(57)【要約】【課題】本発明は、抗生物質耐性遺伝子欠失プラスミドを含むＤＮＡワクチン、その生成方法、及び前記ＤＮＡワクチンを用いて病原因子を対処する方法を提供する。【解決手段】本発明のＤＮＡワクチンは、タンパク抗原に対する免疫応答を発生させるためのＤＮＡワクチンであって、前記タンパク抗原を有するポリペプチドをエンコードする第１の核酸配列と、代謝酵素をエンコードする第２の核酸配列とを含む抗生物質耐性遺伝子欠失プラスミドを有し、前記抗生物質耐性遺伝子欠失プラスミドが栄養要求性細菌株内で増幅され、前記代謝酵素が前記栄養要求性細菌株の代謝欠陥を補完することによって、タンパク抗原に対する免疫応答を発生させることを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク抗原に対する免疫応答を発生させるためのＤＮＡワクチンであって、
前記タンパク抗原を有するポリペプチドをエンコードする第１の核酸配列と、代謝酵素をエンコードする第２の核酸配列とを含む抗生物質耐性遺伝子欠失プラスミドを有し、
前記抗生物質耐性遺伝子欠失プラスミドが栄養要求性細菌株内で増幅され、前記代謝酵素が前記栄養要求性細菌株の代謝欠陥を補完することによって、タンパク抗原に対する免疫応答を発生させることを特徴とするＤＮＡワクチン。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡワクチンであって、
前記抗生物質耐性遺伝子欠失プラスミドは、転写因子をさらに含むことを特徴とするＤＮＡワクチン。
【請求項３】
請求項２に記載のＤＮＡワクチンであって、
前記転写因子は、前記栄養要求性細菌株の染色体において欠失していることを特徴とするＤＮＡワクチン。
【請求項４】
請求項１に記載のＤＮＡワクチンであって、
前記ポリペプチドは、前記タンパク抗原及びさらなるポリペプチドを含む融合タンパクであり、
前記さらなるポリペプチドは、ＬＬＯタンパクの非溶血性断片、ＰＥＳＴ様アミノ酸配列、又はＡｃｔＡタンパクであることを特徴とするＤＮＡワクチン。
【請求項５】
請求項１に記載のＤＮＡワクチンであって、
前記第１の核酸配列は、プロモータ／制御配列に作用可能に連結していることを特徴とするＤＮＡワクチン。
【請求項６】
請求項１に記載のＤＮＡワクチンであって、
前記第２の核酸配列は、プロモータ／制御配列に作用可能に連結していることを特徴とするＤＮＡワクチン。
【請求項７】
請求項１に記載のＤＮＡワクチンであって、
前記代謝酵素は、アミノ酸代謝酵素であることを特徴とするＤＮＡワクチン。
【請求項８】
請求項１に記載のＤＮＡワクチンであって、
前記代謝酵素は、アラニンラセマーゼ酵素であることを特徴とするＤＮＡワクチン。
【請求項９】
請求項１に記載のＤＮＡワクチンであって、
前記代謝酵素は、Ｄ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素であることを特徴とするＤＮＡワクチン。
【請求項１０】
請求項１に記載のＤＮＡワクチンであって、
前記栄養要求性細菌株は、栄養要求性大腸菌株であることを特徴とするＤＮＡワクチン。
【請求項１１】
請求項１に記載のＤＮＡワクチンであって、
前記ＤＮＡワクチンは、アジュバント、サイトカインをエンコードするヌクレオチド分子、又は薬学的に許容される担体をさらに含むことを特徴とするＤＮＡワクチン。
【請求項１２】
請求項１に記載されたタンパク抗原を発現する病原因子を対処するための方法であって、
請求項１に記載のＤＮＡワクチンを投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、
前記病原因子は、病原体であることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法であって、
前記病原因子は、がん細胞又は腫瘍細胞であることを特徴とする方法。
【請求項１５】
タンパク抗原に対する免疫応答を発生させるＤＮＡワクチンを作成するための方法であって、
（ａ）前記タンパク抗原を含むポリペプチドをエンコードする第１の核酸配列と、栄養要求性細菌株の代謝欠陥を補完する代謝酵素をエンコードする第２の核酸配列とを含む、かつ抗生物質耐性遺伝子を含まないプラスミドを有する前記栄養要求性細菌株を増殖させるステップと、
（ｂ）前記栄養要求性細菌株からプラスミドＤＮＡワクチンを単離することによって、タンパク抗原に対する免疫応答を発生させるためのＤＮＡワクチンを作成するステップとを有することを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、
前記プラスミドは、前記栄養要求性細菌株に抗生物質耐性を付与しないことを特徴とす
る方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法であって、
前記栄養要求性細菌株は、さらに転写因子を欠失することを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載のＤＮＡワクチンであって、
前記転写因子は、前記栄養要求性細菌株の染色体において欠失していることを特徴とするＤＮＡワクチン。
【請求項１９】
請求項１５に記載の方法であって、
前記ポリペプチドは、前記タンパク抗原及びさらなるポリペプチドを含む融合タンパクであり、
前記さらなるポリペプチドは、ＬＬＯタンパクの非溶血性断片、ＰＥＳＴ様アミノ酸配列、又はＡｃｔＡタンパクであることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１５に記載の方法であって、
前記第１の核酸配列は、プロモータ／制御配列に作用可能に連結していることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１５に記載の方法であって、
前記代謝酵素は、アミノ酸代謝酵素であることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１５に記載の方法であって、
前記代謝酵素は、アラニンラセマーゼ酵素であることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１５に記載の方法であって、
前記代謝酵素は、Ｄ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素であることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１５に記載の方法であって、
前記第２の核酸配列は、プロモータ／制御配列に作用可能に連結していることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項１５に記載の方法であって、
前記プラスミドにアジュバント、サイトカインをエンコードするヌクレオチド分子、又は薬学的に許容される担体を混合させるステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項１５に記載の方法であって、
前記栄養要求性細菌株は、栄養要求性大腸菌株であることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項１５に記載の方法であって、
前記栄養要求性細菌株をプラスミドと接触させることで、前記栄養要求性細菌株がプラスミドを取り込むステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項１５に記載されたタンパク抗原を発現する病原因子を対処するための方法であって、
請求項１５に記載の方法によって作成されたＤＮＡワクチンを投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、
前記病原因子は、病原体であることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２８に記載の方法であって、
前記病原因子は、がん細胞又は腫瘍細胞であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗生物質耐性遺伝子欠失プラスミドを含むＤＮＡワクチン、その生成方法、及び前記ＤＮＡワクチンを用いて病原因子を対処する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンは、現在のところ知られている、最も有益かつコスト効率の良い公衆衛生手段である。しかしながら、腫瘍及び伝染病に関する理解が深まるにつれ、従来のワクチン戦略は完全に効果的であるとは限らないことが判明した。従来のワクチンでは、不活化又は弱毒化された病原体、あるいは抗原のサブユニットが用いられてきた。この[h1][h2]手法、特に不活化ワクチン又はサブユニットワクチンには、ワクチンが投与された動物における免疫応答が主に体液性であり、死滅するためには、細胞性免疫を必要とする細胞内生物又は腫瘍を対処するには効果的ではないという問題があった。また、弱毒化あるいは不活化された細菌は、多くの場合、免疫を短期間しか誘発せず、その免疫は体液性応答に限られているという問題点もある。さらに、従来の弱毒化又は不活化された細菌ワクチンは、腫瘍細胞及び病原体に寄生された細胞の溶解に必要な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）による免疫応答を引き起こさないという問題点もある。
【０００３】
ウイルス及びバクテリアのベクターは、多くの場合、ＣＴＬ応答を誘発するために用いられている。ウイルス性のワクチンは通常、細胞での連続継代培養で弱毒化された病原性ウイルス、あるいは熱又は化学処理によって死滅させたウイルスである。死滅したウイルスは、細胞に感染することができない。したがって、サブユニットワクチンのように体液性免疫応答のみを誘発する。弱毒化されたウイルスは、細胞感染が可能で、体内でＣＴＬ応答を誘発できる。しかしながら、弱毒化されたウイルスにも欠点はある。第１に、ウイルスの弱毒化は多くの場合、試行錯誤のプロセスである。バクテリアのワクチンベクターもまた、パッセンジャー抗原（passenger antigens）の担体として用いられてきた。例えば、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes：ＬＭ）ワクチンのベクターは、米国特許第５，８３０，７０２号（Paterson and Portnoy)に明示されているように、多くの異種抗原を発現させ、ＣＴＬ応答を誘発するのに非常に有効である。しかしながら、弱毒化されたウイルス及びバクテリアの使用は、特に子供、高齢者、及び免疫疾患者における安全性の問題を伴う。
【０００４】
従来のバクテリア及びウイルスワクチンの問題に対する解決策はＤＮＡワクチンに存在する。ＤＮＡワクチンは通常、抗原をエンコードする核酸を含むプラスミドであり、感染細胞内で抗原が翻訳され、それによってＭＨＣを介した細胞応答が促進され、細胞外環境でその抗原が発現するため、強力な体液性及び細胞性免疫応答を誘発する。また、ＤＮＡワクチンは、抗原、サイトカイン及び酵素のような様々なタンパクを発現することができる。
【０００５】
しかしながら、ＤＮＡワクチンの欠点の１つは、大腸菌のような細菌で作成するためには、繁殖中にプラスミドを保持した細菌を選択できるように、薬剤耐性遺伝子をプラスミドに導入する必要があるということである。そのため、それまで抗生物質治療による対処が可能であった細菌の間で薬剤耐性が広まる可能性がある。したがって、ＤＮＡワクチンにおける抗生物質耐性遺伝子の存在は、安全性の観点から大きな障害と考えられる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、抗生物質耐性遺伝子欠失プラスミドを含むＤＮＡワクチン、その生成方法、及び前記ＤＮＡワクチンを用いて病原因子を対処する方法を提供する。
【０００７】
ある実施形態では、本発明は、タンパク抗原に対する免疫応答を発生させるＤＮＡワクチンであって、（ａ）前記タンパク抗原を有するポリペプチドをエンコードする第１の核酸配列と、（ｂ）代謝酵素をエンコードする第２の核酸配列とを含む抗生物質耐性遺伝子欠失プラスミドを有し、前記抗生物質耐性遺伝子欠失プラスミドは、栄養要求性細菌株内で増幅され、前記代謝酵素は、前記栄養要求性細菌株における代謝欠陥を補完することを特徴とするＤＮＡワクチンを提供する。
【０００８】
他の実施形態では、本発明は、タンパク抗原に対応する免疫応答を発生させるＤＮＡワクチンを作成するための方法であって、（ａ）（ｉ）前記タンパク抗原を含むポリペプチドをエンコードする第１の核酸配列と、（ｉｉ）栄養要求性細菌株での代謝欠陥を補完する代謝酵素をエンコードする第２の塩基配列とを含む、かつ抗生物質耐性遺伝子を含まないプラスミドを有する前記栄養要求性細菌株を増殖させるステップと、（ｂ）前記栄養要求性細菌株から前記プラスミドＤＮＡワクチンを単離し、それによってタンパク抗原に対する免疫応答を発生させるＤＮＡワクチンを作成するステップとを有することを特徴とする方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、抗生物質耐性遺伝子欠失プラスミドを含むＤＮＡワクチン、その生成方法、及び前記ＤＮＡワクチンを用いて病原因子を対処する方法を提供する。
【００１０】
ある実施形態では、本発明は、タンパク抗原に対する免疫応答を発生させるＤＮＡワクチンであって、（ａ）前記タンパク抗原を有するポリペプチドをエンコードする第１の核酸配列と、（ｂ）代謝酵素をエンコードする第２の核酸配列とを含む抗生物質耐性遺伝子欠失プラスミドを有し、前記抗生物質耐性遺伝子欠失プラスミドは、栄養要求性細菌株内で増幅され、前記代謝酵素は、前記栄養要求性細菌株における代謝欠陥を補完することを特徴とするＤＮＡワクチンを提供する。
【００１１】
他の実施形態では、本発明は、タンパク抗原を発現する病原因子に対する防御を付与するＤＮＡワクチンであって、（ａ）前記タンパク抗原を有するポリペプチドをエンコードする第１の核酸配列と、（ｂ）代謝酵素をエンコードする第２の核酸配列とを含む抗生物質耐性遺伝子欠失プラスミドを有し、前記抗生物質耐性遺伝子欠失プラスミドは、栄養要求性細菌株内で増幅され、前記代謝酵素は、前記栄養要求性細菌株における代謝欠陥を補完することを特徴とするＤＮＡワクチンを提供する。
【００１２】
他の実施形態では、本発明の方法及び組成におけるプラスミドは、抗原をエンコードする遺伝子に作用可能に連結したプロモータ／制御配列、アミノ酸代謝遺伝子又はそれらの組み合わせを含む。他の実施形態では、本発明のプラスミドＤＮＡワクチンは、細菌のような原核生物、又は真核生物の宿主内で複製し、増幅し、そしてヒトのような動物に投与される。したがって、この実施形態では、本発明のプラスミドＤＮＡワクチンは、原核生物及び真核生物の両方のプロモータ／制御要素を含む。原核生物のプロモータ／制御要素は、Ｔ７、ＳＰ６０、ｔｒｐオペロン、ｔＲＮＡプロモータ、ｌａｃオペロン、ｒｅｃＡ、ｌｅｘＡ等を含むが、これらに限定されない。原核生物のプロモータ及びその使用方法は、当該技術分野では公知である。各々の原核生物のプロモータ／制御要素は、本発明の個々の実施形態を表す。
【００１３】
他の実施形態では、本発明の方法及び組成におけるプラスミドはさらに、プラスミドＤＮＡワクチンから抗原又は他のタンパクを発現させるのための真核生物のプロモータを含む。本発明に実用的な真核生物のプロモータには、構成的プロモータ、誘導的プロモータ、あるいは組織特異的プロモータが含まれる。遺伝子の構成的発現を誘導するプロモータ／制御配列の多くは、当該技術分野で実用的であり、例えば、cytomegalovirus immediate earlyプロモータ、SV40プロモータ・エンハンサ配列、イムノグロブリン・プロモータ、及びRous sarcoma virusプロモータ等を含むが、これらに限定されない。さらに、抗原の誘導発現及び組織特異的発現は、その抗原をエンコードする核酸配列を誘導的又は組織特異的プロモータ／制御配列下に設置することで実現可能である。この目的ための実用的な組織特異的又は誘導的プロモータ／制御配列は、ＭＭＴＶ  ＬＴＲ誘導プロモータ、及びSV40 late エンハンサ／プロモータを含むがこれらに限定されない。また、金属、グルココルチコイド、テトラサイクリン、ホルモン等の誘導因子によって誘導されるプロモータ、及び当該技術分野で知られているプロモータもまた本発明において考えられる。したがって、本発明は、作用可能に連結された目的のタンパク遺伝子の発現を行える当該技術分野では公知の任意のプロモータ／制御配列の使用を含むと考えられる。
【００１４】
他の実施形態では、本発明の方法及び組成におけるプラスミドは、特にポリヌクレオチドのワクチンのために最適化されてきた。要素には、本明細書に記載されているように、転写プロモータ、免疫原性エピトープ、固有のプロモータを保有した免疫増強遺伝子又は免疫調節遺伝子をエンコードするさらなるシストロン、転写ターミネータ、細菌由来複製起点（bacterial origin of replication）、及び抗生物質耐性遺伝子が含まれる。他の実施形態では、ベクターは、ポリシストロンｍＲＮＡの発現ためにリボソーム内部進入部位（IRS)を含んでいる。対応するＤＮＡによってエンコードされたマルチシストロンｍＲＮＡを生成するためにインビトロで転写されたＲＮＡは、本発明の範囲内であると当業者には考えられる。そのため、転写プロモータとして、Ｔ７プロモータ又はＳＰ６プロモータのような強力なＲＮＡポリメラーゼプロモータを使用すること、及び線状化された鋳型ＤＮＡにおいて、インビトロでラン・オン転写を行うことが望ましい。これらの方法は、当該技術分野では公知であり、例えば、「Lowrie and Whalen, eds., ,DNA vaccines: Methods and Protocols ,Methods in Molecular Medicine, No. 29, 2000, Humana Press, Totowa NJ」に開示されている。
【００１５】
ある実施形態では、本発明の方法及び組成における栄養要求性細菌株は、栄養要求性大腸菌株である。他の実施形態では、栄養要求性細菌株は、当該技術分野において、プラスミドの増幅に実用的と知られている任意の細菌株である。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００１６】
他の実施形態では、本発明の方法及び組成におけるＤＮＡワクチンは、アジュバントをさらに含む。他の実施形態では、ＤＮＡワクチンは、サイトカインをエンコードするヌクレオチド分子をさらに含む。他の実施形態では、ＤＮＡワクチンは薬学的に許容される担体をさらに含む。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００１７】
他の実施形態では、本発明は、病原因子を対処するための方法であって、前記病原因子は本発明のタンパク抗原を発現し、本発明のＤＮＡワクチンを投与するステップを含むことを特徴とする方法を提供する。
【００１８】
ある実施形態では、病原因子は病原体である。他の実施形態では、病原因子はがん細胞である。ほかの実施形態では、病原因子は腫瘍細胞である。他の実施形態では当該技術分野では公知である他のいかなる種類の病原因子である。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００１９】
他の実施形態では、本発明は、タンパク抗原に対応する免疫応答を発生させるＤＮＡワクチンを作成するための方法であって、（ａ）（ｉ）前記タンパク抗原を含むポリペプチドをエンコードする第１の核酸配列と、（ｉｉ）栄養要求性細菌株での代謝欠陥を補完する代謝酵素をエンコードする第２の塩基配列とを含み、かつ抗生物質耐性遺伝子を含まないプラスミドを有する前記栄養要求性細菌株を増殖させるステップと、（ｂ）前記栄養要求性細菌株から前記ＤＮＡワクチンプラスミドを単離し、それによってタンパク抗原に対する免疫応答を発生させるＤＮＡワクチンを作成するステップとを有することを特徴とする方法を提供する。
【００２０】
他の実施形態では、本発明の方法は、栄養要求性細菌株に本発明のプラスミドを接触させ、それにより、前記栄養要求性細菌株はプラスミドを取り込むステップをさらに含んでいる。他の実施形態では、本発明の方法は、栄養要求性細菌株に本発明のプラスミドを形質転換させるステップをさらに含む。他の実施形態では、本発明の方法は、すでにトランスフェクトされた細菌株を用いる。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００２１】
ある実施形態における「形質転換」は、トランスフェクトという用語と同じ意味で使用されており、細菌の細胞がプラスミド又は非相同ＤＮＡ分子（heterologous DNA molecule）を取り込むようにその細胞を操作することを言う。他の実施形態では「形質転換」は、細菌の細胞が、プラスミド又は他の非相同ＤＮＡ分子（heterologous DNA molecule）の遺伝子を発現するためにその細胞を操作することを言う。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００２２】
他の実施形態では、本発明の方法及び組成におけるプラスミドは転写因子をさらに含む。他の実施形態では、栄養要求性細菌株又は本発明の細菌株の染色体において、転写因子等を欠失している。様々な実施形態では、転写因子は当該技術分野では公知である他の任意の転写因子である。
【００２３】
ある実施形態では、代謝遺伝子、転写因子等は細菌株の所定の染色体において欠失している。他の実施形態では、代謝遺伝子、転写因子等は細菌株の全ての染色体において欠失している。他の実施形態では、代謝遺伝子、転写因子等は細菌株のゲノムにおいて、欠失している。
【００２４】
ある実施形態では、転写因子は染色体において変異されている。他の実施形態では、転写因子は染色体から除去されている。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００２５】
他の実施形態では、本発明の方法及び組成におけるプラスミドは、細菌性ワクチン株（bacterial vaccine strain）に抗生物質耐性を付与しない。他の実施形態では、そのプラスミドは抗生物質耐性遺伝子を含んでいない。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００２６】
本発明の方法及び組成における他の実施形態では、本発明の方法及び組成における核酸配列にエンコードされたポリペプチドは、異種抗原（heterologous antigen）及びさらなるポリペプチドを含む融合タンパクである。
【００２７】
他の実施形態では、本発明の融合タンパクは、とりわけ、ＬＭ非溶血性ＬＬＯタンパクを含んでいる（本明細書に例が示されている）。非溶血性ＬＬＯタンパクは、ある実施形態において、全長ＬＬＯタンパク（５２９アミノ酸）の最初の約４００〜４４１のアミノ酸を有し、その配列は例えば、「Mengaud et al., 1988, Infect. Immun. 56:766-772、遺伝子銀行：アクセス番号Ｐ１３１２８」に開示されている。抗原及び非溶血性ＬＬＯタンパクを含んだ融合タンパクの作成は、本明細書の他の部分、及び「Gunn et al., 2001, J. Immunology 167: 6471-6479」に示されている。
【００２８】
他の実施形態では、本発明の方法及び組成における融合タンパクは、ＬＬＯタンパク由来又は真核生物のような他の生物由来のＰＥＳＴ様配列を含む。
【００２９】
他の実施形態では、本発明の方法及び組成における融合タンパクは、リステリア由来のＡｃｔＡ配列を含んでいる。ＰＥＳＴ配列又はＡｃｔＡ配列を含む融合タンパクの作成及び使用は、本明細書及び米国特許第６,７６７,５４２号、 国際公開番号 ＷＯ ０１／７２３２９及び米国出願番号第１０／８３５，６６２号（Paterson et al.）に記載されているようにして行うことができる。ＡｃｔＡタンパク及びその断片は、ＬＬＯと同様に、抗原提示及び免疫力を増大させる。
【００３０】
他の実施形態では、さらなるポリペプチドは当該技術分野では公知である他の任意のポリペプチドである。上記のさらなるポリペプチドは、本発明の異なる実施形態を表す。
【００３１】
抗原を含んだタンパクは、例えば、適切な配列のクローニング及び制限処理（restriction）、又は下記の方法を用いて直接、化学合成することによって調製することが可能である。あるいは、部分配列をクローニングし、適切な制限酵素を用いて適切な部分配列を切断し、目的のＤＮＡ配列を作成するために断片を連結することも可能である。ある実施形態では、抗原をエンコードするＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のようなＤＮＡ増幅方法を用いて生成することができる。最初に、天然ＤＮＡ断片の両方の新末端の両側は、別々に増幅される。増幅した１つの断片の５´末端はペプチドリンカーをエンコードし、もう一方の増幅した配列の３´末端もまた、ペプチドリンカーをエンコードする。第１の断片の５´末端は、第２の断片の３´末端に相補的なので、この２つの断片（ＬＡＰアガロース等での部分精製後）は、第３のＰＣＲ反応において重複鋳型（overlapping template）として用いることができる。増幅された配列は、コドン、（今はアミノ配列を成す）オープニングサイトのカルボキシル側の部分、リンカー、及び、（今はカルボキシル配列を成す）オープニングサイトのアミノ側の配列を含むことになる。各方法は、本発明の異なる実施形態である。
【００３２】
他の実施形態では、本発明の方法及び組成における第１の核酸配列は、プロモータ／制御配列に作用可能に連結している（operably linked）。ある実施形態では、プロモータ／制御配列はｐ６０であり、本発明により、大腸菌において、作用可能であると示されている。他の実施形態では、第２の核酸配列はプロモータ／制御配列に作用可能に連結している。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００３３】
他の実施形態では、第２の核酸配列のプロモータ／制御配列は、大腸菌内で機能し、よって、大腸菌株内でプラスミドが安定に維持される。他の実施形態では、本発明のプラスミドを大腸菌株にトランスフェクトすることにより、第２の核酸配列は大腸株菌内で発現し、その結果、大腸菌株内でプラスミドが安定に維持される。
【００３４】
本発明の方法及び組成における他の実施形態では、対応する核酸配列によってエンコードされた代謝酵素は、アミノ酸代謝酵素である。他の実施形態では、代謝酵素はアラニンラセマーゼ酵素である。他の実施形態では、代謝酵素はＤ−アミノ酸トランスフェラーゼである（D-amino acid transferase enzyme）。ＬＭアラニンラセマーゼは、「Thompson et al., Infec Immun 66: 3552-3561, 1998」に開示されているようにＬＭからクローニング及び単離がされた。他の実施形態では、代謝遺伝子は、リステリア（Listeria）の場合、ＡｒｏＡ，ＡｒｏＢ，及びＡｒｏＥの１つ又はそれ以上のものである。他の実施形態では、代謝遺伝子は、大腸菌の場合、ＡｒｏＡ，ＡｒｏＢ，ＡｒｏＣ，ＡｒｏＤ，ＡｒｏＥ，ＡｒｏＧ，ＡｒｏＫ及びＴｒｐＳの１つ又はそれ以上のものである。
【００３５】
他の実施形態では、本発明で用いられているアラニンラセマーゼ遺伝子の配列は、遺伝子銀行アクセス番号ＡＦ０３８４３８に示されている。他の実施形態では、アラニンラセマーゼ遺伝子は、当該技術分野で公知である他の任意のラセマーゼ遺伝子である。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００３６】
他の実施形態では、本発明で用いられているＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ遺伝子の配列は、遺伝子銀行アクセス番号ＡＦ０３８４３８に示されている。他の実施形態では、Ｄ−アミノ酸トランスフェラーゼ遺伝子は、当該技術分野で公知であるほかの任意のＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ遺伝子である。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００３７】
Ｄ−アラニン要求性株は当該技術分野では公知であり、例えば、「Strych et al., J. Bacteriol. 184:4321-4325, 2002」に開示されている。各栄養要求性細菌株は、本発明の異なる実施形態を表す。
【００３８】
様々な実施形態では、本発明に係る方法及び組成における抗原としては、これらに限定されるものではないが、腫瘍又は次の感染性生物に由来する。菌類病原体、細菌、寄生虫、蠕虫、ウイルスなど。本発明の抗原はとしては、これらに限定されるものではないが、次のものがある。破傷風トキソイド、インフルエンザ菌の血球凝集素分子、ジフテリアトキソイド、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、ＨＩＶ  ｇａｇタンパク、ＩｇＡプロテアーゼ、インシュリンペプチドＢ、粉状そうか病菌抗原、セブリオ症菌抗原、サルモネラ抗原、肺炎球菌抗原、呼吸器合胞体ウイルス抗原、インフルエンザ菌外膜タンパク、ヘリコバクター・ピロリ菌ウレアーゼ、髄膜炎菌ピリン、淋菌ピリン、メラノーマ関連抗原（ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ３、ｇｐ−１００、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１、ＨＳＰ−７０、ｂｅｔａ−ＨＣＧ）、タイプＨＰＶ−１６、−１８、−３１、−３３、３５、又は４５のヒト乳頭腫ウイルスの抗原Ｅ１、Ｅ２、Ｅ６、及びＥ７、腫瘍抗原：Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（例えば、遺伝子銀行アクセス番号Ｍ１  １７３０）、ＮＹ−ＥＳＯ１（例えば、遺伝子銀行アクセス番号ＮＭ００１３２７）ＣＥＡ、変異型又は正常型ラスタンパク、変異型又は正常型ｐ５３タンパクＭｕｃｌ、ｐＳＡ、当該技術分野では公知の次の疾病由来抗原：コレラ、ジフテリア、ヘモフィルス、Ａ型肝炎及びＢ型肝炎、麻疹、髄膜炎、おたふく風邪、百日咳、天然痘、肺炎球菌性肺炎、ポリオ、狂犬病、風疹、破傷風、虫垂炎、腸チフス、水痘帯状ヘルペス、百日咳、黄熱病、アジソン病由来のイムノゲン及び抗原、アレルギー、過敏症、ブルートン症候群（Bruton's syndrome）固形及び血液由来の腫瘍を含んだがん、湿疹、橋本甲状腺炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、後天性免疫不全、腎臓、心臓、すい臓、灰、骨、及び肝臓などの移植拒否反応、グラベス病、多内分泌腺腫症、肝臓炎、顕微鏡的多発性動脈炎、顕微鏡的結節性多発動脈炎、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変症、悪性貧血、セリアック病、抗体性腎炎、糸球体腎炎、リューマチ、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、血清反応陰性脊椎関節症、鼻炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症、硬化性胆管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、疱疹状皮膚炎、乾癬、白斑、多発性硬化症、脳脊髄炎、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、筋無力症候群、強膜（sclera）、上強膜（episclera）、ブドウ膜炎、慢性粘膜皮膚カンジダ症、じんましん、乳児一過性低ガンマグロブリン血症、骨髄腫、Ｘ連鎖高Ｉｇｍ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、類でんぷん症、慢性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、マラリアのスポロゾイト周囲タンパク、微生物抗原、ウイルス抗原、自己抗原、及びリステリア症。
【００３９】
他の実施形態では、本発明で用いられる腫瘍抗原としては、これらに限定されるものではないが、次のものがある。ＭＡＧＥ１（例えば、遺伝子銀行アクセス番号Ｍ７７４８１）、ＭＡＧＥ２（例えば、遺伝子アクセス番号Ｕ０３７３５）、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４等を含め、様々なＭＡＧＥｓ（メラノーマ関連抗原Ｅ）の任意のもの、様々なチロシナーゼの任意のもの、変異ラス、変異ｐ５３（例えば、遺伝子アクセス番号Ｍ１２１５４）。他の腫瘍特異的な抗原には次のものが含まれる。進行がん関連のＲａｓペプチド及びｐ５３、子宮頸がん関連のＨＰＶ  １６／１８及びＥ６／Ｅ７抗原、乳がん関連のＭＵＣ１−ＫＬＨ抗原（例えば、遺伝子銀行アクセス番号Ｊ０３６５１）、結腸直腸がん関連のＣＥＡ（がん胎児性抗原）（例えば、遺伝子銀行アクセス番号Ｘ９８３１１）、ｇｐ１ＯＯ（例えば、遺伝子銀行アクセス番号Ｓ７３００３）、又はメラノーマ関連のＭＡＲＴ１抗原、及び前立腺がん関連のＰＳＡ抗原（例えば、遺伝子銀行アクセス番号Ｘ１４８１０）。ｐ５３配列は公知であり「例えば、Harris et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:4650-4656参照」、遺伝子銀行のアクセス番号Ｍ１４６９４で示されている。Ｈｅｒ−２／Ｎｅｕ（例えば、遺伝子銀行アクセス番号１６７８９．１、Ｍ１６７９０．１、Ｍ１６７９１．１、Ｍ１６７９２．１）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（例えば、遺伝子銀行アクセス番号Ｕ８７４５９）、ｈＴＥＲＴ（別名テロメラ―ゼ）（遺伝子銀行アクセス番号ＮＭ００３２１９（１型）、ＮＭ１９８２５５（２型）、ＮＭ１９８２５３（３型）、及びＮＭ１９８２５４（４型）、プロテイナーゼ３（例えば、遺伝子銀行アクセス番号Ｍ２９１４２、Ｍ７５１５４、Ｍ９６８３９、Ｘ５５６６８、ＮＭ００２７７、Ｍ９６６２８及びＸ５６６０６）、ＨＰＶ  Ｅ６及びＥ７（例えば、遺伝子銀行アクセス番号ＮＣ００１５２６）及びＷＴ−１（例えば、遺伝子アクセス番号ＮＭ０００３７８（Ａ型）、ＮＭ０２４４２４（Ｂ型）、ＮＭ０２４４２５（Ｃ型）、及びＮＭ０２４４２６（Ｄ型））。したがって、本発明は、それらに限定されないが、次のがんに対して免疫療法として用いることができる。子宮頸がん、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、肺がん及びメラノーマ。
【００４０】
他の実施形態では、抗原は、次に記載の感染症の中からその１つに由来している。麻疹、おたふく風邪、風疹、ポリオ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎（例えば、遺伝子銀行アクセス番号Ｅ０２７０７）、及びＣ型肝炎（例えば、遺伝子銀行アクセス番号Ｅ０６８９０）、さらに他の肝炎ウイルス、インフルエンザ、アデノウイルス（例えば４型及び７型）、狂犬病（遺伝子銀行アクセス番号Ｍ３４６７８）、黄熱、日本脳炎（例えば、遺伝子銀行アクセス番号Ｅ０７８８３）、デング熱（例えば、遺伝子アクセス番号Ｍ２４４４４）、ハンタウイルス、及びＨＩＶ（例えば、遺伝子銀行アクセス番号Ｕ１８５５２）。細菌及び寄生虫の抗原は、それらに限定されないが、次の疾病の原因となる公知の病原因子から由来する。ジフテリア、百日咳（例えば、遺伝子銀行アクセス番号Ｍ３５２７４）、破傷風（例えば、遺伝子銀行アクセス番号Ｍ６４３５３）、虫垂炎、細菌性及び菌性肺炎（例えば、インフルエンザ菌、ニューモシスティス・カリニなど）、コレラ、腸チフス、ペスト、細菌性赤痢、サルモネラ中毒（例えば、遺伝子銀行アクセス番号Ｌ０３８３３）、レジオネラ症、ライム病（例えば、遺伝子銀行アクセス番号Ｕ５９４８７）、マラリア（例えば、遺伝子銀行アクセス番号Ｘ５３８３２）、十二指腸虫症、オンコセルカ症（例えば、遺伝子銀行アクセス番号Ｍ２７８０７）、住血吸虫症（例えば、遺伝子銀行アクセス番号Ｌ０８１９８）、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、ランブル鞭毛虫症（例えば、遺伝子銀行アクセス番号Ｍ３３６４１）、アメーバ症、フィラリア症（例えば、遺伝子銀行アクセス番号Ｊ０３２６６）、ボレリア症、及び旋毛虫病。
【００４１】
上記の抗原は、本発明の異なる実施形態を表す。
【００４２】
ある実施形態では、本発明のＤＮＡワクチンの利点は、この機構を任意のコピー数のプラスミドに用いることができるということである。他の実施形態では、本発明のＤＮＡワクチンは、代替的なリプレッサー・ティトレーションシステム（repressor titration system）のように高コピープラスミドに限定されない。他の実施形態では、その利点は、潜在的に有毒となりえる量のＤ−アラニン導入の不要である。各可能な形態は、本発明の実施形態である。
【００４３】
他の実施形態では、本発明は、本発明のＤＮＡワクチン、薬学的に許容される担体、アプリケーター（applicator）、及びその使用のためのインストラクション材を含む一式を提供する。
【００４４】
他の実施形態では、本発明は、本発明のＤＮＡワクチン、アプリケーター、及びその使用のためのインストラクション材を含む一式を提供する。
【００４５】
「アラニンラセマーゼ」は、ある実施形態では、アミノ酸アラニンのＬ−異性体をＤ−
異性体に変換する酵素を意味する。他の実施形態では、そのような酵素は、ＥＣ番号５．１．１．１．として知られている。
【００４６】
「アミノ酸代謝酵素」は、ある実施形態では、これらに限定されるものではないが、例えば、アミノ酸の原子の空間的配置を変更する、アミノ酸を加水分解する、又はアミノ酸に基を付加する、アミノ酸を分裂させるなどのように、アミノ酸を１つの形態から他の形態へ変換する機能的役割を有するペプチド又はタンパクを意味する。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００４７】
「栄養要求性細菌」は、ある実施形態では、その成長又は複製を可能にする因子なしでは、成長又は複製することができない細菌株を意味する。各可能な要素は、本発明の異なる実施形態を表す。
【００４８】
「融合タンパク」は、ある実施形態では、互いに連結された２つ又はそれ以上のタンパクを含むタンパクを意味する。ある実施形態では、前記２つ以上のタンパクは、ペプチド結合によって連結される。他の実施形態では、前記２つ以上のタンパクは、他の化学結合によって連結される。他の実施形態では、前記２つ以上のタンパクは、前記２つ以上のタンパクの間にある、スペーサと呼ばれる１つ又はそれ以上のアミノ酸によって連結される。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００４９】
「相同性（homologous）」は、ある実施形態では、２つの高分子間（例えば、２つの核酸分子、２つのＤＮＡ分子若しくは２つのＲＮＡ分子の間、又は、２つのポリペプチド分子の間）のサブユニット配列の類似性を意味する。２つの分子におけるサブユニット位置が同じ単量体サブユニットによって占められる場合（例えば、２つのＤＮＡ分子の同じ位置がアデニンによって占められている場合）は、それらは、その位置において相同である。他の実施形態では、２つの配列の間での相同性は、一致する数又は相同位置と直接的な関数関係にある。例えば、２つの化合物配列における位置の半分（全長１０個のサブユニットを有するポリマーにおける５つの位置）が相同である場合、前記２つの配列は５０％相同である。また、前記位置の９０％（例えば、１０の内の９）が一致する又は相同である場合は、前記２つの配列は９０％の相同性を共有する。一例としては、ＤＮＡ配列３´ＡＴＴＧＣＣ５´及び３´ＴＡＴＧＧＣは、５０％の相同性を有する。他の実施形態では、「相同性」は、「同一性（identity）」と同義に使われる。他の実施形態では、「相同性」又は「同一性」という用語は、核酸及びタンパクについて使用される場合は、核酸及びアミノ酸配列レベルの両方の「相同性」又は「同一性」に適用されると解釈されるものとする。
【００５０】
他の実施形態では、「遺伝子」及び「組み換え遺伝子」は、本発明のポリペプチドをエンコードするオープン・リーディング・フレームを含んでいる核酸分子を意味する。そのような自然的な対立遺伝子変異は、所定の遺伝子のヌクレオチド配列において、一般的に１〜５％の相違を生じさせることができる。別の対立遺伝子は、様々な異なる人間又は生物の目的の遺伝子を配列決定することにより、同定することができる。これは、様々な人間又は生物における同一の遺伝子座を同定するための交配プローブを使用することにより、容易に実行することができる。そのようなヌクレオチド変異の任意及び全て、並びに、結果として生じるアミノ酸の多型又は変異物（これらは自然的な対立遺伝子変異の結果として生じ、機能活性は変化しない）は、本発明の範囲内であると見なされる。
【００５１】
２つのポリヌクレオチドが「作用可能に連結している」という記載は、ある実施形態では、一本鎖又は二本鎖核酸部分に、２つのポリヌクレオチドが、２つのポリヌクレオチドの少なくとも１つのポリヌクレオチドが他方に対して特異的な生理学的効果を発揮できるように配列されることを意味する。一例としては、遺伝子のコード領域に対して作用可能に連結したプロモータは、前記コード領域の転写を促進することができる。
【００５２】
「プロモータ／制御配列」は、ある実施形態では、プロモータ／制御配列に作用可能なように連結した遺伝子産物の発現に必要である核酸配列、又はその発現を促進する核酸配列を意味する。他の実施形態では、前記配列は、コアプロモータ配列である。他の実施形態では、前記配列は、遺伝子産物の発現に必要な、エンハンサ配列及び他の制御要素も含む。
【００５３】
当業者は、本明細書において示されている情報および方法を得れば、異なった転写因子、ターミネータ、担体ベクター又は特定の遺伝子配列（例えば、市販されている商業ベクターにあるようなもの）が本発明の方法及び組成におけるＤＮＡワクチンにうまく用いることができると直ちに理解する。本発明において考えられているように、これらの機能は、例えば、ｐＵＣシリーズとして知られる市販のプラスミドによって提供されている。他の実施形態では、不必要なＤＮＡ配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）は取り除かれている。
【００５４】
他の実施形態では、本発明において、市販のプラスミドが用いられている。そのようなプラスミドは、例えば、「Invitrogen(La Jolla, CA)」、「Stratagene (La Jolla, CA)」、「Clontech (Palo AIto, Cod)」のような様々なソースからの購入が可能であり、又は当該技術分野では公知の方法を用いて構築することができる。他の実施形態はｐＣＲ２．１（Invitrogen, La Jolla, CA）のようなプラスミドであり、それは、真核生物内での発現を促進するために、真核生物由来複製起点及びプロモータ／制御要素を有する真核生物発現ベクターである。他の実施形態では、プラスミドを縮小し、かつ外部の核酸配列領域に配置される可能性のあるカセット（cassette）を増大するために、前記外部の核酸配列は除去されている。
【００５５】
他の実施形態では、これらに限定されないが、制限酵素による切断、抗生物質耐性遺伝子発現のプロモータの除去、抗生物質耐性遺伝子の部分制限切断、点突然変異、挿入突然変異などの当該技術分野では公知されているあらゆる方法を用いて抗生物質耐性遺伝子は除去されている。
【００５６】
市販されているプラスミドは、例えば「Invitrogen（La Jolla）」のような様々なソースからの購入が可能である。他の実施例では、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）のような市販プラスミドが用いられており、前記市販プラスミドは本発明の方法に従って増幅できるように原核生物由来の複製起点を保有した原核生物発現ベクターである。他の実施例では、プラスミドＤＮＡワクチンを縮小するため、及び外部の核酸配列領域に配置される可能性のあるカセットを増大するために、前記外部の核酸配列が除去されている。他の実施例では、ヒトゲノムにおける相同的組換え及び挿入変異を防ぐため、ヒト又は他の動物のゲノムと相同的な配列が除去されている。他の実施例では、前記市販プラスミドはその後、栄養要求性細菌でのＤＮＡワクチンプラスミドを増幅させるために用いられる。
【００５７】
このような方法は、当該技術分野では公知であり、例えば、「Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York」及び「Ausubei et al., 1997, Current Protocols in Molecular Biology, Green & Wiley, New York」に開示されている。
【００５８】
抗生物質耐性遺伝子は、分子生物学及びワクチンの調製で一般的に用いられる従来の選択とクローニングの過程で使用されている。本発明で考えられる抗生物質耐性遺伝子には、それらに限定されないが、次のものがある。アンピシリン、ペニシリン、メチシリン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール（CAT）、ネオマイシン、ヒグロマイシン、ゲンタマイシン及びその他の当該技術分野では公知の抗生物質に対する耐性をもたらす遺伝子産物。
【００５９】
プラスミドにおける抗生物質耐性遺伝子を除去又は不活化する方法は当該技術分野では公知である。ある実施形態では、プラスミドＤＮＡワクチンの抗生物質耐性遺伝子における制限部位は、「New England Biolabs (Beverly, MA)」市販の「NEB cutter v 1.0」プログラムを用いて同定される。その後、抗生物質耐性遺伝子は、同定された制限部位に特異的に作用する制限酵素を用いて切断され、その結果、２つの制限部位間の核酸は除去される。適切な酵素による制限処理の後、プラスミドＤＮＡワクチンは、再連結又は平滑末端で最連結され、そのため、抗生物質耐性遺伝子は不活化する。他の実施形態では、プラスミドＤＮＡワクチンが複数の抗生物質耐性遺伝子を含む場合、この方法は複数回行われる。他の実施形態では、抗生物質耐性遺伝子のプロモータを不活化するために類似した方法が用いられる。したがって、抗生物質耐性遺伝子のプロモ―タ／制御部分は制限処理により切断され、それ故、抗生物質耐性遺伝子の発現は、制限、阻害、又は停止される。
【００６０】
バクテリアを形質転換する方法は、当該技術分野では公知であり、例えば、塩化カリシウムによるコンピテント細胞に基づく方法、エレクトロポレーション法、バクテリアファージ媒介形質導入、化学的、及び物理学的形質転換技術などがある(de Boer et al., 1989, Cell 56:641649; Miller et al, 1995, FASEB J., 9:190-199, Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York; Ausubel et al., 1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, Gerhardt et al., eds., 1994, Methods for General and Molecular Bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, DC; Miller, 1992, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring EIarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)。ある実施形態では、本発明の栄養要求性細菌株は、エレクトロポレーションを用いて形質転換される。各可能な形態は、本発明の異なる実施形態である。
【００６１】
本発明で有用なプラスミド及び他の発現ベクターは、本明細書の他の部分で説明されており、プロモータ／制御配列、グラム陰性及びグラム陽性細菌の複製起点、融合タンパクをエンコードしている単離核酸、及びアミノ酸代謝遺伝子をエンコードしている単離核酸としての特徴を有し得る。さらに、融合タンパク及びアミノ酸代謝遺伝子をエンコードしている単離核酸は、前記単離核酸の発現を促進するのに適切なプロモータを有し得る。細菌系における発現を促進するのに有用なプロモータは、当該技術分野では公知であり、例えば、バクテリオファージ・ラムダ、ｐＢＲ３２２のベータ・ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモータ、及びｐＢＲ３２５のクロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモータがある。原核生物プロモータのさらなる例としては、例えば、バクテリオファージ・ラムダの（ＰＬ及びＰＲ）の主要な右及び左プロモータ、大腸菌のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ｌａｄ及びｇａｌプロモータ、Ｂ．ズブチリスのアルファ・アミラーゼ（Ulmanen et al., 1985. J. Bacteriol. 162:176-182）及びＳ２８−特異的プロモータ（Gilman et al., 1984 Gene 32:11-20）、バチルスのバクテリオファージのプロモータ（Gryczan, 1982, In: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc., New York）、及びストレプトミセス・プロモータ（Ward et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 203:468-478）がある。本発明で検討されているさらなる原核生物プロモータは、例えば、「Glick, 1987, J. Ind. Microbiol. 1:277-282」、「Cenatiernpo, 1986, Biochimie. 68:505-516」、及び「Gottesman, 1984, Ann. Rev. Genet. 18:415-442」に開示されている。
【００６２】
本発明の方法及び組成におけるＤＮＡワクチンのプラスミドで発現する遺伝子としては、ある実施形態では、栄養要求性変異株を補うタンパクをエンコードしている単離核酸がある。他の実施形態では、栄養要求性細菌が細菌増殖に必要なビタミン合成遺伝子（例えば、パントテン酸）をエンコードしている遺伝子を欠失している場合、前記プラスミドＤＮＡワクチンは、パントテン酸合成のためのタンパクをエンコードしている遺伝子を含む。したがって、プラスミドで前記遺伝子を発現しない栄養要求性細菌はパントテン酸を欠いた状態で増殖することができないのに対して、プラスミドで前記遺伝子を発現する場合は、栄養要求性細菌はパントテン酸を欠いた状態で増殖することができる。
【００６３】
他の実施形態では、前記プラスミドは、アミノ酸代謝酵素をエンコードしている遺伝子を含む。前記酵素は、アミノ酸を細菌増殖及び複製プロセス（例えば、細胞壁合成、タンパク合成、脂肪酸代謝など）に使用できるようにするために、前記アミノ酸を代謝させる。他の実施形態では、栄養要求性細菌は、細胞壁組成成分であるＤ−グルタミン酸のためのアミノ酸代謝酵素を欠いている。Ｄ−グルタミン酸合成は、Ｄ−ｇｌｕ＋ｐｙｒからアルファ・ケトグルタル酸＋Ｄ−ａｌａへの変換の際、及びその逆反応の際に関与するＤアミノ酸トランスフェラーゼ遺伝子によって制御される。Ｄ−グルタミン酸合成は、ｄｇａ遺伝子によっても制御される。また、Ｄ−グルタミン酸合成における欠陥のある栄養要求性変異株は、Ｄ−グルタミン酸が無い状態では増殖しない（Pucci et al, 1995, J Bacteriol. 177: 336-342）。さらなる例は、ジアミノピメリン酸の合成に関与する遺伝子を含む。そのような合成遺伝子は、ベータ・セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼをエンコードし、不活性されたときは、変異株栄養要求性を、これの合成経路に与える（Sizemore et al., 1995, Science 270: 299-302）。
【００６４】
本発明の組み換えタンパクは、他の実施形態では、組み換えＤＮＡ技術を用いて合成される。この技術は、ある実施形態では、融合タンパクをエンコードするＤＮＡ配列を作成するステップと、そのＤＮＡを、特定のプロモータ／制御部位の制御下にある発現カセット（例えば本発明のプラスミドなど）に挿入するステップと、タンパクを発現させるステップとを含む。本発明の融合タンパク（例えば、非溶血性ＬＬＯ／抗原）をエンコードしているＤＮＡは、例えば「Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90-99」のホスホトリエステル法、「Brown et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:109-151」のホスホジエステル法、「Beaucage et al., 1981, Tetra. Lett. 22:1859-1862」のジエチルホスホラミダイト法、及び米国特許第４，４５８，０６６号の固相支持法（solid support method）などの、適切な配列のクローニングや制限、又は直接的な化学合成などの任意の適切な方法によって作成される。
【００６５】
他の実施形態では、化学合成は、一本鎖オリゴヌクレオチドを作成するのに使用される。様々な実施形態では、この一本鎖オリゴヌクレオチドは、相補配列とのハイブリッド形成によって、又はその一本鎖を鋳型として使用し、ＤＮＡポリメラーゼと重合することによって二本鎖オリゴヌクレオチドに変換される。ＤＮＡの化学合成は約１００の塩基の配列に限定されるため、長い配列は短い配列の連結によって得られることは、当業者であれば理解できるであろう。他の実施形態では、部分配列は複製され、適切な部分列は、適切な制限酵素を使用して切断される。その断片は、所望するＤＮＡ配列を作成すべく、その後連結される。
【００６６】
他の実施形態では、本発明の融合タンパク又は組み換えタンパクをエンコードしているＤＮＡは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction：ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅法を用いて複製される。したがって、非溶血性ＬＬＯの遺伝子は、適切な制限酵素認識部位を含んでいるセンス・プライマーと他の制限部位（例えば、クローニングを簡単するための同一でない制限酵素認識部位）を含んだアンチセンス・プライマーを使用してＰＣＲによって増幅される。抗原をエンコードしている単離核酸についても同様なことが行われる。非溶血性ＬＬＯ配列と抗原配列とを連結する、かつその配列をプラスミド又はベクターへ挿入することにより、抗原の末端に結合した非溶血性ＬＬＯをエンコードするベクターができる。２つの分子は、直接的に、又は制限酵素認識部位によって導入される短いスペーサを介して結合される。
【００６７】
他の実施例では、分子は１つ又は複数のアミノ酸を有するペプチド・スペーサにより分離されている。一般的に、スペーサは、タンパクの連結、又はタンパクの間の最小距離あるいは他の空間的な関係の維持以外には、生物学的な活性を有しない。しかし、スペーサを構成するアミノ酸は、折りたたみ、正味荷電、又は疎水性のような分子の特性を影響するように選択される場合もある。他の実施形態では、プラスミドはさらに、プロモータのさらなる要素、並びにリボソーム結合部位、及び転写終結シグナルを含む。他の実施形態では、制御配列は、例えば、イムノグロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus）など由来のプロモータ及びエンハンサ、並びにポリアデニルカ化配列を含む。他の実施形態では、制御配列はスプライス・ドナー及び受容体配列を含む。
【００６８】
これら及び他の疾病の抗原は、当該技術分野では公知であり、当業者は、本明細書に示されている情報、及び方法を理解すれば、非溶血性ＬＬＯタンパクと抗原を含んだ融合タンパクを本発明に用いるために簡単に構築することができる。他の実施形態では、プラスミドを含んだ栄養要求性細菌を選択するために形質転換された栄養要求性細菌は、アミノ酸代謝遺伝子の発現を選択できる培地で培養される。例えば、ある実施形態では、Ｄ−グルタミン酸要求性細菌株は、Ｄ−グルタミン酸合成の遺伝子を含んだプラスミドで形質転換される。前記細菌株はＤ−グルタミン酸を欠いた状態で培養され、そこでは、前記プラスミドによる形質転換をしていない細菌株、又はＤ−グルタミン酸合成のためのタンパクをエンコードするプラスミドが発現していない細菌株は生育しない。他の実施形態では、Ｄ−アラニン要求性細菌は、本発明のプラスミドがＤ−アラニン合成のためのアミノ酸代謝酵素をエンコードする単離された核酸を含む場合、そのプラスミドで形質転換され、Ｄ−アラニンを欠いた状態で培養される。必要な生育因子、栄養、アミノ酸、ビタミン、抗生物質などを含んだ又は欠いた適切な培地を作成するそのような方法は、当該技術分野では公知であり、そして市販されている（Becton-Oickinson, Franklin Lakes, NJ）。各方法は、本発明の異なる実施形態を表す。
【００６９】
他の実施形態では、本発明のプラスミドを含んだ栄養要求性細菌が選択されたとき、前記細菌は選択圧下で繁殖させられる。このような繁殖方法は、必須栄養欠損状態で細菌を培養するステップを含む。栄養要求性細菌内でアミノ酸代謝酵素を発現するプラスミドが存在することにより、その細菌と共にそのプラスミドは複製するため、そのプラスミドを有する細菌の持続的な選択が確実となる。当業者が本明細書に示されている情報及び方法を理解すれば、前記プラスミドを含んだ栄養要求性細菌が生育している培地の量を調節することでＤＮＡワクチンの生産を増加させることができる。
【実施例】
【００７０】
実施例１：抗生物質耐性遺伝子の代わりにアミノ酸代謝酵素遺伝子を含んだプラスミドは、インビボ及びインビトロで栄養要求性細菌に保持される。
【００７１】
［材料及び実験方法］
【００７２】
（形質転換及び選択）
【００７３】
大腸菌ＭＢ２１５９は標準的な手順を用いて形質転換に使用された。細菌細胞は、エレクトロポレーションのためにＨ２Ｏで洗浄処理した。
【００７４】
（細菌の培養及び大腸菌のインビボ継代培養）
【００７５】
標準的な方法で大腸菌は培養された。増殖速度を判断するために、細菌は抗生物質を含んだ１０ｍｌのＬＢ培地で培養された。ＯＤ６００ｎｍを測定し、株間における培養密度を標準化した。前記培養物は、適切な抗生物質及びＤ−アラニンを含んだＬＢ培地（該当する場合）に、１：５０に希釈した。
【００７６】
（抗生物質耐性因子欠失プラスミドｐＴＶ３の構築）
【００７７】
ｐＧＧ５５のサブ・クローニングの開始点は、プラスミドｐＤＰ１６５９であった。ｐＤＰ１６５９は、上流制御配列及びプロモータと共に、ＬＬＯ最初の４２０のアミノ酸をエンコードするゲノムＤＮＡ断片をＰＣＲ（ポリメラ―ゼ連鎖反応）で増幅させ、その断片をｐＵＣ１９に連結することで作成された。ＮＰ抗原をエンコードするＤＮＡ断片は、Dr. Peter Palese提供のｐＡＰＲ５０１プラスミドを鋳型としてＰＣＲで増幅され、イン・フレーム翻訳融合（in-frame translational fusion）としてｐＵＣ１９のＬＬＯ断片下流に連結された。融合タンパクは、その後、グラム陰性及びグラム陽性細菌の両方に複製することができるシャトルベクターであるｐＡＭ４０１にサブ・クローニングされた（Wirth R. An FY, Clewell DB. Highly efficient protoplast transformation system for Streptococcus faecalis and a new Escherichia coli-S. faecalis shuttle vector. J Bacteriol 165(3): 831-6, 1986）。ｈｌｙプロモータ及び遺伝子断片は、５´−ＧＧＧＧＧＣＴＡＧＣＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴＴＡＧＴＡＴＡＴＴＣ−３´（SEQ ID NO:3）プライマー及び５´−ＣＴＣＣＣＴＣＧＡＧＡＴＣＡＴＡＡＴＴＴＡＣＴＴＣＡＴＣ−３´（SEQ ID NO:4）プライマーを使用して作成された。
【００７８】
次に、プラスミドｐＤＰ２０２８は、ｐｒｆＡ遺伝子をｐＤＰ１６５９のＳａｌＩ部位にクローニングすることで構築された。ｐｒｆＡ遺伝子は次のプライマーを使用して増幅された。
【００７９】
５´−ＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＴＧＡＣＣＧＡＣＡＡＧＴＧＡＴＡＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＴＡＡＡＴＡＡＡＴＣＣＧＴＴＴ−３´（SEQ ID NO:5）、及び
【００８０】
５´−ＣＣＣＧＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧ−３´（SEQ ID NO:6）。
【００８１】
次に、ｐＧＧ３４はｐＤＰ２０２８とｐＧＧ４９から作成された。ｐＧＧ４９は、ｈｌｙ−プロモータ、ＨＩＶｇｐ７０と融合したＬＬＯ断片のＮ末端をエンコードする遺伝子、及びリステリアのｐｒｆＡ遺伝子を含むインサートを有する。ｐＧＧ４９は、インサートを除去するためにＮｈｅ１及びＳａＩＩで切断され、そのインサートは、ｐＧＧ３４を産生すべくＸｂａ１及びＳａＩＩで切断されたｐＤ２０２８に連結された。
【００８２】
そこで、ｐＧＧ５５は次のようにｐＧＧ３４から作成された。ヒト乳頭腫ウイルスＥ７遺伝子は、５´−ＧＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣ−３´（SEQ ID NO:1）プライマー及び５´−ＧＧＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡ−３´（SEQ ID NO:2）プライマーを使用してＰＣＲ増幅され、ＸｈｏＩ及びＳｐｅＩ（New England Biolabs, Beverly, MA）で切断され、同様に切断されたｐＧＧ３４に連結された。その結果、Ｅ７遺伝子は、ＸｈｏＩの上流に位置するｈｌｙ遺伝子と融合する。結果として生じたプラスミドｐＧＧ５５は、ｈｌｙ、Ｅ７抗原及びｐｒｆＡの多遺伝子カセットを含む。ｈｌｙプロモータは、Ｅ７遺伝子のＸｈｏＩ部位で結合しているｈｌｙ遺伝子産物であるＬＬＯにおける最初の４４１アミノ酸の発現を促進する。ＬＬＯの溶血性Ｃ末端を除去することにより、融合タンパクの溶血活性は中和されている。多能性転写因子であるｐｒｆＡもまた、ｐＧＧ−５５に含まれており、その発現は、自身の天然プロモータによって引き起こされる。
【００８３】
（ｐ６０アラニンラセマーゼ・セットの構築）
【００８４】
次に、アラニンラセマーゼ遺伝子に融合し、かつ切断されたｐ６０プロモータが構築された。ＬＭアラニンラセマーゼ（ｄａｌ）遺伝子（順方向プライマー：５´−ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ＧＣＴ  ＧＧＣ  ＡＴＣ−３´； SEQ ID NO:8、逆方向プライマー：５´−ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＣＴＡ  ＡＴＧ  ＧＡＴ  ＧＴＡ  ＴＴＴ  ＴＣＴ  ＡＧＧ−３´； SEQ ID NO:9）、及び最小限のｐ６０プロモータ配列（順方向プライマー：５´−ＴＴＡ  ＡＴＴ  ＡＡＣ  ＡＡＡ  ＴＡＧ  ＴＴＧ  ＧＴＡ  ＴＡＧ  ＴＣＣ−３´； SEQ ID NO:22、逆方向プライマー：５´−ＧＡＣ  ＧＡＴ  ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＡＡＡ  ＡＣＴ  ＣＣＴ  ＣＴＣ−３´； SEQ ID NO:23）は、ＬＭ株１０４０３ＳのゲノムからＰＣＲ増幅法によって単離された。前記プライマーは、その後のＳＯＥ（splice overlap extension）-ＰＣＲ法によるｐ６０及びアラニンラセマーゼの融合のために、ｐ６０配列の上流にＰａｃＩ部位を、アラニンラセマーゼ配列の下流にＮｈｅＩ部位（太字の制限酵素認識部位）を、並びにｐ６０プロモータの下流に重複アラニンラセマーゼ配列（最初の１８ｂｐ）を導入した。切断されたｐ６０プロモータ配列は、ＣＡＡＡＴＡＧＴＴＧＧＴＡＴＡＧＴＣＣＴＣＴＴＴＡＧＣＣＴＴＴＧＧＡＧＴＡＴＴＡＴＣＴＣＡＴＣＡＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＡＧＧＴＧＡＡＡＡＣＴＧＧＧＴＡＡＡＣＴＴＡＧＴＡＴＴＡＴＣＡＡＴＡＴＡＡＡＡＴＴＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡＴＡＣＴＴＡＡＴＴＡＣＧＴＡＣＴＧＧＧＡＴＴＴＴＣＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＣＣ（SEQ ID NO:7,Kohler et al,J Bacteriol 173:4668-74,1991）である。ＳＯＥ−ＰＣＲ法を用いて、ｐ６０及びアラニンラセマーゼＰＣＲ産物は融合され、クローニングベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen, La Jolla, CA）内にクローニングされた。
【００８５】
（ｐＧＧ５５からの抗生物質耐性遺伝子の除去）
【００８６】
ｐＧＧ５５からのクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子の除去、及びｐ６０アラニンラセマーゼ・カセットの導入のための次のクローニング戦略により、グラム陽性複製起点をも除去する結果になった(oriRep; Brantl et I al., Nucleic Acid Res 18: 4783-4790, 1990)。グラム陽性ｏｒｉＲｅｐを再導入するために、ｏｒｉＲｅｐは、配列（ＧＣＴＡＧＣＣＡＧＣＡＡＡＧＡＡＡＡＡＣＡＡＡＣＡＣＧ，SEQ ID NO:11）の上流にＮａｒＩ／ＥｈｅＩ部位を付加された５´プライマー及び配列（ＧＣＴＡＧＣＣＡＧＣＡＡＡＧＡＡＡＡＡＣＡＡＡＣＡＣＧ，SEQ ID NO: 11）の下流にＮｈｅＩ部位を付加された３´プライマーを使用してｐＧＧ５５からＰＣＲ増幅された。そのＰＣＲ産物は、クローニングベクターｐＣＲ２．１内にクローニングされ、配列は確認された。
【００８７】
ｐ６０アラニンラセマーゼ配列をｐＧＧ５５ベクターに導入するために、ｐ６０アラニンラセマーゼ発現カセットは、ＰａｃＩ／ＮｈｅＩの２重切断でｐＣＲ−ｐ６０アラニンラセマーゼから切除された。ｐＧＧ５５におけるグラム陽性バクテリアの複製領域は、さらなるＥｈｅＩ及びＮｈｅＩの制限部位を導入するためにＰＣＲ（プライマー１：５´−ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＧＧＴ  ＣＡＣ  ＣＧＧ  ＣＧＣ  ＣＡＣＴＡＡ  ＣＴＣ  ＡＡＣ  ＧＣＴ  ＡＧＴ  ＡＧ−３´； SEQ ID NO:21、プライマー２：５´−ＴＴＡ  ＡＴＴ  ＡＡＧ  ＣＴＡ  ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＡＡＡ  ＣＡＡ  ＡＣＡ  ＣＧ−３´，SEQ ID No:21）によってｐＣＲ−ｏｒｉＲｅｐから増幅された。そのＰＣＲ産物はｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（Invitrogen, Carlsbad, Calif）に連結され、その配列は確認された。その複製領域はＥｈｅＩ／ＮｈｅＩによって切断され、かつベクターｐＧＧ５５はＥｈｅＩ及びＮｈｅＩで２重切断され、同時にプラスミドからＣＡＴ遺伝子が除去された。２つインサート、ｐ６０アラニンラセマーゼ及びｏｒｉＲｅｐ、並びにｐＧＧ５５断片は連結され、ｐＴＶ３を産出した。
【００８８】
（リアルタイムＰＣＲのためのＤＮＡの調整）
【００８９】
全てのＤＮＡは、Masterpure Total DNA キット(Epicentre, Madison, Wl)を用いて調製された。簡単に説明すると、細菌は２５ｍｌのルリアー・ベルターニ（Luria-Bertani：ＬＢ）培地内で、３７℃において２５０ｒｐｍで攪拌されながら２４時間培養された。細菌細胞は、遠心分離により沈殿させられ、５ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含んだＰＢＳに再懸濁され、２０分間３７℃でインキュベートされ、その後、ＤＮＡは単離された。
【００９０】
リアルタイムＰＣＲのための標準な標的ＤＮＡを得るために、ＬＬＯ−Ｅ７遺伝子は、ｐＧＧ５５（５´−ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＴＧＣＴＡＧＴＴＴＴＴＡＴＴＡＣ−３´；SEQ ID NO:12、５´−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧ−３´；SEQ ID NO:13）からＰＣＲ増幅され、ｐＥＴｂｌｕｅ１（Novagen, San Diego, CA)にクローニングされた。同様に、ｐｌｃＡアンプリコンはｐＣＲ２．１にクローニングされた。大腸菌は、ｐＥＴ−ＬＬＯＥ７及びｐＣＲ−ｐｌｃＡで形質転換され、リアルタイムＰＣＲでの使用のため、プラスミドＤＮＡは精製され、調整された。
【００９１】
（リアルタイムＰＣＲ）
【００９２】
Taqmanプライマ―プローブセット（Applied Biosystems, Foster City, CA）は、プラスミド標的としてのＥ７に対する次のプライマー、５´−ＧＣＡＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴＣＧ−３´（SEQ ID NO:14）、５´ＴＧＣＣＣＡＴＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＴＣＣＡ−３´（SEQ ID NO:15）、５´−ＦＡＭ−ＴＧＣＧＴＡＣＡＡＡＧＣＡＣＡＣＡＣＧＴＡＧＡＣＡＴＴＣＧＴＡＣ―ＴＡＭＲＡ−３´（SEQ ID NO:16）、及びゲノム標的としての単一コピー遺伝子ｐｌｃＡのプライマー、ＴＧＡＣＡＴＣＧＴＴＴＧＴＧＴＴＴＧＡＧＣＴＡＧ−３´（SEQ ID NO:17）、５´−ＧＣＡＧＣＧＣＴＣＴＣＴＡＴＡＣＣＡＧＧＴＡＣ−３´（SEQ ID NO:18）、５´−ＴＥＴ−ＴＴＡＡＴＧＴＣＣＡＴＧＴＴＡＴＧＴＣＴＣＣＧＴＴＡＴＡＧＣＴＣＡＴＣＧＴＡ−ＴＡＭＲＡ−３´（SEQ ID NO:19）と共に、ABI PrimerExpressソフトウエア（Biosystems）を使用して設計された。
【００９３】
０．４μＭプライマー及び０．０５ｍＭプローブは、製造業者の提言を受けて、ＰｕＲＥ  ＴａｑＰＣＲビーズ（Amersham, Piscataway, NJ）と混合された。精製されたプラスミドＤＮＡ、ｐＥＴ−ＬＬＯＥ７及びｐＣＲ−ｐｌｃＡを有する各標的について、標準的な曲線が作成され（内部標準）、未知のサンプルの遺伝子コピー数を計算するのに使用された。Ｅ７コピー／ｐｌｃＡコピーの平均割合は、標準曲線に基づいて計算された。全てのサンプルは３通り作成され、それらのｑＰＣＲ分析は３回繰り返された。サンプル間の変動は、ＫｙＰｌｏｔソフトウエアを使用して、２要因の分散分析（two-way ANOVA）によって分析された。ｐ＜０．０５であれば、結果は、統計的に有意であると見なされた。
【００９４】
（生育量測定）
【００９５】
細菌は、＋／−１００マイクログラム（μｇ）／ｍｌ Ｄ−アラニン及び／又は３７μｇ／ｍｌクロラムフェニコールが添加されたＬＢ培地内で、３７℃、２５０ｒｐｍで攪拌されながら培養された。最初の接種材料は、全ての株に対して同一となるように、ＯＤ６００ｎｍ計測に基づいて調節された。
【００９６】
［結果］
【００９７】
抗生物質耐性遺伝子なしで、大腸菌内でプラスミドを保持させる目的でＤ−アラニンラセマーゼに基づいた栄養要求株に対する補完機構を使用した。大腸菌株ＭＢ２１５９は、Ｄ−アラニンラセマーゼを合成できないａｌａ（−）／ｄａｄＸ（−）欠陥変異株である。ＭＢ２１５９は生育のために外来のＤ−アラニンを必要としたが、プラスミドからアラニンラセマーゼ遺伝子が発現したとき、Ｄ−アラニンラセマーゼ機能は回復した。プラスミドｐＧＧ５５は、大腸菌―リステリアシャトルベクターｐＡＭ４０１に基づいており、方法の欄（図１参照）に示されているように、ＣＡＴ遺伝子群を除去し、それらの代わりにｐ６０アラニンラセマーゼ発現カセットを置くことで、改変された。結果としてできたプラスミドｐＴＶ３は安定的に大腸菌内で維持された。Ｄ−アラニン欠損ＬＢ培地での細菌の生育は、細菌におけるアラニンラセマーゼ発現カセットに活性があることを示した。大腸菌ｐＴＶ３はクロラムフェニコールに対して感受性のままに留まり、プラスミドからのＣＡＴ遺伝子両方の除去が成功したことを意味した。
【００９８】
各細胞におけるｐＴＶ３のコピー数は、クロラムフェニコール存在下のＬｍ−ＬＬＯＥ７とクロムフェニコール非存在下のＬｍｄｄＴＶ３の間をＥ７配列のリアルタイムＰＣＲを用いて比較された。Ｌｍ−ＬＬＯＥ７は、ｐＧＧ５５からＬＬＯ／Ｅ７を発現する。Ｌｍｄｄ―ＴＶ３及びＬｍＬＬＯＥ７のプラスミドコピー数は互いに異なることなく、プラスミドｐＴＶ３の安定的な保持を示した。
【００９９】
したがって、形質転換された細菌は、抗生物質耐性なしで選択することができる。
【０１００】
実施例２：ＤＮＡワクチンとして使用するためのアミノ酸代謝酵素遺伝子を含んだプラスミドの精製。
【０１０１】
プラスミドＤＮＡワクチンｐＴＶ３で形質転換した栄養要求性細菌は溶解され、プラスミドＤＮＡは標準的な方法を用いて単離及び精製された。プラスミドは、Qiagenプラスミド・メガ・キットを使用（Qiagen Sciences, Maryland）することで精製された。ＤＮＡ密度は、２６０ｎｍにおける吸光度で判定された。インサートの存在は、制限酵素による切断及びゲル電気泳動によって確認された。プラスミドＤＮＡワクチンは制限処理され、アガロース・ゲルで泳動された後、エチジウムブロマイドで染色された（図３参照）。その結果、プラスミドの単離が成功したことが示された。
【０１０２】
実施例３：代謝酵素を含んだプラスミドを保有するＤＮＡワクチン抗原の発現を行う。
【０１０３】
代謝酵素遺伝子を含んだプラスミドからの抗原の発現は、ウェスタン・ブロット、及び比較のために抗生物質耐性遺伝子を含んだプラスミドで栄養要求性ＬＭ株（Ｌｍｄｄ）を形質転換させることによって、インビトロで分析された。細菌の培養上清液からの等量の全タンパクを分析したとき、Ｌｍｄｄ―ＴＶ３培養液は、Ｌｍ−ＬＬＯＥ７培養液よりも２倍多くの抗原を含んでいた。この違いは、Ｌｍｄｄ−ＴＶ３（７．６ｋＢ）と比較して、Ｌｍ−ＬＬＯＥ７（１２．８ｋＢ）が大きく、その結果、Ｌｍ−ＬＬＯＥ７における全代謝量がより多いことによるかもしれない。
【０１０４】
したがって、抗生物質耐性遺伝子の代わりに代謝酵素を含んだプラスミドは、異種タンパクの発現のための有効な手段であるので、ＤＮＡワクチンにおいて実用性がある。
【０１０５】
実施例４：ｐＴＶ３に基づいた一般的なシャトルベクターの作成
【０１０６】
ｐＴＶ３は、ＫａｓＩ、又はＥｈｅＩ及びＡａｔＩＩで切断され、ｐｒｆＡ遺伝子、ＬＬＯ−Ｅ７融合遺伝子、及びＬＬＯプロモータの大部分が取り除かれる。ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＸｂａＩ、ＮｏｔＩ、ＳｐｅＩ、ＳｍａＩ、及びＳａｃＩを含んだ多重クローニング部位は、次に記載のオリゴヌクレオチドのペアをベクターのバックボーンに連結することで導入した。
【０１０７】
５´―ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＣＣＴ  ＣＧＡ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＡＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  Ｇ（SEQ ID No: 24）
【０１０８】
５´−ＴＣＧ  ＡＣＧ  ＡＧＣ  ＴＣＣ  ＣＣＧ  ＧＧＡ  ＣＴＡ  ＧＴＧ  ＣＧＧ  ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＴＧＡ  ＧＣＴ  ＣＧＡ  ＧＧＧ  ＡＴＣ  ＣＧＡ  ＣＧＴ（SEQ ID No: 25、末端の突出部分は、ＡａｔＩＩ及びＳａｌＩで制限処理されたベクターの部分と互換性がある）
【０１０９】
次に、目的の抗原カセットは、多重クローニング部位に連結された。そこでそのプラスミドは、ＤＮＡワクチンに用いられた。
【０１１０】
実施例５：発現プラスミドに基づいた一般的なシャトルベクターの作成。
【０１１１】
ｐ６０アラニンラセマーゼ発現カセット（実施例１）は、発現プラスミドに組み込まれる。例えば、ｐＣＲ２．１のような市販プラスミドを使用してもよい。その後、抗生物質遺伝子は、プラスミドから除去できる。プラスミドはそこで、ＤＮＡワクチンに使用される。
【０１１２】
実施例６：本発明のＤＮＡワクチンのインビボ分析
【０１１３】
［材料及び実験方法］
【０１１４】
（マウス）
６週間〜８週間齢のＣ５７ＢＬ／６マウスは、Charles River（Wilmington, MA）研究所から購入された。
【０１１５】
（プラスミドの精製）
【０１１６】
プラスミドは、Puresin Inc. (Malvern, Pennsylvania)によって精製された。ＤＮＡの濃度は、Ａ２６０によって測定された。プラスミドの同一性は、制限酵素処理及びゲル電気泳動法によって確認された。
【０１１７】
（腫瘍拒絶分析）
【０１１８】
ＴＣ−１細胞は、２×１０４細胞／マウスの量で５７ＢＬ／６マウスの左の横腹皮下に注入された。３日及び１０日間後にはマウスの筋肉内に５０μｇのプラスミドが注入された。
【０１１９】
［結果］
【０１２０】
本発明のＤＮＡワクチンの抗がん効果は、材料及び実験方法の欄に示されているように、腫瘍の緩解を測定することによって評価された。あるいは、腫瘍の成長の防止をモデルとして使用する。この場合、ＤＮＡワクチンは、腫瘍の移植前に投与される。
【０１２１】
他の実験では、１つ又はそれ以上のサイトカインプラスミドは（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ］又は、ＭＩＰ−α）はＥ７プラスミドと混合される。腫瘍の緩解、及び／又は腫瘍の形成の防止は評価された。
【０１２２】
本発明のＤＮＡワクチンは、腫瘍の形成の防止、及び存在する腫瘍の緩解の誘発に関して有効であると考えられる。したがって、本発明のＤＮＡワクチンは、治療免疫応答、及び予防免疫応答の誘発に関して実用性がある。
【０１２３】
実施例７：本発明のＤＮＡワクチンのさらなるインビボ試験
【０１２４】
［材料及び実験方法］
【０１２５】
ＣＤ８（５３−６．７、ＦＩＴＣ結合）、ＣＤ６２リガンド（ＣＤ６２Ｌ、ＭＥＬ−１４、ＡＰＣ結合）、及びＰＥ抱合Ｅ７  Ｈ−２Ｄｂ四量体のための３色フローサイトメトリーは、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用して実施される。脾細胞は、室温で、Ｅ７ペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）がロードされたＨ２Ｄｂ四量体で染色される。四量体は、国立アレルギー感染病研究所（米国）の四量体コア施設（Tetramer Core Facility）から提供され、１：２００希釈で使用される。ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌlowサブセットは選択され、四量体＋細胞のパーセンテージはFlowJo Software(Tree Star, Inc, Ashland, OR）を使用して比較される。
【０１２６】
［結果］
【０１２７】
次に本発明のＤＮＡワクチンの抗原特異的Ｔ細胞（例えば、Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞）を誘発する能力が評価される。マウスは、Ｅ７プラスミド又はＬＬＯ−Ｅ７プラスミド、並びにＧＭ−ＣＳＦ及びＭＩＰ−１αをエンコードするプラスミドで予防接種される。２回目の予防接種の９日後、脾細胞は単離され、Ｅ７ペプチドがロードされたＨ２Ｄｂ四量体で染色される。本発明のＤＮＡワクチンは、重要なパーセンテージの抗原特異的Ｔ細胞を誘発することが判明している。これらの結果は、Ｅ７ＤＮＡワクチンの抗Ｅ７ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘発能力を裏付ける。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】大腸菌―リステリアのシャトルプラスミドｐＧＧ５５（左側）及びｐＴＶ３（右側）のマップの略図である。ＣＡＴ（−）：大腸菌クロラムフェニコールトランスフェラーゼ、ＣＡＴ（＋）：リステリアクロラムフェニコールトランスフェラーゼ、Ｏｒｉ  Ｌｍ：リステリアの複製起点、Ｏｒｉ  Ｅｃ：大腸菌のｐ１５複製起点、ｐｒｆＡ：リステリアの病原性因子の制御因子、ＬＬＯ：Ｃ末端切断のリステリオリシン（listeriolysin）Ｏ及びそのプロモータ、Ｅ７：ＨＰＶ  Ｅ７、ｐ６０―ｄａｌ：ｐ６０プロモータの発現カセット及びリステリアのアラニンラセマーゼ遺伝子。選択された制限部位も示されている。
【図２Ａ】（Ａ−Ｄ）：ｐＴＶ３で補われなかったＭＢ２１５９の生育の様子。ＭＢ２１５９が生育のためにアラニンを必要とし、クロラムフェニコール存在下では生育しないことを示す。大腸菌株ＭＢ２１５９はｐＴＶ３を含まない。細菌は異なった培地に植えられた。Ａ）ＬＢのみ：ＭＢ２１５９は生育しない。Ｂ）ＬＢ＋Ａｌａ：ＭＢ２１５９は生育する。Ｃ）ＬＢ＋クロラムフェニコール：細菌は全く生育しない。Ｄ）ＬＢ＋クロラムフェニコール＋Ａｌａ：（Ｃ）と同様である。
【図２Ｂ】（Ｅ−Ｈ）：ｐＴＶ３を有する大腸菌株ＭＢ２１５９は生育のためにＤ−アラニンを必要とせず、クロラムフェニコール感受性であり、したがってｐＴＶ３はＤ−アラニンの要求を満たすが、抗生物質耐性を付与しないことが示される。Ｅ）ＬＢのみ：補われた細菌のみが生育する。Ｆ）ＬＢ＋Ａｌａ：ＭＢ２１５９生育する（ｐＴＶ３有無のそれぞれの状態）。Ｇ）ＬＢ＋クロラムフェニコール：ＣＡＴ遺伝子が存在しないため、細菌は生育しない。Ｈ）ＬＢ＋クロラムフェニコール＋Ａｌａ：（Ｇ）と同様である。
【図３】大腸菌株ＭＢ２１５９からのｐＴＶ３のプラスミド調製。核酸の Qiagen（Ｒ）midi調製は、製造者のプロトコルに従って行われる。（左から右へ）レーン１及び７：分子量マーカー、１００Ｂｐ ladder（Invitrogen）。レーン２：ｐＴＶ３、クローン＃１５。レーン３：ｐＴＶ３、クローン＃１６。レーン４：ｐＴＶ３Ｃ、クローン＃２２。レーン５：ｐＴＶ３Ｃ、クローン＃２４。レーン６：ｐＧＧ５５対照。
【図１】
2008511545.tif 000003
【図２Ａ】
2008511545.tif 000004
【図２Ｂ】
2008511545.tif 000005
【図３】
2008511545.tif 000006
【国際調査報告】
2008511545.tif 000007
2008511545.tif 000008
2008511545.tif 000009