(57)【要約】  テストし領内に存在する分析対象の存在又は量を検出するための横流型分析装置が示されており、該横流型分析装置は、抱合パッド及び吸い上げパッドと連通する多孔性膜を有する。多孔性膜は、テスト試料が付与される検出領域を有し、該検出領域は、検出信号を発生するために、分析対象と分析対象抱合複合体の少なくとも一部分に結合するように構成された、不動化された第一捕捉試薬を有する。対照領域は、多孔性膜上の検出領域から下流側に置かれ、対照領域内に不動化された第二捕捉試薬を有する。抱合パッドは、検出領域から上流側に置かれ、分析対象に対する特定結合部材を備えた検出プローブを有する。緩衝材放出領域は、抱合領域の上流側に置かれ、装置に緩衝材を付与し、緩衝材は、検出領域及び対照領域に検出プローブを移動させるように機能する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
テスト試料内に存在する分析対象の存在又は量を検出するための横流型分析装置であって、前記横流型分析装置は、抱合パッド及び吸い上げパッドと連通する多孔性膜を含み、前記多孔性膜には、
前記試料が付与される検出領域が形成され、該検出領域内に、前記分析対象及び分析対象抱合複合体の少なくとも一部分に結合して強さを有する検出信号を生成するように構成された第一捕捉試薬が不動化されており、
前記検出領域から下流側に位置するように対照領域が形成され、該対照領域内に、前記抱合体又は抱合分析対象複合体に結合するように構成された第二捕捉試薬が不動化されており、
前記抱合パッドは前記検出領域から上流側に位置し、前記抱合パッドは、前記分析対象に対する特定の結合部材を備えた検出プローブを有し、
緩衝材放出領域が前記抱合パッドの上流側に位置するように設けられて、前記装置に緩衝材を付加するようになっており、前記緩衝材は、前記検出プローブを前記検出領域及び前記対照領域に移動させるように機能する、
ことを特徴とする装置。
【請求項２】
前記抱合型検出プローブは、クロモゲン、触媒、発光化合物、放射性化合物、可視標識、リポソーム、及びこれらの組み合わせから成るグループから選択された物質を含むことを特徴とする請求項１に記載の横流型分析装置。
【請求項３】
前記抱合型検出プローブは、発光化合物を含むことを特徴とする請求項１に記載の横流型分析装置。
【請求項４】
前記抱合型検出プローブは、可視標識を含むことを特徴とする請求項１に記載の横流型分析装置。
【請求項５】
前記特定の結合部材は、抗原、付着体、アプタマー、一次又は二次抗体、ビオチン、及びこれらの組み合わせから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載の横流型分析装置。
【請求項６】
前記第一捕捉試薬は、抗原、付着体、蛋白質Ａ又はＧ、ニュートラアビジン、アビジン、ストレプトアビジン、カプトアビジン、一次又は二次抗体、及びこれらの複合体から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載の横流型分析装置。
【請求項７】
前記第二捕捉試薬は、抗原、付着体、蛋白質Ａ又はＧ、ニュートラアビジン、アビジン、ストレプトアビジン、カプトアビジン、一次又は二次抗体、及びこれらの複合体から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載の横流型分析装置。
【請求項８】
前記分析対象は、サルモネラ種、髄膜炎菌群、連鎖球菌肺炎、鵞口瘡カンジダ、カンジダトロピカリス、アスペルギルス、ヘモフィラスインフルエンザ、ＨＩＶ、トリコモナス及びプラズモジウムで成るグループから選択された大型病原体であることを特徴とする請求項１に記載の横流型分析装置。
【請求項９】
前記分析対象は、毒素、有機化合物、蛋白質、ペプチド、微生物、アミノ酸、核酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、麻薬、薬剤中間体又は副産物、細菌、ウイルス粒子及び上記した物質いずれかの代謝産物又は抗体から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載の横流型分析装置。
【請求項１０】
前記分析対象は、小型病原体であることを特徴とする請求項１に記載の横流型分析装置。
【請求項１１】
テスト試料内にある分析対象の存在又は量を検出するための方法であって、
i）前記分析対象の特定結合部材と複合する検出プローブを有する抱合パッドと、吸い上げパッドとに対して液体連通状態にある多孔性膜を含み、前記多孔性膜は、第一捕捉試薬が不動化される検出領域及び第二捕捉試薬が不動化される対照領域を定め、前記対照領域は、前記検出領域から下流側に位置し、前記抱合パッドは、前記多孔性膜の上流側に位置し、緩衝材除放出領域が、前記抱合パッドの上流側に位置するように構成された横流型分析装置を準備し、
ii）前記分析対象を含む前記テスト試料を前記検出領域に接触させ、
iii）緩衝材が前記検出領域及び前記対照領域に前記検出プローブを運ぶように、前記緩衝材放出領域において緩衝材を放出し、
iv）検出信号を検出する
ことから成る方法。
【請求項１２】
前記抱合型検出プローブは、クロモゲン、触媒、発光化合物、放射性化合物、可視標識、リポソーム、及びこれらの組み合わせから成るグループから選択された物質を含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抱合型検出プローブは、可視標識を含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記特定結合部材は、抗原、付着体、アプタマー、一次又は二次抗体、ビオチン及びこれらの組み合わせから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第一捕捉試薬は、抗原、付着体、蛋白質Ａ又はＧ、ニュートラアビジン、アビジン、ストレプトアビジン、カプトアビジン、一次又は二次抗体、及びこれらの複合体から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記第二捕捉試薬は、抗原、付着体、蛋白質Ａ又はＧ、ニュートラアビジン、アビジン、ストレプトアビジン、カプトアビジン、一次又は二次抗体、及びこれらの複合体から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記第二捕捉試薬は、高分子電解質を含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記分析対象は、サルモネラ種、髄膜炎菌群、連鎖球菌肺炎、鵞口瘡カンジダ、カンジダトロピカリス、アスペルギルス、ヘモフィラスインフルエンザ、ＨＩＶ、トリコモナス及びプラズモジウムで成るグループから選択された大型病原体であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記分析対象は、毒素、有機化合物、蛋白質、ペプチド、微生物、アミノ酸、核酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、麻薬、薬剤中間体又は副産物、細菌、ウイルス粒子及び上記した物質いずれかの代謝産物又は抗体から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
テスト試料内に存在する分析対象の存在を検出するための横流型分析装置であって、最初に抱合パッド上に置かれている検出プローブが、捕捉試薬を有する検出領域内に置かれている病原体に移動することを特徴とする装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
大型病原体の診断は、近年では、試料を顕微鏡で観察するか又は被験物を培養することにより実施されている。顕微鏡検査には、訓練された専門家及び器具が必要であり、かつ被験物の培養は、結果を得るために２４時間より長い時間が通常必要である。
【０００２】
分析装置を通る流れは、これまでのところ、大型病原体の検出に使用するためには、病原体の大きさのために制限があった。例えば、横流型分析においては、テスト試料に存在する小型分析対象の存在及び／又は濃度を求めるために、様々な分析手順及び装置が一般的に使用されている。例えば、免疫検定装置は、免疫システムの機構を利用するもので、そこでは有機体にとって病原体又は異物である抗原の存在に対応して、抗体が形成される。これらの抗体及び抗原、すなわち免疫反応物質は互いに結合することが可能で、これにより、高度に特定的な反応機構を生じ、これを生物試料に特定の抗原の存在又は濃度を求めるために使用することができる。これらの分析装置は、装置の中を分析対象が移動することを必要とするので、大型で可動性の低い病原体については、その有用性が妨げられることになる。
【０００３】
検出可能な成分により標識付けされた免疫反応物質を使用して分析対象が分析的に検出されるようにした幾つかのよく知られた免疫検定装置がある。例えば、「サンドイッチ型」分析装置は、典型的には、テスト試料と染料ラテックス又は放射性物質などの検出可能なプローブとを混合するもので、これらノードプローブは、分析対象のための特定の結合部材と抱合される。この抱合されたプローブは分析対象と複合体を形成する。これらの複合体は、不動化した抗体の領域に到着し、そこで三元の「サンドイッチ複合体」を形成するために、抗体と分析対象の間に結合が発生する。サンドイッチ複合体は、分析対象の検出領域に集中される。この技術は、定量的又は半定量的結果を得るために使用される。
【０００４】
代替的な技術は「競合型」分析装置である。「競合型」分析装置においては、標識は、典型的には、抗体と、試料内に存在する標識のない分析対象のいずれとも結合するような、競合する標識付き分析対象又は分析対象類似物である。競合型分析装置は、典型的には、付着体などの分析対象を検出するために使用され、各々の付着体は一価であり、１つの抗体分子とだけ結合することが可能である。
【０００５】
これらの装置から得られる利点にかかわらず、多くの従来の横流型分析装置は、比較的高い濃度の分析物質に曝されたとき、及び、流れさせることが困難な非常に大型の病原体を検出しようとする場合には、著しい不正確さを呈する。例えば、分析対象が高濃度で存在する場合には、テスト試料内にある分析対象の大部分は、抱合プローブとは複合体を形成しない。したがって、検出領域に到達した時、非複合型分析対象は、結合位置について複合型分析対象と競合する。非複合型分析対象は、プローブで標識付けされていないので、検出することができない。その結果、多数の結合位置が非複合型分析対象により占められるようになると、分析対象は「偽陰性」を表す。この問題点は、一般的に「フック効果」といわれている。大型病原体、例えば鵞口瘡カンジダの場合は、形成される複合体の大きさのために、複合体は、膜上の検出領域にまで正確に流れない可能性がある。
【０００６】
しかしながら、「フック効果」を減少し、かつ横流型装置を通して流すことが困難な大型病原体を検出する改善した技術の必要性が依然として存在する。
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６，４３６，６５１号公報
【特許文献２】米国特許第４，２７５，１４９号公報
【特許文献３】米国特許第５，６７０，３８１号公報
【特許文献４】米国特許第５，２５２，４５９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の一実施形態によると、テスト試料に存在する大型分析対象の存在又は量を検出するための分析装置が開示される。分析装置は、多孔性膜と液体連通する抱合パッドを含み、該多孔性膜は又、吸い上げパッドと連通する。
【０００９】
多孔性膜は、検出プローブを通すことができる様々な材料のいずれか、例えばニトロセルロースから形成される。多孔性膜は検出領域を有し、該検出領域にテスト試料が接触し、堆積又は付着させられ、かつ、該検出領域内に第一捕捉試薬が不動化させられる。第一捕捉試薬は、分析対象及び分析対象抱合複合体の少なくとも一部分に結合して検出信号を発生するように形成される。第一捕捉試薬は、抗原、付着体、蛋白質Ａ又はＧ、ニュートラアビジン、アビジン、ストレプトアビジン、プトアビジン、一次又は二次抗体、及びこれらの複合体から成るグループから選択される。第一捕捉試薬は、例えば、分析対象と抱合検出プローブとの間に形成された複合体と結合することができる。
【００１０】
対照領域は、検出領域から下流側の多孔性膜上に配置される。第二捕捉試薬が対照領域内において不動化され、抱合体、抱合分析対象複合体又は純粋なプローブと結合するように形成されて分析が正確に実行されていることを示す。一実施形態においては、第二捕捉試薬は、抗原、付着体、蛋白質Ａ又はＧ、ニュートラアビジン、アビジン、ストレプトアビジン、カプトアビジン、一次又は二次抗体、及びこれらの複合体から成るグループから選択される。
【００１１】
抱合パッドは、分析対象の存在を合図する検出プローブを含む。抱合パッドは、他の異なるプローブ集団を更に含むことができ、これらには、対照領域で指示するためのプローブが含まれる。望まれるならば、クロモゲン、触媒、発光化合物（例えば、蛍光性、燐光性など）、放射性化合物、可視標識、リポソーム、及びこれらの組み合わせから成るグループから選択される物質を含むことができる。特定の結合部材は、抗原、付着体、アプタマー、一次又は二次抗体、ビオチン、及びこれらの混合物から成るグループから選択される。
【００１２】
膜から遠い側の抱合パッドの端部と液体連通するように、緩衝材放出領域が設けられる。試料が検出領域に堆積した後、緩衝材が、緩衝材放出領域において抱合パッドの上流側から放出される。緩衝材は、抱合パッドから検出領域に向かってプローブを洗い流し、検出プローブは、検出領域において、もし存在するならば分析対象によって捕捉され、陽性結果をもたらす。試料が何も分析対象を含まない場合には、検出ラインは陰性となる。緩衝材は、ある程度のプローブ（検出プローブとは異なるプローブを含む場合がある）を依然として含む状態で対照領域に達し、そこで、試薬が抱合体、抱合分析対象複合体又は純粋なプローブを捕捉し、分析装置が正確に機能していることを示す。
【００１３】
吸い上げパッドは、膜と液体連通状態であり、パッドの毛管現象により液体移動の駆動力を提供する。
【００１４】
本発明の別の実施形態によると、テスト試料に存在する分析対象の存在又は量を検出するための方法が、開示される。該方法は、
i）分析対象の特定結合部材と抱合する検出プローブを有する抱合パッドと、吸い上げパッドとに対して液体連通状態の多孔性膜を有し、該多孔性膜は、第一捕捉試薬が不動化される検出領域及び第二捕捉試薬が不動化される対照領域を定め、該対照領域は、検出領域から下流側に位置し、抱合パッドが、多孔性膜の上流側に位置し、緩衝材放出領域が、抱合パッドの上流側に位置するように構成された横流型分析装置を準備し、
ii）分析対象を含むテスト試料を検出領域と接触させ、
iii）緩衝材放出領域で緩衝材を放出して緩衝材により検出領域及び対照領域に検出プローブを運ぶようにし、
iv）検出信号を検出する
段階を含む。
【００１５】
本発明の他の特徴及び態様が、以下に更に詳細に示される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
ここで用いられる「分析対象」という用語は、一般的には検出される物質を意味する。例えば、分析対象は、抗原性物質、付着素、抗体、及びこれらの組み合わせを含むことができる。分析対象は、これらに制限されるものではないが、毒素、有機化合物、タンパク質、ペプチド、微生物、アミノ酸、核酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、麻薬（治療用の目的に管理されているものだけでなく、不法目的のために管理されているものも含む）、薬剤中間体又は副産物、細菌、ウイルス粒子及び上記した物質いずれかの代謝産物又は抗体を含む。幾つかの分析対象の特定例として、フェリチン、クレアチニンキナーゼＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）、ジゴキシン、フェニトイン、フェノバルビタール、カルバマゼピン、バンコマイシン、ゲンタマイシン、テオフィリン、バルプロ酸、キニジン、黄体ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、コストラジオール、プロゲステロン、Ｃ−反応性タンパク質、リポカリン、ＩｇＥ抗体、サイトカイン、ビタミンＢ２、ミクログロブリン、グリケートヘモグロビン（Ｇｌｙ．Ｈｂ）、コルチゾール、ジギトキシン、Ｎ−アセチルプロカインアミド（ＮＡＰＡ）、プロカインアミド、ＩｇＧ風疹及びＩｇＭ風疹などの風疹抗体、トキソプラズマＩｇＧ（Ｔｏｘｏ−ＩｇＧ）及びトキソプラズマＩｇＭ（Ｔｏｘｏ−ＩｇＭ）などのトキソプラズマ抗体、テストステロン、サリチル酸、アセタミノーフェン、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、抗Ｂ型肝炎内部抗原ＩｇＧ及びＩｇＭ（抗ＨＢＣ）などの抗Ｂ型肝炎内部抗原、ヒト免疫不全ウイルス１及び２（ＨＩＶ１及び２）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１及び２（ＨＴＬＶ）、Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）、抗Ｂ型肝炎ｅ抗原（抗ＨＢｅ）、インフルエンザウイルス、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、チロキシン（Ｔ４）、トータルトリヨードチロニン（ＴｏｔａｌＴ３）、フリートリヨードチロニン（ＦｒｅｅＴ３）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、リポタンパク質、コレステロール、及びトリグルセリド、及びアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）を含む。乱用及び制御された麻薬物質は、これらに制限される意図はないが、アンフェタミン、メタンフェタミン、アモバルビタール、セコバルビタール、ペントバルビタール、フェノバルビタール及びバルビタールなどのバルビツール酸塩、リブリューム及びバリウムなどのベンゾジアゼピン、ハシシ及びマリファナなどのカンナビノイド、コカイン、フェンタール、ＬＳＤ、メタカロン、ヘロイン、モルヒネ、コデイン、ヒドロモルフォン、ヒドロコドン、メタドン、オキシコドン、オキシモルフォン及びアヘンなどのアヘン剤、フェンシクリジン、及びプロポキシヘンを含む。他の可能な分析対象は、米国特許第６，４３６，６５１号に記載されている。
【００１７】
ここで用いられる「テスト試料」という用語は、一般的に、分析対象を含む疑いのある材料を意味する。テスト試料は、例えば、物質源から直接得られる材料、並びに、例えば、これらに制限されるものではないが、濾過、凝結、希釈、蒸留、混合、凝縮、干渉成分の不活性化、試薬の付加などの技術を使用して前処理した材料を含むことができる。テスト試料は、血液，細胞間流体，唾液，目の中の流体、脳脊髄液、汗、尿、母乳、腹水、粘膜、滑液、腹膜水、膣流体、羊水又は同様のものを含む生理学的流体のような、生物的物質源から抽出することができる。生理学的流体に加えて、水、食物製品などの他の液体試料も使用することができる。更に、分析対象を含むと疑われる中実物質も、テスト試料として使用することができる。
【００１８】
一般的には、本発明は、テスト試料における分析対象の存在又は量を検出するための横流型分析装置に向けられる。分析には、病原体が、堆積した点から検出される点に移動することが必要であることが知られている。本発明は、病原体を検出プローブを含む領域に通し、次いで検出領域に移動させるのではなく、最初に抱合パッドに置かれていたプローブを、捕捉試薬を有する検出領域に置かれている病原体に移動させる。本発明者らは、通常の一般的手法とは逆に、検出プローブを試料に移動させることにより、単純で効率的であり、かつ、経費効果的な方法で、広い濃度範囲にわたり大型分析対象の検出を可能にすることを発見した。更に、特に低濃度の小型病原体の検出にも適当であり、余分な非複合型分析対象により起こる「フック効果」を実質的に排除する。
【００１９】
この装置は、検出領域及び対照領域を有する多孔性膜を利用する。検出領域及び対照領域は、不動化された捕捉試薬を有する。この装置は更に、装置の上流側端部にある緩衝材放出領域及び緩衝材放出領域と多孔性膜の間に位置する抱合パッドを使用する。吸い上げパッドは、装置の下流側端部にある多孔性膜の対向する端部と液体連通状態にある。使用する場合には、試料は検出領域に付与され、しばらく時間が経過した後、緩衝材が放出される。緩衝材は、抱合パッドから検出領域を通り、検出物及び任意に存在する他の型のプローブを洗い流し、その結果、病原体の存在を示す。
【００２０】
本発明における分析対象としての好ましい病原体は、比較的大きいもの、すなわち、約０．０３と３０ミクロンの間の大きさとする。大型病原体は、その大きさが移動を困難にするので、現在知られている横流型装置を使用して検出することは困難である。
【００２１】
本発明を使用して検出することができる適当な病原体の例は、これらに制限されるものではないが、サルモネラ種などの細菌、髄膜炎菌群、肺炎連鎖球菌、鵞口瘡カンジタ、カンジタトロピカリスなどの酵母菌、アスペルギルスなどの菌類、ヘモフィラスインフルエンザなどのウイルス、ＨＩＶ、及びトリコモナス及びプラズモジウムなどの原生動物を含む。
【００２２】
大型病原体が好ましいが、本発明の分析は、小型の病原体（分析対象）、例えば、０．３ミクロンより小さいサイズの病原体にも適している。小型分析対象が低濃度で存在する場合には、分散又は希釈され過ぎ、かつ、量が不十分であるので、従来の横流型装置の検出領域では認識することができない。テスト試料を検出領域に堆積させると、低濃度でも小型病原体を検出する可能性が増加する。小型分析対象が高濃度で存在すると、これより以下に更に述べるように、従来の分析に一般的な「フック効果」を避けることができる。更に、比較的大きい孔を有する多孔性膜の場合には、小型病原体は膜を通って良好に移動しない。この場合には、病原体の検出領域への可動性不足より、偽陰性の結果を示す可能性がある。本発明は、テスト試料を検出領域上に直接堆積させることにより、小型病原体の検出に対するこれらの失敗を克服する。
【００２３】
図１を参照すると、本発明により形成された横流型分析装置２０の一実施形態がより詳細に述べられている。装置を同じ効果を持つ他の方法により形成することができる場合には、「横流」という用語は、説明であって制限するものではないことを認識するべきである。例えば、本発明と同じ原理を使用して、放射型又は垂直流型装置が、本発明の意図から外れることなく容易に考えられる。示されているように、装置２０は、剛性材料２４によって任意に支持されている多孔性膜２２を含む。多孔性膜２２は、検出領域（又はライン）３０を有する。更に、多孔性膜２２は、対照領域（又はライン）３２を有する。
【００２４】
一般的には、多孔性膜２２は、検出プローブが通過することができる種々異なる材料のいずれかから形成することができる。例えば、多孔性膜２２を形成するために使用される材料は、これらに制限されるものではないが、天然物質、合成物質、又は多糖類（例えば、紙、及びセルロースアセテート及びニトロセルロースなどのセルロース派生物のようなセルロース物質）のような合成的に変成された天然物質から生成した物質、ポリエーテルスルフォン、ポリエチレン、ナイロン、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエステル、ポリプロピレン、シリカ、更に非活性アルミナ、珪藻土、ＭｇＳＯ４、又は他の多孔性ポリマーマトリックスに均一に分散された、塩化ビニール、塩化ビニールプロピレンコポリマー、及び塩化ビニールアセテートコポリマ−などのポリマーを持つ無機質微細物質、天然物質から生成された布（例えば綿）及び合成布（例えばナイロン又はレーヨン）、シリカゲル、アガロース、デキストラン、及びゼラチンなどの多孔性ゲル、ポリアクリルアミドのようなポリマー性フィルム、及び同様のものを含む。１つの特定の実施形態においては、多孔性膜２２は、ニトロセルロース及び／又はポリエーテルスルフォン材料から形成される。「ニトロセルロース」という用語は、セルロースの硝酸エステルを意味し、ニトロセルロース単体か、或いは、硝酸と１から７の炭素原子を持つ脂肪族カルボキシル酸のような他の酸との混合物とすることができることを理解すべきである。
【００２５】
装置２０は又、吸い上げパッド２６を含むことができる。吸い上げパッド２６は、一般的に、多孔性膜２２を通って移動してきた流体を受け取る。当業者によく知られているように、吸い上げパッド２６は、毛管作用及び膜２２を通る流体流れを促進するのを助けることができる。
【００２６】
装置２０は、緩衝材放出領域３４を有する。一実施形態においては、緩衝材放出領域３４は、緩衝材３８を格納する緩衝材リザーバ３６を有する。緩衝材３８は、代替的には、別個のリザーバにより供給される。緩衝材２８は、本発明で使用される検出プローブを運搬することができる液体のいずれかとすることができる。適当な緩衝材の例は、リン酸塩緩衝材を含む生理的食塩水（ＰＢＳ）溶液（ｐＨは７．２）、トリ緩衝材を含む生理的食塩水（ＴＢＳ）溶液（ｐＨは８．２）又は２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルフォン酸（ＭＥＳ）（ｐＨは５．３）を含む。
【００２７】
抱合パッド４０は、緩衝材放出領域３４と液体連通状態にあり、緩衝材放出領域３４と多孔性膜２２の間に置かれ、緩衝材３８が緩衝材放出領域３４から移動する時に、抱合パッド４０を横切り、多孔性膜２２上の検出領域３０及び対照領域３２にプローブを運搬する。抱合パッド４０は、緩衝材が通過することが可能な材料から形成される。抱合パッド４０は、例えば、ガラス繊維から形成される。抱合パッド４０が１つだけ示されているが、他の抱合パッドも本発明に使用することができることが分かる。
【００２８】
テスト試料内の分析対象の検出を開始するために、使用者は、多孔性膜２２の一部分である検出領域３０にテスト試料を直接付与し、接触させ又は堆積させる。示した実施形態においては、テスト試料は、検出領域３０に置かれている。試料が検出領域３０に接触すると、緩衝材３８が、緩衝材放出領域３４に放出される。緩衝材３８は、一体的に構成したリザーバによって、或いはピペット又は当業者に知られている他の有効な手段のいずれかのような別の物質源によって付与される。緩衝材３８は、多孔性膜２２と液体連通状態にある抱合パッド４０を通って、検出領域３０及び対照領域３２に移動する。
【００２９】
テスト試料内に分析対象があるか否かの正確な検出を容易にするために、少なくとも１つの予め定められた量の検出プローブが抱合パッド上に用意される。視覚的に又は器具装置によって検出可能な信号を発生させることが一般的に可能なあらゆる物質を、検出プローブとして使用することができる。様々な適当な物質は、クロモゲン、触媒、発光化合物（例えば、蛍光性、燐光性など）、放射性化合物、コロイド性金属（例えば金）及び非金属粒子を含む可視標識、染色粒子、酵素又は基体、又は有機ポリマーラテックス粒子、細胞内脂肪粒子又は信号発生基材を含む他の小胞などを含む。検出プローブとして使用するのに適当な幾つかの酵素が、米国特許第４，２７５，１４９に開示されている。酵素／基材システムの１つの例は、アルカリ性ホスファターゼ酵素及びニトロブルーテトラゾリウム−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸塩基材、又はこれらの派生物或いは相似型、又は４−メチルウンベリフェリル−リン酸塩基材である。他の適当な検出プローブは、米国特許第５，６７０，３８１号及び第５，２５２，４５９号に記載されている。
【００３０】
幾つかの実施形態においては、検出プローブは、検出可能な信号を発生する蛍光性化合物を含むことができる。蛍光性化合物は、蛍光性分子、ポリマー、樹枝状結晶、粒子などを含むことができる。適当な蛍光性分子の幾つかの例は、例えば、これらに制限されるものではないが、フルオレセイン、ユーロピウム、キレート化合物、フィコビリプロテイン、ローダミン、及びこれらの派生物及び相似型を含む。
【００３１】
上記したような検出プローブは、単独で又は微小粒子（「ビーズ」又は「マイクロビーズ」と言われることがある）と組み合わせて使用される。例えば、細胞核、マイコプラズマ、プラスミド、プラスチド、哺乳動物細胞（例えば赤血球影）、酸細胞（例えば細菌）、多糖類（例えばアガロース）などの自然に発生した微小粒子が使用される。更に合成微小粒子も利用することができる。例えば、一実施形態においては、蛍光染料又は着色染料で標識を付せられたラテックス微小粒子が利用される。あらゆるラテックス微小粒子を本発明において使用することができるが、このラテックス微小粒子は、典型的には、ポリスチレン、ブタジエン、スチレン、スチレンアクリル性ビニルターポリマー、ポリメチルメタクリル酸塩、ポリエチルメタクリル酸塩、スチレン−マレインアンヒドライドコポリマー、ポリビニルアセテート、ポリビニルピリジン、ポリジビニルベンゼン、ポリブチレンテレフタレート、アクリロニトリル、塩化ビニル−アクリル酸塩など、又はアルデヒド、カルボキシル、アミノ、ヒドロキシル、又はこれらのヒドラジド派生物から形成される。他の適当な微小粒子は、米国特許第５，６７０，３８１号及び第５，２５２，４５９号に記載されている。商業的に入手可能な適当な蛍光性粒子は、「ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅ」（レッド５８０／６０５）及び「ＴｒａｎｓｆｌｕｏＳｐｈｅｒｅ」（５４３／６２０）の商標でＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．より販売されている蛍光性カルボキシレートマイクロスフェア、同様に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．によって販売されている「Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ」更に５−及び６−カルボキシテトラメチルローダミンを含む。更に、適当な着色された、ラテックス微小粒子の商業的に入手可能な例は、Ｂａｎｇ’ｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｉｎｃ．より販売されているカルボキシレートラテックスビーズを含む。
【００３２】
利用される時、粒子の形状は、全体的に種々異ならせることができる。１つの特定の実施形態においては、例えば、粒子は、球体形状である。しかしながら、皿、ロッド、盤状、棒状、管状、不規則形などのような他の形状も、本発明により考慮されることを理解するべきである。更に、粒子の大きさも種々異ならせることができる。例えば、粒子の平均的サイズ（例えば直径）は、約０．１ナノメートルから約１，０００ミクロン、幾つかの実施形態においては、約０．１ナノメートルから約１００ミクロン、更に幾つかの実施形態においては、約１ナノメートルから約１０ミクロンの範囲とすることができる。例えば、「ミクロン・スケール」粒子が望まれることがある。利用される場合には、「ミクロン・スケール」粒子は、約１ミクロンから約１，０００ミクロン、幾つかの実施形態においては、約１ミクロンから約１００ミクロン、更に幾つかの実施形態においては、約１ミクロンから約１０ミクロンの平均的サイズを有することができる。同様に、「ナノ・スケール」粒子も利用することができる。このような「ナノ・スケール」粒子は、約０．１ナノメートルから約１０ナノメートル、幾つかの実施形態においては、約０．１ナノメートルから約５ナノメートル、更に幾つかの実施形態においては、約１ナノメートルから約５ナノメートルの平均的サイズを有する。
【００３３】
幾つかの例においては、検出プローブが分析対象と結合しやすくできるように、何らかの手法で検出プローブを変成処理することが望ましい。このような場合には、検出プローブは、複合プローブを形成するために接着させる、ある種の特定結合部材とともに変成処理される。特定結合部材は、一般的に、特定結合対の部材、すなわち１つの分子が化学的に及び／又は物理的に第二分子と結合する、２つの異なる分子を意味する。例えば、免疫反応特定結合部材は、抗原、付着素、アプタマー、抗体（第一又は第二）、及び組み換え型ＤＮＡ法又はペプチド合成により形成されるこれらの複合体を含むことができる。抗体は、単クローン抗体又は多クローン抗体、遺伝子組み換え型タンパク質又はこれらの混合物又は断片、更に抗体及び他の特定結合部材の混合物とすることができる。このような抗体の形成及び特定結合部材として使用するための抗体の適合性の詳細は、当業者によく知られている。他の共通した特定結合対は、これらに制限されるものではないが、ビオチンとアビジン（又はこれらの派生物）、ビオチンとストレプトアビジン、炭水化物とレクチン、相補的核酸塩基配列（対象とする核酸配列を検出するためにＤＮＡ交雑分析物質で使用されるプローブ及び捕捉核酸配列を含む）、遺伝子組み換え法により形成されたものを含む相補的ペプチド配列、エフェクター分子とレセプター分子、ホルモンとホルモン結合タンパク質、酵素補助因子と酵素、酵素抑制物質と酵素などを含む。更に、特定結合対は、本来の特定結合部材の類似物とする部材を含むことができる。例えば、分析対象に共通して少なくとも１つのエピトープを有する限り、分析対象の派生物又は断片、すなわち分析対象類似物が使用されることができる。
【００３４】
特定結合部材は、一般的には、種々異なるよく知られた技術のいずれかを使用して、検出プローブに結合させることができる。例えば、特定の結合部材と検出プローブ（例えば粒子）との共有結合がタンパク質結合反応を達成することができる、カルボキシル基、アミノ、アルデヒド、ブルムアセチル、ヨード、チオール、エポキシ及び他の反応性官能基又は架橋官能基、並びに、残留遊離基及び陽イオンを使用して達成することができ、これにより、表面官能基は又、検出プローブの表面が比較的高い表面濃度の有極基を含むことができるという理由から、官能化されたコポリマーとして組み込むことができる。更に、検出プローブは、ある場合においては、ポリ（チオフェノール）のように合成後に官能化されることがしばしばあるが、微小粒子は、更なる変成処理の必要なく直接タンパク質と共有結合が可能である。
【００３５】
再び図１を参照すると、分析装置２０は検出領域３０を含み、その中で、分析対象又は抱合検出プローブと結合することが可能な第一捕捉試薬を不動化する。分析対象の結合は、分析対象が存在するという検出指示をもたらし、このような指示は、可視的手段又は以下に示すような様々な検出器又はリーダー（例えば、蛍光性リーダー）などの他の手段を使用するものである。リーダーは、検出領域での信号強度に基づいて、検出位置での分析対象の相対量を求めるために使用される。
【００３６】
幾つかの実施形態においては、第一捕捉試薬は、生物的捕捉試薬とすることができる。このような生物的捕捉試薬は、当業者によく知られており、更に、これらに制限されるものではないが、抗原、付着体、蛋白質Ａ又はＧ、ニュートラアビジン、アビジン、ストレプトアビジン、カプトアビジン、一次又は二次抗体（例えば、多クローン、単クローンなど）、及びこれらの複合体を含むことができる。多くの場合において、これらの生物的捕捉試薬は、検出プローブ上に存在する特定の結合部材（例えば抗体）と結合することが可能であることが望ましい。
【００３７】
捕捉試薬に対して様々な非生物的材料を利用することも、更に望ましい。例えば、幾つかの実施形態においては、試薬は高分子電解質を含むことができる。高分子電解質は、正味の正電荷又は負電荷、又はほぼ中性である正味電荷を有することができる。例えば、正味の正電荷を有する高分子電解質の幾つかの適当な例は、これらに制限されるものではないが、ポリリジン（ミズーリ−州、セントルイス所在のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．より入手可能）、ポリエチレンイミン、ポリ（ジメチルアミン−コ−エピクロヒドリン）などのエピクロヒドリン官能化ポリアミン及び／又はポリアミドアミン、ポリジアリルジメチル−塩化アンモニウム、４元素アンモニウム水溶性モノマーとグラフトされたセルロースコポリマー又はセルロース派生物などの陽イオンセルロース派生物、及び同様のものを含む。１つの特定の実施形態においては、４元素水溶性モノマーを含むセルロース派生物である、ＣｅｌＱｕａｔ（登録商標）ＳＣ−２３０Ｍ又はＨ−１００（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｒｃｈ＆Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．より入手可能）を利用することができる。正味の負電荷を有する高分子電解質の幾つかの適当な例は、これらに制限されるものではないが、ポリ（エチレン−コ−メタクリル酸、ナトリウム塩）などのポリアクリル酸、及び同様のものを含む。他の高分子電解質も、使用できることも理解されるべきである。両親媒性高分子電解質（すなわち、有極部及び無極部を有する）のようなこれらの幾つかは、ほぼ中性である正味電荷を有することができる。例えば、適当な両親媒性高分子電解室の幾つかの例は、これらに制限されるものではないが、ポリ（スチリル−ｂ−Ｎ−メチル２−ビニルピリジニンヨウ化物）及びポリ（スチリル−ｂ−アクリル酸）を含み、どちらもカナダ、ドーバル所在のＰｏｌｙｍｅｒ  Ｓｏｕｒｃｅ，Ｉｎｃ．より入手可能である。
【００３８】
第一捕捉試薬は、分析対象と検出プローブとの間に形成された複合体に対して固定された結合サイトとして機能する。特定的には、抗体、抗原などのような分析対象は、典型的には２つ又はそれより多い結合サイト（例えばエピトープ）を有する。検出領域３０に到達する時、これらの結合サイトの１つは、プローブの特定結合部材によって占められている。しかしながら、分析対象のない結合サイトは、不動化された捕捉試薬と結合することができる。不動化された捕捉試薬に結合される後は、複合プローブは、新しい三元サンドイッチ複合体を形成する。
【００３９】
検出領域３０は、一般的に、使用者がテスト試料内における特定の分析対象の濃度を求めることができるように、何らかの数の異なる検出領域を設けることがでる。各々の領域は同じ捕捉試薬を含むことができるか、又は複数の分析対象を捕捉するために異なる捕捉試薬を含むことができる。例えば、検出領域３０は、２つ又はそれより多い異なる検出領域（例えば、線、ドットなど）を含むことができる。検出領域は、分析装置２０を通るテスト試料の流れに実質的に垂直な方向に、線状に配置することができる。同様に、幾つかの実施形態においては、検出領域は、分析装置を通るテスト試料の流れに実質的に平行な形態で、線状に配置することができる。
【００４０】
従来の横流サンドイッチ型装置においては、非複合型分析対象は、検出領域に置かれている捕捉試薬に対して複合型分析対象と競合し、分析対象の存在を示す指示を低下させることとなる。時間に対する信号強度を表すグラフにおいては、この低下はフックに似ており、したがってこの現象は「フック効果」として知られている。テスト試料を検出領域３０に直接堆積することは、分析対象が検出プローブと接触する前に捕捉試薬と複合するという結果をもたらす。このことは、一般的には、すべての又は実質的にはすべての試薬の捕捉位置が、分析対象に占められる結果となる。検出プローブは、その後、検出領域に到達した時、新しい三元サンドイッチ型複合体を形成する。分析対象は実質的にはすべての捕捉試薬と結合するので、この配列は、以前の分析において見られていた「フック効果」の実質的排除をもたらし、（十分な分析対象が存在する限り）余分な検出プローブは、実質的にはすべての捕捉試薬位置が複合型分析対象を含むことを確実にする。
【００４１】
図１を再び参照すると、多孔性膜２２は又、検出領域３０の下流側に配置された対照領域３２を含む。対照領域３２は、一般的には単一の識別できる領域（例えば、線、ドット、など）を形成するが、本発明においては多数の領域を考慮することができる。例えば、示された実施形態においては、単一線が利用されている。対照領域３２は、装置２０を通って緩衝材及び検出プローブの流れに実質的に垂直な方向に配置することができる。同様に、幾つかの実施形態においては、領域３２は、装置２０を通って流れに実質的には平行な方向に配置することができる。
【００４２】
第二捕捉試薬は、その形態に関係なく、対照領域３２内の多孔性膜２２上に不動化される。第二捕捉試薬は、あらゆる検出プローブ及び／又は検出領域３０で第一捕捉試薬とは結合しない分析対象／抱合プローブ複合体に対して、固定された結合位置として機能する。第二捕捉試薬は、複合検出プローブと非複合検出プローブ両方と結合することが望まれるので、第二捕捉試薬は、通常は第一捕捉試薬とは異なる。一実施形態においては、第二捕捉試薬は、第一捕捉試薬とは異なる生物的捕捉試薬（例えば、抗原、付着体、蛋白質Ａ又はＧ、ニュートラアビジン、アビジン、ストレプトアビジン、一次又は二次抗体（例えば多クローン、単クローンなど）、及びこれらの複合体）とする。例えば、第一捕捉試薬は、単クローン抗体（例えば、ＣＲＰ  Ｍａｂ１）とすることができ、一方で第二捕捉試薬は、アビジン（６６，０００ダルトンの高い陽イオンの糖蛋白質）、ストレプトアビジン（５２，８００ダルトンの非グリコシレート蛋白質）、ニュートラアビジン（デグリソレートアビジン派生物）、及び／又はカプトアビジン（硝酸化アビジン派生物）とすることができる。この実施形態においては、第二捕捉試薬はビオチンと結合することができ、これはビオチン化されるか、或いは第一捕捉試薬（例えば、ＣＲＰ  Ｍａｂ２）の単クローン抗体とは異なる単クローン抗体と抱合した検出プローブ上に含まれる。
【００４３】
更に、対照領域３２の第二捕捉試薬に対して、様々な非生物的材料を利用することが望ましい。多くの場合において、このような非生物的捕捉試薬は、すべての残存する抱合検出プローブ及び／又は分析対象／抱合プローブ複合体を確実なものとすることが、特に望まれる。
【００４４】
蛍光検出器が、検出領域及び対照領域において分析対象の存在を検出するために使用され、一般的には放出光子を励起光子から分離するための波長濾波と、放出光子を記録して、通常は電気信号又は写真画像として記録可能なアウトプットを形成する検出器を利用する。一般的には、４つの認識された検出器の型がある、すなわち分光蛍光計及びマイクロプレートリーダー、蛍光顕微鏡、蛍光スキャナー、及び流量型細胞計である。本発明に使用するために適当な蛍光検出器の１つには、ニュージャージー州エジソンのＳＰＥＸ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．より販売されているＦｌｕｏｒｏＬｏｇIII分光蛍光器がある。
【００４５】
望まれるならば、「時間分解型蛍光検出器」として知られている技術も、本発明に利用することができる。時間分解型蛍光検出器は、ユーロピウム（Ｅｕ（III））及びテルビウム（Ｔｂ（III））のランタニドキレートなどのある種の蛍光材料の蛍光特性を利用することにより、放出源又は散乱工程（励起放射の散乱により形成される）から背景信号を減少させることを目的とする。実質的には短い波長でキレートを励起した後は、このようなキレートは、強く赤方偏移した、狭帯域で、長持続時間の放出を示すことができる。典型的には、キレートは、分子のランタニドの近位に位置する発色団により、強い紫外線吸収帯を持つ。発色団による軽度の吸収に続いて、励起エネルギーは、励起した発色団からランタニドに移動する。これはランタニドの蛍光放出特性によるものである。パルス状の励起及びタイムゲートによる検出器の使用は、狭帯域の射出フィルターと組み合わせたとき、ランタニドキレートだけからの蛍光の特定的な検出を可能とし、典型的には短命であるか又は短い放出波長を有する試料内の他の種からの放出を排除する。
【００４６】
本発明は、これらの特定の実施形態に対して詳細を示したが、前述したものの理解を得る場合には、当業者は、これらの実施形態の代替物、修正及び均等手段を理解することが分かるであろう。したがって、本発明の範囲は、添付された特許請求の範囲及びあらゆる均等手段として評価されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明による横流型分析装置の一実施形態の斜視図である。
【符号の説明】
【００４８】
２０  装置
２２  多孔性膜
２８  緩衝材
３０  検出領域
３２  対照領域
３４  緩衝材放出領域
３６  緩衝材リザーバ
３８  緩衝材
４０  抱合パッド
【図１】
2008507692.tif 000003
【国際調査報告】
2008507692.tif 000004
2008507692.tif 000005
2008507692.tif 000006