(57)【要約】  本発明は、腫瘍退縮性ピコルナウイルス、ならびに、血液ガンを有する対象を治療するための方法および組成物に関連する。これらは、コクサッキーウイルスのような開示されるピコルナウイルスを用いる、対象への直接投与または間接投与、および移植に先立つ自家移植片内の悪性細胞の生体外除去の方法における、骨髄腫の治療のための方法および組成物を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における血液ガンを治療および／または予防するための方法であって、治療効果的な量のピコルナウイルスまたはその改変形態を、ガンの少なくとも一部の細胞がウイルスによる腫瘍退縮を受けるように投与することを含む、方法。
【請求項２】
ピコルナウイルスは、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ポリオウイルス、未分類のエンテロウイルスを含むエンテロウイルス、ライノウイルス、パラエコーウイルス、ヘパトウイルスおよびカルジオウイルスの原型株および臨床単離株からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ピコルナウイルスは、ＣＶＡ１３、ＣＶＡ１５、ＣＶＡ１８、ＣＶＡ２０、ＣＶＡ２１、その改変形態およびその組合せからなる群から選択されるコクサッキーＡ群ウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ピコルナウイルスは、静脈内投与、腫瘍内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、自家幹細胞移植に先立つ自家移植片内の悪性細胞の生体外除去、または移植に先立つ自家移植片内の悪性細胞の生体外除去によって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
自家移植片は造血系幹細胞を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ウイルス用量の範囲は、約０．０１感染性ウイルスユニット／細胞〜約１０００感染性ウイルスユニット／細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ウイルスは、効果的な量の化学療法剤との組合せで対象に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ウイルスは、効果的な量のプロバイオティクス剤との組合せで対象に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
血液ガンは、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ前リンパ球性白血病および単球性白血病からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
血液ガンの細胞は、ウイルス−細胞進入受容体分子の細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）および／または崩壊促進因子（ＤＡＦ）を過剰発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
血液ガンの細胞はＮＦ−κＢを構成的に発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
対象における多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ前リンパ球性白血病および単球性白血病からなる群から選択される血液ガンを、治療および／または予防するための方法であって、ＣＶＡ１３、ＣＶＡ１５、ＣＶＡ１８およびＣＶＡ２１またはその組合せからなる群から選択されるピコルナウイルスの治療効果的な量を、ガンの少なくとも一部の細胞がウイルスによる腫瘍退縮を受けるように投与することを含む、方法。
【請求項１３】
対象における血液ガンを治療および／または予防するための方法であって、ピコルナウイルスまたはその改変形態に由来する核酸分子の治療効果的な量を、ガンの少なくとも一部の細胞がウイルスによって殺されるように投与することを含む、方法。
【請求項１４】
ピコルナウイルスは、ＣＶＡ１３、ＣＶＡ１５、ＣＶＡ１８、ＣＶＡ２０、ＣＶＡ２１からなる群から選択されるコクサッキーＡ群ウイルスである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
対象はヒトである、請求項１または１３に記載の方法。
【請求項１６】
対象における血液ガンを治療および／または予防することにおいて使用される医薬組成物であって、血液ガンに溶解感染することができるピコルナウイルスまたはその改変形態の効果的な量を、医薬的に許容され得る賦形剤、希釈剤またはキャリアと一緒に含む、医薬組成物。
【請求項１７】
対象における血液ガンを治療および／または予防することにおいて使用される医薬組成物であって、血液ガンに溶解感染することができるピコルナウイルスまたはその改変形態に由来する核酸分子の効果的な量を、医薬的に許容され得る賦形剤、希釈剤またはキャリアと一緒に含む、医薬組成物。
【請求項１８】
対象における血液ガンを治療および／または予防するための医薬品の製造における、血液ガンに溶解感染することができるピコルナウイルスまたはその改変形態の使用。
【請求項１９】
ピコルナウイルスは、ＣＶＡ１３、ＣＶＡ１５、ＣＶＡ１８、ＣＶＡ２０、ＣＶＡ２１からなる群から選択されるコクサッキーＡ群ウイルスである、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
血液ガンは、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ前リンパ球性白血病および単球性白血病からなる群から選択される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２１】
対象における血液ガンを治療および／または予防するための医薬品の製造における、血液ガンに溶解感染することができるピコルナウイルスまたはその改変形態に由来する核酸分子の使用。
【請求項２２】
血液腫瘍細胞または血液ガン細胞に対する対象における免疫応答を誘導するための方法であって、対象の前記細胞に、治療効果的な量のピコルナウイルスまたはその改変形態を、ガンの少なくとも一部の細胞がウイルスによる腫瘍退縮を受けるように感染させることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍退縮性ピコルナウイルス、ならびに、血液ガンを有する対象を治療するための方法および組成物に関連する。
【背景技術】
【０００２】
血液ガンは「血液系の」ガンである。このガンは通常、赤血球（酸素運搬細胞）ではなく、むしろ白血球（疾患および感染と闘う細胞）を冒す。このガンの中には、すべての血液細胞が作られる骨髄に存在するものもあれば、白血球がその中を流れるリンパ節および他のリンパ組織に存在するものもある。白血球の一般的なガンが、白血病、ホジキンリンパ腫、他のリンパ腫および多発性骨髄腫である。
【０００３】
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、全タイプのヒトガンの約１％を占めるＢ細胞悪性腫瘍であり、骨髄性白血病またはホジキン病よりも一般的である。
【０００４】
多発性骨髄腫は、貧血、重度の骨の痛み、ならびに、一部の場合には、病的骨折、感染の危険性増大、高カルシウム血症および腎不全の原因になり得る。化学療法が症候性ＭＭのための好ましい最初の治療ではあるが、この疾患は化学療法剤に対して非常に抵抗性があり、また、そのような治療に対して最初に応答する患者のほとんどが最終的には再発する。
【０００５】
ガンの進行を抑制することにおける新しい方法が、腫瘍退縮性ウイルスの使用によるものである。腫瘍退縮性ウイルスは、正常な宿主細胞を無傷のままにしながら、悪性の細胞を選択的に破壊または「溶解」することができるウイルスである。数多くのヒト固形ガンが、選択的な腫瘍退縮を媒介するための特有の生物学をそれぞれが有する数多くのウイルスの腫瘍退縮活性に対して感受性である。いくつかの悪性腫瘍に対して効果的であり得る３つの既知の腫瘍退縮性ウイルスには、レオウイルス（Ａｌａｉｎ  Ｔ他、Ｂｌｏｏｄ、２００２、１００：４１４６〜４１５３；Ｔｈｉｒｕｋｋｕｍａｒａｎ  ＣＭ他、Ｂｌｏｏｄ、２００３、１０２：３７７〜３８７）、麻疹ウイルス（Ｇｒｏｔｅ  Ｄ他、Ｂｌｏｏｄ、２００１、９７：３７４６〜３７５４）およびニューカッスル病ウイルス（Ｓｃｈｉｒｒｍａｃｈｅｒ  Ｖ他、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ．２００１、１８：９４５〜９５２）がある。
【０００６】
近年、感冒ウイルスのコクサッキーウイルスＡ２１（ＣＶＡ２１）が免疫不全マウスモデルにおけるヒトメラノーマ異種移植片に対して効果的であることが明らかにされた（Ｓｈａｆｒｅｎ  ＤＲ他、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４、１０：５３〜６０）。ＣＶＡ２１は、細胞への感染を媒介するために細胞表面分子の細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）および崩壊促進因子（ＤＡＦ）を選択的に利用することが知られているエンテロウイルスである。ＣＶＡ２１はＤＡＦに結合することができるが、細胞表面でのＩＣＡＭ−１発現がない場合、ＣＶＡ２１は、正常な条件のもとでは、細胞進入を引き起こし、宿主細胞の感染を達成することができないので、ＩＣＡＭ−１が細胞のＣＶＡ２１感染のための重要な受容体である。
【０００７】
本出願人は、ＩＣＡＭ−１を認識する腫瘍退縮性ウイルスを使用して充実性腫瘍悪性物を治療するための新規な方法を以前に開発していた（国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ００／０１４６１（国際特許出願公開ＷＯ０１／３７８６６）、発明の名称：対象における悪性腫瘍を治療するための方法およびその方法において使用される医薬組成物）。優れた治療結果が、様々なコクサッキーウイルスＡ株を数多くの充実性腫瘍細胞タイプに対して使用することによって得られた。インテグリンα２β１を細胞への感染のために認識するウイルス（例えば、エコーウイルスなど）を使用して哺乳動物における異常な細胞（例えば、ガン細胞など）を治療するための新規な方法もまた本出願人によって開発されていた（国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ２００３／００１６８８（国際特許出願公開ＷＯ２００４／０５４６１３）、発明の名称：直接的なピコルナウイルス媒介の腫瘍退縮によって対象における悪性腫瘍を治療する方法）。可能性のあるこのガン治療を拡大し、かつ、さらに一層効果的な治療を提供するために、本発明者らは、驚くことに、ピコルナウイルス単離物もまた、血液ガンにおける腫瘍退縮性薬剤として好適であり得ることを見出している。
【発明の開示】
【０００８】
第１の態様において、本発明は、対象における血液ガンを治療および／または予防するための方法であって、治療効果的な量のピコルナウイルスまたはその改変形態を、ガンの少なくとも一部の細胞がウイルスによる腫瘍退縮を受けるように投与することを含む方法を提供する。
【０００９】
第２の態様において、本発明は、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ前リンパ球性白血病および単球性白血病からなる群から選択される対象における血液ガンを治療および／または予防するための方法であって、治療効果的な量のピコルナウイルスまたはその改変形態を、ガンの少なくとも一部の細胞がウイルスによる腫瘍退縮を受けるように投与することを含む方法を提供する。
【００１０】
本発明の好ましい形態において、対象はヒトである。
【００１１】
ピコルナウイルスは、既知で、分類されているピコルナウイルス、および、まだ分類されていないピコルナウイルスを含めて、任意のピコルナウイルスであり得る。好ましくは、ピコルナウイルスは、原型株および臨床単離株の両方からなる群から選択される。１つの好ましい方法において、ピコルナウイルスは、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ポリオウイルスおよび未分類のエンテロウイルスを含むエンテロウイルスであるか、または、ライノウイルス、パラエコーウイルス、ヘパトウイルス、カルジオウイルス、アフトウイルス、エルボウイルス、コボウイルスおよびテスコウイルスを含み得るピコルナウイルスの他の属に由来する。
【００１２】
好ましい形態において、ピコルナウイルスはコクサッキーウイルスである。好ましくは、コクサッキーＡ群ウイルスが、ＣＶＡ１３、ＣＶＡ１５、ＣＶＡ１８、ＣＶＡ２０、ＣＶＡ２１、その改変形態、および、その組合せからなる群から選択される。より好ましくは、コクサッキーＡ群ウイルスは、ＣＶＡ１３、ＣＶＡ１５、ＣＶＡ１８、ＣＶＡ２０またはＣＶＡ２１から選択される。
【００１３】
好ましい形態において、コクサッキーＡ群ウイルスはＣＶＡ１５またはＣＶＡ２１である。好ましくは、コクサッキーＡ群ウイルスはＣＶＡ１５である。より好ましくは、ＣＶＡ１５はＧ−９である。
【００１４】
別の好ましい形態において、コクサッキーＡ群ウイルスはＣＶＡ２１である。より好ましくは、ＣＶＡ２１はＫｕｙｋｅｎｄａｌｌ株である。
【００１５】
本明細書中で使用される用語「血液ガン」には、非充実性腫瘍、例えば、白血病、多発性骨髄腫、ホジキン病、非ホジキン病、脊髄形成異常およびリンパ腫（例えば、Ｂ細胞リンパ腫など）などが挙げられる。白血病の例には、慢性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ前リンパ球性白血病および単球性白血病が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい形態において、血液ガンは多発性骨髄腫である。
【００１６】
好ましい形態において、血液ガンは１つまたは複数の化学療法剤に対して抵抗性があるか、あるいは、１つまたは複数の化学療法剤に対して抵抗性がある細胞を含む。
【００１７】
好ましい形態において、ピコルナウイルスは任意の好適な様式でヒト対象に投与される。例えば、ウイルスは、静脈内投与、腫瘍内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、眼内投与、皮下投与、経口投与または局所的投与によって、あるいは、自家幹細胞移植に先立つ自家移植片内の悪性細胞の生体外除去によって投与することができる。１つの形態において、本発明の方法は、例えば、ＭＧＵＳに対する予防的治療を含む。１つの形態において、本発明の方法は血液ガン（例えば、多発性骨髄腫）に対する全身的な抗腫瘍剤を含む。１つの形態において、本発明の方法は移植前における自家移植片内の悪性細胞の生体外除去を含む。好ましくは、自家移植片は造血系幹細胞を含む。
【００１８】
好ましい形態において、ウイルス用量の範囲は約０．０１感染性ウイルスユニット／細胞〜約１０００感染性ウイルスユニット／細胞であり得る。
【００１９】
１つの好ましい形態において、ウイルスは効果的な量の化学療法剤との組合せで対象に投与することができる。
【００２０】
別の好ましい形態において、ウイルスは効果的な量のプロバイオティクス剤との組合せで対象に投与することができる。
【００２１】
血液ガンの細胞はウイルス−細胞進入受容体分子の細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）および／または崩壊促進因子（ＤＡＦ）を過剰発現する場合がある。
【００２２】
血液ガンの細胞はＮＦ−κＢを構成的に発現する場合がある。
【００２３】
第３の態様において、本発明は、対象における血液ガンを治療および／または予防するための方法であって、ピコルナウイルスまたはその改変形態に由来する核酸分子の治療効果的な量を、ガンの少なくとも一部の細胞がウイルスによって殺されるように投与することを含む方法を提供する。
【００２４】
核酸分子は、ウイルスに由来する一本鎖ＲＮＡまたは相補的ＤＮＡであり得る。
【００２５】
好ましい形態において、ピコルナウイルスはコクサッキーウイルスである。好ましくは、コクサッキーウイルスはＡ型であり、より好ましくはコクサッキーウイルスＡ２１（ＣＶＡ２１）である。好ましくは、ＣＶＡ２１はＫｕｙｋｅｎｄａｌｌ株である。
【００２６】
第４の態様において、本発明は、対象における血液ガンを治療および／または予防することにおいて使用される医薬組成物であって、血液ガンに溶解感染することができるピコルナウイルスまたはその改変形態の効果的な量を、医薬的に許容され得る賦形剤、希釈剤またはキャリアと一緒に含む医薬組成物を提供する。
【００２７】
医薬的に許容され得る賦形剤、希釈剤またはキャリアは当業者によって広く知られており、これらには、治療剤の投与のためのビヒクルとして使用することができる任意の不活性な物質が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい形態において、医薬的に許容され得るキャリアはリポソームであり得る。
【００２８】
第５の態様において、本発明は、対象における血液ガンを治療および／または予防することにおいて使用される医薬組成物であって、血液ガンに溶解感染することができるピコルナウイルスまたはその改変形態に由来する核酸分子の効果的な量を、医薬的に許容され得る賦形剤、希釈剤またはキャリアと一緒に含む医薬組成物を提供する。
【００２９】
好ましい形態において、医薬組成物はさらに、特定の腫瘍マーカーに結合し、これにより、核酸−リポソーム複合体の標的化を可能にするモノクローナル抗体もまた含有し得るリポソームを含む。
【００３０】
第６の態様において、本発明は、対象における血液ガンを治療および／または予防する方法であって、本発明の第３または第４の態様による医薬組成物の治療効果的な量を、ガンの少なくとも一部の細胞がウイルスによる腫瘍退縮を受けるように投与することを含む方法を提供する。
【００３１】
第７の態様において、本発明は、血液ガンに溶解感染することができるピコルナウイルスまたはその改変形態を、対象における血液ガンを治療および／または予防する方法において、医薬的に許容され得る賦形剤または希釈剤と一緒に使用することを提供する。
【００３２】
第８の態様において、本発明は、血液ガンに溶解感染することができるピコルナウイルスまたはその改変形態に由来する核酸分子を、対象における血液ガンを治療および／または予防する方法において、医薬的に許容され得る賦形剤または希釈剤と一緒に使用することを提供する。
【００３３】
第９の態様において、本発明は、血液ガンに溶解感染することができるピコルナウイルスまたはその改変形態を、対象における血液ガンを治療および／または予防するための医薬品の製造において使用することを提供する。
【００３４】
第１０の態様において、本発明は、本発明は、血液ガンに溶解感染することができるピコルナウイルスまたはその改変形態に由来する核酸分子を、対象における血液ガンを治療および／または予防するための医薬品の製造において使用することを提供する。
【００３５】
第１１の態様において、本発明は、血液腫瘍細胞または血液ガン細胞に対する哺乳動物における免疫応答を誘導するための方法を提供し、この場合、この方法は、哺乳動物における前記細胞に、治療効果的な量のピコルナウイルスまたはその改変形態を、ガンの少なくとも一部の細胞がウイルスによる腫瘍退縮を受けるように感染させることを含む。
【００３６】
本明細書全体を通して、文脈が他のことを要求しない限り、語句「含む（“ｃｏｍｐｒｉｓｅ”）」または変化形（“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”または“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”など）は、言及された要素、完全体または工程、あるいは、要素、完全体または工程の群を包含することを意味し、任意の他の要素、完全体または工程、あるいは、要素、完全体または工程の群を除外することを意味しないことが理解される。
【００３７】
本明細書に含まれている文書、行為、材料、デバイスまたは論文などの議論はいずれも、ある特定の状況を本発明に提供するという目的のためだけである。そのことは、これらの事柄のいずれかまたはすべてが先行技術の基礎の一部を形成しているか、あるいは、本出願の優先日の前において、オーストラリアまたはその他の地域で本発明に関連する分野における広く既知の一般的な知識であったことを認めるものとして理解してはならない。
【００３８】
本発明がより明快に理解され得るために、好ましい形態が、下記の図面および実施例を参照して記載される。
【００３９】
（略称）
略称「ＭＭ」は本明細書中では多発性骨髄腫の代わりに使用される。
【００４０】
略称「ＣＶＡ」は本明細書中ではコクサッキーウイルスＡ群ウイルスの代わりに使用され、例えば、ＣＶＡ２１はコクサッキーウイルスＡ２１の略称である。この分野における文献では、略称「ＣＶＡ」および略称「ＣＶＡ」コクサッキーＡ群ウイルスが様々に使用されており、これらの略称が同じ生物を示し、従って、交換可能であることが本出願のためには理解される。
【００４１】
略称「ＭＯＩ」は本明細書中では感染多重度の代わりに使用される。
【００４２】
略称「ＭＧＵＳ」は本明細書中では、意味未確定の単クローン性高ガンマグロブリン血症の代わりに使用される。
【００４３】
略称「ＢＭ」は本明細書中では骨髄の代わりに使用される。
【００４４】
略称「ＣＦＵ−ＧＭ」は本明細書中では顆粒球／マクロファージコロニー形成ユニットの代わりに使用される。
【００４５】
略称「ＭＴＴアッセイ」は本明細書中では、化学物質の３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミドを使用する微量培養テトラゾリウムアッセイの代わりに使用される。
【００４６】
略称「ＰＩ」は本明細書中ではヨウ化プロピジウムの代わりに使用される。
【００４７】
略称「ＰＢＭＣ」は本明細書中では末梢血単核細胞の代わりに使用される。
【００４８】
略称「ＢＭＳＣ」は本明細書中では骨髄間質細胞の代わりに使用される。
【００４９】
略称「ｍＡｂ」は本明細書中ではモノクローナル抗体の代わりに使用される。
【００５０】
略称「ＴＣＩＤ５０」は本明細書中では５０％組織培養感染量の代わりに使用される。
【００５１】
略称「ＰＦＵ」は本明細書中ではプラーク形成ユニットの代わりに使用される。
【００５２】
略称「ＣＰＥ」は本明細書中では細胞変性効果の代わりに使用される。
【００５３】
略称「ＩＣＡＭ−１」は本明細書中では細胞間接着分子１の代わりに使用される。
【００５４】
略称「ＤＡＦ」は本明細書中では崩壊促進因子の代わりに使用される。
【００５５】
略称「ｋｂ」は本明細書中ではキロベースの代わりに使用される。
【００５６】
略称「ＤＮＡ」は本明細書中ではデオキシリボ核酸の代わりに使用される。
【００５７】
略称「ＲＮＡ」は本明細書中ではリボ核酸の代わりに使用される。
【００５８】
略称「ＥＬＩＳＡ」は本明細書中では酵素結合免疫吸着アッセイの代わりに使用される。
【００５９】
（図面の簡単な説明）
図１は、多発性骨髄腫細胞株に対するＩＣＡＭ−１およびＤＡＦのフローサイトメトリー分析を示す。多発性骨髄腫細胞株（ＲＰＭＩ−８２２６、Ｕ２６６およびＮＣＩ−Ｈ９２９）および正常なＰＢＭＣを抗ＩＣＡＭ−１ｍＡｂおよび抗ＤＡＦｍＡｂにより二重染色した。抗ＩＣＡＭ−１ｍＡｂはＦＩＴＣと直接にコンジュゲート化され、抗ＤＡＦｍＡｂが、ＰＥに連結された二次コンジュゲートを介して間接的に染色された。
図２は、多発性骨髄腫細胞株に対するＣＶＡ２１の細胞変性効果を示す。多発性骨髄腫細胞株および正常なＰＢＭＣに対するＣＶＡ２１の細胞変性効果を評価するために、ＲＰＭＩ−８２２６、Ｕ２６６、ＮＣＩ−Ｈ９２９およびＰＭＢＣの６ウエルプレートでの培養物をＣＶＡ２１の存在下または非存在下において３７℃で４８時間インキュベーションした（約１ＭＯＩ）。細胞上清をウエルのそれぞれから注意深く吸引し、細胞を０．０１％トリパンブルー溶液で染色した。ＣＶＡ２１によって破壊された非生存性細胞がトリパンブルーによって陽性に染色され、一方、生存性細胞はこの色素を排除することができた。顕微鏡写真を１００倍の倍率で撮影した。
図３は、ＭＭＴアッセイを使用するＭＭ細胞株および正常なＰＢＭＣに対するＣＶＡ２１の腫瘍退縮作用を示す。ＭＭ細胞株（ＲＰＭＩ−８２２６、Ｕ２６６およびＮＣＩ−Ｈ９２９）および正常なＰＢＭＣは、４８時間にわたる連続ＣＶＡ２１に対する示差的感受性を明らかにする。誤差バーは群あたり四連ウエルの平均値の標準誤差を示す。
図４は、多発性骨髄腫細胞株感染後のＣＶＡ２１収量を示す。ＣＶＡ２１による２４時間および４８時間の感染の後における感染性ウイルス粒子を生じさせるＭＭ細胞株（ＮＣＩ−Ｈ９２９、Ｕ２６６およびＲＰＭＩ−８２２６）の能力。約１ＭＯＩのＣＶＡ２１を感染させた後、ウイルスの増加を、正常なＰＢＭＣとは対照的に、多発性骨髄腫細胞株のそれぞれにおいて検出することができる。
図５は、多発性骨髄腫細胞におけるＣＶＡ２１のウイルス成長曲線を示す。同時感染（約１の感染多重度）および示された時間間隔でのウイルス子孫の回収の後でのＵ２６６（黒丸）、ＮＣＩ−Ｈ９２９（白丸）およびＲＰＭＩ−８２２６（下向き黒三角）の細胞株におけるＣＶＡ２１のウイルス成長曲線。サンプルの滴定を三連で行い、各時点での平均ウイルス収量をプロットした。
図６は、ＣＶＡ２１を感染させたＲＰＭＩ−８２２６細胞、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞およびＵ２６６細胞におけるＤＮＡ断片化の分析を示す。ＲＰＭＩ−８２２６細胞、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞およびＵ２６６細胞にＣＶＡ２１を２４時間感染させた（〜１０ＴＣＩＤ５０／細胞のＭＯＩ）。総ＤＮＡを感染細胞および非感染細胞から抽出し、断片化をアガロースゲル電気泳動によって評価した。骨髄腫細胞株からのＤＮＡサンプルが示される：ＲＰＭＩ−８２２６（レーン１および２）、ＮＣＩ−Ｈ９２９（レーン３および４）およびＵ２６６（レーン５および６）。レーン「Ｍ」は１ｋｂのＤＮＡラダーを含有する。培地単独で培養されたＭＭ細胞株から抽出されたＤＮＡが、レーン１、レーン３およびレーン５に示され、これに対して、レーン２、レーン４およびレーン６は、ＣＶＡ２１により処理された細胞株から抽出された細胞ＤＮＡを含有する。
図７は、ＰＢＭＣとの混合物からの多発性骨髄腫細胞の生体外除去を示す。正常なＰＢＭＣと多発性骨髄腫細胞（ＲＰＭＩ−８２２６およびＵ２６６）との混合物を一緒に培養し、これにＣＶＡ２１を３日間感染させて、多発性骨髄腫除去の効率を評価した。生存している骨髄腫細胞（ＣＤ１３８＋／ＰＩ−）およびＰＢＭＣ（ＣＤ１３８−／ＰＩ−）をフローサイトメトリーによって評価した。除去処理サンプル（「ＣＶＡ２１」）および除去非処理サンプル（「ウイルスなし」）のフローサイトメトリープロットがＲＰＭＩ−８２２６細胞株およびＵ２６６細胞株の両方について示される。
図８は、多発性骨髄腫の臨床サンプルにおけるＩＣＡＭ−１発現の分析（図８Ａ）およびＣＶＡ２１の成長阻害（図８Ｂ）を示す。図８Ａ：患者の骨髄吸引物を多発性骨髄腫患者から得て（臨床サンプル＃００１）、単一細胞懸濁物を得るために処理した。細胞を抗ＣＤ１３８抗体および抗ＩＣＡＭ−１抗体により二重染色した。ＩＣＡＭ−１の発現について陽性である骨髄腫細胞がドットプロットの上部右側象限（ＣＤ１３８＋／ＩＣＡＭ−１＋）に現れる。原発性腫瘍サンプルにおける細胞の約３７％がＣＤ１３８＋のプラスマ細胞からなっていた。図８Ｂ：患者からの臨床での骨髄細胞に、その後、ＣＶＡ２１を様々な濃度で感染させ、ガン細胞の成長阻害をＭＴＴアッセイによって評価した。グラフは、サンプル＃００１について、異なる投入量のウイルスでの細胞生存率を示す。
図９は、多発性骨髄腫プラスマ細胞を骨髄臨床サンプルから除去するＣＶＡ２１の能力を示す（図９Ａ〜図９Ｃ）。図９Ａ：患者＃００１からの骨髄サンプルを、ウイルスなし、〜２．７５ＴＣＩＤ５０／細胞、〜５．５ＴＣＩＤ５０／細胞または〜１１ＴＣＩＤ５０／細胞のいずれかと７２時間インキュベーションし、その後、フローサイトメトリーにより分析して、依然として生存している骨髄腫細胞の割合を評価した。細胞をヨウ化プロピジウムおよび抗ＣＤ１３８−ＦＩＴＣ抗体により二重染色した。異なる濃度のウイルスによる除去処理の後で残っている生存している骨髄腫細胞を各ドットプロットの下部右側象限（ＣＤ１３８＋／ＰＩ−）に認めることができる。図９Ｂ：０ＴＣＩＤ５０／細胞、〜２．７５ＴＣＩＤ５０／細胞、〜５．５ＴＣＩＤ５０／細胞を４８時間感染させたＣＶＡ２１感染の原発性腫瘍サンプルの顕微鏡写真。細胞の集塊化を、ウイルスなしのコントロールと比較して、両方のウイルス処理サンプルにおいて認めることができる（４０倍の倍率）。図９Ｃ：上記のフローサイトメトリーデータから計算された、異なる濃度のウイルスによる攻撃の後での生存性骨髄腫細胞の割合。
図１０は、ＣＶＡ２１はプラスマ細胞をＭＭおよびＭＧＵＳのＢＭから選択的に除去することを示す（図１０Ａ〜図１０Ｅ）。図１０Ａ：ＣＤ１３８＋細胞におけるＩＣＡＭ−１発現。抗ＣＤ１３８および抗ＩＣＡＭ−１による染色の後における、患者＃００５からの代表的なドットプロット。図１０Ｂ（ｉ）：再発ＭＭ患者（＃００１、＃００２および＃００８）、部分的寛解でのＭＭ患者（＃００３）、意味未確定の単クローン性高ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）の患者（＃００４、＃００６）、および、診断時にＭＭの患者（＃００７）から得られたＢＭサンプルのインビトロ感染および殺傷。７名の患者から得られたＢＭサンプルに、ＣＶＡ２１を、０ＴＣＩＤ５０／細胞（ｍｏｃｋ）、３ＴＣＩＤ５０／細胞または１０ＴＣＩＤ５０／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）でインビトロ感染させた。サンプルを感染後４８時間で集め、ＣＤ１３８について染色した後でフローサイトメトリーによって分析した。１０，０００個の事象をサンプルあたり記録した。ＣＤ１３８陽性であった生存性細胞の割合が示される。図１０Ｂ（ｉｉ）：本明細書中の表１に示されるような様々な条件による合計で１９個の臨床サンプルについての累積的結果。図１０Ｃ：ＢＭ子孫はＣＶＡ２１に対して抵抗性がある。ＣＶＡ２１を、０ＴＣＩＤ５０／細胞（ｍｏｃｋ）、３ＴＣＩＤ５０／細胞および１０ＴＣＩＤ５０／細胞のＭＯＩで４８時間感染させた３つのＢＭサンプルからの残存細胞（約１０，０００個の細胞）を３ｍｌのＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  ＧＦ４４３４完全メチルセルロース培養培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、カナダ）で培養した。ＣＦＵ−ＧＭの培養を６ウエルプレートのウエルで行い、３７℃および５％ＣＯ２において１４日間インキュベーションした。ＣＦＵ−ＧＭを、倒立型顕微鏡を使用して、２０個以上の細胞の顆粒球および／またはマクロファージからなるコロニーとしてスコア化した。それぞれの濃度でのＣＶＡ２１による感染の後における平均コロニー数が示される。誤差バーは３つのサンプルの平均値の標準誤差を示す。示されるコロニー数は、置床された１ｘ１０４細胞あたりである。ＣＦＵ−ＧＭ、顆粒球／マクロファージのコロニー形成ユニット。図１０Ｄ：ＰＢＭＣ（ＣＤ１３８−）集団は、フローサイトメトリーによって評価されたとき、ＣＶＡ２１除去処理後も依然として生存性であった。上記の（Ｂ）（ｉ）に記載される７つの患者ＢＭサンプルへの感染の後、ＣＤ１３８−細胞を同様に定量した。この集団はＣＶＡ２１感染後も比較的変化を受けずにいた。図１０Ｅ：図１０Ｂ（ｉｉ）に記載されるような患者由来のＢＭサンプルのインビトロ感染および殺傷。結果がＣＤ１３８＋細胞の減少率として表される。
図１１は、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ前リンパ球性白血病、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＭＬ）、単球性白血病および多発性骨髄腫の細胞株に対するＩＣＡＭ−１およびＤＡＦのフローサイトメトリー分析を示す（図１１Ａ〜図１１Ｂ）。（Ａ）Ｂ細胞リンパ腫細胞株ＳＣＯＴＴ、Ｂ前リンパ球性白血病細胞株ＪＶＭ１３、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＭＬ）細胞株ＮＢ４、および、（Ｂ）急性前骨髄球性白血病（ＡＰＭＬ）細胞株ＨＬ−６０、単球性白血病細胞株Ｕ９３７および多発性骨髄腫細胞株Ｈ９２９を、抗ＩＣＡＭ−１ｍＡｂおよび抗ＤＡＦｍＡｂにより二重染色した。抗ＩＣＡＭ−１ｍＡｂはＦＩＴＣと直接にコンジュゲート化され、抗ＤＡＦｍＡｂが、ＰＥに連結された二次コンジュゲートを介して間接的に染色された。
図１２は、ＭＭＴアッセイを使用した、選択された血液ガン細胞株に対するＣＶＡ２１、ＣＶＡ１８、ＣＶＡ１５およびＣＶＡ１３の腫瘍退縮作用を示すグラフである（図１２Ａ〜図１２Ｃ）。（Ａ）ＭＭ細胞株ＲＰＭＩ−８２２６、（Ｂ）単球性白血病細胞株Ｕ９３７および（Ｃ）急性前骨髄球性白血病（ＡＰＭＬ）細胞株ＨＬ−６０は、４８時間について示されるように、連続ウイルスに対する示差的な感受性を明らかにする。
図１３は、選択された血液ガン細胞株の感染後におけるＣＶＡ２１収量を示すグラフである。ＣＶＡ２１による２４時間および４８時間の感染の後で感染性ウイルス粒子を生じさせる、（菱形）ＭＭ細胞株ＲＰＭＩ−８２２６、（四角）単球性白血病細胞株Ｕ９３７および（三角）急性前骨髄球性白血病（ＡＰＭＬ）細胞株ＨＬ−６０の能力。約１０ＴＣＩＤ５０／細胞のＣＶＡ２１を感染させた後、ウイルスの増加がＭＭ細胞株ＲＰＭＩ−８２２６においてだけ検出された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６０】
いくつかの天然に存在するピコルナウイルスおよび他のウイルス（例えば、レオウイルスなど）が、限られたタイプのガンの治療における使用のために好適であることが知られているが、改善された治療を開発することが依然として求められている。
【００６１】
本明細書中に記載されるように、本発明者らは、ピコルナウイルスが、血液腫瘍または血液ガンに溶解感染させるために使用できることを発見している。「感受性」である細胞は、細胞変性効果の誘導、ウイルスタンパク質合成および／またはウイルス産生を明らかにする細胞である。
【００６２】
これらの発見に基づいて、本発明者らは、哺乳動物における血液ガンの治療および／または予防のための方法および組成物を開発している。哺乳動物は、本発明による治療を必要としている任意の哺乳動物であり得る。哺乳動物は、ヒト、あるいは、社会的、経済的または研究的に重要である任意の生物種の個体であってもよく、これらには、マウス、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、非ヒト霊長類およびヒトが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【００６３】
細胞の死は、典型的にはウイルスによる細胞への感染から生じ、ウイルスの細胞内複製に起因する細胞の溶解によるか、または、細胞のカスパーゼの活性化の結果であることが最も考えられるアポトーシスを誘導する感染によるかのいずれかで引き起こされ得る。溶解されると、感染細胞の細胞質ゾル内容物が、破裂した原形質膜から漏れ出る場合があり、また、異常な細胞に対する免疫応答を誘発することができる細胞表面抗原を含む様々な抗原が放出される場合がある。従って、本発明の方法による哺乳動物における血液腫瘍細胞または血液ガン細胞の治療は、そのような細胞に対抗する哺乳動物の免疫性に対する押し上げを提供し得る。
【００６４】
ピコルナウイルスは、既知で、分類されているピコルナウイルス、および、まだ分類されていないピコルナウイルスを含めて、任意のピコルナウイルスであり得る。ピコルナウイルスは、原型株および臨床単離株の両方からなる群から選択され得る。ヒトピコルナウイルスの代表的なタイプには、エンテロウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ポリオウイルスおよび未分類のエンテロウイルス、ライノウイルス、パラエコーウイルス、ヘパトウイルスおよびカルジオウイルスが挙げられる。１つの好ましい方法において、ピコルナウイルスは、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ポリオウイルスおよび未分類のエンテロウイルスを含むエンテロウイルスであるか、または、ライノウイルス、パラエコーウイルス、ヘパトウイルス、カルジオウイルス、アフトウイルス、エルボウイルス、コボウイルスおよびテスコウイルスを含み得るピコルナウイルスの他の属に由来する。好ましい形態において、ピコルナウイルスはコクサッキーウイルスである。好ましくは、コクサッキーウイルスはＡ型であり、より好ましくはコクサッキーウイルスＡ２１である。
【００６５】
望ましくは、ウイルスはコクサッキーＡ群ウイルスから選択され得る。ＣＶＡ２１が好ましく、特に、ＣＶＡ２１（Ｋｕｙｋｅｎｄａｌｌ）（Ｓｉｃｋｌｅｓ  Ｇ．Ｍ．、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、１０２：７４２；Ｓｈａｆｒｅｎ  Ｄ．他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９７、７１：４７３６；Ｈｕｇｈｅｓ他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、１９８９、７０：２９４３；Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｎ．Ｊ．他、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、１９６１、１０７：６３）が好ましい。ＣＶＡ２１（Ｋｕｙｋｅｎｄａｌｌ）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９、アメリカ合衆国）からアクセション番号ＶＲ−８５０で入手可能である。他の好ましいコクサッキーＡ群ウイルスもまたＡＴＣＣから入手可能であり、これらには、ＣＶＡ１３（アクセション番号ＶＲ−１７１）、ＣＶＡ１５、特にＧ−９（アクセション番号ＶＲ−１０２１）、および、ＣＶＡ１８（アクセション番号ＶＲ−１０２４および同ＶＲ−１７６）が挙げられる。
【００６６】
ピコルナウイルスは天然に存在するものであり得るか、または改変されたものであり得る。ピコルナウイルスは、自然界の分離源から単離することができ、かつ、実験室においてヒトによって意図的に改変されていないとき、「天然に存在する」ものである。例えば、ピコルナウイルスは、「現場の分離源」から、すなわち、ヒト患者から得られる場合がある。
【００６７】
ピコルナウイルスは改変される場合があるが、血液腫瘍または血液ガンに依然として溶解感染することができる。
【００６８】
好ましくは、本明細書中に記載される方法または組成物において使用されるピコルナウイルスは、受入れ患者においてウイルス感染の臨床的症状をほとんど引き起こさないか、または、受入れ患者においてウイルス感染のほんの軽度の臨床的症状を引き起こすだけである。
【００６９】
ピコルナウイルスは、異なる抗原性決定基を含有し、それにより、ピコルナウイルスのあるサブタイプに以前にさらされた哺乳動物による免疫応答を軽減または防止するように病原性表現型が異なる２つ以上のタイプのピコルナウイルスに由来する組換えピコルナウイルスであってもよい。
【００７０】
本発明の方法では、ピコルナウイルスを個々の対象における血液腫瘍または血液ガンに投与することができる。異なる血清型および／または異なる株および／または異なる種および／または異なる属のピコルナウイルス（例えば、異なる動物種に由来するコクサッキーウイルスなど）の組合せを使用することができる。所望される場合、ピコルナウイルスは、新生物への投与に先立って、（例えば、プロテアーゼ（例えば、キモトリプシンまたはトリプシンなど）による処理によって）化学的または生化学的に前処理することができる。そのような前処理により、ウイルスの外皮が除かれ、それにより、ウイルスのより良好な感染性がもたらされ得る。
【００７１】
ピコルナウイルスは他の治療剤との組合せで投与または使用することができる。例えば、ピコルナウイルスは１つまたは複数の異なる株または血清型または種または属のピコルナウイルスとともに投与することができる。さらなる株または血清型または種または属のピコルナウイルスは、細胞感染のための受容体要求が本発明のピコルナウイルスと同じまたは異なる場合がある。
【００７２】
さらなる一例として、ピコルナウイルスまたはその組合せを、治療されている個体における免疫応答を調節または抑制することができる１つまたは複数の薬剤との組合せで投与することができる。この様式では、ウイルス感染に対する個体の自然の免疫応答が変化する場合があり、それにより、より効率的なウイルス感染および／または腫瘍退縮結果および／または治療結果が可能になる。典型的には、免疫応答を変化させることができる薬剤は、免疫応答を抑制することができる薬剤である。個体（例えば、ヒト個体など）における免疫応答を調節または抑制することができる様々な薬剤が、例えば、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ（第１３版、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．Ｉｎｃ．、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ、米国）に記載される（その内容は参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００７３】
ピコルナウイルスまたはその組合せは１つまたは複数の化学療法剤（これはまた抗新生物剤とも呼ばれる）との組合せで使用することができる。様々な抗新生物剤が、例えば、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ（第１３版、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．Ｉｎｃ．、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ、米国）に記載される。例えば、ピコルナウイルスを下記の化学療法剤とともに投与することができる：例えば、アドリアマイシン、タキソール、フルオロウラシル、メルファラン、シスプラチン、α−インターフェロン、ＣＯＭＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、メトトレキサートおよびプレドニゾン）、エトポシド、ｍＢＡＣＯＤ（メトトレキサート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチンおよびデキサメタゾン）、ＰＲＯＭＡＣＥ／ＭＯＰＰ（プレドニゾン、メトトレキサート（ロイコボリン救済とともに）、ドキソルビシン、シクロホスファミド、タキソール、エトポシド／メクロレタミン、ビンクリスチン、プレドニゾンおよびプロカルバジン）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、アンギオインヒビン、ＴＮＰ−４７０、ペントサンポリサルファート、血小板因子４、アンギオスタチン、ＬＭ−６０９、ＳＵ−１０１、ＣＭ−１０１、テクガラン、サリドマイドおよびＳＰ−ＰＧなど。他の化学療法剤には、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、メルファン、クロラムブチル、シクロホスファミドおよびイホスファミドが挙げられる）；ニトロソウレア剤（カルムスチン、ロムスチン、セムスチンおよびストレプトゾシンが挙げられる）；アルキルスルホナート剤（ブスルファンが挙げられる）；トリアジン系薬剤（ダカルバジンが挙げられる）；エチレンイミン系薬剤（チオテパおよびヘキサメチルメラミンが挙げられる）；葉酸アナログ（メトトレキサートが挙げられる）；ピリミジンアナログ（５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシドが挙げられる）；プリンアナログ（６−メルカプトプリンおよび６−チオグアニンが挙げられる）；抗腫瘍抗生物質（アクチノマシンＤが挙げられる）；アントラサイクリン系薬剤（ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣおよびメトラマイシンが挙げられる）；ホルモンおよびホルモンアンタゴニスト（タモキシフェンおよびコルチコステロイドが挙げられる）；ならびに、その他の薬剤（シスプラチンおよびブレキナルが挙げられる）が挙げられる。ピコルナウイルスは、例えば、メラノーマの治療のために、ブレオマイシン、ビンデシン、ビンクリスチン、ダクタマイシン、プロカルバジン、ロムスチンまたはダカルバジンの１つまたは複数との組合せで使用することができる。ピコルナウイルスは、例えば、卵巣ガンの治療のために、シスプラチンおよびカルボプラチンの１つまたは複数との組合せで使用することができる。例えば、乳ガンの治療のために、ピコルナウイルスとの組合せで使用することができる化学療法剤のさらなる例には、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ）、メトトレキサート（Ａｍｅｔｈｏｐｔｅｒｉｎ、Ｍｅｘａｔｅ、Ｆｏｌｅｘ）およびフルオロウラシル（Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ、５−ＦＵ、Ａｄｒｕｃｉｌ）［ＣＭＦと略称される］；シ���ロホスファミド、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）およびフルオロウラシル［ＣＡＦと略称される］；ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）およびシクロホスファミド［ＡＣと略称される］；パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）を伴うドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）およびシクロホスファミド；ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、続いてＣＭＦ；シクロホスファミド、エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ）およびフルオロウラシルが挙げられる。乳ガンの女性を治療するために使用される他の化学療法剤には、例えば、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）、ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）およびカペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ）が挙げられる。
【００７４】
ピコルナウイルスまたはその組合せは、血液ガンの治療のための既知の治療法（例えば、サリドマイド、プロテオソーム阻害剤および三酸化ヒ素を用いた骨髄腫の治療など）との組合せで使用され得ることが理解される。
【００７５】
１つまたは複数のさらなる薬剤（例えば、１つまたは複数のさらなるピコルナウイルス、免疫応答を調節または刺激することができる１つまたは複数の薬剤、あるいは、１つまたは複数の抗新生物剤など）との「組合せでの」ピコルナウイルスの使用または投与は、そのようなピコルナウイルスおよびさらなる薬剤が治療効果（例えば、重なる時間的効果など）を有する任意の様式での使用または投与を意味することが理解される。組合せの要素は同時に投与することができ、または、所望の治療効果を提供する任意の順序で個々に投与することができる。混合治療のために意図されるとき、ピコルナウイルスおよびさらなる薬剤は、物理的に混合された状態であり得るか、あるいは、例えば、投与のための説明書を伴うか、または伴わないキット形態などで、別々に提供され得る。本発明によるキットはまた、本発明の方法を行うために要求または所望されるような他の構成要素（例えば、緩衝剤および／または希釈剤など）を含むことができる。キットは典型的には、様々な構成要素を収容するための容器、および、本発明の方法においてキットの構成要素を使用するための説明書を含む。
【００７６】
本発明の医薬組成物には、ピコルナウイルスを唯一の治療活性な薬剤として含む組成物だけでなく、１つまたは複数のさらなる治療剤との物理的混合でのピコルナウイルスの組成物が挙げられることが理解される。
【００７７】
ピコルナウイルスは効果的な量のプロバイオティクス剤との組合せで投与することができる。プロバイオティクス剤には、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌ．ｃｏｎｆｕｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅおよびＢ．ｌｏｎｇｕｍが含まれ得るが、これらに限定されない。
【００７８】
血液ガン（例えば、白血病、リンパ腫および骨髄腫など）は、骨髄細胞またはリンパ系組織から生じるガンである。血液ガンは充実性腫瘍または別々の細胞（そのような場合、細胞は白血病細胞として血液中に存在する）として成長することができる。
【００７９】
通常、血液ガンの細胞の少なくとも一部がＩＣＡＭ−１および／またはＤＡＦを発現する。通常、血液ガンの細胞の少なくとも一部が、非悪性細胞と比較して、ＩＣＡＭ−１および／またはＤＡＦを過剰発現する。本発明の方法による治療に対して特に感受性である血液腫瘍または血液ガンには、白血病、多発性骨髄腫、ホジキン病、非ホジキン病、骨髄形成異常およびリンパ腫が挙げられる。白血病の例には、慢性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
ピコルナウイルスは、典型的には、生理学的に許容され得るキャリアまたはビヒクル（例えば、リン酸塩緩衝化生理的食塩水など）において血液ガンに投与される。「血液ガンへの投与」は、ピコルナウイルスが血液ガンの細胞と接触するような様式でピコルナウイルスが投与されることを示す。ピコルナウイルスが投与される経路は、配合物、キャリアまたはビヒクルと同様に、新生物の存在位置ならびにタイプに依存する。広範囲の様々な投与経路を用いることができる。例えば、近づくことができる充実性新生物については、ピコルナウイルスを注射によって新生物に対して直接に投与することができる。造血系新生物については、例えば、ピコルナウイルスを典型的には静脈内または血管内に投与することができる。例えば、静脈内送達は、単回または複数回のボーラス服用量注射によってか、または例えば滴剤を用いる静脈系への緩速注入によって投与することができる。体内において容易に近づくことができない新生物（例えば、転移物または脳ガンなど）については、ピコルナウイルスは、ピコルナウイルスが哺乳動物の身体中を通って全身に輸送され、それにより、新生物に到達し得るような様式で投与される（例えば、クモ膜下、静脈内または筋肉内）。あるいは、ピコルナウイルスを１つだけの充実性新生物に対して直接に投与することができ、この場合、ピコルナウイルスは、その後、全身的に身体中を通って転移物に運ばれる。ピコルナウイルスはまた、皮下、腹腔内、局所的、経口、直腸、膣、鼻腔に、または、吸入スプレーによって投与することができる。
【００８１】
一般には、好適な組成物を当業者に既知の方法に従って調製することができ、従って、好適な組成物は、医薬的に許容され得るキャリア、希釈剤および／または補助剤を含むことができる。
【００８２】
組成物は標準的な経路によって投与することができる。一般に、組成物は、非経口経路（例えば、静脈内経路、髄腔内経路、皮下経路または筋肉内経路）、経口経路または局所経路によって投与することができる。より好ましくは、投与は非経口経路によってである。
【００８３】
キャリア、希釈剤および補助剤は、組成物の他の成分との適合性を有し、かつ、その被投与者に対して有害でないという点で「許容され得る」ことが必要である。
【００８４】
医薬的に許容され得るキャリアまたは希釈剤の例には、脱塩水または蒸留水；生理的食塩水溶液；植物系オイル、例えば、ピーナッツ油、ベニバナ油、オリーブ油、綿実油、ダイズ油、ゴマ油、例えば、ピーナッツ油、ベニバナ油、オリーブ油、綿実油、ダイズ油、ゴマ油、ラッカセイ油またはココナッツ油など；シリコーンオイル、ポリシロキサン（例えば、メチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサンおよびメチルフェニルポリシロキサンなど）が含まれる；揮発性シリコーン；鉱油、例えば、流動パラフィン、軟パラフィンまたはスクアレンなど；セルロース誘導体、例えば、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど；低級アルカノール、例えば、エタノールまたはイソプロパノール；低級アラルカノール；低級ポリアルキレングリコールまたは低級アルキレングリコール、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールまたはグリセリンなど；脂肪酸エステル、例えば、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピルまたはオレイン酸エチルなど；ポリビニルピロリドン；寒天；トラガカントゴムまたはアラビアゴム、およびワセリンがある。典型的には、キャリアは組成物の１０重量％〜９９．９重量％を形成する。
【００８５】
組成物は、注射による投与のために好適な形態、経口摂取のために好適な配合物の形態（例えば、カプセル、錠剤、カプレット、エリキシル剤）、局所投与のために好適な軟膏、クリームまたはローションの形態、点眼剤としての送達のために好適な形態、吸入による投与（例えば、鼻腔内吸入または経口吸入などによる投与）のために好適なエアロゾル形態、非経口投与（すなわち、皮下注射、筋肉内注射または静脈内注射）のために好適な形態にすることができる。
【００８６】
注射可能な溶液または懸濁物として投与される場合、非毒性の非経口的に許容され得る希釈剤またはキャリアには、リンゲル液、等張性の生理的食塩水、リン酸塩緩衝化生理的食塩水、エタノールおよび１，２−プロピレングリコールが含まれ得る。
【００８７】
経口使用される好適なキャリア、希釈剤、賦形剤および補助剤のいくつかの例には、ピーナッツ油、流動パラフィン、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム、トラガカントゴム、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、ゼラチンおよびレシチンが含まれる。加えて、これらの経口配合物は、好適な矯味矯臭剤および着色剤を含有することができる。カプセル形態で使用されるとき、カプセルは、崩壊を遅らせる化合物（例えば、グリセリルモノステアラートまたはグリセリルジステアラートなど）でコーティングすることができる。
【００８８】
補助剤には、典型的には、皮膚軟化剤、乳化剤、増粘剤、保存剤、殺菌剤および緩衝化剤が含まれる。
【００８９】
経口投与される固体形態物は、ヒトおよび動物の製薬実務において許容され得る結合剤、甘味剤、崩壊剤、希釈剤、矯味矯臭剤、コーティング剤、保存剤、滑剤および／または時間遅延剤を含有することができる。好適な結合剤には、アラビアゴム、ゼラチン、トウモロコシデンプン、トラガカントゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースまたはポリエチレングリコールが含まれる。好適な甘味剤には、スクロース、ラクトース、グルコース、アスパルテームまたはサッカリンが含まれる。好適な崩壊剤には、トウモロコシデンプン、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、グアールガム、キサンタンガム、ベントナイト、アルギン酸または寒天が含まれる。好適な希釈剤には、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、デキストロース、カオリン、セルロース、炭酸カルシウム、ケイ酸カルシウムまたはリン酸二カルシウムが含まれる。好適な矯味矯臭剤には、ハッカ油、ウインターグリーン油、サクランボ、オレンジまたはラズベリーの香料が含まれる。好適なコーティング剤には、アクリル酸および／またはメタクリル酸および／またはそれらのエステルのポリマーまたはコポリマー、ワックス、脂肪アルコール、ゼイン、セラックまたはグルテンが含まれる。好適な保存剤には、安息香酸ナトリウム、ビタミンＥ、α−トコフェロール、アスコルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベンまたは重亜硫酸ナトリウムが含まれる。好適な滑剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、オレイン酸ナトリウム、塩化ナトリウムまたはタルクが含まれる。好適な時間遅延剤には、グリセリルモノステアラートまたはグリセリルジステアラートが含まれる。
【００９０】
経口投与される液体形態物は、上記の薬剤に加えて、液体キャリアを含有することができる。好適な液体キャリアには、水、オイル、例えば、オリーブ油、ピーナッツ油、ゴマ油、ヒマワリ油、ベニバナ油、ラッカセイ油、ココナッツ油、流動パラフィン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、グリセロール、脂肪アルコール、トリグリセリドなど、またはその混合物が含まれる。
【００９１】
経口投与される懸濁物は分散化剤および／または懸濁化剤をさらに含むことができる。好適な懸濁化剤には、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウムまたはアセチルアルコールが含まれる。好適な分散化剤には、レシチン、脂肪酸（例えば、ステアリン酸など）のポリオキシエチレンエステル、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレアートまたはポリオキシエチレンソルビトールジオレアート、ポリオキシエチレンソルビトールモノステアラートまたはポリオキシエチレンソルビトールジステアラート、ポリオキシエチレンソルビトールモノラウラートまたはポリオキシエチレンソルビトールジラウラート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートまたはポリオキシエチレンソルビタンジオレアート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアラートまたはポリオキシエチレンソルビタンジステアラート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラートまたはポリオキシエチレンソルビタンジラウラートなどが含まれる。
【００９２】
経口投与されるエマルションは１つまたは複数の乳化剤をさらに含むことができる。好適な乳化剤には、上記で例示されたような分散化剤、または、天然ゴム（例えば、グアールガム、アラビアガムまたはトラガカントガムなど）が含まれる。
【００９３】
非経口投与可能な組成物を調製するための様々な方法が当業者には明らかであり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（第１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、これは本明細書により参考として本明細書中に組み込まれる）においてより詳しく記載される。
【００９４】
本発明の局所配合物は、１つまたは複数の許容され得るキャリアと一緒での有効成分と、必要な場合には任意の他の治療的成分とを含む。局所投与のために好適な配合物には、治療が必要とされる部位への皮膚を介した浸透のために好適な液体または半液体の調製物（例えば、リニメント剤、ローション、クリーム、軟膏またはペーストなど）、および、眼、耳または鼻への投与のために好適な滴剤が含まれる。
【００９５】
本発明による滴剤は無菌の水性または油性の溶液または懸濁物を含むことができる。これらは、有効成分を、殺菌剤および／または抗真菌剤および／または任意の他の好適な保存剤の水溶液に溶解し、そして、必要な場合には、表面活性剤を含むことによって調製することができる。得られる溶液は、その後、ろ過によって清澄化され、好適な容器に移され、滅菌され得る。滅菌は、オートクレーブ処理するか、または、９０℃〜１００℃で半時間維持することによって、あるいは、ろ過し、その後、無菌技術によって容器に移すことによって達成することができる。滴剤に含めるために好適な殺菌剤および抗真菌剤の例には、硝酸フェニル水銀または酢酸フェニル水銀（０．００２％）、ベンザルコニウムクロリド（０．０１％）および酢酸クロルヘキシジン（０．０１％）がある。油性溶液を調製するための好適な溶媒には、グリセロール、希釈されたアルコールおよびプロピレングリコールが含まれる。
【００９６】
本発明によるローションには、皮膚または眼に対する適用のために好適なローションが含まれる。眼用ローションは、殺菌剤を場合により含有する無菌の水溶液を含むことができ、滴剤の調製に関連して上記で記載された方法と類似する方法によって調製することができる。皮膚に適用されるローションまたはリニメント剤はまた、乾燥を急がせ、また、皮膚を冷やすための薬剤（例えば、アルコールまたはアセトンなど）、および／または、保湿剤（例えば、グリセロールなど）、または、オイル（例えば、ひまし油またはラッカセイ油など）を含むことができる。
【００９７】
本発明によるクリーム、軟膏またはペーストは、外用適用のための有効成分の半固体配合物である。それらは、細かく分割された形態または粉末化された形態での有効成分を、単独で、あるいは、水性流体または非水性流体における溶液または懸濁物で、脂肪性または非脂肪性の基剤と混合することによって作製することができる。このような基剤は、炭化水素（例えば、硬パラフィン、軟パラフィンまたは流動パラフィンなど）、グリセロール、蜜ろう、金属石けん；粘漿剤；天然起源のオイル、例えば、アーモンド油、トウモロコシ油、ラッカセイ油、ひまし油またはオリーブ油など；羊毛脂またはその誘導体、あるいは、アルコール（例えば、プロピレングリコールまたはマクロゴールなど）と一緒での脂肪酸（例えば、ステアリン酸またはオレイン酸など）を含むことができる。
【００９８】
本発明の組成物は、任意の好適な界面活性剤、例えば、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤など、例えば、ソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体などを含むことができる。懸濁化剤（例えば、天然ゴム、セルロース誘導体または無機物質（例えば、ケイ酸系シリカなど）など）および他の成分（例えば、ラノリンなど）もまた含めることができる。
【００９９】
ピコルナウイルスの多数回の投与が所望される場合、異なるウイルスを、前回に投与されたウイルスに対する何らかの免疫応答の影響を避け、または最小限に抑えるために、毎回投与することができ、また、治療の経過を、主治医によって決定され得るように１週間〜２週間またはそれ以上にわたって、例えば１ヶ月間〜２ヶ月間またはそれ以上にわたって、延長することができる。最も好ましくは、哺乳動物が以前にさらされていないウイルス、または、哺乳動物が、標準的な技術によって明らかにされ得るような比較的軽微な免疫応答を生じさせるウイルスを投与することができる。
【０１００】
広範囲の様々な投与経路を用いることができる。例えば、血液ガンについては、投与経路は、静脈内、腫瘍内、腹腔内、筋肉内、眼内、皮下、経口または局所的であり得るか、あるいは、自家幹細胞移植に先立つ自家移植片内の悪性細胞の生体外除去による場合がある。
【０１０１】
ピコルナウイルスは、血液ガンを治療するために十分である量（例えば、「効果的な量」）で投与される。血液ガンは、ガンの細胞へのピコルナウイルスの投与がガン細胞の少なくとも一部の腫瘍退縮を達成し、ガンの程度の低下、または、好ましくは、ガンの完全な除去をもたらすとき、「治療される」。ガンの程度の低下、または、好ましくは、ガンの除去は、一般には、ピコルナウイルスによる血液ガン細胞の溶解（「腫瘍退縮」）によって引き起こされる。
【０１０２】
効果的な量は、個体に基づいて決定され、少なくとも部分的には、ピコルナウイルスのタイプ；個体の体格、年齢、性別；ならびに血液ガンのタイプ、範囲および他の特徴に基づくことができる。例えば、ヒトの治療については、約１０２〜約１０１０プラーク形成ユニット（ＣＦＵ）のピコルナウイルスを、具体的な状況（例えば、存在するガンのタイプ、サイズおよび範囲など）に依存して使用することができる。例えば、接種物は約１０５ＰＦＵを超えて含有することができ、例えば、約１０５ＰＦＵ〜約１０６ＰＦＵまたは約１０６ＰＦＵ〜約１０７ＰＦＵまたは約１０７ＰＦＵ〜約１０８ＰＦＵを含有することができる。さらなる一例として、ウイルス用量の範囲は約０．０１〜約１０００感染性ウイルスユニット／細胞である場合があり、例えば、約０．０１〜約０．１感染性ウイルスユニット／細胞、または、約０．１〜約１感染性ウイルスユニット／細胞、または、約１〜約１０感染性ウイルスユニット／細胞、または、約１０〜約１００感染性ウイルスユニット／細胞、または、約１００〜約１０００感染性ウイルスユニット／細胞であり得る。
【０１０３】
ピコルナウイルスは単回服用量または複数回服用量（すなわち、２回以上の服用量）で投与することができる。複数回服用量は、同時に、または、（例えば、数日または数週間の期間にわたって）連続して投与することができる。典型的には、治療的適用では、治療は疾患状態の継続期間において行われ、例えば、少なくとも、血液ガンが通常の手段によってもはや検出できなくなるまでである。例えば、検出できない新生物が存在する可能性があることを治療医が疑う場合、検出可能なガンの存在がなくなるまでの期間にわたって継続することが望ましい場合があることもまた意図される。ピコルナウイルスはまた、同じ個体における２つ以上の血液ガンに対して投与することができる。
【０１０４】
ピコルナウイルスは、ウイルス感染のガン細胞における溶解応答の生成を可能にするためにＲＮＡゲノムあるいはゲノムまたはその十分な一部分の相補的なＤＮＡ複製体を使用することによって間接的に投与され得ることもまた理解される。投与されたとき、ピコルナウイルスは依然として、細胞において複製し、かつ、所望する溶解感染および殺傷を引き起こすことができる。
【０１０５】
典型的には、患者はウイルスの最初の用量で治療され、続いて、ウイルスの最初の投与に対する患者の応答、ならびに、最初の治療から生じるウイルス感染の程度および悪性細胞の死などの要因の結果を待ちながら、さらなるウイルスを患者に投与するための決定がなされるまでの好適な期間にわたってモニターされる。
【０１０６】
望ましくは、個体は所定の間隔で一定期間にわたってウイルスにより治療される。間隔は、それぞれの状況において適切であると決定されるように、毎日であり得るか、あるいは、２４時間〜７２時間以上（例えば、毎週または毎月など）の範囲であり得る。同じウイルスまたは異なるウイルスを、例えば、前回に投与されたウイルスまたは以前に遭遇したウイルスに対する何らかの免疫応答の影響を回避するか、または最小限に抑えるために、そのたび毎に投与することができ、また、治療経過を、主治医によって決定され得るように、１週間〜２週間以上に延ばすことができる。最も好ましくは、個体が以前にさらされていないウイルス、または、個体が、標準的な技術によって明らかにされるような比較的軽い免疫応答を生じさせるウイルスが投与される。あるいは、所望される場合、ウイルスの投与は、例えば、投与されたウイルスに対する受容者の免疫応答を軽減することが所望される場合には、免疫調節剤との組合せであり得る。
【０１０７】
容易に入手可能な既知のウイルスを本発明の方法において好適に用いることができる一方で、従来の技術を使用して改変または操作されたウイルスもまた利用することができる。例えば、ウイルスを、さらなる細胞接着分子を細胞受容体として用いるために改変することができる。例えば、ペプチドモチーフ「ＲＧＤ」が、コクサッキーウイルスＡ９（ＣＶＡ−９）の場合と同様にウイルスのキャプシド表面に発現されるように、コクサッキーウイルスＡ２１を、部位特異的変異誘発を使用して改変することができる。ＲＧＤモチーフはすべてのαｖインテグリンヘテロ二量体によって認識され、このキャプシド改変は、例えば、ウイルスがインテグリンαｖβ３（悪性メラノーマ病変の表面でのＩＣＡＭ−１との組合せでアップレギュレーションされ、インテグリン分子との相互作用またはＩＣＡＭ−１とのその後の相互作用を介してウイルスの高まった取り込みをもたらすことが知られている細胞接着分子）と結合することを可能にし得る。あるいは、ウイルスを、セレクチン（例えば、Ｅ−セレクチンなど）を認識するように、または、ＮＦ−κＢのシグナル伝達経路を標的化するように改変することができる。
【０１０８】
ウイルスは、細胞進入のための別の分子を認識するように改変または選択することができる。そのような改変および選択のための方法が本出願人の同時係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ２００５／００００４８（発明の名称：改変された腫瘍退縮性ウイルス）に記載される（その内容は参考として本明細書中に組み込まれる）。例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ２００５／００００４８は、細胞上の崩壊促進因子（ＤＡＦ）を介するなどして、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の実質的に非存在下で細胞に溶解感染することができるか、または、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の実質的に非存在下で細胞におけるアポトーシスを誘導することができる単離されている選択されたウイルスを開示する。
【実施例】
【０１０９】
次に、本発明が、具体的な実施例を参照することによってより詳しく記載されるが、実施例は、いかなる点においても本発明の範囲を限定するものとして解釈してはならない。
【０１１０】
材料および方法
細胞およびウイルス
コクサッキーＡウイルスＣＶＡ２１の原型株（Ｋｕｙｋｅｎｄａｌｌ株）をＭ．Ｋｅｎｎｅｔｔ博士（Ｅｎｔｅｒｏｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ、オーストラリア）から得た。ＣＶＡ２１を２回プラーク精製し、ＩＣＡＭ−１を発現するメラノーマ細胞（ＳＫ−Ｍｅｌ−２８）において成長させた。ウイルスは、ＣＶＡ２１、ＣＶＡ１８、ＣＶＡ１５およびＣＶＡ１３の研究室保存株であった。コクサッキーＡウイルスのこれらの原型株、ＣＶＡ１３（Ｆｌｏｒｅｓ）、ＣＶＡ１５（Ｇ−９）、ＣＶＡ１８（Ｇ−１３）およびＣＶＡ２１（Ｋｕｙｋｅｎｄａｌｌ）もまたＭ．Ｋｅｎｎｅｔｔ博士から得た。最初に、ＣＶＡ１３、ＣＶＡ１５およびＣＶＡ１８をＨｅＬａ−Ｂ細胞において増殖させ、一方、ＣＶＡ２１ＫｕｙｋｅｎｄａｌｌをＲＤ−ＩＣＡＭ−１細胞において増殖させた。その後、これらのウイルスの作業用の研究室ストックをＳＫ−Ｍｅｌ−２８細胞においてこれらの保存株から調製した。
【０１１１】
ＳＫ−Ｍｅｌ−２８細胞はＰ．Ｈｅｒｓｅｙ博士（Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｍａｔｅｒ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｗａｒａｔａｈ、Ｎｅｗ  Ｓｏｕｔｈ  Ｗａｌｅｓ、オーストラリア）からの譲渡であった。Ｕ２６６、ＲＰＭＩ−８２２６およびＮＣＩ−Ｈ９２９の多発性骨髄腫細胞株をＬ．Ｌｉｎｃｚ博士（Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、Ｍａｔｅｒ  Ｍｉｓｅｒｉｃｏｒｄｉａｔｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｈｕｎｔｅｒ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒｏｕｐ）、Ｅｄｉｔｈ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｗａｒａｔａｈ、Ｎｅｗ  Ｓｏｕｔｈ  Ｗａｌｅｓ、オーストラリア）から得た。さらなる細胞株（Ｂ細胞リンパ腫細胞株ＳＣＯＴＴ、Ｂ前リンパ球性白血病細胞株ＪＶＭ１３、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＭＬ）細胞株のＮＢ４およびＨＬ−６０、ならびに単球性白血病細胞株Ｕ９３７）もまたＬ．Ｌｉｎｃｚ博士から得た。ＳＫ−Ｍｅｌ−２８細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＤＭＥＭにおいて維持し、一方、Ｕ２６６細胞、ＲＰＭＩ−８２２６細胞、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞、ＳＣＯＴＴ細胞、ＪＶＭ１３細胞、ＮＢ４細胞、ＨＬ−６０細胞およびＵ９３７細胞を、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩにおいて培養した。すべての細胞株は５％ＣＯ２の環境とともに３７℃で維持された。健康なドナーからの正常な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、４００ｘｇで３５分間の遠心分離の前に全血サンプルをＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓグラジエント上に４：１の比率で重層することによって単離した。中間層を集め、さらなる使用の前にリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、その後、ＰＢＳで２回洗浄した。
【０１１２】
原発性腫瘍細胞
すべての手順が、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ、ＮＳＷ、オーストラリア）およびＨｕｎｔｅｒ  Ａｒｅａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ、ＮＳＷ、オーストラリア）で承認された。原発性腫瘍細胞を、多発性骨髄腫の診断のために定期的な骨髄検査を受けている患者から得た。骨髄吸引物を、表１に示されるように１９名の患者から集めた。
2008510685.tif 000002
【０１１３】
「ＰＲ」は部分的寛解である；「吸引不能」は骨髄なしを意味する（骨粒子）。すべての患者からインフォームドコンセントを得た。単一細胞懸濁物を、サンプルをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ溶液（Ｎｙｃｏｍｅｄ、Ｏｓｌｏ、ノルウェー）に２：１の比率で重層し、４００ｘｇで３０分間遠心分離することによって骨髄サンプルから得た。単核細胞の層を厚め、さらなる実験での使用の前にＰＢＳで２回洗浄し、５％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩに再懸濁した。
【０１１４】
抗体
ＩＣＡＭ−１のＮ末端ドメイン（Ｂｅｒｅｎｄｔ  ＡＲ他、Ｃｅｌｌ、１９９２、６８：７１〜８１）に対する、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）とコンジュゲート化された市販の抗ＣＤ５４抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅｓ、フランス）を、表面に発現したＩＣＡＭ−１を染色するために使用した。抗ＤＡＦｍＡｂをＢ．Ｌｏｖｅｌａｎｄ博士（Ａｕｓｔｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ、オーストラリア）から得た。抗ＣＤ１３８−ＦＩＴＣｍＡｂ（Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｏｘｆｏｒｄ、英国）はプラスマ細胞抗原Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１に対して特異的であった。フィコエリトリン（ＰＥ）とコンジュゲート化されている別の市販の抗ＣＤ１３８抗体をＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（ＣＡ、米国）から得た。
【０１１５】
フローサイトメトリー
多発性骨髄腫細胞株および他の血液ガン細胞株（Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ前リンパ球性白血病、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＭＬ）および単球性白血病）におけるＩＣＡＭ−１およびＤＡＦの表面発現を二色フローサイトメトリーによって分析した。簡単に記載すると、分散させた細胞（１ｘ１０６個）を、直接にコンジュゲート化された抗ＣＤ５４−ＦＩＴＣｍＡｂ（リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）に希釈された５μｇ／ｍｌ）と氷上で２０分間インキュベーションした。その後、細胞をＰＢＳにより洗浄し、１０００ｘｇで５分間ペレット化し、その後、抗ＤＡＦ  ＩＨ４ｍＡｂ（ＰＢＳにおいて５μｇ／ｍｌ）による二重標識化を氷上で２０分間行った。細胞をＰＢＳにより洗浄し、１００μｌの二次抗体溶液（ＰＢＳにおいて１：１００希釈されたヤギ抗マウス免疫グロブリンのＲ−フィコエリトリンコンジュゲート化Ｆ（ａｂ’）２フラグメント）（ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ、デンマーク）に再懸濁し、氷上で２０分間インキュベーションした。それぞれの細胞株について、適切なコンジュゲートコントロール抗体による染色もまた並行して行った。細胞を上記のように洗浄およびペレット化し、ＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳｔａｒ分析計（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓｙｄｎｅｙ、オーストラリア）を使用してＩＣＡＭ−１発現およびＤＡＦ発現について分析した。
【０１１６】
ウイルス溶解感染および細胞生存性アッセイ
多発性骨髄腫細胞株のＲＰＭＩ−８２２６、Ｕ２６６およびＮＣＩ−Ｈ９２９を、ＣＶＡ２１の存在下または非存在下で４８時間、６ウエルプレートで培養した。健康な志願者から得られた正常なヒト末梢血単核細胞をコントロールとして使用した。感染多重度（ＭＯＩ）はそれぞれの培養物について約５ＴＣＩＤ５０／細胞であった。細胞変性効果（ＣＰＥ）を、トリパンブルー生存性染色を使用してＣＶＡ２１感染後４８時間で評価した。多発性骨髄腫細胞株によって上清中に分泌されたタンパク質に対するトリパンブルーの親和性のために、培養上清を、染色前に、先を丸めた２６ゲージのニードルによるゆっくりした吸引によって最初に除いた。残った細胞を０．４％トリパンブルー溶液により５分間染色した。写真を１００倍の倍率で撮影した。
【０１１７】
インビトロ成長阻害アッセイ
改変型の微量培養テトラゾリウムアッセイ（Ａｌｌｅｙ  ＭＣ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９８８、４８：５８９〜６０１）を、多発性骨髄腫細胞株の成長に対する、ＣＶＡ２１濃度を増大させたときの影響を調べるために使用した。簡単に記載すると、多発性骨髄腫細胞を指数期の維持培養物から集め、１００μｌの体積で反復して９６ウエル培養プレートにおいて分散させた（１ｘ１０５細胞／ウエル）。１００μｌの培養培地、または、ウイルスを含有する培養培地（２ｘ１０−５〜２０ＴＣＩＤ５０／細胞）を適切なウエルに分注した。他のコクサッキーＡウイルス（ＣＶＡ１３、ＣＶＡ１５およびＣＶＡ１８）の成長阻害をＣＶＡ２１と比較するために、１ｘ１０−４〜１００ＴＣＩＤ５０／細胞の範囲での１０倍の連続希釈物を使用した。細胞を含有しないウエルを培地単独またはウイルス溶液単独の「バックグラウンド」測定のために利用した。
【０１１８】
培養プレートを、ＭＴＴ試薬（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｙｄｎｅｙ、Ｎｅｗ  Ｓｏｕｔｈ  Ｗａｌｅｓ、オーストラリア）の添加前に、３７℃で２日間インキュベーションした。ＭＴＴストック溶液を５ｍｇ  ＭＴＴ／ｍｌのＰＢＳ溶液として調製し、０．２μｍのフィルターユニットで滅菌ろ過し、４℃で貯蔵した。２日間のインキュベーションの後での成長阻害のレベルを測定するために、２０μｌのストックＭＴＴ溶液をそれぞれの培養ウエルに加え、３７℃でさらに４時間インキュベーションした。
【０１１９】
インキュベーション後、細胞上清を、先を丸めた２６ゲージのニードルによるゆっくりした吸引によってウエルから除き、１５０μｌのＤＭＳＯにより置き換えた。ホルマザンの結晶を室温（ＲＴ）での穏やかな振とうによって完全に溶解し、各ウエルの吸光度を、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭｃＬｅａｎ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、米国）を使用して５４０ｎｍで測定した。続いて、細胞株の成長阻害を、平均吸光度ユニットに関して、平均「バックグラウンド」吸光度を引いた後のコントロールの吸光度読み取り値の百分率として表した。
【０１２０】
ウイルス収量および終点滴定
ＣＶＡ２１のＣＰＥを３つの骨髄腫細胞株で測定した後、感染期間中に産生された感染性ウイルス粒子の収量を測定するための実験を、Ｕ２６６細胞、ＲＰＭＩ−８２２６細胞、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞およびＰＢＭＣにおいて行った。各細胞株に由来する約３ｘ１０６個の細胞を１ＴＣＩＤ５０／細胞のＭＯＩにより感染させた。ＣＶＡ２１を接種したＵ２６６細胞、ＲＰＭＩ−８２２６細胞、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞およびＰＢＭＣをＰＢＳにより２回洗浄し、６００μｌのＲＰＭＩに再懸濁し、その後、それぞれを３つの２００μｌのアリコートに分割した（約１ｘ１０６細胞／チューブ）。これらのチューブを３７℃でインキュベーションし、細胞株のそれぞれに由来する１つのアリコートを、０時間、１２時間、２４時間および４８時間の時間で集め、細胞を３回の連続した凍結・解凍サイクルによって集めた。細胞溶解物のそれぞれにおけるウイルス収量をＳＫ−Ｍｅｌ−２８細胞における終点滴定アッセイによって評価した。結果が図４に示される。
【０１２１】
簡単に記載すると、終点滴定アッセイのために、９６ウエル組織培養プレートにおけるＳＫ−Ｍｅｌ−２８細胞のコンフルエントな単層にウイルスの１０倍連続希釈物を接種し（四連での１００μｌ／ウエル）、単層を３７℃で５％ＣＯ２の環境において４８時間インキュベーションした。細胞の生存率を、クリスタルバイオレット／メタノール溶液（ＰＢＳにおいて０．１％クリスタルバイオレット、２０％メタノール、４．０％ホルムアルデヒド）（１００μｌ／ウエル）との２４時間のインキュベーション、その後、蒸留水による３回の洗浄によって定量した。個々のウエルの相対的な吸光度をマルチスキャン酵素結合免疫吸着アッセイプレートリーダー（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭｃＬｅａｎ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、米国）で５４０ｎｍにおいて読み取った。５０パーセントのウイルス終点力価を、吸光度の値がコントロール（ウイルスなしのウエル）の平均−３倍標準偏差（ＳＤ）よりも小さいならば、陽性としてウエルをスコア化することによって、ＳｐｅａｒｍａｎＫａｒｂｅｒ法を使用して計算した。
【０１２２】
感染期間中に産生された感染性ウイルス粒子（ＣＶＡ２１）の収量を測定するための実験を、選択された血液ガン細胞株（すなわち、ＭＭ細胞株ＲＰＭＩ−８２２６、単球性白血病細胞株Ｕ９３７および急性前骨髄球性白血病（ＡＰＭＬ）細胞株ＨＬ−６０）においてもまた行った。この方法は上記の方法と類似するが、細胞にはＣＶＡ２１を１０ＴＣＩＤ５０／細胞で感染させ、ウイルスを洗浄前に３７℃で３０分間結合させ、その後、新鮮な培地（ＲＰＭＩ、１０％ＦＣＳ）に入れた。細胞および上清を、感染後の０時間、２４時間および４８時間で集め、ウイルスの量をＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞の単層での終点滴定によって求めた。結果が図１３に示される。
【０１２３】
ウイルス成長速度
３つの骨髄腫細胞株におけるＣＶＡ２１の複製速度を調べるために、１ｘ１０６個のＵ２６６細胞、ＲＰＭＩ−８２２６細胞またはＮＣＩ−Ｈ９２９細胞を含有するチューブに、約３ｘ１０６ＴＣＩＤ５０のＣＶＡ２１を含有する１００μｌのウイルスアリコートを感染させた（〜３ＴＣＩＤ５０／細胞のＭＯＩ）。チューブを室温で３０分間穏やかに振とうし、その後、細胞を毎回５ｍｌのＲＰＭＩにより５回洗浄し、細胞を、１％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩの１ｍｌに再懸濁した。その後、ＣＶＡ２１を接種した細胞のそれぞれのチューブを、適切な時点での回収のために９個の別個の１００μｌアリコート（〜１ｘ１０５細胞／チューブ）に分割した。チューブを実験期間中３７℃でインキュベーションした。同時感染を、０時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、２４時間および４８時間の時間間隔で中断し、試験された細胞株のそれぞれに由来する１つのアリコートをそれぞれの時点で集め、細胞を３回の連続した凍結・解凍サイクルによって溶解し、室温における５分間の１０，０００ｘｇでの遠心分離に供し、その後、細胞溶解物におけるウイルス収量を終点滴定アッセイで測定した。
【０１２４】
ＤＮＡ断片化アッセイ
ＭＭ細胞のＣＶＡ２１感染によるアポトーシスの誘導を、ゲノムＤＮＡの断片化を検出することによって測定した。ＭＭ細胞株のＲＰＭＩ−８２２６、Ｕ２６６およびＮＣＩ−Ｈ９２９を６ウエルプレートで培養し（５ｘ１０５細胞／ウエル）、分析前に３７℃で２４時間、ＣＶＡ２１（〜１０ＴＣＩＤ５０／細胞のＭＯＩ）により感染させたか、または、培地単独により非感染のままにした。細胞を８００ｇでの５分間の遠心分離によってペレット化し、その後、５００μｌの溶解緩衝液（５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ｐＨ８．０）を細胞ペレットに加え、氷上で２０分間インキュベーションした。溶解物を１２，０００ｇで２０分間遠心分離し、ＤＮＡを、フェノール：クロロホルムを使用して上清から抽出した。ＤＮＡをエタノール沈殿し、７０％エタノールで洗浄し、ＲＮａｓｅ（５０μｇ／ｍｌ）を含有する３０μｌのＴＡＥに再懸濁した。ＤＮＡサンプルをアガロースゲル電気泳動による分析の前に３７℃で３０分間インキュベーションした。１５μｌの抽出されたＤＮＡを３μｌの負荷緩衝液（ＴＡＥにおいて０．２５％のオレンジＧ、４０％のグリセロール）と混合し、その後、臭化エチジウムを含有する１．２％ＴＡＥアガロースゲルで分離した。ゲルをＵＶ光のもとで可視化し、像を、Ｇｅｌ  Ｄｏｃシステム（Ｂｉｏ−ＲＡＤ、Ｒｅｇｅｎｔｓ  Ｐａｒｋ、Ｎｅｗ  Ｓｏｕｔｈ  Ｗａｌｅｓ、オーストラリア）を使用してデジタル画像として記録した。
【０１２５】
正常な末梢血単核細胞と同時培養された骨髄腫細胞株の選択的なＣＶＡ２１感染
Ｕ２６６およびＲＰＭＩ−８２２６の骨髄腫細胞株をそれぞれ、１０％の最終的なプラスマ細胞濃度をもたらすように、１０％ＦＣＳが補充されたＲＰＭＩ培地においてＰＢＭＣと混合した。細胞混合物を、７２時間、ＣＶＡ２１（総細胞集団あたり１ＭＯＩ）で処理したか、または、非処理のままにした。除去の３日目に、細胞集団の各混合物からのサンプルをＰＢＳにおいて集め、無傷のガン細胞の数を、抗ＣＤ１３８−ＦＩＴＣ（１０μｌ／ｍｌ）で最初に３０分間染色し、その後、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（５μｇ／ｍｌ）で１０分間染色した後、フローサイトメトリーを使用して評価した。ＦＡＣＳｔａｒ分析計（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓｙｄｎｅｙ、オーストラリア）での分析の前に、細胞を５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、１０００ｇでの遠心分離によってペレット化した。もはや生存していないか、または無傷でない細胞がヨウ化プロピジウムにより陽性に染色され（ＰＩ＋）、一方、抗ＣＤ１３８−ＦＩＴＣによる染色を、多発性骨髄腫細胞（ＣＤ１３８＋）を正常なＰＢＭＣ（ＣＤ１３８−）から明らかにするために使用した。
【０１２６】
ＣＶＡ２１による患者骨髄サンプルの生体外除去処理
原発性腫瘍サンプルを、インフォームドコンセントが得られた２名の多発性骨髄腫患者から得た。定期的な診断のときに採取された骨髄吸引物からの余剰細胞のみをこの研究では使用した。最初に、ＩＣＡＭ−１受容体のレベルを、上記で記載されたような標準的な表面受容体染色プロトコルに基づく、原発性腫瘍細胞（１ｘ１０５細胞）の抗ＣＤ１３８−ＰＥ抗体（１０μｇ／ｍｌ）および抗ＩＣＡＭ−１−ＦＩＴＣ抗体（５μｇ／ｍｌ）による二重染色によってそれぞれの臨床サンプルについて評価した。その後、成長阻害／ＭＴＴアッセイを、ＣＶＡ２１を感染させた臨床サンプルに対して三連で行った。約１ｘ１０５細胞（５％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩにおいて）を、その後、０ＴＣＩＤ５０／細胞から１６ＴＣＩＤ５０／細胞までの範囲での１０倍連続希釈でＣＶＡ２１による腫瘍退縮を評価するために９６ウエルプレートのウエルに接種した。これらの細胞を、ＭＴＴアッセイを使用する分析の前に３７℃で４８時間インキュベーションした。
【０１２７】
成長阻害アッセイ後、臨床骨髄サンプルからの単一細胞懸濁物（５％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩにおいて１ｘ１０６個の細胞）を６ウエルプレートの各ウエルに接種し、０ＴＣＩＤ５０／細胞、２．７５ＴＣＩＤ５０／細胞、５．５ＴＣＩＤ５０／細胞および１１ＴＣＩＤ５０／細胞の濃度で４８時間、ＣＶＡ２１とインキュベーションした。その後、細胞を穏やかなピペッティングによって集め、４ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、１回洗浄し、その後、細胞生存性についての分析を続けた。ＭＭ細胞についてのＣＶＡ２１媒介による腫瘍退縮の選択性を、細胞生存性色素ヨウ化プロピジウム（５μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ１３８−ＦＩＴＣ抗体（１０μｇ／ｍｌ）を使用するフローサイトメトリーによって測定した。
【０１２８】
表１に示されるようなさらなる臨床サンプル（合計で１９個）を同様にアッセイした。
【０１２９】
結果
ＭＭ細胞はＩＣＡＭ−１およびＤＡＦを発現する
フローサイトメトリーを使用して、いくつかのＭＭ細胞株の表面におけるＣＶＡ２１細胞進入受容体のＩＣＡＭ−１およびＤＡＦの相対的なレベルを評価した。Ｕ２６６細胞、ＲＰＭＩ−８２２６細胞およびＮＣＩ−Ｈ９２９細胞を、抗ＩＣＡＭ−１抗体および抗ＤＡＦ抗体による二重染色の後でのフローサイトメトリーによって分析した。これら３つの細胞株のそれぞれが、コンジュゲートコントロールと比較して、それぞれのドットプロット（図１）の上部右側象限における染色細胞によって強調されるように、ＩＣＡＭ−１およびＤＡＦの両方の上昇したレベルを明らかにした。しかしながら、ＰＢＭＣサンプルにおけるすべての細胞がＩＣＡＭ−１の表面発現を示したわけではなく、細胞の大部分がＩＣＡＭ−１について陰性に染色された。しかしながら、ＰＢＭＣは、コンジュゲートサンプルとは対照的に、二重染色されたサンプルでのＰＢＭＣ集団の上方への移動において見られるように、ＤＡＦ発現について陽性であった。
【０１３０】
血液ガン細胞株におけるＩＣＡＭ−１およびＤＡＦの発現
ピコルナウイルスによる感染および溶解に対する血液ガンの潜在的な感受性をさらに調べるために、細胞進入受容体のＩＣＡＭ−１およびＤＡＦの発現を一連の代表的な細胞株について明らかにした。フローサイトメトリーを使用して、Ｂ細胞リンパ腫細胞株ＳＣＯＴＴ、Ｂ前リンパ球性白血病細胞株ＪＶＭ１３、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＭＬ）細胞株のＮＢ４およびＨＬ−６０、単球性白血病細胞株Ｕ９３７、ならびに多発性骨髄腫細胞株Ｈ９２９の表面におけるＣＶＡ２１細胞進入受容体のＩＣＡＭ−１およびＤＡＦの相対的なレベルを抗ＩＣＡＭ−１抗体および抗ＤＡＦ抗体による二重染色の後で評価した。Ｂ細胞リンパ腫細胞株ＳＣＯＴＴ、Ｂ前リンパ球性白血病細胞株ＪＶＭ１３およびＭＭ細胞株Ｈ９２９は、コンジュゲートコントロールと比較して、それぞれのドットプロット（図１１Ａおよび図１１Ｂ）の上部右側象限における染色細胞によって強調されるように、ＩＣＡＭ−１およびＤＡＦの両方の発現を明らかにした。単球性白血病細胞株Ｕ９３７もまた、より少程度ではあったが、ＩＣＡＭ−１およびＤＡＦの上昇したレベルを明らかにした。ＤＡＦ発現について陽性に染色されたが、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＭＬ）細胞株のＮＢ４およびＨＬ−６０における細胞の大部分がＩＣＡＭ−１について陰性に染色された。
【０１３１】
ＭＭ細胞はＣＶＡ２１による溶解感染に対して感受性である
ＩＣＡＭ−１およびＤＡＦを発現する多発性骨髄腫細胞がＣＶＡ２１による腫瘍退縮に対して感受性であるかどうかを評価するために、細胞にＣＶＡ２１（約５ＴＣＩＤ５０／細胞のＭＯＩ）を３７℃で４８時間感染させた。多発性骨髄腫細胞株のそれぞれが２４時間においてＣＶＡ２１感染の初期徴候を示した。Ｕ２６６細胞株、ＲＰＭＩ−８２２６細胞株およびＮＣＩ−Ｈ９２９細胞株におけるＣＶＡ２１の最大の細胞変性効果が、細胞の集塊化および凝集ならびにトリパンブルーの取り込み（図２）によって見られるように、感染後の２４時間〜４８時間で観測された。ヒト末梢血単核細胞における細胞変性効果は、これら３つの多発性骨髄腫細胞株と比較して最小限であった。
【０１３２】
ＣＶＡ２１感染はＭＭ細胞の成長を阻害する
様々な多発性骨髄腫細胞株に対するＣＶＡ２１の示差的な殺傷および成長阻害を、ＭＴＴ細胞生存性アッセイを使用して、より詳しく調べた。平板培養されたＵ２６６細胞、ＲＰＭＩ−８２２６細胞およびＮＣＩ−Ｈ９２９細胞を、増大する濃度のＣＶＡ２１に４８時間さらした。ＣＶＡ２１の腫瘍退縮作用をＣＶＡ２１の増大する用量の関数としてのＭＴＴ生存率によって明らかにした。図３はＣＶＡ２１暴露後の成長阻害プロフィルおよび用量依存的な肩を例示する。アッセイされたＭＭ細胞株のそれぞれが感受性であることが見出され、ＲＰＭＩ−８２２６細胞株およびＵ２６６細胞株では、低濃度のＣＶＡ２１に対する応答における著しい成長阻害が明らかにされた。正常なＰＢＭＣは、高濃度のウイルスに対する暴露の後では成長が阻害され、しかしながら、２０ＭＯＩでさえ、ＰＢＭＣの生存率は、それぞれが１０％未満の生存率であったＭＭ細胞株と比較して、８０％であった。
【０１３３】
ＭＭ細胞は子孫ＣＶＡ２１の繁殖を支援する
さらなる腫瘍退縮作用のために感染性子孫を産生するＣＶＡ２１感染のＭＭ細胞の能力を明らかにするために、Ｕ２６６、ＲＰＭＩ−８２２６、ＮＣＩ−Ｈ９２９およびＰＢＭＣとのＣＶＡ２１感染の後におけるウイルス収量を測定した。感染後の２４時間および４８時間で、３つの骨髄腫細胞株からのウイルス収量は、０時間の時点と比較して、ウイルス力価の劇的な増大を示した（図４）。しかしながら、ＰＢＭＣはＣＶＡ２１収量の増大を示しておらず、このことは、ＣＶＡ２１は正常なヒトＰＢＭＣにおける複製が許容されないという証拠を提供している。ＣＶＡ２１は、ＣＶＡ２１複製またはウイルス収量の増大を何ら伴うことなく、６日の延長された期間までＰＢＭＣにおいて増殖することができた（データ示さず）。
【０１３４】
類似するが、同一でない条件のもとでアッセイされたとき、単球性白血病細胞株Ｕ９３７および急性前骨髄球性白血病（ＡＰＭＬ）細胞株ＨＬ−６０は、感染後の２４時間または４８時間のいずれでも、ＣＶＡ２１収量の増大を示さず、このことは、ＣＶＡ２１はＵ９３７またはＨＬ−９０のいずれにおいても複製が許容されないことを示唆している（図１３）。
【０１３５】
ＣＶＡ２１はＭＭ細胞において迅速な成長速度を有する
悪性細胞のウイルス療法の１つの利点は、局所的部位または遠方の部位でさえ、周囲の悪性細胞をさらに標的とすることができる感染性子孫ウイルスが産生され得ることである。３つの多発性骨髄腫細胞株の同時感染の後、完全な細胞および上清を、示された時点で集めた（図５）。ガン性細胞株におけるＣＶＡ２１の複製が非常に迅速であることが見出され、感染させた多発性骨髄腫細胞からのウイルス力価の増大が、ＣＶＡ２１によるウイルス接種後の４時間もの早期に観測された。Ｕ２６６細胞、ＲＰＭＩ−８２２６細胞およびＮＣＩ−Ｈ９２９細胞におけるＣＶＡ２１の１段階成長曲線分析では、感染後の８時間〜１２時間での最大力価への効率的なウイルス複製が明らかにされた。
【０１３６】
ＣＶＡ２１はＲＰＭＩ−８２２６細胞およびＮＣＩ−Ｈ９２９細胞においてアポトーシスを誘導した
ＣＶＡ２１が感染期間中に多発性骨髄腫細胞のアポトーシスを誘導するかどうかを明らかにするために、ＣＶＡ２１を、ＲＰＭＩ−８２２６細胞、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞またはＵ２６６細胞のいずれかと〜１０ＴＣＩＤ５０／細胞のＭＯＩとインキュベーションし、アポトーシスを感染後２４時間でのＤＮＡ断片化アッセイによって評価した。ＣＶＡ２１は、感染させたＵ２６６細胞（レーン６）ではなく、感染させたＲＰＭＩ−８２２６細胞およびＮＣＩ−Ｈ９２９細胞（それぞれ、レーン２およびレーン４）においてアポトーシスに特徴的なＤＮＡラダー化を誘導した（図６）。ＤＮＡ断片化が、ＣＶＡ２１で処理されたＵ２６６細胞では観測されなかった。このことは、この細胞株におけるＣＶＡ２１による腫瘍退縮はアポトーシスを誘導しなかったことを示している。これらの結果は、ＣＶＡ２１はＲＰＭＩ−８２２６細胞およびＮＣＩ−Ｈ９２９細胞においてアポトーシスを誘導することができ、しかし、Ｕ２６６骨髄腫細胞の腫瘍退縮の期間中にはアポトーシス防止のシグナル伝達経路を活性化し得ることを示唆する。レーン１、レーン３およびレーン５は、ｍｏｃｋ感染のコントロール細胞から抽出されたＤＮＡを含有した。
【０１３７】
悪性細胞および非悪性細胞を含有する骨髄腫同時培養物の生体外除去処理
正常な細胞ではなく、多発性骨髄腫細胞の腫瘍退縮についてのＣＶＡ２１の特異性を、多発性骨髄腫細胞を、約１０％の腫瘍負荷をもたらすように正常なヒト末梢血単核細胞と混合し、ＣＶＡ２１による３日間の除去処理を行うことによって調べた。抗ＣＤ１３８−ＦＩＴＣおよびＰＩで染色することによって、正常なＰＢＭＣおよび多発性骨髄腫細胞の生存性集団および非生存性集団を区別することができる。図７（「ウイルスなし」）に示されるように、ＣＶＡ２１による感染の前では生存性のＲＰＭＩ−８２２６細胞またはＵ２６６細胞の集団（ＣＤ１３８＋／ＰＩ−）をフローサイトメトリーのドットプロットの下部右側象限に見ることができる。ＲＰＭＩ−８２２６同時培養物またはＵ２６６同時培養物をＣＶＡ２１により３日間にわたって１ＴＣＩＤ５０／細胞のＭＯＩで除去処理した後では、０．２６％未満および０．５１％未満の生存性骨髄腫細胞がそれぞれ残存している。ＣＶＡ２１は約９８％のＲＰＭＩ−８２２６細胞および約９５．７％のＵ２６６細胞を同時培養物から除去することができた。生存性リンパ球集団が下部左側象限に示され、ＣＤ１３８およびＰＩに関して陰性に染色される。ウイルスを感染させた後、これらの集団は、ＣＶＡ２１に対する３日間の暴露の後でさえ、比較的変化しないままである。
【０１３８】
臨床骨髄サンプルからの多発性骨髄腫細胞の除去
いくつかの多発性骨髄腫細胞株の効果的な腫瘍退縮をインビトロで明らかにした後、２つの原発性多発性骨髄腫の骨髄サンプルからのガン性細胞の生体外除去を確認した。定期的な診断を受けている２名の患者からの骨髄吸引物を単一細胞懸濁物に処理した。細胞を最初に、多発性骨髄腫細胞におけるＩＣＡＭ−１の表面発現を明らかにするために、抗ＣＤ１３８抗体および抗ＩＣＡＭ−１抗体により染色した。骨髄腫状態（ＣＤ１３８＋）とＩＣＡＭ−１発現との間での著しい相関が、調べられた両方の臨床サンプルにおいて見出された。臨床サンプルの一方からの結果が図８Ａに示される。臨床サンプル＃００１において、総細胞の約３７％が多発性骨髄腫プラスマ細胞であり、ＣＤ１３８マーカーおよびＩＣＡＭ−１の両方を発現していた。骨髄腫細胞の類似する集団が第２の患者において見出され、約４１％の細胞がＣＤ１３８およびＩＣＡＭ−１の両方により染色された（データ示さず）。
【０１３９】
患者の臨床サンプルに対するＭＴＴアッセイからの結果により、ＣＶＡ２１治療は、骨髄腫細胞の成長を種々の濃度のウイルスとの４８時間のインキュベーションの後において用量依存的な様式で効果的に阻害したことが確認された。原発性腫瘍細胞（サンプル＃００１）を様々な濃度のＣＶＡ２１により攻撃した後では、増殖性細胞の割合は、ウイルスの投入量が大きくなるに伴い、着実に低下した（図８Ｂ）。原発性腫瘍サンプルもまた非悪性細胞の集団を含有していたので、ＭＭ細胞に特異的に感染するＣＶＡ２１の特異性はまだ検討されていなかった。
【０１４０】
ＣＶＡ２１が、正常な細胞ではなく、多発性骨髄腫細胞の特異的な溶解を媒介することにおいて選択的であるかどうかを調べるために、原発性腫瘍サンプルに様々な濃度のＣＶＡ２１を４８時間感染させ、その後、原発性腫瘍サンプルを、抗ＣＤ１３８抗体およびヨウ化プロピジウムによる染色によって分析した。フローサイトメトリーを使用して、ＣＤ１３８＋細胞およびＣＤ１３８−細胞の生存性を明らかにし（図９Ａ）、細胞変性効果をＣＶＡ２１感染の３つの濃度で４８時間において観測した（図９Ｂ）。臨床サンプル＃００１からの腫瘍細胞を、０ＴＣＩＤ５０／細胞、２．７５ＴＣＩＤ５０／細胞、５．５ＴＣＩＤ５０／細胞および１１ＴＣＩＤ５０／細胞の濃度でＣＶＡ２１と４８時間インキュベーションしたとき、フローサイトメトリーによって計数された生存している骨髄腫細胞（ＣＤ１３８＋／ＰＩ−）の割合が、ウイルス投入量の増大とともに低下したことが明らかにされた（図９Ａ）。ＣＶＡ２１を１１ＴＣＩＤ５０／細胞で感染させた原発性腫瘍細胞は、検出された悪性骨髄腫細胞の割合において７４％の低下をもたらした。この原発性腫瘍サンプルにおいて、非生存性骨髄腫細胞（ＣＤ１３８＋／ＰＩ＋）の数は着実に増大し、生存性骨髄腫細胞（ＣＤ１３８＋／ＰＩ−）の減少に対応していた。
【０１４１】
これらの結果はそれ以外の臨床サンプルでもまた反映され、ＣＶＡ２１とのより長いインキュベーションの後では、生存性腫瘍細胞における最大で９０％の減少が達成された（データ示さず）。ウイルス治療がない場合でさえ、両方の臨床サンプルは低レベルの非生存性細胞が存在しており、より重要なことに、非生存性ＣＤ１３８−細胞のレベルが、調べられた臨床サンプルにおけるウイルス治療の後では実質的に増大していなかった。検討すべき別の要因は、４８時間にわたるこれらの細胞の生体外培養もまた、ウイルスなしのコントロールにおいて観測されるように、低レベルの細胞死に寄与し得ることである。種々の濃度のＣＶＡ２１による治療の後で残留している臨床サンプル＃００１由来の生存性骨髄腫細胞の割合がフローサイトメトリーからまとめられ、図９Ｃに示される。
【０１４２】
生体外除去用薬剤としてのＣＶＡ２１の臨床的有用性をさらに評価するために、さらなるＢＭ吸引物を調べた。ＣＶＡ２１をおよそ３ＭＯＩおよび１０ＭＯＩの濃度で感染させた、５名のＭＭ患者および２名のＭＧＵＳ患者からのＢＭ吸引物についての結果が図１０Ｂ（ｉ）に示される。様々な状態を有する合計で１９個の臨床サンプル（表１）についての累積的な結果が図１０Ｂ（ｉｉ）に示される。調べられたすべての臨床サンプルからのＣＤ１３８＋細胞の集団がＩＣＡＭ−１を発現していた。患者サンプル＃００６からの代表的なドットプロットが示される（図１０Ａ）。ＣＶＡ２１は、生存性ＣＤ１３８＋細胞の実質的な減少によって示されるように、ウイルスによる１回の治療の後で調べられた７個すべての臨床サンプルにおいて腫瘍退縮性の強力な除去作用を有しており、ＭＭ細胞の最大で９７．２％の除去がサンプル＃００８において認められた（図１０Ｂ（ｉ）および図１０Ｅ）。生存性ＣＤ１３８−の正常な細胞のレベルはウイルス治療の後では実質的に低下していなかった（図１０Ｄ）。より重要なことに、この画分における前駆体細胞は、造血を支援する能力を保持していた。図１０Ｃは、生存性前駆体幹細胞がＣＶＡ２１による原発性サンプルの治療の後において培養され得ることを明らかにする；３つの患者サンプルからのＣＦＵ−ＧＭコロニーの平均数が示される。ｍｏｃｋ感染のコントロールサンプルと比較して、ＣＦＵ−ＧＭコロニーの数はウイルス処置群の方が５７％〜７０％低かった。
【０１４３】
ＣＶＡ１３、ＣＶＡ１５およびＣＶＡ１８に対する血液ガン細胞株の感受性
細胞に感染し、細胞を破壊するためにＩＣＡＭ−１を使用する他のコクサッキーＡウイルス（例えば、ＣＶＡ１３、ＣＶＡ１５およびＣＶＡ１８など）もまた、多発性骨髄腫細胞の成長を阻害することができた。ＲＰＭＩ−８２２６細胞を代表的な多発性骨髄腫細胞株として使用したとき、この細胞のＣＶＡ１３処置、ＣＶＡ１５処置およびＣＶＡ１８処置では、０．１ＴＣＩＤ５０／ｍｌ〜１００ＴＣＩＤ５０／ｍｌの濃度で、ＣＶＡ２１の抗腫瘍効果と類似する抗腫瘍効果が明らかにされた（図１２Ａ）。ＣＶＡ１３、ＣＶＡ１５、ＣＶＡ１８およびＣＶＡ２１の効果は、多発性骨髄腫でないガン細胞のＵ９３７およびＨＬ−６０に対してアッセイされたとき、それほど一致していなかった（図１２Ｂおよび図１２Ｃ）。ある程度の成長阻害がＵ９３７細胞およびＨＬ−６０細胞に対してこれらのウイルスのそれぞれにより観測されたが、これらの細胞の感染の後でのＣＶＡ２１成長の収量に対する詳細な研究では、ガン細胞株のＵ９３７およびＨＬ−６０はウイルスの複製を支援することができず、従って、ウイルス療法のための理想的な候補になり得ないことが示唆される（図１３）。
【０１４４】
考察
コクサッキーウイルスＡ２１は、悪性メラノーマに対する効果的な抗腫瘍性薬剤であることが初めて示された新規な腫瘍退縮薬剤である。ＣＶＡ２１は、軽い上部気道感染症に広く伴うピコルナウイルスであり、ヒトにおいて重篤な疾患を引き起こすことは知られていない（Ｒｕｅｃｋｅｒｔ  ＲＲ、ピコルナウイルス科：ウイルスおよびその複製、Ｆｉｅｌｄｓ  ＢＮ、Ｋｎｉｐｅ  ＤＭ、Ｈｏｗｌｅｙ  ＰＭ編、Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第１巻、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ；１９９６：６０９〜６４５）。これらの結果は、ＣＶＡ２１が、いくつかのＭＭ細胞株のインビトロ試験の後において多発性骨髄腫に対する強力な腫瘍退縮性薬剤であることを明らかにしている。この結論は、ＭＭ細胞株に対するＣＶＡ２１の観測された細胞変性効果（図２）によって、また、ＭＴＴアッセイを介して確認されるようなＭＭ細胞に対するＣＶＡ２１の著しい成長阻害／細胞毒性（図３）によって裏付けられる。
【０１４５】
本明細書中に報告されるデータはまた、ＣＶＡ１３、ＣＶＡ１５およびＣＶＡ１８によって例示される他のピコルナウイルスが、ＭＭ細胞に対する強力な腫瘍退縮性薬剤であることを明らかにする（図１２）。
【０１４６】
この効果は、ＭＭ細胞よりも見かけ上大きな用量依存性を伴うが、ＣＶＡ１３、ＣＶＡ１５、ＣＶＡ１８およびＣＶＡ２１に対する単球性白血病細胞株Ｕ９３７の応答性によって本明細書中に明らかにされるようにＭＭ細胞に限定されない（図１２Ｂ）。
【０１４７】
フローサイトメトリーを使用して、多発性骨髄腫細胞株のＵ２６６、ＲＰＭＩ−８２２６およびＮＣＩ−Ｈ９２９が高レベルのＣＶＡ２１ウイルス進入受容体のＩＣＡＭ−１およびＤＡＦ（これら２つの分子はＣＶＡ２１による腫瘍退縮の選択性および効力の決定因子である）を発現していることが確認された（図１）。
【０１４８】
さらなる血液ガンから確立された細胞株におけるＩＣＡＭ−１およびＤＡＦの発現もまた本明細書中で明らかにされた。このことから、ピコルナウイルスによる血液ガンの治療の幅広い潜在的可能性が強調される。図１１に示されるように、Ｂ細胞リンパ腫細胞株ＳＣＯＴＴおよびＢ前リンパ球性白血病細胞株ＪＶＭ１３ではともに、ＩＣＡＭ−１およびＤＡＦの両方の発現が明らかにされた。単球性白血病細胞株Ｕ９３７でもまた、より低い程度ではあったが、上昇したレベルのＩＣＡＭ−１およびＤＡＦが明らかにされた。ＣＶＡ２１に対する急性前骨髄球性白血病（ＡＰＭＬ）細胞株ＨＬ−６０の検出可能な感受性が見かけ上ないことと一致して、ＨＬ−６０細胞の大部分がＩＣＡＭ−１について陰性に染色された。
【０１４９】
Ｂ細胞リンパ腫細胞株ＳＣＯＴＴおよびＢ前リンパ球性白血病細胞株ＪＶＭ１３は、本明細書中で使用された条件のもとでは非常にゆっくり成長していた。結果として、様々な他の血液ガン細胞株について明らかにされたような、ＣＶＡによるこれらの細胞株のいずれかの腫瘍退縮感染の効力を直接に明らかにすることが不可能であった。しかしながら、これらの細胞株のそれぞれでのＩＣＡＭ−１およびＤＡＦの明らかにされた発現を考慮して、本出願人は、Ｂ細胞リンパ腫およびＢ前リンパ球性白血病のそれぞれが本発明の方法に対して感受性であると考えられている。
【０１５０】
ＭＭ細胞による高レベルのＩＣＡＭ−１発現が文献には広く報告されており、これにより、ＭＭに対する潜在的な治療としての抗ＩＣＡＭ−１ｍＡｂ治療についていくつかの提案がなされている（ｖａｎ  ｄｅ  Ｓｔｏｌｐｅ  Ａ、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓａａｇ  ＰＴ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９６、７４：１３〜３３；Ｈｕａｎｇ  ＹＷ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９９５、５５：６１０〜６１６）。ＭＭ細胞におけるこの高レベルのＩＣＡＭ−１発現に対する理由は、ＭＭ細胞における転写因子ＮＦ−κＢの構成的な活性化によって説明することができる（Ｈｉｄｅｓｈｉｍａ  Ｔ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００２、２７７：１６６３９〜１６６４７）。
【０１５１】
ＮＦ−κＢは、ＭＭの病理発生および薬物抵抗性に関連づけられる細胞生存因子であり、ＭＭ細胞における接着分子発現の重要な調節因子である（Ｃｈａｕｈａｎ  Ｄ他、Ｂｌｏｏｄ、１９９６、８７：１１０４〜１１１２）。ＩＣＡＭ−１遺伝子の５’プロモーター領域は数個のκＢエンハンサーエレメントを含有しており、ＩＣＡＭ−１発現の調節における最も重要な転写調節エレメントの１つである。ＭＭ細胞におけるＮＦ−κＢの活性化、および、接着分子（例えば、ＩＣＡＭ−１など）の生じるアップレギュレーションが、骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）に対するＭＭ細胞の結合を増大させることが示されている（Ｈｉｄｅｓｈｉｍａ  Ｔ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００１、２０：４５１９〜４５２７）。ＢＭＳＣに対するＭＭ細胞の接着は、ＢＭＳＣによるＩＬ−６（インターロイキン−６）（これはＭＭにおける増殖因子かつ抗アポトーシス因子である）の転写のＮＦ−κＢ依存的なアップレギュレーションを誘導することもまた確認されている（Ｃｈａｕｈａｎ  Ｄ他、Ｂｌｏｏｄ、１９９７、８９：２２７〜２３４）。
【０１５２】
ＭＴＴ／成長阻害アッセイでは、最大レベルの細胞毒性／成長阻害が２０ＴＣＩＤ５０／細胞の最初のＣＶＡ２１投入用量で観測されたことが明らかにされた（図３）。本発明者らの結果は、ＣＶＡ２１が、調べられた３つすべての多発性骨髄腫細胞株に対する強力な細胞毒性作用および細胞破壊作用を有し、一方、正常なヒト末梢血単核細胞に対しては低下した細胞毒性を有することを明らかにしており（図３）、このことから、ＣＶＡ２１感染後に観測される細胞変性効果が確認される（図２）。
【０１５３】
好ましい腫瘍退縮性ウイルスの１つの理想的な属性は、局所的部位または遠方の部位における周囲の未感染の腫瘍細胞に伝播して、さらなる腫瘍退縮を引き起こすことができる子孫ウイルスを産生するその能力である。結果は、ＣＶＡ２１が多発性骨髄腫細胞株のそれぞれにおいて効率的に複製することができたことを示しており、このことは、複製能を有する腫瘍退縮性薬剤としてのその使用を裏付けている。種々の骨髄腫細胞株におけるＣＶＡ２１の複製は、同じ条件のもとでのＣＶＡ２１感染の正常なＰＢＭＣにおける増殖性ウイルスの産生を全く伴うことなく、１００倍〜１０００倍の最初の投入用量の増幅をもたらした（図４）。
【０１５４】
好ましい腫瘍退縮性ウイルスの別の重要な属性は、最適なレベルの複製効率である。１段階ウイルス成長曲線分析から、ＣＶＡ２１がＭＭ細胞内で効率的かつ迅速に複製し、感染後の８時間〜１２時間でウイルス産生のピークレベルに達している（図５）。この比較的迅速な複製サイクルにより、伝播し、かつ、ＭＭ疾患の進行を抑える子孫ウイルスの能力を促進させることができる。ＭＭ細胞の成長を阻害するためのＣＶＡ２１の複製能および細胞毒性は、ＭＭのＣＶＡ２１ウイルス療法（例えば、ＭＭのインビボでの治療、および、ＭＭ細胞の生体外での選択的除去など）を支援するためのさらなる証拠である。
【０１５５】
本明細書中に報告される結果は、子孫ウイルスの産生は、局所的部位または遠方の部位における周囲の未感染の腫瘍細胞に伝播して、さらなる腫瘍退縮を引き起こすことを可能にするために好ましい一方で、ピコルナウイルスによる腫瘍退縮性感染を介した血液ガン細胞の死には要求されないことを明らかにしている。単球性白血病細胞株Ｕ９３７は、ＣＶＡに対して許容性であること（図１２）が本明細書中において明らかにされたが、それにもかかわらず、ＣＶＡ２１の成長を支援する観測可能な能力は明らかにされなかった（図１３）。そのようなガンの治療では、ピコルナウイルスの多数回の投与からの利益を特に受けることができる。
【０１５６】
ＣＶＡ２１がＭＭ細胞の死を引き起こす正確な機構は今後、明らかにされなければならない。だが、そのプロセスは、種々の臨床サンプルおよびＭＭ細胞株に存在する細胞の形質転換事象および遺伝的変異に非常に依存していると考えられる。ＣＶＡ２１ならびに他のピコルナウイルスは、宿主細胞のタンパク質合成の遮断、細胞の糖タンパク質の輸送阻害、アポトーシスの誘導、および、転写因子のタンパク質分解的消化の組合せによって細胞死を媒介すると考えられる（Ｒｕｅｃｋｅｒｔ  ＲＲ、ピコルナウイルス科：ウイルスおよびその複製、Ｆｉｅｌｄｓ  ＢＮ、Ｋｎｉｐｅ  ＤＭ、Ｈｏｗｌｅｙ  ＰＭ編、Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第１巻、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ；１９９６：６０９〜６４５）。ＣＶＡ２１感染のＲＰＭＩ−８２２６細胞およびＮＣＩ−Ｈ９２９細胞に対して行われたＤＮＡ断片化アッセイによれば、ＣＶＡ２１は、Ｕ２６６細胞においてではなく、これら２つの細胞株においてアポトーシスを誘導することができる（図６）。Ｕ２６６細胞は細胞の生存および成長についてオートクリンまたはパラクリンによるＩＬ−６刺激に依存している。転写のシグナル伝達物質および活性化因子（ＳＴＡＴ）−３のようなサイトカイン媒介転写因子の活性化に連結して、ＩＬ−６のシグナル伝達経路は、ＣＶＡ２１感染後、Ｕ２６６細胞の抗アポトーシス応答に対する何らかの影響を有し得る。
【０１５７】
最近の研究（Ｂｈａｒｔｉ  ＡＣ他、Ｂｌｏｏｄ、２００４、１０３：３１７５〜３１８４）では、Ｕ２６６細胞が、構成的に活性化されたＳＴＡＴ３を細胞の核において示し、一方で、ＲＰＭＩ−８２２６細胞は、構成的に活性化されたＳＴＡＴ３について陰性であったことが確認された。しかしながら、ＮＦ−κＢの化学的阻害剤は、ＳＴＡＴ３の活性化にもかかわらず、Ｕ２６６細胞株およびＲＰＭＩ−８２２６細胞株の両方のアポトーシスを誘導することが示されており、このことは、ＳＴＡＴ３が、化学的なＮＦ−κＢ阻害剤によって誘発されるアポトーシスにおいて役割を果たしていないようであることを示唆している。しかしながら、本発明者らの結果は、ＳＴＡＴ３のシグナル伝達経路の活性化がＣＶＡ２１感染の骨髄腫細胞の腫瘍退縮における抗アポトーシス的役割を実際に果たし得ることを示している。
【０１５８】
ＮＦ−κＢファミリーの転写因子の役割は実際には複雑であり、ＮＦ−κＢが前アポトーシスおよび抗アポトーシスの両方のシグナル伝達において役割を果たし得ることを示唆する証拠が存在する。ＭＭの治療のための新規な薬剤、例えば、サリドマイド（Ｋｅｉｆｅｒ  ＪＡ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００１、２７６：２２３８２〜２２３８７）、プロテアソーム阻害剤ＰＳ−３４１（Ｈｉｄｅｓｈｉｍａ  Ｔ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００１、６１：３０７１〜３０７６）および三酸化ヒ素Ａｓ２Ｏ３（Ｋａｐａｈｉ  Ｐ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２０００、２７５：３６０６２〜３６０６６）などは、前臨床試験および初期臨床試験においてＮＦ−κＢの活性化を阻害し、かつ、ＭＭの従来の薬物抵抗性を克服することを助けることが示されている。
【０１５９】
本研究において臨床サンプルから集められたデータは、ＣＶＡ２１および他のピコルナウイルスの観測された腫瘍退縮能力が多発性骨髄腫細胞株に限定されるのではなく、他の血液ガン細胞株および生体外感染の原発性腫瘍サンプルにおいてもまた効果的であることを示唆する。臨床サンプルは、著しいレベルのＣＤ１３８プラスマ細胞が骨髄に存在し、そのすべてが、フローサイトメトリーによって調べられたとき、ＩＣＡＭ−１を発現していた（図８Ａ）。増大する用量のＣＶＡ２１を感染させたとき、実質的な成長停止および腫瘍細胞の除去がすべての臨床サンプルにおいて観測され、１つのサンプル（＃００８）では最大で９８％の阻害であった。正常な細胞および悪性細胞に対するＣＶＡ２１の影響をより詳しく調べるために、細胞を、フローサイトメトリーを使用する分析の前に抗ＣＤ１３８およびＰＩにより染色した。ＣＶＡ２１は、１７個の測定可能な臨床サンプルのうちの１４個で、悪性細胞の割合を、８０％を超えて効果的に減少させた（図１０Ｅ）。さらなる臨床サンプル（合計で１９個まで）の分析では、これらの観察結果の一般性が確認された（図１０）。ウイルス投入量の増大およびＣＶＡ２１感染の延長はガン細胞除去レベルを増大させることができる。本研究で使用された臨床サンプルにより、ＣＶＡ２１によるＭＭ細胞の有益な除去が確認される。
【０１６０】
前駆体幹細胞の永続的な生存性とともに、患者サンプルからの骨髄腫腫瘍細胞の実質的な除去は、ＣＶＡ２１が、正常な前駆体細胞に対する比較的最小限の影響を伴って骨髄腫細胞を特異的に殺すことができることを明瞭に明らかにしている。加えて、ＣＶＡ２１治療は、以前には治療されなかった化学療法耐性の腫瘍細胞および激しく前処理された化学療法耐性の腫瘍細胞の両方に対して効果的であった。このことは、ＣＶＡ２１はＭＭのための有用な治療選択肢であり得ることを示している。ＭＭに対する無症候性前駆体、ＭＧＵＳと診断された患者から前ガン性プラスマ細胞を除去することにおけるＣＶＡ２１の有効性もまた著しかった。そのような患者の３０％までがＭＭを発症するように移行し、しかしながら、個体の予後を予測することは現時点では不可能であり、従って、この良性の悪液質は一般には治療されないままである。この患者コホートにおける予防法としてのＣＶＡ２１の潜在的使用では、ＭＭに対する予防的治療としてのウイルス療法のための新規な役割が示唆される。
【０１６１】
ＣＶＡ２１はまた、悪性細胞に対する直接的な細胞毒性作用とは別に、ＭＭの治療において他の役割を有し得る。ほとんどのＭＭ細胞は最初、既存の薬物治療に対して感受性であるが、薬物抵抗性がほとんどの場合においてＭＭの共通する特徴である。ビンクリスチンおよびドキソルビシンなどの薬剤との組合せでの化学感作剤としてのＣＶＡ２１の使用は、いずれかの薬剤を単独で使用するよりも改善された結果をもたらす場合があり、ＭＭ治療法としてＣＶＡ２１を研究するためのさらなる理由である。
【０１６２】
現在、多発性骨髄腫のための治療手段は限られており、新しい治療が求められている。多発性骨髄腫患者の免疫低下状態はこの悪性腫瘍の患者のウイルス療法についての真の懸念を提起する一方で、ＣＶＡ２１ウイルス療法が、抗ウイルス免疫性がないことによる最も成功した結果を有するのはこのような患者においてであり得る。加えて、ＭＭは、ゆっくり増殖する悪性プラスマ細胞の蓄積によって特徴づけられる疾患であり、従って、腫瘍負荷をＣＶＡ２１腫瘍退縮によって効果的に抑制するための理想的な機会を提供する。子孫ウイルスの伝播が十分でないならば、迅速に成長する腫瘍はウイルスによる腫瘍退縮を逃れることがあるので、ウイルス療法は、ゆっくり成長する悪性腫瘍において最も効率的であることが予測されている。
【０１６３】
ＣＶＡ２１が患者において有害な結果を有するならば、ＣＶＡ２１の感染を抗ウイルス化合物（例えば、プレコナリル（Ｒｏｇｅｒｓ  ＪＭ他、Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ、１９９９、４５８：６９〜７６）など）または免疫血清グロブリン（Ｒｏｔｂａｒｔ  ＨＡ他、Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  Ｊ、１９９９、１８：６３２〜６３３）によって抑えることができる。別の代替法では、ＭＭ細胞および他の血液腫瘍細胞を生体外で除去するためのＣＶＡ２１の使用が挙げられる。近年、自家幹細胞移植のための新規な除去法としての腫瘍退縮性レオウイルスの使用が様々な血液悪性腫瘍について評価されたが、しかしながら、アフェレーシス生成物の混合物からの濃縮された生体外多発性骨髄腫細胞の除去処理は不完全であった（Ｔｈｉｒｕｋｋｕｍａｒａｎ  ＣＭ他、Ｂｌｏｏｄ、２００３、１０２：３７７〜３８７）。ＣＶＡ２１は、多発性骨髄腫細胞に対する選択的な細胞毒性を有する特異な腫瘍退縮性ウイルスであり、生体外除去薬剤としての強化された潜在的可能性もまた有し得る。
【０１６４】
要約
本発明者らのデータは、インビボでのＭＭ細胞および血液ガン細胞の直接的な腫瘍退縮における潜在的な適用、そして、末梢幹細胞の自家移植片の生体外での除去処理における潜在的な適用とともに、ＣＶＡ２１および他のピコルナウイルス（例えば、ＣＶＡ１３、ＣＶＡ１５およびＣＶＡ１８など）がインビトロでの多発性骨髄腫細胞株および他の血液ガン細胞株に対する効果的な腫瘍退縮性薬剤であることを明らかにしている。
【０１６５】
本発明は、上記のような様式で詳細に記載されているが、形式または細部における様々な省略、置き換えおよび／または変化を含めて、数多くの変形および／または改変が、広範囲に記載されるような本発明の精神または範囲から逸脱することなく特定の実施形態において示されるように本発明に対してなされ得ることが当業者によって理解される。従って、これらの実施形態は、すべての点で、限定としてではなく、例示であるとして見なされなければならない。
【０１６６】
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【図面の簡単な説明】
【０１６７】
【図１】多発性骨髄腫細胞株に対するＩＣＡＭ−１およびＤＡＦのフローサイトメトリー分析を示す。
【図２】多発性骨髄腫細胞株に対するＣＶＡ２１の細胞変性効果を示す。
【図３】ＭＭＴアッセイを使用するＭＭ細胞株および正常なＰＢＭＣに対するＣＶＡ２１の腫瘍退縮作用を示す。
【図４】多発性骨髄腫細胞株感染後のＣＶＡ２１収量を示す。
【図５】多発性骨髄腫細胞におけるＣＶＡ２１のウイルス成長曲線を示す。
【図６】ＣＶＡ２１を感染させたＲＰＭＩ−８２２６細胞、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞およびＵ２６６細胞におけるＤＮＡ断片化の分析を示す。
【図７】ＰＢＭＣとの混合物からの多発性骨髄腫細胞の生体外除去を示す。
【図８Ａ】多発性骨髄腫の臨床サンプルにおけるＩＣＡＭ−１発現の分析を示す。
【図８Ｂ】多発性骨髄腫の臨床サンプルにおけるＣＶＡ２１の成長阻害を示す。
【図９Ａ】多発性骨髄腫プラスマ細胞を骨髄臨床サンプルから除去するＣＶＡ２１の能力を示す。
【図９Ｂ−Ｃ】多発性骨髄腫プラスマ細胞を骨髄臨床サンプルから除去するＣＶＡ２１の能力を示す。
【図１０Ａ−Ｂ（ｉ）】ＣＶＡ２１はプラスマ細胞をＭＭおよびＭＧＵＳのＢＭから選択的に除去することを示す。
【図１０Ｂ（ｉｉ）】ＣＶＡ２１はプラスマ細胞をＭＭおよびＭＧＵＳのＢＭから選択的に除去することを示す。
【図１０Ｃ−Ｄ】ＣＶＡ２１はプラスマ細胞をＭＭおよびＭＧＵＳのＢＭから選択的に除去することを示す。
【図１０Ｅ】ＣＶＡ２１はプラスマ細胞をＭＭおよびＭＧＵＳのＢＭから選択的に除去することを示す。
【図１１Ａ】Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ前リンパ球性白血病、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＭＬ）、単球性白血病および多発性骨髄腫の細胞株に対するＩＣＡＭ−１およびＤＡＦのフローサイトメトリー分析を示す。
【図１１Ｂ】Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ前リンパ球性白血病、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＭＬ）、単球性白血病および多発性骨髄腫の細胞株に対するＩＣＡＭ−１およびＤＡＦのフローサイトメトリー分析を示す。
【図１２Ａ−Ｂ】ＭＭＴアッセイを使用した、選択された血液ガン細胞株に対するＣＶＡ２１、ＣＶＡ１８、ＣＶＡ１５およびＣＶＡ１３の腫瘍退縮作用を示すグラフである。
【図１２Ｃ】ＭＭＴアッセイを使用した、選択された血液ガン細胞株に対するＣＶＡ２１、ＣＶＡ１８、ＣＶＡ１５およびＣＶＡ１３の腫瘍退縮作用を示すグラフである。
【図１３】選択された血液ガン細胞株の感染後におけるＣＶＡ２１収量を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ−Ｃ】
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【図１０Ａ−Ｂ（ｉ）】
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【図１０Ｂ（ｉｉ）】
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【図１０Ｃ−Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ−Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年7月4日(2006.7.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における血液ガンを治療および／または予防するための方法であって、治療効果的な量のピコルナウイルスまたはその改変形態を、ガンの少なくとも一部の細胞がウイルスによる腫瘍退縮を受けるように投与することを含む、方法。
【請求項２】
ピコルナウイルスは、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ポリオウイルス、未分類のエンテロウイルスを含むエンテロウイルス、ライノウイルス、パラエコーウイルス、ヘパトウイルスおよびカルジオウイルスの原型株および臨床単離株からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ピコルナウイルスは、ＣＶＡ１３、ＣＶＡ１５、ＣＶＡ１８、ＣＶＡ２０、ＣＶＡ２１、その改変形態およびその組合せからなる群から選択されるコクサッキーＡ群ウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ピコルナウイルスは、静脈内投与、腫瘍内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、自家幹細胞移植に先立つ自家移植片内の悪性細胞の生体外除去、または移植に先立つ自家移植片内の悪性細胞の生体外除去によって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
自家移植片は造血系幹細胞を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ウイルス用量の範囲は、約０．０１感染性ウイルスユニット／細胞〜約１０００感染性ウイルスユニット／細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ウイルスは、効果的な量の化学療法剤との組合せで対象に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ウイルスは、効果的な量のプロバイオティクス剤との組合せで対象に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
血液ガンは、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ前リンパ球性白血病および単球性白血病からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
血液ガンの細胞は、ウイルス−細胞進入受容体分子の細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）および／または崩壊促進因子（ＤＡＦ）を過剰発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
血液ガンの細胞はＮＦ−κＢを構成的に発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
対象における多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ前リンパ球性白血病および単球性白血病からなる群から選択される血液ガンを、治療および／または予防するための方法であって、ＣＶＡ１３、ＣＶＡ１５、ＣＶＡ１８およびＣＶＡ２１またはその組合せからなる群から選択されるピコルナウイルスの治療効果的な量を、ガンの少なくとも一部の細胞がウイルスによる腫瘍退縮を受けるように投与することを含む、方法。
【請求項１３】
対象における血液ガンを治療および／または予防するための方法であって、ピコルナウイルスまたはその改変形態に由来する核酸分子の治療効果的な量を、ガンの少なくとも一部の細胞がウイルスによって殺されるように投与することを含む、方法。
【請求項１４】
ピコルナウイルスは、ＣＶＡ１３、ＣＶＡ１５、ＣＶＡ１８、ＣＶＡ２０、ＣＶＡ２１からなる群から選択されるコクサッキーＡ群ウイルスである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
対象はヒトである、請求項１または１３に記載の方法。
【請求項１６】
対象における血液ガンを治療および／または予防することにおいて使用される場合の医薬組成物であって、血液ガンに溶解感染することができるピコルナウイルスまたはその改変形態の効果的な量を、医薬的に許容され得る賦形剤、希釈剤またはキャリアと一緒に含む、医薬組成物。
【請求項１７】
対象における血液ガンを治療および／または予防することにおいて使用される場合の医薬組成物であって、血液ガンに溶解感染することができるピコルナウイルスまたはその改変形態に由来する核酸分子の効果的な量を、医薬的に許容され得る賦形剤、希釈剤またはキャリアと一緒に含む、医薬組成物。
【請求項１８】
対象における血液ガンを治療および／または予防するための医薬品の製造における、血液ガンに溶解感染することができるピコルナウイルスまたはその改変形態の使用。
【請求項１９】
ピコルナウイルスは、ＣＶＡ１３、ＣＶＡ１５、ＣＶＡ１８、ＣＶＡ２０、ＣＶＡ２１からなる群から選択されるコクサッキーＡ群ウイルスである、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
血液ガンは、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ前リンパ球性白血病および単球性白血病からなる群から選択される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２１】
対象における血液ガンを治療および／または予防するための医薬品の製造における、血液ガンに溶解感染することができるピコルナウイルスまたはその改変形態に由来する核酸分子の使用。
【請求項２２】
血液腫瘍細胞または血液ガン細胞に対する対象における免疫応答を誘導するための方法であって、対象の前記細胞に、治療効果的な量のピコルナウイルスまたはその改変形態を、ガンの少なくとも一部の細胞がウイルスによる腫瘍退縮を受けるように感染させることを含む、方法。
【国際調査報告】
2008510685.tif 000025
2008510685.tif 000026