(57)【要約】  本発明は、βアミロイド（Ａβ）と関連する疾患の処置のための改良された剤および方法を提供する。好ましい剤は抗体、例えばＡβに特異的なヒト化抗体を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
認知の迅速な改善が達成されるような、有効用量の１２Ａ１１免疫学的試薬を被験体に投与することを含んでなる、被験体における認知の迅速な改善を遂げる方法。
【請求項２】
被験体がＡβ関連疾患若しくは障害を有するか若しくはその危険性がある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被験体がアミロイド形成疾患若しくは障害を有するか若しくはその危険性がある、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
被験体がアルツハイマー病を有するか若しくはその危険性がある、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
患者がヒトである、請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
有効用量が患者体重１ｋｇ当り約１００μｇから１００ｍｇまでである、請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
有効用量が患者体重１ｋｇ当り約３００μｇから３０ｍｇまでである、請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
有効用量が患者体重１ｋｇ当り約１ｍｇから１０ｍｇまでである、請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
認知の迅速な改善が、１２Ａ１１免疫学的試薬の投与後１２時間以内に達成される、先行する請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
認知の迅速な改善が、免疫学的試薬の投与後２４時間以内に達成される、先行する請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
認知の迅速な改善が、免疫学的試薬の投与後３６時間以内に達成される、先行する請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
認知の迅速な改善が、免疫学的試薬の投与後４８時間以内に達成される、先行する請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
１２Ａ１１抗体剤が、１２Ａ１１抗体若しくはその抗原結合フラグメントである、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
１２Ａ１１免疫学的試薬が、キメラ１２Ａ１１抗体若しくはその抗原結合フラグメントである、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５】
キメラ１２Ａ１１抗体が、実質的に配列番号２若しくは配列番号４に示されるところの可変領域配列、およびヒト免疫グロブリンからの定常領域配列を含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
１２Ａ１１免疫学的試薬が、ヒト化１２Ａ１１抗体若しくはその抗原結合フラグメントである、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１７】
ヒト化抗体が、
（ａ）（ｉ）配列番号２に示されるマウス１２Ａ１１免疫グロブリンＬ鎖可変領域配列からの可変領域相補性決定領域（ＣＤＲ）、および（ｉｉ）ヒトアクセプター免疫グロブリンＬ鎖配列からの可変フレームワーク領域を含んでなるＬ鎖；若しくは
（ｂ）配列番号２に示されるところのマウス１２Ａ１１免疫グロブリンＬ鎖可変領域配列からの可変領域相補性決定領域（ＣＤＲ）、および（ｉｉ）ヒトアクセプター免疫グロブリンＬ鎖配列からの可変フレームワーク領域を含んでなるＬ鎖であるが、但し、最低１個のフレームワーク残基がマウス１２Ａ１１免疫グロブリンＬ鎖可変領域配列からの対応するアミノ酸残基で置換され、該フレームワーク残基は
（ｉ）抗原を直接非共有結合する残基；
（ｉｉ）ＣＤＲに隣接する残基；
（ｉｉｉ）ＣＤＲと相互作用する残基；および
（ｉｖ）ＶＬ−ＶＨ界面に参画する残基
よりなる群から選択され；ならびに
（ｃ）（ｉ）配列番号４に示されるマウス１２Ａ１１免疫グロブリンＨ鎖可変領域配列からの可変領域相補性決定領域（ＣＤＲ）、および（ｉｉ）ヒトアクセプター免疫グロブリンＨ鎖配列からの可変フレームワーク領域を含んでなるＨ鎖；若しくは
（ｄ）（ｉ）配列番号４に示されるところのマウス１２Ａ１１免疫グロブリンＨ鎖可変領域配列からの可変領域相補性決定領域（ＣＤＲ）、および（ｉｉ）ヒトアクセプター免疫グロブリンＨ鎖配列からの可変フレームワーク領域を含んでなるＨ鎖であるが、但し、最低１個のフレームワーク残基がマウス１２Ａ１１免疫グロブリンＨ鎖可変領域配列からの対応するアミノ酸残基で置換され、該フレームワーク残基は
（ｉ）抗原を直接非共有結合する残基；
（ｉｉ）ＣＤＲに隣接する残基；
（ｉｉｉ）ＣＤＲと相互作用する残基；および
（ｉｖ）ＶＬ−ＶＨ界面に参画する残基
よりなる群から選択される、
を含んでなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ヒト化抗体が、
（ａ）（ｉ）配列番号２として示されるマウス１２Ａ１１免疫グロブリンＬ鎖可変領域配列からの可変領域相補性決定領域（ＣＤＲ）、および（ｉｉ）ヒトアクセプター免疫グロブリンＬ鎖配列からの可変フレームワーク領域を含んでなるＬ鎖であるが、但し、最低１個のフレームワーク残基がマウス１２Ａ１１  Ｌ鎖可変領域配列からの対応するアミノ酸残基で置換され、該フレームワーク残基は該１２Ａ１１免疫グロブリンＬ鎖可変領域の三次元モデルの解析により同定されるところのＬ鎖可変領域のコンホメーション若しくは機能に影響を及ぼすことが可能な残基であり；ならびに
（ｂ）（ｉ）配列番号４として示されるマウス１２Ａ１１免疫グロブリンＨ鎖可変領域配列からの可変領域相補性決定領域（ＣＤＲ）、および（ｉｉ）ヒトアクセプター免疫グロブリンＨ鎖からの可変フレームワーク領域を含んでなるＨ鎖であるが、但し、最低１個のフレームワーク残基がマウス１２Ａ１１  Ｈ鎖可変領域配列からの対応するアミノ酸残基で置換され、該フレームワーク残基は該１２Ａ１１免疫グロブリンＨ鎖可変領域の三次元モデルの解析により同定されるところのＨ鎖可変領域のコンホメーション若しくは機能に影響を及ぼすことが可能な残基である、
を含んでなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ヒト化抗体が、
（ａ）（ｉ）配列番号２として示されるマウス１２Ａ１１免疫グロブリンＬ鎖可変領域配列からの可変領域相補性決定領域（ＣＤＲ）、および（ｉｉ）ヒトアクセプター免疫グロブリンＬ鎖配列からの可変フレームワーク領域を含んでなるＬ鎖であるが、但し、最低１
個のフレームワーク残基がマウス１２Ａ１１  Ｌ鎖可変領域配列からの対応するアミノ酸残基で置換され、該フレームワーク残基は、抗原と相互作用することが可能な残基、抗原結合部位に近接の残基、ＣＤＲと相互作用することが可能な残基、ＣＤＲに隣接した残基、ＣＤＲ残基の６Å以内の残基、正準残基、バーニア領域残基、鎖間充填残基、まれな残基、および構造モデルの表面上のグリコシル化部位残基よりなる群から選択され；ならびに
（ｂ）（ｉ）配列番号４として示されるマウス１２Ａ１１免疫グロブリンＨ鎖可変領域配列からの可変領域相補性決定領域（ＣＤＲ）、および（ｉｉ）ヒトアクセプター免疫グロブリンＨ鎖からの可変フレームワーク領域を含んでなるＨ鎖であるが、但し、最低１個のフレームワーク残基がマウス１２Ａ１１  Ｈ鎖可変領域配列からの対応するアミノ酸残基で置換され、該フレームワーク残基は、抗原と相互作用することが可能な残基、抗原結合部位に近接の残基、ＣＤＲと相互作用することが可能な残基、ＣＤＲに隣接した残基、ＣＤＲ残基の６Å以内の残基、正準残基、バーニア領域残基、鎖間充填残基、まれな残基、および構造モデルの表面上のグリコシル化部位残基よりなる群から選択される、
を含んでなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
ヒト化抗体が、
（ａ）（ｉ）配列番号２として示されるマウス１２Ａ１１免疫グロブリンＬ鎖可変領域配列からの可変領域相補性決定領域（ＣＤＲ）、および（ｉｉ）ヒトアクセプター免疫グロブリンＬ鎖からの可変フレームワーク領域を含んでなるＬ鎖であって、該領域は、Ｋａｂａｔにより番号付けられるところのＬ鎖の位置２、４、３６、３８、４０、４４、４６、４７、４８、４９、６４、６８、６９、７１、８７および９８よりなる群から選択される最低１位置で置換され；ならびに
（ｂ）（ｉ）配列番号４として示されるマウス１２Ａ１１免疫グロブリンＨ鎖可変領域配列からの可変領域相補性決定領域（ＣＤＲ）、および（ｉｉ）ヒトアクセプター免疫グロブリンＨ鎖からの可変フレームワーク領域を含んでなるＨ鎖であって、該フレームワーク領域は、Ｋａｂａｔにより番号付けられるところのＨ鎖の位置２、２４、２６、２７、２８、２９、３７、３９、４５、４７、４８、６７、７１、７３、７８、９１、９３、９４および１０３よりなる群から選択される最低１位置で置換される、
を含んでなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
ヒト化抗体が、
（ａ）配列番号２と呼称されるマウス１２Ａ１１免疫グロブリンＬ鎖可変ドメインの対応する相補性決定領域からのアミノ酸配列を有する３個の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）、ならびにヒトＬ鎖可変領域フレームワーク配列からの可変領域フレームワークを含んでなるヒト化Ｌ鎖であるが、但し、正準残基、バーニア残基、充填残基およびまれな残基よりなる群から選択される最低１個のフレームワーク残基は、１２Ａ１１免疫グロブリンＬ鎖可変領域フレームワークの同等な位置に存在する同一のアミノ酸残基により占有され；ならびに
（ｂ）配列番号４と呼称される１２Ａ１１免疫グロブリンＨ鎖可変ドメインの対応する相補性決定領域からのアミノ酸配列を有する３個の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）、ならびにヒトＨ鎖可変領域フレームワーク配列からの可変領域フレームワークを含んでなるヒト化Ｈ鎖であるが、但し、正準残基、バーニア残基、充填残基およびまれな残基よりなる第二の群から選択される最低１個のフレームワーク残基は、１２Ａ１１免疫グロブリンＨ鎖可変領域フレームワークの同等な位置に存在する同一のアミノ酸残基により占有される、
を含んでなり；
該ヒト化１２Ａ１１抗体は最低１０−７Ｍの結合親和性でβアミロイドペプチド（「Ａβ」）に特異的に結合し、
該ヒト化１２Ａ１１抗体は、配列番号２と呼称される可変ドメインをもつＬ鎖および配列
番号４と呼称される可変ドメインをもつＨ鎖を有する、
請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
ヒトＬ鎖可変領域フレームワークがκ  Ｌ鎖可変領域からである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ヒトＨ鎖可変領域フレームワークがＩｇＧ１  Ｈ鎖可変領域からである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
Ｌ鎖可変領域フレームワークが、１２Ａ１１抗体のＬ鎖配列との最低７０％の配列同一性を有するヒト免疫グロブリンＬ鎖からである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
Ｈ鎖可変領域フレームワークが、１２Ａ１１免疫グロブリンのＨ鎖配列との最低７０％の配列同一性を有するヒト免疫グロブリンＨ鎖からである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
ヒト化Ｌ鎖が、１２Ａ１１  Ｈ鎖の対応する相補性決定領域に同一である相補性決定領域を含んでなり、かつ、ヒト化Ｈ鎖が、１２Ａ１１  Ｈ鎖の対応する相補性決定領域に同一である相補性決定領域を含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
ヒト化抗体が、配列番号２として示される１２Ａ１１可変Ｌ鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を含んでなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２８】
ヒト化抗体が、配列番号４として示される１２Ａ１１可変Ｈ鎖配列の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を含んでなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２９】
ヒト化抗体が、１２Ａ１１抗体からの相補性決定領域（ＣＤＲ）に対応するＣＤＲを含んでなる可変領域を含んでなり、かつ、前記ヒト化１２Ａ１１抗体がβアミロイドペプチド（Ａβ）に特異的に結合する、請求項１６に記載の方法。
【請求項３０】
ヒト化抗体が、配列番号７として示される可変Ｌ鎖アミノ酸配列を含み、ならびに配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号３６よりなる群から選択される可変Ｈ鎖アミノ酸配列を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項３１】
認知の長期改善が達成されるような、有効用量の１２Ａ１１免疫学的試薬を被験体に投与することを含んでなる、被験体における認知の長期改善を遂げる方法。
【請求項３２】
被験体における認知の迅速な改善を遂げるための医薬品の製造のための１２Ａ１１免疫学的試薬の使用。
【請求項３３】
被験体における認知の長期改善を遂げるための医薬品の製造のための１２Ａ１１抗体剤の使用。
【請求項３４】
（ｉ）配列番号４として示されるマウス１２Ａ１１免疫グロブリンＨ鎖可変領域配列からの可変領域相補性決定領域（ＣＤＲ）、および（ｉｉ）ヒトアクセプター免疫グロブリンＨ鎖からの可変フレームワーク領域を含んでなるが、但し、最低１個のフレームワーク残基がマウス１２Ａ１１  Ｈ鎖可変領域配列からの対応するアミノ酸残基で置換され、該フレームワーク残基は、Ｋａｂａｔにより番号付けられるところのＨ鎖の位置２４、２９、３７および４８よりなる群から選択される位置で置換される、ヒト化免疫グロブリンＨ鎖。
【請求項３５】
請求項３４に記載のＨ鎖を含んでなるヒト化抗体、若しくは前記抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項３６】
（ａ）（ｉ）配列番号２に示される１２Ａ１１免疫グロブリンＬ鎖可変領域配列からの可変領域相補性決定領域（ＣＤＲ）、および（ｉｉ）ヒトアクセプター免疫グロブリンＬ鎖配列からの可変フレームワーク領域を含んでなるＬ鎖；ならびに
（ｂ）（ｉ）配列番号２に示されるところの２Ａ１１免疫グロブリンＬ鎖可変領域配列からの可変領域相補性決定領域（ＣＤＲ）、および（ｉｉ）ヒトアクセプター免疫グロブリンＬ鎖配列からの可変フレームワーク領域を含んでなるＬ鎖であるが、但し、最低１個のフレームワーク残基は１２Ａ１１免疫グロブリンＬ鎖可変領域配列からの対応するアミノ酸残基で置換され、該フレームワーク残基は
（ｉ）抗原を直接非共有結合する残基；
（ｉｉ）ＣＤＲに隣接する残基；
（ｉｉｉ）ＣＤＲと相互作用する残基；および
（ｉｖ）ＶＬ−ＶＨ界面に参画する残基
よりなる群から選択され；ならびに
（ｃ）（ｉ）配列番号２として示される１２Ａ１１免疫グロブリンＬ鎖可変領域配列からの可変領域相補性決定領域（ＣＤＲ）、および（ｉｉ）ヒトアクセプター免疫グロブリンＬ鎖配列からの可変フレームワーク領域を含んでなるＬ鎖であるが、但し、最低１個のフレームワーク残基はマウス１２Ａ１１  Ｌ可変領域配列からの対応するアミノ酸残基で置換され、該フレームワーク残基は１２Ａ１１免疫グロブリンＬ鎖可変領域の三次元モデルの解析により同定されるところのＬ鎖可変領域のコンホメーション若しくは機能に影響を及ぼすことが可能な残基であり；
（ｄ）（ｉ）配列番号２として示される１２Ａ１１免疫グロブリンＬ鎖可変領域配列からの可変領域相補性決定領域（ＣＤＲ）、および（ｉｉ）ヒトアクセプター免疫グロブリンＬ鎖配列からの可変フレームワーク領域を含んでなるＬ鎖であるが、但し、最低１個のフレームワーク残基がマウス１２Ａ１１  Ｌ鎖可変領域配列からの対応するアミノ酸残基で置換され、該フレームワーク残基は、抗原と相互作用することが可能な残基、抗原結合部位に近接の残基、ＣＤＲと相互作用することが可能な残基、ＣＤＲに隣接する残基、ＣＤＲ残基の６Å以内の残基、正準残基、バーニア領域残基、鎖間充填残基、まれな残基、および構造モデルの表面上のグリコシル化部位残基よりなる群から選択され；ならびに
（ｅ）（ｉ）配列番号２として示される１２Ａ１１免疫グロブリンＬ鎖可変領域配列からの可変領域相補性決定領域（ＣＤＲ）、および（ｉｉ）ヒトアクセプター免疫グロブリンＬ鎖からの可変フレームワーク領域を含んでなるＬ鎖であって、該領域はＫａｂａｔにより番号付けられるところのＬ鎖の位置２、４、３６、３８、４０、４４、４６、４７、４８、４９、６４、６８、６９、７１、８７および９８よりなる群から選択される最低１位置で置換され；ならびに
（ｆ）配列番号２と呼称される１２Ａ１１免疫グロブリンＬ鎖可変ドメインの対応する相補性決定領域からのアミノ酸配列を有する３個の相補性決定領域（ＣＤ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）、ならびにヒトＬ鎖可変領域フレームワーク配列からの可変領域フレームワークを含んでなるＬ鎖であるが、但し、正準残基、バーニア残基、充填残基およびまれな残基よりなる群から選択される最低１個のフレームワーク残基が１２Ａ１１免疫グロブリンＬ鎖可変領域フレームワークの同等な位置に存在する同一のアミノ酸残基により占有される、
よりなる群から選択されるＬ鎖
ならびに請求項３４に記載のＨ鎖
を含んでなるヒト化抗体、若しくは前記抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項３７】
配列番号７として示される可変Ｌ鎖アミノ酸配列、および配列番号３６として示される
可変Ｈ鎖アミノ酸配列を含んでなるヒト化抗体、若しくは前記抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項３８】
ヒトＬ鎖可変領域フレームワークがκ  Ｌ鎖可変領域からである、請求項３５〜３７のいずれか１つに記載のヒト化抗体若しくは抗原結合フラグメント。
【請求項３９】
ヒトＨ鎖可変領域フレームワークがＩｇＧ１  Ｈ鎖可変領域からである、請求項３５〜３７のいずれか１つに記載のヒト化抗体若しくは抗原結合フラグメント。
【請求項４０】
最低１０−７Ｍの結合親和性でβアミロイドペプチド（Ａβ）に特異的に結合する、請求項３５〜３７のいずれか１つに記載のヒト化抗体若しくは抗原結合フラグメント。
【請求項４１】
最低１０−８Ｍの結合親和性でβアミロイドペプチド（Ａβ）に特異的に結合する、請求項３５〜３７のいずれか１つに記載のヒト化抗体若しくは抗原結合フラグメント。
【請求項４２】
最低１０−９Ｍの結合親和性でβアミロイドペプチド（Ａβ）に特異的に結合する、請求項３５〜３７のいずれか１つに記載のヒト化抗体若しくは抗原結合フラグメント。
【請求項４３】
ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンからの定常領域配列を含んでなる、請求項３５〜３７のいずれか１つに記載のヒト化抗体。
【請求項４４】
ヒトＩｇＧ４免疫グロブリンからの定常領域配列を含んでなる、請求項３５〜３７のいずれかに記載のヒト化抗体。
【請求項４５】
配列番号３６のアミノ酸１−１２０を含んでなる単離されたポリペプチド。
【請求項４６】
請求項４２に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
【請求項４７】
配列番号３７の残基１−４１７を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項４８】
請求項４６若しくは４７に記載の核酸分子を含んでなるベクター。
【請求項４８】
請求項４６若しくは４７の核酸分子を含んでなる宿主細胞。
【請求項４９】
請求項４５に記載のポリペプチドを発現するトランスジェニック動物。
【請求項５０】
ポリペプチドが前記動物の乳中で発現される、請求項４９に記載のトランスジェニック動物。
【請求項５１】
抗体若しくはフラグメントが産生されるような条件下で請求項４８に記載の宿主細胞を培養すること、および該宿主細胞若しくは培養物から前記抗体を単離することを含んでなる、抗体若しくはそのフラグメントの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、“Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ａβ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｕｓｅ  Ｉｎ  Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  Ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ（認知の改善における使用のためのヒト化Ａβ抗体）”と題された、２００４年１２月１５日出願の米国仮出願第６０／６３６，７７６号（その内容全体は引用することにより本明細書に組み込まれる）に対する優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
記憶は、過去の経験から受領した情報の脳による保存および／若しくは想起を必要とする重要な認知機能である。条件付けともまた称される学習は、新たな情報が神経系により取得かつ保存されて記憶を形成する過程である。痴呆を伴う患者では、学習および／若しくは記憶のための認知経路が損なわれており、その結果、該患者は学習または新たな記憶を効果的に形成若しくは古い記憶を想起することに失敗する。痴呆を表す個体の数は急速に上昇しており、そして、該上昇速度は、一般大衆が加齢し続けかつ平均余命が延長し続ける際に増大することが期待される。痴呆を伴う患者は、彼らの症状が悪化する際にますます高価かつ集中的介護を必要とする。であるから、施設収容を遅らせる医学的介入が、痴呆を伴う被験体の苦難を軽減することに加え、医療制度に対する要求を低減させるのに役立つとみられる。
【０００３】
重度の痴呆の発症は、ダウン症候群、脳アミロイド血管症、血管性痴呆およびアルツハイマー病（ＡＤ）を包含する、冒された被験体の脳組織中のアミロイドタンパク質沈着物の蓄積で知られる数種のアミロイド形成障害の特徴である。ＡＤは老人性痴呆をもたらす進行性疾患である。大まかに言って、該疾患は２つの範疇、すなわち老齢（６５歳超）で発症する晩発型および老年期の十分に前すなわち３５と６０歳の間で発症する早発型に分けられる。
【０００４】
神経変性は、認知症状が加齢とともに進行性に悪化するようなアミロイド形成障害および他の痴呆障害と関連する。アミロイド形成障害の診断は、通常、脳の剖検で明らかである特徴的な細胞病理学によってのみ確認し得る。組織病理学は、神経原線維変化（ＮＴ）の存在、中枢神経系組織のシナプスおよびニューロンのびまん性喪失、ならびにアミロイド斑（老人斑ともまた呼ばれる）の存在を包含する３つの主要な特徴の最低１つよりなる。全般として、非特許文献１；特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４を参照されたい。
【０００５】
斑の主構成要素はＡβすなわちβ−アミロイドペプチドと命名されるペプチドである。Ａβペプチドは、より大きな膜貫通糖タンパク質（アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と命名された著名なタンパク質）の３９〜４３アミノ酸のおよそ４ｋＤａの内的フラグメントである。多様な分泌酵素によるＡＰＰのタンパク質分解性プロセシングの結果として、Ａβは主として短い形態（長さ４０アミノ酸）および長い形態（長さ４２〜４３アミノ酸からの範囲にわたる）の双方で見出される。ＡＰＰの疎水性膜貫通ドメインの一部はＡβのカルボキシ端で見出され、そしてとりわけ長い形態の場合には斑に凝集するＡβの能力の原因でありうる。脳中のアミロイド斑の蓄積はついには神経細胞死に至る。この型の神経劣化と関連する身体症状がＡＤを特徴づける。
【０００６】
ＡＰＰタンパク質内の数種の突然変異がＡＤの存在と相互に関連づけられている。例えば、非特許文献５（バリン７１７からイソロイシン）；非特許文献６（バリン７１７から
グリシン）；非特許文献７（バリン７１７からフェニルアラニン）；非特許文献８（リシン５９５−メチオニン５９６からアスパラギン５９５−ロイシン５９６に変化する二重突然変異）を参照されたい。こうした突然変異は、ＡＰＰのＡβへの増大された若しくは変えられたプロセシング、とりわけ増大された量の長い形態のＡβ（すなわちＡβ１−４２およびＡβ１−４３）へのＡＰＰのプロセシングによりＡＤを引き起こすと考えられている。プレセニリン遺伝子ＰＳ１およびＰＳ２のような他の遺伝子中の突然変異は、増大された量の長い形態のＡβを生成させるＡＰＰのプロセシングに間接的に影響を及ぼすと考えられている（非特許文献９を参照されたい）。
【０００７】
マウスモデルがＡＤにおけるアミロイド斑の意義を決定するのに成功裏に使用された（非特許文献４、非特許文献１０）。とりわけ、ＰＤＡＰＰトランスジェニックマウス（変異体の形態のヒトＡＰＰを発現しかつ若齢でＡＤの病状を発症する）に長い形態のＡβを注入した場合、それらはＡＤの病状の進行の低下およびＡβペプチドに対する抗体力価の増大の双方を表す（非特許文献１１）。上の知見は、とりわけその長い形態のＡβをＡＤにおける原因要素として関与させる。
【０００８】
Ａβペプチドは溶液中に存在し得、そして中枢神経系（ＣＮＳ）（例えば脳脊髄液（ＣＳＦ））および血漿中で検出し得る。ある条件下では、可溶性Ａβは、ＡＤを伴う患者の老人斑および脳血管で見出される線維状の毒性のβ−シートの形態に変換される。Ａβペプチドの形成を予防することを試みる数種の処置、例えばＡＰＰの切断を予防するための化学的阻害剤の使用が開発された。免疫療法処置もまた、既存の斑の密度および大きさを低下させるための手段として検討されている。これらの戦略は、アミロイド沈着物の消失を誘導する多様な抗Ａβ抗体での受動免疫、ならびに抗Ａβ抗体の生成および沈着物の細胞消失を包含する体液性応答を促進するための可溶性の形態のＡβペプチドでの能動免疫を包含する。能動および受動免疫双方がＡＤのマウスモデルで試験されている。ＰＤＡＰＰマウスにおいて、Ａβでの免疫化は、斑形成、神経炎性ジストロフィーおよびアストログリオーシスの発症を予防することが示された。より高齢の動物の処置もまた、これらのＡＤ様神経病変の程度および進行を顕著に低下させた。非特許文献１１。Ａβ免疫化は、ＡＤのＴｇＣＲＮＤ８マウスモデルにおいて斑および行動障害を低下させることもまた示された。非特許文献１２。Ａβ免疫化はまたＴｇ  ２５７６  ＡＰＰ／ＰＳ１変異体マウスで認知能力を改善しかつアミロイド負荷量を低下させた。非特許文献１３。ＰＤＡＰＰトランスジェニックマウスの受動免疫もまた検討されている。例えば、末梢で投与した抗体がｉｎ  ｖｉｖｏで中枢神経系（ＣＮＳ）に進入しかつ斑消失を誘導したことが見出された。非特許文献１４。該抗体はｅｘ  ｖｉｖｏアッセイでＦｃ受容体媒介性食作用を誘導することがさらに示された。Ａβ４２のＮ末端に特異的な抗体は、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ双方で斑の低下においてとりわけ有効であることが示された。特許文献２および非特許文献１５を参照されたい。Ａβ４２の中央領域に特異的な抗体もまた有効性を示した。特許文献２を参照されたい。
【０００９】
２つの機構すなわち中枢性分解および末梢性分解が、免疫療法による効果的な斑消失に提案されている。中枢性分解の機構は、血液脳関門を横断し、斑に結合しかつ既存の斑の消失を誘導することが可能である抗体に頼る。消失はＦｃ受容体媒介性食作用により促進されることが示されている（非特許文献１４）。Ａβ消失の末梢性分解の機構は、一区画から別のものへのＡβの輸送に至る、抗Ａβ抗体による脳、ＣＳＦおよび血漿間のＡβの動的平衡の破壊に頼る。中枢で派生するＡβはＣＳＦおよび血漿に輸送され、そこでそれは分解される。最近の研究は、可溶性かつ未結合のＡβが、脳中のアミロイド沈着の低下を伴わなくとも、ＡＤと関連する記憶障害に関与していることを結論づけた。さらなる研究が、Ａβ消失のためのこれらの経路の作用および／若しくは相互作用を決定するのに必要とされる（非特許文献１６）。
【００１０】
今日までの処置の大多数はアミロイド斑形成を低下させることを目標としていた一方、アミロイド形成障害と関連するある種の認知障害（例えば海馬依存的な条件付けの欠陥）がアミロイド沈着物の前に出現し始め、かつ、全体的な神経病理学が明らかであることが最近示された（非特許文献１７）。さらに、斑に凝集したアミロイドペプチドの病原性の役割は長年知られている一方、痴呆若しくは認知障害の重症度は、斑の密度といくぶん相関するのみである一方で可溶性Ａβの濃度との有意の相関が存在する（例えば非特許文献１８を参照されたい）。いくつかの研究は、可溶性Ａβオリゴマーが、増大した酸化的ストレスおよびプログラムされた細胞死の誘導を包含する機構により、ＡＰＰトランスジェニックマウスにおいてシナプス毒性および記憶障害に関与していることを示したか若しくは示唆した（例えば、非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５を参照されたい）。これらの結果は、神経変性がアミロイド沈着前に開始することができかつ単にその結果でないことを示す。従って、ＡＤの処置のための新たな治療法および試薬、とりわけＡβ誘発性の神経毒性の多様な機構での介入を介して治療的利益を遂げることが可能な治療法および試薬に対する必要性が存在する。
【００１１】
【特許文献１】Ｈａｒｄｙら、第ＷＯ  ９２／１３０６９号
【特許文献２】米国特許第６，７６１，８８８号
【非特許文献１】Ｓｅｌｋｏｅ、ＴＩＮＳ  １６：４０３（１９９３）
【非特許文献２】Ｓｅｌｋｏｅ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５３：４３８（１９９４）
【非特許文献３】Ｄｕｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７３：４７６（１９９５）
【非特許文献４】Ｇａｍｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７３：５２３（１９９５）
【非特許文献５】Ｇｏａｔｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：７０４（１９９１）
【非特許文献６】Ｃｈａｒｔｉｅｒ  Ｈａｒｌａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：８４４（１９９１）
【非特許文献７】Ｍｕｒｒｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：９７（１９９１）
【非特許文献８】Ｍｕｌｌａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１：３４５（１９９２）
【非特許文献９】Ｈａｒｄｙ、ＴＩＮＳ  ２０：１５４（１９９７）
【非特許文献１０】Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１５５０（１９９７）
【非特許文献１１】Ｓｃｈｅｎｋら、Ｎａｔｕｒｅ  ４００、１７３（１９９９）
【非特許文献１２】Ｊａｎｕｓら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：９７９−９８２
【非特許文献１３】Ｍｏｒｇａｎら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：９８２−９８５
【非特許文献１４】Ｂａｒｄら（２０００）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：９１６−９１９
【非特許文献１５】Ｂａｒｄら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０００：２０２３−２０２８
【非特許文献１６】Ｄｏｄｅｌら、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ、２００３、２：２１５
【非特許文献１７】Ｄｉｎｅｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００２、２２７：２２７６８
【非特許文献１８】ＭｃＬｅａｎら、Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ、４６：８６０−８６６（１９９９）
【非特許文献１９】Ｌａｍｂｅｒｔら、（１９９８）、ＰＮＡＳ、９５：６４４８−５３
【非特許文献２０】Ｎａｓｌｕｎｄら、（２０００）、ＪＡＭＡ、２８３：１５７１
【非特許文献２１】Ｍｕｃｋｅら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０：４０５０−４０５８（２０００）
【非特許文献２２】Ｍｏｒｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、４０８：９８２−９８５（２０００）
【非特許文献２３】Ｄｏｄａｒｔら、Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、５：４５２−４５７（２００２）
【非特許文献２４】Ｓａｌｋｏｅら、（２００２）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９８：７８９−９１
【非特許文献２５】Ｗａｌｓｈら、Ｎａｔｕｒｅ、４１６：５３５−５３９（２００２）
【発明の開示】
【００１２】
［発明の要約］
本発明は、Ａβ関連疾患若しくは障害および／またはアミロイド形成疾患若しくは障害（例えばＡＤ）の予防および処置のための免疫学的試薬、とりわけ治療的抗体試薬を特徴とする。本発明は、少なくとも部分的に、Ａβペプチドに特異的に結合しかつアミロイド形成障害（例えばＡＤ）と関連する斑負荷量の減少で有効であるモノクローナル抗体１２Ａ１１の同定および特徴付けに基づく。１２Ａ１１は、可溶性オリゴマーＡβに対する優先的結合もまた表し、かつ、ＡＤの動物モデルで認知の改善に有効である。本抗体の構造および機能分析は、予防的および／若しくは治療的使用のための多様なヒト化抗体の設計に至る。とりわけ、本発明はこの抗体の可変領域のヒト化を特徴とし、そして、従って、特徴とする抗体のヒト化免疫グロブリンすなわち抗体鎖、無傷のヒト化免疫グロブリンすなわち抗体、および機能的免疫グロブリンすなわち抗体フラグメント、とりわけ抗原結合フラグメントを提供する。
【００１３】
本発明は、ＡＤ若しくは他のアミロイド形成疾患を予防若しくは処置するための免疫学的試薬および改良された方法を特徴とする。本発明は、少なくとも部分的に、βアミロイドタンパク質（Ａβ）の結合（例えば可溶性および／若しくは凝集型Ａβの結合）、（例えば凝集型Ａβの）食作用の媒介、斑負荷量の低減、（例えば被験体における）神経炎性ジストロフィーの低下および／若しくは認知の改善で有効なモノクローナル免疫グロブリン１２Ａ１１の特徴付けに基づく。本発明は、１２Ａ１１免疫グロブリンの可変ＬおよびＨ鎖の一次および二次構造の決定および構造の特徴付け、ならびに活性および免疫原性に重要な残基の同定にさらに基づく。
【００１４】
本明細書に記述される１２Ａ１１モノクローナル免疫グロブリンの可変Ｌおよび／若しくは可変Ｈ鎖を包含する免疫グロブリンが特徴とされる。ヒト化可変Ｌおよび／若しくはヒト化可変Ｈ鎖を包含する好ましい免疫グロブリン、例えば治療的免疫グロブリンが特徴とされる。好ましい可変Ｌおよび／若しくは可変Ｈ鎖は、１２Ａ１１免疫グロブリン（例えばドナー免疫グロブリン）からの相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒトアクセプター免疫グロブリンから若しくは実質的にそれからの可変フレームワーク領域を包含する。「実質的にヒトアクセプター免疫グロブリンから」という句は、大多数の若しくは重要なフレームワーク残基がヒトアクセプター配列からであるがしかしながら該ヒト化免疫グロブリンの活性を改善する（例えばドナー免疫グロブリンの活性をそれがより緊密に模倣するような活性を変える）よう選択されたか若しくは該ヒト化免疫グロブリンの免疫原性を低下させるよう選択された残基でのある位置の残基の置換を見込むことを意味している。
【００１５】
一態様において、本発明は、１２Ａ１１可変領域相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含し（すなわち、配列番号２として示されるＬ鎖可変領域配列からの１、２若しくは３個のＣＤＲを包含するか、または配列番号４として示されるＨ鎖可変領域配列からの１、２若しくは３個のＣＤＲを包含し）、かつ、フレームワーク残基の最低１残基が対応するマウス残基に場合によっては戻し突然変異されているヒトアクセプター免疫グロブリンＬ若しくは
Ｈ鎖配列からの可変フレームワーク領域を包含する、ヒト化免疫グロブリンＬ若しくはＨ鎖を特徴とし、前記戻し突然変異はＡβ結合を指図する該鎖の能力に実質的に影響を及ぼさない。
【００１６】
一態様において、本発明は、１２Ａ１１可変領域相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含し（すなわち、配列番号２として示されるＬ鎖可変領域配列からの１、２若しくは３個のＣＤＲを包含するか、または配列番号４として示されるＨ鎖可変領域配列からの１、２若しくは３個のＣＤＲを包含し）、かつ、フレームワーク残基の最低１残基が対応するマウス残基に場合によっては戻し突然変異されている実質的にヒトアクセプター免疫グロブリンＬ若しくはＨ鎖配列からの可変フレームワーク領域を包含する、ヒト化免疫グロブリンＬ若しくはＨ鎖を特徴とし、前記戻し突然変異はＡβ結合を指図する該鎖の能力に実質的に影響を及ぼさない。
【００１７】
別の態様において、本発明は、１２Ａ１１可変領域相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含し（例えば、配列番号２として示されるＬ鎖可変領域配列からの１、２若しくは３個のＣＤＲを包含しかつ／または配列番号４として示されるＨ鎖可変領域配列からの１、２若しくは３個のＣＤＲを包含し）、かつ、最低１個のフレームワーク残基がマウス１２Ａ１１  Ｌ若しくはＨ鎖可変領域配列からの対応するアミノ酸残基で場合によっては置換されている実質的にヒトアクセプター免疫グロブリンＬ若しくはＨ鎖配列からの可変フレームワーク領域を包含する、ヒト化免疫グロブリンＬ若しくはＨ鎖を特徴とし、該フレームワーク残基は（ａ）抗原を直接非共有結合する残基；（ｂ）ＣＤＲに隣接する残基；（ｃ）ＣＤＲと相互作用する残基（例えば相同な既知の免疫グロブリン鎖の解明された構造で該Ｌ若しくはＨ鎖をモデル化することにより同定される）；および（ｄ）ＶＬ−ＶＨ界面に参画する残基よりなる群から選択される。
【００１８】
別の態様において、本発明は、最低１個のフレームワーク残基がマウス１２Ａ１１  Ｌ若しくはＨ鎖可変領域配列からの対応するアミノ酸残基で場合によっては置換されている、１２Ａ１１可変領域ＣＤＲおよびヒトアクセプター免疫グロブリンＬ若しくはＨ鎖配列からの可変フレームワーク領域を包含する、ヒト化免疫グロブリンＬ若しくはＨ鎖を特徴とし、該フレームワーク残基は、可変領域の三次元モデルの解析により同定されるところのＬ鎖可変領域のコンホメーション若しくは機能に影響を及ぼすことが可能な残基、例えば、抗原と相互作用することが可能な残基、抗原結合部位に近接の残基、ＣＤＲと相互作用することが可能な残基、ＣＤＲに隣接する残基、ＣＤＲ残基の６Å以内の残基、正準残基、バーニア領域残基、鎖間充填残基、まれな残基、若しくは該構造モデルの表面上のグリコシル化部位残基である。
【００１９】
別の態様において、本発明は、上述された置換に加えて、最低１個のまれなヒトフレームワーク残基の置換を特徴とする。例えば、まれな残基はその位置でヒト可変鎖配列に普遍的であるアミノ酸残基で置換し得る。あるいは、まれな残基は相同な生殖系列可変鎖配列からの対応するアミノ酸残基で置換し得る。
【００２０】
別の態様において、本発明は、上述されるところのＬ鎖およびＨ鎖若しくは前記免疫グロブリンの抗原結合フラグメントを包含するヒト化免疫グロブリンを特徴とする。例示的一態様において、ヒト化免疫グロブリンは、βアミロイドペプチド（Ａβ）に最低１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１若しくは１０９Ｍ−１の結合親和性で結合する（例えば特異的に結合する）。別の態様において、該免疫グロブリン若しくは抗原結合フラグメントはアイソタイプγ１を有するＨ鎖を包含する。別の態様において、該免疫グロブリン若しくは抗原結合フラグメントは可溶性βアミロイドペプチド（Ａβ）および凝集型Ａβのいずれか若しくは双方に結合する（例えば特異的に結合する）。別の態様において、該免疫グロブリン若しくは抗原結合フラグメントは可溶性Ａβ（例えば可溶性Ａβ１−４２）を捕捉する
。別の態様において、該免疫グロブリン若しくは抗原結合フラグメントはβアミロイドペプチド（Ａβ）の食作用を媒介する（例えば食作用を誘導する）。なお別の態様において、該免疫グロブリン若しくは抗原結合フラグメントは被験体の血液脳関門を横断する。なお別の態様において、該免疫グロブリン若しくは抗原結合フラグメントは、被験体中のβアミロイドペプチド（Ａβ）負荷量および神経炎性ジストロフィーのいずれか若しくは双方を低下させる。
【００２１】
別の態様において、本発明は１２Ａ１１可変領域（例えば配列番号２若しくは配列番号４として示される可変領域配列）を包含するキメラ免疫グロブリンを特徴とする。なお別の態様において、該免疫グロブリン若しくはその抗原結合フラグメントはＩｇＧ１からの定常領域をさらに包含する。
【００２２】
本明細書に記述される免疫グロブリンは、Ａβ関連疾患若しくは障害またはアミロイド形成疾患若しくは障害の予防若しくは処置を目的とした治療方法での使用にとりわけ適する。一態様において、本発明は、本明細書に記述されるところのヒト化免疫グロブリンの有効投薬量を患者に投与することを必要とする、アミロイド形成疾患若しくは障害（例えばＡＤ）の予防若しくは処置方法を特徴とする。ある態様において、本発明は、神経変性疾患若しくは障害（例えばＡβ関連疾患若しくは障害）を伴う患者で観察される痴呆および／若しくは認知障害の予防若しくは軽減において有効な治療および／若しくは予防方法を特徴とする。とりわけ、本発明は、疾患若しくは障害の発病の初期段階を妨害しかつ不可逆的な神経損傷および／若しくは痴呆を予防する治療薬の投与を含んでなる、改良された治療および／若しくは予防方法を提供する。本発明の特徴とする局面は、１２Ａ１１免疫学的試薬若しくは前記試薬を含んでなる製薬学的組成物の投与を伴う、被験体における認知の迅速な改善方法を提供する。好ましい１２Ａ１１免疫学的試薬は、限定されるものでないが１２Ａ１１抗体、ヒト化１２Ａ１１抗体、キメラ１２Ａ１１抗体、一本鎖１２Ａ１１抗体、二特異性１２Ａ１１抗体、１２Ａ１１抗体フラグメント、１２Ａ１１抗体鎖、それらのバリアント（例えば１２Ａ１１  Ｆｃ抗体バリアント）若しくはそれらの組合せを挙げることができる。
【００２３】
本発明の別の局面は、１２Ａ１１免疫学的試薬若しくは前記試薬を含んでなる製薬学的組成物の投与を伴う、被験体における認知の長期改善を遂げる方法を特徴とする。
【００２４】
例示的態様において、本発明の方法は、痴呆疾患若しくは障害、例えばＡβ関連疾患若しくは障害に罹患している被験体におけるＡβ、とりわけＡβオリゴマーの結合、アミロイド負荷量の低減、および／若しくは認知の迅速な改善で有効である１２Ａ１１免疫学的試薬の投与を伴う。
【００２５】
他の態様において、本発明の方法は、１２Ａ１１モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド試薬、ベクターおよび適する宿主細胞を包含する、前記ポリペプチドを特徴とする。
【００２６】
他の態様において、本発明は、本明細書に記述されるところのヒト化免疫グロブリンおよび製薬学的担体を包含する製薬学的組成物を特徴とする。本明細書に記述される免疫グロブリンまたは免疫グロブリンフラグメント若しくは鎖を製造するための単離された核酸分子、ベクターおよび宿主細胞、ならびに前記免疫グロブリン、免疫グロブリンフラグメント若しくは免疫グロブリン鎖の製造方法もまた特徴とする。
【００２７】
本発明は、それぞれヒト化１２Ａ１１免疫グロブリンを製造する場合に置換の影響を受けやすい１２Ａ１１残基の同定方法をさらに特徴とする。例えば、置換の影響を受けやすい可変フレームワーク領域残基の同定方法は、解明された相同な免疫グロブリン構造で１
２Ａ１１可変領域の三次元構造をモデル化すること、および１２Ａ１１免疫グロブリン可変領域のコンホメーション若しくは機能に影響を及ぼすことが可能な残基について前記モデルを解析することを伴い、その結果置換の影響を受けやすい残基が同定される。本発明は、１２Ａ１１免疫グロブリン、１２Ａ１１免疫グロブリン鎖若しくはそれらのドメインの三次元像の作製における、配列番号２若しくは配列番号４として示される可変領域配列またはそれらのいずれかの部分の使用をさらに特徴とする。
【００２８】
本発明は、エフェクター分子、例えば補体若しくはエフェクター細胞上の受容体を結合する能力のような変えられたエフェクター機能を有する免疫グロブリンをさらに特徴とする。とりわけ、本発明の免疫グロブリンは、Ｆｃ領域の最低１アミノ酸残基が異なる残基若しくは側鎖で置換されている変えられた定常領域例えばＦｃ領域を有する。一態様において、改変された免疫グロブリンはＩｇＧクラスのものであり、免疫グロブリンが例えば未改変の免疫グロブリンに比較して変えられたエフェクター機能を有するようなＦｃ領域中の最低１アミノ酸残基置換を含んでなる。特定の態様において、本発明の免疫グロブリンは、それがより少なく免疫原性であり（例えば望ましくないエフェクター細胞活性、溶解若しくは補体結合を惹起しない）、向上されたアミロイド消失特性を有し、かつ／または所望の半減期を有するような変えられたエフェクター機能を有する。いくつかの態様において、本発明の免疫グロブリンは、ヒンジ領域の１個若しくはそれ以上のアミノ酸変化（例えばＥＵ位置２３４、２３５、２３６および２３７で）を含んでなる。特定の一態様において、本発明の免疫グロブリンは、ヒンジ結合領域の位置２３４および２３７（すなわちＬ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ）のアミノ酸変化を包含するヒト化１２Ａ１１抗体である。
【００２９】
さらなる態様において、本発明の免疫グロブリンはペグ化抗体フラグメント、例えばＦａｂおよびＦａｂ’を含んでなる。なお他の態様において、本発明の免疫グロブリンはアグリコシル化された定常領域を含んでなる。例示的一態様において、免疫グロブリンは位置２９７のアスパラギンのアラニンへのアミノ酸置換を包含し、それにより該免疫グロブリンのグリコシル化を予防する。
【００３０】
免疫グロブリンのＨ鎖をコードする遺伝子中の１個若しくはそれ以上のイントロンを欠失することによる免疫グロブリンの発現の増大方法もまた本明細書で特徴とする。
【００３１】
加えて、本発明は、本発明の１種若しくはそれ以上の免疫グロブリンを使用する、本明細書に記述されるところの処置方法に関する。
【００３２】
［発明の詳細な記述］
１）定義
本発明を記述する前に、下で使用されるべきある用語の定義を示すことがその理解に有用でありうる。
【００３３】
本明細書で使用されるところの「Ａβ関連疾患若しくは障害」という用語は、Ａβペプチドの発生若しくは存在と関連するか若しくはそれらを特徴とする疾患若しくは障害を指す。一態様において、Ａβ関連疾患若しくは障害は可溶性Ａβの存在と関連するか若しくはそれを特徴とする。別の態様において、Ａβ関連疾患若しくは障害は、不溶性Ａβの存在と関連するか若しくはそれを特徴とする。別の態様において、Ａβ関連疾患若しくは障害は、向神経活性Ａβ種（ＮＡβ）の存在と関連するか若しくはそれを特徴とする。別の態様において、Ａβ関連疾患若しくは障害はまたアミロイド形成障害でもある。別の態様において、Ａβ関連疾患若しくは障害は、Ａβ関連の認知障害（ｄｅｆｉｃｉｔ）若しくは障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、例えばＡβ関連痴呆障害を特徴とする。例示的Ａβ関連疾患若しくは障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、ダウン症候群、脳アミロイド血管症、あ
る種の血管性痴呆および軽度認知障害（ＭＣＩ）を包含する。
【００３４】
「βアミロイドタンパク質」、「βアミロイドペプチド」、「βアミロイド」、「Ａβ」および「Ａβペプチド」という用語は本明細書で互換性に使用される。Ａβペプチド（例えばＡβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２およびＡβ４３）は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と命名されたより大きな膜貫通糖タンパク質の３９〜４３アミノ酸の約４ｋＤａの内的フラグメントである。ＡＰＰの複数のアイソフォーム、例えばＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１およびＡＰＰ７７０が存在する。ＡＰＰ内のアミノ酸はＡＰＰ７７０アイソフォームの配列（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０５０６７を参照されたい）に従って割り当てられた番号である。ヒトで存在することが現在既知であるＡＰＰの特定のアイソタイプの例は、「正常」ＡＰＰと呼称されるＫａｎｇら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：７３３−７３６により記述される６９５アミノ酸のポリペプチド；Ｐｏｎｔｅら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：５２５−５２７（１９８８）およびＴａｎｚｉら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：５２８−５３０により記述される７５１アミノ酸のポリペプチド；ならびにＫｉｔａｇｕｃｈｉら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：５３０−５３２により記述される７７０アミノ酸のポリペプチドである。ｉｎ  ｖｉｖｏ若しくはｉｎ  ｓｉｔｕでの多様な分泌酵素によるＡＰＰのタンパク質分解性プロセシングの結果として、Ａβは「短い形態」（長さ４０アミノ酸）および「長い形態」（長さ４２〜４３アミノ酸からの範囲にわたる）双方で見出される。短い形態Ａβ４０はＡＰＰの残基６７２−７１１よりなる。長い形態、例えばＡβ４２若しくはＡβ４３はそれぞれ残基６７２−７１３若しくは６７２−７１４よりなる。ＡＰＰの疎水性ドメインの一部はＡβのカルボキシ端で見出され、そしてとりわけ長い形態の場合にＡβの凝集する能力の原因でありうる。Ａβペプチドは、例えば正常個体およびアミロイド形成障害に罹患している個体双方を包含する、ヒトおよび他の哺乳動物の体液、例えば脳脊髄液中に見出し得るか、若しくはそれから精製し得る。
【００３５】
「βアミロイドタンパク質」、「βアミロイドペプチド」、「βアミロイド」、「Ａβ」および「Ａβペプチド」という用語は、ＡＰＰの分泌酵素切断から生じるペプチド、および切断生成物と同一若しくは本質的に同一の配列を有する合成ペプチドを包含する。本発明のＡβペプチドは多様な供給源、例えば組織、細胞株または体液（例えば血清若しくは脳脊髄液）に由来し得る。例えば、Ａβは、例えばＷａｌｓｈら、（２００２）、Ｎａｔｕｒｅ、４１６、ｐｐ５３５−５３９に記述されるところのＡＰＰ７１７Ｖ→Ｆで安定にトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のようなＡＰＰ発現細胞に由来し得る。Ａβ調製物は前述された方法（例えばＪｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄら、（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１５５０を参照されたい）を使用して組織供給源に由来し得る。あるいは、Ａβペプチドは当業者に公知である方法を使用して合成し得る。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ、Ｇｒａｎｔ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．、ニューヨーク州ニューヨーク、１９９２、ｐ７７を参照されたい）。これ故に、ペプチドは、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓペプチド合成機型式４３０Ａ若しくは４３１で側鎖を保護したアミノ酸を使用するｔ−Ｂｏｃ若しくはＦ−ｍｏｃいずれかの化学により保護したαアミノ基を用いる固相合成の自動化Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ技術を使用して合成し得る。より長いペプチド抗原は公知の組換えＤＮＡ技術を使用して合成し得る。例えば、ペプチド若しくは融合ペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成し得るか若しくは分子的にクローン化し得、そしてトランスフェクションおよび適する宿主細胞による異種発現のため適する発現ベクターに挿入し得る。Ａβペプチドはまた、正常遺伝子のＡβ領域の突然変異から生じる関連Ａβ配列も指す。
【００３６】
「可溶性Ａβ」若しくは「解離型Ａβ」という用語は、単量体の可溶性ならびにオリゴマーの可溶性のＡβポリペプチド（例えば可溶性Ａβ二量体、三量体など）を包含する凝
集していないすなわちばらばらのＡβポリペプチドを指す。可溶性Ａβはｉｎ  ｖｉｖｏで脳脊髄液および／若しくは血清のような生物学的液体中で見出し得る。可溶性Ａβは、例えばＡβペプチドを適切な溶媒および／若しくは溶液中で可溶化することによりｉｎ  ｖｉｔｒｏでもまた調製し得る。例えば、可溶性Ａβは、凍結乾燥したペプチドをアルコール、例えばＨＦＩＰに溶解すること、次いで冷水性溶液での希釈により調製し得る。あるいは、可溶性Ａβは、凍結乾燥したペプチドを希釈していないＤＭＳＯに超音波処理を用いて溶解することにより調製し得る。生じる溶液を遠心分離（例えば１４，０００×ｇ、４℃で１０分）していかなる不溶性の微粒子も除去し得る。
【００３７】
「不溶性Ａβ」若しくは「凝集型Ａβ」という用語は、凝集したＡβペプチド、例えば非共有結合により一緒に保持され、かつ、ＡＤを伴う患者の老人斑および脳血管中で見出される線維状の毒性のβ−シートの形態のＡβペプチド中に存在し得るＡβを指す。Ａβ（例えばＡβ４２）は、少なくとも部分的に、該ペプチドのＣ末端の疎水性残基（ＡＰＰの膜貫通ドメインの一部）の存在により凝集すると考えられる。
【００３８】
本明細書で使用されるところの「向神経活性Ａβ種」という句は、神経細胞の最低１種の活性若しくは物理的特徴を遂げるＡβ種（例えばＡβペプチド若しくはＡβペプチドの１形態）を指す。向神経活性Ａβ種は、例えば、神経細胞の機能、生物学的活性、生存能力、形態学および／若しくは構造を遂げる。神経細胞に対する影響は細胞性であり得る（例えば神経細胞の長期の強化（ＬＰＴ）若しくは神経細胞の生存能力（神経毒性）を遂げること）。あるいは、該影響はｉｎ  ｖｉｖｏの神経系に対してであり得る（例えば適切な動物試験（例えば認知試験）で行動の結果を遂げること）。本明細書で使用されるところの「中和する」という用語は、活性若しくは効果を中立にするか、打ち消すか若しくは無効にすることを意味している。
【００３９】
本明細書で使用されるところの「神経変性疾患」という用語は、ニューロンおよび／若しくは神経組織の変性を伴うか若しくはそれを特徴とする障害若しくは疾患、例えばアミロイド形成疾患を広範に指す。
【００４０】
「アミロイド形成疾患」若しくは「アミロイド形成障害」という用語は、不溶性アミロイド原線維の形成若しくは沈着と関連する（若しくはそれにより引き起こされる）いかなる疾患も包含する。例示的アミロイド形成疾患は、限定されるものでないが全身性アミロイドーシス、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）、成人発症型糖尿病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型痴呆、ならびにプリオン関連の伝染性海綿状脳症（ヒトにおけるクールーおよびクロイツフェルト・ヤコブ病、ならびに、ヒツジおよび畜牛におけるそれぞれスクレイピーおよびＢＳＥ）を挙げることができる。多様なアミロイド形成疾患が、沈着される原線維のポリペプチド成分の性質により定義若しくは特徴付けられる。例えば、アルツハイマー病を有する被験体若しくは患者において、βアミロイドタンパク質（例えば野性型、バリアント若しくは切断型βアミロイドタンパク質）がアミロイド沈着物の主ポリペプチド成分である。従って、アルツハイマー病は、例えば被験体若しくは患者の脳中の「Ａβの沈着物を特徴とする疾患」若しくは「Ａβの沈着物を伴う疾患」の一例である。Ａβの沈着物を特徴とする他の疾患は、アミロイド形成性沈着物が、学習および／若しくは記憶と関連する脳の１個若しくはそれ以上の領域、例えば海馬、扁桃体、鉤状回、帯状皮質、前頭葉前皮質、鼻周囲皮質、感覚皮質および側頭葉内側部に見出される、特徴づけられていない疾患を包含し得る。
【００４１】
「認知」という用語は、限定されるものでないが、学習若しくは記憶（例えば短期若しくは長期の学習若しくは記憶）、知識、覚醒、注意および集中、判断、視覚的認知、抽象的思考、実行機能、言語、視覚−空間（ｖｉｓｕａｌ−ｓｐａｔｉａｌ）（すなわち視覚空間（ｖｉｓｕｏ−ｓｐａｔｉａｌ）見当識）技能、視覚的認知、平衡／敏捷性ならびに
感覚運動活動を挙げることができる、被験体により実施される認知に関する精神過程を指す。例示的認知過程は学習および記憶を包含する。
【００４２】
「認知障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」、「認知障害（ｄｅｆｉｃｉｔ）」若しくは「認知障害（ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）」という用語は本明細書で互換性に使用され、そして被験体の１種若しくはそれ以上の認知に関する精神過程の欠陥若しくは障害を指す。認知障害は多数の起源、すなわち機能的機序（不安、抑うつ）、生理学的加齢（加齢による記憶障害）、脳損傷、精神障害（例えば統合失調症）、薬物、感染症、毒物若しくは解剖学的病変を有しうる。例示的認知障害は、学習若しくは記憶の欠陥若しくは障害（例えば、知的能力、判断、言語、運動技能および／若しくは抽象的思考の短期若しくは長期の学習および／若しくは記憶の喪失における）を包含する。
【００４３】
本明細書で使用されるところの「Ａβ関連認知障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」（または「障害（ｄｅｆｉｃｉｔ）」若しくは「障害（ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）」）という用語は、Ａβペプチドの発生若しくは存在と関連するか若しくはそれを特徴とする認知障害を指す。一態様において、Ａβ関連疾患若しくは障害は可溶性Ａβの存在を伴うか若しくはそれを特徴とする。別の態様において、Ａβ関連疾患若しくは障害は不溶性Ａβの存在を伴うか若しくはそれを特徴とする。別の態様において、Ａβ関連疾患若しくは障害は向神経活性Ａβ種（ＮＡβ）の存在を伴うか若しくはそれを特徴とする。
【００４４】
本明細書で使用されるところの「痴呆障害」という用語は、痴呆（すなわち認知能力の全般的劣化若しくは進行性減退または痴呆様症状）を特徴とする障害を指す。痴呆障害は、しばしば、脳若しくは中枢神経系の１種若しくはそれ以上の異常な過程（例えば神経変性）を伴うか若しくはそれにより引き起こされる。痴呆障害は、一般に、軽度から重篤な段階まで進行し、そして日常生活で独立して機能する被験体の能力を妨害する。痴呆は、冒された脳の領域に依存して皮質若しくは皮質下に分類されうる。痴呆障害は、意識の喪失（錯乱におけるような）若しくは抑うつ、または他の機能的精神障害（偽痴呆）を特徴とする障害を包含しない。痴呆障害は、アルツハイマー病、血管性痴呆、レヴィー小体痴呆、ヤコブ・クロイツフェルト病、ピック病、進行性核上性麻痺、前頭葉痴呆、特発性大脳基底核石灰化、ハンチントン病、多発性硬化症、およびパーキンソン病のような不可逆性痴呆、ならびに外傷（外傷後脳症）、頭蓋内腫瘍（原発性若しくは転移性）、硬膜下血腫、代謝および内分泌学的状態（甲状腺機能低下症および甲状腺機能亢進症、ウィルソン病、尿毒症性脳症、透析脳症症候群、低酸素性および低酸素後痴呆、ならびに慢性の電解質異常）、欠乏状態（ビタミンＢ１２欠乏症およびペラグラ（ビタミンＢ６））、感染症（ＡＩＤＳ、梅毒性髄膜脳炎、辺縁系脳炎、進行性多病巣性白質脳症、真菌感染症、結核）、ならびにアルコール、アルミニウム、重金属（ヒ素、鉛、水銀、マンガン）若しくは処方薬（抗コリン作動薬、鎮静剤、バルビツレートなど）への慢性曝露による可逆性痴呆を包含する。
【００４５】
本明細書で使用されるところの「Ａβ関連痴呆障害」という用語は、Ａβペプチドの発生若しくは存在を伴うか若しくはそれを特徴とする痴呆障害を指す。
【００４６】
本明細書で使用されるところの「認知の改善」という句は、認知技能若しくは機能の増強若しくは増大を指す。同様に、「認知を改善すること」という句は、認知技能若しくは機能の増強若しくは増大を指す。認知の改善は、例えば本発明の処置前の被験体での認知に関する。好ましくは、認知の改善は、正常被験体のもの、または標準的若しくは期待されるレベルに向く。
【００４７】
例えば「認知の迅速な改善」（若しくは「認知を迅速に改善すること」）という句で使用されるところの「迅速な」という用語は、相対的若しくは比較的短い時間がかかること
、または比較的短い時間間隔内に発生すること；すなわちある効果（例えば改善）が（すなわち熟練した臨床家により理解されるところの）臨床での適切さに関して比較的急速に遂行、観察若しくは達成されることを意味している。
【００４８】
例示的一「認知の迅速な改善」は１日以内（すなわち２４時間以内）に遂行、観察若しくは達成される。「認知の迅速な改善」は、１日未満（すなわち２４時間未満）で、例えば２３、２２、２１、２０、２９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２若しくは１時間以内に遂行、観察若しくは達成されうる。「認知の迅速な改善」は、あるいは、１日以上、しかし好ましくは１か月以内、例えば３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３若しくは２日以内に遂行、観察若しくは達成されうる。認知の迅速な改善を遂行、観察若しくは達成するための例示的時間間隔は、数週以内、例えば３週以内、２週以内若しくは１週以内、または例えば１２０時間、９６時間、７２時間、４８時間、２４時間、１８時間、１２時間および／若しくは６時間以内である。
【００４９】
例えば「認知の長期改善」という句で使用されるところの「長期」という用語は、適する対照より比較的若しくは相対的により長い時間間隔にわたって発生すること；すなわち、所望の効果（例えば改善）が、（すなわち熟練した臨床家により理解されるところの）臨床での適切さに関して延長された若しくは長期化された時間、中断を伴わず持続されることが発生するか若しくは観察されることを意味している。
【００５０】
例示的一「認知の長期改善」は最低１週間遂行、観察若しくは達成される。「認知の長期改善」は、１日以上（すなわち２４時間以上）、例えば３６時間、４８時間（すなわち２日）、７２時間（すなわち３日）、９６時間（すなわち４日）１０８時間（すなわち５日）若しくは１３２時間（すなわち６日）以上、遂行、観察若しくは達成されうる。「認知の長期改善」は、あるいは、１週間以上、例えば８、９、１０、１１、１２、１３若しくは１４日（すなわち２週間）、３週間、４週間、５週間、６週間若しくはそれ以上、遂行、観察若しくは達成されうる。認知の長期改善が遂行、観察若しくは達成される例示的時間間隔は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０日を包含する。
【００５１】
本明細書で使用されるところの「調節」という用語は、応答の上方制御すなわち刺激および下方制御すなわち抑制双方を指す。
【００５２】
本明細書で使用されるところの「処置」という用語は、疾患、疾患の症状若しくは疾患に対する素因を治癒、回復、軽減、解放、変化、治療、緩和、改善若しくは影響する目的を伴い、疾患、疾患の症状若しくは疾患に対する素因を有する患者への治療薬の適用若しくは投与、または患者からの単離した組織若しくは細胞株への治療薬の適用若しくは投与と定義する。
【００５３】
「有効用量」若しくは「有効投薬量」という用語は、所望の効果を達成若しくは少なくとも部分的に達成するのに十分な量と定義する。「治療上有効な用量」という用語は、該疾患に既に罹患している患者で該疾患およびその合併症を治癒若しくは少なくとも部分的に抑止するのに十分な量と定義する。この使用に有効な量は、疾患の重症度、患者の全般的な生理機能、例えば患者の体重、齢、性、投与経路、ならびに医師および／若しくは薬理学者に公知の他の因子に依存することができる。有効用量は、例えば、抗体の総量（例えばグラム、ミリグラム若しくはマイクログラムで）として、または体重に対する抗体の量の比として（例えば、キログラムあたりグラム（ｇ／ｋｇ）、キログラムあたりミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）若しくはキログラムあたりマイクログラム（μｇ／ｋｇ）として）表
しうる。本方法で使用される抗体の有効用量は、例えば１μｇ／ｋｇと５００ｍｇ／ｋｇの間の範囲にわたることができる。本発明の方法で使用される抗体の有効用量の例示的一範囲は０．１ｍｇ／ｋｇと１００ｍｇ／ｋｇの間である。例示的有効用量は、限定されるものでないが１０μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇを挙げることができる。
【００５４】
本明細書で使用されるところの「投与すること」という用語は、製薬学的剤を被験体の身体に導入する行動を指す。非経口経路での投与、例えば皮下、静脈内若しくは腹腔内投与の例示的一経路。
【００５５】
「患者」という用語は、本発明の１種若しくはそれ以上の剤（例えば免疫治療薬）での予防的若しくは治療的いずれかの処置を受領するヒトおよび他の哺乳動物被験体を包含する。例示的患者は、本発明の免疫治療薬での予防的若しくは治療的いずれかの処置を受領する。
【００５６】
本明細書で使用されるところの「動物モデル」若しくは「モデル動物」という用語は、疾患若しくは障害のある系、例えばヒトの系、疾患若しくは障害の特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）若しくは特徴（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）を表す、げっ歯類、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌおよびウシのような哺乳動物種の１メンバーを包含する。げっ歯類の族から選択される例示的なヒト以外の動物は、ウサギ、モルモット、ラットおよびマウス、最も好ましくはマウスを包含する。痴呆障害の「動物モデル」若しくはそれを有する「モデル動物」は、例えば痴呆関連障害（例えばＡＤ）と関連する顕著な認知障害を表す。好ましくは、モデル動物は、増大する齢とともに認知障害の進行的悪化を表し、その結果、モデル動物における該疾患の進行は、痴呆障害に罹患している被験体における疾患の進行と同等である。
【００５７】
「免疫学的試薬」という用語は、本明細書で定義されるところの１種若しくはそれ以上の免疫グロブリン、抗体、抗体フラグメント若しくは抗体鎖、またはそれらの組合せを含んでなるか若しくはそれらよりなる剤を指す。「免疫学的剤」という用語は、免疫グロブリン、抗体、抗体フラグメント若しくは抗体鎖をコードする核酸もまた包含する。こうした核酸はＤＮＡ若しくはＲＮＡであり得る。免疫グロブリンをコードする核酸は、典型的には、適切な細胞若しくは組織中での該核酸の発現を可能にするプロモーターおよびエンハンサーのような調節エレメントに連結される。
【００５８】
「１２Ａ１１免疫学的試薬」という用語は、本明細書で記述されるところのモノクローナル抗体１２Ａ１１の１種若しくはそれ以上の特徴を有する免疫学的試薬を指す。１２Ａ１１モノクローナル抗体の特徴は、限定されるものでないが、Ａβペプチドへの特異的結合、可溶性オリゴマーＡβに対する優先的結合、被験体におけるアミロイド形成障害と関連する斑負荷量を減少させるおよびＡＤの動物モデルで認知を改善する能力を挙げることができる。ある局面において、１２Ａ１１免疫学的試薬は、１２Ａ１１モノクローナル抗体と保存された構造上の特徴、例えば本明細書に記述されるところの保存された抗原結合ドメイン若しくは領域（例えば１個若しくはそれ以上の１２Ａ１１  ＣＤＲ）を有する。例示的１２Ａ１１免疫学的試薬は、１２Ａ１１抗体、ヒト化１２Ａ１１抗体、キメラ１２Ａ１１抗体、一本鎖１２Ａ１１抗体、二特異性１２Ａ１１抗体、１２Ａ１１抗体フラグメント、１２Ａ１１抗体鎖、それらのバリアント（例えば親和性成熟させた１２Ａ１１抗体バリアントおよび１２Ａ１１  Ｆｃ抗体バリアント）、またはそれらの組合せを包含する。１２Ａ１１免疫学的試薬という用語は、いかなる抗体（例えばヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、二特異性抗体）、抗体フラグメント、または１２Ａ１１抗体、１２Ａ１１抗体フラグメント、若しくは１２Ａ１１抗体鎖由来の最低１ドメイン、領域若しくはフラグメントを含んでなる抗体鎖もまた包含する。
【００５９】
「免疫治療試薬」という用語は、治療的使用に適する免疫学的試薬を指す。
【００６０】
「免疫グロブリン」若しくは「抗体」（本明細書で互換性に使用される）という用語は、抗原を特異的に結合する能力を有する、２本のＨおよび２本のＬ鎖よりなる基本的４ポリペプチド鎖構造を有するタンパク質を指し、前記鎖は例えば鎖間ジスルフィド結合により安定化される。「抗体」という用語はいかなる供給源（例えば、例示的態様において、ヒトおよびヒト以外の霊長類、ならびに付加的な態様においてげっ歯類、ウサギ目、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジなど）から得られるいかなるＩｇクラス若しくはいかなるＩｇサブクラス（例えばＩｇＧのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブクラス）も包含することを意図している。
【００６１】
本明細書で使用されるところの「Ｉｇクラス」若しくは「免疫グロブリンクラス」という用語は、ヒトおよび高等哺乳動物で同定された免疫グロブリンの５クラス、すなわちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを指す。「Ｉｇサブクラス」という用語は、ヒトおよび高等哺乳動物で同定されたＩｇＭの２サブクラス（ＨおよびＬ）、ＩｇＡの３サブクラス（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２および分泌型ＩｇＡ）、ならびにＩｇＧの４サブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）を指す。
【００６２】
「ＩｇＧサブクラス」という用語は、免疫グロブリンのγ  Ｈ鎖（それぞれγ１〜γ４）によりヒトおよび高等哺乳動物で同定された、免疫グロブリンクラスＩｇＧの４サブクラスすなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を指す。
【００６３】
「一本鎖免疫グロブリン」若しくは「一本鎖抗体」（本明細書で互換性に使用される）という用語は、抗原を特異的に結合する能力を有する、１本のＨおよび１本のＬ鎖よりなる２ポリペプチド鎖構造を有するタンパク質を指し、前記鎖は例えば鎖間ペプチドリンカーにより安定化される。
【００６４】
「ドメイン」という用語は、例えばβ−プリーツシートおよび／若しくは鎖内ジスルフィド結合により安定化されたペプチドループを含んでなる（例えば３ないし４個のペプチドループを含んでなる）Ｈ若しくはＬ鎖ポリペプチドの球状領域を指す。ドメインは、「定常」ドメインの場合には多様なクラスのメンバーのドメイン内の配列変動の相対的欠如、若しくは「可変」ドメインの場合は多様なクラスのメンバーのドメイン内の有意の変動に基づき「定常」若しくは「可変」と本明細書でさらに称される。抗体若しくはポリペプチド「ドメイン」は、しばしば、抗体若しくはポリペプチドの「領域」と当該技術分野で互換性に称される。抗体Ｌ鎖の「定常」ドメインは、「Ｌ鎖定常領域」、「Ｌ鎖定常ドメイン」、「ＣＬ」領域若しくは「ＣＬ」ドメインと互換性に称される。抗体Ｈ鎖の「定常」ドメインは、「Ｈ鎖定常領域」、「Ｈ鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域若しくは「ＣＨ」ドメインと互換性に称される）。抗体Ｌ鎖の「可変」ドメインは、「Ｌ鎖可変領域」、「Ｌ鎖可変ドメイン」、「ＶＬ」領域若しくは「ＶＬ」ドメインと互換性に称される）。抗体Ｈ鎖の「可変」ドメインは、「Ｈ鎖定常領域」、「Ｈ鎖定常ドメイン」、「ＶＨ」領域若しくは「ＶＨ」ドメインと互換性に称される）。
【００６５】
「領域」という用語は、抗体鎖若しくは抗体鎖ドメインの一部若しくは一部分（例えば本明細書で定義されるところのＨ若しくはＬ鎖の一部若しくは一部分、または定常若しくは可変ドメインの一部若しくは一部分）、ならびに前記鎖若しくはドメインのより離れた一部若しくは一部分もまた指すことができる。例えば、ＬおよびＨ鎖若しくはＬおよびＨ鎖可変ドメインは、本明細書で定義されるところの「フレームワーク領域」すなわち「ＦＲ」の間に散在された「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」を包含する。
【００６６】
本明細書で使用されるところの「抗原結合部位」という用語は、抗原（例えば細胞表面若しくは可溶性抗原）を特異的に結合する（それと免疫反応する）部位を指す。本発明の抗体は、好ましくは最低２個の抗原結合部位を含んでなる。抗原結合部位は、一般に、免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖ＣＤＲを包含し、そしてこれらのＣＤＲにより形成される結合部位が該抗体の特異性を決定する。「抗原結合領域」若しくは「抗原結合ドメイン」は、上で定義されたところの抗体結合部位を包含する領域若しくはドメイン（例えば抗体領域若しくはドメインである。
【００６７】
免疫グロブリンすなわち抗体は単量体若しくは多量体の形態で存在し得る（例えば、五量体の形態で存在するＩｇＭ抗体および／または単量体、二量体若しくは多量体の形態で存在するＩｇＡ抗体）。「フラグメント」という用語は、無傷のすなわち完全な抗体若しくは抗体鎖より少ないアミノ酸残基を含んでなる抗体若しくは抗体鎖の一部若しくは一部分を指す。フラグメントは、無傷のすなわち完全な抗体若しくは抗体鎖の化学的若しくは酵素的処理を介して得ることができる。フラグメントは組換え手段によってもまた得ることができる。例示的フラグメントはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃおよび／若しくはＦｖフラグメントを包含する。「抗原結合フラグメント」という用語は、抗原を結合するすなわち抗原結合（すなわち特異的結合）について無傷の抗体と（すなわちそれらが由来した無傷の抗体と）競合する免疫グロブリンすなわち抗体のポリペプチドフラグメントを指す。結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術により、または無傷の免疫グロブリンの酵素的若しくは化学的切断により製造される。結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｖ、一本鎖および一本鎖抗体を包含する。「二特異性」若しくは「二官能性」免疫グロブリンすなわち抗体以外の免疫グロブリンすなわち抗体は、同一のその抗原結合部位のそれぞれを有すると理解される。「二特異性」若しくは「二官能性抗体」は、２種の異なるＨ／Ｌ鎖対および２個の異なる抗原結合部位を有する人工的ハイブリッド抗体である。二特異性抗体は、ハイブリドーマの融合若しくはＦａｂ’フラグメントの連結を包含する多様な方法により製造し得る。例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉとＬａｃｈｍａｎｎ、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８、１５４７−１５５３（１９９２）を参照されたい。
【００６８】
本明細書で使用されるところの「モノクローナル抗体」という用語は、構造および抗原特異性が均一である、抗体産生細胞（例えばＢリンパ球すなわちＢ細胞）の１クローン集団由来の抗体を指す。「ポリクローナル抗体」という用語は、それらの構造およびエピトープ特異性が不均一であるがしかし共通抗原を認識する、抗体産生細胞の多様なクローン集団に由来する複数の抗体を指す。モノクローナルおよびポリクローナル抗体は、体液内に、粗調製物として存在しうるか、若しくは本明細書に記述されるとおり精製しうる。
【００６９】
「ヒト化免疫グロブリン」若しくは「ヒト化抗体」という用語は、最低１本のヒト化免疫グロブリンすなわち抗体鎖（すなわち、最低１本のヒト化Ｌ若しくはＨ鎖）を包含する免疫グロブリンすなわち抗体を指す。「ヒト化免疫グロブリン鎖」若しくは「ヒト化抗体鎖」（すなわち、「ヒト化免疫グロブリンＬ鎖」若しくは「ヒト化免疫グロブリンＨ鎖」）という用語は、実質的にヒト免疫グロブリンすなわち抗体からの可変フレームワーク領域および実質的にヒト以外の免疫グロブリンすなわち抗体からの相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば最低１個のＣＤＲ、好ましくは２個のＣＤＲ、より好ましくは３個のＣＤＲ）を包含する可変領域を有し、かつ、定常領域（例えばＬ鎖の場合は最低１個の定常領域若しくはその一部分、およびＨ鎖の場合は好ましくは３個の定常領域）をさらに包含する免疫グロブリンすなわち抗体鎖（すなわちそれぞれ１本のＬ若しくはＨ鎖）を指す。「ヒト化可変領域」（例えば「ヒト化Ｌ鎖可変領域」若しくは「ヒト化Ｈ鎖可変領域」）という用語は、実質的にヒト免疫グロブリンすなわち抗体からの可変フレームワーク領域および実質的にヒト以外の免疫グロブリンすなわち抗体からの相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含
する可変領域を指す。例えば、Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３（１９８９）、米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号明細書、Ｓｅｌｉｃｋら、第ＷＯ  ９０／０７８６１号、およびＷｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号明細書（全部の目的上そっくりそのまま引用することにより組み込まれる）を参照されたい。
【００７０】
本開示により包含される「ヒト化免疫グロブリン」若しくは「ヒト化抗体」は、本明細書に記述される方法若しくは当該技術分野で公知であるもののいずれを使用しても作成し得る。
【００７１】
「実質的にヒト免疫グロブリンすなわち抗体から」若しくは「実質的にヒト」という句は、ヒト免疫グロブリンすなわち抗体のアミノ配列と比較の目的上整列する場合に、該領域が例えば保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖系列置換、戻し突然変異などを見込んで、ヒトフレームワーク若しくは定常領域配列と最低８０〜９０％、９０〜９５％、若しくは９５〜９９％の同一性（すなわち局所配列同一性）を共有することを意味している。保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖系列置換、戻し突然変異などの導入はしばしばヒト化抗体若しくは鎖の「至適化」と称される。「実質的にヒト以外の免疫グロブリンすなわち抗体から」若しくは「実質的にヒト以外」という句は、ヒト以外の生物体、例えばヒト以外の哺乳動物のものに最低８０〜９５％、好ましくは最低９０〜９５％、より好ましくは９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の免疫グロブリンすなわち抗体配列を有することを意味している。
【００７２】
従って、ヒト化免疫グロブリンすなわち抗体、若しくはヒト化免疫グロブリンすなわち抗体鎖の全領域若しくは残基は、おそらくＣＤＲを除き、１種若しくはそれ以上の天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する領域若しくは残基に実質的に同一である。「対応する領域」若しくは「対応する残基」という用語は、第一および第二の配列を比較の目的上至適に整列する場合に、第一のアミノ酸若しくはヌクレオチド配列上の１領域若しくは残基と同一の（すなわち同等の）位置を占有する第二のアミノ酸若しくはヌクレオチド配列上の領域若しくは残基を指す。
【００７３】
アミノ酸の各ドメインへの割り当ては、Ｋａｂａｔ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（国立保健研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）、メリーランド州ベセスダ、１９８７および１９９１）の定義に従う。代替の構造の定義は、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）；Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８（１９８９）；およびＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６：６５１（１９８９）（下で「Ｃｈｏｔｈｉａら」と集合的に称され、かつ、全部の目的上そっくりそのまま引用することにより組み込まれる）により提案された。
【００７４】
「有意の同一性」という用語は、２ポリペプチド配列を、デフォルトのギャップ重み（ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ）を使用するプログラムＧＡＰ若しくはＢＥＳＴＦＩＴによるように至適に整列する場合に、最低５０〜６０％の配列同一性、好ましくは最低６０〜７０％の配列同一性、より好ましくは最低７０〜８０％の配列同一性、より好ましくは最低８０〜９０％の同一性、なおより好ましくは最低９０〜９５％の同一性、およびなおより好ましくは最低９５％の配列同一性若しくはそれ以上（例えば９９％の配列同一性若しくはそれ以上）を共有することを意味している。「実質的同一性」という用語は、２ポリペプチド配列を、デフォルトのギャップ重みを使用するプログラムＧＡＰ若しくはＢＥＳＴＦＩＴによるように至適に整列する場合に、最低８０〜９０％の配列同一性、好ましくは最低９０〜９５％の配列同一性、およびより好ましくは最低９５％の配列同一性若しくはそれ
以上（例えば９９％の配列同一性若しくはそれ以上）を共有することを意味している。配列の比較のため、典型的には１配列がそれと試験配列を比較する参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列をコンピュータに入力し、必要な場合は下位配列座標を指定し、そして配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。配列比較アルゴリズムがその後、指定されたプログラムパラメータに基づき、参照配列に関しての試験配列（１種若しくは複数）の配列同一性パーセントを計算する。
【００７５】
比較のための配列の至適のアライメントは、例えば、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムにより、ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、ウィスコンシン州マディソン中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）により、若しくは目視により実施し得る（全般として、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照されたい）。配列同一性および配列類似性パーセントを決定するのに適するアルゴリズムの一例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）に記述されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（国立保健研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）のＮＣＢＩインターネットサーバを通じて公的にアクセス可能）を通じて公的に入手可能である。典型的には、デフォルトのプログラムパラメータを使用して配列比較を実施し得るとは言え、カスタマイズしたパラメータもまた使用し得る。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして３の語長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）（Ｗ）、１０の期待値（ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ）（Ｅ）およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（ＨｅｎｉｋｏｆｆとＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９８９）を参照されたい）。
【００７６】
好ましくは、同一でない残基位置は保存的アミノ酸置換により異なる。アミノ酸置換を保存的若しくは非保存的と分類する目的上、アミノ酸を後に続くとおりグループ分けする。すなわち、グループＩ（疎水性側鎖）：ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；グループＩＩ（中性親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；グループＶ（鎖の向きに影響する残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；およびグループＶＩ（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。保存的置換は同一分類中のアミノ鎖間の置換を伴う。非保存的置換は、これらの分類の１つの１メンバーについて別のもののメンバーと交換することを構成する。
【００７７】
好ましくは、ヒト化免疫グロブリンすなわち抗体は、対応するヒト化されていない抗体の親和性の３、４若しくは５の係数内である親和性で抗原を結合する。例えば、ヒト化されていない抗体が１０９Ｍ−１の結合親和性を有する場合、ヒト化抗体は最低３×１０９Ｍ−１、４×１０９Ｍ−１若しくは５×１０９Ｍ−１の結合親和性を有することができる。免疫グロブリンすなわち抗体鎖の結合特性を記述する場合、該鎖は「抗原（例えばＡβ）結合を指図する」その能力に基づき記述し得る。鎖は、それが特異的結合特性若しくは結合親和性を無傷の免疫グロブリンすなわち抗体（若しくはそれらの抗原結合フラグメント）に賦与する場合に「抗原結合を指図する」と言われる。突然変異（例えば戻し突然変異）は、それが、前記鎖を含んでなる無傷の免疫グロブリンすなわち抗体（若しくはそれ
らの抗原結合フラグメント）の結合親和性に、前記突然変異を欠く同等の鎖を含んでなる抗体（若しくはその抗原結合フラグメント）のものに比較して最低１桁だけ影響を及ぼす（例えば低下させる）場合に、抗原結合を指図するＨ若しくはＬ鎖の能力に実質的に影響を及ぼすと言われる。突然変異は、それが前記鎖を含んでなる無傷の免疫グロブリンすなわち抗体（若しくはそれらの抗原結合フラグメント）の結合親和性に、前記突然変異を欠く同等の鎖を含んでなる該抗体（若しくはその抗原結合フラグメント）のものの２、３若しくは４の係数のみ影響を及ぼす（例えば低下させる）場合に、「抗原結合を指図する鎖の能力に実質的に影響を及ぼさ（例えば低下させ）ない」。
【００７８】
「キメラ免疫グロブリン」すなわち抗体という用語は、可変領域が第一の種に由来しかつ定常領域が第二の種に由来する免疫グロブリンすなわち抗体を指す。キメラ免疫グロブリンすなわち抗体は、例えば、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから遺伝子工学により構築し得る。「ヒト化免疫グロブリン」若しくは「ヒト化抗体」という用語は、下で定義されるところのキメラ免疫グロブリンすなわち抗体を包含することを意図していない。ヒト化免疫グロブリンすなわち抗体はそれらの構築がキメラである（すなわちタンパク質の１以上の種からの領域を含んでなる）とは言え、それらは、本明細書で定義されるところのキメラ免疫グロブリンすなわち抗体中で見出されない付加的な特徴（すなわちドナーＣＤＲ残基およびアクセプターフレームワーク残基を含んでなる可変領域）を包含する。
【００７９】
「コンホメーション」という用語は、タンパク質若しくはポリペプチド（例えば抗体、抗体鎖、それらのドメイン若しくは領域）の三次構造を指す。例えば、「Ｌ（若しくはＨ）鎖のコンホメーション」という句はＬ（若しくはＨ）鎖可変領域の三次構造を指し、また、「抗体のコンホメーション」若しくは「抗体フラグメントのコンホメーション」という句は抗体若しくはそのフラグメントの三次構造を指す。
【００８０】
抗体の「特異的結合」は、抗体が特定の１抗原若しくはエピトープに対する認識可能な親和性を表し、かつ、一般的には有意の交差反応性を表さないことを意味している。例示的態様において、抗体は交差反応性を表さない（例えば、Ａβ以外のペプチド若しくはＡβ上の離れたエピトープと交差反応しない）。「認識可能な」すなわち好ましい結合は、最低１０６、１０７、１０８、１０９Ｍ−１若しくは１０１０Ｍ−１の親和性もつ結合を包含する。１０７Ｍ−１以上、好ましくは１０８Ｍ−１以上の親和性がより好ましい。本明細書に示されるものの中間の値もまた本発明の範囲内にあることを意図しており、そして、好ましい結合親和性は、親和性のある範囲、例えば１０６ないし１０１０Ｍ−１、好ましくは１０７ないし１０１０Ｍ−１、より好ましくは１０８ないし１０１０Ｍ−１として示し得る。「有意の交差反応性を表さない」抗体は、望ましくない実体（例えば望ましくないタンパク質性の実体）に認識可能に結合することができないものである。例えば、Ａβに特異的に結合する抗体はＡβを認識可能に結合することができるが、しかし、Ａβ以外のタンパク質若しくはペプチド（例えば斑中に包含されるＡβ以外のタンパク質若しくはペプチド）と有意に反応することができない。特定の１エピトープに特異的な抗体は、例えば同一タンパク質若しくはペプチド上の離れたエピトープと有意に交差反応することができない。特異的結合は、こうした結合を測定するためのいずれかの技術に認識された手段に従って測定し得る。好ましくは、特異的結合はスキャッチャード分析および／若しくは競合結合アッセイに従って測定する。
【００８１】
本明細書で使用されるところの「親和性」という用語は、単一の抗原を結合する部位の抗原決定基との結合の強さを指す。親和性は、抗体結合部位と抗原決定基の間の立体化学的適合の近接度、それらの間の接触の面積の大きさ、荷電したおよび疎水性の基の分布などに依存する。抗体親和性は平衡透析若しくは速度論的ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ法により測定し得る。ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ法は、表面プラスモン波が金属／液体界面で励起される場合
に発生する表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）の現象に頼る。サンプルと接触していない表面の側面に光を向け、そして光はそれから反射され、そしてＳＰＲは角度および波長の特定の組合せで反射光強度の低下を引き起こす。生体分子結合事象は表面層で屈折率の変化を引き起こし、それがＳＰＲシグナルの変化として検出される。
【００８２】
解離定数ＫＤおよび会合定数ＫＡは親和性の量的尺度である。平衡では、遊離抗原（Ａｇ）および遊離抗体（Ａｂ）は抗原−抗体複合体（Ａｇ−Ａｂ）と平衡状態にあり、そして速度定数ｋａおよびｋｄは個々の反応の速度を定量する。
【００８３】
【数１】
2008523815.tif 000002
【００８４】
平衡では、ｋａ［Ａｂ］［Ａｇ］＝ｋｄ［Ａｇ−Ａｂ］。解離定数ＫＤは：ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ＝［Ａｇ］［Ａｂ］／［Ａｇ−Ａｂ］により与えられる。ＫＤは濃度の単位、最も典型的にはＭ、ｍＭ、μＭ、ｎＭ、ｐＭなどを有する。ＫＤとして表される抗体親和性を比較する場合、Ａβに対するより大きい親和性を有することはより小さい値により示される。会合定数ＫＡは：ＫＡ＝ＫＡ／ＫＤ＝［Ａｇ−Ａｂ］／［Ａｇ］［Ａｂ］により与えられる。ＫＡは濃度の逆数の単位、最も典型的にはＭ−１、ｍＭ−１、μＭ−１、ｎＭ−１、ｐＭ−１などを有する。本明細書で使用されるところの「親和性（ａｖｉｄｉｔｙ）」という用語は、可逆性複合体の形成後の抗原−抗体結合の強さを指す。
【００８５】
「Ｆｃ免疫グロブリンバリアント」若しくは「Ｆｃ抗体バリアント」という用語は、変えられたＦｃ領域を有する免疫グロブリンすなわち抗体（例えばヒト化免疫グロブリン、キメラ免疫グロブリン、一本鎖抗体、抗体フラグメントなど）を包含する。例えば、免疫グロブリンが変えられたエフェクター機能を有するようなＦｃ領域が変えられることができる。アミノ酸変化は、免疫グロブリンの、例えば免疫グロブリンのＦｃ領域の１個若しくはそれ以上のアミノ酸のアミノ酸置換、付加、欠失および／若しくは修飾を包含する。いくつかの態様において、本発明の免疫グロブリンはＦｃ領域に１個若しくはそれ以上の突然変異を包含する。いくつかの態様において、Ｆｃ領域は、ヒンジ領域、例えばＥＵ位置２３４、２３５、２３６および／若しくは２３７に１個若しくはそれ以上のアミノ酸変化を包含する。アミノ酸位置２３４、２３５、２３６および／若しくは２３７の１個若しくはそれ以上にヒンジ領域突然変異を包含する抗体は、例えば米国特許第５，６２４，８２１号および米国特許第５，６４８，２６０号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるとおり作成し得る。
【００８６】
「エフェクター機能」という用語は、抗体（例えばＩｇＧ抗体）のＦｃ領域に存する活性を指し、そして、例えば、エフェクター細胞活性、溶解、補体媒介性の活性、抗体消失および抗体半減期のような抗体の数種の免疫機能を制御し得る、補体および／若しくはＦｃ受容体のようなエフェクター分子を結合する該抗体の能力を包含する。
【００８７】
「エフェクター分子」という用語は、限定されるものでないが補体タンパク質若しくはＦｃ受容体を挙げることができる、抗体（例えばＩｇＧ抗体）のＦｃ領域に結合することが可能である分子を指す。
【００８８】
「エフェクター細胞」という用語は、限定されるものでないがリンパ球、例えば抗原提示細胞およびＴ細胞を挙げることができるエフェクター細胞の表面上で発現されるＦｃ受
容体を典型的に介して抗体（例えばＩｇＧ抗体）のＦｃ部分に結合することが可能な細胞を指す。
【００８９】
「Ｆｃ領域」という用語は、ＩｇＧ抗体のＣ末端領域、とりわけ前記ＩｇＧ抗体のＨ鎖（１本若しくは複数）のＣ末端領域を指す。ＩｇＧ  Ｈ鎖のＦｃ領域の境界はわずかに変動し得るとは言え、Ｆｃ領域は、典型的にはヒトＩｇＧ  Ｈ鎖（１本若しくは複数）のほぼアミノ酸残基Ｃｙｓ２２６からカルボキシル末端までにわたると定義される。
【００９０】
「アグリコシル化」抗体という用語は、化学的若しくは酵素的過程、１個若しくはそれ以上のグリコシル化部位の突然変異、細菌中での発現などによって１個若しくはそれ以上の炭水化物を欠く抗体を指す。アグリコシル化抗体は、Ｆｃの炭水化物が例えば化学的若しくは酵素的に除去された抗体である脱グリコシル化抗体でありうる。あるいは、アグリコシル化抗体は、例えば、グリコシル化パターンをコードする１個若しくはそれ以上の残基の突然変異、またはタンパク質に炭水化物を結合しない生物体、例えば細菌中での発現によりＦｃ炭水化物を伴わず発現された抗体である、非グリコシル化若しくは未グリコシル化抗体でありうる。
【００９１】
別の方法で述べられない限り、「Ｋａｂａｔの番号付け」は、Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版  国立保健研究所公衆衛生局（Ｐｕｂｌｉｃｋ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）、メリーランド州ベセスダ（１９９１））（引用することによりに本明細書に明らかに組み込まれる）に教示されるとおりである。別の方法で述べられない限り、「ＥＵ番号付け」もまた、Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版  国立保健研究所公衆衛生局（Ｐｕｂｌｉｃｋ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）、メリーランド州ベセスダ（１９９１））に教示され、そして、例えば、本明細書に記述されるところのＥＵインデックス（ＥＵ  ｉｎｄｅｘ）を使用するＨ鎖抗体配列中の残基の番号付けを指す。この番号付け体系はＥｄｅｌｍａｎら、６３（１）：７８−８５（１９６９）に記述されるＥｕ抗体の配列に基づく。
【００９２】
「Ｆｃ受容体」若しくは「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を指す。抗体（例えばＩｇＧ抗体）のＦｃ領域に結合する典型的なＦｃ受容体は、限定されるものでないが、これらの受容体のアレルバリアントおよび選択的にスプライスされた形態を包含する、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を挙げることができる。他のＦｃ受容体は、抗体の半減期を調節する新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を包含する。Ｆｃ受容体は、ＲａｖｅｔｃｈとＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）；およびｄｅ  Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）に総説されている。
【００９３】
「抗原」は、免疫グロブリンすなわち抗体（若しくはそれらの抗原結合フラグメント）が特異的に結合する実体（例えばタンパク質性の実体若しくはペプチド）である。
【００９４】
「エピトープ」若しくは「抗原決定基」という用語は、免疫グロブリンすなわち抗体（若しくはそれらの抗原結合フラグメント）が特異的に結合する抗原上の１部位を指す。エピトープは、連続するアミノ酸、若しくはタンパク質の三次フォールディングにより並置される連続しないアミノ酸双方から形成され得る。連続するアミノ酸から形成されるエピトープは典型的に変性溶媒への曝露に際して保持される一方、三次フォールディングにより形成されるエピトープは変性溶媒での処理に際して典型的に喪失される。エピトープは
、典型的には独特な空間的コンホメーションに最低３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４若しくは１５アミノ酸を包含する。エピトープの空間的コンホメーションの決定方法は、例えばｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴を包含する。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．６６、Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編（１９９６）を参照されたい。
【００９５】
同一エピトープを認識する抗体は、標的抗原への別の抗体の結合を阻害する一抗体の能力を示す単純なイムノアッセイ、すなわち競合結合アッセイで同定し得る。競合結合は、Ａβのような共通の抗原への参照抗体の特異的結合を試験中の免疫グロブリンが阻害するアッセイで測定する。多数の型の競合結合アッセイ、例えば固相直接若しくは間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接若しくは間接エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９：２４２（１９８３）を参照されたい）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４（１９８６）を参照されたい）：固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）を参照されたい）；Ｉ−１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（１）：７（１９８８）を参照されたい）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６：５４６（１９９０））；および直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７（１９９０））が既知である。典型的には、こうしたアッセイはこれらすなわち未標識の試験免疫グロブリンおよび標識した参照免疫グロブリンのいずれかを担持する固体表面若しくは細胞に結合した精製抗原の使用を必要とする。競合阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で固体表面若しくは細胞に結合した標識の量を測定することにより測定する。通常、試験免疫グロブリンは過剰で存在する。通常は、競合する抗体が過剰に存在する場合、それは共通の抗原への参照抗体の特異的結合を最低５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％、６５〜７０％、７０〜７５％若しくはそれ以上阻害することができる。
【００９６】
エピトープは免疫学的細胞、例えばＢ細胞および／若しくはＴ細胞によってもまた認識される。エピトープの細胞認識は、３Ｈ−チミジン取り込み、サイトカイン分泌、抗体分泌若しくは抗原依存性の死滅（細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ）により測定されるような抗原依存性の増殖を測定するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにより測定し得る。
【００９７】
本発明の抗体が結合する例示的エピトープすなわち抗原決定基は、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）内に見出し得るが、しかし好ましくはＡＰＰのＡβペプチド内に見出される。本明細書に記述されるところのＡβ内の例示的エピトープすなわち抗原決定基は、ＡβのＮ末端、中央領域若しくはＣ末端内に位置する。
【００９８】
「Ｎ末端エピトープ」は、ＡβペプチドのＮ末端内に位置する残基を含んでなるエピトープすなわち抗原決定基である。例示的Ｎ末端エピトープは、Ａβのアミノ酸１−１０若しくは１−１２内、好ましくはＡβ４２の残基１−３、１−４、１−５、１−６、１−７、２−６、３−６若しくは３−７からの残基を包含する。他の例示的Ｎ末端エピトープはＡβの残基１−３で開始しかつ残基７−１１で終了する。付加的な例示的Ｎ末端エピトープは、Ａβの残基２−４、５、６、７若しくは８、Ａβの残基３−５、６、７、８若しくは９、またはＡβ４２の残基４−７、８、９若しくは１０を包含する。
【００９９】
「中央エピトープ」は、Ａβペプチドの中央（ｃｅｎｔｒａｌ）すなわち中央（ｍｉｄ）部分内に位置する残基を含んでなるエピトープすなわち抗原決定基である。例示的中央
エピトープは、Ａβペプチドのアミノ酸１３−３８内、好ましくは１６−２１、１６−２２、１６−２３、１６−２４、１８−２１、１９−２１、１９−２２、１９−２３若しくは１９−２４内の残基を包含する。
【０１００】
「Ｃ末端エピトープ」は、ＡβペプチドのＣ末端内（例えばＡβのほぼアミノ酸３０−４０若しくは３０−４２内）に位置する残基を含んでなるエピトープすなわち抗原決定基である。付加的な例示的エピトープすなわち抗原決定基はＡβの残基３３−４０若しくは３３−４２を包含する。こうしたエピトープを「Ｃ末端エピトープ」と称し得る。
【０１０１】
抗体が、Ａβ３−７のような指定された残基内の１エピトープに結合すると言われる場合、意味しているものは、該抗体が指定された残基（すなわちこの一例ではＡβ３−７）を含有するポリペプチドに特異的に結合することである。こうした抗体はＡβ３−７内のすべての残基と必ずしも接触しない。また、Ａβ３−７内のすべての単一アミノ酸置換若しくは欠失は、結合親和性に必ずしも有意に影響を及ぼさない。
【０１０２】
「Ａβ抗体」および「抗Ａβ」という用語は、Ａβタンパク質内の１個若しくはそれ以上のエピトープすなわち抗原決定基に結合する抗体を指すのに本明細書で互換性に使用する。例示的Ａβ抗体は、Ｎ末端Ａβ抗体、中央Ａβ抗体およびＣ末端Ａβ抗体を包含する。本明細書で使用されるところの「Ｎ末端Ａβ抗体」という用語は、最低１個のＮ末端エピトープすなわち抗原決定基を認識するＡβ抗体を指す。本明細書で使用されるところの「中央Ａβ抗体」という用語は、最低１個の中央のエピトープすなわち抗原決定基を認識するＡβ抗体を指す。本明細書で使用されるところの「Ｃ末端Ａβ抗体」という用語は、最低１個のＣ末端エピトープすなわち抗原決定基を認識するＡβ抗体を指す。
【０１０３】
「免疫学的」若しくは「免疫」応答という用語は、被験体において抗原に向けられた体液性（抗体媒介性）および／または細胞性（抗原特異的Ｔ細胞若しくはそれらの分泌生成物により媒介される）応答の発生である。こうした応答は免疫原の投与により誘導される能動的応答、または抗体若しくは予め刺激されたＴ細胞の投与により誘導される受動的応答であり得る。細胞性免疫応答は、クラスＩ若しくはクラスＩＩ  ＭＨＣ分子とともにのポリペプチドエピトープの提示により導き出されて抗原特異的ＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞および／若しくはＣＤ８＋  細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する。該応答は、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー（「ＮＫ」）細胞、好塩基球、樹状細胞、星状細胞、小膠細胞、抗酸球若しくは自然免疫の他の成分の活性化もまた伴いうる。細胞媒介性の免疫学的応答の存在は、増殖アッセイ（ＣＤ４＋  Ｔ細胞）若しくはＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）アッセイにより測定し得る（Ｂｕｒｋｅ、ＲＥＦ；Ｔｉｇｇｅｓ、ＲＥＦを参照されたい）。免疫原の保護すなわち治療効果への体液性および細胞性応答の相対的寄与は、免疫した動物若しくは個体から抗体およびＴ細胞を別個に単離すること、ならびに保護若しくは治療効果を第二の被験体で測定することにより識別し得る。
【０１０４】
本明細書で使用されるところの「免疫療法」という用語は、免疫応答（例えば能動若しくは受動免疫応答）を意図しておりかつ／若しくはそれを生じる、疾患若しくは障害の処置、例えば治療的若しくは予防的処置を指す。
【０１０５】
「免疫原剤」若しくは「免疫原」は、場合によってはアジュバントとともにの患者への投与に際してそれ自身に対する免疫学的応答を誘導することが可能である。「免疫原組成物」は免疫原剤を含んでなるものである。
【０１０６】
「アジュバント」という用語は、抗原とともに投与される場合に該抗原に対する免疫応答を増強するがしかし単独で投与される場合に該抗原に対する免疫応答を生成しない化合物を指す。アジュバントは、リンパ球動員、Ｂおよび／若しくはＴ細胞の刺激ならびにマ
クロファージの刺激を包含するいくつかの機構により免疫応答を増強し得る。
【０１０７】
本明細書で使用されるところの「キット」という用語は、サンプルの分析を容易にする試薬および他の物質の組合せに関して使用する。いくつかの態様において、本発明のイムノアッセイキットは、適する抗原、検出可能な部分を含んでなる結合剤および検出試薬を包含する。検出可能な部分により生じられるシグナルを増幅するための系もまたキットに包含しても若しくはしなくてもよい。さらに、他の態様において、キットは、限定されるものでないがサンプル収集のための装置、サンプル管、ホルダ、トレイ、ラック、皿、プレート、キット使用者への説明書、溶液若しくは他の化学的試薬、ならびに標準化、正規化に使用すべきサンプル、および／または対照サンプルを包含する。
【０１０８】
本発明の多様な方法論は、値、レベル、特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）、特徴（ｃｈｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）、特性などを、「適切な対照」と本明細書で互換性に称される「適する対照」と比較することを伴う段階を包含する。「適する対照」若しくは「適切な対照」は、比較の目的上有用な当業者になじみのあるいかなる対照若しくは標準でもある。一態様において、「適する対照」若しくは「適切な対照」は、本明細書に記述されるところの本発明の方法論を実施する前に測定される値、レベル、特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）、特徴（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）、特性などである。別の態様において、「適する対照」若しくは「適切な対照」は、被験体、例えば、対照若すなわち例えば正常な特質を表す正常被験体で測定される値、レベル、特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）、特徴（ｃｈｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）、特性などである。なお別の態様において、「適する対照」若しくは「適切な対照」は、予め定義された値、レベル、特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）、特徴（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）、特性などである。
【０１０９】
ＩＩ．免疫学的および治療的試薬
本発明の免疫学的および治療的試薬は、本明細書で定義されるところの免疫原若しくは抗体、またはそれらの機能的若しくは抗原結合フラグメントを含んでなるか若しくはそれらよりなる。基本的な抗体構造単位はサブユニットの四量体を含んでなることが既知である。各四量体はポリペプチド鎖の２個の同一の対から構成され、各対は１本の「Ｌ」（約２５ｋＤａ）および１本の「Ｈ」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主として司る約１００ないし１１０若しくはそれ以上のアミノ酸の可変領域を包含する。各鎖のカルボキシ末端部分はエフェクター機能を主として司る定常領域を定義する。
【０１１０】
Ｌ鎖はκ若しくはλいずれかに分類され、そして長さ約２３０残基である。Ｈ鎖はγ、μ、α、δ若しくはεに分類され、長さ約４５０〜６００残基であり、そして抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥと規定する。ＨおよびＬ鎖双方はドメインにフォールディングされている。「ドメイン」という用語は、タンパク質、例えば免疫グロブリンすなわち抗体の球状領域を指す。免疫グロブリンすなわち抗体のドメインは、例えばβ−プリーツシートおよび１個の鎖間ジスルフィド結合により安定化された３若しくは４個のペプチドループを包含する。無傷のＬ鎖は例えば２ドメイン（ＶＬおよびＣＬ）を有し、また、無傷のＨ鎖は例えば４若しくは５ドメイン（ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）を有する。
【０１１１】
ＬおよびＨ鎖内で、可変および定常領域は約１２若しくはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により結合され、Ｈ鎖は約１０より多いアミノ酸の「Ｄ」領域もまた包含する（全般として、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ，Ｗ．編、第２版  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９８９）、第７章（全部の目的上そっくりそのまま引用することにより組み込まれる）を参照されたい）。
【０１１２】
各Ｌ／Ｈ鎖対の可変領域は抗体結合部位を形成する。従って無傷の抗体は２個の結合部位を有する。二官能性若しくは二特異性抗体でを除き、該２結合部位は同一である。該鎖は全部、相補性決定領域すなわちＣＤＲともまた呼ばれる３個の超可変領域により結合された、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同一の一般構造を表す。天然に存在する鎖、若しくは組換えで製造される鎖はリーダー配列とともに発現され得、リーダー配列は細胞のプロセシングの間に除去されて成熟鎖を生じる。成熟鎖はまた、例えば目的の特定の鎖の分泌を高めるか若しくはプロセシングを変えるために、天然に存在しないリーダー配列を有して組換えで産生もし得る。
【０１１３】
各対の２本の成熟鎖のＣＤＲはフレームワーク領域により整列されて、特定の１エピトープに結合することを可能にする。Ｎ末端からＣ末端まで、ＬおよびＨ鎖双方はドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含んでなる。「ＦＲ４」は可変Ｈ鎖のＤ／Ｊ領域および可変Ｌ鎖のＪ領域ともまた当該技術分野で称される。各ドメインへのアミノ酸の割り当てはＫａｂａｔの定義に従う。
【０１１４】
Ａ．Ａβ抗体
本発明の治療薬はＡβ若しくはアミロイド斑の他成分に特異的に結合する抗体を包含する。好ましい抗体はモノクローナル抗体である。数種のこうした抗体は可溶性の形態に結合することなく凝集型の形態のＡβに特異的に結合する。数種は凝集型の形態に結合することなく可溶性の形態に特異的に結合する。数種は凝集型および可溶性双方の形態に結合する。数種の抗体は斑中のＡβを結合する。数種の抗体は血液脳関門を横断し得る。数種の抗体は被験体中のアミロイド負荷量を低減させ得る。数種の抗体は被験体での神経炎性ジストロフィーを低下させ得る。数種の抗体はシナプス構造を維持し得る（例えばシナプトフィジン）。数種の抗体は１種若しくはそれ以上の向神経活性の形態のＡβを中和し得る。好ましい一態様において、受動免疫療法での使用のための本発明の抗体は、単量体の可溶性および／若しくはオリゴマーの可溶性Ａβポリペプチド（例えば可溶性Ａβ二量体、三量体など）を包含する可溶性Ａβペプチドを結合する。
【０１１５】
本発明の一態様において、該抗体は斑に沈着した凝集型すなわち不溶性Ａβを結合してアミロイド斑の大きさ若しくは密度を低下させることが可能である。別の態様において、該抗体は、単量体の可溶性ならびにオリゴマーの可溶性Ａβポリペプチド（例えば可溶性Ａβ二量体、三量体など）を包含する可溶性Ａβを捕捉し、かつ、Ａβの蓄積を予防しかつ／若しくはＣＮＳからのＡβの除去を促進することが可能である。とりわけ好ましい一態様において、本発明の抗体は可溶性および不溶性双方のＡβペプチド若しくはそれらのフラグメントに結合することが可能であり、ならびに、既存のアミロイド斑の大きさおよび密度もまた減少させつつ付加的なアミロイド斑の形成を予防することが可能である。
【０１１６】
治療方法で使用される抗体は、好ましくは、無傷の定常領域、若しくはＦｃ受容体と相互作用するのに少なくとも十分な定常領域を有する。好ましい抗体は斑中のＡβのＦｃ媒介性の食作用の刺激で有効なものである。ヒトアイソタイプＩｇＧ１は、食細胞上（例えば脳常在性マクロファージ若しくは小膠細胞上の）ＦｃＲＩ受容体に対するヒトアイソタイプの最高の親和性を有するそれのため好ましい。ヒトＩｇＧ１はマウスＩｇＧ２ａの同等物であり、後者は従ってアルツハイマー病の動物（例えばマウス）モデルでｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を試験するのに適する。抗体の一方のアームがＡβおよび他方がＦｃ受容体に対する特異性を有する二特異性Ｆａｂフラグメントもまた使用し得る。好ましい抗体は、約１０６、１０７、１０８、１０９若しくは１０１０Ｍ−１（これらの値の中間の親和性を包含する）以上（若しくはそれらに等しい）結合親和性でＡβに結合する。
【０１１７】
本発明の抗体は、被験体のＣＮＳ若しくは脳中の可溶性Ａβを結合かつ／若しくは消失することが可能である抗体もまた包含する。例示的抗体は、例えば被験体の血流中の可溶
性Ａβを捕捉することが可能である抗体もまた包含する。好ましい抗体は、例えば可溶性Ａβの消失および／若しくは捕捉を介して被験体における認知を迅速に改善することが可能である。
【０１１８】
モノクローナル抗体は、コンホメーション若しくは非コンホメーションエピトープであり得るＡβ内の特定の１エピトープに結合する。抗体の予防的および治療的有効性は、実施例に記述されるトランスジェニック動物モデル手順を使用して試験し得る。好ましいモノクローナル抗体は、Ａβの残基１−１０（天然のＡβの最初のＮ末端残基を１と呼称する）内の１エピトープ、より好ましくはＡβの残基３−７内の１エピトープに結合する。いくつかの方法において、多様なエピトープに対する結合特異性を有する複数のモノクローナル抗体を使用し、例えば、Ａβの残基３−７内の１エピトープに特異的な抗体を、Ａβの残基３−７の外側の１エピトープに特異的な抗体と共投与し得る。こうした抗体は連続して若しくは同時に投与し得る。Ａβ以外のアミロイド成分に対する抗体もまた使用（例えば投与若しくは共投与）し得る。
【０１１９】
抗体のエピトープ特異性は、例えば、多様なメンバーがＡβの異なる配列を表すファージディスプレイライブラリーを形成することにより決定し得る。該ファージディスプレイライブラリーをその後、試験中の抗体に特異的に結合するメンバーについて選択する。一群の配列を単離する。典型的には、こうした一群は、共通の中核配列および多様なメンバーでの隣接配列の変動する長さを含有する。抗体に対する特異的結合を示す最短の中核配列が該抗体により結合されるエピトープを規定する。抗体は、エピトープ特異性が既に決定された抗体との競合アッセイでもまたエピトープ特異性について試験し得る。例えば、Ａβへの結合について１２Ａ１１抗体と競合する抗体は、１２Ａ１１と同一若しくは類似のすなわち残基Ａβ  ３−７内のエピトープに結合する。エピトープ特異性について抗体をスクリーニングすることは治療的有効性の有用な予測因子である。例えば、Ａβの残基１−７内の１エピトープに結合することが決定された抗体は、本発明の方法論に従ってアルツハイマー病の予防および処置において有効であることがありそうである。
【０１２０】
Ａβの他領域に結合することなくＡβの好ましい１セグメントに特異的に結合する抗体は、他領域に結合するモノクローナル抗体若しくは無傷のＡβに対するポリクローナル血清に関して多数の利点を有する。第一に、等質量の投薬量について、好ましいセグメントに特異的に結合する抗体の投薬量は、アミロイド斑の消失において有効な抗体のより高いモル投薬量を含有する。第二に、好ましいセグメントに特異的に結合する抗体は、無傷のＡＰＰポリペプチドに対する消失応答を誘導することなくアミロイド沈着物に対する消失応答を誘導して、それにより潜在的副作用を低下させ得る。
【０１２１】
１．ヒト以外の抗体の製造
本発明はヒト以外の抗体、例えば本発明の好ましいＡβエピトープに対する特異性を有する抗体を特徴とする。こうした抗体は、本発明の多様な治療的組成物の処方において使用し得るか、または、好ましくはヒト化若しくはキメラ抗体（詳細に下述される）の製造のための相補性決定領域を提供し得る。ヒト以外のモノクローナル抗体、例えばマウス、モルモット、霊長類、ウサギ若しくはラットの製造は、例えばＡβで動物を免疫することにより達成し得る。Ａβ若しくはＡβの免疫原性フラグメントを含んでなるより長いポリペプチド、またはＡβに対する抗体に対する抗イディオタイプ抗体もまた使用し得る。ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、上記（全部の目的上引用することにより組み込まれる）を参照されたい。こうした免疫原は天然の供給源から、ペプチド合成若しくは組換え発現により得ることができる。場合によっては、免疫原は下述されるとおり担体タンパク質に融合若しくは別の方法で複合体形成して投与し得る。場合によっては、免疫原はアジュバントともに投与し得る。「アジュバント」という用語は、抗原とともに投与される場合に該抗原に対する免疫応答を増強するが、しかし単独で投与される場合に該抗原に対する免疫応答を
生成しない化合物を指す。アジュバントは、リンパ球動員、Ｂおよび／若しくはＴ細胞の刺激、ならびにマクロファージの刺激を包含する数種の機構により免疫応答を増強し得る。数種の型のアジュバントを下述されるとおり使用し得る。フロイントの完全アジュバント、次いで不完全アジュバントが実験動物の免疫化に好ましい。
【０１２２】
ポリクローナル抗体を作成するためにウサギ若しくはモルモットを典型的に使用する。例えば受動的保護のためのポリクローナル抗体の例示的調製は後に続くとおり実施し得る。１２５匹の非トランスジェニックマウスを１００μｇのＡβ１−４２およびフロイントの完全／不完全アジュバント（ＣＦＡ／ＩＦＡアジュバント）で免疫し、そして４〜５か月で安楽死させる。免疫したマウスから血液を収集する。ＩｇＧを他の血液成分から分離する。免疫原に特異的な抗体をアフィニティークロマトグラフィーにより部分的に精製してもよい。平均約０．５〜１ｍｇの免疫原特異的抗体がマウスあたりで得られ、合計６０〜１２０ｍｇを生じる。
【０１２３】
モノクローナル抗体を作成するのに典型的にマウスを使用する。モノクローナル抗体は、Ａβのフラグメント若しくはより長い形態をマウスに注入すること、ハイブリドーマを調製すること、およびＡβに特異的に結合する抗体についてハイブリドーマをスクリーニングすることにより、あるフラグメントに対し製造し得る。場合によっては、抗体はＡβの他の重ならないフラグメントへの結合を伴わないＡβの特定の１領域若しくは所望のフラグメントへの結合についてスクリーニングする。後者のスクリーニングは、Ａβペプチドの欠失変異体の集合物への抗体の結合を測定すること、およびどの欠失変異体が該抗体に結合するかを決定することにより達成し得る。結合は例えばウエスタンブロット若しくはＥＬＩＳＡにより評価し得る。抗体への特異的結合を示す最小フラグメントが該抗体のエピトープを規定する。あるいは、エピトープ特異性は、試験および参照抗体がＡβへの結合について競合する競合アッセイにより決定し得る。試験および参照抗体が競合する場合には、それらは、同一のエピトープ、若しくは一方の抗体の結合が他方の結合を妨害するような十分に近位のエピトープに結合する。こうした抗体の好ましいアイソタイプはマウスアイソタイプＩｇＧ２ａ若しくは他の種の同等のアイソタイプである。マウスアイソタイプＩｇＧ２ａはヒトアイソタイプＩｇＧ１（例えばヒトＩｇＧ１）の同等物である。
【０１２４】
２．キメラおよびヒト化抗体
本発明は、βアミロイドペプチドに特異的なキメラおよび／若しくはヒト化抗体（例えばキメラおよび／若しくはヒト化免疫グロブリン）もまた特徴とする。キメラおよび／若しくはヒト化抗体は、キメラ若しくはヒト化抗体の構築のための出発原料を提供するマウス若しくは他のヒト以外の抗体と同一若しくは類似の結合特異性および親和性を有する。
【０１２５】
ａ．キメラ抗体の製造
「キメラ抗体」という用語は、そのＬおよびＨ鎖遺伝子が典型的には遺伝子工学により、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから構築された抗体を指す。例えば、マウスモノクローナル抗体からの遺伝子の可変（Ｖ）セグメントを、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４のようなヒト定常（Ｃ）セグメントに結合しうる。ヒトアイソタイプＩｇＧ１およびＩｇＧ４が例示的である。典型的なキメラ抗体は、従って、マウス抗体からのＶすなわち抗原結合ドメインおよびヒト抗体からのＣすなわちエフェクタードメインよりなるハイブリッドタンパク質である。
【０１２６】
ｂ．ヒト化抗体の製造
「ヒト化抗体」という用語は、実質的にヒト抗体鎖（アクセプター免疫グロブリンすなわち抗体と称される）からの可変領域フレームワーク残基、および実質的にマウス抗体（ドナー免疫グロブリンすなわち抗体と称される）からの最低１個の相補性決定領域を含んでなる最低１本の鎖を含んでなる抗体を指す。Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３（１９８９）、米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、Ｓｅｌｉｃｋら、第ＷＯ  ９０／０７８６１号、およびＷｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号明細書（全部の目的上そっくりそのまま引用することにより組み込まれる）を参照されたい。定常領域（１個若しくは複数）もまた、存在する場合、実質的に若しくは完全にヒト免疫グロブリンからである。
【０１２７】
マウスＣＤＲのヒト可変ドメインフレームワークへの置換は、該ＣＤＲが発したマウス可変フレームワークに同一若しくは類似のコンホメーションを該ヒト可変ドメインフレームワークが採用する場合に、それらの正しい空間的向きの保持をもたらすことが最もありそうである。これは、ＣＤＲが由来したマウス可変フレームワークドメインと高程度の配列同一性をそのフレームワーク配列が表すヒト抗体からのヒト可変ドメインを得ることにより達成される。ＨおよびＬ鎖可変フレームワーク領域は同一若しくは異なるヒト抗体配列由来であり得る。ヒト抗体配列は天然に存在するヒト抗体の配列であり得るか、若しくは数種のヒト抗体のコンセンサス配列であり得る。Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４：７７３（１９９１）；Ｋｏｌｂｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６：９７１（１９９３）およびＣａｒｔｅｒら、第ＷＯ  ９２／２２６５３号明細書を参照されたい。
【０１２８】
マウスドナー免疫グロブリンの相補性決定領域および適切なヒトアクセプター免疫グロブリンを同定したら、次の段階は、生じるヒト化抗体の特性を至適化するのにこれらの成分からのどの残基（あれば）を置換すべきであるかを決定することである。一般に、マウスでのヒトアミノ酸残基の置換は最低限にすべきである。マウス残基の導入は、ヒトにおいてヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を導き出す抗体の危険を増大させるためである。技術に認識された免疫応答測定方法を実施して、特定の患者での若しくは臨床試験の間のＨＡＭＡ応答をモニターし得る。ヒト化抗体を投与した患者に、前記治療の投与の開始時およびその間、免疫原性評価を与え得る。ＨＡＭＡ応答は、例えば、表面プラスモン共鳴技術（ＢＩＡＣＯＲＥ）および／若しくは固相ＥＬＩＳＡ分析を包含する当業者に既知の方法を使用して、患者からの血清サンプル中の該ヒト化治療試薬に対する抗体を検出することにより測定する。
【０１２９】
ヒト可変領域フレームワーク残基からのある種のアミノ酸を、ＣＤＲのコンホメーションおよび／若しくは抗原への結合に対するそれらの可能な影響に基づき、置換のため選択する。マウスＣＤＲ領域のヒト可変領域フレームワーク領域との非天然の並置は非天然のコンホメーションの拘束をもたらし得、それはあるアミノ酸残基の置換により補正されない限り、結合親和性の喪失につながる。
【０１３０】
置換のためのアミノ酸残基の選択は部分的にコンピュータモデル化により決定する。免疫グロブリン分子の三次元像を生じるためのコンピュータのハードウェアおよびソフトウェアが本明細書に記述される。一般に、分子モデルは、免疫グロブリン鎖若しくはそれらのドメインの解明された構造から出発して製造する。モデル化されるべき鎖を、解明された三次元構造の鎖若しくはドメインとアミノ酸配列の類似性について比較し、そして最大の配列類似性を示す鎖若しくはドメインを該分子モデルの構築のための出発点として選択する。最低５０％の配列同一性を共有する鎖若しくはドメインをモデル化に選択し、そして、好ましくは最低６０％、７０％、８０％、９０％の配列同一性若しくはそれ以上を共有するものをモデル化に選択する。モデル化されている免疫グロブリン鎖若しくはドメイン中の実際のアミノ酸と出発構造中のものの間の差違を見込むように、解明された出発構造を改変する。改変した構造をその後混成免疫グロブリンに集成する。最後に、エネルギー最小化、ならびに相互からの適切な距離内に全原子があることならびに結合長さおよび角が化学的に許容できる限界内にあることを確認することにより、該モデルを改良する。
【０１３１】
置換のためのアミノ酸残基の選択は、部分的に、特定の位置のアミノ酸の特徴の検査、または特定のアミノ酸の置換若しくは突然変異誘発の影響の経験的観察によってもまた決定し得る。例えば、アミノ酸がマウス可変領域フレームワーク残基と選択したヒト可変領域フレームワーク残基の間で異なる場合、該ヒトフレームワークアミノ酸は、該アミノ酸が：
（１）抗原を直接非共有結合するか、
（２）ＣＤＲ領域に隣接するか、
（３）ＣＤＲ領域と別の方法で相互作用する（例えばコンピュータモデル化により決定されるところのＣＤＲ領域の約３〜６Å以内である）か、若しくは
（４）ＶＬ−ＶＨ界面に参画する
ことが合理的に期待される場合に、マウス抗体からの同等のフレームワークアミノ酸により、通常は置換すべきである。
【０１３２】
「抗原を直接非共有結合する」残基は、確立された化学力により、例えば水素結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用などにより抗原上のアミノ酸と直接相互作用する十分な確率を有するフレームワーク領域中の位置のアミノ酸を包含する。
【０１３３】
ＣＤＲおよびフレームワーク領域はＫａｂａｔら若しくはＣｈｏｔｈｉａら、上記により定義されるとおりである。Ｋａｂａｔら、上記により定義されるところのフレームワーク領域がＣｈｏｔｈｉａら、上記により定義されるところの構造ループ残基を構成する場合、マウス抗体に存在するアミノ酸をヒト化抗体中での置換に選択しうる。「ＣＤＲ領域に隣接」する残基は、例えば、Ｋａｂａｔにより定義されるところのＣＤＲ若しくはＣｈｏｔｈｉａ（例えばＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋ  ＪＭＢ  １９６：９０１（１９８７）を参照されたい）により定義されるところのＣＤＲにすぐ隣接する位置のヒト化免疫グロブリン鎖の一次配列中のＣＤＲの１個若しくはそれ以上にすぐ隣接する位置のアミノ酸残基を包含する。これらのアミノ酸は、とりわけ、ＣＤＲ中のアミノ酸と相互作用し、かつ、アクセプターから選ばれる場合はドナーＣＤＲを歪ませかつ親和性を低下させることがありそうである。さらに、該隣接アミノ酸は抗原と直接相互作用することができ（Ａｍｉｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３３：７４７（１９８６）（引用することにより本明細書に組み込まれる））、そして、ドナーからこれらのアミノ酸を選択することは、元の抗体中で親和性を提供する全部の抗原接触を保つのに望ましいことができる。
【０１３４】
「ＣＤＲ領域と別の方法で相互作用する」残基は、ＣＤＲ領域に影響を及ぼすのに十分な空間的向きにあることが二次構造分析により決定されるものを包含する。一態様において、「ＣＤＲ領域と別の方法で相互作用する」残基は、ドナー免疫グロブリンの三次元モデル（例えばコンピュータ生成モデル）を解析することにより同定する。典型的には元のドナー抗体の三次元モデルは、ＣＤＲの外側のあるアミノ酸がＣＤＲに近接し、そして水素結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用などによりＣＤＲ中のアミノ酸と相互作用する十分な確率を有することを示す。それらのアミノ酸位置ではアクセプター免疫グロブリンアミノ酸よりむしろドナー免疫グロブリンアミノ酸を選択しうる。この基準によるアミノ酸は、一般に、ＣＤＲ中の何らかの原子の約３オングストローム単位（Å）以内に側鎖原子を有することができ、そして、上に列挙されたもののような確立した化学力によりＣＤＲ原子と相互作用し得る原子を含有しなければならない。
【０１３５】
水素結合を形成しうる原子の場合には、３Åがそれらの核間で測定されるが、しかし、結合を形成しない原子については、３Åはそれらのファンデルワールス表面間で測定される。これ故に、後者の場合、核は相互作用することが可能と考えられる原子について約６Å（３Å＋ファンデルワールス半径の総和）以内になければならない。多くの場合、核は４若しくは５から６Åまで離れていることができる。あるアミノ酸がＣＤＲと相互作用し
得るかどうかの決定において、Ｈ鎖ＣＤＲ２の最後の８アミノ酸をＣＤＲの一部とみなさないことが好ましい。構造の見地からはこれら８アミノ酸はフレームワークの一部としてより多く挙動するためである。
【０１３６】
ＣＤＲ中のアミノ酸と相互作用することが可能であるアミノ酸をなお別の方法で同定しうる。各フレームワークアミノ酸の溶媒到達可能な表面積は２方法、すなわち（１）無傷の抗体、および（２）そのＣＤＲを除去した抗体よりなる仮想分子で計算する。約１０平方オングストローム若しくはそれ以上のこれらの数の間の差違は、フレームワークアミノ酸の溶媒への到達がＣＤＲにより少なくとも部分的に阻害されること、および従って該アミノ酸はＣＤＲと接触していることを示す。アミノ酸の溶媒到達可能な表面積は、当該技術分野で既知のアルゴリズム（例えばＣｏｎｎｏｌｌｙ、Ｊ．Ａｐｐｌｙ．Ｃｒｙｓｔ．１６：５４８（１９８３）およびＬｅｅとＲｉｃｈａｒｄｓ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：３７９（１９７１）（それらの双方は引用することにより本明細書に組み込まれる））を使用して、抗体の三次元モデルに基づき計算しうる。フレームワークアミノ酸は、ときに、別のフレームワークアミノ酸（ＣＤＲに順に接触する）のコンホメ―ションに影響を及ぼすことにより、ＣＤＲと間接的にもまた相互作用しうる。
【０１３７】
フレームワーク中の数個の位置のアミノ酸は、多くの抗体でＣＤＲ確認を決定するのに重要（例えばＣＤＲと相互作用することが可能）であることが既知である（ＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋ、上記、Ｃｈｏｔｈｉａら、上記およびＴｒａｍｏｎｔａｎｏら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：１７５（１９９０）（それらの全部は引用することにより本明細書に組み込まれる））。これらの著者らは、数種の既知の抗体の構造の分析によりＣＤＲコンホメーションに重要な保存されたフレームワーク残基を同定した。分析した抗体は、ＣＤＲのコンホメーションに基づき、制限された数の構造若しくは「正準」分類に属した。正準分類のメンバー内の保存されたフレームワーク残基は「正準」残基と称される。正準残基は、Ｌ鎖の残基２、２５、２９、３０、３３、４８、６４、７１、９０、９４および９５、ならびにＨ鎖の残基２４、２６、２９、３４、５４、５５、７１および９４を包含する。付加的な残基（例えばＣＤＲ構造決定残基）は、ＭａｒｔｉｎとＴｈｏｒｔｏｎ（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：８００の方法論に従って同定し得る。注目すべきことに、Ｌ鎖の位置２、４８、６４および７１ならびにＨ鎖の２６−３０、７１および９４のアミノ酸（Ｋａｂａｔによる番号付け）は、多くの抗体中でＣＤＲと相互作用することが可能であることが既知である。Ｌ鎖の位置３５ならびにＨ鎖の９３および１０３のアミノ酸もまたＣＤＲと相互作用することがありそうである。ＣＤＲのコンホメーションを遂げうる付加的な残基は、ＦｏｏｔｅとＷｉｎｔｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７の方法論に従って同定し得る。こうした残基は「バーニア」残基と命名され、そしてＣＤＲのすぐ下の（すなわちその下の「基盤」を形成する）フレームワーク領域中の残基である。全部のこれらの番号付けられた位置で、ヒト化免疫グロブリン中にあるべきアクセプターアミノ酸よりむしろドナーアミノ酸（それらが異なる場合）の選択が好ましい。他方、Ｌ鎖の最初の５アミノ酸のようなＣＤＲ領域と相互作用することが可能なある残基を、ときに、ヒト化免疫グロブリンでの親和性の喪失を伴わずにアクセプター免疫グロブリンから選ぶことができる。
【０１３８】
「ＶＬ−ＶＨ界面に参画する」残基若しくは「充填残基」は、例えばＮｏｖｏｔｎｙとＨａｂｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：４５９２−６６（１９８５）若しくはＣｈｏｔｈｉａら、上記により定義されるところのＶＬとＶＨの間の界面の残基を包含する。一般に、まれな充填残基は、それらがヒトフレームワーク中のものと異なる場合はヒト化抗体中で保持されなければならない。
【０１３９】
一般に、上の基準を満足するアミノ酸の１個若しくはそれ以上を置換し得る。いくつかの態様において、上の基準を満足するアミノ酸の全部若しくは大部分を置換する。ときに
、特定の１アミノ酸が上の基準を満足するかどうかについて若干のあいまいさが存在し、そして、代替のバリアント免疫グロブリンが製造され、その一方はその特定の置換を有し、その他方は有しない。そのように製造された代替のバリアント免疫グロブリンを、本明細書に記述されるアッセイのいずれかで所望の活性について試験し得、そして好ましい免疫グロブリンを選択し得る。
【０１４０】
通常、ヒト化抗体中のＣＤＲ領域は、ドナー抗体の対応するＣＤＲ領域に実質的に同一、そしてより通常は同一である。しかしながら、ある態様において、抗体の抗原結合特異性を改変しかつ／若しくは該抗体の免疫原性を低下させるように、１個若しくはそれ以上のＣＤＲ領域を改変することが望ましいことができる。典型的には、理想化された結合定数が達成されるような、より好都合な結合オン速度（ｏｎ−ｒａｔｅ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ）、より好都合な結合オフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ）、若しくは双方を達成するように結合を改変するようにＣＤＲの１個若しくはそれ以上の残基を変える。この戦略を使用して、例えば１０１０Ｍ−１若しくはそれ以上の超高結合親和性を有する抗体を達成し得る。簡潔には、ドナーＣＤＲ配列は基礎配列と称され、それから１個若しくはそれ以上の残基をその後変える。本明細書に記述されるところの親和性成熟技術を使用してＣＤＲ領域（１個若しくは複数）を変えることができ、次いで生じる結合分子を結合の所望の変化についてスクリーニングし得る。該方法は、潜在的なヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答が最小化若しくは回避されるようなより少なく免疫原性であるようにドナーＣＤＲ、典型的にはマウスＣＤＲを変えるのにもまた使用しうる。従って、ＣＤＲ（１個若しくは複数）が変えられる際に、最良の組合せられた結合および低免疫原性について至適化された抗体が達成されるような、結合親和性ならびに免疫原性の変化をモニターかつ評価し得る（例えば、米国特許第６，６５６，４６７号および米国特許公開第ＵＳ２００２０１６４３２６Ａ１号明細書を参照されたい）。
【０１４１】
別のアプローチにおいて、抗体のＣＤＲ領域を分析して、ドナーＣＤＲのそれぞれをヒト対照物で系統的に置換することにより、各個々のＣＤＲの抗体結合および／若しくは免疫原性への寄与を決定する。ヒト化抗体の得られた一団をその後、各ＣＤＲの抗原親和性および潜在的免疫原性について評価する。こうして、候補の結合分子の２種の臨床上重要な特性すなわち抗原結合および低免疫原性を測定する。対応するマウス若しくはＣＤＲグラフト（ヒト化）形態の抗体に対する患者血清が入手可能である場合には、系統的ヒトＣＤＲ交換を表す抗体の一団全体をスクリーニングして、各ドナーＣＤＲに対する患者の抗イディオタイプ応答を決定し得る（技術的詳細については、例えばＩｗａｓｈｉら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１０７９−９１（１９９９）を参照されたい。こうしたアプローチは、必須でないドナーＣＤＲから必須のドナーＣＤＲ領域を同定することを見込む。必須でないドナーＣＤＲ領域をその後ヒト対照物ＣＤＲと交換しうる。機能の許容できない喪失を伴わずに必須のＣＤＲ領域を交換し得ない場合は、ＣＤＲの特異性決定残基（ＳＤＲ）の同定を、例えば部位特異的突然変異誘発により実施する。こうして、ＣＤＲをその後、ＳＤＲのみ保持しかつＣＤＲ全体の残存するアミノ酸位置でヒトおよび／若しくは最小限に免疫原性であるように再工作し得る。ドナーＣＤＲの一部分のみがグラフトされるこうしたアプローチはまた簡略化ＣＤＲグラフトとも称される（前述の技術に関する技術的詳細については、例えばＴａｍｕｒａら、Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６４（３）：１４３２−４１．（２０００）；Ｇｏｎｚａｌｅｓら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４０：３３７−３４９（２００３）；Ｋａｓｈｍｉｒｉら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３８：３−１６（２００１）；およびＤｅ  Ｐａｓｃａｌｉｓら、Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６９（６）：３０７６−８４．（２００２）を参照されたい。
【０１４２】
さらに、生じるヒト化免疫グロブリンの結合親和性に認識可能に影響を及ぼすことなくＣＤＲ残基の１個若しくはそれ以上の保存的アミノ酸置換を行うことがときに可能である
。保存的置換により、ｇｌｙ、ａｌａ；ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；ａｓｐ、ｇｌｕ；ａｓｎ、ｇｌｎ；ｓｅｒ、ｔｈｒ；ｌｙｓ、ａｒｇ；およびｐｈｅ、ｔｙｒのような組合せを意図している。
【０１４３】
置換の付加的な候補は、その位置でヒト免疫グロブリンに「まれ」であるアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。これらのアミノ酸は、マウスドナー抗体の同等の位置、若しくはより典型的なヒト免疫グロブリンの同等の位置からのアミノ酸で置換し得る。例えば、アクセプター免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域中のアミノ酸がその位置にまれでありかつドナー免疫グロブリン中の対応するアミノ酸がヒト免疫グロブリン配列中のその位置に普遍的である場合；または、アクセプター免疫グロブリン中のアミノ酸がその位置にまれでありかつドナー免疫グロブリン中の対応するアミノ酸もまた他のヒト配列に関してまれである場合は、置換が望ましいことがある。残基がアクセプターヒトフレームワーク配列にまれであるかどうかは、戻し突然変異のための残基をＣＤＲコンホメーションへの寄与に基づき選択する場合にもまた考慮すべきである。例えば、戻し突然変異がアクセプターヒトフレームワーク配列にまれである残基の置換をもたらす場合、ヒト化抗体を活性についてを伴いおよび伴わず試験しうる。戻し突然変異が活性に必要でない場合は、免疫原性の懸念を低下させるためにそれを除外しうる。例えば、以下の残基での戻し突然変異は、アクセプターヒトフレームワーク配列中でまれである残基を導入しうる；ｖｌ＝Ｖ２（２．０％）、Ｌ３（０．４％）、Ｔ７（１．８％）、Ｑ１８（０．２％）、Ｌ８３（１．２％）、Ｉ８５（２．９％）、Ａ１００（０．３％）およびＬ１０６（１．１％）；ならびにｖｈ＝Ｔ３（２．０％）、Ｋ５（１．８％）、Ｉ１１（０．２％）、Ｓ２３（１．５％）、Ｆ２４（１．５％）、Ｓ４１（２．３％）、Ｋ７１（２．４％）、Ｒ７５（１．４％）、Ｉ８２（１．４％）、Ｄ８３（２．２％）およびＬ１０９（０．８％）。これらの基準は、ヒトフレームワーク中の異常なアミノ酸が抗体構造を破壊しないことを確実にするのに役立つ。さらに、まれなヒトアクセプターアミノ酸をヒト抗体にたまたま典型的であるドナー抗体からのアミノ酸で置換することにより、ヒト化抗体をより少なく免疫原性にしうる。
【０１４４】
本明細書で使用されるところの「まれな」という用語は、配列の代表的なサンプル中の配列の約２０％未満、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満、なおより好ましくは約３％未満、なおより好ましくは約２％未満、およびなおより好ましくは約１％未満でその位置に存在するアミノ酸を示し、また、本明細書で使用されるところの「普遍的な」という用語は、代表的サンプル中の配列の約２５％以上、しかし通常は約５０％以上に存在するアミノ酸を示す。例えば、ヒトアクセプター配列中のあるアミノ酸が「まれ」であるか若しくは「普遍的」であるかを決定する場合、ヒト可変領域配列のみを、また、あるマウスアミノ酸が「まれ」であるか若しくは「普遍的」であるかを決定する場合はマウス可変領域配列のみを考えることがしばしば好ましいことができる。さらに、全部のヒトＬおよびＨ鎖可変領域配列はそれぞれ、相互にとりわけ相同でありかつある決定的な位置で同一アミノ酸を有する、配列の「サブグループ」にグループ分けされる（Ｋａｂａｔら、上記）。ヒトアクセプター配列中のあるアミノ酸がヒト配列のなかで「まれ」であるか若しくは「普遍的」であるかを決定する場合、同一サブグループ中のそれらのヒト配列のみをアクセプター配列とみなすことがしばしば好ましいことができる。
【０１４５】
置換の付加的な候補は、Ｃｈｏｔｈｉａら、上記により提案された代替の定義のもとでＣＤＲ領域の一部と同定されるとみられるアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。置換の付加的な候補は、ＡｂＭおよび／若しくは接触の定義のもとでＣＤＲ領域の一部と同定されるとみられるアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。
【０１４６】
置換の付加的な候補は、まれなドナーフレームワーク残基に対応するアクセプターフレームワーク残基である。まれなドナーフレームワーク残基は、その位置でマウス抗体に（
本明細書で定義されるところの）まれであるものである。マウス抗体について、サブグループをＫａｂａｔに従って決定し得、そしてコンセンサスと異なる残基位置を同定し得る。これらのドナー特異的な差違は、活性を高めるマウス配列中の体細胞突然変異を指摘しうる。結合に影響を及ぼすことが予測されるまれな残基（例えば充填正準および／若しくはバーニア残基）は保持される一方、結合に重要でないことが予測される残基は置換し得る。１２Ａ１１  ｖ１配列内のまれな残基はＩ８５（３．６％）を包含する。１２Ａ１１
ｖｈ配列内のまれな残基は、Ｔ３（１．０％）、Ｉ１１（１．７％）、Ｌ１２（１．７％）、Ｓ４１（２．８％）、Ｄ８３（１．８％）およびＡ８５（１．８％）を包含する。
【０１４７】
置換の付加的な候補は、アクセプターフレームワーク領域に存在する非生殖系列残基である。例えば、アクセプター抗体鎖（すなわちドナー抗体鎖と有意の配列同一性を共有するヒト抗体鎖）を生殖系列抗体鎖（同様にドナー鎖と有意の配列同一性を共有する）と整列する場合、アクセプター鎖のフレームワークと生殖系列鎖のフレームワークの間で一致しない残基を、生殖系列配列からの対応する残基で置換し得る。
【０１４８】
上で論考された特定のアミノ酸置換以外に、ヒト化免疫グロブリンのフレームワーク領域は、それらが由来したヒト抗体のフレームワーク領域に通常は実質的に同一、およびより通常は同一である。もちろん、フレームワーク領域中のアミノ酸の多くは、抗体の特異性若しくは親和性に対する直接の寄与をほとんど若しくはまったくなさない。従って、フレームワーク残基の多くの個別の保存的置換は、生じるヒト化免疫グロブリンの特異性若しくは親和性の認識可能な変化を伴わずに耐えら得る。従って、一態様において、ヒト化免疫グロブリンの可変フレームワーク領域は、ヒト可変フレームワーク領域配列若しくはこうした配列のコンセンサスに対する最低８５％の配列同一性を共有する。別の態様において、ヒト化免疫グロブリンの可変フレームワーク領域は、ヒト可変フレームワーク領域配列若しくはこうした配列のコンセンサスに対する最低９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を共有する。しかしながら一般にこうした置換は望ましくない。
【０１４９】
例示的態様において、本発明のヒト化抗体は最低１０７、１０８、１０９若しくは１０１０Ｍ−１の抗原に対する特異的結合親和性を表す。他の態様において、本発明の抗体は最低１０１０、１０１１若しくは１０１２Ｍ−１の結合親和性を有し得る。通常、抗原に対するヒト化抗体の結合親和性の上限は、ドナー免疫グロブリンのものの３、４若しくは５の係数内である。しばしば、結合親和性の下限もまたドナー免疫グロブリンのものの３、４若しくは５の係数内にある。あるいは、結合親和性は、置換を有しないヒト化抗体（例えばドナーＣＤＲおよびアクセプターＦＲを有するがしかしＦＲ置換を有しない抗体）のものと比較し得る。こうした場合は、（置換で）至適化された抗体の結合は、好ましくは未置換の抗体のものより最低２ないし３倍より大きいか、若しくは３ないし４倍より大きい。比較を行うため、多様な抗体の活性を例えばＢＩＡＣＯＲＥ（すなわち未標識試薬を使用する表面プラスモン共鳴）若しくは競合結合アッセイにより測定し得る。
【０１５０】
一態様において、本発明の開示のヒト化抗体は、ヒト化される対応するヒト以外の抗体（例えばマウス）の正準ＣＤＲ構造型に同一若しくは類似である１種若しくはそれ以上のＣＤＲ構造型を包含する、ヒト抗体遺伝子（例えば生殖系列抗体遺伝子セグメント）から選択された可変領域フレームワーク配列を包含する。米国特許第６，８８１，５５７号明細書およびＴａｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：１１１９−１１２５（２００２）（全部の目的上そっくりそのまま引用することにより組み込まれる）を参照されたい。
【０１５１】
例えば米国特許第６，３００，０６４号明細書（全部の目的上そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるところのコンセンサスアミノ酸配列
を有するフレームワーク領域を含んでなるヒト化抗体もまた特徴とする。以下の表は、本明細書に記述されるヒト化抗体でフレームワーク領域として使用し得る多様なコンセンサス配列を列挙する。従って、下に示されるコンセンサス配列のいずれか１つを、本明細書に記述される１個若しくはそれ以上のＣＤＲと組合せでのように使用して、それにより本発明のヒト化免疫グロブリンすなわちヒト化抗体をもたらし得る。
【０１５２】
【表１】
2008523815.tif 000003
【０１５３】
【表２】
2008523815.tif 000004
【０１５４】
本発明のヒト化抗体を製造するのに使用し得るなお別の戦略は、ヒト化されるべきマウス抗体からのＣＤＲを受領するフレームワークとして最も近いヒト生殖配列を選択することである。Ｍｅｒｃｋｅｎら、第ＵＳ  ２００５／０１２９６９５号明細書（全部の目的上そっくりそのまま引用することにより組み込まれる）を参照されたい。生殖系列配列は、再配列されない免疫グロブリン遺伝子から発し、そして従って潜在的に免疫原性である体細胞高頻度変異を提示しない。このアプローチは最も近いヒト生殖系列配列の検索に基づく。とりわけ、マウスＶＬおよびＶＨフレームワーク領域との高程度の配列同一性を表す生殖系列配列からの可変ドメインを、Ｖ−Ｂａｓｅおよび／若しくはＩＭＧＴデータベース（それぞれ、医学研究協議会タンパク質工学センター（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）のインターネットサーバおよび欧州生物情報学研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のインターネットサーバを通じ公的にアクセス可能）を使用して同定し得る。マウスＣＤＲをその後、選ばれたヒト生殖系列可変領域アクセプター配列にグラフトする。
【０１５５】
本発明の免疫グロブリンをヒト化するのに使用し得る付加的な例示的ヒト化技術は、例えば、Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２６２３−２６３２（１９９３）；Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、８９：４２８５−４２８９（１９９２）；Ｃｏｕｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５５：５９７３ｓ−７７ｓ（１９９５）；Ｏ’Ｃｏｎｎｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、１１：３２１−３２８（１９９８）；およびＬｏによるＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｖｏｌ．２４８（２００４）に記述されている。
【０１５６】
加えて、上述されたところの技術のいずれかを使用してフレームワーク残基を分析して、生じるヒト化抗体の特性を至適化するためにどの残基（あれば）を置換すべきかを決定し得る。例えば、コンピュータモデル化を使用して、抗原結合に直接若しくは間接的に影響する十分な確率を有する残基を同定し得る。
【０１５７】
ｃ．ヒト化１２Ａ１１抗体の製造
本発明の好ましい一態様は、とりわけ本明細書に記述される治療および／若しくは診断の方法論での使用のためのＡβのＮ末端に対するヒト化抗体を特徴とする。ヒト化抗体の製造のためのとりわけ好ましい出発原料はモノクローナル抗体１２Ａ１１である。１２Ａ
１１はＡβのＮ末端に特異的であり、そして（１）凝集型Ａβ１−４２に対する高親和性を有し、（２）可溶性Ａβを捕捉する能力を有し、および（３）アミロイド斑の食作用を媒介（すなわち食作用を誘導）することが示されている（実施例１を参照されたい）。１２Ａ１１抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を実施例２に記述する。１２Ａ１１抗体ＨおよびＬ鎖可変領域をコードするｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定を実施例３に記述する。
【０１５８】
適するヒトアクセプター抗体配列は、マウス可変領域のアミノ酸配列の既知のヒト抗体の配列とのコンピュータ比較により同定する。該比較はＨおよびＬ鎖について別個に実施するが、しかし原理はそれぞれについて同様である。とりわけ、フレームワーク配列がマウスＶＬおよびＶＨフレームワーク領域との高程度の配列同一性を表すヒト抗体からの可変ドメインを、例えばそれぞれのマウスフレームワーク配列でのＮＣＢＩ  ＩｇＧ  ＢＬＡＳＴ（国立保健研究所（Ｎａｔｉｏａｎｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）のＮＣＢＩインターネットサーバを通じ公的にアクセス可能）を使用するＫａｂａｔデータベース若しくはＩｇＧタンパク質配列データベースのクエリにより同定する。一態様において、マウスドナー配列、例えばドナーフレームワーク（ＦＲ）配列と５０％以上の配列同一性を共有するアクセプター配列を選択する。好ましくは、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の配列同一性若しくはそれ以上を共有するアクセプター抗体配列を選択する。
【０１５９】
１２Ａ１１のコンピュータ比較は、１２Ａ１１  Ｌ鎖（マウスサブグループＩＩ）が、Ｋａｂａｔら、上記により定義されるところのサブタイプκＩＩのヒトＬ鎖に対する最大の配列同一性を示すこと、および１２Ａ１１  Ｈ鎖（マウスサブグループＩｂ）が、サブタイプＩＩのヒトＨ鎖に対する最大の配列同一性を示すことを示した。ＬおよびＨヒトフレームワーク領域は、これらのサブタイプのヒト抗体若しくはこうしたサブタイプのコンセンサス配列に由来し得る。第一のヒト化の試みにおいて、Ｌ鎖可変フレームワーク領域はヒトサブグループＩＩ抗体に由来した。ヒトサブグループＩＩ抗体由来のＨ鎖可変フレームワーク領域を有するヒト化抗体の高レベルの発現を達成するよう設計された以前の実験に基づき、こうした抗体の発現レベルがときに低かったことが発見された。従って、Ｓａｌｄａｎｈａら（１９９９）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：７０９−１９に記述される論法に基づき、ヒトサブグループＩＩよりむしろヒトサブグループＩＩＩ抗体由来のフレームワーク領域を選んだ。
【０１６０】
ヒトサブグループＩＩ抗体Ｋ６４（ＡＩＭＳ４）（受託番号ＢＡＣ０１７３３）は、１２Ａ１１のＬ鎖可変領域内で有意の配列同一性を有するＮＣＢＩの非重複性データベースから同定した。ヒトサブグループＩＩＩ抗体Ｍ７２（受託番号ＡＡＡ６９７３４）は、１２Ａ１１のＨ鎖可変領域内で有意の配列同一性を有するＮＣＢＩの非重複性データベースから同定した（ＳｃｈｒｏｅｄｅｒとＷａｎｇ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７２：６１４６−６１５０もまた参照されたい。
【０１６１】
代替のＬ鎖アクセプター配列は、例えば、ＰＤＢ受託番号１ＫＦＡ（ｇｉ２４１５８７８２）、ＰＤＢ受託番号１ＫＦＡ（ｇｉ２４１５８７８４）、ＥＭＢＬ受託番号ＣＡＥ７５５７４．１（ｇｉ３８５２２５８７）、ＥＭＢＬ受託番号ＣＡＥ７５５７５．１（ｇｉ３８５２２５９０）、ＥＭＢＬ受託番号ＣＡＥ８４９５２．１（ｇｉ３９８３８８９１）、ＤＪＢ受託番号ＢＡＣ０１７３４．１（ｇｉ２１６６９４１９）、ＤＪＢ受託番号ＢＡＣ０１７３０．１（ｇｉ２１６６９４１１）、ＰＩＲ受託番号Ｓ４０３１２（ｇｉ４８１９７８）、ＥＭＢＬ受託番号ＣＡＡ５１０９０．１（ｇｉ３９８０１１８）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＨ６３５９９．１（ｇｉ３９７９４３０８）、ＰＩＲ受託番号Ｓ２２９０２（ｇｉ１０６５４０）、ＰＩＲ受託番号Ｓ４２６１１（ｇｉ６３１２１５）、ＥＭＢＬ受託番号ＣＡＡ３８０７２．１（ｇｉ４３３８９０）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＤ００８５６．１（ｇｉ４１００３８４）、ＥＭＢＬ受託番号ＣＡＡ３９０７２．１（ｇｉ
３４０００）、ＰＩＲ受託番号Ｓ２３２３０（ｇｉ２８４２５６）、ＤＢＪ受託番号ＢＡＣ０１５９９．１（ｇｉ２１６６９１４９）、ＤＢＪ受託番号ＢＡＣ０１７２９．１（ｇｉ２１６６９４０９）、ＤＢＪ受託番号ＢＡＣ０１５６２．１（ｇｉ２１６６９０７５）、ＥＭＢＬ受託番号ＣＡＡ８５５９０．１（ｇｉ５８７３３８）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＱ９９２４３．１（ｇｉ３７６９４６６５）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＫ９４８１１．１（ｇｉ１８０２５６０４）、ＥＭＢＬ受託番号ＣＡＢ５１２９７．１（ｇｉ５５７８７９４）、ＤＢＪ受託番号ＢＡＣ０１７４０．１（ｇｉ２１６６９４３１）およびＤＢＪ受託番号ＢＡＣ０１７３３．１（ｇｉ２１６６９４１７）を包含する。代替のＨ鎖アクセプター配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ３５００９．１（ｇｉ１０４１８８５）、ＤＢＪ受託番号ＢＡＣ０１９０４．１（ｇｉ２１６６９７８９）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＤ５３８１６．１（ｇｉ５８３４１００）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＳ８６０８１．１（ｇｉ４６２５４２２３）、ＤＢＪ受託番号ＢＡＣ０１４６２．１（ｇｉ２１６６８８７０）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ１８１９１．１（ｇｉ３１７０７７３）、ＤＢＪ受託番号ＢＡＣ０２２６６．１（ｇｉ２１６７０５１３）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＤ５６２５４．１（ｇｉ５９２１５８９）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＤ５３８０７．１（ｇｉ５８３４０８２）、ＤＢＪ受託番号ＢＡＣ０２２６０．１（ｇｉ２１６７０５０１）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ１８１６６．１（ｇｉ３１７０７２３）、ＥＭＢＬ受託番号ＣＡＡ４９４９５．１（ｇｉ３３０８５）、ＰＩＲ受託番号Ｓ３１５１３（ｇｉ３４５９０３）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＳ８６０７９．１（ｇｉ４６２５４２１９）、ＤＢＪ受託番号ＢＡＣ０１９１７．１（ｇｉ２１６６９８１５）、ＤＢＪ受託番号ＢＡＣ０１９１２．１（ｇｉ２１６６９８０５）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ１８２８３．１（ｇｉ３１７０９６１）、ＤＢＪ受託番号ＢＡＣ０１９０３（ｇｉ２１６６９７８７）、ＤＢＪ受託番号ＢＡＣ０１８８７．１（ｇｉ２１６６９７５５）、ＤＢＪ受託番号ＢＡＣ０２２５９．１（ｇｉ２１３７０４９９）、ＤＢＪ受託番号ＢＡＣ０１９１３．１（ｇｉ２１６６９８０７）、ＤＢＪ受託番号ＢＡＣ０１９１０．１（ｇｉ２１６６９８０１）、ＤＪＢ受託番号ＢＡＣ０２２６７．１（ｇｉ２１６７０５１５）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ１８３０６．１（ｇｉ３１７１０１１）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＤ５３８１７．１（ｇｉ５８３４１０２）、ＰＩＲ受託番号Ｅ３６００５（ｇｉ１０６４２３）、ＥＭＢＬ  ＣＡＢ３７１２９．１（ｇｉ４４５６４９４）およびＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＡ６８８９２．１（ｇｉ１８６１９０）を包含する。
【０１６２】
例示的態様において、本発明のヒト化抗体は１２Ａ１１  ＣＤＲおよび上に列挙されるアクセプター配列からのＦＲを包含する。本明細書に記述されるところのＣＤＲのコンホメーションおよび／若しくは活性に重要なフレームワーク領域内の残基を戻し突然変異に選択する（ドナー配列とアクセプター配列の間で異なる場合）。
【０１６３】
次に、後に続くとおり残基を置換のため選択する。アミノ酸が１２Ａ１１可変フレームワーク領域と同等のヒト可変フレームワーク領域の間で異なる場合、ヒトフレームワークアミノ酸は、通常、該アミノ酸が：
（１）抗原を直接非共有結合するか、
（２）ＣＤＲ領域に隣接するか、Ｃｈｏｔｈｉａら、上記により提案された代替の定義のもとでＣＤＲ領域の一部であるか、若しくはＣＤＲ領域と別の方法で相互作用する（例えばＣＤＲ領域の約３Ａ以内である）か、または
（３）ＶＬ−ＶＨ界面に参画する
ことが合理的に期待される場合は、同等のマウスアミノ酸により置換すべきである。
【０１６４】
１２Ａ１１抗体ＨおよびＬ鎖可変領域の構造解析、ならびに１２Ａ１１抗体のヒト化を実施例６に記述する。簡潔には、Ｌ鎖について解明されたマウス抗体構造１ＫＴＲならびにＨ鎖について１ＪＲＨおよび１ＥＴＺの三次元モデルを研究した。ＣＤＲコンホメーションに重要な残基（例えばバーニア残基）の同定のため研究し得る代替の三次元モデルは
、Ｌ鎖について、ＰＤＢ受託番号２ＪＥＬ（ｇｉ３２１２６８８）、ＰＤＢ受託番号１ＴＥＴ（ｇｉ４９４６３９）、ＰＤＢ受託番号ＩＪＰ５（ｇｉ１６９７５３０７）、ＰＤＢ受託番号１ＣＢＶ（ｇｉ４９３９１７）、ＰＤＢ受託番号２ＰＣＰ（ｇｉ４３８８９４３）、ＰＤＢ受託番号１Ｉ９Ｉ（ｇｉ２０５０１１８）、ＰＤＢ受託番号１ＣＬＺ（ｇｉ１８２７９２６）、ＰＤＢ受託番号１ＦＬ６（ｇｉ１７９４２６１５）およびＰＤＢ受託番号１ＫＥＬ（ｇｉ１９４２９６８）、ならびにＨ鎖についてＰＤＢ  １ＧＧＩ（ｇｉ４４２９３８）、ＰＤＢ受託番号１ＧＧＢ（ｇｉ４４２９３４）、ＰＤＢ受託番号１Ｎ５Ｙ（ｇｉ２８３７３９１３）、ＰＤＢ受託番号２ＨＭＩ（ｇｉ３８９１８２１）、ＰＤＢ受託番号１ＦＤＬ（ｇｉ２２９９１５）、ＰＤＢ受託番号１ＫＩＰ（ｇｉ１９４２７８８）、ＰＤＢ受託番号１ＫＩＱ（ｇｉ１９４２７９１）およびＰＤＢ受託番号１ＶＦＡ（ｇｉ５７６３２５）を包含する。
【０１６５】
本明細書に記述される抗体の三次元構造情報は、例えば構造バイオインフォマティクス共同機構（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）のタンパク質データバンク（ＰＤＢ）から公的に入手可能である。該ＰＤＢはワールドワイドウェブのインターネットを介して無料でアクセス可能であり、そしてＢｅｒｍａｎら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２８：２３５に記述されている。解明された三次元構造の研究は１２Ａ１１内のＣＤＲと相互作用する残基の同定を見込む。あるいは、コンピュータモデル化ソフトウェアを使用して、１２Ａ１１のＶＨおよびＶＬ鎖の三次元モデルを生成し得る。簡潔には、ＨおよびＬ鎖について最も近い解明されたマウス抗体構造に基づき三次元モデルを生成する。この目的上、１ＫＴＲを１２Ａ１１  Ｌ鎖をモデル化するための鋳型として使用し得、また、１ＥＴＺおよび１ＪＲＨをＨ鎖をモデル化するための鋳型として使用し得る。モデルは、不都合な原子接触を軽減しかつ静電およびファンデルワールス相互作用を至適化するための一連のエネルギー最小化段階によりさらに改良し得る。付加的な三次元分析および／若しくはモデル化を、これらの解明されたマウス構造とそれぞれの１２Ａ１１鎖の間の類似性に基づき、Ｌ鎖について２ＪＥＬ（２．５Å）および／若しくは１ＴＥＴ（２．３Å）ならびにＨ鎖について１ＧＧＩ（２．８Å）（または上で示された他の抗体）を使用して実施し得る。
【０１６６】
１２Ａ１１の構造のコンピュータモデルは、さらに、ヒトフレームワーク構造で置換した１２Ａ１１相補性決定領域を含有する抗体の三次元構造を予測するための出発点としてはたらき得る。さらなるアミノ酸置換が導入される際に該構造を表す付加的なモデルを構築し得る。
【０１６７】
一般に、上の基準を満たすアミノ酸の１個、大部分若しくは全部の置換が望ましい。従って、本発明のヒト化抗体は、通常、選ばれた位置の最低１、２、３個若しくはそれ以上に、対応する１２Ａ１１残基でのヒトＬ鎖フレームワーク残基の置換を含有することができる。ヒト化抗体は、通常、選ばれた位置の最低１、２、３個若しくはそれ以上に、対応する１２Ａ１１残基でのヒトＨ鎖フレームワーク残基の置換もまた含有する。
【０１６８】
しかしながら、ときに、特定のアミノ酸が上の基準に合致するかどうかについて若干のあいまいさが存在し、そして代替のバリアント免疫グロブリンが製造され、その一方はその特定の置換を有し、その他方は有しない。マウス残基での置換が、特定の一位置にヒト免疫グロブリンでまれである残基を導入するとみられる場合は、該抗体を該特定の置換を伴い若しくは伴わず活性について試験することが望ましいことができる。活性（例えば結合親和性および／若しくは結合特異性）が置換を伴い若しくは伴わずほぼ同一である場合は、置換を伴わない抗体が好ましいことができる。本明細書に記述されるとおりより少ないＨＡＨＡ応答を導き出すことが期待されるとみられるためである。
【０１６９】
置換の他の候補は、その位置でヒト免疫グロブリンにまれであるアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。これらのアミノ酸は、より典型的なヒト免疫グロブリンの同等の位置からのアミノ酸で置換し得る。あるいは、マウス１２Ａ１１中の同等の位置からのアミノ酸を、こうしたアミノ酸が該同等の位置でヒト免疫グロブリンに典型的である場合にヒトフレームワーク領域に導入し得る。
【０１７０】
置換の他の候補はフレームワーク領域に存在する非生殖系列残基である。既知の生殖系列配列との１２Ａ１１のコンピュータ比較を実施することにより、Ｈ若しくはＬ鎖に対する最大の程度の配列同一性をもつ生殖系列配列を同定し得る。フレームワーク領域および生殖系列配列のアライメントは、対応する生殖系列残基での置換にどの残基を選択しうるかを示すことができる。選択したＬ鎖アクセプターフレームワークとこれらの生殖系列配列の１種の間で一致しない残基を、対応する生殖系列残基での置換に選択し得る。
【０１７１】
まれなマウス残基は、ドナーＶＬおよび／若しくはＶＨ配列が属する（Ｋａｂａｔによる）サブグループの他メンバーの配列と該ドナーＶＬおよび／若しくはＶＨ配列を比較すること、ならびにコンセンサスと異なる残基位置を同定することにより同定する。これらのドナー特異的差違が、活性を増強する体細胞突然変異を指摘しうる。結合部位に近接のまれな残基はおそらく抗原を接触することができ、該マウス残基を保持することを望ましくする。しかしながら、該まれなマウス残基が結合に重要でない場合、対応するアクセプター残基の使用が好ましい。該マウス残基がヒト化抗体中に免疫原性の新エピトープを創製しうるためである。ドナー配列中のまれな残基が対応するアクセプター配列中で実際には普遍的な残基である状況では、好ましい残基は明らかにアクセプター残基である。
【０１７２】
表１は１２Ａ１１のＶＨおよびＶＬ領域の配列分析を要約する。
【０１７３】
【表３】
2008523815.tif 000005
【０１７４】
アミノ酸置換の選択において使用し得る生殖系列配列を示す。
【０１７５】
本明細書に記述される抗体の三次元構造情報は、例えば構造バイオインフォマティクス共同機構（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）のタンパク質データバンク（ＰＤＢ）から公的に入手可能である。該ＰＤＢはワールドワイドウェブのインターネットを介して無料でアクセス可能であり、そしてＢｅｒｍａｎら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｐ２３５−２４２に記述されている。本明細書で参照される生殖系列遺伝子配列は、例えば、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）のＩｇｈ、ＩｇκおよびＩｇλ生殖系列Ｖ遺伝子の集合物中の配列のデータベース（国立保健研究所（ＮＩＨ）の国立医学図書館（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（ＮＬＭ）の一部門として）から公的に入手可能である。ＮＣＢＩの「Ｉ
ｇ生殖系列遺伝子」データベースの相同性検索はＩｇＧ  ＢＬＡＳＴＴＭにより提供される。
【０１７６】
例示的一態様において、本発明のヒト化抗体は、（ｉ）マウス１２Ａ１１  ＶＬ  ＣＤＲおよびヒトアクセプターフレームワーク（該フレームワークは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくはそれ以上の残基が対応する１２Ａ１１残基で置換されている）を含んでなる可変ドメインを含んでなるＬ鎖、ならびに（ｉｉ）１２Ａ１１  ＶＨ  ＣＤＲおよびヒトアクセプターフレームワーク（該フレームワークは、最低１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくはそれ以上の残基が対応する１２Ａ１１残基で置換され、また、場合によっては最低１、好ましくは２若しくは３残基が対応するヒト生殖系列残基で置換されている）を含んでなるＨ鎖を含有する。
【０１７７】
別の例示的一態様において、本発明のヒト化抗体は、（ｉ）マウス１２Ａ１１  ＶＬ  ＣＤＲおよびヒトアクセプターフレームワークを含んでなるＬ鎖（該フレームワークは最低１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくはそれ以上の残基が戻し突然変異されており（すなわち対応する１２Ａ１１残基で置換されている）、該戻し突然変異（１個若しくは複数）は正準、充填および／若しくはバーニア残基でである）、ならびに（ｉｉ）１２Ａ１１  ＶＨ  ＣＤＲおよびヒトアクセプターフレームワークを含んでなるＨ鎖（該フレームワークは最低１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくはそれ以上の残基が戻し突然変異されており、該戻し突然変異は正準、充填および／若しくはバーニア残基でである）を含有する。ある態様において、戻し突然変異は、充填および／若しくは正準残基でのみであるか、または主として正準および／若しくは充填残基でである（例えば、ドナーとアクセプター配列の間で異なるバーニア残基の１若しくは２個のバーニア残基のみが戻し突然変異されている）。
【０１７８】
他の態様において、ヒト化抗体は、ドナー抗体（若しくはそのキメラバージョン）の結合親和性に匹敵する結合親和性を保持しつつ可能な最少数の戻し突然変異を包含する。こうしたバージョンに到着するため、戻し突然変異の多様な組合せを除外し得、そして生じる抗体を有効性（例えば結合親和性）について試験し得る。例えば、バーニア残基での戻し突然変異（例えば１、２、３若しくは４個の戻し突然変異）を除外し得るか、または、バーニアおよび充填、バーニアおよび正準、若しくは充填および正準残基の組合せでの戻し突然変異を除外し得る。
【０１７９】
別の態様において、本発明のヒト化抗体は、本明細書に記述されるところの構造の特徴を有し、かつ、以下の活性、すなわち（１）可溶性Ａβを結合する；（２）凝集型Ａβ１−４２を結合する（例えばＥＬＩＳＡにより測定されるとおり）；（３）可溶性Ａβを捕捉する；（４）斑中のＡβを結合する（例えばＡＤおよび／若しくはＰＤＡＰＰ斑の染色）；（５）キメラ１２Ａ１１（例えばマウス可変領域配列およびヒト定常領域配列を有する１２Ａ１１）よりせいぜい２ないし３倍より低い親和性でＡβを結合する；（６）Ａβの食作用を媒介する（例えば、本明細書に記述されるところのｅｘ  ｖｉｖｏ食作用アッセイにおける）；ならびに（７）血液脳関門を横断する（例えば、例えば本明細書に記述されるところのＰＤＡＰＰ動物モデルにおいて短期の脳局在化を示す）の最低１つ（好ましくは２、３、４若しくは全部）をさらに有する。
【０１８０】
別の態様において、本発明のヒト化抗体は、本明細書に記述されるところの構造の特徴を有し、その結果、それは以下のｉｎ  ｖｉｖｏ効果、すなわち（１）Ａβ斑負荷量を低下させる；（２）斑形成を予防する；（３）可溶性Ａβのレベルを低下させる；（４）アミロイド形成障害と関連する神経炎性の病理を低下させる；（５）アミロイド形成障害と関連する最低１種の生理学的症状を減じるか若しくは改善する；および／または（６）認知機能を改善するの最低１種を導き出すのに十分な様式若しくは親和性でＡβを結合する
。
【０１８１】
別の態様において、本発明のヒト化抗体は、本明細書に記述されるところの構造の特徴を有し、そしてＡβの残基３−７を含んでなる１エピトープに特異的に結合する。
【０１８２】
なお別の態様において、本発明のヒト化抗体は、本明細書に記述されるところの構造の特徴を有し、その結果、それはＡβ内のＮ末端エピトープに結合し（例えばＡβのアミノ酸３−７内の１エピトープに結合し）、かつ、（１）Ａβペプチドレベル；（２）Ａβ斑負荷量；および（３）アミロイド形成障害と関連する神経炎性負荷若しくは神経炎性ジストロフィーを低下させることが可能である。
【０１８３】
上述された活性は、本明細書若しくは当該技術分野で記述される多様なアッセイのいずれか１種（例えば結合アッセイ、食作用アッセイなど）を利用して測定し得る。活性は、ｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば標識したアッセイ成分および／若しくは画像化技術を使用して）またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば被験体由来のサンプル若しくは試料を使用して）のいずれでもアッセイし得る。活性は直接若しくは間接のいずれでもアッセイし得る。ある好ましい態様において、神経学的エンドポイント（例えばアミロイド負荷量、神経炎性負荷など）をアッセイする。こうしたエンドポイントは、非侵襲的検出の方法論を使用して生存被験体で（例えばアルツハイマー病の動物モデル若しくは例えば免疫療法を受けているヒト被験体で）アッセイし得る。あるいは、こうしたエンドポイントは死後の被験体でアッセイし得る。動物モデルおよび／若しくは死後のヒト被験体でこうしたエンドポイントをアッセイすることは、類似の免疫療法の応用で利用されるべき多様な剤（例えばヒト化抗体）の有効性の評価において有用である。他の好ましい態様において、行動若しくは神経学的パラメータを、上の神経病理学的活性若しくはエンドポイントの指標として評価し得る。
【０１８４】
３．可変領域の製造
ヒト化免疫グロブリンのＣＤＲおよびフレームワーク成分を概念的に選択したら、多様な方法がこうした免疫グロブリンを製造するのに利用可能である。一般に、抗体のＨおよび／若しくはＬ鎖のマウスの相補性決定領域（ＣＤＲ）の１個若しくはそれ以上をヒト化、例えばプライマーに基づくポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して１種若しくはそれ以上のヒトフレームワーク領域の情況に置くことができる。簡潔には、ヒトフレームワーク領域に重なりかつそれとアニーリングし得る配列もまた含有する標的マウスＣＤＲ領域（１個若しくは複数）にアニーリングすることが可能であるプライマーを設計する。従って、適切な条件下で、プライマーはマウスＣＤＲをマウス抗体鋳型核酸から増幅しかつ増幅した鋳型にヒトフレームワーク配列の一部分を付加し得る。同様に、これらのプライマーを使用するＰＣＲ反応が増幅されたヒトフレームワーク領域（１種若しくは複数）をもたらす標的ヒトフレームワーク領域（１種若しくは複数）にアニーリングすることが可能であるプライマーを設計し得る。各増幅産物をその後変性し、組合せかつ他の産物にアニーリングさせる場合、増幅されたヒトフレームワーク配列と重なるヒトフレームワーク配列を有するマウスＣＤＲ領域を遺伝子的に連結し得る。従って、１種若しくはそれ以上のこうした反応で、１個若しくはそれ以上のマウスＣＤＲ領域を介在するヒトフレームワーク領域に遺伝子的に連結し得る。
【０１８５】
いくつかの態様において、プライマーは、結果として生じたＰＣＲ増幅配列の、より大きな遺伝子セグメント、例えば可変Ｌ若しくはＨ鎖セグメント、Ｈ鎖またはベクターへの遺伝子工作を容易にするための所望の制限酵素認識配列もまた含みうる。加えて、マウスＣＤＲ領域若しくはヒトフレームワーク領域いずれかを増幅するのに使用されるプライマーは、異なるコドンがマウスＣＤＲ若しくはヒトフレームワーク領域に導入されているような、所望の不適正を有しうる。典型的な不適正は、本明細書に記述されるとおり、マウ
スＣＤＲの構造の向きおよび従ってその結合親和性を保存若しくは改良する変化をヒトフレームワーク領域に導入する。
【０１８６】
前述のアプローチを使用して、１、２若しくは全３個のマウスＣＤＲ領域を介在するヒトフレームワーク領域の情況に導入し得ることが理解されるべきである。プライマーに基づくＰＣＲを使用する多様な配列の増幅および連結方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈとＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；ＤＮＡ
Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ．１および２、（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編  １９８５）；ＰＣＲ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｂｅａｕｃａｇｅ編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９９）（編者）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９２）に記述されている。
【０１８７】
暗号の縮重により、多様な核酸配列が各免疫グロブリンアミノ酸配列をコードすることができる。所望の核酸配列は、新規固相ＤＮＡ合成若しくは所望のポリヌクレオチドの以前に調製されたバリアントのＰＣＲ突然変異誘発により製造し得る。オリゴヌクレオチド媒介性の突然変異誘発は、標的ポリペプチドＤＮＡの置換、欠失および挿入バリアントの好ましい製造方法である。Ａｄｅｌｍａｎら、ＤＮＡ  ２：１８３（１９８３）を参照されたい。簡潔には、標的ポリペプチドＤＮＡを、所望の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡ鋳型にハイブリダイズさせることにより変える。ハイブリダイゼーション後に、ＤＮＡポリメラーゼを使用して、該オリゴヌクレオチドプライマーを組み込みかつ標的ポリペプチドＤＮＡ中で選択された変化をコードする鋳型の完全な第二の相補鎖を合成する。
【０１８８】
４．定常領域の選択
上述されたとおり製造した抗体の可変セグメント（例えばキメラ若しくはヒト化抗体のＨおよびＬ鎖可変領域）は、典型的には免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ領域）（典型的にはヒト免疫グロブリンのもの）の少なくとも一部分に連結する。ヒト定常領域のＤＮＡ配列は多様なヒト細胞、しかし好ましくは不死化Ｂ細胞から公知の手順に従って単離し得る（Ｋａｂａｔら、上記、およびＬｉｕら、第Ｗ０８７／０２６７１号明細書（それらのそれぞれは全部の目的上そっくりそのまま引用することにより組み込まれる）を参照されたい）。通常、抗体はＬ鎖およびＨ鎖双方の定常領域を含有することができる。Ｈ鎖定常領域は通常ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４領域を包含する。本明細書に記述される抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを包含する全部の型の定常領域、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を包含するいかなるアイソタイプも有する抗体を包含する。抗体（例えばヒト化抗体）が細胞傷害活性を表すことが望ましい場合、定常ドメインは通常補体固定定常ドメインであり、かつ、クラスは典型的にＩｇＧ１である。ヒトアイソタイプＩｇＧ１およびＩｇＧ４が例示的である。Ｌ鎖定常領域はλ若しくはκであり得る。ヒト化抗体は、１種以上のクラス若しくはアイソタイプからの配列を含みうる。抗体は、２本のＬおよび２本のＨ鎖を含有する四量体として、別個のＨ鎖、Ｌ鎖として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖとして、若しくはＨおよびＬ鎖可変ドメインがスペーサーにより連結されている一本鎖抗体として発現し得る。
【０１８９】
一態様において、本発明のヒト化抗体は、下に配列番号５２に示されるところの、ＩｇＧ１定常領域に連結された１２Ａ１１ｖ．１  ＶＨ領域を包含する。
【０１９０】
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAFSGFSLSTSGMSVGWIRQAPGKGLEWLAHIWWDDDKYYNPSLKSRLTISKDTSKNTV
YLQMNSLRAEDTAVYYCARRTTTADYFAYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(K)
【０１９１】
別の態様において、本発明のヒト化抗体は、下に配列番号５３に示されるところの、ＩｇＧ４定常領域に連結された１２Ａ１１ｖ．１  ＶＨ領域を包含する。
【０１９２】
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAFSGFSLSTSGMSVGWIRQAPGKGLEWLAHIWWDDDKYYNPSLKSRLTISKDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARRTTTADYFAYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(K)
【０１９３】
なお別の態様において、本発明のヒト化抗体は、下にそれぞれ配列番号５４および５５で示されるところの、ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４定常領域に連結された１２Ａ１１ｖ３．１  ＶＨ領域を包含する。
【０１９４】
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAFSGFTLSTSGMSVGWIRQAPGKGLEWLAHIWWDDDKYYNPSLKSRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRTTTADYFAYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(K)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAFSGFTLSTSGMSVGWIRQAPGKGLEWLAHIWWDDDKYYNPSLKSRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRTTTADYFAYWGQGTTVTVSSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAFSGFSLSTSGMSVGWIRQAPGKGLEWLAHIWWDDDKYYNPSLKSRLTISKDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARRTTTADYFAYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(K)
【０１９５】
いくつかの態様において、カッコ内に示されるところの末端のリシンは場合によっては発現される。
【０１９６】
いくつかの態様において、本明細書に記述されるヒト化抗体は、例えば米国特許第６，９４６，２９２号明細書（その内容全体は本明細書に引用することにより組み込まれる）に記述されるもののような技術を使用して、それらの抗原依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を高めるよう改変する。抗体のＡＤＣＣ活性は、一般に、例えばキラー細胞、ナチュラルキラー細胞および活性化型マクロファージのようなエフェクター細胞の表面上に存在する抗体受容体への抗体のＦｃ領域の結合を必要とすると考えられる。ヒト化抗体（すなわちＦｃ領域中）の炭水化物構造のフコシル化を変える（例えば減少若しくは除外する）ことにより、抗体のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、未修飾のヒト化抗体に関して例えば１０倍若しくは２０倍若しくは３０倍若しくは４０倍若しくは５０倍若しくは１００倍高め得る。増大されたＡＤＣＣ活性のため、こうした修飾された抗体は、それらの未修飾の対照物より低投薬量で使用し得、そして一般に患者でより少ない若しくは低下された
副作用を有し得る。
【０１９７】
いくつかの態様において、こうした抗体がアグリコシル化された定常領域を包含する、ヒト化抗体のアグリコシルバージョンを特徴とする。Ａｓｎ−２９７のオリゴ糖が正常なヒトＩｇＧ抗体の特徴的特徴である（Ｋａｂａｔら、１９８７、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、米国保健福祉省刊行物（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）を参照されたい）。ＩｇＧ分子中の２本のＨ鎖のそれぞれは、例えば位置２９７のアスパラギン残基のアミド基に連結されている単一の分枝状鎖炭水化物基を有する。例えばアスパラギンのアラニンでの置換は、例えば米国特許第６，７０６，２６５号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるとおり抗体のグリコシル化を予防する。特定の一態様において、位置２９７のアミノ酸残基Ａｓｎをアラニンに突然変異する。
【０１９８】
５．組換え抗体の発現
キメラおよびヒト化抗体は典型的に組換え発現により製造する。場合によっては定常領域に連結されたＬおよびＨ鎖可変領域をコードする核酸を発現ベクターに挿入する。ＬおよびＨ鎖は同一若しくは異なる発現ベクターにクローン化し得る。免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする、発現ベクター（１種若しくは複数）中の制御配列に作動可能に連結される。発現制御配列は、限定されるものでないが、プロモーター（例えば天然に関連する若しくは異種のプロモーター）、シグナル配列、エンハンサー要素および転写終止配列を挙げることができる。好ましくは、発現制御配列は、真核生物宿主細胞（例えばＣＯＳ若しくはＣＨＯ細胞）を形質転換若しくはトランスフェクトすることが可能なベクター中の真核生物プロモーター系である。ベクターが適切な宿主に一旦組み込まれれば、該宿主を、ヌクレオチド配列の高レベル発現、ならびに交差反応性抗体の収集および精製に適する条件下で維持する。
【０１９９】
これらの発現ベクターは、典型的に、エピソーム若しくは宿主染色体ＤＮＡの一体部分のいずれかとして宿主生物体中で複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換した細胞の検出を可能にするための選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性若しくはネオマイシン耐性）を含有する（例えば、Ｉｔａｋｕｒａら、米国特許第４，７０４，３６２号明細書を参照されたい）。
【０２００】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は本発明のポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ配列）をクローン化するのにとりわけ有用な１種の原核生物宿主である。使用に適する他の微生物宿主は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような桿菌、ならびにサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）および多様なシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）スピーシーズのような他の腸内細菌科を包含する。これらの原核生物宿主中で、該宿主細胞と適合性の発現制御配列（例えば複製起点）を典型的に含有することができる発現ベクターもまた作成し得る。加えて、乳糖プロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、若しくはファージλからのプロモーター系のようないずれかの数の多様な公知のプロモーターが存在することができる。プロモーターは、典型的には、場合によってはオペレーター配列を伴い発現を制御することができ、また、転写および翻訳を開始および終了させるためのリボソーム結合部位配列などを有することができる。
【０２０１】
酵母のような他の微生物もまた発現に有用である。サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）は好ましい酵母宿主であり、適するベクターは発現制御配列（例えばプロモーター）、複製起点、終止配列などを所望のとおり有する。典型的なプロモーターは３
−ホスホグリセリン酸キナーゼおよび他の解糖酵素を包含する。誘導可能な酵母プロモーターは、とりわけ、アルコール脱水素酵素、イソチトクロームＣ、ならびに麦芽糖およびガラクトース利用を司る酵素からのプロモーターを包含する。
【０２０２】
微生物に加え、哺乳動物組織細胞培養物もまた本発明のポリペプチドを発現かつ製造するのに使用しうる（例えば免疫グロブリン若しくはそれらのフラグメントをコードするポリヌクレオチド）。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ、Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ニューヨーク州ニューヨーク（１９８７）を参照されたい。真核生物細胞は、異種タンパク質（例えば無傷の免疫グロブリン）を分泌することが可能な多数の適する宿主細胞株が当該技術分野で開発されているため実際に好ましく、そしてＣＨＯ細胞株、多様なＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、好ましくは骨髄腫細胞株、若しくは形質転換Ｂ細胞またはハイブリドーマを包含する。好ましくは細胞はヒト以外である。これらの細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーターおよびエンハンサー（Ｑｕｅｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））のような発現制御配列、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終止配列のような必要なプロセシング情報部位を包含し得る。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルスなど由来のプロモーターである。Ｃｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照されたい。
【０２０３】
あるいは、抗体をコードする配列は、トランスジェニック動物のゲノムへの導入および該トランスジェニック動物の乳中でのその後の発現のため、導入遺伝子に組み込み得る（例えば、Ｄｅｂｏｅｒら、米国特許第５，７４１，９５７号、Ｒｏｓｅｎ、米国特許第５，３０４，４８９号、およびＭｅａｄｅら、米国特許第５，８４９，９９２号明細書を参照されたい）。適する導入遺伝子は、カゼイン若しくはβ−ラクトグロブリンのような乳腺特異的遺伝子からのプロモーターおよびエンハンサーとの操作可能な連結にあるＬおよび／若しくはＨ鎖のコーディング配列を包含する。
【０２０４】
あるいは、本発明の抗体（例えばヒト化抗体）はトランスジェニック植物（例えばタバコ、トウモロコシ、ダイズおよびアルファルファ）中で製造し得る。改良された「プランティボディ（ｐｌａｎｔｉｂｏｄｙ）」ベクター（Ｈｅｎｄｙら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１３７−１４６）、および形質転換可能な作物種の増大と結合された精製戦略が、こうした方法を、ヒトおよび動物の治療のみならずしかし同様に工業的応用（例えば触媒的抗体）のためにも組換え免疫グロブリンの実際的かつ効率的な製造手段にする。さらに、植物で産生される抗体は安全かつ有効であることが示されており、また、動物由来材料の使用、および従って伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）の病原体での汚染の危険を回避する。さらに、植物および哺乳動物細胞で産生される抗体のグリコシル化パターンの差違は抗原結合若しくは特異性にほとんど若しくは全く影響を有しない。加えて、毒性すなわちＨＡＭＡの証拠は、植物由来の分泌型二量体ＩｇＡ抗体の局所経口適用を受領する患者で観察されていない（Ｌａｒｒｉｃｋら（１９９８）Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：６０３−６０８を参照されたい）。
【０２０５】
トランスジェニック植物で組換え抗体を発現するのに多様な方法を使用しうる。例えば、抗体ＨおよびＬ鎖を発現ベクター（例えばアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ベクター）に独立にクローン化し得、次いで該組換え細菌で植物組織をｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質転換するか、若しくは例えば該ベクターで被覆した粒子（その後例えば遺伝子銃を使用して植物組織に物理的に導入する）を使用して直接形質転換する。その後、個々の鎖を発現する全植物を再構成し、次いでそれらを性的交雑し、最終的に完全に集成されかつ機能的な抗体の産生をもたらす。類似のプロトコルが、タバコ植物で機能的抗体を発現するのに使用されている（Ｈｉａｔ
ｔら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：７６−８７を参照されたい）。多様な態様において、シグナル配列を利用して、未集成の抗体鎖を適切な植物環境（例えばアポプラズマまたは根茎、果実若しくは種子を包含する他の特定の植物組織の水性環境）に向けることにより該鎖の発現、結合およびフォールディングを促進しうる（Ｆｉｅｄｌｅｒら（１９９５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：１０９０−１０９３を参照されたい）。植物バイオリアクターもまた、抗体収量を増大させかつ費用を大きく低減させるのに使用し得る。
【０２０６】
目的のポリヌクレオチド配列（例えばＨおよびＬ鎖をコードする配列および発現制御配列）を含有するベクターは、細胞宿主の型に依存して変動する公知の方法により宿主細胞に移入し得る。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは原核生物細胞に一般に利用される一方、リン酸カルシウム処理、電気穿孔法、リポフェクション、遺伝子銃若しくはウイルスに基づくトランスフェクションを他の細胞宿主に使用しうる（全般として、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８９）（全部の目的上そっくりそのまま引用することにより組み込まれる）を参照されたい）。哺乳動物細胞を形質転換するのに使用される他の方法は、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、電気穿孔法および微小注入法の使用を包含する（全般として、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記を参照されたい）。トランスジェニック動物の製造のためには、導入遺伝子を受精卵母細胞に微小注入し得るか、若しくは胚性幹細胞のゲノムに組み込み得、そしてこうした細胞の核を除核卵母細胞に移入し得る。
【０２０７】
ＨおよびＬ鎖を別個の発現ベクターにクローン化する場合、該ベクターをコトランスフェクトして無傷の免疫グロブリンの発現および集成を得る。一旦発現されれば、全抗体、それらの二量体、個々のＬおよびＨ鎖、若しくは本発明の他の免疫グロブリンの形態を、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ精製、ゲル電気泳動などを包含する当該技術分野の標準的手順に従って精製し得る（全般として、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク（１９８２）を参照されたい）。製薬学的使用には、最低約９０ないし９５％均一な実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、そして９８ないし９９％若しくはそれ以上の均一性が最も好ましい。
【０２０８】
６．抗体フラグメント
抗体フラグメントもまた本発明の範囲内で企図している。一態様において、ヒト以外のおよび／若しくはキメラの抗体のフラグメントが提供される。別の態様において、ヒト化抗体のフラグメントが提供される。典型的には、これらのフラグメントは最低１０７、およびより典型的には１０８若しくは１０９Ｍ−１の親和性での抗原への特異的結合を表す。ヒト化抗体フラグメントは、別個のＨ鎖、Ｌ鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂｃおよびＦｖを包含する。フラグメントは組換えＤＮＡ技術、または無傷の免疫グロブリンの酵素的若しくは化学的分離により製造する。
【０２０９】
いくつかの態様において、抗体フラグメント（例えばＦａｂ若しくはＦａｂ’）の一般に短い半減期がペグ化により延長される。これは一般に、例えばＬｅｏｎｇら  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １６、１０６−１１９（２００１）により記述されるとおりポリエチレングリコール（ＰＥＧ）への融合により達成される。ペグ化は、所望の場合はＦｃ受容体に媒介される機能を排除しかつ／若しくは免疫原性を低下させるという付加された利点を有する。例示的態様において、２〜２０ｋＤａのＰＥＧ分子を、例えば、Ｋ−リンカー−Ｃを介して抗体Ｈ鎖ヒンジ領域に共有結合する（例えば、Ｃｈｏｙら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．４１：１１３３−１１３７（２００２）を参照されたい）。
【０２１０】
７．エピトープマッピング
エピトープマッピングを実施して、Ａβのどの抗原決定基すなわちエピトープが該抗体により認識されるかを決定し得る。一態様において、エピトープマッピングは置換ＮＥＴ（ｒＮＥＴ）分析に従って実施する。ｒＮＥＴエピトープ地図アッセイは、該抗体の全体的結合活性への該エピトープ内の個々の残基の寄与についての情報を提供する。ｒＮＥＴ分析は合成された体系的単一置換ペプチドアナログを使用する。試験されている抗体の結合を、天然のペプチド（天然の抗原）および１９種の代替の「単一置換」ペプチド（各ペプチドは第一の位置でその位置の１９種の非天然のアミノ酸の１種で置換されている）に対し測定する。多様な非天然の残基でのその位置の置換の影響を反映したプロファイルが生成される。プロファイルは同様に、抗原ペプチドに沿った連続する位置でも生成される。組み合わせたプロファイル、すなわちエピトープ地図（全１９種の非天然のアミノ酸での各位置の置換を反映する）をその後、第二の抗体について同様に生成した地図と比較し得る。実質的に類似若しくは同一の地図は、比較されている抗体が同一若しくは類似のエピトープ特異性を有することを示す。
【０２１１】
８．動物モデルでの治療的有効性（例えば斑消失活性）についての抗体の試験
７〜９月齢のＰＤＡＰＰマウスの群それぞれに、ＰＢＳ中０．５ｍｇのポリクローナル抗Ａβ若しくは特異的抗Ａβモノクローナル、ヒト化またはキメラ抗体を注入する。全抗体調製物は低エンドトキシンレベルを有するように精製する。モノクローナル抗体は、Ａβのフラグメント若しくはより長い形態をマウスに注入すること、ハイブリドーマを調製すること、およびＡβの他の重ならないフラグメントに結合することなくＡβの所望の１フラグメントに特異的に結合する抗体について該ハイブリドーマをスクリーニングすることにより、１フラグメントに対し製造し得る。ヒト化および／若しくはキメラ抗体は本明細書に記述されるとおり製造する。
【０２１２】
Ａβ４２若しくは他の免疫原に対するＥＬＩＳＡにより定義される１／１０００以上のＥＬＩＳＡ力価により測定される循環抗体濃度を維持するため、マウスに４か月間にわたり必要とされるように腹腔内注入する。力価をモニターし、そしてマウスを６か月の注入の終了時に安楽死させる。組織化学、Ａβレベルおよび毒物学を死後に実施する。１０匹のマウスを１群あたりに使用する。
【０２１３】
９．可溶性オリゴマーＡβへの結合についての抗体の試験
本発明はまた、生化学的アッセイでの可溶性のオリゴマーＡβに結合する抗体の能力の試験方法も提供する。該生化学的アッセイは、少なくとも部分的に、単量体Ａβへの抗体の結合に比較した１種若しくはそれ以上の形態の可溶性オリゴマーＡβ（例えばＡβ二量体、Ａβ三量体、Ａβ四量体、Ａβ五量体など）への該抗体の結合の比較に基づく。この比較を使用して、単量体Ａβに比較しての可溶性オリゴマーＡβへの抗体の相対的結合を決定し得る。多様な態様において、この相対的結合を、単量体Ａβに対する１種若しくはそれ以上の可溶性オリゴマーＡβへの対照試薬の対応する相対的結合と比較する。他の局面において、１種若しくはそれ以上のオリゴマーＡβ種に対する抗体の親和性を、Ａβ調製物中の単量体Ａβに対する該抗体の親和性と比較する。可溶性オリゴマーＡβ種を優先的に結合するＡβ抗体の能力と、詳細に下述されるところの適切なモデル動物でのＣＦＣアッセイにより評価されるところの認知を迅速に改善する該抗体の能力の間に、強い相関が存在することが発見された。ＣＦＣアッセイでの認知を改善する抗体の能力は、該抗体の最終的なヒト治療の有効性（とりわけ患者での認知の迅速な改善における有効性）の強力な指標若しくは予測因子であるとさらに考えられる。従って、Ａβ抗体結合の優先性および／若しくは親和性の比較は、本発明の治療法での使用、とりわけ患者で認知の迅速な改善を遂げる方法での使用のための候補としてのある種の抗体の同定に至る。
【０２１４】
候補抗体は、単量体Ａβに比較して１種若しくはそれ以上の可溶性オリゴマーＡβ種へ
の優先的なすなわちより大きい結合を表す。単量体Ａβに比較して例えばＡβ二量体、三量体および四量体に優先的に結合する抗体は、患者で認知の迅速な改善を遂げる方法での使用のための好ましい候補である。例えば、単量体Ａβに比較して可溶性オリゴマーＡβ種への２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍若しくはそれ以上大きい結合を表す候補抗体を、治療方法での使用に選択する。
【０２１５】
１種若しくはそれ以上の可溶性オリゴマーＡβ種または単量体Ａβへの抗体の結合は、定性的、定量的、若しくは双方の組合せで測定し得る。一般に、該種を含んでなるＡβ調製物中の単量体ＡβとオリゴマーＡβ種を識別することが可能ないかなる技術も使用し得る。例示的態様において、免疫沈降法、電気泳動分離およびクロマトグラフィー分離（例えば液体クロマトグラフィー）の１種若しくはそれ以上を使用して、該種を含んでなるＡβ調製物中の単量体ＡβとオリゴマーＡβ種を識別し得る。
【０２１６】
好ましい態様において、１種若しくはそれ以上の可溶性のオリゴマーＡβ種または単量体Ａβへの抗体の結合は、Ａβ種を調製物から免疫沈降させることにより測定する。免疫沈降物をその後電気泳動分離（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけて、オリゴマー種を沈殿物中の単量体Ａβと識別する。電気泳動バンド中に存在するオリゴマーＡβ種および単量体Ａβの量は、例えば電気泳動ゲルのイムノブロッティング、若しくは電気泳動ゲルのバンド中のそれぞれの種の直接定量により可視化し得る。１Ａβ種の沈殿物の量は、例えば対応する電気泳動バンド、イムノブロットのバンド若しくは双方の組合せの強度から測定し得る。強度の測定は定性的、定量的若しくは双方の組み合わせであり得る。
【０２１７】
バンド強度の評価は、例えば、走査し得る適切なフィルム露光、およびソフトウェア、例えばＡｌｐｈａＥａｓｅＴＭソフトウェア（ＡｌｐｈａＩｎｎｏｔｅｃｈＴＭ）で測定されるバンドの密度を使用して実施し得る。バンド強度の評価は、例えば抗体、画像化試薬（例えばイムノブロットで使用される抗体）若しくは双方に取り込まれる多数の標識のいずれを使用しても実施し得る。適する標識は、限定されるものでないが、蛍光標識、放射活性標識、常磁性標識、若しくはそれらの組合せを挙げることができる。
【０２１８】
多様な態様において、抗体に結合する１種若しくはそれ以上のオリゴマーＡβ種および／若しくは単量体Ａβの量は、例えばそれを抗体と接触させた適する時間後のＡβ調製物それ自身、あるいは、Ａβ調製物から抽出された抗体に結合した単量体Ａβおよび／または１種若しくはそれ以上の可溶性オリゴマーＡβ種での質量分析を使用して評価し得る。
【０２１９】
ある局面において、１種若しくはそれ以上のオリゴマーＡβ種に対する抗体の親和性を単量体Ａβに対する該抗体の親和性と比較して、本発明の治療方法での使用、とりわけ患者での認知の迅速な改善を遂げる方法での使用の候補として該抗体を同定する。単量体Ａβに比較してのオリゴマーＡβに対する試験抗体（例えばＡβ抗体）の親和性を、対照試薬の結合親和性と比較し得る。標識を使用して単量体Ａβ、オリゴマーＡβ若しくは双方に対する抗体の親和性を評価し得る。多様な態様において、Ａβに対する親和性をもつ一次試薬は未標識であり、そして二次標識剤を使用して一次試薬に結合する。適する標識は、限定されるものでないが蛍光標識、常磁性標識、放射活性標識およびそれらの組合せを挙げることができる。
【０２２０】
ある局面において、本発明の方法は、被験体での免疫治療の有効性を適して予測するアッセイの使用において抗Ａβ抗体が同定される、被験体での認知を迅速に改善することが可能である抗Ａβ抗体の投与を特徴とする。例示的態様において、該アッセイは、試験免疫治療薬へのＡβ調製物中の１種若しくはそれ以上のＡβオリゴマーの結合の、試験免疫治療薬へのＡβ調製物中のＡβ単量体の結合との比較に少なくとも部分的に基づく生化学的アッセイである。１種若しくはそれ以上のＡβオリゴマーは、例えばＡβ二量体、Ａβ
三量体、Ａβ四量体およびＡβ五量体の１種若しくはそれ以上を包含し得る。多様な態様において、試験免疫治療薬は、試験免疫治療薬へのＡβ調製物中の１種若しくはそれ以上のＡβオリゴマーの結合が試験免疫治療薬へのＡβ調製物中Ａβ単量体の結合より大きい場合に同定される。試験免疫学的試薬に結合するＡβ調製物中のＡβ単量体および１種若しくはそれ以上のＡβオリゴマー種の量は、生化学的方法を使用して、例えば試験免疫学的試薬に結合されたＡβ単量体および１種若しくはそれ以上のＡβオリゴマー種をＡβ調製物から沈殿させるための免疫沈降法、次いで免疫沈降物の電気泳動分離を使用して評価し得る。こうした生化学的アッセイは、本明細書、ならびに２００４年１２月１５日出願の米国仮出願第６０／６３６，６８７号および２００５年１１月１０日出願の同第６０／７３６，０４５号明細書（それらのそれぞれの内容全体は本明細書に引用することにより組み込まれる）にさらに論考されている。
【０２２１】
１０．消失活性についての抗体のスクリーニング
本発明は、消失活性が望ましいアミロイド沈着物若しくはいずれかの他の抗原、または関連する生物学的実体の消失における活性についての抗体のスクリーニング方法もまた提供する。アミロイド沈着物に対する活性についてスクリーニングするため、アルツハイマー病を伴う患者、若しくは特徴的なアルツハイマーの病理学を有する動物モデルの脳からの組織サンプルを、小膠細胞のようなＦｃ受容体を担持する食細胞および試験中の抗体と媒体中でｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる。食細胞は初代培養物若しくは細胞株であり得、そしてマウス（例えばＢＶ−２若しくはＣ８−Ｂ４細胞）またはヒト起源（例えばＴＨＰ−１細胞）のものであり得る。いくつかの方法において、顕微鏡モニタリングを容易にするために成分を顕微鏡用スライドガラス上で組合せる。いくつかの方法において、複数の反応をマイクロタイター皿のウェル中で同時に実施する。こうした形式では、別個の小型顕微鏡用スライドガラスを別個のウェルにマウントし得るか、若しくはＡβのＥＬＩＳＡ検出のような非顕微鏡的検出形式を使用し得る。好ましくは、一連の測定は、反応が進行する前の基礎値から出発するｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応混合物中のアミロイド沈着物の量、および反応中の１個若しくはそれ以上の試験値から構成される。抗原は、例えばＡβ若しくはアミロイド斑の他成分に対する蛍光標識抗体での染色により検出し得る。染色に使用する抗体は、消失活性について試験されている抗体と同一であってももしくはなくてもよい。アミロイド沈着物の反応中の基礎に関しての低下は、試験中の抗体が消失活性を有することを示す。こうした抗体はアルツハイマー病および他のアミロイド形成疾患の予防若しくは処置において有用であることがありそうである。アルツハイマー病および他のアミロイド形成疾患を予防若しくは処置するためのとりわけ有用な抗体は、稠密および拡散双方のアミロイド斑を消失させることが可能なもの、例えば本発明の１２Ａ１１抗体、またはそのキメラ若しくはヒト化バージョンを包含する。
【０２２２】
類似の方法を使用して、他の型の生物学的実体の消失における活性について抗体をスクリーニングし得る。該アッセイを使用して、事実上いかなる種類の生物学的実体に対しても消失活性を検出し得る。典型的には、生物学的実体はヒト若しくは動物の疾患において何らかの役割を有する。生物学的実体は組織サンプルとして若しくは単離された形態で提供し得る。組織サンプルとして提供される場合、該組織サンプルは、好ましくは、該組織サンプルの成分への容易な到達を可能にしかつ固定に偶発する成分のコンホメーションの破壊を回避するために固定しない。本アッセイで試験し得る組織サンプルの例は、癌組織、前癌組織、疣贅若しくは母斑のような良性増殖を含有する組織、病原性微生物に感染した組織、炎症細胞に浸潤された組織、細胞間に病理学的マトリックスを担持する組織（例えば線維素性心外膜炎）、異常な抗原を担持する組織、および瘢痕組織を包含する。使用し得る単離された生物学的実体の例は、Ａβ、ウイルス抗原若しくはウイルス、プロテオグリカン、他の病原性微生物の抗原、腫瘍抗原および接着分子を包含する。こうした抗原は、とりわけ天然の供給源、組換え発現若しくは化学合成から得ることができる。組織サンプル若しくは単離された生物学的実体を、単球若しくは小膠細胞のようなＦｃ受容体を
担持する食細胞、および試験されるべき抗体と媒体中で接触させる。抗体は、試験中の生物学的実体若しくは該実体と関連する抗原に向けることができる。後者の状況での目的は生物学的実体が抗原とともに貪食されるかどうかを試験することである。通常、とは言え必ずではなく、抗体および生物学的実体（ときに関連抗原を伴う）は食細胞を添加する前に相互と接触させる。媒体中に残存する生物学的実体および／若しくは関連抗原（存在する場合）の濃度をその後モニターする。媒体中の抗原若しくは関連する生物学的実体の量若しくは濃度の低下は、該抗体が食細胞とともに抗原および／若しくは関連する生物学的実体に対する消失応答を有することを示す。
【０２２３】
１１．ＣＦＣアッセイにおけるに認知の迅速な若しくは長期の改善についての抗体の試験
多様な局面において、本発明の抗体は、認知を改善する能力について適切な動物モデルで試験し得る。例えば、コンテクチュアル・フィアー・コンディショニング（ＣＦＣ）アッセイを介して評価されるところのＡＤの動物モデルで認知を改善する抗体の能力を使用して、本発明の治療方法、とりわけ患者での認知の迅速な改善を遂げる方法での使用のための候補として該抗体を選択し得る。
【０２２４】
コンテクチュアル・フィアー・コンディショニングは、大部分の動物、例えば哺乳動物で例外的に信頼できかつ迅速に取得される学習の普遍的な一形態である。試験動物は、有害経験および／若しくは環境刺激（１種若しくは複数）とのその関連により以前は中立の刺激を恐れることを学習する（例えばＦａｎｓｅｌｏｗ、Ａｎｉｍ．Ｌｅａｒｎ．Ｂｅｈａｖ．１８：２６４−２７０（１９９０）；Ｗｅｈｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１７：３３１−３３４．（１９９７）；Ｃａｌｄａｒｏｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１７：３３５−３３７（１９９７）を参照されたい）。
【０２２５】
コンテクチュアル・フィアー・コンディショニングは、例えば神経変性疾患若しくは障害、Ａβ関連疾患若しくは障害、アミロイド形成疾患若しくは障害のような疾患若しくは障害の結果としての認知機能若しくは機能低下、不都合な遺伝子変化情動的認知機能の存在（例えば遺伝子突然変異、遺伝子破壊若しくは望ましくない遺伝子型）、および／または認知能力に対する剤、例えば抗体剤の有効性を決定するのにとりわけ有用である。従って、ＣＦＣアッセイは、認知疾患若しくは障害、およびとりわけ脳の１種若しくはそれ以上の領域、例えば海馬、鉤状回、帯状皮質、前頭葉前皮質、鼻周囲皮質、感覚皮質および側頭葉内側部を冒す疾患若しくは障害を予防若しくは処置するための剤の治療効果の独立の試験および／若しくは検証方法を提供する。
【０２２６】
典型的には、ＣＦＣアッセイは、標準的動物室、ならびに聴覚（例えばある期間の８５ｄｂホワイトノイズ）、嗅覚（例えばアーモンド若しくはレモン抽出物）、触覚（例えば床ケージの質感）および／または視覚刺激（光点滅）と対にした軽度ショック（例えば０．３５ｍの足ショック）を含んでなる条件付け訓練の使用を使用して実施する。あるいは、条件付け訓練は対にした刺激（すなわち文脈を伴うショック）のないショックの投与を含んでなる。嫌悪経験（ショック）に対する応答は、典型的にはフリージング（呼吸を除く動きの非存在）の１種であるが、しかし、選択した試験動物に依存して瞬き若しくは瞬膜反射の変化もまた包含しうる。嫌悪応答は通常、訓練の第一日に特徴付け、文脈的に条件付けられた恐怖として特徴づけられるその後の試験日の嫌悪応答結果（例えば、同一情況しかし嫌悪刺激の非存在下でのフリージング、および／若しくは刺激の存在下しかし嫌悪経験の非存在下でのフリージング）を伴う未条件付け恐怖の基礎を決定する。向上された信頼性のため、試験動物は、典型的には独立の技術者により長期にわたり個別に試験しかつ記録する。付加的な実験デザインの詳細は、当該技術分野、例えばＣｒａｗｌｅｙ，ＪＮ、Ｗｈａｔ’ｓ  Ｗｒｏｎｇ  ｗｉｔｈ  ｍｙ  Ｍｏｕｓｅ；Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ
Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｍｉｃｅ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、ニューヨーク（２０００）に見出し得る。
【０２２７】
例示的試験動物（例えばモデル動物）は、アルツハイマー病のようなアミロイド形成障害に特徴的である顕著な症状若しくは病理学を表す哺乳動物（例えばげっ歯類若しくはヒト以外の霊長類）を包含する。モデル動物は、所望のについて選択的に同系交配することにより創製しうるか、または、それらは、痴呆障害と関連付けらている遺伝子中の標的とされた遺伝子変化（例えば遺伝子突然変異、遺伝子破壊）が、標的とされた遺伝子の異常な発現若しくは機能につながるような、当該技術分野で公知であるトランスジェニック技術を使用して遺伝子工作しうる。例えば、アルツハイマー病に特徴的であるＡＰＰを過剰発現しかつアミロイド斑の病理学を発生しかつ／若しくは認知障害を発症する数種のトランスジェニックマウス系統が入手可能である（例えば、Ｇａｍｅｓら、上記、Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１５５０（１９９７）；Ｍａｓｌｉａｈ  ＥとＲｏｃｋｅｎｓｔｅｉｎ  Ｅ．（２０００）Ｊ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ  Ｓｕｐｐｌ．；５９：１７５−８３を参照されたい）。
【０２２８】
あるいは、モデル動物は、アミロイド形成障害の特徴的な症状若しくは病理学と関連する解剖学的脳領域（例えば海馬、扁桃体、鼻周囲皮質、内側中隔核、青斑核、乳頭体（ｍａｍｍａｌａｒｙ  ｂｏｄｉｅｓ））または特定のニューロン（例えばセロトニン作動性、コリン作動性若しくはドーパミン作動性ニューロン）の正常機能を除去若しくは別の方法で妨害する化合物（例えば神経毒、麻酔薬）若しくは外科的手技（例えば定位切除、軸索切断、切離、吸引）を使用して創製し得る。ある好ましい態様において、動物モデルは、アミロイド形成障害と関連する神経変性の病理に加え、学習若しくは記憶と関連する顕著な認知障害を表す。より好ましくは、認知障害は、モデル動物での疾患の進行がアミロイド形成障害に罹患している被験体での疾患の進行と平行するような、齢とともに進行的に悪化する。
【０２２９】
本明細書に記述される抗体の機能性を試験するための馴化（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ）恐怖条件付けおよび他のｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは、野性型マウス、または損なわれた記憶につながるある種の遺伝子変化を有するマウス、あるいは脳脊髄液（ＣＳＦ）若しくは血漿中の可溶性Ａβの上昇したレベルを表すマウスモデルを包含する神経変性疾患例えばアルツハイマー病のマウスモデルを使用して実施しうる。例えば、アルツハイマー病の動物モデルは、年齢依存性の記憶障害および斑を示すヒトアミロイド前駆体タンパク質の「スウェーデン型」突然変異（ｈＡＰＰｓｗｅ：Ｔｇ２５７６）を過剰発現するトランスジェニックマウス（Ｈｓｉａｏら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：９９−１０２）を包含する。本明細書に記述される抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ機能性は、若齢で変異体の形態のヒトＡＰＰ（ＡＰＰＶ７１Ｆ）を発現しかつアルツハイマー病を発症するＰＤＡＰＰトランスジェニックマウス（Ｂａｒｄら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：９１６−９１９；Ｍａｓｌｉａｈ  Ｅら（１９９６）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５；１６（１８）：５７９５−８１１）を使用してもまた試験し得る。アルツハイマー病の他のマウスモデルは、Ｈｏｌｃｏｍｂら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：９７−１１０に記述されるＰＳＡＰＰマウス、すなわち変異体ＡＰＰおよびＰＳ１導入遺伝子を過剰発現する二重トランスジェニックマウス（ＰＳＡＰＰ）、ならびにＤｕｆｆら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８３、７１０−７１３に記述されるＰＳ−１変異体マウスを包含する。アルツハイマー病の他の遺伝子的に変えられたトランスジェニックモデルがＭａｓｌｉａｈ  ＥとＲｏｃｋｅｎｓｔｅｉｎ  Ｅ．（２０００）Ｊ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ  Ｓｕｐｐｌ．５９：１７５−８３に記述されている。
【０２３０】
多様な局面において、本発明の方法は、被験体で認知を迅速に改善することが可能である抗Ａβ抗体の投与を含んでなり、抗Ａβ抗体は被験体での免疫療法の有効性を適して予測するアッセイを使用して同定されている。例示的態様において、該アッセイは、適する対照と比較して、動物への試験免疫学的試薬の投与後の動物のコンテクチュアル・フィア
ー・コンディショニング研究から決定されるところの認知を比較することに少なくとも部分的に基づくモデル動物アッセイである。ＣＦＣアッセイは、潜在的治療的化合物での処置に際しての動物（典型的にはマウス若しくはラット）の認知の変化を評価する。ある態様において、評価される認知の変化は記憶障害状態の改善若しくは記憶障害の逆転である。従って、ＣＦＣアッセイは、認知疾患、およびとりわけ脳の１種若しくはそれ以上の領域、例えば海馬、鉤状回、帯状皮質、前頭葉前皮質、鼻周囲皮質、感覚皮質および側頭葉内側部を冒す疾患若しくは障害を予防若しくは処置するための剤の治療効果の直接測定方法を提供する。こうしたＣＦＣアッセイは、本明細書、ならびに２００４年１２月１５日出願の米国仮出願第６０／６３６，８４２号、２００４年１２月１６日出願の同第６０／６３７，２５３号、および２００５年１１月１０日出願の同第６０／７３６，１１９号明細書（それらのそれぞれの内容全体は本明細書に引用することにより組み込まれる）でさらに論考されている。
【０２３１】
１２．変えられたエフェクター機能を有するキメラ／ヒト化抗体
定常領域（Ｆｃ領域）を含んでなる本発明の上述された抗体について、該分子のエフェクター機能を変えることもまた望ましいことがある。一般に、抗体のエフェクター機能は、多様なエフェクター分子、例えば補体タンパク質若しくはＦｃ受容体への結合を媒介し得る該分子の定常すなわちＦｃ領域に存する。Ｆｃ領域への補体の結合は、例えば細胞病原体の捕食および溶解ならびに炎症応答の活性化で重要である。例えばエフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体への抗体の結合は、例えば抗体で被覆された病原体若しくは粒子の貪食および破壊、免疫複合体の消失、キラー細胞による抗体で被覆された標的細胞の溶解（すなわち抗体依存性の細胞媒介性細胞傷害すなわちＡＤＣＣ）、炎症メディエーターの放出、抗体の胎盤通過、ならびに免疫グロブリン産生の制御を包含する多数の重要かつ多彩な生物学的応答を誘発し得る。
【０２３２】
従って、特定の治療若しくは診断の応用に依存して、上で挙げられた免疫機能、若しくは選択された免疫機能のみが望ましいことがある。抗体のＦｃ領域を変えることにより、診断および治療における有益な効果を伴う免疫系の多様な反応を高める若しくは抑制することを包含する該分子のエフェクター機能の多様な局面が達成される。
【０２３３】
ある型のＦｃ受容体とのみ反応する本発明の抗体を製造し得、例えば、本発明の抗体は、該抗体のＦｃ領域に位置するＦｃ受容体結合部位の欠失若しくは変化により、あるＦｃ受容体のみに結合するか、若しくは所望の場合はＦｃ受容体結合を全く欠くように改変し得る。本発明の抗体のＦｃ領域の他の所望の変化を下に列記する。典型的には、ＥＵ番号付け体系（すなわちＫａｂａｔら、上記のＥＵインデックス）を使用して、エフェクター機能の所望の変化を達成するためにＦｃ領域（例えばＩｇＧ抗体の）のどのアミノ酸残基（１個若しくは複数）が（例えばアミノ酸置換により）変えられるかを示す。該番号付け体系は、例えばマウス抗体中で観察される所望のエフェクター機能がその後本発明のヒト、ヒト化若しくはキメラ抗体に系統的に工作され得るような、種を横断して抗体を比較するのにもまた使用される。
【０２３４】
例えば、抗体（例えばＩｇＧ抗体）を、Ｆｃ受容体（例えばヒト単球上のＦｃ受容体（ＦｃγＲＩ））への強固の、中間の若しくは弱い結合を表すことが見出されるものにグループ分けし得ることが観察された。これらの異なる親和性群のアミノ酸配列の比較により、ヒンジ結合領域の単球結合部位（ＥＵ番号付け体系によりＬｅｕ２３４−Ｓｅｒ２３９）が同定された。さらに、ヒトＦｃγＲＩ受容体は単量体としてのヒトＩｇＧ１およびマウスＩｇＧ２ａを結合するが、しかしマウスＩｇＧ２ｂの結合は１００倍より弱い。ヒンジ結合領域のこれらのタンパク質の配列の比較は、強結合体のＥＵ番号付けの位置２３４ないし２３８、すなわちＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号３２）からの配列がマウスγ２ｂすなわち弱結合体でＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配
列番号３３）になることを示す。従って、低下されたＦｃγＩ受容体結合が望ましい場合は、ヒト抗体ヒンジ配列中の対応する変化を作成し得る。同一若しくは類似の結果を達成するために他の変化を作成し得ることが理解される。例えば、ＦｃγＲＩ結合の親和性は、その側鎖に不適切な官能基を有する残基で指定された残基を置換することにより、あるいは荷電した官能基（例えばＧｌｕ若しくはＡｓｐ）または例えば芳香族非極性残基（例えばＰｈｅ、Ｔｙｒ若しくはＴｒｐ）を導入することにより、変えることができる。
【０２３５】
これらの変化は、多様な免疫グロブリン間の配列相同性を考えれば、マウス、ヒトおよびラットの系に等しく適用し得る。ヒトＦｃγＲＩ受容体に結合するヒトＩｇＧ３について、ＥＵ位置２３５のＬｅｕをＧｌｕに変えることは該受容体に対する変異体の相互作用を破壊することが示された。この受容体の結合部位は、従って、適切な突然変異を作成することによりスイッチを入れ若しくは切ることができる。
【０２３６】
ヒンジ結合領域の隣接若しくは近接部位の突然変異（例えば、ＥＵ位置２３４、２３６若しくは２３７の残基をＡｌａにより置換すること）は、少なくとも残基２３４、２３５、２３６および２３７の変化がＦｃγＲＩ受容体に対する親和性に影響を及ぼすことを示す。従って、本発明の抗体はまた、改変されない抗体と比較してＦｃγＲＩに対する変えられた結合親和性をもつ変えられたＦｃ領域も有し得る。こうした抗体は、便宜的に、ＥＵアミノ酸位置２３４、２３５、２３６若しくは２３７に改変を有する。いくつかの態様において、本発明の抗体は、１個若しくはそれ以上のＥＵ位置２３４、２３５、２３６および２３７にアミノ酸変化を包含するヒト化抗体である。本発明の特定の一態様において、ヒト化抗体は、ＩｇＧ１由来のヒンジ結合領域のＥＵ位置２３４および２３７にアミノ酸変化（すなわちＬ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ）を包含する。
【０２３７】
他のＦｃ受容体に対する親和性は、多様な方法で免疫応答を制御するための類似のアプローチにより変えることができる。
【０２３８】
さらなる一例として、補体のＣ１成分の結合後のＩｇＧ抗体の溶解特性を変えることができる。
【０２３９】
補体系の第一の成分Ｃ１は、一緒に強固に結合するＣ１ｑ、Ｃ１ｒおよびＣ１ｓとして既知の３種のタンパク質を含んでなる。Ｃ１ｑが該３タンパク質複合体の抗体への結合の原因であることが示されている。
【０２４０】
従って、抗体のＣ１ｑ結合活性は、Ｈ鎖のＥＵアミノ酸位置３１８、３２０および３２２のアミノ酸残基の最低１個が異なる側鎖を有する残基に変えられている、変えられたＣＨ  ２ドメインをもつ抗体を提供することにより変えることができる。抗体への特異的Ｃ１ｑ結合を変える、例えば低下若しくは廃止するための他の適する変化は、ＥＵ位置３１８（Ｇｌｕ）、３２０（Ｌｙｓ）および３２２（Ｌｙｓ）の残基のいずれか１個をＡｌａに変えることを包含する。
【０２４１】
さらに、これらの残基で突然変異を行うことにより、残基３１８が水素結合する側鎖を有しかつ残基３２０および３２２双方が正に荷電した側鎖を有する限りはＣ１ｑ結合が保持されることが示された。
【０２４２】
Ｃ１ｑ結合活性は、該３個の指定された残基のいずれか１個をその側鎖に不適切な官能性を有する残基で置換することにより廃止し得る。Ｃ１ｑ結合を廃止するためにイオン性残基のみをＡｌａで置換することは必要でない。Ｃ１ｑ結合を廃止するために、該３残基のいずれか１個の代わりにＧｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ若しくはＶａｌのような他のアルキル置換非イオン性残基、またはＰｈｅ、Ｔｙｒ、ＴｙｐおよびＰｒｏのような芳香族非極性
残基を使用することもまた可能である。加えて、Ｃ１ｑ結合活性を廃止するために、残基３２０および３２２（しかし３１８でなく）の代わりにＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＣｙｓおよびＭｅｔのような極性の非イオン性残基を使用することもまた可能である。
【０２４３】
イオン性若しくは非イオン性極性残基上の側鎖は、Ｇｌｕ残基により形成される結合に類似の様式で水素結合を形成することが可能であろうこともまた注目される。従って、極性残基による３１８（Ｇｌｕ）残基の置換はＣ１ｑ結合活性を改変しうるがしかし廃止しないことができる。
【０２４４】
残基２９７（Ａｓｎ）をＡｌａで置換することが、Ｃ１ｑに対する親和性をわずかにのみ低下させる（約３倍より弱い）一方で溶解活性の除去をもたらすこともまた既知である。この変化は、グリコシル化部位および補体活性化に必要とされる炭水化物の存在を破壊する。この部位のいかなる他の置換もまたグリコシル化部位を破壊することができる。
【０２４５】
本発明は、抗体が改変されたヒンジ領域を有する、変えられたエフェクター機能を有する抗体もまた提供する。改変されたヒンジ領域は、ＣＨ１ドメインのものと異なる抗体クラス若しくはサブクラスの抗体由来の完全なヒンジ領域を含みうる。例えば、クラスＩｇＧ１抗体の定常ドメイン（ＣＨ１）をクラスＩｇＧ４抗体のヒンジ領域に結合し得る。あるいは、新たなヒンジ領域は、天然のヒンジの一部、若しくは反復の各単位が天然のヒンジ領域由来である反復単位を含みうる。一例において、天然のヒンジ領域は、１個若しくはそれ以上のシステイン残基をアラニンのような中性残基に変換すること、若しくは適して配置された残基をシステイン残基に変換することにより変えられる。こうした変化は、技術に認識されたタンパク質化学、および好ましくは本明細書に記述されるところの遺伝子工学技術を使用して実施する。
【０２４６】
本発明の一態様において、抗体のヒンジ領域のシステイン残基の数は、例えば１システイン残基まで減少させる。この改変は、抗体、例えば二特異性抗体分子、およびＦｃ部分がエフェクター若しくはレポーター分子により置換された抗体分子の集成を容易にするという利点を有する。単一のジスルフィド結合を形成することのみが必要であるためである。この改変は、例えば化学的手段により直接若しくは間接的のいずれかで別のヒンジ領域またはエフェクター若しくはレポーター分子いずれかにヒンジ領域を結合するための特定の標的もまた提供する。
【０２４７】
逆に、抗体のヒンジ領域のシステイン残基の数を、例えば、天然に存在するシステイン残基の数より最低１個、増加させる。システイン残基の数を増大することを使用して、隣接するヒンジ間の相互作用を安定化し得る。この改変の別の利点は、それが変えられた抗体にエフェクター若しくはレポーター分子、例えば放射標識を結合するためのシステインのチオール基の使用を容易にすることである。
【０２４８】
従って、本発明は、変えられたエフェクター機能を達成するための、抗体クラス、とりわけＩｇＧクラス間のヒンジ領域の交換、および／またはヒンジ領域のシステイン残基の数の増大若しくは減少を提供する（例えば米国特許第５，６７７，４２５号明細書（明らかに本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。変えられた抗体のエフェクター機能の決定は、本明細書に記述されるアッセイ若しくは他の技術に認識される技術を使用して行う。
【０２４９】
重要なことには、結果として生じる抗体は、出発抗体に比較しての生物学的活性のいかなる変化も評価するため１種若しくはそれ以上のアッセイにかけることができる。例えば、補体若しくはＦｃ受容体を結合する変えられたＦｃ領域をもつ抗体の能力は、本明細書に開示されるアッセイならびにいずれかの技術に認識されるアッセイを使用して評価し得
る。
【０２５０】
本発明の抗体の製造は、本明細書に記述される技術ならびに当業者に既知の技術を包含するいずれかの適する技術により実施する。例えば、例えば抗体の関連する定常ドメイン、例えばＦｃ領域の一部若しくは全部、すなわちＣＨ２および／若しくはＣＨ３ドメイン（１個若しくは複数）を形成しかつ適切に変えられた残基（１個若しくは複数）を包含する適切なタンパク質配列を合成し得、そしてその後抗体分子中の適切な場所に化学結合し得る。
【０２５１】
好ましくは、変えられた抗体を製造するために遺伝子工学技術を使用する。好ましい技術は、例えば、ＩｇＧ  Ｈ鎖の少なくとも一部分、例えばＦｃまたは定常領域（例えばＣＨ２および／若しくはＣＨ３）をコードするＤＮＡ配列が１個若しくはそれ以上の残基で変えられているような、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）での使用のための適するプライマーを調製することを包含する。該セグメントはその後、抗体の残存部分、例えば抗体の可変領域、および細胞中での発現のための必要とされる調節エレメントに作動可能に連結し得る。
【０２５２】
本発明は、細胞株を形質転換するのに使用されるベクター、形質転換ベクターの製造で使用されるベクター、形質転換ベクターで形質転換した細胞株、調製ベクターで形質転換した細胞株、およびそれらの製造方法もまた包含する。
【０２５３】
好ましくは、変えられたＦｃ領域をもつ（すなわち変えられたエフェクター機能の）抗体を製造するため形質転換される細胞株は不死化哺乳動物細胞株（例えばＣＨＯ細胞）である。
【０２５４】
変えられたＦｃ領域をもつ抗体を製造するのに使用される細胞株は好ましくは哺乳動物細胞株であるとは言え、細菌細胞株若しくは酵母細胞株のようないずれかの他の適する細胞株をあるいは使用しうる。
【０２５５】
１３．親和性成熟
本発明の抗体（例えばヒト化抗体）は、多数の親和性成熟技術のいずれかを使用して、改良された機能のため改変し得る。典型的には、所定の標的分子に対する結合親和性をもつ候補分子を同定し、そしてその後、標的分子とのより望ましい結合相互作用を有する１種若しくはそれ以上の関係する候補をもたらす突然変異誘発技術を使用してさらに改良すなわち「成熟」させる。典型的には、それは改変される抗体の親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）（若しくは親和性（ａｖｉｄｉｔｙ）、すなわち標的抗原に対する抗体の結合した親和性）であるが、しかしながら、安定性、エフェクター機能、消失、分泌若しくは輸送機能のような該分子の他の特性もまた、親和性成熟技術を使用して別個に若しくは親和性と同時にのいずれかで改変しうる。
【０２５６】
例示的態様において、抗体（例えば本発明のヒト化抗体）の親和性が増大される。例えば、最低１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１若しくは１０９Ｍ−１の結合親和性を有する抗体を、それらの親和性が最低１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１若しくは１０１２Ｍ−１となるように成熟させ得る。
【０２５７】
結合分子を親和性成熟するための１アプローチは、所望の変化（１種若しくは複数）をコードする、結合分子若しくはその部分をコードする核酸を合成することである。オリゴヌクレオチド合成は当該技術分野で公知であり、そしていかなる所望のコドン変化（１個若しくは複数）を有する１種若しくはそれ以上の核酸も製造するように容易に自動化される。制限部位、サイレント突然変異および好都合なコドン使用頻度もまたこうして導入し
うる。あるいは、１種若しくはそれ以上のコドンを、特定のアミノ酸の１サブセット、例えばジスルフィド結合を形成し得るシステインを除外しかつ規定された領域、例えばＣＤＲ領域若しくはその一部分に制限されるサブセットを表すように変えることができる。あるいは、該領域は部分的に若しくは完全に無作為な一組のアミノ酸により表しうる（付加的な詳細については、例えば、米国特許第５，８３０，６５０号；同第５，７９８，２０８号；同第５，８２４，５１４号；同第５，８１７，４８３号；同第５，８１４，４７６号；同第５，７２３，３２３号；同第４，５２８，２６６号；同第４，３５９，５３号；同第５，８４０，４７９号；および同第５，８６９，６４４号明細書を参照されたい）。
【０２５８】
上のアプローチは、当該技術分野で公知であり、かつ、例えば所望の変化（１個若しくは複数）を有するオリゴヌクレオチド、例えばプライマー若しくは一本鎖核酸を二本鎖核酸にかつ適切な発現若しくはクローニングベクターへの遺伝子工作のような他の操作に適する増幅された量で組み込むという利点を有するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して部分的若しくは完全に実施し得ることが理解される。こうしたＰＣＲは、ヌクレオチドの誤取り込みを見込んでそれにより増幅されている核酸に付加的な変動性を導入する条件下でもまた実施し得る。ＰＣＲを実施するための実験の詳細ならびに関連するキット、試薬およびプライマー設計は、例えば米国特許第４，６８３，２０２号；同第４，６８３，１９５号；同第６，０４０，１６６号；および同第６，０９６，５５１号明細書に見出し得る。プライマーに基づくＰＣＲを使用する抗体フレームワーク領域へのＣＤＲ領域の導入方法は、例えば米国特許第５，８５８，７２５号明細書に記述されている。抗体分子のより大きくかつ多彩な組を効率的に増幅し得るような、抗体分子のより大きな組との配列相同性を見出すことが可能な最小のプライマー組を使用する抗体ライブラリー（および方法に従って作成したライブラリー）のプライマーに基づくＰＣＲ増幅方法は、例えば米国特許第５，７８０，２２５号；同第６，３０３，３１３号；および同第６，４７９，２４３号明細書に記述されている。部位特異的突然変異誘発のＰＣＲに基づかない実施方法もまた使用し得、そして、一本鎖のウラシル含有鋳型、および、ハイブリダイズしかつ特定株の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を通過する場合に突然変異を導入するプライマーを使用する「Ｋｕｎｋｅｌ」突然変異誘発を包含する（例えば米国特許第４，８７３，１９２号明細書を参照されたい）。
【０２５９】
抗体配列若しくはその一部分の付加的な変動方法は、至適でない（すなわち変異性）条件下での核酸合成若しくは核酸のＰＣＲ、こうした核酸の変性および再生（アニーリング）、エキソヌクレオアーゼおよび／若しくはエンドヌクレアーゼ消化、次いでライゲーション若しくはＰＣＲによる再集成（核酸シャッフリング）、または例えば米国特許第６，４４０，６６８号；同第６，２３８，８８４号；同第６，１７１，８２０号；同第５，９６５，４０８号；同第６，３６１，９７４号；同第６，３５８，７０９号；同第６，３５２，８４２号；同第４，８８８，２８６号；同第６，３３７，１８６号；同第６，１６５，７９３号；同第６，１３２，９７０号；同第６，１１７，６７９号；同第５，８３０，７２１号；および同第５，６０５，７９３号明細書に記述されるところの前述の技術の１種若しくはそれ以上の組合せを包含する。
【０２６０】
ある態様において、候補抗体分子のある部分、例えば１個若しくはそれ以上のＣＤＲ領域（若しくはその一部分）、１個若しくはそれ以上のフレームワーク領域、および／または１個若しくはそれ以上の定常領域（例えばエフェクター機能を有する定常領域）の多様性を有する候補抗体分子の一群を含んでなる抗体ライブラリー（若しくは親和性成熟ライブラリー）を、技術に認識された技術を使用して発現させ得かつ所望の特性についてスクリーニングし得る（例えば米国特許第６，２９１，１６１号；同第６，２９１，１６０号；同第６，２９１，１５９号；および同第６，２９１，１５８号明細書を参照されたい）。例えば、多様なＣＤＲ３配列を有する抗体可変ドメインの発現ライブラリー、ならびに、突然変異誘発により多様なＣＤＲ３配列を導入すること、および該ライブラリーを回収
することによる多様なＣＤＲ３配列を有するヒト抗体ライブラリーの製造方法を構築し得る（例えば米国特許第６，２４８，５１６号明細書を参照されたい）。
【０２６１】
最後に、親和性成熟させた抗体を発現するために、候補抗体分子をコードする核酸を、標準的ベクターおよび細胞トランスフェクション／形質転換技術を使用して、適切な発現形式で、例えば完全長の抗体ＨおよびＬ鎖（例えばＩｇＧ）、抗体Ｆａｂフラグメント（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２）若しくは一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）として細胞に導入し得る（例えば米国特許第６，３３１，４１５号；同第６，１０３，８８９号；同第５，２６０，２０３号；同第５，２５８，４９８号；および同第４，９４６，７７８号明細書を参照されたい）。
【０２６２】
Ｂ．免疫学的剤および治療薬をコードする核酸
アミロイド沈着物に対する免疫応答は、受動免疫に使用される抗体およびそれらの成分鎖をコードする核酸の投与によってもまた誘導し得る。こうした核酸はＤＮＡ若しくはＲＮＡであり得る。免疫原をコードする核酸セグメントは、典型的には、患者の意図される標的細胞中での該ＤＮＡセグメントの発現を可能にするプロモーターおよびエンハンサーのような調節エレメントに連結する。免疫応答の誘導のため望ましいところの血液細胞中での発現のためには、例示的プロモーターおよびエンハンサー要素は、Ｌ若しくはＨ鎖免疫グロブリン遺伝子ならびに／またはＣＭＶ主要前初期プロモーターおよびエンハンサー（Ｓｔｉｎｓｋｉ、米国特許第５，１６８，０６２号および同第５，３８５，８３９号明細書）からのものを包含する。連結した調節エレメントおよびコーディング配列はしばしばベクターにクローン化される。二本鎖抗体の投与のためには、２本の鎖を同一若しくは別個のベクターにクローン化し得る。
【０２６３】
レトロウイルス系（例えばＬａｗｒｉｅとＴｕｍｉｎ、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：１０２−１０９（１９９３）を参照されたい）；アデノウイルスベクター（例えばＢｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９１１（１９９３）を参照されたい）；アデノ随伴ウイルスベクター（例えばＺｈｏｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７（１９９４）を参照されたい）、ワクシニアウイルスおよび鶏痘ウイルスを包含するポックス族（ｐｏｘ  ｆａｍｉｌｙ）からのウイルスベクター、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林ウイルス由来のもののようなアルファウイルス属からのウイルスベクター（例えばＤｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８（１９９６）を参照されたい）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、米国特許第５，６４３，５７６号明細書を参照されたい）ならびに水疱性口内炎ウイルス（Ｒｏｓｅ、第６，１６８，９４３号明細書を参照されたい）のようなラブドウイルス、ならびにパピローマウイルス（Ｏｈｅら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：３２５（１９９５）；Ｗｏｏら、第ＷＯ  ９４／１２６２９号明細書およびＸｉａｏとＢｒａｎｄｓｍａ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２４、２６３０−２６２２（１９９６））を包含する多数のウイルスベクター系が利用可能である。
【０２６４】
免疫原をコードするＤＮＡ若しくはそれを含有するベクターはリポソームに充填し得る。適する脂質および関連類似物は、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、米国特許第５，２０８，０３６号、Ｆｅｌｇｎｅｒら、米国特許第５，２６４，６１８号、Ｒｏｓｅ、米国特許第５，２７９，８３３号およびＥｐａｎｄら、米国特許第５，２８３，１８５号明細書により記述されている。免疫原をコードするベクターおよびＤＮＡは、微粒子担体に吸着若しくはそれらと会合もまたし得、それらの例はポリメチルメタクリレートポリマーならびにポリラクチドおよびポリ（ラクチドコグリコリド）を包含する。例えばＭａｃＧｅｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏ  Ｅｎｃａｐ．（１９９６）を参照されたい。
【０２６５】
遺伝子治療ベクター若しくは裸のポリペプチド（例えばＤＮＡ）は、個々の患者への投
与、典型的には全身投与（例えば静脈内、腹腔内、鼻、胃、皮内、筋肉内、皮下若しくは頭蓋内注入）または局所適用（例えばＡｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４６号明細書を参照されたい）によりｉｎ  ｖｉｖｏ送達し得る。「裸のポリヌクレオチド」という用語は、トランスフェクション促進剤とともに送達されないポリヌクレオチドを指す。裸のポリヌクレオチドはときにプラスミドベクターにクローン化される。こうしたベクターは、ブピバカイン（Ｗｅｉｎｅｒら、米国特許第５，５９３，９７２号明細書）のような促進剤をさらに包含し得る。ＤＮＡは遺伝子銃を使用してもまた投与し得る。ＸｉａｏとＢｒａｎｄｓｍａ、上記を参照されたい。免疫原をコードするＤＮＡを微細な金属ビーズの表面上に沈殿させる。微小発射体をショック波若しくは膨張ヘリウムガスで加速し、そして数細胞層の深さまで組織に浸透する。例えば、Ａｇｒｉｃｅｔｕｓ，Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州ミドルトンにより製造されるＡｃｃｅｌＴＭ遺伝子送達装置が適する。あるいは、裸のＤＮＡは、単純に該ＤＮＡを化学的若しくは機械的刺激を伴い皮膚上にスポットすることにより血流中まで皮膚を通過させ得る（Ｈｏｗｅｌｌら、第ＷＯ  ９５／０５８５３号明細書を参照されたい）。
【０２６６】
さらなる一変形において、免疫原をコードするベクターは、個々の患者から外植した細胞（例えばリンパ球、骨髄吸引液、組織生検）若しくは普遍的ドナー造血幹細胞のような細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで送達し得、次いで、通常はベクターを取り込んだ細胞について選択後に患者に該細胞を再移植し得る。
【０２６７】
ＩＩ．予防および治療方法
本発明は、とりわけ、可溶性Ａβを特徴とするアミロイド形成障害および疾患（例えばアルツハイマー病）を包含するＡβ関連疾患若しくは障害の処置に向けられる。本発明は、Ａβ関連疾患若しくは障害またはアミロイド形成疾患若しくは障害の処置若しくは予防のための医薬品の製造における開示される免疫学的試薬（例えばヒト化免疫グロブリン）の使用にもまた向けられる。本発明の処置方法は、例えば、Ａβ関連疾患若しくは障害またはアミロイド形成疾患若しくは障害の予防若しくは処置のための患者における、患者で有益な治療応答（例えば認知の迅速な改善、Ａβの食作用の誘導、斑負荷量の減少、斑形成の阻害、神経炎性ジストロフィーの低減、および／または認知低下の逆転、処置若しくは予防）を生成させる条件下での患者への開示される免疫学的試薬（例えばＡβ内の特定のエピトープに対するヒト化免疫グロブリン）の投与を含んでなる。こうした疾患は、アルツハイマー病、ダウン症候群および軽度認知障害を包含する。後者はアミロイド形成疾患の他の特徴を伴い若しくは伴わずに発生し得る。
【０２６８】
本発明の免疫学的試薬を使用して、前記免疫学的試薬での処置が該障害に罹患している患者に治療上の利益を提供することが示されているいかなる障害も処置しうることが、当業者により認識されるであろう。例えば、障害はいかなる認知障害、例えば痴呆障害でもありうる。こうした認知障害は、多数の起源、すなわち、機能的機序（不安、うつ）、生理学的加齢（加齢による記憶障害）、薬物若しくは解剖学的病変を有しうる。本発明の免疫治療薬が有用であり得る適応症は、毒物曝露による学習障害若しくは記憶障害、健忘に至る脳傷害、加齢、統合失調症、癲癇、精神遅滞、アルコール性ブラックアウト、コルサコフ症候群、薬物誘発性健忘（例えばハルシオン）、脳底動脈偏頭痛、若しくは単純ヘルペス脳炎と関連する記憶喪失を包含する。
【０２６９】
本発明のいくつかの方法は、アミロイド沈着物の成分に特異的に結合する抗体の有効投薬量を患者に投与することを含んでなる。こうした方法はヒト患者におけるアルツハイマー病を予防若しくは処置するのにとりわけ有用である。例示的方法は、Ａβに結合する抗体の有効投薬量を投与することを含んでなる。好ましい方法は、Ａβの残基１−１０内の１エピトープに特異的に結合する抗体、例えばＡβの残基１−３内の１エピトープに特異的に結合する抗体、Ａβの残基１−４内の１エピトープに特異的に結合する抗体、Ａβの
残基１−５内の１エピトープに特異的に結合する抗体、Ａβの残基１−６内の１エピトープに特異的に結合する抗体、Ａβの残基１−７内の１エピトープに特異的に結合する抗体、若しくはＡβの残基３−７内の１エピトープに特異的に結合する抗体の有効投薬量を投与することを含んでなる。なお別の局面において、本発明は、Ａβの遊離Ｎ末端残基を含んでなる１エピトープに結合する抗体を投与することを特徴とする。なお別の局面において、本発明は、Ａβの残基１および／若しくは残基７がアスパラギン酸であるＡβの１−１０の残基内の１エピトープに結合する抗体を投与することを特徴とする。なお別の局面において、本発明は、完全長のアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）に結合することなくＡβペプチドに特異的に結合する抗体を投与することを特徴とする。なお別の局面において、該抗体のアイソタイプはヒトＩｇＧ１である。なお別の局面において、該抗体のアイソタイプはヒトＩｇＧ４である。別の局面において、本発明のヒト抗体は低下されたエフェクター機能（例えば、低下されたＦｃ媒介性の食作用、斑をオプソニン化する低下された能力など）を有するアイソタイプを有するよう工作される。特定の一態様において、本発明の抗体はＩｇＧ４アイソタイプを有するヒト化１２Ａ１１抗体（例えばヒト化１２Ａ１１  ｖ．１）である。
【０２７０】
なお別の局面において、本発明はＡβの遊離Ｎ末端残基を含んでなる１エピトープに結合する抗体を投与することを特徴とする。なお別の局面において、本発明は完全長のアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）に結合することなくＡβペプチドに特異的に結合する抗体を投与することを特徴とする。なお別の局面において、該抗体のアイソタイプはヒトＩｇＧ１である。なお別の態様において、本発明は可溶性Ａβに結合かつ／若しくはそれを捕捉する抗体を投与することを特徴とする。
【０２７１】
なお別の局面において、本発明は、患者中のアミロイド沈着物に結合しかつアミロイド沈着物に対する消失応答を誘導する抗体を投与することを特徴とする。例えば、こうした消失応答はＦｃ受容体媒介性の食作用により遂げられ得る。こうした消失応答は、例えばＦｃ受容体結合ドメイン（例えばＩｇＧ２ａ定常領域）を包含することにより抗体に工作し得る。
【０２７２】
該方法は、無症状の患者および疾患の症状を現在示している者双方で使用し得る。Ａβ関連疾患若しくは障害またはアミロイド形成疾患若しくは障害を伴うヒト被験体の受動免疫若しくは免疫療法にで使用される抗体は、ヒト、ヒト化、キメラ若しくはヒト以外の抗体またはそれらのフラグメント（例えば抗原結合フラグメント）であり得、かつ、本明細書に記述されるところのモノクローナル若しくはポリクローナルであり得る。別の局面において、本発明は、製薬学的担体を伴う抗体を製薬学的組成物として投与することを特徴とする。あるいは、抗体は最低１本の抗体鎖をコードするポリヌクレオチドを投与することにより患者に投与し得る。該ポリヌクレオチドが患者中で発現されて抗体鎖を産生する。場合によっては、該ポリヌクレオチドは抗体のＨおよびＬ鎖をコードする。該ポリヌクレオチドが患者中で発現されてＨおよびＬ鎖を産生する。例示的態様において、患者の血中の投与された抗体のレベルについて該患者をモニターする。
【０２７３】
別の局面において、本発明は製薬学的担体を伴う抗体を製薬学的組成物として投与することを特徴とする。あるいは、該抗体は最低１本の抗体鎖をコードするポリヌクレオチドを投与することにより患者に投与し得る。該ポリヌクレオチドが患者中で発現されて抗体鎖を産生する。場合によっては、該ポリヌクレオチドは抗体のＨおよびＬ鎖をコードする。該ポリヌクレオチドが患者中で発現されてＨおよびＬ鎖を産生する。例示的態様において、患者の血中の投与された抗体のレベルについて該患者をモニターする。
【０２７４】
本発明は、かように、Ａβ関連疾患若しくは障害またはアミロイド形成疾患若しくは障害（例えばＡＤ）と関連する神経病理学、および若干の患者では認知障害を予防若しくは
改善するための治療レジメンに対する長年の必要性を満足する。
【０２７５】
Ａ．認知の迅速な改善
本発明は、Ａβ関連疾患若しくは障害またはアミロイド形成疾患若しくは障害（例えばＡＤ）を有するか若しくはそれに罹患する危険性がある患者での認知の迅速な改善を遂げる方法を提供する。好ましい局面において、該方法は、認知の迅速な改善が達成されるような有効用量の１２Ａ１１免疫学的試薬を投与することを特徴とする。本発明の例示的局面において、患者での１種若しくはそれ以上の認知障害（例えば手続き学習および／若しくは記憶障害）の改善が達成される。認知障害は、意識に利用可能でありかつ従って言語により表現され得る特定の情報を保存かつ想起する能力（例えば特定の事実若しくは事象を思い出す能力）と定義される顕在記憶（「陳述」若しくは「作業」記憶としてもまた知られる）の障害であり得る。あるいは、認知障害は、意識に利用可能でなくかつ表現されるために技術、連合、習慣若しくは複雑な反射の学習を必要とする、一般情報若しくは知識を取得、保持および想起する能力、例えば特殊な課題をどのように実行するかを思い出す能力と定義される手続記憶（「潜在」若しくは「文脈」記憶としてもまた知られる）の障害であり得る。手続記憶障害に罹患している個体は正常に機能する彼らの能力がはるかにより損なわれている。であるから、手続記憶の障害の改善において有効である処置が高度に望ましくかつ有利である。
【０２７６】
ある態様において、本発明は、抗体の投与後１か月以内に迅速な改善が達成されるような被験体への抗体剤の投与を含んでなる、被験体での認知の迅速な改善を遂げる方法を提供する。他の態様において、認知の迅速な改善は抗体の投与後１週以内に達成される。他の態様において、認知の迅速な改善は抗体の投与後１日以内に達成される。なお他の態様において、認知の迅速な改善は抗体の投与後１２時間以内に達成される。
【０２７７】
Ｂ．処置に従いやすい患者
処置に従いやすい患者は、Ａβ関連疾患若しくは障害またはアミロイド形成疾患若しくは障害の危険性があるがしかし症状を示していない個体、ならびに現在症状を示している患者を包含する。アルツハイマー病の場合、事実上誰でも彼若しくは彼女が十分に長く生きる場合にアルツハイマー病に罹患する危険性がある。従って、本方法は、主題の患者の危険性のいかなる評価に対する必要性も伴わずに一般集団に予防的に投与し得る。
【０２７８】
本方法は、ＡＤの危険性がある個体、例えばＡＤの危険因子を表す者にとりわけ有用である。ＡＤの主な危険因子は増大した年齢である。集団が加齢する際に、ＡＤの頻度は増大し続ける。現在の推定は、６５歳以上の集団の１０％まで、および８５歳以上の集団の５０％までがＡＤを有することを示す。
【０２７９】
まれとは言え、ある種の個体はＡＤを発症する遺伝的傾向があると若齢で同定され得る。「家族性ＡＤ」若しくは「早発型ＡＤ」として知られる遺伝可能な形態のＡＤを保有する個体は、変異される場合にＡＤを賦与することが既知である遺伝子、例えばＡＰＰ若しくはプレセニリン遺伝子の分析の、ＡＤの十分に報告された家族歴から同定され得る。十分に特徴づけられたＡＰＰ突然変異は、ＡＰＰ７７０のコドン７１６および７１７の「ハーディ型」突然変異（例えば、バリン７１７からイソロイシン（Ｇｏａｔｅら、（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：７０４）；バリン７１７からグリシン（Ｃｈａｒｔｉｅｒら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：８４４；Ｍｕｒｒｅｌｌら（１９９１）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：９７）；バリン７１７からフェニルアラニン（Ｍｕｌｌａｎら（１９９２）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１：３４５−７））、ＡＰＰ７７０のコドン６７０および６７１の「スウェーデン型」突然変異、ならびにＡＰＰ７７０のコドン６９２の「フランダース型」突然変異を包含する。こうした突然変異は、ＡＰＰのＡβへの増大された若しくは変えられたプロセシング、とりわけ増大された量の長い形態のＡβ（すなわち
Ａβ１−４２およびＡβ１−４３）へのＡＰＰのプロセシングによりアルツハイマー病を引き起こすと考えられる。プレセニリン遺伝子ＰＳ１およびＰＳ２のような他の遺伝子中の突然変異は、増大された量の長い形態のＡβを生成させるＡＰＰのプロセシングに影響を及ぼすと間接的に考えられる（Ｈａｒｄｙ、ＴＩＮＳ  ２０：１５４（１９９７）；Ｋｏｗａｌｓｋａら、（２００４）、Ｐｏｌｉｓｈ  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、５６：１７１−８を参照されたい）。ＡＤに加えて、ＡＰＰの７７０アミノ酸のアイソフォームのアミノ酸６９２若しくは６８３の突然変異は、オランダ型のアミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）と呼ばれる脳のアミロイド形成障害に関与している。
【０２８０】
より一般的には、ＡＤは患者により遺伝されないが、しかし多様な遺伝因子の複雑な相互作用により発症する。これらの個体は、診断することがはるかにより困難である一形態「散発性ＡＤ」（「晩発型ＡＤ」としてもまた知られる）を有すると言われる。にもかかわらず、患者集団は、ＡＤを引き起こさないがしかし一般集団より高頻度でＡＤで分離することが既知である感受性アレル若しくは形質、例えばアポリポタンパク質Ｅのε２、ε３およびε４アレル（Ｃｏｒｄｅｒら（１９９３）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１：９２１−９２３）の存在についてスクリーニングし得る。とりわけ、好ましくはＡＤの何らかの他のマーカーに加えてε４アレルを欠く患者はＡＤの「危険性がある」と同定しうる。例えば、ＡＤを有するまたは高コレステロール血症若しくはアテローム硬化症に罹患している親族を有する、ε４アレルを欠く患者は、ＡＤの「危険性がある」と同定しうる。別の潜在的生体マーカーは、脳脊髄液（ＣＳＦ）のＡβ４２およびτのレベルの複合評価である。低いＡβ４２および高いτレベルはＡＤの危険性がある患者の同定において予測的価値を有する。
【０２８１】
ＡＤの危険性がある患者の他の指標は、ｉｎ  ｖｉｖｏの動的神経病理学的データ、例えば脳βアミロイドのｉｎ  ｖｉｖｏ検出、脳活性化のパターンなどを包含する。こうしたデータは、例えば三次元磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）、陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）走査およびシングルフォトンエミッションＣＴ（ＳＰＥＣＴ）を使用して得ることができる。可能なＡＤを有する患者の指標は、限定されるものでないが（１）痴呆を有する、（２）４０〜９０歳の、（３）例えば２個若しくはそれ以上の認知領域での認知障害、（４）６か月以上の障害の進行、（５）意識平静、および／若しくは（６）他の合理的診断の非存在の患者を挙げることができる。
【０２８２】
散発性若しくは家族性いずれの形態のＡＤに罹患している個体も、しかしながら、通常はＡＤの１種若しくはそれ以上の特徴的症状の提示後に診断される。ＡＤの一般的症状は、慣例の技能若しくは課題の実施に影響を及ぼす認知障害、言語での問題、時間若しくは場所に対する失見当、不十分若しくは低下した判断、抽象的思考の障害、運動調節の喪失、気分若しくは行動の変化、人格変化または自発性の喪失を包含する。患者により表される数障害若しくは認知障害の程度は通常、疾患が進行した程度を反映する。例えば、患者は、該患者が記憶（例えば文脈記憶）で問題を表すがしかしそれ以外は十分に機能することが可能であるような軽度認知障害のみを表しうる。
【０２８３】
本方法はＡβ関連認知障害、例えばＡβ関連痴呆を有する個体にもまた有用である。とりわけ、本方法は、中枢神経系（ＣＮＳ）、例えば脳若しくはＣＳＦ中の可溶性オリゴマーＡβの存在により引き起こされるか若しくはそれに起因する認知障害若しくは異常を有する個体にとりわけ有用である。Ａβにより引き起こされるか若しくはそれに関連する認知障害は、（１）脳中でのβアミロイド斑の発生；（２）Ａβの合成、プロセシング、分解若しくは消失の異常な速度；（３）（例えば脳中の）可溶性オリゴマーＡβ種の形成若しくは活性；および／または（４）異常な形態のＡβの形成により引き起こされるか若しくはそれらに関連するものもまた包含する。実際の因果関係が特定の患者でＡβ異常と認知障害の間で確立されることは必要でないが、しかしながら、若干の関連が、例えば、Ａ
β免疫治療薬での処置が有効であると期待されないとみられる非Ａβ関連認知障害に罹患している患者を識別するための、ＡＤの上述されたマーカーの１つにより示されるはずである。
【０２８４】
ヒト被験体、例えば痴呆障害（例えばＡＤ）の症状若しくは病理学の危険性があるか若しくはそれらを有する被験体での認知技能若しくは能力を評価するための数種の検査が開発された。認知障害はこれらの検査の損なわれた成績により同定され得、そして、多くの処置がこれらの検査での成績を改善させるそれらの能力に基づいて提案されている。いくつかの課題が被験体の行動若しくは運動機能を評価したとは言え、大部分の課題は学習若しくは記憶を検査するために設計された。
【０２８５】
ヒトでの認知は限定されるものでないが以下の検査を挙げることができる多様な検査を使用して評価しうる。ＡＤＡＳ−Ｃｏｇ（アルツハイマー病認知評価尺度（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｓｃａｌｅ−Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ）は終了するのに３０分かかる１１部分の検査である。ＡＤＡＳ−Ｃｏｇは言語および記憶技能の研究のための好ましい簡易検査である。Ｒｏｓｅｎら（１９８４）Ａｍ  Ｊ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．１４１（１１）：１３５６−６４；Ｉｈｌら（２０００）Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｂｉｏｌ．４１（２）：１０２−７；およびＷｅｙｅｒら（１９９７）Ｉｎｔ
Ｐｓｙｃｈｏｇｅｒｉａｔｒ．９（２）：１２３−３８を参照されたい。
【０２８６】
Ｂｌｅｓｓｅｄ検査は、日常生活動作および記憶、集中ならびに見当識を評価する認知の別の短時間（約１０分）の検査である。Ｂｌｅｓｓｅｄら（１９６８）Ｂｒ  Ｊ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １１４（５１２）：７９７−８１１を参照されたい。
【０２８７】
ケンブリッジ神経心理学自動検査（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｓｔ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｂａｔｔｅｒｙ）（ＣＡＮＴＡＢ）は神経変性疾患若しくは脳損傷を伴うヒトの認知障害の評価に使用される。それは、記憶、注意および実行機能の１３の相互に関連づけられたコンピュータ化検査よりなり、そしてパーソナルコンピュータからタッチスクリーンを介して実施する。この検査は言語およびほとんど文化によらず、そしてアルツハイマー病の早期検出および慣例のスクリーニングで高度に感受性であることが示された。Ｓｗａｉｎｓｏｎら（２００１）Ｄｅｍｅｎｔ  Ｇｅｒｉａｔｒ  Ｃｏｇｎ  Ｄｉｓｏｒｄ．；１２：２６５−２８０；およびＦｒａｙとＲｏｂｂｉｎｓ（１９９６）Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌ  Ｔｅｒａｔｏｌ．１８（４）：４９９−５０４．Ｒｏｂｂｉｎｓら（１９９４）Ｄｅｍｅｎｔｉａ  ５（５）：２６６−８１を参照されたい。
【０２８８】
アルツハイマー病レジストリ確立協会（Ｔｈｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｔｏ  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈ  ａ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）（ＣＥＲＡＤ）の臨床および神経心理学検査は、言語の流暢さの検査、ボストン命名検査（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｎａｍｉｎｇ  Ｔｅｓｔ）、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）、１０項目語想起、構造練習（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒａｘｉｓ）、および練習項目の遅延想起を包含する。該検査は典型的に２０〜３０分かかり、そして認知低下の評価および追跡で便宜的かつ有効である。Ｍｏｒｒｉｓら（１９８８）Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｂｕｌｌ．２４（４）：６４１−５２；Ｍｏｒｒｉｓら（１９８９）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ３９（９）：１１５９−６５；およびＷｅｌｓｈら（１９９１）Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ．４８（３）：２７８−８１を参照されたい。
【０２８９】
１９７５年にＦｏｌｅｓｔｅｉｎらにより開発されたミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）は精神状態および認知機能の簡易検査である。それは他の精神現象を評価せず、そして従って完全な精神状態検査の代用でない。それは痴呆のスクリーニングにおいて有用
であり、また、その評価体系は進行の長期にわたる追跡において有用である。ミニメンタルステート検査ＭＭＳＥは、年齢および教育について基準を補正して広範に使用されている。それは認知障害をスクリーニングするため、所定の時点の認知障害の重症度を推測するため、１個体の認知変化の経過を長期にわたり追跡するため、および処置に対する１個体の応答を報告するために使用し得る。被験体の認知評価は、９か月若しくはそれ以上（ヒトにおいて）分離された経過観察検査を伴う、公式の神経心理学検査を必要としうる。Ｆｏｌｓｔｅｉｎら（１９７５）Ｊ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ  Ｒｅｓ．１２：１９６−１９８；ＣｏｃｋｒｅｌｌとＦｏｌｓｔｅｉｎ（１９８８）Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ．２４（４）：６８９−６９２；およびＣｒｕｍら（１９９３）Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  １８：２３８６−２３９１を参照されたい。
【０２９０】
Ｓｅｖｅｎ−Ｍｉｎｕｔｅ  Ｓｃｒｅｅｎは、アルツハイマー病について評価すべきである患者を同定するのを助けるスクリーニングツールである。該スクリーニングツールは、多様な型の知的機能性を評価するための一連の質問を使用し、ＡＤの早期徴候に高度に感受性である。該検査は、見当識、記憶、視覚空間技能および表現言語を焦点とする４組の質問よりなる。それは正常な加齢過程による認知変化と痴呆による認知障害を識別し得る。ＳｏｌｏｍｏｎとＰｅｎｄｌｅｂｕｒｙ（１９９８）Ｆａｍ  Ｍｅｄ．３０（４）：２６５−７１、Ｓｏｌｏｍｏｎら（１９９８）Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ．５５（３）：３４９−５５を参照されたい。
【０２９１】
アルツハイマー病に現在罹患している個体は、特徴的な痴呆ならびに上述された危険因子の存在から認識され得る。加えて、多数の診断検査が、ＡＤを有する個体を同定するために利用可能である。これらはＣＳＦのτおよびＡβ４２レベルの測定を包含する。上昇したτおよび低下したＡβ４２レベルはＡＤの存在を意味する。アルツハイマー病に罹患している個体は、実施例の節で論考されるところのＡＤＲＤＡ基準によってもまた診断し得る。
【０２９２】
Ｃ．処置レジメンおよび投薬量
予防的応用において、製薬学的組成物若しくは医薬品を、アルツハイマー病に感受性の、若しくは別の方法でその危険性がある患者に、該危険を排除もしくは低下、重症度を低下、または、該疾患の生化学的、組織学的および／若しくは行動的症状、その合併症、ならびに該疾患の発症の間に現れる中間の病理学的表現型を包含する該疾患の発症を遅らせるのに十分な量で投与する。治療的応用においては、組成物若しくは医薬品を、こうした疾患に感受性の、若しくはすでに罹患している患者に、その合併症および該疾患の発症での中間の病理学的表現型を包含する該疾患の症状（生化学的、組織学的および／若しくは行動的）を治癒若しくは少なくとも部分的に抑止するのに十分な量で投与する。
【０２９３】
いくつかの方法において、試薬の投与は、特徴的なアルツハイマー病の病理を未だ発生していない患者において筋認識（ｍｙｏｃｏｇｎｉｔｉｖｅ）障害を低下若しくは排除する。治療的若しくは予防的処置を達成するのに十分な量は、治療的若しくは予防的有効用量と定義する。予防的および治療的双方のレジメンで、試薬は通常、十分な免疫応答が達成されるまで数投薬量で投与する。「免疫応答」若しくは「免疫学的応答」という用語は、レシピエント被験体中の抗原に向けられた体液性（抗体媒介性）および／または細胞性（抗原特異的Ｔ細胞若しくはそれらの分泌産物により媒介される）応答の発生を包含する。こうした応答は、能動的応答（すなわち免疫原の投与により誘導される）または受動的応答（すなわち免疫グロブリン若しくは抗体または予め刺激されたＴ細胞の投与により誘導される）であり得る。典型的には、免疫応答をモニターし、そして免疫応答が弱まり始める場合に反復投薬量を与える。
【０２９４】
上述された状態の処置のための本発明の組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患
者の生理学的状態、患者がヒトであるか若しくは動物であるか、投与される他の医薬品、および処置が予防的であるか若しくは治療的であるかを包含する多くの多様な因子に依存して変動する。通常、患者はヒトであるが、しかしトランスジェニック哺乳動物を包含するヒト以外の哺乳動物もまた処置し得る。処置投薬量は安全性および有効性を至適化するように滴定される必要がある。
【０２９５】
抗体での受動免疫については、投薬量は約０．０００１から１０ｍｇ／ｋｇまで、およびより通常は０．０１ないし５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇなど）宿主体重の範囲にわたる。例えば、投薬量は１ｍｇ／ｋｇ体重若しくは１０ｍｇ／ｋｇ体重、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは最低１ｍｇ／ｋｇであり得る。別の例において、投薬量は０．５ｍｇ／ｋｇ体重若しくは１５ｍｇ／ｋｇ体重、または０．５〜１５ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは最低１ｍｇ／ｋｇであり得る。別の例において、投薬量は０．５ｍｇ／ｋｇ体重若しくは２０ｍｇ／ｋｇ体重、または０．５〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは最低１ｍｇ／ｋｇであり得る。別の例において、投薬量は０．５ｍｇ／ｋｇ体重若しくは３０ｍｇ／ｋｇ体重、または０．５〜３０ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは最低１ｍｇ／ｋｇであり得る。好ましい一例において、投薬量は約３０ｍｇ／ｋｇであり得る。とりわけ好ましい一例において、１２Ａ１１抗体はおよそ０．３ｍｇ／ｋｇからおよそ３０ｍｇ／ｋｇまでの用量範囲で腹腔内投与される。
【０２９６】
ある態様において、本発明の方法は、単一用量としての被験体への抗体剤（例えばＡβ抗体）の投与を含んでなる。他の態様において、本発明の方法は、複数用量での被験体への抗体剤（例えばＡβ抗体）の投与を含んでなる。一態様において、Ａβ抗体の用量は約１００μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ患者体重までである。別の態様において、Ａβ抗体の用量は約３００μｇ／ｋｇから３０ｍｇ／ｋｇ患者体重までである。なお別の態様において、Ａβ抗体の用量は約１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ患者体重までである。
【０２９７】
上の範囲の中間の用量もまた本発明の範囲内にあることを意図している。被験体は、こうした用量を毎日、隔日、週１回、若しくは経験的分析により決定されるいずれかの他の計画に従って投与され得る。例示的一処置は、例えば最低６か月の長期にわたる複数の投薬量での投与を必要とする。付加的な例示的処置レジメンは、２週ごとあたり１回若しくは月１回若しくは３ないし６か月ごとに１回の投与を必要とする。例示的投薬スケジュールは、連日１〜１０ｍｇ／ｋｇ若しくは１５ｍｇ／ｋｇ、隔日３０ｍｇ／ｋｇ、または週１回６０ｍｇ／ｋｇを包含する。いくつかの方法において、異なる結合特異性をもつ２種若しくはそれ以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、この場合、投与される各抗体の投薬量は示される範囲内にある。
【０２９８】
抗体は通常、複数の機会に投与する。単一投薬量の間の間隔は週、月若しくは年であり得る。間隔は患者のＡβに対する抗体の血液濃度を測定することにより示されるとおり不規則でもまたあり得る。いくつかの方法においては、投薬量を１〜１０００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度、およびいくつかの方法では２５〜３００μｇ／ｍｌを達成するように調節する。あるいは、抗体は除放製剤として投与し得、この場合より少なく頻繁な投与が必要とされる。投薬量および頻度は患者での抗体の半減期に依存して変動する。一般に、ヒト化抗体は最長の半減期を示し、次いでキメラ抗体およびヒト以外の抗体である。
【０２９９】
投薬量および投与頻度は、処置が予防的であるか若しくは治療的であるかに依存して変動し得る。予防的応用において、本抗体若しくはそれらのカクテルを含有する組成物を未だ疾患状態にない患者に投与して該患者の抵抗性を高める。こうした量は「予防的有効用量」であると定義する。この使用において、正確な量は、再度、患者の健康状態および全般的な免疫に依存するが、しかし一般に投与あたり０．１から２５ｍｇまで、とりわけ投
与あたり０．５ないし２．５ｍｇの範囲にわたる。比較的低投薬量を長期にわたり比較的頻繁でない間隔で投与する。若干の患者は彼らの生涯の残りの間処置を受領し続ける。
【０３００】
無症状の患者においては、処置はいずれの齢（例えば１０、２０、３０）でも開始し得る。通常は、しかしながら、患者が４０、５０、６０若しくは７０歳に達するまで処置を開始することは必要でない。処置は、典型的には長期にわたる複数投薬量を必要とする。処置は長期にわたり抗体濃度をアッセイすることによりモニターし得る。応答が下落する場合は追加刺激投薬量が指示される。潜在的ダウン症候群患者の場合、処置は治療試薬を母親に投与することにより出生前に、若しくは出生直後に開始し得る。
【０３０１】
治療的応用においては、疾患の進行を低下若しくは終了させるまで、および好ましくは患者が疾患の症状の部分的若しくは完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高投薬量（例えば投与あたり約１から２００ｍｇまでの抗体、５から２５ｍｇのまで投薬量をより一般的に使用する）がときに必要とされる。その後、本特許は予防的レジメンを投与し得る。
【０３０２】
抗体をコードする核酸の用量は、患者あたり約１０ｎｇから１ｇまで、１００ｎｇないし１００ｍｇ、１μｇないし１０ｍｇ、若しくは３０〜３００μｇのＤＮＡの範囲にわたる。感染性ウイルスベクターの用量は、投与あたり１０〜１００個若しくはそれ以上のビリオンまで変動する。
【０３０３】
治療的試薬は、予防的および／若しくは治療的処置のため非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻内若しくは筋肉内手段により投与し得る。免疫原剤の最も典型的な投与経路は皮下であるとは言え、他の経路が等しく有効であり得る。次の最も一般的な経路は筋肉内注入である。この型の注入は、最も典型的には腕若しくは脚の筋肉で実施する。いくつかの方法においては、沈着物が蓄積した特定の組織に試薬を直接注入する（例えば頭蓋内注入）。筋肉内注入若しくは静脈内注入が抗体の投与に好ましい。いくつかの方法において、特定の治療的抗体を頭蓋中に直接注入する。いくつかの方法においては、抗体を徐放性組成物若しくはＭｅｄｉｐａｄＴＭ装置のような装置として投与する。
【０３０４】
本発明の免疫学的試薬は、場合によっては、アミロイド形成疾患の処置で少なくとも部分的に有効である他の剤とともに投与し得る。ある態様において、本発明のヒト化抗体（例えばヒト化１２Ａ１１）を、第二の免疫原性若しくは免疫学的試薬とともに投与する。例えば、本発明のヒト化１２Ａ１１抗体をＡβに対する別のヒト化抗体とともに投与し得る。他の態様において、ヒト化１２Ａ１１抗体を、Ａβワクチンを受領した若しくは受領している患者に投与する。アミロイド沈着物が脳に存在するアルツハイマー病およびダウン症候群の場合には、本発明の剤は、血液脳関門を横断する本発明の剤の通過を増大させる他の剤とともにもまた投与し得る。本発明の免疫学的試薬は、標的細胞若しくは組織への該治療薬の到達を高める他の剤、例えばリポソームなどとともにもまた投与し得る。こうした剤を共投与することは、所望の効果を達成するのに必要とされる治療薬（例えば治療的抗体若しくは抗体鎖）の投薬量を減少させ得る。
【０３０５】
Ｄ．製薬学的組成物
本発明の免疫学的試薬はしばしば有効成分、すなわち、および多様な他の製薬学的に許容できる成分を含んでなる製薬学的組成物として投与される。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（第１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルバニア州イーストン（１９８０））を参照されたい。好ましい剤形は意図される投与様式および治療的応用に依存する。組成物は、所望の製剤に依存して、製薬学的に許容できる非毒性の担体若しくは希釈剤（動物若しくはヒト投与
のために製薬学的組成物を処方するのに一般に使用されるベヒクルと定義される）もまた包含し得る。希釈剤は該組合せの生物学的活性に影響を及ぼさないように選択する。こうした希釈剤の例は、蒸留水、生理学的リン酸緩衝生理的食塩水、リンゲル液、Ｄ−ブドウ糖溶液およびハンクス液である。加えて、製薬学的組成物若しくは製剤は他の担体、補助物質、若しくは非毒性の非治療的非免疫原性安定剤などもまた包含しうる。
【０３０６】
製薬学的組成物は、タンパク質、キトサンのような多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびコポリマー（ラテックス官能性化セファロース（ＴＭ）、アガロ―ス、セルロースなどのような）、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、ならびに脂質凝集物（油滴若しくはリポソームのような）のような大型のゆっくりと代謝される巨大分子もまた包含し得る。加えて、これらの担体は免疫刺激剤（すなわちアジュバント）としても機能し得る。
【０３０７】
非経口投与のためには、本発明の剤は、水、油、生理的食塩水、グリセロール若しくはエタノールのような無菌の液体であり得る製薬学的担体を含む生理学的に許容できる希釈在中の該物質の溶液若しくは懸濁液の注入可能な投薬量として投与し得る。加えて、湿潤剤若しくは乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質などのような補助物質が組成物中に存在し得る。製薬学的組成物の他の成分は、石油、動物、植物若しくは合成起源のもの、例えばラッカセイ油、ダイズ油および鉱物油である。一般に、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールのようなグリコールは、とりわけ注入可能な溶液の好ましい液体担体である。抗体は、有効成分の持続放出を可能にするような様式で処方し得るデポー注射剤若しくは植込物製剤の形態で投与し得る。例示的組成物は、ＨＣｌでｐＨ６．０に調節した５０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌよりなる水性緩衝液中で処方した５ｍｇ／ｍＬのモノクローナル抗体を含んでなる。
【０３０８】
典型的には、組成物は液体の溶液若しくは懸濁液いずれかとしての注入可能物として製造され；注入前の液体ベヒクル中の溶液若しくは懸濁液に適する固体の形態もまた製造し得る。該製剤は、上で論考されたところの高められたアジュバント効果のためのリポソーム、またはポリラクチド、ポリグリコリド若しくはコポリマーのような微粒子中に乳化若しくは被包化もまたされ得る（Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７（１９９０）およびＨａｎｅｓ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２８：９７（１９９７）を参照されたい）。本発明の剤は、有効成分の持続性若しくはパルス放出を可能にするような様式で処方し得るデポー注射剤若しくは植込物製剤の形態で投与し得る。
【０３０９】
他の投与様式に適する付加的な製剤は、経口、鼻内および肺製剤、坐剤、ならびに経皮適用を包含する。坐剤については、結合剤および担体は、例えばポリアルキレングリコール若しくはトリグリセリドを包含し；こうした坐剤は０．５％ないし１０％、好ましくは１％〜２％の範囲の有効成分を含有する混合物から成形し得る。経口製剤は、製薬学的等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロースおよび炭酸マグネシウムのような賦形剤を包含する。これらの組成物は、溶液、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、除放製剤若しくは散剤の形態を取り、そして１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の有効成分を含有する。
【０３１０】
局所適用は経皮若しくは皮内送達をもたらし得る。局所投与は、コレラ毒素またはその無毒化誘導体若しくはサブユニット、あるいは他の類似の細菌毒素との該剤の共投与により助長し得る（Ｇｌｅｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１、８５１（１９９８）を参照されたい）。共投与は成分を混合物として、または化学的架橋若しくは融合タンパク質としての発現により得られる結合された分子として使用することにより達成し得る。
【０３１１】
あるいは、経皮送達は皮膚貼付剤を使用して、若しくはトランスフェロソーム（Ｐａｕｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：３５２１（１９９５）；Ｃｅｖｃら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３６８：２０１−１５（１９９８））を使用して達成し得る。
【０３１２】
Ｅ．処置の経過のモニタリング
本発明は、アルツハイマー病に罹患しているか若しくはそれに感受性の患者における処置のモニター方法、すなわち患者に投与されている処置の経過のモニター方法を提供する。該方法を使用して、症候性患者での治療的処置および無症候性患者での予防的処置の双方をモニターし得る。とりわけ、該方法は受動免疫をモニターする（例えば投与された抗体のレベルを測定する）のに有用である。
【０３１３】
いくつかの方法は、例えば、１投薬量の剤を投与する前の患者での抗体レベル若しくはプロファイルの基礎値を測定すること、およびこれを処置後の該プロファイル若しくはレベルの値と比較することを必要とする。レベル若しくはプロファイルの値の有意の増大（すなわち、こうした測定値の平均からの１標準偏差として表される、同一サンプルの反復測定での実験誤差の典型的範囲より大きい）は正の処置の結果（すなわち、該剤の投与が所望の応答を達成したこと）を知らせる。免疫応答の値が有意に変化しないか若しくは減少する場合は、負の処置結果を示す。
【０３１４】
他の方法において、レベル若しくはプロファイルの対照値（すなわち平均および標準偏差）を対照集団について測定する。典型的には、対照集団の個体は以前の治療を受領していない。治療薬を投与した後の患者でのレベル若しくはプロファイルの測定値をその後該対照値と比較する。対照値に関しての有意の増大（例えば平均から１標準偏差より大きい）は正のすなわち十分な処置結果を知らせる。有意の増大の欠如若しくは減少は負のすなわち不十分な処置結果を知らせる。剤の投与は、一般に該レベルが対照値に関して増大している間継続する。前のとおり、対照値に関してのプラトーの到達は、処置の投与が中断または投薬量および／若しくは頻度を低下され得ることの指標である。
【０３１５】
他の方法において、レベル若しくはプロファイルの対照値（例えば平均および標準偏差）を、治療薬での処置を受けかつそのレベル若しくはプロファイルが処置に応答してプラトーに達した個体の対照集団から決定する。患者でのレベル若しくはプロファイルの測定値を該対照値と比較する。患者での測定レベルが対照値と有意に異ならない（例えば１標準偏差より大きくない）場合は、処置を中断し得る。患者でのレベルが対照値より有意に下である場合は、剤の継続投与が保証される。患者でのレベルが対照値より下に存続する場合には、処置の変更を示しうる。
【０３１６】
他の方法において、現在処置を受領していないがしかし以前の１クールの処置を受けた患者を、抗体レベル若しくはプロファイルについてモニターして、処置の再開が必要とされるかどうかを決定する。該患者での測定されたレベル若しくはプロファイルを、以前の１クールの処置後に該患者で以前に達成された値と比較し得る。以前の測定値に関しての有意の減少（すなわち同一サンプルの反復測定での誤差の典型的範囲より大きい）は、処置を再開し得ることの指示である。あるいは、患者で測定された値を、１クールの処置を受けた後の患者の集団で測定された対照値（平均および標準偏差）と比較し得る。あるいは、患者での測定値を、疾患の症状がないままである予防的に処置した患者の集団、若しくは疾患の特徴の改善を示す治療的に処置した患者の集団での対照値と比較し得る。これらの場合の全部において、対照値に関しての有意の減少（すなわち１標準偏差より大きい）は、処置を患者で再開すべきであることの指標である。
【０３１７】
分析のための組織サンプルは、典型的には患者からの血液、血漿、血清、粘液若しくは
脳脊髄液である。サンプルを、例えばＡβペプチドに対する抗体のレベル若しくはプロファイル、例えばヒト化抗体のレベル若しくはプロファイルについて分析する。Ａβに特異的な抗体のＥＬＩＳＡ検出方法を実施例の節に記述する。いくつかの方法において、投与された抗体のレベル若しくはプロファイルを、消失アッセイを使用して、例えば本明細書に記述されるところのｉｎ  ｖｉｔｒｏ食作用アッセイで測定する。こうした方法において、試験されている患者からの組織サンプルを（例えばＰＤＡＰＰマウスからの）アミロイド沈着物およびＦｃ受容体をもつ食細胞と接触させる。アミロイド沈着物のその後の消失をその後、モニターする。消失応答の存在および程度は、試験中の患者の組織サンプル中のＡβを消失させるのに有効な抗体の存在およびレベルの指示を提供する。
【０３１８】
受動免疫後の抗体プロファイルは、典型的には抗体濃度の即座のピーク、次いで指数的減衰を示す。さらなる投薬量がなければ、該減衰は、投与された抗体の半減期に依存して数日ないし数ヶ月の期間内に治療前のレベルに近づく。
【０３１９】
いくつかの方法においては、患者中のＡβに対する抗体の基礎測定を投与前に行い、第二の測定をその後まもなく行ってピーク抗体レベルを決定し、そして１回若しくはそれ以上のさらなる測定をときどき行って抗体レベルの減衰をモニターする。抗体のレベルが基礎若しくは基礎より低いピークの予め決められたパーセント（例えば５０％、２５％若しくは１０％）まで減少した場合は、さらなる１投薬量の抗体の投与を投与する。いくつかの方法においては、ピーク若しくはバックグラウンドより低いその後の測定レベルを、他の患者での有益な予防的若しくは治療的処置レジメンを構成するために、以前に測定した参照レベルと比較する。測定した抗体レベルが参照レベルより有意により低い（例えば、処置の利益を得る患者の集団での参照値の平均−１標準偏差より低い）場合は、付加的な１投薬量の抗体の投与が指示される。
【０３２０】
付加的な方法は、アミロイド形成疾患（例えばアルツハイマー病）を診断若しくはモニターするために研究者若しくは医師により慣例に頼られているいずれかの技術に認識された生理学的症状（例えば身体若しくは精神症状）を処置の経過にわたりモニターすることを包含する。例えば認知障害をモニターし得る。後者はアルツハイマー病およびダウン症候群の症状であるが、しかしこれらの疾患のいずれの他の特徴を伴わずにもまた発生し得る。例えば、認知障害は、処置の経過を通じ、規約に従ってミニメンタルステート検査で患者のスコアを決定することによりモニターし得る。
【０３２１】
Ｆ．キット
本発明は上述されたモニタリング方法を実施するためのキットをさらに提供する。典型的には、こうしたキットはＡβに対する抗体に特異的に結合する剤を含有する。該キットは標識もまた包含し得る。Ａβに対する抗体の検出のため、標識は典型的には標識された抗イディオタイプ抗体の形態にある。抗体の検出のため、該剤は、マイクロタイター皿のウェルへのような固相に予め結合して供給し得る。キットは、典型的には該キットの使用のための指示を提供するラベルもまた含有する。該ラベルは、測定された標識のレベルをＡβに対する抗体のレベルと相関させる図若しくは他の対応する型（ｒｅｇｉｍｅ）もまた包含しうる。ラベルという用語は、その製造、輸送、販売若しくは使用の間のいずれかの時点でキットに貼付されるか若しくは別の方法で付随するいかなる文書若しくは記録資料も指す。例えば、ラベルという用語は、広告用パンフレットおよび小冊子、包装資材、説明書、音声若しくはビデオカセット、コンピュータディスク、ならびにキットに直接刻印された文言を包含する。
【０３２２】
本発明は、診断キット、例えば研究、検出および／若しくは診断キット（例えばｉｎ  ｖｉｖｏ画像化を実施するための）もまた提供する。こうしたキットは、典型的に、好ましくは残基１−１０内のＡβの１エピトープに結合するための抗体を含有する。好ましく
は、該抗体は標識されているか、若しくは二次標識試薬がキットに包含される。好ましくは、キットは意図している応用を実施するため、例えばｉｎ  ｖｉｖｏ画像化アッセイを実施するための説明書で区別される。例示的抗体は本明細書に記述されるものである。
【０３２３】
Ｇ．ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化
本発明は患者中のアミロイド沈着物のｉｎ  ｖｉｖｏ画像化方法を提供する。こうした方法はアルツハイマー病若しくはそれに対する感受性を診断若しくはその診断を確認するのに有用である。例えば、該方法を痴呆の症状で診察を受ける患者で使用し得る。患者が異常なアミロイド沈着物を有する場合には、該患者はアルツハイマー病に罹患していることがありそうである。該方法は無症状の患者でもまた使用し得る。アミロイドの異常な沈着物の存在は将来の症候性疾患に対する感受性を示す。該方法は、以前にアルツハイマー病と診断された患者での疾患の進行および／若しくは処置に対する応答をモニターするのにもまた有用である。
【０３２４】
該方法は、Ａβに結合する抗体のような試薬を患者に投与すること、およびその後該剤が結合した後にそれを検出することにより作用する。好ましい抗体は、完全長のＡＰＰポリペプチドに結合することなく患者中のＡβ沈着物に結合する。アミノ酸１−１０内のＡβの１エピトープに結合する抗体がとりわけ好ましい。いくつかの方法において、抗体はＡβのアミノ酸７−１０内の１エピトープに結合する。こうした抗体は、典型的には実質的な消失応答を誘導することなく結合する。他の方法において、抗体はＡβのアミノ酸１−７内の１エピトープに結合する。こうした抗体は、典型的にＡβに結合しかつそれに対する消失応答を誘導する。しかしながら、消失応答はＦａｂのような完全長の定常領域を欠く抗体フラグメントを使用することにより回避し得る。いくつかの方法においては、同一の抗体が処置および診断双方の試薬としてはたらき得る。一般に、Ａβの残基１０に対しＣ末端のエピトープに結合する抗体は、おそらく該Ｃ末端エピトープがアミロイド沈着物中で到達不可能であるため、残基１−１０内のエピトープに結合する抗体ほど強いシグナルを示さない。従ってこうした抗体はより少なく好ましい。
【０３２５】
診断試薬は、患者の体内への静脈内注入により、または頭蓋内注入により若しくは頭蓋を通る孔を開けることにより脳中に直接投与し得る。試薬の投薬量は処置方法についてと同一範囲内にあるべきである。典型的には試薬は標識されるとは言え、いくつかの方法においては、Ａβに対する親和性をもつ一次試薬は未標識であり、そして一次試薬に結合するために二次標識剤を使用する。標識の選択は検出手段に依存する。例えば、蛍光標識は光学的検出に適する。常磁性標識の使用は外科的介入を伴わない断層撮影検出に適する。放射活性標識はＰＥＴ若しくはＳＰＥＣＴを使用してもまた検出し得る。
【０３２６】
診断は、標識された場所の数、大きさおよび／若しくは強度を対応する基礎値と比較することにより実施する。基礎値は疾患に罹っていない個体の集団での平均レベルを表し得る。基礎値は同一患者で測定された以前のレベルもまた表し得る。例えば、基礎値をある患者で処置を開始する前に測定し得、そしてその後測定した値を該基礎値と比較し得る。基礎に関しての値の減少は処置に対する正の応答を知らせる。
【０３２７】
Ｈ．臨床試験
単回投与第Ｉ相試験をヒトでの安全性を決定するため実施し得る。治療薬（例えば本発明の抗体）を、想定される有効性のレベルの約０．０１から開始しかつ有効なマウス投薬量の約１０倍のレベルに達するまで３の係数により増大させる、増大する投薬量で多様な患者に投与する。
【０３２８】
第ＩＩ相試験は治療上の有効性を決定するためにさらに実施し得る。可能なＡＤについてアルツハイマー病・関連障害協会（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ
Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（ＡＤＲＤＡ）の基準を使用して定義される早期ないし中期アルツハイマー病を伴う患者を選択する。適する患者は、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）で１２〜２６の範囲で得点する。他の選択基準は、患者が試験の期間中生存しかつ妨害しうる付随する医薬品の使用のような複雑にする問題を欠くことがありそうであることである。患者機能の基礎評価は、ＭＭＳＥ、およびＡＤＡＳ（アルツハイマー病の状態および機能を伴う患者を評価するための包括的尺度である）のような古典的精神測定尺度を使用して行う。これらの精神測定尺度はアルツハイマー病の状態の進行の尺度を提供する。適する質的生活尺度もまた処置をモニターするのに使用し得る。疾患の進行はＭＲＩによってもまたモニターし得る。免疫原特異的抗体およびＴ細胞応答のアッセイを包含する患者の血液プロファイルもまたモニターし得る。
【０３２９】
基礎測定後に、患者は処置を受領し始める。彼らを無作為化し、そして盲検化様式で治療薬若しくはプラセボいずれかで処置する。患者は最低６か月ごとにモニターする。有効性は、プラセボ群に関する処置群の進行の有意の減少により測定する。
【０３３０】
第二の第ＩＩ相試験は、ときに加齢による記憶障害（ＡＡＭＩ）若しくは軽度認知障害（ＭＣＩ）と称されるアルツハイマー病以外の早期記憶障害から、ＡＤＲＤＡ基準によるように定義されるところの可能なアルツハイマー病への患者の転換を評価するために実施し得る。アルツハイマー病への転換の高危険度を伴う患者は、記憶障害、若しくは前アルツハイマー病の症候学に関連した他の困難の早期徴候、アルツハイマー病の家族歴、遺伝的危険因子、齢、性別、およびアルツハイマー病に対し高危険度と予測することが見出された他の特徴について参照集団をスクリーニングすることにより、非臨床集団から選択する。より正常な集団を評価するよう設計された他の数的指標と一緒の、ＭＭＳＥおよびＡＤＡＳを包含する適する数的指標の基礎スコアを収集する。これらの患者集団を、該剤を含む投薬代替に対するプラセボ比較を伴う適する群に分割する。これらの患者集団を約６か月の間隔で追跡し、そして、各患者のエンドポイントは、彼若しくは彼女が観察の終了時にＡＤＲＤＡ基準により定義されるところの可能なアルツハイマー病に転換するかどうかである。
【０３３１】
本発明は以下の制限しない実施例によりより完全に記述されるであろう。
【０３３２】
［実施例］
免疫グロブリン鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を指すために、実施例の節を通じて以下の配列識別子を使用する。
【０３３３】
【表４】
2008523815.tif 000006
【０３３４】
本明細書で使用されるところの、配列番号１〜４、７、１０、１３〜３１および３４〜
３７のいずれか１つで示されるようなＶＬおよび／もしくはＶＨ配列を含んでなる抗体すなわち免疫グロブリン配列は、完全な配列を含み得るか、または成熟配列（すなわちシグナル若しくはリーダーペプチドを含まない成熟ペプチド）を含み（若しくはコードし）得るかのいずれかである。
【実施例１】
【０３３５】
マウス１２Ａ１１抗体のｅｘ  ｖｉｖｏ有効性
以前の研究は、ｅｘ  ｖｉｖｏで斑を結合する（例えばＰＤＡＰＰ若しくはＡＤ脳切片中で）および／またはｅｘ  ｖｉｖｏ食作用アッセイ（Ｂａｒｄら（２０００）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：９１６−９１９）で斑消失を誘発する抗体の能力により、ＡＤ関連の神経病理学（例えば斑負荷量）の低下における多様なＡβ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を予測することが可能であることを示した。該相関は、小膠細胞および／若しくはマクロファージによるＦｃ依存性の食作用がｉｎ  ｖｉｖｏでの斑消失の過程に重要であるという概念を裏付ける。しかしながら、抗体の有効性はＦｃ相互作用に依存しない機構によりｉｎ  ｖｉｖｏでもまた得ることができることもまた報告された（Ｂａｃｓｋａｉら（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：７８７３−７８７８）。研究は、アミロイド斑を認識し得ない、Ａβの中央部分に向けられた抗体が、可溶性Ａβに結合しかつ斑沈着を低下させるようであることを示した（ＤｅＭａｔｔｏｓら（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：８８５０−８８５５）。マウスモノクローナル抗体１２Ａ１１（アイソタイプＩｇＧ１）の潜在的ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を特徴づけるため、多様なｅｘ  ｖｉｖｏアッセイを最初に実施した。
【０３３６】
Ａβ１−４２に対するｍＡｂ  １２Ａ１１の親和性。凝集させた合成Ａβ１−４２へのモノクローナル抗体１２Ａ１１の結合を、Ｓｃｈｅｎｋら（Ｎａｔｕｒｅ  ４００：１７３（１９９９））に記述されるとおりＥＬＩＳＡにより実施した。比較の目的上、ｍＡｂ
１２Ｂ４および１０Ｄ５もまたアッセイした。可溶性Ａβ１−４２はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で超音波処理した合成Ａβ１−４２ペプチドを指す。２０μｇ／ｍｌの抗体の連続希釈を５０，０００ｃｐｍの［１２５Ｉ］Ａβ１−４２（１９０μＣｉ／μｍｏｌ；Ｉｏｄｏｇｅｎ試薬、Ｐｉｅｒｃｅで標識）とともに室温で一夜インキュベートした。７５ｍｇ／ｍｌプロテインＡセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）および２００μｇのウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を含有する５０マイクロリットルのスラリーを、希釈した抗体とともに室温で１時間インキュベートし、２回洗浄し、そしてＷａｌｌａｃｅガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）でカウントした。全段階は、１０ｍＭトリス、０．５Ｍ
ＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌゼラチンおよび０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、ｐＨ８．０よりなるＲＩＡ緩衝液中で実施した。
【０３３７】
親和性試験からの結果を下の表２に示す。
【０３３８】
【表５】
2008523815.tif 000007
【０３３９】
試験した抗体の全部が、凝集型Ａβ１−４２に対する高親和性を表した。さらに、抗体１２Ｂ４および１２Ａ１１は２０μｇ／ｍｌの抗体濃度で可溶性Ａβ１−４２を認識可能に捕捉した。表２に示されるとおり、ＩｇＧ１抗体１２Ａ１１はＩｇＧ２ａ抗体１２Ｂ４若しくはＩｇＧ１抗体１０Ｄ５より効率的にＡβ１−４２を捕捉した。
【０３４０】
可溶性Ａβを捕捉する多様な抗体（１２Ａ１１を包含する）の能力を後に続くとおりさらにアッセイした。多様な濃度の抗体（１０μｇ／ｍｌまで）を５０，０００ＣＰＭの１２５Ｉ−Ａβ１−４２（若しくは１２５Ｉ−Ａβ１−４０）とともにインキュベートした。放射活性カウントの２５％を結合するのに十分な抗体の濃度を捕捉ラジオイムノアッセイで測定した。１０μｇ／ｍｌでカウントの２５％を結合することが可能でなかった抗体については、１０μｇ／ｍｌで結合されるカウントの比率を決定した。１２Ａ１１は１０μｇ／ｍｌで放射活性カウント（すなわち１２５Ｉ−Ａβ）の２０％を結合した。これは試験した２種の他のＡβ３−７抗体すなわち１２Ｂ４および１０Ｄ５（それぞれ１０μｇ／ｍｌで７％および２％を結合する）により結合される量より大きかった。従って、試験したＮ末端（エピトープＡβ３−７）抗体のうち、１２Ａ１１はＡβを捕捉する最も認識可能な能力を表した。
【０３４１】
Ｆｃ媒介性の斑消失を誘発するそれらの能力の尺度として、抗体を、初代マウス小膠細胞およびＰＤＡＰＰマウスからの脳組織の切片を用いるｅｘ  ｖｉｖｏ食作用アッセイでもまた比較した。Ａβ若しくは該アッセイの他の成分に対する反応性を有しない無関係のＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体を、アイソタイプを一致させた陰性対照として使用した。簡潔には、マウス初代小膠細胞を、抗体の存在下でＰＤＡＰＰマウス脳の未固定クライオスタット切片とともに培養した。２４時間のインキュベーション後に、培養物中に残存するＡβの総レベルをＥＬＩＳＡにより測定した。斑消失／Ａβ分解の程度を定量化するために、ＡβをＥＬＩＳＡ分析のため８Ｍ尿素を用いて小膠細胞および脳切片の培養物（ｎ＝３）から抽出した。データはＡＮＯＶＡ、次いでｐｏｓｔ  ｈｏｃ  Ｄｕｎｎｅｔｔ検定で解析した。
【０３４２】
図１に示されるとおり、１２Ｂ４抗体はＡβレベルを効率的に（１２Ｂ４について７３％；Ｐ＜０．００１）低下させ、１２Ａ１１はいくぶんより小さいがにもかかわらず統計学的に有意の効率（１２Ａ１１について４８％、Ｐ＜０．０５）を示した。１０Ｄ５抗体はＡβレベルを有意に低下させなかった。ｅｘ  ｖｉｖｏ食作用アッセイでの１２Ａ１１の成績は、小膠細胞の食作用に好ましい１アイソタイプであるＩｇＧ２ａアイソタイプへの転換に際して改善されうる。
【実施例２】
【０３４３】
マウス１２Ａ１１抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性：ＡＤの神経病理学の低減
マウス抗体１２Ａ１１はアルツハイマー様の神経病理学をｉｎ  ｖｉｖｏで低減させる
１２Ａ１１のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を決定するために、抗体（１２Ａ１１、１２Ｂ４若しくは１０Ｄ５を包含する）を、Ｂａｒｄら（２０００）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：９１６に記述されたとおり、マウスに１０ｍｇ／ｋｇで週１回腹腔内注入により６か月間投与した。試験の終了時に皮質のＡβの総レベルをＥＬＩＳＡにより測定した。図２Ａに示されるとおり、抗体のそれぞれは総ＡβレベルをＰＢＳ対照と比較して有意に低下させた（Ｐ＜０．００１）。すなわち、１２Ｂ４は６９％の低下を示し、１０Ｄ５は５２％の低下を示し、そして１２Ａ１１は３１％の低下を示した。
【０３４４】
神経炎性ジストロフィーのレベルをその後、上述のマウスからの脳組織の切片で検査して、斑消失と神経保護の間の関連を決定した。神経炎性ジストロフィーにより占有される前頭皮質の比率を検査する脳画像解析からのデータを図２Ｂに示す。これらのデータは、
本明細書に記述されるアッセイにより測定されるとおり、抗体１０Ｄ５および１２Ａ１１が神経炎性ジストロフィーの低減で有効でなかった一方、１２Ｂ４は神経炎性ジストロフィーを有意に低下させた（１２Ｂ４、Ｐ＜０．０５；ＡＮＯＶＡ、次いでｐｏｓｔ  ｈｏｃ  Ｄｕｎｎｅｔｔ検定）ことを示す。再度、１２Ａ１１のこの活性は１２  Ａ１１をＩｇＧ２ａアイソタイプに転換することにより改善しうる（マウスの有効性）。ヒト化バージョンの１２Ａ１１に関して、ＩｇＧ１アイソタイプが神経炎性ジストロフィーを低下させるために好ましい。
【０３４５】
抗体１２Ａ１１の結合特性およびｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を示す実験はＢａｒｄら  ＰＮＡＳ  １００：２０２３（２００３）（引用することにより本明細書に組み込まれる）にもまた記述されている。
【０３４６】
要約すれば、全抗体は凝集型Ａβに対する有意の親和性を有し、かつ、ｅｘ  ｖｉｖｏアッセイで斑消失を誘発した。ＩｇＧ２ａアイソタイプ（Ｆｃ受容体、とりわけＦｃγＲＩに対する親和性）が、Ａβの消失および神経炎性ジストロフィーに対する保護の双方のための重要な属性であるようである。抗体１２Ａ１１（ＩｇＧ１）は可溶性単量体Ａβ１−４２を１２Ｂ４（ＩｇＧ２ａ）若しくは１０Ｄ５（ＩｇＧ１）より効率的に捕捉したが、しかし神経炎性ジストロフィーの低減で同じくらい有効でというわけではなかった。斑負荷量の減少および神経炎性ジストロフィーの低減における高められた有効性は、食作用を最大限に支援するアイソタイプを有するように抗体を工作することにより達成しうる。とりわけ有効な抗体はＡβのＮ末端内のエピトープに結合する。
【０３４７】
さらなる一研究において、１２Ａ１１  ＩｇＧ２ａアイソタイプ抗体を、ＰＤＡＰＰマウスでＡＤ様神経病理学を低下させる能力について試験した。１２〜１３月齢のＰＤＡＰＰマウスに３ｍｇ／ｋｇの１２Ａ１１抗体を週１回６か月間注入した。６か月の終了時に動物を殺し、そして、Ａβ負荷量、神経炎性負荷およびシナプトフィジンレベルを包含する多様なエンドポイントについて脳サンプルを分析した。１２Ａ１１抗体の投与はＰＤＡＰＰの脳サンプル中のアミロイド負荷量のレベルを有意に低下させた。１２Ａ１１抗体の投与は神経炎性ジストロフィー（斑を囲む異常な神経突起）の程度もまた有意に低下させた。加えて、１２Ａ１１投与はシナプトフィジン（シナプスの完全性の尺度）の喪失に対し有意に保護した。
【実施例３】
【０３４８】
Ａβオリゴマー結合の生化学的アッセイにおけるマウス１２Ａ１１抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性
本実施例は、可溶性オリゴマーＡβに優先的に結合する多様なＡβ抗体の能力を示す。該データを、Ａβ抗体の治療的有効性を予測するのに使用する。
【０３４９】
本実施例にて、Ａβ調製物は、実質的に後に続くとおり合成Ａβから調製した。
（１）凍結乾燥したＡβ１−４２ペプチドを氷冷１００％ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）で１ｍＭまで溶解し（ボルテックス攪拌し、その後室温で１時間インキュベートし）、そして微小遠心管中でアリコートに分離し（各チューブは０．５ｍｇのＡβ１−４２ペプチドを含有した）；
（２）ＨＦＩＰを蒸発により除去し、次いで凍結乾燥して残余のＨＦＩＰを除去し；
（３）生じるＡβペプチド薄膜／残渣を−２０℃で乾燥保存し；
（４）Ａβペプチド残渣を５ｍＭのペプチドの最終濃度までＤＭＳＯに再懸濁し、その後氷冷ハムＦ１２（フェノールレッド不含）培地に添加して、ペプチドを１００μＭの最終濃度にし；
（５）ペプチドを４℃で２４時間インキュベートして、およそ１００μＭ濃度の合成Ａβオリゴマーを生じ；ならびに
（６）合成Ａβオリゴマーをペルオキシ亜硝酸で処理した。
【０３５０】
Ａβ調製物のアリコートをその後、それぞれ試験免疫学的試薬（この場合は抗体）およびＡβ単量体と接触させ、そして、試験免疫学的試薬に結合した１種若しくはそれ以上のＡβオリゴマーを免疫沈降によりＡβ調製物から抽出した。多様な免疫沈降物をゲル電気泳動により分離し、そして実質的に後に続くとおり３Ｄ６抗体でイムノブロット（画像化）した。図３〜４の免疫沈降物サンプルをサンプル緩衝液で希釈し、そして１６％トリシンゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。タンパク質をニトロセルロースメンブレンに移し、該メンブレンをＰＢＳ中で沸騰させ、そしてその後ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ／５％カーネーション粉乳の溶液中４℃で一夜ブロッキングした。メンブレンをその後３Ｄ６（残基１−５に対するマウスモノクローナルＡβ抗体）とともにインキュベートした。検出のため、メンブレンを抗マウスＩｇ−ＨＲＰとともにインキュベートし、ＥＣＬ  ＰｌｕｓＴＭを使用して発色させ、そしてフィルムを使用して可視化した。分子量はＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２ＴＭ分子量マーカーにより推定した。
【０３５１】
図３〜４は、Ａβ調製物中の例えばＡβ単量体、二量体、三量体、四量体、五量体などの試験免疫学的試薬への結合を測定するための多様な試験免疫学的試薬（図３〜４でＡβ抗体）と上のＡβ１−４２調製物を接触した結果を描く。図３〜４は、多様なＡβ抗体と接触させたペルオキシ亜硝酸処理したオリゴマーＡβ調製物の免疫沈降物のウエスタンブロット（３Ｄ６を用いて画像化した）を描く。Ａβ１−４２単量体、二量体、三量体および四量体のバンドのおよその位置を各図の左側に示す。該抗体により認識されるＡβエピトープおよび該抗体についてのＣＦＣアッセイの結果（上の実施例５を参照されたい）を各Ａβ抗体の下に示し、「＋」表記は該抗体での処置に際しての増大した認知の観察結果を示し、「−」表記は該抗体での処置に際しての認知の変化なしという観察結果を示し、「＋／−」表記は、該抗体での処置に際しての増大した認知の傾向、しかし増大した認知という観察結果として示されるのに十分に統計学的に有意でない観察結果を示し、そして「ＮＤ」表記はＣＦＣアッセイデータが入手可能でないか若しくはこの抗体と比較してないことを示す。
【０３５２】
図３〜４で、Ａβ調製物中のＡβ単量体に対するＡβ抗体の結合に関してＡβ調製物中のＡβ二量体もしくはより高次のオリゴマーに対するＡβ抗体の増大された結合は、該Ａβ抗体がアルツハイマー病の処置について治療的有効性を有することを予測する。注目すべきは、Ａβ抗体３Ｄ６、１５Ｃ１１、１０Ｄ５、１２Ａ１１および２６６は、単量体Ａβに比較してオリゴマーＡβ種に対する優先的結合を表し、１２Ａ１１がオリゴマーＡβへの最も有意な優先的結合を表した。従って、これらの抗体は、処置認知障害、例えばＡＤに関連するものにおいて治療的有効性を有すると予測される。
【０３５３】
それぞれＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５１２９およびＰＴＡ−５１３０を有する抗体１０Ｄ５および３Ｄ６を産生する細胞株は、ブダペスト条約の規約のもとで２００３年４月８日に寄託され、また、それぞれＡＴＣＣ受託番号＿＿＿＿＿＿＿および＿＿＿＿＿＿を有する抗体６Ｃ６および９Ｇ８を産生する細胞株は、ブダペスト条約の規約のもとで２００５年１０月３１日に寄託された。また、ＡＴＣＣ受託番号＿＿＿＿＿＿、＿＿＿＿＿＿、＿＿＿＿＿＿および＿＿＿＿＿＿を有する抗体２Ｈ３、１２Ａ１１、１５Ｃ１１および３Ａ３を産生する細胞株は、ブダペスト条約の規約のもとで２００５年１２月１２日に寄託された。
【実施例４】
【０３５４】
マウス１２Ａ１１抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性：Ｔｇ２５７６マウスにおける認知の迅速な改善
野性型およびＴｇ２５７６マウスに、腹腔内注入により単一用量のリン酸緩衝生理的食
塩水（ＰＢＳ）若しくは処置抗体を投与した。認知（すなわち文脈的および手掛かり依存的記憶）のいかなる迅速な改善も評価するため、各マウスにＣＦＣ訓練活動を処置直後に、およびＣＦＣ試験活動を処置２４時間以内（すなわち処置後第１日）に実施した。治療的有効性は、記憶障害の逆転および記憶障害状態双方に関して表した。「記憶障害の逆転」は、ｍＡｂ対ＰＢＳ対照処置Ｔｇ２５７６動物のフリージング行動を比較することにより決定した。「記憶障害状態」は野性型対Ｔｇ２５７６  ｍＡｂ処置動物のフリージング行動を比較することにより決定した。
【０３５５】
ＡβのＮ末端に対し生じさせた数種のｍＡｂの治療的有効性を表３に表にする。処置後第１日に実施したＣＦＣ試験活動の結果は、ｍＡｂ  ３Ｄ６、１０Ｄ５および１２Ａ１１が対照処置に関してＴｇ２５７６マウスの文脈的記憶の迅速かつ有意の（**）改善を引き起こした（ｐ値＜０．０５）ことを示す。さらに、３Ｄ６、１０Ｄ５および１２Ａ１１で処置したＴｇ２５７６マウスは、野性型マウスに関して有意の記憶障害（＃＃）を表さなかった（ｐ値＞０．１）。加えて、抗体６Ｃ６、１０Ｄ５および１２Ｂ４は、記憶障害の逆転（*）若しくは記憶障害なし（＃）いずれかを遂げる傾向を表した（０．１＞ｐ値＞０．０５）。
【０３５６】
Ｔｇ２５７６マウスは、１２Ａ１１と呼称されるＮ末端のマウスＩｇＧ２ａ  ｍＡｂを投与した場合に、文脈的記憶のとりわけ顕著な、有意のかつ迅速な改善を表した。例えば、１２Ａ１１は試験したすべての用量（０．３、１、１０若しくは３０ｍｇ／ｋｇ）で記憶障害の逆転をもたらした［図５Ａおよび５Ｂを参照されたい］。対照的に、未処置の（ＰＢＳ）Ｔｇ２５７６マウスは、野性型マウスと比較して文脈依存的記憶の有意の障害（*）を表した［図５Ａ］。しかしながら、Ｔｇ２５７６マウスは、１、１０若しくは３０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）の１２Ａ１１を投与した場合に完全なかつ有意の記憶障害の逆転（＃）を表した。認知能力の改善は、より低用量（０．１および１ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）の１２Ａ１１をマウスに投与した場合に持続した［図５Ｂ］。
【０３５７】
観察された応答がアミロイド結合によったことを確認するため、Ｔｇ２５７６マウスに、鶏コクシジウム（Ｅ．ｔｅｎｎｅｌａ）からの無関係の抗原に対し生じさせたＩｇＧ２ａアイソタイプの対照ｍＡｂ３０ｍｇ／ｋｇを投与した。期待されたとおり、該対照抗体で処置したＴｇ２５７６マウスは、野性型マウスに関して文脈的記憶の顕著な障害を表した。
【０３５８】
【表６】
2008523815.tif 000008
【実施例５】
【０３５９】
マウス１２Ａ１１抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性：Ｔｇ２５７６マウスの認知の長期改善
Ｎ末端のマウス１２Ａ１１抗体（「ｍｕ１２Ａ１１」）での処置後２４時間以内に観察された認知改善の持続期間を、第二の長時間ＣＦＣ試験で評価した。Ｔｇ２５７５および野性型マウスに、再度、ＰＢＳ対照若しくは低用量の１２Ａ１１抗体（１ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ）を投与し、そしてそれらの認知状態を、処置後第０〜１、９〜１０および１６〜１７日のＣＦＣアッセイにより評価した（すなわち、ＣＦＣ訓練活動を第０、９、１６日に実施しかつＣＦＣ試験活動を第１、１０および１７日に実施した）。
【０３６０】
実施例４に記述されたとおり、Ｔｇ２５７６マウスは再度、ｍｕ１２Ａ１１での処置後第１日に文脈的記憶の顕著な有意のかつ迅速な改善を表した［図６を参照されたい］。例えば、ｍｕ１２Ａ１１で処置したＴｇ２５７６は、野性型マウスのものと同等に近づいた有意の記憶障害の逆転（ＰＢＳ処置したＴｇ２５７６マウスと比較した場合）および記憶障害状態を表した。文脈的記憶のこれらの改善は持続し、かつ、処置後第１０日に評価した場合になおより顕著であった。さらに、処置後第１７日に評価した場合、ｍｕ１２Ａ１１は記憶障害なしへの傾向を表し続けた。これらの結果は、単一の低用量のｍｕ１２Ａ１１  Ｎ末端抗体が、ＡＤのマウスモデルの認知能力の永続的かつ長期の改善をもたらし得ることを示した。
【実施例６】
【０３６１】
マウス１２Ａ１１可変領域のクローニングおよび配列決定
ｍｕ１２Ａ１１  ＶＨのクローニングおよび配列分析。ハイブリドーマ細胞からの１２Ａ１１のＶHおよびＶL領域を、ハイブリドーマ細胞からのｍＲＮＡを使用するＲＴ−ＰＣＲおよび５’ＲＡＣＥならびに標準的なクローニングの方法論によりクローン化した。推定されるｍｕ１２Ａ１１  ＶＨドメインをコードする独立のｃＤＮＡクローン由来のヌクレオチド配列（コーディング、配列番号３）および推定されるアミノ酸配列（配列番号４）をそれぞれ表６および表７に示す（図７Ａもまた参照されたい）。
【０３６２】
表６：マウス１２Ａ１１  ＶＨのＤＮＡ配列。
ATGGACAGGCTTACTACTTCATTCCTGCTGCTGATTGTCCCTGCATATGTCTTGTCCCAAGTTACTCTAAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGAAGCCCTCACAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTATGAGTGTAGGCTGGATTCGTCAGCCTTCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTGGTGGGATGATGATAAGTACTATAACCCATCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAGAAACCAGGTATTCCTCAAGATCACCAGTGTGGACACTGCAGATACTGCCACTTACTACTGTGCTCGAAGAACTACTACGGCTGACTACTTTGCCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA（配列番号３）
【０３６３】
表７：マウス１２Ａ１１  ＶＨのアミノ酸配列
mdrlttsflllivpayvlsQVTLKESGPGILKPSQTLSLTCSFSGFSLStsgmsvgWIRQPSGKGLEWLAhiwwdddkyynpslksRLTISKDTSRNQVFLKITSVDTADTATYYCARrtttadyfayWGQGTTLTVSS（配列番号４）
* リーダーペプチドおよびＣＤＲは小文字。
【０３６４】
１２Ａ１１  ＶＬのクローニングおよび配列分析。１２Ａ１１のＬ鎖可変ＶＬ領域をＶＨ領域と類似の様式でクローン化した。推定される１２Ａ１１  ＶＬドメインをコードする２個の独立したｃＤＮＡクローン由来のヌクレオチド配列（コーディング、配列番号１）および推定されるアミノ酸配列（配列番号２）をそれぞれ表８および表９に示す（図７Ｂもまた参照されたい）。
【０３６５】
表８：マウス１２Ａ１１  ＶＬのＤＮＡ配列
ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATGGAAACACCTACTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAATTTATTACTGCTTTCAAAGTTCACATGTTCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA（配列番号１）
【０３６６】
表９：マウス１２Ａ１１  ＶＬアミノ酸配列
mklpvrllvlmfwipasssDVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCrssqsivhsngntyleWYLQKPGQSPKLLIYkvsnrfsGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCfqsshvpltFGAGTKLELK（配列番号２）
* リーダーペプチドおよびＣＤＲは小文字。
【０３６７】
１２Ａ１１のＶＬおよびＶＨ配列は、それらが開始メチオニンからＣ領域までの１個の連続するＯＲＦを含有しかつ免疫グロブリンＶ領域遺伝子の保存された残基の特徴を共有する限りは、機能的Ｖ領域の基準に合致する。Ｎ末端からＣ末端へ、ＬおよびＨ鎖双方はドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含んでなる。
【実施例７】
【０３６８】
キメラ１２Ａ１１抗体の発現
キメラ１２Ａ１１抗体の発現：可変ＨおよびＬ鎖領域をそれぞれのＶＤＪ若しくはＶＪ結合部の下流のスプライスドナー配列をコードするように再工作し、そしてＨ鎖について哺乳動物発現ベクターｐＣＭＶ−ｈγ１（配列番号５７および５８）、ならびにＬ鎖についてｐＣＭＶ−ｈκ１（配列番号５９および６０）にクローン化した（例えばＭａｅｄａら（１９９１）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ．２：１２４−１３４を参照されたい）。これらのベクターは、ヒトγ１およびＣｋ定常領域を、挿入された可変領域カセットの下流のエキソンフラグメントとしてコードする。配列確認後に、Ｈ鎖およびＬ鎖発現ベクターをＣＯＳ細胞にコトランスフェクトした。多様なＨ鎖クローンを、多様なキメラＬ鎖クローンとともに独立にコトランスフェクトして結果の再現性を確認した。抗体はプロテインＡセファロースを使用してＣＯＳ細胞馴化培地から免疫沈降させた。抗体鎖をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのイムノブロット上で検出した。検出は５０００倍希釈のヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を使用して室温で１時間達成した。有意の量の１２Ａ１１  Ｈ＋Ｌ鎖が馴化培地中で検出された。
【０３６９】
Ａβへのキメラ１２Ａ１１抗体の直接結合をＥＬＩＳＡアッセイにより試験した。図８は、キメラ１２Ａ１１が、キメラおよびヒト化３Ｄ６により示されるものと類似の高親和性でＡβに結合することが見出されたことを示す。（３Ｄ６のクローニング、特徴付けおよびヒト化は米国特許出願第１０／０１０，９４２号明細書（その内容全体はこの引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されている。）結合親和性はキメラおよびヒト化１２Ｂ４により示されるものにもまた類似であった。（１２Ｂ４のクローニング、特徴付けおよびヒト化は、米国特許出願第１０／３８８，２１４号明細書（その内容全体はこの引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されている。）
【実施例８】
【０３７０】
１２Ａ１１ヒト化
Ａ．１２Ａ１１ヒト化抗体、バージョン１
相同性／分子モデル解析。マウス１２Ａ１１抗体中の重要な構造フレームワーク残基を同定するため、１２Ａ１１  ＨおよびＬ鎖に対する相同性を有する解明されたマウス抗体の三次元モデルを研究した。１２Ａ１１  Ｌ鎖に対する緊密な相同性を有する１ＫＴＲと呼称される抗体を選び、また、１２Ａ１１  Ｈ鎖に対する緊密な相同性を有する１ＥＴＺおよび１ＪＲＨと呼称される２種の抗体を選んだ。これらのマウス抗体は１２Ａ１１との強い配列保存を示す（Ｖｋについて１１２アミノ酸で９４％の同一性、ならびにＶｈについてそれぞれ１２６アミノ酸で８３％の同一性および１２１アミノ酸で８６％の同一性）。１ＥＴＺのＨ鎖構造を１ＫＴＲのものに重ねた。加えて、Ｖｋについて、選択した抗体のＣＤＲループは、１２Ａ１１  ＶＬのＣＤＲループが属すると同一の正準Ｃｈｏｔｈｉａ構造分類に属する。これらの抗体の結晶構造を、抗体の機能に重要であると予測される残基（例えばＣＤＲのコンホメーションに重要なＦＲ残基など）について、および比較して類似の１２Ａ１１抗体の機能を検査した。
【０３７１】
ヒトアクセプター抗体配列の選択。適するヒトアクセプター抗体配列は、マウス可変領域のアミノ酸配列の既知のヒト抗体の配列とのコンピュータ比較により同定した。該比較は１２Ａ１１  ＨおよびＬ鎖について別個に実施した。とりわけ、そのフレームワーク配列がマウスＶＬおよびＶＨフレームワーク領域と高程度の配列同一性を表したヒト抗体からの可変ドメインを、それぞれのマウスフレームワーク配列でのＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（国立保健研究所のＮＣＢＩインターネットサーバを通じて公的にアクセス可能）を使用するＮＣＢＩ  Ｉｇデータベースのクエリにより同定した。
【０３７２】
以下の基準、すなわち（１）主題の配列との相同性；（２）ドナー配列と正準ＣＤＲ構
造を共有すること；および／若しくは（３）フレームワーク領域中にいかなるまれなアミノ酸残基も含有しないことに基づき、２種の候補配列をアクセプター配列として選んだ。ＶＬについて選択したアクセプター配列はＮＣＢＩ  Ｉｇ非重複性データベースのＢＡＣ０１７３３である。ＶＨについて選択したアクセプター配列はＮＣＢＩ  Ｉｇ非重複性データベースのＡＡＡ６９７３４である。ＡＡＡ６９７３４は（サブグループＩＩよりむしろ）ヒトサブグループＩＩＩ抗体であるが、しかしＳａｌｄａｎｈａら（１９９９）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：７０９の論法に少なくとも部分的に基づいて最初のアクセプター抗体として選択した。ヒト化１２Ａ１１抗体の第一のバージョンはこれらの選択されたアクセプター抗体配列を利用する。該抗体はＳｃｈｒｏｅｄｅｒとＷａｎｇ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７２：６１４６に記述されている。
【０３７３】
アミノ酸残基の置換。上に示されたとおり、本発明のヒト化抗体は、実質的にヒト免疫グロブリン（アクセプター免疫グロブリン）からの可変フレームワーク領域および実質的に１２Ａ１１と命名されたマウス免疫グロブリン（ドナー免疫グロブリン）からの相補性決定領域を含んでなる。１２Ａ１１の相補性決定領域および適切なヒトアクセプター免疫グロブリンを同定したら、次の段階は、生じるヒト化抗体の特性を至適化するためにこれらの成分からのどの残基（あれば）を置換するかを決定することであった。
【０３７４】
再形成したＬ鎖Ｖ領域：
再形成したＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸アライメントを図９Ａに示す。アクセプターフレームワーク（ＢＡＣ０１７３３）の選択は同一のヒトサブグループからである。マウスＶ領域に対応するものはまれなフレームワーク残基を有さず、また、該ＣＤＲは同一のＣｈｏｔｈｉａ正準構造グループに属するからである。戻し突然変異はヒト化１２Ａ１１のバージョン１で行わなかった。
【０３７５】
再形成したＨ鎖Ｖ領域：
再形成したＨ鎖Ｖ領域のアミノ鎖アライメントを図９Ｂに示す。アクセプターフレームワーク（ＡＡＡ６９７３４）の選択は（以前に記述されたところの）ヒトサブグループＩＩＩからであり、そしてまれなフレームワーク残基を有しない。マウス配列へのＡＡＡ６９７３４のアミノ酸アライメントとともにのマウスＶＨ鎖（１ＥＴＺおよび１ＪＲＨ）の構造解析は、再形成されたＨ鎖のバージョン１（ｖ１）中の９個の戻し突然変異、すなわちＡ２４Ｆ  Ｔ２８Ｓ  Ｆ２９Ｌ  Ｖ３７Ｉ  Ｖ４８Ｌ  Ｆ６７Ｌ  Ｒ７１Ｋ  Ｎ７３Ｔ
Ｌ７８Ｖ（Ｋａｂａｔの番号付け）を指図する。該戻し突然変異は図９Ｂに示されるアミノ酸アライメント中で＊印により強調されている。
【０３７６】
該９種の戻し突然変異のうち３種が該モデルにより指図される。該残基は正準残基（Ａ２４Ｆ、Ｆ２９ＬおよびＲ７１Ｋ、黒地白抜き）、すなわちＣＤＲ領域への近接によって抗原結合に寄与しうるフレームワーク残基であるためである。残基の次の最も重要な分類、すなわちＶＨ−ＶＬ充填相互作用に関与する界面残基（下線）に１個の戻し突然変異すなわちＶ３７Ｉが存在する。Ｎ７３Ｔ突然変異は結合部位の縁のバーニア残基（点線で囲まれる）でであり、おそらくＣＤＲ１に隣接するＳ３０と相互作用する。戻し突然変異の標的とされる残存する４残基（Ｔ２８Ｓ、Ｖ４８Ｌ、Ｆ６７Ｌ、Ｌ７８Ｖ、Ｋａｂａｔの番号付け）もまたバーニア分類（ＣＤＲコンホメーションへの間接的寄与、図９Ｂの点線囲み）に属する。
【０３７７】
ヒト化１２Ａ１１のバージョン１に組み込まれた変化の要約を表１０に提示する。
【０３７８】
【表７】
2008523815.tif 000009
【０３７９】
表１１および１２はそれぞれ多様なＬおよびＨ鎖のＫａｂａｔの番号付けの記号表を示す。
【０３８０】
【表８】
2008523815.tif 000010
【０３８１】
【表９】
2008523815.tif 000011
【０３８２】
【表１０】
2008523815.tif 000012
【０３８３】
【表１１】
2008523815.tif 000013
【０３８４】
【表１２】
2008523815.tif 000014
【０３８５】
【表１３】
2008523815.tif 000015
【０３８６】
【表１４】
2008523815.tif 000016
【０３８７】
【表１５】
2008523815.tif 000017
【０３８８】
該ヒト化抗体は、好ましくは最低１０７、１０８、１０９若しくは１０１０Ｍ−１のＡβに対する特異的結合親和性を表す。通常、Ａβのヒト化抗体の結合親和性の上限は１２Ａ１１のものの３、４若しくは５の係数以内（すなわち約１０９Ｍ−１）である。しばしば、結合親和性の下限もまた１２Ａ１１のものの３、４若しくは５の係数以内にある。
【０３８９】
ヒト化１２Ａ１１  ＶＨおよびＶＬ、バージョン１の集成および発現
適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲ媒介性の集成を使用してｈ１２Ａ１１ｖ１を生成した。ヒト化１２Ａ１１ＶＬ（バージョン１）（配列番号３４）および１２Ａ１１ＶＨ（バージョン１）（配列番号３５）のヌクレオチド配列を下にそれぞれ表１３および表１４に列挙する。
【０３９０】
表１３．ヒト化１２Ａ１１ＶＬｖ１のヌクレオチド配列
atgaggctccctgctcagctcctggggctgctgatgctctgggtctctggctccagtgggGATGTTGTGATGACCCAATCTCCACTCTCCCTGCCTGTCACTCCTGGAGAGCCAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTGCATAGTAATGGAAACACCTACCTGGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAAGTTCACATGTTCCTCTCACCTTCGGTCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA（配列番号３４）
（大文字はＶＬセグメントのみ）Ａ１９生殖系列配列によりコードされるリーダーペプチドはｘ６３３９７リーダーペプチド由来
【０３９１】
表１４．ヒト化１２Ａ１１ＶＨｖ１のヌクレオチド配列
atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttctgagaggtgtccagtgtCAAGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGCGGGGTGGTGCAGCCCGGACGGTCCCTCAGGCTGTCTTGTGCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTATGAGTGTGGGCTGGATTCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTGGTGGGATGATGATAAGTACTATAACCCATCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAAAAACACCGTGTACCTCCAGATGAACAGTCTGCGGGCTGAAGATACTGCCGTGTACTACTGTGCTCGAAGAACTACTACCGCTGACTACTTTGCCTACTGGGGCCAAGGCACCACTGTCACAGTCTCCTCA（配列番号３５）
リーダーペプチド（小文字）はＶＨドナー配列受託Ｍ３４０３０．１／ａａａ６９７３４／Ｍ７２由来
【０３９２】
ヒト化１２Ａ１１ＶＬ（バージョン１）（配列番号７）および１２Ａ１１ＶＨ（バージョン１）（配列番号１０）のアミノ酸配列はそれぞれ図９Ａおよび９Ｂに描く。
【０３９３】
Ｂ．ヒト化１２Ａ１１抗体−バージョン２、２．１および３
バーニア残基（例えばＳ２８Ｔ、Ｖ４８Ｌ、Ｆ６７Ｌ、Ｌ７８Ｖ）はＣＤＲのコンホメーションに間接的に寄与し、そしてコンホメーションの混乱に最小に重要であると仮定した。標的とした残基は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅによるキットを使用する部位特異的突然変異誘発、および突然変異誘発鋳型としてのｐＣＲＳプラスミド中のｈ１２Ａ１１ＶＨｖ１により変異させて、バージョン２に対応するクローンで生じさせた。バージョン２の配列決定した確認したＶ領域挿入物を、Ｈ鎖発現ベクターｐＣＭＶ−Ｃγ１（配列番号５７および５８）のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングして、組換えｈ１２Ａ１１ｖ２抗体を生じさせた。位置Ｔ７３Ｎの突然変異に加えて上のバーニア残基突然変異（すなわち戻し突然変異の除外）のそれぞれを有するバージョン２．１抗体を同様に創製した。バージョン３の抗体は、同様に、位置Ｋ７１Ｒの突然変異に加えて上の突然変異すなわちＴ２８Ｓ、Ｌ４８Ｖ、Ｌ６７Ｆ、Ｖ８７Ｌのそれぞれを有した。ヒト化１２Ａ１１ＶＨ（バージョン２）（配列番号１３）、１２Ａ１１ＶＨ（バージョン２．１）（配列番号１４）および１２Ａ１１ＶＨ（バージョン３）（配列番号１５）のアミノ酸配列を図１０Ａ〜Ｃに描く。
【０３９４】
Ｃ．ヒト化１２Ａ１１抗体−バージョン４ないし６
正準および充填残基に戻し突然変異を保持したがしかし１（バージョン４．１ないし４．４）、２（バージョン５．１ないし５．６）若しくは３（バージョン６．１ないし６．４）個のバーニア残基の戻し突然変異を除外した付加的なヒト化１２Ａ１１バージョンを設計した。部位特異的突然変異誘発およびクローン構築を上の下位区分Ｃで記述されたとおり実施した。組換え抗体をＣＯＳ細胞中で発現させ、そしてＣＯＳ細胞上清から精製した。付加的なバージョンは上の組合せ、例えば、最低１個の充填および／若しくは正準残基（例えば位置２８、３７、４８、６７、７１および７８のヒト残基、若しくは位置２８、３７、４８、６７、７１、７３および７８のヒト残基）と組合せで１、２、３、４若しくは５個のバーニア残基にヒト残基を包含しうる。例えば、１個の充填残基および２個の正準残基（すなわち位置２８、４８、６７、７１、７３および７８のヒト残基）と組合せで１個のバーニア残基にヒト残基を有するバージョン３．１抗体を創製した。２１％のマウス可変領域残基（ＶＬ＋ＶＨ）を有するバージョン１に比較して、バージョン３．１はわずか１７％のマウス可変領域残基を有する（すなわちより低いマウス含量を有する）。ヒト化１２Ａ１１ＶＨ（バージョン３．１）（配列番号３６）およびヒト化１２Ａ１１ＶＨバージョン４〜６（配列番号１６〜２９）のアミノ酸配列を図１０Ａ〜Ｃに描く。
【０３９５】
Ｄ．ヒト化１２Ａ１１抗体−バージョン７および８
残基２８（バーニア）のＴ→Ｓ戻し突然変異、および残基３７（充填）のＶ→Ｉ戻し突然変異を除きバージョン１について示された戻し突然変異のそれぞれを有するヒト化１２Ａ１１の第七のバージョンを創製する。残基７３（バーニア）のＮ→Ｔ戻し突然変異を除
きバージョン１について示された戻し突然変異のそれぞれを有するヒト化１２Ａ１１の第八のバージョンを創製する。ヒト化１２Ａ１１ＶＨ（バージョン７）（配列番号３０）およびヒト化１２Ａ１１ＶＨ（バージョン８）（配列番号１６〜３１）のアミノ酸配列を図１０Ａ〜Ｃに描く。
【０３９６】
バージョン１に比較して、バージョン７は７個の戻し突然変異のみ含有する。Ｔ２８Ｓ戻し突然変異は保存的でありかつＨ鎖のバージョン７で排除されている。充填残基Ｖ３７Ｉの戻し突然変異もまたバージョン７で排除されている。バージョン１に比較して、バージョン７は８個の戻し突然変異のみ含有する。バージョン８ではＮ７３Ｔ（バーニア）戻し突然変異が排除されている。
【０３９７】
付加的なバージョンは、上の組合せ、例えば、場合によっては最低１個の充填残基（例えば位置３７）および／若しくは最低１個の正準残基での戻し突然変異の排除と組合せの、位置２８、４８、７８および７３から選択される１、２、３、４（若しくは５）残基でのヒト残基（例えば戻し突然変異の排除）を包含しうる。
【実施例９】
【０３９８】
ヒト化１２Ａ１１抗体の機能試験
全部のヒト化１２Ａ１１バージョンをｐＳＭＥＤ２／ｐＳＭＥＮ２発現系にクローン化した。各抗体のコーディング配列を生殖系列リーダー配列に作動可能に連結して細胞外分泌を助長した。ヒト化１２Ａ１１を、下述される機能試験で使用される抗体の分析的量の製造のためＣＯＳ細胞中で一過性に発現させた。ＣＨＯおよびＨＥＫ２９３細胞株をその後トランスフェクトしかつ懸濁培養物に移してｉｎ  ｖｉｖｏ使用のための抗体の産生レベルの安定な発現を提供した。注目すべきことに、最高レベルの一過性発現は、ヒト化１２Ａ１１抗体ｈｕ１２Ａ１１．ｖ１および１２Ａ１１．ｖ３．１をコードする発現構築物で得られた。一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ細胞でのｈ１２Ａ１１ｖ３．１の発現をＨ鎖イントロンの操作により増大させた。いくつかの実験では、安定にトランスフェクトしたプールでのｈ１２Ａ１１ｖ３．１の発現を、Ｈ鎖イントロン含量（すなわちＣＨ１とヒンジ領域の間のイントロン、ヒンジ領域とＣＨ２との間のイントロン、およびＣＨ２とＣＨ３の間のイントロンの欠失）の操作ならびにシグナル配列（すなわち包括的シグナル配列ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＧＡＨＳ（配列番号５６）の使用）により増大させた。全部のヒト化抗体は技術に認識された方法論に従って精製した。
【０３９９】
ヒト化抗体の結合活性を定量的ＥＬＩＳＡアッセイにより最初に示した（データは示されない）。ヒト化１２Ａ１１のバージョン１を、２種の特性すなわち抗原結合（定量的Ａβ  ＥＬＩＳＡ）および相対親和性について、そのマウスおよびキメラの対照物とさらに比較した。ｈ１２Ａ１１ｖ１の結合活性は定量的Ａβ  ＥＬＩＳＡで示され、そしてマウスおよびキメラの形態の１２Ａ１１と同一であることが見出された（図１１を参照されたい）。
【０４００】
ｈ１２Ａ１１ｖ１抗体の親和性もまた、競合的Ａβ  ＥＬＩＳＡによりマウスおよびキメラ１２Ａ１１抗体と比較した。競合結合アッセイのため、ビオチン結合組換えマウス１２Ａ１１Ｃγ２ａ（アイソタイプスイッチ１２Ａ１１）を使用した。凝集物Ａβ  １−４２に対するビオチニル化ｍ１２Ａ１１  Ｃγ２ａの結合活性を、レポーターとしてストレプトアビジン−ＨＲＰを使用するＥＬＩＳＡアッセイにより確認した。レポーターとしてＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＨＲＰを使用する１２Ａ１１の２種のアイソフォーム（Ｃγ１、Ｃγ２ａ）によるＡβ結合の直接比較は、ビオチン結合組換え１２Ａ１１Ｃγ２ａが元のＣγ１マウス抗体に匹敵することを確認した。
【０４０１】
競合結合研究は、固定された濃度のビオチン結合ｍ１２Ａ１１  Ｃγ２ａ、および図１
２に示されるところの濃度の範囲の試験抗体と競合させることを使用した。図１２は、ｈ１２Ａ１１ｖ１をキメラおよびマウスの形態と比較するｈ１２Ａ１１ｖ１競合アッセイの結果を示す。ヒト化１２Ａ１１ｖ１はそのマウスおよびキメラの対照物と２×ＩＣ５０値以内で競合した。このデータは、マウスＣγ２ａおよびｈ１２Ａ１１ｖ１についてそれぞれ３８ｎＭおよび２３ｎＭというＫＤ値を示したＢｉａｃｏｒｅ技術を使用する親和性測定と矛盾しない（データは示されない）。要約すれば、該知見は、ｈ１２Ａ１１ｖ１がその元のマウス対照物の抗原結合特性および親和性を保持することを示唆する。
【０４０２】
ＣＯＳ細胞を、ヒト化１２Ａ１１ＶＨおよびｈ１２Ａ１１ＶＬｖ１の多様な組合で一過性にトランスフェクトした。馴化培地をトランスフェクション７２時間後に収集した。トランスフェクトしたＣＯＳ細胞からの馴化培地中の抗体濃度を定量的ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡにより測定した。定量的Ａβ（１−４２）凝集物結合アッセイは、ｈ１２Ａ１１ｖ２、ｖ２．１およびｖ３は抗原結合についてｈ１２Ａ１１ｖ１およびキメラ１２Ａ１１に匹敵することを確認した。さらに、バージョン５．１〜５．６および６．１〜６．３は、この結合アッセイで試験される場合に類似の結合活性を表す。バージョン６．４は該アッセイで活性の若干の喪失を示したが、しかし活性はｖ２で顕著に復帰された。
【０４０３】
マウス１２Ａ１１およびｈ１２Ａ１１ｖ１の結合特性もまたＢＩＡｃｏｒｅ技術を使用して比較した。マウス１２Ａ１１およびｈ１２Ａ１１ｖ１は、低若しくは高いずれの密度で固定したＡβペプチド（ｂｉｏ−ＤＡＥペプチド）に曝露した場合も類似の結合プロファイルを表した。ｈ１２Ａ１１ｖ１に対するマウス１２Ａ１１の速度論的分析法もまた実施した。これらの研究で、ＢＩＡｃｏｒｅ技術を使用して、固相結合したビオチニル化ＤＡＥペプチドへの可溶性抗体の結合を測定した。ペプチドをストレプトアビジンバイオセンサーチップ上に固定し、その後変動する濃度の各抗体を三重で適用し、そして結合を時間の関数として測定した。速度論データは二価モデルに適用したＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して解析した。見かけの解離（ｋｄ）および会合（ｋａ）速度定数を、大域解析（ｇｌｏｂａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用して、センサー図の適切な領域から計算した。Ｂｉｏ−ＤＡＥ１０と抗体の間の相互作用の親和性定数を動力学定数から計算した。これらの測定値から見かけの解離（ｋｄ）および会合（ｋａ）速度定数を得、そして相互作用のＫＤを計算するのに使用した。表１５は、ＢＩＡｃｏｒｅ分析により測定されたところの１２Ａ１１抗体のＡβ結合の速度論的分析法の要約を包含する。
【０４０４】
【表１６】
2008523815.tif 000018
【０４０５】
該データは、ヒト化１２Ａ１１  ｖ１が親マウス１２Ａ１１と比較する場合にＡβペプチドに対する類似の親和性を有することを示す。
【０４０６】
別の実験で、ヒト化１２Ａ１１  ｖ１、ｖ２、ｖ２．１、ｖ３およびｖ３．１の速度論的特性を比較した。表１６は、（ＢＩＡｃｏｒｅ分析により測定されるところの）多様なヒト化１２Ａ１１抗体のＡβ結合の速度論的分析法の要約を包含する。
【０４０７】
【表１７】
2008523815.tif 000019
【０４０８】
該データは、ヒト化１２Ａ１１  ｖ１およびヒト化１２Ａ１１  ｖ３．１が、親マウス１２Ａ１１と比較した場合にＡβペプチドに対する類似の親和性を有することを示す（ｈ１２Ａ１１ｖ１＞ｍ１２Ａ１１＞ｃｈｉ１２Ａ１１＞ｈ１２Ａ１１ｖ３．１＞ｈ１２Ａ１１ｖ２．１＞ｈ１２Ａ１１ｖ２＞ｈ１２Ａ１１ｖ３．１）。注目すべきことに、ヒト化１２Ａ１１  ｖ１およびヒト化１２Ａ１１  ｖ３．１の親和性は、競合結合および／若しくはＢＩＡｃｏｒｅ分析により測定されるとおり、キメラ１２Ａ１１抗体のものの２〜３倍以内である。
【０４０９】
類似の結果が、上述されたとおり実施した競合結合研究で見られた（図１３を参照されたい）。注目すべきことに、ＶＨ中のバーニア残基４８の戻し突然変異（Ｖ４８Ｌ）の復帰は、ｈ１２Ａ１１ｖ３．１の親和性をｈ１２Ａ１１ｖ１のもの近くまで増大させる。
【０４１０】
ヒト化１２Ａ１１  ｖ１およびヒト化１２Ａ１１ｖ３を、斑を結合しかつ斑を消失させる能力についてｅｘ  ｖｉｖｏアッセイでさらに試験した。免疫組織化学をＰＤＡＰＰおよびヒトＡＤ脳からのクライオスタット切片で実施した。ヒト化１２Ａ１１  ｖ１およびヒト化１２Ａ１１ｖ３をキメラ１２Ａ１１と比較し、そして試験した全濃度（すなわち０．３μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌおよび３μｇ／ｍｌ）でＰＤＡＰＰおよびヒトクライオスタット切片双方で斑を染色することが見出された。Ｆｃ媒介性の斑消失を誘発するそれらの能力の尺度として、ヒト化１２Ａ１１  ｖ１およびヒト化１２Ａ１１ｖ３を、斑を消失させるそれらの能力について、初代マウス小膠細胞およびＰＤＡＰＰマウスからの脳組織の切片でのｅｘ  ｖｉｖｏ食作用アッセイでもまた試験した。Ａβ若しくはアッセイの他の成分に対する反応性を有しない無関係のＩｇＧ１抗体を陰性対照として使用した。ヒト化１２Ａ１１  ｖ１、ヒト化１２Ａ１１ｖ３およびキメラ１２Ａ１１抗体のそれぞれが、０．３μｇ／ｍｌの濃度で試験した場合にＡβレベルを効率的に低下させた（データは示されない）。
【０４１１】
キメラ１２Ａ１１、ヒト化１２Ａ１１  ｖ１およびヒト化１２Ａ１１ｖ３の結合特異性を、後に続くところの置換ＮＥＴ（ｒＮＥＴ）分析により比較した。簡潔には、ｒＮＥＴエピトープ地図アッセイを実施して、試験した抗体の全体的結合活性へのＡβのＮ末端エピトープ内の個々の残基の寄与についての情報を提供した。ｒＮＥＴ分析は合成した体系的単一置換ペプチドアナログを使用する。ＡβのＮ末端の１０アミノ酸に対応するペプチド（「天然の」抗原）および１９種の代替の「単一置換」ペプチド（各ペプチドは第一の位置で、その位置の１９種の非天然のアミノ酸の１種で置換されている）に対するマウス１２Ａ１１の結合を測定した。結合活性に対する多様な非天然の残基でのその位置の置換の影響を反映するプロファイルが生成された（捕捉ＥＬＩＳＡにより測定される）。プロファイルは同様に、抗原ペプチドに沿った連続する位置（合計８残基）でも生成された。組合せたプロファイル、すなわちエピトープ地図（全１９種の非天然のアミノ酸での各位
置の置換を反映する）をその後、同様に生成したキメラ１２Ａ１１、ヒト化１２Ａ１１  ｖ１およびヒト化１２Ａ１１  ｖ３．１の地図と比較した。注目すべきことに、ヒト化１２Ａ１１  ｖ１およびヒト化１２Ａ１１ｖ３．１の特異性は親マウス１２Ａ１１抗体と同一若しくは同様であった。
【実施例１０】
【０４１２】
ヒト化１２Ａ１１抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性：Ｔｇ２５７６マウスの認知の迅速な改善
マウス１２Ａ１１（ｍｕ１２Ａ１１）、キメラ１２Ａ１１（ｃｈｉ１２Ａ１１）およびヒト化形態の１２Ａ１１（ｖ３．１  ｈｕ１２Ａ１１）抗体の治療的有効性をＣＦＣアッセイで比較した。実施例４でのとおり、野性型およびＴｇ２５７６双方のマウスに、単一用量のリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）若しくは処置抗体を腹腔内注入により投与した。
【０４１３】
認知（すなわち文脈的および手掛かり依存的記憶）のいかなる迅速な改善も評価するため、各マウスに、処置直後にＣＦＣ訓練活動、および処置の２４時間以内（すなわち処置後第１日）にＣＦＣ試験活動を実施した。ＣＦＣアッセイの結果を図１４に描く。該データは、ｍｕ１２Ａ１１、ｃｈｉ１２Ａ１１およびｖ３．１  ｈｕ１２Ａ１１が認知の迅速な改善において類似の効力を有することを明瞭に示す。例えば、３ｍｇ／ｋｇ用量若しくはそれ以上のｃｈｉ１２Ａ１１若しくはｖ３．１  ｈｕ１２Ａ１１いずれも、１ｍｇ／ｋｇ用量のｍｕ１２Ａ１１で得られた結果に大きさが類似であった記憶障害の逆転をもたらした。ヒト化１２Ａ１１抗体ｖ１．０からｖ３．１、とりわけｖ１．０、ｖ３．０およびｖ３．１もまたＣＦＣアッセイで有効と判明し、ｖ１．０およびｖ３．１はマウス１２Ａ１１のものに類似の有効性を有し、また、ｖ３．０は有意の有効性をさらに表した。さらに、ｈ１２Ａ１１  ｖ１．０は、二重トランスジェニックＡＤマウスを試験した（ＭＥＤ＝３ｍｇ／ｋｇ）ＣＦＣアッセイで有効であり、受動的に投与した抗体の有効性がこれらのマウスでの斑結合により滴定されなかったことを示した。マウス抗体２６６（斑結合しない）を陽性対照（ＭＥＤ＝３ｍｇ／ｋｇ）として包含した。
【０４１４】
ＩｇＧアイソタイプｈ１２Ａ１１  ｖ１．０抗体の能力もまたＣＦＣで試験し、そしてＭＥＤ  ０．１ｍｇ／ｋｇで有効であることが判明した。アイソタイプスイッチはＦｃ媒介性の活性を大きく低下させた（しかし排除しなかった）ことを示し、有効性がＦｃ機能にのみ依存しないことを示す。
【０４１５】
前述の発明は理解の明確さの目的上詳細に記述されたとは言え、付随する請求の範囲の範囲内である種の改変を実施しうることが明らかであろう。本明細書で引用される全部の刊行物および特許文書、ならびに図面および配列表中に現れる文章は、これにより、それぞれがそのように個々に示される場合と同一の程度まで、全部の目的上、そっくりそのまま引用することにより組み込まれる。
【０４１６】
前述から、本発明は多数の用途を提供することが明らかであろう。例えば、本発明は、Ａβ関連疾患若しくは障害またはアミロイド形成疾患若しくは障害の処置、予防若しくは診断、あるいはそれらでの使用のための医薬品若しくは診断組成物の製造における上述されたＡβに対する抗体のいずれの使用も提供する。
【図面の簡単な説明】
【０４１７】
【図１】ｅｘ  ｖｉｖｏ食作用アッセイでのＡβ斑の消失での１２Ａ１１を包含する多様な抗体の有効性を検査する実験からの結果をグラフで描く。
【図２Ａ】全Ａβレベルの低下での１２Ａ１１を包含する多様な抗体の有効性を検査する実験からの結果をグラフで描く。棒は中央値を表し、また、水平な点線は対照レベルを示す。
【図２Ｂ】神経炎性ジストロフィーの低下での１２Ａ１１を包含する多様な抗体の有効性を分析する実験からの結果をグラフで描く。棒は中央値を表し、また、水平な点線は対照レベルを示す。データは個々の動物について示し、かつ、対照の平均（１００％に設定）に関する神経炎性ジストロフィーの比率として表す。
【図３】多様なＡβ抗体（３Ｄ６、６Ｃ６、１２Ａ１１、１２Ｂ４、３Ａ３、２６６、９Ｇ８、１５Ｃ１１および６Ｈ９）とともに沈殿させかつ３Ｄ６とともに画像化した、ペルオキシ亜硝酸塩処理したオリゴマーＡβ１−４２調製物の免疫沈降物のウエスタンブロットを描く。Ａβ１−４２単量体、二量体、三量体および四量体バンドのおおよその位置を図の左側に示す。抗体により認識されるＡβエピトープ、および該抗体についてのコンテクチュアル・フィアー・コンディショニング（ＣＦＣ）アッセイの結果を各Ａβ抗体の下に示し、「＋」表記は該抗体での処置に際しての増大した認知の観察結果を示し、「−」表記は該抗体での処置に際して認知の変化なしという観察結果を示し、「＋／−」表記は、該抗体での処置に際しての増大した認知の傾向の観察結果を示すが、しかし該観察された傾向が増大した認知の観察結果として示されるのに十分統計学的に有意でないことを示し、また、「ＮＤ」表記はこの抗体に比較したＣＦＣアッセイデータがないことを示す。
【図４】多様なＡβ抗体（３Ｄ６、６Ｃ６、１２Ａ１１、１２Ｂ４、１０Ｄ５、３Ａ３、２６６および６Ｈ９）とともに沈殿させかつ３Ｄ６とともに画像化した、ペルオキシ亜硝酸塩処理したオリゴマーＡβ１−４２調製物の免疫沈降物のウエスタンブロットを描く。注釈は図３についてと同一である。
【図５Ａ】Ｔｇ２５７６マウスへの単一用量のマウス１２Ａ１１（１、１０および３０ｍｇ／ｋｇ）の投与後に認知の迅速な改善が観察されるＣＦＣアッセイの結果を描く。
【図５Ｂ】Ｔｇ２５７６マウスへの単一の低用量のマウス１２Ａ１１（０．３および１ｍｇ／ｋｇ）の投与後に認知の迅速な改善が観察されるＣＦＣアッセイの結果を描く。
【図６】単一用量のマウス１２Ａ１１（１ｍｇ／ｋｇ）の投与後の改善された認知の持続期間を、コンテクチュアル・フィアー・コンディショニング（ＣＦＣ）アッセイで投与後１、１０および１７日に評価する試験の結果を描く。
【図７Ａ】マウス１２Ａ１１  ＶＨ鎖配列を包含するＤＮＡ配列、および該ＶＨ鎖の推定されるアミノ酸配列（それぞれ配列番号６および３）を描く。成熟ＶＨ鎖は黒棒により示す。ＣＤＲは白棒により示す。ＤＮＡ配列は、クローニング部位およびコザック配列（コーディング配列の上流）ならびにスプライスおよびクローニング配列（下流）を包含する。
【図７Ｂ】マウス１２Ａ１１  ＶＬ鎖を包含するＤＮＡ配列および該ＶＬ鎖の推定されるアミノ酸配列（それぞれ配列番号５および２）を描く。成熟ＶＬ鎖は黒棒により示す。ＣＤＲは白棒により示す。
【図８】Ａβ  １−４２へのキメラ１２Ａ１１、キメラおよびヒト化３Ｄ６（ｈ３Ｄ６）、ならびにキメラおよびヒト化１２Ｂ４の結合を測定する実験からのＥＬＩＳＡの結果をグラフで描く。
【図９Ａ】マウス（若しくはキメラ）１２Ａ１１（配列番号２）、ヒト化１２Ａ１１（成熟ペプチド、配列番号７）、ＧｅｎＢａｎｋ  ＢＡＣ０１７３３（配列番号８）および生殖系列Ａ１９（Ｘ６３３９７、配列番号９）抗体のＬ鎖のアミノ酸配列のアライメントを描く。ＣＤＲ領域が囲まれている。充填残基に下線を付ける。Ｋａｂａｔの番号付けでなく最初のメチオニンから番号付ける。
【図９Ｂ】マウス（若しくはキメラ）１２Ａ１１（配列番号４）、ヒト化１２ａＡ１１（バージョン１）（成熟ペプチド、配列番号１０）、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＡ６９７３４（配列番号１１）および生殖系列ＧｅｎＢａｎｋ  ５６７１２３抗体（配列番号１２）のＨ鎖のアミノ酸配列のアライメントを描く。充填残基に下線を付け、正準残基は黒地白抜きであり、そしてバーニア残基は点線で囲まれている。Ｋａｂａｔの番号付けでなく最初のメチオニンから番号付ける。
【図１０Ａ−Ｂ】ヒト化１２Ａ１１  ｖ１（配列番号１０）、ｖ２（配列番号１３）、ｖ２．１（配列番号１４）、ｖ３（配列番号１５）、ｖ３．１（配列番号３６）、ｖ４．１（配列番号１６）、ｖ４．２（配列番号１７）、ｖ４．３（配列番号１８）、ｖ４．４（配列番号１９）、ｖ５．１（配列番号２０）、ｖ５．２（配列番号２１）、ｖ５．３（配列番号２２）、ｖ５．４（配列番号２３）、ｖ５．５（配列番号２４）、ｖ５．６（配列番号２５）、ｖ６．１（配列番号２６）、ｖ６．２（配列番号２７）、ｖ６．３（配列番号２８）、ｖ６．４（配列番号２９）、ｖ７（配列番号３０）およびｖ８（配列番号３１）のＨ鎖のアミノ酸配列のアライメントを描く。
【図１０Ｃ】ヒト化１２Ａ１１  ｖ１ないしｖ８で行われた戻し突然変異を示す。
【図１１】キメラ１２Ａ１１、ヒト化１２Ａ１１  ｖ１、ヒト化１２Ａ１１  ｖ２、ヒト化１２Ａ１１  ｖ２．１およびヒト化１２Ａ１１  ｖ３を比較する凝集型Ａβ（１−４２）のＥＬＩＳＡからの結果を描く。
【図１２】マウス１２Ａ１１、キメラ１２Ａ１１およびｈ１２Ａ１１  ｖ１を比較する競合Ａβ１−４２  ＥＬＩＳＡ結合アッセイの結果を描く。
【図１３】マウス１２Ａ１１、キメラ１２Ａ１１、ｈ１２Ａ１１  ｖ１、ｈ１２Ａ１１  ｖ２、ｈ１２Ａ１１  ｖ３およびｈ１２Ａ１１  ｖ３．１を比較する競合Ａβ１−４２  ＥＬＩＳＡ結合アッセイの結果を描く。
【図１４】単一用量のヒト化１２Ａ１１抗体ｖ３．１  ｈ１２Ａ１１（１、１０および３０ｍｇ／ｋｇ）のＴｇ２５７６マウスへの投与後に認知の迅速な改善が観察されるＣＦＣアッセイの結果を描く。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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