(57)【要約】  放出可能に組み入れられたＰＴＨを含む強化（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ）マトリックスであって、場合によって顆粒物質を含有する、前記強化マトリックスを本明細書に記載する。ＰＴＨは、マトリックスへの共有連結を通じて、あるいはマトリックスおよび／または顆粒との非共有相互作用を通じてのいずれかで、組み入れられる。これらの強化マトリックスは、自家移植片に比較して、治癒時間が減少し、そしてまたはそうでなければ治癒しないであろう骨折の治癒を誘発する。該マトリックスは生体適合性でそして生物分解性であり、そして移植時点でｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで形成可能である。ＰＴＨは融合ペプチドの一部であってもよい。ＰＴＨは、その生物活性を完全に保持しつつ、マトリックス内に組み入れられることも可能である。骨折が治癒するための徐放ビヒクルとしてマトリックスを用いて、どのように、そしていつ、そしてどの程度の度合いまでＰＴＨが放出されるかに関する制御を提供する技術を用いて、ＰＴＨを放出可能に組み入れることも可能である。
2008526810.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＰＴＨおよびＰＴＨ融合ペプチドからなる群より選択されるペプチド；
（ｉｉ）カルシウム・ミネラルを含む顆粒材料ならびに
（ｉｉｉ）フィブリノーゲン前駆体構成要素およびトロンビン前駆体構成要素を含み、生理学的条件下でフィブリン・マトリックスを形成可能な組成物
を含む配合物であって、
ＰＴＨまたはＰＴＨ融合ペプチドが、０．０１〜２ｍｇ／ｍｌフィブリン・マトリックスまたは該マトリックスを形成する前駆体構成要素の間の濃度範囲内で存在し、但し、０．４ｍｇ／ｍｌフィブリン・マトリックスまたは該マトリックスを形成する前駆体構成要素の濃度は含まれない、
前記配合物。
【請求項２】
フィブリノーゲン前駆体構成要素またはトロンビン前駆体構成要素が、カルシウム供給源をさらに含む、請求項１記載の配合物。
【請求項３】
ＰＴＨ融合ペプチドが、少なくとも２つのドメインを含み、第一のドメインがＰＴＨを含み、そして第二のドメインが架橋可能基質ドメインを含む、請求項１または２記載の配合物。
【請求項４】
ＰＴＨが、ＰＴＨ１−８４、ＰＴＨ１−３８、ＰＴＨ１−３４、ＰＴＨ１−３１およびＰＴＨ１−２５からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の配合物。
【請求項５】
ＰＴＨがＰＴＨ１−３４である、請求項４記載の配合物。
【請求項６】
第二のドメインがトランスグルタミナーゼ基質ドメインを含む、請求項３記載の配合物。
【請求項７】
トランスグルタミナーゼ・ドメインが因子ＸＩＩＩａ基質ドメインを含む、請求項６記載の配合物。
【請求項８】
ＰＴＨ融合ペプチドが、第一のドメインおよび第二のドメインの間に分解部位をさらに含む、請求項３記載の配合物。
【請求項９】
顆粒材料が、リン酸三カルシウムおよびヒドロキシアパタイトの混合物である、請求項１〜８のいずれかに記載の配合物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の配合物を含むキット。
【請求項１１】
フィブリノーゲン前駆体構成要素およびトロンビン前駆体構成要素が互いに分離されている、請求項１０記載のキット。
【請求項１２】
ＰＴＨ融合ペプチドが、第一のドメインおよび第二のドメインの間に分解部位をさらに含み、前記分解部位が酵素的または加水分解的分解部位である、請求項１０または１１記載のキット。
【請求項１３】
（ｉ）ＰＴＨまたはＰＴＨ融合ペプチド；
（ｉｉ）カルシウム・ミネラルを含む顆粒材料および
（ｉｉｉ）フィブリン
を含む強化（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ）マトリックスであって；
前記ＰＴＨまたはＰＴＨ融合ペプチドが、０．０１〜２ｍｇ／ｍｌフィブリン・マトリックスの間の濃度範囲内で存在し、但し、０．４ｍｇ／ｍｌフィブリン・マトリックスの濃度は含まれない、
前記強化マトリックス。
【請求項１４】
ＰＴＨが、ＰＴＨ１−８４、ＰＴＨ１−３８、ＰＴＨ１−３４、ＰＴＨ１−３１およびＰＴＨ１−２５からなる群より選択される、請求項１３記載の強化マトリックス。
【請求項１５】
ＰＴＨがＰＴＨ１−３４である、請求項１４記載の強化マトリックス。
【請求項１６】
強化マトリックスが、フィブリン・マトリックスを形成可能な組成物、および第一のドメインにＰＴＨを、そして第二のドメインに共有的に架橋可能な基質ドメインを含む、融合ペプチドから形成される、請求項１３〜１５のいずれかに記載の強化マトリックス。
【請求項１７】
第二のドメインが因子ＸＩＩＩａ基質ドメインを含む、請求項１６記載の強化マトリックス。
【請求項１８】
ＰＴＨ融合ペプチドが、第一のドメインおよび第二のドメインの間に分解部位をさらに含む、請求項１３〜１７のいずれかに記載の強化マトリックス。
【請求項１９】
分解部位が酵素的分解部位である、請求項１８記載の強化マトリックス。
【請求項２０】
顆粒材料が、リン酸三カルシウムおよびヒドロキシアパタイトの混合物である、請求項１３〜１９のいずれかに記載の強化マトリックス。
【請求項２１】
骨折の修復のために局所投与される薬剤の製造のための、請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の強化マトリックスの使用。
【請求項２２】
骨折の修復のために局所投与される薬剤の製造のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の配合物の使用。
【請求項２３】
骨折が橈骨遠位端または脛骨の骨折である、請求項２１または２２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、骨折の修復および治癒のための強化（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ）マトリックスおよびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
欧州および米国両方において、毎年５００〜６００万人の人々が、外傷、スポーツまたは活動に関連する傷害あるいは骨粗しょう症のために、骨折すると概算される。これらの傷害の大部分は、徒手整復および外固定（例えばギプス）で治療可能である。しかし、骨折のおよそ２０〜２５％は、通常、観血外科処置（ｏｐｅｎ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）を伴う、入院を必要とする。
【０００３】
骨折は、皮質骨構造における不連続と定義され、通常、過剰な機械力から生じる。完全骨折は、２以上の別個の骨セグメントを生成する、全骨構造に渡って生じる不連続または断絶によって定義される。傷害が骨折と分類されるために、骨断片が分離している必要はない。ある場合には、骨膜が、元来の解剖学的部位に、骨断片を保持する。他の場合には、骨折は肢の屈曲を引き起こし、骨膜または周囲の皮膚および筋組織さえ裂く。さらに他の場合には、高速飛来物での傷害または深刻な事故でよくあるように、骨の広い部分が断片化されるか、またはその元来の部位から取り除かれさえする。骨折治療の主なゴールは、変形の結果を伴わない、しっかりした癒合および骨機能の回復である。身体障害の問題および費用抑制のため、これらのゴールに迅速に到達することがますます重要な関心事になっている。患者集団のかなりの部分において、両方のゴール、すなわちしっかりした癒合および骨機能の迅速な回復は、患者の年齢および／または全身の健康状態、ならびに／あるいは骨折の種類および／または部位のため、危険にさらされる。特に、骨粗しょう症患者の場合、非癒合および治癒時間増加のリスクが高い。骨格の病気と同様、骨粗しょう症は、少ない骨量および骨組織の構造的劣化によって特徴付けられ、これは、骨の脆弱性増加、治癒時間増加および非癒合の発生を導く。
【０００４】
骨移植片および骨移植片代用物は、骨損失、癒合遅延および非癒合骨折と関連する問題を治療する多くの整形外科処置において、またはインプラント固定材料として、広く用いられている。重度でそして複雑な骨折の場合、骨移植片および骨移植片代用物は、骨折がその後、金属類で安定化される前に、骨を強化するために用いられる。骨移植材料は、合成起源の自家、同種、異種、脱ミネラル化骨マトリックス（ＤＢＭ）、およびその混合物であってもよい。骨移植材料は、骨伝導（ｏｓｔｅｏｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ）特性、骨誘導（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ）特性、および骨形成特性を持つ材料に分類可能である。骨伝導性材料は骨を生成せず；むしろ、近傍の生存骨細胞が材料内に遊走するよう刺激する。骨誘導性材料は、患者自身の系が骨組織を生成するように刺激する。骨形成性材料は、骨組織を直接生成する。骨形成性材料は、骨組織を生成する、骨芽細胞および間充織幹細胞に限定される。いくつかの材料は、記載される特性の１より多くを示す。
【０００５】
自家移植片は、傷害部位で用いられるべき、患者の体の一部から採取した任意の組織または骨を指す。骨自家移植片は、通常、腸骨稜から採取される。生体適合性であり、安全であり、血管が形成された組成物であり、そして骨誘導特性を示すという利点にもかかわらず、不都合な点は大きい。自家移植片は、第二の手術を必要とし、これが、血液喪失、感染、および疼痛を含む、術後合併症を導く可能性もある。自家移植片は入院期間および手術時間がより長いため、費用が高い。患者あたりの自家移植片の供給は有限であり、そして自家移植材料を採取した後の術後疼痛は、しばしば骨折そのものよりひどい。不都合な点にもかかわらず、自家移植片は、骨移植材料に関しては「最も基準になるもの（ｇｏｌｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）」と見なされている。同種移植片は、ヒトの死体の多様な部位から採取された骨組織であり、異なる構造を持ち、そして異なる形状になるように機械加工可能である。同種移植片は、最小限にしか骨誘導性でなく、限定された供給しかなく、そして宿主病原体のため、患者が感染するリスクを課す。合成骨移植片材料は、自家骨移植材料の「在庫がある（ｏｆｆ−ｔｈｅ−ｓｈｅｌｆ）」代替物として開発されている。合成骨移植片代用物には、ヒドロキシアパタイトおよびポリメチルメタクリレート、コラーゲン、リン酸三カルシウム、硫酸カルシウムおよびリン酸カルシウムのような、ヒト骨の特性を模倣する、セラミック材料および自己セッティング・ポリマーが含まれる。これらの材料は、劣った取り扱い特性および骨誘導特性の欠如を示す。
【０００６】
近年、自家移植片の真の「在庫がある代替物」として、骨誘導特性を示す骨移植片代用物を開発する努力がなされてきている。ＤＢＭは、骨誘導性骨移植片代用物の一例である。しかし、同種材料としてのＤＢＭは、同種骨のような同じ難点に直面する。他の例は、コラーゲン・マトリックスから、組換え的に産生された骨形成タンパク質７（ＢＭＰ７）を送達する、Ｓｔｒｙｋｅｒ社のＯＰ−１（登録商標）、またはコラーゲン・スポンジからの、組換え的に産生されたＢＭＰ２を用いる、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ  Ｓｏ−ｆａｍｏｒ  ＤａｎｅｋのＩＮＦＵＳＥ（登録商標）骨移植片代用物材料である。ＢＭＰが高価であり、そしてその製造プロセスが長いことを別として、どちらの製品中のタンパク質も、高濃度で、コラーゲン・マトリックスから送達される。ウシ起源のコラーゲン・マトリックスは、異種材料のすべてのリスクを所持し、外科処置において劣った取り扱い特性を示し、例えばこれらは傷害部位の形状によく適合して成形することが不能であり、そして高濃度のＢＭＰが体に送達されると、ある患者では、臓器の石灰化または体の他の部分での骨形成を導きうる。
【０００７】
骨欠陥の局所治療のための他のマトリックスには、注射可能ｉｎ  ｓｉｔｕ形成フィブリン・シーラント組成物におけるように、体に送達される、ヒト副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはその誘導体の使用が含まれる。副甲状腺ホルモンは、副甲状腺によって作製されそして分泌される、８４アミノ酸のペプチドである。全長ホルモンは、全身のカルシウムレベルおよび骨代謝回転の制御において役割を果たす。副甲状腺ホルモンは、前駆体骨芽細胞の強力な直接同化因子であり、そして破骨細胞の間接的な同化因子である。骨芽細胞および破骨細胞の平衡を制御することによって、副甲状腺ホルモンは、生じる骨代謝回転およびそれに続く体へのカルシウムの遊離に直接の影響を有する。多くの動物研究によって、骨塩量（ＢＭＤ）に対して、副甲状腺ホルモンが潜在的な同化効果を有することが指摘されてきている。副甲状腺ホルモンは、細胞表面受容体に結合することによって、細胞に作用する。この受容体は、新規骨形成の原因となる細胞である、骨芽細胞上に見られることが知られる。
【０００８】
ヒト副甲状腺ホルモンのＮ末端の３４アミノ酸ドメインは、全長ホルモンと生物学的に同等であると報告されてきている。副甲状腺ホルモン１−３４およびその作用様式は、米国特許第４，０８６，１９６号に最初に報告された。副甲状腺ホルモン１−３４は、ジスルフィド結合または重要な三次構造を持たない、副甲状腺ホルモンの完全活性一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）型であることが知られる。これは、いくつかのアルファらせんを含む、中程度の二次構造を含有する。骨粗しょう症患者において、全体の骨量を増加させるために、副甲状腺ホルモンの全身投与を用いた、多くの臨床研究が行われてきており、その大部分は、副甲状腺ホルモンまたは副甲状腺ホルモン１−３４を単独で、あるいは他の活性剤と組み合わせて、何ヶ月も毎日注射することを要する。ＰＴＨおよび副甲状腺ホルモン１−３４に関する、より詳細な記述が、ＷＯ  ０３／０５２０９１にあり、該文献のそれぞれの内容は本明細書に援用される。生物学的活性を持つ、副甲状腺ホルモンの他の一部切除型には、副甲状腺ホルモン１−２５、１−３１および１−３８が含まれる。
【０００９】
ＰＴＨの全身効果を研究する多くの研究がなされてきているが、ＰＴＨの局所投与はほとんど研究されていない。ＷＯ  ０３／０５２０９１は、ＰＴＨの局所投与用のマトリックスを記載する。具体的には、ＷＯ  ０３／０５２０９１は、合成マトリックスおよび天然マトリックス、特にフィブリンまたはポリエチレングリコール・マトリックスに共有結合したものとして、徐放方式で、必要な部位で局所投与しそして放出するための副甲状腺ホルモンを記載する。
【００１０】
しかし、ＷＯ  ０３／０５２０９１は、癒合遅延または非癒合となるリスクがある骨折の修復のように、骨折、特に重傷の骨折の治癒に適したマトリックスを記載していない。
したがって、本発明の目的は、骨折の局所修復に適したマトリックスを提供することである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
発明の概要
驚くべきことに、ＰＴＨを含有するマトリックス（「強化マトリックス」）を用いて、骨折部位にＰＴＨを局所送達して、骨折を修復し、そして治癒させることも可能であることが見出された。
【００１２】
したがって、本発明は、
（ｉ）ＰＴＨおよびＰＴＨ融合ペプチドからなる群より選択されるペプチド；
（ｉｉ）カルシウム・ミネラルを含む顆粒材料ならびに
（ｉｉｉ）フィブリノーゲン前駆体構成要素およびトロンビン前駆体構成要素を含み、生理学的条件下でフィブリン・マトリックスを形成可能な組成物
を含む配合物であって、
ＰＴＨまたはＰＴＨ融合ペプチドが、０．０１〜２ｍｇ／ｍｌフィブリン・マトリックスまたは該マトリックスを形成する前駆体構成要素の間の濃度範囲内で存在し、但し、０．４ｍｇ／ｍｌフィブリン・マトリックスまたは該マトリックスを形成する前駆体構成要素の濃度は含まれない、
前記配合物に関する。
【００１３】
本発明はまた、
（ｉ）ＰＴＨまたはＰＴＨ融合ペプチド；
（ｉｉ）カルシウム・ミネラルを含む顆粒材料および
（ｉｉｉ）フィブリン
を含む強化マトリックスであって；
前記ＰＴＨまたはＰＴＨ融合ペプチドが、０．０１〜２ｍｇ／ｍｌフィブリン・マトリックスの間の濃度範囲内で存在し、但し、０．４ｍｇ／ｍｌフィブリン・マトリックスの濃度は含まれない、
前記強化マトリックスにも関する。
【００１４】
本発明はまた、骨折の修復のために局所投与される薬剤の製造のための、前記配合物および強化マトリックスの使用にも関する。
好ましくは、ＰＴＨは、マトリックス中に放出可能に組み入れられ、そして強化マトリックスが骨折部位で適用されるかまたは形成される。好ましくは、ＰＴＨはマトリックスに共有結合する。１つの態様において、マトリックスはフィブリン・マトリックスである。副甲状腺ホルモンは、ＰＴＨ１−８４（天然）、ＰＴＨ１−３８、ＰＴＨ１−３４、ＰＴＨ１−３１、またはＰＴＨ１−２５、あるいは前述のもの（「ＰＴＨ」）と同様の特性、すなわち骨形成を示す、ＰＴＨの修飾型または対立遺伝子型いずれであってもよい。好ましくは、ＰＴＨは、ＰＴＨ１−３４である。好ましい態様において、ＰＴＨは、少なくとも２つのドメインを含有する融合ペプチド（「ＰＴＨ融合ペプチド」）であり、第一のドメインはＰＴＨを含み、そして第二のドメインは、マトリックスの形成中または形成後に、マトリックスに架橋可能な、共有的に架橋可能な基質ドメインを含む。
【００１５】
１つの態様において、強化フィブリン・マトリックスは、（ｉ）顆粒材料、（ｉｉ）フィブリノーゲンおよびトロンビンを含有するフィブリン・マトリックスを形成するのに適した組成物、ならびに（ｉｉｉ）骨折を修復し、そして治癒させるのに適した、０．０１〜２ｍｇ  ＰＴＨ／ｍｌフィブリン・マトリックスの間の範囲内のＰＴＨであって、但し、０．４ｍｇ  ＰＴＨ／ｍｌフィブリン・マトリックスの濃度は含まれない、前記ＰＴＨを含む配合物から形成される。
【００１６】
上記配合物を含むキットもまた提供し、ここでマトリックスを形成するのに適した構成要素の少なくとも１つは、マトリックスを形成するための他の構成要素から分離されて保存されている。
【００１７】
配合物および強化マトリックスは、好ましくは、骨折、特に癒合遅延または非癒合となるリスクがある骨折の修復および治癒に用いられる。好ましい適応症には、手首の骨折（橈骨遠位端骨折）、脛骨などの長い骨の骨折、および股関節骨折が含まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
発明の詳細な説明
放出可能に組み入れられたＰＴＨを含む強化マトリックスであって、場合によって顆粒材料を含有する、前記強化マトリックスを本明細書に記載する。ＰＴＨは、マトリックスへの共有連結を通じて、あるいはマトリックスおよび／または顆粒との非共有相互作用を通じてのいずれかで、組み入れられる。これらの強化マトリックスは、自家移植片に比較して、治癒時間を減少させ、そしてまたはそうでなければ治癒しないであろう骨折の治癒を誘発する。該マトリックスは生体適合性でそして生物分解性であり、そして移植時点でｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで形成可能である。ＰＴＨは、その生物活性を完全に保持しつつ、マトリックス内に組み入れられることも可能である。骨折が治癒するための徐放ビヒクルとしてマトリックスを用いて、どのように、そしていつ、そしてどの程度の度合いまでＰＴＨが放出されるかに関する制御を提供する技術を用いて、ＰＴＨを放出可能に組み入れることも可能である。
定義
「接着部位または細胞付着部位」は、本明細書において、一般的に、細胞表面上の分子、例えば接着促進受容体が結合する、ペプチド配列を指す。接着部位の例には、限定されるわけではないが、フィブロネクチン由来のＲＧＤ配列、およびラミニン由来のＹＩＧＳＲ（配列番号１）配列が含まれる。接着部位は、フィブリン・マトリックスに架橋可能な基質ドメインを含めることによって、場合によって、マトリックスに組み入れ可能である。
【００１９】
「生物学的活性」は、本明細書において、一般的に、関心対象のタンパク質に仲介される機能的事象を指す。いくつかの態様において、これには、ポリペプチドと別のポリペプチドの相互作用を測定することによってアッセイされる事象が含まれる。これにはまた、関心対象のタンパク質が、細胞増殖、分化、死、遊走、接着、他のタンパク質との相互作用、酵素活性、タンパク質リン酸化または脱リン酸化、転写、あるいは翻訳に対して有する影響をアッセイすることもまた含まれる。
【００２０】
「骨折」は、本明細書において、２以上の別個の骨セグメントを生成する、全骨構造に渡る不連続または断絶を指す。
「カルシウム・ミネラル」は、本明細書において、一般的に、カルシウム・イオンを含有する、天然存在均質物質を指す。カルシウム・ミネラルの例は、歯および骨の主な構成要素である、ヒドロキシアパタイト（Ｃａ５［（ＯＨ）（ＰＯ４）３］）である。
【００２１】
「架橋」は、本明細書において、一般的に、共有連結の形成を意味する。
「癒合遅延」は、本明細書において、一般的に、３〜４ヶ月以内、すなわち通常の骨治癒には適切であると見なされる時間枠内に、治癒しなかった骨折を意味する。癒合遅延は、癒合が緩慢であるが、さらなる外科的または非外科的介入を伴わずに、最終的に癒合が起こるであろうことを示唆する。しかし、癒合遅延は、ある場合には、後の時点で、非癒合に進行しうる。
【００２２】
「フィブリン・マトリックス」は、本明細書において、一般的に、前駆体構成要素、フィブリノーゲンおよびトロンビンの実質的にすべてが、カルシウム供給源および因子ＸＩＩＩａの存在下で架橋して、三次元ネットワークを形成するプロセスの産物を意味する。
【００２３】
「マトリックス」は、本明細書において、一般的に、材料に応じて、永続的または一時的のいずれかで、生物学的系に干渉して、任意の組織または組織の機能を治療するか、増大させるか、または置換するよう意図される材料を指す。マトリックスは、組み入れられたＰＴＨの送達デバイスとして、そして／または細胞内殖マトリックスとして働きうる。本明細書記載のマトリックスは、体の必要な部位で足場を形成可能な液体前駆体構成要素から形成される。用語「マトリックス」、「ゲル」またはバイオマテリアルは、本明細書において同義に用いられる。用語「マトリックス」および「ゲル」は、前駆体構成要素が一緒に混合された後に形成される組成物を指す。したがって、用語「マトリックス」および「ゲル」は、部分的にまたは完全に架橋されたポリマー性ネットワークを含む。これらは、液体、ペーストなどの半固体、または固体の形であってもよい。前駆体材料の種類に応じて、マトリックスは、水で膨張するが、水に溶解しない、すなわちある期間に渡って体に留まる、ヒドロゲルを形成することも可能である。
【００２４】
「天然存在前駆体構成要素またはポリマー」は、本明細書において、一般的に、天然に見られうる分子を指す。
「非癒合」は、本明細書において、一般的に、毎月のＸ線写真研究で、傷害後、３〜６ヶ月以内（骨折の種類および部位に応じる）に骨折治癒の進行を示さない骨折を意味する。
【００２５】
「ＰＴＨ」は、本明細書において、ＰＴＨ１−８４のヒト配列、ならびに骨形成特性を示す、特に、好ましくはフィブリン・マトリックスに共有結合して組み入れられた際に、該特性を示す、ＰＴＨの一部切除型、修飾型および対立遺伝子型すべてを含む。ＰＴＨの好ましい一部切除型は、ＰＴＨ１−３８、ＰＴＨ１−３４、ＰＴＨ１−３１またはＰＴＨ１−２５である。最も好ましいのはＰＴＨ１−３４である。好ましくは、ＰＴＨはヒトＰＴＨであるが、ウシＰＴＨなどの他の供給源由来のＰＴＨが適切でありうる。
【００２６】
「ＰＴＨ融合ペプチド」は、本明細書において、一般的に、少なくとも第一のドメインおよび第二のドメインを含有するペプチドを指す。一方のドメインは、ＰＴＨ、好ましくはＰＴＨ  １−３４を含有し、そして他方のドメインは、形成中または形成後にフィブリン・マトリックスに架橋可能な基質ドメインを含有する。酵素的または加水分解的分解部位もまた、第一のドメインおよび第二のドメインの間に存在してもよい。
【００２７】
「骨膜」は、本明細書において、関節構造を形成する部分を例外として、全骨構造を覆い、そして骨組織外部に栄養分を与える血管系を含有する、密集した線維層を形成する骨の外層を意味する。
【００２８】
「生理学的」は、本明細書において、一般的に、生存する脊椎動物において見られうるような条件を意味する。特に、生理学的条件は、温度およびｐＨなどのヒト体内の条件を指す。生理学的温度は、特に、３５℃〜４２℃の間の温度範囲、好ましくは３７℃前後を意味する。
【００２９】
「骨折の修復または治癒」は、本明細書において、一般的に、破壊された骨の端を再連結し、そして再編成することを意味する。
「強化マトリックス」またはバイオマテリアルは、本明細書において、一般的に、組み入れられたＰＴＨを有するマトリックスを意味する。
【００３０】
Ｉ．強化マトリックス
Ａ．マトリックス材料
組織修復または再生のため、細胞は、創傷床内に遊走し、増殖し、マトリックス構成要素を発現するかまたは細胞外マトリックスを形成し、そして最終的な組織形状を形成する必要がある。しばしば、多数の細胞集団がこの形態形成反応に関与し、これにはしばしば血管細胞および神経細胞が含まれる。マトリックスは、これが起こることを非常に増進することが立証されており、そしていくつかの場合には、これが起こるために必須であることが見出されてきている。
【００３１】
天然起源または合成起源あるいは両方の混合物からマトリックスを発展させるアプローチが取られてきている。ＷＯ  ０３／０５２０９１に記載されるフィブリン・マトリックスは、骨折の修復に適したマトリックス材料であることが見出されてきている。
【００３２】
マトリックスは、イオン的に、共有的に、またはその組み合わせによって、前駆体分子を架橋することによって、そして／または１以上のポリマー性材料、すなわちマトリックスを膨張させて、細胞のマトリックスへの内殖または遊走を可能にするのに十分なポリマー間空間を有するポリマー性ネットワークを形成することによって、形成される。１つの態様において、マトリックスは、タンパク質、好ましくはマトリックスを移植しようとする患者に天然に存在するタンパク質で形成される。特に好ましいマトリックス・タンパク質はフィブリンであるが、コラーゲンおよびゼラチンなど、他のタンパク質で作製されるマトリックスもまた使用可能である。多糖および糖タンパク質もまた、マトリックスを形成するのに使用可能である。
【００３３】
フィブリン・マトリックス
フィブリンは、いくつかの生物医学適用に関して報告されている天然材料である。フィブリンで作製されるマトリックスは、Ｈｕｂｂｅｌｌらに対する米国特許第６，３３１，４２２号において、細胞内殖マトリックス用の材料として記載されてきている。フィブリンは、多くの組織に結合可能であり、そして創傷治癒において天然に役割を有するため、シーラントとして用いられてきている。いくつかの特定の適用には、血管移植片付着用、心臓弁付着用のシーラントとしての使用が含まれる。さらに、これらのマトリックスは、薬剤送達デバイスとして、そしてニューロン再生のため、用いられてきている。フィブリン・マトリックスは、組織再生および細胞内殖のための固体支持体を提供するが、単量体には、これらのプロセスを直接増進する活性配列はほとんどない。
【００３４】
フィブリノーゲンが重合してフィブリンになるプロセスもまた、性質決定されてきている。まず、プロテアーゼが二量体フィブリノーゲン分子を２つの対称部位で切断する。フィブリノーゲンを切断可能な、ありうるプロテアーゼがいくつかあり、これには、トロンビン、ペプチダーゼ、およびプロテアーゼＩＩＩが含まれ、そしてこれらは各々、異なる部位で該タンパク質を切断する。フィブリノーゲンが切断されたら、フィブリノーゲン単量体が一体となり、そして非共有的に架橋されたポリマーゲルを形成する、自己重合工程が起こる。この自己組み立ては、プロテアーゼ切断が起こった後に、結合部位が暴露されるために起こる。ひとたび暴露されると、分子中央のこれらの結合部位は、ペプチド鎖端に存在する、フィブリノーゲン鎖上の他の部位に結合可能になる。この方式でポリマー・ネットワークが形成される。次いで、因子ＸＩＩＩａ、トロンビン・タンパク質分解によって、因子ＸＩＩＩａから活性化されたトランスグルタミナーゼが、ポリマー・ネットワークを共有架橋しうる。他のトランスグルタミナーゼが存在し、そしてこれらもまた、フィブリン・ネットワークへの共有架橋および移植に関与しうる。
【００３５】
ひとたび架橋フィブリン・マトリックスが形成されたら、続く分解は厳重に制御される。フィブリン分解を制御する際に重要な分子の１つは、α２−プラスミン阻害剤である。この分子は、因子ＸＩＩＩａの作用を通じて、フィブリンのα鎖に架橋することによって作用する。自身をマトリックスに付着させることによって、高濃度の阻害剤がマトリックスに局在化可能である。次いで、阻害剤は、フィブリンへのプラスミノーゲンの結合を防止し、そしてプラスミンを不活性化することによって、作用する。α２−プラスミン阻害剤は、グルタミン基質を含有する。正確な配列は、ＮＱＥＱＶＳＰＬ（配列番号２）と同定されており、最初のグルタミンが架橋のための活性アミノ酸である。
【００３６】
因子ＸＩＩＩａ基質配列および生物活性ペプチド配列を含有する２ドメインのペプチドをフィブリン・マトリックス内に架橋することが可能であり、そしてこの生物活性ペプチドはｉｎ  ｖｉｔｒｏでその細胞活性を保持することが立証されている。
【００３７】
適応症およびフィブリン・マトリックス内に混合される材料に応じて、トロンビンの濃度は多様でありうる。１つの好ましい態様において、フィブリン・マトリックスは、フィブリン・マトリックス１ミリリットルあたり５〜６５ｍｇ、より好ましくは、フィブリン・マトリックス１ミリリットルあたり１５〜６０ｍｇ、さらにより好ましくは、フィブリン・マトリックス１ミリリットルあたり２５〜５５ｍｇ、そして最も好ましくは、フィブリン・マトリックス１ミリリットルあたり３０〜４５ｍｇの範囲内で、フィブリノーゲンを含有する。トロンビンは、フィブリン・マトリックス１ミリリットルあたり０．５〜５Ｉ．Ｕ．の範囲内で、より好ましくは、フィブリン・マトリックス１ミリリットルあたり１．２５〜３．２５Ｉ．Ｕ．の範囲内で、最も好ましくは、フィブリン・マトリックス１ミリリットルあたり１．５〜２．５Ｉ．Ｕ．で存在する。さらに、カルシウム・イオン供給源は、フィブリン・マトリックスが形成されるのを補助する。カルシウム・イオン供給源は、好ましくは、フィブリン・マトリックス１ｍｌあたり０．５〜５ｍｇの濃度範囲内、さらにより好ましくは、フィブリン・マトリックス１ｍｌあたり２〜３．５ｍｇの濃度内、最も好ましくは、フィブリン・マトリックス１ｍｌあたり２．５〜３ｍｇの濃度範囲内のＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏである。この組成物は、フィブリン・マトリックス内に混合する前のいかなる潜在的な顆粒を湿らせるのに用いるいかなる水も考慮に入れず、これは、前記の水が、マトリックス形成プロセスの間中、顆粒の孔に留まり、そしてしたがってフィブリン・マトリックスにおいて、フィブリノーゲンおよびトロンビン濃度に対していかなる希釈効果も持たないであろうためである。Ｉ．Ｕ．は、トロンビンの１国際単位を表し、そしてヒト・トロンビンの第一国際標準の０．０８５３ｍｇに含有される活性として定義される。
【００３８】
フィブリン・マトリックスを形成するための前駆体構成要素
フィブリン・マトリックスは、好ましくは、溶液の形であってもよい２つの前駆体構成要素から形成される。第一の前駆体構成要素は、典型的には溶液の形であり、フィブリノーゲン、好ましくは、前駆体溶液１ミリリットルあたり１０〜１３０ｍｇのフィブリノーゲン、より好ましくは、前駆体溶液１ミリリットルあたり３０〜１２０ｍｇのフィブリノーゲン、さらにより好ましくは、前駆体溶液１ミリリットルあたり５０〜１１０ｍｇのフィブリノーゲン、そして最も好ましくは、前駆体溶液１ミリリットルあたり６０〜９０ｍｇの濃度範囲内のフィブリノーゲンを含有する。マトリックスを形成するために、トロンビンを添加しなければならない場合、第二の前駆体構成要素は、典型的にはやはり溶液の形であり、前駆体溶液１ミリリットルあたり１〜１０Ｉ．Ｕ．のトロンビン、より好ましくは、前駆体溶液１ミリリットルあたり２．５〜６．５Ｉ．Ｕ．のトロンビン、最も好ましくは、前駆体溶液１ミリリットルあたり３〜５Ｉ．Ｕ．の濃度範囲内のトロンビンを含有する。さらに、カルシウム・イオン供給源が、前駆体溶液の１つ中にある。カルシウム・イオン供給源は、好ましくは前駆体溶液１ｍｌあたり１〜１０ｍｇの濃度範囲内、さらにより好ましくは前駆体溶液１ｍｌあたり４〜７ｍｇ、最も好ましくは前駆体溶液１ｍｌあたり５〜６ｍｇのＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏである。場合によって、因子ＸＩＩＩａのように、マトリックス形成を触媒可能な酵素を、前駆体溶液に添加する。好ましくは、因子ＸＩＩＩａは、前駆体溶液１ミリリットルあたり０．５〜１００Ｉ．Ｕ．、より好ましくは、前駆体溶液１ミリリットルあたり１〜６０Ｉ．Ｕ．、そして最も好ましくは、前駆体溶液１ミリリットルあたり１〜１０Ｉ．Ｕ．の濃度範囲内で存在する。
【００３９】
Ｂ．細胞付着部位
細胞は、細胞表面で、タンパク質−タンパク質、タンパク質−オリゴ糖およびタンパク質−多糖相互作用を通じて、環境と相互作用する。細胞外マトリックス・タンパク質は、細胞に多数の生物活性シグナルを提供する。細胞を補助するには、この濃密なネットワークが必要であり、そしてマトリックス中の多くのタンパク質が、細胞接着、伸展、遊走、および分化を制御することが示されてきている。特に活性であることが示されている特定のタンパク質のいくつかには、ラミニン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、フィブリン、フィブリノーゲンおよびコラーゲンが含まれる。ラミニンの多くの研究が行われてきており、そしてラミニンが、ｉｎ  ｖｉｖｏで神経の、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで神経細胞の発生および再生において、ならびに血管新生において、きわめて重要な役割を果たすことが示されてきている。細胞受容体と直接相互作用し、そして接着、伸展またはシグナル伝達を引き起こす特定の配列のいくつかが同定されてきている。
【００４０】
ラミニンは、巨大な多ドメイン・タンパク質であり、いくつかの受容体結合ドメインを含む３つの鎖からなることが示されてきている。これらの受容体結合ドメインには、ラミニンＢ１鎖のＹＩＧＳＲ（配列番号１）配列、ラミニンＡ鎖のＬＲＧＤＮ（配列番号３）、およびラミニンＢ１鎖のＰＤＧＳＲ（配列番号４）が含まれる。細胞に関するいくつかの他の認識配列もまた、同定されてきている。これらには、ラミニンＡ鎖のＩＫＶＡＶ（配列番号５）およびラミニンＢ２鎖の配列ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ（配列番号６）が含まれる。特に好ましいのは、フィブロネクチン由来のＲＧＤ配列である。
【００４１】
さらに好ましい態様において、細胞接着のためのペプチド部位、すなわち細胞表面上の接着促進受容体に結合するペプチドが、マトリックス内に組み入れられる。こうした接着促進ペプチドには、上述のものが含まれる。特に好ましいのは、フィブロネクチン由来のＲＧＤ配列およびラミニン由来のＹＩＧＳＲ（配列番号１）配列である。いくつかの天然マトリックスで、細胞付着部位が含まれてもよい。組み入れは、例えば、システイン含有細胞付着ペプチドと、ＰＥＧアクリレート、ＰＥＧアクリルアミドまたはＰＥＧビニルスルホンなどの共役不飽和基を含む、前駆体分子を混合することによって、達成可能である。この工程は、チオール含有前駆体構成要素などの求核基を含む、残りの前駆体構成要素と混合する前に、短期間で、例えば数分で起こることも可能である。細胞付着部位がシステインを含まない場合、システインを含むように化学的に合成してもよい。この工程中に、接着促進ペプチドは、共役不飽和で多重に官能化された前駆体の一端に組み入れられるようになり；残りのマルチチオールが系に添加されると、架橋されたネットワークが形成されるであろう。
【００４２】
マトリックス内に共有結合した接着部位の濃度は、細胞浸潤の速度に影響を及ぼしうる。例えば、所定のヒドロゲルに関して、ある濃度範囲のＲＧＤをマトリックスに組み入れて、最適な方式で細胞内殖および細胞遊走を支持することも可能である。ＲＧＤのような接着部位の最適濃度範囲は、特に、水取り込み終了後、平衡濃度〜９２重量％の間の水含量を有するマトリックスに関しては、０．０４〜０．０５ｍＭの間、そしてさらにより好ましくは、０．０５ｍＭである。
【００４３】
Ｃ．  ＰＴＨ
用語「ＰＴＨ」には、本明細書において、ＰＴＨ１−８４のヒト配列、ならびに生物分解性天然または合成マトリックスに共有結合した際に、骨形成特性を示す、ＰＴＨの一部切除型、修飾型および対立遺伝子型すべてが含まれる。ＰＴＨの好ましい一部切除型は、ＰＴＨ１−３８、ＰＴＨ１−３４、ＰＴＨ１−３１、ＰＴＨ１−２８またはＰＴＨ１−２５である。最も好ましいのはＰＴＨ１−３４である。好ましくは、ＰＴＨはヒトＰＴＨであるが、ウシＰＴＨなどの他の供給源由来のＰＴＨが適切でありうる。０．０１〜２ｍｇ  ＰＴＨ／ｍｌマトリックスの間の範囲内のＰＴＨが、骨折の修復および治癒に適しており、但し、０．４ｍｇ  ＰＴＨ／ｍｌマトリックスの濃度は含まれない。好ましくは、ＰＴＨの濃度は、０．１〜１．７ｍｇ／ｍｌマトリックスの間の範囲内であり、さらにより好ましくは、濃度範囲は、０．３〜１．５ｍｇ／ｍｌマトリックスの間の範囲内であり、そして最も好ましくは、０．４〜１．１ｍｇ／ｍｌマトリックスの間の濃度範囲内であり、但し、０．４ｍｇ  ＰＴＨ／ｍｌマトリックスの濃度は含まれない。好ましい態様において、マトリックスはフィブリン・マトリックスである。
【００４４】
Ｄ．  ＰＴＨ融合ペプチド
好ましい態様において、ＰＴＨは、少なくとも２つのドメインを含むＰＴＨ融合ペプチドであり、第一のドメインはＰＴＨを含み、そして第二のドメインは、マトリックスの形成中または形成後に、マトリックスに架橋可能な、架橋可能基質ドメインを含む。基質ドメインは、酵素に関するドメインであり、好ましくはトランスグルタミナーゼの基質ドメイン（「トランスグルタミナーゼ基質ドメイン」）、より好ましくは組織トランスグルタミナーゼの基質ドメイン（「組織トランスグルタミナーゼ基質ドメイン」）であり、そして最も好ましくは因子ＸＩＩＩａの基質ドメイン（「因子ＸＩＩＩａ基質ドメイン」）である。トランスグルタミナーゼは、タンパク質に結合したグルタミニル残基のガンマ−カルボキサミド基およびリジン残基のイプシロン−アミノ基の間のアシル−トランスファー反応を触媒し、Ｎ−イプシロン−（ガンマ−グルタミル）リジン・イソペプチド側鎖架橋の形成を生じる。ＰＴＨ融合ペプチドのアミノ酸配列は、酵素的または加水分解的切断部位をさらに含有するように設計可能であり、したがって、一次構造がほとんどまたはまったく修飾されずに、ＰＴＨが放出されることも可能である。
【００４５】
トランスグルタミナーゼ基質ドメイン、および特に因子ＸＩＩＩａ基質ドメインは、フィブリン・マトリックスなどの天然マトリックスに融合ペプチドを連結するのに適している。フィブリン・マトリックスとともに用いた場合、融合ペプチドにおける分解部位は、好ましくは酵素的に分解可能であり、したがって、ＰＴＨの放出は、局在化されたタンパク質分解のように、細胞特異的プロセスによって制御される。
【００４６】
架橋可能基質ドメインには、ＧＡＫＤＶ（配列番号７）、ＫＫＫＫ（配列番号８）、ＹＲＧＤＴＩＧＥＧＱＱＨＨＬＧＧ（配列番号９）、またはＮＱＥＱＶＳＰＬ（配列番号２）が含まれてもよい。
【００４７】
最も好ましい因子ＸＩＩＩａ基質ドメインは、ＮＱＥＱＶＳＰＬ（配列番号２）のアミノ酸配列を有し、そして本明細書において、「ＴＧ」およびＴＧ−ＰＴＨと呼ばれる。
ＰＴＨ融合ペプチドを組換え的にまたは化学合成によって産生してもよい。ＰＴＨ  １−３４融合ペプチドは、好ましくは、化学合成によって産生される。
【００４８】
本発明の目的に適したトランスグルタミナーゼ基質ドメインは、そのアミノ酸配列を含めて、ＷＯ  ０３／０５２０９１に詳細に記載されており、そのそれぞれの内容は本明細書に援用される。
【００４９】
好ましい態様として本明細書に記載するように、因子ＸＩＩＩａ基質ドメインは、ＰＴＨ１−３４に直接連結されるか、またはＰＴＨ（第一のドメイン）およびＮＱＥＱＶＳＰ（配列番号２）配列（第二のドメイン）の間に分解部位が含まれてもよい。こうしたものとして、ＰＴＨ１−３４融合ペプチドは、因子ＸＩＩＩａ基質を介して凝固中にフィブリン内に組み入れられ、そしてＰＴＨ１−３４として放出されることも可能である。
【００５０】
分解部位は、一次ペプチド配列がほとんどまたはまったく修飾されずに、ＰＴＨが放出されることを可能にし、これは、因子のより高い活性を生じうる。さらに、これによって、因子の放出が、細胞特異的プロセスによって制御されることが可能になる。これによって、材料内の細胞の位置に応じて、同じ材料内で、因子が異なる速度で放出されることが可能になる。これはまた、放出が細胞プロセスによって制御されるため、必要とされるＰＴＨ１−３４の総量も減少させる。マトリックスに組み入れられ、そして好ましくはマトリックスに結合したＰＴＨを用いた、上述の骨欠陥の強い治癒に関する１つのありうる説明において、ＰＴＨが、延長された期間に渡って（すなわち単一のパルス用量であるだけでなく）局所投与されるが、連続様式でないことが重要であるようである。これは、マトリックスの酵素的切断または加水分解的切断のいずれかを通じた、緩慢な分解によって達成される。この方式では、次いで、分子が偽パルス効果を通じて送達され、これは持続された期間に渡って起こる。プレ骨芽細胞がマトリックスに浸潤すると、該細胞はＰＴＨ分子と出会い、該分子はプレ骨芽細胞のさらなる増殖を誘導するとともに、新規骨形成に決定的に重要な多数の増殖因子の合成を誘導するであろう。しかし、その特定の細胞が、結合しているＰＴＨをマトリックスから遊離させ続けないならば、該細胞はインターロイキン−６を産生し始めず、それによってより遅い段階での破骨細胞形成に対する異化効果が回避されるであろう。次いで、最終結果は、より高い骨量および骨マトリックスの正味形成である。最後に、ペプチドの療法効果は、欠陥領域に局在化され、そして続いて拡大される。
【００５１】
融合ペプチドの分解部位
酵素的または加水分解的分解部位が、融合ペプチドの第一のドメインおよび第二のドメインの間に存在してもよい。分解部位は、特異的な酵素的分解によって分解可能であってもよい。これによって、局在化されたタンパク質分解など、細胞特異的プロセスによって、ＰＴＨの放出が制御されることが可能になる。これによって、材料内の細胞の位置に応じて、材料内で、ＰＴＨが異なる速度で放出されることが可能になる。好ましくは、分解部位は、プラスミンおよびマトリックス・メタロプロテイナーゼからなる群より選択される酵素によって切断可能である。この酵素的分解部位のＫｍおよびＫｃａｔを注意深く選択することによって、フィブリン・マトリックスの前または後のいずれかで、そして／または類似のまたは似ていない酵素を利用してマトリックスを分解することによって、分解が起こるように制御してもよい。これらの分解可能部位は、フィブリン・マトリックスからのＰＴＨのより特異的な放出を操作することを可能にする。分解可能部位は、マトリックスに侵襲した細胞から放出される酵素によって切断可能である。分解部位によって、その位置での、そして／またはマトリックス内での細胞活性に応じて、マトリックス内の異なる位置で送達速度が多様になることが可能になる。さらなる利点には、送達系内の総薬剤用量がより少ないこと、および空間的な放出制御が、最大細胞活性時に放出される薬剤の割合がより高くなるのを可能にすることが含まれる。分解部位は、本発明の関連において、「ｐｌ」と略される。
【００５２】
タンパク質分解的に分解可能な部位には、コラゲナーゼ、プラスミン、エラスターゼ、ストロメリシン、またはプラスミノーゲン活性化因子の基質が含まれうる。例示的な基質を以下に列挙する。Ｎ１〜Ｎ５は、タンパク質分解が起こる部位から、タンパク質のアミノ末端に向かうアミノ酸１〜５位を示す。Ｎ１’〜Ｎ４’は、タンパク質分解が起こる部位から、タンパク質のカルボキシ末端に向かうアミノ酸１〜４位を示す。
表１：プロテアーゼの実例の基質配列
【００５３】
【表１】
2008526810.tif 000003
【００５４】
好ましい態様は、第一のドメインおよび第二のドメインの間の配列ＹＫＮＲ（配列番号１８）であり、これは連結をプラスミン分解可能にする。
特に好ましいＰＴＨ融合ペプチドはＴＧｐｌＰＴＨ：
ＮＱＥＱＶＳＰＬＹＫＮＲＳＶＳＥＩＱＬＭＨＮＬＧＫＨＬＮＳＭＥＲＶＥＷＬＲＫＫＬＱＤＶＨＮＦ（配列番号１９）
である。
【００５５】
好ましい融合タンパク質には：
ＴＧ−ＰＴＨ１−３４：これは天然ＰＴＨのアミノ酸１−３４とともに、ＴＧ（トランスグルタミナーゼ）基質ドメインを含むＰＴＨの修飾型である：
ＮＱＥＱＶＳＰＬＳＶＳＥＩＱＬＭＨＮＬＧＫＨＬＮＳＭＥＲＶＥＷＬＲＫＫＬＱＤＶＨＮＦ（配列番号２０）
ＴＧ−ｐｌ−ＰＴＨ１−３４：この型は、ＴＧ配列およびＰＴＨ１−３４の間にプラスミン分解可能配列（ｐｌ）をさらに含有する点を除いて、ＴＧ−ＰＴＨに対応する：
ＮＱＥＱＶＳＰＬＹＫＮＲＳＶＳＥＩＱＬＭＨＮＬＧＫＨＬＮＳＭＥＲＶＥＷＬＲＫＫＬＱＤＶＨＮＦ（配列番号１９）
が含まれる。
【００５６】
タンパク質分解的分解に使用可能な酵素は数多い。タンパク質分解的に分解可能な部位には、コラゲナーゼ、プラスミン、エラスターゼ、ストロメリシン、またはプラスミノーゲン活性化因子の基質が含まれうる。
【００５７】
別の好ましい態様において、オリゴ−エステル・ドメインを、第一のドメインおよび第二のドメインの間に挿入してもよい。これは、乳酸のオリゴマーなどのオリゴ−エステルを用いて達成可能である。
【００５８】
マトリックスまたは前駆体構成要素およびＰＴＨの組み合わせ
ＰＴＨまたはＰＴＨ融合ペプチドは、好ましくは、骨折を修復し、そして治癒させるのに適した、０．０１〜２ｍｇ  ＰＴＨ／ｍｌマトリックスまたは該マトリックスを形成する前駆体構成要素の間の範囲内であって、但し、０．４ｍｇ  ＰＴＨ／ｍｌフィブリン・マトリックスまたは該マトリックスを形成する前駆体構成要素の濃度は含まれない。好ましくは、ＰＴＨの濃度は、０．１〜１．７ｍｇ／ｍｌフィブリン・マトリックスまたは該マトリックスを形成する前駆体構成要素の間の範囲内であり、さらにより好ましくは、濃度範囲は、０．３〜１．５ｍｇ／ｍｌフィブリン・マトリックスまたは該マトリックスを形成する前駆体構成要素の間の範囲内であり、そして最も好ましくは、０．４〜１．１ｍｇ／ｍｌフィブリン・マトリックスまたは該マトリックスを形成する前駆体構成要素の間の濃度範囲内であり、但し、０．４ｍｇ  ＰＴＨ／ｍｌフィブリン・マトリックスまたは該マトリックスを形成する前駆体構成要素の濃度は含まれない。患者の年齢に応じて、マトリックスにおいて、ＰＴＨまたはＰＴＨ融合ペプチドの特定の濃度が好ましい。配合物を小児における骨折に適用する場合、ＰＴＨまたはＰＴＨ融合ペプチドの濃度は、好ましくは０．４ｍｇ  ＰＴＨまたはＰＴＨ融合ペプチド／ｍｌマトリックスまたは該マトリックスを形成する前駆体構成要素未満であるが、０．０１ｍｇ  ＰＴＨまたはＰＴＨ融合ペプチド／ｍｌマトリックスまたは該マトリックスを形成する前駆体構成要素より高い。具体的には、ＰＴＨまたはＰＴＨ融合ペプチドの濃度は、０．０１〜０．３５ｍｇ  ＰＴＨまたはＰＴＨ融合ペプチド／ｍｌマトリックスまたは該マトリックスを形成する前駆体構成要素の間の範囲内であり、より好ましくは、０．１〜０．３ｍｇ／ｍｌフィブリン・マトリックスまたは該マトリックスを形成する前駆体構成要素の間の濃度範囲内であり、そして最も好ましくは、０．０５〜０．１５ｍｇ  ＰＴＨまたはＰＴＨ融合ペプチド／ｍｌマトリックスまたは該マトリックスを形成する前駆体構成要素の間の濃度範囲内である。一方、配合物を成人に適用する場合、ＰＴＨまたはＰＴＨ融合ペプチドの濃度は、好ましくは、０．４ｍｇ  ＰＴＨまたはＰＴＨ融合ペプチド／ｍｌマトリックスまたは該マトリックスを形成する前駆体構成要素より高いが、２ｍｇ  ＰＴＨまたはＰＴＨ融合ペプチド／ｍｌマトリックスまたは該マトリックスを形成する前駆体構成要素より高くない。具体的には、ＰＴＨまたはＰＴＨ融合ペプチドの好ましい濃度は、０．４５〜２ｍｇ  ＰＴＨまたはＰＴＨ融合ペプチド／ｍｌマトリックスまたは該マトリックスを形成する前駆体構成要素の間、より好ましくは、０．７〜１．５ｍｇ  ＰＴＨまたはＰＴＨ融合ペプチド／ｍｌマトリックスまたは該マトリックスを形成する前駆体構成要素の間、そして最も好ましくは、０．９〜１．１ｍｇ  ＰＴＨまたはＰＴＨ融合ペプチド／ｍｌマトリックスまたは該マトリックスを形成する前駆体構成要素の間の範囲内である。好ましい態様において、マトリックスはフィブリン・マトリックスである。
【００５９】
Ｅ．顆粒材料
マトリックスはまた、顆粒材料も含有してもよく、好ましくは顆粒材料はカルシウム・ミネラルを含有する。この顆粒材料は、主に、フィブリン・マトリックスが適応症の特定の必要性に適応するように、フィブリン・マトリックスの機械的特性を支持する。顆粒材料は、組成物に必要な機械的支持を提供する、いかなる生体適合材料であってもよく、それによって、機械的支持の度合いは適応症に応じる。好ましくは、顆粒材料はセラミック化合物である。生物分解性セラミック化合物は、マトリックスにおいて、好ましい特性を示してきている。セラミック化合物は、好ましくは、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウムまたは硫酸カルシウムのように、カルシウム・ミネラルを含む。適切な材料には、Ｂｉｏｍａｔｌａｎｔｅ（フランス）のＴＲＩＣＯＳ（登録商標）またはＣａｍ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ、ライデン（オランダ）のＣＡＭＣＥＲＡＭ（登録商標）のような、ヒドロキシアパタイトおよびリン酸三カルシウムの生物分解性多孔混合物が含まれる。最も好ましいのは、ヒドロキシアパタイトおよびリン酸三カルシウムの生物分解性混合物である。一例が、商標名ＴＲＩＣＯＳ（登録商標）の下に市販されている製品であり、該製品は、６０％ヒドロキシアパタイトおよび４０％リン酸三カルシウムを含有する。別の多孔ヒドロキシアパタイト／リン酸三カルシウム顆粒は、ＣＡＭＣＥＲＡＭ（登録商標）である。
【００６０】
無孔性ヒドロキシアパタイト／リン酸三カルシウム顆粒、純粋なヒドロキシアパタイト顆粒（多孔性または無孔性）、リン酸三カルシウム顆粒（多孔性または無孔性）、硫酸カルシウム顆粒、骨チップ（自家移植片または同種移植片いずれか）または異種移植片骨チップを用いることもまた可能である。
【００６１】
強化マトリックス中の顆粒の量は、顆粒のデッドスペースによって制御される。好ましい態様において、顆粒中のデッドスペース体積対マトリックス中の液体の総体積の比は、１：１であり；これは、マトリックス中の顆粒の上限を構成するであろう。骨折の種類に応じて、その骨折の種類が、軽微な機械的支持しか必要としない場合、可能であるものより少ない任意の顆粒の量を用いてもよい。
【００６２】
ＩＩ．適用法
強化マトリックスを、体内または体の上の必要な部位で、ｉｎ  ｓｉｔｕで形成してもよいし、あるいはあらかじめ形成し、そして次いで、所望の部位、すなわち骨折部位内に移植してもよい。ｉｎ  ｓｉｔｕゲル化／形成は、存在するならば顆粒と、ＰＴＨを含有するフィブリン前駆体溶液を混合し、そして骨折部位に該マトリックスを適用することによって、起こりうる。別の態様において、体の外でマトリックスを形成し、そして次いで、あらかじめ形成した形状で適用してもよい。フィブリン・マトリックスが形成される際、前駆体構成要素は、早過ぎる重合を防止するため、適用前には分離されたままにしておくべきである。投与前の早過ぎる接触を防止するため、前駆体溶液を互いに分離するキットを用いてもよい。重合を可能にする条件下で混合した際、前駆体溶液は、ＰＴＨが強化された三次元ネットワークを形成する。前駆体構成要素およびその濃度に応じて、ゲル化時間を必要に合わせて調整することも可能である。
【００６３】
１つの態様において、マトリックスはフィブリノーゲンから形成される。フィブリノーゲンは、適切な温度およびｐＨで、トロンビンおよびカルシウム供給源と接触させられると、多様な反応カスケードを通じてゲル化して、マトリックスを形成する。３つの構成要素、フィブリノーゲン、トロンビン、およびカルシウム供給源は、別個に保存しなければならない。しかし、３つの構成要素のうち少なくとも１つが分離されたままである限り、他の２つの構成要素を投与前に合わせてもよい。
【００６４】
骨折部位に浸透しそして該部位を満たす、液体としての、またはペースト様の堅さ（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｅ）での、マトリックスの導入が可能であるように、強化マトリックスを設計すべきである。固化によって、足場、そしてしたがって活性剤が、骨折部位に保持されることが可能になる。
【００６５】
また、移植時点より前にまたは移植時点に、あるいは移植時点より後にさえ、マトリックスを形成するポリマーの架橋時または架橋に続いてのいずれかで、強化マトリックスに細胞を添加してもよい。これは、マトリックスを架橋して、細胞増殖または内殖を促進するよう設計された格子型空間を生じることに加えてかまたはその代わりであってもよい。
【００６６】
１つの態様において、フィブリノーゲンを生理学的ｐＨ（ｐＨ６．５〜８．０、好ましくはｐＨ７．０〜７．５の範囲内）の緩衝溶液に溶解し（安定性を増加させるため、さらにアプロチニンを含有してもよい）、そして塩化カルシウム緩衝液中のトロンビン溶液と別個に保存する。フィブリノーゲンの緩衝溶液は、さらにＮａＣｌを含むヒスチジン緩衝溶液またはＴＲＩＳ緩衝生理食塩水であってもよい。どちらの溶液も、典型的には凍結して保存され、そして適用前に融解しなければならない。
【００６７】
好ましい態様において、ＰＴＨ、好ましくはＰＴＨ融合タンパク質、好ましくはカルシウム・ミネラルを含有する顆粒材料、フィブリノーゲン、トロンビン、およびカルシウム供給源を含有するキットを提供する。場合によって、キットは、因子ＸＩＩＩａなどの架橋酵素を含有する。ＰＴＨ、好ましくはＰＴＨ融合タンパク質は、フィブリノーゲンまたはトロンビン溶液中のいずれかに存在してもよい。好ましい態様において、フィブリノーゲン溶液は、ＰＴＨ、好ましくはＰＴＨ融合ペプチドを含有する。
【００６８】
フィブリノーゲンおよびトロンビン溶液は、好ましくは、２方向シリンジ・デバイスによって混合され、該デバイス中で、チャンバーおよび／または針および／または静的ミキサーを通じて、両方のシリンジの内容物を押し込むことによって、混合が起こる。
【００６９】
好ましい態様において、フィブリノーゲンおよびトロンビンの両方を、凍結乾燥型で別個に保存する。２つの前駆体構成要素のどちらかが、融合タンパク質および顆粒材料を含有してもよい。使用前に、ｔｒｉｓまたはヒスチジン緩衝液をフィブリノーゲンに添加し、緩衝液は、さらに、アプロチニンを含有して、フィブリノーゲン前駆体溶液を形成してもよい。使用前に、凍結乾燥トロンビンを、塩化カルシウム溶液に溶解して、トロンビン前駆体溶液を形成する。続いて、フィブリノーゲンおよびトロンビン前駆体溶液を、別個の容器、バイアルまたはシリンジ本体にいれ、そして２方向シリンジなどの２方向連結デバイスを用いて混合する。場合によって、容器、バイアルまたはシリンジ本体は、２つの部分からなり、したがって、容器、バイアルまたはシリンジ本体の壁に垂直な調節可能な仕切りによって分離された２つのチャンバーを有する。チャンバーの一方は、凍結乾燥フィブリノーゲンまたはトロンビンを含有する一方、他方のチャンバーは、適切な緩衝溶液を含有する。プランジャーを押し込むと、仕切りが移動し、そして緩衝液がフィブリノーゲン・チャンバー内に放出されて、フィブリノーゲンが溶解する。フィブリノーゲンおよびトロンビンの両方が溶解したら、両方の２部分シリンジ本体を、２方向連結デバイスに取り付けて、そして連結デバイスに取り付けられた注射針を通じて内容物を押し込むことによって、これらを混合する。場合によって、連結デバイスは、内容物の混合を改善するため、静的ミキサーを含有する。
【００７０】
別個のシリンジ中に顆粒材料を提供してもよい。好ましい態様にしたがって、滅菌水をシリンジに注入することによって、顆粒材料を湿らせる。続いて、フィブリン前駆体溶液およびＰＴＨを含有する上記の２方向シリンジを、湿らせた顆粒材料を含有するシリンジに取り付ける。２方向シリンジの全内容物を、顆粒材料を含有するシリンジ内に移す。続いて、骨折部位に、全内容物を注入して、そして数分間、成形可能である。
【００７１】
さらに、上述の成分に加えて他の構成要素が前駆体溶液および／または生じたマトリックスに組み入れられてもよい。例えば、カルシウム・ミネラルを含有する材料、すなわち、ヒドロキシアパタイトなどの、カルシウム・イオンを含有する天然存在均質物質を用いてもよい。
【００７２】
好ましい態様に関して、組成物および方法を記載してきたが、当業者には、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書記載の組成物に、方法に、そして方法の工程において、または方法の工程の順序において、変動を適用してもよいことが明らかであろう。
【実施例】
【００７３】
実施例
実施例１：ＰＴＨ１−３４およびＴＧｐｌＰＴＨ１−３４の生物活性
標準的固相状態ペプチド合成法によって、全長ＰＴＨ１−８４と類似の活性を示すＰＴＨ１−３４ペプチド、およびこの長さのタンパク質を合成してもよい。
【００７４】
標準的９−フルオレニルメチルオキシカルボニル化学反応を用い、自動化ペプチド合成装置を用いて、固形樹脂上で、すべてのペプチドを合成した。ｃ１８クロマトグラフィーによってペプチドを精製し、そして純度を決定するためにＨＰＬＣを介した逆相クロマトグラフィーを用いるとともに、各産物の分子量を同定するために質量分析（ＭＡＬＤＩ）を用いて、分析した。この方法を用いて、ＰＴＨ１−３４ならびにＴＧ−ｐｌ−ＰＴＨ１−３４ＮＱＥＱＶＰＬＹＫＮＲＳＶＳＥＩＱＬＭＨＮＬＧＫＨＬＮＳＭＥＲＶＥＷＬＲＫＫＬ−ＱＤＶＨＮＦ（配列番号１９）およびＴＧＰＴＨ１−３４  ＮＱＥＱＶＰＬＳ−ＶＳＥＩＱＬＭＨＮＬＧＫＨＬＮＳＭＥＲＶＥＷＬＲＫＫＬＱＤＶＨＮＦ（配列番号２０）を合成した。ＴＧｐｌＰＴＨ１−３４およびＴＧＰＴＨ１−３４は、因子ＸＩＩＩａ基質ドメインをさらに含む点がＰＴＨ１−３４とは異なり、該ドメインは、ＴＧｐｌＰＴＨ１−３４の場合はプラスミン分解可能ｐｌ配列ＹＫＮＲ（配列番号１８）を介して、そしてＴＧＰＴＨ１−３４の場合は直接、ＰＴＨ１−３４に連結されている。
【００７５】
ＰＴＨ融合ペプチドの生物活性を調べるため、レポーター遺伝子アッセイを確立した。このアッセイにおいて、副甲状腺ホルモン受容体のプロモーターに連結されたルシフェラーゼ・レポーター遺伝子を含有するプラスミドを、細胞にトランスフェクションする。次いで、細胞がＰＴＨに曝露され、そして続いてＰＴＨが細胞上の受容体に結合すると、上昇したｃＡＭＰレベルを通じて指示されるシグナル・カスケードが開始される。天然のフィードバック制御を通じて、これは次いで、ＰＴＨ受容体レベルの減少を導く。減少がプロモーターを通じて指示されるため、これはまた、次いで、連結されたレポーター遺伝子産生の減少も導く。このアッセイを用いて、天然ＰＴＨ１−３４ならびにＴＧ−ｐｌ−ＰＴＨ１−３４の両方の活性を研究し、そして国際標準に比較した。どちらに関するレポーター遺伝子発現の減少も同じであり、そしてこの活性レベルは、国際標準に関するものと同じであったため、これらの分子の両方が、類似のレベルの活性を示すことが観察された。結果を図１に示す。
【００７６】
実施例２：フィブリン・マトリックスからのＰＴＨ放出
フィブリン・マトリックスを、ＴＩＳＳＥＥＬ（登録商標）キット（Ｂａｘｔｅｒ  ＡＧ、ＣＨ−８６０４  フォルケツヴィル／ＺＨ）フィブリン前駆体構成要素から作製した。組成を表２に列挙する。次いで、０．１μｇ／ｍｌのＰＴＨ１−３４またはＴＧＰＴＨ１−３４の存在下で、トロンビンに添加し、そして混合して均質な濃度を生じた。ＴＧＰＴＨ１−３４は、分解部位を含まず、アミノ末端にトランスグルタミナーゼ配列を有するのみである。したがって、ＴＧＰＴＨ１−３４は、フィブリン・マトリックス自体の分解によってのみ遊離可能である。このペプチドを実施例１に上述するように合成した。
【００７７】
最初の放出アッセイのため、１ｍｌフィブリン・マトリックスあたり０．１ｍｇのＰＴＨまたはＴＧＰＴＨを含む５０μｌのフィブリン・マトリックスを、１０ｍｌ緩衝液中、３７℃でインキュベーションした。したがって、総放出の場合、緩衝液中のＰＴＨまたはＴＧＰＴＨの濃度は、０．５μｇ  ＰＴＨまたはＴＧＰＴＨ／ｍｌフィブリン・マトリックスであろう。アッセイ中のＰＴＨまたはＴＧＰＴＨの安定性を比較するため、ＰＴＨまたはＴＧＰＴＨの試料を、緩衝液中で直接希釈して、０．５μｇ  ＰＴＨまたはＴＧＰＴＨ／ｍｌフィブリン・マトリックスの濃度にした。異なる緩衝液を試験した：蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水。
【００７８】
第０日、第１日、第２日、第４日および第６日にアリコットを採取し、そして直接ＥＬＩＳＡによって分析した。結果によって、ＰＴＨがどの緩衝液中でも２日を超えては安定でないことが示された。したがって、放出データに関して、結論はまったく出せなかった。ＰＴＨ安定性は、ＰＴＨの低濃度および最適でない緩衝液によって、明らかに影響を受けた。
【００７９】
１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中、５０ｍＭマンニトールを含有する安定化緩衝液を用いることによって、放出実験を反復した。さらに、ペプチドのいかなる分解も防止するため、２日ごとに緩衝液を交換した。ＰＴＨまたはＴＧＰＴＨの濃度を、１００μｌフィブリン・マトリックス中、１ｍｇ  ＰＴＨまたはＴＧＰＴＨ／ｍｌフィブリン・マトリックスに増加させ、そして１ｍｌ緩衝液中でインキュベーションを達成した。全放出された場合、緩衝液中のＰＴＨまたはＴＧＰＴＨの濃度は、１００μｇ／ｍｌフィブリン・マトリックスであろう（前回の２００倍多い）。最初の実験におけるように、スパイク処理試料（対照としての、緩衝液中に溶解された、同じ量のＰＴＨまたはＴＧＰＴＨ）を調製して、実験中のＰＴＨまたはＴＧＰＴＨ（１００μｇ／ｍｌ）の安定性を評価した。２週間の間、２〜４日ごとに試料を収集し（緩衝液を交換しながら）、そして直接ＥＬＩＳＡによって分析した。スパイク処理試料もまた、２日ごとに収集した。結果によって、これらの条件下で、ＰＴＨおよびＴＧＰＴＨは２週間を超えて安定であることが示された。
【００８０】
図２からわかるように、フィブリン・マトリックスからの主な放出は、３日以内で達成される。第３日以降には、ほぼ６０％のＰＴＨおよび１３％のＴＧＰＴＨが放出された。これらのデータは、ＴＧ配列の添加によってフィブリン・マトリックス中のＰＴＨの保持が非常に増進されることを立証する。
【００８１】
実施例３：ヒツジ脛骨欠陥モデル
ＴＩＳＳＥＥＬ（登録商標）キット（Ｂａｘｔｅｒ  ＡＧ、ＣＨ−８６０４  フォルケツヴィル／ＺＨ）から出発してフィブリン・マトリックスを形成して、４ｍｌフィブリン・マトリックスを得た。ＴＩＳＳＥＥＬ（登録商標）は、ヒト由来のプールした血漿から産生され、そして活性成分の内容は、あらかじめ定義された範囲内で、ロット間で多様である可能性もある。
【００８２】
マトリックス：３つの別個のシリンジ、フィブリン前駆体溶液およびＰＴＨ融合ペプチドを含有する１つの２方向シリンジ（シリンジ１および２）、ならびに顆粒を含有する２つの一方向シリンジ（シリンジ３および４）を用いて、マトリックスを調製した。表２は、用いた最終組成を列挙する。
表２：ＴＩＳＳＥＥＬ（登録商標）および活性構成要素を含む、最終組成
【００８３】
【表２】
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【００８４】
まず、シリンジ３の水を注入することによって、シリンジ４中のヒドロキシアパタイト／リン酸カルシウム顆粒を湿らせた。シリンジ１のフィブリン前駆体溶液（フィブリン溶解（ｆｉｂｒｏｌｙｓｉｓ）を減少させるのを補助して、フィブリン・マトリックスの完全性を保持するセリンプロテアーゼ阻害剤、アプロチニンを含む溶液中に懸濁された、フィブリノーゲンおよびＰＴＨ）を、シリンジ２のフィブリン前駆体溶液（塩化カルシウム溶液中のトロンビン）と混合した。ＴＧｐｌＰＴＨ１−３４をフィブリノーゲン構成要素中に配合して、マトリックス中、０．１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌのフィブリン・マトリックスの多様な最終濃度を生じ、そしてゲル化プロセス中、ＴＧｐｌＰＴＨ１−３４はマトリックスに架橋された。フィブリン前駆体溶液はまた、血漿フィブロネクチン、因子ＸＩＩＩａ、プラスミノーゲンおよびヒト・アルブミンなどのフィブリン・マトリックスの他の構成要素も含有した。前駆体溶液が等体積である場合、凝固プロセスが起こり、フィブリンが形成される。凝固プロセスは、数分に渡って起こり、これによって、湿った顆粒を含有するシリンジ４への混合溶液の同時注入が可能になる。次いで、マトリックスを必要な部位に導入してもよく、ここで固化が起こる。欠陥部分を完全に満たすのに十分なマトリックスを該部位に入れる。
【００８５】
動物：総数４２頭の４４〜８３ｋｇ（平均：６２．８ｋｇ）および年齢２．２５〜４．７５歳の範囲のＳｗｉｓｓ  Ａｌｐｉｎｅの雌のヒツジを実験動物として選択した。７群を形成して、自家移植片を陽性対照とし、そしてＴＣＰ顆粒を加えたフィブリン・マトリックスを陰性対照とした。他の群は、同じフィブリン・マトリックスおよびＴＣＰ顆粒からなったが、ＴＧｐｌＰＴＨ１−３４の投薬量のみが異なった。１２週間、群を追跡し、この時点で、大学所有の屠殺場で動物を屠殺した。すべての動物実験は、スイスの動物保護および福祉法にしたがって行われ、そして地方の倫理委員会および獣医学当局によって認可された。
【００８６】
手術：骨の上で直接、そして後膝関節の遠位面から飛節に渡って脛骨の骨幹中央へのアプローチを行い、脛骨の中央筋膜を切開して、そして骨膜を乱すことなく脛骨の中央面を暴露した。１１穴の３．５ｍｍ幅の動的圧迫プレート（Ｓｙｎｔｈｅｓ）を骨幹に合わせて成形し、プレートの遠位端が脛骨足根骨関節上に来るようにした。中間の位置で１１の３．５ｍｍのねじを用いてプレートを骨に固定し、そして５つのねじ穴は計画される欠陥に対して遠位に分布し、そして６つのねじ穴は近位に分布した。ねじおよびプレートを取り除いた。その後、５番目および６番目のねじ穴の間に、規格化された１ｃｍの欠陥を確実にするゲージを用いて、手術用メスで骨上に欠陥の印をつけた。振動のこぎりを用いて、一定な洗浄および軟組織の保護の下で、欠陥を切り入れた。円周骨膜を含む１ｃｍセグメントを注意深く取り除き、そしてガーゼで圧を適用して、骨髄または局所軟組織からの局所出血を止めた。上述のように骨ギャップ内にマトリックスを満たす前に、プレートを再配置して、そしてすべてのねじを再挿入した。マトリックスをプレートの下、側部そしてまた経皮質（ｔｒａｎｓｃｏｒｔｅｘ）に等しく分布させるように注意を払った。
【００８７】
陽性自家移植片対照群に関しては、腸骨稜上の直接局所切開を通じて、自家骨を採取した。多数の３．５ｍｍドリル穴を用いて、回腸の骨髄を開放した。キュレットを用いて海綿骨を採取し、そして脛骨の外科的欠陥内に直ちに入れた。欠陥を満たした後、中央筋膜をルーチンに閉じ、そして皮膚をホチキスで留めた（Ｓｉｇｎｅｔ  ３５Ｗ（登録商標）、Ａｕｔｏ  Ｓｕｔｕｒｅｓ、米国コネチカット州）。動物を麻酔したまま、脛骨の内外側および尾頭側視野を用いてＸ線写真を撮影した。全肢遠位部を伴い、膝蓋骨レベルの後膝関節中央まで渡る、完全ギプス（Ｓｃｏｔｃｈ  ＣａｓｔＴＭＰｌｕｓ、Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ  ３Ｍ  Ｓａｎｔｅ、フランス）を適用した。爪の足裏（ｔｈｅ  ｓｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｌａｗｓ）は、骨折部位に対する体重負荷を確実にするが、ギプスを通じた脛骨骨幹の固定を通じた、ねじれまたは剪断力を防止するために開放されたままであった。
【００８８】
動物が横たわり、そして急いで起き上がって肢の再骨折を引き起こすのを防止する、懸垂系で動物を回復させた。動物は４〜５週間、懸垂系で飼育され、ここで介入なしに、眠り、食べ、排便し、そして排尿することが可能であった。その後、研究期間の残りの期間、２〜３頭の動物群で、小さい畜舎で飼育された。
【００８９】
ギプス交換は７〜１０日ごと、または動物が体重負荷に関わる問題を示した場合はそれより早く行われ、そして最短４週間だが最長１２週間、留置された。ギプスを通して、第４週および第８週に、追跡調査Ｘ線写真を撮影した。屠殺時（第１２週）、軟組織、プレートおよびねじを取り除いた後、ｆａｘｉｔｒｏｎ（ＨＰ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）を用いてＸ線写真を撮影した。
【００９０】
巨視的評価：屠殺後、プレートおよび骨折の安定性、炎症の徴候ならびに骨膜仮骨形成に重点を置いて、ギャップの架橋を巨視的に評価した。すべての骨を、デジタルカメラ（Ｍｉｎｉｌｔａ、Ｄｉｍａｇｅ  ７）を用いて文書化した。機械的安定性は手動でのみ試験したが、後の組織標本のため、組織損傷を避けるように注意を払った。
【００９１】
放射線学的評価：Ｘ線写真を評価するため、半定量的スコア系を開発した。骨治癒には、高いスコアが好ましかった。３人の独立の評価者がＸ線写真を評価し、評価者は群および研究中の時点に関して情報を与えられなかった。１セッション中のすべてのＸ線写真をスコア付けし、そしてスコアが異なる場合、統計評価のため、平均スコアを取った。
【００９２】
組織学：簡潔には、先のギャップがすべて含まれるように骨切片を切り出し、そして第一のねじ穴から近位および遠位で切断を行った。４％パラホルムアルデヒド中で３〜４週間固定した後、骨ブロックを洗浄し、上昇する濃度の一連のアルコール中で脱水し、キシレン中で脱脂し、そして最後にアクリル性樹脂中で浸透させた。浸透が完了した後、Ｔｅｆｌｏｎフォーム中で重合を行った。Ｅｘａｃｔａ帯鋸を用いて、中央で、そして骨の長軸に平行に、切片を切り出した。切断切片をａｃｒｏｐａｌプラスチックスライド上でマウントする前に、特別なフィルム（Ｋｏｄａｋ  ＰＰＬ−２）を用い、ｆａｘｉｔｒｏｎでマイクロＸ線写真を撮影した。次いで切片を磨き、そして３０〜４０μｍの厚さに研磨した。トルイジンブルーでの表面染色によって、古い骨マトリックスおよび新しい骨マトリックス、そしてまたＴＣＰ顆粒の間の区別が可能になった。
【００９３】
薄い切片（５μｍ）に関しては、少なくとも１つの皮質、ならびに骨膜および骨内膜仮骨の一部を含有する、より小さい片に、ブロックを切り分けた。正に荷電し、ｃｈｒｏｍａｌａｕｎｅで覆われたガラススライド上に切片をマウントし、脱可塑化（ｄｅｐｌａｓｔｉｆｉｅｄ）し、そしてトルイジンブルーまたはｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ銀染色のいずれかで染色して、ＭｃＮｅａｌで対比染色した。後者では、ミネラル化した骨マトリックスは黒に染色され、一方、石灰化していない類骨は青−青緑色に染色される。
【００９４】
細胞種、炎症の徴候およびマトリックス分解機構に重点を置くことによって、定性的組織学的評価を行った。
半定量的評価は、特別に開発したスコア系を用いて、細胞種の外見に集中し、そして組織形態計測測定値が定量的評価の基礎として働いた。
【００９５】
ヒツジにおける部分的欠陥において、マトリックス（異なる濃度のＴＧｐｌＰＴＨ１−３４を含有する）の再生能をさらに試験した。ここでは、ヒツジ脛骨に、片側性の１ｃｍ全層欠陥を生成した。骨切り術後、骨膜を注意深く取り除いて、欠陥が研究期間に渡って癒合しないことを確実にした。欠陥生成後、適用セクションの方法に上述するように、ｉｎ  ｓｉｔｕゲル化材料を入れた。
【００９６】
比較目的のため、異なる用量のＴＧ−ＰＴＨ：０．４、１、２、５および１０ｍｇ／ｍｌを試験し、フィブリン−顆粒混合マトリックスにＴＧｐｌＰＴＨ１−３４をまったく添加しない（０ｍｇ／ｍｌ）か、または自家移植片（図３および４では「ＡＧ」と略す）を適用する（陽性対照）、２つの対照治療を行った。
【００９７】
４週ごとにＸ線写真を撮影し、そして１２週後に動物を屠殺した。各時点で、Ｘ線写真を分析し、そして治癒の度合いを決定した。さらに、終了時、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、ならびに組織学を介して分析するため、脛骨を摘出した。最後に、完全骨切り術を行い、そして次いで片側にプレートを配置したため、欠陥は顕著なストレスおよび機械力にさらされた。欠陥を治療するのに使用した材料が、顕著な強度を加えない場合、プレートの屈曲および角度の変形を導くこともありうる。これは、Ｘ線写真および最終試料から測定された別のパラメータである。
【００９８】
これらの実験の結果を図３に示す：
このモデルにおいて、ＴＣＰ材料を加えたフィブリンのみ（陰性対照）を試験すると、非常に低い治癒反応が観察された。この対照材料で治療した４頭の動物のうち、臨床的に適切な治癒を示したものはまったくなく、１頭が中程度の治癒反応を示し、そして他の３頭は、１２週後、非癒合の古典的な徴候を示した。さらに、最初の４週以内に、４頭の動物すべてが、プレートの顕著な屈曲およびそれに続く欠陥の変形を示した。
【００９９】
次の一連の動物では、０．４、１、２、５または１０ｍｇ／ｍｌのＴＧｐｌＰＴＨ１−３４の強化マトリックスを試験した。第一の測定として、これらの動物をＸ線写真分析で観察して、骨膜治癒（仮骨形成）量を決定した。続くＸ線写真から、多様な用量のＴＧｐｌＰＴＨ１−３４でこれらの動物を治療すると、治療範囲に渡って用量依存反応が提供されることが観察された。具体的には、これらの動物のＸ線写真を調べると、どの時点でも、０．４〜２ｍｇ／ｍｌの間の用量で、はるかに強い骨膜治癒反応が観察され、０．４および１ｍｇ／ｍｌは、陰性対照材料で治療したものと比較した際、統計的により強い骨膜治癒を提供し、そして１２週では自家移植片と同等の治癒もまた提供した。さらに、１ｍｇ／ｍｌの用量では、大部分の動物が、１２週以内に安定な臨床的癒合を達成することが観察された（図４を参照されたい）。１ｍｇ／ｍｌのＴＧ−ｐｌ−ＰＴＨ１−３４で治療した群では、４週後、治癒の最初の徴候が既に観察可能であった。この治癒は、８週の時点で有意に増加し、この時点では既に１頭の動物が臨床的癒合を示し、一方、他の５頭は進歩した治癒を示した。これは次いで、１２週後、５頭が安定した臨床的癒合を示すように進歩した。さらに、安定性の有意な改善が観察され、１頭の動物のみがプレートの屈曲を示し、これは最初の４週以内に起こった。
【０１００】
図４では、１２週後の部分的脛骨欠陥の安定性を示す。ヒツジを１２週目に屠殺した後、プレートを取り除き、そして元来のギャップの安定性を素早く決定した。次いで、明らかに不安定な欠陥のパーセントを決定した。自家移植片で治療した動物はいずれも不安定な欠陥を持たないことがわかり、モデルが正当であることが確認された。さらに、動物を１ｍｇ／ｍｌのＴＧｐｌＰＴＨ１−３４で治療すると、１頭の動物のみが不安定な欠陥を有し、類似の強い治癒反応が提供された。１ｍｇ／ｍｌに近い用量もまた、ある程度の安定性を示したが、より高い用量およびゼロ用量は、終了時、はるかにより低い安定性を示した。
【０１０１】
治癒の最後の測定として、組織形態計測を通じて、骨内膜骨形成速度（長い骨の内層、すなわちギャップ内部での骨形成）および顆粒吸収を測定した。１ｍｇ／ｍｌ  ＴＧｐｌＰＴＨ１−３４用量を用いると、骨内膜骨形成の量は、他の濃度のＴＧｐｌＰＴＨ１−３４を用いた場合よりはるかに高く、より高い用量は、より少ない量の新規骨形成を提供した。さらに、顆粒吸収速度は、骨内膜骨形成速度に正比例し、再び、１ｍｇ／ｍｌ  ＴＧｐｌＰＴＨ１−３４の用量が最適の反応（すなわち最高吸収速度）を提供した。全用量範囲を観察すると、より高い用量が、骨内膜骨形成および顆粒吸収両方のより低い速度を提供し、およそ１ｍｇ／ｍｌのＴＧｐｌＰＴＨ１−３４が最適な反応を提供した。
【０１０２】
対照群と比較してＴＧｐｌＰＴＨ１−３４で治療した群で改善された結果が得られたことから、強化マトリックス中に臨床的に適切な用量のＴＧｐｌＰＴＨ１−３４が存在すると、治癒において強い改善が導かれうることが立証された。機械的に非常にストレスを与えるこのモデルにおける、より迅速な治癒、骨形成の改善、ならびに安定性改善は、遠位橈骨圧迫骨折における強化マトリックスの適用を正当と評価する適切な特性である。さらに、骨膜骨形成、骨内膜骨形成および顆粒吸収、ならびに全体の安定性の結果を考慮して、０．４ｍｇ／ｍｌ〜１．１ｍｇ／ｍｌ  ＴＧｐｌＰＴＨ１−３４フィブリン・マトリックスの間の用量が、最も好ましい濃度範囲であることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】図１は、ＰＴＨ変異体の生物活性を示す。ＰＴＨ受容体のプロモーターに連結したレポーター遺伝子でトランスフェクションした細胞を、等量のＰＴＨ１−３４、ＴＧ−ｐｌ−ＰＴＨ１−３４（本明細書に記載）または国際的８４アミノ酸標準ＰＴＨのいずれかで処理した。ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子の発現の阻害を測定し、そして溶液中、ＰＴＨに曝露されていないトランスフェクション細胞（対照）と比較した。
【図２】図２は、フィブリン・マトリックスからのＰＴＨ放出アッセイの結果を示す。
【図３】図３は、治癒スコアとして示す、強化マトリックスでの治療に際しての部分的脛骨欠陥の安定性試験の結果を示す。
【図４】図４は、不安定であり続けている関節のパーセントで示す、強化マトリックスでの治療に際しての部分的脛骨欠陥の安定性試験の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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