(57)【要約】  本発明は、微小血管合併症におけるＩＬ−６またはそのフラグメント、変異体、融合タンパク質、機能性誘導体もしくは塩の使用に関する。
2008511612.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病性神経症を除く微小血管合併症の治療および／または予防用の医薬の製造における、ＩＬ−６またはそのフラグメント、変異体、融合タンパク質、機能性誘導体もしくは塩の使用。
【請求項２】
前記微小血管合併症が網膜症、神経症および糖尿病非依存性末梢神経症から選択される請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記微小血管合併症が網膜症である請求項２記載の使用。
【請求項４】
前記微小血管合併症が腎症である請求項２記載の使用。
【請求項５】
前記糖尿病非依存性末梢神経症が慢性低酸素症を原因とする請求項２記載の使用。
【請求項６】
前記糖尿病非依存性末梢神経症が構造的血管疾患を原因とする請求項２記載の使用。
【請求項７】
前記微小血管合併症が高血圧を伴う請求項１記載の使用。
【請求項８】
前記微小血管合併症が潰瘍を伴う請求項１記載の使用。
【請求項９】
ＩＬ−６が組換え体である請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記融合タンパク質がＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６である請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
前記ＩＬ−６が１つもしくはそれ以上の部位でグリコシル化されている請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
前記ＩＬ−６がグリコシル化されない請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
前記融合タンパク質が免疫グロブリン（Ｉｇ）融合体を含む請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
前記機能性誘導体がアミノ酸残基上の１つもしくはそれ以上の側鎖として存在する１つもしくはそれ以上の官能基に結合した少なくとも１つの部分を含む請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
前記部分がポリエチレン部分である請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
前記医薬が、１４０〜２１０、７０〜２１０および１４〜４２ｍｃｇの範囲内の用量でＩＬ−６を含む請求項１〜１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
糖尿病性神経症を除く微小血管合併症の治療および／または予防用医薬の製造における、ＩＬ−６の内因性遺伝子活性化を可能にするために細胞内で機能するＤＮＡ調節配列を有するターゲッティングベクターの使用。
【請求項１８】
糖尿病性神経症を除く微小血管合併症の治療および／または予防用医薬の製造における、ＩＬ−６またはフラグメント、変異体もしくは融合タンパク質を産生するよう遺伝子組換えされた細胞の使用。
【請求項１９】
前記融合タンパク質がＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６である請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
糖尿病性神経症を除く微小血管合併症の治療および／または予防用医薬の製造における、ＩＬ−６またはフラグメント、変異体もしくは融合タンパク質のコーディング配列を含む発現ベクターの使用。
【請求項２１】
前記融合タンパク質がＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６である請求項２０記載の使用。
【請求項２２】
糖尿病性神経症を除く微小血管合併症の治療および／または予防方法であって、それを必要としている患者に、任意には薬学的に許容可能な担体とともに、有効量のＩＬ−６またはそのフラグメント、変異体、融合タンパク質もしくは塩を投与することを含む方法。
【請求項２３】
前記ＩＬ−６を皮下経路によって投与する請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記微小血管合併症が網膜症、神経症および糖尿病非依存性末梢神経症から選択される請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
前記微小血管合併症が網膜症である請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記微小血管合併症が腎症である請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
糖尿病非依存性末梢神経症が慢性低酸素症を原因とする請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
糖尿病非依存性末梢神経症が構造的血管疾患を原因とする請求項２４記載の方法。
【請求項２９】
微小血管合併症が高血圧を伴う請求項２２記載の方法。
【請求項３０】
微小血管合併症が潰瘍を伴う請求項２２記載の方法。
【請求項３１】
ＩＬ−６が組換え体である請求項２２記載の方法。
【請求項３２】
前記融合タンパク質がＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６である請求項２２記載の方法。
【請求項３３】
前記ＩＬ−６が１つもしくはそれ以上の部位でグリコシル化されている請求項２２記載の方法。
【請求項３４】
前記ＩＬ−６がグリコシル化されていない請求項２２記載の方法。
【請求項３５】
前記融合タンパク質が免疫プロブリン（Ｉｇ）融合体を含む請求項２２記載の方法。
【請求項３６】
前記機能性誘導体がアミノ酸残基上の１つもしくはそれ以上の側鎖として存在する１つもしくはそれ以上の官能基に結合した少なくとも１つの部分を含む請求項２２記載の方法。
【請求項３７】
前記部分がポリエチレン部分である請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
有効量が、約２〜３ｍｃｇ／ｋｇ、１〜３ｍｃｇ／ｋｇおよび０．２〜０．６ｍｃｇ／ｋｇの範囲から選択される請求項２２記載の方法。
【請求項３９】
前記有効量が約３ｍｃｇ／ｋｇ、２ｍｃｇ／ｋｇ、１ｍｃｇ／ｋｇ、０．６ｍｃｇ／ｋｇおよび０．２ｍｃｇ／ｋｇから選択される請求項２２記載の方法。
【請求項４０】
前記有効量が１４０〜２１０、７０〜２１０および１４〜４２ｍｃｇの範囲から選択される請求項２２記載の方法。
【請求項４１】
前記ＩＬ−６が１週間に３回投与される請求項２２記載の方法。
【請求項４２】
ＩＬ−６の内因性遺伝子活性化を可能にするために細胞内で機能するＤＮＡ調節配列を有する有効量のターゲッティングベクターを投与することを含む、糖尿病性神経症を除く微小血管合併症の治療および／または予防方法。
【請求項４３】
糖尿病性神経症を除く微小血管合併症の治療および／または予防方法であって、微小血管合併症の治療および／または予防のための医薬の製造においてＩＬ−６またはそのフラグメント、変異体もしくは融合タンパク質を産生するように遺伝子組換えされている細胞を投与することを含む方法。
【請求項４４】
前記融合タンパク質がＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６である請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
ＩＬ−６またはそのフラグメント、変異体もしくは融合タンパク質のコーディング配列を含む発現ベクターを投与することを含む、糖尿病性神経症を除く、微小血管合併症の治療および／または予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微小血管合併症の分野におけるものである。特に、本発明は、微小血管合併症における、ＩＬ−６またはそのフラグメント、変異体、融合タンパク質、機能性融合体もしくは塩の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、糖質代謝の疾患すなわちインスリン分泌および／またはインスリン作用における完全機能障害もしくは相対的機能障害から生じる高血糖によって特徴付けられる症候群である。
【０００３】
糖尿病の分類は、National Diabetes Data Group およびWHOによって採用されている分類に基づいている。かつて、糖尿病の分類は、糖尿病発症時の年齢、持続期間および合併症に基づいていた。妊娠糖尿病は、通常の妊娠時に発症もしくは初めて認識される様々な重篤度の糖質不耐性である。Ｉ型糖尿病（ＤＭ）患者はインスリン依存型ＤＭ（ＩＤＤＭ）もしくは若年発症糖尿病とも呼ばれ、糖尿病性ケトアシドーシス（ＤＫＡ）を発症する可能性がある。非インスリン依存性ＤＭ（ＮＩＤＤＭ）とも呼ばれるＩＩ型ＤＭ患者は、非ケトン性高血糖性昏睡（ＮＫＨＨＣ）を発症する可能性がある。共通に見られる晩期微小血管合併症として、網膜症、腎症および末梢神経障害ならびに自律性神経障害があげられる。感覚喪失のもっとも重要な臨床的帰結は、足の潰瘍であるが、これは糖尿病患者における最も多く見られる入院の原因であり、非外傷性下肢切断の原因の筆頭にあげられている（Boulton 1997, Jude 1999 and Cameron 2001）。大血管合併症には、アテローム性冠状動脈硬化および末梢動脈疾患があげられる。
【０００４】
Ｉ型糖尿病：Ｉ型糖尿病は何歳でも発症する可能性があるが、通常は、小児期もしくは青年期に発症し、３０歳より前に優勢型ＤＭとの診断を受ける。この型の糖尿病は全ＤＭ症例の１０〜１５％を占め、臨床的には、高血糖および糖尿病性ケトアシドーシス傾向によって特徴付けられる。膵臓はほとんど、もしくはまったくインスリンを産生しない。
【０００５】
Ｉ型ＤＭ患者の約８０％が、検出可能な血清島細胞質抗体および島細胞表面抗体（グルタミン酸デカルボキシラーゼに対する抗体およびインスリンに対する抗体の症例も、類似した割合でみられる）に伴う特異的ＨＬＡ発現型である。
【０００６】
これらの患者では、Ｉ型ＤＭは、インスリン分泌細胞の９０％を超える遺伝的感受性粘液介在選択性破壊から生じる。このような患者の膵島は、膵島炎を呈するが、これはマクロファージおよびＢリンパ球を伴うＴリンパ球の浸潤およびグルカゴン分泌アルファ細胞の関与を伴わないベータ細胞の大部分の喪失によって特徴付けられる。診断時に存在したこのような抗体群は、通常、数年後には検出不能となる。これらは、主としてベータ細胞破壊に対する反応であるが、一部は、ベータ細胞に対して細胞毒性を示し、それらの喪失に寄与する可能性がある。Ｉ型ＤＭの臨床的発症は、基本的自己免疫プロセスの潜行性の発症から数年後に一部の患者で生じる。このような抗体のスクリーニングが、現在行われている数多くの予防調査研究の対象となっている。
【０００７】
ＩＩ型糖尿病：ＩＩ型ＤＭは、通常は、３０歳より高齢の患者で診断される型の糖尿病であるが、小児や青少年に発症することもある。ＩＩ型糖尿病は高血糖およびインスリン耐性によって臨床的に特徴付けられる。糖尿病性ケトアシドーシスは稀である。ほとんどの患者が食餌療法、運動および経口薬の服用によって治療されるが、一部の患者は、症候性高血糖をコントロールし、非ケトン性高血糖−高浸透圧性昏睡を予防するため断続的にもしくは持続的にインスリン投与する必要がある。一卵性双生児におけるＩＩ型ＤＭの合致率は９０％より大である。ＩＩ型ＤＭは、一般には肥満、特に上半身（内臓／腹部）の肥満に関係があり、さらに多くの場合、一定期間の体重増加後に発症する。加齢に伴う耐糖能低下は、特徴的な体重増加と深い関わりがある。内臓／腹部肥満のＩＩ型ＤＭ患者は、体重を低下させると正常の血糖値に戻ると考えられる。
【０００８】
ＩＩ型ＤＭは、糖に対するインスリン分泌反応の低下および筋骨格系によって摂取される糖質の刺激および肝臓の糖質産生（インスリン耐性）の維持におけるインスリン効果の低下から高血糖が発症する疾患の混成群である。ただし、インスリン耐性は一般的に認められ、インスリン分泌を十分に増加させることによって体が補償するので、インスリン耐性患者のほとんどは糖尿病を発症することはない。一般的に見られる様々な種類のＩＩ型糖尿病におけるインスリン耐性は、インスリン受容体もしくは糖輸送担体における遺伝子変化の結果生じるものではない。ただし、遺伝子的に判断された受容体後細胞内欠陥も一因となると考えられる。その結果発症するインスリン過剰症から、肥満（腹部）、高血圧、高脂血および冠状動脈疾患（インスリン耐性症候群）などの他の一般的に見られる病態を発症する可能性がある。
【０００９】
遺伝要因は、ＩＩ型ＤＭの発症の主要な決定因子であると思われるが、それでもなおＩＩ型ＤＭと特異的ＨＬＡ発現型もしくは島細胞の細胞質抗体間における関連性はいまだ実証されていない。１つの例外として、ＨＬＡ発現型の１つを媒介する検出可能な島細胞抗体を有し、Ｉ型ＤＭを最終的に発症する可能性のある非肥満型成人の１群がある。
【００１０】
糖尿病が発症する前に、一般に患者は糖に対する早期インスリン分泌反応を喪失し、比較的大量のプロインスリンを分泌する可能性がある。確定した糖尿病では、空腹時インスリンレベルは通常であるか、もしくはＩＩ型糖尿病患者において増加する場合であっても、糖刺激インスリン分泌は明確に減少する。インスリンレベルの低下によって、インスリン介在糖摂取が低下し、肝臓の糖産生を維持することが不可能となる。
【００１１】
結果として高血糖が生じるだけでなく、高血糖はインスリン感性を低下させ、肝臓の糖産生を増大させるので、糖尿病患者における糖耐性（糖毒性）がさらに阻害されることも一因となっている。患者の代謝調節が改善すれば、通常、インスリンまたは血糖降下薬の用量は減少する。
【００１２】
一部のＩＩ型ＤＭ症例は、常染色体優性遺伝の若年の非肥満型の青年（成人発症型糖尿病「ＭＯＤＹ」）に発症する。ＭＯＤＹを発症している多くの家族がグルコキナーゼ遺伝子に突然変異を有している。インスリン分泌および肝糖調節の障害はこれらの患者で実証されている。
【００１３】
異常インスリン症は、欠損遺伝子のヘテロ遺伝の結果生じるＩＩ型ＤＭの臨床的特徴を伴うＤＭの希少な症例であり、インスリン受容体に通常結合しないインスリンを分泌する。これらの患者では、外来インスリンに対する正常な血漿糖反応に伴う血漿免疫反応インスリン値が大幅に上昇する。
【００１４】
糖尿病は、膵臓疾患が原因となる場合も多い。すなわち、慢性膵炎特にアルコール依存症における慢性膵炎は高い頻度で糖尿病に関与する。このような患者は、インスリン分泌およびグルカゴン分泌島の両方を喪失する。したがって、このような患者は軽度の高血糖となり、低用量のインスリンに感応すると考えられる。効果的抗調節（グルカゴンによって阻害されない外性インスリン）が欠落した場合、このような患者は、多くの場合急激に高血糖を発症することになる。アジア、アフリカおよびカリブ海地域では、ＤＭは、一般に重篤なタンパク質欠損および膵臓疾患を有する若年の重度の栄養失調患者に共通して認められる。このような患者は、糖尿病性ケトアシドーシスを発症する傾向はないが、インスリンが必要であろう。
【００１５】
糖尿病の診断：症状のある患者では、ＤＭは空腹時高血糖の診断基準を満たした時点、すなわち血漿（または血清）血糖値が成人もしくは児童における２回にわたる夜間摂食後に１４０ｍｇ／ｄｌ（＞＝７．７７ｍｍｏｌ／Ｌ）より大となった時点で確定される。
【００１６】
経口糖耐性試験は、空腹時血糖値が１１５〜１４０ｍｇ／ｄｌ（６．３８および７．７７ｍｍｏｌ／Ｌ）である患者、および診断未確定のＤＭに関連する可能性のある臨床症状（例えば多発性神経障害、網膜症）の患者でＩＩ型ＤＭの診断を下すのに有用であろう。
【００１７】
高血糖は、糖尿病の微小血管合併症のほとんどに関連付けられる。高血糖は、Ｈｂ  Ａ1c（以下を参照）の値と合併症が発症した割合との間に直線的相関関係を示す。他の調査研究の結果は、８％未満のＨｂ  Ａ1cが、それより低ければほとんどの合併症を予防し得る閾値であることを示唆している。したがって、Ｉ型ＤＭの治療では、高血糖症状を回避しながらＨｂ  Ａ1cを降下させるための代謝コントロールに焦点を合わせる試みをすべきである。しかしながら、状況が悪化し高血糖のリスクが許容不能となったとき（例えば期待寿命が短い患者や脳血管疾患や心疾患のある患者）もしくは患者の高血糖のリスクが高まったとき（例えば、不安定な、または自律性神経障害の患者）には、治療を個別化し、変更すべきである。
【００１８】
体重減少を実現するための食餌療法が、ＩＩ型ＤＭの体重過剰な患者でもっとも重要とされる。高血糖の改善が食餌療法でも実現できなかった場合には、経口薬による試験的療法に着手する必要がある。
【００１９】
患者の足、および足および脚部における脈動と感覚の点検など、合併症の症状および兆候の有無を定期的に評価し、アルブミンに関する尿検査を定期的に実施しなくてはならない。定期的臨床検査評価項目としては、脂質プロファイル、ＢＵＮ（血中尿素窒素）および血中クレアチニン値、ＥＣＧおよび年次の完全な眼科の評価などがあげられる。
【００２０】
高コレステロール症もしくは高血圧症は、特異的な後発性合併症のリスクを高めるので、特別な注意と適切な治療が必要となる。プロプラノロールなどのベータアドレナリン受容体遮断薬ベータブロッカーを、ほとんどの糖尿病患者で安全に使用することができるが、これらは、インスリン誘発性高血糖のベータアドレナリン症状を遮蔽する可能性があり、正常な抗調節反応を損なう可能性がある。したがって、ＡＣＥ阻害剤およびカルシウム拮抗薬が多くの場合使用されている。
【００２１】
血糖値の監視をすべての患者に実施させ、インスリン治療を受けている患者に対しては、それに応じてインスリンの投与量を調節するよう指示する必要がある。血糖値は、１滴の指先の血液を用いて簡便な家庭用分析器で測定することができる。スプリング式ランセットが指先の血液サンプルの取得に推奨される。検査の頻度は個々に決定する。インスリン治療糖尿病患者の場合、理想的には、食事前、食事１〜２時間後、さらには就寝時に、毎日血糖値を計る必要がある。
【００２２】
多くの医師たちがグリコシル化血色素（Ｈｂ  Ａ1c）を定期的に判定して、１〜３カ月前の期間における血糖値のコントロール状況を推定している。Ｈｂ  Ａ1cは、血糖によるＨｂの非酵素介在性グリコシル化の安定した産物であり、血糖値が上昇するに伴って速い速度で形成される。ほとんどの臨床検査の結果で、正常なＨｂ  Ａ1c値は約６％程度である。糖尿病が適正にコントロールされていない場合には、この値は、９〜１２％の範囲である。Ｈｂ  Ａ1cは、糖尿病の診断に特異的な検査であるとはいえないが、Ｈｂ  Ａ1cが上昇した場合、糖尿病に罹患している場合が多い。
【００２３】
フルクトサミン値を判定するという別の検査がある。フルクトサミンは血中タンパク質と糖との化学反応によって形成され、１〜３週間前の期間における糖コントロールの状況を反映している。したがって、この検査はＨｂ  Ａ1c値以前のコントロールの変化を表し、多くの場合、集中治療を適用したときおよび短期的臨床試験で役に立つ。
【００２４】
インスリン治療に関する限り、ヒトのインスリンは多くの場合動物由来の亜種に比べ抗原性が低いため、インスリン治療を開始するに当たっては好ましい。ただし、通常は非常に低い検出可能インスリン抗体値は、ヒトインスリン製剤を投与されている患者をはじめとするほとんどのインスリン治療患者で発現する。
【００２５】
インスリンは、１００Ｕ／ｍｌ（Ｕ−１００インスリン）を含有する製剤として日常的に供与され、使い捨てインスリン注射器で皮下注射される。一般に１／２−ｍｌの注射器が日常的に＝５０Ｕ未満の用量を注入している患者にとって好ましいが、これは、さらに簡単に読み取ることができ、用量が少ない場合も正確な測定を手助けしてくれるからである。一般にインスリンペンと呼ばれている複数用量のインスリン注入用具（ＮｏｖｏｌｉｎＰｅｎ）は、数日分の用量を含有するカートリッジを使用するよう設計されている。
【００２６】
糖尿病は、他の内分泌疾患と関連付けられることがある。ＩＩ型ＤＭは、クッシング症候群、末端肥大症、褐色細胞腫、グルカゴン産生腫瘍、原発性アルドステロン症もしくはソマドスタチン産生腫瘍に対して続発する可能性がある。このような疾患の多くが、末梢もしくは肝臓インスリン抵抗性に関連がある。ひとたびインスリン分泌も併せて低下すると、多くの患者は糖尿病となる。Ｉ型ＤＭの有病率は、特定の自己免疫分泌疾患、例えばグラービス病、橋本甲状腺炎、および特発性アジソン病などの患者で増加する。
【００２７】
糖尿病は、ベータ細胞毒によっても誘発され得る。例えば、ストレプトゾトシンは、ラットで実験的糖尿病を誘発し得るが、人では糖尿病を発症させることは稀である。
【００２８】
糖尿病の成人患者の年間死亡率は約５．４％（糖尿病疾患のない成人の死亡率に比べ２倍）であり、その期待寿命は平均寿命に比べて５〜１０年ほど短い。死亡率の増加は、主として心臓血管系疾患によるものであるが、心臓血管系以外の病因による死亡もまた増加する。糖尿病と診断されると即時に、微小血管もしくは大血管疾患によるほぼ回復不能な様々な臨床的合併症を発症するリスクが高まる。糖尿病の持続は合併症の病因における主要な因子であるが、例えば高血圧、喫煙および高コレステロール症などの他のリスク因子もまた糖尿病と相互作用して微小血管および大血管障害の臨床的経過に影響を与える。
【００２９】
糖尿病における微小血管合併症の１つが網膜症である。糖尿病性網膜症は、さまざまな臨床的異常の有無にしたがって分類される進行性疾患である。網膜症は、３０〜６９歳のヒトが失明する最大の要因となっている。網膜に対する損傷は、微小血管からの血液漏れと微小血管の閉塞の組合せから生じる。これらの変化は、蛍光眼底血管造影によって詳細に目視化することができる。新たに発見されたＩＩ型糖尿病の患者の１／５が、診断時に網膜症にかかっている。Ｉ型糖尿病の場合、視力を脅かす網膜症は診断後最初の５年間もしくは思春期より前には、ほとんど発症しない。ただし１５年が経過すると、Ｉ型糖尿病患者のほとんどすべてとＩＩ型糖尿病患者の２／３がバックグラウンド網膜症に罹患する。
【００３０】
糖尿病におけるさらに別の微小血管合併症が腎症である。糖尿病性腎症は、３００ｍｇ／２４ｈより大のタンパク尿、血圧上昇および進行性の腎機能の低下によって特徴付けられる。最も重篤な場合には、糖尿病性腎症は、透析や移植が必要な末期腎不全に至るが、初期段階においては顕著な疾患の前に初期腎症（もしくは微量尿タンパク）として知られる段階が先行する。この場合、尿中に微量のタンパク質が含まれる（従来の尿検査では検出不可である）。微量アルブミン尿は定期的採取で２０〜３００ｍｇ／２４ｈもしくは２０〜２００μｇ／ｍｉｎのアルブミン排泄速度として定義されており、特にＩ型糖尿病では、高い割合で顕著な糖尿病性腎症の予兆である。
【００３１】
糸球体ろ過率における下降速度は、個人によって大きく異なるが、抗高血圧治療では、腎機能の低下を大幅に遅らせ、糖尿病性腎症の患者の生存率を改善する。
【００３２】
糖尿病性腎症を合併しているＩ型糖尿病患者では、アンジオテンシンを変換する酵素阻害剤が、血圧降下に貢献し得る阻害剤に比べて高い腎保護効果を有している。これらは、たとえ正常血圧の患者の場合であっても有益であり、網膜症などの他の関連する微小血管合併症を寛解させる。ＩＩ型糖尿病患者の場合、良好な血圧コントロール（多くの場合併用治療が必要）を達成することは、抗高血圧薬を選択することよりもむしろ重要であるが、アンジオテンシン変換酵素阻害剤を第１選択治療法として採用する。
【００３３】
糖尿病おけるさらに別の微小血管合併症は多発性神経障害で、これは糖尿病患者における死亡率の主要原因である足の潰瘍や関節の諸問題の主因である。糖尿病性多発性神経障害では、感覚脱失により、足に合わない靴を履いたりもしくは小石を踏んだりするといった共通の原因からの外傷の認知が損なわれてしまう。固有受容の変化から、異常なパターンの体重負荷や時としてシャルコー関節の発症に至る。
【００３４】
足に潰瘍のある患者は多くの場合神経症を発症しているために痛みを感じず、経過がなおざりにされ後期に至るまで、全身症状を呈することがない。重度の潰瘍、特に検出可能なセルライトに関連する潰瘍では、全身毒性および永久的障害が発生する可能性があるので直ちに入院する必要がある。早期の外科的創面切除は、処置上の重要な部分であるが、足の切除が必要になる場合もある。
【００３５】
インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、数種類の細胞型によって産生され、分泌される多機能サイトカインである。この多面性サイトカインは、免疫反応、急性期反応および造血をはじめとする細胞防御機序で中心的な役割を果たす。ＩＬ−６は、すでにクローン化された１８５アミノ酸を有する２０〜２６ｋＤａ糖タンパク質である（Mayら（1986）; Zilbersteinら（1986）; Hiranoら（1986））。ＩＬ−６は、以前はＢ細胞刺激因子２（ＢＳＦ−２）、インターフェロン−ベータ２および肝細胞刺激因子と呼ばれていた。ＩＬ−６は、肝臓、脾臓および骨髄などをはじめとする多数の各種組織および単球、線維芽細胞、内皮細胞、Ｂ細胞およびＴ細胞をはじめとする多種多様な細胞型によって分泌される。ＩＬ−６は、ウイルス、２本鎖ＲＮＡ、バクテリアおよびバクテリアリポ多糖類およびＩＬ−１およびＴＮＦなどの炎症性サイトカインをはじめとする多種多様なシグナルによって転写レベルで活性化される。
【００３６】
ＩＬ−６の生物学的活性は、一方がＩＬ−６受容体もしくはｇｐ８０と呼ばれ、もう一方がｇｐ１３０と呼ばれる２種類のタンパク質を含む膜受容体系が介在する（Hiranoらによる総説（1994））。ｇｐ１３０は、２７７個のアミノ酸からなる細胞内ドメインを含む９１８個のアミノ酸長の膜貫通糖タンパク質であり、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＬＩＦ、オンコスタチンＭ、ＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）、ＣＴ−１の受容体を含む、複数のサイトカイン受容体のサブユニット成分である。ＩＬ−６はｇｐ１３０を通じて作用するサイトカインのプロトタイプであり、そのサイトカインファミリーは「ＩＬ−６型サイトカイン」とも呼ばれている。
【００３７】
ｇｐ１３０は、低親和性受容体鎖に結合することによって、これらのサイトカインの高抗親和性受容体の形成に関与する。したがって、ｇｐ１３０は、「親和性コンバーター」とも呼ばれている。サイトカイン受容体に結合するリガンドは、ｇｐ１３０の二量化（ＩＬ−６受容体について示される）またはＬＩＦＲベータサブユニットとして知られているｇｐ１３０関連タンパク質とのヘテロ二量化（ＬＩＦ、オンコスタチンＭおよびＣＮＴＦ受容体について示される）をもたらす。個々のリガンドの結合は、細胞内シグナル伝導の最初の工程としてヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）として知られているチロシンキナーゼファミリーの活性化／会合を伴う。細胞内シグナル伝達プロセスには、チロシンリン酸化反応およびＳＴＡＴｓ（シグナルトランスデューサーおよび転写アクチベーター）と呼ばれる活性化因子が含まれる。
【００３８】
ヒトｇｐ１３０遺伝子産物は、染色体５および１７上の２つの異なる染色体座に相同しているように思われる。２つの異なるｇｐ１３０遺伝子配列の存在は、霊長類に限定され、他の脊椎動物には認められない。
【００３９】
ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＣＮＴＦ、オンコスタチンＭおよびＬＩＦのシグナル伝達活性は、特にｇｐ１３０を指向する各種モノクローナル抗体によって遮断され得る。これに加え、サイトカインもしくはそれらの受容体の存在とは関係なく、ｇｐ１３０を直接活性化するモノクローナル抗体の存在も認められている。
【００４０】
ｇｐ１３０を指向する他のモノクローナル抗体は、ＩＬ−６介在機能を阻害することが知られている。９０および１１０Ｋｄａの分子量を有する可溶型のｇｐ１３０（ｓｇｐ１３０）が、ヒト血清内に認められている。これらは成分としてのｇｐ１３０とともに受容体系を利用するこれらのサイトカインの生体機能を阻害し得る。
【００４１】
ｇｐ８０の細胞外ドメインに対応するＩＬ−６Ｒ  ｇｐ８０の可溶型（ｓＩＬ−６Ｒ）は、血中および尿中に糖タンパク質として認められる人体の天然の産物である（Novickら、1990, 1992）。ｓＩＬ−６Ｒ分子の例外的特性は、これらがヒト細胞を含む多数の細胞型でＩＬ−６の強力な作用薬として作用するという点である（Tagaら、1989; Novickら、1993）。ｇｐ８０の細胞質内ドメインがない場合であっても、なおｓＩＬ−６ＲはＩＬ−６に反応してｇｐ１３０の二量化を誘発することができ、これはさらに後続のＩＬ−６−特異的シグナル伝達および生物学的効果を介在する（Murakamiら、1993）。ｓＩＬ−６Ｒには、ＩＬ−６特異的生物学的活性に必須であるｇｐ１３０との２種類の相互作用があり（Halimiら、1995）、活性化ＩＬ−６受容体複合体は、２つのｇｐ１３０鎖、２つのＩＬ−６Ｒおよび２つのＩＬ−６リガンドによって形成される六量体構造であるということが提唱されている（Wardら、1994; Paonessaら、1995）。
【００４２】
正常な被験者におけるｓＩＬ−６Ｒ（作用薬）の循環濃度は比較的高く、上記１０ｎｇ／ｍｌの可溶性ｇｐ１３０（天然のＩＬ−６拮抗薬）の循環濃度に匹敵し得る（Corbiら、2000 Eur J Cardiotherac Surg. 18（1）:98-103, Disthabanchongら、Clin Nephrol. 2002 Oct;58（4）:289-95）。これに対し、ＩＬ−６の循環濃度は低く、約１０ｐｇ／ｍｌかそれ以下である（Kadoら、1999 Acta Diabetol. Jun 36（1-2）67-72, Corbiら、2000）。このように、疾患におけるｓＩＬ−６Ｒを併用投与せずに単独でインビボ投与した場合のＩＬ−６の影響は、有効である場合とそうでない場合とがあり、特定の疾患および体内の特定の部位における可溶性作用薬／拮抗薬の濃度によって異なる。
【００４３】
可溶性ＩＬ−６受容体とＩＬ−６とを結合させるキメラ分子が開発されている（Chebathら、Eur Cytokine Netw. 1997 Dec;8（4）:359-65）。これらは、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６と命名されている。キメラＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６分子は、可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）とＩＬ−６をコードするｃＤＮＡの全コーディング領域を融合させることによって生成される（図４を参照）。組換えＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６は、ＣＨＯ細胞内で産生された（Chedathら、Eur Cytokine Netw. 1997, WO99/02552）。ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６は、ｓＩＬ−６ＲとＩＬ−６の混合物に比べ高い効率で、インビボでｇｐ１３０鎖に結合する（Kolletら、Blood. 1999 Aug 1;94（3）:923-31）。
【００４４】
ＩＬ−６は、ヒト炎症性ＣＮＳ疾患の病因と密接に関係している。ＩＬ−６の血漿および脳脊髄液レベルの増加は、例えば、多発性硬化症の患者で実証されている（Freiら（1991））。
【００４５】
中枢および末梢神経系の細胞に対するＩＬ−６の効果に関する最近の実験は、ＩＬ−６が神経細胞に対する保護作用を呈するだけでなく、炎症性神経変性プロセスに対してもなんらかの影響を与える可能性があることを示している（GadientおよびOtten, 1997, Mendelら、1998）。ＩＬ−６は、海馬（Yamadaら、1994）のみならず線条体（Toulmondら、1992）ニューロンにおいてもグルタミン酸誘導型細胞死を防止することが見出された。ヒトＩＬ−６およびヒト可溶性ＩＬ−６Ｒ（ｓＩＬ−６−Ｒ）の両方を高レベルで発現しているトランスジェニックマウスでは、脳における舌下神経核の逆行性標識法によって示されるような舌下神経の障害後に神経再生の加速化が認められた（Hirotaら、1996）。さらに、ＩＬ−６が神経系疾患、すなわち脱髄性疾患の多発性硬化（ＭＳ）で示唆されるいくつかの根拠が存在している（Mendelら、1998）。ＩＬ−６遺伝子欠損マウスは、ＭＳの実験的誘導に耐性を示した。その一方で、ＩＬ−６は神経障害後の初期外傷後期のあいだの神経生存にマイナスの影響を与えることを示唆する報告がある（Fisherら、2001）。
【００４６】
国際公開第０３／０３３０１５号パンフレットは、特定の種類の神経症すなわち糖尿病性神経症の治療および／または予防のため、ＩＬ−６もしくはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラなどのｇｐ１３０を通してシグナル伝達する物質の使用を教示している。国際公開第０３／０３３０１５では、ＩＬ−６による治療が、神経線維をミエリン鞘の欠失および変性から防止したことが示されている。
【００４７】
すでに述べたように、糖尿病は神経機能を損傷させるということがよく知られている。神経機能の損傷は、糖尿病患者における神経血流の減退によるという根拠がある。後者は、糖尿病性神経症の疫学の病因として重要である。神経伝達速度の欠損が、ａｌアドレノセプター拮抗薬、アンジオテンシンＡＴ１拮抗薬をはじめとする様々な血管拡張剤の投与および酵素阻害剤、エンドセリンＥＴＡ拮抗薬、カルシウムチャンネルブロッカーおよびニトロ血管拡張剤の変換によって予防もしくは治療することが可能であることが、いくつかの研究で実証されている［Cameronら、2001に記載］。
【００４８】
例えば、ＩＬ−６血管拡張剤作用に関する相反する結果が、Baudryら（1996）によってインビボにおける調査研究として報告されている。ＩＬ−６に暴露すると、有意な用量依存性血管収縮が誘発されるが、一方でMinghiniら（1998）はＩＬ−６誘発性血管拡張について報告している。
【００４９】
すでに述べたように、糖尿病患者は、網膜、腎糸球体および末梢神経における糖尿病特異性微小血管合併症により、期待寿命および生活の質が大幅に低下する。糖尿病は、失明、末期腎臓病および多種多様な衰弱性神経症の主要因となっている。糖尿病は、腎透析および移植レシピエントの最も伸び率の高い１群である。６０％を超える糖尿病患者が神経症を発症しており、これは米国におけるすべての非外傷性切断の５０％に相当する。
【００５０】
徹底的に血糖値をコントロールすると微小血管合併症が劇的に減少するが、それらをすべて予防できるわけではないので、糖尿病の微小血管合併症の発症を高血糖だけで完全に説明できるわけではない（Effect of intensive diabetes treatment on nerve conduction in the Diabetes Control and Complication Trial. Ann Neurol. 1995 Dec;38（6）:869-80 and Lancet 352:837-853.1998）。糖尿病における微小血管合併症の現在の最適な管理法は、血糖をコントロールすることによってコントロールし、発生時に合併症を処置することにとどまっている。したがって患者は、失明、腎不全の発症および下肢切断などへと進むので、合理的な治療法の開発を推し進めるため微小血管疾患の病因についてさらに深く理解することが急務となっている（Cameronら、2001）。
【発明の開示】
【００５１】
本発明によると、ＩＬ−６の投与が、坐骨神経内膜血のＩＬ−６介在治療によって指摘されているように、微小血管合併症の動物モデルで有益な効果があるということが確かめられた。
【００５２】
したがって本発明は、糖尿病性神経症を除く微小血管合併症の治療および／または予防のための医薬の製造におけるＩＬ−６またはそのフラグメント、変異体、融合タンパク質、機能性誘導体もしくは塩類（「物質（substance）」）の使用に関する。
【００５３】
１つの態様では、本発明は、糖尿病性神経症を除く微小血管合併症の治療および／または予防のための医薬の製造における、ＩＬ−６の内因性遺伝子活性化を可能にするために細胞内で機能するＤＮＡ調節配列を有するターゲッティングベクターの使用に関する。
【００５４】
別の態様では、本発明は、糖尿病性神経症を除く微小血管合併症の治療および／または予防のための医薬の製造における、ＩＬ−６またはそのフラグメント、変異体、融合タンパク質を産生するように遺伝子組換えされた細胞の使用に関する。
【００５５】
さらに別の態様によれば、本発明は、糖尿病性神経症を除く微小血管合併症の治療および／または予防のための医薬の製造における、ＩＬ−６またはそのフラグメント、変異体もしくは融合タンパク質のコーディング配列を含む発現ベクターの使用に関する。
【００５６】
本発明は、糖尿病性神経症を除く微小血管合併症の治療および／または予防方法であって、それを必要としている患者に、任意には薬学的に許容可能な担体とともに、有効量のＩＬ−６またはそのフラグメント、変異体、融合タンパク質もしくは塩類を投与することを含む方法を提供する。
【００５７】
さらに本発明は、糖尿病性神経症を除く微小血管合併症の治療および／または予防方法であって、それを必要とする患者に、ＩＬ−６の内因性遺伝子活性化を可能にするために細胞内で機能するＤＮＡ調節配列を有する有効量のターゲッティングベクターを投与することを含む方法を提供する。
【００５８】
さらに本発明は、糖尿病性神経症を除く微小血管合併症の治療および／または予防方法であって、それを必要としている患者に、微小血管合併症の治療および／または予防のための医薬の製造において、ＩＬ−６またはそのフラグメント、変異体、融合タンパク質もしくは塩類を産生するように遺伝子組換えされた細胞を投与することを含む方法を提供する。
【００５９】
本発明はさらに、糖尿病性神経症を除く微小血管合併症の治療および／または予防方法であって、それを必要としている患者に、ＩＬ−６またはそのフラグメント、変異体もしくは融合タンパク質のコーディング配列を含む発現ベクターを投与することを含む方法を提供する。
【００６０】
１つの好ましい実施態様では、微小血管合併症は、例えば、網膜症、神経症および、例えば慢性低酸素症もしくは構造的血管疾患などによる末梢神経症などの糖尿病非依存性末梢神経症である。
【００６１】
本発明の別の好ましい実施態様では、微小血管合併症は高血圧を伴う。
【００６２】
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、微小血管合併症は潰瘍を伴う。
【００６３】
本発明のさらに好ましい実施態様では、ＩＬ−６は組換え体である。
【００６４】
本発明の１つの実施態様では、物質は１つもしくはそれ以上の部位でグリコシル化される。
【００６５】
本発明の別の実施態様では、物質はグリコシル化されない。
【００６６】
本発明のさらに別の実施態様では、融合タンパク質には免疫グロブリン（Ｉｇ）融合体が含まれている。
【００６７】
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、融合タンパク質はＩＬ６Ｒ−ＩＬ６を含んでいる。
【００６８】
本発明のさらに別の実施態様では、物質の機能性誘導体は、アミノ酸残基上の１つもしくはそれ以上の側鎖として発現する１つまたはそれ以上の官能基に結合した少なくとも１つの部分を含んでいる。
【００６９】
本発明のさらに好ましい実施態様では、機能性誘導体の部分はポリエチレン部分である。
【００７０】
本発明のさらなる実施態様では、医薬は、１４０〜２１０の範囲、好ましくは７０〜２１０の範囲、さらに好ましくは１４〜４２ｍｃｇの範囲における物質を含んでいる。
【００７１】
本発明のさらに好ましい実施態様では、物質は皮下経路によって投与される。
【００７２】
本発明のさらに好ましい実施態様では、有効量の物質は、約２〜３ｍｃｇ／ｋｇの範囲、好ましくは１〜３ｍｃｇ／ｋｇの範囲、さらに好ましくは０．２〜０．６ｍｃｇ／ｋｇの範囲にある。
【００７３】
本発明のさらなる実施態様では、物質の有効量は、約３ｍｃｇ／ｋｇ、２ｍｃｇ／ｋｇ、１ｍｃｇ／ｋｇ、０．６ｍｃｇ／ｋｇおよび０．２ｍｃｇ／ｋｇである。
【００７４】
本発明のさらなる実施態様では、物質の有効量は、約１４０〜２１０の範囲、好ましくは７０〜２１０の範囲、およびさらに好ましくは１４〜４２ｍｃｇの範囲である。
【００７５】
本発明のさらなる実施態様では、物質は１週間に３回の頻度で投与される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７６】
本発明は、ＩＬ−６の投与が糖尿病の動物モデルにおける微小血管合併症を減少させ得るという発見に基づいている。したがって、本発明は、微小血管合併症の治療および／または予防のための医薬の製造における、ＩＬ−６またはそのフラグメント、変異体、融合タンパク質機能性誘導体もしくは塩類（「物質」）の使用に関する。
【００７７】
本書で使用している「治療」および「予防」という用語は、微小血管合併症の１つまたは複数の症候または原因を予防、阻止、減弱、緩和または回復させるものとして理解すべきである。微小血管合併症を「治療」する際には、本発明による物質を微小血管合併症が発症した後に投与し、「予防」は、患者における微小血管合併症の兆候が認められる前の前記物質の投与に関する。
【００７８】
「血管」という用語は、血管に関する。
【００７９】
微小血管系に関する「微小血管」という用語は、細動脈、微小動脈枝、毛細血管、末梢血管、末梢動脈、メタ細動脈および静脈尿細管（venules renal tubules）などといった１００ミクロン以下の内径を持つすべての血管を含むものとして記述されている血管である微小血管を有する体の血管系の部分に関係する。微小血管系は、各種組織に血液を供給する、例えば尿細管は腎臓に、動脈は網膜に供給し、筋肉、皮膚、中枢神経系、腸粘膜、腎糸球体、膵臓、分泌腺に毛細管は存在している。
【００８０】
「合併症」という用語は、同一患者における別の疾患と併発した疾患（複数もあり）もしくは２つ以上の疾患の同時発症に関する。
【００８１】
したがって、本発明は、例えば糖尿病、慢性肺疾患、構造的血管疾患、高血圧および潰瘍などといったいずれかの疾患における微小血管合併症に関する。
【００８２】
本発明の糖尿病動物モデルに認められる結果では、血流障害（したがって低酸素症）は、神経機能障害で中心的役割を果たすこと、ＩＬ−６が血流を改善することが実証された。したがって、抹消神経症は、例えば慢性閉塞性肺疾患の被験者では、慢性低酸素症を患う非糖尿病の被験者の場合にも発症するので、本発明による物質の投与は非糖尿病性末梢神経症でも有効である。
【００８３】
さらに、本発明による物質の投与は、構造的血管疾患によって誘発された神経疾患でも有効である。
【００８４】
本発明の好ましい実施態様では、微小血管合併症は網膜症および神経症である。
【００８５】
ＩＬ−６の投与は、特に、循環系における高レベルのＩＬ−６受容体を示す微小血管合併症の患者では有効である。
【００８６】
糖尿病患者における高血圧は微小血管合併症の強固なリスクファクターであることが示唆されているので、本発明による物質の投与は、特に、高血圧を患う糖尿病患者および非糖尿病患者に有効である。
【００８７】
本発明にしたがって使用される融合タンパク質は、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６であることが好ましい。本発明で使用している（「ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６」または「ＩＬ−６キメラ」とも称する）は、インターロイキン−６のすべてまたは生物学的活性分画に融合したｇｐ８０の可溶性部分を有するキメラ分子である。このキメラタンパク質の部分は、相互に直接融合させることもでき、またはジスルフィド架橋もしくはポリペプチドリンカーなどの任意の適切なリンカーによって結合させることもできる。リンカーは、１〜３アミノ酸残基長という短さ、または長くて例えば１３または１８アミノ酸残基長であり得る短いリンカーペプチドであってもよい。該リンカーは、例えば可溶性ＩＬ−６受容体のアミノ酸配列とＩＬ−６配列との間に導入される配列Ｅ−Ｆ−Ｍ（Glu-Phe-Met）のトリペプチドまたはGlu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Metを含む１３アミノ酸リンカー配列などであってもよい。ＩＬ−６キメラの例は、当技術分野で周知であり、国際公開第９９／０２５５２号パンフレットもしくは国際公開第９７／３２８９１号パンフレットなどに詳細に記載されている。本発明にしたがって使用することができるＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ分子の例を、図４に模式的に示す。
【００８８】
本発明で使用している「変異体」という用語は、元のＩＬ−６もしくはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６と比較して生成物の活性をあまり変化させることなく、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の自然発生成分のアミノ酸残基の１つもしくはそれ以上が、異なるアミノ酸残基によって置き換えられているか、もしくは削除されているか、もしくは１つまたはそれ以上のアミノ酸残基がＩＬ−６もしくはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の元の配列に付加されているような、ＩＬ−６もしくはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の類似体を表す。これらの変異体は、既知の合成法および／または部位特異的突然変異誘発技術もしくはその他の既知の好適な技術によって製造される。
【００８９】
本発明による変異体には、中程度にストリンジェントな条件下もしくはストリンジェントな条件下で、ＩＬ−６もしくはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの補体にハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸によってコードされたタンパク質を含む。「ストリンジェントな条件」という用語は、当業者が「ストリンジェント」として従来表現しているハイブリダイゼーションおよびその後の洗浄条件を表している。Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§6.3 and 6.4（1987,1992）およびSambrook ら（Sambrook, J. C., Fritsch, E. F., and Maniatis, T.（1989）Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）を参照。
【００９０】
制限なく、ストリンジェントな条件の例としては、例えば５分間２×ＳＳＣおよび０．５％  ＳＤＳ、１５分間２×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳ、３０〜６０分間３７℃で０．１×ＳＳＣおよび０．５％  ＳＤＳ、次いで３０〜６０分間６８℃で０．１×ＳＳＣおよび０．５％  ＳＤＳなどでの試験ハイブリッドの計算Ｔｍ値より１２〜２０℃低い洗浄条件などが含まれる。当業者には、ストリンジェントな条件は、ＤＮＡ配列、オリゴヌクレオチドプローブ（１０〜４０塩基など）、あるいは混合ヌクレオチドプローブの長さによって異なるということが理解されるであろう。混合プローブを使用する場合には、ＳＳＣの代わりにテトラメチルアンモニウムクロライド（ＴＭＡＣ）を使用することが好ましい。Ausubelも参照されたい。「中程度にストリンジェントな条件」とは、４２℃で０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの場合など、さらに低い温度、低い塩類もしくは低い洗剤濃度における洗浄条件を意味する（Ausubelら、1989, supra）。
【００９１】
このような変異体は、実質的に類似しているかもしくはＩＬ−６もしくはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６に比べて活性が良好であるように、ＩＬ−６もしくはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の配列を十分に複製しているアミノ酸配列を有していることが好ましい。
【００９２】
ＩＬ−６の特徴的活性は、ＩＬ−６受容体のｇｐ８０要素に結合する能力であり、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の特徴的活性は、ｇｐ１３０に結合する能力にある。ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６のｇｐ１３０に対する結合を測定するためのＥＬＩＳＡ型検定については、本書に引用することによって完全に取り込まれている国際公開第９９／０２５５２号パンフレットの３９頁記載の例７に詳細な説明がある。当業者には、ＩＬ−６をｇｐ８０に結合させるために、類似したＥＬＩＳＡ型検定の開発が可能であることは理解されよう。変異体がｇｐ８０もしくはｇｐ１３０の個々の結合領域に対する実質的結合活性を備えているかぎりは、ＩＬ−６もしくはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６に対する同様の類似した活性も備えているとみなすことができる。したがって、所与の変異体が、国際公開第９９／０２５５２号パンフレットの実施例７に記載されているように、固定化されたｇｐ８０もしくはｇｐ１３０に結合するか否かを判断するための簡単なサンドイッチ結合検定をこのような変異体に適用することからなる日常的実験手段によってＩＬ−６もしくはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６と少なくとも実質的に同じ活性を備えているかを判定することができる。
【００９３】
例えば、マイクロタイター９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に抗ヒトｇｐ８０モノクローナル抗体を塗布し、５０ｎｇ／ｍｌのｇｐ８０（いずれもＲ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス製）を付加する。リン酸バッファー生理食塩水で洗浄した後に、ＩＬ−６を０．１〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲の各種濃度でそれぞれのウェルに塗布する。４０℃で一昼夜インキュベーションした後に、ウサギポリクロナル抗ＩＬ−６を添加し、次に、着色反応（シグマ、セントルイス）によって検出される、ホースラディッシュペルオキシダーゼに抱合されたヤギ抗ラビットＩｇを添加した。
【００９４】
好ましい実施態様では、あらゆるこのような変異体は、国際公開第９９／０２５５２号パンフレットに含まれる成熟ＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ分子の配列と少なくとも４０％同一性または相同性を有する。さらに好ましくは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または最も好ましくは少なくとも９０％同一性または相同性を有する。
【００９５】
同一性は、２つまたはそれ以上のポリペプチド配列間、または２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の、該配列の比較によって決定された関係を反映する。一般的に、同一性は、比較されている配列の全長に渡って、それぞれ２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の、ヌクレオチド−ヌクレオチド、またはアミノ酸−アミノ酸間の正確な一致をいう。
【００９６】
正確な一致がない配列に対しては、「％同一性」が決定され得る。一般的に、比較されるべき２つの配列は、該配列間に最大の相関関係が得られるように整列される。これは、整合の程度を高めるために、片方または両方の配列のいずれかにおける「ギャップ（gap）」の挿入を含む。％同一性は、比較される各配列の全長に渡って決定されても良く（いわゆるグローバルアラインメント）、またはより短く定義された長さに渡って決定されても良い（いわゆるローカルアラインメント）。グローバルアラインメントは、同じかまたは非常に類似した長さの配列に特に適しており、ローカルアラインメントは、不同の長さの配列により適している。
【００９７】
２つまたはそれより多くの配列の同一性と相同性を比較する方法は、当該分野においてよく知られている。したがって、たとえば、ウィスコンシン  シークエンス  アナリシス  パッケージ、バージョン９．１（Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1）（Devereux J et al., 1984）で使用可能なプログラム、たとえばＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰなどのプログラムが、２つのポリヌクレオチド間の％同一性ならびに２つのポリペプチド間の％同一性および％相同性を決定するために使用され得る。ＢＥＳＴＦＩＴは、スミスとウォーターマン（Smith and Waterman）の「ローカルホモロジー」アルゴリズム（１９８１）を使用し、２つの配列間の相同性の最適な単一領域を見つける。配列間の同一性および／または相同性を決定するための他のプログラムも、当業者に知られており、たとえば、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラム（Altschul S F et al, 1990, Altschul S F et al, 1997, www.ncbi.nlm.nih.govでＮＣＢＩのホームページから利用可能である。）およびＦＡＳＴＡ（Pearson W R, 1990; Pearson 1988）である。
【００９８】
本発明によって使用され得るＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの変異体、またはそれをコードする核酸としては、本明細書中に表わされる教示および指針に基づいて、過度の実験なしに、通常の当業者により日常的に得られ得る置換ペプチドまたはヌクレオチドとして実質的に対応する有限の配列が包含される。
【００９９】
本発明による変異体についての好ましい変化は、「保存的」置換として知られるものである。ＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの保存的アミノ酸置換は、充分に類似した物理化学的な特性を有する群の範囲内の同義アミノ酸を含み得るものであり、その群のメンバー間における置換は分子の生物学的機能を保存するものであろう（Grantham, 1974）。とくに挿入または欠失が、たとえば３０以下、好ましくは１０以下のわずかなアミノ酸のみを含むものであり、たとえばシステイン残基など機能的配座に重要なアミノ酸の除去または入れ替えをしない場合、アミノ酸の挿入および欠失もまた、その機能を変化させることなく前記配列内でなされることは明らかである。このような欠失および／または挿入によって産生されるタンパク質およびその変異体は、本発明の範囲内である。
【０１００】
好ましくは、同義のアミノ酸群は、表１に規定される群である。より好ましくは、同義のアミノ酸群は、表２に規定される群である。そして、最も好ましくは、同義のアミノ酸群は、表３に規定される群である。
【０１０１】
【表１】
2008511612.tif 000003
【０１０２】
【表２】
2008511612.tif 000004
【０１０３】
【表３】
2008511612.tif 000005
【０１０４】
本発明に使用するためのＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラのムテインを得るために使用され得る、タンパク質でのアミノ酸置換の製造例としては、Markらによる米国特許第４，９５９，３１４号明細書、同第４，５８８，５８５号明細書および同第４，７３７，４６２号明細書； Kothsらによる同第５，１１６，９４３号明細書、Namenらによる同第４，９６５，１９５号明細書、Chongらによる同第４，８７９，１１１号明細書、Leeらによる同第５，０１７，６９１号明細書などにおいて示された周知の方法手順；および米国特許第４，９０４，５８４号明細書（Shawら）に示されたリジン置換タンパク質などがあげられる。
【０１０５】
本発明に関連して利用されるＩＬ−６の特異的変異体についても記載がある（国際公開第９４／０３４９２Ａ１号パンフレット）。さらに、欧州特許第６６７８７２Ｂ１号明細書には野生型ＩＬ−６に比べ生物学的活性が改善された突然変異ＩＬ−６についての記述がある。これに加え、欧州特許第６５６１１７Ｂ１号明細書には、ＩＬ−６の超作用薬を孤立させるための方法が記載されている。突然変異体もしくは超作用薬は、本発明にしたがって使用してもよい。
【０１０６】
「融合タンパク質」という用語は、たとえば体液内において長期の滞留時間を有する他のタンパク質と融合された、ＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、またはその変異体または断片からなるポリペプチドのことをいう。したがって、ＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラは、たとえば免疫グロブリンまたはその断片といった他のタンパク質、ポリペプチドなどと融合され得る。
【０１０７】
本明細書中で使用される場合、「機能的誘導体」は、本技術分野において周知の方法で、残基の側鎖またはＮ末もしくはＣ末基として存在する官能基から製造され得るＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラの誘導体、ならびにそれらの変異体および融合タンパク質を含み、薬学的に許容し得るかぎり、すなわちＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の活性と実質的に類似しているタンパク質の活性を破壊せず、それを含む組成物において毒性を与えないかぎり、本発明に含まれる。
【０１０８】
例えば、これらの誘導体には、抗原部位を遮蔽し、体液中でＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の在留時間を延長させ得るポリエチレングリコール側鎖などがある。他の誘導体としては、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたは１級アミンもしくは２級アミンと反応することによるアミノキシル基のアミド、アクリル成分とともに形成されたアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体（例えばアルカノイルもしくは炭素環式アロイル基）もしくはアシル成分とともに形成された遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体（例えばセリルもしくはスレオニル残基の誘導体など）などがあげられる。
【０１０９】
本発明による「フラグメント」は、例えば、ＩＬ−６もしくはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の活性画分であってもよい。フラグメントという用語は、分子のいずれかのサブセット、すなわち、ｇｐ１３０の作用薬としての活性を備えた所望の生物学的活性を保持する短いペプチドを表す。フラグメントは、ＩＬ−６もしくはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６のどちらかの末端からアミノ酸を除去し、その特性を残りのフラグメントで検査してｇｐ８０もしくはｇｐ１３０のそれぞれに結合させることによってすぐに製造可能である。ポリペプチドのＮ−末端またはC−末端のどちらかから一度に１個のアミノ酸を除去するためのプロテアーゼが当技術分野で周知であり、したがって、所望の生物学的活性を保持しているフラグメントを判定するためには単に通常の実験を行えばよい。
【０１１０】
ＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６のフラグメント、その変異体および融合タンパク質として、本発明はさらに、単独のタンパク質または、例えば糖もしくはリン酸残基、タンパク質分子の凝集体、または単独の糖残基など、結合している分子もしくは残基と一体となったタンパク質のポリペプチド鎖の画分もしくは前駆体をも網羅するが、該画分がｇｐ１３０および特にはｇｐ１３０上に作用薬活性を有することを前提とする。
【０１１１】
本書記載の「塩類」という用語は、カルボキシル基の塩類およびＩＬ−６もしくはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６分子またはその類似体のアミノ基の酸付加塩類の両方を表す。カルボキシル基の塩類は、当技術分野で周知の手段によって形成することができ、例えばナトリウム塩、カルシウム塩、第二鉄塩および亜鉛塩などの無機塩類、ならびに例えばトリエタノールアミン、アルギニンもしくはリシン、ピペリジン、プロカインなどのアミン類とともに形成された塩基として有機塩基を有する塩類が含まれる。酸付加塩類には、例えば塩酸もしくは硫酸などの無機酸を有する塩類および、例えば酢酸もしくはシュウ酸などの有機酸を有する塩類などがあげられる。当然のことながら、このような塩はいずれもＩＬ−６もしくはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の生物学的活性、すなわちｇｐ１３０を通じてシグナル伝達する能力を保持していなくてはならない。
【０１１２】
本発明の好ましい実施態様では、本発明のＩＬ−６またはそのフラグメント、変異体、融合タンパク質もしくは塩は、１つ以上の部位でグリコシル化されている。
【０１１３】
ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６のグリコシル化された形態は、本発明によればきわめて好ましいキメラ分子である、国際公開第９９／０２５５２号パンフレット（ＰＣＴ／ＩＬ９８／００３２１）に記載されている。本明細書に記載のＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６は、いずれもヒト由来である、成熟自然発生ＩＬ−６の全コーディング配列に自然発生した可溶性ＩＬ−６受容体δ―Ｖａｌの全コーディング配列を融合させることにより取得した組換え糖タンパク質である。当業者であるなら、グリコシル化ＩＬ−６を組換え手段によっても、すなわち真核生物発現系内に発現させることによっても産生できることは理解するであろう。
【０１１４】
本発明によれば、作用薬は、イースト菌細胞、昆虫細胞、バクテリアなどの適切な真核細胞種もしくは原核細胞種で産生可能である。作用薬は、哺乳類の細胞内で産生することが好ましいが、国際公開第９９／０２５５２号パンフレットにＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６に関して記載されているように、遺伝子組換えＣＨＯ細胞内で産生することがもっとも好ましい。ヒト由来のタンパク質が好ましい一方で、当業者は、本書記載の生物学的活性を保持している限り、他のいずれかの生物由来の類似した融合タンパク質も本発明によれば使用可能であることを理解するであろう。
【０１１５】
本発明のさらなる実施例では、本発明のＩＬ−６またはそのフラグメント、変異体、融合タンパク質もしくは塩は、グリコシル化されない。この場合、キメラ分子は、グリコシル残基を合成できないが通常は産生組変えタンパク質の高収率能を備えているバクテリア細胞内で産生できるので、好都合である。非グリコシル化ＩＬ−６の産生についは、例えば欧州特許第５０４７５１Ｂ１号明細書に詳細に記載されている。
【０１１６】
さらに別の実施態様では、本発明のＩＬ−６またはそのフラグメント、変異体、融合タンパク質もしくは塩は、免疫グロブリン融合体を含んでいる、すなわち本発明による分子は、免疫グロブリンのすべてもしくは一部、特に免疫グロブリンのＦｃフラグメントに融合される。免疫グロブリンを産生するための方法は、例えば国際公開第０１／０３７３７号パンフレットに記載されている方法など、当技術分野では広く周知である。当業者であるなら、本発明における産生された融合タンパク質がＩＬ−６もしくはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の生物学的活性、すなわちｇｐ１３０シグナル伝達の刺激能を保持していることを理解するであろう。産生された融合タンパク質は、体液中の残留時間（半減期）の延長、比活性度の亢進、発現レベルの向上、もしくは融合タンパク質の精製促進など、特性が改善されていることが理想的である。
【０１１７】
本発明のＩＬ−６またはそのフラグメント、変異体、融合タンパク質もしくは塩は、Ｉｇ分子の定常領域に融合することが好ましい。これは、例えばヒトＩｇＧｌのＣＨ２およびＣＨ３領域など重鎖領域に融合させてもよい。ＩｇＧ2もしくはＩｇＧ4異性体、または例えばＩｇＭもしくはＩｇＡの異性体、他のＩｇ分子の分級など、Ｉｇ分子の他の異性体も、本発明による融合タンパク質の産生に好適である。したがって、融合タンパク質は、単量体、多量体、ヘテロ多量体もしくはホモ多量体のいずれであってもよい。
【０１１８】
本発明のＩＬ−６またはそのフラグメント、変異体、融合タンパク質もしくは塩の機能性誘導体をポリマーに抱合させて、安定性、半減期、生体利用効率、人体による耐性、免疫原性などのタンパク質の特性を改善することができる。
【０１１９】
したがって、本発明の好ましい実施態様は、アミノ酸残基上の１つもしくはそれ以上の側鎖として存在する１つもしくはそれ以上の官能基に結合した少なくとも１つの部分を有する、本発明のＩＬ−６またはそのフラグメント、変異体、融合タンパク質もしくは塩の機能性誘導体に関する。
【０１２０】
本発明の非常に好ましい実施態様は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合した本発明によるＩＬ−６またはそのフラグメント、変異体、融合タンパク質もしくは塩に関する。ポリエチレングリコール化は、例えば国際公開第９２／１３０９５号パンフレットに記載されている方法など、周知の方法で実施してよい。
【０１２１】
ＩＬ−６の発現に関しては通常静止状態にある細胞内でＩＬ−６の内的産生を誘発および／または促進するベクターもしくは、十分とはいえない量のＩＬ−６を発現させるベクターの使用も本発明によって意図されている。ベクターは、ＩＬ−６を発現するのに所望の細胞内で機能する調節配列を有していてよい。このような調節配列は、プロモーターもしくはエンハンサーを有している。次に、この調節配列を相同的組換えによってゲノムの適正な遺伝子座に導入するので、調節配列は、発現を誘導もしくは促進せねばならない遺伝子と操作可能なように結合する。この技術は一般に「内因性遺伝子活性化」（ＥＧＡ）と呼ばれ、例えば国際公開第９１／０９９５５号パンフレットなどに記載がある。
【０１２２】
本発明の物質は、任意の適切な経路で投与してよい。本発明によれば、皮下投与は非常に好ましい。
【０１２３】
本発明の物質は、任意の適切な処方で作用部位に送達されてよい。ＩＬ−６またはそのフラグメント、変異体、融合タンパク質もしくは活性画分を発現および／または分泌する細胞の形態で、この物質を投与することが好ましい。以下の例に示すように、十分な量のＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６を発現および／または分泌する細胞は、好適な発現ベクターを用いて細胞内にトランスフェクションすることによって産生されている。
【０１２４】
したがって、本発明はさらに、微小血管合併症の治療および／または予防のための医薬の製造で、本発明による本発明のＩＬ−６またはそのフラグメント、変異体、融合タンパク質もしくは塩を発現する細胞の使用に関する。細胞は好適な形態で投与してよい。ただし、ポリマーカプセル化ＩＬ−６もしくはＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６を発現、好ましくは分泌する細胞は、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の非常に好ましい投与形態である。カプセル化手順については、例えばEmerichら（1994）もしくはＵＳ  ５，８５３，３８５に詳細に記述されている。好適な細胞株および安定した発現系は、当技術分野では広く周知である。
【０１２５】
本発明による物質の送達は、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６キメラ、変異体、融合タンパク質またはそれの断片のコーディング配列を含む発現ベクターのようなベクターを使用して行なっても良い。ベクターは、ヒトの体内における、好ましくは末梢神経性細胞における所望のタンパク質の発現のために必要とされる全ての調節配列を含む。発現ベクター用の調節配列は、当業者により既知である。したがって、本発明は、糖尿病性神経障害の治療および／または予防のための医薬の製造のための本発明による物質のコーディング配列を含むベクターの使用にも関する。
【０１２６】
当技術分野で周知の任意の発現ベクターを、本発明にしたがって使用してもよい。ただし、ウイルス由来遺伝子治療ベクターを使用することが非常に好ましい。ＩＬ−６発現用のウイルスベクターの使用については、Bensadoun（2001）による記載がある。
【０１２７】
本発明の物質は、医薬組成物として人体に投与することが好ましい。該医薬組成物は、本発明のＩＬ−６、そのフラグメント、変異体、機能性誘導体、融合タンパク質またはその塩をそのまま有するか、もしくはポリペプチドを発現する細胞または発現ベクター、特に、微小血管合併症の治療および／または予防のための１つもしくはそれ以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤もしくは賦形剤を場合により一体化した、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６、またはその変異体、融合タンパク質もしくは活性フラグメントのコーディング配列を有するレンチウイルス性遺伝子治療ベクターを有していてもよい。
【０１２８】
「薬学的に許容可能な」という用語の定義は、活性成分の生物学的活性の効果に悪影響を及ぼさず、投与する宿主にとって無毒である任意の担体を網羅することを意図している。例えば、非経口投与の場合には、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミンおよびリンガー液などの賦形剤として注入するための、単位投与形態に活性成分を製剤化してもよい。
【０１２９】
活性成分は、さまざまな方法で患者に投与できる。投与経路としては、皮内投与、経皮投与（例えば、徐放性製剤）、筋内投与、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与、経口投与、硬膜外投与、局所投与および鼻内投与がある。例えば、上皮組織もしくは内皮組織を経由して、あるいは活性ポリペプチドをインビボで発現および分泌させるＤＮＡ分子を患者に投与する遺伝子治療によって吸収するなど、他の任意の治療上効果的な投与経路も使用できる。さらに、薬学的に許容可能な界面活性剤、賦形剤、担体、希釈剤および賦形剤など、生物学的活性作用物質の他の成分と一緒に、活性分子を投与することができる。
【０１３０】
非経口投与（例えば、静脈内投与、皮内投与、筋内投与）の場合には、活性成分は、薬学的に許容可能な非経口投与賦形剤（水、生理食塩水、デキストロース溶液など）および等張性（マニトールなど）や化学的安定性（保存料や緩衝液など）を保持する添加物とを合わせて、溶液、懸濁液、乳液もしくは凍結乾燥粉末として、製剤化することができる。製剤は、一般に使用されている技術で滅菌される。
【０１３１】
本発明のさらなる目的は、微小血管合併症の治療および／もしくは予防方法であって、それを必要としている患者に、任意には薬学的に許容可能な担体と一体化した、有効量の本発明のＩＬ−６またはそのフラグメント、変異体、融合タンパク質もしくは塩を投与することを含む方法を提供することにある。
【０１３２】
「有効量」とは、上記疾患の経過および重篤度に十分に影響を与え、このような病気を寛解もしくは緩和させる活性成分の量を表す。有効量は、投与経路および患者の状態によって異なる。
【０１３３】
個体に単回でもしくは複数回で投与する用量は、薬物速度論的特性、投与経路、患者の状態および特徴（性別、年齢、体重、健康状態、体の大きさなど）、症状の程度、併用治療、治療の頻度および所望の効果をはじめとする、多種多様な因子によって異なる。確定した用量範囲の調節および操作は、十分に当業者の能力の及ぶ範囲内にある。
【０１３４】
ただし、げっ歯類における血小板新生因子としてのＩＬ−６の有効用量は、５００ｍｃｇ／ｋｇを超えるが、サルの場合には１０ｍｃｇ／ｋｇである（Herodinら、1992 Blood 80（3）688）。したがって、ＩＬ−６は、げっ歯類の場合より霊長類の場合のほうが５０倍も効果が高いと考えられる。したがって、ｈｒＩＬ−６は、５０倍の効果、またはげっ歯類の場合よりヒトの場合のほうが１桁分高い効果、もしくは少なくとも５倍の効果が生じることが期待される。本実施態様では、微小血管合併症における陽性反応の結果が１０〜３０ｍｃｇ／ｋｇの範囲の用量でげっ歯類に認められたので、１／５０、１／１０、もしくは１／５の用量のヒト組換えＩＬ−６が、ヒトにおける微小血管合併症の治療および／または予防に効果があることが期待される。本発明のＩＬ−６またはそのフラグメント、変異体、融合タンパク質もしくは塩を、約２〜３ｍｃｇ／ｋｇ、１〜３ｍｃｇ／ｋｇおよび０．２〜０．６ｍｃｇ／ｋｇの用量で使用することが好ましい。
【０１３５】
あるいは、固定した低用量のＩＬ−６を、患者１人当たり１４０〜２１０ｍｃｇ、７０〜２１０ｍｃｇおよび１４〜４２ｍｃｇの範囲で投与することもできる。
【０１３６】
本発明の好ましい実施態様では、本発明のＩＬ−６またはそのフラグメント、変異体、機能性誘導体、融合タンパク質もしくは塩を１週間に３回の頻度で投与する。
【０１３７】
ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６、またはその変異体、融合タンパク質もしくは活性フラグメントを発現する細胞の有効量を必要としている患者に投与することを含む微小血管合併症を治療するための方法も、本発明にしたがって考慮されている。ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６、またはその変異体、融合タンパク質もしくは活性フラグメントのコーディング配列を有する発現ベクターを必要としている患者に投与することを含む方法も、さらに本発明の目的の１つである。
【０１３８】
本発明の好ましい実施態様では、発現ベクターは、遺伝子治療ベクターである。ウイルスベクター、特にレンチウイルスベクターは、非常に好ましい。
【０１３９】
次に、以下の限定されない実施例と付随する図面を参照しながら、本発明について詳細に説明する。
【０１４０】
今まで本発明について詳しく説明してきたが、当業者であるなら、不必要な実験を行わなくても、本発明の対象範囲および意図から逸脱することなく、広範囲に渡る同等のパラメータ、濃度および条件の範囲内で、本発明を実施することが可能であることを理解されよう。
【０１４１】
本発明についてその特定の実施例と関連付けて説明してきたが、さらなる修正を加えることが可能であることが理解されよう。本願は、総体的に本発明の原理にしたがった本発明の一切の変形、使用および改変を包含するものであり、本発明が関係する技術の範囲内で周知の方法もしくは習慣的方法の範囲内に含まれ、添付の請求項の範囲内で以下のような以前に記載した本質的特徴に該当するような本発明の開示からのこのような逸脱をも包含するものである。
【０１４２】
本明細書において引用される、雑誌の論文もしくは要旨、公開もしくは未公開の米国もしくは外国特許出願、公布された米国もしくは外国特許または任意のほかの参考文献などのすべての参考文献は、引用される参考文献に示されたすべてのデータ、表、図および文章を含めて、本明細書において完全に参考のために組み込まれる。さらに、本明細書において引用される参考文献中で引用される参考文献の全内容も、参考のために完全に組み込まれる。
【０１４３】
本発明のすべての態様、記述もしくは実施態様を関連技術分野で開示、教示もしくは提言するような、周知の方法の工程、従来の方法の工程、周知の方法もしくは従来の方法に対する参照は、一切認められない。
【０１４４】
特定の実施態様に関する前述の記載は、（本書に記載の参考資料の目次を含めて）当分野における知識を応用することによって、他者が完全に解明し、不必要な実験を行わずに、本発明の一般概念から逸脱せずに、このような特定の実施態様を各種用途に合わせて変更および適合させることが可能となるように、本発明の一般的内容を完全に明らかにしている。したがって、このような適合および変更は、本書に記載の教示内容および指針に基づいて、開示されている実施態様と同等な一連の内容を目的の範囲内に置くことを目的としている。本書記載の用語および専門語は、記述することのみを目的としており、限定することを目的としていないので、本明細書の用語および専門語は、当技術分野の一般的知識を有している人物がその知識を活用すれば、本書記載の教示内容および指針に照らして、当業者が解釈することが可能であることが理解されるべきである。
【実施例】
【０１４５】
実施例１：実験的糖尿病における運動機能および感覚機能の欠損に対するＩＬ−６の効果
下記実験の目的は、糖尿病性神経症のストレプトゾトシン糖尿病ラットモデルを対象とした、大有髄神経線維および小神経線維の各母集団における既存の異常をＩＬ−６投与処置によって治療できるか否かを調査することにある。
【０１４６】
実験材料：糖尿病ラットモデルおよびＩＬ−６投与計画
ストレプトゾトシン（４０〜４５ｍｇ／ｋｇ）を１回腹腔内投与することにより、成熟した（週齢１９歳）オスのスプレーグ−ドーリーラットに糖尿病を誘発させた。無処置のまま４週間経過し、その間に神経伝達速度（ＮＣＶ）および血流が欠失し、症状がそのまま定常化した糖尿病ラットに、それぞれ１０ｍｃｇ／ｋｇおよび３０ｍｃｇ／ｋｇを１日に２回、１週間に３回の頻度で、４週間にわたりＩＬ−６を皮下注射した。
【０１４７】
ＩＬ−６投与処置に着手する前と治療期間の終了時に、それぞれ電気Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｈａｉｒ装置とＲａｎｄａｌｌ−Ｓｅｌｌｉｔｏ試験［Randallら、1957, Chaplanら、1994］により、足の感覚異痛（正常皮膚に対する無害刺激から生じる疼痛）閾値および機械的刺激閾値を測定した。足への無害熱刺激に対して足を引っ込める反射作用が生じるまでの時間を、ハーグリーブス足底検査［Hargreaves 1988］によって推定した。検査はすべて市販の装置（Ugo-Basile, Comerio、イタリア）を用いて実施した。要するに、毎日同じ時間に一定の室温で測定を行い、取り扱い、環境、装置、および実験手順にラットが慣れるように２日間の準備期間を設けた。
【０１４８】
被験群は、下記のとおりである。
非糖尿病対照群（Ｃ；ｎ＝１０）
４ｗｋ糖尿病（１Ｄ；ｎ＝８〜１０）
８ｗｋ糖尿病（２Ｄ；ｎ＝１０）
４ｗｋ糖尿病＋４週間１０ｍｃｇ／ｋｇ  ＩＬ６（Ｄ１０；ｎ＝１０）
４ｗｋ糖尿病＋４週間３０ｍｃｇ／ｋｇ  ＩＬ６（Ｄ３０；ｎ＝８）
【０１４９】
前脛骨筋までの枝部における坐骨運動機能ＮＣＶおよび伏在静脈ＮＣＶを前述のように検査した［Cameron 1989］。
【０１５０】
実験の終了時に、頚動脈カニューレから血糖値を見積もるための血液標本（GOD-Perid 法、べーリンガーマンハイム）を採取した。
【０１５１】
データは、群平均値±ＳＥＭとして表現した。これらのデータについて分散度を計るためＢａｒｔｌｅｔｔ検定を実施し、必要に応じて、一元配置ＡＮＯＶＡを実施する前に、対数変換（血管コンダクタンス）を実施した。全体的な有意水準（ｐ＜０．０５）を取得した場合には、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較検定により群間における統計的有意差を判定した。
【０１５２】
実験結果：
糖尿病ラットは高血糖に罹患し、実験期間中にわたって、主として最初の４週間に体重が減少した（表４）。ＩＬ−６投与治療を行ったが、血糖値の状態や体重の減少には変化がなかった。
【０１５３】
【表４】
2008511612.tif 000006
【０１５４】
坐骨運動機能ＮＣＶは、糖尿病罹患２週間後と４週間後にはそれぞれ、２２．４±１．２％（平均値±ＳＥＭ）および２１．７±１．０％（ｐ＜０．００１）減少した（図１Ａ、それぞれ棒線１Ｄと２Ｄ）。ＩＬ−６を投与したところ、この欠失が９０．０±３．６％（図１Ａ、Ｄ１０、１０ｍｃｇ／ｋｇ；ｐ＜０．００１）および８８．４±６．２％（図１Ａ、Ｄ３０、３０ｍｃｇ／ｋｇ；ｐ＜０．００１）回復した。同様に、それぞれ糖尿病罹患の４週間後（ｐ＜０．００１）に１７．１±１．３％および８週間後（ｐ＜０．００１）に１７．８±１．４％であった伏在静脈感覚機能ＮＣＶ欠失は、２種類のＩＬ−６用量で完全に回復した（ｐ＜０．００１）。無害熱刺激に反応して足を引っ込めるまでの時間は、糖尿病罹患の４週間後の時点では３７．８±２．１％、８週間後の時点では３７．０±５．５％低下し（図２Ａ）、２種類のＩＬ−６用量の両方で痛覚過敏が完全に矯正されたことを示唆していた（ｐ＜０．００１）。事実、１０ｍｃｇ／ｋｇの用量の場合、反応時間は、平均以上であった。電気ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｈａｉｒ装置による触覚刺激に対して足を引っ込めるまでの時間の閾値は、糖尿病罹患の４週間後で４９．１±４．８％（ｐ＜０．００１）、８週間後で５８．７±４．９％（ｐ＜０．００１）それぞれ低下した（図２Ｂ）。ＩＬ−６の投与治療により、この触覚異痛が８３．９±６．７％（１０ｍｃｇ／ｋｇ；ｐ＜０．００１）および７９．３±１０．３％（３０ｍｃｇ／ｋｇ）分矯正された。一定の比率で徐々に強めていった機械的加圧に反応して、糖尿病ラットにおける足を引っ込めるまでの時間の閾値が約３５％（ｐ＜０．００１）低下し、機械的刺激に対する痛覚過敏が示唆された（図２Ｃ）。ただし、他の疼痛に関連する指標とは対照的に、この症状はＩＬ−６投与治療の影響をわずかしか受けないか、もしくはまったく受けないように思われる。
【０１５５】
データは、両用量で使用したＩＬ−６（１０および３０ｍｃｇ／ｋｇ、週３回）により、実験的糖尿病における坐骨運動機能および伏在静脈感覚機能ＮＣＶ欠失が完全に回復したことを明らかに示している。
【０１５６】
ＩＬ−６の投与治療により、熱痛覚過敏や触覚異痛などの運動および感覚伝達をはじめとする、糖尿病ラットにおける大線維機能障害と小線維機能障害の病態が回復した。
【０１５７】
実施例２：微小血管合併症におけるＩＬ−６の薬効
糖尿病性神経症は、低酸素症や血流減弱から発症するという間接証拠が存在している（Cameron 2001）。実施例１で例証した動物モデルでは、糖尿病モデルに神経機能の損傷が認められることが実証された。実施例１では、神経機能がＩＬ−６によって回復することも実証された。
【０１５８】
実施例１の糖尿病モデルにおける神経症が、神経系血流欠如の点でヒトの糖尿病に類似した症状を呈しているかいなか、さらにこのモデルにおけるＩＬ−６の薬効が、神経系血流の回復によるものなのかいなかを直接評価するために、下記の実験を行った。
【０１５９】
したがって、無処置のラット群と糖尿病ラット群、およびＩＬ−６を投与処置した糖尿病ラット群で、神経内膜組織における血流および全身血圧における変化を測定した。
【０１６０】
実施例１のラットにチオブタバルビタール（５０〜１００ｍｃｇ／ｋｇ、腹腔内投与）で麻酔をかけ、血圧測定と人工呼吸のため頚動脈（大血管系）と気管のそれぞれにカニューレを挿入した。
【０１６１】
前述したように、微小電極ポーラログラフ分析および水素クリアランス法によって、坐骨神経内膜の栄養（毛細血管）血流を測定した［Cameron 1991］。
【０１６２】
要するに、微小電極ポーラログラフ分析および水素クリアランス法による伝達速度測定側とは反対側の四肢で坐骨神経内膜血流を見積もった［Cameron 1991, Chaplan 1994およびRandall 1957］。ラットに人工呼吸を施した。血圧をモニターするため、頚動脈にカニューレを挿入し、必要に応じて、ｄ−ツボクラリン（頚動脈カニューレを通じて、２ｍｇ  ｋｇ−１）を使用することにより神経筋遮断薬を与えた。触診に対する血圧の反応を観察することにより麻酔の効果レベルをモニターし、必要に応じてチオブタバルビタール麻酔薬を補充した。坐骨神経を露出させ、切開部周囲の皮膚を金属リングに縫合し、３７℃の鉱物油を満たしたプールを形成した。記録中、放射熱によってプールの温度を３５〜３７℃に維持した。坐骨のくぼみと膝上の神経三叉部との間の坐骨神経内膜に、皮下埋め込み参照電極を基準に２５０ｍＶで分極したガラス絶縁白金微小電極を挿入した。吸入ガスに１０％のＨ2を付加し、Ｏ2とＮ2の各成分比をそれぞれ２０％と７０％に調節した。電極によって記録されたＨ2の流れが安定し、動脈血との平衡状態が示唆された時点で、Ｈ2の供給を遮断しＮ2の供給量を適宜増加させた。「５秒間にわたり電極水素流における系統的減弱が認められない」、として定義されている安定ベースラインに到達するまで、Ｈ2のクリアランスを記録した。次に、別の神経部位でこの手順を繰り返した。実験後、クリアランス曲線を数値化し、非線形回帰分析（プリズム、グラフパッド、サンディエゴ、CA、米国）および汎用の二重指数関数式  ｙ＝ａ  ｅｘｐ（−ｂｘ）＋  ｃ  ｅｘｐ（−ｄｘ）＋  ｅ  を用いて、単一指数関数曲線もしくは二重指数関数ｂｉ−ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ曲線を用いてコンピュータでデータに適合させた。
【０１６３】
上式で、ｙは電極水素流（任意の単位）、ｘは時間（分）、ａとｃはそれぞれ高速（非栄養）と低速（栄養）クリアランス成分に関する加重定数、ｂは高速成分、ｄは低速成分（ｍｌ  ｍｉｎ−１  ｍｌ  神経−１）、およびｅはベースライン電極水素流（任意の単位）をそれぞれ表している。組織密度を１と想定して、ｄＸ１００（ｍｌ  ｍｉｎ−１  １００ｇ−１）として栄養血流を計算した。特定のクリアランス曲線の記録期間にわたる平均動脈血圧によって血流を除算することにより、血管コンダクタンスを計算した。２回の測定結果の平均値を取って、坐骨神経内膜血流パラメータとした。
【０１６４】
図３Ａにまとめた結果から、坐骨神経内膜の栄養（毛細血管）流が、糖尿病罹患の４週間および８週間後にそれぞれ５１．３±４．２％および５３．６±２．７％減少した（ｐ＜０．００１）ことがわかる。ＩＬ−６投与治療がこのような血流の欠失を８４．３±５．２％（１０ｍｃｇ／ｋｇ；ｐ＜０．００１）および９０．８±５．３％（３０ｍｃｇ／ｋｇ；ｐ＜０．００１）回復させ、血管コンダクタンス値は、非糖尿病範囲の上位半分に相当していた（図３Ｃ）。群間には平均全身血圧に有意差は認められなかった（図３Ｂ）。結果は、表５にまとめたとおりである。
【０１６５】
このように、ＩＬ−６は、坐骨神経内膜栄養流の改善で顕著な血管効果を示した。全体として、ＩＬ−６は、微小血管機能欠失の回復にきわめて優れた効能を示した。
【０１６６】
【表５】
2008511612.tif 000007
【０１６７】
実施例３：ＣＨＯ細胞内でのＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の産生
可溶性ＩＬ−６受容体（尿中に特定される天然形態のｓＩＬ−６Ｒ, Ohら、1997）をコードするｃＤＮＡ配列と成熟ＩＬ−６をコードする配列とを融合させる。３個の架橋アミノ酸（ＦＥＭ）の配列も存在している。融合遺伝子をＣＭＶプロモーターの制御下で発現ベクターに挿入し、ＣＨＯ細胞に導入した。産生プロセスを展開し、産生された組換えタンパク質を抗ＩＬ−６Ｒモノクローナル抗体を用いた免疫精製によって精製した。図４は、ＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６の組成を模式的に表したものである。成熟タンパク質には、５２４個のアミノ酸が含まれている。上に略述したように、産生および精製されたタンパク質は、本発明にしたがって投与するのに好適である。
【０１６８】
組換えヒトＩＬ−６（ｒ−ｈＩＬ−６）は、遺伝子組換えが施されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で産生した。産生プロセスでは、はじめに運用されている細胞バンク（ＷＣＢ）から入手した細胞を成長および増大させ、ｒ−ｈＩＬ−６を培地に分泌させる条件の下に、処理を継続した。遺伝子組換え細胞の培地からｒ−ｈＩＬ−６を採取し、精製した。純度は９９．６％より高く、薬効は２３．３ｘ１０６ＩＵ／ｍｌであった（van Damme, J, Van Snick J. Dev Biol Strand, 1988;69:31-8のＩＬ−６のハイブリドーマ成長因子活性（ＨＧＦ）に基づく）。
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】坐骨運動機能（Ａ）および伏在静脈感覚伝達速度の測定値を示す。統計値：１方向ＡＮＯＶＡ＋Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較試験、***ｐ＜０．００１対対照群（Ｃ）、†††ｐ＜０．００１ＩＬ−６処置群対糖尿病（Ｄ）群の効果。非糖尿病対照群（Ｃ；ｎ=１０）、４ｗｋ糖尿病群（１Ｄ；ｎ＝８〜１０）、８ｗｋ糖尿病群（２Ｄ；ｎ＝１０）、４ｗｋ糖尿病＋４週間１０ｍｃｇ／ｋｇ  ＩＬ６（Ｄ１０；ｎ＝１０）、４ｗｋ糖尿病＋４週間３０ｍｃｇ／ｋｇ  ＩＬ６（Ｄ３０；ｎ＝８）。
【図２】熱（非毒性）刺激（Ａ）、異痛（正常な皮膚に対する無害刺激から生じる疼痛）検査（Ｂ）および機械的加圧（Ｃ）に対して足を引っ込めるまでの潜時。統計値：１方向ＡＮＯＶＡ＋Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較試験、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１対対照（Ｃ）群、†††ｐ＜０．００１ＩＬ−６投与群の対糖尿病（Ｄ）群の効果。
【図３】坐骨栄養（毛管）神経内膜血流（Ａ）、平均全身血圧（Ｂ）および神経内膜血管伝導性（Ｃ）を示している。統計値：１方向ＡＮＯＶＡ＋Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較試験、***ｐ＜０．００１対対照（Ｃ）群、†††ｐ＜０．００１ＩＬ−６投与群の対糖尿病（Ｄ）群の効果。
【図４】ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラの模式図を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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