(57)【要約】本発明は、新規な治療用および診断用デンドリマーに関する。特に、本発明は、疾患診断および治療(例えば、癌診断および治療)に用いるためのデンドリマーに基づく多官能性組成物ならびに系を対象とする。組成物および系は、治療用もしくは診断用物質をターゲティングさせる、イメージングする、検出する、および/または供給する、ならびに細胞もしくは組織(例えば、腫瘍)の治療に対する応答をモニターするための1つまたは複数の構成要素を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
デンドリマーを含む組成物であって、該デンドリマーが、部分的アセチル化第5世代(G5)ポリアミドアミン(PAMAM)、ポリプロピルアミン(POPAM)、またはPAMAM-POPAMデンドリマーを含み、該デンドリマーが官能基の結合のための2つまたはそれ以上の反応部位を含む、組成物。
【請求項２】
デンドリマーが2つまたはそれ以上の官能基を含み、該官能基が、治療剤、ターゲティング剤、イメージング剤、および生物学的モニタリング剤からなる群より選択される、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
官能基の少なくとも1つが、エステル結合を介してデンドリマーに結合している、請求項2記載の組成物。
【請求項４】
治療剤がメトトレキセートを含む、請求項2記載の組成物。
【請求項５】
ターゲティング剤が葉酸を含む、請求項2記載の組成物。
【請求項６】
ターゲティング剤がRGDペプチドを含む、請求項2記載の組成物。
【請求項７】
イメージング剤が蛍光剤を含む、請求項2記載の組成物。
【請求項８】
蛍光剤がフルオレセインイソチオシアネートを含む、請求項7記載の組成物。
【請求項９】
蛍光剤が6-TAMARAを含む、請求項7記載の組成物。
【請求項１０】
メトトレキセートがエステル結合を介してデンドリマーに結合している、請求項4記載の組成物。
【請求項１１】
デンドリマーが2個から20個までの間の反応部位を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１２】
デンドリマーが官能基に結合している、請求項2記載の組成物。
【請求項１３】
結合が、共有結合、イオン結合、金属結合、水素結合、ファンデルワールス結合、エステル結合、またはアミド結合を含む、請求項12記載の組成物。
【請求項１４】
治療剤が、化学療法剤、抗発癌剤、抗血管新生剤、腫瘍抑制剤、抗菌剤、または治療用タンパク質をコードする核酸を含む発現構築物を含む、請求項2記載の組成物。
【請求項１５】
治療剤が保護基で保護されている、請求項14記載の組成物。
【請求項１６】
保護基が、光不安定性保護基、放射線不安定性保護基、および酵素不安定性保護基からなる群より選択される、請求項15記載の組成物。
【請求項１７】
デンドリマーが保護コアのジアミンを含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１８】
反応部位が第一級アミン基を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１９】
デンドリマーを含む組成物であって、該デンドリマーが、部分的アセチル化G5 PAMAM、POPAM、またはPAMAM-POPAMデンドリマーを含み、該デンドリマーが、治療剤、ターゲティング剤、およびイメージング剤からなる群より選択される1つまたは複数の官能基をさらに含む、組成物。
【請求項２０】
治療剤が抗発癌剤を含む、請求項19記載の組成物。
【請求項２１】
治療剤が化学療法剤を含む、請求項19記載の組成物。
【請求項２２】
治療剤がメトトレキセートを含む、請求項19記載の組成物。
【請求項２３】
治療剤がトリチウムを含む、請求項19記載の組成物。
【請求項２４】
ターゲティング剤が葉酸を含む、請求項19記載の組成物。
【請求項２５】
ターゲティング剤がRGDペプチドを含む、請求項19記載の組成物。
【請求項２６】
イメージング剤が蛍光剤を含む、請求項19記載の組成物。
【請求項２７】
蛍光剤がフルオレセインイソチオシアネートを含む、請求項26記載の組成物。
【請求項２８】
蛍光剤が6-TAMARAを含む、請求項26記載の組成物。
【請求項２９】
メトトレキセートがエステル結合を介してデンドリマーに結合している、請求項22記載の組成物。
【請求項３０】
治療剤が、化学療法剤、抗発癌剤、抗血管新生剤、腫瘍抑制剤、抗菌剤、および治療用タンパク質をコードする核酸を含む発現構築物からなる群より選択される、請求項19記載の組成物。
【請求項３１】
治療剤が保護基で保護されている、請求項19記載の組成物。
【請求項３２】
保護基が、光不安定性保護基、放射線不安定性保護基、および酵素不安定性保護基からなる群より選択される、請求項31記載の組成物。
【請求項３３】
化学療法剤が、白金複合体、ベラパミル、ポドフィロトキシン、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソ尿素、アドリアマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、エトポシド、タモキシフェン、パクリタキセル、タキソール、トランスプラチナ、5-フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびメトトレキセートからなる群より選択される、請求項21記載の組成物。
【請求項３４】
抗発癌剤がアンチセンス核酸を含む、請求項20記載の組成物。
【請求項３５】
アンチセンス核酸が、発癌遺伝子のRNAに相補的な配列を含む、請求項34記載の組成物。
【請求項３６】
発癌遺伝子が、abl、Bcl-2、Bcl-xL、erb、fms、gsp、hst、jun、myc、neu、raf、ras、ret、src、およびtrkからなる群より選択される、請求項35記載の組成物。
【請求項３７】
核酸が、腫瘍抑制因子、サイトカイン、受容体、アポトーシスの誘導物質、および分化誘導剤からなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項30記載の組成物。
【請求項３８】
腫瘍抑制因子が、BRCA1、BRCA2、C-CAM、p16、p21、p53、p73、Rb、およびp27からなる群より選択される、請求項37記載の組成物。
【請求項３９】
サイトカインが、GMCSF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IFN-β、IFN-γ、およびTNFからなる群より選択される、請求項37記載の組成物。
【請求項４０】
受容体が、CFTR、EGFR、エストロゲン受容体、IL-2受容体、およびVEGFRからなる群より選択される、請求項37記載の組成物。
【請求項４１】
アポトーシスの誘導物質が、AdE1B、Bad、Bak、Bax、Bid、Bik、Bim、Harakid、およびICE-CED3プロテアーゼからなる群より選択される、請求項37記載の組成物。
【請求項４２】
治療剤が短い半減期の放射性同位元素を含む、請求項19記載の組成物。
【請求項４３】
イメージング剤が、14C、36Cl、57Co、58Co、51Cr、125I、131I、111Ln、152Eu、59Fe、67Ga、32P、186Re、35S、75Se、Tc-99m、および175Ybからなる群より選択される放射能標識を含む、請求項19記載の組成物。
【請求項４４】
ターゲティング剤が、抗体、受容体リガンド、ホルモン、ビタミン、および抗原からなる群より選択される、請求項19記載の組成物。
【請求項４５】
抗体が疾患特異的抗原に特異的である、請求項44記載の組成物。
【請求項４６】
疾患特異的抗原が腫瘍特異的抗原を含む、請求項45記載の組成物。
【請求項４７】
受容体リガンドが、CFTRのリガンド、FGFRのリガンド、エストロゲン受容体のリガンド、FGR2のリガンド、葉酸受容体のリガンド、IL-2受容体のリガンド、糖タンパク質、EGFRのリガンド、およびVEGFRのリガンドからなる群より選択される、請求項44記載の組成物。
【請求項４８】
受容体リガンドが葉酸である、請求項44記載の組成物。
【請求項４９】
受容体リガンドがRGDペプチドである、請求項44記載の組成物。
【請求項５０】
疾患を処置する方法であって、該疾患を患っている、または、該疾患に罹りやすい被験体に、請求項19記載の組成物の治療的有効量を投与する段階を含む、方法。
【請求項５１】
疾患が腫瘍性疾患である、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
腫瘍性疾患が、白血病、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄球性(顆粒球性)白血病、慢性リンパ性白血病、真性多血症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、肉腫および癌腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、子宮癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、および神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫からなる群より選択される、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
以下の段階を含む、被験体において腫瘍増殖を変化させる方法：
a)デンドリマーを含む組成物を供給する段階であって、該デンドリマーが、部分的アセチル化G5 PAMAM、POPAM、またはPAMAM-POPAMデンドリマーを含み、該デンドリマーが治療剤、ターゲティング剤、およびイメージング剤からなる群より選択される1つまたは複数の官能基をさらに含む、段階；ならびに
b)該腫瘍増殖が変化するような条件下で被験体に該組成物を投与する段階。
【請求項５４】
変化させることが、被験体において腫瘍増殖を阻害することを含む、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
変化させることが、被験体において腫瘍のサイズを縮小させることを含む、請求項53記載の方法。
【請求項５６】
デンドリマーを含む組成物が、化学療法剤または抗発癌剤と同時投与される、請求項53記載の方法。
【請求項５７】
腫瘍増殖を変化させることが、腫瘍を化学療法剤または抗発癌剤処置に対して感受性を増加させる、請求項53記載の方法。
【請求項５８】
治療剤が抗発癌剤を含む、請求項53記載の方法。
【請求項５９】
治療剤が化学療法剤を含む、請求項53記載の方法。
【請求項６０】
治療剤がメトトレキセートを含む、請求項53記載の方法。
【請求項６１】
治療剤がトリチウムを含む、請求項53記載の方法。
【請求項６２】
ターゲティング剤が葉酸を含む、請求項53記載の方法。
【請求項６３】
ターゲティング剤がRGDペプチドを含む、請求項53記載の方法。
【請求項６４】
イメージング剤が蛍光剤を含む、請求項53記載の方法。
【請求項６５】
蛍光剤がフルオレセインイソチオシアネートを含む、請求項53記載の方法。
【請求項６６】
蛍光剤が6-TAMARAを含む、請求項53記載の方法。
【請求項６７】
メトトレキセートがエステル結合を介してデンドリマーに結合している、請求項53記載の方法。
【請求項６８】
治療剤が、化学療法剤、抗発癌剤、抗血管新生剤、腫瘍抑制剤、抗菌剤、および治療用タンパク質をコードする核酸を含む発現構築物からなる群より選択される、請求項53記載の方法。
【請求項６９】
治療剤が保護基で保護されている、請求項53記載の方法。
【請求項７０】
保護基が、光不安定性保護基、放射線不安定性保護基、および酵素不安定性保護基からなる群より選択される、請求項69記載の方法。
【請求項７１】
化学療法剤が、白金複合体、ベラパミル、ポドフィロトキシン、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソ尿素、アドリアマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、エトポシド、タモキシフェン、パクリタキセル、タキソール、トランスプラチナ、5-フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびメトトレキセートからなる群より選択される、請求項59記載の方法。
【請求項７２】
抗発癌剤がアンチセンス核酸を含む、請求項58記載の方法。
【請求項７３】
アンチセンス核酸が、発癌遺伝子のRNAに相補的な配列を含む、請求項72記載の方法。
【請求項７４】
発癌遺伝子が、abl、Bcl-2、Bcl-xL、erb、fms、gsp、hst、jun、myc、neu、raf、ras、ret、src、およびtrkからなる群より選択される、請求項73記載の方法。
【請求項７５】
核酸が、腫瘍抑制因子、サイトカイン、受容体、アポトーシスの誘導物質、および分化誘導剤からなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項68記載の方法。
【請求項７６】
腫瘍抑制因子が、BRCA1、BRCA2、C-CAM、p16、p21、p53、p73、Rb、およびp27からなる群より選択される、請求項75記載の方法。
【請求項７７】
サイトカインが、GMCSF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IFN-β、IFN-γ、およびTNFからなる群より選択される、請求項75記載の方法。
【請求項７８】
受容体が、CFTR、EGFR、エストロゲン受容体、IL-2受容体、およびVEGFRからなる群より選択される、請求項75記載の方法。
【請求項７９】
アポトーシスの誘導物質が、AdE1B、Bad、Bak、Bax、Bid、Bik、Bim、Harakid、およびICE-CED3プロテアーゼからなる群より選択される、請求項75記載の方法。
【請求項８０】
治療剤が短い半減期の放射性同位元素を含む、請求項53記載の方法。
【請求項８１】
イメージング剤が、14C、36Cl、57Co、58Co、51Cr、125I、131I、111Ln、152Eu、59Fe、67Ga、32P、186Re、35S、75Se、Tc-99m、および175Ybからなる群より選択される放射能標識を含む、請求項53記載の方法。
【請求項８２】
ターゲティング剤が、抗体、受容体リガンド、ホルモン、ビタミン、および抗原からなる群より選択される、請求項53記載の方法。
【請求項８３】
抗体が疾患特異的抗原に特異的である、請求項82記載の方法。
【請求項８４】
疾患特異的抗原が腫瘍特異的抗原を含む、請求項83記載の方法。
【請求項８５】
受容体リガンドが、CFTRのリガンド、FGFRのリガンド、エストロゲン受容体のリガンド、FGR2のリガンド、葉酸受容体のリガンド、IL-2受容体のリガンド、糖タンパク質、EGFRのリガンド、およびVEGFRのリガンドからなる群より選択される、請求項82記載の方法。
【請求項８６】
受容体リガンドが葉酸である、請求項82記載の方法。
【請求項８７】
受容体リガンドがRGDペプチドである、請求項82記載の方法。
【請求項８８】
腫瘍が腫瘍性疾患と関連している、請求項53記載の方法。
【請求項８９】
腫瘍性疾患が、白血病、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄球性(顆粒球性)白血病、慢性リンパ性白血病、真性多血症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、肉腫および癌腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、子宮癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、および神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫からなる群より選択される、請求項88記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新規な治療用および診断用デンドリマーに関する。特に、本発明は、疾患診断および治療(例えば、癌診断および治療)に用いる、デンドリマーに基づく多官能性組成物および系に向けられる。組成物および系は、治療用もしくは診断用物質をターゲティングさせる、イメージングする、検出する、および/または供給する、ならびに細胞もしくは組織(例えば、腫瘍)の治療に対する応答をモニターするための、1つまたは複数の構成要素を含む。
【０００２】
本発明は、2004年8月25日に出願された、米国仮特許出願第60/604,321号および2005年6月15日に出願された第60/690,652号の優先権を主張し、それらの特許出願の開示は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
【０００３】
本発明は、一部、NIH契約NO1-CO-97111およびNCI契約NO1-CM-97065-32により資金を得た。政府は、本発明に一定の権利を有しうる。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
癌は、米国において4人の死亡者に1人の結果となっている、死亡原因の第2位である。1997年において、肺、乳房、前立腺、結腸直腸および卵巣の癌について新しい診断の推定総数は、約2百万人であった。米国における増え続ける老年人口のため、癌発生率が増大し続けるだろうと予想することは妥当である。
【０００５】
癌は、現在、手術、放射線治療および化学療法を含む様々な様式を用いて処置される。処置様式の選択は、癌の型、場所および内転移に依存するものである。例えば、大腸癌のような多くの一般的な新生物は、利用できる治療にほとんど反応しない。
【０００６】
現行の方法に応答性である腫瘍型について、癌のわずかだけがその治療によく応答する。加えて、多くの癌についての治療における改善にもかかわらず、ほとんどの現在用いられる治療剤は、重篤な副作用をもつ。これらの副作用は、しばしば、化学療法剤の有用性を制限し、結果として、いずれの治療法の選択肢もない、癌患者のかなりの部分を生じる。遺伝子治療または免疫治療のような治療先駆けの他の型は、化学療法より特異的であり、かつ副作用が少ないことが証明される場合がある。しかしながら、少数の臨床試験においていくらかの進歩を示しているが、これらのアプローチの実践的使用は現時点では、制限されたままである。
【０００７】
現存する治療法の限られた成功にもかかわらず、腫瘍性細胞の基礎をなす生物学の理解は進歩している。腫瘍性形質変化および変化した細胞増殖に関与する細胞事象は、今では同定され、いくつかのヒト腫瘍の発癌における複数の段階が実証されている(例えば、Isaacs, Cancer 70:1810 (1992)（非特許文献1）参照)。制御されていない細胞増殖を引き起こす発癌遺伝子は同定され、遺伝的原因および機能に関して特徴づけられている。細胞複製周期を制御する特定の経路は、詳細に特徴づけられ、この制御に関与するタンパク質はクローニングおよび特徴づけされている。また、アポトーシスを媒介し、細胞増殖を負に制御する分子が詳細に明らかにされている(Kerr et al., Cancer 73:2013 (1994)（非特許文献2）)。これらの細胞制御経路の操作は、腫瘍性細胞において増殖を停止させ、アポトーシスを誘導することができたことが今では実証されている(例えば、Cohen and Tohoku, Exp. Med., 168:351 (1992)（非特許文献3）およびFujiwara et al., J. Natl. Cancer Inst., 86:458 (1994)（非特許文献4）参照)。腫瘍性細胞において細胞増殖および複製を調節する代謝経路は、重要な治療的標的である。
【０００８】
これらの目覚ましい達成にもかかわらず、これらの治療がインビボで癌細胞を処置するために用いられうる前に、多くの障害がまだ存在する。例えば、これらの治療は、個体の特定の腫瘍細胞における特定の病態生理学的変化の同定を必要とする。これは、腫瘍の機械的侵襲(生検)および典型的にはインビトロでの細胞培養および試験による診断を必要とする。腫瘍表現型は、その後、治療が選択および実行されうる前に分析されなければならない。そのような段階は、時間がかかる、複雑、および高価である。
【０００９】
正常細胞と比較して腫瘍細胞を選択できる処置方法の必要性がある。現行治療は、腫瘍細胞に対して相対的にのみ特異的である。腫瘍ターゲティングはこの選択性問題に取り組むが、たいていの腫瘍は固有の抗原を有しないため、適切ではない。さらに、治療は、理想的には、抵抗性新生物の選択を防ぐために並行して働く作用のいくつかの異なる機構をもつべきであり、かつ腫瘍の場所および型の検証後、医師により解除できるべきである。最後に、治療は、理想的には、医師が、処置前および処置後すぐに、残留または最小疾患を同定すること、および治療への応答をモニターすることを可能にするべきである。わずかな残留細胞が結果として、再増殖または悪化を生じ、治療に抵抗性である腫瘍へと導きうるため、これは非常に重要である。治療の終わりに(すなわち、腫瘍再増殖後よりむしろ)残留疾患を同定することは、わずかな残存する腫瘍細胞の根絶を促進すると思われる。
【００１０】
従って、理想的な治療は、腫瘍をターゲティングし、腫瘍の範囲(例えば、腫瘍転移)をイメージングし、腫瘍細胞における治療剤の存在を同定する能力をもつべきである。従って、医師が、腫瘍細胞における病態生理学的異常に基づいた治療用分子を選択すること、異常細胞において治療剤を活性化すること、治療への応答を実証すること、および残留疾患を同定することを可能にする治療が必要とされる。
【００１１】
【非特許文献１】Isaacs, Cancer 70:1810 (1992)
【非特許文献２】Kerr et al., Cancer 73:2013 (1994)
【非特許文献３】Cohen and Tohoku, Exp. Med., 168:351 (1992)
【非特許文献４】Fujiwara et al., J. Natl. Cancer Inst., 86:458 (1994)
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
本発明は、新規な治療用および診断用デンドリマーに関する。特に、本発明は、疾患診断および治療(例えば、癌診断および治療)に用いる、デンドリマーに基づく多官能性組成物および系に向けられる。組成物および系は、治療用もしくは診断用物質をターゲティングさせる、イメージングする、検出する、および/または供給する、ならびに細胞もしくは組織(例えば、腫瘍)の治療に対する応答をモニターするための、1つまたは複数の構成要素を含む。
【００１３】
従って、いくつかの態様において、本発明は、デンドリマー、部分的にアセチル化された第5世代(G5)デンドリマー(例えば、ポリアミドアミン(PAMAM)、ポリプロピルアミン(POPAM)、またはPAMAM-POPAMデンドリマー)、1つまたは複数の官能基をさらに含むデンドリマーを含む組成物を提供する。本発明は、G5デンドリマーの使用に限定されない。いくつかの態様において、1つまたは複数の官能基は、治療剤、ターゲティング剤および/またはイメージング剤を含む。いくつかの態様において、官能基の少なくとも1つは、エステル結合を介してデンドリマーに結合している。好ましい態様において、治療剤は、化学療法化合物(例えば、メトトレキセート)を含む。いくつかの好ましい態様において、化学療法化合物は、エステル結合を介してデンドリマーに結合している。いくつかの好ましい態様において、ターゲティング剤は、葉酸を含む。さらに他の好ましい態様において、イメージング剤は、フルオレセインイソチオシアネートまたは他の検出可能な標識を含む。いくつかの態様において、官能基は、治療剤、ターゲティング剤、イメージング剤、または生物学的モニタリング剤の1つである。いくつかの態様において、G5デンドリマーは、官能基に結合している。いくつかの態様において、結合は、共有結合、イオン結合、金属結合、水素結合、ファンデルワールス結合、エステル結合またはアミド結合を含む。
【００１４】
本発明のいくつかの態様において、治療剤は、限定されるわけではないが、化学療法剤、抗発癌剤、抗血管新生剤、腫瘍抑制剤、抗菌剤、または治療用タンパク質をコードする核酸を含む発現構築物を含むが、本発明は、治療剤の性質により限定されない。さらなる態様において、治療剤は、光不安定性、放射線不安定性、および酵素不安定性保護基から選択される保護基で保護される。いくつかの態様において、化学療法剤は、限定されるわけではないが、白金複合体、ベラパミル、ポドフィロトキシン、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソ尿素、アドリアマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、エトポシド、タモキシフェン、パクリタキセル、タキソール、トランスプラチナ、5-フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびメトトレキセートからなる群より選択される。いくつかの態様において、抗発癌剤は、アンチセンス核酸(例えば、RNA分子)を含む。特定の態様において、アンチセンス核酸は、発癌遺伝子のRNAに相補的な配列を含む。好ましい態様において、発癌遺伝子は、限定されるわけではないが、abl、Bcl-2、Bcl-xL、erb、fms、gsp、hst、jun、myc、neu、raf；ras、ret、srcまたはtrkを含む。いくつかの態様において、治療用タンパク質をコードする核酸は、限定されるわけではないが、腫瘍抑制因子、サイトカイン、受容体、アポトーシスの誘導物質、または分化誘導剤を含む因子をコードする。好ましい態様において、腫瘍抑制因子は、限定されるわけではないが、BRCA1、BRCA2、C-CAM、p16、p21、p53、p73、Rb、およびp27を含む。好ましい態様において、サイトカインは、限定されるわけではないが、GMCSF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、β-インターフェロン、γ-インターフェロン、およびTNFを含む。好ましい態様において、受容体は、限定されるわけではないが、CFTR、EGFR、エストロゲン受容体、IL-2受容体、およびVEGFRを含む。好ましい態様において、アポトーシスの誘導物質は、限定されるわけではないが、AdE1B、Bad、Bak、Bax、Bid、Bik、Bim、Harakid、およびICE-CED3プロテアーゼを含む。いくつかの態様において、治療剤は、短い半減期の放射性同位元素を含む。
【００１５】
本発明は、用いられる(例えば、本発明のデンドリマーに結合した)抗発癌剤または化学療法剤の型により限定されない。実際、様々な抗発癌剤および化学療法剤が、本発明において有用であることが企図され、限定されるわけではないが、アシビシン；アクラルビシン；塩酸アコダゾール；アクロニン；アドゼレシン；アドリアマイシン；アルデスロイキン；アリトレチノイン；アロプリノールナトリウム；アルトレタミン；アンボマイシン；酢酸アメタントロン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；バンレイシ科の(Annonaceous)アセトゲニンス；アントラマイシン；アシミシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテーパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデーパ；ベキサロテン；ビカルタミド；塩酸ビサントレン；ビスナフィドジメシレート；ビゼレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレクイナールナトリウム；ブロピリミン；ブラタシン；ブスルファン；カベルゴリン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン；カルゼレシン；セデフィンゴール；セレコキシブ；クロラムブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；クリスナトールメシレート；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；DACA(N-[2-(ジメチル-アミノ)エチル]アクリジン-4-カルボキサミド)；ダクチノマイシン；塩酸ダウノルビシン；ダウノマイシン；デシタビン；デニロイキンジフチトックス；デキソルマプラチン；デザグアニン；デザグアニンメシレート；ジアジクオン；ドセタキセル；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；ズアゾマイシン；エダトレキサート；塩酸エフロルニチン；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロメート；エピプロピジン；塩酸エピルビシン；エルブロゾール；塩酸エソルビシン；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸ナトリウム；エタニダゾール；エチオ化オイルI 131；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン；塩酸ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フロキシウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；5-FdUMP；フルロシタビン；ホスクイドン；ホストリエシンナトリウム；FK-317；FK-973；FR-66979；FR-900482；ゲムシタビン；塩酸ゲムシタビン；ゲムツツマブオゾガマイシン；金Au 198；酢酸ゴセレリン；グアナコン；ヒドロキシ尿素；塩酸イダルビシン；イホスファミド；イルモフォシン；インターフェロンα-2a；インターフェロンα-2b；インターフェロンα-n1；インターフェロンα-n3；インターフェロンβ-1a；インターフェロンγ-1b；イプロプラチン；塩酸イリノテカン；酢酸ランレオチド；レトロゾール；酢酸ロイプロリド；塩酸リアロゾール；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；塩酸ロソキサントロン；マソプロコール；メイタンシン；塩酸メクロレタミン；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキセート；メトトレキセートナトリウム；メトキシサレン；メトプリン；メツレデーパ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトジリン；マイトマルシン；マイトマイシン；マイトマイ���ンC；ミトスペル；ミトタン；塩酸ミトキサントロン；マイコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オプレルベキン；オルマプラチン；オキシルラン；パクリタキセル；パミドロネート二ナトリウム；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；硫酸ペプロマイシン；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；塩酸ピロキサントロン；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィメルナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；塩酸プロカルバジン；プロマイシン；塩酸プロマイシン；ピラゾフリン；リボプリン；リツキシマブ；ログレチミド；ロリニアスタチン；サフィンゴール；塩酸サフィンゴール；サマリウム/レキシドロナム；セムスチン；シムトラゼン；スパルホサートナトリウム；スパルソマイシン；塩酸スピロゲルマニウム；スピロムスチン；スピロプラチン；スクアモシン；スクアモタシン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；塩化ストロンチウムSr 89；スロフェヌル；タリソマイシン；タキサン；タキソイド；テコガランナトリウム；テガフル；塩酸テロキサントロン；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテーパ；チミタック；チアゾフリン；チラパザミン；トムデックス；TOP-53；塩酸トポテカン；クエン酸トレミフェン；トラスツマブ；酢酸トレストロン；リン酸トリシリビン；トリメトトレキセート；グルクロン酸トリメトトレキセート；トリプトレリン；塩酸ツブロゾール；ウラシルマスタード；ウレデーパ；バルルビシン；バプレオチド；ベルテポルフィン；ビンブラスチン；硫酸ビンブラスチン；ビンクリスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン；硫酸ビングリシネート；硫酸ビンロイロシン；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンロシジン；硫酸ビンゾリジン；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；塩酸ゾルビシン；2-クロロデオキシアデノシン；2'-デオキシホルマイシン；9-アミノカンプトテシン；ラルチトレキシド；N-プロパルギル-5,8-ジデアザ葉酸；2-クロロ-2'-アラビノ-フルオロ-2'-デオキシアデノシン；2-クロロ-2'-デオキシアデノシン；アニソマイシン；トリコスタチンA；hPRL-G129R；CEP-751；リノミド；サルファマスタード；ナイトロジェンマスタード(メクロレタミン)；シクロホスファミド；メルファラン；クロラムブシル；イホスファミド；ブスルファン；N-メチル-N-ニトロソ尿素(MNU)；N,N'-ビス(2-クロロエチル)-N-ニトロソ尿素(BCNU)；N-(2-クロロエチル)-N'-シクロヘキシル-N-ニトロソ尿素(CCNU)；N-(2-クロロエチル)-N'-(トランス-4-メチルシクロヘキシル-N-ニトロソ尿素(MeCCNU)；N-(2-クロロエチル)-N'-(ジエチル)エチルホスホネート-N-ニトロソ尿素(ホテムスチン)；ストレプトゾトシン；ジアカルバジン(DTIC)；ミトゾロミド；テモゾロミド；チオテーパ；マイトマイシンC；AZQ；アドゼレシン；シスプラチン；カルボプラチン；オルマプラチン；オキサリプラチン；C1-973；DWA 2114R；JM216；JM335；ビス(白金)；トムデックス；アザシチジン；シタラビン；ゲムシタラビン；6-メルカプトプリン；6-チオグアニン；ヒポキサンチン；テニポシド；9-アミノカンプトテシン；トポテカン；CPT-11；ドキソルビシン；ダウノマイシン；エピルビシン；ダルビシン；ミトキサントロン；ロソキサントロン；ダクチノマイシン(アクチノマイシンD)；アムサクリン；ピラゾロアクリジン；オールトランスレチノール；14-ヒドロキシ-レトロ-レチノール；オールトランスレチノイン酸；N-(4-ヒドロキシフェニル)レチナミド；13-シスレチノイン酸；3-メチルTTNEB；9-シスレチノイン酸；フルダラビン(2-F-ara-AMP)；および2-クロロデオキシアデノシン(2-Cda)を含む。
【００１６】
他の抗発癌剤および化学療法剤は、抗増殖剤(例えば、ピリトレキシムイソチオネート)、抗前立腺肥大剤(例えば、シトグルシド)、良性前立腺肥大症治療剤(例えば、塩酸タムスロシン)、前立腺成長抑制剤(例えば、ペントモン)、および放射性物質を含む。
【００１７】
さらに他の抗発癌剤および化学療法剤は、抗癌補充性増強剤を含み得、三環系抗鬱薬(例えば、イミプラミン、デシプラミン、アミトリプチリン、クロミプラミン、トリミプラミン、ドキサピン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン、アモキサピン、およびマプロチリン)；非三環系抗鬱薬(例えば、セルトラリン、トラゾドンおよびシタロプラム)；Ca++アンタゴニスト(例えば、ベラパミール、ニフェジピン、ニトレンジピンおよびカロベリン)；カルモジュリン阻害薬(例えば、プレニルアミン、トリフルオロペラジンおよびクロミプラミン)；アムホテリシンB；トリパラノール類似体(例えば、タモキシフェン)；抗不整脈薬(例えば、クイニジン)；降圧剤(例えば、レセルピン)；チオール消耗剤(例えば、ブチオニンおよびスルホキシミン)およびクレマフォアELのような多剤耐性低減剤を含む。
【００１８】
さらに他の抗発癌剤および化学療法剤は、バンレイシ科のアセトゲニンス；アシミシン；ロリニアスタチン；グアナコン、スクアモシン、ブラタシン；スクラモタシン；タキサン；パクリタキセル；ゲムシタビン；メトトレキセートFR-900482；FK-973；FR-66979；FK-317；5-FU；FUDR；FdUMP；ヒドロキシ尿素；ドセタキセル；ディスコデルモリド；エポチロン；ビンクリスチン；ビンブラスチン；ビノレルビン；メタ-パック；イリノテカン；SN-38；10-OHカンプト；トポテカン；エトポシド；アドリアマイシン；フラボピリドール；シス-Pt；カルボ-Pt；ブレオマイシン；マイトマイシンC；ミトラマイシン；カペシタビン；シタラビン；2-Cl-2'デオキシアデノシン；フルダラビン-PO.sub.4；ミトキサントロン；ミトゾロミド；ペントスタチン；およびトムデックスからなる群より選択されるものである。
【００１９】
まださらに他の抗発癌剤および化学療法剤は、タキサン(例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル)を含む。いくつかの態様において、抗発癌剤または化学療法剤は、タモキシフェンまたはアロマターゼ阻害剤アリミデックス(例えば、アナストロゾール)を含む。
【００２０】
本発明のいくつかの態様において、生物学的モニタリング剤は、治療剤の効果を測定する(例えば、治療剤により誘導された細胞因子または反応を直接的または間接的に測定する)剤を含むが、本発明は、生物学的モニタリング剤の性質により限定されない。いくつかの態様において、モニタリング剤は、治療剤により引き起こされたアポトーシスの量を測定する、または検出する能力がある。
【００２１】
本発明のいくつかの態様において、イメージング剤は、限定されるわけではないが、14C、36Cl、57Co、58Co、51Cr、125I、131I、111Ln、152Eu、59Fe、67Ga、32P、186Re、35S、75Se、Tc-99m、および175Ybを含む放射能標識を含む。いくつかの態様において、イメージング剤は、蛍光を発する実体を含む。好ましい態様において、イメージング剤は、フルオレセインイソチオシアネートまたは6-TAMARAである。
【００２２】
本発明のいくつかの態様において、ターゲティング剤は、限定されるわけではないが、抗体、受容体リガンド、ホルモン、ビタミン、および抗原を含むが、本発明は、ターゲティング剤の性質により限定されない。いくつかの態様において、抗体は、疾患特異的抗原に特異的である。いくつかの好ましい態様において、疾患特異的抗原は、腫瘍特異的抗原を含む、いくつかの態様において、受容体リガンドは、限定されるわけではないが、CFTR、EGFR、エストロゲン受容体、FGR2、葉酸受容体、IL-2受容体、糖タンパク質、およびVEGFRを含む。好ましい態様において、受容体リガンドは葉酸である。本発明と共に用いられうる他の態様は、米国特許第6,471,968号およびWO 01/87348に記載されており、それぞれは、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
【００２３】
いくつかの態様において、本発明のデンドリマー(例えば、G5 PAMAMデンドリマー)は、表面上に2〜250個、10〜200個、または100〜150個の反応部位を含む(例えば、実施例13参照)。好ましい態様において、反応部位は、第一級アミン基を含む。いくつかの態様において、デンドリマーは、50〜250個の反応部位を含む。いくつかの態様において、デンドリマーは、150〜400個の反応部位を含む。好ましい態様において、反応部位は、限定されるわけではないが、治療剤(例えば、メトトレキセート)、ターゲティング剤(例えば、葉酸)、イメージング剤(例えば、FITC)および生物学的モニタリング剤を含む官能基に結合している。
【００２４】
いくつかの態様において、官能基のいずれか1つ(例えば、治療剤)は、単一のデンドリマー上に複数コピーで供給される。従って、いくつかの態様において、単一デンドリマーは、単一の官能基(例えば、メトトレキセートのような治療剤)の2〜100コピーを含む。いくつかの態様において、デンドリマーは、単一の官能基の2〜5、5〜10、10〜20または20〜50コピーを含む。いくつかの態様において、デンドリマーは、5〜20コピーを含む。いくつかの態様において、デンドリマーは、官能基(例えば、治療剤、ターゲティング剤またはイメージング剤)の50〜100または100〜200コピーを含む。いくつかの態様において、デンドリマーは、官能基の200コピーより多くを含む。本発明はさらに、2つまたはそれ以上の異なる官能基の複数コピーを含むデンドリマーを提供する。例えば、いくつかの態様において、本発明は、官能基の1つの型(例えば、メトトレキセートのような治療剤、または本明細書に考察された他のターゲティング剤のいずれか1つ)の複数コピー(例えば、2〜10、5〜10、10〜15、15〜50、50〜100、100〜200、または200より多いコピー)および官能基の第二の型(例えば、葉酸のようなターゲティング剤、または本明細書に考察された他のターゲティング剤のいずれか1つ)の複数コピー(例えば、2〜10、15〜50、50〜100、100〜200、または200より多いコピー)を含むデンドリマーを提供する。いくつかの態様において、デンドリマーは、2〜10個の異なる官能基の複数コピーを含む。例えば、本発明の開発中に発生したデータ(例えば、デンドリマーが官能基の結合のための100〜150個の異なる位置(例えば、第一級アミン基のような反応部位)を含みうることを示すデータ(例えば、実施例13参照))に基づいて、いくつかの態様において、デンドリマーは、治療剤(例えば、メトトレキセート)の2〜100コピー、ターゲティング剤(例えば、葉酸)の2〜100コピー、およびイメージング剤(例えば、FITCまたは6-TAMARA)の2〜100コピーを含みうる。
【００２５】
本発明はまた、デンドリマーを製造するための方法を提供し、方法は、以下の段階の1つまたは複数を含む(任意の順序で)：部分的アセチル化デンドリマーを生成するようにG5デンドリマーをアセチル化する段階；一官能性デンドリマーを生成するようにイメージング剤(例えば、フルオレセインイソチオシアネート)を、部分的アセチル化デンドリマーへ結合する段階；二官能性デンドリマーを生成するようにターゲット剤(例えば、葉酸)を、部分的アセチル化デンドリマーへ結合する段階；グリシドールを、部分的アセチル化二官能性デンドリマーへ結合する段階；および治療剤(例えば、メトトレキセート)を、部分的アセチル化二官能性グリシジル化二官能性デンドリマーへ結合する段階。好ましい態様において、G5デンドリマーは、以下の段階に従って生成される：(a)開始剤コア脂肪族ジアミンを得る段階；(b)マイケル受容体とマイケル反応を行う段階；(c)単一保護ジアミンNH2-(CH2)n-NHPG、(n=1〜10)と縮合する段階；および(d)段階(a)〜(c)を繰り返す段階；単一保護ジアミンは、各世代のアミド形成中に用いられる。本発明は、選択された開始剤コア脂肪族ジアミンの性質により限定されない。いくつかの態様において、開始剤コア脂肪族ジアミンは、限定されるわけではないが、NH2(CH2)n-NH2, (n=1〜10)、NH2-(CH2)n-NHPG, (n=1〜10)、NH2-((CH2)nNH2)3, (n=1〜10)、または非置換型もしくは置換型1,2-；1,3-もしくは1,4-フェニレンジ-n-アルキルアミンを含む群より選択される。好ましい態様において、マイケル受容体は、アクリル酸メチルである。いくつかの態様において、用いられる保護基(PG)は、限定されるわけではないが、t-ブトキシカルバメート(N-t-Boc)、アリロキシカルバメート(N-Alloc)、ベンジルカルバメート(N-Cbz)、9-フルオレニルメチルカルバメート(FMOC)、またはフタルイミド(Phth)を含む群より選択される。
【００２６】
本発明はまた、デンドリマーを含む組成物を提供し、デンドリマーは、保護されたコアのジアミンを含む。いくつかの態様において、デンドリマーは、ポリアミドアミン(PAMAM)、ポリプロピルアミン(POPAM)、またはPAMAM-POPAMデンドリマーを含む。特に好ましい態様において、コアのジアミンは、単一保護されている。いくつかの態様において、コアのジアミンは、NH2-(CH2)n-NHPG、(n=1〜10)である。好ましい態様において、保護されたコアのジアミンは、NH2-CH2-CH2-NHPGである。いくつかの態様において、保護されたコアのジアミンは、保護基(PG)を含み、保護基は、限定されるわけではないが、t-ブトキシカルバメート(N-t-Boc)、アリロキシカルバメート(N-Alloc)、ベンジルカルバメート(N-Cbz)、9-フルオレニルメチルカルバメート(FMOC)、またはフタルイミド(Phth)を含む群より選択される。好ましい態様において、デンドリマーは、部分的にアセチル化されている。特に好ましい態様において、デンドリマーは、官能基に結合している。
【００２７】
本発明はまた、保護されたコアのジアミンを含むデンドリマーを製造する方法を提供し、方法は、以下の段階を含む：a)単一保護開始剤コア脂肪族ジアミンNH2-(CH2)n-NHPG, (n=1〜10)を用いる段階；b)マイケル受容体とマイケル反応を行う段階；(c)単一保護ジアミンの等価物と縮合する段階；および(d)段階(a)〜(c)を繰り返す段階；単一保護開始剤コア脂肪族ジアミンは、各世代のアミド形成中に用いられる。好ましい態様において、マイケル受容体は、アクリル酸メチルである。いくつかの態様において、各繰り返しは、表面アミノ基をもつ反復単位の共有結合した放射状殻の新しい世代(G=1〜10)を生じる。いくつかの態様において、保護基(PG)は、t-ブトキシカルバメート(N-t-Boc)、アリロキシカルバメート(N-Alloc)、ベンジルカルバメート(N-Cbz)、9-フルオレニルメチルカルバメート(FMOC)、またはフタルイミド(Phth)を含む。
【００２８】
本発明はまた、デンドリマーを含む組成物を製造する方法を提供し、方法は、a)開始剤コア脂肪族ジアミンを用いる段階；b)マイケル受容体とマイケル反応を行う段階；(c)単一保護ジアミンNH2-(CH2)n-NHPG、(n=1〜10)と縮合する段階；および(d)段階(a)〜(c)を繰り返す段階を含む；単一保護ジアミンは、各世代のアミド形成中に用いられる。本発明は、選択された開始剤コア脂肪族ジアミンの性質により限定されない。いくつかの態様において、開始剤コア脂肪族ジアミンは、NH2(CH2)n-NH2, (n=1〜10)、NH2-((CH2)nNH2)3, (n=1〜10)、または非置換型もしくは置換型1,2-；1,3-もしくは1,4-フェニレンジ-n-アルキルアミンより選択される。いくつかの態様において、マイケル受容体は、アクリル酸メチルである。いくつかの態様において、各繰り返しは、表面アミノ基をもつ反復単位の共有結合した放射状殻の新しい世代(G=1〜10)を生じる。いくつかの態様において、保護基(PG)は、t-ブトキシカルバメート(N-t-Boc)、アリロキシカルバメート(N-Alloc)、ベンジルカルバメート(N-Cbz)、9-フルオレニルメチルカルバメート(FMOC)、またはフタルイミド(Phth)を含む。
【００２９】
本発明はまた、疾患に罹っているまたは罹りやすい被験体に、本発明のデンドリマーを含む組成物の治療的有効量を投与する段階を含む、疾患(例えば、癌または感染病)を処置する方法を提供する。好ましい態様において、本発明のデンドリマーは、それらが被験体から容易に除去されるように(例えば、有効用量で検出可能な毒性がわずかに有るか無しかであるように)構成される。いくつかの態様において、疾患は、限定されるわけではないが、白血病、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄球性(顆粒球性)白血病、慢性リンパ性白血病、真性多血症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、H鎖病、固形腫瘍、肉腫および癌腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、子宮癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、および神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫から選択される腫瘍性疾患である。いくつかの態様において、疾患は、限定されるわけではないが、湿疹、炎症性腸疾患、関節リウマチ、喘息、乾癬、虚血/再灌流傷害、潰瘍性大腸炎、および急性呼吸窮迫症候群からなる群より選択される炎症性疾患である。いくつかの態様において、疾患は、限定されるわけではないが、B型肝炎、C型肝炎、ロタウイルス、ヒト免疫不全症ウイルスI型(HIV-I)、ヒト免疫不全症ウイルスII型(HIV-II)、ヒトTリンパ球向性ウイルスI型(HTLV-I)、ヒトTリンパ球向性ウイルスII型(HTLV-II)、AIDS、B型肝炎およびC型肝炎ウイルス；アデノ随伴ウイルスおよびサイトメガロウイルスのようなパルボウイルス；パピローマウイルス、ポリオーマウイルスおよびSV40のようなパポバウイルス；アデノウイルス；単純ヘルペスI型(HSV-I)、単純ヘルペスII型(HSV-II)およびエプスタイン・バーウイルスのようなヘルペスウイルス；痘瘡(天然痘)およびワクシニアウイルスのようなポックウイルスのようなDNAウイルス；ならびに、ヒト免疫不全症ウイルスI型(HIV-I)、ヒト免疫不全症ウイルスII型(HIV-II)、ヒトTリンパ球向性ウイルスI型(HTLV-I)、ヒトTリンパ球向性ウイルスII型(HTLV-II)、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、センダイウイルス、ポリオウイルスのようなピコルナウイルス、コクサッキーウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、風疹(rubella)ウイルス(風疹(German measles))およびセムリキ森林熱ウイルスのようなトガウイルス、アルボウイルス、およびA型肝炎ウイルスのようなRNAウイルスにより引き起こされるウイルス性疾患からなる群より選択されるウイルス性疾患である。
【００３０】
本発明はまた、疾患に罹っているまたは罹りやすい被験体に、デンドリマーを含む組成物の治療的有効量を投与する段階を含む、疾患を処置する方法を提供し、デンドリマーは、部分的にアセチル化されたG5 PAMAM、POPAM、またはPAMAM-POPAMデンドリマーを含み、デンドリマーは、1つまたは複数の官能基をさらに含み、1つまたは複数の官能基は、治療剤、ターゲティング剤、およびイメージング剤からなる群より選択される。いくつかの態様において、疾患は腫瘍性疾患である。いくつかの態様において、腫瘍性疾患は、白血病、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄球性、(顆粒球性)白血病、慢性リンパ性白血病、真性多血症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、H鎖病、固形腫瘍、肉腫および癌腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、子宮癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、および神経芽細胞腫網膜芽細胞腫からなる群より選択される。
【００３１】
本発明はまた、被験体において腫瘍増殖を変化させる方法を提供し、デンドリマーを含む組成物を供給する段階であって、デンドリマーが、部分的にアセチル化されたデンドリマーを含み、デンドリマーが1つまたは複数の官能基をさらに含み、1つまたは複数の官能基が治療剤、ターゲティング剤、およびイメージング剤からなる群より選択される、段階；ならびに、腫瘍増殖が変化するような条件下で被験体へその組成物を投与する段階を含む。いくつかの態様において、変化させることは、被験体において腫瘍増殖を抑制することを含む。いくつかの態様において、変化させることは、被験体において腫瘍のサイズを縮小することを含む。いくつかの態様において、デンドリマーを含む組成物は、化学療法剤または抗発癌剤と同時投与される。いくつかの態様において、腫瘍増殖を変化させることは、腫瘍の化学療法または抗発癌処置に対する感受性を増加させる。
【００３２】
定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語および表現が下記に定義される。
【００３３】
本明細書に用いられる場合、用語「剤」は、生物学的に関連した活性または性質を有する組成物を指す。生物学的に関連した活性は、生物学的反応もしくは事象に関連した活性、または生物学的反応もしくは事象の検出、モニタリングもしくは特徴づけを可能にするものである。生物学的に関連した活性は、限定されるわけではないが、治療活性(例えば、生物学的健康を向上させる、または望まれていない生物学的状態に関連した持続性変性を防ぐ能力)、ターゲティング活性(例えば、生体分子もしくは複合体に結合する、または会合する能力)、モニタリング活性(例えば、生物学的事象の進行をモニターする、または生物学的組成物における変化をモニターする能力)、イメージング活性(例えば、生物学的組成物もしくは反応を観察するまたは別なふうに検出する能力)、およびシグネチャー同定活性(例えば、特定の細胞組成物または状態を認識し、かつ組成物または状態の存在を示す検出可能な応答を生じる能力)を含む。本発明の剤は、これらの特定の例証的な例に限定されない。実際、生物学的物質、化粧剤などを送達または破壊する剤を含む任意の有用な剤が、用いられうる。本発明の好ましい態様において、剤は、少なくとも1つのデンドリマーと会合している(例えば、デンドリマーへ組み入れられている、デンドリマー上に表面露出しているなど)。本発明のいくつかの態様において、1つのデンドリマーは、お互いに「異なる」2つまたはそれ以上の剤と会合している(例えば、ターゲティング剤および治療剤と会合した1つのデンドリマー)。「と異なる」とは、化学的構成および/または機能性においてお互いに異なる剤を指す。
【００３４】
本明細書に用いられる場合、用語「ナノデバイス」は、1つもしくは複数の「剤」を含むまたは会合した小さな(例えば、ヒトの肉眼では見えない)組成物を指す。それの最も単純な形において、ナノデバイスは、生物学的機能性を供給する少なくとも1つの剤(例えば、治療剤)と会合した物理的組成物(例えば、デンドリマー)からなる。しかしながら、ナノデバイスは、追加の構成要素(例えば、追加のデンドリマーおよび/または剤)を含みうる。本発明の好ましい態様において、ナノデバイスの物理的組成物は、少なくとも1つのデンドリマーを含み、生物学的機能性は、デンドリマーと会合した少なくとも1つの剤により供給される。
【００３５】
本明細書に用いられる場合、用語「生物活性のある」は、天然に存在する分子の構造的、制御的または生化学的機能を有するタンパク質または他の生物活性のある分子(例えば、触媒性RNAまたは低分子)を指す。
【００３６】
本明細書に用いられる場合、用語「アゴニスト」は、生物活性分子と相互作用する場合、生物活性分子の活性を調節する、生物活性分子における変化(例えば、増強)を引き起こす分子を指す。アゴニストは、生物活性分子を結合する、または、生物活性分子と相互作用するタンパク質、核酸、糖質、または任意の他の分子を含みうる。例えば、アゴニストは、直接的にまたは転写因子を通してRNAポリメラーゼと相互作用することにより遺伝子転写の活性を変化させることができる。
【００３７】
本明細書に用いられる場合、用語「アンタゴニスト」または「阻害剤」は、生物活性分子と相互作用する場合、生物活性分子の生物活性を遮断または調節する分子を指す。アンタゴニストおよび阻害剤は、生物活性分子を結合する、または、生物活性分子と相互作用するタンパク質、核酸、糖質、または任意の他の分子を含みうる。阻害剤およびアンタゴニストは、細胞全体、器官、または生物体の生態に影響を与えることができる(例えば、腫瘍増殖を遅くする阻害剤)。
【００３８】
本明細書に用いられる場合、用語「調節する」は、生物活性分子の生物活性における変化を指す。調節は、活性における増加もしくは減少、結合特性における変化、または、生物活性分子の生物学的、機能的もしくは免疫学的性質における任意の他の変化でありうる。
【００３９】
用語「遺伝子」は、ポリペプチドまたは前駆体の産生に必要なコード配列を含む核酸(例えば、DNA)配列を指す。ポリペプチドは、完全長もしくは断片の所望の活性または機能的性質(例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達など)が保持される限り、完全長コード配列により、またはコード配列の任意の部分により、コードされうる。その用語はまた、構造遺伝子のコード領域、および遺伝子が完全長mRNAの長さに対応するように、どちらの末端においても約1kbまたはそれ以上の距離の間、5'末端および3'末端の両方においてコード領域に隣接して位置する含有配列を含む。コード領域の5'側に位置し、かつmRNA上に存在する配列は、5'非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の3'側または下流に位置し、かつmRNA上に存在する配列は、3'非翻訳配列と呼ばれる。用語「遺伝子」は、遺伝子のcDNA型およびゲノム型の両方を含む。遺伝子のゲノム型またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」もしくは「介在配列」と呼ばれる非コード配列で中断されたコード領域を含む。イントロンは、核RNA(hnRNA)へ転写される遺伝子のセグメントである；イントロンは、エンハンサーのような制御エレメントを含みうる。イントロンは、核または一次転写産物から除去されるまたは「スプライシングされて出される」；イントロンは、それゆえに、メッセンジャーRNA(mRNA)転写産物に存在しない。mRNAは、新生ポリペプチドにおいてアミノ酸の配列または順序を特定するように翻訳中に機能する。
【００４０】
本明細書に用いられる場合、用語「コードする核酸分子」、「コードするDNA配列」、および「コードするDNA」とは、デオキシリボ核酸の鎖に沿った、デオキシリボヌクレオチドの順序または配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、ポリペプチド(タンパク質)鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。DNA配列は、従って、アミノ酸配列をコードする。
【００４１】
本明細書に用いられる場合、用語「抗原決定基」とは、特定の抗体に接触する抗原のその部分(例えば、エピトープ)を指す。タンパク質またはタンパク質の断片が宿主動物を免疫するために用いられる場合、タンパク質の多数の領域が、タンパク質上の所定の領域または3次元構造へ特異的に結合する抗体の産生を誘導しうる。これらの領域または構造が、抗原決定基と呼ばれる。抗原決定基は、抗体への結合について、無傷の抗原(例えば、免疫応答を誘発するために用いられる「免疫原」)と競合しうる。
【００４２】
抗体およびタンパク質またはペプチドの相互作用に関して用いられる場合の用語「特異的結合」または「特異的に結合すること」とは、相互作用が、タンパク質上の特定の構造(例えば、抗原決定基またはエピトープ)の存在に依存することを意味する。換言すれば、抗体は、一般的なタンパク質へよりむしろ特定のタンパク質構造を認識かつ結合している。例えば、抗体がエピトープ「A」に特異的である場合には、標識された「A」および抗体を含む反応において、エピトープAを含むタンパク質(または、遊離の標識されていないA)の存在は、抗体へ結合した標識されたAの量を低下させるだろう。
【００４３】
本明細書に用いられる場合、用語「導入遺伝子」とは、例えば、新たな受精卵または初期胚へ外来遺伝子を導入することにより、生物体中に配置された外来遺伝子を指す。用語「外来遺伝子」とは、実験的操作により動物のゲノムへ導入される任意の核酸(例えば、遺伝子配列)を指し、導入された遺伝子が、天然に存在する遺伝子と同じ位置に存在しない限り、その動物に見出される遺伝子配列を含みうる。
【００４４】
本明細書に用いられる場合、用語「ベクター」は、DNAセグメントを一つの細胞からもう一つの細胞へ移動させる核酸分子に関して用いられる。用語「媒介体」は、時々、「ベクター」と交換可能に用いられる。ベクターは、しばしば、プラスミド、バクテリオファージ、または植物もしくは動物ウイルス由来である。
【００４５】
本明細書に用いられる場合、用語「発現ベクター」とは、所望のコード配列、および特定の宿主生物体において、機能的に連結したコード配列の発現に必要である適切な核酸配列を含む組換えDNA分子を指す。原核生物における発現に必要な核酸配列は、通常、プロモーター、オペレーター(任意の)、およびリボソーム結合部位を、しばしば他の配列と共に含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、ならびに終結およびポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。
【００４６】
本明細書に用いられる場合、用語「遺伝子移入系」とは、核酸配列を含む組成物を細胞または組織へ送達する任意の手段を指す。例えば、遺伝子移入系は、限定されるわけではないが、ベクター(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および他の核酸に基づく送達系)、裸の核酸の微量注入、およびポリマーに基づく送達系(例えば、リポソームに基づいた、および金属粒子に基づいた系)を含む。本明細書に用いられる場合、用語「ウイルス遺伝子移入系」とは、試料の所望の細胞または組織への送達を促進するためにウイルスエレメント(例えば、無傷ウイルスおよび改変ウイルス)を含む遺伝子移入系を指す。本明細書に用いられる場合、用語「アデノウイルス遺伝子移入系」とは、アデノウイルス科(Adenoviridae)に属する無傷または変化したウイルスを含む遺伝子移入系を指す。
【００４７】
本明細書に用いられる場合、用語「トランスフェクション」とは、外来DNAの真核細胞への導入を指す。トランスフェクションは、リン酸カルシウム-DNA共沈殿、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、微量注入、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、および微粒子銃を含む、当技術分野に公知の様々な手段により達成されうる。
【００４８】
本明細書に用いられる場合、用語「細胞培養」とは、細胞の任意のインビトロの培養を指す。この用語に含まれるのは、連続継代細胞系(例えば、不死の表現型をもつ)、初代細胞培養物、有限細胞系(例えば、形質転換されていない細胞)、およびインビトロで維持された任意の他の細胞集団である。
【００４９】
本明細書に用いられる場合、用語「インビトロ」とは、人工的環境、および人工的環境内に生じる過程または反応を指す。インビトロ環境は、限定されるわけではないが、試験管および細胞培養からなりうる。用語「インビボ」とは、自然環境(例えば、動物または細胞)、および自然環境内に生じる過程または反応を指す。
【００５０】
用語「試験化合物」とは、身体の機能の疾患、疾病、病気、または障害を処置または予防するために用いられうる任意の化学成分、調合薬、薬物などを指す。試験化合物は、既知および可能性のある治療化合物の両方を含む。試験化合物は、本発明のスクリーニング方法を用いるスクリーニングにより治療に役立つことを決定されうる。「既知の治療化合物」とは、そのような処置または予防において効果があることが示されている(例えば、動物試験またはヒトへの投与に関する先行経験を通して)治療化合物を指す。
【００５１】
本明細書に用いられる場合、用語「試料」は、それの最も広い意味で用いられ、環境的および生物学的試料を含む。環境的試料は、土壌および水のような環境からの物質を含む。生物学的試料は、ヒトを含む動物、流体(例えば、血液、血漿および血清)、固体(例えば、糞便)、組織、液体食物(例えば、乳)、および固体食物(例えば、野菜)でありうる。
【００５２】
本明細書に用いられる場合、用語「光感受性物質」および「光力学性色素」とは、光子への曝露で励起状態への変換を起こす物質を指す。光感受性物質および光力学性色素の例は、限定されるわけではないが、フォトフリン2、ベンゾポルフィリン、m-テトラヒドロキシフェニルクロリン、スズエチオプルプリン、銅ベンゾクロリン、および他のポルフィリンを含む。
【００５３】
発明の詳細な説明
本発明は、疾患(例えば、癌)の処置、分析およびモニタリングのための新規な系および組成物を提供する。例えば、本発明は、病態生理学的欠陥をターゲティングし、イメージングし、かつ検出する、病的状態に基づいて適切な治療法を提供する、送達された治療用物質への応答をモニターする、および残留する疾患を同定する系ならびに組成物を提供する。本発明の好ましい態様において、組成物は、患者のまたは被験体の細胞へ容易に入るのに、および治療的用量においてわずかに有るか無しかの毒性で身体から除去されるのに、十分小さい。
【００５４】
好ましい態様において、本発明の系および組成物は、癌治療中に処置および/またはモニタリングに用いられる。しかしながら、本発明の系および組成物は、様々な病状または他の生理学的状態の処置およびモニタリングにおいて使用を見出し、本発明は、何か特定の病状または状態との使用に限定されない。本発明との特定の使用を見出す他の病状は、限定されるわけではないが、心疾患、ウイルス性疾患、炎症性疾患、および他の増殖性障害を含む。
【００５５】
好ましい態様において、本発明は、部分的にアセチル化された第5世代(G5)ポリアミドアミン(PAMAM)、デンドリマー(例えば、実施例1参照)を提供する。他の好ましい態様において、本発明は、多官能性G5デンドリマーを製造する方法(例えば、実施例2)、および保護コアのジアミンを含むデンドリマーを製造する方法(例えば、図1〜5参照)を提供する。
【００５６】
本発明の好ましい態様は、1つまたは複数の官能基に結合したデンドリマーを含む組成物を提供し、官能基は、限定されるわけではないが、治療剤、生物学的モニタリング構成要素、生物学的イメージング構成要素、ターゲティング構成要素、および細胞異常の特定のシグネチャーを同定しうる構成要素を含む。そのように、治療用ナノデバイスは、個々のデンドリマーから構成され、それぞれは、1つまたは複数の官能基が、デンドリマーと特異的に結合している、または共有結合している(例えば、実施例2および6参照)。好ましい態様において、官能基の少なくとも1つは、エステル結合を介してデンドリマーに結合している(例えば、実施例7参照)。
【００５７】
以下の考察は、本発明のいくつかの態様において、デンドリマーの個々の構成要素部分、およびその同じものを作製かつ用いる方法を記載する。本発明の系および組成物の設計ならびに使用を例証するために、考察は、乳腺癌および結腸腺癌の処置ならびにモニタリングにおける組成物の使用の特定の態様に焦点を合わせる。これらの特定の態様は、本発明の特定の好ましい態様を例証することのみを意図し、その範囲を限定することを意図しない(例えば、本発明の組成物および方法は、前立腺癌ならびにウイルス感染した細胞および組織の同定および処置において使用を見出す)。いくつかの態様において、本発明のデンドリマーは、細胞表面部分を通して腫瘍性細胞をターゲティングし、例えば、受容体媒介性エンドサイトーシスにより、腫瘍細胞により取り込まれる(例えば、実施例9、図20参照)。好ましい態様において、イメージング構成要素(例えば、本発明のデンドリマーに結合した)は、腫瘍がイメージングされる(例えば、MRIの使用を通して)のを可能にする。
【００５８】
いくつかの態様において、治療剤の放出は、例えば、シスプラチンが、上記のように活性化された蛍光の色を放射するそれらの細胞(例えば、赤色放射細胞)に向けられたレーザー光により放出される光不安定性保護基に付着しているような、治療構成要素が不安定な保護基に付着していることにより促進される。任意で、治療用デバイス(例えば、本発明のデンドリマーを含む組成物)はまた、標的細胞または組織(例えば、腫瘍)の治療への応答をモニターしうる構成要素を有しうる。例えば、本発明のデンドリマーに結合した化学療法剤(例えば、メトトレキセート)は、ターゲティングされた細胞のアポトーシスを誘導し、ターゲティングされた細胞のカスパーゼ活性は、緑色蛍光を活性化するために用いられうる。これは、アポトーシス細胞がオレンジ色(赤色および緑色の組み合わせ)に変わるのを可能にし、一方、残りの細胞は赤色のままである。巻き添え損傷でアポトーシスを起こすように誘導される任意の正常細胞は、緑色の蛍光を発する。
【００５９】
上記の例から明らかであるように、本発明の組成物の使用は、癌ならびに他の疾患および状態についての非侵襲性検出、シグナル伝達および介入を容易にする。癌細胞における分子変化の特異的プロトコールはこの技術を用いて同定されるため、デンドリマーを通しての非侵襲性検出が達成され、その後、様々な腫瘍表現型に対して自動的に用いられうる。
【００６０】
I. デンドリマー
好ましい態様において、本発明の組成物は、デンドリマーを含む(例えば、図1〜5および実施例2を参照)。デンドリマーのポリマーは、広範囲に記載されている(Tomalia, Advanced Materials 6:529 (1994); Angew, Chem. Int. Ed. Engl., 29:138 (1990)参照。全体として参照により本明細書に組み入れられている)。デンドリマーポリマーは、典型的には直径が1〜20ナノメーターの範囲である、定義済みの球体構造として合成されうる。保護コアをもつG5 PAMAMデンドリマーを製造するための方法は、示されている(図1〜5)。いくつかの態様において、保護コアのジアミンは、NH2-CH2-CH2-NHPGである。末端基の分子量および数は、ポリマーの世代(層の数)の関数として指数関数的に増加する(例えば、図9参照)。デンドリマーの異なる型は、ポリマー化過程を開始するコア構造に基づいて合成されうる(例えば、図1〜5参照)。
【００６１】
デンドリマーコア構造は、全体の形、密度および表面機能性のような分子のいくつかの特性を指示する(Tomalia et al., Chem. Int. Ed. Engl., 29:5305 (1990))。球状デンドリマーは、三価開始剤コアとしてアンモニア、または四価開始剤コアとしてエチレンジアミン(EDA)を有しうる(例えば、図9参照)。最近、記載された棒状体デンドリマー(Yin et al., J. Am. Chem. Soc., 120:2678 (1998))は、様々な長さのポリエチレンイミン線状コアを用いる(例えば、コアが長ければ長いほど、棒も長い)。デンドリマーの巨大分子は、キログラム量で市販されており、バイオテクノロジー適用についての最新の適性製造工程(GMP)下で製造される。
【００６２】
デンドリマーは、限定されるわけではないが、エレクトロスプレーイオン化質量分析、13C磁気共鳴分光法、1H核磁気共鳴分光法(例えば、実施例5、図10(A)および実施例7、図14参照)、高速液体クロマトグラフィー(例えば、実施例5、図10(B)、および実施例6、図13参照)、多角レーザー光散乱をもつサイズ排除クロマトグラフィー(例えば、実施例4、図8参照)、紫外分光測光法(例えば、実施例8、図17参照)、キャピラリー電気泳動法およびゲル電気泳動法を含むいくつかの技術により特徴づけられうる。これらの試験は、ポリマー集団の均一性を保証し、GMP適用およびインビボ使用法のためのデンドリマー製造の品質管理をモニターするのに重要である。
【００６３】
多数の米国特許が、デンドリマーを作製するための方法および組成物を記載している。これらの特許の一部の例が、本発明において有用でありうるいくつかのデンドリマー組成物の記載を提供するために下に与えられているが、これらは単に例証的な例にすぎず、多数の他の類似したデンドリマー組成物が本発明に用いられうることは理解されるべきである。
【００６４】
米国特許第4,507,466号、米国特許第4,558,120号、米国特許第4,568,737号および米国特許第4,587,329号それぞれは、通常の星形ポリマー、すなわち、第三世代高密度星形ポリマー、より大きい/均一な反応性をもつ。これらの特許はさらに、アミドアミンデンドリマーの性質およびデンドリマーの3次元分子直径を記載している。
【００６５】
米国特許第4,631,337号は加水分解安定性のポリマーを記載する。米国特許第4,694,064号は、棒状体デンドリマーを記載する。米国特許第4,713,975号は、高密度星形ポリマー、ならびにウイルス、細菌および酵素を含むタンパク質の表面を特徴づけるためのそれらの使用を記載する。架橋高密度星形ポリマーは、米国特許第4,737,550号に記載されている。米国特許第4,857,599号および米国特許第4,871,779号は、イオン交換樹脂、キレート樹脂として有用な固定化コア上の高密度星形ポリマー、およびそのようなポリマーを作製する方法を記載する。
【００６６】
米国特許第5,338,532号は、運ばれる農学的、薬学的または他の物質の少なくとも1つの単位と結合したデンドリマーの星形結合体に向けられている。この特許は、単位ポリマーあたり高濃度の運ばれる物質の送達、制御性送達、ターゲット化送達の手段、ならびに/または、例えば、薬物抗生物質、一般的および特定の毒素、金属イオン、放射性核種、シグナル発生物質、抗体、インターロイキン、ホルモン、インターフェロン、ウイルス、ウイルス断片、農薬および抗菌剤のような複数の種類を提供するためのデンドリマーの使用を記載する。
【００６７】
米国特許第6,471,968号は、共有結合した第一および第二デンドリマーを含むデンドリマー複合体を記載し、第一デンドリマーが第一剤を含み、第二デンドリマーが第二剤を含み、第一デンドリマーは、第二デンドリマーと異なり、第一剤は第二剤と異なっている。
【００６８】
他の有用なデンドリマー型組成物は、高密度星形ポリマーが疎水性外殻を供給する能力がある疎水基でキャップすることにより改変されている米国特許第5,387,617号、米国特許第5,393,797号および米国特許第5,393,795号に記載されている。米国特許第5,527,524号は、抗体結合体におけるアミノ末端化デンドリマーの使用を開示する。
【００６９】
金属イオン担体としてのデンドリマーの使用は、米国特許第5,560,929号に記載されている。米国特許第5,773,527号は、櫛形立体配置をもつ非架橋多分枝型ポリマーおよびそれを作製する方法を開示する。米国特許第5,631,329号は、枝分かれから保護された分枝型ポリマーの第一セットを形成する段階；コアへ接ぐ段階；第一セット分枝型ポリマーを脱保護し、その後、枝分かれから保護された分枝型ポリマーの第二セットを形成し、分枝型ポリマーの第一セットを有するコアへ接ぐ段階などにより高分子量の多分枝型ポリマーを作製するための過程を記載する。
【００７０】
米国特許第5,902,863号は、親油性有機ケイ素化合物および親水性ポリアニクロアミンのナノスケールのドメインを含むデンドリマーネットワークを記載する。ネットワークは、PAMAM(親水性)またはポリプロピレンイミンインテリアおよび有機ケイ素化合物外層を有する共重合デンドリマー前駆体から調製される。これらのデンドリマーは、制御可能なサイズ、形および空間分布をもつ。それらは、特殊性膜、保護性コーティング、有機の有機金属または無機添加剤を含む複合物、皮膚パッチ送達、吸収剤、クロマトグラフィーパーソナルケア製品および農産物のために用いられうる有機ケイ素化合物外層をもつ疎水性デンドリマーである。
【００７１】
米国特許第5,795,582号は、インフルエンザ抗原のためのアジュバントとしてのデンドリマーの使用を記載する。デンドリマーの使用は、低下した抗原用量での抗体力価レベルを生じる。米国特許第5,898,005号および米国特許第5,861,319号は、分析物の濃度を測定するための特異的免疫結合アッセイ法を記載する。米国特許第5,661,025号は、ヌクレオチドの標的部位への送達を助けうるデンドリマーポリカチオンを含む自己組織ポリヌクレオチド送達系の詳細を提供している。この特許は、ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドに非共有結合したデンドリマーポリカチオンを含む組成物と細胞を接触させる段階を含むインビトロでポリヌクレオチドを真核細胞へ導入する方法を提供している。
【００７２】
インビトロの診断適用に用いるデンドリマー-抗体結合体は、以前に実証されている(デンドリマー-キレート-抗体構築物の作製について、およびホウ素化デンドリマー-抗体結合体の開発について(中性子捕獲治療のための)、これらの後者化合物のそれぞれは癌治療用物質として用いられうる(Wu et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 4:449 (1994); Wiener et al., Magn. Reson. Med. 31:1 (1994); Barth et al., Bioconjugate Chem. 5:58 (1994);およびBarth et al.)、のSingh et al., Clin. Chem., 40:1845 (1994))。
【００７３】
これらの結合体の一部はまた、腫瘍の磁気共鳴イメージングに用いられている(Wu et al., (1994)およびWiener et al., (1994)、前記)。この研究からの結果は、インビボで投与される場合、抗体は、デンドリマー会合治療剤を、抗原を有している腫瘍へ向けることができることを実証している。デンドリマーはまた、細胞へ特異的に入り、化学療法剤かまたは遺伝子治療剤のいずれかを運ぶことが示されている。特に、研究により、デンドリマーポリマーに包まれたシスプラチンが効力を増加させて、他の手段により送達されるシスプラチンより毒性が低いことが示されている(Duncan and Malik, Control Rel. Bioact. Mater. 23:105 (1996))。
【００７４】
デンドリマーはまた、蛍光色素または分子ビーコンに結合させられており、細胞へ入ることが示されている。それらは、その後、細胞内の生理学的変化の評価のための検出装置に適合する様式で細胞内で検出されうる(Baker et al., Anal. Chem. 69:990 (1997))。最後に、デンドリマーは、分子の外側部分が酵素または光誘導性触媒作用で消化されうる分化したブロックコポリマーとして構築されている(Urdea and Hom, Science 261:534 (1993))。これは、疾患部位で治療用物質を放出しうるポリマーの制御性分解を可能にし、治療剤を放出しうる外部トリガーのための機構を提供しうる。
【００７５】
いくつかの態様において、本発明は、それぞれが特定の機能性をもつ1つまたは複数の官能基が、単一のデンドリマーに供給されているデンドリマーを提供する(例えば、実施例7および8、図14および15参照)。例えば、本発明の好ましい組成物は、治療剤、ターゲティング剤、およびイメージング剤をさらに含む部分的にアセチル化された第5世代(G5)PAMAMデンドリマーを含み、治療剤はメトトレキセートを含み、ターゲティング剤は葉酸を含み、イメージング剤はフルオレセインイソチオシアネートを含む(例えば、実施例7および8を参照)。このように、本発明は、単一の多官能性デンドリマーを提供する。いくつかの態様において、上記の官能基のいずれか一つ(例えば、治療剤)は、単一デンドリマー上に複数コピーで供給される。例えば、いくつかの態様において、単一デンドリマーは、単一の官能基(例えば、メトトレキセートのような治療剤)の2〜100コピーを含む。さらに他の好ましい態様において、本発明は、治療剤、ターゲティング剤、およびイメージング剤をさらに含む部分的にアセチル化された第5世代(G5)PAMAMデンドリマーを提供し、ターゲティング剤はRGDペプチドを含む(例えば、実施例14参照)。いくつかの態様において、本発明は、治療剤、ターゲティング剤、およびイメージング剤を含む部分的にアセチル化された第5世代(G5)PAMAMデンドリマーを提供し、治療剤はトリチウムを含む(例えば、実施例13参照)。
【００７６】
II. 治療剤
幅広い範囲の治療剤が、本発明との使用を見出す。従って、本発明は、本発明のデンドリマーへ結合されうる治療剤の型により限定されない。デンドリマーと会合しうる任意の治療剤は、本発明の方法、系および組成物を用いて送達されうる。治療剤の送達を例証するために、以下の考察は、主に、癌の処置のためのメトトレキセート、シスプラチンおよびタキソールの送達に焦点を合わせる。様々な光力学的治療化合物および様々な抗菌化合物もまた考察されている。
【００７７】
i. メトトレキセート、シスプラチンおよびタキソール
メトトレキセートの細胞傷害性は、閾値細胞内レベルが維持されている持続時間に依存する(Levasseur et al., Cancer Res 58, 5749 (1998); Goldman & Matherly, Pharmacol Ther 28, 77 (1985))。細胞は、高濃度のDHFRを含み、DHFR活性を完全に遮断するために、DHFRのKiより6桁高い抗葉酸レベルが必要とされる(Sierra & Goldman, Seminars in Oncology 26, 11 (1999))。さらに、酵素活性の5%未満は、完全な細胞性酵素機能に十分である(White & Goldman, Biol Chem 256, 5722 (1981))。シスプラチンおよびタキソールは、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導する明確な作用をもつ(例えば、Lanni et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:9679 (1997); Tortora et al., Cancer Research 57:5107 (1997);およびZaffaroni et al., Brit. J. Cancer 77:1378 (1998)参照)。しかしながら、これらを始めとする化学療法剤での処置は、有意な毒性を負うことなく達成することは困難である。現在使用されている剤は、一般的に、水溶性が低く、かなり毒性で、罹患細胞だけでなく正常細胞にも影響を及ぼす用量で与えられる。例えば、パクリタキセル(タキソール)、発見された最も有望な抗癌化合物の一つ、は水での溶解性が低い。
【００７８】
パクリタキセルは、B16黒色腫、L1210白血病、MX-1乳腺腫瘍およびCS-1結腸腫瘍異種移植片のような幅広い種類の腫瘍モデルにおいて優れた抗腫瘍活性を示している。しかしながら、パクリタキセルの低い水溶解度は、ヒト投与について問題を示す。従って、現在用いられているパクリタキセル製剤は、薬物を可溶化するためにクレマフォアを必要とする。ヒト臨床用量範囲は、200〜500mgである。この用量は、エタノール：クレマフォアの1:1溶液に溶解され、静脈内に与えられる1リットルの液体へ希釈される。現在用いられているクレマフォアは、ポリエトキシル化キャスターオイルである。それは、クレマフォア混合物に溶解し、大容量の水性媒体で希釈することにより注入で与えられる。直接的投与(例えば、皮下の)は、結果として、局所的毒性および低レベルの活性を生じる。従って、これらの化学療法剤についてのより効率的かつ効果的な送達系の必要性がある。
【００７９】
本発明は、特異的薬物送達のための方法および組成物を提供することによりこれらの問題を克服する。本発明はまた、相加効果を生じうる剤の組み合わせ(例えば、2つまたはそれ以上の異なる治療剤)を投与する能力を提供する。多剤の使用は、任意の単一剤への薬剤耐性を無効にするために用いられうる。例えば、いくつかの癌の単一薬物(タキソール)に対する耐性が報告されている(Yu et al., Molecular Cell. 2:581 (1998))。本発明の開発中に行われた実験は、デンドリマーに結合したメトトレキセートが、効率的に癌細胞を消滅させる能力があることを実証している(実施例10、図21および22、ならびに実施例12、図26参照)。
【００８０】
本発明はまた、メトトレキセートおよび/またはシスプラチンおよび/またはタキソールの被験体への送達後、治療の成功をモニターする機会を提供する。例えば、これらの薬物のインビトロでアポトーシスを誘導する能力を測定することは、インビボの効力についてのマーカーであると報告されている(Gibb, Gynecologic Oncology 65:13 (1997))。それゆえに、効果的抗腫瘍治療を提供し、かつ毒性を低減するためのこれらの薬物(または他の治療剤)のいずれか1つ、2つまたは全部のターゲティングされた送達に加えて、治療の効果は、アポトーシスの誘導をモニターする本発明の技術により測定されうる。重要なことには、これらの治療用物質は、限定されるわけではないが、乳癌および大腸癌を含む、広い範囲の腫瘍型に対して活性がある(Akutsu et al., Eur. J. Cancer 31A:2341 (1995))。
【００８１】
上の考察は3つの特定の剤を記載しているが、癌治療関係に日常的に用いられる任意の剤(例えば、調合薬)は、本発明において使用を見出す。本発明に従って癌を処置する際、デンドリマーの治療構成要素は、限定されるわけではないが、アドリアマイシン、5-フルオロウラシル、エトポシド、カンプトテシン、アクチノマイシン-D、マイトマイシンC、またはより好ましくは、シスプラチンを含む化合物を含みうる。剤は、本明細書に記載されているように、それを免疫治療剤と組み合わすことにより、組み合わされた治療組成物またはキットとして調製され、用いられうる。
【００８２】
本発明のいくつかの態様において、デンドリマーは、本発明の相乗的抗腫瘍性剤がDNA損傷へ導くのを促進するために、核酸(例えば、DNA)を直接的に架橋結合する1つまたは複数の剤を含むことが企図される。シスプラチンのような剤および他のDNAアルキル化剤が用いられうる。シスプラチンは、合計3コースとして3週間ごとに5日間、20mg/M2の臨床適用に用いられる有効量で、癌を処置するために広く用いられている。デンドリマーは、限定されるわけではないが、静脈内、皮下、腫瘍内、腹腔内、または局所的(例えば、粘膜面への)での注射を含む任意の適した方法を介して送達されうる。
【００８３】
DNAを損傷する剤はまた、DNA複製、有糸分裂および染色体分離に干渉する化合物を含む。そのような化学療法化合物は、ドキソルビシンとしても知られているアドリアマイシン、エトポシド、ベラパミール、ポドフィロトキシンなどを含む。新生物の処置のための臨床的設定に広く用いられているが、これらの化合物は、静脈内での、アドリアマイシンについての21日間隔での25〜75Mg/M2からエトポシドについての35〜50Mg/M2までの範囲である用量で静脈内ボーラス注入法を通して投与される、または経口で静脈内用量を2倍にする。
【００８４】
核酸前駆体およびサブユニットの合成ならびに正確性を破壊する剤もまた、DNA損傷へ導き、本発明において化学療法剤として使用を見出す。いくつかの核酸前駆体が開発されている。特に有用なのは、広範囲にわたる試験を受けており、容易に入手できる剤である。そのように、5-フルオロウラシル(5-FU)のような剤は、優先的に腫瘍性組織に用いられ、この剤を腫瘍性細胞へターゲティングさせるのを特に有用にしている。送達される用量は、3mg/kg/日から15mg/kg/日までの範囲でありうるが、他の用量は、病期、治療に対する細胞の従順性、剤に対する抵抗性の量などを含む様々な因子に従ってかなり変わりうる。
【００８５】
本発明に使用を見出す抗癌治療剤は、デンドリマー構造への取り込みを受け入れられる、またはそれらがそれの抗癌効果の正確性の損失なしに被験体、組織または細胞へ送達されうるように、別なふうにデンドリマー構造と会合しているものである。白金複合体、ベラパミル、ポドフィロトキシン、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソ尿素、アドリアマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、エトポシド(VP16)、タモキシフェン、タキソール、トランスプラチナ、5-フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびメトトレキセートのような癌治療剤ならびに他の類似した抗癌剤のより詳細な説明について、当業者は、限定されるわけではないが、Physician's Desk referenceおよびGoodman and Gilmanの「Pharmaceutical Basis of Therapeutics」、第9版、Eds. Hardman et al., 1996を含む教育的マニュアルの任意のナンバーを参照できる。
【００８６】
いくつかの態様において、薬物は、好ましくは、光開裂性リンカーでデンドリマーへ付着している。例えば、本発明との使用を見出すいくつかのヘテロ二官能性の光開裂性リンカーは、Ottl et al.(Ottl et al., Bioconjugate Chem., 9:143 (1998))により記載されている。これらのリンカーは、水溶性かまたは有機可溶性のいずれかでありうる。それらは、アミンまたはアルコールと反応できる活性化エステルおよびチオール基と反応できるエポキシドを含む。2つの基の間に、3,4-ジメトキシ6-ニトロフェニル光異性化基があり、近紫外光(365nm)に曝された場合、無傷の形でアミンまたはアルコールを放出する。従って、治療剤は、そのようなリンカーを用いて本発明の組成物に連結している場合、標的領域の近紫外光への曝露を通して生物学的に活性のあるまたは活性化可能な形で放出されうる。
【００８７】
好ましい態様において、メトトレキセートは、エステル結合を介してデンドリマーへ結合している(例えば、実施例7参照)。例示的態様において、タキソールのアルコール基は、有機可溶性リンカーの活性化エステルと反応させられる。この生成物は、次に、適切なデンドリマーの部分的チオール化表面と反応させられる(デンドリマーの第一級アミンは、2-イミノチオラノの半化学量論的量との反応によりチオール含有基へ部分的に変換されうる)。シスプラチンの場合、その薬物のアミノ基は、リンカーの水溶性型と反応させられる。アミノ基が十分、反応性でない場合には、Pt(II)二塩化スルファジアジン(Pasani et al., Inorg. Chim. Acta 80:99 (1983)およびAbel et al, Eur. J. Cancer 9:4 (1973))のようなシスプラチンの第一級アミノ含有活性類似体が用いられうる。このように結合すると、薬物は、不活性であり、正常細胞を傷つけない。その結合体が腫瘍細胞内に局在している場合、それは、適切な近紫外波長のレーザー光に曝され、活性薬物を細胞へ放出させる。
【００８８】
同様に、本発明の他の態様において、シスプラチン(またはその類似体)のアミノ基は、2-ニトロベンジルオキシカルボニル基のような非常に疎水性の光開裂性保護基と連結している(Pillai, V.N.R. Synthesis: 1-26 (1980))。この疎水性基が付着していて、その薬物は、負荷され、水性環境から侵襲されたPAMAMデンドリマー内の疎水性空洞により非常に優先的に保持される(例えば、Esfand et al., Pharm. Sci., 2:157 (1996)参照)。近紫外光(約365nm)に曝された場合、疎水性基は切断され、無傷薬物を残す。その薬物自身、親水性であるため、それは、デンドリマーから出て、腫瘍細胞へと拡散し、アポトーシスを惹起する。
【００８９】
光開裂性リンカーの代替は、酵素切断性リンカーである。いくつかの光開裂性リンカーは、効果的な抗腫瘍結合体として実証されており、ドキソルビシンのような癌治療用物質を適切な短いペプチドリンカーで水溶性ポリマーへ付着させることにより調製されうる(例えば、Vasey et al., Clin. Cancer Res., 5:83 (1999))。リンカーは細胞の外側で安定しているが、一度でも細胞内に入ると、チオールプロテアーゼにより切断される。好ましい態様において、結合体PK1が用いられる。光開裂性リンカーストラテジーの代替として、Gly-Phe-Leu-Glyのような酵素分解性リンカーが用いられうる。
【００９０】
本発明は、治療技術の性質により限定されない。例えば、本発明との使用を見出す他の結合体は、限定されるわけではないが、BNCTについての結合ホウ素ダスターを用いること(Capala et al., Bioconjugate Chem., 7:7 (1996))、放射性同位元素の使用、およびリシンのような毒素のナノデバイスへの結合を含む。
【００９１】
ii. 光力学的治療
光力学的治療剤もまた、本発明において治療剤として用いられうる。いくつかの態様において、光力学的化合物を含む本発明のデンドリマー組成物が照射され、結果として、ファイバーのない放射効果器から出て拡散し、生物学的標的(例えば、腫瘍細胞または細菌細胞)に作用する一重項酸素およびフリーラジカルの生成を生じる。いくつかの好ましい光力学的化合物は、限定されるわけではないが、以下のII型光化学反応に関与しうるものを含む。
2008510829.tif 000002
PS＝光感受性物質、PS*(1)＝PSの励起一重項状態、PS*(3)＝PSの励起三重項状態、hv＝光量子、*O2＝酸素の励起一重項状態、およびT＝生物学的標的。本発明に有用な他の光力学的化合物は、一重項酸素生成と異なる機構により細胞傷害性を引き起こすものを含む(例えば、銅ベンゾクロリン、参照により本明細書に組み入れられている、Selman et al., Photochem. Photobiol., 57:681-85 (1993))。本発明において使用を見出す光力学的化合物の例は、限定されるわけではないが、フォトフリン2、フタロシアニン(例えば、Brasseur et al., Photochem. Photobiol., 47:705-11 (1988)参照)、ベンゾポルフィリン、テトラヒドロキシフェニルポルフィリン、ナフタロシアニン(例えば、Firey and Rodgers, Photochem. Photobiol., 45:535-38 (1987)参照)、サップフィリン(Sessler et al., Proc. SPIE, 1426:318-29 (1991))、ポルフィノン(Chang et al., Proc. SPIE, 1203:281-86 (1990))、スズエチオプルプリン、エーテル置換ポルフィリン(Pandey et al., Photochem. Photobiol., 53:65-72 (1991))、およびフェノキサジンのようなカチオン色素(例えば、Cinocotta et al., SPIE Proc., 1203:202-10 (1990)参照)を含む。
【００９２】
iii. 抗菌治療剤
抗菌治療剤もまた、本発明において治療剤として用いられうる。微生物体の機能を消滅させる、阻害する、または別なふうに減弱することができる任意の剤、加えて、そのような活性をもつように企図される任意の剤が用いられうる。抗菌剤は、限定されるわけではないが、単独または組み合わせて用いられる、天然および合成抗生物質、抗体、阻害性タンパク質、アンチセンス核酸、膜破壊剤などを含む。実際、限定されるわけではないが、抗細菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤などを含む抗生物質の任意の型が用いられうる。
【００９３】
III. シグネチャー同定剤
特定の態様において、本発明のナノデバイスは、シグネチャー構成要素(「シグネチャー」)により活性化される、または、シグネチャー構成要素と相互作用する能力がある、1つまたは複数のシグネチャー同定剤を含む。好ましい態様において、シグネチャー同定剤は、シグネチャー(例えば、ターゲティングされるべき細胞に特異的な細胞表面分子)を特異的に結合する抗体、好ましくはモノクローナル抗体、である。
【００９４】
本発明のいくつかの態様において、腫瘍細胞が同定される。腫瘍細胞は、乳癌におけるMuc1、HER-2および突然変異型p53のような癌特異的抗原の定義済みの発現を含む、幅広い種類のシグネチャーをもつ。これらは、癌についての特異的シグネチャーとしての役割を果たし、乳癌の30%(HER-2)〜70%(突然変異型p53)で存在している。好ましい態様において、本発明のデンドリマーは、乳癌に存在するp53の突然変異型に特異的に結合するモノクローナル抗体を含む。
【００９５】
本発明のいくつかの態様において、感受性遺伝子を発現させる癌細胞が同定される。例えば、いくつかの態様において、乳癌についての特異的なシグネチャーとして用いられる2つの乳癌感受性遺伝子：染色体17上のBRCA1および染色体13上のBRCA2がある。個体がBRCA1かまたはBRCA2のいずれかにおいて突然変異を有する場合、彼らは、人生のある時期に乳癌または卵巣癌と診断されるリスクが高い。これらの遺伝子は、二本鎖DNAにおける放射線誘発切断を修復することに関与する。BRCA1またはBRCA2における突然変異は、この機構を無能にし、DNA複製におけるより多くのエラーへ、および最終的には癌性増殖へと導きうると考えられている。
【００９６】
さらに、いくつかの異なる細胞表面受容体の発現は、ナノデバイスの結合および取り込みのための標的としての使用を見出す。そのような受容体は、限定されるわけではないが、EGF受容体、葉酸受容体、FGR受容体2などを含む。
【００９７】
本発明のいくつかの態様において、染色体異常に関連した遺伝子発現における変化は、シグネチャー構成要素である。例えば、バーキットリンパ腫は、Myc遺伝子を含む染色体転座に起因する。染色体転座は、染色体が切断され、他の染色体の部分と結合するのを可能にすることを意味する。バーキットリンパ腫における古典的な染色体転座は、染色体8、Myc遺伝子の部位を含む。これは、Myc発現のパターンを変化させ、それにより、細胞成長および増殖を制御することにおけるそれの通常の機能を乱す。
【００９８】
他の態様において、大腸癌に関連した遺伝子発現が、シグネチャー構成要素として同定される。以下の2つの鍵遺伝子は、大腸癌に関与していることが知られている：染色体2上のMSH2および染色体3上のMLH1。正常には、これらの遺伝子のタンパク質産生は、DNA複製に生じる誤りを修復するのを助ける。MSH2およびMLH1タンパク質が突然変異している場合には、複製における誤りは、修復されないままで、損傷DNAおよび大腸癌へと導く。多発性内分泌腺腫に関与するMEN1遺伝子は、染色体11上に見出されることが知られて数年になり、1997年により微細にマッピングされ、そのような癌についてのシグネチャーとしての役割を果たす。本発明の好ましい態様において、変化したタンパク質に、または検出されるべき発現された遺伝子に特異的な抗体は、本発明のナノデバイスと複合体化される。
【００９９】
さらにもう一つの態様において、結腸の腺癌は、CEAおよび突然変異型p53の定義された発現を有し、両方とも十分立証された腫瘍シグネチャーである。これらの細胞系の一部におけるp53の突然変異は、乳癌細胞の一部において観察されるそれと類似しており、これらの癌のそれぞれについての2つのナノデバイス間でp53検出構成要素の共有を可能にする(すなわち、ナノデバイスを構築する際に、同じシグネチャー同定剤を含むデンドリマーがそれぞれの癌型に用いられうる)。大腸癌および乳癌細胞の両方は、ヌードマウスに腫瘍を生じうる細胞系を用いて確実に研究され得、動物における最適化および特徴づけを可能にする。
【０１００】
上記考察から、本発明との使用を見出す多くの異なる腫瘍シグネチャーがあり、一部は癌の特定の型に特異的であり、一部はそれらの起源において乱交雑である。本発明は、何か特定の腫瘍シグネチャーまたは任意の他の疾患特異的シグネチャーに限定されない。例えば、本発明においてシグネチャーとしての使用を見出す腫瘍抑制因子は、限定されるわけではないが、p53、Muc1、CEA、p16、p21、p27、CCAM、RB、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-1、MEN-II、p73、VHL、FCCおよびMCCを含む。
【０１０１】
IV. 生物学的イメージング構成要素
本発明のいくつかの態様において、ナノデバイスは、容易にイメージングされうる、少なくとも1つのデンドリマーに基づくナノスケールのビルディングブロックを含む。本発明は、用いられるイメージング構成要素の性質に限定されない。本発明の一部の態様において、イメージングモジュールは、生体分子に結合した、硫化亜鉛キャップ化セレン化カドミウム(Sooklal, Adv. Mater., 10:1083 (1998))のような量子ドットの表面修飾(例えば、Chan and Nie, Science 281:2016 (1998))を含む。
【０１０２】
しかしながら、好ましい態様において、イメージング分子は、「ナノ組成物」概念により作製されるデンドリマーを含む(Balogh et al., Proc. of ACS PMSE 77:118 (1997)およびBalogh and Tomalia, J. Am. Che. Soc., 120:7355 (1998))。これらの態様において、デンドリマーは、反応性封入により作製され、反応物はデンドリマー鋳型によりあらかじめ組織化され、その後、続いて、第二反応物によりポリマー分子の中/上に固定化される。これらのナノ粒子のサイズ、形、サイズ分布、および表面機能性が決定され、樹枝状巨大分子により制御される。これらの物質は、宿主の溶解性および適合性を有し、ゲスト分子(すなわち、イメージングを可能にする分子)の光学的または生理学的性質を有する。デンドリマー宿主は、媒体により変わりうるが、異なる化合物を様々なゲスト濃度レベルでデンドリマー宿主に負荷することが可能である。複合体および組成物は、様々な金属または他の無機物質の使用を含みうる。これらの物質の高電子密度は、電子顕微鏡および関連した散乱技術によるイメージングをかなり単純化する。さらに、無機原子の性質は、干渉生体物質の存在下または非存在下のいずれにおいてもイメージングについての新しくかつ測定可能な性質を導入する。本発明のいくつかの態様において、金、銀、コバルト、鉄原子/分子および/またはフルオレセインのような有機色素分子の封入は、ナノスケールの複合標識/トレーサーとして用いるためにデンドリマーへ封入されるが、イメージングまたは検出を容易にする任意の物質が用いられうる。好ましい態様において、イメージング剤は、フルオレセインイソチオシアネートである。
【０１０３】
本発明のいくつかの態様において、イメージングは、調べられる複合体の選択される物理的性質の密度における局所的違いの受動的または能動的観察に基づいている。これらの違いは、異なる形(例えば、原子間力顕微鏡により検出される密度)、変化した組成(例えば、X線により検出される放射線不透過性)、別個の光放射(例えば、分光測光法により検出される蛍光色素)、異なる回折(例えば、TEMにより検出される電子ビーム)、対比される吸収(例えば、光学的方法により検出される光)、または特別な放射線放出(例えば、アイソトープ法)などによりうる。従って、イメージングの質および感度は、観察される性質、および用いられる技術に依存する。癌性細胞についてのイメージング技術は、選択された細胞の小さな局所濃度を観察するのに十分な感度レベルを提供しなければならない。癌シグネチャーの最も早い同定は、高い選択性(すなわち、適切なターゲティングにより提供される高特異的認識)および最高可能感度を必要とする。
【０１０４】
A. 磁気共鳴イメージング
いったんターゲティングされるナノデバイスが腫瘍細胞に付着したならば、デバイス上の1つまたは複数のモジュールは、それの位置をイメージングする役割を果たす。デンドリマーは、すでに生物医学的イメージング剤として、おそらく最も顕著には磁気共鳴画像法(MRI)コントラスト促進剤に用いられている(例えば、Wiener et al., Mag. Reson. Med. 31:1 (1994)参照; PAMAMデンドリマーを用いる例)。これらの剤は、典型的には、Gd(III)-ジエチレントリアミンペンタ酢酸(Gd(III)-DTPA)のようなキレート化常磁性イオンを水溶性デンドリマーへ結合することにより構築される。これに関連して有用でありうる他の常磁性イオンは、限定されるわけではないが、ガドリニウム、マンガン、銅、クロミウム、鉄、コバルト、エルビウム、ニッケル、ユーロピウム、テクネチウム、インジウム、サマリウム、ジスプロシウム、ルテニウム、イットリウム、およびホルミウムイオンならびにそれらの組み合わせを含む。本発明のいくつかの態様において、デンドリマーはまた、上皮成長因子(EGF)のようなターゲティング基に結合させられ、その結合体が所望の細胞型(例えば、EGFの場合、EGFR発現腫瘍細胞)へ特異的に結合するようにさせる。本発明の好ましい態様において、DTPAは、Wiener(Wiener et al., Mag. Reson. Med. 31:1 (1994))により記載されているように、DTPAのイソチオシアネートを介してデンドリマーへ付着している。
【０１０５】
デンドリマーのMRI剤は、デンドリマーの多価性、サイズおよび構造のため、特に効果的であり、結果として、大きなプロトン緩和増強をもつ分子、高い分子緩和性、および標的部位における常磁性イオンの高い有効濃度を生じる。デンドリマーのガドリニウム造影剤は、動的MRIを用いて良性乳房腫瘍と悪性乳房腫瘍の間を、腫瘍の後者型についての脈管構造がどれくらいより高密度にイメージングするかに基づいて、区別するために用いられていることまである(Adam et al., Ivest. Rad. 31:26 (1996))。従って、MRIは、本発明の特に有用なイメージング系を提供する。
【０１０６】
B. 顕微鏡的イメージング
癌性細胞および組織の静的構造的顕微鏡的イメージングは、伝統的に、患者の外側で行われている。組織生検の古典的組織学は、優れた例証となる例を提供し、癌診断および処置への強力な補助であることが立証されている。除去後、検体は薄くスライスされ(例えば、40ミクロン未満)、染色され、固定され、病理学者により調べられる。画像が得られる場合には、それらは、ほとんどの場合、2-D透過明視野投射画像である。染色されていない組織にはほとんど存在しない選択的対比を提供するように、および異常な細胞成分の同定もまた提供するように、特定化された色素が用いられる。細胞下構造の特徴を核倍数性測定においてのようなコンピュータ支援分析を用いることにより定量化することは、検体の薄さのせいでの組織学的関連の損失および3-D情報の全体的不足によりしばしば、混乱させられる。静的イメージングアプローチの制限にもかかわらず、生検組織において新形成の同定を可能にすることは非常に有益であった。さらに、それの使用は、重篤な付帯的組織損傷、合併症、および患者の死までもしばしば伴う化学療法、外科手術、および放射線療法の侵襲的かつリスクを伴う組み合わせを行う決定において、しばしば、重大な要素である。
【０１０７】
本発明のナノデバイスは、腫瘍の機能的顕微鏡的イメージングを可能にし、イメージングのための改善された方法を提供する。方法は、インビボ、インビトロ、およびエクスビボでの使用を見出す。例えば、本発明の一つの態様において、本発明のデンドリマーは、光への曝露で光または他の検出可能なシグナルを放射するように設計される。標識されたデンドリマーは、顕微鏡技術の光学的分解能限界より物理的に小さい可能性があるが、それらは、励起された時、自己発光物体になり、光学的技術を用いて容易に観察でき、かつ測定できる。本発明のいくつかの態様において、顕微鏡における検出蛍光バイオセンサーは、整調可能な励起および発光フィルターならびに多波長供給源の使用を含む(Farkas et al., SPEI 2678:200 (1997))。イメージング剤が深部組織に存在する態様において、近赤外(NMR)におけるより長い波長が用いられる(例えば、Lester et al., Cell Mol. Biol. 44:29 (1998)参照)。近赤外におけるデンドリマーのバイオセンシングは、デンドリマーのバイオセンシングアンテナ様構造で実証されている(Shortreed et al., J. Phys. Chem., 101:6318 (1997))。本発明との使用を見出すバイオセンサーは、限定されるわけではないが、蛍光色素および分子ビーコンを含む。
【０１０８】
本発明のいくつかの態様において、インビボイメージングは、機能的イメージング技術を用いて達成される。機能的イメージングは、補完的であり、静的構造的イメージングと比較して、より強力な技術である可能性がある。機能的イメージングは、肉眼的スケールにおけるそれの適用で最も良く知られており、機能的磁気共鳴イメージング法(fMRI)およびポジトロン放出断層撮影法(PET)を含む例がある。しかしながら、機能的顕微鏡的イメージングもまた行われ、生きている組織のインビボおよびエクスビボ分析において使用を見出しうる。機能的顕微鏡的イメージングは、3-Dイメージング、3-D空間的マルチスペクトル容積割当、および時間的サンプリングの効率的な組み合わせである。要するに、一種の3-Dスペクトル顕微鏡的映画ループ。興味深いことに、細胞および組織は、自己蛍光を発する。いくつかの波長により励起された場合、特異的な標識なしにいくつかの細胞成分(例えば、核)を特徴づけるために必要とされる基本的3-D構造の大部分を提供する。斜光照明もまた、構造的情報を収集するために有用であり、日常的に用いられる。構造的スペクトルマイクロイメージングとは対照的に、機能的スペクトルマイクロイメージングは、バイオセンサーと共に用いることができ、細胞または組織内で生理学的シグナルの位置を特定するように働く。例えば、本発明のいくつかの態様において、本発明のデンドリマーを含むバイオセンサーは、葉酸またはEGFクラスのような上方制御された受容体ファミリーをイメージングするために用いられる。そのような態様において、機能的バイオセンシングは、それゆえに、初期でさえも発癌または悪性度に関連した生理学的異常の検出を含む。いくつかの生理学的状態は、限定されるわけではないが、pH、酸素濃度、Ca2+濃度、および他の生理学的関連分析物についてのナノスケールのデンドリマーバイオセンサーの検出を含む、本発明の組成物および方法を用いてイメージングされうる。
【０１０９】
V. 生物学的モニタリング構成要素
本発明のナノデバイスの生物学的モニタリングまたは検出構成要素は、剤(例えば、ナノデバイスの治療的構成要素により供給される治療剤)により誘発された腫瘍細胞における特定の応答をモニターすることができるものである。本発明は、何か特定のモニタリング系に限定されないが、本発明は、癌処置をモニターするための方法および組成物により例証される。本発明の好ましい態様において、剤は細胞においてアポトーシスを誘導し、モニタリングはアポトーシスの検出を含む。特定の態様において、モニタリング構成要素は、アポトーシスが起きた場合、特定の波長で蛍光を発する剤である。例えば、好ましい態様において、カスパーゼ活性は、モニタリング構成要素における緑色蛍光を活性化する。赤色標識をもつ特定のシグネチャーによりターゲティングされた結果として赤色に変わったアポトーシス癌細胞は、オレンジ色に変わるが、残りの癌細胞は赤色のままである。アポトーシスを起こすように誘導された(例えば、付帯的損傷を通して)正常細胞は、存在しているなら、緑色の蛍光を発する。
【０１１０】
これらの態様において、フルオレセインのような蛍光群は、モニタリング構成要素に用いられる。フルオレセインは、イソチオシアネート誘導体を介してデンドリマー表面へ容易に付着し、Molecular Probes, Inc.から入手できる。これは、ナノデバイスが共焦点顕微鏡により細胞と共にイメージングされるのを可能にする。ナノデバイスの効果の検出は、好ましくは、蛍光発生的ペプチド酵素基質を用いることにより達成される。例えば、治療剤により引き起こされたアポトーシスは、結果として、ペプチダーゼ、カスパーゼ-1(ICE)の産生を生じる。Calbiochemは、蛍光部分を放出するこの酵素についてのいくつかのペプチド基質を販売している。本発明に用いる特に有用なペプチドは以下である。
MCA-Tyr-Glu-Val-Asp-Gly-Trp-Lys-(DNP)-NH2 (SEQ ID NO:1)
MCAは(7-メトキシクマリン-4-イル)アセチルであり、DNPは2,4-ジニトロフェニル基である(Talanian et al., J. Biol. Chem., 272:9677 (1997))。このペプチドにおいて、MCA基は、DNP基への蛍光発生的共鳴エネルギー移動(FRET)のために、大いに減弱した蛍光を発する。酵素が、ペプチドをアスパラギン酸とグリシン残基の間で切断する場合、MCAおよびDNPは分離され、MCA基は、緑色の蛍光を強く発する(325nmにおいて励起極大および392nmにおいて発光極大)。
【０１１１】
本発明の好ましい態様において、ペプチドのリシン末端はMCA基が切断された時サイトゾルへと放出されるように、ナノデバイスへ連結される。ペプチドのリシン末端は、例えばそれがMal-PEG-Osuのような二官能性リンカーの活性化エステル基と反応できるため、結合のための有用な合成的柄である。従って、これらの方法を用いて生じた標的細胞における緑色蛍光の出現は、アポトーシスが始まった明らかな指標を提供する(細胞がすでに、集合した量子ドットの存在から赤色をもつ場合には、細胞は、組み合わされた色からオレンジ色に変わる)。
【０１１２】
本発明との使用を見出す追加の蛍光色素は、限定されるわけではないが、アポトーシス細胞におけるDNA変化に感受性があると報告されている、アクリジンオレンジ(Abrams et al., Development 117:29 (1993))およびアポトーシスを伴う脂質過酸化に感受性があるシス-パリナリン酸(Hockenbery et al., Cell 75:241 (1993))を含む。ペプチドおよび蛍光色素は単に例示にすぎないことに留意すべきである。アポトーシスの結果として産生されるカスパーゼについての基質として効果的に働く任意のペプチドが本発明との使用を見出すことが企図される。
【０１１３】
VI. ターゲティング構成要素
上記のように、本発明のもう一つの構成要素は、ナノデバイス組成物が特定の細胞型(例えば、腫瘍細胞)を特異的にターゲティングすることができることである。機構の理解は本発明を実施するために必要ではなく、本発明は何か特定の作用機構に限定されないが、いくつかの態様において、ナノデバイスは細胞表面部分を通して細胞(例えば、腫瘍性細胞)をターゲティングし、受容体媒介性エンドサイトーシスを通して細胞へ取り込まれる。
【０１１４】
標的細胞(例えば、腫瘍細胞)の表面上に位置することが知られている任意の部分は、本発明との使用を見出す。例えば、そのような部分に対して方向づけられた抗体は、本発明の組成物をその部分を含む細胞表面へターゲティングさせる。または、ターゲティング部分は、細胞表面上に存在する受容体へ向けられるリガンドであり得、または逆も同様である。本発明の好ましい態様において、ターゲティング部分は、葉酸受容体である。いくつかの態様において、ターゲティング部分は、RGDペプチド受容体(例えば、αvβ3インテグリン)である。同様に、ビタミンもまた、本発明の治療用物質を特定の細胞へターゲティングさせるために用いられうる。
【０１１５】
本発明のいくつかの態様において、ターゲティング部分はまた、シグネチャー構成要素として機能しうる。例えば、限定されるわけではないが、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、チロシナーゼ、ras、シアリルルイス抗原、erb、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、MN、gp100、pg75、p97、プロテイナーゼ3、ムチン、CD81、CID9、CD63、CD53、CD38、CO-029、CA125、GD2、GM2、およびO-アセチルGD3、M-TAA、M-胎児またはM-尿を含む腫瘍特異的抗原が本発明との使用を見出す。または、ターゲティング部分は、腫瘍抑制因子、サイトカイン、ケモカイン、腫瘍特異的受容体リガンド、受容体、アポトーシスの誘導物質、または分化誘導剤でありうる。
【０１１６】
ターゲティングについて企図される腫瘍抑制因子タンパク質は、限定されるわけではないが、p16、p21、p27、p53、p73、Rb、ウィルムス腫瘍(WT-1)、DCC、神経線維腫症1型(NF-1)、フォン・ヒッペル・リンドウ(VHL)病腫瘍抑制因子、Maspin、Brush-1、BRCA-1、BRCA-2、多発性腫瘍抑制因子(MTS)、ヒト黒色腫のgp95/p97抗原、腎細胞癌関連G250抗原、KS 1/4汎癌腫抗原、卵巣癌抗原(CA125)、前立腺特異的抗原、黒色腫抗原gp75、CD9、CD63、CD53、CD37、R2、CD81、CO029、TI-1、L6およびSASを含む。もちろん、これらは単に例示的な腫瘍抑制因子であり、本発明は、腫瘍抑制因子として当業者に公知である、または公知になる任意の他の剤と共に用いられうることが構想されている。
【０１１７】
本発明の好ましい態様において、ターゲティングは、発癌遺伝子により発現される因子へ向けられる。これらは、限定されるわけではないが、Srcファミリーのメンバーのようなチロシンキナーゼ、膜結合型および細胞質型の両方、Mosのようなセリン/トレオニンキナーゼ、血小板由来成長因子(PDDG)のような成長因子および受容体、rasファミリーを
含むSMALL GTP加水分解酵素(Gプロテイン)、サイクリン依存性タンパク質キナーゼ(cdk)、c-myc、N-mycおよびL-mycを含むmycファミリーメンバーのメンバー、ならびにbcl-2およびファミリーメンバーを含む。
【０１１８】
本発明によりターゲティングされうるサイトカインは、限定されるわけではないが、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、ILA 1、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、TNF、GMCSF、β-インターフェロン、およびγ-インターフェロンを含む。用いられうるケモカインは、限定されるわけではないが、M1P1α、M1P1β、およびRANTESを含む。
【０１１９】
本発明によりターゲティングされうる酵素は、限定されるわけではないが、シトシンデアミナーゼ、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ガラクトース-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、グルコセルブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、α-L-イズロニダーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、HSVチミジンキナーゼ、およびヒトチミジンキナーゼを含む。
【０１２０】
本発明との関連において使用を見出す受容体およびそれらの関連リガンドは、限定されるわけではないが、葉酸受容体、アドレナリン受容体、成長ホルモン受容体、黄体形成ホルモン受容体、エストロゲン受容体、上皮成長因子受容体、線維芽細胞成長因子受容体などを含む。
【０１２１】
本発明のターゲティング局面において使用を見出すホルモンおよびそれらの受容体は、限定されるわけではないが、成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、甲状腺刺激ホルモン、レプチン、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)、アンジオテンシンI、アンジオテンシンII、β-エンドルフィン、β-メラニン細胞刺激ホルモン(β-MSH)、コレシストキニン、エンドセリンI、ガラニン、胃抑制ペプチド(GIP)、グルカゴン、インスリン、アミリン、リポトロピン、GLP-1(7-37)ニューロフィシン、およびソマトスタチンを含む。
【０１２２】
さらに、本発明は、ナノデバイスのターゲティング構成要素に置かれるビタミン(脂溶性および非脂溶性の両方)が、これらのビタミンについての受容体を有する、または別なふうにこれらのビタミンを取り込む細胞をターゲティングするために用いられうる。この局面について特に好ましいのは、ビタミンDおよびそれの類似体、ビタミンE、ビタミンAなどのような脂溶性ビタミン、またはビタミンCなどのような水溶性ビタミンである。
【０１２３】
本発明のいくつかの態様において、癌細胞ターゲティング基のいくつでもデンドリマーに付着させられる。ターゲティングデンドリマーは、次に、コアのデンドリマーへ結合させられる。従って、本発明のナノデバイスは、それが、癌細胞をターゲティングすることに特異的であるようになる(すなわち、癌細胞に付着し、かつ健康な細胞には付着しない可能性がよりずっと高い)。さらに、デンドリマーの多価性は、血液循環時間を増加させかつ結合体の免疫原性を減少させるのを助けるためのポリエチレングリコール(PEG)またはポリエチルオキサゾリン(PEOX)鎖の付着を可能にする。
【０１２４】
本発明の好ましい態様において、ターゲティング基は、短い(例えば、直接的結合)、中位(例えば、Pierce Chemical Companyにより販売されている、SPDPのような低分子二官能性リンカーを用いて)、または長い(例えば、Shearwater Polymersにより販売されている、PEG二官能性リンカー)結合のいずれかでデンドリマーへ結合させられる。デンドリマーは、多数の官能基をもつ表面を有するため、1つより多いターゲティング基が各デンドリマーへ付着しうる。結果として、デンドリマーと標的細胞の間の複数の結合事象がある。これらの態様において、デンドリマーは、この「協同的結合」または多価性相互作用効果を介してそれらの標的細胞への非常に高い親和性をもつ。
【０１２５】
立体的理由により、リガンドが小さければ小さいほど、デンドリマーの表面へより多く付着することができる。最近、葉酸を付着したデンドリマーは、高親和性葉酸受容体(hFR)を発現させている腫瘍細胞の表面上および内に特異的に蓄積するだろうことをWienerが報告した(Wiener et al., Invest. Radiol., 32:748 (1997))。hFR受容体は、乳癌を含む上皮腫瘍上で発現される、または上方制御される。hFRを欠損する対照細胞は、葉酸誘導体化デンドリマーの有意な蓄積を示さなかった。葉酸は、カルボジイミド結合反応を介して全世代PAMAMデンドリマーに付着しうる。葉酸は、それの小さいサイズおよび簡単な結合手順で、デンドリマーについての良いターゲティング候補である。
【０１２６】
より大きいが、まだ比較的小さいリガンドは、上皮成長因子(EGF)、53アミノ酸残基をもつ一本鎖ペプチドである。リンカーSPDPでEGFに結合したPAMAMデンドリマーは、ヒト神経膠腫細胞の細胞表面に結合し、エンドサイトーシスによって取り込まれ、リソソームに蓄積することが示されている(Casale et al., Bioconjugate Chem., 7:7 (1996))。EGF受容体密度は、正常細胞と比較して、脳腫瘍細胞上で最高100倍まで高いため、EGFは、これらの種類の腫瘍についての有用なターゲティング剤を提供する。EGF受容体はまた、乳癌および大腸癌に過剰発現されているため、EGFは、同様にこれらの細胞についてのターゲティング剤として用いられうる。同様に、線維芽細胞成長因子受容体(EGER)もまた、比較的小さいポリペプチド(FGF)を結合し、多くは、乳癌細胞系において高レベルで発現されていることが知られている(特に、FGF1、2および4)(Penault-Llorca et al., Int. J. Cancer 61:170 (1995))。
【０１２７】
本発明の好ましい態様において、ターゲティング部分は、抗体または抗体の抗原結合断片(例えば、Fabユニット)である。例えば、多くの癌(乳房HER2腫瘍を含む)の表面上に見出される十分研究された抗原は、糖タンパク質p185であり、もっぱら悪性細胞においてのみ発現される(Press et al., Oncogene 5:953 (1990))。組換えヒト化抗HER2モノクローナル抗体(rhuMabHER2)は、HER2過剰発現乳癌細胞の増殖を阻害することまで示されており、進行乳癌の処置について第三相臨床試験において評価されることになっている(通常の化学療法薬と併用して)(Pegram et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 14:106 (1995))。ParkおよびPapahadjopoulosは、rhuMabHER2のFab断片を小さな単層リポソームへ付着させたが、その後、化学療法薬、ドキソルビシン(dox)と共に負荷され、HER2過剰発現腫瘍異種移植片へターゲティングされうる(Park et al., Cancer Lett., 118:153 (1997)およびKirpotin et al., Biochem., 36:66 (1997))。これらのdox負荷「免疫リポソーム」は、対応する非ターゲティング化dox負荷リポソームまたは遊離doxと比較して腫瘍に対する細胞傷害性の増加、および遊離doxと比較して全身毒性の減少を示した。
【０１２８】
抗体は、様々な生物学的標的(例えば、病原体、腫瘍細胞、正常組織)上の抗原または免疫原(例えば、腫瘍、組織または病原体特異的抗原)のターゲティングを可能にするように作製されうる。そのような抗体は、限定されるわけではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Fab断片、およびFab発現ライブラリーを含む。
【０１２９】
いくつかの好ましい態様において、抗体は、腫瘍特異的エピトープを認識する(例えば、TAG-72(Kjeldsen et al., Cancer Res. 48:2214-2220 (1988)；米国特許第5,892,020号；第5,892,019号；および第5,512,443号)；ヒト癌腫抗原(米国特許第5,693,763号；第5,545,530号；および第5,808,005号)；骨癌細胞由来のTP1およびTP3抗原(米国特許第5,855,866号)；腺癌細胞由来のトムゼン-フリートライヒ(TF)抗原(米国特許第5,110,911号)；ヒト前立腺癌由来の「KC-4抗原」(米国特許第4,708,930号および第4,743,543号)；ヒト結腸直腸癌抗原(米国特許第4,921,789号)；嚢胞腺癌由来のCA125抗原(米国特許第4,921,790号)；ヒト乳癌由来のDF3抗原(米国特許第4,963,484号および第5,053,489号)；ヒト乳房腫瘍抗原(米国特許第4,939,240号)；ヒト黒色腫のp97抗原(米国特許第4,918,164号)；癌腫またはオロソムコイド関連抗原(CORA)(米国特許第4,914,021号)；ヒト扁平上皮細胞肺癌と反応するが、ヒト小細胞肺癌と反応しないヒト肺癌抗原(米国特許第4,892,935号)；ヒト乳癌の糖タンパク質におけるTおよびTnハプテン(Springer et al., Carbohydr. Res. 178:271-292 (1988))、MSA乳癌糖タンパク質と名付けられた(Tjandra et al., Br. J. Surg. 75:811-817 (1988))；MFGM乳癌抗原(Ishida et al., Tumor Biol. 10:12-22 (1989))；DU-PAN-2膵臓癌抗原(Lan et al., Cancer Res. 45:305-310 (1985))；CA125卵巣癌抗原(Hanisch et al., Carbohydr. Res. 178:29-47 (1988))；YH206肺癌抗原(Hinoda et al., (1988) Cancer J. 42:653-658 (1988))。前記参考文献のそれぞれは、参照により本明細書に具体的に組み入れられている。
【０１３０】
他の好ましい態様において、抗体は、特定の病原体を認識する(例えば、レジオネラ・ペオモフィリア(Legionella peomophilia)、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、破傷風菌(Clostridium tetani)、インフルエンザ菌(Hemophilus influenzae)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)、炭疽菌(Bacillus anthracis)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheria)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、ヒトパピローマウイルス(human papilloma virus)、ヒト免疫不全症ウイルス(human immunodeficiency virus)、風疹(rubella)ウイルス、ポリオ(polio)ウイルスなど)。
【０１３１】
当技術分野において公知の様々な手順が、ポリクローナル抗体の産生のために用いられる。抗体の産生について、限定されるわけではないが、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどを含む様々な宿主動物が、所望のエピトープに対応するペプチドの注射により免疫されうる。好ましい態様において、ペプチドは、免疫原性担体(例えば、ジフテリアトキソイド、ウシ血清アルブミン(BSA)、またはキーホールリンペットヘモシアニン(KLH))に結合している。限定されるわけではないが、フロイント(完全および不完全)、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチンのような表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにBCG(Bacille Calmette-Guerin)およびコリネバクテリウム・パルブム(Corynebacterium parvum)のような有用である可能性が高いヒトアジュバントを含む様々なアジュバントが、宿主種に依存して、免疫応答を増加させるために用いられる。
【０１３２】
モノクローナル抗体の調製について、培養中の連続継代細胞系による抗体分子の産生を供給する任意の技術が用いられる(例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.参照)。これらは、限定されるわけではないが、KohlerおよびMilsteinにより最初に開発されたハイブリドーマ技術(Kohler and Milstein, Nature 256:495-497 (1975))、加えてトリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(例えば、Kozbor et al. Immunol. Today 4:72 (1983)参照)、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ技術(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985))を含む。
【０１３３】
本発明の追加の態様において、モノクローナル抗体は、最近のテクノロジーを利用する無菌動物において産生されうる(例えば、PCT/US90/02545参照)。本発明により、ヒト抗体が用いられ得、ヒトハイブリドーマを用いることにより(Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030 (1983))、またはインビトロでヒトB細胞をEBVウイルスで形質転換させることにより(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77-96 (1985))、得ることができる。
【０１３４】
本発明により、一本鎖抗体の作製について記載された技術(米国特許第4,946,778号；参照により本明細書に組み入れられている)は、特定の一本鎖抗体を作製するように適応しうる。本発明の追加の態様は、所望の特異性をもつモノクローナルFab断片の迅速かつ簡単な同定を可能にするように、Fab発現ライブラリーの構築について記載された技術(Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989))を利用する。
【０１３５】
抗体分子のイディオタイプ(抗原結合領域)を含む抗体断片は、公知の技術により作製されうる。例えば、そのような断片は、限定されるわけではないが、以下を含む：抗体分子のペプシン消化により生成されうるF(ab')2断片；F(ab')2断片のジスルフィド架橋を還元することにより生じうるFab'断片、ならびにパパインおよび還元剤で抗体分子を処理することにより生じうるFab断片を含む。
【０１３６】
抗体の作製において、所望の抗体についてのスクリーニングは、当技術分野における公知の技術により達成されうる(例えば、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着測定法)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射線測定法、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散測定法、インサイチューイムノアッセイ(例えば、コロイド金、酵素または放射性同位元素標識を用いる)、ウェスタンブロット法、沈降反応、凝集反応(例えば、ゲル凝集測定法、血球凝集測定法など)、補体結合測定法、免疫蛍光測定法、プロテインA測定法、および免疫電気泳動測定法など)。
【０１３７】
本発明のデンドリマー系は、それらのより高い安定性、それらのサイズおよび多分散性のより優れた制御、ならびに一般的により低い毒性および免疫原性のような、リポソームを超える多くの利点を有する(例えば、Duncan et al., Polymer Preprints 39:180 (1998)参照)。従って、本発明のいくつかの態様において、抗HER2抗体断片、および他のターゲティング抗体は、本発明のナノデバイスについてのターゲティング剤としてデンドリマーに結合している。
【０１３８】
いくつかの態様において、癌(例えば、乳癌)について、細胞表面は、葉酸、EGF、FGF、ならびに腫瘍関連抗原MUC1、cMet受容体およびCD56(NCAM)に対する抗体(または抗体断片)でターゲティングされうる。いったん細胞へ内部移行されたならば、ナノデバイスは、HER2、MUC1または突然変異型p53に結合する(結合した抗体を介して)。
【０１３９】
二官能性リンカーSPDPおよびSMCCならびにより長いMal-PEG-Osuリンカーは、抗体-デンドリマー結合に特に有用である。さらに、多くの腫瘍細胞は、後者の末端糖残基に主として起因する特異的認識で、オリゴ糖に結合する表面レクチンを含む(Sharon and Lis, Science 246:227 (1989))。適切な単糖をBSAのような非グリコシル化タンパク質へ付着させることは、遊離単糖よりずっと堅く腫瘍レクチンに結合する結合体を提供する(Monsigny et al., Biochemie 70:1633 (1988))。
【０１４０】
マンノシル化PAMAMデンドリマーは、単量体のマンノシドより最高400まで強くマンノシド結合レクチンを結合する(Page and Roy, Bioconjugate Chem., 8:714 (1997))。シアリル化デンドリマーおよび他の樹枝状ポリマーは、インビトロおよびインビボの両方で様々なシアル酸結合ウイルスに結合して阻害する。複数の単糖残基(例えば、ガラクトース結合細胞について、α-ガラクトシド)をデンドリマーに結合することにより、多価性結合体は、腫瘍細胞の対応する型への高い親和性をもって作製される。付着反応は、市販されているα-ガラクトシジル-フェニルイソチオシアネートとの末端アミンの反応を介して容易に行われる。糖の小さいサイズは、デンドリマー表面上に存在しうる高濃度を可能にする。
【０１４１】
適切なペプチドターゲティング基を同定かつ選択するための非常に順応性のある方法は、ファージディスプレイ技術であり(例えば、Cortese et al., Curr. Opin. Biotechol., 6:73 (1995)参照)、市販されているキットを用いて便利に行われうる。ファージディスプレイ手順は、ファージの表面に付着したペプチドの大きくかつ多様なコンビナトリアルライブラリーを作製し、堅い結合について固定化表面受容体に対してスクリーニングされる。堅い結合後、ウイルス構築物は単離され、ペプチド配列を同定するためにシーケンシングされる。サイクルは、次のペプチドライブラリーについての開始点として最良ペプチドを用いて繰り返される。最終的に、適切に高親和性ペプチドが同定され、その後、生体適合性および標的特異性についてスクリーニングされる。このようにして、デンドリマーに結合されうるペプチドを作製し、標的細胞受容体(例えば、腫瘍細胞受容体)または他の所望の標的への高い特異性および親和性をもつ多価性結合体を作製することが可能である。
【０１４２】
上記のターゲティングアプローチに関連するのは、「プレターゲティング」アプローチである(例えば、Goodwin and Meares, Cancer (suppl.) 80:2675 (1997)参照)。このストラテジーの例は、腫瘍特異的モノクローナル抗体およびストレプトアビジンの結合体での患者の初期処置を含む。残存する可溶性結合体は、適切なビオチン化クリアリング剤で血流から除去される。腫瘍局在結合体が、残っている全部である場合、放射能標識ビオチン化剤が導入され、次に、強くかつ特異的なビオチン-ストレプトアビジン相互作用により腫瘍部位に局在化させる。従って、放射性用量は癌細胞の近くで最大にされ、それが健康な細胞を傷つけうる身体の残りにおいて最小にされる。
【０１４３】
ポリスチレンへ十分に結合したストレプトアビジン分子は、最初、ビオチン化デンドリマーで処理され、その後、放射能標識されたストレプトアビジンが導入されると、ポリスチレン結合ストレプトアビジン1つあたり標識されたストレプトアビジン分子が最高4つまで結合する(Wilbur et al., Bioconjugate Chem., 9:813 (1998))。従って、ビオチン化デンドリマーは、本発明の方法に用いられうるが、インビボで放射能標識についての多価性受容体として働き、結果として、結合した抗体結合体あたりの放射性用量の増幅を生じる。本発明の好ましい態様において、クラスター形成されたデンドリマー上の1つまたは複数の多重ビオチン化モジュールは、放射能標識もしくはホウ素化(Barth et al., Cancer Investigation 14:534 (1996))アビジンまたはストレプトアビジンについての多価性標的を提示し、この場合もやはり、結果として腫瘍細胞への放射線の用量増幅を生じる。
【０１４４】
デンドリマーはまた、例えば多価性ガラクトースまたはマンノース表面をもつデンドリマーを部分的にビオチン化することにより、クリアリング剤として用いられうる。結合体-クリアリング剤複合体は、その後、対応する肝細胞受容体への非常に強い親和性を有する。
【０１４５】
本発明の他の態様において、増強透過保持(EPR)方法がターゲティングに用いられる。増強透過保持(EPR)効果は、腫瘍をターゲティングする、より「受動的」方法である(Duncan and Sat, Ann. Oncol., 9:39 (1998)参照)。EPR効果は、透過性亢進の脈管構造および腫瘍の弱いリンパ性ドレナージにより引き起こされる、腫瘍微小環境における巨大分子および小粒子の選択的濃縮である。本発明のデンドリマー組成物は、それらが、比較的硬い、狭い多分散をもつ、制御されるサイズおよび表面化学的性質をもつ、ならびに抗腫瘍薬を運び、その後放出しうる内部「カーゴ(cargo)」空間を有する点で、この用途について理想的なポリマーを提供する。実際、PAMAMデンドリマー-白金酸塩は、固形腫瘍に蓄積され(シスプラチンで得られたものより約50倍高いPtレベル)、シスプラチンが効果を示さない固形腫瘍モデルにおいてインビボ活性をもつことが示されている(Malik et al., Proc. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 24:107 (1997)およびDuncan et al., Polymer Preprints 39:180 (1998))。
【０１４６】
本発明のターゲティング部分は、生物学的標的上(例えば、病原体上)の様々な他のエピトープを認識しうる。いくつかの態様において、分子認識要素は、様々な病原性生物体を認識する、ターゲティングするまたは検出するために組み入れられ、限定されるわけではないが、HIV(Wies et al., Nature 333:426 (1988))、インフルエンザ(White et al., Cell 56:725 (1989))、クラミジア(Infect. Imm. 57:2378 (1989))、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ストレプトコッカス・スイス(Streptococcus suis)、サルモネラ(Salmonella)、流行性耳下腺炎、ニューカッスル病、ならびに、レトロウイルス、センダイウイルス(Sendai virus)、およびミクソウイルスを含む様々なウイルスをターゲティングするためのシアル酸；ならびに、コロナウイルス、脳脊髄炎ウイルス、およびロタウイルスをターゲティングするための9-OACシアル酸；サイトメガロウイルス(Virology 176:337 (1990))および麻疹ウイルス(Virology 172:386 (1989))を検出するための非シアル酸糖タンパク質；HIVをターゲティングするためのCD4(Khatzman et al., Nature 312:763 (1985))、血管活性腸管ペプチド(Sacerdote et al., J. of Neuroscience Research 18:102 (1987))およびペプチドT(Ruff et al., FEBS Letters 211:17 (1987))；ワクシニア(vaccinia)(Epstein et al., Nature 318:663 (1985))をターゲティングするための上皮成長因子；狂犬病(Lentz et al., Science 215:182 (1982))をターゲティングするためのアセチルコリン受容体；エプスタイン・バー(Epstein-Barr)ウイルス(Carel et al., J. Biol. Chem. 265:12293 (1990))をターゲティングするためのCd3補体受容体；レオウイルス(Co et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82:1494 (1985))をターゲティングするためのβ-アドレナリン受容体；ライノウイルスをターゲティングするためのICAM-1(Marlin et al., Nature 344:70 (1990))、N-CAMおよびミエリン結合糖タンパク質モノクローナル抗体(Shephey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:7743 (1988))；ポリオウイルス(Mendelsohn et al., Cell 56:855 (1989))をターゲティングするためのポリオウイルス受容体；ヘルペスウイルス(Kaner et al., Science 248:1410 (1990))をターゲティングするための線維芽細胞成長因子受容体；大腸菌(Escherichia coli)をターゲティングするためのオリゴマンノース；髄膜炎菌(Neisseria meningitidis) をターゲティングするためのガングリオシドG置換M1；ならびに、幅広い種類の病原体(例えば、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、V. ブルニフィカス(V. vulnificus)、腸炎ビブリオ菌(V. parahaemolyticus)、コレラ菌(V. cholerae)、およびV. アルジノリティカス(V. alginolyticus))を検出するための抗体を含む。
【０１４７】
本発明のいくつかの態様において、ターゲティング部分は、好ましくは、核酸(例えば、RNAまたはDNA)である。いくつかの態様において、核酸ターゲティング部分は、特定の核酸(例えば、染色体DNA、mRNA、またはリボソームRNA)へ塩基対形成によりハイブリダイズするように設計される。他の態様において、核酸は、リガンドまたは生物学的標的を結合する。以下のタンパク質を結合する核酸は同定されている：逆転写酵素、HIVのRevおよびTatタンパク質(Tuerk et al., Gene 137(1):33-9 (1993))；ヒト神経成長因子(Binkley et al., Nuc. Acids Res. 23(16):3198-205 (1995))；および血管内皮成長因子(Jellinek et al., Biochem. 83(34):10450-6 (1994))。リガンドを結合する核酸は、多くの方法が当技術分野において公知であるが、好ましくは、SELEX手順により同定される(例えば、米国特許第5,475,096号；第5,270,163号；および第5,475,096号；ならびにPCT公開WO 97/38134、WO 98/33941およびWO 99/07724を参照、すべては参照により本明細書に組み入れられている)。
【０１４８】
VII. 合成および結合
本セクションは、ナノデバイスの個々の構成要素(すなわち、上記の構成要素の1つ以上を含む個々のデンドリマー)の合成および形成、ならびにそのような構成要素のデンドリマーへの結合の説明を提供する。
【０１４９】
本発明の好ましい態様において、PAMAMデンドリマーの調製は、典型的な分岐的(開始剤コアから巨大分子を築き上げる)合成により行われる。それは、アクリル酸メチル(MA)の二重結合へのアミノ基のマイケル付加、続いてその結果生じた末端カルボメトキシ、--(CO2CH3)基のエチレンジアミン(EDA)でのアミド化からなる2段階成長手順を含む。
【０１５０】
この過程の第一段階において、アンモニアを、不活性窒素雰囲気下でMAと(モル比：1:4.25)47℃で48時間、反応するようにさせておく。その結果生じた化合物は、世代＝0、星分枝型PAMAMトリ-エステルと呼ばれる。次の段階は、星分枝型PAMAMトリ-アミン(G=0)を生成するように過剰のEDAとトリ-エステルを反応させる段階を含む。この反応は、不活性雰囲気(窒素)下、メタノール中で行われ、完了のために0℃で48時間、必要とされる。このマイケル付加およびアミド化手順は世代＝1を生じる。
【０１５１】
このトリ-アミンの調製は、PAMAMデンドリマーの分岐的合成の第一全サイクルを完了する。この反応手順の繰り返しは、結果として、より大きい世代(G=1〜5)デンドリマー(すなわち、それぞれ、エステル-およびアミン-末端分子)の合成を生じる。例えば、この手順の第二繰り返しは、それぞれ、ヘキサ-エステルおよびヘキサ-アミン表面をもつ、第1世代を生成する。同じ反応が、すべてのその後の第1〜9世代に関して同様に行われ、上で示されているように、末端基の正確な分子量および数をもつコア-殻の構造を与える分枝セルの層を築き上げる。カルボキシレート表面デンドリマーは、エステル末端PAMAMデンドリマーの加水分解、またはアミン表面デンドリマー(例えば、全世代PAMAM、POPAM、またはPOPAM-PAMAMハイブリッドデンドリマー)との無水コハク酸の反応により生成されうる。
【０１５２】
様々なデンドリマーは、重合過程を開始するコア構造に基づいて合成されうる。これらのコア構造は、全体の形、密度、および表面機能性のようなデンドリマー分子のいくつかの重要な特性を指示する(Tomalia et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 29:5305 (1990))。アンモニアから由来する球状デンドリマーは、三価開始剤コアを有するが、EDAは四価開始剤コアである。最近、様々な長さの線状ポリ(エチレンイミン)コアに基づいて、コアが長ければ長いほど、棒も長くなる棒状体デンドリマーが報告されている(Yin et al., J. Am. Chem. Soc., 120:2678 (1998))。
【０１５３】
好ましい態様において、本発明のデンドリマーは、保護コアのジアミンを含む。特に好ましい態様において、保護開始剤コアのジアミンは、NH2-(CH2)n-NHPG, (n=1〜10)である。他の好ましい態様において、開始剤コアは、限定されるわけではないが、NH2(CH2)n-NH2 (n=1〜10)、NH2-((CH2)nNH2)3 (n=1〜10)、または非置換型もしくは置換型1,2-；1,3-もしくは1,4-フェニレンジ-n-アルキルアミンを含む群より選択され、単一保護ジアミン(例えば、NH2-(CH2)n-NHPG)が各世代のアミド形成中に用いられる。これらのアプローチにおいて、保護ジアミンは、特徴づけおよび分析を困難にさせうる不均一なナノ構造の生成なしにデンドリマーの大量製造を可能にする。ジアミンの反応性を1つの末端のみに限定することにより、ダイマー/ポリマー形成および分子内反応の機会は、大過剰のジアミンを用いることの必要性なしに未然に防がれる。末端単一保護中間体は、保護基が、結晶化またはクロマトグラフィーのような古典的な技術による生産的精製のための適した柄を提供するため、容易に精製されうる。
【０１５４】
保護中間体は、脱保護段階において脱保護され得、結果として生じるデンドリマーの世代は、精製の必要性なしに、次の反復の化学反応にかけられる。本発明は、特定の保護基に限定されない。実際、様々な保護基が企図され、限定されるわけではないが、t-ブトキシカルバメート(N-t-Boc)、アリロキシカルバメート(N-Alloc)、ベンジルカルバメート(N-Cbz)、9-フルオレニルメチルカルバメート(FMOC)、またはフタルイミド(Phth)を含む。本発明の好ましい態様において、保護基は、ベンジルカルバメート(N-Cbz)である。N-Cbzは、それだけが、F-MOC基を除去するために必要とされる強酸性または塩基性条件に頼ることなしに、接触水素化(Pd/C)により「中性」条件下で容易に切断されうるため、本発明にとって理想的である。保護モノマーの使用は、より少量のモノマーが用いられ得、製造コストを低減させるため、高処理量製造工程に特別な使用を見出す。
【０１５５】
デンドリマーは、任意の適した分析的技術によりサイズおよび均一性について特徴づけられうる。これらは、限定されるわけではないが、原子間力顕微鏡法(AFM)、エレクトロスプレーイオン化質量分析法、MALDI-TOF質量分析法、13C核磁気共鳴分光法、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)(多角レーザー光散乱、二重UVおよび屈折率検出器を備えた)、キャピラリー電気泳動法、およびゲル電気泳動法を含む。これらの分析方法は、デンドリマー集団の均一性を保証し、インビボ適用における最終的使用のためのデンドリマー製造の品質管理において重要である。最も重要なことには、静脈内に投与された場合、デンドリマーが毒性の証拠を示さずに、広範囲の仕事が行われている(Roberts et al., J. Biomed. Mater. Res., 30:53 (1996)およびBoume et al., J. Magnetic Resonance Imaging, 6:305 (1996))。
【０１５６】
VIII. ナノデバイスの抗腫瘍効力および毒性の評価
様々な治療剤の癌細胞系および初代細胞培養物への抗腫瘍効果は、本発明のナノデバイスを用いて評価されうる。例えば、好ましい態様において、アッセイは、確立された腫瘍細胞系モデルまたは初代培養細胞を用いてインビトロで行われる(例えば、実施例10〜12参照)、または、アッセイは、動物モデルを用いてインビボで行われうる(例えば、実施例13参照)。
【０１５７】
A. インビトロでのヒト腫瘍細胞のアポトーシスの誘導の定量化
本発明の例示的態様において、本発明のナノデバイスは、インビトロでヒト腫瘍細胞のアポトーシスをアッセイするために用いられる。細胞におけるアポトーシスについての試験は、治療剤の効力を決定する。アポトーシスの複数の局面が測定されうる、かつ測定されるべきである。これらの局面は、上で記載されたものに加えて、限定されるわけではないが、血漿膜の内側から外側表面へのホスファチジルセリン(PS)転位置の測定、DNA断片化の測定、アポトーシス関連タンパク質の検出、カスパーゼ-3活性の測定を含む局面を含む。
【０１５８】
B. インビトロ毒物学
本発明のいくつかの態様において、特定のナノデバイスプラットフォームまたはその系の構成要素の安全性への一般的展望を得るために、毒性試験が行われる。毒物学的情報は、限定されるわけではないが、履歴データベース、インビトロ試験、およびインビボ動物研究を含む多数の情報源から引き出されうる。
【０１５９】
インビトロ毒物学的方法は、動物実験の代替についての要望の増加ならびに可能性のある倫理的、商業的および科学的価値に対する認知の増加のせいで、近年、人気を得ている。インビトロ毒性試験系は、効率性の向上、コストの低下、および実験間の変動性の低減を含む多数の利点をもつ。これらの系はまた、動物使用量を減らす、交絡全身的効果(例えば、免疫性)を排除する、および環境的条件を制御する。
【０１６０】
任意のインビトロ試験系が本発明と用いられうるが、インビトロ試験に利用される最も一般的なアプローチは、培養細胞モデルの使用である。これらの系は、新鮮に単離された細胞、一次細胞、または形質転換された細胞培養物を含む。インビトロ毒物学を研究する基本的手段としての細胞培養は、複数培養物の迅速なスクリーニング、細胞、細胞下、または分子レベルにおいて毒性効果を同定および評価する際の有用性により、有利である。インビトロ細胞培養方法は、一般的に、膜完全性、代謝活性、および細胞下攪乱の測定を通して基本的な細胞毒性を示す。膜完全性についての一般的に用いられる指標は、細胞生存度(細胞計数)、クローン増殖試験、トリパンブルー排除、細胞内酵素放出(例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ)、小さいイオン(K1、Ca2+)の膜透過性、および低分子(例えば、51Cr、コハク酸塩)の細胞内Ala蓄積を含む。細胞下攪乱は、例えば、MTT試験を介してミトコンドリア酵素活性レベルをモニターすること、細胞性アデニン三リン酸(ATP)レベルを測定すること、リソソームへのニュートラルレッド取り込み、および全タンパク質合成の定量化を含む。代謝活性指標は、グルタチオン含有量、脂質過酸化、および乳酸/ピルビン酸比を含む。
【０１６１】
C. MTTアッセイ
MTTアッセイは、細胞生存度測定を得るための速く、正確で、信頼性のある方法である。MTTアッセイは、最初、Mosmann(Mosmann, J. Immunol. Meth., 65:55 (1983))により開発された。それは、多数の研究室が毒性結果を得るために利用している単純な比色アッセイである(例えば、Kuhlmann et al., Arch. Toxicol., 72:536 (1998))。簡単には、ミトコンドリアは、ATPを生成して、細胞へ十分なエネルギーを供給する。これを行うために、ミトコンドリアは、ピルビン酸を代謝して、アセチルCoAを生成する。ミトコンドリア内で、アセチルCoAは、トリカルボン酸回路において様々な酵素と反応し、結果として、その後のATPの生成を生じる。MTTアッセイに特に有用な酵素の一つは、コハク酸デヒドロゲナーゼである。MTT(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2ジフェニルテトラゾリウムブロミド)は、コハク酸デヒドロゲナーゼにより切断され、紫色のホルマザン生成物を形成する、黄色の基質である。色素における変化が、ミトコンドリア機能における変化を同定する。生育不能な細胞は、ホルマザンを生成することができず、それゆえに、生成される量は、生細胞の量と直接的に相関する。540nmにおける吸光度は、ホルマザン生成物の量を測定するために利用される。
【０１６２】
インビトロ試験の結果は、生きている動物条件まで外挿するためにインビボ毒性試験と比較されうる(例えば、実施例13参照)。典型的には、物質の単一用量からの急性毒性が評価される。動物は、毒性のどんな徴候(温度上昇、呼吸困難、死など)についても14日間に渡ってモニターされる。伝統的には、急性毒性の標準は、処置された集団の半分が殺害される推定用量である、半致死量(LD50)である。この用量の決定は、管理条件下で試験動物を等比級数の用量に曝すことにより生じる。他の試験は、せいぜい14日間で、ナノデバイスの反復投与に対する動物の応答を測定する亜急性毒性試験を含む。亜慢性毒性試験は、90日間の反復投与の試験を含む。慢性毒性試験は、亜慢性試験と類似しているが、90日の期間を超えて続きうる。インビボ試験はまた、特定の組織に関して毒性を測定するために行われうる。例えば、本発明のいくつかの態様において、腫瘍毒性(すなわち、本発明の組成物の腫瘍組織の生存への効果)が測定される(例えば、腫瘍組織のサイズおよび/または増殖における変化を検出することにより)。
【０１６３】
IX. 遺伝子治療ベクター
本発明の特定の態様において、デンドリマー組成物は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボでの標的細胞または組織への送達および発現のための導入遺伝子を含む。そのような態様において、実際のタンパク質を含むことよりむしろ、デンドリマー複合体は、例えば、対象となる遺伝子をコードする異種性DNA、および標的細胞において対象となる特定のタンパク質の産生を促進する様々な制御エレメントを含む発現ベクター構築物を含む。
【０１６４】
いくつかの態様において、遺伝子は、例えば欠陥遺伝子を置換して癌を処置するために用いられる治療用遺伝子、または、目的物を選択もしくはモニターするために用いられるマーカーもしくはレポーター遺伝子である。遺伝子治療ベクターに関連して、遺伝子は、DNAの異種性断片でありうる。異種性DNAは、1つより多い源由来でありうる(すなわち、多重遺伝子構築物または融合タンパク質)。さらに、異種性DNAは、一つの源由来の制御配列および異なる源由来の遺伝子を含みうる。
【０１６５】
組織特異的プロモーターは、ターゲティングされない組織への可能性のある毒性または望ましくない効果を低減するために特定の組織または細胞において転写をもたらすために用いられうる。例えば、PSA、プロバシン、前立腺酸性ホスファターゼまたは前立腺特異的腺カリクレイン(hK2)のようなプロモーターが、前立腺における遺伝子発現をターゲティングするために用いられうる。同様に、プロモーターは、他の組織における遺伝子発現をターゲティングするために用いられうる(例えば、インスリン、エラスチン、アミラーゼ、pdr-1、pdx-1およびグルコキナーゼプロモーターは膵臓へターゲティングさせる；アルブミン、PEPCK、HBVエンハンサー、αフェトプロテイン、アポリポタンパク質C、α-1アンチトリプシン、ビテロゲニン、NF-ABおよびトランスチレチンプロモーターは、肝臓へターゲティングさせる；ミオシンH鎖、筋肉クレアチンキナーゼ、ジストロフィン、カルパインp94、骨格α-アクチン、速トロポニン1プロモーターは骨格筋へターゲティングさせる；ケラチンプロモーターは皮膚をターゲティングする；sm22α；SM-α-アクチンプロモーターは平滑筋をターゲティングする；CFTR；ヒトサイトケラチン18(K18)；肺胞界面活性物質タンパク質A、BおよびQ CC-10；P1プロモーターは肺組織をターゲティングする；エンドセリン-1；E-セレクチン；フォンビルブランド因子；KDR/flk-1は内皮をターゲティングする；チロシンキナーゼはメラニン細胞をターゲティングする)。
【０１６６】
核酸は、cDNAかまたはゲノムDNAのいずれかでありうる。核酸は、任意の適した治療用タンパク質をコードしうる。好ましくは、核酸は、腫瘍抑制因子、サイトカイン、受容体、アポトーシスの誘導物質、または分化誘導剤をコードする。核酸は、アンチセンス核酸でありうる。そのような態様において、アンチセンス核酸は、発現ベクターの関連外で、本発明のナノデバイスへ組み入れられうる。
【０１６７】
好ましい態様において核酸は、腫瘍抑制因子、サイトカイン、受容体、アポトーシスの誘導物質をコードする。適した腫瘍抑制因子は、BRCA1、BRCA2、C-CAM、p16、p211、p53、p73、またはRbを含む。適したサイトカインは、GMCSF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、β-インターフェロン、γ-インターフェロン、またはTNFを含む。適した受容体は、CFTR、EGFR、エストロゲン受容体、IL-2受容体、またはVEGFRを含む。適したアポトーシスの誘導物質は、AdE1B、Bad、Bak、Bax、Bid、Bik、Bim、Harakiri、またはICE-CED3プロテアーゼを含む。
【０１６８】
X. 併用治療の方法
DNA損傷剤に対する腫瘍細胞抵抗性は、臨床腫瘍学における主な問題を表している。本発明のナノデバイスは、併用治療アプローチを効果的に施すことによりこの問題を改善する手段を提供する。しかしながら、伝統的な併用治療が本発明のナノデバイスと組み合わせて用いられうることは、留意されるべきである。例えば、本発明のいくつかの態様において、ナノデバイスは、伝統的治療の前に、後に、または組み合わせて用いられうる。
【０１６９】
併用治療において、本発明の方法および組成物を用いて、細胞を消滅させる、細胞増殖、もしくは転移、もしくは血管形成を阻害する、または別なふうに腫瘍細胞の悪性表現型を逆転させるもしくは低下させるために、「標的」細胞を、本明細書に記載されたナノデバイス組成物および少なくとも1つの他の剤と接触させる。これらの組成物は、細胞の増殖を絶つまたは阻害するのに効果的な組み合わされた量で提供される。この過程は、免疫治療剤および剤または因子と同時に細胞を接触させる段階を含みうる。これは、両方の剤を含む単一の組成物もしくは薬理学的製剤と細胞を接触させることにより、または一方の組成物が例えば発現構築物を含み、他方が治療剤を含む、2つの別個の組成物もしくは製剤と同時に細胞を接触させることにより、達成されうる。
【０１７０】
または、ナノデバイス処置は、何分間から何週間までの範囲の間隔で、他の剤処置の前または後に行われうる。他の剤および免疫治療が細胞へ別々に適用される態様において、一般的に、剤およびナノデバイスが、細胞への有利な複合効果をまだ発揮することができるように、有意な期間は各送達の時間の間で失効しなかったことを保証する。そのような場合には、細胞が、両方の様式と、お互いから約12〜24時間内、およびより好ましくは、お互いから約6〜12時間内に、接触させられることが企図されるが、たった約12時間の遅延時間が最も好ましい。場合によっては、処置のための期間を有意に延長することが望ましくありうるが、数日間(2〜7)〜数週間(1〜8)は、それぞれの投与の間で切れる。
【０１７１】
いくつかの態様において、本発明の免疫治療組成物または他の剤の1回より多い投与が利用される。様々な組み合わせが用いられ得、下に例示されているように、デンドリマーが「A」であり、他の剤が「B」である。
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【０１７２】
他の組み合わせが企図される。この場合もやはり、細胞殺害を達成するために、両方の剤が、細胞を消滅させるまたは無能にするのに有効な組み合わされた量で細胞へ送達される。
【０１７３】
本発明のナノデバイスとの併用治療に用いられうる他の因子は、限定されるわけではないが、γ線、X線のようなDNA損傷を引き起こす因子、および/または放射性同位元素の腫瘍細胞への方向づけられた送達を含む。マイクロ波およびUV照射のようなDNA損傷因子の他の型もまた企図される。X線についての線量範囲は、長期間(3〜4週間)について50〜200レントゲンの一日量から、2000〜6000レントゲンの単一用量までの範囲である。放射性同位元素についての用量範囲は幅広く変わり、同位元素の半減期、放射される放射線の強さおよび型、ならびに腫瘍性細胞による取り込みに依存する。当業者は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版, 33章, 特にページ624-652に教示される。用量におけるいくらかの変動は、処置されることになっている被験体の状態に依存して必然的に生じるものである。投与に対して責任のある人は、とにかく、個々の被験体についての適切な用量を決定する。さらに、ヒト投与について、調製物は、FDA Office of Biologics標準規格により要求されているように、滅菌、発熱、一般的安全性および純度標準規格を満たすべきである。
【０１７４】
本発明の好ましい態様において、癌をもつ患者へのナノデバイスの局所的送達は、送達される剤の治療効果を最大にするために利用される。同様に、1つまたは複数の官能基(例えば、化学療法薬または放射線治療薬のような治療剤)を含むナノデバイスは、被験体身体の特定の病変部位へ向けられうる。または、ナノデバイス(例えば、治療剤、ターゲティング剤、および/またはイメージング剤を含むデンドリマー)の全身送達は、特定の状況において、例えば、広範な転移が起きている場合、または転移が疑われる場合に適切でありうる。
【０１７５】
ナノデバイスを化学療法薬および放射線治療薬と結合させることに加えて、伝統的な遺伝子治療が用いられることも企図される。例えば、ナノデバイスの処置と共にp53またはp16突然変異のターゲティングは、抗癌処置の向上を提供する。本発明は、限定されるわけではないが、p21、Rb、APC、DCC、NF-I、NF-2、BCRA2、p16、FHIT、WT-I、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、FCC、MCC、ras、myc、neu、raf、erb、src、fms、jun、trk、ret、gsp、hst、bcl、およびablを含む他の腫瘍関連遺伝子との同時処置を企図する。
【０１７６】
インビボおよびエクスビボ処置は、特定の被験体についての特定の構築物の遺伝子送達のためにうまく働く適切な方法を用いて適用される。例えば、ウイルスベクターについて、典型的には、1x104個、1x105個、1x106個、1x107個、1x108個、1x109個、1x1010個、1x1011個、または1x1012個の感染性粒子を患者へ送達する。類似した数字は、相対的取り込み効率を比較することにより、リポソームまたは他の非ウイルス製剤について外挿されうる。
【０１７７】
本発明の魅力的な特徴は、治療組成物が、医学的装置により患者における局所部位へ送達されうることである。本発明に用いるのに適している医学的装置は、治療剤の限局化送達のための公知の装置を含む。そのような装置は、限定されるわけではないが、注射カテーテル、バルーンカテーテル、2倍バルーンカテーテル、微孔性バルーンカテーテル、チャネルバルーンカテーテル、注入カテーテル、灌流カテーテルなどのようなカテーテルであって、例えば、治療剤でコーティングされている、またはそれらを通して剤が投与される、カテーテル；ジェット式注射器のような針なし注射装置；コーティング化ステント、二股ステント、血管移植片、ステント移植片など；およびワイヤーコイルのようなコーティング化血管閉塞装置を含む。
【０１７８】
例示的な装置は、米国特許第5,935,114号；第5,908,413号；第5,792,105号；第5,693,014号；第5,674,192号；第5,876,445号；第5,913,894号；第5,868,719号；第5,851,228号；第5,843,089号；第5,800,519号；第5,800,508号；第5,800,391号；第5,354,308号；第5,755,722号；第5,733,303号；第5,866,561号；第5,857,998号；第5,843,003号；および第5,933,145号に記載されている；全内容は参照により本明細書に組み入れられている。市販されており、本適用において用いられうる例示的なステントは、RADIUS(Scimed Life Systems, Inc.)、SYMPHONY(Boston Scientific Corporation)、Wallstent(Schneider Inc.)、PRECEDENT II(Boston Scientific Corporation)およびNIR(Medinol Inc.)を含む。そのような装置は、公知の技術により、身体内の標的位置に送達される、および/または移植される。
【０１７９】
XI. 光力学的治療
いくつかの態様において、本発明の治療複合体は、患者へ投与される光力学的化合物およびターゲティング剤を含む。いくつかの態様において、ターゲティング剤は、その後、「標的」細胞を結合しうる時間を許され(例えば、約1分間〜24時間)、結果として、標的細胞-ターゲティング剤複合体の形成を生じる。いくつかの態様において、ターゲティング剤および光力学的化合物を含む治療複合体は、その後、照射される(例えば、赤色レーザー、白熱球、X線、またはフィルター処理された日光で)。いくつかの態様において、光は、頚静脈またはいくつかの他の表在性血管もしくはリンパ管に向けられる。いくつかの態様において、一重項酸素およびフリーラジカルは、光力学的化合物から標的細胞(例えば、癌細胞または病原体)へ拡散し、それの破壊を引き起こす。
【０１８０】
XII. 薬学的製剤
臨床適用が企図される場合、本発明のいくつかの態様において、ナノデバイスは、意図される適用に適切な形をとる薬学的組成物の一部として調製される。一般的にこれは、本質的に発熱物質、およびヒトまたは動物に有害でありうる他の不純物を含まない組成物を調製することを必要とする。しかしながら、本発明のいくつかの態様において、デンドリマー製剤そのものは、本明細書に記載された経路の1つまたは複数を用いて投与されうる。
【０１８１】
好ましい態様において、ナノデバイスは、標的細胞による取り込みを可能にする安定な様式で組成物の送達を与えるために適切な塩および緩衝液と共に用いられる。緩衝液はまた、ナノデバイスが患者へ導入される時に用いられる。水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒体に分散した、細胞へのナノデバイスの有効量を含む。そのような組成物はまた、接種材料と呼ばれる。表現、「薬学的にまたは薬理学的に許容される」とは、動物またはヒトに投与された場合、有害な、アレルギー性の、または他の都合の悪い反応を生じない分子実体および組成物を指す。本明細書に用いられる場合、「薬学的に許容される担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌および抗真菌剤、等張性剤および吸収遅延化剤などを含む。任意の通常の媒質または剤が本発明のベクターまたは細胞と適合しない場合を除いて、治療組成物におけるそれの使用が企図される。補足的な活性成分もまた、組成物へ組み入れられうる。
【０１８２】
本発明のいくつかの態様において、活性組成物は、古典的な薬学的調製物を含む。本発明によるこれらの組成物の投与は、標的組織がその経路を介して有効である限り、任意の一般的な経路による。これは、口、鼻、頬、直腸、膣または局所を含む。または、投与は、同所性、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内注射でありうる。
【０１８３】
活性ナノデバイスはまた、非経口で、または腹腔内に、または腫瘍内に投与されうる。遊離塩基または薬学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合された水に調製される。分散はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物において、ならびに油において、調製されうる。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐために保存料を含む。
【０１８４】
いくつかの態様において、本発明は、ターゲティング剤、治療剤およびイメージング剤を含むデンドリマーを含む組成物を提供する。好ましい態様において、デンドリマーは、インビボの腫瘍細胞への治療剤(例えば、メトトレキセート)の送達に用いられる(例えば、実施例13、図27参照)。いくつかの態様において、治療剤は、酸不安定性リンカーを介してデンドリマーに結合している。従って、いくつかの態様において、治療剤は、標的細胞内で(例えば、エンドソーム内で)デンドリマーから放出される。細胞内放出のこの型(例えば、エンドソームの酸不安定性リンカーの破壊)は、本発明の組成物および方法について追加の特異性を与えるために企図される。好ましい態様において、本発明のデンドリマー(例えば、G5 PAMAMデンドリマー)は、表面上に100〜150個の第一級アミンを含む(例えば、実施例13参照)。従って、本発明は、限定されるわけではないが、治療剤、ターゲティング剤、イメージング剤および生物学的モニタリング剤を含む官能基の結合のための複数(例えば、100〜150)の反応部位をもつデンドリマーを提供する。
【０１８５】
本発明の組成物および方法は、本発明のデンドリマー組成物がフルオレセイン(例えば、FITC)イメージング剤を含むかどうかに関わらず、同等に有効であるように企図される(例えば、実施例13参照)。従って、デンドリマー組成物に存在する各官能基は、他の官能基とは無関係に働くことができる。従って、本発明は、ターゲティング、治療、イメージング、および生物学的モニタリングの官能基の複数の組み合わせを含みうるデンドリマーを提供する。
【０１８６】
本発明はまた、標的細胞(例えば、癌細胞)の内部へ分子(例えば、治療およびイメージングの官能基)を送達する非常に効果的かつ特異的な方法を提供する。従って、いくつかの態様において、本発明は、機能するために細胞への分子の送達を含む、または必要とする治療の方法を提供する(例えば、siRNAのような遺伝物質の送達)。
【０１８７】
いくつかの態様において、注射用に適した薬学的形は、滅菌水性溶液または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末を含む。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、それらの適した混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒でありうる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用により、分散の場合において必要とされる粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、維持されうる。微生物の作用の予防は、様々な抗細菌または抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど、によりもたらされうる。多くの場合、等張性剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましくありうる。注射用組成物の持続性吸収は、吸収を遅らせる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物における使用によりもたらされうる。
【０１８８】
殺菌注射用溶液は、上で列挙された様々な他の成分と共に適切な溶媒に必要とされる量で活性化合物を組み入れ、必要に応じて、続いて濾過滅菌を行うことにより調製される。一般的に、分散液は、基本的な分散媒および上で列挙されたものからの必要とされる他の成分を含む滅菌媒体へ様々な滅菌された活性成分を組み入れることにより調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、活性成分プラス任意の追加の所望の成分の粉末を、それらの前に滅菌濾過された溶液から生じる真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０１８９】
処方において、デンドリマー組成物は、投薬処方と適合性のある様式で、治療的に有効であるような量で投与される。製剤は、注射用溶液、薬物放出カプセルなどのような様々な剤形で容易に投与される。例えば、水溶液での非経口投与について、溶液は、必要ならば、適切に緩衝され、液体希釈液は、まず、十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。例えば、1用量が、1mlの等張性NaCl溶液に溶解され、1000mlの皮下注入液を添加されるか、または注入の提案された部位に注射されるかのいずれかでありうる(例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版, ページ1035-1038および1570-1580参照)。本発明のいくつかの態様において、活性粒子または剤は、用量あたり約0.0001〜1.0ミリグラム、または約0.001〜0.1ミリグラム、または約0.1〜1.0ミリグラム、または約10ミリグラムまでも含むように治療用混合物内に製剤化される。複数の用量が投与されうる。
【０１９０】
投与の他の様式に適している追加の製剤は、膣坐剤およびペッサリーを含む。直腸ペッサリーまたは坐剤もまた用いられうる。坐剤は、直腸、膣または尿道への挿入のための、通常、薬物を添加された、様々な重量および形の固体剤形である。挿入後、坐剤は、腔の液において柔らかになる、融解する、または溶解する。一般的に、坐剤について、伝統的な結合剤および担体は、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含みうる；そのような坐剤は、0.5%〜10%、好ましくは1%〜2%の範囲で活性成分を含む混合物から形成されうる。膣坐剤またはペッサリーは、通常、球形または卵形であり、それぞれ、約5gの重さがある。膣薬物は、坐剤の古典的概念から逸脱するが、様々な物理的形態、例えば、クリーム、ゲルまたは液体で利用できる。さらに、坐剤は、大腸癌に関連して用いられうる。ナノデバイスはまた、肺癌などの処置のための吸入剤として製剤化されうる。
【０１９１】
XIII. 癌および病原性疾患の処置または予防の方法
本発明の特定の態様において、方法および組成物は、癌治療における腫瘍の処置のために提供される(例えば、実施例13参照)。本治療は、特異的なシグネチャーが同定されている、またはターゲティングされうる任意の癌の処置において用いられうることが企図される。本発明の方法で処置可能であると企図される、細胞増殖性障害または癌は、限定されるわけではないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、ユーイング腫瘍、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫を含むヒト肉腫および癌腫；白血病、急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病(骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病)；慢性白血病(慢性骨髄球性(顆粒球性)白血病および慢性リンパ性白血病)；ならびに真性多血症、リンパ腫(ホジキン病および非ホジキン病)、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、および重鎖病を含む。
【０１９２】
本治療は、特異的なシグネチャーが同定されている、または所定の病原体についてターゲティングされうる任意の病原性疾患の処置において用いられうることが企図される。本発明の方法で処置可能であると企図される病原体の例は、限定されるわけではないが、レジオネラ・ペオモフィリア(Legionella peomophilia)、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、破傷風菌(Clostridium tetani)、インフルエンザ菌(Hemophilus influenzae)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)、炭疽菌(Bacillus anthracis)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheria)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、ヒトパピローマウイルス(human papilloma virus)、ヒト免疫不全症ウイルス(human immunodeficiency virus)、風疹(rubella)ウイルス、ポリオ(polio)ウイルスなどを含む。  
【０１９３】
実験
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい態様および局面を実証し、さらに例証するために提供され、その範囲を限定するとして解釈されるべきではない。
【０１９４】
後に続く実験の開示において、以下の略語が適用される：g(グラム)：lまたはL(リットル)；μg(マイクログラム)；μl(マイクロリットル)；μm(マイクロメートル)；μM(マイクロモル濃度)；μmol(マイクロモル)；mg(ミリグラム)；ml(ミリリットル)；mm(ミリメートル)；mM(ミリモル濃度)；mmol(ミリモル)；M(モル濃度)；mol(モル)；ng(ナノグラム)；nm(ナノメートル)；nmol(ナノモル)；N(規定濃度)；pmol(ピコモル)；Aldrich(Sigma/Aldrich, Milwaukee, WI)；Sigma(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)；Fisher Scientific(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)；Millipore(Millipore, Billerica, MA)；Mettler Toledo(Mettler Toledo, Columbus, OH)；Waters(Waters Corporation, Milford, Massachusetts)；Wyatt Technology(Wyatt Technology Corp., Santa Barbara, CA)；TosoHaas(TosoHaas Corp., Montgomeryville, PA)；Perkin Elmer(Perkin Elmer, Wellesley, MA)；Beckman Coulter(Beckman Coulter Corp., Fullerton, CA)；Phenomenex(Phenomenex, Torrance, CA)；GiboBRL(GibcoBRL/Life Technologies, Gaithersburg, MD)；Pierce(Pierce Chemical Company, Rockford, IL)；Roche(F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Switzerland)。
【０１９５】
実施例1
材料および方法
G5 PAMAMデンドリマーは、Center for Biologic Nanotechnology, University of Michiganにおいて合成され、特徴づけられた。MeOH(HPLCグレード)、無水酢酸(99%)、トリエチルアミン(99.5%)、DMSO(99.9%)、フルオレセインイソチオシアネート(98%)、グリシドール(ラセミ体、96%)、DMF(99.8%)、1-(3-ジメチルアミノ)-プロピル)-3-エチルカルボジイミドHCl(EDC、98%)、クエン酸(99.5%)、アジ化ナトリウム(99.99%)、D2O、NaCl、および電位差滴定のための滴定液(0.1M HClおよび0.1M NaOH)は、すべて、Aldrichから購入され、一般に容認されているように用いられた。メトトレキセート(99+%)および葉酸(98%)は、Sigmaからであり、Spectra/Por(登録商標)透析膜(MWCO 3,500)、Millipor Centricon限外濾過膜YM-10、およびリン酸緩衝食塩水(PBS、pH=7.4)は、Fisher Scientificからであった。
【０１９６】
電位差滴定：滴定は、室温、23±1℃において、Mettler Toledo MP230 pHメーターおよびMicroComb pH電極を用いて手作業で行われた。0.1M NaClの10mL溶液が、アミン基相互作用を遮蔽するために、正確に重量を計られた100mgのPAMAMデンドリマーへ添加された。滴定は、0.1028N HClで行われ、0.1009N NaOHが逆滴定に用いられた。第一級および第三級アミンの数は、逆滴定データから決定された。
【０１９７】
ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)：GPC実験は、2487 Dual Wavelengh UV Absorbance Detector(Waters)、Wyatt Dawn(登録商標)DSP Laser Photometer、 Optilab DSP Interferometric Refractometer(Wyatt Technology)を、ならびにTosoHaas TSK-Gel(登録商標)Guard PHW 06762(75x7.5mm, 12μm)、G 2000 PW 05761(300x7.5mm, 10μm)、G 3000 PW 05762(300x7.5mm, 10μm)およびG 4000 PW(300x7.5mm, 17μm)カラムを備えたAlliance Waters 2690 Separation Moduleにおいて行われた。カラム温度は、Waters Temperature Control Moduleにより25±0.1℃に維持された。定組成移動相は、1ml/分の流速で、0.1Mクエン酸および0.025w%アジ化ナトリウム、pH2.74であった。試料濃度は、100μLの注入容量で、10mg/5mlであった。PAMAMデンドリマーおよびそれの結合体のの分子量ならびに分子量分布は、Astra 4.7ソフトウェア(Wyatt Technology)を用いて測定された。
【０１９８】
核磁気共鳴分析法：1Hおよび13C NMRスペクトルは、D2Oにおいて取られ、Bruker AVANCE DRX 500装置を使って構造分析についての積算値を与えるように用いられた。
【０１９９】
UV分光測光法：UVスペクトルは、PBSにおいてPerkin Elmer UV/VIS Spectrometer Lambda 20およびLambda 20ソフトウェアを用いて記録された。
【０２００】
逆相高速液体クロマトグラフィー：逆相イオン対高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)システムは、System GOLD(商標)126溶媒モジュール、100μlループを備えたModel 507自動試料採取装置、およびModel 166 UV検出器(Beckman Coulter)からなった。Phenomenex Jupiter C5シリカ基剤HPLCカラム(250x4.6mm, 300A)は、分析物の分離のために用いられた。2つのPhenomenex Widepore C5ガードカラム(4x3mm)もまた、HPLCカラムの上流に取り付けられた。PAMAMデンドリマーの溶出のための移動相は、1ml/分の流速で、90:10水/アセトニトリル(ACN)から始まる線形勾配であり、30分間後、50:50に達した。水中およびACN中0.14w%濃度でのトリフルオロ酢酸(TFA)が、デンドリマー-結合体表面を疎水性にするために対イオンとして用いられた。結合体は、移動相(90:10水/ACN)に溶解された。各場合における注入容量は、約1mg/mlの試料濃度をもつ50μlであり、溶出された試料の検出は、210nm、または242nm、または280nmで行われた。分析は、BeckmanのSystem GOLD(商標)Nouveauソフトウェアを用いて行われた。各デバイスおよびすべての中間体の特徴づけは、UV、HPLC、NMR、およびGPCの使用を通して行われている。
【０２０１】
KB細胞は、ATCC(CLL17; Rockville, MD)から入手された。トリプシン-EDTA、Dulbeccoのリン酸緩衝食塩水(PBS)、ウシ胎児血清、細胞培養抗生物質、およびRPMI培地は、Gibco/BRLから入手された。すべての他の試薬はSigmaからであった。デンドリマー-結合体の合成および特徴づけは、別々の交信として報告される。この研究に用いられたすべてのデンドリマー調製物は、本発明者らのセンターで合成され、遊離表面アミノ基のアセチル化により表面中和されている。
【０２０２】
細胞培養および処置：KB細胞は、ヒト血清に見出されるものと類似した細胞外FAを供給するように、10%血清を含む、葉酸無しの培地(例えば、Quintana et al, Pharm. Res. 19, 1310 (2002)参照)において維持された。細胞は、取り込み研究のために12ウェルプレートに、細胞増殖分析のために24ウェルプレートに、およびXTTアッセイのために96ウェルプレートに蒔かれた。細胞は、透析された血清を含む、FA無しの培地でリンスされ、デンドリマー-薬物結合体と、指示された時間および濃度について、37℃でインキュベートされた。KB細胞はまた、低いFARを発現させる細胞を得るために2μM FAを含むRPMI培地で維持された。
【０２０３】
フローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡法：デンドリマー溶液の標準蛍光は、Beckman分光蛍光計を用いて定量化された。ターゲティングされるポリマーの取り込みのフローサイトメトリー分析について、細胞はトリプシン処理され、0.1%ウシ血清アルブミン(PBSB)を含むPBSに懸濁され、Becton Dickinson FACScanアナライザーを用いて分析された。10,000個の細胞のFL1-蛍光が測定され、ゲートされた生細胞の平均蛍光が定量化された。共焦点顕微鏡分析は、Carl Ziess共焦点顕微鏡を用いてガラスカバースリップ上に蒔かれた細胞において行われた。蛍光および微分干渉コントラスト(DIC)画像が、FITCについて適切なフィルターを用い、アルゴンレーザーを使って同時に収集された。
【０２０４】
デンドリマー細胞傷害性の評価：細胞増殖は、ビシンコニン酸試薬(PIERCE)を用いて処理された細胞の可溶化物における総タンパク質のアッセイにより、およびRocheからのキットを用いてXTTアッセイにより、測定された。
【０２０５】
実施例2
デンドリマーの合成
デンドリマーは、以下の工程に従って合成された(例えば、図6参照)：
2008510829.tif 000004
(注記：Ac1、Ac2、Ac3において示された上付き文字は、アセチル化反応の異なるセットを識別するために利用される)。
【０２０６】
1. G5担体
PAMAM G5デンドリマーは、Center for Biologic Nanotechnology, University of Michiganにおいて合成され、特徴づけられた。PAMAMデンドリマーは、4つの放射デンドロンアームをもつエチレンジアミン(EDA)開始剤コアから構成され、アクリル酸メチル(MA)の消耗的マイケル付加、および各継続的世代を生じるための、その結果生じたエステルの大過剰のEDAとの縮合(アミド化)からなる反復反応手順を用いて合成される。各継続的反応は、それゆえに、理論的には、表面アミノ基の数を二倍にし、官能付与について活性化されうる。合成されたデンドリマーは、分析されており、分子量は、GPCにより26,380g/モルであることが見出されており、第一級アミノ基の平均数は、110であると電位差滴定により決定されている。
【０２０７】
2. G5-Ac3(82)
160mlの無水MeOHにおけるG5 PAMAMデンドリマー(GPCによるMW=26,380g/モル、電位差滴定による第一級アミンの数=110)の2.38696g(8.997*10-5モル)を、1.254ml(8.997*10-3モル、25%モル過剰)のトリエチルアミンの存在下で679.1μl(7.198*10-3モル)の無水酢酸と反応するようにさせておいた。強力な透析および凍結乾燥後、2.51147g(93.4%)G5-Ac3(82)生成物が生じた。アセチル基の平均数(82)は、1H NMR較正に基づいて決定されている(Majoros, I.J., Keszler, B., Woehler, S., Bull, t., and Baker, J.R., Jr. (2003))。
【０２０８】
3. G5-Ac3(82)-FITC
110mlの無水DMSOにおけるG5-Ac3(82)部分的アセチル化PAMAM(GPCによるMW=29,880g/モル)の1.16106g(3.884*10-5モル)を窒素下で0.08394g(90%純度)(1.94*10-4モル)のFITCと一晩、反応するようにさせておいた。強力な透析、凍結乾燥後、1.10781g(89.58%)G5-Ac3(82)-FITC生成物が生じた。さらなる精製は、膜濾過を通して行われた。
【０２０９】
4. G5-Ac3(82)-FITC-OH
0.20882g(6.51*10-6モル)のG5-Ac3(82)-FITCを、150mlのDI水において19.9μl(2.99*10-4モル)のグリシドール(ラセミ)と反応するようにさせておいた。2つのグリシドール分子は、それぞれの残りの第一級アミノ基について計算された。反応混合物は、室温で3時間、活発に撹拌された。2日間の強力な透析、および凍結乾燥後、生成物G5-Ac3(82)-FITC-OHの収量は0.18666g(84.85%)であった。
【０２１０】
5. G5-Ac3(82)-FITC-OH-MTXe
0.02354g MTX(5.18*10-5モル)を、活発に撹拌しながら、室温で1時間、27 ml DMFおよび9 ml DMSOにおいて0.13269g(6.92*10-4モル)EDCと反応するようにさせておいた。この溶液は、0.09112g(2.72*10-6モル)のG5-Ac3(82)-FITC-OHを含む150ml DI水溶液へ滴下式で添加された。反応は、室温で3日間、活発に撹拌された。強力な透析、および凍結乾燥後、目標にされた分子G5-Ac3(82)-FITC-OH-MTXeの収量は、0.08268g(73.5%)であった。
【０２１１】
6. G5-Ac3(82)-FITC-FA
0.03756g(8.51*10-5モル)のFA(MW=441.4g/モル)を、窒素雰囲気下で1時間、27ml ドライDMFおよび9ml ドライDMSO混合物における0.23394g(1.22*10-3モル)のEDC(1-(3-ジメチルアミノ)-プロピル)-3-エチルカルボジイミドHCl；MW=191.71g/モル)と反応するようにさせておいた。その後、この有機反応混合物は、0.49597g(1.55*10-5モル；MW=32,150g/モル) G5-Ac3(82)-FITCのDI水溶液(100ml)へ滴下式で添加された。反応混合物は、2日間、活発に撹拌された。透析および凍結乾燥後、G5-Ac3(82)-FITC-FA重量は、0.5202g(98.1%)であった。さらなる精製は膜濾過を通して行われた。
【０２１２】
7. G5-Ac1(82)-FITC-FA-MTXa
2.1763*10-5モル(0.00989g)のMTX(MW=454.45g/モル)を、窒素雰囲気下で1時間、66ml ドライDMFおよび22ml ドライDMSO混合物における3.0948*10-4モル(0.05933g)のEDCと反応するようにさせておいた。この有機反応混合物は、0.09254g(2.7051*10-6モル；GPCによるMW=34,710g/モル) G5-Ac1(82)-FITC-FA-NH2のDI水溶液(260ml)へ滴下式で添加された。溶液は2日間、活発に撹拌された。透析および凍結乾燥後、G5-Ac1(82)-FITC-FA-MTXa重量は、0.09503g(96.5%)であった。さらなる精製は、分析の前に、膜濾過により行われた。この三官能性デバイスは、インビトロの細胞傷害性研究において薬物切断における対照化合物として働いた。
【０２１３】
8. G5-Ac3(82)-FITC-FA-OH
200mlのDI水における0.29597g(8.63*10-6モル)のG5-Ac3(82)-FITC-FA部分的アセチル化PAMAMデンドリマー結合体(GPCによるMW=34,710g/モル)を、3時間、20.6μl(3.1*10-4モル、25%モル過剰)のグリシドール(MW=74.08g/モル)と反応するようにさせておいた。強力な透析、凍結乾燥および繰り返し膜濾過後、0.27787g(90.35%)完全グリシジル化G5-Ac3(82)-FITC-FA-OH生成物が生じた。インビトロ研究において、非特異的取り込みは観察されなかった(取り込み研究(24)についてこの研究のパートII参照)。
【０２１４】
9. G5-Ac3(82)-FITC-FA-OH-MTXe
0.03848g(8.4674*10-5モル)のMTX(MW=454.45g/モル)を、窒素雰囲気下で1時間、54ml ドライDMFおよび18ml ドライDMSO混合物における0.22547g(1.176*10-3モル)のEDCと反応するようにさせておいた。この有機反応混合物は、0.16393g(4.6339*10-6モル；MW=36,820g/モル)G5-Ac3(82)-FITC-FA-OHのDI水溶液(240ml)へ滴下式で添加された。溶液は、3日間、活発に撹拌された。透析、繰り返し膜濾過および凍結乾燥後、G5-Ac3(82)-FITC-FA-MTXe重量は0.18205g(90.88%)であった。
【０２１５】
10. G5-Ac2(82)-FA
FAは、2つの連続的な反応でG5-Ac2(82)に付着した。0.03278g(7.426*10-5モル)FAを、室温で、24ml DMF、8ml DMSO溶媒混合物における14倍過剰のEDC0.19979g(1.042*10-3モル)と反応するようにさせておき、その後、このFA活性エステル溶液は、90ml水における部分的アセチル化生成物G5-Ac2(82)(0.40366g、1.347*10-5モル)の水溶液へ滴下式で添加された。透析および凍結乾燥後、生成物重量は、0.41791g(96.7%)であった。FA分子の数は、UV分光法により測定された。追加の特徴づけとして、UV検出器を備えたGPCにより、またはアガロースゲルにより、遊離FAは観察されなかった。
【０２１６】
11. G5-Ac2(82)-FA-OH
0.21174g(6.60*10-6モル)の一官能性樹枝状デバイス、G5-Ac2(82)-FA、を活発な撹拌下で3時間、154ml DI水における20.1μl(3.04*10-4モル)のグリシドールと反応するようにさせておいた。透析および凍結乾燥後、表面上にヒドロキシル基を有するグリシドール化一官能性デバイス(収量：0.20302g、91.05%)は、メトトレキセートとの結合反応に関与した。
【０２１７】
12. G5-Ac2(82)-FA-OH-MTXe
27mlのDMFおよび9mlのDMSO溶媒混合物において、0.02459g(5.41*10-5モル)のMTXおよび0.14315g(7.46*10-4モル)の1-(3-(ジメチルアミノ)-プロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC)を、窒素下、室温で1時間、反応するようにさせておいた。反応混合物は、活発に撹拌された。MTX活性エステル溶液は、150ml DI水における表面上にヒドロキシル基を有する一官能性樹枝状デバイスの0.09975g(2.95*10-6モル)へ滴下式で添加され、この反応混合物は、室温で3日間、撹拌された。透析および凍結乾燥後、この二官能性デバイスG5-Ac2(82)-FA-OH-MTXe(収量：0.11544g、93.9%)は、組成的および生物学的事項により試験された。
【０２１８】
実施例3
G5 PAPAMデンドリマーの末端第一級アミノ基を分析する電位差滴定曲線
電位差滴定は、第一級および第三級アミノ基の数を測定するために行われた。理論的には、G5 PAMAMデンドリマーは、それの表面上の128個の第一級アミン基、および126個の第三級アミン基を有する。これらの値は、数学的モデルの使用を通して決定されうる。電位差滴定より、G5 PAMAMデンドリマー担体の表面上に存在する110個の第一級アミンがあることが明らかにされた(例えば、0.1M HCl滴定液での直接滴定および0.1M NaOH滴定液での逆滴定により行われた滴定曲線を示す、図7を参照)。第一級アミノ基の平均数は、0.1M NaOH滴定液で行われた逆滴定を用いて計算された。
【０２１９】
各結合体構造の分子量の測定もまた、十分定義された多官能性デンドリマーを作製するために必要であった。多角レーザー光散乱および濃度検出器としてのRI検出器を備えたGPCが、この目的のために用いられた(例えば、それぞれについて与えられた分子量および分子量分布をもつPAMAMデンドリマー担体ならびにそれの一、二および三官能性結合体を示す、表1を参照)。上付きの数字2および3(例えば、-G5-Ac2およびG5-Ac3)は、これらが2つの独立したアセチル化反応であることを示す。
【０２２０】
【表１】
2008510829.tif 000005
【０２２１】
実施例4
ゲル浸透クロマトグラフィーによるデンドリマー特徴づけ
26,380g/モルのG5デンドリマーの測定された分子量は、理論上のもの(28,826g/モル)よりわずかに低い。これらの結果は、理論的構造からの偏向を示す。表1における値は、各結合体についてのGPCデータを利用して計算され(例えば、図8参照)、担体に付着した各官能基の正確な数を導くために計算された。各官能性分子の平均数は、問題の官能性分子無しの結合体のMn値を、その官能性分子を含む結合体のMn値から引き、官能性分子の分子量で割ることにより、計算されうる。G5-Ac2、G5-Ac2(82)-FA-OH-MTXe、G5-Ac3(82)-FITC-OH-MTXe、およびG5-Ac2(82)-FITC-FA-OH-MTXeのGPC溶出曲線（eluogram）が提示され得、RIシグナルおよびレーザー光散乱シグナルは、90°で重なる(例えば、図8参照)。
【０２２２】
GPC分析に基づいて、結合されたFITC、FA、MTXおよびグリシドール分子の数は決定されうる(例えば、図8参照：FITC: 5.8、FA: 5.7、MTXe: 5〜6、OH: 28〜30)。GPCにより測定される場合の結合された分子の数は、想定されたものよりわずかに高かった；これは、最も可能性が高くは、問題のデバイスに依存する様々な効果を生じる、溶出剤におけるクエン酸の効果のせいである。NMRおよびUVスペクトルの分析を通して得られた値と共にこれらの値は、デンドリマーに付着した各結合分子の数を正確に決定するために組み合わせて利用される。
【０２２３】
G5 PAMAMデンドリマーの理論上の、および欠陥のある化学的構造が提示されている(例えば、図9参照)。架橋のような副反応、および理論上予想されるより世代あたりのより少ないアームの生成は、G5 PAMAMデンドリマーの理論的表示とはわずかに異なる構造を生じるのを促進する。G5 PAMAMデンドリマーの欠陥のある化学的構造は、各世代からのアームの欠損を示し、それらがデンドリマーの球形を妨げ、それゆえに、付着することが可能である官能性分子の数に影響を及ぼし、かつ各官能性分子がターゲティングされた細胞内で生じうる効果を減らすため、問題となりうる。
【０２２４】
実施例5
デンドリマー官能基の特徴づけ
デンドリマーのアセチル化：アセチル化は、デンドリマーの合成における第一の必須段階である。部分的アセチル化は、さらなる反応または生体系内の分子間相互作用からデンドリマー表面の部分を無効にするために用いられ、それゆえに、非特異的相互作用が合成中および薬物送達中に生じるのを防ぐ。アセチル化されていない表面アミンの部分を残すことは、官能基の付着を可能にする。残りのアミノ基のアセチル化は、結果として、水溶性の増加を生じ、デンドリマーが、増加したターゲティング特異性をもって水性媒質内をより自由に分散することを可能にし、多くの通常の媒質と比較してターゲティングされる送達系としての使用についてより大きな可能性を与える(Quintana et al., Pharm. Res. 19, 1310 (2002))。
【０２２５】
強力な透析、凍結乾燥、ならびにPBSおよびDI水を用いる繰り返し膜濾過は、精製された、部分的アセチル化G5-Ac2(82)およびG5-Ac3(82)PAMAMデンドリマーをもたらすために用いられた(例えば、Majoros et al., Macromolec 36, 5526 (2003)参照)。フルオレセインイソチオシアネート(FITC)および(FITC-FA)の結合後、デンドリマーは、インビトロ取り込み研究のために再び完全にアセチル化され、続いて、(Wang, et al., Blood. 15, 3529 (2000))に見出されるように、同じ反応手順を行った。強力な透析、凍結乾燥および繰り返し膜濾過が行われ、完全アセチル化G5-Ac1(82)-FITCおよびG5-Ac1(82)-FITC-FA PAMAMを生じた。アセチル化の度合いが上昇するにつれて、デンドリマーの直径は減少し、アセチル化の度合いとデンドリマー直径の間の反比例関係を示している(例えば、Majoros et al., Macromolec 36, 5526 (2003)参照)。プロトン化に利用できる第一級アミンのより少ない数(より低い度合いと比較した、より高い度合いのアセチル化における)は、電荷-電荷相互作用によりあまり影響を及ぼされない構造へと導き、それゆえに、よりコンパクトな構造へと導く。分子量は、しかしながら、アセチル化の度合いが上昇するにつれて分子量は増加するため、アセチル化の度合いと並行関係をもつ。
【０２２６】
PAMAMデンドリマーは、H1-NMRおよびHPLCにより(例えば、それぞれ、図10(A)および(B)参照)、210nmにおけるUV検出により溶出された画分をモニターすることにより、さらに特徴づけられた。G5-AcについてのH1-NMRスペクトルは以下を示す：4.71ppmに出現するピークは、D2Oを表し、3.67ppmにおけるピークは、外部標準ジオクサンを表し、1.89ppmにおけるピークはアセトアミドのメチルプロトンを表す。ピーク2.34ppm、2.55ppm、2.74ppm、3.04ppm、3.21ppm、および3.39ppmは、アセチル化デンドリマーに存在するプロトンを表す。
【０２２７】
官能基の構造：FITC、FAおよびMTXの構造は提示され、デンドリマーに付着しうる基がアスタリスクでマークされている(例えば、図11参照、α-およびγ-カルボキシル基がFAおよびMTX分子の両方において標識されている)。FA上のγ-カルボキシル基がデンドリマーへの結合に用いられる場合、FAは、それの受容体への強い親和性を保持し、FAがターゲティング剤として働く能力を保持することを可能にする。さらに、γ-カルボキシル基は、α-カルボキシル基と比較して、カルボジイミド媒介されたアミノ基への結合中により高い反応性を有する(例えば、Quintana, et al., Pharm. Res. 19, 1310 (2002)参照)。
【０２２８】
官能基のH1-NMR：デンドリマーに付着した官能基の各型の数を最終的に決定するために、官能基それら自身のH-NMR、および官能基と結合したデンドリマーのH1-NMRが比較されなければならない。官能基のH1-NMR(例えば、図12参照)：FITC H1-NMR-芳香族ピーク：7.9ppm、7.68ppm、7.23ppm、6.6ppm、6.65ppm、6.75ppm；FA H1-NMR-芳香族ピーク：8.73ppm、6.75ppm、7.65ppm、4.85ppmにおけるD2O、3.3ppmにおけるCH3OD、脂肪族ピーク：2.15ppm、2.2ppm、2.4ppm；およびMTX H1-NMR-芳香族ピーク：8.65ppm、8.75ppm、7.85ppm、4.8ppmにおけるD2O、3.35ppmにおけるCH3OD、脂肪族ピーク：2.05ppm、2.25ppm、2.45ppm。
【０２２９】
実施例6
官能基のアセチル化デンドリマーへの結合
フルオレセインイソチオシアネートのアセチル化デンドリマーへの結合：部分的アセチル化G5-Ac3(82)PAMAMデンドリマーは、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)の結合に用いられた。部分的アセチル化デンドリマーを、フルオレセインイソチオシアネートと反応するようにさせておき、強力な透析、凍結乾燥および繰り返し膜濾過後、G5-Ac3(82)-FITC生成物が生じた。形成されたチオ尿素結合は、デバイスの研究中に安定であった。
【０２３０】
葉酸のアセチル化一官能性デンドリマーへの結合：葉酸の部分的アセチル化一官能性樹枝状デバイスへの結合は、葉酸のγ-カルボキシル基とデンドリマーの第一級アミノ基の間の縮合を介して行われた。この反応混合物は、G5-Ac3(82)-FITCを含むDI水の溶液へ滴下式で添加され、FAがG5-Ac3(82)-FITCへ完全に結合するのを可能にするように、2日間(窒素雰囲気下で)、活発に撹拌された。αカルボキシル基は、縮合反応に関与するだろうことは明らかであるが、それの反応性は、γカルボキシル基と比較した場合、よりずっと低い。NMRもまた、デンドリマーに付着したFA分子の数を確認するために用いられた。遊離FAが試料内に存在する場合、スペクトルに鋭いピークが出現するであろう。遊離FA(例えば、図12参照)およびG5-Ac3(82)-FITC-FAの1H NMRスペクトルが取られた。G5-Ac3(82)-FITC-FAスペクトルにおける芳香族プロトンの広がりは、FAとデンドリマーの間の共有結合の存在を示す。アセトアミド基におけるメチルプロトンおよびFAにおける芳香族プロトンの積算値に基づいて、付着したFA分子の数は、4.5であると計算された。FA分子の数(4.8)は、遊離FA濃度検量線を利用して、UV分光法により決定された。
【０２３１】
MTXのアセチル化二官能性デンドリマーへの結合(アミド結合を介して)：対照、MTX、三官能性結合体は、G5-Ac3(82)-FITC-FAから合成された。MTX、一般的に用いられる抗癌薬、の構造におけるFAとの類似性は、FAを第一級アミノ基へ付着させるのに用いられた同じ縮合反応を通してG5-Ac3(82)-FITC-FAへのそれの付着を可能にする。デンドリマーあたり5つの薬物分子が付着していることが、反応物のモル比から予想された。三官能性デバイスの1H NMRスペクトルが取られた。芳香族プロトンピークの広がりは、メトトレキセートとデンドリマーの間の共有結合の存在を示す。アセトアミド基におけるメチルプロトンおよび結合された分子における芳香族プロトンの積算値に基づいて、付着したメトトレキセート分子の数は、5であると計算された。アミド結合によるMTX結合は、エステル結合を通してのMTX結合の比較のための対照デバイスとしての役割を果たした。エステル結合を介したメトトレキセートの付着は、アミド結合によるMTXのデンドリマーへの結合と比較して、系への薬物の相対的により容易な切断および放出を可能にする。
【０２３２】
グリシドールのアセチル化二官能性デンドリマーへの結合：グリシドールのアセチル化二官能性デバイスへの結合は、MTXをエステル結合を介して付着させ、生体系内での任意の望まれていない非特異的ターゲティングを避けるために残ったNH2を除去するために、重要な前駆的段階であった。グリシドールのG5-Ac3(82)-FITC-FAへの結合は、すべての残った第一級アミノ基をアルコール基へ変換し、G5-Ac3(82)-FITC-FA-OHを生成した。特徴づけを目的として、FAまたはFITCを含むグリシドール化樹枝状デバイスへのMTXの結合は、G5-Ac2-FA-OH-MTXe1*およびG5-Ac3-FITC-OH-MTXe2*を生じた(例えば、図13(A)および(B)、それぞれ、各試料のHPLC溶出曲線、を参照）。
【０２３３】
実施例7
エステル結合を介してアセチル化グリシジル化二官能性デンドリマーへ結合したMTXの特徴づけ
G5-Ac2-FA-OH-MTXeについてのH1-NMRが示されている(例えば、図14参照)。結合されたデバイスの芳香族プロトンを表すピークは、遊離FAおよびMTXのH1-NMRに見出される芳香族プロトンと識別できない。芳香族プロトンは、二重で6.59ppm、7.53ppmに、および単独で8.37ppmに出現する。遊離FAおよび遊離MTXのH1-NMRの、結合されたデバイスのそれとの比較は、芳香族領域がほとんど全く同じに重なり、それゆえに、芳香族プロトンの位置を決定することを不可能にさせることを示している。FAおよびMTXの付着した分子の数もまた、ピークの分布に影響を及ぼす。4.70ppmに出現するピークは、溶媒D2Oを表し、3.67ppmに出現するピークは、外部標準ジオクサンを表し、1.89ppmに出現するピークは、アセトアミド基のメチルプロトンを表す。ピーク2.31ppm、2.52ppm、2.71ppmおよび3.26ppmは、デンドリマーのプロトンを表す。
【０２３４】
実施例8
デンドリマーのUVスペクトル特徴づけ
エステル結合を介したMTX結合は、アミド結合を介したデンドリマーへの結合と比較して切断の向上について試験された。MTXは、EDC化学的性質の使用により付着させられる。305nmにおけるG5-Ac-FITC-FA-OH-MTXeについてのHPLC溶出曲線が示されている(例えば、図15参照)。遊離FA、MTXおよびFITCについての組み合わされたUVスペクトルは、G5-Ac(82)、一、二および三官能性デンドリマーのUVスペクトルと比較されうる(例えば、それぞれ、図16および17参照)。UVスペクトルは、FAについて正確に281nmおよび349nmに、MTXについておよそ258nm、304nmおよび374nmに、ならびにFITCについて493nmに、特徴づけるピークを示す。目に見えるFA、FITCおよびMTXについての特徴的なピーク(例えば、図16参照)は、各分子のデンドリマーへの結合に依存している。遊離物質およびデンドリマー結合した物質のUVスペクトルの比較による各デバイスの特徴づけは、どの官能基がデンドリマーへ付着しているかを決定するために用いられた。
【０２３５】
実施例9
デンドリマーの細胞取り込み
結合体G5-FI、G5-FITC-FAおよびG5-FITC-FA-MTXの標準溶液の蛍光は、分光蛍光計を用いて測定された。デンドリマー濃度と蛍光の間の直線関係が、10〜1000nMにおいて観察された。G5-FITC、G5-FITC-FAおよびG5-FITC-FA-MTXの100nM溶液の蛍光は、それぞれ、0.57、0.23、および0.11分光蛍光ユニットであった。蛍光におけるこれらの差は、デンドリマー上のFAおよびMTXの存在による消光を示している可能性がある。
【０２３６】
デンドリマーの細胞取り込みは、高い細胞表面FA受容体(FAR)を発現させるKB細胞において測定された。FA結合デンドリマーは、用量依存様式で細胞に結合し、G5-FITC-FAおよびG5-FITC-FA-MTXの両方について10〜15nMにおいて50%結合したが、対照デンドリマーG5-FITCは、KB細胞において検出されなかった(例えば、図18A参照)。得られた蛍光が、デンドリマーの標準溶液において観察された消光について標準化された場合、G5-FITC-FAおよびG5-FITC-FA-MTXについて同一の結合曲線が得られた(例えば、図18B参照)。G5-FITC-FA-MTX(100nM)の結合の反応速度の分析は、最大限結合が、遊離葉酸の結合についての報告と同様である30分以内に達成されることを示した。
【０２３７】
デンドリマーの取り込みへの遊離FAの効果は、高いFARおよび低いFARを発現させる両方のKB細胞において試験された。G5-FITC-FAおよびG5-FITC-FA-MTXの両方について、結合体の低FAR発現KB細胞への結合は、高FAR発現細胞のそれの30%であった(例えば、図19、左パネル参照)。50μM FAは、低および高FAR発現細胞の両方においていずれのターゲティングされたデンドリマー(30nM)の取り込みも完全にブロックした(例えば、図19、右パネル参照)。デンドリマーのKB細胞への結合および内部移行は、共焦点顕微鏡法により評価された。KB細胞は、250nMの示されたデンドリマーと24時間、インキュベートされ、共焦点画像が撮られた。ターゲティング分子FAを含む結合体は、24時間以内にKB細胞へ内部移行した(例えば、図20参照)。対照結合体で処理された細胞と比較して、G5-FITC-FA-MTXに曝された細胞は、より接着性が少なく、かつ集合させられ、薬物-結合体により引き起こされた細胞傷害性を示した。
【０２３８】
実施例10
官能基結合デンドリマーは細胞増殖を阻害する
結合体のKB細胞への結合は、1時間以内に最大取り込みに達するため(Quintana et al., 2002. Pharmaceutical Research 19:1310-1316)、G5-FI-FA-MTXの細胞増殖への効果は、最初は、細胞の結合体との1時間のプレインキュベーション、続いて薬物を含まない培地における5日間のインキュベーションにより試験された。そのような条件下で、結合体は、KB細胞において少しの増殖阻害性効果も示すことができなかった。細胞がデンドリマーと4時間、プレインキュベートされた場合、XTTアッセイにより測定される場合、細胞増殖において約10%の小幅な減少があった。細胞傷害性測定は、それゆえに、最低限24時間、有意な細胞傷害性を引き起こすのに示されたプレインキュベーション時間、デンドリマーとのインキュベーションにより行われた。
【０２３９】
細胞増殖の経時変化および用量依存性阻害：MTXに引き起こされた細胞傷害性は、培地が完全にFAを奪われている場合のみ、インビトロで検出可能であることを以前の研究は示している(例えば、Sobrero & Bertino, Int. J. Cell Cloning 4,51 (1986)参照)。三官能性デンドリマーの細胞増殖への効果は、FA欠損培地でインキュベートされた細胞において試験された。細胞は、300nM結合体(1500nM MTXと等価)または1500nM遊離MTXで、1〜4日間、処理され、細胞増殖は、細胞タンパク質含有量の推定により測定された。細胞は、結合体または遊離MTXの異なる濃度で2日間、処理された(結合体濃度は、デンドリマー分子あたり5つのMTXで、MTX当量として与えられる)。高および低FARを発現させるKB細胞は、30nMのデンドリマーと37℃で1時間、インキュベートされ、リンスされ、細胞の蛍光は、フローサイトメトリー分析により測定された(例えば、図21、左パネル参照)。50μM遊離FAとの30分間のプレインキュベーションは、ポリマー結合体の細胞結合および取り込みを完全に阻止する(例えば、図21、左パネル参照)。
【０２４０】
結合体により引き起こされる細胞増殖の阻害はまた、生きている細胞の活性ミトコンドリアによりXTTのホルマザンへの変換に基づいているXTTアッセイにより試験された(例えば、Roehm et al., J Immunol Methods 142, 257 (1991)参照)。G5-FITCまたはG5-FITC-FAは、1日、2日または3日目において細胞に対して増殖阻害性ではなかったが、G5-FITC-FA-MTXおよび遊離MTXは、時間依存性細胞傷害性を示した(例えば、図22参照)。このゆえに、G5-FITC-FA-MTXおよび遊離MTXは、時間および用量依存性様式で細胞増殖を阻害したが、対照デンドリマーは、細胞増殖を阻害することができなかった(例えば、図21および22参照)。
【０２４１】
実施例11
葉酸は、細胞を、メトトレキセートが細胞傷害性を引き起こすことから救う
遊離MTXにより引き起こされた増殖阻害は、1μM未満のG5-FITC-FA-MTXにおけるMTXの等モル濃度でより高かったため(例えば、図21参照)、G5-FITC-FA-MTXにおけるFA部分が細胞をMTX誘導性細胞傷害性から救っているかどうかが試験された。G5-FITC-FA-MTX調製物はMTXおよびFAの等モル濃度を含むため、遊離MTXおよび遊離FAの類似した濃度の細胞増殖の阻害への効果が測定された。遊離FAおよびMTXの等モル濃度において、FAは、MTXにより引き起こされる細胞増殖の阻害を逆転した(例えば、図23参照)。KB細胞は、等モル濃度の遊離FAの存在または非存在下において、24時間、150nMまたは500nM MTXで処理された。細胞はまた、並行して、30nMおよび100nM G5-FI-FA-MTX(150nMおよび500nM MTXと等価)で処理された。細胞は、薬物を除去するためにリンスされ、新鮮な培地とさらに6日間、インキュベートされ、総細胞タンパク質が測定された。150nM FAの存在は、150nM MTXにより引き起こされる増殖停止をほとんど完全に逆転した。さらに、G5-FITC-FA-MTX(例えば、図23、黒塗りの四角の記号、参照)ならびにFAおよびMTXの等モル組み合わせ(例えば、図23、黒塗りの円の記号、参照)により引き起こされる細胞傷害性は、類似した。
【０２４２】
遊離FAは、デンドリマーの取り込みをブロックし、加えて細胞をMTX誘導性細胞傷害性から救うため、細胞の過剰FAとのプレインキュベーションの、G5-FITC-FA-MTXの抗増殖性効果への効果が試験された。KB細胞は、50μM FAの非存在または存在下で、24時間、結合体または遊離MTXの異なる濃度に曝された。インキュベーション培地は除去され、細胞はリンスされ、薬物の非存在下で、新鮮な培地とさらに5日間、インキュベートされ、XTTアッセイが行われた(例えば、図24参照、□、■はMTXで処理された細胞を表す；△、▲はG5-FITC-FA-MTXで処理された細胞を表す)。過剰遊離FAは、増殖阻害をブロックするだけでなく、細胞増殖を対照細胞のそれより20%高く増加させた(例えば、図24参照)。
【０２４３】
実施例12
デンドリマーの安定性
デンドリマーの安定性は、MTXが、細胞へのそれの侵入の前にデンドリマーから放出されるかどうかを調べるために、細胞培地において試験された。G5-FITC-FA-MTXは、細胞培地と1時間、2時間、4時間および24時間、インキュベートされ、インキュベーション培地は、10,000-MWカットオフ限外濾過装置を用いて濾過された。残留物および濾液のKB細胞の増殖への効果が試験された。G5-FITC-FA-MTXは、培地と2μM濃度で24時間、インキュベートされた。インキュベーション培地は、Centricon 10K-MWカットオフフィルターを通して濾過された。残留物(濾過前容量に調整された)および濾液は、KB細胞(濾過前試料の濃度から測定される場合、200nM結合体において)と2日間、インキュベートされ、XTTアッセイが行われた。同様の結果は、1時間、2時間および4時間、デンドリマーとプレインキュベートされた培地から得られた残留物および濾液について得られた。24時間のインキュベーション時間中、残留物は細胞傷害性であったが、濾液は少しの細胞傷害性も示すことができなかったが(例えば、図25参照)、結合体からの遊離MTXの放出の欠如を示している。24時間後、MTXの遅い放出があり、1週間で、最大40〜50%放出に達した。
【０２４４】
MTX-結合体の抗増殖性効果は、FA分子かまたはFITC分子のいずれかを欠損した結合体と比較された。KB細胞は、30nMの結合体(=150nM有効MTX濃度)と24時間、インキュベートされ、インキュベーション培地は除去された。細胞はリンスされ、薬物の非存在下で新鮮な培地中、さらに5日間、インキュベートされ、XTTアッセイが行われた。FAを欠損したMTX結合デンドリマーは、細胞傷害性を引き起こすことができなかったが、色素分子FITCの存在または非存在下におけるターゲティングされたデンドリマーは、細胞傷害性を引き起こした(例えば、図26参照)。
【０２４５】
実施例13
インビボで腫瘍をターゲティングするためのデンドリマーの使用
本発明の組成物(例えば、多官能性デンドリマー)および方法は、癌(例えば、ヒト上皮癌)の動物モデルにおいて治療応答を測定するために用いられた。
【０２４６】
材料および試薬：すべての試薬は、商業的供給元から入手された。葉酸、ペニシリン/ストレプトマイシン、ウシ胎児血清、コラゲナーゼIV型、TX100、ビス-ベンゾイミド、FITC、メトトレキセート、過酸化水素、無水酢酸、エチレンジアミン、メタノール、ジメチルホルムアミド、およびDMSOは、Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)から購入された。トリプシン-EDTA、DulbeccoのPBS、およびRPMI 1640(葉酸を含むまたは含まない)は、Invitrogen(Gaithersburg, MD)からであった。「可解(solvable)」溶液およびヒオニックフルオル(hionic fluor)はPackard Bioscience(Downers Grove, IL)からであった。OCT包埋剤は、Electron Microscopy Sciences(Fort Washington, PA)からであり、2-メチルブタンはFisher Scientific(Pittsburgh, PA)から、6-カルボキシテトラメチルローダミン(6-TAMRA)およびProlongはMolecular Probes, Inc.(Eugene, OR)からであった。トリチウム標識無水酢酸(CH3CO)2O[3H](100mCi, 3.7GBq)は、ICN Biomedicals(Irvine, CA)から購入された。注射用メトトレキセートは、Bedford Laboratories(Bedford, OH)からであった。葉酸は、生理食塩水に可溶化され、1N NaOHでpH7.0に調整され、注射用に濾過滅菌された。
【０２４７】
PAMAMデンドリマー結合体の合成および特徴づけ：G5 PAMAMデンドリマーは、合成され、低モル質量混入物およびより高いモル質量ダイマーまたはオリゴマーから精製された(例えば、Majoros et al., Macromolecules 36, 5529 (2003)参照)。デンドリマーの数平均モル質量は、多角レーザー光散乱、UVおよび屈折率検出器を用いるサイズ排除クロマトグラフィーにより26,530g/モルであると測定された。デンドリマーにおける表面第一級アミン基の平均数は、モル質量と共に電位差滴定を用いて110であると測定された。理想的な単分散試料についての重量平均モル質量と数平均モル質量の比として定義される、多分散性指数は1.0に等しい。G5デンドリマーの多分散性指数は、1.032であると計算され、平均値あたりの非常に狭い分布を示し、G5デンドリマーの高純度を確認した。G5 PAMAMデンドリマーの表面アミンは、デンドリマーの非特異的結合を低減するために、無水酢酸でアセチル化された。無水酢酸とデンドリマーの間の比率は、50から80までの異なるアセチル化レベルおよび100個の第一級アミンを達成するように選択された。精製後、アセチル化デンドリマーは、検出およびイメージングのためにイメージング剤(例えば、FITCまたは6-TAMRA)に結合させられた。イメージング-結合型(例えば、色素-結合型)デンドリマーを、その後、ターゲティング剤(例えば、葉酸)の活性化エステルと反応するようにさせておき、この反応の精製生成物は、結合したターゲティング剤(例えば、葉酸分子)の数を決定するために1H核磁気共鳴法(NMR)により分析された。その後、治療剤(例えば、メトトレキセート)は、エステル結合を介して結合させられた(例えば、Quintana et al., Pharm Res 19, 1310 (2002)参照)。
【０２４８】
放射能標識化合物は、トリチウム化無水酢酸(Ac-3H)を用いてG5-(Ac)50-(FA)6またはG5-(Ac)50から合成された(例えば、Malik et al., J Control Release 65, 133 (2000); Nigavekar et al., Pharm Res 21, 476 (2004); Wilbur et al., Bioconjug Chem 9, 813 (1998)参照)。トリチウム化結合体、G5-3H-FAおよびG5-3H、は完全にアセチル化された。G5-NHCOC-3HおよびG5-FA-NHCOC-3H結合体の比放射能は、それぞれ、10.27mCi/gおよび38.63mCi/gであった。残留遊離トリチウムは、総放射能量の<0.3%であった。
【０２４９】
PAMAMデンドリマー結合体の品質は、PAGE、1H NMR、13C NMRおよび質量分析法を用いて試験された。キャピラリー電気泳動法は、最終生成物の純度および均一性を確認するために用いられた。
【０２５０】
葉酸-ターゲット化結合体は、具体的には、以下の分子を含む：G5-(Ac)82-(FITC)5-(FA)5、G5-(Ac)82-(6-TAMRA)3-(FA)4、G5-(Ac)82-(FITC)5-(FA)5-MTX5、およびG5-(Ac)50-(Ac-3H)54-(FA)6、それぞれ、頭字語G5-FI-FA、G5-6T-FA、G5-FI-FA-MTX、およびG5-3H-FAと同一であるとした。非ターゲット化対照は以下の分子を含んだ：G5-(Ac)82-(FITC)5、G5-(Ac)82-(6-TAMRA)3、G5-(Ac)82-(FITC)5-MTX5、およびG5-(Ac)50-(Ac-3H)54、それぞれ、頭字語G5-FI、G5-6T、G5-FI-MTXおよびG5-3Hと同一であるとした。
【０２５１】
レシピエント動物および腫瘍モデル：免疫不全の、6〜8週齢の胸腺欠損ヌード雌マウス[Sim:(NCr)nu/nu fisol]は、Simonsen Laboratories, Inc.(Gilroy, CA)から購入された。5〜6週齢Fox Chase重症複合免疫不全(SCID；CB-17/lcrCrl-scidBR)雌マウスは、Charles River Laboratories(Wilmington, MA)から購入され、University's Committee on the Use and Care of Animalsの規制、およびPrinciples of Laboratory Animal Careを含む連邦ガイドラインに従って、University of Michigan Medical Centerにおける特定の無菌動物施設において飼育された。動物は、Laboratory Autoclavable Rodent Diet 5010(PMI Nutrition International, St. Louis, MO)を無制限に与えられた。腫瘍細胞注射の3週間前に、餌は、葉酸欠乏食餌(TestDiet, Richmond, IN)へ変えられた。尿および糞便収集のために、動物は、代謝齧歯類ケージ(Nalgene, Rochester, NY)において飼育された。
【０２５２】
腫瘍細胞系：葉酸受容体を過剰発現させるKBヒト細胞系(例えば、Turek et al, J Cell Sci 106, 423 (1993)参照)は、American Type Tissue Collection(Manassas, VA)から購入され、ペニシリン(100ユニット/mL)、ストレプトマイシン(100μg/mL)および10%加熱不活性化ウシ胎児血清を追加した葉酸欠乏RPMI 1640において、37℃、5%CO2、インビトロで維持された。マウスにおける注射の前に、細胞は、トリプシン-EDTA溶液で収集され、洗浄され、PBSに再懸濁された。細胞懸濁液(0.2mL中に5x106細胞)が、30-ゲージ針を用いて各マウスの一方の脇腹へ皮下注射された。体内分布研究において、腫瘍を、容積が〜0.9cm3に達するまで2週間、増殖するようにさせておいた。腫瘍容積を計算するために選ばれた式は、楕円の標準容積についてであり、V＝4/3π(1/2長さ×1/2幅×1/2深さ)であった。幅は深さに等しく、kは3に等しいという仮定で、用いられる式は、V＝1/2×長さ×幅2であった。結合体注射を用いるターゲット化薬物送達は、KB細胞の移植後第4日目に開始された。
【０２５３】
トリチウム化デンドリマーの体内分布および排泄：動物は、174μg G5-NHCOC-3H(1.8ACi)または200μg G5-FA-NHCOC-3H(7.7μCi)を含む0.5mL PBSを側面尾静脈を経由して注射された。両方のトリチウム標識結合体は、修飾されたデンドリマーの等モル濃度で送達された。注射後5分、2時間目、1日目、4日目、および7日目において、動物は安楽死させられ、腫瘍、心臓、肺、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、および脳の試料が採取された。マウスの第三群は、200μg G5-3H-FAの注射の5分前に、80μg遊離葉酸のボーラスを受けた。この181nmol濃度の遊離葉酸は、血液中〜5μmol/L濃度を生じる放射能標識されたターゲット化デンドリマー(G5-3H-FA)と比較して、血液中〜150μmol/L濃度を生じ、20gマウスの1.2mL血液容量に基づいている。マウスは、注射後5分、1日目、および4日目において、安楽死させられ、組織が、上記のように採取された。血液は、心臓穿刺により各時点において収集された。各群は3〜5匹のマウスを含んだ。尿および糞便は、2時間目、4時間目、8時間目および12時間目、ならびに1日目、2日目、3日目および4日目において収集された。
【０２５４】
放射性組織試料は、Nigavekar et al, Pharm Res 21, 476 (2004)に記載されているように調製された。トリチウム含有量は、液体シンチレーションカウンター(LS 6500, Beckman Coulter, Fullerton, CA)において測定された。測定された放射能の値は、装置の計数効率について調整され、試料あたりの放射能(1μCi＝2.22×106dpm)を導くために用いられた。これらの値は、その後、組織重量により標準化され、結合体の比放射能は、注射された用量のパーセンテージ(%ID/g)として報告された。尿および糞便により排泄された放射能(デンドリマー)は、注射された用量のパーセンテージ(%ID)として報告された。
【０２５５】
蛍光デンドリマー結合体の体内分布：マウスは、0.2mg G5-6TまたはG5-6T-FA結合体を含む0.5ml生理食塩水を側面尾静脈を経由して注射された。注射後15時間目および4日目までにおいて、動物は、安楽死させられ、腫瘍の試料が採取され、すぐに、切片形成およびイメージングのために凍結された。フローサイトメトリー分析が、腫瘍から単離された単個細胞浮遊液で行われた。腫瘍は破砕され、細胞浮遊液は、70μmナイロンメッシュ(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)を通して濾過され、PBS中で洗浄された。試料は、EPICS XLフローサイトメーター(Coulter, Miami, FL)を用いて分析された。事前ヨー化プロピジウム染色により測定される場合、生きている細胞のみが分析のためにゲートされる。データは、細胞集団の平均チャネル蛍光として報告された。
【０２５６】
共焦点顕微鏡イメージングについて、組織は切開され、OCTに包埋され、ドライアイス浴において2-メチル-ブタンに凍結された。切片(15μm)は、クリオスタット上で切断され、スライド上へ載せられ、染色されるまで-80℃で保存された。染色後、スライドは、4%パラホルムアルデヒドに固定され、リン酸緩衝液(0.1モル/L；pH7.2)中でリンスされ、Prolongに載せられた。画像は、補正カラーをもつx40 Plan-Apo 1.2開口数(浸水)対物レンズを備えたZeiss 510メタレーザースキャニング共焦点顕微鏡を用いて得られた。共焦点画像は、ピクセルあたり0.45x0.45x0.37μmのスケールで512x512x48ピクセルとして記録された。各画像立方体は、光学的に48断面へ切断され、核および細胞質を横断する断面が提示された。
【０２５７】
ターゲット化ナノ粒子治療用物質の送達：週に2回、皮下にKB異種移植片をもつSCIDは、腫瘍移植後4日目に開始して、メトトレキセートを含むターゲット化または非ターゲット化結合体、メトトレキセートを含まない結合体、遊離メトトレキセート、または対照として生理食塩水のいずれかの注射を尾静脈を経由して受けた。化合物は、20gのマウスあたり0.2mL容量の生理食塩水において送達された。各時点に送達されるメトトレキセートの単一用量は、0.33mg/kgに等しかった。1.67mg/kgおよび3.33mg/kg遊離メトトレキセートのより高い用量もまた、試験された。結合体は、ナノ粒子に存在するメトトレキセート分子の数に基づいて計算されたメトトレキセートの等モル濃度で送達された。メトトレキセートを含まない結合体は、デンドリマーの等モル濃度で送達された。初期試験において、各群に5匹のマウスをもつマウスの6つの群が、最高15回までの注射を受けた。追跡試験において、マウスは、生存率に依存して最高28回までの注射を受けた。マウスの体重は、薬物の副作用の指標として、実験を通じてモニターされた。複数の器官の組織病理学が、各試験の終了時に、およびマウスが毒素効果または腫瘍負荷のせいで安楽死させられなければならないごとに、行われた。肺、心臓、肝臓、膵臓、脾臓、腎臓および腫瘍由来の組織が分析された。さらに、細胞は、腫瘍から単離され、ターゲット化フルオレセイン標識結合体で染色され、フローサイトメトリーを用いて葉酸受容体の存在について試験された。
【０２５８】
統計学的方法：データの平均、SDおよびSEが計算された。実験群と対照群の間の差は、スチューデントの検定、ニューマン-クールズの検定を用いて検定され、P<0.05は有意とみなされた。
【０２５９】
トリチウム化デンドリマーの体内分布：トリチウム化G5-3H-FAの体内分布および排出は、まず、免疫不全ヌードマウスにおいて確立された葉酸受容体陽性ヒトKB腫瘍異種移植片をターゲティングするそれの能力を試験するために調べられた。マウスは、葉酸の循環レベルを最小にするために実験の期間中、葉酸欠乏食餌で維持された(例えば、Mathias et al., J Nucl Med 29, 1579 (1998)参照)。実験前のマウスの血清において達成される遊離葉酸レベルは、ヒト血清レベルに近づいた(Belz et al., Anal Biochem 265, 157 (1998); Nelson et al., Anal Biochem 325, 41 (2004)参照)。マウスは、結合体の静脈内投与後、様々な時点(5分〜7日目)において評価された。マウスの2つの群は、対照の非ターゲット化トリチウム化G5-3Hデンドリマーかまたはターゲット化トリチウム化G5-3H-FA結合体のいずれかを受けた(図27AおよびB)。結合体は、注射後第1日目中に腎臓を経由して血液から迅速に除去され、G5-3Hは、5分における23.4%ID/gから24時間目における1.8%ID/gへ減少した(図27A)。G5-3H-FAの血中濃度は、5分における29.1%ID/gから24時間目における0.2%ID/gへ減少した(図27B)。肺のようないくつかの器官において、組織分布は、血中濃度と類似した傾向を示し、G5-3Hは5分における9.7%ID/gから24時間目における1.6%ID/gへ減少し、G5-3H-FAは5分における9.6%ID/gから24時間目における1.7%ID/gへ減少した。肺の高い血管分布のために、初期時点で測定された結合体レベルは、血中濃度を反映している可能性が高い。除去の同様のパターンは、心臓、膵臓および脾臓について観察された。これらの器官は、葉酸受容体を発現させないことが知られており、非ターゲット化およびターゲット化デンドリマーの間で有意差を示さない。脳におけるG5-3HおよびG5-3H-FAの両方の濃度は、すべての時点において低く、ポリマー結合体が血液脳関門を横断しないことを示唆した(図27AおよびB)。腎臓は、これらのデンドリマーについての主要な除去器官であるが、それはまた、それの細管上に高レベルの葉酸受容体を発現させることが知られている。腎臓における非ターゲット化G5-3Hのレベルは、急速に減少し、次の数日間に渡って中位のレベルで維持された(図27A)。対照的に、G5-3H-FAのレベルは、おそらく、腎臓細管上に存在する葉酸受容体のために、最初の24時間に渡ってわずかに増加した。これは、化合物が腎臓を通して除去されるため、続いて、次の数日間に渡って減少があった(図27B)。
【０２６０】
G5-3HおよびG5-3H-FAの両方は、注射後24時間以内に、主に腎臓を通して、迅速に排泄された。両方の化合物の漸増性排泄は、結合体の腎臓保持と完全に一致しているように思われた(図27AおよびB)。両方のターゲット化および非ターゲット化結合体はまた、糞便に現れたが、それは、非常に低量であった。任意の物質が実際に糞便に排斥されたかどうかは、糞便の少量の尿混入のせいで決定するのが困難であった。最初の4日間に渡るターゲット化G5-3H-FAの累積的除去は、G5-3Hのそれより低く、葉酸受容体を発現させている組織内でのG5-3H-FAの保持を反映している可能性がある。肝臓およびKB腫瘍は、高レベルの葉酸受容体を発現させることが知られている。これらの組織において、非ターゲット化G5-3Hの濃度は、血液からのデンドリマーの除去で急速に減少した；濃度は、組織が研究される残りの日に渡って、低レベルで維持された(図27A)。対照的に、肝臓および腫瘍の両方において、ターゲット化G5-3H-FA含有量は、最初の4日間に渡って増加する(図27B)。これは、放射性結合体の血中レベルが低い時間中に生じ、脈管構造を通してのデンドリマーの単純な捕捉とは対照的に、これらの組織におけるデンドリマーの濃度勾配に対する特異的な取り込みを示唆した。
【０２６１】
ターゲット化薬物送達の特異性は、G5-3H-FAの注射の前に181nmol遊離葉酸を受けたマウスの群においてさらに取り組まれた(図27C)。注射後4日目において、遊離葉酸での葉酸受容体のブロッキングに関連した放射能における有意な減弱が、デンドリマーを排泄する能力をもたない腫瘍組織において観察された(図27C)。これは、ターゲット化と非ターゲット化ポリマー結合体の間での腫瘍濃度における差が、腫瘍に過剰発現された葉酸受容体を通してのこれらの分子の特異的取り込みのためであることを示唆する。すべての他の組織における分布は、ターゲット化結合体の注射前の遊離葉酸の送達によって有意には変化しなかった。
【０２６２】
蛍光デンドリマー結合体のターゲティングおよび内部移行：腫瘍組織内のデンドリマーナノ粒子をさらに確認し、位置を特定するために、6-TAMRAを結合したデンドリマーが用いられた。共焦点顕微鏡画像は、ターゲット化G5-6T-FAおよび非ターゲット化G5-6T結合体の静脈注射後15時間目における腫瘍試料から得られた(図28)。腫瘍組織は、非ターゲット化デンドリマーをもつの(図28A)と比較して、ターゲット化色素結合デンドリマーG5-6T-FAをもつ蛍光細胞(図28B)の有意な数を示した。同じ腫瘍から単離された単個細胞浮遊液のフローサイトメトリー分析は、G5-6T-FAを受けたマウス由来の腫瘍細胞についてより高い平均チャネル蛍光を示した(図28C)。
【０２６３】
共焦点顕微鏡法はまた、結合体が腫瘍に存在し、腫瘍細胞の多くに付着して、内部に取り入れられていることを示した(図28D)。光学的重複断面が、先端から中央を通って基底断面まで組織スライドから取られた。本明細書に提示された腫瘍細胞の中央断面は、結合体の6Tからのサイトゾル中の蛍光を示し、細胞および核境界がはっきりと目に見える(図28D)。
【０２６４】
デンドリマー結合体の毒性：すべてのマウスは、脱水症、飲食不能、衰弱の徴候、または活性レベルにおける変化について、研究の期間中、観察された。デンドリマー結合体がメトトレキセートを含むかどうかに関わらず、99日間目まで、急性的または慢性的のいずれでも全体的な毒性は観察されなかった。体重は実験を通じてモニターされ、体重減少は観察されなかった；実際、動物は、体重が増えた。各時点において、肝臓、脾臓、腎臓、肺、および心臓の肉眼的検査および組織病理学が行われた。組織病理学的検査において形態学的異常は観察されなかった。デンドリマー注射後のいずれの動物群においてもインビボ毒性は観察されなかった。
【０２６５】
葉酸受容体を通しての腫瘍細胞へのターゲット化薬物送達：結合体の異なる用量の効力が、皮下にヒトKB異種移植片を有するSCID CB-17マウスにおいて試験され、遊離メトトレキセートの等価用量およびより高い用量と比較された。マウスは、ヒト血清におけるのとほぼ等しい葉酸の循環レベルに達するために、および腫瘍異種移植片上の葉酸受容体の下方制御を防ぐために、KB腫瘍細胞の注射前の3週間、葉酸欠乏食餌で維持された(Mathias et al., J Nucl Med 29, 1579 (1998)参照)。各群に5匹のマウスをもつSCIDマウスの6つの群が、0.2mL PBS懸濁液における5x106個のKB細胞を一方の脇腹に皮下注射された。用いられたG5-FI-FA-MTX治療用物質の最高総用量は、55.0mg/kgに等しく、遊離メトトレキセートの5.0mg/kg総蓄積用量と等価である(図29)。結合体の治療的用量は、マウス生存率に基づいて、10〜15回の注射において蓄積された33.3mg/kg、21.7mg/kg、および5.0mg/kgと等価の遊離メトトレキセートの3つの蓄積用量と比較された。生理食塩水およびメトトレキセートを含まない結合体(G5-FI-FA)が、対照として用いられた。
【０２６６】
マウスの体重は、薬物の副作用の指標として、実験を通じてモニターされ、体重の変化は、33.3mg/kgおよび21.7mg/kgとそれぞれに等しい遊離メトトレキセートの最も高い、ならびに二番目に高い蓄積用量において、急性および慢性毒性を示した。遊離薬物の2つの用量は、腫瘍増殖に影響を及ぼしつつあったが、両方とも、試験の32日目〜36日目までに致死になった(図29)。残りの実験群は、生理食塩水またはメトトレキセートを含まない結合体での対照群と比較した場合、毒性を示さない、非常に一定した体重周期的変動があった。用いられた遊離メトトレキセートの最高蓄積用量について、肝臓の組織病理学的分析より、進行した肝臓病変、炎症性細胞の集合体、および門脈周囲性炎症が明らかにされた。対照的に、5.0mg/kg遊離メトトレキセートと等価の治療用結合体の総蓄積用量も同じ用量における遊離メトトレキセートも毒性ではなかった(図29)。重要なことには、用いられた遊離メトトレキセートの最低用量と等しい結合体の治療的用量は、遊離メトトレキセートの二番目に高い用量(13回の注射における21.7mg/kg)と同等の効果があったが、この濃度における遊離薬物は、腫瘍増殖へ効果を生じなかった(図29)。メトトレキセートを含まない結合体(G5-FI-FA)もまた、対照の生理食塩水の注射と比較した場合、治療効果を生じなかった(図29)。結合体(G5-FI-FA-MTX)を受けたマウスからの肝臓スライドは、まばらに存在する門脈周囲のリンパ球を示し、生理食塩水を注射された対照動物のそれとは異ならない炎症および単細胞壊死を示した。
【０２６７】
第二の99日間の試験中、非ターゲット化G5-FI-MTX結合体、遊離メトトレキセート、または生理食塩水で処置されたものと比較して、G5-FI-FA-MTX結合体、またはFITCを含まないG5-FA-MTX結合体で処置された腫瘍の増殖の統計学的に有意な(P<0.05)遅延があった。生存しているマウスへ両方のターゲット化結合体で送達されたメトトレキセートの等価用量は、遊離メトトレキセートを受けたマウスのすべてが試験の66日目までに死んだため、遊離メトトレキセートの用量より高かった(図30)。G5-FI-FA-MTXまたはG5-FA-MTX結合体を受けた群からのマウスの生存率は、4cm3の終点容積に基づいた腫瘍増殖が少なくとも30日目まで遅延されうることを示している(図30)。この値は、それが臨床的終点を模倣し、疾患の進行を通じてマウスの観察を必要とするため、結合体の抗腫瘍効果を示している。さらに、G5-FA-MTX結合体で処置された1匹のマウスにおいて、試験の39日目に全快が得られた。このマウスにおける腫瘍は、試験の60日目までの次の20日間、触知できなかった。試験の終了時において、G5-FA-MTXを受けた3匹(8匹のうちの)の生存者およびG5-FI-FA-MTXを受けた2匹(8匹のうちの)の生存者があった。遊離メトトレキセートを受けた群において、またはいずれの他の対照群においても、生存しているマウスはなかった。従って、いくつかの態様において、本発明は、ターゲティング剤、治療剤およびイメージング剤を含むデンドリマーを含む組成物を提供する。好ましい態様において、デンドリマーは、インビボで腫瘍細胞への、治療剤(例えば、メトトレキセート)の、標的特異的様式での、送達に用いられる。
【０２６８】
結合体の有効量は、体重変化および行われた組織病理学的検査に基づいて、毒性ではなかった。両方の試験の終了時において、組織病理学的検査により、心臓における毒性の徴候は示されず、筋障害は発症しなかった。腎臓における急性腎尿細管壊死は、これらの動物において観察されなかった。腫瘍スライドの分析により、対照および生理食塩水注射された動物において軽度の壊死をもつ生存可能な腫瘍が示されたが、治療用結合体は、遊離メトトレキセートの等価用量と比較して腫瘍において有意なまで重度の壊死を引き起こした。試験の終了時において、腫瘍細胞は、マウスの長期間の葉酸欠乏食餌による、KB細胞と比較した腫瘍における葉酸受容体の可能な上方制御について評価された。ターゲット化フルオレセイン標識結合体での染色後の腫瘍細胞のフローサイトメトリー分析により、細胞は葉酸受容体陽性のままであったが、最初のKB細胞系と比較して1/2〜1/5のレベルであったことが明らかにされた。
【０２６９】
実施例14
PAMAMデンドリマー-RGD4Cペプチド結合体合成
薬物ターゲティングは、効果的な癌化学療法にとって重大な意味をもつ。ターゲット化送達は、化学療法効果を増強し、これらの強力な薬物の毒性副作用から正常組織を救う。抗血管形成性治療は、内皮細胞の増殖、遊走および分化を阻害することにより血管新生を防ぐ(例えば、Los and Voest, Semin. Oncol., 2001, 28,93参照)。新しく形成された毛細血管をそれらの成熟した対応物から区別することができる分子マーカーの同定は、細胞傷害性剤の腫瘍脈管構造へのターゲット化送達を可能にする(例えば、Baillie et al., Br. J. Cancer, 1995, 72, 257; Ruoslahti, Nat. Rev. Cancer, 2002, 2,83; Arap et al., Science, 1998, 279, 377参照)。αvβ3インテグリンは、これらの固有のマーカーの最も特異的なものの一つである。
【０２７０】
αvβ3インテグリンは、血管形成中のみ内皮細胞の表層上に見出される。このマーカーは、血管形成中、脈管性間隙に限定される作用物質をターゲティングすることにより認識されうる(例えば、Brooks et al., Science, 1994, 264,569; Cleaver and Melton, Nat. Med., 2003, 9, 661参照)。高親和性αvβ3選択的リガンド、Arg-Gly-Asp(RGD)は、ファージディスプレイ研究により同定されている(Pasqualinie et al., Nat. Biotech., 1997, 15, 542)。二重環化ペプチド(4つのシステイン残基を介して2つのジスルフィド結合を含むRGD4C)および高次構造的に制限されたRGDは、単一ジスルフィド架橋をもつペプチドまたは線状ペプチドより強くαvβ3に結合する。遺伝子送達(例えば、Kunath et al., J. Gene. Med., 2003, 5, 588-599参照)、腫瘍ターゲティング(例えば、Mitra et al., J. Controlled Release, 2005, 102, 191参照)、およびイメージング適用(例えば、Chen et al., J. Nucl. Med., 2004, 45, 1776)のためのポリマー-RGD結合体の合成への関心が高まっている。
【０２７１】
いくつかの態様において、本発明は、蛍光標識された第5世代デンドリマーに結合したRGD4Cの合成を提供する。さらに、本発明は、これらの結合体の結合性質および細胞取り込みを提供する。
【０２７２】
アミン末端化デンドリマーは、表面上の正電荷のために非特異的様式で細胞に結合することが報告されている。ターゲティング効力を向上させ、非特異的相互作用を低減するために、アミン末端化G5デンドリマーは、塩基としてトリエチルアミンの存在下において、無水酢酸(75%xモル過剰量)で部分的に表面修飾された(例えば、Majoros et al., Macromolecules, 2003, 36, 5526. 4参照)。結合体は、最初に、PBS緩衝液に対して、およびその後、水に対しての透析により精製された。無水酢酸の75モル過剰量の使用は、さらなる修飾のためのいくつかのアミン基を残し、凝集、分子間相互作用および溶解性の減少から生じる問題を防ぐ。
【０２７３】
アセチル化G5デンドリマー(G5-Ac)のアセチル化および純度の程度は、1H NMR分光法を用いてモニターされうる。フローサイトメトリーまたは共焦点顕微鏡法による結合体の検出について、検出可能なプローブ(例えば、蛍光プローブ)が用いられうる。例えば、Alexa Fluor 488(AF)は、蛍光標識として用いられうる。部分的アセチル化デンドリマーを、蛍光標識された結合体(G5-Ac-AF)を与えるために、製造会社のプロトコールに記載されているように、5モル過剰量のAlexafluor-NHSエステルと反応させた。この結合体は、ゲル濾過およびその後の透析により精製された。色素分子の数は、製造会社(Molecular Probes)のプロトコールに記載されているように、1H NMRおよびUV-vis分光法によりデンドリマーあたり〜3個であると推定された。
【０２７４】
本発明のいくつかの態様において用いられるRGDペプチド(RGD4C)は、αvβ3へ高親和性で特異的に結合する高次構造的に制限されたRGD配列を有する。ヘテロダイマーのαvβ3インテグリンにおけるRGD結合部位は、2つのサブユニット間の間隙に位置している。ペプチドの結合部分を標的部位に曝されるように保つために、ε-Aca(アシルヘキサン酸)スペーサーが、ペプチドをデンドリマーに結合するために用いられた。RGD-4Cペプチドのプロトン化NH2末端は、それゆえに、生物活性に必須ではない。従って、いくつかの態様において、NH2末端は、アセチル基でキャップされる(例えば、de Groot et al., Mol. Cancer Therap., 2002, 1, 901参照)。
【０２７５】
ペプチドの活性エステルは、HOBtの存在下でDMF/DMSO溶媒混合物におけるEDCを用いることにより調製され、その後、これは、G5-Ac-AFの水溶液へ滴下式で添加された。反応時間は、それぞれ、2時間、および3日間である。アミド化は、主に、アシルヘキサン酸リンカーカルボキシレート基上で起こる(例えば、DMSO中の1.1当量アリルアミンとのモデル反応は、67%純度(HPLC)でモノアミド化生成物を与える。ESI-MS m/z 1282 [M+H]+)。AlexaFluorおよびRGDペプチドと結合した部分的アセチル化PAMAMデンドリマー、G5-Ac-AF-RGD、は膜濾過および透析により精製された。結合体の1H NMRは、デンドリマーについての予想された脂肪族シグナルと離れて、AlexaFluorおよびペプチドのフェニル環の両方について芳香族領域における重なっているシグナルを示す。ペプチドの数は、MALDI-TOF質量分析法に基づいてデンドリマーあたり2〜3個のペプチドであると計算された。
【０２７６】
MALDI-TOF MSは、不均一に官能性をもたせたデンドリマーの表面官能付与の特徴づけのために広く用いられる技術である(例えば、Woller et al., J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 8820-8826参照)。
【０２７７】
質量スペクトルは、高質量PAD検出器を用いて、Waters TOfspec-2Eに記録され、ディレイド・エクストラクション(delayed extraction)様式で実行され、シナピン酸におけるBSAで較正された。ペプチドでのデンドリマーの官能付与を測定するために、出発物質の(m/z 29650 [M+H]+)は、生成物の(m/z 32770 [M+H]+)から引かれた。
【０２７８】
G5-Ac-AF-RGDの上記の合成を描く概略図は、図31に示されている。
【０２７９】
実施例15
PAMAMデンドリマー-RGD4Cペプチド結合体のインビトロのターゲティング抗力
デンドリマー-RGD4C結合体の細胞取り込みは、細胞表面αvβ3受容体を高発現させるヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)において測定された。簡単には、HUVEC細胞は、内皮細胞成長因子を追加したRPMI培地において培養された。細胞は、異なる濃度のG5-Ac-AF-RGD結合体で処理され、取り込みが、フローサイトメトリーによりモニターされた。図32に示されているように、フローサイトメトリー分析は、HUVEC細胞への用量依存性かつ飽和性結合を示した。
【０２８０】
様々なレベルのインテグリン受容体発現をもついくつかの異なる細胞系へのこの結合体の結合もまた、フローサイトメトリーを用いて試験された(図33参照)。結合体は、様々な細胞系に対して異なる結合親和性を示し、HUVEC細胞が最も効果的に結合体に結合し、次いでジャーカット(Jurkat)細胞が続いた。ヒトリンパ球細胞系ジャーカットは、多数のインテグリン受容体を有すると以前に報告されており、RGD 4Cペプチドに結合することができた(例えば、Assa-Munt et al., Biochemistry, 2001, 40, 2373参照)。L1210マウスリンパ球系は、結合体を結合することができなかったが、KB細胞は中位の結合だけ示した。
【０２８１】
本発明の結合体が、細胞表面インテグリン受容体発現の異なるレベルをもつ細胞系に対して可変性の特異性を示すことは、明らかである。フローサイトメトリーにより見られる結合は、共焦点顕微鏡分析により確認された。G5-AF-RGD4C(0nm、30nm、60nm、100nm)濃度で処理されたHUVEC細胞は、洗浄され、p-ホルムアルデヒドで固定され、核は、DAPIで対比染色された。取り込みが、結合体の増加する濃度と共に増加することは、図34における共焦点顕微鏡画像における蛍光の出現から明らかである。遊離ペプチドの添加は、HUVEC細胞による結合体の取り込みを有意なレベルまで阻害したが、受容体が、結合体の取り込みを仲介したことを示している(図35参照)。
【０２８２】
多価性相互作用が、一価性相互作用と比較した場合、より強い結合を示すかどうかを確かめるために、G5-Ac-AF-RGD4C結合体およびRGD4Cペプチドの結合親和性が、BIAcore装置(BIAcore AB, Uppsala, Sweden)を用いて、ヒトインテグリンαvβ3精製タンパク質(Chemicon International, Inc. Temecula, CA)においてモニターされた。両方の分析物についての得られたデータは、BIAevaluation 3.2ソフトウェア(BIAcore AB)を用いて二価結合モデルへの全体的フィッティングにより解析された。平衡解離定数(KD)は、解離および結合速度定数(koff/kon)の比から計算された。遊離RGD4Cペプチドのヒトインテグリンαvβ3への結合は、10 RUの最大結合に達するにおいて非常に速かった。これに反して、G5-Ac-AF-RGD4C結合体の結合は、約1500 RUの最大結合に達するのに、それほど速くなかった。両方の分析物は、異なるオフ速度を示した。遊離RGD4Cペプチドは、ランニング緩衝液での洗浄時間中、リガンドから急速に解離した。ナノデバイス解離は、遊離ペプチドと比較して、約522倍遅かった。従って、本発明は、単一デンドリマー上での複数ペプチド結合事象が、結合効力へ相乗効果を発揮する、多官能性デンドリマーを提供する。
【０２８３】
このように、本発明は、PAMAMデンドリマーRGD4Cペプチド結合体を提供する。いくつかの態様において、デンドリマーは、αvβ3受容体を発現させる細胞により取り込まれる。従って、いくつかの好ましい態様において、デンドリマー結合体は、イメージング剤および/または化学療法薬を血管形成性腫瘍脈管構造へ向けるために用いられる。
【０２８４】
上記明細書に挙げられたすべての刊行物および特許は、参照により本明細書に組み入れられている。本発明の記載された方法および系の様々な改変および変化は、本発明の範囲および真意から逸脱することなく、当業者に明らかであると思われる。本発明は、特定の好ましい態様に関して記載されているが、主張されているような本発明が、そのような特定の態様に不当に限定されるべきではないことは理解されるべきである。実際、当業者に明らかである、本発明を実行するための記載された様式の様々な改変は、本発明の範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２８５】
【図１】PAPAMデンドリマーを合成するために用いられる、(A)古典的過程、対(B)本発明のいくつかの態様における過程を描く。
【図２】保護コアドメインの好ましい保護基(PG)を描く。
【図３】コアのジアミンがフェニレンジアミン、N-((CH2)n-NH2)3 (n=1〜10)である場合のコアのジアミンを描く。
【図４】図3のフェニレンジアミンを描くが、置換基を有しており、ここでRおよびR1は独立して水素、C1〜C6直鎖もしくは分枝アルキル、C3〜C6シクロアルキル、置換されていないC5〜C10アリル、またはC1〜C6アルキル、C1〜C6アルコキシル、1,3-ジオキソラニル、トリハロアルキル、カルボキシル、C1〜C6ジアルキルアミノ、C1〜C6スルファナトアルキル、C1〜C6スルファミルアルキル、もしくはC1〜C6ホスファナトアルキルで置換された、C5〜C10アリルであるように選択される。
【図５】市販されているフェニレンビスアセトニトリルの接触還元によるフェニレンジアミンの合成を描く。
【図６】多官能性G5 PAMAMデンドリマーを作製するための合成スキームを描く。
【図７】G5 PAMAMデンドリマーの電位差滴定曲線を描く。
【図８】部分的アセチル化担体および最終生成物のゲル浸透クロマトグラフィー溶出曲線を描き、RIシグナルおよび90°でのレーザー光散乱シグナルが重なっている。
【図９】G5 PAMAMデンドリマーの理論上の、および欠陥のある化学的構造を描く。
【図１０】G5-Ac2デンドリマーの(A)H1-NMRスペクトルおよび(B)HPLC溶出曲線を描く。
【図１１】フルオレセインイソチオシアネート、葉酸、およびメトトレキセートの化学的構造を描き、結合に用いられる基がアスタリスクでマークされている。
【図１２】フルオレセインイソチオシアネート、葉酸およびメトトレキセートのプロトンNMRイメージングを描く。
【図１３】305nmにおける(A)G5-Ac2-FITC-OH-MTXeおよび(B)G5-Ac3-FITC-OH-MTXeのHPLC溶出曲線を描く。
【図１４】G5-Ac2-FITC-FA-OH-MTXeのH1-NMRスペクトルを描く。
【図１５】305nmにおけるG5-Ac-FITC-FA-OH-MTXeのHPLC溶出曲線を描く。
【図１６】遊離フルオレセインイソチオシアネート、葉酸およびメトトレキセートのUVスペクトルを描く。
【図１７】G5-Ac、G5-Ac3-FITC、G5-Ac3-FITC-FA、およびG5-Ac3-FITC-FA-MTXeのUVスペクトルを描く。
【図１８】KB細胞におけるG5-FITC-FA-MTXの用量依存性結合の(A)生のおよび(B)標準化された蛍光を描く。
【図１９】FA受容体を高発現および低発現させるKB細胞におけるG5-FITC-FAおよびG5-FITC-FA-MTXの取り込みへの遊離FAの効果を描く。
【図２０】デンドリマーで処理されたKB細胞の共焦点顕微鏡法を描く。
【図２１】デンドリマーを用いる細胞増殖の(A)経時変化および(B)用量依存性阻害を描く。
【図２２】XTTアッセイにより測定される、デンドリマーによるKB細胞の増殖阻害を描く。
【図２３】G5-FITC-FA-MTX、ならびにMTXおよび遊離FAの混合物の等モル濃度を用いる細胞増殖阻害の比較を描く。
【図２４】遊離FAによる細胞増殖のG5-FA-MTX誘導性阻害の逆転を描く。
【図２５】細胞培地におけるデンドリマー安定性を描く。
【図２６】デンドリマーの細胞傷害性を描く。
【図２７】器官の1グラムあたり回収されるデンドリマーの注射用量のパーセンテージとして描かれる、KB異種移植片腫瘍を有するnu/nuマウスにおける放射能標識された(A)非ターゲット化および(B)ターゲット化結合体の体内分布を示す。
【図２８】(A)非ターゲット化G5-6-TAMRAまたは(B)ターゲット化G5-FA-6-TAMRA結合体のいずれかの10nmolを、腫瘍単離の(B)15時間前にまたは(D)4日前に注射されたSCIDマウス由来の凍結切片化腫瘍試料の共焦点顕微鏡分析を示す。G5-FA-6-TAMRA対G5-6-TAMRAの腫瘍細胞による特異的取り込みは(C)に示されている。
【図２９】G5-FI-FA-MTX結合体および遊離メトトレキセート(MTX)での処理中のKB異種移植片を有するSCIDマウスにおける腫瘍増殖を描く。
【図３０】KB腫瘍を有するSCIDマウスの生存率を描く。
【図３１】G5-Ac-AF-RGDについての合成スキームを描く。
【図３２】G5-Ac-AF-RGDのHUVEC細胞への結合を示す。
【図３３】G5-Ac-AF-RGDの様々な細胞系への結合を示す。
【図３４】共焦点顕微鏡法により測定される、G5-Ac-AF-RGDのHUVEC細胞への用量依存性結合を示す。
【図３５】遊離ペプチドの添加での、G5-Ac-AF-RGDのHUVEC細胞による取り込みの阻害を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【国際調査報告】
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