(57)【要約】本明細書中に提供されているのは、分泌型リソソーム酵素がないことまたは欠陥のある分泌型リソソーム酵素により特徴付けられる、リソソーム蓄積障害の処置のための方法である。そのようなリソソーム蓄積障害としては、神経セロイドリポフスチノーシスが挙げられるが、これらに限定されない。上記の開示された方法は、上記リソソーム蓄積障害を罹っている患者のＣＮＳへのヒト多能性神経幹細胞の移植に関する。また、本明細書中に提供されているのは、神経セロイドリポフスチノーシスに苦しんでいる患者またはその発症の危険に瀕している患者における神経変性を逆転させる方法またはその進行を遅らせる方法である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類動物におけるリソソーム蓄積障害を処置するための薬剤の製造における、有効量の多能性自己再生中枢神経系幹細胞集団の使用。
【請求項２】
請求項１に記載の使用であって、ここで、前記リソソーム蓄積障害は、分泌型リソソーム酵素がないことまたは欠陥のある分泌型リソソーム酵素により特徴付けられる、使用。
【請求項３】
請求項１に記載の使用であって、ここで、前記リソソーム蓄積障害は、分泌型リソソーム酵素をコードする遺伝子における変異により特徴付けられる、使用。
【請求項４】
請求項３に記載の使用であって、ここで、前記変異は、パルミトイルプロテインチオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）遺伝子におけるものである、使用。
【請求項５】
請求項３に記載の使用であって、ここで、前記変異は、トリペプチジルペプチダーゼＩ（ＴＰＰ−Ｉ）遺伝子におけるものである、使用。
【請求項６】
請求項１に記載の使用であって、ここで、前記多能性自己再生中枢神経系神経幹細胞集団は、ヒトから得られる、使用。
【請求項７】
請求項１に記載の使用であって、ここで、前記多能性ＣＮＳ神経幹細胞集団の細胞は、懸濁培養で増殖されている、使用。
【請求項８】
請求項１に記載の使用であって、ここで、前記多能性ＣＮＳ神経幹細胞集団の細胞は、付着培養で増殖されている、使用。
【請求項９】
請求項６に記載の使用であって、ここで、前記リソソーム蓄積障害は、神経セロイドリポフスチノーシスである、使用。
【請求項１０】
請求項９に記載の使用であって、ここで、前記神経セロイドリポフスチノーシスは、乳児型ＮＣＬおよび後期乳児型ＮＣＬからなる群から選択される、使用。
【請求項１１】
請求項１に記載の使用であって、ここで、前記薬剤は、哺乳類動物のＣＮＳへの移植に適切である、使用。
【請求項１２】
請求項１１に記載の使用であって、ここで、前記哺乳類動物は、ヒトである、使用。
【請求項１３】
請求項１２に記載の使用であって、ここで、前記薬剤は、海馬への移植に適切である、使用。
【請求項１４】
請求項１２に記載の使用であって、ここで、前記薬剤は、皮質への移植に適切である、使用。
【請求項１５】
請求項１１に記載の使用であって、ここで、前記薬剤は、皮質下注入または脳室内注入による移植に適切である、使用。
【請求項１６】
請求項１１に記載の使用であって、ここで、前記有効量は、３×１０６と１×１０１０との間の個数の細胞を含む、使用。
【請求項１７】
請求項１１に記載の使用であって、ここで、前記有効量は、１×１０８と５×１０９との間の個数の細胞を含む、使用。
【請求項１８】
請求項１１に記載の使用であって、ここで、前記薬剤は、前記哺乳類動物に１回用量で投与される、使用。
【請求項１９】
請求項１１に記載の使用であって、ここで、前記薬剤は、前記哺乳類動物に複数回用量で投与される、使用。
【請求項２０】
請求項１に記載の使用であって、ここで、前記有効量の多能性ＣＮＳ神経幹細胞集団は、前記哺乳類動物の神経組織から得られる、使用。
【請求項２１】
請求項１に記載の使用であって、ここで、前記有効量の多能性ＣＮＳ神経幹細胞集団は、新生児、若年または成体の哺乳類動物の神経組織に由来する、使用。
【請求項２２】
神経セロイドリポフスチノーシスに苦しんでいる患者またはその発症の危険に瀕している患者における神経変性を逆転させるかまたは遅らせるための薬剤の製造における、有効量の多能性自己再生ＣＮＳ神経幹細胞集団の使用であって、ここで、該薬剤は、該患者の海馬、皮質、または両者への移植に適切である、使用。
【請求項２３】
請求項２２に記載の使用であって、ここで、前記有効量は、３×１０６と１×１０１０との間の個数の細胞を含む、使用。
【請求項２４】
請求項２２に記載の使用であって、ここで、前記有効量は、１×１０８と５×１０９との間の個数の細胞を含む、使用。
【請求項２５】
請求項２２に記載の使用であって、ここで、前記神経セロイドリポフスチノーシスは、乳児型ＮＣＬおよび後期乳児型ＮＣＬからなる群から選択される、使用。
【請求項２６】
請求項２２に記載の使用であって、ここで、前記移植は、皮質下注入または脳室内注入により生じる、使用。
【請求項２７】
請求項２２に記載の使用であって、ここで、前記薬剤は、前記患者に１回用量で移植される、使用。
【請求項２８】
請求項２２に記載の使用であって、ここで、前記薬剤は、前記患者に複数回用量で移植される、使用。
【請求項２９】
請求項２２に記載の使用であって、ここで、前記有効量の多能性ＣＮＳ神経幹細胞集団は、前記哺乳類動物の神経組織から得られる、使用。
【請求項３０】
請求項２２に記載の使用であって、ここで、前記有効量の多能性ＣＮＳ神経幹細胞集団は、新生児、若年または成体の哺乳類動物の神経組織に由来する、使用。
【請求項３１】
リソソーム蓄積障害を処置するための薬学的組成物であって、該組成物は、３×１０６と１×１０１０との間の個数の細胞を含む、組成物。
【請求項３２】
リソソーム蓄積障害を処置するための薬学的組成物であって、該組成物は、１×１０８と５×１０９との間の個数の細胞を含む、組成物。
【請求項３３】
一つ以上の容器内に、請求項３１に記載の薬学的組成物を含む、キット。
【請求項３４】
一つ以上の容器内に、請求項３２に記載の薬学的組成物を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、リソソーム蓄積障害の処置のための多能性神経幹細胞の神経移植のための方法に関する。上記リソソーム蓄積障害では、分泌型リソソーム酵素は、欠陥があるか、または存在しない。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
リソソーム蓄積障害（「ＬＳＤ」）は、リソソーム酵素をコードする遺伝子における遺伝性の変異の結果である。欠陥のある酵素または酵素がないことの結果は、リソソームにおける分解されていない（ｕｎｄｅｒｇｒａｄｅｄ）代謝基質の蓄積である。この代謝基礎質の蓄積は、最終的に、細胞変性をもたらす（非特許文献１を参照のこと）。
【非特許文献１】Ｆｕｔｅｒｍａｎ  ａｎｄ  ｖａｎ  Ｍｅｅｒ著、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２００４年、５、ｐ．５５４−６５
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
本明細書中に提供されているのは、有効量の多能性自己再生中枢神経系神経幹細胞集団を上記哺乳類動物に投与することにより、哺乳類動物における（例えば、ヒトにおける）リソソーム蓄積障害を処置する方法である。当業者は、本発明が、哺乳類動物における（例えば、ヒトにおける）リソソーム蓄積障害の処置のための薬剤の製造における、有効量の多能性自己再生中枢神経系神経幹細胞集団の使用も含むことを認識している。
【０００４】
具体的には、上記リソソーム蓄積障害は、分泌型リソソーム酵素がないことまたは欠陥のある分泌型リソソーム酵素により特徴付けられる疾患または障害であり得る。さらに、上記リソソーム蓄積障害は、また、分泌型リソソーム酵素をコードする遺伝子における変異により特徴付けられ得る。例えば、上記変異は、パルミトイルプロテインチオエステラーゼ１（ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｉｏｅｓｔｅｒａｓｅ  1）（ＰＰＴ１）遺伝子またはトリペプチジルペプチダーゼＩ（ｔｒｉｐｅｔｉｄｙｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｉ）（ＴＰＰ−Ｉ）遺伝子のいずれかにおけるものであり得る。
【０００５】
好ましくは、上記多能性自己再生中枢神経系神経幹細胞集団は、ヒトから得られる（例えば、ＨｕＣＮＳ−ＳＣ）。上記多能性ＣＮＳ神経幹細胞集団の細胞は、上記哺乳類動物への投与前または上記薬剤の製造前に、懸濁培養または付着培養で増殖され得る。
【０００６】
例えば、本発明の方法および／または使用に従って処置されるリソソーム蓄積障害は、神経セロイドリポフスチノーシスであり得る。例示的な神経セロイドリポフスチノーシスとしては、乳児型ＮＣＬおよび後期乳児型ＮＣＬが挙げられるが、これらに限定されない。しかしながら、当業者は、他のリソソーム蓄積障害も、有効量の多能性自己再生ＣＮＳ幹細胞集団を用いて処置され得ることを認識している。
【０００７】
さらに、本発明の方法に従って、リソソーム蓄積障害の処置のための有効量の多能性自己再生ＣＮＳ神経幹細胞集団および／または薬剤は、上記哺乳類動物のＣＮＳに移植される（または、そうでなければ、投与、注入および／または挿入される）。いくつかの好ましい実施形態では、上記哺乳類動物は、ヒトである。例えば、上記細胞（または上記薬剤）は、その海馬に移植され得る。あるいは（またはさらに）、上記細胞（または上記薬剤）は、その皮質に移植され得る。当業者は、哺乳類動物におけるリソソーム蓄積障害の処置のための多能性自己再生ＣＮＳ神経幹細胞集団および／または薬剤が、上記哺乳類動物のＣＮＳ内の任意の他の適切な場所に移植され得ることを認識している。所定のリソソーム蓄積障害の処置にふさわしい、適切なＣＮＳ移植領域の決定は、当該分野の慣用技術のレベルの範囲内である。
【０００８】
当業者に公知の、任意の適切な移植方法または投与方法は、本発明の方法に従って、リソソーム蓄積障害の処置のための、有効量の多能性自己再生中枢神経系（ＣＮＳ）神経幹細胞集団および／または薬剤を、上記哺乳類動物に投与するために用いられ得る。非制限的な例として、移植は、皮質下注入により、脳室内注入により、または、当業者に公知の任意の神経移植プロトコールにより達成され得る（例えば、本明細書中に参考として援用されている、米国特許第６，４９７，８７２号を参照のこと）。
【０００９】
本明細書中に記載されている方法に従って、約３×１０６〜約１×１０１０の間（例えば、約５×１０８〜約２×１０９の間、または、約１×１０８と約５×１０９との間）の範囲の個数の細胞が、上記哺乳類動物に投与され得る。例えば、一実施形態では、５×１０８個の細胞という低用量は、上記哺乳類動物に、移植またはインプラントまたは注入または投与され得る。別の実施形態では、１×１０９個の細胞という高用量が、上記哺乳類動物に、移植またはインプラントまたは注入または投与され得る。当業者は、上記リソソーム蓄積障害を処置するために用いられる、有効量の多能性ＣＮＳ神経幹細胞集団が、１回用量または複数回用量のいずれかで投与され得ることを認識している。
【００１０】
同様に、哺乳類動物におけるリソソーム蓄積障害を処置するための薬剤は、約３×１０６〜約１×１０１０の間（例えば、約５×１０８〜約２×１０９の間、または、約１×１０８〜約５×１０９の間）の範囲の個数の細胞を含み得る。例えば、一実施形態では、上記薬剤は、５×１０８個の細胞という低用量を含み得る。別の実施形態では、上記薬剤は、１×１０９個の細胞という高用量を含み得る。当業者は、リソソーム蓄積障害の処置のための薬剤が、１回用量または複数回用量のいずれかで投与され得ることを認識している。
【００１１】
さらに、本発明の様々な実施形態では、有効量の上記多能性ＣＮＳ神経幹細胞集団は、上記哺乳類動物自身の神経組織から得られる。さらに、本発明の他の実施形態では、上記多能性ＣＮＳ神経幹細胞集団は、乳児、若年または成体の哺乳類の神経組織に由来し得る。
【００１２】
一つの特定実施形態では、本発明は、また、神経セロイドリポフスチノーシス（例えば、乳児型神経セロイドリポフスチノーシスまたは後期乳児型神経セロイドリポフスチノーシス）の処置の必要を有する被験者に、約５×１０８〜約１×１０９の間の個数という用量の多能性自己再生ＣＮＳ神経幹細胞を投与することによる、その処置方法にも関する。別の特定実施形態では、本発明は、また、被験体における神経セロイドリポフスチノーシス（例えば、乳児型神経セロイドリポフスチノーシスまたは後期乳児型神経セロイドリポフスチノーシス）の処置のための薬剤の製造における、約５×１０８〜約１×１０９の間の個数の多能性自己再生ＣＮＳ神経幹細胞の使用にも関する。
【００１３】
また、本明細書中に提供されているのは、患者の海馬および／または皮質に、有効量の多能性自己再生ＣＮＳ神経幹細胞集団を移植することにより、リソソーム蓄積障害（例えば、神経リポフスチノーシス）に苦しんでいる患者またはその発症の危険に瀕している患者における神経変性を逆転させる方法または遅らせる方法（すなわち、神経保護方法）である。例えば、これらの神経変性を逆転させる方法または遅らせる方法は、乳児型ＮＣＬまたは後期乳児型ＮＣＬに苦しんでいる患者またはその発症の危険に瀕している患者に適用され得る。
【００１４】
約３×１０６〜約１×１０１０の間（例えば、約５×１０８〜約２×１０９の間、または、約１×１０８〜約５×１０９の間）の範囲の個数の細胞は、上記患者に投与され得る。様々な実施形態では、これらの神経保護方法に従って移植される、有効量の多能性自己再生ＣＮＳ神経幹細胞集団は、５×１０８個の細胞（低用量）または１×１０９個の細胞（高用量）である。当業者は、上記有効量の多能性自己再生ＣＮＳ神経幹細胞集団が、１回用量または複数回用量で移植され得ることを認識している。さらに、当業者は、また、上記移植が、皮質下注入または脳室内注入により起こり得ることも認識している。しかしながら、任意の他の適切な、当業者に公知の移植方法もまた、本願の神経保護方法に従って用いられ得る。
【００１５】
いくつかの神経保護方法では、上記多能性ＣＮＳ神経幹細胞集団は、上記哺乳類動物自身の神経組織から得られる。さらに、上記多能性ＣＮＳ神経幹細胞集団はまた、乳児、若年または成体の哺乳類の神経組織にも由来し得る。
【００１６】
当業者は、本発明がまた、リソソーム蓄積障害に苦しんでいる患者またはその発症の危険に瀕している患者における、神経変性を逆転させるかまたは遅らせるための薬剤の製造における、有効量の多能性自己再生ＣＮＳ神経幹細胞集団の使用も含むことを認識している。例えば、上記リソソーム蓄積障害は、神経セロイドリポフスチノーシス（乳児型ＮＣＬまたは後期乳児型ＮＣＬが挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。そのような薬剤は、上記リソソーム蓄積障害に苦しんでいる患者またはその発症の危険に瀕している患者の海馬および／または皮質への投与および／または移植に適切である。
【００１７】
リソソーム蓄積障害に苦しんでいる患者またはその発症の危険に瀕している患者における神経変性を逆転させるかまたは遅らせるための薬剤は、約３×１０６〜約１×１０１０の間（例えば、約５×１０８〜約２×１０９の間、または、約１×１０８〜約５×１０９の間）の範囲の個数の細胞を含み得る。様々な実施形態では、リソソーム蓄積障害に苦しんでいる患者またはその発症の危険に瀕している患者における神経変性を逆転させるかまたは遅らせるための薬剤は、５×１０８個の細胞（低用量）または１×１０９個の細胞（高用量）を含む。当業者は、上記薬剤が、１回用量または複数回用量で上記宿主に投与または移植され得ることを認識している。さらに、当業者はまた、上記薬剤が、皮質下注入または脳室内注入による移植または投与に適切であることも認識している。しかしながら、任意の他の、当業者に公知の適切な移植方法または投与方法も、用いられ得る。
【００１８】
上記薬剤における、有効量の多能性ＣＮＳ神経幹細胞集団は、上記哺乳類動物自身の神経組織から得られてもよいし、新生児、若年または成体の哺乳類の神経組織に由来してもよい。
【００１９】
リソソーム蓄積障害を処置するための薬学的組成物も、提供される。そのような組成物は、約３×１０６と約１×１０１０との間または約１×１０８と約５×１０９との間の個数の細胞、および薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。当業者に公知の任意の薬学的に受容可能なキャリアが、用いられ得る。さらに、本発明は、一つ以上の容器内に、本発明の薬学的組成物を含むキットも提供する。
【００２０】
そうでないと定義されない限り、本明細書中に用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるのと同様または均等な方法および材料が、本発明の実施または試験において用いられ得るが、適切な方法および材料は、以下に記載される。本明細書中に言及される全ての文献、特許出願、特許および他の参考文献は、参考として全体が援用される。矛盾する場合、定義を含む本発明の明細書が、支配する。さらに、上記材料、方法および実施例は、単に説明するためであって、制限することを意図されていない。
【００２１】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
リソソーム蓄積障害は、通常、単一遺伝子性である。しかしながら、ほとんどのＬＳＤについて、多数の変異が、異なる患者についての同一遺伝子において記載されている（Ｆｕｔｅｒｍａｎ  ａｎｄ  ｖａｎ  Ｍｅｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：５５４−６５（２００４）を参照のこと）。多くのＬＳＤの分類は、その欠陥のある酵素またはタンパク質の特徴付けに基づいて行われてもよく、あるいは、蓄積する基質の種類に基づいて行われてもよい。ほとんどのＬＳＤは、乳児型、若年型、および成体型で存在する。最も重篤なＬＳＤは、上記乳児型である。上記乳児型は、急性脳合併症（ａｃｕｔｅ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ）と共に現れる。乳児型のＬＳＤを患っている患者は、典型的に、生涯の初めの年の内に死亡する。成体型では、症状はより遅く進行し、身体障害が主に末梢性症状から生じる。若年型のＬＳＤは、乳児型と成体型との間の状態になる。
【００２３】
ＬＳＤに関連した神経症状は、例えば、発作、認知症および脳幹機能障害を含み得る。末梢性症状は、例えば、脾臓および肝臓の膨大、心臓および腎臓の傷害、異常骨形成、筋萎縮、ならびに眼疾患を含み得る。様々なＬＳＤの要約は、表１に提供される。
【００２４】
【表１】
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（神経セロイドリポフスチノーシス）
上記神経セロイドリポフスチノーシス（ＮＣＬ）は、ニューロンおよび他の細胞における蛍光性セロイドリポフスチン蓄積物質の細胞内蓄積により特徴付けられる、一群の遺伝性神経変性リソソーム蓄積障害である。ＮＣＬは、進行性の認知衰退および運動性衰退、失明、発作ならびに早死により特徴付けられる。これまでのところ、治療処置は、利用可能でない。
【００２５】
上記ＮＣＬ障害は、リソソーム蓄積症として分類される。ＮＣＬ障害の様々な疾患サブタイプへの分類は、伝統的に、発症年齢、臨床的特徴の出現順序ならびに光学顕微鏡下および電子顕微鏡下でのリソソーム物質の形態などの表現型発現に依存している。この分類は、４つのサブタイプを記載する：乳児型神経セロイドリポフスチノーシス（「ＩＮＣＬ」）、後期乳児型神経セロイドリポフスチノーシス（「ＬＩＮＣＬ」）、若年型神経セロイドリポフスチノーシス（「ＪＮＣＬ」）および成体型神経セロイドリポフスチノーシス（「ＡＮＣＬ」）。世界規模で最もよく知られた型のＮＣＬは、ＩＮＣＬおよびＬＩＮＣＬである。上記ＮＣＬ障害群は、共通して、バッテン病と呼ばれている。乳児型神経セロイドリポフスチノーシスおよび後期乳児型セロイドリポフスチノーシスは、バッテン病の最も重篤な形態である。
【００２６】
Ｈａｌｔｉａ−Ｓａｎｔａｖｕｏｒｉ病またはＣＬＮ１としても公知の乳児型ＮＣＬ（ＩＮＣＬ）は、Ｓａｎｔａｖｕｏｒｉおよび共同研究者により１９７３年に初めて記載された（Ｓａｎｔａｖｕｏｒｉら著，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ  １８：２５７−６７（１９７３）を参照のこと）。その最初の症状は、ほぼ１歳のときに、筋肉の緊張低下、運動機能および認知機能の退行、ならびに進行性小脳症として現れる。被刺激性および睡眠障害も、初期に一般的な徴候である。視覚不全は、１２箇月と２２箇月との間の年齢で認められ、すぐに失明に至る。てんかん性発作およびミオクローヌスの痙動は、顕著である。ＩＮＣＬを患っている被験者の状態は迅速に悪化し、３歳までに、全ての認知能力および運動能力が失われる。死亡は、通常、８年と１１年との間の年齢に起こる。世界規模でＩＮＣＬの最も高い発生数は、フィンランドである。
【００２７】
ヤンスキー・ビールショウスキー（Ｊａｎｓｋｙ−Ｂｉｅｌｃｈｏｗｓｋｙ）病またはＣＬＮ２としても公知の、古典的な後期乳児型ＮＣＬ（ＬＩＮＣＬ）は、もともと、ヤンスキーにより１９０８年に、および、ビールショウスキーにより１９１３年に記載された。しかしながら、ヤンスキーおよびビールショウスキーは、この型のＮＣＬと後期発症型とを区別できなかった（Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉら著，Ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｒｏｉｄ  ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｅｓ：Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ｉｎ：Ｂａｔｔｅｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉら編集，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）を参照のこと）。ＬＩＮＣＬでは、上記疾患の発症は、２歳と４歳との間に現れる。ＬＩＮＣＬの最初の徴候は、通常、てんかんである。時々、発語遅延は、てんかんの開始に先行し得る。さらなる症状は、認知症、運動失調およびミオクローヌスの痙動を含む。視覚不全は、通常、５歳または６歳までに、失明に至る。死亡は、通常、６歳と１５歳との間に起こる。ＬＩＮＣＬはフィンランドでは稀であるが、米国およびカナダでは最も一般的なＮＣＬ型の一つである。
【００２８】
いずれかの型のバッテン病であると診断された子供は、発作、ならびに運動能力、視覚および精神的受容力の進行性喪失に苦しみ、最終的に、失明、寝たきりおよびコミュニケーション不能になる。今日、バッテン病は、常に致死的である。
【００２９】
（神経セロイドリポフスチノーシスにおける治療効果）
中枢神経系（「ＣＮＳ」）の発達の間、多能性前駆体細胞（神経幹細胞としても公知）は、増殖し、かつ、一時的に分裂する前駆細胞を生じさせる。この一時的に分裂する前駆細胞は、最終的に、成体脳を構成する細胞型へと分化する。神経幹細胞は、古典的に、自己再生する（すなわち、より多くの幹細胞を形成する）能力、増殖する能力、および複数の異なる表現型の系列（ニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトを含む）に分化する能力を有すると定義される。
【００３０】
神経幹細胞の非幹細胞子孫は、典型的に、「前駆（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）」細胞と呼ばれる。この「前駆」細胞は、一つ以上の系列の範囲内で様々な細胞型を生じる能力を有する。従って、用語「神経前駆細胞」は、神経幹細胞由来の分化されていない細胞を表し、それ自身、幹細胞ではない。ある前駆細胞は、１より多い細胞型に分化する能力を有する子孫を生じ得る。前駆細胞の顕著な特徴は、幹細胞と異なり、上記前駆細胞が、自己維持を表さず、典型的には特定の分化経路に拘束されていると考えられ、そして、適切な条件下で、最終的に、グリアまたはニューロンに分化することである。
【００３１】
用語「前駆体細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）」は、神経幹細胞の子孫を表し、従って、前駆細胞と娘神経幹細胞（ｄａｕｇｈｔｅｒ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）との両者を含む。
【００３２】
神経幹細胞は、マウス、ラット、ブタおよびヒトを含むいくつかの哺乳類種から単離されている。例えば、全て本明細書中に参考として援用されている、ＷＯ  ９３／０１２７５；ＷＯ  ９４／０９１１９；ＷＯ  ９４／１０２９２；ＷＯ  ９４／１６７１８；米国特許第５，９６８，８２９号；Ｃａｔｔａｎｅｏら著、Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，４２，ｐｐ．１６１−６６（１９９６）を参照のこと。
【００３３】
自己再生する能力および成体ＣＮＳの分化された成熟細胞表現型を生じる能力において、幹細胞の性質を表す細胞集団が成体ＣＮＳ内に存在する。これらの幹細胞は、ＣＮＳ全体に（特に、その脳室下領域およびその海馬の歯状回において）見出される。増殖因子応答性の幹細胞は、マウス、齧歯類およびヒトのＣＮＳ組織の異なる発達段階で、多くの脳脊髄幹領域から単離され得る。これらの細胞は、増殖因子（例えば、ＥＧＦ、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−２）およびトランスホーミング増殖因子α（ＴＧＦα））に対する応答の点で異なり、培養物中で長期間分化されない状態で維持および増幅され得る。懸濁培養物かまたは付着培養物のいずれかとしての、ヒトを含む哺乳類の神経幹細胞培養物の同定、培養、増殖および使用は、以下に開示されている：Ｗｅｉｓｓら、米国特許第５，７５０，３７６号およびＷｅｉｓｓら、米国特許第５，８５１，８３２号（これら両者は、本明細書中に参考として援用されている）。同様に、本明細書中に参考として援用されているＪｏｈｅ、米国特許第５，７５３，５０６号は、付着ＣＮＳ神経幹細胞培養物に言及する。懸濁状態で培養される場合、ＣＮＳ神経幹細胞培養物は、典型的に、神経球体（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）を形成する。
【００３４】
単一神経球体の細胞は、単一神経幹細胞の子孫であるので、上記単一神経球体の細胞は、性質がクローンである。ＥＧＦなどのような増殖誘導性増殖因子の持続して存在すると、上記神経球体内の前駆体細胞は、分裂し続けて、上記神経球体のサイズおよび分化されていない神経細胞の個数の増加を生じる。神経球体は、神経線維（ＮＦ；ニューロンのマーカー）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ；ニューロンのマーカー）またはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ；オリゴデンドロサイトのマーカー）のいずれに対しても免疫反応性でない。しかしながら、上記神経球体内の細胞は、多くの型の分化されていないＣＮＳ細胞において見出される中間フィラメントタンパク質であるネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）に対して免疫反応性である（本明細書中に参考として援用されている、Ｌｅｈｎｄａｈｌら著、６０  Ｃｅｌｌ  ５８５−５９５（１９９０）を参照のこと）。抗体（Ｒａｔ４０１と呼ばれるラット抗体を含む）は、ネスチンを同定するために利用できる。上記神経球体が分化を許容する条件において培養される場合、上記前駆細胞は、ニューロンおよびグリアへ分化する。上記神経幹細胞子孫に由来し得る分化された細胞型と関連した成熟表現型は、主に、上記ネスチン表現型について陰性である。
【００３５】
ヒト中枢神経系幹細胞由来の神経球体（「ＨｕＣＮＳ−ＳＣＴＭ」）（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）は、神経前駆細胞の均質無菌懸濁液から構成される体細胞療法産物である。この神経前駆細胞は、その移植部位から移動し、脳の成熟細胞型に分化する能力を有する。ＨｕＣＮＳ−ＳＣは、リソソーム酵素に欠陥を有する被験者における、神経セロイドリポフスチノーシス（ＮＣＬ）に関連した徴候および症状の処置のための細胞療法として開発中である。上記リソソーム酵素は、ＣＬＮ１がコードするパルミトイルプロテインチオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）およびＣＬＮ２がコードするトリペプチジルペプチダーゼＩ（ＴＰＰ−Ｉ）である。
【００３６】
神経セロイドリポフスチノーシス（ＮＣＬ）は、いくつかの型のリソソーム蓄積障害を含む。上記いくつかの型のリソソーム蓄積障害は、様々な遺伝子における遺伝性遺伝子変異により決定される臨床的症状の発症により互いに区別されている。これらの変異の結果は、様々な細胞型におけるリポフスチン様蛍光含有物の蓄積であり、そして、最終的には細胞変性に至る（Ｇｏｅｂｅｌ，Ｊ．  Ｃｈｉｌｄ  Ｎｅｕｒｏｌ  １０：４２４−３７（１９９５）を参照のこと）。乳児型ＮＣＬは、ＣＬＮ１遺伝子における変異を有する（Ｖｅｓａら著，Ｎａｔｕｒｅ  ３７６：５８４−８７（１９９５）；Ｓｃｈｒｉｎｅｒら著，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３４：３１７−２２（１９９６）を参照のこと）。上記ＣＬＮ１遺伝子は、パルミトイルプロテインチオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）をコードする。後期乳児型ＮＣＬは、ＣＬＮ２遺伝子における変異を有する（Ｓｈａｒｐら著，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ６：５９１−９５（１９９７）；Ｓｌｅａｔら著，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：１８０２−０５（１９９７）を参照のこと）。上記ＣＬＮ２遺伝子は、トリペプチジルペプチダーゼＩ（ＴＰＰ−Ｉ）をコードする。ＰＰＴ１酵素は、パルミトイル基とシステインアミノ酸残基の硫黄原子との間のチオエステル結合を加水分解するが、ＴＰＰ−Ｉは、セリン−カルボキシルペプチダーゼであるセドリジン（ｓｅｄｏｌｉｓｉｎ）ファミリーの構成員であると提案されている（Ｗｌｏｄａｗｅｒら著，ＢＭＣ  Ｓｔｒｕｃ  Ｂｉｏｌ  ３：８−１０（２００３）；Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎ，ＴＩＢＳ  ２４：３５５−５９（１９９９）を参照のこと）。機能的なＰＰＴ１酵素レベルが正常酵素レベルの約３％未満である場合、ＣＬＮ１遺伝子における変異を有するヒトは、ＩＮＣＬの疾患症状を発症することが示されている。
【００３７】
上記二つの酵素、ＰＰＴ１およびＴＰＰ−Ｉは、粗面小胞体（ＲＥＲ）からそのマンノース６−リン酸受容体タンパク質分類経路を通じてそのリソソームへ経路を定められている古典的溶解性リソソーム加水分解酵素と分類される。新しく合成された加水分解酵素の一定のパーセンテージは、上記ＲＥＲにおけるマンノース６−リン酸受容体による認識を逃れ、最終的には分泌小胞内に存在するので、上記新しく合成された加水分解酵素は、二次的に分泌される。上記細胞外酵素は、細胞表面マンノース６−リン酸受容体特異的に結合し、その複合体は、内在化されてそのリソソームへと方向付けられる。上記リソソームの酸性ｐＨにより、上記タンパク質がその受容体から分離され、次に、マンノース上の６−リン酸基は、リソソームホスファターゼから除去されて、上記内在化されたタンパク質がリソソーム内に留まって蓄積することを確実にし、そして上記受容体を再利用してそのＥＲへ戻ることを可能にする。
【００３８】
ＴＰＰ−Ｉは、前駆体たんぱく質として合成されて（Ｇｏｌａｂｅｋら著，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：７１３５−４５（２００３）を参照のこと）、従って、ＴＰＰ−Ｉは、そのリソソームにおいて自触反応で切断されて活性型に変換されるまでは、不活性である。過剰発現され、分泌された、組換えＰＰＴ１酵素およびＴＰＰ−Ｉ酵素は、哺乳類細胞により内在化され得ることが以前に明らかにされている（ＶｅｒｋｒｕｙｓｅおよびＨｏｆｍａｎｎ著，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：１５８３１−３６（１９９６）；Ｂｅｌｌｉｚｚｉら著，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：４５７３−７８（２０００）；Ｌｅｈｔｏｖｉｒｔａ  Ｍ．ら著，Ｈｕｍ  Ｍｏｌｅｃ  Ｇｅｎｅｔ  １０：６９−７５（２００１）；ＬｉｎおよびＬｏｂｅｌら著，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３５７：４９−５５（２００１）を参照のこと）。受容体依存的なエンドサイトーシス取込みは、その細胞表面に存在するマンノース６−リン酸受容体を通じて特異的に介されることが示され、そして、マンノース６−リン酸は、ＰＰＴ１内在化とＴＰＰ−Ｉ内在化との両者を阻害する。
【００３９】
ＨｕＣＮＳ−ＳＣは、標準培養条件下で、構成的に合成されて、ＰＰＴ１酵素とＴＰＰ−Ｉ酵素との両者を分泌することが示されている。このことは、細胞溶解産物および培養培地における酵素活性の検出により実証された通りである（図１を参照のこと）。ＰＰＴ１酵素およびＴＰＰ−Ｉ酵素は、ヒト細胞のリソソーム区画に蓄積し、分泌される酵素の一部分は、ＣＬＮ１遺伝子かまたはＣＬＮ２遺伝子のいずれかの変異を各々有する患者の線維芽細胞へエンドサイトーシスされ得る。これらの酵素の天然の受容体であるマンノース６−リン酸受容体の競合的阻害は、この実験システムにおける受容体介在性エンドサイトーシスを遮断する。
【００４０】
インビボでは、神経球体は、新生仔ＮＯＤ．ＣＢ１７−ＰｒｋｄｃＳｃｉｄ／Ｊ（ＮＯＤ−Ｓｃｉｄ）系統のマウスの発達中の脳における長期間の移植を確立する。これらの細胞は、移植部位から遠位の領域に移動し、ＧＡＢＡ作動性（ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ）ニューロンおよびチロシン水酸化酵素−免疫反応性のニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトに分化する。遺伝的ＰＰＴ１欠損の動物モデル（ＮＯＤ−Ｓｃｉｄ遺伝的背景に戻し交配されたＣＬＮ１遺伝子ノックアウト（ＰＰＴ１−Ｓｃｉｄ））では、ＨｕＣＮＳ−ＳＣの移植は、十分な移植および酵素分泌を生じた（図２を参照のこと）。ＰＰＴ１Ｋ／Ｏ  Ｓｃｉｄマウスに移植されたＨｕＣＮＳ−ＳＣは、このよく表現された神経変性モデルにおいて、移動し、分化し、酵素を生じる。
【００４１】
（リソソーム蓄積障害に対する療法）
（酵素補充療法）
現在、酵素補充療法は、リソソーム蓄積障害を処置するために用いられる。そのような療法は、細胞表面マンノース６−リン酸受容体経路を通じてリソソームタンパク質を内在化するという細胞の能力を利用する（Ｇｅｒｍａｉｎ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ  １１：１４６７−７６（２００２）；Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎら著，Ｌａｎｃｅｔ  ３６１：３５２（２００３）を参照のこと）。これらの療法は、末梢系に関連した症状の処置に有効である。しかしながら、中枢神経系（ＣＮＳ）に関連した症状は、酵素補充療法において用いられる酵素の血液脳関門における非透過性に起因して、軽減することが困難であることが証明されている。
【００４２】
（ＨｕＣＮＳ−ＳＣ療法）
ＣＮＳに関連したＬＳＤ症状の処置のための酵素補充療法の失敗は、ＨｕＣＮＳ−ＳＣを患者のＣＮＳに移植することにより、患者のＣＮＳに直接的に上記酵素を送達することにより克服され得る。ＨｕＣＮＳ−ＳＣは、天然に、ＴＰＰ−ＩおよびＰＰＴ１を含む可溶性リソソーム酵素を生じ、そして分泌する（図１を参照のこと）。従って、ＣＮＳにＨｕＣＮＳ−ＳＣを播種および移植すると、この細胞は、ＣＮＳへの可溶性リソソーム酵素の、持続的、かつ、永久的な供給源として働く。
【００４３】
ＨｕＣＮＳ−ＳＣは、ＰＰＴ１酵素とＴＰＰ−Ｉ酵素の両者を生じることが示されている（図１を参照のこと）。さらに、ＰＰＴ１欠損の前臨床モデルでは、その対応する酵素活性は、移植後に時間が経つにつれ増加する。従って、ＩＮＣＬまたはＬＩＮＣＬを患っている患者の脳の適切な場所にＨｕＣＮＳ−ＳＣを配置することを用いて、これらの存在しない酵素を補充し得る。
【００４４】
その遺伝子における遺伝性変異に起因して不活性化される場合にリソソーム蓄積障害に至る可溶性リソソーム酵素の他の例は、例えば、β−グルコセレブロシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼおよびスルファミダーゼを含む。具体的には、β−グルコセレブロシダーゼにおける変異は、リソソームにおける分解されていないグルコシルセラミドの蓄積に起因して、ゴーシェ病に至る。同様に、α−Ｌ−イズロニダーゼ酵素の欠陥は、ハーラー（ＭＰＳ  Ｉ）病を引き起こす。ハーラー（ＭＰＳ  Ｉ）病では、デルマタン硫酸物質およびヘパラン硫酸物質が、リソソームにおいて構築される。最後に、スルファミダーゼ酵素の欠損は、サンフィリポ（ＭＰＳ  ＩＩＩＡ）病をもたらす。サンフィリポ（ＭＰＳ  ＩＩＩＡ）病では、ヘパラン硫酸が、リソソームにおいて蓄積する。他の例は、テイ・サックス病、サンドホフ病およびハンター病を含む。さらなる例は、前出の表１にも詳述されている。
【００４５】
当該分野において、ＣＮＳへの組織の移植が、神経変性障害および外傷に起因するＣＮＳ損傷の処置の可能性を提供することはよく認識されている（Ｌｉｎｄｖａｌｌ，（１９９１）ＴＩＮＳ  第１４巻（８）：３７６−３８３を参照のこと）。さらに、本明細書中に記載されている通り、ＨｕＣＮＳ−ＳＣの移植は、リソソーム蓄積障害の処置の可能性を提供する。
【００４６】
ＣＮＳへの新しい細胞の移植は、損傷を受けたサーキットリーを修復し、欠陥のある生物学的活性分子、欠失しているまたは存在しない生物学的活性分子を提供し、それらにより、機能を回復させる可能性を有する。しかしながら、移植目的に適切な細胞がないために、この手順の十分な可能性を満たすことが妨げられている。「適切な」細胞は、以下の基準を満たす細胞である：１）多数得られ得る；２）必要であれば遺伝物質の挿入を許容するために、インビトロで増殖され得る；３）無制限に生存し得るが脳への移植後に増殖を止め得る；４）免疫原性ではなく、好ましくは、患者自身の組織から得られる；５）正常な神経結合を形成し、かつ、神経の生理学的シグナルに応答することが可能である（Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ（１９９１）ＴＩＮＳ  １４巻（８）：３１９−３２２を参照のこと）。インビトロで維持される場合に無制限に分裂することが可能である、胚性ＣＮＳ組織または成体ＣＮＳ組織から入手可能な多能性神経幹細胞の子孫は、神経移植目的に適切な細胞の全ての望ましい必要条件を満たし、そしてこれらの細胞は不死化されておらず、かつ、腫瘍形成性起源のものではないので、特に適切な細胞株である。
【００４７】
ＨｕＣＮＳ−ＳＣは、任意の方法で得られた異常な神経学的症状または神経変性症状を有する任意の動物に、投与され得る。さらに、ＨｕＣＮＳ−ＳＣは、リソソーム蓄積障害を患っている患者にも投与され得る。
【００４８】
いくつかの場合、レシピエント自身の神経系からＨｕＣＮＳ−ＳＣを調製することが可能であり得る（例えば、腫瘍除去生検材料などの場合）。そのような場合、神経幹細胞子孫は、解離された組織から作られ得、当業者に公知の任意の適切な方法を用いて、インビトロで増殖され得る。細胞数の適切な拡大において、ＨｕＣＮＳ−ＳＣ細胞は、回収され得、必要であれば、遺伝子改変され得、そして、上記レシピエントのＣＮＳへの直接的な注入の準備をされ得る。
【００４９】
ＨｕＣＮＳ−ＳＣは、特定の神経領域に投与される場合、好ましくは、神経グラフトを形成し、ここで、ニューロン細胞は、正常なニューロン連結または隣接するニューロンとのシナプス接合を形成し、ニューロンの軸索の周囲にミエリン鞘を形成し得る移植されたグリア細胞または存在しているグリア細胞との接触を維持し、かつ、上記ニューロンに対する栄養的影響を提供する。
【００５０】
生存している宿主における上記グラフトの生存は、様々な非侵襲性スキャン（例えば、コンピュータ連動断層撮影法（ＣＡＴスキャンまたはＣＴスキャン）、核磁気共鳴法または磁気共鳴画像法（ＮＭＲまたはＭＲＩ）、あるいは、より好ましくは、陽電子断層撮影（ＰＥＴ）スキャン）を用いて調べられ得る。グラフト生存の死後の検査は、その神経組織を取り出し、そして、罹患した領域を肉眼で調べ、または、より好ましくは、顕微鏡を用いて調べることにより行われ得る。細胞は、光学顕微鏡条件下または電子顕微鏡条件下で可視の任意の染料を用いて（より具体的には、ニューロンおよびグリアに特異的な染料を用いて）染色され得る。特に、有用なものは、ドナー細胞と宿主細胞とを識別および／または同定するモノクローナル抗体（特に、Ｈ−２組織適合抗原またはＨＬＡ組織適合抗原についての差を識別および／または同定するモノクローナル抗体）である。最も好ましいものは、神経伝達物質を同定する抗体（特に、ＧＡＢＡ、ＴＨ、ＣｈＡＴおよびサブスタンスＰ、ならびに神経伝達物質の合成に関係する酵素（特に、ＧＡＤ）に対する抗体）である。移植された細胞は、また、ローダミン標識ミクロスフェアまたはフルオレセイン標識ミクロスフェア、ファストブルー（ｆａｓｔ  ｂｌｕｅ）、ビスベンズアミドのようなトレーサー染料、あるいは、β−ガラクトシダーゼを生じるｌａｃ  Ｚ遺伝子のようなレトロウイルスにより導入された組織化学的マーカーの先行した取り込みにより同定され得る。
【００５１】
宿主神経組織への上記グラフトの機能的統合は、様々な機能を回復することにおけるグラフトの有効性を調べること（リソソーム機能についての試験が挙げられるが、これに限定されない）により評価され得る。
【００５２】
ヒト患者への移植に関して、当業者は、ＨｕＣＮＳ−ＳＣの移植、投与、注入および／またはインプラントについての任意の適切な方法が患者において適用され得ることを認識している（例えば、本明細書中に参考として援用されている、米国特許第６，４９７，８７２号を参照のこと）。
【００５３】
約３×１０６〜約１×１０１０の間の（例えば、約５×１０８〜約２×１０９または約１×１０８〜約５×１０９の間の）範囲の個数のＨｕＣＮＳ−ＳＣ細胞は、リソソーム蓄積障害を患っている哺乳類動物に投与され得る。特に、５×１０８個の細胞という低用量または１×１０９個の細胞という高用量は、上記哺乳類動物に移植またはインプラントまたは注入または投与され得る。当業者は、移植が、当業者に公知の任意の神経移植プロトコールを用いて達成され得ることを認識している（例えば、本明細書中に参考として援用されている、米国特許第６，４９７，８７２号を参照のこと）。
【００５４】
ＨｕＣＮＳ−ＳＣは、患者のＣＮＳの８個の特定領域（外側の脳室、ならびに脳の各半球における皮質の前頭領域、頭頂領域および頭頂／後頭領域を含む）に投与される。ＨｕＣＮＳ−ＳＣは、６回の両側皮質下注入および２回の両側脳室内注入からなる外科的手順を介して、脳にインプラントされる。上記手順は、手術室で全身麻酔下で小児神経外科医により行われる。三つの穿孔穴が、各大脳半球にまたがって作製される。上記穿孔術は、前頭葉および頭頂葉の中央面を中心にされる。患者は、５×１０７個の細胞／皮質穿孔および１×１０８個の細胞／脳室穿孔（被験体毎に全用量で５×１０８個のＨｕＣＮＳ−ＳＣ）または１×１０８個の細胞／皮質穿孔および２×１０８個の細胞／脳室穿孔（被験体毎に全用量で１×１０９個のＨｕＣＮＳ−ＳＣ）のいずれかを受ける。
【００５５】
本発明は、以下の実施例にさらに説明される。これらの実施例は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を制限しない。
【実施例】
【００５６】
（実施例１：ＣＬＮ１患者およびＣＬＮ２患者におけるＨｕＣＮＳ−ＳＣの移植）
ヒトＣＮＳ幹細胞（ＨｕＣＮＳ−ＳＣ）は、ヒト神経幹細胞／前駆細胞の注入可能な懸濁液から構成される細胞療法産物である。ＨｕＣＮＳ−ＳＣを、部分的に上記ＣＬＮ１患者および上記ＣＬＮ２患者に移植して、この移植された細胞が、病気に冒された個体の脳に、その存在しないリソソーム酵素を分泌するかどうかを決定する。ＨｕＣＮＳ−ＳＣは、ＰＰＴ１酵素とＴＰＰ−Ｉ酵素との両者を生じて、それによって、酵素の補充、ならびにこの適応症での細胞の救出に対する科学的な正当な証拠を提供することが示されている。ＰＰＴ１欠乏の前臨床モデルでは、その対応する酵素活性は、移植後の時間経過に伴って増加する。従って、一般的にバッテン病と呼ばれる障害群の最も重篤な形態である、乳児および後期乳児の神経セロイドリポフスチノーシス（ＮＣＬ）の処置における、ＨｕＣＮＳ−ＳＣの安全性を、調べ得る。
【００５７】
（ＨｕＣＮＳ−ＳＣ移植）
約３×１０６〜約１×１０１０の間の（例えば、約５×１０８〜約２×１０９または約１×１０８〜約５×１０９の間の）範囲の個数のＨｕＣＮＳ−ＳＣ細胞を、リソソーム蓄積障害を患っている哺乳類動物に投与し得る。例えば、ＨｕＣＮＳ−ＳＣを、外科的に、皮質下注入および脳室内注入により投与する。二種類の用量の細胞を、投与する：濃度５×１０７細胞／ｍｌで注入する５×１０８個の細胞という低用量、および濃度１×１０８細胞／ｍｌで注入する１×１０９個の細胞という高用量。
【００５８】
手術前ＭＲＩを用いて、前方および前外側の前頭葉、ならびに頭頂葉内の皮質下標的部位を選択する。上記標的部位では、皮質性被膜（脳表面から脳室表面）は、少なくとも２０〜３０ｍｍの厚さである。標的部位を、また、表情豊かな皮質および他の重要な脳構造物を避けるように選択する。皮質の厚みを、ＭＲＩ走査画像から直接的にを測定する。四つのバーホール（ｂｕｒｒ  ｈｏｌｅ）を頭蓋の各側に置き、選択した皮質下部位に接近するように三つ、外側の脳室に接近するように一つを置く。上記標的とした皮質下注入部位に対応するバーホールの解剖学的位置の位置決定を助けるために、解剖学上の目印に加えて、ＳｔｅａｌｔｈＳｔａｉｏｎ（登録商標）（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ、５１０Ｋ  Ｋ００１１５３番）のような定位ナビゲーション機器を用い得る。上記定位ナビゲーション機器を、計画目的のため、ならびに解剖学的構造物の位置を決定することに対する援助としてのみ用いる；上記定位ナビゲーション機器を、ＨｕＣＮＳ−ＳＣの注入のために用いない。
【００５９】
ＨｕＣＮＳ−ＳＣを、皮質下に、上記皮質表面よりおよそ２０ｍｍ下の深さまで注入する。１ｍｌのＨｕＣＮＳ−ＳＣ懸濁液を、３〜５分にわたり手動で注入する。針の跡に沿った目に見えるほどの逆流を伴わずにその容量を吸収する脳の能力に基づいて、注入速度を手で調節する。上記針を、適所に各注入後２〜３分間放置して、その後、ゆっくりと引き出す。
【００６０】
上記脳室注入のため、外側の脳室の前角に、カテーテルを挿入する。上記選択したカテーテルは、脳室への無外傷性接近のため、ならびに抗体、化学療法剤または色素の脳室への注入のために用いる、よく確立された脳外科の器具であるべきである。約５ｍｌの患者ＣＳＦを、上記カテーテルを通じて引き出し、とっておいて、注入後に上記カテーテルを洗うために用いる。２ｍｌのＨｕＣＮＳ−ＳＣ懸濁液を、２〜３分にわたり手動で注入する。上記カテーテルを、２ｍｌの患者ＣＳＦで２〜３分にわたり洗い、その後ゆっくりと除去する。
【００６１】
上記手順の最後に、Ｓｕｒｇｉｆｏａｍ吸収性ゼラチンスポンジ（Ｅｔｈｉｃｏｎ、ＰＭＡ  Ｐ９９０００４番）を硬膜上のバーホール内に置くことにより、各バーホールを閉じて、その帽状腱膜をＶｉｃｒｙｌ縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ）を用いて閉じて、その皮膚をＭｏｎｏｃｒｙ縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ）を用いて閉じる。患者を、手術後、少なくとも一晩、小児科の集中治療室内でモニターする。
【００６２】
（免疫抑制）
ＨｕＣＮＳ−ＳＣ細胞療法は、同種異系移植である。上記細胞を、ドナーおよびレシピエントの組織型のマッチングをせずに被験体に移植する。従って、免疫抑制は、この移植したＨｕＣＮＳ−ＳＣ細胞の拒絶を防ぐために必要であり得る。
【００６３】
例えば、コルチコステロイド（１０ｍｇ／ｋｇ／日）およびＰｒｏｇｒａｆ（登録商標）（０．３ｍｇ／ｋｇ／日）を用いた、組み合わせ免疫抑制療法を、移植後１年まで用い得る。特に、Ｐｒｏｇｒａｆ（登録商標）を移植前に開始し、そして、移植後１年まで維持し得る（移植後の３０日間、投与量を、０．１ｍｇ／ｋｇ／日まで減じる）。Ｐｒｏｇｒａｆ（登録商標）の投与を、移植後の特定の間隔での有害経験に関してモニターし得、耐性を評価し得る。Ｐｒｏｇｒａｆ（登録商標）の血液レベルの毒物動態学的評価は、各被験体に応じて設定された投薬を可能にする。さらに、コルチコステロイドを、手術の直前に投与して手術後５日間まで投与し、その後、次第に減らして中止し得る。
【００６４】
（実施例２：頭蓋内のＰＰＴ１酵素活性の薬理学的研究）
図２に示されている通り、多くの研究は、ＰＰＴ１−ＫＯ／ＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウス内のＨｕＣＮＳ−ＳＣ移植の異なる用量および養生法を用いて、行われている。本明細書中に用いられる場合、用語「ＰＰＴ１−ＫＯ／ＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウス」および「ＣＬＮ１マウス」は、ＰＰＴ１−／−ノックアウトマウスを表すために交換可能に用いられている。図２は、ＰＰＴ１−ＫＯ／ＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウスにおける高用量レベルおよび複数の移植の影響を調べたデータを含む。
【００６５】
ＰＰＴ１−ＫＯ／ＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウスモデルでは、内因性のＰＰＴ１酵素は、特定の検出レベル未満である。３〜８×１０５個のＨｕＣＮＳ−ＳＣという用量を新生児ＰＰＴ１−ＫＯ／ＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウス細胞（群２）に移植する研究は、全脳ＰＰＴ１酵素レベルのうちの２．６％という平均値を生じた。上記新生児マウスの制限された脳の大きさのため、これらの動物の脳に高用量のＨｕＣＮＳ−ＳＣを送達する連続した移植スキームを開発した。（新生児および出生後、または若年性の）群３／４の移植片を用いて、１．５〜２．０×１０６個の細胞を投与し、（新生児、出生後および若年性の）群５の移植片を用いて、２．８×１０６個の細胞を投与した。これらの実験におけるいくつかの動物は、小脳および／または海馬へと標的されたＨｕＣＮＳ−ＳＣを有した。二回の移植でのＰＰＴ１酵素レベルは平均して４．１％に達し、三回の移植では、酵素レベルは平均して６．７％に達した（ＰＰＴ１  ＫＯ／ＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウスの異なるコホートの特徴に関しては、図２および表２を参照のこと）。本明細書中に記載されている実験では、群１は、陰性対照として、移植していない対照ＰＰＴ１−Ｓｃｉｄマウスを含んでいた（「移植していない群」）；群２は、新生児（Ｐ０〜Ｐ１）の時に一回移植したマウスを含んでいた（「一回移植群」）；群３は、新生児（Ｐ０〜Ｐ１）の時に一回、および出生後（Ｐ７〜Ｐ８）再度移植したマウスを含んでいた（「二回移植−ＮＰ群」）；群４は、新生児の時に、および、記載されている通り、若年の成体になりたての時期に再度移植したマウスを含んでいた（「二回移植−ＮＪ群」）；ならびに、群５は、新生児の時に、出生後（Ｐ７〜Ｐ８）におよび若年の成体初期に移植したマウスを含んでいた（「三回移植群」）。
【００６６】
【表２】
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（実施例３：自己蛍光性リポフスチン蓄積の減少についての薬理学研究）
ＰＰＴ１−／−マウス病理の顕著な特徴は、脳の至る所の、ニューロンおよび他の細胞中のリポフスチン沈着物の蓄積である。上記変異マウスは、その皮質および海馬における病理学的変化およびニューロン細胞喪失により特徴付けられ得る、進行性の神経変性を有する（Ｂｉｂｌｅら著、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ  １６（２）：３４６−５９（２００４）を参照のこと）。
【００６７】
試験的研究は、新生児の時に外側の脳室および小脳に注入した４００，０００個の細胞で処置し（ｎ＝３）、移植後１６０〜１６７日目に屠殺したマウス（一動物には、屠殺の１日前に、その海馬にさらに１００，０００個の細胞という二回目の移植を行っている）内の自己蛍光の量を定量した。移植していない対照脳（ｎ＝３）と比較して、ＨｕＣＮＳ−ＳＣで処置した動物は、皮質内の蓄積物質について１５％の減少、および海馬ＣＡ１領域については２１％の減少を示した。この試験的研究に関係したマウスの数は少なかったので、それらの結果は、統計的に有意ではなかった（図３を参照のこと）。
【００６８】
移植していない対照と比較して、ＨｕＣＮＳ−ＳＣ移植をしたＰＰＴ１−ＫＯ／ＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウスの脳内に蓄積する自己蛍光性蓄積物質の量を解析することにより、上記疾患の生物学的マーカーにおける用量効果を管理した。自己蛍光性リポフスチン負荷量を、移植していないＰＰＴ１−ＫＯ／ＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウス（ｎ＝４）、および１．５〜１．８×１０６個のＨｕＣＮＳ−ＳＣ細胞を移植したマウス（ｎ＝３、群４）内において測定した。リポフスチン蓄積を、吻側皮質、尾側皮質、視床、海馬のＣＡ領域および小脳における画像視野毎に自己蛍光を発した平均面積（μｍ２）として、定量した。各脳領域内の自己蛍光の平均減少パーセントを、移植していない対照と移植したＰＰＴ１−ＫＯ／ＮＯＤ−Ｓｃｉｄレシピエントとの間で算出した。
【００６９】
自己蛍光性沈着物の有意な減少が、測定した脳の全領域について、移植したマウスにおいて得られた（Ｐ＝０．０００１；図４を参照のこと）。対照と比較した自己蛍光性沈着物の減少のパーセンテージは、尾側皮質（ｃａｕｄａｌ  ｃｏｒｔｅｘ）についての３１％から、小脳についての５４％までの範囲に及んだ。
【００７０】
（実施例４．ＨｕＣＮＳ−ＳＣの移植による神経保護の特徴付け）
ＰＰＴ１−ＫＯ／ＮＯＤ−Ｓｃｉｄ（以下、「ＰＰＴ１−／−」または「ＰＰＴ１−Ｓｃｉｄ」または「ＣＬＮ１」）マウスを、６世代（Ｎ６）にわたりＮＯＤ−Ｓｃｉｄ背景に戻し交配した。細胞投与の制限としての脳容量を克服するために、ＰＰＴ１−Ｓｃｉｄマウスに、生涯の最初の数週間にわたり複数回、誕生から若年期（成体初期）までに移植した。異なる用量の細胞を移植したマウスの脳を、表３に表されるように、神経保護の解析用に選択した。群１は、陰性対照として、移植していない対照ＰＰＴ１−Ｓｃｉｄマウスを含んでいた（ｎ＝９）（「移植していない群」）；群２は、新生児（Ｐ０〜Ｐ１）の時に一回移植したマウスを含んでいた（ｎ＝３）（「一回移植群」）；群３は、新生児（Ｐ０〜Ｐ１）の時に一回、および出生後（Ｐ７〜Ｐ８）再度移植したマウスを含んでいた（ｎ＝５）（「二回移植−ＮＰ群」）；群４は、新生児の時に、および、記載されている通り、若年の成体になりたての時期に再度移植したマウスを含んでいた（ｎ＝６）（「二回移植−ＮＪ群」）；ならびに、群５は、新生児の時に、出生後（Ｐ７〜Ｐ８）におよび若年の成体初期に移植したマウスを含んでいた（ｎ＝６）（「三回移植群」）；ならびに、群６は、正常なＮｅｕＮ染色の対照として、移植していないＮＯＤ−Ｓｃｉｄを含んでいた（ｎ＝２）（ＮＯＤ−Ｓｃｉｄ（「ＰＰＴ１＋／＋群」））。
【００７１】
【表３】
2008526778.tif 000005
屠殺時に、マウスを麻酔して、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で経心的に（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｌｌｙ）灌流した。脳半球を、４％パラホルムアルデヒド中にて２４時間固定し、３０％スクロース溶液中にて４８時間凍結保護した。上記の固定した脳半球を、滑るように動く氷点に近いミクロトームで、４０ｐｍの厚さの切片にした。切片を、９６ウェルのプレートに回収した（１切片／ウェル）。６枚目ごとの４０μｍの矢状切片を、ＮｅｕＮに対するＭＡｂで染色し（１：５０００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、次いで、ビオチン化されたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体およびＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  ＥＬＩＴＥ  ＡＢＣ  ＫＩＴ（Ｖｅｃｔｏｒ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）の構成要素と共にインキュベーションを行った。抗体−免疫ペルオキシダーゼ複合体を、ＮｏｖａＲＥＤ基質（Ｖｅｃｔｏｒ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）を用いて明示した。脳切片を、スライドガラスにマウントし、メチルグリーンを用いて対比染色（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｔａｉｎ）した。
【００７２】
（画像の獲得および解析）
この研究において利用した全ての組織学的切片を、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＤＰ７０  １２−ｂｉｔ  冷却型デジタルカラーカメラを装備したＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ６１完全自動化研究用顕微鏡を用いて、画像化した。
【００７３】
上記宿主脳の矢状切片内のＣＮＳサブ構造を、予期して、目的の領域（「ＲＯＩ」）として規定し、画像の獲得および定量的解析のために用いた。上記海馬のＣＡ１領域を含むＲＯＩを、ＨＣ−ＣＡ１という。海馬のＣＡ２領域とＣＡ３領域とを組み合わせて（ＣＡ２／３）、ＨＣ−ＣＡ２／３と言及した。
【００７４】
上記皮質を含むＲＯＩを、従来の組織学的目印に従って輪郭を描いた。この組織学的目印は、腹側の眼窩皮質の前方境界線から、板状骨後皮質の後方境界線まで、ならびに腹側では脳梁を伴う境界線までである。上記皮質を含むＲＯＩをまた、ＣＲＴＸと言及し得る。
【００７５】
定量的な画像解析を、ＳｃｏｐｅｖｉｅｗソフトウェアとともにＳｏｆｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＩＳ）  ＧｍｂＨ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｕｉｔｅを用いて行った。定量のため、所定のマウスにおける一連の矢状脳切片を、中央方向から後方まで調べた。上記規定した景観の範囲内で、適切な構造を有する切片を、画像解析用に選択した。ＮｅｕＮ染色を定量するために、１つの脳につき、５と９との間の個数の切片を用いた。切片あたりの所定のＲＯＩにおける染色面積の合計を、ＳＩＳ画像解析により、全切片について定量した。異なる群についてのＲＯＩにおける染色面積の合計の平均値を、標準誤差と共に算出した。
【００７６】
（統計解析）
全てのデータポイントを、片側分散分析、次いでＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定（ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔ）により解析した。目的の各領域、ＨＣ−ＣＡ１、ＨＣ−ＣＡ２／３およびＣＲＴＸについて、別個の統計解析を行った。対照と処置した（移植した）群との間の差の統計的有意性は、Ｐ＜０．０５で認められた。
【００７７】
（結果）
（ＰＰＴ１−Ｓｃｉｄマウス脳内のＮｅｕＮ陽性細胞の特徴付け）
本研究において、移植したＨｕＣＮＳ−ＳＣがＣＬＮ１マウスの脳において、宿主ニューロンを変性から保護し得ることが実証された。本実験は、移植したＰＰＴ−１−Ｓｃｉｄ（ＣＬＮ１）マウスの海馬のＣＡ１領域およびＣＡ２／３領域ならびに皮質に焦点をあわせた。この理由は、これらの領域が、ヒトＣＬＮ１患者において、激しく冒されるからである。
【００７８】
ＮＯＤ−Ｓｃｉｄ背景に戻し交配したＣＬＮ１マウスは、生涯にわたり進行性神経変性を受けて、約２４週齢（１６８日）で尚早に死亡する。６週齢という早い時期に、ＣＬＮ１マウスは、高レベルの、リポフスチンとして公知の自己蛍光性化合物を蓄積し始める。上記自己蛍光性物質は、ＣＬＮ１マウスの生涯を通じてニューロン内に蓄積し、かつ、特に、その皮質およびその海馬のＣＡ領域におけるニューロン細胞死と関連している（Ｇｕｐｔａら著、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８（２４）：１３５６６−７１（２００１）；Ｂｉｂｌｅら著、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ  １６（２）：３４６−５９（２００４））。病気の動物の脳は、生涯の終末期に著しく萎縮している。
【００７９】
調べたマウスの齢は、１６５日齢〜１８８日齢の範囲であった。移植していないＰＰＴ１−Ｓｃｉｄ対照コホートおよび移植したコホートは、それらを調べた時点での齢が部分的に重なる。
【００８０】
成熟ニューロンの数個のマーカー（例えば、カルビンディン、カルレチニン（ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ）およびＮｅｕＮ）を、スクリーニングした。ＮｅｕＮの発現は、皮質および海馬に広範囲に分布しており、染色は、上記ニューロンの細胞体に局在していた。ＮｅｕＮ（神経核抗原）は、ほとんどの有糸分裂後ニューロンの核および核周辺細胞質内で発現している、ＤＮＡ結合タンパク質である。ＮｅｕＮは、マウスのプルキンエ細胞、僧帽状細胞および光受容体内では発現していない。市販されている抗ＮｅｕＮ抗体は、齧歯類動物型のＮｅｕＮとヒト型のＮｅｕＮとの両者に免疫反応性である。しかしながら、これらの市販抗体は、マウスニューロンにより強く反応する。従って、上記市販抗体は、優先的にマウスニューロンのみを染色するように滴定され得る。
【００８１】
二重標識実験を、ＮｅｕＮおよびヒト特異的ｍＡｂ  ＳＣ１２１を用いて行った。ＳＣ１２１は、細胞質抗原を認識し、かつ、齧歯類および非ヒト霊長類の脳内に移植したヒト細胞の多様な形態的特徴を与える（Ｋｅｌｌｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１１８３９−４４（２００４）；Ｃｕｍｍｉｎｇｓ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２：１４０６９−７４（２００５）を参照のこと）。移植したＰＰＴ１−Ｓｃｉｄマウスの皮質および海馬を、ＮｅｕＮ抗体およびＳＣ１２１抗体を用いて染色し、そして、共焦点顕微鏡により解析した。その画像の積み重ねを、Ｖｏｌｏｃｉｔｙで入手可能な正射投影ツールまたは３Ｄ化ツールを用いて、Ｚ次元において詳細に調べた。
【００８２】
ＮｅｕＮ染色は、主に、マウスニューロンの細胞体に限定されている。移植したＰＰＴ１−Ｓｃｉｄマウスの皮質または海馬に移植したＳＣ１２１陽性ヒト細胞のいずれも、ＮｅｕＮ陽性でなかった。しかしながら、注入コアに留まっているヒト細胞の中で、ＮｅｕＮ陽性細胞が時々検出された。上記注入コア内の細胞密度は高過ぎたので、個々のＮｅｕＮ陽性細胞は、それらがマウス起源であるのかまたはヒト起源であるのかを決定する目的で識別することはできなかった。従って、上記注入コアを、規定した目的の解析領域から除外した。本研究の情況においては、ＮｅｕＮ陽性細胞がマウス宿主細胞であると考えている。
【００８３】
脳切片を、抗ＮｅｕＮ抗体で処理し、免疫ペルオキシダーゼ染色方法を用いて検出した。図４は、（Ａ）移植していない（ＮＴ、群１）、（Ｂ）新生児の時および若年期の二回移植した（ＤＴ−ＮＪ、群４）、および（Ｃ）新生児の時、出生後および若年期の三回移植した（ＴＴ、群５）からの代表的なＮｅｕＮ染色を示す。定性的に、移植していないマウス（Ａ）の海馬のＮｅｕＮ染色により、そのＣＡ領域（特に、ＣＡ１）が、顕著に染色を減少させ、ニューロン細胞の損失を示していることを明らかにされている。二回の移植または三回の移植（ＢおよびＣ)のいずかを受けたＰＰＴ１−Ｓｃｉｄ動物で、より多くのＮｅｕＮ免疫反応性が観察された。これにより、移植したｈＣＮＳ−ＳＣによる宿主細胞の神経保護が強く示唆される。これらの観察結果に基づいて、ＮｅｕＮ陽性染色の面積を、神経保護の尺度として定量した。
【００８４】
（ＮｅｕＮ陽性細胞の定量）
ＣＬＮ１マウス海馬のＣＡ１領域は、ピラミッドのようなニューロンの明瞭な層からなっており、そのため、ＣＡ１領域は、定量的画像解析にとって理想的になる。マウス脳の矢状切片を抗ＮｅｕＮ抗体で染色し、切片毎のＣＡ１領域における染色面積の合計を、ＳＩＳ画像解析により、全切片について定量した。異なる移植した群について、海馬のＣＡ１領域における染色面積の合計の平均値を、標準誤差と共に算出した（図５Ｄを参照のこと）。
【００８５】
移植していないＰＰＴ１−Ｓｃｉｄ対照では、ＮＯＤ−Ｓｃｉｄ動物と比較して、宿主ニューロンのうちの８％のみが、調べた時点で生存する。移植した全ての群では、ＰＰＴ１−Ｓｃｉｄの移植していない対照と比較して、有意に高いレベルのＮｅｕＮ陽性ニューロンが存在する。最も高い細胞用量を受けたマウス（群５）内には、５７％という高いＮｅｕＮ陽性細胞面積が存在した。ＮｅｕＮ染色面積は、移植したＨｕＣＮＳ−ＳＣの個数を増加させるにつれて増加した。二回の移植−ＮＰ（新生児および出生後）を受けた群は、予想外に、低い量のＮｅｕＮ陽性細胞面積を有した。この群は、新生児の時のみ移植した一回移植群のレベルと同等のＮｅｕＮ陽性レベルを有するはずである。出生後のマウスにおいて行われる細胞移植は、技術的に、その海馬を標的とすることが難しいので、その結果として、上記細胞は、その皮質へと優先的に送達され得た。
【００８６】
海馬のＣＡ２領域およびＣＡ３領域では、ＮｅｕＮ染色面積の定量的画像解析を、上記矢状切片について行った。値を、各処置群についてのＮｅｕＮ陽性細胞の面積の合計の平均値として表３に報告する。
【００８７】
移植していない対照ＰＰＴ１−Ｓｃｉｄ動物では、ＮｅｕＮ陽性細胞の面積は、齢を合わせたＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウスの４７％にまで減少した。全ての移植した群では、移植していない対照と比較して、ＮｅｕＮ陽性細胞の面積の有意な増加があった。顕著に、９２％および９７％のＮｅｕＮ陽性細胞が、各々、二回移殖した−ＮＪマウスおよび三回移植したマウス内で検出された。
【００８８】
上記皮質におけるＮｅｕＮ陽性細胞の面積の定量的画像解析も、上記矢状切片について行った。そして、そられの結果を、表４に要約する。表４には、上記海馬におけるＮｅｕＮ定量に基づいた宿主ニューロン細胞生存の平均値を示す。パーセンテージを、処置していないＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウスに対して正規化する。表４に報告する平均値は、ＲＯＩの面積の合計の平均値を表す。各移植群の規定した領域におけるＮｅｕＮ染色面積のパーセンテージを、ＮＯＤ−Ｓｃｉｄ（すなわち、ＰＰＴ１＋／＋）マウスと比較して正規化した。
【００８９】
ＮｅｕＮ染色面積は、ＮＯＤ−Ｓｃｉｄ対照と比較して、ＰＰＴ−／−の移植していない対照では５９％であった。移植細胞用量の増加とＮｅｕＮ陽性染色面積の増加とに関する明確な傾向が、存在する。三回の移植は、移植していないＰＰＴ１−Ｓｃｉｄ対照と比較して、有意に（Ｐ＜０．０５）大きい面積のＮｅｕＮ陽性細胞を有する。
【００９０】
【表４】
2008526778.tif 000006
特定の脳領域についての体系的な解析を行って、移植していないＰＰＴ１  ＫＯ  ＮＯＤ−ＳｃｉｄマウスまたはＨｕＣＮＳ−ＳＣを移植したＰＰＴ１  ＫＯ  ＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウスのいずれかにおける宿主ＮｅｕＮ＋細胞の個数を定量した。調べた全領域では、ＨｕＣＮＳ−ＳＣ移植を受けた動物内では、齢を合わせた移植していない対照と比較した場合、より多くのＮｅｕＮ陽性細胞が数え上げられた。特に、移植した動物の海馬のＣＡ１領域およびＣＡ２／３領域において、ならびに皮質において、より多くの細胞が検出された。さらに、一般的に、低度の細胞用量を受けたマウスと比較して、高用量のヒト細胞を受けたマウスでは、より多くのＮｅｕＮ陽性細胞が観察された。最も顕著な知見は、上記移植していない群における、たったの約８％の生存宿主細胞と比較して、高い細胞用量を受けた動物内の海馬のＣＡ１領域では、最高５７％までの宿主ＮｅｕＮ陽性細胞が生存するという観察結果であった。さらに加えて、高い細胞用量を受けるマウス内では、それらの海馬のＣＡ２領域において、９７％の正常ＮｅｕＮレベルが観察された。
【００９１】
この神経保護研究では、対照動物が、移植していない群と移植した群とを比較するために適切な範囲の齢について入手可能であった。二回移植−ＮＰ（群３）は、他の移植した群と比較して、海馬のＣＡ１領域およびＣＡ２／３領域において僅かに少ない神経保護を表した。このことは、新生児の時および出生後という齢の仔の海馬を標的とすることの技術的な困難さの結果であり得る。具体的には、定位注入は困難であり、上記仔の大きさは、同腹子のサイズ、母親の授乳状態および上記マウスがいかによく同胞と食べ物をめぐって競争できるかに依存して、大きく変化する。さらに、Ｐ７では、頭蓋を露出させるために皮膚を切断してはおらず、この皮膚は半透明ではない。従って、基準ラムダポイントでの血管の可視化は困難である。実際、５匹の二回移植−ＮＰ動物のうちの１匹のみが、その海馬における注入コアを有していたが、６匹の二回移植−ＮＰ動物のうちの６匹が、その海馬へと適切に標的された注入コアを有していた。このことは、特定の標的部位へのＨｕＣＮＳ−ＳＣの送達が神経保護を最大化するために重要であることを強調する。
【００９２】
上記定量的ＮｅｕＮ解析は、全ての移植群（一回、二回および三回）が、上記移植していないＰＰＴ１−Ｓｃｉｄ対照と比較して、高レベルのＮｅｕＮ陽性細胞を有したことを示し、上記三回移植群では、最も高いレベルの神経保護が観察された。移植した動物は、ＰＰＴ１−Ｓｃｉｄ対照と比較して、自己蛍光のレベルを減少させた。このことは、神経保護と減少された自己蛍光の蓄積との相関が存在することを示唆する。自己蛍光におけるかなりの減少が、上記ＣＡ１領域において観察された。これは、ＣＡ１領域が、上記移植した動物における最も高いレベルの神経保護を表す領域であるという観察結果と一致する。
【００９３】
上記ＨｕＣＮＳ−ＳＣが十分なＰＰＴ１酵素レベルを提供し続ける限り、たとえ、リポフスチンのレベルが増加しても、宿主ニューロンの生存はまだ持続し得ることは可能である。研究仮説は、移植したＨｕＣＮＳ−ＳＣが宿主ニューロンにＰＰＴ１酵素を提供し、自己蛍光性沈着物を減少させ、上記宿主ニューロンの生存を増加させるということである。本研究の結果は、ＰＰＴ１−Ｓｃｉｄマウスの脳へのＨｕＣＮＳ−ＳＣの移植が、その海馬のＣＡ１、ＣＡ２／３および皮質における神経保護をもたらすことを実証した。最も高い細胞用量を受けている動物は、最も高いレベルの宿主ニューロン生存を示した。さらなる研究は、神経保護に対する、ＨｕＣＮＳ−ＳＣの移植のタイミング、送達部位および細胞用量の影響と取り組む。
【００９４】
（実施例５：臨床的開始用量に対する正当化）
約３×１０６〜約１×１０１０の間、好ましくは、約５×１０８〜約２×１０９または約１×１０８〜約５×１０９の間の範囲にわたる個数の細胞を、ＣＬＮ１またはＣＬＮ２を有する患者に投与し得る。臨床的細胞用量は、脳の重量に基づいて約３×１０６〜約１×１０１０の範囲にわたる個数の細胞を用いて、齧歯類および非ヒト霊長類について行う毒物学研究および概念証明薬理学研究、ならびに有害な作用は観察されなかったという知見に基づく。５億個の細胞という開始ヒト用量（「低用量」）は、上記齧歯類および上記非ヒト霊長類における最大試験用量と比較して、約１．５〜３倍の安全係数を提供する。これらの用量は、これらの種に対する有害作用の観察されるレベル（「ＮＯＡＥＬ」）を必ずしも規定せず、むしろ、上記最大試験用量に基づいていた。マウスおよびヒトの両方での安全性毒物学研究では、最大試験用量において有害作用は観察されなかった。概念証明研究では、ＨｕＣＮＳ−ＳＣを移植することは、ＰＰＴ１ノックアウトＮＯＤ  Ｓｃｉｄマウス（ＰＰＴ１−ＫＯ／ＮＯＤ−Ｓｃｉｄ）の脳内において、ＰＰＴ１酵素レベルを上昇させ、病的な自己蛍光性リポフスチン物質の蓄積を減少させ、宿主ニューロンの神経保護を提供した。相対的な脳重量に基づいて、上記選択した用量が、その治療上の範囲内にあり、かつ、許容可能な安全限界を提供すると予期される。
【００９５】
齧歯類および非ヒト霊長類において試験した用量に関する毒性は存在しなかったので、臨床的開始用量の選択を、さらに、推定上の薬理学的活性用量を選択したいという要望によって誘導した。上記ＰＰＴ１−ＫＯ／ＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウスにおける、約０．３×１０６〜０．８×１０６の範囲にわたる個数の細胞用量は、ＰＰＴ１酵素レベルを上昇させ（図２を参照のこと）、自己蛍光性リポフスチン物質の蓄積を減少させ（図３を参照のこと）、かつ、宿主細胞を神経保護した（図５および表４を参照のこと）。この用量に均等なヒトの用量は、約５億個の細胞である。神経セロイドリポフスチノーシスを有する患者から得た酵素活性データは、ＰＰＴ１酵素活性が正常の２〜３％未満である場合、苦痛が生じることを示している。従って、脳重量により決定されるような、これらの用量に対する、上記ヒト均等用量は、各々、３．６億および９．６億である。
【００９６】
従って、毒性学的データおよび薬理学的データに基づいて、約５億個（上記「低用量」）〜約１０億個（上記「高用量」）の用量のＨｕＣＮＳ−ＳＣ細胞は、許容可能な安全限界、ＰＰＴ１酵素レベルの有意な上昇および蓄積された自己蛍光性リポフスチンの有意な減少を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は、ｈＣＮＳ−ＳＣにより分泌されるＰＰＴ１酵素およびＴＰＰ１酵素が、マンノース６−リン酸受容体を介して、変異型線維芽細胞により内在化されることを示すグラフである。トランスウェルプレート内の共存培養は、７日間行われた。細胞外取り込みは、培養物への遊離マンノース６−リン酸の添加により遮断され得る。（Ａ）ＣＬＮ１患者に由来する線維芽細胞におけるＰＰＴ１酵素活性に関して、変異型線維芽細胞のみ（左側の棒）、ＨｕＣＮＳ−ＳＣとのトランスウェル共存培養（中央の棒）、ならびにＨｕＣＮＳ−ＳＣおよびマンノース６−リン酸との共存培養（右側の棒）における細胞内酵素活性。（Ｂ）ＣＬＮ２患者に由来する線維芽細胞におけるＴＰＰ１酵素活性に関して、変異型線維芽細胞のみ（左側の棒）、ＨｕＣＮＳ−ＳＣとのトランスウェル共存培養（中央の棒）、ならびにＨｕＣＮＳ−ＳＣおよびマンノース６−リン酸との共存培養（右側の棒）における細胞内酵素活性。平均値±ＳＥＭが示されている。
【図２】図２は、異なる用量のＨｕＣＮＳ−ＳＣの移植後の、全脳ＰＰＴ１酵素レベルの増加を示すグラフである。これらの研究に用いられたマウスは、Ｎ６戻し交配世代に由来し、かつ、移植後期間の範囲（１１７日〜１９９日）に及んだ。試験した異なる投与群の平均ＰＰＴ１酵素レベルが、示されている。ＰＰＴ１  ＫＯ／ＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウスの特徴は、前出の表２に記載されている。エラーバーは、平均値の標準誤差を表し、上のＰ値は、分散分析により試験された群間での差を示す。
【図３】図３は、３匹の対照ＰＰＴ１−ＫＯ／ＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウスおよび３匹の移植された（群１）ＰＰＴ１−ＫＯ／ＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウスの、皮質および海馬における自己蛍光性病巣の個数を示すグラフである。
【図４】図４は、ＨｕＣＮＳ−ＳＣ移植プロトコールにより、ＮＯＤ−Ｓｃｉｄ／ＰＰＴ１−／−マウスの５個の異なる脳領域において、自己蛍光面積が減少したことを示すグラフである。４匹の移植されていないＮＯＤ−Ｓｃｉｄ／ＰＰＴ１−／−動物および３匹の移植されたＮＯＤ−Ｓｃｉｄ／ＰＰＴ１−／−マウス（群３、後出の表２を参照のこと）が示されている。エラーバーは、平均値の標準誤差を表し、上のＰ値は、群間の差を示す（Ｐ値の対応は、グラフ本体に示されている）。上記５個の異なる脳領域は、以下である：ＲＣｔｘ、吻側皮質；ＣＣｔｘ、尾側皮質；Ｔｈａｌ、視床；ＣＡ１、海馬のＣＡ１領域；およびＣｂ、小脳。画像視野あたりの沈着面積の平均減少パーセンテージ（％）は、移植されていない対照（左の棒）と移植されたＰＰＴ１−Ｓｃｉｄレシピエント（右の棒）との間で算出される。
【図５】図５Ａ〜図５Ｃは、ＨｕＣＮＳ−ＳＣがＰＰＴ１−Ｓｃｉｄマウスにおける宿主細胞ニューロンを保護することを示す、一連の顕微鏡写真である。ヒト細胞は、ＰＰＴ１−Ｓｃｉｄマウスの脳において移植された。脳切片は、ＮｅｕＮに対するＭＡｂで染色された。その海馬のＣＡ野は、移植されていない脳において神経細胞の喪失を示した（図５Ａ）。移植されたＨｕＣＮＳ−ＳＣは、移植されたマウスの対応する領域における神経保護を提供した（図５Ｂおよび図５Ｃ）。群４（図５Ｂ）および群５（図５Ｃ）の代表的海馬写真が、示されている。ＰＰＴ１  ＫＯ／ＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウスのコホートの特徴は、前出の表３に示されている。図５Ｄは、ＳＩＳ画像解析による、上記海馬のＣＡ１領域におけるＮｅｕＮ陽性染色の定量を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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