(57)【要約】【課題】【解決手段】  本発明は、重鎖可変ドメインを含む、Ｈｅｒ２／ｎｅｕに特異的に結合できる単離された抗体、又はそのフラグメント、変異体、若しくは誘導体であって、前記重鎖可変ドメインが配列番号：１、２、又は３の少なくとも１つに記載されているアミノ酸配列、或いはそれに対し少なくとも７５％の同一性（相同性）を有する配列、又はそれらの機能的フラグメントを含む単離された抗体、又はそのフラグメント、変異体、若しくは誘導体、並びにそれをコードする核酸配列及びそれらを産生するための方法を記載するものである。発明は、患者のＨｅｒ２／ｎｅｕを発現している癌を治療するための方法であって、そのような治療を必要とする患者に、本発明に記載のこれらの抗体、ペプチド、又は核酸分子のいずれかを、治療有効量投与することを含む方法にも関するものである。【選択図】なし
2008529549.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変ドメインを具えるＨｅｒ２／ｎｅｕに特異的に結合することができる単離された抗体又はフラグメント、これらの変異体又は誘導体において、前記重鎖可変ドメインが配列番号：１、２、若しくは３の少なくとも１つに記載されているアミノ酸配列、又はこれに対して少なくとも７５％の同一性（相同性）を有する配列、或いはこれらの機能的フラグメントを具えることを特徴とする単離された抗体又はフラグメント、これらの変異体又は誘導体。
【請求項２】
請求項１に記載の単離された抗体において、軽鎖可変ドメインを更に具え、前記軽鎖可変ドメインが配列番号：４、５、若しくは６の少なくとも１つに記載されているアミノ酸配列、又はこれらに対し少なくとも７５％の同一性（相同性）を有する配列、或いはそれらの機能的フラグメントを具えることを特徴とする単離された抗体。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の単離された抗体が、配列番号：１から６のいずれか１つに示す少なくとも１つのアミノ酸配列、又はこれらに対して少なくとも７５％の同一性（相同性）を有する配列、或いはこれらの機能的フラグメントを具えることを特徴とする単離された抗体。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載の単離された抗体において、配列番号：１から６の少なくとも２つの組み合わせを具えることを特徴とする単離された抗体。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載の単離された抗体において、配列番号：１から３全ての組み合わせを具える重鎖可変ドメインを具えることを特徴とする単離された抗体。
【請求項６】
請求項１から４のいずれか１項に記載の単離された抗体において、配列番号：４から６全ての組み合わせを具える軽鎖可変ドメインを具えることを特徴とする単離された抗体。
【請求項７】
請求項５に記載の単離された抗体において、配列番号：７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインを具えることを特徴とする単離された抗体。
【請求項８】
請求項６に記載の単離された抗体において、配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを具えることを特徴とする単離された抗体。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１項に記載の単離された抗体が、配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインと組み合わせて、配列番号：７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインを具えることを特徴とする単離された抗体。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか１項に記載の単離された抗体において、前記抗体が迅速に内在化できることを特徴とする単離された抗体。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか１項に記載の単離された抗体において、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを発現している細胞に与えられた場合に、前記抗体が抗増殖作用を発揮できることを特徴とする単離された抗体。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか１項に記載の単離された抗体において、前記抗体が配列番号：１から６のいずれかに記載のＣＤＲ及びフレームワーク領域を具えるＦｖフラグメントであることを特徴とする単離された抗体。
【請求項１３】
請求項１から１１のいずれか１項に記載の単離された抗体において、前記抗体がＦａｂフラグメントであることを特徴とする単離された抗体。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか１項に記載の単離された抗体において、前記抗体が親和性、安定性、及び／又は半減期を増加するように修飾されていることを特徴とする単離された抗体。
【請求項１５】
請求項１４に記載の単離された抗体において、前記修飾抗体が完全抗体又はチェインシャッフリング技術によって突然変異した抗体であることを特徴とする単離された抗体。
【請求項１６】
第２分子と共役している請求項１から１５のいずれか１項に記載の単離された抗体において、前記第２分子が細胞毒性薬物、細胞増殖抑制薬物、免疫毒、免疫リポソーム、ＤＮＡ分子から成る群より選択されることを特徴とする単離された抗体。
【請求項１７】
単離されたポリペプチドにおいて、配列番号：１から８のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はそれに対し少なくとも７５％の同一性（相同性）を有する配列、或いはそれらの機能的フラグメントを有することを特徴とする単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
単離された核酸分子において、請求項１から１７のいずれか１項に記載の１又はそれ以上の抗体分子又はポリペプチド又はこれらの相同体をコードすることを特徴とする単離された核酸分子。
【請求項１９】
請求項１８に記載の単離された核酸分子において、配列番号：１から８のいずれかに記載のアミノ酸配列、又はこれらに対し少なくとも７５％の同一性（相同性）を有する配列、或いはこれらの効果的フラグメントを具える抗体をコードすることを特徴とする単離された核酸分子。
【請求項２０】
請求項１８又は１９のいずれか１項に記載の単離された核酸分子において、前記核酸分子が配列番号：９から１６のいずれかに記載の配列を具えることを特徴とする核酸分子。
【請求項２１】
プラスミド又はベクター系が、請求項１から１７のいずれか１項に記載の抗体をコードする核酸、又はこれらの相同体若しくは誘導体を具えることを特徴とするプラスミド又はベクター系。
【請求項２２】
プラスミド又はベクター系が、請求項１８から２０のいずれか１項に記載の核酸を具えることを特徴とするプラスミド又はベクター系。
【請求項２３】
宿主細胞において、請求項１８から２０のいずれか１項に記載の核酸分子、又は請求項２１又は２２に記載のプラスミド若しくはベクター系によって形質転換若しくはトランスフェクションされていることを特徴とする宿主細胞。
【請求項２４】
以下の：請求項１から１６のいずれか１項に請求されている抗体分子、請求項１７に記載の１又はそれ以上のポリペプチド、及び請求項１８から２０のいずれか１項に記載の核酸分子、並びに薬学的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤から成る群より選択されたいずれかのこれらの分子を具えることを特徴とする化合物。
【請求項２５】
患者のＨｅｒ２／ｎｅｕを発現している癌を治療するための方法が、このような治療を必要とする患者に、以下の：請求項１から１６のいずれかに１項に記載の抗体分子、請求項１７に記載の１又はそれ以上のポリペプチド、及び請求項１８から２０のいずれか１項に記載の核酸分子から成る群より選択された治療上効果的な量のこれらのいずれかの分子を投与するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項２６】
Ｈｅｒ２を発現する癌の治療に用いられる医薬品の調製における、以下の：請求項１から１６のいずれか１項に記載の抗体分子、請求項１７に記載の１又はそれ以上のポリペプチド、及び請求項１８から２０のいずれか１項に記載の核酸分子から成る群より選択されたこれらの分子のいずれかの使用。
【請求項２７】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕを発現している癌を診断するための方法が、サンプルを請求項１から１６のいずれか１項に記載の抗体と接触させることを具えることを特徴とする方法。
【請求項２８】
診断における請求項１から１６のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを認識する抗体に関する。具体的には、本発明はＨｅｒ２／ｎｅｕ発現細胞に抗増殖効果を発揮する特別な抗体に関する。
【０００２】
発明の背景
Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ｅｒｂＢ２）（本明細書ではＨｅｒ２とも呼ぶ）遺伝子は、上皮成長因子レセプターのｅｒｂＢファミリーに属する分子量１８５，０００の膜貫通糖タンパク質をコードしている（Ａｋｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｒｕｂｉｎ  ａｎｄ  Ｙａｒｄｅｎ，２００１）。リガンドの結合は、ｅｒｂＢホモ−及びヘテロダイマーの形成を誘導して、細胞質キナーゼドメインを活性化する（Ｍａｒｍｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。Ｈｅｒ２／ｎｅｕはリガンドのないレセプターであり、リガンド結合ＥＧＦＲファミリーのＨｅｒ１（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ３、及び（Ｈｅｒ４）との間で優先的にヘテロダイマーを形成するパートナーである（Ｙａｒｄｅｎ  ａｎｄ  Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ，２００１）。コレセプターのＨｅｒ２／ｎｅｕがシグナル伝達を仲介すると、有糸分裂、アポトーシス、血管新生、及び細胞分化が起こる（Ｈａｒａｒｉ  ａｎｄ  Ｙａｒｄｅｎ，２０００；Ｔｚａｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。厳密に制御されたｅｒｂＢレセプターシグナル伝達経路が変更されると、大きな異常及び腫瘍形成が起こる。
【０００３】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子は、浸潤性乳癌の〜２０から３０％で増幅及び過剰発現しており、それに伴って転移する可能性が高くなり、予後が不良となる（Ｐｒｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９３；Ｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，１９９８；Ｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｌａｍｏｎ，１９８７）。更には、Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプターの過剰発現は、卵巣、前立腺、胃、肺、膀胱、及び腎臓癌を含む様々なヒトの癌で起こっている（Ｋｏｅｐｐｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｓｌａｍｏｎ，１９８７）。Ｈｅｒ２／ｎｅｕはその効果を、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ高発現差細胞ではリガンド−非依存的な活性様式で、ホモダイマーを介して発揮できる。Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプターはゆっくりとタンパク質分解的に切断され、生じた分子量１１０，０００のレセプター細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、コンディショニング媒体中（Ｚａｂｒｅｃｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）、及び乳癌患者の血清中（Ｍｏｌｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，２００２）に検出できる。タンパク質分解性の切断は、アミノ末端側が切り揃えられた分子量９５，０００の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼ活性を有する膜関連フラグメントも生成する（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。一方、Ｈｅｒ２／ｎｅｕは別のｅｒｂＢレセプターのリガンド介在刺激によって活性化できる。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ低発現細胞では、シグナル伝達はＨｅｒ２／ｎｅｕヘテロダイマーによって大きく高められる（Ｃｉｔｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｈｏｌｂｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｍｅｌｌｉｎｇｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０００４】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕの細胞外領域に関する最近の結晶学研究は、リガンド−活性化状態に近い固定状態の立体構造を明らかにし、直接のリガンド結合が無い場合は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕは他のｅｒｂＢレセプターと相互作用して平衡状態を取ることを示した（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｇａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ひとたびＥＣＤが取り除かれると、残ったＨｅｒ２／ｎｅｕ膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインは自己集合して未切断のＨｅｒ２／ｎｅｕと相互作用して構成的なキナーゼ活性を生ずると言われている（Ｂｕｒｇｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｍｏｌｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【０００５】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕのシグナル伝達を遮断すること、及び様々な利用可能な膜分子を制限することが最も治療的なアプローチとして注目されている。ハーセプチンは、マウス４Ｄ５  ｍＡｂのヒト化版であり、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの膜近傍領域に結合し（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、レセプターの細胞外ドメインの切断を妨害することでその抗増殖活性を発揮し（その結果レセプターは構成的に活性化される）、レセプターをダウンレギュレーションする（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０００６】
ｍＡｂ  ２Ｃ４はドメインＩＩ中心近くの、レセプターの細胞外ドメイン内にあるハーセプチンとは異なるエピトープに結合し（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、ＨＥＲ２とｅｒｂＢファミリーの他メンバーとの会合を立体的に阻止し、リガンドの活性化を妨害する（Ａｇｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。ヒト化された２Ｃ４  ｍＡｂであるペルツズマブが最近、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ低発現癌を対象とした臨床試験にかけられた（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。さらには、トラツズマブ及びペルツズマブは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ過剰発現乳癌細胞株の生存を相乗的に阻害する（Ｎａｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０００７】
ファージ上に提示させた内在化ヒトｓｃＦｖ（エルビシン）が、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性細胞株に対する細胞増殖抑制／細胞傷害性効果を伴って単離された（Ｄｅ  Ｌｏｒｅｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。このｓｃＦｖの可溶型は、ファージ形式のものに比べ抗癌剤としての活性は低かった；おそらくは、可溶性型は安定性が低い立体構造を持つと思われる。最近、このｓｃＦｖをコンパクトに縮小した形のＩｇＧが、抗体依存的な細胞依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導できる腫瘍標的細胞に対し抗増殖効果を持つ新規抗癌剤として作られた（Ｄｅ  Ｌｏｒｅｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０００８】
ハーセプチンは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性癌の治療を目的に臨床で使用された最初の抗体であるが、その抗癌活性はＨｅｒ２／ｎｅｕを過剰発現している患者の最大３０％にしか見られず、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの発現レベルが低い腫瘍に対する活性は殆どない（Ｃａｍｉｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【０００９】
かくして、治療力が向上したＨｅｒ２／ｎｅｕに対する別の抗体が求められている。
【００１０】
発明の開示
本発明は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプターの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を認識する改良された抗体の同定に関する。発明の抗体、特に本明細書でＦａｂ６３と呼ばれるヒトＦａｂフラグメントは、可溶性Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプターへの結合を巡ってハーセプチンと競合し、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ過剰発現細胞の表面にある天然レセプターに結合できる。更には、発明のＦａｂ６３によって例示される抗体は、シグナル伝達においてリガンド−非依存性のメカニズムが優性であるＳＫＢＲ３及びＭＤＡ−ＭＢ−４５３癌細胞に対し有意な抗増殖効果を有している。更には、リガンドであるＨＲＧ−β１が存在する時には、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの高発現及び低発現細胞であるＭＢ−４５３及びＭＣＦ７において、増殖阻害が検出された。ハーセプチンとは異なり、Ｆａｂ６３は強い内在化を示す。これに加えて、エルビシンに比べＦａｂ６３の内在化時間は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ高発現細胞で有意に短縮されている。この特性の組み合わせが発明の抗体を、診断及び治療に好適な抗癌剤にしている。
【００１１】
従って、発明の第１の態様では、重鎖可変ドメインを含むＨｅｒ２／ｎｅｕに特異的に結合できる単離された抗体、又はそのフラグメント、変異体、若しくは誘導体が提供され、このとき前記重鎖可変ドメインは配列番号：１、２、若しくは３の少なくとも一つに記載されているアミノ酸配列、又はそれに対し少なくとも７５％の同一性（相同性）を有する配列、或いはその機能的フラグメントを含む。
【００１２】
好ましい態様では、第１の態様による前記の単離された抗体は軽鎖可変ドメインを更に含み、このとき前記軽鎖可変ドメインは、配列番号：４、５、若しくは６のいずれか一つに記載されているアミノ酸配列、又はそれに対し少なくとも７５％の同一性（相同性）を有するか配列、或いはその機能的フラグメントを含む。
【００１３】
好適には、抗体は配列番号：１から６のいずれかに示すアミノ酸配列を少なくとも１つ、又はそれに対し少なくとも７５％の同一性（相同性）を有する配列、或いはその機能的フラグメントを含む。
【００１４】
好ましくは、相同的なアミノ酸配列は、前記配列に対し少なくとも７５、８０、８１、８５、又は９０％同一である、好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１５】
別の態様では、発明による前記抗体は、配列番号：１から６の少なくとも２つの組み合わせを含む。好ましくは、前記抗体は配列番号：１から３全ての組み合わせを含む重鎖可変ドメインを含む。別の態様では、前記抗体は配列番号：４から６全ての組み合わせを含む軽鎖可変ドメインを含む。
【００１６】
好ましい態様では、発明の抗体は、配列番号：７に記載のアミノ酸配列を持つ重鎖可変ドメインを含む。別の態様では、抗体は配列番号：８に記載のアミノ酸配列を持つ軽鎖可変ドメインを含む。
【００１７】
更に別の態様では、抗体は配列番号：７に記載のアミノ酸配列を持つ重鎖可変ドメインを、配列番号：８に記載のアミノ酸配列を持つ軽鎖可変ドメインと組み合わせて含む。
【００１８】
発明の上記の態様によれば、用語「Ｈｅｒ２／ｎｅｕに特異的に結合する」とは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕがその他の抗原と一緒に含まれている試薬混合液の中でＨｅｒ２／ｎｅｕのみに結合することを意味する。即ち、本発明の抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体の結合はＨｅｒ２に選択的である。発明に従った抗体の特異的結合を示す一つの方法は、ハーセプチンのような他の既知の抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体を用いた競合結合アッセイであり、この場合ハーセプチンの結合を置き換え又は競合できる能力が特異的なＨｅｒ２／ｎｅｕ結合の指標である。好適な方法が、本明細書に記載されている。これに代わって親和性の測定を、本明細書に記載されているＢＩＡＣＯＲＥ測定を利用することを含む当業者に既知である方法を用いて行っても良い。特異的結合決定に好適なその他の方法は当業者にとって馴染み深いだろう。
【００１９】
好ましくは、発明の単離された抗体は、迅速に内在化できる。
【００２０】
「内在化」とは、抗体がＨｅｒ２／ｎｅｕが発現している細胞の中に取り込まれることを意味する。好適には、抗体は迅速に内在化され、即ち内在化は抗体とＨｅｒ２／ｎｅｕレセプター発現している細胞と３７℃でインキュベーションした時、約３０分以内に観察されるのが好ましく、好適には内在化の最大効率は３７℃でインキュベーションしたとき２時間後に観察される。
【００２１】
好適には、発明の単離された抗体は、Ｈｅｒ２発現細胞に与えた時に抗増殖効果を発揮できる。
【００２２】
発明の上記態様によれば、用語「抗増殖効果を発揮する」とは、未処理のサンプル、及び／又は無関係な抗体で処理したサンプルと比較した時に抗体で処理したサンプルの細胞増殖を阻害することを意味する。細胞増殖を判定するのに好適なアッセイは当業者に既知であり、本明細書内に記載されている。好ましくは、抗増殖効果は、細胞増殖の％阻害を測定することで検知される。好適には１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％増殖阻害が検知され、発明の抗体の抗増殖効果が示される。
【００２３】
好適には、抗体は配列番号：１から６に記載のＣＤＲ、及びフレームワーク領域を含むＦｖフラグメントである。別の態様では、抗体はＦａｂフラグメントである。好適には、前記Ｆａｂフラグメントは、重鎖及び軽鎖の定常ドメインを含む。更に別の態様では、抗体はｓｃＦｖフラグメントである。この態様では、前記重鎖可変ドメイン及び前記軽鎖可変ドメインが作動可能に連結してｓｃＦｖを形成するのが好適である。
【００２４】
小サイズのＦａｂ及びｓｃＦｖフラグメントは、固形腫瘍内への浸透及び悪性細胞の標的化について完全又は小型抗体よりも優れており、特にそれらを細胞傷害性又は細胞増殖抑制性に使用する場合に優れているだろう（Ｈａｒｒｉｓ，２００４）。内在化Ｆａｂ及びｓｃＦｖも単離されており（Ｐｏｕｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、それらは一度レセプターに結合すると膜バリアーを超えて細胞質内に入ることから、免疫毒素、免疫リポソーム又はＤＮＡを細胞内に送り込むツールとしてより強力であり、大きな関心を集めている（Ｆｏｍｉｎａｙａ  ａｎｄ  Ｗｅｌｓ、１９９６；Ｐａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。これに加えて、内在化した抗体は膜表面に常に露出している抗体に比べて、細胞傷害性が限定されている。
【００２５】
別の態様では、抗体は単一又は二重特異的抗体に、或いはより高い価数を持つ抗体フラグメントにもオリゴマー化できる。
【００２６】
特に好ましい態様では、Ｆａｂフラグメントは本明細書に記載のＦａｂ６３である。
【００２７】
Ａａｂ６３はヒトライブラリーに由来し、且つヒトに投与した時に非免疫原性であること好都合である。
【００２８】
抗体工学の進歩によって、完全なヒト抗体Ｆａｂ及びｓｃＦｖフラグメントをファージディスプレイヒト抗体ライブラリーから単離することが可能となった（Ｃａｒｔｅｒ，２００１）。完全なヒト抗体フラグメントを作る能力は、それによって抗体のキメラ化若しくはヒト化により生ずる宿主抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応を克服できることから重要である（Ｂｒｅｋｋｅ  ａｎｄ  Ｓａｎｄｌｉｎｅ，２００３）。それ故に好ましい態様では、発明の抗体はヒト抗体である。
【００２９】
別の態様では、抗体は安定性及び／又は半減期が増すように修飾できる。例えば、抗体の半減期は、抗体若しくは抗体フラグメントをＰＥＧ化（ポリエチレングリコール化）することによって増すことができる（例えば、Ｃｈａｐｍａｎ  ＡＰ、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ２００２，５４；５３１から５４５を参照）。発明の抗体は、強化処理技術を採用した強化分子として作ることもできる。これに加えて、完全抗体は、例えばヒト免疫グロブリンのＦｃ定常部分を付加するか、又は本明細書に記載されているチェインシャッフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）のような技術を用いて、突然変異抗体を作製することによって構築できる。
【００３０】
抗体は診断薬又は治療薬に連結した抗体構成要素を含む免疫共役体として作ることもできる。前記連結は、化学的共役又は遺伝的融合を含む当業者に認められている手段により行うことができる。
【００３１】
前記治療薬は、抗体、免疫モジュレータ、ホルモン、細胞毒性薬物、薬物、毒素、酵素、放射核種、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせから成る群より選択できる。
【００３２】
それ故に別の態様では、第２分子と共役している発明の抗体であって、前記第２分子が細胞毒性薬、細胞増殖抑制薬、免疫毒素、免疫リポソーム、ＤＮＡ分子から成る群より選択される抗体が提供される。
【００３３】
発明の別の態様では、配列番号：１から８のいずれかに記載されている単離されたアミノ酸配列、又はそれに対し少なくとも７５％の同一性（相同性）を有する配列、或いはそれらの機能的フラグメントが提供される。
【００３４】
好適には、配列番号：１から６のいずれか１項に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ配列が提供される。
【００３５】
発明の別の態様では、発明の態様のいずれかの態様に従った一つ以上の任意の抗体分子及び／又はＣＤＲ、或いはアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子が提供される。
【００３６】
好適には、前記単離及び／又は精製された核酸分子は、配列番号：１から８のいずれかに示すアミノ酸配列、又はそれに対し少なくとも７５％の同一性（相同性）を有する配列、或いはそれらの機能的フラグメントを含む抗体をコードする。別の態様では、発明は、配列番号：１から８に同一であるか、又はそれに相補的であるか、又はそれらの好適なコドン置き換えを含むヌクレオチド配列を含むか、或いは配列番号：１から８のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列相同性を有する配列を含む、単離及び／又は精製された核酸分子を提供する。
【００３７】
一つの態様では、配列番号：９から１６のいずれか１項に記載の配列を含む核酸分子が提供される。
【００３８】
別の態様では、発明は本明細書に記載されている抗体をコードする核酸、又はその相同体若しくは誘導体を含むプラスミド又はベクター系を提供する。好ましくは、プラスミド又はベクター系は、配列番号：９から１６のいずれか１項に記載の核酸配列、又はそれに対し少なくとも７５％相同である配列、或いはそれらの機能的フラグメントを含む。好適には、プラスミド又はベクター系は、配列番号：９から１６のいずれか１項に記載の核酸配列、又はそれに対し少なくとも７５％の同一性（相同性）を有する配列がコードする、いずれかの抗体を微生物内で発現させるための発現ベクターである。好適な発現ベクターは、本明細書に記載されている。
【００３９】
発明の別の態様では、本明細書に記載されている抗体をコードする核酸で形質転換されたか、又はトランスフェクションされた宿主細胞が提供される。
【００４０】
好適には、発明のこの態様の宿主細胞は、配列番号：１から８のいずれか１項に記載のアミノ酸配列、又はその機能的フラグメント、或いはそれに対し少なくとも７５％相同である配列を含む抗体を含む。
【００４１】
一つの態様では、前記宿主細胞は発明のベクターで形質転換される。
【００４２】
好ましくは、前記宿主細胞は抗体を産生する。
【００４３】
好適には、宿主細胞は、酵母を含む細菌及び真菌を含む微生物に由来する。特に好ましい態様では、宿主細胞は原核生物細菌細胞である。好適な細菌宿主細胞としては、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、及びイプシロン亜群のメンバーを含むプロテオバクテリア、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ及び関連菌のようなグラム陽性菌、フラボバクテリア、シアノバクテリア、緑色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌、及び古細菌を含む、各種原核生物の分類群の細菌が挙げられる。特に好ましいものは、ガンマ亜分類に属するプロテオバクテリアである大腸菌のような腸内細菌、及びＢａｃｉｌｌｕｓのようなＧＣ−グラム陽性細菌である。
【００４４】
好適な真菌宿主細胞としては、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｅｎｕｌａ、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓのようなＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅのようなＳｈｃｉｚｏｓａｃｃｈａｒｍｙｃｅｔｅｓ、並びにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓを含むアナモルフィックなＡｓｃｏｍｙｃｏｔａを含むＡｓｃｏｍｙｃｏｔａから成る群から選択される酵母が挙げられる。
【００４５】
宿主細胞はまた真核生物細胞でもよい。好適な真核生物宿主細胞は当業者にとって馴染み深いものであり、哺乳動物、植物、及び原虫細胞（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ等のような）が挙げられる。
【００４６】
別の好適な真核生物宿主細胞としては、ＳＦ９、ＳＦ２１、Ｔｒｙｃｈｐｌｕｓｉａｎｉ及びＭ１２１細胞のような昆虫細胞が挙げられる。例えば、発明の抗体は、昆虫細胞系で都合よく発現できる。培養昆虫細胞での発現に加えて、フィターゼ遺伝子は無傷の昆虫に発現させることもできる。バキュロウイルスのようなウイルスベクターは、あらゆる昆虫の感染を可能にしている。カイコのような大型の昆虫は、高い異種タンパク質収率をもたらす。タンパク質は昆虫から、通常の抽出技術によって抽出できる。発明での使用に好適な発現ベクターとしては、昆虫細胞株での異種多パク質の発現が可能な全てのベクターが挙げられる。
【００４７】
別の態様では、発明の抗体分子を合成するための方法が提供される。
【００４８】
上記の発明の態様によれば、用語「抗体を合成する」とは、上記の配列を含む完全／未変性抗体を選択すること、及び／又は上記の配列を含む抗体フラグメントを選択すること、並びに続いてそれらをアッセンブルすることをその範囲内に含んでいる。より更には、本用語は、アミノ酸レベル若しくは核酸レベルで好適な配列に突然変異を誘導し、上記配列を生成することもその範囲内に含んでいる。突然変異は、置換、欠失、逆位、又は挿入の形を取ることができる。好都合な突然変異は置き換えであろう。突然変異誘導を実施する方法、及び核酸又はアミノ酸配列を操作するための方法は標準的な研究技術を含み、当業者にとって馴染み深いものであろう。
【００４９】
これに加えて用語「抗体を合成する」は、上記の各種配列又はそのフラグメントをコードする核酸構築体をｄｅ  ｎｏｖｏにアッセンブリーすること、又はｄｅ  ｎｏｖｏに合成することもその範囲内に含んでいる。核酸の合成は、ＰＣＲを基礎とするアプローチを含んでよい。当業者は、上記配列をコードする核酸の合成に好適なその他の方法を承知しているだろう。
【００５０】
抗体及び／又はそれらをコードする核酸構築体は、有意な治療価値を有している。
【００５１】
本発明の抗体は特に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、予防及び治療を目的に使用される。具体的には、本発明者らは発明の抗体がＨｅｒ２／ｎｅｕ発現細胞株の細胞増殖を阻害できることを見出している。
【００５２】
従って発明の別の態様では、次の：発明の抗体分子、発明の１以上のＣＤＲ、及び発明の核酸構築体、並びに薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤から成る群より選択される任意の分子を含む組成物が提供される。
【００５３】
別の態様では、そのような治療を必要としている患者に、１以上の本発明の抗体分子を治療有効量投与することを含む、患者内のＨｅｒ２／ｎｅｕを発現している癌を治療するための方法が提供される。
【００５４】
これに加えて、前記治療方法は発明の核酸分子を投与することを含んでよい。
【００５５】
更なる態様では、Ｈｅｒ２を発現している癌の治療に使用する医薬品調製物への発明の抗体の使用が提供される。
【００５６】
これに加えて、Ｈｅｒ２を発現している癌の治療に使用する医薬品調製物への発明の核酸配列の使用も提供される。
【００５７】
別の態様では、サンプルに本明細書に記載の抗体を接触させることを含む、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを発現している癌を診断又は治療するための方法が提供される。
【００５８】
更なる態様では、診断での発明の抗体の使用が提供される。
【００５９】
発明の別の態様では、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓでＨｅｒ２／ｎｅｕ（ＥＣＤ）の細胞外ドメインを発現させるための構築体が提供される。好適には、前記構築体は本発明の実施例の節に記載されたものである。更に別の態様では、このような構築体の抗体を同定する方法への使用が提供される。
【００６０】
更には、本発明はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓに発現させたＥＣＤのワクチンとしての使用を提供する。好適には、前記ＥＣＤは本明細書の実施例の節に記載されたものである。
【００６１】
詳細な説明
定義
免疫グロブリン分子は、本発明によれば、標的に結合できる任意の成分を指す。具体的には、それらは、抗体分子の免疫グロブリン折りたたみ特性を備えたポリペプチドのファミリーである免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーを含み、それらは２枚のベータシート及び、通常は、保存されたジスルフィド結合を含む。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーは、免疫系（例えば抗体、Ｔ細胞レセプター分子等）での広範囲の役割、細胞接着への関与（例えばＩＣＡＭ分子）、及び細胞内シグナル伝達（例えばＰＤＧＦレセプターのようなレセプター分子）を含む多くの態様のｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞性及び非細胞性の相互作用に関わっている。
【００６２】
抗体は、本明細書では、完全な抗体又は選択した標的に結合できる抗体フラグメントを指し、Ｆｖ、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）、及びＦ（ａｂ’）２、モノクローナル及びポリクローナル抗体、キメラ、ＣＤＲ移植、及びヒト化抗体を含む遺伝子工学的に作製された抗体、並びにファージディスプレイ又は代替技術を用いて作られた人工的に選択された抗体が含まれる。好適には、抗体及びそのフラグメントはヒト化抗体である。Ｆｖ及びｓｃＦｖのような小フラグメントは、そのサイズが小さく、結果として組織分布に優れていることから、診断及び治療応用に優れた特性を有している。
【００６３】
抗体の抗原結合部位を具備する融合タンパク質及びその他合成タンパク質もまた含まれる。
【００６４】
Ｆａｂフラグメントの製造技術は米国特許第５，６５８，７２７号に記載されている。単鎖抗体の製造技術は、米国特許第４，９４６，７７８号に記載されている。
【００６５】
本明細書が定義する用語「抗体」は、その範囲内に、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインのみを含む抗原結合成分を含む分子を含んでいる。発明の好ましい態様では、抗体は重鎖可変ドメインのみを含む。
【００６６】
発明の抗体は、修飾することもできる。用語「修飾抗体」は、例えば抗体の一部を欠失させる、付加する、又は置き換えすることによって修飾されたモノクローナル抗体、キメラ抗体、及びヒト抗体のような抗体を含めることも意図している。例えば抗体は、定常域を欠失させて、それを抗体の半減期、例えば血清半減期、安定性、又は親和性を増加させた定常域と交換することで修飾できる。発明の「修飾抗体」はまた、より高い親和性を得るため、及び／又は抗原主導メカニズムによって突然変異が誘導された特定のアミノ酸を同定するために「チェインシャッフリング」技術によって修飾してもよい（例えばＰａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．２０００．Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｃｈａｉｎ  ｓｕｆｆｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２７５：５５３；Ｈｕｌｓ  ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｂｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｍａｔｕｒｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０：１６３；Ｆｏｓｔｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  Ｆａｂ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｉｇｈｌｙ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｈｉｃｈ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ｔｈｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｒｏｍ  ｍｙａｓｔｈｅｎｉｃ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５：６３２を参照）。
【００６７】
重鎖可変ドメインは、その分子の抗原結合部位の一部を形成している、免疫グロブリンの重鎖部分を指す。ＶＨ４サブグループは、重鎖可変ドメインの特定のサブグループ（ＶＨ４）を表す。一般的には、このグループに登録されている可変鎖アミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子は、Ｋａｂａｔデータベース内のＶＨ４コンセンサス配列によって表すことができるＶＨアミノ酸配列を有している。
【００６８】
軽鎖可変ドメインは、その分子の抗原結合部位の一部を形成している、免疫グロブリンの軽鎖部分を指す。免疫グロブリン分子のＶＫサブグループは、特定の可変軽鎖のサブグループを表す。一般的に、このグループ内に登録されている可変鎖アミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子は、Ｋａｂａｔデータベース内のＶＫコンセンサス配列で表すことができるＶＬアミノ酸配列を有している。
【００６９】
免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域。免疫グロブリン分子の可変ドメインは、免疫グロブリン折りたたみの存在を特徴とする、特別な３次元立体構造を有している。可変ドメインに存在する特定アミノ酸残基が、この特徴的な免疫グロブリンドメインのコア構造の維持を担っている。これらの残基は、フレームワーク残基として知られており、高く保存される傾向にある。
【００７０】
免疫グロブリン分子重鎖及び軽鎖可変ドメインのＣＤＲ（相補性決定領域）は、フレームワーク領域残基ではなく、且つ可変ドメインの超可変ループ内に含まれているアミノ酸何基を表す。これら超可変フープは、免疫グロブリンとリガンドとの相互作用に直接関与している。これらループ内の残基は、フレームワーク領域内の残基に比べ保存度が低い傾向にある。
【００７１】
本発明の関係においては、ＶＨ及びＶＬ鎖のコンセンサス配列とは、リガンドと選択的に結合できる免疫グロブリン分子の、ＶＨ及びＶＬ鎖のコンセンサス配列を指す。結合可能な免疫グロブリンの配列を比較した時、ある任意の場所について最も一般的である残基がその場所のコンセンサス残基として選ばれる。
【００７２】
本発明の関係において特異的（抗体）結合とは、抗体とリガンドとの間の相互作用が選択であること、即ち複数の分子が抗体に提示された場合に、抗体が提示された分子の一つ又は少数とのみ結合することを意味する。有利な事に、抗体―リガンドの相互作用は、高親和性である。免疫グロブリンとリガンドとの間の相互作用は、水素結合及びファンデルワールス力のような非共有結合性の相互作用が仲介する。
【００７３】
単離された
一つの態様では、ヌクレオチド又はアミノ酸配列は単離された形態であることが好ましい。用語「単離された」とは、配列が、少なくとも１又はそれ以上の自然界では必然的に付随し、且つ自然界で見出されるその他成分を、少なくとも実質的に含んでいないことを意味している。
【００７４】
精製された
一つの態様では、ヌクレオチド又はアミノ酸配列は精製された形態であることが好ましい。用語「精製された」とは、配列が比較的純粋な状態にある−例えば、少なくとも約９０％純粋、又は少なくとも約９５％純粋、又は少なくとも９８％純粋であることを意味する。
【００７５】
核酸分子又はヌクレオチド配列
本発明の範囲には、本明細書に明記する特別な性質を有する抗体をコードするヌクレオチド配列が包含される。
【００７６】
本明細書で使用する用語「核酸分子」又は「ヌクレオチド配列」は、オリゴヌクレオチド配列、核酸又はポリヌクレオチド配列、並びにその変異体、相同体、フラグメント、及び誘導体（その一部のような）を指す。ヌクレオチド配列は、ゲノム起源でも合成若しくは組換え体起源でもよく、それらは二重鎖でも、又はセンス若しくはアンチセンス鎖いずれかの単鎖でもよい。
【００７７】
本発明に関係する用語「ヌクレオチド配列」又は「核酸分子」としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ，及びＲＮＡが挙げられる。好ましくは、それは発明をコードするＤＮＡ、より好ましくはｃＤＮＡ配列を意味する。
【００７８】
好ましい態様では、本発明に関係し、且つ本発明の本質的な範囲に含まれるヌクレオチド配列は、その自然環境に在る本発明の天然ヌクレオチド配列、及び自然状態でそれに結合している、それ自体も自然環境内に在る配列と連結している本発明の天然ヌクレオチド配列は含まない。呼びやすくするために、我々はこの好ましい態様を「非天然ヌクレオチド配列」と呼ぶこととする。これに関して用語「天然ヌクレオチド配列」は、それが天然の環境内に存在しており、且つ天然状態でそれに結合している完全なプロモータと動作可能に連結し、且つプロモータもまた天然環境中に存在している完全なヌクレオチド配列を意味する。しかしながら、本発明の範囲が包含するアミノ酸配列は、その本来の生物の中でヌクレオチド配列を発現させた後に、単離及び／又は精製することができる。本発明が包含するアミノ酸配列は、その本来の生物のヌクレオチドによって、しかしヌクレオチド配列がその生物の中で本来結合しているプロモータの制御下にない状態で好ましく発現させることができる。
【００７９】
ヌクレオチド配列の調製
典型的には、本発明の範囲に包含されるヌクレオチド配列、又は本発明で使用するためのヌクレオチド配列は、組換え体ＤＮＡ技術を用いて調製される（即ち組換え体ＤＮＡ）。しかしながら、別の本発明の態様では、ヌクレオチド配列は、全体又は一部を、当技術分野で周知である化学的方法を用いて合成することもできる（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ＭＨ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ  ２１５から２３及びＨｏｒｎ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ  ２２５から２３２を参照）。
【００８０】
本明細書に明記した特別な性質を有する抗体、又は修飾に好適な抗体をコードするヌクレオチド配列は、前記抗体を産生する任意のファージ、細胞、又は生物から同定、及び／又は単離、及び／又は精製することができる。ヌクレオチド配列の同定及び／又は単離及び／又は精製するための様々な方法が当技術分野では周知である。例を挙げると、一度好適な配列が同定及び／又は単離及び／又は精製されれば、ＰＣＲ増幅技術を用いて配列を多数調製することができる。
【００８１】
更なる例を挙げれば、ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリーは、抗体産生細胞由来の染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを用いて構築できる。
【００８２】
更に別の例では、抗体をコードするヌクレオチド配列は、確立している標準的な方法、例えばＢｅｕｃａｇｅ  Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２、ｐ１８５９から１８６９が記載したホスホロアミダイト法、又はＭａｔｔｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３，ｐ８０１から８０５が記載した方法によって合成することができる。ホスホロアミダイト法では、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成装置で合成され、精製、アニーリングされて、適切なベクター内に連結されてクローニングされる。
【００８３】
ヌクレオチド配列は、合成、ゲノム、又はｃＤＮＡ起源（適切な場合）のフラグメントを標準的な技術によって連結した、ゲノム及び合成起源の混合物、合成及びｃＤＮＡ起源の混合物、ゲノム及びｃＤＮＡ起源の混合物でよい。各連結フラグメントは、全ヌクレオチド配列の様々な部分に対応する。ＤＮＡ配列はまた、例えば米国特許第４，６８３，２０２号、又はＳａｉｋｉ  Ｒ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９，ｐｐ４８７から４９１）に記載されているようにして、特異的プライマーを使ったポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によっても調製できる。
【００８４】
遺伝子コードの縮重性によって、元々のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸の幾つか、又は全てについて、トリプレットコドンを変更し、それによって元々のヌクレオチド配列との相同性は低いが、元々のヌクレオチド配列がコードするものと同一、又は異形のアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を容易に作ることができる。例えば、殆ど全てのアミノ酸について、遺伝子コードの縮重性はトリプレットコドンの３番目の位置（ウォッブル位置（Ｗｏｂｂｌｅ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ））（例えばＳｔｒｙｅｒ，Ｌｕｂｅｒｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  ０−７１６７−１９２０−７）に存在しているため、全てのトリプレットコドンの三番目の位置を「ウォッブルした」ヌクレオチド配列は元のヌクレオチド配列と約６６％の同一性を有することになるが、この変更されたヌクレオチド配列は、元のヌクレオチド配列と同一、又は異形の一次アミノ酸配列をコードするだろう。
【００８５】
それ故に本発明は更に、少なくとも１つのアミノ酸をコードするトリプレットコドンに別のトリプレットコドンを使用するが、元々のヌクレオチド配列がコードするポリペプチド配列と同一又は異形の任意のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列に関係する。
【００８６】
更には、特定の生物は一般的にアミノ酸をコードするのに用いるトリプレットコドンに偏りがある。優先して用いられるコドンの表は広く出回っており、これを用いてコドン最適化遺伝子を調製できる。このようなコドンの最適化技術は、異種宿主での導入遺伝子の発現を最適化するのに日常的に用いられている。
【００８７】
アミノ酸配列
本発明の範囲には、本明細書に明記されている特定の性質を持つ抗体のアミノ酸配列も包含される。
【００８８】
本明細書で用いられる場合、用語「アミノ酸配列」は用語「ポリペプチド」及び／又は用語「タンパク質」と同義である。幾つかの例では、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義である。幾つかの例では、用語「アミノ酸配列」は用語「抗体」と同義である。
【００８９】
アミノ酸配列は、好適な供給源から調製／単離できるか、或いはそれは合成されるか、又は組換え体ＤＮＡ技術を用いて調製できる。
【００９０】
本発明に包含される抗体は、他の抗体と一緒に用いても良い。従って本発明は、組み合わせが本発明の抗体と他の抗体とを含み、このとき他の抗体は本発明の別の抗体でよい抗体の組み合わせも対象の範囲とする。この態様については後節で論じる。
【００９１】
好ましくは、本発明の実際の範囲と関係し、且つこれに包含されるアミノ酸配列は天然抗体ではない。これに関して、用語「天然抗体」は、その天然環境にあって、その天然ヌクレオチド配列によって発現される完全抗体を意味する。
【００９２】
変異体／相同体／誘導体
本発明はまた、抗体の任意のアミノ酸配列、又はそのような抗体をコードする任意のヌクレオチド配列の変異体、相同体、及び誘導体の使用を包含する。
【００９３】
本明細書では、用語「相同体」とは前記アミノ酸配列及びヌクレオチド配列と一定の相同性を有する実存物を意味する。ここで言う用語「相同性」は、「同一性」と同等と見なすことができる。
【００９４】
本コンテキストでは、相同なアミノ酸配列には、前記配列に少なくとも７５、８０、８１、８５、又は９０％同一である、好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含めることができる。典型的には、相同体は、例えば主題のアミノ酸と同一の活性部位等を含むだろう。相同性は類似性の観点から考えることもできるが（即ち類似の化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）、本発明の関係では相同性は配列同一性として表すことが好ましい。
【００９５】
「機能的フラグメント」とは、そのポリペプチドの特徴的な特性を保持しているペプチドのフラグメントを意味する。本発明の関係では、本明細書に記載の抗体の機能的フラグメントは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ結合能を保持したフラグメントである。
【００９６】
本コンテキストでは、相同的ヌクレオチド配列としては、本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列（主題配列）に少なくとも７５、８０、８１、８５、又は９０％同一である、好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８、又は９９％同一であるヌクレオチド配列が含まれる。典型的には、相同体は主題配列と同一のＣＤＲをコードしている同一の配列を含む。相同性は類似性の観点から考えることもできるが（即ち類似の化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）、本発明の関係では相同性は配列同一性として表すことが好ましい。
【００９７】
アミノ酸配列及びヌクレオチド配列に関しては、相同性の比較は肉眼、より一般的には容易に入手できる配列比較プログラムの助けを借りて行うことができる。これら市販のコンピュータプログラムは、２以上の配列間の％相同性を計算できる。
【００９８】
％相同性は、連続配列全体について行うことができ、即ち一つの配列を別の配列と並べて、一方の配列中の各アミノ酸を別の配列中の対応するアミノ酸と一つずつ直接比較する。これは「アンギャプド（ｕｎｇａｐｐｅｄ）」アラインメントと呼ばれる。典型的には、このようなアンギャップドアラインメントは、比較的短い残基数についてのみ行われる。
【００９９】
この方法は非常に簡便且つ一貫性のある方法であるが、例えばそれ以外は同一である配列のペアを考えた時に、１つの挿入又は欠失によってそれ以後のアミノ酸残基のアラインメントが崩れ、全体のアラインメントをとった場合に％相同性が大きく低下する可能性があることを考慮していない。それ故に大部分の配列比較法は、全体の相同性スコアにとって極端に不利益にならずに、考えら得る挿入及び欠失を考慮しながら最適なアラインメントを出すように設計されている。これは、配列アラインメント内に「ギャップ」を挿入して、局部の相同性を最大化することで達成される。
【０１００】
しかしながら、これらのより複雑な方法は、アラインメント内に生じたそれぞれのギャップに「ギャップペナルティー」を割り当てて、同一アミノ酸の数が同数の場合、可能な限りギャップが少ない配列のアラインメントが−これは比較対象の２つの配列の関連性をより高くしている−ギャップの多いアラインメントに比べスコアが高くなるようにする。ギャップの存在に比較的高いコストを課し、ギャップに続く各残基により小さなペナルティーを課す「アフィンギャップコスト（Ａｆｆｉｎｅ  ｇａｐ  ｃｏｓｔｓ）」が一般的に用いられる。これは最も広く用いられているギャップスコア化システムである。ほとんどのアラインメントプログラムでギャップペナルティーを修正できる。高いギャップペナルティーは当然ギャップが少ない最適化されたアラインメントを作る。しかしながら、このような比較を行うソフトウエアを使用する場合は、専ら初期設定値が用いられている。例えばＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列の初期ギャップペナルティーはギャップ一つについて−１２であり、それが伸びる毎に−４である。
【０１０１】
それ故に最大％相同性の計算ではまず、ギャップペナルティーを考慮しながら最適なアラインメントを作る必要がある。このようなアラインメント取りを行うのに適したコンピュータプログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２  ｐ３８７）である。配列比較が可能なその他のソフトウエアの例としては、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ−Ｃａｐｔｅｒ１８を参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３から４１０）及びＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツールセットが挙げられる。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡはオフライン及びオンライン検索によって利用できる（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，７−５８から７−６０ページを参照）。
【０１０２】
しかしながら幾つかの応用では、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムが好んで用いられている。ＢＬＡＳＴ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる新しいツールを利用して、タンパク質とヌクレオチド配列を比較することもできる（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９  １７４（２）：２４７から５０；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９  １７７（１）：１７８から８、及びｔａｔｉａｎａ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照）。
【０１０３】
最終％相同性は、同一性の観点から測定することも出来るが、アラインメントのプロセスそれ自体は、典型的には絶対的なペアの比較に基づくものではない。これに代わって、各ペアの比較に、化学的類似性又は進化的な距離に基づいてスコアを付ける、定量類似性スコアマトリックスが一般的に用いられる。このような一般に用いられているマトリックスの例は、−ＢＬＡＳＴプログラムセットの初期設定マトリックスのＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般的には公表されている初期設定値又は供給されている場合にはカスタムシンボル比較表（詳しくはユーザーマニュアルを参照）のどちらかを使用する。いくつかの応用については、ＧＣＧパッケージの公表初期設定値が専ら用いられるか、別のソフトウエアの場合は、ＢＬＯＳＵＭ６２のような初期設定マトリックスが用いられる。
【０１０４】
代替的に、パーセント相同性は、アルゴリズムに基づいてＤＮＡＳＩＳ（登録商標）（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｗａｒｅ）によって、ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧ  ＆  Ｓｈａｒｐ  ＰＭ（１９８８），Ｇｅｎｅ  ７３（１），２３７から２４４）と同様にして複数のアラインメントの特徴を利用して計算することもできる。
【０１０５】
一度ソフトウエアが最適なアラインメントを作り出すと、％相同性、好ましくは％配列同一性を計算することができる。ソフトウエアは、典型的にはこれを配列の比較の一部として実施し、数値結果を算出する。
【０１０６】
配列には、サイレントな変化を生じ、結果として機能的に均等な物質を生ずるアミノ酸残基の欠失、挿入、又は置き換えを有することもある。アミノ酸の特性（残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性）の類似性に基づいて意図的にアミノ酸を置き換えすることもでき、従ってアミノ酸を機能グループ別にまとめることも有益である。アミノ酸はその側鎖の特性にのみ基づいてグループ化できる。しかしながら、突然変異データも含めるとより有益である。こうして得られたアミノ酸のセットは、構造的な理由から保存的である思われる。このようなセットは、Ｖｅｎｎ図の形で記載できる（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ  Ｃ．Ｄ．ａｎｄ  Ｂａｒｔｏｎ  Ｇ．Ｊ．（１９９３）「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ：ａ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ」Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ．９：７４５から７５６）（Ｔａｙｌｏｒ  Ｗ．Ｒ．（１９８６）「Ｔｈｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ」Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１１９；２０５から２１８）。保存的な置き換えは、例えば一般的に受け入れられているアミノ酸グループ化のベン図を記した下表に従って行うことができる。
【０１０７】
2008529549.tif 000003
【０１０８】
本発明はまた、起こり得る相同的な置換（本明細書では置き換え及び交換は共に既存のアミノ酸残基を別の残基に置き換えることを表すのに用いられている）、即ち塩基性から塩基性、酸性から酸性、極性から極性といった似たもの同士の置き換えも包含している。非相同的な置換、即ちある分類の残基から別の分類の残基への置換、又はオルニチン（以下Ｚと表す）、ジアミノブチル酸オルニチン（以下Ｂと表す）、ノルロイシンオルニチン（以下Ｏと表す）、ピリイルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、及びフェニルグリシンのような非天然アミノ酸が関係することも含めた置き換えが起こることもある。
【０１０９】
交換は、非天然アミノ酸によっても起こることがある。
【０１１０】
変異体アミノ酸配列は、配列中の任意の２つのアミノ酸残基の間に、グリシン又はβ−アラニン残基のようなアミノ酸スペーサーに加えて、メチル、エチル、又はプロピル基のようなアルキル基を含む挿入可能な好適なスペーサー基を含んでよい。変異体の別の形態は１又はそれ以上のペプトイドの形をしたアミノ酸残基の存在を含むが、この形態は当業者に周知である。誤解無いように説明すると、「ペプトイドの形」とは、α−炭素置換基がα−炭素以外の残基の窒素原子の上に在る変異体アミノ酸残基を表すのに用いている。ペプトイドの形をしたペプチドを調製するための工程は当技術分野で知られており、例えばＳｉｍｏｎ  ＲＪ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９２）８９（２０），９３６７から９３７１及びＨｏｒｗｅｌｌ  ＤＣ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）１３（４）、１３２から１３４がある。
【０１１１】
本発明で使用するためのヌクレオチド配列は、その中に合成又は修飾ヌクレオチドを含んでよい。本技術分野では、オリゴヌクレオチドに対する様々なタイプの修飾が知られている。そのようなものには、メチルホスホナート及びホスホロチオエート主鎖、及び／又は分子の３’及び／又は５’末端へのアクリジン又はポリリジン鎖の付加がある。本発明の目的について、本明細書に記載されたヌクレオチド配列は、当技術分野で利用可能な任意の方法によって修飾できることが了解される。このような修飾は、本発明のヌクレオチド配列のｉｎ  ｖｉｖｏ活性又は寿命を延ばすために行うことができる。
【０１１２】
本発明はまた、本明細書に示す配列に相補的であるヌクレオチド配列、又はその誘導体、フラグメント、若しくは誘導体の使用も包含する。配列がそのフラグメントに相補的であるならば、その配列はプローブとして用いて他の生物等中に在る同様のコード配列を同定することができる。
【０１１３】
本発明の配列に１００％相同でないが発明の範囲内に入るポリヌクレオチドは、様々な方法で得ることができる。本明細書に記載の配列のその他変異体は、例えば、ある範囲の個体、例えば異なる集団に由来する個体から作製したＤＮＡライブラリーをプロービングすることによって得ることができる。これに加えてその他の相同体を得ることもでき、そのような相同体及びそのフラグメントは、一般的には本明細書にリストアップしている配列中に在る配列に選択的にハイブリダイゼーションできるだろう。このような配列は、他の種から作製したｃＤＮＡライブラリー、又は由来するゲノムＤＮＡライブラリーをプロービングすることによって、或いは付属の配列リスト中の配列の任意の一つを完全又は一部含むプローブを用いて、そのようなライブラリーを高いストリンジェントな条件下プロービングすることによって得ることかができる。同様のことは、発明のポリペプチド又はヌクレオチド配列の種相同体及び対立遺伝子変異体を得る場合にも当てはまる。
【０１１４】
変異体及び株／種の相同体はまた、本発明の配列内にある保存されたアミノ酸配列をコードする変異体及び相同体内の配列を標的とするように設計されたプライマーを用いる変性ＰＣＲによっても得ることができる。保存配列は、例えば複数の変異体／相同体のアミノ酸配列を並べて比較することによって推測できる。配列アラインメント取りは、当技術分野で既知のコンピュータソフトウエアを用いて行うことができる。例えばＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＰｉｌｅＵｐプログラムが広く用いられている。
【０１１５】
変性ＰＣＲで使用するプライマーは１カ所以上の変性部位を含んでおり、単一配列プライマーを用いた既知配列に対する配列クローニングで用いたよりは低いストリンジェントな条件で用いられる。
【０１１６】
又は、このようなポリヌクレオチドは、特徴が分かっている配列に部位指定の突然変異を誘導しても得ることができる。これは、例えばポリヌクレオチド配列を発現させる特別な宿主細胞に合わせてコドン優先性を最適化するためにサイレントなコドン配列交換が求められる場合に有用である。制限抗体認識部位を導入するか、ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの特性又は機能を変更するために、他の配列変更が望まれることもある。
【０１１７】
発明のポリヌクレオチド（ヌクレオチド配列）は、プライマー、例えばＰＣＲプライマー、別の増幅反応のためのプライマー、プローブ、例えば放射性又は非放射性標識物を使った通常の手段による提示標識で標識されたプローブを作製するのに用いることができ、又はポリヌクレオチドはベクターにクローニングできる。このようなプライマー、プローブ、及びその他フラグメントは少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、例えば少なくとも２５、３０、又は４０ヌクレオチド長であり、これらも本明細書で使用される用語、発明のポリヌクレオチドに包含される。
【０１１８】
発明のＤＮＡポリヌクレオチド及びプローブのようなポリヌクレオチドは、組換え体、合成、又は当業者が利用可能な任意の手段によって作ることができる。それらは、標準的な技術によってクローニングすることもできる。
【０１１９】
一般的には、プライマーは、所望するヌクレオチド配列を一度に１ヌクレオチドずつ段階的に作ることを含む合成手段によって作られる。自動化技術を用いてこれを達成する技術は、当技術分野で容易に入手できる。
【０１２０】
より大型のポリヌクレオチドは、一般的には組換え体の手段を用いて、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を用いて作られる。プライマーは増幅されたＤＮＡが好適クローニングベクター内にクローニングできるように、好適な制限抗体認識部位を含むように設計することができる。
【０１２１】
ハイブリダイゼーション
本発明はまた、本発明の核酸配列に相補的である配列又は本発明の配列若しくはそれに相補的な配列のいずれかとハイブリダイゼーションできる配列も包含する。
【０１２２】
本明細書で使用する用語「ハイブリダイゼーション」は、「塩基対合による相補鎖との核酸鎖が結合する工程」だけでなくポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術で実施されるような増幅プロセスも含むものとする。
【０１２３】
本発明は、本明細書に示す配列、又はその誘導体、フラグメント、若しくは誘導体である配列にハイブリダイゼーションできる核酸配列の使用も包含する。
【０１２４】
用語「変異体」はまた、本明細書に示すヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションできる配列に相補的である配列も包含する。
【０１２５】
好ましくは用語「変異体」は、ストリンジェントな条件（例えば５０℃、且つ０．２×ＳＣＣ（１×ＳＣＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  Ｎａ３クエン酸  ｐＨ７．０）下で本明細書に示す配列とハイブリダイゼーションできる配列に相補的である配列を包含する。
【０１２６】
より好ましくは、用語「変異体」は、高いストリンジェントな条件（例えば６５℃、且つ０．１×ＳＣＣ（１×ＳＣＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  Ｎａ３クエン酸  ｐＨ７．０）下で本明細書に示す配列とハイブリダイゼーションできる配列に相補的である配列を包含する。
【０１２７】
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列（本明細書に示す配列の相補的配列を含む）にハイブリダイゼーションできるヌクレオチド配列とも関係する。
【０１２８】
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列（本明細書に示す配列の相補的配列を含む）にハイブリダイゼーションできる配列に相補的であるヌクレオチド配列とも関係する。
【０１２９】
中程度から最大のストリンジェントな条件下で、本明細書に示すヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションできるポリヌクレオチド配列も本発明の範囲内に含まれる。
【０１３０】
好ましい態様では、本発明は、ストリンジェントな条件（例えば５０℃、且つ０．２×ＳＳＣ）の下で、本発明のヌクレオチド配列又はその相補体にハイブリダイゼーションできるヌクレオチド配列を対象範囲に含む。
【０１３１】
より好ましい態様では、本発明は、高いストリンジェントな条件（例えば６５℃、且つ０．１×ＳＳＣ）の下で、本発明のヌクレオチド配列又はその相補体にハイブリダイゼーションできるヌクレオチド配列を対象範囲に入れる。
【０１３２】
発現ベクター
用語「プラスミド」、「ベクター系」、又は「発現ベクター」は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現できる構築体を意味する。本発明の関係では、これら構築体は、抗体をコードする遺伝子を宿主細胞内に導入するのに用いることができる。好適には、発現が誘導される遺伝子は、「発現可能導入遺伝子」と呼ぶことができる。
【０１３３】
好ましくは、発現ベクターは好適な宿主生物のゲノム内に組み入れられる。用語「組み入れる」は、好ましくはゲノム内への安定した組み入れを対象範囲に入れる。
【０１３４】
本発明のヌクレオチド配列を含めた本明細書に記載のヌクレオチド配列、はベクター内に存在でき、ベクターの中で前記ヌクレオチド配列は、好適宿主生物によるヌクレオチド配列の発現を提供できる制御配列と作動可能に連結している。
【０１３５】
本発明に使用するベクターは、以下説明するように好適宿主細胞内に形質変換でき、本発明のポリペプチドの発現を提供できる。
【０１３６】
ベクターの選択、例えばプラスミド、コスミド、又はファージベクターの選択は、それが導入される宿主細胞に依存することが多い。
【０１３７】
本発明に用いられるベクターは、抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、又はテトラサイクリン耐性を付与する遺伝子のような選択マーカー遺伝子を１以上含んでよい。又は、選択は、同時形質転換（ＷＯ９１／１７２４３に記載のような）によっても達成できる。
【０１３８】
ベクターは、例えばＲＮＡの産生のためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで、又は宿主細胞をトランスフェクション、形質転換、形質導入、又は感染するのに用いることができる。
【０１３９】
かくして更なる態様では、発明は、本発明のヌクレオチド配列を複製可能なベクター内に導入して、前記ベクターを適合した宿主細胞内に導入し、且つベクターの複製を引き起こす条件の下で宿主細胞を増殖させることによって、本発明のヌクレオチド配列を作製する方法に提供する。
【０１４０】
ベクターは、問題の宿主細胞内でベクターが複製できるようにするヌクレオチド配列を更に含むことができる。このような配列の例は、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１、ｐＩＪ７０２、及びｐＥＴ１１の複製起点である。
【０１４１】
制御配列
幾つかの応用では、本発明で使用するためのヌクレオチド配列は、選択された宿主細胞等によって、ヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる制御配列と作動可能に連結している。例を挙げれば、本発明は、そのような制御配列と作動可能に連結している本発明のヌクレオチド配列を含むベクターを対象範囲に含んでおり、即ち前記ベクターは発現ベクターである。
【０１４２】
用語「作動可能に連結している」とは、記載の構成要素が、それらが意図する形でそれらを機能できるようにする関係で隣接していることを指す。コード配列と「作動可能に連結している」制御配列は、制御配列に適合した条件の下でコード配列の発現が達成できるように連結している。
【０１４３】
用語「制御配列」は、プロモータ及びエンハンサー、並びにその他発現制御シグナルを含む。
【０１４４】
用語「プロモータ」は、当技術分野の通常の意味で用いられ、例えばＲＮＡポリメラーゼ結合部位である。
【０１４５】
本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列の増強発現は、異種の制御領域、例えばプロモータ、分泌リーダー、及びターミネーター領域を選択することによっても達成できる。
【０１４６】
好ましくは、本発明のヌクレオチド配列は、少なくともプロモータと作動可能に連結している。
【０１４７】
細菌、真菌、又は酵母におけるヌクレオチド配列の転写を指示するのに好適なプロモータの例は、当技術分野では周知である。
【０１４８】
構築体
用語「構築体」は「コンジュゲート」、「カセット」、及び「ハイブリッド」のような用語と同義語であり、本発明による使用のための、プロモータに直接又は間接的に付着しているヌクレオチド配列を含む。
【０１４９】
間接的付着の例は、Ｓｈ１−イントロン又はＡＤＨイントロンのようなイントロン配列のような好適なスペーサー群がプロモータと本発明のヌクレオチド配列の間に介在しているものである。このことは、本発明に関係した用語「融合」にも当てはまり、これも直接又は間接的な付着を含む。いくつかの例では、前記用語は、タンパク質をコードしている核酸配列と、通所それに結合している野生型遺伝子プロモータとの組み合わせであって、且つ共にその自然環境内に存在している組み合わせは対象範囲に含まない。  
【０１５０】
構築体は、遺伝子構築体の選択を可能にするマーカーを含んでも、又は発現してもよい。
【０１５１】
幾つかの応用では、本発明の構築体は少なくとも、プロモータと作動可能に連結した本発明のヌクレオチド配列を含むのが好ましい。
【０１５２】
宿主細胞
用語「宿主細胞」は、本発明に関係する場合には、上記のヌクレオチド配列又は発現ベクターのいずれかを含む任意の細胞、及び本明細書に明記した特別な性質を有する抗体の組換え体産生又は本発明の方法に用いられる任意の細胞を含む。
【０１５３】
かくして本発明の更なる態様は、本発明に記載されている抗体を発現する、ヌクレオチドで形質転換又はトランスフェクションされた宿主細胞を提供する。細胞は、前記ベクターに合わせて選択され、例えば原核生物（例えば細菌）、真菌、酵母、又は植物細胞でよい。好ましくは、宿主細胞はヒト以外の細胞である。
【０１５４】
好適な細菌宿主生物の例は、グラム陽性又はグラム陰性細菌種である。
【０１５５】
本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列の性質、及び／又は発現されたタンパク質の更なる処理が望まれるかによって、酵母又はその他真菌のような真核生物宿主が優先されるだろう。一般的には、操作が容易なことから真菌細胞よりも酵母細胞が好まれる。しかしながら、いくつかのタンパク質は、酵母細胞からの分泌が不良であるか、又は幾つかの例では処理が適切でない（例えば酵母での過剰グリココシル化）。このような例では、別の真菌宿主生物を選択しなければならない。
【０１５６】
好適な宿主細胞−酵母、真菌、及び植物宿主細胞のような−の使用は、本発明の組換え体発現産物に最適な生物活性を付与するのに必要な場合に、翻訳後修飾（例えばミリストイル化、グリコシル化、切断、脂質化、及びチロシン、セリン、又はスレオニンのリン酸化）が提供できる。
【０１５７】
宿主細胞の遺伝子型を変更して発現を改善することができる。
【０１５８】
培養及び産生
本発明のヌクレオチド配列を用いて形質転換した宿主細胞は、コードした抗体の産生を誘導できる条件で培養することができ、細胞及び／又は培地からの抗体の回収を容易にする。
【０１５９】
細胞の培養に用いる培地は問題の宿主細胞の増殖及び抗体の発現獲得に適した通常の培地でよい。
【０１６０】
組換え体細胞が産生したタンパク質は、細胞の表面に提示させてもよい。
【０１６１】
抗体は宿主細胞から分泌させてもよく、周知の手順を用いて培地から通常に回収できる。
【０１６２】
検出
当技術分野では、抗体及びそれらに対応する抗原への結合を検出及び測定するための様々なプロトコールが知られている。例を挙げると、抗体結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）がある。
【０１６３】
多様な標識物及び標識化技術が当業者に知られており、且つ様々な核酸及びアミノ酸アッセイに使用できる。
【０１６４】
Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、及びＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）のような多くの企業が、これら手順のための市販キット及びプロトコールを供給している。
【０１６５】
好適なレポーター分子又は標識物としては、放射線核種、酵素、蛍光体、化学発光体、又は発色剤、並びに基質、補助因子、阻害剤、磁性粒子等が挙げられる。このような標識物の使用を教示する特許としては、ＵＳ−Ａ−３，８１７，８３７；ＵＳ−Ａ−３，８５０，７５２；ＵＳ−Ａ−３，９３９，３５０；ＵＳ−Ａ−３，９９６，３４５；ＵＳ−Ａ−４，２７７，４３７；ＵＳ−Ａ−４，２７５，１４９、及びＵＳ−Ａ−４，３６６，２４１が挙げられる。
【０１６６】
本発明の抗体の使用
本発明の抗体分子、好ましくはＦａｂ分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの治療及び予防応用、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの診断応用、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ及び試薬応用、機能的ゲノム応用等に利用できる。
【０１６７】
本発明の抗体及び組成物の治療及び予防的な使用は、上記のものをヒトのようなレシピエント哺乳動物に投与することを含む。好ましくは、それら使用は哺乳動物の細胞内環境への投与を含む。
【０１６８】
哺乳動物への投与には、少なくとも９０から９５％相同である実質的に純粋な抗体が好ましく、薬学的使用では、特に哺乳動物がヒトの場合、９８から９９％又はそれより高い相同性が最も好ましい。望ましい程度まで部分精製されるか、又は均一になったならば、免疫グロブリン分子は診断又は治療（体外的なものも含む）、或いは当業者に知られている方法を用いたアッセイ手順の開発及び実施に用いることができる。
【０１６９】
本出願では、用語「予防」は、疾患が誘発される前に保護的組成物を投与することを含む。「抑制」は、事象が誘発された後ではあるが、疾患の臨床的出現の前である組成物の投与を含む。「治療」は、疾患の症状が出現した後の保護的組成物の投与を含む。
【０１７０】
本発明の選択された抗体分子は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性細胞に結合し、レセプター機能をｉｎ  ｖｉｖｏでダウンレギュレーションでき、従って典型的には癌の予防、抑制、及び治療に使用が見いだせるだろう。特に、発明の抗体はＨｅｒ２／ｎｅｕを発現している標的細胞の増殖を低下させることができる。
【０１７１】
「標的細胞」は、発明の組成物（例えばヒトモノクローナル抗体、二重特異性又は多特異性分子）が標的にできる、被験体内の望ましくない細胞を意味する。好ましい態様では、標的細胞は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを発現している、好ましくは過剰発現している細胞である。Ｈｅｒ２／ｎｅｕを発現している細胞としては、典型的なものとして、例えば唾液腺、胃、及び腎臓を含む腺癌細胞、乳腺癌細胞、肺癌細胞、扁平上皮癌細胞、及び卵巣癌細胞を含む腫瘍細胞が挙げられる。
【０１７２】
本発明の選択された抗体の疾患予防又は治療における有効性のスクリーニングに用いることができる動物モデル系は入手可能である。癌の好適なモデルは、当業者には知られているだろう。
【０１７３】
一般的には、本発明の選択された抗体は、精製された形態で、薬学的に適切な担体と一緒に用いられる。典型的には、これら担体としては、食塩水及び／又は緩衝媒体を含む水溶液若しくはアルコール／水溶液、乳液、又は懸濁液が挙げられる。非経口賦形剤としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、並びにラクトース添加リンゲル液が挙げられる。好適な生理学的に許容される補助剤は、ポリペプチド複合体を懸濁液に保つのに必要な場合、カルボキシルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、及びアルギン酸塩のような増粘剤から選ぶことができる。
【０１７４】
静脈賦形剤としては、リンゲルデキストロースを基本にしたような流体及び栄養補給物、及び電解質補給物が挙げられる。抗菌剤、酸化防止剤、キレート化剤、及び不活性ガスのような保存剤及びその他添加物も存在してよい（Ｍａｃｋ（１９８２）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）。
【０１７５】
本発明の選択された抗体は、別々に投与される組成物としても、他の作用物質と一緒に用いても良い。このような作用物質としては、シクロスポリン、メトトレキサート、アドリアマイシン、又はシスプチナムのような免疫治療薬、及び免疫毒素が挙げられる。薬学的組成物には、様々な細胞毒性物質又はその他作用物質と本発明の抗体を一緒にした「カクテル」、又は本発明の抗体の組み合わせたものもこれに入る。
【０１７６】
発明の薬学的組成物の投与経路は、当業者に公知である任意の経路でよい。免疫治療を含むが、これに限定されない治療では、発明の選択された抗体は、標準的な技術に従って患者に投与できる。投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮的、肺経路を介するものを含む任意の適切な様態で行うことができ、又は適切な場合には、カテーテルを使って直接注入することもできる。投与の用量及び頻度は、患者の年齢、性別、及び状態、同時に投与される他の薬物、禁忌事項、及び医師が考慮すべきその他のパラメータに依存するだろう。
【０１７７】
本発明の選択された抗体は保存向けに凍結乾燥し、且つ使用前に好適な担体で再生することができる。既知の凍結乾燥及び再生技術を用いることができる。当業者は、凍結乾燥及び再生が様々な程度で機能活性を損失させること、及び使用レベルを上方修正して補正しなければならいことがあることを認識しているだろう。
【０１７８】
本発明のこの選択された抗体を含む組成物又はそのカクテルは、予防及び／又は治療的処理のために投与できる。ある治療応用において、少なくとも選択された細胞の集団の一部阻害、抑制、変調、殺滅、又はその他測定可能なパラメータの実施に適切な量は「治療効果用量」として定義される。この投薬量を得るのに必要な量は、疾患の重篤度、患者自身の免疫系の一般状態に依存するが、一般的には体重１キログラム当たり０．００５から５．０ｍｇの選択された免疫グロブリンであり、０．０５から２．０ｍｇ／ｋｇ／投与の用量がより広く用いられている。予防的な応用については、本選択された免疫グロブリン分子又はそのカクテルを含有する組成物を同様又は若干少ない投与量で投与することもできる。
【０１７９】
本発明による選択された抗体分子を１種類以上含有する組成物を予防的及び治療目的に利用して、哺乳動物に於ける選択標的細胞集団の変更、不活性化、殺滅、又は除去を補助することができる。これに加えて、本明細書に記載されているポリペプチドの選択されたレパートリーを体外的又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いて、不均一な細胞集合体から標的細胞の集合を選択的に殺滅、枯渇、さもなければ効率的に除去することができる。哺乳動物の血液は、選択した細胞、細胞表面レセプター、又はその結合タンパク質と体外で組み合わせて望ましくない細胞を殺すか、さもなければ血液から除去して、標準的な技術に従って哺乳動物に戻すこともできる。
【０１８０】
本発明を、以下の図面を参照しながら実施例の形で更に説明する。
【０１８１】
実施例
一般的方法
本明細書に記載されている方法は、特に指示しない限り化学、分子生物、微生物、組換え体ＤＮＡ、及び免疫学の通常の技術を用い、これらは当業者の能力の範囲内である。このような技術は、文献中に説明されている。例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ  １９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｂｏｏｋｓ  １−３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）及び定期増刊物；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｃｈ．９、１３、及び１６、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）；Ｂ．Ｒｏｅ，Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ  ａｎｄ  Ａ．Ｋａｈｎ，１９９６，ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｊ．Ｍ．Ｐｏｌａｋ  ａｎｄ  Ｊａｍｅｓ  Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ、１９９０、Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（Ｅｄｉｔｏｒ），１９８４、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉｒｌ  Ｐｒｅｓｓ；Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｊ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＮＯ．１  ｂｙ  Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ（１９９９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−５４４−７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｂｙ  Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ（Ｅｄｉｔｏｒ）、Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（Ｅｄｉｔｏｒ）（１９８８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３１４−２）、１８５５．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ  Ｓｅｅｔｈａｌａ、Ｐｒａｂｈａｖａｔｈｉ  Ｂ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ編集（２００１、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ＩＳＢＮ  ０−８２４７−０５６２−９）；及びＬａｂ  Ｒｅｆ：Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｅｃｉｐｅｓ，Ｒｅａｇｅｎｔｓ，  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ａｔ  ｔｈｅＢｅｎｃｈ、Ｊａｎｅ  Ｒｏｓｋａｍｓ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄａ  Ｒｏｄｇｅｒｓ編集、２００２、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−６３０−３、「Ｍｏｎｏｃｌ��ｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」１９９４  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃ．Ｆ．Ｂａｒｂａｓ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｂｕｒｔｏｎを参照し、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。
【０１８２】
材料及び方法
プラスミド構築、及び酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓでのＨｅｒ２／ｎｅｕ細胞外ドメインの可溶性発現
ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ発癌遺伝子のＮ−末端細胞外ドメイン（１８８１ｂｐフラグメント、アミノ酸残基１から６２７）を完全長ｃＤＮＡクローン（好意によりＤｒ  Ｍｉｅｎ−Ｃｈｉｅ  Ｈｕｎｇより提供された）を用いたＰＣＲによって酵素的に増幅した。上流プライマー（５’−ＣＴＣＴＴＧＣＣＣＣＣＣＧＧＡＡＴＣＧＡＴＡＧＣＡＣＣＣＡＡＧＴＧＴＧＣ−３’）及び下流プライマー（５’−ＧＡＧＡＴＧＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＣＴＡＧＡＣＴＧＧＣＴＣＴＣＴＧＣＴＣＧ−３’）を構築して、ＣｌａＩ及びＸｂａＩ制限部位をそれぞれ含めた（下線部）。相応しい制限エンドヌクレアーゼを用いて、精製ｃＤＮＡフラグメントを発現ベクターｐＰＩＣＺαＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。組換え体フラグメントに先行して、ＡＯＸプロモータの転写制御を受け、メタノールで誘導されるシグナルペプチドα−因子が在り、一方Ｃ末端にはｃ−Ｍｙｃエピトープ及びポリヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグをコードする配列が融合している。直線化した構築体をＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ内にエレクトロポレーションし、形質転換した細胞を、ゼオシン（１００μｇ／ｍｌ）を加えたＹＰＤＳ（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％デキストロース、及び１Ｍソルビトール）に接種して３０℃で３日間インキュベーションした。形質転換体を５’α因子及び３’ＡＯＸ１プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたＰＣＲでスクリーニングした。個々のクローンをＢＭＧＹ、ＢＭＧＨ、又はＭＧＹＨ培地で培養した。１６から２０時間培養した後、細胞を遠心分離（３０００×ｇ、５分間、室温）で集め、ＢＭＭＹ、ＢＭＭＨ、又はＭＭＨ培地にそれぞれ浮遊させて（１％グリセロールの代わりに０．５％メタノールが入ったＢＭＧＹ、ＢＭＧＨ、又はＭＧＹＨから成る）誘導を開始した。発現は最初の１及び２日間、０．５％ｖ／ｖメタノールを加えて、第３及び４日には１％ｖ／ｖのメタノールを加えて行った。誘導終了時に培養物を遠心分離（８０００×ｇ、２０分間、４℃）で集め、細胞及び細胞破壊物を除いた。培養上清を、高−Ｍｙｃ  ９Ｅ．１０ｍＡｂ（ＡＴＣＣ）を用いたドット分析によってＨｅｒ２／ｎｅｕーＥＣＤの発現について試験した。大規模タンパク質発現には、最高のタンパク質収量を示したクローンを用いた。
【０１８３】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ培養上清からのＥＣＤ精製
培養上清を０．２２μｍメンブレンフィルターに通してから、ＰＭＳＦ（最終濃度１ｍＭ）及びＮａＮ３（最終濃度０．０５％）を加えた。続いて濾過液を、３０ｋＤａカットオフメンブレンを装着したＭｉｎｉｔａｎ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａ）を用いて２０倍に濃縮し、リン酸緩衝液に対し徹底的に透析した（５．８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、４０ｍＭ  Ｎａ２ＰＯ４、ｐＨ８）。濃縮されたタンパク質を、次にＮｉ２＋−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー（ＱＩＡｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、製造元のプロトコールに従って、未変性条件に精製した。非特異的相互作用を防止するために、結合及び洗浄作業は、高塩濃度（２Ｍ  ＮａＣｌ）及び低イミダゾール濃度（１０ｍＭ）リン酸緩衝液、ｐＨ８の中で行った。同一緩衝液で平衡化したＮｉ２＋−ＮＴＡアガロースを透析した上清に加え、ゆっくり回転させながら１６時間、４℃でインキュベーションした。組換え体タンパク質の溶出は、イミダゾール濃度を上げて（４０、６０、８０、及び１００ｍＭ）行った。溶出液のタンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを標準物質に用いて、クマジープラスタンパク質アッセイ試薬キット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を製造元指示書に従って用い決定した。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ−ＥＣＤの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて推定した。
【０１８４】
組換え体Ｈｅｒ２／ｎｅｕ−ＥＣＤのＩｎ  ｖｉｔｒｏ脱グリコシル化
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来の組換え体ＥＣＤの翻訳後修飾を、脱グリコシル化反応で分析した。約７μｇのＥＣＤを、０．５％のＳＤＳ及び１％のβメルカプトエタノールを含む緩衝液中で、１００℃で１０分間変性させた。５０ｍＭのリン酸ナトリウムと最終濃度１％のＮＰを加え、タンパク質を１０００単位のＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と、総反応容積１６０μｌで１時間、３７℃でインキュベーションした。ＰＮＧａｓｅ  Ｆの見かけ上の分子量は３６ｋＤａである。
【０１８５】
細胞株及び培地
細胞株のパネルを、前に修正した乳癌モデルとして用いた（Ｌａｃｒｏｉｘ  ａｎｄ  Ｌｅｃｌｅｒｃｑ、２００４）。それらには、Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質を過剰発現しているＳＫＢＲ３及びＭＤＡ−ＭＢ−４５３、及びＨｅｒ２／ｎｅｕの発現が低いＭＤＡ−ＭＢ−４３５及びＭＣＦ７が含まれている。これらの細胞及びＨｅＬａ細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を補充したＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０の中に、５％ＣＯ２−９５％大気の下、３７℃で維持された。
【０１８６】
組換え体ヒトＦａｂ−ファージライブラリーの構築及びバイオパンニング
Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性乳癌患者のリンパ細胞を、Ｌｙｍｐｈｐｒｅｐ  Ｆｉｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて浸潤リンパ節より単離し、次にＢ細胞集団を抗−ＣＤ１９カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使って取り除いた。全ＲＮＡは、グアニジンイソチオシアネート／酸フェノール法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ、１９８７）を用いて単離された。ライブラリーの構築とパンニングは、既に記載した様にして行った（Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１；Ｂｕｒｔｏｎ、１９９１；Ｂａｒｂａｓ  ＆  Ｂｕｒｔｏｎ、１９９４）。簡単に説明すると、Ｂ細胞由来の全ＲＮＡ、並びに重鎖Ｆｄ及び軽鎖に対するヒトＩｇ−特異的変性プライマーを１段階ＲＴ−ＰＣＲ反応に使用した（Ａｃｃｅｓｓ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ）。ｐＣｏｍｂ３Ｈベクター（Ｄｒ．Ｃ．Ｂａｒｂａｓ及びＰｒ．Ｄ．Ｂｕｒｔｏｎから好意により提供された）（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３）にクローニングのための制限部位を導入するために、ＰＣＲ産物を精製して再増幅した。増幅されたＶλ−Ｃλ、Ｖκ−Ｃκ、及びＶＨ−ＣＨ１  ｃＤＮＡフラグメントをｐＣｏｍｂ３Ｈファージミドに、それぞれＳａｃＩ／ＸｂａＩ及びＸｈｏＩ／ＳｐｅＩ制限部位の間にクローニングした。コンビナトリアルライブラリーをＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞にエレクトロポレーションし、報告されているようにしてＶＣＳ−Ｍ１３ヘルパーファージにパッケージングした（Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１）。４％ポリエチレングリコール、０．５ＭのＮａＣｌを加えてファージを沈殿させてから１％ＢＳＡ，０．０２％ＮａＮ３を含むＰＢＳ２ｍｌに浮遊させた。
【０１８７】
ライブラリーパンニングは、酵母Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓが発現した組換え体Ｈｅｒ２／ｎｅｕ−ＥＣＤ（１μｇ／ウエル）の抗原をコーティングした４つのマイクロタイタープレートウエル（４×５０μｌ）の中で行った。プレートをブロッキングし、１０１２ｃｆｕ／ｍｌの濃度のＰＥＧ沈殿ファージ５０μｌと、２時間、３７℃でインキュベーションした。厳密性を１×、３×、６×、１０×に高めた洗浄段階モードにより非特異的結合物を除き、結合したファージを溶出してから次のパンニングのために再増幅した。ブロッキング媒体は３％ＢＳＡのＰＢＳ溶液であり、ファージを０．５％Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ溶液で洗浄し、グリシン緩衝液ｐＨ２．２で溶出して、２Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基を用いて中和した。ファージは１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液中に４℃で保存した。
【０１８８】
可溶性Ｆａｂフラグメントの産生及び精製
最終ラウンドのパンニングのファージミドＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉから単離し、ｐＩＩＩタンパク質を除いてから再連結してＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞を形質転換するためにＳｐｅＩ／ＮｈｅＩ（Ｎ．Ｅ．Ｂｉｏｌａｂｓ）消化にかけた。単一コロニー由来の細菌培地を３７℃でＯＤ６００が〜１．００になるまで増殖させ、次に１ｍＭのＩＰＴＧ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を添加してから一晩、３０℃で増殖させて、可溶性Ｆａｂの産生を誘導した。可溶性Ｆａｂは、凍結−融解法又は超音波処理を用いて細胞を溶解し、周辺質から得た（Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１）。
【０１８９】
可溶性Ｆａｂは、プロテインＧコーティングアガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に共有結合させたヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２抗体（ＰＩＥＲＣＥ、ＵＳＡ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーを使って、既に報告されているとおりに精製した（Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１）。結合したＦａｂを０．２Ｍのグリシン−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ２．８、続いて０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ２．５で溶出し、両溶出液を直ちに１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０で中和し、ＰＢＳ、０．２ｍＭのＥＤＴＡに対し透析した。
【０１９０】
溶出液を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて、タンパク質をクマジー又は銀染色によって視覚化した。Ｆａｂはヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２、続いて抗ヤギＨＲＰ標識抗体（１：１０００、ＤＡＫＯ）を用いるウエスタンブロットで検出した。タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｉｏｒａｄ）で決定し、Ｆａｂは上記のＥＬＩＳＡを用いて試験した。以後、全ての実験で精製Ｆａｂを使用した。
【０１９１】
ＤＮＡ配列決定及び分析
Ｆａｂ発現クローンのＤＮＡ標本の配列は、重鎖向けのＰｅｌＢ及びＳＥＱＧｚプライマー及び軽鎖向けのＯｍｐＡ、ＳＥＱκｂ、及びＳＥＱλｂプライマーを用いて、両方向について、手動（シークエナーゼチェインターミネーションＤＮＡ法、ＵＳＢ）及びＡＬＦ−Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌａｂのシークエンス施設、ＩＭＢＢ、Ｃｒｅｔｅ）による自動の両方で決定した。再配置されたＶＨ及びＶＬ配列の生殖細胞中の該当配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩｇＢＬＡＳＴサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を用いて分析し、ＣｌｕｓｔａｌＷソフトウエアを使って配列のアラインメントをとった。相補性決定領域（ＣＤＲｓ）は、Ｋａｂａｔの定義に従って割り当てた（Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．）。
【０１９２】
ＥＬＩＳＡ及び免疫沈降によるＦａｂの特徴付け
マイクロタイタープレートをＨｅｒ２／ｎｅｕ−ＥＣＤ又はコントロールの抗原でコーティングし（１０μｇ／ｍｌ）、３％ＢＳＡのＰＢＳ溶液でブロッキングしてから、Ｆａｂフラグメントを含む粗溶解物と一緒に１時間３７℃でインキュベーションした。次にプレートを１０回、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ溶液で洗浄し、ヒトの軽鎖ＩｇＧを認識するヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２アルカリホスファターゼ標識体（１：１０００、ＰＩＥＲＣＥ）と１時間、３７℃でインキュベーションした。上記の通りに最終洗浄した後、基質液（ｐＮＰＰ、ＳＩＧＭＡ）を加えて、プレートのＯＤを、ＥＬＩＳＡリーダー（Ｂｉｏｒａｄ）で４０５ｎｍについて読みとった。
【０１９３】
サンドイッチＥＬＩＳＡでは、精製したＦａｂ６３及びコントロールの抗体、抗−ＡＣｈＲ  Ｆａｂ（Ｆｏｓｔｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）及びハーセプチンを、０．５μｇ／ｍｌのマウス抗−Ｈｅｒ２抗体（ＴＡＢ２５０、Ｚｙｍｅｄ）を用いたマイクロタイタープレートに事前に捕捉しておいた可溶化Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプターとインキュベーションした。Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプターは、ＳＫＢＲ３細胞から、細胞を溶解緩衝液（１４０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮＦ、１０ｍＭのＴｒｉｓ、５ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＥＧＴＡ、５ｍＭのＩＡＡ、０．５ｍＭのＰＭＳＦ、５ｕ／ｍｌのアプロチニン、５μｇ／ｍｌのペプスタチン）の中で細胞を、４℃で３０分間ホモジェナイゼーションして抽出した。続いて遠心分離した沈殿物（１４，０００ｇ、３０分間、４℃）を洗浄し、２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加えて同一緩衝液に再浮遊させて、針の付いた注射筒を使ってホモジェナイゼーションした。サンプルを４℃で一晩インキュベーションし、上記の通りに遠心分離して可溶化レセプターを含む上清を集めた。Ｆａｂ又は抗体検出の最終段階は、前記したように行った。
【０１９４】
競合ＥＬＩＳＡの場合は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプターをまず精製Ｆａｂ６３又は競合抗体と一晩、４℃で予備インキュベーションし、得られたレセプター復党外をマクロタイタープレートの５μｇ／ｍｌのＦａｂ６３又は１μｇ／ｍｌのハーセプチンＩｇＧで捕捉した。レセプターはＣ−１８ポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、続いて抗ウサギＨＲＰ（１：１０００、ＤＡＣＯ）を用いて、基質（ＴＭＢ、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）添加後に最終ＯＤを４５０ｎｍについて読みとって検出した。
【０１９５】
免疫沈降の場合は、細胞を６−ウエルプレートの中で一晩、〜５０％集密度まで増殖させた。翌日、細胞をＰＢＳで洗浄して〜５００ｎＭのＦａｂ又は６６ｎＭのハーセプチンと３０分間インキュベーションした。細胞を上記した通りに溶解し、膜抽出物を事前にプロテインビーズに結合させておいたヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２のスラリー１０μｌを使って、最終容積５０μｌにて、１から２時間、室温んで免疫沈降させた。ビーズを３回、０．１％Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ローディング緩衝液に浮遊させて、煮沸し、ウエスタンブロットで分析した。Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプターは、Ｃ−１８ポリクローナル抗体を使って検出し、一方Ｆａｂの軽鎖及びハーセプチンは、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２  ｍＡｂを使って検出した。
【０１９６】
サイトフローメトリー分析
生細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄して、ブロッキング緩衝液（１％ＦＢＳのＰＢＳ溶液）で飽和させた。一部、１×１０５個の細胞を、ブロッキング緩衝液で希釈したＦａｂ６３、ハーセプチン、抗−ＡＣｈＲヒトＦａｂと１から２時間、４℃でインキュベーションした。細胞をヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２（１：１０００）とインキュベーションし、続いてＦＩＴＣ標識ウサギ抗ヤギ抗体（１：１００、Ｄａｋｏ）とインキュベーションした。細胞を洗浄し、ＰＢＳに再浮遊させ、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）フローサイトメーターの平均蛍光強度（ＭＦＩ）について分析した。
【０１９７】
共焦点レーザー走査顕微鏡
ポリ−ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ）をコーティングしたガラス薄板状に増殖させた半集密状態のＳＫＢＲ３細胞を、ＰＢＳで洗浄してＦａｂ６３又はハーセプチンと、指定された時間、４℃又は３７℃でインキュベーションした。次に細胞を４％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液で、室温にて５分間固定し、一方内在化研究では氷冷アセトンを使って細胞を３０秒間透過処理した（Ｐｏｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、２０００）。細胞を洗浄してからＭａｂ緩衝液（１０％ＦＢＳ、６０ｍＭのリジンＰＢＳ溶液）で、２０分間、３７℃でブロッキングし、Ｆａｂ６３及びハーセプチンの蛍光標識をフローサイトメトリーの場合と同様にして行った。最後に薄板を洗浄してＣｉｔｉｆｏｕｒ（登録商標）を使ってマウントしてスライドの上に逆さにして載せた。免疫蛍光分析はＬｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ共焦点顕微鏡で行った。
【０１９８】
細胞増殖アッセイ
１０５細胞／ｍｌの単一細胞浮遊液を調製し、１００μｌ／ウエルの量で９６ウエル培養プレートに一晩付着させた。軽く細胞を洗浄した後、１０％ＦＢＳと５０から５５０ｎＭの範囲の濃度のＦａｂ６３、或いは６６ｎＭのハーセプチンを含む、又は含まない１００μｌの培地を加えた。Ｆａｂ６３−ハーセプチンの相乗作用を試験するために、細胞を、両剤が最大濃度比で存在する状態で培養した。リガンド活性化試験では、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３及びＭＣＦ７細胞株それぞれについて１０％及び１％ＦＢＳが存在する状態でＦａｂ６３又はハーセプチンを添加した後に、細胞をＨＲＧ−β１（５０ｎｇ／ｍｌ）で３０分間処理した。細胞を７２時間インキュベーションし、生細胞数をＭＴＴアッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  細胞増殖アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて決定した。細胞生存率は、Ｆａｂ６３又はハーセプチン無しで培養した細胞の増殖パーセントとして表した。
【０１９９】
結果
酵母Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓでのＨｅｒ２の細胞外ドメインの発現及び精製
Ｈｅｒ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードするｃＤＮＡをＰＣＲで増幅し、タンパク質を大規模に発現し、且つ精製するためにｐＰＩＣＺαＣ  Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現ベクターにクローニングした（図１Ａ）。この構築体、ｐＰＩＣＺαＣ−ＥＣＤを直線化し、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株Ｘ３３及びＧＳ１１５を形質転換し、組換え体クローンをゼオシン（１００μｇ／ｍｌ）含む培地で選択した。個々の形質転換対を３種類の培地（ＢＭＧＹ、ＢＭＧＨ、及びＭＧＹＨ）で増殖させて、タンパク質の発現を判定した。タンパク質産生を、エタノールを添加して２４時間毎、４日間モニタリングして、最適なタンパク質産生に必要な時間を決定した。培養上清のドットブロット分析は、Ｈｅｒ２−ＥＣＤの最高レベルの発現がＸ３３形質転換体について、メタノールを用いた誘導７２時間後にＢＭＧＹ培地に見られることを明らかにした（データ未提示）。更なる分析のために、高発現クローンを選択した。
【０２００】
分泌されたＥＣＤを、Ｎｉ２＋−ＮＴＡカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより培養上清から精製した。非特異的相互作用を防止するために、結合及び洗浄作業は２ＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのイミダゾールを含むリン酸緩衝液、ｐＨ８を用いて行った。タンパク質は、イミダゾール濃度を上げて（４０、６０、８０、及び１００ｍＭ）溶出した。分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングで分析した。図１Ｂは、Ｈｅｒ２−ＥＣＤタンパク質の大部分が４０、６０、及び８０ｍＭのイミダゾールで溶出されたことを示している。産物の分子量は、１２０から２１０ｋＤａと推定され、アミノ酸配列から予想したもの（７３ｋＤａ）より大きかった。この差は、ペプチドＮ−グリコシダーゼＦを用いた酵素的脱グリコシレーションにより見かけ上約８５ｋＤａの分子量に減少したことから、分子のグリコシル化によるものと思われる（図１Ｃ）。更には、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０）及び抗ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ  ＩＣＲ１２ｍＡｂｓの両方を用いたウエスタンブロッティングでも脱グリコシル化及び未処理のＥＣＤが検出された（図１Ｄ）。これらの結果は、元々のタンパク質ｅｒｂＢ２と同様にＨｅｒ２−ＥＣＤもグリコシル化さていることを示す。精製ＥＣＤの収量は０．２から０．３ｍｇ／リットルであった。
【０２０１】
抗ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ  ｍＡｂ  ＩＣＲ１１２及びｍＡｂｓ  ＴＡＢ２５０，並びに変性Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質に結合しない（データ未提示）ハーセプチンを、精製組換え体Ｈｅｒ２−ＥＣＤへの結合についてＥＬＩＳＡでアッセイした。試験した全てのｍＡｂがＥＣＤを非常に良く認識し、組換え体タンパク質が天然に近い立体構造に折りたたまれていることが示唆された（図１Ｅ、図４Ａ）
【０２０２】
コンビナトリアルヒトＦａｂライブラリーの構築−特異的抗Ｈｅｒ２−ＥＣＤ  Ｆａｂ６３の単離
ファージディスプレイＦａｂライブラリーを、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性乳癌患者の浸潤リンパ節から単離されたＢ−リンパ細胞から構築した。軽鎖遺伝子レパートリー（κ及びλ）をｐＣｏｍｂ３Ｈファージミドにクローニングし、続いてγ１イソ型のＦｄ重鎖遺伝子レパートリーを軽鎖ライブラリーに挿入した。複雑度１×１０７ｃｆｕ／μｇのヒトコンビナトリアルＦａｂライブラリーを創作した。特異的抗Ｈｅｒ２  Ｆａｂ抗体フラグメントを選択するために、コンビナトリアルライブラリーを組換え体Ｈｅｒ２−ＥＣＤ抗原でパンニングした。最終ラウンドのパンニングからは、第３ラウンドのパンニングの最低溶出物に比べて１００倍増幅されたファージ力価が得られ（図２Ａ）、特定抗原に対し親和性が増強したクローンが濃縮されたことが示された。ファージミドＤＮＡは、パンニングの第８ラウンドから単離し、可溶異性Ｆａｂｓを産生するように変更した。複数のクローンをＨｅｒ２−ＥＣＤを用いたＥＬＩＳＡで試験し、クローン６３を選択して更なる特徴付けを行った。
【０２０３】
ヒトＦａｂ６３の特異的結合をまずＥＬＩＳＡアッセイで試験した。図２Ｂは、Ｆａｂ６３がＨｅｒ２−ＥＣＤに特異的に結合するが、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ヒトＡＣｈＲのアルファ１−ＥＣＤ（α１−ＥＣＤ）（Ｐｓａｒｉｄｉ−Ｌｉｎａｒｄａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００２）（共にＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓで産生された）、又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のような無関係な抗原には結合しないことを示している。
【０２０４】
可溶性Ｆａｂ６３はＩＰＴＧ誘導を用いて大規模に産生された。Ｆａｂはクマジー及び銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約３０ｋＤの２本のバンドとして認められ、純度について試験され、また抗ヒトＦａｂ抗体を用いたウエスタンブロットでも検出された（データ未提示）。純粋なＦａｂ６３はＢｒａｄｆｏｒｄ法により定量化され、その後の全ての実験でＰＢＳ溶液の形で用いられた。精製Ｆａｂの収量はおおよそ１ｍｇ／リットルであった。
【０２０５】
完全なヒトＦａｂ６３の一次構造は、配列分析及びＫａｂａｔとＢｌａｓｔデータベースによる生殖細胞Ｖ遺伝子と比較することによって決定された。Ｆａｂ６３のＶＨ−ｃＤＮＡはＶＨ４遺伝子ファミリーに極めて近く、アミノ酸分析は８３％の相同性を示したが（図３Ａ）、一方ＶＬ−ｃＤＮＡはＫサブグループに属し、Ｏ２生殖細胞アミノ酸配列と８２％の相同性を示した（図３Ｂ）。Ｆａｂ６３のＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれぞれ図３Ｃ及び３Ｄに示す。
【０２０６】
天然Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプターに対するＦａｂ６３の特異性
Ｆａｂ６３は、上記のようなＨｅｒ２／ｎｅｕ高発現ＳＫＢＲ３細胞株から抽出された可溶性Ｈｅｒ２／ｎｅｕ全レセプターと結合できる。レセプターは、ＥＬＩＳＡプレート内で、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの細胞外ドメインに特異的な抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕマウス抗体によって捕捉された。Ｆａｂ６３を、陽性抗体となる１０ｎＭのハーセプチンと陰性抗体となる２５０ｎＭ濃度の抗−ｈｕＡＣｈＲ  Ｆａｂ（抗−ＡＣｈＲ）と一緒に、２５０ｎＭの濃度で加えた。抗−ヒトＦａｂ抗体を用いたＦａｂ６３及びハーセプチンの検出では、Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプターが捕捉されているウエルだけに強いシグナルが得られた。無関係なＦａｂはいずれの場合もバックグランドの結合を示した（図４Ａ）。
【０２０７】
我々はフローサイトメトリーを使って無傷細胞へのＦａｂ６３の結合能力について更に研究した。Ｆａｂ６３はＨｅｒ２／ｎｅｕＳＫＢＲ３細胞株と結合するが、ハーセプチン（図４Ｂ）及び抗−ｈｕＡＣｈＲ  Ｆａｂ（データ未提示）に比べ陰性のＨｅＬａ細胞株ではバックグランドシグナルのみを生じた。
【０２０８】
同じ結果は共焦点顕微鏡を使っても得た。前もって増殖し、カバーガラスの上に固定しておいた細胞を４℃で染色することによって、ＳＫＢＲ３細胞の膜にＦａｂ６３及びハーセプチンの結合を見ることができた（図６）。
【０２０９】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプターへのＦａｂ６３の結合の特異性について更に研究した。ＳＫＢＲ３細胞をＦａｂ６３で処理すると、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ膜レセプターが抗体フラグメントと共沈殿することが見出された（図４Ｃ）。ウエスタンブロットでは、Ｎｅｕ  Ｃ−１８ポリクローナルＡｂを使って、Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質に対応する１８５ｋＤａのバンドが検出され、一方Ｆａｂ６３の軽鎖及びハーセプチンは抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２ｍＡｂで検出された。
【０２１０】
Ｆａｂ６３認識部位を突きとめてハーセプチンとの競合能力を検証するために、我々は可溶性Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプター結合について競合アッセイを行った。使用した市販の抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ非ヒト抗体には、レセプターへのＦａｂ６３の結合に影響を及ぼすことができるものはなく、ハーセプチンのみ２ｎＭという低濃度でＦａｂ６３結合を競合した（データ未表示）。逆に、Ｆａｂ６３をＨｅｒ２／ｎｅｕと事前にインキュベーションすると、レセプターへのハーセプチンの結合を５５０ｎＭで最大８８％阻害した。ハーセプチンは、６６ｎＭの濃度では、自己競合体としてそれ自体の結合を１００％阻害したが、一方抗−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＩｇＭヒトＡｂ及び無関係な抗−ｈｕＡＣｈＲ  Ｆａｂは競合しなかった（図４Ｄ）。これらのデータは、ハーセプチン及びＦａｂ６３の結合部位が近接していることを示唆している。
【０２１１】
Ｆａｂ６３はＳＫＢＲ３細胞に内在化される
多くの標的化治療には、抗体の細胞内内在化能力が求められる。初期の内在化実験は、２時間のインキュベーションで行われ、Ｆａｂ６３の強い細胞内進入特性が明示されたが、ハーセプチンは細胞膜に検出された（図５）。続いて３０分、１、２、及び５時間目に行った経時的共焦点分析は（図６）、３０分間のＳＫＢＲ３とインキュベーションの間にＦａｂ６３が速やかに内在化されることを示した。Ｆａｂ６３は、２時間、３７℃後に最大の内在化効率を発揮し、強い細胞内シグナルを示したが、一方ハーセプチンは対応する時間間隔において細胞膜だけを染色した。非透過条件下、並びに４℃でのインキュベーションでは、Ｆａｂ６３のシグナルは予想通り膜表面に検出された。
【０２１２】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕ発現細胞株に対するヒトＦａｂ６３の増殖阻害作用
細胞に対するＦａｂ６３の機能特性を更に探るために、レセプターへの結合及び内在化に続いて我々はＨｅｒ２／ｎｅｕ高発現及び低発現癌細胞株のパネルを用いて、細胞増殖に及ぼす作用について研究した。正常な細胞増殖速度を推定するために、Ｆａｂ６３の濃度を上げながら、及びＦａｂ無しに細胞をインキュベーションし、７２時間培養後に細胞数を測定した。Ｆａｂ６３は、最高濃度の５００ｎＭにおいて細胞増殖をＭＤＡ−ＭＢ−４５３では〜４４％まで、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ高発現細胞株であるＳＫＢ３では〜３７％阻害した。５０及び２５０ｎＭというより低い濃度でも増殖阻害は観察され、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３及びＳＫＢＲ３細胞への用量依存的な作用を示したが、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ低発現細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−４３５では、いずれの濃度でも細胞増殖は停止しなかった（図７Ａ）。
【０２１３】
ハーセプチンはＨｅｒ２／ｎｅｕ陽性細胞の細胞増殖を細胞増殖抑制的に停止させることが知られており、したがってこれを陽性標準体及びＦａｂ６３の競合作用物質として用いた。ハーセプチンは、Ｆａｂ６３に似た挙動を示し、６ｎＭの低濃度においてＭＤＡ−ＭＢ−４５３では細胞増殖を〜３６％、ＳＫＢＲ３細胞では〜４０％阻害したが、一方Ｈｅｒ２／ｎｅｕ低発現細胞については増殖への影響はなかった（図７Ｂ）。細胞を２種類の抗体と同時にインキュベーションすると、増殖阻害は若干増加した（データ未提示）。
【０２１４】
別の一連の実験では、Ｆａｂ６３の抗増殖作用をＨｅｒ３レセプターのリガンドであるＨＲＧ−β１存在下に試験した。Ｆａｂ６３は高Ｈｅｒ２／ｎｅｕのＭＤＡ−ＭＢ−４５３及び低Ｈｅｒ２／ｎｅｕのＭＣＦ７細胞の両方で細胞増殖を、Ｆａｂ未処理細胞に比べてそれぞれ最大３４．５％（ｐ＜０．０５）及び２１％（ｐ＜０．０５）と有意に阻害した（図８）。ハーセプチンはＨＲＧ−β１存在下に、両細胞株に対して有意な細胞増殖阻害を誘導しなかった（ｐ＞０．１）。予想通り、リガンド非存在下では、Ｆａｂ６３及びハーセプチンは共にＨｅｒ２／ｎｅｕ高発現細胞の細胞増殖を阻害したが、ＭＣＦ７細胞株については低い阻害が観察された。
【０２１５】
これらのデータは、Ｆａｂ６３が、リガンド非依存的なメカニズムがシグナル伝達の主流であるＳＫＢＲ３及びＭＤＡ−ＭＢ−４５３癌細胞については有意な抗増殖作用を示すが、ＨＲＧ−β１増殖因子存在下では、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３及びＨｅｒ２／ｎｅｕ低発現ＭＣＦ７細胞株の両方について細胞増殖に対し負にも作用できることを示しており、リガンド依存的な増殖の関与を暗示している。
【０２１６】
考察
本研究は、酵母のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓに可溶性の形で発現させた、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ発癌タンパク質の細胞外ドメインに対する完全なヒト抗体フラグメント、Ｆａｂ６３を上手く単離できたことを記している。Ｆａｂ６３はその細胞質内に迅速に内在化する特性とＨｅｒ２／ｎｅｕ高発現癌細胞に強力な抗増殖作用とを合わせ持っている。
【０２１７】
転移性乳癌に特徴的な事象は、患者血清中のＨｅｒ２／ｎｅｕ  ＥＣＤのレベルが高いことである（Ｍｏｌｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．、２００２；Ｗｕ、２００２）。更には、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体の存在、及びそれらとＨｅｒ２／ｎｅｕ陽性癌とが相関することから、癌自体が発現したＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質に患者が暴露した結果Ｈｅｒ２／ｎｅｕの免疫が発生することを暗示している（Ｄｉｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７）。複数のグループが、腫瘍細胞に対する抗増殖作用のような免疫治療特性を示すＨｅｒ２／ｎｅｕ  ＥＣＤに対するマウス及びラットｍＡｂｓを単離している（Ｈｕｄｚｉａｋ  ＲＭ．、１９８９；Ｈａｒｗｅｒｔｈ  ＩＭ．、１９９３；Ｋｉｔａ  Ｙ．、１９９６）。しかしながら、そのヒト以外の起源であることが、反復処理によってヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ反応）を起こすことから、その使用を制限している。齧歯類の抗体を操作してよりヒトに近い変異体にし、免疫原性を下げた治療薬の製造が可能になている（Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．、１９９２）。２種類のマウスｍＡｂのヒト化変異体であるハーセプチン及びペルツブマブが、それぞれＨｅｒ２／ｎｅｕ高発現、及び／又は低発現癌細胞を標的とする治療薬として導入されている（Ｆｒａｋｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００４；Ｓｌａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）。最近、ファージディスプレイ技術を用いて、大規模なヒト抗体フラグメントのコンビナトリアルライブラリーから完全なヒトｓｃＦｖ又はＦａｂｓが単離されている（Ｂｕｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ、１９９４；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１）。更には、腫瘍特異的組換え体抗体を製造するために、腫瘍関連抗原に対するｉｎ  ｖｉｖｏ抗体反応をｉｎ  ｖｉｔｒｏで開発することができる。これによれば、進行乳癌患者のリンパ節に由来するヒトＦａｂコンビナトリアルライブラリーは、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体フラグメントの豊かな供給源となる（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７）。抗腫瘍活性を持つ作用物質を単離するために、ヒトｓｃＦｖコンビナトリアルファージディスプレイライブラリーをＣＨＯ細胞に発現させた組換え体ＥＣＤに大してパンニングしたが単離に成功していない（Ｓｃｈｉｅｒ  Ｒ．、１９９５；Ｓｈｅｅｔｓ  ＭＤ．、１９９８）。最近、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ−陽性及び−陰性細胞株の２つの組み合わせを用いることを基礎とした減算選択法を用いて、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ発現生細胞に対しファージライブラリーをパンニングすることによりファージｓｃＦｖ（エルビシン）が選別された（Ｄｅ  Ｌｏｒｅｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．、２００２）。より安定な立体構造をえるためのこのｓｃＦｖフラグメントは、元々の抗体フラグメントの抗増殖特性を保持した、ＩｇＧのコンパクトな縮小版として再構築されている（Ｄｅ  Ｌｏｒｅｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）。
【０２１８】
今回の研究では、我々は免疫ファージディスプレイライブラリーから抗−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  Ｆａｂフラグメントを単離するために、メチル栄養性の酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓで発現したＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原の細胞外ドメインを使用した。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの異種発現系は、培地中に炊き収量で組換え体タンパク質を分泌させられる効率的な分泌経路を持っている。更には、それはグリコシル化を含む翻訳後しゅ宇食を可能にし、且つＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに比べ過グリコシル化を起こしにくい（Ｃｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０００；Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ、２０００；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ、１９９７；Ｖｅｄｖｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１）。様々な立体構造依存的抗−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  ｍＡｂｓが組換え体ＥＣＤフラグメントに結合できることは、ＥＣＤが天然タンパク質に近いことを示唆している。このフラグメントはまた、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ過剰発現腫瘍を持つ患者の浸潤Ｂリンパ細胞から構築されたＦａｂコンビナトリアルライブラリーから、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原を特異的に認識するファージ抗体を効率よく選択するのにも用いられる。前述したように、その腫瘍がＨｅｒ２／ｎｅｕを過剰発現している患者にはＴ−ヘルパー、細胞傷害性の抗体反応が認められており（Ｄｉｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４）、更にマウスにおいて抗腫瘍免疫を提示するＨｅｒ２／ｎｅｕ内の複数のペプチド配列並びにＤＮＡワクチンも見つかっている（Ｙｏｓｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４；Ｐｅｏｐｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５；Ｐｉｅｃｈｏｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）。
【０２１９】
免疫ライブラリーから選択されたＦａｂフラグメントを、ＥＬＩＳＡを使って交叉反応性について調べたところ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び抗原ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む無関係な抗原のパネル、並びにＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓで発現させた抗原のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びＡｃｈＲのα１−ＥＣＤに対しては陰性であることが示された。我々の選択はＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原の精製組換え体フラグメントに基づいていることから、Ｆａｂ６３が天然のＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質を認識でき、且つｉｎ  ｖｉｖｏ条件を表していることを確認することが必須であった。免疫蛍光分析が示すように、Ｆａｂ６３は可溶性Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプターを認識し、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ高発現ＳＫＢＲ３細胞株には特異的に結合するが、ＨｅＬａ細胞には結合しなかった。
【０２２０】
Ｆａｂ６３の結合を〜６３０残基のドメインに沿って基部方向に向けようとした最初の試みにおいて我々は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプターとの競合アッセイの中で数多くの入手可能な抗−Ｈｅｒ２抗体を使用した。Ｆａｂ６３とハーセプチンの間でのみ強い阻害効果が認められたことから、この２種類の抗体の結合部位に関連性がある可能性が示唆された。ハーセプチンとＦａｂ−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＥＣＤ複合体は結晶学像が明らかにされており、ＥＣＤのＩＶドメインのＣ末端に抗体が結合することが明示されている（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。この膜近傍の結合部位にハーセプチンの抗腫瘍特性があり、それが乳癌細胞でのＥＣＤの開裂を阻害し、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ自己会合及び構成的なキナーゼの活性化を遮断すると強く信じられている（ｍｏｌｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）。
【０２２１】
Ｆａｂ６３とハーセプチン及びその他抗体とを区別しているものは、その抗増殖作用が、標的細胞内への強力且つ迅速な内在化できるその能力と結びついていることである。これまでの研究から、ハーセプチンの元のマウス版であるｍＡｂ４Ｄ５の一価又は二価型のｓｃＦｖは共にＥｒｂＢ２過剰発現細胞に対し有意な増殖変更作用を持っていないことが示されている（Ｎｅｖｅ  ＲＭ．ｅｔ  ａｌ．、２００１）。更には、内在化した抗腫瘍特性を持たないＦａｂｓについての記載はあるが（Ｐｏｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、２０００）、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕＦａｂ一価フラグメントペアについてこれら２つの動態の報告はない。これまでに報告された抗腫瘍特性を持つファージｓｃＦｖ又はそれぞれの可溶性ｓｃＦｖ（エルビシン）は、３７℃のインキュベーションでは、１６時間以内にＳＫＢＲ３細胞内に内在化された（Ｄｅ  Ｌｏｒｅｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．、２００２）。これに対し、Ｆａｂ６３は同一細胞と３０分間インキュベーションする間に迅速に内在化され、３７℃では２時間以内に最大の内在化効率を示す。最近の研究は３７℃、３時間後にトラツズマブ（ハーセプチン）の内在化が検出されることを示しているが（Ａｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）、これらの実験では対応する時間間隔では、ハーセプチンは細胞の膜のみを染色した。更には、Ｆａｂ６３は、Ｈｅｒ３のリガンド、ＨＲＧ−β１存在下にＨｅｒ２／ｎｅｕ高発現及び低発現細胞について細胞増殖を阻害する能力を持っているが、ハーセプチンは同様の効果を誘導できないだろう。Ｆａｂ６３の細胞増殖阻害のメカニズムについては研究中である。
【０２２２】
結論すると、酵母のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓで発現したＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質の細胞外ドメインに対する新規の完全ヒトＦａｂフラグメントが単離され、そのフラグメントは強力な抗増殖作用及び内在化特性を有している。
【０２２３】
参考文献
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Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．（２００１）Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  １，１１８−２９．
Ｃｈｏ  Ｈ．Ｓ．，Ｍａｓｏｎ  Ｋ．，Ｒａｍｙａｒ  Ｋ．Ｘ．，Ｓｔａｎｌｅｙ  Ａ．Ｍ．，Ｇａｂｅｌｌｉ  Ｓ．Ｂ．，Ｄｅｎｎｅｙ  Ｄ．Ｗ．，Ｊｒ．ａｎｄ  Ｌｅａｈｙ  Ｄ．Ｊ．（２００３）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ＨＥＲ２  ａｌｏｎｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ  Ｆａｂ．Ｎａｔｕｒｅ  ４２１，７５６−６０．
Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  Ｐ．ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ  Ｎ．（１９８７）Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｃｉｄ  ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １６２，１５６−９．
Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ  Ｔ．Ａ．，Ｄｏｈｅｒｔｙ  Ｊ．Ｋ．，Ｌｉｎ  Ｙ．Ｊ．，Ｒａｍｓｅｙ  Ｅ．Ｅ．，Ｈｏｌｍｅｓ  Ｒ．，Ｋｅｅｎａｎ  Ｅ．Ｊ．ａｎｄ  Ｃｌｉｎｔｏｎ  Ｇ．Ｍ．（１９９８）ＮＨ２−ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｗｉｔｈ  ｓｈｅｄｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５８，５１２３−９．
Ｃｉｔｒｉ  Ａ．，Ｓｋａｒｉａ  Ｋ．Ｂ．ａｎｄ  Ｙａｒｄｅｎ  Ｙ．（２００３）Ｔｈｅ  ｄｅａｆ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｄｕｍｂ：ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＥｒｂＢ−２  ａｎｄ  ＥｒｂＢ−３．Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２８４，５４−６５．
Ｃｌａｒｋ  Ｍ．Ａ．，Ｈａｗｋｉｎｓ  Ｎ．Ｊ．，Ｐａｐａｉｏａｎｎｏｕ  Ａ．，Ｆｉｄｄｅｓ  Ｒ．Ｊ．ａｎｄ  Ｗａｒｄ  Ｒ．Ｌ．（１９９７）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ｃ−ｅｒｂＢ−２  Ｆａｂｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ．ＣＨｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０９，１６６−７４．
Ｃｒｅｇｇ  Ｊ．Ｍ．，Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ  Ｊ．Ｌ．，Ｓｈｉ  Ｊ．ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｄ．Ｒ．（２０００）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ．  ＭｏＩ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６，２３−５２．
Ｄｅ  Ｌｏｒｅｎｚｏ  Ｃ，Ｐａｌｍｅｒ  Ｄ．Ｂ．，Ｐｉｃｃｏｌｉ  Ｒ．，Ｒｉｔｔｅｒ  Ｍ．Ａ．ａｎｄ  Ｄ’Ａｌｅｓｓｉｏ  Ｇ．（２００２）Ａ  ｎｅｗ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｒｅａｇｅｎｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ＥｒｂＢ２．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ８，１７１０−９．
Ｄｅ  Ｌｏｒｅｎｚｏ  Ｃ，Ｔｅｄｅｓｃｏ  Ａ．，Ｔｅｒｒａｚｚａｎｏ  Ｇ．，Ｃｏｚｚｏｌｉｎｏ  Ｒ．，Ｌａｃｃｅｔｔｉ  Ｐ．，Ｐｉｃｃｏｌｉ  Ｒ．ａｎｄ  Ｄ’Ａｌｅｓｓｉｏ  Ｇ．（２００４）Ａ  ｈｕｍａｎ，ｃｏｍｐａｃｔ，ｆｕｌｌｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ＥｒｂＢ２  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒ  ａｇｅｎｔ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９１，１２００−４．
Ｄｉｓｉｓ  ＭＬ，Ｓｍｉｔｈ  ＪＷ，Ｍｕｒｐｈｙ  ＡＥ，Ｃｈｅｎ  Ｗ，Ｃｈｅｅｖｅｒ  ＭＡ．（１９９４）Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４，１０７１−６．
Ｄｉｓｉｓ  Ｍ．Ｌ．，Ｐｕｐａ  Ｓ．Ｍ．，Ｇｒａｌｏｗ  Ｊ．Ｒ．，Ｄｉｔｔａｄｉ  Ｒ．，Ｍｅｎａｒｄ  Ｓ．ａｎｄ  Ｃｈｅｅｖｅｒ  Ｍ．Ａ．（１９９７）Ｈｉｇｈ−ｔｉｔｅｒ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃａｎ  ｂｅ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅａｒｌｙ−ｓｔａｇｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  ＣＨｎ  Ｏｎｃｏｌ  １５，３３６３−７．
Ｆｏｍｉｎａｙａ  Ｊ．ａｎｄ  ＷｅＩｓ  Ｗ．（１９９６）Ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍｕｌｔｉｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｎｏｖｅｌ  ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１，１０５６０−８．
Ｆｏｓｔｉｅｒｉ  Ｅ．，Ｔｚａｒｔｏｓ  ＳＪ，Ｂｅｒｒｉｈ−Ａｋｎｉｎ  Ｓ，Ｂｅｅｓｏｎ  Ｄ，Ｍａｍａｌａｋｉ  Ａ．（２００５）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  Ｆａｂ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｉｇｈｌｙ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｈｉｃｈ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ｔｈｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｒｏｍ  ｍｙａｓｔｈｅｎｉｃ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，（ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）
Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｍ．Ｃ，Ｃａｒｅｙ  Ｋ．Ｄ．，Ｖａｊｄｏｓ  Ｆ．Ｆ．，Ｌｅａｈｙ  Ｄ．Ｊ．，ｄｅ  Ｖｏｓ  Ａ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ  Ｍ．Ｘ．（２００４）Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ＥｒｂＢ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥｒｂＢ２−ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５，３１７−２８．
Ｇａｒｒｅｔｔ  Ｔ．Ｐ．，ＭｃＫｅｒｎ  Ｎ．Ｍ．，Ｌｏｕ  Ｍ．，Ｅｌｌｅｍａｎ  Ｔ．Ｃ，Ａｄａｍｓ  Ｔ．Ｅ．，Ｌｏｖｒｅｃｚ  Ｇ．Ｏ．，Ｋｏｆｌｅｒ  Ｍ．，Ｊｏｒｉｓｓｅｎ  Ｒ．Ｎ．，Ｎｉｃｅ  Ｅ．Ｃ，Ｂｕｒｇｅｓｓ  Ａ．Ｗ．ａｎｄ  Ｗａｒｄ  Ｃ．Ｗ．（２００３）Ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ＥｒｂＢ２  ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａｎ  ａｃｔｉｖｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  ｐｏｉｓｅｄ  ｔｏ  ｉｎｔｅｒａｃｔ  ｗｉｔｈ  ｏｔｈｅｒ  ＥｒｂＢ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．ＭｏＩ  Ｃｅｌｌ  １１，４９５−５０５．  
Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ  Ｇ．（２０００）Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｙｅａｓｔｓ．ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５４，７４１−５０．
Ｇｒａｕｓ  Ｙ．Ｆ．，ｄｅ  Ｂａｅｔｓ  Ｍ．Ｈ．，ｖａｎ  Ｂｒｅｄａ  Ｖｒｉｅｓｍａｎ  Ｐ．Ｊ．ａｎｄ  Ｂｕｒｔｏｎ  Ｄ．Ｒ．（１９９７）Ａｎｔｉ−ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆａｂ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｙｍｕｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ  ｇｒａｖｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｒｅｆｌｅｃｔ  ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  ｂｌｏｃｋ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｓｅｒｕｍ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ５７，５９−６２．
Ｈａｒａｒｉ  Ｄ．ａｎｄ  Ｙａｒｄｅｎ  Ｙ．（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２  ａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９，６１０２−１４．
Ｈａｒｒｉｓ  Ｍ．（２００４）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  ５，２９２−３０２．
Ｈｏｌｂｒｏ  Ｔ．，Ｂｅｅｒｌｉ  Ｒ．Ｒ．，Ｍａｕｒｅｒ  Ｆ．，Ｋｏｚｉｃｚａｋ  Ｍ．，Ｂａｒｂａｓ  Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ  ａｎｄ  Ｈｙｎｅｓ  Ｎ．Ｅ．（２００３）Ｔｈｅ  ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｓ  ａｎ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｕｎｉｔ：ＥｒｂＢ２  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ＥｒｂＢ３  ｔｏ  ｄｒｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳ  Ａ  １００，８９３３−８．
Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ  Ｃ．Ｐ．ａｎｄ  Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ  Ｇ．（１９９７）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｙｅａｓｔｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８，５５４−６０．
Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．Ｔ．Ｔ．Ｗ．，Ｈ．Ｍ．Ｐｅｒｒｙ，Ｋ．Ｓ．Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ａｎｄ  Ｃ．Ｆｏｅｌｌｅｒ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  １９９１．
Ｋｏｅｐｐｅｎ  Ｈ．Ｋ．，Ｗｒｉｇｈｔ  Ｂ．Ｄ．，Ｂｕｒｔ  Ａ．Ｄ．，Ｑｕｉｒｋｅ  Ｐ．，ＭｃＮｉｃｏｌ  Ａ．Ｍ．，Ｄｙｂｄａｌ  Ｎ．Ｏ．，Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ  Ｍ．Ｘ．ａｎｄ  Ｈｉｌｌａｎ  Ｋ．Ｊ．（２００１）Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｉｎ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｕｒｓ：ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｕｒｖｅｙ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ３８，９６−１０４．
Ｌａｃｒｏｉｘ  Ｍ．ａｎｄ  Ｌｅｃｌｅｒｃｑ  Ｇ．（２００４）Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ａｓ  ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｕｒｓ：ａｎ  ｕｐｄａｔｅ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  ８３，２４９−８９．
Ｌｕ  Ｙ．，Ｚｉ  Ｘ．，Ｚｈａｏ  Ｙ．，Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓ  Ｄ．ａｎｄ  Ｐｏｌｌａｋ  Ｍ．（２００１）Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−Ｉ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ９３，１８５２−７．
Ｍａｒｋｓ  Ｊ．Ｄ．，Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｈ．Ｒ．，Ｂｏｎｎｅｒｔ  Ｔ．Ｐ．，ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  Ｊ．，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  Ａ．Ｄ．ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ．（１９９１）Ｂｙ−ｐａｓｓｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．  Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｖ−ｇｅｎｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｏｎ  ｐｈａｇｅ．Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ  ２２２，５８１−９７．
Ｍａｒｍｏｒ  Ｍ．Ｄ．，Ｓｋａｒｉａ  Ｋ．Ｂ．ａｎｄ  Ｙａｒｄｅｎ  Ｙ．（２００４）Ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ＥｒｂＢ／ＨＥＲ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．ＩｎｔＪＲａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ  ５８，９０３−１３．
Ｍｅｌｌｉｎｇｈｏｆｆ  Ｉ．Ｋ．，Ｖｉｖａｎｃｏ  Ｉ．，Ｋｗｏｎ  Ａ．，Ｔｒａｎ  Ｃ，Ｗｏｎｇｖｉｐａｔ  Ｊ．ａｎｄ  Ｓａｗｙｅｒｓ  Ｃ．Ｌ．（２００４）ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｌｄｎａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ６，５１７−２７．
Ｍｏｌｉｎａ  Ｍ．Ａ．，Ｃｏｄｏｎｙ−Ｓｅｒｖａｔ  Ｊ．，Ａｌｂａｎｅｌｌ  Ｊ．，Ｒｏｊｏ  Ｆ．，Ａｒｒｉｂａｓ  Ｊ．ａｎｄ  Ｂａｓｅｌｇａ  Ｊ．（２００１）Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ），ａ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｂａｓａｌ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｈｅｒ２  ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１，４７４４−９．
Ｍｏｌｉｎａ  Ｍ．Ａ．，Ｓａｅｚ  Ｒ．，Ｒａｍｓｅｙ  Ｅ．Ｅ．，Ｇａｒｃｉａ−Ｂａｒｃｈｉｎｏ  Ｍ．Ｊ．，Ｒｏｊｏ  Ｆ．，Ｅｖａｎｓ  Ａ．Ｊ．，Ａｌｂａｎｅｌｌ  Ｊ．，Ｋｅｅｎａｎ  Ｅ．Ｊ．，Ｌｌｕｃｈ  Ａ．，Ｇａｒｃｉａ−Ｃｏｎｄｅ  Ｊ．，Ｂａｓｅｌｇａ  Ｊ．ａｎｄ  Ｃｌｉｎｔｏｎ  Ｇ．Ｍ．（２００２）ＮＨ（２）−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ＨＥＲ−２  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｎｏｄａｌ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ８，３４７−５３．
Ｎａｈｔａ  Ｒ．，Ｈｕｎｇ  Ｍ．Ｃ．ａｎｄ  Ｅｓｔｅｖａ  Ｆ．Ｊ．（２００４）Ｔｈｅ  ＨＥＲ−２−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ａｎｄ  ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｔｈｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４，２３４３−６．
Ｐａｒｋ  Ｊ．Ｗ．，Ｈｏｎｇ  Ｋ．，Ｋｉｒｐｏｔｉｎ  Ｄ．Ｂ．，Ｃｏｌｂｅｒｎ  Ｇ．，Ｓｈａｌａｂｙ  Ｒ．，Ｂａｓｅｌｇａ  Ｊ．，Ｓｈａｏ  Ｙ．，Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｕ．Ｂ．，Ｍａｒｋｓ  Ｊ．Ｄ．，Ｍｏｏｒｅ  Ｄ．，Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ  Ｄ．ａｎｄ  Ｂｅｎｚ  Ｃ．Ｃ．（２００２）Ａｎｔｉ−ＨＥＲ２  ｉｍｍｕｎｏ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｔｔｒｉｂｕｔａｂｌｅ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ８，１１７２−８１．
Ｐｅｏｐｌｅｓ  ＧＥ，Ｓｍｉｔｈ  ＲＣ，Ｌｉｎｅｈａｎ  ＤＣ，Ｙｏｓｈｉｎｏ  Ｉ，Ｇｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒｅ  ＰＳ，Ｅｂｅｒｌｅｉｎ  ＴＪ．（１９９５）Ｓｈａｒｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｉｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４，２７９−８６．
Ｐｉｅｃｈｏｃｋｉ  ＭＰ，Ｐｉｌｏｎ  ＳＡ，Ｗｅｉ  ＷＺ．（２００１）Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｈｕｍａｎ  ＥｒｂＢ−２．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７，３３６７−７４．
Ｐｏｕｌ  Ｍ．Ａ．，Ｂｅｃｅｒｒｉｌ  Ｂ．，Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｕ．Ｂ．，Ｍｏｒｉｓｓｏｎ  Ｐ．ａｎｄ  Ｍａｒｋｓ  Ｊ．Ｄ．（２０００）Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｈａｇｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｊ  ＭｏＩ５ｚｏ／３０１，１１４９−６１．
Ｐｒｅｓｓ  Ｍ．Ｆ．，Ｐｉｋｅ  Ｍ．Ｃ，Ｃｈａｚｉｎ  Ｖ．Ｒ．，Ｈｕｎｇ  Ｇ．，Ｕｄｏｖｅ  Ｊ．Ａ．，Ｍａｒｋｏｗｉｃｚ  Ｍ．，Ｄａｎｙｌｕｋ  Ｊ．，Ｇｏｄｏｌｐｈｉｎ  Ｗ．，Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ  Ｍ．，Ａｋｉｔａ  Ｒ．ａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｎｏｄｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：ｄｉｒｅｃｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ  ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３，４９６０−７０．
Ｐｓａｒｉｄｉ−Ｌｉｎａｒｄａｋｉ  Ｌ，Ｍａｍａｌａｋｉ  Ａ，Ｒｅｍｏｕｎｄｏｓ  Ｍ，Ｔｚａｒｔｏｓ  ＳＪ．（２００２）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｌｉｇａｎｄ−ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｌｐｈａ−ｂｕｎｇａｒｏｔｏｘｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７７，２６９８０−６．
Ｒｏｓｓ  Ｊ．Ｓ．ａｎｄ  Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  Ｊ．Ａ．（１９９８）Ｔｈｅ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ，ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ，ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １６，４１３−２８．
Ｒｏｓｓ  Ｊ．Ｓ．，Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  Ｊ．Ａ．，Ｌｉｎｅｔｔｅ  Ｇ．Ｐ．，Ｓｔｅｃ  Ｊ．，Ｃｌａｒｋ  Ｅ．，Ａｙｅｒｓ  Ｍ．，Ｓｙｍｍａｎｓ  Ｗ．Ｆ．，Ｐｕｓｚｔａｉ  Ｌ．ａｎｄ  Ｂｌｏｏｍ  Ｋ．Ｊ．（２００３）Ｔｈｅ  Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ２００３：ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  ８，３０７−２５．
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【０２２４】
上記明細書に記載された全ての刊行物、並びに前記刊行物に引用された参考文献は、参照によって本明細書に組み入れられる。本発明の記載の方法及びシステムの各種の変更及び変形は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなしに当業者に明らかになるだろう。発明は特定の好ましい態様に関連させて記載されているが、請求項に記載の発明はこのような特定の態様に限定されるものではないことを了解しなければならない。実際、分子生物学又は関連分野の当業者に明らかである発明を実施するための記載の方法の各種変更は、以下の特許請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【０２２５】
【図１】酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓでのＨｅｒ２／ｎｅｕ  ＥＣＤの可溶性発現Ａ）は可溶性Ｈｅｒ２／ｎｅｕ−ＥＣＤ発現のために構築されたプラスミドの概略図である：Ｈｅｒ２／ｎｅｕ−ＥＣＤをコードするｃＤＮＡをｐＰＩＣＺαＣ発現ベクターのＣｌａ  ＩとＸｂａ  Ｉ制限部位の間にサブクローニングした。ＥＣＤの先頭側にはＳ．  ｃｅｒｖｉｓｉａｅのα−因子が在り、且つ宿主の酵素によってＣ−末端で開裂されてｃ−ｍｙｃエピトープ及び６Ｈｉｓ−残基タグと融合している。Ｂ）はＮｉ＋２−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを用いたＥＣＤの精製を示す図である：イミダゾール濃度上昇（４０、６０、及び８０ｍＭ）に対応して溶出されたサンプルを８％ＳＤＳ  ＰＡＧＥで分析した。タンパク質は銀染色し、分子量マーカーを示してある。（Ｃ、Ｄ）はペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）によるＥＣＤの脱グリコシル化を示す図である：ＰＮＧａｓｅＦ存在・非存在下に１時間、３７℃でインキュベーションした精製ＥＣＤを８％ＳＤＳ  ＰＡＧＥにかけ、続いて抗ｍｙｃ  ｍＡｂ９Ｅ１０（Ｃ）及び銀染色（Ｄ）を用いたウエスタンブロットで分析した。Ｅ）はＥＣＤを確認するためのＥＬＩＳＡ試験を表す図である。ｍＡＢ  ＴＡＢ２５０を連続希釈して、１０μｇ／ｍｌの精製組換え体ＥＣＤへの結合を評価した。
【図２】乳癌コンビナトリアルライブラリーからの抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  Ｆａｂ５３の単離及び特徴付けＡ）はファージディスプレイライブラリーのパンニングを表す図である：４回のパンニングの後ファージの力価は劇的に上昇し、ファージが濃縮されたことを示した。Ｂ）はＥＬＩＳＡにおけるＦａｂ６３  ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ＥＣＤの特異的結合を示す図である：Ｆａｂ６３はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、又はヒトＡＣｈＲのアルファ−ＥＣＤ（α１−ＡＣｈＲ）との間に有意な交叉反応は示さなかった。全ての抗原は、ＥＬＩＳＡプレートに１０μｇ／ｍｌの濃度でコーティングされた。抗−ＡＣｈＲ：ヒトＡＣｈＲのα１−ＥＣＤに対するヒトＦａｂ。
【図３Ａ】ヒトＦａｂ６３と生殖細胞配列の相同性：Ｆａｂ６３  ＶＨ（Ａ）領域のｃＤＮＡ及び推論アミノ酸配列を示す図。配列は、ヒト生殖細胞遺伝子との相同性が最大になるように並べられている。ダッシュは、ヌクレオチド配列が同一であることを示す。ＣＤＲ部分を示した。
【図３Ｂ】Ｆａｂ６３  ＶＬ（Ｂ）領域のｃＤＮＡ及び推論アミノ酸配列を示す図。配列は、ヒト生殖細胞遺伝子との相同性が最大になるように並べられている。ダッシュは、ヌクレオチド配列が同一であることを示す。ＣＤＲ部分を示した。
【図３Ｃ】Ｆａｂ６３ＶＨ（Ｃ）のｃＤＮＡ配列
【図３Ｄ】Ｆａｂ６３ＶＬ（Ｄ）のｃＤＮＡ配列
【図４】天然Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプターに対するＦａｂ６３の特異性：Ａ）はＳＫＢＲ３細胞から抽出した可溶性Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプターを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡを示す図である。Ｈｅｒ２／ｎｅｕは抗Ｈｅｒ２マウスｍＡＢ（ＴＡＢ２５０）コーティングウエル（０．５μｇ／ｍｌ）によってＥＬＩＳＡプレート内に捕捉された。ハーセプチン抗体を陽性コントロールに用い、抗−ｈｕＡＣｈＲ  Ｆａｂを陰性コントロールに用いた。Ｆａｂ及びハーセプチンは、ヤギ抗−Ｆ（ａｂ’）２−ＡＰ標識ｍＡＢ抗体により検出した。Ｆａｂ６３のシグナルは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプターの存在により有意に上昇した。Ｂ）はＨｅｒ２／ｎｅｕ発現陽性及び陰性細胞へのＦａｂ６３結合のＦＡＣＳ分析を表す図である。上部パネルでは、Ｆａｂ６３は陽性抗体ハーセプチン（黒の棒グラフ）及び細胞バックグランド（白の棒グラフ）に比べてＨｅｒ２／ｎｅｕ発現ＳＫＢＲ３細胞によく結合している。Ｆａｂ６３及びハーセプチンは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陰性ＨｅＬａ細胞株に対しては有意な結合を示さなかった（下部パネル）。Ｃ）はＦａｂ６３とＨｅｒ２／ｎｅｕレセプターの共免疫沈殿を表す図である。免疫沈殿物のウエスタンブロットは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質（１８５ｋＤａ）の存在、及びハーセプチン及びＦａｂ６３軽鎖（〜２５ｋＤａ）の存在を示している。Ｄ）はサンドイッチＥＬＩＳＡを利用したＨｅｒ２／ｎｅｕレセプターを巡るＦａｂ６３とハーセプチンの競合アッセイを示す図である。Ｆａｂ６３（５５０ｎＭ）をＨｅｒ２／ｎｅｕレセプターと事前にインキュベーションすると、ハーセプチンに対するレセプターの結合が８８％まで阻害されたが、一方ハーセプチンはより低濃度（６６ｎＭ）では自己阻害剤として働く。抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＩｇＭ及び抗−α１ヒトＡＣｈＲ  Ｆａｂでは変化は無かった。阻害のパーセンテージは、阻害剤非存在下でのハーセプチンに対するＨｅｒ２ｎｅｕレセプターの結合から導出した。阻害剤の濃度は対数スケール（ｘ軸）で表示されている。
【図５】ＳＫＢＲ３細胞へのＦａｂ６３の内在化Ｆａｂ６３処理細胞した透過処理細胞の免疫蛍光検出は、３７℃、２時間のインキュベーションの後に、細胞質の強染色を示した。ハーセプチンシグナルは、同一条件で細胞質に局在したが、培地のみで処理された細胞は有意な蛍光標識を示さなかった。一次Ｆａｂ／Ａｂは、抗ヒトカッパ軽鎖／ＦＩＴＣを用いて検出し、結果は共焦点顕微鏡で分析した。
【図６】ＳＫＢＲ３細胞へのＦａｂ６３内在化の経時変化Ｆａｂ６３の細胞内染色は、インキュベーション３０分以内に観察され、そしてアセトン処理後、細胞を３７℃で２時間インキュベーションした時に最大強度に達した。Ｆａｂ６３はまた５時間のインキュベーション後でも検出できた。同一条件でハーセプチン処理及び免疫蛍光した場合、細胞の膜だけが染色された。実験を４℃で実施した場合、及び透過処理の段階を省略した場合、Ｆａｂ６３の検出は細胞膜に局在した。細胞を透過処理しない場合には、Ｆａｂ６３のシグナルは膜に検出された。
【図７】Ｆａｂ６３はＨｅｒ２／ｎｅｕ陽性ＭＤＡ−ＭＢ−４５３及びＳＫＢＲ３細胞の増殖を阻害する。Ａ）はＨｅｒ２／ｎｅｕ発現陽性細部株（ＭＤＡ−ＭＢ−４５３及びＳＫＢＲ３細胞）又はＨｅｒ２／ｎｅｕ陰性（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５）細胞の用量反応曲線を示す図である。細胞生存率は未処理細胞と比較した生細胞のパーセンテージとして表した。Ｆａｂ６３はＨｅｒ２．ｎｅｕ高発現細胞のみに対し増殖阻害を示した。Ｂ）はＨｅｒ２／ｎｅｕ陽性（ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＳＫＢＲ３）及び陰性（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５）細胞株の増殖に対するＦａｂ６３とハーセプチンの比較を表す図である。
【図８】ＨＲＧ−β１リガンド存在下・非存在下での癌細胞株に対するＦａｂ６３の効果ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（Ａ）及びＭＣＦ７（Ｂ）癌細胞を２５０ｎＭのＦａｂ６３又は６６ｎＭのハーセプチンで処理した。増殖因子非存在下ではＦａｂ６３及びハーセプチンは共にＨｅｒ２／ｎｅｕ高発現細胞のＭＤＡ−ＭＢ−４５３の増殖を阻害し、低発現細胞のＭＣＦ７は阻害しなかったが、一方ＨＲＧ−β１存在下ではＦａｂ６３のみが両細胞株に対し有意な増殖阻害を示した。
【０２２６】
配列表
［配列番号：１］ＶＨ  Ｆａｂ６３のＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
［配列番号：２］ＶＨ  Ｆａｂ６３のＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
［配列番号：３］ＶＨ  Ｆａｂ６３のＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
［配列番号：４］ＶＬ  Ｆａｂ６３のＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
［配列番号：５］ＶＬ  Ｆａｂ６３のＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
［配列番号：６］ＶＬ  Ｆａｂ６３のＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
［配列番号：７］ＶＨ  Ｆａｂ６３のアミノ酸配列である。
［配列番号：８］ＶＬ  Ｆａｂ６３のアミノ酸配列である。
［配列番号：９］ＶＨ  Ｆａｂ６３のＣＤＲ１の核酸配列である。
［配列番号：１０］ＶＨ  Ｆａｂ６３のＣＤＲ２の核酸配列である。
［配列番号：１１］ＶＨ  Ｆａｂ６３のＣＤＲ３の核酸配列である。
［配列番号：１２］ＶＬ  Ｆａｂ６３のＣＤＲ１の核酸配列である。
［配列番号：１３］ＶＬ  Ｆａｂ６３のＣＤＲ２の核酸配列である。
［配列番号：１４］ＶＬ  Ｆａｂ６３のＣＤＲ３の核酸配列である。
［配列番号：１５］ＶＨ  Ｆａｂ６３の核酸配列である。
［配列番号：１６］ＶＬ  Ｆａｂ６３の核酸配列である。
【図１】
2008529549.tif 000004
【図２】
2008529549.tif 000005
【図３Ａ】
2008529549.tif 000006
【図３Ｂ】
2008529549.tif 000007
【図３Ｃ】
2008529549.tif 000008
【図３Ｄ】
2008529549.tif 000009
【図４】
2008529549.tif 000010
【図５】
2008529549.tif 000011
【図６】
2008529549.tif 000012
【図７】
2008529549.tif 000013
【図８】
2008529549.tif 000014
【配列表】
2008529549000001.xml
【国際調査報告】
2008529549.tif 000022
2008529549.tif 000023
2008529549.tif 000024
2008529549.tif 000025
2008529549.tif 000026
2008529549.tif 000027