(57)【要約】  本発明は、生物試料中のリン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の過剰発現を測定することにより、ヒト肺癌細胞を含んで成る生物試料が、上皮成長因子受容体阻害剤と化学療法剤の組み合わせに対して感受性であるかどうかを決定する方法に関する。本発明は、リン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質が用いられる患者中の肺癌の進行を阻害するための、候補薬剤を得るための又は組成物を選択するための方法にも関する。
2008538817.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト肺癌細胞を含んで成る生物試料が上皮成長因子受容体阻害剤と化学療法剤の組み合わせに対して感受性であるかどうかを決定する方法であって、
リン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の過剰発現が、ヒト肺癌細胞を含んで成る生物試料が上皮成長因子受容体阻害剤と化学療法剤の組み合わせに対して感受性であることの指標である、生物試料中のリン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の過剰発現を測定することを含んで成る前記方法。
【請求項２】
生物試料中のリン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の過剰発現を、
ａ）生物試料中のリン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルを測定すること、
ｂ）上皮成長因子阻害剤と化学療法剤の組み合わせに対して感受性でないヒト肺癌細胞を含んで成る生物試料中の、リン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルを測定すること、
ｃ）段階ａ）及び段階ｂ）において測定したリン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルの差異を測定し、それにより、リン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の過剰発現を測定すること、
により測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階ａ）及び段階ｂ）において測定したリン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルの差異が、少なくとも１０％である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
段階ａ）及び段階ｂ）において測定したリン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルの差異が、少なくとも２５％である、請求項２〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
生物試料が、原発肺腫瘍又は転移である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＥＧＦＲ阻害剤が、エルロチニブ又はＮ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−４−アミンである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
化学療法剤が、ゲムシタビン又はシスプラチンである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
リン酸化Ａｋｔタンパク質又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の過剰発現が、リン酸化タンパク質に特異的に結合する試薬を用いて測定される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
抗体、抗体誘導体、又は抗体フラグメントが、リン酸化ＡＫＴタンパク質又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質に特異的に結合する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
リン酸化ＡＫＴタンパク質が、Ａｋｔ１タンパク質のアミノ酸位置４７３に対応するアミノ酸位置でリン酸化され、或いはＭＡＰＫタンパク質が、ＭＡＰＫ１のアミノ酸位置２０２及び２０４に対応するアミノ酸位置でリン酸化される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＭＡＰＫタンパク質のアミノ酸配列が、アミノ酸配列の配列番号１又は２であり、ＡＫＴタンパク質のアミノ酸配列が、アミノ酸配列の配列番号６、７又は８である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
発現レベルが、プロテオミクス、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、免疫組織化学及び酵素結合免疫測定法から成る群から選択される方法を用いて測定される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
リン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の過剰発現を、
ａ）生物試料を免疫組織化学的に染色すること、
ｂ）生物試料中の細胞の染色の外観検査により、リン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルに対して、１、２、３及び４の数から選択されるグレードを割り当て、それにより、発現レベルに対して最も高い検出可能なグレードを割り当てること、
ｃ）免疫組織化学的に染色した生物試料中で、最も高い検出可能なグレードを有する細胞のパーセンテージを測定すること、
ｄ）割り当てたグレードに、免疫組織化学的に染色した生物試料中で最も高い検出可能なグレードを有する細胞のパーセンテージ、及び１００を掛けること、及び
ｅ）段階ｄ）における掛け算の結果が１００超である場合に、生物試料中のリン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の過剰発現を測定すること、
により測定する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ヒト肺癌細胞を含んで成る生物試料が、上皮成長因子阻害剤と化学療法剤の組み合わせに対して感受性であるかどうかを決定するための、リン酸化ＡＫＴタンパク質に結合する抗体又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質に結合する抗体の使用。
【請求項１５】
ａ）複数の試験組成物の存在下で、患者からのＥＧＦＲ阻害剤と化学療法剤の組み合わせに対して感受性である肺癌細胞を含んで成る生物試料のアリコートを、別々に曝露すること；
ｂ）試験組成物と接触させた生物試料のアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベル、及び試験組成物と接触させていない生物試料のアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルを比較すること、
ｃ）試験組成物と接触させていないアリコートと比べて、試験組成物を含むアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルを変化させる試験組成物の１つを選択すること、ここで、試験組成物と接触させた生物試料のアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルと、試験組成物と接触させていない生物試料のアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルの間の少なくとも１０％の差異が、試験組成物の選択のための指標である、
を含んで成る、患者における肺癌の進行を阻害するための組成物を選択する方法。
【請求項１６】
ａ）ＥＧＦＲ阻害剤及び化学療法剤に対して感受性である肺癌細胞を含む生物試料のアリコートを、候補薬剤と接触させること、
ｂ）候補薬剤と接触させた生物試料のアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルを測定すること、及び候補薬剤と接触させていない生物試料のアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルを測定すること、
ｃ）候補薬剤と接触させた生物試料のアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベル、及び候補薬剤と接触させていない生物試料のアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルを比較することにより、候補薬剤の効果を観察すること、
ｄ）観察された効果から当該薬剤を得ること、ここで、候補薬剤と接触させた生物試料のアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルと、候補薬剤と接触させていない生物試料のアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルの間の少なくとも１０％の差異が、候補薬剤の効果の指標である、
を含んで成る、候補薬剤を得る方法。
【請求項１７】
候補薬剤が候補阻害剤である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
候補薬剤が候補増強剤である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法により得られる候補薬剤。
【請求項２０】
請求項１９に記載の薬剤を含んで成る、医薬調製物。
【請求項２１】
肺癌の進行の阻害のための組成物の調製のための、請求項１９に記載の薬剤の使用。
【請求項２２】
請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法の段階；及び
ｉ）対象に対して治療有効量の薬剤を供給するのに十分な量で、段階（ｃ）で同定された候補薬剤又はその類似体若しくは誘導体を合成すること；及び／又は
ｉｉ）段階（ｃ）で同定された候補薬剤又はその類似体若しくは誘導体を、医薬として許容される担体と混合すること、
を含んで成る、薬剤を製造する方法。
【請求項２３】
患者における肺癌の進行を阻害するための候補薬剤を得るための又は組成物を選択するための、Ａｋｔタンパク質、ＭＡＰＫタンパク質、リン酸化Ａｋｔタンパク質、リン酸化ＭＡＰＫタンパク質、リン酸化Ａｋｔタンパク質又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質に選択的に結合する抗体の使用。
【請求項２４】
リン酸化ＭＡＰＫ及び／又はリン酸化Ａｋｔタンパク質に対する抗体を含んで成るキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物試料中のリン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の過剰発現を測定することにより、ヒト肺癌細胞を含んで成る生物試料が、上皮成長因子受容体阻害剤と化学療法剤の組み合わせに対して感受性であるかどうかを決定する方法に関する。本発明は、リン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質が用いられる患者中の肺癌の進行を阻害するための候補薬剤を得るための又は組成物を選択するための方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ｅｒｂＢ１遺伝子によりコードされるＥＧＦＲは、ヒト悪性腫瘍において因果的に関係する。特に、ＥＧＦＲの発現の増加は、乳癌、膀胱癌、肺癌、頭部癌、頸部癌及び胃癌、並びに神経膠芽腫において観察された。上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（１７０ｋＤの糖タンパク質）は、Ｎ末端細胞外ドメイン、疎水性膜貫通ドメイン、及びキナーゼドメインを含むＣ末端細胞内領域から構成される。ＥＧＦＲリガンド誘導性二量化は、固有のＲＴＫドメイン（Ｓｒｃホモロジードメイン１、ＳＨ１）を活性化し、細胞質ドメインの非触媒尾部中の６個の特異的なＥＧＦＲチロシン残基上での自己リン酸化を生じさせる。
【０００３】
癌細胞中のＥＧＦＲ活性化の細胞効果としては、増殖の増大、細胞運動の促進、接着、浸潤、血管新生、及びアポトーシスの阻害による細胞生存性の強化が挙げられる。ＥＧＦＲの活性化は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードの刺激により、腫瘍細胞増殖を誘導する。ＥＧＦＲに結合するリガンドにおいて、ＳＯＳグアニンヌクレオチド交換因子は、Ｇｒｂ２アダプタータンパク質により原形質膜に動員され、これは、小さなＧタンパク質であるＲａｓ上で、ＧＴＰのＧＤＰへの交換を促進し、その後、Ｒａｆ、ＭＥＫ、及びＥＲＫから成るＭＡＰＫカスケードを活性化する。ＥＲＫ（ｐＭＡＰＫ、ｐＥＲＫ１／２）の活性化は、順に、ＥＬＫ−１又はｃ−Ｍｙｃ（細胞成長を促進する）などの転写因子をリン酸化し、活性化する。
【０００４】
多くの成長因子経路は、多くのキナーゼの活性化を通して、ＮＳＣＬＣ細胞の発達及び生存に寄与する。ＥＧＦＲは、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ経路及びＳＴＡＴ経路を経るシグナル伝達によっても、癌細胞の生存率を強化する。Ａｋｔは、他の成長因子、例えばインスリン成長因子１、塩基性線維芽細胞成長因子、及びインターロイキン３及び６によっても刺激される。Ａｋｔ１〜３の３つのアイソフォームは、全て、活性化ドメインにおけるＴ３０８残基とＣＯＯＨ末端ドメインにおけるＳ４７３残基において、同様の様式でリン酸化される（ｐＡＫＴ）。
【０００５】
エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））は、有力な上皮成長因子受容体（ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）であり、これは、単剤（ＷＯ０１／３４５７４）として用いた場合に、以前の化学療法が失敗であった非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する患者に対して、延命効果を提供する。様々な試験においてＴａｒｃｅｖａ（登録商標）の有効性が試験された。その化学名は、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−４−アミンである。
【０００６】
ＴＡＬＥＮＴ試験は、一次ＮＳＣＬＣ患者におけるプラセボ対照第３相試験であり、患者は、１５０ｍｇ／日でのエルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））又はプラセボと組み合わせてゲムシタビン及びシスプラチン（この併用化学放射線療法は、治療の非ＵＳ標準であった）を受けた。主要評価項目は、生存期間であり、副次的評価項目は、腫瘍増殖停止時間、奏功率；奏功期間；薬物動態パラメータ及び薬力学的パラメータ、及び生活の質であった。ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２の発現率も評価した。標準安全性解析を実施した。ＴＡＬＥＮＴ試験の全ての結果は、陰性であった。主要評価項目及び副次的評価項目に関して、ゲムシタビン及びシスプラチン単独と比較して、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））と化学療法（ゲムシタビン及びシスプラチン）に対する実証できる利点は存在しなかった（Ｇａｔｚｅｍｅｉｅｒ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２３（２００４）６１７（Ａｂｓｔｒａｃｔ７０１０））。エルロチニブとカルボプラチン及びパクリタキセルを用いた、ＵＳ基準のＴＲＩＢＵＴＥ試験において、同一結果が見られた（Ｈｅｒｂｓｔ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ（２００４）ＡＳＣＯ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ．Ｐｏｓｔ−Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；２２（Ｊｕｌｙ  １５  Ｓｕｐｐｌ．）（Ａｂｓｔｒａｃｔ７０１１））。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に対する二次又は三次治療としての単剤エルロチニブの無作為プラセボ対照第３相試験（ＢＲ．２１；ＮＣＩＣ／ＯＳＩＰ）は、プラセボ（４．７ヶ月）と比較して、エルロチニブ（６．７ヶ月）による生存性において、統計学的に顕著な改善を見出した。
【０００７】
様々な試験は、非小細胞肺癌中のバイオマーカー及び特定のＥＧＦＲ阻害薬剤への関係の調査に関する。Ｈａｎ等（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １１３（２００５）１０９−１１５）は、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標）、ＥＧＦＲ  ＴＫＩ）単剤治療により６５人の患者を調べる。彼らは、化学療法耐性非小細胞肺癌中のゲフィチニブに対する応答予測マーカーとして、ＥＧＦＲの下流分子を分析する。Ｃａｐｐｕｚｚｏ，Ｆ．等（ＪＮＣｌ  ９６（２００４）１１３３−１１４１）は、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ、ＥＧＦＲ  ＴＫＩ）単剤治療により１０６人の患者を調べる。彼らは、進行性非小細胞肺癌を有する患者におけるＡｋｔリン酸化及びゲフィチニブの有効性を調査し、ゲフィチニブを受けたＰ−Ａｋｔ−陽性腫瘍を有する患者は、Ｐ−Ａｋｔ−陰性腫瘍を有する患者より、治療からより多く利益を得ることを見出す。Ｖｉｃｅｎｔ，Ｓ．等（Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ９０（２００４）１０４７−１０５２）は、１１１人のＮＳＣＬＣ患者を調べる。彼らは、ｐＥＲＫが非小細胞肺癌中で活性化され、進行性腫瘍に関連することを見出す。Ｈａｎ，Ｓ．Ｗ．等（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２３（２００５）２４９３−２５０１）は、ゲフィチニブ（ＥＧＦＲ  ＴＫＩ）単剤治療により９０人の患者を調べる。彼らは、ゲフィニチブで処置した、非小細胞肺癌患者における上皮成長因子受容体変異の予測及び予後影響を分析する。Ｍｕｋｏｈａｒａ，Ｔ．等（Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ４１（２００３）１２３−１３０）は、ネオアジュバント化学療法又は放射線療法のいずれかを受けた６０人の患者（１段階あたり２０人の患者）を調べる。ＥＧＦＲの発現は、ｐＥＲＫ及びｐＡｋｔの発現と相互に関連する。試料サイズは、著者自身により言及されているように過度に低い。Ｒａｂｅｎ，Ｄ．等（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ  ５９（２００４）２７−３８）は、非小細胞肺癌に対する標的治療を調べる。Ｏｎｏ，Ｍ．等（Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ３（２００４）４６５−４７２）は、９個のＮＳＣＬＣ細胞株を試験し、ゲフィチニブで処理した。Ｈｉｒｓｃｈ，Ｆ．Ｒ．等（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １７（２００５）１１８−１２２）は、ゲフィチニブ耐性に対する有力なマーカーとしてＡｋｔ及びＭＡＰＫのリン酸化状態を再調査する。Ｍｅｅｒｔ等（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００３）２３１６−２３２６）は、ＥＧＦＲ阻害剤活性の側面において、ＮＳＣＬＣ細胞株を調べる。ＥＧＦＲの発現レベルもＨｅｒ２の発現レベルも、ＥＧＦＲ阻害剤に対する感受性と相互に関連しない。Ｂｒｏｇｎａｒｄ，Ｊ．等（Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ９（２００２）８９３−９０４）は、１９個のＮＳＣＬＣ細胞株を試験し、それにより、１７個は、Ｅｒｋ１／２のリン酸化及び恒常的活性を示した。Ｄａｖｉｄ，Ｏ．等（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０（２００４）６８６５−６８７１）は、ｐＡｋｔの過剰発現は、ＮＳＣＬＣ中の独立した予後因子であることを開示する。Ｋａｋｉｕｃｈｉ，Ｓ．等（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３（２００４）３０２９−３０４３）は、３３人のＮＳＣＬＣ患者の、ゲノム規模でのｃＤＮＡマイクロアレイを調べる。全てには、単剤治療設定においてゲフィチニブが与えられた。Ａｋｔ／ｐＡｋｔの発現レベル、ＥＧＦＲ遺伝子状態又はｐＥＧＦＲ染色とゲフィチニブ応答の間の相互関係に関して、証拠は見出されなかった。Ｋｉｍ，Ｒ．Ｈ．等（Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ７（２００５）２６３−２７３）は、ＤＪ−１の発現（癌遺伝子）が、ｐＡｋｔレベルに等しいことを開示した。Ｂａｌｓａｒａ，Ｂ．Ｒ．等（Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２５（２００４）２０５３−２０５９）は、ＴＭＡ ｐＡｋｔ発現により、１１０人のＮＳＣＬＣ患者を調べる。ｐＡｋｔ陰性と陽性の間に、生存率の顕著な差異は存在しない。Ｈｉｒａｍｉ，Ｙ．等（Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２１４（２００４）１５７−１６４）は、非小細胞肺癌中の上皮成長因子受容体、ｐＡｋｔ及び低酸素誘導因子−１アルファの関係を調べる。Ｌｅｅ，Ｓ．Ｈ．等（ＡＰＭＩＳ  １１０（２００２）５８７−５９２）は、ＮＳＣＬＣ患者の４３ＬＮ転移について分析する。ＮＳＣＬＣ中のＡｋｔ活性化は、腫瘍進行よりむしろ、腫瘍発達において役割を果たす。Ｅｎｇｅｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．等（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２（２００４）３７８８−３７９３）は、ｅｒｂＢ−３がゲフィチニブ感受性非小細胞肺癌細胞株におけるホスホイノシチド３−キナーゼ活性を介在することを分析する。Ｄａｖｉｄ，Ｏ．（Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ５（２００１）４３０−４３３）は、肺癌における新規の診断マーカーとしての、Ａｋｔ及びＰＴＥＮの役割を論じる。Ｍａｎｔｈａ，Ａ．等（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１１（２００５）２３９８−２４０７）は、上皮成長因子受容体の役割を阻害するメバロン酸経路標的化について調べる。
【０００８】
ＥＧＦＲ陽性癌に関連する予後マーカーは、ＷＯ２００４／０４６３８６において調べられている。ＥＧＦＲ阻害薬剤に対する応答に関する遺伝子発現マーカーは、ＵＳ２００４／０１５７２５５により開示されている。上皮成長因子受容体モジュレーターに対する感受性を決定するためのバイオマーカー及び方法は、ＷＯ２００４／０６３７０９に開示されている。ＷＯ０１／００２４５は、ヒト化抗ＥｒｂＢ２抗体及び抗ＥｒｂＢ２抗体、例えばヒト化抗ｅｒｂＢ２抗体を用いて癌を処置するための方法について記載する。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
ＥＧＦＲ阻害剤治療、特にＥＧＦＲ阻害剤の化学療法剤との併用治療に対する感受性を決定するための方法を提供する必要性が未だに存在する。
【００１０】
従って、本発明の実施態様において、ヒト肺癌細胞を含んで成る生物試料が上皮成長因子受容体阻害剤と化学療法剤の組み合わせに対して感受性であるかどうかを決定する方法であって、リン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の過剰発現が、ヒト肺癌細胞を含んで成る生物試料が上皮成長因子受容体阻害剤と化学療法剤の組み合わせに対して感受性であることの指標である、生物試料中のリン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の過剰発現を測定することを含んで成る前記方法を提供する。
【００１１】
本発明の別の実施態様において、リン酸化ＡＫＴタンパク質に結合する抗体又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質に結合する抗体は、ヒト肺癌細胞を含んで成る生物試料が上皮成長因子受容体阻害剤と化学療法剤の組み合わせに対して感受性であるかどうかを決定するために用いられる。
【００１２】
本発明の別の実施態様においては、
ａ）複数の試験組成物の存在下で、患者からのＥＧＦＲ阻害剤と化学療法剤の組み合わせに対して感受性である肺癌細胞を含んで成る生物試料のアリコートを、別々に曝露すること；
ｂ）試験組成物と接触させた生物試料のアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベル、及び試験組成物と接触させていない生物試料のアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルを比較すること、
ｃ）試験組成物と接触させていないアリコートと比べて、試験組成物を含むアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルを変化させる試験組成物の１つを選択すること、ここで、試験組成物と接触させた生物試料のアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルと、試験組成物と接触させていない生物試料のアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルの間の少なくとも１０％の差異が、試験組成物の選択のための指標である、
を含んで成る、患者における肺癌の進行を阻害するための組成物を選択する方法が提供される。
【００１３】
本発明の更に別の実施態様においては、
ａ）ＥＧＦＲ阻害剤及び化学療法剤に対して感受性である肺癌細胞を含む生物試料のアリコートを、候補薬剤と接触させること、
（ｂ）候補薬剤と接触させた生物試料のアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルを測定すること、及び候補薬剤と接触させていない生物試料のアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルを測定すること、
（ｃ）候補薬剤と接触させた生物試料のアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベル、及び候補薬剤と接触させていない生物試料のアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルを比較することにより、候補薬剤の効果を観察すること、
（ｄ）観察された効果から当該薬剤を得ること、ここで、候補薬剤と接触させた生物試料のアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルと、候補薬剤と接触させていない生物試料のアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルの間の少なくとも１０％の差異が、候補薬剤の効果の指標である、
を含んで成る、候補薬剤を得る方法が提供される。
【００１４】
本発明の別の実施態様においては、本発明の方法により得られる候補薬剤、及び本発明の薬剤を含んで成る医薬調製物が提供される。
【００１５】
本発明の更に別の実施態様において、本発明の薬剤は、肺癌の進行の阻害のための組成物の調製に用いられる。
【００１６】
本発明の更に別の実施態様においては、本発明の方法の段階、及び
（ｉ）対象に対して治療有効量の薬剤を供給するのに十分な量で、段階（ｃ）で同定された候補薬剤又はその類似体若しくは誘導体を合成すること；及び／又は
（ｉｉ）段階（ｃ）で同定された候補薬剤又はその類似体若しくは誘導体を、医薬として許容される担体と混合すること、
を含んで成る、薬剤を製造するための方法。
【００１７】
本発明の別の実施態様においては、Ａｋｔタンパク質、ＭＡＰＫタンパク質、リン酸化Ａｋｔタンパク質、リン酸化ＭＡＰＫタンパク質、リン酸化Ａｋｔタンパク質又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質に対して選択的に結合する抗体が、患者において肺癌の進行を阻害するための候補薬剤を得るために又は組成物を選択するために用いられる。
【００１８】
本発明の更に別の実施態様においては、リン酸化ＭＡＰＫ及び／又はリン酸化Ａｋｔタンパク質に対する抗体を含んで成るキットが提供される。
【００１９】
用語「生物試料」は、一般的に、個々の体液、細部株、組織培養、又は他の起源から得られる任意の生物試料を意味する。体液は、例えばリンパ液、血清、血漿、尿、精液、滑液及び髄液である。本発明によると、生物試料は、肺癌細胞及び非肺癌細胞（他の細胞）を含んで成る。哺乳動物から生検組織及び体液を得るための方法は、当業界で周知である。
【００２０】
用語「発現のレベル」又は「発現レベル」は、一般的に、試料中のアミノ酸産物又はタンパク質の量、好ましくは本発明の試料中のリン酸化アミノ酸産物又はリン酸化タンパク質の量を指す。「発現」は、遺伝子コード情報が、細胞中に存在し、作動（例えば、本発明のリン酸化）する構造へと変換される工程を指す。本明細書中で用いる場合、「発現遺伝子」は、ｍＲＮＡへと転写され、その後タンパク質へと翻訳され、翻訳後に修飾（例えば、リン酸化）されたものを含む。単に完全性のために、この用語は、ＲＮＡへと転写されるが、タンパク質へと翻訳されない（例えば、トランスファーＲＮＡ及びリボソームＲＮＡ）発現遺伝子も含む。用語「過剰発現」及び「過少発現」は、コントロールとして用いる試料中のベースライン発現レベルと比較した場合の、発現レベルにおける上方又は下方の偏差それぞれを指す。従って、「過剰発現」は「増大した発現」でもあり、「過少発現」は「減少した発現」である。
【００２１】
本明細書中の用語「抗体」は、最も広い意味において用いられ、具体的には、所望の生物活性を示す限り、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される多特異的抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体フラグメントに及ぶ。
【００２２】
本明細書中で用いる場合、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に同質な抗体の集団から得られる抗体を指す。すなわち、その集団を組んで成る個々の抗体は、少量で存在し得る自然に生じる可能性のある変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に向けられる。更に、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に向けられる。特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが他の抗体により汚染されずに合成することができる点で有利である。修飾語句「モノクローナル」は、実質的に同質な抗体の集団から得られる抗体の性質を示し、抗体の生成を必要とする場合、任意の特定の方法により構築されない。例えば、本発明で用いられるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．等（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６（１９７５）４９５）により最初に説明されたハイブリドーマ法により生成することができ、或いは組み換えＤＮＡ法により生成することができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の一部分を含んで成る。
【００２３】
本発明の着目の抗原（すなわち、リン酸化ＭＡＰＫ又はリン酸化ｐＡＫＴタンパク質）に「結合する」抗体は、抗体が抗原の存在を検出するのに有用であるように十分な親和性で抗原に結合することができるものである。本発明の抗体は、リン酸化ＭＡＰＫ又はリン酸化ｐＡＫＴタンパク質に結合するものであり、これは、通常、非リン酸化ＭＡＰＫ又は非リン酸化ｐＡＫＴタンパク質とは対照的に、リン酸化ＭＡＰＫ又はリン酸化ｐＡＫＴタンパク質に選択的に結合し、或いは非リン酸化ＭＡＰＫ又は非リン酸化ｐＡＫＴタンパク質とは顕著に交差反応しない。このような実施態様において、非リン酸化タンパク質への抗体の結合の程度は、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析又は放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）により測定した場合に、１０％未満であるだろう。言い換えれば、それは、リン酸化ＭＡＰＫ又はリン酸化ｐＡＫＴタンパク質に特異的に結合し、非リン酸化ＭＡＰＫ又は非リン酸化ｐＡＫＴタンパク質に特異的に結合しないか又は全く結合しない。
【００２４】
「化学療法剤」は、癌の処置に有用な化合物である。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロスホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））、スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メトレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）；エチレンイミン及びメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎ）、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスファオラミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）及びトリメチロロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えばアクラシノマイシン、アクチノマイシン、オウスラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポフィロマイシン（ｐｏｆｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗物質、例えばメトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵ；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充物質（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）、例えばフロリニン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビスアントレン；���ダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン；エルホルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；エリプチニム酢酸塩（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ）；エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）；ミトキサントロン；モピダモル（ｍｏｐｉｄａｍｏｌ）；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｃｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメト（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ．)及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；及び任意の上記のものの医薬として許容される塩、酸又は誘導体が挙げられる。また、この定義の中に、腫瘍においてホルモン作用を調節又は阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば抗エストロゲン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリゾキシム、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）；及び、抗アンドロゲン剤、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；及び、任意の上記のものの医薬として許容される塩、酸又は誘導体も含まれる。「化学療法剤」自体は、上記の癌の組み合わせの処置に有用である化合物の組み合わせであることができる。すなわち、当該組み合わせは、ゲムシタビン／シスプラチンだけでなく、例えばシスプラチン／パクリタキセル、シスプラチン／ドセタキセル、シスプラチン／ビノレルビン、ゲムシタビン／カルボプラチン、又はカルボプラチン／ドセタキセルであることができる。
【００２５】
用語「ＥＧＦＲ阻害剤」は、ＥＧＦＲに結合し、任意にＥＧＦＲ活性を阻害する治療剤を指す。このような薬剤の例としては、ＥＧＦＲに結合する抗体及び小分子が挙げられる。ＥＧＦＲに結合する抗体の例としては、ＭＡｂ５７９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ＨＢ  ８５０６）、ＭＡｂ４５５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ＨＢ８５０７）、ＭＡｂ２２５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ８５０８）、ＭＡｂ５２８（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ８５０９）（ＵＳ４，９４３，５３３、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．を参照のこと）、及びその変異体、例えばキメラ化２２５（Ｃ２２５又はＣｅｔｕｘｉｍａｂ；ＥＲＢＵＴＩＸ（登録商標））及び再形成ヒト２２５（Ｈ２２５）（ＷＯ９６／４０２１０、Ｉｍｃｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．を参照のこと）；タイプ１１変異体ＥＧＦＲに結合する抗体（ＵＳ５，２１２，２９０）；ＵＳ５，８９１，９９６に記載されたＥＧＦＲに結合するヒト化及びキメラ化抗体；及びＥＧＦＲに結合するヒト抗体、例えばＡＢＸ−ＥＧＦ（ＷＯ９８／５０４３３、Ａｂｇｅｎｉｘを参照のこと）が挙げられる。抗ＥＧＦＲ抗体は、細胞毒性剤により抱合して、免疫抱合体を生成することができる（例えば、ＥＰ０６５９４３９Ａ２、Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨを参照のこと）。ＥＧＦＲに結合する小分子の例としては、ＺＤ１８３９又はゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）；Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）、ＣＰ−３５８７７４（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ）及びＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）が挙げられる。本出願において特に好ましいのは、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤、特に小分子ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤、例えばＴａｒｃｅｖａ（登録商標）である。「小分子」は、例えば、約１０，０００グラム／モル未満、好ましくは約５，０００グラム／モル未満の分子量を有するペプチド又はペプチド模倣体であることができる。好ましくは、「小分子」は、約５，０００グラム／モル未満、好ましくは約１，０００グラム／モル未満、より好ましくは５００グラム／モル未満の分子量を有する化合物、すなわち有機化合物又は無機化合物、並びにそのような化合物の塩、エステル、及び他の医薬として許容される形態である。従って、本発明の好ましい実施態様において、ＥＧＦＲ阻害剤は、約５，０００グラム／モル未満、好ましくは約１，０００グラム／モル未満の分子量を有する化合物であるＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤、並びにそのような化合物の塩、エステル、及び他の医薬として許容される形態である。言い換えると、ＥＧＦＲ阻害剤は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性を阻害し、約５，０００グラム／モル未満、好ましくは約１，０００グラム／モル未満、より好ましくは５００グラム／モル未満の分子量を有する化合物、並びにそのような化合物の塩、エステル、及び他の医薬として許容される形態である。
【００２６】
「ゲムシタビン」は、デオキシリボース部分が２位において２個のフッ素原子を含む、デオキシシチジンのピリミジン類似体である、化学療法剤２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン（ｄＦｄＣ）である（Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｖ．等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４８（１９８８）４０２４を参照のこと）。それは、Ｇｅｍｚａｒ（登録商標）として、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ，ＵＳＡ）から市販されている。
【００２７】
本出願において用いる場合、「シスプラチン」は、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）として、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ）から市販されている、化学療法剤シス-ジアンミンジクロロ白金（ＵＳ５，５６２，９２５を参照のこと）である。「シスプラチン」は、シス位の２個の塩素原子及び２個のアンモニア分子により囲まれた白金の中心原子を含む重金属複合体である。
【００２８】
本発明によると、「ヒト肺癌細胞を含んで成る生物試料が上皮成長因子受容体阻害剤と化学療法剤の組み合わせに対して感受性である」という表現は、ヒト肺癌細胞を含んで成る生物試料が、上皮成長因子受容体阻害剤単独での処理とは対照的に、上皮成長因子受容体阻害剤と化学療法剤の組み合わせによる処置に対して感受性であることを意味する。「感受性である」とは、「に対して反応する」又は「に対して反応を示す」と理解されることもでき、特に肺癌患者に対して有効な反応である。それにより、肺癌患者が、上皮成長因子受容体阻害剤単独での処理とは対照的に、上皮成長因子受容体阻害剤と化学療法剤の組み合わせによる処置に対して感受性であるかどうかを決定することができる。これは、患者がそのような処置から利益を享受するだろうことを意味する。
【００２９】
「ＭＡＰＫ」タンパク質は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）又は細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）として知られる、高度に保存された細胞質セリン／スレオニンタンパク質キナーゼファミリーのメンバーである。このタンパク質ファミリーは、いくつかのサブグループを有する。ＥＲＫは、様々な細胞外シグナル、例えば浸透圧ストレス、熱ショック、炎症誘発性サイトカイン、ホルモン、及びマイトジェンに応答して、活性化及びチロシン−又はスレオニン−リン酸化される。本発明で用いる場合、用語「ＭＡＰＫタンパク質」は、好ましくは、ＭＡＰＫ１及びＭＡＰＫ３を含んで成る、或いは、好ましくは、ＭＡＰＫ１及びＭＡＰＫ３から成るＭＡＰＫタンパク質ファミリーのメンバーを指す。ＭＡＰＫ１（ＥＲＫ２）のアミノ酸配列は、配列番号１であり、ＭＡＰＫ３（ＥＲＫ１）（配列番号２）。これらのアミノ酸配列は、ｍＲＮＡ配列、すなわちＭＡＰＫ１に関してはｃＤＮＡ配列の配列番号３及び４、ＭＡＰＫ３に関しては配列番号５によりコードされている。ＭＡＰＫ１における主なリン酸化部位は、Ｔｈｒ１８５及びＴｙｒ１８５であり、ＭＡＰＫ３における主なリン酸化は、Ｔｈｒ２０２及びＴｙｒ２０４である。これらのリン酸化部位は、本発明において用いられる抗体、すなわち好ましくはＭＡＰＫ１及びＭＡＰＫ３のリン酸化形態に対するポリクローナル抗体血清によっても認識される。
【００３０】
用語「Ａｋｔ」タンパク質は、それぞれＡｋｔ１／ＰＫＢアルファ、Ａｋｔ２／ＰＫＢベータ（Ｓｔａａｌ，Ｓ．Ｐ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４（１９８７）５０３４−５０３７）、及びＡｋｔ３／ＰＫＢガンマ（Ｎａｋａｔａｎｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２５７（１９９９）９０６−９１０；ＵＳ６，８８１，５５５）と呼ばれている３つのメンバーを有する、二次メッセンジャー調節セリン／スレオニンタンパク質キナーゼのＡｋｔ／ＰＫＢサブファミリーのタンパク質を指す。アイソフォームは相同であり、ホスファチジルイノシトール３’−ＯＨキナーゼ（ＰＩ３Ｋ）シグナル伝達に応答してリン酸化により活性化される。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＰＫＢ経路は、腫瘍形成においても、細胞生存／細胞死を調節するのに重要であるようである（Ｄｕｄｅｋ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７５（１９９７）６６１−６６５）。本発明において用いる場合、用語「Ａｋｔタンパク質」は、好ましくは、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３を含んで成る、或いは、好ましくは、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２及びＡｋｔ３から成るＡｋｔタンパク質ファミリーのメンバーを指す。Ａｋｔ／ＰＫＢαのリン酸化は、２つの部位Ｔｈｒ308及びＳｅｒ473において生じる（Ｍｅｉｅｒ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１９９７）３０４９１−３０４９７）。同等のリン酸化部位は、Ａｋｔ２／ＰＫＢベータ（Ｔｈｒ309及びＳｅｒ474）及びＡｋｔ３／ＰＢＫガンマ（Ｔｈｒ305及びＳｅｒ472）中に生じる。用語「リン酸化Ａｋｔ」タンパク質は、リン酸化された、好ましくは上記の部位においてリン酸化された「Ａｋｔ」タンパク質を指す。本発明において用いる場合、用語「ＭＡＰＫタンパク質」は、好ましくは、ＭＡＰＫ１及びＭＡＰＫ３を含んで成る、或いは、好ましくは、ＭＡＰＫ１及びＭＡＰＫ３から成るＭＡＰＫタンパク質ファミリーのメンバーを指す。Ａｋｔ１は、ヒトＲＡＣ−アルファ セリン／スレオニン−タンパク質キナーゼ（ＥＣ２．７．１．３７）（ＲＡＣ−ＰＫ−アルファ）、タンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢ）（Ｃ−ＡＫＴ）としても知られており、Ａｋｔ１のアミノ酸配列は、配列番号６である。ＡＫＴ２は、ヒトＲＡＣ−ベータ セリン／スレオニン−タンパク質キナーゼ（ＥＣ２．７．１．３７）（ＲＡＣ−ＰＫ−ベータ）、タンパク質キナーゼＡｋｔ−２、又はタンパク質キナーゼＢ、ベータ（ＰＫＢベータ）としても知られており、Ａｋｔ２のアミノ酸配列は、配列番号７である。ＡＫＴ３は、ヒトＲＡＣ−ガンマ セリン／スレオニン−タンパク質キナーゼ）（ＥＣ２．７．１．３７）（ＲＡＣ−ＰＫ−ガンマ）、タンパク質キナーゼＡｋｔ−３又はタンパク質キナーゼＢ、ガンマ（ＰＫＢガンマ）（ＳＴＫ−２）としても知られており、Ａｋｔ３のアミノ酸配列は、配列番号８である。
【００３１】
発明の詳細な説明
当業界の技術の範囲内である分子生物学及び核酸化学の通常の技術は、文献中で説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｇａｉｔ，ＭＪ．（ｅｄ．），Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８４；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ，ＳＪ．（ｅｄｓ．），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８５；及び、シリーズ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと。これらの全ては、引用文献により本明細書中に組み込まれる。上記及び下記の、全ての特許、特許出願、及び本明細書中で言及される刊行物は、引用文献により本明細書中に組み込まれる。
【００３２】
本発明の実施態様において、ヒト肺癌細胞を含んで成る生物試料が上皮成長因子受容体阻害剤と化学療法剤の組み合わせに対して感受性であるかどうかを決定する方法であって、リン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の過剰発現が、ヒト肺癌細胞を含んで成る生物試料が上皮成長因子受容体阻害剤と化学療法剤の組み合わせに対して感受性であることの指標である、生物試料中のリン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の過剰発現を測定することを含んで成る前記方法を提供する。
【００３３】
好ましくは、本発明の方法において、生物試料中のリン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の過剰発現を、
ａ）生物試料中のリン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルを測定すること、
ｂ）上皮成長因子阻害剤と化学療法剤の組み合わせに対して感受性でないヒト肺癌細胞を含んで成る生物試料中の、リン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルを測定すること、
ｃ）段階ａ）及び段階ｂ）において測定したリン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルの差異を測定し、それにより、リン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の過剰発現を測定すること、
により測定する。
【００３４】
好ましくは、段階ａ）及び段階ｂ）において測定したリン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルの差異は、少なくとも１０％である。より好ましくは、段階ａ）及び段階ｂ）において測定したリン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルの差異は、少なくとも２５％である。別の実施態様において、段階ａ）及び段階ｂ）において測定したリン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルの差異は、少なくとも５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、３００％、４００％、５００％又は１，０００％である。段階ａ）及び段階ｂ）において測定したリン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルの差異は、最大で１０，０００％又は５０，０００％であることができる。段階ａ）及び段階ｂ）において測定したリン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルの差異は、好ましくは１０％〜１０，０００％、より好ましくは２５％〜１０，０００％、５０％〜１０，０００％、１００％〜１０，０００％、更により好ましくは２５％〜５，０００％、５０％〜５，０００％、１００％〜５，０００％である。
【００３５】
本発明の好ましい実施態様において、生物試料は、例えば肺生検により、或いは生検により他の器官から得ることができる原発肺腫瘍又は転移（局所又は遠隔）である。転移は、例えば肝臓又はリンパ節からの遠隔転移であることもできる。このような遠隔転移は、転移が肺に由来する場合、肺癌細胞も含むことに注意する必要がある。
【００３６】
別の好ましい実施態様において、癌は、膵臓癌のような肺癌以外の別の癌である。しかし、固形腫瘍を有する他の癌も適しており、例えば卵巣、結腸直腸、頭部及び頸部、腎臓細胞癌、神経膠腫及び消化管癌、特に胃癌である。
【００３７】
別の好ましい実施態様において、ＥＧＦＲ阻害剤は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤、特に小分子ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤、例えばＴａｒｃｅｖａ（登録商標）である。従って、言い換えれば、本発明の特に好ましい実施態様において、ＥＧＦＲ阻害剤は、エルロチニブ又はＮ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−４−アミンである。
【００３８】
本発明の更に別の好ましい実施態様において、化学療法剤は、ゲムシタビン及び／又はシスプラチンである。
【００３９】
本発明の別の好ましい実施態様において、リン酸化Ａｋｔタンパク質又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の過剰発現は、リン酸化タンパク質に特異的に結合し、好ましくは非リン酸化タンパク質に特異的に結合しないか又は全く結合しない試薬を用いて測定する。好ましくは、抗体、抗体誘導体、又は抗体フラグメントは、リン酸化ＡＫＴタンパク質又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質に特異的に結合し、好ましくは非リン酸化ＡＫＴタンパク質又は非リン酸化ＭＡＰＫタンパク質に特異的に結合しないか又は全く結合しない。
【００４０】
本発明の更に別の好ましい実施態様において、リン酸化ＡＫＴタンパク質は、Ａｋｔ１タンパク質のアミノ酸位置４７３に対応するアミノ酸位置でリン酸化され、或いはＭＡＰＫタンパク質は、ＭＡＰＫ１のアミノ酸位置２０２及び２０４に対応するアミノ酸位置でリン酸化される。好ましくは、ＭＡＰＫタンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸配列の配列番号１又は２であり、ＡＫＴタンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸配列の配列番号６、７又は８である。
【００４１】
本発明の方法で用いることができる多くの異なるタイプの免疫測定法が存在し、例えば酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫吸着法（ＦＩＡ）、化学発光免疫吸着法（ＣＬＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、及び免疫ブロット法である。用いることのできる異なる免疫測定法の概説に関しては、以下を参照のこと：Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ  ａｎｄ  Ｚｏｒｂａｓ（ｅｄｓ．），Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ，１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ  １９９８，Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ。従って、本発明の更に別の好ましい実施態様において、発現レベルは、プロテオミクス、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、免疫組織化学及び酵素結合免疫測定法から成る群から選択される方法を用いて測定される。
【００４２】
本発明の好ましい実施態様において、リン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の過剰発現は、以下の段階により測定することができる
ａ）生物試料を免疫組織化学的に染色すること、
ｂ）生物試料中の細胞の染色の外観検査により、リン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルに対して、１、２、３及び４の数から選択されるグレードを割り当て、それにより、発現レベルに対して最も高い検出可能なグレードを割り当てること、
ｃ）免疫組織化学的に染色した生物試料中で、最も高い検出可能なグレードを有する細胞のパーセンテージを測定すること、
ｄ）割り当てたグレードに、免疫組織化学的に染色した生物試料中で最も高い検出可能なグレードを有する細胞のパーセンテージ、及び１００を掛けること、及び
ｅ）段階ｄ）における掛け算の結果が１００超である場合に、生物試料中のリン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の過剰発現を測定すること。
【００４３】
本発明の別の実施態様において、肺癌患者が、上皮成長因子受容体阻害剤と化学療法剤の組み合わせから利益を得るかどうかを決定するための方法であって、リン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の過剰発現が、患者が上皮成長因子受容体阻害剤と化学療法剤の組み合わせから利益を得ることの指標である、患者からの試料中のリン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の過剰発現を測定することを含んでなる前記方法が提供される。上記の全ての他の好ましい実施態様は、等しくこの実施態様に適用する。好ましくは、本発明の方法において、患者からの試料中のリン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の過剰発現は、以下の段階により測定される、
ａ）患者からの試料中のリン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の過剰発現レベルを測定すること、
ｂ）上皮成長因子阻害剤と化学療法剤の組み合わせから利益を得ない肺癌患者からの試料中の、リン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の過剰発現レベルを測定すること、
ｃ）段階ａ）及び段階ｂ）において測定されたリン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルの差異を測定すること、それにより、リン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の過剰発現を測定する。用語「利益を得る」は、上皮成長因子受容体阻害剤単独での処置とは対照的に、上皮成長因子受容体阻害剤と化学療法剤の組み合わせの処置から患者が利益を得ないことを意味する。
【００４４】
本発明の別の好ましい実施態様において、リン酸化ＡＫＴタンパク質に結合する抗体又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質に結合する抗体を、ヒト肺癌細胞を含んで成る生物試料が、上皮成長因子阻害剤と化学療法剤の組み合わせに対して感受性であるかどうかを決定するのに用いる。
【００４５】
本発明の更に別の実施態様において、
ａ）複数の試験組成物の存在下で、患者からのＥＧＦＲ阻害剤と化学療法剤の組み合わせに対して感受性である肺癌細胞を含んで成る生物試料のアリコートを、別々に曝露すること；
ｂ）試験組成物と接触させた生物試料のアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベル、及び試験組成物と接触させていない生物試料のアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルを比較すること、
ｃ）試験組成物と接触させていないアリコートと比べて、試験組成物を含むアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルを変化させる試験組成物の１つを選択すること、ここで、試験組成物と接触させた生物試料のアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルと、試験組成物と接触させていない生物試料のアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルの間の少なくとも１０％の差異が、試験組成物の選択のための指標である、
を含んで成る、患者における肺癌の進行を阻害するための組成物を選択する方法が提供される。
【００４６】
好ましくは、段階ｃ）における、リン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルの差異は、少なくとも２５％である。より好ましくは、段階ｃ）における、リン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルの差異は、少なくとも５０％である。別の実施態様において、段階ｃ）における、リン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルの差異は、少なくとも７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、３００％、４００％、５００％又は１，０００％である。段階ｃ）において測定したリン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルの差異は、最大で１０，０００％又は５０，０００％であることができる。段階ｃ）において測定したリン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルの差異は、好ましくは１０％〜１０，０００％、より好ましくは２５％〜１０，０００％、５０％〜１０，０００％、１００％〜１０，０００％、更により好ましくは２５％〜５，０００％、５０％〜５，０００％、１００％〜５，０００％である。
【００４７】
本発明の更に別の実施態様においては、
ａ）ＥＧＦＲ阻害剤及び化学療法剤に対して感受性である肺癌細胞を含む生物試料のアリコートを、候補薬剤と接触させること、
（ｂ）候補薬剤と接触させた生物試料のアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルを測定すること、及び候補薬剤と接触させていない生物試料のアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルを測定すること、
（ｃ）候補薬剤と接触させた生物試料のアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベル、及び候補薬剤と接触させていない生物試料のアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルを比較することにより、候補薬剤の効果を観察すること、
（ｄ）観察された効果から当該薬剤を得ること、ここで、候補薬剤と接触させた生物試料のアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルと、候補薬剤と接触させていない生物試料のアリコート中のリン酸化Ａｋｔタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルの間の少なくとも１０％の差異が、候補薬剤の効果の指標である、
を含んで成る、候補薬剤を得る方法が提供される。
【００４８】
好ましくは、段階ｄ）におけるリン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルの差異は、少なくとも２５％である。より好ましくは、段階ｄ）におけるリン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルの差異は、少なくとも５０％である。別の実施態様において、段階ｄ）におけるリン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルの差異は、少なくとも７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、３００％、４００％、５００％又は１，０００％である。段階ｄ）において測定したリン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルの差異は、最大で１０，０００％又は５０，０００％であることができる。段階ｄ）において測定したリン酸化ＡＫＴタンパク質及び／又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質の発現レベルの差異は、好ましくは１０％〜１０，０００％、より好ましくは２５％〜１０，０００％、５０％〜１０，０００％、１００％〜１０，０００％、更により好ましくは２５％〜５，０００％、５０％〜５，０００％、１００％〜５，０００％である。
【００４９】
好ましい実施態様において、候補薬剤は、候補阻害剤又は候補増強剤である。
【００５０】
本発明の別の実施態様において、本発明の方法により得られる候補薬剤が提供される。
【００５１】
更に別の実施態様において、本発明の薬剤を含んで成る医薬調製物が提供される。
【００５２】
更に別の実施態様において、本発明の薬剤は、肺癌の進行を阻害するための組成物の調製のために用いられる。
【００５３】
本発明の更に別の実施態様において、本発明の方法の段階、及び
（ｉ）対象に対して治療有効量の薬剤を提供するのに十分な量で、段階（ｃ）で同定された候補薬剤、或いはその類似体又は誘導体を合成すること；及び／又は
（ｉｉ）段階（ｃ）で同定された候補薬剤、或いはその類似体又は誘導体を、医薬として許容される担体と混合すること、
を含んで成る薬剤を製造する方法が提供される。
【００５４】
更に別の実施態様において、Ａｋｔタンパク質、ＭＡＰＫタンパク質、リン酸化Ａｋｔタンパク質、リン酸化ＭＡＰＫタンパク質、リン酸化Ａｋｔタンパク質又はリン酸化ＭＡＰＫタンパク質に選択的に結合する抗体を、患者における肺癌の進行を阻害するための候補薬剤を得るため又は組成物を選択するのに用いる。
【００５５】
本発明の別の実施態様において、キットは、リン酸化ＭＡＰＫ及び／又はリン酸化Ａｋｔタンパク質に対する抗体を含んで成ることが意図される。当業界で知られたこのようなキットは、本発明の方法、好ましくは免疫測定法、例えば酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫吸着法（ＦＩＡ）、化学発光免疫吸着法（ＣＬＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、及び免疫ブロット法を実施するための、増幅手順の間に用いることのできるプラスチック用品、例えば９６又は３８４ウエル形式のマイクロタイタープレート、又は例えばＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により製造された通常の反応チューブ、及び全ての他の試薬を更に含んで成る。用いることのできる異なる免疫測定法及び試薬の概説に関しては、以下のものを参照のこと：Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ  ａｎｄ  Ｚｏｒｂａｓ(ｅｄｓ．）、Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ、１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ １９９８、Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ。
【００５６】
以下の実施例、引用文献、配列表及び図面は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は、添付した特許請求の範囲において示される。本発明の精神から逸脱することなく、示した方法において変更が可能であることが理解される。
【実施例】
【００５７】
実施例１
腫瘍組織飼料におけるバイオマーカー試験
臨床試験に関する探索腫瘍バイオマーカー試験の目的は、Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）処置の陽性又は陰性臨床転帰を最も良く予測するそれらのマーカー又はマーカーの組み合わせの同定であった。試験の臨床結果が、Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）による処置からより利益を得る患者集団をどのように選択するかについて仮説を生み出さなかったので、特別な重点が、Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）の組み合わせ対化学療法単独の対照治療群において特異的に利益を得る患者（サブグループ）を区別するマーカーの同定に置かれた。更に、Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）対化学療法単独の対照治療群との具体的な組み合わせからの有害な作用を有する患者（サブグループ）を区別するマーカーの同定が、調べられた。
【００５８】
この試験の目的は、ＥＧＦＲシグナル伝達経路に関連する腫瘍特異的なバイオマーカー、例えばＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ｐＡＫＴ、及びｐＭＡＰＫを試験することである。
【００５９】
バイオマーカーデータは、臨床データと相互に関連した（全体的及び治療特異的試験）。
【００６０】
材料及び方法：
臨床試料：
バイオマーカー試験は、１４１人の患者の試料サブセットについて実施した。このために、最初の診断からのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織ブロックを得た。
【００６１】
ＩＨＣ試験のための抗体：
【表１】
2008538817.tif 000003
【００６２】
ｐＭＡＰＫ ＩＨＣプロトコル：
１．パラフィン−アレイ−ブロックから約３〜４ｎｍの厚さの切片を切り取る。
２．スライド・グラス上に切片を載せ、それらを一晩乾燥させる。
３．キシレン、その後低下するエタノール系において、スライドを脱パラフィンする：
−キシレン  一晩
−キシレン  ２×１０分間
−無水エタノール  ２×１０分間
−９６％のエタノール  ２×５分間
−８０％のエタノール  １×５分間
−７０％のエタノール  ２×５分間
−ＰＢＳ緩衝液  １０分間（１又は２回緩衝液を交換する）
４．抗原回復／試料前処理
圧力釜  ｐＨ６の１×クエン酸緩衝液中で１２０℃において５分間（Ｂｉｏｃｙｃ  ＧｍｂＨ、注文番号４００３００６９２）。ＴＢＳ／ＰＢＳ（１：１０）緩衝液中で５分間洗浄する。
５．ペルオキシダーゼブロッキング
−スライドを、３％のＨ2Ｏ2中で１０分間インキュベートする。
−ＴＢＳ／ＰＢＳ緩衝液中で２×５分間洗浄する。
６．抗体インキュベーション
−トリス緩衝液又は他のブロッキング溶液中に希釈した正常血清（１．５％）中にスライドを置く。
−１：１５０希釈した一次抗体（Ｚｙｍｅｄ  ウサギ抗ホスホ−ＥＲＫ１＋２  ｃａｔ ｎｏ．３６−８８００）をスライド上に置き、腐植化（ｈｕｍｉｆｉｅｄ）チャンバー中で３０℃において２時間それをインキュベートする。
−ＴＢＳ／ＰＢＳ緩衝液中で２×５分間洗浄する。
−スライド上にＥｎｖｉｓｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  ＨＲＰ（Ｄａｋｏ）を置き、腐植化チャンバー中で３０℃において３０分間インキュベートする。
−ＴＢＳ／ＰＢＳ緩衝液中で２×５分間洗浄する。
７．検出
−ｐＨ７．６の０．０５Ｍのトリス緩衝液で２０分間スライドを洗浄する
−５分間ＤＡＢ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（Ｌｉｑｕｉｄ  ＤＡＢ  Ｄａｋｏ  ｃｏｄｅ ｎｏ．Ｋ３４６７）でスライドをカバーし、それを５〜１０分間インキュベートする。
−脱塩水で５分間スライドを洗浄し、呈色反応を止める。
−ヘマトキシリン（Ｈａｒｒｉｓ  Ｈａｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ＨＴＸ  ３１０００、Ｍｅｄｉｔｅ  ＧｍｂＨ）で対比染色する
−水ですすぐ
−ＨＣＬ−エタノール中で識別する
−５分間水中で「青」
−漸増するエタノール系
−キシレン
−カバー
【００６３】
ｐＡＫＴ ＩＨＣプロトコル：
以下のことを除いて、ｐＭＡＰＫと同様のプロトコル
−比較４．：ｐＨ９のクエン酸緩衝液中での試料の前処理（Ｄａｋｏ  ｃｏｄｅ  ｎｏ．Ｓ２３６７）
−比較６．：１：４５０希釈した一次抗体（ａｂｃａｍ  ＡＫＴ  ホスホ  Ｓ４７３）（比較６．）
【００６４】
ＩＨＣデータ報告：
一人の病理学者が、全ての免疫染色を評価した。核染色強度（ｐＡＫＴ、ｐＭＡＰＫ）を、４段階スケール（０、１、２、３）で、外観検査により評価した。核染色強度に加えて、陽性細胞のパーセンテージ、及び分析の失敗の理由（すなわち、組織スポット中の腫瘍細胞の欠如、又はＴＭＡスライド上の組織スポットの欠如）を記録した。
【００６５】
調査統計分析：
バイオマーカーデータの統計分析は、各マーカーにより別々に及び／又は適切な組み合わせにより、臨床上の利益及び／又は毒性を予測する潜在的能力を調査することを目的とした。
【００６６】
経験によると、多くのバイオマーカーは、患者を超えて及び患者内で、傾斜統計分布を示す。しばしば、変動プロセスが乗法構造を有している点で、このゆがみのいくつかの生化学的バックグラウンドも存在する。線形統計アプローチ（例えば、回帰）を用いる場合、傾斜分布は問題を示す。統計モデルにおいて共変量として用いる場合、ゆがみも結果を曖昧にし得る。従って、これらの測定結果をおよそガウス型の分布へと変換する適切な変換が見出される必要がある。バイオマーカー領域における典型的な選択は、式ｌｏｇ（ｘ＋ｃ）の変換である。これらの変換は、値の順序は変えず、ランク又はカットオフに基づくノンパラメトリック分析は、変換により不変のままである。線形多変量法、例えば判別分析及び主成分分析を用いる場合、このような変換は必須でもある。
【００６７】
異なるマーカーの基礎統計及び相互依存性を、記述的に調べた。例えばＩＨＣのための異なる測定アプローチを比較する方法論的分析を、信頼性及び妥当性に関して実施した。Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）の利益を、臨床的エンドポイント生存期間（又は死亡までの時間、ＴＴＤ）、ＰＦＳ時間（進行までの時間、ＴＴＰ／Ｄ）、客観的反応、最良反応（ＣＲ／ＰＲ／ＳＤ／ＰＤ）により規定される。
【００６８】
これらの分析から現れるｐ値は、確認的意味に解釈されない；それらは、効率的な候補予測ルールへの調査を導くための特別な記述ツールとして理解される。マーカーは、臨床的エンドポイントの予測（例えば、カットオフのためのサーチ）の可能性に関する一変量レベルについて評価した。更なる多変量法（例えば、線形判別分析、多重ロジスティック回帰、回転による主成分分析、クラスタ分析、ＣＡＲＴ方法論）を用いて、マーカーの組み合わせを試験した。バイオマーカー及び臨床的共変量による応答補正を調べた。バイオマーカーから得た候補分類は、イベントまでの時間変数によりチェックした（カプラン−マイヤー曲線、Ｃｏｘ比例ハザードモデル、ログランク検定）。
【００６９】
結果：
全ての試験集団と比較したＴＭＡ試料サブセットの分析
バイオマーカー分析のための試料を用いた患者サブセットを、ベースライン患者特性及び臨床転帰パラメータに関して、全体の試験集団と比較した。概要を、以下の表に示す。
【００７０】
【表２】
2008538817.tif 000004
【００７１】
結果：
バイオマーカーデータを有する患者サブセットは、ＢＯ１６４１１試験集団に関する代表ではない。主な集団とバイオマーカーサブグループの間で、ＴＴＤとＴＴＰに関する危険率における差異が存在する。バイオマーカーサブグループのＴａｒｃｅｖａ（登録商標）処置患者は、主な臨床集団と比較して、より悪い予後を有する。いくつかのベースライン共変量は、バイオマーカーサブグループ−及びこのサブグループ内、特にＴａｒｃｅｖａ（登録商標）−関連患者は、主な試験集団と比較して、より病的な場合の混合を示したことを示す。ＫＭプロット（図１〜４）も、考慮されるべきである。
【００７２】
ｐＭＡＰＫ ＩＨＣ分析の結果
・ｐＭＡＰＫ ＩＨＣデータは、更なる統計分析にふさわしい十分な分散を示した。
・ｐＭＡＰＫ発現及び臨床転帰の間の相互関係を測定するために、記述的統計分析により、カットオフ値を確立した：フランクリン Ｈ−スコアを、染色強度と染色腫瘍細胞のパーセンテージを組み合わせることにより決定した（ｐＭＡＰＫ＿ｈｓｃｏ＝（ｐＭＡＰＫ＿核＿染色＋１）*ｐＭＡＰＫ＿核＿Ｐｏｓ＿細胞；範囲：０〜４００）。「陽性」ｐＭＡＰＫ染色を、Ｈ−スコアの＝／＞１００により規定し、さもなければ、染色は「陰性」であった。
・カプラン−マイヤープロットを、図５〜８に示す。
【００７３】
【表３】
2008538817.tif 000005
【００７４】
結果：
・化学療法／プラセボで処置した患者に関して、「陽性」ｐＭＡＰＫ発現は、より悪い予後に関連し（ＴＴＤ：ＨＲ ４．８８２、ｐ＝０．０００１）、一方、「陰性」ｐＡＫＴ発現は、より長い生存に関連するようである。
・傾向：「陽性ｐＭＡＰＫ」患者は、化学療法／Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）の組み合わせから利益を受け得る（ＨＲ ０．５００、ｐ：０．０５１６）（−−−−）
【００７５】
ｐＡＫＴ ＩＨＣ分析の結果
・ｐＡＫＴ ＩＨＣデータは、更なる統計分析にふさわしい十分な分散を示した。
・ｐＡＫＴ発現及び臨床転帰の間の相互関係を測定するために、記述的統計分析により、カットオフ値を確立した：フランクリン Ｈ−スコアを、核染色強度と染色腫瘍細胞のパーセンテージを組み合わせることにより決定した（ｐＡＫＴ＿ｈｓｃｏ＝（ｐＡＫＴ＿核＿染色＋１）*ｐＡＫＴ＿核＿Ｐｏｓ＿細胞；範囲：０〜４００）。「陽性」ｐＡＫＴ染色を、Ｈ−スコアの＝／＞３００により規定し、さもなければ、染色は「陰性」であった。
・カプラン−マイヤープロットを、図９〜１１に示す。
【００７６】
ＩＨＣと臨床データの相互関係
【表４】
2008538817.tif 000006
【００７７】
結果：
・化学療法／プラセボで処置した患者に関して、「陽性」ｐＡＫｔ発現は、より悪い予後に関連し（ＴＴＤ：ＨＲ ２．２５８、ｐ＝０．０５７３）、一方、「陰性」ｐＡＫＴ発現は、より長い生存に関連するようである。
・より小さな差異は、化学療法／Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）の組み合わせで処置した患者に対して見出された。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】エルロチニブ／ゲムシタビン／シスプラチン（Ａ）又はプラセボ／ゲムシタビン／シスプラチン処置に無作為に割り当てられた全ての患者の間での、死亡までの時間（ＯＳ）試験に関するカプラン−マイヤー曲線（円は、事象が生じる前に観測が終了された場合の、打ち切り観測時間を示す）。
【図２】エルロチニブ／ゲムシタビン／シスプラチン（Ａ）又はプラセボ／ゲムシタビン／シスプラチン処置に無作為に割り当てられた、バイオマーカーのデータを含む全ての患者の間での、死亡までの時間（ＯＳ）試験に関するカプラン−マイヤー曲線（円は、イベントが起こる前に観測が終了された場合の、打ち切り観測時間を示す）。
【図３】エルロチニブ／ゲムシタビン／シスプラチン（Ａ）又はプラセボ／ゲムシタビン／シスプラチン処置に無作為に割り当てられた全ての患者の間での、進行／死亡までの時間（ＰＦＳ）試験に関するカプラン−マイヤー曲線（円は、イベントが起こる前に観測が終了された場合の、打ち切り観測時間を示す）。
【図４】エルロチニブ／ゲムシタビン／シスプラチン（Ａ）又はプラセボ／ゲムシタビン／シスプラチン処置に無作為に割り当てられた、バイオマーカーのデータを含む全ての患者の間での、進行／死亡までの時間（ＰＦＳ）試験に関するカプラン−マイヤー曲線（円は、イベントが起こる前に観測が終了された場合の、打ち切り観測時間を示す）。
【図５】ｐＭＡＰＫ Ｈ−スコア≧１００（Ｈ）を有する患者を、ｐＭＡＰＫ Ｈ−スコア＜１００を有する患者と比較する、プラセボ／ゲムシタビン／シスプラチンで処置した全てのバイオマーカー患者の間での、死亡までの時間（ＯＳ）試験に関するカプラン−マイヤー曲線（円は、イベントが起こる前に観測が終了された場合の、打ち切り観測時間を示す）。
【図６】エルロチニブ／ゲムシタビン／シスプラチン（Ａ）をプラセボ／ゲムシタビン／シスプラチン処置と比較する、ｐＭＡＰＫ Ｈ−スコア＜１００を有する全てのバイオマーカー患者の間での、死亡までの時間（ＯＳ）試験に関するカプラン−マイヤー曲線（円は、イベントが起こる前に観測が終了された場合の、打ち切り観測時間を示す）。
【図７】それぞれ、エルロチニブ／ゲムシタビン／シスプラチン（ＬＡ、ＨＡ）をプラセボ／ゲムシタビン／シスプラチン（Ｈ）処置と比較する、ｐＭＡＰＫ Ｈ−スコア＜１００及びｐＭＡＰＫ Ｈ−スコア≧１００を有する全てのバイオマーカー患者の間での、死亡までの時間（ＯＳ）試験に関するカプラン−マイヤー曲線（円は、イベントが起こる前に観測が終了された場合の、打ち切り観測時間を示す）。
【図８】それぞれ、エルロチニブ／ゲムシタビン／シスプラチン（ＬＡ、ＨＡ）をプラセボ／ゲムシタビン／シスプラチン（Ｈ）処置と比較する、ｐＭＡＰＫ Ｈ−スコア＜１００及びｐＭＡＰＫ Ｈ−スコア≧１００を有する全てのバイオマーカー患者の間での、進行／死亡までの時間（ＰＦＳ）試験に関するカプラン−マイヤー曲線（円は、イベントが起こる前に観測が終了された場合の、打ち切り観測時間を示す）。
【図９】ｐＡＫＴ１ Ｈ−スコア＜３００（Ｌ）及びｐＡＫＴ１ Ｈ−スコア≧３００（Ｈ）を比較する、全てのプラセボ／ゲムシタビン／シスプラチン処置したバイオマーカー患者の間での、死亡までの時間（ＯＳ）試験に関するカプラン−マイヤー曲線（円は、イベントが起こる前に観測が終了された場合の、打ち切り観測時間を示す）。
【図１０】ｐＡＫＴ１ Ｈ−スコア＜３００（Ｌ）及びｐＡＫＴ１ Ｈ−スコア≧３００（Ｈ）を比較する、全てのエルロチニブ／ゲムシタビン／シスプラチン処置したバイオマーカー患者の間での、死亡までの時間（ＯＳ）試験に関するカプラン−マイヤー曲線（円は、イベントが起こる前に観測が終了された場合の、打ち切り観測時間を示す）。
【図１１】それぞれ、エルロチニブ／ゲムシタビン／シスプラチン（ＬＡ、ＨＡ）をプラセボ／ゲムシタビン／シスプラチン（Ｈ）処置と比較する、ｐＡＫＴ１ Ｈ−スコア＜３００（Ｌ）及びｐＡＫＴ１ Ｈ−スコア≧３００を有する全てのバイオマーカー患者の間での、死亡までの時間（ＯＳ）試験に関するカプラン−マイヤー曲線（円は、イベントが起こる前に観測が終了された場合の、打ち切り観測時間を示す）。
【図１】
2008538817.tif 000007
【図２】
2008538817.tif 000008
【図３】
2008538817.tif 000009
【図４】
2008538817.tif 000010
【図５】
2008538817.tif 000011
【図６】
2008538817.tif 000012
【図７】
2008538817.tif 000013
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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