胞密度上の所定のセンサの結合されたピークの最大半減（ＰＷＨＭ）でのピーク幅の依存を使用する。
開示された組成物、方法および技術の或る実施例において、マイクロプレートの全部のセンサの内結合している共振バンドの像が、同時に集められ、細胞増殖に対するそれらの影響のための化合物をスクリーニングする高いスループット手段として使われる。
【０１１７】
光学バイオセンサを使用しているシグナル伝達経路細胞のスクリーニングモジュレータの方法が、開示される。
細胞内で起こっているシグナル伝達現象にとってと同様に細胞表面で、たとえば、方法はＲＴＫｓまたはＧＰＣＲに適用され得る。
【０１１８】
光学バイオセンサを使用している細胞骨格成分のスクリーニングモジュレータの方法が、開示される。
方法は、細胞骨格成分のモジュレータによって透過化処理された細胞起因性から巨大分子の測定放出に基づく。
具体的には、方法は十分に生体細胞の形質膜を細胞内部で可溶タンパク質が離れて拡散する多孔質とするために特別な化学薬品または生物学的製剤（例えばサポニン、ストレプトリジンＯ、等）を利用する。
細胞骨格−分裂モジュレータを有する細胞の処理は、細胞骨格によって隔離されるＲＮＡおよびタンパク質を含んでいる生体分子の更なる放出を導き、結果として光学バイオセンサによって検出され得る質量の減失になる。
【０１１９】
標識フリー光学バイオセンサ（例えば可能であるグレーティング型バイオセンサおよび方法が異なる構成および組み合わせにおいて使用した光導波路光モード分光学および導波路）のような、光学バイオセンサの討論は、提供される。
これの後に、質量再分布の討論およびこれが光学バイオセンサに関する方法が続く。
また、標識フリー光学バイオセンサを最初に使用しているアッセイを実行することのような、これらのアッセイに対する添加および一時変異と同様にここに開示される光学バイオセンサを使用する、が、それからそれから二次性であるか追加のアッセイにおいて使われるアッセイの一つ以上の試薬に結合する標識の特定のタイプを有して実行され得る典型的な細胞アッセイの討論は、提供される。
【０１２０】
化合物スクリーニングおよびプロフィーリングを可能にするＧＰＣＲ細胞ベースのアッセイのような標識フリー機能細胞アッセイを実行するために用いることが可能である方法が、開示される。
開示された方法は、関心のある受容体を過剰発現する細胞を遺伝的に操作する必要なしに、生体細胞内の内因性のＧＰＣＲを研究することを可能とする。但し或る実施例において、関心のある過剰発現ＧＰＣＲを有す細胞は、高感度および最適のアッセイ結果を達成するために好ましくは使われる。
【０１２１】
開示された方法は、単一センサを使用している多重化細胞ベースのアッセイを実行するかまたは異なる親の細胞または同じ親の細胞（すなわち細胞の所定の特定のタイプ）から始められる細胞の少なくとも２つの異なるタイプの中の化合物の機能の比較のための多数センサを使用する。
方法は、増加するスループットの効果を提供する。
【０１２２】
単一センサを使用しているかまたはシグナル伝達の特定の細胞の標的または刺激作用に応答して測られる細胞現象の併発を確かめるための多数センサを使用している多重化アッセイを実行するために用いることが可能である方法が、開示される。
方法は、少なくとも２つの異なる領域を有する単一センサを使用する：
一時変異のない１および一時変異を有するもう一方；
または、同じチャンバまたは分離されたチャンバ内でリース２つのセンサで使用する：
一時変異のない１および一時変異を有するもう一方。
たとえば、センサの修飾領域は印刷するかまたは試薬／遺伝子または干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）またはアンチセンスのオリゴヌクレオチドかａｎｔｉｓｅｎｓｅ／抗原ペプチド核の酸（ＰＮＡ）を含んでいる点またはタンパク質を堆積させた、または、抗体細胞がこれらの領域に培養されて、かぶせられる、付着細胞取込みこれらの試薬／材料、そして、トランスフェクションする。
かかる方法は、位置の界面によって媒介されたトランスフェクションと称する。
一旦これらの材料によってトランスフェクションすると、細胞の特定の標的が終わったようになって、−界面によって媒介された遺伝子トランスフェクションまたはタンパク質出産で表してまたは刺激に対する応答を抑制され得るアンチセンス／抗原抑制またはＲＮＡ干渉またはノックアウトまたは抗体遮断。
アメリカ特許文献ＵＳ２００４／００２３３９１Ａ１およびＵＳ６，５４４，７９０は、材料のための最少で全体としてここに取り入れられる以外細胞に出産のための方法に関した。
位置の界面によって媒介されたトランスフェクションは、特定の標的を有する、そして、のない細胞の特定のタイプの刺激作用−誘導応答の検出を許す。
位置の表層の媒介されたトランスフェクションは、刺激性事象と考えられる。
したがって、本発明の方法は、シグナルの特定の細胞の標的または標識フリー光学バイオセンサを使用して測られる細胞現象の併発を確かめる。
センサ界面の上の材料の沈着または印刷は、ピンプリントのような密着焼付け法（アメリカ特許文献ＵＳ５８０７５２２  Ａ，ＵＳ６１０１９４６  Ａ）またはマイクロプリント方法（アメリカ特許文献ＵＳ５，７３１，１５２）、キャピラリ供給装置（ＵＳ５，８０７，５２２）、調剤装置（米国特許第５，６０１，９８０号）マイクロパターン装置または圧被駆動印刷またはマイクロ／ナノ供給装置（アメリカ特許文献ＵＳ６６５６４３２  Ｂ１、ＥＰ０８９５０８２  Ｂ１またはＵＳ６３９９３９６  Ｂ１）のような非接触の印刷を含むがこれに限らず、最高水準の方法を使用して達成され得る。
【０１２３】
多数侵入深さを利用する標識フリーバイオセンサに基づく細胞アッセイを実行する方法が、開示される。
また、一重化または多重化アッセイフォーマットでかかるアッセイを実行する装置も開示される。
【０１２４】
ＯＷＬＳによれば、ＴＭモードのＰＷＨＭ変化は、界面不均質性にＴＥモードのそれより知覚しうる。
界面に広がる細胞開始がその後起源のレベルへ５０％の細胞適用範囲および減衰ころにその最高に到達するときに、ＰＷＨＭは増加する。
【０１２５】
光学バイオセンサを使用して複毒性−起因性波長または角度シフトによって実証されたように、開示内容は、細胞−センサ界面の近くのかなり集密的な細胞層に対する化合物の吸着、分配および毒性がリアルタイムでモニタされ得ることここに明らかにする。
【０１２６】
光学バイオセンサによって調査される活性酸素種（ＲＯＳ）の細胞の機能を研究する方法が、開示される。
また、ＲＯＳシグナル伝達と同様に培養細胞のレドックス状態に影響を及ぼすモジュレータをスクリーニングするとともに、培養細胞のレドックス状態を評価する方法が、開示される。
活性酸素種は、過酸化水素のような分子、次亜塩素酸塩イオンのようなイオン、水酸基のようなラジカルおよびイオンおよびラジカルであるスーパーオキシドアニオンである。
他物質を酸化する能力を有する物質は、酸性であると言われていて、酸化剤、オキシダントまたは酸化剤として公知である。
オキシダントは、通常高い酸化数（例えばＨ２Ｏ２、ＭｎＯ４−、ＣｒＯ３、Ｃｒ２Ｏ７２−、ＯｓＯ４）の元素または高く物質（Ｏ２、Ｏ３、Ｆ２、Ｃｌ２、Ｂｒ２）を酸化することによって特別な１、２電子を得る電気的陰性物質物質を有する化学物質である。
活性酸素種は、いくつかの異なる機構によって形成される：
（１）生体分子を有するイオン化放射線の相互作用；
（２）細胞呼吸の避けられない副産物として（例えば、呼吸鎖を下に伝わっている若干の電子は、主な経路（特にそれらがユビキノンを通過するように）から離れて漏れ、酸素分子をスーパーオキシドアニオンに直接変える）；
（３）好中球のような食細胞の細胞およびマクロファージの専用の酵素によって総合される（例えば、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（食細胞の両方のタイプ）；
またはミエロペルオキシダーゼ（好中球だけで））。
ＲＯＳは決定的である、しかし、ＲＯＳ否定の産生を制限する試みがあまりによく成功することは重要である。
ＲＯＳが細胞において実行するために重要な機能を有するからである。
例は、（１）甲状腺の細胞がヨウ素原子をチロキシンの合成のサイログロブリンに付けるために過酸化水素に作らなければならないである。（２）マクロファージおよび好中球は数種類のそれらがファゴサイトーシスによってのみ込むバクテリアを殺すためにＲＯＳを生成しなければならない。（３）好中球（しかし、マクロファージでなく）も強く防腐性の次亜塩素酸塩イオンを産生するために塩化物イオンを有する過酸化水素（スーパーオキシドアニオンから作られて）の反応に触媒作用を及ぼす酵素ミエロペルオキシダーゼを使用することによってのみ込まれた病原を絶滅させる。（４）多くの生物エネルギーは貯蔵されて、レドックス反応によって放出される。
光合成は、分子状酸素に糖への二酸化炭素および水の酸化反応の還元を含む。
逆反応（呼吸）は、二酸化炭素および水を産生するために糖を酸化する。
中間体ステップとして、還元した炭素化合物はＮＡＤ（ＮＡＤ＋）（それはそれからプロトン勾配の生成に貢献する）を減らすために用いる。そして、それはアデノシントリホスフェートの合成を駆動して、酸素の還元によって維持される。
動物細胞において、ミトコンドリアは同様機能を実行する。
語レドックス状態は、しばしばＮＡＤ＋／ＮＡＤＨおよび生物系（例えば細胞または器官）のＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨの均衡を記載するために用いる。
レドックス状態は、相互転換がこれらの比に依存しているメタボライト（例えば、乳酸塩およびピルベート（β−ヒドロキシ酪酸塩およびアセトアセテート））のいくつかのセットの均衡において反映される。
異常なレドックス状態は、様々な有害な状況（例えば酸素圧低下、ショックおよび敗血症）において発達する。
分子、化合物およびこのパラグラフにおいて議論される組成の全てのフラックスおよび効果が同定され得るかまたはここに開示される方法において一方使われると理解される。
【０１２７】
例えば標的のＧＰＣＲおよびＲＴＫ間の異なるクラスの中のと同様に標的（例えばＧＰＣＲ、ＲＴＫｓ、その他）のファミリ中の交差性の伝達を検査する方法が開示される。
細胞は、それらが各々の近くに位置するかまたははるかに別々である、お互いと通信することを必要とする。
細胞外のシグナル伝達分子は、細胞間の相互作用を管理する。
基本的な機構は、リガンド（シグナル伝達分子）が細胞外のシグナルを細胞内のシグナルに変換するためにその受容体と相互に作用することを必要とする。
このプロセスは、シグナル伝達と呼ばれていて、いくつかの形態で起こる。
第一シグナルが全ての生物と通信するために必要な場合；
シグナル伝達分子は、血流に分泌される。
たとえば、内分泌シグナル伝達は、細胞が循環系に合成して、ホルモンを分泌することを必要とする。
そのホルモンは、それから形質膜上の細胞原形質内の特定標的細胞タンパク質（受容体）によって認識される。
第２に、他状況において、シグナルは局所的に行うことを必要とする。
たとえば、パラ分泌シグナル伝達分子（局在部メディエータ）は、隣接細胞によって放出され得、ＥＣＭで局所的に拡散し、近い標的細胞を刺激する。
たとえば、成長および分化因子は、主にパラ分泌シグナル伝達分子として作用すると考えられる。
伝達の第３の形態は、ニューロンのシグナル伝達である。
かかるシグナル伝達は長距離を通じて起こる、しかし、出産は軸索と呼ばれている長く続く細胞過程を経由してある。
ニューロンのシグナルは、標的細胞にまたは他ノイロン細胞に作用する。
軸索末端にそれを渡すことの神経伝達物質と呼ばれている化学シグナルに変えられる電気インパルスとして、シグナルは軸索で進行する。
シグナル伝達の第４の形態は、全部の最も多くの短範囲である。
それは、概して分泌された分子の放出を必要としない。
たとえば、シグナル伝達分子が標的細胞の形質膜に埋め込まれる受容体分子に結合するためにシグナル伝達細胞の形質膜において停泊するときに、接触に依存するシグナル伝達はトランスダクションが完了されることを必要とする。
接触に依存するシグナル伝達は、また、細胞外のマトリックスと相互に作用している細胞の形で起こる。
各細胞は、受容体のその限られたタイプと同様にその専門機能のために、シグナルの限られたセットに応答することが可能である。
その上、各細胞は異なってシグナル分子に応答する。
この症例（たとえば神経伝達物質）のアセチルコリンが１種類の筋細胞を刺激して接触（骨格）または収縮を抑制する（強心剤）。
アセチルコリンは、また、特定の細胞にそれらの分泌小胞の内容物を分泌するようにする。
あるいは、同様受容体は異なる細胞内のシグナル伝達経路を活性化する、または、リガンドは異なる受容体に結合する。
線形モデルにおいては、情報の主な流れが逐次的で、受容体から特定の細胞機能まで中間体ステップの線状鎖を通り抜けると、シグナル伝達経路は考えられる。
しかし、細胞生物学（線形の情報流の代わりに）の複雑度のため、刺激作用によって媒介されたシグナル伝達は拡散ステップ（広がるフィードバック系）を含んでいるフィードバックによる結合である、または、シグナル伝達タンパク質および／または足場タンパク質の複合体に物理的にリンクされる多くのモジュールからなる。
たとえば、広がるフィードバックモジュールは、カルシウムおよびイノシトールトリスリン酸受容体が細胞質ゾルカルシウム濃度を管理する正および負のフィードバックループに示す。
これらの正および負のフィードバックループは、シグナル伝達の交差性連絡で重要な役割を演ずる。
多くの分裂促進のＧＰＣＲのシグナル伝達がかけ合せに示されて、たとえば−ネガか実在方法のＥＧＦＲシグナル伝達を有する通信する。
これらのＧＰＣＲの活性化も、同じ細胞（アダプタタンパク質を行うタンパク質キナーゼＣまたはｂ−アレスチンによるどちらでも）のＥＧＦＲの活性化を導く。
【０１２８】
少なくとも２つの終末点計測に基づく、高いスループットフォーマットにおいて特定の標的または標的のクラスに対するモジュレータをスクリーニングする方法が、開示される。
（ａ）  監視細胞健康体のためのＯＷＬＳの使用）
【０１２９】
現在の組成、方法および技術は、化合物毒性をスクリーニングしている高いスループットのための所定の導波モードまたは共鳴バンド画像化の光導波路光モード分光学または共鳴ピークスペクトルの使用を開示する。
光学型バイオセンサを使用している化合物毒性をスクリーニングしている高いスループットに適している計測が、開示される。
開示された方法、組成および技術は、細胞または細胞群の健康体をモニタするために用いることが可能である。
語「健康体」は、生存および細胞機能に関して細胞の全体的な状態に関連する。
たとえば、細胞がタンパク質またはメッセンジャーＲＮＡ産生、細胞シグナル伝達の減少および／または関するタンパク質の増加のようなその健康体（例えば細胞分割の減少、細胞機能の減少）上のネガ効果を表示する多数方法が、細胞死にある。
伝統的に、細胞健康体価値判断は、ＤＮＡまたはＲＮＡへの標識されたヌクレオチドまたは細胞の核のクロモソームの保全の特定の遺伝子産物または移入の特定の標的タンパク質（例えばミトコンドリアデヒドロゲナーゼ）または合成の細胞膜統合性または機能を検査するために蛍光染色方法または他の手段を使用した。
或る実施例において、方法は化合物の毒性のために修飾された細胞密度、細胞死パターンおよび細胞層不均質性に関わる所定のセンサの結合されたピークの最大半減（ＰＷＨＭ）でのピーク幅の依存を利用する。
化合物毒性は、導波薄膜表面上の生存細胞、被影響細胞および死細胞の三個体群の発生の結果をもたらす。
界面の結果としてなられた増加する不均質性は、共振ピークブロードニングおよび平坦分裂を導く。
共振ピークブロードニングおよび分裂が、化合物毒性のためのシグニチャとして使われる。
細胞が化合物にさらされたあと、共振ピークスペクトルか全部のセンサ共振像は集められることができて、特定時間で分析され得る。
【０１３０】
開示された組成物、方法および技術は、吸着、分配および光学センサ上で培養される細胞層上の複行為の毒性をモニタするために方法を提供する。
方法は貢献される化合物に応答する細胞の層のための角の波長シフトのリアルタイム計測を含むかまたは、細胞層の質量再分布のために、細胞によってインキュベートされた。そして、光学バイオセンサを使用した。
これらの方法は、細胞毒性およびアポトーシスの動態および機構を研究することに役立つ。
また、高スループット方法が、開示される。
（２．細胞健康体を監視する高スループット方法）
【０１３１】
或る実施例において、これらの方法は、多数導波路グレーティングバイオセンサを同時にモニタすることができ、および／または多数バイオセンサの所定の導波モードの共鳴ピークスペクトルを得ることができ、および／または多数バイオセンサの所定の導波モードの共鳴バンド像を視覚化する光学測定システムを利用する。
たとえば、アメリカ特許出願１０／６０２，３０４（出願日０６−２４−２００３公開番号ＵＳ−２００４−０２６３８４１公開日１２−３０−２００４）、アメリカ特許出願１１／０１９，４３９（出願日１２−２１−２００４）、およびＮ．  Ｆｏｎｔａｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  によるＡｐｒｉｌ  ５，  ２００５出願日のアメリカ特許出願（発明の名称"OPTICAL INTERROGATION SYSTEM AND METHOD FOR 2-D SENSOR ARRAYS"）に開示した光学角度測定システム（バイオセンサおよびそれらの使用以外）は本出願の明細書に援用したものとする。
【０１３２】
アメリカ特許出願１０／６０２，３０４（出願日０６−２４−２００３公開番号ＵＳ−２００４−０２６３８４１公開日１２−３０−２００４）、アメリカ特許出願１１／０１９，４３９（出願日１２−２１−２００４）、およびＮ．  Ｆｏｎｔａｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  によるＡｐｒｉｌ  ５，  ２００５出願日のアメリカ特許出願（発明の名称"OPTICAL INTERROGATION SYSTEM AND METHOD FOR 2-D SENSOR ARRAYS"）は、各々がＲＷＧセンサを約２００μｍ×３０００μｍの寸法で照射するようになされた、光ビームアレーを生成する発射システムと、センサから反射光ビームの角度によって示されるように、全ての応答を受信する受信システムと、を提供する。
たとえば、このシステムは、３秒（例は、図１に示された）の速度で、同時にサンプルをとれる７×７ウェルセンサまで許容する。
これは、９６ウェルマイクロプレートの９６サンプルのための細胞健康体価値判断が数秒内でされ得ることを意味する。
他の典型的なシステムとして、Ｎ．  Ｆｏｎｔａｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．によるアメリカ特許出願１０／９９３，５６５（出願日１１−１８−０４）、およびＹ．  Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．によるＡｐｒｉｌ  ５，  ２００５出願日のアメリカ特許出願  （発明の名称"METHOD FOR ELIMINATING CROSSTALK BETWEEN WAVEGUIDE GRATING-BASED BIOSENSORS LOCATED IN A MICROPLATE AND THE RESULTING MICROPLATE"）に開示されたものがあり、この両文献は全体として、そして少なくとも、バイオセンサ、スキャン装置およびマイクロプレートに関連した材料は本出願の明細書に援用したものとし、かかるシステムは各々が１つのバイオセンサを照らして同じバイオセンサから応答を受け取るように配列された光を生成するための配列された光ファイバを使用して、逐次的な方法のマイクロプレート内の多数バイオセンサからと同様に単一センサ内の多数領域から応答を集めるために管理された精査モジュールを使用する。
かかるシステムによって、細胞健康体価値判断が約３０秒内でされ得る。
（３．光学型バイオセンサ）
【０１３３】
光学型バイオセンサは、オリゴヌクレオチド、抗体−テスト相互作用、ホルモン受容体相互作用および酵素基質干渉を含む様々な生体分子相互作用を検出するために用いられた。
細胞ベースの研究のための光学標識フリー技術の使用を記載しているぶんけんは比較的少なかった。
たとえば、光導波路グレーティング型バイオセンサが動物細胞の接着および拡散を調査するために用いられている。(J.J.Ramsden, et al., "Kinetics of Adhesion and Spreading of Animal Cells," Biotechnol.Bioeng.1994, 43, 939-945)および、表面プラスモン共振（ＳＰＲ）が生体細胞のリガンド起因性細胞内反応の研究に使われている。(M. Hide, et al, "Real-time Analysis of Ligand-Induced Cell Surface and IntraCellular Reactions of Living Mast Cells Using a Surface Plasmon Resonance-Based Biosensor," Anal.Biochem. 2002, 302, 28-37) 
【０１３４】
光学型バイオセンサは、一般に２つの構成要素、高度の特定の認識要素と分子同定現象を定量化シグナルに変換する光変換器とからなる。
直接表層検知方法は、表面プラスモン共振（ＳＰＲ）（Jordan & Corn,, "Surface Plasmon Resonance Imaging Measurements of Electrostatic Biopolymer Adsorption onto Chemically Modified Gold Surfaces," Anal. Chem., 1997, 69:1449-1456)と、グレーティングカプラ(Morhard et al., "Immobilization of Antibodies in Micropatterns for Cell Detection by Optical Diffraction," Sensors and Actuators B, 2000, 70, 232-242)と、エリプソメトリ(Jin et al., "A Biosensor Concept Based on Imaging Ellipsometry for Visualization of Biomolecular Interactions," Analytical Biochemistry, 1995, 232, 69-72)と、エバネセント波装置(Huber et al., "Direct Optical Immunosensing (Sensitivity and Selectivity)," Sensors and Actuators B, 1992, 6, 122-126)と、反射計測(Brecht & Gauglitz, "Optical Probes and Transducers," Biosensors and Bioelectronics, 1995, 10, 923-936）と、を含む。
ＳＰＲまたは導波路グレーティングセンサの計測に使用される典型的測定には、適当なスペクトルまたは角成分を有する光ビームを利用して、このビームが検知界面によって反射されるときに、共鳴する角度または波長応答は出力応答の主要成分になる。
共通の特徴は、ＳＰＲおよびグレーティング結合器（すなわちＯＷＧまたはＲＷＧ）技術両者がセンサ界面若しくは付近で屈折率変化を検知するということである。
【０１３５】
この技術のバイオセンサとしての１つの主要な適用法は、異なる界面性状および異なる溶液特性の条件の下で、その位置で特定の被検体の界面の行動をモニタすることである。
この技術は標識フリー検出を可能とし、相互作用がシグナルを出す読み出しのための特定の標識を必要とする大部分の現在技術と異なる。
標識を付加することに関連した不利な点は、その標識付加が労働集約タイプであり高価なだけでなくて、標的生物学的製剤または化合物の生物学的性質の潜在的干渉を有しており、データ解読が難しく偽りの情報がアッセイから発生するかもしれないことが挙げられる。
これらの不利な点、非標識可視化技術の使用時または標識付加に使われる時間を減少することができる、非標識技術がここに開示される。
また、ここに開示されるセンサのいずれでも様々な方法で使われると理解されるべきで、例えば、多重化された多重井戸タイププレート（例えば修飾９６ウェルマイクロプレート）に使用できるので、その他複合的な方法で使われる。
ここに開示されるように、標識フリーバイオセンサ、例えばＲＷＧまたはＯＷＧバイオセンサが細胞と連動して使われ、そして、細胞の活動がモニタされ得る。
細胞はバイオセンサ上に培養され得、培養細胞が従来のプレートに培養されてプレートの底面に対する被着層になる時のようにバイオセンサに対する被着層となるようになされる。
細胞が開示されたバイオセンサ上で培養されるとき、バイオセンサの出力が変化する。
図１は、システム上の培養細胞の出力の例を示す。
図２は、光導波路グレーティングセンサの線図を示す。
この図において、細胞はセンサの上に培養される。
光源（例えばレーザ）が角度を変化させることでのセンサでの定方向であるときに、角度の特定のセットで、光はセンサに結合される。
他の角度で、光は直接反射されるかセンサを通過する。
ここに明らかにしたように、細胞表面での受容体の刺激作用のような細胞操作において、質量再分布が細胞内で起こる。
この質量再分布によって多くのものが生じ、その一つは光がセンサに結合する角度の変化である。
この角度変化は細胞内で起こっている現象を同定するために利用され得、そして、かかる現象が細胞内で起こる質量再分布に基づくバイオセンサと関連した出力に関するシグニチャプロファイル（signature profile）を有することはここの記載から理解できる。
【０１３６】
一般に標識および冗長なインキュベーションステップを必要とする従来の細胞増殖アッセイと異なって、開示された組成物、方法および技術の実施例は、所定の導波モードまたは共鳴性バンドの光導波路光モード分光学（ＯＷＬＳ）または共鳴ピーク分光学に基づく方法においていかなる標識も必要としない所定の導波モードの画像化を提供する。
さらに、実施例において、開示された組成物、方法および技術は、試薬反応および洗浄ステップを含むいかなる特別な処理ステップも省くことができる。
また、或る実施例、細胞増殖アッセイのような開示された組成物、方法およびおよび技術は、ほとんどすべての従来法のために一般に必要である他のいかなる試薬の影響なく、関心ある化合物だけの非共存および存在の標準培養条件の下で実行できる。
他の試薬の存在は、アッセイ結果の誤解に結果としてなるであろう。  
(J.J. Ramsden, et al., "Kinetics of Adhension and Spreading of Animal Cells", Biotechnol. Bioeng. 1994, 43, 939-945)
これらの試薬自体が細胞増殖上の直接効果を有するであろう。
(M. Hide, et al., "Real-time Analysis of Ligand-Induced Cell Surface and IntraCellular Reactions of Living Mast Cells Using a Surface Plasmon Resonance-Based Biosensor," Anal. Biochem. 2002, 302, 28-37)  
スクリーニングされる化合物は、細胞増殖よりむしろ、これらの試薬上の効果を有するであろう。
たとえば、直接細胞のミトコンドリアデヒドロゲナーゼを抑制する化合物はＭＴＴの遺伝子変換の抑制に結果をもたらし、それによって、ＭＴＴアッセイは、関心ある特定の他の標的に対してモジュレータをスクリーニングするために用いられるときに、偽陽性を導くであろう。
【０１３７】
細胞増殖による角または波長シフトのリアルタイム計測を含むアプローチを検出している光導波路を含む他の現在の標識フリー細胞増殖アッセイと異なり、開示された或る実施例における組成、方法および技術は、阻害物質および活性化物質を探索するために極端な高いスループットをもたらすスクリーニングアプローチを提供する。
細胞増殖が一般に遅いプロセス（例えば、数時間、数日または数週かかる）であり、一般に３７℃インキュベーションを必要とするので、ここに開示される以外の室温で一般にシグナルを集める標識フリー増殖アッセイでは高スループットスクリーニングの実行がむずかしい。
【０１３８】
ここに開示される方法は、特別な試薬のなくとも正確な計測を提供でき、その使用や、他の機能上スクリーニングと統合することが簡単である。
たとえば、放射性であるか他の物質（例えば光に敏感な蛍光化合物）を貯蔵または操作する必要がない。
【０１３９】
他が細胞増殖アッセイのための光導波路型バイオセンサを使用すると共に、光導波路型バイオセンサのそれらの使用が開始細胞所定の数のための化合物の異なる濃度がある場合には、細胞の付着のためにセンサの波長シフトをモニタした。(Cunningham, B.T., et al., "Label-Free Assays on the BIND System," J. Biomol.Screening 2004, 9, 481-490 and U.S.Patent Application Publication No. US20030068657 A1 for "Label-free methods for performing assays using a colorimetric resonant reflectance optical biosensor" SRU Biosystems LLC by Lin, Bo et al.)。
細胞増殖上の化合物のＩＣ５０ｓを検査するために、特定の状況において、これらの方法が、使われる。
しかし、ここに開示される方法がそうであるように、これらの方法は、高スループットスクリーニングに適していない。
ここに開示されて、導波路型バイオセンサは、Ｇタンパク質の活性化のための作動薬−起因性指向性質量再分布が受容体（ＧＰＣＲ）または受容体チロシンキナーゼ（例えばＥＧＦＲｉｎ生体細胞）を結合したモニターもだけでなくに、指向性質量再分布を導くシグナル伝達経路または細胞の機構を研究するために用いることが可能である。
（ａ）  ＯＷＬＳおよび細胞毒性）
【０１４０】
ＯＷＬＳによれば、導波路の表層上のパターンおよび不均質性は、結合されたピークスペクトルの広幅化および微細構造を産生する。
センサ上の界面固定化、生物学的製剤の不均質付着を有するセンサのためのこれらの微細構造または実験的に、そして、理論的に観察される材料としては挙げられるが、これに限定されるものではない均質のための各々のモードの１つの鋭い共振ピークの代わりに、少なくとも一つの肩部（すなわち、二次性の）が各々のモードのための各々のモードおよびよく分離した重複の（さらに）ピークの主な共振ピークを有する排臨をピークまで上げること。参照(see Horvath, R., et al. "Effect of patterns and inhomogeneities on the surface of waveguides used for optical waveguide lightmode spectroscopy applications", Appl. Phys. B. 2001, 72, 441-447; Voros, J., Graf, R. et al.,  "Feasibility Study of an Online Toxicological Sensor Based on the Optical Waveguide Technique," Biosensors & Bioelectronics 2000, 15, 423-429 the references therein are incorporated)。
以前に、研究者は導波路上の細胞付着性および拡散移動の間、結合されたピークが広げられることに気がついた。その一方で、グレーティング上の標準ミクロ構造はピークのシフトおよび分裂を産生する。
共振ピークの広幅化が、細胞付着性および拡散移動の指紋として使われた。
（４．細胞の光学バイオセンサおよび質量再分布）
【０１４１】
概してＳＰＲまたは導波路グレーティングセンサを測定した計測は適当なスペクトルまたは角度内容を有する光ビームを利用して、このビームが検知界面によって反射されたときに、共鳴する角度または波長応答が出力ビームの主要成分になる。
具体的には、センサとして使用するプレーナ光導波路は、基質、導波性薄膜およびカバー培地からなる。ここで、カバー培地は屈折率を決定することによって特徴づけられる物質である。
プレーナー型導波路型バイオセンサは、導波路を囲んでいる培地における変化を検出するために使用され、導波路の電磁場伝搬性が周囲の培地に達してエバネッセント電磁場（その深度は、侵入深さまたは検知体積とみなせる）として伝搬する。
質量再分布が検知体積内で起こるときに、応答変化は反射ビームの角であるかスペクトルの変化として観察される。
角のシフトは、質量再分布応答シグナルの動態を得るために測定される。
加えて、それのため、異なる細胞応答は全体的な質量再分布シグナルとは異なって貢献する。
たとえば、細胞外のマトリックスからの細胞離断はセンサは表面若しくは付近で起こり、したがって、細胞で起こっているそれらよりかなり大きい応答を導くであろう。
【０１４２】
生物学的製剤細胞は、図９にて図示したように、ナノメータから何十もミクロンまで大きさにおいて変動している成分を有する複素構造である。
細胞は、多数の細胞器官を含んでいる細胞原形質（概して５−３０μＭ）からなる。
最大の細胞器官は、大きさが３−１０μｍの間で概して変動する細胞核である。
細胞核はＤＮＡ−タンパク質複合体およびタンパク質で満たされる。そして、最も重要なものがクロマチンである。
ミトコンドリアは、０．５−１．５μｍから概して変動している大きさを有する一連の折られた膜からなる小さい細胞器官である。
他細胞成分は、小胞体（ＥＲ）（概して０．２−１μｍ）、リソソーム（概して０．２−０．５μｍ）、ペルオキシソーム（概して０．２−０．５μｍ）、エンドソーム（概して約１００ｎｍ）およびｇｏｌｇｉを含む。
ａ）  光導波路グレーティングベースの表層の検知技術
【０１４３】
センサ（ＲＷＧ）および光導波路グレーティング（ＯＷＧ）に共鳴性導波路グレーティングを取り換えられて使われる。
ＲＷＧバイオセンサは、回折グレーティングによって導波路への光の共振結合に基づく、エバネッセント波センサである。
ＲＷＧに基づく表層の検知技術はエバネセント場を利用する。そして、それは、選択的に所定のスペクトル帯幅の上の固定された化学で生物学的な分子の吸着に応答するために、導波路界面からの波長より通らない。
【０１４４】
光学ＬＩＤバイオセンサ（例えば１００４の図１０）の例はＳＰＲセンサ１００４である、または、導波路グレーティングはセンサ１００４の基礎を形成した。
他の光学型バイオセンサが、また、エリプソメトリ装置、エバネッセント波装置および反射計測装置のような使われる。
Ｏｐｔは、構造についてのより詳細な討論およびＬＩＤバイオセンサについてアメリカ文献（U.S. Patent No. 4,815,843 entitled "Optical Sensor for Selective Detection of Substances and/or for the Detection of Refractive Index Changes in Gaseous, Liquid, Solid and Porous Samples" and K. Tiefenthaler et al. "Integrated Optical Switches and Gas Sensors" Opt. Lett. 10, No. 4, April 1984, pp.137-139,）提供され、いずれがバイオセンサのための全体として最少で材料についてここに取り入れられる。バイオセンサについてアメリカ特許文献U.S. Patent App. 60/701,445, filed 7-20-2005, for "Label-Free High Throughput Biomolecular Screen System and Method" and U.S. Patent App. 11/019,439, filed 12-21-2004, and U.S. Patent App. for "OPTICAL INTERROGATION SYSTEM AND METHOD FOR 2-D SENSOR ARRAYS" by N. Fontaine et al., filed on April 5, 2005,に開示されている。これらはここに本願に援用される。
（（１）  対称性導波路グレーティングバイオセンサ）
【０１４５】
対称性導波路グレーティングバイオセンサの例は、Jordan & Corn, "Surface Plasmon Resonance Imaging Measurements of Electrostatic Biopolymer Adsorption onto Chemically Modified Gold Surfaces," Anal. Chem., 1997, 69:1449-1456; Morhard et al., "Immobilization of antibodies in micropatterns for cell detection by optical diffraction," Sensors and Actuators B, 2000, 70, 232-242; and Tiefenthaler, K., and W. Lukosz, "Sensitivity of grating couplers as integrated optical chemical sensors" J. Opt. Soc. Am.B, 1989, 6, 209-220 に開示されている。これらは、そして、全体としてここに引用したものとするが、少なくとも材料のために被結合バイオセンサにグレーティングをつけることに関連がある。
【０１４６】
グレーティング結合器バイオセンサは、回折グレーティングによって導波路への光の共振結合に基づくエバネッセント波センサである。
グレーティング結合器センサは、導波路および回折グレーティングの組み合わせからなる。
図２ａは、高屈折率（例えばＮｂ２Ｏ５のｎＦ約２．３６）の薄膜からなる古典的な４つの層導波路バイオセンサに下部の屈折率（例えば１７３７のガラスのためのｎｓ約１．５０）の基質上の厚さｄＦを有する材料を示す。
屈折率を有する生物学的製剤の付着層は、導波薄膜に固定する（ｎＡ）１．４および厚さｄＡのまわりで、そして、全てのセンサの上に構造がカバー培地（１．３５のまわりの屈折率（ｎｃ）を有する生物学的な溶液であること）であること。
この従来の構成において、導波薄膜の屈折率は、少なくとも１％、たとえば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、５０％、７０％または１００％による下部の屈折率の基質のそれより高い。
たとえば、下部の屈折率の基質の屈折率は、５％、７％、１０％、１５％、２０％、３０％または５０％カバー培地のそれより高い。
カバー培地（一般に細胞ベースのアッセイ適用法のための水溶媒質）の屈折率は、概して約１．３２、１．３５、ａｎｄ１．３８である。
【０１４７】
プレーナー型導波路における被きょう導波またはモードは、ＴＥｍ（横電気またはｓ−偏光）と、ＴＭｍ（横磁気またはｐ−偏光）である（ここでｍ＝０，１，２、…はモード次数である）。
所定の導波モードはたとえばＴＭ０、ＴＥ０、ＴＭ１、ＴＥ１、その他に関連する。
レーザは角度を変化させて導波路を照射して、光は導波モードの実効屈折率（Ｎとして示される）によって決定される特定の角度だけで、導波路に結合される。
光モードのエバネッセントテイルは基質内にて伝搬し薄膜に沿って培地をカバーするので、光モードは３つの培地全部を同時に経験または知覚する。
これは、進行している光モードによって経験される屈折率が３つの屈折率の評価される混合であることを意味する。
実効屈折率Ｎは、モード方程式から数値的に算出され得る。そして、それは薄い付着層の厚さが光の波長未満（ｄＡ＜＜λ）であると仮定している４つの層導波路のための以下の形態式で書かれる。
[Tiefenthaler, K., and W. Lukosz, "Sensitivity of grating couplers as integrated optical chemical sensors" J. Opt. Soc. Am.B, 1989, 6, 209-220]：
【数１】
2008538287.tif 000003
ここで、ｋ＝２π／λであり、λは導波光の真空波長であり、σはＴＥモードのための１およびＴＭのための０に等しい基本モードタイプ数である。
【０１４８】
光が界面−レリーフグレーティングによって導波路に結合される場合、Ｎは内結合している角度から算出され得る。
【数２】
2008538287.tif 000004
【０１４９】
ここで、Ｎａｉｒ＝１．０００３は空気の屈折率であり、θは空気中で測った入射角であり、λは波長であり、Λはグレーティング周期、そして、ｌ＝±１（±２）…は回折次数である。
この方程式の左側上のプラスおよびマイナス符号はそれぞれ＋ｘおよび−ｘ方向に伝搬する導波モードを示している。
【０１５０】
グレーティング領域の導波路における誘導された実効屈折率変化ΔＮは、次の方程式に記載された変化Δθを導く。
【数３】
2008538287.tif 000005
【０１５１】
レーザ光が結合され導波薄膜の平面の界面と平行して伝播するので、これは界面隣接液体の電磁場（すなわちエバネッセント波）をつくる。
エバネッセント波の振幅（Ｅｍ）は、界面から距離ｄの増加と共に指数的に減衰する。
【数４】
2008538287.tif 000006
【数５】
2008538287.tif 000007
ΔＺｃはカバー培地への高強度を有する導波路モードの侵入深さである。
【０１５２】
２つの条件：（ａ）導波薄膜の屈折率が少なくとも１％でかつ周囲の基質およびカバー培地の屈折率より大きい屈折率を有すること；（２）導波薄膜の厚さはカットオフ厚さｄＣと呼ぶ次式の定義値より大きいこと：が満たされる必要がありこの場合、所定モードタイプは導波波だけとして広がる。
【数６】
2008538287.tif 000008
【０１５３】
ここでｎｍｉｎ＝ｍｉｎ｛ｎｓ，ｎＣ｝およびｎｍａｘ＝ｍａｘ｛ｎｓ，ｎＣ｝である。
膜厚がカットオフ厚さに接近するときに、モードの実効屈折率（Ｎ）がｎｍａｘに接近することを公知である。
さらに、式（５）は、侵入深さが、より大きい屈折率を有する薄膜側のカットオフ点で無限大となり、他方側では、侵入深さが有限であるとを意味する。
この場合また、ｄｅｆｆは、無限である。
【０１５４】
また、導波路グレーティングバイオセンサが従来の導波路構成にあるときには、導波路センサの光伝搬性からの指数的に減衰しているエバネセント場は、高強度をもって５０−２００ｎｍの深度にカバー培地を貫通するだけである。
この値は、界面（グレーティング構造と同様に照明波長）に存在する培地の屈折率に依存する。
入射角が臨界値に等しいときに、ｄＣは無限となり、そして、屈折光の波面は界面に直角となる。
【０１５５】
４−層導波路を以下パラメータ：ｎＦ＝２．３７（Ｎｂ２Ｏ５層）、ｎｓ＝１．５１（１７３７ガラス）、ｎｃ＝１．３３３（水溶液）、ｎＡ＝１．３７（細胞）、ｄＡ  ＝５００ｎｍ（培養細胞の平均値厚さ）、ｄＦ＝１５７ｎｍ、波長８３０ｎｍ、グレーティング周期５３０ｎｍ、で考慮すると、次のことが得られる。このセンサがＴＥ０およびＴＭ０モードを支持する場合、（１）カットオフ厚さはＴＥ０モードで２７ｎｍ、ＴＭ０モードで６９ｎｍ、ＴＥ１モードで２５２ｎｍ、ＴＭ１モードで２９４ｎｍ、である。（２）侵入深さは、ＴＥ０モードで７８ｎｍおよびＴＭ０モードで１１２ｎｍである。
これは、（１）図２ａにおいて細胞内部で破線の矢印によって強調されるように、我々はモニタされたのは細胞の付着層の底一部だけであること、（２）図４に示すように、標的または複合体がセンサ界面により近い時と、それがセンサ界面からもっと先である時と比べて、特定の質量の標的または複合体はより総合応答に貢献することを意味する。
図４は、距離の増加と共に指数的に減衰する培地に通されるエバネッセント波の強度を示す。
そのより高い感度により、特記しなければ、本出願の大部分の典型的な研究においてＴＭ０が使われている。
（（２）    逆対称性導波路グレーティングバイオセンサ）
【０１５６】
従来の構成を有する上記導波路センサにおいて、基質屈折率（たとえば、ガラス基質、概してｎｓ約１．５）は、常に水のカバー培地屈折率（概して約１．３３）より高い。
かかる対称性導波路センサの光伝搬性からの指数的に減衰しているエバネセント場は、短い深度（概して約５０−２００ｎｍ）に、カバー培地を通すだけである。
基質側面上のエバネッセントテイルはカバー培地側面上のものより、かなり長くてかつ強度が高い。
感度が被検体付着層のモード仕事率伝搬性の画分に依存するように、これは応答を被検体に制限する。
モードプロフィールの反転はこの限界を克服して、より大きく侵入深さを許可する（より長く）。そして、それによって形態または細胞内成分の解析を許す。
Horvath et al. (US20030109055A1 and Horvath, R., Lindvold, L.R., and Larsen, N.B. "Demonstration of Reverse Symmetry Waveguide Sensing in Aqueous Solutions,", Applied Physics B, 2002, 74, 383-393; これらはここに本願に援用される。
これらはいわゆる逆の対称性導波路の実施可能性を示す。
逆の対称性導波路の原理は、図２ａに示すように、導波性薄膜（すなわち概して水溶液のための１．３３）をカバーしている培地の屈折率未満の導波路基質の屈折率を作ることに基づく。
図５に示すように、逆対称性は、三つの異なる幾何学構成によって実現する：
（１）希薄導波薄膜は、マイクロメートルサイズで構築された支持体に沈澱した；
かかるナノポーラス（nanoprous）な基質の屈折率が約１．１５であるメソポーラス（mesoporous）であるかナノ多孔質支持体に、（２）希薄導波薄膜は、沈澱した；
そして、薄い導波薄膜は、ナノメートルサイズで構築された支持体に沈澱した。
かかる逆構成を使用することによって、カバー培地侵入深さはかなり従来の導波路のそれを上回る。そのとき、膜厚は２つの導波路のカットオフ厚さに接近する。
さらに、膜厚を制御することによって、探測深度は、また、上限なしで管理されていることが可能である。
（（３）  光検出系）
【０１５７】
或る実施例の、光検出系がいずれの角度測定もまたは波長測定でありえること、または、たとえば、それらの変異系配列された角度測定システムまたは精査波長測定システムはアメリカ特許文献参照(U.S. Patent App. 10/993,565, filed 11-18-04 by N. Fontaine, et al. and "METHOD FOR ELIMINATING CROSSTALK BETWEEN WAVEGUIDE GRATING-BASED BIOSENSORS LOCATED IN A MICROPLATE AND THE RESULTING MICROPLATE" by Y. Fang, et al., filed on March 31, 2005 両方は、バイオセンサ、精査装置およびマイクロプレートに関連した材料のために、全体として、そして、少なくとも光学導波路バイオセンサ取り入れられる使われる。
U.S. Patent App. 10/602,304, filed 06-24-2003 having publication no. US-2004-0263841, published 12-30-2004 and U.S. App. 11/019,439, filed 12-21-2004, and U.S. Patent App. for "OPTICAL INTERROGATION SYSTEM AND METHOD FOR 2-D SENSOR ARRAYS" by N. Fontaine, et al., filed on March 31, 2005, これら全てはバイオセンサおよびそれらの使用のための最少で、援用によって全体としてここに取り入れられる。
【０１５８】
マイクロプレートのＯＷＧバイオセンサの特定の構成によって使われるプレートの例、各ウェルが光導波路グレーティング（ＯＷＧ）を含む９６ウェルのコーニングＥｐｉｃバイオセンサマイクロプレートは、ガラス製の支持体基質の底面において包埋されるバイオセンサである。
【０１５９】
導波モードのエバネセント場がカバー液体の中へ出るので、導波路モードは絶妙にカバー生育環境に影響される。
細胞現象が導波路界面（例えば透過化処理された細胞からの生物物質の管理された解放）で起こるときに、結果は質量（導波路モードの定数がまた、マクスウェルの電磁方程式に従って変えなければならない伝搬）の減失を原因として生じるので、カバー培地の実効屈折率を変える。
導波路グレーティング構造のための位相整合条件の結果が上記に言及したように、入力光の好適な結合角度（または波長）は導波路伝搬定数変化に従って変わらなければならない。
これらの肉眼の物理変化は、顕微鏡学的な細胞現象を示すためにモニタされ得る。
（ｂ）  光導波路光モード分光学（ＯＷＬＳ）理論）
【０１６０】
グレーティング結合器バイオセンサは、回折グレーティングによって導波路への光の共振結合に基づくエバネッセント波センサである。
折れ線波動モデルによって記載されている全反射によって、導波モードはプレーナー型導波路において広がる。折れ線波動モデルを得た後、通常波と２反射波との位相差は薄膜β内の光の所定導波路構造および偏光と波長のための波ベクトルχ成分との関数である。
自己無どう着性基準によって決定されて、βの値は、モード方程式(Horvath, R., et al., "Effect of Patterns and Inhomogeneities on the Surface of Waveguides Used for Optical Waveguide Lightmode Spectroscopy Applications," Appl. Phys. B. 72, 441-447)から、数値的に算出され得る：
【数７】
2008538287.tif 000009
【０１６１】
ここで、ｋ＝２π／λで、λが導かれた光の真空波長であるところに、ρはＴＭモードのためのＴＥおよび０のための１に等しいモード基本タイプ数である。ｎＦ、ｎｓおよびｎｃは薄膜、基質および、それぞれ、カバー培地の屈折率である。
導波路のモード伝搬方向はχである、そして、ｍ＝０，１，２…．はｍ次案内モードのモード屈折率である。
折れ線波動モデルにおいて、各々の光線が平面波を表す(P.K. Tien., "Integrated Optics and New Wave Phenomena in Optical Waveguides," Rev. Mod. Phys. 1977, 49, 361)。
光が導波路に結合される場合、それは折れ線波が薄膜界面に当たるそれらの点で、結合を考慮するのに必要なだけである、そして、これらの点で、薬草光線光学が使われる。
【０１６２】
図３に示すように、１つの折れ線の間の位相変化がΦ（β）であると仮定するならば、第ｎ番目の折れ線（Ａｎ（β））の後の波の振幅は幾何級数によって与えられる：
【数８】
2008538287.tif 000010
ここで、ｉは虚数単位および（９）を示す。
【数９】
2008538287.tif 000011
【数１０】
2008538287.tif 000012
【０１６３】
全部のグレーティング長さが照らされると仮定するならば、カップリング長さＬがグレーティング長さ、総数、ｎに等しくて、十分の中で、折れ線は算出され得る：
【数１１】
2008538287.tif 000013
【０１６４】
角度ａｏでグレーティングを照らして、β０を有する導波路モードが発生する：
【数１２】
2008538287.tif 000014
【０１６５】
ｎａｉｒが空気およびＬの屈折率であり、Λはグレーティング周期性である。
グレーティングおよびレーザ光線の有限の幅を原因として生じるので、平面波を有する角度ａｏの下でグレーティングを照らすときに、回析された光は平面波分配を使用して記載されている。
これは、ほぼ２ｐ／Ｌの最大半減（ＰＷＨＭ）でのピーク幅を有するβ０でピークに至り、これは光学不確定原理から算出される  (Tiefenthaler, K. and Lukosz, W, J., "Sensitivity of grating couplers as integrated-optical chemical sensors", J. Opt. Soc. Am. B. 1989, 6, 209-220)。
【０１６６】
第ｎ番目の切片（Ｉｎ（β））の後の被結合光の強度は、光の振幅の絶対の四角に対する比例的である：
｜Ｇ（β）｜２＝ＩＧ（β）。
被結合光強度、Ｉ（α）および入射角（それはまた、光導波路光モード分光学（ＯＷＬＳ）技術を使用して測定され得る）間の関係は、以下の方程式を使用して算出され得る：
【数１３】
2008538287.tif 000015
ここで、Ｉｄ（β，α）が第１の目回折の強度分布である。
【数１４】
2008538287.tif 000016
（ｃ）  垂直の質量再分布および外側塊再分布）
【０１６７】
生体細胞は非常に動的である、そして、たとえば、大部分の細胞器官はシグナル伝達分子または経路の活性化に応答して、細胞内で広く進行する。
たとえば、マイクロチューブルは長距離の上の細胞器官を輸送する。
刺激は、細胞が培養されるセンサ界面のまさしくその末梢の濃く包まれた細胞器官のサブミクロン運動に結果としてなることが可能である；
かかる運動は、細胞内で質量再分布を導く。
模倣が「輸送」ことまたは「転位」と呼ばれているというシグナルまたは「再分布」に応答するかかる運動。
かかる輸送転位または再分布現象は、一般に質量再分布と関連する。
質量再分布は、光学バイオセンサによって検出され得る；
そして、質量再分布に関するシグナルは指向性質量再分布（ＤＭＲ）シグナルと呼ばれる。
【０１６８】
刺激作用が三次元の細胞の内容物の動的再分布を導くので、入射角または波長変化を有する細胞応答をモニタすることはバイオセンサでの細胞検出には充分ではないもしれない。
解析を単純化するために、動的質量再分布は、２つのタイプ、センサ界面に垂直に起こる垂直質量再分布と、センサ界面に平行して起こる横（水平）質量再分布とに分割され得る。
特定の刺激性事象がこれらの質量再分布うちの１つ、または両方の結果としてなると理解される。
【０１６９】
入射角または共鳴性波長の動的な変化によって関係するように、ＤＭＲシグナルが主に生じられて、起こる細胞の内容物の再分布センサ界面にバイオセンサが大部分はセンサのエバネッセント波の方向に、質量再分布平行に知覚しうった時から垂線。
かかるＤＭＲは、また、垂直の質量再分布とみなせる。
具体的には、センサ界面に対する平行である方向およびセンサのエバネッセント波の方向に対する垂線の刺激性事象−起因性質量再分布は、細胞層内の質量の均一の変化およびこのように共鳴ピーク、共鳴バンド像および／またはＯＷＬＳスペクトルの変化の結果を導く。
かかる変化が、検出されることができて、刺激性事象の効果または刺激性事象−起因性細胞応答上の化合物のためのシグニチャとして使われる。
かかる質量再分布は、外側塊再分布とみなせる。
【０１７０】
図２および３に示すように、細胞は共鳴導波路グレーティングバイオセンサ（ＲＷＧ）の表層の上で、直接培養される。
外部性シグナルは特定の細胞シグナル伝達の活性化を媒介する。そして、多くの場合細胞の内容物（動的質量再分布に対する当量）の動的再分布に結果としてなる。
検知体積（すなわちエバネッセント波の侵入深さ）内で起こるときに、ＤＭＲは明らかにされることができて、このようにＲＷＧバイオセンサ（センサ界面の近くで局在部屈折率の変化に知覚しうる標識フリー技術）によって、リアルタイムにおいてモニタした。
多パラメタ計測のためのその機能のため、バイオセンサは細胞のための高い情報内容に検出することを提供するためにポテンシャルを有する。
これらのパラメータは、角のシフト（最も一般の出力のうちの１つ）、強度、最大半減（ＰＷＨＭ）でのピーク幅および共鳴ピークの領域を含む。
各々のセンサを照らすために約２００μｍ  ×３０００μｍの光ビームを使用する我々の角測定システムのユニーク設計のために、各々のセンサの共鳴バンド像が細胞状態（例えば、密度および接着程度）の均一性にに関して、全てのセンサ全体の異なる場所にある細胞のための細胞応答の均一と同様に追加の役立つ情報に提供できる。
【０１７１】
ＲＷＧバイオセンサは、回折グレーティングを経た導波路への光の共振結合によって発生するエバネッセント波を利用する。
導かれた光は、基質−薄膜および培地−薄膜界面での全反射による制限により、全てが導波路に平行な伝搬方向を有する光の一つ以上のモードとして見られる。
導波路は、その周囲の培地より高い屈折率値を有する。
導かれた光モードが全ての層をカバーする横振幅プロフィールを有するので、各モードの実効屈折率Ｎは全ての層の屈折率の秤量合計である。
【数１５】
2008538287.tif 000017
ここで、ｎＦ、ｎｓ、ｎｃ、および、ｎａｄはそれぞれ導波路、基質、カバー培地および細胞の付着層の屈折率にある。ｄＦおよびｄａｄは、それぞれ薄膜および細胞層の有効厚さである。λは使用する光の真空波長である。ｍ＝０、１、２、…はモード次数である。
そして、σはモードタイプ数で、ＴＥ（横電気波またはｓ−偏光）で１に等しく、ＴＭモード（横磁気波またはｐ−偏光）で０に等しい。
【０１７２】
付着細胞の中で光学検出することは、ユニークで、界面と相互に作用している細胞および細胞構造および機能の複雑度の本来の原因として生じるので、全く挑戦している。
数種類の細胞は、主に接触の三タイプ、局所の接触、近い接触および細胞間マトリックス（ＥＣＭ）接触によって、界面上に被着することは公知である。
局所の接触は、基質界面の１０〜１５ｎｍ内で来る付着細胞膜（例えば０．２μＭ×１０μｍ）の狭い領域である。
近い接触は基質から１〜５０ｎｍの分離される細胞膜の領域に関連し、これに対してＥＣＭ接触が基質から１００ｎｍ以上分離される細胞膜の領域を示す。
このように、センサが細胞密集度がまだ高量（約９５％）であるときでも、カバー培地を検出することが可能であると分かる。
しかし、生体細胞が約７０％水を含むことを公知であり、そして、大部分の細胞内の生体高分子はフィラメントネットワークのマトリックスによって構成されて、空間的に哺乳動物細胞の適当な部位に制限される。
さらに、細胞の体高は概して入射光（ここでλ＝８３０ｍｍ）の手に余る。その一方で、侵入深さは一般に細胞の体高より非常に小さい。
このように、検出することはそうする細胞のためのバイオセンサは、基質、導波路および細胞層の三層構成として見られる。
【０１７３】
実効屈折率Ｎの値は、三層導波路の所定モードのためのモード方程式から、数値的に算出され得る[Tiefenthaler, K., and W. Lukosz, "Sensitivity of grating couplers as integrated optical chemical sensors" J. Opt. Soc. Am.B, 1989, 6, 209-220]:
【数１６】
2008538287.tif 000018
ここで波数ベクタｋ＝２πｍ／λである。
【０１７４】
導かれた光モードは平面導波路の界面に、平行を伝播する。そして、このように減衰している指数関数的の形質を有する薄膜の両辺を囲んでいる低屈折率培地に達している電磁場（すなわちエバネッセント波）をつくる。
エバネッセント波の振幅（Ｅｍ）は、界面から距離ｚの増加と共に指数的に減衰する：
【数１７】
2008538287.tif 000019
【数１８】
2008538287.tif 000020
カバー培地に達する導波路モードのエバネッセントテイルの侵入深さである。
細胞性状の使用するバイオセンサおよび一意性の構成に基づく、ここで使用するＴＭ０モードの侵入深さが約１２０であることナノメートル、我々が細胞の底一部をモニタするだけだった意味。
【０１７５】
タンパク質および／または分子集合体の転位は、外部性シグナルによって引き起こされる多数細胞応答に共通である。
転位は、振幅、持続期間および特定の標的による細胞シグナル伝達の動態の正確なコントロールを可能にする。
加えて、場合によっては、外部性刺激によって、また、細胞状態（例えば接着程度および細胞骨格構造）の変化が生じることがありえた。
かかる変化が検知体積内で起こるときに、モード屈折率Ｎはカバー培地およびエバネッセントテイル間の相互作用のために変化する。
【０１７６】
導波モード（垂直の質量再分布に関連した）のエバネッセントテイルに対するセンサ界面、しかし、平行に対する垂線である方向の細胞の内容物の再分布のために、多数の同等の間隔を置かれたおよび同質薄層に、付着細胞の底一部を分ける。そして、接着の程度および構成が所定の時間で光ビームによって調査されている細胞のための同様であると仮定する。
各々の層は、それ自身の屈折率ｎｉを有して、ｚｉ（図２ｂ）の距離によって、センサ界面から離間される。
全ての層は等体積を有すると考慮されてもよい。その理由は、単位面積Ａは定常的であると考慮されて、導波路の被きょう導波の伝搬長さと同様に入射光ビームの物理的な大きさに限られている光学バイオセンサの空間分解能によって決定されるからである。
細胞内の所定の体積の屈折率は、主に生体分子の濃度によって決定される主にタンパク質[Beuthan J, O. Minet, J. Helfmann, M. Herrig, and G. Muller. 1996. The spatial variation of the refractive index in biological cells. Phys. Med. Biol. 41:369-382):
【数１９】
2008538287.tif 000021
ここでｎ０は溶剤の屈折率にあり、それは細胞の水に対する定数およびほぼ同等である。αは比屈折増分でタンパク質で０．００１８、ナトリウムのような細胞の他溶質で０．００１６である。
Ｃｉは、層ｉの溶質の濃度（ｇ／１００ｍｌ）である。
比屈折増分がタンパク質および他溶質のための同様である間、体積につき重量に関するそれらの濃度がかなり他の溶質より大きいので、タンパク質は主に各々の層の屈折率を説明する。
このように、均一な層ｉの屈折率変化Δｎｉは、ほぼ区分的連続関数を形成する：
【数２０】
2008538287.tif 000022
【０１７７】
検知体積内の評価屈折率変化Δｎｃは、評価因子ｅｘｐ（−ｚ／ΔＺｃ）を有するΔｎｉの組込みである：
【数２１】
2008538287.tif 000023
【０１７８】
Δｎ（ｚ）で式（７）を置換して、ｚ＝０からｚ＝∞まで積分して再配列すると、以下を得る。
【数２２】
2008538287.tif 000024
【０１７９】
ほとんどの場合、Δｎｃがバイオセンサによって検出される細胞の屈折率が小さいもの（一般に２０％未満の）であるので、第一に、実効屈折率の変化を命じて、変化はつぎのようになる。
【数２３】
2008538287.tif 000025
ここで、Ｓ（Ｃ）がカバー培地（すなわち細胞）に対する感度である。
【数２４】
2008538287.tif 000026
ここで、ｄｅｆｆは実効導波路厚さであり、つぎで与えられる：
【数２５】
2008538287.tif 000027
式（９）および（１１）を式（１２）に代入して、検出シグナルのために、値が得れる：
【数２６】
2008538287.tif 000028
【０１８０】
式（２６）は提案する：（ｉ）実効屈折率の変化（このように、測った入射角のシフトが光学シグニチャに関している）は、主に検知体積内で垂直の質量再分布で知覚しうる；
（ｉｉ）実効屈折率の変化はタンパク質再配置のためのイオン可動化（例えばＣａ２＋流入およびＣａ２＋フラックス）が刺激作用によって媒介したよりはむしろタンパク質濃度の変化の直接の関数になる；
（ｉｉｉ）センサ界面に向かう特定質量の標的または複合体の再配置が界面から離間されるその移向より総合応答率に貢献する；
（ｉｖ）光学シグニチャは、センサ界面から離れて異なる距離で起こっている質量再分布からの寄与の合計である統合したシグナルである。
細胞シグナル伝達の複合した本来性のため、異なる標的で媒介された異なる細胞シグナル伝達の活性化は類似した全体的なＤＭＲシグナルに結果としてなるかもしれない。
しかし、特定のシグナル伝達現象のための細胞の標的のユニークセットの関与のため、選択的阻害物質の予め定められたセットによって媒介された阻害プロフィールは特定の刺激によって活性化されている細胞シグナル伝達の特異性を分類する手段を提供するかもしれない。
【０１８１】
上記のように、入射角または共鳴性波長のシフトは主に検知体積内で垂直の質量再分布によって決定される。そのとき、細胞は刺激作用に応答する。
バイオセンサの痩せた横方向解像力のため、外側塊再分布はこれらのシフトによって分解されるためにむずかしくてもよい。
しかし、グレーティングおよびレーザ光線の有限の幅のため、ＲＷＬＳ理論切片において議論されるように、平面波を有する角度ａｏの下でグレーティングを照らすときに、回析された光は平面波分配を使用して記載されている。
これは、いかなる付着層も存在しないとき光学不確定原理から算出した、ほぼ２ｐ／ＬのＰＷＨＭを有するｂｏでのピークを導く。
これらの方程式を使用しているモデリングは面白い所見を導き、それは共鳴ピーク（またはスペクトル）の形が質量分布の横方向不均質性について価値ある情報を運ぶことを示唆する。
かかる横方向不均質性は、強くカバー培地屈折率を乱さなくて、かなり共鳴ピークの形を変える。
【０１８２】
特定の外存性のシグナルが単一細胞および多数細胞のレベルで、有意な不斉外側塊再分布を導いてもよいことは、周知である。
たとえば、細胞の異なる個体群は異質に細胞に対し毒性である化合物に応答してもよい。その一方で、単一の付着細胞は若干の細胞過程（例えば細胞移動および侵襲）の間、特定の細胞の標的または分子集合体の偏在を経てもよい。
我々は、起こるときに、不斉外側塊再分布がまた、微細構造の変化および共鳴ピークの形に結果としてなることがありえたと仮定した。
（ｄ）  細胞シグナル伝達および細胞生理の動的質量再分布）
【０１８３】
生体細胞はタンパク質フィラメントの複合して動的なネットからなる。そして、成熟核の細胞原形質の全体にわたって伸びる細胞骨格として、細胞と呼ばれる。
細胞骨格は、たとえば、抗張力を、「軌道」または「ドッキング部位」をシグナル伝達のために用意して、輸送することによって、そして、力を細胞移動、細胞内輸送および細胞分割のために用意することによって、細胞形状を維持するために提供することによって多様な細胞の活性を実行することに関係させる。
細胞骨格フィラメントの三種、アクチンフィラメント、中間径フィラメントおよびマイクロチューブルがある：
（各々の実行異なる生物学的な諸関数）。
これらのフィラメントの中で、それらが細胞の形を保って、細胞質的な隆起を形成して、若干の細胞−−細胞または細胞−−マトリクス結合、シグナル伝達および筋収縮に参加するように、アクチンフィラメント大部分は形質膜の下でちょうど集中する。
【０１８４】
大部分の細胞内の生体高分子がフィラメントネットワークのマトリックスによって構成されて、空間的に哺乳動物細胞の適当な部位に制限されることは公知である。
さらに、細胞のタンパク質の局在は、タンパク質相互作用の特異性および効率を厳格に管理して、空間的にタンパク質活性化および失活機構を分離して、特定の細胞機能および応答を決定するために制御される。
刺激作用に応答して、しばしば、時々、シグナル伝達経路およびそのネット相互作用の性質、細胞状態および細胞のコンテクスト（ｃｏｎｔｅｘｔ）に依存する細胞のタンパク質の有意な再配置がある。
タンパク質および分子集合体の再配置は、その振幅、持続期間および動態の正確なコントロールを可能にすることによる細胞シグナル伝達だけでなく、細胞機能（例えば移動、侵襲、成長、サイクリング、分化、生残および死亡）に対して基本的である。
【０１８５】
完全な例は、シグナル伝達Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）において例示される。
ＧＰＣＲは、膜結合タンパク質の表面のファミリである。
非刺激の細胞において、内存性ＧＰＣＲは、主に細胞表面で位置決めをする。
リガンドにさらされた後に、細胞は細胞内のシグナル伝達および調節性機構によって、きつく、そして、正確に管理されている一連の間隙で一時性の現象で応ずる。
これらの現象は、ＧＰＣＲのシグナル伝達サイクル（シグナル伝達サイクル）の間、細胞の内容物の秩序あって、誘導されて、方向で動的な再分布を導く。
細胞の内容物の動的な再分布をモニタすることは、ＧＰＣＲシグナル伝達への洞察およびＧＰＣＲスクリーニングのための強力な手段を提供した。
例（直接のスクリーニングストラテジとしてのこのプロセスの作動薬刺激作用始められた関心のある後のβ２−アドレナリン受容体密度ＧＦＰ共役の再配置の直接タイプ可視化）について説明すると、
これらの輸送アッセイのうちの１つは、Xsira Pharmaceuticals Inc（前はNorak Biosciences）からのTransfluor技術である。
この技術は、化合物に応答して蛍光標識されたアレスチンの細胞内の位置をモニタするために高分解能蛍光画像化を使用する。
蛍光標識されたアレスチンの再局在は、活性現象の指示として見られる。
【０１８６】
これらの現象の多くは細胞（それは光学バイオセンサによって明らかにされ得る）の底一部内で起こる。そして、動的質量再分布（ＤＭＲ）に関する光学シグナルに結果としてなる。
ＤＭＲシグナルは、生体細胞の新しい生理応答として作用する。
理論的解析は光学シグニチャ（そのことは入射角または波長のシフトによって指示した）が主に検知体積（ＤＭＲに関連した）内で、垂直の質量再分布に知覚しうることを示した。その一方で、共鳴ピークの形（例えば最大の半分のピーク幅、強度および領域）に関する光学出力パラメータは刺激作用−起因性外側塊再分布に影響される。
細胞層へのはかなさ波尾穿通性の指数関数的減衰のため、それがセンサ界面からもっと先である時と比べて、標的または複合体がセンサ界面により近いときに、特定の質量の標的または複合体はより総合応答率に貢献する。
さらに、センサ界面の方の特定の質量の標的または複合体の再配置はシグナルの増加に結果としてなるのに、標的または複合体移向の再配置は界面から離れてシグナルの減少につながる。
【０１８７】
特定の標的で媒介されたＤＭＲシグナルが、細胞状態（例えば接着の程度および細胞状態（例えば増殖していて静止性状態））に依存するとわかった。
センサの共鳴ピークの幅または位置が細胞密度および増殖に知覚しうるので、かなりアッセイ結果に衝撃を与えてもよい細胞（例えば細胞増殖、細胞密度および接着の程度）の生物学的な状態は検査され得る。そして、還元したアッセイ多様性に結果としてなる。
【０１８８】
系生態学適用法のための所定のアプローチの適合性に資格を与える３つの重要な見方は、多パラメタ解析の中で、多重化する、そして、量的システム応答プロフィールの機能である。
光学バイオセンサが標識のなくて非観血的であるので、バイオセンサに基づく細胞アッセイは多重化する。
たとえば、Ａ４３１のプロテアーゼ活性受容体（ＰＡＲ）と同様に内因性のブラジキニンＢ２受容体（Ｐ２Ｙ受容体）の作動薬−起因性活性化が、類似したＧｑ−タイプ光学シグニチャ（図６６）を導くことがわかった。
さらに、光学バイオセンサが統合した応答を提供した時から、特定の標的で媒介されたＤＭＲシグナル伝達はまた、その下流のシグナル伝達標的の輪郭を描くために用いることが可能である。
たとえば、Ａ４３１のＥＧＦ−起因性ＤＭＲは、その下流の標的を１つの標的とする化合物の輪郭を描くために使用される：ＭＥＫ１（図４４）。
これらの結果は、バイオセンサに基づく細胞アッセイが本来多重化していることを示唆した。
【０１８９】
光学バイオセンサは、リガンド起因性ＤＭＲ応答を分析するために多パラメタを提供する。
これらのパラメータは、シフトを垂直の質量再分布に知覚しうる反射光および大部分は外側塊再分布に知覚しうる共鳴ピークの形を定義しているパラメータの角度または波長に含む。
これらのパラメータの組み合わせは、更に検査される（ＥＧＦＲシグナル伝達のための図８４において、そして、ブラジキニンＢ２シグナル伝達のための図８５において、例は活性酸素種シグナル伝達のための図８０に示される）細胞上のリガンドの作用上の詳細な情報を提供してもよい。
あるいは、バイオセンサが非観血的だった時から、バイオセンサに基づく細胞アッセイは容易に他技術（例えば質量分析および蛍光画像化）と統合され得る。
これらの技術は、更に細胞上の化合物またはリガンドの作用を確かめる。
【０１９０】
特定の標的で媒介されたＤＭＲシグナルは、センサ界面から離れて異なる距離で起こっている質量再分布からの寄与の合計である統合して定量化シグナルである。
細胞シグナル伝達の複合した性質のため、異なる標的で媒介された異なる細胞シグナル伝達の活性化は類似した全体的なＤＭＲシグナルに結果としてなるかもしれない。
しかし、特定のシグナル伝達現象のための細胞の標的のユニークセットの関与のため、選択的モジュレータの予め定められたセットによって媒介された転形プロフィールは特定の刺激によって活性化されている細胞シグナル伝達の特異性を分類する手段を提供するかもしれない。
したがって、ＤＭＲ応答は、生体細胞の系生態学研究のためのユニークおよび完全な読み出しとして処理され得る（例は、ＥＧＦＲシグナル伝達のための図３８−４７に示される；
または、Ａ４３１細胞のＰＡＲシグナル伝達のための図７１−７９の）。
これらの研究は、異なる標的の転形がＥＧＦによってＤＭＲシグナル誘導の異なる減衰に結果としてなることを示した。
上皮増殖因子（ＥＧＦ）刺激作用に応答して、静止Ａ４３１細胞のＤＭＲ応答が、ＥＧＦの濃度に対する飽和性であるとわかって、種で有力なＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害物質（ＡＧ１４７８）によって、充分に抑制されることが可能だった。
静止Ａ４３１細胞のＤＭＲ応答上のさまざまな周知の阻害物質／薬剤の効果は細胞応答を主にＲａｓ／ｍｉｔｏｇｅｎ−活性タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ経路に結合した。そして、それは主にＭＥＫで進む。
（５．細胞アッセイ）
【０１９１】
光学フリーバイオセンサの方法および使用が開示されるが、いかなる細胞アッセイも実行して、例えば、細胞死のためのアッセイ、細胞増殖のためのアッセイ、受容体活性化または阻害のためのアッセイ、細胞膜統合性のためのアッセイ、脂質シグナル伝達のためのアッセイ、細胞シグナル伝達のためのアッセイ、活性種のシグナル伝達のためのアッセイ、細胞のレドックス状態を評価するためのアッセイ、異なる標的間の交差性伝達研究のためのアッセイ、終末点計測を使用している高スループット化合物スクリーニングのためのアッセイ、原子核シグナル伝達または活性を分析するアッセイ、または、細胞骨格再配列のためのアッセイも実行する。
これらのアッセイは、アッセイのためのシグニチャを産生するために用いることが可能である、または、アッセイから一つ以上のステップと同様に決定を作るために用いることが可能である一つ以上のバイオセンサ出力パラメータの使用を取り入れる。
【０１９２】
バイオセンサは、異なる形態（例えば画素または角のクソ）においてある出力を産生するまたは、たとえば、波長シフト。
条件の特定のセットのために集められる出力情報である出力データの形で、出力があることが可能である、そして、貯蔵されてリアルタイムの分析をした。
バイオセンサの使用中に生成するデータ出力は、概してグラフ形態例えば応答ユニット対時間（一例としてここに開示される多くの他の図と同様に図６Ａを参照）として表される。
応答ユニットは角度測定検出系が使われる角のシフト（程度に関して）であり、または、ＣＣＤカメラを利用している角度測定検出系がある波長シフト（波長測定検出系が使われるピコ−メートルに関して）または画素位置シフト（画素に関して）はバイオセンサの共鳴バンド像をまとめたものである。
また、応答ユニットは角度（図６Ｂ参照）を内結合する機能としての結合された光または波長の強度である。そのとき、所定モードの共鳴ピークスペクトルが使われる。
もう一つの実施例では、ＣＣＤカメラを利用している角度測定検出系がバイオセンサ（図６Ｃ参照）の共鳴バンド像をまとめるために用いるときに、応答ユニットは画素または位置的強度の位置である。
バイオセンサ出力パラメータまたはバイオセンサ出力データパラメータはそれぞれバイオセンサ出力または出力データのいかなる形質でもある。そして、測定されることができて、バイオセンサ出力またはバイオセンサ出力データを分析したものである。
或る実施例において、バイオセンサ出力パラメータは、また、同定されることができて、多数アッセイ全体に使われる形質である。
シグニチャは、特定のアッセイのための症候として使われるパラメータのいかなるバイオセンサ出力パラメータもまたは組み合わせである。
たとえば、シグニチャは刺激性事象の後のピークの強度大きさの使用でありえた、または、それは刺激性事象の後のピーク強度の位置でありえた、または、それは最大半減のピーク強度の位置でありえた。
たとえば、このシグニチャがそれから使われる、細胞の培養上の２つの異なる化合物または細胞（全てのデータ出力の比較よりむしろ）の２つの異なる培養上の単一化合物の効果の効果を比較する。
このように、シグニチャは単一の時間点または単一の波長または単一波動角度で起こってもよく、または、組み合わせはそうであることに従い分析される。
（応答ユニットのために上の討論参照）
（ａ）  バイオセンサ出力パラメータ）
【０１９３】
使われる多くの異なるバイオセンサ出力パラメータは、図６において例示される。
たとえば、細胞内で刺激作用−起因性指向性質量再分布の動態を定義している６つのパラメータは、全体的動態（すなわち形）でありえる応答の位相（この具体例において、細胞応答に関する３つの主な位相が、正の指向性質量再分布（Ｐ−ＤＭＲ）（図６Ａ点Ｃ−Ｄ）；ネット−ゼロ指向性質量再分布（ネット−ゼロＤＭＲ）（図６Ａ点Ｄ−Ｅ）；そして、負の指向性質量再分布（Ｎ−ＤＭＲ）（図６Ａ点Ｅ−Ｆ−Ｇ）；（動態）各々の位相、Ｐ−およびＮ−ＤＭＲ位相の総振幅およびＰ−からＮ−ＤＭＲ位相（図６Ａ）への遷移時間ｔの全体の持続期間時間；がある。
他のバイオセンサ出力パラメータは、共鳴ピーク（図６Ｂ）から得られる。
たとえば、ピーク位置、強度、ピーク形および最大半減（ＰＷＨＭ）でのピーク幅が、使われる（図６Ｂ）。
バイオセンサ出力パラメータは、また、バイオセンサの共鳴バンド像から得られる。
データは、配列された角度測定システムを使用して得られて、５つの５つの追加の特徴：バンド形、位置、強度、分配および幅を例示する。
ここに開示されるように、これらのパラメータの全部がバイオセンサを使用しているいかなる細胞アッセイものいかなる所定の適用法のためにも、それぞれにまたは一緒に使われる。
いかなるサブセットもまたは組み合わせのパラメータの使用は特定のアッセイ（例えば細胞受容体アッセイのためのシグニチャ）上の所定のアッセイまたは所定の変異のためのシグニチャを産生する、そうすると、ＥＧＦ受容体のための特定のシグニチャはアッセイの基礎を形成した。
（（１）  刺激作用−起因性指向性質量再分布の動態に関連したパラメータ）
【０１９４】
刺激作用−起因性ＤＭＲの動態に関する多くのバイオセンサ出力パラメータがある。
これらのパラメータは、細胞に対する刺激性事象が起こるようにバイオセンサデータ出力に起こるのでその変化率に注目する。
刺激性事象は例えば、培地に対する分子の添加、培地からの分子の除去、ペーハー（ｐＨ）の変化または温度変化または細胞に対する照射の導入など、細胞の状態を変えるいかなる現象でもある。
刺激性事象は、刺激性事象によって生じる細胞に対するいかなる影響（例えば指向性質量再分布）でもある刺激性効果を産生する。
刺激性事象は、化合物、化学物質、生化学、生物学的製剤、ポリマーなどである。
生化学であるものまたは生物学的製剤は、そうしてもよいペプチド、合成ペプチドまたは自然ペプチドである。
たとえば、多くの異なるペプチドはシグナル伝達分子として作用して、炎症誘発性ペプチドブラジキニン、プロテアーゼ酵素トロンビン、および、血圧管理ペプチドアンギオテンシンを含む。
これらの三つのタンパク質がそれらの配列および生理学において区別され、異なる細胞表面受容体で作用すると共に、それらはＧ−タンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）と呼ばれている細胞表面受容体の一般のクラスにおいて分担する。
他のＧＰＣＲのポリペチドリガンドは、バソプレシン、オキシトシン、ソマトスタチン、ニューロペプチドＹ、ＧｎＲＨ、ロイチナイジングホルモン、ＦＳＨ、パラトルモン、オレキシン、ウロテンシンＩＩ、エンドルフィン、エンケファリンおよび多数他を含む。
ＧＰＣＲは広くて多様な遺伝子ファミリであり、ペプチドリガンドに応答するだけでなく、また、小分子神経伝達物質（アセチルコリン、ドーパミン、セロトニンおよびアドレナリン）や、光、臭気物質、味覚、脂質、ヌクレオチドおよびイオンにも応答する。
ＧＰＣＲによって使用される主なシグナル伝達機構は、細胞内のカルシウム遊離およびｃＡＭＰ産生を含んでいる下流二次メッセンジャ系に結合するＧタンパク質ＧＴＰアーゼタンパク質と相互に作用することである。
ペプチドＧＰＣＲによって使用される細胞内のシグナル伝達系は、全部ＧＰＣＲによって使用するそれらに対する同様であって、それらが相互に作用するＧタンパク質および活性化される二次メッセンジャ系によって概して分類される。
Ｇｓ−被結合ＧＰＣＲのために、受容体によるＧタンパク質Ｇｓの活性化はｃＡＭＰのアデニル酸シクラーゼおよび産生の下流活性化を刺激し、その一方で、Ｇｉ−共役型受容体はｃＡＭＰ産生を抑制する。
ｃＡＭＰ産生のキー結果のうちの１つは、タンパク質キナーゼＡの活性化である。Ｇｑ−共役型受容体はホスホリパーゼＣ、放出ＩＰ３、そして、ジアシルグリセロールを刺激する。
ＩＰ３はＥＲ内の受容体に結合し、細胞内カルシウムの放出、次のタンパク質キナーゼＣの活性化、カルモジュリン依存性経路を生ぜしめる。
ＧＰＣＲのための二次メッセンジャシグナル伝達系に加えて、ＧＰＣＲ経路は、チロシンキナーゼ生長因子受容体を含んでいる他のシグナル伝達経路でクロストークを呈し、そしてキナーゼ経路をマップ（ｍａｐ）する。
ＥＧＦ受容体または局所の接着複合体のような受容体チロシンキナーゼのトランスアクチベーションは、アダプタタンパク質Ｓｈｃ、Ｇｒｂ２およびＳｏｓでｒａｓ活性化を刺激し、そして、Ｅｒｋ１およびＥｒｋ２を活性化しているキナーゼを下流マップ（downstream Map）する。
また、Ｓｒｃキナーゼは、ラス癌遺伝子（ｒａｓ）の活性化で決定的な介在の役割を演じ、ＧＰＣＲによってキナーゼ経路をマップする。
【０１９５】
若干の刺激性事象が起こることはあり得る、しかし、データ出力の不変がある。
細胞の条件が指向性質量再分布が生じることがありえた若干の方法または細胞または細胞培養の変化において変わったので、この状況はまだ刺激性事象である。
【０１９６】
ここに開示されるように、特定のシグニチャがいかなるアッセイもまたはいかなる細胞条件のためにも決定され得ると理解される。
多くの異なるアッセイのためにここに開示される多数の「シグニチャ」がある、しかし、ここに実行されるいかなるアッセイのためにも、そのアッセイの「シグニチャ」は決定され得る。
また、いかなる所定のアッセイのためもの複数の「シグニチャ」があることが可能であることはあり得る、そして、ここに記載されているように、各々は決定され得る。
バイオセンサ出力データを集めて、一つ以上に注目した後に、所定のアッセイのためのパラメータまたはシグニチャは、得られる。
最適のシグニチャを同定することは多数実験を実行するのに必要でもよい、そして、最適のシグニチャを見つけることは異なる条件の下で実験を実行するのに必要でもよい、しかし、これはされ得る。
ここに開示される方法のいずれでも「同定する」ステップまたは「決定する」ステップまたは、たとえば、「提供する」ステップを含み、たとえば、シグニチャがそれらの上へ加わったものと理解される。
（（ａ）  全体的動態）
【０１９７】
注目され得るパラメータのうちの１つは、データ出力の全体的な動態である。
この全体的な動的パラメータは、データ収集の完全な運動の写真を観察する。
観察され得る全体的な動態の１つの見方は、時間上のデータ出力によって産生される曲線の形状の変化である。
このように、データ出力によって産生される曲線形状は刺激性事象の発生において、変化するかまたは確実に留まる。
その変化の方向は、全体的な質量分布を示し、たとえば、正のＤＭＲ（Ｐ−ＤＭＲ）位相は、センサのエバネッセントテイル内での正味の質量増加を示し、ネット−ゼロＤＭＲはセンサのエバネッセントテイル内で質量の正味変化がほとんどないことを示唆し、負のＤＭＲはセンサのエバネッセントテイル内で正味の減少質量を示す。
光学バイオセンサを使用して得られた刺激作用−起因性細胞応答の全体的な動態は、単一の位相（Ｐ−ＤＭＲ、Ｎ−ＤＭＲ、もしくは、ネット−ゼロＤＭＲ）、または、二位相（例えば、二相はこれらの三位相のいかなる組み合わせでもありえる）、または、三位相、または、多数位相（例えば一以上のＰ−ＤＭＲが時間経過中に起こり得る）からなる。
（（ｂ）  応答の位相）
【０１９８】
他のパラメータは時間の関数として観察できるパラメータで、データ出力で起こる相転移である。
標識フリーバイオセンサは、曲線としてグラフで示され得るデータが出力を産生する。
たとえば、この曲線は転移点を有し、ここで、データは増加状態から減少状態またはその逆まで状態にする。
これらの変化は相転移と呼ばれ、そして、たとえば、それらが起こる時間およびそれらの形状がバイオセンサ出力パラメータとして使われる。
たとえば、正の指向性質量再分布（Ｐ−ＤＭＲ）、ネット−ゼロ指向性質量再分布（ネット−ゼロＤＭＲ）または負の指向性質量再分布（Ｎ−ＤＭＲ）がある。
Ｐ−ＤＭＲ、Ｎ−ＤＭＲおよびＮＺ−ＤＭＲの振幅は、分離したバイオセンサ出力パラメータ（たとえば図６Ａおよび図７参照）として測定され得る。
（（ｃ）  動態）
【０１９９】
他のバイオセンサ出力パラメータは、データ出力の見方のいずれの動態でありえる。
たとえば、相転移の完成でのレートである。
たとえば、相転移完了はどのくらいの速さか、または、データ出力完了にどのくらい長くかかるか、である。
測定され得る動態の他の例は、データ出力の全体的な位相がいずれをするか時間の長さである。
他の例は、Ｐ−およびＮ−ＤＭＲ位相の一方または両方の時間の全体の持続期間である。
他の例は、それがいずれをＰ−およびＮ−ＤＭＲ位相の一方または両方の総振幅を得るとみなすか速度または時間である。
他の例は、Ｐ−からＮ−ＤＭＲ位相への遷移時間ｔでありえる（図６Ａ（図が動態力学的パラメータのこれらのタイプの全ての多数例に他と同様に提供する）。
Ｐ−ＤＭＲてＮ−ＤＭＲ現象または位相の動態は、また、測定され得る。
たとえば、図６Ａおよび図７Ａに示すように、上皮増殖因子（ＥＧＦ）を有する人間の静止性人間類表皮癌Ａ４３１の刺激作用は、少なくとも３つの位相からなるダイナミック応答に結果としてなる。
６Ａ図および７において立証されるように、ＥＧＦ濃度はより高い、より大きいＰ−ＤＭＲてＮ−ＤＭＲシグナルの振幅にある、断食しているものはＰ−ＤＭＲてＮ−ＤＭＲ現象である、そして、より短い、遷移時間はＰ−ＤＭＲからＮ−ＤＭＲ現象まである。
Ｐ−ＤＭＲ現象の振幅がＥＧＦ濃度を有する合併した類縁を示すときに、Ｎ−ＤＭＲシグナルの振幅は明らかにＥＧＦ濃度に対する飽和性であった。そして、約１．４５ｎＭ（図７Ｂ参照）のＥＣ５０に結果としてなった。
遷移時間ｔが、数秒でＥＧＦ（図７Ｃ参照）の濃度増大Ｃによって、指数的に減少するとわかった。
加えて、Ｎ−ＤＭＲシグナルの減衰は、非線形回帰を付けている。
得られた一つの位相減衰定数ｋはまた、飽和性であった。そして、５．７６ｎＭ（図７Ｄ参照）のＫｄに結果としてなった。
（（２）  共鳴ピークに関連したパラメータ）
【０２００】
所定の導波モードの共鳴ピークは、たとえば、バイオセンサに被結合光の波長対バイオセンサへの光または光の強度の結合の光対角度の強度に注目することによって起こる一特定のデータ出力である。
光導波路光モードスペクトルは、バイオセンサを照らす光の角度の広い範囲を使用して、角度の関数として、結合された強度の強度をモニタする方法のバイオセンサに、光の結合の光対角度の強度に注目することによって起こる一特定のデータ出力である。
このスペクトルにおいて、多数導波モードの多数の共鳴ピークは、共同起こる。
共鳴ピークおよびＯＷＬＳスペクトルの後の原理が同じものであるので、取り換えられて所定の導波モードの共鳴ピークまたは多数導波モードのＯＷＬＳスペクトルを使用する。
バイオセンサにおいて、特定の波長光が起こるか、または、光がバイオセンサに特定の角度で当たるように光が生じる時のどちらかの場合、光源から発される光はバイオセンサに結合され、そして、この結合はバイオセンサからのシグナルを増加する。
結合光角度または波長の関数としての強度のこの変化は、共鳴ピークと呼ばれている。
（たとえば、図６Ｂ参照）。
センサの異なる所定モードは、異なる特性を有する類似した共鳴ピークを引き起こす。
関して使われる所定モードで異なる共鳴ピークまたは共鳴性スペクトルを定義している多くのパラメータが、ＤＭＲまたは細胞効果を査定するためにこのピークにある。
これらのサブセットは、議論される。
（（ａ）  ピーク位置）
【０２０１】
データ出力をグラフで示してあるが、たとえば、共振ピークはバイオセンサへの光結合のための特定の特定の光波長または入射角で起こる。
これが起こる角度または波長（位置）は、刺激性事象に応答して質量再分布または細胞現象により変わる。
たとえば、ＥＧＦ受容体のような特定の受容体のための潜在的な成育因子がある場合には、培養細胞のための共鳴ピークの位置は結合波長または結合角度を増加または減少させ、結果として共鳴ピークの中央の位置の変化させる。
理解されることは、ピーク強度の位置が測定され得、測るに良好な点であると、たとえば、７５％のピーク強度または５０％のピーク強度または２５％のピーク強度または６６％のピーク強度または４５％のピーク強度での位置のような、共鳴ピークに沿ったいかなる点の位置でも測定され得る（たとえば、ピーク強度の１−１００％からの全てのレベルが考慮されることが開示される）。
しかし、ピーク強度以外の点を使用するときに、位置は常にピーク強度（たとえば、４５％のピーク強度であるピーク強度）位置の前および後にある。
このように、ピーク強度以外のいかなる強度のためにも、その強度が起こるピーク内で、２つの位置が、常にある。
これらのピークでない強度の位置はバイオセンサ出力パラメータとして利用され得る、しかし、単に強度の位置がプレピーク強度かポスト−ピーク強度であるかどうかについて知っていることを必要とする。
（（ｂ）  強度）
【０２０２】
ちょうど共鳴ピークのかかる特定の強度の位置としてバイオセンサ出力パラメータが使用され、強度自体の総計がバイオセンサ出力パラメータとなりえる。
１つの特に関連した強度は、所定モードの共鳴ピークの最大強度である。
最大強度のこの大きさは、位置のように、細胞または細胞培養に対するかかる影響を有する刺激性事象の存在に基づく変わり、この変化が測定され、シグニチャを使用できる。
ちょうど共鳴ピーク位置と同様に、共鳴ピーク強度は、また、ピーク内でいかなる強度もまたは位置で測定され得る。
例えば、バイオセンサ出力パラメータ、５０％の最大強度または３０％の最大強度である強度または最大１％および１００％の強度間の最高強度またはいかなるパーセントもの７０％として使用してもよい。
同様に、強度の位置と同様に、最大４５％の強度のような、最大強度以外の強度が使われる場合、この強度を有する共鳴ピーク内で、２つの位置が常にある。
強度を有する非最大強度を用いて位置パラメータがされ得るちょうどその時、ちょうど強度が予め最大強度かポスト−最高強度であるかどうかを説明しなければならない。
【０２０３】
たとえば、両阻害物質および活性化物質の存在は、原細胞密集度が約５０％（約５０％密集度で、センサ界面上の細胞は、最大ＰＷＨＭ値を導く傾向がある）である培養の後の最大半減（ＰＷＨＭ）でのピーク幅の減少の結果をもたらす；
しかし、他のバイオセンサ出力パラメータは、全体の角のシフト（すなわち共鳴ピークの中央の位置）のような、まったく効果のない分子から阻害物質および活性化物質を区別するために用いることができる。
ＰＷＨＭは、図６Ｂにおいて例示されるように、ピークの最大強度（体高）の半分であるピーク上の点の間で引かれるラインの長さである。
たとえば、細胞増殖の阻害物質はまったく処理なしで細胞のためのシフトより小さい角のシフトを引き起こす傾向があるのに、活性化物質は、まったくいかなる処理も、全てのセンサ上の細胞密度が本質的に同一である時またはほぼ同じものない細胞を有するセンサと比較すると、より大きい角のシフトを引き起こす傾向がある。
細胞増殖を抑制する（阻害物質として）かまたは刺激する（活性化物質として）化合物の潜在能力または機能は、全化合物の濃度が同じであるとすると、ＰＷＨＭ値上のそれらの効果によって決定され得る。
ＰＷＨＭ変化の予め定められた値は、共鳴ピークの中央の位置の変化と協力して、阻害物質または活性化物質をろ過するために用いることが可能である。
使用する測定システムに従い、所定モード、ユニットまたはＰＷＨＭの値の共鳴ピークを検出することは、変化してもよい。
たとえば、角度測定システムのために、ユニットは程度でありえる。
程度のＰＷＨＭの変化は、第１０００に（たとえば）第１０００に第１０００に第１０００に第１０００に第１０００に１、２、３、５、７または１０でありえた。
（（ｃ）  ピーク形）
【０２０４】
使われる他のバイオセンサ出力パラメータは、両者間に全体的なピーク形またはピークのまたは特定の強度での形である。
最大半減のピーク強度でのピークの形または他のいかなる強度にもたとえば（（例えば３０％、４０％、７０％または８８％）、または、あらゆる２０および１００％間のパーセント）バイオセンサ出力パラメータとして使用する。
形は、下記のピークの領域によってまたは特定の強度より上に特徴づけられる。
たとえば、半分で、最大のそこのピーク強度は、点（すなわちプレピーク強度および点（すなわちポスト−ピーク強度））である。
ラインはこれらの２つの点の間で引かれる、そして、共鳴ピーク内のこのラインまたは共鳴ピーク内で線より下の領域より上の領域は決定されることができて、バイオセンサ出力パラメータになる。
所定のピークの統合した領域がまた、細胞に作用している化合物の効果を分析するために用いることが可能であると理解される。
【０２０５】
形関連した他のバイオセンサ出力パラメータは、特定のピーク強度のための共鳴ピークの幅でありえる。
たとえば、半分での共鳴ピークの幅で、最大のピーク強度（ＨＭＰＷ）は、５０％のピーク強度である共鳴ピーク上の予めピークの強度点および５０％のピーク強度であるポスト−ピークであるライン上の点間のラインの大きさを測定することによって決定され得る。
この計測が、それからバイオセンサ出力パラメータとして使われる。
共鳴ピークの幅が２０および１００％のピーク強度間のいかなる強度のためにも、このような方法で決定され得ると理解される。
（これの例は、図（例えば図６Ｂ）から透けて見える）。
（（３）  バイオセンサの共鳴バンド像に関連したパラメータ）
【０２０６】
現在まで、大部分の光学バイオセンサは、一つずつセンサ界面に固定されるプローブ分子またはセンサ界面上の細胞付着性または細胞増殖に標的分子の結合をモニタする。
多数バイオセンサ上の結合現象または細胞付着性または細胞増殖のために、研究者は一般に時間−逐次的な方法のこれらの現象をモニタする。
したがって、異なるセンサの中の直接タイプ比較は、対抗でありえる。
さらに、これらの検出系測定がセンサを照らすために小さい点（約１００−５００ｍｍ直径）のレーザ光線を利用することは、波長であるか角であるどうか。
応答または共鳴ピークは、明らかにする領域から細胞応答の平均値を表す。
９６ウェルバイオセンサマイクロプレート（例えばコーニングＥｐｉｃマイクロプレート）のために、各々のＲＷＧセンサがほぼ３×３ｍｍ２であって、各ウェルの底にあり、センサは一般に３８４ウェルマイクロプレートフォーマットのための１×１ｍｍ２の大きさを有する。
したがって、現在のセンサ技術を使用して得られた応答は、センサ界面の少ない分を表すだけである。
理想的には、検出系によって、同時に多数バイオセンサ上の生体細胞被着の応答をモニタできなければならないだけでなくて、各々のセンサの比較的大きい領域または多数領域から、シグナル測定を許しもしならない。
【０２０７】
画像化光学測定システム（例えばＣＣＤカメラ）による共鳴性バンドは、たとえば、物理的な位置対単一センサ全体の画定された位置で、反射された（すなわち、外結合（out-coupled）された）光の強度に注目することによって起こる一特定のデータ出力である。
反射光は、直接結合された光に関する。
あるいは、共鳴バンドは、センサを照らすために小さいレーザ点を使用する方法および一次元または二次元の全部のセンサ全体のスキャンの精査測定システムで集められることができて、所定の導波モードの共鳴ピークを集める。
センサ内の位置の関数としての共鳴ピークまたは光強度は、センサの共鳴バンドを形成するために最後に再構成され得る。
バイオセンサにおいて、特定の波長光が起こるか、または、光がバイオセンサに特定の角度で当たるように光が生じる時のどちらかの場合、外結合された光はセンサ界面の又は近くの屈折率変化の関数として変化して、そして、この変化は画像化システムによって集められた各々のセンサの共鳴バンドの特性のシフトを導く。
さらに、後に培養される全てのセンサ全体の細胞の平坦でない付着は、共鳴バンド（たとえば、図１の回られた共鳴性バンド参照）を使用して、直接視覚化され得る。
理想的な多重井戸タイプバイオセンサマイクロプレートにおいて、各々のセンサの位置は、他バイオセンサに正規化する親族である。
すなわち、センサは並び全体の各ウェルまたはマイクロプレートのカラムの中心で整列配置される。
したがって、得られた共鳴バンド像が、刺激作用に応答して細胞付着性または細胞変化にに関して、内部基準として使われる。
したがって、所定モードの各センサのかかる共鳴バンドは、ＤＭＲまたは細胞効果を査定するためにこのバンドに関して使われる付加パラメータを提供する。
これらのサブセットは、議論される。
（（ａ）  バンド形状）
【０２０８】
使われる他のバイオセンサ出力パラメータは、所定モードの各々のバイオセンサの共鳴バンドの形状である。
形は、各々のセンサの大きい領域全体の強度分布によって定義される。
図１および他に示すように、形は、大きい領域（たとえば、図１に示すように、各々の共鳴バンドは、約２００ｍｍ×３０００ｍｍの大きさを有する全てのセンサ全体の応答を表す）全体の刺激作用に応答して、付けられる細胞の均一性または細胞変化の指標として使われる。
（（ｂ）  位置）
【０２０９】
所定モードの各々のセンサの共鳴ピークの位置と同様に、各々の共鳴バンドの位置が、バイオセンサ出力パラメータとして使われる。
強度は、各々のバンドの最高強度を有する中心位置を生成するために画像化ソフトウェアを使用して量を定められる。
かかる位置は、刺激作用または化合物処理に応答して細胞変化を検査するために用いることが可能である。
（（ｃ）  強度）
【０２１０】
ちょうど共鳴バンドの位置として、画像化システムを使用して集められる外結合された光の強度が、バイオセンサ出力パラメータとして使われる。
全てのバンドの平均値強度または画像化バンドの各々の画素（ピクセル）の絶対強度は、細胞付着性の品質を検査して、細胞応答を評価するために用いることが可能である。
（（ｄ）  分配）
【０２１１】
画定された角度を有する外結合された光または画像化システムを使用して集められる波長の分配が、バイオセンサ出力パラメータとして使われる。
このパラメータは、細胞がないか、または、固定された調査分子がないとき、センサ自体の界面特性を評価するために使用され  そして、センサ界面の照射された領域全体の細胞付着の品質を検査する。
また、全ての領域全体の細胞密度が同一のときに、このパラメータがまた、細胞に対する化合物影響の均一性を検査するために使われる；
または、なぜならば、細胞密度が照射された領域全体の他からの異なる１つの領域である化合物−起因性細胞応答上の細胞密度の効果を検査すること。
（（ｅ）  幅）
【０２１２】
所定モードの共鳴ピークのＰＷＨＭのように、画像化システムを使用して得られた共鳴バンドの幅が、バイオセンサ出力パラメータとして使われる。
このパラメータは共鳴ピークのＰＷＨＭ値のそれらに対するほとんど同一の特徴（このように役立つ情報内容）を共有する。但し、次の場合は除く−あれはセンサ（共鳴ピークに利用できる１つのＰＷＨＭだけの代わりに）の照射された領域の多数領域で、多数帯域幅を得る。
他パラメータに対する同様が共鳴バンド像によって得られて、幅が上述した適用法のために使われる。
【０２１３】
ここに開示されるように、これらのパラメータの全部がバイオセンサを使用しているいかなる細胞アッセイものいかなる所定の適用法のためにも、それぞれにまたは一緒に使われる。
いかなるサブセットもまたは組み合わせのパラメータの使用は特定のアッセイ（例えば細胞受容体アッセイのためのシグニチャ）上の所定のアッセイまたは所定の変異のためのシグニチャを産生する、そうすると、ＥＧＦ受容体のための特定のシグニチャはアッセイの基礎を形成した。
（ｂ）  細胞および細胞コンテクスト操作）
【０２１４】
細胞は、生物系の基本的構造単位である。
そこで、細胞を理解することは、細胞小器官現象（例えば細胞生物学、生化学）および分子生物学および多細胞現象（例えば生理学）を理解するための必須である。
細胞を分析することによって、生物学者は異なる標的分子の中の複合した機能上の類縁の多数を学んでいる。
標的分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、タンパク質および、その中に、炭水化物を含む、そして、かかる分子の会合体中のいかなる生体分子でもありえる。
さらに、生物学者は基本的な細胞生物学原理を理解して、人間疾患を処理して、人の健康を改良するための薬剤候補物質をスクリーニングするために細胞を使用する価値を学んだ。
【０２１５】
細胞は、分析されまたは光学バイオセンサを用いて解析のために使われる。
分析される細胞は、本質的に細胞のいかなるタイプでもあってもよい。
細胞のいかなるタイプも、開示された方法のいずれにでもおいて分析され得る。
分析される細胞は、生物または試験管で細胞培養されたものいずれから直接得られる。
標的を有する細胞は、いかなる生殖細胞系列、体細胞、分化全能性もしくは多能性幹細胞  、分裂もしくは非分裂細胞、実組織もしくは上皮細胞、又は不死化もしくは形質転換細胞からのいかなる細胞でもあってもよい。
現在まで、不死化安定細胞株の広いアレーが利用できる。
これらの安定細胞株は、多くの異なる生物、組織および発育時期に誘導する。
この巨大なアレーの試料採集は、American Type Cell Culture Collectionおよび他の細胞庫から入手可能である。
細胞は、一般に膜二重層によって少なくとも部分的に制限するか、２つ以上の実体への複製および分裂またはかかる実体の子孫、いかなる生物学的な実体も含む。
【０２１６】
細胞の例は、真核細胞（すなわち動物からの細胞を含む細胞核を有する細胞、植物、菌類、イーストおよび原生動物など）；
無核または突然変異した誘導体またはそれの子孫（例えばネット状赤血球および成熟した赤血球、その他）；
それらの細胞核を取り除かれた誘導体；
そして、それらのいずれ間の融合体；
加えて、細胞は配偶子（例えば卵子、精液、など）を含む。
細胞も、原核生物（例えばバクテリアおよびアキアクトテリア（ａｒｃｈａｃｔａｃｔｅｒｉａ）を含む。
【０２１７】
適切な細胞はいかなる適切な生物からも誘導され得る。そして、研究（基本、臨床面および、その中に、バイオテクノロジ研究のような）、ドラッグデザイン、薬剤発見および／または他の経済であるか、政治的であるか人道主義の理由のために研究されるいかなる生物も含む。
典型的な生物は、その中に哺乳類（例えば類人猿、ネコ、ウシ、イヌ、ウマ、人間、サル、ハツカネズミ、ブタおよびヒツジ）を含む。
典型的な生物も、その中に非哺乳動物脊椎動物（例えば鳥類、爬虫類動物、両生類（例えばツメガエルのようなカエル）および魚（例えばアウト（ｋｏｕｔ）、サケ、金魚およびゼブラフィッシュ））を含む。
典型的な生物も、非哺乳類無脊椎動物（例えばショウジョウバエ（例えばＤ．キイロショウジョウバエおよびＤ．オナジショウジョウバエ）の生物種、線虫（例えばＣ．エレガンス）、ウニ（例えばムラサキウニ）および粘菌（例えば細胞性粘菌））を含む。
典型的な生物も、単細胞の真核生物（例えばイースト（例えばサッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、ピキアパストリスおよびカンジダアルビカンス）および原生動物（例えば病原で非病原の原生動物））を含む。
典型的な生物も、無維管束植物と同様に植物（例えばシロイヌナズナ、イネ、トウモロコシ、ジャガイモ、豆、テーダマツ）を含む。
【０２１８】
適切な細胞は、野生タイプ、ミュータント、トランスジェニック、空想的な受精卵、桑実胚、胞胚、胎児、胚、新生児、若年性、成体またはいかなる生物もの他発育時期から直接に得られた一次細胞であってもよい。
一次細胞は、異なる細胞タイプ、組織、器官または生物の領域から生じるか、またはそれらの混合液であってもよい。
例は、血液幹細胞、Ｂ−およびＴ−リンパ球、赤血球、好中球、好酸球性、マスト細胞、顆粒球、巨核球、マクロファージ、脂肪細胞、こう細胞、星状細胞、神経芽細胞、ニューロン、骨格筋芽細胞または筋管、平滑筋筋芽細胞、強心剤筋芽細胞、繊維芽細胞、骨芽細胞、骨細胞、内分泌細胞、外分泌細胞、血管内皮細胞、ケラチン合成細胞、軟骨細胞、内胚葉から誘導される細胞、中胚葉、外胚葉、および／または、栄養芽層のような胚体外の誘導体を含む。
【０２１９】
適切な細胞は、いかなる供与源からも組織または組織から得られる。
組織は、一般にいかなるグループもの細胞を生物の一時であるか安定間隙の接近またはそれの培養された外植体に含む。
この間隙の接近は、自然におよび／または人工的に起こることができ、天然であるか通常の状態および／または誘導されたか病気にかかった状態、またはその中を表す。
人工の接近は、移植され、植設され、および／または融合された組織（器官または組織移植体、異種移植片、異タイプ移植、などを含む）を含み、さらに、その中に個別の有機体（例えば植皮片）内で移動された組織を含む。
病気にかかった組織は、（１）遺伝子欠損；
（２）汚染物質トキシンまたは照射のような環境性被害；
（３）非抑制成長；
（４）異常分化；
（５）異常細胞移動；
（６）例えばウィルス、バクテリア、原生動物、イースト、真菌および／または寄生生物の感染；
または（７）それのあらゆる組み合わせによる異常組織を含む。
【０２２０】
本発明ために、適切な典型的な病気にかかった組織は、たとえば、流体吸引液からか外科的に針生検から得られる腫瘍材料である。
組織は、いかなる野生タイプ、ミュータント、トランスジェニック、非現実的受精卵、桑実胚、胞胚、胎児、胚、新生児、若年性、青年または成人からのいかなる組織でもあってもよい。
適切な生後の組織の例は、
（１）、心筋、平滑筋、骨格筋を含むの筋肉；
（２）中央または末梢神経系（例えば脊髄または脳）からの神経組織；
（３）他の心臓組織；
（４）腎臓；
（５）肝臓；
（６）脾臓；
（７）食道、胃、小腸および大腸を含む消化系；
（８）膵臓；
（９）胆嚢；
（１０）心臓、静脈および動脈を含む循環系組織および造血系細胞；
（１１）免疫組織（例えば胸腺およびリンパ節）；
（１２）副腎；
（１３）硬骨；
（１４）軟骨；
（１５）乳房の上皮その他のような上皮組織；を含む。
組織も、上記のいずれでもの自然および人工のものを含む。
【０２２１】
組織は、光学バイオセンサを有する使用の前の個別細胞に、少なくとも部分的にまたは完全に分解され得るかまたはセンサ全体にまたは切片において適用され得る。
【０２２２】
本発明の若干の適用法は、出産前であるか生後の人間または他動物に由来する細胞を使用している臨床診断に適している。
胎児期細胞の例は、羊水、割球、絨毛膜絨毛、胎児血および他の胎児の組織から得られるそれらを含む。
出生後細胞の例は、骨髄穿刺液、リンパ、全血、血清、血漿、胸水、皮ふ生検、腫瘍生検または外科手術から得られるそれらを含む。
上記の通りに、出生後細胞の追加の例は、他の身体の流体および／または分泌（例えば尿、大便、唾液、粘質、粘液、涙、発汗、精液、脊髄液、乳汁、痰、など）からまたは組織から得られたそれらを含む。
【０２２３】
一次細胞および組織、またはそれらの適切に培養された誘導体からよりも、細胞は確立した株化細胞から得られる。
これらの確立した細胞株はいかなる適切な方法、ウイルス性、腫瘍性、物理的、化学的、突然変異誘発性、自然発生的および／またはカンズジェニック（ｋａｎｓｇｅｎｉｃ）形質転換を含む方法によって産生できる。
加えて、細胞はいかなる適切な方法（例えば遺伝の一時変異（例えば、物理的なおよび／または化学処理、照射、処理、感染または射出によって）および／または後成的発現一時変異（例えば、メチル化か他の分子の一時変異、カンズポソン（ｋａｎｓｐｏｓｏｎ）機能、クロモソーム刷込み、酵母接合タイプスイッチングおよび／またはテロメアサイレンシングによって））にもよって修飾された株化細胞の特徴づけられるか特徴のない誘導体を含む。
【０２２４】
細胞は、幹細胞または分化細胞であってもよい。
差別化される細胞タイプは、脂肪細胞、繊維芽細胞、ミオサイト、心筋細胞、内皮、ニューロン、グリア、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球性、好塩基、マスト細胞、白血球、顆粒球、ケラチン合成細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞および内分泌または外分泌腺の細胞を含む。
幹細胞はドナーから最近得られる幹細胞であってもよい、そして、特定の好適な実施例において、幹細胞は自己由来の幹細胞である。
ガラス管内で伝播される確立した幹細胞株から、幹細胞がまた、あってもよい。
ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔに、多能であるにせよ、適切な幹細胞は、胎生期幹細胞および成体幹細胞を含み、分化全能性もしくは多能性、多分化能、または、より小さい発生的の細胞を含む。
幹細胞は、好ましくは哺乳類（例えば齧歯動物（例えばハツカネズミまたはラット）、霊長目動物（例えばサル、チンパンジまたは人間）、ブタ、および反すう動物（例えばウシ、ヒツジおよびヤギ））に由来する。
【０２２５】
通常、各々の細胞株は、その由来、遺伝子タイプ、不死化方法、培養条件および環境性生立に基づく異なる特性を有する。
このように、単一細胞株が、全ての実験または化合物スクリーニングに適しているというわけではない。
たとえば、特定の標的の発現量は、明確に１種類の他のタイプに対する細胞からの異なるであり、場合によっては、特定の標的（例えばＥＧＦＲ）によるシグナル伝達経路は、細胞の異なるタイプの中でかなり異なってもよい。
したがって、かかる標的による効果を生成するモジュレータが、開示される質量再分布を含んでいる劇的に異なる細胞応答を導くことができる。
それらの理由のため、細胞の特定のタイプは、特定の標的が制御可能に発現されまたは減少または眠らせるように、再操作されることを必要とする、または、若干の例において、特定のシグナル伝達経路が操作される。
かかる再操作された細胞に結果としてなり得る多くの最高水準の技術がある。
たとえば、トランスフェクション試薬または他の物理的なアプローチの助けを借りて、標的遺伝子または標的分子を有する細胞のトランスフェクションは、特定の標的の増加している発現量に結果としてなり得る。一方、反対の標的抗体またはアンチセンス、反対の標的遺伝子オリゴヌクレオチドおよびそれらの派生物、ペプチド阻害物質、または、干渉リボゾームリボ核酸（ＲＮＡｉ）を有する細胞のトランスフェクションは、標的分子の抑制に至ることができる。
加えて、細胞シグナル伝達の決定または細胞のコンテクストに依存している細胞応答のための新規な技術の必要がある。
細胞のコンテクスト上の細胞シグナル伝達の依存は、受容体チロシンキナーゼシグナル伝達によって完全に例示される。
ＲＴＫ刺激作用に応答して細胞表面で発生するシグナルの生物学的な結果は、強く細胞のコンテクストに依存している。
異なる細胞、または、特定の細胞株の分化の異なるステージにおいて発現されたときに、同じＲＴＫは全く異なる応答を誘発する（参照、J. Schlessinger, "Cell signaling by receptor tyrosine kinases." Cell 2000,103, 211-225）。
たとえば、発生の初めに、ＦＧＦＲ１は、細胞移動のコントロールにおいて中肺葉性パータニングおよび原腸形成のための重大プロセスの重要な役割を演じている。
しかしながら、繊維芽細胞におけるＦＧＦＲ１の刺激作用は細胞増殖を導く一方、ノイロン細胞において発現されたＦＧＦＲ１の刺激作用が細胞生存および分化を誘発する。
これらの目視観測のための最もらしい説明は、異なる細胞が異なる応答を媒介する細胞タイプ−特定のエフェクタタンパク質および転写因子を発現するということである。
この見解によれば、ＲＴＫｓおよびそれらのシグナル伝達経路は多数プロセスに栄養補給ができ、そして異なるエフェクタタンパク質および異なる細胞の生育環境の転写因子の活性を管理できる。
したがって、類似した入力は、異なる細胞のコンテクストの異なる出力を生成する。
換言すれば、ＲＴＫｓによって活性化されたシグナル伝達カセットは、情報を細胞表面から細胞核およびそれらの活性化の生物学的な結果の他細胞の区画まで中継するために、展開したのである。
【０２２６】
「インキュベートしている」語は、細胞をいかなる条件下にも置くことを含む。
細胞を「培養する」ことは一つ以上の細胞が生きて成長すること意味する。
特定の状況では、一つ以上の条件下で細胞をインキュベートすることは、実際に一つ以上の細胞を殺す場合もある。
（ｃ）  一般の方法ステップ）
【０２２７】
ここに開示される細胞アッセイを実行するための一般の方法は、図８において見つかる。
この一般の方法において、標識フリー光学バイオセンサ（８０１）を提供する。
その時の細胞は、直接ある所望の密集度．に対するこのバイオセンサ（８０２）上の培養する
（培地に１％の密集度から１００％の密集度および各々のパーセンテージまで）。
それから、緩衝液は任意に適用され得る（８０３）。
また、化合物または化合物、または、試験される組成は、バイオセンサ上の培養細胞に適用され得る。
これは、刺激性の現象である（８０４）。
それからここに記載されているバイオセンサ出力パラメータのいずれでも使用して、バイオセンサは測定され、刺激性の現象（５０４）に対する細胞応答がモニタされ得るために、データは集められる。
【０２２８】
通常、標識フリーバイオセンサ（例えば光学ＬＩＤバイオセンサ表面上の生体細胞被着内のモニター質量再分布に対する光学標識インディペンデント検出（ＬＩＤ）バイオセンサ）を使用している生体細胞ベースのアッセイを実行するための方法が、開示される。
一般に、起こる多くの異なるステップが、開示された方法内である。
たとえば、方法は標識フリー光学バイオセンサ（例えば光学ＬＩＤバイオセンサ）を提供することを含む。
ここに議論されるように、方法も一般にバイオセンサ上の細胞を培養することを含む。
概して細胞を培養することは、光学バイオセンサをカバーする細胞培地で起こる。
或る実施例において、たとえば、細胞を培養皿に付けるように、細胞がバイオセンサの界面に付属するようにすることができる。
細胞がバイオセンサ上で培養されるときに、ここに議論されるように、それらはいかなる密集度にも育てられる、そうすると、さまざまなアッセイは細胞で実行され得る。
たとえば、細胞は、細胞の化合物もしくは組成または細胞内の特定の標的上の効果を決定する、受容体の作動薬もしくは拮抗薬またはシグナル伝達経路の活性化物質もしくはリプレッサのようなモジュレータ、または、作動薬、拮抗薬、活性化物質またはサプレッサのような潜在的モジュレータのような検査化合物または検査化合物もしくは組成のセットによってインキュベートされ得る。
モジュレータは、特定の現象を増加するか減少させる分子である。
作動薬は、受容体をもたらし、天然リガンドが受容体を達成する方法に関する分子（例えば化合物または組成）である。
一般的に、これは受容体をオンにするかまたはそれを活性化することである。
拮抗薬は、天然リガンドの効果を減少または除去する方法の受容体に関する分子（例えば化合物または組成）である
一般的に、拮抗薬は受容体の阻害物質またはリプレッサである。
作動薬の若干のクラスは天然リガンドまたはリガンド類似体の非存在下で作用できると理解される。その一方で、他はリガンドまたはリガンド類似体の存在下で機能する。
たとえば、拮抗薬は天然リガンドの競合阻害剤であり、または、それは非競合阻害剤であり得る。
【０２２９】
いかなる点でも、細胞培養の間、細胞はバイオセンサによって分析され得、そこにおいて、バイオセンサは設計されたように、例えば特定のスペクトルまたは特定の角度の光を供給することによって、利用される。
バイオセンサからの出力は、時間依存している方法を含んでいる様々な方法で集められる。
たとえば、時間依存光学応答を得るための光学ＬＩＤバイオセンサを測定するステップは、生体細胞内での質量再分布を示し、生体細胞内で作動薬−起因性ＧＰＣＲ活性化をモニタ可能にするように、実行され得る。
【０２３０】
光学ＬＩＤバイオセンサ溶液の界面に置かれる細胞培地に、少なくとも一回緩衝液を適用するステップは、また、方法のいずれの期間でもいかなる点でも実行され得る。
これらの緩衝液は、培地またはバイオセンサ、または、細胞を安定させるために適用され得る。
使用する緩衝液は、モジュレータ−標的相互作用または刺激性事象−標的相互作用に基づく最適のアッセイ結果を獲得するために一般に選ばれる。
【０２３１】
また、かかる方法はシグナル伝達経路を調整（ｍｏｄｕｌａｔｅ：意味は活性化するかまたは抑制する）する分子、または、生体細胞内の特定の細胞表面受容体（例えばＧＰＣＲまたはＥＧＦＲ）を調整する分子のためのスクリーニンングに使用できるとも理解される。
【０２３２】
また、或る実施例において、平行的または連続的に１以上の化合物のインキュベーションが実行可能であると理解される。
たとえば、ここに議論されるように、一組のパラメータの特定のシグニチャを産生する周知のモジュレータ（例えば作動薬または拮抗薬）によって、バイオセンサ−細胞培養複合体はインキュベートされてもよい、そうすると、他の化合物または組成物はバイオセンサ−細胞モジュレータ混合液によってインキュベートされてもよく、モジュレータ活性上の化合物の効果は、一般に測定の後、シグニチャの変化またはバイオセンサ出力を探索することによって決定され得る。
化合物または緩衝液に関連したステップの全部が量を増やす際に実行され、組成濃度の効果に注目し、または、組成がバイオセンサ出力に関係していると理解される。
【０２３３】
ここに記載されているように、方法はいかなるバイオセンサにもよって実行され得る、しかし、特定のバイオセンサは自己参照しているバイオセンサ（それは出力データを細胞アッセイのために集めるだけではないバイオセンサである）を作成できるが、しかし、それはまた、制御データをバイオセンサに集められるデータのために集める。
これは多くの方法で完成させることが可能で、生体細胞が光学ＬＩＤバイオセンサ表面の非遮断部に付着可能であるように、培養細胞の付着を防ぐスタンプを使用して、光学ＬＩＤバイオセンサの一部界面を遮断（ブロック）して、それから光学ＬＩＤバイオセンサ表面の非遮断部をカバーするように細胞培地の生体細胞を配置することができ、その後、光学ＬＩＤバイオセンサ表面からスタンプを取り外すようにする。
【０２３４】
細胞の第１の培養がバイオセンサおよびそれから配置することに付着したあと、方法を参照している自己上の変異はスタンプを取り外すことになっているスタンプによって保護されていたバイオセンサの位置上の第２の細胞培養を産生するもう一つの細胞培地。
第２の細胞は細胞または同じタイプの細胞の異なる段階、その他で異なるタイプ、しかし、それらでありえる。そして、第２の細胞は第一のインディペンデントを培養している。
スタンプがあるように、これが多数時間として実行され得ると理解される。
それで、たとえば、４枚の分離したスタンプがある場合、それがバイオセンサに使われた、そして、これらの各々が連続的に移動する、そして、他の細胞群がセンサに提供される場合、バイオセンサ上の細胞の５つの培養において達するだろう。
方法を参照している自己および系は、還元を考慮に入れてまたは外界温度、圧変動および他の環境性変化に対する不必要な感度を除去して、更に細胞の特定の標的またはタイプに関して、確証する情報を提供する。
【０２３５】
それは理解される。そして、否定だけはそうする。そして、細胞の異なるタイプ上の多数化合物の効果は分析される、そして、細胞の異なるタイプ上の単一化合物の効果は異なる受容体を有し、たとえば細胞以外は、分析されて、それらが調整されて、お互いに匹敵するようにまた、分析され得る。
これは、また、装置に多数バイオセンサ（例えば異なるバイオセンサを有するチャンバ）を供給することによって多重化され得る。
【０２３６】
また、例えば、多数の異なる受容体がバイオセンサ上で培養された異なる細胞にある場合、それば特定の拮抗薬のような特定の分子が提供されてもよい場合、たとえば、化合物または化合物は試験され得ると理解される。
かかる方法は、たとえば、どの受容体拮抗薬が遂行されたかについて、どの化合物によってについての情報を提供するであろう。
【０２３７】
開示システムは以下を含む。
測定システム；
そして、前記測定システムが前記光学ＬＩＤバイオセンサに対する光ビームを発して、前記測定システムに光学ＬＩＤバイオセンサ表面にある生体細胞内で、質量再分布をモニタするのを可能にする前記光学ＬＩＤバイオセンサから、光ビームを受け取る光学標識インディペンデント検出（ＬＩＤ）バイオセンサ。
【０２３８】
また、前記測定システムがステップが実行されることになった後によりはるかに生体細胞内の細胞例えば作動薬−起因性Ｇ−タンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）活性化のモニタリング転形ができる系が、開示される：
光学ＬＩＤバイオセンサを提供すること；
生体細胞が光学ＬＩＤバイオセンサ表面に付くことが可能であるように、光学ＬＩＤバイオセンサをカバーするために培地の細胞の生体細胞を配置すること；
光学ＬＩＤバイオセンサ表面にある細胞培地に、化合物を含んでいる溶液を適用すること；
そして、１に生体細胞内で作動薬−起因性ＧＰＣＲ活性化のために、質量再分布をモニタするのを可能にする生体細胞内で、質量再分布を示す時間依存光学応答を得るために光学ＬＩＤバイオセンサに測定すること。
また、少なくとも緩衝液を適用する所で、光学ＬＩＤバイオセンサ溶液の表層にある細胞培地に系は開示される。
【０２３９】
ここに議論される方法ステップのいずれでもステップを実行するための系に適用され得ると理解される。
【０２４０】
また、異なる時間的間隔（たとえば１秒、３秒、５秒、１０秒、１５秒、３０秒、６０秒、２分、５分、１０分、１５分、３０分、６０分、２時間、５時間、１０時間、２４時間）で以外、光学出力シグナルがリアルタイムにおいてモニタされ得ると理解される。
【０２４１】
また、アッセイの間の２つの点だけが細胞に化合物添加の前後で測定されると理解される。
光出力パラメータに関する差分は、分析される。
（ｄ）  細胞増殖アッセイのためのバイオセンサの使用）
【０２４２】
どちらでも細胞増殖を進めるかまたは遅らせる作因の性格付けは、細胞生物学および薬剤−発見研究の極めて重要な領域である。
いくつかのアプローチが、過去において使われた。
トリパンブルー染色は細胞生存のための起訴者として使われる細胞膜統合性を評価する単一の方法である、しかし、方法は顕微鏡の下で死んでいる細胞を計数することを必要として、高スループットスクリーニングに適応することができない。
多くの細胞増殖アッセイは、増殖（すなわち細胞分割）の間、３Ｈ−チミジンまたは５−ブロモ−２'−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ（チミジン類似体））を細胞に組み込むことによって溶解する細胞の測定全体の核酸またはタンパク質含有量によって細胞の数を推定する。
新しく合成されたＤＮＡへの５−ブロモ−２'−デオキシウリジンの移入は蛍光標識された反ＢｒｄＵ抗体または特定の核酸ステイン（例えばヘキスト３３３４２、ＴＯ−ＰＲＯ−３およびＬＤＳ  ７５１）を有する速く増殖している細胞の間接的な検出を許可する。そして、それによってＢｒｄＵ標識付加期間の間、細胞周期のＳ期を進んだ細胞の同定を容易にする。
最も普及しているアッセイのうちのもう１つは、ＭＴＴ細胞増殖アッセイである。
成育可能で代謝的に活性細胞において機能するだけである細胞のミトコンドリアデヒドロゲナーゼによって、比色ＭＴＴアッセイは、還元のために不溶解性の紫のホルマザン結晶に黄色のテトラゾリウム塩（ＭＴＴ）の遺伝子変換に基づく。
ほぼ２−４時間のＭＴＴ試薬での細胞のインキュベーションの後、清浄液は細胞を溶解させて、色のついたホルマザン結晶を可溶化するために添加される。
サンプルは、プレート読取機を使用して５７０ナノメートルの波長で読み込まれる。
産生される色の総計は、生体細胞の数に正比例する。
生体細胞の数の拡大はミトコンドリアデヒドロゲナーゼの活性の増加に結果としてなった。そして、これは、形成されたホルマザン色素の総計の増加を導く。
【０２４３】
アッセイの前のタイプは、冗長なインキュベーションステップの必要を原因として生じるので時間がかかる。
たとえば、多くの従来のＢｒｄＵに基づくプロトコルは、ＢｒｄＵエピトープのためにＤＮＡ変質が反対のＢｒｄＵ抗体にアクセスできるようになることを必要とする。
ＤＮＡ変質は、熱（＞９０°Ｃ）または酸（２−４ｍ  ＨＣｌ）によって概して達成される。
他細胞構造およびテストがこれらの処理の間、かなり保存されないので、かかるきつい処理は、しばしば多パラメタ解析を実行することをむずかしくする。
加えて、これらの従来のアッセイは、特定の細胞タイプを分析することに役立ってもよい；
そして、細胞の異なるタイプは、適切に異なるインキュベーションプロトコルが最適のアッセイ結果を達成することを必要とする。
（ｅ）  高スループットスクリーニングのための特性）
【０２４４】
変調する化合物または細胞または細胞増殖のシグナル伝達経路効果一つ以上の高いスループットスクリーニングまたは細胞死に適している方法が、開示される。
バイオセンサ出力データがここに議論されるように、多くの異なるパラメータを使用して査定され得るという条件で、これらの高スループット方法は基礎を形成される。
そして、ここに議論されるように、死亡または増殖のような細胞または特定の細胞現象内のその特定の細胞または受容体またはシグナル伝達経路の転形は特定のシグニチャを有する。
ここに議論されるように、このシグニチャは一つ以上のバイオセンサ出力パラメータからなる。
重要な高スループット方法のため、方法期間中の時間点は重要であり、バイオセンサ出力パラメータデータの収集が細胞の状態の症候であり、すなわち、シグナル伝達経路が活性化してまたは不活性化され、または、細胞は死もしくは細胞は増殖していた。
かかるこの点が、シグニチャを定義するために用いるバイオセンサ出力パラメータの組み合わせが存在する所である。
【０２４５】
高スループット方法が、多数バイオセンサ、かかる最高４９のウェルまたは９６のウェルを有する装置を有する、たとえば、装置において使われるかまたはより多くである。
また、この方法は、バイオセンサ上の細胞培養のための刺激性事象について、１時間、３０分、１２分、１１分、１０分、９分、８分、７分、６分、５分、４分、３分、２分、１分、５９秒、または、各１秒ごとカウントダウンした時間内でバイオセンサ出力パラメータデータを集めると理解される。
バイオセンサ（たとえばセンサの完全プレート）の全てのための収集の全部がこれらの時間にもおいて完了されることはまた、好ましい、しかし、これが必要でないと理解される。
【０２４６】
平行に検査されるサンプルのデータ収集持続期間および数と関連する特性と比べて、方法とシステムを使用する際の結果がここに開示した結果のデータ分析および統合した提示は、たとえば、共鳴バンド像でありえて、集められることができて、部位において示され得る時間点をあらかじめ決めた。
（（１）  細胞密集度）
【０２４７】
方法のために、特に、高いスループットスクリーニングのため、ここに開示される方法の臨界パラメータのうちの１つは、使用する開始細胞数である。
正常培養条件の下の導波路基質上の細胞現象としてなられた密度によって、細胞（減少と同様に両方の増加）の数の変化を検査するように、開始細胞数は限界範囲においてなければならない。
細胞密度が大きくなるにつれて、バイオセンサからの出力シグナルも大きくなると理解される。なぜなら、プレートにある細胞が多くなるにつれて、例えば刺激性事象の後のような所定時間で測定されるＤＭＲ現象が多くなる事実からである。
このように、細胞の数は、たとえばＤＭＲ現象（例えばＰ−ＤＭＲおよび／またはＮ−ＤＭＲ）の共鳴バンド像（例えばバンド形、幅、強度、分配および／または位置）および／または振幅の共鳴ピーク（例えば強度、ＰＷＨＭ、形および／または位置）および／または特徴の特性を変える。
たとえば、しかし、密集度は３０−１００％、３０−７０％、４０−６０％、５５％に対する４５％または約５０％でありえる。そして、密集度は、３８または５７または６３のような、３０および１００％間のいかなるパーセントでもありえるまたは８８または７５または９５、または、９９％。
異なる適用法のために、好適な密集度は、最適の運転性能を達成するために変化してもよい。
たとえば、細胞増殖アッセイのために一般に、好適な密集度は約５０％である、しかし、これは僅かに異なる細胞タイプまたは異なるアッセイのための異なるであろう。
これらの条件の下で、標準状態の下で培養される細胞のために最大のＰＷＨＭがまわりにあること細胞増殖を妨げるモジュレータが同時に、角度／波長シフトまたは共鳴ピーク／バンド位置と協力して評価され得るために、物質モジュレータが、細胞同定のための促進因子か阻害物質であるかどうか
ここで、ＰＷＨＭの減少の両方のモジュレータは結果、しかし、促進因子は、角のシフトを増加する阻害物質ｄｅｓｃｒｅａｓｅ、いかなる処理のないも細胞と比較して、角のシフト。
細胞シグナル伝達およびネット相互作用に関する受容体アッセイまたはほかの応用のために、モニタされる細胞現象に従い、細胞の密集度は、３０％から約９９％まで変化してもよい。
たとえば、細胞アポトーシス研究のために、細胞密集度は、約１０％−約９９％の範囲であってもよい
ＧＰＣＲスクリーニングまたはＥＧＦＲスクリーニングのための細胞密集度は、好ましくは約５０％−９９％の範囲である。
（（ａ）  細胞増殖阻害）
【０２４８】
本方法は、センサの全プレートに対して、短い時間内で細胞増殖に影響を及ぼす化合物を検出するが、例えば６０秒、５０秒、４０秒、３０秒、２０秒、１０秒、または、各１秒ごとカウントダウンした時間内で検出する。
実施例において、細胞増殖上の化合物の効果を測定するための開示される方法は、次のステップを含む：
（ａ）第１および第２の光学型標識フリーバイオセンサを用意する；
（ｂ）培地の所定接種数のうちの１つの細胞を前記第１のセンサ上に配置して、細胞増殖条件下の最適培養後、付けた細胞が最適密集度に届くようにする；
（ｃ）所定濃度化合物がある場合に前記培地の同じ接種数の同じ細胞を配置する；
（ｄ）上述の第１のセンサの細胞密度まで最適の密度に到達するまで同じ条件の下で細胞を培養する；
（ｅ）そして、光学測定システムを使用して光学出力パラメータを集める。
最適の密度は、好ましくは４０％−７０％の間にあり、最も好ましくは  ４５％−５５％の間である。
光学測定システムは、好ましくは平行の測定システムまたは精査測定システムである。
化合物、いずれの阻害物質もまたは活性化物質は、ここに開示する、センサ基質上へ付けられる細胞の異なる数に結果としてなって、細胞の所定のタイプの増殖速度を変える。
取付けられた細胞の密度の差分は、異なる光導波路光モードスペクトルを引き起こす。
２つのパラメータ、角のシフトおよびＰＷＭＨに基づく、活性化物質対阻害物質を区別する。
（ｆ）  細胞毒性スクリーニングのためのバイオセンサの使用）
【０２４９】
薬剤発見は、化合物の巨大なライブラリが選ばれた標的に対して活性のためにスクリーニングされる工業化されたプロセスになった。
これらの一次性のスクリーニングから現れる活性化合物の財産は、薬物開発のボトルネックをつくった。
第１ラウンドのヒットはしばしば安全性を満たさない、そして、効能基準は人間処理のために要求したので、産物が人間に与えられる前に、最適化の逐次的な回診は必要である。
最適化は、Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ、Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ（排出）およびＴｏｘｉｃｉｔｙ（ＡＤＭＥ／Ｔｏｘ）を試験するアッセイを必要とする。
ＡＤＭＥ／、今日３０億ドルの市場を薬剤発見および現像セッティングにおいて代表して、Ｔｏｘスクリーニングは、関連するリード化合物および薬剤障害の大きい画分を与えられる中心段階に毒性性状を持っていっている。
発生的配管路の全体の新薬摩滅の３０のパーセントは、毒性プロフィールおよび副作用に帰される。
ＡＤＭＥ／Ｔｏｘスクリーニングは、市場または医療に持ってこられるいくつかの薬剤によって生じる死亡を防いでもよかった（Ｚｅｃｈｎｉｃｈ、Ａ．Ｄ．その他（１９９４）西。Ｊ．  Ｍｅｄ．  １６０（３２１−５））。
この驚くべき毒性は、ＡＤＭＥ／Ｔｏｘスクリーニング年の初めに現在市場に出ている安全な抗ヒスタミン剤の数および薬剤科学者の中の発達する関心を考慮して優れたケーススタディを提供する。
リード化合物および薬剤障害の大きい画分が毒性性状と関連したと仮定すると、ＡＤＭＥ／Ｔｏｘスクリーニングは薬剤発見および現像セッティングの中心段階をしている。
化学物質ライブラリが正や負効果のスペクトルを有する化合物を含むという仮定は、ＡＤＭＥ／Ｔｏｘスクリーニングの基礎を形成する。
その中に、薬剤候補物質の有益な特徴は、高量特異性、低い毒性、良好な口の生体吸収および半減期を含む。
早い高量−スループットＡＤＭＥ／Ｔｏｘスクリーニングのゴールは、発見プロセスの初期に、毒性に関して、「良好」で「悪い」化合物とを区別することである。
課題の同定は、今日では、薬剤スクリーニングの初期に単一の最大のコストを節減する機会を薬剤工業において代表する。
【０２５０】
ＡＤＭＥ／Ｔｏｘスクリーニングは、一般に小腸、生物に対する分配、肝臓による代謝、腎臓による排出および毒性プロフィールによって生体吸収に関して化合物の性状を特徴づけるために用いるそれらの検査のアンサンブルを記載するために用いる語である。
伝統的に、薬物開発のＡＤＭＥ／Ｔｏｘアプローチの配備は薬物開発の後の段階で起こった本質的に発見の初期位相に続くプロセス下旬−の「ヒット（ｈｉｔ）化合物」Ｓｕｃｈ、配列は実行可能だった。そして、薬剤発見標的の数はほんの少しだった、そして、高量−スループットスクリーニングアッセイ点の数は製薬の企業全体に比較的低かった。
薬剤発見空間の変更概念図式については、薬剤標的の数は広がっている、そして、アッセイ点の体積も高量−スループットスクリーニングにおいて実行される。
したがって、それはトリアージに迅速かつ効率よく産業のために避けられない、または、同定する（「ポテンシャルヒット」）、それはＡＤＭＥおよび毒性スクリーニングができないもしれない。
このように、ＡＤＭＥ／Ｔｏｘスクリーニングは、薬剤発見および現像（例えば原発（高量−スループットスクリーニング）および二次性スクリーニング）の中で進行中に以前に実行されることを必要とする。
さらに、薬剤吸着を予測するための統合したアプローチ、毒性および生理作用は、非常に薬剤発見および生長過程のためになる。
（（１）  化合物吸着をモニタしているリアルタイム、分配および毒性）
【０２５１】
ＡＤＭＥ／Ｔｏｘスクリーニングは、小腸、生物に対する分配、肝臓による代謝、腎臓による排出および毒性プロフィールによって生体吸収に関して化合物の性状を試験することを含む。
従来のＨＴＳスクリーニングの間の化合物吸着および毒性に関する情報は、一般に捨てられるかまたは逃がされる；
加えて、化合物吸着および毒性のための効果は、データ分析を複雑にする。
技術をスクリーニングしている高量内容の増加している使用は、機能的スクリーニングを有する毒性スクリーニングに橋をかけ始める。
【０２５２】
開示された組成物、方法および技術の１つの見方は、ＡＤＭＥ／Ｔｏｘスクリーニングおよび標識フリー光学センサと協力して細胞ベースのアッセイを使用している機能的スクリーニング間の出ているギャップ期を除去することになっている。
【０２５３】
実施例において、リアルタイムの化合物吸着および毒性をモニタするための開示される方法が次のステップを含む：
（ａ）光学型標識フリーバイオセンサを提供し；
（ｂ）培地の細胞を配置して、細胞はバイオセンサ表面上へ付け；
（ｃ）細胞培地に化合物を含んでいる溶液を適用し；
（ｄ）そして、バイオセンサ上で培養される細胞応答をモニタする。開示された方法は、また、細胞培地に少なくとも緩衝液をＯｐｔｉｏｎａｌｌｙに適用している（ｃ）によって特徴づけられる。
さらに、解析においてここに議論されるように、開示された方法はまた、複数のバイオセンサ出力パラメータを取り入れる。
事実、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５、または、より多くのバイオセンサ出力パラメータを利用して方法は実行され得、そして、或る実施例において、たとえば、正確にアッセイまたは細胞条件のためのシグニチャを得ることは複数のパラメータを利用するのに必要である。
また、或る実施例において、刺激性事象またはバイオセンサデータ出力収集の後、シグニチャのために使用したバイオセンサデータ出力パラメータは、１時間、５０分、４０分、２５分、１０分、９分、８分、７分、６分、５分、４分、３分、２分、１分、５９秒、または、各１秒ごとカウントダウンした時間未満で起こる。
（ｇ）  監視細胞活性のためのバイオセンサの使用）
【０２５４】
導波路グレーティング−型バイオセンサを含んでいる標識フリー光学バイオセンサの分野に関する組成、方法および技術が開示される。
組成、方法および開示される技術は細胞ベースのアッセイの分野にも関する。
使われるセンサのエバネッセント波の小さい侵入深さおよび性質のために、センサ界面の近くで起こる細胞の付着層内の刺激作用−起因性ＤＭＲだけは実効屈折率の変化を導く、そして、順に、それはセンサからの反射光の角度シフトを結果としもたらす。
角のシフトは、ＤＭＲ応答シグナルの動態を得るために測定される。
加えて、それのため、異なる細胞応答は全体的な質量再分布シグナルとは異なって貢献する。
たとえば、細胞外のマトリックスからの細胞離断はセンサは表面若しくは付近で起こり、したがって、細胞で起こっているそれらよりかなり大きい応答を導くであろう。
細胞活性を検出するために光学バイオセンサを利用する方法およびセンサの検知体積内の質量再分布に基づく化合物／刺激作用起因性細胞変化が、開示される。
例えば、開示された組成物、方法および技術は受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫｓ）および逐次的なシグナル伝達現象にリガンドの結合をモニタするための光学型バイオセンサの使用および使用方法に関しており、かかる現象には細胞内のシグナル、分子もしくは会合体の運動のリアルタイムの内部移行、および／または、細胞骨格再配列および細胞形態学的変化を含んでいる。
これらの生体細胞内のシグナル伝達現象のうちの１つを妨げる化合物またはモジュレータスクリーニングのための方法が開示される。
【０２５５】
本発明は、導波路型バイオセンサを含んでいる光学型バイオセンサを使用し、リガンドと受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の結合、細胞表面受容体のファミリおよび生体細胞内のいくつかの逐次的シグナル伝達現象をモニタするかまたは調査する。
これらのシグナル伝達現象、例えば結合、逐次的なリン酸化（ｐｈｙｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、内部移行／細胞骨格再配列および細胞接着（接着）を潜在的に妨げ得る化合物またはモジュレータをスクリーニングするための方法も開示される。
もう一つの実施例では、生体細胞の特定の受容体に対して化合物の生理学的であるか薬理学的な効果を確かめる方法が、開示される。
【０２５６】
化合物スクリーニングおよびプロフィーリングのためのリアルタイム標識フリー機能受容体チロシンキナーゼ細胞ベースのアッセイが開示される。
開示された方法によって、リガンド結合、リン酸化および内部移行／細胞骨格再配列の、三つのシグナル伝達経路受容体の現象の動態を同時に研究することが可能となる。
本発明の方法によれば、これらのシグナル伝達現象を妨げる化合物をスクリーニングするかまたは分類することが可能となる。
また他の実施例では、光学出力パラメータで定義されたようなそれらのユニークな特性に基づく測定されたＤＭＲシグナルを妨げるシグナル伝達経路の多数標的のためのモジュレータをスクリーニングする方法が開示される。
【０２５７】
ＥＧＦ受容体系の計算のモデルは、受容体経路の異なる一部間の複合体相互作用を理解することに非常に有益である。
しかし、これらの細胞内のシグナル伝達および輸送動態の直接測定に利用できる限られた実験データだけがある。
直接測定がシグナル伝達現象の動態だけで足りないことは、これらのモデルの確証を制限する。
したがって、細胞シグナル伝達現象の動態を同時に研究する方法および技術が、ＥＧＦＲシグナル伝達を更に理解するために必要である。
（（１）  質量再分布モニタリング）
【０２５８】
ここに開示された、吸着、分配および細胞−センサ界面の近くの特定の集密的な細胞層に対する化合物の毒性は、リアルタイムにおいてモニタされ得る。
光学型バイオセンサの固有の限られた侵入（５０−５００ｎＭ）検知特性（すなわち、体積の検出）のため、センサが感知する体積内で起こる質量再分布は、反射ビームの角度またはスペクトルとして観察可能であるセンサ応答の変化に結果として得られる。
このセンサ応答は、溶液組成変化と同様に時間の関数として記録され得る。
このように、いかなる刺激性事象もの動態または検知体積内で質量再分布を導く刺激性事象によって生じる効果が分析され得る。
分析される細胞の密集度が高感度検出にとって重要であると理解されなければならない。
ここで記載するように、必要とした感度をより多くすればするほど、最適の検出のために細胞の密集度はより重要となる。
刺激性事象によって起因性をモニタしている質量再分布のための細胞の密集度は、３０−１００％の範囲内が好ましい。
あるいは、それが７０−９９％であっても好ましい。
異なる応用（細胞増殖、化合物毒性、細胞アポトーシス、化合物吸着および代謝、細胞シグナル伝達経路活性化、細胞形態学的変化、細胞接着（接着）および運動、受容体および標的（分子または分子集合体）活性化、並びに、移動、その他）のための開示方法は、最適のアッセイ結果を達成するため異なる細胞密集度（すなわち細胞密度）を必要とする。
また、異なる標的／シグナル伝達経路活性化と同様に細胞の異なるタイプは、最適の細胞応答および機能のための異なる細胞密集度を必要とする。
かかる密集度がアッセイプロトコルまたは方法を制限する意図でないと理解されなければならない。
（ｈ）  細胞成分およびバイオセンサ）
【０２５９】
図９の略図に示すように、生物学的製剤細胞は、ナノメータから何十もミクロンまで大きさにおいて変動している成分を有する複素構造である。
細胞（例えば図１０で示す概して１００８）は、多数の細胞器官を含む細胞原形質（典型的範囲５−３０μＭ）を有する。
一般的に、最大の細胞器官は、大きさが３−１０μｍの間で変動する細胞核である。
細胞核は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質および核酸−タンパク質複合体（例えばＤＮＡ−タンパク質またはＲＮＡ−タンパク質複合体）を含む。
重要なＤＮＡ−タンパク質複合体は、クロマチンである。
ミトコンドリアは、０．５−１．５μｍから概して変動している大きさを有する一連の折られた膜からなる小さい細胞器官である。
たとえば、他細胞成分は、小胞体（ＥＲ）（概して０．２−１μｍ）、ライソソーム（概して０．２−０．５μｍ）、ペルオキシソーム（概して０．２−０．５μｍ）、エンドソーム（概して約１００ｎｍ）およびｇｏｇｌｉを含む。
生体細胞（例えば１００８）は非常に動的である、そして、大部分の細胞器官は細胞内で広く進行する。
たとえば、マイクロチューブルは長距離の上の細胞器官を輸送する。
刺激はセンサ界面（例えば１０１０）のまさしくその末梢の濃く包まれた細胞器官のサブミクロン運動に結果としてなることが可能である。そこでは、細胞（例えば１００８）は培養される；
そして、かかる運動は、細胞（例えば１００８）内の質量再分布（例えば１００６）を導く。
質量再分布（例えば１００６）は、光学バイオセンサ（例えば１０１４）によって検出され得る；
質量再分布（例えば１００６）に関するシグナルは指向性質量再分布（ＤＭＲ）シグナルと呼ばれる。
エバネッセント電磁場として周囲の培地（たとえば（付着細胞１００８））に達するバイオセンサ（例えば光学ＬＩＤセンサ１０１４）の電磁場伝搬性の限られた範囲（何百ものナノメータに対する約ｔｅｎｓ）のために、中で、侵入深さが細胞層の、たとえば、ずっと細胞または細胞を通してしみ出るために不十分であるので、特定の状況（質量再分布の例えば画分だけ）において、１００６は検出され得る。
電磁場が延長する距離は侵入深さまたは検知体積と呼ばれる。
特定の状況において、バイオセンサ界面（例えば１０１０）に、特定の距離内である付着細胞の下部だけは、検出され得る。
【０２６０】
仮に、原形質膜（プラズマ細胞膜）の下方が分泌系細胞小器官（分泌系オルガネラ）の結合箇所で占められており、原形質膜上の細胞内小胞が細胞質基質（シトソル）内で当該細胞内小胞の処理ステーションに達していたとすれば、細胞輸送が起こり得る。
いずれの方向にしても、細胞小器官は、原形質膜の下方で、いわゆるアクチン皮質に侵入しなければならず、アクチン・フィラメントの緻密な網目構造が数百ナノメータの厚みを構成している。
アクチン・フィラメントが絶えず集合し離散する限り、その網目構造は、動的であり、細胞小器官に対する浸透性を有する。
その集合と離散とを調整する制御機構は、アクチン皮質の浸透性をも調整すると思われる。
【０２６１】
細胞外小胞（エキソサイトーシス小胞）は、受容体を原形質膜内に挿入し、リガンドを細胞外空間に解放する。
細胞内小胞（エンドサイトーシス小胞）は、結合性リガンドとともに受容体を内部処理ステーションに輸送する。
カベオラは、細胞シグナル伝達における役割を持つとみられる、原形質膜関連の小胞である。
脂質ラフトは、原形質膜を小さな浮島として定着させるものと考えられており、当該浮島では、選び抜かれた複数の膜タンパク質が密かに出会ってシグナルを交換する。
結局、ここに開示されるように、膜受容体の母集団領域が存在することとなる。
これらの多くは、おそらく、下流のエフェクター分子を絶えず補充し解放する大きな分子複合体に組み込まれている。
【０２６２】
細胞の構成要素の輸送すなわち細胞外の刺激は、原形質膜で生じるだけでなく、シグナル伝達経路を介して細胞内で、そして、多数の細胞内区画および細胞器官内で起こる。
そのような現象の中には、（１）タンパク質の標的化、あるいは、細胞核、細胞膜、細胞基質（シトソル）に対する再循環経路を介した基質の補充、あるいは、他の細胞外空間から若しくは他の細胞外空間に対する基質の補充、あるいは、細胞外空間からの取り込み（リガンド結合、遺伝子トランスフェクション、感染およびタンパク質配送）という現象や、（２）媒介による放出地点とともに所定の微少環境において様々な機能区画内で新たに合成された細胞内構成要素の再分布という現象が含まれる。
これらの細胞性現象は、シグナル伝達サイクル期間の間に或る時点で指向性質量再分布をもたらす。
（（３）多数の細胞モニタリングのための侵入深さ）
【０２６３】
ほとんどまたは細胞コンパートメントの全ては、非常に動的で、分に対するミリ秒のそれらの仕事をして、時々すぐにその後で、拡散する。
シグナル伝達現象が単一の細胞器官およびシグナル伝達複合体によって媒介されたのを見るために、伝統的に生体内の方法は、単一細胞器官を撮像して、小数で分子を検出して、やがて高分解能および空間でそれらの機能を報告することを必要とする。
若干の細胞器官が具体的には、色素で染色され得る限り、蛍光−顕微鏡法は自然の選出である、そして、ますます、タンパク質はそれらの機能を悪くすることのない緑の蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）のような蛍光性タンパク質を有する複合化であった。
しかし、大部分の形質膜現象は、一時的に形質膜に入れられた細胞質ゾルタンパク質を有する相互作用を含む。
形質膜に集中するときに、コンフォーカル顕微鏡検査でもほとんど半ミクロンの深度まで細胞を調査するので、これらおよびより従来の蛍光−顕微鏡は細胞質ゾルからの強い『バックグラウンド』蛍光を示し、細胞質ゾルは、形質膜の近くの小さい構造または分子集合体からのより弱い蛍光を隠す。
【０２６４】
刺激作用中に、生体細胞が多くの細胞現象、例えば、受容体または細胞内標的に対するリガンド／化合物の結合、細胞の成分の運動および転位、細胞のシグナル伝達分子の相互作用、細胞の細胞器官または分子集合体の変更活性および等速運動、二次メッセンジャ生成、細胞骨格再配列、および劇的細胞形態学的変化、を限定しないが、を受けることになる。
たとえば、ＧＰＣＲはシグナル伝達経路細胞の広いアレーに関与している。
リガンド結合は、受容体配座変化と、受容体オリゴマー形成と、Ｇタンパク質活性化（Ｇαサブユニット上のＧＤＰ−ＧＴＰ交換、ＧαおよびＧβγ脱会合、受容体からのＧタンパク質デカップリング、Ｇα−およびＧβγ−シグナル伝達複合体の生成）と、下流のシグナル伝達活性化（二次メッセンジャ生成（Ｃａ２＋可動化、ｉｎｏｓｉｔｏｌｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅな生成および／または細胞内のｃＡＭＰレベル転形）を導く）と、を含む一連の細胞内および細胞のシグナル伝達現象を始め、そして最終的に、特定の遺伝子形質発現の変化を起こす結果となる。
リガンドによって媒介されたＧＰＣＲ活性化も、細胞表面からＧＰＣＲの脱感作および多くの細胞内のタンパク質の輸送を導き、同じく、標的細胞のフェノタイプ、形態および物性の変化を導く。
これらの変化は、静的、長期持続または動的（例えばサイクリングまたは振動）である。
異なるシグナル伝達現象は、ミリ秒（例えばＧＰＣＲ配座変化）から、何十秒（例えばＣａ２＋フラックス）、何十分（例えば遺伝子形質発現または形態学的変化）、までの範囲で変動して、かなり異なる動態を呈する。
それらの特性（例えば動態）がはっきりしているにもかかわらず、これらの現象は質量再分布を導く。
さらに、一般に光学バイオセンサを使用して得られた光学出力パラメータは、多くの細胞現象による応答の全体的な平均値を表わし、異なるの細胞現象は全体的な出力パラメータに異なる寄与をもたらす結果となる。
侵入深さにかかわる細胞の全体的なＤＭＲ応答の依存性は、ＤＭＲシグナルがどこで、いつ起こることを示す極めて役立つ指標である。
【０２６５】
上記したように、センサ構造および性状に従い、光学バイオセンサは、限られた侵入に対する上昇にカバー培地（概して５０ｎｍ−５００ｎｍ）への深度を与えて、高い細胞（約１０ミクロンの直径）またはバクテリア（約１ミクロンの直径）の底部分を検出するだけである。
したがって、測定された量は、主に生物および界面間の接触面に、そして、センサ界面の近くの形質膜領域および形態学的変化の近くで関係する。
形質膜からはるかに間隔をおいて配置される細胞または全部の生物の屈折率内部で異なる区画または細胞器官の運動または活性を調査するために、これらの変化に到達するために侵入深さを延長しなければならない。
図１１は、侵入深さに依存するセンサのエバネッセント波の行動を示す。
これは、細胞モニタリング上の侵入深さの重要性を強調する。
光学出力シグナルまたはパラメータが統合されかつ代表的な刺激作用−起因性細胞応答の読み出しであるので、受容体エンドサイトーシスまたは標的複合体運動または細胞の細胞形態学的変化または細胞接着または運動のような多数の現象は光学バイオセンサを使用して、得られた総合応答に対する異なる貢献をしてもよい。
これらの現象は、センサ界面に関する異なる位置で起こってもよい。
したがって、同じ刺激性事象により誘因された細胞応答をモニタするための多数侵入深さを使用することによって、総合応答に対する各々の結果の寄与およびこのように細胞応答の機構が理解され得る。
【０２６６】
刺激作用に応答して細胞のＤＭＲシグナルをモニタするために用いることが可能である方法が、開示される。
実施例において、方法は特定の刺激作用に応答して細胞の特定のタイプの全体的なＤＭＲシグナルを測定するためにセンサで異なるモードを含む。
異なる侵入深さのセンサ結果のモードを与えられる異なるは、感度を変えた（例えば、ＴＭ０モードは、同じセンサのための約９０ｎｍのような、ＴＥ０モードがするより、長い侵入深さ（例えば所定のセンサのための１２０ナノメートル）を引き起こす傾向がある。
もう一つの実施例でが、開示された方法は、異なる導波路およびグレーティング構造を有する少なくとも２つのバイオセンサおよび細胞の全体的なＤＭＲシグナルを測定するために所定モードのための異なる侵入深さに結果としてなる性状を利用する。
もう一つの実施例でが、開示された方法は、細胞の全体的なＤＲＭシグナルを測定するために従来の対称性および逆対称性導波路バイオセンサにグレーティングを使用する。
輸送シグナルの感度または再分布（ＤＭＲ）が侵入深さにシグナルを出す方向質量が、特定の細胞の輸送現象を同定するためのシグニチャとして使われる。
バイオセンサ構成および構造の一時変異を含む本発明の方法または「調律」特定の導波路センサの侵入深さ、高感度および細胞内の区画特異性を有する特定の細胞の輸送現象をモニタするかまたは検出する役立つ手段を提供する。
異なる侵入深さを有する多数センサの特に使用は、各々の細胞のＤＭＲまたは輸送現象のシグニチャを表すために用いることが可能である。
かかる輸送またはＤＭＲ現象のために、本発明によって、Ｚ軸の高空間分解能およびより高い感度で現象を測定または検出できる。
（（４）多重化細胞光学バイオセンサを使用しているアッセイ）
【０２６７】
一度に単一の標的を分析して、標準のスクリーニングキャンペーンは、有力な薬剤候補物質を同定するために成功していた。
しかし、化合物選択作用についてのごくわずかな情報しか、発生しない。
現在、選択作用研究は、薬剤発見プロセスの行われた下流である；
不都合な結合を原因として生じるので現段階で化合物を捨てることは、薬剤発見プロセスを高価で時間がかかるようにする。
平行に多数標的に対して化合物の活性を検査するマルチ標的スクリーニングは、薬剤発見プロセスの初期に能率的に化合物選択作用のアドレス指定を行うのに必要である。
これらの考慮を与えられて、標的の同定の増加しているペースおよび化合物ライブラリの拡大と共に、マルチ標的スクリーニングに快く従う新しい技術が、必要である。
【０２６８】
マルチ標的およびマルチ細胞スクリーニングのために使われる方法が、開示される。
実施例において、本発明の方法は、同じクラス標的の標的または多数ファミリの多数クラスに対して、スクリーニング化合物のための手段として集積光出力パラメータを利用する。
たとえば、ＥＧＦによって媒介したＥＧＦＲを通した人間のＡ４３１細胞のＲａｓ／ＭＡＰＫ経路の活性化は、ユニークなＤＭＲシグニチャを導く。
標的の多数クラスがＥＧＦＲ（Ｓｒｃキナーゼ）を含んで、ＭＥＫ１／２、ダイナミンおよびアクチンフィラメントは、全体的なＤＭＲシグニチャで異なる役割を演ずる。
また、Ａ４３１細胞の他の例において、Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路の活性化は、ＥＧＦ−誘導応答として類似したＤＭＲシグニチャのいくつかのＧＰＣＲ作動薬−起因性ＥＧＦＲトランスアクチベーションおよび結果で媒介され得る；
このように、ＧＰＣＲクラス標的の多数ファミリは、審査されることができて、検査した。
【０２６９】
もう一つの実施例では、本発明は単一センサの異なる領域上へ順番に少なくとも２種類の細胞を培養する方法を開示する。そして、それは光学バイオセンサを使用していた多重化細胞アッセイのために使われる。
細胞は、異なる種類の細胞であり、生理学的関連、疾患関連または病理学的関連のものである。
細胞は細胞の同じタイプから由来したものでも、または、未修飾されたもの、または、関心のある特定の標的をノックアウトまたは抑制または過剰発現したような、遺伝的操作もしくは再操作したものでもでもあり得る。
たとえば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびそれらの再操作されたＣＨＯ細胞が、使われる。
図１２に示すように、バイオセンサ（１２０１）が用意され、そして、このバイオセンサの一部は物理的に遮断され（１２０２）、よって、細胞がたとえバイオセンサ上に配置されても細胞はこのバイオセンサ遮断部上にて培養されなくなる。
それから細胞タイプＡを有する細胞培地を配置して、非遮断領域上で成長させるようにする（１２０３）。
それから、バイオセンサの遮断領域は非遮断とされて、そして、細胞の第２の培地たとえば細胞タイプＢが添加されて、タイプＢが遮断された領域（８０５）上で培養されるようなる。
刺激性事象（１２０６）を与える分子を含む溶液は、それから供給される。
バイオセンサは、それから、２つの領域（初期の非遮断領域および遮断領域）からのデータが集められ比較されるように作動される。
ブロッキング遮断は、一部のセンサをカバーするためにゴムスタンプを配置することによってまたはポストまたはカラムの所定の数を有するカバープレートを配置することによって達成され得る。
ポストまたはカラムの端は、センサの表面部分に接触する時にセンサ性能の損傷または劣化しないように、ゴムのような軟らかい材料でできている。
ポストまたはカラムの数および位置は、センサマイクロプレートの所定のフォーマットに適合されている。
あるいは、各々のセンサが少なくとも２つの区画に分割され得るように、ブロッキングはセンサマイクロプレートに装置を配置することによって達成され得る。
たとえば、装置はマイクロカラムの所定の数を有するカバープレートとし、各々のカラム端（またはカラム全部）において、ポリマーのような柔らかい材料でできている薄い壁（概して１ｍｍ）を設けることが可能である。
一度、カラムが各ウェルに配置されると、マイクロカラムの底がセンサの中心領域に接触して、両側は各ウェルの内壁と接触する。
カバープレートは、好ましくは流体経絡の所定の数を含み、各経絡は各マイクロカラムまたはマイクロカラムの部分と協働する。
【０２７０】
他の実施例のまた、物理的に分離された多数のバイオセンサおよび各々のバイオセンサが使って１種類の細胞のホストをつとめることを利用する方法が、開示される。
原基細胞付着性の後、一般の培地は、多数のバイオセンサを含むチャンバに適用され得る。
図１３および１４に示すように、方法はバイオセンサが位置する事実に関連した開示された方法の一時変異にチャンバ（例えばミクロタイタープレートのウェル）の特定の点を提供する。
多数区画を有する多数のウェルマイクロプレートを各ウェル内で含む装置が利用される、そして、各々の区画がバイオセンサを有する場合、異なる細胞の解析または条件のセットを考慮に入れて、細胞の異なるタイプは各ウェルまたはバイオセンサ（１３０２）のために異なる各々のチャンバに置かれる。
それから任意に、一般の培地は全てのバイオセンサをカバーするために各ウェルに配置され得る、または、各々の区画のために異なる培地は開示されている（１３０３）二つ間のいかなる組み合わせにもよって適用され得る。
溶液１３０３はマーカー（例えば刺激性事象をつくる分子）を含む、または、二次性の溶液は刺激性事象（１３０４）のための一つ以上の分子を含んで適用され得る。
バイオセンサはそれからモニタされることができて、測定される、そして、各々の区画またはセンサからの結果は集められることができて、比較され得る（１３０５）。
或る実施例において、本発明はバイオセンサマイクロプレートのユニークタイプを示し、そして、図１４の例に示されるように、光学バイオセンサ埋設多区画および多重井戸タイプマイクロプレートであり、各井戸が４つの区画を含み、各区画が１つの基質包埋導波路グレーティングを有している。
各々の区画が、細胞の寄主単一のタイプに使われる。
４つの区画は内壁によって分離され得る、内壁（好ましくは１００ミクロンおよび２ミリメータ間の）の体高は概して各ウェル（それは、いかなる所定のマイクロプレートもの典型的体高である）のそれら未満である、４つの区画を有する各ウェルがそうするように、細胞の多数の標的または多数タイプ上の１つの薬剤候補物質の効果を同時に検査するために用いる。
細胞培地溶液がある時が隣接した区画を有する交叉汚染のない前記区画の１つの区画および滞在にあてはまったように、ウェル内の区画は物理的なパリアによって分離され得る。
区画が２、３、４、５、６およびより多くでありえ得ると理解されなければならない。
多区画を有する各ウェルはより高い物理的なパリア（例えば典型的マイクロプレートのプラスチック壁）によって分離され得る。そうすると、親族大容積を有する一般の溶液が全ての区画をカバーする各ウェルに適用されることができて、単一のアッセイのために使われる。
【０２７１】
もう一つの実施例では、位置的を利用する方法および単一のチャンバまたはウェル内で単一センサまたは多数センサ内で多数の種類の細胞を生成する界面によって媒介されたトランスフェクションが、開示される。
単一センサのための、予め定められた領域がかつての細胞が培養されて、付いたように、材料を堆積させるために細胞に選ばれること、取込みはそうする材料、そして、したがって、中で結果修飾か再操作された細胞（堆積する材料のない他の領域を培養して、付いた原細胞とは別の）。
材料は、好ましくは標的遺伝子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドでありえる、そして、その派生物または抗原  ｏｌｉｏｇｏｎｃｕｌｅｏｔｉｄｅ、そして、その派生物または干渉ＲＮＡ（単一の要素をもつか重複の座礁された、または、あらゆる種）、または、抗体またはタンパク質、または、タンパク質ドメインまたは薬剤、または、ペプチド。
摘出される材料の異なる種または細胞によるｕｐｔａｋｅｎのために、特定のトランスフェクション試薬は、使って最適の効果に到達する。
かかる方法または組成は、細胞に制限のための方法に関連した材料のために少なくともＵＳ２００４／００２３３９１Ａ１およびＵＳ  ６，５４４，７９０（それは全体としてここに取り入れられる）にて説明したように、一致することを成し遂げられる。
【０２７２】
もう一つの実施例では、位置的を利用する方法および単一のチャンバまたはウェル内で単一センサまたは多数センサ内で多数の種類の細胞を生成する界面によって媒介されたトランスフェクションが、開示される。
単一センサのための、予め定められた領域がかつての細胞が培養されて、付いたように、材料を堆積させるために細胞に選ばれること、材料およびしたがって、中で結果が修飾した取込みまたは再操作された細胞（堆積する材料のない他の領域を培養して、付属する原細胞とは別の）は、そうする。
材料は、好ましくは標的遺伝子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドでありえる、そして、その派生物または抗原オリゴヌクレオチドそして、その派生物または干渉ＲＮＡ（単一の要素をもつか重複の座礁された、または、あらゆる種）、または、抗体またはタンパク質、または、タンパク質ドメインまたは薬剤、または、ペプチド。
摘出される材料の異なる種または細胞によるｕｐｔａｋｅｎのために、特定のトランスフェクション試薬は、使って最適の効果に到達する。
かかる方法または組成は、細胞に制限のための方法に関連した材料のために少なくともアメリカ文献ＵＳ２００４／００２３３９１Ａ１およびＵＳ  ６，５４４，７９０（それは全体としてここに取り入れられる）にて説明したように、一致することを成し遂げられる。
材料の沈着は、密着焼付け法技術（例えば技術を印刷しているピン）を使用するか、または装置または非接触の印刷技術（例えば調剤者装置または系）に印を押して達成され得る。
物理的パリアによって分離される同じウェル内の多バイオセンサのために、直接、材料を含んでいる溶液の沈着は、達成されたマイクロプレート調剤者でありえる。
かかる方法は、基質の界面の上へ供給材料のための方法に関連した材料のために、少なくとも、たとえば、アメリカ文献ＵＳ５８０７５２２  Ａ、ＵＳ６１０１９４６  Ａ、米国特許第５，７３１，１５２号、米国特許第５，８０７，５２２号、米国特許第５，６０１，９８０号、ＵＳ６６５６４３２  Ｂ１、ＥＰ０８９５０８２  Ｂ１またはＵＳ６３９９３９６  Ｂ１（それは全体としてここに取り入れられる）の説明として一致することを成し遂げられる。
【０２７３】
もう一つの実施例では、ウェル内で異なるセンサに位置する細胞のための位置溶液トランスフェクション手技を使用する、そして、物理的パリアによって分かれなかった方法が、開示される。
これらの方法は、細胞が予め培養されている各々の区画に、トランスフェクション試薬を混ぜ合わせられる材料の直接タイプ導入を使用することができて、センサに付属した。
たとえば、ＤＮＡを含有するトランスフェクション試薬液は、細胞が底基質の上へ配置された各々の区画に添加される。
（（５）光学バイオセンサを使用している標的の同定）
【０２７４】
薬剤標的は、開始期の基本的役割または特定の疾患のプログレッションを演奏する大部分はタンパク質を含む。
薬剤研究者がほぼ５００の生物学的な標的だけを研究することに限られていて、（(Drews, J., "Drug Discovery: A Historical Perspective" Science 2000, 287, 1960-1963)）。最近まで、ヒトゲノムのシークエンシングの完成については、利用できる潜在的な生物学的な標的の数は、非常に拡張されている。
ｇｅｎｏｍｉｃｓに基づく方法であけられるポテンシャル標的の数は、標的価値判断技術の莫大な必要をつくった。
従来の薬剤発見教育法は、しかし限られた数の標的ファミリだけ有して、アドレス指定を行う。
この状況は従来法が「インチを閉じ込められた」ことを示唆し、方法は速く主要な薬品会社の事務ゴールを満たすのに必要である新しい薬剤（例えば５当たり年に対する三）の数として、つくることができない。
従来の方法は、主要な疾患、例えば心臓血管疾患、神経変性疾患、癌およびタイプ−２つの糖尿か何かのための突破処理に主に会ったことのない医学のニーズを提供しそうにない。
これらの理由のために、標的価値判断は、最速成長のうちの１つおよびゲノム研究の大部分の臨界分野になった。
薬剤が臨床試験へ進むときに、標的タンパク質および疾患間のより強いリンクの確立は低い不全率を導く、そして、薬剤標的として価値があることを証明された標的のより短いリストはより大きい成功を導く。
加えて、タンパク質機能のより良い理解を成し遂げるより速い手段は、標的価値判断プロセスを短くする。
【０２７５】
薬剤発見において、標的価値判断は、一般に三大前提（感受期）を含む：
１）標的スクリーニング、２）標的の同定、そして、３）標的確証。
標的価値判断の第一および／または初期として、標的スクリーニング段階は、疾患プロセス（例えば遺伝子形質発現解析で同定される特定の遺伝子の増加機構）と関連する分子を同定することを含む。
標的の同定は、明らかに疾患プロセスで役割を演ずる分子を同定することを含む。
このように、かかるアプローチは、確実性のより大きい程度、しかし、可能性がまだ存在すると定める同定された標的が、最高種でないかまたは疾患プロセスを妨げるために最高結合部に付属しないまたはそれらが、それが疾患でｄｏｍｉｎａｔ役割を演ずることができない、または、薬剤による標的の癌または一時変異が不都合な副作用を導くので、標的が薬剤標的に適していないことを意味して、「ｄｒｕｇｇａｂｌｅ」であってはならない。
全部が成功している場合、標的確証まで進むことができて、選択された分子の中のいずれがｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃな変化を導くかについて決定するプロセスである調整される、（それが処理の標的として値を有することを示唆すること）。
【０２７６】
実施例において、光学バイオセンサによってモニタされる質量再分布に基づく、標的の同定および価値判断のために使われる方法が、開示される。
たとえば、シグナル伝達経路活性化、細胞運動性および形態学的変化に関連した質量再分布は、特定の標的の疾患会合のシグニチャとして使われるが、これら多数の変化が腫瘍プログレッションおよび移動の含むからである。
実施例において、方法は２種類の特定の標的による刺激性事象によって媒介された細胞のＤＭＲ応答の比較を含む。
図１５に示すように、光学バイオセンサ（１５０１）が用意される。
それから、細胞の特定タイプ細胞Ａ（１５０２）を含む細胞培地がバイオセンサに配置される。それから、緩衝液（１５０３）が任意に添加され得る。
特定の経路または受容体のモジュレータまたはポテンシャルモジュレータまたは細胞のような刺激性事象である特定のマーカーは、例えば溶液（１５０４）に加えられる。
それからバイオセンサは、細胞応答をモニタするために用いる（１５０５）。
この同じステップのセットは、第２のバイオセンサ（１５０６）上にて、そして、第２の細胞タイプまたは細胞培養で実行される（１５０７）。
第２のバイオセンサ（１５１０）の測定の後、２つの応答（１５０５）および（１５１０）が比較される（１５１１）。
【０２７７】
図１２は、指向性質量再分布に基づく標的の同定および価値判断のための代替方式を示す。
バイオセンサ（１２０１）が用意され、そして、このバイオセンサの一部は物理的に遮断され（１２０２）、よって、細胞がたとえバイオセンサ上に配置されても細胞はこのバイオセンサ遮断部上にて培養されなくなる。
それから細胞タイプＡを有する細胞培地を配置して、非遮断領域上で成長させるようにする（１２０３）。
それから、バイオセンサの遮断領域は非遮断とされて、そして、細胞の第２の培地たとえば細胞タイプＢが添加されて、タイプＢが遮断された領域（１２０５）上で培養されるようなる。
刺激性事象（１２０６）を与える分子を含む溶液は、それから供給される。
バイオセンサは、それから、２つの領域（初期の非遮断領域および遮断領域）からのデータが集められ比較されるように作動される（１２０７）。
【０２７８】
図１３は、指向性質量再分布に基づく標的の同定および価値判断のための代替方式を示す。
図１３は、バイオセンサが位置する事実に関連した開示された方法の一時変異にチャンバ（例えばミクロタイタープレートのウェル）の特定の点を提供する。
装置が利用される場合、それは多数チャンバを含む、そして、多数バイオセンサが使われる、そして、異なる細胞の解析または条件のセットを考慮に入れて、細胞の異なるタイプは各々のチャンバまたはバイオセンサ（１３０２）のために異なる各々のバイオセンサに配置され得る。
それから任意に、一般の培地は全てのバイオセンサをカバーするために各々のチャンバに配置され得る、または、各々のチャンバのために異なる培地は開示されている（１３０３）二つ間のいかなる組み合わせにもよって適用され得る。
溶液１３０３はマーカー（例えば刺激性事象をつくる分子）を含む、または、二次性の溶液は刺激性事象（１３０４）のための一つ以上の分子を含んで適用され得る。
バイオセンサはそれからモニタされることができて測定される、そして、各々からの結果は集まって、匹敵した（１３０５）。
【０２７９】
図２ａに示されたものと同様に、図１０は基礎成分に沿った典型的な標識フリーバイオセンサをを示す線図を示す。
光学ＬＩＤシステム１０００は光を制御するためのモジュール、データ生成のための電子技術および他成分、収集および解析からなる測定システム１００２を含む、そして、光学ＬＩＤバイオセンサ１００４は非常に使って質量再分布を検出して、モニタする。
質量再分布が起こる時がセンサのエバネッセント波の方向に合わせられて、方向質量として再分布と呼ばれるシグナルは、発生して、集められることができて、分析される。
しかし、再分布が起こる質量またはセンサに対する平行は力に表面をつけるまた、ある例えば、多くの出力パラメータ（例えばＰＷＨＭ、共鳴性帯域幅および形、その他）によって示されるように、光学バイオセンサによって検出される、ＧＰＣＲ１０２０または分子集合体のような分子の転位は細胞内区画（例えばエンドソームまたは小胞体）に、センサに直面している細胞表面からから起こってもよい。
かかる運動は、生体細胞１００８（１つだけ示される）で番号１００６をつけた矢印に示すように、一般に、侵入深さで決まるセンサの検知体積内の質量の減少を導く。
好適な実施例においては、測定システム１００２は、光学ＬＩＤバイオセンサ１００４（たとえば、ＳＰＲセンサ１００４や導波路グレーティングセンサ１００４）に対する計測を実行して、生体細胞１００８内の質量再分布を検出しかつ測定する。
このような計測は、光学ＬＩＤバイオセンサ１００４に対して適当なスペクトルや角度を持つ光ビーム１０１２を照射して、光ビーム１０１２が検知界面１０１０で反射されたときに、その反射光ビーム１０１４において前記質量再分布を表す共鳴角成分や波長応答成分が主成分となるように実行され得る。
よって、生体細胞１００８内に検出可能な質量再分布が存在すれば、光学ＬＩＤバイオセンサ１００４は、角度成分や波長成分の変化として観測される応答量変化を検出することが可能である。
そのような光学的応答量は、時間に関する関数として記録することができる。
このように、ここに議論されるように、生体細胞１００８内の質量再分布に導く動態バイオセンサ出力パラメータすなわち他パラメータのいかなる現象のを解析することが可能である。
【０２８０】
図１６を参照すると、光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４の上面１０１０上に置かれた（図中１個だけの）生体細胞１００８内のＧタンパク質共役型受容体１６０２（ＧＰＣＲ１６０２）の作動薬誘発性の転位を測定するために使用される光学ＬＩＤシステム１０００が図示されている。
すなわち、図は、作動薬誘発性でありかつ時間依存性の光学応答１６０１を示し、この光学応答１６０１の一部は、生体細胞１００８内の標的ＧＰＣＲ１６０２の転位に起因するものである。
当該細胞は、導波路型バイオセンサ１０１４の上面１０１０に付着している。
説明の便宜上、測定システム１００２は、符号"Ｃ"を付された部分には示されていない。
【０２８１】
図に示されているように、休止状態にあるＧＰＣＲ１６０２が細胞表面１６０４（形質膜１６０４）に位置する一方で、ＧＰＣＲキナーゼ１６０６（ＧＲＫ１６０６）とアレスチン１６０８とが生体細胞１００８の内部に一様に分布している（図"Ａ"を参照）。
作動薬による活性化に応じて、ＧＰＣＲ１６０２は、α、βおよびγというサブユニットからなるヘテロトリマーＧタンパク質を活性化する。
これらのＧαサブユニットおよびＧβγサブユニットは解離して、形質膜１６０４でＧＲＫ１６０６が受容体１６０２に補充されるように働く。
次に、ＧＲＫ１６０６は、ＧＰＣＲ１６０２のカルボキシ末端をリン酸化する。
そして、比較的豊富な細胞内タンパク質であるβ−アレスチン１６０８は、形質膜１６０４において細胞質内で急速に（数分以内に）活性化ＧＰＣＲ１６０２へ転位し、ＧＲＫリン酸化受容体を捕捉し、同族のＧタンパク質から当該受容体を切り離す（脱共役する）。
このとき、β−アレスチン１６０８は、脱感作されたＧＰＣＲ１６０２に結合し、細胞表面１６０４のクラスリンで覆われたピットに転位し、そこでは、受容体１６０２がクラスリンで覆われた小胞（ＣＣＶ：Clathrin-Coated Vesicles）に内面化される（図"Ｂ"参照）。
最終的に、完全な複合体１６０２，１６０６がエンドソーム１６１０（細胞内小胞１６１０）に運ばれる（図"Ｃ"参照）。
以上のプロセスは、転位（トランスロケーション）現象として知られている。
ＧＰＣＲ転位に関するより詳細な情報については、以下の３つの論文を参照されたし。・Ｄｒｅｗｓ，Ｊ．著、「薬物発見：１つの歴史観（Drug discovery: a historical perspective）」、サイエンス（Science）、２０００年、第２８７巻、１９６０〜１９６３ページ。・Ｍａ，Ｐ．、Ｚｅｍｍｅｌ，Ｒ．共著、「新規性の価値（Value of novelty）」、  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．、２００２年、第１巻、５７１〜５７２ページ。・Ｐｉｅｒｃｅ，Ｋ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．共著、「７つの膜貫通型受容体（Seven-transmembrane receptors）」、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２００２年、第３巻、６３９〜６５０ページ。上記３つの論文の内容は、本願明細書に援用されるものとする。
【０２８２】
上記の転位現象は、特定の時点で生体細胞１００８内の指向性質量再分布（たとえば、細胞表面の方向へ、あるいは細胞表面から離れる方向への再分布）をもたらし、結果として、長期間に亘って複数の異なる光学応答を生み出すものであることが分かる。
指向性質量再分布をもたらす可能性がある他の生物学的現象は、ＧＰＣＲ活性化に起因する細胞の形態的変化である。
かかる細胞の形態的変化の中には、細胞骨格の再構成や付着力の変化が含まれる。
細胞骨格は、真核細胞の細胞質の至るところに広がるタンパク質微細繊維の複合ネットワークであり、当該真核細胞内での多種多様な活動の実行に関わっている。
細胞骨格は、当該細胞に対する引張強度を与えるとともに筋収縮を可能にするものでもあり、細胞運動を行い、細胞内のシグナル伝達および輸送、細胞分裂、セル形状の変化に関係するものである。
Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の活性化は、理論的には細胞骨格の再構成に影響を及ぼすであろう少なくとも２つの独立した現象を引き起こす。
第１の現象は、細胞内のシグナル伝達経路の活性化であり、第２の現象は、受容体媒介のエンドサイトーシス（細胞食作用）（すなわち、転位現象）であり、このエンドサイトーシスは、ＧＰＣＲの大部分で作動薬による活性化が生じた後に起こる現象である。
作動薬またはＧＰＣＲの結合が生じた後に細胞内シグナル伝達経路が活性化すると、さらに２系統の関連現象が誘発される。
第１の系統では、二次の細胞内シグナル伝達経路の活性化をもたらすプロセスが誘発される（Ｇタンパク質−＞エフェクタ−＞メッセージ）。一方、第２の系統のメカニズムは、第１の系統の現象に作用することによって細胞内のシグナル伝達の度合いを調整するものである。
これらのメカニズムの中には、膜結合型受容体の下方制御（ダウンレギュレーション）、内部移行およびリン酸化反応や脱感作が含まれる。
双方の系統の現象が、細胞内のアクチン・フィラメントの再構成をもたらすことができると仮定する。
たとえば、ＧＰＣＲが活性化した後は、色々な形のＧタンパク質（たとえば、ＧαおよびＧβγ）がＦ−アクチン・フィラメントと結合し得る。また、前記のシグナル伝達分子等がアクチン・フィラメントから分離し得る。
受容体媒介のエンドサイトーシスを介して起こる膜結合型受容体の内部移行プロセスも、アクチン・フィラメントの動態に関与している可能性がある。
【０２８３】
また図１６を参照すると、本願発明によれば、光学ＬＩＤシステム１０００から得られた光学応答１６０１を解析することによって、生体細胞１００８内のＧＰＣＲ転位に関連する複数の異なる状態を特定し測定することができる。
事実、図１６に示される光学応答１６０１によれば、３つの異なる現象を特定することができる。
これら３つの主要な現象は、以下の通りである。（１）作動薬を入れると、大きな屈折率変化に起因して、シグナル１６０１に非常に大きく急激な低下を確認できる（すなわち、一般に化合物溶液は細胞媒体よりも比較的低い屈折率を有しているので、化合物を入れるとＬＩＤシグナルが低下する）。
（２）応答シグナル１６０１がほとんど２０分間に亘って緩慢に変化する移行期間を確認できる。この移行期間は、クラスリン被覆ピットに対する受容体１６０２の脱感作、アレスチン結合、ＧＲＫ１６０６による活性化された受容体のリン酸化反応、その他の細胞性応答あるいはこれらの組み合わせと関係しているのかもしれない。
（３）エンドソーム１６０２に対するＧＰＣＲ複合体１６０２，１６０８の転位に対応して、ほとんど５０分間に亘って応答シグナル１６０１の緩慢な低下を確認できる。
他の場合としては、初期段階の直後に生ずる付加的現象も、明らかに確認できる（たとえば、図１６）。すなわち、これは、主に、細胞媒体内の化合物の拡散現象や、細胞表面の活性化されたＧＰＣＲに対して細胞内の構成要素が補充された現象に起因する応答シグナル１６０１の増加を意味する。
光学ＬＩＤシステム１００２がこの検査をどのような方法で実行するのかにつき、図１７に示される方法１７００を参照しつつ以下に詳細に説明する。
【０２８４】
図１８は、ＤＭＲを使用している標的の同定の例を示す。
図１８の物質ＣＨＯ細胞が１０％の胎仔血清（ＦＢＳ）（示されないデータ）または０．１％のＦＢＳ（少なくとも１６時間）（１８０１）を含んでいる培地で培養されされようと、１５０ｍｌの細胞培地に５０ｍｌのＥＧＦ溶液の導入の直後に２０秒未満、概して続くシグナルの迅速変化を除いて、ＥＧＦ刺激作用は有意なＤＭＲ応答の否定結果を示さなかった。
この迅速変化は、バルク屈折率変化による。
対照的に、ＥＧＦの添加のような刺激性事象が起こるときに、Ａ４３１細胞のＥＧＦ−誘導応答は強く培養条件に依存する。
２０時間の０．１％のＦＢＳにおいて餓死Ａ４３１細胞のＥＧＦ−処理は、３つの逐次的な位相からなる時間依存応答（１８０２）を引き起こして、３つのバイオセンサ出力パラメータ、（ｉ）増加するシグナル（Ｐ−ＤＭＲ）（点Ｃ−Ｄ）を有する正の位相、
（ｉｉ）ネット−ゼロ位相（点Ｄ−Ｅ）、および、（ｉｉｉ）バルク屈折率変化の初期の急速位相の後の減少されたシグナル（Ｎ−ＤＭＲ）（点Ｅ−Ｆ−Ｇ）を有する減衰位相、を示した。
対照的に、増殖しているＡ４３１細胞（１０％のＦＢＳ）はＰ−ＤＭＲ位相（１８０３）を引き起こしたが、一方、それらの静止Ａ４３１細胞と比較して、４時間だけの０．１％のＦＢＳによって処理されたＡ４３１細胞は、変えられた動態および非常小さい振幅を有する以外、同様応答（１８０４）を引き起こした。
これらの結果は、例えば細胞シグナル伝達経路（すなわちこの特定のサンプルのＥＧＦ）の活性化物質または阻害物質を使用することで、マーカー−起因性ＤＭＲ応答に基づく細胞の所定のタイプの標的（例えばＥＧＦＲ）を同定または評価できることを示唆する。
（ｉ）  細胞シグナル伝達）
【０２８５】
細胞シグナル伝達が、開示されたシステム及び方法を使用してモニタされ得る。
例えば、図３を参照すると、本発明に係る光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４を用いて、生体細胞１００８内の作動薬誘発性のＧＰＣＲ活性化に起因する質量再分布をリアルタイムに測定する方法１７００の基本手順を示すフローチャートが図示されている。
この方法１７００は、（ａ）、光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４を用意し（ステップ１７０２）、
（ｂ）生体細胞１００８が光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４の上面１０１０に付着するように、光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４を覆う媒体の中に適当な数の生体細胞１００８を配置し（ステップ１７０４）、
（ｃ）必要に応じて、少なくとも１回、緩衝溶液を細胞媒体の中に添加し（ステップ１７０６）、
（ｄ）化合物（作動薬）含有溶液を細胞媒体の中に添加し（ステップ１７０８）、
（ｅ）光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４に対する計測を実行し、光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４上に培養された生体細胞１００８の時間依存性の光学応答１６０１を測定する（ステップ１７１０）、
という手順である。
【０２８６】
前述の化合物を添加する前に、ステップ１７０６を実行して緩衝溶液（前述の化合物を形成するために使用された緩衝溶液と同じもの）を生体細胞１００８に添加した場合には、生体細胞１００８が環境変化に応答することに起因する望ましくない効果を最小限に抑えることが可能であるという点に留意すべきである。
これは、光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４上に培養された生体細胞１００８が生き生きと活動しているからこそ可能となる。すなわち、そのような生体細胞１００８は、周囲の媒体組織の変化や温度変化を感知し、そのような変化に応答し得るからである。
これに対し、生体細胞１００８は、緩衝液を入れた場合と同様の変化を感知するので、化学物質をこれ以上導入しないと仮定すれば、前記の媒体組織の変化に対して耐性を持つことになる傾向がある。
【０２８７】
また、上記のリアルタイムに測定する方法１７００は定量化情報を与えるという点に留意すべきである。また、同様に重要なことは、当該方法は、ＧＰＣＲ活性化に起因する細胞内の質量再分布の動態情報を与えるという点である。
従来のＧＰＣＲのスクリーニング方法と比べて、この方法１７００は、標識に依存せずに、より高い感度で、より容易に実行することができ、既知の受容体が下流のシグナル伝達経路とどのように結合しているのかという予備知識や天然リガンドの予備知識を必要とせずに、全てのＧＰＣＲ１６０２に適用可能なものである。
［０２２９］  さらに、前記ステップ１７０４では、高い感度を得るために、最適条件下で培養されてからしばらく後に、細胞が光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４の上面１０１０上で接着性を持つようになりかつ高い密集度（必要に応じて７５％以上）を持つに至るように細胞の数が最適化される必要があるという点に留意すべきである。
【０２８８】
図１９を参照すると、本発明に係る光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４を用いて、生体細胞１００８内の質量再分布に基づいて標的ＧＰＣＲ１６０２に対する作動薬のスクリーニングを実行する方法１９００の基本手順を示すフローチャートが図示されている。
この方法１９００は、（ａ）光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４を用意し（ステップ１９０２）、
（ｂ）生体細胞１００８が光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４の上面１０１０に付着するように、光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４を覆う媒体の中に適当な数の生体細胞１００８を配置し（ステップ１９０４）、
（ｃ）光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４が安定化するまでのしばらくの間に、既知の親和性（結合力）を持つ拮抗薬を一定濃度で含む溶液を細胞媒体の中に添加し（ステップ１９０６）、
（ｄ）受容体と結合した拮抗薬から離れて競合するために十分な高い濃度を有する化合物（作動薬）を含む溶液を細胞媒体の中に添加し（ステップ１９０８）、
（ｅ）光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４に対する計測を実行して、光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４上で培養された生体細胞１００８の時間依存性の光学応答１６０１を測定する（ステップ１９１０）、
という手順である。
【０２８９】
この方法１９００では、生体細胞１００８内の１つの受容体に拮抗薬を予め添加することにより、この特殊な受容体に対する作動薬用化合物の効果的なスクリーニングを行うことが可能になる点に留意すべきである。
さらに、この方法１９００は、当該方法１９００が生体細胞１００８における同族受容体用の化合物の機能性に関する予備知識を必要とするという一点を除いて、上記方法１７００と同様の方法である点に留意すべきである。
たとえば、拮抗薬がＧＰＣＲ１６０２の活性化を抑制するか否か、あるいは、拮抗薬がＧＰＣＲ１０２０を活性化させて転位をもたらすか否かを知っておくことが必要である。
【０２９０】
図２０を参照すると、本発明に係る光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４を用いて、生体細胞１００８内の質量再分布に基づいて標的ＧＰＣＲ１６０２に対する拮抗薬のスクリーニングの方法の基本手順を示すフローチャートが図示されている。
この方法２０００は、（ａ）光学的ＬＩＤバイオセンサを用意し（ステップ２００２）、
（ｂ）生体細胞１００８が光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４の上面１０１０に付着するように、光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４を覆う媒体の中に適当な数の生体細胞１００８を配置し（ステップ２００４）、
（ｃ）転位が起こらないように、短時間の間に、既知の親和性（結合力）を持つ作動薬を一定濃度で含む溶液を細胞媒体の中に添加し（ステップ２００６）、
（ｄ）当該短時間が経過した後、一定濃度を有する化合物を含む溶液を細胞媒体の中に添加し（ステップ２００８）、
（ｅ）光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４に対する計測を実行して、光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４上に培養された生体細胞１００８の時間依存性の光学応答１６０１を測定する、
という手順である。方法１９００と同様に、この方法２０００は、生体細胞１００８内の標的ＧＰＣＲ１６０２に関する予備知識を必要とし、この特殊なＧＰＣＲ１６０２に対して、生体細胞１００８を前処理するための作動薬あるいは拮抗薬を事前に選別しておくことが必要である点に留意すべきである。
【０２９１】
上記ステップ２００６とステップ２００８を一体化して単一のステップにすることが可能である点に留意すべきである。すなわち、細胞内で標的ＧＰＣＲに知られた作動薬を、化合物とともに与えることが可能である。
また、上記方法１７００と同様に、検査対象の化合物を最初に導入し、続けて、既知の作動薬を入れることができる。
【０２９２】
さらに、自己参照型の光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４を用いて、上記方法１７００，１９００，２０００の各々をさらに強化することができる。
光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４の性能は、一般に、光学的特性や当該センサの設計内容および特性の影響を受けること、並びに周辺温度や圧力といった環境変動の影響を受けることがよく知られている。
自己参照型の光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４を使用することの主な利点は、上面１０１０が参照領域とサンプル領域とを有するので、これにより、当該サンプル領域を用いて生体細胞１００８内の質量再分布を検出することが可能になると同時に、参照領域が当該参照領域に付着する生体細胞１００８を持たないようにすれば、このような参照領域を用いて、生体細胞１００８内の質量再分布の検出に悪影響を与え得る偽の変化量を参照することが可能になる、という点である。
【０２９３】
１つの実施例によれば、図２１に示す方法２１００に従って自己参照型の光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４を構成することができる。
この自己参照型光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４は、以下の手順を用いて構成できる。すなわち、
（ａ）光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４を用意し（ステップ２１０２）、
（ｂ）軟質スタンプ（たとえば、ゴム製スタンプ）を用いて光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４の上面１０１０の一領域（参照領域）を物理的に遮断し（ステップ２１０４）、
（ｃ）光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４の遮断されていない領域（サンプル領域）を覆う成長媒体の中に適当な数の生体細胞を配置し（ステップ２１０６）、
光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４上の遮断されていない領域に生体細胞１００８が付着した後に、前記軟質スタンプを除去する（ステップ２１０８）。
この時点で、方法１７００，１９００，２０００で説明した通りの生体細胞分析を実行する。
ここで、細胞研究のため、異なる方法を適用して自己参照型ＬＩＤセンサを構成することが可能である点に留意すべきである。
たとえば、物理的な遮蔽物を用いてセンサを２つの部材に分割し、一方の部材にのみ媒体内の細胞を付着させることができる。
細胞が付着した後にその物理的な遮蔽物を除去すればよい。
【０２９４】
次に、本発明の他の特徴については、多重細胞分析（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  細胞  ａｓｓａｙｓ）の重要性が増大しており、スループット（処理量）の増大のためだけではなく、単一分析から利用できる優れた確証的な情報のためにも多重細胞分析は重要であることがよく知られている。
よって、本発明がさらに多重生体細胞分析を同時に実行するように強化されることが望ましい。
【０２９５】
１つの実施例として、図２２に示す方法２２００を用いて多重生体細胞分析を同時に実行するように本発明を強化することができる。
方法２２００によれば、以下の手順により、複数種の生体細胞１００８における作動薬誘発性のＧＰＣＲ活性化に起因する質量再分布を測定することができる。
すなわち、（ａ）光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４を用意し（ステップ２２０２）、
（ｂ）光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４の上面１０１０の一部部位に生体細胞１００８が付着することを防止するスタンプを用いて、光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４の上面１０１０の当該部位を遮蔽し（ステップ２２０４）、
（ｃ）光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４の上面１０１０のうちの遮蔽されていない部位を覆う細胞媒体の中に第１のタイプの生体細胞１００８を配置して、光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４の上面１０１０のうちの遮蔽されていない部位に生体細胞１００８が付着できるようにし（ステップ２２０６）、
（ｄ）光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４の上面１０１０からスタンプを除去し（ステップ２２０８）、
（ｅ）光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４を覆う細胞媒体の中に第２のタイプの生体細胞１００８を配置して、光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４の新たな暴露表面（遮蔽物が除去された表面）１１０に当該第２のタイプの生体細胞１００８が付着できるようにし（ステップ２２１０）、
（ｆ）光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４の上面１０１０に配置された細胞媒体の中に化合物含有溶液を添加し（ステップ２２１２）、
（ｇ）光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４に対する計測を実行して、光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４上にある２タイプの生体細胞１００８内の質量再分布を表す時間依存性の光学応答１６０１を測定する（ステップ２２１４）、
という手順である。前述した２タイプの細胞を互いに関連付けることができる点に留意すべきである。たとえば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ  細胞ｓ）に対して、過剰発現した標的受容体を含む遺伝子操作されたＣＨＯ細胞を関連付けることができる。
【０２９６】
この方法は、多重細胞分析を可能にするだけでなく、標的受容体の発現量を除いて２つの細胞は同じであるから、２つの異なる細胞に作用する同一化合物の光学的応答量を比較することにより標的受容体へ化合物が与える効果に関する確証的結果を提供するものである。
【０２９７】
他の実施例として、図２３に示す方法２３００を用いて多重生体細胞測定を同時に実行するように本発明を強化することができる。
方法２３００によれば、以下の手順に従って、複数種の生体細胞１００８における作動薬誘発性のＧＰＣＲ活性化に起因する質量再分布を測定することができる。
すなわち、（ａ）複数の光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４からなる配列を含むチャンバー（マイクロプレート）を用意し（ステップ２３０２）、
（ｂ）これら光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４のうちの少なくとも１つのバイオセンサを覆う細胞媒体の中に第１のタイプの生体細胞１００８を配置し、当該少なくとも１つのバイオセンサ１００４の上面１０１０に当該第１のタイプの生体細胞１００８が付着できるようにし（ステップ２３０４）、
（ｃ）被覆されていない残る光学的ＬＩＤバイオセンサのうちの少なくとも１つのバイオセンサを覆うように細胞媒体の中に第２のタイプの生体細胞１００８を配置して、当該少なくとも１つの残る光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４の上面１０１０に当該第２のタイプの生体細胞１００８が付着できるようにし（ステップ２３０６）、
（ｄ）覆いのある光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４の上面１０１０に置かれた細胞媒体の中に化合物含有溶液を添加し（ステップ２３１０）、
当該覆いのある光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４に対する計測を実行して、当該覆いのある光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４の各々の生体細胞１００８内の質量再分布を表す時間依存性の光学応答１６０１を測定する（ステップ２３１２）、
という手順である。
【０２９８】
ＬＩＤセンサ上には、互いに異なる複数の標的受容体遺伝子を有しかつ互いに異なる複数のＤＮＡベクターからなる配列をトランスフェクション試薬と一緒に堆積することができる点、並びに、単一タイプの細胞がそのような配列と重畳するように置かれて当該標的受容体遺伝子を取り込む点に留意すべきである。
したがって、各スポット領域に重畳された細胞のみが形質導入されることとなり、この結果、形質導入型細胞クラスター配列を形成することとなる（米国特許第６５４４７９０号"Reverse transfection method"）。
同様に、タンパク質細胞導入試薬と複合した複数の機能性受容タンパク質からなる配列を、類似の形質導入型細胞クラスター配列に利用することが可能である（米国特許出願公開第２００４／００２３３９１号； "Methods and devices for protein delivery"）。
現存の技術を用いれば、いずれのタイプの形質導入型細胞配列も化合物スクリーニングのために利用することが可能である。
【０２９９】
さらに他の実施例として、図２４に示す方法２４００を用いて単一タイプの細胞において多重標的スクリーニングを同時に実行するように本発明をさらに強化することができる。
方法２４００によれば、以下の手順を実行することにより、単一タイプの生体細胞１００８内の複数のＧＰＣＲに対する作動薬のスクリーニングを行うことができる。
すなわち、（ａ）光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４を用意し（ステップ２４０２）、
（ｂ）光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４を覆う細胞媒体の中に生体細胞１００８を配置して、生体細胞１００８が光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４の上面１０１０に付着できるようにし（ステップ２４０４）、
（ｃ）複数の拮抗薬の混合溶液からなる溶液を添加し（ステップ２４０６）、
（ｄ）光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４の上面１０１０に置かれた細胞媒体の中に化合物含有溶液を添加し（ステップ２４０８）、
（ｅ）光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４に対する計測を実行して、生体細胞１００８内の質量再分布を表す時間依存性の光学応答１６０１を測定する（ステップ２４１０）、という手順である。
【０３００】
上記方法２４００を変形することにより同一の細胞株にある複数の受容体に対する拮抗薬のスクリーニングを実行するように同様の方法を適用することが可能である点に留意すべきである。
上記ステップ２４０６で使用された複数の拮抗薬からなる混合溶液の代わりに、上記化合物からなる溶液を使用すると同時に、上記ステップ２４０８で使用された化合物溶液に代えて、複数の拮抗薬からなる混合溶液を使用することができる。
（（１）  輸送動態研究の重要性）
【０３０１】
シグナル伝達経路細胞およびそれらの関連する細胞活性に関する動態および他細胞変化は細胞生物学および生理学を理解するだけではないことにとって極めて重要である、しかし、それらはまた、細胞アッセイ現像および薬剤発見にとって重要である。
たとえば、ＥＧＦＲシグナル伝達ネットは、ほとんど瞬間的な反応（リガンド結合の後の受容体リン酸化）から、多数分（ライソソームに対する小胞形成またはソーティング）を通じて起こる反応または特定の細胞株の形態学的変化まで変動している反応を含む。
ＥＧＦＲの中で輸送ことは多数ステップで管理される。そして、エンドサイトーシス、早いｅｎｄｏｓｏｍａｌなソーティングおよびライソソームターゲッティングを含む。
内部移行の後、ＥＧＦＲは形質膜へ往復されるか遅発タイプまたはｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒエンドソームに輸送される。
後期エンドソームの受容体は、減生のためのライソソームに更にソートされるかまたは細胞表面に戻ってリサイクルした。
受容体の占有は、ソーティングプロセスの各々のステップに参加するそれらの能力を書き取らせる。
ＥＧＦＲシグナル伝達カスケードおよびその活性化配列の主要な階層が周知であるにもかかわらず、細胞発育、生残または分化のような異なる細胞応答を制御する合併した動態ネットワークおよび臨界なシグナル伝達現象は不十分だが理解される。
リガンドによって媒介されたＥＧＦＲ活性化による細胞応答のリアルタイム動態を測定する技術は、非常にシグナル伝達カスケードおよびネットの動態についてよく知っていることのためになる。
（（２）  Ｇ−タンパク質共役型受容体経路）
【０３０２】
ＧＰＣＲは、細胞表面受容体のファミリに帰属して、新薬化合物が設計される最も一般の標的の中である。
ＧＰＣＲが外部性シグナル（すなわち新薬のような刺激の存在）を細胞内に変換するので、ｒｅｓｐｏｎｓｅ（ｓ）はそれらを薬剤標的として、そして、新薬を試験するために極めて価値があるようにする。
【０３０３】
たとえば、ＧＰＣＲはシグナル伝達経路細胞の広いアレーに関与している。
リガンド結合は、受容体配座変化と、受容体オリゴマー形成と、Ｇタンパク質活性化（Ｇαサブユニット上のＧＤＰ−ＧＴＰ交換、ＧαおよびＧβγ脱会合、受容体からのＧタンパク質デカップリング、Ｇα−およびＧβγ−シグナル伝達複合体の生成）と、下流のシグナル伝達活性化（二次メッセンジャ生成（Ｃａ２＋可動化、inositoltriphosphateな生成および／または細胞内のｃＡＭＰレベル転形）を導く）と、を含む一連の細胞内および細胞のシグナル伝達現象を始め、そして最終的に、特定の遺伝子形質発現の変化を起こす結果となる。
リガンドによって媒介されたＧＰＣＲ活性化も、細胞表面からＧＰＣＲの脱感作および多くの細胞内のタンパク質の輸送を導き、同じく、標的細胞のフェノタイプ、形態および物性の変化を導く。
これらの変化は、静的、長期持続または動的（例えばサイクリングまたは振動）である。
異なるシグナル伝達現象は、ミリ秒（例えばＧＰＣＲ配座変化）から、何十秒（例えばＣａ２＋フラックス）、何十分（例えば遺伝子形質発現または形態学的変化）、までの範囲で変動して、かなり異なる動態を呈する。
現在のＧＰＣＲアッセイは、リガンド受容体結合、二次メッセンジャ（Ｃａ２＋、ＩＰ３のｃＡＭＰ）アッセイ、タンパク質相互作用アッセイ、転位アッセイおよびリポータ遺伝子アッセイを含む。
ＧＰＣＲ活性化が最終的に輸送タンパク質および／または形態学的変化を導くので、細胞表面上のＧＰＣＲによるいかなる化合物の作用および続く遂行された細胞現象（例えば、輸送ことおよび／または形態学的変化）を研究する方法が要求される。
（（３）  シグナル伝達経路受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ））
（（ａ）  ＲＴＫｓの多様性）
【０３０４】
大きいグループの細胞表面受容体にわたっている膜として機能するタンパク質のために、真核生物がコード化する全ての遺伝子。
膜受容体は、それらが認識するリガンド、それらが誘導する生物応答およびそれらが有する一次構造に基づく異なるファミリに分類され得る。
細胞表面受容体の１つの大ファミリは、固有タンパク質チロシンキナーゼ活性を与えられる。
これらの受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫｓ）は、標的タンパク質上のＹの水酸基にＡＴＰのリン酸塩の移植に触媒作用を及ぼす。
ＲＴＫｓは、細胞周期を含んでいる大部分の基本的細胞過程、細胞移動、細胞代謝および生残（細胞増殖および分化と同様に）の制御時に重要な役割を演ずる。
【０３０５】
受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫｓ）は、タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫｓ）の表面のファミリに帰属する。
ＰＴＫｓは、大きくて多様な多遺伝子族である。
それらの主関数は、生物の多細胞見方の調節を含む。
成長に関する細胞シグナルに対する細胞、分化、接着、運動性および死亡は、チロシンキナーゼでしばしば伝達される。
対照的に、セリン／トレオニンキナーゼファミリ（例えばサイクリン依存しているキナーゼおよびＭＡＰキナーゼ）の多数は、真核生物の全体にわたって節約されて、単細胞で多細胞有機体のプロセスを管理する。
人間において、チロシンキナーゼは多数疾病状態の現像で有意な役割を演ずるために示された。そして、糖尿および癌を含んだ。
歴史的に、チロシンキナーゼはオンコ遺伝子の原型的なクラスを定義する。そして、人間悪性の大部分の形態に関係している。
チロシンキナーゼ遺伝子は、また、多種多様な先天の遺伝的症候群に結合された。
チロシンキナーゼは、タンパク質セリン／Ｔおよび構成メンバをチロシンキナーゼと明らかに同定しているユニークなサブドメインモティーフを有する二相の特異性キナーゼ以外のそれらに、非常に節約された触媒作用のドメイン同様を含む。
チロシンキナーゼ遺伝子は、海綿動物、刺胞動物、ネマトーダ、環形動物、節足動物、きょく皮動物および脊索動物、その他において特徴づけられた。
いずれのイントロンも／エキソン構造または系統的配列解析に基づく、人間のチロシンキナーゼは、２０の受容体および１０の非受容体クラスに分類され得る。
【０３０６】
全ての受容体チロシンキナーゼは、通常グリコシル化されて、受容体二量体化に関係しているドメインを結合している細胞外のリガンドを含む。
ドメインをリガンド結合は、単一の膜内外ヘリックスによる細胞質のチロシンキナーゼドメインに対する結合である。
細胞質のドメインは、異種タンパク質キナーゼによって自己リン酸化およびリン酸化に従属する節約されたタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）コアおよび追加の調節配列を含む。
ＲＴＫｓは、受容体のいくつかのサブファミリへの更なる広告でありえる：
インシュリン受容体（ＩＲ）ファミリ、ｅｐｉｄｍｅｒａｌな成育因子（ＥＧＦ）受容体ファミリ、たとえば、ＰＤＧＦ受容体ファミリ。
受容体チロシンキナーゼの上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリは、４つの受容体、ＥＧＦ−Ｒ（ＥｒｂＢ１）、ＥｒｂＢ２（Ｎｅｕ）、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４からなる。
（（ｂ）  ＲＴＫｓの二量体化）
【０３０７】
ＲＴＫｓのインシュリン受容体（ＩＲ）ファミリを除いては、全ての周知のＲＴＫｓ（例えばｅｐｉｄｍｅｒａｌな成育因子（ＥＧＦ）受容体、ＰＤＧＦ受容体）は、細胞膜のモノマーである。
リガンド結合は、それらの細胞質のドメインの自己リン酸化に結果としてなっているこれらの受容体の二量体化を誘発する。
ＩＲファミリの構成メンバは、２２のヘテロダイマを形成している２つのポリペプチド鎖のジスルフィド結合されたダイマーである。
ＩＲの細胞外のドメインに対するインシュリン結合は、細胞質のドメインの増加する自己リン酸化に至る四原子ヘテロテロラメリック（heterotetrameric）構造の再配列を誘発する。
【０３０８】
全部ＲＴＫｓが二量体化によって活性化されるにもかかわらず、異なるリガンドは異なる活性ダイマー状態の発生を誘発する。
特性リガンドは、ダイマー対を定義する；
順番に、ダイマー対は、シグナル伝達経路を定義する。
（ＧＨ受容体（ＧＨＲ）を有する複合体における成長ホルモン（ＧＨ）およびＥＰＯ受容体（ＥＰＯＲ）を有する複合体におけるエリスロポイエチン（ＥＰＯ）の構造学はこれらのサイトカインが二価であることを示す。そして、１つのリガンドは同時に２つの受容体に結合して１：２（リガンド：受容体）複合体を形成する。
受容体二量体化は、追加の受容体：受容体相互作用によって更に安定させられる。
ＲＴＫｓおよびサイトカイン受容体の細胞外で細胞質のドメインのユニーク構成を有する受容体ダイマーの特定の形態だけは、トランス−自己リン酸化およびＰＴＫ刺激作用を導く。
（（ｃ）  ＥＧＦＲ）
【０３０９】
４つの構成メンバからなる上記したように、ＥＧＲ受容体は、受容体のチロシンキナーゼファミリに帰属して、実質的に哺乳類の全ての器官において表される。
ＥＧＦ受容体は、胎生期および生後発育の間、そして、腫瘍のプログレッションにおいて複合した役割を演ずる。
成長および分化のそれらの役割から離れて、ＥＧＦＲ受容体は、トランスアクチベーションプロセスに参加して、他受容体（例えばＧＰＣＲ）を有するクロストークに関係している。
（（ｄ）  シグナル伝達経路ＥＧＦＲ）
【０３１０】
その同族リガンドによるＥＧＦＲのエンゲージメントは、多くの細胞内のシグナル（図３８に示すように）の生成に結果としてなる。
以下のリガンドが結合して、初期の変化は、他ファミリ、受容体のキナーゼ活性の活性化および細胞質のドメインのＹ残基上の受容体の自己リン酸化を有する形態ホモダイマまたはヘテロダイマに対する受容体二量体化である。
受容体自己リン酸化はＳｒｃ相同２（ＳＨ２）のような特定のタンパク質相互作用ドメインにドメインを運んでいる多くの二次性のシグナル伝達タンパク質類のためのドッキング部位の生成に結果としてなる。そして、それは具体的には、リン酸化されたＹ残基と相互に作用する。
各々のｄｉｍｅｒｉｃな受容体複合体は、異なるＳＨ２を含有するエフェクタタンパク質を入れることによって異なるシグナル伝達経路を始める。
この相互作用の結果として、これらの二次性のシグナル伝達タンパク質類は、動作中になることができて、多くの下流シグナルの引き起こす。
たとえば、接着体タンパク質（Ｇｒｂ）を有する複合体がグアニンヌクレオチド解離因子（ＳＯＳ）に結合した活性ＥＧＦ−Ｒダイマー。
複合体がそうするＧｒｂ−ＳＯＳも、直接受容体のまたは間接的にＳｈｃによるホスホチロシン部位に結合する。
これらのタンパク質相互作用はＲａｓに近い接近にＳＯＳをもたらす。そして、Ｒａｓ活性化を考慮に入れる。
これは、その後、順番に、遺伝子形質発現を進めて、細胞増殖に貢献する転写因子（例えばｃ−ｆｏｓ、ＡＰ−１およびＥｌｋ−１）を活性化するシグナル伝達経路ＥＲＫおよびＪＮＫを活性化する。
細胞増殖を進める１つの特定の経路は、シグナル伝達タンパク質Ｓｈｃ、Ｇｒｂ２、Ｓｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫおよびＥＲＫ／ＭＡＰＫを含んで、Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路として公知である。
（（ｉ）  ＥＧＦＲシグナル伝達および質量再分布）
【０３１１】
ＥＧＦＲｓのためのリガンドは、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ、ヘパリン−結合ＥＧＦのような成育因子、ｂｅｔａ細胞ｕｌｉｎおよびｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎを含む。
ＥＧＦＲは多くの異なるリガンドのいかなる一つもの結合によって活性化され得る。そして、それぞれは生物応答のいくぶん異なるスペクトルを刺激するように見える。
さらに、異なるＥＧＦＲリガンドは、受容体微小環境（例えばｉｎｔｒａｖｅｓｉｃｕｌａｒペーハー）の関数として、受容体に結合するそれらの能力において変化する。
【０３１２】
結合の後、活性ＥＧＦＲは、エンドサイトーシスによって速く内面化される。
受容体依存性エンドサイトーシスは形質膜からの細胞表面受容体およびそれらの貨物の特定の除去を許して、エンドソームにそれらを標的とする。ここで、それらはダウンレギュレーションまたはリサイクリングのためにソートされる。
エンドサイトーシスの後、受容体−リガンド複合体は、それらのｉｎｔｒａｖｅｓｉｃｕｌａｒ環境において変化するいくつかの異なる区画を通過する。
細胞の区画（輸送として参照した）の中の受容体運動は、複合体の活性に対する有意な影響を有する。
異なる細胞内の区画も、ＥＧＦＲキナーゼのいくつかの基質に、それらのアクセスにおいて変化する。
異なるエンドサイトーシス区画の基質アクセスおよびリガンドに依存する活性間の結合した類縁は、輸送ことは各々のリガンドに情報ユニークを「復号化する」ように機能してもよいことを示唆する。
さらに、リガンド−受容体相互作用の残存は、輸送受容体を制御する。
このように、受容体エンドサイトーシスおよび減生は、シグナルの大きさ、応答の特異性および応答の持続期間を制御する重要な機構でる。
【０３１３】
ＥＧＦＲのリガンド起因性内部移行は、飽和性プロセスであり、さらに、ＥＧＦＲ形質発現のレベルにおいて受容体の損なわれた内部移行を導く特定の限界を越え増加する。
【０３１４】
ＥＧＦ受容体は、誘導された経路または構成する経路によって内面化され得る。
誘導された経路で形成される小胞は、被覆−ピット媒介された早期エンドソーム（ＥＥ）小胞と称する。Ａｌ  ＥＥ小胞はソーティング段階を通り抜けるか、細胞表面に戻るか後期エンドソーム（ＬＥ）になる。
ＥＥ小胞が形質膜（ＰＭ）に戻ってリサイクルするときに、その受容体の全ては形質膜の部分になり、そして、いかなる解放されたリガンドも細胞外の培地に放出される。
同様に、ＥＥ小胞がＬＥになるときに、その内容の全てはＬＥへ移される。
形質膜に対するリサイクリングおよび後期エンドソームになる速度は、ＥＥ小胞のタイプに依存する。
エンドサイトーシス小胞は、非常に速い速度または遅れ（すなわち、ゆっくり）た後、形質膜へリサイクルされる。
通常、被覆−ピットＥＥ小胞は、ゆっくり形質膜に戻ってリサイクルする、そして、その結果、被覆−ピットＥＥ小胞のかなりのパーセンテージが、ＬＥ．になる
対照的に、構成するＥＥ小胞はより耐性の再循環速度を有する、そして、このように、それらのほとんどは形質膜に戻る。
受容体は、ＬＥのソーティングの第２の段階を通り抜けられるか、減生のためにタグを付けられるか、ライソソームに送られるか細胞表面へリサイクルされる。
小さい小胞は、特定の速度でソーティングエンドソームから逃げる。
この小胞も等級を下げられるその内容のためのライソソームに溶ける、または、それは形質膜の方へ戻ってリサイクルする。
力学的に、後期エンドソームからリサイクルしている受容体は、ｇｏｌｇｉを通過しそうである。
それらのエンドサイトーシスプロセスのネット結果は、ＥＧＦＲ活性化の後、細胞の指向性質量再分布を導く。
【０３１５】
特定の細胞株の細胞のコンテクストに従い、リガンド起因性ＥＧＦＲ活性化は、他と比較した主要成分になる異なるシグナル伝達経路または多数のシグナル伝達経路を導くであろう。
さらに、ＥＧＦＲｓの発現量は、１から他の細胞株まで変化してもよい。
それのため、リガンド起因性ＥＧＦＲ活性化によって媒介された細胞内の質量再分布は異なる細胞株の中で変化してもよい。
たとえば、人間の表皮がんＡ４３１細胞が、過剰発現するＥＧＦＲｓ（細胞につき約１，７００，０００コピー）を内生的にすることは公知で、このようにＥＧＦＲシグナル伝達のためのイデアルモデルとして使われた(D.W. Barnes, "Epidermal growth factor inhibits growth of A431 human epidermoid carcinoma in serum-free cell culture," J. Cell. Biol. 1982, 93, 1-4)。
ＥＧＦを結合すると、即座に、Ａ４３１細胞のＥＧＦＲｓは、動作中になって、Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路を含んでいる異なる経路で、さまざまな細胞応答を導く。
たとえば、３７℃でのＥＧＦを有する静止Ａ４３１細胞の刺激作用は、細胞外のマトリックスから最終的に受容体エンドサイトーシス、ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ形態学的変化および細胞離断を導く(Z. Lu, G. Jiang, P. Blume-Jensen, and T. Hunter,  "Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase," Mol. Cell Biol. 2001, 21, 4016-4031. and Y. Danjo and I. K. Gipson, "Actin 'purse string' filaments are anchored by E-cadherin-mediated adherens junctions at the leading edge of the epithelial wound, providing coordinated cell movement," J. Cell Sci. 1998, 111, 3323-3332)。
また、受容体エンドサイトーシスはＥＧＦシグナルを減らす重要な細胞過程である。但し、若干の証明はＥＧＦ受容体複合体がｅｎｄｏｓｏｍａｌな区画のシグナルに続くことを示唆する。
エンドサイトーシスプロセスは、多数ステップを含む：
活性受容体に対する細胞内成分の加入、エンドソームへの結果としてなられた複合体の次の内部移行、細胞内のいくつかの区画の中の内面化された受容体複合体の運動および最終的に細胞膜に対する減生およびリサイクリング背。
細胞の密度が受容体および密度に表面をつけて、それらのリガンドの大きさのため、加えて、そして、受容体輸送と同様に使用する（例えばＡ４３１細胞株）細胞株の形態が活性化の後、引き起こすＲＴＫ経路の多くのシグナル伝達現象が、指向性質量再分布にある。
たとえば、細胞表面ＥＧＦＲｓに対するリガンドの結合は、細胞表面で質量の増加を導く；
短い期間の間の質量再分布のネット−ゼロ−変化の活性ＥＧＦＲｓ結果と相互に作用している逐次的な自己リン酸化および細胞内成分。
活性受容体の中で輸送は、各細胞の異なる区画内で有意な質量再分布を導く。
【０３１６】
質量再分布のための可能な他の資源は、細胞骨格再配列による。
たとえば、ＥＧＦＲ輸送プロセスは、細胞膜の表面上のタンパク質グレーティングに、形質膜、クラトリンの会合体によって形成される構造およびアダプタでクラトリン−被覆−ピットに、受容体の加入によって始められる。
六角形配列へのクラトリンのポリメリゼーションは懸垂足場をアダプタを組織するために提供する。そして、それは内面化された受容体の細胞質のドメインの配列モティーフを認識する。
アクチン細胞骨格はクラトリン−被覆−ピットの発生に貢献すると考えられる。但し、アクチンフィラメントとエンドサイトーシス機構を接続する特定の成分は不明である。
Ｃｏｒｔａｃｔｉｎは、Ｆアクチン関連のタンパク質であって、膜内で培養細胞の火ぶくれを局所化して、大きいＧＴＰアーゼダイナミンの直接の結合パートナーである。
アクチンおよびダイナミンと共に、Ｃｏｒｔａｃｔｉｎは受容体によって媒介されたエンドサイトーシス機構(Bajzer, Z., et al., "Binding internalization, and intracellular processing of proteins interacting with recycling receptors - a kinetic analysis", J. Biol. Chem. 1989, 264:13623-13631)の重要な成分である。
（（ｉｉ）  ＥＧＦＲｓの構成する活性）
【０３１７】
受容体モノマーが受容体ダイマーを有する平衡においてあると思われる。
受容体ダイマーの限られた個体群が、ＰＴＫ活性（活性ダイマー）のトランス−自己リン酸化および刺激作用と互換性を持つ構成のそれらの細胞外で細胞質のドメインの四次構造によって存在する。
細胞外のドメインに対するリガンド結合は、活性ダイマーおよび従ってＰＴＫ刺激作用の発生を安定させる。
ＲＴＫｓの自己リン酸化がリガンド結合の非存在下でさえチロシンホスファターゼの阻害物質によってまたは受容体過剰発現によって強化されるので、活性ダイマーがリガンド結合の非存在下でさえ存在することを提案された。
実験は、形質膜上にて１分当たり、２％の非結合（リガンドなしの）および１５％のリガンド結合の受容体が内面化されことをを示す。
さらには、静止Ａ４３１細胞においては、成育因子の比較的低い濃度（例えばウシ胎児血清（ＦＢＳ））（重量の０．５％未満）を含んでいる培地またはいかなるＦＢＳのない培地において、細胞を培養することによって得られ、その構成性によるＥＧＦＲのさらに若干の程度リン酸化がある。
【０３１８】
図７は、ＥＧＦ刺激作用が強い用量依存的ダイナミック応答（図７Ａ参照）を導くことを示す；
ＥＧＦの濃度が増加するように、応答を定義している３つの主要なバイオセンサパラメータはかなり変わる。
ＥＧＦ濃度はより高くなり、１）より大きいＰ−ＤＭＲてＮ−ＤＭＲシグナルの振幅、２）、Ｐ−ＤＭＲてＮ−ＤＭＲ現象の動態はより耐性である、そして、３）時より短いＰ−ＤＭＲからＮ−ＤＭＲ現象（遷移時間ｔ）への遷移の結果としてなる。
Ｐ−ＤＭＲ現象の振幅がＥＧＦ濃度を有する複雑な類縁を示すときに、Ｎ−ＤＭＲシグナルの振幅はＥＧＦ上の強いおよび飽和性供与量依存を示した。そして、約１．４５  ｎＭ（図７ｂ参照）のＥＣ５０に結果としてなった。
遷移時間ｔが、数秒でＥＧＦ（図７ｃ参照）の濃度増大によって、指数的に減少するとわかった：
加えて、Ｎ−ＤＭＲシグナルの減衰は、非線形回帰を付けている。
得られた一つの位相減衰定数ｋは、５．７６ｎＭ（図７ｄ参照）のＫｄを有する典型的飽和性応答を引き起こした。
それらの用量依存的動態パラメータ（Ｎ−ＤＭＲ位相の遷移時間および減衰定数）は、前の実験データとの優れた契約およびヒーラー細胞の標的遺伝子（Ｃ−ｆｏｓ）の形質発現の動態に関する計算の予報において、そして、ＥＧＦＲエンドサイトーシスの中であった(Schoeberl, B., C. Eichler-Jonsson, E. D. Gilles, and G. Muller. "Computational modeling of the dynamics of the MAP kinase cascade activated by surface and internalized EGF receptors". Nat. Biotech. 2000, 20:370-375)。
これらの結果は、ＥＧＦ−誘導細胞形態学的変化および受容体エンドサイトーシスがＤＭＲ現象である、そして、ＤＭＲがＥＧＦＲ活性化従属現象であることを示した。
（（ｅ）  ＰＤＧＦＲ）
【０３１９】
ＥＧＦＲｓと同様に、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は増殖、生残、移動および細胞間マトリックス（ＥＣＭ）および組織リモデリング因子の沈着を含む細胞応答を駆動することを示した。
ノックアウト研究は、ＰＤＧＦに対するこれらの細胞応答の多くがハツカネズミ現像の間の必須であることを証明した。
２つのリガンド（ＰＤＧＦａおよびＰＤＧＦｂ）が、ある、そして、２つの受容体、ＰＤＧＦ受容体αおよびＰＤＧＦ受容体β（ＰＤＧＦＲａおよび、それぞれ、ＰＤＧＦＲβ）。
ＰＤＧＦｂおよびＰＤＧＦＲｓは脈管系の支持体細胞の現像のための必須であるのに、中枢神経系、神経冠および器官現像を含む多数のコンテクストの必須役割については、ＰＤＧＦａおよびＰＤＧＦＲａは胚形成の間、広くより必須である。
【０３２０】
ＰＤＧＦシグナル伝達ネットワークは、４つのリガンド、ＰＤＧＦＡ−Ｄおよび２つの受容体（ＰＤＧＦＲａおよびＰＤＧＦＲｓ）からなる。
全てのＰＤＧＦは分泌された、ジスルフィドにリンクされたホモダイマとして機能する、しかし、ＰＤＧＦＡおよびＢだけは機能的ヘテロダイマを形成する。
ＰＤＧＦＲｓも、ホモおよびヘテロダイマとして、そして、アッセイがリガンドがそれらの親和性において異なることを証明したビトロにおいて機能する、そして、ｓｓ受容体。
全ての周知のＰＤＧＦは特性『ＰＤＧＦドメイン』を有する。そして、それはｉｎｔｅｒ−および分子内結合に関係している８つの節約されたＣを含む。
【０３２１】
ＰＤＧＦＲｓは、ＥＧＦＲｓのように、受容体チロシンキナーゼである。
各々の受容体は、細胞質の領域の細胞外のリガンド−結合ドメインおよび裂けたチロシンキナーゼドメインの５つの免疫グロブリン反複を有する。
リガンド結合に、チロシンキナーゼドメインを活性化して、ＰＤＧＦＲｓはｄｉｍｅｒｉｚｅする。そして、それはそれから受容体細胞質のドメインのいくつかのＹ残基を自動的にリン酸化する。
これは、シグナル伝達タンパク質のためのドッキング部位およびＰＤＧＦＲ結合にシグナル伝達を始めるアダプタをつくる。
両方の受容体は同じ主要なシグナル伝達経路の多数を活性化する。そして、Ｒａｓ−ＭＡＰＫ（マイトジェンは、タンパク質キナーゼを活性化した）、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）およびホスホリパーゼＣ経路を含む。
しかし、相互に作用しているタンパク質のアレーはＰＤＧＦＲａおよびＰＤＧＦＲｓの間で僅かに異なる。そして、生体内にそれらの機能上の能力のなんらかの違いに結果としてなる。
【０３２２】
ＥＧＦＲシグナル伝達と同様に、ＰＤＧＦＲｓの活性化はモニタされ、光学バイオセンサによって分析され、有意な質量再分布を導くであろう。
（（ｆ）  他のＲＴＫｓ）
【０３２３】
チロシンキナーゼは、主に受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）（例えばＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲおよびＩＲ）として分類されて、非受容体チロシンキナーゼ（ＮＲＴＫ）（例えばＳＲＣ、ＡＢＬ、ＦＡＫおよびヤヌスキナーゼ）。
ＥＧＦＲｓおよびＰＤＧＦＲｓの他に、他受容体チロシンキナーゼは、インシュリン受容体、インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＦＧ−１Ｒ）、神経成長因子受容体（ＮＧＦＲｓ）、繊維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲｓ）を含む。
同様に、これらのＲＴＫｓは、細胞表面膜横断受容体だけでなくあるが、また、キナーゼ活性を有する酵素である。
受容体チロシンキナーゼの構造上の組織は、リガンド特異性、単一のパス膜内外疎水性ヘリックスおよびチロシンキナーゼドメインを含んでいる細胞質の一部を運ぶための多領域細胞外のリガンドを呈する。
キナーゼドメインは、ＮおよびＣ末端上の両方に調節配列を有する。
【０３２４】
ＮＲＴＫは細胞質のタンパク質である。そして、かなりの構造上の多様性を呈する。
ＮＲＴＫは、キナーゼドメインを有して、しばしば追加のいくつかのシグナル伝達またはタンパク質−タンパク質相互に作用しているドメイン（例えばＳＨ２、ＳＨ３およびＰＨドメイン）を所有する。
と、と、とを備えることを特徴とする。
ＡＴＰは２つの葉の間に開裂において結合する、そして、タンパク質基質の配列を含んでいるＹはＣ末端葉の残基と相互に作用する。
ＲＴＫｓは受容体の二量体化が続く細胞外のドメインに、リガンド結合によって活性化される。そして、ＮＲＴＫの活性化機構が、リン酸基転移応答を可能にするために異形のタンパク質−タンパク質相互作用を含んで、より多くの複合体であるのに対して、細胞質のドメインのリン酸基転移応答を容易にする。
（（４）  細胞骨格転形）
【０３２５】
細胞骨格は、細胞原形質内で含まれるユニークで細胞の「足場」または「骨格」である。
細胞骨格は、真核細胞の細胞原形質の全体にわたって伸びるタンパク質フィラメントの複合して動的なネットである。
細胞骨格は、細胞の多種多様活性を実行することに関係している。
それは、抗張力を細胞のために用意することによって細胞形状を維持する。
それも、若干の細胞移動（構造（例えば鞭毛およびシリア）を使用すること）を可能にして、細胞内輸送（小胞および、たとえば、細胞器官の運動）および細胞の分裂で重要な役割を演ずる。
細胞骨格は、細胞が細胞器官を移動する「軌道」を提供することにシグナルを出していて、輸送細胞内、クロモソームおよび他ものに関係している。
【０３２６】
真核細胞は細胞骨格によって組織化した形を与えられている。
細胞骨格の長い繊維は、サブユニットのポリマーである。
細胞骨格からなる繊維の一次タイプは、マイクロフィラメント、マイクロチューブルおよび中間径フィラメントである。
（ｉ）  マイクロフィラメントは、７ナノメートルから１２ｃｍの長く続くまで概してタンパク質の紐からなるねじれた二本鎖である。
タンパク質は、アクチンである。
その機能は、筋収縮、細胞形状および細胞原形質の運動を助ける。
（ｉｉ）  中間径フィラメントは、クラス−ストランドの８つのサブユニットでできている。
タンパク質構造は、異なる組織タイプによって変化する。
この成分は、形を維持し、神経細胞拡張を支持して、一緒に細胞を付けるのを助ける。
（ｉｉｉ）  マイクロチューブルは、螺旋形になる２−部分サブユニットからなる管である、。
それは、チュービュリンでできている。
それは、染色体移動、細胞器官の運動およびシリアおよび鞭毛の運動を手伝う。
たとえば、小腸の上皮細胞において、繊維の全ての三タイプがある。
マイクロフィラメントは絨毛への突起し、細胞表面に形を与えている。
マイクロチューブルは、中心体から細胞周辺へ伸びている。
中間径フィラメントは、隣接した細胞をデスモソーム経由で接続する。
（（ａ）  細胞骨格構造）
【０３２７】
細胞骨格は、細胞原形質内の他の全ての細胞器官として、含まれる細胞の「足場」または「骨格」である。
それは、細胞形状を維持して、若干の細胞移動（構造（例えば鞭毛およびシリア）を使用すること）を可能にして、細胞内輸送（小胞および、たとえば、細胞器官の運動）および細胞の分裂で重要な役割を演ずる動的な構造である。
真核細胞は、細胞骨格フィラメントの三種、アクチンフィラメント、中間径フィラメント、およびマイクロチューブルを含む。(Janmey, P. A. (1998). The cytoskeleton and cell signaling: component localization and mechanical coupling. Physiol. Rev. 78, 763-781))アクチンフィラメントは直径約７ナノメートルである。
このフィラメントは、ヘリコイダル形において指向される２つのアクチン連鎖からなる。
それらは大部分は形質膜の下でちょうど集中する、それらが細胞の形（形態細胞質突出隆起（仮足および微小絨毛のような））を保つように、シグナルの若干の細胞−細胞および細胞−マトリックス結合およびトランスダクションに参加する。
それらは、また、細胞質分裂にとって重要で、ミオシンと一緒に、筋収縮である。
中間径フィラメントの直径は約８〜１１ナノメータである。
それらは、細胞骨格のより安定（強く結合した）で異質の成分である。
それらは、細胞（例えば、それらは核エンベロープまたはサルコメアの構造成分である）の内の三次元構造を組織する。
それらも、細胞−細胞て細胞−マトリックス若干の結合に参加する。
マイクロチューブルは、約２５ｎｍの中空シリンダであり、順に、αおよびβチュービュリンのポリマーである１３プロトフィラメントによって形成される。
それらは非常に動的な行動を有して、ポリメリゼーションのためのＧＴＰを結合する。
それらは、中心体によって構成される。
これらのフィラメントは、細胞内輸送でキー役割（ダイニンおよびキネシンを有する関連するそれらが、コンドリオソームまたは小胞のような細胞器官を輸送する）を演し、そして、有糸分裂紡錘体である。
（（ｂ）  透過化処理された細胞からの生体材料の管理された解放）
【０３２８】
透過化処理された細胞からの生体材料の徐放に関する討論は、Negrutskii, B.S. and Deutscher, M.P. (1992) "A sequester pool of aminoacyl-tRNA in mammalian cells" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 3601-3604; Negrutskii, B.S., Stapulionis, R. and Deutscher, M.P. (1994) "Supramolecular organization of the mammalian translation system" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 3601-3604において見つかる。これらはそれらの全部において、そして、少なくとも透過化処理された細胞から生体材料の徐放まで関する材料のためにここに援用されられる。
【０３２９】
生体細胞は、高分子の会合体である。
多数研究は、内存性巨大分子が細胞骨格要素に結合している直接タイプによる哺乳動物細胞の細胞原形質内で、非常に構成されることを示した。
細胞骨格（特にアクチンミクロフィラメントネット）は、この組織を維持することで重要な役割を演ずる。
【０３３０】
透過化処理された細胞は、細胞構築を検査するために用いられた。
多数化学薬品または生物学的製剤での細胞の処理は、透過化処理された細胞に至る細胞表層膜の小孔形成に結果としてなる。
これらの化学薬品または生物学的製剤は、界面活性剤（例えばサポニンおよびフィリピン）またはトキシン（例えばジギトニンまたはストレプトリジンＯ）を含む。
しかし、内部膜に最小の損傷を生ぜしめかつ透過化処理された細胞の非常に一様な個体群（＞９７％）に導くことで慎重に滴定されるときに、他の孔形成試薬と比較して、サポニンは長所がある。
サポニン（プラントから派生したグリコシド）は、周知であるが、可溶タンパク質が離れて拡散するために十分に形質膜を多孔質とする能力を有する。
サポニン処理された細胞が生体高分子の若干の一部の減失を経るにもかかわらず、透過化処理された細胞現象としてなられたが生体細胞の生物学的機能で最も多くのものを依然として保持している。
これは、プロセスの複雑度にもかかわらず、これらの透過化処理された細胞のタンパク質合成が高レベルで残るという事実によって立証され、それはこのシステムが生体細胞の起源の構造保全の多くを保持したことを示唆する。
これは大部分の巨大分子が構成される細胞構造の一部として隔離されるという理由からである。そして、したがって、これらの透過化処理された細胞から解放されない。
たとえば、運搬ＲＮＡ、アミノアシル‐ｔＲＮＡ合成酵素およびＥＦｌのような翻訳器具の成分は、透過化処理された細胞において通常きつく隔離される。
タンパク質合成機構だけは細胞骨格によって隔離されない、細胞の多くの他の成分はまた、安定してまたは一時的に細胞構造と関連する。
これらの一時的に関連する成分は、部分的に透過化処理された細胞から解放され得る。
【０３３１】
しかし、細胞からこれらの翻訳成分の放出が付いてくるタンパク質合成の劇的な還元は、マイクロフィラメントの破壊にそこにある。
また、多くの他の引っ込んだ生体高分子は、細胞骨格構造を分裂させた後にこれらの透過化処理された細胞から解放される。
透過化処理された細胞からのこれらの更なる放出された材料は、質量の減失に結果としてなる；
ＬＩＤセンサによって検出され得るＬＩＤセンサの界面上の細胞層の実効屈折率の変化にこのように結果としてなること。
このように、光学バイオセンサを使用して得られた変化が、細胞骨格構造を妨げるモジュレータの指標として使われる。
【０３３２】
伝統的に、細胞骨格構造を妨げるモジュレータに対するスクリーニング方法は主にインビトロアッセイを使用している結合能計測に基づく。そして、アクチン結合タンパク質アッセイ、マイクロチューブル安定化／不安定化アッセイおよびアクチン／チュブリン重合アッセイを含む。
他方法は高分解能蛍光映像技術に基づき、直接、細胞内の細胞骨格構造を視覚化するかまたは化合物処理の後細胞の運動性を測定するか、または細胞骨格−相互に作用しているメーカータンパク質（例えばＣｄｃ４２またはＲｈｏ．）の活性化を測定する。
【０３３３】
細胞骨格配列を妨げるモジュレータのスクリーニングに光学バイオセンサを使用した標識フリー検査法が、ここに開示される。
【０３３４】
或る実施例では、光学バイオセンサ分野における光学標識無依存検出（ＬＩＤ）バイオセンサ（例えば導波路グレーティング−型バイオセンサ）を使用するシステム及び方法に対して、透過化処理された機能細胞において細胞骨格によって隔離される細胞内成分の化合物−起因性解放をリアルタイムでモニタするの方法が、開示される。
化学薬品または生物学的製剤を使用して可溶タンパク質が離れて拡散する透過化処理された細胞を生成する方法が、開示される。
光学バイオセンサを使用して細胞骨格成分のモジュレータをスクリーニングするためのＬＩＤバイオセンサを使用するシステムと方法が、開示される。
【０３３５】
細胞骨格配列のための全ての既存のアッセイ技術と異なって、細胞骨格構造を妨げるスクリーニングモジュレータに、開示された方法は、標識フリー（標識なし）およびリアルタイム方法を提供する。
加えて、細胞骨格配列のための全ての既存で細胞ベースのアッセイとは異なり、本発明の方法は、生体細胞よりかなり多くの単純さについては以外、生体細胞の大部分の生物学的な機能を保持する透過化処理された細胞を利用する。
単一の標的に対して通常モジュレータをスクリーニングする蛍光画像化ベースのアッセイと異なって、本発明の方法は、多重化能力（すなわち細胞内で多数標的を妨げるモジュレータをスクリーニングする能力）を提供する。
全体の内部反射けい光映像技術によって結合に、動態、親和性、含まれる標的を含む、開示された方法は、高量情報に毒性と同様に内容スクリーニングを提供する。
【０３３６】
図２５は、透過化処理されて機能上の細胞の細胞骨格によって隔離される細胞内成分の化合物−起因性解放のリアルタイムの計測に基づく、方法の例を示す。
方法は、可溶タンパク質が離れて拡散する透過化処理された細胞を生成するために孔形成試薬（たとえば（サポニン））の使用を含む。
多くの孔形成試薬を有する細胞の処理が透過化処理された細胞を導くことを公知である。
細胞内巨大分子が細胞骨格要素に直接タイプ結合による哺乳動物細胞の細胞原形質内で、非常に構成されるので、サポニン−処理された細胞が生体高分子の若干の一部の減失を経るにもかかわらず、透過化処理された細胞は細胞骨格超集められた構造による細胞内機構の隔離によって、まだ生体細胞の大部分の生物学的な機能を保持する。
しかし、細胞からこれらの翻訳成分の放出が付いてくるタンパク質合成の劇的な還元は、マイクロフィラメントの破壊にそこにある。
また、多くの他の引っ込んだ生体高分子は、細胞骨格構造を分裂させた後にこれらの透過化処理された細胞から解放される。
透過化処理された細胞からのこれらの更なる放出された材料は、質量の減失に結果としてなる；
ＬＩＤバイオセンサによって検出され得るＬＩＤバイオセンサの界面上の細胞層の実効屈折率の変化にこのように結果としてなること。
このように、光学バイオセンサを使用して得られた変化が、細胞骨格構造を妨げるモジュレータの指標として使われる。
実施例において、本発明の方法は、図２５に示される方法２５００を使用して細胞骨格構造を妨げるモジュレータをスクリーニングする。
方法２５０１に従って、生体細胞１００８のサポニンのような孔形成試薬によって誘導された細胞表面膜の小孔形成による質量再分布をモニタする方法は次のステップを含む：
（ａ）光学にＬＩＤバイオセンサ１００４を提供し（ステップ２５０２）；
（ｂ）前記センサ１００４の上の細胞培地に細胞１００８を配置し（ステップ２５０４）；
（ｃ）緩衝液を任意に適用し（ステップ２５０６）；
（ｄ）おおわれた光学ＬＩＤバイオセンサ１００４の上面１０１０に位置決めをした細胞培地に、化合物を含んでいる溶液を適用し（ステップ２５０８）；
孔形成試薬を含んでいる溶液を適用し（ステップ２５１０）；
（ｅ）そして、光学ＬＩＤバイオセンサ１０１０を測定して透過化処理された細胞１００８内での質量再分布を示す時間依存している光学応答をモニタする（ステップ２５１２）。
孔形成性試薬は、細胞が試薬にさらされるときに、細胞表層膜の細孔の発生に結果としてなることが可能である化学であるか生物学的な化合物または組成物である。
【０３３７】
一般的に、ここに開示されるように、光学バイオセンサを使用している細胞機能または活性に関する計測またはアッセイはリアルタイムにおいてされ得る。
様々な光学出力パラメータが細胞モニタリングおよび検査のために使われるにもかかわらず、刺激作用−起因性指向性質量再分布の動態に関する出力パラメータは監視細胞シグナル伝達のための２つのパラメータおよびリアルタイムのその結果である。
【０３３８】
シグナル伝達経路細胞は、Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路に限定することなく、ｃＡＭＰ経路、ＧＰＣＲシグナル伝達経路、ＲｈｏＡ経路、Ａｋｔ経路、ｉｎｔｒｅｇｉｎ経路、ＧＰＣＲ減衰経路、Ｇタンパク質経路、Ｃａ経路、ホスホリパーゼＣ経路、細胞形質転換経路、細胞移動経路、細胞ａｄｈｅｎｓｉｏｎ経路、その他を含み、シグナル伝達経路細胞は光学バイオセンサを使用して測ったＤＭＲシグナルと協働することができる。
たとえば、ＭＡＰＫキナーゼ経路の活性化は、インテグリンが、細胞展開または移動の間の細胞形状変化を導く遺伝子形質発現を管理するために、細胞間マトリックス（ＥＣＭ）原因インテグリン媒介ＦＡＫリン酸化（周囲のタンパク質（ｐａｘｉｌｌｉｎ、Ｆｙｎ／ｓｈｃおよびｓｒｃ）を順番にリン酸化して、シグナル増幅を導く）に応じて上皮細胞を使用する機構と確認されている。
ＦＡＫも、ＰＩ−３つのキナーゼを結合して、ＭＡＰキナーゼ経路の上流域である。
ＭＡＰキナーゼまたはＰＩ−３つのキナーゼが抑制されるときに、アクチン再構成は遮断された。
ＲｈｏＧＴＰがより長く活性のままであるそのＧＡＰ機能を機能させなくて、Ｓｒｃはｐ１９０ＲｈｏＧＡＰをリン酸化する。そして、更なるシグナル増幅を進める。
活性ＲｈｏＧＴＰは、下流キナーゼ（例えばＲｈｏ関連の高次コイルを含有するタンパク質キナーゼ（ｐ１６０ＲＯＣＫ）および増加アクチン重合および収縮に透けて見える（ｐ１４０Ｄｉａ）ｐ１４０）に結合する。
アクチン再構成はインテグリン菌株群形成を援助する。そして、ＦＡＫリン酸化および他のシグナル伝達現象を増やすより多くのＥＣＭ結合を許す。
シグナル伝達経路細胞およびそれらの細胞現象が強く細胞のコンテクストに依存しているので、所定の細胞タイプのために、種で予め定められた標的による所定のシグナル伝達経路の活性化がいかなるＤＭＲ（刺激作用がネット−ゼロＤＭＲ位相を導くだけのことを意味すること）も、を導くことができないと理解されなければならない、または、場合によっては、それからの異なるＤＭＲ応答の結果は異なる細胞株を使用することを得た。
さらに、異なる標的（例えばＲＴＫ対ＧＰＣＲ）による刺激によって媒介された特定のシグナル伝達経路の活性化は、細胞の単一のタイプの同一であるか異なるＤＭＲ応答を導くかもしれない。
換言すれば、特定の標的による刺激によって媒介されたＤＭＲは、多数の細胞−シグナル伝達ネットの相互作用の統合して代表的な提示である。
さらに、刺激−起因性細胞応答力も、細胞条件に依存する（静止状態状態対増殖するか、または区別を生じるかまたは非分化して、例えば他状態対回路−Ｇ１の状態、その他）。
場合によっては、センサ界面に付けられる細胞は、所望の状態に到達するために前処理されなければならないかもしれない。
たとえば、特定の標的の刺激−起因性活性化で活性化され、そして細胞発育および増殖および／または分化を最終的に導く特定の特定のシグナル伝達経路の活性化を研究するために、細胞は好ましくは静止性状態においてあるべきである。
静止状態状態に到達するために、細胞発育および増殖を刺激する増殖している状態での細胞が、ほとんどいかなる成育因子も有しない培地等によって前処理されてなければならない。
前処理時間は、また、細胞の機能および動態を原因として生じるので、所望の状態に到達する臨界である。
【０３３９】
具体的には、細胞シグナル伝達経路の活性化およびその結果を研究するために用いる方法が開示され、これは増殖している状態よりむしろ静止性状態に到達するための細胞の前処理を必要とする。ＲＴＫｓはこの一例である。
或る実施例において、細胞の監視リガンド結合およびリアルタイムの逐次的なシグナル伝達現象のための方法が開示され、以下のステップを含む：
（ａ）光学型標識フリーバイオセンサを用意し；
（ｂ）受容体チロシンキナーゼを有する細胞をセンサ界面上に配置する。ここで、細胞は、バイオセンサ界面上の付着および細胞の成長のために必要である血清の特定の濃度を含む培地内で懸濁し；
（ｃ）任意ではあるが、３７℃で特定時間、低濃度血清または無添加の培地において付着細胞を飢餓させ（スターベーション）；
（ｄ）細胞の層を有するバイオセンサを検出系へ配置して、その応答をモニタし；
（ｅ）任意ではあるが、少なくとも一回、緩衝液を細胞培地に特定期間で、添加し；
（ｆ）任意ではあるが、ＲＴＫにリガンドを含んでいる溶液を培地に添加し；
（ｇ）そして、付着細胞の層の時間依存応答をモニタする。
ＲＴＫを有する細胞のスターベーション処理はリガンドに対する細胞応答を最大にするため、好ましい。その理由は、血清で多数成育因子が見つけられるからである。
これらの成育因子は、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）、ＥＧＦ、インシュリン、ＴＧＦ−ａ、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）および神経成長因子（ＮＧＦ）を含む。
血清の培地または低濃度（約０．５％）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が、細胞を飢餓させるために使われる。
スターベーション時間は、概してオーバーナイトスターベーションを含む。
ここに開示されるかかる方法がＲＴＫシグナル伝達に限られていないと理解されなければならないし、そして、標的（例えば分裂促進のＧＰＣＲおよびそれらのリガンド）の多くの他のタイプに適用され得る。
【０３４０】
もう一つの実施例では、細胞のＲＴＫｓの発現量および細胞−界面発現量を測定または決定するための方法が開示され、次のステップを含む：
（ａ）マイクロプレートに多数ウェル（底に埋め込まれる光学型標識フリーバイオセンサを有する各ウェル）を供給し；
（ｂ）細胞の多数のタイプを提供し；
（ｃ）培地おいて懸濁した１種類の細胞を少なくとも一つのウェルに配置し；
（ｄ）密集度の特定のレベルまで達されるまで細胞を付着および成長のため適当な培地で培養し；
（ｅ）各々が細胞の層によってカバーされているバイオセンサを有するマイクロプレートを検出系に配置して、応答をモニタリングし；
（ｆ）培地にＲＴＫにリガンドを含んでいる溶液を適用し；
（ｇ）細胞の異なるタイプの層の時間依存応答をモニタして、比較する。
細胞で異なるタイプは、異なる細胞増殖培養液を必要とするかもしれない。
同じ種類の細胞のために、異なる細胞増殖培養液は、関心のあるＲＴＫの細胞表面発現量上の培地の効果を研究するために適用され得る。
【０３４１】
もう一つの実施例では、光学バイオセンサを使用してＲＴＫｓに対しリガンドの効力を決定するための方法が開示され、次のステップを含む：
（ａ）マイクロプレートに多数ウェル（底に埋め込まれる光学型標識フリーバイオセンサを有する各ウェル）を供給し；
（ｂ）細胞が所望の密集度で各々のバイオセンサに付けられるようにＲＴＫの比較的高い形質発現レベルを有する細胞の特定の数を培地に提供し；
（ｃ）特定時間で付着細胞を飢餓させるために培地を交換し；
（ｄ）各々が細胞の層によってカバーされているバイオセンサを有するマイクロプレートを検出系に配置して、応答をモニタリングし；
（ｆ）各々のバイオセンサをカバーしている培地に、異なる濃度でリガンドを含んでいる溶液を適用し；
（ｇ）細胞の用量依存および時間依存応答をモニタして、比較する。
それらの対応する動態と同様に結合している用量依存的およびＤＭＲシグナルは、関心のあるＲＴＫに使ってリガンドの効力を決定する。
かかる方法がまた、ＲＴＫまたは他のシグナル伝達分子の活性化および次の細胞変化のために全体的なＤＭＲシグナルで有意な役割を演ずる下流標的に対して、阻害物質の効力を決定するために使われると理解されなければならない。
たとえば、静止Ａ４３１細胞のＥＧＦ−起因性ＤＭＲシグナルは、調整され得るかまたはＭＥＫ１／２またはアクチンフィラメントのような下流にｐｏｌｙｅｒｍｉｚａｔｉｏｎまたはダイナミンまたは受容体キナーゼ活性によって影響を受けるかまたは上流に分子（例えばカルバコールを含んでいる特定のＧＰＣＲ作動薬）を送られている。
標的に対するまた、それらのユニークなＤＭＲシグニチャを使用して検査され得るモジュレータまたは得られた全体的なＤＭＲシグナルに対する影響の効力。
【０３４２】
また、ＲＴＫシグナル伝達に影響を及ぼすモジュレータに対するスクリーニング方法が開示され、次のステップを含む：
（ａ）光学型標識フリーバイオセンサを提供し；
（ｂ）配置しているバイオセンサをカバーする培地の関心のあるＲＴＫを有する細胞の特定の数細胞がバイオセンサの界面の上へ付属する；
（ｃ）バイオセンサを使用している細胞応答をモニタしている；
（ｄ）添加細胞培地に特定の濃度で化合物を含んでいる溶液；
（ｅ）ＲＴＫにリガンドを含んでいる溶液を適用して、連続的に細胞の時間依存している応答をモニタすることは、続けてバイオセンサを培養した。
（（５）  分析コレステロール輸送）
【０３４３】
細胞膜中のコレステロールの正しい細胞内の分配は哺乳動物細胞の多くのシグナル伝達および膜通過を含む生物学的な機能のための必須である。
輸送膜のコレステロールの顕著な役割は、ますます明らかになる。
たとえば、形質膜−局在性コレステロールのスターベーションはクラトリンによって媒介されたエンドサイトーシスを阻害するが、しかし、小胞性リサイクリングは影響を受けないようである。
直接のある程度のコレステロールが実行可能でないので、間接的ないくつかの方法はコレステロールおよび脂質シグナル伝達の細胞内分配を研究するために開発された。
膜非透過性失活剤を使用している蛍光性ステロールからのクエンチング発光は、形質膜のコレステロールの細胞内ｔｒａｎｓｂｉｌｙａｒ分配を決定するために用いる。
しかし、このアプローチは理想的でない、幾分、蛍光性のコレステロール類似体の性状の量的差分がコレステロールと比較してあってもよいからである。
コレステロールが不十分に水の可溶であるにもかかわらず、さらに、コレステロールかなりの速度での膜から自発的に脱着できる。
最もしばしば、それは同じ膜に戻るが、それはまた、利用できるどんな他の疎水性結合部にでも結合する。
【０３４４】
新しく合成されたコレステロールの運搬および分配は、３Ｈ−酢酸塩を生体細胞にもたらして、異なる時間で隔離の膜の３Ｈのコレステロールの総計を測定することによって決定され得る。
放射性同位元素を使って同定されたコレステロールおよびコレステロールエステルは、リポタンパク質によって摘出され得る。
総コレステロールは、ガスクロマトグラフィー／質量分析法のような直接タイプ化学法によってまたは間接的な方法（例えばコレステロールオキシダーゼに基づくアッセイ）によって測定され得る。
コレステロール輸送を測定するこれらの方法および使われる分配のいずれのためにでも、関心のあるさまざまな細胞器官は、浄化されなければならない。
非常に精製された膜分画を得ることは、一般に全くむずかしく、そして、冗長な純化プロトコルは、コレステロール移植のリスクを増やす。
小胞体および形質膜と同様に、細胞器官が容易に分離され得るときに、これらの方法は最も役立つ、しかし、それらはエンドソームおよびゴルジ膜のような細胞器官が考慮されるときに、解釈するのが非常に困難でありえる。
【０３４５】
フィリピン染色は、この蛍光性界面活性剤がコレステロールエステルに選択的に否定以外のコレステロールに結合するというその事実のために、生体細胞のさまざまな膜細胞器官にコレステロールを認めるために広く使われていた。
フィリピンは、比較的弱い蛍光団であって、冷やされた電荷結合素子カメラによって検出され得る。
しかし、フィリピン染色は質的な情報をコレステロール分布のために用意するだけである。これは、その蛍光強度が必ずしも線形にコレステロール組成に関連があるというわけではないからである。
他の限界は、コレステロールが長く続くの間、フィリピンを有するインキュベーションを再配布するかもしれないということである。
このように、フィリピンを使用している実験からの細胞内のコレステロール分布の数量化は、可能でない。
【０３４６】
専門若干の技術（例えばコレステロールオキシダーゼアッセイ）は、形質膜のコレステロールの量を定めるために開発された。
このアッセイは、形質膜上の酵素が細胞内区画（例えば、生体細胞のエンドサイトーシスによってまたは膜切断によって）に接近する場合コレステロールの総計を過大評価する、または、コレステロールがアッセイの間、形質膜へ移動する。
多数の方法が細胞のコレステロール分布の測定するたにに開発されると共に、その全部はそれらの解読の不確実性のさまざまな程度に委ねられる。
それは、したがって、細胞内コレステロール分布の信頼できる解析を得るためにいくつかの異なる方法によって得られた結果を比較するのに必要である。
【０３４７】
コレステロール否定は、１つの位置または区画から細胞のもう一方まで輸送され得るだけである。
プロセスを使用している細胞が逆コレステロール輸送と言った外側に、それはまた、排泄され得る。
逆コレステロール輸送の第一段階は、細胞外の受容体に対する末梢の細胞の形質膜からの自由なコレステロールの発散である。
コレステロールのこの運動は、細胞で細胞外の因子によって支配される。
多数研究は、細胞コレステロール（具体的には、これらの受容体の一時変異が明らかにコレステロール流出を強化する方法）の細胞外の受容体に集中した。
逆コレステロール輸送が高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）によって媒介されたと一般に考えられる。
ＨＤＬのようなリン脂質を含有する受容体については、律速段階は形質膜からのコレステロール分子の脱着である。
【０３４８】
コレステロールが除去され得る少なくとも２つの経路が、末梢の細胞からある。
コレステロール受容体（それはすでにリン脂質、例えばＨＤＬ粒子またはＰＬ−ａｐｏＡ  １つの円板を含む）は、膜コレステロールドナーおよび受容体粒子間の濃度勾配を経た拡散によって、コレステロールを除去する。
水の拡散モデルはしたがって、双方向性の質量の輸送モデルである。そして、それは受容体粒子が細胞の形質膜を結合するかまたは通すことを必要としない。
スカベンジャー受容体Ｂタイプ１（ＳＲ−Ｂ１）の発現レベルは、ＨＤＬまたはリン脂質粒子にコレステロール流出の速度に関連する。
コレステロール流出を刺激するＳＲ−Ｂ１の機能は、受容体−リガンド結合から独立しているように見えて、受容体粒子にコレステロールの水溶拡散を容易にする膜コレステロールドメインの組織に対する影響を反映する。
【０３４９】
あるいは、ａｐｏＡ−１のような脂質−低コレステロール受容体は形質膜と直接相互に作用して、同時にコレステロールおよびリン脂質を抽出する。
脂質フリーａｐｏＡ−１に対するコレステロール流出は、カセット輸送体Ａ１（ＡＢＣＡ１）を結合しているＡＴＰの形質発現に大いに依存している。
ａｐｏＡ−１媒介コレステロール流出の重要性が明確であるとともに、コレステロール搬出のＡＢＣＡ１の正確な機能には議論の余地があり、最近の研究では、ａｐｏＡ−１の受容体としての役割、細胞内のコレステロール輸送体、または、細胞表面でのａｐｏＡ−１のドッキングを支持する膜脂質分配に一時変異を誘発することを提案している。
【０３５０】
開示方法はコレステロール輸送測定、、たとえば、流出することおよび取込みのような、コレステロール輸送を遂行する分子のためのスクリーニングに使われる。
図２６は、方法の例が流出しているコレステロールを妨げるモジュレータをスクリーニングすることを示す。
この方法は、流出しているコレステロール上の化合物の効果のリアルタイムの計測に基づく。
細胞表面または細胞内プール上のコレステロール組成のスターベーションは細胞表面に位置する微小絨毛の消失に結果としてなる。そして、界面上の細胞被着の平坦度に結果としてなる。
細胞の平坦度は、増加するシグナルを有する正のＤＭＲ位相を導く。
この生体影響に基づく、細胞表面（例えば比較的低い濃度でのサポニン）上のコレステロールをコレステロールを細胞表面（例えばメチル−βシクロデキストリン（ｍβＣＤ）または高密度リポタンパク質（ＨＤＬ））から抽出するか結合するかまたは隔離するマーカーとして、我々は試薬を使用する。
光学バイオセンサを使用して得られた変化が、流出しているコレステロールを妨げるモジュレータの指標として使われる。
図２７は、コレステロール経路の概略図を提供する。
【０３５１】
図２８の結果は、Ａ４３１およびヒーラー細胞のｍβＣＤ処理がＬＩＤバイオセンサを使用して、得られた類似した時間依存応答を引き起こすことを示した。
これらの２つの細胞タイプ間の差分は、細胞表面と関連する異なるコレステロール組成による。
ＥＧＦを有するＡ４３１細胞の前処理は、かなりｍβＣＤ−誘導応答を抑制した。
これは、細胞表面に位置するＥＧＦＲｓに対するＥＧＦの結合が受容体の有意なエンドサイトーシスに結果としてなるという理由からである；
そして、受容体エンドサイトーシスによって、細胞表面コレステロール組成の還元が生じる。
同様に、Ｈ７、タンパク質キナーゼＡ、ＣおよびＧ阻害物質を有するＡ４３１細胞の前処理は、また、ｍβＣＤ−誘導応答の抑制を導いた。
これは、タンパク質キナーゼが細胞表面上のコレステロール組成の臨界な調節因子であるという理由からである。
（（６）  活性種のシグナル伝達および細胞レドックス状態を分析すること）
【０３５２】
分子状酸素（酸素；Ｏ２）、全部の生残のための必須は、好気性生物である。
好気エネルギー代謝は、酸化的リン酸化（ミトコンドリア電子伝達（多成分ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ酵素の複合体を経た）の酸化還元エネルギーがＡＴＰの高エネルギーリン酸結合に変換されるプロセス）に依存している。
Ｏ２はシトクロムｃオキシダーゼ（このミトコンドリア酵素の複合体の末端の酵素の成分）のための最終的な電子受容体として役立つ。そして、それはＨ２ＯにＯ２の四電子還元に触媒作用を及ぼす。
Ｏ２の部分的に還元して非常に活性メタボライトはこれらの（そして、他）電子伝達反応の間、形成され得る。これら  Ｏ２メタボライトはスーパーオキシドアニオン（Ｏ２ｏ）および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）（それぞれ、Ｏ２のｏｎｅ−および二電子還元によって形成される）を含む。
遷移金属イオンがある場合には、より多くの活性水酸基ラジカル（ＯＨｏ）は、形成され得る。
Ｏ２のこれらの部分的に還元したメタボライトは、分子Ｏ２と関連してしばしばそれらのより高い反応性による「活性酸素種」（ＲＯＳ）と称する。
【０３５３】
ＲＯＳは、細胞の機能に対する二相の衝撃を有する。
ＲＯＳは、まず最初に脂質、タンパク質およびＤＮＡに原因損傷にポテンシャルを有する代謝の毒性副生成物とみなされる。
ＲＯＳの潜在的に損害を与えている効果から守るために、細胞はいくつかの抗酸化剤酵素（例えばＳＯＤ（それは、Ｏ２ｏをＨ２Ｏ２に下げる）、カタラーゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼ（それは、Ｈ２Ｏ２をＨ２Ｏに下げる））を所有する。
このように、酸性の応力は、オキシダント産生間のインバランスおよび細胞の抗酸化剤容量として広義には酸性の外傷を防ぐことであってもよい。
酸性の応力は、アテローム性動脈硬化、肺線維症、癌、神経変性疾患および加齢を含む多数の人間の疾患に関係した。
【０３５４】
ＲＯＳが一般に呼吸の毒性副生成物であると考慮されるにもかかわらず、最近の証明はＲＯＳの産生が細胞シグナル伝達および調節の必須参加者であるかもしれないことを示唆する。
哺乳動物細胞において、様々な細胞外の刺激は最近ＲＯＳの細胞内の濃度のエバネッセント増加を誘発することを示した、そして、ＲＯＳ生成の特性阻害は刺激剤に依存するシグナル伝達の完全な遮断に結果としてなる。
ＲＯＳ産生の下流効果は、タンパク質の多少可逆性の酸化反応である。
反転可能に酸化されるそれらの機能によって、チオールは酸性の応力のキー標的と認められる。
レドックスに敏感なタンパク質（それは活性サイトＣとしてチロシンホスファターゼ（ＰＴＰｓ）を含む）はＨ２Ｏ２を含むさまざまなオキシダントによる特性酸化反応の標的である、そして、この一時変異は細胞内還元剤によって逆転する。
ＰＴＰｓ上のＲＯＳによって動作する阻害はシグナルがタンパク質Ｙリン酸化によって媒介した受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の伝搬を助ける。そして、一般に増殖刺激と関連する。
【０３５５】
細胞の機能の調節の必須生体分子としての、そして、代謝の毒性副生成物としてのＲＯＳの役割の明らかな逆説は、部分の最少で、産生されるＲＯＳの濃度の差分に関する。
ＲＯＳの細胞の産生がその抗酸化剤容量を圧倒するときに、脂質、タンパク質およびＤＮＡのような細胞高分子に対する損傷は起こる。
【０３５６】
ＲＯＳの高反応性および親族不安定は、それらを検出するかまたは生物系において測るのが極めて困難にする。
このように、ＲＯＳおよびフリーラジカル生成の検査は、主に細胞の成分（例えば脂質、タンパク質またはＤＮＡ）を有するＲＯＳの相互作用から生じているさまざまな最終産物の間接測定によって製造した。
特性ＲＯＳの同定のための大部分の方法は、発光であるか蛍光性のシグナルを引き出すために酸化的に修飾されるさまざまな「検出器」分子（例えば発けい光性、化学ルミネセンスであるか色原体のプローブ）を有する反応に基づく。
かかる方法は、同じ細胞のリアクタンス性酸素の多数形態を有する可能性によって複雑になってもよい。
加えて、酸化窒素ラジカルは、他の活性酸素分子をするのと、同じプローブの光学的性質の変化を産生する。
定量分析は、また、むずかしい：
１）チエニル（ｔｈｉｙｌ）またはスルフィニルラジカルまたは別トラップを形成するかまたは酸素種を減らすグルタチオンの高い細胞内の濃度；
２）金属の易変の濃度、どちらでも触媒作用を及ぼすかまたはいずれを抑制するラジカル反応；
そして、３）スペルミンのような他のフリーラジカル−クエンチング作因の存在。
【０３５７】
リアルタイムのモニターに対する方法が、開示する生体細胞のＨ２Ｏ２−起因性動的質量再分布（ＤＭＲ）上の化合物の効果。
ＲＯＳシグナル伝達を研究するために、さまざまな細胞の標的のための周知で特定のモジュレータの広いアレーは、特定時間（概して１時間）のための細胞を前処理するために用いた。
ＲＯＳシグナル伝達ネットは、それからＨ２Ｏ２−起因性ＤＭＲシグナル上のモジュレータの効果によれば、計画を立てられる。
細胞のレドックス状態を調整するスクリーニング化合物にとって、細胞は長く続く期間（概して一晩日に）の間の化合物によって前処理される。
細胞のレドックス状態上の化合物の効果は、Ｈ２Ｏ２によって媒介されたＤＭＲシグナルによって検査され得る。
【０３５８】
ＲＯＳシグナル伝達およびレドックス状態のための全ての既存のアッセイ技術と異なって、ＲＯＳシグナル伝達およびそのネット相互作用を妨げるスクリーニングモジュレータに、本発明は標識−自由なおよびリアルタイム方法を提供する。
本発明も、光学バイオセンサに基づく細胞の適用法に検出することをする。
【０３５９】
ＲＯＳの細胞の産生は、酵素で非酵素的な供与源から起こる。
いかなる電子−転送タンパク質もまたは酵素の系は、電子伝達反応の「副生成物」としてＲＯＳの発生に結果としてなることが可能である。
酵素の供与源は、以下からなる：
【０３６０】
コンドリオソームの（ｉ）  細胞代謝。
コンドリオソームのＲＯＳの生成は、還元条件の下で全体のＯ２消費量の約１−２％を説明する。
ミトコンドリアＳＯＤの高濃度のために、細胞原形質に逃げそうにないＯ２の内部ミトコンドリア濃度は、非常に低い定常タイプレベルで維持されてあって、ある。
特にアポトーシスの調節に関して、細胞シグナル伝達を媒介するミトコンドリアＲＯＳのためのポテンシャルは、近年の有意な耳目を得た。
酸素圧低下−起因性遺伝子転写を媒介することは、また、コンドリオソームが「Ｏ２センサ」として機能することを示唆された。
【０３６１】
（ｉｉ）小胞体（ＥＲ）の脂質およびタンパク質生合成。
小胞体は、主に脂質およびタンパク質生合成に関係している他の膜結合細胞内小器官である。
平滑な小胞体（境界リボソームを欠いている）は、脂質−可溶薬剤を無毒化するために一連の反応に触媒作用を及ぼすチトクロームＰ−４５０および他の有害な代謝産物を含む酵素を含む。チトクロームＰ−４５０が、不飽和脂肪酸および生体外物質を酸化することができ、Ｏ２および／またはＨ２Ｏ２を産生するために分子Ｏ２を減らす。
【０３６２】
（ｉｉｉ）核膜からのＲＯＳ。
核膜は、いずれが未知数であるか、機能以外の小胞体のそれらに似ているシトクロムオキシダーゼおよび電子伝達系を含む。
これらの酵素の系からの電子「漏れ」が生体内に細胞のＤＮＡに損害を与えるＲＯＳを引き起こすと仮定された。
【０３６３】
（ｉｖ）ペルオキシソームのＨ２Ｏ２生成。
ペルオキシソームは、全体の細胞のＨ２Ｏ２産生の重要な供与源である。
それらは、グリコール酸塩オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、尿酸オキシダーゼＬ−ヒドロキシ酸オキシダーゼ、および脂肪酸アシルＣｏＡオキシダーゼを含む多くのＨ２Ｏ２−生成酵素を含む。
ペルオキシソームカタラーゼは、「過酸化的」反応の様々な他の基質を酸化するためにこれらのオキシダーゼによって産生されるＨ２Ｏ２を利用する。
ペルオキシソームが循環に入る様々な毒性分子（エチルアルコールを含むこと）を無毒化する肝臓および腎臓細胞において酸性反応のこれらのタイプは、特に重要である。
ペルオキシソームにおいて実行される酸性反応の他の機能は脂肪酸の酸化反応である。そして、哺乳動物細胞のそれはコンドリオソームおよびペルオキシソームで起こる。
これらの細胞内小器官において発生するＨ２Ｏ２の小さい画分だけは、ペルオキシソームカタラーゼを逃れるように見える。
【０３６４】
（ｖ）可溶性酵素からのＲＯＳ。
キサンチンオキシダーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、ジヒドロオロット酸デヒドロゲナーゼ、フラビンタンパク質デヒドロゲナーゼおよびＷジオキシゲナーゼのような可溶性酵素は、触媒作用的サイクリングの間、ＲＯＳを生成する。
【０３６５】
（ｖｉ）小分子からのＲＯＳ。
ドーパミン、エピネフリン、フラビンおよびヒドロキノンのような小分子の自動酸化は、細胞内のＲＯＳ産生の重要な供与源でありえる。
ほとんどの場合、かかる自己酸化反応の直積は、Ｏ２である。
【０３６６】
（ｖｉｉ）酵素と関連した形質膜からのＲＯＳ。
形質膜関連のオキシダーゼ（例えば食細胞のＮＡＤＰＨオキシダーゼ）は大部分の成長因子−および／またはサイトカイン−刺激されたオキシダント産生の供与源として関係した。但し、正確な酵素の供与源はまだ充分に特徴づけられていない。
【０３６７】
（ｖｉｉｉ）シグナル伝達からのＲＯＳ。
異なるクラスの受容体を結合する様々なサイトカインおよび成育因子は、細胞のＲＯＳを生成すると報告された。
【０３６８】
（ｉｘ）生育環境からのＲＯＳ。
外部性ＲＯＳは、また、生体細胞において導かれる。
たとえば、外部性Ｈ２Ｏ２は、細胞に形質膜全体に拡散する。
【０３６９】
ＲＯＳは、受容体から細胞核まで多数レベルで多数のシグナル伝達経路を管理する。
細胞の標的はより明確でないにもかかわらず、同定されて、過去の１０年を通じて広がった。
受容体キナーゼおよびホスファターゼは、酸性の応力の標的であってもよい。
生長因子受容体は、非常に自動的にリン酸化する。にリガンド起因性二量体化またはオリゴマー形成によって共通に最も活性その細胞質のキナーゼドメイン。
紫外線に応答する受容体のリガンドから独立した菌株群形成および活性化はまた、かなり示された、そして、この効果はＲＯＳによって媒介されたように見える。
外部性Ｈ２Ｏ２（通常ミリモル範囲の）は、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦおよびＥＧＦ受容体のＹリン酸化および活性化を誘発することを示した。
ＥＧＦ受容体のLysophatidic酸の起因性トランスアクチベーションは、ＲＯＳの中間の発生によって媒介されたように見える。
大部分の成育因子およびサイトカインが形質膜で、又はその近くで、ＲＯＳを生成するように見えるので、リン脂質メタボライトはレドックスシグナル伝達のための潜在的に重要な標的である。
たとえば、ジアシルグリセロールの酸化タイプは、ＰＫＣを活性化する際に、その非酸化されたフォームより効果的だった。
加えて、ＰＫＣ活性化およびタンパク質Ｙリン酸化は、血管内皮細胞および繊維芽細胞のＨ２Ｏ２−起因性ＰＬＤ活性化のために必要に見える。
Ｓｒｃファミリ（Ｓｒｃキナーゼ）およびヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）ファミリに帰属している非ＲＴＫｓは、また、少なくとも、外因的な加算オキシダントのための標的である。
【０３７０】
ＲＯＳシグナル伝達も、平滑筋細胞を含んでいる多くの細胞タイプの細胞内Ｃａ２＋の変化の引き起こすことが可能である。
さらに、ＲＯＳシグナル伝達は、ＭＡＰＫ経路に参加する。
外部性オキシダントは、ＥＲＫＭＡＰＫ経路を活性化する。
この効果のための機構は不明である、そして、正確な分子的標的は未知数である。
若干の研究は、ＲＯＳによって媒介されたＥＲＫ活性化が生長因子受容体、Ｓｒｃキナーゼおよび／またはｐ２１Ｒａｓの高さの上流域現象であってもよいことを示唆する。
この効果のための潜在的な他の機構は、チロシンホスファターゼ（ＰＴＰｓ）および／またはプロテインホスファターゼＡのオキシダント−起因性失活であってもよい。
【０３７１】
同定された多くの他の細胞内の標的が、酸化反応応答する分子としてある。
これらの標的は、ＮＦ−ｋＢ（免疫性で扇動的な応答に関係している多くの遺伝子の形質発現を管理する転写因子）、活性化物質タンパク質−１（ＡＰ−１）（転写複合体は、Ｆｏｓ−６月または６月−６月の二量体化によって、タンパク質を形成した）およびＤＮＡ結合が類似したレドックス機構（例えばＳｐ−１、ｃ−Ｍｙｂ、ｐ５３およびｅｇｒ−１）によって管理される他転写因子を含む。
【０３７２】
ＲＯＳシグナル伝達は、主に２つの一般の作用機構を含む：
１）細胞内レドックス状態および２の変化）タンパク質の酸性の一時変異。
【０３７３】
実施例において、ＲＯＳシグナル伝達を妨げるスクリーニング化合物に、本発明は方法を光学バイオセンサの使用のために用意する。
方法は、培養細胞層の底部分内で、質量再分布を媒介するために外部性ＲＯＳとして過酸化水素の使用を含む。
方法は、以下のステップを含む：
光学を提供することは、独立検出にマルチ光学出力パラメータ計測ができる（ＬＩＤ）バイオセンサと標識する；
バイオセンサ表面上で細胞をインキュベートすること；
モジュレータ溶液を細胞に適用すること；
外因の活性酸素種溶液を細胞に適用すること；
監視前記光学出力パラメータ。
前記モジュレータは、細胞の標的のよく特徴づけられたモジュレータのプールから選ばれる。
前記モジュレータ溶液は、適用されて、前記細胞（例えば３０分、６０分、１時間、３時間、６時間、２４時間、２日、３日、５日、その他）を有する短い期間の間、インキュベートした。
前記活性酸素種は、過酸化水素である。
（６．標識フリー細胞アッセイに対する添加）
（ａ）  標識付加技術と連動して標識フリーバイオセンサを使用している２つの部分アッセイ）
【０３７４】
基礎を形成される自由なバイオセンサ細胞が分析する開示された標識が、また、生体試料上の多数パラメトリック情報を提供するために従来の標識技術（例えば蛍光）と協動して使われる。
【０３７５】
標識無依存検出は、被検体のいずれも標識付加を必要としない方法の生体分子現象を測定する技術のセットを含む。
最も普及している２つの技術は、表面プラスモン共振（ＳＰＲ）またはグレーティング結合導波路のような技術を使用して、ここに議論されるように質量分析（ＭＳ）および屈折率（ＲＩ）の変化の計測に基づく。
屈折率および蛍光（コンフォーカルまたはエバネセント場）の変化の同時計測のための誘電被覆光学グレーティングを含んでいる光学バイオセンサに結合する機器を含んでいる系はここに開示される。
【０３７６】
ＲＩが方法が有意な効果を提供する独立検出（ＲＩＬＩＤ）が技術と分類した標識の基礎を形成すると共に、限界は現象が直接特定の種と相関ができていないということである。
例（蛍光と異なった）のために、所望のタンパク質の結合および望ましくない若干のタンパク質は、質的にシグナル（屈折率の変化）の同じ「タイプ」を提供する。
標識フリー検査法は、したがって、本来的に非特異的である。
このあいまい性を相殺するために、ＲＩＬＩＤ方法は、結合した生物特定の同定を可能にするためにＭＳに結合した。
【０３７７】
リアルタイムでＲＩＬＩＤ計測が可能であり、その機能が注目されており、これにより基質界面の約２００ｎｍ以内でかつ約１０μｍ以下の横方向解像力で現象を検出する。
蛍光は、多数種の標識付加（異なる蛍光染料または粒子により）を可能にして、約２００ナノメートル内で検出を可能にするエバネッセントモード（全内反射率蛍光またはグレーティング結合導波路を使用する）、または、約１０μｍ内の検出を可能にして、優れた横方向解像力（遠距離場の約３００ナノメートル未満または近距離場の＜１００ｎｍ）を有するコンフォーカルモードにおいて使われる。
標識フリーバイオセンサおよび標識化の２つの技術の組み合わせを使用したバイオ検出のための他の「経絡」としてのＲＩＬＩＤの使用が開示され、両技術は時間および空間解像力を共有するが、一方が本来の種の特異性（標識化すなわち蛍光）であり、他方が本来の種の非特異性（標識フリーバイオセンサ、ＲＩＬＩＤ）である。
それが１に遭遇されるそれらのような複合したバイオ−検出結果を分析するのを可能にするように、細胞内で生物学的経路を研究すると共に、この組み合わせは本質的に強力である。
たとえば、受容体（例えばＧＰＣＲ）に対するリガンドの結合は、時間を有する屈折率プロフィールの複合した変化に結果としてなる細胞のカスケードを誘発する。
これらのカスケードの一つ以上は、異なるリポータ系を使用している蛍光または標識化によって調査され得、標識化は細胞、細胞器官（例えば小胞体を調査する使用している細胞器官特性色素、ゴルジまたは細胞核））、タンパク質（例えばＧＦＰ−ｂアレスチンの転位）、または、ＤＮＡレベル（蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）を使用している遺伝子形質発現）で行われる。
時間内の多色蛍光および空間に対するＬＩＤシグナルの相関は、経路について重要な手がかりを提供する。
さらに、特定の蛍光性リポータおよび／または標識は、しばしば相互に互換性がない。
一つ以上の蛍光性リポータの必要が除去されるように、その情報がＲＩＬＩＤ．３０９を通して入手可能であるので、開示された方法は相関の解析を許して、アッセイ現像を可能にする。
プレーナー型導波路型バイオセンサを利用している多モード検出系が、開示される。
この系は、屈折率変化（結合することのバイオマスおよび次の活性化のネット変化および細胞応答によって波長の変化または反射光起因性の角度によって示される）をモニタするだけでなくて、蛍光（または化学発光、バイオ発光、リン光または電子発光、その他）において変わりもする。
また、薬剤発見および基本的研究ために、極めて高い内容アッセイを提供する検出系は、提供される。
【０３７８】
現在のバイオアナリティカル技術は、概して本来、ユニパラメトリックである。
その結果、多数の異なるアッセイからの出力は、薬剤発見（または分化）について、案内決定にくり返し的にまとめられる。
このプロセスは、時間がかかることがありえてまぎらわしくありえる。
マルチパラメトリック検出は、潜在的な薬剤化合物によって経路（または多数経路）およびそれらの転形の多数ステップについて、手がかりを提供する解析手法の組み合わせを使用しているいくつかの正面上の情報を得ようとする。
多重化が結合する同期の検出を意味するという点で、マルチパラメトリック検出は、多重化することとは別であるためにまたは経路の同じステップをモニタするために１つの技術（または組み合わせ（例えば放射性で蛍光性の標識の組み合わせ））を使用している多数の生物学的な生物特定の活性化。
多数の可能性が多数上の情報の中でタイプする申し込みが同時にサンプルをとる多重化アッセイ（例えば、トランスフェクションアレーを逆転させる）と連動して、マルチパラメトリック検出。
グレーティング結合導波路は、ＲＩＬＩＤおよび蛍光を可能にすることによってマルチパラメトリック検出のためのプラットフォームに関して独自に有利である。
（ＩＩＩ．  組成）
【０３７９】
ここに開示される方法内で使われる組成と同様に開示された組成物にそれ自身を用意するために使用成分が、開示される。
これらの開示材料は、それらが組み合わせ、結合、サブセット、相互作用、基、その他とされたとき、それはこれらの材料の中で開示された理解されるべきで、これらの化合物の各々のさまざまな個体および集団組み合わせおよび置換の特性基準が明確に開示されることができないと共に、各々は具体的には、熟慮されて、ここに記載されていると理解される。
どの組み合わせも熟慮される具体的には、特定の受容体が開示されて、議論され、そして、受容体を含んでいる分子数に作られる多くの一時変異が議論される場合、たとえば、そして、可能である受容体および一時変異の置換具体的には、反対に示される。
ＢおよびＣが分子Ｄ、ＥおよびＦのクラスと同じく開示されて、分子Ａのクラスである場合、このように、そして、結合分子の例、ＡＤは開示される、そして、各々が個々に詳述されない場合であっても、各々は組み合わせ、Ａ−Ｅ，  Ａ−Ｆ，  Ｂ−Ｄ，  Ｂ−Ｅ，  Ｂ−Ｆ，  Ｃ−Ｄ，  Ｃ−Ｅ，  およびＣ−Ｆが開示されて考慮されることを意味して、個々に、そして、集合的に熟慮される。
同様に、これらのいかなるサブセットもまたは組み合わせは、また、開示される。
このように、たとえば、ＡＥ、Ｂａｃｈｅｌｏｒ  ｏｆ  ＦｉｎａｎｃｅおよびＣ−Ｅの亜属が、開示されて考慮される。
この概念が、開示された組成物を製作し使用する方法におけるステップを含むがこれに限らず本出願の全ての見方にあてはまる。
このように、実行され得る様々な追加のステップがある場合、各々のこれらの追加のステップが開示された方法の実施例のいかなる或る実施例もまたは組み合わせによって実行され得ると理解される。
（１．開示された組成物／組合せの化学を有するスクリーニングによって同定される組成）
（ａ）  組合せの化学）
【０３８０】
開示された組成物が、分子を同定するいかなる組合せの技術もまたは所望の方法の開示された組成物と相互に作用する高分子の分子のための標的として使われる。
核酸、ペプチドおよびここに開示される関連した分子が、組合せのアプローチのための標的として使われる。
また、ここに中で開示される組成または一部がそれについて組合せのスクリーニングプロトコルの標的として使われる組合せの技術またはスクリーニング手技で、同定される組成が、開示される。
【０３８１】
組合せの技術またはスクリーニング法の開示された組成物を使用するときに、阻害または刺激作用のような特定の所望の性状または標的分子の機能を有する分子（例えば高分子の分子）が同定されると理解される。
分子が、開示された組成物（例えば開示された細胞）を使用することはまた、開示される時を同定して、単離した。
このように、産物は開示された組成物（例えば開示された細胞）がまた、ここに考慮されることを含むアプローチが開示した組合せであるものまたはスクリーニングを使用することを生じた。
【０３８２】
ここで議論され開示された分子を同定する方法が、高いスループット手段を使用して実行され得ると理解される。
たとえば、推定の阻害物質は、急速に相互作用を同定するためにFluorescence Resonance Energy Transfer（ＦＲＥＴ）を使用して同定され得る。
技術の下にある理論は２つの分子がバックグラウンドを越えてレベルで空間（ｉｅ）の近くに相互に作用するときに、シグナルが生じるということである、または、シグナルはいやされ得る。
それから、様々な実験は実行され得る。そして、たとえば、推定の阻害物質において加わることを含む。
阻害物質が２つのシグナル伝達分子間の相互作用と争う場合、シグナルは空間の各々から除去される、そして、使用するシグナルのタイプに従い、これによってシグナルの減少または増加が生じる。
この減少または増加しているシグナルは、推定の阻害物質の有無と相関している。
いかなるシグナル伝達手段も、使われる。
たとえば、たとえば、開示され分子二つの間の相互作用の阻害物質を同定する方法が開示され、次のステップ：推定の阻害物質がある場合、一緒に第１の分子および第２の分子に連絡させるステップ（そこにおいて、第１の分子または第２の分子は蛍光ドナーからなり、または、第１であるか第２の分子は概して蛍光ドナー分子でなく蛍光受容体からなり、）と；そして、推定の阻害物質が存在および不存在の場合、蛍光共鳴エネルギー移動  （ＦＲＥＴ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）を測定するステップ（そこにおいて、その非共存のＦＲＥＴ計測と比較した推定の阻害物質がある場合には、ＦＲＥＴの減少は、推定の阻害物質が２つの分子間のバインディングを抑制することを示す）とを含む。
かかる方法は、細胞システムにもよって実行され得る。
【０３８３】
所定の機能（触媒作用的またはリガンド−結合）を有するオリゴヌクレオチド分子は、「試験管内遺伝学」（Ｓｚｏｓｔａｋに、ＴＩＢＳ  １９：８９、１９９２）と称したことのランダムオリゴヌクレオチドの複合した混合液から単離され得る。
ランダム方向分子の大きいプールを合成して、配列を定義して、若干の選抜および濃度プロセスに対するその複合した混合液（たとえば１００のヌクレオチドＲＮＡの１００ｍｇのほぼ１０１５個別連鎖）を従属させる。
カラム上のリガンドに対する分子境界のアフィニティークロマトグラフィおよびＰＣＲ増幅の繰り返された回路で、Ellington and Szostak (1990) は、小分子を結合することは染まるというような方法で、１０１０のＲＮＡ分子の折り重なったと見積もった。
かかるリガンド−結合行動を有するＤＮＡ分子は、同様に単離された 。(Ellington and Szostak, 1992; Bock et al, 1992).
同様ゴールを狙う技術が、小有機分子、タンパク質、抗体および従来技術において熟練のそれらにとって公知の他巨大分子のために存在する。
小さい器官のライブラリ、オリゴヌクレオチドまたは抗体に基づく広く組合せの化学と称するかどうか、スクリーニングは所望の活性のための分子の中で固まる。
組合せの技術は分子間の結合相互作用を定義するために、そして、特定の結合活性を有する分子を単離するために特に適している。そして、巨大分子が核酸であるときに、しばしばアプタマと呼ばれている。
【０３８４】
タンパク質を単離するための多くの方法がある。そして、どちらでも新たに有する活性または修飾活性。
たとえば、バクテリオファージ表示ライブラリは、特定の標的と相互に作用する多数のペプチドを単離するために用いた。U.S. Patent 6,031,071; 5,824,520; 5,596,079; and 5,565,332 、そして、表示および方法が組合せの化学と関係づけるバクテリオファージに関連したそれらの材料のために、少なくともここに援用したものとする５。
【０３８５】
所定の機能を有するタンパク質を単離するための好適な方法は、ロバーツおよびＳｚｏｓｔａｋによって記載されている（Roberts and Szostak (Roberts R.W. and Szostak J.W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(23)12997-302 (1997)）。
この組合せの化学方法は、核酸のタンパク質および遺伝の仕事率の機能上の仕事率を結合する。
ＲＮＡ分子は、ピューロマイシン分子がいずれの中で共有結合して３末端に付けられるかについて発生するＲＮＡ分子。
この修飾ＲＮＡ分子の試験管内の翻訳によって正しいタンパク質が生じる。そして、翻訳されるＲＮＡによってコード化される。
加えて、ピューロマイシン（延長されることができないペプチド受容体）の付着のため、発達するペプチド鎖はＲＮＡに付けられるピューロマイシンに付けられる。
このように、タンパク質分子はそれをコード化する遺伝形質に付けられる。
正常な試験管内の選抜手順は、現在機能的ペプチドを単離するためにされ得る。
一旦ペプチド機能のための選抜手順が完全な従来の核酸であると、操作手順は選択された機能上のペプチドのために符号化する核酸を拡大するために実行される。
遺伝子の物質的な、新規なＲＮＡの増幅が３末端でピューロマイシンによって写されたあと、新規なペプチドは翻訳される、そして、選抜の機能上の他の回診は実行される。
このように、タンパク質選抜は、核酸選抜技術のように反復的な方法において実行され得る。
翻訳されるペプチドは、ピューロマイシンに付けられるＲＮＡの配列によって管理されている。
この配列は最適翻訳（すなわちストップコードンでないその他）のために設計される乱数列からの何ででもありえる、または、それは探す分子が改善した周知のＲＮＡの退化した配列でありえるかまたは周知のペプチドの機能を変えた。
核酸増幅およびインビトロ翻訳のための条件は、従来技術において通常の熟練のそれらにとって周知で、ロバーツおよびＳｚｏｓｔａｋに記載の好ましくは実行されるRoberts and Szostak (Roberts R.W. and Szostak J.W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(23)12997-302 (1997)。
【０３８６】
ペプチドを単離するように設計された組合せの方法のための好適な他の方法は、コーエンその他に記載されている（(Fields and Song, Nature 340:245-6 (1989))この方法は、２−ハイブリッド技術を利用して、修正する。
イースト２−雑種系は、タンパク質：タンパク質相互作用の検出および解析に役立つ。
二−雑種系（まず最初にイーストＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに記載されている）は、新規な調節分子（関心（場および宋（ネイチャー３４０：２４５−６（１９８９）））のタンパク質に対する特性）を同定するための強力な分子的遺伝学的技術である。
選出の分子を結合する合成薬品または設計されたペプチド配列間の新しい相互作用が同定されてもよいために、コーエンその他はこの技術を修正した。
かかる技術の利点は、選抜が細胞内の生育環境においてされるということである。
方法は、酸性活性化ドメインに付属したペプチド分子のライブラリを利用する。
従来技術において方法論を熟練のそれらにとって周知に扱って、さまざまな組合せのライブラリと協力して、それらの小分子または巨大分子を単離することができて、特徴づける。そして、それは所望の標的を結合するかまたは相互に作用する。
これらの化合物の相対的な結合能は比較され得る、そして、最適化合物は競争的結合研究を使用することを同定した。そして、それは従来技術において熟練のそれらにとって周知である。
【０３８７】
組合せのライブラリおよび映っている組合せのライブラリを所望の標的を結合する分子を単離するために実行するための技術は、従来技術において熟練のそれらにとって周知である。
代表的な技術および方法は、米国特許5,084,824, 5,288,514, 5,449,754, 5,506,337, 5,539,083, 5,545,568, 5,556,762, 5,565,324, 5,565,332, 5,573,905, 5,618,825, 5,619,680, 5,627,210, 5,646,285, 5,663,046, 5,670,326, 5,677,195, 5,683,899, 5,688,696, 5,688,997, 5,698,685, 5,712,146, 5,721,099, 5,723,598, 5,741,713, 5,792,431, 5,807,683, 5,807,754, 5,821,130, 5,831,014, 5,834,195, 5,834,318, 5,834,588, 5,840,500, 5,847,150, 5,856,107, 5,856,496, 5,859,190, 5,864,010, 5,874,443, 5,877,214, 5,880,972, 5,886,126, 5,886,127, 5,891,737, 5,916,899, 5,919,955, 5,925,527, 5,939,268, 5,942,387, 5,945,070, 5,948,696, 5,958,702, 5,958,792, 5,962,337, 5,965,719, 5,972,719, 5,976,894, 5,980,704, 5,985,356, 5,999,086, 6,001,579, 6,004,617, 6,008,321, 6,017,768, 6,025,371, 6,030,917, 6,040,193, 6,045,671, 6,045,755, 6,060,596, and 6,061,636.に、中で見つかるが、これに限られていない。
【０３８８】
組合せのライブラリは、多くの異なる合成の手技を使用している分子の広いアレーから作られる。例えば、縮合２，４−ピリミジンジオン (U.S. Patent 6,025,371) ジハイドロベンゾピラン  (U.S. Patents 6,017,768 and 5,821,130), アミドアルコール (U.S. Patent 5,976,894), ヒドロキシ−アミノ酸アミド（(U.S. Patent 5,972,719) 炭水化物 (U.S. Patent 5,965,719),１，４−ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎ−２，５−ジオン(U.S. Patent 5,962,337),サイクリックス (U.S. Patent 5,958,792), ビアリールアミノ酸アミド (U.S Patent 5,948,696), チオフェン(U.S. Patent 5,942,387), トリサイクリックテトラハイドロキノリン (U.S. Patent 5,925,527),ベンゾフラン (U.S. Patent 5,919,955),イソキノリン (U.S. Patent 5,916,899), ヒダントインおよびチオヒダントイン (U.S. Patent 5,859,190), インドール (U.S. Patent 5,856,496), イミダゾルピリドインドールおよびイミダゾル−ピリドベンゾチオフェン (U.S. Patent 5,856,107) 置換２−ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ−２、３−ジハイドロチアゾル(U.S. Patent 5,847,150),キノリン (U.S. Patent 5,840,500), ＰＮＡ(U.S. Patent 5,831,014), 含有タグ (U.S. Patent 5,721,099), polyketides (U.S. Patent 5,712,146),  モルホリノスブユニット (U.S. Patents 5,698,685 and 5,506,337), サルファミド (U.S. Patent 5,618,825), およびベンゾダイアゼピン (U.S. Patent 5,288,514).
【０３８９】
ここで使用しているように、組合せの方法およびライブラリは、方法およびインタラクウティブロセスにおいて使用するライブラリと同様に従来のスクリーニング法およびライブラリを含んだ。
（ｂ）  コンピュータは、ドラッグデザインを援助した）
【０３９０】
開示された組成物が、同定するいかなる分子のモデリング技術のためもの標的としても使われる開示された組成物の構造、またが、開示された組成物を扱う所望の方法で相互に作用する潜在的であるか実際の分子（例えば小分子）を同定すること。
核酸、ペプチドおよびここに開示される関連した分子が、いかなる分子のモデリングプログラムもまたはアプローチの標的として使われる。
【０３９１】
モデリング技術の開示された組成物を使用するときに、阻害または刺激作用のような特定の所望の性状または標的分子の機能を有する分子（例えば高分子分子）が同定されると理解される。
分子が、開示された組成物（例えば開示された細胞）を使用することはまた、開示される時を同定して、単離した。
このように、産物は開示された組成物（例えば開示された細胞）がまた、ここに考慮されることを含むモデリングアプローチが開示した分子的を使用することを生じた。
【０３９２】
このように、選出の分子を結合する分子を単離する１本の道は、合理的設計である。
これは、構造知見およびコンピュータモデリングで達成される。
コンピュータモデリング技術は、選択された分子の三次元原子構造および分子と相互に作用する新化合物の合理的な設計の可視化を許す。
三次元作成物は、選択された分子のＸ線結晶学的解析またはＮＭＲ画像化から、概してデータに依存する。
分子の力学は、力場データを必要とする。
コンピュータグラフィックス系は、新化合物が標的分子とつながって、化合物および標的分子の構造の実験的操作を許す方法の予報に結合特異性を仕上げるのを可能にする。
分子−化合物相互作用が小さい変化が一方または両方において作られる時であるというの予報は分子力学ソフトウェアおよびcomputationallyな加強法のコンピュータを必要とする。そして、通常分子デザインプログラムおよびユーザー間のユーザーフレンドリーな、メニュー選択方式の界面に結合する。
【０３９３】
分子のモデリング系の例は、ＣＨＡＲＭｍおよびＱＵＡＮＴＡプログラム、Ｐｏｌｙｇｅｎ社、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡである。
ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー極小化および分子動態力学機能を実行する。
ＱＵＡＮＴＡは、建設、グラフィックモデリングおよび分子構造の解析を実行する。
ＱＵＡＮＴＡは、双方向建設、一時変異、可視化および各々を有する分子の行動の解析を許す。
【０３９４】
多くの条項は、特性タンパク質、その他によって対話的な薬剤のコンピュータモデリングのいくつかの記事がある。Rotivinen, et al., 1988 Acta Pharmaceutica Fennica 97, 159-166; Ripka, New Scientist 54-57 (June 16, 1988); McKinaly and Rossmann, 1989 Annu. Rev. Pharmacol. Toxiciol. 29, 111-122; Perry and Davies, QSAR: Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design pp. 189-193 (Alan R. Liss, Inc. 1989); Lewis and Dean, 1989 Proc. R. Soc. Lond. 236, 125-140 and 141-162; 
そして、核酸成分、のためのモデル酵素に関しては、Askew, et al., 1989 J. Am. Chem. Soc. 111, 1082-1090.がある。化学薬品をスクリーニングして、視覚的に表す他コンピュータプログラムは、BioDesign, Inc., Pasadena, CA., Allelix, Inc, Mississauga, Ontario, Canada, and Hypercube, Inc., Cambridge, Ontario.である。
これらが主にかかるタンパク質に薬剤特性に適用法のために設計されるにもかかわらず、それらは一旦その領域が同定されるならば、ＤＮＡまたはＲＮＡの特性領域と、特に相互に作用している分子の設計に適している。
【０３９５】
結合することを変えてもよい化合物の設計および生成に関して上記したにもかかわらず、また、天然物または合成薬品化学薬品および生物学上活性材料を含む周知の化合物のライブラリをスクリーニングしてもよい。そして、基質結合または酵素活性を変える化合物のために、タンパク質を含む。
（２．キット）
【０３９６】
ここに開示される方法を実践する際に使われる試薬の方へ引き寄せられるキットは、ここに開示される。
キットはいかなる試薬も含む、または、ここに議論される試薬の組み合わせまたはそれは必要であると理解されるかまたは開示された方法の実算において有益である。
たとえば、キットは方法の或る実施例において議論される増幅反応を実行するためにプライマを含んでもよい。そして、衝液および酵素と同程度よく意図するプライマを使用することを必要とする。
（ＩＶ．  組成を作る方法）
【０３９７】
ここに開示される組成および開示された方法を実行するに必要な組成は、特に強調されない限り、その特定の試薬または化合物の当業者にとって公知のいかなる方法も使用して作成することができる。
（１．核酸合成）
【０３９８】
例えば、プライマとして使用されるオリゴヌクレオチドなどの核酸は、標準の化学合成方法を使用して作られ、または、酵素法または他のいかなる周知の方法も使用して作られる。
かかる方法は、ヌクレオチドフラグメント単離にしたがう標準酵素消化から、（たとえば、次の参照されたい：Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) Chapters 5, 6)）、純合成薬品方法、たとえば、ミリガンオアベックマンシステム１プラスＤＮＡ合成装置（たとえば、Model 8700 automated synthesizer of Milligen-Biosearch, Burlington, MA or ABI Model 380B)）を使用したシアノエチルホスホラミダイト法に、及ぶ。
オリゴヌクレオチド生成に役立つ合成薬品方法は、Ikuta et al., Ann. Rev. Biochem. 53:323-356 (1984), (phosphotriester and phosphite-triester methods), and Narang et al., Methods Enzymol., 65:610-620 (1980)に記載されている。
タンパク質核酸分子は、Nielsen et al., Bioconjug. Chem. 5:3-7 (1994)に記載されている周知方法を使用して作られる。
（２．ペプチド合成）
【０３９９】
開示されたタンパク質（例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）を産生する１つの方法は、タンパク質化学技術によって２つ以上のペプチドまたはポリペチドを結びつけることにある。
たとえば、ペプチドまたはポリペチドは、いずれのＦｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）基またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）基化学もも使用して、現在利用できる実験室設備を使用して、化学的に合成できる。（アプライドバイオシステムズ社、フォスター市、カルフォルニア）（Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA）
当業者は、たとえば、開示されたタンパク質に対応するペプチドまたはポリペチドが正規化学反応によって合成され得ると直ちに認めるであろう。
たとえば、ペプチドまたはポリペチドは合成できて、その合成樹脂から切断できないのに、ペプチドまたはタンパク質の他のフラグメントは合成できて、樹脂からその後切断され得る。それによって、他のフラグメントに機能的に遮断される末端基を露出できる。
ペプチド縮合反応によって、これらの２つのフラグメントは、それらのカルボキシルおよびアミノ末端でペプチド結合を経て共有結合で接続され、それぞれ、抗体またはそれのフラグメントを形成する。(Grant GA (1992) Synthetic Peptides: A User Guide. W.H. Freeman and Co., N.Y. (1992); Bodansky M. and Trost B., Ed. (1993)これらは、ペプチド合成に関する材料のために少なくともここに援用したものとする。
また、ここに記載されているように、ペプチドまたはポリペチドは生体内でそれぞれに合成される。
一度、隔離されると、これらの独立ペプチドまたはポリペチドはペプチドまたは類似したペプチド縮合反応を経てそれのフラグメントを形成するために結合され得る。
【０４００】
たとえば、クローンまたは合成ペプチドセグメントの酵素のライゲーションによって、比較的短いペプチドフラグメントが接続され、より大きいペプチドフラグメント、ポリペチドまたは総タンパク質ドメインを産生する(Abrahmsen L et al., Biochemistry, 30:4151 (1991))。
あるいは、合成ペプチドの天然型化学ライゲーションは、総合してより短いペプチドフラグメントから大きいペプチドまたはポリペチドを造るために利用され得る。
この方法は、２つのステップ化学反応からなる（Dawson et al. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation.Science, 266:776-779 (1994))。
第一ステップは、アミノ末端Ｃｙｓ残基を含んでいる保護されていない他のペプチドセグメントと保護されていない合成ペプチドチオエステルとの化学種選択的反応であり、チオエステル結合中間体を初期の共有結合性産物として与える。
反応条件の変化なしで、この中間体は自発的速い分子内反応を経て、ライゲーション部位で天然型ペプチド結合を形成する((Baggiolini M et al. (1992) FEBS Lett. 307:97-101;Clark-Lewis I et al., J.Biol.Chem., 269:16075 (1994);Clark-Lewis I et al., Biochemistry, 30:3128 (1991);Rajarathnam K et al., Biochemistry 33:6623-30 (1994)))。
【０４０１】
または、保護されていないペプチドセグメントはペプチドセグメント間で形成される結合の所で化学的に結合され、結果として、化学ライゲーションのる不自然な（非ペプチド）結合となる(Schnolzer, M et al. Science, 256:221 (1992))。
この技術は、タンパク質ドメインの類似体と同様に、大量の十分な生物学的活性度を有する比較的純粋なタンパク質を合成するために用いられている(deLisle Milton RC et al., Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Press, New York, pp. 257-267 (1992))。
（３．組成生成方法クレーム）
【０４０２】
中間体を導く組成と同様な組成を作るための生成プロセスが、開示される。
生成プロセスには、合成薬品化学法および標準の分子生物学方法などこれらの組成を作るために使われる様々な方法がある。
これらおよび他の開示された組成物を作る方法が具体的に開示されると理解される。
開示された核酸のいずれでも細胞を変えるプロセスによって産生される細胞が、開示される。
不自然に起こり開示された核酸のいずれでも細胞を変えるプロセスによって産生される細胞が、開示される。
【０４０３】
開示された核酸のいずれでも発現させるプロセスによって産生される開示されたペプチドのいずれでもが、開示される。
開示された核酸のいずれでも発現させるプロセスによって産生される不自然に起こっている開示されたペプチドのいずれでも、開示される。
開示された不自然の核酸のいずれでも発現させるプロセスによって産生される開示されたペプチドのいずれでも、開示される。
【０４０４】
ここに開示される核酸分子のいずれでも動物内で細胞をトランスフェクションさせるプロセスによって産生される動物が、開示される。
ここに開示した核酸分子のいずれでも、動物が哺乳類である動物内で、細胞をトランスフェクションさせるプロセスによって産生される動物が、開示される。
また、核酸分子のいずれでもここに開示した、哺乳類がハツカネズミ、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタまたは霊長類である動物内で、細胞をトランスフェクションさせるプロセスによって産生される動物が、開示される。
【０４０５】
また、開示する、動物を増すプロセスによって産生される動物は、ここに開示される細胞のいずれででもある。
（Ｖ．組成を使用する方法）
（１．研究道具として組成を使用する方法）
【０４０６】
開示された組成物が、マイクロアレーのまたは現存のマイクロアレイを調査するかまたは分析する試薬としてのいずれの試薬もと同程度ここに議論されて使われる。
開示された組成物が、単一のヌクレオチド染色体の多タイプを単離するかまたは同定するためのいかなる周知の方法にもおいて使われる。
組成がまた、スクリーニングアッセイのいかなる周知の方法にもおいて使われる。そして、木っ端／マイクロアレーに関する。
組成がまた、たとえば、研究相関性に開示された組成物のコンピュータ読み込み可能な実施例を使用するいかなる周知の方法でも使われる、または、分子のモデリング解析を実行することは開示された組成物に関した。
（ＶＩ．  或る実施例の図解）
【０４０７】
バイオセンサからバイオセンサ出力データを集めて、培養細胞に刺激性事象を提供して、バイオセンサ上の細胞を培養して、標識フリーバイオセンサを提供することからなる細胞に対する刺激性事象の影響を試験する方法が、開示される。
【０４０８】
また、細胞の生存に影響を及ぼすスクリーニング化合物またはバイオセンサ表面上の細胞の不均質性に基づく増殖に対する方法が、開示される。
【０４０９】
刺激性事象に影響を及ぼすスクリーニングモジュレータに対する方法は標識フリーバイオセンサを提供することからなる細胞上の効果である。そして、バイオセンサからバイオセンサ出力データを集めて、培養細胞に刺激性事象を提供して、種で予め定められた時間のための化合物を含んでいる溶液によってインキュベートして、バイオセンサ上の細胞をインキュベートする。
【０４１０】
また、培地の細胞を配置して、検出系が複数のバイオセンサに、バイオセンサの結合がそこにおいて、起こる発生率の角度または波長を測定して、化合物溶液を適用して、少なくとも７０％の密集度にバイオセンサ上の細胞を培養することを提供するならば、成り立っている細胞を分析するための方法は開示される、計測は１０分未満で起こる。
【０４１１】
また、化合物毒性をモニタするための方法が開示され、次のステップを含む：
（ａ）光学型標識フリーバイオセンサを提供し；
（ｂ）細胞がバイオセンサ表面上へ付属するように培地に細胞を配置し；
（ｃ）細胞培地に化合物を含んでいる溶液を適用し；
（ｄ）そして、バイオセンサ上で培養された細胞応答をモニタする。
【０４１２】
また、細胞上の化合物の効果をモニタするための方法が開示され、次のステップを含む：
（ａ）細胞がバイオセンサ表面上へ付属するように化合物を有する細胞をインキュベートし；
（ｂ）化合物の細胞上の効果を同定して、同定ステップは標識フリーバイオセンサの出力を観察して分析するステップを含む。
【０４１３】
また、細胞上の化合物の効果をモニタするための方法が開示され、次のステップを含む：
（ａ）細胞がバイオセンサ表面上へ付属するように化合物を有する細胞をインキュベートし；
（ｂ）化合物の細胞上の効果を同定して、同定ステップは標識フリーバイオセンサの出力を観察して、出力とシグニチャ出力と比較するステップを含む。
【０４１４】
また、リアルタイムの化合物吸着および毒性をモニタするための方法が開示され、次のステップを含む：
（ａ）光学型標識フリーバイオセンサを提供し；
（ｂ）細胞がバイオセンサ表面上へ付属するように、培地へ細胞の特定の数を配置してバイオセンサをカバーし；
（ｃ）細胞培地に化合物を含んでいる溶液を適用し；
（ｅ）、そして、バイオセンサ上で培養された細胞の時間依存応答をモニタする。
【０４１５】
また、細胞の状態を同定する方法が開示され、次のステップを含む：
（ａ）細胞−バイオセンサ組成を形成しているバイオセンサの界面上の細胞を培養し；
（ｂ）細胞−バイオセンサ組成を分析して、分析のステップが細胞が培養される界面の不均質性を同定するステップを含む。
【０４１６】
また、バイオセンサを使用して細胞上の化合物毒性の高いスループットスクリーニングのための方法が開示され、次のステップを含む：
（ａ）バイオセンサを提供し；
（ｂ）細胞がバイオセンサ表面上へ付いて高量密集度に到達するように、各ウェルに細胞を配置してバイオセンサをカバーし；
（ｃ）各ウェルの細胞培地に化合物溶液を適用し；
（ｄ）特定の時間で光導波路光モードスペクトルを集め；
（ｅ）細胞がいかなる化合物にもさらされないようして、コントロールウェルを有する各々の化合物のＰＷＨＭを比較して、単一のデータポイントを使用して、化合物の毒性があることを評価する。
【０４１７】
また、化合物毒性を評価する方法が開示され、次のステップを含む：
（ａ）マイクロプレートへ取り付けた光学型標識フリーバイオセンサを用意し；
（ｂ）細胞がバイオセンサ表面上へ付属して細胞がバイオセンサをカバーするように、細胞培地とともに各ウェルに細胞を配置し；
（ｃ）各ウェルの細胞培地に、化合物溶液を適用し；
（ｄ）指定された時間での各ウェルの全部のセンサ領域のＴＭ０モード共振角バンド像を収集する。
【０４１８】
また、光学バイオセンサを使用している細胞増殖に対する化合物の影響のための化合物の高いスループットスクリーニングのための方法が開示され、次のステップを含む：
（ａ）バイオセンサを用意し；
（ｂ）細胞発育のための期間の後細胞密集度４５％−５５％に達するように、細胞をバイオセンサに接触させて細胞−バイオセンサ組成物を形成し；
（ｃ）細胞−バイオセンサ組成物を有する化合物をインキュベートして化合物−細胞バイオセンサ複合体を形成し；
（ｄ）バイオセンサの出力を集め；
（ｄ）出力からＰＷＨＭを得て；
（ｅ）各化合物−細胞バイオセンサ複合体のＰＷＨＭをコントロールと比較し；
そして、細胞−バイオセンサ組成物が化合物にさらされないようにして、細胞に対する化合物の影響を有することをＰＷＨＭの減少が示す。
【０４１９】
また、リアルタイムの細胞のリガンド結合および逐次的なシグナル伝達現象をモニタリングする方法が開示され、次のステップを含む：
（ａ）光学型標識フリーバイオセンサを提供し；
（ｂ）細胞が、付着のために必要である血清の特定の濃度を含んでいる培地およびバイオセンサ界面上の細胞の成長において懸濁されるようにして、センサ界面上に受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を有する細胞を配置し；
（ｃ）細胞の静止状態状態に達するために血清または他の成長因子のないまたはオーバーナイトのためのいかなる血清または他成育因子のない培地を有する細胞を任意にインキュベートし；
（ｄ）検出系へ細胞の層を有するバイオセンサを配置して応答をモニタし；
（ｅ）刺激を含んでいる溶液の添加の前後で、または、２つの溶液（化合物を含んでいる第１のものおよびリガンドまたはマーカーを含んでいる第２のもの）の特定の期間でに分けた逐次的な添加で、付着細胞の層の時間依存応答をモニタする。
【０４２０】
また、細胞における受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の発現量および細胞−界面発現量を測定または決定するための方法が開示され、次のステップを含む：
（ａ）各ウェル底に埋め込まれる光学型標識フリーバイオセンサがある多数ウェルを有するマイクロプレートを供給し；
（ｂ）多数のタイプの細胞の提供し；
（ｃ）培地において懸濁した１種類の細胞を、少なくとも一つのウェルに配置し；
（ｄ）細胞を、密集度の特定のレベルまで達するまで付着および成長させるための適当な培地で培養し；
（ｅ）各が細胞の層によってカバーされたバイオセンサを有するマイクロプレートを検出系へ配置して、応答をモニタリングし；
（ｆ）培地にＲＴＫにリガンドを含んでいる溶液を適用し；
（ｇ）細胞の異なるタイプの層の時間依存応答をモニタして、比較する。
【０４２１】
また、ＲＴＫにリガンドの効力があると決定するための方法が開示され、次のステップを含む：
（ａ）各ウェル底に埋め込まれる光学型標識フリーバイオセンサがある多数ウェルを有するマイクロプレートを供給し；
（ｂ）細胞が所望の密集度で各々のバイオセンサに付けられるようにＲＴＫの比較的高い形質発現レベルを有する細胞の特定の数を培地に提供し；
（ｃ）特定時間で付着細胞を飢餓させるために培地を交換し；
（ｄ）各々が細胞の層によってカバーされているバイオセンサを有するマイクロプレートを検出系に配置して、応答をモニタリングし
（ｆ）各々のバイオセンサをカバーしている培地に、異なる濃度でリガンドを含んでいる溶液を適用し
（ｇ）細胞の用量依存および時間依存応答をモニタして、比較する。
【０４２２】
また、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）シグナル伝達に影響を及ぼすモジュレータのスクリーニング方法が開示され、以下のステップを含む：
（ａ）光学型標識フリーバイオセンサを用意し；
（ｂ）関心のあるＲＴＫを有する細胞の特定の数を、細胞がバイオセンサ界面上へ付属するように配置し；
（ｃ）バイオセンサを使用してる細胞応答をモニタし；
（ｄ）細胞培地に特定の濃度で化合物を含んでいる溶液を添加し；
（ｅ）リガンドを含んでいる溶液をＲＴＫに添加して、バイオセンサ上で培養した細胞の時間依存している応答を連続的にモニタする。
【０４２３】
また、細胞の細胞骨格配列を分析するための方法であって、光学標識無依存検出（ＬＩＤ）バイオセンサを用意し、そして光学ＬＩＤバイオセンサ表面上の細胞被着から生体材料の放出することをモニタする方法が開示される。
【０４２４】
また、細胞骨格再配列を分析するための方法が開示され、次のステップを含む：光学ＬＩＤバイオセンサを用意し；
生体細胞が光学ＬＩＤバイオセンサ表面に付属できるように、培地の細胞の生体細胞を配置して光学ＬＩＤバイオセンサをカバーし；
光学ＬＩＤバイオセンサ表面にある細胞培地に、孔形成試薬を含んでいる溶液を適用し；
そして、光学ＬＩＤバイオセンサを測定して細胞から生体材料の減失を示す時間依存光学応答を得る。
【０４２５】
また、細胞骨格構造を分析する方法が開示され、次のステップを含む：光学ＬＩＤバイオセンサを用意し；
生体細胞が光学ＬＩＤバイオセンサ表面に付属できるように、培地の細胞の生体細胞を配置して光学ＬＩＤバイオセンサをカバーし；
光学ＬＩＤバイオセンサ表面にある細胞培地に、化合物を含んでいる溶液を適用し；
そして、光学ＬＩＤバイオセンサを測定して細胞内で細胞骨格構造を妨げるモジュレータをスクリーニングするのを可能にする細胞から、生体材料の減失を示す時間依存光学応答を得る。
【０４２６】
また、細胞骨格構造を分析する方法が開示され、次のステップを含む：光学ＬＩＤバイオセンサを用意し；
生体細胞が光学ＬＩＤバイオセンサ表面に付属できるように、培地の細胞の生体細胞を配置して光学ＬＩＤバイオセンサをカバーし；
光学ＬＩＤバイオセンサ表面にある細胞培地に、孔形成試薬を含んでいる溶液を適用し；
光学ＬＩＤバイオセンサ表面にある細胞培地に、化合物を含んでいる溶液を適用し；
そして、光学ＬＩＤバイオセンサを測定して細胞内で細胞骨格構造を妨げるモジュレータをスクリーニングするのを可能にする細胞から、生体材料の減失を示す時間依存光学応答を得る。
【０４２７】
細胞上の刺激性事象の効果を試験する方が開示され、次のステップを含む：標識フリーバイオセンサを用意し；、バイオセンサ上の細胞をインキュベートし；インキュベートされた細胞に刺激性事象を提供し；
バイオセンサからバイオセンサ出力を集める。
【０４２８】
また、細胞の状態を同定する方が開示され、次のステップを含む：細胞−バイオセンサ組成物を形成している標識フリーバイオセンサの界面上の細胞を培養し；細胞−バイオセンサ組成を分析して、分析は細胞が培養される界面の不均質性を同定する。
【０４２９】
また、細胞をインキュベートすることは刺激性効果がバイオセンサ出力から同定される細胞を培養することを含む方法を含む方法が、開示される。
【０４３０】
、
また、細胞が２０−９９％密集度で培養される方法、細胞が３０−８０％密集度で培養される方法、細胞が４０−６５％密集度で培養される方法、細胞が７０−９９％密集度で培養される方法、および、細胞が８０−９５％密集度で培養される方法のいすれかを含む方法が、開示される。
【０４３１】
また、細胞が付着細胞である方法、細胞がバイオセンサと接触してある方法、および、細胞がバイオセンサに付属する方法のいすれかを含む方法が、開示される。
【０４３２】
また、刺激性事象が化合物を細胞培養に加えることからなる方法、化合物が細胞のシグナル伝達経路細胞を調整する方法、転形がシグナル伝達経路細胞を活性化する方法、転形がシグナル伝達経路細胞を抑制する方法、化合物が細胞上の細胞表面受容体を調整する方法、化合物が受容体の作動薬である方法、および、化合物が受容体の拮抗薬である方法のいすれかを含む方法が、開示される。
【０４３３】
また、細胞表面受容体がＧタンパク質共役型受容体、イオンチャネル、受容体チロシンキナーゼ、サイトカイン受容体、インテグリン受容体、Ｎａ＋／Ｈ＋交換体受容体または免疫性の受容体である方法、細胞表面受容体がＧｑ−共役型受容体、Ｇｓ−共役型受容体、Ｇｉ−共役型受容体、Ｇ１２／１３−共役型受容体、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、繊維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦ）または血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）である方法、化合物が細胞内で細胞骨格成分を調整する方法、化合物が細胞骨格構造を不安定にする方法、化合物が細胞骨格構造を安定させる方法、化合物が細胞内酵素、細胞内のキナーゼ、細胞内小器官、細胞内のタンパク質または細胞間マトリックスを調整する方法、化合物が化合物溶液に添加される方法のいすれかを含む方法が、開示される。
【０４３４】
また、化合物が細胞に対し毒性であるかどうか決定する方法を更に含むことを含む方法が、開示される。
【０４３５】
また、複数の化合物が細胞に対し毒性である化合物のためのスクリーニング試験される方法、および、化合物の毒性のレベルがバイオセンサ出力を経てモニタされる方法のいすれかを含む方法が、開示される。
【０４３６】
また、細胞が化合物の効果のためのバイオセンサ出力を経てモニタされる方法を含む方法が、開示される。
【０４３７】
また、化合物の生体吸収がバイオセンサ出力を経てモニタされる方法を含む方法が、開示される。
【０４３８】
また、バイオセンサが１００ナノメートルの深度に細胞を通すすなわち光侵入する方法、バイオセンサが１００ナノメート、２００ナノメートル、３００ナノメートル、または５００ナノメートルルの深度に細胞を通す方法、バイオセンサが細胞内で光侵入の多数の深度からデータを受け取る方法、光侵入の深度が最高５００ナノメートルである方法のいすれかを含む方法が、開示される。
【０４３９】
また、細胞の状態がバイオセンサ出力を使用して同定される方法を含む方法が、開示される。
【０４４０】
また、刺激性事象が細胞の生存又は増殖に影響を及ぼすかどうか決定することを更に含むことを含む方法が、開示される。
【０４４１】
また、複数の化合物が細胞に対し毒性である化合物のためのスクリーニング試験される方法、細胞上の化合物の効果がモニタされる方法、および、化合物が抗癌化合物である方法のいすれかを含む方法が、開示される。
【０４４２】
また、バイオセンサからバイオセンサ出力を集めることはバイオセンサ出力パラメータを集めることからなる方法を含む方法が、開示される。
【０４４３】
また、バイオセンサ出力パラメータがバイオセンサ出力の動態に関連したパラメータである方法を含む方法が、開示される。
【０４４４】
また、バイオセンサ出力パラメータがバイオセンサ出力の全体的な動態を分析することからなる方法、全体的な動態を分析することは相転移の完成で１つの位相から他の位相への変化率を分析することからなる方法、全体的な動態を分析することはそれがバイオセンサ出力の出力を完了することにかかる時間の長さを分析することからなる方法、全体的な動態を分析することはバイオセンサ出力の出力の全体的な位相がいずれをするか時間の長さを分析することからなる方法、全体的な動態を分析することはＰ−ＤＭＲ位相の全体の持続期間を分析することからなる方法、全体的な動態を分析することはＮ−ＤＭＲ位相の全体の持続期間を分析することからなる方法、全体的な動態を分析することはＰ−ＤＭＲの総振幅を獲得するための速度を分析することからなる方法、全体的な動態を分析することはＮ−ＤＭＲの総振幅を獲得するための速度を分析することからなる方法、全体的な動態を分析することはＮ−ＤＭＲからＰ−ＤＭＲまで行くために速度を分析することからなる方法、および、全体的な動態を分析することは、ネット−ゼロ位相にＰ−ＤＭＲ位相からＮ−ＤＭＲ位相、Ｐ−ＤＭＲ位相に対するネット−ゼロ位相、Ｎ−ＤＭＲ位相に対するネット−ゼロ位相、および、ネット−ゼロ位相に対するＰ−ＤＭＲ位相またはＮ−ＤＭＲ位相への遷移時間ｔを分析する方法のいすれかを含む方法が、開示される。
【０４４５】
また、バイオセンサ出力パラメータがバイオセンサ出力の位相を分析することからなる方法、位相を分析することは相転移を分析することからなる方法、位相を分析することは正の指向性質量再分布（Ｐ−ＤＭＲ）シグナルを分析することからなる方法、位相を分析することは負の指向性質量再分布（Ｎ−ＤＭＲ）シグナルを分析することからなる方法、位相を分析することはネット−ゼロ指向性質量再分布（ネット−ゼロＤＭＲ）を分析することからなる方法、位相を分析することは正の指向性質量再分布（Ｐ−ＤＭＲ）シグナルの形を分析することからなる方法、位相を分析することは正の指向性質量再分布（Ｐ−ＤＭＲ）シグナルの振幅を分析することからなる方法、位相を分析することは負の指向性質量再分布（Ｎ−ＤＭＲ）シグナルの形を分析することからなる方法、および、位相を分析することは負の指向性質量再分布（Ｎ−ＤＭＲ）シグナルの振幅を分析することからなる方法のいすれかを含む方法が、開示される。
【０４４６】
また、バイオセンサ出力パラメータがバイオセンサ出力の全体的な動態からなる方法、および、全体的な動態を分析することはバイオセンサ出力によって産生される完全な曲線の形を分析することからなる方法を含む方法が、開示される。
【０４４７】
また、バイオセンサ出力パラメータが共鳴ピークに関するパラメータである方法を含む方法が、開示される。
【０４４８】
また、バイオセンサ出力パラメータが光がバイオセンサに結合される入射角対光強度を分析することからなる方法を含む方法が、開示される。
【０４４９】
また、バイオセンサ出力パラメータが光がバイオセンサに結合される光の波長対光強度を分析することからなる方法を含む方法が、開示される。
【０４５０】
また、バイオセンサ出力パラメータがピーク位置を分析することからなる方法を含む方法が、開示される。
【０４５１】
また、ピーク位置を分析することは最大の強度の位置の前に起こっている最大半減のピーク強度の位置を分析することからなる方法を含む方法が、開示される。
【０４５２】
また、ピーク位置を分析することは最大の強度の位置の後に起こっている最大半減のピーク強度の位置を分析することからなる方法を含む方法が、開示される。
【０４５３】
また、バイオセンサ出力パラメータが共鳴ピークの位置の強度を分析することからなる方法を含む方法が、開示される。
【０４５４】
また、共鳴ピークの強度を分析することは最大の強度の強度を分析することからなる方法を含む方法が、開示される。
【０４５５】
また、共鳴ピークの強度を分析することはピーク強度の前に共鳴ピークに起こる最大半減のピーク強度の強度を分析することからなる方法を含む方法が、開示される。
【０４５６】
また、共鳴ピークの強度を分析することはピーク強度の後に共鳴ピークに起こる最大半減のピーク強度の強度を分析することからなる方法を含む方法が、開示される。
【０４５７】
また、方法が第２のバイオセンサ出力パラメータを集めることを更に含む方法を含む方法が、開示される。
【０４５８】
また、第２のバイオセンサ出力パラメータが分析ピーク位置からなる方法を含む方法が、開示される。
【０４５９】
また、バイオセンサ出力パラメータがピーク形を分析することからなる方法を含む方法が、開示される。
【０４６０】
また、ピーク形を分析することは共鳴ピークの下の領域を決定することからなる方法を含む方法が、開示される。
【０４６１】
また、共鳴ピークの下の領域が共鳴ピークに起こっている最大半減の強度点の間で引かれるラインより上の領域を含むだけである方法を含む方法が、開示される。
【０４６２】
また、ピーク形を分析することは最大半減の強度点で共鳴ピークの幅を分析することからなる方法を含む方法が、開示される。
【０４６３】
また、バイオセンサ出力パラメータが共鳴バンド像に関連したパラメータである方法を含む方法が、開示される。
【０４６４】
また、共鳴バンド像は、バイオセンサ全体を光スポットで照射して、バイオセンサ全体の内結合した光強度分布を画像化して得られる方法を含む方法が、開示される。
【０４６５】
また、内結合された光強度分布がＣＣＤカメラによって撮像される方法を含む方法が、開示される。
【０４６６】
また、共鳴バンド像に関連したパラメータがバンド形、バンド位置、バンド強度または光強度分布である方法を含む方法が、開示される。
【０４６７】
また、最大強度の位置と協力した最大半減（ＰＷＨＭ）でのピーク幅が分析される方法を含む方法が、開示される。
【０４６８】
また、化合物を有する培養細胞をインキュベートすることを更に含むことを含む方法が、開示される。
【０４６９】
また、化合物が細胞上の刺激性事象の効果に影響を及ぼすかどうか決定することを更に含むことを含む方法が、開示される。
【０４７０】
また、細胞上の刺激性事象の効果上の化合物の効果を決定することを更に含むことを含む方法が、開示される。
【０４７１】
また、一つ以上の追加の化合物はスクリーニングされ、化合物が細胞上の刺激性事象の効果に影響を及ぼすかどうか決定する方法を含む方法が、開示される。
【０４７２】
また、バイオセンサ出力が１０分、５分、１分、３０秒、１０秒、５秒または１秒未満で集められる方法を含む方法が、開示される。
【０４７３】
また、バイオセンサ出力が実質的に刺激性効果のための生物学的拡散制限すると同じ１回に集められる方法を含む方法が、開示される。
【０４７４】
また、検出系を提供することを更に含むことを含む方法が、開示される。
【０４７５】
また、複数の標識フリーバイオセンサが提供され、細胞がバイオセンサのうちの２つ以上の各々に培養され、刺激性事象が２つ以上の標識フリーバイオセンサに与えられ、バイオセンサ出力が２つ以上の標識フリーバイオセンサから集められる方法を含む方法が、開示される。
【０４７６】
また、細胞の多数の侵入深さがモニタされる方法を含む方法が、開示される。
【０４７７】
また、各々のバイオセンサが侵入深さのうちの１つを有する方法を含む方法が、開示される。
【０４７８】
また、２つ以上のバイオセンサからのバイオセンサ出力が同時に集められる方法を含む方法が、開示される。
【０４７９】
また、細胞が同時に培養される方法を含む方法が、開示される。
【０４８０】
また、刺激性事象が同時に２つ以上のバイオセンサに提供される方法を含む方法が、開示される。
【０４８１】
また、異なる細胞タイプの多数がバイオセンサの多数にインキュベートされる方法を含む方法が、開示される。
【０４８２】
また、細胞のうちの少なくとも１つが遺伝子操作されたので、少なくとも２つの細胞からなる多数細胞が異なる方法を含む方法が、開示される。
【０４８３】
また、細胞タイプの多数内の各細胞タイプがバイオセンサの多数の異なるバイオセンサによって検出される方法を含む方法が、開示される。
【０４８４】
また、細胞が少なくとも７０％の密集度で培養される方法を含む方法が、開示される。
【０４８５】
また、細胞が複数の細胞からなる方法を含む方法が、開示される。
【０４８６】
また、細胞のタイプおよび刺激性事象のタイプと互換性を持つ緩衝液を細胞に適用することを更に含むことを含む方法が、開示される。
【０４８７】
また、バイオセンサ出力を集めることは、入射角を変化させて、光にバイオセンサをさらし、そして、内結合した光の入射角を測定することを含む方法が、開示される。
【０４８８】
また、バイオセンサ出力を集めることは、波長を変化させて、光にバイオセンサをさらし、そして、内結合した光の波長を測定することを含む方法が、開示される。
【０４８９】
また、細胞は、増殖している状態において、静止性状態において、差別化された状態において、異なるレドックス／酸化された状態において、または、特定の細胞周期状態においてある方法を含む方法が、開示される。
【０４９０】
また、細胞が細胞増殖培養液を有する細胞を培養することによって増殖している状態においてある方法を含む方法が、開示される。
【０４９１】
また、細胞は、スターベーション培地を有する細胞を培養することによって静止性状態においてある方法を含む方法が、開示される。
【０４９２】
また、バイオセンサ出力を分析することを更に含むことを含む方法が、開示される。
【０４９３】
また、モニタリングは、１秒、３秒、５秒、１０秒、２０秒、３０秒、１分または５分のサンプリングレートによって、連続的に起こる方法を含む方法が、開示される。
【０４９４】
また、細胞上の刺激性事象の効果を同定することを更に含むことを含む方法が、開示される。
【０４９５】
また、効果を同定することはバイオセンサ出力をシグニチャ出力と比較することからなる方法を含む方法が、開示される。
【０４９６】
また、シグニチャ出力が正のＤＭと負のＤＭＲとネット−ゼロＤＭＲ位相のうちの少なくとも１つからなる動的質量再分布応答からなる方法を含む方法が、開示される。
【０４９７】
また、細胞が細胞株から起こる方法を含む方法が、開示される。
【０４９８】
また、細胞株が遺伝子操作による変種細胞株である方法を含む方法が、開示される。
【０４９９】
また、刺激性事象は、化合物を細胞培養に添加することからなり、刺激性効果が細胞上の化合物の吸収、分配、代謝または毒性に対する影響である方法を含む方法が、開示される。
【０５００】
また、刺激性事象は、化合物を細胞培養に添加することからなり、化合物の刺激性効果を決定することは、化合物の刺激性効果の機能上検査と、吸収、分配、代謝、排出または毒性の細胞に対する影響の同定とからなる方法を含む方法が、開示される。
【０５０１】
また、バイオセンサの出力が細胞内で質量再分布の変化に関連する方法を含む方法が、開示される。
【０５０２】
また、バイオセンサの出力がバイオセンサの反射ビームの角度であるかスペクトルの変化としての観察可能である方法を含む方法が、開示される。
【０５０３】
また、バイオセンサ出力を集めることは培養細胞の時間に依存している応答をモニタすることからなる方法を含む方法が、開示される。
【０５０４】
また、細胞が少なくとも８０％の密集度に到達した方法を含む方法が、開示される。
【０５０５】
また、バイオセンサがマイクロプレートに埋め込まれる方法を含む方法が、開示される。
【０５０６】
また、細胞が少なくとも１時間、５時間、１０時間、１６時間、２４時間、３６時間、１週または２週の間のバイオセンサ上で育てられる方法を含む方法が、開示される。
【０５０７】
また、バイオセンサは、生体細胞と接触したバイオセンサ界面の領域と、刺激性事象によって影響を受けた細胞と接触するバイオセンサ界面の領域と、細胞に接触していないバイオセンサ界面の領域と、間に差異を認める方法を含む方法が、開示される。
【０５０８】
また、影響を受けた細胞が一部のその細胞内の成分を放出するかまたは死んでいる細胞である方法を含む方法が、開示される。
【０５０９】
また、化合物を有する細胞−バイオセンサ組成をインキュベートすることを更に含むことを含む方法が、開示される。
【０５１０】
また、化合物が化学物質、生化学物質、生体分子、薬剤またはポリマーである方法を含む方法が、開示される。
【０５１１】
また、分析が化合物によってインキュベートした後に実行される方法を含む方法が、開示される。
【０５１２】
また、分析が６０秒、４５秒、３０秒、１５秒、１０秒、５秒、４秒、３秒、２秒または１秒以下で起こる方法を含む方法が、開示される。
【０５１３】
また、不均質性は、バイオセンサ出力が最大強度を有する導波モードの共鳴ピークからなるバイオセンサからのバイオセンサ出力を集めて、最大半減強度（ＰＷＨＭ）で、ピークの幅を比較することによって決定される方法を含む方法が、開示される。
【０５１４】
また、導波モードがＴＭモードである方法を含む方法が、開示される。
【０５１５】
また、バイオセンサが単一であるか多重化フォーマットにおいてある方法を含む方法が、開示される。
【０５１６】
また、バイオセンサが多重化フォーマットにおいてある時、バイオセンサがマイクロプレートの一つ以上のウェルに埋め込まれる方法を含む方法が、開示される。
【０５１７】
また、マイクロプレートの１つのウェルに１つのバイオセンサがある方法をそこで含む方法が、開示される。
【０５１８】
また、マイクロプレートの１つの空に多数のバイオセンサがあり、バイオセンサはパリアの有無にかかわらず物理的に分離される方法をそこで含む方法が、開示される。
【０５１９】
また、バイオセンサがパリアで物理的に分離され、ウェル内で区画を画定するパリアがマイクロプレートのウェルを画定しているパリアより低い方法を含む方法が、開示される。
【０５２０】
また、バイオセンサが光導波路バイオセンサである方法を含む方法が、開示される。
【０５２１】
また、バイオセンサが光導波路グレーティングバイオセンサである方法を含む方法が、開示される。
【０５２２】
また、細胞が刺激性事象が２つ以上のウェル刺激性事象が化合物を２つ以上のウェルバイオセンサ出力がより多くのウェルウェルのうちの２つ以上のＰＷＨＭがコントロールウェル刺激性事象がコントロールウェルに提供されないと比較される二つから集められるに添加されることからなるに提供される各々の２つ以上のウェルで培養される方法を含む方法が、開示される。
【０５２３】
また、バイオセンサ出力が、ウェル当たり、１秒か、２秒か、３秒か、４秒か、５秒か、１０秒か、１５秒か、３０秒か、４５秒か、または６０秒より大きい速度で集められる方法を含む方法が、開示される。
【０５２４】
また、バイオセンサ出力が、分当たり、６０か、３０か、１５か、１０か、７つか、５つか、４つか、３つか、２つか、または１つのウェルより大きい速度である方法を含む方法が、開示される。
【０５２５】
また、ウェルのＰＷＨＭが、ウェル当たり、１秒か、２秒か、３秒か、４秒か、５秒、１０秒、１５秒、３０秒、４５秒、または６０秒より大きい速度で比較される方法を含む方法が、開示される。
【０５２６】
また、ウェルのＰＷＨＭが、分当たり、６０か、３０か、１５か、１０か、７つか、５つか、４つか、３つか、２つか、または１つのウェルより大きい速度で比較される方法を含む方法が、開示される。
【０５２７】
また、化合物の毒性が単一のデータポイントを使用して評価され得る方法を含む方法が、開示される。
【０５２８】
また、そこにおいて、方法を含む方法が、開示される、バイオセンサ出力は、時間に依存するＰＷＨＭ変化である。
【０５２９】
また、バイオセンサが光学バイオセンサである方法を含む方法が、開示される。
【０５３０】
開示される１４のＡｌｓｏは、バイオセンサが光学型バイオセンサである方法を含む方法である。
【０５３１】
また、バイオセンサが標識フリーバイオセンサである方法を含む方法が、開示される
【０５３２】
また、バイオセンサが細胞を培養するための系に付けられる方法を含む方法が、開示される。
【０５３３】
また、系がプレートである方法を含む方法が、開示される。
【０５３４】
また、プレートが複数のウェルを有するプレートである方法を含む方法が、開示される。
【０５３５】
また、プレートがマイクロプレートである方法を含む方法が、開示される。
【０５３６】
また、細胞がマイクロプレートがウェルバイオセンサ出力が指定された時間での各ウェルの全部のセンサ領域のＴＭ０モード共振角のバンドの像であるからなる各々の２つ以上のウェルで培養される方法を含む方法が、開示される。
【０５３７】
また、細胞が７０％の密集度に到達する方法を含む方法が、開示される。
【０５３８】
また、刺激性事象が化合物をＴＭ０モード共振角のバンドの幅が化合物なしでウェルのＴＭ０モード共振角のバンドに添加される化合物を有するウェルの角のバンドが添加したＴＭ０モード共振の幅と比較されるウェルのうちの２つ以上に添加されることからなる方法を含む方法が、開示される。
【０５３９】
また、バイオセンサが導波路型バイオセンサである方法を含む方法が、開示される。
【０５４０】
また、導波路型バイオセンサがＮｂ２Ｏ５光学型バイオセンサである方法を含む方法が、開示される。
【０５４１】
また、細胞が付着細胞である方法を含む方法が、開示される。
【０５４２】
また、細胞が３０％、５０％または９０％の密集度に育てられる方法を含む方法が、開示される。
【０５４３】
また、バイオセンサ出力が光導波路光モードスペクトル（ＯＷＬＳ）、導波モードの共鳴ピークまたは導波モードの共鳴バンド像である方法を含む方法が、開示される。
【０５４４】
また、ＰＷＨＭの減少が化合物が細胞に対し毒性であることを示す方法を含む方法が、開示される。
【０５４５】
また、ＰＷＨＭの広幅化が化合物が細胞に対し毒性であることを示す方法を含む方法が、開示される。
【０５４６】
また、ＰＷＨＭの分裂が化合物が細胞に対し毒性であることを示す方法を含む方法が、開示される。
【０５４７】
また、共振バンド広がりが化合物が細胞に対し毒性であることを示す方法を含む方法が、開示される。
【０５４８】
また、細胞が少なくとも７０％の密集度に到達した方法を含む方法が、開示される。
【０５４９】
また、ＰＷＨＭの減少が化合物が細胞に対する影響を有することを示す方法を含む方法が、開示される。
【０５５０】
また、バイオセンサがマイクロプレートに付けられる方法を含む方法が、開示される。
【０５５１】
また、バイオセンサがマイクロプレートの各ウェルの底に埋め込まれる方法を含む方法が、開示される。
【０５５２】
また、バイオセンサが光学型標識フリーバイオセンサである方法を含む方法が、開示される。
【０５５３】
また、細胞−バイオセンサが化合物で覆われいる方法を含む方法が、開示される。
【０５５４】
また、化合物が溶液においてある方法を含む方法が、開示される。
【０５５５】
また、開始細胞数が増殖の増加か増殖の減少の解析を見越す方法を含む方法が、開示される。
【０５５６】
また、細胞の数は化合物の非存在下で３０−７０％間の密集度に到達する方法を含む方法が、開示される。
【０５５７】
また、細胞の数は４０−６０％間の密集度に到達する方法を含む方法が、開示される。
【０５５８】
また、細胞の数は４５−５５％間の密集度に到達する方法を含む方法が、開示される。
【０５５９】
また、細胞の数は５０％の密集度に到達する方法を含む方法が、開示される。
【０５６０】
また、化合物を有するインキュベーションの前にバイオセンサ上で培養される細胞の数が少なくとも１０００か、２０００か、３０００か、４，０００か、５，０００か、６，０００か、７，０００か、８，０００か、９，０００か、１０，０００か、１１，０００か、１２，０００か、１３，０００か、１４，０００か、１５，０００か、１６，０００か、１７，０００か、１８，０００か、１９，０００か、２０，０００か、２１，０００か、２２，０００か、２３，０００か、２４，０００か、２５，０００か、３０，０００か、３５，０００か、４０，０００か、４５，０００か、５０，０００か、５５，０００か、６０，０００か、６５，０００か７０，０００の細胞からなる方法を含む方法が、開示される。
【０５６１】
また、バイオセンサ出力が単一の時間点で集められる方法を含む方法が、開示される。
【０５６２】
また、集められるバイオセンサ出力がスペクトルである方法を含む方法が、開示される。
【０５６３】
また、集められるバイオセンサ出力が全部の独立のバイオセンサ領域のＴＭ０モード共振角のバンドの像である方法を含む方法が、開示される。
【０５６４】
また、集められるバイオセンサ出力が全部の独立のバイオセンサ領域のＴＭ０モード共振角のバンドの像である方法を含む方法が、開示される。
【０５６５】
また、バイオセンサ出力が全体の角のシフトの減少が化合物が細胞増殖の阻害物質であることを示す全体の角のシフトからなる方法を含む方法が、開示される。
【０５６６】
また、バイオセンサ出力が全体の角のシフトの増加が化合物が細胞増殖の阻害物質であることを示す全体の角のシフトからなる方法を含む方法が、開示される。
【０５６７】
また、バイオセンサ出力が結合された光の強度が光の入射角の関数として、プロットされる結合された光の強度からなる方法を含む方法が、開示される。
【０５６８】
また、細胞が少なくとも１時間、５時間、１０時間、１６時間、２４時間、３６時間、１週または２週の間のバイオセンサ上で培養される方法を含む方法が、開示される。
【０５６９】
また、バイオセンサ出力が結合モードからなる方法を含む方法が、開示される。
【０５７０】
また、結合モードがＴＭモード（ＴＭ０）である方法を含む方法が、開示される。
【０５７１】
また、ＴＭ０モードが始細胞接種数の関数として、プロットされる方法を含む方法が、開示される。
【０５７２】
また、細胞が細胞が付着を見越す濃度およびバイオセンサ界面細胞がバイオセンサ界面に付着する上の細胞の成長で血清を含んでいる培地において懸濁される受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を有する方法を含む方法が、開示される。
【０５７３】
また、スターベーション培地が血清の低濃度を含んでいる培地である３７℃で、細胞をスターベーション培地で培養することによって付着細胞を飢餓させることを更に含むことを含む方法が、開示される。
【０５７４】
また、培地に少なくとも緩衝液を適用することを更に含むことを含む方法が、開示される。
【０５７５】
また、刺激性事象が培地にリガンドをＲＴＫに適用することからなる方法を含む方法が、開示される。
【０５７６】
また、培地がＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）、ＥＧＦ、インシュリン、ＴＧＦ−ａ、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）および神経成長因子（ＮＧＦ）を欠いている方法を含む方法が、開示される。
【０５７７】
また、スターベーション培地が血清またはウシ胎児血清（ＦＢＳ）の約０．１％未満の濃度を有する方法を含む方法が、開示される。
【０５７８】
また、時間依存応答が少なくとも１つか、２つか、３つか、４つか、５つか、６つか、７つか、８つか、９つか、１０か、１１か、１２か、１３か、１４か、１５か、１６か、１７か、１８か、１９か、２０か、２１か、２２か、２３か、２４か、３６か４８時間起こる方法を含む方法が、開示される。
【０５７９】
また、バイオセンサが細胞で異なるタイプが各々の２つ以上のウェル刺激性事象が２つ以上のウェル刺激性事象が２つ以上のウェルバイオセンサ出力がより多くのウェルバイオセンサ出力が細胞で異なるタイプの時間依存応答である二つから集められるにリガンドをＲＴＫに加えることからなるに提供されるで培養される複数のウェルを有するマイクロプレートの底において包埋される方法を含む方法が、開示される。
【０５８０】
また、細胞の異なるタイプが異なる培養条件を必要とする方法を含む方法が、開示される。
【０５８１】
また、ＲＴＫの発現量または細胞表面発現量が測定されるかまたは細胞の異なるタイプにおいて決定される方法を含む方法が、開示される。
【０５８２】
また、化合物を有する培養細胞をインキュベートして、化合物がＲＴＫのシグナル伝達を調整するかどうか決定することを更に含むことを含む方法が、開示される。
【０５８３】
また、細胞がバイオセンサが複数のウェル細胞が各々の２つ以上のウェル刺激性事象が２つ以上のウェル刺激性事象が２つ以上のウェルＲＴＫに対するリガンドで異なる濃度が２つ以上の細胞バイオセンサ出力がより多くのウェルバイオセンサ出力が異なるウェルの細胞の用量依存および時間依存応答である二つから集められるに添加されるにリガンドをＲＴＫに添加されることからなるに提供されるで培養されるを有するマイクロプレートの底において包埋されるＲＴＫの比較的高い発現量を有する方法を含む方法が、開示される。
【０５８４】
また、細胞の用量依存および時間依存応答が比較される方法を含む方法が、開示される。
【０５８５】
また、リガンドの効力が決定される方法を含む方法が、開示される。
【０５８６】
また、細胞の細胞骨格の状態が分析されるそれによって細胞から生体材料の放出のためのバイオセンサ出力を分析することを更に含むことを含む方法が、開示される。
【０５８７】
また、細胞からの生体材料の放出が細胞の孔形成試薬−起因性透過性に依存している方法を含む方法が、開示される。
【０５８８】
また、孔形成試薬を細胞培養に適用することを更に含むことを含む方法が、開示される。
【０５８９】
また、バイオセンサ出力が時間依存光学応答である方法を含む方法が、開示される。
【０５９０】
また、前記孔形成試薬が細胞表層膜の小孔形成に結果としてなることが可能である化学であるか生物学的な化合物である方法を含む方法が、開示される。
【０５９１】
また、孔形成試薬がサポニン、ジギトニン、フィリピンまたはストレプトリジンＯである方法を含む方法が、開示される。
【０５９２】
また、化合物を細胞培養に孔形成試薬の適用法に続いている細胞培養に適用することを更に含むことを含む方法が、開示される。
【０５９３】
また、一つ以上の追加の化合物が化合物が細胞内で細胞骨格構造を妨げるかどうか決定することにスクリーニングされる方法を含む方法が、開示される。
【０５９４】
また、細胞培養に孔形成試薬の適用法の前に化合物を細胞培養に適用することを更に含むことを含む方法が、開示される。
【０５９５】
また、一つ以上の追加の化合物が化合物が細胞内で細胞骨格構造を妨げるかどうか決定することにスクリーニングされる方法を含む方法が、開示される。
【０５９６】
また、標識を検出する装置を有する標識を検出するステップを更に含むことを含む方法が、開示される。
【０５９７】
また、標識が蛍光性標識、放射性の標識または発光顔料標識である方法を含む方法が、開示される。
【０５９８】
また、標識を検出するステップがバイオセンサをモニタするステップによって、同時に起こる方法を含む方法が、開示される。
【０５９９】
また、バイオセンサが２つの領域を有する、堆積する材料を含有する混合液を有する第１のものでないおよび細胞がある時がセンサの上へインキュベートしたように、堆積する材料を含有する細胞が第２の領域にかぶせた効果があっている第２のものが材料によってトランスフェクションする方法を含む方法が、開示される。
【０６００】
また、材料が標的遺伝子、標的タンパク質、標的タンパク質および標識タンパク質の融合タンパク質、標的に対するＲＮＡｉ、標的に対する抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその派生物、抗原オリゴヌクレオチドおよびその派生物である方法を含む方法が、開示される。
【０６０１】
また、標識タンパク質がヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）ＧＦＰタンパク質またはその派生物である方法を含む方法が、開示される。
【０６０２】
また、細胞がセンサの材料提示領域の上へ付着するときに細胞が材料を取込むようにして、材料は試薬によって複合体になる方法を含む方法が、開示される。
【０６０３】
また、領域がグレーティング構造に沿ってセンサ界面の一つの半分の上へ、材料を含有する混合液を選択的に堆積させることによって形成される方法を含む方法が、開示される。
【０６０４】
また、観察するステップが共鳴導波路グレーティングバイオセンサに起こる細胞の内容物の動的質量再分布を観察することからなる生体細胞の状態を決定する方法が、開示される。
【０６０５】
また、最初に細胞を洗って、細胞を飢餓させて、細胞を有する化合物をインキュベートして、バイオセンサを有するシグナルを記録して、バイオセンサ上の成っている、培養している細胞細胞に対する化合物影響を試験するための方法が、開示される。
【０６０６】
また、飢餓ステップの後、緩衝液を有するすすぎのステップを更に含んでいる方法
６０５が、開示される；
または、方法において、細胞は９０％を超える密集度に育てられる；
または、方法において、細胞は洗浄液で二回洗浄される；
または、方法において、細胞を飢餓させることは、それらをＤＭＥＭだけで培養することから成る；
または、方法において、細胞を飢餓させることは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０時間、起こる；
または、方法において、細胞を飢餓させることは、一晩起こる；
または、方法において、すすぎ緩衝液は、２．５ｍＭのプロベニシド（ｐｒｏｂｅｎｉｃｉｄ）がある場合には、１×標準ハンクス均衡塩類溶液、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ペーハー７．０から成る；
または、方法において、シグナルはカルシウムシグナルである；
または。方法において、カルシウムシグナルは６秒の間隔で、６分以上記録された；
または、方法において、バイオセンサはＨＴＳ７０００バイオアッセイリーダ（BioAssay Reader）から成る；
または、方法において、方法は室温で、起こる；
または、方法において、バイオセンサはコーニングＥｐｉｃＴＭ角度測定システムである；
または。方法において、バイオセンサは、ＴＭモードの使用する；
または、方法において、バイオセンサがｐ−偏光を所定のＴＭ０モードにおいて使われる；
または、方法において、化合物はすすぎ緩衝液において薄められた；
または、方法において、すすぎ緩衝液は、１×標準ハンクス均衡塩類溶液、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ペーハー７．０から成る；
または、方法において、細胞を飢餓させることは、ＦＢＳを欠いている緩衝液で起こる；
または、方法において、溶液が０．０５％未満のＤＭＳＯを有する溶液において、化合物はある；
または、方法において、飢餓させるステップは、３７℃で起こる；
または、方法において、更に飢餓させるステップは、空気／５％のＣＯ２の下で起こる；
または、方法において、細胞は細胞を有する化合物溶液をインキュベートする前に化合物を欠いている化合物溶液によって前処理される、それまで、安定した位相に達する；
または、方法において、バイオセンサは共鳴バンドの中央の位置の画素密度の変化を同定する；
または、方法において、バイオセンサは共鳴バンドのまたは更に時間の関数として、バイオセンサデータをプロットするステップから成る角のシフトを測定する；
または、方法において、増加するシグナル（Ｐ−ＤＭＲ）は検知体積内で生体分子の総計の増加を意味する、そして、減少されたシグナル（Ｎ−ＤＭＲ）は検知体積内で生体分子の総計の減少を意味する；
または、方法において、方法は細胞および化合物のためのシグニチャを同定する；
または、方法において、シグニチャは次のＮ−ＤＭＲ位相が続くＰ−ＤＭＲ位相から成る；。方法において、Ｐ−ＤＭＲ位相はＮ−ＤＭＲ位相の崩壊速度より高い速度で起こる；
または、方法において、シグニチャはＰ−ＤＭＲがそれまで位相が評価プラトーに渡すＰ−ＤＭＲを段階的に実行することを成る；
または、方法において、シグニチャは２つの連続的Ｐ−ＤＭＲ現象から成る。方法において、高いレベルに対する第１のＰ−ＤＭＲ位相は第２のＰ−ＤＭＲ位相が１秒起こる速度がレベルを上げたより、大きい速度で起こる；
または、方法において、シグニチャは化合物濃度の関数として、シグナルをバイオセンサからプロットするステップから成る、更にか騒音レベルより上にいかなるＤＭＲシグナルも含まない。
【０６０７】
細胞は、２０−９９％密集度、３０−８０％密集度、４０−６５％密集度、７０−９９％密集度、および８０−９５％密集度で培養され得る。
細胞は、付着細胞でありえる。
付着細胞は、バイオセンサ表面に付着する細胞である。
刺激性事象は、化合物を細胞培養に加えることからなる。
化合物は、細胞のシグナル伝達経路細胞を調整する。
転形は、シグナル伝達経路細胞を活性化する。
転形は、シグナル伝達経路細胞を抑制する。
化合物は、細胞上の細胞表面受容体を調整する。
化合物転形は、受容体の作動薬でありえる。
化合物転形は、受容体の拮抗薬でありえる。
細胞表面受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、イオンチャネル、受容体チロシンキナーゼ、サイトカイン受容体、インテグリン受容体、Ｎａ＋／Ｈ＋交換体受容体および免疫性の受容体でありえる。
受容体チロシンキナーゼは、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、繊維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦ）、インシュリン受容体、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）でありえる。
【０６０８】
化合物は、細胞内で細胞骨格成分を調整する。
モジュレータは、細胞骨格構造を不安定にする。
モジュレータは、細胞骨格構造を安定させる。
化合物は、細胞内酵素、細胞内のキナーゼ、細胞内小器官または細胞内のタンパク質を調整する。
化合物は、細胞間マトリックスを調整する。
【０６０９】
バイオセンサからバイオセンサ出力データを集めるステップは、バイオセンサ出力データパラメータを集めることからなる。
バイオセンサ出力データパラメータは、刺激性事象の動態に関連したパラメータでありえる。
バイオセンサ出力パラメータは、バイオセンサ出力データの全体的な動態を分析することからなる。
全体的な動態を分析することは、相転移の完成の速度を分析することからなる。
全体的な動態を分析することは、それがデータ出力を完了することにかかる時間の長さを分析することからなる。
全体的な動態を分析することは、データ出力の全体的な位相がいずれをするか時間の長さを分析することからなる。
全体的な動態を分析することは、Ｐ−ＤＭＲ位相の時間の全体の持続期間を分析することからなる。
全体的な動態を分析することは、Ｎ−ＤＭＲ位相の時間の全体の持続期間を分析することからなる。
全体的な動態を分析することは、Ｐ−ＤＭＲの総振幅を得るための速度を分析することからなる。
全体的な動態を分析することは、それがＮ−ＤＭＲの総振幅と考える時間の全長を分析することからなる。
全体的な動態を分析することは、それがＰ−ＤＭＲの総振幅と考える時間の全長を分析することからなる。
全体的な動態を分析することは、Ｐ−からＮ−ＤＭＲ位相への遷移時間ｔを分析することからなる。
【０６１０】
バイオセンサ出力パラメータは、バイオセンサ出力データの位相を分析することからなる。
位相を分析することは、相転移を分析することからなる。
位相を分析することは、正の指向性質量再分布（Ｐ−ＤＭＲ）シグナルを分析することからなる。
位相を分析することは、負の指向性質量再分布（Ｎ−ＤＭＲ）シグナルを分析することからなる。
位相を分析することは、ネット−ゼロ指向性質量再分布（ネット−ゼロＤＭＲ）を分析することからなる。
位相を分析することは、正の指向性質量再分布（Ｐ−ＤＭＲ）シグナルの形を分析することからなる。
位相を分析することは、振幅を分析することからなるの正の指向性質量再分布（Ｐ−ＤＭＲ）シグナル。
位相を分析することは、負の指向性質量再分布（Ｎ−ＤＭＲ）シグナルの形を分析することからなる。
位相を分析することは、負の指向性質量再分布（Ｎ−ＤＭＲ）シグナルの振幅を分析することからなる。
【０６１１】
バイオセンサ出力パラメータは、バイオセンサ出力データの全体的な動態からなる。
分析全体的動的は、出力データによって産生される完全な曲線の形を分析することからなる。
バイオセンサ出力データパラメータは、共鳴ピークに関するパラメータでありえる。
バイオセンサ出力パラメータなる光がバイオセンサに結合される入射角対光強度を分析する。
バイオセンサ出力パラメータは、光がバイオセンサに結合される光の波長対光強度を分析することからなる。
バイオセンサ出力パラメータは、ピーク位置を分析することからなる。
ピーク位置を分析することは、ピーク強度の位置の前に起こっている最大半減のピーク強度の位置を分析することからなる。
ピーク位置を分析することは、ピーク強度の位置の後、起こっている最大半減のピーク強度の位置を分析することからなる。
【０６１２】
バイオセンサ出力パラメータは、共鳴ピークの点の強度を分析することからなる。
共鳴ピークの強度を分析することは、ピーク強度の強度を分析することからなる。
共鳴ピークの強度を分析することは、ピーク強度の前に共鳴ピークに起こる最大半減のピーク強度の強度を分析することからなる。
共鳴ピークの強度を分析することは、ピーク強度の後、共鳴ピークに起こる最大半減のピーク強度の強度を分析することからなる。
【０６１３】
方法は、第２のバイオセンサ出力パラメータから更になる。
第２のバイオセンサ出力パラメータは、分析ピーク位置からなる。
バイオセンサ出力パラメータは、ピーク形を分析することからなる。
ピーク形を分析することは、共鳴ピークの下の領域を決定することからなる。
共鳴ピークの下の領域は、共鳴ピークに起こっている最大半減の強度点の間で引かれるラインより上の領域だけを含む。
ピーク形を分析することは、最大半減の強度点で共鳴ピークの幅を分析することからなる。
バイオセンサ出力データパラメータは、共鳴バンド像に関連したパラメータでありえる。
共鳴バンド像は受信システムとの協働でセンサ全体を光スポットで照射して集められ、センサ全体に内結合した光強度分布の共鳴バンド像を形成する。
受信システムはＣＣＤカメラを含む。
共鳴バンド像に関するパラメータは、バンド形、バンド位置、バンド強度または光強度分布でありえる。
【０６１４】
最大強度の位置と協力したＰＷＨＭは、分析され得る。
バイオセンサは、同時に分析され得る。
各ウェルバイオセンサからデータポイントを集めるための時間は１時間未満、３０分、５分、１分、３０秒、１０秒、５秒、２秒においてされ得る。そして、それが生物学的拡散である１秒およびところが制限される。
細胞は、スターベーション培地または差別化された状態を有する細胞を培養することによって細胞増殖培養液または静止性状態を有する細胞を培養することによって増殖している状態であるまたは特定の細胞周期状態で、得られる。
スターベーション培地は、細胞の培養の細胞増殖容量を減少させるいかなる培地でもある。
【０６１５】
方法はさらに細胞培地に少なくとも一度緩衝液を適用するステップを含み、方法において、使用する緩衝液は細胞タイプおよび標的−化合物相互作用の性質に従う最適のアッセイに基づくことが可能である。
モニタリングは、１秒、３秒、５秒、１０秒、２０秒、３０秒、１分または５分、３０分のサンプリングレートで持続性のやり方で行われる。
シグニチャ出力は、正のＤＭＲ、負のＤＭＲおよびネット−ゼロＤＭＲ位相の三位相のうちの少なくとも１つからなる動的質量再分布応答を含む。
細胞は、細胞株または遺伝子操作による変種細胞株から生じる。
化合物の効果は、吸着、分配、代謝および細胞上の化合物の毒性の解析のために決定され得る。
かかる効果は、細胞上の化合物の機能上の検査から得られ、吸着、分配、代謝、排出および細胞上の毒性の効果を同定する。
【０６１６】
バイオセンサの出力は、細胞を有する質量再分布の変化に関連する。
バイオセンサの出力は、バイオセンサの反射ビームの角であるかスペクトルの変化としての観察可能でありえる。
細胞培地に方法は少なくとも緩衝液を適用することを更に含む。
化合物は、抗癌化合物または潜在的な抗癌化合物でありえる。
バイオセンサ上の少なくとも１０５の１０５の細胞が、あることが可能である。
細胞は、少なくとも８０％の密集度に到達する。
バイオセンサは、マイクロプレートに埋め込まれる。
細胞は、少なくとも１時間、５時間、１６時間、２４時間、３６時間、１週または２週の間のバイオセンサに育てられる。
バイオセンサは、生体細胞と接触してバイオセンサ界面の領域との間に差異を認めることが可能である。
遂行された細胞は、一部のその細胞内の成分を放出するかまたは死んでいる細胞でありえる。
【０６１７】
方法は、化合物を有する細胞−バイオセンサ組成をインキュベートすることを更に含む。
化合物は、化学物質である、生化学（生物学的製剤）薬剤またはポリマー。
方法は、化合物によってインキュベートした後にアッセイステップを実行することを更に含む。
分析は、６０秒か、４５秒か、３０秒か、１５秒か、１０秒か、５秒か、４秒か、３秒か、２秒か、１秒以下で起こる。
不均質性は、最大強度を有する導波モードの共鳴ピークを産生する出力を集めて、最大半減強度（ＰＷＨＭ）で、ピークの幅を比較することによって決定され得る。
導波モードは、ＴＭモードでありえる。
【０６１８】
バイオセンサは、単一であるか多重化フォーマットにおいてある。
バイオセンサが多重化フォーマットにおいてあるときに、バイオセンサはマイクロプレートのいくつかのウェルに埋め込まれる。
マイクロプレートの１つのウェルの１つのバイオセンサが、あることが可能である。
マイクロプレートの１つのウェルの多数バイオセンサがあることが可能である。そこにおいて、バイオセンサはパリアの有無にかかわらず物理的に分離され得る。
あってそこで物理的に、パリア（ウェル内の区画がより低くマイクロプレートのウェルを非常に定義しているそれでありえることを定義しているパリア）。
バイオセンサは、光導波路バイオセンサでありえる。
バイオセンサは、光導波路グレーティングバイオセンサでありえる。
【０６１９】
方法は、時間に依存するＰＷＨＭ変化を集めることを更に含む。
光導波路光モードスペクトルは、導かれたＴＭモードの共鳴ピークでありえる。
バイオセンサは、光学バイオセンサでありえる。
バイオセンサは、光学型バイオセンサでありえる。
バイオセンサは、標識フリーバイオセンサでありえる。
バイオセンサは、細胞を培養するための系に付けられる。
系は、プレートでありえる。
プレートは、複数のウェルを有するプレートでありえる。
プレートは、マイクロプレートでありえる。
細胞は、７０％の密集度に到達する。
【０６２０】
方法は、ＴＭ０モード共振角のバンドの幅を得て、ＴＭ０モード共振に適用される化合物のないウェルの角のバンドが添加した効果があっているウェルのＴＭ０モード共振角のバンドの幅を比較するステップをさらに含む。
バイオセンサは、導波路型バイオセンサでありえる。
導波路型バイオセンサは、Ｎｂ２Ｏ５光学型バイオセンサでありえる。
細胞は、付着細胞でありえる。
細胞は、３０％、５０％または９０％の密集度に育てられる。
出力は、導波モードまたは導波モードの共鳴バンド像の光導波路光モードスペクトル（ＯＷＬＳ）または共鳴ピークでありえる。
ＰＷＨＭの変化は、化合物が細胞に対し毒性であることを示す。
ＰＷＨＭの広幅化は、化合物が細胞に対し毒性であることを示す。
ＰＷＨＭの分裂は、化合物が細胞に対し毒性であることを示す。
共振バンド広がりは、化合物が細胞に対し毒性であることを示す。
細胞は、少なくとも７０％の密集度に到達する。
バイオセンサは、マイクロプレートに付けられる。
バイオセンサは、マイクロプレートの各ウェルの底に埋め込まれる。
バイオセンサは、光学型標識フリーバイオセンサでありえる。
細胞−バイオセンサは、化合物で覆われる。
化合物は、溶液においてある。
開始細胞数は、増殖の増加か増殖の減少の解析を見越す。
細胞の数は、化合物の非存在下で３０−７０％間の密集度に到達する。
細胞の数は、４０−６０％間の密集度に到達する。
細胞の数は、４５−５５％間の密集度に到達する。
細胞の数は、５０％の密集度に到達する。
化合物を有するインキュベーションの前にバイオセンサ上で培養される細胞の数は、少なくとも１０００か、２０００か、３０００か、４，０００か、５，０００か、６，０００か、７，０００か、８，０００か、９，０００か、１０，０００か、１１，０００か、１２，０００か、１３，０００か、１４，０００か、１５，０００か、１６，０００か、１７，０００か、１８，０００か、１９，０００か、２０，０００か、２１，０００か、２２，０００か、２３，０００か、２４，０００か、２５，０００か、３０，０００か、３５，０００か、４０，０００か、４５，０００か、５０，０００か、５５，０００か、６０，０００か、６５，０００か７０，０００の細胞からなる。
【０６２１】
出力は、単一の時間点で集められる。
集められる出力は、スペクトルでありえる。
集められる出力は、全部の独立のバイオセンサ領域のＴＭ０モード共振角のバンドの像でありえる。
集められる出力は、全部の独立のバイオセンサ領域のＴＭ０モード共振角のバンドの像でありえる。
方法は全体の角のシフトを提供している出力を得ることを更に含む。方法において、全体の角のシフトの減少は化合物が細胞増殖の阻害物質であることを示す。
方法は全体の角のシフトを提供している出力を得ることを更に含む。方法において、全体の角のシフトの増加は化合物が細胞増殖の阻害物質であることを示す。
集められる出力は、結合された光の強度を得ることができて、これをプロットする光の入射角の機能。
細胞は、少なくとも１時間、５時間、１０時間、１６時間、２４時間、３６時間またはオーバーナイトのためのバイオセンサ上で培養され得る。
【０６２２】
出力は、結合モードからなる。
結合モードは、ＴＭモード（ＴＭ０）でありえる。
ＴＭ０モードは、始細胞接種数の関数として、更にプロットされ得る。
方法は、３７℃で特定の時間のための血清の低濃度を含んでいる培地の付着細胞を飢餓させることを更に含む。
時間の特定の総計のための細胞培地に少なくとも緩衝液を適用することを更に含む。
方法は、培地にＲＴＫにリガンドを含んでいる溶液を適用することを更に含む。
細胞培地は、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）、ＥＧＦ、インシュリン、ＴＧＦ−ａ、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）および神経成長因子（ＮＧＦ）を欠いている。
スターベーション培地は、血清またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の約０．１％未満の濃度を有する。
バイオセンサ出力の収集は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３６または４８時間起こる。
細胞の異なるタイプは、異なる培養条件を必要とする。
細胞からの生体材料の監視放出は、細胞の孔形成試薬−起因性透過性に依存していることが可能である。
孔形成試薬は、細胞表層膜の小孔形成に結果としてなることが可能である化学物質または生物学的製剤でありえる。
孔形成試薬は、サポニン、ジギトニン、フィリピンまたはストレプトリジンＯでありえる。
（ＶＩＩ．実施例）
【０６２３】
以下の例は、従来技術において完全な告知を有する通常の熟練および化合物、組成、条項、装置および／またはここに請求される方法が作られて、評価される方法の記述のそれらを提供するために出されて、単に典型的なことを目的として、告知を制限することを目的としない。
数（例えば総計、温度、その他）に関して精度を確実にするために努力実行された、しかし、若干の間違いおよび偏差は説明されなければならない。
一方、部分が重量部であることを示さなかった限り、温度が°Ｃにおいてあるかまたは外界温度および圧力であって、ある大気の。
（１．例１−バイオセンサに基づく細胞毒性スクリーニング）
【０６２４】
それらの細胞障害能および抗増殖効果によって化合物の輪郭を描くことは、プロフィールポテンシャル抗癌剤にしばしば使用される。
細胞が細胞障害能作因にさらされるときに、そのようなフェノタイプはプラズマ膜統合性の妥協である。そして、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。
導波路型バイオセンサ技術を使用して、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびＡ４３１細胞上のＤＭＳＯの効果をモニタするための実施可能性は、検査された。
ほぼ１０５の１０５の細胞は、コーニングＥｐｉｃＬＩＤマイクロプレートの各ウェルに配置された。
これらの細胞は、細胞が基質界面に対する被着層になったことを確実にして、少なくとも８０％の密集度に到達するためにオーバーナイトのための血清培地で培養された。
異なる濃度（１％、２％、５％、１０％、１５％、１８％および２０％）でのＤＭＳＯに対する細胞応答は、検査された。
より高い濃度約≧２５％の使用するセンサおよびシグナルの最大手に余るバルク屈折率変化のＤＭＳＯ結果は、消失した。
リース２で、実験のセットは、各々の細胞株のために実行された。
（ａ）  材料および方法）
【０６２５】
全ての細胞株は、American Type Cell Cultureから購入された。
ＤＭＳＯは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（セントルイス（ＭＯ））から得られた。
動物細胞のためのＬｉｖｅ／ＤＥＡＤ細胞増殖試薬キット分子フローブ（Molecular Probes）は、ユージン（オレゴン）から得られた。
【０６２６】
Ａ４３１およびＣＨＯ−Ｋ１細胞は、１０％のウシ胎仔血清で補充されるダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）において育てられた１００μｇ／ｍｌペニシリン、そして、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン。
細胞培養のための、約１０×１０５細胞（Ａ４３１またはＣＨＯ−Ｋ１）が２００ｍｌの培地において懸濁されたものを、９６ウェルコーニングＥｐｉｃバイオセンサマイクロプレートの各ウェルの配置されて、そして、オーバーナイトのための空気／５％のＣＯ２の３７℃で培養された。
アッセイの前に、細胞は対応する培地を有する一度、洗浄された。
アッセイの間、１００ｍｌの培地の細胞は、５０ｍｌのＤＭＳＯ溶液が適用される前に、各々２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（pH７．４）を含んでいる２５ｍｌのＨＢＳＳ緩衝液液が少なくとも１５分によって分離した二つに委ねられた。
全てのこれらのステップの間、平行の角度測定システムは、細胞応答のリアルタイム動態をモニタするために用いた。
【０６２７】
アッセイの後、対応する結果として生じる細胞は、直ちに供給元によって推薦されるプロトコルを使用しているＬｉｖｅ／ＤＥＡＤ染色に委ねられた。
染色の後、蛍光−顕微鏡法（ツァイスＡｘｉｏｐｌａｎ蛍光−顕微鏡）は処理されて未処置の細胞の形態および蛍光分配を視覚化するために用いた。
（ｂ）  結果）
【０６２８】
結果は、バイオセンサに付着した細胞が類似した応答曲線を引き起こすことを示した。
図２９のように、ＤＭＳＯ−起因性用量応答およびＣＨＯ細胞の時間に依存する応答曲線に示すように層は＜２０％のＤＭＳＯ濃度で、応答がほとんど特色のないことを示す。但し、段階的な減少がＤＭＳＯ溶液の導入の後場合は除く。
原基がある、そして、急速が位相を増やした点に注意される。そして、それは全ての濃度でのＤＭＳＯが導かれたあと、右の屈折率変化をかさばらせるために予定される。
しかし、ＤＭＳＯの濃度が２０％に達するときに、観察され得る４つの現象がある：
（Ａ）大きい応答シグナルにより、バルク屈折率がＤＭＳＯ溶液の導入の直後に変わる；
（Ｂ）小さい減少されたシグナル（おそらくウェルの２つの流体の混合による）；
（Ｃ）それらの濃度でのＤＭＳＯが細胞内部で通して、バイオ流体を交換するので、緩慢および安定はおそらくシグナルを増やした；
（Ｄ）そして、ＤＭＳＯおよび結果としてなること高濃度の毒性によって生じる細胞のタンパク質または他生体分子の減失のための持続性で減少されたシグナルは、細胞表層膜の保全を失った。
屈折率値があることを公知である：
ＤＭＳＯのためのこのｓｔｕｄｙ１．４３７およびタンパク質のための約１．５において使用される水の緩衝液媒体のための１．３３２８。
加えて、バイオ流体（それは主に１．３３２８の屈折率を有する水からなる）のための約７０％（重量）が、細胞にある。
もう３０％は、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質分子を含む。
また、ＤＭＳＯの濃度が１０％未満のときに、細胞膜が実験の継続期間の間にＤＭＳＯによってかなり影響を受けないことを公知である；
しかし、ＤＭＳＯの濃度が１０％および２０％の間にあるときに、障害を生じる細胞膜のパーセンテージは増加している。
より高い濃度で、ほとんど全ての細胞膜が障害を生じた(Beske, O., et al., "A novel encoded particle technology that enables simultaneous interrogation of multiple cell types", J. Biomol. Screening. 2004, 9, 173-185)。
【０６２９】
同様用量応答曲線は、Ａ４３１細胞（図３０）に作用しているＤＭＳＯのために観察された。
ＣＨＯ細胞およびＡ４３１細胞株間の現象Ｂのために異なる行動は、基質上の細胞の２つのタイプの異なる付着および形態のためにありそうである。
ＣＨＯ細胞はＡ４３１細胞未満で広がる傾向がある。そして、大部分の現象Ｄを説明する遂行された細胞からの材料で失われたものは両方の細胞株に対して同様であるときに、基質（それはバイオ流体交換現象（現象Ｃ）が生物学的な再分布現象より顕著ではならないことを意味する）に付けられるＡ４３１細胞のより薄い層に結果としてなる。
（２．例２−光学センサによる化合物毒性ＨＴスクリーニング）
（ａ）  化合物毒性をスクリーニングしている高量スループットのための方法）
【０６３０】
本発明の１つの見方は、化合物毒性をスクリーニングしている高量スループットおよび標識を使用しているアポトーシスに適している方法に自由な光学センサを提供することである。
本発明の方法によって、全部のプレートのための数秒内の化合物毒性を検出する。
【０６３１】
本発明の方法の原理は、所定の化合物の毒性が細胞漏出および細胞死さえ導くであろうという事実にある。
これは順番に、細胞が培養されるセンサ界面の不均質性に結果としてなる。
毒性研究の間、バイオセンサは三タイプ領域：生体細胞有する領域、死んでいるか瀕死の細胞を有する領域（そこにおいて、死んでいる細胞は細胞内の成分減失傾向になり屈折率変化を導く）、および細胞のない領域、を検出する。
不均質性発生によって所定の導波モードまたは幅の共鳴ピークおよび共鳴バンド像の分配のＰＷＨＭの変化が生じることがありえた。そして、それは全く細胞密度に依存している。
薄膜界面で培養される細胞が指向されすなわち特定の種類の好適な構造を有するようにするか、または、特定の領域での細胞が毒性化合物を知覚しうるようにする事例の場合、化合物毒性は例えば共振ピークの肩部（共鳴ピークおよびバンド広がりを導く）および平坦分裂などの微細構造を起こすことになる。
【０６３２】
細胞が導波路センサプレート上に予め培養され、高量密集度（＞７５％）に到達するようにし、センサは、約１．３７（約１．３３の屈折率を有するカバー培地と同様）の屈折率を有する生体細胞大部分を検出する。
ＴＭ０ピークのＰＷＨＭは、比較的低い。
毒性化合物が加えられたあと、細胞は影響を受け始める。
影響を受ける細胞は、物理的で生理学的な変化（すなわち形態、形および細胞内の成分再配列）を経る。
最終的に、影響を受ける細胞は、死ぬ。
化合物処理の後の特定の時間で、細胞の個体群：生体細胞、影響を受けた細胞および死んでいる細胞は、混ぜられる。
したがって、時間が化合物処理の後、増加するように、ＴＭ０ピークのＰＷＨＭはその比較的低いレベルから増加して、特定の時間でのその最高に着いて、減少された総合応答率（すなわち角の波長シフト）によって、また本来低次にその減衰を始める。
その最高に到達する動態は、細胞に作用している化合物の細胞株および機構に依存している。
このプロセスは、細胞付着性および拡散移動プロセスに対する反対形である。
【０６３３】
本発明は実施例において光学バイオセンサを使用して細胞上の化合物毒性をスクリーニングする高量スループット方法を提供し、以下のステップを含む：
（ａ）  光学型標識フリーバイオセンサがマイクロプレートの各ウェルの底に埋めたものを用意する；
（ｂ）細胞がバイオセンサ表面上へ付いて高量密集度に到達するようにバイオセンサをカバーするようにた各々へ細胞を配置する；
（ｃ）各ウェルの細胞培地に、化合物溶液を添加する；
（ｅ）特定の時間での光導波路光モードスペクトルを集める。
細胞がいかなる化合物溶液にもさらされないコントロールウェルを有する各々の化合物のＰＷＨＭを比較して、単一のデータポイントを使用して化合物の毒性を評価する。
必要であるならば、時間に依存するＰＷＨＭ変化は動態を研究するために記録され得る。
【０６３４】
発明の他の実施例が化合物毒性を評価するために代替方式に提供し、以下のステップを含む：
（ａ）  光学型標識フリーバイオセンサがマイクロプレートの各ウェルの底に埋めたものを用意する；
（ｂ）細胞がバイオセンサ表面上へ付いて高量密集度に到達するようにバイオセンサをカバーするようにた各々へ細胞を配置する；
（ｃ）各ウェルの細胞培地に、化合物溶液を添加する；
（ｅ）特定の時間での各ウェルの全部のセンサ領域のＴＭ０モード共振角のバンド像を集める。
細胞がいかなる化合物溶液にもさらされないコントロールウェルのそれを有する化合物溶液によって処理されたセンサの共鳴バンドの幅を比較して化合物の毒性を評価する。
【０６３５】
それらの細胞障害能および抗増殖効果によって化合物の輪郭を描くことは、プロフィールポテンシャル抗癌剤にしばしば使用される。
細胞が細胞障害能作因にさらされるときに、そのようなフェノタイプはプラズマ膜統合性の妥協である。そして、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。
導波路型バイオセンサ技術を使用して、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびＡ４３１細胞上のＤＭＳＯの効果をモニタするための実施可能性は、高スループット方法を使用して検査された。
【０６３６】
図３１Ａは、Ｎｂ２Ｏ５ベースの光導波路バイオセンサ上で培養される異なる密集度（３０％、５０％および９０％）を有するＣＨＯ細胞の層のための入射角の関数として、結合された光の強度を示す。
結合モードは、横磁気（ＴＭ０）モードである。
図３１Ｂは、ＴＭ０モードの最大半減（ＰＷＨＭ）のピーク幅が算出されて、ＣＨＯ細胞密集度の関数として、プロットされることを示す。
細胞の密集度が増加するように、ＰＷＨＭは増加して、５０％の密集度あたりで最高で届いて、出発値に減少を始める。
細胞のための結合されたピークのための小さいショルダーピークが全ての密集度レベルにある点に注意することは価値がある、しかし、細胞を有しないセンサのための否定は付属した。
これは、おそらくＣＨＯ細胞が選択方位（図３５Ａ参照）を有するグレーティングセンサ界面上へ付属するのを好むという事実による。
【０６３７】
それぞれ、図３２は２つの異なる密集度、５％（左の）および７５％の（右）を有するＣＨＯ細胞の層のＴＭ０モード共鳴ピークを示す。そして、導波路グレーティングセンサ上で培養される。
共鳴ピークスペクトルは、ＤＭＳＯ（１８％の終濃度を有する）の添加の後、異なる時間で記録された。
約２５％の下の細胞密度のために、時間の上のＰＷＨＭ値の不変が、ある。
しかし、センサ上の細胞の密集度が高量（＞７０％）であるときに、続かれるＰＷＨＭの初期の増加が減少性ＰＷＨＭ値によってある。
共振ピークの広幅化の他に、ＤＭＳＯ処理後の約２５分の時点での共振ピークの肩部および平坦分裂のような微細構造の発生がある。
面白いことには、ＤＭＳＯ処理に応答する共鳴ピークの広幅化または形変化は動的プロセスであり、ＤＭＳＯ−起因性細胞応答が特定の細胞のシグナル伝達経路（例えばアポトーシス）と整合していることを示唆している。
【０６３８】
図３３は、全部のセンサの共振バンド像が異なる密集度でＣＨＯ細胞の層によってカバーしたことをＴＭ０モードに明らかにする。
像は、緩衝液（カラム２）を有する、そして、１８％のＤＭＳＯ（カラム１）を有する２５分処理の後、される。
像は、その（ｉ）に緩衝液によって処理される細胞が物質を全部のセンサの共振バンドのいかなる変化もの否定結果にしないことを示唆する細胞の密集度があること；
そして、１８％のＤＭＳＯで処理される細胞が密集度依存している共振バンド広がりに、上昇に与える（ｉｉ）。
細胞の密集度が７０％を超えるであるときに、ＤＭＳＯ−起因性共振バンド広がりがある。
これらの結果は、共振バンド広がりの広幅化が化合物毒性のためのシグニチャとして使われることを示唆する；
そして、細胞密度または密集度は、有効なかかるｅｖｕｌａｔｉｏｎを作るために重要である。
共鳴ピークスペクトル、広幅化またはＤＭＳＯ処理に応答する共鳴バンド像の形変化に対する同様は動的機構である。そして、ＤＭＳＯ−起因性細胞応答が特定の細胞のシグナル伝達経路（例えばアポトーシス）に関するかもしれないことを示唆する。
より重要なことに、マイクロプレート内の全ての９６のセンサのための共鳴バンド像は３秒内で集められる。そして、共鳴バンド像またはスペクトルに基づく本発明の方法が極めて高いスループット技術を細胞毒性価値判断および複毒性スクリーニングに対して提供することを示唆する。
【０６３９】
図３４は、全部のセンサの共振バンド像が同じ密集度（約９５％）で、ＣＨＯ細胞の層によってカバーしたことをＴＭ０モードに明らかにする。
像は、緩衝液（カラム２の６つのウェル）を有する、そして、ＤＭＳＯ（カラム１の６つのウェルおよびカラム３の図３４に示す６つのウェル）の異なる濃度を有する２５分処理の後、される。
結果は、ＤＭＳＯの毒性効果が濃度に依存していることを示す；
より高い濃度だけによって有意な細胞毒性が生じる。そして、そのことはバンド形の変化によって指示した。
特に面白い所見は、使用するＤＭＳＯの濃度が約１５％であるときに、第２の共振バンド排臨（おそらくセンサ上のＣＨＯ細胞培養の選択方位による）があるということである。
培養条件（図３５参照）の下でグレーティング構造によって整列配置するようである。
これらの結果が、整合しているとわかった、そして、このように、方法（示されないデータ）を染色している従来のＬｉｖｅ／ＤＥＡＤ細胞によって確かめられる。
（３．例３−高スループット増殖分析）
【０６４０】
図３６Ａは、導波路グレーティングセンサ界面上へ培養されるＣＨＯ細胞のための入射角の関数として、結合された光の強度を示す細胞の数に別に種をまいている３６時間の正常増殖条件下の培養のための使用する。
結合モードは、横磁気（ＴＭ０）モードである。
図３６Ｂは、ＴＭ０を使用している最大半減（ＰＷＨＭ）で、モードが算出されて、初期の接種細胞数の関数として、プロットされることをピークの幅に明らかにする。
初期の細胞接種数が増加するので、ＰＷＨＭは増加し、最高で２００００および３００００の間の初期の接種細胞（対応する密集度は約５０％である）に届き、そして、出発値へ減少を開始する。
細胞のための結合されたピークのための明らかなショルダーピークが全ての密集度レベルにある点に注意することは価値がある、しかし、細胞を有しないセンサのための否定は付属した。
また、ＣＨＯ細胞が好む事実のために、これは選択方位（図３５参照）を有するグレーティングセンサ界面上への付属傾向である。
面白いことに、ここで示される結果は固定された期間（図３１参照）以後、異なる細胞密度に到達するために細胞の異なる接種数を使用して、得られたそれらと整合している。そして、本発明の方法が再生可能なことを示唆する。
【０６４１】
図３７は、３６時間、導波路グレーティングセンサ上で培養後、異なるウェルが細胞の異なる初期の接種数のホストをつとめた、ＣＨＯ細胞によってカバーされた全センサのＴＭ０モード共振バンド像を示す。
センサが細胞密度に知覚しうることを示唆して、バンドが全部のセンサの中で撮像する共振が観察されるＴＭ０モードの形および位置は、初期の接種細胞数に依存している；
蛍光−顕微鏡法を使用している細胞密度解析によって確かめられるように、ＣＨＯ細胞の増殖速度は、初期の接種細胞数に依存するの後、分子フローブからの生／死細胞キットを有する染色する。
対応する密集度は、５％、３０％、５５％、７５％および９５％、それぞれ、１００００の、２００００の、３００００、４００００、５００００の細胞の初期の接種数のためのである。
（４．例４−バイオセンサを使用している細胞シグナル伝達経路研究）
（ａ）  材料および方法）
【０６４２】
全ての細胞株は、American Type Cell Cultureから購入された。
全ての化学薬品は、いずれのSigma Chemical社（セントルイス（ＭＯ））もまたはTocris Chemical社（セントルイス（ＭＯ））から得られた。
【０６４３】
Ａ４３１およびＣＨＯ−Ｋ１細胞は、１０％のウシ胎仔血清で補充されるダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）において育てられた１００μｇ／ｍｌペニシリン、そして、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン。
細胞培養のための、細胞（２×１０５〜１×１０６）（Ａ４３１かＣＨＯ−Ｋ１）の特定の数が２００ｍｌの培地において懸濁されたこと９６ウェルコーニングＥｐｉｃバイオセンサマイクロプレートの各ウェルの配置されて、そして、細胞密度達する約９０％および上記（もし指定されていなければ）までの特定の時間のための空気／５％のＣＯ２の３７℃で培養された。
結果としてなられた細胞は、「増殖（profilerating）する」として細胞と呼ばれた。
「静止性」細胞は、いいえを含んでいる培地を有する所望の密集度の増殖している細胞を培養することによって得られるかまたは少なくとも１６時間小さい（約０．１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ））。
【０６４４】
細胞（増殖することか静止状態細胞）は、あったどちらか、直接使用する対応する培地（細胞応答の明らかな差分の両方の結果）を有するアッセイまたは洗浄された一度のための。
アッセイの間、１００ｍｌの培地の細胞は、刺激を含有する５０ｍｌの溶液が適用される前に、各々２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ペーハー７．４）を含んでいる２５ｍｌのＨＢＳＳ緩衝液が少なくとも１５分によって分離した二つに委ねられた。
全てのこれらのステップの間、平行の角度測定システムは、細胞応答のリアルタイム動態をモニタするために用いた。
複効果研究のために、逐次的な処理に対する５０ｍｌの培地に委ねられ、始める改質プロトコルが、使われた：
二回２５ｍｌのＨＢＳＳ緩衝液（少なくとも１５分によって分離される各々）、５０ｍｌの化合物溶液および最後に刺激を含有する５０ｍｌの溶液。
【０６４５】
使用するセンサは９６ウェルコーニングＥｐｉｃバイオセンサマイクロプレート（図１および図２ａに示すように）であった、そして、細胞培養のために直接使われる。
使用する検出系は、U.S. Patent App. 10/602,304, filed 06-24-2003 having publication no. US-2004-0263841, published 12-30-2004 and U.S. Patent App. 11/019,439, filed 12-21-2004, and U.S. Patent App. For "OPTICAL INTERROGATION SYSTEM AND METHOD FOR 2-D SENSOR ARRAYS" by N. Fontaine, et al., filed on March 31, 2005, のそれでありえる。いずれもバイオセンサのための最少で援用によって全体としてここに取り入れられるか、それらが使用される。
（ｂ）  結果）
（（１）  リガンド結合をモニタしているリアルタイムおよびＲＴＫｓの逐次的なシグナル伝達現象）
【０６４６】
図６Ａは、静止状態の層の時間依存応答を示すかまたは８ｎＭのＥＧＦの添加の前後でＡ４３１細胞（光学バイオセンサを使用することをモニタした）を飢餓させた。
Ａ４３１細胞株は、内生的にな過剰発現されたＥＧＦＲｓを有する癌細胞線である。
１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含んでいるダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）の培地のＡ４３１細胞は、各ウェルの底の導波路バイオセンサを有するマイクロプレートの各ウェルに適用された。
細胞は３７℃一晩培養された、血清培地は交換された。そして、０．１％の血清だけを含んでいる培地および細胞はもう１８時間連続的に培養された。
全部の時間経過は、室温で、得られた（約２０℃）。
ＥＧＦ（Ａ）の添加の後、静止Ａ４３１細胞（１８時間の０．１％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）で培養されることによって得られる）のＥＧＦ−処理は、３つの異なる、逐次的な位相からなる時間依存応答を引き起こした：
（ｉ）増加するシグナル（Ｐ−ＤＭＲ）を有する正の位相（図６Ａの点Ｃ〜Ｄ）；
（ｉｉ）ネット−ゼロ位相（点Ｄ〜Ｅ）；および、
（ｉｉｉ）減少するシグナル（Ｎ−ＤＭＲ）を有する減衰位相（点Ｅ〜Ｆ〜Ｇ）。
２０秒未満（図６ＡのＣに対する点Ｂ）の間続いて、シグナルの速い応答変化がある点に注意された。そして、それはウェルに５０ｍｌのＥＧＦ溶液の導入に起こる。
この迅速変化はバルク屈折率変化に主に予定される。そして、それは一時的にいかなるＤＭＲシグナルも圧倒する。
測定されたＰ−ＤＭＲシグナルは主にＥＧＦＲ活性化の後、形質膜の陥入のために活性ＥＧＦＲｓに対する細胞内成分および細胞の平坦度の加入によるのに、細胞離断および受容体内部移行はＮ−ＤＭＲ現象の２つの主な誘因である。
しかし、Ｐ−ＤＭＲ現象はまた、非細胞機能に関連した現象を含むかもしれない。そして、細胞培地および化合物溶液の間で溶液拡散および温度差を含む。
【０６４７】
応答曲線の上述のステップの動態は、リガンド結合の中で、ＥＧＦ−起因性ＥＧＦＲシグナル伝達のリン酸化および輸送現象が文献において報告したことに整合している.(B. Schoeberl, C. Eichler-Jonsson, E. D. Gilles, G. Muller, "Computational Modeling of the Dynamics of the MAP Kinase Cascade Activated by Surface and Internalized EGF Receptors," Nat. Biotech. 20, 370 (2002)。
生物学的製剤および生化学研究は、３７℃で、ほとんど細胞膜の内側の表面で位置決めをする約５−２０分内で、ＥＧＦ−境界受容体が早期エンドソームに内面化され得ることを示した。
その後、他成分を有する複合体化のこれらのＥＧＦＲｓは、いずれが細胞膜（すなわち、輸送ことの間、これらの受容体は、センサ界面から移動する）の内側の顔から遠く離れて、相対的に両方とも位置するか減生のための遅発タイプエンドソーム（２０−６０分）およびライソソーム（＞６０分）へ移される。
受容体およびリガンドの継続的なフラックスが、異なる区画である；
そして、多数ステップは、それらの全体的な動的な分配を書き取らせる。
ＥＧＦ−境界受容体は、急速内部移行のために細胞表面（約３分）で、比較的短い時間を費やすだけである。
（（２）  ＥＧＦＲの発現量および細胞表面発現量を測定する方法）
【０６４８】
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲｓ）を内生的に過剰発現するＡ４３１細胞（細胞につき約１，７００，０００コピー）は、ＥＧＦＲシグナル伝達のためのよく研究された周到なモデルである（(A. Glading, P. Chang, D.A. Lauffenburger, and A. Wells,  "Epidermal growth factor receptor activation of calpain is required for fibroblast motility and occurs via an ERK/MAP kinase signaling pathway," J. Biol. Chem. 2000, 275:2390-2398)）。
ＥＧＦまたは３７℃を有する静止Ａ４３１細胞の刺激作用は、最終的に細胞外のマトリックスから室温で、受容体エンドサイトーシス、屈折体形態学的変化および細胞離断を導く(Z. Lu, G. Jiang, P. Blume-Jensen, and T. Hunter,  "Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase," Mol. Cell Biol. 2001, 21, 4016-4031)。
このように、配列された測定システム（図６Ａ（図１８）参照）を使用しているリアルタイムにおいて測られるように、ＥＧＦ刺激作用は、Ａ４３１細胞内で有意な質量再分布に結果としてなる。
結果は、細胞が強く培養条件に依存することをＡ４３１のそのＥＧＦ−起因性ＤＭＲ応答に明らかにした。
２０時間の０．１％のＦＢＳで培養されるＡ４３１細胞のＥＧＦ−処理は、３つの異なる逐次的な位相からなる時間依存応答を引き起こした：
（ｉ）増加するシグナル（Ｐ−ＤＭＲ）を有する正の位相（図６Ａの点Ｃ〜Ｄ）；
（ｉｉ）ネット−ゼロ位相（点Ｄ〜Ｅ）；および、
（ｉｉｉ）減少するシグナル（Ｎ−ＤＭＲ）を有する減衰位相（点Ｅ〜Ｆ）。
しかし、静止Ａ４３１細胞と比較して、４時間だけの０．１％のＦＢＳによって処理されるＡ４３１細胞は、変えられた動態および非常により小さい振幅を有する同様応答以外を引き起こした。
逆に、増殖しているＡ４３１細胞（１０％のＦＢＳによって培養されて）は、ＥＧＦ刺激作用に応答してＰ−ＤＭＲ現象を引き起こすだけだった。
さらに、ＣＨＯ細胞が内生的ににＥＧＦＲを表さないという事実と整合した有意な応答は、静止性であるか増殖しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のために観察されてなかった(E. Livneh, R. Prywes, O. Kashle, N. Reiss, I. Sasson, Y. Mory, A. Ullrich, and J. Schlessinger, "Reconstitution of human epidermal growth factor receptors and its deletion mutants in cultured hamster cells," J. Biol. Chem. 1986, 261, 12490-12497.)。
これらの結果は、ＥＧＦ−起因性ＤＭＲシグナルが依存しているＥＧＦＲであることを示唆した。
【０６４９】
図３９は、細胞のこれらの三タイプのためのＰ−ＤＭＲてＮ−ＤＭＲシグナルを要約する。
結果は、ＣＨＯ細胞がＥＧＦ（ＣＨＯ細胞がＥＧＦＲを表さないという事実と整合した）によってインキュベートされるときに、透明なＰ−ＤＭＲしも、Ｂ−ＤＭＲもシグナルがないことを示す。
対照的に、ＥＧＦ刺激作用によって誘発されるＰ−ＤＭＲてＮ−ＤＭＲシグナルは、静止Ａ４３１細胞のための３０８および、それぞれ、２．３４である。
しかし、非餓死（すなわち、増殖している）Ａ４３１細胞は、明らかなＮ−ＤＭＲなしで非常により小さいＰ−ＤＭＲシグナルを引き起こした。
これらの結果は、血清細胞増殖培養液がＥＧＦＲｓの細胞表面発現量に影響を及ぼすという事実を確かめる；
より高い血清培地は、血清がＥＧＦを含むという事実および多くの他の成育因子のために下部の細胞表面ＥＧＦＲ形質発現に結果としてなる。
（（３）  ＲＴＫｓにリガンドの効力を決定する方法）
【０６５０】
図７に示すように、異なる濃度全部でのＥＧＦを有する刺激作用は、類似した応答（図７Ａ）を導いた；
しかし、応答を定義している三大前提パラメータは、透明な傾向を使用するＥＧＦの濃度に表示した。
ＥＧＦ濃度はより高い、（ｉ）より大きいＰ−ＤＭＲてＮ−ＤＭＲシグナルの振幅にある、断食している人はＰ−ＤＭＲてＮ−ＤＭＲ現象および（ｉｉｉ）である（ｉｉ）より短い、遷移時間はＰ−ＤＭＲからＮ−ＤＭＲ現象へのｔである。
Ｐ−ＤＭＲ現象は、細胞機能−関連したおよび他寄与を含む。
考えられる貢献者は、処理、細胞膜ｉｎｖｉｇｉｎａｔｉｏｎ、細胞内成分の加入および細胞骨格リモデリングに応答して、そして、より少ない外延（ＥＧＦ結合）に細胞平坦度を含むが、これに限定されるものではない。
細胞培地および化合物溶液間の溶液拡散および温度差を含む、非細胞機能に関連した現象は、また、解析を複雑にするかもしれない。
それらのため、我々はＥＧＦ濃度を有する全体的なＰ−ＤＭＲ振幅の合併した類縁を観察した。
Ｐ−ＤＭＲ現象の振幅がＥＧＦ濃度を有する合併した類縁を示すときに、Ｎ−ＤＭＲシグナルの振幅は明らかにＥＧＦ濃度に対する飽和性であった。そして、約１．４５  ｎＭ（図７Ｂ）のＥＣ５０に結果としてなった。
遷移時間ｔが、数秒でＥＧＦ（図７Ｃ）の濃度増大Ｃによって、指数的に減少するとわかった：
【０６５１】
加えて、Ｎ−ＤＭＲシグナルの減衰は、非線形回帰を付けている。
得られた一つの位相減衰定数ｋはまた、飽和性であった。そして、５．７６ｎＭ（図７Ｄ）のＫｄに結果としてなった。
結果は、ＥＧＦ−起因性ＤＭＲがシグナルを出す（ｉ）がＥＧＦＲ活性化に依存していることを示した；
光学バイオセンサが使って、リガンド起因性質量再分布に基づくリガンドの効力がシグナルを出すと決定する（ｉｉ）。
（（４）  異なる段階でＲＴＫシグナル伝達に影響を及ぼすスクリーニングモジュレータに対する方法）
【０６５２】
図４０は、餓死Ａ４３１細胞の層のためのＥＧＦ−起因性８ｎＭシグナル伝達の時間依存応答上の異なる化合物を有する前処理の効果を示す。
図４１は、異なる条件の下で結合およびＤＭＲシグナルのネット変化を要約する。
その結果は、細胞浸透ダイナミン抑制ペプチド（ＤＩＰ）(Burke, P., et al., "Regulation of epidermal growth factor receptor signaling by endocytosis and intracellular trafficking", Mol. Biol. Cell. 2001, 12:1897-1910)が、全く、Ｎ−ＤＭＲシグナルを遮断するが、Ｐ−ＤＭＲシグナルを非常により遅い動態によって僅かに増加させることを示した。
ＤＩＰはＧＴＰアーゼダイナミンの浸透する細胞阻害物質であり、エンドサイトーシスを防止するアンフィフィシンとダイナミンの結合を競争的遮断する((Burke, P., et al., "Regulation of epidermal growth factor receptor signaling by endocytosis and intracellular trafficking", Mol. Biol. Cell. 2001, 12: 1897-1910)。
これらの目視観測はＮ−ＤＭＲシグナルが受容体転位およびその関連する細胞形態変化を含むことを示唆する。これは、ＥＧＦ−起因性ＥＧＦＲ内部移行はダイナミンに依存する経路で主に起こって、細胞骨格再配列を含み、活性ＥＧＦＲｓを有するダイナミンの結合はＥＧＦ結合の親和性に影響を及ぼすからである。
ＤＩＰがある場合の全体のＰ−ＤＭＲシグナルは、ＤＩＰの非存在下のものより５０％以上超え、Ｐ−ＤＭＲ位相（Ｃから図６ＡのＤまで）の間、いくつか内面化された活性化ＥＧＦＲがあることを示唆している。
ＥＧＦ−境界受容体が急速内部移行のために３７℃で細胞表面（約３分）で、比較的短い時間を費やすことは公知である。
加えて、輸送の間、それぞれ形成された被覆ピットおよび平滑ピットＥＥの４８．７％および９６．２％、、が細胞表面に戻ってリサイクルすると見積もられた。
すなわち、クラトリン−被覆−ピットによる受容体内部移行は、大多数のエンドサイトーシスを説明するのに十分である。
したがって、被覆−ピットＥＥ小胞による受容体内部移行は細胞内の受容体蓄積の優位な機構である、そして、リガンドが系に存在するときに、これは特に真性である。
【０６５３】
ウオルトマニンによる餓死Ａ４３１細胞の前処理は、それらの動態と同様にＰ−ＤＭＲてＮ−ＤＭＲシグナルに対する明らかな影響を有しない。
ウオルトマニンは、強力（選択的な）である２−４ｎＭ(Powis, et al, "Wortmannin, a potent and selective inhibitor of phosphatidylinositol-3-kinase", (1994) Cancer Res. 54 2419)のＩＣ５０を有するホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ  ３−キナーゼ）の浸透する細胞および不可逆阻害剤。
これは、ＰＬＣ−ガンマ経路のブロッキングがＥＧＦ刺激作用に応答して細胞の両方の現象に影響を及ぼすというわけではないことを示唆する。
【０６５４】
成長ホルモン（ＧＨ）、ＰＤ９８０５９およびＰＰ１（また、Ｓｅｅ図４３）否定を有する餓死Ａ４３１細胞の前処理は、かなり結合およびＤＭＲシグナルを減らすだけであるが、また、Ｐ−ＤＭＲてＮ−ＤＭＲ現象の動態の減少に結果としてなるだけである。
ＰＤ  ９８０５９は、ＭＥＫの機能させなくされた形態に結合することによるマイトジェン−活性タンパク質キナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ／ＭＥＫ）および行動の特定の阻害物質である。それによって、ｃＲＡＦまたはＭＥＫキナーゼ（ＩＣ５０＝２−７μＭ）によってそのリン酸化を防ぐ(Alessi, et al., "PD 98059 is a specific inhibitor of the activation of mitogen-activated protein kinase kinase in vitro and in vivo", November 17, 1995, J.Biol.Chem., Vol. 270, No. 46, pg. 27489-27494)。
ＰＤ９８０５９によるＭＡＰＫＫｓのブロッキングは、ＥＧＦ結合におそらくＥＧＦＲを有する細胞応答のシグナルおよび持続期間の大きさを減らす。
ＰＰ１は、Ｓｒｃ−ファミリチロシンキナーゼの強力阻害剤であって、ｐ５６ｌｃｋおよびｐ５９ｆｙｎＴ（それぞれ、５および６ｎＭのＩＣ５０）を抑制して、更に適度にｐ３８、ＣＳＫ、ＰＤＧＦ受容体、ＲＥＴから派生したオンコプロテイン、ｃ−キットおよびＢｃｒ−Ａｂｌを抑制する(Liu et al, Structural basis for selective inhibition of Src family kinases by PP1",  (1999) Chem.Biol. 6, 671)。
その受容体に結合している上皮増殖因子（ＥＧＦ）によってＹ  １４７７でクラトリンＨ鎖の急速リン酸化が生じる。そして、それはクラトリン会合体を制御しているドメインでうそをつく。
ＥＧＦによって媒介されたクラトリンリン酸化の後に、細胞末梢に対するクラトリン再分布が続いて、シグナル伝達ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）によるＳＲＣキナーゼの下流活性化の産物である。
ＳＲＣキナーゼを欠いている細胞または特定のＳＲＣファミリキナーゼ阻害物質によって処理される細胞において、クラトリンリン酸化および再分布のＥＧＦ刺激作用は起こらない、そして、ＥＧＦエンドサイトーシスは遅れる。
これらは、海流観測と整合している。
【０６５５】
成長ホルモン（ＧＨ）は、構造上の類似をプロラクチンおよびさまざまなインターロイキンを含むホルモンおよびサイトカインの大きいクラスおよびコロニー刺激因子と共有する４−ヘリックス束状構造タンパク質である（ホワン、Ｙ．、ほか、「３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞の上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体の成長ホルモン−起因性リン酸化」、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２７８，  １８９０２−１８９１３）．
ＧＨは、ＧＨ受容体（ＧＨＲ）（サイトカイン受容体超ファミリの細胞表面グリコプロテイン構成メンバ）と相互に作用することによってその深在性の体形成で代謝の調整効果を行う。
最近の研究は、クロストークがＥＧＦＲファミリ（表面上異特定の種類のシグナル伝達受容体（それぞれ、チロシンキナーゼ受容体のサイトカイン受容体およびファミリ）の例）のＧＨＲおよび構成メンバの間にあることを示唆する。
ＧＨによって、上皮増殖因子受容体のリン酸化が生じる（ＥＧＦＲ；
ＥｒｂＢ−１）、そして、そのファミリ（ＥｒｂＢ−２）。
このＧＨ−起因性ＥＧＦＲ  Ｙリン酸化は、否定ＥＧＦＲ（キナーゼ活性）以外の、ＪＡＫ２を必要とすることを示した。
ＧＨによって基礎でＥＧＦ−起因性ＥｒｂＢ−２つのチロシンキナーゼ活性化およびＹリン酸化の減少が生じる。そして、ＧＨによってそれを描くＥｒｂＢ２の経路に依存するリン酸化がＥＧＦに応答して活性化に脱感作したＥＲＫが生じることを示唆する。
蛍光−顕微鏡法研究は、ＥＧＦＲ−シアン蛍光性のタンパク質キメラのＥＧＦ−起因性細胞内の再分布がＧＨ共同処理によって著しく減少することを示した。
これは、また、海流観測と整合している(Huang, Y., et al., "Growth hormone-induced phosphorylation of epidermal growth factor (EGF) receptor in 3T3-F442A cells", J. Biol.Chem. 278, 18902-18913)。
（（５）  ＡＧ１４７８による静止Ａ４３１細胞起因性のＥＧＦ−誘導応答の供与量依存している抑制）
【０６５６】
図４２は、ＡＧ１４７８によって静止Ａ４３１細胞起因性のＥＧＦ−誘導応答の供与量依存している抑制を示す。
これらのＤＭＲ現象が受容体リン酸化、強力および特定のＥＧＦＲキナーゼに依存していると同定するために、阻害物質ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ  ＡＧ１４７８が、使われた。
Ａ４３１は予め２０時間のいかなるＦＢＳのないも培地において飢餓させた。そして、それらが同じ期間（図４２Ａ）の０．１％のＦＢＳ媒体で飢餓させたより、かなり耐性のＰ−ＤＭＲ現象およびより短い遷移時間のための動態に結果としてなった。
１時間の異なる濃度でのＡＧ１４７８を有するＡ４３１細胞の前処理は、ＥＧＦ−誘導応答の用量依存的抑制において、Ｎ−ＤＭＲシグナルの振幅がＡＧ１４７８の機能としてプロットされるときに、典型的阻害を生むことは約１９４ｎＭのＩＣ５０によってカーブする結果になった（図４２、そして、ｂ）。
しかし、０．５％のジメチルスルホキシドを有するＡ４３１の前処理は、ＥＧＦ−誘導応答（示されないデータ）に対する少しの影響を有した。
これらのデータは、ＥＧＦＲキナーゼリン酸化がＥＧＦ−起因性ＤＭＲ変化のために必要なことを示す；
そして、使って光学バイオセンサを使用して得られたＤＭＲシグナルは、測定されるＤＭＲ現象で重要な役割を演ずるモジュレータの効力を決定する。
（（６）  静止Ａ４３１細胞の３２ナノメートルのＥＧＦ−誘導応答上のラス癌遺伝子／ＭＡＰＫ経路モジュレータの効果）
【０６５７】
ＥＧＦは、細胞増殖および分化を管理して、部分の最少で、下流シグナルとしてマイトジェン−活性タンパク質キナーゼを使用する。
さらに、ＥＲＫ活性化はＥＧＦＲ活性化の大域的、陰のシグナル下流を表すようである。そして、それはｄｅａｄｈｅｓｉｏｎにおいて重要でもよい。
このように、ＭＥＫ阻害物質Ｕ０１２６、ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害物質ＳＢ２０３５８０およびＳＢ２０２１９を含む、Ｒａｓ−ＭＡＰＫ経路を標的としている阻害物質の効果、そして、ＪＮＫ阻害物質ＳＰ６００１２５は、検査された（図４４参照）。
Ｕ０１２６は、かなり後発の時間ｔを有するＰ−ＤＭＲてＮ−ＤＭＲシグナルの振幅を圧縮した。
これは、ＭＥＫ１／２の阻害がＮ−ＤＭＲシグナル（前の研究と整合した）を導く細胞離断および運動を防ぐことを示唆する。
しかし、ＭＥＫ１／２が抑制されるときに、活性ＥＧＦＲのエンドサイトーシスはまだ起こってもよい。
エンドサイトーシスが細胞離断および運動と比較してセンサ界面から離れて起こるので、エンドサイトーシスはかなり総合応答率により貢献してはならない。
したがって、それらの静止Ａ４３１の応答がＭＥＫ１／２つの阻害物質によって前処理したＥＧＦ−起因性は、受容体エンドサイトーシスと整合している。
これは、更に計算のモデリング結果と整合している応答の動態で支えられた。
対照的に、ＳＢ２０３５８０およびＳＢ２０２１９は不完全な減衰を導くだけだったのに、ＳＰ６００１２５はＥＧＦ−誘導応答に対するほとんど影響を有しなかった。
これらの結果は、ＤＭＲの静止Ａ４３１細胞ＥＧＦ模倣において応答がＭＥＫでＲａｆ−ＭＥＫ経路および収益を含むことを示す。
（（７）  静止Ａ４３１細胞の３２ナノメートルのＥＧＦ−誘導応答上のタンパク質キナーゼ阻害物質の効果）
【０６５８】
ＥＧＦＲシグナル伝達が様々な他のタンパク質キナーゼを含んだ時から、ＥＧＦ−誘導応答上のタンパク質キナーゼ阻害物質の効果は検査された。
１を有するＡ４３１の前処理μＭ  ｗｏｒｔｍａｉｎｎｉｎ（強力および選択的ＰＩ３Ｋ阻害物質）１μＭ  ＫＴ  ５７２０（タンパク質キナーゼＡの有力で選択的阻害物質）１０μＭ  ＫＴ５８２３（タンパク質キナーゼＧの選択的阻害物質）、そして、１０μＭ  ＫＮ  ６２（ＣａＭキナーゼＩＩの選択的阻害物質）は、応答上のほとんど効果を有しなかった。
対照的に、ＧＦ  １０９２０３ｘ（タンパク質キナーゼＣの選択的阻害物質）は応答（図４５参照）上の部分音減衰を呈した。
これらの結果はそのタンパク質キナーゼＣを示す、しかし、ＰＩ３Ｋ（タンパク質キナーゼＡおよびＣａＭ  ＩＩ）はＤＭＲ変化を刺激するためにＥＧＦの機能を変えない。
（（８）  静止Ａ４３１細胞の３２ナノメートルのＥＧＦ−誘導応答上の細胞骨格モジュレータの効果）
【０６５９】
ＥＧＦ刺激作用に応答して細胞の標的および形態学的変化の中で輸送ことは細胞骨格構造のリモデリングを必要とするので、ＥＧＦ−起因性ＤＭＲ応答上の細胞骨格モジュレータの効果は検査された（図４６参照）。
アクチンフィラメント破壊作因（サイトカラシンＢかラトランキュリンＡ）を有するＡ４３１の前処理は、全くＮ−ＤＭＲシグナルを破壊して、かなり遅い動態を有する持続性のＰ−ＤＭＲ位相に結果としてなった。
２つのトキシンは、異なる機構によってアクチン組み立て分解をかき乱す：
サイトカラシンＢはアクチンフィラメントを覆い、そして最終的にアクチンフィラメント脱重合を導く。その一方で、ラトランキュリンＡはアクチンモノマーを隔離して、アクチンフィラメント脱重合を生ぜしめる。
しかし、安定させている多因子のＦアクチン作因ファロイジンかマイクロチューブル分裂するものビンブラスチンおよびノコダゾール（示されないデータ）は、ＥＧＦ−誘導応答に対する少しの影響も有した。
これらの結果は、むしろ、Ｎ−ＤＭＲシグナルに結果としてなっている細胞の運動がアクチン重合以外のアクチンより先に存在する再構成によらなくて、マイクロチューブル会合体から独立していると同定する。
対照的に、細胞内タンパク質の中で輸送ことはアクチンフィラメントを必要とした時から、Ｐ−ＤＭＲシグナルは活性受容体に少なくとも部分的に細胞内成分の加入による。
特別な証明は、細胞膜浸透するダイナミン抑制のペプチド（ＤＩＰＣ）の効果から来た。
５０でのＤＩＰＣを有するＡ４３１の前処理μＭは、より耐性の動態については以外、サイトカラシンＢおよびラトランキュリンＡによって前処理されるそれらに、同様応答を引き起こした。
（（９）  静止Ａ４３１細胞の３２ナノメートルのＥＧＦ−誘導応答上のホスホジエステラーゼ阻害物質の効果）
【０６６０】
ｃＡＭＰ（ｃＡＭＰ）は、細胞内の二次メッセンジャの概念図式として役立って、実質的に細胞の機能（例えば代謝、収縮性、運動性および全ての細胞タイプの転写）の無数を管理する。
前の研究は、細胞のコンテクスト上のそのｃＡＭＰ経路クロストークおよび従属する漸先形の成育因子−刺激されたＭＡＰキナーゼ活性を示した。
ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）が細胞のｃＡＭＰレベルを管理するので、ＥＧＦ−誘導応答上のＰＤＥｓの役割がＰＤＥ阻害物質ｃｉｌｏｓｔａｍｒｉｄｅ、ミルリノン、Ｒｏ  ２０−１７２４、Ｒ（−）−ロリプラムおよびザルダベリンを使用して研究されて、（１０時に各々μＭ）。
これらの阻害物質のどれも応答（図４７参照）に対する明らかな影響を有しなかった。そして、ｃＡＭＰが全体的なＤＭＲ応答に関係していないことを示唆した。
前の研究は、タンパク質キナーゼＡがＲａｆ−１の活性に敵対することができて、このようにＰＤＥ活性を調整することによるＲａｓ−ＭＡＰＫ経路を管理することを示した。
しかし、静止状態において、細胞Ｒａｆ−１はＰＫＡ阻害物質を知覚しえない構成リン酸化を呈し、これは、ＰＫＡ阻害物質ＫＴ５７２０  （Ｆｉｇｕｒｅ  ４５）およびＰＤＥ４阻害物質Ｒｏ  ２０−１７２４およびＲ−（−）−ｒｏｌｉｐｒａｍがＥＧＦ−起因性ＤＭＲシグナルにほとんど遂行しないという我々の目視観測と整合した。
（（１０）  ＥＧＦ起因性ＥＧＦＲ内部移行、細胞形態変化および室温で、Ａ４３１細胞（２２℃）の指向性質量再分布）
【０６６１】
ＥＧＦを有するＡ４３１細胞の刺激作用は、室温で、最終的に受容体エンドサイトーシスを導く受容体二量体化および成行き自己リン酸化によるＥＧＦＲ活性化の引き起こす（図４８Ａ−Ｃ、ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ形態学的変化（図４８Ｄ参照）および指向性質量再分布（図２Ａ、図１８および他参照）を参照のこと。
酸ストリップ法を使用している界面−境界テトラメチルロヂミン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄｉｍｉｎｅ）の標識されたＥＧＦ（ＴＭＲ−ＥＧＦ）を選択的に除去することによって、ＥＧＦＲ内部移行の外延が、検査されて、細胞培養条件に依存しているとわかった。
増殖している細胞のそれらより非常に高い細胞表層で内面化された受容体は、静止状態細胞で見つけられた。
静止状態細胞のＥＧＦ−起因性形態学的変化は、定着の後、テキサス赤標識ファロイジン染色によって視覚化された。
前の研究は、３７℃でのＡ４３１がＥＧＦ処理に細胞間マトリックスから時間に依存するｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ形態学的変化および離断を呈することを示した。
これらの研究と整合して、細胞の端にフィラメントアクチンの端によって示されるように、ＥＧＦ処理およびこの変化の約１５分の後、変化に始まるアクチンリモデリングは、より長い刺激作用でより劇的になった。
（（１１）  略図は、ＥＧＦ−起因性ＤＭＲシグナル−受容体エンドサイトーシスのための１つの可能な機構を示す）
【０６６２】
エンドサイトーシスのアクチン細胞骨格のためのポテンシャル役割。
図４９のモデルは、皮質のアクチン細胞骨格がエンドサイトーシスおよび細胞骨格組織の界面で、分子のための潜在的な機能上の役割を関係させているエンドサイトーシスプロセスの異なるステップに関係している方法を表す。
その同族リガンド（例えばＥＧＦ）によって、受容体活性化に続いて、受容体エンドサイトーシスにおける三大前提ステップが、ある：
１）エンドサイトーシス機構の間隙の組織。
細胞骨格構造は、エンドサイトーシスのための機構の側方運動性を組織するかまたは強制する。
形質膜の変形および陥入は、細胞骨格で支えられる。
２）、形質膜の基礎をなしている皮質のアクチン障害は、溶かされることを必要とするかもしれない。
アクチン重合はエンドサイトーシス小胞形成および３の間、膜分裂を駆動するために力を提供する）、Ａｃｔｉｎポリメリゼーションは彗星テイルを形成することによって細胞原形質に新しく形成されたエンドサイトーシス小胞の運動を進める。
（５．例５−細胞骨格のためのモジュレータをスクリーニングする方法）
【０６６３】
孔形成試薬はサポニンおよびフィリピンのような界面活性剤またはジギトニンまたはストレプトリシンＯ．  Ｉｔのようなトキシンを含む。そして、公知のウェルはこれらの試薬を有する細胞のその処理である細胞表層膜の小孔形成の結果としてなる；
結果としてなられた透過化処理された細胞は、細胞内材料（主に可溶タンパク質）の特定の総計を放出する。
しかし、直接結合することによる隔離または細胞骨格構造を有する会合のためにこれらの透過化処理された細胞によってまだとどまる多くの生体材料が、ある。
実は、これらの透過化処理された細胞は、タンパク質合成のような生体細胞の生物学的な機能の多数を保持する。
細胞骨格構造を分裂させる化合物を有する細胞の処理は、相当に生体材料をこれらの透過化処理された細胞から自由にすることに結果としてなることが可能である。
【０６６４】
細胞骨格は、真核細胞の細胞原形質の全体にわたって伸びるタンパク質フィラメントの複合して動的なネットである。
細胞骨格は、細胞の多種多様活性を実行することに関係している。
それは、抗張力を細胞のために用意することによって細胞形状を維持する。
それも、若干の細胞移動（構造（例えば鞭毛およびシリア）を使用すること）を可能にして、細胞内輸送（小胞および、たとえば、細胞器官の運動）および細胞の分裂で重要な役割を演ずる。
細胞骨格は、細胞が細胞器官を移動する「軌道」を提供することにシグナルを出していて、輸送細胞内、クロモソームおよび他ものに関係している。
【０６６５】
図５０は、時間の関数として、サポニンに応答してＬＩＤセンサの界面上のＣＨＯ細胞被着の用量依存的応答を示す。
異なる濃度でのサポニンの添加の後、異なる応答は、顕性である。
低濃度で、応答がほとんどない。
サポニンの濃度が約２０ｕｇ／ｍｌより上にあるときに、続かれる減少されたシグナルが増加応答によってある。
初期の増加するシグナルはセンサの界面上の細胞から平らにすることのために最適でありえる。そして、センサの検知体積内で、質量増加に結果としてなる；
ところが、減少されたシグナルは、細胞からたぶん生体材料の減失を反映する；
他の可能性は、センサの検知体積内で、ネット−減少された質量を導く細胞の成分および／または形態変化の再配列による。
試験される最も高い濃度で、初期の増加するシグナルがない；
逆に、下部の濃度でのそれらより大きい有意な応答を有する減少されたシグナルだけが、ある。
【０６６６】
サポニンのより高い濃度によって処理される細胞の透過性は、サポニン（示されないデータ）の異なる濃度を有する既処理の後、テキサスＲｅｄ−ファロイジン（Texas red- phalloidin）で染色されるＣＨＯ細胞の蛍光像によって立証され得る。
テキサスＲｅｄ−Ｘファロイジン（Texas red-X phalloidin）は、きのこ毒複合化から作られるＦアクチンのための高親和性プローブである。
テキサスＲｅｄ−ファロイジンを使用している染色は細胞が浸透することが必要である。そして、ホルムアルデヒド固定の後、一般にされる。
これは蛍光性のファロイジン結合が大部分の生体細胞に透過性でないという理由からである。但し、非標識のファロイジンは細胞の膜を通す。
サポニンの高濃度で処理される細胞内部の強い蛍光は小孔形成を示す、そして、細胞は浸透する。
この研究に基づく、６７のｕｇ／ｍｌでのサポニンの濃度は、化合物スクリーニングのために選ばれた。
【０６６７】
図５１は、異なる化合物によって前処理された後にＣＨＯ細胞のサポニン−起因性時間依存応答を示す。
結果は、これらの化合物が主に４つのカテゴリに分類され得ることを示す：
Ｎ−ＤＭＲシグナルの増加する動態および振幅によって証明されたように、生体材料の増加する減失が生じる（ｉ）化合物（例えばサイトカラシンＢ）；
サポニン−誘導応答に対する影響を示さない（ｉｉ）化合物（例えばダイナミン抑制のペプチド、ブレフェルジンＡ）；
より長い時間の後の類似した全体の変化については以外、サポニン−処理された細胞の生体材料の減失を遅延させる（ｉｉｉ）化合物（例えばファロイジン）；
そして、細胞から生体材料のサポニン−起因性減失を遮断する（ｉｖ）化合物（例えばビンブラスチン）。
これらの目視観測は、これらの化合物の周知の性状と整合している。
サイトカラシンＢは、会合体を防いでいるアクチンフィラメントをおおって、アクチンフィラメントの最終的に動的性質のために、アクチンフィラメント脱重合を導く。
対照的に、ファロイジンはＦアクチンに結合して、アクチン重合を進める。
ビンブラスチンは、チュービュリンを結合することによるマイクロチューブル会合体を抑制して、螺旋会合物の自己会合を誘発する。
ダイナミン抑制のペプチド（ＤＩＰＣ）およびブレフェルジンＡは、アクチンまたは他フィラメントに対する非結合剤である。
これらの結果も、否定他フィラメント以外の、アクチンフィラメントが生体高分子のための引っ込んだ部位で最も多くのものを提供することを示唆する。
【０６６８】
サポニン−処理の後のテキサスＲｅｄ−ファロイジンを有する染色は、サイトカラシンＢ−前処理された細胞が他化合物（示されないデータ）によって前処理されるそれらと比較して、類似した染色パターンを引き起こすことを明らかにする。
これは、利用できる限られた蛍光解像力によることが可能である。
しかし、ファロイジン−前処理された細胞は、かなり下部の染色を引き起こす。
これは、非標識のファロイジンが標識付加のファロトキシンによってＦアクチン染色を遮断するという理由からである。
（６．例６−標識フリー光学バイオセンサを用いたＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）細胞分析を実行するためのシステムおよび方法）
【０６６９】
図５２−６０はいくつかの異なる実験の結果を示したさまざまなグラフおよびフローチャートを示し、実験は光学ＬＩＤシステムが生体細胞内の質量再分布（例えばＧＰＣＲ転位）をモニタできることを示すために行われた。
ここに開示されるように、これらの転位は光学ＬＩＤバイオセンサ表面に配置できる。
図５２−６０に示される特定のデータは、コーニング（Corning）社によって製造された光導波路グレーティングセンサシステムおよびＬＩＤマイクロプレート（Ｎｂ２Ｏ５プレート）を使用して、得られた。
図５２は、光学ＬＩＤシステム１０００によって測定された、チャイニーズハムスター卵巣細胞１００８（ＣＨＯ細胞１００８）内の作動薬誘発性応答を示すグラフである。
ＣＨＯ細胞１００８は、ベータ−アレスチンやＧＲＫのみならず、ベータアドレナリン受容体、アルファ２−アドレナリン受容体、Ｐ２Ｙ受容体をも内在的に発現することが知られている。
また、ムスカリン受容体は、ＣＨＯ細胞１００８において非常に低いレベルで内在的に発現されることが知られている。
この実験では、複数の光学ＬＩＤバイオセンサ１０１４からなる配列を含むマイクロプレートの各ウェルの中には、約５×１０４個のＣＨＯ細胞１００８が入れられた。
次いで、ＣＨＯ細胞１００８が基板上面１０１０に対して確実に付着性を有するように、２４時間の間、ＣＨＯ細胞１００８は１５０μｌの血清媒体内で培養された。
グラフには、検査済みの４種類の化合物に対するＣＨＯ細胞１００８の光学的応答が示されている。
これら４種類の化合物は、（１）Ｐ２Ｙ受容体に対する作動薬であるＡＴＰ（１００μＭ）、（２）アルファ２−アドレナリン受容体に対する作動薬であるクロニジン（１０μＭ）、（３）ベータアドレナリン受容体に対する作動薬であるエピネフリン（１００μＭ）、（４）ムスカリン受容体に対する作動薬であるオキソトレモリンＭ（１０μＭ）、である。
ムスカリン受容体は、ＣＨＯ細胞１００８の中で非常に低いレベルで内在的に発現されるので、ムスカリン受容体に対する作動薬であるオキソトレモリンＭは調整機能を果たす。
各ウェルには血清媒体が入れられており、上記の４種類の作動薬はそれぞれ異なるウェルに直接的に添加された。
その後、光学ＬＩＤシステム１０００によって光学的応答が収集された。
【０６７０】
その結果、ＡＴＰ、クロニジンおよびエピネフリンという３つの作動薬の導入後に得られた光学的応答に示されるように、付着ＣＨＯ細胞１００８は、類似の動態および転移を示した。
オキソトレモリンＭは、ほとんど細胞応答を誘発しなかった。
図５３によれば、プロセスの最終段階の動態解析により、３つの作動薬（ＡＴＰ、エピネフリン、クロニジン）の全てについて類似の緩慢なプロセスに至ったことが明らかである。
図１６に示されるステージ３での変化は、これら作動薬によって引き起こされたものであり、図１２のグラフが示すものである。
このような類似の変化は、ＧＰＣＲ転位について必須成分であるベータ−アレスチンがＣＨＯ細胞１００８内の制限因子であるという事実を反映している可能性があり、これは、クラスリン被覆ピットのサイズとベータ−アレスチンのサイズとが似たサイズであるという事実を与えるものである。
図５５は、導波路バイオセンサ１００４上の生体ＣＨＯ細胞１００８における単分子膜のリガンド依存性かつ時間依存性の応答量を表す実験結果を示すグラフである。
作動薬としては、（１）クロニジン、（２）オキソトレモリンＭ、（３）ＮＥＣＡ、および、Ｍ１受容体に対する拮抗薬であるテレンゼピンを含むものが使用された。
【０６７１】
図５６は、導波路バイオセンサ１００４上において安定的に過剰発現したラットのムスカリン受容体のサブタイプ１（Ｍ１）を有する生体ＣＨＯ細胞１００８における単分子膜のリガンド依存性かつ時間依存性の応答量を表す実験結果を示すグラフである。
作動薬としては、（１）クロニジン、（２）オキソトレモリンＭ、（３）ＮＥＣＡ、および、Ｍ１受容体に対する拮抗薬であるテレンゼピンを含むものが使用された。
図５７は、導波路バイオセンサ１００４上において安定的に過剰発現したラットのムスカリン受容体のサブタイプ１（Ｍ１  ＣＨＯ）を有する場合と（ＣＨＯ）を有しない場合とについて、生体ＣＨＯ細胞１００８における単分子膜の応答量のリガンド誘発性変化の総量を表す実験結果を示すグラフである。
図５２と図５４〜図５６に示した結果は、（１）ＣＨＯ細胞とＭ１−ＣＨＯ細胞の双方で発現したアルファ２−アドレナリン受容体が存在して、これらの作動薬（クロニジン）が質量再分布シグナルを誘発し、
（２）ＣＨＯ細胞では、比較的低レベルあるいは無視できる程度のＭ１受容体が発現した一方で、Ｍ１−ＣＨＯ細胞では、高レベルのＭ１受容体が発現したが、その理由として、拮抗薬（テレンゼピン）ではなく、作動薬（オキソトレモリンＭ）がＭ１−ＣＨＯ細胞内で極めて大きな応答を引き起こしたことが挙げられる。
【０６７２】
図５８は、導波路バイオセンサ１００４上において安定的に過剰発現したラットのムスカリン受容体のサブタイプ１（Ｍ１  ＣＨＯ）を有する場合とこれを有しない場合とについて、生体ＣＨＯ細胞１００８における単分子膜のオキソトレモリンＭ誘発性かつ時間依存性の応答量に対し、ダイナミンリン酸化抑制剤（ダイナミン抑制ペプチド：ＤＩＰ）の前保温・培養処理（プレインキュベーション：ｐｒｅ−ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）が与える影響を表す実験結果を示すグラフである。
実験結果は、ＤＩＰを有する細胞の前保温・培養処理が、双方の細胞株でオキソトレモリンＭ誘発性の質量再分布応答をほぼ完全に抑制したことを示しており、これは、オキソトレモリンＭ誘発性の質量再分布がダイナミン依存性を持つことを示唆している。
このようなダイナミン依存性は、作動薬誘発性のＧＰＣＲ転位の大部分で共通の性質である。
【０６７３】
図５９は、導波路バイオセンサ１００４上において安定的に過剰発現したラットのムスカリン受容体のサブタイプ１（Ｍ１  ＣＨＯ）を有する場合とこれを有しない場合とについて、生きたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における単分子膜のクロニジン誘発性かつ時間依存性の応答量に対し、ダイナミンリン酸化抑制剤（ダイナミン抑制ペプチド：ＤＩＰ）の前保温・培養処理（プレインキュベーション：pre-incubation）が与える影響を表す実験結果を示すグラフである。
実験結果は、ＤＩＰを有する双方の細胞株の前保温・培養処理が、クロニジン誘発性の質量再分布応答をほぼ完全に抑制したことを示しており、これは、クロニジン誘発性の質量再分布もダイナミン依存性を持つことを示唆している。
【０６７４】
図６０は、導波路バイオセンサ１００４上において安定的に過剰発現したラットのムスカリン受容体のサブタイプ１（Ｍ１  ＣＨＯ）を有する場合とこれを有しない場合とについて、生体ＣＨＯ細胞１００８における単分子層のＮＥＣＡ誘発性かつ時間依存性の応答量に対し、ダイナミンリン酸化抑制剤（ダイナミン抑制ペプチド：ＤＩＰ）の前保温・培養処理（プレインキュベーション）が与える影響を表す実験結果を示すグラフである。
実験結果は、ＤＩＰを有する双方の細胞の前保温・培養処理がＮＥＣＡ誘発性応答に若干影響を与えたことを示しており、これは、ＮＥＣＡが、ダイナミンに依存しない経路を通じて双方の細胞株で質量再分布シグナルを引き起こしたことを示唆している。
図６１は、静止Ａ４３１細胞の付着層内でＧＰＣＲ作動薬−起因性指向性質量再分布の結果を示す。
三つのＧＰＣＲ作動薬、ブラジキニン（１００ｎＭ）、カルバコール（１０μＭ）、および、クロニジン（１μＭ）は、ＥＧＦ（８ｎＭ）によるその起因性と比較すると、静止Ａ４３１細胞の誘導された時間依存応答である。
（Ｆ）  ＧＰＣＲ作動薬−およびＥＧＦ−誘導応答に関する１０μＭＡＧ１４７８でのＡ４３１の前処理。
【０６７５】
図６２は、略図がＥＧＦ−起因性ＥＧＦＲ活性化およびＧＰＣＲ作動薬−起因性ＥＧＦＲトランスアクチベーションの機構を示すことを示す。
ＥＧＦＲがシグナル伝達系の臨界的な下流の要素であるとわかった。そして、分裂促進のＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、サイトカイン受容体、インテグリンおよび膜−脱分極性応力−誘導している作因によって使用されるそれらを含んだ。
前の研究は、Ａ４３１が内生的ににブラジキニンＢ２受容体、ムスカリニック受容体およびα２−アドレナリン作用性受容体を表すことを示した。
ＧＰＣＲ作動薬、ブラジキニン、クロニジンおよびカルバコールを有する静止Ａ４３１の刺激作用は、２つの異なるＤＭＲ応答曲線の結果を示した。
カルバコールおよびクロニジン刺激作用は、ＥＧＦの低濃度（２−８ｎＭ）によって、それらの起因性としてほとんど同一の特徴を有する応答を導いた。
期待されるように、処理前の１０でのＡＧ１４７８を有するＡ４３１のμＭは、全くＮ−ＤＭＲ位相を破壊して、かなりＰ−ＤＭＲ位相の動態を減らした。
対照的に、ブラジキニン刺激は極めて速いＰ−ＤＭＲ位相（１００秒以内で）および非常により短い遷移時間ｔに結果としてなる。
ＡＧ１４７８を有するＡ４３１の前処理は、部分的に応答を減らすだけである。
（ｉ）他によるそれらの前の研究を有する整合した、ＧＰＣＲ作動薬を有する刺激作用はそうしてもよい特定の細胞のコンテクストに依存する異なる機構によるＲａｓ−ＭＡＰＫ経路を有するクロストーク、ＧＰＣＲ作動薬−起因性ＥＧＦＲトランスアクチベーションはＲａｓ／ＭＡＰＫ活性化の結果としてなられたシグニチャを使用して検査され得る。（２）ＧＰＣＲ作動薬−引き起こされるＥＧＦＲトランスアクチベーションがＥＧＦ刺激作用として比較できるＤＭＲシグナルを導くので、その天然型生育環境の内因性の標的ＧＰＣＲに対して、ＧＰＣＲシグナル伝達およびスクリーニング作動薬および拮抗薬を研究するように、トランスアクチベーションはシグナル伝達増幅機構として作用する。
異なるＧＰＣＲ作動薬に応答するＤＭＲ応答の異なる動態は異なるＧＰＣＲが異なる機構によるＲａｓ／ＭＡＰＫ経路をトランスアクチベート（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｅ）することを示す。そして、おそらく受容体が結合したＧタンパク質および細胞コンテクストに依存する。
【０６７６】
図６２上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）において、シグナル伝達経路は、示される。
ＥＧＦＲファミリの構成メンバは、細胞質のチロシンキナーゼドメイン、単一の膜貫通領域およびリガンド結合および受容体二量体化に関係している細胞外のドメインを含む。
ＥＧＦＲに対するリガンドの結合は、ホモダイマの発生または他ファミリを有する受容体のヘテロダイマを導く。
各々のｄｉｍｅｒｉｃな受容体複合体は、異なるＳｒｃ相同２（ＳＨ２）を入れることによって異なるシグナル伝達経路を始める−エフェクタタンパク質を含む。
二量体化は、下流の細胞のシグナル伝達経路の多種多様アレーを始める自動的にリン酸化の結果となる。
接着体タンパク質（Ｇｒｂ）を有する活性ＥＧＦ−Ｒダイマー複合体は、解離因子（ＳＯＳ）をグアニンヌクレオチドに結合した。
複合体がそうするＧｒｂ−ＳＯＳも、直接受容体のまたは間接的にＳｈｃによるホスホチロシン部位に結合する。
これらのタンパク質相互作用はＲａｓに近い接近にＳＯＳをもたらす。そして、Ｒａｓ活性化を考慮に入れる。
これは、その後、順番に、遺伝子形質発現を進めて、細胞増殖に貢献する転写因子（例えばｃ−ｆｏｓ、ＡＰ−１およびＥｌｋ−１）を活性化するシグナル伝達経路ＥＲＫおよびＪＮＫを活性化する。
ＥＧＦ  ＝上皮増殖因子、ＥＧＦＲ  ＝上皮増殖因子受容体、Ｓｈｃ＝ｓｒｃ相同ドメインコンセンサス、ｇｒｂ２  ＝生長因子受容体−境界タンパク質２、ｓｅｖｅｎｌｅｓｓのＳＯＳ  ＝哺乳動物息子、Ｒａｆ＝ＲａｓII活性化II因子、ＭＥＫ＝ＭＡＰキナーゼキナーゼ、ＭＡＰＫ  ＝マイトジェン活性タンパク質キナーゼ（ＰＩ３Ｋ  ＝ホスファチジルイノシトール３』キナーゼ（ＰＩＰ２  ＝フォスファチジルイノシトール３，４）（ジホスフェート、ＰＩＰ３  ＝フォスファチジルイノシトール３，４，５トリホスフェート、ＰＬＣｇ＝フォスフォリパーゼ（ｇ、ＤＡＧ  ＝ジアシルグリセリン、ＩＰ３  ＝イノシトール３，４，５トリホスフェート、ＰＫＣ  ＝タンパク質キナーゼＣ）））。
図６１  ＧＰＣＲ作動薬において、誘導されたＥＧＦＲトランスアクチベーションは、示される。
受容体チロシンキナーゼのＧＰＣＲ−刺激されたトランスアクチベーションによるＳｒｃファミリキナーゼの活性化。
ＧＰＣＲおよび受容体チロシンキナーゼ間のクロストークの最もよく理解されている機構は、リガンド（例えば膜関連のＡＤＡＭファミリＭＭＰｓのＨＢ−ＥＧＦ、以下の活性化）のＧＰＣＲ−刺激されたタンパク質分解性放出を含む。
ＴｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｅｄされたＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ１／２）はＳｈｃおよびＧｒｂ２／ｍＳｏｓ複合体を入れる。そして、それらがＲａｓ活性化複合体のＧＰＣＲ−起因性会合体のためのプラットフォームとして役立つ。
ＥＧＦ受容体のトランスアクチベーションは、ｃＲａｆ−１、ＭＥＫ１／２、多数系のＥＲＫ１／２  ＭＡＰキナーゼカスケードのＧＰＣＲ−刺激された活性化を説明する。
Ｓｒｃファミリキナーゼは、ＥＧＦ受容体活性化に応答して活性化されて、ＧＰＣＲシグナル伝達のこの種類の決定的なｄｏｗｎｓｔｒｅａｍｒｏｌｅを演奏する。
なお、添加若干の証明が、特にＧβｇサブユニット−依存している経路において、ＳｒｃがＧＰＣＲ−刺激されたＭＭＰ活性化の不十分によく理解されているプロセスで、役割を演ずることを示唆するにおいては、
（７．例７−多モード検査法）
【０６７７】
グレーティング結合器バイオセンサは、回折グレーティングによって導波路への光の共振結合に基づくエバネッセント波センサである。
（ここに異なるバイオセンサの討論参照）。
例は、案内多層の、そして、回折グレーティングの組み合わせの中で、概してバイオセンサ（グレーティング結合器センサ）からなる。
概して、４つの層導波路バイオセンサは、薄膜、しかし、それ以上より低い屈折率（ｎｓ）（例えば屈折率約１．５０を有する１７３７ガラス、コーニング符号）の基質上のｄＦ（例えば屈折率約２．３６のＮｂ２Ｏ５）の厚さを有する高屈折率（ｎＦ）材料の薄膜からなるカバー培地に屈折率約１．３５（ｎｃ）を有する生物学的な溶液にある。
基質は、基質側面から光入射を許可するために好ましくは透明である。
生物学的製剤（屈折率約１．４（ｎＡ）および厚さｄＡ．については、導波薄膜に固定される）の付着層
固定される生物学的製剤としては、挙げられるが、これに限定されるものではない（抗体）テスト、受容体、ペプチド、バクテリオファージ、「単一の要素をもつ」ＤＮＡ（ＲＮＡ）−切片、遺伝子、遺伝子切片、標的、タンパク質、結合タンパク質、酵素、阻害物質、核酸、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、アレルゲン、病原、炭水化物、メタボライト、ホルモン、有効成分、低分子量を有する分子、脂質、シグナル、細胞およびバクテリア。
【０６７８】
プレーナー型導波路の被きょう導波またはモードはＴＥｍ（横電気波またはｓ−偏光）、および、ＴＭｍ（横磁気波またはｐ−偏光）である。ここでｍ＝０，１，２、…はモード次数である。
レーザは角度を変化させることで導波路を照らす、そして、光は導波モードの実効屈折率によって決定される特定の角度だけで、導波路に結合される。
結合されるレーザ光線は、界面に隣接して液体の電磁場をつくっている導波薄膜の平面の界面に、平行を伝播する。
２つの条件が果たされることを必要とする場合、所定モードタイプは導波波だけとして広がる：
導波薄膜の屈折率が少なくとも１％、周囲の基質より大きくて、培地の屈折率をカバーするために有する（ａ）；
そして、導波薄膜の厚さは異なる値より大きい（２）、カットオフ厚さｄＣを呼ぶ。
【０６７９】
導波路グレーティングバイオセンサは、少なくとも一つの導波路グレーティング構造ユニットの中でまたは少なくとも一つのセンサ位置の中でなる。
バイオセンサはマイクロプレートと関連して、各ウェルが少なくとも一つの導波路グレーティング構造を含む。
【０６８０】
サンプルの検体に標識を付けるかまたは標識を付けられる方法が、開示される。
検体が標識をつけられるときに、傾向、例えば、付けられる部分、検体が発するいずれにでもおいて、それは蛍光、化学発光、バイオ発光、リン光または光（広いおよび／または狭い励起スペクトルを有する）または化学物質／電気化学的活性化を有する励起上の電子発光と標識をつけられる。
被検体が標識をつけられないときに、それが固定されたプローブ分子のｓｉｔｅ（ｓ）を結合している特性に結合する標識をつけられた結合パートナーは親和性が基準リガンドとして使われるように要求した。
基準リガンドは、プローブ分子に対して被検体の相対活量または親和性を決定するために用いる。
【０６８１】
検体の結合および／またはグレーティング領域に位置する固定されたプローブ分子に対する基準リガンドの標識から独立した検出は、屈折率変化（例えば、アメリカ４，８１５，８４３またはアメリカ５，４７９，２６０参照）のために、反射光の波長または角度の変化に基づく。
プローブ分子に対する基準リガンドに対する被検体の基準リガンドまたは競争的結合の結合の標識に依存する検出は、色の変化に基づく（（例えば蛍光、化学発光またはバイオ発光、リン光、または電子発光、その他）。
【０６８２】
標識をつけられた依存している検出は、２つの異なる典型的な方法によって達成され得る。
第１の方法において、導波路グレーティング基質は、導波薄膜内の光を伝播して、同時に、固定されるプローブ分子の側を通しているエバネッセント波を生成するために用いる。
標識をつけられた分子および導波薄膜界面間の距離に依存している異なる効率については、通されたエバネッセント波は、標識をつけられた被検体または標識をつけられた基準リガンドの励起に結果としてなる。
標識をつけられた分子は、界面により近ければちかいほど励起の効率も向上する。
特に、エバネセント場励起は、全ての平らな導波性界面に沿って、界面−境界蛍光団の強化された励起確率／効率を提供する(Budach, W.; Abel, A. P.; Bruno, A. E.; Neuschafer, D.; "Planar Waveguides as High-Performance Sensing Platforms for Fluorescence-Based Multiplexed Oligonucleotide Hybridization Assays" Anal. Chem. 1999, 71(16): 3347-3355. and Edmiston, P. L.; Lee, J. E.; Wood, L. L.; Saavedra, S. S. "Dipole Orientation Distributions in Langmuir-Blodgett Films by Planar Waveguide Linear Dichroism and Fluorescence Anisotropy" J. Phys. Chem.1996, 100: 775-784.)。
これはコンフォーカル顕微鏡検査に基づく発光検出原理とは対照的にある。ここで、光源は画定された体積要素に集光され強い局所電界（すなわちエピ蛍光）を導く。
これをすることによって、導波路グレーティング構造は、次の２検出のためのコア構成要素になる。両検出の一方は、センサー界面での特定の分子吸着によるエバネセント場の伝搬培地の屈折率変化に基づく標識に依存しない検出であり、他方は、色変化（強度、強度分布、全反射蛍光強度、その他）に基づく標識に依存する検出である。これらは優れた感度を提供する。その理由は、エバネッセント波が標的の標識の有無にかかわらず標的またはその複合体の距離の増加に応じて指数的に減衰する事実にある。
【０６８３】
このアプローチのために、蛍光に基づく検出が標的とされるときに、同時に導波路への光を結合して、蛍光部分を刺激する特別なセンサ設計が必要である。
ユニーク構造（例えば、グレーティング構造、期間、深度、導波薄膜の性状および厚さ、センサの構成、その他）を有する所定のセンサは、特定波長のレーザが正常な角度の近くででセンサに結合され得る傾向がある。
この正常な角度結合（直角）は細胞検出に好適であり、細胞が培地で覆われ同様に大部分の液状処理装置が直角で液変化を選ぶからである。
しかし、一般に励起蛍光分子は、波長の特定の範囲を有する特定光源を必要とする。
たとえば、Ｃｙ３は５３０−５６０ｎｍの範囲である励起光を必要とする。
ＤＭＲシグナル同様に同じ光源を使用する蛍光を検出するために、センサは同一光源と導波路との結合を許すように構成しなければならない。
このように、伝播された光のエバネッセント波は、侵入深さまたは検知体積内で蛍光分子を刺激するために用いることが可能である。
【０６８４】
第２の方法は、境界標識化被検体または基準リガンドを特に励起する独立した励起光源と、発光光を集める独立した発光検出装置とを要する。
このアプローチは、導波路センサ設計に関し厳格さを緩和し、広範囲にわたる異なるセンサ設計に適用され得る。
（８．例８−Ａ４３１細胞中の内存性ＧＰＣＲの同定）
【０６８５】
細胞の内容物（動的質量再分布（ＤＭＲ）に対する当量）の動的再分布は刺激作用に返事のＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）によるシグナル伝達を含んでいる多数細胞過程に共通である。ＤＭＲは共鳴性導波路グレーティングバイオセンサ（ＲＷＧ）およびＤＭＲシグナルが実在の生理学的条件の下で検知生体細胞のために新しくて統合した読み出しに提供する結果によって明らかにされ得る。
ＧＰＣＲ作動薬のパネルと協力してＲＷＧバイオセンサを使用している内存性ＧＰＣＲの活性化で媒介された静止Ａ４３１細胞のＤＭＲシグナルを調査すると、受容体が結合されるＧタンパク質（すなわちＧｑ、ＧｓおよびＧｉ）に基づく、ユニークなＤＭＲシグニチャが、ＧＰＣＲの各々のクラスのために同定された。
ＤＭＲシグナルは、作動薬の供与量および内存性受容体の発現量に依存していた。
ＤＭＲシグナルの一方のタイプから他方に対する用量依存的スイッチングは、ＧＰＣＲ作動薬の小さいセットのために観察された。
ネットワーク相互作用およびＧＰＣＲシグナル伝達の調節をマッピングする能力があると共に、標識フリーでかつ非侵入的なバイオセンサは、リアルタイム動態力学的計測を可能にする。そして、このようにそれらがＧＰＣＲ薬剤発見およびデオルファナイゼーション（deorphanization）のために使われる。
【０６８６】
Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、一般の構造上のモティーフをドメイン、細胞外のＮ末端および細胞内のＣ末端にわたっている７つの膜内外と共有する膜タンパク質の超ファミリである。
ＧＰＣＲは、心血管で、呼吸で、胃腸で、神経学上で、精神医学で代謝無秩序のような主要な疾患の現像およびプログレッションに関係した。
ＧＰＣＲは、ヒトゲノムのｄｒｕｇｇａｂｌｅな標的の単一の最大のファミリを表して、ＧＰＣＲが２０００の販売の６００億ドル以上を有する現在の薬剤標的の約５０％を説明するという事実で示すように、小分子薬剤発見のための最も産生的な領域であることを証明された。
現在のＧＰＣＲに基づく薬剤がほぼ２００の周知のＧＰＣＲの約２５％を標的として、約１４０新しく分類された孤児のための受容体でそこであるだけのことを考えれば、ＧＰＣＲは十分な機会を薬剤発見に対して提供する標的クラスである。
【０６８７】
外部性刺激の光、イオン、ニューロトランスミッタ（neurotransmittors）およびホルモンを含んでいる多種多様アレーは、ＧＰＣＲによる細胞の生理学および病態生理学特性をを変調（ここでは調整とも称する）する。
作動薬によって媒介されたＧＰＣＲの活性化はそれらの関連するＧタンパク質および他調節タンパク質を有する動的な相互作用の引き起こす。そして、それは細胞内反応のカスケードを支配する。
ＧＰＣＲは三基に分割され得る。そして、それらの被結合Ｇタンパク質亜タイプ：Ｇｑ、ＧｓおよびＧｉによって特徴づけられる。
概してＧＰＣＲで媒介されたリガンド起因性細胞現象は、受容体コンフォメーションおよびオリゴマー形成状態と共に始まる。そして、シグナル伝達活性化Ｇタンパク質活性（Ｇαサブユニット上のＧＤＰ−ＧＴＰ交換、ＧαおよびＧβγ脱会合、受容体からのＧタンパク質デカップリング、Ｇα−の生成およびＧβγ−シグナル伝達複合体）、並びに、二次メッセンジャ生成（Ｃａ２＋可動化、inositoltriphosphate生成および／または細胞内のｃＡＭＰレベル転形）を導く下流シグナル伝達、が続く。
その後、ＧＰＣＲシグナル伝達は、エンドサイトーシスによる細胞表面から特性遺伝子の形質発現およびＧＰＣＲの脱感作まで至る；そのいずれかの多数が多数の細胞内のタンパク質の中で動的輸送を巻き込む。
最終的に、フェノタイプ、形態および標的細胞の物性は、変えられる。
シグナル伝達および調節性機構は、一般に細胞応答を支配するタイムリで正確に管理された作用をする。
その結果、シグナル伝達ほとんどすべてのＧＰＣＲは、細胞の内容物の動的再分布がシグナル伝達サイクルの間、命じられて、管理されるという感覚において共通である。
細胞の内容物の動的な再分布をモニタすることは、ＧＰＣＲシグナル伝達の洞察およびＧＰＣＲスクリーンのための強力な手段を決意しなければならない。
（ａ）  材料および方法）
（（１）  材料）
【０６８８】
アミンアデノシンコンジナ（ＡＤＡＣ）、アナンダミド、ＡＴＰ、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターフェロン−γ誘導性のタンパク質−１０（ＩＰ−１０）、オレオイル−Ｌ−、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、ＮＥＣＡ、ノコダゾール、トロンビン、トリプシンおよびＵＫ１４３０４は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（セントルイス（ＭＯ））から購入された。
Ａ−７７６３６、ＢＲＬ  ５４４４３、クロニジン、エピネフリン、ジマレート（dimaleate）ＨＴＭＴ、イソプレンターノル（isoprenternol）、オキソトレモリンＭ、オキシメタゾリンおよびＳＫＦ３８３９２は、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（セントルイス（ＭＯ））から得られた。
Ｆｌｕｏ−３は、分子プローブ（Molecular Probes）（ユージン（ＯＲ））から得られた。
アンギオテンシンＩＩ、ａｐｅｌｉｎ１−１７、ａｐｅｌｉｎ１−１３、ボンベシン、ブラジキニン、ＤＡＭＧＯ、ダイノルフィンＡ、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１、ガラニン、ＧＬＩＧＫＶ−アミド、ＧＬＩＧＬＲ−アミド、グルカゴン、ａ−メラノサイト刺激的ホルモン（ａ−ＭＳＨ）、モチリン、ニューロキニンＡ、ニューロメジンＮ、ニューロペプチドＹ、ニューロテンシン、ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｎ、ＳＦＦＬＲ−アミド、Ｐ物質、ウロテンシンＩＩおよびＹＦＬＬＮＲＰ−アミドは、Ｂａｃｈｅｍ（プロシアの王（ＰＡ））から得られた。
コーニングＥｐｉｃ（登録商標）ＴＭの９６ウェルおよび３８４ウェルバイオセンサマイクロプレートは、コーニング社（コーニング（ＮＹ））から得られ、使用の前に６分のための高強度性紫外線（ＵＶＯ−洗浄剤、Ｊｅｌｉｇｈｔ社会社、ラグーナヒルズ、ＣＡ）照射によって洗浄した。
【０６８９】
人間表皮がんＡ４３１細胞（American Type Cell Culture）は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、４．５ｇ／リットルグルコース、２ｍＭのグルタミンおよび抗生物質で補充されるダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）において育てられた。
１０％のＦＢＳを含んでいるＤＭＥＭ培地が９６ウェルマイクロプレートの中で各々よく置かれた２００ｍｌにおいて、３−５経路での約３〜７．５×１０４細胞は、停止した。
細胞増殖培養液が３８４ウェルマイクロプレートの中で各々よく置かれた５０ｍｌの同様に約１〜２×１０４細胞。
細胞接種の後、約９５％密集度に達する（約２−４日）まで、細胞は空気／５％のＣＯ２の下で３７℃で培養された。
（（２）  Ｆｌｕｏ−３−Ｃａ２＋可動化アッセイ）
【０６９０】
３−５経路でのＡ４３１は約９５％密集度までのＣｏｓｔａｒ（登録商標）の９６ウェルクリア細胞培養マイクロプレートにおいて育てられて、二度洗浄されて、ＤＭＥＭだけを有するオーバーナイトを飢餓させた。そして、２．５ｍＭのプロベニシドがある場合には、１×ＨＢＳＳ（１×標準ハンクス均衡塩類溶液、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ペーハー７．０）によって洗浄されて、室温で、１時間の４μＭのＦｌｕｏ−３を含んでいる同じ緩衝液において標識をつけられた。
細胞はそれから緩衝液によって二回洗浄された。そして、２．５ｍＭのプロベニシドを含んでいる１×１００ｍｌのＨＢＳＳによって維持された。
アッセイは１００ｍｌのＧＰＣＲ作動薬溶液を細胞プレートへ移すことによって始められた、そして、カルシウムシグナルは、ＨＴＳ７０００バイオアッセイリーダ（PerkinElmer Life Science, Boston, MA）を使用して、６秒の間隔で、６分以上記録された。
アッセイは、光学検知データを有する直接タイプ比較を許すために室温で、実行された。
（３）  光学バイオセンサが分析する動的質量再分布（ＤＭＲ）
【０６９１】
横行性マグネチックまたはｐ−偏光を与えられたＴＭ０モードを有するコーニングＥｐｉｃＴＭ角度測定システムが、全ての研究のために使われた。
特別ないくつかの作用が取られ、不必要な効果を最小にした。
第１に、バルク屈折率変化を最小にするために、化合物溶液が導かれるときに、いかなるプロベネシドのないも１×ＨＢＳＳ緩衝液は全ての化合物を希釈するために用いたのに、ＤＭＥＭ緩衝液は細胞を飢餓させるために用いるだけだった。
第２に、速く定常状態に到達するのと同様に、細胞応答を容易にするために、細胞を有するセンサプレートが室温で、系に置かれるときに、細胞は予め持続性の期間（概して２０±２時間）のいかなるＦＢＳのないもＤＭＥＭ緩衝液によって飢餓させた、そして、静止性細胞がいかなる洗浄液のないもアッセイのために直接使われた。
第３に、全ての化合物溶液のＤＭＳＯ濃度は０．０５％以下まで最小にされた。但し、ＤＭＳＯのより高い濃度が開示されたアッセイにおいて使われる。
【０６９２】
動態計測のために、培養細胞（約９５％密集度）は空気／５％のＣＯ２下で３７℃で単独でＤＭＥＭを有する約２０時間、飢餓させた。
その後、細胞を含んでいるセンサマイクロプレートは光学系に配置された、そして、細胞応答は室温で、溶液の添加の前後で記録された。
化合物研究のため、５０μｌのＧＰＣＲ作動薬溶液が導かれる前に、各ウェルの細胞が５０μｌの化合物溶液即ち１×ＨＢＳＳによって安定した位相（すなわち明らかな質量再分布でない）まで前処理された。安定した位相は（一般に１時間内で）達した。
全ての研究は、温度変動および蒸気化冷却の効果を最小にするために、溶液が導かれた短い期間（約数秒）の除外上のマイクロプレートの蓋を有する室温で、実行された。
ここに示される応答のユニットは、ＣＣＤカメラによって撮像された各センサの共鳴バンドの中央位置の画素の変化であり、１ユニットは実験的な正常化プロトコルに基づいて約５．８２×１０−４の屈折率に等しかった。そして、正常化プロトコルはグリセリンおよびジメチルスルホキシドの濃度に依存する応答を使用する。
ここに開示されるように、他ユニットがパラメータおよびアッセイの必要を作動することに基づく決定され得ると理解される。
（ｂ）  結果および討論）
（（１）  Ａ４３１細胞の内存性ＧＰＣＲおよびそれらのシグナル伝達）
【０６９３】
Ａ４３１細胞が、実在の生理学的条件の下のＧＰＣＲ（Ｇｑ、ＧｓおよびＧｉ−共役型受容体）の全ての３つの主要なタイプのリガンド起因性光学シグニチャを研究するためにモデル系として使われた。
ＧＰＣＲの多くの他の異なるタイプに対して、周知の作動薬の小さいライブラリを使用しているランダムスクリーニングと協力して、アプローチは主にＡ４３１の周知の内因性の受容体に基づいた。
特定のＧＰＣＲが受容体が結合されるＧタンパク質の複数のタイプによる、そして、他の非Ｇタンパク質シグナル伝達経路にさえよるシグナルを変換してもよいことは非常にあり得る。
【０６９４】
Ａ４３１細胞の周知の内因性のＧＰＣＲは、ブラジキニンＢ２受容体、ｂ２アドレナリン作動受容体、アデノシン受容体Ａ１、Ａ２Ａおよびプロテアーゼ活性化Ａ２Ｂ（ヒスタミン受容体Ｈ１）を含む受容体ＰＡＲ１、そして、ＰＡＲ２（プリン受容体Ｐ２Ｙ１）Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６、そして、Ｐ２Ｙ１１（ＬＰＡ受容体ＬＰＡ１）ＬＰＡ２、そして、ＬＰＡ３、そして、ボンベシン受容体ＢＲＳ１．
他によってされるＲＴ−ＰＣＲ研究は、他研究がＰ２Ｙ２がまた、内生的に発現されることを示唆したにもかかわらず、Ａ４３１が内生的ににＰ２Ｙ受容体（Ｐ２Ｙ１（比較的低く）、Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６およびＰ２Ｙ１１）の少なくとも４つのファミリを表すことを示した。
【０６９５】
これらの受容体、Ｂ２、Ｐ２Ｙ受容体、ＰＡＲ受容体、ＬＰＡ２およびＬＰＡ３の中の、そして、ＢＲＳ１受容体は主にＧｑ−共役型受容体であるのに、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂおよびｂ２はＧｓ−共役型受容体である。
ほとんど何も、Ａ４３１のＨ１受容体のシグナル伝達経路に知られていない。
面白くＡ４３１．の内因性のＧｉ−共役型受容体のための文献記録でほんの少しであるだけにある
１つの例は、Ａ１受容体である。
ＬＰＡ１が主にＧｉ経路によるシグナル伝達を導くことは公知であるにもかかわらず、いいえがあって、あらゆる文献Ａ４３１．のＬＰＡ１のシグナル伝達機構のための記録
（（２）  Ａ４３１の内存性ＧＰＣＲの活性化の光学シグニチャ）
【０６９６】
作動薬のパネルは、個々に静止Ａ４３１細胞を刺激するために用いた。
用量依存的および動態力学的応答は、記録されて、分析された。
典型的運動の計測において、作動薬による各々のセンサ起因性の共鳴性光の角のシフトは、リアルタイムにおいてモニタされて、時間の関数として、プロットされる。
増加するシグナル（Ｐ−ＤＭＲ）は、検知体積（約１２０ｎｍ）内で、生体分子の総計の増加を意味する；
逆に、減少されたシグナル（Ｎ−ＤＭＲ）は、検知体積内で生体分子の総計の減少を意味する。
検知体積（また、侵入深さとして公知の）は導波薄膜内の被結合光の固有特性である。そして、それは細胞層および培地に達しているエバネッセント波をつくる。
【０６９７】
図６３は、ＧＰＣＲ作動薬によって媒介されたＡ４３１細胞の光学応答の４つのクラスを示した。
図６３ａに示すように、光学シグニチャの第一類は２つの主要な位相を呈した−急速を有するＰ−ＤＭＲ位相はゆっくり減衰するシグナル（図６３ａのＣに対する点Ｂ）を有するシグナル（図６３ａのＢに対する点Ａ）および次のＮ−ＤＭＲ位相を増やした。
光学シグニチャのかかるタイプに結果としてなる作動薬は、Ｂ２受容体作用薬ブラジキニン、Ｐ２Ｙ受容体作動薬ＡＴＰおよびＰＡＲ作動薬トロンビン（トリプシン）を含むＧＬＩＧＬＲ−アミド、ＧＬＩＧＫＶ−アミドおよびＳＦＦＬＲ−アミド。
Ｆｌｕｏ−３を使用している従来のＣａ２＋可動化アッセイは、細胞のＦｌｕｏ−３の蛍光強度の変化によって測られるように、これらの作動薬の全部が細胞内のＣａ２＋レベルの用量依存的隆起の引き起こすことを示した。
ブラジキニンによって媒介されたＡ４３１応答のための細胞の機構の詳細な解析と共に、これらの結果はかかる光学シグニチャがＧｑ−共役型受容体の活性化に帰されることを示唆した。そして、それは速いＣａ２＋可動化および下流シグナル伝達現象を導く。
【０６９８】
光学シグニチャの第２のクラスは１つの主要な位相（図６３ｂ）を呈した−それまでのゆっくり増加するシグナルを有するＰ−ＤＭＲ位相は評価プラトー（図６３ｂのＣに対する点Ｂ）に到達する。
多くの場合、ゆっくり減少されたシグナルおよび小さい振幅を有する初期位相がある。そして、それは作動薬溶液（図６３ｂのＢに対する点Ａ）の導入の直後に起こる。
一般に初期位相を完了する時は、化合物溶液（約数秒）の導入によるそれらの起因性より非常に長い。
化合物溶液が添加されるときに、化合物溶液およびＤＭＥＭ培地間のマッチしない屈折率はもしあればバルク屈折率変化に関する速い位相に結果としてなる。
光学シグニチャのかかるタイプに結果としてなる作動薬は、ｂ２作動薬エピネフリンおよびｉｓｏｐｒｅｎｔｅｒｎｏｌ、並びにＡ２ＡおよびＡ２Ｂ作動薬ＮＥＣＡを含む。
従来のＣａ２＋可動化アッセイは、これらの作動薬の全部が細胞内のＣａ２＋レベル（示されないデータ）のいかなる有意な変化もの引き金を引かないことを示した。
一方、２つのアデニル酸シクラーゼ活性化物質フォルスコリンおよびＮＫＨ４４７のどちらでも、いずれのｂ２またはＡ２作動薬（図６４）にもよるそれらの起因性に対する同様である光学シグニチャに結果としてなった。
両方の化学薬品は、ｃＡＭＰ（Ｇｓ−共役型受容体シグナル伝達の二次メッセンジャ）の細胞内のレベルの増加を導くアデニル酸シクラーゼを活性化することは公知である。
１０μＭのフォルスコリンまたはＮＫＨ４４７を有する静止状態細胞の前処理は完全にエピネフリン（図６５）によって媒介されたＤＭＲ応答を破壊した。そして、両方の化合物がこれらの作動薬を有する同じ下流シグナル伝達経路を共有している細胞応答に結果としてなったことを示した。
これらの結果はかかる光学シグニチャがＧｓ−共役型受容体の活性化に帰されることを示唆した。そして、それは細胞内ｃＡＭＰおよび下流シグナル伝達現象の蓄積を導く。
【０６９９】
光学シグニチャの第三級は２つの連続的Ｐ−ＤＭＲ現象（図６３ｃ）を呈した−それまでゆっくり増加するシグナルを有する高いレベル（Ｂｉｎ図６３ｃに対する点Ａ）および次のＰ−ＤＭＲ位相を導く速いＰ−ＤＭＲ位相は高い他のプラトー（図６３ｃのＣに対する点Ｂ）に到達する。
周知の内因性のＧＰＣＲを標的とするこれらの作動薬の中で、約５００ｎＭの下の供与量でのＬＰＡ受容体作用薬ＬＰＡだけは、かかる光学シグニチャに結果としてなった。
また、かかる応答の引き金を引いた他作動薬は、ＭＣ受容体ａ−ＭＳＨを含む。
かかる光学シグニチャはＧｉ−共役型受容体の活性化に帰され得る。それはＧｓ−共役型受容体と同様に驚かない類似を共有するからである。
ＧｉおよびＧｓシグナル伝達は、対立するの方法の細胞内ｃＡＭＰ以外の転形を導く。
【０７００】
シグニチャがそうしなかった光学の第四種はいかなる有意なＤＭＲシグナル（図６３ｄ）も呈した。そして、それは単独でＨＢＳＳによるその起因性に対する同様であった。
各々の作動薬は１ｎＭおよび１０μＭ間の５つの異なる供与量で、概して検査された、そして、少なくとも２つの独立実験は結果を確実にするために実行された。
このカテゴリに分類される作動薬は、Ａ−７７６３６、ＳＣＨ２３３９０およびＳＫＦ３８３９２（ＤＲＤ１）（アナンダミド  （ＣＮＲ１およびＣＮＲ２））を含むＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ（ＡＧＴＲ１）、ａｐｅｌｉｎ  １−１７およびａｐｅｌｉｎ  １−１３（ＡＧＴＲＬ１）、ＢＲＬ  ５４４４３（ＨＴＲ１Ｅ／Ｆ）、クロニジン、そして、ＵＫ１４３０４（ＡＤＲＡ２Ａ、ＢおよびＣ）（ＤＡＭＧＯおよびダイノルフィンＡ（ＯＰＲＭ１およびＯＰＲＫ１））ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１（ＥＤＮＲＡおよびＥＤＮＲＢ）、ガラニン（ＧＡＬＲ１およびＧＡＬＲ２）、グルカゴン（ＧＣＧＲ）、インターロイキン−８（ＣＸＣＲ１）、ＩＰ−１０（ＣＸＣＲ３）、モチリン（ＭＯＴＲ）、Ｐ物質（ＴＡＣＲ１）、ニューロキニンＡ（ＴＡＣＲ２）、ニューロメジンＮ、そして、ニューロテンシン（ＮＴＳＲ１）（ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ１、２、４、５、６Ｒ））ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｎ（ＯＰＲＬ１）、オキシメタゾリン（ＡＤＲＡ１Ａ）およびウロテンシンＩＩ（ＧＲＰ１４）。
これらの作動薬の標的とされた受容体は、括弧において示された。
その少しも有意でないＤＭＲシグナルは、Ａ４３１細胞のそれらの対応する受容体のいいえまたは比較的低い発現量がある示されるこれらの作動薬から結果になった。
小さいＤＭＲシグナルは、内存性ＣＸＣＲ１のその比較的低いレベルがＡ４３１細胞において表されることを示唆されるＩＬ−８つの刺激作用（示されないデータ）から生じた。
他の可能性は、ＩＬ−８の低構成する分泌がＡ４３１細胞からあるということである。
【０７０１】
ボンベシン受容体亜タイプ１（ＢＲＳ１）は、また、以前にＡ４３１細胞の急行を内生的にすると報告された。
Ｆｌｕｏ−３つのアッセイは、ボンベシンが２０±５％の細胞内のＣａ２＋レベルの最大増加を導くことを示した（ｎ＝５；
示されないデータ）（ボンベシンがＧｑ−シグナル伝達の引き起こすことを示唆すること）。
予想されるように、それらがブラジキニンによって媒介したより、非常に小さい振幅については以外、ボンベシンを有する静止Ａ４３１の刺激作用が用量依存的Ｇｑ−タイプ光学シグニチャ（示されないデータ）を導いて、ＡＴＰ、または、ＰＡＲ作動薬のどちらでも。
明らかなＩＣ５０が、ほぼ１ｎＭであるとわかった。
ボンベシンによるＤＭＲシグナル起因性の小さい振幅は、Ａ４３１のＢＲＳ１の比較的低い形質発現を提案した。
（（３）  Ａ４３１の内存性ＧＰＣＲを活性化する作動薬効能の決定）
【０７０２】
次に、有意なＤＭＲシグナルに結果としてなるこれらの作動薬の効能は、検査された。
場合によっては複数のサブファミリ受容体がＡ４３１において内生的に発現される、そして、特定の作動薬が異なる効能を有するサブファミリ受容体の多数を活性化してもよいので、作動薬溶液の５×濃度系はまず最初に細胞応答を検査するために用いた。
ほとんどの場合、作動薬溶液の２倍濃度系は、よりはるかに正確に作動薬のＥＣ５０値を決定するために用いた。
ＤＭＲシグナルの振幅は、作動薬濃度の関数として、プロットされて、ＥＣ５０を算出するためにＰｒｉｓｍによって分析された。
【０７０３】
内因性のＧｑ−共役型受容体を標的とする作動薬によって、図６６は用量依存的応答起因性を要約した。
ほとんど同一のＥＣ５０の作動薬濃度結果の関数としてのＰ−ＤＭＲてＮ−ＤＭＲシグナルの振幅の解析から、Ｐ−ＤＭＲシグナルだけはプロットされた、そして、作動薬の結果効能は議論された。
全ての飽和曲線はウェルに１−結合部非線形回帰を付けた。そして、明らかなＥＣ５０を導いた。
明らかなＥＣ５０値が、２．２±０．６μＭ（ｎ＝３）、１０．０±１．２ｎＭ（ｎ＝３）およびＡＴＰ、ブラジキニンおよび、それぞれ、トロンビンのための９．６±２．０ユニット／ｍｌ（ｎ＝３）であるとわかった。
割に、これらの作動薬のＥＣ５０値が、また、Ｃａ２＋フラックスアッセイ（示されないデータ）を使用して決定されて、光学バイオセンサアッセイによって得られたそれらと整合しているとわかった。
細胞外のＡＴＰは、イオンチャネルタイプＰ２ＸおよびＧタンパク質−被結合Ｐ２Ｙ受容体の強力作動薬であることを示した。
ＲＷＧバイオセンサがイオンよりむしろ細胞の生体高分子の再分布に、最も知覚しうる、そして、ＡＴＰによって媒介された光学シグニチャがブラジキニンおよびＰＡＲ作動薬によるそれらの起因性に対する同様であるので、内因性のＰ２Ｙ受容体が主にＡＴＰによってＤＭＲシグナル起因性を説明することを論じられた。
一方、Ｂ２、しかし、否定Ｂ１受容体は、ブラジキニンの大部分の生理学的で病態生理学的作用のためのＡ４３１およびＢ２受容体会計において内生的に発現される。
トロンビンはＰＡＲ１のための作動薬である、そして、ＳＬＩＧＬＲ−アミドおよびＳＬＩＧＫＶ−アミドはＰＡＲ２−特性作動薬である。
しかし、ＳＦＦＬＲ−アミドおよびトリプシンは、明白にＰＡＲ１およびＰＡＲ２を活性化する。
【０７０４】
内因性のＧｓ−共役型受容体を活性化する作動薬によって、図６７は用量依存的応答起因性を要約した。
ここで、ゆっくり増加するＰ−ＤＭＲシグナルの振幅は、作動薬濃度の関数として、プロットされた。
それぞれ、明らかなＥＣ５０値は、ＮＥＣＡおよびエピネフリンのための２１．５±１．２ｎＭ（ｎ＝３）および６．０±１．４ｎＭ（ｎ＝３）に分かった。
ＮＥＣＡは、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂおよび、それぞれ、２０、３３０および１４ｎＭの親和性を有するＡ１受容体のための作動薬である。
Ａ４３１．を含んでいるいくつかの細胞株を有する活性が記載されていたアデニル酸シクラーゼ上の作用の反対側の共存しているＡ１およびＡ２アデノシン受容体
Ａ４３１において、Ａは低薬量（＜約１０μＭ）がＡ１受容体によるコロニー形成の阻害を産生した二相の応答を呼び起こした、しかし、より高い濃度（最高１００μＭ）は次第にＡ２受容体によるこの阻害を逆転させた。
かかる二重効果は、このように逆数コントロールおよび微調整のための機会にシグナル伝達経路を与える。
ＮＥＣＡがＡ１およびＡ２Ａに同様親和性を有するので、ＮＥＣＡによる光学シグニチャ起因性はＧｓシグナル伝達が支配されることを示した。
Ａ１に更に効果、アデノシンアミンコンジナ（ＡＤＡＣ：Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ａｍｉｎｅ  ｃｏｇｅｎｅｒ）、０．８５、２１０および２８５ｎＭの親和性を有するアデノシン受容体選択的作動薬を同定するために、Ａ２ＡおよびＡ３受容体が、それぞれ使われた。
我々は、特にＡＤＡＣの高用量に興味があった。
結果は、高用量（＞５０ｎＭ）で、３．７±１．１μＭ（ｎ＝３）の明らかで効果的ＥＣ５０については、ＡＤＡＣが用量依存的方法の典型的Ｇｓ−タイプ光学シグニチャを刺激したことを示した。
一方、Ａ４３１が内生的ににｂ２受容体（細胞につき約４０，０００コピー）の高量数を表した時から、観察されるエピネフリン−起因性ＤＭＲシグナルは活性化ｂ２に対する特性である。
エピネフリンは、５−２０ｎＭのＥＣ５０を有するｂ２に結合する。
【０７０５】
図６８は、ａ−ＭＳＨによって用量依存的応答起因性を示した。
ここで、２つのＰ−ＤＭＲ現象の全体の応答は、作動薬濃度の関数として、プロットされた。
明らかなＥＣ５０値は、ａ−ＭＳＨ（文献値と整合した）のための９．０±１．６ｎＭ（ｎ＝３）に分かった。
【０７０６】
ここの我々は、多種多様なＧＰＣＲを標的とする作動薬のパネルによって刺激される静止Ａ４３１細胞の光学シグニチャを組織的に検査した。
作動薬の選出は、部分的にＡ４３１の周知の内因性のＧＰＣＲに基づいた。
結果は、光学シグニチャ（すなわち媒介体（すなわちＨＢＳＳ）だけで処理されるそれに対する同様）（図６３ｄ）の四分の一タイプの他に、光学シグニチャが三大前提カテゴリ（図６３ａ，ｂおよびｃ）に、それらの作動薬落下によって媒介することを示した。
三異なるストラテジは、これらの光学シグニチャのための細胞のシグナル伝達機構会計を明らかにするために使用された。
最初に、従来の二次メッセンジャアッセイ（すなわちＦｌｕｏ−３つのアッセイ）は、Ｃａ２＋可動化が生じるそれらの能力のための作動薬を分類するために用いた。
第２に、活性化物質（フォルスコリンおよびＮＫＨ４４７）が使われた２つのアデニリルｃｙｌａｓｅ（ＡＣ）は、静止Ａ４３１細胞を刺激する。
ＧＰＣＲ作動薬によって媒介されたアデニル酸シクラーゼ活性化物質−媒介された光学シグニチャ間の類似は、検査されて、Ｇｓによって媒介されたシグナル伝達を指摘したものである。
三分の一、特定の作動薬による光学シグニチャ起因性上の周知のモジュレータのパネルの効果の系統学のマッピングは、その細胞の機構およびシグナル伝達ネット相互作用を調査するために実行された。
これらの研究に基づく、光学シグニチャの３つの主要なクラスは、ＧＰＣＲシグナル伝達の３つの古典的なタイプに割り当てられた：
Ｇｑ−、Ｇｓ−およびＧｉ−シグナル伝達。
限界のため、内存性の情報はＡ４３１細胞（更に確かめられるＧｉ−タイプ光学シグニチャ必要）の受容体をＧｉ−ｃｏｕｐｌｅｄした。但し、ＨＴＭＴによる用量依存的応答起因性は強くかかる指示を支持した。
【０７０７】
ＩＬ−８の中で、Ａ４３１の全ての周知の内因性のＧＰＣＲを標的とする全ての作動薬は、有意なＤＭＲ応答を導いた。以外
適用できる文献記録である場合ＲＷＧバイオセンサによって決定されるそれらの効能はいずれのＦｌｕｏ−３つのアッセイ結果もと整合していた。そして、ＭＲＣＡＴが使って正確に作動薬効能を決定することを示唆した。
（（４）  作動薬によって媒介された細胞応答のシグニチャスイッチング）
【０７０８】
ＧＰＣＲシグナル伝達は複雑になる、細胞の状態およびコンテクストに従い、作動薬の選択作用および形質発現は水平になる、そして、受容体の中でタイプする。
細胞の状態およびコンテクストに従い、特定のＧＰＣＲの活性化は、複数種類のＧタンパク質による細胞応答の引き金を引いてもよい。
たとえば、ブラジキニンによる内因性のブラジキニンＢ２受容体起因性の活性化は、Ａ４３１細胞のＧｑおよびＧｓ−経路による細胞のシグナル伝達を媒介する；
両方のシグナル伝達経路は、各々をｃｒｏｓｓ−ｒｅｇｕｌａｔｅする。
Ｂ２受容体で媒介されたシグナル伝達がブラジキニンの服用と同様にＡ４３１細胞の細胞の状態に依存していることは、ここに分かった。
増殖している状態において、ブラジキニンの低薬量（＜１００ｎＭ）は好ましくはＧｓによって媒介されたシグナル伝達の引き起こす。そのとき、高量はブラジキニン好意Ｇｑ−シグナル伝達の中で、薬を飲む（＞１００ｎＭ）。
その他が手渡すもの、０．５ｎＭ間のブラジキニンおよび約１００ｎＭはＧｓおよびＧｑ−経路を媒介した。そのとき、それは約２０時間の０．１％のＦＢＳによって得られた静止Ａ４３１細胞を刺激するために用いた。
逆に、充分に静止Ａ４３１（約２０時間のいかなるＦＢＳまたは他成育因子の非存在下でも、ＤＭＥＭ培地によって得られる）は、主にＧｑ−シグナル伝達（示されないデータ）を有する全ての供与量で、ブラジキニンに応答した。
【０７０９】
ＬＰＡおよびＨＴＭＴを含む作動薬の少しが比較的合併した用量依存を呈したＤＭＲシグナルの引き金を引いたことは、同定された。
図６９は、ＬＰＡによって用量依存的応答起因性を示した。
充分に静止Ａ４３１細胞は、ＬＰＡの低薬量での典型的Ｇｉ−タイプ光学シグニチャを有するＬＰＡ刺激作用に応答して、ＬＰＡの高用量で次第にＧｑ−タイプ光学シグニチャへ切替えた。
１つの可能性は、低薬量でのＬＰＡが好ましくはＧｉによって媒介されたシグナル伝達を導くＬＰＡ１受容体を活性化したということである。
ＬＰＡの濃度が増加するときに、内因性のＬＰＡ２およびＬＰＡ３受容体は動作中になる。そして、Ｇｑによって媒介されたシグナル伝達を導く。
【０７１０】
図７０は、ＨＴＭＴによって用量依存的光学シグナル起因性を示した。
ＨＴＭＴは、Ｈ１およびＨ２受容体の作動薬である。
低薬量（＜約４０ｎＭ）で、ＨＴＭＴは用量依存的に典型的Ｇｉ−タイプ光学シグニチャ（図７０ｂ）に結果としてなった。
ＨＴＭＴの濃度が約８０ｎＭまで増加し続けるように、ＤＭＲに関する光学シグニチャは減少し始めて、ほとんど安定した（すなわち明らかなＤＭＲでない）ようになった。
ＨＴＭＴの濃度の更なる増加は、典型的Ｇｓ−タイプ光学シグニチャ（図７０ｂ）に、スイッチングに結果としてなった。
Ｐ−ＤＭＲシグナルの振幅は、ＨＴＭＴ濃度の関数として、プロットされて、明らかにスイッチング（図７３ｃ）を示した。
Ｇｉシグナル伝達は細胞内ｃＡＭＰの蓄積を導きそしてＧｓシグナル伝達は対立する効果を生じるので、ＨＴＭＴが異なる効能でおそらく異なるリセプタでＧｓおよびＧｉ−シグナル伝達経路を活性化すると推測することは合理的である。
ＧｓおよびＧｉシグナル伝達間の虚弱な均衡はネット（正味）の細胞応答を決定する、動的に関する最少で、ＲＷＧバイオセンサによってモニタされるように、再分布をかたまりにする。
（９．例９−異なる標的間の交差性伝達の調査）
【０７１１】
異なる標的中の交差性の伝達があることは共通であり、さらに標的のサブファミリの構成メンバ中でさえ共通である。
たとえば、ＥＧＦＲは特定のＧＰＣＲ作動薬によってトランスアクチベートされ得る。
また、１つの標的（例えばＧＰＣＲ）の活性化物質は、他の密接に関連した標的を活性化する。
【０７１２】
プロテアーゼ活性受容体（ＰＡＲ）は、現在までＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３およびＰＡＲ４を含むＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の新しいファミリからなる。
可逆性のリガンド結合で活性化される代わりに、ＰＡＲはユニークなタンパク質分解性機構を活性化のために利用する。
トロンビンおよびトリプシンのようなセリンプロテアーゼは、細胞外のＮ末端外ドメイン（exodomain）で部位特定的に受容体を切断する。
切断部位を活性化することは、残基４１−４２（Ｒ↓ＳＦＬＬＲＮ）、３６−３７（Ｒ↓ＳＬＩＧＫＶ）、３８−３９（Ｋ↓ＴＦＲＧＡＰ）およびＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３および、それぞれ、ＰＡＲ４のための人間の４７−４８（Ｒ↓ＧＹＰＧＱＶ）である。
開裂は新規なＮ末端の仮面をはぐ。そして、それは順番に縄でつながれたリガンド配列として作用する。
縄でつながれたリガンドドメインは受容体を分子内に結合して、活性化する。そして、このようにシグナル伝達を始める。
ＰＡＲを活性化するプロテアーゼは、上皮組織（トリプシン）から凝固因子（例えばトロンビン、凝固因子ＶＩＩａおよびＸａ）、炎症細胞（マスト細胞トリプターゼ（好中球カテプシンＧ））からのプロテアーゼおよび酵素を含む。
４つのＰＡＲ（ＰＡＲ１、ＰＡＲ３およびＰＡＲ４）のうちの３つは主にトロンビンによって活性化される。その一方で、ＰＡＲ２はトリプシンのようなプロテアーゼ（例えばマスト細胞トリプターゼおよび凝結Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ）によって活性化される。
ＰＡＲ３を除いて、縄でつながれたリガンド配列の最初の５つか６つのアミノ酸と一致して、合成ペプチド（ＰＡＲ−活性化しているペプチドまたはＰＡＲ−ＡＰｓ）は直接ＰＡＲを活性化する。
これらの合成ペプチドがプロテオリシスの中でそれぞれに受容体作用薬として機能するので、ＰＡＲ−ＡＰｓはＰＡＲの生理学的で病態生理学的機能を研究することに役立つ。
【０７１３】
ＰＡＲは、皮ふ、血小板、血管内皮細胞、胃腸管、脳および肺臓を含む多種多様な正常で悪性の組織および細胞で見つけられる。
大部分の細胞タイプは、多数ＰＡＲを発現する。
１つの例は、内生的ににＰＡＲ１およびＰＡＲ２を発現するＡ４３１細胞である。
しかし、Ａ４３１のＰＡＲのシグナル伝達経路の細胞はほとんど知られていないが、ｅｐｉｄｅｒｉｏｍｏｉｄカルシノーマ細胞が潜在的なＰＡＲ活性化物質であってもよい人間気道トリプシンのようなプロテアーゼを含んでいるいくつかのセリンプロテアーゼを発現する。
（ａ）  材料および方法）
（（１）  試薬）
【０７１４】
トロンビン、トリプシン、ラトランキュリンＡ、サイトカラシンＢ、ファロイジン、ノコダゾール、メチル−βシクロデキストリン（ｍβＣＤ）、α−シクロデキストリン（αＣＤ）、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ  Ｒエチルエステル（ＢＡＥＥ）および上皮増殖因子（ＥＧＦ）は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（セントルイス（ＭＯ））から購入された。
ＫＮ−６２およびＧＦ１０９２０３ｘは、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（セントルイス（ＭＯ））から得られた。
Ｆｌｕｏ−３およびテキサスＲｅｄ−ファロイジン（ＴＲ−ファロイジン）は、分子フローブ（ユージン（ＯＲ））から得られた。
ＳＦＦＬＲ−アミド、ＧＬＩＧＫＶ−アミド、ＧＬＩＧＬＲ−アミド、ブラジキニンおよびＹＦＬＬＮＲＰ−アミドは、Ｂａｃｈｅｍ（キングオブプロシア（ＰＡ））から得られた。
コーニング社製のＥｐｉｃＴＭの９６ウェルバイオセンサマイクロプレートは、コーニングＩｎｃ（コーニング（ＮＹ））から得られて、使用の前に６分の高強度性紫外線（ＵＶＯ−洗浄剤、Ｊｅｌｉｇｈｔ社会社、ラグーナヒルズ、ＣＡ）照射によってきれいにした。
（（２）  細胞培養）
【０７１５】
人間表皮がんＡ４３１細胞（American Type Cell Culture）は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、４．５ｇ／リットルグルコース、２ｍＭのグルタミンおよび抗生物質で補充されるダルベッコ変法イーグル培地ＤＭＥＭ）において育てられた。
３−５経路での約３〜７．５×１０４細胞は２００ｍｌにおいて停止した。そして、１０％のＦＢＳを含んでいるＤＭＥＭ培地は９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに置かれてあって、約９５％密集度に達する（約２−４つの日）まで、空気／５％のＣＯ２の下で３７℃で培養されてあった。
（（３）  Ｆｌｕｏ−３つのＣａ２＋可動化アッセイ）
【０７１６】
３−５経路でのでのＡ４３１は約９５％密集度までのＣｏｓｔａｒの９６ウェルクリア細胞培養マイクロプレートにおいて育てられて、二度、洗浄され、ＤＭＥＭだけを有するオーバーナイトを飢餓させた。そして、２．５ｍＭのプロベニシドがある場合には、１×ＨＢＳＳ（１×標準ハンクス均衡塩類溶液、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ペーハー７．０）によって洗浄されて、室温で、１時間の４μＭのＦｌｕｏ−３を含んでいる同じ緩衝液において標識をつけられた。
細胞はそれから緩衝液によって二回洗浄された。そして、２．５ｍＭのプロベニシドを含んでいる１×１００ｍｌのＨＢＳＳによって維持された。
アッセイは５０ｍｌのＰＡＲ作動薬溶液を細胞プレートへ移すことによって始められた、そして、カルシウムシグナルはＨＴＳ７０００バイオアッセイリーダ（パーキンエルマーライフサイエンス、ボストン、ＭＡ）を使用している６秒の間隔を有する記録された６分以上であった。
アッセイは、光学検知データを有する直接タイプ比較を許すために室温で、実行された。
（（４）  光学バイオセンサが分析する動的質量再分布（ＤＭＲ））
【０７１７】
横行性マグネチックまたはｐ−偏光を与えられたＴＭ０モードを有するコーニング社製ＥｐｉｃＴＭ角度測定システムが、全ての研究のために使われた。
培養した後に、細胞（約９５％密集度）が約２０時間ＤＭＥＭのみで飢餓させて、二回洗浄されて、１００μｌのＤＭＥＭによって維持された。
その後、細胞を含んでいるセンサマイクロプレートは光学系に配置された、そして、細胞応答は溶液の添加の前後で記録された。
化合物研究のための、各ウェルの細胞は、ＰＡＲ作動薬溶液５０μｌが導かれる前に、５０μｌの化合物溶液または１×ＨＢＳＳによって安定した位相（すなわち明らかな質量再分布でない）に達するまで（一般に１時間内で）、前処理された。
化合物またはＰＡＲ作動薬溶液は、細胞培地および化合物溶液間の屈折率にマッチするために１×ＨＢＳＳにおいて作られた。これは、化合物溶液の導入により一時的起こるにいかなるＤＭＲシグナルも圧倒するバルク屈折率変化の不必要な影響を最小にする。
全ての研究は、温度変動および蒸気化の冷却の効果を最小にするために、溶液が導かれた短い期間（約数秒）の間の除外上のマイクロプレートの蓋を有する室温で、実行された。
ＣＣＤカメラによって撮像されるように、本願明細書の全体にわたって示される応答のユニットは、ＣＣＤカメラによって撮像された各センサの共鳴バンドの中央位置の画素の変化であり、１ユニットは実験的な正常化プロトコルに基づいて約５．８２×１０−４の屈折率に等しかった。そして、正常化プロトコルはグリセリンおよびジメチルスルホキシドの濃度に依存する応答を使用する。
（（５）  蛍光画像化）
【０７１８】
コーニングＥｐｉｃＴＭの９６ウェルバイオセンサマイクロプレート（血清のないＤＭＥＭ培地を有するオーバーナイトのために餓死）に育てられた細胞は、特定の時間のためのいずれのトリプシンもまたはトロンビンによって突進して、４％のパラホルムアルデヒドによって固定して、０．２％のトリトンを含んでいるリン酸塩緩衝液食塩水（ＰＢＳ）において透過化処理して、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によってブロックした。
その後、細胞は室温で、１時間、０．５μＭテキサス赤標識ファロイジンによってインキュベートされ、洗った。
最終的な洗浄液およびマウンティングの後、細胞は４０×対物レンズ（ツァイスＡｘｉｏｐｌａｎ蛍光−顕微鏡において備えられた）によって検査された。
（ｂ）  結果）
（（１）  ＰＡＲ作動薬は、Ａ４３１細胞の細胞内Ｃａ２＋の隆起を媒介する）
【０７１９】
静止Ａ４３１細胞において、Ｆｌｕｏ−３つの蛍光強度の増加によって測られるように、トロンビン、トリプシン、ＰＡＲ１−ＡＰ（ＳＦＦＬＲ−アミド）およびＰＡＲ２−ＡＰｓ（ＧＬＩＧＫＶ−アミドてＧＬＩＧＬＲ−アミド）の全部が細胞内Ｃａ２＋（［Ｃａ２＋］ｉ）の急速かつ一過性増加を濃度に依存して誘発した。
非線形回帰およびスキャッチャード解析に基づく、全てのＰＡＲ作動薬によって媒介された飽和曲線は、１−部位結合に非常によく適合しているようである。
ＥＣ５０が、６±１ユニット／ｍｌ（６０±１０ｎＭに対する当量）、５．０±０．４μＭ、４５．７±５．８ｎＭ、２．５±０．３μＭおよび３．８±０．４μＭ、それぞれトロンビン、ＳＦＦＬＲ−アミド、トリプシン、ＳＬＩＧＬＲ−アミドおよびＳＬＩＧＫＶ−アミドのためのであるとわかった。
トロンビン、ＳＦＦＬＲ−アミド、トリプシン、ＳＬＩＧＫＶ−アミドおよびＳＬＩＧＬＲ−アミドにより誘導された最大である［Ｃａ２＋］ｉ隆起はそれぞれ、４８．２±３．５％、７４．３±３．９％、１００±６．３％、５２±６．３％および６４±３．７％であることが分かった（図７１）。
トリプシンによって得られた最大である［Ｃａ２＋］ｉ隆起は、トロンビンによって得られたのと同じ程度のほぼ２つのひだであった。
他方、トリプシンによって得られる最大である［Ｃａ２＋］ｉ隆起も、２つのＰＡＲ２−ＡＰｓによって得られたそれらより非常に高かった。
一方、ＳＦＦＬＲ−アミド（２０μＭ）およびＳＬＩＧＫＶ−アミド（２０μＭ）の混合液を有するＡ４３１の刺激作用は、単独で２００ｎＭトリプシンによって得られるそれに対する同様に、１０２±５．４％の［Ｃａ２＋］ｉ隆起を誘導した。
面白く、１６０μＭ濃度でのＰＡＲ１特性不完全作動薬ＹＦＬＬＲＮＰは、いずれも著しい［Ｃａ２＋］ｉ隆起の誘発をしなかった、しかし、８０μＭのＹＦＬＬＲＮＰを有する細胞の前処理は、２００ｎＭトリプシン（４８．３±４．５％（ｎ＝５））によって媒介した［Ｃａ２＋］ｉ隆起を抑制した。
適当な濃度（＜約１００μＭ）でのＹＦＬＬＲＮＰが、人間血小板のシグナル伝達経路ＧｑまたはＧｉを刺激せずに、血小板形変化に結果としてなっているＰＡＲ１で、選択的にＧ１２／１３のシグナル伝達カスケードを活性化するとわかった。
これらの結果は、トリプシンがＰＡＲ２以外のＰＡＲを活性化することを示唆する。
最大の応答を誘発することを必要とする濃度は、４０ユニット／ｍｌ、２０μＭ、４００ｎＭ、２０μＭおよび２０μＭ、それぞれ、トロンビン、ＳＦＦＬＲ−アミド、トリプシン、ＳＬＩＧＫＶ−アミドおよびＳＬＩＧＬＲ−アミドであった。
（（２）  ＰＡＲ作動薬は、Ａ４３１細胞のアクチンフィラメントの再構成を媒介する）
【０７２０】
ＰＡＲの活性化は、おそらくＲｈｏファミリタンパク質の活性化により、いくつかの細胞株（例えばＬＮＣａＰ）の細胞骨格構造の再構成を導くことは公知である。
高量密集度（＞９０％）での細胞の細胞骨格構造上のＰＡＲ作動薬の効果は、光バンドを使用する我々の光学検知システムのユニーク設計を原因として生じるので調査された。（光バンドの大きさ２００×３０００μｍ、注：これは、我々の角度測定の現在の構成である；照射のために使用する光の大きさは、概して約５０μｍ〜５ｍｍまでの範囲である）調査されたのは各々のバイオセンサを照射して行われた（ＤＭＲに関する光学シグニチャが照射する領域内の全ての細胞の平均値であることを意味すること）。
いずれのトロンビンもまたはトリプシンを有する約９５％の密集度での静止Ａ４３１細胞の刺激作用はアクチンフィラメントの再構成を誘発した。そして、そのことはテキサスＲｅｄ−Ｘファロイジンによって、汚れることは模倣する（示されないデータ）ことを示した。
休止Ａ４３１細胞は典型的染色パターンを示した−アクチンフィラメントは大部分は延長して現れて、細胞原形質の全体にわたって均一に分配する。
１００ｎＭトリプシンまたは４０ユニット／ｍｌトロンビンで処理された細胞は、約１０分（示されないデータ）以後の有意な細胞骨格再構成の引き金を引いて、約３０分以後明らかになる。
アクチンフィラメントは、いずれのトロンビンもまたはトリプシンによって刺激された後に主に３０分、細胞の端のまわりで集中した。
これらの結果は、トロンビンおよびトリプシンがＡ４３１細胞のアクチンフィラメントの再構成を媒介することを証明した。
（（３）  ＰＡＲ作動薬は、Ａ４３１細胞の有意な動的質量再分布を媒介する）
【０７２１】
５つのＰＡＲ作動薬のいずれの一つも全く作動薬濃度に対する飽和性であるＧｑ−タイプ光学シグニチャの結果を検査することを証明されたことをここに明らかにする。
Ｃａ２＋可動化結果と同様に、作動薬によって媒介されたＤＭＲシグナルが光学バイオセンサアッセイにもよって、得たＰＡＲの飽和曲線は、非線形回帰およびスキャッチャード解析に基づく、モデルを結合している１−部位によって、非常によく合った。
それは、トリプシンのために、高用量（＞２０００ｎＭ）でのトリプシンがバイオセンサ（示されないデータ）の表層から、有意な細胞離断まで至るので、低薬量（＜２０００ｎＭ）でのトリプシンによるＤＭＲシグナル起因性が集中された点に注意する価値がある。
【０７２２】
輸送ことを含む細胞活性、シグナル伝達および形態学的変化の多くの重要な見方が細胞骨格構造の再配列を必要とするので、ＰＡＲ作動薬−起因性光学応答（図７２）の細胞骨格転形の役割は調査された。
ラトランキュリンＡを有するＡ４３１の前処理は完全にトロンビン−かトリプシンによって媒介されたＤＭＲシグナルを遮断した。その一方で、サイトカラシンＢはまして応答を抑制することに効果的だった。
２つの作因が原因アクチン脱重合に異なる機構を利用することを公知である：
サイトカラシンＢはアクチンフィラメントをおおう。その一方で、ラトランキュリンＡはアクチンモノマーを隔離する。
かかる差分は、シグナル伝達機構のエンドサイトーシスに影響を及ぼすことか会合体によって受容体シグナル伝達を調整するために各々のトキシンのための異なる機能を導く。
逆に、安定させている多因子のＦアクチン作因ファロイジンもマイクロチューブル分裂するものノコダゾールも、トロンビンおよびトリプシンに媒介された応答に対する有意な影響を有しなかった。
【０７２３】
細胞骨格再構成を管理するＲｈｏ活性化を導くＰＡＲ細胞内シグナル伝達は、２つの主要なシグナル伝達経路を含むように見える：
ホスホイノシトール加水分解およびカルシウムに依存するＲｈｏ活性化に結果としてなっているＧｑ−被結合経路およびＧ１２／１３−被結合ｐ１１５Ｒｈｏ−ＧＥＦによるＲｈｏのカルシウムから独立した直接の活性化。
このように、Ｃａ２＋シグナル伝達を標的とするモジュレータの効果は、検査された。
使用するモジュレータは、有力なＰＫＣ阻害物質ＧＦ１０９２０３ｘおよび有力なＣａ２＋／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎに依存するタンパク質キナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）阻害物質ＫＮ−６２（図７３）であった。
ＧＦ１０９２０３ｘは、トロンビンおよびトリプシンによって媒介されたＤＭＲシグナルに対する明らかな影響を有しなかった。
しかし、ＫＮ−６２の前処理は、異なってトロンビンおよびトリプシンによって媒介されたＤＭＲシグナルに影響を及ぼした。
ＫＮ−６２が僅かにトロンビンによって媒介されたＤＭＲシグナルを抑制するときに、それはほとんど完全にトリプシンによって媒介されたＤＭＲシグナルを破壊した。
トリプシン活性を直接抑制しているＫＮ−６２の可能性を検査するために、ＢＡＥＥ  ｈｙｄｒｏｌｙｉｓｉｓアッセイが、使われた。
結果は、ＫＮ−６２の存在がトリプシン活性（示されないデータ）に遂行することが明らかでないことを示した。
【０７２４】
以前にＧ１２／１３を活性化することを示すＰＡＲ１特性不完全作動薬ＹＦＦＬＲＮＲＰの効果が細胞形状変化に結果としてなって、否定以外の、人間血小板のＧｑによって媒介されたＣａ２＋シグナル伝達は再度、検査された。
高用量だけでのＹＦＦＬＲＮＰは、有意なＤＭＲシグナル（示されないデータ）を刺激した。
ＹＦＦＬＲＮＰは、用量依存的にトロンビン、ＳＦＦＬＲ−ａｍｉｄｅ−およびトリプシン（図７４）によって媒介されたＤＭＲシグナルを抑制した。
検査される最も高い供与量で、ＹＦＦＬＲＮＰはほとんど完全にトロンビンによって媒介されたＤＭＲを遮断するが、部分的にＳＦＦＬＲ−アミドてトリプシンによって媒介されたＤＭＲを減らすだけだった。
逆に、ＹＦＦＬＲＮＰはＰＡＲ２−ＡＰ  ＧＬＩＧＫＶによって媒介されたＤＭＲシグナルに対する明らかな影響を有しない。
集合的に、これらの結果は、細胞骨格再構成が主に生じられることを示唆したＰＡＲ２活性化によるＧｑによって媒介されたＣａ２＋シグナル伝達、しかし、ＰＡＲ１活性化によるＣａ２＋から独立した機構。
（（４）  ＰＡＲ作動薬の受容体脱感作および交差脱感作）
【０７２５】
Ａ４３１は少なくとも内生的ににＰＡＲ１およびＰＡＲ２を発現する、そして、トロンビンまたはトリプシンが潜在的に複数の受容体（ＰＡＲ作動薬のさまざまな組み合わせの次の刺激作用に応答する受容体の脱感作および交差脱感作）を活性化するどちらでも、Ｆｌｕｏ−３を有する［Ｃａ２＋］ｉ隆起外延によって評価された、または、光学バイオセンサを有するＤＭＲシグナルは、検査された。
間隔は、ＤＭＲ光学アッセイのためのＣａ２＋可動化アッセイおよび約１時間の６分であった。
【０７２６】
図７５は、ＰＡＲ作動薬のさまざまな組み合わせにおいて順番に刺激された主なＡ４３１の［Ｃａ２＋］ｉの結果を要約する。
一旦Ａ４３１細胞がトリプシンによって刺激されると、他のＰＡＲ作動薬（４０ユニット／ｍｌトロンビン、２０μＭのＳＦＦＬＲ−アミド、２０μＭのＧＬＩＧＫＶ−アミド、２０μＭのＧＬＩＧＬＲ−アミドまたは２００ｎＭトリプシン）の次の適用が、ほとんど［Ｃａ２＋］ｉ隆起なしを誘導した（図７５ａ−ｃ（示されないデータ））。
逆に、検査されるＰＡＲ作動薬のどちらも、ブラジキニン（Ａ４３１細胞において内生的に発現されるＢ２受容体のための作動薬）の次の刺激作用によって媒介された［Ｃａ２＋］ｉ隆起のいかなる効果もなかった（図７９ｄに例示）、これは、トリプシンを有する前の刺激作用によるＰＡＲ作動薬に対する応答の阻害が膜タンパク質の非特異的消化作用によらなかったことを示唆する。
他方、４０ユニット／ｍｌトロンビンを有する前の刺激作用は、４０ユニット／ｍｌトロンビンによって媒介された［Ｃａ２＋］ｉ隆起を全くブロックしたが、僅かにトリプシン−起因性［Ｃａ２＋］ｉ隆起を抑制した。ところが、ＳＦＦＬＲ−アミド、ＧＬＩＧＫＶ−アミドまたはＧＬＩＧＬＲ−アミドの前の刺激作用はかなり減らされ、しかし、トリプシン−起因性［Ｃａ２＋］ｉ隆起を完全に消してはない（図７９ｅ−ｇ；示されないデータ）。
トロンビンの前の刺激作用の後、ＰＡＲ２−ＡＰ  ＳＬＩＧＫＶ−アミドは、前の刺激作用（５２．０±６．３％）なしで得たのと同様に［Ｃａ２＋］ｉ隆起（４８．５±３．８％）を誘導した。
逆に、トロンビンの前の刺激作用は、ＳＦＦＬＲ−アミド（３２±４．３％）によって誘導した［Ｃａ２＋］ｉ隆起を部分的にブロックするだけであるが、これは、ＳＦＦＬＲ−アミドがＰＡＲ１およびＰＡＲ２を活性化する他によってなされた以前の目視観測と両立する。[ Blackhart, B. D.; Emilsson, K.; Nguyen, D.; Teng, G. W.; Martelli, A. J.; Nysted, S.; Sundelin, J.; Scarborough, R. M. J. Biol. Chem. 1996, 271, 16466-16471].。
このように、トリプシンはＰＡＲ１−ＡＰおよびＰＡＲ２−ＡＰｓに反応性を脱感作したのに、トロンビンはＰＡＲ２−ＡＰｓに反応性を脱感作しなかった。
【０７２７】
ＰＡＲ作動薬のさまざまな組み合わせにおいて順番に刺激されるＡ４３１のＤＭＲ応答の主な結果を要約される図７６は、ＲＷＧバイオセンサを使用しているリアルタイムにおいてモニタした。
トリプシンを有する前の刺激作用はいずれのトリプシン（示されないデータ）もまたはトロンビン（図７６ａ）によって完全にＤＭＲシグナル起因性を除去した。その一方で、それは三ＰＡＲ−ＡＰｓ（ＳＦＦＬＲ−アミド、ＧＬＩＧＫＶ−アミド、ＧＬＩＧＬＲ−アミド）（図７６ｂ−ｃ（示されないデータ））のどちらにでもよって、かなりＤＭＲシグナル起因性を抑制した。
逆に、トリプシン前処理は、ブラジキニン（図７６ｄ）によって媒介されたＤＭＲに対するほとんど影響を有しない。
ＳＦＦＬＲ−アミド、ＧＬＩＧＫＶ−アミドまたはＧＬＩＧＬＲ−アミドがかなり抑制する一方（トロンビンを有する前の刺激作用）、しかし、否定は、完全にトリプシン−起因性ＤＭＲシグナルを除去する（図７６ｅ−ｇ；示されないデータ）。
さらに、トロンビンを有する前の刺激作用の後、２つのＰＡＲ２−ＡＰｓ（ＳＬＩＧＫＶ−アミドてＳＬＩＧＬＲ−アミド）は、前の刺激作用（示されないデータ）なしで得られるそれに、ＤＭＲシグナル同様を誘発した。
概要において、これらの結果はトロンビンが主にＰＡＲ１を活性化することを示した。その一方で、トリプシンはＰＡＲ１およびＰＡＲ２を活性化する。
（（５）  ［トロンビンおよびトリプシンによって媒介されたＣａ２＋］ｉ隆起およびＤＭＲシグナルは、細胞のコレステロールレベルに影響される）
【０７２８】
細胞コレステロールレベルがＧＰＣＲシグナル伝達を含んでいる多数細胞機能にとって重要であるので、細胞内のＣａ２＋隆起およびＤＭＲ応答上のｍβＣＤによるコレステロール欠損の効果はトロンビンによって媒介した、そして、トリプシンは検査された。
ｍβＣＤを有する静止Ａ４３１細胞の前処理は、用量依存的抑制を導いた［Ｃａ２＋］ｉ隆起は、いずれのトリプシンもまたはトロンビン（示されないデータ）によって媒介した。
両方の用量依存的抑制は、一つの位相減衰非線形回帰によって、非常によく発作をカーブさせる；ｍβＣＤが細胞膜コレステロール分子を速く流出することに結果としてなるという事実と整合した。
一方、非活動性のシクロデキストリン立体異性体αＣＤは、最高８ｍＭ、トリプシンおよびトロンビン−誘導応答（示されないデータ）に対する影響を有しなかった。
【０７２９】
同様に、ｍβＣＤを有するＡ４３１の前処理も、トロンビンまたはトリプシン（図７７）によって光学シグニチャ起因性の用量依存的変化を導いた。
Ｃａ２＋可動化によって測定されたものと同様に用量依存を示したｍβＣＤによるトロンビン媒介ＤＭＲの抑制と異なって、ｍβＣＤによるトリプシン媒介ＤＭＲの抑制は、複雑な性質、ｍβＣＤの増加する服用に対する遅く衰えた減衰を示した。
この差分は、トリプシンによって媒介されたＤＭＲシグナルがトロンビンによるその起因性より合併した細胞の機構を含むことを示唆した。
逆に、非活動性のシクロデキストリン立体異性体αＣＤが、最高８ｍＭ、両方の作動薬−起因性ＤＭＲ応答に対するほとんど影響を有するというわけではなかった。
しかし、αＣＤ（＞１０ｍＭ）の高用量は、バイオセンサ（示されないデータ）の表層から取り外される細胞の有意な総計に結果としてなった。
ｍβＣＤを有するコレステロール欠損の後のＰＡＲの機能上の回収は、また、検査された。
この実験は、ｍβＣＤを含んでいる培地の除去の後、ｍβＣＤ−処理された細胞の細胞表面コレステロールのタイムリな回収に基づいた。
そうするために、静止Ａ４３１細胞は細胞表面コレステロール組成の除去を確実にするために１５分のための５ｍＭのｍβＣＤによって処理された。そして、ＤＭＥＭ培地だけでの処理された細胞は、続いて三時間、洗浄された。
細胞はそれから１００μｌによって維持された培地、そして、光学系に配置される。
細胞が合理的に安定した状態に達しているのを許すために１５分のためのインキュベーションの後、８０ユニット／ｍｌでのトロンビンの１００μｌ溶液は、特定の時間で各ウェルに添加された。
光学応答は、アッセイの全体にわたって記録された。
図７８に示されるように、細胞表面コレステロールが除去されたあと、トロンビン−起因性ＤＭＲシグナルが時間に依存していたことを示す結果になった。
それがコレステロール除去なしで得られる起源のレベルに達するまで、トロンビン−起因性ＤＭＲシグナルは次第に回復した。
トロンビン−起因性光学シグニチャの時間に依存する回収はコレステロールによって援助された微小ドメインの発生が動的で可逆性のことを強く意味した、そして、細胞膜でのコレステロール濃度はＰＡＲシグナル伝達を管理する際に重要である。
（（６）  ＥＧＦＲおよび部間の交差性の伝達）
【０７３０】
特定のＧＰＣＲ作動薬がＥＧＦＲｓをトランスアクチベートするので、ＰＡＲシグナル伝達上のＥＧＦの効果は検査された。
ＥＧＦを有する前の刺激作用は、ほとんど効果を有しなかった［Ｃａ２＋］ｉ隆起は、トリプシン（図７９ａ）またはトロンビン（示されないデータ）によって媒介された。
しかし、充分にＥＧＦＲｓ、ＥＧＦを活性化している１００ｎＭでは全くＮ−ＤＭＲ現象は遮断されたが、トリプシン（図７９ｂ）またはトロンビン（図７９ｃ）によって媒介されたＤＭＲ応答のためのＰ−ＤＭＲ現象は減衰するだけだった。
これらの結果は、アクチンフィラメント再構成を管理する観点からの最少で、交差性の伝達がＥＧＦＲおよびＰＡＲの間にあってもよいことを示唆した。
【０７３１】
概要において、Ａ４３１細胞、５つのＰＡＲ作動薬（トロンビン、ＰＡＲ１−ＡＰ  ＦＬＬＬＲ−アミド、トリプシン、ＰＡＲ２−ＡＰｓ  ＧＬＩＧＬＲ−アミドおよびＧＬＩＧＫＶ−アミド）および１つのＰＡＲ１特性不完全作動薬ＹＦＬＬＲＮＰのＰＡＲシグナル伝達の分子機序を解明することは、Ａ４３１細胞を刺激するために用いた。
変化を中で含んでいる細胞応答［Ｃａ２＋］ｉレベルおよび動的質量再分布は、検査された。
証明の三ラインはトロンビンが主にＰＡＲ１を活性化することを支えた。その一方で、トリプシンはＰＡＲ１およびＰＡＲ２を活性化する。
第一、用量依存、そして、飽和性の［検査されるＰＡＲ作動薬のどちらにでも対するＣａ２＋］ｉ隆起およびＤＭＲシグナルは、Ａ４３１細胞のＰＡＲ１およびＰＡＲ２シグナル伝達の存在を提案した。
より大きいものを他のＰＡＲ作動薬によって媒介されたそれらに比較する［Ｃａ２＋］ｉ隆起およびＤＭＲシグナルは、そのトリプシンがＰＡＲ２以外の受容体を活性化するかもしれないことを示唆されるトリプシンによって媒介した。
［  ＳＦＦＬＲ−アミドおよびＧＬＩＧＫＶ−アミドの混合液によって媒介されたＣａ２＋］ｉ隆起は単独でトリプシンによって媒介されたそれに対する同様である。そして、更にトリプシンがＡ４３１細胞のＰＡＲ１およびＰＡＲ２を活性化するという可能性を強化する。
トリプシンを有する前の刺激作用がほとんど完全に遮断した目視観測から、第２の証明は、ある［Ｃａ２＋］ｉ隆起は全てのＰＡＲ作動薬、しかし、否定ブラジキニン（Ｂ２受容体作用薬）のいずれの一つにもよって媒介した。そして、ＰＡＲ２と一緒に、ＰＡＲ１が切断されて、トリプシンによって活性化されたことをこのように示唆した。
他方、トロンビンを有する前の刺激作用は、僅かに減るだけだった［Ｃａ２＋］ｉ隆起、しかし、かなりＤＭＲシグナルは、トリプシンによって媒介した。
面白いことに、トリプシンを有する持続性の前の刺激作用（約１時間）は全くトロンビンによって媒介されたＡ４３１細胞のＤＭＲ応答を抑制した。そして、無損傷のトロンビン−活性受容体がトリプシンを有する持続性の１時間の刺激作用の後、回復しないことを示唆した。
しかし［Ｃａ２＋］ｉ計測異なり、トリプシンでの持続性の前の刺激作用は、シグナルが全ての三つのＰＡＲ−ＡＰｓによって媒介されたＤＭＲを部分的に抑制するだけだった。これは、ＰＡＲ２受容体の若干の一部が回復されていること意味する。
ＳＦＦＬＲ−アミドは、ＰＡＲ１およびＰＡＲ２を活性化することが可能なことは公知である。
また、受容体プロテオリシスおよびリン酸化が受容体内部移行によるＰＡＲおよび細胞内シグナル伝達の阻害の活性を管理することは公知である。
細胞のコンテクストに従い、細胞表面での機能的受容体の回収は、何十分から時間まで減じてもよい。
証明の三分の一ラインは、ＹＦＦＬＲＮＰの効果から来た。
ＹＦＦＬＲＮＰを有する前の刺激作用は、用量依存的に、ＰＡＲ２−ＡＰ  ＳＬＩＧＫＶ−アミド以外でない、トロンビン、ＳＦＦＬＲ−アミドまたはトリプシンによって媒介されたＤＭＲシグナルを抑制した。
最も高い供与量（７２９μＭ）で、ＹＦＦＬＲＮＰは全くトロンビンによって媒介されたＤＭＲシグナルを遮断するが、ＳＦＦＬＲ−アミドまたはトリプシンによって部分的にそれらの起因性を抑制するだけだった。
集合的に、これらの結果は、ＰＡＲ２と比べて、トリプシンがまた、Ａ４３１細胞のＰＡＲ１を活性化するかもしれないことを示唆した。
ＰＡＲ１、ＰＡＲ３およびＰＡＲ４がトロンビン受容体として役立つと報告される。その一方で、トリプシンは、ＰＡＲ２の他に、ＰＡＲ１およびＰＡＲ４を活性化することが可能である。
【０７３２】
アクチンフィラメントがテキサスＲｅｄ−Ｘ−ファロイジンによって汚れて、現れられるように、動的質量再分布と共に、ＲＷＧバイオセンサはＰＡＲ１の活性化の役割およびＰＡＲ２のＡ４３１細胞の細胞骨格再構成を支持した。
ＰＡＲ１の活性化は、数種類の血小板およびＬＮＣａＰ細胞を含む細胞の細胞骨格再構成を導くことを示した。
いずれのトロンビンも有するＡ４３１細胞または無作為化された分配からアクチンフィラメントの有意な再配列を引き起こされるトリプシンの刺激作用は、細胞の端の近くで濃度したフィラメントにアクチンフィラメントを延長した。
さらに、検査される全てのＰＡＲ作動薬も、バイオセンサ表面上の付着細胞の底部分内で、劇的な質量再分布を誘発した。
アクチンフィラメント破壊作因ラトランキュリンＡおよび、選択的にトロンビンまたはトリプシンによって媒介されたＤＭＲシグナルを減らす否定アクチン重合−促進している作因ファロイジンまたはマイクロチューブル破壊作因ノコダゾール以外は、サイトカラシンＢの機能は、ＤＭＲ応答（このようにＡ４３１細胞の細胞骨格再構成のＰＡＲシグナル伝達の役割）のアクチンフィラメント再配列の役割を提案した。
人間血小板の、示量拡散移動および形変化を経るトロンビンにさらされる、ＰＡＲ１はｐ１１５Ｒｈｏ−ＧＥＦ、ＰＡＲ１−被結合Ｇタンパク質と関連するＧＴＰ交換因子（ＧＥＦ）、Ｇ１２／１３によるＲｈｏＡを活性化することを示した。
Ａ４３１細胞において、ＹＦＦＬＲＮＰ（具体的には、Ｇ１２／１３を活性化すると報告されるＰＡＲ１特性不完全作動薬、しかし、否定Ｇｑ）が他のＰＡＲ作動薬（示されないデータ）に、ＤＭＲシグナル同様を誘発することが可能であるとわかった。
さらに、ＹＦＦＬＲＮＰを有するＡ４３１細胞の前処理は、用量依存的に、否定ＰＡＲ２−ＡＰ  ＧＬＩＧＫＶ−アミド以外の、トロンビンおよびＳＦＦＬＲ−アミドによって媒介されたＤＭＲシグナルを減らした。
これらの結果は、Ａ４３１力のＰＡＲ１もの活性化がＧ１２／１３による細胞骨格再構成の引き起こすことを示唆した。
他方、トリプシンによって媒介された細胞骨格再構成は、両Ｇ１２／１３−およびＧｑに依存する経路から生じられる。これは、トリプシンによって媒介されるＤＭＲシグナルがＰＡＲ１特性不完全作動薬ＹＦＦＬＲＮＰと同様にＣａＭＫＩＩインヒビターＫＮ−６２に影響されたからである。
１つの可能性は、ＰＡＲ１の活性化によるＧ１２／１３のシグナル伝達経路以外の、トリプシンがＰＡＲ２の活性化によるＧｑシグナル伝達経路に従い、細胞骨格再構成を誘発したということである。
【０７３３】
スフィンゴリピドを含んでいる他脂質および飽和したリン脂質と共に、細胞表面でのコレステロールは微小ドメインを集める傾向がある。そして、それは選択的に多数のシグナル伝達タンパク質を区分するように機能する。
その非活動性の立体異性体αＣＤ以外のｍβＣＤを有する細胞の処理は、トロンビンおよびトリプシンによってＣａ２＋可動化および動的質量再分布起因性を含むＰＡＲシグナル伝達を減らさなかった。
コレステロール欠損によるＥＧＦＲのトランスアクチベーションが少なくともＮ−ＤＭＲ現象の減衰を説明することを示唆されるＥＧＦを有する前の刺激作用の効果は、トロンビンまたはトリプシンによって媒介した。
さらに、Ｃａ２＋可動化を減らすコレステロール欠損の機能は、そのコレステロールを膜が経路をＧｑ−シグナル伝達して、ＰＡＲ１およびＰＡＲ２のシグナル伝達を管理するプラズマに関係させた。
コレステロール抽出が、ＡＲシグナル伝達のための２つの重要な分子ＰｔｄＩｎｓ  ４，５−Ｐ２およびＧｑの区画化の減失を導くことを公知である。
コレステロール欠損によるＣａ２＋可動化の抑制は、ＰｔｄＩｎｓおよびＧｑの非局在化の直接の結果であるかもしれない。
上記のように、ＰＡＲで媒介されたＤＭＲシグナルは、Ｇｑ経路の中でそれぞれに他経路を含む。
しかし、充分にＤＭＲシグナルを遮断するコレステロール除去の機能は、Ｇ１２／１３のような、そのコレステロール欠損がまた、他のシグナル伝達経路を悪くするかもしれないことを示唆されるトリプシンおよびトロンビンによって媒介した。
これらの所見は、Ａ４３１細胞においてラフリング（ｒａｆｆｌｉｎｇ）している膜がコレステロールを必要とする他によってされる前の目視観測に同意した。
面白いことに、機能上の回復実験は、コレステロール−集められた微小ドメインが動的で可逆性であることを示した。
【０７３４】
トリプシン、トロンビンまたはＰＡＲ−ＡＰｓによるＣａ２＋シグナル伝達および動的質量再分布はトロンビンがＰＡＲ１シグナル伝達を媒介することを示唆した、そして、トリプシンはＡ４３１細胞のＰＡＲ１およびＰＡＲ２を活性化する。
ＰＡＲ１およびＰＡＲ２が異なる機構でおそらく細胞骨格構造の再構成を導く両方ともの活性化。
Ｇｑ、そして、Ｃａ２＋に依存する機構Ｇ１２を含んでいる他のシグナル伝達経路／１３がＰＡＲ１によって媒介された再配列に貢献するかもしれないと共に、ＰＡＲ２によって媒介された細胞骨格再配列に割り当てる。
さらに、細胞表面でのコレステロールは、Ａ４３１のＰＡＲシグナル伝達を管理することで重要な役割を演ずる。
これらの所見は、ＰＡＲシグナル伝達が腫瘍浸潤および転移にとって重要かもしれないことを示唆する。
現在の研究は、強く細胞シグナル伝達を解読する際のＲＷＧバイオセンサおよびそのネット相互作用の大きいポテンシャルを増やす。
（１０．例１０−活性酸素種シグナル伝達および細胞レドックス状態の研究）
【０７３５】
ＲＯＳは、受容体から細胞核まで多数レベルで多数のシグナル伝達経路を管理する。
より透明でないにもかかわらず、細胞の標的は同定されて、過去の１０位を通じて広がった。
受容体キナーゼおよびホスファターゼは、酸性の応力の標的であってもよい。
生長因子受容体は、非常に自動的にリン酸化する。にリガンド起因性二量体化またはオリゴマー形成によって共通に最も活性その細胞質のキナーゼドメイン。
紫外線に応答する受容体のリガンドから独立した菌株群形成および活性化はまた、かなり示された、そして、この効果はＲＯＳによって媒介されたように見える。
外部性Ｈ２Ｏ２（通常ミリモル範囲の）は、ＰＤＧＦ−およびＥＧＦ受容体のＹリン酸化および活性化を誘発することを示した。
ＥＧＦ受容体のＬｙｓｏｐｈａｔｉｄｉｃな酸の起因性トランスアクチベーションは、ＲＯＳの中間の発生によって媒介されたように見える。
大部分の成育因子およびサイトカインが形質膜で、又はその近くで、ＲＯＳを生成するように見えるので、リン脂質メタボライトはレドックスシグナル伝達のための潜在的に重要な標的である。
たとえば、ジアシルグリセロールの酸化タイプは、ＰＫＣを活性化する際に、その未酸化されたフォームより効果的だった。
加えて、ＰＫＣ活性化およびタンパク質Ｙリン酸化は、血管内皮細胞および繊維芽細胞のＨ２Ｏ２−起因性ＰＬＤ活性化のために必要に見える。
Ｓｒｃファミリ（Ｓｒｃキナーゼ）およびヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）ファミリに帰属している非ＲＴＫｓは、また、少なくとも、外因的な加算オキシダントのための標的である。
【０７３６】
この研究において、全ての光学応答は、波長測定システムによってモニタされた。
ＲＷＧバイオセンサは、バイオアッセ適用法のための三主成分からなる：
ＥｐｉｃＴＭセンサマイクロプレート、ＲＷＧ検出器および液状の取り扱い系。
センサマイクロプレートは所定のＳＢＳフォーマット（例えば９６ウェルまたは３８４−ウェル）のプラスチックの清浄なプレートに付けられるガラス製の床プレートからなる。そして、それは高いスループットスクリーニングを可能にする。
９６ウェル  ＥｐｉｃＴＭセンサマイクロプレートにおいて、各ウェルは、ほぼ３×３ｍｍ２の１つのＲＷＧセンサを含む。
ＲＷＧセンサは、ガラス基質を示しているグレーティング上の誘電材料の薄膜からなる。
【０７３７】
検出器系が集中する波長測定は、光ファイバを統合した。
広帯域光源（マイクロプレートの底による名目上、正常な発生率で、光ファイバおよびコリメーティングレンズで発生する）は、グレーティング界面の小さい領域を照らすために用いる。
反射光を記録するための検出光ファイバは、照明光ファイバとバンドルされる。
一連の８つの照明／検出ヘッドは線形の傾向に配置される。その結果、反射スペクトルはすぐにマイクロプレートの同じカラム内で、全ての８つのウェルから集められる。
空間的に制御された運動を有する、全部のプレートが照明／検出ヘッド全体の各々のセンサがアドレス指定を行われた多数の時間および各々のカラムでありえるために移向であること順番にアドレス指定を行う。
反射光の一連のスペクトルが、集められて、解析のために使われる。
この検出系が刺激作用に応答して細胞応答によって反射光起因性の波長シフトを測定するので、このアプローチは波長測定システムとみなせる。
【０７３８】
角度測定システムによってモニタされるように、図８０は１ｍＭのＨ２Ｏ２に応答して静止Ａ４３１細胞のマルチ光出力パラメータを示した。
Ｈ２Ｏ２による刺激作用は、センサ（図８４Ａ）の検知体積内の有意な質量再分布をトリガした。
ＤＭＲシグナルは、２つの主要な現象：三位相（増加する質量シグナル（Ｐ−ＤＭＲ）、遷移位相および減少された質量シグナル（Ｎ−ＤＭＲ））からなる初期のピーク；そして、最終的にプラトーを導く持続性で増加する質量シグナルからなる。
一方、Ｈ２Ｏ２による刺激作用は僅かにまた、ＴＭ０モードの共鳴ピークのＰＷＨＭを増やした。そして、細胞層の底一部内で質量分布の増加する不均質性を示した。
ＰＷＨＭと整合して、統合した領域がほとんど定常的なままであると共に、ピーク強度は、また、刺激作用の後、時間を通じて僅かに減少した。
【０７３９】
図８１は、波長測定システムで波長のシフトによってモニタされるように、異なる供与量でＨ２Ｏ２に応答した静止Ａ４３１細胞の動的質量再分布シグナルを示した。
図８１ａおよびｂに示すように、Ｈ２Ｏ２刺激作用の光学シグニチャは、強くその供与量に依存する。
Ｈ２Ｏ２の濃度が約８ｍＭでまたはその未満にあるときに、Ｈ２Ｏ２の細胞応答は２つの主要な現象（初期ピーク、および持続性増加質量シグナル）からなる典型的曲線を有する。
しかし、Ｈ２Ｏ２の濃度が１６ｍＭでまたはそれより上にあるときに、Ｈ２Ｏ２の細胞応答は異なる特性（いくぶん安定した遷移状態に続いた初期増加質量シグナル、および最終的に減少された質量シグナル）を有する。
後者の減少質量シグナルは生／死細胞染色（示されないデータ）を有する目視観測と、かなり整合している。そして、それはＨ２Ｏ２の高用量によって処理される細胞がアポトーシス（細胞の質量減失を導くプロセス）を経ることを示した。
【０７４０】
図８２は、細胞応答上のキナーゼモジュレータが１ｍＭのＨ２Ｏ２によって媒介することをｓｒｃの効果に明らかにした。
結果はキナーゼ阻害物質（ＰＰ１およびＰＰ２）がかなりＨ２Ｏ２によって媒介された細胞応答を抑制することをその２つの特定のｓｒｃに明らかにしたのに、陰性対照（ＰＰ３）は応答に影響を及ぼさなかった。
これらは、キナーゼがＨ２Ｏ２によって媒介されたＤＭＲシグナルに関係させるそのＳｒｃを提案した；
そして、光学バイオセンサは、使ってＲＯＳシグナル伝達に影響を及ぼすモジュレータをスクリーニングする。
【０７４１】
図８３は、Ｈ２Ｏ２によって媒介されたＤＭＲシグナル上の静止Ａ４３１細胞の異なるレドックス状態の効果を示した。
異なるレドックス状態は、時間を培養している異なると協力して細胞の異なる初期の接種数を使用することによって達成された。
低いレドックス細胞は、３日の間のウェルにつき７５，０００の細胞を培養することによって達成された０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を有する標準状態およびその後夜通しのスターベーションの下で培養する高いレドックス細胞が１０日の間のウェルにつき１０，０００の細胞を培養することによって達成される、０％のＦＢＳを有する標準状態およびその後夜通しのスターベーションの下で培養する。
細胞密度は同様（約９５％）であった。そして、そのことは光学顕微鏡法によって検査した。
図８３に示すように、細胞の２つの異なるレドックス状態は、異なって４ｍＭのＨ２Ｏ２に応答した。
Ｈ２Ｏ２は細胞の低いレドックス状態のための典型的ＤＭＲシグナルの引き金を引いた。そして、それは細胞の底一部内で最終的に質量を増やした。
しかし、同じ濃度でのＨ２Ｏ２は、アポトーシス（すなわち、最終的に、細胞内で質量において消失して）を経ている細胞の形質を有する細胞の高いレドックス状態のＤＭＲシグナルを媒介した。
これらの結果は、光学バイオセンサが使って培養細胞の、そして、細胞のレドックス状態に影響を及ぼすスクリーニングモジュレータに対するレドックス状態を差別化することを示した。
（１１．例１１−細胞アッセイのための多数の光学出力パラメータの）
【０７４２】
多数の光学出力パラメータはリアルタイムにおいて、そして、よく周到ないくつかの細胞応答およびプロセスのための平行において記録された。そして、ＥＧＦＲまたはブラジキニンＢ２受容体による細胞のシグナル伝達と同様に接着および拡散移動（離断）を含んだ。
これらの光学読み出しは、シフトを入射角（共鳴ピークの形を定義している三パラメータと同様に）に含む：
強度、ＰＷＨＭおよび領域。
その高感度および情報内容のため、ＴＭ０モードだけが全てのデータ収集および解析のために使われた。
（ａ）  ＴＭ０ピークの形）
【０７４３】
図３１に示すように、培養されたＣＨＯ細胞のためのＴＭ０ピークの形および位置が、細胞密集度に依存しているとわかった。
細胞密集度が増加するように、共鳴ピークは高量入射角の方向へ移る。
ＰＷＨＭ値（ピーク形を定義しているパラメータ）も、細胞密集度（図３１ｂ）上の依存を呈した。
ＰＷＨＭ値は、約５０％の細胞密集度で、その最高に到達した；
最大ＰＷＨＭは、約３５％、７５％より上の高比重を有する細胞単層の非共存または存在のそれらより高かった。
細胞が充分に起こったあと、これらのデータが得られた点に注意することは約２ｄａｙｓの後、細胞増殖培養液で培養することを広げたことは、価値がある。
【０７４４】
被着ＣＨＯ細胞のＴＭ０ピークが、また、ＤＭＳＯ（高用量が使われる毒性化合物）に影響されるとわかった。
図３２ａに示すように、増殖している細胞（１０％のＦＢＳにおいて得られる）が１８％のＤＭＳＯで処理されるときに、ＴＭ０ピークの形および位置は動的変化を呈した。
ＤＭＳＯを有する既処理の後、時間の全体にわたるピーク増加の強度および領域は、モニタした（約３時間）。
しかし、ピーク位置（すなわち入射角）は動態力学特性を示した：
入射角は、まず最初に質量（例えば２５分）の増加およびそれから質量（例えば４０および１２０分）の減少へ移る。
同様に、ピーク形はまず最初に広げられて、複雑な微細構造（例えば２５分）を示して、結局狭く（例えば４０および１２０分）なった。
複雑なピーク構造の外観がセンサ界面で、又はその近くで、質量の大規模な不規則な不均質性の含意として使われた。そして、ＤＭＳＯを有する特定の期間後療法の間、バイオセンサが増加する界面不均質性を検出することをこのように示した。
ＣＨＯ細胞（ＤＭＳＯ処理の後、２５分得られる）の生活／死んでいる染色パターンは、細胞の個体群が混ぜられることを示した：
ＣＨＯ細胞がＤＭＳＯ処理に異質に答辞のようなことを意味して、成育可能で、死んでいて影響を受ける細胞（図３２ｂ）。
これらの結果は、ＴＭ０ピークの形が検知体積内で異質の横方向質量分布を検査するために役立つことを示唆した。
（（ｂ）  細胞接着および拡散移動）
【０７４５】
界面での細胞の接着および拡散移動は、光学バイオセンサ（例えばＳＰＲおよびＲＷＧ）と同様に光学映像技術を使用して、かなり研究された。
細胞は、初期接触による界面または細胞が一般にそれらが懸濁において所有した円脚の形を保持する付着と相互に作用し始める。
その後、取付けられた細胞は、拡散移動（細胞が界面と接触してそれらの領域を増やすプロセス）として公知の形態学的変化を経る。
付着および拡散移動は、界面の性質および細胞が懸濁される培地に依存している。
細胞接着および拡散移動は明らかに検知体積内の垂直で水平の質量再分布を導くので、我々は最初にビンクリスチンの非共存および存在の５％のＦＢＳのＡ４３１細胞の接着および拡散移動を特徴づけた。
ビンクリスチンは、チュービュリンに結合することによってマイクロチューブル会合体を抑制する植物アルカロイド（ａｌｋａｏｉｄ）である。
【０７４６】
我々は、室温（２５℃）で非共存の５％のＦＢＳおよびビンクリスチンの存在のＡ４３１細胞の接着および拡散移動を研究した。
結果は、ビンクリスチンの非存在下で、入射角のシフトが三大前提位相（示されないデータ）を呈したことを示す。
細胞溶液の添加に続くことは即時で速い増加するシグナルで、おそらく三つの現象から生じる：
細胞溶液、センサ界面の上の血清タンパクの固定化および界面を有する細胞の細胞および次の接触の沈降の添加からの増加するバルク屈折率。
その後、持続性の増加するシグナルは起こった。そして、細胞拡散移動の遅いプロセスを示した。
最終的に、飽和したレベルに、達した。
飽和したレベル（１６．８±０．６ユニット、ｎ＝３）は、同様密度（２２．６±１．０ユニット、ｎ＝３）で、充分に広げられた細胞のそれら未満だった。
一方、正規化されたＰＷＨＭ値が、また、異なる特性（示されないデータ）を有する動的であるとわかった。
細胞溶液が加えられたあと、ＰＷＨＭ値は増加し始めた。
約２０分後に、ＰＷＨＭは約２時間内でその起源のレベルへ減衰し始めた。そして、それがプラトーに到達するまで、ゆっくり持続性の増加が続いた。
終末点でのＰＷＨＭは約２５％、開始点でのそれより高かった。そして、それは細胞が、周囲条件の下のバイオセンサを有する２０時間の分析の後、さえ、充分に広げられる否定であることを示した。
これは、光学顕微鏡法像（示されないデータ）によって確かめられた。
これらの結果は、室温で、Ａ４３１細胞が否定のようであることは（ｉ）接着の最適の程度に到達することが可能であるように提案した；
細胞は、多数ステップによる界面と相互に作用する（ｉｉ）と、各々がそれ自身の特徴を有する；
そして、拡散移動ステップは検知体積内で明らかに質量を増やす（ｉｉｉ）。そして、それは界面を有する細胞の増加する接触を意味する。
【０７４７】
１００ｎＭビンクリスチンの存在は、かなり光学シグニチャを変えた。
ビンクリスチンの存在は、初期で全体の応答だけを抑制しなくて、また、細胞拡散移動（示されないデータ）の動態を減らした。
ビンクリスチンがある場合には、入射角の全体の変化は、約２０％、ビンクリスチンの非存在下でそれより少なかった。
面白いことに、ビンクリスチンもＰＷＨＭ値（示されないデータ）の動的な特徴を変えた。
ビンクリスチンの非存在下でとは異なり、それがプラトーに到達するまで、ＰＷＨＭはまず最初に減少して、約３時間低いままで、その後増加した。そして、ビンクリスチンが主に細胞接着および拡散移動プロセスの間、初期のステップに影響を及ぼすことを示した。
これらの結果は、バイオセンサが洞察を界面を有する細胞の相互作用のために用意するために有能なだけではないことを示唆したまた、細胞接着および拡散移動プロセスを変えるそれらの能力のための化合物を差別化するために、しかし。
（（ｃ）ＥＧＦＲシグナル伝達）
【０７４８】
上記のように、豊かな情報は、様々な周知のモジュレータによってＥＧＦ−起因性ＤＭＲシグナルの転形の解析から得られた。
結果は、ＥＧＦによって媒介された静止Ａ４３１細胞のＤＭＲがＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性、アクチン重合およびダイナミン活性を必要とすることを示して、主にＭＥＫで進む。
平行の多パラメタ計測を使用しているＥＧＦによって媒介されたＥＧＦＲシグナル伝達の光学シグニチャは、特徴づけられた。
角のシフトによって明らかにされるように、図８４ａ（細胞応答）に示すように、ＥＧＦの高用量による起因性は特に面白かった。
３２ｎＭより上にＥＧＦの高用量によって刺激されるときに、ＤＭＲシグナルの新しい位相は静止Ａ４３１細胞のために観察された。
減少されたシグナルを有する短い遷移位相および長い減衰Ｎ−ＤＭＲが続く増加するシグナルを有する初期の速いＰ−ＤＭＲの他に、細胞の前の増加するシグナルを有するＲＰ−ＤＭＲ位相が最終的に同様レベルをそれらの起因性に示すプラトーに渡す不完全な回収が、１６ｎＭか３２ｎＭある。
１つの可能性は、細胞が経たＥＧＦの高用量によって、後に刺激されるそれである離断プロセス（不完全な再付着プロセスが続く）。
【０７４９】
ＥＧＦがＥＧＦ−起因性細胞移動にとって重要であるＰＩ３Ｋのような特定の細胞の標的の不斉横方向再分布を媒介するので、共鳴ピークの形を定義しているパラメータは平行にモニタされた。
しかし、パラメータが定常的なままのようである全ての三は、異なる供与量でＥＧＦによって刺激となった（図８５ｂ；
ＰＷＨＭだけは、示された）（ＥＧＦ刺激作用が細胞の底一部内で横方向質量分布の不均質性を増加しないことを示すこと）。
これは、ＴＲ−ファロイジン（図８５ｃおよびｄ）を有するアクチンフィラメントの染色パターンに矛盾している。
これらの像は、ＥＧＦが横方向大きさのアクチンフィラメントの有意な再配列を媒介することを示した。
外側塊再分布のいかなる不均質性も検出することができないことは、不斉再分布が主に検知体積の外側で起こるかもしれないことを示唆されるＥＧＦによって引き金を引いた。
（ｂ）  ブラジキニンＢ２受容体シグナル伝達）
【０７５０】
ブラジキニンＢ２受容体は、ブラジキニン（ＢＫ）の大部分の生理学的で病態生理学的作用のためのＧタンパク質共役型受容体および会計である。
ブラジキニン（ＢＫ）は、分裂促進で反ミトーゲン効果を含んでいる多種多様な生理学的で病態生理学的応答のメディエータとして作用するように見える。
否定Ｂ１受容体以外の、Ａ４３１細胞は、内生的ににブラジキニンＢ２受容体を発現する。
ＢＫ刺激作用に応答する静止Ａ４３１細胞の光学シグニチャが特徴づけられたことをここに明らかにする、そして、Ａ４３１細胞が動的質量再分布を有するＢＫ刺激作用に応答することを分かった；
その動態、振幅および持続期間は、細胞培養条件、ＢＫの服用および細胞のコンテクストに依存する。
図８６において示したように、静止Ａ４３１細胞のＢＫ刺激作用はＰＷＨＭ（起源のレベルへ遅い減衰が続く）の速い増加に結果としてなる。その一方で、ピーク強度はＰＷＨＭおよび角のシフトのそれらに対する反形であるダイナミック応答を引き起こした。
さらに、両方のパラメータの変化はまた、ＢＫ用量依存的である、そして、それらの動態および動態は類似を以前に報告されるＤＭＲシグナルに示した。
これらの結果はＥＧＦによって媒介された細胞応答と比較して、ＢＫ刺激作用が細胞の内容物のより有意な不斉再分布を導くことを示唆した。そして、順番に、それは細胞の底一部内で横方向質量分布の不均質性を増やす。
【０７５１】
概要において、ＲＷＧバイオセンサは、豊かな情報内容を生体細胞を調査するために提供した。
理論的解析が、測定される光学シグニチャが統合した応答であることを明らかにして、標識を必要とせずにそれらの天然型生育環境の細胞を検査するための読み出しのために使われる。
いくつかの細胞応答およびプロセスが接着および拡散移動を含んで、ＥＧＦＲおよびブラジキニンＢ２受容体による離断および細胞シグナル伝達は、組織的に調査された。
多数の光学出力パラメータの平行および動態力学的計測は、細胞の底部分内で垂直で横方向大きさの刺激作用によって媒介された動的質量再分布のためのユニークシグニチャの同定を導いた。
細胞接着および拡散移動が、多数ステップを含むとわかった；
ビンクリスチンが、その初期のステップを妨げることによって細胞接着および拡散移動を調整することが可能であるとわかった。
予想外に、細胞の底部分の範囲内の最少で、ＥＧＦは明らかな不斉外側塊再分布の引き金を引かなかった。
これは、細胞の内容物（細胞移動のための重要なプロセス）のＥＧＦ−起因性非対称分布が細胞の底部分の細胞の最上部で起こることを示唆した。
しかし、バイオセンサ（例えば、それは、導波路構成を逆転させる）の侵入深度を増やすことは、かかる横方向再分布を検出することが可能でなければならない。
もかかわらず、多パラメタモニタリングは、刺激作用によって誘導した細胞現象をはっきりさせる為により多くの次元の大きさを加えなければならない。
【０７５２】
面白いことに、ブラジキニンによるＡ４３１起因性のＢ２受容体の活性化は、垂直線および外側塊再分布の引き金を引いた。
（１２．例１２−終末点計測を使用している内存性ＧＰＣＲに対する化合物の高いスループットスクリーニング）
【０７５３】
変調する化合物または細胞または細胞増殖のシグナル伝達経路効果一つ以上の高いスループットスクリーニングまたは細胞死に適している方法が、開示される。
バイオセンサ出力データがここに議論されるように、多くの異なるパラメータを使用して査定され得るという条件で、これらの高スループット方法は基礎を形成される。
そして、ここに議論されるように、死亡または増殖のような細胞または特定の細胞現象内のその特定の細胞または受容体またはシグナル伝達経路の転形は特定のシグニチャを有する。
ここに議論されるように、このシグニチャは一つ以上のバイオセンサ出力パラメータから成り立つ。
高スループット方法のため重要なことは、バイオセンサ出力パラメータデータ収集の期間中の時間点であり、すなわち、方法の期間中の時間点でバイオセンサ出力パラメータデータが細胞の状態の症候となり得、すなわち、シグナル伝達経路が活性化または不活性化され、または、細胞の死または細胞の増殖を示したので重要である。
シグニチャを定義するために用いるバイオセンサ出力パラメータの組み合わせがある所で、この点が、あることが可能である。
【０７５４】
リガンド起因性ＤＭＲシグナルは、持続性の期間（約数十分）に概して進む。
このように、動態力学的計測は、適用法をスクリーニングしている高量スループット（ＨＴ）のために快く従うようではない。
しかし、特定のリガンドによるＤＭＲシグナル起因性の全体的な動態およびよく特徴づけられた動態に基づく、直ちにＨＴＳ適用法のための終末点計測を開発する。
２つのＧＰＣＲ（Ａ４３１細胞中のブラジキニンＢ２受容体、およびＣＨＯ細胞中のプロテアーゼ活性化受容体亜タイプ１（ＰＡＲ１））の光学シグニチャに基づいて、２つの終末点計測は高いスループットスクリーニング法を開発するために使用された。
【０７５５】
図８６は、化合物の関数として、アッセイ中の２つの時間点間の波長シフトを示した。
２つの時間点は、化合物添加（ベースライン点）前の右側と、化合物添加（測定された点）の後の５分であった。
２つの終末点間の差分は、ブラジキニン（ブラジキニンＢ２受容体作用薬）によって媒介されたＰ−ＤＭＲ現象の総振幅を反映する。
Ｂ２受容体は、Ａ４３１細胞において内生的に発現される。
細胞は、ブラジキニン刺激の前の静止状態になる。
この例では、３８４ウェルＣｏｒｉｎｇＥｐｉｃバイオセンサプレートが、使われた。
各ウェルは、約９０％の密集度でＡ４３１細胞を含む。
ウェルの半分は１００ｎＭでブラジキニンによって処理された一方、ウェルの他半分は緩衝液ＨＢＳＳだけで処理された。
結果は、細胞がＨＢＳＳ緩衝液によって扱ったところが非常に小さい振幅で応ずるだけであることを約８００ｐｍの波長の全体の変化の１００ｎＭブラジキニン結果によって処理されるその細胞に明らかにした（約−１０ｐｍ）。
アッセイ窓は全く大きい（約８１０ｐｍ）、そして、アッセイ変数（varability）は小さい（ブラジキニンで処理される細胞のためのＣＶの約６％）。
【０７５６】
図８７は、化合物の関数として、アッセイ中の２つの時間点間の波長シフトを示した。
２つの時間点は、化合物添加（ベースライン点）前の右側と、化合物添加（測定された点）の後の５分であった。
２つの終末点間の差分は、トロンビン（ＰＡＲ１受容体作用薬）によって媒介されたＰ−ＤＭＲ現象の総振幅を反映する。
ここで、異なる細胞は整列する−ＣＨＯ細胞が使われた。
ＰＡＲ１受容体は、ＣＨＯ細胞において内生的に発現される。
細胞は、トロンビン促進の前に細胞を４時間のＤＭＥＭ培地で培養することによる部分的に静止状態になる。
この例では、３８４ウェルＣｏｒｉｎｇＥｐｉｃバイオセンサプレートが、使われた。
各ウェルは、約９０％の密集度でＣＨＯ細胞を含む。
ウェルの半分は４０ユニット／ｍｌでトロンビンによって処理された一方、ウェルの他半分は緩衝液ＨＢＳＳだけで処理された。
Ａ４３１のＢ２およびＣＨＯ細胞のＰＡＲ１の作動薬−起因性活性化がＧｑシグナル伝達を導くので、このアッセイ結果の有意差はＧｑ−タイプ光学シグニチャが両方の細胞株において少なくとも一般的であるということである。
類似した終末点計測を使用することによって、異なる細胞の異なる内因性の標的に対して、ＧＰＣＲモジュレータをスクリーニングすることが可能である。
【０７５７】
図８８は、トロンビン濃度の関数として、アッセイ中の２つの時間点間の波長シフトを示した。
２つの時間点は、化合物添加（ベースライン点）前の右側と、化合物添加（測定された点）の後の５分であった。
ＣＨＯ細胞は、異なる供与量でトロンビンで処理された。
結果は終末点計測を使用することによって、細胞が用量依存的にトロンビン促進に応答したことを示した。そして、１２．５ユニット／ｍｌの明らかなＥＣ５０を導いた。
このアッセイ結果が終末点計測がＧＰＣＲモジュレータの高いスループットスクリーニングを可能にするだけでなくて、孤立性の細胞応答を分析する実在の生理学的な条件
このアッセイ結果は、終末点計測がＧＰＣＲモジュレータの高いスループットスクリーニングを可能にするだけでなくて、実際の生理学的条件の内因性ＧＰＣＲのためのＧＰＣＲ作動薬の活性現象および効能の決定を可能することを示唆した。
離散的細胞応答または標識化された標的を分析する従来法と異なって、バイオセンサベースの細胞アッセイは、ポテンシャルリガンドの大規模で多数の標的に基づく選抜に適用できる。
内因性ＧＰＣＲのためのＧＰＣＲ作動薬の活性現象および効能の決定を可能にして、一旦ユニークなＤＭＲシグニチャが同定されて、特性状態で細胞株の標的の特定のクラスによる特定のシグナル伝達経路に結合されると、化合物のライブラリがスクリーニングされて、化合物は、それらの光学シグニチャに基づく異なるカテゴリに分類され得る。
かかるスクリーニングは、化合物分類法に役立つ。
【０７５８】
あるいは、Ｇｑ−共役型受容体のような内存性受容体の同じクラスに対する作動薬が、光学シグニチャの所定のタイプに結果としてなっている化合物からあることがありえた。
受容体−特性作動薬−起因性ＤＭＲシグナル上のかかる化合物を有する刺激作用に先行する効果が、検査されることができて、標的特異性の指示として使われる。
かかるスクリーニングは、標的に基づくスクリーニングに役立つ。
【０７５９】
適当な導出構造の同定は、薬剤発見におけるキーステップである。
一旦導出構造が選ばれると、生体細胞上のそれの作用は開示された光学バイオセンサを使用して組織的に研究され得る。
たとえば、シグナル伝達経路の一組の標的の周知のモジュレータのパネルは使って導出構造−起因性ＤＭＲシグナル上の転形プロフィールを研究する。そして、特定の標的またはシグナル伝達経路にこのように導出構造の作用を結合する。
一旦リンケージが決められると、バイオセンサはそれから導出構造を最適化するために用いることが可能である。
標的による細胞シグナル伝達が複合しているので、それらが選択的に受容体または特定の経路の特定のオリゴマー形成状態を調整するだけであるように、導出構造が更に最適化されることができて、または、細胞の状態。
【図面の簡単な説明】
【０７６０】
【図１】生体細胞がセンサ界面上の被着した後、光導波路グレーティングマイクロプレートの特定検出構成の例を示す画像である。
【図２】細胞付着層内で刺激作用起因性指向性質量再分布に基づく細胞アッセイのための光学バイオセンサを示す模式線図である。
【図３】刺激作用によって媒介された細胞内容物の非対称に横方向再分布の関数としての位相変化を示す模式線図である。
【図４】センサ界面から離れてた距離の関数として、センサの導波モードのエバネッセント波の強度を示すグラフである。
【図５】ＯＷＧセンサの他の対称性を示す模式線図である。
【図６】細胞アッセイがバイオセンサを使用して基礎を形成するパラメータを示すグラフ、およびバイオセンサの典型的ＴＭ０共鳴性バンド像を示す画像である。
【図７】ＥＧＦによって誘導された静止Ａ４３１細胞の供与量に依存している応答を示すグラフである。
【図８】指向性質量再分布に基づいた特定の標的またはシグナル伝達経路に対して化合物をスクリーニングおよび分級するのための方法を示す流れ図である。
【図９】さまざまな典型的成分を有する生物学的な細胞の模式図である。
【図１０】ここに開示される方法とシステムに従って使用されている光学ＬＩＤシステムが生体細胞内で質量再分布（例えばＧＰＣＲ転位）をモニタすることを示している線図である。
【図１１】３つの異なる侵入深さを有する３つのセンサタイプのためのセンサ界面から離れた生物学的標的の距離の関数としてのエバネセント場を示すグラフである。
【図１２】指向性質量再分布に基づく標的の同定および価値判断の方法を示す流れ図である。
【図１３】指向性質量再分布に基づく標的の同定および価値判断のための代替方式を示す流れ図である
【図１４】図１３において示した代替方式で使われる光学ＬＩＤバイオセンサマイクロプレートを示す正面図である。
【図１５】指向性質量再分布に基づく標的の同定および価値判断のための代替方式を示す流れ図である。
【図１６】例えば図１０に示した光学ＬＩＤシステムからの時間依存している光学応答出力を分析することによって同定され得る生体細胞内のＧＰＣＲ転位のような刺激性事象によって、細胞転形に関連した異なる状態を示すグラフである。
【図１７】刺激性事象のリアルタイムのモニタリングのための方法の基本的なステップを例示する流れ図である。
【図１８】指向性質量再分布に基づく標的の同定の例を示すグラフである。
【図１９】ここに開示される光学ＬＩＤバイオセンサを使用して、生体細胞内で質量再分布に基づく標的（例えばＧＰＣＲ）に対する刺激性事象（例えば作動薬現象）をスクリーニングする方法の基本的なステップを例示している流れ図である。
【図２０】ここに開示される光学ＬＩＤバイオセンサを使用して、生体細胞内で質量再分布に基づく受容体のような細胞の標的（例えばＧＰＣＲ）に対する刺激性事象（例えば作動薬現象）をスクリーニングする方法の基本的なステップを例示している流れ図である。
【図２１】ここに開示される方法のいずれにおいても使われる自己参照している光学ＬＩＤバイオセンサを作成する方法の基本的ステップを例示している流れ図である。
【図２２】同じセンサ内で空間的に分離された領域で２種類の細胞被着のホストをつとめ、そして、ここに開示される方法のいずれにおいても使われる自己参照している光学ＬＩＤバイオセンサをつくるための他の方法の基本的なステップを例示している流れ図である。
【図２３】刺激性事象をモニタするための方法の基本的なステップを例示している流れ図である。
【図２４】ここに開示される光学ＬＩＤバイオセンサを使用している質量再分布に基づく生体細胞の単一のタイプ内の多数ＧＰＣＲに対するポテンシャル作動薬または特定の受容体のための例えば拮抗薬のような、化合物のパネルをスクリーニングする方法の基本的なステップを例示している流れ図である。
【図２５】細胞の細胞骨格構造を妨げるモジュレータをスクリーニングする方法を示す流れ図である。
【図２６】コレステロール流出を妨げるモジュレータをスクリーニングする方法の一例を示す流れ図ある。
【図２７】体内の脂質シグナル伝達および運搬を示している略図である。
【図２８】静止Ａ４３１細胞の付着層またはＬＩＤセンサ上のヒーラー細胞上のメチル−βシクロデキストリン（ｍβＣＤ）の時間に依存する応答、および、静止Ａ４３１細胞のｍβＣＤ−誘導応答上の化合物（２０ｎＭのＥＧＦまたは１０００ｎＭのＨ７）の効果を示すグラフである。
【図２９】導波路ベースバイオセンサ上のＣＨＯ細胞付着層のＤＭＳＯ−起因性用量応答および時間依存応答に示すグラフである。
【図３０】導波路型バイオセンサ上被着のＡ４３１細胞層剤のＤＭＳＯ−起因性用量応答および時間依存応答に示すグラフである。
【図３１】Ｎｂ２Ｏ５ベースの光導波路バイオセンサ上で培養される異なる密集度（３０％、５０％および９０％）を有するＣＨＯ細胞層に対する入射角の関数として、内結合された光の強度を示すグラフである。
【図３２】導波路グレーティングセンサ上で培養された２つの異なる密集度、５％および７５％を有するＣＨＯ細胞の層のＴＭ０モード共鳴ピークを示すグラフである。
【図３３】全部のセンサのＴＭ０モード共振バンド像を示す画像である。
【図３４】全部のセンサのＴＭ０モード共振バンド像を示す画像である。
【図３５】それぞれ、導波路グレーティングセンサ領域上およびセンサ領域外側で培養されたＣＨＯ細胞の位相造影像を示す画像である。
【図３６】３６時間のＮｂ２Ｏ５ベースの光導波路バイオセンサ上で培養された後、ＣＨＯ細胞への入射角の関数として、ＴＭ０モードの結合された光の強度を示すグラフ、および、ＣＨＯ細胞の初期の接種数の関数として、ＴＭ０モードを使用して算出されプロットされた最大半減（ＰＷＨＭ）でのピーク幅を示すグラフである。
【図３７】導波路グレーティングセンサ上の異なる初期の接種数でのＣＨＯ細胞増殖のモニタリングを示す画像である。
【図３８】シグナル伝達経路上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を示す線図である。
【図３９】静止性ＣＨＯ細胞（ＣＨＯとして指示した）と比較して、増殖するＥＧＦ−誘導応答および静止Ａ４３１細胞のために観察されるＰ−ＤＭＲてＮ−ＤＭＲ現象のネット応答を示すグラフである。
【図４０】１６ｎＭのＥＧＦの添加の後、時間依存応答上の異なる化合物での餓死Ａ４３１細胞の層の３０分の前処理の効果を示すグラフである。
【図４１】導波路バイオセンサ上で培養され、１６ｎＭのＥＧＦを有する刺激作用に応答した餓死Ａ４３１細胞の層のためのＰ−ＤＭＲおよびＮ−ＤＭＲシグナルのネット応答を示すグラフである。
【図４２】ＡＧ１４７８によって誘導された静止Ａ４３１細胞のＥＧＦ−誘導応答の供与量に依存している抑制を示すグラフである。
【図４３】静止Ａ４３１細胞のＥＧＦ−起因性ＤＭＲ応答上のＳｒｃキナーゼ阻害物質ＰＰ１の効果を示すグラフである。
【図４４】静止Ａ４３１細胞の３２ｎＭのＥＧＦ−誘導応答上のＲａｓ／ＭＡＰＫ経路モジュレータの効果を示すグラフである。
【図４５】静止Ａ４３１細胞の３２ｎＭのＥＧＦ−誘導応答上のタンパク質キナーゼ阻害物質の効果を示すグラフである。
【図４６】静止Ａ４３１細胞の３２ｎＭのＥＧＦ−誘導応答上の細胞骨格モジュレータの効果を示すグラフである。
【図４７】静止Ａ４３１細胞の３２ｎＭのＥＧＦ−誘導応答上のホスホジエステラーゼおよび他阻害物質の効果を示すグラフである。
【図４８】光学バイオセンサを使用して観察した静止Ａ４３１細胞のＥＧＦにより誘導された全体的なＤＭＲシグナルの２つの主な誘因を示す画像である。
【図４９】ＥＧＦ−起因性ＤＭＲシグナル−受容体エンドサイトーシスのための可能な機構の一例の略図を示す線図である。
【図５０】ＬＩＤセンサ界面の付着した、サポニンの添加の前後におけるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）の供与量依存応答を示すグラフである。
【図５１】異なる化合物での前処理および続くサポニン処理後のＣＨＯ細胞のリアルタイム応答を示すグラフである。
【図５２】化合物添加の前後におけるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の時間依存ＬＩＤ応答を示すグラフである。
【図５３】作動薬−起因性ＧＰＣＲ活性化による質量再分布の異なる動態を示すグラフである。
【図５４】図１６において強調されたステージ３の作動薬−起因性質量変化の化合物依存全体応答を示すグラフである。
【図５５】化合物添加の前後におけるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の時間依存ＬＩＤ応答を示すグラフである。
【図５６】化合物添加の前後における、過剰発現したラットムスカリン受容体亜タイプ１で遺伝子操作されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の時間依存ＬＩＤ応答を示すグラフである。
【図５７】２つの異なる細胞株のために図１６において強調されるステージ３の化合物依存合計応答を比較することを示すグラフである。
【図５８】オキソトレモリンＭ（１０μＭ）の添加の前後で、２種類の細胞（ＣＨＯおよびＭ１ＣＨＯ）の時間依存ＬＩＤ応答を示すグラフである。
【図５９】クロニジン（１０μＭ）の添加の前後で、２種類の細胞（ＣＨＯおよびＭ１ＣＨＯ）の時間依存ＬＩＤ応答を示すグラフである。
【図６０】ＮＥＣＡ（１０μＭ）の添加の前後で、２種類の細胞（ＣＨＯおよびＭ１ＣＨＯ）の時間に依存するＬＩＤ応答を示すグラフである。
【図６１】静止Ａ４３１細胞の付着層内でのＧＰＣＲ作動薬−起因性指向性質量再分布を示すグラフである。
【図６２】ＥＧＦ−起因性ＥＧＦＲ活性化の機構およびＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）作動薬起因性ＥＧＦＲトランスアクチベーションの１つの可能な機構を示す模式図グラフである。
【図６３】ＧＰＣＲ作動薬によって誘導された光学シグニチャの４つのクラスを示すグラフである。
【図６４】アデニル酸シクラーゼ活性化物質フォルスコリンおよびＮＫＨ４４７によって誘導された静止Ａ４３１細胞の光学シグニチャを示すグラフである。
【図６５】フォルスコリンを有する静止Ａ４３１細胞の前処理を示し、ＮＫＨ４４７は２５ｎＭ  エピネフリンによって媒介されたＤＭＲ応答完全にを破壊したグラフである。
【図６６】Ｇｑ−タイプシグニチャの引き起こす作動薬の効能を示すグラフである。
【図６７】Ｇｓ−タイプシグニチャの引き起こす作動薬の効能を示すグラフである。
【図６８】ａ−ＭＳＨ（ａ−メラノサイト刺激ホルモン）によって誘導された静止Ａ４３１細胞の用量依存動態力学的応答および飽和曲線を示すグラフである。
【図６９】低薬量（ａ）から高用量（ｂ）までのＬＰＡ（オレオイル−Ｌ−リゾホスファチジン酸）によって誘導された光学シグニチャのスイッチングを示すグラフである。
【図７０】低薬量（ａ）から高用量（ｂ）までのＨＴＭＴによって誘導された光学シグニチャのスイッチングを示すグラフである。
【図７１】Ｆｌｕｏ−３によって得られたＣａ２＋の蛍光強度によって測られた細胞内Ｃａ２＋レベルにおける最大パーセンテージ増加に示し、ＰＡＲ作動薬の関数として、プロットされたグラフである。
【図７２】１００ｎＭトリプシン（ａ）および４０ユニット／ｍｌトロンビン（ｂ）によって媒介されたＤＭＲシグナル上の細胞骨格モジュレータの効果を示すグラフである。
【図７３】２００ｎＭトリプシン（ａ）および４０ユニット／ｍｌトロンビン（ｂ）によって媒介されたＤＭＲシグナル上のキナーゼ阻害物質の効果を示すグラフである。
【図７４】トロンビン（４０ユニット／ｍｌ）、ＳＦＦＬＲ−アミド（２０μＭ）およびＳＬＩＧＫＶ−アミド（２０μＭ）によって媒介されたＤＭＲ応答上のＹＦＦＬＮＲＰの効果を示し、ＹＦＦＬＮＲＰ濃度の関数としてのＰ−ＤＭＲ現象の振幅としてプロットされたグラフである。
【図７５】ＰＡＲｓによって媒介されたＣａ２＋シグナル伝達の交差脱感作を示すグラフである。
【図７６】ＰＡＲによって媒介された動的質量再分布シグナルの交差脱感作を示すグラフである。
【図７７】４０ユニット／ｍｌトロンビン（ａ）および２００ｎＭトリプシン（ｂ）によって媒介されたＰ−およびＮ−ＤＭＲシグナルの振幅上のｍβＣＤによるコレステロール欠損の効果を示グラフである。
【図７８】ＰＡＲシグナル伝達の機能上の回収を示すグラフである。
【図７９】ＰＡＲシグナル伝達上の先行するＥＧＦ刺激作用の効果を示すグラフである。
【図８０】時間の関数として、１μＭの過酸化水素に応答した静止Ａ４３１細胞の多数パラメタを示すグラフである。
【図８１】そして、過酸化水素の添加の前後における、ＬＩＤセンサ界面上の静止Ａ４３１細胞付着層の供与量依存応答を示すグラフである。
【図８２】１μＭのＨ２Ｏ２によって媒介された静止Ａ４３１細胞のＤＭＲシグナル上のｓｒｃ阻害物質の効果を示すグラフである。
【図８３】４μＭのＨ２Ｏ２によって媒介されたＤＭＲ応答上の静止状態細胞の異なるレドックス状態の効果を示すグラフである。
【図８４】ＥＧＦ刺激作用に対する静止Ａ４３１細胞応答を示すグラフおよび画像である。
【図８５】ブラジキニンによってブラジキニンＢ２受容体シグナル伝達で媒介された静止Ａ４３１細胞の光学シグニチャを示すグラフである。
【図８６】化合物の関数として、アッセイ中の２つの時間点間の波長シフトを示すグラフである。
【図８７】化合物の関数として、アッセイ中の２つの時間点間の波長シフトを示すグラフである。
【図８８】トロンビン濃度の関数として、アッセイ中の２つの時間点間の波長シフトを示すグラフである。
【図１】
2008538287.tif 000029
【図２】
2008538287.tif 000030
【図３】
2008538287.tif 000031
【図４】
2008538287.tif 000032
【図５】
2008538287.tif 000033
【図６】
2008538287.tif 000034
【図７】
2008538287.tif 000035
【図８】
2008538287.tif 000036
【図９】
2008538287.tif 000037
【図１０】
2008538287.tif 000038
【図１１】
2008538287.tif 000039
【図１２】
2008538287.tif 000040
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年12月6日(2007.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞上の刺激性事象の効果を試験する方法であって、
標識フリーバイオセンサを用意すること；
バイオセンサ上の細胞をインキュベートすること；
インキュベートされた細胞に刺激性事象を提供すること；および、
バイオセンサからバイオセンサ出力を集めることを含む方法。
【請求項２】
標識を検出する装置を有する標識を検出することを更に含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
標識が蛍光性標識、放射性の標識または発光顔料標識である請求項２記載の方法。
【請求項４】
複数の標識フリーバイオセンサが用意され、
細胞がバイオセンサのうちの２つ以上の各々上で培養され、
刺激性事象が２つ以上のバイオセンサに提供され、
バイオセンサ出力は２つ以上のバイオセンサから集められる請求項１記載の方法。
【請求項５】
バイオセンサは、堆積された材料を含有しない混合物を有する第１領域と、堆積された材料を含有する混合物を有する第２の領域とを有し、細胞がセンサ上でインキュベートされたとき、第２の領域上の細胞が堆積材料によってトランスフェクションされる請求項１記載の方法。
【請求項６】
バイオセンサはバリアによってそれぞれ物理的に分離される２つ以上のバイオセンサからなり、ウェル内で区画を画定するパリアがマイクロプレートのウェルを画定しているパリアより低い請求項１記載の方法。
【請求項７】
インキュベートされた細胞が受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を有し、インキュベートされた細胞がバイオセンサ界面上の細胞付着および細胞の成長を見越す濃度で血清を含んでいる培地において懸濁され、インキュベートされた細胞がバイオセンサ界面に付着する請求項１記載の方法。
【請求項８】
細胞の状態を同定する方法であって、
細胞−バイオセンサ組成を形成するために標識フリーバイオセンサの界面上で細胞を培養すること；および
細胞−バイオセンサ組成を分析して、細胞が培養される界面の不均質性を同定すること、を含む方法。
【請求項９】
生体細胞の状態を決定する方法であって、共鳴導波路グレーティングバイオセンサで、細胞の内容物の動的質量再分布を観察することを含む方法。
【請求項１０】
細胞に対する化合物の影響を試験するための方法であって、
バイオセンサ上で細胞を培養すること；
細胞を洗浄すること；
細胞を飢餓させること；
細胞を有する化合物をインキュベートすること；および
バイオセンサでシグナルを記録することを含む方法。