(57)【要約】  細胞培養物の寿命を増加させ、タンパク質（好ましくは、抗体、ペプチド、酵素、成長因子、インターロイキン、インターフェロン、ホルモン、およびワクチンなどの組換えタンパク質）の産生を増加させる組成物および方法を本明細書中に開示する。培養物中での細胞のアポトーシス阻害遺伝子またはベクターでのトランスフェクションにより、培養物中の細胞はより長く生存することができ、それにより、タンパク質生合成の状態および収率が増大する。細胞内でのアポトーシスインヒビターの発現により、これが細胞を死滅させないので、細胞またはその増加したフラクションをより長い期間培養物中で維持することが可能である。次いで、本発明により、商業的および研究的に使用するための細胞株のタンパク質産生が制御、増強され、特に、成長因子、インターフェロン、インターロイキン、ホルモン、酵素、およびモノクローナル抗体などの産生が増強される。本方法は、培養物中に真核細胞を選択的に含み、より有利には、培養物中に哺乳動物細胞を含む。
2008507300.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えタンパク質の発現に適切な条件下で適切な培地中で宿主細胞を培養するステップを含み、前記宿主細胞が、前記組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むことと、前記宿主細胞が、前記宿主細胞の生存を増強する薬剤によって修飾されていることとを含む、組換えタンパク質の作製方法。
【請求項２】
前記宿主細胞の生存を増強する薬剤が、アポトーシスを阻害する薬剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記宿主細胞が、リンパ球、上皮細胞、間葉細胞、ニューロン細胞、またはこれらの悪性形態である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記宿主細胞が、骨髄腫細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記骨髄腫細胞が、Ｓｐ２／０細胞もしくはその誘導体、マウスＮＳＯ細胞、またはラットＹＢ２／０細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記宿主細胞が、上皮細胞またはその悪性形態である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記上皮細胞が、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記宿主細胞が、間葉細胞またはその悪性形態である、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記間葉細胞が、線維芽細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記線維芽細胞が、ＣＯＳ−１細胞またはＣＯＳ−７細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞が、ニューロン細胞、膠細胞、またはこれらの悪性形態である、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記ニューロン細胞が、網膜細胞、膠細胞、または神経膠腫細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記宿主細胞の生存を増強する薬剤が、宿主細胞によって発現された異種タンパク質である、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
前記異種タンパク質が、前記宿主細胞の染色体ＤＮＡ中に組み込まれた核酸配列によってコードされる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記宿主細胞の生存を増強する薬剤が、乳頭腫ウイルスＥ６タンパク質である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記宿主細胞の生存を増強する薬剤が、乳頭腫ウイルスＥ７タンパク質である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記宿主細胞の生存を増強する薬剤が、乳頭腫ウイルスＥ６タンパク質および乳頭腫ウイルスＥ７タンパク質である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記宿主細胞の生存を増強する薬剤が、アポトーシスインヒビターのＢｃｌ−２ファミリーから選択されるアポトーシスインヒビターである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記アポトーシスインヒビターが、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｃｌ−ＥＥＥ、Ｂｈｒｆ１、ＫＳ−Ｂｃｌ−２、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ、Ｂｃｌ−６、およびＭｃｌ−１からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記培地が、少なくとも１つのカスパーゼインヒビターをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２３】
前記カスパーゼインヒビターが、カスパーゼ−１インヒビター、カスパーゼ−３インヒビター、カスパーゼ−９インヒビター、カスパーゼ−１２インヒビター、およびｐａｎ−カスパーゼインヒビターからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記インヒビターが、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｃｈｏ、Ａｖｅｎ、およびＸＩＡＰからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記培地が、アポトーシスを阻害し、および／または細胞保護剤として機能する外因的に添加した薬剤をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２６】
前記外因性薬剤が、サイトカインＩ型スーパーファミリーのメンバーである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記サイトカインＩ型スーパーファミリーのメンバーがエリスロポエチンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記組換えタンパク質が、免疫グロブリン、ペプチド、酵素、成長因子、ホルモン、ワクチン、リンフォカイン、およびサイトカインからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２９】
前記組換えタンパク質が、抗体、抗体フラグメント、多重特異性抗体、および一本鎖抗体からなる群から選択される免疫グロブリンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記タンパク質が、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、およびトロンボポエチンからなる群から選択される成長因子である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記タンパク質が、ＩＬ−１〜ＩＬ−３１、αインターフェロン、βインターフェロン、γインターフェロン、およびコンセンサスインターフェロンからなる群から選択されるリンフォカインである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記宿主細胞を、宿主細胞の生存を増強する薬剤で最初に修飾し、前記宿主細胞の生存を増強する薬剤が、アポトーシスを阻害する薬剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記宿主細胞が、リンパ球、上皮細胞、間葉細胞、ニューロン細胞、またはこれらの悪性形態である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記宿主細胞が、骨髄腫細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記骨髄腫細胞が、Ｓｐ２／０細胞もしくはその誘導体、マウスＮＳＯ細胞、またはラットＹＢ２／０細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記宿主細胞が、上皮細胞またはその悪性形態である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記上皮細胞が、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記宿主細胞が、間葉細胞またはその悪性形態である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記間葉細胞が、線維芽細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記線維芽細胞が、ＣＯＳ−１細胞またはＣＯＳ−７細胞である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記宿主細胞が、ニューロン細胞、膠細胞、またはこれらの悪性形態である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４２】
前記ニューロン細胞が、網膜細胞、膠細胞、または神経膠腫細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記宿主細胞の生存を増強する薬剤が、宿主細胞によって発現された異種タンパク質である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４４】
前記異種タンパク質が、前記宿主細胞の染色体ＤＮＡ中に組み込まれた核酸配列によってコードされる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記宿主細胞の生存を増強する薬剤が、乳頭腫ウイルスＥ６タンパク質である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記宿主細胞の生存を増強する薬剤が、乳頭腫ウイルスＥ７タンパク質である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記宿主細胞の生存を増強する薬剤が、乳頭腫ウイルスＥ６タンパク質および乳頭腫ウイルスＥ７タンパク質である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記宿主細胞の生存を増強する薬剤が、アポトーシスインヒビターのＢｃｌ−２ファミリーから選択されるアポトーシスインヒビターである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
前記アポトーシスインヒビターが、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｃｌ−ＥＥＥ、Ｂｈｒｆ１、ＫＳ−Ｂｃｌ−２、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ、Ｂｃｌ−６、およびＭｃｌ−１からなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記培地が、少なくとも１つのカスパーゼインヒビターをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項５１】
前記カスパーゼインヒビターが、カスパーゼ−１インヒビター、カスパーゼ−３インヒビター、カスパーゼ−９インヒビター、カスパーゼ−１２インヒビター、およびｐａｎ−カスパーゼインヒビターからなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記インヒビターが、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｃｈｏ、Ａｖｅｎ、およびＸＩＡＰからなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記培地が、アポトーシスを阻害し、および／または細胞保護剤として機能する外因的に添加した薬剤をさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記外因性薬剤が、サイトカインＩ型スーパーファミリーのメンバーである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記サイトカインＩ型スーパーファミリーのメンバーがエリスロポエチンである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記組換えタンパク質が、免疫グロブリン、ペプチド、酵素、成長因子、ホルモン、ワクチン、リンフォカイン、およびサイトカインからなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記組換えタンパク質が、抗体、抗体フラグメント、多重特異性抗体、および一本鎖抗体からなる群から選択される免疫グロブリンである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記タンパク質が、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、およびトロンボポエチンからなる群から選択される成長因子である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記タンパク質が、ＩＬ−１〜ＩＬ−３１、αインターフェロン、βインターフェロン、γインターフェロン、およびコンセンサスインターフェロンからなる群から選択されるリンフォカインである、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
宿主細胞の生存を増強する組換えタンパク質をコードする外因性核酸配列を含む宿主細胞。
【請求項６１】
前記宿主細胞の生存を増強する組換えタンパク質が、乳頭腫ウイルスＥ６タンパク質、乳頭腫ウイルスＥ７タンパク質、およびアポトーシスインヒビターのＢｃｌ−２ファミリーからなる群から選択される、請求項６０に記載の宿主細胞。
【請求項６２】
前記タンパク質が、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｃｌ−ＥＥＥ、Ｂｈｒｆ１、ＫＳ−Ｂｃｌ−２、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ、Ｂｃｌ−６、およびＭｃｌ−１からなる群から選択される、請求項６１に記載の宿主細胞。
【請求項６３】
前記宿主細胞が、アポトーシス耐性を示す、請求項６１に記載の宿主細胞。
【請求項６４】
前記宿主細胞が、Ｓｐ−Ｅ２６である、請求項６３に記載の宿主細胞。
【請求項６５】
前記宿主細胞が、Ｓｐ−ＥＥＥである、請求項６３に記載の宿主細胞。
【請求項６６】
前記宿主細胞が、目的の組換えタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、請求項６３に記載の宿主細胞。
【請求項６７】
前記組換えタンパク質が、免疫グロブリン、ペプチド、酵素、成長因子、ホルモン、ワクチン、リンフォカイン、およびサイトカインからなる群から選択される、請求項６６に記載の宿主細胞。
【請求項６８】
前記組換えタンパク質が、抗体、抗体フラグメント、多重特異性抗体、および一本鎖抗体からなる群から選択される免疫グロブリンである、請求項６７に記載の宿主細胞。
【請求項６９】
前記タンパク質が、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、およびトロンボポエチンからなる群から選択される成長因子である、請求項６７に記載の宿主細胞。
【請求項７０】
前記タンパク質が、ＩＬ−１〜ＩＬ−３１、αインターフェロン、βインターフェロン、γインターフェロン、およびコンセンサスインターフェロンからなる群から選択されるリンフォカインである、請求項６７に記載の宿主細胞。
【請求項７１】
前記宿主細胞が、リンパ球、上皮細胞、間葉細胞、ニューロン細胞、またはこれらの悪性形態からなる群から選択される、請求項６３〜７０のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項７２】
前記宿主細胞が、骨髄腫細胞である、請求項７１に記載の宿主細胞。
【請求項７３】
前記骨髄腫細胞が、Ｓｐ２／０細胞もしくはその誘導体、マウスＮＳＯ細胞、またはラットＹＢ２／０細胞である、請求項７２に記載の宿主細胞。
【請求項７４】
前記宿主細胞が、上皮細胞である、請求項７１に記載の宿主細胞。
【請求項７５】
前記上皮細胞が、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞である、請求項７４に記載の宿主細胞。
【請求項７６】
前記宿主細胞が、間葉細胞である、請求項７１に記載の宿主細胞。
【請求項７７】
前記間葉細胞が、線維芽細胞である、請求項７６に記載の宿主細胞。
【請求項７８】
前記線維芽細胞が、ＣＯＳ−１細胞またはＣＯＳ−７細胞である、請求項７７に記載の宿主細胞。
【請求項７９】
前記宿主細胞が、ニューロン細胞または膠細胞である、請求項７１に記載の宿主細胞。
【請求項８０】
前記ニューロン細胞が、網膜細胞、膠細胞、または神経膠腫細胞である、請求項７９に記載の宿主細胞。
【請求項８１】
細胞増殖に適切な培地中に請求項６３〜７０のいずれかに記載の宿主細胞のクローン集団を含む細胞培養物。
【請求項８２】
前記培地が、少なくとも１つのカスパーゼインヒビターを含む、請求項８１に記載の細胞培養物。
【請求項８３】
前記カスパーゼインヒビターが、カスパーゼ−１インヒビター、カスパーゼ−３インヒビター、カスパーゼ−９インヒビター、カスパーゼ−１２インヒビター、およびｐａｎ−カスパーゼインヒビターからなる群から選択される、請求項８２に記載の細胞培養物。
【請求項８４】
前記インヒビターが、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｃｈｏ、Ａｖｅｎ、およびＸＩＡＰからなる群から選択される、請求項８３に記載の細胞培養物。
【請求項８５】
前記培地が、アポトーシスを阻害し、および／または細胞保護剤として機能する外因的に添加した薬剤をさらに含む、請求項８１に記載の細胞培養物。
【請求項８６】
前記外因性薬剤が、サイトカインＩ型スーパーファミリーのメンバーである、請求項８５に記載の細胞培養物。
【請求項８７】
前記サイトカインＩ型スーパーファミリーのメンバーがエリスロポエチンである、請求項８６に記載の細胞培養物。
【請求項８８】
前記宿主細胞を、灌流反応器中で培養する、請求項３に記載の方法。
【請求項８９】
前記宿主細胞を、灌流反応器中で培養する、請求項３２に記載の方法。
【請求項９０】
前記宿主細胞を、流加培養で培養する、請求項３に記載の方法。
【請求項９１】
前記宿主細胞を、流加培養で培養する、請求項３２に記載の方法。
【請求項９２】
前記宿主細胞を、懸濁液中で培養する、請求項３に記載の方法。
【請求項９３】
前記宿主細胞を、懸濁液中で培養する、請求項３２に記載の方法。
【請求項９４】
細胞培養物の寿命が少なくとも２日間増加する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９５】
細胞培養物の寿命が少なくとも２日間増加する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９６】
細胞培養物の寿命が少なくとも２日間増加する、請求項９２に記載の方法。
【請求項９７】
細胞培養物の寿命が少なくとも２日間増加する、請求項８９、請求項９１、または請求項９３に記載の方法。
【請求項９８】
細胞培養物の寿命が少なくとも４日間増加する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９９】
細胞培養物の寿命が少なくとも４日間増加する、請求項９０に記載の方法。
【請求項１００】
細胞培養物の寿命が少なくとも４日間増加する、請求項９２に記載の方法。
【請求項１０１】
細胞培養物の寿命が少なくとも４日間増加する、請求項８９、９１、または９３に記載の方法。
【請求項１０２】
細胞培養物の寿命が少なくとも６日間増加する、請求項８８に記載の方法。
【請求項１０３】
細胞培養物の寿命が少なくとも６日間増加する、請求項９０に記載の方法。
【請求項１０４】
細胞培養物の寿命が少なくとも６日間増加する、請求項９２に記載の方法。
【請求項１０５】
細胞培養物の寿命が少なくとも６日間増加する、請求項８９、９１、または９３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００４年７月２３日出願の米国特許出願番号６０／５９０，３４９号の優先権を主張する。本出願は、上記仮出願で開示された主題のみを主張し、それにより、新規事項を示さない。
【背景技術】
【０００２】
特に、巨大なバイオリアクターにおけるインビトロでの細胞培養は、多数のバイオテクノロジー産物の産生の基本であり、支持体へのこれらのタンパク質産物の細胞による作製（ｅｌａｂｏｒａｔｉｏｎ）を含み、これらの産物を単離し、臨床的使用の前にさらに処理する。培養物中で増殖した細胞からの長期にわたるタンパク質の産生量は、例えば、細胞密度、細胞周期の段階、細胞のタンパク質生合成率、細胞の生存度および増殖を支持するために使用される培地の条件、ならびに培養物中の細胞の寿命（プログラム細胞死（すなわち、アポトーシス）のために死滅するまでの期間）などの多数の要因に依存する。例えば、栄養素、細胞密度、酸素および二酸化炭素の含有量、乳酸デヒドロゲナーゼ、ｐＨ、浸透圧、異化生成物などの調節による所望のタンパク質の生産性を増加させる方法と共に、培養物中の細胞の生存度および寿命に対する種々の改良方法が開発されている。例えば、細胞密度の増加により、過程の生産性をより高くすることができるが、培養物中の細胞の寿命も短縮され得る。したがって、最大密度が達成された場合、できるだけ長く最も生産性の高い状態で細胞集団を維持するために、培養物中のこのような細胞の増殖速度を低下させることが望ましい。これにより、その産生ピークでのバイオリアクターサイクルが増加または延長され、所望のタンパク質産物が長期間で作製され、これにより、バイオリアクターサイクル由来の収率がより高くなる。
【０００３】
細胞増殖を支持する培地の調整、一定の成長促進因子の添加、およびタンパク質合成に影響を与えない細胞増殖の阻害などのバイオリアクターのサイクル時間を増加させるための多数の異なるアプローチが追求されている。１つの特定のアプローチは、細胞周期標的に影響を与えるための遺伝子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用による細胞周期の調節によって培養細胞の寿命を増加させることを目的とし、それにより、細胞周期の進行を阻害していわゆる偽老化状態を誘導するベクターでのトランスフェクション、形質転換、または感染によって細胞を偽老化状態に誘導し、さらに、細胞分裂を遮断し、培養物中の細胞のタンパク質合成能を拡大する。言い換えれば、細胞周期インヒビターを発現するベクターでの細胞の形質転換によって偽老化状態を誘導することができる（Ｂｕｃｃｉａｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ２００２／０１６０４５０  Ａ１；ｉｄｅｍ．，ＷＯ  ０２／１６５９０  Ａ２）。後者の方法は、ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＳｉｎｇａｌ（Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ８８，３５９−６４，１９７４；Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １７：１９９−２０５，１９９８）に記載のように、細胞複製の阻害により、細胞を細胞培養の寿命を延長することができる状態になるように図り、アポトーシスに耐性を示し得る（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７，４２９１−６，２０００；Ｊａｖｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９，６１−８，２０００）。
【０００４】
さらに別のアプローチは、アデノウイルスＥ１遺伝子でのトランスフェクション後に初代二倍体ヒト細胞または無制限に増殖するその誘導体を樹立するステップを含む。機能的なＡｄ５Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子産物を発現する新規の細胞株（そのうちの１つは、ＰＥＲ．Ｃ６（ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０）である）は、遺伝子療法およびワクチンならびにヒト成長因子およびヒト抗体などの組換え治療タンパク質の産生のためにデザインされた組換えアデノウイルスおよび他のウイルス（例えば、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス）を産生することができる（Ｖｏｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ０２／４０６６５Ａ２）。
【０００５】
他のアプローチは、細胞中のアポトーシスの防止または遅延のためのカスパーゼインヒビターの使用に注目している。例えば、米国特許第６，５８６，２０６号を参照のこと。さらに他のアプローチにより、細胞中でのアポトーシス防止または遅延のためのＢｃｌ−２ファミリーのメンバーなどのアポトーシスインヒビターの使用が試みされている。Ａｒｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｊｏｕｒｎａｌ，３：２３−２８（２００４）を参照のこと。これらのアプローチにより、予想不可能な結果が得られている。例えば、ある研究では、Ｂｃｌ−２発現により細胞の生存度が増加するが、タンパク質産生は増加しなかった。Ｔｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６８：３１−４３（２０００）を参照のこと。別の例にはＣＨＯ細胞のアポトーシスを遅延させるためのＢｃｌ−２タンパク質の過剰発現が記載されているが、Ｂｃｌ−ｘＬはタンパク質産生を増加させるのに対して、Ｂｃｌ−２はタンパク質産生を減少させた（ＷＯ０３／０８３０９３を参照のこと）。さらなる例には、培養物中のＳｐ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５８１、以後Ｓｐ２／０と呼ぶ）細胞の生存を延長するためにＢｃｌ−２タンパク質の発現を使用した実験が記載されているが、Ｂｃｌ−２発現クローンの細胞密度はその親培養物の細胞密度より２０〜５０％低く、生物医薬品産業におけるその実用的な適用への関心が高まっている（ＷＯ０３／０４０３７４を参照のこと）。したがって、組換えタンパク質の高レベル発現のための改良宿主細胞および宿主細胞における組換えタンパク質産生、特に抗体および抗体フラグメント、多重特異性抗体、フラグメント、および一本鎖構築物、ペプチド、酵素、成長因子、ホルモン、インターロイキン、インターフェロン、およびワクチンの産生を確実に増加させる方法が非常に望ましいことが明らかである。
【発明の開示】
【０００６】
したがって、本発明の目的は、老化を阻害するか細胞生存を促進する薬剤（例えば、抗アポトーシス剤）の細胞への導入による、細胞培養物の寿命および組換えタンパク質の収率を増加させる改良された宿主細胞および方法を提供することである。このような薬剤の使用により、所望の組換えタンパク質の産生のために使用された培養物中の細胞の寿命および生存度を優先的に増加させ、それに伴ってこのような培養物中の細胞の生産性が増加し、それにより、所望のタンパク質の収率が最適になる。好ましくは、本発明の方法で使用されるアポトーシスインヒビターには、Ｂｃｌ−２およびそのファミリーメンバーが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、細胞クローンの寿命および組換えタンパク質の収率を、ｐ５３およびＲｂなどの細胞内アポトーシス促進性タンパク質レベルをダウンレギュレートするか、Ｂｃｌ−２などの細胞内抗アポトーシス性タンパク質をアップレギュレートする薬剤を細胞に導入することによって改良することができる。好ましくは、本発明の方法で使用される調節剤には、ヒト乳頭腫ウイルス１６型（ＨＰＶ−１６）の腫瘍性タンパク質Ｅ６およびＥ７ならびにその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。さらに、本明細書中に記載のカスパーゼインヒビターはまた、アポトーシスの遮断または減少に寄与し、それにより、細胞生存が増加し、培養物中の細胞による組換えタンパク質産生が増加し得る。これらの培養物中で組換えタンパク質の産生を増強するために使用することができる抗アポトーシス剤のさらなるクラスには、エリスロポエチン（ＥＰＯ）などのサイトカインＩ型スーパーファミリーの特定のメンバーが含まれる。このクラスの代表的な分子としてのＥＰＯは、赤血球だけでなく複数の細胞型のアポトーシスの主な修飾因子であり、それにより、内皮細胞、心筋細胞、腎臓の尿細管上皮細胞、皮膚、およびニューロンなどにおいてより一般的な細胞保護機能を有する[Ｐ．Ｇｈｅｚｚｉ  ａｎｄ  Ｍ．Ｂｒｉｎｅｓ，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  １１（ｓｕｐｐｌ．１），ｓ３７−ｓ４４，Ｊｕｌｙ  ２００４の概説を参照のこと]。
【０００７】
本発明はまた、細胞培養物の寿命が増加し、および／または最適になり、所望の組換えタンパク質の収率が増加する細胞培養条件をもたらすための因子（トランスフェクションベクター、所望の性質を有する細胞クローンの分泌および選択、細胞培養培地、増殖条件、バイオリアクターの配置、および細胞型が含まれるが、これらに限定されない）の新規の組み合わせを組み込んだ細胞培養法を教示する。これらの細胞培養方法には、懸濁産生法、灌流産生法、および流加産生法が含まれる。Ｔｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７９：１４７−１５９（２０００）；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７９：１７１−１８１（２００４）；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．５５：７８３−７９２（１９９７）を参照のこと。
【０００８】
他で定義しない限り、本発明で使用した全ての技術用語および科学用語は、当業者に一般に理解されている意味を有する。さらに、本明細書中に引用した全ての特許および他の引例の内容全体が、本明細書中に参照することにより組み込まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、改良された組成物（宿主細胞株を含む）およびこのような細胞株中での組換えタンパク質の産生を増強する方法を提供する。１つまたは複数の抗アポトーシス性遺伝子を構成的に発現し、この抗アポトーシス性遺伝子の発現によって培養物中のトランスフェクション細胞の生存が延長されて目的のタンパク質またはペプチドの収率が増強される、目的のタンパク質またはペプチドをコードする発現構築物でトランスフェクトすることができる細胞株を作製した。
【００１０】
詳細には、本発明者らは、Ｓｐ２／０骨髄腫細胞株から、バッチ培養における生存が増強されたＳｐ−Ｅ２６およびＳｐ−ＥＥＥと呼ばれる２つの新規の細胞株を作製した。Ｓｐ−Ｅ２６およびＳｐ−ＥＥＥは、それぞれ、ＨＰＶ−１６のＥ６およびＥ７タンパク質ならびにＢｃｌ−２変異体（Ｂｃｌ−２−ＥＥＥと呼ばれる）を構成的に発現する。さらに、目的の組換えタンパク質のための発現ベクターでのＳｐ−Ｅ２６またはＳｐ−ＥＥＥのいずれかのトランスフェクションの際に、組換えタンパク質産生、特に、組換え抗体および抗体フラグメントの産生を改良することができる。Ｅ６／Ｅ７またはＢｃｌ−２−ＥＥＥタンパク質は、宿主細胞におけるアポトーシスの誘導を遅延させ、宿主細胞における組換えタンパク質産生を増強する。１つまたは複数のカスパーゼインヒビター（例えば、カスパーゼ１インヒビターおよび／またはカスパーゼ３インヒビター）の添加（Ｂｉｎ  Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｅｐｈｒｏｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  ２００４；９６：ｅ３９−ｅ５１）および／またはサイトカインＩ型スーパーファミリーの１つまたは複数のメンバー（エリスロポエチン（ＥＰＯ）など）の細胞の増殖培地への添加の添加によって、タンパク質産生をなおさらに高めることができる。これに関して、ｐａｎ−カスパーゼインヒビターが特に有効である。
【００１１】
本発明者らはまた、アポトーシスインヒビター（Ｂｃｌ−２など）の同時発現によって宿主細胞中で抗体または抗体フラグメントなどの組換えタンパク質の産生を有意に増強することができることを見出した。特に、抗体または抗体フラグメントをコードする発現ベクターで安定にトランスフェクトされ、アポトーシスインヒビター（Ｂｃｌ−２など）をコードする発現ベクターで同時トランスフェクトした骨髄腫細胞株（Ｓｐ２／０など）において、タンパク質産生が有意に増強される。Ｅ６／Ｅ７遺伝子でトランスフェクトした宿主細胞で抗体産生を増加させることもできる。細胞の増殖培地への１つまたは複数のカスパーゼインヒビターの添加によって、組換えタンパク質産生をいっそう高めることができる。これに関して、ｐａｎ−カスパーゼインヒビターが特に有効である。また、細胞培養培地へのＥＰＯ（すなわち、別の抗アポトーシス性サイトカイン）の供給によって、組換えタンパク質の産生を増強することができる。
【００１２】
アポトーシスと呼ばれる生理学的細胞死（すなわち、プログラム細胞死）（Ｋｅｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．，２６：２３９−２５７，１９７２）は、適切な組織の発達および維持に不可欠であり、進化過程で保存されている内因性遺伝子プログラムによって調節される（Ｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，７，６６３−６９８，１９９１）。したがって、人工的環境で（エクスビボ培養物などで）細胞が増殖する場合、この遺伝子の素質によって寿命に限度がある。したがって、医薬品および産業ならびに研究で使用されるタンパク質の産生のためのこのような細胞培養物の有用性は、このような培養物がアポトーシス機構によって死滅する前に寿命（すなわち、周期）が長期間維持されることに依存する。
【００１３】
アポトーシス効果からの細胞周期の区別によって、細胞増殖および細胞死事象と無関係に作用する方法および薬剤を発見した。Ｂｃｌ−２は、周知のアポトーシスの細胞内調節因子であり（Ｖａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３５，４４０−２，１９８８）、細胞周期に入ることに対するその阻害的影響とは遺伝的に異なる抗アポトーシス効果を有することが見出されているがん原遺伝子である（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  １６，４６２８−３８，１９９７）。Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘL、およびＢｃｌ−ｗの２つのホモログも細胞生存を延長させるが、Ｂｃｌ−２ファミリーの他のメンバー（ＢａｘおよびＢａｋなど）はアポトーシス促進性を示す（Ｏｌｔｖａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７４，６０９−１９，１９９３；Ｃｈｉｔｔｅｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４，７３３−６，１９９５；Ｆａｒｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４，７３１−３，１９９５；Ｋｉｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４，７３６−９，１９９５）。他の抗アポトーシス性遺伝子には、Ｂｃｌ−６およびＭｃｌ−１が含まれる。
【００１４】
したがって、Ｂｃｌ−２および特定のそのファミリーメンバーは、アポトーシスに対して保護効果を発揮し、それにより、それは、タンパク質産生のために使用される培養物中で特定の宿主細胞の寿命を増加させ、それによって産生および単離されるタンパク質量が増強される方法と仮定される。Ｂリンパ球、特に、骨髄腫細胞によって抗体が産生されるので、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー（Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘL、Ｂｃｌ−ｗ、またはこれらのタンパク質の変異体など）の過剰発現によってアポトーシスが阻害され、それにより、細胞密度が増加し、培養物の生存が長くなる。したがって、他で提案されているように（同節）、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリー遺伝子のトランスフェクションにより、細胞周期自体の妨害によって細胞培養を延長する必要性が回避される。同様に、Ｂｃｌ−２遺伝子での線維芽細胞のトランスフェクションによってこれらの細胞中でＢｃｌ−２が過剰発現され、再度アポトーシスに拮抗作用し、これらの細胞の寿命が増加し、それに伴って組換えタンパク質の産生および単離が増加する。サイトカインの使用中止の際に、インターロイキン−６（ＩＬ−６）依存性マウス骨髄腫細胞は、アポトーシスを受けているかのように期限が切れることも認められた。このような細胞中のＩＬ−６−受容体をＢｃｌ−２またはＢｃｌ−ｘＬによって調節してアポトーシスを延長することができることも見出された（Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５：２２６２−５，１９９５）。
【００１５】
最近の文献もまた、３箇所の点変異（Ｔ６９Ｅ、Ｓ７０Ｅ、およびＳ８７Ｅ）を有する変異Ｂｃｌ−２が、野生型または１箇所の点変異体と比較して、有意により高い抗アポトーシス活性を示すことを証明している（Ｄｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（１０１）１５３−１５８，２００４）。したがって、本発明は、Ｂｃｌ−２−ＥＥＥ三重変異体の発現ベクターの構築を教示し、これを使用してＳｐ２／０細胞をトランスフェクトして、寿命および組換えタンパク質産生が改善されたＳｐ−ＥＥＥクローンおよびサブクローンを作製する。
【００１６】
腫瘍ウイルスなどの他の作用因子はまた、その細胞不死化誘発の一部としてアポトーシスを妨害し、最終的には極めて有害な形質転換（高リスク型ＨＰＶ癌タンパク質Ｅ６およびＥ７など）を完了することができる（Ｆｉｎｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  １８８，１５−２４，２００２）。例えば、ウイルスＥ６タンパク質は、紫外線に対する上皮アポトーシス応答を有効に遮断する（Ｓｔｏｒｅｙ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ８，４１７−２１，２００２）。状況証拠から、ヒト乳頭腫ウイルスによって扁平上皮癌（基底細胞癌ではない）におけるアポトーシスを減少させることができる（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８７，３１９−２３，２００２）。しかし、全ての乳頭腫ウイルスの癌タンパク質が抗アポトーシス効果を有するわけではない。例えば、他の研究では、ウシ種の乳頭腫ウイルスＥ６タンパク質が細胞にアポトーシス感受性を与えると報告されており（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２９５，２３０−７，２００２）、これは、ＨＰＶ−１６  Ｅ７遺伝子が、一定の刺激によって誘導されたアポトーシスから星状細胞を防御することを示す他の研究（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｏｎｓｅｉ  Ｍｅｄ  Ｊ  ４２，４７１−９，２００１）と対照的である。Ｅ６結合タンパク質アプタマーの使用により、ＨＰＶ  Ｅ６癌タンパク質がＨＰＶ陽性腫瘍細胞において抗アポトーシス活性を有するという直接的な実験による証拠が得られた（Ｂｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７，６６９３−７，２０００）。しかし、他のＨＰＶ癌タンパク質は逆の効果を有することができ、Ｅ２タンパク質は他のＨＰＶタンパク質の非存在下でアポトーシスを誘導する（Ｗｅｂｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５，８７−９４，２０００）。Ｅ６およびＥ７タンパク質の連続的発現には、子宮頸癌細胞の最適な増殖および２つのウイルスタンパク質が細胞生存に対して異なる効果を発揮することが必要であることが知られている（ＤｅＦｉｌｉｐｐｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７，１５５１−６３，２００３）。ＨＰＶ−１６  Ｅ６に寄与する主な細胞内標的はｐ５３である。Ｅ６は、ｐ５３および細胞ユビキチンリガーゼと三重複合体（Ｅ６ＡＰ）を形成し、それにより、プロテオソーム経路およびｐ５３の不活化によってｐ５３をユビキチン化して分解する。他方では、ＨＰＶ−１６  Ｅ７タンパク質は、腫瘍抑制タンパク質Ｒｂと相互作用して不安定にする。さらに、アポトーシスおよび細胞周期経路に関与する種々の他の細胞内タンパク質のレベルは、Ｅ６およびＥ７形質転換（Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、ｐ７３、ＭＤＭ２、ｐ２１、サイクリンおよびｃｄｃ、ｃｄｋタンパク質など）によって調節されることが報告されていた。これらのタンパク質発現の変化は、細胞の生理学的特性に非常に影響を与える。したがって、本発明者らは、培養物中でのＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７による細胞のトランスフェクションが加齢培養条件誘導性アポトーシスに耐性を示す遺伝子操作されたクローンの生成に非常に有効であり、それにより、細胞培養物の寿命が延長されるという仮説を立てた。ＨＰＶ−１６��タンパク質Ｅ７またはＥ６のみのいずれかの細胞への導入が、加齢培養条件誘導性アポトーシス耐性が改良された遺伝子操作されたクローンの生成に十分であり得るとも仮定した。細胞が組換えタンパク質産生クローンである場合、生理学的性質の改良により、全タンパク質生産性が増強される。
【００１７】
＜ウイルス抗アポトーシス遺伝子を発現する新規の宿主細胞の生成＞
ウイルス抗アポトーシス性遺伝子（ＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７タンパク質など）を構成的に発現する宿主細胞（骨髄腫宿主細胞など）を生成することができる。これらの宿主細胞を、目的の組換えタンパク質をコードする発現ベクターでトランスフェクトすることができ、抗アポトーシス性遺伝子の同時発現により、組換えタンパク質の産生が有意に増加する。
【００１８】
宿主細胞は、本質的に、ウイルス抗アポトーシス性遺伝子で安定に形質転換することができる組換えタンパク質の産生に適切な任意の宿主細胞であり得る。多数の組換えタンパク質について、ＣＨＯおよびＣＯＳ細胞などの宿主細胞が有利である一方で、抗体などの他のタンパク質については、骨髄腫細胞およびＣＨＯ細胞などの宿主細胞を一般的に選択する。遺伝子が構成的または誘導的に発現される任意の適切な方法（すなわち、宿主細胞の染色体に遺伝子が安定に組み込まれる一方で、遺伝子が発現される任意の方法）によって、ウイルス遺伝子を宿主細胞に導入することができる。目的の遺伝子で宿主細胞を安定に形質転換する方法は、当分野で周知である。特に有利な方法は、ウイルス抗アポトーシス性遺伝子をコードするレトロウイルスベクターを使用することである。適切なベクターには、ＬＳＸＮベクターが含まれる（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７，９８０−９０，１９８９）。
【００１９】
有利には、宿主細胞をトランスフェクトするために使用されるベクターは、ベクターを含む細胞が選択される選択マーカーを含む。適切な選択マーカー（トランスフェクション細胞に抗生物質耐性を付与する酵素など）は、当分野で周知である。トランスフェクション後、選択剤（抗生物質など）を含む培地中に細胞を維持し、マーカー耐性についてスクリーニングする。細胞を選択し、従来の方法を使用した限界希釈によってクローニングすることができる。
【００２０】
ウイルス抗アポトーシス性遺伝子が細胞生存度を増加させる能力を、アポトーシスを誘導する薬剤（シクロヘキシミド（ＣＨＸ）など）での細胞の攻撃誘発によって試験することができる。ウイルス抗アポトーシス性遺伝子を発現しない細胞が有意なアポトーシスの発症を示す傾向があるのに対して、この遺伝子を発現する細胞がアポトーシス活性を劇的に減少させる。アポトーシスの検出方法は当分野で周知であり、例えば、細胞表面ＦＩＴＣ−アネキシンＶ結合アッセイ、ＤＮＡラダリングアッセイ、およびＴＵＮＥＬアッセイが含まれる。ウイルス抗アポトーシス遺伝子を発現する適切な細胞の選択の際、細胞を、最適な組換えタンパク質をコードする発現ベクターでトランスフェクトすることができる。発現ベクターは、一過性発現に適切なベクターにすることができ、真核生物複製起点を含むエピソームベクターまたは安定に組み込まれ、その後に発現カセットの遺伝子が増幅する増幅ベクターとすることができる。適切なベクターは当分野で周知であり、例えば、特に、抗体および抗体フラグメントの産生に適切なｐｄＨＬ２ベクターが含まれる。増幅発現カセットを使用する場合、レトロウイルスベクター中で使用される選択マーカーと異なり、トランスフェクション細胞が選択される選択マーカーを含むことが有利である。再度、適切にトランスフェクトされた細胞を選択し、その後に限界希釈によってクローニングすることができる。
【００２１】
適切なクローンの選択の際、細胞を適切な培地に入れ、培養して、目的の所望のタンパク質を産生することができる。培地は、血清を含むことができるが、好ましくは、無血清である。さらに、細胞の寿命およびタンパク質産生を、培養培地への１つまたは複数のカスパーゼインヒビター（例えば、カスパーゼ１または３）の添加によって増加させることができる。好ましくは、カスパーゼインヒビターは、１つまたは複数のカスパーゼ３、カスパーゼ９、および／またはカスパーゼ１２を阻害するように作用する。細胞透過性カスパーゼインヒビターを使用することが有利であり、ｐａｎ−カスパーゼインヒビターが特に有利である。Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋおよびＡｃ−ＤＥＶＤ−ｃｈｏなどの適切なインヒビターが当分野で周知である。あるいは、カスパーゼインヒビター（ＡｖｅｎまたはＸＩＡＰなど）を発現するように細胞株をさらにトランスフェクトして、アポトーシスに影響を及ぼすことによってその増殖特性を増強することができる。これに関して、サイトカインＩ型スーパーファミリーの特定のメンバー（ＥＰＯなど）はまた、抗アポトーシス性作用および細胞保護作用を有することによって細胞生存を増加させることができる。上記の方法により、本質的に任意の所望の遺伝子によるトランスフェクションに使用することができる細胞株を生成することができる。しかし、当業者は、所望のタンパク質、特に、組換えタンパク質を構成的に発現する樹立細胞株を、その後にウイルスまたはＢｃｌ−２ファミリー抗アポトーシス性遺伝子をコードする適切なベクターで形質転換することができることを認識している。以下の実施例２を参照のこと。
【００２２】
目的のタンパク質は、本質的に、宿主細胞中で検出可能な量で産生することができる任意のタンパク質であり得る。例には、伝統的なＩｇＧ型抗体、Ｆ（ａｂ’）2またはＦａｂフラグメント、ｓｃＦｖ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ＩｇＧ−ｓｃＦｖまたはＦａｂ−ｓｃＦｖ融合抗体、ＩｇＧ−またはＦａｂ−ペプチド毒素融合タンパク質、またはワクチン（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、またはＣ型肝炎；ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、乳頭腫ウイルス、疱疹ウイルス、ハンターンウイルス、エボラウイルス、ロタウイルス、サイトメガロウイルス、リーシュマニアＲＮＡウイルス、ＳＡＲＳ、マラリア、結核（放線菌）、炭疽、天然痘、野兎病、およびｗｗｗ．ｖａｃｃｉｎｅｓ．ｏｒｇ（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に列挙されている他のワクチンが含まれるが、これらに限定されない）が含まれる。本明細書中に記載の宿主細胞は、実施例１および２に記載の骨髄種細胞株中での抗体および抗体フラグメントならびに組換え成長因子（例えば、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、トロンボポエチン）、ホルモン、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−３１）、インターフェロン（例えば、α、β、γ、およびコンセンサス）、ならびに酵素の高度に有効な産生に特に適切である。これらの方法を、組換えタンパク質の産生で使用される任意の多数の細胞株（他の骨髄腫細胞株（マウスのＮＳＯまたはラットＹＢ２／０など）；上皮株（ＣＨＯおよびＨＥＫ  ２９３など）；間葉細胞株（線維芽細胞株ＣＯＳ−１またはＣＯＳ−７など）；およびニューロン細胞（網膜細胞、膠細胞、および神経膠種細胞など）が含まれる）に適用することができる。
【００２３】
＜アポトーシス性インヒビターを発現する細胞中での組換え抗体発現＞
以前の研究では、キメラ抗体を産生する組換えＣＨＯ細胞中で同時発現するＢｃｌ−２（天然に存在するアポトーシスインヒビター）の効果が記載されている。Ｔｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６８：３１−４３（２０００）を参照のこと。細胞培養物の寿命の増加が認められるにもかかわらず、Ｂｃｌ−２発現を欠いた等価な細胞では抗体産生は増加しなかった。しかし、本発明者らは、細胞がＢｃｌ−２も発現する場合、骨髄腫細胞からの組換え抗体の産生が有意に増加することを見出した。
【００２４】
有利には、骨髄腫細胞株を、抗体または抗体フラグメントをコードする発現カセットで安定にトランスフェクトする。適切な発現カセットは、上記の選択マーカーと共に抗体の重鎖および軽鎖の発現（ｓｃＦｖの場合、一本鎖）を調節する１つまたは複数のプロモーターを含む。特に有用なベクターは、選択マーカー酵素をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む選択マーカー遺伝子、目的のタンパク質をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む転写単位、第１のエンハンサーの非存在下での選択マーカー遺伝子および第１の転写単位の両方の転写と比較して、選択マーカー遺伝子および第１の転写単位の両方の転写を刺激する、選択マーカー遺伝子と転写単位との間のエンハンサーエレメントを含むｐｄＨＬ２である。ベクターはまた、第１のエンハンサーと選択マーカー遺伝子との間に存在するプロモーターを有し、選択マーカー遺伝子の転写刺激を選択的に軽減させる遮断エレメントを含む。ＶH配列およびＶL配列を、ｐｄＨＬ２にライゲーションすることができ、ｐｄＨＬ２は、ヒト軽鎖定常領域、重鎖定常領域、増幅可能なｄｈｆｒ遺伝子（それぞれ、別のプロモーターによって調節される）の配列を含む増幅可能なベクターである。Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ２：１８４，（１９９６）およびＬｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ８０：２６６０−２６６７，（１９９７）を参照のこと。このベクターを、例えば、エレクトロポレーションによって細胞にトランスフェクトすることができる。培養培地への０．１μＭまたは適切な濃度のメトトレキセート（ＭＴＸ）の添加によって選択することができる。３μＭまでまたはそれを超える漸増濃度のＭＴＸを使用した段階的様式で増幅することができる。したがって、発現カセットで安定にトランスフェクトされ、目的の抗体を構成的に発現する細胞を得ることができ、当分野で周知の方法を使用して特徴づけることができる。以下の実施例４も参照のこと。選択およびクローニング後、抗体発現細胞株を、Ｂｃｌ−２などの抗アポトーシス性遺伝子をコードする発現ベクターでトランスフェクトすることができる。例えば、ＳＶ４０プロモーターに融合したＢｃｌ−２遺伝子を含むベクターｐＺｅｏＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、エレクトロポレーションなどの適切な方法を使用して細胞にトランスフェクトし、必要に応じて選択および遺伝子の増幅を行うことができる。上記のように得られた細胞株を使用して抗体を産生し、アポトーシス性インヒビターを発現しない細胞における産生と比較することができる。
【００２５】
本方法は、抗体または抗体フラグメントを発現する細胞株の最初の調製およびその後のＢｃｌ−２または類似のインヒビターを発現するベクターでのトランスフェクションを記載する。しかし、当業者は、Ｂｃｌ−２または他の抗アポトーシス性タンパク質を構成的に発現する細胞株を樹立し、その後に抗体または抗体フラグメントをコードする適切なベクターにより形質転換することができることを認識する。本発明を説明する代表例を以下に示す。実施例１は、ＨＰＶ−１６  Ｅ６／Ｅ７のＳｐ２／０細胞への組み込みによってアポトーシスを減少／遅延することを特徴とする改良された細胞クローンＳｐ−Ｅ２６が得られることを記載している。実施例２は、ＨＰＶ−１６  Ｅ７エレメントのみの過剰発現によって宿主細胞株を改良する方法を記載している。実施例３は、組換えＡｂを産生する細胞クローンを開発するための宿主として改良された細胞Ｓｐ−Ｅ２６の使用を記載している。実施例４は、Ｅ６／Ｅ７エレメントを同時発現する抗体産生細胞株で認められたＭａｂ産生の増強を説明している。実施例５は、３つの点変異を有する変異Ｂｃｌ−２（Ｂｃｌ−２−ＥＥＥ）を構成的に発現し、寿命が改良された修飾Ｓｐ２／０細胞株の生成および特徴付けを記載している。実施例６は、Ｂｃｌ−２を発現する抗体産生細胞株の増殖特性の改良を記載している。実施例７は、実施例６のＢｃｌ−２発現細胞株で認められたＭＡｂ産生の増強を記載している。実施例８は、細胞中のＢｃｌ−２発現の導入による低レベル組換えタンパク質を産生する細胞クローンの改良方法を記載している。実施例９は、細胞中でのＢｃｌ−２発現の導入によるＳｐ−Ｅ２６の改良方法を記載している。実施例１０は、組換えＡｂを産生する細胞クローンを開発するための宿主としての改良された細胞株（Ｓｐ−ＥＥＥ）の使用を記載している。実施例１１は、収率を最適にするための流加反応器のプロフィールおよび供給スケジュールの使用を記載している。
【実施例１】
【００２６】
＜ＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７遺伝子の安定な発現によるアポトーシス耐性細胞クローンの生成＞
＜ＣＨＸ処理に耐性を示す細胞クローンの選択＞
Ｓｐ２／０細胞を、ＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７遺伝子の発現カセットを含むＬＸＳＮレトロウイルスベクターによって１０：１のＭＯＩ（感染多重度）で形質導入した。２４時間後の回収後、感染細胞を、Ｇ４１８（１０００μｇ／ｍｌ）中で１０日間選択した。Ｇ４１８耐性細胞を、限界希釈（０．５細胞／ウェル）によって９６ウェル細胞培養プレート中でクローニングした。安定な感染細胞を、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）（強力なアポトーシス誘導剤）による処理に対しての耐性についてスクリーニングした。簡単に述べれば、健康な細胞（生存度９５％超、図１ＣおよびＤ）を、２５μｇ／ｍｌのＣＨＸを含む培地中でインキュベートし、顕微鏡下で細胞の形態を調査した。２〜３時間のインキュベーション後に５０％を超える親Ｓｐ２／０細胞の形態が変化し、断片化されるようになり（図１Ａ）、いくつかのＥ６／Ｅ７トランスフェクションクローンの形態変化の範囲が狭く、アポトーシス耐性を示す。Ｓｐ−Ｅ２６と呼ばれる最良のクローンは、４時間の処理で明らかな形態の変化は認められなかった（図１Ｂ）。
【００２７】
面倒な目視試験を回避するために、ＭＴＴアッセイを使用して、生存細胞集団の変化を得ることができる。健康な細胞を、ＣＨＸを含むか含まない通常の培養条件下で２〜３時間インキュベートした後、ＭＴＴ色素をウェルに添加した。さらなる２時間のインキュベーション後、ＳＤＳおよびＨＣｌを含む溶解緩衝液の添加によって細胞を可溶化した。プレートを、３７℃で一晩インキュベートし、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して５９０ｎｍのＯＤを読み取った。図２に示すように、Ｓｐ２／０細胞をＣＨＸで処理した場合に生存細胞集団がわずかに減少した。比較により、同一の処理条件下で（ＣＨＸ濃度および時間）、Ｓｐ−Ｅ２６細胞は、ＣＨＸ処理に対してより耐性を示した。これに関して、さらなる分析のために多数のクローンをスクリーニングし、選択した（図２）。
【００２８】
＜Ｓｐ−Ｅ２６の抗アポトーシス特性＞
Ｓｐ−Ｅ２６および親Ｓｐ２／０細胞におけるＣＨＸ誘導性アポトーシスを、アネキシンＶ染色およびＤＮＡ断片化アッセイによって評価した。２５μｇ／ｍｌのＣＨＸを含む培地中でのインキュベーション後、細胞を回収し、Ｇｕａｖａ  Ｎｅｘｉｎ試薬（アネキシンＶ染色の等価物）で染色し、Ｇｕａｖａパーソナル細胞分析システム（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して分析した。図３は、約１．５時間ＣＨＸ処理に曝露した場合に３０％を超えるＳｐ２／０細胞がアネキシンＶ陽性になる（アポトーシスを示す）一方で、Ｓｐ−Ｅ２６は健康なままであり、初期アポトーシス細胞中で増加しないことを示す。
【００２９】
細胞内オリゴヌクレオソームＤＮＡフラグメント（アポトーシスの特質）形成の分析によって、ＣＨＸによるアポトーシスの誘導を明らかにすることができる。細胞ＤＮＡを、ＣＨＸ処理および未処理Ｓｐ−Ｅ２６およびＳｐ２／０細胞から抽出し、ＤＮＡラダリングアッセイを行った。Ｓｐ２／０細胞をＣＨＸで処理し、多数のＤＮＡ断片化が検出された（図４）。対照的に、同一の処理条件下で、Ｓｐ−Ｅ２６のゲノムＤＮＡは依然として無傷のままであり、ＤＮＡ断片化の外観は認められなかった（図４）。
【００３０】
＜Ｓｐ−Ｅ２６中のＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７遺伝子の存在＞
Ｅ６およびＥ７遺伝子がＳｐ−Ｅ２６細胞のゲノム中に安定に存在することを確認するために、Ｅ６およびＥ７遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーをデザインし、テンプレートしてＳｐ−Ｅ２６から抽出したゲノムＤＮＡとのＰＣＲ反応で使用し、約７００ｂｐのＤＮＡフラグメントを得た。ＰＣＲ産物をクローニングし、ＤＮＡ配列決定によってＥ６およびＥ７遺伝子であることを確認した。親Ｓｐ２／０細胞中にＥ６およびＥ７遺伝子が検出された。
【００３１】
＜Ｓｐ−Ｅ２６の増殖特性の改良＞
Ｔフラスコ（図５）および３Ｌバッチバイオリアクター（図６）Ｓｐ−Ｅ２６の増殖特性を評価した。Ｓｐ−Ｅ２６は、バッチ培養において親Ｓｐ２／０細胞よりも改良された増殖特性を示し、より高い最大細胞密度およびより長い生存期間が達成された。
【実施例２】
【００３２】
＜ＨＰＶ１６  Ｅ７遺伝子の安定な過剰発現によるアポトーシス耐性細胞クローンの生成＞
クローンＳｐ−Ｅ２６のゲノムに組み込まれたポリシストロン性ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７遺伝子の構造を、プライマー対Ｅ６−Ｎ８+（５’−ＡＴＧ  ＴＴＴ  ＣＡＧ  ＧＡＣ  ＣＣＡ  ＣＡＧ  ＧＡＧ  ＣＧＡ−３’）およびＥ７−Ｃ８-（５’−ＴＴＡ  ＴＧＧ  ＴＴＴ  ＣＴＧ  ＡＧＡ  ＡＣＡ  ＧＡＴ  ＧＧＧ−３’）を使用したＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定によって分析した。プライマーＥ６−Ｎ８+およびＥ７−Ｃ８-の配列は、Ｅ６のＮ末端８アミノ酸残基のコード配列およびＥ７のＣ末端８コドンの相補配列とそれぞれ適合するので、全長Ｅ６およびＥ７のアンプリコンは、約８５０ｂｐであると予想される。しかし、Ｅ６−Ｎ８+およびＥ７−Ｃ８-を使用したＳｐ−Ｅ２６細胞から調製したゲノムＤＮＡの増幅により、約７００ｂｐのＰＣＲフラグメントしか得られなかった。７００ｂｐのＰＣＲ産物のＤＮＡ配列決定により、Ｅ６遺伝子からの１８２ポリヌクレオチドフラグメントの欠失が明らかとなった。欠損Ｅ６遺伝子は、スプライシングに起因する可能性が高く、Ｎ末端４３アミノ酸残基を有する短縮Ｅ６ペプチドをコードする。Ｅ６による主な生理活性がｐ５３発現のダウンレギュレート能力であることを考慮すると、Ｓｐ−Ｅ２６中のｐ５３レベルがＳｐ２／０よりも安定であることが見出されているので、短縮Ｅ６タンパク質は、おそらく、十分に機能的ではない。
【００３３】
したがって、ＨＰＶ−１６  Ｅ７遺伝子のみで抗アポトーシス効果を有し、Ｓｐ２／０細胞の増殖特性を改良するのに十分であるかどうかを評価するために、ＨＰＶ−１６  Ｅ７でのＳｐ２／０細胞のトランスフェクションを、以下のように行った。
（ｉ）Ｅ７をコードするＤＮＡ配列を、ＲＴ−ＰＣＲによってＳｐ−Ｅ２６細胞からクローニングする。哺乳動物ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）への遺伝子のライゲーションを容易にするために、適切な制限部位を導入する。Ｅ７ｐＲｃと命名されたベクター内でのウイルス遺伝子の転写は、ＣＭＶプロモーター−エンハンサー配列から誘導される。ベクターはまた、ＳＶ４０プロモーターから転写されるネオマイシン耐性を付与する遺伝子を含む。
（ｉｉ）Ｓｐ２／０細胞を、ＨＰＶ−１６Ｅ７遺伝子の発現カセットを含む発現ベクターによってトランスフェクトする。簡単に述べれば、５μｇのＥ７ｐＲｃを、ＳｃａＩによって線状化し、エレクトロポレーションによって細胞にトランスフェクトする。
（ｉｉｉ）２４時間後の回収後、トランスフェクション細胞を、Ｇ４１８（１０００μｇ／ｍｌ）中で１０日間選択する。
（ｉｖ）次いで、Ｇ４１８耐性細胞を、限界希釈（０．５細胞／ウェル）によって９６ウェル細胞培養プレート中でクローニングする。安定なトランスフェクタントを選択し、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）（強力なアポトーシス誘導剤）によって治療耐性についてスクリーニングする。
（ｖ）健康な細胞（生存度９５％超）を、通常の培養条件下で２５μｇ／ｍｌのＣＨＸを含むまたは含まない培地中で３〜４時間のインキュベーション後、ＭＴＴ色素をウェルに添加する。さらなる２時間のインキュベーション後、ＳＤＳおよびＨＣｌを含む溶解緩衝液の添加によって細胞を可溶化する。プレートを、３７℃で一晩インキュベートし、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して５９０ｎｍのＯＤを読み取る。さらなる分析のためにＣＨＸ処理に耐性を示す細胞クローンを選択し、拡大する。
（ｖｉ）Ｅ７トランスフェクション細胞の抗アポトーシス性を、アネキシンＶ染色およびＤＮＡ断片化アッセイによって評価する。アネキシンＶアッセイでは、２５μｇ／ｍｌのＣＨＸを含む培地中でのインキュベーション後、細胞を回収し、Ｇｕａｖａ  Ｎｅｘｉｎ試薬（アネキシンＶ染色の等価物）で染色し、Ｇｕａｖａパーソナル細胞分析システム（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して分析する。ＤＮＡ断片化アッセイでは、細胞ＤＮＡを、ＣＨＸ処理および未処理Ｅ７トランスフェクタントおよびＳｐ２／０細胞から抽出し、アガロースゲル電気泳動で分析する。
（ｖｉｉ）Ｅ７トランスフェクタント中のウイルス癌遺伝子の発現を、サザンブロット分析（ゲノムレベル）、ノーザンブロット分析（ｍＲＮＡレベル）、および免疫ブロット分析（タンパク質レベル）によって評価する。アポトーシス過程に関与し、Ｅ７タンパク質に影響を受ける細胞内タンパク質の発現を、免疫ブロッティング分析によって試験する。
（ｖｉｉｉ）選択されたＥ７トランスフェクタントの増殖特性を、Ｔ−フラスコ中および３Ｌバッチバイオリアクター中で評価する。トランスフェクタントは、バッチ培養において親Ｓｐ２／０細胞よりも改良された増殖特性を示し（より高い最大細胞密度およびより長い生存期間が達成され）、より良好な宿主細胞と見なされる。
【実施例３】
【００３４】
＜Ｓｐ−Ｅ２６中でのｈＬＬ２  ＩｇＧの高レベル発現＞
この実施例では、Ｓｐ−Ｅ２６を、ｈＬＬ２（ＮＨＬ患者および自己免疫疾患患者を治療するために開発されたヒト化抗ＣＤ２２Ａｂ）を産生する細胞クローンを生成するための宿主として使用する。ｈＬＬ２産生クローン（８７−２−Ｃ９）は、以前に宿主としてＳｐ２／０細胞を使用することによって生成され（Ｌｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ８０，２６６０−２６６６，１９９７）、この場合、トランスフェクション後に１つの陽性クローンのみが同定され（約２．５×１０-7の頻度）、増幅前のＴ−フラスコにおけるコンディション最終培養培地中の抗体濃度として定義されたｈＬＬ２産生クローンのみの最大生産性（Ｐmax）は、１．４ｍｇ／Ｌであった。Ｌｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ  ８０，２６６０−２６６６，１９９７）によって記載された類似の方法の使用による同一のｈＬＬ２ｐｄＨＬ２ベクターでのＳｐ−Ｅ２６細胞のトランスフェクションにより、２００個を超える安定なｈＬＬ２産生クローンが得られた（１０-4を超える頻度）。１２個の無作為に選択したクローンのＰmaxを評価し、１３ｍｇ／Ｌと１７０ｍｇ／Ｌとの間であり、平均５０ｍｇ／Ｌであることが見出された。これらのクローンの生産性を、ＭＴＸでの遺伝子増幅によってさらに増強することができる。この実施例により、組換えタンパク質を産生する細胞クローンの開発のための宿主としてＳｐ−Ｅ２６を使用することがその親Ｓｐ２／０細胞よりも有利であることが証明された。
【実施例４】
【００３５】
＜ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７遺伝子の安定な発現によるＡｂ産生細胞株の改良＞
６０７−３ｕ−８細胞をトランスフェクションによってＳｐ２／０から最初に生成し、ヒト化モノクローナルＡｂを産生した。最大（Ａｂ）生産性を１５０ｍｇ／Ｌまで増強する（培養培地中の血清補足のウィーニング（ｗｅａｎｉｎｇ）後に約１００ｍｇ／Ｌに減少した）ために、（ＭＴＸでの）遺伝子の増幅およびサブクローニングによってクローンを開発した。無血清条件下でより高い抗体生産性を得るために、ＨＰＶ−１６のＥ６／Ｅ７遺伝子を、６０７−３ｕ−８に導入し、Ａｂ生産性に対するＥ６／Ｅ７の効果を以下のように評価した。１０％ＦＢＳおよび３μＭのＭＴＸを補足したＨＳＦＭ中で維持した６０７−３ｕ−８細胞を、ＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７遺伝子の発現カセットを含むＬＸＳＮレトロウイルスベクターで１０：１のＭＯＩで形質導入した。２４時間後の回収後、安定にトランスフェクトされた細胞を、Ｇ４１８（４００μｇ／ｍｌ）中で１０日間選択した。Ｇ４１８耐性細胞を、限界希釈（０．５細胞／ウェル）によって９６ウェル細胞培養プレート中でサブクローニングした。評価のために６０７Ｅ１Ｃ１２と命名した生存クローンを得た。Ｅ６／Ｅ７トランスフェクションを行っていない６０７−３ｕ−８−７Ｇ７および６０７−３ｕ−８−２Ｄ１０と命名された６０７−３ｕ−８の２つのサブクローンも選択した。これら３つのクローンのＰmaxを決定し、有意差はなかった（表１）。これらの結果により、細胞へのＥ６／Ｅ７遺伝子の導入によって細胞のＡｂ産生能力は変化しないことが示唆される。次に、６０７Ｅ１Ｃ１２、６０７−３ｕ−８−７Ｇ７、および６０７−３ｕ−８−２Ｄ１０を、無血清培地中で増殖するように適合させ、これらのクローンの生産性を決定した。全細胞を、無血清培地を含む増殖ウェル中で増殖させた。クローン６０７Ｅ１Ｃ１２の最終抗体生産性は１５０ｍｇ／Ｌに維持される一方で、Ｅ６／Ｅ７を含まない２つのクローンでは実質的に減少した。さらに、６０７Ｅ１Ｃ１２の生産性は、凍結融解後に（低温保存に対して）安定であった（表１）。
【００３６】
【表１】
2008507300.tif 000003
【実施例５】
【００３７】
＜変異Ｂｃｌ−２を構成的に発現する遺伝子操作されたＳｐ２／０細胞株の生成および特徴付け＞
証拠により、３箇所の点変異（Ｔ６９Ｅ、Ｓ７０Ｅ、およびＳ８７Ｅ）を有する変異Ｂｃｌ−２が、野生型または１箇所の点変異体と比較して、有意により高い抗アポトーシス活性を示すことが示唆される（Ｄｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０１：１５３−１５８，２００４）。したがって、この三重変異体（Ｂｃｌ−２−ＥＥＥと命名する）のための発現ベクターを構築し、これを使用して、特にバイオリアクター中の生存および生産性を増加させるためにＳｐ２／０細胞をトランスフェクトした。クローンを単離し、Ｂｃｌ−２−ＥＥＥ発現レベル、増殖、およびアポトーシス特性について評価した。Ｂｃｌ−２−ＥＥＥの核酸配列を、配列番号３に示し、対応するＢｃｌ−２−ＥＥＥタンパク質のアミノ酸配列を、配列＃４に示す。
【００３８】
ヒトＢｃｌ−２のアミノ酸残基６４〜１０１のコード配列に基づいて、１１６ｂｐの合成ＤＮＡ二重鎖をデザインした。残基６９、７０、および８７のコドン全てを、グルタミン酸のコドン（Ｅ）に変更した。全配列は並外れてＧＣがリッチであり、多数のポリＧおよびポリＣ連続物（ｒｕｎ）が存在する。ＧおよびＣ連続物を破壊するためにいくつかのコドンを保存的に変化させ、全ＧＣ含有量を減少させた。
【００３９】
組み合わせ、長さが１１６ｂｐの配列であり、その３’末端が２２ｂｐ重複した２つの８０量体オリゴヌクレオチドを合成した（配列番号５および６を参照のこと）。オリゴヌクレオチドをアニーリングし、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用したプライマー伸長によって二重鎖ＤＮＡを生成した。ＰＣＲプライマー、Ｂｃｌ−２−ＥＥＥ  ＰＣＲ左（５’−ＴＡＴＡＴＧＧＡＣＣＣＧＧＴＣＧＣＣＡＧＡＧＡＡＧ−３’）およびＢｃｌ−２−ＥＥＥ  ＰＣＲ右（５’−ＴＴＡＡＴＣＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＧＴＣ−３’）を使用して、二重鎖を増幅させた。
【００４０】
次いで、１２６ｂｐの増幅物を、ｐＧｅｍＴ  ＰＣＲクローニングベクターにクローニングした。Ｂｃｌ−２−ＥＥＥ−ｐＧｅｍＴ構築物を、ＴｔｈＩおよびＮｇｏＭＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、１５０ｂｐフラグメントをゲルで単離し、ＴｔｈＩおよびＮｇｏＭＩで消化したｈＢｃｌ−２−ｐｕｃ１９ベクター（ＡＴＣＣ  ７９８０４）でライゲーションして、ｈＢｃｌ−２（ＥＥＥ）−ｐｕｃ１９を生成した。この構築物の配列を確認した。
【００４１】
９４８ｂｐインサートフラグメントを、ＥｃｏＲＩを使用してｈＢｃｌ−２（ＥＥＥ）−ｐｕｃ１９から切り出し、ＥｃｏＲＩで消化したｐＺｅｏＳＶ２＋ベクターとライゲーションし、アルカリホスファターゼで処理した。得られた構築物は、ｈＢｃｌ−２（ＥＥＥ）−ｐＺｅｏＳＶ２＋である。
【００４２】
次いで、Ｓｐ２／０細胞についての標準的なプロトコールにしたがったエレクトロポレーションによって、Ｓｐ２／０細胞（５．６×１０6）を、６０μｇのｈＢｃｌ−２（ＥＥＥ）−ｐＺｅｏＳＶ２＋でトランスフェクトした。細胞を、６つの９６ウェルプレートにプレートし、選択せずに４８時間インキュベートした。２日後、８００μｇ／ｍｌのゼオシンを培地に添加した。
【００４３】
４０ウェル由来の細胞を、２４ウェルプレートに拡大し、抗ｈＢｃｌ−２および抗βアクチンを使用したウェスタンブロットによって分析した。４０個のうちの５個を除けば、中レベル〜高レベルのＢｃｌ−２−ＥＥＥ発現を示した。４つのゲルのうちの１つの結果を、図７に示す。事前に野生型Ｂｃｌ−２でトランスフェクトしたＳｐ２／０由来のｈＭＮ１４細胞株（クローン６６４．Ｂ４）を、正のコントロール（＋）として使用した。Ｄｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．で証明されているように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、Ｂｃｌ−２−ＥＥＥは、野生型Ｂｃｌ−２よりもわずかにゆっくり移動する。
【００４４】
さらなる評価およびサブクローニングのために、３つの強い陽性のウェル（番号７、番号２５、および番号８７）を選択した。限界希釈プレーティングにより、９６ウェルプレートあたりの陽性ウェルは２０未満であり、これにより、各ウェル中の細胞が実際にクローニングされる非常に高い確率が示される（９９％超）。最初に、３つの元のウェル由来の２３個のサブクローンを、抗ｈＢｃｌ−２−ＰＥを使用したＧｕａｖａ  Ｅｘｐｒｅｓｓによって分析した（図８）。結果により、元のウェルが細胞クローンの混合物を含んでいたことが確認された。ウェル番号７から最も強いシグナルを有するクローンが得られ、ウェル番号２５から最も低いシグナルを有するクローンが得られた。さらなる分析のために、クローン７−１２、７−１６、８７−２および８７−１０を拡大した。その後、最初に増殖の遅いサブクローンを同様に分析し、１つのクローン（８７−２９）から任意の他のクローンよりも２０％高いシグナルが得られ、さらなる分析のためにこれを拡大した。２つの高発現ＳＰ−ＥＥＥクローン（８７−２９および７−１６）を、非トランスフェクションＳｐ２／０細胞、Ｒａｊｉ細胞、およびＤａｕｄｉ細胞と比較した（図９）。Ｓｐ−ＥＥＥクローンは、推定上正常な細胞レベルでＢｃｌ−２を発現することが知られているＲａｊｉ細胞およびＤａｕｄｉ細胞より約２０倍発現する。Ｓｐ２／０細胞は、陰性であった。これを、抗Ｂｃｌ−２免疫ブロットによってさらに検証した（図１０）。ヒトＢｃｌ−２特異的抗体を使用してＳｐ２／０細胞中にＢｃｌ−２は検出されず、高タンパク質負荷（５０Ｋ細胞）および長期Ｘ線フィルム曝露でさえも検出されなかった。マウス、ラット、およびヒトのＢｃｌ−２を認識する抗Ｂｃｌ−２  ＭＡｂ（Ｃ−２、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．）を使用した免疫ブロット分析によって、非トランスフェクションＳｐ２／０細胞からいかなるＢｃｌ−２も検出されず、高タンパク質負荷（１００Ｋ細胞）および長期Ｘ線フィルム曝露でさえも検出されなかった（図１０Ｂ）。Ｓｐ２／０細胞中で任意のＢｃｌ−２が発現される場合、クローン８７−２９中のＢｃｌ−２−ＥＥＥより満たない２桁を超えるレベルである。５つのＳｐ−ＥＥＥサブクローンおよびＳｐ２／０細胞の増殖曲線を比較した。３つのＳｐ−ＥＥＥサブクローンは、Ｓｐ２／０細胞よりも明確な利点を示した。これら３つ（７−１２、７−１６、および８７−２９）はまた、最も高いレベルのＢｃｌ−２−ＥＥＥを発現する。７−１２および７−１６は、同起源のウェルに由来し、ほぼ同一の性質を有し（Ｂｃｌ−２−ＥＥＥレベルおよび増殖曲線）、これらは、同一の元のクローンに由来する可能性が高い。最良の２つのＳＰ−ＥＥＥサブクローン（７−１６および８７−２９）を、さらなる評価のために使用した。
【００４５】
１０％、１％、または０％の血清（ウィーニング（ｗｅａｎｉｎｇ）せず）を補足した培地中にクローンをプレートし、細胞密度および生存度をモニタリングした。１０％血清では、８７−２９は高密度まで増殖し、Ｓｐ２／０細胞と比較して４日間を超えて生存が延長された（図１１）。１％血清では、全細胞は、１０％血清で達成された密度の約３５〜４０％に増殖し、Ｂｃｌ−２−ＥＥＥトランスフェクタントは、Ｓｐ２／０に類似の延命効果を有していた（図１２）。無血清培地に直接移した場合、Ｓｐ２／０細胞は６００Ｋ細胞／ｍｌしか増殖せず、８７−２９細胞は２倍の密度で増殖した（図１３）。各血清濃度では、８７−２９細胞は、Ｓｐ２／０細胞よりも４〜６日間長く生存した。
【００４６】
８７−２９のメトトレキセート（ＭＴＸ）感受性を決定した（図１４）。データにより、ＭＴＸ耐性クローンの最初の選択には最小濃度（０．０４μＭ）のＭＴＸで十分であることが示唆される。したがって、Ｓｐ２／０細胞で使用した同一の選択および増幅プロトコールを、ＳＰ−ＥＥＥ細胞に使用することができる。
【００４７】
Ｂｃｌ−２は、生存促進性／抗アポトーシス性タンパク質である。いくつかのグループにより、可動性ループドメイン（ＦＬＤ）を欠くＢｃｌ−２欠失変異体はアポトーシス阻害能力が増強されることが証明されている（Ｆｉｇｕｅｒｏａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７３，２１１−２２２；Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１６，９６８−９７７）。より最近では、リン酸化を模倣するＢｃｌ−２のＦＬＤ中の１〜３つのＳ／Ｔ残基のグルタミン酸への変異により、その抗アポトーシス能力が有意に増強されることが証明されている（Ｄｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００４，ＰＮＡＳ，１０１，１５３−１５８）。三重変異体（Ｔ６９Ｅ、Ｓ７０Ｅ、およびＳ８７Ｅ）は、最も有意に生存が増強された。ここで、本発明は、Ｓｐ２／０細胞を安定にトランスフェクトするために使用される類似のＢｃｌ−２三重変異構築物（Ｂｃｌ−２−ＥＥＥ）の生成を教示する。
【００４８】
上記の全実験は、Ｂｃｌ−２−ＥＥＥの発現によってＳｐ２／０細胞におけるアポトーシス率が減少することを示す。この効果は、クローンの発現レベルが高いほどより低いレベルのクローンより長く生存するという点で、非常に用量に依存した。最良のクローン（８７−２９）は、非トランスフェクションＳｐ２／０細胞と比較して、１５〜２０％高い細胞密度で増殖し、さらに４〜６日間長く生存する。
【００４９】
クローン（８７−２９）中のＢｃｌ−２−ＥＥＥレベルは、Ｄａｕｄｉ細胞またはＲａｊｉ細胞中の通常のレベルの約２０倍である。非トランスフェクションＳｐ２／０細胞ではＢｃｌ−２発現は検出されなかった。実施例６に記載するように、ｈＭＮ−１４発現Ｓｐ２／０細胞を、野生型Ｂｃｌ−２発現のための類似の構築物でトランスフェクトし、例外的な増殖特性および生産性が増強したクローンを単離した。このクローン（６６４．Ｂ４）を、ＭＴＸを使用してさらに増幅させた場合、Ｂｃｌ−２レベルが有意に増加した。最終的に、増幅された（３μＭ  ＭＴＸ）細胞株をサブクローニングし、１つのクローン（６６４．Ｂ４．１Ｃ１）のＢｃｌ−２レベルは、６６４．Ｂ４の２倍であった。この特定のサブクローンは、生産性および増殖特性が優れている。８７−２９中のＢｃｌ−２−ＥＥＥレベルは、増幅された６６４．Ｂ４．１Ｃ１中のＢｃｌ−２レベルの約２倍である。８７−２９細胞は、Ｓｐ２／０細胞に匹敵する増殖率を有し、見かけ上さらに１日間増殖し続け、Ｓｐ２／０よりも１５〜２０％高い最大密度に到達し得る。Ｅ６／Ｅ７発現Ｓｐ−Ｅ２６細胞株について類似の性質が見出された。Ｂｃｌ−２−ＥＥＥ発現８７−２９クローンは、親Ｓｐ２／０細胞よりもさらに４〜６日間長く生存し、１日だけ長く生存するＳｐ−Ｅ２６クローンより優れている。
【００５０】
８７−２９クローンとして示したＳｐ−ＥＥＥ細胞株は、組換えタンパク質の遺伝子を含む適切なベクターでのトランスフェクションの際の組換えタンパク質の発現のためのアポトーシス耐性宿主として有用である。この細胞株を有用にするために、この細胞株は、トランスフェクションおよび増幅後ならびに培養物の拡大中にそのＢｃｌ−２−ＥＥＥ発現および延命効果を維持しなければならない。安定にトランスフェクトされたＢｃｌ−２−ＥＥＥ遺伝子はその後のトランスフェクション中に失われる可能性が低いので、生存特性が損なわれるはずがない。ＭＴＸ増幅はＢｃｌ−２タンパク質発現の増加によって産生クローンの生存を実に改良することが可能である。実際、このことは、野生型Ｂｃｌ−２でトランスフェクトしたｈＭＮ１４  ６６４．Ｂ４細胞株でもそうであった。増幅およびサブクローニング後、Ｂｃｌ−２レベルは数倍に増加し、細胞生存は有意に改良された。
【実施例６】
【００５１】
＜ヒトＢｃｌ−２遺伝子の安定な発現による静置バッチ培養におけるＡｂ産生細胞生存の改良＞
＜Ｂｃｌ−２トランスフェクション細胞クローンの生成＞
トランスフェクションによってＳｐ２／０から細胞クローン６６５．２Ｂ９を最初に生成し、ヒト化モノクローナル抗ＣＥＡ  Ａｂを産生した（Ｑｕ  ｅｔ  ａｌ．、未発表の結果）。ｈＭＮ１４ｐｄＨＬ２と命名されたベクターを使用してＳｐ２／０細胞をトランスフェクトし、細胞クローン６６５．２Ｂ９を得た。ｐｄＨＬ２ベクターは、Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．によって最初に記載され、メトトレキセート処理によってその後に選択および増幅される増幅可能なマウスｄｈｆｒ遺伝子を有していた（Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１（１９８９））。一般に、ｐｄＨＬ２ベクターはＩｇＧ重鎖および軽鎖の遺伝子両方を発現し、これらは、２つのメタロチオネインプロモーターおよびＩｇＨエンハンサーによって独立して調節される。ｈＭＮ１４ｐｄＨＬ２ベクターの図を、図１６に示す。配列番号１は、このベクターの配列を示し、配列番号２は、エンハンサー配列として定義された７２ｂｐ配列を示し、プロモーター配列は、ｈＭＮ１４ｐｄＨＬ２のｎｔ２９０８〜２９７９に対応する。
【００５２】
Ｓｐ２／０細胞を、一般に、エレクトロポレーションによって、本実施例で使用されるｈＭＮ１４ｐｄＨＬ２などの線状化ｐｄＨＬ２ベクターでトランスフェクトすることができる。０．０５〜０．１μＭ  ＭＴＸを含む培地との細胞のインキュベーションによって、トランスフェクションから４８時間後に選択を開始することができる。５μＭまでの濃度のＭＴＸの段階的増加によって、挿入された抗体配列を増幅させる。
【００５３】
クローンを、０．３μＭまでのＭＴＸの段階的増加を使用した遺伝子増幅に供し、この時点で、抗体の最大生産性（Ｐｍａｘ）は約１００ｍｇ／Ｌに増加した。細胞増殖特性を改良するために、６６５．２Ｂ９細胞を、エレクトロポレーションによって、ヒトＢｃｌ−２遺伝子を含むプラスミド発現ベクター（図１７）でトランスフェクトした。Ｂｃｌ−２遺伝子を、ＥｃｏＲＩ部位を使用してＡＴＣＣから購入したｐＢ４プラスミド（ｐＢ４、カタログ番号７９８０４）から切り出し、同一の制限酵素を使用して、哺乳動物発現ベクターｐＺｅｏＳＶ（＋）のＭＣＳに挿入した。ゼオシン耐性遺伝子がベクターの一部であるので、トランスフェクション細胞を、５０〜３０μｇ／ｍＬの範囲のゼオシンを含む培地に入れた。３００ｍｇ／ｍｌゼオシンを含む培地から安定なクローンを選択し、０．５細胞／１００μＬ／ウェルの密度での９６ウェルプレートへのプレーティングによってゼオシンを含まない培地中でサブクローニングした。その後、ゼオシンを含まない培地を使用した。ウェル中のクローンの形成を、顕微鏡下での目視によって確認した。１細胞クラスターのみを含むウェル由来の細胞を拡大した。各９６ウェルプレートから約３０クローンが産生され、そのうちの１４クローンをさらなる研究のために無作為に選択した。これらのクローンの増殖特性を、１日の細胞計数ならびにＶｉａＣｏｕｎｔ試薬およびＧｕａｖａＰＣＡを使用した生存度の測定によって評価した。２４ウェルプレート中で評価した１４クローンから（図１８、１９）、増殖特性が改良された（細胞密度がより高くなり、細胞生存が延長された）１つのＢｃｌ−２トランスフェクションクローンを同定し、６６５．２Ｂ９＃４（またはクローン＃４）と命名した。親６６５．２Ｂ９クローンと比較して、クローン＃４は、Ｔフラスコ中でより高い細胞密度（約１．７倍）で増殖し、４〜６日間長く生存し（図２０、２１）、より良好な増殖の結果として、ＥＬＩＳＡ滴定およびプロテインＡカラム精製によって決定したところ、クローン＃４のＰmaxは、約１７０ｍｇ／Ｌに増加した。
【００５４】
＜６６５．２Ｂ９＃４におけるＢｃｌ−２発現＞
６６５．２Ｂ９＃４の増殖特性の改良がＢｃｌ−２のトランスフェクションに起因することを確認するために、ヒトＢｃｌ−２タンパク質の細胞内レベルを、Ｇｕａｖａ  Ｅｘｐｒｅｓｓ試薬およびＧｕａｖａ  ＰＣＡ装置の使用によって測定した。簡単に述べれば、１．５ｍｌスピンチューブに入れた４×１０5細胞を、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、１×ＰＢＳで３回洗浄した。上清を慎重に吸引した。Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＳＣＢ）Ｉｎｃ．の固定液（１０×、６０μＬ）（カタログ番号ｓｃ−３６２２）を細胞ペレットに１５分間添加し、氷上でインキュベートした。固定液を、４℃の４×１ｍＬ  ＰＢＳを使用して除去し、記載の時間スピンした。−２０℃の透過処理緩衝液（０．５ｍＬ）（ＳＣＢカタログ番号ｓｃ−３６２３）をボルテックスしながら滴下し、その後、氷上で１５分間インキュベートした。次いで、細胞をスピンし、０．５ｍＬ  ＦＣＭ洗浄緩衝液（ＳＣＢカタログ番号ｓｃ−３６２４）で２回洗浄した。最終細胞ペレットを、１００μＬのＦＣＭ洗浄緩衝液に再懸濁し、１０μＬのＰＥにコンジュゲートした抗Ｂｃｌ−２マウスモノクローナル抗体（ＳＣＢから入手）にてＢｃｌ−２細胞内タンパク質を染色した。室温の暗所で１時間インキュベートした。その後に、０．５ｍＬのＦＣＭ洗浄緩衝液で２回洗浄した。最終細胞ペレットを、０．４ｍＬのＦＣＭ洗浄緩衝液に再懸濁し、ＧｕａｖａＰＣにて細胞を分析した。各クローンについての蛍光強度の平均値（ＭＦＩ）を、ＰＥとコンジュゲートした非特異的アイソタイプマウスＩｇＧ１でのコントロール染色と比較した。表２にまとめた結果により、クローン６６５．２Ｂ９＃４が親細胞株と比較して高レベルのＢｃｌ−２タンパク質を発現することが確認される。親６６５．２Ｂ９と類似の増殖プロフィールを示したゼオシン耐性クローン（＃１３）は、Ｂｃｌ−２染色に対して陰性であり、増殖の改良にＢｃｌ−２発現が必要であることが確認された。
【００５５】
【表２】
2008507300.tif 000004
【００５６】
Ｇｕａｖａ  Ｅｘｐｒｅｓｓ分析を使用して、Ｂｃｌ−２レベルに対応する蛍光染色強度がクローン６６５．２Ｂ９＃４のＭＴＸ増幅と共に上昇することが見出され、Ｂｃｌ−２のｄｈｆｒ遺伝子との同時増幅が示唆された。増幅細胞の細胞内Ｂｃｌ−２レベルを比較するために、抗ヒトＢｃｌ−２抗体を使用して、クローン６６５．２Ｂ９＃４（Ｂｃｌ−２陽性）およびクローン＃１３（Ｂｃｌ−２陰性）の細胞溶解物に対してウェスタンブロッティング分析を行った。濃度測定評価により、１．０μＭ  ＭＴＸ中で増殖したクローン６６５．２Ｂ９＃４のＢｃｌ−２シグナルが０．６μＭ  ＭＴＸ中の細胞よりも２倍強いことが示された。クローン＃１３の溶解物は、Ｂｃｌ−２タンパク質の存在を示さなかった（図２２）。
【実施例７】
【００５７】
＜バッチ培養条件下でのクローン６６５．２Ｂ９＃４のＡｂ産生の改良＞
細胞培養物における末期付近の栄養素消費のモニタリングにより、グルコースおよびＬ−グルタミンが最初に消費される栄養素であることが見出された。これらの制限された栄養の補足によって最終抗体収率が改良されるかどうかを決定するための実験を行った。以下の２つの培養型を開始した：これらの制限成分をその消費時に補足する急増流加培養および栄養素を補足しない非流加培養。０．６μＭおよび１μＭのＭＴＸを含む培地中で増殖するＢｃｌ−２陽性クローン６６５．２Ｂ９＃４ならびに０．３μＭ  ＭＴＸ中で増殖するＢｃｌ−２陰性クローン＃１３を試験した。図２３および２４は、両培養型が末期に達するまでの両培養型における細胞生存度および細胞密度のプロフィールを示す。ｍｇ／Ｌで示すタンパク質収率を、表３に示す。この実験の結果により、全培養物において、栄養素の急増によって抗体の産生全収率が約２倍に改良されることが示唆される。
【００５８】
【表３】
2008507300.tif 000005
【実施例８】
【００５９】
＜低レベルの組換えタンパク質を産生する細胞株へのＢｃｌ−２遺伝子の導入＞
トランスフェクションによってＳｐ２／０から細胞クローン４８２．２Ｃ４Ａを最初に生成し、ＩｇＧ型（抗ＣＥＡ）および２つのｓｃＦｖ（抗ＤＴＰＡ）型（それぞれ、ＩｇＧ重鎖のＣ末端に共有結合されている）の二重特異性Ａｂを産生した（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．４１：２７０Ｐ，２０００；Ｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．４３：９６９，２００２）。クローンを遺伝子増幅に供し、その最終生産性は約２０ｍｇ／Ｌであった。増殖特性および最終的なＡｂ生産性を改良するために、実施例６に記載のように、４８２．２Ｃ４Ａ細胞を、エレクトロポレーションによってヒトＢｃｌ−２遺伝子を含むプラスミド発現ベクターでトランスフェクトした。３週間後、７５０μｇ／ｍｌのゼオシンを含む培地中でトランスフェクタントを選択した。
【００６０】
ゼオシン耐性細胞を２５μｇ／ｍｌのＣＨＸで５時間処理して、アポトーシス感受性細胞を排除した。処理細胞を新鮮な培養培地で２回洗浄してＣＨＸを除去し、新鮮な増殖培地中に再懸濁した。２４時間後の回収後、生存細胞を、限界希釈（０．５細胞／ウェル）によって、９６ウェル細胞培養プレートにクローニングした。クローンが２週間でウェル中に出現し、これを、Ａｂ産生、ＣＨＸ誘導性アポトーシス耐性、および増殖プロフィールについてスクリーニングした。全局面で親４８２．２Ｃ４Ａよりも能力の高いクローンを選択し、さらに特徴づける。親４８２．２Ｃ４Ａ細胞と比較して、最良のクローンは、ストレス条件下で培養した場合により頑強であり、老化培養条件誘導性アポトーシス耐性を示し、最大Ａｂ生産性がより高い（約１５０％またはそれ以上）と予想される。
【実施例９】
【００６１】
＜細胞増殖特性のさらなる改良のためのＳｐ−Ｅ２６へのＢｃｌ−２遺伝子の導入＞
実施例５に記載のように、Ｓｐ−Ｅ２６細胞を、エレクトロポレーションによって、ヒトＢｃｌ−２−ＥＥＥ遺伝子を含むプラスミド発現ベクターでトランスフェクトする。３週間後に、５００μｇ／ｍｌのゼオシンを含む培地中でトランスフェクタントを選択する。
【００６２】
ゼオシン耐性細胞を２５μｇ／ｍｌのＣＨＸで５時間処理して、アポトーシス感受性細胞を排除する。処理細胞を新鮮な培養培地で２回洗浄してＣＨＸを除去し、新鮮な増殖培地中に再懸濁する。２４時間後の回収後、生存細胞を、限界希釈（０．５細胞／ウェル）によって、９６ウェル細胞培養プレートにクローニングする。クローンが２週間でウェル中に出現し、これを、ＣＨＸ誘導性アポトーシス耐性および増殖プロフィールについてスクリーニングする。Ｓｐ−ＥＥＥと同様に、全局面で親Ｓｐ−Ｅ２６よりも能力の高いクローンを選択し、さらに特徴づける。親Ｓｐ−Ｅ２６およびＳｐ／ＥＥＥ細胞と比較して、ＨＰＶ−１６  Ｅ６／Ｅ７およびＢｃｌ−２−ＥＥＥを含む最良のクローンは、ストレス条件下で培養した場合により頑強であり、老化培養条件誘導性アポトーシス耐性を示すと予想され、それにより、組換えタンパク質産生のためのより良好な宿主細胞である。
【実施例１０】
【００６３】
＜Ｓｐ−ＥＥＥ細胞株を使用した組換えタンパク質産生の改良＞
組換えタンパク質の産生のために生存度が増強された細胞株を開発する場合に取ることができる経路が２つ存在する。実施例６に記載のように、非常に首尾よく達成された１つの方法は、生存促進性遺伝子（Ｂｃｌ−２など）での既に産生されている細胞株の安定なトランスフェクションを含む。しかし、この方法は、さらなるトランスフェクションステップ、選択ステップ、およびクローニングステップが必要であり、それにより、細胞株の開発過程が少なくとも２ヶ月、おそらくそれ以上長期化する。さらに、各クローンに対して多数のパラメーター（増殖／生存、Ｂｃｌ−２発現レベル、および生産性が含まれる）を決定する必要があるので、「最良の」クローンのスクリーニングがむしろ必要である。したがって、少数のクローンしか評価することができない。生産性が最も高いクローンの生存がより優れていないかもしれない可能性およびその逆の可能性が非常に高い。本明細書で使用した別のストラテジーは、より優れた増殖特性および生存特性を有する親細胞株を開発し、その後に所望のタンパク質の産生のための発現ベクターでトランスフェクトすることである。
【００６４】
Ｓｐ２／０細胞と比較して、Ｓｐ−ＥＥＥ細胞は、培養液中でさらに１日増殖し続け、１５〜２０％高い最大密度に達し、さらに４〜６日間長く生存する。組換えタンパク質（ＩｇＧ、抗体フラグメント、および融合タンパク質など）、成長因子（Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＦＳ、ＥＰＯ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦなど）、サイトカイン（インターロイキンファミリーメンバー（ＩＬ−１〜ＩＬ−３１）またはインターフェロンファミリーメンバー（α、β、またはγインターフェロンなど）など）、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ホルモン、酵素、またはワクチン（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、またはＣ型肝炎、および上記の他のワクチン）の産生のための遺伝子でその後にトランスフェクトした場合、細胞はその増強された増殖特性および生存特性を保持する。
【００６５】
組換えタンパク質（ＩｇＧなど）のための１つまたは複数の発現カセットを含むＤＮＡベクター（ｐｄＨＬ２など）を使用して、標準的な方法（エレクトロポレーションなど）によってＳｐ−ＥＥＥ細胞をトランスフェクトする。トランスフェクタントを、９６ウェルプレートに入れ、クローンを、ＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅなどの樹立された技術によってタンパク質産生について分析する。生産性の高いクローンを、培養培地中で数ヵ月にわたって漸増濃度のＭＴＸに供し、遺伝子コピー数を増幅させる。Ｂｃｌ−２陰性Ｓｐ２／０細胞中に生成されたクローンと比較して、Ｂｃｌ−２−ＥＥＥ発現クローンが約２０％高い細胞密度で増殖し、少なくともさらに４日間長く生存し、前者は、標準的なフラスコまたはローラーボトル培養において、少なくとも２０％より多くの組み合わせタンパク質を生成する。懸濁、灌流、または流加バイオリアクター培養でさらにより高い増加が実現される。
【実施例１１】
【００６６】
＜バイオリアクター中でのＢｃｌ−２トランスフェクションクローン６６５．Ｂ４．１Ｃ１のＡｂ産生の改良＞
実施例６の６６５．２Ｂ９＃４および親クローン６６５．２Ｂ９両方を、無血清培地にウィーニングさせた（ｗｅａｎｅｄ）。細胞を、Ｔフラスコ中で数ヵ月の継続的継代培養によって３μＭ  ＭＴＸを含むハイブリドーマ無血清培地（ＨＳＦＭ）（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ  ＰＮ  １００７０）のカスタマイズされた形成に適合させた。適合させた細胞を、保存のためにＴフラスコからローラーボトルに掻き取った。４５％コンディション培地（対数増殖期における培養物の遠心分離後に上清として回収した培地）、１０％ＤＭＳＯ、および４５％ＨＳＦＭから構成される無ＦＢＳ低温保存液を使用した１ｍＬバイアル中で、１×１０-7生存細胞を使用して、各細胞株についてのマスターセルバンク（ＭＣＢ）を作製した。ＭＣＢ細胞株を、それぞれ、６６５．２Ｂ９．１Ｅ４（Ｂｃｌ−２遺伝子なし）および６６５．Ｂ４．１Ｃ１（Ｂｃｌ−２遺伝子を含む）と命名した。これら２つのクローンの増殖特性および抗体産生を、バッチ培養条件下で比較した。
【００６７】
ＭＣＢから拡大された上記細胞を使用して、３Ｌのベンチスケールバイオリアクター中で実験を行った。３Ｌバイオリアクターシステムは、２５００Ｌ  ｃＧＭＰバイオリアクターシステムの縮小モデルである。したがって、評価の結果は、商業的大量製造へのこれらの細胞株の適合性を支持する。
【００６８】
ＭＣＢ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ  ＰＮ  １００７０）の作製で使用したものと同一の増殖ＨＳＦＭを使用して、細胞株を維持し、接種材料を調製した。基本ＨＳＦＭ（特別に修正した増殖ＨＳＦＭに基づいた特別な配合物（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ））（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ  ＰＮ  １０１９４）を、３Ｌ流加バイオリアクター過程で使用した。両培地は、微量タンパク質としてのみインスリンおよびトランスフェリンを含む。撹拌および曝気による剪断から細胞を保護するために、さらに０．１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８を配合物に組み込んだ。この培地も３μＭのＭＴＸを含んだ。
【００６９】
連続供給溶液およびパルス供給溶液の特徴を、以下の表４および５に示す。
【００７０】
【表４】
2008507300.tif 000006
【００７１】
【表５】
2008507300.tif 000007
【００７２】
可動範囲２Ｌで３Ｌ  Ｂｅｌｌｃｏ撹拌フラスコバイオリアクターシステム（Ｂｅｌｌｃｏ  ｇｌａｓｓｅｓ，Ｖｉｎｅｌａｎｄ，ＮＪ）中で流加試験を行った。バイオリアクターの温度、ｐＨ、および溶存酸素（ＤＯ）をモニタリングし、単ループ制御装置によって制御した。反応器の温度を、加熱ブランケットによって３７℃に制御した。培養物のｐＨを、ＣＯ2または６％Ｎａ2ＣＯ3の添加によってｐＨ７．３に制御した。円筒形焼結（ｓｉｎｔｅｒｅｄ）スパージャーによって１０ｍｌ／分の曝気を行った。培地へのＯ2の間欠的噴霧によって、ＤＯを４０％を超える空気飽和（ａｉｒ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）に制御した。５０〜６０ｒｐｍの一定の撹拌速度を培養中に使用した。
【００７３】
ＭＣＢ由来の凍結バイアルを融解し、約１〜２週間Ｔフラスコに回収した。次いで、細胞をＴフラスコからローラーボトルに拡大し、バイオリアクターでインキュベートした。細胞を、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で培養し、拡大過程中は対数増殖期を維持した。
【００７４】
インキュベーション前に、１．２リットルの基本ＨＳＦＭを、ポンプにて無菌でバイオリアクターに移した。培地の空気を飽和させて、溶存酸素（ＤＯ）プローブを較正した。また、ｐＨプローブを較正するために、培地サンプルを採取した。一旦ｐＨプローブおよびＤＯプローブが較正されると、両制御装置を、ＡＵＴＯモードに設定した。一旦システムが、ｐＨ（７．３）および温度（３７℃）の定値に達すると、計算された量の接種材料が、ローラーボトルからバイオリアクターに移された。接種後生存細胞密度（ＶＣＤ）は、約２×１０5バイアル細胞／ｍｌであった。
【００７５】
供給ストラテジーを以下に示す。培養中、濃縮栄養溶液をバイオリアクターに供給して、細胞に必要且つ過剰でない栄養素を細胞に供給した（全過程の略図については、図２５を参照のこと）。濃縮栄養溶液を、連続供給およびパルス供給によって培養物に送達させた。連続供給溶液を、蠕動ポンプ（Ｗａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗ  １０１Ｕ／Ｒ）を使用して、反応器に移した。パルス供給溶液を、１日１回培養物にパルス供給した。
【００７６】
２つの流加ストラテジーを開発し、両細胞株に適用した。過程番号１は、培養中に組換えインスリンを供給しない。過程番号２を、修飾リノール酸、脂質供給スケジュール、およびインスリンのさらなる供給を使用して過程番号１に基づいてデザインする。
【００７７】
以下の表は、両細胞株の両過程の供給をまとめている。
【００７８】
【表６】
2008507300.tif 000008
【００７９】
【表７】
2008507300.tif 000009
【００８０】
【表８】
2008507300.tif 000010
【００８１】
【表９】
2008507300.tif 000011
【００８２】
培養中、オフライン分析のためにバイオリアクターサンプルを定期的に採取した。生存細胞密度（ＶＣＤ）および細胞生存度を、０．４％トリパンブルー色素での染色後の血球計算板を使用した顕微鏡での計数によって測定した。グルコース、乳酸塩、グルタミン、アンモニアの濃度を、Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ  ２００を使用して測定した。抗体濃度を、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィカラムを使用したＨＰＬＣ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐ／Ｎ２−１００１−００）によって決定した。
【００８３】
以下のように、産生培養抗体を培養物中の全生存細胞の時間積分で割ることによって、特異的抗体生産性を計算した。
【００８４】
【数１】
2008507300.tif 000012
（ここで、
【数２】
2008507300.tif 000013
は台形公式
【数３】
2008507300.tif 000014
によって概算する）
【００８５】
図２６は、過程番号１および過程番号２による両細胞株の増殖曲線（ＶＣＤおよび生存度）を示す。過程番号１により、６６５．２Ｂ９．１Ｅ４細胞は、６日目に生存度８６％で１×１０7生存細胞／ｍｌの最大ＶＣＤに増殖した。６日後、ＶＣＤおよびＶ％は急速に減少し、８日目に培養物を回収した。過程番号２は、１．２×１０7生存細胞／ｍｌのより高いＶＣＤに到達し、１日長く維持されるのに役立つ。
【００８６】
６６５．２Ｂ９．１Ｅ４細胞と比較して、６６５．Ｂ４．１Ｃ１細胞は、両過程でさらにより良好に増殖した。過程番号１では、そのＶＣＤは、７日目に生存度９７％で２×１０7生存細胞／ｍｌに達した。培養物はまた、このＶＣＤおよびＶ％をさらに２日間維持し、その後減少し始めた。１１日目に培養物を回収した。過程番号２では、６６５．Ｂ４．１Ｃ１細胞は、過程番号１と類似の増殖プロフィールを示した。より詳細には、細胞は、２．３×１０7生存細胞／ｍｌの最も高いＶＣＤに到達し、生存度はわずかに遅く、１１日目に回収した。この所見は、過程番号２で増殖における利点が証明された６６５．２Ｂ９．１Ｅ４細胞株と幾らか異なっていた。
【００８７】
過程番号１および過程番号２における２つの細胞株の抗体収率を、図２７で比較した。６６５．２Ｂ９．１Ｅ４細胞の最終収率は、過程番号１で０．４２ｇ／Ｌ、過程番号２で０．５５ｇ／Ｌであった。比較のために、６６５．Ｂ４．１Ｃ１細胞は、両過程において、１．５ｇ／Ｌのより高い最終収率であった。
【００８８】
１日の特異的抗体生産性（細胞基準あたり）を計算し、図２８に示す。図に示すように、６６５．２Ｂ９．１Ｅ４細胞の１日あたりの平均Ｑ[MAb]は、両過程の一連の培養を通して約１５ｐｇ／細胞／日であった。過程番号２における最も高いＶＣＤでのより長い増殖日数により、より高い最終抗体濃度が得られた。
【００８９】
６６５．Ｂ４．１Ｃ１細胞は、両過程において類似の１日あたりの特異的抗体生産性プロフィールを示し、過程番号１の生産性はわずかに高かった。１日のＱ[MAb]は、９日目まで２０〜２５ｐｇ／細胞／日に維持された。その後、生産性は低下した。
【００９０】
６６５．２Ｂ９．１Ｅ４細胞株と比較して、６６５．Ｂ４．１Ｃ１細胞株は、１５ｐｇ／細胞／日と比較して、２０〜２５ｐｇ／細胞／日のより高い特異的抗体生産性を示した。そのより良好な増殖と組み合わせて、６６５．Ｂ４．１Ｃ１細胞株の最終抗体収率は、６６５．２Ｂ９．１Ｅ４細胞株によって達成された０．５５ｇ／Ｌと比較して、１．５ｇ／Ｌと３倍になった。これらの結果は、組換えタンパク質（この場合、臨床用抗体）の商業的大量調製のためにバイオリアクター中の無血清培地中でその増殖および抗体収率を増強するために宿主細胞にＢｃｌ−２遺伝子を組み込むことが有利であることを証明する。当業者は、本明細書中に開示の方法および過程を必要に応じて修正することができる。本明細書中に含まれる全ての刊行物、特許、特許出願、および引例は、その全体が本明細書中で参照することにより組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】シクロヘキシミドで処置（＋ＣＨＸ）、又は未処置（−ＣＨＸ）のＳｐ２／０細胞およびＳｐ−Ｅ２６細胞の画像を示す。
【図２】ＣＨＸ処置に対する耐性がより高いＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７形質導入細胞のスクリーニングの結果を示す。全部で５５クローンをスクリーニングし、第１の実験では、３１クローンをスクリーニングし（上のパネル）、第２の実験では、２４クローンをスクリーニングした（下のパネル）。各クローンの健康な細胞を、２つの等しい部分に分割した。一方をＣＨＸで２時間処置し、他方を未処置のままにした。次いで、これら２つの培養物中の生存細胞を、ＭＴＴアッセイによって測定し、処置した生存細胞集団（ＣＨＸ+）：非処置生存細胞集団（ＣＨＸ-）比をプロットした。上のパネルに示すように、ＣＨＸ処置により、Ｓｐ２／０細胞の生存度が３０％減少する一方で、Ｓｐ−Ｅ２６細胞では６％しか減少しなかった。スクリーニングした３１クローンのうちの７クローン（*で示す）は、Ｓｐ２／０よりも有意に良好であったが（生存度の減少は２０％未満）、Ｓｐ−Ｅ２６ほどではなかった。第２の実験でスクリーニングした２４クローンについて（下のパネル）、ＣＨＸ処置により、Ｓｐ２／０細胞の生存度が約５０％減少し、Ｓｐ−Ｅ２６の生存度の減少が約２０％未満であった。スクリーニングした２４クローンのうちの１０クローン（*または**で示す）は、Ｓｐ２／０よりも有意に良好であり（減少は３０％未満）、これらのうちの６クローン（**で示す）は、Ｓｐ−Ｅ２６に匹敵するかこれより良好であった（２０％未満）。Ｅ２８およびＥ３６は２つのさらなるコントロールクローンであり、Ｓｐ２／０よりも良好であるが、Ｓｐ−Ｅ２６ほどではない。
【図３】ＧｕａｖａネキシンＶアッセイのドットプロットを示す。初期アポトーシス細胞（ネキシンＶ陽性および７−ＡＡＤ陰性）の比率を、右下の四分円に示す。
【図４】ＣＨＸによって処置されたＳｐ２／０のＤＮＡ断片化を示す。対照的に、Ｓｐ−Ｅ２６細胞は、この処置に耐性を示す。
【図５】Ｔフラスコ中でのＳｐ２／０細胞およびＳｐ−Ｅ２６細胞の増殖プロフィールを示す。健康な細胞（生存度９５％超）を、初期細胞密度２００，０００／ｍｌでＴフラスコに播種した。生存細胞および死滅細胞を、Ｇｕａｖａ  ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬（Ｇｕａｖａ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）およびＰＣＡ装置（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して毎日計数した。ＮＨ4+および乳酸塩の蓄積もモニタリングした。
【図６】３Ｌバイオリアクター中でのバッチ培養について測定したＳｐ２／０細胞およびＳｐ−Ｅ２６細胞の増殖プロフィールを比較する。健康な細胞（生存度９５％超）を、初期細胞密度２５０，０００／ｍｌでバイオリアクターに播種した。トリパンブルーおよび顕微鏡によって細胞を毎日計数した。
【図７】Ｂｃｌ−２−ＥＥＥ発現についてクローンをスクリーニングするためにＢｃｌ−２（１００）抗体（Ｓａｎｔａ  ＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈ．）で染色し、増強された化学発光を使用して発色させた代表的免疫ブロットを示す。
【図８】Ｇｕａｖａ  Ｅｘｐｒｅｓｓを使用したフローサイトメトリーの結果のグラフを示す。細胞を固定し、透過処理を行い、その後、フィコエリトリン抱合抗Ｂｃｌ−２抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）で染色した。いくつかのサブクローンを比較する。
【図９】Ｇｕａｖａ  Ｅｘｐｒｅｓｓを使用したフローサイトメトリーの結果のグラフを示す。細胞を固定し、透過処理を行い、その後、フィコエリトリン抱合抗Ｂｃｌ−２抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）で染色した。Ｓｐ２／０細胞、Ｒａｊｉ細胞、およびＤａｕｄｉ細胞を、Ｂｃｌ−２−ＥＥＥクローンと比較した。
【図１０】６６５．Ｂ４．１Ｃ１細胞、Ｓｐ２／０細胞、Ｒａｊｉ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｓｐ−ＥＥＥ細胞（８７〜２９クローン）、およびＳｐ−ＥＥＥ細胞（７〜１６クローン）の溶解物の免疫ブロット分析の結果を示す。Ａ．ヒトＢｃｌ−２特異的抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）を使用して染色したブロット。Ｂ．マウスＢｃｌ−２およびヒトＢｃｌ−２を認識する抗Ｂｃｌ−２抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）を使用して染色したブロット。
【図１１】１０％ウシ胎児血清を補足した培地で増殖したＳｐ２／０細胞と比較したＳｐ−ＥＥＥクローンの増殖曲線（Ａ）および生存度（Ｂ）を示す。
【図１２】１％ウシ胎児血清を補足した培地で増殖したＳｐ２／０細胞と比較したＳｐ−ＥＥＥクローンの増殖曲線（Ａ）および生存度（Ｂ）を示す。
【図１３】無血清培地で増殖したＳｐ２／０細胞と比較したＳｐ−ＥＥＥクローンの増殖曲線（Ａ）および生存度（Ｂ）を示す。
【図１４】Ｓｐ−ＥＥＥ細胞（８７〜２９クローン）のメトトレキセート死滅曲線を示す。
【図１５】１ｍｇ／ｍｌゼオシンの存在下または非存在下で増殖したＳｐ−ＥＥＥクローンを含むＧｕａｖａ  Ｅｘｐｒｅｓｓを使用したフローサイトメトリーの結果のグラフを示す。細胞を固定し、透過処理を行い、その後、フィコエリトリン抱合抗Ｂｃｌ−２抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）で染色した。
【図１６】Ｓｐ２／０細胞をトランスフェクトして、ヒト化抗体配列、ＳＶ４０プロモーター配列、およびエンハンサー配列を有する６６５．２Ｂ９クローンを得るために使用したｐｄＨＬ２ベクターのマップを示す。
【図１７】クローン６６５．２Ｂ９のトランスフェクションに使用したＢｃｌ−２遺伝子を組み込んだＤＮＡプラスミドのマップを示す。
【図１８】Ｂｃｌ−２トランスフェクションクローン６６５．２Ｂ９＃４、Ｂｃｌ−２陰性クローン、および非トランスフェクションコントロールの増殖プロフィールを示す。健康な細胞（生存度９５％超）を、初期細胞密度４００，０００／ｍｌで２４ウェルプレートに播種した。生存細胞および死滅細胞を、Ｇｕａｖａ  ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬およびＰＣＡ装置を使用して毎日計数した。
【図１９】Ｂｃｌ−２トランスフェクションクローン６６５．２Ｂ９＃４、Ｂｃｌ−２陰性クローン、および非トランスフェクションコントロールの増殖プロフィールを示す。健康な細胞（生存度９５％超）を、初期細胞密度４００，０００／ｍｌで２４ウェルプレートに播種した。生存細胞および死滅細胞を、Ｇｕａｖａ  ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬およびＰＣＡ装置を使用して毎日計数した。
【図２０】異なるＭＴＸ濃度でのＢｃｌ−２トランスフェクションクローン６６５．２Ｂ９＃４およびＢｃｌ−２陰性クローンの増殖プロフィールを示す。健康な細胞（生存度９５％超）を、初期細胞密度１００，０００／ｍｌでＴフラスコに播種した。生存細胞および死滅細胞を、Ｇｕａｖａ  ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬およびＰＣＡ装置を使用して毎日計数した。
【図２１】異なるＭＴＸ濃度でのＢｃｌ−２トランスフェクションクローン６６５．２Ｂ９＃４およびＢｃｌ−２陰性クローンの増殖プロフィールを示す。健康な細胞（生存度９５％超）を、初期細胞密度１００，０００／ｍｌでＴフラスコに播種した。生存細胞および死滅細胞を、Ｇｕａｖａ  ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬およびＰＣＡ装置を使用して毎日計数した。
【図２２】ウェスタンブロッティングによって検出した漸増濃度のＭＴＸおよびクローン＃１３中でクローン６６５．２Ｂ９＃４によって発現したヒトＢｃｌ−２レベルを示す。
【図２３】急増Ｌ−グルタミンおよびグルコースを含むか含まない０．６μＭまたは１μＭのＭＴＸ中で培養したクローン６６５．２Ｂ９＃４ならびに０．３μＭ  ＭＴＸ中で培養したＢｃｌ−２陰性クローンの細胞生存度および生存細胞密度のプロフィールをそれぞれ示す。健康な細胞（生存度９５％超）を、初期細胞密度２００，０００／ｍｌでローラーボトルに播種した。２日目および４日目に（矢印で示す）、グルコースおよびＬ−グルタミンを含む栄養補足溶液を、「急増」培養物に添加した。生存細胞および死滅細胞を、Ｇｕａｖａ  ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬およびＰＣＡ装置を使用して毎日計数した。
【図２４】急増Ｌ−グルタミンおよびグルコースを含むか含まない０．６μＭまたは１μＭのＭＴＸ中で培養したクローン６６５．２Ｂ９＃４ならびに０．３μＭ  ＭＴＸ中で培養したＢｃｌ−２陰性クローンの細胞生存度および生存細胞密度のプロフィールをそれぞれ示す。健康な細胞（生存度９５％超）を、初期細胞密度２００，０００／ｍｌでローラーボトルに播種した。２日目および４日目に（矢印で示す）、グルコースおよびＬ−グルタミンを含む栄養補足溶液を、「急増」培養物に添加した。生存細胞および死滅細胞を、Ｇｕａｖａ  ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬およびＰＣＡ装置を使用して毎日計数した。
【図２５】バイオリアクター供給ストラテジーについての過程の略図を示す。
【図２６】組換えインスリンを供給しない過程番号１、過程番号１に基づいて修飾リノール酸および脂質供給スケジュールを使用し、インスリンをさらに供給した過程番号２による６６５．２Ｂ９．１Ｅ４細胞株および６６５．Ｂ４．１Ｃ１細胞株の増殖曲線（ＶＣＤおよび生存度）を示す。
【図２７】過程番号１および２における６６５．２Ｂ９．１Ｅ４細胞株および６６５．Ｂ４．１Ｃ１細胞株の抗体収率を示す。６６５．２Ｂ９．１Ｅ４細胞の最終収率は、過程番号１では０．４２ｇ／Ｌであり、過程番号２では０．５５ｇ／Ｌであった。比較のために、６６５．Ｂ４．１Ｃ１細胞は、両方の過程において１．５ｇ／Ｌのより高い最終収率が実現された。
【図２８】１日の特異的抗体産生性を示す（細胞基準あたり）。図に示すように、一連の培養による両過程についての６６５．２Ｂ９．１Ｅ４細胞の１日あたりの平均Ｑ[MAb]は約１５ｐｇ／細胞／日であった。過程番号２における最も高いＶＣＤでの増殖日数の追加により、最終抗体濃度がより高くなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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