(57)【要約】  本発明は、医学、免疫学、ウイルス学及び分子生物学の分野に関連する。本発明は、ＲＮＡバクテリオファージＡＰ２０５由来の修飾されたウイルス様粒子(ＶＬＰ)を含有してなる組成物を提供する。また、本発明は、前述のＶＬＰの産生方法を提供する。本発明において開示した修飾されたウイルス様粒子は、感染性疾患、アレルギー、癌及び薬物中毒を含む疾患、障害の予防又は治療のために免疫応答を誘発するための組成物の産生に有用である。さらに、本発明の修飾されたウイルス様粒子は、特に、自己特異的免疫応答、特に抗体応答を効果的に誘発するために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一の融合タンパク質を含有してなる修飾されたウイルス様粒子(ＶＬＰ)であって、当該少なくとも一の融合タンパク質が：
(a) 第一ポリペプチド；と
(b) 第二ポリペプチド
とを含有してなり、該第一ポリペプチドがＡＰ２０５バクテリオファージのコートタンパク質又はそのムテインであり、該第二ポリペプチドが該第一ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端の何れか、又は該第一ポリペプチドに融合している、修飾されたウイルス様粒子。
【請求項２】
前記第二ポリペプチドが少なくとも一の抗原を含有してなる、請求項１に記載の修飾されたウイルス様粒子。
【請求項３】
前記第一ポリペプチドが１２４−１３８アミノ酸からなる、請求項１又は２に記載の修飾されたウイルス様粒子。
【請求項４】
ＡＰ２０５バクテリオファージの前記コートタンパク質又はそのムテインが、
(a) 配列番号１；
(b) 配列番号２；
(c) 配列番号４２；
(d) 配列番号６７；
(e) 配列番号６８；
(f) 配列番号６９；及び
(g) 配列番号１又は６７のムテイン；
からなる群から選択される、請求項１ないし３の何れか一に記載の修飾されたウイルス様粒子。
【請求項５】
前記ムテインが配列番号１又は６７に記載のアミノ酸配列を有し、配列番号１又は６７の最大３アミノ酸残基が欠失、内部に付加又は置換されている、請求項４に記載の修飾されたウイルス様粒子。
【請求項６】
前記融合タンパク質がさらにスペーサーを含有し、該スペーサーが前記の第一ポリペプチドと前記の第二ポリペプチドの間に位置する、請求項１ないし５の何れか一に記載の修飾されたウイルス様粒子。
【請求項７】
前記スペーサーが最大１５アミノ酸を有する、請求項６に記載の修飾されたウイルス様粒子。
【請求項８】
前記の第二ポリペプチドが、
(a) 癌細胞に対する免疫応答を誘発するために適した抗原；
(b) 少なくとも一の病原性微生物に対する免疫応答を誘発するために適した抗原；
(c) 少なくとも一のアレルゲンに対する免疫応答を誘発するために適した抗原；
(d) 少なくとも一の自己抗原に対する免疫応答を誘発するために適した抗原；
(e) 畜産動物又は愛玩動物の免疫応答を誘発するために適した抗原；及び
(f) ポリペプチド毒又はポリペプチドホルモンに対する免疫応答を誘発するために適した抗原
からなる群から選択される少なくとも一の抗原を含有してなる、請求項１ないし７の何れか一に記載の修飾されたウイルス様粒子。
【請求項９】
前記の少なくとも一の抗原が、
(a) ＨＩＶのポリペプチド；
(b) Ｂ型肝炎ウイルスのポリペプチド；
(c) インフルエンザウイルスのポリペプチド；
(d) Ｃ型肝炎ウイルスのポリペプチド；
(e) トキソプラズマのポリペプチド；
(f) マラリヤ原虫のポリペプチド；
(g) 三日熱マラリアのポリペプチド；
(h) 卵形マラリア原虫のポリペプチド；
(i) 四日熱マラリア原虫のポリペプチド；
(j) クラミジアのポリペプチド；
(k) 乳癌細胞のポリペプチド、
(l) 腎臓癌細胞のポリペプチド、
(m) 前立腺癌細胞のポリペプチド、
(n) 皮膚癌細胞のポリペプチド、
(o) 脳癌細胞のポリペプチド、
(p) 白血病細胞のポリペプチド、
(q) 組換え体プロファイリング、
(r) ミツバチの針アレルギーに伴われるポリペプチド、
(s) 木の実アレルギーに伴われるポリペプチド、
(t) 食物アレルギーに伴われるポリペプチド、
(u) 喘息に伴われるポリペプチド、
(v) Ｈｅｒ２；
(w) ＧＤ２；
(x) ＥＧＦ-Ｒ；
(y) ＣＥＡ；
(z) ＣＤ５２；
(aa) ヒトメラノーマｇｐ１００；
(bb) ヒトメラノーマｍｅｌａｎＡ
(cc) チロシナーゼ；
(dd) ＮＡ１７-Ａ  ｎｔ；
(ee) ＭＡＧＥ３；
(ff) Ｐ５３；
(gg) ＣＤ２１；
(hh) ＨＰＶ１６Ｅ７；
(ii) ホスホリパーゼＡ２タンパク質；
(jj) Ｄｅｒ  ｐＩペプチド；
(kk) インフルエンザＭ２タンパク質；
(ll) (a)から(z)及び(aa)から(kk)の前記少なくとも一の抗原の断片；及び、
(mm) (a)から(z)及び(aa)から(kk)の前記少なくとも一の抗原の変異体
からなる群から選択されるものである、請求項１ないし８の何れか一に記載の修飾されたウイルス様粒子。
【請求項１０】
前記の少なくとも一の抗原が自己抗原である、請求項１ないし９の何れか一に記載の修飾されたウイルス様粒子。
【請求項１１】
前記の自己抗原が、
(a) リンホトキシン(好ましくはリンホトキシンα(ＬＴα)、リンホトキシンβ(ＬＴβ))；
(b) リンホトキシンレセプター；
(c) 核因子ｋＢリガンド(ＲＡＮＫＬ)のレセプター活性化因子；
(d) 血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)；
(e) 血管内皮成長因子レセプター(ＶＥＧＦ-Ｒ)；
(f) インターロイキン-５；
(g) インターロイキン-１７；
(h) インターロイキン-１３；
(i) ＩＬ-２３ｐ１９；
(j) グレリン；
(k) ＣＣＬ２１；
(l) ＣＸＣＬ１２；
(m) ＳＤＦ-１；
(n) Ｍ-ＣＳＦ；
(o) ＭＣＰ-１；
(p) エンドグリン；
(q) ＧｎＲＨ；
(r) ＴＲＨ；
(s) エオタキシン；
(t) ブラジキニン；
(u) ＢＬＣ；
(v) 腫瘍壊死因子α；
(w) アミロイドβペプチド(Ａβ１−４２)；
(x) Ａβ１−６；
(y) アンギオテンシン；
(z) ＣＣＲ５細胞外ドメイン；
(aa) ＣＸＣＲ４細胞外ドメイン；
(bb) ガストリン；
(cc) ＣＥＴＰ；
(dd) Ｃ５ａ；
(ee) ブラジキニン；
(ff) Ｄｅｓ-Ａｒｇブラジキニン
(gg) (a)−(ff)の断片；及び、
(hh) (a)−(ff)の変異体
からなる群から選択されるポリペプチドである、請求項１０に記載の修飾されたウイルス様粒子。
【請求項１２】
前記の第二ポリペプチドが５−３０アミノ酸からなる、請求項１ないし１１の何れか一に記載の修飾されたウイルス様粒子。
【請求項１３】
前記の第二ポリペプチドが、
(a) インフルエンザウイルスＭ２ペプチド(配列番号：４３)；
(b) Ｂ型肝炎ウイルスＰｒｅ  Ｓ１ペプチド(配列番号：６２)；
(c) ＨＩＶ Ｎｅｆポリエピトープ(配列番号：２３)；
(d) ＧｎＲＨ(配列番号：２０)；
(e) ガストリンＧ１７(配列番号：４７)；
(f) ネコグレリン(配列番号：５９)；
(g) イヌグレリン(配列番号：５８)；
(h) ＨＩＶ  Ｅｎｖペプチド１(配列番号：９８)；
(i) ＨＩＶ  Ｅｎｖペプチド２(配列番号：９９)；
(j) ＣＣＲ５ ＰＮｔ(配列番号：４５)；及び、
(k) ＣＣＲ５ ＥＣＬ２(配列番号：９１)
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有してなる、請求項１ないし１２の何れか一に記載の修飾されたウイルス様粒子。
【請求項１４】
さらに、少なくとも一の免疫賦活性核酸を含有してなり、該免疫賦活性核酸が前記の修飾されたウイルス様粒子内にパッケージ化されている、請求項１ないし１３の何れか一に記載の修飾されたウイルス様粒子。
【請求項１５】
少なくとも一の非メチル化ＣｐＧモチーフを含有する前記核酸が配列GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (配列番号：７１)を含有する、請求項１４に記載の修飾されたウイルス様粒子。
【請求項１６】
(a) 請求項１ないし１５の何れか一に記載の修飾されたウイルス様粒子；及び
(b) 受容可能な薬剤的担体
を含有してなる薬剤組成物。
【請求項１７】
免疫学的に有効な量の請求項１ないし１５の何れか一に記載の修飾されたウイルス様粒子を含有してなるワクチン組成物。
【請求項１８】
さらに、アジュバントを含有してなる、請求項１７に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
請求項１７又は１８に記載のワクチン組成物が動物又はヒトに投与されることを含む、免疫化方法。
【請求項２０】
ポリペプチドを含有してなる融合タンパク質であり、該ポリペプチドがＡＰ２０５バクテリオファージのコートタンパク質又はそのムテインのＮ末端又はＣ末端、又はその両端に融合されており、該ポリペプチドが３−１０アミノ酸からなり、該融合タンパク質がウイルス様粒子を形成することができる、融合タンパク質。
【請求項２１】
請求項２０の前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【請求項２２】
(a) スペーサーをコードするヌクレオチド配列を、第一ポリペプチドをコードする第一ヌクレオチド配列又は第二ポリペプチドをコードする第二ヌクレオチド配列に選択的にインフレームで連結する；
(b) 前記第二ヌクレオチド配列を前記第一ヌクレオチド配列にインフレームで連結した結果、前記の融合タンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列を生じる；
(c) 第一ヌクレオチド配列の３'で抑制される停止コドンを選択的に導入する；
(d) 好ましくは結果として生じる発現されたタンパク質が前記の修飾されたウイルス様粒子を形成することができる条件下で、宿主内で該第三ヌクレオチド配列を発現させる；
(e) (d)の工程で得られた該修飾されたウイルス様粒子を精製する、
という工程を含む、請求項１ないし１５の何れか一に記載の修飾されたウイルス様粒子の産生方法。
【請求項２３】
動物又はヒトに、請求項１ないし１５の何れか一に記載の修飾されたウイルス様粒子又は請求項１６に記載の薬剤組成物又は請求項１７ないし１８に記載のワクチン組成物が投与されることを含む、個体の疾患、障害又は病理学的症状を治療又は予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（発明の背景）
発明の分野
本発明は、医学、免疫学、ウイルス学及び分子生物学の分野に関連する。
本発明は、ＲＮＡバクテリオファージＡＰ２０５由来の修飾されたウイルス様粒子(ＶＬＰ)を含有してなる組成物を提供する。また、本発明は、前述のＶＬＰの産生方法を提供する。本発明において開示した修飾されたＶＬＰは、感染性疾患、アレルギー、癌及び薬物中毒を含む疾患、障害の予防又は治療のために免疫応答を誘発するための組成物の産生に有用である。さらに、本発明の修飾されたＶＬＰは、特に、自己特異的免疫応答、特に抗体応答を効果的に誘発するために有用である。
【０００２】
関連技術
ウイルスのコートタンパク質に融合される外因性エピトープに対して免疫応答を誘発させるためには少なくとも２つの条件が必要である。まず第一に、外因性配列の融合がウイルス様粒子内のコートタンパク質のアッセンブリを妨げないこと、第二に、外因性エピトープがウイルス様粒子の表面上に表出されることである。ＲＮＡファージのコートタンパク質へのアミノ酸配列の融合については、過去に記載されている。例えば、ＭＳ２ファージのコートタンパク質のＡＢループ内へのエピトープの挿入が記載されている(国際公開公報９２／１３０８１；Mastico 等 J. Gen. Virol. (1993) 74:541-548)。エピトープのＮ末端又はＣ末端の融合はＭＳ２ファージについて記載されていない。この技術の重大な限界は、ＭＳ２のＡＢループ内への挿入を介してポリペプチドがその天然の立体構造とは異なる立体構造内に無理に存在することである。
【０００３】
また、ＲＮＡファージｆｒのコートタンパク質のアミノ酸１２８と１２９の間、位置５０と５２の間(ｆｒキャプシドの内部表面に曝される)又は位置２と３の間へのアミノ酸配列の挿入が報告されている(Pushko P. 等 Protein Eng (1993) 8: 883-891)。また、Pushko等は、様々なＮ末端挿入変異体が二量体のみへのアッセンブリを示すので、Ｆｒ ＣＰのＮ末端の変化が外見上３フォールド軸でのアッセンブリに影響しうることを報告した(Pushko, 890頁, 最終段落, Protein Eng, (1993) 8: 883-891)。ｆｒコートタンパク質の最後のＣ末端残基の前の３つのアミノ酸配列の挿入によってキャプシドアッセンブリが起こる反面、他のより長いエピトープはキャプシドアッセンブリを妨げた。３アミノ酸エピトープ挿入のアッセンブリ能は調べなかった。ゆえに、コートタンパク質ｆｒ内へのアミノ酸の内部挿入のみが現在のところ記載されている。
しかしながら、多くの場合、エピトープのフリーＮ末端又はフリーＣ末端の存在はエピトープ認識のための重要な因子である。例えば、Seubert P. 等 (Neurobiol. (2004), Aging 25: S588)は、Ａβエピトープのマッピングはそれぞれのワクチンによって誘発された抗体に認識されるが、マッピングした試料の４１では、主要な抗体エピトープがＡβの遊離型(フリー)アミノ末端に対するものであることを発見し、報告した。同様に、アンジオテンシンIIのＣ末端に特異的な抗体も記載されている(Budisavljevic M. 等. (1988) J. Immunol. 140:3059-3065)。
【０００４】
Ｃ末端へのエピトープの融合は、伸展の後にモザイクＶＬＰ内でのみアッセンブリされるＲＮＡファージＱβのｓ Ａ１伸展の切断型においてのみ報告されている。これらは、エピトープを表出しているＡ１サブユニットとそれを欠いている野生型のコートタンパク質との混合物のアッセンブリされた粒子の形態である。エピトープを表出するＡ１伸展のみが大腸菌内で発現される場合に得られる粒子はない(Vasiljeva 等 (1998) FEBS Letters 431: 7-11)。しかしながら、これらモザイク粒子は低濃度でエピトープを表出する。このことがワクチンとしての使用に支障があるようである。この問題の一つには、低濃度の抗原表出により十分な免疫応答、特に抗原が自己抗原である場合に自己耐性を壊すほどの免疫応答が誘発されないことである(Bachmann & Zinkernagel, Immunol. Today 17:553-558 (1996))。
したがって、当分野では、多種類の抗原がウイルスのコートタンパク質に融合し、結果として生じる融合タンパク質がＶＬＰを形成して、ＶＬＰの該表面上に抗原を表出することができる能力を有する、ウイルスのコートタンパク質を同定することが求められている。さらに、外因性エピトープの融合が起こり、フリー末端が強力な免疫原性を担う場合にエピトープのフリー末端がアクセス可能になるような、ウイルスのコートタンパク質を発見することが求められている。
【０００５】
（発明の要約）
驚くべきことに、多種類のポリペプチドがＡＰ２０５のコートタンパク質のＮ末端又はＣ末端に融合することができ、宿主、一般的で好ましくは大腸菌内で発現された場合、結果として生じる融合タンパク質はウイルス様粒子を形成することを発見した。さらに驚くべきことに、前記ポリペプチドが少なくとも一の抗原を含有する場合、抗原又は抗原の少なくとも一の抗原性部位がアッセンブリされたＶＬＰの体表面上に表出されることも発見した。
したがって、第一の態様では、本発明は、少なくとも一の融合タンパク質を含有してなる修飾されたウイルス様粒子(ＶＬＰ)であって、当該少なくとも一の融合タンパク質が：(a) 第一ポリペプチド；と(b) 第二ポリペプチドとを含有してなり、該第一ポリペプチドがＡＰ２０５バクテリオファージのコートタンパク質又はそのムテインであり、該第二ポリペプチドが該第一ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端の何れかに融合している、修飾されたウイルス様粒子を提供する。
【０００６】
ある好適な実施態様では、第二ポリペプチドが少なくとも一の抗原を含有する。長さ、疎水性及び構造が異なる多種類のポリペプチド、好ましくは抗原がＡＰ２０５のコートタンパク質の何れかの末端に融合することができ、結果として生じた融合タンパク質が依然としてウイルス様粒子を形成する能力を持つという点で公知文献よりも本発明に利点がある。例えば、ＡＰ２０５のコートタンパク質と高い疎水性のＴ細胞エピトープであるｐ３３エピトープを含有する融合タンパク質はウイルス様粒子を形成するのに対して、同じＴ細胞エピトープとｆｒのコートタンパク質を含有する融合タンパク質はＶＬＰを形成することができないことを発見した。さらに、コートタンパク質に融合される抗原は適切にホールディングされて、ウイルス様粒子の外表面上に表出し、修飾されたＶＬＰは抗原に対して強力な抗体応答を誘発する。
さらに、本発明は、少なくとも一抗原の少なくとも一端が自由にアクセス可能としている。これは、フリー端(free end)が強力な免疫応答の誘発の原因とみなされる場合に重要である。さらに、コートタンパク質の何れかの一端に少なくとも一の抗原を表出するために同じＶＬＰを使用する可能性から、運搬の効果に依存しない、少なくとも一の抗原のＮ末端又はＣ末端融合型の免疫原性を評価することができる。
【０００７】
ある好適な実施態様では、さらに、修飾されたＶＬＰは少なくとも一の免疫賦活性物質、免疫賦活性核酸、さらにより好ましくは少なくとも一の非メチル化ＣｐＧモチーフを含有する免疫賦活性核酸を含有する。修飾されたＶＬＰに結合された免疫賦活性物質、好ましくは修飾されたＶＬＰ内にパッケージ化される免疫賦活性物質を封入することにより、修飾されたＶＬＰによって誘発される免疫応答が亢進する。これは、少なくとも一の抗原がウイルス抗原、細菌抗原などの微生物病原体や癌細胞やアレルゲンに対する免疫応答を誘発する抗原由来の抗原である場合に特に有用である。
他の態様では、本発明は、修飾されたＶＬＰを含有するワクチン組成物を提供する。さらに、本発明は、動物又はヒトへのワクチンの投与方法を提供する。
ある態様では、本発明は、(a) スペーサーをコードするヌクレオチド配列を、第一ポリペプチドをコードする第一ヌクレオチド配列又は第二ポリペプチドをコードする第二ヌクレオチド配列に(選択的に)インフレームで連結する；(b) 前記第二ヌクレオチド配列を前記第一ヌクレオチド配列にインフレームで連結した結果、前記の融合タンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列を生じる；(c) 第一ヌクレオチド配列の３'で抑制される停止コドンを(選択的に)導入する；(d) 好ましくは結果として生じる発現されたタンパク質が前記の修飾されたウイルス様粒子を形成することができる条件下で、宿主内で該第三ヌクレオチド配列を発現させる；そして(e) (d)の工程で得られた該修飾されたウイルス様粒子を精製する、という工程を含む、本発明の修飾されたＶＬＰの産生方法を提供する。
【０００８】
他の態様では、本発明は、ポリペプチドを含有してなる融合タンパク質であり、該ポリペプチドがＡＰ２０５のコートタンパク質又はそのムテインのＮ末端ないしはＣ末端又はその両方に融合している融合タンパク質を提供する。更なる態様では、本発明は前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を提供する。
更なるある態様では、本発明は、修飾されたＶＬＰと薬剤的に受容可能な担体を含有してなる薬剤組成物を提供する。
さらに他の態様では、本発明は、動物又はヒトに、本発明の修飾されたＶＬＰ又は、本発明の薬剤組成物又は、本発明のワクチン組成物が投与されることを含む、個体の疾患、障害又は病理学的症状を治療又は予防する方法を提供する。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
定義：
「ＡＰ２０５バクテリオファージ」なる用語及び「ＲＮＡファージＡＰ２０５」なる用語は、本明細書中において相互に交換可能に用いられる。
抗原：本明細書で使用するように、「抗原」という用語は、ＭＨＣ分子によって提示される場合、抗体又はＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）に特異的に結合されうる分子を指す。「抗原」という用語は、本明細書で使用するように、Ｔ細胞エピトープも含む。さらに抗原は、免疫系に認識されることができ、及び／又は、Ｂ及び／又はＴリンパ球の活性化がもたらされる体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を誘導することができる。しかしながら、このことは、少なくともいくつかの場合において、抗原がＴｈ細胞エピトープを含むかあるいはこれと連結し、アジュバント中に存在することが必要でありうる。または抗原が本発明に従って提示されることが必要でありうる。抗原は、１つ又は複数のエピトープ又は抗原性部位（ＢおよびＴエピトープ）を有しうる。本明細書中で用いる「特異的な結合」なる用語は、抗原が、好ましくは典型的には非常に選択的な方式で、その対応する抗体又はＴＣＲと反応し、他の抗原によって誘発される可能性がある多数の他の抗体又はＴＣＲとは反応しないことを示すことを意図する。また、ここで用いた抗原はいくつかの別々の抗原の混合でもよい。しかしながら、本出願の範囲内で用いられる「抗原」なる用語は、ＡＰ２０５バクテリオファージのＶＬＰに加えて、さらにＡＰ２０５のコートタンパク質又はそのムテインに加えて、ＡＰ２０５のコートタンパク質又はそのムテインでない抗原であり、ＡＰ２０５バクテリオファージのＶＬＰでない抗原であることを意味する。
【００１０】
抗原性部位：本明細書中において相互に交換可能に用いられる「抗原性部位」なる用語及び「抗原性エピトープ」なる用語は、ＭＨＣ分子の環境におけるＴ細胞レセプター又は抗体によって免疫特異的に結合されるポリペプチドの連続的な又は非連続的な部位を意味する。少なくともいくつかの場合においては、抗体と抗原性部位との結合には、抗原性部位が本発明に従って提示されることが必要である。免疫特異的な結合には、非特異的な結合が除外されるが必ずしも交差反応が除外されない。典型的に、抗原性部位は、抗原性部位に特有の空間的な立体構造内に５−１０アミノ酸を含有する。
結合(bound)：本発明で用いる「結合」なる用語は、共有、たとえば化学的結合、又は非共有、たとえばイオン性相互作用、疎水性相互作用、水素結合などでありうる結合を指す。共有結合は、たとえばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−イオウ結合、炭素−リン結合などであってよい。また、この用語は、物質の封入、又は部分的封入も含む。「結合(bound)」なる用語はより広義であり、「連結(coupled)」、「融合(fused)」、「封入(enclosed)」、「パッケージ化(packaged)」および「付着(attached)」などを含む。
【００１１】
パッケージ化(packaged)：本明細書で使用するように、「パッケージ化」という用語は、修飾されたＶＬＰとの関係で、免疫賦活物質、特に免疫賦活性核酸の状態を指す。本明細書で使用するように、「パッケージ化」なる用語は免疫賦活性物質、好ましくは免疫賦活性核酸物質の封入、又は部分的封入を意味する。本明細書中で用いる「パッケージ化」という用語は、共有、たとえば化学的連結、又は非共有、たとえばイオン性相互作用、疎水性相互作用、水素結合などでありうる結合を含む。しかしながら、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドなどの免疫賦活物質を、実際に共有結合しなくても、ＶＬＰによって封入することができる。好適な実施態様では、免疫賦活性核酸はＶＬＰ内部にパッケージ化されるため、典型的に好ましくは、ＤＮａｓｅ又はＲＮａｓｅによる加水分解作用に侵されない。
ＡＰ２０５バクテリオファージのコートタンパク質：ここで用いる「ＡＰ２０５のコートタンパク質」なる用語は、ＡＰ２０５バクテリオファージのゲノム又はＡＰ２０５バクテリオファージの変異体のゲノムによってコードされるコートタンパク質を意味する。典型的に好ましくは、本明細書中で用いられる「ＡＰ２０５のコートタンパク質」なる用語は、ＡＰ２０５バクテリオファージのゲノムによってコードされるコートタンパク質を意味する。より好ましくは、「ＡＰ２０５のコートタンパク質」なる用語は、配列番号１又はそのアミノ酸配列を意味し、この第一メチオニンは配列番号１(配列番号６７)から切断される。典型的に好ましくは、ＡＰ２０５のコートタンパク質は、ウイルスキャプシドの一サブユニット又はＲＮＡファージＡＰ２０５のＶＬＰとしてアッセンブリされうる。
【００１２】
ＣｐＧ：ここで用いる「ＣｐＧ」なる用語は、非メチル化シトシン、グアニンジヌクレオチド配列（たとえば、シトシンの次にグアノシンを含み、リン酸結合によって連結している「ＣｐＧ ＤＮＡ」又はＤＮＡ）を含み、脊椎動物細胞を刺激する／活性化する、たとえば脊椎動物細胞に対して分裂促進効果を有する、あるいはサイトカイン発現を誘導するか増大させる、オリゴヌクレオチドを指す。たとえばＣｐＧは、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および抗原提示細胞、たとえば、単球、樹状細胞およびマクロファージ、及びＴ細胞の活性化に有用でありうる。ＣｐＧは、ヌクレオチド類似体、たとえば、ホスホロチオエステル結合を含む類似体などを含むことができ、二本鎖又は一本鎖であってよい。一般に、二本鎖分子はインビボでより安定性があり、一方で一本鎖分子は高い免疫活性を有する。
エピトープ：ここで用いる「エピトープ」なる用語は、動物、好ましくは哺乳動物、および最も好ましくはヒトの、抗原又は免疫活性を有するポリペプチドの連続的又は非連続的一部分を指す。エピトープはＭＨＣ分子の関係でそのＴ細胞レセプターを介して抗体又はＴ細胞により認識される。ここで用いる「免疫原生エピトープ」は、当分野で知られている任意の方法によって決定される（たとえば、Geysen他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA81:3998-4002(1983)を参照のこと）、動物の抗体応答を誘発するかあるいはＴ細胞応答を誘導する、ポリペプチドの一部分として定義する。本明細書で使用する「抗原性エピトープ」は、当分野でよく知られている任意の方法によって決定される、抗体がその抗原に特異的に結合するタンパク質の一部分として定義される。免疫特異的結合は非特異的結合を除外するが、他の抗原との交差反応性は必ずしも除外しない。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。抗原性エピトープはＴ細胞エピトープであってもよく、この場合抗原性エピトープを、ＭＨＣ分子の概念でＴ細胞レセプターによって免疫特異的に結合させることができる。
【００１３】
ＡＰ２０５のコートタンパク質の断片：本明細書中で用いられる「ＡＰ２０５のコートタンパク質の断片」なる用語は、ＡＰ２０５のウイルス様粒子を形成することができ、ＡＰ２０５のコートタンパク質を少なくとも一回切断したもの、少なくとも一の内部欠損があるもの、又はその組合せであり、さらにＡＰ２０５のコートタンパク質長の少なくとも７０％、好ましくは８０％であるポリペプチドを意味する。さらに、本明細書中で用いられる「ＡＰ２０５のコートタンパク質の断片」なる用語は、ＡＰ２０５のウイルス様粒子を形成することができ、上記した「ＡＰ２０５のコートタンパク質の断片」に８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上のアミノ酸配列相同性を有するポリペプチドを包含する。
融合(fusion)(又は融合する(fuse))：本明細書中で用いられる「融合」(又はその動詞である「融合する」)なる用語は、コードするヌクレオチド配列がインフレームで組み合わさることによって、一つのポリペプチド鎖内に異なる起源のアミノ酸配列が組み合わさっていることを意味する。一以上のヌクレオチド配列は、ゲノムコードの縮重によりある特定のアミノ酸配列をコードしうる。
【００１４】
免疫賦活性核酸：本明細書で使用するように、免疫賦活性核酸という用語は、免疫応答を誘導する、及び／又は高めることができる核酸を指す。免疫賦活性核酸は、少なくとも１つのＣｐＧモチーフ、たとえばＣが非メチル化状態であるＣＧジヌクレオチドを含むことが好ましい。ＣＧジヌクレオチドはパリンドローム配列の一部であってよく、あるいは非パリンドローム配列中に含まれてもよい。前述したＣｐＧモチーフを含まない免疫賦活性核酸は、たとえばＣｐＧジヌクレオチドを欠いた核酸、ならびにメチル化ＣＧジヌクレオチドを有するＣＧモチーフを含む核酸を包含する。本明細書で使用するように、「免疫賦活性核酸」なる用語は、４-ブロモ-シトシンなどの修飾体を含む核酸も指すはずである。
免疫賦活物質：本明細書で使用するように、「免疫賦活物質」なる用語は、免疫応答を誘導する、及び／又は高めることができる物質を指す。好ましくは、免疫賦活物質は、ｔｏｌｌ様レセプター(toll-like receptor)活性化物質を指す。本出願の文脈で用いられる「免疫賦活性物質」なる用語は、前記の修飾されたＶＬＰに加えて、本発明の修飾されたＶＬＰでない免疫賦活性物質を指す。
【００１５】
ＡＰ２０５バクテリオファージのコートタンパク質のムテイン：本明細書中で用いられる「ＡＰ２０５バクテリオファージのコートタンパク質のムテイン」なる用語は、そのアミノ酸配列が特定のＡＰ２０５バクテリオファージのコートタンパク質のアミノ酸配列と比較して少なくとも一アミノ酸が異なり、特定のＡＰ２０５バクテリオファージのコートタンパク質のアミノ酸配列に少なくとも９０％、より好ましくは９２％、さらにより好ましくは９５％、より好ましくは９７％の相同性を有するポリペプチドを指す。典型的に好ましくは、ＡＰ２０５バクテリオファージのコートタンパク質のムテインはＲＮＡファージＡＰ２０５のＶＬＰを形成する能力を保持する。本明細書中で用いられる「配列番号１又は配列番号６７のムテイン」なる用語は、そのアミノ酸が配列番号１又は配列番号６７のアミノ酸配列と比較して少なくとも一アミノ酸が異なり、配列番号１又は配列番号６７のアミノ酸配列に少なくとも９０％、より好ましくは９２％、さらにより好ましくは９５％、より好ましくは９７％の相同性を有するポリペプチドを指す。典型的に好ましくは、ＡＰ２０５のコートタンパク質と該コートタンパク質のムテインとの配列差異は少なくとも一の遺伝子操作によって導入されるものであり、この遺伝子操作は、内部付加、挿入、欠損、切断(タンパク質の一端からの欠損ともいう)、置換及びこれらの組合せからなる群から選択される。外部から付加されたアミノ酸、すなわち付加アミノ酸又はＡＰ２０５バクテリオファージのコートタンパク質ないしはＡＰ２０５バクテリオファージのコートタンパク質のムテインの何れか一端ないしは両端のアミノ酸は、ＡＰ２０５バクテリオファージのコートタンパク質のムテインの配列の一部とみなさない。さらに、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸の置換は、保存性のあるアミノ酸置換である。当分野の技術者によって理解される、保存性のあるアミノ酸置換は、等配性の置換を含む、典型的に好ましくは、等配性の置換からなる。この置換はアミノ酸の荷電性、極性、芳香族、脂肪族又は疎水性性質が維持されるものである。典型的に保存性のある置換は、以下のグループ：Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；Ｐｈｅ、Ｔｙｒ内のアミノ酸間の置換である。
【００１６】
規則的で反復性の抗原アレイ：本明細書で用いる「規則的で反復性の抗原アレイ」なる用語は、一般的に、ウイルス様粒子との関係で抗原中に、典型的に好ましくは非常に規則的に均一に空間的に配置していることに特徴がある抗原の反復パターンを指す。本発明の一つの実施態様では、反復パターンは幾何学的パターンである。ＲＮＡファージＡＰ２０５の修飾されたＶＬＰは、好ましくは１から３０ナノメーターの間隔、好ましくは２から１５ナノメーターの間隔、より好ましくは２から１０ナノメーターの間隔、さらにより好ましくは２から８ナノメーターの間隔、さらにより好ましくは１．６から７ナノメーターの間隔、最も好ましくは０．５から７ナノメーターの間隔を有する、抗原の準結晶性の、厳密に反復的な順序配列を持つ。
ポリペプチド：本明細書で使用するように、「ポリペプチド」なる用語は、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直線的に連結したモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。これはアミノ酸の分子鎖を示し、特定の長さの生成物を指すわけではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチドの定義中に含まれる。たとえば、グリコシル化、アシル化、リン酸化など、ポリペプチドの翻訳後修飾も包含する。
【００１７】
自己抗原：本明細書で使用するように、「自己抗原」なる用語は、宿主のＤＮＡによってコードされるポリペプチドと、自己とみなされる宿主のＤＮＡによってコードされるポリペプチド又はＲＮＡによって生成される生成物を指す。さらにまた、ここで用いる「自己抗原」なる用語は、自己抗原の分画を含む、あるいは自己抗原の分画からなるポリペプチドであり、好ましくは少なくとも４、好ましくは少なくとも５、より好ましくは少なくとも６、少なくとも７又は少なくとも８アミノ酸を有するポリペプチドを指すのが好ましい。加えてまた、本明細書中で用いられる「自己抗原」なる用語は、上記に定義する自己抗原に高い相同性を有するポリペプチドであり、好ましくは少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチドを指すのが好ましい。さらに、本明細書中で用いられる「自己抗原」なる用語は、上記に定義する自己抗原のオルソログを包含するのが好ましく、該オルソログは自己抗原に対して特異的に免疫応答を生成することができるものである。「オルソログ」なる用語は、異なる種由来のポリペプチドの機能的な相対物である一種由来のポリペプチドを意味する。オルソログ間の配列差異は種分化によるものである。さらに、本明細書中で用いられる「自己抗原」なる用語は、２又は多数の自己抗原が組み合わさったポリペプチドを指すのが好ましい。
本明細書中で用いられるウイルス様粒子(ＶＬＰ)とは、ウイルス粒子に似ている構造を指す。本発明のウイルス様粒子はウイルスゲノムのすべてないしは一部を欠損している、典型的に好ましくは、ウイルスゲノムの複製及び感染因子のすべてないしは一部を欠損しているため、非複製性で非感染性である。
【００１８】
ＲＮＡファージＡＰ２０５のウイルス様粒子：「ＲＮＡファージＡＰ２０５のウイルス様粒子」なる用語は、ＲＮＡファージＡＰ２０５のコートタンパク質、そのムテインないしは断片を含んでなる、好ましくは基本的にこれからなる、あるいはこれからなるウイルス様粒子を指す。さらに、ＲＮＡファージＡＰ２０５のウイルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の構造に類似しており、非複製性で非感染性であり、ＲＮＡファージＡＰ２０５の複製機構をコードする遺伝子ないしは遺伝子群を少なくとも欠損しており、また典型的には、ウイルス接着を担う、ないしは宿主内に侵入するためのタンパク質ないしはタンパク質群をコードする遺伝子ないしは遺伝子群を欠損している。しかしながら、この定義には、前述の遺伝子ないしは遺伝子群が存在するが不活性な状態にあるために非複製性で非感染性のＲＮＡファージＡＰ２０５のウイルス様粒子となっているＲＮＡファージＡＰ２０５のウイルス様粒子も包含する。好適なＲＮＡファージＡＰ２０５由来のＶＬＰは、対称な正二十面体を表し、１８０サブユニットからなる。本開示の範囲内の「サブユニット」及び「単量体」は本文脈中で、相互に交換可能に同義で用いられる。
本出願内で、抗体は、１０６Ｍ−１以上、好ましくは１０７Ｍ−１以上、より好ましくは１０８Ｍ−１以上、最も好ましくは１０９Ｍ−１以上の結合親和性(Ｋａ)で抗原に結合する場合、特定に結合するものとして定義される。抗体の親和性は、当分野の通常の任意の技術(例えばスキャッチャード分析)によって測定することができる。
【００１９】
ポリペプチドのアミノ酸相同性は、ベストフィット(Bestfit)などの公知のコンピュータプログラムを用いて慣習的に測定することができる。ベストフィットないしは任意の他の配列アラインメントプログラムを用いて、好ましくはベストフィットを用いて、特定の配列が例えば参照するアミノ酸配列に対して９５％の相同性であるかどうかを決定するために、参照アミノ酸配列の完全長に対する相同性の割合が算出され、参照配列中のアミノ酸残基の合計数の５％以下の相同性にギャップが挿入されるようにパラメータを設定する。ポリペプチド間の相同性の割合を測定する前述の方法は、本発明似開示するすべてのタンパク質、ポリペプチドないしはその断片に適するものである。
Ｏｎｅ、ａ、又はａｎ：用語「ｏｎｅ」、「ａ」、又は「ａｎ」を本開示中で使用するとき、それらは、特に示さない限りは、「少なくとも１つ」、又は「１つ又は複数」を意味する。
本明細書中で用いられる任意の数値を示す場合の「約」又は「およそ」なる用語は、記載の値の±１０％の値を意味することを意図する。例えば、「約５０℃」(又は「およそ５０℃」)は、４５℃から５５℃の温度範囲を包括的に包含する。同様に、「約１００ｍＭ」(又は「およそ１００ｍＭ」)は、９０ｍＭから１１０ｍＭの濃度範囲を包括的に包含する。
【００２０】
本発明は、少なくとも一の融合タンパク質を含有してなる修飾されたウイルス様粒子(ＶＬＰ)であって、当該少なくとも一の融合タンパク質が：(a) 第一ポリペプチド；と(b) 第二ポリペプチドとを含有してなり、ないしは基本的にこれらからなり、ないしはこれらからなり、該第一ポリペプチドがＡＰ２０５バクテリオファージのコートタンパク質又はそのムテインであり、該第二ポリペプチドが該第一ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端の何れかに融合している、修飾されたウイルス様粒子を提供する。
近年、ＲＮＡバクテリオファージＡＰ205が同定されている(Klovins,J., 等, J. Gen. Virol. 83: 1523-33 (2002))。ＡＰ２０５ＲＮＡファージ(Taxonomy ID: 154784)は、一本鎖のポジティブ鎖ＲＮＡウイルスである。ＡＰ２０５ゲノムは、長さの４２６７ヌクレオチド(ｎｔ)である(寄託 AF334111, NC_002700)。ＡＰ２０５ファージの天然の宿主はアシネトバクター属種である。(Klovins,J., 等, J. Gen. Virol. 83: 1523-33 (2002))。ＡＰ２０５ファージのゲノムは、３つの大きな転写解読枠(ＯＲＦ)を具備しており、このＯＲＦは成熟タンパク質、コートタンパク質およびレプリカーゼタンパク質をそれぞれコードする。加えて、２つの付加的な小さいＯＲＦが成熟遺伝子の前の５'末端に存在する。これらのＯＲＦによってコードされるタンパク質の機能は、知られていない。これらのＯＲＦのうちの１つが溶解タンパク質をコードすると推測されている(Klovins,J., 等, J. Gen. Virol. 83: 1523-33 (2002))。また近年、ＶＬＰ内での大腸菌で発現されたＡＰ２０５コートタンパク質のアッセンブリについては国際公開公報２００４／００７５３８において開示されており、その開示内容は引用により本明細書中に組み込まれる。ＡＰ２０５のコートタンパク質のクローニング及び発現については、国際公開公報０４／００７５３８の２４頁の第２段落から２５頁の第２段落と同じ出願の実施例１及び２に開示されており、これらの具体的な開示内容は引用によって本明細書中に組み込まれる。
【００２１】
ある好適な実施態様では、第一ポリペプチドは、１１８−１４４アミノ酸、好ましくは１２１−１４１、より好ましくは１２４−１３８、さらにより好ましくは１２７−１３５、また更に好ましくは１２８−１３４のアミノ酸から成る。ある好適な実施態様では、第一ポリペプチドは、１３１−１４２アミノ酸、好ましくは１３１−１３９、より好ましくは、１３１−１３５及びなおより好ましくは１３１−１３４アミノ酸から成る。
本発明のある好適な実施態様では、ＡＰ２０５バクテリオファージの前記コートタンパク質又はそのムテインが：(a) 配列番号１；(b) 配列番号２；(c) 配列番号４２；(d) 配列番号６７；(e) 配列番号６８；(f) 配列番号６９；及び(g) 配列番号１又は６７のムテイン；からなる群から選択される。ある好適な実施態様では、ムテインは、配列番号１、２、４２、６７、６８又は６９に記載のアミノ酸配列を有するものであり、配列番号１、２、４２、６７、６８又は６９の最大６アミノ酸残基、好ましくは最大５、４又は３アミノ酸残基、より好ましくは最大２アミノ酸残基、及びさらにより好ましくは１アミノ酸残基が欠損、内部付加又は置換されており、該置換の好ましくは少なくとも１、より好ましくは少なくとも２、３又は４、及びさらにより好ましくは全てが保存的な置換である。
【００２２】
ある好適な実施態様では、ムテインは配列番号１、２、４２、６７、６８又は６９に記載のアミノ酸配列を有するものであり、少なくとも１のシステイン残基、好ましくは最大２のシステイン残基が欠損されるか置換されており、該置換の好ましくは少なくとも一、より好ましくは少なくとも２、及びさらにより好ましくは全てが保存的な置換である。
ある好適な実施態様では、ムテインは配列番号１、２、４２、６７、６８又は６９に記載のアミノ酸配列を有するものであり、少なくとも１のリジン残基、好ましくは最大３のリジン残基、より好ましくは最大２のリジン残基、さらにより好ましくは１リジンが欠損されるか置換されており、該置換の好ましくは少なくとも一、より好ましくは少なくとも２ないし３、及びさらにより好ましくは全てが保存的な置換である。
本発明は、多様な配列と多様な長さのポリペプチドの多くが、ＡＰ２０５バクテリオファージのコートタンパク質ないしはそのムテインに融合することができ、結果として生じた融合タンパク質が依然としてＶＬＰを形成する能力を持つという驚くべき発見に基づいている。
【００２３】
ある好適な実施態様では、第二ポリペプチドは、１００未満、より好ましくは８０未満、６０未満、より好ましくは４０未満、さらにより好ましくは３０未満のアミノ酸を有する。好ましくは、第二ポリペプチドは、ＶＬＰ内へのＡＰ２０５バクテリオファージのコートタンパク質ないしはそのムテインのアッセンブリを妨げないフォールディングユニット内へ、ないしは独立したドメイン内へフォールディングされる。
一つの更なる好適な実施態様では、第二ポリペプチドは、１−６０アミノ酸、好ましくは３−４０、より好ましくは５−３０、さらにより好ましくは１０−２５アミノ酸からなる。第二ポリペプチドの存在により、第一ポリペプチドのＶＬＰへのアッセンブリが妨げられないことが好ましい。
ある好適な実施態様では、第二ポリペプチドは、少なくとも一の活性な機能的な基を有する少なくとも一のアミノ酸を含有するかあるいは、それからなる。一つの更なる好適な実施態様では、第二ポリペプチドは、少なくとも一システイン、好ましくは一システイン残基を含有するかあるいは、それからなる。少なくとも一の活性な機能的な基を有する少なくとも一のアミノ酸は、同じあるいは他の分子成分からなる他の機能的な基と作用するための接着部位として有用である。
【００２４】
更なるある態様では、本発明は、タンパク質ベースの薬剤運搬システムとして修飾されたＶＬＰの使用を提供するものであり、該薬剤は、修飾されたＶＬＰの内部にパッケージ化されているものである。薬剤は、典型的に好ましくは、化学的化合物、毒素、生物学的に活性な物質、遺伝子治療を目的とする核酸を指す。一つの更なる好適な実施態様では、第二ポリペプチドは、ポリペプチドである標的分子を含有する。タンパク質ベースの薬剤運搬システムは、Brown WL. 等 (2002) Intervirology 45: 371.380、Wu M. 等 (1995) Bioconjugate Chem. 6: 587-595、及び欧州特許第０６４８２７２号などの公知文献に開示されている。これらの開示内容は、全体が出典明記によって本明細書中に組み込まれる。
本発明のある好適な実施態様では、第二ポリペプチドが、少なくとも一の抗原を含有するかないしは、そこから基本的になるか、それからなるものであり、この少なくとも一の抗原はポリペプチドである。抗原の大きさ、疎水性及び構造は、本発明によるＶＬＰ内への融合タンパク質のアッセンブリに適合するものでなければならない。さらに、この発明は、多様な配列と多様な長さの抗原の多くが、ＡＰ２０５バクテリオファージのコートタンパク質ないしはそのムテインに融合することができ、結果として生じた融合タンパク質が依然としてＶＬＰを形成する能力を持つという驚くべき発見に基づいている。さらに、抗原ないしは抗原の少なくとも一の抗原性部位が形成されたＶＬＰの外表面上に表出されるという驚くべき発見があった。
【００２５】
大腸菌内で融合コートタンパク質を発現させ、必要があれば細胞溶解物からゲル濾過によってキャプシドを精製し、免疫拡散アッセイ(オークタロニー試験)又は電子顕微鏡(ＥＭ)(Kozlovska, T. M.. 等, Gene 137:133-37 (1993))においてキャプシド形成を分析することによって当分野の技術者が評価するように、融合タンパク質のＶＬＰ内へのアッセンブリを試験してもよい。免疫拡散アッセイ及びＥＭは細胞溶解物に直接行ってもよい。
修飾されたＶＬＰの表面上の抗原ないしは抗原の少なくとも一の抗原性部位の表出を、マウスなどの動物を修飾されたＶＬＰで免疫化して、抗原ないしは抗原の少なくとも一の抗原性部位に特異的なＥＬＩＳＡでの抗体応答を測定することによって評価してもよい。あるいは、阻害ＥＬＩＳＡを行ってもよい。抗原はＥＬＩＳＡプレートに直接的又は間接的にコートする。コートされた抗原への抗原特異的な血清、例えばマウス血清の結合の阻害は、修飾されたＶＬＰの段階希釈液を添加することによって測定することができる。
一実施態様では、少なくとも一の抗原はタンパク質である。他の実施態様では、少なくとも一の抗原はタンパク質の断片である。本明細書中で用いられる「タンパク質の断片」なる用語又はそれと相互に交換可能に用いられる「ポリペプチドの断片」ないしは「抗原の断片」は、本明細書中で定義したタンパク質、ポリペプチドないしは抗原の少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１７、１８、１９、２０、２５、３０の連続するないしは連続しないアミノ酸を含有するか、ないしは好ましくはこれらアミノ酸からなる任意のポリペプチドであり、並びに、それらに対して６５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上のアミノ酸配列相同性を有するポリペプチドを包含する。タンパク質の断片は、少なくとも一の抗原性部位を含有しなければならない。本発明に従って存在する場合のタンパク質の断片は、インビボのＴ細胞の刺激ないしは抗体の産生を誘導することができるものであり、この抗体はＭＨＣ分子の関係で提示されるタンパク質ないしはタンパク質の断片に特異的に結合するものである。タンパク質の断片の好適な実施態様は、タンパク質の切断型ないしは内部欠損型である。
【００２６】
タンパク質の抗原性部位を結成する方法は当分野の技術者に公知である。ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００４９８０の２６頁の第１段落から２７頁の第４段落にこれらの方法のいくつかが詳述されており、これら具体的な開示内容は出典明記によって本明細書中に組み込まれる。これの方法は、一般的に、他のポリペプチド抗原に応用できるものであるため、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００４９８０に開示されるように、ＩＬ-２３ ｐ１９に限定されるものでないことを注記する。
本発明の更なる他の実施態様では、少なくとも一の抗原はタンパク質の変異体である。本明細書中で用いられる「タンパク質の変異体」なる用語又はそれと相互に交換可能に用いられる「ポリペプチドの変異体」ないしは「抗原の変異体」は、タンパク質、抗原ないしはポリペプチドの配列に、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９７％以上のアミノ酸配列相同性を有する、任意の天然ないしは遺伝子操作したポリペプチドを含有するか、ないしは好ましくはこれらポリペプチドからなる任意のポリペプチドを包含する。タンパク質の変異体を生成する好適な方法は、好ましくは挿入、置換、欠損ないしはこれらの組合せによって遺伝子操作することによるものである。本発明に従って提示されるタンパク質の変異体は、インビボのＴ細胞の刺激ないしは抗体の産生を誘導することができるものであり、この抗体はＭＨＣ分子の関係で提示されるタンパク質ないしはタンパク質の断片に特異的に結合するものである。
【００２７】
ある好適な実施態様では、第二ポリペプチドが少なくとも一の天然に生じる抗原ないしはその一部を含有するか、ないしはそれからなるものであり、この天然に生じる抗原の一部が少なくとも一の抗原性部位を含有するか、ないしはそれからなるものである。天然に生じる抗原は、そのアミノ酸配列が自然界に存在する、好ましくは生物体、例えば植物、動物、細菌やウイルスなどの微生物に存在する抗原を指す。
本発明の好適な実施態様では、少なくとも一の抗原は、(a) 癌細胞に対する免疫応答を誘発するために適した抗原；(b) 少なくとも一の病原性微生物に対する免疫応答を誘発するために適した抗原；(c) 少なくとも一のアレルゲンに対する免疫応答を誘発するために適した抗原；(d) 少なくとも一の自己抗原に対する免疫応答を誘発するために適した抗原；(e) 畜産動物又は愛玩動物の免疫応答を誘発するために適した抗原；及び(f) ポリペプチド毒又はポリペプチドホルモンに対する免疫応答を誘発するために適した抗原、からなる群から選択されるものである。
【００２８】
本発明のある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原は癌細胞に対する免疫応答を誘発するために適するものであり、少なくとも一の抗原は腫瘍抗原、又はその変異体ないしは断片であることが好ましい。本発明の一つの更なる好適な実施態様では、腫瘍抗原は乳癌細胞のポリペプチド、腎臓癌細胞のポリペプチド、前立腺癌細胞のポリペプチド、皮膚癌細胞のポリペプチド、脳癌細胞のポリペプチド、又は白血病細胞のポリペプチドである。一つの更なる好適な実施態様では、腫瘍抗原は、(a) Ｈｅｒ２；(b) ＧＤ２；(c) ＥＧＦ-Ｒ；(d) ＣＥＡ；(e) ＣＤ５２；(f) ヒトメラノーマタンパク質ｇｐ１００；(g) ヒトメラノーマタンパク質ｍｅｌａｎ-Ａ／ＭＡＲＴ-１；(h) チロシナーゼ；(i) ＮＡ１７-Ａ  ｎｔタンパク質；(j) ＭＡＧＥ-３タンパク質；(k) Ｐ５３タンパク質；(l) ＣＤ２１；(m) ＨＰＶ１６Ｅ７タンパク質；(n) (a)から(m)の任意の腫瘍抗原の断片；及び、(o) (a)から(m)の任意の腫瘍抗原の変異体からなる群から選択されるものである。
【００２９】
本発明の他の好適な実施態様では、少なくとも一の抗原は感染性疾患ないしは少なくとも一の病原性微生物に対する免疫応答を誘発するために適するものであり、少なくとも一の抗原は病原性微生物、又はその変異体ないしは断片に由来する抗原であることが好ましい。感染性疾患、病原性微生物及び病原性微生物由来の抗原は米国特許出願US-2003-0091593-A1の、特に７５頁の第２段落から８３頁の第４段落までに開示されている。この開示内容は、出典明記により本明細書中に組み込まれる。一つの更なる好適な実施態様では、病原性微生物由来の少なくとも一の抗原が、ＨＩＶのポリペプチド、インフルエンザウイルスのポリペプチド、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスのポリペプチド、トキソプラズマのポリペプチド、マラリヤ原虫のポリペプチド、三日熱マラリアのポリペプチド、卵形マラリア原虫のポリペプチド、クラミジアのポリペプチド、四日熱マラリア原虫のポリペプチドないしはインフルエンザＭ２タンパク質、これらポリペプチドの変異体、及びこれらポリペプチドの断片である。したがって、ある態様では、本発明は、感染性疾患を予防及び／又は治療するためのワクチンとしての本発明の修飾されたＶＬＰの使用を提供する。このワクチンは動物又はヒトに投与されうる。好適な動物は、家畜動物ないしは愛玩動物、例えば限定するものではないが、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ及びニワトリである。
【００３０】
ある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原は、インフルエンザＭ２タンパク質の細胞外ドメインを含有するか、基本的にそれからなるか、それからなる。ある好適な実施態様では、Ｍ２タンパク質の細胞外ドメインはＡＰ２０５バクテリオファージのコートタンパク質又はそのムテインないしは断片のＮ末端に融合する。ある好適な実施態様では、少なくとも一抗原は、インフルエンザＭ２タンパク質の細胞外ドメインの断片を含有するか、基本的にそれからなるか、あるいはそれからなるものであり、該断片は、インフルエンザＭ２タンパク質の細胞外ドメインの配列のうちの少なくとも５，好ましくは少なくとも７、より好ましくは少なくとも１０の連続したアミノ酸を有する。さらに好適な実施態様では、前記のインフルエンザＭ２タンパク質の細胞外ドメインの断片は、該細胞外ドメインの半分のＮ末端を含有する。ある好適な実施態様では、インフルエンザＭ２タンパク質の細胞外ドメインは配列番号４３に記載の配列からなる。一つの更なる好適な実施態様では、インフルエンザＭ２タンパク質の細胞外ドメインは配列番号４３に記載の配列からなり、その配列番号４３の最大３アミノ酸残基が欠損、内部付加又は置換されているものである。
ある好適な実施態様では、少なくとも一抗原は、直列のＭ２タンパク質、好ましくは直列のＭ２二量体、あるいは直列のＭ２三量体を含有するか、基本的にそれからなるか、それからなる。この実施態様は、Ｍ２ペプチドに対して誘発される免疫応答を亢進しうる。一つの更なる好適な実施態様では、さらに少なくとも一の抗原は少なくとも一のスペーサーを含有しており、該スペーサーはＭ２ペプチド間に位置する。好ましくは、スペーサーは最大１５アミノ酸、好ましくは最大１０、より好ましくは最大８、最大６、より好ましくは最大４アミノ酸である。
【００３１】
本発明のある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原は、Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)大表面タンパク質のＰｒｅＳ１領域由来のペプチドであるＰｒｅＳ１(ａａ２１−４７)(PLGFFPDHQLDPAFRANTANPDWDFNP、配列番号６２)を含有するか、それからなる。ヒトＨＢＶのエンベロープは、小(Ｓ)、中(Ｍ)、大(Ｌ)の表面タンパク質と称される３つの両辺共有のタンパク質を含有する。Ｓタンパク質は３つの中で最も豊富にあるものであり、２２６アミノ酸からなる。Ｍタンパク質はＳタンパク質配列とＮ末端に付加される５５のアミノ酸を含有してなる。５５のアミノ酸配列はＰｒｅＳ２配列と称される。Ｌタンパク質はＳ及びＰｒｅＳ２配列とＮ末端に付加される１１９(又はＨＢＶサブタイプによっては１０８)のアミノ酸を含有しており、ＰｒｅＳ１配列と称される。今のところ肝細胞レセプターを同定するためのＨＢＶ結合部位はＰｒｅＳ１領域内、アミノ酸２１と４７の間に位置することが示されている(Shouval, D., 2003, Journal of Hepatology 39. S70-S76)。
Ｂ型肝炎は、世界的に３５０万人以上の人々が慢性的に感染している、重大な健康問題である。Ｂ型肝炎ウイルスに慢性的に感染すると、肝硬変及び肝癌などの多くの疾患が起こる。
【００３２】
ある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原は、ＨＩＶタンパク質又はその断片ないし変異体である。有用なＨＩＶ抗原には、ｐ１７-ＧＡＧ、ｐ２４-ＧＡＧ、ｐ１５-ＧＡＧ、プロテアーゼ、逆転写酵素(RT)、インテグラーゼ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、ｇｐ-４１-Ｅｎｖ、ｇｐ-１２０-Ｅｎｖ及びＮｅｆが含まれる(Addo, M.M. 等, J. Virol. 77: 2081-2092 (2003))。ＨＩＶ抗原ｐ２４-ＧＡＧ及びＮｅｆは最も高いエピトープ密度を有していることが明らかとなっている(Addo, M.M. 等, J. Virol. 77: 2081-2092 (2003))。本発明の好適な実施態様では、したがって抗原はｐ２４-ＧＡＧ-ＣＴＬ及び／又はＮＥＦ-ＣＴＬ及び／又はＴｈ細胞エピトープを含有する。Ｔｈ細胞エピトープはＣＴＬ応答の誘発及び維持に関与すると思われる。ＨＩＶ ＣＴＬエピトープ及びＨＩＶコンセンサス配列は、データベース(例えば、ウェブサイト：http://hiv-web.lanl.gov/seq-db.html)及び、参考文献「The Identification of Optimal HIV-Derived CTL Epitopes in Diverse Populations Using HIV Clade-Specific Consensus」(, I-1-20頁、HIV Molecular Immunology 2001. Edited by: Korber BTK, Brander C, Haynes BF, Koup R, Kuiken C, Moore JP, Walker BD, and Watkins D.)から選択することができる。ワクチン接種の際に誘発されるＴ細胞応答を増殖アッセイ(Ｔｈ細胞応答について、Belshe R.B. 等, J. Inf. Dis. 183: 1343-1352 (2001))、ELISPOTアッセイ(Oxenius, A. 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 13747-13752 (2002))、又は細胞障害性アッセイ(Belshe R.B. 等, J. Inf. Dis. 183: 1343-1352 (2001))で評価する。
【００３３】
ある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原は、ＨＩＶのポリペプチドを含有するか、それからなる。本明細書中で用いられる「ＨＩＶのポリペプチド」なる用語は、同じないしは異なるＨＩＶポリペプチド由来の少なくとも２つのＨＩＶエピトープの組合せを指し、該少なくとも２つのＨＩＶエピトープが一ポリペプチド内に融合しているものである。さらに好適な実施態様では、ポリペプチドはＡＰ２０５コートタンパク質又はそのムテインのＣ末端に融合されている。ある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原はＨＩＶ Ｎｅｆ由来のポリペプチドである。さらに好適な実施態様では、Ｎｅｆ由来のポリペプチドはＮｅｆ５５(配列番号２３)である。更なる好適な実施態様では、少なくとも一の抗原Ｎｅｆ５５はＡＰ２０５コートタンパク質のＣ末端に融合されている。他の好適な実施態様では、少なくとも一の抗原はＨＩＶ Ｇａｇ由来のポリペプチドである。さらに好適な実施態様では、ＨＩＶ Ｇａｇ由来のポリペプチドはｇａｇ Ｇ５０(配列番号１１９)である。更なる好適な実施態様では、ＨＩＶ Ｇａｇ由来のポリペプチドはペプチドの溶解性を上げるためにＣ末端にリジン残基を付加しているｇａｇ Ｇ５０(配列番号１２０)である。
【００３４】
ある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原は、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１６０由来のペプチドを含有するか、基本的にそれからなるか、それからなり、該ペプチドがすべてのＨＩＶ株の間で高く保存(７０％以上の保存)されているものであるか、該ペプチドが中和抗体を誘発するか、該ペプチドがブロックペプチドであることが好ましい。更なる好適な実施態様では、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０又はｇｐ４１由来のペプチドは、以下からなる群から選択されるものである。
(a) HIV env 1：SLEQIWNNMTWMQWDK (配列番号98)；
(b) HIV env 2：SLEQIWNNMTWMQWDR (配列番号99)；
(c) HIV env 3：IWNNMTWMQWDR (配列番号100)；
(d) HIV env 4：WASLWNW (配列番号101)；
(e) HIV env 5：NWFDISNWLW (配列番号102)；
(f) HIV env 6：LLELDKWASLWNWFNL (配列番号103)；
(g) HIV env 7：ELDKWA, (配列番号104)；
(h) HIV env 8：WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL (配列番号105)；
(i) HIV env 9：CSKLIC (配列番号106)；
(j) HIV env 10：GFLGAAGSTMGAASITLVQ (配列番号107)；
(k) HIV env 11：QQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQL (配列番号108)；
(l) HIV env 12：GIVQQQ (配列番号109)；
(m) HIV env 13：QLLGIWGCSGKLICTTAVPWNSSWS (配列番号110)；
(n) HIV env 14：NAKTIIVQLNQSVE (配列番号111)；
(o) HIV env 15：GGNSNNESEIFRPGGGD (配列番号112)；及び
(p) HIV env 16：VAPTKAKRRVVQREKRAVGIGALFLGFLGAAGSGC (配列番号113)
【００３５】
ある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原は少なくとも一の自己抗原に対する免疫応答を誘発するために適するものであり、この少なくとも一の抗原は自己抗原又はその変異体あるいは断片であることが好ましい。疾患、特に自己抗原の過剰産生ないしは機能不全による自己免疫性疾患、慢性炎症性疾患の例は、特許出願国際公開公報02/056905の５３頁の最終段落に開示されている。
本発明の更なる好適な実施態様では、自己抗原は、(a) リンホトキシン(好ましくはリンホトキシンα(ＬＴα)、リンホトキシンβ(ＬＴβ))；(b) リンホトキシンレセプター；(c) 核因子ｋＢリガンド(ＲＡＮＫＬ)のレセプター活性化因子；(d) 血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)；(e) 血管内皮成長因子レセプター(ＶＥＧＦ-Ｒ)；(f) インターロイキン-５；(g) インターロイキン-１７；(h) インターロイキン-１３；(i) ＩＬ-２３ ｐ１９；(j) グレリン；(k) ＣＣＬ２１；(l) ＣＸＣＬ１２；(m) ＳＤＦ-１；(n) Ｍ-ＣＳＦ；(o) ＭＣＰ-１；(p) エンドグリン；(q) ＧｎＲＨ；(r) ＴＲＨ；(s) エオタキシン；(t) ブラジキニン；(u) ＢＬＣ；(v) 腫瘍壊死因子α；(w) アミロイドβペプチド(Ａβ１−４２)；(x) Ａβ１−６；(y) アンギオテンシン；(z) ＣＣＲ５細胞外ドメイン；(aa) ＣＸＣＲ４細胞外ドメイン；(bb) ガストリン；(cc) ＣＥＴＰ；(dd) Ｃ５ａ；(ee) ブラジキニン；(ff) Ｄｅｓ-Ａｒｇブラジキニン；(gg) (a)−(ff)の断片；(hh) (a)−(ff)の変異体、からなる群から選択されるものである。前述の自己抗原又はその断片ないしは変異体については国際公開公報02/056905の５６頁の最終段落から８６頁の第一段落に詳しく開示されている。この開示内容は出典明記によって本明細書中に組み込まれる。
【００３６】
ある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原は、PCT/EP2005/004980に記載されるように、ＩＬ-２３ ｐ１９タンパク質又はより好ましくはＩＬ-２３ ｐ１９断片であり、その内容は出典明記により本明細書中に組み込まれる。本発明に有用で具体的かつ好適な断片は、PCT/EP2005/004980に開示される、配列番号４−１５、配列番号５２及び５３である。
ある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原はＧｎＲＨないしはその断片である。ワクチンの産生に有用なＶＬＰ-ＧｎＲＨコンジュゲートはPCT/EP2005/053858に開示されており、その内容は出典明記により本明細書中に組み込まれる。好適な実施態様では、GnRH (EHWSYGLRPG (配列番号２０)又はQHWSYGLRPG (配列番号１１４))がＡＰ２０５のコートタンパク質のＣ末端に融合されている。少なくとも一の抗原としてＧｎＲＨを含有する修飾されたＶＬＰは、雄ブタの肉質の汚染を防ぐためにブタなどの哺乳動物に投与されうる。ＧｎＲＨを含有する修飾されたＶＬＰは、繁殖行動及び／又は繁殖能力を低減するためにイヌ、ネコ、ヒツジ、ウシなどの動物に投与されうる。ＧｎＲＨを含有する修飾されたＶＬＰは、性腺ステロイドホルモン依存性の癌を有するヒトに投与されうる。
【００３７】
ある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原はグレリン又はその変異体ないしは断片である。肥満及び摂食増加や体重増加に関する他の疾患の治療のためのワクチンの産生に有用なＶＬＰ-グレリンコンジュゲートは、ＰＣＴ特許出願公開番号WO04/009124に開示されており、その内容は出典明記により本明細書中に組み込まれる。本発明に有用で具体的かつ好適なグレリンペプチドないしは断片は、WO04/009124の配列番号３１−３２、４８−５６、５９−６３及び１１１−１１９、並びにネコグレリン又はその変異体ないしは断片、イヌグレリン又はその変異体ないしは断片である。ある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原は配列番号５４のヒトグレリンないしは、イヌやネコなどの他の哺乳動物の相対物オルソログのアミノ酸配列を有するグレリンである。一つの更なる好適な実施態様では、少なくとも一の抗原は配列番号５４のアミノ酸３−７を含有するグレリン断片である。好適には、前記グレリン断片は、合計で最大２８、好ましくは最大２５、より好ましくは最大２０のアミノ酸である。一つの更なる好適な実施態様では、グレリン断片は、配列番号５４のアミノ酸３−７を含有し、配列番号５４の１８の近接するアミノ酸、好ましくは１６の近接するアミノ酸、より好ましくは１４の近接するアミノ酸を含有するか好ましくはこれらからなるものである。ある好適な実施態様では、グレリン断片は配列番号５５に記載のアミノ酸を含有するかあるいはこれらからなる。ある好適な実施態様では、グレリン断片は配列番号５６に記載のアミノ酸を含有するかあるいはこれらからなる。ある好適な実施態様では、グレリン断片は配列番号５７に記載のアミノ酸を含有するかあるいはこれらからなる。ある好適な実施態様では、グレリン断片はイヌの配列番号５８及びネコの配列番号５９に記載のアミノ酸を含有するかあるいはこれらからなる。
【００３８】
ある具体的で好適な実施態様では、少なくとも一の抗原がアンギオテンシン又はその変異体ないしは断片である。高血圧の治療のためのワクチンの産生に有用なＶＬＰ-アンギオテンシンコンジュゲートはＰＣＴ特許出願公開番号WO03/031466に開示されており、その内容は出典明記により本明細書中に組み込まれる。本発明に有用で具体的かつ好適なタンパク質ないしは断片は、Angio I: DRVYIHPF (配列番号１５)、Angio XVIII: DRVYIHP (配列番号１１５)及びアンギオテンシンI: DRVYIHPFHL (配列番号１１６)である。ある好適な実施態様では、Angio IはＡＰ２０５コートタンパク質のＣ末端に融合する。
ある具体的で好適な実施態様では、少なくとも一の抗原はアミロイドβペプチド断片を含有するかそれからなるものである。ある具体的で好適なその断片はＡβ１−６(DAEFRH、配列番号１１７)であり、ＰＣＴ特許出願公開番号WO04/016282に開示されており、その内容は出典明記により本明細書中に組み込まれる。
ある具体的で好適な実施態様では、少なくとも一の抗原はＴＮＦ-α又はその変異体ないしは断片を含有するか、それからなるものである。本発明に有用なＴＮＦ-αの好適な断片はPCT/EP2005/005935及びPCT/EP2005/005936に開示されている。これら２つの出願の全体の内容は出典明記により本明細書中に組み込まれる。ある非常に好適な実施態様では、少なくとも一の抗原はマウスＴＮＦ-α配列のアミノ酸４−２３(配列番号４１)である。一つの更なる好適な実施態様では、抗原は、ＡＰ２０５のコートタンパク質のＣ末端に融合されている。本発明のある好適な実施態様では、修飾されたＶＬＰは少なくとも一の融合タンパク質を含有しており、この融合タンパク質は配列番号４１を含有しており、ヒトのワクチンとして用いられる。
【００３９】
ある好適な実施態様では、前記の少なくとも一の抗原はＣＸＣＲ４、好ましくはＣＸＣＲ４細胞外ドメイン、より好ましくはＣＸＣＲ４細胞外ドメインの断片である。ＬＥＳＴＲやｆｕｓｉｏｎとしても知られるケモカインレセプターＣＸＣＲ４は、７つの膜貫通ドメインを有するＧプロテイン結合レセプターのファミリーに属する(Federsppiel 等 (1993), Genomics 16:707)。ＣＸＣＲ４の公知のリガンドはＳＤＦ-１である(Pelchen-Mattews, 等 (1999) Immunol. Rev. 168:33)。ＣＸＣＲ４は後になってＨＩＶのコレセプターとして同定された(Feng 等 (1996) Science 272:872)。したがって、侵入にＣＸＣＲ４が必要なＨＩＶ株はＸ４株に分類される。ＳＤＦ-１はＨＩＶ-１の侵入をブロックすることが知られている(Oberlin 等 (1996), Nature 382:833；Bleul, 等 (1996) Nature 382:829)。
本発明のある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原がＣＸＣＲ４細胞外ドメインの断片を含有するか、それからなるものである。ＣＸＣＲ４細胞外ドメインの断片は少なくとも６、７、好ましくは少なくとも８、９、１０アミノ酸を有し、ＣＣＲ５細胞外ドメインの断片は３０未満、好ましくは２０、より好ましくは１５、さらにより好ましくは１２アミノ酸を有する。
【００４０】
ある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原はＣＸＣＲ４のＮ末端細胞外ドメインを含有するか、それからなるものである。一つの更なる好適な実施態様では、ＣＸＣＲ４のＮ末端細胞外ドメインは配列番号４８を含有するか、それからなる。ある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原はＣＸＣＲ４細胞外ドメインＥＣＬ２の断片を含有するか、それからなる。好適には、前記の断片は少なくとも６、好ましくは７のアミノ酸を有する。更なる好適な実施態様では、少なくとも一の抗原は、配列番号４９のアミノ酸配列を有するＣＸＣＲ４細胞外ドメインＥＣＬ２の断片を含有するか、それからなる。
本発明のある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原はＣＣＲ５、好ましくはＣＣＲ５細胞外ドメイン、より好ましくはＣＣＲ５細胞外ドメインの断片である。ＨＩＶ Ｒ５株は、マクロファージ及びＣＤ４＋Ｔ細胞に接着して侵入するために細胞表面分子ＣＤ４及びＣＣＲ５を用いる。ＣＣＲ５は、ＰＮｔ、ＥＣＬ-１、ＥＣＬ-２及びＥＣＬ-３とそれぞれ称される４つの細胞外ドメイン：Ｎ末端配列及び細胞外領域に露出された３つのループを有する７膜貫通型レセプターである。
ある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原はＣＣＲ５細胞外ドメインの断片を含有するか、それからなる。ＣＣＲ５細胞外ドメインの断片は少なくとも６、７、好ましくは少なくとも８、９、１０のアミノ酸を有しており、ＣＣＲ５細胞外ドメインの断片は３５未満、好ましくは３０未満、好ましくは２０未満、より好ましくは１５未満、さらにより好ましくは１２未満のアミノ酸を有する。
【００４１】
ある好適な実施態様では、ＣＣＲ５細胞外ドメインの断片はＥＣＬ２Ａを含有するか、それからなる。一般的に当分野で理解されるＥＣＬ２Ａは、ＥＣＬ２の第一アミノ酸から開始し、ＥＣＬ２のシステインの直前のスレオニンで停止するのが好ましい。一つの更なる好適な実施態様では、ＥＣＬ２Ａは配列番号４６を含有するか、あるいはそれからなる。ある好適な実施態様では、本発明の抗原は、ＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔを含有するか、それからなる。一つの更なる好適な実施態様では、ＰＮｔドメインは配列番号４５を含有するか、好ましくはそれからなる。ある好適な実施態様では、本発明の抗原は、ＣＣＲ５細胞外ドメインＥＣＬ２を含有するか、それからなる。一つの更なる好適な実施態様では、ＥＣＬ２ドメインは配列番号９１を含有するか、好ましくはそれからなる。好ましくは、あるいは、ＰＮｔ又はＥＣＬ２配列内の天然に生じるシステインはセリンに置換されている。
本発明のある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原はガストリン及び／又はプロガストリンである。ガストリン(Ｇ１７)は、大腸や膵臓に微量に存在する古典的な内臓ペプチドホルモネーゼのグループにある(Koh , Regulatory Peptides. 93, 37-44 (2000))。ガストリンはその前駆体であるプロガストリン(Ｇ３４)からプロセシングされる。ガストリンとプロガストリンは何れもＣ末端グリシン伸展型及びＣ末端フェニルアラニンアミド化型で存在する。ガストリンは胃酸の分泌を刺激する能力についてよく知られている(Pharmacol Ther. 98, 109-127 (2003))。近年のデータから、ガストリンが消化器系の癌の発達を促すであろうことが示唆される。
【００４２】
ある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原は、Ｇ１７(配列番号４７)を含有するか、好ましくはそれからなる。一つの更なる好適な実施態様では、少なくとも一の抗原はＣ末端にグリシンが付加されているＧ１７を含有するか、それからなる。ある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原は、プロガストリンＧ３４(配列番号６０)を含有するか、それからなる。一つの更なる好適な実施態様では、少なくとも一の抗原は、Ｃ末端にグリシンが付加されているＧ３４を含有するか、それからなる。ある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原は、好ましくはＣ末端に融合されるリンカー配列を有する、より好ましくはＣ末端に融合されるリンカー配列SSPPPPCを有するＧ１７ １−９断片(配列番号６１)を含有するか、それからなる。
ガストリン配列の一部としての配列EGPWLEEEEの何れかの位置のＥは、Ｅ、ｐｙｒｏＥ又はＱである。付加されるアミノ酸がEGPWLEEEEのＮ末端に融合される場合、配列EGPWLEEEEの何れかの位置にあるＥがＥ又は好ましくはＱでありうる。
【００４３】
本発明のある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原がＣ５ａである。７４アミノ酸で、４ヘリックス束糖タンパク質であるＣ５ａ(Fernandez及びHugli, J. Biol. Chem. 253, 6955-6964, 1978)は、感染性の微生物と戦う局所的な炎症を誘導するための細胞系、特に好中球、内皮細胞及びマクロファージへの多様な作用の生成を担っている(Ward P., Nat.Rev. Immunol. 4:133, 2004)。しかしながら、同様に、敗血症における過剰なＣ５ａの生成により好中球に重大な機能的欠損が起こる(Czermak 等, Nat. Med. 5:788, 1999；Huber-Lang 等, J. Immunol. 166:1193, 2001)。また、Ｃ５ａの亢進した活性は、一次及び／又は慢性の炎症性疾患、例えば関節リウマチ(Jose P. Ann Rheum. Dis. 49:747, 1990)、乾癬(Takematsu H., Arch. Dermatol. 129:74, 1993)、成人呼吸窮迫症候群(Langlois P., Heart Lung 18:71, 1989)、再灌流障害(Homeister, J. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34:17, 1994)、ループス腎炎、類天疱瘡の多くと関係している。ある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原はＣ５ａを含有するか、それからなる。ある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原はＣ５ａ断片を含有するか、それからなる。一つの更なる好適な実施態様では、Ｃ５ａ断片は配列番号５０に記載のアミノ酸配列を有する。
【００４４】
本発明のある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原はＣＥＴＰである。コレステロールエステル転移タンパク質(ＣＥＴＰ)は、高密度リポタンパク質(ＨＤＬ)粒子とａｐｏＢ豊富な粒子、例えば非常に低密度のリポタンパク質(ＶＬＤＬ)粒子又は低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)粒子）との間でコレステロールエステル(ＣＥ)及びトリグリセライド(ＴＧ)の交換を媒介する血漿糖タンパク質である。小分子インヒビター、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は能動免疫化を用いたウサギのＣＥＴＰ活性の阻害により、相次いで抗アテローム生成効果が示されている(Barter, P.J. 等 (2003) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 23: 160-167)。
ある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原は配列番号：５１のアミノ酸配列を有するＣＥＴＰ断片を含有するか、それからなる。
ある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原はブラジキニンを含有するか、それからなる。ブラジキニン(ＢＫ、KRPPGFSPFR、配列番号５２)は、主要な血管拡張因子ペプチドであって、血圧、血流及び血管透過の局所的な調節機能において、重要な役割を果たす(Margolius H.S, 等, Hypertension, 1995)。さらに、ブラジキニンのいくつかの他の生物学的活性は、平滑筋の収縮と緩和、痛覚と痛覚過敏の誘導及び炎症反応の調節などが記載されている。ブラジキニンはＢ２-レセプターを介してその効果を及ぼす。
【００４５】
本発明のある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原はｄｅｓ-Ａｒｇ９-ブラジキニンを含有するか、それからなる。ｄｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫ(KRPPGFSPF、配列番号５３)はブラジキニンの異なる機能と重なり合う機能の両方を有する。所見から、ｄｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫが組織損傷の後に急速に生成され、炎症性過程、例えば血管拡張作用、血管透過の増加、血漿管外遊出、細胞移動、疼痛及び痛覚過敏などで観察される大部分の現象を調整することが示唆される(Calixto J.B. 等, Pain 2000)。Ｄｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫはＢ１-レセプターを介してその効果を示す。さらに、炎症性過程におけるｄｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫの重要性は、肋膜炎症のモデルのＢ１Ｒ−／−マウスが急性の炎症反応が非常に減少を示すという所見により強く裏付けられる。(Pesquero J.B. 等, PNAS, 2000)。
ＢＫ とＤｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫは、一次及び慢性の炎症性疾患、特にウイルスなどの特定の抗原やアレルゲンによって誘発される気道炎症及び関節炎に役割がある。
【００４６】
本発明のある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原はアレルギーに対する免疫応答を誘発するために適しており、好ましくは少なくとも一の抗原はアレルゲン又はその変異体ないしは断片である。一つの更なる好適な実施態様では、少なくとも一の抗原は、(a) ミツバチの針アレルギーに伴われるポリペプチド、(b) 木の実アレルギーに伴われるポリペプチド、(c) 食物アレルギーに伴われるポリペプチド、(d) 喘息に伴われるポリペプチド、(e) ハウスダストダニアレルギーに伴われるポリペプチド、(f) 花粉アレルギーに伴われるポリペプチド、(g) (a)から(d)の変異体、及び(f) (a)から(d)の断片からなる群から選択されるものである。よりさらに好適な実施態様では、少なくとも一の抗原は、(a) ホスホリパーゼＡ２タンパク質、(b) Ｂｅｔ ｖ Ｉ(カバノキ花粉抗原)、(c) Ｄｏｌ ｍＶ(クロスズメバチ毒物アレルゲン)、(d) Ｍｅｌｌｉｔｉｎ、(e) Ｄｅｒ ｐ Iペプチド(ハウスダストダニアレルゲン)、(f) (a)から(e)の変異体、及び(g) (a)から(e)の断片、からなる群から選択されるものである。
ある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原がポリペプチド毒に対する免疫応答を誘発するために適しており、好ましくは少なくとも一の抗原がポリペプチド毒又はその断片ないしは変異体である。
【００４７】
本発明のある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原がポリペプチドホルモンに対する免疫応答を誘発するために適しており、好ましくは少なくとも一の抗原がポリペプチドホルモン又はその断片ないしは変異体である。
本発明のある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原が畜産動物又は愛玩動物の免疫応答を誘発するために適するものである。更なる好適な実施態様では、この抗原は、(a) 畜産動物又は愛玩動物の癌細胞に対する免疫応答を誘発するために適した抗原；(b) 畜産動物又は愛玩動物に感染する少なくとも一の病原性微生物に対する免疫応答を誘発するために適した抗原；(c) 畜産動物又は愛玩動物の少なくとも一の自己抗原に対する免疫応答を誘発するために適した抗原；及び(d) ポリペプチド毒又はポリペプチドホルモンに対する免疫応答を誘発するために適した抗原、からなる群から選択されるものである。本出願に開示されるような本発明に有用な抗原の例は、ヒト又は動物起源のものであり、したがって、後者は本発明の修飾されたＶＬＰが動物のワクチンとして用いられる場合、本発明の好適な実施態様である。「動物」なる用語は、例えばヒト、ヒツジ、エルク、シカ、ラバミンク、サル、ウマ、雄ウシ、ウシ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、ニワトリ、カモ、ラット及びマウスなどを意味する。好適な動物は、脊椎動物であり、より好適な動物は真獣類であり、さらにより好適な動物は哺乳動物である。
【００４８】
本発明のある好適な実施態様では、本発明の融合タンパク質がさらにスペーサーを含有し、該スペーサーが前記の第一ポリペプチドと前記の第二ポリペプチドの間に位置する。スペーサーの選択は、本発明の抗原の性質、その生物学的な性質、例えばｐＩ、電荷分布及びグリコシル化に依存するであろう。一般的に、可動性(フレキシブルな)スペーサーが好ましい。スペーサーは好ましくはたった３０、より好ましくはたった１５アミノ酸である。スペーサーで用いるためにはグリシンとセリン残基が特に好ましいアミノ酸であり、好適にはスペーサーは少なくとも一グリシン又は少なくとも一セリン残基を含有する。他のアミノ酸、好適にはアラニン、スレオニン及び荷電型アミノ酸がスペーサーに含有されてもよい。場合によっては、プロリンもスペーサーに含有されてもよい。通常、スペーサーはＡＰ２０５のコートタンパク質と少なくとも一の抗原との間隙を増やすために付加される。さらに、スペーサーは付加的な可動性を与えるものであり、これによってＡＰ２０５のコートタンパク質の配列内への少なくとも一の抗原の融合による潜在的な不安定さが低減され、少なくとも一の抗原の存在によるアッセンブリの阻害が減少する。
【００４９】
第一ポリペプチドと第二ポリペプチドの間のスペーサーの遺伝子操作は組み換えＤＮＡ技術によって達成できる。例えば、ある便利な方法は、本発明の少なくとも一の抗原をクローニングするために用いるプライマー配列内にスペーサーをコードするヌクレオチド配列を組み込むことである。あるいは、スペーサーをコードするヌクレオチド配列を発現ベクター内にＡＰ２０５のコートタンパク質をクローニングするために用いるプライマー配列内に組み込んでもよい。この結果、Ｎ末端とＣ末端の何れかに融合されたスペーサーを有するＡＰ２０５のコートタンパク質を発現するプラスミドが生じる。
ある好適な実施態様では、スペーサーは最大１５アミノ酸、好ましくは最大１３、より好ましくは最大１１、さらにより好ましくは最大８アミノ酸、さらにより好ましくは最大４、よりさらに好ましくは最大３アミノ酸を有する。
本発明のある好適な実施態様では、スペーサーのアミノ酸配列は、(a) GSGG；(b) GSG；(c) GTAGGGSG；(d) SGG及び(e) GSGTAGGGSGSからなる群から選択されるものである。
【００５０】
ある好適な実施態様では、少なくとも一の抗原は抗原の何れかの一端に少なくとも一、好ましくは一システインが隣接している。隣接するシステインは、抗原内に天然に生じるものか、あるいは人工的に抗原に付加することができる。これによって、２つの隣接するシステイン間に形成されるジスルフィド結合によって環状型の抗原が提示される。これは天然に存在する抗原の立体構造に類似している。望ましくないジスルフィド結合形成を妨げるために、抗原内の天然に生じるシステインは、置換によって抗原の免疫原性が変化しないように、好ましくは保存的な置換、より好ましくはセリンによって置換されるのが好ましい。例えば、ＣＣＲ５のＥＣＬ２ドメインは、７膜貫通型レセプターの第二細胞外ドメインとして天然に存在する。したがって、ある好適な実施態様では、第二ポリペプチドは環状ＥＣＬ２又は環状ＥＣＬ２ａを含有するか、それからなる。一つの更なる好適な実施態様では、第二ポリペプチドは配列番号７３、配列番号１１６又は配列番号７４を含有するか、それからなる。
【００５１】
抗原に隣接する２つのシステイン間のジスルフィド結合の形成は、１０ｍＭ ＤＴＴの存在下にて修飾されたＶＬＰを精製して、その後、ジスルフィド結合形成が可能となるｐＨを有し(ｐＨ６．５〜９、好ましくは６．８〜８．５、例えば、５０ｍＭ トリス、１５０ｍＭ Ｎａｃｌ、ｐＨ８．０)、酸化型グルタチオン及び還元型グルタチオン(レドックスシャッフル)の混合物又はジスルフィド結合形成を触媒する他の薬剤、例えばシスチン及びシステインのレドックスシャッフルを含有する酸化バッファーにて透析することによって促すことができる。レドックスシャッフルは、例えば０．１から５ｍＭの還元型グルタチオンと０．１から５ｍＭの酸化型グルタチオンを含有してもよい。好ましくは、シャッフルが酸化されている。還元型グルタチオンに対する酸化型グルタチオンの有用な比率は、例えば、(ｍＭの単位で)5/0.2、5/0.5、5/1、5/2、1/1、2/2、1/0.2、1/0.5、2/0.2、2/0.5、2/1である。選択的な方法では、システインは酸化型グルタチオン(例えば１から５０ｍＭ)又は四チオン酸ナトリウム(例えば５ｍＭ)と反応し、過剰な試薬を除去するために透析されるものであり、ループ内ジスルフィド結合は、例えば還元型グルタチオン(０．１−５ｍＭ)、ジチオトレイトール(０．１−１０ｍＭ)、β-メルカプトエタノール(０．１−１０ｍＭ)又はシステイン(０．１−１０ｍＭ)によって触媒されるジスルフィド交換反応に収まる。その後さらに、酸化されたＶＬＰ調整物を、５０ｍＭ トリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０又はＰＢＳ又は２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２にてさらに透析し、誘発された抗体のエピトープ及び特異性を表出する免疫原性を試験するために、マウスに注射してもよい。
【００５２】
ジスルフィド結合の形成に適する条件は、ループ立体構造内のペプチドに特異的な抗体を用いて経験的に試験する。ある実験の設定では、ループ立体構造に酸化されたペプチドを表出する修飾されたＶＬＰをＥＬＩＳＡプレート上にコートし、上記の様々な条件のバッファーを用いてプレート上で試験し、最後に、ループ立体構造のペプチドに特異的な抗体を用いたＥＬＩＳＡにより評価する。
ある好適な実施態様では、第二ポリペプチドは、(a) インフルエンザウイルスＭ２ペプチド(配列番号４３)；(b) Ｂ型肝炎ウイルスＰｒｅ  Ｓ１ペプチド(配列番号６２)；(c) ＨＩＶ  Ｎｅｆポリエピトープ(配列番号２３)；(d) ＧｎＲＨ(配列番号２０)；(e) ガストリンＧ１７(配列番号４７)；(f) ネコグレリン(配列番号５９)；(g) イヌグレリン(配列番号５８)；(h) ＨＩＶ  Ｅｎｖペプチド１(配列番号９８)；(i) ＨＩＶ  Ｅｎｖペプチド２(配列番号９９)；(j) ＣＣＲ５ ＰＮｔ(配列番号４５)；及び(ｋ) ＣＣＲ５ ＥＣＬ２(配列番号９１)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有するか、基本的にそれからなるか、それからなるものである。
【００５３】
ある好適な実施態様では、本発明の修飾されたＶＬＰはモザイクＶＬＰである。一つの更なる好適な実施態様では、本発明の融合タンパク質に加えてモザイクＶＬＰは、さらに少なくとも一のタンパク質を含有し、該タンパク質のアミノ酸配列は本発明の融合タンパク質とは異なる。本発明の更なる好適な実施態様では、前記タンパク質はＡＰ２０５のコートタンパク質である。より更なる好適な実施態様では、前記タンパク質は、(a) 配列番号１；(b) 配列番号２；(c) 配列番号４２；(d) 配列番号６７；(e) 配列番号６８；(f) 配列番号６９；及び(g) 配列番号１又は６７のムテイン、からなる群から選択されるものである。ＡＰ２０５のコートタンパク質ないしはそのムテインによって、修飾されたＶＬＰ内への本発明の融合タンパク質のアッセンブリが容易になされ、形成された修飾されたＶＬＰが安定化される。一宿主細胞、好ましくは細菌内で異なる配列を持つタンパク質を発現させるための様々な方法が公知文献から提供される。ある好適な方法は、第一ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３'で、オパールコドンやアンバー停止コドンなどの停止させる停止コドンをインフレーム内に遺伝子操作することである。ヌクレオチド配列が細菌宿主内で発現される場合、２つの異なる長さのタンパク質が生成されるであろう。翻訳機構が停止コドンを認識して翻訳を停止した場合、ＡＰ２０５のコートタンパク質が生成されるであろう。翻訳機構が停止コドンを無視してｍＲＮＡを翻訳すると、本発明の融合物が産生されるであろう。
【００５４】
ある好適な実施態様では、本発明のバクテリオファージＡＰ２０５の修飾されたＶＬＰは、さらに少なくとも一の免疫賦活性物質を含有する。好ましくは、免疫賦活性物質はＴｏｌｌ様レセプターリガンドであり、(a) 免疫賦活性核酸；(b) ペプチドグリカン；(c) リポポリサッカリド；(d) リポテイコ酸；(e) イミダゾキノリン化合物；(f) フラゲリン；(g) リポタンパク質；(h) 免疫賦活性有機分子；(i) 非メチル化ＣｐＧ-含有オリゴヌクレオチド；及び(j) (a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)及び(i)の物質の混合物からなる群から選択されるのが好ましい。本発明の組成物における少なくとも一の免疫賦活性物質、好ましくは少なくとも一のＴｏｌｌ様レセプターリガンドの封入により、組成物の免疫原性が劇的に増加して、Ｂ及びＴ細胞応答が亢進される。したがって、少なくとも一の免疫賦活性物質をさらに含有する本発明の組成物は、アレルギー、腫瘍及び慢性ウイルス性疾患に対する予防ないしは治療のための新規のワクチン組成物であるといえる。
【００５５】
他の好適な実施態様では、免疫賦活性核酸は、(a) 細菌性起源の核酸；(b) ウイルス起源の核酸；(c) 非メチル化ＣｐＧモチーフを含有する核酸；(d) 二本鎖ＲＮＡ；(e) 一本鎖ＲＮＡ；及び(g) 非メチル化ＣｐＧモチーフのフリー核酸、からなる群から選択されるのが好ましい。非メチル化ＣｐＧモチーフを含有しない免疫賦活性核酸は、例えば国際公開公報01/22972に開示されており、その内容は出典明記によって本明細書中に組み込まれる。本明細書で用いられる「核酸」なる用語は、直線的に共有結合した単量体(ヌクレオチド)からなる分子を指す。ヌクレオチドの分子鎖を表し、生成物の特定の長さを意味するのではない。したがって、オリゴヌクレオチドは核酸の定義の範囲内に包含される。ヌクレオチド間の結合は、典型的に好ましくはホスホジエステル結合である。結合の修飾を含有する核酸、例えばホスホロチオエート結合も本発明に包含されるものである。
ある好適な実施態様では、免疫賦活性核酸は、(a) 免疫賦活性配列、特に隣接する塩基内の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド(ＣｐＧモチーフと称する)を含有する細菌ＤＮＡ、及び(b) 多種類のウイルスによって合成される二本鎖ＲＮＡ、からなる群から選択されるものが好ましい。一つの更なる好適な実施態様では、免疫核酸は二本鎖ＲＮＡポリＩ：Ｃを含有するか、基本的にそれからなるか、あるいはそれからなる。
【００５６】
ある好適な実施態様では、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、X1、X2、X3及びX4が任意のヌクレオチドである配列：5' X1X2CGX3X4 3'を含有してなる。好ましくは、オリゴヌクレオチドは約２０から約３００ヌクレオチドを含有するのが好ましい。ある好適な実施態様では、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはリン酸主鎖に一又は複数のホスホロチオエート修飾を含有する。選択的な好適な実施態様では、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはリン酸主鎖にホスホロチオエート修飾を欠いている。ある好適な実施態様では、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはTCCATGACGTTCCTGAATAAT (配列番号９４)を含有するか、それからなる。
更なる一つの好適な実施態様では、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、パリンドローム配列を含有するか、あるいは基本的にそれからなるか、あるいはそれからなる。更なる好適な実施態様では、前記パリンドローム配列はグアニンヌクレオチド、好ましくは少なくとも４又は６グアニンヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも８又は１０グアニンヌクレオチドが隣接する。ある好適な実施態様では、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはGGGGTCAACGTTGAAGGGGGG (配列番号９５)を含有するか、それからなる。
【００５７】
ある好適な実施態様では、前記パリンドローム配列は、GACGATCGTC (配列番号７０)を含有するか、あるいは基本的にそれからなるか、あるいはそれからなる。非常に好適な実施態様では、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (配列番号７１)を含有するか、あるいは基本的にそれからなるか、あるいはそれからなる。
他の有用な免疫賦活性核酸配列は公開された国際公開公報2004/085635に開示さており、その開示内容は出典明記によって本明細書中に組み込まれる。免疫賦活性物質、特に免疫賦活性核酸、より好ましくは非メチル化ＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチドについては、国際公開公報03/024480、国際公開公報03/024481及びPCT/EP/04/003165に詳述されている。
ある好適な実施態様では、免疫賦活性物質は修飾されたＶＬＰと混合される。他の好適な実施態様では、免疫賦活性物質は修飾されたＶＬＰに結合されているか、好ましくは内部にパッケージ化されている。免疫賦活性物質をＶＬＰ-抗原と混合する方法は国際公開公報03/024480に開示されている。免疫賦活性物質をＶＬＰ内部にパッケージ化する方法は国際公開公報03/024481に開示されている。国際公開公報03/024480、同03/024481及びPCT/EP/04/003165の出願内容は出典明記によって本明細書中に組み込まれる。さらに、パッケージ化された核酸とＣｐＧのそれぞれは分解から保護される、すなわちこれらはより安定である。さらに、先天性の免疫システムの細胞の非特異的活性は劇的に減少する。
【００５８】
一態様では、本発明は、本発明の修飾されたＶＬＰを含有するワクチン組成物を提供するものであり、該ワクチン組成物がさらにバッファーを含有するのが好ましい。一実施態様では、ワクチン組成物はさらにアジュバントを含有する。少なくとも一のアジュバントの投与は、本発明の組成物の投与の前、あるいはそれと同時、あるいはその後であってもよい。何れのアジュバントも樹状細胞のターゲティングを容易にし、樹状細胞を活性化するか、局所的な抗原貯蔵所の形成を誘発する物質を含有する。少なくとも一のアジュバントの例には、完全及び不完全なフロイントアジュバント、酸化アルミニウム三水和物、アルミニウム塩類及び変性ムラミルジペプチドなどがあり、好ましくはこれらからなる。さらに、アジュバントは、ミネラルゲル、例えば酸化アルミニウム三水和物、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール及び潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばＢＣＧ(カルメットゲラン桿菌)及びコリネバクテリウム・パルバムである。また、このようなアジュバントは当分野で公知である。さらに、本発明の組成物と共に投与されうるアジュバントは、一リン酸化脂質免疫修飾物質、ＡｄｊｕＶａｘ １００ａ、ＱＳ-２１、ＱＳ-１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩類(ミョウバン)、ＭＦ ５９、ＯＭ-１７４、ＯＭ-１９７、ＯＭ-２９４およびＶｉｒｏｓｏｍａｌアジュバント技術を含むが、これに限定されるものではない。さらにアジュバントは免疫賦活性核酸を含有するものであり、該免疫賦活性核酸が主鎖に一又は複数の修飾、好ましくはホスホロチオエート修飾を含有する。修飾は分解に対して核酸を安定化するものである。
【００５９】
また、アジュバントはこれらの物質の混合を含有しうる。しかしながら、本明細書の範囲内で用いられる「アジュバント」なる用語は、前記の修飾されたＶＬＰに加えて、応用できるならば、修飾されたＶＬＰ内にパッケージ化される免疫賦活性物質、好ましくは免疫賦活性核酸に加えて、本発明の修飾されたＶＬＰでない、応用できるならば、修飾されたＶＬＰ内にパッケージ化される免疫賦活性物質、好ましくは免疫賦活性核酸でないアジュバンドを指す。
ある好適な実施態様では、ワクチン組成物はアジュバントを欠いている。したがって、本発明のワクチン組成物の患者への投与は、該ワクチンの投与の前、あるいはそれと同時、あるいはその後に、同じ患者への少なくとも一のアジュバントを投与せずに行ってもよい。本発明の有利な特徴は、アジュバントがない場合においても組成物の免疫原性が高いことである。さらに、アジュバントがないと、ワクチン接種、特に自己抗原に対するワクチン接種の安全性を表す、不要な炎症性Ｔ細胞応答の発生を最小限にする。
【００６０】
さらに、本発明は、本発明のワクチンが動物又はヒトに投与されることを含む免疫化方法を開示する。動物は、好ましくはネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、イヌ、ラット、マウスなどの哺乳動物、特にヒトである。ワクチンは、当分野で公知の様々な方法によって動物又はヒトに投与されてもよいが、通常、注射、注入、吸入、経口投与又は他の適切な理学的方法によって投与されうる。コンジュゲートは、選択的に、筋肉内、静脈内、粘膜経由、鼻腔内、腹膜内又は皮下投与されてもよい。投与のためのコンジュゲート成分は、滅菌水(例えば、生理食塩液)又は非水溶溶及び懸濁液などである。非水溶性溶媒の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルなどがある。担体又は密封包帯を、皮膚透過性を増やして、抗原吸収を上げるために用いてもよい。
免疫応答の性質は、抗原の性質、体内への導入経路、用量及び投与計画、抗原の反復性性質、宿主のバックグラウンド又は免疫系のシグナル伝達因子に影響されうる。当分野の公知の理論と日常の経験との総合的な表れとして免疫応答が起こる。投与される個体に投与が合っていれば、本発明のワクチンは「製薬的に受容可能」であるといえる。さらに、本発明のワクチンは、「治療的に有効な量」(すなわち、所望の生理学的効果を示す量)で投与されうる。免疫応答の性質又は種類は本発明で開示される因子に限定するものではない。
【００６１】
他の態様では、本発明は、(a) 本発明の修飾されたＶＬＰ；と(b) 受容可能な製薬的担体を含有する薬剤組成物を提供する。本発明のワクチンが個体に投与される場合、コンジュゲートの有効性を改善するために望ましい他の物質、アジュバント、バッファー又は塩類を含有する形態でありうる。薬剤組成物の調整における使用に好適な材料の例は、REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Osol, A, ed., Mack Publishing Co., (1990))を含む多くの情報源に示される。
更なる一つの態様では、本発明は、個体の疾患、障害又は病理学的症状を治療又は予防する方法を提供するものであり、該方法は、本発明の修飾されたＶＬＰ、本発明のワクチン組成物又は本発明の薬剤組成物が、動物又はヒトに投与されることを含む。他の態様では、本発明は、動物又はヒトの疾患、障害又は病理学的症状を治療又は予防するための医薬を製造するための修飾されたＶＬＰの使用を提供する。
一態様では、本発明は、本発明の修飾されたＶＬＰの産生方法であって、(a) スペーサーをコードするヌクレオチド配列を、第一ポリペプチドをコードする第一ヌクレオチド配列又は第二ポリペプチドをコードする第二ヌクレオチド配列に(選択的に)インフレームで連結する；(b) 前記第二ヌクレオチド配列を前記第一ヌクレオチド配列にインフレームで連結した結果、前記の融合タンパク質をコードする第三ヌクレオチド配列を生じる；(c) 第一ヌクレオチド配列の３'で抑制される停止コドンを(選択的に)導入する；(d) 好ましくは結果として生じる発現されたタンパク質が前記の修飾されたウイルス様粒子を形成することができる条件下で、宿主内で該第三ヌクレオチド配列を発現させる；(e) (d)の工程で得られた該修飾されたウイルス様粒子を精製する、という工程を含む産生方法を提供する。
【００６２】
一態様では、本発明は、ポリペプチドを含有する融合タンパク質であって、該ポリペプチドがＡＰ２０５バクテリオファージのコートタンパク質ないしはそのムテインのＮ末端ないしはＣ末端、又はその両方に融合され、該ポリペプチドが好ましくは１−６０アミノ酸、好ましくは３−４０、より好ましくは５−３０、さらにより好ましくは１０−２５アミノ酸、さらにより好ましくは１−１５、さらにより好ましくは３−１５、より好ましくは１−１１、より好ましくは３−１１、より好ましくは１−８、より好ましくは３−８アミノ酸からなるものであり、該融合タンパク質がＶＬＰを形成することができる、融合タンパク質を提供する。
他の好適な実施態様では、ＡＰ２０５バクテリオファージのコートタンパク質ないしはそのムテインの末端に融合されるポリペプチドは、３０アミノ酸未満、好ましくは２０アミノ酸未満、より好ましくは１５アミノ酸未満、さらにより好ましくは１０アミノ酸未満を有する。
さらに好適なある実施態様では、ポリペプチドは、(a) 配列番号１；(b) 配列番号２；(c) 配列番号４２；(d) 配列番号６７；(e) 配列番号６８；(f) 配列番号６９；及び(g) 配列番号１又は６７のムテインからなる群から選択されるＡＰ２０５のコートタンパク質ないしはそのムテインのＮ末端ないしはＣ末端、又はその両端に融合される。
更なるある態様では、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を提供する。ムテインの一アミノ酸配列は、遺伝子コードの縮重のために一以上のヌクレオチド配列によってコードされるかもしれない。したがって、ムテインと同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列は本発明に包含される。
【実施例】
【００６３】
実施例１  ＡＰ２０５コートタンパク質のＮ末端又はＣ末端への抗原の融合のためのプラスミドの構築
以下に記載するクローニング作業においてＡＰ２０５コートタンパク質のＮ末端を指す場合、「Ｎ末端」なる用語は、開始メチオニンでなく第一アラニンを指す。
コンストラクト３７８-２：短いＧＳＧＧスペーサーと、ＡＰ２０５コートタンパク質のＮ末端の該スペーサーをコードする核酸配列内にＮｃｏＩ及びＫｐｎ２Ｉクローニング部位を付加。
これは、ｐＡＰ２８３-５８(配列番号３)を鋳型として、ＮｃｏＩ制限酵素部位を含有する上流プライマーｐ２.５６１(配列番号４)とＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を含有する下流プライマーｐ１.４６(配列番号５)を用いたＰＣＲによって構築した。ＰＣＲ断片をＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して、ｐＱｂ１８５内の同じ制限酵素部位内にクローニングして、プラスミドｐＡＰ３７８-２を生成した。
【００６４】
コンストラクト３８２-２：長いＧＳＧＴＡＧＧＧＳＧＳスペーサーと、ＡＰ２０５コートタンパク質のＮ末端の該スペーサーをコードする核酸配列内にＮｃｏＩ及びＫｐｎ２Ｉクローニング部位をＰＣＲによって付加。
これは、３７８-２を鋳型として、ＮｃｏＩ制限酵素部位を含有する上流プライマーｐ２.５８９(配列番号６)とＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を含有する下流プライマーｐ１.４６(配列番号５)を用いたＰＣＲによって構築した。ＰＣＲ断片をＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して、ｐＱｂ１８５内の同じ制限酵素部位内にクローニングして、プラスミドｐＡＰ３８２-２を生成した。
コンストラクト４０９-４４：短いＧＳＧスペーサーと、ＡＰ２０５コートタンパク質のＣ末端の該スペーサーをコードする核酸配列内にＫｐｎ２Ｉ及びＭｐｈ１１０３Ｉクローニング部位を付加。
これは、ｐＡＰ２８３-５８(配列番号３)を鋳型として、ＸｂａＩ制限酵素部位を含有する上流プライマーｐ１.４５(配列番号７)とＭｐｈ１１０３Ｉ制限酵素部位を含有する下流プライマーｐ２.５８７(配列番号８)を用いたＰＣＲによって構築した。ＰＣＲ断片をＸｂａＩとＭｐｈ１１０３Ｉで消化して、ｐＱｂ１０内の同じ制限酵素部位内にクローニングして、プラスミドｐＡＰ４０９-４４を生成した。
【００６５】
コンストラクト４０５-６１：長いＧＴＡＧＧＧＳＧスペーサーと、ＡＰ２０５コートタンパク質のＣ末端の該スペーサーをコードする核酸配列内にＫｐｎ２Ｉ及びＭｐｈ１１０３Ｉクローニング部位を付加。
これは、４０９-４４を鋳型として、ＸｂａＩ制限酵素部位を含有する上流プライマーｐ１.４５(配列番号７)とＭｐｈ１１０３Ｉ制限酵素部位を含有する下流プライマーｐ２.５８８(配列番号９)を用いたＰＣＲによって構築した。ＰＣＲ断片をＸｂａＩとＭｐｈ１１０３Ｉで消化して、ｐＱｂ１０内の同じ制限酵素部位内にクローニングして、プラスミドｐＡＰ４０５-６１を生成した。
コンストラクト３７８-２、３８２-２、４０９-４４、４０５-６１とその対応するプラスミドは、便宜上３７８ (ｐＡＰ３７８)、３８２ (ｐＡＰ３８２)、４０９ (ｐＡＰ４０９)及び４０５ (ｐＡＰ４０５)と称する。以下の実施例において、多種類の抗原を上記のベクター内にクローニングした。
粒子アッセンブリに対するリンカーの効果を試験するために、コンストラクト３７８のタンパク質を実施例２に記載のように発現させ、ＶＬＰへのアッセンブリをＥＭと免疫核酸(オークタロニー法)アッセイによって証明した。
【００６６】
実施例２  ＡＰ２０５融合タンパク質の発現
大腸菌ＪＭ１０９細胞を対応するＡＰ２０５融合タンパク質プラスミドにて形質転換させた。２０ｍｇ／ｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地内に、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含有する寒天上で生育させた個々のコロニーを播種し、振とうせずに３７℃で終夜培養させることによって種培養を調整した。例えば、終夜培養物を、casaminoacids (Difco)と２０ｍｇ／ｌのアンピシリンを添加したＭ９培地にて１：５０に希釈し、活発に通気しながら１４−２０時間、３７℃で培養物を生育させた。細胞を６０００ｒｐｍで１５−２０分間、４−８℃で遠心して回収した。
【００６７】
実施例３  Ｄ２ペプチドと融合したコートタンパク質の融合タンパク質を含有する修飾されたＶＬＰのクローニング、発現及び精製
ＡＰ２０５コートタンパク質のＣ末端のＤ２ペプチドのクローニング
Ｄ２ペプチドをコードするＤＮＡ断片(TSNGSNPSTSYGFAN、配列番号１０) を、２つのオリゴヌクレオチド−oligo２.１９６(配列番号１１)及びoligo ２.１９７(配列番号１２)とアニーリングさせて作製した。得られた断片をＫｐｎ２Ｉ及びＭｐｈ１１０３Ｉで消化して、ｐＡＰ４０９-４４及びｐＡＰ４０５-６１の、大腸菌トリプトファンオペロンプロモータの制御下にある同じ制限酵素部位内にクローニングした。結果として生じたコンストラクトは以下の通りである。
４１８-７ (４０９-４４ベース)：ＡＰ２０５コートタンパク質−GSG− Ｄ２ペプチド
４２０-２１ (４０５-６１ベース)：ＡＰ２０５コートタンパク質−GTAGGGSG−D２ペプチド
【００６８】
ＡＰ２０５コートタンパク質のＮ末端のＤ２ペプチドのクローニング
Ｄ２ペプチドをコードするＤＮＡ断片(TSNGSNPSTSYGFAN、配列番号１０) を、２つのオリゴヌクレオチド−oligo２.５９０(配列番号１３)及びoligo ２.５９１(配列番号１４)とアニーリングさせて作製した。得られた断片をＮｃｏＩ及びＫｐｎ２Ｉで消化して、ベクターｐＡＰ３７８-２及びｐＡＰ３８２-２の同じ制限酵素部位内にクローニングした。結果として生じたコンストラクトは以下の通りである。
４２１-８ (３７８-２ベース)：ＭＧ−Ｄ２ペプチド−GSGG−ＡＰ２０５コートタンパク質
クローニングの結果、配列番号１のアミノ酸１４がアスパラギン酸に変化した。
４２２-２ (３８２-２ベース)：ＭＧ−Ｄ２ペプチド−GSGTAGGGSGS−ＡＰ２０５コートタンパク質
以降、コンストラクト４１８-７、４２０-２１、４２１-８及び４２２-２を便宜上４１８、４２０、４２１及び４２２と称する。
【００６９】
精製
精製の前工程に用いる標準バッファーはＮＥＴバッファー：５ｍＭ ＥＤＴＡ及び１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  トリス-ＨＣｌ、ｐＨ７．８である。
細胞溶解物をＣＬ-４Ｂカラムにて精製し、プールした溶出分画をさらにＣｓＣｌ勾配超遠心によって精製した。精製したタンパク質の濃度をブラッドフォード試験によって測定した。
抗原の表出は阻害ＥＬＩＳＡにて試験した。この場合、ペプチドＤ２を、アミノ酸スペーサー(CGG)とクロスリンカーSPDPを介してＲＮアーゼにコンジュゲートして、ＥＬＩＳＡプレート上にコートし、一方Ｄ２ペプチドを表出するＶＬＰを、ＶＬＰ内にアッセンブリされたＤ２-ｆｒ融合タンパク質に対して生じた抗Ｄ２ウサギ抗血清と共にインキュベートした。ロバ抗ウサギＨＲＰコンジュゲートにて検出した。
４つすべての修飾されたＶＬＰ(短いスペーサー又は長いスペーサーの何れかを有するＮ末端又はＣ末端のＤ２ペプチド)は、ＲＮアーゼにコンジュゲートさせ、ＥＬＩＳＡによって示されるプレート上にコートしたＤ２ペプチドに対する抗Ｄ２抗血清の結合を阻害した。これにより、４つの融合タンパク質からアッセンブリされた修飾されたＶＬＰ上にＤ２ペプチドが表出されたことが示唆される(図２)。
さらに、ゲル濾過によって精製された４つすべての修飾されたＶＬＰの電子顕微鏡像によってキャプシドアッセンブリが確認された(図１)。
【００７０】
実施例４  Ｄ２ペプチドを表出するＡＰ２０５の修飾されたＶＬＰによるマウスの免疫化と免疫応答の分析
以降、４１８、４２０、４２１及び４２２と称するコンストラクト４１８-７、４２０-２１、４２１-８及び４２２-２からのタンパク質２５μｇにて、第０日目及び第１４日目にマウスに皮下注射して免疫化した(１グループ当たりｎ＝３)。タンパク質をＰＢＳにて最終容量２００μｌにまで希釈し、１００μｌを各動物の左右の鼠径部に注射した。動物を第１４及び第２１日目に採血し、抗体応答をＥＬＩＳＡにて測定した。簡潔にいうと、そのＮ末端にアミノ酸配列CGGを含有するＤ２ペプチドの変異体をクロスリンカーSPDPを用いてＲＮアーゼに結合させた。結果として生じたコンジュゲートを終夜、４℃でコートした。西洋ワサビペルオキシダーゼヤギ抗マウスＩｇＧコンジュゲートにて血清の結合を検出した。
４つすべての修飾されたＶＬＰはＤ２ペプチドに対して高い力価の抗体応答を誘発したが、免疫化前の血清では血清の結合は検出されなかった。これより、結合の特異性が示唆される。この力価を最大半量の結合が与えられる希釈として測定し、３匹の動物の平均力価は、コンストラクト４１８については１０７００±８６００、コンストラクト４２０については１：１０２００±３０００、コンストラクト４２１については１：７９００±５５００、及びコンストラクト４２２については１：２０１８±２５００であった。
【００７１】
実施例５  Angio Iペプチドを表出するＡＰ２０５の修飾されたＶＬＰのクローニング、発現及び精製
ＡＰ２０５コートタンパク質のＣ末端のAngio Iペプチドのクローニング
Angio IペプチドをコードするＤＮＡ断片(DRVYIHPF、配列番号１５) を、２つのオリゴヌクレオチド−oligo３.２１６(配列番号１６)及びoligo ３.２１７(配列番号１７)とアニーリングさせて作製した。得られた断片をＫｐｎ２Ｉ及びＭｐｈ１１０３Ｉで消化して、ｐＡＰ４０９-４４及びｐＡＰ４０５-６１の、大腸菌トリプトファンオペロンプロモータの制御下にある同じ制限酵素部位内にクローニングした。結果として生じたコンストラクトは以下の通りである。
４４１-９ (４０９-４４ベース)：ＡＰ２０５コートタンパク質−GSG− DRVYIHPF
４４２-７ (４０５-６１ベース)：ＡＰ２０５コートタンパク質−GTAGGGSG−DRVYIHPF
【００７２】
ＡＰ２０５コートタンパク質のＮ末端のAngio Iペプチドのクローニング
アミノ酸配列DRVYIHPF (配列番号１５)のペプチドをAngio Iペプチドと称する。Angio Iペプチドをコードする断片を、２つのオリゴヌクレオチド−oligo３.２１８(配列番号１８)及びoligo ３.２１９(配列番号１９)とアニーリングさせて作製した。得られた断片をＮｃｏＩ及びＫｐｎ２Ｉで消化して、ベクターｐＡＰ３７８-２及びｐＡＰ３８２-２の同じ制限酵素部位内にクローニングした。結果として生じたコンストラクトは以下の通りである。
４４６-６ (３７８-２ベース)：ＭＧ−DRVYIHPF−GSGG−ＡＰ２０５コートタンパク質
４４７-９ (３８２-２ベース)：ＭＧ−DRVYIHPF−GSGTAGGGSGS−ＡＰ２０５コートタンパク質
以降、コンストラクト４４１-９、４４２-７、４４６-６及び４４７-９を便宜上４４１、４４２、４４６及び４４７と称する。
【００７３】
精製
１ｍｇ／ｍｌ リゾチーム及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するトリス-緩衝溶解バッファー中で凍結と解凍を３回繰り返した後、超音波処理を行うことによって細胞を溶解した。溶解物を遠心によって分類して溶解物１と溶解物バッファーにて再抽出したペレットを溶解物２とした。その後ゲル濾過工程の組み合わせによって上清を精製し、結果として生じた純粋な分画を混合した。
各コンストラクトについてのゲル濾過の組合せは以下の通りである。
コンストラクト４４１：溶解物１はセファロースＣＬ-２Ｂの後、セファロース６Ｂカラムに流した。第二溶解物はＣＬ-４Ｂの後、ＣＬ-２Ｂカラムに流した。
コンストラクト４４２：溶解物１はＣＬ-２Ｂの後、ＣＬ-４Ｂ、最後にセファロース６Ｂカラムに流した。溶解物２はＣＬ-４Ｂの後、セファロース６Ｂカラムに流した。
コンストラクト４４６：溶解物１はＣＬ-２Ｂの後、セファロース６Ｂカラムにて精製した。溶解物２は廃棄した。
コンストラクト４４７：溶解物１はＣＬ-４Ｂの後、セファロース６Ｂカラムにて精製した。溶解物２はＣＬ-４Ｂカラムにて２回精製した。
修飾されたＶＬＰを形成した４つすべてのコンストラクトは電子顕微鏡像によって確認した。ＶＬＰ上のAngio Iペプチドの表出はさらにＥＬＩＳＡにて確認した。このＥＬＩＳＡによって、ＶＬＰをおよそ１０μｇ／ｍｌの濃度でコートして、Angio I又はAngio XVIIIそれぞれに対してマウス内で生じた２つの抗血清の結合を評価した。４つすべての修飾されたＶＬＰはＥＬＩＳＡにおいて陽性であった。これにより、修飾されたＶＬＰ上でのAngio Iペプチドの表出が確認された。
【００７４】
実施例６  ＧｎＲＨを表出するＡＰ２０５の修飾されたＶＬＰのクローニング、発現及び精製と、マウスの免疫化
ＡＰ２０５コートタンパク質のＣ末端のＧｎＲＨのクローニング
ＧｎＲＨペプチドをコードするＤＮＡ断片(EHWSYGLRPG、配列番号２０) を、２つのオリゴヌクレオチド−oligo４.５６(配列番号２１)及びoligo ４.５７(配列番号２２)とアニーリングさせて作製した。得られた断片をＫｐｎ２Ｉ及びＭｐｈ１１０３Ｉで消化して、ｐＡＰ４０５-６１の、大腸菌トリプトファンオペロンプロモータの制御下にある同じ制限酵素部位内にクローニングした。結果として生じたコンストラクトは以下の通りである。
４８９-７ (４０５-６１ベース)：ＡＰ２０５コートタンパク質−GTAGGGSG− EHWSYGLRPG、このコンストラクトを便宜上コンストラクト４８９と称する。
精製
実施例４に記載のように細胞を溶解した。４つの７Ｍ 尿素及び０．０５Ｍ トリスを含有するバッファーにてペレットを抽出した。プールした上清をＮＥＴバッファーで平衡化したセファロースＣＬ-２Ｂカラムに流した後、セファロース６Ｂカラムにてクロマトグラフィを再度行った。キャプシドアッセンブリをＥＭ分析にて確認した。
【００７５】
ＡＰ２０５コートタンパク質とＧｎＲＨの融合を含有する修飾されたＶＬＰによるマウスの免疫化と免疫応答の分析
コンストラクト４８９から発現されるタンパク質５０μｇにて、第０日目にマウスに皮下注射して免疫化した(１グループ当たりｎ＝５)。タンパク質を２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．２にて最終容量２００μｌにまで希釈し、１００μｌを各動物の左右の鼠径部に注射した。動物を第２１日目に採血し、抗体応答をＥＬＩＳＡにて測定した。簡潔にいうと、そのＮ末端にアミノ酸配列CGGを含有する変異体ＧｎＲＨペプチドをクロスリンカーSPDPを用いてＲＮアーゼに結合させた。結果として生じたコンジュゲートを終夜、４℃でコートした。西洋ワサビペルオキシダーゼヤギ抗マウスＩｇＧコンジュゲートにて血清の結合を検出した。
コンストラクト４８９からのタンパク質はＧｎＲＨペプチドに対して高い力価の抗体応答を誘発したが、免疫化前の血清では血清の結合は検出されなかった。これより、結合の特異性が示唆される。この力価を最大半量の結合が与えられる希釈として測定し、５匹の動物の平均力価は、１：１８３２９、標準偏差(standard derivation)９２４５であった。
【００７６】
実施例７  Ｎｅｆ５５エピトープを表出するＡＰ２０５ＶＬＰのクローニング、発現及び精製
クローニング
Ｎｅｆ５５(配列番号２３)はＨＩＶ Ｎｅｆコンセンサス配列由来のポリペプチドであり、最も多いと思われるＴ細胞エピトープを含有し、溶解性があるために選択した。Ｎｅｆ５５をＨＩＶ Ｎｅｆの他のポリペプチドであるＮｅｆ７４ポリペプチドをコードするＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。Ｎｅｆ５５をコードするＤＮＡは、アミノ酸配列GVGFPVRPQVPLRPMTYKAAV-DLSHFLKEKGGLE及びGPGIRYPLTFGWCFKLVPVEPをコードするＰＣＲによって産生された２つの断片からアッセンブリされたものである。３４のアミノ酸断片を増幅するために、Ｋｐｎ２Ｉ制限酵素部位を含有する上流プライマーｐ３.２４２(配列番号２４)と下流プライマーｐ３.２２２(配列番号２５)を用いた。２１のアミノ酸断片を増幅するために、上流プライマーｐ３.２２３(配列番号２６)とＭｐｈ１１０３Ｉ制限酵素部位を含有する下流プライマーｐ３.２２５(配列番号２７)を用いた。断片の融合は、上記と同じ上流及び下流のプライマーを用いたアッセンブリＰＣＲにて行った。得られた断片を、Ｋｐｎ２Ｉ及びＭｐｈ１１０３Ｉにて消化して、大腸菌トリプトファンオペロンプロモータの制御下にあるベクターｐＡＰ４０９-４４及びｐＡＰ４０５-６１内の同じ制限酵素部位にクローニングした。
結果として生じたコンストラクトは以下の通りである。
コンストラクト４５７-１７ (４０９-４４ベース)：ＡＰ２０５コートタンパク質−GSG−Ｎｅｆ５５
コンストラクト４５９-３５ (４０５-６１ベース)：ＡＰ２０５コートタンパク質−GTAGGGSG−Ｎｅｆ５５
コンストラクト４５７-１７及び４５９-３５は便宜上、以下では４５７及び４５９とそれぞれ称する。
【００７７】
精製
実施例４に記載のように細胞を溶解した。コンストラクト４５７については、プールした溶解物をショ糖密度勾配超遠心の後にセファロース２Ｂカラムによって精製した。部分的に精製されたタンパク質のＥＭ分析においてキャプシドが可視化されるが、目に見える多くのキャプシドの半分は質が悪い。
コンストラクト４５９については、溶解物２を、２ｍｌ／時の溶解速度でセファロース２Ｂカラム(サイズ２．５×４５ｃｍ)に流し、Amicon遠心濃縮器にて濃縮し、セファデックス２Ｂカラムに流した。さらに、タンパク質をＣｓＣｌ密度勾配超遠心で２回精製した。融合タンパク質のＶＬＰ内へのアッセンブリをＥＭ分析によって確認し、一様に良好な形のキャプシドを確認した(図３)。
ＨＨＤマウスは、Ｄｂα３ドメインと融合したＡ２α１とα２ドメインのＮ末端に共有結合したヒトβ２ミクログロブリンを有するキメラ単鎖クラスＩ分子を発現する(Firat, H. 等 1999, Eur.J.Immunol., 29:3112)。これらマウスにおけるＨＬＡ-Ａ２導入遺伝子発現により、ＡＰ２０５-Ｎｅｆ５５ ＶＬＰの一次ＣＴＬへの能力をインビボで調査することができる。さらに、ＩＳＳとしてのアジュバントの効果をインビボで研究した。
ＨＨＤマウスを、未処理のものと、１００μｇのＡＰ２０５-Ｎｅｆ５５を皮下注射することで免疫化するものに分けた。８日後、脾臓細胞を単離し、ＨＩＶエピトープやコンセンサス配列についてオンラインデータベース(http://hiv-web.lanl.gov/seq-db.html)を用いるなどして同定した、刺激するために好適なＨＬＡ-Ａ２限局性Ｔ細胞エピトープを用いて、増殖アッセイ(Ｔｈ細胞応答について、Belshe R.B. 等, J. Inf. Dis. 183: 1343-1352 (2001))、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ(Oxenius, A. 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 13747-13752 (2002))又は細胞障害性アッセイ(Belshe R.B. 等, J. Inf. Dis. 183: 1343-1352 (2001))におけるインターフェロンγについて細胞内サイトカイン染色アッセイにおいてＴ細胞誘導を分析した。
【００７８】
実施例８  オパールコドンがＡＰ２０５コートタンパク質のＣ末端からＮｅｆ５５を分離した結果生じるモザイクＶＬＰであるＡＰ２０５の修飾されたＶＬＰのクローニング、発現及び精製
クローニング
ＡＰ２０５コートタンパク質とＮｅｆ５５コード配列の供給源としてコンストラクト４５９-３５を用いた。コートタンパク質とコードする配列と、アミノ酸スペーサーGTAGGGSGをコードする配列の間にオパールコドンを導入するために、新規のコンストラクト５１２を２工程ＰＣＲによって設定した。
オパールコドンの導入は逆方向ＰＣＲによって行った。逆方向プライマーは、逆位のテールトゥテールの方向で、ＴＧＡが挿入されるようにプライマーｐ４.１０１(配列番号２８)とｐ４.１０２(配列番号２９)を用いて設定した。ＮｃｏＩ制限酵素部位を含有する上流プライマーｐ１.４４(配列番号３０)及びコンストラクト４５９-３５内のＮｅｆ５６ペプチドのＣ末端の非翻訳領域の２３ヌクレオチド下流に相補的な下流プライマーｐ７４-２(配列番号３１)を用いた。
ＰＣＲ断片をＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して、大腸菌トリプトファンオペロンプロモータの制御下にあるｐＧＥＭ由来発現ベクター内の同じ制限酵素部位にクローニングした。
結果として生じるコンストラクトは以下の通りである。
コンストラクト５１２-２４：ＡＰ２０５コートタンパク質−オパールコドン−GTAGGGSG−Ｎｅｆ５５、以降、このコンストラクトを便宜上５１２と称する。
【００７９】
発現
ヘルパープラスミドｐＩＳＭ３００１を含有する大腸菌ＪＭ１０９細胞を、プラスミドｐＡＰ５１２-２４に形質転換して、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンと１０ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天上に播いた。１０ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールをすべての培養培地に添加することを除いては上記と同じようにその後の工程を行った。
精製
細胞を実施例４に記載のように溶解した。溶解物１を、トリス、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡバッファー(ＮＥＴバッファー)にて、１ｍｌ／時の溶解速度で、セファロース４Ｂカラム(１．２×２５ｃｍ)にて精製した。溶出した分画をプールして、Amicon遠心濃縮器にて濃縮して、２ｍｌ／時の溶解速度で、セファロース６Ｂカラム(１．２×３５ｃｍ)に流した。ＡＰ２０５コートタンパク質と融合タンパク質の発現は、精製されたＶＬＰのウェスタンブロット分析によって確認し、キャプシドアッセンブリをＥＭ分析によって確認した。
【００８０】
実施例９  ＡＰ２０５コートタンパク質のＮ末端の伸展したｐ３３ペプチドを表出するＡＰ２０５の修飾されたＶＬＰのクローニング、発現及び精製
クローニング
伸展したｐ３３ペプチドをコードするＤＮＡ断片(AKSLKAVYNFATMA、配列番号３２) を、２つのオリゴヌクレオチド−oligo３.３０９(配列番号３３)及びoligo ３.３１０(配列番号３４)とアニーリングさせて作製した。得られた断片をＮｃｏＩ及びＫｐｎ２Ｉで消化して、ベクター３７８-２及び３８２-２の、大腸菌トリプトファンオペロンプロモータの制御下にある同じ制限酵素部位内にクローニングした。結果として生じたコンストラクトは以下の通りである。
４６６ (３８２-２ベース)：MAKSLKAVYNFATMA−GSGTAGGGSGS− ＡＰ２０５コートタンパク質。伸展したｐ３３ペプチドはＣＴＬエピトープKAVYNFATMを含有する。
精製
細胞を実施例４に記載のように溶解した。溶解物２から単離したペレットを、緩衝した７Ｍ 尿素、ｐＨ７．５トリスバッファーにてさらに抽出した。ｐ３３ペプチドを表出する修飾されたＶＬＰをセファロース４Ｂカラム(１．２×２５ｃｍ)にて精製し、ＮＥＴバッファーで平衡化して１ｍｌ／時で溶出した。ＶＬＰにて較正したカラムからの溶出体積にてキャプシドアッセンブリを確認した。
【００８１】
実施例１０  ｐ３３ペプチドに融合したｆｒコートタンパク質のクローニング、発現及び精製
伸展したｐ３３ペプチドの配列(KSLKAVYNFATMA、配列番号３２)はｐ３３ＣＴＬエピトープ(KAVYNFATM)を含有する。
以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
5’ CG AAA TCT CTT AAA GCG GTT TAC AAC TTC GCT ACC ATG GCT T (配列番号３９)
5’ CGA AGC CAT GGT AGC GAA GTT  GTA AAC CGC TTT AAG AGA  TTT (配列番号４０)
オリゴヌクレオチド１は特有のＮｃｏＩ部位を含有しており、クローンの選択が容易である。オリゴヌクレオチドをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにて３７℃で３０分間処理し、次いで、混合物１、２を１００℃で３分間熱し、ゆっくり室温まで冷ました。
ベクター調整
プラスミドｐＦＲｄ８をＡｓｕＩＩ部位で３７℃で３時間かけて切断した。ベクター断片を精製して、アニールさせたオリゴ１及びオリゴ２に結合させた。結果として生じたコンストラクトは、ｆｒコートタンパク質のアミノ酸２とアミノ酸３の間に配列KSLKAVYNFATMAが挿入されていた(切断されたＮ末端アラニンの後の開始アラニンは位置１である)。
【００８２】
タンパク質精製のための細胞抽出物の調整
細菌細胞溶解物の調整と超音波処理を含めたタンパク質精製の初めの工程はバッファーＡを用いて行った。
バッファーＡ：２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ７．２、５％ グリセロール、２ｍＭ ＥＤＴＡ及びライソザイムを２０μｇ／ｍｌに添加した。
１ｇの細胞を３倍量のバッファーＡに懸濁し、この懸濁液を４℃で２０分間インキュベートし、次いで、この懸濁液を２００ワット-秒、３回の３０ｓバーストにて超音波処理を行った。超音波処理した懸濁液を１０℃で２０分間インキュベートし、このとき１ｍＭのＰＭＳＦと共に等量の同じバッファーを添加した。混合物を既に述べたように超音波処理して、次いで１００００×ｇで３０分間遠心した。ペレットを３ｍｌの４Ｍ 尿素にて抽出した。
ポリイミンＰ(１０％ｗ／ｖ ｐＨ７．２)を０．３５％ｗ／ｖの終濃度となるように懸濁液にゆっくしと添加し、この混合溶液を６０００ｇにて１５分間遠心した。上清を硫酸アンモニウムにて３５％飽和させて沈殿させ、さらに３時間溶液を撹拌し、次いで８０００×ｇにて１５分間遠心した。ペレットをバッファーＢの１細胞体積(１ｍｌ)に再懸濁させた。
バッファーＢ：１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ７．２、５％ グリセロール、１ｍＭ ＥＤＴＡ
次いで、上清を、硫酸アンモニウムにて５０％飽和にして沈殿させた。タンパク質調製物の各々の処置からの分割量をＳＤＳ  ＰＡＧＥ電気泳動して、ウェスタンブロット分析を行った。試料を、カラムクロマトグラフィ及びショ糖密度勾配遠心法によるその後の精製に用いた。
バッファーＢで３５％飽和状態の硫酸アンモニウム沈殿によって得られたタンパク質調製物をＥＭにて分析したが、キャプシドは検出されなかった。にもかかわらず、タンパク質の分析量は、比較のためのセファクリルＳ-４００又はセファクリルＳ-２００ゲル濾過カラムにて精製した。トリス-ＨＣｌ ｐＨ７．２、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡにてタンパク質を溶出した。回収した１２の分画は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにて分析した。セファクリル４００のピークに対応する分画を回収して、ＥＭ(電子顕微鏡)分析にて分析した。電子顕微鏡分析では精製した画分中に粒子は検出されなかった。このことから、ｆｒコートタンパク質に対するｐ３３ペプチドの融合がキャプシドアッセンブリを妨げたことが示唆される。
【００８３】
実施例１１  ＡＰ２０５のコートタンパク質への多様な抗原の融合
長いスペーサーないしは短いスペーサーを有するＮ末端(コンストラクト３７８-２及び３８２-２)ないしはＣ末端(コンストラクト４０９-４４及び４０５-６１)の何れかへ抗原を融合するための４つのプラスミドを実施例１により入手した。４つのベクターは、ＡＰ２０５へ融合される配列が挿入されうる特定の制限酵素部位を含有する。簡単にいえば、それぞれのベクターに存在する制限酵素部位を含有し、ＡＰ２０５コード配列と共にインフレームに融合される所望のアミノ酸配列(以下を参照のこと)をコードする２つの相補的なオリゴヌクレオチドを合成した。また、融合がＡＰ２０５のＣ末端に達する場合、コード配列の終わりに停止コドンを含有させた。２つのオリゴヌクレオチドをアニールさせ、好適な制限酵素にて消化し、それぞれのＡＰ２０５融合発現ベクター内にクローニングした。
ＣＣＲ５細胞外ドメイン断片ＥＣＬ２Ａ(配列番号４６、RSQKEGLHYT)をコードするヌクレオチド配列を４つのすべてのプラスミド内にインフレーム結合させた。
ＣＸＣＲ４ １７６-１８５(配列番号４９)をコードするヌクレオチド配列を４つのすべてのプラスミド内にインフレーム結合させた。
ヒトＣ５ａ断片５５-７４(配列番号４６)をコードするヌクレオチド配列を４つのすべてのプラスミド内にインフレーム結合させた。
ガストリンＧ１７(配列番号４７、EGPWLEEEEEAYGWMDF)をコードするヌクレオチド配列を４つのすべてのプラスミド内にインフレーム結合させた。
ＣＥＴＰ断片４６１-４７６(配列番号５１)をコードするヌクレオチド配列を４つのすべてのプラスミド内にインフレーム結合させた。
ブラジキニン(配列番号５２)をコードするヌクレオチド配列を４つのすべてのプラスミド内にインフレーム結合させた。
ｄｅｓ-Ａｒｇ-ブラジキニン(配列番号５３)をコードするヌクレオチド配列を４つのすべてのプラスミド内にインフレーム結合させた。
上記の融合タンパク質の発現及び精製は実施例２及び３に記載のものと実質的に同じである。ＡＰ２０５融合タンパク質とのＶＬＰの形成を確認するために、試料を電子顕微鏡で分析した。
【００８４】
実施例１２  多様な抗原と融合させたＡＰ２０５コートタンパク質のＶＬＰによるマウスの免疫化
実施例１１から入手したＡＰ２０５融合タンパク質のＶＬＰのタンパク質２５μｇにて、第０日目及び第１４日目にマウスに皮下注射して免疫化した(１グループ当たりｎ＝３)。タンパク質をＰＢＳにて最終容量２００μｌにまで希釈し、１００μｌを各動物の左右の鼠径部に注射した。動物を第１４及び第２１日目に採血し、抗体応答をＥＬＩＳＡにて測定した。
簡潔にいうと、試験する抗原をアミノ酸スペーサー(ＣＧＧ)及びクロスリンカーSPDPを用いてＲＮアーゼにコンジュゲートさせ、ＥＬＩＳＡプレート上に４℃で終夜をかけてコートした。西洋ワサビペルオキシダーゼヤギ抗マウスＩｇＧコンジュゲートにて血清の結合を検出した。
【００８５】
実施例１３  ＧｎＲＨと融合させたＡＰ２０５コートタンパク質のＶＬＰによるブタの免疫化
実施例６に記載のコンストラクト４８９から発現して精製したタンパク質４００μｇにて、第０日目にブタに皮下注射して免疫化した(１グループ当たりｎ＝２)。タンパク質を、アジュバントとして終濃度１５％でＤＥＡＥデキストランを含有する５ｍＭ リン酸／１００ｍＭ ＮａＣｌバッファー, ｐＨ６．８にて最終容量１ｍＬにまで希釈した。ワクチンは各動物の耳の裏に皮下注射した。２０ｍＭ ＨｅｐｅｓバッファーｐＨ７．２で調整し、１５％のＤＥＡＥデキストランを含有する１ｍｌのＱβ ＶＬＰ(０．４ｍｇ／ｍｌ)にて免疫化したものを対照動物とした(１グループ当たりｎ＝２)。動物は、初回の免疫化で用いたのと同じ量のワクチン組成物で第２８日目に追加免疫した。動物を第２８及び第４９日目に採血し、抗体応答をＥＬＩＳＡにて測定した。簡潔にいうと、Ｎ末端にアミノ酸配列CGGを含有する変異体ＧｎＲＨペプチドをクロスリンカーSPDPを用いてＲＮアーゼに結合させ、４℃で終夜をかけてコートした。西洋ワサビペルオキシダーゼヤギ抗マウスＩｇＧコンジュゲートにて血清の結合を検出した。
表１に示すように、ＧｎＲＨに融合したＡＰ２０５コートタンパク質で免疫化したブタはＧｎＲＨペプチドに対して高い力価の抗体応答を誘発したが、免疫化前の血清でも、Ｑβ免疫化対照ブタの血清でも血清の結合は検出されなかった。これより、結合の特異性が示唆される。この力価を最大半量の結合が与えられる希釈として測定した。
表１
2008513035.tif 000002
【００８６】
実施例１４  コートタンパク質の融合タンパク質とｐｒｅＳ１(ａａ２１-４７)ペプチドを含有する修飾されたＶＬＰのクローニング、発現及び精製
ＡＰ２０５コートタンパク質のＣ末端のｐｒｅＳ１ペプチドのクローニング
ｐｒｅＳ１ペプチドをコードするＤＮＡ断片(PLGFFPDHQLDPAFRANTANPDWDFNP、配列番号６２) を、２つのオリゴヌクレオチド−oligo preS1-1(配列番号６３)及びoligo  preS1-2(配列番号６４)とアニーリングさせて作製した。得られた断片をＫｐｎ２Ｉ及びＭｐｈ１１０３Ｉで消化して、ｐＡＰ４０９-４４及びｐＡＰ４０５-６１の、大腸菌トリプトファンオペロンプロモータの制御下にある同じ制限酵素部位内にクローニングした。結果として生じたコンストラクトは以下の通りである。
ｐｒｅＳ１-Ａ (４０９-４４ベース)：ＡＰ２０５コートタンパク質−GSG− ｐｒｅＳ１ペプチド
ｐｒｅＳ１-Ｂ (４０５-６１ベース)：ＡＰ２０５コートタンパク質−GTAGGGSG−ｐｒｅＳ１ペプチド
【００８７】
ＡＰ２０５コートタンパク質のＮ末端のｐｒｅＳ１ペプチドのクローニング
ｐｒｅＳ１ペプチドをコードする断片を、２つのオリゴヌクレオチド−preS1-3(配列番号６５)及びoligo preS1-4(配列番号６６)とアニーリングさせて作製した。得られた断片をＮｃｏＩ及びＫｐｎ２Ｉで消化して、ベクターｐＡＰ３７８-２及びｐＡＰ３８２-２の同じ制限酵素部位内にクローニングした。結果として生じたコンストラクトは以下の通りである。
ｐｒｅＳ１-Ｃ (３７８-２ベース)：ＭＧ−ｐｒｅＳ１ペプチド−GSGG−ＡＰ２０５コートタンパク質
ｐｒｅＳ１-Ｄ (３８２-２ベース)：ＭＧ−ｐｒｅＳ１ペプチド−GSGTAGGGSGS−ＡＰ２０５コートタンパク質
上記の融合タンパク質の発現及び精製はＡＰ２０５-Ｄ２融合物と実質的に同じように行った。
【００８８】
実施例１５  ＰｒｅＳ１(ａａ２１-４７)-特異的抗体の生成と中和活性の測定
成体雄のＣ５７ＢＬ／６マウス(１グループ当たり５匹)にＡＰ２０５-ｐｒｅＳ１(ａａ２１-４７)ＶＬＰ、又は、対照としてＡＰ２０５ ＶＬＰをワクチン接種した。各マウスについて、１００μｇの透析したワクチンを２００μｌの体積にまでＰＢＳで希釈し、第０日目及び第１４日目に皮下注射した(１００μｌを腹側２箇所に)。ワクチンはアジュバントなしで投与した。対照として、１グループのマウスにＰＢＳを接種した。第２１日目に心穿刺してマウスから採血し、血清を精製した。各グループの５匹のマウスからの血清をプールして、１４０００ｒｐｍにて５分間遠心した。３ｍｌのプレウォッシュプロテインＧセファロースのカラム(Amersham Biosciences)に上清を流した。次いで、カラムを１０カラム容量のＰＢＳにて洗浄して、１００ｍＭ グリシンｐＨ２．８にて溶出させた。１ｍｌの分画を、２００μｌの１Ｍ トリスｐＨ８．０を含有するチューブに回収した。タンパク質含有分画をプールして、５ｋＤａの分子重量カットオフのMillipore Ultrafree遠心フィルター(Millipore)を用いて濃縮した。同じ濃縮フィルターを用いてバッファーをＰＢＳに交換した。精製したＩｇＧ分画をMillipore Millexフィルター(Millipore)を用いてフィルター滅菌し、液体Ｎ２で凍結させ、長期保存の場合には−８０℃で保存するか、一定期間であれば４℃で保存した。
ｐｒｅＳ１-特異的ポリクローナルＩｇＧの中和活性を基本的に記載される(Glebe 等, 1993,  J. Virol. 77, 9511-9521)ように行った。簡潔に言うと、慢性のキャリア由来の精製したＢ型肝炎ウイルス遺伝子型Ｄ(１ウェル当たり１×１０８ゲノム)を精製したポリクローナルＩｇＧ(０．１から１００μｇ／ｍｌ)と共に２０℃で１時間、プレインキュベートした。次いで、原発性tupaia belangeri肝細胞(１ウェル当たり５×１０５)をウイルス菌種と共に３７℃で１０時間インキュベートし、その後、細胞を十分に洗浄して、３７℃でのインキュベートを続けた。培養液を３日ごとに交換して、市販されている酵素結合免疫吸着アッセイ(AxSYM, Abbott Laboratories)によって、感染後９日から１２日まで産生されるＢ型肝炎ｅ抗原の量を測定した。
【００８９】
実施例１６  ＣＣＲ５ペプチドを表出するＡＰ２０５ ＶＬＰのクローニング、発現、精製及びパッケージ化
クローニングと発現
ヒトＣＣＲ５に対する抗体を誘発するワクチンを生成するために、ヒトＣＣＲ５の第二細胞外ループ(ＥＣＬ２)とＮ末端(Ｎｔ)に対応するペプチドをＡＰ２０５に融合させた。次いで、ワクチンをマウスに接種し、ＨＩＶ中和活性について抗体を試験した。Ｎ末端ペプチドに加えて、２つのループペプチド、遺伝子操作したＮ末端及びＣ末端のシステインを有し、ループ形成を阻害しないように位置１１のＣｙｓがＳｅｒに変異している完全長ＥＣＬ２の相対物、及びＮ末端に遺伝子操作したシステインを有するＥＣＬ２ａである他のものを試験した。したがって、両ループはループ内のＮ末端とＣ末端のシステインの間のジスルフィド結合によって近接しうる。
【００９０】
位置１１のシステインがセリンに変化したＣＣＲ５ペプチドＥＣＬ２(CRSQKEGLHYTSSSHFPYSQYQFWKNFQTLKIC、cECL2c、配列番号７３)、Ｃｙｓ２０がＳｅｒであるＮｔ(MDYQVSSPIYDINYYTSEPSQKINVKQIAAR、配列番号９０)、又はＥＣＬ２ａ(CRSQKEGLHYTC、cECL2a、配列番号７４)をコードするＤＮＡ断片を、何れか２つの重なり合うリン酸化相補的オリゴデオキシヌクレオチド−ｃＥＣＬ２ｃにはoligo 2-I (5’-CCGGATGTCGATCGCAGAAGGAAGGCCTACATTACACATCCTCATCTCACTTCCCATATTCTCAATATCAATTCTGGAAGAATTTCCAAACTCTGAAGATCTGTTAATGCA-3’ 配列番号８６)とoligo 2-II  (5’-TTAACAGATCTTCAGAGTTTGGAAATTCTTCCAGAATTGATATTGAGAATATGGGAAGTGAGATGAGGATGTGTAATGTAGGCCTTCCTTCTGCGATCGACAT-3’、配列番号８７)、Ｎｔにはoligo (CATGGATTATCAAGTCTCGAGCCCTATCTATGACATTAACTATTACACTTCGGAACCTTCGCAGAAGATTAACGTTAAACAAATTGCAGCACGTT、配列番号９２)とoligo (CCGGAACGTGCTGCAATTTGTTTAACGTTAATCTTCTGCGAAGGTTCCGAAGTGTAATAGTTAATGTCATAGATAGGGCTCGAGACTTGATAATC、配列番号９３)、又はＥＣＬ２ａには２つのオリゴデオキシヌクレオチド−oligo 3-I (5’-GTTCCGGATGTCGATCGCAGAAGGAAGGCCTACATTACACATGCTAATGCATGT-3’、配列番号８８)とoligo 3-II (5’-ACATGCATTAGCATGTGTAATGTAGGCCTTCCTTCTGCGATCGACATCCGGAAC-3’、配列番号８９)にアニーリングさせることによって作製した。
【００９１】
得られたｃＥＣＬ２ａをコードする断片をＫｐｎ２ＩとＭｐｈ１１０３Ｉにてさらに消化した。次いで、３つのＤＮＡ断片を予め消化したベクターｐＡＰ４０５(ｃＥＣＬ２ａ及びｃＥＣＬ２ｃ)とｐＡｐ３７８(Ｎｔ)の、大腸菌のトリプトファンオペロンプロモータの制御下にそれぞれ連結させた。結果として生じたコンストラクトは以下の通りである。
５４２：(４０５ベース)：ＡＰ２０５コートタンパク質−GTAGGGSG−CRSQKEGLHYTSSSHFPYSQYQFWKNFQTLKIC
５３０：(４０５ベース)：ＡＰ２０５コートタンパク質−GTAGGGSG−CRSQKEGLHYTC
５４１：(３７８ベース)：MDYQVSSPIYDINYYTSEPSQKINVKQIAAR−SGG−ＡＰ２０５コートタンパク質
結果として生じたプラスミドｐＡＰ５４２、ｐＡＰ５３０及びｐＡＰ５４１にて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して、実施例２に記載のように発現させた。３つすべてのコンストラクトの溶解物中でキャプシドが同定された。これにより、大腸菌内でのそれぞれのＡＰ２０５コートタンパク質融合物の発現の際にＶＬＰの自己アッセンブリが起こることが示された。
【００９２】
コンストラクト５４２の精製
細胞を、５μｇ／ｍｌのＰＭＳＦを添加した溶解バッファー(５０ｍＭ トリス、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０, ｐＨ８．０)中で超音波処理することによって溶解した。溶解物を遠心によって分離し、ペレットを溶解バッファーにて３回洗浄した。プールした上清をＮＥＴバッファーのセファロース４Ｂカラムにて精製した。ＶＬＰを含有する溶出分画をプールし、Amicon遠心フィルターユニットを用いて濃縮し、ＮＥＴバッファーのセファロース２Ｂカラムにて精製した。ＥＣＬ２ペプチドの粒子のアッセンブリと表出は、ＥＣＬ２ペプチドに特異的なマウス抗血清を用いたウェスタンブロット、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及びＥＭによって精製したＶＬＰを分析することによって確認した。
【００９３】
コンストラクト５３０の精製
細胞を、溶解バッファー(５０ｍＭ トリス、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０, ｐＨ８．０、５μｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ)中で超音波処理することによって溶解した。溶解物を遠心によって分離し、ペレットを、１０ｍＭ ＤＴＴを含有する溶解バッファーにて３回洗浄した。プールした洗浄物の上清をＮＥＴバッファーのセファロース４Ｂカラムにて精製した。ＶＬＰを含有する溶出分画をプールし、１０ｍＭ ＤＴＴを加えて、Amicon遠心フィルターユニットを用いて濃縮し、ＮＥＴバッファーのセファロース４Ｂカラムにて再びクロマトグラフィを行った。ＥＣＬ２ａペプチドの粒子のアッセンブリと表出は、ＥＣＬ２ａペプチドに特異的なマウス抗血清を用いたウェスタンブロット、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及びＥＭによって精製したＶＬＰを分析することによって確認した。
ＥＣＬ２ａペプチドの２つのシステインのジスルフィド結合を促進してＥＣＬ２ａループを近づけるために、上記のようにして得られたＶＬＰ調整物を、０．１から１ｍＭの還元型グルタチオンと０．２から５ｍＭの酸化型グルタチオンを含有する、５０ｍＭ トリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ, ｐＨ８．０にて透析した。その後、透析したＶＬＰ調整物をさらに、５０ｍＭ トリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ, ｐＨ８．０又はＰＢＳ又は２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ, ｐＦ７．２にて透析し、表出したエピトープの免疫原性を試験するためにマウスに接種した。
【００９４】
穏やかな還元条件下でのコンストラクトの精製
０．１ｍＭ ＤＴＴを含有する溶解バッファーにて上記に記載のように細胞を溶解した。その後のすべての工程は０．１ｍＭ ＤＴＴを含有したバッファーで行った。ジスルフィド結合の形成が不十分であることが予想される場合には、上記のように、選択的にＥＣＬ２ａループの内部システインを最終的に酸化することができる。
【００９５】
実施例１７  ＣＸＣＲ４ Ｎ末端ペプチドを表出するＡＰ２０５ ＶＬＰのクローニング、発現、精製及びパッケージ化
クローニング及び発現
ヒトＣＸＣＲ４に対する抗体を誘発するワクチンを生成するために、ヒトＣＸＣＲ４のＮ末端に対応するペプチド(酸化を防ぐためにＣｙｓ２８のＳｅｒへの変異を有する)をＡＰ２０５に融合した。次いで、ワクチンをマウスに接種し、ＨＩＶ中和活性について抗体を試験した。ＣＸＣＲ４ Ｎ末端ペプチド(CXCR4-Nt) (MEGISIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPSFREENANFNKI、配列番号７５)をコードするＤＮＡ断片を、２つの５'リン酸化オリゴヌクレオチド−oligo Oligo 4-I (5’-CATGGAAGGAATTTCCATATATACTTCGGACAACTACACCGAGGAAATGGGTAGCGGCGACTACGACAGCATGAAAGAACCATCCTTCCGCGAGGAGAATGCAAATTTTAATAAAATTT-3’、配列番号７６)とoligo Oligo 4-II (5’-CCGGAAATTTTATTAAAATTTGCATTCTCCTCGCGGAAGGATGGTTCTTTCATGCTGTCGTAGTCGCCGCTACCCATTTCCTCGGTGTAGTTGTCCGAAGTATATATGGAAATTCCTTC-3’、配列番号７７)をアニールさせることによって作製した。得られた断片を、予めＮｃｏＩ及びＫｐｎ２Ｉで消化したベクターｐＡＰ３７８に結合させた。
５４３：(３７８ベース)：MEGISIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPSFREENANFNKI−SGG−ＡＰ２０５コートタンパク質
結果として生じたプラスミドｐＡＰ５４３にて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、実施例２に記載のように発現させた。溶解物中のキャプシドは、個々のＡＰ２０５コートタンパク質融合物が大腸菌内で発現される際に、ＶＬＰの自己アッセンブリがあることを示す。
【００９６】
精製
細胞を、５μｇ／ｍｌのＰＭＳＦを添加した溶解バッファー(５０ｍＭ トリス、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０, ｐＨ８．０)中で超音波処理することによって溶解した。溶解物を遠心によって分離させ、ペレットを１Ｍの尿素を含有する溶解バッファーにて洗浄した。プールした上清をＮＥＴバッファーのセファロース４Ｂカラムにて精製した。ＶＬＰを含有する溶出分画をプールし、Amicon遠心フィルターユニットを用いて濃縮し、ＮＥＴバッファーのセファロース６Ｂカラムにて精製した。ＣＸＣＲ４-Ｎｔペプチドの粒子のアッセンブリと表出は、ＣＸＣＲ４-Ｎｔペプチドに特異的なマウス抗血清を用いたウェスタンブロット、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及びＥＭによって精製したＶＬＰを分析することによって確認した。
【００９７】
実施例１９  免疫化とＨＩＶ中和アッセイ
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、実施例１７及び１８より入手した５０μｇのＮｔ-ＡＰ２０５、ＡＰ２０５-ｃＥＣＬ２ｃ、ＡＰ２０５-ｃＥＣＬ２Ａ、ＣＸＣＲ４-Ｎｔ-ＡＰ２０５ ＶＬＰにて、第０日目に初回刺激し(皮下に０．２ｍｌＰＢＳ)、５０μｇのコンストラクト３７８及び４０５ＶＬＰにて初回刺激したＢａｌｂＣマウスとそれぞれ比較した。第１４日目に同じワクチンで追加免役した後、α-ＡＰ２０５及びα-ＣＣＲ５、α-ＣＸＣＲ４抗体の力価を第１４日目と第２１日目にＥＬＩＳＡにて確認した。
ポリクローナルマウスＩｇＧの精製
マウスを免疫化した血清を１４０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を３．３ｍｌのプレウォッシュしたプロテインＧセファロース(Amersham Biosciences, Otelfingen, Switzerland)のカラムに流した。次いで、カラムをＰＢＳで洗浄し、１００ｍＭ グリシン ｐＨ２．８にて溶出した。１ｍｌの分画を、予め１２０μｌの１Ｍ トリスｐＨ８を入れたチューブに回収した。２８０ｎｍの吸光度のピーク時の分画をプールした。
【００９８】
ポリクローナルマウスＩｇＧを有する細胞性ＣＣＲ５のＦＡＣＳ染色
ＣＥＭ.ＮＫＲ-ＣＣＲ５は、ＣＤ４を天然に発現するヒト細胞株であるＣＥＭ.ＮＫＲ細胞株のＣＣＲ５-発現変異体である(Trkola 等, J. Virol., 1999, 8966頁)。ＣＥＭ.ＮＫＲ-ＣＣＲ５細胞をＲＰＭＩ１６４０培養液(１０％ ＦＣＳ、グルタミン及び抗生物質を有する)中で生育させた。細胞をペレット化し、２．３×１０６細胞／ｍｌとなるように、１％ ウシ胎仔血清(ＦＣＳ)を含有するリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)に再懸濁した。２ｍｇ／ｌのラット-α-マウス-ＣＤ１６／ＣＤ３２(Ｆｃγ)(Pharmingen, Basel, Switzerland)をブロック試薬として添加し、２０分間インキュベートした。細胞を１％ ＦＣＳ／ＰＢＳにて１回洗浄し、０．１ｍｌ(２．３×１０５細胞／ウェル)を播き、次いでＶ底９６ウェルプレート中でペレット化した。次いで、細胞を０．１ｍｌのα-ＣＣＲ５ポリクローナル抗体(３５０  ｍｇ／ｌ、３５ｍｇ／ｌ、３．５ｍｇ／ｌ又は０．３５ｍｇ／ｌ；プロテインＧカラムから溶出；１％ ＦＣＳ／ＰＢＳにて希釈)と共に再懸濁した。４℃で３０分間置いた後、細胞を１％ ＦＣＳ／ＰＢＳにて洗浄し、１５ｍｇ／ｌのＦＩＴＣ-ヤギ-α-マウス-ＩｇＧ(Jackson, Milan Analytica, LaRoche)を含む１％ ＦＣＳ／ＰＢＳにて４℃で２０分間染色した。１％ ＦＣＳ／ＰＢＳで２回洗浄した後、５０００−１００００の染色した細胞をフローサイトメトリーによって分析した。各染色物の相乗平均を「cell quest」フローサイトメトリーソフトウェアを用いて測定した。
【００９９】
ＨＩＶ-中和アッセイ
一次ＣＤ８枯渇ＰＢＭＣの刺激
簡単に言うと、３の健康な血液ドナーから得たバフィーコートをRosette Sep混合液(StemCell Technologies Inc., BIOCOBA AG)を用いてＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇を行い、Ficoll-Hypaque遠心分離(Amersham-Pharmacia Biotech)によってＰＢＭＣを単離した。細胞を培養液(RPMI 1640、10% FCS、100 U/ml IL-2、グルタミン及び抗生物質)にて４×１０６／ｍｌに調整して、３つに分け、５μｇ／ｍｌ フィトヘマグルチニン(ＰＨＡ)、０．５μｇ／ｍｌ ＰＨＡ又は１ｍｇ／ｌ 抗ＣＤ３ ＭＡｂ ＯＫＴ３の何れかで刺激した。７２時間後、３つすべての刺激したものからの細胞を混合し、感染とウイルス中和実験のために刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞の供給源として用いた。
ＨＩＶ中和アッセイは、基本的に既に記載されているように行った(Trkola 等, J. Virol., 1999, 8966頁)。Ｒ５ウイルス(ＣＣＲ５コレセプター特異的細胞株)、ＪＲ-ＦＬ及びＳＦ１６２は既に記載されている(O'Brien 等, Nature 1990, 348, 69頁；及びShioda 等, Nature 1991, 349, 167頁)。あるいは、Ｘ４細胞株ＮＬ４-３及び２０４４は既に記載されている(Trkola 等 (1998), J. Virol. 72:396；Trkoly 等 (1998), J. Virol 72-1876)。簡単に言えば、９６ウェルの培養プレートにて、精製したポリクローナルマウスＩｇＧ又は対照抗体２Ｄ７の段階希釈物(２５μｇ／ｍｌ−２５ｎｇ／ｍｌ；Pharmingen)と共に細胞を３７℃で１時間インキュベートした。
ＨＩＶ-１菌種を、アッセイ培地中におよそ１０００から４０００ＴＣＩＤ５０／ｍｌ含むように調整した(ＴＣＩＤ５０：５０％組織培養感染用量、Trkola 等, J. Virol., 1999, 8966頁)。ウイルス菌種(１００ＴＣＩＤ５０：５０％組織培養感染用量)を加え、４−１４日間プレートを培養した。合計の感染容量を２００μｌとした。好ましくは、感染６日後に、上清培養物をＨＩＶ-１ ｐ２４抗原産生について、記載される(Moore 等, 1990. Science 250, 139頁)ように免疫アッセイを用いてアッセイした。
【０１００】
実施例１９  コートタンパク質のＣ末端にＰ３３エピトープを表出するＡＰ２０５ ＶＬＰのクローニング、発現、精製及びパッケージ化
クローニング及び発現
抗原提示細胞中のプロセシングを改善するためにＮ末端にロイシンが付加されたＰ３３ペプチドをコードするＤＮＡ断片を、２つのオリゴヌクレオチド−oligo 2.198  (5'-CCTCCGGACTGAAA GCTGTGTATAACTTCGCGACTATGTAATGCATCG-3'、配列番号７９)とoligo  2.199   (5'-CGATGCATTACATAGTCGCGAAGTTATACACAGCTTTCAGTCCGGAGG-3'、配列番号８０)をアニールさせることによって作製した。得られた断片をＫｐｎ２Ｉ及びＭｐｈ１１０３Ｉで消化して、大腸菌トリプトファンオペロンプロモータの制御下にあるベクターｐＡＰ４０９内の同じ制限酵素部位内にクローニングした。結果として生じたコンストラクトは以下の通りである。
４２５：(４０９ベース)：ＡＰ２０５コートタンパク質−GSG−LKAVYNFATM
結果として生じたプラスミドをｐＡＰ４２５と称し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して、実施例２に記載のように発現させた。
【０１０１】
精製
細胞を、５μｇ／ｍｌ ＰＭＳＦを添加した溶解バッファー(５０ｍＭ トリス、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ トリトンＸ１００, ｐＨ８．０)中で超音波処理することによって溶解した。溶解物を遠心によって分離し、ペレットを、溶解バッファーにて２回、１Ｍ 尿素を含有する溶解バッファーにて１回洗浄した。プールした上清をＮＥＴバッファーのセファロースＣＬ-４Ｂカラムにて精製した。ＶＬＰを含有する溶出分画をプールし、Amicon遠心フィルターユニットを用いて濃縮し、ＮＥＴバッファーのＣＬ-６Ｂカラムにて精製した。Ｐ３３ペプチドの粒子のアッセンブリと表出は、Ｐ３３ペプチドに特異的なマウス抗血清を用いたウェスタンブロット、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及びＥＭによって精製したＶＬＰを分析することによって確認した。タンパク質の回収率は２．７ｍｇ／ｇ細胞であった。したがって、Ｐ３３ペプチドは、ＡＰ２０５コートタンパク質のＣ末端に成功裏に融合し、大量に粒子形成が起こった。この結果から、修飾されたＡＰ２０５ ＶＬＰはＰ３３などのエピトープの融合の強固なシステムであり、Ｆｒなどの他のＲＮＡファージＶＬＰに融合した場合には粒子のアッセンブリを妨げることが示唆される。
【０１０２】
パッケージ化
上記のように得られたＡＰ２０５-ｐ３３(２．７ｍｇ／ｍｌ)を２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ, ｐＨ７．４で透析し、ＲＮアーゼ(３００μｇ／ｍｌ ＶＬＰ)にて３７℃で３時間消化した。次いで、ＲＮアーゼ処理したＶＬＰを４℃で終夜透析した(Molecular weight cutoff=100000)。オリゴデオキシヌクレオチド(oligos)１６６８ｐｔ(t*c*c*a*t*g*a*c*g*t*t*c*c*t*g*a*a*t*a*a*t、この*はホスホロチオエート結合を意味する、配列番号９４)及びＮＫｐｔ(g*g*g*g*t*c*a*a*c*g*t*t*g*a*g*g*g*g*g*g、配列番号９５)を以下のようにＡＰ２０５-ｐ３３内にパッケージ化した。０．１２ｍｌの１ｍＭ oligo貯蔵物／ｍｌ 処理したＶＬＰとＭｇＣｌ２(終濃度２ｍＭ)を加え、３７℃で３時間インキュベートした。フリーoligoを２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ, ｐＨ７．４バッファーを用いた接線流量濾過(tangential flow filtration)によって除去した。oligoのパッケージ化は、エチジウムブロマイドのアガロースゲル電気泳動法によって再アッセンブリされたＶＬＰの分析を行うことにより確認した。パッケージ化されたＶＬＰ調整物中の残渣フリーoligoを、同じゲル上の同じoligoの標準物質の８つの希釈物と比較することによって定量した。オリゴの合計量をプロテイナーゼＫでパッケージ化されたＶＬＰ調整物を処理して、１０％ ＴＢＥ／尿素ゲルのＰＡＧＥによって分析することによって定量した。ゲルをＳＹＢＲゴールドにて染色して、標準物質として同じoligoの５つの希釈物を用いたデンシトメトリーによって各バンドの合計オリゴ含有量を定量した。パッケージ化されたoligo含有量を求めるために、残渣のoligo含有量を合計のoligo含有量から減算した。これは、ＮＫｐｔ oligoは４．３６ｎｍｏｌ／１００μｇ ＶＬＰであり、１６６８ｐｔ oligoは２．９８ｎｍｏｌ／１００μｇ ＶＬＰであった。
【０１０３】
実施例２０  オリゴデオキシヌクレオチドの存在下で再アッセンブリされるＡＰ２０５ ｐ３３融合タンパク質によるＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘発
実施例１９に記載のoligo１６６８ｐｔ又は内部パッケージ化oligoＮＫｐｔとＡＰ２０５-ｐ３３(コンストラクト４２５)、又はＴｏｌｌ様レセプターに対するリガンドでない、異なる量のポリ-Ｌ-グルタミン酸の存在下で再アッセンブリされるＡＰ２０５-ｐ３３ ＶＬＰ(０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ又は０．４ｍｇ／ｍｌのポリ-Ｌ-グルタミン酸とＡＰ２０５-ｐ３３／ポリ-Ｌ-Ｇｌｕ)、１５０μｇを皮下接種することによってＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫化した。８日後、免疫化した動物から採取した血液をｇｐ３３-特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖について分析した。血液をＦＡＣＳバッファー(ＰＢＳ、２％ ＦＣＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ, ｐＨ８．２)中に回収して、ｇｐ３３-ペプチド(Proimmune)を添加したＰＥ-標識Ｈ２-Ｄｂ-四量体にて３７℃で１０分間染色した後、ＡＰＣ標識ラット抗マウスＣＤ８ａ抗体(BD PharMingen)にて４℃で３０分間染色した。洗浄の後、赤血球をBD-Lyzing溶液(BD Biosciences, San Jose, USA)にて室温で１０分間かけて溶解した。最後に、CellQuestソフトウェアを用いたFACS Caliburにて細胞を分析した。まず初めに、細胞をフォワードスキャッターとサイドスキャッターに置き、リンパ球をゲートした。このリンパ球集団から、ｇｐ３３-ＰＥ標識細胞及びＣＤ８-ＡＰＣ標識細胞をＦＬ２及びＦＬ４検出器にてそれぞれ測定した。ｇｐ３３-特異的Ｔ細胞をＣＤ８陽性リンパ球の合計に対するパーセントＣＤ８陽性、ｇｐ３３陽性細胞として算出した。
ｇｐ３３-特異的Ｔ細胞応答の測定の後に、マウスを、ｇｐ３３-ペプチドを発現する１．５×１０６ｐｆｕの組み換えワクチンにて負荷試験した。５日後、マウスの卵巣におけるウイルス力価を測定した。単一の卵巣の細胞懸濁液をＢＳＣ４０細胞の段階希釈物中でインキュベートした。５％ ＣＯ２、３７℃で終夜インキュベートした後、ウイルス誘発細胞溶解物由来の細胞層にてプラークを可視化するために、細胞をクリスタルバイオレット(５００ｍｌ ９６％ エタノール、５ｇ クリスタルバイオレット(Sigma C-3886)、８ｇ ＮａＣｌ、４５０ｍｌ Ｈ２Ｏ、５０ｍｌ ホルムアルデヒド)にて染色した。卵巣中の残渣ウイルスの数はプラーク形成単位(ｐｆｕ)として算出した。
【０１０４】
実施例２１  グレリンペプチドを表出するＡＰ２０５ ＶＬＰのクローニング、発現及び精製
クローニング及び発現
グレリンに対して抗体を誘発するワクチンを作製するために、ヒトグレリン(１-８)に対応するペプチドをＡＰ２０５のＣ末端に融合した。次いで、ワクチンをマウスに接種し、グレリンへの結合について抗体を試験した。グレリンペプチド(GSSFLSPE、配列番号５５)をコードするＤＮＡ断片を２つのオリゴヌクレオチド−Oligo 4.173 (5’-GT TCC GGA GGG AGC TCC TTC CTG TCT CCG GAA TAA TGCATGT-3’、配列番号８１)とOligo 4.174 (5’-ACATGCA TTA TTC CGG AGA CAG GAA GGA GCT CCC TCC GGA AC-3’、配列番号８２)にアニールさせることによって作製した。得られた断片をＫｐｎ２Ｉ及びＭｐｈ１１０３Ｉにて消化して、大腸菌トリプトファンオペロンプロモータの制御下にあるベクターｐＡＰ４０５及びｐＡＰ４０９内の同じ制限酵素部位内にクローニングした。結果として生じたコンストラクトは以下の通りである。
(405ベース) 513  ＡＰ２０５コートタンパク質−GTAGGGSG−GSSFLSPE   
(409ベース) 514  ＡＰ２０５コートタンパク質−GSG−GSSFLSPE 
結果として生じたプラスミドｐＡＰ５１３及びｐＡＰ５１４にて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して、実施例２に記載のように発現させた。溶解物中に存在するキャプシドにより、それぞれのＡＰ２０５コートタンパク質融合物が大腸菌内で発現される際にＶＬＰの自己アッセンブリが起こることが示された。
【０１０５】
コンストラクト５１３からのＶＬＰの精製
細胞を、５μｇ／ｍｌ ＰＭＳＦを添加した溶解バッファー(５０ｍＭ トリス、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０, ｐＨ８．０)中で超音波処理することによって溶解した。溶解物を遠心によって分離し、ペレットを溶解バッファーにて３回洗浄した。プールした上清に終濃度０．４ＭとなるようにＮａＣｌを添加し、半量の４０％ ＰＥＧ６０００水溶液にて沈殿させた。沈殿物を遠心によって単離し、洗浄して、Ｈ２Ｏに再懸濁して、ＮＥＴバッファーのセファロースＣＬ-２Ｂカラムにて精製した。ＶＬＰを含有する溶出分画をプールし、Amicon遠心フィルターユニットを用いて濃縮した。さらに、コンストラクト５１３からのタンパク質を、以下のショ糖溶液にて調整したショ糖密度勾配法により精製した：９ｍｌ ３６％、３ｍｌ ３０％、６ｍｌ ２５％、８ｍｌ ２０％、６ｍｌ １５％、６ｍｌ １０％及び３ｍｌ ５％。ＶＬＰ分画をプールし、遠心フィルターユニットにより濃縮して、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ, ｐＨ７．５にて透析した。コンストラクト５１４からのタンパク質のＣＬ-２Ｂ精製物からのＶＬＰを含有する濃縮された分画をさらに、セファロース６Ｂカラムにて精製して、ＶＬＰを含有する分画を遠心フィルターユニットにより濃縮した。
グレリンペプチドの表出は、グレリンに特異的なマウス抗血清を用いたウェスタンブロット、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、ＡＰ２０５-グレリン ＶＬＰにてＥＬＩＳＡプレートをコートし、ＲＮＡアーゼにコンジュゲートされたグレリンペプチドへのグレリンに特異的なマウス抗血清の結合を阻害する阻害ＥＬＩＳＡ、及びＥＭによって精製したＶＬＰを分析することによって確認した。
【０１０６】
成体雌のＣ５７ＢＬ／６マウス(１グループ当たり５匹)に、コンストラクト５１３からの精製されたＶＬＰにてワクチン接種した。このときコンストラクト４０５からの精製されたＶＬＰをネガティブ対照として用いた。あるいは、成体雌のＣ５７ＢＬ／６マウス(１グループ当たり５匹)を、コンストラクト５１４からの精製されたＶＬＰにてワクチン接種した。このときコンストラクト４０９からの精製されたＶＬＰをネガティブ対照として用いた。各試料からの透析したワクチン１００μｇを２００μｌの容量にＰＢＳで希釈して、第０日目、第１４日目、第２８日目及び第４２日目に皮下注射した(１００μｌを腹側２箇所に)。第０日目、第１４日目、第２８日目、第４２日目及び第５６日目にマウスの後眼窩から採血し、その血清をＥＬＩＳＡによって分析した。
その後、グレリン特異的な抗体力価が実験中に著しく低下した場合には、マウスを追加免役した。すべてのマウスに高脂肪食(３５重量％の脂肪、６０％エネルギー)を与え、食事誘発性の肥満の発達を容易にした。食事と水は適宜与えた。一定の間隔で体重をモニターした。
【０１０７】
実施例２２  Ｎ末端にＭ２ペプチドを表出するＡＰ２０５ ＶＬＰのクローニング、発現、精製及びパッケージ化
クローニング及び発現
インフルエンザタンパク質Ｍ２に対して抗体を誘発するワクチンを作製するために、インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質に対応するペプチドをＡＰ２０５のＮ末端に融合した。次いで、ワクチンをマウスに接種し、免疫化の保護効果を評価した。Ｎ末端にＭＧが付加されたＭ２ペプチド(MGSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDG、配列番号８３)をコードするＤＮＡ断片を２つの５'リン酸化オリゴデオキシヌクレオチド−oligo M2- I (5’- GGC CAT GGG ATC TCT GCT GAC CGA AGT TGA AAC CCC GAT TCG TAA TGA ATG GGG TTG CCG TTG CAA TGA TTC TTC TGA TGG TTC CGG AGG - 3’、配列番号８４) とoligo M2- II (5’- CCT CCG GAA CCA TCA GAA GAA TCA TTG CAA CGG CAA CCC CAT TCA TTA CGA ATC GGG GTT TCA ACT TCG GTC AGC AGA GAT CCC ATG GCC -3’、配列番号８５)にアニールさせることによって作製した。得られた断片を、予めＮｃｏＩ及びＫｐｎ２Ｉで消化したベクターｐＡＰ３７８内にクローニングした。結果として生じたコンストラクトは以下の通りである。
５５１：(３７８ベース)：MGSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDG−SGG−ＡＰ２０５コートタンパク質
結果として生じたプラスミドｐＡＰ５５１にて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して、実施例２に記載のように発現させた。溶解物中に存在するキャプシドにより、ＡＰ２０５コートタンパク質融合物が大腸菌内で発現される際にＶＬＰの自己アッセンブリが起こることが示された。
【０１０８】
精製
細胞を、５μｇ／ｍｌ ＰＭＳＦを添加した溶解バッファー(５０ｍＭ トリス、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０, ｐＨ８．０)中で超音波処理することによって溶解した。溶解物を遠心によって分離し、ペレットを１Ｍ 尿素を含有する溶解バッファーにて洗浄した。プールした上清をＮＥＴバッファーのセファロースＣＬ-４Ｂカラムにて精製した。ＶＬＰを含有する溶出分画をプールし、Amicon遠心フィルターユニットを用いて濃縮し、ＮＥＴバッファーのセファロース６Ｂカラムにて精製した。ＶＬＰを含有する分画をプールし、遠心フィルターユニットにより濃縮して、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ, ｐＨ７．５にて透析し、Ｍ２ペプチドの粒子のアッセンブリと表出を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びＥＭによって精製したＶＬＰを分析することによって確認した。
【０１０９】
実施例２３  Ｃ末端にＭ２ペプチドを表出するＡＰ２０５ ＶＬＰのクローニング、発現及び精製
クローニング及び発現
インフルエンザウイルスのＭ２ペプチドに対応するペプチドをＡＰ２０５コートタンパク質のＣ末端に融合した。簡単に言うと、ＡＰ２０５コートタンパク質とインフレーム融合し、クローニングのためのＫｐｎ２Ｉ及びＭｐｈ１１０３Ｉの制限酵素部位に隣接するＭ２配列(配列番号４３)をコードする２つの相補的なオリゴヌクレオチドを合成した。また、ペプチドコード配列の終末に停止コドンを含有させた。この相補的なオリゴヌクレオチドをアニールさせ、Ｋｐｎ２Ｉ及びＭｐｈ１１０３Ｉにて消化して、Ｃ末端融合物の生成のためにｐＡＰ４０９、ｐＡＰ４０５内にクローニングした。結果として生じたコンストラクトは以下の通りである。
ｐＡＰ４０９-Ｍ２：ＡＰ２０５−GSG−SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDG
ｐＡＰ４０５-Ｍ２：ＡＰ２０５−GTAGGGSG−SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDG
実質的に実施例２２に記載と同じように、対応する融合タンパク質を発現させて精製した。
【０１１０】
実施例２４  Ｃ末端又はＮ末端に融合させたＭ２ペプチドの多量体を表出するＡＰ２０５ ＶＬＰのクローニング、発現及び精製
発現ベクターのクローニング
短いスペーサー配列で直列に分離するＭ２ペプチドの多量体をＡＰ２０５コートタンパク質にインフレーム融合させた。簡単に言うと、ＡＰ２０５コートタンパク質とインフレーム融合し、クローニングに好適な制限酵素部位に隣接する所望の配列(以下を参照)をコードする２つの相補的なオリゴヌクレオチドを合成した。また、ＡＰ２０５のＣ末端に融合させるためのペプチドコード配列の終末に停止コドンを含有させた(ｐＡＰ４０９、ｐＡＰ４０５内にクローニング)。相補的なオリゴヌクレオチドをアニールし、好適な制限酵素にて消化して、それぞれのＡＰ２０５融合ベクター内にクローニングした。Ｎ末端融合物を生成するためにｐＡＰ３７８及びｐＡＰ３８２内に、Ｃ末端融合物を生成するためにｐＡＰ４０９及びｐＡＰ４０５内に、Ｍ２二量体(SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDG−GSSG−SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDG、配列番号９６)又はＭ２三量体( SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDG−GSSG−SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDG−GSSG−SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDG、配列番号９７)をクローニングした。実質的に実施例２２と同じように、対応する融合タンパク質を発現させ、精製した。
【０１１１】
実施例２５  表面上にＭ２ペプチド又はその多量体を表出するＡＰ２０５ ＶＬＰの機能的な試験
異なるＡＰ２０５-Ｍ２融合ワクチンを試験するために、実施例２２−２４より入手したＶＬＰにて免疫化し、その後、基本的には既に記載される(Jegerlehner 等, J. Immunol., 2004, 5598-5605頁)ようにインフルエンザＡウイルス負荷試験を行った。簡単に言うと、実施例２２−２４からそれぞれ入手したＶＬＰとネガティブ対照としてＡＰ２０５ ＶＬＰを用いて、成体Ｃ５７ＢＬ／６マウス(１グループ当たり５匹)にワクチン接種した。各マウスについて、１００μｇのワクチンを２００μｌの容積にまでＰＢＳで希釈し、第０日目及び第１４日目に、各動物の左右の鼠径部に皮下注射した。第１４日目及び第２１日目に動物から採血し、Ｍ２特異的抗体応答をＥＬＩＳＡで測定した。簡単に言うと、Ｍ２ペプチドを、アミノ酸スペーサー(CGG)とクロスリンカーSPDPを介してＲＮアーゼにコンジュゲートさせ、ＥＬＩＳＡプレート上に４℃で終夜をかけてコートした。血清の結合を西洋ワサビペルオキシダーゼヤギ抗マウスＩｇＧコンジュゲートにて検出した。
第３３日目に、すべてのマウスを、４０００生インフルエンザＡウイルス(細胞株：A/Puerto Rico 8/34, H1N1サブタイプ)／マウスにて負荷試験した。次いで、各免疫化グループの体重及び死亡率を１４日間モニターした。
【０１１２】
実施例２６  ＨＩＶ ｅｎｖペプチドとのＡＰ２０５コートタンパク質の融合タンパク質を含有する修飾されたＶＬＰのクローニング、発現及び精製
クローニング及び発現
ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１６０由来のペプチド(配列番号９８−１１３)をＡＰ２０５コートタンパク質にインフレーム融合させた。簡単に言うと、ＡＰ２０５コートタンパク質とインフレーム融合し、クローニングに好適な制限酵素部位に隣接する所望の配列をコードする２つの相補的なオリゴヌクレオチドを合成した。また、ＡＰ２０５のＣ末端に融合させるためのペプチドコード配列の終末に停止コドンを含有させた(ｐＡＰ４０９、ｐＡＰ４０５内にクローニング)。ＡＰ２０５のＮ末端で融合させるためのOligoの開始部分に開始メチオニンコドンを付加した。相補的なオリゴヌクレオチドをアニールさせ、好適な制限酵素にて消化し、それぞれのＡＰ２０５融合ベクター内にクローニングした。ＨＩＶ ｅｎｖペプチドを、Ｎ末端融合物を生成するためにｐＡＰ３７８及びｐＡＰ３８２内に、Ｃ末端融合物を生成するためにｐＡＰ４０９及びｐＡＰ４０５内にクローニングした。
実質的に、実施例２及び３に記載のように、対応する融合タンパク質の発現と精製を行った。
【０１１３】
それぞれのＡＰ２０５-ＨＩＶ ｅｎｖペプチドと、対照としてＡＰ２０５ ＶＬＰを用いて、成体Ｃ５７ＢＬ／６マウス(１グループ当たり５匹)にワクチン接種した。各マウスについて、１００μｇのワクチンを２００μｌの容積にまでＰＢＳで希釈し、第０日目及び第１４日目に、各動物の左右の鼠径部に皮下注射した。
第１４日目及び第２１日目に動物から採血し、抗体応答をＥＬＩＳＡで測定した。簡単に言うと、試験する抗原を、アミノ酸スペーサー(CGG)とクロスリンカーSPDPを介してＲＮアーゼにコンジュゲートさせ、ＥＬＩＳＡプレート上に４℃で終夜をかけてコートした。血清の結合を西洋ワサビペルオキシダーゼヤギ抗マウスＩｇＧコンジュゲートにて検出した。
第２１日目に心穿刺してマウスから採血し、各ワクチンの血清を以下のように精製した：各グループの５匹のマウスからの血清をプールして、１４０００ｒｐｍにて５分間遠心した。３ｍｌのプレウォッシュプロテインＧセファロースのカラム(Amersham Biosciences)に上清を流した。次いで、カラムを１０カラム容量のＰＢＳにて洗浄して、１００ｍＭ グリシンｐＨ２．８にて溶出させた。１ｍｌの分画を、２００μｌの１Ｍ トリスｐＨ８．０を含有するチューブに回収した。タンパク質含有分画をプールして、５ｋＤａの分子重量カットオフのMillipore Ultrafree遠心フィルター(Millipore)を用いて濃縮した。同じ濃縮フィルターを用いてバッファーをＰＢＳに交換した。精製したＩｇＧ分画をMillipore Millexフィルター(Millipore)を用いてフィルター滅菌し、液体Ｎ２で凍結させ、長期保存の場合には−８０℃で保存、又は一定期間であれば４℃で保存した。
次いで、得られた血清を、Ｒ５、Ｘ４ウイルス株を用いて基本的には実施例１９に記載のようにＨＩＶ中和アッセイにて試験した。さらに、精製したＩｇＧ分画を、既に記載されている(Hovanessian 等, Immunity 2004, 617-627頁)ように一次ＨＩＶ単離物を中和する能力について試験した。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】Ｄ２ペプチドとＡＰ２０５のコートタンパク質の融合タンパク質を含有してなる修飾されたＶＬＰの電子顕微鏡像を示す。Ｄ２は、スペーサーGSG (コンストラクト418)又はスペーサーGTAGGGSG (コンストラクト420)を介してコートタンパク質のＣ末端に融合させた。Ｄ２は、スペーサーGSGG (コンストラクト421)又はスペーサーGSGTAGGGSGS (コンストラクト422)を介してコートタンパク質のＮ末端に融合させた。
【図２】Ｄ２ペプチドとＡＰ２０５のコートタンパク質の融合タンパク質を含有してなる修飾されたＶＬＰの阻害ＥＬＩＳＡを示す。◆ コンストラクト４１８；□ コンストラクト４２０；▲ コンストラクト４２１；○ コンストラクト４２２。これらのコンストラクトは図１に記載した。
【図３】Ｎｅｆ５５とＡＰ２０５のコートタンパク質の融合タンパク質を含有してなる修飾されたＶＬＰの電子顕微鏡像を示す。Ｎｅｆ５５はスペーサーGTAGGGSGを介してコートタンパク質のＣ末端に融合させた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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