(57)【要約】  本発明は、高感受性を有する組換えエンドヌクレアーゼを生産する方法、当該方法により得られるエンドヌクレアーゼ調製物、及び特にミスマッチの検出のためのそれらの使用に関する。【配列表】                         SEQUENCE LISTING<110>  GENOPLANTE-VALOR       INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE       BENDAHMANE, Abdelhafid       STURBOIS, Benedicte       TRIQUES, Karine       CABOCHE, Michel<120>  METHOD FOR PRODUCING HIGHLY SENSITIVE ENDONUCLEASES, NOVEL        PREPARATIONS OF ENDONUCLEASES AND USES THEREOF.<130>  MJP/bv1516-19<150>  PCT/EP2004/009159<151>  2004-07-30<150>  PCT/EP2004/009166<151>  2004-07-30<160>  25 <170>  PatentIn version 3.3<210>  1<211>  2640<212>  DNA<213>  Arabidopsis thaliana<220><221>  misc#feature<223>  ENDO 1 Gene At1g11190<400>  1aaattcgatg aggttgttat agacaagaga agacattttt atacaaaaga gtttatcatt     60atataagttt caaactttga agatatggca tcggctttta gatcatccac gaggttgatt    120cttgtattag gtatactgat tttgtgttcg gtttcttctg tccgaagctg gagcaaagaa    180ggtcatattc ttacttgtag aattgctcag gtaattaagt taatgatcta ttgtttgaag    240caactatttt ggttattctt gtcttatata tgtattagtg agatatacct acaaattttt    300aattaggatt gacttttaaa ttgctatacg ttaccatgcc taacatctca tgtagatgat    360catgaataca aacatgtcta atggcatatc aaattccaag tttttttggt agagatctga    420gtcatttgac cgttataaga ttcataacaa aagttcgtat gtgtgtgttt ttgtggtgtg    480accagaatct tttagaagcc ggaccagcac atgtagtaga gaatctgtta ccggattacg    540tgaaaggaga tttatcagca ttgtgtgtgt ggcctgacca gatccgacat tggtacaagt    600atcgttggac cagccatctc cattacatcg acactcccga ccaagcctgc tcttacgaat    660actctagtaa gtcacaaccg agacattttc agataacctt aatccgtttt ctaattatct    720tgaaccggag ttaaccaaaa aatcaattac aaataccaaa ccggattaaa aacaggggat    780tgtcatgatc aacatggatt gaaggatatg tgtgtggatg gagcaatcca gaatttcacg    840tctcagcttc agcattacgg tgaaggaaca tctgatcgta gatgtatgtc atcattttca    900tttatttcat ataatgatga tatccaaagt gtaactgcgt attttgtatt ttgatgcata    960acttaagttt ttaaaattat aatatatcct tgttcaatca catagataac atgaccgaag   1020cccttttgtt cttgtctcat ttcatgggag atattcatca ggtttattac tcatcatcga   1080ttcatttcac acctccacac atatagctct atttccatgt taaatattta attaacatgg   1140tttttttttt tttccttaaa aagccgatgc atgtgggatt cacaagtgat gaaggaggaa   1200acacgataga tttacgttgg tacaaacaca aatccaatct acatcatgta agcttcttct   1260tttgtctctt tcaactttaa atttcatcat gaaaacaaaa aaaaaattaa cgaaggaaac   1320aaaatatgta ggtatgggat agagagatca ttctcacggc tctaaaagaa aactacgaca   1380agaacttgga tcttctccaa gaggatcttg agaagaacat caccaatgta atagacacta   1440atttattcat attttactat aattttaaga atctttataa tggttatcat atattaggga   1500ttatggcacg acgatctatc ttcgtggaca gaatgcaacg atcttatcgc ttgtccacac   1560aagtaagttt taaattactt ggtttaagat tggcttgacg ctcgtttgaa gctagctaca   1620aattttgata ctttttctgg tccaaaaatc ttacaaagat actgaaaata aaataatagg   1680ttttaaactt ttaatttatt tggagttgga taggattaag tttcactaac ttccaattca   1740aagtcaatta atagtagttt accatgatta gtgggttgac taatgtacca tatatattac   1800cttatatcac atcttatttc cgatgtgaga tttcttatga aacataatta gactcgaacc   1860ttttgtgttt cgatatatgt agtgtattca tgatcagaat cttattaagt ttacaactga   1920aaactaaaat attaacatca taattataga ttcttaagta ggttttgttt gggtggagaa   1980aatatccaat ttcgaataac attatataaa atattgaact aattttaatt gtatacgcag   2040gtatgcttca gagagtataa agttagcttg taaatgggga tacaaaggcg tcaagtctgg   2100tgaaacgtta tcaggtacgt tgtttgcttc ttctttttct cgtacgctaa caaaaatatt   2160taaaaataaa cccgaccaaa tgaagtttaa ttaatcggat taatgatttt taatagtcac   2220tacttttttt gtgtgggata tatgactgtc taatatataa ttttataaga aagctaaagg   2280atttgtttaa taatttccga taaataattt tgcagaagaa tatttcaata caaggttgcc   2340aatagtgatg aagagaatag ttcagggagg agttagacta gccatgatac taaaccgggt   2400ttttagtgac gatcatgcta ttgctggtgt tgctgccact tgaaccaaac ccgacatacc   2460ggggcatcaa agcatttgat taagagatta tttgatacat tcacaaaatt aattaaggct   2520gatcagacat tcttttcttt tagtagcttt atctatgtga cagctaatgc ctgtggactg   2580ctttgtttag aagtgtttag cattagatca tatgctaatt caatgttatt aattcatcgt   2640<210>  2<211>  305<212>  PRT<213>  Arabidopsis thaliana<220><221>  misc#feature<223>  Protein ENDO 1 At1g11190<400>  2Met Ala Ser Ala Phe Arg Ser Ser Thr Arg Leu Ile Leu Val Leu Gly 1               5                   10                  15Ile Leu Ile Leu Cys Ser Val Ser Ser Val Arg Ser Trp Ser Lys Glu             20                  25                  30Gly His Ile Leu Thr Cys Arg Ile Ala Gln Asn Leu Leu Glu Ala Gly         35                  40                  45Pro Ala His Val Val Glu Asn Leu Leu Pro Asp Tyr Val Lys Gly Asp     50                  55                  60Leu Ser Ala Leu Cys Val Trp Pro Asp Gln Ile Arg His Trp Tyr Lys 65                  70                  75                  80Tyr Arg Trp Thr Ser His Leu His Tyr Ile Asp Thr Pro Asp Gln Ala                 85                  90                  95Cys Ser Tyr Glu Tyr Ser Arg Asp Cys His Asp Gln His Gly Leu Lys             100                 105                 110 Asp Met Cys Val Asp Gly Ala Ile Gln Asn Phe Thr Ser Gln Leu Gln         115                 120                 125 His Tyr Gly Glu Gly Thr Ser Asp Arg Arg Tyr Asn Met Thr Glu Ala     130                 135                 140 Leu Leu Phe Leu Ser His Phe Met Gly Asp Ile His Gln Pro Met His 145                 150                 155                 160 Val Gly Phe Thr Ser Asp Glu Gly Gly Asn Thr Ile Asp Leu Arg Trp                 165                 170                 175 Tyr Lys His Lys Ser Asn Leu His His Val Trp Asp Arg Glu Ile Ile             180                 185                 190 Leu Thr Ala Leu Lys Glu Asn Tyr Asp Lys Asn Leu Asp Leu Leu Gln         195                 200                 205 Glu Asp Leu Glu Lys Asn Ile Thr Asn Gly Leu Trp His Asp Asp Leu     210                 215                 220 Ser Ser Trp Thr Glu Cys Asn Asp Leu Ile Ala Cys Pro His Lys Tyr 225                 230                 235                 240 Ala Ser Glu Ser Ile Lys Leu Ala Cys Lys Trp Gly Tyr Lys Gly Val                 245                 250                 255 Lys Ser Gly Glu Thr Leu Ser Glu Glu Tyr Phe Asn Thr Arg Leu Pro             260                 265                 270 Ile Val Met Lys Arg Ile Val Gln Gly Gly Val Arg Leu Ala Met Ile         275                 280                 285 Leu Asn Arg Val Phe Ser Asp Asp His Ala Ile Ala Gly Val Ala Ala     290                 295                 300 Thr 305 <210>  3<211>  28<212>  DNA<213>  Artificial sequence<220><223>  Primer 4-960<400>  3gtgtttgtcc agtaatagtg tcagcata                                        28<210>  4<211>  26<212>  DNA<213>  Artificial sequence<220><223>  Primer 4-721<400>  4aggaacctga gaaaagactc gccagc                                          26<210>  5<211>  40<212>  DNA<213>  Artificial Sequence<220><223>  CEL N Terminal<400>  5tatcgttcta gagggaatga cgcgattata ttctgtgttc                           40<210>  6<211>  27<212>  DNA<213>  Artificial sequence<220><223>  CEL C Terminal<400>  6tatctgaatt catgccaaag aatgatc                                         27<210>  7<211>  50<212>  DNA<213>  Artificial sequence<220><223>  CEL C terminal 8 His<400>  7aattcaatgg tgatggtggt gatggtgatg tgccaaagaa tgatctgcgg                50<210>  8<211>  25<212>  DNA<213>  Artificial sequence<220><223>  Primer (R21)<400>  8gacatatgga ctacagaagc ttggg                                           25<210>  9<211>  25<212>  DNA<213>  Artificial sequence<220><223>  Primer (R22)<400>  9gttcacgggt cacatcatgc attcc                                           25<210>  10<211>  22<212>  DNA<213>  Artificial sequence<220><223>  Primer 4m118<400>  10ttggttggac ttcactttga gc                                              22<210>  11<211>  22<212>  DNA<213>  Artificial sequence<220><223>  Primer 4m984<400>  11cacaacaatc agcaatgaca gc                                              22<210>  12<211>  23<212>  DNA<213>  Artificial sequence<220><223>  Primer 4-347<400>  12gtgattgctc cacctccgcc acc                                             23<210>  13<211>  30<212>  DNA<213>  Artificial sequence<220><223>  Primer 4-134<400>  13tacagcgatt gatataatat aaaattatcc                                      30<210>  14<211>  27<212>  DNA<213>  Artificial sequence<220><223>  Primer le 2462<400>  14tgatattgtc gtgcaatatg atgaaac                                         27<210>  15<211>  25<212>  DNA<213>  Artificial sequence<220><223>  Primer le 3082<400>  15atacctattt agcccacttg gacac                                           25<210>  16<211>  27<212>  DNA<213>  Artificial sequence<220><223>  Forward Primer for ENDO5<400>  16aaggatccga aagctctgtg tttcaga                                         27<210>  17<211>  28<212>  DNA<213>  Artificial sequence<220><223>  Reverse Primer for ENDO5<400>  17ggagttgtta cgtgggttct caaggatc                                        28<210>  18<211>  28<212>  DNA<213>  Artificial sequence<220><223>  Forward Primer for ENDO4<400>  18ctggatccct gtttttaact ttggaaag                                        28<210>  19<211>  26<212>  DNA<213>  Artificial sequence<220><223>  Reverse Primer for ENDO4<400>  19ggatgttcaa gtgattctcc tggatc                                          26<210>  20<211>  27<212>  DNA<213>  Artificial sequence<220><223>  Forward Primer for ENDO3<400>  20aaggatccat tcgacaaact ttgtaac                                         27<210>  21<211>  28<212>  DNA<213>  Artificial sequence<220><223>  Reverse Primer for ENDO3<400>  21agagtggtct tgggaatatt tatctcag                                        28<210>  22<211>  26<212>  DNA<213>  Artificial sequence<220><223>  Forward Primer for ENDO2<400>  22acggatccca tttcaaagaa ctctga                                          26<210>  23<211>  26<212>  DNA<213>  Artificial sequence<220><223>  Reverse Primer for ENDO2<400>  23gaccaatcat tatgctgtaa cttcag                                          26<210>  24<211>  25<212>  DNA<213>  Artificial sequence<220><223>  Forward Primer for ENDO1<400>  24caggatccaa gtttcaaact tgaag                                           25<210>  25<211>  26<212>  DNA<213>  Artificial sequence<220><223>  Reverse Primer for ENDO1<400>  25cggtatgtcg ggtttggttc aagtgg                                          26【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えエンドヌクレアーゼを生産する方法であって、
−前記エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有するアグロバクテリア株で一過的に形質転換した宿主植物の細胞において前記組換えエンドヌクレアーゼを発現させること、
−前記宿主植物細胞から前記組換えエンドヌクレアーゼを単離すること
を含む方法。
【請求項２】
前記植物細胞が植物全体又は植物全体から切り離された器官に存在し、前記アグロバクテリア株による一過性形質転換がアグロバクテリアへの感染により実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アグロバクテリアへの感染が前記宿主植物の葉で実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記宿主植物がタバコ属に属する、請求項１から３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
前記エンドヌクレアーゼが、
−前記エンドヌクレアーゼを発現する、アグロバクテリアを感染させた器官から細胞内容物を抽出する工程、
−少なくとも３０％の最終濃度で硫酸アンモニウムを前記抽出物へ添加し、上清からタンパク質沈殿物を分離する工程、
−少なくとも８０％の最終濃度で硫酸アンモニウムを前記上清へ添加し、エンドヌクレアーゼを含むタンパク質沈殿物を回収する工程
を含むプロセスにより、アグロバクテリアを感染させた植物の器官から単離される、請求項２から４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項６】
硫酸アンモニウムが第一の沈殿工程では最終濃度３０％で、そして第二の沈殿工程では最終濃度８０％で添加される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｓ１／Ｐ１ファミリー（ＰＦＡＭ  ０２２６５）の候補エンドヌクレアーゼがミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼであるかどうかを試験する方法であって、
ａ）請求項１から５のいずれか一つに記載の方法により、前記候補エンドヌクレアーゼを組換え型で生産すること、
ｂ）前記組換えエンドヌクレアーゼを、一本鎖ＤＮＡを分解する能力について試験すること、
ｃ）前記組換えエンドヌクレアーゼを、予め規定したミスマッチ部位で試験ヘテロ二本鎖ＤＮＡ断片を切断する能力について試験すること、
ｄ）前記組換えエンドヌクレアーゼを、全てのタイプのミスマッチを有するヘテロ二本鎖ＤＮＡ断片を切断する能力について試験すること
を含む方法。
【請求項８】
ミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼをスクリーニングする方法であって、
ａ）請求項１から５のいずれか一つに記載の方法により、候補エンドヌクレアーゼを組換え型で生産すること、
ｂ）前記組換えエンドヌクレアーゼを、一本鎖ＤＮＡを分解する能力について試験すること、
ｃ）一本鎖ＤＮＡを分解することが可能な組換えエンドヌクレアーゼを選択し、それらを、既知で且つ特徴が十分に明らかなミスマッチ部位で試験ヘテロ二本鎖ＤＮＡ断片を切断する能力について試験すること、
ｄ）既知で且つ特徴が十分に明らかなミスマッチ部位で試験ヘテロ二本鎖ＤＮＡ断片を切断することが可能な組換えエンドヌクレアーゼを選択し、それらを、全てのタイプのミスマッチを有するヘテロ二本鎖ＤＮＡ断片を切断する能力について試験すること、
ｅ）工程ｂ）、ｃ）及びｄ）の試験をクリアする組換えエンドヌクレアーゼを選択すること
を含む方法。
【請求項９】
前記組換えエンドヌクレアーゼを、過剰な野生型対立遺伝子の存在下でＤＮＡプールにおいて突然変異対立遺伝子を検出する能力を試験することにより、その感受性について試験すること、及び少なくとも９倍過剰な野生型対立遺伝子の存在下で前記突然変異対立遺伝子を検出することが可能であるエンドヌクレアーゼを選択することから成る工程をさらに含む、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項７から９のいずれか一つに記載の方法により得ることが可能な組換えエンドヌクレアーゼ調製物。
【請求項１１】
前記エンドヌクレアーゼがセロリ（Ａｐｉｕｍ  ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）由来のＣＥＬ  Ｉ及びシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＢＦＮ１の中から選択される、請求項１０に記載の組換えエンドヌクレアーゼ調製物。
【請求項１２】
前記組換えＣＥＬ  ＩエンドヌクレアーゼがＴ／Ｔ〜Ｔ／Ｇ〜Ａ／Ｇ〜Ｇ／Ｇ〜Ｇ／Ａ〜Ｇ／Ｔ≧Ａ／Ａ〜Ｃ／Ｃ≧Ｔ／Ｃ〜Ｃ／Ｔ＞Ａ／Ｃ〜Ｃ／Ａのミスマッチ選択性を有し、２３倍過剰な野生型対立遺伝子の存在下で突然変異対立遺伝子を認識することが可能である、請求項１１に記載の組換えＣＥＬ  Ｉエンドヌクレアーゼ調製物。
【請求項１３】
前記組換えＢＦＮ１がＧ／Ｇ〜Ｇ／Ａ〜Ａ／Ｇ〜Ｇ／Ｔ〜Ｔ／Ｇ＞Ｔ／Ｔ〜Ａ／Ａ〜Ｃ／Ｃ〜Ｔ／Ｃ＞Ｃ／Ｔ〜Ａ／Ｃ〜Ｃ／Ａのミスマッチ選択性を有し、５９倍過剰な野生型対立遺伝子の存在下で突然変異対立遺伝子を認識することが可能である、請求項７に記載の方法により得ることが可能な組換えＢＦＮ１エンドヌクレアーゼ調製物。
【請求項１４】
ＤＮＡ二本鎖において、塩基置換に起因する、又は前記二本鎖の一方の鎖における一つもしくはそれ以上のヌクレオチドの挿入もしくは欠失に起因するミスマッチを検出するための、請求項１０から１３のいずれか一つに記載の組換えエンドヌクレアーゼ調製物の使用方法。
【請求項１５】
Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｌｏｃａｌ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  ＩＮ  Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＴＩＬＬＩＮＧ）のミスマッチ切断手順における、請求項１０から１３のいずれか一つに記載の組換えエンドヌクレアーゼ調製物の使用方法。
【請求項１６】
Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇによる自然集団におけるＤＮＡ多型の同定のための、請求項１０から１３のいずれか一つに記載の組換えエンドヌクレアーゼ調製物の使用方法。
【請求項１７】
ミスマッチ検出試薬としての、請求項１０から１３のいずれか一つに記載の組換えエンドヌクレアーゼ調製物の使用方法。
【請求項１８】
ミスマッチスクリーニングの方法における、請求項１０から１３のいずれか一つに記載の組換えエンドヌクレアーゼ調製物の使用方法。
【請求項１９】
ａ）集団の各個体について前記標的遺伝子又はその一部を増幅する工程、
ｂ）前記増幅産物を、列、行（２次元マトリクス）及び段（３次元マトリクス）から成る、２次元マトリクス又は３次元マトリクスに並べる工程、
ｃ）前記増幅産物をプールし、各々が前記マトリクスの行、列又は段を表す、種々のプールを得る工程、
ｄ）突然変異していない遺伝子から得られた参照増幅産物を各プールへ添加し、かかるプールをヘテロ二本鎖の形成を可能にする条件下でインキュベートする工程、並びに
ｅ）前記エンドヌクレアーゼ調製物とともに各プールをインキュベートする工程、並びに
ｆ）前記インキュベートしたプールにおいてヘテロ二本鎖の存在を検出する工程
を実施することによりあらゆる生物又はそれらに由来する細胞系の集団において標的遺伝子の一つ又はそれ以上の突然変異を同時にスクリーニングするための、請求項１０から１３のいずれか一つに記載の組換えエンドヌクレアーゼ調製物の使用方法。
【請求項２０】
ａ）集団の各個体を、列、行（２次元マトリクス）及び段（３次元マトリクス）から成る、２次元マトリクス又は３次元マトリクスに並べる工程、
ｂ）各行、列及び段をプールし、各プールが前記マトリクスの行、列又は段を表す、種々のプールを得る工程、
ｃ）突然変異していない遺伝子から得られた参照遺伝子産物を各プールに添加する工程、
ｄ）各プールの前記標的遺伝子又はその一部を増幅し、増幅産物のプールを得る工程、
ｅ）前記増幅産物のプールを、へテロ二本鎖の形成を可能にする条件下でインキュベートする工程、
ｆ）前記増幅産物のプールを前記エンドヌクレアーゼ調製物とともにインキュベートする工程、並びに
ｇ）前記インキュベートしたプールにおいてヘテロ二本鎖の存在を検出する工程
を実施することによりあらゆる生物又はそれらに由来する細胞系の集団において標的遺伝子の一つ又はそれ以上の突然変異を同時にスクリーニングするための、請求項１０から１３のいずれか一つに記載の組換えエンドヌクレアーゼ調製物の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高い活性及び感受性並びに広範囲の基質特異性を有するミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼの同定及び調製に関する。
【背景技術】
【０００２】
前世紀の初め、放射線又は化学物質がＤＮＡ内に突然変異を誘発する可能性が見出され、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子機能の理解に多大なる希望をもたらした。それ以来、突然変異誘発及び自然な配列の変化が、新たな機能、特定の機能に対応する遺伝子、及び特定のタンパク質内の活性部位を同定するために広く使用されている。
【０００３】
特に点突然変異の場合、このアプローチを行う際の重要な側面は、診断感受性又は特異性を低減させることなく広範なＤＮＡをスクリーニングし、同時に突然変異の位置に関する情報を提供するように設計された、突然変異検出方法を選択することである。最も使用されるツールの一つは、二つのＤＮＡ分子の変性及び再生によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで生じ得る、不完全にマッチしたＤＮＡに基づいた方法である。ミスマッチは、これらのヘテロ二本鎖分子において、溝結合剤やミスマッチ部位で一本鎖ＤＮＡを特異的に切断することができる分子といった化学物質を使用して検出される。あるいは、一本鎖特異的エンドヌクレアーゼが、ＤＮＡをミスマッチ部位で切断するために使用されている。これまでに記載されたエンドヌクレアーゼの大部分が、Ｓ１／Ｐ１クラスのヌクレアーゼに属する。
【０００４】
同一の「Ｓ１／Ｐ１ヌクレアーゼファミリー」または「Ｓ１ヌクレアーゼファミリー」と呼ばれるファミリーに属する、Ｓ１、Ｐ１及びマングビーンヌクレアーゼ（ｍｕｎｇ  ｂｅａｎ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）といったヌクレアーゼは、一本鎖の領域でＤＮＡを切断することが知られている。しかしながら、これらのヌクレアーゼは、最適ｐＨが４．０〜５．０の範囲の酸性である。
【０００５】
これは、低いｐＨ値がＤＮＡの脱プリンに有利に働き、ＤＮＡ二本鎖を不安定化し、それにより非特異的なＤＮＡ分解を招き、検出の感受性及び特異性を低減させることから、ミスマッチの検出には不都合である。
【０００６】
数年前、ＯＬＥＹＫＯＷＳＫＩら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  ２６，  ４５９７−４６０２，  １９９８）は、様々な植物の抽出物において、最適ｐＨが中性（およそｐＨ８）である、ミスマッチ部位の３’側で一本鎖を切断するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を検出した。著者は、このミスマッチエンドヌクレアーゼ活性が、アルファルファもやし、アスパラガス、セロリ及びトマトの抽出物におけるマンノシル化糖タンパク質と関係していることを報告している。ＣＥＬ  Ｉと呼ばれるセロリ由来の酵素が、硫酸アンモニウム沈殿、コンカナバリンＡ−アガロースカラムに結合しての［アルファ］ｄ＋マンノースによる溶出、ホスホセルロースカラムに結合してのＫＣｌの線形濃度勾配による溶出、並びにサイズ排除クロマトグラフィーによる分画という連続した工程により、セロリの茎から精製された。このようにして得られたＣＥＬ  Ｉの調製物は、３４〜３９ｋＤａの幾つかのタンパク質のバンドを含んでいた。
【０００７】
ＹＡＮＧら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３９，  ３５３３−３５４１，  ２０００）及びＰＣＴ出願の国際公開第０１／６２９７４号パンフレットは、内因性レクチンとのＣＥＬ  Ｉの凝集を克服するための、精製バッファー中でアルファ−メチルマンノシドを使用することによるＣＥＬ  Ｉの改善された精製について記載している。これらの文献はまた、ＣＥＬ  ＩのｃＤＮＡのクローニングを開示している。配列のデータに基づいて、ＣＥＬ  ＩはＳ１／Ｐ１ヌクレアーゼファミリーのサブファミリーに割り当てられ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＢＦＮ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋヌクレオチド、ＡＹ０４００１６）、ジニアのＺＥＮ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ（ヌクレオチド）、ＡＢ００３１３１）及びカンゾウのＤＳＡ６遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ（ヌクレオチド）、ＡＦ０８２０３１）にコードされる、幾つかの潜在的な類似体が同定された。
【０００８】
ＣＥＬ  Ｉのエンドヌクレアーゼ活性は、塩基置換によるミスマッチ、及び挿入／欠失により生じるミスマッチに高度に特異的であること、並びにフランキング配列の状況とは無関係であることが分かっている。したがってそれは、突然変異のスクリーニングを伴う各種方法における突然変異検出試薬として有用である。ＣＥＬ  Ｉによるミスマッチ検出システムは、標的配列のＰＣＲ増幅、野生型と突然変異型の対立遺伝子間でのヘテロ二本鎖の形成を可能にする変性及びアニーリング、酵素によるミスマッチの切断、並びにゲル電気泳動による産物の分析を要する、簡単なアッセイである。ＣＥＬ  Ｉによるミスマッチ検出システムは、広範なＤＮＡにおけるミスマッチの検出についてのその特異性及び感受性のため、変性ＨＰＬＣのような他の一般的なミスマッチ検出システムよりも好適である。
【０００９】
一例として、ＯＬＥＹＫＯＷＳＫＩら及びＹＡＮＧら（上記で引用した刊行物）は、ヒトＢＲＣＡ１遺伝子における配列の改変を検出するためのその使用について報告しており、ＳＯＫＵＲＥＮＫＯら（Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２９，  ｅ１１１，  ２００１）は、ゲノムＤＮＡの広範な領域における突然変異及び多型を検出するためのその使用について開示している。ＣＥＬ  Ｉはまた、化学的突然変異誘発の後に点突然変異についてのスクリーニングが行われるＴＩＬＬＩＮＧ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｌｏｃａｌ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  ＩＮ  Ｇｅｎｏｍｅｓ）におけるハイスループットスクリーニングに、或いは「Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ」（ＣＯＭＡＩ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ３７，  ７７８−７８６，  ２００４）とも呼ばれる自然集団における多型の検出に使用される。ＣＥＬ  Ｉは、植物においても（ＣＯＬＢＥＲＴ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １２６，  ４８０−４８４，  ２００１、  ＴＩＬＬ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３，  ５２４−５３０，  ２００３、  ＰＥＲＲＹ  ｅｔ  ａｌ.,  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １３１，  ８６６−８７１，  ２００３）、ゼブラフィッシュのような動物（ＷＩＥＮＨＯＬＤＳ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，  １３，  ２７００−２７０７，  ２００３）においても使用されている。ＰＣＴ出願の国際公開第０３／０６６８０９号パンフレットは、「ミスマッチの分解による遺伝子再集合（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ  ｂｙ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）」（ＧＲＡＭＭＲ）と称される、関連するポリヌクレオチド間で配列の変形物を再集合させる方法においてＣＥＬ  Ｉを使用することを提唱している。
【００１０】
しかしながら、ＣＥＬ  Ｉは、切断の効率がミスマッチによって異なるという不都合を有し、ＯＬＥＹＫＯＷＳＫＩら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９９８  Ｏｃｔ  １５；  ２６（２０）：  ４５９７−６０２）は、一つのヌクレオチドの挿入を有するＤＮＡループの場合、ＣＥＬ  Ｉの基質選択性はＧ＞Ａ＞Ｃ＞Ｔであり、塩基置換によるミスマッチの場合、ＣＥＬ  Ｉの基質選択性はＣ／Ｃ≧Ｃ／Ａ〜Ｃ／Ｔ≧Ｇ／Ｇ＞Ａ／Ｃ〜Ａ／Ａ〜Ｔ／Ｃ＞Ｔ／Ｇ〜Ｇ／Ｔ〜Ｇ／Ａ〜Ａ／Ｇ＞Ｔ／Ｔであると報告している。その効率は、ミスマッチＣ／Ａ、Ｃ／Ｃ、Ｃ／Ｔ、Ｇ／Ｇで顕著である。他のミスマッチでは活性の減少が見られ、ミスマッチＴ／Ｔではほとんど効果がない。この切断効率のばらつきにより、ＤＮＡのプールで一つの対立遺伝子を検出したい場合、幾つかの突然変異の検出において精度が低下する可能性がある。
【００１１】
ＣＥＬ  Ｉの使用を制限する別の不都合は、利用可能な精製方法が低収率であることである。ＯＬＥＹＫＯＷＳＫＩらは、約３５０ｇのタンパク質を含有するセロリの茎７ｋｇから開始して、０．１μｇ／μｌのＣＥＬ  Ｉを３ｍｌ得ている。ＹＡＮＧらにより、またＰＣＴの国際公開第０１／６２９７４号パンフレットにおいて開示された精製手順では、１０５ｋｇのセロリの茎から開始して、３．１×１０7ＣＥＬ  Ｉユニット／ｍｇタンパク質の比活性の、５μｇの精製ＣＥＬ  Ｉが得られている。
【００１２】
より多い量のＣＥＬ  Ｉを得るために、組換えＤＮＡ技術によりＣＥＬ  Ｉを生産することが提唱されている。ＰＣＴ出願の国際公開第０３／０６６８０９号パンフレットは、ほとんど全ての既知の原核生物又は真核生物の発現系を包含する、適切と考えられるベクター及び宿主細胞の広範なリストを提供している。しかしながら、この文献で実際に開示されている唯一の発現系は、トバモウイルスに基づいたベクターである。６−ヒスチジンタグをコードする配列に融合されたＣＥＬ  ＩのｃＤＮＡを前記ベクターにおいてクローニングして得られる構築物は、タバコ植物を感染させるために使用されている。組換えＣＥＬ  Ｉは、感染した植物の細胞内液から回収され、ニッケル−ＮＴＡ樹脂上での金属アフィニティークロマトグラフィーにより精製された。ＰＣＴの国際公開第０３／０６６８０９号パンフレットは、精製された酵素の収率に関しては言及していない。当該文献は、ＧＲＡＭＭＲ反応におけるその活性が、セロリから精製される天然酵素の一つに類似していることを示している。この系の不都合の一つは、ウイルスが、発現した遺伝子を部分的に或いは完全に緩めて組換える傾向にあることである。これは、完全長ＣＥＬ  Ｉのほかに先端が切断された形態が生産されることを招き、酵素の比活性を減少させる。
【００１３】
ＰＣＴ出願の国際公開第２００４／０３５７７１号パンフレットは、酵母においてＣＥＬ  Ｉを生産する方法に関する。この趣旨で、ＣＥＬ  Ｉをコードする合成遺伝子が、酵母におけるコドンの使用に従ってＣＥＬ  Ｉの天然のＤＮＡ配列を改変することにより構築された。この文献は、この合成遺伝子により生産される組換えＣＥＬ  Ｉが、考え得る全てのミスマッチの組み合わせを認識することが可能であることを示し、またミスマッチＡ／Ａの認識及び切断を例証している。他方で、前記組換えＣＥＬ  Ｉのミスマッチの選択性に関しては言及していない。
【００１４】
上記から、組換えＣＥＬ  Ｉを生産するための現在利用可能な方法は、セロリからの天然ＣＥＬ  Ｉの生産を上回るいかなる有意な改善をも提供しないと思われる。さらに、それらの方法は、天然ＣＥＬ  Ｉの基質選択性の問題に対処していない。
【００１５】
同様に、ＣＥＬ  Ｉのように中性のｐＨ下で鋳型ヘテロ二本鎖ＤＮＡにおける単一塩基対のミスマッチを切断することが可能であるが、異なるミスマッチ選択性を有するか或いは好ましくは全てのミスマッチを等しく良好に切断する、他のエンドヌクレアーゼを得ることが望ましい。しかしながら、かかるエンドヌクレアーゼは現在のところ同定されていない。
【００１６】
ＣＥＬ  Ｉ様エンドヌクレアーゼ活性の存在は、多くの植物で報告されている（例えば、上記で引用したＯＬＥＹＫＯＷＳＫＩら、１９９８を参照）。しかしながら、これらの活性に関与する酵素は、特徴を明らかにされておらず、基質選択性のようなそれらの生化学的特性は研究されておらず、それらの配列は同定されていない。他方で、ＣＥＬ  Ｉの構造類似体は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで同定されている（上記で引用したＹＡＮＧら、ＴＩＬＬ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３２，  ２６３２−４１，  ２００４）。それらのうちの三つ（シロイヌナズナのＢＦＮ１、ジニアのＺＥＮ１及びカンゾウのＤＳＡ６）は、植物の老化に関与すると報告されている（ＰＥＲＥＺ−ＡＭＡＤＯＲ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １２２，  １６９−１８０，  ２０００）。しかしながら、それらは精製されておらず、また依然として生化学的特徴が明らかにされていない。特に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヘテロ二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチを認識するためのそれらの効率は試験されていない。その活性に基づいてＳ１／Ｐ１ファミリーに割り当てられ、また最適ｐＨが中性であるＳＰと呼ばれるエンドヌクレアーゼが、ホウレンソウから精製されている。ＣＥＬ  Iと同様に、この酵素は、挿入／欠失、及び塩基の置換によるミスマッチを切断するが、グアニン残基を含有するものは認識しない（ＯＬＥＹＫＯＷＳＫＩ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３８，  ２２００−５，  １９９９）。
【００１７】
組換えＣＥＬ  Ｉを得るための代替的方法を模索して、本発明者は、アグロバクテリアを介した一過的発現を介してｉｎ  ｐｌａｎｔａで組換えＣＥＬ  Ｉを発現させることを試みた。
【００１８】
本発明者は、アグロバクテリアに感染させたタバコの葉において組換えＣＥＬ  Ｉを発現させ、それを、硫酸アンモニウム沈殿により葉抽出物から精製した。本発明者は、驚くべきことに、高活性の組換えＣＥＬ  Ｉが非常に高収率で得られること、さらに前記組換えＣＥＬ  Ｉ調製物が、従来技術において既知のＣＥＬ  Ｉの調製物よりも広範囲の特異性及び高い感受性でミスマッチを認識し、ＣＥＬ  Ｉではあまり認識されないと考えられていたＴ／Ｔのようなミスマッチでさえ明瞭に検出することができるということを見出した。
【００１９】
これらの結果を考慮して、本発明者は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでＳ１／Ｐ１ファミリーに属するとして同定されたエンドヌクレアーゼの活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験することによって当該エンドヌクレアーゼをスクリーニングするためにこの方法を用いるということに想到した。
【特許文献１】国際公開第０３／０６６８０９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００４／０３５７７１号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
したがって、本発明は、少量の出発材料から大量のエンドヌクレアーゼ、特にＳ１／Ｐ１ヌクレアーゼを得る、簡単且つ迅速な方法を提供し、また、特にミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼを同定するために、候補エンドヌクレアーゼのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性を評価する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
ミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼは、本明細書中で、塩基置換による全てのミスマッチ（即ち、Ａ／Ａ、Ｇ／Ｇ、Ｃ／Ｃ、Ｔ／Ｔ、Ａ／Ｇ、Ａ／Ｃ、Ｇ／Ｔ、Ｃ／Ｔ、Ｇ／Ａ、Ｃ／Ａ、Ｔ／Ｃ、Ｔ／Ｇ）並びに一つ又はそれ以上のヌクレオチドの挿入／欠失を特異的に切断することが可能であるエンドヌクレアーゼとして定義される。
【００２２】
したがって、本発明の目的は、組換えエンドヌクレアーゼを生産する方法であって、
−前記エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有するアグロバクテリア株で一過性形質転換した宿主植物細胞において前記組換えエンドヌクレアーゼを発現させること、
−前記宿主植物細胞から前記組換えエンドヌクレアーゼを単離すること
を含む方法である。
【００２３】
前記植物細胞は、細胞懸濁物、又は組織もしくは器官の培養物の一部であってもよい。この場合、酵素は、上清及び／又は培養された細胞もしくは組織もしくは器官から回収することができる。好ましくは、それらは、植物全体又は植物全体から切り離された器官の一部であり、この場合、アグロバクテリア株による一過性形質転換は、アグロバクテリアへの感染により実施される。
【００２４】
アグロバクテリアへの感染は、目的の遺伝子を含有するアグロバクテリアを無傷の植物組織へ導入することに基づく一過性発現の方法である。
【００２５】
目的の遺伝子を含むＤＮＡ構築物は、バイナリーベクターへクローニングし、選択したアグロバクテリア株へ移し、形質転換したアグロバクテリアを対数期又は飽和状態へ成長させて、従来のアグロバクテリアを介する形質転換と同じ方法で回収する。古典的には、アグロバクテリアへの感染は、針のないシリンジの使用による選択した植物の器官（通常は葉）への注入により、又は数分間の減圧浸透により、形質転換したアグロバクテリア細胞の懸濁液をアプライすることにより実施する。減圧の解除後、器官又は植物全体を生育器に入れる。目的の発現タンパク質を、通常は感染の１〜４日後に、感染させた器官から抽出する。アグロバクテリアへの感染の手順は、様々な刊行物、例えばＫＡＰＩＬＡら（Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．  １２２，  １０１−１０８，  １９９７）、ＢＥＮＤＡＨＭＡＮＥら（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  １１，  ７８１−７９２，  １９９９）、ＳＣＯＦＩＥＬＤら（Ｓｃｉｅｎｃｅ．，  ２７４，  ２０６３−５，  １９９６）、ＴＡＮＧら（Ｓｃｉｅｎｃｅ．，  ２７４，  ２０６０−３，  １９９６）、ＭＡＲＩＬＬＯＮＮＥＴら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  １０１，  ６８５２−７，  ２００４）、ＷＲＯＢＬＥＷＳＫＩら（Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｊ．，  ３，  ｐｐ．  ２５９−２７３，  ２００５）に開示されている。
【００２６】
アグロバクテリアを介した一過性発現、特にアグロバクテリアへの感染に使用される古典的な手順は、本発明の実施に使用することができる。アグロバクテリア、バイナリーベクター、及び目的の遺伝子の発現を制御する調節エレメントの数々が利用可能であり、当業者は、例えば使用しようとする宿主植物に応じて、それらの中でもより適切なものを選択することができる。
【００２７】
以下の実施例で開示される実験では、本発明者は、ｐＢＩＮ１９由来のバイナリーベクターであるｐＢＩＮ６１、及び高病原性のｐＣＨ３２プラスミドを有するアグロバクテリア株Ｃ５８Ｃ１を使用しており、ｃＤＮＡ又はゲノムコード配列を、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター下で発現させている。しかしながら、他のバイナリーベクター、アグロバクテリアの他の株及び他の構成的プロモーター又は誘導プロモーターも、同様の結果を伴って使用することができる。
【００２８】
好適には、アグロバクテリアへの感染は、感染の直前又は直後に上記植物から任意に切り離すことができる葉で実施する。
【００２９】
本発明の方法で使用することができる宿主植物は、アグロバクテリアの形質転換に適合する任意の植物を包含する。好ましい植物としては、特にタバコ属の植物、特にベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）及びタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）が挙げられる。
【００３０】
本発明の一つの好ましい実施形態によれば、上記エンドヌクレアーゼは、
−上記エンドヌクレアーゼを発現する、アグロバクテリアを感染させた器官から細胞内容物を抽出する工程、
−３０％以上の最終濃度で硫酸アンモニウムを前記抽出物へ添加し、上清からタンパク質沈殿物を分離する工程、
−８０％以上の最終濃度で硫酸アンモニウムを前記上清へ添加し、エンドヌクレアーゼを含むタンパク質沈殿物を回収する工程
を含むプロセスにより、アグロバクテリアを感染させた植物器官、特にアグロバクテリアを感染させた葉から単離される。
【００３１】
上記タンパク質沈殿物を、適切な緩衝液、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、ＰＭＳＦ及び１０％グリセロールを含む緩衝液中に再懸濁させる。これは、直接使用しても良く、或いは使用するまで−８０℃で保管しても良い。
【００３２】
あるいは、上記で示した第一の工程の後に得られる全抽出物を、硫酸アンモニウムによる沈殿工程を実施することなくそのまま使用することができる。
【００３３】
任意に、本発明の方法により生産されるエンドヌクレアーゼを、ＣＥＬ  Ｉをカラム中の特定の成分に親和性を有するタグでタグ付けして行うカラムアフィニティー精製のような、それ自体既知のあらゆる適切な方法によりさらに精製することができる。好ましい実施形態によれば、本発明のＣＥＬ  Ｉは、６−ヒスチジンタグを付され、ニッケル−ＮＴＡ上での金属アフィニティークロマトグラフィにより精製される。
【００３４】
本発明はまた、候補エンドヌクレアーゼがミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼであるかどうかを試験する方法を提供し、当該方法は、
ａ）上記で規定したような本発明の方法により、組換え型で前記候補エンドヌクレアーゼを生産すること、
ｂ）前記組換えエンドヌクレアーゼを、一本鎖ＤＮＡを分解する能力について試験すること、
ｃ）前記組換えエンドヌクレアーゼを、予め規定したミスマッチ部位で試験ヘテロ二本鎖ＤＮＡ断片を切断する能力について試験すること、
ｄ）前記組換えエンドヌクレアーゼを、全てのタイプのミスマッチ（すなわち、塩基置換によるミスマッチＡ／Ａ、Ｇ／Ｇ、Ｃ／Ｃ、Ｔ／Ｔ、Ａ／Ｇ、Ａ／Ｃ、Ｇ／Ｔ、Ｃ／Ｔ、Ｇ／Ａ、Ｃ／Ａ、Ｔ／Ｃ、Ｔ／Ｇ、並びに挿入又は欠失によるミスマッチ）を有するヘテロ二本鎖ＤＮＡ断片を切断する能力について試験すること
を含む。
【００３５】
エンドヌクレアーゼが工程ｂ）、ｃ）及びｄ）の試験をクリアする場合（すなわち、一本鎖ＤＮＡを分解すること、予め規定したミスマッチ部位で試験ヘテロ二本鎖ＤＮＡ断片を切断すること、及び全てのタイプのミスマッチを有するヘテロ二本鎖ＤＮＡ断片を切断することが可能である場合）、このエンドヌクレアーゼをミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼと見なす。
【００３６】
本発明はまた、ミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼをスクリーニングする方法を提供し、当該方法は、
ａ）上記で規定したような本発明の方法により、候補エンドヌクレアーゼを組換え型で生産すること、
ｂ）前記組換えエンドヌクレアーゼを、一本鎖ＤＮＡを分解する能力について試験すること、
ｃ）一本鎖ＤＮＡを分解することが可能な組換えエンドヌクレアーゼを選択し、それらを、既知で且つ特徴が十分に明らかなミスマッチ部位で試験ヘテロ二本鎖ＤＮＡ断片を切断する能力について試験すること、
ｄ）既知で且つ特徴が十分に明らかなミスマッチ部位で試験ヘテロ二本鎖ＤＮＡ断片を切断することが可能な組換えエンドヌクレアーゼを選択し、それらを、全てのタイプのミスマッチを有するヘテロ二本鎖ＤＮＡ断片を切断する能力について試験すること、
ｅ）工程ｂ）、ｃ）及びｄ）の試験をクリアする組換えエンドヌクレアーゼを選択すること
を含む。
【００３７】
上記で規定した方法の一つの好ましい実施形態によれば、これらの方法は、上記エンドヌクレアーゼを、過剰な野生型対立遺伝子の存在下でＤＮＡプールにおいて突然変異対立遺伝子を検出する能力を試験することにより、その感受性について試験すること、及び少なくとも９倍過剰な野生型対立遺伝子の存在下（即ち、１０個のプール中に突然変異体対立遺伝子が一つ）で、好ましくは少なくとも１４倍過剰な野生型対立遺伝子の存在下で、さらに好ましくは少なくとも１９倍過剰、順により一層好ましくは、２９倍過剰、３９倍過剰、４９倍過剰、５９倍過剰の野生型対立遺伝子の存在下で前記突然変異対立遺伝子を検出することが可能であるエンドヌクレアーゼを選択することから成る工程をさらに含む。
【００３８】
好ましくは、上記で規定した試験は、７〜８、好適には７．４〜７．８のｐＨを有し且つ５〜２０ｍＭ、好適には１０ｍＭのＭｇＣｌ2を含有する反応混合物中で実施する。好適には、前記反応混合物はまた、０．５ｍＭ〜２ｍＭ、好ましくは１ｍＭのＤＴＴを含む。本発明者はまた、最終反応混合物の２％〜１０％（ｗ／ｖ）、特に５％でＰＥＧ−８０００を添加するとエンドヌクレアーゼの全体的な活性が増大することを観察した。
【００３９】
本発明の方法により試験することができる候補エンドヌクレアーゼは、Ｓ１／Ｐ１ファミリーのものの中に見出すことができる。ＰＦＡＭデータベース（ＢＡＴＥＭＡＮ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３２，  Ｄ１３８−４１，  ２００４）では、このファミリーはＰＦＡＭ０２２６５として指定されている。例えば、ＨＭＭＥＲソフトウェアを用いて、利用可能なＤＮＡ配列データバンクをスクリーニングするためのプローブとしてＰＦＡＭ０２２６５から構築されたプロフィールＨＭＭ（隠れマルコフモデル）を使用して、種々の植物において候補エンドヌクレアーゼを同定することができる。
【００４０】
あるいは、ＩｎｔｅｒＰｒｏ  ＩＰＲ００３１５４コード（Ｓ１／Ｐ１ヌクレアーゼに相当する）は、例えばアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／ＩＳｐｙ？ｉｐｒ＝ＩＰＲ００３１５４を使用して、データベースのコンテンツをスクリーニングするために使用することができる。
【００４１】
このコードを用いてＴｒｅｍｂｌ／Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースをスクリーニングすることにより４３個のタンパク質が同定された（表１）。
【００４２】
【表１ａ】
2008507965.tif 000002
【表１ｂ】
2008507965.tif 000003
【００４３】
この分析は好ましくは、参照タンパク質配列（例えばＣＥＬ  Ｉ配列）を使用して、データベース（ｂｌａｓｔｐ又はｔｂｌａｓｔｎ）でＢｌａｓｔを実施すること、及び最良のヒットを選択することにより完了する。
【００４４】
以下の実施例は、シロイヌナズナ由来の５つの候補エンドヌクレアーゼの試験についてより詳細に記載する。
【００４５】
本発明者は、添付の配列表に配列番号２で示され（対応するＤＮＡ配列は配列番号１に示した）シロイヌナズナのＢＦＮ１に相当する、これらのエンドヌクレアーゼの一つが、ＣＥＬ  Ｉと異なる特異性を有し、ＣＥＬ  Ｉよりもはるかに大きい感受性を有することを見出した。
【００４６】
現在に至るまで未知であった、ＢＦＮ１のミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼとしての特性の発見により、塩基置換に起因する、並びに一つ又はそれ以上のヌクレオチドの挿入／欠失に起因するミスマッチを検出するための突然変異検出試薬としてそれを使用することを提唱することが可能となる。
【００４７】
ＢＦＮ１、並びに本発明の方法により同定することができるあらゆるミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼは、本発明によるエンドヌクレアーゼの生産方法により大量に得ることができる。
【００４８】
本発明はまた、本発明による生産方法により得ることが可能な組換えエンドヌクレアーゼ調製物を包含する。これらは特に組換えＣＥＬ  Ｉ調製物及び組換えＢＦＮ１調製物である。
【００４９】
本発明の組換えＣＥＬ  Ｉ調製物は、従来技術のＣＥＬ  Ｉ調製物と異なるミスマッチ特異性を有し、またそれよりも高い感受性を有する。本発明の組換えＣＥＬ  Ｉ調製物がＴ／Ｇ〜Ａ／Ｇ〜Ｇ／Ｇ〜Ｇ／Ｔ〜Ｔ／Ｔ〜Ｇ／Ａ≧Ａ／Ａ〜Ｃ／Ｃ≧Ｔ／Ｃ〜Ｃ／Ｔ＞Ａ／Ｃ〜Ｃ／Ａのミスマッチ選択性を有するのに対して、従来技術のＣＥＬ  Ｉ調製物のミスマッチ選択性はＣ／Ｃ≧Ｃ／Ａ〜Ｃ／Ｔ≧Ｇ／Ｇ＞Ａ／Ｃ〜Ａ／Ａ〜Ｔ／Ｃ＞Ｔ／Ｇ〜Ｇ／Ｔ〜Ｇ／Ａ〜Ａ／Ｇ＞Ｔ／Ｔである。本発明の組換えＣＥＬ  Ｉ調製物は、２３倍過剰な野生型対立遺伝子の存在下で突然変異体対立遺伝子を認識することができるのに対して、従来技術のＣＥＬ  Ｉ調製物は、８倍希釈を上回って希釈されると、突然変異体対立遺伝子を効率的に認識しない。
【００５０】
本発明の組換えＢＦＮ１調製物はまた、従来技術のＣＥＬ  Ｉ調製物及び本発明の組換えＣＥＬ  Ｉ調製物の両方と異なるミスマッチ特異性を有する。本発明の組換えＢＦＮ１調製物は、Ｇ／Ｇ〜Ｇ／Ａ〜Ａ／Ｇ〜Ｇ／Ｔ〜Ｔ／Ｇ＞Ｔ／Ｔ〜Ａ／Ａ〜Ｃ／Ｃ〜Ｔ／Ｃ＞Ｃ／Ｔ〜Ａ／Ｃ〜Ｃ／Ａのミスマッチ選択性を有する。これらの酵素の各々のミスマッチ選択性を以下の表２にまとめる。
【００５１】
【表２】
2008507965.tif 000004
*＝これらのミスマッチは、組換えＣｅｌ  ＩよりもＢＦＮ１（ＥＮＤＯ１）によってより効率的に認識される。
** 注：切断効率の評価は半定量的にすぎず、従って、ミスマッチの順序付けには、実験者及び／又は実験に依存して、エンドヌクレアーゼによるそれらの認識に基づいてわずかな変動が起こり得る。
【００５２】
本発明の組換えＢＦＮ１調製物はさらに、従来技術のＣＥＬ  Ｉ調製物及び本発明の組換えＣＥＬ  Ｉ調製物の両方よりも高い感受性を有する。本発明の組換えＢＦＮ１調製物は、５９倍過剰な野生型対立遺伝子の存在下で突然変異体対立遺伝子を認識することができる。
【００５３】
本発明の組換えＢＦＮ１又はＣＥＬ  Ｉエンドヌクレアーゼ調製物は、上述のように、ミスマッチスクリーニングを伴うあらゆる方法において、突然変異検出試薬として使用することができる。それらは、遺伝子型決定、ＴＩＬＬＩＮＧ、ハイスループットＴＩＬＬＩＮＧ、Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ、ＧＲＡＭＭＲ等において特に有利である。
【００５４】
本発明のエンドヌクレアーゼ調製物を使用する方法は、従来技術の方法と基本的に同じ工程、即ち、標的配列のＰＣＲ増幅、増幅産物の変性及び野生型と突然変異型の対立遺伝子間でヘテロ二本鎖を形成させるためのアニーリング、エンドヌクレアーゼによるヘテロ二本鎖の切断、並びに切断産物の分析を包含する。種々のエンドヌクレアーゼの混合物を、これらの方法の実施の際にヘテロ二本鎖を切断するために好適に使用することができる。
【００５５】
本発明のエンドヌクレアーゼ調製物は、感受性が高いため、サンプルにおける突然変異を同定するためのハイスループット方法を実施することも可能にする。例えば、本発明によるエンドヌクレアーゼ調製物は、分析のために多くのサンプルを一緒にプールすることが可能であるため、非常に多数のサンプルで、国際公開第０１／７５１６７号パンフレットに記載されるような方法を実施するために使用することができる。
【００５６】
本発明によれば、上述のエンドヌクレアーゼ調製物は、あらゆる生物又はそれらに由来する細胞系から得た多数のサンプルにおいて標的遺伝子の一つ又はそれ以上の突然変異をスクリーニングするために使用することができ、このスクリーニングは、
ａ）前記集団の各個体に由来する前記標的遺伝子又はその一部を増幅させる工程、
ｂ）前記増幅産物を、列、行（２次元マトリクス）及び段（３次元マトリクス）から成る、２次元マトリクス又は３次元マトリクスに並べる工程、
ｃ）前記増幅産物をプールし、各々が前記マトリクスの行、列又は段を表す、種々のプールを得る工程、
ｄ）突然変異していない遺伝子から得られた参照増幅産物を各プールに添加し、このプールをヘテロ二本鎖の形成を可能にする条件下でインキュベートする工程、
ｅ）本発明によるエンドヌクレアーゼ調製物とともに各プールをインキュベートする工程、並びに
ｆ）上記インキュベートしたプールにおいてヘテロ二本鎖の存在を検出する工程
を実施することにより行う。
【００５７】
あるいは、上記方法は、まずサンプルをマトリクスに並べ、続いてそれらをプールし（参照の添加を伴う）、そして増幅工程、インキュベーション工程及び検出工程を行うことにより実施することができる。
【００５８】
スクリーニングするサンプルの数に応じて、マトリクスは２次元マトリクス又は３次元マトリクスであり得る。例えば、５７６個のサンプルをスクリーニングすべき場合、２４×２４のマトリクスが使用され得る。したがって、１３８２４個のサンプルをスクリーニングする場合は、３次元マトリクスがより適切であり得る（２４×２４×２４）。この集団をスクリーニングするために必要なのは７２の反応のみであり、突然変異した遺伝子は、それが属する段、行及び列のプールにより区別される。
【００５９】
参照増幅産物は、集団内の標的遺伝子と同じプライマーを用いて増幅された参照遺伝子（これと比較して突然変異が探索される）から得られる増幅産物に相当する。参照増幅産物を添加することは重要である。実際は、全てのサンプルが参照遺伝子と比較した場合に全く同じ突然変異を有する可能性は非常に低いが、このことは、プールが突然変異を有する標的遺伝子を含む場合にヘテロ二本鎖が形成され得ることを確実にする。
【００６０】
本発明は、組換えＣＥＬ  Ｉエンドヌクレアーゼの調製物及び特性、シロイヌナズナ由来の５つの候補エンドヌクレアーゼの試験、並びにＢＦＮ１（以下、ＥＮＤＯ１とも称する）のミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼとしての同定について例示した実施例を参照する、以下のさらなる記載によりさらに説明される。しかしながら、これらの実施例は、本発明の例示のみを目的として提示され、いかなる場合でも本発明の限定を構成しないことが理解されるべきである。
【００６１】
図面の説明
図１は、アガロースゲル上での点突然変異の検出を示す図である。（野生型ＤＮＡと突然変異型ＤＮＡとの）ヘテロ二本鎖を、様々に希釈した組換えＣｅｌ  Ｉ（Ｄ１００〜Ｄ１０００）で、又はタンパク質なし（−）で、インキュベートした。
【００６２】
図２は、アクリルアミドゲル上での点突然変異の検出を示す図である。ＷＴ＋Ｍｕｔ：ＰＣＲ前に野生型由来のＤＮＡと突然変異型由来のＤＮＡとを共に混合し、それによりヘテロ二本鎖を形成している。ＷＴ：野生型ＤＮＡのみをＰＣＲに使用し、それによりホモ二本鎖のみを形成している。Ｍｕｔ：突然変異型ＤＮＡのみをＰＣＲに使用し、それによりホモ二本鎖のみを形成している。Ｄ１００、Ｄ５００及びＤ１０００：組換えタンパク質Ｃｅｌ  Ｉの希釈度。
ゲルの上端にはホモ二本鎖のサイズ（６６１ｂｐ）が示されている。４０５ｂｐの矢印は、ＦＡＭ蛍光色素で標識された断片を示している。２５６ｂｐの矢印は、ＲＯＸ蛍光色素で標識された断片を示している。
【００６３】
図３は、アガロースゲル上での、ゲノムＤＮＡにおける点突然変異の検出を示す図である。ＰＣＲ産物を、以下の実施例４で記載したように、プライマー４−９６０及び４−７２１（配列番号３及び配列番号４）を使用して得た。それから、それらを、硫酸アンモニウム沈澱によって得た、様々に希釈した組換えＣＥＬ  Ｉ調製物で消化し（実施例２で記載したように）、アガロースゲル上で分析した。ｒｍｓ１−１３突然変異型対立遺伝子及び野生型対立遺伝子についてのＰＣＲ産物のサイズは約５００ｂｐ（正確には４８１ｂｐ）である。ヘテロ二本鎖ＤＮＡにおける突然変異の検出の結果、およそ２００ｂｐ及びおよそ３００ｂｐの二つのバンドが得られた。タバコで生成されたタンパク質の１／１０００の希釈度であっても、アガロースゲル上に二つのバンドを確認することができる。
１：Ｄ１００、２：Ｄ５００、３：Ｄ１０００、４：酵素なし。
Ａ：Ｔｅｒｅｓｅ、Ｂ：ｒｍｓ１．１３、Ｃ：Ｔ＋ｒｍｓ１．１３。
【００６４】
図４は、全てのタイプのミスマッチでの組換えＣｅｌ  Ｉ活性の分析を示す図である。Ｒｘ遺伝子に基づく一連の突然変異型をＰＣＲによって得て、ヘテロ二本鎖を、これらの様々な変異型に対応する増幅産物を混合することによって得た。ＩＲＤ７００フルオロフォア及びＩＲＤ８００フルオロフォア（ＭＷＳ（登録商標））で標識したオリゴヌクレオチドをＰＣＲに使用して、ＬＩＣＯＲ４３００（ＬＩＣＯＲ（登録商標））でミスマッチ検出を行った。この図は、ＩＲＤ７００色素（Ａ）及びＩＲＤ８００色素（Ｂ）の泳動のチャネルを示している。チャネルＡは５’末端断片がＩＲＤ７００によって標識された２０４ｂｐの断片を示し、チャネルＢは３’末端断片がＩＲＤ８００色素によって標識された４３８ｂｐの断片を示す。
【００６５】
図５は、タバコにおいて生成された組換えＣｅｌ  Ｉタンパク質の感受性を示す図である。１：Ｗｔ  Ｐｅａ、２：Ｌｅ１、３：Ｗｔ＋Ｌｅ１、４：Ｗｔ＋Ｌｅ１＋２ＤＮＡ、５：Ｗｔ＋Ｌｅ１＋４ＤＮＡ、６：Ｗｔ＋Ｌｅ１＋６ＤＮＡ、７：Ｗｔ＋Ｌｅ１＋８ＤＮＡ、８：Ｗｔ＋Ｌｅ１＋１０ＤＮＡ。
【００６６】
図６は、５つの候補エンドヌクレアーゼによる、Ｃ−Ａ／Ｔ−Ｇミスマッチ部位でのヘテロ二本鎖ＤＮＡの切断を示す図である。（Ｈｏ）＝ホモ二本鎖ＤＮＡ、（Ｈｔ）＝ヘテロ二本鎖ＤＮＡ。
【００６７】
図７は、ＥＮＤＯ１及びＥＮＤＯ５による全てのタイプのミスマッチの特異的な認識の詳細な分析を示す図である。図４と同じ手順を用いた。
【００６８】
図８は、ＥＮＤＯ１の検出感受性を測定するための試験を示す図である。突然変異型（Ｌｅ−１）ＤＮＡと野生型（Ｔｏｒｓｔａｇ）ＤＮＡとの混合物をＥＮＤＯ１活性の鋳型として用い、１つの変異型に対して、２、４、６、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０及び６０個の野生型（左から右）の比とした。各パネルの最後の二つのラインはホモ二本鎖（突然変異型のみ及び野生型のみ）である。左側のパネル：ＩＲＤ７００のチャネル、検出した断片のサイズ＝３３８ｂｐ。右側のパネル：ＩＲＤ８００のチャネル、検出した断片のサイズ＝３００ｂｐ。
【００６９】
図９は、Ｃｅｌ  Ｉ及びＥｎｄｏ１によるミスマッチ検出の比較を示す図である。ライン１、５、８及び１０はホモ二本鎖に対応している。エンドヌクレアーゼによる切断により得られた断片は、４０５ｂｐのもの（青く標識）及び２５６ｂｐのもの（赤く標識、白黒ではあまり見えない）である。Ｅｎｄｏ１は、Ｃｅｌ  Ｉよりも効率的にミスマッチを認識する。その上、バックグラウンド（非特異的な活性）がＥｎｄｏ１ではさらに低い。
【００７０】
図１０は、二つの異なる希釈度（Ｄ１０００及びＤ５０００）におけるＥＮＤＯ１による、アクリルアミドゲル上での既知の点突然変異の検出を示す図である。Ｍ５及びＭ１２はＲｘ遺伝子を含む二つのプラスミドであり、一方はＷｔ型を含み、もう一方は突然変異型を含む。プライマー：Ｒｘ２１ｒｏｘ及びＲｘ２２ｆａｍ（この図では、赤く標識された、より小さな切断バンドがゲル上ではっきりと現れているが、白黒ではあまり見えない）。
【実施例１】
【００７１】
ＣＥＬ  Ｉエンドヌクレアーゼのクローニング、精製及び生成
【００７２】
ＣＥＬ  ＩのｃＤＮＡのクローニング
セロリからのＲＮＡの抽出
若い葉の組織（１ｇ）を乳棒及び乳鉢を使用して液体窒素内で粉砕した。この粉末を１０ｍｌのＴｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ）抽出緩衝液に懸濁した。この懸濁液を２ｍｌのクロロホルムと混合し、４℃で１５分間、１２０００ｒｐｍで遠心分離した。この上清を等量のイソプロパノールと混合し、４℃で１０分間、１２０００ｒｐｍで遠心分離して全ＲＮＡを沈澱させた。このペレットを８０％エタノールで洗浄し、空気乾燥して、２００μｌのＤＥＰＣ水に再懸濁した。
【００７３】
ＤＮａｓｅ処理
ＲＮＡ調製物に混入しているＤＮＡを加水分解するためにＤＮａｓｅ処理を行った。製造者（Ｐｒｏｍｅｇａ）の条件に従って、１０ユニットのＤＮａｓｅを用いて１０μｇの全ＲＮＡをインキュベートした。
【００７４】
この反応物を室温で１５分間インキュベートし、それから最終濃度が２５ｍＭになるまでＥＤＴＡを添加し１０分間６５℃でＤＮａｓｅを熱不活性化することによって、この反応を停止させた。
【００７５】
ＣＥＬ  ＩのｃＤＮＡの合成
ＤＮａｓｅ処理した１０μｌのＲＮＡを第一鎖ｃＤＮＡの合成に使用した。第一鎖ｃＤＮＡの合成を２ピコモルの２０ｍｅｒのオリゴｄＴプライマーで準備した。５０μｌの反応混合物（１０μｌの５×Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ緩衝液（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）、５μｌの１００ｍＭのＤＴＴ、５μｌの５ｍＭのｄＮＴＰ）を７０℃で１０分間加熱し、それから氷冷した。１μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（２００ユニット／μｌ、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）及び１μｌのＲＮａｓｅ阻害剤（３７ユニット／μｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を加えて、反応物を４２℃で１時間インキュベートした。ＣＥＬ  Ｉの５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲに特異的な二つのプライマーを使用したＰＣＲ増幅によって、第一鎖ｃＤＮＡを二本鎖ＤＮＡにした（以下の表３を参照のこと）。
【００７６】
ＣＥＬ  Ｉのクローニング及びタバコの葉における発現
全長ＣＥＬ  ＩのオープンリーディングフレームをＰＣＲ増幅し、バイナリーベクターｐＢｉｎ１９の３５ＳプロモーターとＣａＭＶの転写ターミネーターとの間に挿入し、ｐＢＩＮ３５Ｓ−ＣＥＬＩを得た。もう一つの構築物ｐＢＩＮ３５Ｓ−ＣＥＬＩ８Ｈｉｓも構築した。ｐＢＩＮ３５Ｓ−ＣＥＬＩ８Ｈｉｓは、８個のアミノ酸のヒスチジンタグがＣＥＬ  Ｉタンパク質のＣ末端に挿入されていることを除いて、ｐＢＩＮ３５Ｓ−ＣＥＬＩと同一である。ｐＢＩＮ３５Ｓ−ＣＥＬＩ及びｐＢＩＮ３５Ｓ−ＣＥＬＩ８Ｈｉｓを得るために用いたオリゴヌクレオチドを以下の表３に示す。
【００７７】
【表３】
2008507965.tif 000005
【００７８】
これらの構築物を、病原性ヘルパープラスミドｐＣＨ３２（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ，  ９３（１８）：  ９９７５−９９７９，  １９９６）を有するアグロバクテリア株Ｃ５８Ｃ１へ形質転換した。ｐＣＨ３２はＶｉｒＧ及びＶｉｒＥを発現し、Ｔ−ＤＮＡの転写を促進させるために使用した。５０μｇ／ｍＬのカナマイシン及び５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを補充した５ｍＬのＬ  ｂｒｏｔｈ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）にアグロバクテリア細胞を接種し、２８℃で一晩成長させた。それから、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン及び５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを補充したＬ  ｂｒｏｔｈ培地（５０ｍＬ）に、一晩培養した５ｍＬの培養物を接種し、２９℃で２日間成長させた。細胞を沈澱させ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．６）及び１５０μＭのアセトシリンゴンを含む溶液に、ＯＤ600が０．５の最終濃度まで再懸濁した。この培養物を室温で２時間インキュベートした後、ベンサミアナタバコの葉にアグロバクテリアを感染させた。
【００７９】
アグロバクテリア懸濁液は、針のないシリンジを使用して葉に注入した。
【００８０】
アグロバクテリアを感染させたベンサミアナタバコ植物を、２４℃、１６時間の明期、湿度６０％の条件で、少なくとも４８時間インキュベートした。アグロバクテリアへの感染の効率を試験するため、植物に、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する構築物を有するアグロバクテリアも感染させた。葉を採取する前に、ＵＶランプを使用してそれぞれの葉におけるＧＦＰの発現強度を確認した。ＧＦＰを発現していた場合にのみ植物の葉を採取した。
【００８１】
硫酸アンモニウム沈澱によるタバコの葉からのタンパク質の調製
アグロバクテリアを感染させたタバコの葉を採取し、秤量した。アグロバクテリアを感染させた２グラムの葉を、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、２００μＭのＰＭＳＦ、０．１２５ｍＭのβ−メルカプトエタノール及び１０％のグリセロールを含む７ｍｌの緩衝液でホモジナイズし、その後、３０００ｇで２５分間遠心分離して、細胞残屑をペレット化した。上清に１００％の硫酸アンモニウムを最終濃度が３０％になるまで添加してから、サンプルを氷上で１時間インキュベートし、４℃で３０分間、３００００ｇで遠心分離して、３０％の硫酸アンモニウムで沈澱させたタンパク質をペレット化した。上清に１００％の硫酸アンモニウムを添加し、８０％の最終濃度を得て、サンプルを再び氷上で１時間インキュベートし、上記の通り遠心分離し、８０％の硫酸アンモニウムで沈澱させたタンパク質をペレット化した。８０％の硫酸アンモニウムで沈澱させたタンパク質を含むペレットを６００μｌのホモジナイズ緩衝液に再懸濁した。タンパク質濃度は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ａｓｓａｙキット（Ｐｉｅｒｃｅ）で測定した。ホモジナイズしたペレットは１４μｇ／μｌのタンパク質を含有する。このようにして、アグロバクテリアに感染させた２ｇのタバコの葉から８４００μｇのタンパク質を回収した。ホモジナイズしたペレットを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１０％グリセロール及び１００μＭのＰＭＳＦを含む緩衝液で１μｇ／μｌに希釈し、一定分量に分け、−８０℃で保存した。
【００８２】
Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーによる、Ｈｉｓ−６でタグ付けしたタンパク質の精製
アグロバクテリアに感染させた５ｇのタバコの葉を回収し、リン酸Ｎａ（１００ｍＭ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）（１０ｍＭ）、ＮａＣｌ（２００ｍＭ）、メタ重亜硫酸ナトリウム（０．２％）、ＰＭＳＦ（１ｍＭ）、βメルカプトエタノール（１０ｍＭ）を含む、１５ｍｌの氷冷した緩衝液にホモジナイズした。ホモジナイズの後、サンプルを４℃で１０分間、６０００ｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ、  ｒｏｔｏｒ  ＪＡ  ２０）で遠心分離した。上清にイミダゾール（１０ｍＭ）を添加し、ＮａＯＨでｐＨを９に調整した。溶液を４℃で６０分間、４２０００ｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ、  ｒｏｔｏｒ  ＪＡ  ２０）で遠心分離した。上清を、ホモジナイズ緩衝液＋１０ｍＭのイミダゾール（ｐＨ９）（緩衝液Ｂ）で事前に平衡化した１ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｕｉａｇｅｎ）と混合した。混合物を４℃で２時間ホモジナイズし、タンパク質をＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズに結合させた。ビーズを１ｍｌのポリプロピレンカラム（Ｑｕｉａｇｅｎ）に封入し、樹脂を２０ｍｌの緩衝液Ｂで洗浄した。タンパク質を５ｍｌ（５×１ｍｌ）の緩衝液Ｂ＋２５０ｍＭのイミダゾール（ｐＨ９）で溶出した。一定分量に分けた画分を、精製中の酵素活性を追跡するために保存した。高濃度のイミダゾールによる酵素活性のあらゆる阻害を避けるために、溶出した画分を、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１００μＭのＰＭＳＦ及び２μＭのＺｎＣｌ2を含む４Ｌの緩衝液に対して４℃で一晩透析した。このようにして１０００μｇのタンパク質を回収した。ホモジナイズしたペレットを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１０％グリセロール及び１００μＭのＰＭＳＦを含む緩衝液で、３μｇ／μｌに希釈し、一定分量に分け、−８０℃で保存した（希釈度Ｄ１００００）。
【実施例２】
【００８３】
一本鎖特異的なＤＮＡ分解
【００８４】
一本鎖ＤＮＡの分解に対する組換えＣｅｌ  Ｉの活性を以前に記載されているように測定した（ＳＵＮＧ  ＳＣ，  ＬＡＫＫＯＷＳＫＩ  Ｍ  Ｓｒ．（１９６２）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  １９６２  Ｆｅｂ；  ２３７：  ５０６−１１）。ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ及びプロテアーゼを含まないエンドウの３０μｇのゲノムＤＮＡを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＤＴＴ及び５％ＰＥＧ−８０００を含む緩衝液で、２μｇのタンパク質抽出物とともにインキュベートした。反応を停止させるために、０．２ＮのＨＣｌ中で２０ｍＭのＬａＣｌ3を等量添加した。サンプルを４０分間２１０００ｇで遠心分離し、分光光度計を使用して上清の２６０ｎｍでの吸光度を測定し、酸可溶性になったＤＮＡ量を決定した。
【実施例３】
【００８５】
ヘテロ二本鎖ＤＮＡの切断、並びに、タバコにおいて生成されるエンドヌクレアーゼによる、アガロースゲル及びアクリルアミドゲル上での、試験遺伝子における既知の点突然変異の検出
【００８６】
タバコにおいて生成されるＣＥＬ  Ｉエンドヌクレアーゼが単一点突然変異を認識することができるかどうかを試験するために、硫酸アンモニウム沈殿によって得られた組換えＣＥＬ  Ｉ調製物の活性を、Ｃ−Ｇ変異とＡ−Ｔ変異とで単一点突然変異が異なる二つのクローンに由来するヘテロ二本鎖ＤＮＡで試験した（Ｂｅｎｄｈａｍａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  １１，  ７８１−７９２，  １９９９）。二つのオリゴヌクレオチドＲ２１及びＲ２２（Ｒ２１：  ５’  ＧＡＣ  ＡＴＡ  ＴＧＧ  ＡＣＴ  ＡＣＡ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＴＧＧ  Ｇ  ３’（配列番号８）、  Ｒ２２：  ５’  ＧＴＴ  ＣＡＣ  ＧＧＧ  ＴＣＡ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＧＣＡ  ＴＴＣ  Ｃ  ３’（配列番号９））を使用して、二つのクローンでＰＣＲを行った。ヘテロ二本鎖ＤＮＡのＰＣＲ増幅及び再構築を以下のプログラムを使用して行った。９５℃で２分間変性し、その後、９４℃で２０秒、Ｔｍ（５５℃）＋３℃〜Ｔｍ−４℃で１５秒、−１℃を１サイクルとし、これを７サイクル行い、０．５℃／秒で７２℃までの温度勾配及び７２℃で１分間の伸長の後、９４℃で２０秒、Ｔｍ−５℃で３０℃、０．５℃／秒で７２℃までの温度勾配及び７２℃で１分間の伸長、７２℃で５分間の最終の伸長、そして９４℃で１０分間の熱変性ステップ、その後２０秒で４０℃までの温度傾斜、そして−０．３℃を１サイクルとし、これを４４サイクル行う。
【００８７】
ＰＣＲ産物（野生型ＤＮＡと突然変異型ＤＮＡとの混合物、又は野生型ＤＮＡのみもしくは突然変異型ＤＮＡのみ）を、ＣＥＬ  Ｉ調製物（１μｇ／μｌの原液を１／１００、１／５００、又は１／１０００に希釈したもの）とともに以下のようにインキュベートした。例えば、１０μｌのＰＣＲ産物（５００ｎｇ）を、２．５μｌの反応緩衝液（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１０ｍＭのＭｇＳＯ4、０．００２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、１０ｍＭのＫＣｌ）及び全量が２５μｌになるように希釈した２．５μｌのＣＥＬ  Ｉ調製物と、３７℃で３０分間インキュベートした。この反応を５μｌの５００ｍＭのＥＤＴＡによって停止させ、消化産物を３％アガロースゲル上で分析した。
【００８８】
図１に示したように、ヘテロ二本鎖ＤＮＡ上の試験遺伝子Ｒｘにおける点突然変異の検出を、１／１００、１／５００及び１／１０００希釈での約２００ｂｐ及び約４００ｂｐの二つのバンドの出現によって確認した。これらのバンドは、酵素を添加していない時には現れない。
【００８９】
蛍光標識したプライマーを使用して得た、上記と同じ方法で消化したＰＣＲ産物を、ＡＢＩ３７７シーケンサーによりアクリルアミドゲル上で分析した（図２）。
【００９０】
図２に示したように、ＷｔのＤＮＡ及びＭｕｔのＤＮＡが共に混合されているときにのみ、２５６ｂｐ及び４０５ｂｐの二つのバンドが現れるが、それはその二つのＤＮＡ間でヘテロ二本鎖が形成されるためである。これは、ゲルを視覚化するために異なる波長を使用することでより一層はっきりと現れる。特に、ＲＯＸ蛍光色素（赤）で標識した、白黒の図２ではあまりはっきりと識別されない２５６ｂｐのバンドは、ＷＴ＋Ｍｕｔ混合物をＰＣＲ鋳型として使用した時ははっきりと現れ、他の場合では見られない。
【００９１】
これらの結果は、ｉｎ  ｐｌａｎｔａで生成されたＣＥＬ  Ｉタンパク質がＤＮＡのミスマッチを認識することができることを示している。
【実施例４】
【００９２】
組換えＣＥＬ  Ｉによるエンドウ由来のゲノムＤＮＡにおける点突然変異の検出
【００９３】
タバコから精製した組換えＣＥＬ  Ｉをエンドウにおける単一点突然変異を検出するために使用することができるか否かを試験するために、Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ  Ｒａｍｅａｕ（ＭＯＲＵＳ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２００１，  １２６：  １２０５−１２１３、  ＲＡＭＥＡＵ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２００２，  １１５：  ４５８−４６７）によって以前に特徴を明らかにされた、様々なエンドウのｒｍｓ突然変異型及びｌｅ突然変異型を試験として使用した。ｒｍｓ１．１１は遺伝子配列における様々な位置でＧ→Ａを含み、ｒｍｓ１−１２もＧ→Ａを含み、ｒｍｓ１−１３もＧ→Ａを含む。全てのものが、同じｒｍｓ１遺伝子上で、しかし異なる位置で、Ｇ→Ａの突然変異を有していた。
【００９４】
ｒｍｓ遺伝子座（ｒｍｓ１−１３、ｒｍｓ１−１０、ｒｍｓ１−１２）及びｌｅ遺伝子座の野生型対立遺伝子及び突然変異対立遺伝子を増幅するために、５０ナノグラムのエンドウのゲノムＤＮＡを鋳型として使用した。このＰＣＲ増幅で使用したプライマーを表４にまとめる。
【００９５】
【表４】
2008507965.tif 000006
【００９６】
ＰＣＲ増幅のプログラムは、９４℃で１分、（９４℃で１５秒、５５℃で１５秒、７４℃で１分、×３５）、７４℃で７分、８℃であった。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分析し、上記の実施例２に記載したように、硫酸アンモニウム沈澱によって得られた様々な希釈度の組換えＣＥＬ  Ｉ調製物で消化した。図３に示したように、ｒｍｓ１−１３突然変異体及び野生型突然変異体のＰＣＲ産物のサイズは、約５００ｂｐ（正確には４８１ｂｐ）である。ヘテロ二本鎖ＤＮＡにおける突然変異の検出の結果、約２００ｂｐ及び約３００ｂｐの二つのバンドが得られた。この２つのバンドは、タバコで生成したタンパク質の１／１０００希釈であってもアガロースゲル上に確認することができた。この結果は、ｉｎ  ｐｌａｎｔａで生成されるタンパク質が、第一に、ゲノムＤＮＡに存在する点突然変異を認識することができること、第二に、タンパク質を１／１０００に希釈しても消化産物を確認することができることから非常に活性があることを示している。
【実施例５】
【００９７】
組換えＣＥＬ  Ｉによる種々のミスマッチに対するミスマッチ切断の効率
【００９８】
本発明によって調製される組換えＣＥＬ  Ｉが、セロリから抽出したＣＥＬ  Ｉのように一つのタイプのミスマッチを選択的に切断するか否かを試験するために、Ｒｘ遺伝子に基づく一連の突然変異体を得た。この目的のために本発明者は、それぞれ異なる点突然変異を含む種々のプライマー（Ｒｘ−Ａ、Ｒｘ−Ｔ、Ｒｘ−Ｇ又はＲｘ−Ｃと呼ぶ）を設計した。これらのプライマーの各々が、Ｒｘ遺伝子の所定の位置に４つの塩基の一つ（Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣ）を導入することができる。ヘテロ二本鎖は、異なるプライマーで得た増幅産物を混合することで得られる。
【００９９】
ＰＣＲ混合物（全量５０μｌ中）は、鋳型ＤＮＡ（５０ｎｇ）、ｄＮＴＰ（０．２ｍＭ）、５μｌのＰＣＲ緩衝液Ｐｆｕ（×１０、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、プライマーＲｘ２１（０．４μＭ）、プライマーＲｘ−Ａ又はＲｘ−Ｔ又はＲｘ−Ｇ又はＲｘ−Ｃ（０．４μＭ）、Ｐｆｕ（５Ｕ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、２．５ユニット／μｌ）を含む。ＰＣＲ増幅に使用するプログラムは、９４℃で１分間、（９４℃で１５秒、５５℃で１５秒、７４℃で２分、×３５）、７４℃で７分、８℃で一晩であった。ＩＲＤ７００フルオロフォア及びＩＲＤ８００フルオロフォア（ＭＷＳ（登録商標））で標識したオリゴヌクレオチドをＰＣＲに使用して、ＬＩＣＯＲ４３００（ＬＩＣＯＲ（登録商標））でのミスマッチ検出を可能にした。
【０１００】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分析し、ｐＧＥＭ３Ｚｆでクローニングした。全てのクローンを配列決定して、正確な突然変異が挿入されていることを確認した。これらの構築物の組み合わせをＰＣＲ増幅における鋳型として使用して、全てのタイプのミスマッチを再構築した。
【０１０１】
ミスマッチしたＰＣＲ産物を、上記の実施例１に記載したように硫酸アンモニウム沈澱によってタバコの葉から得られた組換えＣＥＬ  Ｉ調製物とともに、上記の実施例２に記載したようにインキュベートした。
【０１０２】
消化産物をアクリルアミドゲル上で分析した。６．５％変性アクリルアミドゲルを使用し、電気泳動条件は、スキャンスピード１で、１５００Ｖ、４０Ｗ、４０ｍＡ、４５℃であった。
【０１０３】
この結果を図４に示す（Ｌｉｃｏｒ  Ｇｅｌ）。
【０１０４】
これらの結果は、本発明のＣＥＬ  Ｉ調製物が全てのタイプのミスマッチ、そして特に、セロリから直接精製したＣＥＬ  Ｉによって弱く認識されると従来技術では報告されていたミスマッチを認識することを示している。実際に、上記の表２に示したように、本発明のＣＥＬ  Ｉ調製物は、Ｔ／Ｔ、Ｇ／Ａ、Ａ／Ｇ、Ｇ／Ｔ、Ｔ／Ｇのような従来技術のＣＥＬ  Ｉ調製物によって弱く認識されるミスマッチを非常に高い特異性で認識し、この酵素のミスマッチ選択性は、Ｔ／Ｇ〜Ａ／Ｇ〜Ｇ／Ｇ〜Ｇ／Ｔ＞Ｔ／Ｔ〜Ｇ／Ａ〜Ａ／Ａ〜Ｃ／Ｃ＞Ｔ／Ｃ〜Ｃ／Ｔ〜Ａ／Ｃ〜Ｃ／Ａである。
【０１０５】
ＣＥＬ  Ｉ反応緩衝液に５％ＰＥＧを補充したとき、この比活性も増大した（データは図示していない）。
【実施例６】
【０１０６】
組換えＣＥＬ  Ｉの感受性
【０１０７】
本発明の組換えＣＥＬ  Ｉをハイスループットの遺伝子型決定に使用することができることを確認するために、それが個体のプールにおいて突然変異を認識することができるか否かを試験した。
【０１０８】
エンドウの矮性突然変異型Ｌｅ１に対応する既知のＳＮＰ（Ｃ→Ｔ）を有するゲノムＤＮＡと、野生型のエンドウの品種ＴｏｒｓｔａｇのゲノムＤＮＡを、Ｌｅ１遺伝子座を増幅するために使用した。これらのゲノムＤＮＡを、ホモ二本鎖及びヘテロ二本鎖の形成の対照として使用した。
【０１０９】
ヘテロ二本鎖ＤＮＡを得るために、エンドウ植物のｌｅ１遺伝子座に関するホモ接合体に由来するゲノムＤＮＡを、エンドウ植物のＬｅ１遺伝子座に関するホモ接合体由来のゲノムＤＮＡで様々な割合で希釈し、その３０ｎｇを、ＴＥＴ蛍光色素で標識したプライマーＬｅ２４６２（５’−ＴＧＡＴＡＴＴＧＴＣＧＴＧＣＡＡＴＡＴＧＡＴＧＡＡＡＣ−３’、配列番号１４）及びＲＯＸ（ＭＷＧ（登録商標））蛍光色素で標識したプライマーＬｅ３０８２（５’−ＡＴＡＣＣＴＡＴＴＴＡＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＡＣＡＣ−３’、配列番号１５）を用いたＰＣＲ増幅に使用した。ＰＣＲ反応は以下のように行った。９４℃で１分、（９４℃で１５秒、５５℃で１５秒、７４℃で１分）×３５、７４℃で７分。ＰＣＲ産物から再構築したヘテロ二本鎖ＤＮＡを、上記のようなミスマッチ検出アッセイにおいて鋳型として使用した。
【０１１０】
タバコにおいて生成されるタンパク質を使用したこのプール実験の結果を図５に示す。予想した通り、本願の組換えタンパク質は、野生型ＤＮＡ鎖と突然変異型ＤＮＡ鎖との間でヘテロ二本鎖が形成されているときはいつでも、ＳＮＰ  Ｌｅ１を認識することができる。消化の結果、所望のサイズの２つのバンド（３００ｂｐ及び３３８ｂｐ）が得られ、また未消化のホモ二本鎖に対応する３番目のバンド（６３８ｂｐ）も得られた。赤く標識された３３８ｂｐのバンドがゲル上にはっきりと現れている（しかし白黒ではあまり見えない）。最も興味深いことに、この突然変異は、２４個の異なるゲノムＤＮＡからなるプールを使用したときでさえ（Ｌｅ１と２３個の未知のゲノムＤＮＡを有する野生型とを加える）、このタンパク質によって検出することができる。
【０１１１】
結論として、ｉｎ  ｐｌａｎｔａで生成されたタンパク質は高い感受性を有しており、少なくとも２４個の個体のゲノムＤＮＡに由来する増幅したＤＮＡ配列内における既知のＳＮＰを同定することを可能にしている。
【実施例７】
【０１１２】
シロイヌナズナの様々なエンドヌクレアーゼについての生物情報の調査
【０１１３】
エンドヌクレアーゼをコードするシロイヌナズナ由来の遺伝子のファミリーの分析が、データベースＰＦＡＭからのタンパク質プロフィールＰＦ０２２６５を使用して行われている。このプロフィールＨＭＭを、シロイヌナズナゲノムにおける２７１１７の予測されたタンパク質全て及び自動的に構造的な注釈の影響を避けるために６つの異なるフレームシフトで翻訳したゲノムの全体を対象とするプローブとして使用した。この分析において、本発明者は５つの候補遺伝子、Ａｔ１ｇ１１１９０、Ａｔ１ｇ６８２９０、Ａｔ４ｇ２１５９０、Ａｔ４ｇ２１５８５及びＡｔ４ｇ２１６００を同定した。
【実施例８】
【０１１４】
タバコの葉におけるシロイヌナズナの候補遺伝子のクローニング及び発現
【０１１５】
各候補遺伝子のｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、バイナリーベクターｐＢｉｎ６１の３５ＳプロモーターとＣａＭＶの転写ターミネーターとの間に挿入して、Ａｔ１ｇ１１１９０、Ａｔ１ｇ６８２９０、Ａｔ４ｇ２１５８５、Ａｔ４ｇ２１５９０及びＡｔ４ｇ２１６００にそれぞれ対応するｐＢＩＮ３５Ｓ−ＥＮＤＯ１、ｐＢＩＮ３５Ｓ−ＥＮＤＯ２、ｐＢＩＮ３５Ｓ−ＥＮＤＯ３、ｐＢＩＮ３５Ｓ−ＥＮＤＯ４及びｐＢＩＮ３５Ｓ−ＥＮＤＯ５を得た（表５）。これらの構築物を、病原性ヘルパープラスミドｐＣＨ３２（ＨＡＭＩＬＴＯＮ  ＣＭ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，  ９３（１８）：  ９９７５−９）を有するアグロバクテリア株Ｃ５８Ｃ１に形質転換した。ｐＣＨ３２はＶｉｒＧ及びＶｉｒＥを発現し、Ｔ−ＤＮＡの転写を増大するために使用した。アグロバクテリア細胞を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン及び５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを補充した２ｍＬのＬ  ｂｒｏｔｈ培地（ＳＡＭＢＲＯＯＫ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）に接種し、２８℃で一晩成長させた。細胞を沈澱させ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．６）及び１５０μＭのアセトシリンゴンを含む溶液に、ＯＤ600が０．５の最終濃度になるまで再懸濁した。培養物を室温で２時間インキュベートし、その後ベンサミアナタバコの葉にアグロバクテリアを感染させた。アグロバクテリアを感染させたベンサミアナタバコ植物を、２４℃、１６時間の明期、湿度６０％の条件で、少なくとも２４時間インキュベートした。アグロバクテリアへの感染の効率を試験するために、植物に、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する構築物を有するアグロバクテリアも感染させた。葉を採取する前に、ＵＶランプを使用してそれぞれの葉におけるＧＦＰの発現強度を確認した。ＧＦＰを発現していた場合にのみ植物の葉を採取した。候補タンパク質を実施例１で記載したように硫酸アンモニウム沈澱によって抽出した。
【０１１６】
【表５】
2008507965.tif 000007
【実施例９】
【０１１７】
候補タンパク質の生化学的特性
【０１１８】
候補タンパク質が活性であるかどうかを確認するための簡単な試験として、本発明者は幾つかのスーパーコイル状のプラスミドを、様々な希釈のタンパク質抽出物とともにインキュベートする（８０％硫酸アンモニウム沈澱）。タンパク質抽出物におけるエンドヌクレアーゼの存在の結果、アガロースゲル上で培養培地を泳動させるとスーパーコイル状の構造が緩まり、幾つかの新しいＤＮＡバンドが現れるであろう。様々な希釈を使用して本発明者は様々なエンドヌクレアーゼを比較し、どれが最も活性であるかを確認することができる。対照は常に、上記の実施例１に記載したように硫酸アンモニウム沈澱によって調製される組換えＣｅｌ  Ｉエンドヌクレアーゼであった。
【０１１９】
ミスマッチ部位でヘテロ二本鎖ＤＮＡを切断することができる候補タンパク質をスクリーニングするために、本発明者は三つの連続的なステップに基づく迅速な解析システムを使用することもできる。
【０１２０】
第一のステップでは、一本鎖ＤＮＡを分解する能力について候補タンパク質を試験した。ヘテロ二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチ部位のＤＮＡが一本鎖であるので、この条件について試験した。したがって、一本鎖ＤＮＡを消化することのできないエンドヌクレアーゼは、ミスマッチ部位でＤＮＡを切断することができないと予想される。第二に、候補タンパク質は、既知の十分に特徴が明らかなミスマッチ部位で試験用ヘテロ二本鎖ＤＮＡを切断しなければいけない。第三に、試験１及び試験２をクリアしたタンパク質を、全てのタイプのミスマッチを有するヘテロ二本鎖ＤＮＡ断片を切断する効率について評価した。これは、特定の挿入位置に４つの考えられるヌクレオチドの各々を含む十分に特徴が明らかなプラスミド構築物の組から成るＤＮＡツールボックスを使用して行った。
【０１２１】
一本鎖ＤＮＡを分解する能力
一本鎖ＤＮＡの分解における候補タンパク質の活性を、実施例２に記載したように測定した。この分析では、５つの候補タンパク質全てがヌクレアーゼ活性を示し、最も活性のあるものから活性の低い方へ順に、ＥＮＤＯ１、ＥＮＤＯ５、ＥＮＤＯ２、ＥＮＤＯ３、そしてＥＮＤＯ４と分類した。
【０１２２】
Ｃ−Ａ／Ｔ−Ｇミスマッチ部位でのヘテロ二本鎖ＤＮＡの切断
タバコで生成した候補タンパク質が単一点突然変異を認識することができるかどうかを試験するために、本発明者は実施例３で記載したように得られたヘテロ二本鎖ＤＮＡに対するタンパク質抽出物の活性を試験した。対立遺伝子の一方又は両方を含むＰＣＲ産物を、候補エンドヌクレアーゼ遺伝子を有する、又は対照としてＧＦＰを有するアグロバクテリアを感染させた葉に由来するタンパク質抽出物の１／１０００希釈物とともに、以下のようにインキュベートした。５００ｎｇのＰＣＲ産物を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＤＴＴ及び５％ＰＥＧ−８０００を含む２５μｌの最終容量内におけるタバコのタンパク質抽出物とともに、３７℃で３０分間。この反応を８０ｍＭの最終濃度のＥＤＴＡで停止させ、３％アガロースゲル上で分析した。
【０１２３】
二つのオリゴヌクレオチドが蛍光標識された場合、消化産物を３７７Ａｂｉ  ＤＮＡシーケンサーで、アクリルアミドゲル上で分析した。この実験において本発明者は、タンパク質抽出物がミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼを含んでいる場合、ヘテロ二本鎖ＤＮＡがミスマッチ部位で切断され、それによって２５６ｂｐ及び４０５ｂｐの二つのバンドを生じさせると予測した。
【０１２４】
この結果を図６に示す（赤く標識された２５６ｂｐのバンドはヘテロ二本鎖の存在下に酵素があるときは明らかに確認でき、非存在下ではそうではないこと、このバンドは白黒ではあまり識別できないことに留意されたい）。
【０１２５】
この生化学分析から、本発明者は５つのエンドヌクレアーゼがミスマッチ特異的な切断活性を示すと結論付けた。さらに、より高い一本鎖ＤＮＡ特異的ヌクレアーゼ活性を有する三つの酵素、ＥＮＤＯ１、ＥＮＤＯ５、ＥＮＤＯ２は、Ｃ−Ａ／Ｔ−Ｇミスマッチ部位でヘテロ二本鎖ＤＮＡを、ここでもより高い効率で切断する。その上、これら三つのエンドヌクレアーゼのうちＥＮＤＯ１及びＥＮＤＯ５が最も活性が高かった。したがって、これら二つのヌクレアーゼをさらなる正確な解析のために選択した。
【０１２６】
候補エンドヌクレアーゼによる、様々なミスマッチのミスマッチ切断の効率
この作業の主な目的は、ＣＥＬ−Ｉによって効率的に認識されないミスマッチを切断するエンドヌクレアーゼを同定することである。これは、特定の挿入位置に４つの考えられるヌクレオチドの各々を含む十分に特徴が明らかなプラスミド構築物の組から成るＤＮＡツールボックスを使用して行った。ＰＣＲ増幅における鋳型としてのこれらの構築物の組み合わせを、全てのタイプのミスマッチを再構築するために使用した。
【０１２７】
ミスマッチしたＰＣＲ産物を、上記のように（実施例５を参照のこと）候補エンドヌクレアーゼでインキュベートして、ＬＩＣＯＲ配列決定装置で分析した。
【０１２８】
結果を図７に示す。
【０１２９】
この分析において、ＥＮＤＯ５はＣＥＬ−１のようにＴ／Ｔタイプのミスマッチを弱く認識する。これに対して、ＥＮＤＯ１はほとんど全てのタイプのミスマッチを高い効率で認識する。この分析から、本発明者は、ＥＮＤＯ１がＣＥＬ−Ｉによって検出されないミスマッチを認識することができると結論付けることができる。
【実施例１０】
【０１３０】
ＤＮＡプールにおける突然変異対立遺伝子を検出するＥＮＤＯ１の感受性
【０１３１】
ＥＮＤＯ１の感受性を、実施例３で記載したように、野生型対立遺伝子を有するＤＮＡの２、４、６、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０又は６０倍の希釈物で評価した。
【０１３２】
このプール実験の結果を図８に表した。これはホモ接合体の野生型に由来する６０個の対立遺伝子の中からの、ホモ接合体の突然変異型に由来する一つの対立遺伝子の検出を示している。二つの生物からＰＣＲを行い、アンプリコンをアガロースゲル上で定量して、１：１〜１：６０まで減少していくＰＣＲアンプリコンの比に従って、共に混合した。それからＥＮＤＯ１活性をこれらの突然変異型：野生型の様々な比について分析した。
【０１３３】
同一の実験において、セロリから精製されたＣＥＬ−Ｉは、最大１６個の対立遺伝子のうち一つの対立遺伝子を低い感受性で検出することができ、正確な感受性は、希釈が８倍以下であるときにのみ得られる。
【０１３４】
結論として、本発明によるエンドヌクレアーゼ、特にＥＮＤＯ１は、Ｃｅｌ  Ｉよりもバックグラウンドノイズが非常に少なく、Ｃｅｌ  Ｉに比べて非常に高い希釈で使用することができ、Ｃｅｌ  Ｉエンドヌクレアーゼより高い特異性及び活性を有している。
【０１３５】
アクリルアミドゲル上での点突然変異の検出
Ｒｘ遺伝子に基づいた一連の突然変異型が得られた。本発明者は、ＥＮＤＯ１の特異性を示すために、ミスマッチの一つのタイプの各々を含む様々なプラスミドを設計した。ＰＣＲ混合物には、プラスミドに特異的なオリゴヌクレオチドが含まれる。ＲＯＸフルオロフォア及びＦＡＭフルオロフォア（ＭＷＧ（登録商標））で標識したオリゴヌクレオチドをＰＣＲに用いて、ＡＢＩ３７７  ＭＷＧ（登録商標）でのミスマッチ検出を可能にした。
【０１３６】
図９に示したように、ＥＮＤＯ１はホモ二本鎖のみが存在するとき、例えばレーン１又はレーン５では切断せず、本発明者がゲル上に確認することができるバンドはゲルの上端（約６００ｂｐ）のホモ二本鎖だけである。
【０１３７】
サンプルにおいてミスマッチが存在するとき（例えばレーン２、３、４又は６、７及び９のような、２つの異なるプラスミドに由来するＤＮＡの二本鎖の間でのヘテロ二本鎖の形成により）はいつでも、ＥＮＤＯ１はミスマッチ部位を認識及び切断し、各々一つのフルオロフォアで標識した二つの産物に対応する２つのバンドを出現させる。ＥＮＤＯ１の消化ではバックグラウンドの減少が見られ、幾つかのミスマッチがＥＮＤＯ１でのみ検出される（例えばレーン９）。
【０１３８】
アクリルアミドゲル上での、二つの異なる希釈液Ｄ１０００及びＤ５０００のＥＮＤＯ１による既知の点突然変異の検出
Ｒｘ遺伝子の野生型及び突然変異型を含む二つのプラスミドを使用した。これらは一つの既知の点突然変異のみによって異なる。ＰＣＲ混合物には、プラスミドに特異的なオリゴヌクレオチドが含まれる。ＲＯＸフルオロフォア及びＦＡＭフルオロフォア（ＭＷＧ（登録商標））で標識したオリゴヌクレオチドをＰＣＲに使用して、ＡＢＩ３７７  ＭＷＧ（登録商標）でのミスマッチ検出を可能にした。
【０１３９】
図１０に示したように、ヘテロ二本鎖がサンプル（Ｍ５＋Ｍ１２）に存在するときはいつでも、ＥＮＤＯ１はミスマッチ部位を認識及び切断し、フルオロフォアで標識された二つのバンドを出現させる。Ｍ５ホモ二本鎖又はＭ１２ホモ二本鎖のみが存在するとき、ＥＮＤＯ１は切断せず、ゲル上に確認することができるバンドはゲルの上端（約６００ｂｐ）のホモ二本鎖だけである。本発明者がＥＮＤＯ１のＤ５０００を使用したとき、バックグラウンドの改善が確認できる。したがって、Ｅｎｄｏ１は、当該技術分野で既知のあらゆるエンドヌクレアーゼと比較して非常に高い希釈で使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】アガロースゲル上での点突然変異の検出を示す図である。
【図２】アクリルアミドゲル上での点突然変異の検出を示す図である。
【図３】アガロースゲル上での、ゲノムＤＮＡにおける点突然変異の検出を示す図である。
【図４】全てのタイプのミスマッチでの組換えＣｅｌ  Ｉ活性の分析を示す図である。
【図５】タバコにおいて生成された組換えＣｅｌ  Ｉタンパク質の感受性を示す図である。
【図６】５つの候補エンドヌクレアーゼによる、Ｃ−Ａ／Ｔ−Ｇミスマッチ部位でのヘテロ二本鎖ＤＮＡの切断を示す図である。
【図７】ＥＮＤＯ１及びＥＮＤＯ５による全てのタイプのミスマッチの特異的な認識の詳細な分析を示す図である。
【図８】ＥＮＤＯ１の検出感受性を測定するための試験を示す図である。
【図９】Ｃｅｌ  Ｉ及びＥｎｄｏ１によるミスマッチ検出の比較を示す図である。
【図１０】二つの異なる希釈度（Ｄ１０００及びＤ５０００）におけるＥＮＤＯ１による、アクリルアミドゲル上での既知の点突然変異の検出を示す図である。
【図１】
2008507965.tif 000008
【図２】
2008507965.tif 000009
【図３】
2008507965.tif 000010
【図４】
2008507965.tif 000011
【図５】
2008507965.tif 000012
【図６】
2008507965.tif 000013
【図７】
2008507965.tif 000014
【図８】
2008507965.tif 000015
【図９】
2008507965.tif 000016
【図１０】
2008507965.tif 000017
【配列表】
2008507965000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月21日(2007.5.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008507965000001.app
【国際調査報告】
2008507965.tif 000026
2008507965.tif 000027
2008507965.tif 000028