(57)【要約】  本発明は、心臓血管疾患を治療する医薬品を製造するための、ＴＲＰＣチャンネル、それらの不活性化した突然変異体、または、ＴＲＰＣチャンネルもしくは不活性化した突然変異体をコードするヌクレオチド配列の使用、および、ＴＲＰＣチャンネルまたはそれらの不活性化した突然変異体に対する調節因子のスクリーニング方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
心臓血管疾患を治療する医薬品を製造するための、ＴＲＰＣチャンネル、それらの不活性化した突然変異体、または、ＴＲＰＣチャンネルもしくは不活性化した突然変異体をコードするヌクレオチド配列の使用。
【請求項２】
ＴＲＰＣチャンネルは、ＴＲＰＣ３チャンネル、ＴＲＰＣ６チャンネル、および／または、ＴＲＰＣ７チャンネルから選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ＴＲＰＣ３のアミノ酸配列は、配列番号１に記載のアミノ酸配列であり、ＴＲＰＣ６のアミノ酸配列は、配列番号５に記載のアミノ酸配列であり、ＴＲＰＣ７のアミノ酸配列は、配列番号９に記載のアミノ酸配列である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
不活性化した突然変異体は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するＴＲＰＣ３DN、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するＴＲＰＣ６DN、または、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有するＴＲＰＣ７DNである、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
ＴＲＰＣ３をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２に記載のヌクレオチド配列であり、ＴＲＰＣ６のヌクレオチドの配列は、配列番号６に記載のヌクレオチド配列であり、ＴＲＰＣ７のヌクレオチドの配列は、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列である、請求項２に記載の使用。
【請求項６】
ＴＲＰＣ３DNをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４に記載のヌクレオチド配列であり、ＴＲＰＣ６DNをコードするヌクレオチド配列は、配列番号８に記載のヌクレオチド配列であり、ＴＲＰＣ７DNをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列である、請求項４に記載の使用。
【請求項７】
心臓血管疾患を治療するための医薬品としてのＴＲＰＣチャンネルの調節因子を発見するための、ＴＲＰＣチャンネル、それらの不活性化した突然変異体、または、ＴＲＰＣチャンネルもしくは不活性化した突然変異体をコードするヌクレオチド配列の使用。
【請求項８】
ＴＲＰＣチャンネルは、ＴＲＰＣ３チャンネル、ＴＲＰＣ６チャンネル、および／または、ＴＲＰＣ７チャンネルから選択される、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
ＴＲＰＣ３のアミノ酸配列は、配列番号１に記載のアミノ酸配列であり、ＴＲＰＣ６のアミノ酸配列は、配列番号５に記載のアミノ酸配列であり、ＴＲＰＣ７のアミノ酸配列は、配列番号９に記載のアミノ酸配列である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
不活性化した突然変異体は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するＴＲＰＣ３DN、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するＴＲＰＣ６DN、または、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有するＴＲＰＣ７DNである、請求項８に記載の使用。
【請求項１１】
ＴＲＰＣ３をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２に記載のヌクレオチド配列であり、ＴＲＰＣ６のヌクレオチドの配列は、配列番号６に記載のヌクレオチド配列であり、ＴＲＰＣ７のヌクレオチドの配列は、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列である、請求項８に記載の使用。
【請求項１２】
ＴＲＰＣ３DNをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４に記載のヌクレオチド配列であり、ＴＲＰＣ６DNをコードするヌクレオチド配列は、配列番号８に記載のヌクレオチド配列であり、ＴＲＰＣ７DNをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
ＴＲＰＣチャンネル、それらの不活性化した突然変異体、または、ＴＲＰＣチャンネルもしくは不活性化した突然変異体をコードするヌクレオチド配列と、試験化合物とを接触させ、ＴＲＰＣチャンネル、それらの不活性化した突然変異体、または、ＴＲＰＣチャンネルもしくは不活性化した突然変異体をコードするヌクレオチド配列に対する試験化合物の影響を測定するか、または、検出する、請求項５〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
心臓血管疾患は、アテローム性動脈硬化症である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
ＴＲＰＣチャンネル、または、それらの不活性化した突然変異体、または、ＴＲＰＣチャンネルまたは不活性化した突然変異体をコードするヌクレオチド配列の調節因子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＴＲＰＣまたはそれらの不活性化した突然変異体を発現する細胞を接触させる工程、
（ｂ）該細胞と試験化合物とを接触させる前に、それと同時に、または、その後に、チャンネルの活性化因子によって、Ｃａ2+流入を刺激する工程、および、
（ｃ）ＴＲＰＣチャンネルの活性の変化を測定または検出する工程、
を含む、上記方法。
【請求項１６】
（ｄ）試験化合物の非存在下でＴＲＰＣチャンネルの活性の変化を比較することによって、心臓血管疾患に対する活性を有する試験化合物を選択する工程
をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
細胞におけるＴＲＰＣチャンネル、または、それらの不活性化した突然変異体の発現は、誘導性プロモーターによって制御される、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
誘導性プロモーターは、テトラサイクリン誘導性プロモーターから選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
細胞は、蛍光細胞である、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
細胞は、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＢＨＫ、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３、または、ＣＨＯ細胞から選択される、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ＴＲＰＣチャンネルの活性は、イオンの流れ、特にＣａ2+の流れにおける変化を測定または検出することによって測定または検出され、該測定または検出は、好ましくはパッチクランプ技術、全細胞電流、放射標識したイオンの流れ、または、特に蛍光、好ましくは電位感受性色素またはイオン感受性色素を用いた蛍光によってなされる、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
チャンネルの活性化因子は、ジアシルグリセロール、特に１−オレイル−２アセチル−ｓｎ−グリセロール（ＯＡＧ）、Ｇq共役受容体アゴニスト、特にフェニレフリン、特にトリプシン、受容体チロシンキナーゼを刺激するアゴニスト、特に上皮増殖因子（ＥＧＦ）、または、ジアシルグリセロールを生成する酵素、特にホスホリパーゼ、または、それらの活性化因子から選択される化合物である、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ＴＲＰＣは、ＴＲＰＣ３、ＴＲＰＣ６、ＴＲＰＣ７、または、それらの不活性化した突然変異体から選択される、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
不活性化した突然変異体は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するＴＲＰＣ３DN、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するＴＲＰＣ６DN、または、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有するＴＲＰＣ７DNである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
試験化合物は、化学物質ライブラリーの形態で提供される、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
方法は、アレイ上で行われる、請求項１５〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
方法は、ロボットシステムで行われる、請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
方法は、試験化合物をハイスループットスクリーニングする方法である、請求項１５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
検出された試験化合物は、阻害因子である、請求項１５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
細胞は、マルチウェルの試験プレートのウェル上にシーディングされる、請求項１５〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
心臓血管疾患を治療するための医薬品の製造方法であって：
（ａ）請求項１５〜３０のいずれか一項に記載の方法を行う工程、
（ｂ）心臓血管疾患を治療するのに適した検出された試験化合物を単離する工程、および、
（ｃ）該検出された試験化合物を、１またはそれ以上の製薬上許容できるキャリアーまたは補助剤と共に製剤化する工程、
を含む、上記方法。
【請求項３２】
心臓血管疾患は、アテローム性動脈硬化症である、請求項１５〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心臓血管疾患を治療する医薬品を製造するための、ＴＲＰＣチャンネル、それらの不活性化した突然変異体、または、ＴＲＰＣチャンネルもしくは不活性化した突然変異体をコードするヌクレオチド配列の使用、ならびに、ＴＲＰＣチャンネル、または、それらの不活性化した突然変異体の調節因子をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
西欧諸国において、アテローム性動脈硬化症は心臓血管疾患の主要な原因の１つである。２００１年において、米国では、これらの病気が約１百万人の死亡原因となっている。その上、発展途上国における生活様式の変化のために、アテローム性動脈硬化症や関連する心臓血管疾患が世界的に蔓延しつつある。ＷＨＯの報告では、２０１０年までに、心臓血管疾患が発展途上世界における主な死亡原因になると予想している。
【０００３】
従って、アテローム性動脈硬化症を予防および治療する新しい医薬品に対する莫大な医学上の必要性がある。アテローム性動脈硬化症の発生と進行は複雑であり、そのプロセスは多数の後天的な要因（例えば、生活様式、栄養、運動）、および、遺伝的な要因に依存しており、十分理解されていない。多数の臨床的な観察から、アテローム性動脈硬化症およびアテローム発生の病態生理学に、血管の内壁を覆う内皮細胞の機能不全が関与している（Ｒｏｓｓ, Ｒ．Ｎ．（１９９９），Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４０：１１５〜１２６）。
【０００４】
それゆえに、内皮機能の調節に関与するタンパク質は、抗アテローム性動脈硬化症治療の一次標的となり得る。酸化窒素（ＮＯ）の生産のような重要な内皮機能は、細胞内Ｃａ2+のレベルで制御されるために、Ｃａ2+調節タンパク質が特に興味深いと考えられる。
【０００５】
ＴＲＰＣチャンネルは、イオンチャンネルタンパク質の新規のクラスであるが、これらは、Ｃａ2+透過性の非選択的なカチオンチャンネルであり、心臓血管系などの系で発現される。配列相同性に基づき、ＴＲＰＣ３、ＴＲＰＣ６およびＴＲＰＣ７は、別個のＴＲＰＣサブファミリーを構成する。発現系において、これらのチャンネルは、Ｇタンパク質共役受容体、または、細胞内の貯蔵Ｃａ2+の枯渇によって活性化される（Ｃｌａｐｈａｍ等（２００１），Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：３８７〜３９６）。また、ＴＲＰＣ３は、培養内皮細胞において、酸化的ストレスで活性化されたカチオン電流に寄与する可能性もある（Ｂａｌｚｅｒ等（１９９９）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．４２：５４３〜５４９）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
平滑筋細胞におけるＴＲＰＣ１の機能的役割を研究するために、ＷＯ０２／０５９１５５では、ＴＲＰＣ１の特異的なエピトープに対する抗体が用いられている。しかしながら、このエピトープは、他のＴＲＰＣチャンネルでは見出されていない。ＷＯ０５／０４９０８４は、化合物２−アミノエトキシジフェニルボラート（２−ＡＰＢ）を用いた、単離したラット心室の筋細胞に関する機能的な研究を開示している。しかしながら、この化合物は、特にＴＲＰＣ３に対して非特異的で疑わしい作用を示すことが知られている（ｖａｎ  Ｒｏｓｓｕｍ等（２０００），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ.，２７５，２８５６２〜２８５６８）。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
我々は、本発明に従って、遺伝学的なアプローチを用いて、インビボで、アテローム性動脈硬化症のウサギの内皮細胞におけるＴＲＰＣ３、ＴＲＰＣ６およびＴＲＰＣ７活性を抑制した。驚くべきことに、我々は、ドミナントネガティブのＴＲＰＣ３遺伝子で処理した血管において、血管の機能の劇的な改善、および、アテローム性動脈硬化症の組織学的なマーカーの減少を見出し、これは、ＴＲＰＣチャンネル（具体的には上述のチャンネル）の活性を抑制することと、抗アテローム性動脈硬化症の作用を示すことを意味する。これらの発見により、ＴＲＰＣチャンネルと、アテローム性動脈硬化症のような心臓血管疾患との新規の関連が確立される。
【０００８】
それゆえに、本発明の主題の一つは、心臓血管疾患、具体的にはアテローム性動脈硬化症を治療する医薬品を製造するための、ＴＲＰＣチャンネル、それらの不活性化した突然変異体、または、ＴＲＰＣチャンネルもしくは不活性化した突然変異体をコードするヌクレオチド配列の使用に向けられる。
【０００９】
好ましいＴＲＰＣチャンネルは、ＴＲＰＣ３チャンネル、ＴＲＰＣ６チャンネル、または、ＴＲＰＣ７チャンネルであり、具体的にはＴＲＰＣ３チャンネル、または、ＴＲＰＣ６チャンネルであり、特にＴＲＰＣ３チャンネルである。
【００１０】
それに対応するアミノ酸配列は、配列番号１（ＴＲＰＣ３）、配列番号５（ＴＲＰＣ６）、および、配列番号９（ＴＲＰＣ７）であり、具体的には、ＴＲＰＣ３チャンネルをコードする配列番号１のアミノ酸配列である。それに対応するヌクレオチド配列は、配列番号２（ＴＲＰＣ３）、配列番号６（ＴＲＰＣ６）、および、配列番号１０（ＴＲＰＣ７）であり、具体的にはＴＲＰＣ３チャンネルをコードする配列番号２のヌクレオチド配列である。
【００１１】
本発明に係る用語「不活性化した突然変異体」は、カチオンチャンネルとして機能的に不活性だが、相同な天然に存在するＴＲＰＣチャンネルのチャンネル活性を抑制することができる突然変異体を意味する。天然の多量体チャンネルからなる集合体において、細胞膜中の実質的に全ての天然に存在するＴＲＰＣチャンネルに、突然変異体チャンネルのサブユニットを含ませるか、または、突然変異体チャンネルで全て置換させるような作用によって、相同なＴＲＰＣチャンネルのサブユニットを置換することにより抑制が達成されると思われる。チャンネルのサブユニットを不活性にする突然変異は、好ましくは、ＴＲＰＣ３の孔領域（配列番号１におけるアミノ酸６０３〜６４５）、ＴＲＰＣ６の孔領域（配列番号５におけるアミノ酸６６０〜７０５）、および、ＴＲＰＣ７の孔領域（配列番号９におけるアミノ酸６１０〜６５０）内に位置するものが可能である。具体的な例は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する突然変異体ＴＲＰＣ３チャンネル（ＴＲＰＣ３DN）、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する突然変異体ＴＲＰＣ６チャンネル（ＴＲＰＣ６DN）、および、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する突然変異体ＴＲＰＣ７チャンネル（ＴＲＰＣ７DN）である。ＴＲＰＣ３DNをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４に記載のヌクレオチド配列であり；ＴＲＰＣ６DNをコードするヌクレオチド配列は、配列番号８に記載のヌクレオチド配列であり、ＴＲＰＣ７DNをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列である。特に好ましい例は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するドミナントネガティブ突然変異体ＴＲＰＣ３DNである。ＴＲＰＣ３DNをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４に記載のヌクレオチド配列である。
【００１２】
さらに、「不活性化した突然変異体」は、タンパク質合成、または、原形質膜への輸送のあらゆる工程で、天然に存在するＴＲＰＣチャンネルと相互作用することによって天然に存在するＴＲＰＣチャンネルの機能抑制する能力を保持するＴＲＰＣ３、ＴＲＰＣ６またはＴＲＰＣ７のいずれか一部分からなっていてもよい。このような部分は、例えばＴＲＰＣ３のアミノ酸０〜３０２（配列番号１）であり得る（Ｂａｌｚｅｒ等（１９９９）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．４２：５４３〜５４９を参照）。
【００１３】
不活性化した突然変異体は、全細胞のパッチ・クランプ法を用いて（例証として実施例で説明した）、検出および／または解析することができる。
【００１４】
本発明のその他の主題は、心臓血管疾患、具体的にはアテローム性動脈硬化症を治療するための医薬品として、ＴＲＰＣチャンネルの調節因子、具体的には阻害因子を発見するための、ＴＲＰＣチャンネル、それらの不活性化した突然変異体、または、ＴＲＰＣチャンネルもしくは不活性化した突然変異体をコードするヌクレオチド配列の使用に向けられる。
【００１５】
好ましいＴＲＰＣチャンネルは、上記で詳述したような、ＴＲＰＣ３チャンネル、ＴＲＰＣ６チャンネル、または、ＴＲＰＣ７チャンネルであり、具体的にはＴＲＰＣ３チャンネル、または、ＴＲＰＣ６チャンネルであり、特にＴＲＰＣ３チャンネルである。
【００１６】
一般的に、ＴＲＰＣチャンネル、または、それらの不活性化した突然変異体、または、ＴＲＰＣチャンネル、または、それらの不活性化した突然変異体をコードするヌクレオチド配列と、試験化合物とを接触させ、ＴＲＰＣチャンネル、それらの不活性化した突然変異体、または、ＴＲＰＣチャンネルもしくは不活性化した突然変異体をコードするヌクレオチド配列に対する試験化合物の影響を測定するか、または、検出する。
【００１７】
本発明に係る用語「ＴＲＰＣチャンネルの調節因子」は、ＴＲＰＣチャンネルを調節する分子（「調節因子」）を意味し、具体的には、阻害分子または活性化分子（「阻害因子」または「活性化因子」）であり、特に、本発明の分析に従って同定可能なＴＲＰＣチャンネルの阻害因子である。阻害因子とは、一般的には、例えば、結合して、好ましくは上記で詳述したようなＴＲＰＣチャンネルの少なくとも１種の活性または発現を、部分的もしくは完全にブロックする。減少する、抑制する、活性化を遅延する、不活性化する、脱感作する、または、ダウンレギュレートする化合物である。活性化因子とは、一般的に、例えば、好ましくは上記で詳述したようなＴＲＰＣチャンネルの少なくとも１種の活性または発現を高める、開口する、活性化する、促進する、活性化を強化する、感度を高める、作動させる、または、アップレギュレートする化合物である。このような調節因子としては、ＴＲＰＣチャンネルの遺伝子組換え的変換型、好ましくはＴＲＰＣチャンネルの不活性化した突然変異体、例えばＴＲＰＣ３DM、加えて、天然または合成のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、ペプチド、環状ペプチド、核酸、抗体、アンチセンス分子、リボザイム、有機小分子などが挙げられる。
【００１８】
ＴＲＰＣチャンネル活性を測定するための例としては、以下の工程を含む分析が挙げられる：
（ａ）ＴＲＰＣチャンネルを発現する蛍光細胞を接触させる工程、
（ｂ）該蛍光細胞と調節因子または試験化合物とを接触させる前に、それと同時に、または、その後に、チャンネルの活性化因子によって、Ｃａ2+流入を刺激する工程、および、
（ｃ）蛍光の変化を測定または検出する工程。
【００１９】
このような分析のさらなる詳細および代替法、または、好ましい実施形態を以下で説明し、加えて実施例でも説明する。
【００２０】
それゆえに、本発明のその他の主題は、ＴＲＰＣ、もしくは、それらの不活性化した突然変異体、または、ＴＲＰＣ、もしくは、不活性化した突然変異体をコードするヌクレオチド配列の調節因子のスクリーニング方法に向けられ、ここにおいて、本方法は、以下の工程を含む：
（ａ）ＴＲＰＣチャンネルまたはそれらの不活性化した突然変異体を発現する細胞を接触させる工程、
（ｂ）該細胞と試験化合物とを接触させる前に、それと同時に、または、その後に、チャンネルの活性化因子によって、Ｃａ2+流入を刺激する工程、および、
（ｃ）ＴＲＰＣチャンネルの活性の変化を測定または検出する工程。
【００２１】
好ましい実施形態において、本方法は、以下の工程をさらに含む：
（ｄ）該試験化合物の非存在下におけるＴＲＰＣチャンネルの活性の変化を比較することによって、心臓血管疾患に対して活性を有する試験化合物を選択する工程。
【００２２】
その他の好ましい実施形態において、上記細胞におけるＴＲＰＣチャンネル、または、それらの不活性化した突然変異体の発現は、誘導性プロモーター、好ましくはテトラサイクリン誘導性プロモーターから選択されるプロモーターによって制御される。
【００２３】
具体的な好ましい実施形態において、上記細胞は、蛍光細胞であり、例えば以下でさらに説明される細胞が挙げられる。
【００２４】
本発明に係る好ましい細胞または細胞系は、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＢＨＫ、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３、または、ＣＨＯ細胞であり、具体的にはＨＥＫ２９３細胞系である。
【００２５】
ＴＲＰＣチャンネルの活性は、イオンの流れ、具体的にはＣａ2+の流れにおける変化を測定または検出することによって測定または検出することができ、このような測定または検出は、例えばパッチクランプ技術、全細胞電流、放射標識したイオンの流れ、または、具体的には蛍光、例えば電位感受性色素またはイオン感受性色素を用いた蛍光によってなされる（Ｖｅｓｔｅｒｇａｒｒｄ−Ｂｏｇｉｎｄ等（１９８８），Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌ.，８８：６７〜７５；Ｄａｎｉｅｌ等（１９９１）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｍｅｔｈ．２５：１８５〜１９３；Ｈｏｅｖｉｎｓｋｙ等（１９９４）Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌ.，１３７：５９〜７０；Ａｃｋｅｒｍａｎ等（１９９７），Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ.，３３６：１５７５〜１５９５；Ｈａｍｉｌ等（１９８１），Ｐｆｌｕｇｅｒｓ．Ａｒｃｈｉｖ.，３９１：１８５）。
【００２６】
このような色素の例は、ジ−４−ＡＮＥＰＰＳ（ピリジニウム４−（２（６−（ジブチルアミノ）−２−ナフタレニル）エテニル）−１−（３−スルホプロピル）水酸化物）、ＣＣ−２−ＤＭＰＥ（１,２−ジテトラデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミントリエチルアンモニウム）、ＤｉＳＢＡＣ２（ビス−（１,２−ジバルビツール酸）−トリメチンオキサノール、ＤｉｓＢＡＣ３（（ビス−（１,３−ジバルビツール酸）−トリメチンオキサノール））、ＳＢＦＩ−ＡＭ（１,３−ベンゼンジカルボン酸，４,４’−［１,４,１０−トリオキサ−７,１３−ジアザシクロペンタデカン−７,１３−ジイルビス（５−メトキシ−６,１２−ベンゾフランジイル）］ビス−（テトラキス−［（アセチルオキシ）メチル］エステル））、ｆｌｕｏ３ａｍ（１−［２−アミノ−５−（２,７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−３−オキシ−９−キサンテニル）フェノキシ］−２−（２’−アミノ−５’−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’−四酢酸）、ｆｌｕｏ４ａｍ（１−［２−アミノ−５−（２,７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−４−オキシ−９−キサンテニル）フェノキシ］−２−（２’−アミノ−５’−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’−四酢酸）、または、ｆｕｒａ２ａｍ（１−［２−（５’−カルボキシオキサゾール−２’−イル）−６−アミノベンゾフラン−５−オキシ］−２−（２’−アミノ−５’−メチル−フェノキシ）−エタン−Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’−四酢酸）である。
【００２７】
上記チャンネルの活性化因子の例は、ジアシルグリセロール、具体的には１−オレイル−２アセチル−ｓｎ−グリセロール（ＯＡＧ）、Ｇｑ共役受容体アゴニスト、例えばフェニレフリン、具体的にはトリプシン、受容体チロシンキナーゼを刺激するアゴニスト、例えば上皮増殖因子（ＥＧＦ）、または、ジアシルグリセロールを生成する酵素、例えばホスホリパーゼ、もしくはそれらの活性化因子である。
【００２８】
上記チャンネルの活性化因子、具体的にはＯＡＧを、ＴＲＰＣチャンネルを直接刺激するのに用いることができ、これは、例えば本発明の分析において偽陽性の結果の割合が実質的に減少するために、本発明の分析において受容体が介在する間接的なチャンネル活性化に比べてさらに利点がある。
【００２９】
一般的に、例えば上述したような誘導性プロモーター下でＴＲＰＣチャンネル、または、それらの不活性化した突然変異体を発現する細胞が提供される。このような細胞は、当業者既知の遺伝学的な方法（さらに実施例で説明されている）を用いて生産することができる。ＴＲＰＣチャンネル、または、それらの不活性化した突然変異体の発現を誘導した後、このような細胞は通常、例えばマイクロタイタープレートで平板培養し、増殖させる。通常、このような細胞はマルチウェルプレートの底部で増殖し、固定される。その後、一般的に、これらの細胞は洗浄され、適切なローディング緩衝液中で色素（好ましくはｆｌｕｏ４ａｍのような蛍光色素）をローディングされる。ローディング緩衝液を除去した後、これらの細胞を、例えば化学物質ライブラリーの形態で、試験化合物または調節因子と、具体的には上述のような生化学的または化学的な試験化合物とインキュベートする。Ｃａ2+測定は、例えば蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）を用いて行うことができる。ＴＲＰＣチャンネルを介したＣａ2+流入を刺激するために、一般的に、ＯＡＧのようなチャンネルの活性化因子が適用されるべきである。
【００３０】
ＴＲＰＣチャンネルを活性化する代替の様式として、Ｇq共役受容体アゴニストとしてのトリプシンが適用可能である。
【００３１】
予想される阻害因子の作用は、例えば蛍光の増加が少なくなることであり得る。活性化因子は、例えば活性化因子によって誘発された蛍光のさらなる増加を起こすか、または、例えば活性化因子非依存性の蛍光の増加を誘導する可能性がある。
【００３２】
その後、適切な調節因子、具体的には阻害因子を解析し、および／または、単離することができる。化学物質ライブラリーをスクリーニングするためには、ハイスループット分析の使用が好ましく、これは当業者既知であるか、または、市販されている。
【００３３】
本発明に係る用語「化学物質ライブラリー」は、数々のあらゆる源から集められた多数の化学物質を意味し、例えば、化学合成された分子、および、天然物質、または、コンビナトリアル化学物質ライブラリーが含まれる。
【００３４】
有利には、本発明の方法は、アレイ上で、および／または、ロボットシステムで行われ、このようなシステムとしては、例えばロボット式プレーティングシステム、および、例えばマイクロフルイディクス（すなわち流体導路構造）を用いたロボット式液体トランスファーシステムが挙げられる。
【００３５】
本発明のその他の実施形態において、本方法は、ハイスループットスクリーニングシステムの形態で行われる。このようなシステムにおいて、有利には、スクリーニング方法は自動化、小型化されており、具体的には小型化されたウェル、および、ロボット制御されたマイクロフルイディクスを利用する。
【００３６】
特に好ましい実施形態において、本発明の分析／方法は、上記で詳述したような誘導性プロモーターの制御下にＴＲＰＣチャンネルの遺伝子を含む細胞系で行われ、ここにおいて、チャンネルの活性化因子は可溶化されている。例えば、好ましくは、活性化因子ＯＡＧは、血清アルブミン、例えばウシ血清アルブミン、または、プルロニック酸（ｐｌｕｔｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）の存在下で可溶化される。
【００３７】
本発明のその他の主題は、アテローム性動脈硬化症を治療するための医薬品の製造方法に向けられ、ここにおいて、本方法は、以下の工程を含む：
（ａ）上記方法を行う工程、
（ｂ）心臓血管疾患、具体的にはアテローム性動脈硬化症を治療するのに適した検出された試験化合物を単離する工程、および、
（ｃ）検出された試験化合物を、１またはそれ以上の製薬上許容できるキャリアーまたは補助剤と共に製剤化する工程。
【００３８】
製薬上許容できるキャリアーまたは補助剤は、例えば生理学的な緩衝溶液、例えば塩化ナトリウム溶液、脱塩水、安定剤、例えばプロテアーゼもしくはヌクレアーゼ阻害剤、または、金属イオン封鎖剤、例えばＥＤＴＡである。
【００３９】
以下の図、配列および実施例は本発明を説明するものであり、本発明の範囲を制限することはない。
【００４０】
図面の説明
図１Ａおよび１Ｂは、ＴＲＰＣ３DNは、機能的なイオン電流を運搬しないことを示す。
図２ＡおよびＢは、ＴＲＰＣ３DNのＴＲＰＣ３およびＴＲＰＣ６に対するドミナントネガティブ作用を示す。
図３は、アテローム性動脈硬化症のウサギの頚動脈におけるアセチルコリンで誘導された血管反応性に対するＴＲＰＣ３DNの作用を示す。
図４は、ＴＲＰＣ３DNを発現する頚動脈部分における流動によって誘導された血管反応性の音波検査による評価を示す。
図５は、ＴＲＰＣ３DNを発現する頚動脈部分におけるアテローム斑の大きさを示す。
図６は、アテローム性動脈硬化症の頚動脈における平均マクロファージ密度に対するＴＲＰＣ３DN発現の作用を示す。
図７Ａおよび７Ｂは、ＦＬＩＰＲ技術を用いた、誘導性のＴＲＰＣ３およびＴＲＰＣ６細胞系におけるＯＡＧで活性化されたＣａ2+シグナルの検出を示す。
図８Ａおよび８Ｂは、ＦＬＩＰＲ分析によって、ドキシサイクリンで誘導された細胞系におけるＳＫＦ９６３６５によるＴＲＰＣ３およびＴＲＰＣ６阻害に関するＩＣ50を説明する。
【００４１】
配列の説明
配列番号１は、ＴＲＰＣ３のアミノ酸配列を示す。
配列番号２は、ＴＲＰＣ３をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号３は、ドミナントネガティブＴＲＰＣ３チャンネル（ＴＲＰＣ３DN）の完全なアミノ酸配列を示す（突然変異したアミノ酸は太字で示す）。
配列番号４は、ＴＲＰＣ３DNのヌクレオチドの完全な配列を示す（突然変異したヌクレオチドは太字で示す）。
配列番号５は、ＴＲＰＣ６のアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、ＴＲＰＣ６をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号７は、ドミナントネガティブＴＲＰＣ６チャンネル（ＴＲＰＣ６DN）のアミノ酸配列を示す（突然変異したアミノ酸は太字で示す）。
配列番号８は、ＴＲＰＣ６DNのヌクレオチドの完全な配列を示す（突然変異したヌクレオチドは太字で示す）。
配列番号９は、ＴＲＰＣ７のアミノ酸配列を示す。
配列番号１０は、ＴＲＰＣ７をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号１１は、ドミナントネガティブＴＲＰＣ７チャンネル（ＴＲＰＣ７DN）のアミノ酸配列を示す（突然変異したアミノ酸は太字で示す）。
配列番号１２は、ＴＲＰＣ７DNのヌクレオチドの完全な配列を示す（突然変異したヌクレオチドは太字で示す）。
【実施例】
【００４２】
１．ＴＲＰＣ３DNの構築および機能的な特性
インビトロおよびインビボでのＴＲＰＣチャンネルの機能を研究するために、我々は、天然型のＴＲＰＣチャンネル活性を調節するためにドミナントネガティブのチャンネル突然変異体を使用した。ＴＲＰＣチャンネルに関するこのアプローチの適用性はこれまでに実証されている（Ｈｏｆｍａｎｎ等（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．−Ｕ．Ｓ．Ａ.，９９，７４６１〜７４６６）。我々は、部位特異的変異誘発によって、野生型ヒトＴＲＰＣ３（ＮＰ＿００３２９６）のアミノ酸６２１〜６２３をアラニンに置換することによって、ドミナントネガティブＴＲＰＣ３チャンネル（ＴＲＰＣ３DN）を作製した。このインサートを、ゲートウェイ（ｇａｔｅｗａｙ）技術（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），カールスルーエ，ドイツ）を用いて改変ｐｃＤＮＡ３ベクター主鎖にクローニングした。
【００４３】
この研究では、ムスカリン性Ｍ1受容体を安定して発現するＨＥＫ２９３系（ＨＭ１細胞）を用いた（Ｐｅｒａｌｔａ等（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３４，４３４〜４３７）。１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（インビトロジェン，カールスルーエ，ドイツ）が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培地中で、５.５％ＣＯ2中３７℃で細胞を増殖させた。この増殖培地に、Ｇ４１８（０.５ｍｇ／ｍｌ）を添加した。ｈＴＲＰＣ３（Ｕ４７０５０）、ｈＴＲＰＣ６（ＡＦ０８０３９４）、ＴＲＰＣ３DN、および、ｅＧＦＰ（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１，ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ），パロアルト，カリフォルニア州）、または、上記チャンネルタンパク質のＹＦＰ−タグを有する型に関するｃＤＮＡを、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン，カールスルーエ，ドイツ）を製造元の説明書に従って用いてトランスフェクションした。
【００４４】
電気生理学的試験のために、３５ｍｍの培養皿中で、細胞を指定された量のｃＤＮＡでトランスフェクションし、トランスフェクションの１２〜２４時間後にカバーガラス上で平板培養した。平板培養して２４〜４８時間後の細胞を用いた。特に他の指定がなければ、パッチクランプ実験のための発現マーカーとしてｅＧＦＰ（０.４μｇ）を共にトランスフェクションした。
【００４５】
ＨＥＫＡ  ＥＰＣ１０パッチクランプ増幅器、および、パルスソフトウェア（ＨＥＫＡ，ラムブレヒト，ドイツ）を用いて、蛍光細胞から全細胞電流を室温で記録した。標準的な細胞外の緩衝液中で２〜５Ｍ(の抵抗を有するパッチピペットを、ホウケイ酸ガラスから引き出した。保持電位を−７０ｍＶに設定し、電圧が−１００から＋６０ｍＶに上昇する１６０ｍｓの間の電流を６.６ｋＨｚでサンプリングした。全ての記録を２ｋＨｚでフィルタリングした。
【００４６】
標準的な外部緩衝液は、ＮａＣｌを１４０ｍＭ、ＫＣｌを５.４ｍＭ、ＣａＣｌ2を２ｍＭ、ＭｇＣｌ2を１ｍＭ、グルコースを１０ｍＭ、ＨＥＰＥＳを１０ｍＭ含み、ｐＨは、ＮａＯＨで７.４に調節した。標準的なピペット緩衝液は、ＣｓＯＨを１２０ｍＭ、グルコン酸を１２０ｍＭ、ＭｇＣｌ2を２ｍＭ、ＣａＣｌ2を３ｍＭ、Ｃｓ4−ＢＡＰＴＡを５ｍＭ、ＨＥＰＥＳを１０ｍＭ含み、ｐＨは、グルコン酸で７.３に調節した。遊離の［Ｃａ2+］は、ＣａＢｕｆプログラム（Ｇ．Ｄｒｏｏｇｍａｎｓ，ＫＵ  Ｌｅｕｖｅｎ）を用いて〜２００ｎＭと計算された。１０μＭカルバコールを適用することによって、ＨＭ１細胞において受容体で活性化された電流を誘発した。
【００４７】
全ての統計データを、平均±ＳＥＭとして示した。統計的分析を、シグマスタット（ＳｉｇｍａＳｔａｔ，ＳＰＳＳ，シカゴ，イリノイ州）を用いて行った。結果をプールし、マン・ホイットニーの順位和検定を用いて解析した。有意差のレベルをｐ＜０．０５に設定した。
【００４８】
１．１：ＴＲＰＣ３DNは、機能的なイオン電流を運搬しない
ＴＲＰＣ３DNがＴＲＰＣチャンネルの負の調節因子として作用することを確立するために、全細胞パッチクランプによってチャンネル突然変異体の機能的な特性を調査した。
図１Ａおよび１Ｂに、ＴＲＰＣ３またはＴＲＰＣ３DN（３μｇ）でトランスフェクションされたＨＭ１細胞から得られた代表的な電流の記録を示す。アセチルコリン受容体アゴニストのカルバコール（１０μＭ）によってＴＲＰＣの電流を誘発した。カルバコール存在前（ｃｏｎ）、および、カルバコール存在下（ｃａｒｂ）の電流を記録した。
【００４９】
平均して、ＴＲＰＣ３DNを発現する細胞の電流密度（１.３ｐＡ／ｐＦ，ｎ＝１１）は、ネガティブコントロールとしてのＬａｃＺでトランスフェクションされた細胞（１.２ｐＡ／ｐＦ，ｎ＝１０）と差がなかった。図１Ａおよび１Ｂに示される記録によれば、ポジティブコントロールとしてのＴＲＰＣ３でトランスフェクションされた細胞は、より有意に大きい電流密度（１１.２ｐＡ／ｐＦ，ｎ＝１１；ｐ＜０.００１）を示した。従って、ＴＲＰＣ３DNは、注目するほどのイオン電流は運搬しなかった。
【００５０】
以前の研究によれば、ＴＲＰＣ３は、それ自身と直接相互作用すること、さらに、ＴＲＰＣ６とＴＲＰＣ７とも同様であることが示唆されている（Ｈｏｆｍａｎｎ等（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ.，９９，７４６１〜７４６６）。従って、ＴＲＰＣ３DNの調節作用を、野生型ＴＲＰＣ３とＴＲＰＣ６チャンネルとを共に発現させることによって試験した。
【００５１】
１．２：ＴＲＰＣ３DNのＴＲＰＣ３およびＴＲＰＣ６に対するドミナントネガティブ作用
図２Ａによれば、ＨＭ１細胞を、ＴＲＰＣ３−ＹＦＰ（７μｇ）、および、コントロールとしてＬａｃＺ（７μｇ）（白いバー）またはＴＲＰＣ３DN（７μｇ）（灰色のバー）と共にトランスフェクションした。図２Ｂによれば、図２Ａと同様に、ＨＭ１細胞を、ＴＲＰＣ６−ＹＦＰ（７μｇ）、および、ＬａｃＺまたはＴＲＰＣ３DNで共にトランスフェクションした。
カルバコールで誘導された電流を−７０ｍＶで測定し、細胞の静電容量に標準化した。ＴＲＰＣ３DNは、ＴＲＰＣ３およびＴＲＰＣ６のいずれによっても電流を有意に抑制した（***ｐ＜０．００１）。
【００５２】
２．インビボにおけるＴＲＰＣ３DNの抗アテローム性動脈硬化症の作用
図２Ａおよび２Ｂで示されるように、ＴＲＰＣ３DNは、ＴＲＰＣ３およびＴＲＰＣ６チャンネルにドミナントネガティブ作用を与える。配列相同性とこれまでの報告に基づき（Ｈｏｆｍａｎｎ等（２００２），上記）、相同なＴＲＰＣ７チャンネルもＴＲＰＣ３DNによって抑制されると考えられる。ＴＲＰＣ３DN発現の作用、従って、アテローム性動脈硬化症に対するＴＲＰＣ３、ＴＲＰＣ６およびＴＲＰＣ７の阻害の作用を調査するために、アテローム性動脈硬化症のウサギの血管へのＴＲＰＣ３DNのウイルス遺伝子移入を用いた。
頚動脈を、ＴＲＰＣ３DN、または、コントロールとしてｅＧＦＰを保持するウイルスで感染させた。遺伝子移入の８週間後、機能的および組織学的なパラメーターによって疾病状態を評価した。
【００５３】
２．１：ウイルス作製および動物実験
ＴＲＰＣ３のドミナントネガティブ変異体をコードするアデノウイルスを作製し、増幅し、ラージスケールで精製した。その後、配列の正確さをＤＮＡ配列解析（メディジェノミクス，マルティンスリート，ドイツ）でチェックし、上記タンパク質の特異的な発現をウェスタンブロッティングで確認した。
【００５４】
２０週齢のニュージーランドホワイトウサギ（Ｗｈｉｔｅ  Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  ｒａｂｂｉｔ）に、１％コレステロール＋５％トウモロコシ油を含む餌を供給した。給餌の１週間後、トランスジーン発現を、カテーテルを用いたウイルス遺伝子移入により誘導した（以下を参照）。実験の全経過中、コレステロール給餌を続けた。各グループにおいて少なくとも８匹の動物を個別に調査した。
【００５５】
給餌を開始する前に、遺伝子移入の直前に、ならびに、遺伝子移入の２、４および８週間後に、血清コレステロール濃度を評価した。この測定は、獣医師用の血清測定（Ｓｙｎｌａｂ，アウグスブルグ，ドイツ）に特化した、検証済みの実験室で行った。また、ＬＤＬおよびＨＤＬの亜分画も標準的な技術によって測定した。血清コレステロール、ＬＤＬまたはＨＤＬコレステロールに関しては、測定された全てのタイムポイントで（各グループにおいてｎ＝８）、コントロールとＴＲＰＣ３DNを移入された動物との間で有意差は観察されなかった（ｐ＞０．０５）。
【００５６】
２．２：頚動脈への内皮の遺伝子移入
頚動脈への遺伝子移入のために、頚部の中線切開を行い、左総頸動脈を露出させた。２個の小さい組織を傷つけないクリップ（ＢＩＥＭＥＲの血管クリップ，ＦＤ５６１Ｒ）で４ｃｍの区分を分離した。分離した区分に、ＴＲＰＣ３DNまたはｅＧＦＰウイルス溶液（タイターは１０10ｐｆｕ）の約０.２ｍｌを小注射針（０．４×２０）で注射した。インキュベート時間は２０分間であった。次に、クリップを除去し、血液循環を回復させた。頚部の創傷を縫合し、これら動物を回復させた。術後の７２時間は、ウサギを無痛化にした（１２時間毎に、テムジェシク(R)、ブプレノルフィンを０.０１ｍｇ／ｋｇ皮下注射した）。
【００５７】
２．３：内皮の血管反応性の測定
実験の最後に、遺伝子移入の８週間後に、基礎的な血管の直径とアセチルコリンで誘導された血管反応性を、頚動脈の高解像度の超音波像によって測定した。
インビボで、ＴＲＰＣ３DN（斜線のバー）またはｅＧＦＰ（白いバー）で形質導入されたアテローム性動脈硬化症のウサギ、および、健康な（アテローム性動脈硬化症に罹っていない）ウサギ（黒いバー）の頚動脈区分の管腔の血管直径の測定を行った（図３）。所定用量のアセチルコリンを注射した後、アセチルコリンで誘導された血管反応性を１分毎に４回測定した。ＴＲＰＣ３DNの発現は、ｅＧＦＰを発現する区間に比べて、アセチルコリンで誘導された血管反応性を有意に改善した（***ｐ＜０.００１）。ｅＧＦＰを発現する区間では、健康なコントロールに比べて、血管反応性の減少が観察された（#ｐ＜０.０１）。
【００５８】
第二の実験の設定では、塩化ナトリウム溶液投与に応答して、流動によって誘導される血管反応性を試験した（図４）。
ＴＲＰＣ３DN（斜線のバー）またはｅＧＦＰ（白いバー）で形質導入されたアテローム性動脈硬化症のウサギ、および、健康な（アテローム性動脈硬化症に罹っていない）ウサギ（黒いバー）の頚動脈部分の管腔の血管直径を測定した。塩化ナトリウム溶液１００ｍｌを投与している間（５分間かけて投与）、流動によって誘導される血管反応性を試験した。輸液８０ｍｌを投与した後、および、全ての容量が投与されてから１〜２分後に行った測定を示す。ＴＲＰＣ３DNの発現は、ｅＧＦＰを発現する区間に比べて、流動によって誘導される血管反応性を有意に改善した（**ｐ＜０.０１）。
【００５９】
２．４：アテローム性動脈硬化症の組織学的なマーカーの測定
病気の進行を組織学的に評価するために、動物にヘパリンを注射しそして犠牲にした胸骨から１ｃｍの近位で、かつ喉頭蓋からは遠位の位置で、頚動脈を切り出した。血管を生理食塩水で洗い流し、慎重に乾燥させ、衝撃凍結させた。ＧＦＰ発現、ＨＥおよびファン・ギーソン染色、ならびに、免疫組織化学の調査のために、中央領域からの動脈片を切り出した。
【００６０】
残りの動脈は、脂質プラークを検出するためのスダンのマクロ染色に用いた。この目的のために、血管を生理食塩水で２分間潅流し、中央部で縦方向に切断した後に、スダンレッド染色を直接行った。その後、血管を、スダン染色溶液（アルコールおよびアセトンに溶解させたスダンＩＩＩ）に移した。
【００６１】
相対的なプラークの大きさを、スダンレッド染色の後、ＴＲＰＣ３DNまたはｅＧＦＰで形質導入された頚動脈区分の組織学的な画像解析によって測定した（図５）。ＴＲＰＣ３DNを（左の動脈に）投与したウサギから得た右の頚動脈を未処理コントロールとして評価した。ＴＲＰＣ３DNは、ｅＧＦＰ（**ｐ＜０.０１）、および、未処理（*ｐ＜０.０５）コントロールの両方に比べて、プラークの大きさを減少させた。
【００６２】
アテローム性動脈硬化症の進行のその他のマーカーとして、血管内膜のマクロファージの浸潤を免疫細胞化学によって調べた。組織染色のために、脂肪を除去して調製された全ての血管の中央部から６μｍの切片を切り出した。これら切片を、アセトンで、室温で１０分間固定し、空気乾燥させた。次に、これらを１００％メタノール中の０.６％Ｈ2Ｏ2で５分間浸透させ、ＰＢＳで３回洗浄し、２０％ウサギ血清とインキュベートした。次に、これら切片を、抗マクロファージモノクローナル抗体（１：１００，クローンＲＡＭ−１１，ダコ，ハンブルグ，ドイツ）と２０℃で２０〜３０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した。次に、これらを、適切にビオチン標識された二次抗体と２０℃で３０分間インキュベートし、再度ＰＢＳで３回洗浄した。その後、切片を、ＡＢＣ試薬と３０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、ジアミノベンジジンとＨ2Ｏ2で１０分間染色した。その後、ハリス／ヘマトキシリン／エオシンでの対比染色を行った。各スライドの血管内膜中の単独の陽性細胞を、標準的な計数手順によって、高倍率で（典型的には６００倍）直接計数することによって解析を行った（図６）。
【００６３】
免疫細胞化学によって、ＴＲＰＣ３DNまたはｅＧＦＰを発現する頚動脈の内膜層におけるマクロファージを同定した。ＴＲＰＣ３DNは、ｅＧＦＰを発現する血管と比べて、マクロファージ浸潤の有意な減少を引き起こした（*ｐ＜０.０５）。
【００６４】
３．ＴＲＰＣ３、ＴＲＰＣ６およびＴＲＰＣ７の調節因子のハイスループット同定のためのアッセイ方法
ＴＲＰＣチャンネルの調節因子を同定するアッセイ方法を開発するために、組換えＨＥＫ２９３細胞系を、誘導性プロモーターの制御下でＴＲＰＣ３（登録番号Ｕ４７０５０）、または、ＴＲＰＣ６（登録番号ＡＦ０８０３９４）のｃＤＮＡを発現するＦｌｐ−Ｉｎ
Ｔ−ＲＥｘ系（インビトロジェン，カールスルーエ，ドイツ）を用いて作成した。チャンネルのｃＤＮＡを標準的な技術で増幅し、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ（インビトロジェン，カールスルーエ，ドイツ）にクローニングした。Ｆｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−Ｒｅｘ２９３細胞をチャンネルのコンストラクトでトランスフェクションした後、安定な細胞系をハイグロマイシンで選択した。製造元の説明書に従って細胞を維持し、チャンネルの発現を、１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンの添加によって２０〜３０時間誘導した。実験の２０〜３０時間前に、９６ウェルのポリ−ｄ−リシンで被覆した黒色のウェルを含む透明な底のマイクロタイタープレート（ＢＤバイオサイエンス，ベッドフォード，マサチューセッツ州）に、細胞を４００００〜５００００細胞／ウェルの密度で平板培養した。次に、細胞を洗浄し、１×ＨＢＳＳ（番号１４０６５〜０４９，インビトロジェン）、１ｍＭのＣａＣｌ2、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０.０２％プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ−１２７（モレキュラープローブス）、および、０.０５％ウシ血清アルブミンを含む緩衝液（ｐＨ＝７.４）中で、２μＭのｆｌｕｏ４ａｍ（モレキュラープローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ），ユージーン，オレゴン州）を、室温で３０〜４５分間ローディングした。ローディング緩衝液を除去し、細胞を試験化合物と室温で１０分間インキュベートした。９６ウェルの蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）（モレキュラー・デバイス社、サニーベール，カリフォルニア州）を用いて、Ｃａ2+測定を行った。ＴＲＰＣ３またはＴＲＰＣ６を介したＣａ2+流入を刺激するために、我々は、チャンネルの活性化因子１−オレイル−２−アセチル−ｓｎ−グリセロール（ＯＡＧ）（Ｈｏｆｍａｎｎ等，１９９９）を最終濃度３０〜５０μＭで適用した。ＯＡＧを、１×ＨＢＳＳ（番号１４０６５〜０４９，インビトロジェン）、１ｍＭのＣａＣｌ2、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０.０２％プルロニックＦ−１２７（モレキュラープローブス）を含む緩衝液（ｐＨ＝７．４）に溶解させ、細胞に添加した。あるいは、ＯＡＧを、１×ＨＢＳＳ（番号１４０６５〜０４９，インビトロジェン）、１ｍＭのＣａＣｌ2、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、および、０.１％ウシ血清アルブミンを含む緩衝液（ｐＨ＝７.４）に溶解させてもよい。
【００６５】
図７Ａおよび７Ｂによれば、ドキシサイクリン処理された細胞だけでなく、誘導されていない細胞でもＯＡＧに対する応答が観察されたことが示される。従って、この結果は、ＯＡＧで活性化されたＣａ2+シグナルに、ＴＲＰＣ３またはＴＲＰＣ６それぞれが特異的に介在していることを実証する。
【００６６】
ＦＬＩＰＲ  ＩＩを用いて、ｆｌｕｏ−４をローディングした細胞における蛍光の変化を測定した。バーは、５０μＭのＯＡＧの適用を示す。それぞれ９ウェルの平均の蛍光値±ＳＥＭを示した。蛍光値を、平均の基準の蛍光（Ｆ0）に標準化した。
【００６７】
上述のアッセイ方法を用いてＴＲＰＣ３またはＴＲＰＣ６の調節因子を同定するために、誘導された細胞を用い、ＯＡＧ適用の前に、または、その後に、ウェルに試験化合物を添加した。阻害因子の予想される作用は、蛍光の増加が少なくなることと予想された。チャンネルの活性化因子により、ＯＡＧで誘発されたシグナルのさらなる増加が生じるか、または、ＯＡＧ非依存性の蛍光の増加が誘導されると予想された。ＳＫＦ９６３６５（１−（β−［３−（４−メトキシフェニル）プロポキシ］−４−メトキシフェネチル）−１Ｈ−イミダゾール−ＨＣｌ）は、ＴＲＰＣ３およびＴＲＰＣ６などのカチオンチャンネルの非選択的な阻害因子と記載されている（Ｂｏｕｌａｙ等（１９９７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，２９６７２〜２９６８０；Ｚｈｕ等（１９９８），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１３３〜１４２）。
【００６８】
図８Ａおよび８Ｂで示されるように、ＳＫＦ９６３６５は、ＴＲＰＣ３を発現する細胞では、ＩＣ50が１.８±０.１２μＭ（ｎ＝８）で、ＯＡＧで活性化された蛍光の応答を阻害し、ＴＲＰＣ６を発現する細胞では、ＩＣ50が５．０４±０．１７μＭ（ｎ＝８）で阻害した。従って、示された実施例により、ＴＲＰＣ３およびＴＲＰＣ６調節因子を同定する本分析の能力が実証された。
【００６９】
ＴＲＰＣ３およびＴＲＰＣ６を発現する細胞において３０μＭのＯＡＧにより誘導された蛍光の変化は、既定濃度のＳＫＦ９６３６５の存在下で測定された。平均阻害値±ＳＥＭが示される。阻害は、ＳＫＦ９６３６５非存在下でのコントロールの蛍光に対する％として示される。用量応答曲線を、標準的な用量応答の方程式にフィッティングした。スプライン曲線から、複合データに対して最良の適合が示された。
【００７０】
ＴＲＰＣ３およびＴＲＰＣ６チャンネルの活性化の代替の様式として、プロテアーゼで活性化された受容体アゴニストのトリプシン（２００ｎＭ）を適用して、Ｆｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ−ＴＲＰＣ３、および、Ｆｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ−ＴＲＰＣ６細胞を誘導した。この処理は、ＴＲＰＣ３またはＴＲＰＣ６を刺激するためのＧq共役受容体アゴニストの使用の例示である。適用後、時間６０秒で、トリプシンは、誘導されたＦｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ−ＴＲＰＣ３、および、Ｆｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ−ＴＲＰＣ６細胞において、誘導されていないコントロールより有意に大きい蛍光の増加を誘導した（表１）。従って、Ｇq共役受容体アゴニスト（例えばトリプシン）はまた、ＴＲＰＣ３およびＴＲＰＣ６応答を刺激する分析で用いてもよい。
【００７１】
【表１】
2008526905.tif 000002
【００７２】
値は平均±ＳＥＭとして示される。誘導グループと非誘導なしグループとでは、有意に異なっていた（ｐ＜０.００１，ｔ検定）。
【００７３】
【化１】
2008526905.tif 000003
【００７４】
【化２】
2008526905.tif 000004
【００７５】
【化３】
2008526905.tif 000005
【００７６】
【化４】
2008526905.tif 000006
【００７７】
【化５】
2008526905.tif 000007
【００７８】
【化６】
2008526905.tif 000008
【００７９】
【化７】
2008526905.tif 000009
【００８０】
【化８】
2008526905.tif 000010
【００８１】
【化９】
2008526905.tif 000011
【００８２】
【化１０】
2008526905.tif 000012
【００８３】
【化１１】
2008526905.tif 000013
【００８４】
【化１２】
2008526905.tif 000014
【００８５】
【化１３】
2008526905.tif 000015
【００８６】
【化１４】
2008526905.tif 000016
【００８７】
【化１５】
2008526905.tif 000017
【００８８】
【化１６】
2008526905.tif 000018
【００８９】
【化１７】
2008526905.tif 000019
【００９０】
【化１８】
2008526905.tif 000020
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】ＴＲＰＣ３DNは、機能的なイオン電流を運搬しないことを示す図である。
【図２】ＴＲＰＣ３DNのＴＲＰＣ３およびＴＲＰＣ６に対するドミナントネガティブ作用を示す図である。
【図３】アテローム性動脈硬化症のウサギの頚動脈におけるアセチルコリンで誘導された血管反応性に対するＴＲＰＣ３DNの作用を示す図である。
【図４】ＴＲＰＣ３DNを発現する頚動脈部分における流動によって誘導された血管反応性の音波検査による評価を示す図である。
【図５】ＴＲＰＣ３DNを発現する頚動脈部分におけるアテローム斑の大きさを示す図である。
【図６】アテローム性動脈硬化症の頚動脈における平均マクロファージ密度に対するＴＲＰＣ３DN発現の作用を示す図である。
【図７】ＦＬＩＰＲ技術を用いた、誘導性のＴＲＰＣ３およびＴＲＰＣ６細胞系におけるＯＡＧで活性化されたＣａ2+シグナルの検出を示す図である。
【図８】ＦＬＩＰＲ分析によって、ドキシサイクリンで誘導された細胞系におけるＳＫＦ９６３６５によるＴＲＰＣ３およびＴＲＰＣ６阻害に関するＩＣ50を説明する図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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