(57)【要約】  本発明は、ゲノムがpiggyBacファミリートランスポゾン系の１以上のエレメントを含む、トランスジェニック脊椎動物（哺乳類を含む〜）細胞に関する。又、ゲノムがpiggyBacファミリートランスポゾン系の１以上のエレメントを含む、トランスジェニック非ヒト脊椎動物（トランスジェニック非ヒト哺乳類を含む）も提供される。医学、獣医学および農業分野での適用をはじめ、本発明の細胞および動物の作出方法および使用方法もさらに提供される。本発明は又かかる方法を実施するのに有用なキットにも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1.5kbのインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する方法であって：
(a)ex vivoにおいて非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞に、少なくとも1.5kbのインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンを含む核酸と、同じ核酸内、または別の核酸上のpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列とを導入する工程；
(b)得られた非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞を、該胚の、トランスジェニック非ヒト脊椎動物への発達に有利な条件下で、同種の好ましい代理母に移植する工程；および
(c)該胚をトランスジェニック非ヒト脊椎動物へ発達させるに十分な期間の後、該母親から該トランスジェニック非ヒト脊椎動物を回収し、
それにより、少なくとも1.5kbのインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
前記piggyBac様トランスポゾンが、前記トランスジェニック非ヒト脊椎動物の形質を改変するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
piggyBac様トランスポゾンを含む前記核酸が、１以上の細胞のゲノムが、複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー内に該piggyBac様トランスポゾンを含むように線状化されている、請求項１記載の方法。
【請求項４】
piggyBac様トランスポゾンを含む前記核酸が、１以上の細胞のゲノムが、複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー内に該piggyBac様トランスポゾンを含むように線状化されている、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記piggyBac様トランスポゾンが、核酸と結合し、および／または核酸を改変するタンパク質により認識される配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記核酸修飾タンパク質が、DNA結合タンパク質、DNA修飾タンパク質、RNA結合タンパク質、またはRNA修飾タンパク質である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記piggyBac様トランスポゾンが部位特異的リコンビナーゼの標的部位を含む、請求項５のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記標的部位がFRT標的部位またはlox標的部位である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記piggyBac様トランスポゾンが選択マーカーを含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記piggyBac様トランスポゾンがリポーター遺伝子を含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記リポーター遺伝子が前記の種に内在している、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記piggyBac様トランスポゾンが選択マーカーとリポーター遺伝子の双方を含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
前記piggyBac様トランスポゾンと前記piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列が同じ核酸内にある、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
前記piggyBac様トランスポゾンと前記piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列が別の核酸上にある、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
前記piggyBac様トランスポゾンを含む核酸がDNAであり、前記piggyBac様トランスポゼースを含む核酸がRNAである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記piggyBac様トランスポゾンが前記非ヒト脊椎動物で不動化されている、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記piggyBac様トランスポゾンと前記piggyBac様トランスポゼースを含む核酸がともにDNAである、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
前記トランスジェニック非ヒト脊椎動物が、piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列を、その１以上の細胞のゲノムにさらに含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列がプロモーターに機能し得るように連結されている、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記プロモーターが生殖細胞系におけるトランスポゼースの発現を指示する、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記プロモーターが生殖細胞系特異的プロモーターである、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記１以上の細胞のゲノムが、コンカテマー内に前記piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列を含み、該コンカテマーは、piggyBac様トランスポゼースをコードする複数のヌクレオチド配列を各々含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
前記非ヒト脊椎動物が非ヒト哺乳類である、請求項１記載の方法。
【請求項２４】
前記非ヒト脊椎動物が家畜である、請求項１記載の方法。
【請求項２５】
トランスジェニック非ヒト脊椎動物の形質を改変するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する方法であって：
(a)ex vivoにおいて非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞に、トランスジェニック非ヒト脊椎動物の形質を改変するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むpiggyBac様トランスポゾンを含む核酸と、同じ核酸内、または別の核酸上のpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列とを導入する工程；
(b)得られた非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞を、該胚の、トランスジェニック非ヒト脊椎動物への発達に有利な条件下で、同種の代理母に移植する工程；および
(c)該胚をトランスジェニック非ヒト脊椎動物へ発達させるに十分な期間の後、該母親から該トランスジェニック非ヒト脊椎動物を回収し、
それにより、該トランスジェニック非ヒト脊椎動物の形質を改変するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する工程を含む、前記方法。
【請求項２６】
piggyBac様トランスポゾンを含む前記核酸が、１以上の細胞のゲノムが、複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー内に該piggyBac様トランスポゾンを含むように線状化されている、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記piggyBac様トランスポゾンが、核酸と結合し、および／または核酸を改変するタンパク質により認識される配列を含む、請求項２５または２６記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸修飾タンパク質が、DNA結合タンパク質、DNA修飾タンパク質、RNA結合タンパク質、またはRNA修飾タンパク質である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記piggyBac様トランスポゾンが部位特異的リコンビナーゼの標的部位を含む、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
前記標的部位がFRT標的部位またはlox標的部位である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記piggyBac様トランスポゾンが選択マーカーを含む、請求項２５または２６記載の方法。
【請求項３２】
前記piggyBac様トランスポゾンがリポーター遺伝子を含む、請求項２５または２６記載の方法。
【請求項３３】
前記リポーター遺伝子が前記の種に内在している、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記piggyBac様トランスポゾンが選択マーカーとリポーター遺伝子の双方を含む、請求項２５または２６記載の方法。
【請求項３５】
前記piggyBac様トランスポゾンと前記piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列が同じ核酸内にある、請求項２５または２６記載の方法。
【請求項３６】
前記piggyBac様トランスポゾンと前記piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列が別の核酸上にある、請求項２５または２６記載の方法。
【請求項３７】
前記piggyBac様トランスポゾンを含む核酸がDNAであり、前記piggyBac様トランスポゼースを含む核酸がRNAである、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記piggyBac様トランスポゾンが前記非ヒト脊椎動物で不動化されている、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記piggyBac様トランスポゾンと前記piggyBac様トランスポゼースを含む核酸がともにDNAである、請求項３６記載の方法。
【請求項４０】
前記トランスジェニック非ヒト脊椎動物が、piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列を、その１以上の細胞のゲノムにさらに含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列がプロモーターに機能し得るように連結されている、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記プロモーターが生殖細胞系におけるトランスポゼースの発現を指示する、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記プロモーターが生殖細胞系特異的プロモーターである、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
前記１以上の細胞のゲノムが、コンカテマー内に前記piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列を含み、該コンカテマーは、piggyBac様トランスポゼースをコードする複数のヌクレオチド配列を各々含む、請求項４０記載の方法。
【請求項４５】
前記非ヒト脊椎動物が非ヒト哺乳類である、請求項２５記載の方法。
【請求項４６】
前記非ヒト脊椎動物が家畜である、請求項２５記載の方法。
【請求項４７】
複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー内にあるpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する方法であって：
(a)ex vivoにおいて非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞に、piggyBac様トランスポゾンを含む線状化核酸と、同じ核酸内、または別の核酸上のpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列とを導入する工程；
(b)得られた非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞を、該胚の、トランスジェニック非ヒト脊椎動物への発達に有利な条件下で、同種の代理母に移植する工程；および
(c)該胚をトランスジェニック非ヒト脊椎動物へ発達させるに十分な期間の後、該母親から該トランスジェニック非ヒト脊椎動物を回収し、
それにより、複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー内のpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する工程を含む、前記方法。
【請求項４８】
前記piggyBac様トランスポゾンが、核酸と結合し、および／または核酸を改変するタンパク質により認識される配列を含む、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
前記核酸修飾タンパク質が、DNA結合タンパク質、DNA修飾タンパク質、RNA結合タンパク質、またはRNA修飾タンパク質である、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
前記piggyBac様トランスポゾンが部位特異的リコンビナーゼの標的部位を含む、請求項４８記載の方法。
【請求項５１】
前記標的部位がFRT標的部位またはlox標的部位である、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
前記piggyBac様トランスポゾンが選択マーカーを含む、請求項４７記載の方法。
【請求項５３】
前記piggyBac様トランスポゾンがリポーター遺伝子を含む、請求項４７記載の方法。
【請求項５４】
前記リポーター遺伝子が前記の種に内在している、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
前記piggyBac様トランスポゾンが選択マーカーとリポーター遺伝子の双方を含む、請求項４７記載の方法。
【請求項５６】
前記piggyBac様トランスポゾンと前記piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列が同じ核酸内にある、請求項４７記載の方法。
【請求項５７】
前記piggyBac様トランスポゾンと前記piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列が別の核酸上にある、請求項４７記載の方法。
【請求項５８】
前記piggyBac様トランスポゾンを含む核酸がDNAであり、前記piggyBac様トランスポゼースを含む核酸がRNAである、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
前記piggyBac様トランスポゾンが前記非ヒト脊椎動物で不動化されている、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
前記piggyBac様トランスポゾンと前記piggyBac様トランスポゼースを含む核酸がともにDNAである、請求項５７記載の方法。
【請求項６１】
前記トランスジェニック非ヒト脊椎動物が、piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列を、その１以上の細胞のゲノムにさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列がプロモーターに機能し得るように連結されている、請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
前記プロモーターが生殖細胞系におけるトランスポゼースの発現を指示する、請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
前記プロモーターが生殖細胞系特異的プロモーターである、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
前記１以上の細胞のゲノムが、コンカテマー内に前記piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列を含み、該コンカテマーは、piggyBac様トランスポゼースをコードする複数のヌクレオチド配列を各々含む、請求項６１記載の方法。
【請求項６６】
前記非ヒト脊椎動物が非ヒト哺乳類である、請求項４７記載の方法。
【請求項６７】
前記非ヒト脊椎動物が家畜である、請求項４７記載の方法。
【請求項６８】
piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列（該piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列は、各々がpiggyBac様トランスポゼースをコードする複数のヌクレオチド配列を含むコンカテマー内にある）を、piggyBac様トランスポゼースをコードするその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する方法であって：
(a)ex vivoにおいて非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞に、piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列を含む線状化核酸を導入する工程；
(b)得られた非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞を、該胚の、トランスジェニック非ヒト脊椎動物への発達に有利な条件下で、同種の代理母に移植する工程；および
(c)該胚をトランスジェニック非ヒト脊椎動物へ発達させるに十分な期間の後、該母親から該トランスジェニック非ヒト脊椎動物を回収し、
それにより、piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列をその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する工程（ここで、piggyBac様トランスポゼースをコードする該ヌクレオチド配列は、各々がpiggyBac様トランスポゼースをコードする複数のヌクレオチド配列を含むコンカテマー内にある）を含む、前記方法。
【請求項６９】
前記piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列がプロモーターに機能し得るように連結されている、請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
前記プロモーターが生殖細胞系におけるトランスポゼースの発現を指示する、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
前記プロモーターが生殖細胞系特異的プロモーターである、請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
前記非ヒト脊椎動物が非ヒト哺乳類である、請求項６８記載の方法。
【請求項７３】
前記非ヒト脊椎動物が家畜である、請求項６８記載の方法。
【請求項７４】
不動化されたpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する方法であって：
(a)ex vivoにおいて非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞に、(i)piggyBac様トランスポゾンを含む核酸と；(ii)piggyBac様トランスポゾンの、それぞれ、該胚の１以上の細胞のゲノムへの組み込み、または該卵母細胞若しくはそれに由来する胚の１以上の細胞のゲノムへの組み込みを誘導するのに有効な量のpiggyBac様トランスポゼースとを導入する工程；
(b)得られた非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞を、該胚の、トランスジェニック非ヒト脊椎動物への発達に有利な条件下で、同種の代理母に移植する工程；および
(c)該胚をトランスジェニック非ヒト脊椎動物へ発達させるに十分な期間の後、該母親から該トランスジェニック非ヒト脊椎動物を回収し、
それにより、不動化されたpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する工程を含む、前記方法。
【請求項７５】
前記piggyBac様トランスポゾンが少なくとも1.5kbのインサートを有する、請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
前記piggyBac様トランスポゾンが、前記トランスジェニック非ヒト脊椎動物の形質を改変するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項７４記載の方法。
【請求項７７】
前記核酸が、piggyBac様トランスポゾンが、複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー内にあるように線状化されている、請求項７４記載の方法。
【請求項７８】
前記非ヒト脊椎動物が非ヒト哺乳類である、請求項７４記載の方法。
【請求項７９】
前記非ヒト脊椎動物が家畜である、請求項７４記載の方法。
【請求項８０】
ゲノムが少なくとも1.5kbのインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンを含む培養組換え脊椎動物細胞を作出する方法であって：
(a)少なくとも1.5kbのインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンを含む核酸と、同じ核酸内、または別の核酸上のpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列とを培養脊椎動物細胞に導入する工程；および
(b)該細胞を、piggyBac様トランスポゼースが発現されて、piggyBac様トランスポゾンが該培養脊椎動物細胞のゲノムに組み込まれるような条件下で培養し、
それにより、ゲノムが少なくとも1.5kbのインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンを含む培養組換え脊椎動物細胞を作出する工程を含む、前記方法。
【請求項８１】
ゲノムが、脊椎動物の疾病または障害の治療または予防に有用なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むpiggyBac様トランスポゾンを含む培養組換え脊椎動物細胞を作出する方法であって：
(a)培養脊椎動物細胞に、脊椎動物の疾病または障害の治療または予防に有用なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むpiggyBac様トランスポゾンを含む核酸と、同じ核酸内、または別の核酸上のpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列を導入する工程；
(b)該細胞を、piggyBac様トランスポゼースが発現されて、piggyBac様トランスポゾンが該培養脊椎動物細胞のゲノムに組み込まれるような条件下で培養し、
それにより、ゲノムが脊椎動物の疾病または障害の治療または予防に有用なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むpiggyBac様トランスポゾンを含む培養組換え脊椎動物細胞を作出する工程を含む、前記方法。
【請求項８２】
ゲノムがpiggyBac様トランスポゾンを含み、該piggyBac様トランスポゾンが複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー内にある培養組換え脊椎動物細胞を作出する方法であって：
(a)培養脊椎動物細胞に、piggyBac様トランスポゾンを含む線状化核酸と、同じ核酸内、または別の核酸上のpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列とを導入する工程；
(b)該細胞を、piggyBac様トランスポゼースが発現されて、piggyBac様トランスポゾンが該培養脊椎動物細胞のゲノムに組み込まれるような条件下で培養し、
それにより、ゲノムがpiggyBac様トランスポゾンを含み、該piggyBac様トランスポゾンが複数の該piggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー内にある培養組換え脊椎動物細胞を作出する工程を含む、前記方法。
【請求項８３】
ゲノムがpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列を含み、該piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列が、各々がpiggyBac様トランスポゼースをコードする複数のヌクレオチド配列を含むコンカテマー内にある培養組換え脊椎動物細胞を作出する方法であって：
(a)培養脊椎動物細胞に、piggyBac様トランスポゼースをコードする核酸を含む線状化核酸を導入する工程；および
(b)piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列が培養脊椎動物細胞のゲノムに組み込まれる条件下で培養し、
それにより、ゲノムがpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列（該piggyBac様トランスポゼースをコードする該ヌクレオチド配列は、各々がpiggyBac様トランスポゼースをコードする複数のヌクレオチド配列を含むコンカテマー内にある）を含む培養組換え脊椎動物細胞を作出する工程を含む、前記方法。
【請求項８４】
前記脊椎動物細胞が哺乳類細胞である、請求項８０〜８３のいずれか一項記載の方法。
【請求項８５】
前記哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項８４記載の方法。
【請求項８６】
非ヒト脊椎動物においてpiggyBac様トランスポゾンを可動化する方法であって：
(a)少なくとも1.5kbのインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の生殖細胞のゲノムに含む第一のトランスジェニック非ヒト脊椎動物と、piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列をその１以上の生殖細胞のゲノムに含む第二のトランスジェニック非ヒト脊椎動物とを交配させて１以上の子孫を得る工程；
(b)該piggyBac様トランスポゾンと、該piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の双方をその１以上の細胞のゲノムに含み、従って、該piggyBac様トランスポゼースが発現され、該トランスポゾンが可動化される、工程(a)の１以上の子孫の少なくとも１つを同定し、それにより、非ヒト脊椎動物におけるpiggyBac様トランスポゾンを可動化する工程を含む、前記方法。
【請求項８７】
前記第一のトランスジェニック非ヒト脊椎動物が請求項１４に記載の方法により作製される、請求項８６記載の方法。
【請求項８８】
前記第一のトランスジェニック非ヒト脊椎動物が請求項７４に記載の方法により作製される、請求項８６記載の方法。
【請求項８９】
前記第二のトランスジェニック非ヒト脊椎動物が請求項６８に記載の方法により作製される、請求項８６記載の方法。
【請求項９０】
非ヒト脊椎動物においてpiggyBac様トランスポゾンを可動化する方法であって：
(a)トランスジェニック非ヒト脊椎動物の形質を改変するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の生殖細胞のゲノムに含む第一のトランスジェニック非ヒト脊椎動物と、piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列をその１以上の生殖細胞のゲノムに含む第二のトランスジェニック非ヒト脊椎動物とを交配させて１以上の子孫を得る工程；
(b)該piggyBac様トランスポゾンと、該piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の双方をその１以上の細胞のゲノムに含み、従って、該piggyBac様トランスポゼースが発現され、該トランスポゾンが可動化される、工程(a)の１以上の子孫の少なくとも１つを同定し、
それにより、非ヒト脊椎動物におけるpiggyBac様トランスポゾンを可動化する工程
を含む、前記方法。
【請求項９１】
前記第一のトランスジェニック非ヒト脊椎動物が請求項３６に記載の方法により作製される、請求項９０記載の方法。
【請求項９２】
前記第一のトランスジェニック非ヒト脊椎動物が請求項７４に記載の方法により作製される、請求項９０記載の方法。
【請求項９３】
前記第二のトランスジェニック非ヒト脊椎動物が請求項６８に記載の方法により作製される、請求項９０記載の方法。
【請求項９４】
非ヒト脊椎動物においてpiggyBac様トランスポゾンを可動化する方法であって：
(a)複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー内にあるpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の生殖細胞のゲノムに含む第一のトランスジェニック非ヒト脊椎動物と、piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列をその１以上の生殖細胞のゲノムに含む第二のトランスジェニック非ヒト脊椎動物とを交配させて１以上の子孫を得る工程；
(b)該piggyBac様トランスポゾンと、該piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の双方をその１以上の細胞のゲノムに含み、従って、該piggyBac様トランスポゼースが発現され、該トランスポゾンが可動化される、工程(a)の１以上の子孫の少なくとも１つを同定し、
それにより、非ヒト脊椎動物におけるpiggyBac様トランスポゾンを可動化する工程を含む、前記方法。
【請求項９５】
前記第一のトランスジェニック非ヒト脊椎動物が請求項５７に記載の方法により作製される、請求項９４記載の方法。
【請求項９６】
前記第一のトランスジェニック非ヒト脊椎動物が請求項７４に記載の方法により作製される、請求項９４記載の方法。
【請求項９７】
前記第二のトランスジェニック非ヒト脊椎動物が請求項６８に記載の方法により作製される、請求項９４記載の方法。
【請求項９８】
非ヒト脊椎動物においてpiggyBac様トランスポゾンを不動化する方法であって、
(a)(i)少なくとも2kbのインサートを含むpiggyBac様トランスポゾンと、(ii)piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の双方をその１以上の細胞のゲノムに含む第一のトランスジェニック非ヒト脊椎動物と、第二の成体脊椎動物とを交配させて１以上の子孫を得る工程；
(b)該piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列をそのゲノムに含まず、かつ、該piggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含み、従って、該子孫においてpiggyBac様トランスポゾンが不動化される、工程(a)の１以上の子孫の少なくとも１つを同定し、
それにより、非ヒト脊椎動物におけるpiggyBac様トランスポゾンを不動化する工程
を含む、前記方法。
【請求項９９】
前記第一のトランスジェニック非ヒト脊椎動物が請求項１８に記載の方法により作製される、請求項９８記載の方法。
【請求項１００】
非ヒト脊椎動物においてpiggyBac様トランスポゾンを不動化する方法であって：
(a)(i)トランスジェニック非ヒト脊椎動物の形質を改変するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むpiggyBac様トランスポゾンと、(ii)piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の双方をその１以上の細胞のゲノムに含む第一のトランスジェニック非ヒト脊椎動物と、第二の成体脊椎動物とを交配させて１以上の子孫を得る工程；
(b)該piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列をそのゲノムに含まず、かつ、該piggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含み、従って、該子孫においてpiggyBac様トランスポゾンが不動化される、工程(a)の１以上の子孫の少なくとも１つを同定し、
それにより、非ヒト脊椎動物におけるpiggyBac様トランスポゾンを不動化する工程を含む、前記方法。
【請求項１０１】
前記第一のトランスジェニック非ヒト脊椎動物が請求項４０に記載の方法により作製される、請求項１００記載の方法。
【請求項１０２】
非ヒト脊椎動物においてpiggyBac様トランスポゾンを不動化する方法であって：
(a)(i)複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー内にあるpiggyBac様トランスポゾンと、(ii)piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の双方をその１以上の細胞のゲノムに含む第一のトランスジェニック非ヒト脊椎動物と、第二の成体脊椎動物とを交配させて１以上の子孫を得る工程；
(b)該piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列をそのゲノムに含まず、かつ、該piggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含み、従って、該子孫においてpiggyBac様トランスポゾンが不動化される、工程(a)の１以上の子孫の少なくとも１つを同定し、
それにより、非ヒト脊椎動物におけるpiggyBac様トランスポゾンを不動化する工程を含む、前記方法。
【請求項１０３】
前記第一のトランスジェニック非ヒト脊椎動物が請求項６１に記載の方法により作製される、請求項１０２記載の方法。
【請求項１０４】
不動化されたpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する方法であって：
(a)ex vivoにおいて非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞に、(i)piggyBac様トランスポゾンと、(ii)生殖細胞系で発現されるプロモーターに機能し得るように連結されたpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の双方をその複数の生殖系細胞のゲノムに含む（ここで、該piggyBac様トランスポゾンと該piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一方は、複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー、または各々がpiggyBac様トランスポゼースをコードする複数のヌクレオチド配列を含むコンカテマー内にある）トランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する工程；
(i)piggyBac様トランスポゾンと、(ii)生殖細胞系で発現されるプロモーターに機能し得るように連結されたpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列とを含む１以上の核酸（該１以上の核酸の少なくとも１つは線状化されている）を導入する工程；
得られた非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞を、該胚の、トランスジェニック非ヒト脊椎動物への発達に有利な条件下で、同種の代理母に移植する工程；および
該胚をトランスジェニック非ヒト脊椎動物へ発達させるに十分な期間の後、該母親から、(i)piggyBac様トランスポゾンと、(ii)生殖細胞系で発現されるプロモーターに機能し得るように連結されたpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の双方をその複数の生殖系細胞のゲノムに含む（ここで、該piggyBac様トランスポゾンと該piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一方は、複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー、または各々がpiggyBac様トランスポゼースをコードする複数のヌクレオチド配列を含むコンカテマー内にある）トランスジェニック非ヒト脊椎動物を回収する工程を含む工程；
(b)工程(a)の回収されたトランスジェニック非ヒト脊椎動物を成体まで成長させる工程；
(c)工程(b)の成体トランスジェニック非ヒト脊椎動物と第二の成体脊椎動物を交配させて１以上の子孫を得る工程；
(d)生殖細胞系で発現されるプロモーターに機能し得るように連結されたpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列をそのゲノムに含まず、かつ、piggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含む工程(c)の１以上の子孫（ここで、該１以上の子孫は各々、不動化されたpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物である）の少なくとも１つを同定し、
それにより、不動化されたpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する工程を含む、前記方法。
【請求項１０５】
各々が不動化されたpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物のライブラリーを作出する方法であって：
(a)(i)piggyBac様トランスポゾンと、(ii)生殖細胞系で発現されるプロモーターに機能し得るように連結されたpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の双方をその複数の生殖系細胞のゲノムに含む（ここで、該piggyBac様トランスポゾンと該piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一方は、複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー、または各々がpiggyBac様トランスポゼースをコードする複数のヌクレオチド配列を含むコンカテマー内にある）トランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する工程；
ex vivoにおいて非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞に、(i)piggyBac様トランスポゾンと、(ii)生殖細胞系で発現されるプロモーターに機能し得るように連結されたpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列とを含む１以上の核酸（該１以上の核酸の少なくとも１つは線状化されている）を導入する工程；
得られた非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞を、該胚の、トランスジェニック非ヒト脊椎動物への発達に有利な条件下で、同種の代理母に移植する工程；および
該胚をトランスジェニック非ヒト脊椎動物へ発達させるに十分な期間の後、該母親から、(i)piggyBac様トランスポゾンと、(ii)生殖細胞系で発現されるプロモーターに機能し得るように連結されたpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の双方をその複数の生殖系細胞のゲノムに含む（ここで、該piggyBac様トランスポゾンと該piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一方は、複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー、または各々がpiggyBac様トランスポゼースをコードする複数のヌクレオチド配列を含むコンカテマー内にある）トランスジェニック非ヒト脊椎動物を回収する工程を含む工程；
(b)工程(a)の回収されたトランスジェニック非ヒト脊椎動物を成体まで成長させる工程；
(c)工程(b)の成体トランスジェニック非ヒト脊椎動物と第二の成体脊椎動物を交配させて１以上の子孫を得る工程；
(d)各々生殖細胞系で発現されるプロモーターに機能し得るように連結されたpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列をそのゲノムに含まず、かつ、piggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含む工程(c)の２以上の子孫（ここで、該２以上の子孫は各々、不動化されたpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物である）を同定し、
それにより、各々不動化されたpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物のライブラリーを作出する工程を含む、前記方法。
【請求項１０６】
少なくとも1.5kbのインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンを、その１以上の細胞のゲノムに含む、トランスジェニック非ヒト脊椎動物。
【請求項１０７】
前記トランスジェニック非ヒト脊椎動物の形質を改変するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むpiggyBac様トランスポゾンを、その１以上の細胞のゲノムに含む、トランスジェニック非ヒト脊椎動物。
【請求項１０８】
piggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含み、該piggyBac様トランスポゾンは、複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー内にある、トランスジェニック非ヒト脊椎動物。
【請求項１０９】
少なくとも1.5kbのインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンをそのゲノムに含む、培養脊椎動物細胞。
【請求項１１０】
脊椎動物の疾病または障害の治療または予防に有用なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むpiggyBac様トランスポゾンをそのゲノムに含む、培養脊椎動物細胞。
【請求項１１１】
トランスジェニック非ヒト脊椎動物の形質を改変するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むpiggyBac様トランスポゾンをそのゲノムに含む、培養脊椎動物細胞。
【請求項１１２】
piggyBac様トランスポゾンをそのゲノムに含み、該piggyBac様トランスポゾンは、複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー内にある、培養脊椎動物細胞。
【請求項１１３】
請求項１０５記載の方法により作製されたトランスジェニック非ヒト脊椎動物のライブラリー。
【請求項１１４】
少なくとも1.5kbのインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに各々含む複数の異なるトランスジェニック非ヒト脊椎動物を含む、トランスジェニック非ヒト脊椎動物のライブラリー。
【請求項１１５】
脊椎動物の疾病または障害の治療または予防に有用なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに各々含む複数の異なるトランスジェニック非ヒト脊椎動物を含む、トランスジェニック非ヒト脊椎動物のライブラリー。
【請求項１１６】
トランスジェニック非ヒト脊椎動物の形質を改変するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに各々含む複数の異なるトランスジェニック非ヒト脊椎動物を含む、トランスジェニック非ヒト脊椎動物のライブラリー。
【請求項１１７】
複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー内にあるpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに各々含む複数の異なるトランスジェニック非ヒト脊椎動物を含む、トランスジェニック非ヒト脊椎動物のライブラリー。
【請求項１１８】
少なくとも10個体のトランスジェニック非ヒト動物を含む、請求項１１３、１１４、１１５、１１６または１１７記載のトランスジェニック非ヒト動物のライブラリー。
【請求項１１９】
少なくとも20個体のトランスジェニック非ヒト動物を含む、請求項１１８記載のトランスジェニック非ヒト動物のライブラリー。
【請求項１２０】
少なくとも1.5kbのインサートを各々有するpiggyBac様トランスポゾンをそのゲノムに含む複数の異なる細胞を含む、培養脊椎動物細胞のライブラリー。
【請求項１２１】
脊椎動物の疾病または障害の治療に有用なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むpiggyBac様トランスポゾンをそのゲノムに各々含む複数の異なる細胞を含む、培養脊椎動物細胞のライブラリー。
【請求項１２２】
トランスジェニック非ヒト脊椎動物の形質を改変するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むpiggyBac様トランスポゾンをそのゲノムに各々含む複数の異なる細胞を含む、培養脊椎動物細胞のライブラリー。
【請求項１２３】
複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー内にあるpiggyBac様トランスポゾンをそのゲノムに各々含む複数の異なる細胞を含む、培養脊椎動物細胞のライブラリー。
【請求項１２４】
ゲノムが、脊椎動物の疾病または障害の治療または予防に有用なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むpiggyBac様トランスポゾンを含む、組換え脊椎動物細胞を、かかる治療または予防を必要とする対象に投与する工程を含む、疾病または障害の治療または予防方法。
【請求項１２５】
組換え脊椎動物細胞が請求項８１記載の方法に従って作製される、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
脊椎動物の障害の治療または予防に有用なタンパク質をコードする核酸を、かかる治療または予防を必要とする対象の１以上の細胞に送達する方法であって、ゲノムが、(i)該タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むpiggyBac様トランスポゾンと、(ii)該対象の１以上の細胞においてpiggyBac様トランスポゼースの発現を指示するプロモーターに機能し得るように連結されたpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列とを含む組換えウイルスを投与し、該投与の後に、piggyBac様トランスポゾンが該対象の１以上の細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、かかる治療または予防を必要とする対象に、脊椎動物の障害の治療または予防に有用なタンパク質をコードする核酸を送達する工程を含む、前記方法。
【請求項１２７】
ウイルスがレトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスである、請求項１２６記載の方法。
【請求項１２８】
ゲノムが(i)前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むpiggyBac様トランスポゾンと、(ii)プロモーターに機能し得るように連結されたpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列とを含む組換えウイルス。
【請求項１２９】
レトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスである、請求項１２８に記載の組換えウイルス。
【請求項１３０】
piggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物が示す表現型が該piggyBac様トランスポゾンにより生じているものかどうかを判定する方法であって：
(a)piggyBac様トランスポゾンが切除されている該トランスジェニック非ヒト脊椎動物の１以上の子孫を作出すること；
(b)該子孫の該piggyBac様トランスポゾンの切除と該表現型の復帰の間に相関が存在するかどうかを判定し、相関が、該表現型が該piggyBac様トランスポゾンにより生じたものであることの指標となり、
それにより、piggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物が示す表現型が、該piggyBac様トランスポゾンにより生じたものかどうかを判定することを含む、前記方法。
【請求項１３１】
非ヒト脊椎動物からエンハンサーを単離する方法であって：
(a)最小プロモーターの制御下にリポーター遺伝子を含むpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞または組織のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物において、該トランスジェニック非ヒト脊椎動物またはそれらから得られた子孫の１以上の細胞または組織におけるリポーター遺伝子の発現を評価する工程；および
(b)該１以上の細胞または組織においてリポーター遺伝子の発現を担っている、該piggyBac様トランスポゾンにフランキングしている核酸を単離し、
それにより、非ヒト脊椎動物からエンハンサーを単離する工程を含む、前記方法。
【請求項１３２】
最小プロモーターの制御下にリポーター遺伝子を含むpiggyBac様トランスポゾンを含む培養組換え脊椎動物細胞からエンハンサーを単離する方法であって：
(a)該組換え脊椎動物細胞またはその子孫においてリポーター遺伝子の発現を評価する工程；および
(b)組換え脊椎動物細胞においてリポーター遺伝子の発現を担っている、該piggyBac様トランスポゾンにフランキングしている核酸を単離し、
それにより、培養組換え脊椎動物細胞からエンハンサーを単離する工程を含む、前記方法。
【請求項１３３】
piggyBac様トランスポゾンに関してモザイクの非ヒト脊椎動物を作出する方法であって：
(a)そのゲノムに、(i)piggyBac様トランスポゾンに関して同形接合の遺伝子座（該piggyBac様トランスポゾンは部位特異的リコンビナーゼ認識配列を含む）と、(ii)プロモーターに機能し得るように連結された該部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列とを含むトランスジェニック非ヒト胚を作出する工程；
(b)該トランスジェニック非ヒト胚を、該部位特異的リコンビナーゼが発現され、増殖が起こる条件下で培養し、
それにより、piggyBac様トランスポゾンに関してモザイクの該非ヒト脊椎動物を作出する工程を含む、前記方法。
【請求項１３４】
(a)(i)少なくとも1.5kbのインサートを含むpiggyBac様トランスポゾンと、(ii)piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列とを含む、１以上の容器内の１以上の核酸と、
(b)第二の容器内の(i)培養脊椎動物細胞、または(ii)非ヒト脊椎動物卵母細胞と
を含む、キット。
【請求項１３５】
(a)(i)脊椎動物の疾病または障害の治療または予防に有用なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むpiggyBac様トランスポゾンと、(ii)piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列とを含む、１以上の容器内の１以上の核酸と、
(b)第二の容器内の(i)培養脊椎動物細胞、または(ii)非ヒト脊椎動物卵母細胞と
を含む、キット。
【請求項１３６】
(a)(i)piggyBac様トランスポゾンと、(ii)piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列（該１以上の核酸の少なくとも１つが線状化されている）とを含む、１以上の容器の１以上の核酸と、
(b)第二の容器内の、(i)培養脊椎動物細胞、または(ii)非ヒト脊椎動物卵母細胞と
を含む、キット。
【請求項１３７】
前記piggyBac様トランスポゾンがpiggyBacトランスポゾンであり、および／または該piggyBac様トランスポゼースがpiggyBacトランスポゼースである、請求項１、２５、４７、６８、８０、８１、８２、８３、８６、９０、９４、９８、１００、１０２、１０４、１０５、１２４、１２６、１２８、１３０、１３１、１３２、または１３３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３８】
前記piggyBac様トランスポゾンがpiggyBacトランスポゾンであり、および／または該piggyBac様トランスポゼースがpiggyBacトランスポゼースである、請求項１０６〜１０８のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト脊椎動物。
【請求項１３９】
前記piggyBac様トランスポゾンがpiggyBacトランスポゾンであり、および／または該piggyBac様トランスポゼースがpiggyBacトランスポゼースである、請求項１１３〜１１７および請求項１２０〜１２３のいずれか一項記載のライブラリー。
【請求項１４０】
前記piggyBac様トランスポゾンがpiggyBacトランスポゾンであり、および／または該piggyBac様トランスポゼースがpiggyBacトランスポゼースである、請求項１０９〜１１２のいずれか一項記載の培養脊椎動物細胞。
【請求項１４１】
前記piggyBac様トランスポゾンがpiggyBacトランスポゾンであり、および／または該piggyBac様トランスポゼースがpiggyBacトランスポゼースである、請求項１２８記載の組換えウイルス。
【請求項１４２】
前記piggyBac様トランスポゾンがpiggyBacトランスポゾンであり、および／または該piggyBac様トランスポゼースがpiggyBacトランスポゼースである、請求項１３４〜１３６のいずれか一項記載のキット。
【請求項１４３】
前記piggyBac様トランスポゾンが少なくとも2.5kbのインサートを有する、請求項１、８０および８６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４４】
前記piggyBac様トランスポゾンが少なくとも2.5kbのインサートを有する、請求項１０６記載のトランスジェニック非ヒト脊椎動物。
【請求項１４５】
前記piggyBac様トランスポゾンが少なくとも2.5kbのインサートを有する、請求項１１４および１２０のいずれか一項記載のライブラリー。
【請求項１４６】
前記piggyBac様トランスポゾンが少なくとも2.5kbのインサートを有する、請求項１０９記載の培養脊椎動物細胞。
【請求項１４７】
前記piggyBac様トランスポゾンが少なくとも2.5kbのインサートを有する、請求項１３４記載のキット。
【請求項１４８】
前記工程(d)の同定が逆ポリメラーゼ連鎖反応を行うことをさらに含む、請求項１０５記載の方法。
【請求項１４９】
前記生殖細胞系特異的プロモーターが雄性特異的プロモーターである、請求項２１、４３、６４、または７１記載の方法。
【請求項１５０】
前記雄性特異的プロモーターがプロタミン(Prm)プロモーターである、請求項１４９記載の方法。
【請求項１５１】
前記生殖細胞系特異的プロモーターが雌性特異的プロモーターである、請求項２１、４３、６４、または７１記載の方法。
【請求項１５２】
前記雌性特異的プロモーターがＺＰ３プロモーターである、請求項１５１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（1.発明の分野）
本発明は、ゲノムがpiggyBacファミリートランスポゾン系の１以上のエレメントを含むトランスジェニック脊椎動物（哺乳類を含む）細胞、およびトランスジェニック非ヒト脊椎動物（非ヒト哺乳類を含む）、並びに該細胞および動物の作出方法および使用方法に関する。本発明は又、このような方法に有用なキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
（2.発明の背景）
トランスポゾン可能なエレメントまたはトランスポゾンは、蠕虫、昆虫およびヒトをはじめとする多くの後生動物において同定されている動く遺伝子である。ヒトおよびマウスでは、トランスポゾン由来の配列は、ゲノムの40%強を占め(Landerらの論文(2001, Nature 409:860-921; Waterstonらの論文(2002, Nature 420:520-562))、進化における転位の重要性を示している。McClintock (McClintock, 1950, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 36:344-345)によってトウモロコシにおいて最初のトランスポゾンが発見されて以来、動くエレメントは多くの生物の遺伝子解析の有用な手段となっている。原核生物では、トランスポゾンに基づく突然変異誘発が微生物の病原性に重要な遺伝子の発見につながった(Hutchisonらの論文(1999, Science 286:2165-2169); Vilenらの論文(2003, J. Virol. 77:123-134))。真核生物では、P-エレメントにより媒介される遺伝子導入および挿入突然変異誘発の導入が、ショウジョウバエ(Drosophila)遺伝学を劇的に進展させた(RubinおよびSpradlingの論文 (1982, Science 218:348-353))。P-エレメントをはじめ多くのトランスポゾンはその天然宿主外では機能しないが、このことは転位に宿主因子が関与していることを示唆している(Handlerらの論文(1993, Archives of Insect Biochemistry & Physiology 22:373-384)。
【０００３】
Tcl/Marinerファミリー由来のメンバーを含むトランスポゾン系は、マウスおよびゼブラフィッシュDanio rerioで用いられてきた。比較系統発生学的アプローチを用いることで、合成Tcl様トランスポゾンSleeping Beauty (SB)がマウスおよびヒト細胞で有効であることが分かった(Iviesらの論文(1997, Cell 91:501-510); Luoらの論文（1998, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 95:10769-10773))。Sleeping BeautyおよびMinosなどのトランスポゾンは、マウスでは挿入突然変異誘発に関して試験されてきたが(Dupuyらの論文(2001, Genesis 30:82-88); Fischerらの論文(2001, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 98:6759-6764); Horieらの論文(2001, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 98:9191-9196); Zagoraiouらの論文(2001, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 98:11474-11478))、マウス遺伝学におけるこれらトランスポゾンの一般適用はやはり、新たなトランスポゾンの挿入が元の部位付近に極度に集中し、低率でしか起こらないために限定されている(Drabekらの論文(2003, Genomics 81:108-111); Dupuyらの論文(2001, Genesis 30:82-88); Fischerらの論文(2001, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 98:6759-6764); Horieらの論文(2001, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 98:9191-9196); Horieらの論文(2003, Mol. Cell Biol. 23:9189-9207); Zagoraiouらの論文(2001, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 98:11474-11478))。
【０００４】
piggyBacエレメントは、13bpの逆方向末端反復配列(「ITR」)と594アミノ酸のトランスポゼースを有する2472bpのトランスポゾンである(Caryらの論文(Virology, Volume 161, 8-17, 1989))。キャベツにつく蛾、イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)に由来する動くエレメントpiggyBac(Caryらの論文(Virology, Volume 161, 8-17, 1989))は、チチュウカイミバエ(Ceratitis capitata)において有効な遺伝子導入ベクターであることが示されている(Handlerらの論文(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Volume 95, 7520-7525, 1998))。piggyBacプロモーターの調節下で非改変トランスポゼースヘルパーを用いると、転写調節並びに酵素活性が維持されたことから、チチュウカイミバエにおいてpiggyBacが自律的機能を保持することを示唆する。他の昆虫生殖細胞系形質転換で上手くいったものは全て、同じまたは別の双翅類から単離されたベクターを用いた場合の双翅類に限られていたことから、この知見は独特なものであった。チチュウカイミバエの最初の形質転換(Loukerisらの論文(Science, Volume 270, 2002-2005, 1995)ではカスリショウジョウバエ(Drosophila hydei)由来のMinosベクター(Franz & Savakis, Nucl. Acids Res., Volume 19, 6646, 1991)が用いられ、ネッタイシマカ(Aedes aegypti)がイエバエ(Musca domestica)(Warrenらの論文(Genet. Res. Camb., Volume 64, 87-97, 1994)由来のHermes (Jasinskieneらの論文(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Voume 95, 3743-3747, 1998))から、又、モーリシャスショウジョウバエ(Drosophila mauritiana)(Jacobsonらの論文(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Volume 83, 8684-8688, 1986))由来のmariner(Coatesらの論文(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Volume 95, 3748-3751, 1998))から形質転換された。キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)も同様にHermes (O'Brochtaらの論文(Insect Biochem. Molec. Biol., Volume 26, 739-753, 1996))、mariner (Lidholmらの論文(Genetics, Volume 134, 859-868, 1993))、Minos (Franzらの論文(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Volume 91, 4746-4750, 1994)により、又、その固有のゲノムに元々発見されていたPおよびhoboトランスポゾン(RubinおよびSpradlingの論文(1989); Blackmanらの論文(EMBO J., Volume 8, 211-217, 1989))により形質転換された。クロショウジョウバエ(Drosophila virilis)も、hobo (Lozovskayaらの論文(Genetics, Volume 143, 365-374, 1995); GomezおよびHandlerの論文(Insect Mol. Biol., Volume 6, 1-8, 1997))およびmariner (Loheらの論文(Genetics, Volume 143, 365-374, 1996))により形質転換された。双翅類ベクターに限定されるのは、１つには、双翅類以外の種から得られるトランスポゾン系の数が限られているためであるが、トランスポゾン機能における系統発生学的制限は予測されず、機能的トランスポゾンに対する悪影響は宿主ゲノム上にあるのではないか懸念される。これは、実際に、種間、ある宿主内の系統間、さらにはある生物内の細胞種間でのトランスポゾンの移動に置かれている高レベルの調節により表されている(BergおよびHoweの論文(Mobile DNA, American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1989))。
piggyBac(PB)は、あるエレメントを一般に、切り貼り機能によって、あるゲノム部位から切り取られて別の部位に組み込むDNAトランスポゾンに属す。piggyBacは、13bpの逆方向末端反復配列(ITR)と594アミノ酸のトランスポゼースを有する2472bpのトランスポゾンである(Caryらの論文(1989, Virology 172:156-169); Fraserらの論文(1995, Virology 211:397-407); Fraserらの論文(1996, Insect Molecular Biology 5:141-151))。piggyBacエレメントはキイロショウジョウバエおよびその他の昆虫の遺伝子解析に用いられている。このトランスポゾンは４ヌクレオチドTTAA部位に挿入され、挿入時に倍加することが分かった(Fraserらの論文(1995, Virology 211:397-407); Fraserらの論文(1996, Insect Molecular Biology 5:141-151))。独特なトランスポゼースおよびTTAA標的部位配列のため、このトランスポゾンは新規なDNAトランスポゾンファミリーの創始メンバーpiggyBacファミリーとして提案されている(Robertsonの論文(2002, In Mobile DNA II, Craigら編(Washington, D.C, ASM Press), pp. 1093-1110))。piggyBacは４目の昆虫にわたる12種を超える生殖細胞系の形質転換に用いられてきた(Handlerらの論文(2002, Insect Biochemistry & Molecular Biology 32:1211-1220); Sumitaniらの論文(2003, Insect Biochem. Mol. Biol. 33:449-458)。突然変異誘発因子として、piggyBacはショウジョウバエにおいて少なくともP-エレメントと同等の効果で転位する(Thibaultらの論文(2004, Nat. Genet. 36:283-287))。コクヌストモドキ(Tribolium castaneum)では、piggyBac転位は非相同染色体間でも効率的に起こった(Lorenzenらの論文(2003, Insect Mol. Biol. 12:433-440))。哺乳類に対する真菌に由来する発生系統学的に多様な種のゲノムには多くのpiggyBac様配列が見られ、それらの活性が昆虫に限定されるものではないことを示す(Sarkarらの論文(2003, Mol. Genet. Genomics 270:173-180))。実際に、最近になって、piggyBacはプラナリア(Girardia tigrina)でも転位が可能であることが示された(Gonzalez-Estevezらの論文(2003, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 100:14046-14051))。
【０００５】
本明細書における参照文献の記載または引用は、そのような参照文献が本発明の先行技術であることを認めると解釈すべきでない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（3.発明の要旨）
本発明は、piggyBacが、in vivoおよびex vivoの双方で哺乳類をはじめとする脊椎動物の細胞内で効率的に転位し得るという驚くべき発見に基づくものである。piggyBac転位は、厳密な切り貼り方式に従ってほとんどがTTAA部位で起こる。このpiggyBacトランスポゾンは、受精卵に導入した場合、明確な染色体領域を選ばずにマウスゲノムに組み込まれ、好ましくは転写単位に挿入される。又、piggyBacエレメントは、複数のマーカー遺伝子を有し、これらの遺伝子を種々の挿入部位において発現させることができる。よって、このpiggyBacトランスポゾン系および「piggyBac様」トランスポゾンファミリーの他のメンバーはマウスおよび他の脊椎動物において効率的な遺伝子操作および解析に有用な新規な手段となる。
【０００７】
本発明は、１以上の細胞のゲノムにpiggyBac様トランスポゾンおよび／またはpiggyBac様トランスポゼースを含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物の作出方法を提供する。よって、本明細書では、piggyBac様トランスポゾンおよびトランスポゼースを動物に導入する方法が提供され、piggyBac様トランスポゾンを可動化または不動化する方法も提供される。
【０００８】
ある実施態様において、本発明は、少なくとも1.5kbのインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する方法であって、(a)ex vivoにおいて非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞に、少なくとも1.5kbのインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンを含む核酸と、同じ核酸内、または別の核酸上のpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列とを導入する工程；(b)得られた非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞を、該胚の、トランスジェニック非ヒト脊椎動物への発達に有利な条件下で、同種の好ましい代理母に移植する工程；および(c)該胚をトランスジェニック非ヒト脊椎動物へ発達させるに十分な期間の後、該母親から該トランスジェニック非ヒト脊椎動物を回収し、それにより、少なくとも1.5kbのインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する工程を含む方法を提供する。
【０００９】
ex vivoにおいて非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞に、少なくとも1.5kbのインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンを含む核酸を導入する代わりに、piggyBac様トランスポゾンの重複部分を含む複数の核酸を導入することもできる（ただし、その重複が、核酸が導入される細胞内で相同組換えが起こるに十分なものである場合に限る）。この別法は、大きなインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンを細胞のゲノムに導入するのに特に有用である。よって、このような実施態様では、第一の核酸はpiggyBac様トランスポゾンの左末端とインサートの少なくとも一部を含み、第二の核酸はpiggyBac様トランスポゾンの右末端とインサートの少なくとも一部を含む。２つの核酸だけが用いられる場合、第一の核酸が有するインサート部分と第二の核酸が有するインサート部分は重複する。第三の核酸が用いられる場合には、その第三の核酸は、一方の末端には第一の核酸との重複領域を、そして、もう一方の末端には第二の核酸との重複領域を有する。図１４Ｂは、このような実施態様を示す。この複数（例えば、2、3、4、5、6またはそれ以上）の重複核酸との相同組換えの原理は、脊椎動物細胞および生物のゲノムに、大きなインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンを導入するために適用可能である。
【００１０】
本発明は又、トランスジェニック非ヒト脊椎動物の形質を改変するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する方法であって、(a)ex vivoにおいて非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞に、トランスジェニック非ヒト脊椎動物の形質を改変するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むpiggyBac様トランスポゾンを含む核酸と、同じ核酸内、または別の核酸上のpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列とを導入する工程；(b)得られた非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞を、該胚の、トランスジェニック非ヒト脊椎動物への発達に有利な条件下で、同種の代理母に移植する工程；および(c)該胚をトランスジェニック非ヒト脊椎動物へ発達させるに十分な期間の後、該母親から該トランスジェニック非ヒト脊椎動物を回収し、それにより、該トランスジェニック非ヒト脊椎動物の形質を改変するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する工程を含む方法を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー内にあるpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する方法であって、(a)ex vivoにおいて非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞に、piggyBac様トランスポゾンを含む線状化核酸と、同じ核酸内、または別の核酸上のpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列とを導入する工程；(b)得られた非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞を、該胚の、トランスジェニック非ヒト脊椎動物への発達に有利な条件下で、同種の代理母に移植する工程；および(c)該胚をトランスジェニック非ヒト脊椎動物へ発達させるに十分な期間の後、該母親から該トランスジェニック非ヒト脊椎動物を回収し、それにより、複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー内のpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する工程を含む方法を提供する。
【００１２】
本発明はなおさらに、piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列（該piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列は、各々がpiggyBac様トランスポゼースをコードする複数のヌクレオチド配列を含むコンカテマー内にある）を、piggyBac様トランスポゼースをコードするその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する方法であって、(a)ex vivoにおいて非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞に、piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列を含む線状化核酸を導入する工程；(b)得られた非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞を、該胚の、トランスジェニック非ヒト脊椎動物への発達に有利な条件下で、同種の代理母に移植する工程；および(c)該胚をトランスジェニック非ヒト脊椎動物へ発達させるに十分な期間の後、該母親から該トランスジェニック非ヒト脊椎動物を回収し、それにより、piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列をその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する工程を含み、ここで、piggyBac様トランスポゼースをコードする該ヌクレオチド配列は、各々がpiggyBac様トランスポゼースをコードする複数のヌクレオチド配列を含むコンカテマー内にある、方法を提供する。
【００１３】
本発明はなおさらに、不動化されたpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する方法であって、(a)ex vivoにおいて非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞に、(i)piggyBac様トランスポゾンを含む核酸と；(ii)piggyBac様トランスポゾンの、それぞれ、該胚の１以上の細胞のゲノムへの組み込み、または該卵母細胞若しくはそれに由来する胚の１以上の細胞のゲノムへの組み込みを誘導するのに有効な量のpiggyBac様トランスポゼースとを導入する工程；(b)得られた非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞を、該胚の、トランスジェニック非ヒト脊椎動物への発達に有利な条件下で、同種の代理母に移植する工程；および(c)該胚をトランスジェニック非ヒト脊椎動物へ発達させるに十分な期間の後、該母親から該トランスジェニック非ヒト脊椎動物を回収し、それにより、不動化されたpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する工程を含む方法を提供する。
【００１４】
本発明はなおさらに、ゲノムが少なくとも1.5kbのインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンを含む培養組換え脊椎動物細胞を作出する方法であって、(a)少なくとも1.5kbのインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンを含む核酸と、同じ核酸内、または別の核酸上のpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列とを培養脊椎動物細胞に導入する工程；および(b)該細胞を、piggyBac様トランスポゼースが発現されて、piggyBac様トランスポゾンが該培養脊椎動物細胞のゲノムに組み込まれるような条件下で培養し、それにより、ゲノムが少なくとも1.5kbのインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンを含む培養組換え脊椎動物細胞を作出する工程を含む方法を提供する。
【００１５】
少なくとも1.5kbのインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンを含む核酸を培養脊椎動物細胞に導入する代わりに、piggyBac様トランスポゾンの重複部分を含む複数の核酸を導入することもできる（ただし、その重複が、核酸が導入される細胞内で相同組換えが起こるに十分なものである場合に限る）。上記のように、piggyBac様トランスポゾン部分とそれらのインサートだけを含む複数の核酸を用いることで、この別法は、大きなインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンを作出し、細胞のゲノムに導入するのに特に有用である。
【００１６】
本発明はなおさらに、ゲノムが、脊椎動物の疾病または障害の治療または予防に有用なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むpiggyBac様トランスポゾンを含む培養組換え脊椎動物細胞を作出する方法であって、(a)培養脊椎動物細胞に、脊椎動物の疾病または障害の治療または予防に有用なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むpiggyBac様トランスポゾンを含む核酸と、同じ核酸内、または別の核酸上のpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列を導入する工程；(b)該細胞を、piggyBac様トランスポゼースが発現されて、piggyBac様トランスポゾンが該培養脊椎動物細胞のゲノムに組み込まれるような条件下で培養し、それにより、ゲノムが脊椎動物の疾病または障害の治療または予防に有用なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むpiggyBac様トランスポゾンを含む培養組換え脊椎動物細胞を作出する工程を含む方法を提供する。
【００１７】
本発明はなおさらに、ゲノムがpiggyBac様トランスポゾンを含み、該piggyBac様トランスポゾンが複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー内にある培養組換え脊椎動物細胞を作出する方法であって、(a)培養脊椎動物細胞に、piggyBac様トランスポゾンを含む線状化核酸と、同じ核酸内、または別の核酸上のpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列とを導入する工程；(b)該細胞を、piggyBac様トランスポゼースが発現されて、piggyBac様トランスポゾンが該培養脊椎動物細胞のゲノムに組み込まれるような条件下で培養し、それにより、ゲノムがpiggyBac様トランスポゾンを含み、該piggyBac様トランスポゾンが複数の該piggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー内にある培養組換え脊椎動物細胞を作出する工程を含む方法を提供する。
【００１８】
本発明はなおさらに、ゲノムがpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列を含み、該piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列が、各々がpiggyBac様トランスポゼースをコードする複数のヌクレオチド配列を含むコンカテマー内にある培養組換え脊椎動物細胞を作出する方法であって、(a)培養脊椎動物細胞に、piggyBac様トランスポゼースをコードする核酸を含む線状化核酸を導入する工程；(b)piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列が培養脊椎動物細胞のゲノムに組み込まれる条件下で培養し、それにより、ゲノムがpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列（該piggyBac様トランスポゼースをコードする該ヌクレオチド配列は、各々がpiggyBac様トランスポゼースをコードする複数のヌクレオチド配列を含むコンカテマー内にある）を含む培養組換え脊椎動物細胞を作出する工程を含む方法を提供する。
【００１９】
本発明はなおさらに、非ヒト脊椎動物においてpiggyBac様トランスポゾンを可動化する方法であって、(a)少なくとも1.5kbのインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の生殖細胞のゲノムに含む第一のトランスジェニック非ヒト脊椎動物と、piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列をその１以上の生殖細胞のゲノムに含む第二のトランスジェニック非ヒト脊椎動物とを交配させて１以上の子孫を得る工程；(b)該piggyBac様トランスポゾンと、該piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の双方をその１以上の細胞のゲノムに含み、従って、該piggyBac様トランスポゼースが発現され、該トランスポゾンが可動化される、工程(a)の１以上の子孫の少なくとも１つを同定し、それにより、非ヒト脊椎動物におけるpiggyBac様トランスポゾンを可動化する工程を含む方法を提供する。前記第一および第二のトランスジェニック非ヒト脊椎動物は、本明細書に記載される方法のいずれかに従って作出することができる。
【００２０】
本発明はなおさらに、非ヒト脊椎動物においてpiggyBac様トランスポゾンを可動化する方法であって、(a)トランスジェニック非ヒト脊椎動物の形質を改変するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の生殖細胞のゲノムに含む第一のトランスジェニック非ヒト脊椎動物と、piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列をその１以上の生殖細胞のゲノムに含む第二のトランスジェニック非ヒト脊椎動物とを交配させて１以上の子孫を得る工程；(b)該piggyBac様トランスポゾンと、該piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の双方をその１以上の細胞のゲノムに含み、従って、該piggyBac様トランスポゼースが発現され、該トランスポゾンが可動化される、工程(a)の１以上の子孫の少なくとも１つを同定し、それにより、非ヒト脊椎動物におけるpiggyBac様トランスポゾンを可動化する工程を含む方法を提供する。前記第一および第二のトランスジェニック非ヒト脊椎動物は、本明細書に記載される方法のいずれかに従って作出することができる。
【００２１】
本発明はなおさらに、非ヒト脊椎動物においてpiggyBac様トランスポゾンを可動化する方法であって、(a)複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー内にあるpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の生殖細胞のゲノムに含む第一のトランスジェニック非ヒト脊椎動物と、piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列をその１以上の生殖細胞のゲノムに含む第二のトランスジェニック非ヒト脊椎動物とを交配させて１以上の子孫を得る工程；(b)該piggyBac様トランスポゾンと、該piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の双方をその１以上の細胞のゲノムに含み、従って、該piggyBac様トランスポゼースが発現され、該トランスポゾンが可動化される、工程(a)の１以上の子孫の少なくとも１つを同定し、それにより、非ヒト脊椎動物におけるpiggyBac様トランスポゾンを可動化する工程を含む方法を提供する。前記第一および第二のトランスジェニック非ヒト脊椎動物は、本明細書に記載される方法のいずれかに従って作出することができる。
【００２２】
本発明はなおさらに、非ヒト脊椎動物においてpiggyBac様トランスポゾンを不動化する方法であって、(a)(i)少なくとも2kbのインサートを含むpiggyBac様トランスポゾンと、(ii)piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の双方をその１以上の細胞のゲノムに含む第一のトランスジェニック非ヒト脊椎動物と、第二の成体脊椎動物とを交配させて１以上の子孫を得る工程；(b)該piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列をそのゲノムに含まず、かつ、該piggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含み、従って、該子孫においてpiggyBac様トランスポゾンが不動化される、工程(a)の１以上の子孫の少なくとも１つを同定し、それにより、非ヒト脊椎動物におけるpiggyBac様トランスポゾンを不動化する工程を含む方法を提供する。前記第一のトランスジェニック非ヒト脊椎動物は、本明細書に記載される方法のいずれかに従って作出することができる。前記第二のトランスジェニック非ヒト脊椎動物は必ずしもトランスジェニック動物である必要はないが、トランスジェニックであれば、それは本明細書に記載される方法のいずれかに従って作出することができる。
【００２３】
本発明はなおさらに、非ヒト脊椎動物においてpiggyBac様トランスポゾンを不動化する方法であって、(a)(i)トランスジェニック非ヒト脊椎動物の形質を改変するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むpiggyBac様トランスポゾンと、(ii)piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の双方をその１以上の細胞のゲノムに含む第一のトランスジェニック非ヒト脊椎動物と、第二の成体脊椎動物とを交配させて１以上の子孫を得る工程；(b)該piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列をそのゲノムに含まず、かつ、該piggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含み、従って、該子孫においてpiggyBac様トランスポゾンが不動化される、工程(a)の１以上の子孫の少なくとも１つを同定し、それにより、非ヒト脊椎動物におけるpiggyBac様トランスポゾンを不動化する工程を含む方法を提供する。前記第一のトランスジェニック非ヒト脊椎動物は、本明細書に記載される方法のいずれかに従って作出することができる。前記第二のトランスジェニック非ヒト脊椎動物は必ずしもトランスジェニック動物である必要はないが、トランスジェニックであれば、それは本明細書に記載される方法のいずれかに従って作出することができる。
【００２４】
本発明はなおさらに、非ヒト脊椎動物においてpiggyBac様トランスポゾンを不動化する方法であって、(a)(i)複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー内にあるpiggyBac様トランスポゾンと、(ii)piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の双方をその１以上の細胞のゲノムに含む第一のトランスジェニック非ヒト脊椎動物と、第二の成体脊椎動物とを交配させて１以上の子孫を得る工程；(b)該piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列をそのゲノムに含まず、かつ、該piggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含み、従って、該子孫においてpiggyBac様トランスポゾンが不動化される、工程(a)の１以上の子孫の少なくとも１つを同定し、それにより、非ヒト脊椎動物におけるpiggyBac様トランスポゾンを不動化する工程を含む方法を提供する。前記第一のトランスジェニック非ヒト脊椎動物は、本明細書に記載される方法のいずれかに従って作出することができる。前記第二のトランスジェニック非ヒト脊椎動物は必ずしもトランスジェニック動物である必要はないが、トランスジェニックであれば、それは本明細書に記載される方法のいずれかに従って作出することができる。
【００２５】
本発明はなおさらに、不動化されたpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する方法であって、(a)ex vivoにおいて非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞に、(i)piggyBac様トランスポゾンと、(ii)生殖細胞系で発現されるプロモーターに機能し得るように連結されたpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の双方をその複数の生殖系細胞のゲノムに含む（ここで、該piggyBac様トランスポゾンと該piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一方は、複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー、または各々がpiggyBac様トランスポゼースをコードする複数のヌクレオチド配列を含むコンカテマー内にある）トランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する工程であって、(i)piggyBac様トランスポゾンと、(ii)生殖細胞系で発現されるプロモーターに機能し得るように連結されたpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列とを含む１以上の核酸（該１以上の核酸の少なくとも１つは線状化されている）を導入する工程；得られた非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞を、該胚の、トランスジェニック非ヒト脊椎動物への発達に有利な条件下で、同種の代理母に移植する工程；および該胚をトランスジェニック非ヒト脊椎動物へ発達させるに十分な期間の後、該母親から、(i)piggyBac様トランスポゾンと、(ii)生殖細胞系で発現されるプロモーターに機能し得るように連結されたpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の双方をその複数の生殖系細胞のゲノムに含む（ここで、該piggyBac様トランスポゾンと該piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一方は、複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー、または各々がpiggyBac様トランスポゼースをコードする複数のヌクレオチド配列を含むコンカテマー内にある）トランスジェニック非ヒト脊椎動物を回収する工程を含む工程；(b)工程(a)の回収されたトランスジェニック非ヒト脊椎動物を成体まで成長させる工程；(c)工程(b)の成体トランスジェニック非ヒト脊椎動物と第二の成体脊椎動物を交配させて１以上の子孫を得る工程；(d)生殖細胞系で発現されるプロモーターに機能し得るように連結されたpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列をそのゲノムに含まず、かつ、piggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含む工程(c)の１以上の子孫（ここで、該１以上の子孫は各々、不動化されたpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物である）の少なくとも１つを同定し、それにより、不動化されたpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する工程を含む方法を提供する。
【００２６】
本発明はなおさらに、各々が不動化されたpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物のライブラリーを作出する方法であって、(a)(i)piggyBac様トランスポゾンと、(ii)生殖細胞系で発現されるプロモーターに機能し得るように連結されたpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の双方をその複数の生殖系細胞のゲノムに含む（ここで、該piggyBac様トランスポゾンと該piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一方は、複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー、または各々がpiggyBac様トランスポゼースをコードする複数のヌクレオチド配列を含むコンカテマー内にある）トランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する工程であって、ex vivoにおいて非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞に、(i)piggyBac様トランスポゾンと、(ii)生殖細胞系で発現されるプロモーターに機能し得るように連結されたpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列とを含む１以上の核酸（該１以上の核酸の少なくとも１つは線状化されている）を導入する工程；得られた非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞を、該胚の、トランスジェニック非ヒト脊椎動物への発達に有利な条件下で、同種の代理母に移植する工程；および該胚をトランスジェニック非ヒト脊椎動物へ発達させるに十分な期間の後、該母親から、(i)piggyBac様トランスポゾンと、(ii)生殖細胞系で発現されるプロモーターに機能し得るように連結されたpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の双方をその複数の生殖系細胞のゲノムに含む（ここで、該piggyBac様トランスポゾンと該piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一方は、複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー、または各々がpiggyBac様トランスポゼースをコードする複数のヌクレオチド配列を含むコンカテマー内にある）トランスジェニック非ヒト脊椎動物を回収する工程を含む工程；(b)工程(a)の回収されたトランスジェニック非ヒト脊椎動物を成体まで成長させる工程；(c)工程(b)の成体トランスジェニック非ヒト脊椎動物と第二の成体脊椎動物を交配させて１以上の子孫を得る工程；(d)各々生殖細胞系で発現されるプロモーターに機能し得るように連結されたpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列をそのゲノムに含まず、かつ、piggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含む工程(c)の２以上の子孫（ここで、該２以上の子孫は各々、不動化されたpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物である）を同定し、それにより、各々不動化されたpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物のライブラリーを作出する工程を含む方法を提供する。
【００２７】
ある態様において、本発明はさらに、piggyBac様トランスポゾンおよび／またはpiggyBac様トランスポゼースをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を提供する。ある実施態様では、該トランスポゾンは少なくとも1.5kbのインサートを有し、該トランスジェニック非ヒト脊椎動物の形質を改変するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、および／または複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー内にある。
【００２８】
ある態様において、本発明はさらに、piggyBac様トランスポゾンおよび／またはpiggyBac様トランスポゼースをそのゲノムに含む培養脊椎動物細胞を提供する。ある実施態様では、該トランスポゾンは少なくとも1.5kbのインサートを有し、トランスジェニック非ヒト脊椎動物の形質を改変するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー内にあり、および／または脊椎動物疾病若しくは障害の治療若しくは予防に有用なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００２９】
本発明はさらに、本明細書に記載されるトランスジェニック非ヒト脊椎動物または培養脊椎動物細胞のライブラリーを提供する。ある実施態様では、該ライブラリーは本発明の方法により作出される。ある実施態様では、トランスジェニック非ヒト脊椎動物のライブラリーは少なくとも6、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも50または少なくとも100構成員を含み、そのうち少なくともいくらか、または好ましくは全てがそのゲノムの種々の位置にpiggyBac様トランスポゾンを含む。ある実施態様では、培養脊椎動物細胞のライブラリーは少なくとも10、少なくとも20、少なくとも50、少なくとも100構成員、または少なくとも1000構成員を含み、そのうち少なくともいくらか、または好ましくは全てがそのゲノムの種々の位置にpiggyBac様トランスポゾンを含む。よって、ある実施態様において、本発明は、そのゲノムに少なくとも1.5kbのインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンを含み、トランスジェニック非ヒト脊椎動物の形質を改変するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー内にあり、および／または脊椎動物の疾病若しくは障害の治療若しくは予防に有用なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、トランスジェニック非ヒト脊椎動物または培養脊椎動物細胞のライブラリーを提供する。
【００３０】
本発明の方法および組成物は疾病および障害の治療および予防に有用である。よって、ある態様において、本発明は、ゲノムが、脊椎動物の疾病または障害の治療または予防に有用なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むpiggyBac様トランスポゾンを含む、組換え脊椎動物細胞を、かかる治療または予防を必要とする対象に投与する工程を含む、疾病または障害の治療または予防方法を提供する。
【００３１】
他の態様において、本発明は、脊椎動物の障害の治療または予防に有用なタンパク質をコードする核酸を、かかる治療または予防を必要とする対象の１以上の細胞に送達する方法であって、ゲノムが、(i)該タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むpiggyBac様トランスポゾンと、(ii)該対象の１以上の細胞においてpiggyBac様トランスポゼースの発現を指示するプロモーターに機能し得るように連結されたpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列とを含む組換えウイルスを投与し、該投与の後に、piggyBac様トランスポゾンが該対象の１以上の細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、かかる治療または予防を必要とする対象に、脊椎動物の障害の治療または予防に有用なタンパク質をコードする核酸を送達する工程を含む方法を提供する。ある実施態様では、該ウイルスはレトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスであり得る。
【００３２】
本発明はさらに、ゲノムが(i)前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むpiggyBac様トランスポゾンと、(ii)プロモーターに機能し得るように連結されたpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列とを含む組換えウイルス、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスを提供する。
【００３３】
piggyBac様トランスポゾンの切断が正確であるため、本方法は、その１以上の細胞のゲノムにpiggyBac様トランスポゾンを含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物が示す表現型がpiggyBac様トランスポゾンによって生じたものかどうかを判定するのに有利であり得る。ある態様では、該方法は、(a)piggyBac様トランスポゾンが切除されているトランスジェニック非ヒト脊椎動物の１以上の子孫を作出する工程；(b)該子孫の該piggyBac様トランスポゾンの切除と該表現型の復帰の間に相関が存在するかどうかを判定し、相関が、該表現型が該piggyBac様トランスポゾンにより生じたものであることの指標となり、それにより、piggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物が示す表現型が該piggyBac様トランスポゾンにより生じたものかどうかを判定する工程を含む。
【００３４】
本発明のpiggyBac様トランスポゾンは、エンハンサーのトラップに有用である。よって、本発明は、非ヒト脊椎動物または培養脊椎動物細胞からエンハンサーを単離する方法を提供する。ある態様において、該方法は、(a)最小プロモーターの制御下にリポーター遺伝子を含むpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞または組織のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物において、該トランスジェニック非ヒト脊椎動物またはそれらから得られた子孫の１以上の細胞または組織におけるリポーター遺伝子の発現を評価する工程；および(b)該１以上の細胞または組織においてリポーター遺伝子の発現を担っている、該piggyBac様トランスポゾンにフランキングしている核酸を単離し、それにより、非ヒト脊椎動物からエンハンサーを単離する工程を含む。他の態様では、最小プロモーターの制御下にリポーター遺伝子を含むpiggyBac様トランスポゾンを含む培養組換え脊椎動物細胞からエンハンサーを単離するのに有用な方法は、(a)該組換え脊椎動物細胞またはその子孫においてリポーター遺伝子の発現を評価する工程；および(b)組換え脊椎動物細胞においてリポーター遺伝子の発現を担っている、該piggyBac様トランスポゾンにフランキングしている核酸を単離し、それにより、培養組換え脊椎動物細胞からエンハンサーを単離する工程を含む。
【００３５】
本発明の方法は、キメラ非ヒト脊椎動物を作出するのに有用な方法である。よって、ある態様において、本発明は、細胞がpiggyBac様トランスポゾンに関してモザイクであるトランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する方法であって、(a)ゲノムに、(i) piggyBac様トランスポゾン（該piggyBac様トランスポゾンは部位特異的リコンビナーゼ認識配列を含む）に関して同形接合性の遺伝子座と、(ii)プロモーターに機能し得るように連結された該部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列とを含む、トランスジェニック非ヒト胚を作出する工程；(b)該トランスジェニック非ヒト胚を、該部位特異的リコンビナーゼが発現され、増殖が起こる条件下で培養し、それにより、細胞がpiggyBac様トランスポゾンに関してモザイクである非ヒトトランスジェニック脊椎動物を作出する工程を含む方法を提供する。かかる方法により作出されたキメラ動物も、本発明に包含される。
【００３６】
本発明はさらに、本発明を実施するのに好適な材料を含むキットを提供する。よって、ある態様において、本発明は、(a)(i)piggyBac様トランスポゾンと、(ii)piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列とを含む、１以上の容器内の１以上の核酸と、(b)第二の容器内の(i)培養脊椎動物細胞、または(ii)非ヒト脊椎動物卵母細胞とを含むキットを提供する。特定の実施態様では、該piggyBac様トランスポゾンは少なくとも1.5kbのインサートを有し、および／または脊椎動物の疾病若しくは障害の治療若しくは予防に有用なタンパク質をコードするインサートを有する。ある態様では、本発明のキット内の少なくとも１つの核酸が線状化されている。
【００３７】
本明細書における請求項記載の方法および組成物のある実施態様には、前記トランスジェニック非ヒト脊椎動物の形質を改変するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むpiggyBac様トランスポゾンがある。
【００３８】
本明細書における請求項記載の方法および組成物のある態様では、piggyBac様トランスポゾンを含む核酸は、その１以上の細胞のゲノムが、複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー内に、piggyBac様トランスポゾンを含むように線状化されている。
【００３９】
本明細書における請求項記載の方法および組成物のさらに他の態様では、piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、その１以上の細胞のゲノムが、各々がpiggyBac様トランスポゼースをコードする複数のヌクレオチド配列を含むコンカテマー内に、piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列を含むように線状化されている。
【００４０】
本明細書における請求項記載の方法および組成物のさらに他の態様では、piggyBac様トランスポゾンは、核酸と結合し、および／または核酸を修飾するタンパク質により認識される配列を含む。ある実施態様では、該核酸修飾タンパク質はDNA結合タンパク質、DNA修飾タンパク質、RNA結合タンパク質、またはRNA修飾タンパク質である。該核酸修飾タンパク質は又、部位特異的リコンビナーゼの標的部位、例えば、FRTまたはリコンビナーゼの標的部位であってもよい。
【００４１】
本発明の方法および組成物のさらに他の態様では、piggyBac様トランスポゾンは選択マーカーを含む。さらに他の態様では、piggyBac様トランスポゾンはリポーター遺伝子を含む。特定の実施態様では、piggyBac様トランスポゾンは選択マーカーとリポーター遺伝子の双方を含む。別の特定の実施態様では、リポーター遺伝子は、トランスポゾンが導入されている種に内在するものである。
【００４２】
本発明の方法および組成物のさらに他の態様では、piggyBac様トランスポゾンは、少なくとも0.5kb、少なくとも1kb、または少なくとも1.5kbのインサートを含む。他の実施態様では、piggyBac様トランスポゾンは、少なくとも2kb、少なくとも2.5kb、少なくとも3kb、少なくとも4kb、少なくとも5kb、少なくとも6kb、少なくとも7kb、少なくとも8kb、少なくとも9kb、少なくとも10kb、少なくとも11kb、少なくとも11.5kb、少なくとも13 kb、少なくとも14kb、または少なくとも15kbのインサートを含む。他の特定の実施態様では、piggyBac様トランスポゾンは、15kb以下、20kb以下、25kb以下、30kb以下、35kb以下、40kb以下、45kb以下、50kb以下、60kb以下、75kb以下、または100kb以下のインサートを含む。さらに他の特定の実施態様では、piggyBac様トランスポゾンは、1.5〜3kb、1.5〜5kb、1.5〜10kb、1.5〜20kb、1.5〜30kb、1.5〜50kb、1.5〜75kb、2〜5kb、2〜10kb、2〜20kb、2〜30kb、2〜50kb、2〜75kb、3〜5kb、3〜10kb、3〜20kb、3〜30kb、3〜50kb、3〜75kb、5〜10kb、5〜20kb、5〜30kb、5〜50kb、5〜75kb、10〜20kb、10〜30kb、10〜50kb、または10〜75kbの間の範囲のインサートを含む。
【００４３】
本発明の方法または組成物が、piggyBac様トランスポゾンとpiggyBacトランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の双方を細胞または生物体に導入することを必要とする場合、このpiggyBac様トランスポゾンおよびpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列は、同じ核酸内にあっても別の核酸上にあってもよい。トランスポゾンおよびトランスポゼースコード領域が別の核酸上にある実施態様では、piggyBac様トランスポゾンを含む核酸はDNAであり、piggyBac様トランスポゼースを含む核酸はRNAであれば、piggyBac様トランスポゾンを該細胞または生物体のゲノムにおいて不動化させることができる。
【００４４】
あるいは、piggyBac様トランスポゾンとpiggyBac様トランスポゼースを含む核酸はともにDNAであってもよく、ゲノムがpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列を含む細胞または生物体も作出が可能である。好ましくは、該piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列はプロモーターに機能し得るように連結されている。一実施態様では、プロモーターは生殖細胞系におけるトランスポゼースの発現を指示し、例えば偏在プロモーターであり、またはより好ましくは、生殖細胞系特異的プロモーターである。一実施態様では、該生殖細胞系特異的プロモーターは、雄性特異的プロモーター（例えば、本明細書に記載されるようなプロタミン1(Prm)プロモーター）である。別の実施形態では、該生殖細胞系特異的プロモーターは、雌性特異的プロモーター（例えば、ZP3プロモーター）である。
【００４５】
本発明の治療および予防方法の対象は、好ましくは非ヒト脊椎動物である。好ましい実施態様では、該対象はヒトまたは非ヒト動物である。特定の実施態様では、該動物はペット（例えば、ネコ、イヌ）または家畜（ウシ、ウマ）である。
【００４６】
ある実施態様では、本発明のトランスジェニック非ヒト脊椎動物は、鳥類（例えば、ニワトリまたは他の家禽類）、または魚類（例えば、ゼブラフィッシュ）である。他の実施態様では、該脊椎動物は、限定されるものではないが、非ヒト霊長類、ウシ、ネコ、イヌ、ウマ、ヒツジ、マウス、ラット、モルモット、パンダ、およびブタを含む非ヒト哺乳類である。特定の実施態様では、該トランスジェニック非ヒト脊椎動物は家畜である。
【００４７】
本発明の組換え細胞は、いずれの脊椎動物細胞であってもよい。特定の実施態様では、該細胞は、鳥類（例えば、ニワトリまたは他の家禽類）または魚類（例えば、ゼブラフィッシュ）起源のものである。他の実施態様では、該細胞は、限定されるものではないが、霊長類（限定されるものではないが、ヒト細胞およびチンパンジー細胞を含む）、ウシ、ネコ、イヌ、ウマ、ヒツジ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ミンク、パンダ、およびブタを含む哺乳類起源のものである。他の実施態様では、該細胞は、カエル細胞、例えば、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)細胞である。特定の実施態様では、該細胞の起源は、家畜である。該細胞は正常なものでも罹患したものでもよく、いずれの分化種または分化状態のものであってもよい。
【００４８】
本発明のある実施態様では、piggyBac様トランスポゾンおよび／またはトランスポゼースコード配列を含む核酸は、細胞または生物体に導入する前に、核酸が前記または生物体(said or organism)のゲノムにコンカテマーとして挿入されるように線状化する。
【００４９】
好ましくは、本発明の方法および組成物で用いるpiggyBac様トランスポゾンはpiggyBacトランスポゾンであり、および／またはpiggyBac様トランスポゼースはpiggyBacトランスポゼースである。
【００５０】
本発明は又、本明細書に記載される特徴のいずれか、および全ての組合せを包含する実施態様を提供する。本明細書に挙げられている、例えば、piggyBac様トランスポゾンの挿入サイズまたは細胞／生物体のライブラリーサイズに関する、全ての数値および全ての数値間の範囲は本発明に包含される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
（5.発明の詳細な説明）
本発明は、脊椎動物細胞および非ヒト脊椎動物生物体におけるpiggyBac様トランスポゾン系の適用を提供する。本発明は、該piggyBac様トランスポゾン系の成分を発現するように操作した脊椎動物細胞および非ヒト生物体、かかる細胞および生物体を作出する方法、かかる操作された細胞および生物体のライブラリーを提供する。
【００５２】
本発明は、本発明のpiggyBac様トランスポゾンの、細胞のゲノムへの導入に関する。トランスポゾンの効率的な組み込みは、細胞がpiggyBac様トランスポゼースも含む場合に起こる。前述のように、該piggyBac様トランスポゼースは、piggyBac様トランスポゼースタンパク質として、またはpiggyBac様トランスポゼースをコードする核酸として細胞に提供され得る。piggyBac様トランスポゼースをコードする核酸は、RNAまたはDNAの形態を採り得る。さらに、piggyBac様トランスポゼースをコードする核酸は、細胞内でのpiggyBac様トランスポゼースの一時的または長期的発現を助けるよう、細胞に安定的または一時的に組み込むことができる。さらに、量的様式または組織特異的様式でタンパク質の発現を調節するために、プロモーターまたは他の発現制御領域を、piggyBac様トランスポゼースをコードする核酸と機能し得るように連結することができる。
【００５３】
本発明のpiggyBac様トランスポゾンは、限定されるものではないが、マイクロインジェクション、トランスポゾンを含む核酸と陽イオン脂質小胞などの脂質小胞との組合せ、粒子衝撃、エレクトロポレーション、DNA凝集試薬（例えば、リン酸カルシウム、ポリリジンまたはポリエチレンイミン）またはウイルスベクターにトランスポゾンを組み込み、そのウイルスベクターと細胞を接触させるなど、当技術分野で公知の種々の技術のいずれかを用いて１以上の細胞に導入することができる。ウイルスベクターを用いる場合、そのウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターをはじめ、当技術分野で公知の種々のウイルスベクターのいずれもを含む。
【００５４】
本発明のpiggyBac様トランスポゾン系は、特定のマーカーを有するか、または動物の１以上の細胞において特定のタンパク質を発現するトランスジェニック動物を作出するために容易に使用することができる。トランスジェニック動物を作出する方法は当技術分野で公知である。
【００５５】
本発明の別の適用において、本発明は、細胞においてpiggyBac様配列を可動化する方法を提供する。この方法では、piggyBac様トランスポゾンを細胞内のDNAに組み込む。さらなるpiggyBac様トランスポゼースまたはpiggyBac様トランスポゼースをコードする核酸を細胞に組み込んで、このタンパク質は、その細胞のDNA内の第一の位置からその細胞のDNA内の第二の位置へ核酸断片を可動化する（すなわち、移動させる）ことができる。この方法は、ゲノムのある位置からゲノムの別の位置へ、または例えば、細胞中のプラスミドからその細胞のゲノムへ核酸断片を移動させることができる。一実施態様では、細胞は培養細胞である。
【００５６】
又、例えば、その生殖細胞の少なくともいくつかにpiggyBac様トランスポゾンを有するものと、その生殖細胞の少なくともいくつかにpiggyBac様トランスポゼースコード配列を有する別のもの、の２つの成体を交配させ、それにより、トランスポゾンとトランスポゼースの双方を有する子孫を作出することにより、piggyBac様トランスポゾンの可動化を動物に対して行うこともできる。あるいは、トランスジェニック動物は、piggyBac様トランスポゾンおよびトランスポゼース（同じまたは別の核酸上）の核酸を卵子または受精卵に同時注入し、それにより、piggyBac様トランスポゾンとトランスポゼースコード配列の双方を含むトランスジェニック動物を作出することにより作出される。該トランスポゼースコード配列は偏在プロモーターまたは組織特異的プロモーター下に置き、このトランスポゾンを含む少なくともいくつかの細胞において発現させることができる。これによりトランスポゾンの可動化が可能となる。生殖細胞系で該プロモーターの活性があれば、該動物の子孫は該可動化トランスポゾンを受け継ぐことができる。可動化トランスポゾンの安定性を確保するためには、トランスポゼースをコードする遺伝子を含まない子孫を選択する。かかる子孫においては、トランスポゾンは不動化されている。
【００５７】
piggyBac様トランスポゾンをpiggyBac様トランスポゼースタンパク質またはpiggyBac様トランスポゼースをコードする核酸と組み合わせて含む本発明のpiggyBac様トランスポゾン系は、生殖細胞系の形質転換、トランスジェニック動物の作出、細胞内のDNAへの核酸の導入、挿入突然変異誘発、および様々な脊椎動物における遺伝子タギングに有力な手段である。
【００５８】
本発明はさらに、効率的な遺伝子操作および解析の手段としての、脊椎動物におけるこの系の適用を提供し、医学、製薬および畜産に適用される。
【００５９】
（5.1. piggyBac様トランスポゾン系）
本発明は、脊椎動物細胞におけるpiggyBac様トランスポゾン系の使用に関する。かかる系は脊椎動物細胞のDNAに核酸配列を導入するために用いられる。piggyBac様トランスポゼースは、piggyBac様トランスポゾンの逆方向反復配列内の認識部位と結合し、標的細胞のゲノムDNAなどのDNAへのトランスポゾンの組み込みを触媒する。実施例に示されるように、piggyBac様トランスポゾンとこのpiggyBac様トランスポゼースコード核酸との組合せは、細胞または生物体へのトランスポゾン配列の組み込みをもたらす。
【００６０】
piggyBac様トランスポゾンは、piggyBac様トランスポゼースの存在下で、DNA上のある位置からDNA上の別の位置へ移動可能であるという点で可動である。piggyBac様トランスポゾン系には、活性型のpiggyBac様トランスポゼースの供給源と該トランスポゼースにより認識され、可動化されるpiggyBac様ITRの２つの基本的成分が存在する。これらのITRの可動化により、ITR間に介在する核酸の可動化もまた可能となる。
【００６１】
従って、本発明のpiggyBac様トランスポゾン系は、２成分、すなわち、piggyBac様トランスポゼースまたはpiggyBac様トランスポゼースをコードする核酸と、piggyBac様トランスポゼースにより認識される少なくとも２つの逆方向反復配列を含む核酸である、クローン化piggyBac様トランスポゾンとを含む。これらの２成分を一緒に置くと、有効なトランスポゾン活性が得られる。使用時、該トランスポゼースは逆方向反復配列と結合し、細胞のDNA への介在核酸配列の組み込みを促進する。
【００６２】
よって、本組成の方法の実施には、piggyBac様トランスポゾンエレメントとpiggyBac様トランスポゼースまたはpiggyBac様トランスポゼースをコードする核酸を含む二連のpiggyBac様トランスポゾン系が必要である。該piggyBac様成分は、piggyBacまたは関連のいずれかのpiggyBac様トランスポゾン系から誘導することができる。
【００６３】
本発明のpiggyBac様トランスポゾンでは、左および右トランスポゾン末端（piggyBac様トランスポゼースにより認識される5'および3'末端逆方向反復配列を含む）は、例えば、詳しく後述されるように、標的細胞ゲノムに挿入される核酸などのインサートをフランキングするか、または選択マーカー若しくは表現型マーカーをコードしている。
【００６４】
piggyBac様トランスポゾンの左末端と右末端の間に配置された、または位置するインサートはかなり大きくてもよい。実際、本発明者らは、piggyBacが、14kb以上といった大きなインサートを有する場合でも、安定して転位するという、驚くべき発見をした。特定の実施態様では、インサートは少なくとも0.5kb、少なくとも1 kb、少なくとも1.5kb、少なくとも2kb、少なくとも2.5kb、少なくとも3kb、少なくとも4kb、少なくとも5kb、少なくとも6kb、少なくとも7kb、少なくとも8kb、少なくとも9kb、少なくとも10kb、少なくとも11kb、少なくとも11.5kb、少なくとも13kb、少なくとも14kb、または少なくとも15kbである。他の特定の実施態様では、piggyBac様トランスポゾンは、15 kb以下、20kb以下、25kb以下、30kb以下、35kb以下、40kb以下、45kb以下、50kb以下、60kb以下、75kb以下、または100kb以下のインサートを含む。さらに他の特定の実施態様では、piggyBac様トランスポゾンは、1.5〜3kb、1.5〜5kb、1.5〜10kb、1.5〜20kb、1.5〜30kb、1.5〜50kb、1.5〜75kb、2〜5kb、2〜10kb、2〜20kb、2〜30kb、2〜50kb、2〜75kb、2.5〜5kb、2.5〜10kb、2.5〜20kb、2.5〜30kb、2.5〜50kb、2.5〜75kb、3〜5kb、3〜10kb、3〜20kb、3〜30kb、3〜50kb、3〜75kb、5〜10kb、5〜20kb、5〜30kb、5〜50kb、5〜75kb、10〜20kb、10〜30kb、10〜50kb、または10〜75kbの間の範囲のインサートを含む。
【００６５】
インサートが、そのトランスポゾン系の、トランスポゾンを標的ゲノムに組み込む能力を不活性にしてしまうほどの大きさである場合には、トランスポゾンを異なる核酸上の重複部分（例えば、2または3または4）として供給することができ、その結果、相同組換えにより、種々の核酸を細胞内で組換え、piggyBac様トランスポゼースの存在下で単一の大きなトランスポゾンとしてゲノムに組み込ませることができる。よって、かかる実施態様では、第一の核酸はpiggyBac様トランスポゾンの左末端とインサートの少なくとも一部を含み、第二の核酸はpiggyBac様トランスポゾンの右末端とインサートの少なくとも一部を含む。核酸を２つだけ用いる場合には、第一の核酸が有するインサートの部分と第二の核酸が有するインサートの部分は重複する。第三の核酸を用いる場合は、この第三の核酸は、一方の末端に第一の核酸と重複する領域を、他方の末端に第二の核酸と重複する領域を有する。図１４Ｂは、かかる実施態様を示す。この複数の重複する核酸（例えば、2、3、4、5、6またはそれ以上）との相同組換えの原理は、脊椎動物細胞および生物体のゲノムに、大きなインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンを導入するために適用することができる。この様式では、50kb、60kb、75kb、100kb、120kb、140kb、160kbまでまたはそれを超えるようなインサートを有するトランスポゾンを標的細胞のゲノムに導入することができる。
【００６６】
この相同組換え系は有利なことに、大きなDNA片、例えば、イントロン、エキソンおよび調節エレメントを含む遺伝子全体を標的細胞に挿入することを可能とする。各核酸対の間の重複の程度は、標的細胞の組換え要件によって異なるが、約20ヌクレオチドから数キロベースといった小さなものであってよい。特定の実施態様では、重複の程度は少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、少なくとも500ヌクレオチド、少なくとも750ヌクレオチドまたは少なくとも1kbである。他の実施態様では、重複の程度は750ヌクレオチド以下、1kb以下、1.5kb以下または1.5kb以下である。
【００６７】
前述のように、本発明のpiggyBac様トランスポゾン系は又、piggyBac様トランスポゼース活性の供給源も含む。piggyBac様トランスポゼース活性は、piggyBac様トランスポゾンの逆方向反復配列と結合し、標的細胞のゲノムへのトランスポゾンの組み込みを媒介する活性である。好適なpiggyBac様トランスポゼース活性であれば、前記のパラメーターを満たす限り、いずれのものでも本方法に使用することができる。piggyBac様トランスポゼース活性は、piggyBac様トランスポゾンそれ自体と同じ供給源であっても異なる供給源であってもよい。
【００６８】
piggyBac様トランスポゼース活性の供給源は多様であり得る。ある実施態様では、この供給源は、piggyBac様トランスポゼース活性を示すタンパク質であってもよい。しかしながら、この供給源は一般には、piggyBac様トランスポゼース活性を有するタンパク質をコードする核酸である。供給源がpiggyBac様トランスポゼース活性を有するタンパク質をコードする核酸である場合、このトランスポゼースタンパク質をコードする核酸は一般に、上記のような発現モジュールの一部であり、この場合、必要に応じ、付加的エレメントがトランスポゼースの発現をもたらす。よって、このトランスポゼースは標的細胞のゲノムに組み込まれ得る。しかし、ある実施態様では、このトランスポゼースはタンパク質として、またはRNAとして細胞に供給される。
【００６９】
本発明のpiggyBac様トランスポゾンは一般に、プラスミド、ウイルスに基づくベクター、直鎖DNA分子などのベクターにて、標的細胞に導入される。好ましくは、piggyBac様トランスポゾンは、オープンリーディングフレームの少なくとも一部を含むインサートを含む。好適なオープンリーディングフレームは第5.14節に示されている。一実施態様では、piggyBac様トランスポゾンインサートはさらに、転写調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、遺伝子座制御領域、またはボーダーエレメント）などの調節領域を含む。好適な調節領域は第5.11節に示されている。好ましくは、この調節領域はオープンリーディングフレームに連結されている。
【００７０】
トランスポゼース活性の供給源がpiggyBac様トランスポゼースをコードする核酸である、ある実施態様では、piggyBac様トランスポゾンとトランスポゼースをコードする核酸は、別のベクター、例えば別のプラスミド上に存在する。他のある実施態様では、トランスポゼースコード配列は、そのトランスポゾンと同じベクター、例えば同じプラスミド上に存在していてもよい。同じベクター上に存在する場合、piggyBac様トランスポゼースコード領域またはドメインは、トランスポゾンITRの外部にある。
【００７１】
本発明のトランスポゾンおよびトランスポゼースエレメントが得られるトランスポゾン系の例を下表１に示す。
【表１】
2008545375.tif 000002
【００７２】
上記の表１および下記の第6節に示されている特定のpiggyBac様トランスポゼース配列の他、piggyBac様トランスポゼースは、コードされるタンパク質がpiggyBac様トランスポゾンに対してトランスポゼース活性を保持している限り、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で表１に示されるトランスポゼースコード配列とハイブリダイズし得るDNAによりコードされていてもよい。特定の実施態様では、トランスポゼースは、表１に示されるpiggyBac様トランスポゼースコード配列と少なくとも60%、70%、80%、90%、95%、98%または99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされている。
【００７３】
ある実施態様では、piggyBac様活性を変化させずにpiggyBac様トランスポゼースのアミノ酸配列に対してなし得る様々な保存的変異がある。これらの変異は保存的突然変異と呼ばれ、すなわち、特定の大きさまたは特徴を有するあるアミノ酸群に属するアミノ酸は、特に、例えば、触媒活性やDNA結合活性と関連のないタンパク質の領域で別のアミノ酸に置換することができる。piggyBac様トランスポゼースの他のアミノ酸配列としては、本明細書で提供される配列に対して、そのトランスポゼースの機能を有意に変化させない保存的変異を含むアミノ酸配列を有するトランスポゾンを含む。アミノ酸配列の置換は、そのアミノ酸が属すクラスの他のメンバーから選択すればよい。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニンおよびトリプトファンが含まれる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。正電荷（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが含まれる。負電荷（酸性) アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。特に好ましい保存的置換としては、限定されるものではないが、正電荷を維持するためのLysのArgによる置換（およびその逆）、負電荷を維持するためのGluのAspによる置換（およびその逆）、遊離ヒドロキシル基を維持するためのSerのThrによる置換（およびその逆）、並びに遊離アミノ基を維持するためのGlnのAsnによる置換が挙げられる。
【００７４】
さらに、piggyBac様トランスポゼースをコードする特定のDNA配列は、特定の細胞種に好ましいコドン、例えば、そのトランスポゼースコード配列が導入される標的細胞のコドンを用いるよう改変することができる。
【００７５】
表１および下記の第6節に具体的に挙げられているpiggyBac様トランスポゾン配列の他、「piggyBac様トランスポゾン」は、天然または人工トランスポゼースによって切断され、ゲノム内のTTAA標的部位に再挿入され、そのエレメントをフランキングする標的部位倍加(TSD)を起こし得るいずれのDNA断片も包含する。特定の実施態様では、この配列は表１に挙げられている、または下記の第6節に記載されているpiggyBacまたはpiggyBac様エレメントに由来するものである。
【００７６】
（5.2. piggyBac様トランスポゾン系の作製方法）
本発明に用いられるpiggyBac様トランスポゾン系の種々のエレメント、例えば、piggyBac様トランスポゾンまたはトランスポゼースエレメントを含むベクターは、制限酵素切断、連結および分子クローニングの標準法により作製することができる。本ベクターを構築するための１つのプロトコールとしては、次の工程を含む。まず、所望の成分であるヌクレオチド配列並びに外来を含む精製核酸断片を最初の供給源、例えば、piggyBac様トランスポゾンを含むベクターから制限エンドヌクレアーゼで切り出す。次に、所望のヌクレオチド配列を含む断片を、例えば、アガロースゲル電気泳動によるなど、従来の分離を用いて必要のない種々の大きさの断片から分離する。このゲルから所望の断片を切り出し、本明細書に記載されているような所望の配列を含む環状核酸またはプラスミドが産生されるように適当な配置でともに連結する。次に、所望により、このようにして構築された環状分子を、例えば大腸菌(E. coli)などの原核生物宿主で増幅させる。これらの工程に含まれる切断、プラスミドの構築、細胞の形質転換およびプラスミドの産生の手順は当業者に周知であり、制限および連結に必要な酵素は市販されている（例えば、T. Maniatis, E. F. FritschおよびJ. SambrookのMolecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982); Catalog 1982-83, New England Biolabs, Inc.; Catalog 1982-83, Bethesda Research Laboratories, Inc.を参照されたい）。本方法で用いられるベクターの構築方法のさらなる例は、下記第6節に示されている。
【００７７】
（5.3.標的細胞ゲノムに核酸を組み込むためのpiggyBac様トランスポゾン系の使用）
本明細書に記載される方法は、標的細胞または生物体のゲノム外来核酸を導入し、安定的に組み込むことが望まれる様々な適用で用いられる。
【００７８】
対象生物としては脊椎動物が含まれ、多くの実施態様で、この脊椎動物は哺乳類である。ある実施態様では、本発明の脊椎動物は鳥類（例えば、ニワトリ若しくは他の家禽類）、または魚類（例えば、ゼブラフィッシュ）である。他の実施態様では、該脊椎動物は、限定されるものではないが、非ヒト霊長類、ウシ、ネコ、イヌ、ウマ、ヒツジ、マウス、ラット、ハムスター、ミンク、モルモット、パンダ、およびブタを含む非ヒト哺乳類である。他の実施態様では、該生物は、カエル、例えば、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)である。特定の実施態様では、該トランスジェニック非ヒト脊椎動物は、家畜である。
【００７９】
例えば遺伝子療法目的で（下記第5.4節により包括的に記載）、このトランスポゾン系を多細胞生物に直接投与することを含む実施態様では、哺乳類はヒトであってもよい。
【００８０】
（5.4. piggyBac様転位系を多細胞生物に導入する方法）
piggyBac様トランスポゾン系の多細胞生物への経路は、その系の成分を運ぶベクターの性質、送達ビヒクルの性質、その生物の性質などを含むいくつかのパラメーターに依存する。
【００８１】
この投与様式の共通の特徴は、標的細胞へのトランスポゾン系成分のin vivo送達を提供することである。ある実施態様では、直鎖または環状DNA、例えば、プラスミドを、標的細胞へトランスポゾン系を送達するためのベクターとして用いる。かかる実施態様では、このプラスミドは、水性送達ビヒクル、例えば、生理食塩水にて投与することができる。あるいは、多細胞生物中のベクターの分布を調節する薬剤を用いてもよい。例えば、本系の成分を含むベクターがプラスミドベクターである場合、脂質に基づく、例えば、リポソームビヒクルを用いてもよく、この場合、この脂質に基づくビヒクルはベクターの細胞または組織特異的送達を目的に、特定の細胞種へ標的化することができる。かかる方法を開示する特許としては、引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許第5,877,302号、同第5,840,710号、同第5,830,430号、および同第5,827,703号が挙げられる。あるいは、ポリリジンに基づくペプチドを担体として用いるなどしてもよく、これは標的化部分で修飾してもしなくてもよい(Brooks, A. I.らの文献(1998, J. Neurosci. Methods V. 80 p: 137-47); Muramatsu, T., Nakamura, A., およびH. M. Parkの文献(1998, Int. J. Mol. Med. V. 1 p: 55-62))。さらに他の実施態様では、これらの系成分は、アデノウイルス由来ベクター、シンドビスウイルス由来ベクター、レトロウイルス由来ベクターなどのようなウイルスベクター、およびハイブリッドベクターなどにて組み込むことができる。上記のベクターおよび送達ビヒクルは単に代表例である。いずれのベクター／送達ビヒクルの組合せも、多細胞生物および標的細胞にトランスポゾン系のin vivo投与を提供する限り、使用可能である。遺伝子療法に関して好適なベクター／送達ビヒクルは、下記第5.13に示されている。
【００８２】
使用可能な種々のタイプのベクターおよび送達ビヒクルが数多くあるため、いくつかの異なる経路による投与が可能であるが、代表的な投与経路としては、経口、局所、動脈内、静脈内、腹腔内、筋肉内などが挙げられる。特定の投与様式は、少なくとも１つには、piggyBac様トランスポゾン系を有するベクターに用いられる送達ビヒクルの性質に依存する。多くの実施態様では、piggyBac様トランスポゾン系を有するベクターは、水性送達ビヒクル、例えば、生理食塩水を用いて血管内投与、例えば、動脈投与または静脈投与される。
【００８３】
piggyBac様トランスポゾン系のエレメント、例えば、piggyBac様トランスポゾンおよびpiggyBac様トランスポゼース供給源はin vivo様式で多細胞生物に投与され、これにより、トランスポゾンを運ぶベクターから、逆方向反復配列にフランクされる核酸を切り取るのに十分な条件下で多細胞生物の標的細胞に導入され、その後、切り取られた核酸の、標的細胞のゲノムへの組み込みが起こる。このトランスポゾンベクターそれ自体の構造、すなわち、そのベクターがpiggyBac様トランスポゼース活性を有する産物をコードする領域を含んでいるかどうかによって、この方法はさらに、必要なトランスポゼース活性をコードする第二のベクターを標的細胞に導入することを含んでもよい。
【００８４】
トランスポゾンエレメントを含むベクター核酸の量、多くの実施態様では、細胞に導入されるトランスポゼースをコードするベクター核酸の量は、所望のトランスポゾン核酸の切断と標的細胞ゲノムへの挿入をもたらすに十分なものである。導入されるベクター核酸の量はそれ自体、十分な量のトランスポゼース活性、および標的細胞に挿入することが望まれる十分なコピー数の核酸をもたらさなければならない。標的細胞に導入されるベクター核酸の量は、用いる特定の導入プロトコール、他と、用いる特定のin vivo投与プロトコールの効率によって異なる。
【００８５】
多細胞生物に投与するこの系の各成分の特定の用量は、トランスポゾン核酸の性質、例えば、発現モジュールおよび遺伝子の性質、その成分エレメントが存在するベクターの性質、並びに送達ビヒクルの性質などによって異なる。用量は当業者ならば経験的に容易に決定することができる。例えば、マウスで、piggyBac様トランスポゾン系成分が、生理食塩水ビヒクルにて哺乳類に静脈投与される別のプラスミド上に存在する場合、多くの実施態様で、トランスポゾンプラスミドの投与量は一般に約0.5〜40の範囲であり、一般には約25μgであるが、piggyBac様トランスポゼースコードプラスミドの投与量は一般に約0.5〜25の範囲であり、通常は約1μgである。
【００８６】
ひと度、このベクターDNAが、必要なトランスポゼースとともに標的細胞に入れば、逆方向反復配列によりフランキングされるベクターの核酸領域、すなわち、piggyBac様トランスポゼースにより認識される逆方向反復配列間に位置するベクター核酸が、与えられたトランスポゼースを介してベクターから切り取られ、標的細胞のゲノムに挿入される。このベクターDNAの標的細胞への導入の後、ベクターが運ぶ外来核酸の、トランスポゼースにより媒介される切断と標的細胞ゲノムへの挿入が起こる。
【００８７】
本発明は、前記第5.1節に記載されるように、種々の大きさの核酸を標的細胞ゲノムに組み込むために使用可能である。
【００８８】
本方法により標的細胞ゲノムへの核酸の安定した組み込みが得られる。安定した組み込みとは、その核酸が一時的な期間よりも長く標的細胞ゲノムに存在し続け、染色体の遺伝物質の一部として標的細胞の子孫に伝えられることを意味する。
【００８９】
（5.5.piggyBac様トランスポゾンを含む組換え細胞の作出方法）
形質転換細胞の作出には、まず、DNAが宿主細胞内に物理的に置かれる必要がある。現行の形質転換法では、DNAを細胞に導入するため様々な技術を用いる。形質転換の一形態では、マイクロピペットを用いてDNAを直接細胞にマイクロインジェクションする。あるいは、高速衝撃を用いて、小DNAが会合した粒子を細胞に向け発射することができる。別の形態としては、ポリエチレングリコールの存在により細胞を透過性とすると、DNAを拡散により細胞に進入させることができる。又、DNAは、プロトプラストを、DNAを含む他の物体と融合させることにより細胞内に導入することもできる。これらの物体としては、ミニ細胞、細胞、リソソームまたは他の融合性の脂質で表面処理した小体が挙げられる。エレクトロポレーションも、DNAを細胞に導入するために認知されている方法である。この技術では、細胞に、生体膜を可逆的に透過性にして外来DNA配列の進入を可能とする高い電界強度の電気的衝撃パルスを与える。本発明に従って形質転換構築を細胞に導入する１つの好ましい方法は、受精卵に該構築物をマイクロインジェクションすることである。トランスポゾン逆方向反復配列によりフランキングされたDNA配列を生物の発達中に受精卵のゲノムに挿入すると、このDNAは全ての子孫細胞に伝わり、トランスジェニック生物が得られる。トランスジェニック動物を作出するための卵のマイクロインジェクションは従前に記載されており、これを形質転換哺乳類を作出するために用いる(Hoganらの論文(Manipulating The Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N. Y., 1986); Shirkらの論文(In Biotechnology For Crop Protection, Hedinら(編), ACS Books, Washington D.C., 135-146, 1988); Morganらの論文(Annu. Rev., Biochem., Volume 62, 191-217, 1993)、全て引用により本明細書中に組み込まれている）。
【００９０】
あるいは、この二部分のpiggyBac様トランスポゾン系は、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスその他を含むウイルスを介して細胞に送達することもできる。逆方向末端反復配列(ITR)にフランキングされた目的の導入遺伝子を含むトランスポゾン部分とトランスポゼースをコードする遺伝子の送達機構にはいくつかの可能性のある組合せがある。例えば、トランスポゾンとトランスポゼース遺伝子の双方は同じ組換えウイルスゲノム上に一緒に含まれていてもよく、１回の感染でpiggyBac系の両部分を送達し、その結果、次に、このトランスポゼースの発現が、組換えウイルスゲノムからの、その後に細胞の染色体に組み込むためのトランスポゾンの切断を指示する。別の例では、このトランスポゼースおよびトランスポゾンは、ウイルス系および／または脂質含有系などの非ウイルス系の組合せにより別々に送達することができる。これらの場合、トランスポゾンおよび／またはトランスポゼース遺伝子のいずれかを組換えウイルスにより送達することができる。いずれの場合でも、発現したトランスポゼース遺伝子は、その担体DNA（ウイルスゲノム）からの、染色体DNAに組み込むためのトランスポゾンの遊離を指示する。
【００９１】
本発明のpiggyBac様トランスポゾン系は脊椎動物起源のいずれの細胞系統または一次細胞系統に導入することもできる。
ある実施態様では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、HeLa、VERO、BHK、Cos、MDCK、293、3T3、骨髄腫（例えば、NSO、NSI）、HT-1080またはW138細胞などの細胞系統のものである。脊椎動物細胞は又、ハイブリドーマ細胞などの細胞融合事象の産物であってもよい。
【００９２】
ある実施態様では、細胞は、多分化能細胞（すなわち、その子孫が造血幹細胞または他の幹細胞などのいくつかの限定された細胞種に分化することができる細胞）または全能性細胞（すなわち、例えば、胚幹細胞など、その子孫が生物のいずれの細胞種にもなり得る細胞）であり得る。本発明では、例えば、卵母細胞、卵、および胚の１以上の細胞などの細胞も考慮する。
さらに他の実施態様では、細胞は、様々な器官または組織に由来する成熟細胞であり得る。かかる細胞としては、限定されるものではないが、リンパ球、肝細胞、神経細胞、筋肉細胞、様々な血液細胞、および生物の様々な細胞が挙げられる。
【００９３】
（5.6. piggyBac様トランスポゾンを含む組換え動物の作出方法）
上記のpiggyBac様導入遺伝子を非ヒト哺乳類に導入する。マウスおよびラットなどの齧歯類、ウサギ、ヒツジおよびヤギなどのヒツジ類、ブタなどのブタ類、並びに畜牛および水牛などのウシ類をはじめとするほとんどの非ヒト哺乳類が好適である。
【００９４】
遺伝子導入のいくつかの方法では、導入遺伝子は受精卵母細胞の前核に導入される。マウスなどのいくつかの動物では、in vivoで受精を行い、受精卵を外科的に摘出する。他の動物、特にウシ類では、生きている動物、または屠殺場の動物から卵を取り出し、その卵を試験管内受精することが好ましい。DeBoerらのWO91/08216を参照されたい。試験管内受精により、組み込みに最適な細胞周期（S期を過ぎない）に実質的に同調した細胞に導入遺伝子を導入することができる。導入遺伝子は通常、マイクロインジェクションにより導入される。米国特許第4,873,292号を参照されたい。次に、受精卵母細胞を、約16〜150細胞を含む移植前胚が得られるまでin vitroで培養する。16〜32細胞段階の胚は桑実胚といわれる。32細胞を上回る移植前胚は胚盤胞と呼ばれる。これらの胚は胞胚腔の発達を示し、一般に64細胞の段階である。受精卵母細胞を移植前段階まで培養する方法は、Gordonらの論文(1984, Methods Enzymol. 101, 414); Hoganらの論文(Manipulation of the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, C.S.H.L. N.Y., 1986（マウス胚）;およびHammerらの論文(1985, Nature 315, 680（ウサギおよびブタの胚）; Gandolfiらの論文(1987, J. Reprod. Fert. 81, 23-28); Rexroadらの論文(1988, J. Anim. Sci. 66, 947-953 （ヒツジ胚）およびEyestoneらの論文)(1989, J. Reprod. Fert. 85, 715-720); Camousらの論文(1984, J. Reprod. Fert. 72, 779-785);およびHeymanらの論文(1987, Theriogenology 27, 5968（ウシ胚）（目的を問わず、引用により本明細書中にそのまま組み入れられる）に記載されている。場合によっては、移植前胚は移植までの期間、冷凍保存される。移植前胚を、導入遺伝子が組み込まれた際の発達の段階に応じてトランスジェニック動物またはキメラ動物の誕生をもたらす適当な雌に移植する。キメラ哺乳類は、真の生殖細胞系トランスジェニック動物となるように交配させることができる。
【００９５】
あるいは、導入遺伝子を胚幹細胞(ES)へ導入することもできる。これらの細胞はin vitro培養した移植前胚から得られる。Bradleyらの論文(1984, Nature 309, 255-258)（目的を問わず、引用により本明細書中に組み入れられる）。導入遺伝子はかかる細胞にエレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションにより導入することができる。形質転換ES細胞を非ヒト動物由来の胚盤胞と組み合わせる。ES細胞は胚に着床し、胚によっては、生じたキメラ動物の生殖細胞系が形成する。Jaenischの論文(Science, 240, 1468-1474, 1988)（目的を問わず、引用により本明細書中にそのまま組み入れられる）を参照されたい。あるいは、ES細胞を、除核した受精卵母細胞に移植するための核供給源として用い、トランスジェニック哺乳類を得ることもできる。
【００９６】
２以上の導入遺伝子を含むトランスジェニック動物を作出するためには、例えば、本発明のpiggyBac様トランスポゾン成分とpiggyBac様トランスポゼース成分が別の核酸によって動物に導入される実施態様では、これらの導入遺伝子は、単一の導入遺伝子の場合と同じ手順を用い、同時に導入することができる。あるいは、これらの導入遺伝子をまず別々の動物に導入し、その後、それらの動物を交配させることにより、同じゲノム内に一緒にすることができる。あるいは、導入遺伝子の一方を含む第一のトランスジェニック動物を作出し、その後、その動物由来の受精卵または胚幹細胞に第二の導入遺伝子を導入する。
【００９７】
いくつかの実施態様では、長さが約50kbを超える導入遺伝子は重複断片として構築される。かかる重複断片は受精卵母細胞または胚幹細胞に同時に導入され、in vivoで相同組換えを受ける。KayらのWO92/03917（目的を問わず、引用により本明細書中にそのまま組み入れられる）を参照されたい。
トランスジェニック哺乳類は、上記の導入遺伝子を哺乳類の受精卵（前核期のもの）にマイクロインジェクションにより導入し、卵を、付加的なインキュベーションを少々施した後、雌哺乳類（レシピエント哺乳類）の卵管に移植するか、またはそのまま偽妊娠に同調させた子宮に移植し、幼体を得ることによって便宜に作出することができる。
【００９８】
作出された幼体がトランスジェニックであるかどうかを調べるためには、下記のドットブロット法、PCR、免疫組織学的分析、補体阻害分析などを使用することができる。
このようにして作出されたトランスジェニック哺乳類は、従来のように交配させて幼体を得るか、またはトランスジェニック哺乳類の体細胞の核（初期化されていてもされていなくてもよい）を予め徐核した受精卵に移入し、これらの卵をレシピエント哺乳類の卵管または子宮に移植し、クローン幼体を得ることによって繁殖させることができる。
【００９９】
導入DNA配列の一部として選択マーカーが含まれていれば、形質転換細胞および／またはトランスジェニック生物（宿主細胞のDNAに挿入DNAを含むもの）を、非形質転換細胞および／または形質転換生物から選択することができる。選択マーカーとしては、例えば、抗生物質耐性をもたらす遺伝子；目に見える表現型の変化をもたらす、例えば緑色蛍光タンパク質などの宿主生理を改変する遺伝子などが挙げられる。これらの遺伝子を含む細胞および／または生物体は、非形質転換細胞／生物体を死滅させる抗生物質濃度、殺虫剤濃度または除草剤濃度の存在下で生存し得るか、または目に見える表現型の変化をもたらし得る。例えば、サザンブロット法およびポリメラーゼ連鎖反応などの当業者に公知の標準的な技術を用い、トランスジェニック細胞および／または生物体からDNAを単離し、導入したDNAが挿入されたことを確認することができる。
【０１００】
（5.7. 部位特異的リコンビナーゼ認識部位を有するpiggyBac様トランスポゾン）
本発明のpiggyBac様トランスポゾン系を用いれば、部位特異的リコンビナーゼ認識配列を非ヒト脊椎動物の染色体の無作為に挿入し、突然変異動物および／またはモザイク動物の作出を助けることができる。特定の実施態様では、部位特異的リコンビナーゼはCre-loxP系またはFLP-FRT系である（引用により本明細書中に組み入れられるKilbyらの論文(1993, Trends Genet 9(12):413-421を参照されたい）。
異なる染色体に組み込まれた部位特異的リコンビナーゼ認識配列間の組換えにより、それらの染色体間の転座が起こる。かかる転座は、発達異常または腫瘍形成をもたらす突然変異を作り出す一般的手段である。
正方向反復配列の２つの部位特異的リコンビナーゼ認識配列間の組換えでは、介在するDNA配列（例えば、遺伝子）の切断が起こり得る。かかる事象は潜在的に可逆的であるが、切断されたDNA配列が細胞分裂中に、または分解により消失することで不可逆的な突然変異となる。いずれの遺伝子においてもヌル突然変異はこのようにして作出でき、特定の細胞および／または特定の発達段階における遺伝子の機能を調べることができる。
【０１０１】
逆方向反復配列の２つの部位特異的リコンビナーゼ認識配列間の組換えでは、介在配列または遺伝子の逆位が起こり得る。逆位は遺伝子の活性化または不活性かをもたらし得る。遺伝子活性が検出可能な場合（例えば、選択マーカー、組織化学マーカー、リポーター遺伝子）、遺伝子の活性化または不活性化により、細胞およびその子孫をマーキングする組換え事象を確認することによって細胞の系統を追跡することができる。細胞の系列は、部位特異的リコンビナーゼ認識配列の組み込み部位の違いをモニタリングすることにより、遺伝子活性とは無関係に追跡することができる。
【０１０２】
染色体に組み込まれた部位特異的リコンビナーゼ認識配列と染色体外遺伝物質に組み込まれた部位特異的リコンビナーゼ認識配列の間の組換えにより、その染色体への遺伝物質の挿入が起こり得る。このようにして作り出された挿入は、染色体部位特異的リコンビナーゼ認識配列によって特定されたゲノム部位に１コピーの導入遺伝子の部位特異的組み込みを有するトランスジェニック非ヒト動物を作出するための手段を提供する。
【０１０３】
好ましくは、該介在配列または遺伝物質は、例えば、発達遺伝子、必須遺伝子、サイトカイン遺伝子、神経伝達物質遺伝子、神経伝達物質受容体遺伝子、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、選択マーカー、または組織化学マーカーなどの遺伝子、またはその一部を含む。組換えは、節領域と遺伝子との近接、または調節領域と遺伝子との遠隔によって、それぞれ活性化または不活性化が生じ得る。
【０１０４】
（5.8.エキソントラップ）
本発明のpiggyBac様トランスポゾン系は又、様々な組織における示差的な遺伝子発現を検出するために、エキソントラップクローニング、またはプロモータートラップ法で使用することもできる。例えば、D. Auch & Rethらの論文「エキソントラップクローニング：ゲノムDNA断片からエキソンを迅速に検出およびクローニングするためのPCRの使用」(Nucleic Research, Vol. 18, No. 22, p. 6743); Bucklerらの論文(1996, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:4005-4009, 1991); Henskeらの論文(Am. J. Hum. Genet. 59:400-406)を参照されたい。かかる実施態様では、piggyBac様トランスポゾンは好ましくは、エキソンスプライシング供与部位および受容部位によってフランキングされた、GFPまたは親和性タグなどの検出可能なマーカー遺伝子を含む。このように、マーカー遺伝子によりコードされているタンパク質は、piggyBac様トランスポゾンが挿入されている遺伝子座によりコードされているタンパク質内で翻訳され、その遺伝子座によってコードされているタンパク質の検出が可能となる。
【０１０５】
（5.9.ポリペプチド合成適用）
本明細書に記載の、トランスジェニックおよびモザイク動物並びに組換え細胞を作出する方法は、ポリペプチド、例えば、目的のタンパク質の合成に使用することができる。
かかる適用では、その細胞のいくつかまたは全てのゲノムが、目的のポリペプチドをコードするインサートを、必要および／または所望の発現調節配列、例えば、プロモーターなどと組み合わせて含むpiggyBac様トランスポゾン（すなわち、発現モジュール）を含む、トランスジェニックまたはモザイク動物を作出し、そのポリペプチドの発現のための発現宿主として利用する。同様に、かかるpiggyBac様トランスポゾンを含む培養脊椎動物細胞もこれらの方法に使用可能である。次に、このトランスジェニックまたはモザイク動物または組換え細胞を、piggyBac様トランスポゾンが有するインサートによりコードされているポリペプチドの発現に十分な条件に置く。その後、発現したタンパク質を回収し、所望により、便宜ないずれかのプロトコールを用いて精製する。
【０１０６】
トランスジェニックまたはモザイク動物に関して、本発明の方法は、動物において目的タンパク質を発現させる、または目的タンパク質の高レベル発現を可能とする細胞系統を作出する手段を提供する。よって、本発明により作出される動物および細胞は目的タンパク質の生産のための「バイオリアクター」として有用である。目的タンパク質はこれらの細胞または動物に対して内因性ものでも外因性のものでもよい。
さらに、本明細書に記載の方法は、家畜の形質改良にも有用である。
【０１０７】
（5.10.治療適用）
本発明の方法は、治療用核酸、例えば遺伝子を標的細胞のゲノムに安定的に組み込むためにpiggyBac様トランスポゾン系を用いる治療適用、すなわち、遺伝子療法適用に有用である。これらのpiggyBac様トランスポゾン系を用いれば、対象に多様な治療用核酸を送達することができる。対象となる治療用核酸としては、遺伝子欠陥に基づく罹患状態の一因となるもの、癌治療に治療的有用性を有するものなど、標的宿主細胞における欠陥遺伝子に取って代わる遺伝子またはオープンリーディングフレームが挙げられる。治療上有益なコード配列の例としては、第5.13節に開示されている。
【０１０８】
上記のように、本方法の重要な特徴は、本方法がin vivo遺伝子療法適用に使用可能であるということである。in vivo遺伝子療法適用とは、治療遺伝子の発現が望まれる標的細胞が、トランスポゾン系と接触させる前に宿主から取り出されることを意味する。これに対し、トランスポゾン系を含むベクターは多細胞生物に直接投与され、その遺伝子の、標的細胞ゲノムへの組み込みが起こった後、標的細胞により取り込まれる。
【０１０９】
（5.11.プロモーター）
本発明の一実施態様では、piggyBac様トランスポゾンに挿入された核酸は、オープンリーディングフレーム(「ORF」)の発現を調節するエレメントと機能し得るように連結されたORFをコードする。さらに、調節エレメントは、piggyBac様トランスポゼースの発現を調節するのに、特に、トランスポゼースをコードする核酸が動物のゲノムに導入される本発明の実施態様においては、望ましい。
【０１１０】
好ましくは、piggyBac様トランスポゾン内の発現モジュールは、トランスポゾンが有しているORFの発現をもたらす転写調節エレメントを含む。特定の転写調節エレメントの例としては、Dijkemaらの論文(EMBO J. (1985) 4:761)に記載されているようなSV40エレメント；Gormanらの論文(Proc. Nat'l Acad. Sci USA (1982) 79:6777)に記載されているようなラウス肉腫ウイルスのLTRに由来する転写調節エレメント；Boshartらの論文(Cell (1985) 41:521)に記載されているようなヒトサイトメガロウイルス(CMV)のLTRに由来する転写調節エレメント；hsp70プロモーター(Levy-Holtzman, R.およびI. Schechterの論文(Biochim. Biophys. Acta (1995) 1263: 96-98)、Presnail, J. K.およびM. A. Hoyの論文(Exp. Appl. Acarol. (1994) 18: 301-308))などが挙げられる。
【０１１１】
特定の実施態様では、調節エレメントは誘導プロモーターである。誘導プロモーターは当業者に公知であり、トランスポゼース遺伝子の発現を駆動するために使用可能な様々なものがある。誘導系としては、例えば、熱ショックプロモーター系、メタロチオネイン系、グルココルチコイド系、組織特異的プロモーターなどが挙げられる。通常70kDaの熱ショックタンパク質をコードする遺伝子と会合しているプロモーターなど、熱ショックにより調節されるプロモーターは、高温に曝された後に数倍発現が高まる。又、グルココルチコイド系も、遺伝子発現の誘発に十分機能する。この系は、ステロイドホルモン（すなわち、グルココルチコイド、またはデキサメタゾンなどのその合成相当物のあるもの）の存在下でそのホルモンと複合体を形成するグルココルチコイド受容体タンパク質(GR)をコードする遺伝子からなる。この複合体は次にグルココルチコイド反応エレメント(GRE)と呼ばれる短いヌクレオチド配列(26bp)と結合し、この結合が連結されている遺伝子の発現を活性化する。このように、誘導プロモーターは、導入された遺伝子の発現を制御するため、環境誘導プロモーターとして使用可能である。遺伝子産物の機能的活性化を制御するための誘導プロモーター以外の手段も当業者に知られている。
【０１１２】
ある実施態様では、piggyBac様トランスポゼースは、生殖細胞系特異的プロモーターの制御下で発現する。ある実施態様では、生殖細胞系特異的プロモーターは、雄性特異的プロモーター（例えば、本明細書に記載されているようなプロタミン1(Prm)プロモーター）である。他の実施態様では、生殖細胞系特異的プロモーターは、雌性特異的プロモーター（例えば、ネズミZP3(mZP3)プロモーターなどのZP3プロモーター(Liraらの論文(1990, Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 87(18):7215-9))である。
【０１１３】
バイオリアクターとして家畜を用いる場合、タンパク質は乳汁、尿、血液または卵中で多量に生産することができる。プロモーターは、乳汁、尿、血液または卵中で発現を誘導することが知られ、これらのものとしては、限定されるものではないが、それぞれカゼインプロモーター、マウス尿タンパク質プロモーター、β-グロビンプロモーターおよびオボアルブミンプロモーターが挙げられる。
【０１１４】
（5.12.pissvBac様トランスポゾン突然変異誘発および遺伝子の発見）
トランスポゾンタギングは、トランスジェニックDNAを細胞に送達し、遺伝子に組み込み、それにより、挿入突然変異誘発によってそれらを不活性化する技術である。この方法では、不活性化した遺伝子を転位可能なエレメントでタグ付けし、その後、これを用いて突然変異した対立遺伝子を回復させることができる。転位可能なエレメントを挿入することで、特徴的な表現型をもたらし得る遺伝子の機能を妨げることができる。
【０１１５】
それらのある染色体位置からゲノム内およびゲノム間の別の位置へ移動する固有の能力のため、転位可能なエレメントは、細菌(Gonzalesらの論文(1996 Vet. Microbiol. 48, 283-291); LeeおよびHenkの論文(1996, Vet. Microbiol. 50, 143-148))、ショウジョウバエ(BallingerおよびBenzerの論文(1989 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9402-9406)); Bellenらの論文(1989, Genes Dev. 3, 1288-1300); Spradlingらの論文(1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10824-10830))、C.エレガンス(C. elegans)(Plasterkの論文(1995, Meth. Cell. Biol., Academic Press, Inc. pp. 59-80))および様々な植物種(OpiggyBac-likeorneおよびBakerの論文(Curr. Opin. Cell Biol, 7, 406-413, 1995))をはじめとする特定の生物の遺伝子操作に大変革をもたらした。トランスポゾンは、トランスポゾンタギング、エンハンサートラッピングおよび遺伝子導入のための有用なベクターとして活用されてきた。しかしながら、全てとは言えないまでも大部分の脊椎動物にはかかる有力な手段がない。本発明のpiggyBac様トランスポゾン系は、その多様な生物における簡便性および機能性のため、DNAトランスポゾン技術が現在利用できない種にとっても効率的なベクターとして有用である。
【０１１６】
トランスポゾンタギングは、トランスポゾンが可動化されて遺伝子に飛び移り、それにより、挿入突然変異誘発によってそれらを不活性化する技術である。これらの方法は、Evansらの論文(TIG 1997 13:370-374)により述べられている。この方法では、不活性された遺伝子は転位可能なエレメントにより「タグ付け」され、その後これを用いて突然変異した対立遺伝子を回復させることができる。従って、本発明は、piggyBac様トランスポゾンタグを細胞のゲノムに導入するための効率的な方法を提供する。このタグが、特定の表現型に関連するタンパク質の発現を妨げる細胞の位置に挿入される場合、piggyBac様トランスポゾンを含む細胞における変更された表現型の発現は、トランスポゾンにより分断された特定の遺伝子と特定の表現型を関連づけることができる。ここで、piggyBac様トランスポゾンはタグとして機能する。逆PCRのために、または本発明の核酸断片をフランキングするゲノムDNAの配列を決定するために設計されたプライマーを用い、分断された遺伝子に関する配列情報を得ることができる。
【０１１７】
タグ付けされた遺伝子を単離するにはいくつかの方法がある。いずれの場合でも、常法により（組織や動物が異なれば異なる）、突然変異動物の１以上の組織に由来する細胞からゲノムDNAを単離する。このDNAを制限エンドヌクレアーゼにより切断するが、この制限エンドヌクレアーゼはトランスポゾンにおいて切断するもので切断しないものでもよい（しばしば既知の部位で切断する）。次に、得られた断片を、プラスミドに直接、またはトランスポゾンDNAに対するプローブを用いて同定するためのファージベクターにクローニングすることができる（Kimらの論文(1995, Mobile Genetic Elements, IRL Press, D. L. Sheratt編)を参照されたい）。あるいは、このDNAを多くの方法のいずれかを用いてPCR増幅することもできる。IzsvakおよびIvies (1993, Biotechniques. 15(5):814-8)のLM-PCR法を使用することができる。このLM-PCR法をDevonら(1995, Nucleic acids Res. 23(9): 1644-5)により改変されたように行い、トランスポゾンプローブとのハイブリダイゼーションにより同定することができる。別法としては、逆PCR（例えば、Allendeらの論文(1996, Genes Dev., 10:3141-3155)を参照されたい）がある。クローニング方法によらず、同定されたクローンを次に配列決定する。トランスポゾン（または他の挿入DNA）をフランキングする配列は、挿入配列と同一でないことにより確認することができる。これらの配列は組合せ、その後、従前に同定されている他の遺伝子との相同性、またはいくつかの機能をコードする遺伝子若しくは配列モチーフとの部分的相同性に関して核酸データベースを検索するために使用することができる。場合によっては、この遺伝子は既知のタンパク質とは相同性がない場合もある。これは、その他のものと比較する新規な配列となる。コードされるタンパク質は、その回復を誘導された表現型を生じる上でのその役割のさらなる検討の中心となる。
【０１１８】
よって、piggyBac様トランスポゾンは、脊椎動物ゲノムの突然変異を誘発し、機能欠損突然変異の作出および対象とする表現型に関する突然変異のスクリーニングを可能とするために使用することができる。一般に、piggyBac様トランスポゾンは、トランスポゾンを含む動物の検出を可能とする１以上のエレメントを含むものが使用される。ほとんどの場合、外被または目の色などの目に見える形質に影響を及ぼすマーカー遺伝子が用いられる。しかしながら、トランスジェニック動物において確実かつ容易に表現型変化を評価できる遺伝子ならばいずれのものもマーカーとして使用できる。
【０１１９】
piggyBac様トランスポゾンが挿入されている遺伝子は、トランスポゾンが挿入されている細胞のDNAを、piggyBac様トランスポゾン配列を切断し得る制限エンドヌクレアーゼで消化し；トランスポゾンの逆方向反復配列を同定し；その逆方向反復配列に近接する核酸の配列決定を行って、オープンリーディングフレームに由来するDNA配列を得；そのDNA配列とコンピューターデータベースの配列情報とを比較することによって同定することができる。一実施態様では、制限エンドヌクレアーゼは4塩基認識配列を認識する。別の実施形態では、この消化工程はさらに、消化された断片をクローニングするか、または消化された断片をPCR増幅することを含む。一実施態様では、遺伝子は逆PCRにより同定される。
【０１２０】
よって、本発明のpiggyBac様トランスポゾン系は又、遺伝子の発見のためにも使用することができる。一例では、piggyBac様を、piggyBac様トランスポゼースタンパク質またはpiggyBac様トランスポゼースをコードする核酸と組み合わせて細胞に導入する。このpiggyBac様トランスポゾンは好ましくは、GFPなどのマーカータンパク質と制限エンドヌクレアーゼ認識部位、好ましくは、6塩基認識配列を含むインサートを含む。組み込みの後、細胞のDNAを単離し、制限エンドヌクレアーゼで消化する。4塩基認識配列を用いる制限エンドヌクレアーゼを使用する場合、細胞のDNAは平均して約256bp断片に切断される。これらの断片はクローニングするか、または消化された断片の末端にリンカーを付加してPCRプライマー用の相補的配列を得ることができる。リンカーを付加する場合には、PCR反応を用い、リンカーに由来するプライマーと核酸断片における逆方向反復配列の正方向反復と結合するプライマーを用いて断片を増幅する。次に、増幅された断片を配列決定し、正方向反復にフランキングするDNAを用いて、GenBankなどのコンピューターデータベースを検索する。
【０１２１】
（5.12.1.突然変異の確認のための表現型復帰）
本発明の方法に用いるpiggyBac様トランスポゾンは、in vivo転位の際に、切断時にトランスポゾン配列の下流を残さずに正確に切断する。piggyBac様トランスポゾン系のこの特徴は、非ヒト脊椎動物で見られる表現型が、piggyBac様トランスポゾンがゲノムに挿入されたことによるものであることを確認するために利用することができる。
【０１２２】
（5.13.遺伝子療法）
遺伝子療法用の遺伝子導入ベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターに大きく分類することができる。piggyBac様トランスポゾン系の使用は、非ウイルスDNAにより媒介される遺伝子導入の精巧なものである。これまでにウイルスベクターの方が、細胞における遺伝子に導入および発現に効率的であることが分かっている。新たな遺伝子両方の開発で非ウイルス遺伝子導入がウイルス媒介型の遺伝子導入よりも優れている理由はいくつかある。例えば、遺伝子療法の薬剤としてウイルスを採用する場合には、遺伝子デザインは大きさ、構造および発現の調節という点でウイルスゲノムの制約に縛られる。非ウイルスベクターは大抵、合成出発材料から作製されるので、ウイルスベクターよりも製造が容易である。非ウイルス性試薬はウイルス薬剤よりもおそらく免疫原性が小さく、反復投与が可能となる。非ウイルスベクターはウイルスベクターよりも安定性が高いので、ウイルスベクターよりも医薬処方および適用に適している。
【０１２３】
現行の非ウイルス遺伝子導入系には、宿主染色体を含む細胞のDNAへの核酸の導入を促すために必要な備えがない。そのため、非ウイルス系を用いた場合の安定的遺伝子導入頻度は極めて低く、組織培養細胞ではせいぜい0.1%、一次細胞および組織ではさらに低い。本系は、組み込みを助け、安定的遺伝子導入の頻度を著しく向上させる非ウイルス遺伝子導入系である。
【０１２４】
本発明の遺伝子導入系では、piggyBac様トランスポゼースは、タンパク質またはタンパク質をコードする核酸として細胞に導入することができる。一実施態様では、該タンパク質をコードする核酸はRNAであり、別の実施態様では、該核酸はDNAである。さらに、piggyBac様トランスポゼースをコードする核酸は、ウイルスベクター、陽イオン脂質、または真核細胞に用いられるエレクトロポレーション若しくは粒子衝撃をはじめとする他の標準的なトランスフェクション機構により細胞に組み込むことができる。piggyBac様トランスポゾンをコードする核酸を導入した後、同じ細胞にpiggyBac様トランスポゼースを導入することができる。
【０１２５】
同様に、piggyBac様トランスポゼースは、直鎖断片または環状断片、好ましくは、プラスミドまたは組換えウイルスDNAとして細胞に導入することができる。好ましくは、該核酸配列は、アミノ酸含有産物を生産するためのオープンリーディングフレームの少なくとも一部を含む。好ましい実施形態では、piggyBac様トランスポゾンは、少なくとも１つのタンパク質、例えば、選択マーカー、リポーター、治療用タンパク質または畜産で有用なタンパク質をコードするインサートを含み、かつ、piggyBac様トランスポゾンに挿入されたオープンリーディングフレームまたはコード領域の発現を指示するよう選択された少なくとも１つのプロモーターを含む。本発明のpiggyBac様トランスポゾンに含まれる好適なコード領域のより包括的な説明は下記の第5.14節に示されている。
【０１２６】
遺伝子療法の方法の概説としては、Goldspielらの論文(1993, Clinical Pharmacy 12:488-505); WuおよびWuの論文(1991, Biotherapy 3:87-95); Tolstoshevの論文(1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596); Mulliganの論文(1993, Science 260:926-932);並びにMorganおよびAndersonの論文(1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217); Mayの論文(1993, TIBTECH 11(5):155-215)を参照された。使用可能な組換えDNA技術の、当技術分野で一般に知られている方法は、Ausubelら(編), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York ;およびKriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, New Yorkに記載されている。かかる方法はいずれも、本発明のpiggyBac様核酸を送達するために使用可能である。
【０１２７】
プロモーターに機能し得るように連結された、piggyBac様核酸、例えば、piggyBac様トランスポゾンを含む核酸および／またはpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列の、患者への送達は、直接的であっても（この場合、患者は核酸または核酸を運ぶベクターに直接曝される）、間接的であってもよい（この場合、まず細胞をin vitroでpiggyBac様核酸で形質転換し、その後、患者に移植する）。これらの２つのアプローチはそれぞれin vivo遺伝子療法またはex vivo遺伝子療法として知られている。
【０１２８】
特定の実施態様では、核酸を直接in vivo投与し、そこで発現して、コードされている産物を産生する。これは、例えば、適当な核酸発現ベクターの一部として構築し、例えば、欠陥若しくは弱毒レトロウイルスまたは他のウイルスベクターを用いた感染によりそれを投与して細胞内に入れることによるか（米国特許第4,980,286号を参照されたい）、または裸のDNAの直接注入によるか、または微粒子衝撃の使用によるか（例えば、遺伝子ガン; Biolistic, Dupont)、または脂質若しくは細胞表面受容体若しくはトランスフェクト剤によるコーティング、リポソーム、微粒子若しくはマイクロカプセル封入、または受容体媒介エンドサイトーシスを受けるリガンドと連結して投与する（例えば、WuおよびWuの論文(1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432)を参照されたい）（その受容体を特異的に発現する細胞種を標的とするために使用できる）など、核に入ることが知られているペプチドと連結して投与することによるなど、当技術分野で公知の多くの方法のいずれかにより達成することができる。別の実施形態では、そのリガンドがエンドソームを妨げる融合性ウイルスペプチドを含む核酸-リガンド複合体を形成し、核酸にリソソーム分解を避けさせることができる。さらに別の実施態様では、特異的受容体を標的化することにより、核酸を細胞特異的な取り込みおよび発現に関してin vivoで標的化することができる（例えば、1992年4月16日付けのPCT国際公開WO92/06180(Wuら); 1992年12月23日付けのWO92/226353(Wilsonら); 1992年11月26日付けのWO92/20316(Findeisら); 1993年7月22日付けのWO93/14188(Clarkeら); 1993年10月14日付けのWO93/20221(Young)を参照されたい）。あるいは、核酸は、相同組換えにより、発現のための宿主細胞に細胞内導入し、そのDNA内に組み込むことができる(KollerおよびSmithiesの論文(1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935); Zijlstraらの論文(1989, Nature 342:435-438))。
【０１２９】
特定の実施態様では、piggyBac様核酸を含むウイルスベクターを用いる。例えば、レトロウイルスベクターを使用することができる(Millerらの論文(1993, Meth. Enzymol. 217:581-599)を参照されたい)。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのパッケージングおよび宿主細胞DNAへの組み込みに必要のないレトロウイルス配列を削除して改変されている。遺伝子療法に使用されるpiggyBac様核酸をベクターにクローニングすると、その遺伝子の患者への送達が補助される。レトロウイルスベクターに関してさらに詳しいことはBoesenらの論文(1994, Biotherapy 6:291-302)に見出すことができる。遺伝子療法におけるレトロウイルスベクターの使用を示す他の参照文献としては、Clowesらの論文(1994, J. Clin. Invest. 93:644-651); Kiemらの論文(1994, Blood 83:1467-1473); SalmonsおよびGunzberg, 1993, Human  Gene Therapy 4:129-141);並びにGrossmanおよびWilson, 1993, Curr. Opin., in genetics and Devel. 3:110-114)がある。
【０１３０】
遺伝子療法に使用可能なウイルスベクターとしてはアデノウイルスがある。アデノウイルスは呼吸器上皮に遺伝子を送達するのに特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルスは本来呼吸器に感染し、そこで軽度の疾患を起こす。アデノウイルスに基づく送達系の他の標的としては肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉がある。アデノウイルスは非分裂茶房に感染し得るという利点がある。KozarskyおよびWilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503は、アデノウイルスに基づく遺伝子療法の総説を示している。Boutらの論文(1994, Human Gene Therapy 5:3-10)は、アカゲザルの呼吸器上皮へ遺伝子を導入するためのアデノウイルスベクターの使用を実証している。遺伝子療法におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Rosenfeldらの論文(1991, Science 252:431-434); Rosenfeldらの論文(1992, Cell 68: 143-155);およびMastrangeliらの論文 (1993, J. Clin. Invest. 91:225-234)に見出すことができる。
【０１３１】
アデノ随伴ウイルス(AAV)も又、遺伝子療法における使用が提案されている(Walshらの論文(1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300)）。
遺伝子療法の別のアプローチとしては、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染などの方法により、組織培養細胞にpiggyBac様核酸を導入することを含む。通常、導入法は、それらの細胞への選択マーカーの導入を含む。次に、これらの細胞を、導入遺伝子を取り込み、発現する細胞を単離するための選択下に置く。その後、これらの細胞を患者に送達する。
【０１３２】
この実施態様では、piggyBac様核酸は、得られた組換え細胞のin vivo投与の前に細胞に導入する。かかる導入は、限定されるものではないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、その核酸配列を含むウイルスまたはバクテリオファージベクター感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子導入、マイクロセル媒介遺伝子導入、スフェロプラスト融合などをはじめとする当技術分野で公知のいずれかの方法により行うことができる。当技術分野では、外来遺伝子を細胞に導入する多くの技術が知られており（例えば、LoefflerおよびBehrの論文(1993, Meth. Enzymol. 217:599-618); Cohenらの論文(1993, Meth. Enzymol. 217:618-644); Clineの論文(1985, Pharmac. Ther. 29:69-92)を参照されたい）、レシピエント細胞の必要な発達および生理機能が妨げられない限り、本発明に従って使用可能である。この技術は細胞に対する核酸の安定な導入を提供するものでなければならず、その結果、その核酸が細胞により発現可能であり、好ましくはその細胞子孫により伝達可能であり、かつ、発現可能である。
【０１３３】
得られた組換え細胞は当技術分野で公知の種々の方法によって患者に送達することができる。好ましい実施形態では、上皮細胞が、例えば皮下注射される。別の実施形態では、組換え皮膚細胞が患者に対する皮膚移植片として適用され得る。組換え血液細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）が好ましくは静脈投与される。使用のために考えられる細胞量は、所望の効果、患者の状態などによって異なり、当業者ならば決定することができる。
【０１３４】
遺伝子療法の目的でpiggyBac様核酸が導入可能な細胞としては所望のいずれの利用可能な細胞種も包含し、限定されるものではないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、繊維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Tリンパ球、Bリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球など血液細胞；様々な幹細胞または前駆細胞、特に、造血幹細胞または前駆細胞、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などから得られるものが挙げられる。
【０１３５】
（5.14.piggyBac様トランスポゾンによってコードされるタンパク質）
本明細書に述べられるように、本発明のpiggyBac様トランスポゾンは、核酸が有している様々な核酸を対象に送達するのに有用である。さらに、エンハンサートラッピングなどの特定の適用では、これらのトランスポゾンは通常マーカー遺伝子を有する。さらに他の態様では、piggyBac様トランスポゾンは、標的細胞または生物のゲノムに形質を改変するヌクレオチド配列、選択マーカーなどを有し得る。本発明のpiggyBac様トランスポゾンが有するかかる核酸の例を下記に示す。
【０１３６】
遺伝子欠陥に基づく病態の治療または予防に用いられる特定の治療用遺伝子としては、次の生成物を挙げることができる：因子IX、β-グロビン、低密度タンパク質受容体、アデノシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、スフィンゴ実エリナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、嚢胞性繊維症トランスメンブラン受容体、α-アンチトリプシン、CD 18、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノスクシネートシンセターゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、分枝鎖α-ケト酸デヒドロゲナーゼ、フマリルアセトアセテートヒドロラーゼ、グルコース6-ホスファターゼ、α-L-フコシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、α-L-イブロニダーゼ、ガラクトース1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、インスリン、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン、凝固因子VII、ウシ成長ホルモン、血小板由来増殖因子、凝固因子VIII、トロンボポエチン、インターロイキン-1、インターロイキン(interluekin)-2、インターロイキン-1RA、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、繊維芽細胞増殖因子、神経突起伸長因子、顆粒球コロニー刺激因子、L-アスパラギナーゼ、ウリカーゼ、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、スクラーゼ、カルシトニン、Ob遺伝子産物、グルカゴン、インターフェロン、トランスフォーミング増殖因子、繊毛神経突起トランスフォーミング因子、インスリン様増殖因子-1、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、脳由来神経突起因子、インスリントロピン、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、アデノシンデアミダーゼ、カルシトニン、アルギナーゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、γ-インターフェロン、ペプシン、トリプシン、エラスターゼ、ラクターゼ、内因子、コレシストキニン、およびインスリン向性ホルモンなどをコードする遺伝子である。
【０１３７】
本方法によって送達され得る癌治療遺伝子としては、リンパ球の抗腫瘍活性を増強する遺伝子、その発現産物が腫瘍細胞の免疫原性を増強する遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、毒素遺伝子、自殺遺伝子、多剤耐性遺伝子、アンチセンス配列などが挙げられる。
【０１３８】
本発明のpiggyBac様トランスポゾンが有するマーカー遺伝子配列は酵素、エピトープを含むタンパク質またはペプチド、受容体、輸送体、tRNA、rRNA、または生物発光分子、化学発光分子若しくは蛍光分子であり得る。特定の実施態様では、該マーカーは緑色蛍光タンパク質(GFP)または蛍光波長が改変されているか、蛍光が増強されているか、またはその双方である突然変異GFPなどのその突然変異体である。ある特定の実施態様では、該突然変異GFPは、青色GFPである。この実施態様の他の様式では、該蛍光分子は赤色蛍光タンパク質（第6節を参照されたい）または黄色蛍光タンパク質である。さらに他の実施態様では、該マーカーはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、β-ガラクトシダーゼ(lacZ)、およびルシフェラーゼ(LUC)である。
【０１３９】
家畜を使用する場合、該piggyBac様トランスポゾンは、例えばトランスジェニック動物の成長を促進するため、インスリン様増殖因子(IGF)などの成長ホルモンに関する配列を有し得る。他の家畜使用では、piggyBac様トランスポゾンが有する導入遺伝子は疾病に対してより大きな耐性を提供し得る。
【０１４０】
本発明のpiggyBac様トランスポゾンにはいくつかのマーカー遺伝子を挿入することができ、限定されるものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wiglerらの論文(1977, Cell 11:223))、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(SzybalskaおよびSzybalskiの論文(1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026))、並びにアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowyらの論文(1980, Cell 22:817)遺伝子が挙げられ、これらの遺伝子はそれぞれtk-、hgprt-またはaprt-細胞において使用可能である。又、代謝拮抗物質耐性も、メトトレキサート耐性を付与するdhfr(Wiglerらの論文(1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567)；O'Hareらの論文(1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527)); ミコフェノール酸耐性を付与するgpt(MulliganおよびBergの論文(1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072))；アミノグリコシドG-418耐性を付与するneo(Colberre-Garapinらの論文(1981, J. Mol. Biol. 150:1))；ハイグロマイシン耐性を付与するhygro(Santerreらの論文(1984, Gene 30:147))；細胞にトリプトファンの代わりにインドールを利用可能とするtrpB；細胞にヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用可能とするhisD(HartmanおよびMulliganの論文(1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047))；並びにオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤である2- (ジフルオロメチル)-DL-オルニチン、DFMO耐性を付与するODC（オルニチンデカルボキシラーゼ）(McConlogue, L.の論文(1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory編))の選択の基礎として使用可能である。
【０１４１】
（5.15.piggyBac様トランスポゾンが有する非コード配列）
それに加えて、またはその代わりに、ORF、本発明のpiggyBac様トランスポゾンは又、核酸と結合し、および／または核酸を改変するタンパク質により認識される少なくとも１つの配列を含み得る。特定の実施態様では、該タンパク質はDNA結合タンパク質、DNA改変タンパク質、RNA結合タンパク質、またはRNA改変タンパク質である。
【０１４２】
ある特定の実施態様では、該配列は、制限エンドヌクレアーゼにより認識されるもの、すなわち、制限部位である。様々な制限部位が当技術分野で知られ、例えば、次の制限酵素：HindIII、PstI、SalI、AccI、HincII、XbaI、BamHI、SmaI、XmaI、KpnI、SacI、EcoRIなどにより認識される部位が挙げられる。
【０１４３】
他の特定の実施態様では、該配列は、FLPリコンビナーゼ（すなわち、該配列はFRTである）またはCREリコンビナーゼ（すなわち、該配列はloxPである）などの部位特異的リコンビナーゼの標的部位である。かかる実施態様は、第5.7節に記載されているように、モザイク動物を作出するのに有用である。
【０１４４】
（5.16.本発明の獣医学的使用および畜産使用）
本方法および組成物は、疾病若しくは障害を治療若しくは予防するため、または家畜の品質を改良するために獣医学的用途として非ヒト度津物に使用することができる。
特定の実施態様では、該非ヒト動物は家庭内ペットである。別の特定の実施態様では、該非ヒト動物は家畜である。好ましい実施形態では、該非ヒト動物は哺乳類、最も好ましくは、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ミンク、またはモルモットである。別の好ましい実施形態では、該非ヒト動物は家禽種、最も好ましくは、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、またはウズラである。
【実施例】
【０１４５】
（6.実施例）
（6.1.導入）
転位可能なエレメントは、トランスジェニック動物の作出および挿入突然変異誘発をはじめとする、下等生物の遺伝子操作のための手段として慣例的に使用されてきた。これに対し、マウスおよび他の脊椎動物系におけるトランスポゾンの利用は、効率的なトランスポゾン系がないためにまだ限られたものである。本発明者らは、キャベツにつく蛾、イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)由来のDNAトランスポゾンであるpiggyBacの、哺乳類系において転位する能力を調べ、複数の遺伝子を運ぶpiggyBacエレメントがヒトおよびマウス細胞系統でもマウスでも、効率的に転位し得ることを見出した。本明細書に示されているデータは、生殖細胞系転位の際にpiggyBacエレメントが元の挿入部位から正確に切り取られ、マウスゲノムの多様な位置、好ましくは転写単位に転位し、そのトランスポゾンによって運ばれるマーカー遺伝子の発現を可能とすることを見出した。これらのデータは、マウスおよび他の脊椎動物において、遺伝子導入および挿入突然変異誘発を含む様々な遺伝子操作のための高効率トランスポゾン系に向けての重要なステップとなる。
【０１４６】
（6.2.材料および方法）
（6.2.1.プラスミドの構築）
PB[SV40-neo］：pSLfa1180fa(HornおよびWimmerの論文(2000, Dev Genes Evol 210, 630-637))のBamHI-KpnI断片をpCLXSN(IMGENEX)由来のBamHI-KpnI断片に置換した。次に、このネオマイシンカセットをAscIで切断し、pBac{3xP3-EGFPafm}のAscI部位に挿入した(HornおよびWimmerの論文(2000, Dev. Genes Evol. 210:630-637))。
【０１４７】
CMV-PBアーゼ：piggyBacトランスポゼースのコード配列を、プライマーBacEN-F(5'-GCCACCATGGGATGTTCTTTAG-3 ')(配列番号1)およびBacEN-B(5'-GTACTCAGAAACAACTTTGGC-3')(配列番号2)を用い、phsp-Bac(HandlerおよびHarrellの論文(2001, Insect Biochem Mol Biol 31:199-205)) からPCR増幅し、pSLfa1180faのSpeIおよびSphI部位にクローニングし、pSL-BacENを作出した。このトランスポゼース遺伝子を含むHindIII-EcoRI断片をpSL-BacENから単離し、pcDNA4/HisA(Invitrogen)に挿入し、最終構築物を作出した。
【０１４８】
PB[PGK-neo]：pPNT(Tybulewiczらの論文(1991, Cell 65:1153- 1163))由来のPGK-neo遺伝子を改変piggyBac構築物pBac-ABのBglII部位にクローニングし、PB[PGK-neo]を作出した。
【０１４９】
PB[Act-RFP]：pCX-EGFP(Okabeらの論文(1997, FEBS Lett 407:313-319))の0.7kb EcoRI断片をmRFP(Campbellらの論文(2002, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 99:7877-7882))のコード配列に置換し、pCX-RFPを作出した。完全なRFP発現カセットを含むpCX-RFPのSalI-BamHI断片をさらに、pBac-ABのBglII部位にクローニングし、PB[Act-RFP]を作出した。ポリリンカーを付加し、複数の独特なクローニング部位を有するユニバーサルPBベクターPB[Act-RFP]DSを作出した。
【０１５０】
Prm1-PBアーゼ：pPrm1-SB10(Fischerらの論文(2001, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 98:6759-6764))由来のPmr-1プロモーターおよびBamHI-SalI断片をpSL-BacENのHindIII部位およびBamHI-XhoI部位にそれぞれクローニングし、この精巣特異的転位可能ヘルパープラスミドを作出した。
【０１５１】
Act-PBアーゼ：NheI-NotIリンカーを用い、pCX-EGFPのEcoRI断片をpSL-BacENのSpeI-EagIトランスポゼース断片に置換し、この偏在発現するトランスポゼースヘルパープラスミドを作出した。 
【０１５２】
PB[K14-Tyr：plnK14-アルビノ(Saitouらの論文(1995, Nature 374:159-162))中のK14プロモーターのSmaI断片、RT-PCRにより129Svマウスの皮膚サンプルから増幅したチロシナーゼcDNA、およびSV40ポリAをpBac-ABのBglII部位に挿入し、PB[K14-Tyr]を挿入した。
【０１５３】
PB[K14-Tyr, Act-KFP]：pCX-RFP由来のSalI-BamHI断片をPB[K14-Tyr]のAscI部位にクローニングし、この構築物を作出した。
【０１５４】
PB[Act-RFP, MCK-TSC1]：RFP発現カセットと左末端(piggyBacL)からなるPB[Act-RFV]由来のSmaI断片を用い、pBluescriptのSalI-EcoRV断片を置換し、pBS-BLRFPを作出した。次に、右末端(PBR)からなるPB[Act-RFP]のSmaI-EcoRV断片をpBS-BLRFPのPmeI部位にクローニングし、piggyBacに基づくトランスジェニックベクターとして役立つPB［Act-RFP]を作出した。MCK-TSC1構築物のBssHII断片(Inokiらの論文(2002, Nat. Cell Biol. 4:648-657))とhGHポリA(Nguyenらの論文(1998, Science 279:1725-1729))をPB[Act-RFP]DSのSwaI部位にクローニングした。
【０１５５】
（6.2.2.細胞トランスフェクション）
293細胞を、10%血清を添加したDMEM(GIBCO/BRL)中、37℃、5%CO2下で培養した。トランスフェクション１日前に24ウェルプレートの各ウェルに1.5x105細胞を播種した。各ウェルで、試験群としては0.5μg環状PB[SV40-neo]および0.5μg環状CMV-PBアーゼを、または対照群としては0.5μg環状pcDNA4/HisAを、リポフェクトアミン2000により標準的なプロトコール(Invitrogen)に従ってトランスフェクトした。トランスフェクション１日後、各ウェルの細胞をトリプシン処理し、10cmプレート１個の、500mg/ml G-418(GIBCO/BRL)を含む培地に播種した。薬剤選択は２週間続けた。
【０１５６】
W4/129S6マウス胚幹(ES)細胞の培養およびエレクトロポレーション条件は製造業者が奨励するプロトコール(Taconic)に記載されいている。試験群としては24μgの環状PB[PGK-neo]および6μgのAct-PBアーゼ、または対照群としては6 μgのニシン精子DNA(Promega)を、1x107細胞のエレクトロポレーションに用いた。エレクトロポレーション(eletroporation)後すぐに各ウェルの細胞を、マイトマイシンCで処理したマウス胚繊維芽フィーダー細胞を含む３つの10cmプレートに播種した。エレクトロポレーション48時間後に、200mg/ml G-418を含む培地で選択を開始した。薬剤選択は２週間続けた。
【０１５７】
薬剤選択の終了時に、細胞を、4%パラホルムアルデヒドを含むPBSで10分間固定し、その後、0.2%メチレンで1時間染色した。脱イオン水で十分洗浄した後、クローンを計数した。
【０１５８】
（6.2.3.PCRおよび配列解析）
ゲノムDNAのHaeIIIまたはMspI消化物を逆PCR 用の鋳型として用いるため自己連結させた。piggyBacトランスポゾンの左側のフランキング配列を再生するために用いたプライマーは、LF1(5'-CTT GAC CTT GCC ACA GAG GAC TAT TAG AGG-3')(配列番号3)およびLR1(5'-CAG TGA CAC TTA CCG CAT TGA CAA GCA CGC-3')(配列番号4)であった。piggyBacトランスポゾンの右側のフランキング配列を再生するために用いたプライマーは、RF1(5'-CCT CGA TAT ACA GAC CGA TAA AAC ACA TGC-3')(配列番号5)およびRR1(5'-AGT CAG TCA GAA ACA ACT TTG GCA CAT ATC-3')(配列番号6)であった。
【０１５９】
切断部位のPCR検出は、プライマーEL1(5'-CCA TAT ACG CAT CGG GTT GA-3')(配列番号7)およびプライマーER1(5'-TTA AAG TTT AGG TCG AGT AAA GCG C-3')(配列番号8)を用いて行った。
ＰＣＲ産物を、その後の配列決定のため、pGEM-Tベクター(Promega)にクローニングした。配列決定の結果をNCBI BLAST検索(www.ncbi.nlm.nih.gov)、およびをヒトまたはマウスゲノムデータベース(www.ensembl.org)を用いて解析した。
【０１６０】
PB挿入挿入事象のさらなる配列向性を検出するため、マウスにおいてTTAA標的部位の5塩基対上流および下流を100のpiggyBac挿入に関して解析した。同時に、無作為に選択した100箇所のTTAA部位を対照として解析した。STATISTICA 6.0を用い、２つの割合の間の片側確率を算出した。
【０１６１】
（6.2.4.トランスジェニックマウスの作出）
環状piggyBac供与構築物をヘルパープラスミドと2:1の比率で混合した。混合したDNAサンプル(2ng/μl)を記載されているように(Nagyらの論文(2003, Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual, 第3編, Cold Spring Harbor Laboratory Press))、受精したFVB/Nj卵母細胞にマイクロインジェクションした。
【０１６２】
（6.2.5.サザンブロット）
ゲノムDNAを尾のサンプルから単離し、EcoRVおよびBglIIで消化し、その後、0.7%アガロースゲルで分画した後、サザン解析を行った。プローブはPB[Act-RFP]のSacII消化の499bp断片であった。
【０１６３】
（6.3.結果）
（6.3.1.培養哺乳類細胞におけるpiggyBacの転位活性）
組織培養細胞においてpiggyBac媒介型の染色体組み込み事象を検出するため、ドナープラスミドとヘルパープラスミドの双方からなる２元コトランスフェクションアッセイを設計した。このドナープラスミドは、piggyBacトランスポゼース(PBアーゼ)を薬剤選択マーカーで置換したpiggyBacエレメントを含んでいた(図1A)。ヘルパープラスミドは、トランスポゼース断片を運ぶが、転位に必要な末端配列を欠いていた(図1B)。ヘルパープラスミドの不在下では、ドナープラスミドはゲノムに無作為に組み込まれ得るが、このプラスミドが環状形態で維持されれば、これらの無作為な組み込み事象は最小となり得る。よって、ヘルパープラスミドの存在下での薬剤耐性クローンの増加は転位事象を示唆する。
【０１６４】
本発明者らはヒト293細胞におけるpiggyBac転位を調べた。SV40プロモーターにより駆動されるネオマイシン耐性(neo)遺伝子を運ぶドナーPB[SV40-neo]エレメントと偏在発現性のトランスポゼースを運ぶヘルパーCMV-PBアーゼを同時トランスフェクションすると(図1)、ドナープラスミド単独でトランスフェクションした場合よりも10倍多いネオマイシン耐性クローンが得られた(図2A)。このドナーの組み込みの上昇が転位によるものかどうかを調べるため、逆PCRを行い、組み込まれたPB[SV40-neo］のpiggyBac右逆方向末端反復配列(PBR)部位に隣接する配列を再生した(図1A)。真の転位事象から得られたPCR産物は、プラスミド配列ではなくPBR の外側のゲノム配列を生じなければならない。18の独立したゲノム配列を薬剤耐性クローンから再生した。これらの配列は全て、組み込み部位に特徴的なTTAAを含んでいた(表2)。
【０１６５】
【表２】
2008545375.tif 000003
【０１６６】
TTAAの倍加は他方のトランスポゾン末端におけるいくつかの連結部合断片を配列決定することにより確認した（データは示されていない）。これに対し、PB[SV40-neo]単独で安定的にトランスフェクトされたネオマイシン耐性クローンの逆PCR解析では、無作為な挿入事象と一致する連結プラスミド配列が検出された（データは示されていない）。この実験は、昆虫細胞と同じ部位向性を有するヒト細胞でpiggyBac転位が起こったことを実証した。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞およびMv1Lu細胞（乳汁起源）でこの同時トランスフェクション法を行った場合にも同様の結果が得られた（図7参照）。
【０１６７】
本発明者らはマウスW4/129S6胚幹(ES)細胞におけるpiggyBacの転位能を調べた。この試験では、PGKプロモーターにより駆動されるneo遺伝子を運ぶドナープラスミドとヘルパープラスミドAct-PBアーゼPB[PGK-neo]エレメントは、ハイブリッドアクチンプロモーターの制御下でpiggyBacトランスポゼースを提供した(図1B)。３回の反復トランスフェクション実験において、PB[PGK-neo]およびAct-PBアーゼの同時トランスフェクションにより、PB[PGK-neo]トランスフェクション単独よりも平均で50倍多い薬剤耐性クローンが得られた(図2Bおよび2C)。逆PCR解析により、増強されたクローン生産が転位によるものであったことが確認された(表3)。
【０１６８】
【表３】
2008545375.tif 000004
【０１６９】
ミンク、ハムスター、ラット、サル、ヒトおよびニワトリをはじめとする起源の異なる様々な細胞系統で同時トランスフェクション法を行った場合にも同様の転位結果が得られた（図8参照）。
【０１７０】
（6.3.2.マウス生殖細胞系において効率的なpissvBac転位）
マウスES細胞における効率的な転位は、マウス生殖細胞系におけるpiggyBac転位の実現可能性を本発明者らに試験するに至らせた。トランスジェニックマウスを作出するため、トランスポゾンドナープラスミドとトランスポゼースヘルパープラスミドの前核同時注入を行った。トランスジェニックマウスにおける転移の解析を容易にするため、本発明者らはドナープラスミドにおいて薬剤耐性マーカーの代わりに可視マーカー（赤色蛍光タンパク質，RFP）を用いた。ドナーPB［Act-RFP]エレメントとヘルパープラスミドAct-PBアーゼをFVB/Njマウス胚塩基の前核に環状形態で同時注入した。PCR解析を行ったところ、創始系統の34.8%(62/184)がPB[Act-RFP]一重陽性であり、0.5%(1/184)がAct-PBアーゼ一重陽性であり、2.7%(5/184)が二重陽性であったことが示された。これに対し、PB[Act-RFP]単独で注入を行った場合、子孫の10.4%(10/96)のみが陽性であった。皮膚の色素沈着に影響を及ぼす違うマーカー遺伝子チロシナーゼを有するより長いPBエレメント、PB[K14-Tyr]を同じヘルパー構築物とともに同時注入した場合にも同様の結果が得られた（図1および図3A）。
【０１７１】
RFP陽性創始系統において組み込まれた導入遺伝子の構造を解析するため、トランスポゾン特異的プローブとサザンハイブリダイゼーションを行った(図1A)。創始系統の大多数が複数の組み込みを有していた(図3B)。次に、本発明者らは、トランスポゾン末端をフランキングするゲノム配列を再生するために逆PCRを行った。42のRFP陽性創始系統から、全部で85の転位事象が再生された(表4)。
【０１７２】
【表４】
2008545375.tif 000005
2008545375.tif 000006
2008545375.tif 000007
2008545375.tif 000008
【０１７３】
これらの転位の大部分を、組み込まれたランスポゾンの右末端反復配列をフランキングするゲノム配列に従い、マウスゲノムにマッピングした。本発明者らは無作為に9つの転位事象を選択し、そのトランスポゾンの反対側にあるゲノム連結部配列を増幅させた。各場合で、トランスポゾン挿入は組み込み部位の正確なTTAA倍加をもたらすことが分かった（データは示されていない）。これらの結果は、同時注入から生じた導入遺伝子組み込みののほとんどが転位によるものであったことを示す。
【０１７４】
組み込まれたトランスポゾンの、生殖細胞系による伝達能を調べるため、PB[Act-RFP]陽性であるが、ヘルパープラスミド陰性のいくつかの創始系統を野生型FVB/Njマウスと交配させてトランスジェニック系統を作出した。8つのPB[Act-RFP]組み込みを有する１つの創始系統(AF0-61)を詳細に解析した。PCRに基づくジェノタイピングを行ったところ、この創始系統の子孫16個体のうち15個体がトランスポゾンDNAを保持していたことが示された。PCR陽性個体のサザン解析を行ったところ、それらが全て少なくとも１コピーの転位PB[Act-RFP]を受け継いでいたことを示した（図3C、データは示されていない）。これらの導入遺伝子は無作為に分離するが、このことは創始系統の最初の転位事象の多様な染色体分布を示唆した。単一のトランスポゾンを運ぶ第二の創始系統(AF0-47)の子孫解析を行ったところ、１回の同腹子内のF18個体中2個体がトランスポゾンを受け継いでいたことを示した（3C、データは示されていない）。いくつかの個々のトランスポゾン組み込み部位を標的とするプライマーを用いたPCRに基づくジェノタイピングを行ったところ、創始系統からF1世代に組み込まれたトランスポゾンの安定な遺伝が確認された（データは示されていない）。これらのことを考え合わせると、高頻度の転位媒介遺伝子組み込みおよび組み込まれた導入遺伝子の、生殖細胞系による伝達能は、マウスにおける遺伝子導入手段としてのpiggyBacエレメントの使用の実現可能性を実証するものである。
【０１７５】
（6.3.3.マウス生殖細胞系におけるpiggyBacの正確な切断と転位）
本発明者らはさらに、「ジャンプスターター」および「ミューテーター」原種の従来の育種戦略を用い、マウス生殖細胞系におけるpiggyBacの転位挙動を調べた(Cooleyらの論文(1988, Science 239:1121-1128; Hornらの論文(2003, Genetics 163:647-661))。この手順において、非自律的トランスポゾンを有するミューテーター系統を、雄生殖細胞系でトランスポゼースを発現するジャンプスターターと交配させる。有効な転位は、トランスポゾンとトランスポゼースDNAの双方を有する雄の生殖細胞でもっぱら起こると考えられる。次に、これらの雄を野生型の雌と交配させ、新たなトランスポゾン挿入を有する系統を作出する。本発明者らはこの手順を修正し、非自律的トランスポゾンとヘルパートランスポゼース遺伝子に関して二重に陽性のマウスを直接作出するための同時注入法を用いた。同じ遺伝子座におけるドナープラスミドとヘルパープラスミドの双方の同時組み込みを確保する線状プラスミドの従来の前核注入によりトランスジェニック動物を作出した。PB[Act-RFP]とプロタミン1(prm1)プロモーター駆動型のpiggyBacトランスポゼース導入遺伝子(Prm1-PBアーゼ)の双方を有する数系統のトランスジェニックマウスを作出した。このprm1プロモーターは精子形成中は活性であると考えられる(O'Gormanらの論文(1997, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 94:14602-14607))。よって、かかる二重陽性トランスジェニック系統では、雄マウスは新しい転位事象をもたらすと考えられるが、雌マウスは原原種として使用可能である。
【０１７６】
これらの二重トランスジェニック系統のうちBF0-33と呼ばれる１系統の子孫における転位を調べた。トランスポゾン特異的プライマーとのサザンハイブリダイゼーションを行ったところ(図1A)、67.8%(19/28)のトランスポゾン陽性子孫において新たなトランスポゾン組み込みが明らかになった（図4A、データは示されていない）。１配偶子当たり平均1.1の新たな挿入が起こっていた。これらの新たな挿入のうち３つの配列決定を行ったところ、別の３つの染色体（表４のBF1-29T6、BF1-30T43、およびBF1-44T10）に位置していることが分かったことから、これらの新たな挿入は局部的なものではないと思われる。
【０１７７】
トランスポゾンにフランキングするPB[Act-RFP]プラスミド配列を標的とするプライマーを用い、生殖細胞系におけるpiggyBacの転位挙動を探索した(図4B)。piggyBacが切り貼りの様式で転位していたとしたら、273bpのPCR産物が検出される。実際、BF0-33系由来の子孫17個体のうち10個体でこのPCR産物が検出された(図4C)。これらのサンプルのいくつかを配列決定したところ、１つのTTAA標的部位の存在が明らかなになり（データは示されていない）、このことはマウスの雄生殖細胞系において正確な切り貼り機構によりpiggyBacが転位したことを証明している。この創始系統は導入遺伝子アレイを有していたことから、いくつかの転位事象（図4B-Cの子孫BF1-30およびBF1-32）はこの273bpの産物の検出を伴っていないと考えられた。
【０１７８】
（6.3.4.独特なトランスジェニック手段としてのpiggyBacトランスポゾン系）
転位効率はいくつかのトランスポゾンの長さが増すにつれ有意に低下することがこれまでに示されているが、これは遺伝学的手段としての有用性を損なう。例えば、Hela細胞では、SBトランスポゾンは、その元の長さ2.2kbに加えて1kb長さが増すごとに転位効率がおよそ30%低下することが示されている(Izsvakらの論文(2000, J. Mol. Biol. 302:93-102))。マウスにおけるPB転位の大きさの制限を調べるため、4.8〜14.3kbの範囲のいくつかのPBエレメントをトランスジェニックマウスの作出に用いた(図1A)。これらのトランスポゾンはRFPリポーターカセットおよび／または分かれた転写単位を有していた。環状プラスミドにおけるこれらPBエレメントの組み込みを、Act-PBアーゼヘルパープラスミドの不在下および存在下で調べた(図3A)。結果は、PBエレメントが、組み込み効率の有意な低下を伴わずに9.1kbの外来配列を有し得ることを示した。PCR解析を行ったところ、創始系統の83.9%(26/31)で、２つのマーカー遺伝子を有するPB[K14-Tyr, Act-RFP]エレメントの転位事象が存在していることが確認された。ヘルパーにより補助される組み込みは、14.3kbのPB[Act-RFP, MCK-TSC1]エレメントを用いると低下した。11のPB[Act-RFP, MCK-TSC1]陽性創始系統をサザンハイブリダイゼーションおよび逆PCRによって解析したところ、4系統が転位組み込みを有していたことが分かった（表4、データは示されていない）。よって、PBは14kbまでの配列を転位することができる。
【０１７９】
次に、本発明者らは、組み込まれたPBエレメントからの導入遺伝子の発現挙動を評価した。PB[Act-RFP]を有するマウスのうち98%(39/40)がRFPマーカーを発現した。本発明者らの実験では、１コピーのPB[Act-RFP]トランスポゾンであってもUV照射下で目に見える赤いシグナルを生じた(図5A)。これら創始系統のうちのいくつかはモザイク状のRFPシグナルを示したが、この現象は一細胞段階の後の胚発達中の転位によるものである可能性が最も高い(図5B)。RFPとシロしナーゼマーカーの同時発現は、K14プロモーター駆動型のチロシナーゼ遺伝子(K14-tyr)とRFP発現カセットを含む転位PB[K14-Tyr, Act-RFP]を有する創始系統のうち29%(9/31)に見られた(図1A, 5Cおよび5D)。よって、独特なクローニング部位とRFPマーカーを含むPB[Act-RFP]構築物は、ユニバーサルトランスジェニックPBベクターとして役立つ。この２つに分かれた転写単位の同時発現および高頻度の組み込み事象は、PB転位がトランスジェニックマウスを作出するために有効な方法として使用可能であることを示唆する。
【０１８０】
（6.3.5.挿入突然変異誘発手段としてのpiggyBacトランスポゾン系）
脊椎動物における挿入突然変異誘発手段としてのPBの実現可能性を調べるため、本発明者らはマウスにおいて作出された104の転位事象を評価した(表3)。まず、TTAA配列を、１つを除く全てのPB組み込み部位で発見した。次に、本発明者らは、このTTAA組み込み部位にフランキングするゲノム配列とマウスゲノムで無作為にサンプリングしたTTAA部位と比較し、核TTAA配列を取り巻いてTとAが豊富であることを見出した(図6A)。これは昆虫で見られた組み込み部位と同様(Liらの論文(2005, Insect Mol Biol. 14(1): 17-30))。最後に、これらの転位部位のゲノム位置をEnsemblマウスゲノムデータベースに対して解析した。これらの部位のうちいくつかは、データベース中に繰り返し配列や配列ギャップが存在するためにマッピングできなかったが、93箇所の転位組み込み部位の正確な位置が決定された(表4, 図6E)。これらの転位部位間には広範な染色体分布が見られた。２つ（染色体19と染色体Y）を除く全てのマウス染色体がPB転位による作用を受けた(図6E)。
【０１８１】
全ての転位部位のうち67%(70/104)が既知の、または推定される転写単位にマッピングされた。これらの組み込みのうち、約97%(68/70)がイントロンに作用し、3%(2/70)がエキソンに作用した(図6B)。解析から未確認（すなわち、推定）遺伝子およびESTを除いても、転写単位内の組み込みのパーセンテージはやはり高かった(48%(50/104))。さらに、「遺伝子間」転位の40%超が50Kbの既知の遺伝子またはEST内にマッピングされた(図6Cおよび6D)。転写単位の5'末端および3'末端における調節領域に関する任意の閾値として10Kb間隔を設定した場合、PB転位により作用を受ける遺伝子の頻度は、既知の、または推定される転写単位では約80%(83/104)であった(図6B)。この広い染色体分布と転写単位中への転位の向性は、ゲノム全域遺伝子スクリーンのために極めて有効な突然変異誘発因子としてPBエレメントを使用できることを示す。
【０１８２】
全128の新たな挿入に関してさらなる検討を行ったところ、112が全染色体にわたって転写単位に位置していることが示された。これらトランスポゾンのうち5つはエキソンにマッピングされ、63はイントロンにマッピングされる。
【０１８３】
（6.4.考察）
本発明者らは、PBエレメントがマウスおよびヒト細胞において活発に転位し得ることを示した。PB転位は、12種を超える異なる昆虫種において転位可能な唯一の既知のトランスポゾンであり、他のトランスポゾンよりも宿主因子への依存性が小さいと考えられてきた(Handlerの論文(2002, Insect Biochemistry & Molecular Biology 32:1211-1220; Sumitaniらの論文(2003, Insect Biochem. Mol. Biol. 33:449-458))。PBは昆虫と哺乳類の双方において有効に転位し得るという事実は、このトランスポゾン系が無脊椎動物と脊椎動物の双方における遺伝学的研究に広い適用を持ち得ることを示す。このことはさらに、PBエレメントの転位機構は、非常に限定された種でしか機能しない天然に存在する他のトランスポゾンとは著しく異なり得ることを示唆している。
【０１８４】
（6.4.1.遺伝子導入の手段としてのpiggyBac）
本発明者らの研究により、PBがトランスジェニックマウスを作出するため、又、おそらくは他のトランスジェニック脊椎動物を作出ための実用的手段であることが示唆される。第一に、PBはマウス生殖細胞系に高効率で導入することができる。ヘルパープラスミドとドナープラスミドの前核同時注入により、その生殖細胞系にドナープラスミドが組み込まれた30%を超えるドナーが得られる。第二に、このアプローチは１コピーの組み込み導入遺伝子を生じる。ほとんど場合、マウスへの従来の線状DNAの前核注入により、導入遺伝子コンカテマーが形成される(Nagyら, 2003, Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual, 第3編(Cold Spring Harbor Laboratory Press))。本発明者らは、個々のトランスポゾン組み込み部位は逆PCRにより迅速に定義することができることを示した。よって、組み込まれた導入遺伝子に対するクロマチン環境の効果を評価することができる。第三に、PBエレメントは、それが運ぶ導入遺伝子の発現を可能とする。予測されるトランスジェニック発現パターンを示すマウスの全頻度を従来のトランスジェニック実験と比較することができる。最後に、本発明者らの結果は、PBが転位頻度に有意な低下を伴わずに9.1kbまでの導入遺伝子を運び得ることを示す。14.3kbといった大きな導入遺伝子でも転位が見られ、これによりレトロウイルスベクターが運ぶものよりもはるかに大きな挿入が可能となる。よって、１つのPBエレメントで複数の遺伝子を運ぶことができ、可視マーカーの助けで陽性トランスジェニック動物を同定するなど、複雑なトランスジェニック実験の実施が可能となる。
【０１８５】
（6.4.2.遺伝子機能を解読するゲノミクス手段としてのpiggyBac）
ポストゲノム時代においては、体系的な遺伝子の不活性化が、ゲノムの機能を解読する最も有力なアプローチの１つとなる。このアプローチは、細菌および酵母菌のような単細胞生物、並びにC.エレガンス、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュおよびアラビドプシス(Arabidopsis)などの多細胞生物の研究で上手くいくことが分かった。残念なことに、哺乳類においてゲノム全域の遺伝子を不活性化するために効率的な方法はまだ限られている。ENU突然変異誘発は、マウスにおけるゲノム規模の遺伝子不活性化のために利用可能な数少ない方法の１つであるが、ENUにより誘導された突然変異のマッピングおよびこれらの突然変異により定義される遺伝子のクローニングは通常、労力も時間もかかる(Herronらの論文(2002, Nat. Genet. 30:185-189)）。レトロウイルスにより媒介される挿入突然変異誘発も、マウスゲノムにわたる突然変異を作出するために広く用いられている。この方法で実際に多数の突然変異を作出できるが、これらの突然変異のほとんどはマウスES細胞において作出されるものであり、生きている動物へこれらの遺伝子特異的突然変異を伝達するにはさらに多大な努力を要する。最近では、SBはマウスにおける挿入突然変異誘発に関して検討されている。しかしながら、局部的な飛び移りと転写単位への転位が相対的に低いことにより、幅広い適用が阻まれている。
【０１８６】
これに対し、PBはマウスにおいて劣性突然変異をスクリーニングするための新規かつ魅力的な選択肢となる。マウスの生殖細胞系において十分なPB転位が可能であったことは、このトランスポゾンの挿入突然変異誘発適性を示唆している。PBのいくつかの独特な特性は、マウスにおいて挿入突然変異誘発を大きく助けることができた。挿入突然変異誘発実験の１つの重要な懸念点は、その突然変異が偏り無く、ゲノムのどの遺伝子にも作用し得るかどうかということである。本発明者らの実験では、PBの組み込みがマウスゲノム中に多様な分布を持つことを示したが、これはPBが広く使用されているP-エレメントよりも偏りの少ない様式で遺伝子に作用するこをと示したショウジョウバエでの最近の研究と一致している(Thibaultらの論文(2004, Nat. Genet. 36:283-287))。
【０１８７】
興味深いことに、本発明者らの研究で、転写単位に対するPB転位の高い向性が明らかになった。トランスポゾン組み込みの67%が、既知の、または推定される転写単位内に見られた。転写開始部位および転写終結部位に隣接する調節領域における挿入を含めると、遺伝子におけるPB転位の頻度はいっそう高くなる。マウス真性クロマチン配列の約せいぜい15%だけが遺伝子をコードし、PB転位はコード配列に対して高い選択性を有する。この組み込み特性がPBエレメントにより運ばれるゲノムまたは外来遺伝子の転写化性によって影響を受けるかどうかは明らかでない。しかしながらやはり、この組み込み向性は、PBをゲノム全域の挿入突然変異誘発にとって潜在的に展望のあるものとする。
【０１８８】
ランダム突然変異誘発から得られた突然変異の解析における重要な局面は、突然変異とそれらが生じる表現型の間の関係を照合することである。これは特に、新規な遺伝子の解析において重要である。遺伝子型／表現型相関の照合は通常、突然変異のバックグラウンドに野生型遺伝子を導入し、表現型の「救済」（理想的には、誘導された突然変異の野生型への復帰）を探すことにより行う。遺伝子型／表現型相関を決定する別法として、挿入突然変異を切り出し、表現型の復帰を探すものがある。このように、トランスポゾンの切断能は常に、レトロウイルスベクターを超える重要な利点と考えられている。しかし、ほとんどのトランスポゾンでは、元の部位から切断された後、小さな欠失または挿入が残る。興味深いことに、PBは一般に、切断後に跡を残さず、これにより復帰突然変異体を作出するのに理想的なものとなる。又、この特徴により、複数の転位事象が単一のゲノム内で起こる突然変異誘発の際にゲノムの損傷を引き起こす可能性が低くなる。本発明者らの研究では、PB切断がトランスポゼースの生殖細胞系発現を伴って容易に達成されることが実証された。PBが転位の際に複数の遺伝子を運び得るという事実は、挿入突然変異誘発および表現型同定をはじめとする多くの遺伝子操作に多大な利点をもたらす。これにより、挿入／突然変異、並びにRFPおよびチロシナーゼなどの可視マーカーによって、異系接合性と同系接合性、そして単一突然変異と二重突然変異といった突然変異の状態を追跡することが可能となる。マウスの育種に関わる世代期間の長さと動物飼育コストの高さを勘案すれば、これにより多種の実験にかかるコストが劇的に削減され、いくつかの非現実的な実験の実施も可能となる。
【０１８９】
さらに、挿入突然変異誘発のためのPBトランスポゾンは又、エンハンサー／プロモーター検出、または「遺伝子トラッピング」のためのリポーター遺伝子も運ぶことができ、マウスゲノムの機能注釈の試みに大きな助けとなり、多種の生物学的解析の試薬を提供する。例えば、遺伝子トラップ技術をPB系と併用することができる。遺伝子トラップベクターを運ぶPBトランスポゾンをマウスゲノムに転位させるには、マイクロインジェクションまたは交配を使用することができる。トランスポゾンが遺伝子のイントロンに正方向に挿入されれば、そこでマーカー遺伝子（例えば、LacZ）が活性化され、内在遺伝子が妨げられる。これにより、リポーター発現と、場合によってはトラップされた系統のいくつかにおいて遺伝子分断によって生じる目に見える表現型の双方の検出が可能となる。
【０１９０】
結論として、本発明者らの実験は、マウスにおける高効率遺伝子導入および挿入突然変異誘発系の基礎を提供し、このPB系が他の脊椎動物生物体における遺伝子操作の有力な手段としても使用可能であることも示唆する(Thibaultらの論文(2004, Nat. Genet. 36:283-287)。
【０１９１】
（7.引用文献）
本明細書に引用されている参照文献は全て、個々の刊行物または特許または特許出願の各々が目的を問わず、引用により本明細書中にそのまま組み入れられることが個々に明示されている場合と同様に、目的を問わず、引用により本明細書中にそのまま組み入れられる。
【０１９２】
当業者に明らかなように、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の多くの改変および変更をなすことできる。本明細書に記載される具体的な実施態様は単に例として示すものであり、本発明は、唯一添付の特許請求の範囲によって、かかる特許請求の範囲と同格の等価物の全範囲にわたって制限される。
【図面の簡単な説明】
【０１９３】
（4.図面の簡単な説明）
【図１】哺乳類細胞およびマウスのためのpiggyBacバイナリートランスポゾン系のトランスポゾンベクターとトランスポゼース構築物。（図１Ａ）PBドナー構築物。種々のプロモーターにより駆動されるマーカーまたは内在遺伝子 （斜線の四角、矢印は転写方向を表す）は、PBリピート末端対（PBLおよびPBR、黒い矢印）の間に配置した。末端の先の矢印は、逆PCRに用いるプライマーの相対位置を示す。トランスポゾンも全長も示されている。白い四角はプラスミドの主鎖配列を表す。M: MfeI; B: BamHI; S: SwaI; A: AscI; H: HindIII。（図１Ｂ）PBトランスポゼースヘルパー構築物。サイトメガロウイルス(CMV)により駆動されるpiggyBacトランスポゼース遺伝子（PBアーゼ）、β-アクチン(Act)、またはプロタミン1(Prm1)プロモーターの後に、ウシ成長ホルモンポリA(BGH pA)かウサギβ-グロビンポリA(rBG pA)のいずれかが続いている。
【図２】哺乳類培養細胞におけるpiggyBacの組み込み。（図２Ａ）293細胞における導入遺伝子の組み込み増強の統計学的結果。ヘルパープラスミドを用いた場合と用いない場合のドナートランスポゾン構築物のトランスフェクションから、G418耐性クローンの数を数えた。各数値は3回のトランスフェクション実験から得られた平均値である。バーは標準偏差を示す(P＜O.0001)。（図２Ｂ）マウスW4/129S6 ES細胞における導入遺伝子の組み込み増強の統計学的結果。クローンを(A)と同様に計数した。（図２Ｃ）マウスES細胞トランスフェクション実験の例。G418選択の後、生存クローンをメチレンブルーで染色した。
【図３】マウスにおけるpiggyBacエレメントの転位。（図３Ａ）環状プラスミドの注入から得られた全ての子のPCRジェノタイピングにより判定されたトランスポゾン陽性創始系統の割合。黒いバーおよび白いバーはそれぞれ、ドナープラスミドとヘルパープラスミドの同時注入、またはドナープラスミド単独の注入により得られた結果を表す。PBトランスポゼースの存在は、トランスジェニック効率の上昇をもたらした。（図３Ｂ）PB[Act-RFP]陽性創始系統のサザン解析。野生型対照ではシグナルは見られなかったが、１つの創始マウス(AF0-41)において10を超える組み込みが見られた場合もあった。（図３Ｃ）サザン解析はPBエレメントの生殖細胞系伝達を示した。野生型動物と交配した後、創始系統とそれらの子孫を分析した。雄創始系統(AF0-61)におけるPB[Act-RFP]の多重組み込みはその子孫では分離した。単一のPB[Act-RFP]転写組み込みを有する雌PB[Act-RFP]創始系統(AF0-47)（サザンおよび逆PCR結果により判断、表３のA47T6）も、そのトランスポゾンを子孫(47-336)に伝達した。
【図４】マウス生殖細胞系におけるpiggyBacの正確な切断と転位。Prm1-PBアーゼとPB[Act-RFP]を同時注入した雄創始マウスを、生殖細胞系転位を解析するために用いた。（図４Ａ）PB[Act-RFP]トランスポゾンの尺度化構造。ゲノムDNAを波線で表し、PBトランスポゾン含有プラスミドコンカテマーを一列の四角で示す。制限部位：M: MluI E: EcoRV B: BglII A: Acc65I。サザン解析用のプローブの位置を実線で示す。切断事象を検出するために用いたプライマーを矢印で示す。（図４Ｂ）創始系統(BF0-33)とその子孫のサザン解析により、1.3kbコンカテマーシグナル以外のバンドが明らかであったことから、生殖細胞系転位が起こったことが示唆される。（図４Ｃ）（図４Ａ）に示されるプライマーを用いてPCR増幅を行った後、いくつかの子孫で、正確な切断から予測される長さを有する陽性バンドが見られた。
【図５】piggyBacベクターにおける導入遺伝子の発現。（図５Ａ）子孫におけるPB[Act-RFP]の発現の結果、ポータブル長波長UV光の照射下で赤色蛍光を生じた。同じ１コピーのトランスポゾンを有する２個体の陽性マウス（矢印）と２個体の陰性同腹子（星印）を示す。（図５Ｂ）創始マウスおよびその子孫におけるPB[Act-RFP]の発現。創始系統では、赤色蛍光はモザイク状であった。子孫においてトランスポゾンが分離した結果、種々の強度のRFPシグナルが生じた。アスタリスクは導入遺伝子陰性の同腹子を示す。（図５Ｃ）および（図５Ｄ）同じpiggyBacベクター中の２つの導入遺伝子の同時発現。チロシナーゼが発現した結果、PB[K14-Tyr, Act-RFP]創始系統は、白色光下で灰色の体毛を示すが、導入遺伝子陰性の同腹子はアルビノのままである（それぞれ図５Ｃの右と左）。UVを照射すると、この創始系統から赤色蛍光が見られた（図５Ｄ）。
【図６】マウスにおけるpiggyBacの組み込み部位。（図６Ａ）100PB組み込み部位由来のフランキング配列のヌクレオチド組成。このフランキング配列には、TTAA標的部位特異性の他、TおよびAが豊富なことが観察された。アスタリスクは、無作為にサンプリングしたTTAA 対照のフランキング配列と比べた場合のP＜O.05を示す。（図６Ｂ）遺伝子におけるPB挿入の分布。エキソン、イントロン、5'調節配列（転写開始部位に隣接する10kb）、3'調節配列（ポリA部位に隣接する10kb）に位置するPB挿入、および４領域全て（全長）に位置するPB挿入のパーセンテージを示す。黒いバーは全ての既知および推定遺伝子からのデータを示し、白いバーは既知遺伝子またはESTからのデータを示す。（図６Ｃ）5'領域におけるPB挿入の分布。（図６Ｄ）3'領域におけるPB挿入の分布。（図６Ｅ）マウスにおいて93の組み込み部位を解析したところ、PBの組み込みは、２つの最も短い染色体(19とY)以外の全ての染色体で起こるようであることが示された。黒い矢印はエキソンで起こる場合を示し、影付きの矢印はイントロンで起こる場合を示し、白い矢印は推定される遺伝子間領域で起こる場合を示す。
【図７】種々の哺乳類細胞系統におけるpiggyBac組み込みの増強。
【図８】piggyBacは種々の種において転位可能である。
【図９】piggyBacはマウス体細胞において切断および転位が可能である。交配により、Act-PBアーゼおよびPBのコンカテマーに関して二重に陽性のマウスを得た。PBフランキングプライマーを用いたPCRにより、元の部位からのトランスポゾンの切断を検出した。さらに新たな挿入は、同じ個体からの逆PCRにより明らかにした。PB単独陽性親では、これらの事象は検出されなかった。このDNAは尾のサンプルから抽出した後、切断および転位は体細胞で起こったと考えられる。
【図１０】piggyBacトランスポゾンとPmr-piggyBacトランスポゼース構築物の同時注入による転位。
【図１１Ａ−Ｃ】交配による転位。（図１１Ａ）雄性生殖細胞系特異的プロモーター(prm)を、交配戦略を用いてさらに検討した。piggyBacトランスポゾンを有するマウスを、Pmr-PBアーゼ導入遺伝子を有するマウスと交配させ、これらの結果は、交配戦略を利用して新たな転位を誘導することができることを示している。（図１１Ｂ）Act-PBアーゼおよびPBのコンカテマーに関して二重に陽性のマウスを野生型マウスと交配させた。この交配の子孫における新たな転位事象は、逆PCRおよびサザンブロット法により検出された。調べた３つに新たな転位は全て、次世代に安定して伝達可能であった。（図１１Ｃ）Pmr-PBアーゼおよびPBのコンカテマーに関して二重に陽性の雄マウス(DF0-9)は、新たなトランスポゾン挿入を有する子孫を盛んに産み出した（左側のパネルのサザンおよび逆PCRにより明らかにした）。新たな挿入のうち約50%は、第4染色体上の推定される元の部位の付近に位置していたが、このことは、PBのジャンプが起こる際にその場で飛び移る場合があることを示唆する。非自律的PBトランスポゾン（コンカテマーまたは１コピー)を有するマウスを、トランスポゼース（例えば、マウス生殖細胞系で特異的にトランスポゼースを発現するPmr-PBアーゼ）を有するマウスと交配させた。トランスポゾン／トランスポゼース二重陽性F1マウス（Pmr-PBアーゼの場合には雄マウスのみ）を、野生型マウスと交配させた。次世代(F2)において、サザンブロットおよび逆PCRを用い、新たな転位部位をクローン化した。Pmr-PBアーゼとAct-PBアーゼの双方を使用すれば、１コピーのトランスポゾンしか持たないマウスを出発系統として用いた場合でも、組換えを試行する度に新たな挿入が得られた。解析した転位の１つは元は第5染色体にあり、第1染色体に飛んだものであった。
【図１２Ａ−Ｂ】piggyBac挿入は遺伝子発現パターンを表す。lacZ含有piggyBacトランスポゾンは、それらが挿入される遺伝子の発現パターンを表す。２つの例：F27iR43における挿入（図１２Ａ）とGrb10における挿入（図１２Ｂ）。図１２Ｂでは、lacZリポーター遺伝子を有するPBに基づくエキソントラップベクターの結果を示す。トランスポゾンがGrb10の最初のイントロンに挿入された場合、マウス胚のlacZ染色は、他のものによって示された結果に適合するGrb10発現パターンを示した。
【図１３Ａ−Ｂ】piggyBac挿入はマウスにおいて表現型を生じ得る。２つの例：従来のノックアウト法によって作出された突然変異マウスと同様に、Pkd2遺伝子における挿入は胚致死を生じ（劣性、Pkd2同形接合胚において局部出血および全身浮腫を生じる）（図１３Ａ〜Ｂ）、Eya1遺伝子における挿入は眼の欠陥（優性）を生じる（図１３Ｂ）。
【図１４Ａ−Ｂ】大きなDNA片を脊椎動物ゲノムに挿入するためのpiggyBac様トランスポゾンの使用を示す。図１４Ａは、１以上の遺伝子（影付きの矢印により表される）を有し、piggyBac様トランスポゾンの逆方向末端反復配列(ITR)にクローニングされるプラスミド、コスミド、P1断片、またはBAC断片を示す。piggyBac様トランスポゼース（丸）が存在する場合、このカセット全体が転位によりゲノム（実線）に挿入される。あるいは、図１４Ｂに示されるように、大きな染色体領域を、最も外側の断片が各々piggyBac様ITRを有するように、いくつかの部分的に重複する断片に切断する。piggyBac様トランスポゼースが存在する場合、これらの断片は、転位と相同組換えによりゲノム（実線）に組み込まれる。
【図１】
2008545375.tif 000009
【図２】
2008545375.tif 000010
【図３】
2008545375.tif 000011
【図４】
2008545375.tif 000012
【図５】
2008545375.tif 000013
【図６】
2008545375.tif 000014
【図７】
2008545375.tif 000015
【図８】
2008545375.tif 000016
【図９】
2008545375.tif 000017
【図１０】
2008545375.tif 000018
【図１１Ａ】
2008545375.tif 000019
【図１１Ｂ】
2008545375.tif 000020
【図１１Ｃ】
2008545375.tif 000021
【図１２Ａ】
2008545375.tif 000022
【図１２Ｂ】
2008545375.tif 000023
【図１３Ａ】
2008545375.tif 000024
【図１３Ｂ】
2008545375.tif 000025
【図１４】
2008545375.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成20年2月15日(2008.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008545375000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年5月13日(2008.5.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1.5kbのインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する方法であって：
(a)ex vivoにおいて非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞に、少なくとも1.5kbのインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンを含む核酸と、同じ核酸内、または別の核酸上のpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列とを導入する工程；
(b)得られた非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞を、該胚の、トランスジェニック非ヒト脊椎動物への発達に有利な条件下で、同種の好ましい代理母に移植する工程；および
(c)該胚をトランスジェニック非ヒト脊椎動物へ発達させるに十分な期間の後、該母親から該トランスジェニック非ヒト脊椎動物を回収し、
それにより、少なくとも1.5kbのインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンをその１以上の細胞のゲノムに含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
前記piggyBac様トランスポゾンが、前記トランスジェニック非ヒト脊椎動物の形質を改変するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
piggyBac様トランスポゾンを含む前記核酸が、１以上の細胞のゲノムが、複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー内に該piggyBac様トランスポゾンを含むように線状化されている、請求項１記載の方法。
【請求項４】
piggyBac様トランスポゾンを含む前記核酸が、１以上の細胞のゲノムが、複数のpiggyBac様トランスポゾンを含むコンカテマー内に該piggyBac様トランスポゾンを含むように線状化されている、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記piggyBac様トランスポゾンが、核酸と結合し、および／または核酸を改変するタンパク質により認識される配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記核酸修飾タンパク質が、DNA結合タンパク質、DNA修飾タンパク質、RNA結合タンパク質、またはRNA修飾タンパク質である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記piggyBac様トランスポゾンが部位特異的リコンビナーゼの標的部位を含む、請求項５のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記標的部位がFRT標的部位またはlox標的部位である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記piggyBac様トランスポゾンが選択マーカーを含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記piggyBac様トランスポゾンがリポーター遺伝子を含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記リポーター遺伝子が前記の種に内在している、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記piggyBac様トランスポゾンが選択マーカーとリポーター遺伝子の双方を含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
前記piggyBac様トランスポゾンと前記piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列が同じ核酸内にある、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
前記piggyBac様トランスポゾンと前記piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列が別の核酸上にある、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
前記piggyBac様トランスポゾンを含む核酸がDNAであり、かつ前記piggyBac様トランスポゼースを含む核酸がRNAである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記piggyBac様トランスポゾンが前記非ヒト脊椎動物で不動化されている、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記piggyBac様トランスポゾンと前記piggyBac様トランスポゼースを含む核酸がともにDNAである、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
前記トランスジェニック非ヒト脊椎動物が、piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列を、その１以上の細胞のゲノムにさらに含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列がプロモーターに機能し得るように連結されている、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記プロモーターが生殖細胞系におけるトランスポゼースの発現を指示する、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記プロモーターが生殖細胞系特異的プロモーターである、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記１以上の細胞のゲノムが、コンカテマー内に前記piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列を含み、該コンカテマーは、piggyBac様トランスポゼースを各々コードする複数のヌクレオチド配列を含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
前記非ヒト脊椎動物が非ヒト哺乳類である、請求項１記載の方法。
【請求項２４】
前記非ヒト脊椎動物が家畜である、請求項１記載の方法。
【請求項２５】
ゲノムが少なくとも1.5kbのインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンを含む培養組換え脊椎動物細胞を作出する方法であって：
(a)少なくとも1.5kbのインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンを含む核酸と、同じ核酸内、または別の核酸上のpiggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列とを培養脊椎動物細胞に導入する工程；および
(b)該細胞を、piggyBac様トランスポゼースが発現されて、piggyBac様トランスポゾンが該培養脊椎動物細胞のゲノムに組み込まれるような条件下で培養し、
それにより、ゲノムが少なくとも1.5kbのインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンを含む培養組換え脊椎動物細胞を作出する工程を含む、前記方法。
【請求項２６】
前記piggyBac様トランスポゾンが、脊椎動物の疾病または障害の治療または予防に有用なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記脊椎動物細胞が哺乳類細胞である、請求項２５、および２６のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
前記哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも1.5kbのインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンを、その１以上の細胞のゲノムに含む、トランスジェニック非ヒト脊椎動物。
【請求項３０】
前記piggyBac様トランスポゾンが前記トランスジェニック非ヒト脊椎動物の形質を改変するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２９記載のトランスジェニック非ヒト脊椎動物。
【請求項３１】
少なくとも1.5kbのインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンをそのゲノムに含む、培養脊椎動物細胞。
【請求項３２】
前記piggyBac様トランスポゾンが、脊椎動物の疾病または障害の治療または予防に有用なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項３１記載の脊椎動物細胞。
【請求項３３】
前記piggyBac様トランスポゾンが、トランスジェニック非ヒト脊椎動物の形質を改変するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項３１記載の脊椎動物細胞。
【請求項３４】
工程(a)が、前記非ヒト脊椎動物胚または受精卵母細胞に組換えウイルスを導入することを含み、該組換えウイルスのゲノムが、(i)前記piggyBac様トランスポゾンと、(ii)プロモーターに機能し得るように連結されている、piggyBac様トランスポゼースをコードする前記ヌクレオチド配列とを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３５】
前記ウイルスが、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスである、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記piggyBac様トランスポゾンがpiggyBacトランスポゾンであり、かつ／または前記piggyBac様トランスポゼースがpiggyBacトランスポゼースである、請求項１、２５、２６、または３４のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
前記piggyBac様トランスポゾンがpiggyBacトランスポゾンであり、かつ／または前記piggyBac様トランスポゼースがpiggyBacトランスポゼースである、請求項２９〜３０のいずれか一項記載のトランスジェニック非ヒト脊椎動物。
【請求項３８】
前記piggyBac様トランスポゾンがpiggyBacトランスポゾンであり、かつ／または前記piggyBac様トランスポゼースがpiggyBacトランスポゼースである、請求項３１〜３３のいずれか一項記載の脊椎動物細胞。
【請求項３９】
前記piggyBac様トランスポゾンが少なくとも4kbのインサートを有する、請求項１、および２５のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
前記piggyBac様トランスポゾンが少なくとも4kbのインサートを有する、請求項２９記載のトランスジェニック非ヒト脊椎動物。
【請求項４１】
前記piggyBac様トランスポゾンが少なくとも4kbのインサートを有する、請求項３１記載の脊椎動物細胞。
【請求項４２】
前記生殖細胞系特異的プロモーターが雄性特異的プロモーターである、請求項２１記載の方法。
【請求項４３】
前記雄性特異的プロモーターがプロタミン(Prm)プロモーターである、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
前記生殖細胞系特異的プロモーターが雌性特異的プロモーターである、請求項２１記載の方法。
【請求項４５】
前記雌性特異的プロモーターがＺＰ３プロモーターである、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
少なくとも1.5kbのインサートを有するpiggyBac様トランスポゾンを含む核酸であって、該インサートが脊椎動物のプロモーターを含む、前記核酸。
【請求項４７】
脊椎動物のプロモーターに機能し得るように連結されている、piggyBac様トランスポゼースをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
【国際調査報告】
2008545375.tif 000027
2008545375.tif 000028
2008545375.tif 000029
2008545375.tif 000030
2008545375.tif 000031