(57)【要約】後続のインビトロ核酸増幅反応において使用するのに適当な生体サンプルを調製する方法。本方法は、アルカリ溶液を、界面活性剤と、インビトロ増幅を用いて特定の核酸種の存在について試験される予定の生体サンプルとを含むｐＨ緩衝溶液と混合するステップによって達成され得るアルカリ条件に対する、迅速な、一時的な曝露を含む。発明された方法は、他のものの検出能を実質的に損なうことなく、いくつかの標的核酸の検出を改善できることが有利である。本方法は、マルチプレックス増幅反応において使用できるＲＮＡとＤＮＡ鋳型を同時調製するのに特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプルを処理する方法であって、
（ａ）該生体サンプルと、ｐＨ緩衝液および界面活性剤とを合わせ、それによって、第１のｐＨを有する第１の液体組成物を作製するステップと、
（ｂ）該第１の液体組成物を、アルカリ組成物と混合し、それによって第２のｐＨを有する第２の液体組成物を作製するステップであって、該第２のｐＨが、該第１のｐＨよりも少なくとも０．２ｐＨ単位高く、かつ、前記の第２のｐＨがｐＨ９．５よりも低いステップと、
（ｃ）該第２の液体組成物から１種以上の核酸を固体支持体上に捕獲するステップと、
（ｄ）該１種以上の核酸のいずれかが上に捕獲されている固体支持体を単離するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）における前記ｐＨ緩衝液および前記界面活性剤が、各々、緩衝界面活性剤溶液の成分であり、前記合わせるステップが、前記生体サンプルを、該緩衝界面活性剤溶液のアリコートと合わせるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２のｐＨがｐＨ８．０〜ｐＨ９．２の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｃ）において捕獲される前記１種以上の核酸のうち少なくとも１種がＲＮＡ分子を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｃ）において捕獲される前記１種以上の核酸のうち少なくとも１種がＤＮＡ分子を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のｐＨが６．５〜８．０の範囲である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｃ）が、前記の１種以上の核酸を、それに相補的な１種以上の、固定されているかまたは固定可能なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるステップを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）における前記ｐＨ緩衝液および前記界面活性剤が、各々、緩衝界面活性剤溶液の成分であり、合わせるステップが、前記生体サンプルを、該緩衝界面活性剤溶液のアリコートと合わせるステップを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記緩衝界面活性剤溶液が、前記１種以上の固定されているか、または固定可能なオリゴヌクレオチドをさらに含む、ステップ８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１のｐＨが６．５〜８．０の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｃ）が、前記１種以上の核酸を、それに相補的な１種以上の、固定されているかまたは固定可能なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるステップを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ａ）における前記ｐＨ緩衝液および前記界面活性剤が、各々、緩衝界面活性剤溶液の成分であり、合わせるステップが、前記生体サンプルを、該緩衝界面活性剤溶液のアリコートと合わせるステップを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記緩衝界面活性剤溶液が、前記１種以上の固定されているか、または固定可能なオリゴヌクレオチドをさらに含む、ステップ１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｄ）が、前記固体支持体を、その上に捕獲されていない物質と分離するステップと、次いで、前記１種以上の核酸のうちのいずれかが上に捕獲されている固体支持体を洗浄するステップとを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ａ）〜（ｄ）の各々を単一反応容器中で実施する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｃ）が、前記の１種以上の核酸を、それに相補的な１種以上の固定されているか、または固定可能なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ａ）における前記ｐＨ緩衝液および前記界面活性剤が、各々、緩衝界面活性剤溶液の成分であり、合わせるステップが、前記生体サンプルを、該緩衝界面活性剤溶液のアリコートと合わせるステップを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記緩衝界面活性剤溶液が、前記１種以上の固定されているか、または固定可能なオリゴヌクレオチドをさらに含む、ステップ１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記界面活性剤が陰イオン界面活性剤および非イオン界面活性剤からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記アルカリ組成物が、ＮａＯＨおよびＬｉＯＨからなる群から選択される強塩基を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ａ）〜（ｄ）の各々を単一反応容器中で実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ｂ）が、（ｉ）軌道振盪による撹拌または（ｉｉ）ボルテックス処理のいずれかを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記固体支持体がビーズを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ビーズが磁性ビーズである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｐＨ緩衝液のｐＫａが６．０〜９．０の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（ｃ）において捕獲された前記１種以上の核酸のうち少なくとも１種が、ＲＮＡ分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
ステップ（ｃ）において捕獲された前記１種以上の核酸のうち少なくとも１種がＤＮＡ分子を含む、請求項１に記載の方法
【請求項２８】
前記第１のｐＨがｐＨ６．５〜８．０の範囲であり、かつ、前記第２のｐＨがｐＨ８．２〜９．２の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
（ｅ）鋳型として、ステップ（ｄ）で単離された前記固体支持体上に捕獲されている前記１種以上の核酸のうち少なくとも１種を用いるインビトロ核酸増幅反応を実施するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記第２のｐＨがｐＨ８．０〜ｐＨ９．２の範囲である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１のｐＨが６．５〜８．０の範囲である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１のｐＨが６．５〜８．０の範囲である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記第２のｐＨがｐＨ８．２〜９．２の範囲である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記インビトロ核酸増幅反応がマルチプレックス反応である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
ステップ（ｃ）において捕獲された前記１種以上の核酸が２種以上の捕獲されている核酸を含み、ステップ（ｄ）において単離された前記１種以上の核酸が２種以上の単離核酸を含み、前記マルチプレックス反応が、鋳型として、ステップ（ｃ）において捕獲され、次いで、ステップ（ｄ）において単離された、前記２種以上の核酸を用いる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記マルチプレックス反応において鋳型として用いられる前記２種の核酸が、ＲＮＡ分子およびＤＮＡ分子を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ステップ（ａ）〜（ｅ）の各々を単一反応容器中で実施する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
ステップ（ｂ）が、（ｉ）軌道振盪による撹拌または（ｉｉ）ボルテックス処理のいずれかを含む、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２００５年２月１８日に出願された米国仮特許出願番号６０／６５４，１９９および２００５年４月６日に出願された米国仮特許出願番号６０／６６９，１９２の利益を主張する。これらの先行出願の開示は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、核酸増幅技術に関する。より詳しくは、本発明は、インビトロ核酸増幅反応を実施するのに先立ってサンプルを調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
インビトロ核酸増幅技術は、合成および、おそらくは、ほとんどないに等しいほど少量の核酸標的の検出のために、今ではよく用いられている。これらの技術は、従来、１種以上のオリゴヌクレオチドプライマーおよび核酸重合酵素を用いて、核酸鋳型の一方または両方の鎖のコピーを合成する。増幅手順に先立って生体サンプルを調製するには、多数の異なる方法が用いられてきた。
【０００４】
単一反応で、試験サンプルから複数の異なる核酸標的のいずれをも増幅できるマルチプレックス化アッセイは、特別な設計課題を提示する。例えば、マルチプレックスアッセイにおいて増幅可能な標的は、ＲＮＡ標的、ＤＮＡ標的またはＲＮＡとＤＮＡ標的の組み合わせでさえもあり得る。１つの課題は、ＲＮＡおよびＤＮＡ核酸は異なる化学安定性を示すという事実から生じる。もう１つの課題は、単一の標的種の種々の関連サブタイプのいずれも最大感度で検出したいというよくある要望から生じる。反応においてサブタイプ特異的プライマーを用いる場合であっても、単一の生物種の異なるサブタイプに対して実質的に同様の検出感度を達成することは困難であり得る。
【０００５】
したがって、核酸増幅反応において個々の標的の検出能を増強できる一般的な技術が必要である。マルチプレックス増幅反応において、同一反応におけるその他の標的の検出能を実質的に犠牲にすることなく、１種以上の標的の検出能を増強することがさらに必要である。
【０００６】
実際、本明細書に開示される本発明は、インビトロ核酸増幅を用いて核酸標的の存在について試験される予定の生体サンプルを調製するための好都合な方法を提供する。この方法は、種々の核酸含有生体サンプルについて、信頼できる結果を提供しながら、特定の核酸標的の検出能を大幅に改善することが有利である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
一般的に言えば、本発明は生体サンプルを処理する方法に関する。この方法は、生体サンプルを、ｐＨ緩衝液および界面活性剤と合わせ、その結果、第１のｐＨを有する第１の液体組成物が得られるステップで開始する。合わせるステップを単純にするには、ｐＨ緩衝液が、および界面活性剤が、液体の形であることが好都合である。次いで、第１の液体組成物をアルカリ組成物と混合し、その結果、第２のｐＨを有する第２の液体組成物が得られるステップがある。第２のｐＨは、第１のｐＨよりも少なくとも０．２ｐＨ単位高くなくてはならないことが重要であるが、これは添加されたアルカリによるものである。また、第２のｐＨがｐＨ９．５よりも低いということも良好な結果を達成するために重要である。これに、第２の液体組成物から１種以上の核酸を固体支持体上に捕獲するステップを続ける。最後に、１種以上の核酸のうちいずれかが上に捕獲されている固体支持体を単離するステップがある。これは、例えば、液相中に残る結合していない物質を吸引することによって、固体支持体およびその上に捕獲されている核酸をいずれも物理的に単離するステップを含み得る。
【０００８】
一実施形態では、合わせるステップに用いられるｐＨ緩衝液および界面活性剤は、各々、緩衝界面活性剤溶液の成分であり、合わせるステップが、生体サンプルを、緩衝界面活性剤溶液のアリコートと合わせるステップを含む。
【０００９】
もう１つの実施形態では、生体サンプル、緩衝液およびアルカリ組成物を含む混合物のｐＨを意味する第２のｐＨは、ｐＨ８．０〜ｐＨ９．２の範囲である。捕獲ステップは、第２のｐＨがｐＨ８．０〜９．２の範囲に入る場合に、固体支持体に１種以上のＲＮＡ種を捕獲するステップまたは１種以上のＤＮＡ種を捕獲するステップを含むことが好ましい。もう１つの好ましい実施形態では、第１のｐＨは、第２のｐＨがｐＨ８．０〜９．２の範囲に入る場合には、６．５〜８．０の範囲である。さらにもう１つの好ましい実施形態では、捕獲ステップは、第２のｐＨがｐＨ８．０〜９．２の範囲に入る場合に、第２の液体組成物から得られた１種以上の核酸を、それに相補的な、１種以上の固定されているか、または固定可能なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるステップを含み得る。合わせるステップにおけるｐＨ緩衝液および界面活性剤は、各々、緩衝界面活性剤溶液の成分であり、合わせるステップが、生体サンプルを、緩衝界面活性剤溶液のアリコートと合わせるステップを含むことがより好ましい。ｐＨ緩衝液および界面活性剤を含む緩衝界面活性剤溶液は、混合ステップに由来する第２の液体組成物から得られた核酸のハイブリダイズおよび捕獲に使用できる、固定されているか、または固定可能なオリゴヌクレオチドをさらに含むことが、さらにより好ましい。
【００１０】
もう１つの好ましい実施形態では、生体サンプル、緩衝液および界面活性剤を合わせたもののｐＨを意味する第１のｐＨは、６．５〜８．０の範囲である。この場合には、捕獲ステップが、捕獲される１種以上の核酸を、それに相補的な、１種以上の固定されているか、または固定可能なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるステップを含むことが好ましい。合わせるステップに用いられるｐＨ緩衝液および界面活性剤は、各々、緩衝界面活性剤溶液の成分であり、合わせるステップが、生体サンプルを、緩衝界面活性剤溶液のアリコートと合わせるステップを含むことがより好ましい。緩衝界面活性剤溶液が、第２の液体組成物から得られる核酸を捕獲するのに使用される、１種以上の固定されているか、または固定可能なオリゴヌクレオチドをさらに含むことがさらにより好ましい。単離ステップが、固体支持体を、上に捕獲されていない物質から分離するステップと、次いで、いずれかの核酸が上に捕獲されている固体支持体を洗浄するステップとを含むことが、なおさらにより好ましい。上記のステップのすべてを単一の反応容器中で実施することがいっそうなおさらにより好ましい。
【００１１】
もう１つの好ましい実施形態では、捕獲ステップが、捕獲される１種以上の核酸を、それに相補的な１種以上の固定されているか、または固定可能なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるステップを含む。この場合には、合わせるステップに用いられるｐＨ緩衝液および界面活性剤が、各々、緩衝界面活性剤溶液の成分であり、合わせるステップが、生体サンプルを、緩衝界面活性剤溶液のアリコートと合わせるステップを含むことが好ましい。この緩衝界面活性剤溶液は、第２の液体組成物からの核酸の捕獲に使用できる、１種以上の固定されているか、または固定可能なオリゴヌクレオチドをさらに含むことがより好ましい。
【００１２】
もう１つの好ましい実施形態では、合わせるステップに用いられる界面活性剤は、陰イオン界面活性剤または非イオン界面活性剤である。この場合には、混合ステップに用いられるアルカリ組成物は、強塩基、例えば、ＮａＯＨおよびＬｉＯＨであることが好ましい。
【００１３】
もう１つの実施形態では、合わせるステップ、混合ステップ、捕獲ステップおよび単離ステップのすべてを単一反応容器中で実施する。この場合には、混合ステップは軌道振盪またはボルテックス処理のいずれかによる撹拌を含むことが好ましい。
【００１４】
もう１つの実施形態では、捕獲ステップにおける固体支持体は、ビーズ、例えば、磁性ビーズを含む。
【００１５】
もう１つの実施形態では、合わせるステップに用いられるｐＨ緩衝液のｐＫａは、６．０〜９．０の間である。
【００１６】
もう１つの実施形態では、捕獲ステップにおいて捕獲される１種以上の核酸のうち少なくとも１種は、ＲＮＡ分子である。
【００１７】
もう１つの実施形態では、捕獲ステップにおいて捕獲される１種以上の核酸のうち少なくとも１種は、ＤＮＡ分子である。もう１つの好ましい実施形態では、第１のｐＨはｐＨ６．５〜８．０の範囲に入り、第２のｐＨはｐＨ８．２〜９．２の範囲に入る。この関係は、ＤＮＡ鋳型とＲＮＡ鋳型両方の処理にとって一様に良好な結果を与えた。したがって、この組み合わせの範囲は、本発明を実施するために高度に好ましい。
【００１８】
本発明のもう１つの一般的な態様は、生体サンプルを処理して核酸を得、次いで、特定の適用において、得られた核酸を用いる方法に関する。上記のように、この方法は、生体サンプルを、ｐＨ緩衝液および界面活性剤と合わせ、その結果、第１のｐＨを有する第１の液体組成物が得られるステップで開始する。次いで、第１の液体組成物をアルカリ組成物と混合し、その結果、第２のｐＨを有する第２の液体組成物が得られるステップがある。やはり、良好な結果を達成するには、第２のｐＨが、第１のｐＨよりも少なくとも０．２ｐＨ単位高く、かつ、第２のｐＨがｐＨ９．５よりも低いことが重要である。これに、第２の液体組成物から１種以上の核酸を固体支持体上に捕獲するステップを続ける。次に、１種以上の核酸のいずれかが上に捕獲されている固体支持体を単離するステップがある。これは、例えば、液相中に残る結合していない物質を吸引することによって、固体支持体およびその上に捕獲されている核酸のいずれをも物理的に単離するステップを含み得る。最後に、鋳型として、固体支持体上に捕獲され、単離ステップにおいて単離された核酸のうち少なくとも１種を用いるインビトロ核酸増幅反応を実施するステップがある。
【００１９】
好ましい実施形態では、第２のｐＨはｐＨ８．０〜ｐＨ９．２の範囲である。この場合には、第１のｐＨは６．５〜８．０の範囲であることが好ましい。
【００２０】
もう１つの好ましい実施形態では、第１のｐＨは６．５〜８．０の範囲である。第１のｐＨが６．５〜８．０の範囲に入る場合には、第２のｐＨがｐＨ８．２〜９．２の範囲に入ることが高度に望ましい。実際、このセットの範囲は、ＤＮＡ鋳型とＲＮＡ鋳型両方の処理に一様に良好な結果を与えた。したがって、この組み合わせの範囲は、本発明を実施するために高度に好ましい。
【００２１】
異なる好ましい実施形態では、インビトロ核酸増幅反応は２種以上の核酸配列を増幅できるマルチプレックス反応である。この場合には、捕獲ステップにおいて捕獲される１種以上の核酸は、２種以上の捕獲される核酸を含み、単離ステップにおいて単離される１種以上の核酸単離は、２種以上の単離核酸を含み、マルチプレックス反応は、捕獲および単離された核酸のうち２種を鋳型として用いる。実際、マルチプレックス反応において鋳型として用いられる２種の核酸が、ＲＮＡ分子およびＤＮＡ分子を含むことが高度に好ましい。
【００２２】
さらに異なる好ましい実施形態では、合わせるステップ、混合ステップ、捕獲ステップ、単離ステップおよび核酸増幅反応を実施するステップのすべてを単一反応容器中で実施する。この場合には、混合ステップが軌道振盪またはボルテックス処理のいずれかによる撹拌を含むことが好ましい。
【００２３】
定義
以下の用語は、本明細書において別段明示的な記載のない限り、この開示内容の目的上、以下の意味を有する。
【００２４】
本明細書において「アルカリショック」とは、最初に、生体サンプルを、ｐＨ緩衝液および界面活性剤と合わせ、その結果、第１の組成物が得られるステップと、次いで、その第１の組成物を、得られる混合物のｐＨを高めるのに十分な量のアルカリ組成物と混合するステップとによって達成される、一時的な高ｐＨを指す。第１の組成物のｐＨの有用な開始範囲およびアルカリ組成物の添加後の混合物のｐＨの有用な最終範囲は、本明細書に記載されている。
【００２５】
本明細書において、「生体サンプル」とは、ヒト、動物または環境サンプルから得られた、いずれかの組織またはポリヌクレオチドを含有する物質である。本発明に従う生体サンプルとしては、末梢血、血漿、血清またはその他の体液、骨髄またはその他の器官、生検組織または生体起源のその他の物質が挙げられる。生体サンプルを、組織または細胞構造を破壊するよう処理し、それによって、酵素、緩衝液、塩、界面活性剤などを含み得る細胞内成分を溶液中に放出させることができる。
【００２６】
本明細書において、「ポリヌクレオチド」とは、配列中に存在し得、相補配列を有する第２の分子とのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを妨げない、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか、ならびにいずれかの合成ヌクレオチド類似体またはその他の分子を意味する。
【００２７】
本明細書において、「検出可能な標識」とは、検出され得るか、または検出可能な反応をもたらし得る化学種である。本発明に従う検出可能な標識はポリヌクレオチドプローブと直接または間接的のいずれかで結合でき、これとしては、放射性同位体、酵素、ハプテン、発色団、例えば、色素または検出可能な色を付与する粒子（例えば、ラテックスビーズまたは金属粒子）、発光化合物（例えば、生体発光部分、リン光性発光部分または化学発光部分）および蛍光化合物が挙げられる。
【００２８】
「均一検出可能標識」とは、標識が、標的配列とハイブリダイズされているプローブ上にあるかどうかを調べることによって均一様式で検出され得る標識を指す。すなわち、均一検出可能標識は、ハイブリダイズ型の標識または標識化プローブを、非ハイブリダイズ型の標識または標識化プローブから物理的に回収することなく検出できる。均一検出可能標識は、増幅された核酸を検出するために標識化プローブを用いる場合に好ましい。均一標識の例は、Ａｒｎｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，２８３，１７４号、Ｗｏｏｄｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，６５６，２０７号およびＮｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，６５８，７３７号によって詳細に記載されている。均一アッセイにおいて用いるのに好ましい標識としては、化学発光化合物が挙げられる（例えば、Ｗｏｏｄｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，６５６，２０７号、Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，６５８，７３７号およびＡｒｎｏｌｄ，  Ｊｒ．，  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，６３９，６０４号参照のこと）。好ましい化学発光標識としては、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物、例えば、標準ＡＥまたはその誘導体（例えば、ナフチル−ＡＥ、オルト−ＡＥ、１−もしくは３−メチル−ＡＥ、２，７−ジメチル−ＡＥ、４，５−ジメチル−ＡＥ、オルト−ジブロモ−ＡＥ、オルト−ジメチル−ＡＥ、メタ−ジメチル−ＡＥ、オルト−メトキシ−ＡＥ、オルト−メトキシ（シンナミル）−ＡＥ、オルト−メチル−ＡＥ、オルト−フルオロ−ＡＥ、１−もしくは３−メチル−オルト−フルオロ−ＡＥ、１−もしくは３−メチル−メタ−ジフルオロ−ＡＥおよび２−メチル−ＡＥ）がある。
【００２９】
「均一アッセイ」とは、特異的プローブハイブリダイゼーション度の測定に先立って、ハイブリダイズしているプローブの、ハイブリダイズしていないプローブからの物理的な分離を必要としない検出手順を指す。例示的均一アッセイ、例えば、本明細書に記載されるものは、分子指標または適当な標識とハイブリダイズしている場合に蛍光シグナルを発するその他の自己報告性プローブ、ハイブリッド二本鎖中に存在しない場合は化学的手段によって選択的に破壊され得る化学発光アクリジニウムエステル標識および当業者によく知られるその他の均一検出可能標識を用いることができる。
【００３０】
本明細書において、「核酸増幅」または簡単に「増幅」とは、標的核酸配列、その相補体またはその断片のマルチプルコピーを得るためのインビトロ手順を指す。
【００３１】
「標的核酸」または「標的」とは、標的核酸配列を含む核酸を意味する。一般に、増幅される標的核酸配列は、２つの反対に配置した増幅オリゴヌクレオチドの間に配置し、増幅オリゴヌクレオチドの各々と十分に相補的である標的核酸の一部を含む。
【００３２】
「標的核酸配列」または「標的配列」または「標的領域」とは、一本鎖核酸分子のヌクレオチド配列のすべてまたは一部およびそれに相補的なデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を含む特定のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を意味する。
【００３３】
「転写関連増幅」とは、核酸鋳型からＲＮＡポリメラーゼを用いて複数のＲＮＡ転写物を製造する、いずれかの種類の核酸増幅を意味する。転写関連増幅法の１つの例は、「転写媒介性増幅」（ＴＭＡ）と呼ばれ、通常、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸およびプロモーター鋳型相補的オリゴヌクレオチドを用い、場合により、１種以上の類似のオリゴヌクレチドを含み得る。ＴＭＡの変法は、Ｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，４３７，９９０号、Ｋａｃｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，３９９，４９１号および同５，５５４，５１６号、Ｋａｃｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＣＴ番号ＷＯ９３／２２４６１、Ｇｉｎｇｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＣＴ番号ＷＯ８８／０１３０２、Ｇｉｎｇｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＣＴ番号ＷＯ８８／１０３１５、Ｍａｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，１３０，２３８号、Ｕｒｄｅａ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４，８６８，１０５号および同５，１２４，２４６号、ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＣＴ番号ＷＯ９４／０３４７２およびＲｙｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＣＴ番号ＷＯ９５／０３４３０に詳細に開示されるように、当技術分野では周知である。本明細書に開示される種類の核酸増幅手順を実施するには、Ｋａｃｉａｎ  ｅｔ  ａｌの方法が好ましい。
【００３４】
本明細書において、「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、少なくとも２個の、通常、約５〜約１００個の間の化学サブユニットからなり、各サブユニットがヌクレオチド塩基部分と、糖部分と、線形空間配置にサブユニットを連結する結合部分とを含むポリマー鎖である。一般的なヌクレオチド塩基部分は、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）であるが、その他の、水素結合できる稀な、または修飾されたヌクレオチド塩基は当業者には周知である。オリゴヌクレオチドは、場合により、糖部分、塩基部分および骨格成分のいずれかの類似体を含み得る。本発明の好ましいオリゴヌクレオチドは、約１０〜約１００残基のサイズ範囲に入る。オリゴヌクレオチドは、天然供給源から精製できるが、種々の周知の酵素法または化学法のいずれかを用いて合成することが好ましい。
【００３５】
本明細書において、「プローブ」とは、検出可能なハイブリッドを形成するためにハイブリダイゼーションを促進する条件下で、核酸中、好ましくは増幅された核酸中の標的配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。プローブは、場合により、プローブの末端に付着できるか、またはプローブの内部にあり得る検出可能な部分を含み得る。検出可能部分がプローブの配列の内部である場合のように、標的ポリヌクレオチドと合わせるプローブのヌクレオチドは厳密に隣接している必要はない。検出は直接（すなわち、標的配列または増幅された核酸との直接的なプローブハイブリダイジングに起因する）または間接（すなわち、プローブを標的配列または増幅された核酸とつなぐ中間体分子構造とのプローブハイブリダイジングに起因する）のいずれかであり得る。プローブの「標的」とは、通常、標準水素結合形成（すなわち、塩基対形成）を用いて少なくともプローブオリゴヌクレオチドの一部と特異的にハイブリダイズする、増幅された核酸配列内に含まれる配列を指す。プローブは、標的特異的配列と、場合により、検出される予定の標的配列と非相補的であるその他の配列とを含み得る。これらの非相補的配列は、プロモーター配列と、制限エンドヌクレアーゼ認識部位またはプローブの三次元コンホメーションに寄与する配列（例えば、Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，１１８，８０１号および同５，３１２，７２８号に記載されるような）とを含み得る。「十分に相補的な」配列により、プローブオリゴヌクレオチドの、プローブの標的特異的配列と完全に相補的でない標的配列との安定なハイブリダイゼーションが可能となる。
【００３６】
「増幅オリゴヌクレオチド」とは、核酸増幅反応に参加し、鋳型核酸配列またはその相補体のマルチプルコピーの合成をもたらすことができるオリゴヌクレオチドを意味する。増幅反応にとって少なくとも２種の増幅オリゴヌクレオチドを用い、増幅オリゴヌクレチドの少なくとも一方が増幅プライマーとして働くことはよくあることである。
【００３７】
本明細書において、「増幅プライマー」またはより単純に「プライマー」とは、標的核酸またはその相補体とハイブリダイズし、鋳型依存性プライマー伸長反応において伸長できるオリゴヌクレオチドである。例えば、増幅プライマーは、場合により、鋳型核酸とハイブリダイズでき、ＤＮＡポリメラーゼ活性によって伸長され得る３’末端を有する修飾されたオリゴヌクレオチドであり得る。一般に、プライマーは、下流の標的に相補的な配列と、場合により、標的核酸と相補的でない上流の配列を有する。任意の上流配列は、例えば、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとして働く場合もあるし、または制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む場合もある。
【００３８】
「実質的に相同」、「実質的に対応する（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ）」または「実質的に対応する（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ）」とは、主題オリゴヌクレオチドが、参照塩基配列中に存在する少なくとも１０個の連続する塩基領域（ＲＮＡおよびＤＮＡ同等物を除く）と、少なくとも７０％相同である、好ましくは、少なくとも８０％相同である、より好ましくは、少なくとも９０％相同である、最も好ましくは、少なくとも１００％相同である、少なくとも１０個の連続する塩基領域を含む塩基配列を有することを意味する。当業者には、容認できないレベルの非特異的ハイブリダイゼーションを防ぎながら、オリゴヌクレオチドの、標的配列とのハイブリダイゼーションを可能にする、種々の相同パーセンテージでのハイブリダイゼーションアッセイ条件に行うことができる修飾は容易に理解されよう。類似度は、２種の配列をなすヌクレオ塩基の順序を比較し、構造上の相違が相補塩基との水素結合形成を妨げないならば、２種の配列間に存在し得るその他の構造上の相違を考慮しないことによって求める。２種の配列間の相同度はまた、比較されている少なくとも１０個の連続する塩基の各セット中に存在する塩基ミスマッチ数の点から表すことができ、これは０〜２塩基の相違の範囲であり得る。
「実質的に相補的」とは、主題オリゴヌクレオチドが、標的核酸配列中に存在する少なくとも１０個の連続する塩基領域（ＲＮＡおよびＤＮＡ同等物を除く）と、少なくとも７０％相補的な、好ましくは、少なくとも８０％相補的な、より好ましくは、少なくとも９０％相補的な、最も好ましくは、１００％相補的な、少なくとも１０個の連続する塩基領域を含む塩基配列を有することを意味する。（当業者には、容認できないレベルの非特異的ハイブリダイゼーションを防ぎながら、オリゴヌクレオチドの、標的配列とのハイブリダイゼーションを可能にする、種々の相補性パーセンテージでのハイブリダイゼーションアッセイ条件に行うことができる修飾は容易に理解されよう。）相補性度は、２種の配列をなすヌクレオ塩基の順序を比較し、構造上の相違が相補塩基との水素結合形成を妨げないならば、２種の配列間に存在し得るその他の構造上の相違を考慮しないことによって求める。２種の配列間の相補性度はまた、比較されている少なくとも１０個の連続する塩基の各セット中に存在する塩基ミスマッチ数の点から表すことができ、これは０〜２塩基のミスマッチの範囲であり得る。
【００３９】
「十分に相補的」とは、一連の相補的塩基の間での水素結合形成によって別の塩基配列とハイブリダイズできる連続する核酸塩基配列を意味する。相補的な塩基配列は、標準塩基対形成（例えば、Ｇ：Ｃ、Ａ：ＴまたはＡ：Ｕ対形成）を用いてオリゴヌクレオチドの塩基配列中の各位置で相補的であり得、または標準水素結合形成（例えば、脱塩基「ヌクレオチド」）を用いて相補的でない１個以上の残基を含み得るが、全相補的塩基配列は、適当なハイブリダイゼーション条件下で別の塩基配列と特異的にハイブリダイズできる。連続する塩基は、オリゴヌクレオチドが特異的にハイブリダイズする予定である配列に対して、少なくとも約８０％相補的であることが好ましく、少なくとも約９０％がより好ましく、約１００％が最も好ましい。適当なハイブリダイゼーション条件は、当業者には周知であり、塩基配列組成に基づいて容易に予測できるか、または慣例の試験を用いて実験的に決定できる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  ２ｎｄ  ｅｄ．  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８９）の§§１．９０〜１．９１、７．３７〜７．５７、９．４７〜９．５１および１１．４７〜１１．５７、特に、§§９．５０〜９．５１、１１．１２〜１１．１３、１１．４５〜１１．４７および１１．５５〜１１．５７）。
【００４０】
「捕獲オリゴヌクレオチド」とは、塩基対ハイブリダイゼーションによって標的配列と固定されたオリゴヌクレオチドを特異的に連結する手段を提供する少なくとも１種の核酸オリゴヌクレオチドを意味する。捕獲オリゴヌクレオチドは、通常、同一オリゴヌクレオチド上で連続している、２つの結合領域：標的配列結合性領域と固定されたプローブ結合性領域とを含むことが好ましいが、捕獲オリゴヌクレオチドは、１種以上のリンカーによって一緒に連結された２つの異なるオリゴヌクレオチド上に存在する標的配列結合性領域と固定されたプローブ結合性領域とを含み得る。例えば、固定されたプローブ結合性領域が、第１のオリゴヌクレオチド上に存在し得、標的配列結合性領域が第２のオリゴヌクレオチド上に存在し得、２つの異なるオリゴヌクレオチドが、第１および第２のオリゴヌクレオチドの配列と特異的にハイブリダイズする配列を含む第３のオリゴヌクレオチドであるリンカーを用いる水素結合形成によって連結されている。
【００４１】
「固定されたオリゴヌクレオチド」または「固定された核酸」およびその変種とは、捕獲オリゴヌクレオチドを、固定された支持体と直接または間接的に連結する核酸を意味する。固定されたプローブは、サンプルにおいて結合している標的配列を結合していない物質と分離するのを容易にする固体支持体と連結しているオリゴヌクレオチドである。「固定可能な」オリゴヌクレオチドとは、固体支持体に直接固定されたオリゴヌクレオチドとの相補的塩基相互作用によって、固体支持体に固定されるようになり得るオリゴヌクレオチドである。
【００４２】
「分離」または「精製」とは、生体サンプルの１種以上の成分が、サンプルの１種以上のその他の成分から取り除かれることを意味する。サンプル成分は、通常、水性の溶液相中に核酸を含み、これはまた、タンパク質、炭水化物、脂質および標識されたプローブなどの物質を含み得る。分離または精製ステップは、サンプル中に存在するその他の成分の少なくとも約７０％を除去することが好ましく、少なくとも約９０％がより好ましく、少なくとも約９５％がさらにより好ましい。
【００４３】
「ＲＮＡおよびＤＮＡ同等物」または「ＲＮＡおよびＤＮＡ同等塩基」とは、同様の相補的な塩基対ハイブリダイゼーション特性を有するＲＮＡおよびＤＮＡなどの分子を意味する。ＲＮＡおよびＤＮＡ同等物は異なる糖部分を有し（すなわち、リボース対デオキシリボース）、またＲＮＡ中のウラシルおよびＤＮＡ中のチミンの存在によって異なり得る。ＲＮＡとＤＮＡ同等物間の相違は、相同性の相違に寄与しないが、これは同等物が特定の配列に対して同程度の相補性を有するからである。
【００４４】
「本質的にからなる」とは、本発明の基本的および新規特徴を著しく変更しない、さらなる成分（類）、組成物（類）または方法ステップ（類）が、本発明の組成物またはキットまたは方法中に含まれ得ることを意味する。このような特徴としては、生体サンプル、例えば、全血または血漿中の標的核酸を選択的に検出する能力が挙げられる。本発明の基本的および新規特徴に対して重大な影響を有する成分（類）、組成物（類）または方法ステップ（類）はいずれも、この用語に入らない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
（発明の詳細な説明）
本明細書には、核酸含有生体サンプルを調製する方法が開示されている。本方法を用いて、ウイルス、細菌または真核生物供給源からＤＮＡとＲＮＡ鋳型の両方を調製でき、またこれを用いて、調製された核酸を鋳型として用いて実施される増幅反応の感度を高めることができる。驚くべきことに、これらの利点のすべては、核酸検出手順の標的捕獲、増幅または検出ステップにおいて用いられるオリゴヌクレオチドのいずれも再設計することなく達成できる。
【００４６】
一般的に言えば、本発明の主題は、混合後のｐＨが指定の範囲内に入るような、生体サンプルを含む緩衝界面活性剤溶液へのアルカリ溶液の添加が、続いて、核酸増幅反応において、処理されたサンプルが鋳型の供給源として働く場合に特定の利点を提供するという予期しない発見に関する。発明されたサンプル処理手順は、標的捕獲成分を含み、ここで、アルカリの添加後の条件は、固定された捕獲オリゴヌクレオチドと生体サンプルから遊離されたポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドハイブリッドの形成と適合していることが好ましい。以下に示される証拠によって示されるように、アルカリおよびｐＨ緩衝界面活性剤溶液をまず合わせ、次いで、生体サンプルに添加される場合には本発明の利点は達成されない。
【００４７】
本発明の開発を引き起こした知見は、増幅されたアッセイの、種々のＨＢＶサブタイプを検出する能力の差に関するものであった。より詳しくは、ＨＩＶ−Ｉ、ＨＣＶおよびＨＢＶ核酸標的をいずれも増幅および検出できるマルチプレックス化アッセイは、種々のＨＢＶサブタイプに対して大きく異なる感度を示すことがわかった。以下に示されるように、アッセイによって、サブタイプ−Ａおよび−Ｃに対してはほぼ同等の感度が得られたが、サブタイプ−Ｂに対しては、１６倍近く低下した。これは、ＨＢＶの３種のサブタイプが密接な系統発生関係を共有するという事実にかかわらず、またアッセイ手順において共通のプライマーおよびプローブのセットを使用できるという事実にかかわらずそうであった。種々のサブタイプのすべてを高い感度で検出することが望ましかったので、その他のサブタイプの検出を実質的に損なうことなく１種のウイルスサブタイプの検出のためのアッセイ感度を高めることは興味深いことであった。
【００４８】
ＨＢＶサブタイプ−Ｂ検出の感度を向上させることは、あるいは、いくつかのアプローチのいずれかによって達成されている可能性がある。例えば、アッセイに用いるオリゴヌクレオチド成分を再設計することが向上をもたらした可能性がある。しかし、このことが達成されていた可能性があるとしても、その解決法は再設計されたアッセイにとって特有であっただけである。より望ましい解決法は、ＨＢＶサブタイプ−Ｂ検出性およびおそらくは、その他のアッセイの性能も同様に向上させるための一般的な手段を提供する。したがって、本発明の１つの目的は、マルチプレックス化アッセイにおいて少なくとも１種の標的の検出性を向上させる方法に関するものであった。
【００４９】
好ましい緩衝液およびｐＨ範囲
発明されたアルカリショックに基づくサンプル調製法を実施するのに有用な緩衝液は、約６．０〜約９．０の範囲のｐＫａ値を有することが好ましい。本発明の有用性を実証するのに用いられる例示的緩衝液としては、２０℃で７．５５というｐＫａを有し、６．８〜８．２のｐＨ範囲において最強の緩衝能を有するＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）がある。もちろん、本技術の成功は、いずれかの特定の緩衝液に使用によって制限されるものではない。
【００５０】
本発明を実施するための好ましい方法によれば、生体サンプルをまず、ｐＨ緩衝液および界面活性剤と合わせて第１の組成物を得、次いで、これを濃水酸化物溶液のアリコートと合わせてアルカリショックを達成する。緩衝液および界面活性剤は、互いに合わせることができ、その結果、試薬添加ステップにおいて、緩衝界面活性剤溶液の単一のアリコートを分配できることが好都合である。緩衝界面活性剤溶液が、１種以上の任意の固定可能なまたは固定された捕獲オリゴヌクレオチドをさらに含み、試薬添加ステップの複雑性をさらに低減し、それによって、本方法をロボット分注器の使用による自動化に特に適合させることが好ましい。液体または液化生体サンプルのアリコートを、緩衝液と、界面活性剤と捕獲オリゴヌクレオチドと固体支持体（すなわち、ビーズ）とを含む単一試薬組成物と合わせ、捕獲を達成することによってアルカリショックサンプル調製法を実施する場合には、試薬組成物は「溶解／捕獲試薬」と呼ばれる。溶解／捕獲試薬を生体サンプルと合わせた後に、約９０ｍＭ〜約３５５ｍＭの範囲の最終緩衝液濃度が生じた、約２００ｍＭ〜約８００ｍＭの範囲の緩衝液濃度を有する溶解／捕獲試薬を用いて優れた結果が達成された。もちろん、緩衝液強度の変更は、添加されるアルカリ性水酸化物の量が、混合物の最終ｐＨを、本明細書において指定される範囲の１つ中にするよう調整されることを必要とする。したがって、本技術の成功は、アルカリショックを達成するアルカリ溶液を添加する前の混合物中の緩衝液の量または濃度によって制限されるものではない。
【００５１】
そのアルカリショックを達成するためのアルカリの添加前の生体サンプルと混合された緩衝界面活性剤溶液の組み合わせの出発ｐＨ範囲は、ｐＨ６．５〜８．０の範囲であることが好ましく、ｐＨ７．０〜８．０の範囲にあることがさらにより好ましく、またはｐＨ７．０〜７．５の範囲にあることがなおさらにより好ましい。７．０、７．５および８．０という出発出発ｐＨを有する緩衝界面活性剤溶液を用いて実施した試験は、アルカリショックプロトコールに従って核酸鋳型を調製し、次いで、それらの鋳型を増幅および検出すると、すべて良好な結果をもたらした。これらの結果は、アルカリ組成物の添加前の、試料処理を受けている生体サンプルと、ｐＨ緩衝液と界面活性剤とを含む第１の組成物の出発ｐＨの有用な範囲を裏付けた。この試験は、同時増幅可能なＲＮＡ内部対照を用いて実施されたので、また、すべての試験が妥当な結果をもたらしたので、ＲＮＡはこの範囲の出発ｐＨ条件にわたって安定であると結論付けられたことは注目される。本発明の記載を簡単にするために、以下に示される実施例はすべて、アルカリ性水酸化物の添加の前に約７．５という出発ｐＨを有する生体サンプル／緩衝液／界面活性剤の組合せを用いた。やはり、アルカリショックサンプル処理技術の成功は、広い出発ｐＨ範囲にかけて達成され得る。
【００５２】
処理方法−−アルカリおよび界面活性剤条件
発明された方法の好ましい実施形態では、生体サンプルと、ｐＨ緩衝液と界面活性剤とを含む第１の組成物を、アルカリ組成物を含む第２の組成物と合わせる。この合わせたものを混合し、固定された捕獲プローブおよび、おそらくはまた、固定されたプローブと注目される標的核酸の間に架橋を形成できる可溶性捕獲プローブとともにインキュベートすることを可能にすることが好ましい。通常、本方法を実施する際に、アルカリ性水酸化物を、すでに第１の組成物を含んでいる試験管またはその他の反応容器に添加する。高度に好ましい実施形態では、第１の組成物はまた、アルカリ性水酸化物の添加に先立って、可溶性捕獲プローブと固定された捕獲プローブとを含むか、または合わせる。
【００５３】
アルカリショックを達成するためにアルカリ組成物として使用できる物質は、水溶液に溶解した場合に強力なアルカリ溶液を生じる、固体、液体またはガス状物質のいずれであってもよい。強力な塩基としては、本発明に関連して有用な高度に好ましいアルカリ組成物（以下、一般に「アルカリ性水酸化物」と呼ぶ）がある。発明されたサンプル調製法を実施するために使用できる好ましいアルカリ性水酸化物の例として、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カリウムなどが挙げられる。固体アルカリ組成物を、緩衝界面活性剤と、生体サンプル溶液とを含む第１の組成物と合わせることができる（測定された量の乾燥アルカリ性水酸化物試薬をあらかじめ含んでいる試験管への第１の組成物の添加によって達成され得るように）ということが考慮されるが、溶液の形でアルカリ組成物を用いることが好ましい。
【００５４】
本発明の利益を達成するには、生体サンプルと、ｐＨ緩衝液と、界面活性剤とを含む組成物に添加されるアルカリ組成物の量が決定的であり、完全混合物の最終ｐＨによって容易に評価できる。添加されるアルカリ性水酸化物の量は、得られる混合物のｐＨを少なくとも０．２ｐＨ単位高めるのに十分であるが９．５を超えてｐＨを高めるほどではないことが好ましく、９．２を超えないことがより好ましく、９．０を超えないことがより好ましく、８．８を超えないことがさらにより好ましい。試験結果により、有用な量の添加されるアルカリ性水酸化物は、混合物の最終ｐＨを指定の範囲内に入れさせる量であることが確認される。好ましい最終ｐＨ範囲は約ｐＨ８．０〜９．２の間であり、ｐＨ８．２〜９．２の間がより好ましく、ｐＨ８．２〜８．８の間がさらにより好ましい。以下に繰り返すように、アルカリショック後の混合物の最終ｐＨがｐＨ８．２〜９．２の範囲中に入る場合に、一様に良好な結果が達成された。これは、ＤＮＡおよびＲＮＡ鋳型の両方に当てはまった。添加されるアルカリ性水酸化物の量が混合物を９．５という最終ｐＨを越えさせた場合には、悪い結果が達成された。
【００５５】
好ましい界面活性剤
本発明に関連して使用できる界面活性剤は、陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤または陽イオン界面活性剤であり得る。もちろん、陰イオン界面活性剤および非イオン界面活性剤が最も好ましい。溶解／捕獲試薬中の界面活性剤濃度は、０．０１〜１５重量％の間が好ましく、０．０５〜１０重量％の間の範囲の濃度が特に好ましい。４００μｌの溶解／捕獲試薬および５００μｌの生体サンプルという実証された使用に基づいて、緩衝液と、界面活性剤と、生体サンプルとを含む混合された組成物中の界面活性剤の最終濃度は、約０．０１重量％〜約６．７重量％の範囲に入ることが好ましい。強力な陰イオン界面活性剤、例えば、アルキルアルコールの硫酸塩およびＮ−アシル−アミノ酸が高度に好ましい。アルカリショックに基づくサンプル調製手順を実施するために用いられる界面活性剤の厳密な性質は決定的であるとは考えられないが、特に好ましい界面活性剤の例としては、ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられる。
【００５６】
処理期間
好ましい実施形態では、アルカリ性水酸化物溶液のアリコートを、反応容器中で、生体サンプルと、緩衝液と、界面活性剤と、配列特異的標的捕獲が実施される予定である場合には、１種以上の固定可能な捕獲オリゴヌクレオチドとを含む組成物と合わせる。約１秒〜約１時間の期間の後、内容物を撹拌し、確実に均一混合させ、生体サンプルから遊離されたポリヌクレオチドと、固定されたオリゴヌクレオチドの直接か間接の固定化を含む標的捕獲プロセスが続く。もちろん、非特異的標的捕獲も使用できる。実験室生産性を促進するためには、標的捕獲ステップが実施される期間の長さが必要とされるだけであることが望ましい。しかし、生体サンプルから遊離された核酸は、アルカリ性水酸化物の添加後、混合された組成物中で安定であるので、混合物を最大少なくとも数時間静置させることは標的核酸にとって有害であるとは考えられない。したがって、アルカリショックと関連する処理条件は非常に穏やかであると考えられる。
【００５７】
自動分析装置において使い捨てされるプラスチック容器
発明されたサンプル調製法は、プラスチック試験管などの使い捨ての反応容器または複数の試験管を間隙を介した配置で含む使い捨てユニット中で実施されることが好ましい。例えば、使い捨ての反応容器は、アルカリ性水酸化物溶液が添加される時点で分析装置内に配置されていることが好ましく、添加ステップは手動または自動化またはロボットピペッティング装置によって実施されることが好ましい。高度に好ましい実施形態では、使い捨て反応容器は分析装置中に搭載されており、手動または自動化またはロボットピペッティング装置が、生体サンプルのアリコートと、生体膜、例えば、細胞膜、ウイルスエンベロープなどを溶解または破壊するためのｐＨ緩衝液および界面活性剤を含む溶解／捕獲試薬のアリコートとを容器に加える。溶解／捕獲試薬はまた、生体サンプルから遊離されたポリヌクレオチドを捕獲するための、固定可能な捕獲オリゴヌクレオチドと不溶性ビーズとを含むことが好ましい。その後、同一または異なる自動化またはロボットピペッティング装置が、アルカリ性水酸化物溶液のアリコートを試験管に加える。次いで、試験管の内容物を撹拌し、確実に完全混合し、混合されたサンプルを一定温度で遊離されたポリヌクレオチドの捕獲が可能となるのに十分な期間インキュベートすればよい。アルカリショック条件は穏やかであるので、異なる分析プロトコールを実験室試験の単一の１日サイクルにおいて自動化分析器で実施した場合に生じ得るような、長期間または不定期間の静置によって生じることがわかっている実質的な化学分解はない。
【００５８】
標的捕獲−−方法およびオリゴヌクレオチド
開示されたアルカリショックに基づくサンプル調製法は、サンプルを核酸に富むものにする標的捕獲手順と相まった場合に特に価値が高いと実証された。個々の好ましい実施形態は、非特異的標的捕獲（すなわち、核酸が、核酸の塩基配列と実質的に無関係な方法で捕獲される場合）および配列特異的標的捕獲に依存する。これらの方法のいずれかまたは両方とも、固定可能であるか、または固定されている捕獲オリゴヌクレオチドを使用できる。
【００５９】
好ましい捕獲オリゴヌクレオチドは、固体支持体上への固定化の標的として働く第２の配列（すなわち、「テール」配列）と共有結合によって結合している、増幅される予定の標的配列を含むポリヌクレオチドと相補的である第１の配列を含む。捕獲オリゴヌクレオチドの塩基配列と結合する骨格はいずれも使用できる。特定の好ましい実施形態では、捕獲オリゴヌクレオチドは、骨格中に少なくとも１つのメトキシ結合を含む。捕獲オリゴヌクレオチドの３’末端であることが好ましいテール配列を用いて相補塩基配列とハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしている標的核酸を生体サンプル中のその他の成分に優先して捕獲するための手段を提供する。
【００６０】
相補塩基配列とハイブリダイズする塩基配列はいずれもテール配列中に使用できるが、ハイブリダイズする配列は約５〜５０ヌクレオチド残基の長さに及ぶことが好ましい。特に好ましいテール配列は実質的にホモポリマー状であり、約１０〜約４０ヌクレオチド残基を含み、約１４〜約３０残基がより好ましい。本発明の捕獲オリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドと特異的に結合する第１の配列と、固体支持体に固定されているオリゴ（ｄＴ）ストレッチと特異的に結合する第２の配列とを含み得る。
【００６１】
図１に示される成分を用いる、生体サンプルにおいて核酸配列を検出するための１つのアッセイは、捕獲オリゴヌクレオチドを用いて標的核酸を捕獲するステップと、少なくとも２種の増幅オリゴヌクレオチドまたは少なくとも２種のプライマーを用いて捕獲された標的領域を増幅するステップと、まず、標識されたプローブを増幅された核酸中に含まれる配列とハイブリダイズさせ、次いで、結合している標識されたプローブに起因するシグナルを検出することによって増幅された核酸を検出するステップとを含む。
【００６２】
捕獲ステップは、捕獲オリゴヌクレオチドを用いることが好ましく、これではハイブリダイジング条件下では、捕獲オリゴヌクレオチドのある部分が標的核酸中の配列と特異的にハイブリダイズし、テール部分が結合対の１つの成分、例えば、リガンド（例えば、ビオチン−アビジン結合対）として働き、これによって標的領域がサンプルのその他の成分から分離されることが可能となる。捕獲オリゴヌクレオチドのテール部分は、固体支持体粒子に固定されている相補配列とハイブリダイズする配列であることが好ましい。まず、捕獲オリゴヌクレオチドと標的核酸を溶解して、溶液相ハイブリダイゼーション動力学を利用することが好ましい。ハイブリダイゼーションにより、捕獲オリゴヌクレオチドのテール部分と、相補的な固定された配列とのハイブリダイゼーションによって固定されたプローブと結合できる捕獲オリゴヌクレオチド：標的核酸複合体が生じる。したがって、ハイブリダイゼーション条件下で、標的核酸と、捕獲オリゴヌクレオチドと、固定されているプローブとを含む複合体が形成される。固定されたプローブは、繰り返しの多い配列であることが好ましく、テール配列と相補的であり、固体支持体と結合されている、ホモポリマー状配列（例えば、ポリ−Ａ、ポリ−Ｔ、ポリ−Ｃまたはポリ−Ｇ）がより好ましい。例えば、捕獲オリゴヌクレオチドのテール部分がポリＡ配列を含む場合には、固定されたプローブはポリＴ配列を含むが、いずれの組み合わせの相補配列も使用できる。捕獲オリゴヌクレオチドはまた、標的とハイブリダイズする塩基配列と、固定されたプローブとハイブリダイズするテールの塩基配列の間に位置する１個以上の塩基である、「スペーサー」残基も含み得る。固体支持体はいずれも、標的核酸：捕獲オリゴヌクレオチド複合体を結合するために使用できる。有用な支持体は、マトリックスまたは溶液中で遊離型の粒子のいずれか（例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレン、および好ましくは、磁力によって引き寄せられる粒子）であり得る。固定されるプローブを固体支持体と結合する方法は周知である。支持体は、標準法（例えば、遠心分離、磁性粒子の磁力など）を用いて溶液から回収できる粒子であることが好ましい。好ましい支持体としては、常磁性単分散粒子（すなわち、サイズが均一±約５％）がある。
【００６３】
標的核酸：捕獲オリゴヌクレオチド：固定されたプローブ複合体を回収することにより、標的核酸を効率的に濃縮し（生体サンプル中のその濃度と比べて）、生体サンプル中に存在し得る増幅阻害剤から標的核酸を精製する。捕獲された標的核酸は１回以上洗浄し、例えば、洗浄溶液に、結合している標的核酸：捕獲オリゴヌクレオチド：固定されたプローブ複合体を含む粒子を再懸濁し、次いで、上記のように洗浄溶液から、結合している複合体を含む粒子を回収することによって標的をさらに精製してもよい。好ましい実施形態では、捕獲ステップは、捕獲オリゴヌクレオチドを標的核酸と逐次的にハイブリダイズさせ、次いで、ハイブリダイゼーション条件を調整して、捕獲オリゴヌクレオチドのテール部分と固定された相補配列とのハイブリダイゼーションを可能にすることによって起こる（例えば、ＰＣＴ番号ＷＯ９８／５０５８３に記載されるとおり）。捕獲ステップおよび何らかの任意の洗浄ステップが完了した後、次いで、標的核酸を増幅することができる。処理ステップの数を制限するために、場合により、標的核酸を捕獲オリゴヌクレオチドから放出させずに増幅することができる。
【００６４】
有用な捕獲オリゴヌクレオチドは、ミスマッチ配列が、増幅されようとする配列を含む核酸とハイブリダイズする限りは、上記で示される配列に対してミスマッチを含み得る。
【００６５】
有用な増幅法
本発明に関連して有用な増幅法としては、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、ヌクレイック・アシッド・シークエンス−ベースド・アンプリフィケーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ストランド・ディスプレイスメント・アンプリフィケーション（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）および自己複製ポリヌクレオチド分子および複製酵素、例えば、ＭＤＡ−１ＲＮＡおよびＱ−β酵素を用いる増幅法が挙げられる。これらの種々の増幅技術を実施する方法は、それぞれ、米国特許第５，３９９，４９１号、公開された欧州特許出願ＥＰ０５２５８８２、米国特許第４，９６５，１８８号、同５，４５５，１６６号、同５，４７２，８４０号およびＬｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７  （１９８８）に見出すことができる。核酸増幅反応を実施するための方法を説明するこれらの文書の開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６６】
本発明の好ましい実施形態では、標的核酸配列をＴＭＡプロトコールを用いて増幅する。このプロトコールによれば、ＤＮＡポリメラーゼ活性を提供する逆転写酵素はまた、内因性ＲＮアーゼＨ活性も保持する。この手順に用いられるプライマーの１種は、増幅される標的核酸の一方の鎖と相補的である配列の上流に位置するプロモーター配列を含む。増幅の第１のステップでは、プロモーター−プライマーが標的ＲＮＡと規定の部位でハイブリダイズする。逆転写酵素により、プロモーター−プライマーの３’末端から伸長することによって標的ＲＮＡの相補的ＤＮＡコピーが生じる。反対の鎖のプライマーと新規に合成されたＤＮＡ鎖との相互作用の後、逆転写酵素によって、ＤＮＡの第２の鎖がプライマーの末端から合成され、それによって二本鎖ＤＮＡ分子が生じる。ＲＮＡポリメラーゼは、この二本鎖ＤＮＡ鋳型中のプロモーター配列を認識し、転写を開始する。新規に合成されたＲＮＡアンプリコンは各々、ＴＭＡプロセスに再度入り、複製の新規ラウンドの鋳型として働き、それによって、ＲＮＡアンプリコンの指数増大がもたらされる。ＤＮＡ鋳型の各々は１００〜１０００コピーのＲＮＡアンプリコンを作製し得るので、この増大は、１時間未満で１００億個のアンプリコンの製造をもたらし得る。全プロセスは自己触媒的であり、一定温度で実施される。
【００６７】
キット
本発明はまた、アルカリショックに基づくサンプル調製手順を実施するために使用できるキットも包含する。本発明のキットは、分離しているバイアルまたは容器中に、溶解／捕獲試薬と、アルカリ性水酸化物とを含む。本発明の特定の実施形態では、これらの試薬のうち一方または両方とも、使用前に水などの液体成分で再構成され得る、乾燥した、凍結乾燥した、または半固体の組成物である。特定の高度に好ましい実施形態では、アルカリ性水酸化物組成物は、使用前に液体物質での再構成を必要とする。その他の実施形態では、アルカリ性水酸化物は、液体組成物としてキット中にパッケージングされている。溶解／捕獲試薬は、再構成が必要である場合には、再構成時にｐＨが８．０未満である、界面活性剤および緩衝液を含むことが好ましい。
【００６８】
本発明の好ましい実施形態
核酸増幅に基づくアッセイにおいて、ＲＮＡ標的の検出能を実質的に損なうことなくＤＮＡ標的の検出能を増強するための一般的な手順を確実に開発するために、その開示内容が参照により組み込まれる、公開された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／１８９９３の実施例７に本質的に記載されるモデルマルチプレックスアッセイを用いて本発明の特定の態様を作製した。ＲＮＡ標的（ＨＩＶ−１およびＨＣＶ）とＤＮＡ標的（ＨＢＶ）の双方を増幅できるこのアッセイは、ＨＢＶサブタイプＡ〜Ｃを増幅するために共通セットのプライマーを用いる。したがって、以下に記載される手順は、サンプル調製を変量として本質的に単離した。
【００６９】
本明細書に記載される手順に用いられるモデルアッセイは、すべて単一の試験管中で起こる３つの主なステップ：サンプル調製：ＨＩＶ−１またはＨＣＶ  ＲＮＡまたはＨＢＶ  ＤＮＡ標的増幅：ハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）による増幅産物（アンプリコン）の検出を含んでいた。サンプル調製の際に、標的捕獲の使用によって血漿試料からウイルスＲＮＡおよびＤＮＡを単離した。血漿を緩衝界面活性剤溶液と合わせて、試料に含まれる、ウイルスエンベロープの可溶化、タンパク質の変性ならびにウイルス粒子からのウイルスゲノムＲＮＡおよび／またはＤＮＡの放出を容易にする。アルカリ性水酸化物溶液のさらなる添加によって達成されるアルカリショックは、本発明の開発の間の試験ステップとして働く。簡単にするために、血漿試料と合わせた緩衝界面活性剤溶液は、「溶解／捕獲試薬」と呼んだ。ＨＩＶ−Ｉ、ＨＣＶおよびＨＢＶの保存された領域と相同であったオリゴヌクレオチド（捕獲オリゴヌクレオチド）を、試験試料中の、存在すれば、ＨＩＶ−ＩまたはＨＣＶ  ＲＮＡまたはＨＢＶ  ＤＮＡ標的とハイブリダイズさせた。次いで、ハイブリダイズした標的を磁性微粒子上に捕獲し、磁場においてバルク血漿から分離した。洗浄ステップを用いて、無関係な血漿成分を反応試験管から除去した。次いで、捕獲したウイルス核酸のいずれかをプライマー依存性インビトロ核酸増幅反応において鋳型として用いた。モデルアッセイにおける標的増幅は、ＴＭＡ、２種の酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写に基づく核酸増幅法によって生じた。モデルアッセイは、ＨＩＶ−Ｉ  ＲＮＡ、ＨＣＶ  ＲＮＡおよび／またはＨＢＶ  ＤＮＡの領域を増幅できた。アンプリコンの検出は、アンプリコンと相補的である一本鎖核酸プローブの混合物を用いるＨＰＡによって達成した。各核酸プローブは、化学発光標識を有し、アンプリコンの１種と特異的にハイブリダイズする。「選択」試薬は、ハイブリダイズしていないプローブ上の標識を不活化することによって、ハイブリダイズしているプローブとハイブリダイズしていないプローブ間を区別した。検出ステップの際、ハイブリダイズしているプローブによって生じた化学発光シグナルを、ルミノメーターで測定し、相対発光量（ＲＬＵ）として報告した。
【００７０】
アッセイ結果の整合性は、溶解／捕獲試薬の作用を介して、各試験試料に添加された内部対照（ＩＣ）、外部対照またはアッセイ校正試験管の使用によって確認した。この試薬中のＩＣは試料処理、増幅および検出ステップを制御した。各試験管またはアッセイ反応物中のＩＣシグナルは、異なる標識を含むプローブからの光発光の異なる動力学によってＨＩＶ−１／ＨＣＶ／ＨＢＶシグナルと区別した。ＩＣアンプリコンは、光を迅速発光（フラッシャーシグナルと呼ばれる）を有するプローブを用いて検出した。ＨＩＶ−１／ＨＣＶ／ＨＢＶに特異的なアンプリコンは、光発光の相対的に遅い動力学（グラウアシグナルと呼ばれる）を有するプローブを用いて検出した。当業者には理解されるであろうが、二重キネティックアッセイ（Ｄｕａｌ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ａｓｓａｙ）（ＤＫＡ）は、フラッシャー標識とグラウア標識からのシグナル間を区別するために用いられる標準法である。ＨＩＶ−Ｉ、ＨＣＶおよびＨＢＶの同時検出に用いられる場合は、モデルアッセイは、ＩＣと、合わせたＨＩＶ−１／ＨＣＶ／ＨＢＶシグナル間を区別したが、個々のＨＩＶ−Ｉ、ＨＣＶおよびＨＢＶシグナル間は区別しなかった。
【００７１】
アッセイ結果の解釈は、標的核酸の１種ならびにＩＣの検出を表すシグナルに依存した。より詳しくは、各アッセイに対して２つのカットオフ：分析物カットオフと呼ばれる分析物シグナル（グラウアシグナル）のためのものと、ＩＣカットオフと呼ばれる、ＩＣシグナル（フラッシャーシグナル）のためのものを決定した。各サンプルについて、分析物シグナルＲＬＵ値およびＩＣシグナルＲＬＵ値を求めた。分析物カットオフで除した分析物シグナルＲＬＵを、分析物シグナル／カットオフ、すなわち、「Ｓ／ＣＯ」と呼んだ。分析物カットオフ未満の分析物シグナル（すなわち、分析物Ｓ／ＣＯ＜１．００）を有するサンプルについては、結果が妥当であるには、内部対照（ＩＣ）シグナルは内部対照カットオフ（ＩＣカットオフ）以上でなくてはならない。この場合には、内部対照結果は妥当であると考えられ、サンプルは反応なしとして報告される。分析物カットオフ未満の分析物シグナル（すなわち、分析物Ｓ／ＣＯ＜１．００）および内部対照カットオフ未満の内部対照シグナルを有するサンプルについては、内部対照結果は妥当でないと考えられ、サンプル結果は妥当でない。すべてのサンプルについて、内部対照シグナルが４７５，０００ＲＬＵを超えることはない。このような場合には、サンプルは自動的に妥当でないと報告される。
【００７２】
上記で示したように、本発明を例示するために用いた増幅技術は、転写媒介性増幅であった。しかし、開示されたサンプル調製法は、当業者によく知られるいずれのインビトロ核酸増幅技術と併用してもよい。これは、発明された方法が、核酸増幅手順と独立している、溶解および標的捕獲ステップを改善する働きをするためである。
【００７３】
以下の実施例は、溶解／捕獲試薬のサンプルに、混合物の緩衝能を完全に越えることなく添加できるアルカリ性水酸化物溶液の量を実験的に定めた予備実験を説明する。この場合には、例示的緩衝界面活性剤溶液は、捕獲オリゴヌクレオチドおよび磁性ビーズを含んだＨＥＰＥＳ緩衝ラウリル硫酸リチウム溶液であった。これらの手順を用いて、ｐＨプロファイルのみを定め、核酸増幅は含まなかった。溶解／捕獲試薬のＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペリジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）成分のｐＫａは約７．５であり、従来、ｐＨ６．８〜８．２の範囲の緩衝溶液に用いられている。添加されるアルカリ溶液が最終ｐＨを以下に指定される範囲内に入れるような量で添加されるという条件で、ＨＥＰＥＳ以外の緩衝液を用いて、発明されたサンプル調製手順を実施できる。もちろん、緩衝界面活性剤溶液の出発ｐＨは、約ｐＨ６．５〜約８．０の範囲を意味するほぼ中性〜わずかにアルカリ性であることが好ましく、約ｐＨ７．０〜約８．０がより好ましく、または約ｐＨ７．０〜約７．５がさらにより好ましい。
【実施例】
【００７４】
実施例１は、添加された血漿サンプルを含んでいたか、または含んでいなかったＨＥＰＥＳ緩衝界面活性剤溶液へのアルカリ性水酸化物溶液の添加の効果を説明する。この手順から得た結果は、種々の量の水酸化物溶液を用いて生じた混合物の最終ｐＨを求めるための経験的基礎を提供した。
【００７５】
（実施例１）
血漿サンプルを含む緩衝界面活性剤溶液へのアルカリ添加のｐＨ効果の測定
溶解／捕獲試薬（すなわち、緩衝界面活性剤溶液）のアリコート（４００μｌ）をプラスチック反応試験管に分配した。溶解／捕獲試薬は、可溶性捕獲オリゴヌクレオチドと、ポリ−（ｄＴ１４）と共有結合している約４０μｇの０．７〜１．０５μ常磁性粒子（Ｓｅｒａｄｙｎ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）とを含んでいた。捕獲オリゴヌクレオチドは、粒子結合型ポリ−（ｄＴ）と、およびＨＢＶサブタイプ−Ａ、−Ｂまたは−Ｃの核酸と同時ハイブリダイズできた。溶解／捕獲試薬は、ＨＩＶ−１内部増幅コントロール鋳型と、ＨＩＶ−ＩおよびＨＣＶ特異的捕獲オリゴヌクレオチドと、約８００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．５）と、約１０％重量／容積ラウリル硫酸リチウムとをさらに含んでいた。また、反応試験管の半分には、フィブリンを含まない処理対照血漿のアリコート（５００μｌ）を加えた。次いで、これらの試験管に、１．０〜２．５Ｎの範囲の濃度を有するＮａＯＨ溶液の１００μｌのアリコートを加えた。溶解／捕獲試薬、または溶解／捕獲試薬と血漿サンプルを合わせたものを含有する１セットの試験管を、ＮａＯＨ溶液のアリコートを加えなかった対照として用意した。すべてのサンプルを、機械的ボルテクサーを用いて混合し、得られた混合物のｐＨ値は、ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  （Ｃｈｅｓｔｅｒ，  ＰＡ）製のモデル９１００ｐＨメーターを用いて測定した。これらの手順から得られた結果を表１に示す。
【００７６】
【化１】
2008529553.tif 000002
表１に示される結果は、２．２Ｎ以上の濃度を有するＮａＯＨ溶液１００μｌの添加は、血漿サンプルが加えられていようがいまいが、緩衝界面活性剤溶液の緩衝能を超え始めたことを示した。これは、２．２Ｎ以上のＮａＯＨの濃度を用いた場合のみ、混合物の最終ｐＨを１ｐＨ単位を超えて高めたという知見に基づくものであった。これらの結果は、インビトロ増幅反応においてＤＮＡ標的を検出する能力に対する、添加されたアルカリの効果の定量化を目的としたさらなる研究のための基礎を提供し、また、手順を、高ｐＨという条件下では加水分解に付され得るＲＮＡ標的の使用に適応させるのに有用な手引きを提供した。
【００７７】
以下の実施例により、可変量の添加されたアルカリが、ウイルス溶解と、放出された核酸の捕獲と、増幅と、検出ステップとを含む、インビトロ増幅システムにおけるＨＢＶサブタイプ−Ｂの検出にどのように影響を及ぼしたかを説明する。この手順では、モニターされたアッセイパラメーターは、検出の陽性％と、ＣＶ（変動の係数）％と、平均定量的シグナル強度（相対発行量、すなわち、「ＲＬＵ」で測定した）を含んでいた。当業者には理解されるであろうが、低ＣＶ％値が高レベルのアッセイ精度を示すことが有利であり、そして極めて好ましい。
【００７８】
実施例２は、インビトロ核酸増幅反応を実施するのに先立って、ウイルス含有血漿と、溶解／捕獲試薬との混合物に添加できる有用な量のアルカリを規定する手順を説明する。
【００７９】
（実施例２）
アルカリショックを含むサンプル調製はアッセイ性能を向上させる
プラスチック反応試験管中で、実施例１に記載された溶解／捕獲試薬のアリコート４００μｌを、ＨＢＶサブタイプ−Ｂに感染した個体から得た血漿サンプル５００μｌと合わせた。対照試験管は、ウイルス陽性サンプルの代わりにウイルス陰性血漿を含んでいた。この手順においてウイルス鋳型の供給源として用いたすべての血漿サンプルは、ウイルス陰性処理対照血漿で１：３希釈されていた。次いで、種々の濃度のＮａＯＨ溶液のアリコート１００μｌを、溶解／捕獲試薬と血漿を合わせたものを含む種々の試験管に添加した。この手順に用いたアルカリ溶液は、０．０５〜２．５Ｎの範囲のＮａＯＨ濃度を有していた。対照試験管は、ＮａＯＨ溶液の代わりに水を含んでいた。混合物を短時間ボルテックス処理して確実に混合し、６０℃で約２０分間加熱し、次いで、室温に１５分間冷却し、ハイブリダイゼーションおよび標的捕獲を可能にした。Ｗａｎｇによって米国特許第４，８９５，６５０号に記載されたものなどの手順を用い、磁場を加えて、固定された捕獲オリゴヌクレオチドと、ＨＢＶ  ＤＮＡを含む粒子複合体を集めた。次いで、１ｍｌの洗浄緩衝液（ｐＨ７．５の１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、６．５ｍＭ  ＮａＯＨ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３％（ｖ／ｖ）エタノール、０．０２％（ｗ／ｖ）メチルパラベン、０．０１％（ｗ／ｖ）プロピルパラベン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸ナトリウム）で粒子を２回洗浄した。洗浄した粒子を、７５μｌの増幅試薬に再懸濁し、蒸発を防ぐために、試験管の内容物を不活性オイルで表面を覆った。増幅試薬は、塩、ヌクレオチド、リボヌクレオチド、ＨＢＶ特異的プライマーならびにＨＩＶ−１およびＨＣＶ標的配列を増幅できるプライマーを含んでいた。短時間ボルテックス処理した後、混合物をまず６０℃で１０分間インキュベートしてプライマーアニーリングを促進し、次いで、４１．５℃で１０分間平衡にした。次いで、予め加温した、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素（５，６００ユニット／反応物）と、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（３，５００ユニット／反応物）とを含む酵素試薬のアリコートを混合物に添加した。４１．５℃で１時間インキュベートした後、反応が完了し、公開された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／１８９９３の実施例１のもとで本質的に説明される均一保護アッセイにおいてアクリジニウムエステル標識したハイブリダイゼーションプローブを用いてＨＢＶ増幅産物を検出した。内部対照アンプリコンに特異的なプローブと、またはＨＢＶアンプリコンに特異的なプローブとハイブリダイズした場合に、陽性シグナルを生じた反応を、有効な実施として記録した。有効な実施を、ＨＢＶアンプリコンの存在について陽性と考えるには、アッセイにおいて、プローブハイブリダイゼーションを示す化学発光シグナルが５０，０００ＲＬＵを超えなくてはならない。これらの手順から得られた結果を表２および図２Ａ〜２Ｃに示す。
【００８０】
【化２】
2008529553.tif 000003
これらの手順から得られた結果は、アルカリショックステップを含むサンプル調製は大幅に改善されたアッセイ性能をもたらしたことが有利であると示した。アルカリショックステップの性質によってのみ異なっているすべてのアッセイによって、アルカリショックの使用によって達成可能な利益は、この手順に用いられる特定のオリゴヌクレオチドに依存しないことが確認されたという事実が注目される。実際、ＮａＯＨ溶液の代わりに水のアリコートを加えた対照試験は、相対的に低い陽性レベル％と、望ましくない高ＣＶ％値を示した。逆に、０．１〜２．２Ｎの範囲の濃度を有するＮａＯＨ溶液を用いて実施したアルカリショックは大幅に高い陽性レベル％と、ＣＶ％値の低下によって判断される高い精度を示した。
【００８１】
これらの結果がまた、アルカリショック手順において使用できる最適範囲の水酸化物濃度についての証拠を提供したことは重要である。より詳しくは、データは、最高濃度のＮａＯＨの使用は、アッセイ性能を陽性％がゼロに低下する点まで実質的に損なうことを示した。この量の水酸化物溶液は、溶解／捕獲試薬と、血漿サンプルを混合した場合に、１２．６という最終ｐＨをもたらした（表１参照のこと）。したがって、１２．６という最終ｐＨをもたらすのに十分なアルカリ性水酸化物量を添加することは、アッセイの、標的を検出する能力をなくす。逆に、最終ｐＨを、約８．０〜約１０．６の範囲に上昇させるのに十分な量のＮａＯＨ溶液の添加が良好な結果を示した。この実験では、最終ｐＨを約８．３〜約８．８の範囲に上昇させるのに十分な量のＮａＯＨ溶液を添加することによって最良の結果が達成された。この範囲は、以下の実施例８において定められるｐＨ８．２〜９．２という好ましい範囲とほぼ同一であったことが注目される。これらの範囲は、生体サンプルを含有する緩衝界面活性剤溶液への、適当な量のアルカリ溶液、好ましくは、アルカリ性水酸化物溶液の添加から得られる好ましいｐＨ範囲を規定する。
【００８２】
以下の手順は、アッセイ感度の改善を達成するには、一時的な高ｐＨ（すなわち、「アルカリショック」）が必要であるということを証明した。この実施例では、３種の試薬を合わせる順序を変えて、本明細書に記載される有益な効果がサンプルの最終ｐＨの変更に起因するのか、または異なる機構に起因するのかを調べた。
【００８３】
実施例３は、アルカリ条件への一時的な曝露に由来するアルカリショック法の有益な効果を証明した手順を説明する。
【００８４】
（実施例３）
アッセイ性能を改善するには一時的なアルカリショックが必要である
異なる順序で３種の試薬（アルカリ性水酸化物、血漿サンプルおよび溶解／捕獲試薬）を合わせることを含んでいたサンプル調製法を用いて、観察されたアッセイ改善の根底にある作用機序に取り組んだ。手順に用いた試薬およびその量は、溶解／捕獲試薬４００μｌ、ＨＢＶサブタイプ−Ｂウイルス粒子を含有する血漿サンプル（すなわち、ウイルス陰性処理血漿で１：１０希釈した、ヒトドナーから得たウイルス感染血漿）５００μｌおよび１．６Ｎ  ＮａＯＨ１００μｌとした。アルカリ性水酸化物溶液の濃度は、前記の実施例において良好な結果をもたらしたものの範囲内であるので選択した。すべての試薬は、プラスチック反応試験管にピペットで入れ、標的捕獲、増幅および検出は、前記の実施例に記載されたとおりに実施した。１：１０希釈したＨＢＶ陽性血漿と、溶解／捕獲試薬とを用い、ＮａＯＨを全く添加せずに実施した対照反応は、４０％の陽性反応性を示し、それによって、比較基準を規定した。表に列挙される条件のすべてについて、ＨＢＶ陽性血清サンプル（表２中「ＨＢＶサンプル」）の代わりにＨＢＶ陰性血漿を用いて実施した陰性対照反応は、予想されるとおり、増幅および検出反応において陽性反応性０％を一様に示した。１：１０希釈されたサンプルの代わりに、１：２０希釈されたＨＢＶ陽性血漿サンプルを用いて実施した手順は、表３に示されるものと一致した結果を示した。各試験条件（ｎ＝１０）についての３種の試薬の添加順序を表に示す。
【００８５】
【化３】
2008529553.tif 000004
表３の結果は、試薬添加の順序がアッセイ結果に大いに影響を及ぼすことを示した。まず、溶解／捕獲試薬とアルカリ性水酸化物溶液を、反応試験管へのこれらの試薬の添加順序にかかわらず、互いに合わせることは、アルカリショックを省いた対照と同様の結果をもたらした。したがって、溶解／捕獲試薬とアルカリ性水酸化物をすでに合わせた後に、ウイルス含有サンプルを添加することによっては、陽性％によって測定可能な利益は全くもたらされなかった。逆に、まず、溶解／捕獲試薬とＨＢＶウイルス粒子を含有するサンプルを合わせること（いずれかの順序で）と、その後、アルカリ性水酸化物溶液をその混合物と合わせることとによって優れた結果が達成された。この高度に好ましい添加順序によって濃水酸化物溶液への生体サンプルの直接曝露を避けられることは有利であり、そのようにして、ＲＮＡ鋳型のアルカリ加水分解を最小にするはずであることも有利である。
【００８６】
いずれかの特定の動作理論に拘束されようとは思わないが、前記結果は、溶解／捕獲試薬とウイルスサンプルとを含有する反応試験管内の局所的、一時的高ｐＨが、本明細書に開示された有利な点をもたらすいくつかの効果を有していたという機構を支持する。技術の成功は一時的な高ｐＨ曝露に起因するものであるので、本明細書に開示される方法を「アルカリショック」と名づけた。
【００８７】
上記で示される結果はまた、反応混合物の最終ｐＨ（実施例１に記載される）を用いて、良好な結果が生じるのに必要とされるアルカリ溶液の量を判断できることを示したが、混合物の最終ｐＨは手順の成功を予測でするものではなかった。実際、混合物の最終ＰＨがアッセイの結末を決定するならば、表３に示される試験条件のすべてが同一の結果をもたらすが、それは事実ではなかった。したがって、本発明の好ましい実施様式は、ｐＨ緩衝液と、界面活性剤と、特定の核酸の存在について試験されようとする生体サンプルとを含むサンプルにアルカリ溶液を添加するステップ含む。高度に好ましい実施形態では、生体サンプルは、体液、例えば、全血、血漿、血清などである。
【００８８】
以下の実施例は統計分析を用い、サンプル調製手順の間にアルカリショックを含めることによって種々のＨＢＶサブタイプについてのアッセイ感度がどのように改善されるかを測定した。この実証の目的上、本質的に、公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／１８９９３の実施例７のもとで開示されるマルチプレックスアッセイは、唯一の本質的差異はサンプル調製手順の間のアルカリショックステップの付加である状態で用いた。
【００８９】
実施例４は、アルカリショック技術が複数のＨＢＶサブタイプについて定量的アッセイ性能をどのように改善したかを説明する。
【００９０】
（実施例４）
アルカリショック技術の効果の定量化
既知量のＨＢＶサブタイプ−Ａ、−Ｂまたは−Ｃウイルス粒子を含有する血漿サンプルのパネルを、当業者によく知られる方法によって製造した。サンプルは、プラスチック反応試験管中で溶解／捕獲試薬４００μｌと個々のパネルメンバー５００μｌをまず合わせ、１．６Ｎ  ＮａＯＨ１００μｌを添加し、その後、試験管を撹拌して混合を確実に完了させるアルカリショックプロトコールを用いて調製した。標的捕獲、増幅および増幅産物の検出は、上記の通りに実施した。アルカリショック手順を省いた対照反応を平行して実施した。ＳＡＳ（登録商標）システムソフトウェア（バージョン８．０２）（Ｃａｒｙ，ＮＣ）においてプロビット関数を用いる回帰分析を用いて、９５％および５０％検出レベルを算出した。妥当でない反応は再試験せず、分析感度の解析に含めなかった。これらの手順から得られた結果を図３Ａ〜３Ｃに示し、プロビット分析は表４に要約する。
【００９１】
【化４】
2008529553.tif 000005
表４に要約された結果により、アルカリショック手順は、少し違う程度にではあるが、ＨＢＶの３種のサブタイプすべての検出能を増強することが確認された。アルカリショックを用いなかった従来手順を用いると、９５％検出確率でのサブタイプ−Ｂウイルスのアッセイ感度は、その他のサブタイプよりも約１６倍低かった。標的捕獲および増幅の前にアルカリショック手順を組み込んだ、改善されたサンプル調製法を用いると、１００コピー／ｍｌより低いレベルのサンプルですべてのサブタイプが検出され得るまでにアッセイ性能を著しく改善した。アルカリショックサンプル調製法はサブタイプ−Ｂウイルスのアッセイ感度を最も大幅に改善したことが興味深い。この異なった改善は、この提示の前には予測され得なかったことであり、発明された方法の効果の基礎をなす機構に関する洞察を提供し得る。
【００９２】
前記の実施例に示された結果は、サンプル調製手順の間の一時的なアルカリショックはその後の核酸標的の検出を大幅に改善することを示した。以下の実施例に記載される試験は、この改善の基礎をなす機構に取り組んだ。より詳しくは、溶解／捕獲試薬と生体サンプルの混合物へのアルカリ性水酸化物溶液の添加が、サンプル中のタンパク質および核酸に対する変性作用のみを有し、それによって、その後の増幅および検出に対するウイルス核酸のアベイラビリティーを高めたかどうかを調べるために実験を実施した。アルカリ条件はタンパク質および核酸を変性させることがわかっているが、以下に示される結果は、本明細書に記載された手順によって観察された有益な結果はアルカリ変性によって十分に説明されないということを示した。
【００９３】
実施例５は、アルカリショック現象は、タンパク質および／または核酸のアルカリ変性によって主として媒介されるわけではないということを証明した手順を説明する。
【００９４】
（実施例５）
アルカリショックはアルカリと界面活性剤の合わせた効果を必要とする
０％、５％または１０％のいずれかのラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）界面活性剤を含むよう特殊化した溶解／捕獲試薬を調製した。本明細書に記載されるすべてのその他の場合の溶解／捕獲試薬は１０％ＬＬＳを用いて調製したことは注目される。まず、１種の標的捕獲試薬のアリコート（４００μｌ）を、ＨＢＶサブタイプ−Ｂに感染した患者から得られた血清サンプルの１：１０希釈物のアリコート（５００μｌ）と合わせた。すべての試験は、約１００コピーのＨＢＶゲノムを含んでいた。その後、アルカリ性水酸化物で処理される予定の試験には、１．６Ｎ  ＮａＯＨ１００μｌを加え、短時間ボルテックス処理した。対照試験にはＮａＯＨ溶液の代わりに１００μｌの水を加えた。標的捕獲、増幅および増幅産物の検出は、上記のとおりに実施した。すべての試験は、１０の複製で実施した。これらの手順から得られた結果を表５に示す。
【００９５】
【化５】
2008529553.tif 000006
表５に示される結果は、アルカリショックを達成するには界面活性剤とアルカリを合わせることが必要とされることを示した。実際、界面活性剤を省いた溶解／捕獲試薬を用いて調製したサンプルは、アルカリ性水酸化物を加えた試験においてでも、ＨＢＶ検体を検出できなかった。したがって、指定のｐＨ条件下での界面活性剤の不在下でのアルカリでの処理は良好な結果を生じるのに十分ではなかった。このことは、アルカリショックが達成される機構は、完全にタンパク質および核酸のアルカリ媒介性変性によるものではないということを示した。そうではなく、生体サンプルを緩衝液および界面活性剤とまず合わせるステップと、その後、アルカリ性水酸化物を添加するステップとを必要とする相乗効果があった。
【００９６】
ＤＮＡ標的のモデル供給源としてＨＢＶ粒子を用いて実施した手順に加えて、さらなる実験を実施して、ＲＮＡ標的に対するサンプル調製の間のアルカリショックの効果を調べた。前記の実施例におけるのと同様、ＨＩＶ−１、ＨＣＶおよびＨＢＶ核酸を増幅および検出できるマルチプレックスアッセイを用いてＲＮＡ標的に対するアルカリショックの効果を調べた。実際、加水分解に対するＲＮＡの既知の感度は、アルカリショック手順は、増幅および検出に先立つＤＮＡ標的の単離に関連して有用であるだけであるということを示唆した。
【００９７】
実施例６は、ＲＮＡ標的が、アルカリショックを含んでいた手順で調製した核酸鋳型を用いて増幅および検出され得なかったことを実証した手順を説明する。
【００９８】
（実施例６）
ＨＩＶ−１およびＨＣＶの検出に対するアルカリショックの効果
既知量の、以下のＲＮＡウイルスのうちの１種を有する血漿サンプルのパネルを標準法によって作製した：ＨＣＶ−１ａ、ＨＣＶ−２ｂおよびＨＩＶ−１ｂ。サンプルは、まず、プラスチック反応試験管中で、溶解／捕獲試薬４００μｌと個々のパネルメンバー５００μｌを合わせ、１．６Ｎ  ＮａＯＨ１００μｌを添加し、その後、試験管を撹拌して混合を確実に完了させるアルカリショックプロトコールを用いて調製した。標的捕獲、増幅および増幅産物の検出は、増幅手順の終わりで適当な検出プローブを用い、上記のとおりに本質的に実施した。アルカリショック手順を省いた対照反応を平行して実施した。最高のウイルス力価を用いて実施した試験を除き、すべての反応は、２０の複製を用いて実施した。３００コピー／ｍｌの血漿サンプルの同等物を用いて実施した反応は、１０の複製を用いて行った。これらの手順から得られた結果を表６〜８に、および図４Ａ〜４Ｃに要約する。表９は、表６〜８のデータのプロビット解析から得られた結果を示す。
【００９９】
【化６】
2008529553.tif 000007
【０１００】
【化７】
2008529553.tif 000008
表６〜８に、および図４Ａ〜４Ｃに示される結果は、ＲＮＡウイルスの存在について試験されているサンプルのアルカリショック処理の効果はいずれも、極めて小さいことを示した。例えば、ＨＣＶ−１ａのアッセイ感度はわずかに増加すると思われたが、ＨＣＶ−２ｂおよびＨＩＶ−１ｂの感度はわずかに低下した場合があった。極めて低いウイルス力価でのみ記載されたこれらの相違が、統計上有意であったかどうかは不明確であることは注目される。全体的に、結果から、アルカリショックは、ＲＮＡおよびＤＮＡ標的を単離するための単一のサンプル調製手順に統合され得ることが確認された。処理が、ＤＮＡ標的の実質的な濃縮を提供するのに適当でありながら、ＲＮＡ標的のその後の検出を可能にするのに十分なほど穏やかであり得るということは幾分か驚くべきことであった。
【０１０１】
【化８】
2008529553.tif 000009
表９に示される、表にされた、プロビット解析から得られた結果は、アルカリショック処理はＲＮＡ標的の検出能を実質的に損なわないということを示した。したがって、ＨＢＶサブタイプ−Ｂ核酸の検出を増強した同一のアルカリショック条件はＲＮＡ標的の検出を実質的に損なわなかった。
【０１０２】
前記の実施例は、アルカリショックを組み込んだサンプル調製手順を用いて、ＤＮＡ鋳型の他にＲＮＡ鋳型を単離できることを実証した。ＲＮＡはアルカリ条件下で加水分解を受けることがわかっているので、この結果は幾分か驚くべきことであった。以下の実施例によって、既知量のＨＩＶ−Ｏビリオンを含有する生体サンプルを、ｐＨ緩衝液および界面活性剤の添加に先立って、アルカリ性水酸化物とまず合わせるよう、サンプル調製手順が変更された場合にこの感受性が確認された。
【０１０３】
実施例７は、アルカリ処理の、ＲＮＡ標的の完全性に対する効果を評価するために続けた手順を説明する。これらの手順から得られた結果は、ＲＮＡ加水分解は、ＨＩＶ−Ｏビリオンを含有する生体サンプルとアルカリ性水酸化物溶液間を接触させた後極めて迅速であることを示した。
【０１０４】
（実施例７）
試薬添加順序はＲＮＡ完全性に大きく影響を及ぼす
ＨＩＶ−Ｏビリオンを含有する血清サンプルを、ウイルス陰性血清を用いて既知力価に希釈した。ビリオン含有血清（すなわち、３０コピー／ｍｌを含有）のアリコート（５００μｌ）を、まずプラスチック反応試験管に入れた。その後、１．８Ｎ  ＬｉＯＨのアリコート１００μｌを添加し、この試験管を可変の期間静置させた。次いで、溶解／捕獲試薬のアリコート（４００μｌ）を添加し、短時間ボルテックス処理した。アルカリ性水酸化物溶液とｐＨ緩衝界面活性剤溶液（すなわち、溶解／捕獲試薬）の添加間の遅延時間は、０分〜１時間の範囲とした。残存するＲＮＡ鋳型を、本質的に上記のとおりに捕獲、増幅および検出した。この手順におけるｐＨ緩衝溶解／捕獲試薬は、内部増幅対照として働く合成ＨＩＶ−１転写物を含んでいたことが注目される。すべての試験は、１０の複製で実施した。
【０１０５】
【化９】
2008529553.tif 000010
表１０に示される結果は、ＨＩＶ−Ｏ  ＲＮＡ標的の加水分解は、アルカリ性水酸化物溶液がｐＨ緩衝液の不在下で生体サンプルに添加された場合に極めて迅速であることを示した。予備試験から得られた結果が、ＨＩＶ−Ｏ標的は、アルカリ性水酸化物が手順から省かれるか、ウイルス含有サンプルを、まず、溶解／捕獲試薬（すなわち、ＰＨ緩衝界面活性剤溶液）と合わせた後に添加された場合のいずれかで、３０コピー／ｍｌレベルで１００％の効率で検出されることを示したことは注目される。表に示されるように、ウイルス含有血清をアルカリ性水酸化物溶液と混合し、その後直ちに、ｐＨ緩衝液を含む溶解／捕獲試薬の添加によって中和した場合には、１０の複製のうち１しか検出可能なＲＮＡ鋳型を生じなかった。アルカリ処理ウイルスサンプルへのｐＨ緩衝溶液の添加間の遅延を最大１時間に延ばしたその他の時点からもまた、検出可能なＲＮＡ鋳型は得られず、そのため表から省かれている。すべての試験が妥当であると考えられたという事実から判断される、ＲＮＡ内部対照が手順で残存したという事実が予想された。総合すると、これらの結果から、ｐＨ緩衝液の添加に先立って、ＲＮＡ標的を含有する生体サンプルを、アルカリ性水酸化物溶液と混合することによって、ＲＮＡ鋳型の完全性が完全に損なわれたということが確認された。他方、アルカリ性水酸化物溶液との混合に先立って、まず、ＲＮＡ鋳型をｐＨ緩衝液と合わせることによって鋳型の完全性が保たれた。
【０１０６】
アルカリショックを組み込んだ共通サンプル調製法を用いるマルチプレックスアッセイにおいてＲＮＡおよびＤＮＡ標的が検出され得るという成果を考えると、最終アッセイ性能に対する、サンプル調製手順の間のｐＨの効果をより十分に調査することは興味深いことであった。以下に示されるように、サンプル調製手順に用いたアルカリ性水酸化物の量が、９．５を超える最終ｐＨをもたらした場合には、アッセイは不十分に実施された。以下の実施例に記載される手順が、アルカリショックを達成するためにＮａＯＨの代わりにＬｉＯＨを用い、また、手順において用いられるアルカリ性水酸化物の同一性はサンプル調製法の成功にとって重大なことではないと示したことは注目される。
【０１０７】
実施例８は、アルカリショックに基づくサンプル調製手順を実施するのに有用なｐＨ範囲の上限を調べるために続けた手順を説明する。
【０１０８】
（実施例８）
アルカリショックを実施するために用いられるアルカリ性水酸化物の量の最適化
ＲＮＡまたはＤＮＡウイルス標的を含有する生体サンプルを、モデルマルチプレックスアッセイにおいて試験し、サンプル調製手順の間に、ウイルス含有血漿または血清サンプルと、緩衝界面活性剤溶液（すなわち、溶解／捕獲試薬）と、アルカリ性水酸化物とを含む混合物の最終ｐＨによってアッセイ性能がどのように影響を受けるかを調べた。この手順では、１．６Ｎ  ＮａＯＨの代わりに１．９Ｎ  ＬｉＯＨを用いてアルカリショックを達成した。種々の量のＬｉＯＨ溶液の添加に起因する最終ｐＨを調べるための予備手順を、３の複製で実施し、それらの読み取り値から平均ｐＨを求めた。これらの予備手順では、溶解／捕獲試薬４００μｌを、ウイルス陰性血清５００μｌおよび種々の容積の１．９Ｎ  ＬｉＯＨと合わせ、混合物の最終ｐＨを上記の通り調べた。試験した生体サンプルは、（１）３０コピー／ｍｌのウイルスＲＮＡの相当物を含有するＨＩＶ−１Ｏ群陽性血漿、（２）３０コピー／ｍｌのウイルスＲＮＡの相当物を含有するＨＣＶ−１ａ陽性血漿、（３）２００コピー／ｍｌ未満のレベルにウイルス陰性対照血清に希釈したＨＢＶサブタイプＢ。この手順ではウイルス陰性血清は対照として働いた。すべての例において、生体サンプルをまず、溶解／捕獲試薬と合わせ、アルカリ性水酸化物溶液のアリコートを添加し、その後混合した。増幅および検出手順の後、妥当なおよび妥当でない実施の数を記録し、陽性反応性試験を妥当な実施のパーセンテージとして求めた。すべての反応は、１０の複製を用いて実施した。個々の手順は本質的に同様の方法を含んでいたが、サンプル調製ステップの間にわずかに異なるｐＨ範囲をもたらす量でのＬｉＯＨの添加を中心に考え、ＨＢＶサブタイプＢ含有血清サンプルと、ＨＢＶサブタイプＣ含有血清サンプルと、ＨＩＶ−１Ｏ群陽性血漿とを試験した。これらの手順から得られた結果を表１１および１２に要約する。
【０１０９】
【化１０】
2008529553.tif 000011
【０１１０】
【化１１】
2008529553.tif 000012
表１１に示される結果により、試験したすべてのｐＨレベルでＨＢＶが検出され得ることが確認され、ＲＮＡ検体またはＲＮＡ内部対照を含むアッセイの有用なｐＨ範囲の上限を設定した。より詳しくは、表１１は、ＨＢＶサブタイプ−Ｂを標的として用いて反応を実施し、添加されたアルカリ性水酸化物のすべてのレベルで妥当な反応において１００％の検出能を示したことを示す。しかし、最高ｐＨ条件下では、ＨＢＶ検体について反応性試験の数は１／２より低く低下した。したがって、添加されるアルカリ性水酸化物の量がｐＨ１０を越えるｐＨをもたらす場合には、また、方法が、増幅に先立って検体核酸を捕獲するステップを含む場合には、アルカリショックに基づくサンプル調製を実施することはあまり好ましくない。ＲＮＡ標的を検出するよう設計されたアッセイまたはＲＮＡを含む、コントロールまたは標準物質に依存するアッセイは、ＤＮＡ標的を用いる結果と比較した場合に、ｐＨ条件に対して明らかに異なる感度を示した。アルカリショックを達成するために用いたアルカリ性水酸化物の量が、９．５以上の最終ｐＨを有する混合物をもたらした場合、９．２以下の最終ｐＨ条件を用いて実施した試験の結果と比較して、妥当でない実施数は著しく増大した。さらに、陽性％結果が、ＨＩＶ−１  Ｏ群およびＨＣＶ−１ａ  ＲＮＡ標的を用いて実施した試験は、混合物の最終ｐＨが９．２以下であった場合には、妥当な結果を生じた反応の１００％で検出されたことを示した。最終ｐＨが９．５であった場合には陽性％値は幾分か低下し、最終ｐＨが１０．７であった場合には全く損なわれた。いずれかの特定の動作理論に拘束されたいとは思わないが、これらの結果は、最終ｐＨが約９．５を超えた場合に、その後の増幅のために無傷の標的を捕獲する効率の低下と一致した。
【０１１１】
表１２に示される結果は、すべての実施は妥当であり、また、生体サンプルと、緩衝界面活性剤溶液（すなわち、溶解／捕獲試薬）の混合物に添加されたアルカリ性水酸化物の量が、約ｐＨ８．０から最大約ｐＨ１０未満の範囲内に入るｐＨをもたらすのに十分であった場合に、良好な結果が達成されたことを示した。添加されたアルカリ性水酸化物の量が、約８．０〜最大約８．７の範囲に入るｐＨをもたらすのに十分であった場合に優れた結果が達成された。表１２に現れる結果を生じた手順は、アルカリショックを達成するために使用できるアルカリ性水酸化物の上限を明確には設定していなかった。その決定は、表１１中の結果に基づいて行った。
【０１１２】
本明細書に示される集められた結果に基づき、緩衝界面活性剤溶液（すなわち、溶解／捕獲試薬）と、生体サンプル（例えば、血液、血漿または血清のサンプル）と、アルカリ性水酸化物とを含む混合物のｐＨに好ましい上限があった。より詳しくは、混合物中に用いられるアルカリ性水酸化物の量は、少なくともｐＨ８．０の最終ｐＨをもたらすことが好ましいが約ｐＨ１０．０を超えてはならない。特に、ＲＮＡ標的が捕獲および増幅される場合には、混合物中に用いられるアルカリ性水酸化物の量は少なくとも８．０の最終ｐＨをもたらすはずであることが好ましいがｐＨ９．５未満がより好ましい。混合物中に用いられるアルカリ性水酸化物の量は、少なくともｐＨ８．０の最終ｐＨをもたらすはずであること好ましいが、約９．２以下であるはずであること（すなわち、ｐＨ８．０〜９．２の範囲の最終ｐＨ）がさらにより好ましい。混合物中に用いられるアルカリ性水酸化物の量は、少なくともｐＨ８．０の最終ｐＨをもたらすはずであることが好ましいが、約ｐＨ８．７３以下（すなわち、ｐＨ８．０〜８．７３の範囲の最終ｐＨ）がさらにより好ましい。混合物中に用いられるアルカリ性水酸化物の量は、少なくともｐＨ８．０の最終ｐＨをもたらすはずであることが好ましいが、約ｐＨ８．６以下（すなわち、ｐＨ８．０〜８．６の範囲の最終ｐＨ）がなおさらにより好ましい。すべての場合において、生体サンプルと、緩衝液と、界面活性剤とを合わせたもの（すなわち、アルカリショックを達成するために用いられるアルカリ組成物の添加の前）が、６．５〜８．０の範囲に入るｐＨを有することが好ましく、ｐＨ７．０〜８．０の範囲がより好ましく、７．０〜約７．５の範囲がより好ましい。実際、生体サンプルと、緩衝液と、界面活性剤とを合わせたものが、ｐＨ６．５〜８．０の範囲に入るｐＨをもたらす場合、アルカリショックを達成するためのアルカリ組成物の添加が少なくとも０．２ｐＨ単位の増大をもたらす場合、およびアルカリショック後の混合物の最終ｐＨがｐＨ８．２〜９．２の範囲に入った場合、ＤＮＡおよびＲＮＡ鋳型の調製について優れた結果が達成された。
【０１１３】
前記の実証は、ＲＮＡおよびＤＮＡウイルスからの核酸の調製の間にアルカリショック技術を用いることの利益を中心に考えた。以下の実施例は、同一のアルカリショック技術が細菌からの核酸の調製にどのように拡張されたかを説明する。この例示では、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｉｃｃｙｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳ）のメンバーから核酸を調製した。当業者には理解されるであろうが、ＧＢＳ細菌は溶解するのが困難であることが知られている。したがって、以下に示される例示は、アルカリショックサンプル調製法の厳しい試験に相当し、本技術はいずれの細菌種からの核酸の調製にとっても有用であるということを示すものととることができる。
【０１１４】
実施例９では、細菌から核酸を調製および検出するために用いた手順を詳述する。この手順は、アルカリショックステップを含むか含まずに実施された、十分に統合された溶解、標的捕獲、増幅および検出プロトコールを含んでいた。これによって、細菌からの核酸鋳型の調製に関するアルカリショック手順の効果を単離した。インビトロ増幅は、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）プロトコールを用いて実施した。
【０１１５】
（実施例９）
細菌核酸の調製および検出
アルカリショック技術を用いるサンプル調製の効率を試験するのに、培養Ｓ．アガラクチア（ａｇａｌａｃｔｉａｅ）細菌を用いた。液体培養培地で一晩増殖させた細菌を、穏やかな遠心分離によって集め、次いで、ＰＢＳで１０回洗浄し、培養培地中に放出された可能性がある核酸の残りの痕跡を除去した。得られた細菌ペレットをＰＢＳに取り入れ、次いで、段階希釈した。種々の希釈物のアリコートを血液寒天プレート上に広げて正確な力価を調べた。サンプルの残りの部分を、アルカリショックを含むか含まない核酸の調製に用い、調製したサンプルをＴＭＡ増幅反応における核酸鋳型の供給源として用いた。プラスチック反応試験管中で、４ｐｍｏｌの配列番号１を有する捕獲オリゴヌクレオチドを、約４０μｇの、ポリ−（ｄＴ１４）と共有結合している０．７〜１．０５μ磁性粒子（Ｓｅｒａｄｙｎ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）とともに含有する溶解／捕獲試薬のアリコート（４００μｌ）を、既知数の生物を含有する希釈されたＧＢＳのアリコート（５００μｌ）と合わせる。捕獲オリゴヌクレオチドは、粒子結合型ポリ−（ｄＴ）と、または細菌ｒＲＮＡと同時ハイブリダイズできる。サンプルは、試験を受けている細菌の各レベルについて９の複製で調製した。対照試験管は、細菌細胞の代わりに１，０００コピーの精製細菌ｒＲＮＡを含有するＰＢＳ５００μｌを含む各セットを含んでいた。次いで、１００μｌの水対照か、１．６Ｎ  ＮａＯＨのいずれかを各試験管に加えてアルカリショックを達成した。１０秒間ボルテックス処理した後、混合物を水浴中、６０℃で１５分間インキュベートし、続いて、室温でさらに１５分間インキュベートして磁性粒子上でのハイブリダイゼーションおよび標的捕獲を可能にした。上記に記載されるように、磁場を加えて、固定された捕獲オリゴヌクレオチドとｒＲＮＡとを含む粒子複合体を集め、集めた粒子を１ｍｌの洗浄緩衝液で２回洗浄した。洗浄した粒子を７５μｌの増幅試薬に再懸濁し、蒸発を防ぐために、試験管の内容物を不活性オイルで表面を覆った。上記のように、増幅試薬は、塩、ヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび配列番号３および配列番号２の配列を有する２種のｒＲＮＡ特異的プライマー各々約５ｐｍｏｌ／反応を含んでいた。短時間ボルテックス処理した後、混合物を６０℃で１０分間インキュベートし、プライマーアニーリングを促進し、次いで、４１．５℃で１０分間平衡にした。次いで、予め加温した、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素（５，６００ユニット／反応物）と、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（３，５００ユニット／反応物）とを含む酵素試薬のアリコートを混合物に添加した。４１．５℃で１時間インキュベートした後、反応が完了し、公開された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／１８９９３の実施例１のもとで本質的に説明される標準均一保護アッセイにおいて配列番号４の配列を有するアクリジニウムエステル標識したハイブリダイゼーションプローブを用いてｒＲＮＡ増幅産物を検出した。ＧＢＳ細菌を増幅および検出するのに用いた関連オリゴヌクレオチドの配列は表１３中に表示される。
【０１１６】
【化１２】
2008529553.tif 000013
図５に示された結果により、アルカリショックを含むサンプル調製手順は、標準手順を上回る大幅に改善された結果をもたらすということが確認された。どの場合においても、サンプルは、ｒＲＮＡアンプリコンの検出を示す化学発光シグナルが、１０００コピーのｒＲＮＡ鋳型を用いて実施された対照試験において検出されたシグナルを超えた場合に陽性と判断された。図に示されるように、核酸鋳型の供給源として少なくとも２０種のＧＢＳ細菌を用いて実施した試験は、サンプル調製手順にアルカリショックが含まれていたかどうかにかかわらず、一様に陽性結果を示した。しかし、標準サンプル調製手順は、インビトロ増殖および検出アッセイと併用した場合に、わずか約１０種のＧＢＳ細菌についての確実な検出にとって有用であったのに対し、アルカリショックを含んでいた手順は、わずか１種の細菌の確実な検出に使用できた。これらの結論は統計分析に基づいており、１種の細菌を含むよう意図されたアリコートを加えた複製サンプルの集合物の中でも、含まないサンプルもあり、２種の細菌を含むサンプルもある。アルカリショックサンプル調製手順が、細菌標的核酸の検出を大幅に改善したことは明らかである。
【０１１７】
本発明はいくつかの特定の実施例およびその実施形態を参照して記載されている。もちろん、当業者には前記の詳細な説明を見直すと、本発明のいくつかの異なる実施形態から、それ自体が示唆される。したがって、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲を参照した際に決定されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】図１は、モデル標的核酸内の標的領域（太い水平線によって表される）を検出するために使用できる種々のポリヌクレオチドを示す模式図である。以下の核酸の位置は、標的領域に対して示される：「捕獲オリゴヌクレオチド」とは、増幅に先立って、標的核酸とハイブリダイズし、捕獲するために用いられる核酸を指し、ここで、「Ｔ」は、相補的な配列を有する固定されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするために用いられるテール配列を指し（示していない）；「非Ｔ７プライマー」および「Ｔ７プロモーター−プライマー」とは、ＴＭＡを実施するために用いられる２種の増幅プライマーを表し、ここで、「Ｐ」は、Ｔ７プロモーター−プライマーのプロモーター配列を示し；「プローブ」とは、増幅された核酸を検出するために用いられるプローブを指す。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、種々の濃度のＮａＯＨ溶液を用いて実施された試験から得られた結果を示す一連の棒グラフを示す図である。図２Ａは、アルカリショックステップにおいて用いたＮａＯＨの濃度の関数として陽性％として測定された結果を示す。図２Ｂは、アルカリショックステップにおいて用いたＮａＯＨの濃度の関数としてＣＶ（変動の係数）％として測定された結果を示す。図２Ｃは、アルカリショックステップにおいて用いたＮａＯＨの濃度の関数として平均ＲＬＵとして測定された結果を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、種々のレベルの投与ＨＢＶウイルスに対する反応％として測定された結果を示す一連の棒グラフを示す図である。図３Ａは、ＨＢＶサブタイプ−Ｂの結果を示す。図３Ｂは、ＨＢＶサブタイプ−Ｃの結果を示す。図３Ｃは、ＨＢＶサブタイプ−Ａの結果を示す。対照試験は白抜きバーによって示されている。アルカリショックを与えた試験から得られた結果は、黒バーによって示されている。
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、種々のレベルの投与ＲＮＡウイルスに対する反応％として測定される結果を示す一連の棒グラフを示す図である。図４Ａは、ＨＣＶ−１ａウイルスの結果を示す。図４Ｂは、ＨＣＶ−２ｂウイルスの結果を示す。図４Ｃは、ＨＩＶ−１ｂウイルスの結果を示す。対照試験は白抜きバーによって示されている。アルカリショックを与えた試験から得られた結果は、黒バーによって示されている。
【図５】図５は、種々の数のＧＢＳ細菌から単離した鋳型核酸を用いる増幅反応において求められる陽性％を示す一連の棒グラフを示す図である。アルカリショックなしで処理された酸鋳型を用いる試験は、白抜きバーによって示されている。アルカリショックを用いて処理された核酸鋳型を用いる試験は黒バーによって示されている。
【図１】
2008529553.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
2008529553000001.app
【国際調査報告】
2008529553.tif 000019
2008529553.tif 000020