(57)【要約】  本発明は、切断型ＦＡＡＨポリペプチドをコードする核酸組成物、組換えＦＡＡＨを発現する方法、および組換えＦＡＡＨを精製する方法に関する。上記核酸組成物は、原核細胞宿主中での転写に最適化された配列を含む。【図１】2008529481.tif 000005
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．配列番号１に記載のヌクレオチド配列と、
ｂ．配列番号１に記載のヌクレオチド配列と９５から９９％同一であるヌクレオチド配列と、
ｃ．配列番号２に記載のヌクレオチド配列と、
ｄ．配列番号２に記載のヌクレオチド配列と少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列と、
ｅ．配列番号４のアミノ酸３０〜５７９をコードするヌクレオチド配列と、
ｆ．配列番号４のアミノ酸３２〜５７９をコードするヌクレオチド配列と
からなる群より選択されたヌクレオチド配列からなる単離された核酸分子。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸分子によってコードされている単離されたポリペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸分子を含み、かつＳＵＭＯポリペプチド配列をコードする核酸分子をさらに含むベクター。
【請求項５】
請求項１に記載の核酸分子を含み、かつ前記核酸分子に作用可能に連結したプロモーター配列をさらに含み、前記プロモーターがＴ７プロモーターであるベクター。
【請求項６】
請求項２に記載のベクターで形質転換された細菌宿主細胞。
【請求項７】
ＦＡＡＨタンパク質を発現させる方法であって、ＦＡＡＨポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターで細菌宿主細胞を形質転換させるステップと、前記ポリペプチドの発現を誘導するステップとを含み、前記誘導された発現によって、細胞培養物１リットルあたり少なくとも０．１３から５０ｍｇのＦＡＡＨポリペプチドが産生される方法。
【請求項８】
前記ポリペプチドがヒトＦＡＡＨであり、かつ前記誘導された発現によって、細胞培養物１リットルあたり少なくとも０．１３から２６ｍｇの活性かつ可溶性のＦＡＡＨが産生される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記誘導が、５０から３００μＭのＩＰＴＧの存在下、かつＬ−アラビノースの存在下で行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドがラットＦＡＡＨであり、かつ前記誘導された発現によって、細胞培養物１リットルあたり少なくとも１０〜５０ｍｇの活性かつ可溶性のＦＡＡＨが産生される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
ＦＡＡＨタンパク質を発現させる方法であって、請求項６の宿主細胞を培養するステップを含む方法。
【請求項１２】
精製されたＦＡＡＨポリペプチドを生産する方法であって、
ａ．宿主細胞内で異種ＦＡＡＨポリペプチドを発現させるステップと、
ｂ．界面活性剤の非存在下における少なくとも１回の超遠心分離ステップによって、前記宿主細胞の膜画分を単離するステップと
を含む方法。
【請求項１３】
前記ＦＡＡＨポリペプチドが、請求項１に記載の核酸分子によってコードされている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
精製されたＦＡＡＨポリペプチドを生産する方法であって、
ａ．宿主細胞内で異種ＦＡＡＨポリペプチドを発現させるステップと、
ｂ．界面活性剤の非存在下で前記宿主細胞を溶解させるステップと、
ｃ．ステップ（ｂ）の溶解物を低速で遠心分離し、上清を保持するステップと、
ｄ．前記上清を超遠心分離し、ペレットを保持するステップと、
ｅ．界面活性剤を含有しない緩衝液に前記ペレットを再懸濁させるステップと、
ｆ．前記再懸濁液を超遠心分離し、ペレットを保持するステップと、
ｇ．ステップ（ｆ）の前記ペレットに含まれている可溶性ポリペプチドを、非イオン性界面活性剤を含む緩衝液に前記ペレットを再懸濁させることによって可溶化するステップと、
ｈ．ステップ（ｇ）の前記再懸濁液を超遠心分離し、上清を保持するステップと、
ｉ．ステップ（ｈ）の上清からＦＡＡＨポリペプチドを単離するステップと
を含む方法。
【請求項１５】
前記ＦＡＡＨポリペプチドがヒスチジンタグに融合しており、かつステップｉの前記単離が、陽イオンで荷電されたビーズを含むカラムを用いたカラムクロマトグラフィーを含む、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪酸アミド加水分解酵素（ＦＡＡＨ）の増強発現および精製のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸アミドは、多様な細胞作用および生理作用を有する生理活性脂質の増大しつつあるファミリーを表す（Ｃｒａｖａｔｔ，Ｂ．Ｆ．ら（１９９５年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１５０６−１５０９）；（Ｄｅｖａｎｅ，Ｗ．Ａ．ら（１９９２年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：１９４６−１９４９）；（Ｆａｃｃｉ，Ｌ．ら（１９９５年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：３３７６−３３８０）。脂肪酸アミドは、脂肪酸アミド加水分解酵素（ＦＡＡＨ）として知られる酵素によって、それらに対応する脂肪酸に加水分解される（Ｕｅｄａら（２０００年）、Ｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓ  Ｌｉｐｉｄｓ  １０８（１−２）：１０７−２１）。ＦＡＡＨは、神経調節性化合物であるアナンダミドおよびオレアミドを含めた多数の１級および２級脂肪酸アミドの加水分解を行う、哺乳動物の膜内在性セリン加水分解酵素である。アナンダミド（アラキドノイルエタノールアミド）は、カンナビノイド様の鎮痛特性を有することが示されており、刺激されたニューロンによって放出される。アナンダミドの作用および内因性レベルは、疼痛刺激に伴って増大する。これは、疼痛神経伝達の抑制および行動的鎮痛（ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ａｎａｌｇｅｓｉａ）におけるアナンダミドの役割を示唆するものである。これを支持するものとして、脳のアナンダミドレベルを上昇させるＦＡＡＨ阻害剤が、不安の動物モデルで有効であることが実証された。第２の脂肪酸アミドであるオレアミド（９−Ｚ−オクタデセンアミド）は、睡眠を誘導することが示されている。ＦＡＡＨは、中枢神経系内部のニューロンで強く発現されており、この酵素は、それらのニューロンにおけるそれらの推定作用部位で、脂肪酸アミドを不活性化できる状態にあるようである。脂肪酸アミドは、疎水性の性質を有し、酵素と細胞膜との間で相互作用して、効率的な速度での基質の加水分解と、産物の放出とを得ている。ＦＡＡＨは、生理的に活性な脂肪酸アミドを分解し、それによって、その脂肪酸アミドのシグナル伝達機能を終止させる内在性膜タンパク質である。ＦＡＡＨによる膜との相互作用の性質を明確にすることによって、ＦＡＡＨがどのようにして脂肪酸アミドシグナル伝達の調節に関与しているかに関して、より一層の理解を得ることができる。脂肪酸アミド代謝におけるＦＡＡＨの役割を考えると、この酵素の特徴をさらに明らかにしていく必要がある。しかし、機能研究および高分解能結晶研究用の精製された活性酵素を十分な量得ることが困難であった。
【０００３】
マウス、ラット、およびヒトＦＡＡＨタンパク質の一次配列分析は、これらの酵素が単一の膜貫通ドメインと、タンパク質配列の大部分を含有している大きな細胞質テールとを有するＩ型内在性膜タンパク質であることを予測している（Ｐａｔｒｉｃｅｌｌｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９８年、第３７巻、１５１７７）。ラットＦＡＡＨがクローニングされ（Ｎａｔｕｒｅ  １９９６年、３８４、８３−７）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現された（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９８年、３７、１５１７７−１５１８７）。ヒトＦＡＡＨもクローニングされている（ＵＳ２００２／０１８７５４２Ａ１）。ヒトＦＡＡＨは、ラットＦＡＡＨと８２％のアミノ酸同一性を共有している。可溶性の活性ヒトＦＡＡＨを得ることが困難であるため、大腸菌におけるヒトＦＡＡＨの発現は、よくても最小限のものであった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、切断型ヒトＦＡＡＨポリペプチドをコードする核酸組成物と、大腸菌で組換えヒトＦＡＡＨを発現する方法と、発現されたポリペプチドを精製する方法とを包含する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
以下に記述する本発明の特定の実施形態では、核酸配列が原核細胞宿主での転写用に最適化されている。
【０００６】
一態様では、本発明は、
ａ．配列番号１に記載のヌクレオチド配列と、
ｂ．配列番号１に記載のヌクレオチド配列と９５から９９％同一であるヌクレオチド配列と、
ｃ．配列番号２に記載のヌクレオチド配列と、
ｄ．配列番号２に記載のヌクレオチド配列と少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列と、
ｅ．配列番号４のアミノ酸３０〜５７９をコードするヌクレオチド配列と、
ｆ．配列番号４のアミノ酸３２〜５７９をコードするヌクレオチド配列と
からなる群から選択されたヌクレオチド配列からなる単離された核酸分子である。
【０００７】
別の態様では、本発明は、上述の単離された核酸を含むベクターである。
【０００８】
別の態様では、本発明は、上述のベクターで形質転換された宿主細胞である。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、上述のベクターで形質転換された細菌宿主細胞である。
【００１０】
別の態様では、本発明は、ＦＡＡＨポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターで大腸菌宿主細胞を形質転換させるステップと、前記ポリペプチドの発現を誘導するステップとを含み、前記発現によって、細胞培養物１リットルあたり少なくとも０．１３から５０ｍｇのＦＡＡＨポリペプチドが産生される、ＦＡＡＨタンパク質を発現させる方法である。一実施形態では、前記発現によって、細胞培養物１リットルあたり０．１３から２６ｍｇのＦＡＡＨポリペプチドが産生される。
【００１１】
別の態様では、本発明は、上述の宿主細胞を培養するステップを含む、ＦＡＡＨタンパク質を発現させる方法である。
【００１２】
別の態様では、本発明は、
ａ．宿主細胞内で異種ＦＡＡＨポリペプチドを発現させるステップと、
ｂ．界面活性剤の非存在下における少なくとも１回の超遠心分離ステップによって、前記宿主細胞の膜画分を単離するステップと
を含む、精製されたＦＡＡＨポリペプチドを生産する方法である。
【００１３】
別の態様では、本発明は、
ａ．宿主細胞内で異種ＦＡＡＨポリペプチドを発現させるステップと、
ｂ．界面活性剤の非存在下で前記宿主細胞を溶解させるステップと、
ｃ．ステップ（ｂ）の前記溶解物を低速で遠心分離し、上清を保持するステップと、
ｄ．前記上清を超遠心分離し、ペレットを保持するステップと、
ｅ．界面活性剤を含有しない緩衝液に前記ペレットを再懸濁させるステップと、
ｆ．前記再懸濁液を超遠心分離し、ペレットを保持するステップと、
ｇ．ステップ（ｆ）の前記ペレットに含まれている可溶性ポリペプチドを、非イオン性界面活性剤を含む緩衝液に前記ペレットを再懸濁させることによって可溶化するステップと、
ｈ．ステップ（ｇ）の前記再懸濁液を超遠心分離し、上清を保持するステップと、
ｉ．ステップ（ｈ）の上記上清からＦＡＡＨポリペプチドを単離するステップと
を含む、精製されたＦＡＡＨポリペプチドを生産する方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、切断型ヒトＦＡＡＨポリペプチドをコードする配列を含む核酸分子と、原核細胞宿主で組換えヒトＦＡＡＨを発現させる方法と、発現されたポリペプチドを精製する方法とを包含する。以下に記述する本発明の特定の実施形態では、核酸配列が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ））での転写用に最適化されている。ここに提示する核酸組成物には、ＦＡＡＨポリペプチドの膜貫通ドメインをコードするヌクレオチドに対応する領域の欠失を有するものが含まれる。すなわち、上記本発明の核酸組成物の発現は、膜貫通ドメインを欠失した機能的ＦＡＡＨポリペプチドを産生する。本発明の特定の実施形態では、上記ヌクレオチド組成が、原核細胞宿主での発現用にさらに最適化されている。特定の実施形態では、上記原核細胞宿主が大腸菌である。この最適化では、真核細胞の転写コドンを原核細胞の転写コドンで置換する。他の実施形態では、本発明の核酸分子は、本明細書に記載の切断型ＦＡＡＨポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列と、ＦＡＡＨポリペプチドの発現を増強するポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列とを含み、上記第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列とが作用可能に連結している。したがって、本発明は、第１の切断型ＦＡＡＨポリペプチドと、選択により含まれる第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質ならびにこれらの融合タンパク質をコードする核酸を包含する。第２のポリペプチドは切断型ＦＡＡＨの適切な折りたたみを促進することが企図されている。一実施形態では、上記第２のポリペプチドがＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子）である。例えば、Ｍａｌａｋｏｖら（２００４年）、５（１−２）：７５−８６を参照のこと。別の実施形態では、本発明の核酸分子は、第３のヌクレオチド配列をさらに含み、第３のヌクレオチド配列がコードするポリペプチドは、前記タグを含有している発現されたタンパク質の精製を容易にするポリペプチドである。一実施形態では、上記タグがヒスチジン（Ｈｉｓ）タグである。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に関するそのような実施形態では、「作用可能に連結」は、上記第１、第２、および／または第３のヌクレオチド配列を含む核酸分子の、前記ヌクレオチド配列を発現できる宿主細胞における発現によって、上記第１、第２、および／または第３のヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドを含む融合タンパク質が産生されることを意味する。上記第２および／または第３のヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドを、上記第１のヌクレオチド配列によってコードされたＦＡＡＨポリペプチドから切断してもよく、そのためのタンパク質分解性切断部位は、容易に構築できることが認められている。上記第１および／または第２のヌクレオチド配列を５’または３’末端に作用可能に連結することができることも認められている。それぞれの連結は、上記第３のヌクレオチド配列と連続していてもよいことがさらに認められている。
【００１５】
以下にさらに記述する通り、ＦＡＡＨポリペプチドの増強発現および精製の方法も提供する。上記方法は、本明細書に記載のものを含めた哺乳動物ＦＡＡＨに適用できる。
【００１６】
本発明の組成物および方法は、機能的な組換えＦＡＡＨポリペプチドを生産するのに有用である。本発明の組成物および方法は、高分解能結晶解析のため；ペプチドライブラリーおよび小分子ライブラリーのハイスループットスクリーニングを含めた、ＦＡＡＨ活性を調節する分子を求めたスクリーニングを行うため；ならびに、不安および不眠を含めた障害の治療に用いるＦＡＡＨ阻害剤の、構造に基づく設計を促進するために必要となりうる量で、上記ポリペプチドを生産するために有用である。
【００１７】
一態様では、本発明は、
ａ．配列番号１に記載のヌクレオチド配列と、
ｂ．配列番号１に記載のヌクレオチド配列に９５から９９％同一であるヌクレオチド配列と、
ｃ．配列番号２に記載のヌクレオチド配列と、
ｄ．配列番号２に記載のヌクレオチド配列に少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列と、
ｅ．配列番号４のアミノ酸３０〜５７９をコードするヌクレオチド配列と、
ｆ．配列番号４のアミノ酸３２〜５７９をコードするヌクレオチド配列と
からなる群から選択されたヌクレオチド配列からなる単離された核酸分子である。
【００１８】
配列番号１に記載のヌクレオチドは、切断型ヒトＦＡＡＨをコードする。すなわち、膜貫通ドメインである野生型ヒトＦＡＡＨのアミノ酸１〜２９が欠失しており、ヒトＦＡＡＨの細胞質ドメインに相当するアミノ酸３０〜５７９が保持されている。配列番号２に記載のヌクレオチド配列は、膜貫通ドメインであるアミノ酸１〜２９が同様に欠失しており、アミノ酸３０〜５７９が保持されている切断型ＦＡＡＨポリペプチドをコードする。さらに、配列番号２のヌクレオチド配列は、コドン使用頻度に関して、原核宿主細胞での発現用に最適化されている。配列番号２に記載のヌクレオチド配列は、配列番号１に記載の配列に少なくとも７０％同一である。
【００１９】
本発明の核酸分子は、機能的かつ可溶性のＦＡＡＨポリペプチドをコードし、上記コードされているポリペプチドは、膜貫通ドメインを欠失しており、かつ、催眠性脂肪酸１級アミドと、それらに対応する脂肪酸との間の加水分解変換を触媒する。この触媒は、野生型ＦＡＡＨの機能であり、当技術分野で知られている方法で試験することができる（Ｋａｔｈｕｒｉａ，Ｓ．ら（２００３年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９：７６−８１）；（Ｐａｔｒｉｃｅｌｌｉ，Ｍ．ら（１９９８年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：１５１７７−１５１８７）；または本明細書に記載の実施例に記述する別の方法。
【００２０】
一実施形態では、本発明は、上述の通り、ａ）からｆ）に記載されている本発明のヌクレオチド配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列からなる核酸分子を含むベクターである。
【００２１】
別の実施形態では、上記ベクターは、ヒスチジンタグをコードする核酸分子を含む。ヒスチジンタグをコードする配列は、本明細書に記載のＦＡＡＨをコードする配列の５’末端または３’末端に作用可能に連結させてよいことが認められている。ヒスチジンタグをコードするヌクレオチドと、ＦＡＡＨをコードするヌクレオチドとの間に、タンパク質分解性切断部位を作用可能に含有させてもよいことがさらに認められている。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、上記ａ）からｆ）に記載されている本発明のヌクレオチド配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列からなる核酸分子を含み、かつＳＵＭＯポリペプチド配列をコードする核酸分子をさらに含むベクターである。ＳＵＭＯをコードするヌクレオチドは、ＦＡＡＨをコードする配列の５’末端に連結させてもよい。本発明の目的では、「ＳＵＭＯ」は、低分子ユビキチン様修飾因子ポリペプチドを意味する。低発現のタンパク質のＮ末端にＳＵＭＯポリペプチドを結合させると、大腸菌でのタンパク質発現が増強される。ＳＵＭＯをコードするヌクレオチド、およびそれらを所望のコード配列に作用可能に連結させる方法は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（米国カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）所在）から入手できる。
【００２３】
本発明のこの態様における別の実施形態では、上記ベクターが、前記核酸分子に作用可能に連結したプロモーター配列をさらに含む。本発明のこの態様におけるこの実施形態および他の実施形態では、プロモーターと、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との作用可能な連結に関して、「作用可能に連結」は、上記プロモーターに結合した適当なポリメラーゼが上記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を転写するように、上記プロモーターが上記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に連結していることを意味する。当業者ならば、そのような作用可能な連結をつくる方法を容易に認識する。通常、市販されているベクターの多重クローニング部位に正しい方向性で連結されたコード配列は、そのベクターに含まれているプロモーターに作用可能に連結している。
【００２４】
本発明のこの態様における別の実施形態では、前記プロモーターが、Ｔ７プロモーターまたはＴｒｃプロモーターである。さらに別の実施形態では、前記プロモーターがＴ７プロモーターである。Ｔ７プロモーターを含有する発現プラスミドには、ｐＥＴ−９ａ、ｐＥＴ−１７ｂ、ｐＥＴ−１１ａ、ｐＥＴ−２４ａ−ｄ（＋）、ｐＥＴ−２８ａ−ｃ（＋）が含まれるが、これらに限定されない。これらは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（米国カリフォルニア州カールズバッド９２００８所在）から購入でき、本発明の実施に使用できる。プラスミドｐＥＴ−２８ａ−ｃ（＋）は、順番に、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合部位、構造遺伝子の挿入を可能にする制限部位、およびＴ７ターミネータ配列を含む。特定の実施形態では、上記宿主細菌細胞に形質移入するのに、ｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクターを用いる。Ｔｒｃプロモーターを含有する発現プラスミドも、本発明のこの態様の実施で用いることができ、限定されるものではないが、それらにはｐＴｒｃＨｉｓが含まれる。
【００２５】
一態様では、本発明は、上述のａ）からｆ）からなる群から選択されたヌクレオチド配列からなる核酸分子を含むベクターで形質転換された細菌宿主細胞である。
【００２６】
一実施形態では、上記細菌宿主細胞が大腸菌株である。限定されるものではないが、ＢＬ２１、ＢＬ２１−ＡＩ、ＢＬ２１（ＤＥ３）、および同様のものを含めた大腸菌株を、本発明の実施に使用できる。別の実施形態では、上記大腸菌株がＢＬ２１−ＡＩである。
【００２７】
一態様では、本発明は、ＦＡＡＨポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターで大腸菌宿主細胞を形質転換させるステップと、前記ポリペプチドの発現を誘導するステップとを含み、前記誘導された発現によって、細胞培養物１リットルあたり少なくとも０．１３から２６ｍｇのＦＡＡＨポリペプチドが産生される、ＦＡＡＨポリペプチドを発現させるための方法である。収率を測定する方法は、当業者によって容易に認識できるもの、および／または本明細書に記載の実施例に別途に記述するものである。
【００２８】
本発明の一実施形態では、本発明の発現方法は、細胞培養物１リットルあたり、０．１３、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ｍｇの機能的ＦＡＡＨタンパク質を産生する。別の実施形態では、上記方法は、細胞培養物１リットルあたり０．１３から２６ｍｇの機能的かつ可溶性のＦＡＡＨタンパク質を産生する。
【００２９】
一態様では、本発明は、大腸菌宿主細胞を形質転換するステップと、上述のａ）からｆ）からなる群から選択されたヌクレオチド配列からなる単離された核酸分子を含むベクターでＦＡＡＨタンパク質の発現を誘導するステップとを含む、ＦＡＡＨタンパク質を発現させる方法である。本発明の一実施形態では、上記誘導が、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、または３００μＭのＩＰＴＧの存在下で行われる。一実施形態では、上記誘導が、さらに、Ｌ−アラビノースの存在下で行われる。本発明の目的では、「ＩＰＴＧ」は、イソプロピルチオガラクトシドを意味する。別の実施形態では、上記誘導が、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、または３０℃の温度で行われる。別の実施形態では、上記誘導が、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間行われる。特定の実施形態では、上記誘導が、１００μＭ  ＩＰＴＧおよび０．２％Ｌ−アラビノースの存在下、２５℃で、１６時間行われる。
【００３０】
限定されるものではないが、ＬＢまたはＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈを含めた培地中で、形質転換された大腸菌細菌細胞を増殖させることができる。ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ培地は、トリプトン、塩化ナトリウム、酵母抽出物、および緩衝剤を含有する。特定の実施形態では、本発明のベクターは、カナマイシン耐性配列をさらに含む。したがって、一実施形態では、本発明の形質転換大腸菌を、カナマイシンの存在下、ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ培地中で増殖させる。別の実施形態では、上記カナマイシンの濃度が３０μｇ／ｍｌである。ベクターに含まれている抗生物質耐性配列と、それに対応する抗生物質との選択は、当業者が変更できるものと認められている。
【００３１】
一態様では、本発明は、
ａ．宿主細胞内で異種ＦＡＡＨポリペプチドを発現させるステップと、
ｂ．界面活性剤の非存在下における少なくとも１回の超遠心分離ステップによって、前記宿主細胞の膜画分を単離するステップと
を含む、精製されたＦＡＡＨポリペプチドを生産する方法である。「異種ＦＡＡＨポリペプチド」は、上記ポリペプチドが、前記ポリペプチドをコードする核酸で形質転換された細菌宿主細胞に自然状態で存在するものでないことを意味する。
【００３２】
本発明のこの態様における一実施形態では、ＦＡＡＨポリペプチドが、上述のａ）からｆ）からなる群から選択されたヌクレオチド配列からなる核酸分子によってコードされている。別の実施形態では、上記宿主細胞が細菌宿主細胞である。
【００３３】
一態様では、本発明は、
ａ．宿主細胞内で異種ＦＡＡＨポリペプチドを発現させるステップと、
ｂ．界面活性剤の非存在下で前記宿主細胞を溶解させるステップと、
ｃ．ステップ（ｂ）の前記溶解物を低速で遠心分離し、上清を保持するステップと、
ｄ．前記上清を超遠心分離し、ペレットを保持するステップと、
ｅ．界面活性剤を含有しない緩衝液に前記ペレットを再懸濁させるステップと、
ｆ．前記再懸濁液を超遠心分離し、ペレットを保持するステップと、
ｇ．ステップ（ｆ）の前記ペレットに含まれている可溶性ポリペプチドを、非イオン性界面活性剤を含む緩衝液に前記ペレットを再懸濁させることによって可溶化するステップと、
ｈ．ステップ（ｇ）の前記再懸濁液を超遠心分離し、上清を保持するステップと
ｉ．ステップ（ｈ）の上記上清からＦＡＡＨポリペプチドを単離するステップと
を含む、精製されたＦＡＡＨポリペプチドを生産する方法である。
【００３４】
一実施形態では、前記上清を陽イオン金属カラムに添加して、精製されたＦＡＡＨタンパク質を入手することによって、上記単離を行う。
【００３５】
本発明の一実施形態では、上記宿主細胞が細菌宿主細胞である。本発明の特定の実施形態では、上記細菌宿主細胞が大腸菌である。
【００３６】
ミクロフルイダイザーで上記細菌宿主細胞を溶解させ、その細胞膜を破壊することができる。本発明のこの態様では、「低速」は、通常、細胞片およびオルガネラを含むが、細胞膜画分を含まないペレットを生成する遠心法の速度を意味する。そのような低速遠心法のために選択された特定の速度は、可変的であり、当業者ならば容易に選択することができる。本発明の一実施形態では、上記低速遠心法が５０００×ｇで行われる。
【００３７】
本発明のこの態様では、「超遠心分離する」は、通常、細胞膜画分を含むペレットを生成する速度で、低速遠心法ステップの上清を遠心分離することを意味する。「細胞膜画分」は、本明細書で使用される場合、膜と、その内在性膜タンパク質および結合膜タンパク質とを含む画分として意図されている。本明細書で使用される場合、「内在性膜タンパク質」は、少なくとも１つの膜貫通ドメインを含むタンパク質を意味するものとする。本明細書で使用される場合、「結合膜タンパク質」は、膜貫通ドメインをもたないが、別の方法で上記細胞膜画分に含まれているタンパク質を意味するものとする。本発明の核酸によってコードされたＦＡＡＨポリペプチドは、結合膜タンパク質であると認められている。すなわち、上記ポリペプチドは膜貫通ドメインをもたず、それにもかかわらず、超遠心分離法ステップの細胞膜画分に含有される。本発明の一実施形態では、超遠心分離を、５００００〜１０００００×ｇの速度で行う。別の実施形態では、上記上清を、１０００００×ｇで１時間遠心分離する。
【００３８】
本発明の別の実施形態では、超遠心分離後に得られたペレットを保持し、界面活性剤を含まない緩衝液中に少なくとも１回再懸濁する。本発明の特定の実施形態では、超遠心分離と再懸濁とを１、２、または３回反復する。別の実施形態では、超遠心分離を３回反復する。別の実施形態では、上記緩衝液が、２０ｍＭ  ＮａＰｉ、ｐＨ７．８／１００ｍＭ  ＮａＣｌである。
【００３９】
界面活性剤は、イオン性、陽イオン性、および非イオン性の界面活性剤を包含する。非イオン性界面活性剤には、Ｂｒｉｊ、Ｉｇｅｐａｌ、Ｓａｐｏｎｉｎ、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ、ＴｒｉｔｏｎＣＦ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ、およびＴｙｌｏｘａｐａｌが含まれるが、これらに限定されない。再懸濁させたペレットに界面活性剤を添加して、膜結合タンパク質画分を遊離させる。一実施形態では、非イオン性界面活性剤がＴｒｉｔｏｎＸ−１００である。
【００４０】
本発明の一実施形態では、超遠心分離に続く前記ＦＡＡＨポリペプチドの単離がカラムクロマトグラフィーを含む。さらに別の実施形態では、上記ＦＡＡＨポリペプチドがヒスチジンタグに融合しており、上記カラムクロマトグラフィーは、陽イオンで荷電されたビーズを含むカラムの使用を含む。上記金属陽イオンは、ヒスチジンＨｉｓ−タグへの親和性を有する。したがって、Ｈｉｓ−タグ付きのヒトＦＡＡＨポリペプチドは、新生細菌膜タンパク質から分離され、金属陽イオンカラム上に保持される。この単離の後で、上記タグ付きのタンパク質は、上記カラムから容易に溶出される。
【００４１】
本発明のこの態様における別の実施形態では、上記陽イオンがニッケルである。陽イオン金属には、ニッケルまたはコバルトが含まれるが、これらに限定されない。
【００４２】
本発明を、以下の非限定的実施例で詳細に説明する。
【実施例】
【００４３】
（実施例１）
ｈＦＡＡＨプラスミドのクローニングおよび構築
既知の分子生物学的技法を用いて、本明細書に記載の構築体をクローニングおよび構築する。そのような技法は、例えば、Ｄａｖｉｓら、「Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｅｌｓｅｖｉｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、米国ニューヨーク州ニューヨーク所在、１９８６年；Ｈａｍｅｓら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、ＩＬ  Ｐｒｅｓｓ社、１９８５年；「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ社；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら編集、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ社；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」、Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編集、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ社；および「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編集、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ社で言及されている。
【００４４】
ＰＴｒｃＨｉｓ  Ａ−ｈＦＡＡＨ（ヒト（ｈ）ＦＡＡＨアミノ酸３０〜５７９をコードする）
下記のｃＤＮＡを注文合成させて、ｐＵＣ１１９ベクターにサブクローニングした（Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国ワシントン州ボセル（Ｂｏｔｈｅｌｌ）所在）。大腸菌コドン最適化を、最適化アルゴリズムを用いることによって実施した（Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国ワシントン州ボセル所在）。
−  ｐＵＣ１１９−ｈＦＡＡＨ（ｈＦＡＡＨ、アミノ酸１〜５７９をコードする）：５’−Ｘｈｏ  Ｉ部位、３’終止コドン、および３’−ＥｃｏＲ  Ｉ部位を有する、ｈＦＡＡＨ（アミノ酸１〜５７９をコードする）の大腸菌コドン最適化されたＤＮＡ配列を含有するｃＤＮＡ（配列番号６）。
−  ｐＵＣ１１９−ｈＦＡＡＨ（ｈＦＡＡＨ、アミノ酸３０〜１０５をコードする）：５’−Ｘｈｏ  Ｉ部位および３’−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位を有する、ｈＦＡＡＨ（アミノ酸３０〜１０５）の大腸菌コドン最適化されたＤＮＡ配列を含有するｃＤＮＡ（配列番号７）。
【００４５】
ｐＵＣ１１９−ｈＦＡＡＨ（ｈＦＡＡＨ、アミノ酸１〜５７９をコードする）をＸｈｏ  Ｉ−ＥｃｏＲ  Ｉで消化し、この挿入配列を、Ｘｈｏ  Ｉ−  ＥｃｏＲ  Ｉで消化されたｐＴｒｃＨｉｓ  Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ＃Ｖ３６０−２０）中にサブクローニングし、ｐＴｒｃＨｉＮＨｉｓ  Ａ−ｈＦＡＡＨ（アミノ酸１〜５７９をコードする）を生成させた。ｐＴｒｃＨｉｓ  Ａ−ｈＦＡＡＨベクターをＸｈｏ  Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで消化し、その結果得られたＸｈｏ  Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ片（約４．５ｋｂ）およびＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ片（約１．５ｋｂ）を、ｐＵＣ１１９−ｈＦＡＡＨ（アミノ酸３０〜１０５をコードする）構築体をＸｈｏ  Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで消化することから生成されたＸｈｏ  Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ断片（２２５ｂｐ）と連結させ、ＮＨ２末端にＨｉｓタグを有するｐＴｒｃＨｉｓ  Ａ−ｈＦＡＡＨ（アミノ酸３０〜５７９をコードする）を生成させた。
【００４６】
ｐＥＴ２８ａ−ｈＦＡＡＨ（ｈＦＡＡＨ、アミノ酸３２〜５７９をコードする）
原核細胞発現ベクターであるｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社、カタログ＃６９８６４−３）にサブクローニングするためのヒトＦＡＡＨ構築体を、下記のプライマーを用いた、ｐＴｒｃＨｉｓ  Ａ−ｈＦＡＡＨ（アミノ酸３０〜５７９）構築体からのＰＣＲによって生成させた。センスプライマー、５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＴＣＡＧＧＴＣＧＴＣＧＴＡＣＣＧＣＡＣＧＴＧ−３’（配列番号８）；およびアンチセンスプライマー、５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＧＡＧＧＡＴＴＧＴＴＴ  ＴＴＣＣＧＧＡＧＴＣＡＴ−３’（配列番号９）。この結果得られたＰＣＲ産物を、Ｎｄｅ  Ｉ−Ｘｈｏ  Ｉで消化し、Ｎｄｅ  Ｉ−Ｘｈｏ  Ｉ消化されたｐＥＴ２８ａ（＋）ベクターにサブクローニングして、ＮＨ２末端にＨｉｓタグを有するｐＥＴ２８ａ−ｈＦＡＡＨ（アミノ酸３２〜５７９をコードする）を生成させた。
【００４７】
ｐＥＴ−ＳＵＭＯ−ｈＦＡＡＨ（ｈＦＡＡＨをコードするアミノ酸３０〜５７９）
原核細胞発現ベクターであるｐＥＴ−ＳＵＭＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ＃Ｋ３００−０１）にサブクローニングするためのヒトＦＡＡＨ構築体を、下記のプライマーを用いた、ｐＥＴ２８ａ−ｈＦＡＡＨ（アミノ酸３２〜５７９）構築体からのＰＣＲによって生成させた。センスプライマー、５’−ＣＧＴＴＧＧＴＣＡＧＧＴＣＧＴＣＧＴＡＣＣＧＣＡＣＧ−３’（配列番号１０）；およびアンチセンスプライマー、５’−ＴＴＡＴＧＡＧＧＡＴＴＧＴＴＴＴＴＣＣＧＧＡＧＴＣ−３’（配列番号１１）。この結果得られたＰＣＲ産物を、ＴＡクローニングによって、製造業者の指示に従って、ｐＥＴ−ＳＵＭＯベクターにサブクローニングし、ＮＨ２末端にＨｉｓタグおよびＳＵＭＯタグを有するｐＥＴ−ＳＵＭＯ−ｈＦＡＡＨ（ヒトアミノ酸３０〜５７９をコードする）を生成させた。
【００４８】
ヒトＦＡＡＨ構築体の概要
ｐＴｒｃＨｉｓ  Ａ−ｈＦＡＡＨは、ｈＦＡＡＨのアミノ酸（３０〜５７９）、すなわち
ＭＧＧＳＨＨＨＨＨＨＧＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＲＴＬＹＤＤＤＤＫＤＲＷＧＳＥＬＥ−−−−ｈＦＡＡＨ
をコードする。
【００４９】
ｐＥＴ２８ａ−ｈＦＡＡＨは、ｈＦＡＡＨのアミノ酸（３２〜５７９）、すなわち
ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭ−−−−ｈＦＡＡＨ
をコードする。
【００５０】
ｐＥＴ−ＳＵＭＯ−ｈＦＡＡＨは、ｈＦＡＡＨのアミノ酸（３０〜５７９）、すなわち
ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＧＳＧＬＶＰＲＲＧＳＡＳＭＳＤＳＥＶＮＱＥＡＫＰＥＶＫＰＥＶＫＰＥＴＨＩ
ＮＬＫＶＳＤＧＳＳＥＩＦＦＫＩＫＫＴＴＰＬＲＲＬＭＥＡＦＡＫＲＱＧＫＥＭＤＳＬＲＦＬＹＤＧＩＲＩＱＡＤＱＴＰＥＤＬＤＭＥ
ＤＮＤＩＩＥＡＨＲＥＱＩＧＧ−−−−ｈＦＡＡＨ
をコードする。
【００５１】
「−−−−」は、アミノ酸位置を表すものではない。示されているｈＦＡＡＨ位置それぞれは、明確に示されているＨＨＨＨＨＨを含むリーディングアミノ酸配列と連続していた。
【００５２】
（実施例２）
切断型ｈＦＡＡＨの発現
「ＲＴ」は、通常、２５℃±３°である室温を示す。
【００５３】
野生型ヒトＦＡＡＨのアミノ酸３２〜５７９に対応するアミノ酸をコードするｐＥＴ２８ａ−ｈＦＡＡＨ構築体を、大腸菌ＢＬ２１−ＡＩで発現させた。この培養物を、３０μｇ／ｍｌカナマイシンの存在下、ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ培地中、３７℃で増殖させ、ＯＤ６００が０．６〜０．６５のときに、ＲＴまたは３０℃で、１００μＭ  ＩＰＴＧおよび０．２％Ｌ−アラビノースを用いて誘導を行った。この実施例の条件下で、ヒトＦＡＡＨの最適な発現は、ＲＴで２０時間誘導した後に得られた。
【００５４】
（実施例３）
ＳＵＭＯ構築体を用いた切断型ｈＦＡＡＨの発現
野生型ヒトＦＡＡＨのアミノ酸３０〜５７９に対応するアミノ酸をコードするｐＥＴ−ＳＵＭＯ−ｈＦＡＡＨ構築体を、大腸菌ＢＬ２１−ＡＩで発現させた。この培養物を、３０μｇ／ｍｌカナマイシンの存在下、ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ培地中、３７℃で増殖させ、ＯＤ６００が０．６〜０．６５のときに、ＲＴで、１００μＭ  ＩＰＴＧおよび０．２％Ｌ−アラビノースを用いて誘導を行った。この実施例の条件下では、１６時間で最適な発現を得た。
【００５５】
時間経過計測を行うために、１０ｍｌの培養物を所望の時点に取り出し、５０００×ｇでペレットにした。これらの細胞を、１０ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁し、５０００×ｇでの遠心分離によって採集することによって洗浄した。これらの細胞を、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有している０．５ｍｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭ  ＮａＰｉ、ｐＨ７．８／１００ｍＭ  ＮａＣｌ）に再懸濁し、最終濃度１ｍｇ／ｍｌのリソチームを添加した。氷上、３０分間のインキュベーションの後に、溶解物を、１０秒間のパルスで超音波処理し、１００００×ｇで３０分間、遠心分離した。この結果得られた上清を、以下に記述するＦＡＡＨ活性アッセイまたはウエスタンブロットによって、ＦＡＡＨ発現を分析するのに用いた。
【００５６】
ＦＡＡＨ活性アッセイ
ＦＡＡＨアッセイは、以前の記載（Ｏｍｅｉｒ，Ｒ．ら（１９９５年）、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５６：１９９９−２００５）に従い、それにいくつかの変更を加えて行った。通常の反応は、ポリプロピレンチューブ中、全容積２００μｌで行った。６７％エタノール中に溶解させた１５μｌの［３Ｈ］アナンダミド（４００００ｃｐｍ）を、ＮａＰｉ、ｐＨ７．４、およびＥＤＴＡを含有する反応混合物（１６５μｌ）に添加した。酵素反応を開始するために、２０ｍＭ  ＮａＰｉ、ｐＨ７．４／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する緩衝液中に希釈したＦＡＡＨ溶液２０μｌを添加した。ＮａＰｉ、ｐＨ７．４、ＥＤＴＡ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、および基質の最終濃度は、それぞれ５０ｍＭ、１ｍＭ、０．０７５％、および１０μＭであった。３７℃、１時間のインキュベーションの後に、反応を停止させ、その産物を有機溶剤抽出（４００μｌ、クロロホルム：メタノール、１：１）によって分離した。混合物を徹底的にボルテックスし、１００００×ｇで１０分間、遠心分離した。［３Ｈ］エタノールアミンを含有する水層（２００μｌ）をシンチレーションカウンターによって定量した。
【００５７】
（実施例４）
ｈＦＡＡＨの精製
ヒトＦＡＡＨプラスミドであるｐＥＴ２８ａ−ｈＦＡＡＨで大腸菌ＢＬ２１−ＡＩ株を形質転換させた。新たに形質転換された発現株の２リットル培養物を、３０μｇ／ｍｌカナマイシンの存在下、ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ培地中、３７℃で増殖させた。ＯＤ６００が約０．１２のときに、培養物をＲＴに移し、ＯＤ６００が０．６〜０．６５のときに、１００μＭ  ＩＰＴＧおよび０．２％Ｌ−アラビノースを用いて、ＲＴで２０時間、誘導した。別段の記述がない限り、以下におけるすべての操作が、４℃で行われたものである。その後、細胞を５０００×ｇの遠心分離によって採取し、細胞ペレットを、７００ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、５０００×ｇの遠心分離で採取することによって洗浄した。この時点で、細胞ペーストを冷凍して、必要になるまで−８０℃で保存してもよい。撹拌しながら、細胞を１００ｍｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭ  ＮａＰｉ、ｐＨ７．８／１００ｍＭ  ＮａＣｌ）に再懸濁した。５００単位のｂｅｎｚｏｎａｓｅを添加した後に、さらに１５分間、細胞懸濁液を撹拌し、その後、製造業者の指示に従って、ミクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社、米国マサチューセッツ州ニュートン（Ｎｅｗｔｏｎ）所在）に通すことによって細胞を溶解させた。５０００×ｇ、２０分間の遠心分離によって細胞片を除去し、上清を１０００００×ｇで１時間、遠心分離した。この結果得られたペレットを１００ｍｌの緩衝液Ａに再懸濁し、再度、１０００００×ｇで１時間、遠心分離した。最終のステップをさらに２回反復した後に、ペレットを８０ｍｌの緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  ＮａＰｉ、ｐＨ７．８／５００ｍＭ  ＮａＣｌ／１％ＴｒｉｔｏｎＸ）に再懸濁し、１０００００×ｇで１時間、遠心分離した。この結果得られた上清を、緩衝液Ｂで平衡化してあった１ｍｌのＮｉカラムに０．５〜１ｍｌ／分で添加した。カラムを２０ｍｌの緩衝液Ｂ、０．２ｍｌ／分で洗浄した。２０ｍＭのイミダゾールを含有する１０ｍｌの緩衝液Ｂを用いて、次いで、５０ｍＭのイミダゾールを含有する１０ｍｌの緩衝液Ｂを用いて、カラムを０．２ｍｌ／分でさらに洗浄した。溶出は、２０ｍｌの勾配（緩衝液Ｂ、５０〜２００ｍＭイミダゾール）、０．２ｍｌ／分で行った。１ｍｌの画分を収集した。直ちに、ピーク画分を緩衝液Ｃ（２０ｍＭ  ＮａＰｉ、ｐＨ７．８／５００ｍＭ  ＮａＣｌ）に対して、終夜、透析した。クーマシーブルー染色で可視化したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％勾配）は、図１に示す通り（ｈＦＡＡＨと標識されている）、発現されたｈＦＡＡＨに対応する支配的な単一バンドの存在を明らかにした。
【００５８】
（実施例５）
ＳＵＭＯ−ｈＦＡＡＨの精製
ｐＥＴ−ＳＵＭＯ−ｈＦＡＡＨを得るために、ｐＥＴ２８ａ−ｈＦＡＡＨに関して上述したのと同様に、但し、誘導は２０時間ではなく１６時間行い、ｐＥＴ−ＳＵＭＯ−ｈＦＡＡＨを用いて２リットルの培養物を調製した。ＳＵＭＯ−ＦＡＡＨの精製は、ｐＥＴ２８ａ−ｈＦＡＡＨの精製に関して上述したものと同じ手順を用い、それに以下の変更を加えて行った。４０ｍｌの勾配（緩衝液Ｂ、５０〜３５０ｍＭイミダゾール）を用いて、５ｍｌのＮｉカラムからの溶出を行った。クーマシーブルー染色で可視化したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％勾配）は、図１に示す通り（ＳＵＭＯ−ｈＦＡＡＨと標識されている）、発現されたＳＵＭＯ融合ｈＦＡＡＨに対応する支配的な単一バンドの存在を明らかにした。
【００５９】
【表１】
2008529481.tif 000003
【００６０】
上記方法に記載した条件下において、ｐＴｒｃＨｉｓ  Ａベクタープロモーターに作用可能に連結した、ヒトＦＡＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチドは、培養物１リットルあたり０．１３〜０．２３ｍｇのＦＡＡＨを産生した。ｐＥＴ２８ａベクタープロモーターに作用可能に連結した、ヒトＦＡＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチドは、培養物１リットルあたり２．５〜４．５ｍｇのＦＡＡＨを産生した。ＳＵＭＯ融合タンパク質およびｐＥＴベクタープロモーターに作用可能に連結した、ヒトＦＡＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチドは、培養物１リットルあたり１４〜２６ｍｇのＦＡＡＨを産生した。
【００６１】
（実施例６）
切断型ラット（ｒ）ＦＡＡＨのクローニング、発現、および精製
ｐＴｒｃＨｉｓ  Ａ−ｒＦＡＡＨの（アミノ酸３２〜５７９）：ｒＦＡＡＨのアミノ酸３２〜５７９（配列番号３の残基７から最後までによってコードされている）をコードするラットＦＡＡＨ  ｃＤＮＡを、下記のプライマーを用いて、ラット脳のＱｕｉｃｋ−ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡライブラリー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）から増幅させた。センスプライマー、５’−ＧＣＣＴＣＧＡＧＡＣＣＧＧＧＣＧＣＣＡＧＡＡＧＧ−３’（配列番号１２）；およびアンチセンスプライマー、５’−ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＧＡＴＧＧＣＴＧＣ  ＴＴＴＴＧＡＧＧ−３’（配列番号１３）。この結果得られたＰＣＲ産物を、Ｘｈｏ  Ｉ−ＥｃｏＲ  Ｉで消化し、Ｘｈｏ  Ｉ−ＥｃｏＲ  Ｉ消化されたｐＴｒｃＨｉｓ  Ａベクターにサブクローニングして、ＮＨ２末端にＨｉｓタグを有するｐＴｒｃＨｉｓ  Ａ−ｒＦＡＡＨ（アミノ酸３２〜５７９）を生成させた。
【００６２】
ｐＥＴ２８ａ−ｒＦＡＡＨ（ラットＦＡＡＨのアミノ酸３０〜５７９は配列番号３によってコードされている）：原核細胞発現ベクターであるｐＥＴ２８ａ（＋）にサブクローニングするためのラットＦＡＡＨ構築体を、下記のプライマーを用いた、ｐＴｒｃＨｉｓ  Ａ−ｒＦＡＡＨ（アミノ酸３２〜５７９）構築体からのＰＣＲによって生成させた。センスプライマー、５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＡＧＣＣＧＡＴＧＧＡＣＣＧＧＧＣＧＣＣＡＧＡＡＧＧＣ−３’（配列番号１４）；およびアンチセンスプライマー、５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＧＡＴＧＧ  ＣＴＧＣＴＴＴＴＧＡＧＧＧＧＴＣ−３’（配列番号１５）。
【００６３】
この結果得られたＰＣＲ産物を、Ｎｈｅ  Ｉ−Ｘｈｏ  Ｉで消化し、Ｎｈｅ  Ｉ−Ｘｈｏ  Ｉ消化されたｐＥＴ２８ａ（＋）ベクターにサブクローニングして、ＮＨ２末端にＨｉｓタグを有するｐＥＴ２８ａ−ｒＦＡＡＨ（アミノ酸３０〜５７９をコードする）を生成させた。
【００６４】
上述の方法を用いて、切断型ｒＦＡＡＨ配列を含む構築体を作製した。これらの構築体を用い、上述したものと同様な方法によって、上記ｒＦＡＡＨを発現、精製、およびアッセイした。ｒＦＡＡＨを用いて得られた結果を表２にまとめる。クーマシーブルー染色で可視化したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％勾配）は、図１に示す通り（ｒＦＡＡＨと標識されている）、発現されたｒＦＡＡＨに対応する支配的な単一バンドの存在を明らかにした。
【００６５】
【表２】
2008529481.tif 000004
【００６６】
上記に言及したすべての出版物を、参照により全体として本明細書に援用する。
【００６７】
配列表の説明：
配列番号１  野生型ヒト（ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎ）ＦＡＡＨのアミノ酸３０〜５７９をコードするヌクレオチド配列。
配列番号２  大腸菌発現用に最適化されている、ヒトＦＡＡＨのアミノ酸３０〜５７９をコードするヌクレオチド配列。
配列番号３  完全長ラットＦＡＡＨのアミノ酸３０〜５７９をコードするヌクレオチド配列。
配列番号４  野生型ヒトＦＡＡＨのアミノ酸配列。
配列番号５  完全長ラットＦＡＡＨ（アミノ酸１〜５７９）をコードするヌクレオチド配列。
配列番号６  ５’−Ｘｈｏ  Ｉ部位、３’終止コドン、および３’−ＥｃｏＲ  Ｉ部位を有する、ｈＦＡＡＨ（アミノ酸１〜５７９）の大腸菌コドン最適化配列のＤＮＡ配列。
配列番号７  ５’−Ｘｈｏ  Ｉ部位および３’−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位を有する、ｈＦＡＡＨ（アミノ酸３０〜１０５）の大腸菌コドン最適化配列のＤＮＡ配列。
配列番号８〜１５  プライマー。
配列番号１６  野生型ヒトＦＡＡＨをコードするヌクレオチド配列。
配列番号１７  ｈＦＡＡＨのアミノ酸３０〜５７９と連結して発現させた、ｐＴｒｃＨｉｓＡ−ｈＦＡＡＨによってコードされているアミノ酸配列。
配列番号１８  ｈＦＡＡＨのアミノ酸３２〜５７９と連結して発現させた、ｐＥＴ２８ａ−ｈＦＡＡＨによってコードされているアミノ酸配列。
配列番号１９  ｈＦＡＡＨのアミノ酸３０〜５７９と連結して発現させた、ｐＥＴ−ＳＵＭＯ−ｈＦＡＡＨによってコードされているアミノ酸配列。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】クーマシーブルー染色による推定で９８％超の純度を有するヒトＦＡＡＨ、ＳＵＭＯ−ヒトＦＡＡＨ、およびラットＦＡＡＨを示す図である。
【図１】
2008529481.tif 000006
【配列表】
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【国際調査報告】
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