(57)【要約】【課題】サンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法は、サンプルの１つ又は複数のシーケンスの複数の異なる目的断片を増幅産物となるように増幅することのできる１回又は複数回の増幅反応を実施する工程と、サンプルのシーケンスの特定の異なる目的断片が増幅されたかどうかを検出する工程と、増幅産物中に存在する又は存在しない特定の異なる目的断片の個体数に基づいて、サンプル中の１つ又は複数のシーケンスの個体数を決定する工程とを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルの１つの所定のシーケンス、もしくは、前記所定のシーケンスと同一又はほぼ同一の複数のシーケンスの個体数を決定する方法であって、
上記サンプルの上記１つ又は複数のシーケンスの複数の異なる目的断片を増幅産物となるように増幅することのできる１回又は複数回の増幅反応を実施する工程と、
上記サンプルの上記シーケンスの特定の異なる目的断片が増幅されたかどうかを検出する工程と、
上記増幅産物中に存在する又は存在しない上記特定の異なる目的断片の個体数に基づいて、上記サンプル中の上記１つ又は複数のシーケンスの個体数を決定する工程と
を含むサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法。
【請求項２】
請求項１に記載されたサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法において、
（ａ）上記シーケンスを個体数ｎ個含むサンプルを用意する工程と、
（ｂ）上記サンプル中の上記所定のシーケンスの数ｍの目的断片をそれぞれ異なる増幅産物となるように増幅することのできるプライマーを用意する工程と、
（ｃ）上記工程（ａ）の上記サンプルと上記工程（ｂ）の上記プライマーとを用いる１回又は複数回の増幅反応を、成功する増幅反応の数が上記サンプル中の所定のシーケンスの個体数ｎに対応するように選択した反応条件下で実施する工程と、
（ｄ）上記工程（ｃ）で増幅された上記目的断片を検出し、上記成功した増幅反応の数を決定する工程と、
（ｅ）上記サンプル中に含まれる所定のシーケンスの個体数ｎを決定する工程と
を含むサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載されたサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法において、
（ｆ）上記サンプルに含まれるシーケンスの個体数ｎを、上記所定のシーケンスを既知の個体数含む１つ又は複数の対象との比較によって決定する工程をさらに含むサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法。
【請求項４】
請求項３に記載されたサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法において、
上記工程（ｆ）の上記対象は、上記シーケンスを既知の固体数含む対照サンプルであり、該対照サンプルに、上記サンプルと同じ増幅条件を適用するサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法。
【請求項５】
請求項３に記載されたサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法において、
上記工程（ｆ）の上記対象が、上記シーケンスを既知の個体数含む対照サンプルの有効データであって、該対照サンプルには、上記サンプルと同じ上記増幅条件が適用されているサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかに記載されたサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法において、
上記増幅反応を実施する工程が、
（ｉ）上記所定のシーケンスを非特異的に増幅する１つ又は複数の非特異性プライマーを用いる第１増幅反応の実施と、
（ｉｉ）上記各目的断片に対して特異性のプライマーを用いる第２増幅反応の実施と、を含むサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかに記載されたサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法において、
上記サンプルは、単細胞である、及び／又は、ただ１つの細胞の上記シーケンスを含んでいるサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれかに記載されたサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法において、
上記サンプルは、極体である、及び／又は、ただ１つの極体の上記シーケンスを含んでいるサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれかに記載されたサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法において、
上記所定のシーケンスは、染色体、又は、染色体の小部分又は一部であるサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれかに記載されたサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法において、
上記サンプル中の所定のシーケンスの個体数ｎは、０〜１００であり、好ましくは０〜３０であり、より好ましくは０〜１０であるサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法。
【請求項１１】
請求項１乃至１０のいずれかに記載されたサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法において、
上記サンプル中の所定のシーケンスの個体数ｎは、０〜５であるサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載されたサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法において、
上記サンプル中の所定のシーケンスの個体数ｎは、０、１、２、又は、３であるサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法。
【請求項１３】
請求項１乃至１２のいずれかに記載されたサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法において、
上記成功する増幅反応の閾値が決められているサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法。
【請求項１４】
請求項１乃至１３のいずれかに記載されたサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法において、
上記反応条件を、任意の目的断片に対するｎ＝１のための上記増幅反応の効率が０．２と１未満との間であるように選択するサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法。
【請求項１５】
請求項１０に記載されたサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法において、
上記反応条件を、任意の目的断片に対するｎ＝１のための上記増幅反応の効率が０．４と０．６との間、好ましくは、例えば約０．５となるように選択するサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法。
【請求項１６】
請求項１乃至１５のいずれかに記載されたサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法において、
上記所定のシーケンスに対して特異性を有する上記目的断片の数ｍが、少なくとも４であるサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載されたサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法において、
上記所定のシーケンスに対して特異性を有する上記目的断片の数ｍが、少なくとも６であるサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法。
【請求項１８】
請求項１６又は１７に記載されたサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法において、
上記所定のシーケンスに対して特異性を有する上記目的断片の数ｍが、少なくとも８であるサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法。
【請求項１９】
請求項１乃至１８のいずれかに記載されたサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法において、
上記所定の異なる目的断片の増幅産物の存在又は不在に基づいて上記サンプル中の１つ又は複数の所定のシーケンスの個体数ｎを決定する際に、該所定のシーケンスを既知の個体数含む対照サンプルから得た有効データを使用することで、該所定のシーケンスの絶対的な個体数を決定するサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法。
【請求項２０】
請求項１乃至１９のいずれかに記載されたサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法において、
上記増幅反応を実施するために、プライマー（統計的なプライマー）のうち、上記１つ又は複数のシーケンスの異なる目的断片の増幅に適した１種類を使用するサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載されたサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法において、
上記所定のシーケンスの特定の目的断片が増幅されたかどうかを検査するために、上記増幅産物を、該特定の異なる目的断片の１つ又は複数に対してそれぞれ特異性を有する数種類のプライマーを用いて増幅するサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法。
【請求項２２】
請求項１乃至２１のいずれかに記載されたサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法において、  
上記サンプルの上記増幅反応を実施するために、上記特定の異なる目的断片の１つ又は複数に対してそれぞれ特異性を有する数種類のプライマーを用いるサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法。
【請求項２３】
請求項１乃至２２のいずれかに記載されたサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法において、
上記増幅産物に対し、電気泳動、ＤＮＡアレイ上のハイブリダイゼーション分析、マーキング法、ビードシステム、もしくは、その他の光学的、電気的又は電気化学的な測定によって、上記異なる断片の存在について検査し、各目的断片の増幅産物の量が特定の閾値を上回っているかどうかを決定するサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法。
【請求項２４】
請求項１乃至２３のいずれかに記載されたサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法において、
マーキングのついた特異性プライマーを使用し、
上記特定の異なる目的断片の検査の際に、上記各プライマーを用いてある特定の異なる目的断片に対して割り当てられている上記マーキングが、所定の閾値を上回っているかどうかを検出するサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法。
【請求項２５】
請求項１乃至２４のいずれかに記載されたサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法において、
上記１つ又は複数の所定のシーケンスの個体数を、上記増幅産物中の所定の目的断片の個体数の統計的な分析によって決定するサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載されたサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法において、
上記統計的な分析の証拠は、１０％未満、好ましくは１％未満の誤り確率を含むサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法。
【請求項２７】
請求項１乃至２６のいずれかに記載されたサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法を実施するためのキットであって、
（ｉ）サンプル中の個体数が決定される上記所定のシーケンスの数ｍの目的断片を、それぞれ異なる増幅産物となるように増幅することのできる、１つ又は複数の特異性プライマーと、
（ｉｉ）場合によっては、上記対照サンプル中の上記所定のシーケンスの個体数の各可能性のある値ｎに対する対照サンプル、及び／又は、
（ｉｉｉ）場合によっては、上記（ｉ）の上記プライマーを用いた増幅反応、及び／又は、計数される上記シーケンスを既知の個体数含む対照サンプルの結果と、
（ｉｖ）上記増幅反応に対する上記反応条件の説明書と
を含むキット。
【請求項２８】
請求項２７に記載されたキットにおいて、
（ｖ）上記所定のシーケンスを非特異的に増幅することのできる１つ又は複数の非特異性プライマーと、
（ｖｉ）場合によっては、上記（ｉ）及び（ｖ）のプライマーを用いる増幅反応、及び／又は、計数される上記シーケンスを既知の個体数含む対照サンプルの結果と、
（ｖｉｉ）上記増幅反応に対する上記反応条件の説明書と
をさらに含むキット。
【請求項２９】
請求項２７又は２８に記載されたキットにおいて、
上記増幅反応を実施するための試薬をさらに含むキット。
【請求項３０】
請求項２７乃至２９のいずれかに記載されたキットにおいて、
上記増幅反応、及び／又は、上記増幅された目的断片の検出を実施するための固定キャリアをさらに含むキット。
【請求項３１】
請求項３０に記載されたキットにおいて、
上記固定キャリアが、チップ又はスライドであるキット。
【請求項３２】
請求項２７乃至３１のいずれかに記載されたキットにおいて、
上記特異性目的断片の検出に適したプローブをさらに含むキット。
【請求項３３】
請求項１乃至２６のいずれかに記載されたサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法を実施するための装置であって、
（ａ）請求項１乃至２６のいずれかに記載されたサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法を実施するための固定キャリアと、
（ｂ）上記（ａ）の上記固定キャリア上で得られた増幅産物を検出するためのユニットと、
（ｃ）上記所定のシーケンスを既知の個体数含む対照サンプルから得られた格納された対照データ、又は、
（ｄ）上記対照サンプルを請求項１乃至２６のいずれかに記載されたサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法と同じ条件下で分析することのできる対照管理部と
を備える装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプルの所定のシーケンス、もしくは、所定のシーケンスと同一またはほぼ同一の（相同性の）複数のシーケンスの個体数を決定するための方法、その方法を実施するためのキット及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
シーケンス分析の他に、核酸の定量分析は、分子医学における主要課題の１つである。細胞、組織、及び、有機体の生態を基本的に理解するには、遺伝子シーケンスの組成と個体数とを例えばＤＮＡレベルまたはその転写（ＲＮＡレベル）で知ることが必要不可欠である。有機体間の相違、遺伝子に起因する病気の原因、および、疾病素質は、シーケンスの相違（変異、例えば欠失、插入）および存在するシーケンスの個体数に基づいている。したがって、ゲノム（ＤＮＡ）およびトランスクリプトーム（ＲＮＡ）の定量分析は、分子医学の中心的な課題となっている。
【０００３】
遺伝子情報の全体は、有機体のゲノム中に固定されている。情報担体（Ｇ、Ａ、ＴおよびＣの塩基配列を有する核酸の遺伝子シーケンス＝ＤＮＡ）の変化は、病気として発現する可能性がある。多方面において、定義されたシーケンス断片に関して定量的に示された証拠は、診断に必要不可欠である。例えば、遺伝子シーケンスの個体数が異なることに起因する臨床像は様々である。
【０００４】
全染色体のトリソミー／モノソミー
２１トリソミー、ダウン症候群：染色体（２１）全体に関するものであり、各細胞につき（２つのコピーではなく）３つのコピーがある。
【０００５】
反復配列
ハンチントン病：特定の配列（ＣＡＧ）が直接前後に３８コピー以上連続している。病気促進につながる疾病素質は、この配列の反復の数に伴って増大する。ヒトにおける三核種シーケンスの他の例としては、ケネディー症候群または脊髄小脳失調１があげられる。
【０００６】
小さなシーケンス断片の染色体微小欠失
臨床的な症候群の増加について、染色体微小欠失がある役割を果たしていることが分かる。例えばウォルフ・ヒルシュホーン症候群（４Ｐ１６．３の欠失）、ウィリアムズビューレン症候群（７ｑ１１．２３、ある遺伝子全体の欠失に該当する）、又は、父系遺伝子のみに該当するプラダーラプハルトウィリー症候群（１５ｑ１１−ｑ１３）などの多数の例がある。より稀なのは微小重複であるが、このような断片を見出すことは、方法上の理由により今日では非常に困難である。
【０００７】
点変異
多数の臨床像は、ちょうど１つの塩基位置が変化して存在することにより生じ、このことは、結果として生じる蛋白質において機能障害となる。このような場合（一塩基変異多型、ＳＮＰ）においても、定量的に示された証拠は、重要な意味を持っている。なぜなら、変異または対立遺伝子は全ての細胞には生じず、つまり、異なる頻度で発現する可能性があるからである。遺伝子シーケンス中にないこのような種類の変異は、ゲノム中に非常に頻繁に生じており、通例では臨床像にはならない。しかしながら、これらは、マーカーとして適切である。なぜなら、多くの腫瘍細胞は、両親型の対立遺伝子の１つを失う傾向を有しているからである（ヘテロ接合体の喪失、ＬＯＨ）。元々は２つのシーケンス変異体のうち１つだけが存在していることを立証することは、腫瘍診断のために潜在的に非常に意味がある。この状態を確実かつ定量的に認識するための方法上の開発に、デジタルＲＣＲがある（特許文献１）。
【０００８】
全ての上記の例において、分子の診断は、シーケンス断片の定量化によって行われる、すなわち、所定のシーケンスがサンプル中にどれほどの頻度で含まれているかを検出する必要がある。
【０００９】
従来技術
今日、上記のようなＤＮＡについての課題を解決するために、診断および検査において主に以下の方法が使用されている。
【００１０】
ＦＩＳＨ法によるインシチュハイブリダイゼーション（蛍光性インシチュハイブリダイゼーション）のための染色体特異性プローブ分子について、特許文献２に記載されている。この場合、様々な蛍光体を様々に組み合わせることにより、全てのヒト染色体を同時に検出することができる。
【００１１】
分析される染色体を、染料によってマークされたハイブリダイゼーションプローブと接触させることにより、シーケンス相補的な断片を見出すことができる。シーケンス特異性のハイブリダイゼーションの後に洗浄工程を行い、続いて、細胞の蛍光信号を蛍光顕微鏡によって評価する。蛍光信号があれば、シーケンスが存在している。したがって、例えば、完全な染色体が存在していると結論付けることができる。蛍光信号がなければ、染色体が欠失しているか、または、プローブの領域に微小欠失が存在している。今日、ＦＩＳＨは、使用する蛍光染料によって評価時に区別される、１つのゲノム内の複数の様々なシーケンスのコピー数を、並行して決定することができる。上記の数は、同時に使用することのできる蛍光染料の数によって制限されている。典型的には、全てが同じ遺伝子状態を有する細胞集団が検査される。
【００１２】
ＦＩＳＨ分析の有効性を確認することは非常に困難である。非特許文献１には、ＦＩＳＨ分析の結果の解釈について、「細胞分裂間期分析に使用されるサンプルは、（９０％を上回る）高効率でハイブリダイズするように選択されるほうがよい」と記載されている。すなわち、一方では少なくとも１００個の細胞が必要であり、他方ではこの証言はＦＩＳＨによる単細胞診断を一般的に除外している。この方法は、単細胞診断には不十分である。
【００１３】
複数のシーケンスのコピー数を並行して決定することのできる他の方法は、ＣＧＨ（比較ゲノムハイブリダイゼーション、特許文献３：核型分析手段および方法）である。ここでは、患者ＤＮＡをある蛍光染料（例えば、赤）によってマークし、基準ＤＮＡを第２の染料（例えば、緑）によってマークする。様々なＤＮＡ集団を同じ量で混合し、ガラス表面上の染色体伸展標本に対してハイブリダイズさせる。相補的な鎖は、染色体断片の結合場所を求めて競争しあう。患者ＤＮＡと基準ＤＮＡとにおけるシーケンス断片が同じ頻度であれば、染色体の対応するハイブリダイゼーション場所において、緑と赤の比率が１：１となる。一方の色が多ければ、患者ＤＮＡが重複している、または、対応する断片が欠失している、ということが示される。蛍光顕微鏡で染色体伸展標本を分析する。このことは、方法の解像を制限しており、解像度は、約１０〜３０Ｍｂ（１Ｍｂ＝１メガベース＝１０６シーケンスユニット）である。染色体伸展標本のＣＧＨでは、ある定義されたシーケンスの単一の染色体に、（赤または緑にマークされた）プローブがちょうど１つだけ結合できる。単にこの方法の空間的解像度の低さゆえに、多数の信号を同時に受信することとなり、それゆえ、これらの信号は統計的に比率分析の余地がある。
【００１４】
この方法の特別な実施としては、マトリックスＣＧＨ（チップまたはアレイフォーマット）が挙げられる。このマトリックスＣＧＨでは、染色体伸展標本の代わりに、ＤＮＡアレイの離散型測定点の形で遺伝子断片が存在している。ここでも、２つのハイブリダイゼーション信号の強度比較が行われる。ＣＧＨのためには、サンプルを（例えば、ＰＣＲによって）増幅するか、または、名目上は同一の多数の細胞が存在している必要がある。
【００１５】
原則的に、定量リアルタイムＰＣＲ方法は、最少量の核酸（原則的に、シーケンスの１コピー）の検出に適している。定量分析は、内部標準によって保証される（非特許文献２）。この方法は、ルーチン診断に使用される。しかしながら、原材料の量を任意に減らすことはできない。なぜなら、原材料としてのスタート分子が少ない（１０〜１００個の）場合、確率論的なエラーは、指数的な増幅のせいで非常に大きくなり、定量的に示された証拠を許容しないからである。
【００１６】
ＰＣＲの他に、上記範囲における定量的に示された証拠を許容しない、酵素をベースとした他の増幅方法がある（例えば、ＮＡＳＢＡ１  ＬＣＲ，ＳＤＡ  ＲＴ−ＰＣＲまたはＱs−レプリカーゼ；非特許文献２の総覧）。
【００１７】
全ての上記方法は、シーケンスの定量分析の際に様々な欠点を有している。その結果、これらは、コピー数についての絶対的な証拠を示すには適切なものではない。
【００１８】
今日、シーケンス断片を（０，１，２，３から約１０までの範囲において）計数する簡単且つ確実な方法はない。なぜなら、２つの開発は、完全に逆行するものだからである。ａ）増幅せずに作業する場合は、多数（ＣＧＨでは典型的に１０６個の数）の細胞が必要不可欠であり、他方では、蛍光を測定できない。ハイブリダイゼーション反応の複雑性（非特異性の結合、交差反応、遅く且つ大抵の場合は未知である運動）と、コストのかかるサンプルの準備（サンプルの精製、蛍光染料が付加する際の未知の効率）とにより、遺伝子シーケンスの定量化は実験的に非常に複雑であり、結果の解釈は決して明白ではない。ｂ）ある定義されたシーケンスの（０，１，２，３．．の意味での）コピー数を例えばリアルタイムＰＣＲ時の信号の上昇に基づいて決定するために、少ない原材料の定量的な増幅反応を行う場合、指数的な増幅率のせいでエラーが多くなる。
【００１９】
特許文献１に、サンプル中のシーケンスの相対的な個体数を決定するための、デジタル増幅またはデジタルＰＣＲと呼ばれる方法が記載されている。ここでは、サンプルを、検査される複数のシーケンスのうちの１つのシーケンスの単一の分子が１つの反応槽にできる限り１つしか存在しなくなるまで希釈し、多数の反応槽に分配する。次に、複数の反応槽に分配したサンプルを、複数のプライマーによって増幅する。この場合、プライマーは、それぞれ、シーケンスの１つに対して特異性を有するものであり、特定のマーカーが備えられている。増幅後、増幅産物に結合したマーカーに基づいて、どの反応槽にシーケンスのうちどれが存在していたかを識別する。シーケンスのうちそれぞれ１つの特定のシーケンスを含む反応槽を数えることにより、元のサンプル中のシーケンスの割合を立証する事ができる。この方法は、主に連続希釈法に起因するかなりの不確実性を有している。なぜなら、ある１つの反応槽に複数のシーケンス分子が含まれていないかどうかということを絶対的な確実性で確定することは決してできず、それゆえ、結果が変わる可能性があるからである。そのうえ、この方法では、割合が絶対的にではなく相対的に決定されてしまう。
【００２０】
シーケンスの相対的な個体数を決定することのできる他の方法は、特許文献４に記載されている。この方法では、例えば、ある遺伝子材料の範囲限定可能な複数の部分集合（すなわち、分離した核酸またはシーケンス）の１つが、その他の範囲限定可能な部分集合よりも頻繁にサンプル中に存在しているのか、それとも、稀に存在しているのかが決定される。従来技術によるこの方法の具体的な実施形態は、細胞中の個々の染色体の相対的な個体数の決定（例えば、異数体があるかどうかの決定）に関する。特許文献４に開示された方法の実施形態では、まず、単細胞増幅（例えば、全ゲノム増幅（ＷＧＡ））が、１つの非特異性プライマーまたは複数のこのようなプライマーによって行われる。この場合、１つの染色体に対して特異性を有する複数の目的シーケンスが、それぞれ理論的に増幅される必要がある。しかしながら、このような全ゲノム増幅は、１００％まで効率的に行われないので、統計的な平均値において、論理的にはプライマーによって増幅可能な目的シーケンスの全てが増幅されるわけではない。増幅反応後、各染色体に対して特異性を有する目的シーケンスが検出される。
【特許文献１】米国特許第６，４４０，７０６号明細書
【特許文献２】米国特許第５，８１７，４６２号明細書
【特許文献３】国際公開第００／２４９２５号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００４／０２７０８９号パンフレット
【非特許文献１】DE Rooney ed.、「ヒト細胞遺伝学体質分析（Human Cytogenetics Constitutional Analysis）」、オックスフォード大学出版局（Oxford University Press）、２００１年
【非特許文献２】Hagen-Mann, K. & Mann, W.、「核酸の生体外の増幅のためのＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲの代替方法（RT-PCR and alternative methods to PCR for in vitro amplification of nucleic acids.）」、１９９５年、Exp. Clin. Endocrinol. 103: 150-155
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
上記方法のいずれも、サンプル中における例えば１０個以下の数のほぼ同一のシーケンスを計数することができない。大抵の方法は、このような少数のシーケンスを定量的に検出するには原則的に適していない。デジタルＰＣＲによってのみ、比較的少ない量で存在する異なるシーケンスの相対的な個体数を確定することができる。連続希釈法の使用により、非常に少ない数（例えば１０以下）で存在するシーケンスの相対的な個体数の確定には問題がある。
【００２２】
本発明の目的は、サンプルの所定のシーケンス、もしくは、所定のシーケンスと同一またはほぼ同一の（相同性の）複数のシーケンスの個体数を決定するための方法であって、たとえサンプルのシーケンスの数が少なくても、確実に、簡単に、かつ、低コストで実施可能な方法、その方法を実施するためのキット及び装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明に係るサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法は、サンプルの１つ又は複数のシーケンスの複数の異なる目的断片を増幅産物となるように増幅することのできる１回又は複数回の増幅反応を実施する工程と、サンプルのシーケンスの特定の異なる目的断片が増幅されたかどうかを検出する工程と、増幅産物中に存在する又は存在しない特定の異なる目的断片の個体数に基づいて、サンプル中の１つ又は複数のシーケンスの個体数を決定する工程とを含むことを特徴とする。
【００２４】
本発明に係るサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法を実施するためのキットは、（ｉ）サンプル中の個体数が決定される所定のシーケンスの数ｍの目的断片を、それぞれ異なる増幅産物となるように増幅することのできる、１つ又は複数の特異性プライマーと、（ｉｉ）場合によっては、対照サンプル中の所定のシーケンスの個体数の各可能性のある値ｎに対する対照サンプル、及び／又は、（ｉｉｉ）場合によっては、（ｉ）のプライマーを用いた増幅反応、及び／又は、計数されるシーケンスを既知の個体数含む対照サンプルの結果と、（ｉｖ）増幅反応に対する反応条件の説明書とを含むことを特徴とする。
【００２５】
本発明に係るサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法を実施するための装置は、（ａ）サンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法を実施するための固定キャリアと、（ｂ）（ａ）の固定キャリア上で得られた増幅産物を検出するためのユニットと、（ｃ）所定のシーケンスを既知の個体数含む対照サンプルから得られた格納された対照データ、又は、（ｄ）対照サンプルを請求項１乃至２６のいずれかに記載されたサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法と同じ条件下で分析することのできる対照管理部と
を備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、サンプルのシーケンスの数が少なくても、確実に、簡単に、かつ、低コストで実施をすることができるサンプル中のシーケンスの個体数を決定する方法、その方法を実施するためのキット及び装置を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明は、請求項１に記載の方法によって達成される。本発明の好ましい実施形態は、従属請求項に記載されている。
【００２８】
サンプル中の１つの所定のシーケンス、もしくは、同一またはほぼ同一の（相同性の）複数のシーケンスの個体数を決定するための本発明の方法は、サンプルの１つまたは複数のシーケンスの複数の目的断片を増幅産物となるように増幅することのできる１回または複数回の増幅反応を実施する工程と、サンプルのシーケンスの特定の目的断片が増幅されたかどうかを検出する工程と、増幅産物中に存在するまたは存在しない特定の目的断片の個体数に基づいて、サンプル中の１つまたは複数のシーケンスの個体数を決定する工程とを含んでいる。
【００２９】
本発明の方法の好ましい実施形態は、請求項２に記載されている。この方法は、サンプル中の１つの所定のシーケンス、もしくは、前記所定のシーケンスと同一またはほぼ同一の複数のシーケンスの個体数ｎを決定するための方法であって、（ａ）上記シーケンスを決定されることとなる個体数ｎ個含むサンプルを用意する工程と、（ｂ）上記サンプル中の上記所定のシーケンスの数ｍの目的断片をそれぞれ異なる増幅産物となるように増幅することのできるプライマーを用意する工程と、（ｃ）（ａ）の上記サンプルと（ｂ）の上記プライマーとを用いる１回または複数回の増幅反応を、成功する増幅反応の数が上記サンプル中の上記所定のシーケンスの上記個体数ｎに応じているように選択されている反応条件下で実施する工程と、（ｄ）工程（ｃ）で増幅された上記目的断片を検出し、上記成功した増幅反応の数を決定する工程と、（ｅ）上記サンプル中に含まれる上記所定のシーケンスの上記個体数ｎを決定する工程とを含んでいる。
【００３０】
上記サンプル中に含まれる上記所定のシーケンスの上記個体数ｎを、上記所定のシーケンスを既知の個体数含む１つまたは複数の対象との比較によって決定することが好ましい。対象は、本発明の方法が並行して行われる対照サンプルであってもよく、その場合は、この並行対照サンプルに対して、サンプルに増幅反応を実施する場合と同じ反応条件が適用される。また、対照サンプルに対して、サンプルとは無関係に本発明の方法を行い、サンプルと比較するための対象としての役割を果たす有効データまたは基準データを生成することもできる。
【００３１】
元々のシーケンスの複数の目的断片の増幅は、シーケンスの１つの特定の目的断片または少数の特定の目的断片に対してそれぞれ特異性を有する複数のプライマー対またはプライマーの組み合わせを使用すること、もしくは、多数の特定の目的断片に対してそれぞれ特異性を有する複数のプライマーを使用することなどによって行える。
【００３２】
本発明の目的のために、プライマーという概念は、単一のプライマーだけではなく、プライマー対（すなわち、フォワードプライマーおよびリバースプライマー）およびプライマーの組み合わせ（１つの特定の目的断片に対してそれぞれ２つ以上のフォワードプライマーおよびリバースプライマー）を含んでいる。
【００３３】
多数の特定の目的断片を増幅するプライマーを使用するＰＣＲ方法は、ＩＲＳ−ＰＣＲ（Inter-Repetetive-Sequence-PCR）またはＷＧＡ−ＰＣＲ（Whole-Genome-Amplification-PCR）と呼ばれる。すなわち、プライマーは、多数の異なるシーケンスを増幅する限り非特異性である。
【００３４】
本発明の発明者は、シーケンスの複数の異なる特定の目的断片の増幅時に増幅される異なる目的断片の数がサンプル中に元々存在するシーケンスの数に応じている、ということを立証した。サンプル中に存在するシーケンスの数が少ないほど、前記シーケンスから増幅される異なる目的断片の数も少ない。
【００３５】
その原因としては各増幅の成功が特定の確率または効率に従っている、すなわち、各増幅が絶対的な確実性で実施されない、ということが考えられる。したがって、例えば複数の異なる断片を同時に増幅する場合は、個々の異なる断片の増幅反応の間に競争が生じる。その結果、所定のシーケンスのうちの１つまたは少数しかサンプル材料中に存在していない場合、まるで多数のシーケンスが増幅されたかのように、個々の異なる断片の小数が増幅される。
【００３６】
効率は多数の要因に依存している。多数の要因の例としては、プライマーの選択、増幅されるシーケンスの長さ、および、その他の反応条件（例えばＰＣＲの場合は、温度プロトコル、サイクルの期間、サイクルの数、反応剤の濃度、反応体積、ポリメラーゼなど）が挙げられる。当業者は、所望の効率が達成されるように、これらのパラメータを調整することができる。
【００３７】
これらの要因を決定することにより、ある程度の範囲における増幅の効率を決定することも可能である。例えばシーケンスをできる限り高い確実性で増幅したほうがよいが少数のシーケンスしかない場合は、できる限り１に近い効率であれば有利である。このことは、例えば、診断用のＰＣＲ（病原の検出）および同様の他のアプリケーションにおいて有利である。
【００３８】
他方では、本発明の方法でのように、とりわけ、サンプルが所定のシーケンスをたった１回含んでいるのか、２回含んでいるのか、３回含んでいるのか、または、この程度の少数含んでいるのかを判断する場合、増幅の効率を平均値に（例えば０．１〜０．９、好ましくは０．２〜０．８、好ましくは０．３〜０．７、好ましくは０．４〜０．６の範囲に、最も好ましくは約０．５に）設定することがより有利である。増幅の効率は、元々存在するシーケンス（すなわち、核酸分子）の絶対量についての統計的に意味のある証拠となり得る範囲であるほうがよい。
【００３９】
したがって、効率という概念を、以下では、任意の多数の原材料が存在していると仮定した増幅の確率と解釈する。本発明に適した増幅の効率は、典型的には、０．５〜１の範囲である。これに対して、シーケンスのスタートコピーの数が少ない場合に特定の断片が増幅される実際の確率は、原材料の量、すなわち、サンプル中の所定のシーケンスの数に依存しており、基本的に、０〜１の全ての可能な範囲を含み得る。
【００４０】
したがって、例えば、ある１つのシーケンスの複数の目的断片を増幅する特定の条件下では、これら複数の目的断片に対してそれぞれ適切なプライマーを選択した場合でも、各増幅反応において全ての目的断片が増幅されるわけではない。したがって、このことは、特に、元々の鋳型（すなわち、目的断片が増幅される元々のシーケンス）がほんのわずかなコピー数で（例えば、０，１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０の範囲で）存在している場合に該当する。
【００４１】
各増幅反応にはある程度のエラー確率があるので、従来技術の方法によって、鋳型のどの異なる数が増幅反応のために含まれているのかを異なるサンプル間で区別することは非常に困難である。例えば、あるサンプルが、それぞれ特定の目的断片が増幅される２つのシーケンスを含んでおり、第２のサンプルが、特定の目的断片が増幅されるこれらのシーケンスの３つを含んでいる可能性がある。従来技術の増幅方法では、このような小さい範囲の数である場合、増幅の結果に基づいて元々の鋳型、すなわち、サンプル中に元々存在するシーケンスの個体数を逆推論することはこれまで不可能であった。
【００４２】
しかしながら、本発明の方法では、サンプル中に元々存在するシーケンスの絶対数を、本発明の目的のためにｎで表されるこの数が特にｎ＝０，１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０の範囲にある場合に、決定することができる。ｎは、好ましくは０〜１００、好ましくは０〜３０、好ましくは０〜１０、好ましくは０〜５の範囲である。本発明の方法を、ｎ＝０，１，２，３および４のシーケンス数を有するサンプルを定量的に決定する事ができるように設定することが特に有利である。
【００４３】
このため、ｎ＝１に対する増幅反応の効率が０．２〜０．８、好ましくは０．４〜０．６の範囲になるように増幅条件を選択することが好ましい。上記増幅効率は、約０．５程度であることが特に好ましい。このことは、サンプル中のシーケンスの数ｎが１であり（すなわち、このシーケンスはサンプル中にたった１回存在しており、つまり、ただ１つの鋳型が利用可能であり）、かつ、このシーケンスに対して数ｍの目的断片を増幅する場合、統計的な平均値における０．５の効率では、増幅反応後に目的断片の半分だけを検出できることを意味している。
【００４４】
したがって、本発明の方法により、サンプル中に存在するシーケンスのコピー数について量的な証拠を示すことができる。この目的のために、増幅反応を行い、シーケンスの複数の異なる目的断片を増幅産物となるように増幅する。複数の目的断片が増幅される所定のシーケンスが、非常に少ないコピー数で存在しており、増幅効率が１未満である場合、たとえ増幅反応を複数のサイクルで実施したとしても、選択された目的断片の全ては増幅反応によって実際に増幅されない確率が高くなる。サンプルの増幅反応の結果を、複数の異なる目的断片の検出によって１つの所定のシーケンスと比較する場合、および、この結果を、所定のシーケンスを２コピー含むサンプルの同じ条件下で実施された増幅反応と比較する場合、２コピーを有するサンプルに対しては、統計的に有効な確率で、正に検出可能な、増幅された、より多数の目的断片が得られる。
【００４５】
この統計的な方法を以下に詳しく説明する。
【００４６】
定義されたＰＣＲプロトコル（とりわけ、温度プロトコル、サイクル数、反応剤の濃度、体積、増幅産物の検出時の閾値）に基づいて、特異性のプライマーまたはプライマー対を用いて実施された増幅反応の増幅産物の存在または不在は、原材料中のシーケンスのコピー数に応じている。本発明の計数方法を、以下で例示的に思考実験において説明する。
【００４７】
サンプル中のコピー数０、１、および２以下は、９０％以上の確実性で区別されるほうがよい。これらのコピー数を極体中の染色体に関連付けると、モノソミー（極体中のコピー数２）の場合と、健康な細胞（極体中のコピー数１）の場合と、トリソミー（極体中のコピー数０）の場合とが区別される。まず、蛍光によってマークされたｍ＝８の異なるプライマーと、定義されたＰＣＲプロトコルとによって、コピー数ｎ＝０，１，２の分かっている対照サンプルにＰＣＲを行う。増幅産物の検出を、増幅産物の存在についての５重のバックグラウンド信号の閾値を用いるアレイ上のハイブリダイゼーションによって行う。ｋ＝１００の実験毎に、コピー数ｎの３つの場合に対して、以下の個体数分布が得られる。
【００４８】
【表１】
2008507963.tif 000002
【００４９】
より大きな数ｋに対しても上記分布は変化しないということを前提として、上記表から以下の結論を引き出せる。不特定のコピー数を有するサンプルに対して同じ実験を実施し、結果５／８、６／８、７／８、または、８／８が正であれば、コピー数ｎ＝２であるということを、必要とされる確実性で結論付けることができる。結果０／８が正であれば、元々のコピー数は、９０％を上回る信頼度でｎ＝０である。結果が２／８、３／８であれば、必要とされる確実性でコピー数ｎ＝１である。結果１／８および４／８を、必要とされる信頼度で判断することはできない。これらの場合にも必要とされる確実性で判断したいならば、例えば異なる増幅の数ｍを増やしてもよいし、または、ＰＣＲプロトコルを変更してもよい。他の思考実験において、ｍ＝１２とすれば、以下の表２の対応する対照サンプルでの個体数分布が得られる。
【００５０】
【表２】
2008507963.tif 000003
【００５１】
この場合、正の増幅反応の数は交差していない。すなわち、全ての当該値ｎを必要とされる信頼区間で判断できる。そこで、対照サンプルについての他の思考実験を、以下の結果となる他のＰＣＲ条件下で（サイクル数Ｉ＝３０をＩ＝２７に低減して）実施する。
【００５２】
【表３】
2008507963.tif 000004
【００５３】
この場合は、値１／１２および６／１２に対して証拠をはっきりと示すことはできない。他の反復工程において、例えば検出の閾値を調節することにより、同じ実験に基づいて交差していない結果を得ることを再び試みてもよい。
【００５４】
一般的に、本発明の計数法の最適化の目的は、出来る限りないｍ回のＰＣＲ反応によって、所望の範囲におけるコピー数ｎを確実に判断することである。このため、ＰＣＲ条件、および、場合によってはプライマーを対応して最適化する必要がある。したがって、得られたパラメータは、本発明のキットに添付されていてもよく、使用者が使用者の結果を解釈するために役立つ。
【００５５】
表４は、互いに独立して検査された結果の数が上昇した場合に証拠の統計的な確実性がどれほど上昇するかを示している。正規分布が基礎とされている。
【００５６】
【表４】
2008507963.tif 000005
【００５７】
目的シーケンスに関する結果が、名目上は同一の原材料を用いる複数の単一実験（最後の場合は互いに依存していない３２回の単一反応）において得られるのか、または、ただ１つの多重反応（例えば、ただ１つの細胞を基礎とする３２重）において得られるのかは無関係である。
【００５８】
本発明の方法を実施する際には、多重実験において増幅反応の依存性が互いに決められている、ということも可能である。
【００５９】
本発明の方法では、反応条件を、成功した増幅反応についての上記で例示した分布ができる限りはっきりするように設定することが好ましい。すなわち、特に、個体数の少ない所定のシーケンスを検出するために、ｎ＝１を有するサンプルを、ｎ＝２のサンプルおよびｎ＝３のサンプルと区別できる。
【００６０】
驚くべきことに、増幅反応において、特にＰＣＲ増幅反応において、上記で説明したような分布は、条件が適切に設定されている場合は予測以上により一層はっきりとしている、ということが明示された。
【００６１】
したがって、本発明の方法は、シーケンスの少数の（好ましくは０〜１０の範囲の数である）個体数を決定するためにも特に適している。シーケンスの数の予期される数範囲に応じて、独立したＰＣＲ反応の数ｍとＰＣＲ条件とを、シーケンスの予期される数についての結果の信頼性が最適になるように設定できることが好ましい。
【００６２】
サンプル材料として、ただ１つの細胞のゲノムのみを使用することが好ましく、この場合、所定のシーケンスが存在していないのか、もしくは、例えば１回または２回または３回または４回または５回存在しているのかを、本発明の方法によって確実に立証することができる。
【００６３】
本発明の方法は、特に極体分析にも適している。
【００６４】
所定のシーケンスは、例えば染色体であってもよいし、染色体の小部分、または、染色体の一部であってもよい。しかしながら、所定のシーケンスは、遺伝子、または、より大きなシーケンス断片であってもよい。基本的に、本発明の方法は、核酸および核酸シーケンスの各種（例えばプラスミドおよび他の人工シーケンス）に対して使用することができる。したがって、以下で例示する実施形態は、制限を目的として示すものではなく、原サンプル中の少数の核酸シーケンスの定量的検出の各々に適している。核酸シーケンスは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは遺伝子ＤＮＡであってもよい。
【００６５】
特に、本発明の方法は、ただ１つの細胞における染色体の数を決定するために適している。すなわち、この方法は、異数体の存在の確定に適している。
【００６６】
本発明の方法は、複数の実施形態で実施することができる。
【００６７】
染色体分析のために例示的に説明される第１実施形態では、特異性プライマーを用いて単細胞増幅が実施される。この場合は、細胞に対して、ＷＧＡ、すなわち、非特異性増幅をまず実施する必要がない。
【００６８】
しかしながら、好ましい第２実施形態では、単細胞または少数の細胞の核酸材料を非特異的に増幅するために、ＷＧＡを先ず実施する。続いて、請求項１に基づく特異性増幅を行う。ＰＣＲなどの増幅反応がこのように２つ次々と連続する場合も、増幅産物の数は、計数されるシーケンスのサンプル中に元々存在するコピー数に応じている。次に、表１〜３と同様の表を全プロセスに対して実験的に決定し、使用者は、これを基礎として使用者のサンプルでのコピー数を推定できる。この場合も、増幅産物が存在しているかしていないかについてある程度の確率分布が生じている。
【００６９】
特異性増幅では、細胞に対する増幅反応を、特異性のプライマーまたは対応するプライマー対／プライマーの組み合わせを用いて行う。この場合、プライマーまたはプライマー対は、特定かつ特異性の数ｍの目的断片が染色体毎に増幅され得るように選択されている。染色体分析に対して、増幅される目的断片の数ｍは、少なくとも４であることが好ましく、少なくとも６であることがより好ましく、少なくとも８であることがより好ましい。染色体毎に、より多くの（例えば、１０，１２，１４，１６，２０，３０またはそれ以上の）目的断片を選択することもできる。しかしながら、ここでは、染色体毎に目的シーケンスの適切な数を選択することは当業者に委ねられている。各染色体に対して特異性を有する目的シーケンスの数ｍ（この場合は染色体毎のｍと解釈される）は、成功した及び成功しなかった増幅反応の統計的分布において、最終的に、鋳型分子のもともと存在する数についての証拠となり得るように十分に多い方がよい。他方では、染色体毎の特異性目的断片の数ｍは、使用されるプライマー又はプライマー対の数が妥当な程度を上回らないように、多すぎないほうがよい。既に説明したように、当業者は、染色体毎に増幅される目的断片の数ｍを、分析及び増幅方法に応じて独自に選択し、且つ、相応しい増幅条件を決めることができる。
【００７０】
本発明の目的のために、核酸分子の数ｎの分かっている細胞からそれぞれ対照サンプルを、例えば核酸が全く存在していない細胞を対象０とし、核酸が１回だけ存在する細胞を対象１とするなどして選択して対照実験を行う。続いて、これらの対照サンプルの全てに対する増幅反応を、対応して選択されたプライマーまたはプライマー対を用いて行い、増幅条件を、核酸が１回（ｎ＝１）存在する対照サンプルに対して、上記核酸に対して特異性を有する目的断片の数がｍ＝４〜３０の範囲となり、増幅効率が約０．５の範囲となるように最適化する。このことは、核酸を２固体含む対照サンプル２を同じ増幅条件下で増幅する場合、増幅効率が著しく高くなることを意味している。このことは、表１からも分かる。
【００７１】
本発明の第１実施形態は、個々の細胞中の染色体数の検出に特に好適である。特に、この方法は、極体が半数または倍数の染色体組を含んでいる可能性のある場合の極体分析に適している。ここでは、染色体毎に、各染色体に対して特異性を有する例えば４〜３０個の、好ましくは６個の、好ましくは８個の目的断片を選択することが好ましい。目的断片の各々は、各染色体にたった１回存在していることが好ましく、それゆえ特異性である。このような細胞を、１つの染色体に対して１組のプライマー、または、全ての染色体に対して複数組のこのようなプライマーによって増幅する場合、増幅反応は、上記のように、全ての場合に増幅産物を生成するわけではなく、即ち、染色体毎にｍ個の目的断片のうちのいくつかは増幅されず、後に検出もできない。例えば、染色体が一回だけ存在している場合は、各染色体の例えば８個の目的断片のうちの４個（統計的な平均値）だけが増幅されるように、条件を設定することができる。このことは、結果において、対応するプローブによる後続の検出が４／８の結果となることを意味している。対照サンプルに基づいて増幅効率を予め０．５の値に決めておいた場合、結果４／８に基づいてサンプル中に染色体は１回だけ存在していたと結論づけることができる。
【００７２】
例１によって、極体が染色体２を１回含んでいるのか、または、２回含んでいるのかを検査することができる。１つの極体に染色体が１回存在しているのかまたは２回存在しているのかという疑問は、極体の検査にとって意義がある。しかしながら、他の問題提起においては、所定のシーケンスが他の個体数で存在しているかどうか、および、可能性のある数範囲がこの例のように１および２の２つの数だけを含むのではなくて例えば３、４、または、５個の数の数範囲を含んでいるかどうかを確定することは有効である。より大きな数範囲、例えば所定のシーケンスがサンプル中に３回含まれているのか、４回含まれているのか、５回含まれているのか、または、６回含まれているのかも認識できるように、基本的には本発明を使用することができる。より大きな数範囲は、より大きな統計的根拠によってのみ認識可能である。ここでは、所定のシーケンスのより多くの異なる断片を増幅し、検出する必要がある。
【００７３】
本発明の方法は、例えば２０未満、１０未満、好ましくは５または３未満である少数の所定のシーケンスの個体数を決定するためまたは計数するために特に適している。なぜなら、増幅の成功したシーケンス断片の数の統計的な拡張は、サンプル中の所定のシーケンスが少数である場合、特に明瞭だからである。
【００７４】
例１では、統計的な方法としてＸ２テストが使用される。しかしながら、他の統計的な方法も増幅結果の評価に適している。例えば、平均値比較（ｔテスト、Ｆテスト）、分散分析法方法（ＡＮＯＶＡ、ＭＡＮＯＶＡ）、多フィールドＸ２検査または階層対数線形方法などが可能である。
【００７５】
しかしながら、好ましい第２実施形態において、特異性目的断片に対して特異性を有するプライマーにより、サンプルに対する増幅反応を直接行う代わりに、全ゲノム増幅を先ず行うことも可能である。請求項１に基づく特異性増幅を後に行うＷＧＡ増幅に対して、親核酸（鋳型）の数ｎの分かっている対照サンプルの統計的な決定を参考にして、増幅条件を、以下のように決定することもできる。すなわち、増幅された目的断片の数から、正すなわち成功した増幅反応と、負すなわち成功しなかった増幅反応との統計的な分布を参考にして、予め選択した目的断片の数（ｍ）と比較して、元々存在する核酸の数（ｎ）を結論付けるように、増幅条件を決定することもできる。したがって、個体数表（表１、２、３）は、双方の増幅の組み合わせに関連している。
【００７６】
この第２実施形態の一例を例１に示す。
【００７７】
本発明の範囲内において、検出されるシーケンスの複数の異なる所定の断片を増幅することのできる各増幅方法は、サンプルの増幅に適している。このため、例１のように、単一のプライマーを使用してもよい。しかしながら、特定の断片または少数の断片に対してそれぞれ特異性を有する複数のプライマー対を使用することもできる。
【００７８】
増幅産物は、例えば、電気泳動法、ＤＮＡアレイ上のハイブリダイゼーション分析、ビードシステム、もしくは、他の光学的測定、電気的測定または電気化学的測定によって分析することができる。
【００７９】
単一の細胞の、または、名目上は同一の少数の細胞のゲノム中の所定のシーケンスの個体数を決定するには、方法の以下のような変形形態が有効である。
１．１細胞、ＷＧＡ増幅（非特異性の単細胞増幅）、後続のＰＣＲ反応（マーカーＰＣＲ）の空間的な分離、（上記実施例に対応して）断片を検出する。
２．１細胞、ＷＧＡ増幅（非特異性の単細胞増幅）、複合ハイブリダイゼーションにより断片を検出する。
３．１細胞、多重ＰＣＲ、他の増幅をせずに断片を直接検出する。
４．名目上は同一の少数の細胞、反応槽毎にそれぞれ１つの細胞との多重ＰＣＲ、他の増幅をせずに断片を検出する。
５．名目上は同一の少数の細胞、反応槽毎にそれぞれ１つの細胞との特異性ＰＣＲ（正確に１つの）反応、他の増幅をせずに断片を検出する。
６．名目上は同一の少数の細胞、反応槽毎にそれぞれ１つの細胞との特異性ＰＣＲ（正確に１つの）反応、各反応および細胞毎にそれぞれ異なるプライマー対を用いる増幅、断片を検出する。
【００８０】
上記方法１〜３を、好ましくは数の分かっている少数の（例えば、１０以下の）名目上は同一の細胞を用いて実施することもできる。
【００８１】
上記変形形態１および２では、上記実施例のＷＧＡ増幅に相当するＷＧＡ増幅を実施する。このような単細胞増幅を、統計的な増幅ともいう。
【００８２】
番号２の変形形態では、他の増幅をせずに、複合ハイブリダイゼーションによって断片を検出する。複合ハイブリダイゼーションを、ＤＮＡアレイまたはビードシステムでの場合のように、複数のプローブが同時に存在している方法と解釈する。
【００８３】
番号３および４の変形形態では、多重ＰＣＲを実施する。これは、１つの反応槽において同時に実施される、複数の特異性のプライマー対を用いるＰＣＲである。各プライマー対によって、シーケンスの正確に１つの断片が増幅されることが好ましい。このような多重ＰＣＲによって、２〜１０個の断片を同時に増幅できることが目的に適っている。断片の数がより大きい場合は問題が生じる。なぜなら、その場合は増幅が非特異性になりすぎるからである。
【００８４】
変形形態４では、名目上は同一の少数の細胞の遺伝子材料についての情報が、１つのサンプルにまとめられている。変形形態５および６では、まず、少数の名目上は同一の細胞の遺伝子材料を、それぞれ異なる反応槽において互いに独立して、正確に１つの断片を増幅する特異性ＰＣＲによって検査する。その後、他の増幅を行わずに（変形形態５）または他の増幅を行って（変形形態６）、断片を検出する。
【００８５】
複数の細胞を分析する場合は、個体数の決定についての不確実性がより大きくなる。個体数の決定が最適に行われるのは、単一の細胞を分析する場合である。名目上は同一の細胞が数個ある場合は、結果を比較することができる。本発明の方法は、単一の細胞のゲノム（例えば、極体、母体血からの個々の胎性細胞など）の分析に特に適している。
【００８６】
本発明の方法によって、サンプル中の所定のシーケンスの個体数を決定できる。所定のシーケンスは、サンプル中の分離した分子中に何回も存在している可能性がある。しかしながら、所定のシーケンスは、１つの鎖に何重にも形成されていてもよい。したがって、本発明の方法は、１つの鎖に何重にも存在する所定のシーケンスを、分離した分子の形状で存在する所定のシーケンスと同様に計数することができる。決定されるシーケンスは、複数の断片が互いに独立して増幅され得るように、ただ十分に長くなければならない。所定のシーケンスの長さは、少なくとも１００個の塩基であり、好ましくは数１００個の塩基である。
【００８７】
本発明の方法によって、複数の異なる所定のシーケンスの個体数を同時に決定することができ、この場合も、異なるシーケンスが異なる鎖にまたは同じ鎖に形成されていてもよい。同じ鎖では、異なるシーケンスは重なり合っていてもよい。
【００８８】
本発明の方法によって、異なるサンプルの所定のシーケンスの相対的な個体数を確定することができる。しかしながら、本発明の方法を、実験手順によって、増幅産物に存在するまたは存在しない特定の断片の個体数がサンプルの所定のシーケンスの絶対数についての証拠であり得るように変更することができる。
【００８９】
本発明の方法を、共通の鎖上に存在するシーケンスの個体数を決定するため、および、異なる鎖上に存在するシーケンスの個体数を決定するために使用することができる。シーケンスは、プライマーによって異なる断片がアドレスされ得るように、ただ十分に長いほうがよい。
【００９０】
本発明の他の対象は、本発明の方法を実施するためのキットであって、（ｉ）サンプル中の個体数が決定される上記所定のシーケンスの数ｍの目的断片を、それぞれ異なる増幅産物となるように増幅することのできる、１つまたは複数の特異性プライマーと、
（ｉｉ）場合によっては、上記対照サンプル中の上記所定のシーケンスの上記個体数の各可能性のある値ｎに対する対照サンプル、および／または、
（ｉｉｉ）場合によっては、（ｉ）の上記プライマーを用いた増幅反応、および／または、計数される上記シーケンスを既知の個体数含む対照サンプル（例えば、（ｉｉ）の対照サンプル）の結果と、
（ｉｖ）上記増幅反応に対する上記反応条件の説明書と
を含むキットである。
【００９１】
このキットは、所定のシーケンスを所定のプロトコルに基づいて非特異的に増幅することのできる１つまたは複数の非特異性プライマーをさらに含んでいてもよい。
【００９２】
対照増幅反応の結果の説明書は、格納されたデータの形状であってもよいし、または、印刷された資料がキットに添付されていてもよい。対照増幅反応の結果から、使用者は結果を読み取り、実際のサンプルからの使用者の独自の結果と比較することができる。
【００９３】
本発明の方法を、小さな空間において（例えば、固定キャリア、チップ、またはスライドなどの上で）実施することができる。マルチウエルプレート（例えば、マイクロタイタープレート）においても、この方法を実施することができる。固定キャリアは、スライド、ＣＤ、またはＤＮＡアレイフォーマットに対して使用されるその他の固定キャリアであることが好ましい。
【００９４】
本発明の他の対象は、本発明の方法を実施するのに適した装置である。この装置は、例えばマークされたプローブによって「捕捉」された核酸を検出するためのユニット、すなわち、例えば、蛍光を検出するため、または、比色測定法のためのユニットを備えていることが好ましい。この装置は、比較データとしての役割を果たす格納されたデータをさらに有しており、この格納されたデータによって、比較によってサンプル中に元々含まれている所定のシーケンスの絶対数の決定が可能となるように、対照データに増幅の結果を割り当てることができる。もしくは、装置は、装置に格納されている対照データの代わりに、または、対照データに加えてさらに、サンプルと同じ条件下で対照サンプルを分析することのできる対照管理部を備えていてもよい。対照サンプルは、例えば実際の検査において検出される核酸または所定のシーケンスをｎ＝０、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３などの数で含んでいる。したがって、本発明の方法は、実際のサンプルによるのと全く同じように対照によって行われる。
【００９５】
添付の図を参照して本発明をさらに説明する。
【００９６】
本発明の方法を以下の例を参考に説明する。
（例１）
【００９７】
１つの極体に染色体２が、１回存在しているのか、または、２回存在しているのかを検査する。
【００９８】
このため、極体を採取した後、蒸留水によって洗浄し、コーティングされたスライド上に置いた。この極体を、サンプル１とした。比較のため、２つの極体を有するサンプル２を同様に用意した。
【００９９】
単細胞ＷＧＡ−ＰＣＲ
単細胞ＷＧＡ−ＰＣＲによって、双方のサンプルを増幅した。単細胞ＷＧＡ−ＰＣＲは、単一の細胞または少数の細胞の遺伝子材料を増幅するように設定されている。単細胞ＷＧＡ−ＰＣＲを、スライド上で実施し、この場合、サンプル上に、それぞれ１μｌのＰＣＲ−Ｍｉｘと５μｌの鉱物油とを加えた。
【０１００】
２５μｌのＰＣＲ−Ｍｉｘは、以下のように組成されている。
１９．１２５μｌのアンプル水
２．５μｌのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）
２．５μｌのｄＮＴＰ混合物（それぞれ２ｎＭ）
０．３７５μｌのQiagen社のHot Star Taq-DNAポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）
０．５μｌのＡｌｅ１プライマー（１００ｐｍｏｌ／μｌ）
Ａｌｅ１プライマーは、以下のシーケンスを含んでいる。
Ale1 5'-TCCCAAAGTGCTGGGATTACAG-3’ (SEQ ID No. 1)
１つのサンプルと、ＰＣＲ−Ｍｉｘと、油膜とをそれぞれ含むＰＣＲバッチを、以下のＰＣＲ条件で攪拌した。
変性：        ９５℃で１５分
４０サイクル  ９４℃で３０秒
６２℃で３０秒
７２℃で３０秒
変位          ７２℃で１０分
このＰＣＲでは、サンプルの複数の異なる断片が同時に増幅される。したがって、このＰＣＲを、ＷＧＡ−ＰＣＲとも称する。
【０１０１】
ＰＣＲ生成物を、２０μｌのＴＥバッファへ移した。そのうちの２μｌをポリアクリルアミドゲル上で分析し、１５μｌをマーカーＰＣＲによって増幅した。残りを−２０℃で凍結した。
【０１０２】
マーカーＰＣＲ
サンプルの特定の断片が単細胞ＷＧＡ−ＰＣＲによって増幅されたかどうか、を検出するために、マーカーＰＣＲを実施した。
【０１０３】
マーカーＰＣＲによって、単細胞ＰＣＲのＰＣＲ生成物の複数の部分を、これらの断片の１つに対してそれぞれ特異性である各１つの異なるプライマー対をその都度用いて増幅した。各単一のマーカーＰＣＲに対して、以下のＰＣＲバッチを用意した。
１．５９２５μｌのアンプル水
０．６μｌのバッファ
０．６μｌのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）
０．０３２５μｌのPromega社のTaqポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）
０．０７５μｌの単細胞ＰＣＲのＰＣＲ生成物
２．５μｌのプライマー（２ｐｍｏｌ／μｌ）が準備された
プライマー対をマイクロタイタープレートの反応槽に入れ、これに残りのＰＣＲバッチをピペットで加えた。単細胞ＰＣＲによって染色体２から増幅された断片を検出するために、以下の８個のプライマー対を使用した。
RH102790 5'-TGAAGTCATCGTCTATAAGGCA-3' 5'-TCTATTTGTCCTGGGACCCA-3' 
SHGC-31419 5'-TCCTATTTTGAGGGCGAGG-3' 5'-ATAAATACAAACATGTCAGACTGGG -3' 
SHGC-62010 5'-AAGGTTTTATAATGGAAACACTG-3' 5'-TGAGTTCTGGAATTCATTACATA-5' 
RH102813 5'-CCAACCACTTCAAGAAATAGGC-3' 5'-AATACAGTGTGGCCAAAGCC-3' 
SHGC-30955 5'-GTTTTTTCTTTGAGTGACACAAGC-3' 5'-ACTTGTGTGATTTGTAAGCTGAAC-3' 
G62066 5'-GCCTCACAAGCCTCATCAGT-3' 5'-CGGACTTGTCTAGAAATGAGCA-3' 
G31877 5'-TTGGCCTCCACTTTACAGAC-3' 5'-CACCCGGCCTATGGACAGA-3' 
SHGC-144725 5'-ATGGACAGGATGGTGATAAGGAA-3' 5'-AGATGCAAGGAAAGATGCTTACG-3'
上記プライマーのシーケンスをＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２〜１７で示す。
【０１０４】
以下のＰＣＲ条件で、双方のサンプルを、それぞれ８個のＰＣＲバッチにおいて、上記プライマー対の１つによってそれぞれ増幅する。
変性：        ９５℃で３分
３５サイクル  ９５℃で３０秒
５５℃で３０秒
７２℃で３０秒
変位          ７２℃で１０分
増幅後、１６個の増幅産物を、１つのローディングバッファーによって、ポリアクリルアミドゲル上で、各所定のシーケンス断片が存在していたかどうか、すなわち、増幅が正に行われたのかまたは負に行われたのかについてそれぞれ分析した。ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動検査の対応する画像を図２ａおよび図２ｂに示す。なお、図２ａは、サンプル１の巻きフィルム、図２ｂはサンプル２の巻きフィルムを示している。これらの画像に基づいて、サンプル１では２つの正の増幅産物が確定された、ということを認識できる。残りのその他の６個の増幅産物は、負である、すなわち、マーカーＰＣＲのプライマーの選択によって予め決められた染色体２の所定の断片のうちの２つだけが、単細胞ＰＣＲによって増幅された。サンプル２では、８個の増幅産物が確定された。すなわち、８個の所定の断片の全てが、単細胞ＰＣＲによって増幅された。結果は図１にまとめられている。
【０１０５】
図２ａおよび図２ｂに示す例において、サンプル２では８個全ての断片が増幅されたのに対してサンプル１では番号２および７の付された断片だけが増幅された、ということがはっきりと分かる。なお、番号２の付された断片に対する信号はより弱い。例えば負の増幅については「０」、および、正の増幅については「１」によっても示すことのできる純粋に数字の結果を得るために、断片の正の増幅と負の増幅とを区別する閾値を決めることが基本的には有利である。これらの閾値は、断片を検出するために選択された方法に応じて経験的に決める必要がある。
【０１０６】
例１は、サンプル中の所定のシーケンスの数がより少ない場合（ここでは、サンプル１の染色体２）、サンプル中の所定のシーケンスの数がより多い場合（ここでは、サンプル２の染色体２）よりも少ないシーケンスの断片が増幅されるという効果を非常に顕著に示す。
【０１０７】
この結果が純粋に無作為の任意抽出に基づいているのか、または、有意性を有しているのかを、統計的な方法によって確定することができる。適切な統計的な方法は、例えばL. Cavalli - Sforza, Biometrie, Gustav Fischer出版社, Stuttgart, 1974の２２章に記載されているようなＸ２テスト（カイ２乗検定とも言う）である。確定された結果に対してこのテストを行う場合、Ｘ２に対して９．６、および、誤り確率Ｐに対して０．００３の値が出る。このことは、「観察される個体数における相違が無作為である」という仮定がＰ＝０．００３の誤り確率によって打ち消される、ということを意味している。
【０１０８】
したがって、この方法によって、サンプル２にはサンプル１よりも多くの染色体２が含まれている、ということが立証された。
【０１０９】
上記方法を数回実施し、結果を統計的に評価する場合、これにより確定される統計的なデータを参考にして、サンプル中の染色体２の絶対数を、増幅産物中の特定の断片の存在または不在の個体数に基づいて決定することができる。このことは、サンプルの所定のシーケンスの絶対数を計数するための方法の有効化を示す。この有効化の際に、上記閾値の影響について考慮する必要がある。閾値を高く設定すれば、正に増幅される断片はより少なく、これに対し、閾値が低い場合は、より多くの正の増幅が行われる。
（例２）
【０１１０】
特定の染色体の存在または不在について７個の細胞株（Ｐ１−２〜Ｐ１−８）をテストした。これらの細胞株は、Coriell社から取得したものである。Coriell社から取得した細胞は、Coriell社自身によって特定の染色体の存在または不在について既にテストされている。これらの細胞を、本発明の方法によって同じくテストした。結果を図３に示す（透明な方眼区画：染色体存在（方法の結果は一致する）。斜線の付いた方眼区画：染色体不在（方法の結果は一致する）。点の付いた方眼区画：染色体の存在を、本発明の方法は示し、他の方法は示さない。黒い方眼区画：本発明の方法は染色体の不在を示し、他の方法は染色体の存在を示す。）。
【０１１１】
細胞のＤＮＡは、取り出され、パックラベルに基づいて、ヒト染色体についてある特定のパネルを含んでいる。Coriell社の証拠に加えて、Coriell社のウエブサイトのブロッティングテストに基づく試験結果も用いてもよい。 なぜこの会社が２つの説明書を作っているのかはわからない。ブロッティングテストは、細胞の小部分にのみ含まれている染色体も検出するために、明らかに十分な感度である。図３の第３列は、チップの結果をそれぞれ示している。
【０１１２】
結果：
本発明の方法の結果は、９０％を上回るケースにおいて、他の方法の結果に一致している。
【０１１３】
本発明に基づくCoriell社の細胞に対するＰＣＲの実験的な実施：
各１０ｎｇの染色体ＤＮＡを、表５及び表６に示すように２５μｌのＡｌｅ中でＰＣＲ（プライマーＡｌｅ１による全ゲノム増幅、例１参照）し、標準条件に基づいて攪拌した。
【０１１４】
【表５】
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【０１１５】
【表６】
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【０１１６】
２５μｌのＰＣＲバッチを洗浄し（ＰＣＲ浄化キットMacherey & Nagel社）、表７に示すように２５０μｌの溶離バッファに入れ、そのうち、それぞれ１μｌを、チップのMaster-Mixの添付された錨状体上にそれぞれ与えた。
【０１１７】
【表７】
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【０１１８】
そして、このバッチを、以下の条件で攪拌し、ハイブリダイズさせた。
【０１１９】
【表８】
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【０１２０】
続いて、スライドを洗浄し、スキャンした（Axxon社またはTecan社の標準的なスキャナ）。
（例３）
【０１２１】
ヒト卵母細胞の減数分裂の間に、あるシーケンスの４つのコピーを有する倍数の染色体組は、ただ１つのコピーを有する成熟卵母細胞に還元される。分裂は、２工程で行われる。
ａ．卵母細胞における相同染色体の分裂←→１．極体
ｂ．成熟卵母細胞における染色分体の分裂←→２．極体
第１極体は、あるシーケンスの２つのコピーを含んでおり、成熟卵母細胞および第２極体は、あるシーケンスの１つのコピーをそれぞれ含んでいる。以下の分裂（一部は誤った分裂）が考えられる。
成熟卵母細胞は４つのコピーを含んでいる。←→極体はコピーを含んでいない。
成熟卵母細胞は３つのコピーを含んでいる。←→極体は１つのコピーを含んでいる。
成熟卵母細胞は２つのコピーを含んでいる。←→極体は２つのコピーを含んでいる。
成熟卵母細胞は１つのコピーを含んでいる。←→極体は３つのコピーを含んでいる。
成熟卵母細胞はコピーを含んでいない。←→極体は４つのコピーを含んでいる。
【０１２２】
誤った分裂が生じ、誤った分裂は、本発明の方法の正確さを示すために役立ち得る。
【０１２３】
上記例では、対応する極体と卵母細胞とが検査される。蛍光インシチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）が４つの正しい信号を示すならば、極体中にシーケンスを検出することはできないであろう。ＦＩＳＨが３つ以下の信号を示すならば、本発明の方法は正である（極体は少なくとも１つのコピーを含んでいる）に違いない。
【０１２４】
以下の実験は、確立されたＦＩＳＨ方法に対するチップ結果の対応を示す。単細胞の処理およびＦＩＳＨハイブリダイゼーションを、各キットに添付のVysis社のプロトコルに基づいて行う。
【０１２５】
Vysis社のハイブリダイゼーションキットを用いたヒト卵母細胞のＦＩＳＨ分析の結果を図４に示す。最大の点（オリジナルでは青）は、蛍光によってマークされたプローブ分子であり、このプローブ分子は、染色体１６を特異的に検出する。４つの正の信号（偽信号無し）は、卵母細胞中に４つの染色分体があり、減数分裂の間に染色分体は卵母細胞中に誤って残留していることを示している。
【０１２６】
チップ毎の対応する分析全染色体の存在／不在について、全ゲノム増幅に基づいて、極体増幅産物を検査する。実験の手順は上記で例１および例２において説明した。ＰＣＲ条件および成分は例２と同様であるが、鋳型（ＤＮＡ）は、チップ上に鋳型として存在する極体によって置換されている。
【０１２７】
スキャンの結果：イメージファイルのイメージ分析を、Alopex社のプログラム「ＴＩＦＦアナライザー」を用いて行う。染色体１６は、検出されない。この分析の結果を図５の欄５に示す。
【０１２８】
したがって、対応する第１極体は、染色体１６を含んでいない。このことを、チップによって示すことができる。
【産業上の利用可能性】
【０１２９】
以上説明したように、本発明は、サンプル中のシーケンスの個体数を決定するための方法、その方法を実施するためのキット及び装置について有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】第１例の結果を示す表である。
【図２】ａは、所定の断片を検出するための電気泳動検査の画像である。ｂは、所定の断片を検出するための電気泳動検査の画像である。
【図３】一方側にCoriell社の、かつ、他方側に本発明の方法の、７個の細胞株についての染色体の存在または不在に関する比較を示す図である。
【図４】Vysis社のハイブリダイゼーションキットを用いたヒト卵母細胞のＦＩＳＨ分析の結果を示す図である。
【図５】プログラム「ＴＩＦＦアナライザー」を用いるスキャンのイメージ分析を示す表である。
【図１】
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【図５】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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