(57)【要約】血管形成に関する状態を有する被験体を処置する方法であって、被験体における血管形成を助長または阻害するために、甲状腺ホルモンのポリマー形態、またはそのアンタゴニストの有効量を投与することを含む方法が開示される。甲状腺ホルモンのポリマー形態、または甲状腺ホルモンアナログの組成物も開示される。本発明により処置される疾患としては、閉塞性血管疾患、冠動脈疾患、勃起不全、心筋梗塞、虚血、脳卒中、末梢動脈血管障害、および創傷が挙げられ得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管形成を助長することによって処置の影響を受けやすい状態を処置する方法であって、それを必要とする被験体に、該被験体の血管形成を助長するのに有効な量の甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモンアナログ、またはそのポリマー形態を投与することを含む方法。
【請求項２】
血管形成を助長することによる処置の影響を受けやすい前記状態が、閉塞性血管疾患、冠動脈疾患、勃起不全、心筋梗塞、虚血、脳卒中、末梢動脈血管障害、および創傷から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記甲状腺ホルモンまたはアナログがポリビニルアルコール、アクリル酸エチレンコポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸、およびアガロースから成る群より選択される構成要素にコンジュゲートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記甲状腺ホルモンアナログがレボチロキシン（Ｔ４）、トリヨードチロニン（Ｔ３）、３，５−ジメチル−４−（４’−ヒドロキシ（ｈｙｄｒｏｙ）−３’−イソプロピルベンジル）−フェノキシ酢酸（ＧＣ−１）、または３，５−ジヨードチロプロピオン酸（ＤＩＴＰＡ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモンアナログ、またはそのポリマー形態の投与方式が非経口、経口、経直腸、局所、またはそれらの組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記非経口投与が皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、またはそれらの組合せである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモンアナログ、またはそのポリマー形態が微粒子、リポソーム、またはポリマー内にカプセル化されるか、あるいは包含される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリマーがポリグリコリド、ポリラクチド、またはそのコポリマーである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記リポソームまたは微粒子が約２００ｎｍ未満のサイズを有する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記リポソームまたは微粒子が静脈内投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記リポソームまたは微粒子が虚血組織を包囲する毛細血管床に入れられる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモンアナログ、またはそのポリマー形態がカテーテルによって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモンアナログ、またはそのポリマー形態が、前記カテーテルによって血管の内側に塗布されるポリマー系内に存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモンアナログ、またはそのポリマー形態が成長因子、血管拡張薬、抗凝固薬、およびそれらの組合せから成る群より選択される１つ以上の化合物と同時投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記成長因子が形質転換成長因子アルファ（ＴＧＦα）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、塩基性線維芽細胞成長因子、血管内皮成長因子、上皮成長因子，神経成長因子、血小板由来成長因子、および血管透過性因子から成る群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記血管拡張薬がアデノシン、アデノシン誘導体、またはそれらの組合せである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗凝固薬がヘパリン、ヘパリン誘導体、抗因子Ｘａ、抗トロンビン、アスピリン、クロピドグレル、またはそれらの組合せである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモンアナログ、またはそのポリマー形態が、前記成長因子、血管拡張薬、抗凝固薬、またはそれらの組合せを投与する前または後に、ボーラス注射として投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
医療器具に沿って、またはその周囲で血管形成を助長する方法であって、該器具を患者に挿入する前に甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモンアナログ、またはそのポリマー形態によって該器具をコーティングすることを含む方法。
【請求項２０】
前記コーティング工程が前記器具を成長因子、血管拡張薬、抗凝固薬、またはそれらの組合せによってコーティングすることをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記医療器具がステント、カテーテル、カニューレ、または電極である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
血管形成を阻害することによる処置の影響を受けやすい状態を処置する方法であって、それを必要とする被験体に、該被験体での血管形成を阻害するのに有効な量の抗血管形成剤を投与することを含む方法。
【請求項２３】
血管形成を阻害することによる処置の影響を受けやすい前記状態が原発性または転移性腫瘍、グリオーマ、乳癌、および糖尿病網膜症から成る群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗血管形成剤がテトラヨードチロ酢酸（ＴＥＴＲＡＣ）、トリヨードチロ酢酸（ＴＲＩＡＣ）、モノクローナル抗体ＬＭ６０９、ＸＴ１９９、またはそれらの組合せである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗血管形成剤の投与方式が非経口、経口、経直腸、局所、またはそれらの組合せである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗血管形成剤が１つ以上の他の抗血管形成療法または化学療法剤と同時投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗血管形成剤が細胞表面にて作用する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記甲状腺ホルモンまたはそのアナログを含む血管形成剤。
【請求項２９】
前記ポリマーにコンジュゲートされた甲状腺ホルモンまたはそのアナログを含む血管形成剤。
【請求項３０】
前記アナログが図２０、表Ａ〜Ｄに列挙された化合物から選択される、請求項２９に記載の血管形成剤。
【請求項３１】
前記甲状腺ホルモンアナログがレボチロキシン（Ｔ４）、トリヨードチロニン（Ｔ３）、３，５−ジメチル−４−（４’−ヒドロキシ（ｈｙｄｒｏｙ）−３’−イソプロピルベンジル）−フェノキシ酢酸（ＧＣ−１）、または３，５−ジヨードチロプロピオン酸（ＤＩＴＰＡ）である、請求項２９に記載の血管形成剤。
【請求項３２】
前記ポリマーがポリビニルアルコール、アクリル酸エチレンコポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸、またはアガロースである、請求項２９に記載の血管形成剤。
【請求項３３】
前記コンジュゲーションが共有結合または非共有結合を介する、請求項２９に記載の血管形成剤。
【請求項３４】
前記共有結合がエステル結合または無水物結合である、請求項３３に記載の血管形成剤。
【請求項３５】
製薬的に許容される担体中に請求項２９に記載の血管形成剤を含む製薬調剤物。
【請求項３６】
１つ以上の製薬的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項３５に記載の製薬調剤物。
【請求項３７】
前記薬剤が微粒子、リポソーム、またはポリマーにカプセル化されるか、または含まれている、請求項３５に記載の製薬調剤物。
【請求項３８】
前記リポソームまたは微粒子が２００ｎｍ未満のサイズを有する、請求項３７に記載の製薬調剤物。
【請求項３９】
前記調剤物が非経口、経口、経直腸、または局所投与方式、またはそれらの組合せを有する、請求項３５に記載の製薬調剤物。
【請求項４０】
前記調剤物がそれを必要とする被験体に成長因子、血管拡張薬、抗凝固薬、およびそれらの組合せから成る群より選択される１つ以上の化合物と共に同時投与される、請求項３５に記載の製薬調剤物。
【請求項４１】
１つ以上の甲状腺ホルモンアナログの治療有効量を含む、神経変性疾患または障害を処置するための製薬組成物。
【請求項４２】
前記甲状腺ホルモンアナログがＴ３、ＤＩＴＰＡ、またはＧＣ−１である、請求項４１に記載の製薬組成物。
【請求項４３】
前記甲状腺ホルモンアナログがポリマーコンジュゲートされている、請求項４１に記載の製薬組成物。
【請求項４４】
前記ポリマーがポリビニルアルコール、ポリ乳酸、アクリル酸無水物、ポリエチレングリコール、セルロース、およびデンドリマーから成る群より選択される、請求項４３に記載の製薬組成物。
【請求項４５】
前記甲状腺ホルモンアナログがナノ粒子にコンジュゲートされている、請求項４１に記載の製薬組成物。
【請求項４６】
前記組成物が血管形成誘発因子、神経成長因子、神経形成因子、抗炎症剤、抗酸化剤、またはそれらの組合せをさらに含む、請求項４１に記載の製薬組成物。
【請求項４７】
前記血管形成誘発因子がＦＧＦまたはＶＥＧＦである、請求項４６に記載の製薬組成物。
【請求項４８】
前記抗酸化剤がビタミンＣ、ビタミンＥ、レスベラトロル様化合物、またはそれらの組合せである、請求項４６に記載の製薬組成物。
【請求項４９】
前記抗炎症剤が非ステロイド性化合物、インスリン増感剤、およびプロテソームインヒビタから成る群より選択される化合物である、請求項４６に記載の製薬組成物。
【請求項５０】
前記組成物が製薬的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項４１に記載の製薬組成物。
【請求項５１】
前記治療有効量が１〜１００ｍｇの投薬量である、請求項４１に記載の製薬組成物。
【請求項５２】
前記神経変性疾患または障害が運動ニューロン欠陥、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、脊髄損傷、脱髄疾患、ミエロパシーから成る群より選択される、請求項４１に記載の製薬組成物。
【請求項５３】
神経変性疾患または障害を処置する方法であって、それを必要とする被験体に１つ以上の甲状腺ホルモンアナログを含む製薬組成物の製薬的有効量を投与することを含む方法。
【請求項５４】
前記製薬組成物が神経成長因子、神経形成因子、抗酸化剤、抗炎症剤、またはそれらの組合せと同時投与される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
末梢神経系または中枢神経系の損傷した神経路を修復する方法であって、それを必要とする被験体に１つ以上の甲状腺ホルモンアナログを含む製薬組成物の製薬的有効量を投与することを含む方法。
【請求項５６】
トランスチレチンに結合する標識甲状腺ホルモンアナログを含む、神経変性疾患を診断するための造影剤。
【請求項５７】
前記薬剤が血液脳関門を通過する、請求項５６に記載の造影剤。
【請求項５８】
前記甲状腺ホルモンアナログがＴ３、Ｔ４、ＤＩＴＰＡ、ＧＣ−１から成る群より選択される、請求項５６に記載の造影剤。
【請求項５９】
前記甲状腺ホルモンアナログがポリマーコンジュゲートされている、請求項５６に記載の造影剤。
【請求項６０】
前記甲状腺ホルモンアナログがデンドリマーにコンジュゲートされている、請求項５６に記載の造影剤。
【請求項６１】
前記神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項５６に記載の造影剤。
【請求項６２】
前記薬剤がアミロイドフィブリルの形成を阻害する請求項６１に記載の造影剤。
【請求項６３】
前記薬剤が陽電子放出断層撮影、単光子放出コンピュータ断層撮影、または磁気共鳴撮像によって撮像される、請求項５６に記載の造影剤。
【請求項６４】
前記甲状腺ホルモンアナログがレチノイン酸、ハロゲン化スチルベストロール、またはそのアナログにコンジュゲートされる、請求項５６に記載の造影剤。
【請求項６５】
アルツハイマー病を診断する方法であって、アルツハイマー病を有することが疑われる、またはアルツハイマー病のリスクに瀕した被験体にトランスチレチンに結合する標識甲状腺ホルモンアナログを含む造影剤を投与する工程と、陽電子放出断層撮影、単光子放出コンピュータ断層撮影、または磁気共鳴撮像から成る群より選択される脳撮像技法を使用して、該被験体の脳内での造影剤の分布を示す少なくとも１枚の画像を形成する工程とを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモンアナログおよびその誘導体、ならびにそのポリマー形態に関する。そのような化合物、およびそれを含有する製薬組成物を使用する方法も開示される。本発明は、そのような化合物を調製する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
甲状腺ホルモンであるＬ−チロキシン（Ｔ４）およびＬ−トリヨードチロニン（Ｔ３）は、脊椎動物の各種の組織における多数の各種生理学的プロセスを調節する。甲状腺ホルモンの作用の大半は、リガンド活性化転写制御因子の核受容体スーパーファミリの一員である、甲状腺ホルモン受容体（「ＴＲ」）によって仲介される。このスーパーファミリは、ステロイドホルモン、レチノイド、および１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の受容体も含む。これらの受容体は、各種の組織における特異的遺伝子の発現を制御できる転写因子であり、幅広く使用される薬物、たとえばタモキシフェン、エストロゲン受容体部分アンタゴニストの標的である。２つの異なるＴＲであるＴＲαおよびＴＲβをコードする２つの異なる遺伝子がある。これらの２つのＴＲは、異なる組織において異なるレベルで同時発現されることが多い。大半の甲状腺ホルモンは２つのＴＲを区別せず、どちらとも同様の親和性で結合する。
【０００３】
マウスでの遺伝子ノックアウト試験は、ＴＲβは聴覚系の発達において、そして下垂体中のＴ３による甲状腺刺激ホルモンの負のフィードバックにおいて役割を果たすのに対して、ＴＲαは熱発生に対する、そして心臓血管系に対する甲状腺ホルモンの効果を調節することを示している。ＴＲアンタゴニストの同定は、甲状腺機能低下症の将来の処置で重要な役割を果たせる。そのような分子は、甲状腺ホルモンの効果を受容体レベルで直接アンタゴナイズすることによって迅速に作用し、外科手術を必要とする、心臓疾患を有する、または生命を脅かす甲状腺クリーゼの危機に瀕している甲状腺機能低下症患者にとって著しい改善である。
【０００４】
それゆえ、内科的治療に有用であることが証明される甲状腺ホルモン受容体（ＴＲ）のアイソフォーム選択的アゴニストまたはアンタゴニストとして機能することによって、甲状腺ホルモン作用を選択的に調節する化合物の開発への必要が残っている。近年の研究成果は、潜在的な治療剤および化学プローブとしての甲状腺ホルモン（Ｔ３／Ｔ４）アンタゴニストの設計および合成に集中している。天然ホルモンよりも接近しやすく、潜在的に有用な受容体結合および活性化特性を有するチロミメティック化合物の開発への必要もある。
【０００５】
甲状腺ホルモン受容体は、循環Ｌ−チロキシン（Ｔ４）の組織脱ヨード化に由来するホルモンアナログである、３，５，３’−トリヨード−Ｌ−チロニン（Ｔ３）に優先的に結合する。しかしながらＴ４およびＴ３がＴＲとは独立して、細胞内シグナル伝達カスケードを活性化する能力は、複数の研究所によって近年記述されている。甲状腺ホルモンは、ＴＲとは独立して作用して、原形質膜Ｎａ＋／Ｈ＋交換体、Ｃａ２＋刺激性ＡＴＰａｓｅ、複数の他のイオンポンプまたはチャネルの活性、およびシナプトソームのＧＴＰａｓｅ活性も調節する。複数の研究所による試験は、甲状腺ホルモンがＭＡＰＫシグナル伝達カスケードを活性化する能力を証明している。これらの経路は通例、細胞表面での物理的および化学的シグナルによって活性化される。甲状腺ホルモンの原形質膜への結合の動力学およびアナログ特異性は繰返し報告されてきたが、甲状腺ホルモンに関するこれらのＴＲ依存性作用を説明する細胞表面受容体は以前に同定されていない。
【０００６】
本発明者らの研究所は、機能性ＴＲを欠くＣＶ−１サル線維芽細胞系において、そして他の細胞において、Ｔ４が有糸分裂促進物質活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ；ＥＲＫ１１２）シグナル伝達カスケードを活性化して、Ｔ４の生理学的濃度利用の早くも１０分後にＭＡＰＫのホスホリル化および核転座を促進することを示している。甲状腺ホルモン処置細胞の核画分において、本発明者らは活性化ＭＡＰＫおよびＭＡＰＫのセリンキナーゼ活性のための基質であるトランス活性化因子核タンパク質の複合体について述べている。これらのタンパク質は、シグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ）−１α、ＳＴＡＴ３、ｐ５３、エストロゲン受容体（ＥＲ）−αを、そしてＴＲを含有する細胞には、Ｔ３の核甲状腺ホルモン受容体（ＴＲβ１）を含む。これらのタンパク質の甲状腺ホルモン支配ＭＡＰＫ依存性ホスホリル化は、その転写性能を向上させる。Ｔ４誘発ＭＡＰＫ活性化の効果は、ＭＡＰＫシグナル伝達経路のインヒビタによって、そして細胞表面へのＴｑ結合を阻害する甲状腺ホルモンアナログであるテトラヨードチロ酢酸（ｔｅｔｒａｃ）によって遮断される。甲状腺ホルモン活性化ＭＡＰＫは、むしろ細胞核に転座されるときよりも、原形質膜にてたとえばＮ＋／Ｈ＋アンチポータにも作用できる。ＭＡＰＫカスケードの活性化に関連付けられるＴ４の細胞表面レセプタは以前に同定されていない。
【０００７】
インテグリンは、非共有結合性ヘテロダイマーを形成する膜貫通糖タンパク質のファミリである。インテグリンの細胞外ドメインは、細胞外マトリクス糖タンパク質を含む各種のリガンドと相互作用して、細胞内ドメインは細胞骨格に関連付けられる。甲状腺ホルモンは１０年前に、インテグリンと細胞外マトリクスタンパク質のラミニンとの相互作用に影響することが示されたが、機構は不明であった。インテグリンαＶβ３は成長因子を含めて多数の細胞外タンパク質リガンドを有し、リガンド結合時にＭＡＰＫカスケードを活性化できる。複数のインテグリンは、マトリクスのリガンド化に重要であるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（「ＲＧＤ」）認識部位およびＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含有する他の細胞外タンパク質を含有する。
【０００８】
それゆえ甲状腺ホルモン、またはそのアナログおよびポリマーによって処置された細胞におけるＭＡＰＫシグナル伝達カスケードの誘発のための開始部位を同定および提供することが望ましく、それにより成長因子およびその細胞表面受容体がこの開始部位付近に密集した他のポリペプチドを調節する方法が提供される。
【０００９】
米国では５００万人の人々が慢性安定狭心症に罹患していると概算されている。毎年２００，０００人の６５歳未満の人々が、「早期虚血性心疾患」と呼ばれるもので死亡している。内科的治療にもかかわらず、多くが心筋梗塞および衰弱症状を引き起こし、経皮経腔冠動脈血管形成術または冠動脈バイパス手術のどちらかを用いた血管再生術への要求が促される。心筋虚血を軽減する１つの方法は冠状血管副行循環を向上させることである、ということが仮定されている。
【００１０】
心筋梗塞急性期中の冠内血栓溶解治療時に描出された冠状側副血管（「側枝」）の解剖学的外観およびクレアチンキナーゼ時間−活性曲線、梗塞のサイズ、ならびに動脈瘤形成の間に、相関関係がもたらされている。これらの試験は、冠動脈閉塞疾患のある心臓内での側枝の保護的役割を証明し、側枝が描出されない患者と比較して、より小さい梗塞、より少ない動脈瘤形成、および改善された心室機能を示している。心筋細胞が虚血になると、側枝は内皮および平滑筋細胞のＤＮＡ複製および有糸分裂による成長によって活発に発達する。虚血が発現すると、これらの因子は活性化されて、受容体占有に利用できるようになり、このことによって外因性ヘパリンへの暴露後に血管形成が開始することがある。都合の悪いことに、血管形成が発生する「天然」プロセスは、冠動脈疾患を持つほぼすべての患者での虚血を取消すのには不十分である。
【００１１】
虚血の間、アデノシンはＡＴＰの分解によって放出される。アデノシンは多くの心臓保護生物学的事象に関与している。アデノシンは血行変化、たとえば除脈および血管拡張での役割を有し、アデノシンは、前条件付けなどの関係のない現象で、そしておそらく再潅流傷害の減少で役割を有することが示唆されている（Ｅｌｙ  ａｎｄ  Ｂｅｒｎｅ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８５：８９３（１９９２）。
【００１２】
血管形成は、先在する血管からの新しい血管の発現である（Ｍｏｕｓａ，Ｓ．Ａ．，Ｉｎ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｓ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌａｎｄｅｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ，Ｔｅｘａｓ；Ｃｈａｐｔｅｒ  １，（２０００））。生理学的に、血管形成は成熟した生物の適正な発育を確実にして、卵着床のために子宮を準備し、創傷治癒で重要な役割を果たす。胚形成中の血管網目の発達または正常または病的血管形成は、成長因子および細胞外マトリクスとの細胞相互作用に依存する（Ｂｒｅｉｅｒら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６：４５４−４５６（１９９６）；Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １：２７−３１（１９９５）；Ｒｉｓａｕ，Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：６７１−６７４（１９９７）。血管は、胚形成の間に２つのプロセス：脈管形成および血管形成によって発生する（Ｂｌｏｏｄら、Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０３２：８９−１１８（１９９０）。血管形成は、血管形成誘発因子と抗血管形成剤とのバランスによって制御される多工程プロセスである。このプロセスの後者のステージは、チューブ様構造内への内皮細胞（ＥＣ）への増殖および組織化を含む。ＦＧＦ２およびＶＥＧＦなどの成長因子は、内皮細胞成長および分化を促進する重要な担い手であると考えられる。
【００１３】
血管形成の制御は、血管成長因子（Ｐ  Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９０２：２４９−２６０，２０００）、細胞外マトリクス、接着分子および代謝因子（ＲＪ  Ｔｏｍａｎｅｋ，ＧＣ  Ｓｃｈａｔｔｅｍａｎ，Ａｎａｔ  Ｒｅｃ  ２６１：１２６−１３５，２０００）の局所放出を含む複雑なプロセスである。血管内の機械的力も役割を演じることがある（Ｏ  Ｈｕｄｌｉｃｋａ，Ｍｏｌｅｃ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １４７：５７−６８，１９９５）。新しい血管成長に関与する内因性成長因子の主なクラスは、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリおよび血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）（Ｇ  Ｐａｇｅｓ，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９０２：１８７−２００，２０００）である。有糸分裂促進活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ；ＥＲＫ１／２）シグナル伝達カスケードは、ＶＥＧＦ遺伝子発現と、血管内皮細胞の増殖制御との両方に関与する。
【００１４】
内因性アデノシンは心筋酸素要求量の増加に対する冠血流反応を促進するため、冠血流余裕量を調節できる。Ｅｔｈｉｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｈ１３１（１９９３）は、生理学的濃度のアデノシンのヒト臍静脈内皮細胞培養物への添加が、おそらくは表面受容体によって増殖を刺激することを証明した。アデノシンはヒト内皮細胞成長、そしておそらく血管形成の因子でありうる。血管形成は冠動脈疾患（「ＣＡＤ」）などの血流閉塞を持つ患者にとっては保護的であると思われるが、血管が自然に成長する速度は、疾患を逆行させるには不十分である。それゆえ体の自然な血管形成ポテンシャルを向上および加速する方法は、ＣＡＤ患者には有益なはずである。
【００１５】
同様に、創傷治癒は多くの発展途上国で主要な問題であり、糖尿病患者は創傷治癒の低下および慢性炎症性障害を抱え、各種のシクロオキシゲナーゼ−２（ＣｏＸ２）インヒビタの使用が増加している。新しい血管は活性細胞を支援するために栄養素を供給し、肉芽組織形成を促進して、残骸の除去を促進するため、血管形成は創傷修復に必要である。肉芽組織塊の約６０％は、修復および脈管成長を刺激するために必要な酸素も供給する血管で構成される。血管形成剤が創傷液中に存在し、抗血管形成剤が修復を阻害するのに対して修復を促進することが十分に述べられている。創傷血管形成は複雑な多工程プロセスである。多くの血管形成剤に関する詳細な情報にも関わらず、これら因子の供給源の定義、創傷血管形成に関与する制御事象および修復を促進するための血管形成刺激物質の臨床使用ではほとんど進歩が見られない。創傷血管形成および修復の理解をさらに複雑にしているのは、修復に関与する機構およびメディエータが創傷の深さ、創傷の種類（火傷、外傷など）、そして位置（筋肉、皮膚、骨など）に応じて変化しやすいという事実である。患者の状態および年齢（糖尿病、下半身不随、ステロイド治療中、高齢者対幼児など）も、修復の速度および血管形成剤への反応を決定できる。患者の性別およびホルモン状態（月経閉止前、月経閉止後など）も修復機構および反応に影響を及ぼすことがある。創傷治癒の障害は、米国における高齢者および１４００万人の糖尿病患者の多くに特に影響を及ぼす。血管形成の減少はこのような患者群での創傷治癒問題の病原因子であることが多いので、創傷修復において重要である血管形成剤を定義して、創傷治癒の障害を防止および／または修正するための臨床用途を開発することが重要である。
【００１６】
それゆえ創傷治癒の促進、冠動脈血管形成、あるいは他の血管形成関連障害のための一次または補助療法のどちらかとしての、最小限の副作用を伴う、血管形成剤に関する有効な療法への要求がなお残存している。そのような療法は、血管障害、たとえば心筋梗塞、脳卒中または末梢動脈疾患を有する患者にとって特に有用であり、高いリスクの虚血および心筋梗塞に曝されている、冠循環が劣悪な患者に予防的に使用できる。
【００１７】
甲状腺ホルモン、アナログ、およびポリマーコンジュゲーションは、脳の発達に重要な役割を果たす。ますます増加する証拠は、ポリマー甲状腺ホルモンの初期発達段階での不足がＣＮＳにおける構造的および機能的障害を引き起こすことを示唆しているが、この基礎を成す正確な機構は捕らえどころがないままである。
【００１８】
哺乳類の神経系は、末梢神経系（ＰＮＳ）および中枢神経系（ＣＮＳ、脳および脊髄を含む）より成り、細胞の２つの主要なクラス：ニューロンおよびグリア細胞で構成される。グリア細胞はニューロン間の空間を充填して、それらに栄養分を与え、その機能を調節する。あるグリア細胞、たとえばＰＮＳにおけるシュワン細胞およびＣＮＳにおける乏突起膠細胞は神経プロセスを取り巻くミエリン鞘も提供する。ミエリン鞘はニューロンに沿った迅速な伝達を可能にする。末梢神経系において、複数のニューロンの軸索は、神経線維を形成するために共に束となることができる。これらは次に組合されて束（ｆａｓｃｉｃｌｅ）または束（ｂｕｎｄｌｅ）となる。
【００１９】
発達の間に、中枢および末梢神経系からの分化ニューロンは、成長して特定の標的細胞と接触する軸索を送出する。一部の症例では、軸索は途方もない距離を被験体としなければならない；ある軸索は末梢内へ成長し、これに対して他の軸索は中枢神経系内に限定される。哺乳類では、神経形成のこの段階は生命の胎生期の間に完了し、ニューロン細胞はそれらが完全に分化してしまうと増殖しない。
【００２０】
神経系に影響を及ぼす多くのニューロパシーが確認されている。ニューロン自体または関連するグリア細胞に影響を及ぼすことのある神経障害は、細胞代謝機能不全、感染、毒性因子への暴露、自己免疫、栄養不良、または虚血から生じることがある。一部の症例では、細胞神経障害は細胞死を直接誘発すると考えられる。他の症例では、神経障害は、体の免疫／炎症系及び初期外傷に対する免疫反応を刺激するのに十分な組織壊死を誘発でき、次に神経路を破壊する。
【００２１】
損傷した神経路がＣＮＳ軸索損傷から生じる場合、中枢神経系における損傷部を橋架けして、軸索にその正常な標的エリアに戻らせるために、自己末梢神経グラフトが使用されてきた。ＣＮＳニューロンとは対照的に、末梢神経系のニューロンは、軸索損傷に対する反応において新しい末梢プロセスを拡張できる。末梢神経系軸索のこの修復特性は、これらのセグメントのＣＮＳ軸索へのグラフトを可能にするのに十分であると考えられる。しかしながらグラフト処置の成功は、バイパスされるＣＮＳ軸索損傷部の長さ、およびＣＮＳニューロン細胞体からのグラフト部位の距離を含む多数の因子によって、細胞体付近で発生するグラフトの成功と共に制限されるように思われる。
【００２２】
末梢神経系内で、ニューロンのこの細胞修復特性は、損傷した神経路に対して機能を修復する限定された能力を有する。特に、新しい軸索は無作為に拡張し、方向を誤ることが多く、異常機能を引き起こしうる不適切な標的と接触する。たとえば運動神経が損傷された場合、再生する軸索は誤った筋肉と接触して、麻痺を生じさせる。加えて切断された神経プロセスが数ミリメートルより長い、たとえば１０ミリメートル（ｍｍ）を超える隙間を生じる場合、プロセスが必要な距離だけ成長できないために、または誤った方向の軸索成長のためのどちらかによって、適切な神経再生は起こらない。外科的手段による末梢神経損傷を修復する努力は、特に損傷が著しい距離に及んでいる場合に、入り混じった結果に見舞われている。一部の症例では、切断された神経端を適正に整列させるために使用される縫合工程が、軸索再生を阻害すると考えられる。瘢痕組織の形成を刺激する瘢痕組織形成が減少された場合ですら、神経誘導チャネルまたは他の管状プロテーゼの使用と同様に、再生の成功は一般に、距離が１０ミリメートルの神経損傷になお制限されている。加えて末梢ニューロンの修復能力は、傷害または神経障害が細胞体自体に著しく影響を及ぼす場合、あるいはは遠位軸索の広範囲に及ぶ変性を引き起こす場合に著しく阻害される。
【００２３】
哺乳類神経路も腫瘍性病変によって引き起こされた損傷によるリスクに瀕している。ニューロンおよびグリア細胞の両方の新生組織形成が確認されている。神経起源の形質転換細胞は一般に正常な分化細胞として挙動するその能力を失い、機能損失により神経路を破壊することができる。加えて増殖する腫瘍は、正常な神経組織構造をゆがめて、神経を圧縮することによって経路を阻害して、脊髄液または血液供給の流れを妨害し、および／または体の免疫反応を刺激することによって、病巣を誘発できる。脳および脊髄での腫瘍性病変の重要な原因である転移性腫瘍も同様に、神経路を損傷して、ニューロン細胞死を誘発することがある。
【００２４】
ニューロン細胞成長、分化および発達に関連する形態制御性分子の１つの種類は、細胞接着細胞（「ＣＡＭ」）、最も顕著には神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）である。ＣＡＭは、免疫グロブリンスーパーファミリの構成要素である。それらは同種親和性結合による発達および生体組織における細胞間相互作用、すなわち並置細胞でのＣＡＭ−ＣＡＭ結合を仲介する。多数の各種ＣＡＭが確認されている。これらのうち、素も徹底的に研究されたのはＮ−ＣＡＭおよびＬ−ＣＡＭ（肝臓細胞接着分子）であり、そのどちらも発達の早期段階での細胞すべてではもちろんのこと、各種の生体組織でも確認されている。神経組織の発達では、Ｎ−ＣＡＭ発現は、組織構成、ニューロン遊走、神経筋肉組織接着、網膜形成、シナプス形成、および神経変性において重要であると考えられる。Ｎ−ＣＡＭ発現の低下も神経機能不全に関連すると考えられる。たとえばＮ−ＣＡＭの少なくとも１つの形の発現であるＮ−ＣＡＭ−１８０は、マウス脱髄性ミュータントで低下する。Ｂｈａｔ，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．４５２：３７３−３７７（１９８８）．Ｎ−ＣＡＭのレベルの低下は、正常圧水頭症、Ｗｅｒｄｅｌｉｎ，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃａｎｄ．７９：１７７−１８１（１９８９）、およびＩＩ型統合失調症にも関連している。Ｌｙｏｎｓら、Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ２３：７６９−７７５（１９８８）。加えてＮ−ＣＡＭに対する抗体は、損傷神経での機能回復を妨害することが示されている。Ｒｅｍｓｅｎ，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１１０：２６８−２７３（１９９０）。
【００２５】
現在、運動ニューロンの外傷性傷害および運動ニューロンの疾患によって引き起こされた損傷を修復する満足な方法は存在しない。米国には毎年１５，０００〜１８，０００人の脊髄損傷の新患がいる。加えて約２００，０００人の脊髄損傷生存者がいる。これらの患者に対する治療の年間コストは、７０億ドルを超える。急性脊髄外傷後の病態生理は複雑であり、十分に理解されていない機構である。機械的外傷によって引き起こされた原発性組織損傷がただちに発生して、非可逆性である。Ａｌｌｅｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．５７：８７８−８８０（１９Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  Ｇ，Ｓｏｕｔｈｗｅｌｌ  ＢＲ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ＳＪ．Ｈｏｒｍｏｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ−ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ．Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ．１９９５；１０３（２）：７５−８０１１）。実験的証拠は、外傷後組織損傷の多くが傷害後数分以内に開始し、数日または数週継続する反応プロセスの結果であることを示している。Ｊａｎｓｓｅｎら、Ｓｐｉｎｅ  １４：２３−３２（１９８９）およびＰａｎｔｅｒら、（１９９２）。この進行性自己破壊プロセスは、病態生理的機構、たとえば出血、外傷後虚血、浮腫、軸索およびニューロン壊死、ならびに嚢胞形成および梗塞後の脱髄を含む。概説についてはＴａｔｏｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ，７５：１５−２６（１９９１）およびＦａｄｅｎ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．７：１７５−１８６（１９９３）を参照。提示された傷害因子は、細胞内カルシウムの上昇がそれによりイベントのカスケードを開始する電解質の変化（Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  ９，Ｓｕｐｐｌ．１：Ｓ９−Ｓ２５（１９９２）およびＹｏｕｎｇ，Ｊ．Ｅｍｅｒｇ．Ｍｅｄ  １１：１３−２２（１９９３））、管理されない伝達物質放出による生化学的変化（Ｌｉｕら、Ｃｅｌｌ  ６６：８０７−８１５（１９９１）およびＹａｎａｓｅら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  ８３：８８４−８８８（１９９５）、アラキドン酸放出、遊離ラジカル生成、脂質過酸化（Ｂｒａｕｇｈｌｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  ９，Ｓｕｐｐｌ．１：Ｓ１−Ｓ７（１９９２）、エイコサノイド生成（Ｄｅｍｅｄｉｕｋら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．２０：１１５−１２１（１９８８）、内因性オピオイド（Ｆａｄｅｎら、Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ．１７：３８６−３９０（１９８５）、酸素およびグルコースの変動を含む代謝変化（Ｆａｄｅｎ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．７：１７５−１８６（１９９３））、炎症性変化（Ｂｌｉｇｈｔ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  ９，Ｓｕｐｐｌ．１：Ｓ８３−Ｓ９１（１９９２）、およびアストロサイト浮腫（Ｋｉｍｅｌｂｅｒｇ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  ９，Ｓｕｐｐｌ．１：Ｓ７１−Ｓ８１（１９９２）を含む。過去４００年間に渡って、癒合を伴う椎弓切除術および除圧術を含む外科的手法が最も一般的に実施された処置方法であった。Ｈａｎｓｅｂｏｕｔ，  “Ｅａｒｌｙ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｃｕｔｅ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｃａｒｄ  Ｉｎｊｕｒｙ”，ｐｐ．１８１−１９６（１９８２）およびＪａｎｓｓｅｎら、Ｓｐｉｎｅ  １４：２３−３２（１９８９）．しかしながらこれらの手順は、脊髄組織の再生特性を増強する技法の利用は含んでいない。
【００２６】
脱髄疾患、ミエロパシー、および筋萎縮性側索硬化症（「ＡＬＳ」）などの運動ニューロンの疾患を含む、多数の運動ニューロンの疾患が確認されている。ＩＮＴＥＲＮＡＬ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，ｃｈ．１２１−１２３（４ｔｈ  ｅｄ．，Ｊ．Ｈ．Ｓｔｅｉｎ，ｅｄ．，Ｍｏｓｂｙ，１９９４）。多発性硬化症（「ＭＳ」）は、中枢神経系の最も一般的な脱髄性障害であり、脳および脊髄に硬化の斑（すなわちプラーク）を引き起こす。ＭＳは、プラークの位置およびサイズに応じた不定形の臨床所見を有する。代表的な症状は、視力喪失、複視、眼振、構音障害、脱力、知覚異常、膀胱異常、および気分の変容を含む。この長期の可変性疾病には無数の処置が提示されている。提示された処置のリストは、食餌療法から鍼による電気刺激、精神的支援、そして各種の形式の免疫阻害療法まであらゆるものを含む。いずれも満足であることが証明されていない。
【００２７】
下位および上位運動ニューロンの進行性消失は、複数の疾患で発生する（たとえば原発性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、良性限局性筋萎縮症）。しかしながらＡＬＳは運動ニューロン疾患の最も一般的な形である。ＡＬＳでは下位および上位運動ニューロン両方の消失が発生する。症状は、進行性骨格筋消耗、脱力、線維束性攣縮、および痙攣を含む。一部の症例は脳幹運動ニューロンの支配的関与を有する（進行性球麻痺）。都合の悪いことに、運動ニューロンおよび関連疾患の処置は現時点では概して対症的である。ＩＮＴＥＲＮＡＬ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，ｃｈ．１２３（４ｔｈ  ｅｄ．，Ｊ．Ｈ．Ｓｔｅｉｎ，ｅｄ．，Ｍｏｓｂｙ，１９９４）。
【００２８】
したがって当分野では、運動ニューロン障害および傷害、ならびに神経機能の関連疾患の処置に対する要求がある。したがって本発明の目的は、血管形成を刺激するための、ニューロン分化を誘発するための、そしてニューロン細胞の死または変性を防止するための組成物および方法を提供することである。
【００２９】
チロシンは、１個（モノヨードチロシン）または２個（ジヨードチロシン）の部位でヨウ素化され、次に結合して活性ホルモンを形成する（ジヨードチロシン＋ジヨードチロシン→テトラヨードチロニン［チロキシン、Ｔ４］；ジヨードチロシン＋モノヨードチロシン→トリヨードチロニン［Ｔ３］。甲状腺内の別のＴ３供給源は、セレン含有酵素：Ｉ型５’−脱ヨウ素酵素（５’Ｄ−Ｉ）によるＴ４の外環脱ヨウ素の結果である。そのマトリクス内にＴ３およびＴ４を含有する糖タンパク質であるチログロブリンは、濾胞からコロイド状液滴として甲状腺細胞によって吸収される。
【００３０】
リソソーム含有プロテアーゼは、Ｔ３およびＴ４をチログロブリンから開裂させて、遊離Ｔ３およびＴ４の放出を引き起こす。ヨードチロシン（モノヨードチロシンおよびジヨードチロシン）もチログロブリンから放出されるが、血流に達するのはごくわずかな量である。ヨウ素は、細胞内脱ヨウ素酵素によってそれらから除去され、このヨウ素が甲状腺によって使用される。
【００３１】
タンパク質分解によって甲状腺から放出されたＴ４およびＴ３は血流に達し、そこでそれらは輸送のために甲状腺ホルモン結合血清タンパク質に結合される。主要な甲状腺ホルモン結合タンパク質は、チロキシン結合グロブリン（「ＴＢＧ」）であり、Ｔ４およびＴ３に対して高い親和性、しかし小さい容量を有する。ＴＢＧは通常、結合ホルモンの７５％を占める。他の甲状腺ホルモン結合タンパク質−主に、Ｔ４に対して高い親和性、しかし小さい容量を有する、トランスチレチン（「ＴＴＲ」）とも呼ばれるチロキシン結合プレアルブミン、そしてＴ４およびＴ３に対して低い親和性、しかし大きい容量を有するアルブミンが結合血清甲状腺ホルモンの残りを占める。血清Ｔ４全体の約０．０３％および血清Ｔ３全体の０．３％が遊離しており、結合ホルモンと平衡になっている。末梢組織にとっては、甲状腺ホルモン作用のために遊離Ｔ４およびＴ３のみが利用できる。
【００３２】
甲状腺ホルモンは２つの主要な生理的効果を有する：（１）それらは実質的にあらゆる体組織でのタンパク質合成を上昇させる（Ｔ３およびＴ４が細胞に進入し、そこで循環に、そして細胞内でのＴ４からＴ３への変換に由来するＴ３が別個の核受容体に結合して、ｍＲＮＡの形成に影響を及ぼす）。（２）Ｔ３は、主に基底Ｏ２消費に関与する組織（すなわち肝臓、腎臓、心臓、および骨格筋）でのＮａ＋、Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅの活性（Ｎａポンプ）を向上させることによって、Ｏ２消費を増加させる。Ｎａ＋、Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅの活性上昇は、この酵素の合成増加に続く；したがってＯ２消費の増加はおそらく甲状腺ホルモンの核結合にも関連する。しかしながらＴ３のミトコンドリアに対する直接の効果は除外されていない。Ｔ３は活性甲状腺ホルモンと考えられるが、Ｔ４自体は生物活性であるかもしれない。
【００３３】
ホルモンの生物作用にとって重要である甲状腺ホルモンのプールは、遊離甲状腺ホルモンのプールである。このプールのサイズは、細胞への／からの甲状腺ホルモンの吸収／放出および甲状腺ホルモン結合タンパク質による甲状腺ホルモンの結合／放出によって短期間で決定される。これらのタンパク質の割合および絶対濃度はどちらも、血漿および脳髄液（「ＣＳＦ」）で異なる。最も顕著な相違は、脳で合成された唯一の甲状腺ホルモン結合血漿タンパク質であるトランスチレチン（「ＴＴＲ」）で見出される（非特許文献１）。ＴＴＲも、遺伝的欠損の非存在によって、ヒトの他の２つの甲状腺ホルモン結合血漿タンパク質とは異なる。ＴＴＲ遺伝子発現は、進化の間に肝臓よりも脳ではるかに早く開始された。チロキシン（ＴＲ）Ｔ４結合に関与するＴＴＲのドメインの構造は、３億５万年に渡って完全に保存されてきた。これらの観察結果は、脳におけるＴＴＲの特殊な機能上の重要性を指摘している。これが脳の細胞外コンパートメントにおける遊離Ｔ４のレベルの決定であることが提示されている。次にＴ４は特異性脱ヨウ素酵素によって、脳内でトリヨードチロニンＴ３に変換できる。このＴ３は、細胞核において受容体と相互作用して、遺伝子転写を制御する。
【００３４】
アルツハイマー病は重度の神経変性障害であり、現在、約４００万人のアメリカ人がこの疾患に罹患している。老齢人口が増加するにつれて、治療法または予防法が発見されなければ、この数は次の世紀の中ごろまでに１４００万人に達する可能性がある。現在、この疾患の早期診断のための感受性が高く、特異的な生前試験はない。アルツハイマー病は現在、これらの症状の他の考えられる原因の系統的除外と組合された、認知低下の臨床的観察に基づいて診断される。「推定アルツハイマー病」の臨床診断の確認は、死後の脳の検査によってのみ行える。アルツハイマー病脳は、学習および記憶に関与する脳の領域（たとえば大脳皮質および海馬）における２つの明確な異常タンパク質性沈着の出現によって特徴付けられる。これらの沈着は、アルツハイマー病に特徴的である細胞外アミロイドプラークと、他の神経変性障害でも同様に見られる細胞内神経原線維濃縮体（「ＮＦＴ」）である。アミロイドペプチドは通例、長さが４０または４２アミノ酸のどちらかであり（それぞれ「Ａ１−４０」または「Ａ１−４２」）、未知の機能のより大きい膜結合タンパク質、アミロイド前駆タンパク質（「ＡＰＰ」）の異常な処理から形成される。これらのペプチドのオリゴマー凝集体は神経毒性であると考えられ、最終的にシナプス変性およびニューロン消失を生じさせる。アミロイド沈着の量は、死の時点での症状の重症度におおよそ相関している。
【００３５】
過去には、アルツハイマー病の生前診断用の診断剤として使用できる放射性医薬品の設計へのいくつかの試みがあった。Ｂｏｒｎｅｂｒｏｅｋらは、１２３Ｉで標識したアミロイド結合タンパク質血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）が、脳アミロイドーシス患者の大脳皮質、おそらく血管壁に低レベルで蓄積することを示した（非特許文献２）。
【００３６】
Ｓａｉｔｏらは、血液脳関門を通じた１２３Ｉ標識Ａ１−４０の宿主仲介送達を提唱した。ヨウ素化Ａ１−４０が組織切片中のＡアミロイドプラークに結合することが報告されている（非特許文献３）。特許文献１は、アルツハイマー病患者の脳で発見された、Ａ４アミロイドポリペプチドに対する特異性を備えた抗体を開示している。しかしながら血液脳関門を超えたこれらの抗体の送達方法は述べられていない。Ｚｈｅｎらは、「コンゴレッドＴＭ」として既知のアミロイド結合染料の修飾と、これらの修飾分子とテクネチウムおよびレニウムとの錯体について述べた。放射性イオンとの錯体は、アルツハイマー病の潜在的造影剤と称されている（非特許文献４）。しかしながら錯体が血液脳関門を渡る可能性は限定されている。
【００３７】
米国のペンシルベニア大学のグループ（非特許文献５）が、脳透過性であり、アミロイド物質に非特異的に結合するコンゴレッドの蛍光標識誘導体（すなわちプリーツシート立体配座のペプチド）を開発した。この化合物は、放射性標識して、次に臨床試験前に薬物動力学および毒性についての前臨床スクリーンを受けさせる必要がある。これに対して本発明者らの発明は、天然発生物質の誘導体を単独で、またはアルツハイマー病の診断、予防、および処置と組合せて利用する。Ｋｌｕｎｋらは、コンゴレッドＴＭ、クリサミンＧ（「ＣＧ」）の誘導体を用いた実験を報告した。ＣＧが試験管内で合成アミロイドに良好に結合して、正常マウスにて血液脳関門を通過することが報告された（非特許文献６）。Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍらは、アルツハイマー病でのＭ１およびＭ２ムスカリン性アセチルコリン受容体の描出のための潜在的な放射性リガンドとして、１２３Ｉで標識した化合物を紹介した（非特許文献７）。
【００３８】
近年、ある特異性ケモカイン受容体がアルツハイマー病患者の脳でアップレギュレートされることが発見されている（Ｈｏｒｕｋ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７），Ｖｏｌ．１５８，ｐｐ．２８８２−２８９０；Ｘｉａら、Ｊ．ＮｅｕｒｏＶｉｒｏｌ（１９９９），Ｖｏｌ．５，ｐｐ．３２−４１）。加えて、近年、ケモカイン受容体ＣＣＲ１が、進行したアルツハイマー病患者の脳においてアップレギュレートされ、正常な加齢脳には存在しないことが示されている（Ｈａｌｋｓ−Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，ＣＣＲ１  Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｂｒａｉｎｓ，Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔ，  ＃７８７．６，Ｖｏｌｕｍｅ  ２４，１９９８）。ＣＣＲ１受容体のアンタゴニストおよび抗炎症剤としてのその使用は、特許文献２で説明されている。
【００３９】
上述の提示のいずれも、アルツハイマー病の早期診断用造影剤の臨床開発をもたらしていない。したがってアルツハイマー病の信頼できる早期の診断に使用できる診断剤への臨床的要求がなお存在する。加えて提示された方法も、アルツハイマー患者におけるアミロイドプラーク形成または蓄積の阻害に有用である。したがって本発明の目的は、神経変性疾患、たとえばアルツハイマー病の早期診断、予防、および処置のための組成物および方法を提供することである。
【特許文献１】米国特許第５，２３１，０００号明細書
【特許文献２】国際公開第９８／５６７７１号パンフレット
【非特許文献１】Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  Ｇ，Ｓｏｕｔｈｗｅｌｌ  ＢＲ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ＳＪ．Ｈｏｒｍｏｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ−ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ．Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ．１９９５；１０３（２）：７５−８０
【非特許文献２】Ｂｏｒｎｅｂｒｏｅｋ，Ｍ．ら、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９６），Ｖｏｌ．１７，ｐｐ．９２９−９３３
【非特許文献３】Ｓａｉｔｏ，Ｙ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９５，Ｖｏｌ．９２，ｐｐ．１０２２７−１０２３１
【非特許文献４】Ｚｈｅｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９９），Ｖｏｌ．４２，ｐｐ．２８０５−２８１５
【非特許文献５】Ｓｋｏｖｒｏｎｓｋｙ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０００，Ｖｏｌ．９７，ｐｐ．７６０９−７６１４
【非特許文献６】Ｋｌｕｎｋら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ（１９９４），Ｖｏｌ．１５，Ｎｏ．６，ｐｐ．６９１−６９８
【非特許文献７】Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．（１９９９），Ｖｏｌ．２６，ｐｐ．１４８２−１４８５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００４０】
血管形成が、固形腫瘍成長および転移；関節リウマチ；乾癬；強皮症；失明の一般的な３つの原因−糖尿病網膜症、水晶体後線維増殖症および血管新生緑内障（実際に、目の疾患はほとんど常に脈管化を伴う）を含む、他の状況でも発生することに注目することが興味深いが、それは望ましくない。創傷血管形成のプロセスは実際には、腫瘍血管形成と共通する多くの特徴を有する。それゆえ血管形成が望ましくない、糖尿病網膜症あるいは原発性または転移性腫瘍の発生などの条件がいくつかある。それゆえ癌の処置のために血管形成剤の効果を阻害する方法への要求が残存している。
【課題を解決するための手段】
【００４１】
（要旨）
本発明は、一部は甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモンアナログ、およびそのポリマー形態が細胞膜レベルで作用して、核甲状腺ホルモン効果と独立した血管形成誘発特性を有するという発見に基づいている。したがってこれらの甲状腺ホルモンアナログおよびポリマー形態（すなわち血管形成剤）を使用して、各種の障害を処置できる。同様に本発明は、甲状腺ホルモンアナログアンタゴニストがそのようなアナログの血管形成誘発効果を阻害して、各種の障害を処置するためにも使用できるという発見にも基づいている。
【００４２】
したがって１つの態様において、本発明は、血管形成の助長に有効な甲状腺ホルモンのポリマー形態、またはそのアナログの量を、それを必要とする被験体に投与することにより血管形成を助長することによる処置の影響を受けやすい状態を処置する方法を特徴とする。血管形成を助長することによる処置の影響を受けやすいそのような状態の例は本明細書に与えられており、閉塞性血管疾患、冠動脈疾患、勃起不全、心筋梗塞、虚血、脳卒中、末梢動脈血管障害、および創傷を含むことができる。
【００４３】
甲状腺ホルモンアナログの例も本明細書に与えられており、トリヨードチロニン（Ｔ３）、レボチロキシン（Ｔ４）、３，５−ジメチル−４−（４’−ヒドロキシ（ｈｙｄｒｏｙ）−３’−イソプロピルベンジル）−フェノキシ酢酸（ＧＣ−１）、または３，５−ジヨードチロプロピオン酸（ＤＩＴＰＡ）、テトラヨードチロ酢酸（ＴＥＴＲＡＣ）、およびトリヨードチロ酢酸（ＴＲＩＡＣ）を含むことができる。追加のアナログは図２０表Ａ〜Ｄにある。これらのアナログは、ポリビニルアルコール、アクリル酸エチレンコポリマー、ポリ乳酸、またはアガロースに結合できる。コンジュゲーションは、使用したポリマーによって共有結合または非共有結合による。
【００４４】
１つの実施形態において、甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモンアナログ、またはそのポリマー形態が非経口、経口、経直腸、または局所手段、あるいはそれらの組合せによって投与される。非経口投与方式はたとえば皮下、腹腔内、筋肉内、またはカテーテルによってなどの静脈内方式を含む。局所投与方式はたとえば、バンドエイドを含むことができる。
【００４５】
別の実施形態において、甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモンアナログ、またはそのポリマー形態は、微粒子、リポソーム、またはポリマー内にカプセル化させるか、あるいは包含させることができる。該ポリマーはたとえばポリグリコリド、ポリラクチド、またはそのコポリマーを含むことができる。該リポソームまたは微粒子は、約２００ナノメートル未満のサイズを有し、１つ以上の非経口経路、あるいは別の投与方式によって投与できる。別の実施形態において、該リポソームまたは微粒子は、虚血組織を包囲する毛細血管床に入れるか、またはカテーテルによって血管の内側に施すことができる。
【００４６】
本発明による甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモンアナログ、またはそのポリマー形態は、たとえば成長因子、血管拡張薬、抗凝固薬、抗ウィルス剤、抗菌剤、抗炎症剤、免疫阻害剤、鎮痛剤、血管新生剤、または細胞接着分子、あるいはそれらの組合せを含むことができる１つ以上の生物活性物質と同時投与することもできる。１つの実施形態において、甲状腺ホルモンアナログまたはポリマー形態は、１つ以上の生物活性物質の投与前または投与後にボーラス注射として投与される。
【００４７】
成長因子はたとえば形質転換成長因子アルファ（「ＴＧＦα」）、形質転換成長因子ベータ（「ＴＧＦβ」）、塩基性線維芽細胞成長因子、血管内皮成長因子、上皮成長因子、神経成長因子、血小板由来成長因子、および血管透過性因子を含むことができる。血管拡張薬はたとえばアデノシン、アデノシン誘導体。またはそれらの組合せを含むことができる。抗凝固薬はこれに限定されるわけではないが、ヘパリン、ヘパリン誘導体、抗因子Ｘａ、抗トロンビン、アスピリン、クロピドグレル、またはそれらの組合せを含む。
【００４８】
本発明の別の形態において、医療器具を患者内に挿入する前に該器具を本発明による甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモンアナログまたはそのポリマー形態でコーティングすることによって、医療器具に沿って、または医療器具の周囲に血管形成を助長するための方法が提供される。コーティング工程は、器具を１つ以上の生物活性物質、たとえばこれに限定されるわけではないが成長因子、血管拡張薬、抗凝固薬、またはそれらの組合せによってコーティングすることをさらに含むことができる。本発明による甲状腺ホルモンアナログまたはポリマー形態によってコーティングできる医療器具の例は、ステント、カテーテル、カニューレまたは電極を含む。
【００４９】
さらなる態様において、本発明は、血管形成を阻害するのに有効な抗血管形成剤の量を、それを必要とする被験体に投与することにより血管形成を阻害することによる処置の影響を受けやすい状態を処置する方法を提供する。血管形成を阻害することによる処置の影響を受けやすい状態の例は、これに限定されるわけではないが、原発性または転移性腫瘍、糖尿病網膜症、および関連する状態を含む。血管形成を阻害するために使用される抗血管形成剤の例は、本発明によっても提供され、これに限定されるわけではないが、テトラヨードチロ酢酸（ＴＥＴＲＡＣ）、トリヨードチロ酢酸（ＴＲＩＡＣ）、モノクローナル抗体ＬＭ６０９、ＸＴ１９９またはそれらの組合せを含む。そのような抗血管形成剤は、血管形成誘発剤を阻害するために細胞表面で作用できる。
【００５０】
１つの実施形態において、該抗血管形成剤は、非経口、経口、経直腸、または局所方式、あるいはそれらの組合せによって投与される。別の実施形態において、該抗血管形成剤は１つ以上の抗血管形成療法または化学療法剤と同時投与できる。
【００５１】
なおさらなる態様において、本発明は、ポリマーに結合された甲状腺ホルモン、およびアナログを含む組成物（すなわち血管形成剤）を提供する。該コンジュゲーションは、ポリマーに応じて、共有結合または非共有結合によって可能である。共有結合はたとえば、エステルまたは無水物リンケージを通じて起こりうる。甲状腺ホルモンアナログの例は、本発明によって提供され、レボチロキシン（Ｔ４）、トリヨードチロニン（Ｔ３）、３，５−ジメチル−４−（４’−ヒドロキシ（ｈｙｄｒｏｙ）−３’−イソプロピルベンジル）−フェノキシ酢酸（ＧＣ−１）、または３，５−ジヨードチロプロピオン酸（ＤＩＴＰＡ）を含む。１つの実施形態において、該ポリマーはこれに限定されるわけではないが、ポリビニルアルコール、アクリル酸エチレンコポリマー、ポリ乳酸、またはアガロースを含むことができる。
【００５２】
別の態様において、本発明は、製薬的に許容される担体中に本発明による血管形成剤を含む製薬調剤物を提供する。１つの実施形態において、該製薬調剤物は１つ以上の製薬的に許容される賦形剤を含むことができる。
【００５３】
本発明による該製薬調剤物は、カプセル化するか、あるいは微粒子、リポソーム、またはポリマー内に包含させることができる。該リポソームまたは微粒子は、約２００ナノメートル未満のサイズを有する。本発明による製薬調剤物のいずれも、非経口、経口、経直腸、または局所手段、あるいはそれらの組合せによって投与できる。別の実施形態において、該製薬調剤物はそれを必要とする被験体に、これに限定されるわけではないが、成長因子、血管拡張薬、抗凝固薬、またはそれらの組合せを含む１つ以上の生物活性物質と共に同時投与できる。
【００５４】
他の態様において、本発明は、ニューロン機能を回復し、神経細胞の生存を増強するための、ポリマー性甲状腺ホルモンアナログおよび前記ホルモンを含有する製薬調剤物の使用に関する。本発明の目的では、ニューロン機能は、胎生および生後期の間の神経系の発達を可能にして、生体動物において、そのある部分が変性して、再生できないときに損傷したニューロンの再生機構の、そして中枢神経系の適応能力の基礎である集合的な生理的、生化学的および解剖学的機構を意味すると解釈される。
【００５５】
したがって以下のプロセスは、ニューロン機能を達成するために起こる：神経除去、神経再支配、シナプス形成、シナプス阻害、シナプス拡張、軸索の出芽、神経再生、発達および損傷したものに取って代わるための神経路および回路の組織化。したがって本発明によるポリマー性甲状腺ホルモンアナログまたはそれらの組合せによって処置される適切な患者は、中枢神経系の変性病状（老年認知症様アルツハイマー病、パーキンソニズム、ハンチントン舞踏病、脳脊髄副腎白質ジストロフィー）、外傷および脳虚血に罹患した患者である。
【００５６】
好ましい実施形態において、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、および脊髄損傷を含む運動ニューロン欠陥を処置するための本発明の方法は、ポリマー性甲状腺ホルモンアナログ、またはそれらの組合せを成長因子、神経成長因子、あるいは他の血管形成誘発または神経形成因子と組合せて投与することを含む。脊髄損傷は、腫瘍、機械的外傷、および化学的外傷から生じる損傷を含む。筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、または脊髄損傷を有する哺乳類の運動機能を回復するために、同じまたは同様の方法が考慮される。上述のポリマー性甲状腺ホルモンアナログの１つを単独で、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合せて投与することも、予防機能を与える。そのような投与は、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、または脊髄損傷を有する、またはそのリスクに瀕した哺乳類の運動機能を保護する効果を有する。また本発明により、ポリマー性甲状腺ホルモンアナログは単独で、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子投与と組合されて、黒質線状体路の完全性を保護する。
【００５７】
特に（発症前または発症後に）筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、または脊髄損傷を処置するための本発明の方法は、ポリマー性甲状腺ホルモンアナログを単独で、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合せて投与することを含む。特に好ましい実施形態において、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合された該ポリマー性甲状腺ホルモンアナログは、少なくとも１つのポリマー性甲状腺ホルモンアナログを単独で、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されて含む、溶解性複合体である。
【００５８】
１つの態様において、本発明は、組成物と、哺乳類に形態形成タンパク質（「単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログ」）の治療有効量を本明細書で定義するように、神経路への傷害時に、またはそのような傷害が予想されるときに、損傷路を修復すること、またはそれに対する追加の損傷を阻害することを含めて神経路を維持するのに十分な時間および濃度で投与することを含む治療的処置方法を特徴とする。
【００５９】
別の態様において、本発明は、神経路を維持するための組成物および治療的処置方法を特徴とする。そのような処置は、哺乳類に神経路への傷害時に、またはそのような傷害が予想されるときに、内因性ポリマー性甲状腺ホルモンアナログの治療的有効濃度を刺激する化合物を投与することを含む。これらの化合物は本明細書では単独で、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子刺激剤と組合されて、ポリマー性甲状腺ホルモンアナログと呼ばれ、哺乳類に投与されたときに、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログの生成および／または単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログの分泌に通常関与する、あるいは生成および／または分泌が可能である組織または器官に作用する、そして単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログの内因性レベルを変化させる、物質を含むと理解される。
【００６０】
特に本発明は、神経傷害に対する体の免疫および炎症反応に関連する組織破壊効果からニューロンを保護する方法を提供する。本発明は、ニューロン起源の形質転換細胞の、未形質転換ニューロンに特有の形態への再分化を誘発させることを含む、その分化した表現型を維持するためにニューロンを刺激する方法も提供する。１つの実施形態において、本発明は、細胞接着分子、特に神経細胞接着分子（「Ｎ−ＣＡＭ」）の生成を刺激する手段を提供する。本発明は、損傷した樹状突起または軸索を再生することを含む、損傷したニューロンおよび神経路の細胞修復を刺激するための方法、組成物および装置も提供する。加えて本発明は、神経組織の状態を評価するための、そして単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログのレベルの変動を監視することによりニューロパシーを検知および監視するための手段も提供する。
【００６１】
本発明の１つの態様において、本明細書述べる単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログは、末梢神経系の損傷した神経路を修復するのに有用である。とりわけ単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログは、横切された、またはそうでなければ損傷した神経線維を含めて、損傷した神経路を修復するのに有用である。特に本発明で述べる単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログは、血管新生およびミエリン鞘の再形成を含めて、完全な軸索神経再生を刺激することができる。好ましくは単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログは、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログを該部位に、そして必要な場合は切開されたニューロンの近位端から遠位端までの軸索成長方向付ける手段を維持できる生体適合性、生体吸収性担体内の傷害部位に供給される。たとえば軸索成長を方向付ける手段は、延長された距離、たとえば１０ｍｍ超に渡って神経再生を誘発すべき場合に必要とされることがある。このような機能を提供できる多くの担体が想定される。たとえば有用な担体は、ラミニン、ヒアルロン酸またはコラーゲンを含む本明細書で開示されるように調製される実質的に不溶性の材料または粘性溶液、あるいは他の適切な合成生体適合性ポリマー材料、たとえばポリ乳酸、ポリグリコール酸またはポリ酪酸および／またはそのコポリマーを含む。好ましい担体は、たとえばマウス肉腫細胞に由来する細胞外マトリクス組成物を含む。
【００６２】
とりわけ好ましい実施形態において、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログは、損傷路の距離に渡る神経誘導チャネル内に配置されている。該チャネルは保護被覆物と、神経突起の成長を誘導する物理的手段の両方として作用する。有用なチャネルは、構造が管状であり、修復される神経での隙間に及ぶのに十分な寸法を有し、切断された神経端を収容するのに適した開口を有する生体適合性膜を含む。該膜は任意の生体適合性，非炎症性材料、たとえばシリコーンあるいは生体適合性ポリマー、たとえばポリエチレンまたはポリエチレンビニルアセテートで作成できる。ケーシングも、たとえばコラーゲン、ヒアルロン酸、ポリ乳酸、ポリ酪酸、およびポリグリコール酸を含む生体適合性、生体吸収性ポリマーで構成できる。好ましい実施形態において、チャネルの外面は実質的に不浸透性である。
【００６３】
単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログは、生体適合性担体材料と結合したチャネル内に配置できるか、あるいはＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，０１１，４８６に述べられているように、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログが切断された神経端に接近できるという条件で、ケーシングの内面に吸着させるか、そうでなければ結合させることができる。
【００６４】
本発明の別の形態において、本明細書で述べる単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログは、神経組織への初期傷害に対する体の免疫／炎症反応に関連する損傷から保護するのに有用である。そのような反応は、たとえば自己免疫機能不全、腫瘍性病変、感染、化学的または機械的外傷、疾患によって、ニューロンまたはグリア細胞への血流の中断によって、あるいは神経または周囲物質への他の外傷によって引き起こされた、神経組織への外傷に続くことがある。たとえば塞栓性脳卒中でのように、神経血液供給の閉塞後の低酸素症または虚血再灌流から生じる原発性損傷は、免疫学的に関連していると考えられる。加えて多数の原発性脳腫瘍に関連する損傷の少なくとも一部も、免疫学的に関連していると思われる。単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログの利用は、直接的にまたは全身的にのどちらかで、神経傷害に対する免疫学的に関連する反応を緩和および／または阻害する。あるいは単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子発現と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログの生体内での発現および／または分泌を刺激できる薬剤の、好ましくは傷害部位での投与も使用できる。外科手術または他の強度の臨床処置の間のように、傷害が誘発される場合、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子または薬剤と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログは、リスクに瀕した神経組織へ神経保護効果を提供するために傷害誘発前に供給できる。
【００６５】
一般に、本発明の方法および組成物で有用な単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログは、１つ以上の真核（たとえば哺乳類）細胞、組織または器官の形態形成を誘発するニ量体タンパク質である。組織形態形成は、発達中に脊椎動物胎子で起こるようなデノボまたは再生組織形成を含む。特に興味深いのは、少なくとも骨または神経組織で組織特異性形態形成を誘発する単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログである。本明細書で定義するように、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログは、甲状腺受容体を提示する細胞または組織において形態形成反応を引き出す二量体タンパク質を折畳まれたときに形成するポリペプチドの対を含む。すなわち単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログは一般に、形態形成的に許容される環境において以下のすべてを含むイベントのカスケードを誘発する：前駆体細胞の増殖の刺激；前駆体細胞の分化の刺激；分化した細胞の増殖の刺激；分化した細胞の成長および維持の補助。「前駆体」細胞は、そのゲノムレパートリーおよび形態形成が誘発される許容される環境の組織特異性に応じて、分化した細胞の１つ以上の特定の種類に分化できる非委任細胞である。前駆体細胞の例は、造血幹細胞、間葉幹細胞、基底上皮細胞、神経冠細胞などである。さらに単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログは、表現型および／または組織機能の老化または静止関連損失の開始を遅延または緩和できる。なおさらに単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログは、その代謝および／または機能性、たとえば分泌特性の発現を含む、分化した細胞種類の表現型発現を刺激できる。加えて単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログは、適切な条件下で委任細胞（たとえば骨芽細胞、神経芽細胞など）の分化を誘発できる。上述したように、少なくとも骨または神経組織の増殖および／または分化を誘発する、および／または神経組織の成長、維持および／または機能特性を支持する、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログは本明細書で特に興味深い。
【００６６】
特に興味深いのは、哺乳類の特定の組織に与えられたときに、組織特異性形態形成を誘発する、またはその組織の分化および成長の正常な状態を維持する、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログである。好ましい実施形態において、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合された本ポリマー性甲状腺ホルモンアナログは、脊椎動物（たとえば鳥類または哺乳類）体組織、たとえばこれに限定されるわけではないが、神経、目、骨、軟骨、骨髄、靭帯、歯象牙質、歯周組織、肝臓、腎臓、肺、心臓、または胃腸内蔵の形成を誘発する。好ましい方法は、胚組織発達の状況で、または後胚組織での無菌の非瘢痕化創傷部位にて実施できる。
【００６７】
本発明の他の態様は、神経変性障害、たとえばアルツハイマー病の撮像および診断に甲状腺ホルモンアナログおよびそのポリマーを使用する組成物および方法を含む。たとえば１つの態様において、本発明は、生体内で被験体に投与されたときに標的部位に高い特異性を有するＴ４アナログを特徴とする。好ましいＴ４アナログは、少なくとも４：１の標的対非標的比を示し、生体内で安定であり、投与後１時間以内に標的に実質的に局在化する。別の態様において、本発明は、単光子放出（「ＳＰＥＣＴ」）を使用するガンマ撮像用のテクネチウム、インジウムのための、そしてＭＲＩ撮像用の造影剤を含む、Ｔ４アナログに結合したリンカより成る製薬組成物を特徴とする。加えてＴＴＲを結合するハロゲン化アナログは、アミロイドフィブリルの形成を阻害でき、それゆえアルツハイマー病の防止および処置に利用できる。そのような化合物は、陽電子放出断層撮影（「ＰＥＴ」）撮像法によっても使用できる。
【００６８】
他の態様において、本発明は、成長因子およびその細胞表面受容体がインテグリンαＶβ３の周囲にクラスタ化されている他のポリペプチド、あるいはアミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（「ＲＧＤ」）を含有する他の細胞表面受容体の作用を調節するための組成物および方法も含む。調節できるポリペプチドは、たとえばインスリン、インスリン様成長因子、上皮成長因子、およびインターフェロン−γを含む。
【００６９】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の添付された説明で述べられている。本明細書で述べられているものと同様または同等の任意の方法および物質を本発明の慣行または試験において使用できるが、好ましい方法および物質をここで説明する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明から、そして請求項から明らかになるであろう。明細書および添付請求項において、文脈が別途明確に指示しない限り、単数形は複数の言及を含む。別途定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で引用するすべての特許および公報は、参照によりその全体が組み入れられている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７０】
（発明の詳細な説明）
ここで本発明の特徴および他の詳細事項を添付図面に関連して、請求項によって指摘されるようにより詳細に説明する。便宜上、明細書、実施例および請求項で使用したある用語がここに集められている。別途定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術および科学用語は、本発明が関連する当業技術者に普通に理解されるのと同じ意味を有する。
【００７１】
本明細書で使用するように、「血管形成剤」という用語は、単独であるか、または別の物質と組合されたかどうかにかかわらず、血管形成を助長または促進する任意の化合物または物質を含む。例は、これに限定されるわけではないが、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ３またはＴ４−アガロース、Ｔ３、Ｔ４のポリマーアナログ、３，５−ジメチル−４−（４’−ヒドロキシ（ｈｙｄｒｏｙ）−３’−イソプロピルベンジル）−フェノキシ酢酸（ＧＣ−１）、あるいはＤＩＴＰＡを含む。対照的に「抗血管形成（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）剤」または「抗血管形成（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）剤」という用語は、単独であるか、または別の物質と組合されたかどうかにかかわらず、血管形成を阻害または阻止する任意の化合物または物質を指す。例は、これに限定されるわけではないが、ＴＥＴＲＡＣ、ＴＲＩＡＣ、ＸＴ１９９、およびｍＡｂ  ＬＭ６０９を含む。
【００７２】
本明細書で使用するように、「心筋虚血」という用語は、心臓血管の能力の低下によって引き起こされた心筋への不十分な血液供給として定義される。本明細書で使用するように、「冠動脈疾患」という用語は、冠血管が正常機能のために十分な血流を供給する能力との間の不均衡による心機能の疾患／障害として定義される。本明細書で述べる組成物および方法によって処置できる冠動脈疾患に関連する具体的な冠動脈疾患／障害は、心筋虚血、狭心症、冠動脈瘤、冠動脈血栓、冠攣縮、冠動脈疾患、冠動脈心疾患、冠動脈閉塞および冠動脈狭窄を含む。
【００７３】
本明細書で使用するように「閉塞性末梢血管疾患」（末梢動脈閉塞性障害としても既知）という用語は、腸骨動脈を含む、頚動脈または大腿動脈における血管障害関与遮断である。大腿動脈での遮断は、疼痛および運動の制限を引き起こす。閉塞性末梢血管疾患に関連する具体的な障害は、糖尿病患者に影響を及ぼし、足の切断を引き起こすことが多い、糖尿病性足病変である。
【００７４】
本明細書で使用するように、「血管の再生」、「血管形成」、「血管再生術」および「副行循環の増加」（またはその効果に対する語）という用語は類義語として見なされる。「製薬的に許容される」という用語は、天然または合成物質を指すときに、物質がそのはるかに大きい有益な効果を考慮して許容される毒性効果を有することを意味するが、これに対して関連する「生理的に許容される」という用語は、物質が比較的低い毒性を有することを意味する。「同時投与された」という用語は、２つ以上の薬物を、それらの効果がほぼ同時に作用するか、または実質的に重複するように、患者にほぼ同時に、または近い順序で与えることを意味する。この用語は、連続的であることはもちろんのこと、同時の薬物投与も含む。
【００７５】
「製薬的に許容される塩」は甲状腺ホルモンアナログ、ポリマー形態、および誘導体の製薬的に許容される塩を指し、該塩は当分野で周知の多種多様の有機および無機対イオンに由来し、ほんの一例として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウムなどを含む；そして分子が塩基性官能基を含有するとき、有機または無機酸の塩、たとえば塩酸塩、臭化水素酸、酒石酸塩、メシル酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩などを製薬的に許容される塩として使用できる。該用語はまた、および塩基付加塩の両方を含む。
【００７６】
「製薬的に許容される酸付加塩」は、遊離塩基の生物学的有効性および特性を保持し、生物学的またはそれ以外でも望ましくないことはなく、無機酸、たとえば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など、そして有機酸、たとえば酢酸、プロピオン酸、ピルビン酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などによって形成される塩を指す。本発明の化合物の特に好ましい塩は、モノ塩化物塩およびジ塩化物塩である。
【００７７】
「製薬的に許容される塩基付加塩」は、遊離酸の生物学的有効性および特性を保持し、生物学的またはそれ以外でも望ましくないことはない塩を指す。これらの塩は、遊離酸への無機塩基または有機塩基の添加から調製される。無機塩基に由来する塩は、これに限定されるわけではないが、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、アルミニウム塩などを含む。好ましい無機塩は、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、およびマグネシウム塩である。有機塩基に由来する塩は、これに限定されるわけではないが、１級、２級、および３級アミンの塩、天然型置換アミンを含む置換アミン、環状アミンおよび塩基性イオン交換樹脂、たとえばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、トリメタミン、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、ポリアミン樹脂などを含む。特に好ましい有機塩基はイソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリンおよびカフェインである。
【００７８】
「ウレイド」は式−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ２のラジカルを指す。
【００７９】
上の定義および例から置換アルキル基を含有するラジカルでは、そこでの任意の置換がアルキル基の任意の炭素上で起こりうることが理解される。本発明の化合物、またはその製薬的に許容される塩は、その構造内に不斉炭素原子を含みうる。したがって本発明の化合物およびその製薬的に許容される塩は、単一のエナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ化合物、ならびにエナンチオマーおよびジアステレオマーの混合物として存在できる。すべてのそのような単一のエナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ化合物およびその混合物は、本発明の範囲内であるものとする。化合物内のある炭素原子の絶対配置は、既知であるならば絶対記述子ＲまたはＳによって示す。
【００８０】
別個のエナンチオマーは、光学活性開始物質および／または中間体の使用によって、あるいは従来の解決技法、たとえば酵素分割またはキラルＨＰＬＣの使用によって調製できる。
【００８１】
本明細書で使用するように、「成長因子」または「神経形成因子」という句は、ＣＮＳまたはＰＮＳの細胞に対して成長、増殖、分化、または栄養効果を有するタンパク質、ペプチドまたは他の分子を指す。そのような因子は、増殖または分化を誘発するために使用でき、たとえば栄養、または成長誘発効果を細胞に及ぼすために細胞の表面上の受容体に結合する分子を含めて、ＣＮＳまたはＰＮＳの細胞を増殖させる任意の栄養素を含むことができる。好ましい因子は、これに限定されるわけではないが、神経成長因子（「ＮＧＦ」）、上皮成長因子（「ＥＧＦ」）、血小板由来成長因子（「ＰＤＧＦ」）、インスリン様成長因子（「ＩＧＦ」）、酸性線維芽細胞成長因子（「ａＦＧＦ」または「ＦＧＦ−Ｉ」）、塩基性線維芽細胞成長因子（「ｂＦＧＦ」または「ＦＧＦ−２」）、および形質転換成長因子−アルファおよび−ベータ（「ＴＧＦ−α」および「ＴＧＦ−β」）を含む。
【００８２】
「被験体」は、生物、たとえばヒト、サル、雌ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ネコ、ヤギ、イヌ、マウス、ラット、それからの培養、およびその遺伝子導入種を含む。好ましい実施形態において、被験体はヒトである。本発明の組成物の、処置される被験体への投与は、被験体の状態を処置するのに有効な投薬量および期間で既知の手順を使用して実施できる。治療効果を達成するのに必要な治療化合物の有効量は、因子、たとえば被験体の年齢、性別、および体重、ならびに被験体における外部因子を処置する治療化合物の能力によって代わる。投与計画は、最適な治療反応を提供するように調節できる。たとえば複数回に分割された用量を毎日投与できるか、または治療状況の緊急性によって指示されるように、用量を比例的に減少させることができる。
【００８３】
「投与すること」は、本発明の組成物にその所期の機能、たとえば血管形成の助長を実施させる投与経路を含む。必ずしもこれに限定されるわけではないが、非経口（たとえば静脈内、動脈内、筋肉内、皮下注射）、経口（たとえば食餌）、局所、経鼻、経直腸を含む、あるいは処置される疾患または状態に応じた遅延放出マイクロキャリアを介した、多種多様の投与経路が可能である。経口、非経口および静脈内投与は好ましい投与方式である。投与される化合物の製剤は、選択された投与経路によって変化するであろう（たとえば溶液、エマルジョン、ゲル、エアゾール、カプセル）。投与される化合物を含む適切な組成物は、生理的に許容されるビヒクルまたは担体および任意のアジュバントおよび保存料中で調製できる。溶液またはエマルジョンでは、適切な担体はたとえば、生理食塩水および緩衝培地、滅菌水、クリーム、軟膏、ローション、オイル、ペーストおよび担体を含めて、水性またはアルコール／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁物を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲル液、リンゲルデキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液または固定油を含むことができる。静脈内ビヒクルは各種の添加剤、保存料、または流体、栄養剤または電解質補給剤を含むことができる（一般にＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ，Ｅｄ．（１９８０）を参照）。
【００８４】
「有効量」は、その所期の機能、たとえば本明細書で述べる血管形成関連障害における血管形成の助長または阻害を実施させる、血管形成誘発または抗血管形成化合物のそれらの量を含む。該有効量は、生物活性，年齢、体重、性別、全身健康状態、処置される状態の重症度を含む多数のはもちろんのこと、適切な薬物動態学的特性にも依存するであろう。たとえば活性物質の投薬量は約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約５００ｍｇ／ｋｇ／日、好都合には約０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日でありうる。活性物質の治療有効量は適切な経路により１回用量または複数回用量で投与できる。さらに活性物質の投薬量は、治療または予防状況の緊急性によって指示されるように比例的に増加または減少させることができる。
【００８５】
「製薬的に許容される担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散培地、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに化合物の活性に適合性であり、被験体に対して生理的に許容されるものなどを含む。製薬的に許容される担体の例は、緩衝生理食塩水（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）である。そのような培地および薬剤の製薬活性物質への使用は、当分野で公知である。任意の従来の培地または薬剤が治療化合物と不適合である場合を除いて、製薬的投与に適した組成物でのその使用が検討される。補足的な活性化合物も組成物中に包含させることができる。
【００８６】
「追加成分」はこれに限定されるわけではないが、以下の１つ以上：賦形剤；表面活性剤；分散剤；不活性希釈剤；造粒剤および崩壊剤；結合剤；潤滑剤；甘味剤；香味剤；着色剤；保存料；生理的分解性組成物、たとえばゼラチン；水性ビヒクルおよび溶媒；油性ビヒクルおよび溶媒；懸濁剤；分散剤または湿潤剤；乳化剤、粘滑薬；緩衝剤；塩；増粘剤；充填剤；乳化剤；抗酸化剤；抗生物質；抗真菌剤；安定剤；および製薬的に許容されるポリマーまたは疎水性物質を含む。本発明の製薬組成物に含まれることができる他の「追加成分」は当分野で既知であり、たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ  ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに述べられている。
【００８７】
（組成物）
甲状腺ホルモン，そのアナログ、ならびにホルモンおよびそのアナログのポリマーコンジュゲーションを含む血管形成剤が本明細書で開示される。開示される組成物は、血管形成が有益である障害を処置する目的で血管形成を助長するために使用できる。加えて、これらの甲状腺ホルモン、アナログおよびポリマーコンジュゲーションの阻害は、そのような望ましくない血管形成に関連する障害を処置する目的で血管形成を阻害するために使用できる。本明細書で使用するように、「血管形成剤」という用語は、血管形成、単独であるか、または別の物質と組合されたかどうかにかかわらず、血管形成を助長または促進する任意の化合物または物質を含む。例は、これに限定されるわけではないが、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ３またはＴ４−アガロース、Ｔ３、Ｔ４のポリマーアナログ、３，５−ジメチル−４−（４’−ヒドロキシ（ｈｙｄｒｏｙ）−３’−イソプロピルベンジル）−フェノキシ酢酸（ＧＣ−１）、あるいはＤＩＴＰＡを含む。
【００８８】
ポリマーコンジュゲーションは、薬物バイアビリティを改善するために使用される。多くの新旧の治療薬は耐容性良好であるが、多くの化合物は毒性を低下させる、循環時間を延長する、または体内分布を加減するために、高度な創薬技術が必要である。薬物バイアビリティを改善するための１つの方法は、水溶性ポリマーの利用である。各種の水溶性ポリマーは、体内分布を加減し、細胞取り込み方式を改善して、生理的バリアへの透過率を変化させ、体内でのクリアランス速度を加減することが示されている。ターゲティングまたは持続放出効果のどちらかを達成するために、ポリマー鎖における末端基として、主鎖の一部として、またはペンダント基としての薬物部分を含有する水溶性ポリマーが合成されてきた。
【００８９】
本発明の代表的な組成物は、ポリマーにコンジュゲートされた甲状腺ホルモンまたはそのアナログを含む。ポリマーとのコンジュゲーションは、共有結合または非共有結合のどちらかによって可能である。好ましい実施形態において、ポリマーコンジュゲーションはエステル結合または無水物結合（ａｎｈｙｄｒｉｄｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）を介して行うことができる。ポリビニルアルコールを使用する、エステル結合を介したポリマーコンジュゲーションの例を図１７に示す。この調製にあたって、市販のポリビニルアルコール（または関連コポリマー）は、酸塩化物形を含む、甲状腺ホルモンアナログの酸塩化物による処置によってエステル化できる。該塩酸塩は、トリエチルアミンの添加によって中和され、各種のアナログの甲状腺ホルモンエステルポリマー形態の沈殿時に水によって洗浄できるトリエチルアミン塩酸塩を生じる。ポリマーへのエステル結合は、生体内で加水分解を受けて、活性血管形成誘発甲状腺ホルモンアナログを放出できる。
【００９０】
アクリル酸エチレンコポリマーを使用する、無水物結合を介したポリマーコンジュゲーションの例を図１８に示す。前のポリマー共有コンジュゲーションと同様であるが、しかしながら今回は、アクリル酸コポリマーの反応に由来する無水物結合を介してである。この無水物結合も生体内での加水分解を受けて、甲状腺ホルモンアナログを放出できる。塩酸の中和は、トリエチルアミンによる処置によって実施され、続いての水による沈殿ポリ無水物ポリマーの洗浄はトリエチルアミン塩酸塩副生成物を除去する。この反応は甲状腺ホルモンアナログアクリル酸コポリマー＋トリエチルアミンの形成を引き起こすであろう。生体内での加水分解時に、甲状腺ホルモンアナログは制御できる時間に渡って、アクリル酸エチレンコポリマーと共に放出されるであろう。
【００９１】
別の代表的なポリマーコンジュゲーションは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされた甲状腺ホルモンまたはそのアナログを含む。各種の薬物、タンパク質およびリポソームへのＰＥＧの付着は、滞留時間を改善し、毒性を低下させることが示されている。ＰＥＧは、鎖の端のヒドロキシル基を介して、そして他の化学的方法に活性剤に結合することができる。しかしながらＰＥＧ自体は、分子当たり２つの活性剤に限定される。別の手法では、ＰＥＧおよびアミノ酸のコポリマーが、ＰＥＧの生体適合性特性を保持するが、分子当たり多数の付着点の追加の利点を有し、多種多様の用途に合せるために合成により設計できる、新規の生体材料として調査されている。
【００９２】
別の代表的なポリマーコンジュゲーションは、ポリマーと非共有コンジュゲーションした甲状腺ホルモンまたはそのアナログを含む。これを図１９に詳細に示す。好ましい非共有コンジュゲーションは、甲状腺ホルモンまたはそのアナログのポリ乳酸ポリマー内への捕捉である。ポリ乳酸ポリエステルポリマー（ＰＬＡ）は、生体内での乳酸モノマーへの加水分解を受け、これは薬物送達システムのビヒクルとして利用されてきた。甲状腺ホルモンアナログが化学結合によってポリマーに結合される従来の２つの共有方法とは異なり、これは甲状腺ホルモンアナログをＰＬＡポリマービーズ内にカプセル化する非共有結合方法である。この反応は、水中での甲状腺ホルモンアナログ含有ＰＬＡビーズの形成をもたらすであろう。フィルタおよび洗浄は、甲状腺ホルモンアナログ含有ＰＬＡビーズの形成を引き起こし、これは生体内での加水分解時に、制御されたレベルの甲状腺ホルモンおよび乳酸の発生をもたらすであろう。
【００９３】
なおさらに、本発明の組成物は、レチノール（たとえば甲状腺ホルモン結合タンパク質トランスチレチン（「ＴＴＲ」）およびレチノイン結合タンパク質（「ＲＢＰ」）に結合するレチノイン酸（すなわちビタミンＡ）にコンジュゲートした甲状腺ホルモンアナログを含む。甲状腺ホルモンアナログは、アミロイド斑の検出および抑制で使用するために、単独で、またはレチノイン酸と組合されてハロゲン化スチルベステロールともコンジュゲートできる。これらのアナログは、Ｔ４−ＴＴＲの好都合な特性、すなわち脳およびアミロイドでの迅速な取り込みおよび長期保持を、フッ素−１８、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２４、ヨウ素−１３１、臭素−７５、臭素−７６、臭素−７７および臭素−８２を含む、ＰＥＴ撮像にある有用なハロゲン同位体を含むハロゲン置換基の特性と組合せる。
【００９４】
さらに、ナノメートルスケールでサイズ決定された有用な物質および構造の作成にナノテクノロジーを使用できる。生物活性物質による主な欠点は、脆弱性である。ナノスケール物質は、物質の耐久性を劇的に改善して、物質の局在化された高濃度を生じさせ、損失を最小限にすることによってコストを削減するために生物活性物質と組合せることができる。したがって追加のポリマーコンジュゲーションは、甲状腺ホルモンおよびそのアナログのナノ粒子製剤を含む。そのような実施形態において、ナノポリマーおよびナノ粒子は、ｔｈｙｒｉｄホルモンおよびそのアナログの局所送達用のマトリクスとして使用できる。これは細胞および組織標的への時間制御デリバリーを補助するであろう。
【００９５】
本発明の組成物は両方の甲状腺ホルモン、アナログ、および誘導体を単独で、あるいはポリマーとの共有または非共有コンジュゲーションで含む。代表的なアナログおよび誘導体の例を図２０、表Ａ〜Ｄに示す。表ＡはＴ２、Ｔ３、Ｔ４、およびブロモ誘導体を示す。表Ｂは、アラニル側鎖修飾を示す。表Ｃは、ヒドロキシ基、ジフェニルエステル結合、そしてＤ配置を示す。表Ｄはチロシンアナログを示す。
【００９６】
「抗血管形成（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）剤」または「抗血管形成（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）剤」という用語は、単独であるか、または別の物質と組合されたかどうかにかかわらず、血管形成を阻害または阻止する任意の化合物または物質を指す。例は、これに限定されるわけではないが、ＴＥＴＲＡＣ、ＴＲＩＡＣ、ＸＴ１９９、およびｍＡｂ  ＬＭ６０９を含む。
【００９７】
（血管形成の助長における甲状腺ホルモン、アナログ、およびポリマーコンジュゲーションの役割）
甲状腺ホルモンアナログまたはポリマー形態の血管形成誘発効果は、ＭＡＰＫシグナル伝達経路の薬理学的インヒビタによる低下に対するホルモン効果の感受性によって試験されたように、非ゲノム開始に依存する。そのような結果は、甲状腺ホルモンによるＭＡＰの活性化の別の結果が新しい血管成長であることを示す。後者は非ゲノム的に開始されるが、もちろん結果的な複合遺伝子転写プログラムを必要とする。甲状腺ホルモンの周囲濃度は比較的安定である。ＣＡＭモデルは本発明者らが試験した時点で甲状腺欠損であり、それゆえ無傷の生物を再生しないシステムとして見なすことができる。
【００９８】
血管形成に関するニワトリ絨毛尿膜膜（ＣＡＭ）アッセイの有効性は、血管形成を定量化するための、そして新しい血管成長の甲状腺ホルモンによる誘発に関与する考えられる機構を試験するためのモデルを提供した。本出願は、ＦＧＦ２のＣＡＭモデルにおける血管誘発効果に近く、ＦＧＦ２の最適以下の用量の作用を向上させることができる、Ｔ４の血管形成誘発効果を開示する。ホルモンの血管形成誘発効果が原形質膜にて開始され、ＭＡＰＫシグナル伝達経路のＴ４による活性化に依存することがさらに開示される。上に挙げたように、閉塞性末梢血管疾患および冠動脈疾患、特に冠血管の閉塞、そして末梢脈管構造および／または冠血管の閉塞に関連する障害の処置のための方法が開示される。それを必要とする患者において血管形成を助長する、および／または側副血管を補充するための組成物および方法も開示される。該組成物は、甲状腺ホルモンアナログ、ポリマー形態、および誘導体の有効量を含む。該方法は、他の標準血管形成誘発成長因子、血管拡張薬、抗凝固薬、血栓溶解薬または他の血管関連療法を伴う、１週間以上に渡る少ない１日投薬量での、甲状腺ホルモンアナログ、ポリマー形態、および誘導体の有効量の同時投与を含む。
【００９９】
ＣＡＭアッセイは、血管形成を助長する多種多様の成長因子および化合物の血管形成活性を検証するために使用されてきた。たとえば生理的濃度のＴ４は、この試験管内モデルにおいて、ＦＧＦ２の活性を有するモルベースで血管形成誘発性であることが示された。ＰＴＵの存在はＴ４の効果を低下させず、Ｔ３を生成するＴ４の脱ヨウ素化がこのモデルでの前提条件でないことを示す。各種の甲状腺ホルモンアナログの血管形成誘発効果のまとめを表１に示す。
【０１００】
【表１】
2008513461.tif 000002
グループ当たりｎ＝８
このモデルでの新しい血管成長の出現は数日を必要とし、甲状腺ホルモンの効果が甲状腺ホルモン（ＴＲ）の核受容体のホルモンとの相互作用に完全に依存することを示している。その天然リガンドＴ３によるＴＲの核内錯化を必要とするヨードチロニンの作用は、定義によってゲノム的であり、遺伝子発現において最高潮に達する。他方、ＴＲの天然リガンドであるＴ３よりもむしろ、Ｔ４に対するこのモデルシステムの優先的反応は、血管形成は原形質膜にてＴ４により非ゲノム的に開始され、遺伝子転写を必要とする効果が頂点に達するという可能性を上昇させた。Ｔ４の非ゲノム作用は幅広く述べられており、通常は原形質膜にて開始して、シグナル伝達経路によって仲介される。それらはヨードチロニンおよびＴＲの核内リガンドを必要としないが、遺伝子転写と相互作用するか、それを調節できる。ステロイドの非ゲノム作用も十分に述べられており、ステロイドまたは他の化合物のゲノム作用と相互作用することが既知である。Ｔ４およびｔｅｔｒａｃによって、またはアガロース−Ｔ４によって実施された実験は、Ｔ４の血管形成誘発効果が実際にたいてい、原形質膜において開始されることを示した。Ｔｅｔｒａｃは、Ｔ４の膜開始効果を遮断するが、それ自体はシグナル伝達を活性化しない。それゆえそれは甲状腺ホルモンの非ゲノム作用のプローブである。アガロース−Ｔ４は細胞内部に入り込まないと考えられ、ホルモンの考えられる細胞表面開始作用のモデルを調査するために使用されてきた。ニワトリ絨毛尿膜膜（「ＣＡＭ」）モデルにおける甲状腺ホルモンの血管形成誘発効果の調査は、既存血管からの新しい血管の生成が、１０−７〜１０−９ＭにてＬ−チロキシン（Ｔ４）または３，５，３’−トリヨード−Ｌ−チロニン（Ｔ３）のどちらかによって２〜３倍助長されることを示した。さらに興味深いことに、細胞膜を通過しない甲状腺ホルモンアナログであるＴ４−アガロースは、Ｔ３またはＴ４によって得られた効果と比較して強力な血管形成誘発効果を生成した。
【０１０１】
部分的に、本発明はそれを必要とする被験体の血管形成を助長する組成物および方法を提供する。血管形成を助長することによる処置の影響を受けやすい状態は、たとえば閉塞性末梢血管疾患および冠動脈疾患、特に冠血管の閉塞、ならびに末梢脈管構造および／または冠血管の閉塞に関連する障害、勃起不全、脳卒中、ならびに創傷を含む。それを必要とする患者において血管形成を助長する、および／または側副血管を補充する組成物および方法も開示されている。該組成物は、甲状腺ホルモンアナログおよび誘導体のポリマー形態の有効量ならびにアデノシンおよび／または一酸化炭素供給体の有効量を含む。該組成物は、生理的および製薬的に許容される担体中に甲状腺ホルモン様物質およびアデノシン誘導体の血管形成的有効量を場合により１つ以上の賦形剤と共に含む、滅菌注射用製薬調剤物の形でもよい。
【０１０２】
（心筋梗塞）
急性心筋梗塞後の心不全の主な理由は、新しい血管形成（ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、すなわち血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）の不十分な反応である。甲状腺ホルモンおよびそのアナログは心不全において有益であり、冠動脈血管形成を刺激する。本発明の方法は部分的に、一時的等容性収縮を引き起こして血管形成および／または心室リモデリングを達成するために、梗塞時に心筋への直接注射、または間欠的大動脈結紮による冠注射の刺激のどちらかによって、甲状腺ホルモンアナログの１回処置を送達することを含む。
【０１０３】
したがって１つの態様において、本発明は、血管形成を助長するのに有効な量の甲状腺ホルモン、またはそのアナログのポリマー形態をそれを必要とする被験体に投与することによって血管形成を助長することによる、閉塞性血管疾患、冠動脈疾患、心筋梗塞、虚血、脳卒中および／または末梢動脈血管障害を処置する方法を特徴とする。
【０１０４】
甲状腺ホルモンアナログのポリマー形態の例も本明細書に提供され、ポリビニルアルコール、アクリル酸エチレンコポリマー、ポリ乳酸、またはアガロースにコンジュゲートされたトリヨードチロニン（Ｔ３）、レボチロキシン（Ｔ４）、（ＧＣ−１）、または３，５−ジヨードチロプロピオン酸（ＤＩＴＰＡ）を含むことができる。
【０１０５】
該方法は、１週間以上に渡る少ない１日投薬量での、甲状腺ホルモン様物質の有効量およびアデノシンおよび／またはＮＯ供給体の有効量の同時投与も含む。一方または両方の成分をカテーテルによって局所的に送達できる。甲状腺ホルモンアナログ、および誘導体は生体内で、化合物の適切にサイズ決めされたリポソームまたは微粒子への包含により、虚血組織を包囲する毛細血管床に送達できる。甲状腺ホルモンアナログ、ポリマー形態および誘導体は、適切な抗体との共有結合により虚血組織へ標的化できる。
【０１０６】
該方法は、心筋梗塞後の心機能を回復する処置として使用できる。該方法は、心筋虚血または心臓以外の部位への不十分な血流に苦しむ、たとえば閉塞性末梢血管疾患（末梢動脈閉塞疾患としても既知）、または勃起不全を含む、冠動脈疾患を持つ患者での血流の改善にも使用できる。
【０１０７】
（創傷治癒）
創傷血管形成は、治癒の増殖期の重要な部分である。最表面以外の任意の創傷の治癒は、血管形成なしでは行うことができない。任意の損傷脈管構造を修復する必要があるだけでなく、治癒に必要な局所細胞活性の上昇も血流からの栄養素の供給増加を必要とする。その上、血管の内層を形成する内皮細胞は、治癒の形成体および制御因子としてそれ自体重要である。
【０１０８】
それゆえ血管形成は、治癒を補助する新しい微小循環を提供する。新しい血管は、傷害の４日後までに創傷スペース内で臨床的に見られるようになる。血管内皮細胞，線維芽細胞、および平滑筋細胞はすべて協調して増殖して、創傷肉芽形成を補助する。同時に再上皮化が起こり、上皮被覆を再確立する。創傷縁から、または深い毛包からの上皮細胞創傷を介して移動し、肉芽組織および仮のマトリクス上でそれ自体を確立する。成長因、たとえばケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）はこのプロセスを仲介する。上皮化の複数のモデル（スライディング細胞対ローリング細胞）が存在する。
【０１０９】
甲状腺ホルモンが代謝速度を制御するので、甲状腺機能低下症によって減速すると、創傷治癒も減速する。したがって創傷治癒で局所的に利用された甲状腺ホルモンアナログまたはポリマー形態の役割は、創傷治癒能力が損なわれた糖尿病および非糖尿病での創傷治癒を加速する新しい方法を意味する。局所投与は、バンドエイドへの付着の形で可能である。加えてナノポリマーおよびナノ粒子は、ｔｈｙｒｉｄホルモンおよびそのアナログの局所送達へのマトリクスとして使用できる。これは細胞および組織標的への時間制御送達を補助するであろう。
【０１１０】
したがって本発明の別の実施形態は、血管形成を助長するのに有効な量の甲状腺ホルモン、またはそのアナログのポリマー形態をそれを必要とする被験体に投与することによって血管形成を助長することによる、創傷を処置する方法を特徴とする。詳細については、実施例９Ａおよび９Ｂを参照。
【０１１１】
（ニューロン細胞の誘発および維持における、神経成長因子と組合された甲状腺ホルモン、アナログ、およびポリマーコンジュゲーションの役割）
神経誘導の従来の理解に反して、本発明は、一部は、血管形成を開始および維持する機構が神経形成の有効な助長体および支持体であるという予期せぬ発見結果に基づいている。このような方法および組成物はたとえば、外傷、傷害およびニューロン障害における運動ニューロン傷害および神経障害の処置に有用である。本発明は、単独での、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合された各種の血管形成誘発方法の使用を開示する。血管形成誘発因子は、本明細書で説明するようなポリマー性甲状腺ホルモンアナログを含む。該ポリマー性甲状腺ホルモンアナログおよびそのポリマーコンジュゲートは、単独で、または当分野で既知の他の血管形成誘発成長因子と、そして神経成長因子または他の神経形成因子と組合せて、最適な神経形成のために併用できる。
【０１１２】
死のリスクに瀕したニューロンの生存を強化することと、損傷したニューロンおよび神経路の細胞修復を誘発することと、その分化表現型を維持するためにニューロンを刺激することとを含む、哺乳類において神経路を維持するための治療的処置方法、組成物および器具が開示される。加えて、ポリマー性甲状腺ホルモンアナログ、およびそれらの組合せを含有する組成物は、抗酸化剤および／または抗炎症剤の存在下でのニューロン再生および保護を証明する。
【０１１３】
本発明は、ニューロンの生存を強化して、神経路を維持するための、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合される甲状腺ホルモン、アナログ、およびポリマーコンジュゲーションも提供する。本明細書で開示されるように、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログは、ニューロンの生存を強化し、ニューロンＣＡＭ発現を刺激して、分化ニューロンの表現型発現を維持し、神経起源の形質転換細胞の再分化を誘発して、神経プロセスの中断、特に軸索内の大きな隙間での軸索成長を刺激することができる。モルフォゲンも免疫関連神経組織損傷に関連する組織破壊から保護する。最後に単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログは、哺乳類における神経組織の生存能を監視する方法の一部として使用できる。
【０１１４】
本発明は、試験管内での機能性シナプス形成を評価するシステムを使用して、培養ラット皮質ニューロン間のシナプス形成に対するポリマー性甲状腺ホルモンの効果も提供する。１０−９Ｍポリマー性甲状腺ホルモン、３，５，３’−トリヨードチロニンまたはチロキシンへの暴露は、細胞内カルシウム濃度における自発的な同期発振変化の周波数の上昇を引き起こし、これは形成されたシナプスの数と相関していた。免疫細胞化学および免疫ブロット分析によるシナプス小胞結合タンパク質シナプシンＩの分析も、チロキシンへの暴露がシナプス形成を促進することを確認した。５’−脱ヨウ素酵素のインヒビタであるアミオダロン、または除草剤であるアミトロールの存在は、チロキシンの存在下でシナプス形成を阻害した。それゆえ本発明は、ポリマー性甲状腺系を混乱させることによって発達中のＣＮＳにおけるシナプス形成を妨害しうる種々の化学薬品のスクリーニングのための、有用な試験管内アッセイシステムも提供する。
【０１１５】
一般的な問題として、本発明の方法は、神経組織傷害または神経障害のリスクに瀕した、またはそれらに罹患した任意の哺乳類被験体の処置に利用できる。本発明は任意の霊長類、好ましくは高等霊長類、たとえばヒトの処置に適切である。加えて、しかしながら本発明は、ヒトの仲間として保持される（たとえばイヌ、ネコ、ウマ）、著しい商業価値を有する（たとえばヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、狩猟用および牽引用動物）、著しい化学的価値を有する（たとえば絶滅危惧種の捕獲または遊離試料、あるいは同系または組換え動物種）、あるいはそうでなければ価値を有する、家畜化された哺乳類の処置に利用できる。
【０１１６】
本明細書で述べる単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログは、特に死の危機に瀕したニューロン細胞の細胞生存を強化する。たとえば完全に分化したニューロンは、非有糸分裂性であり、当分野で既知の化学的に定義された、または低血清の培地を使用する標準哺乳類細胞培養条件下で培養したときに試験管内で死ぬ。たとえばＣｈａｒｎｅｓｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６：３１６４−３１６９（１９８６）およびＦｒｅｅｓｅら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．５２１：２５４−２６４（１９９０）を参照。しかしながら非有糸分裂性ニューロン細胞の一次培養物を単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺アナログで処置する場合、このような細胞の生存は、著しく強化される。たとえば成ラット脳の黒質から分離した線条体基底核の一次培養物は、標準手順を使用して、たとえばパスツールピペットによる黒質組織の粉砕による解離によって、標準組織培養プロトコルを使用して調製し、たとえば５０％  ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）、５０％  Ｆ−１２培地、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび４ｇ／ｌグルコースを添加した熱失活ウマ血清を含有する、低血清培地中で培養した。標準培養条件では、これらの細胞は無血清培地で培養したときに、３週までに著しい細胞死を受ける。細胞死は、細胞が接着性を維持できないことによって、そしてその超微細構造的特徴の変化によって、たとえばクロマチンクランピングおよびオルガネラ崩壊によって、形態学的に証明される。特に、細胞は接着性のままであり、生存可能な分化ニューロンの形態を引き続き維持した。単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子処置と組合された甲状腺アナログの非存在下では、培養細胞の大多数が解離し、細胞壊死を受けた。
【０１１７】
黒質の基底核における機能不全は、生体内でのハンチントン舞踏病およびパーキンソニズムと関連付けられる。本明細書で定義した単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログがニューロン生存を強化する能力は、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたこれらのポリマー性甲状腺ホルモンアナログが、たとえば神経障害あるいは化学的または機械的外傷のために、生体内で死のリスクに瀕したニューロン細胞の生存を強化する両方の一部として有用であることを示す。本発明はさらに、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたこれらのポリマー性甲状腺ホルモンアナログがハンチントン舞踏病およびパーキンソン病を含む、線条体基底核に影響を及ぼすニューロパシーを処置するために有用な治療剤を提供することを規定する。臨床用途では、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログを投与できるか、あるいは単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子刺激剤と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログを投与できる。
【０１１８】
本明細書で述べた甲状腺ホルモン化合物は、化学的外傷からの神経組織保護にも使用できる。本明細書で述べた単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログがニューロン細胞の生存を強化する、そして再分化細胞での細胞凝集および細胞間接着を誘発する能力は、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログが、化学的外傷によって引き起こされた損傷からの経路を画成する細胞を保護することによって神経路を維持する治療剤として有用であることを示す。特に、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログは、ニューロンの増殖および遊走を阻害して、細胞間接着を妨害することが知られた毒素の効果から発達中のニューロンを含むニューロンを保護できる。そのような毒素の例は、エタノール、タバコ煙中に存在する毒素の１つ以上、および多種多様のオピエートを含む。発達中のニューロンに対するエタノールの毒性効果は、胎児性アルコール症候群で明らかにされた神経損傷を誘発する。単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログは、興奮性アミノ酸、たとえばグルタメートと関連する細胞毒性効果からニューロンを保護することもできる。
【０１１９】
たとえばエタノールは、単独で、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子処置ＮＧ１０８−１５細胞と組合されたポリマー性甲状腺アナログにて誘発される細胞間接着効果を、これらの細胞に２５〜５０ｍＭの濃度で与えられたときに阻害する。最大半量阻害は、単一アルコール飲料摂取後の成人の血中アルコール濃度である５〜１０ｍＭエタノールによって達成できる。単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺アナログに誘発されたＮ−ＣＡＭレベルはエタノールによって影響を受けないため、エタノールは細胞間でＣＡＭの同種親和性結合を誘発するよりもむしろ阻害しやすい。その上、阻害効果は、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子濃度と組合されたポリマー性甲状腺アナログに反比例する。したがって単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺アナログ、あるいは単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子刺激剤と組合されたポリマー性甲状腺アナログの、エタノールなどの毒素への暴露による損傷のリスクに瀕したニューロン、特に発達中のニューロンへの投与は、毒素の阻害効果を克服することによって、これらの細胞を神経組織損傷から保護できることが想定される。単独の、あるいは本明細書で述べた神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺アナログは、これらの毒素への暴露によって誘発された神経障害から生じた損傷神経路を処置する療法においても有用である。
【０１２０】
単独の、あるいは本明細書で述べた神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログの生体内活性はまた、本明細書で述べた動物モデルでただちに評価される。好ましくはたとえば遺伝的または環境的に誘発された神経組織損傷を示す適切な動物に、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７などの適切な治療剤形中の、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログの有効量を脳内注射する。単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログは好ましくは、影響を受けたニューロンの部位内に注射される。影響を受けた組織は次の時点で切除され、組織は、形態的に、および／または適切な生化学マーカーの評価により（たとえば単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログ、あるいはＮ−ＣＡＭ局在化により）あるいはたとえばグリア線維性酸性タンパク質をマーカーとして用い、ＣＮＳ神経栄養性活性またはＣＮＳ組織損傷について生化学マーカーに対する用量依存性効果を測定することによって、評価される。投薬量およびインキュベーション時間は、試験される動物によって変化するであろう。異なる種の適切な投薬量範囲は確立された動物モデルとの比較によって決定できる。ラット脳スタブモデルのプロトコル例を以下に示す。
【０１２１】
簡単には、標準の販売元から入手したオスＬｏｎｇ  Ｅｖａｎｓラットに麻酔をかけ、頭部に外科手術の準備をする。標準外科処置を使用して頭蓋冠を露出させて、各葉の中心に向かって、０．０３５Ｋワイヤを使用して穴を開け、頭蓋冠だけを穿刺する。次に単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子（たとえばＯＰ−１、２５ｍｇ）あるいはＰＢＳと組合された、どちらかのポリマー性甲状腺アナログを含有する溶液２５ｍｌをＨａｍｉｌｔｏｎシリンジによって各穴に供給する。溶液を表面から約３ｍｍの深さにて下にある皮質、脳梁および海馬へ送達する。次に皮膚を切開して、動物を回復させた。
【０１２２】
手術の３日後にラットを断頭により殺処分して、その脳を切片作成のために処置した。瘢痕組織形成をグリア線維性酸性タンパク質、グリア性瘢痕のマーカータンパク質について免疫蛍光染色で評価して、瘢痕形成の程度を定量的に決定する。グリア線維性酸性タンパク質抗体は、たとえばミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から市販されている。切片はまた抗ＯＰ−１抗体によってプローブして、ＯＰ−１の存在を判定する。グリア線維性酸性タンパク質のレベルの低下は単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺アナログで処置した動物の組織切片で予想され、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺アナログがグリア性瘢痕形成を阻害し、神経再生を刺激する能力を証明する。
【０１２３】
（神経変性疾患の脳撮像、診断、および治療での甲状腺ホルモン、アナログ、およびポリマーコンジュゲーションの役割）
本発明は、神経変性疾患、たとえばアルツハイマー病の早期診断、予防、および処置に有用な新規の医薬品および放射性医薬品に関する。本発明は、生物系において特異性結合を有し、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、単光子放出（ＳＰＥＣＴ）撮像法、および磁気共鳴（ＭＲＩ）撮像法に使用できる新規化学化合物も含む。Ｔ４および他の甲状腺ホルモンアナログが体内の局在化リガンドに結合する能力は、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、ＭＲＩ、および同様の撮像法によるリガンドのインサイチュー撮像にそのような化合物を利用することを可能にする。原則として結合が起こる限り、リガンドの性質に関して知る必要はなく、そのような結合は興味のある細胞、器官、組織または受容体のクラスに特異的である。
【０１２４】
ＰＥＴ撮像は、陽電子放出同位体で標識されたトレーサ化合物を用いて達成される（Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｍ．Ｍ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｏｓｉｔｒｏｎ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｏｓｂｙ  Ｙｅａｒｂｏｏｋ，１９９２，Ｋ．Ｆ．Ｈｕｂｎｅｒら、Ｃｈａｐｔｅｒ  １４）。大半の生体物質では、適切な同位体はほとんどない。炭素同位体１１ＣはＰＥＴに使用されてきたが、２０．５分というその短い半減期は、速に合成および精製できる化合物、ならびに前駆体Ｃ１１開始物質が生成される、サイクロトロンに近接する設備への有用性を制限している。他の同位体は、なお短い半減期を有する。Ｎ１３は１０分の半減期を有し、Ｏ１５は２分のなお短い半減期を有する。両方の放出はＣ１１の放出よりも活発である。それにもかかわらずＰＥＴの研究がこれらの同位体を用いて実施されている（Ｈｕｂｎｅｒ，Ｋ．Ｆ．，ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｏｓｉｔｒｏｎ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｏｓｂｙ  Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ，１９９２，Ｋ．Ｆ．Ｈｕｂｎｅｒら、Ｃｈａｐｔｅｒ  ２）。さらに有用な同位体１８Ｆは１１０分の半減期を有する。これは放射性標識トレーサ内への包含のために、精製のために、そしてヒトまたは動物被験体への投与のために十分な時間を与える。加えてサイクロトロンからさらに、最大半径約２００マイル離れた設備は、Ｆ１８標識化合物を利用することができる。１８Ｆの欠点は、天然型生体物質と同等機能を有するフッ化アナログが比較的乏しいことと、サイクロトロン内で生成される開始物質を効率的に利用する合成方法の設計が困難なことである。そのような開始物質はフッ化物イオンまたはフッ素ガスのどちらかでありうる。後者の場合、２分子ガスのフッ素原子１個のみが実際に放射性核種であるので、ガスはＦ−Ｆ１８と呼ばれる。したがってＦ−Ｆ１８を開始物質として使用する反応は、Ｋ．Ｆ１８を開始物質として利用する反応の放射性核種存在量の半分のみを有する生成物を生じる。他方Ｆ１８は、無担体求核置換反応を使用して、キュリー量でフッ化物イオンとして高い特異性活性の放射性医薬化合物中へ包含させるために、理論的に１．７Ｃｉ／ｎｍｏｌで調製できる。Ｆ１８のエネルギー放出は０．６３５ＭｅＶであり、組織中に比較的短い２．４ｍｍ平均陽電子範囲を生じ、高分解能ＰＥＴ画像を可能にする。
【０１２５】
ＳＰＥＣＴ撮像は、高エネルギー光子を放出する同位体トレーサを利用する（ガンマエミッタ）。有用な同位体の範囲はＰＥＴよりも大きいが、ＳＰＥＣＴはより低い三次元分解能を与える。それにもかかわらず、ＳＰＥＣＴは、アナログ結合、局在化およびクリアランス速度に関する臨床的に重要な情報を入手するために幅広く使用される。ＳＰＥＣＴ撮像に有用な同位体は、半減期が１３．３時間のＩ１２３α−ガンマエミッタである。Ｉ１２３で標識した化合物は、製造現場から約１０００マイルまで出荷できるか、または現場合成のために同位体自体を輸送できる。同位体の放出の８５パーセントが１５９ＫｅＶ光子であり、現在使用されているＳＰＥＣＴ機器によってただちに測定される。本発明の化合物は、テクネチウムによって標識できる。テクネチウム−９９ｍは、ＳＰＥＣＴ撮像に有用な放射性核種であることが既知である。本発明のＴ４アナログは、飽和させることができるか、あるいは二重または三重結合を持つ４〜６炭素鎖を通じてＴｃ−９９ｍ金属クラスタに結合できる。
【０１２６】
ＰＥＴでのＦ１８標識化合物の使用は、２、３のアナログ化合物に限定されてきた。最も顕著には１８Ｆ−フルオロデオキシグルコースが、脳活性に関連するグルコース代謝およびグルコース取り込みの局在化の研究に幅広く使用されている。１８Ｆ−Ｌ−フルオロドパおよび他のドーパミン受容体アナログもドーパミン受容体分布のマッピングに使用されている。
【０１２７】
他のハロゲン同位体は、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ撮像に、あるいは従来のトレーサ標識に役立つことができる。これらは７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒおよび８２Ｂｒを、有用な半減期および放出特性を有するとして含む。一般に化学的手段が存在して、任意のハロゲン部分を説明した同位体と置換する。したがって、安定な同位体ハロゲンホモログを含めて、説明した化合物の任意のハロゲン化ホモログの生化学的または生理的活性は今や、当業者による使用のために利用できる。アスタチンは、他のハロゲンアイソタイプと置換できる。２１０Ａｔは、たとえば８．３時間の半減期を持つアルファ粒子を放出する。他の同位体も合理的に有用な半減期を持つアルファ粒子を放出する。従ってＡｔ置換化合物は、結合が十分に脳特異性である脳療法に有用である。
【０１２８】
多くの研究が、炭水化物およびアミノ酸の悪性脳細胞内への包含の増加を証明している。この蓄積はそのような細胞の増殖およびタンパク質合成の加速と関連付けられる。グルコースアナログ１８Ｆ−２−フルオロ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＦＤＧ）は、高度の悪性脳を、正常な脳組織または良性成長から区別するために使用されている（ＤｉＣｈｉｒｏ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（ＮＹ）３２：１３２３−１３２９．しかしながらフッ素−１８標識２−ＦＤＧは、正常組織への高度の取り込みが脳の存在を隠すので、低悪性度の脳を検出するために最適な薬剤ではない。加えてフッ素−１８標識２−ＦＤＧは、感染組織および膀胱それぞれでの２−ＦＤＧ放射能の高い取り込みのために、肺脳を感染組織から区別するには、または卵巣癌を検出するには理想的な放射性医薬品ではない。炭素−１１によって標識された天然型アミノ酸のメチオニン標識は、悪性組織を正常組織から区別するためにも使用されている。しかしまた正常組織での比較的高い取り込みを有する。その上、炭素−１１の半減期はわずか２０分である；したがってＣ１１メチオニンは長期間に渡って貯蔵できない。
【０１２９】
ラットおよびヒトにおける主なＣＳＦチロキシン（Ｔ４）担体タンパク質である、脳髄液（「ＣＳＦ」）トランスチレチン（「ＴＴＲ」）は、脈絡叢（「ＣＰ」）にて合成される。１２５Ｉ−Ｔ４のラットへの注射後、放射性Ｔ４は最初にＣＰに、次にＣＳＦに、その後、脳に蓄積する（Ｃｈａｎｏｉｎｅ  ＪＰ，  Ｂｒａｖｅｒｍａｎ  ＬＥ．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｔｏ  ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ  ａｎｄ  ｂｒａｉｎ．  Ａｃｔａ  Ｍｅｄ  Ａｕｓｔｒｉａｃａ．１９９２；１９  Ｓｕｐｐｌ  １：２５−８）。
【０１３０】
本発明の化合物は、アミロイドタンパク質を有する体の部位、特に脳の部位の、実質的に改良されたＰＥＴ撮像を提供する。生物活性化合物に包含できる利用可能な陽電子放出同位体はすべて、短い半減期を有する。したがってそのような標識化合物の実用性は、標識化合物がどれだけ迅速に合成できるか、最終生成物の合成収率および放射化学純度に依存する。それでも同位体源、すなわちサイクロトロン設備からＰＥＴ撮像が行われる病院または研究所までのから出荷時間は制限される。有用な距離の概算は、半減期１分当たり約２マイルである。それゆえ２０．５分の半減期を持つＣ１１は、供給源から約半径４０マイルに制限され、これに対してＦ１８によって標識された化合物は、半径約２００マイル内で使用できる。１８Ｆ標識化合物のさらなる要件は、それが結合することになっている受容体または標的分子に対して特異性の結合を有することと、他の標的への非特異性結合が標的と非標的結合とを区別させるのに十分に低いことと、試験環境で他の物質との交換を避けるために、標識が試験の条件下で安定であることである。さらに詳細には、本発明の化合物は、他の組織または細胞と比較に値する程度まで結合できないのと同時に、所望の標的への十分な結合を示す必要がある。
【０１３１】
ＰＥＴ撮像の厳密な要件に対する部分的な解決策は、ＳＰＥＣＴ撮像でのガンマ放出同位体を利用することである。Ｉ１２３はＳＰＥＣＴで一般に使用される同位体マーカーであり、合成場所から１０００マイルを超える有用な範囲のために１３時間の半減期を有する。本発明の化合物は、ＰＥＴ撮像の代わりに、ＳＰＥＣＴ分析での使用のためにＩ１２３によって迅速かつ効率的に標識できる。さらに同じ化合物がどちらかの同位体によって標識できるという事実のために、同じトレーサを使用してＰＥＴおよびＳＰＥＣＴによって得られた結果を最初に比較することが可能である。
【０１３２】
脳結合の特異性は、本発明のＩ置換化合物の有用性も提供する。そのような化合物は、ＳＰＥＣＴ撮像では短寿命の１２３Ｉによって、または療法の経過監視などの長期試験では長命の１２５Ｉによって標識できる。他のヨウ素および臭素同位体は、例示されたものと置換できる。
【０１３３】
したがって本発明の化合物は、ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴを使用する脳撮像の改良された方法を提供する。該方法は、（実験および／または診断目的で、ヒトまたは動物でありうる）被験体に、適切な同位体によって標識された本発明の化合物の画像生成量を投与することと、次にＦ１８または他の陽電子エミッタが利用される場合にはＰＥＴによって、あるいはＩ１２３または他のガンマエミッタが利用される場合にはＳＰＥＣＴによって、化合物の分布を測定することとを必要とする。画像生成量は、スキャナの検出感度およびノイズレベル、同位体の寿命、被験体の体のサイズおよび投与経路を考慮した、少なくともＰＥＴまたはＳＰＥＣＴスキャナで画像を提供できる量であり、そのような変数はすべて、過度の実験を用いることなく当業者に既知である計算および測定値によって、既知であり説明される変数の例である。
【０１３４】
本発明の化合物は、構造中の任意の原子または原子の組合せの同位体によって標識できることが理解されるであろう。本明細書ではＦ１８、Ｉ１２３、およびＩ１２５がＰＥＴ、ＳＰＥＣＴおよびトレーサで特に有用であるとして強調されているが、安定な同位体ホモログの生理的または薬理学的特性に由来する使用を含む他の使用も期待され、当業者に明らかとなるであろう。
【０１３５】
本発明は、Ｔｃ付加体によるテクネチウム（Ｔｃ）標識も提供する。Ｔｃの同位体、とりわけＴｃ９９ｍが脳撮像に使用されている。本発明は、脳撮像に有用である、本発明の化合物のＴｃ錯化付加体を提供する。付加体は、飽和させることができるか、あるいは二重または三重結合を持つ４〜６炭素鎖によって環状アミノ酸に結合されたＴｃ配位錯体である。二重結合が存在する場合、Ｅ（トランス）またはＺ（シス）異性体のどちらかが合成でき、どちらかの異性体が使用できる。異性体の有用寿命を最大限にするために、最終工程として９９ｍＴｃ同位体を包含するための合成を説明する。
【０１３６】
以下の方法を本明細書で報告された手順で利用した。１８Ｆ−フルオリドは、Ｓｅｉｍｅｎｓサイクロトロンから９５％濃縮１８Ｏ水の１１ＭｅＶプロトンとの１８Ｏ（ｐ，ｎ）１８Ｆ反応を使用して生成した。すべての溶媒および化学薬品は、分析グレードであり、さらに精製せずに使用した。化合物の融点は、Ｂｕｃｈｉ  ＳＰ装置を使用して毛細管内で決定した。薄層クロマトグラフィー分析（ＴＬＣ）は、アルミニウム上にコーティングされたシリカゲルＧ  ＰＦ−２５４の２５０ｍｍ厚層を使用することによって実施した（Ａｎａｌｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．より入手）。カラムクロマトフラフィーは６０〜２００メッシュシリカゲル（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を使用して実施した。赤外スペクトル（ＩＲ）をＢｅｃｋｍａｎ  １８Ａ分光光度計でＮａＣｌプレートを用いて記録した。プロトン核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ  ＮＭＲ）をＮｉｃｏｌｅｔ高分解能装置によって３００ＭＨｚにて得た。
【０１３７】
別の態様において、本発明は、ヒトのアルツハイマー病の診断用放射性医薬品の製造に本発明の化合物を使用する方法に関する。別の態様において、本発明は、本発明の化合物を調製する方法に関する。
【０１３８】
本発明の化合物は、本明細書で述べたように、ＴＴＲに結合して、血液脳関門を通過する能力を有する、甲状腺ホルモンアナログまたは他のＴＴＲ結合リガンドである。したがって該化合物は、アルツハイマー病の撮像用の生体内診断剤として適している。放射能の検出は、ガンマカメラの使用、または陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）のどちらかによって、当分野で周知の手順に従って実施される。
【０１３９】
好ましくは遊離塩基または本発明の化合物の製薬的に許容される塩形、たとえばモノ塩化物またはジ塩化物塩は、診断剤としての生薬製剤に使用される。本発明の化合物を含有する生薬製剤は場合により、当分野で既知のアジュバント、たとえば緩衝剤、塩化ナトリウム、乳酸、界面活性剤などを含有する。使用前に滅菌条件下での生薬製剤の濾過による滅菌が可能である。
【０１４０】
放射線量は利用当たり１〜１００ｍＣｉ、好ましくは５〜３０ｍＣｉ、そして最も好ましくは５〜２０ｍＣｉの範囲であるべきである。
【０１４１】
本発明各種の態様の中で、ある化合物（たとえば実施例１６〜２０で開示される化合物）が好ましい。特に好ましいのは、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）での診断剤としての使用のための化合物である。
【０１４２】
本発明の化合物は任意の適切な経路によって、好ましくはそのような経路に適した製薬組成物の形で、そして脳内のＴＴＲを結合して、ガンマカメラまたはＰＥＴによって検出されるのに有効な用量で投与できる。通例、投与は非経口、たとえば静脈内、腹腔内、皮下、皮内、または筋肉内である。静脈内投与が好ましい。それゆえたとえば本発明は、許容される担体、たとえば血清または生理的塩化ナトリウム溶液に溶解または懸濁させた造影剤の溶液を含む、非経口投与用の組成物を提供する。
【０１４３】
水性担体は水、アルコール性／水性溶液、生理食塩溶液、非経口ビヒクル、たとえば塩化ナトリウム、リンゲルデキストロースなどを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油および注射用有機エステル、たとえばエチルオレアートである。他の製薬的に許容される担体、非毒性賦形剤は、塩、保存料、緩衝剤などを含めてたとえばＲＥＭＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１５．ｓｕｐ．ｔｈ  Ｅｄ．Ｅａｓｔｏｎ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，ｐｐ．１４０５−１４１２および１４６１−１４８７（１９７５）ならびにＴＨＥ  ＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＦＯＲＭＵＬＡＲＹ  ＸＩＶ．，１４．ｓｕｐ．ｔｈ  Ｅｄ．  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  （１９７５）に述べられている。水性担体が好ましい。
【０１４４】
本発明の製薬組成物は、本発明の化合物を−場合により製薬学で慣習的な添加剤と組合せて−水性溶媒に懸濁または溶解させることと、次に場合によりｔ懸濁物または溶液を滅菌することとによって、それ自体既知の方法で生成される。適切な添加剤はたとえば生理的に許容される緩衝液（たとえばトロメタミン）、錯化剤（たとえばジエチレントリアミンペンタ酢酸）または−必要ならば−電解質、たとえば塩化ナトリウムまたは−必要ならば−抗酸化剤、たとえばアスコルビン酸の添加である。
【０１４５】
水または生理的食塩溶液による、本発明の化合物の懸濁物または溶液が腸内投与または他の目的に望ましい場合、それらはガレヌス薬学で慣習的であるように、助剤（たとえばメチルセルロース、ラクトース、マンニトール）および／またはテンシド（たとえばレシチン、「Ｔｗｅｅｎ」、「Ｍｙｒｊ」）および／または味を改善するための香味剤（たとえば精油）の１つまたは複数と混合される。
【０１４６】
組成物は従来の周知の滅菌技法によって滅菌でき、または滅菌濾過できる。得られた水溶液はそのまま包装されるか、または凍結乾燥させ、凍結乾燥させた調製物は投与前に滅菌溶液と組合される。該組成物は、生理的条件に近づけるために必要とされるような製薬的に許容される補助物質、ｐＨ調節および緩衝剤、張性調節剤、湿潤剤など、たとえば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウラート、トリエタノールアミンオレアートなどを含有できる。
【０１４７】
放射性ハロゲンを有する本発明による化合物では、これらの化合物は「高温」化合物として、すなわち化合物中の放射性ハロゲンと共に出荷され、たとえば生理的に許容される生理食塩溶液中で投与できる。金属錯体の場合、これらの化合物は、「低温」化合物として、すなわち放射性イオンなしで出荷され、次にＴｃジェネレータ溶出液またはＲｅジェネレータ溶出液と混合できる。
【０１４８】
（その細胞表面受容体がインテグリンαβ３、または他のＲＧＤ含有化合物の周囲にクラスタ化されたポリペプチドの作用の調節における甲状腺ホルモン、アナログ、およびポリマーコンジュゲーションの役割）
インテグリンαＶβ３は、アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（「ＲＧＤ」）を含有する複数の細胞外マトリクスタンパク質リガンドを備えたヘテロダイマー原形質膜タンパク質である。精製インテグリンを使用して、本発明者らは、インテグリンαＶβ３はＴ４を結合することと、この相互作用がαＶβ３アンタゴニストによって混乱されることとを発見した。放射性リガンド結合研究は、精製αＶβ３がＴ４を高い親和性で結合し（ＥＣ５０、３７１ｐＭ）、Ｔ３よりもＴ４を優先的に結合するように見えることを明らかにした。これは、Ｔ３と比較してＴ４によるＭＡＰＫ活性化および核移行はもちろんのこと、ホルモン誘発血管形成も示すを示す以前の報告と一致している。インテグリンαＶβ３アンタゴニストはＴ４のインテグリンへの結合を阻害し、重要なことにＭＡＰＫシグナル伝達カスケードのＴ４による活性化を防止する。インテグリンへのホルモン結合のこの機能的結果−ＭＡＰＫ活性化−は、インテグリンαＶβ３アンタゴニストによる、甲状腺ホルモンのＭＡＰＫ依存性血管形成誘発作用の阻害と共に、本発明者らがにインテグリン上のヨードチロニン結合部位を受容体として説明させる。甲状腺ホルモン誘導体である、３−ヨードチロナミンは近年、Ｓｃａｎｌａｎらによって微量のアミン受容体（ＴＡＲＩ）に結合するが、このアナログの作用が興味深いことにＴ４およびＴ３の作用と反対であることに注目すべきである。
【０１４９】
インテグリンの従来のリガンドはタンパク質である。その小型分子、甲状腺ホルモンもインテグリンのリガンドであるということは、新規の発見である。本発明は、甲状腺ホルモンの結合から生じるのとは異なる機能性細胞結果のアポトーシスを伴って、多少のエストロゲン活性を持つポリフェノールであるレスベラトロルがインテグリンαＶβ３に結合することも開示する。Ｔ４が結合するインテグリンの部位は、ヘテロダイマーインテグリンのＲＧＤ結合溝またはその付近である。しかしながら、タンパク質の他の箇所でＴ４に結合することと、ｔｅｔｒａｃまたはＲＧＤ含有ペプチドによるＲＧＤ認識部位の占有が、Ｔ４結合部位をアロステリックに遮断するか、またはＴ４部位を利用不可にするインテグリン内の配座変化を引き起こすこととが可能である。したがってアストロサイトのラミニン−インテグリン相互作用のＴ４による調節は、ホルモンのインテグリンへの結合の結果である。それゆえラミニンに加えて、細胞にて外部甲状腺ホルモンが細胞外マトリクスタンパク質のインテグリンαＶβ３による配位に影響を及ぼす可能性が存在する。
【０１５０】
機構にて非ゲノム性であるＴ４の作用は、近年十分に裏付けられている。多数のこれらの活性は、ＭＡＰＫに仲介される。本発明者らは、プロテインキナーゼＣの活性化を含む、ＭＡＰＫカスケードの甲状腺ホルモンによる活性化の初期工程がＧＴＰγＳおよび百日咳毒素に感受性であることを示し、甲状腺ホルモンの原形質膜受容体がＧタンパク質感受性であることを示している。インテグリンαＶβ３によって仲介されるある細胞機能が他の機能によってＧタンパク質調節性であると示されたことに注目すべきである。たとえばＲＧＤ結合ドメインの部位特異的変異誘発は、ヌクレオチド受容体Ｐ２Ｙ２がＧ０を活性化する能力を廃止するが、これに対してＧｑの活性化は影響を受けなかった。Ｗａｎｇらはインテグリン結合タンパク質、ＩＡＰ／ＣＤ４７がＭＡＰＫ活性化のＧｉ仲介阻害によって平滑筋細胞遊走を誘発することを証明した。
【０１５１】
インテグリンαＶβ３によるＴ４および他のアナログの結合を特異性細胞内シグナル伝達経路の活性化を結び付けることに加えて、本発明は、インテグリンのホルモンの配位がＭＡＰＫ依存性血管形成のＴ４による誘発にとって重要であることも開示している。ＣＡＭモデルにおいて、著しい血管成長がＴ４処置の４８〜７２時間後に起こり、Ｔ４の原形質膜効果が錯体転写変化を生じうることを示す。それゆえ細胞表面Ｔ４シグナルのホルモン伝達の非ゲノム作用として開始されることは、新血管新生で最大に達するホルモンのゲノム効果と相互作用する。甲状腺ホルモンの非ゲノムおよびゲノム作用のインタフェース、たとえばＴ４により細胞表面にて開始され、コリプレッサタンパク質のＴＲによる分断およびコアクチベータの補充を生じる、ＴＲβ１のＳｅｒ−１４２におけるＭＡＰＫ依存性ホスホリル化が述べられている。本発明は、Ｔ４がＲＧＤペプチドによって阻害されるＭＡＰＫ依存性機構によってＣ−６グリア細胞の成長を刺激することと、甲状腺ホルモンがＲＧＤペプチドによって阻害できることが今や既知であるプロセスによる、ＭＣＦ−７細胞中での核エストロゲン受容体（ＥＲα）のＭＡＲＫ仲介セリンホスホリル化を引き起こすこととも開示している。複数の細胞系でのこのような発見結果は、甲状腺ホルモンに対する細胞の機能性反応におけるインテグリンの関与をすべて裏付けている。
【０１５２】
甲状腺ホルモンの膜受容体としてのαＶβ３の同定は、インテグリンとホルモンとの相互作用の臨床的意義および血管形成の下流結果を示す。たとえばαＶβ３は多くの腫瘍において過剰発現され、この過剰発現は腫瘍浸潤および成長で役割を果たすように思われる。甲状腺ホルモンの比較的一定の循環レベルは、腫瘍関連血管形成を促進できる。本明細書または別の箇所でのＣＡＭモデルにおけるＴ４の血管形成誘発作用を示すことに加えて、本発明は、ヒト皮膚微小血管内皮細胞も甲状腺ホルモンに暴露されたときに、新しい血管を形成することも開示している。αＶβ３アンタゴニストまたはｔｅｔｒａｃの腫瘍細胞付近への局所送達は、甲状腺ホルモン刺激血管形成を阻害できる。ｔｅｔｒａｃは甲状腺ホルモンの生物活性の多くが不足しているが、ある細胞の内部へ接近する。ｔｅｔｒａｃ、または特異性ＲＧＤアンタゴニストの非免疫原性基質（アガロースまたはポリマー）への固着は、該化合物が原形質膜を通過して、本明細書で示すようにＴ４誘発血管形成を防止する能力をなお保持する可能性を排除する。それゆえ本研究で使用したアガロース−Ｔ４は、特異的な細胞効果を有するが、細胞内部に接近しない甲状腺ホルモンアナログの新たなファミリの原型である。
【０１５３】
したがって本明細書の実施例は、インテグリンαＶβ３を、甲状腺ホルモン（Ｌ−チロキシン、Ｔ４）の細胞表面受容体として、そして細胞内シグナル伝達カスケードのＴ４誘発活性化の開始部位として確認する。αＶβ３は放射性標識Ｔ４を高い親和性で解離自在に結合する；放射性リガンド結合は、テトラヨードチロ酢酸（ｔｅｔｒａｃ）、αＶβ３抗体およびインテグリンＲＧＤ認識部位ペプチドによって置換される。ＣＶ−１細胞は核甲状腺ホルモン受容体を持たないが、原形質膜αＶβ３を持つ；これらの細胞の生理学的濃度Ｔ４による処置は、ｔｅｔｒａｃ、ＲＧＤペプチドおよびαＶβ３抗体によって阻害される効果である、ＭＡＰＫ経路を活性化する。インテグリンへのＴ４結合のインヒビタは、Ｔ４のＭＡＰＫ仲介血管形成誘発作用も遮断する。ＭＡＰＫのＴ４誘発ホスホリル化は、αＶおよびβ３のｓｉＲＮＡノックダウンによって遮断される。これらの発見結果は、Ｔ４がＲＧＤ認識部位付近でαＶβ３に結合することを示し、αＶβ３へのホルモン結合が生理学的結果を有することを示す。
【０１５４】
（血管形成の阻害での甲状腺ホルモン、アナログ、およびポリマーコンジュゲーションの役割）
本発明は、別の部分で、それを必要とする被験体での血管形成を阻害する組成物および方法も提供する。血管形成を阻害することによる処置に影響を受けやすい状態は、たとえば原発性または転移性腫瘍および糖尿病網膜症を含む。該組成物は、ＴＥＴＲＡＣ、ＴＲＩＡＣまたはｍＡｂ  ＬＭ６０９の有効量を含むことができる。該組成物は、生理的および製薬的に許容される担体中に抗血管形成物質の抗血管形成的有効量を、場合により１つ以上の賦形剤と共に含む、滅菌注射用製薬調剤物の形でもよい。
【０１５５】
さらなる態様において、本発明は、抗血管形成剤の血管形成を阻害するのに有効な量をそれを必要とする被験体に投与することによって、血管形成を阻害することによる処置の影響を受けやすい状態を処置する方法を提供する。
【０１５６】
血管形成を阻害するために使用される抗血管形成剤の例は、本発明によっても提供され、これに限定されるわけではないが、テトラヨードチロ酢酸（ＴＥＴＲＡＣ）、トリヨードチロ酢酸（ＴＲＩＡＣ）、モノクローナル抗体ＬＭ６０９、またはそれらの組合せを含む。そのような抗血管形成剤は、細胞表面にて血管形成誘発剤を阻害するように作用できる。
【０１５７】
（癌関連の新たな血管成長）
血管形成を阻害することによる処置の影響を受けやすい状態は、これに限定されるわけではないが、これに限定されるわけではないがグリオーマおよび乳癌を含む、原発性または転移性腫瘍を含む。そのような方法では、甲状腺ホルモン誘発血管形成効果を阻害する化合物が血管形成を阻害するのに使用される。そのような方法の詳細は実施例１２で説明する。
【０１５８】
（糖尿病網膜症）
血管形成を阻害することによる処置の影響を受けやすい状態の例はこれに限定されるわけではないが、糖尿病網膜症、および関連状態を含む。そのような方法では、甲状腺ホルモン誘発血管形成効果を阻害する化合物が血管形成を阻害するのに使用される。そのような方法の詳細は実施例８ＡおよびＢで説明する。
【０１５９】
（糖尿病よりもむしろ）低酸素症によって誘発される増殖性網膜症は、アルファＶ（αＶ）インテグリン発現に依存することが既知である（Ｅ  Ｃｈａｖａｋｉｓら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４５：２６２−２６７，２００２）。本明細書では、特異性インテグリンアルファＶベータ−３（αＶβ３）に対する甲状腺ホルモン作用が糖尿病網膜症の発生で許容されることを提唱する。インテグリンαＶβ３は本明細書では、甲状腺ホルモンの細胞表面受容体であることが確認されている。甲状腺ホルモン、そのアナログ、およびポリマーコンジュゲーションはこの受容体を介して作用して、血管形成を誘発する。
【０１６０】
（処置および製剤の方法）
甲状腺ホルモンアナログ、ポリマー形態、および誘導体は、血管形成をそれを必要とする患者において助長する方法で使用できる。該方法は、１週間以上に渡る少ない１日投薬量での、甲状腺ホルモンアナログ、ポリマー形態、および誘導体の有効量の同時投与を含む。該方法は、心筋梗塞後に心機能を回復する処置として使用できる。該方法は、血流の低下が問題である、心筋虚血または心臓以外の部位への不十分な血流、たとえば末梢血管疾患、たとえば末梢動脈閉塞疾患に苦しむ、冠動脈疾患患者の血流を改善するために使用できる。
【０１６１】
該化合物は、経口、経直腸、局所または非経口（皮下、筋肉内および静脈内を含む）投与を含む、投与される化合物に適切である任意の医学的に許容される手段を介して投与できる。たとえばアデノシンは非常に短い半減期を有する。この理由で、それは好ましくは静脈内投与される。しかしながら、はるかに長い半減期を有し、他の手段によって投与できるアデノシンＡ．ｓｕｂ．２アゴニストが開発されている。甲状腺ホルモンアナログ、ポリマー形態、および誘導体は、たとえば静脈内、経口、局所、鼻腔内投与で投与できる。
【０１６２】
ある実施形態において、甲状腺ホルモンアナログ、ポリマー形態、および誘導体は異なる手段を介して投与される。
【０１６３】
血管形成の刺激で有効であるために必要な甲状腺ホルモン、そのアナログ、ポリマー形態、および誘導体の量はもちろん処置される個体によって変わり、最終的に医師の裁量による。考慮される因子は、処置される患者の状態、使用される特定のアデノシンＡ２受容体アゴニストの有効性、製剤の性質、および患者の体重を含む。甲状腺ホルモンアナログまたはそのポリマー形態、および誘導体の閉塞処置投薬量は、所望の効果を与える任意の投薬量である。
【０１６４】
上述の化合物は好ましくは、甲状腺ホルモンアナログまたはそのポリマー形態、および誘導体を許容される担体と共に含む、投与方式のための製剤で投与される。当業者に一般に既知であるような、所期の目的に適切である活性成分を含有する任意の製剤または薬物送達システムを使用できる。経口、経直腸、局所または非経口（皮下、腹腔内、筋肉内および静脈内を含む）投与のために適切な製薬的に許容される担体が当業者に既知である。該担体は、製剤の他の成分と適合性であり、そのレシピエントに有害でないという意味で製薬的に許容されねばならない。
【０１６５】
非経口投与に適切な製剤は好都合に、好ましくはレシピエントの血液と等張である、活性化合物の滅菌水性調製物を含む。それゆえそのような製剤は、蒸留水、蒸留水または食塩水中の５％デキストロースを好都合に含有できる。有用な製剤は、適切な溶媒による希釈時に、上のｐａｒｅｎｔａｌ投与に適切な溶液を与える、式（Ｉ）の化合物を含有する濃縮溶液または固体も含む。
【０１６６】
腸内投与では、化合物は、活性化合物の規定量をそれぞれ含有する、カプセル剤、カシェ剤、錠剤、または菱形錠；粉剤または粒剤として；あるいは水性液体または非水性液体中の懸濁物または溶液、たとえばシロップ、エリキシル剤、および乳剤またはドラフト剤などの別個の単位の不活性担体中に包含される。適切な担体は、デンプンまたは糖であり、潤滑剤、香料、バインダ、および同じ性質の他の物質を含む。
【０１６７】
錠剤は、場合により１つ以上の付属成分を用いて、圧縮または成形によって作成できる。圧縮錠剤は、適切な機械で自由流動形の活性化合物、たとえば粉剤または粒剤を場合により付属成分、たとえばバインダ、潤滑剤、不活性希釈剤、表面活性剤または分散剤と混合して圧縮することによって調製できる。成形錠剤は、適切な機械で粉末化活性化合物と任意の適切な担体との混合物を成形することによって作成できる。
【０１６８】
シロップ剤または懸濁剤は、活性化合物を濃縮された糖、たとえばスクロースの水溶液に加えて、それにまた任意の付属成分を添加することによって作成できる。そのような付属成分は、香料、糖の結晶化を遅延させる薬剤または他の任意の成分の溶解度を上昇させる薬剤、たとえば多価アルコール、たとえばグリセロールまたはソルビトールを含むことができる。
【０１６９】
直腸投与用の製剤は、坐剤ベース用の従来の担体、たとえばココアバターまたはＷｉｔｅｐｓｏｌ  Ｓ５５（Ｄｙｎａｍｉｔｅ  Ｎｏｂｅｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌの商標、ドイツ）を含む坐剤として提供できる。
【０１７０】
あるいは化合物は、リポソームまたはミクロスフェア（または微粒子）中で投与できる。患者への投与のためのリポソームおよびミクロスフェアを調製する方法は、当業者に周知である。内容が参照により本明細書に組み入れられているＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，７８９，７３４は、生体物質をリポソームにカプセル化する方法について述べている。本質的に、該物質は水溶液に溶解され、適切なリン脂質および脂質を必要ならば界面活性剤と共に添加し、必要ならば該物質を透析または超音波処理する。既知の方法の概説は、Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４，”Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，”Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｐ．２８７〜３４１（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９７９）によって与えられる。
【０１７１】
ポリマーまたはタンパク質より形成されたミクロスフェアは当業者に周知であり、胃腸管を通じた血流への直接の通過のために適応させることができる。あるいは、化合物を包含させ、該ミクロスフェア、またはミクロスフェアの複合体を数日から数ヶ月の範囲の期間に渡る低速放出のために埋め込むことができる。たとえばその内容が参照により本明細書に組み入れられている、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．４，９０６，４７４、４，９２５，６７３および３，６２５，２１４、およびＪｅｉｎ，ＴＩＰＳ  １９：１５５−１５７（１９９８）を参照。
【０１７２】
１つの実施形態において、甲状腺ホルモンアナログまたはそのポリマー形態、およびアデノシン誘導体は、静脈内投与後に毛細管床にとどまるために適切なサイズに作成されたリポソームまたは微粒子内へ処方可能である。リポソームまたは微粒子が虚血組織を包囲する毛細血管床にとどまっているときに、該薬剤は最も有効でありうる部位に局所的に投与できる。たとえばその内容が参照により本明細書に組み入れられている、”“Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｔｉｓｓｕｅ”という題名の、ＢａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒへのＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５９３，６８８に開示されているように、虚血組織を標的化するための適切なリポソームは、一般に約２００ナノメータ未満であり、通例、単層ベシクルでもある。
【０１７３】
好ましい微粒子は、生分解性ポリマー、たとえばポリグリコリド、ポリ乳酸およびそのコポリマーから調製された微粒子である。当業者は、所望の薬物放出速度および所望の投薬量を含む各種の因子に依存して、適切な担体系をただちに決定できる。
【０１７４】
１つの実施形態において、製剤はカテーテルによって、血管内部に直接投与される。該投与はたとえばカテーテル内の穴を通じて行うことができる。活性化合物が比較的長い半減期（ほぼ１日〜１週間以上）を有する実施形態において、製剤をＨｕｂｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．へのＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，４１０，０１６に開示されているような生分解性ポリマーハイドロゲル中に含めることができる。これらのポリマーハイドロゲルは組織管腔の内側に送達可能であり、活性化合物はポリマーが分解するにつれ経時的に放出される。所望ならば該ポリマーハイドロゲルは、活性化合物がその中に分散された微粒子またはリポソームを有することができ、活性化合物の制御放出のための別の機構を提供する。
【０１７５】
製剤は好都合に単位投薬形で提供することができ、製薬分野で周知の方法のいずれかによって調製できる。すべての方法は、活性化合物を、１つ以上の付属成分を構成する担体と結合させる工程を含む。一般に製剤は、活性化合物を液体担体または微粉化固体担体と均一および密接に結合させて、次に必要ならば生成物を所望の単位投薬形に成形することによって調製される。
【０１７６】
該調製物は場合により追加の成分、たとえば各種の生物活性物質、たとえば成長因子（ＴＧＦ−ベータ、塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ２）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子アルファおよびベータ（ＴＧＦアルファ、およびベータ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ならびに血管内皮成長因子／血管透過性因子（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ））、抗ウィルス剤、抗菌剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、鎮痛剤、血管形成剤、および細胞接着分子を含むことができる。
【０１７７】
上述の成分に加えて、製剤は製薬調剤物の分野で利用される１つ以上の任意の追加成分、たとえば希釈剤、緩衝剤、香味剤、バインダ、表面活性剤、増粘剤、潤滑剤、懸濁剤、保存料（抗酸化剤を含む）などをさらに含む。
【０１７８】
（製造および処置の方法）
単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子誘発剤と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログ、あるいは単独の、あるいは本発明の神経成長因子または他の神経形成因子受容体と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログのアゴニストは、利用される単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子、誘発剤またはアゴニストと組合された特定のポリマー性甲状腺ホルモンアナログと適合する任意の経路で投与できる。それゆえ必要に応じて、投与は経口、あるいは静脈内および腹腔内投与経路を含む非経口でありうる。加えて投与は、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子、誘発剤またはアゴニストと組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログの定期的なボーラス注射によるか、あるいは外部（たとえばたとえば静脈内バッグ）または内部（たとえば生分解性インプラント、または単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子生成細胞と組合されたインプラント型ポリマー性甲状腺アナログのコロニー）であるリザーバーからの静脈内または腹腔内投与によってより連続的に行える。
【０１７９】
本発明の治療剤（すなわち単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子、誘発剤と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログ、あるいは単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログ受容体のアゴニスト）は、個体に任意の適切な手段によって、直接（たとえば組織部位への注射、インプラントまたは局所投与などによって局所的に）または全身的に（たとえば非経口的または経口的に）に提供できる。薬剤が静脈内、皮下、分子内、眼科的、腹腔内、筋肉内、頬側、経直腸、経膣、眼窩内、脳内、頭蓋内、脊髄内、脳室内、くも膜下腔内、大槽内、嚢内、鼻腔内によって、またはエアゾール投与などによって非経口的に供給される場合、該好ましくは水性または生理的に適合する流体懸濁剤または液剤の一部を構成する。それゆえ単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子担体またはビヒクルと組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログは生理的に許容されるので、所望の薬剤の患者への送達に加え、その他の点では患者の電解質および／または体積バランスに悪影響を及ぼさない。それゆえ該薬剤の流体溶媒は、正常な生理食塩水（たとえば９．８５％水性ＮａＣｌ、０．１５Ｍ、ｐＨ７〜７．４）を含むことができる。
【０１８０】
ダイマーとポリマー性甲状腺ホルモンアナログプロドメインとの結合は、通例、対応する成熟形よりも生理的溶液により溶解しやすい、ポリマー性甲状腺ホルモンアナログのプロ形を生成する。
【０１８１】
非経口投与に有用な溶液は、たとえばＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．，ｅｄ．），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．，１９９０に述べられているように製薬分野で周知の方法のいずれかによって調製できる。本発明の治療剤の製剤はたとえばポリアルキレングリコール、たとえばポリエチレングリコール、植物起源の油、水素添加ナフタレンなどを含むことができる。直接投与用の製剤は特に、該薬剤を所望の部位への維持を補助するために、グリセロール、および高い粘度の他の組成物を含むことができる。たとえばヒアルロン酸、コラーゲン、トリカルシウムホスフェート、ポリ酪酸、ラクチド、ならびにグリコリドポリマーおよびラクチド／グリコリドコポリマーを含む生体適合性、好ましくは、生体吸収性ポリマーは生体内での薬剤の放出を制御するために有用な賦形剤である。このような薬剤のための他の潜在的に有用な非経口デリバリーシステムは、エチレンビニルアセテートコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、インプラント型輸液システム、およびリポソームを含む。吸入投与用の製剤は賦形剤として、たとえばラクトースを含有するか、または点鼻薬の形で、または鼻腔内に塗布するゲルとして投与するために、たとえばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココラートおよびデオキシコラートを含有する水溶液、あるいは油性溶液でありうる。非経口投与の製剤は、頬側投与用のグリココラート、直腸投与用のメトキシサリチラート、または経膣投与のｃｕｔｒｉｃ  ａｃｉｄも含むことができる。直腸投与用の坐剤は、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子、誘発剤またはアゴニストと組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログを非炎症性賦形剤、たとえばココアバターまたは室温にて固体であり、体温にて液体である他の組成物と混合することによっても調製できる。
【０１８２】
皮膚表面への局所投与用の製剤は、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子、誘発剤またはアゴニストと組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログを皮膚科学的に許容される担体、たとえばローション、クリーム、軟膏または石鹸と共に分散させることによって調製できる。特に有用なのは、塗布を局在化させ、除去を抑制するために、皮膚上にフィルムまたは層を形成できる担体である。内部組織表面への局所投与のために、該薬剤を液体組織接着剤または組織表面への吸着を向上させることが既知の他の物質中に分散させることができる。たとえばヒドロキシプロピルセルロースまたはフィブリノゲン／トロンビン溶液は、有利に使用できる。
【０１８３】
あるいは、組織コーティング溶液、たとえばペクチン含有製剤を使用できる。あるいは、本明細書で述べた薬剤は経口投与できる。大半のタンパク質は血流中に吸収可能となる前に哺乳類消化系で消化酵素および酸によってただちに分解されるため、治療薬としてのタンパク質の経口投与は一般に実施されない。しかしながら本明細書で述べた単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログは通例、酸安定性およびプロテアーゼ耐性である（たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，９６８，５９０を参照）。加えてＯＰ−１は乳腺抽出物、初乳および５７日乳にて確認されている。その上、乳腺抽出物から精製されたＯＰ−１は形態形成活性であり、血流中で検出される。摂取乳による母体投与は、ＴＧＦ−βスーパーファミリタンパク質の自然の投与経路でありうる。Ｌｅｔｔｅｒｉｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：１９３６−１９３８（１９９４）は、ＴＧＦ−βがマウス乳中に存在することと、放射性標識ＴＧＦ−βが授乳期若年者の胃腸粘膜によって吸収されることとを報告している。標識された摂取ＴＧＦ−βは、肺、心臓および肝臓を含む若年者の体組織で無傷の形で迅速に出現する。最後に、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合された溶解形ポリマー性甲状腺ホルモンアナログ、たとえば抗酸化剤または抗炎症剤を含む、または含まない、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合された成熟ポリマー性甲状腺ホルモンアナログ。これらの発見結果は、以下の実施例で開示されるものと同様に、経口および非経口投与が単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺アナログを含むＴＧＦ−βスーパーファミリタンパク質を個体に投与するための実行可能な手段であることを示す。加えて、本明細書で述べた単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたあるポリマー性甲状腺アナログの成熟形は通例、溶解性が乏しいが、乳（ならびに乳腺抽出物および初乳）中で単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子形と組合されたポリマー性甲状腺アナログは、おそらく成熟した形態形成活性形と発現された全長ポリペプチド配列のプロドメインの一部またはすべてとの結合によって  および／または１つ以上の乳成分との結合によってただちに溶解できる。したがって本明細書で提供される化合物も、試験管内または生体内でその溶解性を向上させることができる分子と結合させることができる。
【０１８４】
単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログがＣＮＳ障害の治療剤として使用される場合、別の問題：血中に存在する物質の選択した種類以外すべてを有効に遮断する脳毛細血管壁構造である、血液脳関門を克服し、脳へのそれらの通過を防止することに対処する必要がある。血液脳関門は、ポリマー性甲状腺ホルモンアナログの脳，への直接注入によって、あるいは嗅覚ニューロンによる取り込みおよび逆行性輸送に適切な製剤の鼻腔内投与または吸入によって、有効にバイパスできる。あるいは該ポリマー性甲状腺ホルモンアナログを修飾して、血液脳関門でのその輸送を向上させることができる。たとえば単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログ、あるいは単独の、神経成長因子または他の神経形成因子刺激剤と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログが最も成功している。あるいは本明細書で提供する単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子、誘発剤またはアゴニストと組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログは、当業者に既知である標準手段を使用して、誘導体化できるか、あるいはリン脂質部分または血液脳関門を介して能動的に輸送される物質にコンジュゲートできるたとえばＰａｒｄｒｉｄｇｅ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ７：３１４−３３０（１９８６）およびＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８０１，５７５を参照。
【０１８５】
本明細書で提供する化合物は、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子、誘発剤またはアゴニストと組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログを所望の組織に標的化できる分子と結合することもできる。たとえば所望の組織の細胞上の表面分子と特異的に相互作用する抗体、抗体断片、または他の結合タンパク質を使用できる。有用な標的化分子はたとえば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，０９１，５１３で開示された単鎖結合部位技術を使用して設計できる。標的化分子は、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子、誘発剤またはアゴニストと組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログと共有結合または非共有結合できる。
【０１８６】
当業者によって認識されるように、製剤組成物は、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子、誘発剤またはそのアゴニストと組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログの治療有効量を含有する。すなわちそれらは、損なわれた中枢または末梢神経系機能の検出可能な回復をその完全な回復を含めて刺激するのに十分な時間に渡って神経系組織に影響を及ぼす薬剤の適切な濃度を提供する量を含有する。当業者によって認識されるように、これらの濃度は選択した薬剤の生物学的効率、特定の薬剤、１つ以上の賦形剤との混合物を含むその製剤の化学的特徴（たとえば疎水性）、投与経路、および組織部位内に直接投与されるかどうか、またはそれが全身投与されるかどうかを含む想定された処置を含む、多数の因子によって変わるであろう。投与される好ましい投薬量はまた、疾患または損傷組織の状態、特定の哺乳類の全身健康状態などの変数によって変化しやすい。一般的な問題として、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺アナログ０．００００１〜１０００ｍｇの１回、毎日、隔週または毎週投薬量が抗酸化剤および／または抗炎症剤の存在下で十分であり、０．０００１〜１００ｍｇが好ましく、０．００１〜１０ｍｇがなおさらに好ましい。あるいは、０．０１〜１０００．ｍｕ．ｇ／ｋｇ体重の１回、毎日、隔週または毎週投薬量、さらに好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重が好都合に利用される。本有効用量は、または特定の状況下で要望通りに、または適切と見なされるように、１回用量または複数回（２回以上）の分割用量で投与できる。ボーラス注射または拡散性輸液製剤を使用できる。繰返しの、または頻繁な輸液を促進することが望ましい場合、半永久ステント（たとえば静脈内、腹腔内、大槽内または嚢内）の埋め込みが賢明である。
【０１８７】
本発明の単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子、誘発剤またはアゴニストと組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログはもちろん、単独で、または本明細書で述べた状態の処置で有益であることが既知の他の分子と組合せて投与できる。たとえば各種の周知の成長因子、ホルモン、酵素、治療組成物、抗生物質、または他の生物活性剤も、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログと共に投与できる。それゆえ各種の既知の成長因子、たとえばＮＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−α、およびＴＧＦ−βはもちろんのこと、酵素、酵素インヒビタ、抗酸化剤、抗炎症剤、フリーラジカル除去剤、抗生物質および／または化学誘引物質／化学走性因子も、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子製剤と組合された本ポリマー性甲状腺ホルモンアナログ中に含むことができる。
【０１８８】
（材料および方法）
試薬：すべての試薬は化学グレードであり、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（セントルイス、ミズーリ州）から、またはＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ブリッジポート、ニュージャージー州）を通じて購入した。コルチゾンアセテート、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびゼラチン溶液（ウシ皮膚による２％タイプＢ）はＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から購入した。受精鶏卵はＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＳＰＡＦＡＳ  Ａｖｉａｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＆  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（ノースフランクリン、コネチカット州）から購入した。Ｔ４、３，５，３’−トリヨード−Ｌ−チロニン（Ｔ３）、テトラヨードチロ酢酸（ｔｅｔｒａｃ）、Ｔ４−アガロース、６−Ｎ−プロピル−２−チオウラシル（ＰＴＵ）、ＲＧＤ含有ペプチド、およびＲＧＥ含有ペプチドはＳｉｇｍａから入手した；ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍよりＰＤ９８０５９；そしてＣＧＰ４１２５１は、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ（バーゼル、スイス）から寄贈された。ポリクローナル抗ＦＧＦ２およびモノクローナル抗β−アクチンはＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから、ヒト組換えＦＧＦ２およびＶＥＧＦはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。ホスホリル化ＥＲＫ１／２に対するポリクローナル抗体は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから、ヤギ抗ウサギＩｇＧはＤＡＫＯから入手した。αＶβ３に対する（ＳＣ７３  １２）およびα−チューブリン（Ｅ９）に対するモノクローナル抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（サンタクルス、カリフォルニア州）から購入した。正常マウスＩｇＧおよびＨＲＰ−コンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇは、Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ（カーペンテリア、カリフォルニア州）から購入した。αＶβ３（ＬＭ６０９）およびαＶβ５（Ｐ１Ｆ６）に対するモノクローナル抗体は、精製αＶβ３と同様にＣｈｅｍｉｃｏｎ（テメキュラ、カリフォルニア州）から購入した。  Ｌ−［１２５Ｉ］−Ｔ４（特異的活性、１２５０μＣｉ／μｇ）はＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ボストン、マサチューセッツ州）から入手した。
【０１８９】
血管形成の絨毛尿膜膜（ＣＡＭ）モデル：生体内新血管新生は、上述した方法によって調査した。９〜１２個の１０日齢ニワトリ胚をＳＰＡＦＡＳ（プレストン、コネチカット州）から入手して、３７℃、５５％相対湿度にてインキュベートした。皮下注射針を使用して気嚢を隠している殻に小穴を開け、第２の穴を卵の広い側面の、光によって確認された胚膜の血管部分の上に直接作成した。第１の穴での陰圧の印加によって、第２の穴の下に偽気嚢を作成して、ＣＡＭを殻より分離させた。約１．０ｃｍ２の窓を小型工作用砥石車（Ｄｒｅｍｅｌ、Ｅｍｅｒｓｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏ．の部門）によって、降下したＣＡＭの上の殻へ切込んで、下にあるＣＡＭへの直接接近を可能にした。ＦＧＦ２（１μｇ／ｍｌ）を標準血管形成誘発剤として使用して、１０日齢胚のＣＡＭに新しい血管分枝を誘発させた。Ｎｏ．１濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の滅菌ディスクを３ｍｇ／ｍｌコルチゾンアセテートおよび１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＴＵによって予備処置して、滅菌条件下で空気乾燥させた。甲状腺ホルモン、ホルモンアナログ、ＦＧＦ２または対照溶媒、およびインヒビタを次にディスクに塗布して、ディスクを乾燥させた。該ディスクを次にＰＢＳ中で懸濁させて、成長するＣＡＭの上に置いた。Ｔ４またはＦＧＦ２によって処置したフィルタを３日間のインキュベーションの初日に置き、ＦＧＦ２に対する抗体を指示したように選択サンプルに３０分後に追加した。２４時間後に、ＭＡＰＫカスケードインヒビタＰＤ９８０５９も濾紙ディスクによって、ＣＡＭに局所的に添加した。
【０１９０】
ＣＡＭ切片の顕微鏡解析：３７℃、５５％相対湿度での３日間のインキュベーションの後に、各フィルタディスク直下のＣＡＭ組織を対照および処置ＣＡＭサンプルから切除した。組織をＰＢＳによって３回洗浄して、３５ｍｍペトリ皿（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）において、ＳＶ６立体顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）下で倍率５０倍にて検査した。フィルタに露出させたＣＡＭ切片のデジタル画像は、３電荷結合素子カラービデオカメラシステム（東芝）を用いて収集し、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）によって解析した。各フィルタディスクの範囲に等しい円形領域に含有されていた血管分岐点の数をカウントした。各ＣＡＭ調製物につき１枚の画像を数えて、８〜１０個のＣＡＭ調製物からの発見結果を各処置条件（甲状腺ホルモンまたはアナログ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ２抗体、ＰＤ９８０５９）について解析した。加えて各実験を３回実施した。得られた血管形成インデックスは、サンプルの各セットにおける新しい分岐点の平均±ＳＥＭである。
【０１９１】
ＦＧＦ２アッセイ：ＥＣＶ３０４内皮細胞を、１０％ウシ胎児血清を添加したＭ１９９培地で培養した。ＥＣＶ３０４細胞（１０６細胞）を完全培地中の０．２％ゲルコーティング２４ウェルプレートで一晩プレーティングして、次に細胞を無血清培地で洗浄し、指示されたようにＴ４またはＴ３で処置した。７２時間後、上澄みを収集して、希釈せずに、ＥＬＩＳＡシステム（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＦＧＦに関するアッセイを実施した。
【０１９２】
ＭＡＰＫ活性化：ＥＣＶ３０４内皮細胞を、０．２５％ホルモン枯渇血清１３を含むＭ１９９培地で２日間培養した。次に細胞はＴ４（１０−７ｍｏｌ／Ｌ）によって１５分〜６時間に渡って処置した。追加実験では、細胞はＴ４またはＦＧＦ２によって、あるいはＰＤ９８０５９またはＣＧＰ４１２５１の存在下でＴ４によって処置した。核画分をすべてのサンプルから前に報告した本発明者らの方法によって調製し、タンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離して、ホスホリル化ＥＲＫ１／２に対する抗体による免疫ブロットのために膜に移した。核ホスホリル化ＥＲＫ１／２の出現は、これらのＭＡＰＫアイソフォームのＴ４による活性化を示している。
【０１９３】
逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応：１０ｃｍプレート内のコンフルエントＥＣＶ３０４細胞をＴ４（１０−７ｍｏｌ／Ｌ）によって６〜４８時間処置して、グアニジウムイソチオシアナート（Ｂｉｏｔｅｃｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して全ＲＮＡを抽出した。Ａｃｃｅｓｓ  ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＲＮＡ（１μｇ）に逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を受けさせた。全ＲＮＡが４８℃にて４５分間に渡ってｃＤＮＡに逆転写され、次に９４℃にて２分間変性させた。第２鎖合成およびＰＣＲ増幅は、９４℃での３０秒間の変性、６０℃にて６０秒間のアニーリング、６８℃にて１２０秒間の伸長を４０サイクルと、すべてのサイクルの完了後に６８℃にて７分間の最終伸長とを実施した。ＦＧＦ２のＰＣＲプライマは以下の通りである：ＦＧＦ２センス鎖５’−ＴＧＧＴＡＴＧＴＧＧＣＡＣＴＧＡＡＡＣＧ−３’（配列番号：１）、アンチセンス鎖５’−ＣＴＣＡＡＴＧＡＣＣＴＧＧＣＧＡＡＧＡＣ−３’（配列番号：２）；ＰＣＲ生成物の長さは７３４ｂｐであった。ＧＡＰＤＨのプライ間はセンス鎖５’−ＡＡＧＧＴＣＡＴＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧＡＡＣＧ−３’（配列番号：３）、およびアンチセンス鎖５’−ＧＧＧＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＴＣＡＧＡ−３’（配列番号：４）を含んでいた；ＰＣＲ生成物の長さは２１８ｂｐであった。ＲＴ−ＰＣＲの生成物を１．５％アガロースゲルでの電気泳動によって分離して、エチジウムブロミドによって描出した。ゲルの標的バンドをＬａｂＩｍａｇｅソフトウェア（Ｋａｐｅｌａｎ）を使用して定量して、［ＦＧＦ２／ＧＡＰＤＨ］Ｘ１０の値を各時点について計算した。
【０１９４】
統計解析：統計解析を、実験を各対照群と比較する一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって実施し、統計的有意性をＰ＜０．０５に基づいて計算した。
【０１９５】
マウスにおけるマトリゲルＦＧＦ２または癌細胞系インプラントでの生体内血管形成：生体内マウス血管形成モデル：マウスマトリゲルモデルは、上述の方法（Ｇｒａｎｔら、１９９１；Ｏｋａｄａら、１９９５）に従って、本発明者らの実験室で実施した通りに行った（Ｐｏｗｅｌら、２０００）。間欠には、成長因子を含まないマトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ベッドフォード、マサチューセッツ州）を４℃にて一晩解凍して、氷の上に置く。マトリゲルの分割量を低温プロピレン管内に入れて、ＦＧＦ２、甲状腺ホルモンアナログまたは癌細胞（１ｘ１０６細胞）をマトリゲルに添加する。マトリゲルを生理的食塩水、ＦＧＦ２、甲状腺ホルモンアナログまたは癌細胞と共に、マウスの腹側正中に皮下注射する。第１４日にマウスを殺処分して、固化したゲルを切除して、新しい血管の存在について分析する。化合物Ａ〜Ｄを各種の用量で皮下注射する。対照および実験ゲルインプラントを細胞溶解溶液０．５ｍｌ（Ｓｉｇｍａ，セントルイス、ミズーリ州）を含有する遠心分離管に入れ、乳棒で粉砕する。次に管を４℃にて一晩インキュベートして、翌日１，５００ｘｇで１５分間遠心分離にかける。各サンプルの細胞溶解液の分割量２００μｌをＤｒａｂｋｉｎの試薬溶液（Ｓｉｇｍａ，セントルイス、ミズーリ州）１．３ｍｌに添加する。該溶液を分光光度計で５４０ｎｍにて分析する。光の吸収は、サンプル中に含有されているヘモグロビンの量に比例する。
【０１９６】
腫瘍成長および転移−腫瘍インプラントのニワトリ絨毛尿膜膜（ＣＡＭ）モデル：プロトコルは以前に説明されている（Ｋｉｍら、２００１）。簡潔には、腫瘍細胞１ｘ１０７個を各ＣＡＭ（７日齢胚）の表面に置いて、１週間インキュベートする。得られた腫瘍を切除して、５０ｍｇの断片に切断する。これらの断片をグループ当たり追加の１０個のＣＡＭに載せて、翌日、ＰＢＳに溶解させた化合物（Ａ〜Ｄ）２５μｌによって局所的に処置する。７日後、次に腫瘍を卵から切除して、ＣＡＭごとに腫瘍重量を決定する。図８は、ＣＡＭの生体内腫瘍成長モデルに関与する工程を示す概略図である。
【０１９７】
癌細胞系の腫瘍成長速度、腫瘍血管形成、および腫瘍転移に対するＴＥＴＲＡＣ、ＴＲＩＡＣ、および甲状腺ホルモンアンタゴニストの効果を決定できる。
【０１９８】
腫瘍成長および転移−マウスにおける腫瘍異種移植モデル：モデルは、参照によりその全体がそれぞれ本明細書に組み入れられている、Ｋｅｒｒら、２０００；Ｖａｎ  Ｗａｅｓら、２０００；Ａｌｉら、２００１；およびＡｌｉら、２００１による本発明者らの公報で述べた通りである。各種の用量での各種の腫瘍タイプに対する、ＴＥＴＲＡＣ、ＴＲＩＡＣ、および他の甲状腺ホルモンアンタゴニストの抗癌有効性を決定および比較できる。
【０１９９】
腫瘍成長および転移−転移の実験モデル：モデルは、本発明者らの最近の公報で述べた通りである（参照によりその全体がそれぞれ本明細書に組み入れられている、Ｍｏｕｓａ，２００２；Ａｍｉｒｋｈｏｓｒａｖｉら、２００３ａおよび２００３ｂ）。簡潔には、Ｂ１６マウス悪性メラノーマ細胞（ＡＴＣＣ，ロックビル、メリーランド州）および他の癌系を、１０％ウシ胎児血清、ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ，セントルイス、ミズーリ州）を添加したＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールスバッド、カリフォルニア州）で培養する。細胞を７０％コンフルエントまで培養し、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）によって収集して、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄する。実験転移のために、細胞をどちらかの２．０ｘ１０５細胞／ｍｌの濃度のＰＢＳ中で再懸濁させる。動物：本試験では、体重１８〜２１グラムのＣ５７／ＢＬ６マウス（Ｈａｒｌａｎ，インディアナポリス、インディアナ州）に使用されるであろう。すべての手順は、ＩＡＣＵＣおよび施設指針に従う。各種の用量での各種の腫瘍タイプに対する、ＴＥＴＲＡＣ、ＴＲＩＡＣ、および他の甲状腺ホルモンアンタゴニストの抗癌有効性を決定および比較できる。
【０２００】
（血管形成に対する甲状腺ホルモンアナログの効果）
Ｔ４は、ＣＡＭモデルの血管形成インデックスの著しい上昇（基底を超えた倍上昇）を誘発した。０．００１〜１．０μＭでのＴ３または０．１〜１．０μＭのＴ４は、ＦＧＦ２  １μｇによる血管形成インデックスの２〜３倍の上昇と比較して、血管形成インデックスの２〜２．５倍の上昇を生じる最大効果を達成した（表１ならびに図１ａおよび１ｂ）。血管形成を助長するＴ４の効果（血管形成インデックスの２〜２．５倍の上昇）は、ＰＴＵの存在または非存在下で達成され、これはＴ４からＴ３への変換を阻害する。９１〜１００ｎＭ）のＴ３自体は、ＣＡＭモデルで強力な血管形成誘発効果を誘発した。Ｔ４アガロースは、Ｔ４によって達成されたのと同様の血管形成誘発効果を生じた。Ｔ４またはＴ４−アガロースのどちらかの血管形成誘発効果は、ＴＥＴＲＡＣまたはＴＲＩＡＣによって１００％遮断された。
【０２０１】
（Ｔ４の亜最大濃度によるＦＧＦ２の血管形成誘発活性の向上）
亜最大濃度のＴ４およびＦＧＦ２の組合せは、ＦＧＦ２またはＴ４のどちらかの最大血管形成誘発効果と同じレベルまでの、血管形成インデックスの付加的上昇を生じた（図２）。
【０２０２】
ＣＡＭモデルにおけるＴ４およびＦＧｆ２の血管形成誘発作用に対するＭＡＰＫカスケードインヒビタの効果。Ｔ４またはＦＧＦ２のどちらかの血管形成誘発効果は、０．８〜８μｇのＰＤ９８０５９によって完全に遮断された（図３）。
【０２０３】
ＣＡＭモデルにおけるＴ４およびＦＧｆ２の血管形成誘発作用に対する特異性インテグリンαＶβ３アンタゴニストの効果。Ｔ４またはＦＧＦ２ｎどちらかの血管形成誘発効果は、１０μｇの特異性モノクローナル抗体ＬＭ６０９によって完全に遮断された（図４ａおよび４ｂ）。
【０２０４】
ＣＡＭアッセイは、多種多様の成長因子および血管形成の他のプロモータまたはインヒビタの血管形成活性を検証するために使用されてきた。本研究では、Ｔ４は生理的濃度でＦＧＦ２のそれに匹敵する活性で血管形成誘発性であることが示されている。ＰＴＵの存在はＴ４の効果を低下させず、本モデルではＴ３を生成するためのＴ４の脱ヨウ素化が前提条件でなかったことを示している。本モデルでの新しい血管成長の出現は数日を要するので、本発明者らは甲状腺ホルモンの効果が甲状腺ホルモン（ＴＲ）の核受容体の相互作用に完全に依存すると仮定した。ＴＲのその天然リガンドＴ３による核内錯化を必要とするヨードチロニンの作用は定義により、ゲノム的であり、遺伝子発現において頂点に達する。他方、ＴＲの天然リガンドであるＴ３よりもむしろＴ４に対する、本モデルの優先的反応は、血管形成が原形質膜にてＴ４により非ゲノム的に開始され、遺伝子転写を必要とする効果が頂点に達するという可能性を上昇させる。Ｔ４の非ゲノム作用は幅広く説明されており、通常は原形質膜にて開始され、シグナル伝達経路によって仲介される。それらはヨードチロニンおよびＴＲの核内リガンド結合を必要としないが、遺伝子転写と相互作用できるか、または遺伝子転写を調節できる。ステロイドの非ゲノム作用も十分に述べられており、ステロイドの、または他の化合物のゲノム作用と相互作用することが既知である。Ｔ４およびｔｅｔｒａｃによって、またはアガロース−Ｔ４によって実施した実験は、Ｔ４の血管形成誘発効果が実際に原形質膜にて非常に起こりやすいことを示した。本発明者らは別の箇所で、ｔｅｔｒａｃがＴ４の膜開始効果を遮断するが、それ自体はシグナル伝達を活性化しないことを示している。それゆえそれは甲状腺ホルモンの非ゲノム作用のプローブである。アガロース−Ｔ４細胞内部に入り込むとは考えられないが、本発明者らや他者によってホルモンの考えられる細胞表面開始作用のモデルを調査するために使用されている。
【０２０５】
これらの結果は、甲状腺ホルモンによるＭＡＰＫの活性化の別の結果が新しい血管成長であることを示唆している。後者は非ゲノム的に開始されるが、もちろん結果的な複合遺伝子転写プログラムを必要とする。
【０２０６】
甲状腺ホルモンの周囲濃度は比較的安定である。ＣＡＭモデルは本発明者らが試験した時点で甲状腺欠損であり、それゆえ無傷の生物を再生しないシステムとして見なすことができる。本発明者らは、Ｔ４の循環レベルが多種多様の他のレギュレータと共に、内因性血管形成剤、たとえばＶＥＧＦおよびＦＧＦ２に対する脈管の感受性を調節するように作用することを提唱する。
【０２０７】
（三次元血管形成アッセイ）
フィブリンでコーティングしたマイクロキャリアビーズ上で培養したヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）の試験管内三次元萌出血管形成：コンフルエントＨＤＭＥＣ（継代５〜１０）は、ゼラチンでコーティングしたＣｙｔｏｄｅｘ−３ビーズとビーズ当たり細胞４０個の比で混合した。細胞およびビーズ（２４ウェルプレートでウェル当たりビーズ１５０〜２００個）をＥＢＭ＋１５％正常ヒト血清５ｍｌで懸濁させて、最初の４時間は１時間ごとに静かに混合し、次にＣＯ２インキュベータで一晩培養した。翌日、新しいＥＢＭ＋５％  ＨＳ  １０ｍｌを添加して、混合物をさらに３時間培養した。実験前にＥＣビーズ培養物を点検した；次にＰＢＳ  ５００ｕｌを２４ウェルプレートに添加して、ＥＣビーズ培養物溶液１００ｕｌをＰＢＳに添加した。ビーズの数をカウントして、ＥＣ／ビーズの濃度を計算した。
【０２０８】
血管形成因子または試験因子を含む、または含まないＥＢＭ培地中のフィブリノゲン溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を調製した。正の対照には、５０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ＋２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２を使用した。ＥＣビーズをＥＢＭ培地で２回洗浄して、ＥＣビーズをフィブリノゲン溶液に添加した。実験を各条件について３通り実施した。ＥＣビーズフィブリノゲン溶液と静かに混合して、ヒトトロンビン２．５ｕｌ（０．０５Ｕ／ｕｌ）をフィブリノゲン溶液１ｍｌに添加した；３００ｕｌを２４ウェルプレートの各ウェルにただちに移した。フィブリノゲン溶液は５〜１０分後に重合する；２０分後、本発明者らはＥＢＭ＋２０％正常ヒト血清＋１０ｕｇ／ｍｌアプロチニンを添加した。該プレートをＣＯ２インキュベータでインキュベートした。ＨＤＭＥＣがフィブリンゲルに浸潤して、チューブを形成するのに約２４〜４８時間かかる。
【０２０９】
ウシフィブリンゲル内でのウシ肺動脈内皮細胞血管形成挙動を調査するために以前に設計されたマイクロキャリア試験管内血管形成アッセイ［Ｎｅｈｌｓ  ａｎｄ  Ｄｒｅｎｃｋｈａｈｎ，１９９５ａ，ｂ］を三次元ＥＣＭ環境でのヒト微小血管内皮細胞血管形成の研究のために改良した（図１および２）。簡潔には、前述のように単離したヒトフィブリノゲン［Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ，１９９９］をＭ１９９培地に１ｍｇ／ｍｌ（ｐＨ７．４）の濃度で溶解させて、０．２２マイクロフィルタで濾過することによって滅菌した。５ｘＭ１９９培地および蒸留水中で滅菌Ｖｉｔｒｏｇｅｎ  １００を混合することによって、等張１．５ｍｇ／ｍｌコラーゲン溶液を調製した。ｐＨを１Ｎ  ＮａＯＨによって７．４に調整した。ある実験では、成長因子およびＥＣＭタンパク質（たとえばＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、血清、ゼラチン、およびフィブロネクチン）をフィブリノゲンまたはコラーゲン溶液に添加した。次にＥＣビーズ約５００個を１ｍｇ／ｍｌフィブリノゲンまたは１．５ｍｇ／ｍｌコラーゲン溶液に添加した。続いてＥＣビーズ−コラーゲンまたはＥＣビーズ−フィブリノゲン懸濁物（ＥＣビーズ５００個／ｍｌ）を２４ウェルプレートに３００ｕｌ／ウェルでプレーティングした。ＥＣビーズ−コラーゲン培養物を３７℃にてインキュベートしてゲルを形成させた。ＥＣビーズ−フィブリノゲン培養物のゲル化は、最終濃度０．５Ｕ／ｍｌでのトロンビンの添加後、室温にて５分以内に発生した。ゲル化後、新しいアッセイ培地１ｍｌ（ＨＤＭＥＣには２０％正常ヒト血清を添加したＥＢＭ、または１０％ウシ胎児血清を添加したＥＢＭ）を各ウェルに添加した。血管形成反応を視覚的に監視して、ビデオ画像キャプチャによって記録した。特に毛細血管萌出形成を観察して、Ｎｉｋｏｎ  ＮＰ−２サーモスタットおよびＳｈｅｌｄｏｎ＃２００４二酸化炭素フローミキサを備えたインキュベータハウジングを装備した、Ｎｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ−ＴＭＤ倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｃ．；メルビル、ニューヨーク州）によって記録した。顕微鏡をＭａｃｉｎｔｏｓｈ  Ｇ３コンピュータに接続されたＤａｇｅ−ＭＴＩ  ＣＣＤ−７２ＳビデオカメラおよびＳｏｎｙ  １２”ＰＶＭ−１２２ビデオモニタで構成されるビデオシステムに直接インタフェースした。Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して、画像を各種の倍率で取り込んだ。萌出血管形成に対する血管形成剤の効果を、毛細血管萌出のあるＥＣビーズの数およびパーセントを決定することにより、視覚的に定量した。実験条件ごとに３通りのウェルそれぞれにおいてビーズ１００個（５〜６ランダム低倍率視野）をカウントした。すべての実験は少なくとも３回反復した。
【０２１０】
（細胞培養）
甲状腺ホルモンに対する核受容体のないアフリカミドリザル線維芽細胞系ＣＶ−１（ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア州）を、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを添加してＤＭＥＭ中に５０００細胞／ｃｍ２でプレーティングして、維持した。培養試薬はすべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カールスバッド、カリフォルニア州）から購入した。培養物を５％  ＣＯ２を含む３７℃の加湿チャンバ内で維持した。該培地を３日おきに交換して、細胞系を８０％コンフルエントで継代した。実験処置では、細胞を１０ｃｍ細胞培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，コーニング、ニューヨーク州）にプレーティングして、１０％  ＦＢＳ含有培地中で２４時間成長させた。次に該細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回すすいで、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびＨＥＰＥＳを添加した無血清ＤＭＥＭを供給した。無血清培地での４８時間のインキュベーションの後、細胞をビヒクル対照（０．４％ポリエチレングリコール［ｖ／ｖ］を含む０．００４Ｎ  ＫＯＨの最終濃度）またはＴ４（１０−７Ｍ最終濃度）によって３０分間処置した；次に培地を収集して、遊離Ｔ４レベルを酵素免疫アッセイによって決定した。１０−７Ｍ  全Ｔ４でインキュベートした培養物は、１０−９〜１０−１０Ｍ遊離Ｔ４を有する。処置後、細胞を収集して、前述したように核タンパク質を調製した。
【０２１１】
（ｓｉＲＮＡによる一過性形質移入）
ＣＶ−１細胞を１０ｃｍ皿にプレーティングして（細胞１５０，０００個／皿）、１０％  ＦＢＳを添加したＤＭＥＭで２４時間インキュベートした。細胞をＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ａｍｂｉｏｎ，オースチン、テキサス州）ですすぎ、メーカーの指示に従ってｓｉＰＯＲＴ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、αＶ、β３、またはαＶおよびβ３の両方に対してｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ最終濃度）を形質移入した。ＣＶ−１細胞の追加セットはスクランブルｓｉＲＮＡで形質移入して、負の対照として役立てた。形質移入の４時間後、１０％  ＦＢＳ含有培地７ｍｌを皿に添加して、培養物を一晩インキュベートさせた。次に細胞をＰＢＳによってすすぎ、Ｔ４による処置の前に無血清ＤＭＥＭ中に４８時間入れた。
【０２１２】
（ＲＮＡ単離およびＲＴ−ＰＣＲ）
形質移入の７２時間後にＱｉａｇｅｎ（バレンシア、カリフォルニア州）によるＲＮｅａｓｙキットをメーカーの説明書に従って使用して、全ＲＮＡを細胞培養物から抽出した。全ＲＮＡ  ２００ナノグラムを、Ａｃｃｅｓｓ  ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ，マディソン、ウィスコンシン州）をメーカーの指示に従って使用して逆転写した。プライマは公開された種特異性配列に基づいていた：αＶ（アクセション番号ＮＭ−００２２１０）Ｆ−５’−ＴＧＧＧＡＴＴＧＴＧＧＡＡＧＧＡＧおよびＲ−５’−ＡＡＡＴＣＣＣＴＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＴ（３１９ｂｐ生成物）、β３（ＮＭ０００２１２）Ｆ−５’−ＧＴＧＴＧＡＧＴＧＣＴＣＡＧＡＧＧＡＧおよびＲ−５’−ＣＴＧＡＣＴＣＡＡＴＣＴＣＧＴＣＡＣＧＧ（５１５ｂｐ生成物）、およびＧＡＰＤＨ（ＡＦ２６１０８５）Ｆ−５’−ＧＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＡＣＣＴＧＡＣＣＴおよびＲ−５’−ＴＧＡＧＣＴＴＧＡＣＭＧＴＧＧＴＣＧ（２１２ｂｐ生成物）。ＲＴ−ＰＣＲはＦｌｅｘｉｇｅｎｅサーマルサイクラーｅｏｍ  ＴＥＣＨＮＥ（バーリントン、ニュージャージー州）で実施した。９５℃での２分間のインキュベーションの後、以下の工程を２５サイクル実施した：９４℃で１分間の変性、５７℃で１分間のアニーリング、６８℃で１分間の伸長の２５サイクル。ＰＣＲ生成物をエチジウムブロミドで染色した１．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲルに描出した。
【０２１３】
（ウェスタンブロッティング）
核タンパク質の分割量（１０μｇ／レーン）をＬａｃｍｍｌｉサンプル緩衝液と混合して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％分離ゲル）によって分離してから、次にニトロセルロース膜に移した。１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）中の５％無脂肪乳によって３０分間遮断した後、膜をホスホリル化ｐ４４／４２  ＭＡＰキナーゼに対するモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ビバリー、マサチューセッツ州）の、５％乳を含むＴＢＳＴ中の１：１０００希釈物で４℃にて一晩インキュベートした。ＴＢＳＴ中での３ｘ１０分間の洗浄後、５％乳を含むＴＢＳＴ中のＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（カーペンテリア、カリフォルニア州）によるＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇ（１：１０００希釈物）で、膜を室温にて１時間インキュベートした。膜をＴＢＳＴ中で３ｘ５分間洗浄して、免疫反応性タンパク質を化学発光（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって検出した。バンド強度はＶｅｒｓａＤｏｃ  ５０００撮像システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ハーキュリーズ、カリフォルニア州）を使用して決定した。
【０２１４】
（放射性リガンド結合アッセイ）
精製αＶβ３  ２μｇを試験化合物の指示濃度と混合して、室温にて３０分間インキュベートした。次に［１２５Ｉ］−Ｔ４（２μＣｉ）を添加して、混合物を２０℃にてさらに３０分間インキュベートした。サンプルをサンプル緩衝液（５０％グリセロール、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、およびブロモフェノールブルー）と混合して、５％塩基性未変性ゲルに４５ｍＡにて２４時間に渡って冷所で流した。装置を分解して、ゲルを濾紙上に置いて、プラスチック製ラップに包んで、フィルムに露出させた。バンド強度は、ＶｅｒｓａＤｏｃ  ５０００撮像システムを使用して決定した。
【０２１５】
（ニワトリ絨毛尿膜膜（ＣＡＭ）アッセイ（αＶβ３試験））
１０日齢ニワトリ胚をＳＰＡＦＡＳ（プレストン、コネチカット州）から購入して、３７℃、５５％相対湿度でインキュベートした。皮下注射針を使用して卵の太いほうの端に小穴を開け、第２の穴を卵の広い側面の、光によって確認された胚膜の血管部分の上に直接作成した。第１の穴に弱い吸引力を印加して、気嚢を移動させて、ＣＡＭを殻より降下させた。Ｄｒｅｍｅｌモデル工作用ドリル（Ｄｒｅｍｅｌ、ラシーン、ウィスコンシン州）を使用して、約１．０ｃｍ２の窓を偽気嚢の上の殻に切込み、ＣＡＭに接近できるようにした。Ｎｏ．１濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ  クリフトン、ニュージャージー州）の滅菌ディスクを３ｍｇ／ｍｌコルチゾンアセテートおよび１ｍｍｏｌ／Ｌプロピルチオウラシルによって予備処置して、滅菌条件下で空気乾燥させた。甲状腺ホルモン、対照溶媒、およびｍＡｂ  ＬＭ６０９をディスクに塗布して、続いて乾燥させた。該ディスクを次にＰＢＳ中で懸濁させて、成長するＣＡＭの上に置いた。３日間のインキュベーションの後、フィルタディスクの下のＣＡＭを切開して、ＰＢＳですすいだ。各膜を３５ｍｍペトリ皿に置いて、ＳＶ６立体顕微鏡下で倍率５０倍にて検査した。デジタル画像を取り込んで、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａｃｙｂｅｍｅｔｉｃｓ）で解析した。フィルタディスクに等しい円形領域に含有されていた血管分岐点の数を数えた。各処置条件について８〜１０個のＣＡＭ調製物それぞれから１枚の画像をカウントして、加えて、各実験を３回実施した。
【０２１６】
本発明を以下の非制限的な実施例でさらに説明する。
【実施例】
【０２１７】
（実施例１）
血管形成に対する甲状腺ホルモンの効果：図１Ａに示し、図１Ｂにまとめたように、Ｌ−Ｔ４およびＬ−Ｔ３はどちらもＣＡＭアッセイで血管形成を向上させた。Ｔ４は０．１μｍｏｌ／Ｌの培地における生理学的全濃度にて、血管分岐形成を２．５倍（Ｐ＜０．００１）上昇させた。Ｔ３（１ｎｍｏｌ／Ｌ）も血管形成を２倍刺激した。細胞５’−モノ脱ヨウ素酵素によるＴ４のＴ３への変換のためにＴ４のみ有効であるという可能性は、脱ヨウ素酵素インヒビタＰＴＵがＴ４によって生成された血管形成に対して阻害効果を持たないという発見結果によって除外された。ＰＴＵはＣＡＭモデルで使用したすべての濾紙ディスクに塗布した。それゆえＴ４およびＴ３は、成長因子のアッセイで以前に標準化されたＣＡＭモデルにおいて新しい血管分岐形成を助長する。
【０２１８】
（実施例２）
Ｔ４−アガロースおよびＴｅｔｒａｃの効果：本発明者らは以前に、Ｔ４−アガロースが原形質膜にて開始された細胞シグナル伝達経路をＴ４と同じ方式で刺激することと、Ｔ４およびＴ４−アガロースの作用が、Ｔ４の原形質膜への結合を阻害することが既知である脱アミノ化ヨードチロニンアナログ、ｔｅｔｒａｃによって遮断されることとを示した。ＣＡＭモデルでは、ｔｅｔｒａｃ（０．１μｍｏｌ／Ｌ）の添加はＴ４の作用を阻害するが（図２Ａ）、ｔｅｔｒａｃ単独では血管形成に対して効果を持たない（図２Ｃ）。０．１μｍｏｌ／Ｌのホルモン濃度で添加されたＴ４−アガロースの作用は、ＣＡＭモデルでのＴ４の作用に匹敵しており（図２Ｂ）、Ｔ４−アガロースの効果は、ｔｅｔｒａｃの作用によっても阻害される（図２Ｂ；２Ｃにまとめる）。
【０２１９】
（実施例３）
Ｔ４の亜最大濃度によるＦＧＦ２の血管形成誘発活性の向上：血管形成は、通常、ポリペプチド成長因子の関与を必要とする複雑なプロセスである。ＣＡＭアッセイは、血管成長が明白になるのに少なくとも４８時間を必要とする；それゆえこのモデルにおける甲状腺ホルモンの明らかな原形質膜効果は、ホルモンに対する複雑な転写反応を引き起こしやすい。したがって本発明者らは、ＦＧＦ２がホルモン反応に関与するかどうか、そして該ホルモンがこの成長因子の亜生理学的レベルの効果を増強できるかどうかを判定した。Ｔ４（０．０５μｍｏｌ／Ｌ）およびＦＧＦ２（０．５μｇ／ｍＬ）は個別に血管形成を中程度まで刺激した（図３）。ＦＧＦ２のこの亜最大濃度の血管形成効果は、Ｔ４の亜生理学的濃度によって、１．０μｇ  ＦＧＦ２単独によって引き起こされるレベルまで向上した。それゆえ亜最大ホルモンおよび成長因子濃度の効果は付加的であると思われる。血管形成の甲状腺ホルモン刺激におけるＦＧＦ２の役割をさらに精密に定義するために、ＦＧＦ２に対するポリクローナル抗体をＦＧＦ２またはＴ４のどちらかで処置したフィルタに添加して、７２時間後に血管形成を測定した。図４は、ＦＧＦ２抗体が外因性ＦＧＦ２の非存在下でＦＧＦ２またはＴ４のどちらかによって刺激された血管形成を阻害することを証明し、ＣＡＭアッセイでのＴ４効果がＦＧＦ２発現の上昇によって仲介されることを示唆している。対照ＩｇＧ抗体は、ＣＡＭアッセイで刺激または阻害効果を持たない。
【０２２０】
（実施例４）
甲状腺ホルモンによる、内皮細胞からのＦＧＦ２放出の刺激：ＦＧＦ２のレベルは、Ｔ４（０．１μｍｏｌ／Ｌ）またはＴ３（０．０１μｍｏｌ／Ｌ）のどちらかで処置したＥＣＶ３０４内皮細胞の培地中で３日間測定した。表２に見られるように、Ｔ３は培地中でＦＧＦ２濃度を３．６倍刺激し、これに対してＴ４は１．４倍の増加を引き起こした。この発見結果は、甲状腺ホルモンは、少なくとも一部は、内皮細胞に利用可能な成長因子の濃度を上昇させることによって、ＦＧＦ２の血管形成効果を向上させることを示している。
【０２２１】
【表２】
2008513461.tif 000003
＊Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡによってＴ３処置サンプルを対照サンプルと比較；
†Ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡによってＴ４処置サンプルを対照サンプルと比較。
【０２２２】
（実施例５）
甲状腺ホルモンおよびＦＧＦ２による血管形成の刺激におけるＥＲＫ１／２シグナル伝達経路の役割：Ｔ４が非ゲノム効果を細胞に及ぼす経路は、ＭＡＰＫシグナル伝達カスケード、特にＥＲＫ１／２活性化のそれである。本発明者らはＴ４が上皮成長因子によってＥＲＫ１／２活性化を上昇させることを知っている。ＦＧＦ２発現の甲状腺ホルモンによる刺激におけるＭＡＰＫ経路の役割は、チロシン−トレオニンキナーゼＭＡＰＫキナーゼ−１（ＭＥＫ１）およびＭＥＫ２によるＥＲＫ１／２活性化のインヒビタであるＰＤ９８０５９（２〜２０μｍｏｌ／Ｌ）の使用によって検査した。表のデータは、ＰＤ９８０５９がＴ４またはＴ３のどちらかで処置したＥＣＶ３０４内皮細胞からのＦＧＦ２放出の増加を効果的に遮断したことを証明している。ＣＡＭアッセイでＥＲＫ１／２阻害の並行試験を実施し、代表的な結果を図５に示す。Ｔ３およびＴ４の組合せはそれぞれ生理学的濃度で、３μｍｏｌ／Ｌ  ＰＤ９８０５９によって完全に遮断された効果である、血管分岐において２．４倍の増加を生じた（図５Ａ）。分岐形成のＦＧＦ２刺激（２．２倍）も、ＥＲＫ１／２の活性化のこのインヒビタによって効果的に遮断された（図５Ｂ）。それゆえ甲状腺ホルモンの血管形成誘発効果は、原形質膜にて開始し、内皮細胞からのＦＧＦ２放出を助長するＥＲＫ１／２経路の活性化を含む。ＥＲＫ１／２活性化は、ＦＧＦ２シグナルを伝達して、新しい血管形成を引き起こすために再度必要とされる。
【０２２３】
（実施例６）
ＭＡＰＫ活性化に対する甲状腺ホルモンおよびＦＧＦ２の作用
ＥＲＫ１／２  ＭＡＰＫのホスホリル化および核移行の刺激を、Ｔ４（１０−７ｍｏｌ／Ｌ）で１５分〜６時間処置したＥＣＶ３０４細胞で試験した。細胞核におけるホスホリル化ＥＲＫ１／２の出現は、Ｔ４処置の１５分以内に発生して、３０分で最大レベルに達し、６時間後になお明らかであった（図６Ａ）。ホルモンのこの効果は、ＰＤ９８０５９（図６Ｂ）によって阻害され、このことはこの化合物がＭＡＰＫキナーゼによってＥＲＫ１／２のホスホリル化を遮断するために予想される結果である。本発明者らが他の細胞系でのＴ４で見たように、これまでのプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）−α、ＰＫＣ−β、およびＰＫＣ−γインヒビタＣＧＰ４１２５１も、これらの細胞でのＭＡＰＫ活性化に対するホルモンの効果を遮断した。甲状腺ホルモンは、複数のサイトカインおよび成長因子、たとえばインターフェロン−γ１３および上皮成長因子の作用を向上させる。ＥＣＶ３０４細胞では、Ｔ４は１５分間の同時インキュベーションでＦＧＦ２によって引き起こされたＭＡＰＫ活性化を向上させた（図６Ｃ）。ＥＣＶ３０４細胞で行った観察をＣＡＭモデルに適用して、本発明者らは、ホルモンが血管形成を誘発する複雑な機構が、ＦＧＦ２の内皮細胞放出および血管形成に対する放出されたＦＧＦ２の自己分泌効果の向上を含むことを提唱している。
【０２２４】
（実施例７）
甲状腺ホルモンで処置したＥＣＶ３０４細胞におけるＲＴ−ＰＣＲ：Ｔ４の血管形成誘発作用機構の研究において対処された最後の問題は、ホルモンがＦＧＦ２遺伝子発現を誘発できるかどうかであった。内皮細胞をＴ４（１０−７ｍｏｌ／Ｌ）で６〜４８時間処置して、ＦＧＦ２およびＧＡＰＤＨ  ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲベースの推定（ｃＤＮＡ測定から推測；図７）を実施した。ＧＡＰＤＨ含有量について補正したＦＧＦ２  ｃＤＮＡの存在量の増加は、ホルモン処置の６時間によって明らかであり、４８時間でさらに増強された。
【０２２５】
（実施例８Ａ）
マウスでの網膜新血管新生モデル（糖尿病および非糖尿病）：網膜新血管新生に対する試験物質の薬理活性を評価するために、授乳期マウスを高酸素環境に７日間暴露して、回復させ、それによって網膜上での新しい血管の形成を刺激した。試験物質を評価して、網膜新血管新生が抑制されるかどうかを評価する。網膜は、ヘマトキシリン−エオシン染色によって、そして新血管新生を示す少なくとも１つの染色（通常セレクチン染色）によって検査する。他の染色（たとえばＰＣＮＡ、ＰＡＳ、ＧＦＡＰ、血管形成のマーカーなど）を使用できる。モデルのまとめは次のとおりである：
動物モデル
・授乳期マウス（Ｐ７）およびその母親を過剰酸素添加環境（７０〜８０％）に７日間置く。
・Ｐ１２では、マウスを酸素添加環境から取り出して、正常な環境に置く。
・マウスを５〜７日間回復させる。
・次にマウスを殺処分して、眼を収集する。
・眼を必要に応じて凍結または固定する。
・眼を適切な組織化学染色によって染色する。
・眼を適切な免疫組織化学染色によって染色する。
・血液、血清、または他の組織を収集できる。
・眼を特に微小血管の変化に関して、ありとあらゆる発見結果について検査する。新生血管成長を半定量的に評価する。画像解析も利用できる。
【０２２６】
（実施例８Ｂ）
甲状腺ホルモンおよび糖尿病網膜症
Ｊ  ｄｅ  Ｉａ  Ｃｒｕｚら、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２８０：４５４−４５９，１９９７に開示されたプロトコルをストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発実験糖尿病および糖尿病網膜症を有するラットへのＴｅｔｒａｃの投与に使用する。終点は、増殖性網膜症（血管形成）の出現の、Ｔｅｔｒａｃによる阻害である。
【０２２７】
（実施例９Ａ）
甲状腺ホルモンおよびアナログの新規医薬ポリマー製剤を使用する創傷治癒および止血処置
本発明は、固定化甲状腺ホルモンアナログ、好ましくはＴ４アナログ、塩化カルシウム、およびコラーゲンを含む新規の創傷治癒および止血処置も含む。この新規製剤は、静脈および動脈出血の両方を著しく制御して、出血時間を短縮し、フィブリン／血小板血栓を生成して、血小板由来創傷治癒因子を低レベルのコラーゲンの存在下で持続的な方法で放出し、安全である。そのような創傷治癒および止血包帯法の開発は、戦争負傷者治療での短期および長期使用とって非常に貴重でありうる。コラーゲンおよび塩化カルシウムを含有するハイドロゲルまたは包帯中の固定化Ｌ−チロキシン（Ｔ４）および粒状六糖類の製薬調剤物を最適化できる。ハイドロゲルまたは包帯のこの新規の創傷治癒および止血（ＷＨ製剤）処置は、微生物の添加を含むことができる。
【０２２８】
ポリマーにコンジュゲートされた、またはアガロースに固定化されたＬ−チロキシンは、細胞内シグナル伝達イベントの活性化につながる接着細胞表面受容体（インテグリンαＶβ３）の活性化を通じて、血管形成の強力な刺激を示し、これが次に各種の成長因子生成のアップレギュレーションにつながる。加えて固定化Ｔ４は、上皮、線維芽細胞、およびケラチノサイト細胞遊走を誘発する。Ｔ３または他のアナログではなく、固定化Ｔ４は、コラーゲン誘発血小板凝集および分泌を向上させて、このことは被験体自体の血小板血栓の形成を助長する。さらに固定化Ｔ４は、感染と戦うために重要である白血球遊走も助長する。それゆえ固定化Ｔ４は、損傷した血管を再生するために使用される化合物をさらに生成するのを補助でき、創傷部位でフリーラジカルを生成する白血球の量を増加させた。フリーラジカルは、創傷から潜在的に病原性の細菌を除去するのを助ける。
【０２２９】
それゆえＴ３、ＤＩＰＴＡ、またはＧＣ−１ではなく、Ｔ４またはＴ４−アガロース（１０〜１００ｎＭ）は、血小板凝集および分泌（脱顆粒）を増強するのに有効である。したがってＴ４（またはアナログおよびそのポリマーコンジュゲーション、たとえばＴ４−アガロース）は、１０ｍＭ塩化カルシウムと組合せて、またはコラーゲンを含んで、または含まないで、創傷治癒に好ましい。図２３Ａ〜Ｅを参照。
【０２３０】
（トロンボエラストグラフィー）
トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）は、１９４８年、Ｈａｒｔｅｒｔによる開発以来、各種の病院環境で使用されてきた。ＴＥＧの原理は、血餅の物理粘弾性特徴の測定に基づいている。血餅形成は、３７℃にて、表面間に１ｍｍの隙間がある振動プラスチック製円筒キュベット（「カップ」）および同軸吊下げされた静止ピストン（「ピン」）内でコンピュータ化トロンボエラストグラフ（ＴＥＧ  Ｍｏｄｅｌ  ３０００，Ｈａｅｍｏｓｃｏｐｅ，スコーキー、イリノイ州）を使用して監視した。カップは４．５秒ごとにどちらかの方向に振動して、１秒のサイクル内静止期間があり；０．１Ｈｚの周波数および１秒当たり０．１の最大剪断率を生じた。ピンは、トルク変換器として作用するねじりワイヤによって吊下げられる。血餅形成によって、フィブリンフィブリルはカップをピンに物理的に結合して、血餅の粘弾性によって影響されるカップの回転（ピンに伝達される）はＩＢＭ互換パーソナルコンピュータおよびカスタマイズソフトウェア（Ｈａｅｍｏｓｃｏｐｅ  Ｃｏｒｐ．，スコーキー、イリノイ州）を使用してオンラインで表示される。ピンが受けたトルク（カップの振動に対して）を時間の関数としてプロットする。
【０２３１】
ＴＥＧは、各種のパラメータ、たとえば血餅の初期開始の潜時（Ｒ）、約２０ｍｍ振幅の固定血餅固さの開始までの時間（ｋ）、角度によって測定されるような血餅発達の動力学（α）、血餅の最大振幅（ＭＡ）を測定することによって凝固を評価する。パラメータＡは、ＭＡの任意の点における追跡の幅を測定する。ｍｍの振幅Ａは、血餅の強度または弾性の関数である。ＴＥＧ追跡の振幅は、血餅の剛性の尺度である；血餅によって得られたピーク強度または剪断弾性率、Ｇは血餅剛性の関数であり、ＴＥＧ追跡の最大振幅（ＭＡ）から計算できる。
【０２３２】
以下のパラメータは、ＴＥＧ追跡から測定した：
・Ｒ、反応時間（ゲル化時間）は、３次元フィブリンゲル網目の確立前の潜伏期を表す（約２ｍｍ振幅の測定可能な剛性）。
・最大振幅（ＭＡ、ｍｍ）は、血餅によって現れたピーク剛性である。
・剪断弾性率または血餅強度（Ｇ、ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２）は：
Ｇ＝（５０００Ａ）／（１００−Ａ）
によって定義される。
【０２３３】
血餅は血管傷害の部位で剪断応力に耐えねばならないので、血餅固さは、生体内血栓形成および止血にとって重要なパラメータである。ＴＥＧは、血餅形成および収縮に関与する各種の因子（凝固活性化、トロンビン生成、フィブリン形成、血小板活性化、血小板−フィブリン相互作用、およびフィブリン重合）に対する各種の薬理学的介入の有効性を評価できる。ヒト全血においてコンピュータ化ＴＥＧによって測定されたエンドトキシン（０．６３ｕｇ）、Ｘａ（０．２５ｎＭ）、トロンビン（０．３ｍＵ）、およびＴＦ（２５ｎｇ）の、各種の血餅パラメータに対する効果を表３に示す。
【０２３４】
血液サンプリング：
Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｂｅａｕｍｏｎｔ  ＨｏｓｐｉｔａｌのＨｕｍａｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたプロトコルの下で、同意したボランティアから採血した。２注射器方法を使用して、サンプルを２１ゲージ翼状針によって採取し、最初に血液３ｍｌを廃棄した。全血（ＷＢ）を、１：９（ｖ／ｖ）のクエン酸と全血の比が維持されるように３．８％クエン酸三ナトリウムを含有する、シリコーン処置Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ管（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ラザフォード、ニュージャージー州に収集した。血液収集の３時間以内にＴＥＧを実施した。カルシウムを１〜２．５ｍＭで再び添加して、各種の刺激の添加を続けた。塩化カルシウム自体は使用した濃度で、血餅形成および血餅強度の最小の効果のみを示した。
【０２３５】
血餅形成は、フィブリノゲンからのＦｉｂｒｉｎｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ａのトロンビン誘発開裂によって開始される。得られたフィブリンモノマーは自発的に重合して、フィブリン線維の三次元網目の形成につながる、線形伸長、分岐、および側方結合を受けるフィブリル鎖を形成する。網目構造の独自の特性は、それらが変形剪断応力に対抗できる剛性弾性固体として挙動することである。変形に対するこの耐性は、弾性率−血餅強度のインデックスによって測定できる。血餅形成開始までの時間のみに基づく従来の凝固試験（プロトロンビン時間および部分トロンボプラスチン時間など）とは異なり、ＴＥＧは、血餅によって得られた最大強度の測定を可能にする定量的情報の取得を可能にする。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体を介して、血小板はフィブリン（フィブリノゲン）を結合して、血餅の粘弾性特性を調節する。本発明者らの結果は、ＴＦ−ＴＥＧの血餅強度が明らかに血小板濃度の関数であり、血小板が血餅強度を剪断下で８倍上昇させたことを示した。各種の血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト（クラスＩ対クラスＩＩ）は、剪断下でのＴＦ−ＴＥＧを使用して血小板−フィブリン仲介血餅強度を抑制する明確な有効性を持って挙動した。
【０２３６】
（統計解析）
データは、平均±ＳＥＭとして表される。データは、適用できる場合、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定またはＡＮＯＶＡを使用して対または群解析のどちらかで解析した；差は、Ｐ＜０．０５で有意と見なした。
【０２３７】
【表３】
2008513461.tif 000004
データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝４、＊Ｐ＜０．０１を表す。
【０２３８】
インピーダンスを使用する全血における血小板凝集および脱顆粒：
本試験では、Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによるＭｏｄｅｌ  ５６０全血血小板凝集計および関連Ａｇｇｒｏ−Ｌｉｎｋソフトウェアを使用した。２個の電極を希釈血液に入れ、電気インパルスを一方から他方へ送る。血小板が電極の周囲で凝集するので、Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇは、電気信号のインピーダンスを抵抗７のオームで測定する。
【０２３９】
（血液サンプリング）
全血を１７〜２１歳の健康なドナーから、３．８％緩衝クエン酸ナトリウムを含む４．５ミリリットルＶａｃｕｔａｉｎｅｒバイアル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ラザフォード、ニュージャージー州）内に毎日採取した。血液をロッカーの上に保持して、血小板の寿命を延長させて、実験を瀉血の５時間以内に実施した。
手順：対照として、全血５００マイクロリットル、０．９％生理食塩水５００マイクロリットル、および磁気撹拌棒をキュベット内へ混合して、５分間に渡って３７℃まで加熱した。閾値下凝集は１〜２μｇ／ｍｌコラーゲン５マイクロリットルによって誘発され、これは血小板凝集計が６〜７分間測定した。Ｔ４、Ｔ４−アガロース対Ｔ３および他の甲状腺ホルモンアナログのコラーゲン誘発凝集および分泌に対する効果を試験した。Ｉｎｇｅｒｍａｎ−Ｗｏｊｅｎｓｋｉ  Ｃ，Ｓｍｉｔｈ  ＪＢ，Ｓｉｌｖｅｒ  ＭＪ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｒｙ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｏｐｔｉｃａｌ  ａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｒｙ，ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＴＰ，ａｎｄ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ．Ｊ  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ．１９８３  Ｊａｎ；１０１（１）：４４−５２．
（細胞遊走アッセイ）
ヒト顆粒球をＭｏｕｓａ  ｅｔ  ａｌ．の方法によって流血から単離して、細胞遊走アッセイを前述のように実施した（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９（３）：１７９−１８７，１９９７，およびＭｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  ＣｅＩｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９（３）：１８９−１９５，１９９７）。簡潔には、８μＭ孔径を備えたニューロプローブ９６ウェル使い捨て走化性チャンバを使用する。このチャンバは、ケモカイン、サイトカインまたは細胞外マトリクスタンパク質の勾配に対する細胞遊走の定量化を可能にする。細胞懸濁物（２ｘ１０６の４５μｌ）をフラバノイドまたは甲状腺ホルモン誘導体などの試験薬剤５μｌを含有するポリプロピレンプレートに添加して、２２℃にて１０分間インキュベートする。ＩＬ８（０．１〜１００ｎｇ）Ｔ３／Ｔ４（３３μｌ）を用いて、または用いずに０．００１〜０．１μＭにて使い捨て走化性チャンバの下部ウェルに添加して、次に予備組み立てフィルタを使用してチャンバを組み立てた。細胞／試験薬剤懸濁物２５μｌを上部フィルタウェルに添加して、次に加湿細胞培養インキュベータで一晩インキュベートした（３７℃、５％  ＣＯ２にて２２時間）。一晩のインキュベーションの後、非遊走細胞および過剰な培地を１２チャネルピペットおよび細胞スクレーパを使用して静かに除去する。次にフィルタをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄して、ＰＢＳ緩衝液中の１％ホルムアルデヒドで固定した。遊走細胞の膜は、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（０．２％）を浸透させて、次にＰＢＳで２〜３回洗浄する。遊走細胞のアクチンフィラメントは、ローダミンファロイジン（１２．８ＩＵ／ｍｌ）によって３０分間（２２℃）染色する。ローダミンファロイジンは毎週新しく作り、３日間まで再使用して、貯蔵するときには４℃にて光を避ける。走化性はＣｙｔｏｆｌｕｏｒ  ＩＩマイクロフィルタ蛍光計（５３０励起／５９０放出）を使用して蛍光検出によって定量的に検出する。すべての細胞処置と、次の洗浄は、独自に設計された処置／洗浄ステーションを使用して実施する（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９（３）：１７９−１８７，１９９７）。この技法は、細胞遊走の正確な定量を可能にして、最小限のアッセイ間およびアッセイ内変動での再現可能な結果を提供する。
【０２４０】
（細胞遊走アッセイ）
これらのアッセイは、孔径８μＭのＮｅｕｒｏｐｒｏｂｅ  ９６ウェル使い捨て走化性チャンバを使用して実施した。このチャンバは、ビトロネクチンまたはオステオポンチンのどちらかに対する細胞遊走の定量を可能にする。培養した細胞は、ＥＤＴＡ／トリプシン（０．０１％／０．０２５％）を使用する標準化方法の後に除去した。除去後、細胞を２回洗浄して、ＥＢＭ（内皮細胞基本培地、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）中で再懸濁させた（２ｘ１０６／ｍｌ）。ビトロネクチンまたはオステオポンチン（３３μｌ）のどちらかを０．０１２５〜１００μｇ／ｍｌにて使い捨て走化性チャンバにてを使い捨て走化性チャンバの下部ウェルに添加して、次に予備組み立てフィルタを使用して組み立てた。細胞懸濁物（４５μｌ）を各種の濃度の試験薬剤５μｌを含有するポリプロピレンプレートに添加して、２２℃にて１０分間インキュベートした。細胞／試験薬剤懸濁物２５μｌを上部フィルタウェルに添加して、次に加湿細胞培養インキュベータで一晩インキュベートした（３７℃にて２２時間）。一晩のインキュベーションの後、非遊走細胞および過剰な培地を１２チャネルピペットおよび細胞スクレーパを使用して静かに除去する。次にフィルタをＰＢＳ（Ｃａ＋２またはＭｇ＋２なし）で２回洗浄して、１％ホルムアルデヒドで固定した。遊走細胞の膜は、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（０．２％）を浸透させて、次にＰＢＳで２〜３回洗浄した。遊走細胞のアクチンフィラメントは、ローダミンファロイジン（１２．８ＩＵ／ｍｌ）によって３０分間（２２℃）染色した。ローダミンファロイジンは毎週新しく作り、３日間まで再使用して、貯蔵するときには４℃にて光を避けた。走化性はＣｙｔｏｆｌｕｏｒ  ＩＩマイクロフィルタ蛍光計（５３０励起／５９０放出）を使用して蛍光検出によって定量的に検出した。すべての細胞処置と、次の洗浄は、独自に設計された処置／洗浄ステーションを使用して実施した。このステーションは、それぞれ３０ｍｌ容積容量を備えた６個の独立した試薬ユニットで構成されていた。独立したユニットに以下の試薬のうち１つを充填した：ＰＢＳ、ホルムアルデヒド、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、またはローダミン−ファロイジン。この技法を使用して、フィルタを適切な溶液に静かに浸漬し、それゆえ遊走細胞の損失を最小限に抑えた。この技法は、細胞遊走の正確な定量を可能にして、最小限のアッセイ間およびアッセイ内変動での再現可能な結果を提供した（１、２）。
【０２４１】
【化１】
2008513461.tif 000005
ＬＣ＝下部チャンバ、ＵＣ＝上部チャンバ
ＬＭ６０９およびＳＭ２５６などの他の強力および特異性のａｖｂ３アンタゴニストを用いて、同様のデータを得た。
【０２４２】
（実施例９Ｂ）
試験管内ヒト上皮および線維芽細胞創傷治癒：試験管内２次元創傷治癒方法は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている、Ｍｏｈａｍｅｄ  Ｓ，Ｎａｄｉｊｃｋａ  Ｄ，Ｈａｎｓｏｎ，Ｖ．Ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃｉｍｅｔｉｄｉｎｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｄｒｕｇ  Ｉｎｔｅｌｌ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍ  ２０：９７３−９７５；１９８６に述べられている。加えて、本発明者らの研究所ですでに確立された３次元創傷治癒方法を本試験で使用する（以下を参照）。データは、甲状腺ホルモンによる創傷治癒の強力な刺激を示す。
【０２４３】
（ヒト皮膚線維芽細胞の試験管内３Ｄ創傷治癒アッセイ）
工程１：収縮コラーゲンゲルを調製する：
１）２４ウェルプレートを２％  ＢＳＡ  ３５０ｕｌによって室温にて２時間コーティングする。
２）８０％コンフルエントＮＨＤＦ（正常ヒト皮膚線維芽細胞細胞、継代５〜９）をトリプシン処置して、成長培地で中和し、遠心分離にかけて、ＰＢＳで１回洗浄する。
３）コラーゲン細胞混合物を調製し、氷上で静かに常時混合する：
原液                                            終濃度
５×ＤＭＥＣ                                    １×ＤＭＥＭ
３ｍｇ／ｍｌウィルス遺伝子                      ２ｍｇ／ｍｌ
ｄｄＨ２Ｏ                                      最適
ＮＨＤＦ                                        ２×１０〜５細胞／ｍｌ
ＦＢＳ                                          １％
４）２４ウェルプレートから２％  ＢＳＡを吸引し、コラーゲン−細胞混合物３５０ｕｌ／ウェルを添加して、３７℃のＣＯ２インキュベータ内でプレートをインキュベートする。
５）１時間後、ＤＭＥＭ＋５％  ＦＢＳ培地  ０．５ｍｌ／ウェルを添加して、１０ｕｌチップを使用する。
各ウェルの縁からコラーゲンゲルを取り外し、２日間インキュベートする。線維芽細胞がコラーゲンゲルを収縮させる。
【０２４４】
工程２：３Ｄフィブリン創傷血餅を調製し、創傷コラーゲン培養物を埋め込む
１）試験試薬を用いて、または用いずにフィブリノゲン溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を調製する。エッペンドルフ管内で、各ウェルにフィブリノゲン溶液３５０ｕｌ。
原液                                            終濃度
５×ＤＭＥＣ                                    １×ＤＭＥＭ
フィブリノゲン                                  １ｍｇ／ｍｌ
ｄｄＨ２Ｏ                                      最適
試験試薬                                        最適濃度
ＦＢＳ                                          １％または５％
２）各収縮コラーゲンゲルを中間からはさみで切り出す。ゲルをＰＢＳで洗浄して、２４ウェルプレートの各ウェルの中央にゲルを移す。
３）ヒトトロンビン（０．２５Ｕ／ｕｌ）１．５ｕｌを各管に添加して、ウェルを混合して、溶液をコラーゲンゲルの周囲に添加すると、溶液は１０分後に重合する。２０分後に、試験薬剤と共に、または試験薬剤なしでＤＭＥＭ＋１％（または５％）ＦＢＳを４５０ｕｌ／ウェルで添加して、プレートを３７℃のＣＯ２インキュベータ内で最大５日間インキュベートする。毎日写真を撮影する。
【０２４５】
（糖尿病ラットの生体内創傷治癒）
糖尿病ラットの急性切開創傷モデルを使用して、甲状腺ホルモンアナログおよびそのコンジュゲート形の効果を試験する。創傷閉止の速度、破壊強度解析および組織学は、第３〜２１日に定期的に実施する。
【０２４６】
（方法）
試験では動物（マウスおよびラット）に小型の穿刺創傷を２箇所与える−ＷＨを創傷の一方に塗布して、他方は対照として生理食塩水溶液で被覆した。そうでなければ創傷を放置され自然に治癒する。
【０２４７】
該動物を創傷の５日後に安楽死させる。皮膚の小規模な面積−１〜１．５ミリメートルを処置および未処置創傷の縁から切除する。
創傷閉止および創傷閉止までの時間を決定する。加えて、創傷の肉芽組織にて結合組織を構築するのを補助するタンパク質であるテネイシンのレベルが決定される。肉芽組織（すなわち創傷治癒、新規毛細血管および結合組織として通常形成される粗い、ピンク色がかった組織）の品質も決定される。
【０２４８】
（材料および方法）
慢性肉芽創を当分野で周知の方法によって作成した。体重３００〜３５０グラムのオスＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを使用前に本発明者らの施設で馴化させる。腹腔内ネンブタール麻酔（３５ｍｇ／ｋｇ）下で、ラット背側を剪毛および脱毛する。動物を別々のケージに入れて、食餌および水を自由に与える。すべての実験は、ニューヨーク州アルバニーのＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ａｆｆａｉｒｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＣｅｎｔｅｒのＡｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ指針に従って実施した。
【０２４９】
ヒト慢性肉芽創と比較したこの創傷の組織学的特徴付けは、以前に実施されていた。次にラット６４匹を８つの処置群に分ける（ｎ＝８／群）。動物をビヒクル（ビヒクル対照）の局所塗布によって第５、９、１２、１５、および１８日に処置する。ビヒクル対照は、Ｌ−チロキシンのコンジュゲーションで使用されるアガロース（群１）またはポリマー形態（群２）のどちらかが可能である。創傷は、第５、９、１２、１５、および１８日に局所的に塗布される粒状六糖類１０μｇ、コラーゲン１０μｇ、および１０ｎＭ塩化カルシウムの存在下で、Ｔ４−アガロース（群３〜５）またはＴ４−ポリマー（群６〜８）によって１、１０、１００μｇ／ｃｍ２にて処置する。すべての創傷は露出したまま放置した。４８時間おきに創傷の輪郭をアセテートシートに透写可能であり、面積の計算はコンピュータ処置デジタル面積測定を使用して実施できる。
【０２５０】
次に肉芽組織の全長横片３枚を第１９日に頭側端、中間、および尾側端から収集して、１０パーセント緩衝ホルマリン中で固定する。横切片（５μｍ）を各試料から取り、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。肉芽組織の厚さは、接眼ミクロメータを低倍率で用いて概算できる。高倍率視野は、肉芽組織の表面炎症層のすぐ下を検査する。肉芽組織の各片から隣接する５個の高倍率視野を撮影およびコードできる。次にこれらの撮影の拡大プリントを盲検方式での組織測定分析に使用する。線維芽細胞、「円形」細胞（マクロファージ、リンパ球、および好中球）、および毛細血管をカウントする。加えて、各切片の細胞性を１（細胞数減少）〜５（高度に細胞性）のスケールの細胞性として等級付ける
（統計解析）
連続面積測定値を時間に対してプロットした。各動物のデータにＧｏｍｐｅｒｔｚ式を当てはめる（代表的なｒ２＝０．８５）。この曲線を使用して、創傷半減期を概算できる。群間の比較は、生命表解析およびＷｉｌｃｏｘｏｎ順位検定を使用して実施する。これらの統計解析は、ＳＡＳ（ＳＡＳ／ＳＴＡＴ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ケアリー、ノースカロライナ州、１９８７、ｐ１０２８）およびＢＭＤＰ（ＢＭＤＰ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｍａｎｕａｌ，ロサンゼルス、ＢＭＤＰ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．１９８８）パッケージを使用してパーソナルコンピュータで実施する。
【０２５１】
各種の処置群の細胞カウントをプールして、一元配置分散分析を使用して実施した。群間の差の事後解析は、Ｔｕｋｅｙの検定（すべて対多重比較検定）を使用して実施でき、ｐ＜０．０５は有意と見なされる。Ｓｉｇｍａ  Ｓｔａｔ統計ソフトウェア（Ｊａｎｄｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，コートマデラ、カリフォルニア州）がデータ解析に使用されるであろう。
【０２５２】
（実施例１０）
心筋梗塞のげっ歯類モデル：心筋梗塞の冠動脈結紮モデルを使用して、ラットの心機能を調査する。ラットを最初にキシラジンおよびケタミンによって麻酔をかけ、適切な麻酔が得られた後に、気管に挿管して、陽圧換気を開始する。該動物を仰臥位で置き、その四肢を緩くテープ止めして、胸骨正中切開を実施する。心臓を静かに外に取り出し、６−Ｏ縫合糸を左前下行枝冠動脈の周囲で固く縛る。心臓を素早く胸内に戻し、開胸切開を３−Ｏ巾着縫合と、それに続く結節縫合または外科用クリップを用いた皮膚閉止によって閉じる。動物を温度制御加熱パッド上に置き、回復中に綿密に観察する。必要ならば酸素補給および心肺蘇生術を与える。回復後、ラットを動物ケア施設に戻す。ラットのそのような冠動脈結紮は、大規模な前壁心筋梗塞を生じる。この処置の４８時間死亡率は、５０％の高さにもなり、本処置によって生じた梗塞のサイズに変動がある。これらの考慮事項および以前の経験に基づいて、以下で述べる甲状腺ホルモン送達の２つのモデルを比較できるように、大規模な梗塞を持つ１６〜２０匹のラットを得るために、約４００匹のラットが必要である。
【０２５３】
これらの実験は、冠動脈結紮前または後の甲状腺ホルモンの全身投与が心エコー検査および血行動態計測によって評価される血行動態異常の程度、梗塞のサイズの縮小を含む、無傷の動物での有益な効果につながることを示すように設計されている。成果測定は梗塞の３週間後に計画される。一部のラットは梗塞を持たないか、または小規模な梗塞のみが生成されるが、これらのラットは、正常な心エコー図および正常な血行動態によって識別できる（左室拡張末期圧＜８ｍｍＨｇ）。
【０２５４】
（甲状腺ホルモン送達）
２つの送達手法がある。第１に甲状腺ホルモンは、梗塞心筋周囲に直接注射される。正常心筋と虚血心筋との間の境界は急性開胸閉塞の間に容易に識別されるので、この手法は血管形成効果を検出するために十分なホルモン送達を提供する。
【０２５５】
第１のモデルは冠動脈バイパス手術を受ける患者に有用であり、１回の局所注射が血管形成を誘発するという原理の証拠を構成するが、第２のモデルを使用するより幅広い手法も使用できる。第２のモデルでは、心筋梗塞を誘発させる前に、逆行性カテーテルを麻酔ラットの頚動脈を介して左室内に入れる。あるいは、大動脈弁のすぐ上で大動脈の直接針穿刺のを実施する。次に甲状腺ホルモンの冠内注射は、数秒間に渡る冠血管開始点のすぐ上で大動脈を突然閉塞させることにより、そして等容性収縮を生じさせることによって刺激される。次に大動脈収縮の直後に、甲状腺ホルモンを左室または大動脈に注入する。生じた等容性収縮は、冠血管で血液を下方に推進して、心筋全体に甲状腺ホルモンを潅流させる。この処置は、有効性を達成するために必要に応じて何回も実施できる。注射の回数は、使用用量および新しい血管の形成によって変わる。
【０２５６】
（心エコー検査）
無麻酔ラットで２−ＤおよびＭモード心エコー図を得る方法が開発されている。左室の寸法、機能、壁厚および壁運動は再現性および信頼性を持って測定できる。測定は、甲状腺ホルモン投与に関する偏見をなくすために、盲検方式で実施される。
【０２５７】
（血行動態）
血行動態計測を左室損傷の程度を判定するために使用する。ラットをイソフルランで麻酔する。右前頸部に沿った切開を通じて、右頚動脈および右頚静脈を単離して、圧力変換カテーテル（Ｍｉｌｌａｒ，ＳＰＲ−６１２，１．２Ｆｒ）をカニューレ挿入する。次に以下の測定を実施する：心拍数、収縮期および拡張期ＢＰ、平均動脈圧、左室収縮期および拡張末期圧、ならびに＋および−ｄＰ／ｄｔ。特に有用なのは、左室収縮末期圧の測定であり、その進行的上昇は心筋損傷の程度と相関している。
【０２５８】
（梗塞サイズ）
ＴＴＣ法を使用して梗塞サイズの測定のために、ラットを殺処分する。
【０２５９】
（形態計測）
微小血管密度［微小血管／ｍｍ２］を梗塞部位、梗塞周囲部位、および梗塞に対向する残りの心筋、通常後壁にて測定する。各ラットから、横に薄切りされた筋細胞により７〜１０個の顕微鏡高倍率視野［ｘ４００］をＩｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用してデジタル記録する。微小血管は盲検調査者がカウントする。微小循環は、小動脈と細静脈との間に組織を供給する、直径１５０マイクロメートル以下の三次小動脈を超える血管として定義される。左室肥大の差を補正するために、微小血管密度を体重について補正した左室重量で割る。偽手術ラットからの心筋は対照として作用する。
【０２６０】
（実施例１１）
Ｔ４またはＦＧＦ２の血管形成誘発効果に対するαＶβ３アンタゴニストの効果
αＶβ３インヒビタＬＭ６０９は１０マイクログラムで、ＣＡＭモデルにおけるＦＧＦ２またはＴ４誘発血管形成誘発効果をどちらも完全に阻害した（図１６）。
【０２６１】
（実施例１２）
癌関連の新血管成長の阻害
Ｊ．Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：２２１１−２２１５，  ２００２で開示されたプロトコルを、ヒト乳癌細胞のインプラントを移植されたＳＣＩＤマウス（ＭＣＦ−７）へのテトラヨードチロ酢酸（Ｔｅｔｒａｃ）の投与に使用する。Ｔｅｔｒａｃはマウスモデルの該ホルモンアナログの循環レベルを１０−６Ｍまで上昇させるために、飲用水中に供給する。終点は、埋め込んだ腫瘍周囲での血管形成に対するｔｅｔｒａｃの阻害作用である。
【０２６２】
（実施例１３）
試験管内三次元微小血管内皮萌出モデルにおけるＶＥＧＦおよびＦＧＦ２の閾値下レベルでの甲状腺ホルモンおよびそのアナログの血管形成誘発助長効果
Ｔ３、Ｔ４、Ｔ４−アガロース、または線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）のいずれかおよび血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、試験管内三次元微小血管内皮萌出モデルにおいて比較可能な血管形成誘発効果を生じた。甲状腺ホルモンアナログの血管形成誘発効果は、有糸分裂促進活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ；ＥＲＫ１／２）シグナル伝達カスケードのインヒビタである、ＰＤ９８０５９によって遮断された。加えて、特異性αＶβ３インテグリンアンタゴニスト（ＸＴ１９９）は、甲状腺ホルモンアナログまたはＴ４−アガロースのどちらかの血管形成誘発効果を阻害した。データは、甲状腺ホルモンアンタゴニストＴｅｔｒａｃが甲状腺アナログの血管形成誘発反応を阻害することも証明した。それゆえ試験されたこれらの甲状腺ホルモンアナログは、血管形成誘発性であり、その作用は原形質膜にて開始される作用であり、αＶβ３インテグリン受容体を含み、ＭＡＰＫ依存性である。
【０２６３】
本発明は、試験管内三次元微小血管内皮萌出モデルにおけるＶＥＧＦおよびＦＧＦ２の閾値下レベルでのＴ３、Ｔ４、またはＴ４−アガロースの血管形成誘発助長効果について説明する。本発明は、ホルモン効果が内皮細胞原形質膜にて開始され、αＶβ３インテグリンおよびＥＲＫ１／２シグナル伝達経路の活性化によって仲介されるという証拠も提供する。
【０２６４】
三次元萌出アッセイにおける低濃度のＶＥＧＦおよびＦＧＦ２の血管形成活性のＴ３、Ｔ４、またはＴ４−アガロースによる上昇が証明された。総ホルモン濃度が１０−７〜１０−８ＭのＴ３、Ｔ４のどちらか、または１０−７ＭのＴ４−アガロースは血管形成誘発活性で、この試験管内モデルにおけるＶＥＧＦおよびＦＧＦ２効果の最大濃度に匹敵した。ラット心臓での新しい血管成長が高用量のＴ４によって心筋肥大の誘発と同時に発生することが報告されているが、甲状腺ホルモンは血管形成因子と見なされてはいない。本例は、生理学的濃度のホルモンが心臓以外の環境で血管形成誘発性であることを確認している。
【０２６５】
Ｔ４−アガロースはＴ４の効果を再現し、甲状腺ホルモンのこの誘導体は、細胞内部に入り込まないと考えられている；それは本発明者らの研究所では、ヨードチロニンの考えられる細胞表面開始作用に関するホルモン作用のモデルを調査するために使用されている。さらにＴ４およびｔｅｔｒａｃを用いた実験も、このモデルでのＴ４の作用が原形質膜にて開始されるという結論を裏付けた。ＴｅｔｒａｃはＴ４の膜開始効果を遮断する。
【０２６６】
甲状腺ホルモンはＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）シグナル伝達経路を非ゲノム的に活性化するので、血管形成に対するホルモンの作用は、ＭＡＰＫ仲介できる。ＣＡＭモデルに添加されると、ＭＡＰＫカスケードのインヒビタであるＰＤ９８０５９は、Ｔ４の血管形成誘発作用を阻害した。この結果はＦＧＦ２生成のＴ４の効果の上流の甲状腺ホルモンシグナルの伝達に対する効果と一致するが、ＭＡＰＫ依存性機構を介しても作用することが既知である。Ｔ４およびＦＧＦ２は亜最大用量で使用されるときに、個別に内皮細胞におけるＥＲＫ１／２のホスホリル化および核移行を引き起こし、併用されてＥＲＫ１／２活性化をさらに向上させる。血管形成のホルモン刺激のＭＡＰＫ依存性成分のみが脈管成長に対するＦＧＦ２の作用に独占的に関連しているという可能性を調査するために、ＰＤ９８０５９の存在下でのＴ４に反応したＦＧＦ２の細胞放出を測定した。後者の薬剤は、成長因子濃度のホルモン誘発上昇を遮断し、ＭＡＰＫ活性化が、血管形成に対するＦＧＦ２の結果的な効果と同様に、内皮細胞からのＦＧＦ２放出に対するＴ４の作用に関与していることを示した。
【０２６７】
（血管形成に対する甲状腺ホルモンの効果）
Ｔ４、Ｔ３、またはＴ４−アガロースのいずれかは０．０１〜０．１μＭにて、血管形成の有意な（Ｐ＜０．０１）刺激を生じた（表４）。これはＦＧＦ２（５０ｎｇ／ｍｌ）プラスＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）の血管形成誘発有効性に匹敵することが示されている。
【０２６８】
（表４．三次元ヒト微小血管内皮萌出アッセイにおける成長因子、甲状腺ホルモン、およびアナログの試験管内血管形成誘発効果）
【０２６９】
【表４】
2008513461.tif 000006
データ（平均±ＳＤ）を３回の実験から得た。細胞は、閾値下レベルのＦＧＦ２（１．２５ｎｇ／ｍｌ）＋ＶＥＧＦ（２．５ｎｇ／ｍｌ）によって予備処置した。データは、対照での処置と比較して、ＡＮＯＶＡによる平均±ＳＤ、ｎ＝３、＊Ｐ＜０．０１を表す。
【０２７０】
（甲状腺血管形成誘発作用に対するＴｅｔｒａｃの効果）
Ｔ３は、原形質膜で開始された細胞シグナル伝達経路を刺激する。これらの血管形成誘発作用は、Ｔ４の原形質膜への結合を阻害することが既知である、脱アミノ化ヨードチロニンアナログ、ｔｅｔｒａｃによって遮断される。ｔｅｔｒａｃ（０．１μＭ）の添加は、Ｔ３、Ｔ４、またはＴ４−アガロースのいずれかの血管形成誘発作用を阻害する（表５〜７）。これは微小血管内皮細胞遊走の数および血管長の阻害によって示される（表５〜７）。
【０２７１】
（甲状腺ホルモンによる血管形成の刺激におけるＥＲＫ１／２シグナル伝達経路の役割）
三次元微小血管萌出アッセイでＥＲＫ１／２阻害の並列試験を実施した。甲状腺ホルモンおよびアナログは０．０１〜０．１μＭで、ＰＤ９８０５９によって有意に（Ｐ＜０．０１）遮断された効果である、管長および遊走細胞の数の著しい増大を引き起こした（表５〜７）。これは微小血管内皮細胞遊走の数および血管長の阻害によって示される（表５〜７）。
【０２７２】
（甲状腺ホルモンによる血管形成の刺激におけるインテグリンαＶβ３の役割）
閾値下レベルのＶＥＧＦおよびＦＧＦ２の存在下での、０．０１〜０．１μＭにおけるＴ３、Ｔ４、またはＴ４−アガロースのいずれかが仲介する血管形成誘発は、αＶβ３インテグリンアンタゴニストＸＴ１９９によって有意に（Ｐ＜０．０１）遮断された（表５〜７）。これは微小血管内皮細胞遊走の数および血管長の数の阻害によって示される（表５〜７）。
【０２７３】
それゆえ甲状腺ホルモンおよびそのアナログの血管形成誘発効果は、原形質膜αＶβ３インテグリンにて開始し、ＥＲＫ１／２の活性化を含む。
【０２７４】
（表５：三次元ヒト微小血管内皮萌出アッセイにおける甲状腺ホルモンＴ３の血管形成誘発機構）
【０２７５】
【表５】
2008513461.tif 000007
ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＤＭＶＣ）を使用した。細胞はＦＧＦ２（１．２５ｎｇ／ｍｌ）＋ＶＥＧＦ（２．５ｎｇ／ｍｌ）によって予備処置した。画像は第３日に４および１０Ｘで撮影した。データは平均±ＳＤ、ｎ＝３、＊Ｐ＜０．０１を表す。
【０２７６】
（表６：三次元ヒト微小血管内皮萌出アッセイにおける甲状腺ホルモンＴ４の血管形成誘発機構）
【０２７７】
【表６】
2008513461.tif 000008
ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＤＭＶＣ）を使用した。細胞はＦＧＦ２（１．２５ｎｇ／ｍｌ）＋ＶＥＧＦ（２．５ｎｇ／ｍｌ）によって予備処置した。画像は第３日に４および１０Ｘで撮影した。データは平均±ＳＤ、ｎ＝３、＊Ｐ＜０．０１を表す。
【０２７８】
（表７：三次元ヒト微小血管内皮萌出アッセイにおける甲状腺ホルモンＴ４−アガロースの血管形成誘発機構）
【０２７９】
【表７】
2008513461.tif 000009
ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＤＭＶＣ）を使用した。細胞はＦＧＦ２（１．２５ｎｇ／ｍｌ）＋ＶＥＧＦ（２．５ｎｇ／ｍｌ）によって予備処置した。画像は第３日に４および１０Ｘで撮影した。データは平均±ＳＤ、ｎ＝３、＊Ｐ＜０．０１を表す。
【０２８０】
（実施例１４）
血液脳関門でのポリマー性甲状腺アナログ輸送を評価するための試験管内モデル
単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合された、選択されたポリマー性甲状腺アナログがそれを用いて血液脳関門をおそらく通過する能力を評価する試験管内方法を以下に説明する。モデルおよびプロトコルの詳細な説明は、参照によりその開示が本明細書に組み入れられている、Ａｕｄｕｓら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ５０７：９−１８（１９８７）によって与えられている。
【０２８１】
簡潔には、微小血管内皮細胞、新しいウシ脳の大脳灰白質から単離する。脳は地元の屠殺場から入手し、抗生物質を含む氷冷最小必須培地（「ＭＥＭ」）中で研究所まで運搬する。滅菌条件下で標準解剖処置を使用して、大きな表面血管および髄膜を除去する。大脳灰白質は吸引によって除去し、次に約１ｍｍの立方体に刻む。次に刻んだ灰白質を０．５％ディスパーゼ（ＢＭＢ，インディアナポリス、インディアナ州）によって３７℃にて振とう水浴内で３時間インキュベートする。３時間の消化の後、混合物を遠心分離（１０００ｘｇで１０分間）によって濃縮して、次に１３％デキストラン中で再懸濁させて、５８００ｘｇにて１０分間遠心分離にかける。上澄み脂肪、細胞破片およびミエリンを廃棄して、粗微小血管ペレットを１ｍｇ／ｍｌコラーゲナーゼ／ディスパーゼに再懸濁させて、３７℃にて振とう水浴内で５時間インキュベートする。５時間の消化の後、微小血管懸濁物を予め確立された５０％  Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配に加えて、１０００ｘｇにて１０分間遠心分離にかける。精製内皮細胞を含有するバンド（勾配の上部から２番目のバンド）を除去して、培地（たとえば５０％  ＭＥＭ／５０％  Ｆ−１２栄養ミックス）で２回洗浄する。該細胞を後で使用するために、２０％  ＤＭＳＯおよび１０％ウマ血清を含有する培地中で凍結（−８０℃）させる。
【０２８２】
単離後、約５ｘ１０５細胞／ｃｍ２をラットコラーゲンおよびフィブロネクチンでコーティングした培養皿または５〜１２ｍｍ孔径ポリカーボネートフィルタにプレーティングする。細胞播種の１０〜１２日後、細胞単層を顕微鏡によってコンフルエントについて検査する。
【０２８３】
これらの細胞の形態学的、組織化学的および生化学的特性のキャラクタリゼーションは、これらの細胞が血液脳関門の顕著な特徴の多くを有することを示している。これらの特徴は：固堅な細胞内結合、膜開窓の欠如、低レベルの飲作用活性、ならびにガンマ−グルタミルトランスペプチダーゼ、アルカリホスファターゼ、および第ＶＩＩＩ因子抗原活性の存在を含む。
【０２８４】
培養した細胞は、極性結合または輸送のモデルが必要である広範囲に渡る実験に使用できる。細胞をマルチウェルプレートにプレーティングすることによって、大および小分子の両方の受容体および非受容体結合を実施できる。経内皮細胞流量測定を実施するために、細胞を多孔性ポリカーボネート膜フィルタ（たとえばＮｕｃｌｅｏｐｏｒｅより、プレザントン、カリフォルニア州）上で増殖させる。フィルタが分離流量の速度制限バリアとなる可能性を回避するために、大孔径フィルタ（５〜１２ｍｍ）を使用する。これらの大孔径フィルタの使用は、フィルタ下での細胞成長を許容せず、細胞単層の目視検査を可能にする。
【０２８５】
細胞がコンフルエントに達したら、それらを並列拡散セル装置（たとえばＣｒｏｗｎ  Ｇｌａｓｓより、サマービル、ニュージャージー州）に入れる。流量測定のために、拡散セルの供給チャンバに試験物質をパルス送出して、次にパルス後各種の時点で分析のために受容チャンバから分割量を取り出す。放射性または蛍光標識物質は、分子流量の信頼できる定量を可能にする。単層完全性は、非輸送性物質、たとえばスクロースまたはイヌリンの添加によって同時に測定し、統計的有意性を確保するために少なくとも４回の判定の反復を測定する。
【０２８６】
（実施例１５）
外傷性傷害モデル
流体打診（ｆｌｕｉｄ  ｐｅｒｃｕｓｓｉｏｎ）脳傷害モデルを使用して、単独の、あるいは神経成長因子または他の神経形成因子と組合されたポリマー性甲状腺ホルモンアナログが著しい外傷性脳傷害後に中枢神経系機能を回復する能力を評価した。
【０２８７】
Ｉ．流体打診（ｆｌｕｉｄ  ｐｅｒｃｕｓｓｉｏｎ）脳傷害処置
本試験で使用した動物は、体重２５０〜３００グラムのオスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）であった。流体打診（ｆｌｕｉｄ  ｐｅｒｃｕｓｓｉｏｎ）脳傷害の基本外科医準備は上述されている。参照により本明細書に組み入れられている、Ｄｉｅｔｒｉｃｈら、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．８７：２５０−２５８（１９９４）。簡潔には、ラットを３％ハロタン、３０％酸素、および残りの亜酸化窒素によって麻酔した。気管挿管を実施し、ラットを定位固定フレームに置いた。次に４．８ｍｍ開頭術を右頭頂葉皮質に重ねて、前頂の後方３．８ｍｍおよび正中の側方２．５ｍｍに実施した。傷害管を露出した硬膜上に置き、接着剤によって接合した。次に歯科用アクリルを傷害管の周囲に注ぎ、次に該傷害管をゲルフォームスポンジで塞いだ。頭皮を縫合で閉じて、動物を元のケースに戻して、一晩回復させた。
【０２８８】
翌日、流体打診（ｆｌｕｉｄ  ｐｅｒｃｕｓｓｉｏｎ）脳傷害を本質的にＤｉｘｏｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．６７：１１０−１１９（１９８７）およびＣｌｉｆｔｏｎら、Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．１１：１１４−１２１（１９９１）で述べられているように生成させた。流体打診（ｆｌｕｉｄ  ｐｅｒｃｕｓｓｉｏｎ）装置は、変換器ハウジングを装着した生理食塩水を充填したＰｌｅｘｉｇｌａｓシリンダと、ラットの頭蓋に適した傷害ネジで構成されていた。金属製ネジを挿管された麻酔ラット（７０％亜酸化窒素、１．５％ハロタン、および３０％酸素）のプラスチック製傷害管に確実に連結して、ピストンを打つ振り子の下降によって傷害を誘発させた。ラットには１．６〜１．９ａｔｍの軽度〜中程度の頭部傷害を受けさせた。右側頭筋に挿入したサーミスタプローブによって脳温度を間接的に監視し、３７〜３７．５℃に維持した。直腸温度も測定して、監視期間の前および監視期間を通じて３７℃に維持した。
【０２８９】
挙動試験：
３つの標準機能／挙動試験を使用して、脳傷害後の感覚運動および反射機能を評価した。該試験は、Ｂｅｄｅｒｓｏｎら、（１９８６）Ｓｔｒｏｋｅ  １７：４７２−４７６；ＤｅＲｙｃｋら、（１９９２）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．５７３：４４−６０；Ｍａｒｋｇｒａｆら、（１９９２）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．５７５：２３８−２４６；およびＡｌｅｘｉｓら、（１９９５）Ｓｔｒｏｋｅ  ２６：２３３８−２３４６を含む文献で十分に説明されている。
【０２９０】
Ａ．前肢配置試験
運動感覚統合を評価するために、３つの独立した刺激（視覚、触覚、および固有受容性）に対する前肢配置を測定した。ＤｅＲｙｃｋら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．５７３：４４−６０（１９９２）。視覚配置サブテストでは、該動物を研究者が直立させた状態で維持して、テーブル面へ近づける。テーブル上での肢の正常な配置を「０」として採点し、遅延配置（＜２秒）を「１」として採点し、配置なしまたは非常に遅延した配置（＞２秒）を「２」として採点する。該動物が前方へ移動されたときに最初に、そして該動物がテーブルの横に移動されたときに再度、独立したスコアを得る（肢当たりの最大スコア＝４；各場合で、より高い数字がより大きい欠陥を示す）。触覚配置サブテストでは、該動物がテーブル面を見たり、そのヒゲで触れたりできないように保持する。該動物が前方に移動されたときに最初に、そしてテーブルの横に移動されたときに再度、背側前肢をテーブル面に軽く触れさせる。配置の各時間は上のように採点する（肢当たりの最大スコア＝４）。固有受容性配置サブテストでは、該動物を前方のみに移動して、背側前肢により大きな圧力を印加する；配置は上のように採点する（肢当たりの最大スコア＝２）。最後に、動物がテーブル面によるヒゲ刺激に反応して前肢を配置する能力を試験した（肢当たりの最大スコア＝２）。次にサブスコアを加えて、肢当たりの全前肢配置スコアを得た（範囲＝０〜１２）。
【０２９１】
Ｂ．梁平衡試験
梁平衡は運動皮質傷害に対して感受性である。この作業を使用して、ラットに狭い梁の上で絶え間なくバランスを取ることを要求して、全体の前庭運動機能を評価した。Ｆｅｅｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１７：８５５−８５７（１９８２）；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、Ｂｅｈａｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０４：３１８−３２５（１９９０）。該試験は、基準データを得るために、外科手術２４時間前の６０秒間の訓練試行を３回含んでいた。該装置は長さ１０インチ、テーブル面上１フィートに吊るされた、３／４インチ幅梁で構成されていた。ラットを梁に位置決めして、梁の上で四肢を安定した姿勢で６０秒間維持する必要があった。該動物の成績を１〜６の範囲であり、スコア１が正常であり、スコア６が、該動物が自身を梁の上で維持できないことを示す、Ｃｌｉｆｔｏｎら、Ｊ．Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．１１：Ｉｌ１４−１２１（１９９１）のスケールで評価した。
【０２９２】
Ｃ．梁歩行試験
これは特に後肢機能を調査する運動感覚統合の試験である。該試験装置はおよび評価手順は、Ｆｅｅｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１７：８５５−８５７（１９８２）から改良した。照明を暗くした室内で、長さ４フィートの１インチ幅梁を床から３フィートの高さに吊下げた。梁の遠端には、狭い進入用通路を備えた暗色ゴールボックスがあった。梁に沿った等距離に４個の３インチ金属ネジが位置決めされ、梁の中心から曲がっている。梁の始点にあるホワイトノイズ発生器および明るい光源は該動物を刺激して、梁を横断させ、ゴールボックスに進入させる。ゴールボックスに入ると、刺激は終了した。ラットが梁を横断するときのゴールボックスに到達するまでの潜時（秒）および後肢の性能を（１〜７の評価スケールに基づいて）記録した。スコア７は、足スリップが２回未満の正常な梁歩行を示し、スコア１はラットが８０秒未満で梁を横断できなかったことを示す。３回の連続試行で作業を習得して、正常性能（スコア７）を達成するために、外科手術前に各ラットを３日間訓練した。３回の基準試行を外科手術の２４時間前に収集して、その後、３回の試験試行を記録した。潜時およびスコアの平均値をそれぞれの日について計算した。
【０２９３】
（実施例１６）
甲状腺ホルモンアナログ
【０２９４】
【化２】
2008513461.tif 000010
（実施例１７）
レチノイン酸アナログ
【０２９５】
【化３】
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（実施例１８）
レチノイン酸とコンジュゲートした甲状腺ホルモンアナログ
【０２９６】
【化４】
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【０２９７】
【化５】
2008513461.tif 000013
【０２９８】
【化６】
2008513461.tif 000014
（実施例１９）
ハロゲン化スチルベストロールアナログ
【０２９９】
【化７】
2008513461.tif 000015
（実施例２０）
Ｔ４アナログ、ハロゲン化スチルベストロール、およびレチノイン酸の組成物
【０３００】
【化８】
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（実施例２１）
ＰＥＴ撮像用の化合物の調製
一般に、本発明の放射性造影剤（実施例１６〜２０）は、放射性４−ハロベンジル誘導体をピペラジン誘導体と反応させることによって調製する。ＰＥＴ撮像には好ましいのは、Ｆ−１８標識４−フルオロベンジル誘導体である。４−フルオロ−．ｓｕｐ．１８Ｆ−ベンジルハライドの調製の一般方法は、Ｉｗａｔａら、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ（２０００），Ｖｏｌ．５２，ｐｐ．８７−９２に述べられている。
【０３０１】
（実施例２２）
ＳＰＥＣＴ撮像用化合物の調製
単光子放出コンピュータ断層撮影（「ＳＰＥＣＴ」）では、９９ｍＴｃ標識化合物が好ましい。これらの化合物の一般合成経路は、９９ｍＴｃ結合キレータ、たとえばＮ２Ｓ２キレータと反応する、実施例１６〜２０による化合物の非放射性アナログによって開始する。キレータの合成は標準手順、たとえばＡ．Ｍａｈｍｏｏｄら、Ａ  Ｎ２  Ｓ２−Ｔｅｔｒａｄｅｎｔａｔｅ  Ｃｈｅｌａｔｅ  ｆｏｒ  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｔｅｃｈｎｅｔｉｕｍ，Ｒｈｅｎｉｕｍ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９９），Ｖｏｌ．５，ｐ．７１，またはＺ．Ｐ．Ｚｈｕａｎｇら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９９），Ｖｏｌ．１０，ｐ．１５９に述べられている手順に従う。
【０３０２】
キレータの１つは、実施例１６〜２０の非放射性活性化合物の−Ｎ（Ｒ４）Ｒ５基中の窒素に直接、または１〜１０個の炭素原子を有するアルキルラジカルを含むリンカ部分を介して結合されるかのどちらかであり、該アルキルラジカルは場合により、１〜１０個の−Ｃ（Ｏ）基、１〜１０個の−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−基、１〜１０個の−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）基、１〜１０個の−Ｎ（Ｒ）基、１〜１０個の−Ｎ（Ｒ）２基、１〜１０個のヒドロキシ基、１〜１０個の−Ｃ（Ｏ）ＯＲ−基、１〜１０個の酸素原子、１〜１０個の硫黄原子、１〜１０個の窒素原子、１〜１０個のハロゲン原子、１〜１０個のアリール基、および１〜１０個の飽和または不飽和複素環式環を含有し、Ｒはハロゲンまたはアルキルである。好ましいリンカ部分は、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−である。
【０３０３】
（実施例２３）
Ｔ４はαＶβ３インテグリンのリガンドである
Ｔ４がαＶβ３インテグリンのリガンドかどうかを判定するために、市販の精製タンパク質２μｇを［１２５Ｉ］Ｔ４でインキュベートして、混合物を未変性ポリアクリルアミドゲルに流した。αＶβ３は放射性標識Ｔ４に結合して、この相互作用は、［１２５Ｉ］Ｔ４インキュベーションの前にαＶβ３に添加された未標識Ｔ４によって、濃度依存的な方法で競合的に妨害された（図２４）。未標識Ｔ４の添加は、インテグリンの放射性標識リガンドへの結合を全体１０−７Ｍ（３ｘ１０−１０Ｍ遊離Ｔ４）の全Ｔ４濃度にて１３％、全体１０−６Ｍ（１．６ｘ１０−９Ｍ遊離）にて５８％低下させ、結合の阻害は１０−５Ｍ未標識Ｔ４で最大であった。非線形回帰を使用して、αＶβ３の遊離Ｔ４との相互作用は、３３３ｐＭのＫｄおよび３７１ｐＭのＥＣ５０を有すると判定された。未標識Ｔ４はαＶβ３への［１２５Ｉ］Ｔ４結合を移動させるのにより有効でなく、１０−４Ｍ全体Ｔ３では信号を２８％低下させた。
【０３０４】
（実施例２４）
ｔｅｔｒａｃ、ＲＧＤペプチドおよびインテグリン抗体によってαＶβ３へのＴ４結合が遮断される
本発明者らは以前に、細胞表面で活性化されたＴ４刺激シグナル伝達経路がＴ４の原形質膜への結合を防止することが示されている、ヨードチロニンアナログｔｅｔｒａｃによって阻害可能であることを示している。本発明者らの放射性リガンド結合アッセイにおいて、１０−８Ｍ  ｔｅｔｒａｃは精製αＶβ３への［１２５Ｉ］Ｔ４結合に対する効果を持たないが、Ｔ４およびαＶβ３の結合は、１０−７Ｍ  ｔｅｔｒａｃの存在下で３８％、１０−５Ｍ  ｔｅｔｒａｃの存在下で９０％減少した（図２５）。相互作用の特異性を判定するために、インテグリンとの結合からＴ４を移動させることを試みて、αＶβ３の細胞外マトリクス結合部位に結合するＲＧＤペプチド、およびアスパラギン酸残基の代わりにグルタミン酸残基を有し、それゆえαＶβ３を結合しないＲＧＥペプチドを添加した。ＲＧＥペプチドではなく、ＲＧＤペプチドの利用は、［１２５Ｉ］Ｔ４のαＶβ３との相互作用を用量依存的な方法で低下させた（図２５）。
【０３０５】
Ｔ４のαＶβ３との相互作用をさらに特徴付けるために、［１２５Ｉ］Ｔ４の添加前に、αＶβ３またはαＶβ５に対する抗体を精製αＶβ３に添加した。１μｇ／ｍｌのαＶβ３モノクローナル抗体ＬＭ６０９の添加は、インテグリンとＴ４との間の錯体形成を未処置対照サンプルと比較して５２％低下させた。ＬＭ６０９の量を２μｇ、４μｇ、および８μｇ／ｍｌまで増加させると、バンド強度がそれぞれ６４％、６３％および８１％低下した（図２６）。各種のαＶβ３モノクローナル抗体ＳＣ７３１２をインテグリンによってインキュベートしたときに、同様の結果が観察された。ＳＣ７３１２は、Ｔ４がαＶβ３に結合する能力を、抗体の存在が１μｇ／ｍｌで２０％、２μｇで４６％、４μｇで４７％、そして８μｇ／ｍｌの抗体が存在するときに５９％低下させた。αＶおよびβ３へのモノクローナル抗体によるインキュベーションは別個に、αＶβ３への［１２５Ｉ］Ｔ４結合に影響を及ぼさず、該結合がαＶβ３のヘテロダイマー錯体から生成された結合ポケットを必要とし、どちらかのモノマーの特異性領域を必ずしも必要としないことを示唆した。バンド強度の低下が抗体によるαＶβ３の特異的認識であることを検証するために、［１２５Ｉ］Ｔ４の添加前に精製αＶβ３を、どちらもインテグリンと放射性リガンドとの間での錯体形成に影響を及ぼさなかったαＶβ５（Ｐ１Ｆ６）またはマウスＩｇＧへのモノクローナル抗体によってインキュベートした（図２６）。
【０３０６】
（実施例２５）
Ｔ４刺激ＭＡＰＫ活性化がホルモン結合およびインテグリンαＶβ３のインヒビタによって遮断される
ホスホリル化ＭＡＰＫ（ｐＥＲＫ１／２）の核移行を生理的レベルのＴ４  １０−７Ｍ全体ホルモン濃度、１０−１０Ｍ遊離ホルモン）によって３０分間処置したＣＶ−１細胞で試験した。本発明者らが以前に報告した結果と一致して、Ｔ４はＣＶ−１細胞へのホスホリル化ＭＡＰＫの核蓄積を３０分以内に誘発した（図２７）。表示濃度のαＶβ３アンタゴニストによるＣＶ−１細胞の１６時間に渡るインキュベーションは、Ｔ４がＭＡＰＫ活性化および移行を誘発する能力を低下させた。１０−８および１０−７ＭでのＲＧＤペプチドの利用は、ＭＡＰＫ活性化に対して最小限の効果を有していた。しかしながら１０−６Ｍ  ＲＧＤペプチドはＭＡＰＫホスホリル化を対照培養物と比較して６２％阻害し、活性化は、１０−５Ｍ  ＲＧＤ（８５％の低下）および１０−４Ｍ  ＲＧＤ（８７％の低下）が培地中に存在するときに最大限に低下した。非特異性ＲＧＥペプチドの培地への添加はＣＶ−１細胞でのＴ４処置後にはＭＡＰＫホスホリル化および核移行に対する効果がなかった。
【０３０７】
Ｔ４の原形質膜への結合を防止するＴｅｔｒａｃは、Ｔ４誘発ＭＡＰＫ活性化の有効なインヒビタである。Ｔ４と共に１０−６Ｍの濃度で存在するとき、ｔｅｔｒａｃはＴ４単独で処置した培養物と比較して、ＭＡＰＫホスホリル化および移行を８６％低下させる（図２７）。Ｔ４利用の１６時間前に培地に１０−４Ｍ  ｔｅｔｒａｃを添加したときに、阻害は９７％まで上昇した。Ｔ４による刺激の１６時間前の、αＶβ３モノクローナル抗体ＬＭ６０９の培地への添加も、Ｔ４誘発ＭＡＰＫ活性化を低下させた。培地中０．０１および０．００１μｇ／ｍｌのＬＭ６０９は、Ｔ４処置後にＭＡＰＫ活性化に影響を及ぼさなかった。培地中の抗体濃度を０．１、１、および１０μｇ／ｍｌに上昇させると、Ｔ４単独で処理した細胞と比較したときに、細胞の核画分に見出されたホスホリル化ＭＡＰＫのレベルがそれぞれ２９％、８０％、および８８％低下した。
【０３０８】
ＣＶ−１細胞はαＶ、β３またはαＶおよびβ３の両方に対してｓｉＲＮＡによって一過性形質移入され、無血清培地に入れる前に１６時間に渡って回復させた。３０分間のＴ４処置の後、細胞を収集して、核タンパク質またはＲＮＡのどちらかを抽出した。図２８Ａは、標的インテグリンサブユニットに対する各ｓｉＲＮＡの特異性を示している。αＶ  ｓｉＲＮＡまたはαＶおよびβ３  ｓｉＲＮＡ両方のどちらかによって形質移入されたＣＶ−１細胞は、αＶサブユニットＲＴ−ＰＣＲ生成物の減少を示したが、細胞がβ３に対して特異性であるｓｉＲＮＡによって形質移入されたとき、または外因性ｓｉＲＮＡの存在下で形質移入試薬に暴露されたときに、αＶ  ｍＲＮＡ発現には相違はなかった。同様にβ３  ｓｉＲＮＡによって形質移入された細胞は、β３  ｍＲＮＡのレベルを低下させたが、αＶ  ｓｉＲＮＡのレベルは比較的変わらなかった。３０分間に渡るＴ４の添加は、細胞に形質移入されたｓｉＲＮＡとは無関係に、αＶまたはβ３のどちらでもｍＲＮＡレベルを変化させなかった。
【０３０９】
活性化ＭＡＰＫレベルは、αＶおよびβ３に対するｓｉＲＮＡによって、個別にまたは組合せて、ＣＶ−１細胞中でのウェスタンブロットによって測定した（図２８Ｂ）。スクランブルされた負の対照ｓｉＲＮＡによって処置されたＣＶ−１細胞は、親細胞系と比較したときに、Ｔ４誘発活性化ＭＡＰＫのわずかに上昇したレベルを有していた。形質移入試薬のみに暴露された細胞は、非形質移入ＣＶ−１細胞と同様の、ＭＡＰＫホスホリル化のレベルおよびパターンを示す。単独の、または組合されたαＶ  ｓｉＲＮＡまたはβ３  ｓｉＲＮＡのどちらかがＣＶ−１細胞内へ形質移入されたとき、ビヒクル処置培養物中のホスホリル化ＭＡＰＫのレベルは上昇するが、活性化ＭＡＰＫレベルをさらに上昇させる能力は阻害される。
【０３１０】
（実施例２６）
ホルモン誘発血管形成がαＶβ３に対する抗体によって遮断される
ＣＡＭアッセイにおいて血管形成は、生理学的濃度Ｔ４の利用によって刺激される（図２９Ａおよび図２９Ｂにまとめる）。ＣＡＭフィルタディスクに置かれた１０−７Ｍ  Ｔ４はＰＢＳ処置膜と比較したときに、血管分岐形成を２．３倍（Ｐ＜０．００１）を誘起する。Ｔ４のＴ３への変換を防止するプロピルチオウラシルは、Ｔ４によって引き起こされた血管形成に対する効果を持たない。αＶβ３に対して作られたモノクローナル抗体、ＬＭ６０９（１０μｇ／フィルタディスク）の添加は、Ｔ４に対する血管形成誘発反応を阻害した。
【０３１１】
（実施例２７）
短期および長期送達用の甲状腺ホルモンアナログの生体適合性ポリマーコンジュゲート
スケッチ１：
甲状腺ホルモンアナログ：
【０３１２】
【化９】
2008513461.tif 000017
スケッチ２：
比較評価のためのスティック、ボール＆スティック、ディスクおよびスペース充填モデルにおける形態＆分子構造の３Ｄビューを示す分子モデル
スティックモデル。２セットの分子−下のセットで分子密度を示す。
【０３１３】
【化１０】
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ボール＆スティックモデル：ＴｒｉａｃおよびＴｅｔｒａｃ−下のセットは分子密度および形態配列を示す。
セット１
【０３１４】
【化１１】
2008513461.tif 000019
【０３１５】
【化１２】
2008513461.tif 000020
（甲状腺ホルモンアナログおよび抗癌活性）
甲状腺ホルモン代謝産物ＴｒｉａｃおよびＴｅｔｒａｃは甲状腺癌の処置において、強化するために、その必要性に対する代用療法として使用される。
【０３１６】
市販の甲状腺ホルモンおよびそのアナログ：
Ｕｎｉｔｈｒｏｉｄ（登録商標）、Ｌｅｖｏｔｈｒｏｉｄ（登録商標）、Ｓｙｎｔｈｒｏｉｄ（登録商標）およびＬｅｖｏｘｙｌ（登録商標）を含む、複数の商標名の合成甲状腺ホルモンが市場で入手できる。Ｌｅｖｏ−Ｔ（登録商標）、Ｌｅｖｏｔｈｙｒｏｘｉｎｅ  Ｓｏｄｉｕｍ（登録商標）およびＮｏｖｏｔｈｙｒｏｘ（登録商標）などのジェネリック製剤がある。
【０３１７】
天然甲状腺ホルモンは、食品サプリメントとして、屠殺した動物の甲状腺から取得した乾燥粉末形で販売されている。この乾燥生成物丸剤は、望ましくない動物タンパク質、不適当なバランスのＴ３およびＴ４化合物ならびに少なくともヒト消費のために推奨される合成バインダを含有することがある。Ｔ３のＴ４に対する比は、動物の腺に応じて各バッチで異なることがあり、ヒト被験体での適正な送達のためには一定でないことが見出されている。該系での用量、送達および有効性の複雑さは、安全なヒト消費および他の局所用途のための標準化された、一定の、限定された用量および一時放出計画を議論する。
【０３１８】
（甲状腺ホルモン制御放出系）
現在、米国の患者にとって、利用できる甲状腺ホルモン代替療法のための具体的で標準化された処置計画はない。本発明者らは、試験系での用量、所望の活性および反応プロフィールについて事前に分類された個別要求に基づいて、個々の甲状腺構成要素の長期持続性低速放出系を提案している。本発明者らはそれを、用量定義のための、制限された分布での、これらの生成物の部位へのポリマー結合甲状腺構成要素の送達を通じて実現している。提案したコンジュゲート（図３−スケッチ）は、加水分解性および非加水分解性特徴を通じて達成される短期および長期放出の両方を有するであろう。これは特定の心臓血管および創傷治癒特性のために最小用量レベル送達を達成するであろう。
【０３１９】
スケッチ３：規則的なポリマーコンジュゲートおよびランダムポリマーコンジュゲート
【０３２０】
【化１３】
2008513461.tif 000021
Ｏ＝コンジュゲートされている薬物／有機化合物／物質
薬物／ＡＰＩコンジュゲートの代表的なポリマーテンプレート。
【０３２１】
（コンジュゲート送達システム）
発展中の送達システムのうち、合成ポリマーコンジュゲート化学物質は、勢いを得ている。多種多様の合成、効率的な生分解性主鎖ポリマーを持つ天然およびバイオポリマー起源の側鎖が入手可能であり、当分野で使用されている。ポリアルキルグリコール、ポリエステル、ポリ無水物、ポリ多糖類、およびポリアミノ酸は、目的のための試験管内システムではもちろんのこと、生体内でのその親水性、疎水性性質、酵素、補因子および生物学的に利用可能な酸による加水分解に関するコンジュゲート生成物の最終特徴に応じてコンジュゲーションに利用できる。
【０３２２】
（ポリマーコンジュゲーション−合成および精製）
本発明者らは、バイオポリマーを含む制御された加水分解性はもちろんのこと、非加水分解性ポリマーコンジュゲート生成物のコンジュゲート生成物のライブラリを提案している（図６および表−１を参照）。テストケースは、各カテゴリのポリマー生成物から、送達、輸送、半減期および分解およびまたは腐食データを含む薬物動態に関するその詳細な試験のために進化するであろう。そのシリーズは、ポリマーコンジュゲーションのコンビナトリアルまたはパラレル合成における将来の発展を目指して、リンカの配置および一般に使用されているＮＨＳエステルベースの合成方法を含めた、ＤＣＣ、ＤＣＣ／ＨＯＢｔベースおよび他の水溶性試薬を利用する基質および種々のポリマーの反応の同様の化学クラスに適合する、コンビナトリアル合成の同時またはライブラリ設計として作成を試みられるであろう。ＰＲＩでの合成機の利用可能な機能は、この効果のために利用され、各生成物は生物試験システムの適合性のために個別に精製されるであろう。
【０３２３】
スケッチ４：天然、合成およびポリペプチドポリマー鎖による代表的なポリマーコンジュゲート構造
【０３２４】
【化１４】
2008513461.tif 000022
ｎ＝鎖長
Ｒ＝Ｈ、二官能性ＰＥＧ結合Ｔ３
Ｒ＝Ｉ、二官能性ＰＥＧ結合Ｔ４
ＰＥＧベース甲状腺化合物ポリマーコンジュゲートデリバリーシステム
【０３２５】
【化１５】
2008513461.tif 000023
メトキシ−ＰＥＧ結合Ｔ４甲状腺生成物のポリマーコンジュゲート
【０３２６】
【化１６】
2008513461.tif 000024
Ｒ＝ＨＥＭＡ鎖の反復単位
ポリ−（ＨＥＭＡ）結合Ｔ４コンジュゲート
【０３２７】
【化１７】
2008513461.tif 000025
ポリ−（ビニ−コ−マレイン酸無水物）固定化コンジュゲート
Ａ＝甲状腺構成要素（アミン端を通じてコンジュゲート）
【０３２８】
【化１８】
2008513461.tif 000026
Ｒ＝反復鎖単位
Ａ＝甲状腺構成要素（カルボキシル端を通じてコンジュゲート）
ポリ−（ラクチド−コ−リジン）固定化コンジュゲート
【０３２９】
【化１９】
2008513461.tif 000027
Ｒ１＝多糖類鎖のモノマー
Ｒ２＝甲状腺構成要素
ヒアルロン酸結合コンジュゲート
【０３３０】
【化２０】
2008513461.tif 000028
Ｒ＝甲状腺構成要素Ｔ３／Ｔ４／ＤＩＴＰＡ／ＧＣ−１
多官能性ポリアミドアミンの固定化甲状腺構成要素
【０３３１】
【化２１】
2008513461.tif 000029
Ａ＝コンジュゲート選択甲状腺構成要素
可動化甲状腺ポリペプチドコンジュゲート。
【０３３２】
（ポリマーコンジュゲート−物理および化学キャラクタリゼーション）
ポリマー結合化合物の徹底的な分光分析およびクロマトグラフィー分析は、ＮＭＲ（利用可能な限り、Ｈｉｇｈ＆Ｌｏｗ  Ｆｉｅｌｄ−Ｐｒｏｔｏｎ＆Ｃａｒｂｏｎ，ＤＥＰＴ，ＨＯＭＯＣＯＳＹ＆ＨＥＴＥＲＯＣＯＳＹ／ＨＥＴＣＯＲ）、ＩＲ、ＭＳ、ＨＰＬＣ、安定適合性および分解速度プロフィールに関する熱および環境分解分析を使用して実施できるであろう。
【０３３３】
（放出および安定性試験）
定量放出分析のための詳細なＨＰＬＣ分析は、個々のポリマーおよびポリマーコンジュゲート生成物のクロマトグラフィーおよび分光分析プロフィールと共に、ＴｒｉａｃおよびＴｅｔｒａｃと同様に、個々の甲状腺生成物、すなわちＧＣ−１、Ｔ３、Ｔ４およびＤＩＴＰＡについての本発明者らの確立されたプロトコルに基づいて実施されるであろう。
【０３３４】
（コンジュゲーションのためのポリマー適合性基準）
生分解性および生体適合性ポリマーは、非加水分解性ポリマーコンジュゲートを含む長期および短期送達ビヒクル用の有望な担体に指定されている（表１）。ＰＥＧおよびＰＥＯは、溶解度（イージーキャリアモード、ｅａｓｙ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｍｏｄｅ）、分解時間およびコンジュゲーションの容易さのために選択される、広範囲に渡る分子量の最も一般的なヒドロキシル端ポリマーである。１端保護メトキシ−ＰＥＧも膨潤して、それにより細胞内輸送中にタンパク質が付着または固定される可能性を低下させられる直鎖担体として利用できるであろう。本来、例外的に良好な生体適合性、低い結晶性および疎水性を有する、エチレンと酢酸ビニルのあるコポリマー、すなわちＥＶＡｃは、カプセル化仲介薬物送達担体の理想的な候補である。
【０３３５】
立証された高い半減期およびシステム内保持特性を備えたポリマーは、コンジュゲーションのために着手されるであろう。中でも乳酸およびグリコール酸からの最も一般的で推奨される生分解性ポリマーが利用されるであろう。Ｌ−ラクチド、およびＬ−リジンのコポリマーは、アミド結合形成のためのアミノ官能基のその有効性のために有用であり、これはすべての甲状腺構成要素におけるカルボキシ部分を通じて共に結合された担体および輸送可能な甲状腺化合物の、より持続性の共有結合部位として作用する。
【０３３６】
セルロース、キチン、デキストラン、フィコール、ペクチン、カラギナン（すべてのサブタイプ）、およびアルギネートからの天然型多糖類およびその半合成誘導体の一部は、その高い生体適合性、親生物系分解生成物（グルコースおよびフルクトースからの単糖類）、親水性性質、溶解性、ポリマーマトリクスの長期安定性のタンパク質固定化／相互作用のために理想的な担体である。これは経時的な分解に対するポリマーマトリクスへの追加の保護のための外殻を提供し、コンジュゲートの有効半減期を延長させる。
【０３３７】
血清アルブミン、コラーゲン、ゼラチンおよびポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アラニン、ポリ−Ｌ−セリンからのタンパク質およびポリペプチドは、担体分子の生分解、生体適合性および適度の放出時間の利点を備えた天然アミノ酸ベース薬物担体である。ポリ−Ｌ−セリンは、その各種の鎖誘導体、たとえばポリセリンエステル、ポリセリンイミンおよび特定の共有コンジュゲーションに利用できる部位を備えた従来のポリセリンポリマー鎖のためにさらに興味深い。
【０３３８】
メタクリレート由来ポリマーからの合成ハイドロゲルは、生組織へのその類似性のために、生物医学用途で頻繁に使用されてきた。最も広範に使用された合成ハイドロゲルは、アクリル酸、アクリルアミドおよび２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）のポリマーである。ポリＨＥＭＡは安価で、コンジュゲーション用の生体適合性の入手可能な１級アルコール側鎖伸長官能基であり、それらを完全な薬物送達物質にする眼、眼内および他の眼科用途に適している。ｐＨＥＭＡは細胞付着に影響されず、細胞運動性を備えておらず、そのことはそれらを内部送達システムの理想的な候補にする。
【０３３９】
合成甲状腺アナログＤＩＴＰＡコンジュゲーションライブラリ設計プログラムは、粗ＤＩＴＰＡコンジュゲート生成物の開発によって実現された。ジシクロヘキシルカルボジイミドを通じて、親水性および疎水性の他のカップリング試薬によって仲介されたＰＶＡおよびＰＥＧ親水性ポリマーカップリングは、進行中である。
【０３４０】
固相合成機でのライブラリ合成の発展のための設計はその最終段階にあり、その高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）のモデルは、試験システムおよびパラメータ基準の共通性に基づいて導入されるであろう。コンジュゲートの送達時間、半減期および構想された安定性についての統計解析は、構造送達解析（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎａｌｙｓｅｓ（ＳＤＡ））のために蓄積されるであろう。以下は調製用の所期のポリマーコンジュゲートのリストである（表８）。
【０３４１】
表−８：化学クラス反応性および安定性データに基づく可能な調製のための指定されたポリマーコンジュゲートのライブラリ
【０３４２】
【表８】
2008513461.tif 000030
（他の実施形態）
本発明をその詳説された記述と併せて述べたが、上の記述は、添付請求項の範囲によって定義される本発明の範囲を例示するものであって、制限するものではない。他の態様、利点、および改良は、以下の請求項の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０３４３】
【図１】ニワトリＣＡＭアッセイで定量した、血管形成に対するＬ−Ｔ４およびＬ−Ｔ３の効果。Ａ、対照サンプルをＰＢＳに、追加のサンプルを１ｎＭ  Ｔ３または０．１μｍｏｌ／Ｌ  Ｔ４に３日間暴露した。どちらのホルモンも、３回の実験によるこれらの代表的な画像では血管分岐の増加を引き起こした。Ｂ、それぞれ９回のＣＡＭアッセイを含む３回の実験から得た、実験期間中に既存の血管から形成された新しい分岐の平均±ＳＥＭの表形式。表示した濃度では、Ｔ３およびＴ４は同様の効果を引き起こした（分岐形成でそれぞれ１．９倍および２．５倍の増加）。ホルモン処置サンプルをＰＢＳ処置ＣＡＭサンプルと比較した、一元配置ＡＮＯＶＡにより、＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２】Ｔｅｔｒａｃは、Ｔ４およびアガロース結合Ｔ４（Ｔ４−ａｇ）による血管形成の刺激を阻害する。Ａ、血管分岐形成の２．５倍の増加が０．１μｍｏｌ／Ｌ  Ｔ４に３日間暴露した代表的なＣＡＭ調製物で見られる。同様の３階の実験において、２．３倍の増加があった。ホルモンのこの効果は、Ｔ４の原形質膜作用を阻害することが以前に示されたＴ４アナログである、ｔｅｔｒａｃ（０．１μｍｏｌ／Ｌ）によって阻害される。１３  ｔｅｔｒａｃ単独では血管形成を刺激しない（Ｃ）。Ｂ、Ｔ４−ａｇ（０．１μｍｏｌ／Ｌ）は、ｔｅｔｒａｃによって遮断された効果である、血管形成を２．３倍（３回の実験で２．９倍）刺激する。Ｃ、ＣＡＭアッセイにおけるｔｅｔｒａｃ、Ｔ４−ａｇ、およびＴ４の作用を検査する３回の実験結果のまとめ。データ（平均±ＳＥＭ）は、３回の実験それぞれの各実験条件での１０枚の画像から得た。Ｔ４処置およびＴ４−アガロース処置サンプルをＰＢＳ処置対照サンプルと比較したＡＮＯＶＡにより、＊＊Ｐ＜０．００１。
【図３】ＦＧＦ２およびＴ４の血管形成誘発効果の比較。Ａ、亜最大濃度でのＴ４（０．０５μｍｏｌ／Ｌ）およびＦＧＦ２（０．５μｇ／ｍＬ）のタンデム効果は、ＣＡＭアッセイで加法的であり、ＦＧＦ２（Ｔ４の非存在下で１μｇ／ｍＬ）で見られた血管形成のレベルと等しい。Ｂ、Ａと同様に、ＣＡＭアッセイにおけるＦＧＦ２およびＴ４の作用を検査した、３回の実験による結果のまとめ（平均±ＳＥＭ）。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００１、３回の実験で処置サンプルの結果をＰＢＳ処置対照サンプルの結果と比較。
【図４】Ｔ４または外因性ＦＧＦ２によって引き起こされた血管形成に対する抗ＦＧＦ２の効果。Ａ、ＦＧＦ２は、抗体（ａｂ）−ＦＧＦ２（８μｇ）によって阻害された効果である、３回の実験でのＣＡＭモデルにおける血管形成で２倍の増加を引き起こした。Ｔ４は血管形成も１．５倍刺激して、この効果もＦＧＦ２抗体によって遮断され、Ｔ４およびＴ３がＣＡＭモデルの細胞からＦＧＦ２放出を引き起こすため（表１）ＣＡＭモデルでの甲状腺ホルモンの作用がＦＧＦ２自己分泌／傍分泌効果に仲介されることが示されている。本発明者らは以前に、非特異性ＩｇＧ抗体がＣＡＭアッセイにおいて血管形成に何の効果も持たないことを示した。Ｂ、ＦＧＦ２またはＴ４の存在下でのＦＧＦ２−ａｂの作用を研究した、３回のＣＡＭ実験による結果のまとめ。＊Ｐ＜０．０１；＊＊Ｐ＜０．００１、甲状腺ホルモンおよびＦＧＦ２の血管形成に対する効果および抗体−ＦＧＦ２の存在下でのこれらの効果の消失について研究した３回の実験における有意な効果を示す。
【図５】ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）シグナル伝達カスケードインヒビタであるＰＤ９８０５９の、Ｔ４、Ｔ３、およびＦＧＦ２によって誘発された血管形成に対する効果。Ａ、Ｔ４（０．１μｍｏｌ／Ｌ）およびＴ３（１ｎｍｏｌ／Ｌ）で共に刺激された血管形成は、ＰＤ９８０５９（３μｍｏｌ／Ｌ）によって完全に阻害される。Ｂ、ＦＧＦ２（１μｇ／ｍＬ）によって誘発された血管形成もＰＤ９８０５９によって阻害され、成長因子の作用もＥＲＫ１／２経路の活性化に依存することを示す。Ｔ４がその血管形成誘発効果を細胞膜にて開始することを示す、Ｔ４−アガロース（Ｔ４−ａｇ）およびｔｅｔｒａｃ（図２）を含む実験の状況では、ＡおよびＢに示す結果が甲状腺ホルモンの血管形成誘発作用でＭＡＰＫが演じた２つの役割と一致する：ＥＲＫ１／２は、ＦＧＦ２同化につながるホルモンの早期シグナルを伝達し、ＦＧＦ２の血管形成に対する次の作用を伝達する。Ｃ、ＣＡＭモデルにおけるＴ４およびＦＧＦ２の作用に対する、ＰＤ９８０５９の効果を示す、ＡおよびＢによって表された、３回の実験の結果のまとめ。＊Ｐ＜０．０１；＊＊Ｐ＜０．００１、３回の実験によるデータに対するＡＮＯＶＡの結果を示す。
【図６】Ｔ４およびＦＧＦ２はＥＣＶ３０４内皮細胞にてＭＡＰＫを活性化する。細胞は０．２５％ホルモン枯渇血清を含むＭ１９９培地中で調製して、Ｔ４（０．１μｍｏｌ／Ｌ）によって１５分間〜６時間処置した。細胞を収集して、以前に述べたように核画分を調製した。ゲル電気泳動によって分離した核タンパク質を抗体−ホスホリル化ＭＡＰＫ（ｐＥＲＫ１およびｐＥＲＫ２、それぞれ４４および４２ｋＤａ）を用いて、続いてルミネセンス検出システムに結合された第２の抗体によって免疫ブロットした。核画分のβ−アクチン免疫ブロットは、この図の各部分のゲル装填用の対照として作用する。各免疫ブロットは３回の実験を代表する。Ａ、Ｔ４は、ＥＣＶ３０４細胞でのホスホリル化の増加およびＥＲＫ１／２の核移行を引き起こす。該効果は３０分後に最大であるが、効果は≧６時間に渡って残存する。Ｂ、ＥＣＶ３０４細胞をＥＲＫ１／２活性化インヒビタＰＤ９８０５９（ＰＤ；３０μｍｏｌ／Ｌ）またはＰＫＣインヒビタＣＧＰ４１２５１（ＣＧＰ；１００ｎｍｏｌ／Ｌ）によって３０分間処置して、その後、１０−７Ｍ  Ｔ４を１５分間に渡って、表示した細胞サンプルに添加した。核を収集すると、この代表的な実験は、両方のインヒビタ（レーン５および６）によって阻害される、Ｔ４（レーン４）によるＥＲＫ１／２のホスホリル化（活性化）の増加を示し、ＰＫＣ活性が内皮細胞でのＴ４によるＭＡＰＫ活性化にとって必須であることを示唆している。Ｃ、ＥＣＶ３０４細胞は、Ｔ４（１０−７ｍｏｌ／Ｌ）、ＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍＬ）、または両方の因子のいずれかによって１５分間に渡って処置した。図は、ホルモンまたは成長因子のどちらかで処置した核でのｐＥＲＫ１／２蓄積と、両方の因子による核ｐＥＲＫ１／２蓄積の増加を示す。
【図７】Ｔ４は、ＥＣＶ３０４内皮細胞でのＦＧＦ２  ｃＤＮＡの蓄積を増加させる。細胞を６〜４８時間に渡ってＴ４（１０−７ｍｏｌ／Ｌ）およびＦＧＦ２によって処置して、ＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡを各細胞分割量から単離した。上のブロットに示すＦＧＦ２  ｃＤＮＡのレベルを、下のブロットに示すＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡ癌流量の変動について補正して、ＦＧＦ２の補正レベルを下のグラフに示す（平均±平均のＳＥ；ｎ＝２実験）。すべての時点で、Ｔ４によって処置した細胞から抽出したＲＮＡ中のＦＧＦ２転写物の存在量が増加した。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１、対照値に対する各時点での値のＡＮＯＶＡによる比較を示す。
【図８】７日齢ニワトリ胚腫瘍成長モデル。腫瘍移植のニワトリ絨毛尿膜膜（ＣＡＭ）モデルの説明図。
【図９】Ｔ４は３Ｄ創傷治癒を刺激する。本明細書で述べた３Ｄ創傷治癒アッセイによる、Ｔ４および対照に暴露されたヒト皮膚線維芽細胞の写真。
【図１０】Ｔ４は創傷治癒を用量依存的に向上させる、第３日。グラフによって示されるように、Ｔ４は０．１μＭ〜１．０μＭの濃度にて用量依存的な方法で創傷治癒（外部遊走細胞によって測定）を向上させる。０．１μＭ〜３．０μＭのＴ４の濃度では、この同じ向上は見られない。
【図１１】精製インテグリンへのＩ−１２５−Ｔ４結合に対する未標識Ｔ４およびＴ３の効果。未標識Ｔ４（１０−４Ｍ〜１０−１１Ｍ）またはＴ３（１０−４Ｍ〜１０−８Ｍ）を精製αＶβ３インテグリンに添加して（２μｇ／サンプル）、３０分間インキュベートした。Ｉ−１２５標識Ｔ４  ２マイクロキュリーを各サンプルに添加した。該サンプルを２０分間室温にてインキュベートして装填染料と混合し、５％未処置ゲルに２４時間に渡って４℃、４５ｍÅにて流した。電気泳動の後、ゲルをプラスチックラップに包んで、フィルムに暴露した。精製αＶβ３へのＩ−１２５−Ｔ４結合は、１０−１１Ｍ〜１０−７Ｍの範囲の未標識Ｔ４には影響されないが、１０−６Ｍの濃度では用量依存的な方法で未標識Ｔ４に競合勝ちされている。インテグリンへの高温のＴ４結合は、１０−４Ｍ未標識Ｔ４によってほぼ完全に取って代わられる。Ｔ３は、αＶβ３へのＴ４結合との競合勝ちにはあまり有効ではなく、シグナルを１０−６Ｍ、１０−５Ｍ、１０−４Ｍ  Ｔ３にてそれぞれ１１％、１６％、２８％低下させる。
【図１２】ＲＧＥ含有ペプチドではなく、ｔｅｔｒａｃおよびＲＧＤ含有ペプチドが精製αＶβ３へのＴ４結合に競合勝ちする。Ａ）精製αＶβ３へのＴｅｔｒａｃ添加は、インテグリンへのＩ−１２５標識Ｔ４結合を用量依存的な方法で減少させる。１０−８Ｍ  ｔｅｔｒａｃは、インテグリンの高温Ｔ４結合との競合勝ちには無効である。Ｔ４およびαＶβ３の結合は、１０−７Ｍ  ｔｅｔｒａｃの存在下で３８％、１０−５Ｍ  ｔｅｔｒａｃによって９０％減少した。１０−５ＭでのＲＧＤペプチドの添加は、αＶβ３へのＴ４結合に競合勝ちする。ＲＧＤペプチドの対照としての１０−５Ｍおよび１０−４Ｍ  ＲＧＥペプチドの添加は、精製αＶβ３への高温Ｔ４結合を減弱できなかった。Ｂ）パネルＡからのｔｅｔｒａｃおよびＲＧＤデータのグラフ表示。データ点を３回の独立した実験の平均±ＳＤとして示す。
【図１３】αＶβ３へのＴ４結合に対するモノクローナル抗体ＬＭ６０９の効果。Ａ）ＬＭ６０９をαＶβ３に表示濃度で添加した。サンプル当たりＬＭ６０９  １μｇは、インテグリンへの標識Ｔ４結合を５２％減少させた。インテグリンへのＴ４結合の最大阻害は、ＬＭ６０９の濃度がサンプル当たり２μｇであるときに達成され、８μｇもの高い抗体濃度で維持された。抗体特異性の対照として、Ｔ４によるインキュベーションの前に１０μｇ／サンプル  Ｃｏｘ−２  ｍＡＢおよび１０μｇ／サンプルマウスＩｇＧをαＶβ３に添加した。Ｂ）パネルＡからのデータのグラフ表示。データ点を３回の独立した実験の平均±ＳＤとして示す。
【図１４】Ｔ４誘発ＭＡＰＫ活性化に対するＲＧＤ、ＲＧＥ、ｔｅｔｒａｃ、およびｍＡＢ  ＬＭ６０９の効果。Ａ）ＣＶ−１細胞（５０〜７０％コンフルエント）を１０−７Ｍ  Ｔ４（１０−７Ｍ全濃度、１０−１０Ｍ遊離濃度によって３０分間処置した。Ｔ４の添加前に、選択したサンプルをＲＧＤ含有ペプチド、ＲＧＥ含有ペプチド、ｔｅｔｒａｃ、またはＬＭ６０９のいずれかの表示濃度で１６時間処置した。核タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、抗ホスホ−ＭＡＰＫ（ｐＥＲＫ１／２）抗体を用いて免疫ブロットした。ｐＥＲＫ１／２の核蓄積は、１０−６Ｍまたはそれ以上のＲＧＤペプチドによって処置したサンプルでは減弱されるが、１０−４Ｍ  ＲＧＥで処置したサンプルでは著しく変化しない。ｐＥＲＫ１／２蓄積を１０−６Ｍ  ｔｅｔｒａｃによって処置したＣＶ１細胞では７６％するのに対して、１０−５Ｍ以上の濃度のｔｅｔｒａｃは、ｐＥＲＫ１／２の核蓄積を未処置対照サンプルと同様のレベルまで低下させる。αＶβ３  ＬＭ６０９へのモノクローナル抗体は、ＣＶ１培養物に１μｇ／ｍｌの濃度で加えるときに、核内の活性化ＭＡＰＫの蓄積を低下させる。Ｂ）パネルＡに示すＲＧＤ、ＲＧＥ、およびｔｅｔｒａｃのデータのグラフ表示。データ点を３回の別個の実験の平均±ＳＤとして示す。
【図１５】Ｔ４誘発ＭＡＰＫ活性化に対するαＶおよびβ３へのｓｉＲＮＡの効果。ＣＶ１細胞をｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ最終濃度）によってαＶ、β３、またはαＶおよびβ３の両方に対して形質移入した。形質移入の２日後、細胞を１０−７Ｍ  Ｔ４によって処置した。Ａ）各形質移入群から単離したＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲを実施して、各ｓｉＲＮＡの特異性および機能性を検証した。Ｂ）各形質移入からの核タンパク質を単離して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。
【図１６ＡＢ】ＣＡＭモデルにおけるＴ４刺激血管形成に対するαＶβ３  ｍＡＢ（ＬＭ６０９）の阻害効果。Ａ）サンプルをＰＢＳ、Ｔ４（０．１μＭ）、またはＴ４＋１０ｍｇ／ｍｌ  ＬＭ６０９に３日間暴露した。Ｔ４によって刺激された血管形成は、αＶβ３モノクローナル抗体  ＬＭ６０９の添加によって実質的に阻害された。Ｂ）実験期間中に既存血管から形成された新しい分岐の平均±ＳＥＭの表形式。データは、各処置群の９個のサンプルをそれぞれ含む、３回の別個の実験から得た。
【図１６Ｃ】ＣＡＭモデルにおけるＴ４刺激血管形成に対するαＶβ３  ｍＡＢ（ＬＭ６０９）の阻害効果。Ｃ、Ｄ）Ｔ４またはＦＧＦ２によって刺激された血管形成も、αＶβ３モノクローナル抗体ＬＭ６０９またはＸＴ１９９の添加によって阻害される。
【図１６Ｄ】ＣＡＭモデルにおけるＴ４刺激血管形成に対するαＶβ３  ｍＡＢ（ＬＭ６０９）の阻害効果。Ｃ、Ｄ）Ｔ４またはＦＧＦ２によって刺激された血管形成も、αＶβ３モノクローナル抗体ＬＭ６０９またはＸＴ１９９の添加によって阻害される。
【図１７】甲状腺ホルモンアナログのポリマー組成物−ポリビニルアルコールを使用したエステル結合によるポリマーコンジュゲーション。この調製物では、市販のポリビニルアルコール（または関連コポリマー）は、甲状腺ホルモンアナログの酸塩化物、すなわち酸塩化物形を用いた処置によりエステル化できる。塩酸塩はトリエチルアミンの添加によって中和され、各種のアナログの甲状腺ホルモンエステルポリマー形態の沈殿時に水によって洗浄できるトリエチルアミン塩酸塩を生じる。ポリマーへのエステル結合は生体内での加水分解を受けて、活性血管形成誘発甲状腺ホルモンアナログを放出できる。
【図１８】甲状腺ホルモンアナログのポリマー組成物−アクリル酸エチレンコポリマーを使用した無水物結合によるポリマーコンジュゲーション。これは前のポリマー共有コンジュゲーションと類似している。しかしながら今回は、アクリル酸コポリマーの反応に由来する無水物結合による。この無水物結合は生体内での加水分解も受けやすく、甲状腺ホルモンアナログを放出する。塩酸の中和はトリエチルアミンによる処置によって実施され、続いての水による沈殿ポリ無水物ポリマーの洗浄はトリエチルアミン塩酸塩副生成物を除去する。この反応は甲状腺ホルモンアナログアクリル酸コポリマー＋トリエチルアミンの形成を引き起こすであろう。生体内での加水分解時に、甲状腺ホルモンアナログは制御できる時間に渡って、アクリル酸エチレンコポリマーと共に放出されるであろう。
【図１９】甲状腺ホルモンアナログのポリマー組成物−ポリ乳酸ポリマー内への捕捉。ポリ乳酸ポリエステルポリマー（ＰＬＡ）は、生体内で加水分解への加水分解を受け、これはヒトにおける薬物送達システム用のビヒクルとして使用されてきた。甲状腺ホルモンアナログがポリマーに化学結合によって結合される前の２つの共有結合方法とは異なり、これは甲状腺ホルモンアナログをＰＬＡポリマービーズ内にカプセル化する非共有結合方法である。この反応は、水中での甲状腺ホルモンアナログ含有ＰＬＡビーズの形成をもたらすであろう。フィルタおよび洗浄は、甲状腺ホルモンアナログ含有ＰＬＡビーズの形成を引き起こし、これは生体内での加水分解時に、制御されたレベルの甲状腺ホルモンおよび乳酸の発生をもたらすであろう。
【図２０ＡＢ】各種のポリマーとのコンジュゲーションが可能な甲状腺ホルモンアナログ。Ａ〜Ｄは、本発明の甲状腺ホルモンアナログのポリマー形態を作成するためにコンジュゲートできる各種の甲状腺ホルモンアナログを得るために必要な置換を示す。
【図２０ＣＤ】各種のポリマーとのコンジュゲーションが可能な甲状腺ホルモンアナログ。Ａ〜Ｄは、本発明の甲状腺ホルモンアナログのポリマー形態を作成するためにコンジュゲートできる各種の甲状腺ホルモンアナログを得るために必要な置換を示す。
【図２１】試験管内３−Ｄ血管形成アッセイ  図２１は、フィブリン被覆ビーズでのヒト微小血管内皮の三次元試験管内萌出アッセイのプロトコルおよび図解である。
【図２２】３−ＤフィブリンでのＨＯＭＥＣの試験管内萌出血管形成  図２２は、各種の拡大での三次元でのヒト微小血管内皮細胞萌出の図解である。
【図２３Ａ】低レベルのコラーゲン存在下での血小板由来創傷治癒因子の放出。
【図２３Ｂ】低レベルのコラーゲン存在下での血小板由来創傷治癒因子の放出。
【図２３Ｃ】低レベルのコラーゲン存在下での血小板由来創傷治癒因子の放出。
【図２３Ｄ】低レベルのコラーゲン存在下での血小板由来創傷治癒因子の放出。
【図２３Ｅ】低レベルのコラーゲン存在下での血小板由来創傷治癒因子の放出。
【図２４】未標識Ｔ４およびＴ３が精製インテグリンからの［１２５Ｉ］−Ｔ４と取って代わる。未標識Ｔ４（１０−１１Ｍ〜１０−４Ｍ）またはＴ３（１０−８〜１０−４Ｍ）を［１２５Ｉ］−Ｔ４の添加前に、精製αＶβ３インテグリンに添加する（２μｇ／サンプル）。（ａ）精製αＶβ３への［１２５Ｉ］−Ｔ４結合は、１０−１１Ｍ〜１０−７Ｍの範囲では未標識Ｔ４に影響を受けなかったが、濃度≧１０−６Ｍでは濃度依存的な方法で未標識Ｔ４によって取って代わられた。Ｔ３は、αＶβ３へのＴ４結合の置換えにはあまり有効ではなかった。（ｂ）３回の独立した実験の平均±ＳＤの、Ｔ４およびＴ３データのグラフ表示。
【図２５】ＲＧＥ含有ペプチドではなく、ＴｅｔｒａｃおよびＲＧＤ含有ペプチドが精製αＶβ３へのＴ４結合に取って代わる。（ａ）精製αＶβ３のｔｅｔｒａｃまたはＲＧＤ含有ペプチドによるプレインキュベーションは、インテグリンと［１２５Ｉ］−Ｔ４との間の相互作用を用量依存的な方法で低下させた。ＲＧＤペプチドの対照としての１０−５Ｍおよび１０−４Ｍ  ＲＧＥペプチドの利用は、精製αＶβ３への標識Ｔ４結合を減弱しなかった。（ｂ）ｔｅｔｒａｃおよびＲＧＤデータのグラフ表示は、３回の独立した実験からの結果の平均±ＳＤを示す。
【図２６】インテグリン抗体はαＶβ３へのＴ４結合を阻害する。［１２５Ｉ］−Ｔ４添加の３０分前に、抗体ＬＭ６０９およびＳＣ７３１２をαＶβ３に表示濃度（μｇ／ｍｌ）で添加した。インテグリンへのＴ４結合の最大阻害は、ＬＭ６０９濃度が２μｇ／ｍｌであるときに達成され、８μｇもの高い抗体濃度で維持された。ＳＣ７３１２はαＶβ３へのＴ４結合を、２μｇ／ｍｌ抗体／サンプルにて４６％、抗体８μｇ／ｍｌが存在するときに５８％低下させた。Ｔ４によるインキュベーションの前に、１０μｇ／ｍｌ  抗αＶβ３  ｍＡｂ（Ｐ１Ｆ６）および１０μｇ／ｍｌマウスＩｇＧを抗体特異性の対照としてαＶβ３に添加した。グラフは３回の独立した実験によるデータの平均±ＳＤを示す。
【図２７】Ｔ４誘発ＭＡＰＫ活性化に対するＲＧＤおよびＲＧＥペプチド、ｔｅｔｒａｃ、およびｍＡｂ  ＬＭ６０９の効果。（ａ）ｐＥＲＫ１／２の核蓄積は、１０−６Ｍ以上ＲＧＤペプチドによって処置したサンプルで減弱されたが、１０−４Ｍ  ＲＧＥまでで処置されたサンプルでは著しく変化しなかった。１０−５Ｍ  ｔｅｔｒａｃおよびＴ４によって処置したＣＶ−１細胞中のｐＥＲＫ１／２蓄積は、未処置対照サンプルで観察されたレベルと同様であった。αＶβ３へのモノクローナル抗体であるＬＭ６０９は、１μｇ／ｍｌの濃度でＣＶ−１培養物に添加されたときに、核内の活性化ＭＡＰＫの蓄積を減少させた。（ｂ）３回の別個の実験からのデータの平均±ＳＤを示す。α−チューブリン抗体による免疫ブロットは、ゲル装填対照として含まれる。
【図２８】Ｔ４誘発ＭＡＰＫ活性化に対するαＶおよびβ３へのｓｉＲＮＡの効果。ＣＶ−１細胞をｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ最終濃度）によってαＶ、β３、またはαＶおよびβ３の両方に対して形質移入した。形質移入の２日後、細胞を１０−７Ｍ  Ｔ４またはビヒクル対照によって３０分間処置した。（ａ）各形質移入群から単離したＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲを実施して、各ｓｉＲＮＡの特異性および機能性を検証した。（ｂ）形質移入細胞の各セットからの核タンパク質を単離して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて、ｐＥＲＫ１／２についてＴ４による処置の存在下または非存在下でプローブした。親細胞およびスクランブルｓｉＲＮＡによって処置した細胞において、Ｔ４によるｐＥＲＫ１／２の核蓄積は明らかであった。αＶまたはβ３に対してｓｉＲＮＡによって処置した細胞は、Ｔ４の非存在下でｐＥＲＫ１／２の増加を示し、Ｔ４処置により低下を示した。αＶおよびβ３  ｓｉＲＮＡを含有する細胞は、Ｔ４処置に反応しなかった。
【図２９】ＣＡＭモデルにおけるＴ４刺激血管形成に対するαＶβ３  ｍＡＢ（ＬＭ６０９）の阻害効果。ＣＡＭＳをＰＢＳ、Ｔ４（１０−７Ｍ）、またはＴ４＋１０μｇ／ｍｌ  ＬＭ６０９によって３日間処置したフィルタディスクに暴露した。（Ａ）Ｔ４によって刺激された血管形成はαＶβ３モノクローナル抗体  ＬＭ６０９の添加により実質的に阻害された。（ｂ）実験期間中に既存血管から形成された新しい分岐の平均±ＳＥＭの表形式を示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１、処置群ごとに９枚の画像を含む、３回の別個の実験でのＴ４／ＬＭ６０９処置サンプルの結果をＴ４処置サンプルと比較する。統計解析は、一元配置ＡＮＯＶＡによって実施した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６ＡＢ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０ＡＢ】
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【図２０ＣＤ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【国際調査報告】
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