(57)【要約】  アンバーセレクターコドンに応答して光調節型アミノ酸、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインを蛋白質に組込む蛋白質生合成機構の成分（直交ロイシルｔＲＮＡ、直交ロイシル−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、及びロイシルｔＲＮＡ／シンテターゼの直交対）を作製する組成物及び方法を提供する。これらの直交対の同定方法と、これらの直交対を使用して光調節型アミノ酸、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインを組込んだ蛋白質を生産する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）又はその修飾変異体と；
α−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、及びアゾベンジル−Ｐｈｅから構成される群から選択される１種以上のアミノ酸を直交ｔＲＮＡもしくはその修飾変異体に優先的に負荷する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）、又はＯ−ｔＲＮＡもしくはその修飾変異体にｏ−メチルチロシンを優先的に負荷する配列番号９〜１２の配列を含むＯ−ＲＳもしくはその修飾変異体を含む翻訳系。
【請求項２】
翻訳系が細胞を含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項３】
細胞が酵母細胞であるか又は細胞が真正細菌細胞である請求項２に記載の翻訳系。
【請求項４】
アミノ酸が非天然アミノ酸である請求項１に記載の翻訳系。
【請求項５】
Ｏ−ｔＲＮＡが修飾ロイシル−Ｏ−ｔＲＮＡである請求項１に記載の翻訳系。
【請求項６】
Ｏ−ｔＲＮＡが修飾チロシル−Ｏ−ｔＲＮＡである請求項１に記載の翻訳系。
【請求項７】
Ｏ−ｔＲＮＡもしくはその修飾変異体、Ｏ−ＲＳ、又はＯ−ｔＲＮＡとその修飾変異体の両者が大腸菌から誘導される請求項１に記載の翻訳系。
【請求項８】
Ｏ−ｔＲＮＡもしくはその修飾変異体、Ｏ−ＲＳ、又はＯ−ｔＲＮＡとその修飾変異体の両者がＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉから誘導される請求項１に記載の翻訳系。
【請求項９】
Ｏ−ＲＳが配列番号３のアミノ酸配列をもつ野生型大腸菌ｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１０】
Ｏ−ＲＳが配列番号４のアミノ酸配列をもつ野生型Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１１】
Ｏ−ＲＳが配列番号３のアミノ酸配列をもつ野生型大腸菌ｔＲＮＡシンテターゼから誘導され、Ｏ−ＲＳが、
（ａ）アミノ酸４０位にＡｌａ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、又はＴｒｐ；
（ｂ）アミノ酸４１位にＡｌａ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒ；
（ｃ）アミノ酸４９９位にＰｒｏ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、又はＴｒｐ；
（ｄ）アミノ酸５２７位にＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ、又はＴｈｒ；及び
（ｅ）アミノ酸５３７位にＧｌｙを含むアミノ酸配列をもつ請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１２】
Ｏ−ＲＳが配列番号４のアミノ酸配列をもつ野生型Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｔＲＮＡシンテターゼから誘導され、Ｏ−ＲＳが、
（ａ）アミノ酸３２位にＧｌｙ；
（ｂ）アミノ酸６５位にＧｌｕ；
（ｃ）アミノ酸１０８位にＡｌａ；
（ｄ）アミノ酸１０９位にＧｌｕ；
（ｅ）アミノ酸１５８位にＧｌｙ；及び
（ｆ）アミノ酸１６２位にＨｉｓを含むアミノ酸配列をもつ請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１３】
Ｏ−ＲＳが配列番号５〜１７、及びその保存変異体から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１４】
系がＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含み、Ｏ−ＲＳが配列番号５〜１７、及びその保存変異体から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１５】
ポリヌクレオチドが配列番号２０〜３２のヌクレオチド配列から選択される請求項１４に記載の翻訳系。
【請求項１６】
Ｏ−ｔＲＮＡが配列番号１〜２に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１７】
第１のＯ−ＲＳと少なくとも１個のセレクターコドンを含む核酸を含み、前記セレクターコドンが第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識される請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１８】
第２のＯ−ＲＳと第２のＯ−ｔＲＮＡを含み、第２のＯ−ＲＳが第１のアミノ酸と異なる第２のアミノ酸で第２のＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡが第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンと異なるセレクターコドンを認識する請求項１７に記載の翻訳系。
【請求項１９】
Ｏ−ｔＲＮＡ又はその修飾変異体がアンバーコドンの認識配列を含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項２０】
アンバーコドンを含むターゲット核酸を含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項２１】
ターゲット核酸によりコードされる蛋白質を含む請求項２０に記載の翻訳系。
【請求項２２】
蛋白質が光調節型アミノ酸を含む請求項２１に記載の翻訳系。
【請求項２３】
蛋白質がアゾベンジル−Ｐｈｅ又はｏ−ニトロベンジルシステインを含む請求項２２に記載の翻訳系。
【請求項２４】
請求項１に記載の翻訳系により生産された蛋白質。
【請求項２５】
蛋白質が非天然アミノ酸を含む請求項２４に記載の蛋白質。
【請求項２６】
非天然アミノ酸がα−アミノカプリル酸、Ｏ−メチルチロシン、ｏ−ニトロベンジルシステイン、又はアゾベンジル−Ｐｈｅである請求項２５に記載の蛋白質。
【請求項２７】
請求項２４に記載の蛋白質を含む組成物。
【請求項２８】
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み、前記Ｏ−ＲＳがα−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、もしくはアゾベンジル−ＰｈｅでＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するか、又は前記Ｏ−ＲＳが配列番号９〜１２の配列を含み、Ｏ−ｔＲＮＡをｏ−メチルチロシンで優先的にアミノアシル化する組成物。
【請求項２９】
Ｏ−ｔＲＮＡがロイシル−Ｏ−ｔＲＮＡである請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
Ｏ−ｔＲＮＡがチロシル−Ｏ−ｔＲＮＡである請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
Ｏ−ＲＳが配列番号５〜１７のアミノ酸配列又はその保存変異体を含む請求項２８に記載の組成物。
【請求項３２】
Ｏ−ＲＳが配列番号５〜８及び１３〜１７のいずれか１種の効率の少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する請求項２８に記載の組成物。
【請求項３３】
Ｏ−ＲＳが大腸菌から誘導される請求項２８に記載の組成物。
【請求項３４】
Ｏ−ＲＳがＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉから誘導される請求項２８に記載の組成物。
【請求項３５】
Ｏ−ｔＲＮＡがアンバーセレクターコドンを認識する請求項２８に記載の組成物。
【請求項３６】
細胞を含み、Ｏ−ＲＳが前記細胞で１種以上の核酸によりコードされ、前記核酸が配列番号２０〜３２又はその保存変異体から選択される請求項２７に記載の組成物。
【請求項３７】
細胞が酵母細胞である請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
翻訳系を含む請求項２７に記載の組成物。
【請求項３９】
細胞を含み、Ｏ−ＲＳが前記細胞で１種以上の核酸によりコードされ、前記細胞が更に、
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
α−アミノカプリル酸、Ｏ−メチルチロシン、ｏ−ニトロベンジルシステイン、又はアゾベンジル−Ｐｈｅの１種以上を含み；
Ｏ−ｔＲＮＡがセレクターコドンを認識し、Ｏ−ＲＳがα−アミノカプリル酸、Ｏ−メチルチロシン、ｏ−ニトロベンジルシステイン、又はアゾベンジル−Ｐｈｅの１種でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する請求項２７に記載の組成物。
【請求項４０】
細胞が該当ポリペプチドをコードするターゲット核酸を含み、ターゲット核酸がＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
配列番号５〜１７のいずれか１種、又はその保存変異体をコードする核酸。
【請求項４２】
核酸が配列番号２０〜３２から選択される請求項４１に記載の核酸。
【請求項４３】
α−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、又はアゾベンジル−Ｐｈｅの１種以上を含む蛋白質。
【請求項４４】
請求項４３に記載の蛋白質を含む組成物。
【請求項４５】
α−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、又はアゾベンジル−Ｐｈｅを直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）に負荷する活性直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の選択方法であって、
Ｏ−ｔＲＮＡを含む細胞集団のメンバーに対して直交性のＯ−ｔＲＮＡと；
集団の１個以上の細胞においてα−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、又はアゾベンジル−ＰｈｅをＯ−ｔＲＮＡに負荷する１個以上の活性Ｏ−ＲＳメンバーを含む複数のＯ−ＲＳと；
選択マーカーをコードし、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドと；
α−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、又はアゾベンジル−Ｐｈｅを併有する細胞の集団に選択を実施し、複数のＲＳを含まず且つＯ−ｔＲＮＡを含む対照細胞の抑圧効率に比較して選択マーカーの抑圧効率の増加により、活性Ｏ−ＲＳを含むターゲット細胞を集団から同定する段階と；
ターゲット細胞を選択することにより、活性Ｏ−ＲＳを選択する段階を含む前記方法。
【請求項４６】
α−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、又はアゾベンジル−Ｐｈｅ以外のアミノ酸をＯ−ｔＲＮＡに負荷する非ターゲットＯ−ＲＳを含む細胞を排除するように細胞を更に選択する請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
選択がポジティブ選択を含み、選択マーカーがポジティブ選択マーカーを含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
Ｏ−ｔＲＮＡがロイシル−Ｏ−ｔＲＮＡである請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
Ｏ−ｔＲＮＡがチロシル−Ｏ−ｔＲＮＡである請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
請求項４５に記載の方法により同定された直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ。
【請求項５１】
１種以上のα−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、アゾベンジル−Ｐｈｅ、光調節型セリン、光調節型セリンアナログ、フルオロフォア、スピン標識アミノ酸、又はダンシル側鎖を含むアミノ酸を１個以上の特定位置に組込んだ蛋白質を細胞で生産する方法であって、
少なくとも１個のセレクターコドンを含み、蛋白質をコードする核酸を含む細胞を適当な培地で増殖させる段階と；
α−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、アゾベンジル−Ｐｈｅ、光調節型セリン、光調節型セリンアナログ、フルオロフォア、スピン標識アミノ酸、又はダンシル側鎖を含むアミノ酸を提供する段階を含み；
前記細胞が更に、
セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
α−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、アゾベンジル−Ｐｈｅ、光調節型セリン、光調節型セリンアナログ、フルオロフォア、スピン標識アミノ酸、又はダンシル側鎖を含むアミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み；
更に、セレクターコドンに応答してα−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、アゾベンジル−Ｐｈｅ、光調節型セリン、光調節型セリンアナログ、フルオロフォア、スピン標識アミノ酸、又はダンシル側鎖を含むアミノ酸を特定位置に組込むことにより、蛋白質を生産する段階を含む前記方法。
【請求項５２】
Ｏ−ＲＳが配列番号５〜１７に対応するアミノ酸配列、又はその保存変異体を含む請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
宿主細胞で機能する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の同定に有用なポリヌクレオチドメンバーのライブラリーであって、前記ポリヌクレオチドメンバーが、
（ｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列（その場合、前記ポリヌクレオチドメンバーは配列番号４のＴｙｒ３２、Ｌｅｕ６５、Ｐｈｅ１０８、Ｇｌｎ１０９、Ａｓｐ１５８及びＬｅｕ１６２をコードするコドンのランダム化ヌクレオチド位置を含む）；又は
（ｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列以外の古細菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸配列（その場合、前記ポリヌクレオチドメンバーは対応するアミノ酸が配列番号４のＴｙｒ３２、Ｌｅｕ６５、Ｐｈｅ１０８、Ｇｌｎ１０９、Ａｓｐ１５８及びＬｅｕ１６２に空間的に対応するコドンのランダム化ヌクレオチド位置を含む）から選択されるアミノ酸配列の変異体をコードする前記ライブラリー。
【請求項５４】
前記ポリヌクレオチドが発現ベクターを含む請求項５３に記載のライブラリー。
【請求項５５】
前記Ｏ−ＲＳが直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する請求項５３に記載のライブラリー。
【請求項５６】
前記Ｏ−ＲＳが（ｉ）配列番号４の３２、６５、１０８、１０９、１５８及び１６２位；又は（ｉｉ）配列番号４のＴｙｒ３２、Ｌｅｕ６５、Ｐｈｅ１０８、Ｇｌｎ１０９、Ａｓｐ１５８及びＬｅｕ１６２に空間的に対応する位置以外の位置に１個以上の保存アミノ酸置換を含む請求項５３に記載のライブラリー。
【請求項５７】
前記宿主細胞が大腸菌細胞である請求項５３に記載のライブラリー。
【請求項５８】
請求項５３に記載の複数のライブラリーポリヌクレオチドメンバーを含む複数の細胞。
【請求項５９】
前記古細菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼがＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼである請求項５３に記載のライブラリー。
【請求項６０】
前記Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼがＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼである請求項５９に記載のライブラリー。
【請求項６１】
ａ）（ｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の変異体をコードし、配列番号４のＴｙｒ３２、Ｌｅｕ６５、Ｐｈｅ１０８、Ｇｌｎ１０９、Ａｓｐ１５８及びＬｅｕ１６２をコードするコドンのランダム化ヌクレオチド位置を含むポリヌクレオチドメンバーのライブラリーと；
（ｉｉ）宿主細胞を提供する段階と；
ｂ）前記宿主細胞において直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドメンバーを前記ライブラリーから検出することにより、所望Ｏ−ＲＳを同定する段階を含む所望直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の同定方法。
【請求項６２】
前記検出段階がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ蛋白質を発現させ、クロラムフェニコールの存在下で細胞生存を検出することにより実施されるポジティブ選択を含む請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記検出段階がバルナーゼ蛋白質を発現させることにより実施されるネガティブ選択を含む請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
宿主細胞で機能する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の同定に有用なポリヌクレオチドメンバーのライブラリーであって、前記ポリヌクレオチドメンバーが、
（ｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列（その場合、前記ポリヌクレオチドメンバーは配列番号３のＭｅｔ４０、Ｌｅｕ４１、Ｔｙｒ４９９、Ｔｙｒ５２７、及びＨｉｓ５３７をコードするコドンのランダム化ヌクレオチド位置を含む）；又は
（ｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列以外の真正細菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸配列（その場合、前記ポリヌクレオチドメンバーは対応するアミノ酸が配列番号３のＭｅｔ４０、Ｌｅｕ４１、Ｔｙｒ４９９、Ｔｙｒ５２７、及びＨｉｓ５３７に空間的に対応するコドンのランダム化ヌクレオチド位置を含む）から選択されるアミノ酸配列の変異体をコードする前記ライブラリー。
【請求項６５】
前記ポリヌクレオチドが発現ベクターを含む請求項６４に記載のライブラリー。
【請求項６６】
前記Ｏ−ＲＳが直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する請求項６４に記載のライブラリー。
【請求項６７】
前記Ｏ−ＲＳが（ｉ）配列番号３の４０、４１、４９９、５２７、及び５３７位；又は（ｉｉ）配列番号３のＭｅｔ４０、Ｌｅｕ４１、Ｔｙｒ４９９、Ｔｙｒ５２７、及びＨｉｓ５３７に空間的に対応する位置以外の位置に１個以上の保存アミノ酸を含む請求項６４に記載のライブラリー。
【請求項６８】
前記宿主細胞がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である請求項６４に記載のライブラリー。
【請求項６９】
請求項６４に記載の複数のライブラリーポリヌクレオチドメンバーを含む複数の細胞。
【請求項７０】
前記真正細菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが大腸菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼである請求項６４に記載のライブラリー。
【請求項７１】
前記大腸菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが大腸菌ロイシルｔＲＮＡシンテターゼである請求項７０に記載のライブラリー。
【請求項７２】
ａ）（ｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列の変異体をコードし、配列番号３のＭｅｔ４０、Ｌｅｕ４１、Ｔｙｒ４９９、Ｔｙｒ５２７、及びＨｉｓ５３７をコードするコドンのランダム化ヌクレオチド位置を含むポリヌクレオチドメンバーのライブラリーと；
（ｉｉ）宿主細胞を提供する段階と；
ｂ）前記宿主細胞において直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドメンバーを前記ライブラリーから検出することにより、所望Ｏ−ＲＳを同定する段階を含む所望直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の同定方法。
【請求項７３】
前記検出段階がｇａｌ４蛋白質を発現させ、ウラシルの不在下又はヒスチジンの不在下で且つアミノトリアゾールの存在下に細胞生存を検出することにより実施されるポジティブ選択を含む請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記検出段階がフルオロオロチン酸の存在下でｕｒａ３蛋白質を発現させることにより実施されるネガティブ選択を含む請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
ａ）アゾベンジル−Ｐｈｅ又はｏ−ニトロベンジルシステインに特異的なＯ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの対を介してアゾベンジル−Ｐｈｅ又はｏ−ニトロベンジルシステインを蛋白質に組込む段階と；
ｂ）アゾベンジル−Ｐｈｅ又はｏ−ニトロベンジルシステインを光調節する光エネルギーの波長に蛋白質を暴露することにより、アゾベンジル−Ｐｈｅ又はｏ−ニトロベンジルシステインを含む蛋白質の活性を調節する段階を含む蛋白質の活性の調節方法。
【請求項７６】
ａ）アゾベンジル−Ｐｈｅ又はｏ−ニトロベンジルシステインを組込んだ蛋白質と；
ｂ）蛋白質のアゾベンジル−Ｐｈｅ又はｏ−ニトロベンジルシステインを光調節することにより、蛋白質の活性を調節する光源を含む蛋白質の活性の調節システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願とのクロスリファレンス）
本願は仮特許出願ＵＳＳＮ６０／６１２，２２３（出願日２００４年９月２１日）、及びＵＳＳＮ６０−６２０，６２５（出願日２００４年１０月１９日）の関連出願であり、その優先権と特典を主張し、その開示内容全体を参考資料として全目的で本明細書に組込む。
【０００２】
（連邦政府支援研究開発から創出された発明の権利に関する陳述）
本発明は国立衛生研究所助成番号ＧＭ６２１５９及びエネルギー省助成番号ＥＲ４６０５１として米国政府助成下に創出された。米国政府は本発明に所定の権利をもつことができる。
【０００３】
（発明の技術分野）
本発明は翻訳生化学の分野に関する。本発明は終止セレクターコドンや４塩基コドン等のセレクターコドンに応答して非天然アミノ酸（例えば光調節型アミノ酸）を蛋白質に選択的に組込む直交ｔＲＮＡ、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、及びその対を作製及び使用するためのライブラリー、組成物及び方法に関する。これはこのようなコドンに応答して単一蛋白質鎖に複数の異なる非天然アミノ酸を組込むことも含む。本発明は更に前記対を使用して細胞で蛋白質を生産する方法と関連組成物にも関する。
【背景技術】
【０００４】
少数の例外を除き、全公知生物の遺伝コードは同一の２０種のアミノ酸をコードする。この特徴により、光調節可能な蛋白質修飾のための新規化学の開発における天然アミノ酸の使用は制限される。生物のレパートリーに新規アミノ酸を付加するためには、ユニークｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対、アミノ酸源、及びアミノ酸を指定するユニークセレクターコドンが必要である（Ｆｕｒｔｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，７：４１９−４２６）。既に本発明者らは大腸菌で新規特性をもつ各種アミノ酸を遺伝的にコードするためにアンバーナンセンスコドンＴＡＧを直交Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ及び大腸菌ｔＲＮＡ／シンテターゼ対と併用できることを示している。このようなアプローチは真正細菌である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）や他の生物のｉｎ  ｖｉｖｏ蛋白質生合成機構において非天然アミノ酸を蛋白質に付加するために実現可能であることが分かっている。例えばＷａｎｇら，２０００，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２２：５０１０−５０１１；Ｃｈｉｎら，２００２，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２４：９０２６−９０２７；Ｗａｎｇら，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：４９８−５００；Ｗａｎｇら，２００３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：５６−６１；Ｃｈｉｎら，２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１１０２０−１１０２４，Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，２００２，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，１−１０、及びＣｈｉｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，２００２，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，３：１１３５−１１３７参照。国際特許公開第ＷＯ２００２／０８６０７５号、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｔＲＮＡ  ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  Ｐａｉｒｓ）」；及びＷＯ２００４／０９４５９３号、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」；並びに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２２１８７号（出願日２００４年７月７日）も参照。
【０００５】
同時に、生体活性分子（例えば酵素）を研究及び操作するために光調節型ペプチドも必要とされている。例えばＡｄａｍｓら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９３，５５：７５５−７８４参照。遺伝コードを更に拡張するためには、生合成機構の改良及び／又は付加成分（例えば直交ｔＲＮＡ、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び／又はユニークコドン）を開発することが必要である。高度に特異的な標的蛋白質修飾を実施するための新規方法と、蛋白質を光調節可能にするように蛋白質の規定位置に非天然アミノ酸をｉｎ  ｖｉｖｏで組込む直交翻訳成分の開発も依然として必要である。本発明は以下の開示から明らかなように、上記及び他の必要を満たすものである。
【特許文献１】国際特許公開第ＷＯ２００２／０８６０７５号
【特許文献２】国際特許公開第ＷＯ２００４／０９４５９３号
【特許文献３】国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２２１８７号
【非特許文献１】Ｆｕｒｔｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，７：４１９−４２６
【非特許文献２】Ｗａｎｇら，２０００，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２２：５０１０−５０１１
【非特許文献３】Ｃｈｉｎら，２００２，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２４：９０２６−９０２７
【非特許文献４】Ｗａｎｇら，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：４９８−５００
【非特許文献５】Ｗａｎｇら，２００３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：５６−６１
【非特許文献６】Ｃｈｉｎら，２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１１０２０−１１０２４
【非特許文献７】Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，２００２，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，１−１０
【非特許文献８】Ｃｈｉｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，２００２，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，３：１１３５−１１３７
【非特許文献９】Ａｄａｍｓら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９３，５５：７５５−７８４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は特に大腸菌ｔＲＮＡＬＥＵ／ロイシルｔＲＮＡシンテターゼ対をベースとする酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）用直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対を含む。新規遺伝子選択を使用し、本発明はＣ８アミノ酸としてα−アミノカプリル酸、Ｏ−メチルチロシン、及び／又はフォトケージドアミノ酸としてｏ−ニトロベンジルシステインをアンバーサプレッサーｔＲＮＡに選択的に負荷する一連のシンテターゼ突然変異体を同定し、アンバーナンセンスコドンＴＡＧに応答してこれらのアミノ酸を酵母の蛋白質に挿入できるようにする。他の側面では、本発明はＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｔＲＮＡＴｙｒ／チロシルｔＲＮＡシンテターゼ対をベースとする大腸菌用直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対を含む。この場合も、新規遺伝子選択を使用し、本発明は光調節可能な（光異性化可能な）アミノ酸アゾベンジル−ＰｈｅをＯ−ｔＲＮＡに選択的に負荷するシンテターゼ突然変異体を同定し、前記アミノ酸を大腸菌の蛋白質に挿入できるようにする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は該当非天然アミノ酸を宿主細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで組込むための直交翻訳系を得るように、適切なｔＲＮＡと共働するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ蛋白質を同定及び単離するための組成物と方法を提供する。
【０００８】
所定側面において、本発明は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、又はその修飾変異体と、前記直交ｔＲＮＡ、又はその修飾変異体に１種以上のアミノ酸を優先的に負荷する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む翻訳系を含む。このようなアミノ酸はα−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、アゾベンジル−Ｐｈｅから選択され、翻訳系はＯ−ｔＲＮＡ又はその修飾変異体にＯ−メチルチロシンを優先的に負荷する配列番号９〜１２の配列を含むＯ−ＲＳ又はその修飾変異体を含む。本発明の翻訳系は細胞（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等の酵母細胞又は大腸菌等の真正細菌細胞）を含むことができる。更に、翻訳系の各種態様において、アミノ酸は非天然アミノ酸である。所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡはロイシル−Ｏ−ｔＲＮＡであり、他の態様では、Ｏ−ｔＲＮＡはチロシル−Ｏ−ｔＲＮＡである。更に、所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡもしくはその修飾変異体、Ｏ−ＲＳ、又はＯ−ｔＲＮＡとその修飾変異体の両者は大腸菌（例えば配列番号３のアミノ酸配列をもつ野生型大腸菌ｔＲＮＡシンテターゼ）から誘導され、他の態様では、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（例えば配列番号４のアミノ酸配列をもつ野生型Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｔＲＮＡシンテターゼ）から誘導される。本発明の翻訳系は（例えば配列番号３のアミノ酸配列をもつ野生型大腸菌ｔＲＮＡシンテターゼから誘導される）Ｏ−ＲＳを含むことができ、Ｏ−ＲＳは（ａ）アミノ酸４０位にＡｌａ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、又はＴｒｐ；（ｂ）アミノ酸４１位にＡｌａ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒ；（ｃ）アミノ酸４９９位にＰｒｏ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、又はＴｒｐ；（ｄ）アミノ酸５２７位にＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ、又はＴｈｒ；及び（ｅ）アミノ酸５３７位にＧｌｙを含むアミノ酸配列をもつ。他の態様では、本発明の翻訳系は配列番号４のアミノ酸配列をもつ（例えば野生型Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｔＲＮＡシンテターゼから誘導される）Ｏ−ＲＳを含むことができ、Ｏ−ＲＳは（ａ）アミノ酸３２位にＧｌｙ；（ｂ）アミノ酸６５位にＧｌｕ；（ｃ）アミノ酸１０８位にＡｌａ；（ｄ）アミノ酸１０９位にＧｌｕ；（ｅ）アミノ酸１５８位にＧｌｙ；及び（ｆ）アミノ酸１６２位にＨｉｓを含むアミノ酸配列をもつ。他の態様では、翻訳系は配列番号５〜１７、及びその保存変異体から選択されるアミノ酸配列を含むＯ−ＲＳをもつ。所定態様では、本発明の翻訳系は（例えば配列番号２０〜３２のヌクレオチド配列から選択される）Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含み、Ｏ−ＲＳは配列番号５〜１７、及びその保存変異体から選択されるアミノ酸配列を含む。本発明の翻訳系のＯ−ｔＲＮＡは配列番号１〜２に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされることができる。所定態様では、本発明の翻訳系は第１のＯ−ＲＳと第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含む核酸を含む。このような態様は更に、第２のＯ−ＲＳと第２のＯ−ｔＲＮＡを含むことができ、第２のＯ−ＲＳは第１のアミノ酸と異なる第２のアミノ酸で第２のＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡは第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンと異なるセレクターコドンを認識する。本発明は更にＯ−ｔＲＮＡ又はその修飾変異体がアンバーコドンの認識配列を含むか、及び／又はＴＡＧの認識配列を含むか、及び／又はアンバーコドンを含むターゲット核酸を含むか、及び／又はターゲット核酸によりコードされる蛋白質を含む翻訳系を含むことができる。所定態様では、翻訳系の蛋白質は光調節型アミノ酸（例えばアゾベンジル−Ｐｈｅ又はｏ−ニトロベンジルシステイン）を含む。本発明は更に本発明の翻訳系により生産された蛋白質（例えばα−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、アゾベンジル−Ｐｈｅ、又はＯ−メチルチロシン等の非天然アミノ酸）と、このような蛋白質を含む組成物も含む。
【０００９】
他の側面では、本発明はα−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、もしくはアゾベンジル−ＰｈｅでＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含むか、又はＯ−ＲＳが配列番号９〜１２の配列を含み、Ｏ−ｔＲＮＡをＯ−メチルチロシンで優先的にアミノアシル化する組成物を提供する。このような組成物において、Ｏ−ｔＲＮＡはロイシルＯ−ｔＲＮＡ又はチロシルＯ−ｔＲＮＡとすることができ、場合によりアンバーセレクターコドン（例えばＴＡＧ配列）を認識することができ、Ｏ−ＲＳは大腸菌又はＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉから誘導することができる。Ｏ−ＲＳは配列番号５〜１７のアミノ酸配列又はその保存変異体を含むことができるか、及び／又は配列番号５〜８及び１３〜１７のいずれか１種の効率の少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化することができる。所定態様では、本発明の組成物は細胞（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等の酵母細胞又は大腸菌等の真正細菌細胞）を含み、Ｏ−ＲＳは前記細胞で１種以上の核酸によりコードされ、核酸は配列番号２０〜３２又はその保存変異体から選択される。本発明の組成物は翻訳系を含むことができる。組成物が細胞を含む態様では、Ｏ−ＲＳは前記細胞で１種以上の核酸によりコードすることができ；前記細胞は更に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、α−アミノカプリル酸、Ｏ−メチルチロシン、ｏ−ニトロベンジルシステイン、又はアゾベンジル−Ｐｈｅの１種以上を含むことができ；Ｏ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、Ｏ−ＲＳはα−アミノカプリル酸、Ｏ−メチルチロシン、ｏ−ニトロベンジルシステイン、又はアゾベンジル−Ｐｈｅの１種でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。このような細胞は該当ポリペプチドをコードするターゲット核酸を含むことができ、ターゲット核酸はＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。
【００１０】
本発明は更に配列番号５〜１７のいずれかのアミノ酸、又はその保存変異体をコードする（例えば配列番号２０〜３２から選択される）核酸を提供する。
【００１１】
他の側面では、本発明はα−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、又はアゾベンジル−Ｐｈｅの１種以上を含む蛋白質と、前記蛋白質を含む組成物を提供する。
【００１２】
更に他の態様では、本発明はα−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、又はアゾベンジル−Ｐｈｅを直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）に負荷する活性直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の選択方法を含む。前記方法は、（Ｏ−ｔＲＮＡを含む細胞集団のメンバーに対して直交性の）Ｏ−ｔＲＮＡと；集団の１個以上の細胞においてα−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、又はアゾベンジル−ＰｈｅをＯ−ｔＲＮＡに負荷する１個以上の活性Ｏ−ＲＳメンバーを含む複数のＯ−ＲＳと；選択マーカーをコードするポリヌクレオチド（前記ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含む）と；α−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、又はアゾベンジル−Ｐｈｅを併有する細胞の集団に選択を実施し、複数のＲＳを含まず且つＯ−ｔＲＮＡを含む対照細胞の抑圧効率に比較して選択マーカーの抑圧効率の増加により、活性Ｏ−ＲＳを含むターゲット細胞を集団から同定する段階と；ターゲット細胞を選択することにより、活性Ｏ−ＲＳを選択する段階を含む。前記選択方法では、α−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、又はアゾベンジル−Ｐｈｅ以外のアミノ酸をＯ−ｔＲＮＡに負荷する非ターゲットＯ−ＲＳを含む細胞を排除するように細胞を更に選択することができる。更に、前記選択方法では、選択はポジティブ選択を含むことができ、選択マーカーはポジティブ選択マーカーを含む。各種態様において、Ｏ−ｔＲＮＡはロイシル−Ｏ−ｔＲＮＡ又はチロシル−Ｏ−ｔＲＮＡとすることができる。本発明は更に前記方法により同定された直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む。
【００１３】
他の側面では、本発明は蛋白質（例えば１種以上のα−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、アゾベンジル−Ｐｈｅ、光調節型セリン、光調節型セリンアナログ、フルオロフォア、スピン標識アミノ酸、又はダンシル側鎖を含むアミノ酸を１個以上の特定位置に含む蛋白質）を細胞で生産する方法を含む。前記方法は、（少なくとも１個のセレクターコドンを含み、蛋白質をコードする核酸と、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、α−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、アゾベンジル−Ｐｈｅ、光調節型セリン、光調節型セリンアナログ、フルオロフォア、スピン標識アミノ酸、又はダンシル側鎖を含むアミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む）細胞を適当な培地で増殖させる段階と；α−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、アゾベンジル−Ｐｈｅ、光調節型セリン、光調節型セリンアナログ、フルオロフォア、スピン標識アミノ酸、又はダンシル側鎖を含むアミノ酸を提供する段階と；セレクターコドンに応答してα−アミノカプリル酸、ｏ−ニトロベンジルシステイン、アゾベンジル−Ｐｈｅ、光調節型セリン、光調節型セリンアナログ、フルオロフォア、スピン標識アミノ酸、又はダンシル側鎖を含むアミノ酸を特定位置に組込むことにより、蛋白質を生産する段階を含む。前記方法において、Ｏ−ＲＳは配列番号５〜１７に対応するアミノ酸配列又はその保存変異体を含むことができる。
【００１４】
本発明は宿主細胞で機能する好ましい直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼポリペプチド（Ｏ−ＲＳ）をコードするポリヌクレオチドのスクリーニングに使用することができるポリヌクレオチドライブラリーを提供する。これらのライブラリーは配列番号４に記載のアミノ酸配列（野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ）の変異体をコードするポリヌクレオチドを含み、ライブラリーメンバーは配列番号４のＴｙｒ３２、Ｌｅｕ６５、Ｐｈｅ１０８、Ｇｌｎ１０９、Ａｓｐ１５８及びＬｅｕ１６２をコードするコドンのランダム化ヌクレオチド位置をもつ。あるいは、ライブラリーは配列番号４に記載のアミノ酸配列以外の古細菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（例えば野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼのオーソログ）の変異体をコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼのＴｙｒ３２、Ｌｅｕ６５、Ｐｈｅ１０８、Ｇｌｎ１０９、Ａｓｐ１５８及びＬｅｕ１６２に空間的に対応するコドンのランダム化ヌクレオチド位置をもつ。所定態様では、ライブラリーのポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングする。所定態様では、Ｏ−ＲＳは直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。ライブラリーから同定された任意Ｏ−ＲＳは更に例えばランダム化位置以外の位置に１個以上の保存アミノ酸置換をもつことができる。所定側面では、本発明のライブラリーは大腸菌宿主細胞に含まれる。所定態様では、古細菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼであり、更にＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼである。
【００１５】
本発明は更に該当非天然アミノ酸を組込む所望直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を同定する目的で上記ライブラリー等のライブラリーをスクリーニングする方法を提供する。所定態様では、これらの方法は（ｉ）野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼの変異体をコードし、Ｔｙｒ３２、Ｌｅｕ６５、Ｐｈｅ１０８、Ｇｌｎ１０９、Ａｓｐ１５８及びＬｅｕ１６２をコードするコドンのランダム化ヌクレオチド位置をもつポリヌクレオチドのライブラリーを提供する段階と；更に宿主細胞を提供する段階を含み、前記方法は宿主細胞において直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化するＲＳをコードするポリヌクレオチドを前記ライブラリーから検出することにより、所望Ｏ−ＲＳを同定する段階を含む。
【００１６】
所定態様では、好ましい変異体の選択は一般にポジティブ選択段階を含む（例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ蛋白質の発現とクロラムフェニコール含有培地での増殖）。所定態様では、ポジティブ選択をネガティブ選択段階（例えば毒性バルナーゼ蛋白質を発現する細胞の逆選択）と併用する。
【００１７】
別の側面では、本発明は更に宿主細胞で機能する好ましい直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）をコードするポリヌクレオチドのスクリーニングに使用することができる別のポリヌクレオチドライブラリーを提供する。このようなライブラリーは配列番号３に記載のアミノ酸配列（野生型大腸菌ロイシルｔＲＮＡシンテターゼ）の変異体をコードするポリヌクレオチドを含み、ライブラリーメンバーは配列番号３のＭｅｔ４０、Ｌｅｕ４１、Ｔｙｒ４９９、Ｔｙｒ５２７、及びＨｉｓ５３７をコードするコドンのランダム化ヌクレオチド位置をもつ。あるいは、ライブラリーは配列番号３に記載のアミノ酸配列以外の真正細菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（例えば野生型大腸菌ロイシルｔＲＮＡシンテターゼのオーソログ）の変異体をコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは野生型大腸菌ロイシルｔＲＮＡシンテターゼのＭｅｔ４０、Ｌｅｕ４１、Ｔｙｒ４９９、Ｔｙｒ５２７、及びＨｉｓ５３７に空間的に対応するコドンのランダム化ヌクレオチド位置をもつ。所定態様では、ライブラリーのポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングする。所定態様では、Ｏ−ＲＳは直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。ライブラリーから同定された任意Ｏ−ＲＳは更に例えばランダム化位置以外の位置に１個以上の保存アミノ酸置換をもつことができる。所定側面では、本発明のライブラリーはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等の真核宿主細胞に含まれる。所定態様では、真正細菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは大腸菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼであり、更に大腸菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは大腸菌ロイシルｔＲＮＡシンテターゼである。
【００１８】
本発明は更に該当非天然アミノ酸を組込む所望直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を同定する目的で上記ライブラリー等のライブラリーをスクリーニングする方法を提供する。所定態様では、これらの方法は（ｉ）野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼの変異体をコードし、Ｔｙｒ３２、Ｌｅｕ６５、Ｐｈｅ１０８、Ｇｌｎ１０９、Ａｓｐ１５８及びＬｅｕ１６２をコードするコドンのランダム化ヌクレオチド位置をもつポリヌクレオチドのライブラリー又は野生型大腸菌ロイシルｔＲＮＡシンテターゼの変異体をコードし、Ｍｅｔ４０、Ｌｅｕ４１、Ｔｙｒ４９９、Ｔｙｒ５２７、及びＨｉｓ５３７をコードするコドンのランダム化ヌクレオチド位置をもつポリヌクレオチドのライブラリーを提供する段階と；更に宿主細胞を提供する段階を含み、前記方法は宿主細胞において直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化するＲＳをコードするポリヌクレオチドを前記ライブラリーから検出することにより、所望Ｏ−ＲＳを同定する段階を含む。
【００１９】
所定態様では、好ましい変異体の選択は一般にポジティブ選択段階を含む（例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ蛋白質の発現とクロラムフェニコール含有培地での増殖又はｇａｌ４遺伝子産物の発現とウラシル不含培地もしくはアミノトリアゾール含有ヒスチジン不含培地での増殖）。所定態様では、ポジティブ選択をネガティブ選択段階（例えば毒性バルナーゼ蛋白質を発現する細胞の逆選択又はフルオロオロチン酸の存在下のｕｒａ３遺伝子産物の発現）と併用する。
【００２０】
本発明は更にアゾベンジル−Ｐｈｅ又はｏ−ニトロベンジルシステインに特異的なＯ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの対を介してアゾベンジル−Ｐｈｅ又はｏ−ニトロベンジルシステインを蛋白質に組込む段階と、アゾベンジル−Ｐｈｅ又はｏ−ニトロベンジルシステインを光調節する光エネルギーの波長に蛋白質を暴露することにより、アゾベンジル−Ｐｈｅ又はｏ−ニトロベンジルシステインを含む蛋白質の活性を調節する段階により、蛋白質の活性を調節する方法を提供する。本発明は更に蛋白質の活性の調節システムを提供する。前記システムはアゾベンジル−Ｐｈｅ又はｏ−ニトロベンジルシステインを組込んだ蛋白質と、蛋白質のアゾベンジル−Ｐｈｅ又はｏ−ニトロベンジルシステインを光調節することにより、蛋白質の活性を調節する光源を含む。
【００２１】
本発明の上記及び他の目的及び特徴は添付図面を参照して以下の詳細な説明から更に明瞭に理解されよう。
（定義）
【００２２】
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定生物系に限定されず、当然のことながら種々に適用できると理解すべきである。同様に、本明細書で使用する用語は特定態様のみの説明を目的とし、限定的でないことも理解すべきである。本明細書と特許請求の範囲で使用する単数形はそうでないことが内容から明白である場合を除き、複数形も含む。従って、例えば「細胞」と言う場合には２個以上の細胞の組合せを含み、「細菌」と言う場合には細菌混合物を含み、他の用語についても同様である。
【００２３】
直交：本明細書で使用する「直交」なる用語は細胞又は他の翻訳系に内在する対応分子に比較して低効率で細胞の内在成分と共働するか、あるいは細胞の内在成分と共働できない分子（例えば直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及び／又は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ））を意味する。ｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼに関して直交とは、内在ｔＲＮＡが内在ｔＲＮＡシンテターゼと共働する能力に比較して直交ｔＲＮＡが内在ｔＲＮＡシンテターゼと共働できないか又は低効率（例えば２０％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満の効率）でしか共働できず、あるいは、内在ｔＲＮＡシンテターゼが内在ｔＲＮＡと共働する能力に比較して直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが内在ｔＲＮＡと共働できないか又は低効率でしか共働できないことを意味する。直交分子は細胞内に機能的に正常な相補的内在分子をもたない。例えば、細胞中の直交ｔＲＮＡがこの細胞の任意内在ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される効率は内在ｔＲＮＡが内在ＲＳによりアミノアシル化される効率に比較して低いか又は検出不能か又はゼロである。別の例では、直交ＲＳが該当細胞中の任意内在ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率は内在ｔＲＮＡが内在ＲＳによりアミノアシル化される効率に比較して低いか又は検出不能か又はゼロである。第１の直交分子と共働する第２の直交分子を細胞に導入することができる。例えば、直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対は対照（例えば対応するｔＲＮＡ／ＲＳ内在対、又は活性直交対（例えばロイシル直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対））の効率に比較して所定の効率（例えば４５％の効率、５０％の効率、６０％の効率、７０％の効率、７５％の効率、８０％の効率、９０％の効率、９５％の効率、又は９９％以上の効率）で細胞において共働する導入相補成分を含む。
【００２４】
直交ロイシルｔＲＮＡ：本明細書で使用する直交ロイシルｔＲＮＡ（ロイシル−Ｏ−ｔＲＮＡ）とは該当翻訳系に直交性のｔＲＮＡであり、ｔＲＮＡは（１）天然に存在するロイシルｔＲＮＡと同一であるか又は実質的に類似しているか、（２）自然又は人工突然変異誘発により天然に存在するロイシルｔＲＮＡから誘導されるか、（３）（１）又は（２）の野生型又は突然変異体ロイシルｔＲＮＡ配列の配列を考慮する任意プロセスにより誘導されるか、（４）野生型又は突然変異体ロイシルｔＲＮＡと相同であるか；（５）表２又は３にロイシルｔＲＮＡシンテターゼの基質として指定する任意特定ｔＲＮＡと相同であるか、あるいは（６）表２又は３にロイシルｔＲＮＡシンテターゼの基質として指定する任意特定ｔＲＮＡの保存変異体である。ロイシルｔＲＮＡはアミノ酸を負荷した状態でも負荷しない状態でも存在することができる。更に当然のことながら、「ロイシル−Ｏ−ｔＲＮＡ」は場合によりコグネイトシンテターゼによりロイシン以外のアミノ酸（例えばＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステイン等の光調節型アミノ酸）を負荷（アミノアシル化）される。実際に、当然のことながら、本発明のロイシル−Ｏ−ｔＲＮＡは翻訳中にセレクターコドンに応答して成長中のポリペプチドに天然又は人工のいずれかに拘わらずほぼ任意アミノ酸（例えばＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステイン等の光調節型アミノ酸）を挿入するために有利に使用される。
【００２５】
直交チロシルｔＲＮＡ：本明細書で使用する直交チロシルｔＲＮＡ（チロシル−Ｏ−ｔＲＮＡ）とは該当翻訳系に直交性のｔＲＮＡであり、ｔＲＮＡは（１）天然に存在するチロシルｔＲＮＡと同一であるか又は実質的に類似しているか、（２）自然又は人工突然変異誘発により天然に存在するチロシルｔＲＮＡから誘導されるか、（３）（１）又は（２）の野生型又は突然変異体チロシルｔＲＮＡ配列の配列を考慮する任意プロセスにより誘導されるか、（４）野生型又は突然変異体チロシルｔＲＮＡと相同であるか；（５）下記実施例又は配列表にチロシルｔＲＮＡシンテターゼの基質として指定する任意特定ｔＲＮＡ（例えばアゾベンジル−Ｐｈｅ）と相同であるか、あるいは（６）下記実施例又は配列表にチロシルｔＲＮＡシンテターゼの基質として指定する任意特定ｔＲＮＡの保存変異体である。チロシルｔＲＮＡはアミノ酸を負荷した状態でも負荷しない状態でも存在することができる。更に当然のことながら、「チロシル−Ｏ−ｔＲＮＡ」は場合によりコグネイトシンテターゼによりチロシン以外のアミノ酸（例えばアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸）を負荷（アミノアシル化）される。実際に、当然のことながら、本発明のチロシル−Ｏ−ｔＲＮＡは翻訳中にセレクターコドンに応答して成長中のポリペプチドに天然又は人工のいずれかに拘わらずほぼ任意アミノ酸（例えばアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸）を挿入するために有利に使用される。
【００２６】
直交ロイシルアミノ酸シンテターゼ：本明細書で使用する直交ロイシルアミノ酸シンテターゼ（ロイシル−Ｏ−ＲＳ）とは該当翻訳系においてロイシル−Ｏ−ｔＲＮＡをアミノ酸で優先的にアミノアシル化する酵素である。ロイシル−Ｏ−ＲＳがロイシル−Ｏ−ｔＲＮＡに負荷するアミノ酸は天然又は人工のいずれかを問わずに任意アミノ酸とすることができ、本明細書では限定しない。所定態様では、アミノ酸はＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又は光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステイン）である。シンテターゼは場合により天然に存在するロイシルアミノ酸シンテターゼと同一又は相同であるか、あるいは表２又は３又は下記実施例及び配列表にロイシル−Ｏ−ＲＳとして指定するシンテターゼと同一又は相同である。例えば、ロイシル−Ｏ−ＲＳは表２もしくは３又は下記実施例もしくは配列表のロイシル−Ｏ−ＲＳの保存変異体とすることができ、及び／又は表２もしくは３又は下記実施例もしくは配列表のロイシル−Ｏ−ＲＳと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又はそれ以上配列が一致することができる。
【００２７】
直交チロシルアミノ酸シンテターゼ：本明細書で使用する直交チロシルアミノ酸シンテターゼ（チロシル−Ｏ−ＲＳ）とは該当翻訳系においてチロシル−Ｏ−ｔＲＮＡをアミノ酸で優先的にアミノアシル化する酵素である。チロシル−Ｏ−ＲＳがチロシル−Ｏ−ｔＲＮＡに負荷するアミノ酸は天然又は人工のいずれかを問わずに任意アミノ酸とすることができ、本明細書では限定しない。所定態様では、アミノ酸はアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸である。シンテターゼは場合により天然に存在するチロシルアミノ酸シンテターゼと同一又は相同であるか、あるいは下記実施例又は配列表にチロシル−Ｏ−ＲＳとして指定するシンテターゼと同一又は相同である。例えば、チロシル−Ｏ−ＲＳは下記実施例又は配列表のチロシル−Ｏ−ＲＳの保存変異体とすることができ、及び／又は下記実施例又は配列表のチロシル−Ｏ−ＲＳと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又はそれ以上配列が一致することができる。
【００２８】
コグネイト：「コグネイト」なる用語は共働する成分、例えば直交ｔＲＮＡと直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを意味する。これらの成分は「相補的」であると言うこともできる。
【００２９】
優先的にアミノアシル化する：本明細書で直交翻訳系に関して使用する場合に、Ｏ−ＲＳはＯ−ＲＳが発現系で任意内在ｔＲＮＡに負荷するよりも効率的にＯ−ｔＲＮＡにアミノ酸を負荷するときにコグネイトＯ−ｔＲＮＡを「優先的にアミノアシル化する」。即ち、Ｏ−ｔＲＮＡと所与の任意内在ｔＲＮＡがほぼ等モル比で翻訳系に存在するとき、Ｏ−ＲＳは内在ｔＲＮＡに負荷するよりも高頻度でＯ−ｔＲＮＡに負荷する。Ｏ−ＲＳにより負荷されるＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳにより負荷される内在ｔＲＮＡの相対比は高いことが好ましく、従って、Ｏ−ｔＲＮＡと内在ｔＲＮＡが等モル濃度で翻訳系に存在する場合にはＯ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的、又はほぼ排他的に負荷することが好ましい。Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳが等モル濃度で存在する場合にＯ−ＲＳにより負荷されるＯ−ｔＲＮＡと内在ｔＲＮＡの相対比は１：１を上回り、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、更に好ましくは１０：１、更に好ましくは２０：１、更に好ましくは５０：１、更に好ましくは７５：１、更に好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１又はそれ以上である。
【００３０】
本明細書で使用する「空間的に対応するアミノ酸位置」なる用語及び同様の表現は２個の直交蛋白質のアミノ酸位置が機能的には同一であるが、一次蛋白質構造の同一位置に存在しないことを意味する（即ち、２個の直交蛋白質は同一アミノ酸配列をもたない）。
【００３１】
セレクターコドン：「セレクターコドン」なる用語は翻訳プロセスでＯ−ｔＲＮＡにより認識され、一般に内在ｔＲＮＡにより認識されないコドンを意味する。Ｏ−ｔＲＮＡアンチコドンループは例えばｍＲＮＡ上でセレクターコドンを認識し、翻訳中のポリペプチドのこの部位にそのアミノ酸（例えば非天然アミノ酸、例えばＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸）を挿入する。例えば、本発明の１態様では、Ｏ−ｔＲＮＡはアンバーコドン等のセレクターコドンを認識し、翻訳プロセスにより生産中のポリペプチドに非天然アミノ酸（例えばＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸）を付加する。セレクターコドンとしては例えばナンセンスコドン（例えばアンバー、オーカー及びオパールコドン等の終止コドン）、４塩基以上のコドン、レアコドン、天然又は非天然塩基対から誘導されるコドン及び／又は同等物を挙げることができる。
【００３２】
サプレッサーｔＲＮＡ：サプレッサーｔＲＮＡは例えばセレクターコドンに応答してポリペプチド鎖にアミノ酸を組込むためのメカニズムを提供することにより、所与翻訳系でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の読取りを変更するｔＲＮＡである。例えば、サプレッサーｔＲＮＡは例えば終止コドン（例えばアンバー、オーカー又はオパールコドン）、４塩基コドン、レアコドン等を読み飛ばすことができる。
【００３３】
抑圧活性：本明細書で使用する「抑圧活性」なる用語は一般に、読み飛ばさないと翻訳終結又は誤訳（例えばフレームシフト）をもたらすコドン（例えばアンバーコドン等の終止コドンや、４塩基以上のコドン等のセレクターコドン）の翻訳読み飛ばしを行うｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の能力を意味する。サプレッサーｔＲＮＡの抑圧活性は第２のサプレッサーｔＲＮＡ又は対照系（例えばＯ−ＲＳをもたない対照系）に比較して観察される翻訳読み飛ばし活性の百分率として表すことができる。
【００３４】
本発明は抑圧活性を定量することが可能な種々の手段を提供する。該当セレクターコドン（例えばアンバーコドン）に対する特定Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの抑圧百分率とは、Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ及びセレクターコドンをもたないポジティブ対照構築物に比較して、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡを含む該当翻訳系で発現され、そのコーディング核酸中にセレクターコドンを含む所与試験マーカー（例えばＬａｃＺ）の活性百分率を意味する。従って、例えば、セレクターコドンをもたない活性ポジティブ対照マーカー構築物が所与翻訳系において該当マーカーアッセイに関連する単位で表した観測活性「Ｘ」をもつ場合には、セレクターコドンを含む試験構築物の抑圧百分率は、Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳを更に含む翻訳系で発現される以外はポジティブ対照マーカーが発現される条件とほぼ同一の環境条件下で試験マーカー構築物が示す「Ｘ」の百分率である。一般に、試験マーカーを発現する翻訳系は更にＯ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡにより認識されるアミノ酸を含む。場合により、抑圧百分率測定値は、Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ及び／又はＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳにより認識される該当アミノ酸を含まない系で試験マーカーと同一のセレクターコドンを含む「バックグラウンド」又は「ネガティブ」対照マーカー構築物に試験マーカーを比較することにより精確にすることができる。このネガティブ対照は該当翻訳系におけるマーカーからのバックグラウンドシグナル効果を考慮するように抑圧百分率測定値を正規化するのに有用である。
【００３５】
抑圧効率は当分野で公知の多数のアッセイの任意のものにより測定することができる。例えば、β−ガラクトシダーゼレポーターアッセイを使用することができ、例えば本発明のＯ−ｔＲＮＡを含むプラスミドと共に修飾ｌａｃＺプラスミド（構築物はｌａｃＺ核酸配列中にセレクターコドンをもつ）を適当な生物（例えば直交成分を使用することができる生物）に由来する細胞に導入する。コグネイトシンテターゼも（ポリペプチド又は発現されるとコグネイトシンテターゼをコードするポリヌクレオチドとして）導入することができる。細胞を培地で所望密度（例えばＯＤ６００＝約０．５）まで増殖させ、例えばＢｅｔａＦｌｕｏｒ（登録商標）β−ガラクトシダーゼアッセイキット（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用してβ−ガラクトシダーゼアッセイを実施する。比較可能な対照（例えば所望位置にセレクターコドンではなく対応するセンスコドンをもつ修飾ｌａｃＺ構築物から観察される値）に対するサンプルの活性百分率として抑圧百分率を計算することができる。
【００３６】
翻訳系：「翻訳系」なる用語は成長中のポリペプチド鎖（蛋白質）にアミノ酸を組込む成分を意味する。翻訳系の成分としては例えばリボソーム、ｔＲＮＡ、シンテターゼ、ｍＲＮＡ等を挙げることができる。本発明のＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳは例えば原核（非真核）細胞（例えば細菌（例えば大腸菌））、又は真核細胞（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等の酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、昆虫細胞、及び／又は同等物）でｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳系に付加するか又はその一部とすることができる。
【００３７】
非天然アミノ酸：本明細書で使用する「非天然アミノ酸」なる用語は２０種の標準天然アミノ酸の１種又は微量天然アミノ酸セレノシステインもしくはピロリジン以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸、及び／又はアミノ酸類似体（例えばＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸）を意味する。
【００３８】
から誘導：本明細書で使用する「から誘導」なる用語は特定分子もしくは生物から単離されているか、あるいは特定分子もしくは生物を使用するか又は特定分子もしくは生物からの情報を使用して作製された成分を意味する。例えば、第２のポリペプチドから誘導されるポリペプチドは第２のポリペプチドのアミノ酸配列と同一又は実質的に同様のアミノ酸配列を含む。ポリペプチドの場合には、誘導種は例えば自然突然変異誘発、人工的特異的突然変異誘発又は人工的ランダム突然変異誘発により得ることができる。ポリペプチドを誘導するために使用される突然変異誘発は意図的に特異的でも意図的にランダムでもよい。第１のポリペプチドから誘導される別のポリペプチドを作製するためのポリペプチドの突然変異誘発は（例えばポリメラーゼの非忠実に起因する）ランダムなイベントとすることができ、誘導されたポリペプチドの同定は偶然とすることができる。ポリペプチドの突然変異誘発は一般にポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの操作を伴う。
【００３９】
ポジティブ選択又はスクリーニングマーカー：本明細書で使用する「ポジティブ選択又はスクリーニングマーカー」なる用語は、このマーカーが存在する（例えば発現、活性化等される）と、このマーカーに対応する形質をもたない細胞から前記形質を含む細胞（例えばポジティブ選択マーカーをもつ細胞）を識別することができるマーカーを意味する。
【００４０】
ネガティブ選択又はスクリーニングマーカー：本明細書で使用する「ネガティブ選択又はスクリーニングマーカー」なる用語は、このマーカーが存在する（例えば発現、活性化等される）と、（例えば選択性質又は形質をもつ細胞に対して）前記性質又は形質をもたない細胞を識別することができるマーカーを意味する。
【００４１】
レポーター：本明細書で使用する「レポーター」なる用語は該当系のターゲット成分を同定及び／又は選択するために使用することができる成分を意味する。例えば、レポーターとしては蛋白質、例えば抗生物質耐性又は感受性を付与する酵素（例えばβ−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）等）、蛍光スクリーニングマーカー（例えば緑色蛍光蛋白質、ＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ等）、発光マーカー（例えばホタルルシフェラーゼ蛋白質）、アフィニティースクリーニングマーカー、又はポジティブもしくはネガティブ選択マーカー遺伝子（例えばｌａｃＺ、β−ｇａｌ／ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）、Ａｄｈ（アルコールデヒドロゲナーゼ）、ｈｉｓ３、ｕｒａ３、ｌｅｕ２、ｌｙｓ２等）を挙げることができる。
【００４２】
真核生物：本明細書で使用する「真核生物」なる用語は系統発生学的ドメイン又は上界の真核生物に属する生物を意味する。真核生物はその構成が一般に多細胞であり（但し、酵母のように一般に多細胞ではない真核生物もある）、膜結合核と他の膜結合オルガネラが存在し、遺伝物質が線状であり（即ち染色体が線状）、オペロンが存在せず、イントロン、メッセージキャッピング及びポリＡ  ｍＲＮＡが存在し、更に他の生化学的特徴（例えば特徴的リボソーム構造）により一般に原核細胞から区別できる。真核生物としては例えば動物（例えば哺乳動物、昆虫、爬虫類、鳥類等）、繊毛虫、植物（例えば単子葉植物、双子葉植物、藻類等）、真菌類、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物等が挙げられる。
【００４３】
原核生物：本明細書で使用する「原核生物」なる用語は例えばドメイン又は上界の真正細菌及び古細菌に属する非真核生物を意味し、モネラとも言う。原核生物はその構成が一般に単細胞であり、出芽又は分裂による無性生殖であり、膜結合核又は他の膜結合オルガネラをもたず、染色体が環状であり、オペロンが存在し、イントロン、メッセージキャッピング及びポリＡ  ｍＲＮＡが存在せず、更に他の生化学的特徴（例えば特徴的リボソーム構造）により一般に真核細胞から区別できる。原核生物は真正細菌と古細菌の両者を含む。シアノバクテリア（藍藻類）とマイコブラズマもこの分類に含むことができる。
【００４４】
細菌及び古細菌：本明細書で使用する「細菌」及び「真正細菌」なる用語は「古細菌」から区別できる原核生物を意味する。同様に、古細菌は真核生物から区別できる原核生物を意味する。真正細菌と古細菌は多数の形態学的及び生化学的基準により区別できる。例えば、リボソームＲＮＡ配列、ＲＮＡポリメラーゼ構造、イントロンの有無、抗生物質感受性、細胞壁ペプチドグリカン及び他の細胞壁成分の有無、膜脂質構造の分岐の有無、並びにヒストン及びヒストン様蛋白質の有無を使用して真正細菌と古細菌を区別する。
【００４５】
真正細菌の例としては、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓが挙げられる。古細菌の例としては、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｍｊ）、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ（Ｍｍ）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔ）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ（Ａｆ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（Ｐｈ）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ（Ａｐ）、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、及びＴｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍが挙げられる。
【００４６】
保存変異体：翻訳成分に関して本明細書で使用する「保存変異体」なる用語は翻訳成分を意味し、例えば類似する基本成分（例えばＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳ）と同様に機能するが、参照Ｏ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳに比較して配列に変異をもつ保存変異体Ｏ−ｔＲＮＡ又は保存変異体Ｏ−ＲＳが挙げられる。例えば、Ｏ−ＲＳは相補的Ｏ−ｔＲＮＡ又は保存変異体Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸（例えばＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸）でアミノアシル化するが、Ｏ−ｔＲＮＡと保存変異体Ｏ−ｔＲＮＡは同一配列をもたない。保存変異体は保存変異体が対応するＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳに相補的である限り、例えば配列の１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、又は５カ所以上に変異をもつことができる。
【００４７】
選択又はスクリーニング物質：本明細書で使用する「選択又はスクリーニング物質」なる用語はこのような物質が存在すると、集団から所定成分を選択／スクリーニングすることができる物質を意味する。例えば、選択又はスクリーニング物質としては限定されないが、栄養素、抗生物質、光波長、抗体、発現されたポリヌクレオチド等が挙げられる。選択物質は例えば濃度、強度等を変動させることができる。
【００４８】
〜に応答して：本明細書で使用する「〜に応答して」なる用語は本発明のｔＲＮＡがセレクターコドンを認識し、ｔＲＮＡと結合した該当アミノ酸（例えば非天然アミノ酸、例えばＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸）を成長中のポリペプチド鎖に組込むのを媒介するプロセスを意味する。
【００４９】
コードする：本明細書で使用する「コードする」なる用語は第１の分子又は配列鎖とは異なる第２の分子又は配列鎖の生産を導くためにポリマー巨大分子又は配列鎖中の情報を使用する任意プロセスを意味する。本明細書ではこの用語を広義に使用し、種々に適用することができる。１側面では、「コードする」なる用語は新規に合成された相補的姉妹鎖をＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりコードするための鋳型として２本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖を使用する半保存的ＤＮＡ複製プロセスを意味する。
【００５０】
別の側面では、「コードする」なる用語は第１の分子とは異なる化学的性質をもつ第２の分子の生産を導くためにある分子中の情報を使用する任意プロセスを意味する。例えば、ＤＮＡ分子は（例えばＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素を含む転写プロセスにより）ＲＮＡ分子をコードすることができる。また、ＲＮＡ分子は翻訳プロセスと同様にポリペプチドをコードすることができる。翻訳プロセスについて使用する場合には、「コードする」なる用語はアミノ酸をコードする三重項コドンにも適用する。所定側面では、ＲＮＡ分子は例えばＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含む逆転写プロセスによりＤＮＡ分子をコードすることができる。別の側面では、ＤＮＡ分子はポリペプチドをコードすることができ、この場合に使用する「コードする」とは当然のことながら転写プロセスと翻訳プロセスの両者を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
付加合成アミノ酸（例えばＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸）を遺伝コードにｉｎ  ｖｉｖｏ付加するためには、翻訳機構で効率的に機能することができるが、対が翻訳系に内在性のシンテターゼ及びｔＲＮＡから独立して機能するという意味で該当翻訳系に対して「直交性」のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼとｔＲＮＡの新規直交対が必要である。このような直交対の所望特徴としては、内在ｔＲＮＡによりデコードされない特定新規コドン（例えばセレクターコドン）のみをデコード又は認識するｔＲＮＡと、そのコグネイトｔＲＮＡを特定非天然アミノ酸（例えばＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸）のみで優先的にアミノアシル化（又は負荷）するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが挙げられる。Ｏ−ｔＲＮＡは内在シンテターゼによりアミノアシル化されないことも望ましい。例えば大腸菌では、直交対は例えば大腸菌に存在する４０種の内在ｔＲＮＡのいずれをも実質的にアミノアシル化しないアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと、例えば大腸菌に存在する２１種の内在シンテターゼのいずれによっても実質的にアミノアシル化されない直交ｔＲＮＡを含む。
【００５２】
本発明は、３塩基セレクターコドンＴＡＧに応答して酵母で光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステイン）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、及びα−アミノカプリル酸をカスパーゼ３等の蛋白質に効率的且つ選択的に組込む大腸菌ｔＲＮＡＬｅｕ配列から誘導される新規直交シンテターゼ／ｔＲＮＡ対の作製を含む。本発明は更に３塩基セレクターコドンＴＡＧに応答して大腸菌で光調節型アミノ酸アゾベンジル−ＰｈｅをＣＡＰ等の蛋白質に効率的且つ選択的に組込むＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｔＲＮＡＴｙｒ配列から誘導される新規直交シンテターゼ／ｔＲＮＡ対の作製を含む。
【００５３】
非天然アミノ酸をｉｎ  ｖｉｖｏコードするためには、特定コドンを固有に認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）とこのＯ−ｔＲＮＡのみを該当非天然アミノ酸で固有にアミノアシル化する対応するシンテターゼを作製する必要がある。
【００５４】
本発明は非天然アミノ酸（例えばＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸）を組込むために使用することができる付加直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対（例えばＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対）のライブラリー、組成物並びにその同定及び作製方法を提供する。本発明のＯ−ｔＲＮＡの１例はＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質へのＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又は光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）の例えばｉｎ  ｖｉｖｏでの組込みを媒介することができる。Ｏ−ｔＲＮＡのアンチコドンループはｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、そのアミノ酸（例えばＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸）をポリペプチドのこの部位に組込む。本発明の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼはそのＯ−ｔＲＮＡを特定非天然アミノ酸のみで優先的にアミノアシル化（又は負荷）する。
直交ｔＲＮＡ／直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼとその対
【００５５】
直交対はＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ、フレームシフトｔＲＮＡ等）とＯ−ＲＳから構成される。Ｏ−ｔＲＮＡは内在シンテターゼによりアシル化されず、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質への非天然アミノ酸（例えばＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸）のｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ組込みを媒介することができる。Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを認識し、例えば真核細胞、原核細胞、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ等においてＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。直交対の作製方法と前記方法により作製された直交対及び使用される直交対の組成物も本発明に含まれる。複数の直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対が開発されると、異なるコドンを使用して複数の非天然アミノ酸の同時組込みが可能になる。国際公開第ＷＯ２００２／０８６０７５号、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ｔＲＮＡ−ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ）」、ＷＯ２００２／０８５９２３号、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」、及びＷＯ２００４／０９４５９３号、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」は本発明と併用可能又は本発明により使用可能な翻訳系を記載している。更に、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１７８６号（出願日２００４年４月１６日）及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２２１８７号（出願日２００４年７月７日）参照。これらの各出願はその開示内容全体を参考資料として本明細書に組込む。翻訳系は一般に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、非天然アミノ酸を含む細胞を含む（例えば大腸菌等の非真核細胞又は酵母（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の真核細胞とすることができる）。本発明では、これらの系は非天然アミノ酸（例えばＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸）の組込みに適している。Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡをＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸でアミノアシル化する。本発明の直交対はＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ、フレームシフトｔＲＮＡ等）とＯ−ＲＳを含む。本発明は個々の成分も提供する。
【００５６】
一般に、直交対がセレクターコドンを認識し、セレクターコドンに応答してアミノ酸を負荷するとき、直交対はセレクターコドンを「抑圧」すると言う。即ち、翻訳系の（例えば細胞の）内在機構により認識されないセレクターコドンは通常翻訳されないので、非抑圧下で核酸から翻訳されるポリペプチドの生産を阻止することができる。本発明のＯ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、本明細書（例えば配列表）に記載するポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡに比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の抑圧効率を含む。Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを該当非天然アミノ酸（例えばＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸）でアミノアシル化する。細胞は例えば該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を介して成長中のポリペプチド鎖に非天然アミノ酸を組込むためにＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を使用し、ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。所定の望ましい側面では、細胞は付加Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含むことができ、付加Ｏ−ｔＲＮＡは付加Ｏ−ＲＳにより別の非天然アミノ酸を負荷される。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡの一方は４塩基コドンを認識することができ、他方は終止コドンを認識することができる。あるいは、複数の異なる終止コドン又は複数の異なる４塩基コドンが各セレクターコドンを特異的に認識することができる。
【００５７】
所定態様では、本発明は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、非天然アミノ酸（例えばＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸）と、該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む細胞（例えば大腸菌細胞又はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞）を含み、ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。翻訳系は無細胞系でもよく、例えば各種市販「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」転写／翻訳系の任意のものを本明細書に記載するようなＯ−ｔＲＮＡ／ＯＲＳ対及び非天然アミノ酸と併用することができる。
【００５８】
１態様では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率はＯ−ＲＳの不在下のＯ−ｔＲＮＡの抑圧効率の例えば約５倍、１０倍、１５倍、２０倍、又は２５倍以上である。１側面では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率は本明細書（例えば配列表又は実施例）に記載するような直交シンテターゼ対の抑圧効率の少なくとも例えば約３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上である。
【００５９】
上述のように、本発明は場合により細胞又は他の翻訳系に複数のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含み、２種以上の非天然アミノ酸（例えばＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸と別の非天然アミノ酸）を組込むことができる。例えば、細胞は更に別の付加Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対と第２の非天然アミノ酸を含むことができ、この付加Ｏ−ｔＲＮＡは第２のセレクターコドンを認識し、この付加Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対（Ｏ−ｔＲＮＡは例えばアンバーセレクターコドンを認識する）を含む細胞は更に第２の直交対（例えばロイシル、リシル、グルタミル等）を含むことができる（第２のＯ−ｔＲＮＡは別のセレクターコドン、例えばオパール、４塩基コドン等を認識する）。各直交対は異なるセレクターコドンの認識を助長できるように異なる起源に由来することが望ましい。
【００６０】
Ｏ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳは天然に存在するものでもよいし、例えば種々の生物の任意のものに由来するｔＲＮＡのライブラリー及び／又はＲＳのライブラリーを作製するか及び／又は種々の利用可能な突然変異ストラテジーの任意のものを使用することにより、天然に存在するｔＲＮＡ及び／又はＲＳの突然変異により誘導してもよい。例えば、直交ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製する１ストラテジーは例えば宿主細胞以外の起源又は多重起源に由来する（宿主に対して）異種のｔＲＮＡ／シンテターゼ対を宿主細胞に導入する方法である。異種シンテターゼ候補の特性としては、例えば宿主細胞ｔＲＮＡに負荷しないことが挙げられ、異種ｔＲＮＡ候補の特性としては、例えば宿主細胞シンテターゼによりアミノアシル化されないことが挙げられる。更に、異種ｔＲＮＡは全宿主細胞シンテターゼに対して直交性である。
【００６１】
直交対を作製するための第２のストラテジーはＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳをスクリーニング及び／又は選択するための突然変異体ライブラリーを作製する方法である。下記実施例参照。これらのストラテジーを組み合わせてもよい。
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）
【００６２】
本発明の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）はＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドン（例えばアンバーコドン）を含むポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質への非天然アミノ酸（例えばＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸）の例えばｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組込みを媒介することが望ましい。所定態様では、本発明のＯ−ｔＲＮＡは本明細書（例えば配列表及び実施例）に記載する配列のＯ−ｔＲＮＡ配列に記載するポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡに比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の抑圧効率を含む。
【００６３】
抑圧効率は当分野で公知の多数のアッセイの任意のものにより測定することができる。例えば、β−ガラクトシダーゼレポーターアッセイを使用することができ、例えば本発明のＯ−ｔＲＮＡを含むプラスミドと共に修飾ｌａｃＺプラスミド（構築物はｌａｃＺ核酸配列中にセレクターコドンをもつ）を適当な生物（例えば直交成分を使用することができる生物）に由来する細胞に導入する。コグネイトシンテターゼも（ポリペプチド又は発現されるとコグネイトシンテターゼをコードするポリヌクレオチドとして）導入することができる。細胞を培地で所望密度（例えばＯＤ６００＝約０．５）まで増殖させ、例えばＢｅｔａＦｌｕｏｒ（登録商標）β−ガラクトシダーゼアッセイキット（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用してβ−ガラクトシダーゼアッセイを実施する。比較可能な対照（例えば所望位置にセレクターコドンではなく対応するセンスコドンをもつ修飾ｌａｃＺ構築物から観察される値）に対するサンプルの活性百分率として抑圧百分率を計算することができる。
【００６４】
本発明のＯ−ｔＲＮＡの例を本明細書（例えば配列表）に記載する。代表的Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ分子の配列については本明細書の表、実施例及び図面も参照されたい。更に、本明細書の「核酸及びポリペプチド配列と変異体」のセクションも参照。Ｏ−ＲＳ  ｍＲＮＡ又はＯ−ｔＲＮＡ分子等のＲＮＡ分子では、所与配列又はその相補配列に対してチミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）で置換されている（コーディングＤＮＡでは逆）。塩基に付加修飾を加えてもよい。
【００６５】
本発明は本明細書に記載する特定Ｏ−ｔＲＮＡに対応するＯ−ｔＲＮＡの保存変異体も含む。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡの保存変異体としては、例えば本明細書の配列表及び実施例に記載するような特定Ｏ−ｔＲＮＡと同様に機能し、適当な自己相補性によりｔＲＮＡ  Ｌ形構造を維持するが、例えば本明細書の配列表、図面又は実施例に記載する配列と同一配列をもたない分子が挙げられる（更に野生型ｔＲＮＡ分子以外のものであることが望ましい）。本明細書の「核酸及びポリペプチド配列と変異体」のセクションも参照。
【００６６】
Ｏ−ｔＲＮＡを含む組成物は更に直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含むことができ、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸（例えばＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸）で優先的にアミノアシル化する。所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡを含む組成物は更に（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ）翻訳系を含むことができる。該当ポリペプチドをコードし、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを含む核酸、又はこれらの１種以上の組み合わせも細胞に加えることができる。本明細書の「直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ」のセクションも参照。
【００６７】
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）の作製方法も本発明の特徴である。本方法により作製されたＯ−ｔＲＮＡも本発明の特徴である。本発明の所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは突然変異体ライブラリーを作製することにより作製することができる。突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーは当分野で公知の種々の突然変異誘発技術を使用して作製することができる。例えば、突然変異体ｔＲＮＡは部位特異的突然変異、ランダム点突然変異、相同組換え、ＤＮＡシャフリング又は他の帰納的突然変異誘発法、キメラ構築又はその任意組み合わせにより作製することができる。
【００６８】
ｔＲＮＡの所望ループ又は領域（例えばアンチコドンループ、受容体ステム、Ｄアーム又はループ、可変ループ、ＴＰＣアーム又はループ、ｔＲＮＡ分子の他の領域又はその組合せ）の特定位置（例えば非保存位置又は保存位置）、ランダム位置又は両者の組合せに付加突然変異を導入することができる。一般に、ｔＲＮＡの突然変異としてはセレクターコドンの認識を可能にするように突然変異体ｔＲＮＡライブラリーの各メンバーのアンチコドンループを突然変異させる方法が挙げられる。この方法は更にＯ−ｔＲＮＡの末端に付加配列（ＣＣＡ）を付加する段階を含むことができる。一般に、Ｏ−ｔＲＮＡは所望ＲＳに対するその親和性等を維持しながら、出発材料（例えば複数のｔＲＮＡ配列）に比較して所望生物に対する直交性が改善されている。
【００６９】
前記方法は場合によりｔＲＮＡ及び／又はアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの配列の類似性（及び／又は推定相同性）を分析し、特定生物について直交性であると思われるＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ及び／又はその対の潜在候補を決定する段階を含む。分析には、当分野で公知であり、本明細書に記載するコンピュータープログラム（例えばＢＬＡＳＴ及びｐｉｌｅｕｐプログラム）を使用することができる。１例では、原核生物である大腸菌で使用するための潜在直交性翻訳成分を選択するためには、原核生物に密接な配列類似性を示さないシンテターゼ及び／又はｔＲＮＡを選択する。当然のことながら、他の状況では下記例に関する同様の例として、例えば原核生物（例えば大腸菌）と真核生物（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は原核生物（例えば大腸菌）と古細菌（例えばＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）が挙げられる。
【００７０】
一般に、Ｏ−ｔＲＮＡは複数の潜在的Ｏ−ｔＲＮＡのメンバーを含む第１の種の細胞の集団に例えばネガティブ選択を実施することにより得られる。ネガティブ選択は細胞に内在性のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される潜在的Ｏ−ｔＲＮＡライブラリーのメンバーを含む細胞を排除する。こうして、第１の種の細胞に直交性のｔＲＮＡプールが得られる。
【００７１】
所定態様において、ネガティブ選択では、ネガティブ選択マーカー（例えば抗生物質耐性を付与する酵素（例えばβ−ラクタマーゼ）、検出可能な産物を付与する酵素（例えばβ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））、例えば毒性物質（例えばバルナーゼ））をコードするポリヌクレオチドの非必須位置（例えば機能的バルナーゼを依然として産生する）等にセレクターコドンを導入する。場合により選択物質（例えばアンピシリン等の抗生物質）の存在下で細胞集団を増殖させることによりスクリーニング／選択を実施する。１態様では、選択物質の濃度を変動させる。
【００７２】
例えば、サプレッサーｔＲＮＡの活性を測定するためには、セレクターコドンのｉｎ  ｖｉｖｏ抑圧（例えばネガティブ選択マーカー（例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子（ｂｌａ））をコードするポリヌクレオチドに導入されたナンセンス又はフレームシフト突然変異）に基づく選択システムを使用する。例えば、所定位置（例えばＡ１８４）にセレクターコドンをもつポリヌクレオチド変異体（例えばｂｌａ変異体）を構築する。細胞（例えば細菌）をこれらのポリヌクレオチドで形質転換する。内在大腸菌シンテターゼにより効率的に負荷することができない直交ｔＲＮＡの場合には、抗生物質耐性（例えばアンピシリン耐性）はプラスミドで形質転換されていない細菌と同等以下のはずである。ｔＲＮＡが非直交性の場合、又はｔＲＮＡに負荷することが可能な異種シンテターゼをシステムで同時発現させる場合には、より高レベルの抗生物質（例えばアンピシリン）耐性が観察される。プラスミドで形質転換されていない細胞と同等の抗生物質濃度のＬＢ寒天プレートで増殖することができない細胞（例えば細菌）を選択する。
【００７３】
毒性物質（例えばリボヌクレアーゼ又はバルナーゼ）の場合には、複数の潜在的ｔＲＮＡのメンバーが内在宿主（例えば大腸菌）シンテターゼによりアミノアシル化されるとき（即ち、宿主（例えば大腸菌）シンテターゼに非直交性であるとき）には、セレクターコドンは抑圧され、生産される毒性ポリヌクレオチド産物は細胞死を生じる。直交ｔＲＮＡ又は非機能的ｔＲＮＡを含む細胞は生存する。
【００７４】
１態様では、所望生物に直交性のｔＲＮＡプールに次にポジティブ選択を実施し、セレクターコドンを例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子等の薬剤耐性遺伝子によりコードされるポジティブ選択マーカーに配置する。ポジティブ選択は細胞に直交性のｔＲＮＡプールのメンバーをコードするか又は前記メンバーを含むポリヌクレオチドと、ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドと、コグネイトＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む細胞で実施される。所定態様では、第２の細胞集団はネガティブ選択により排除されなかった細胞を含む。ポリヌクレオチドを細胞で発現させ、選択物質（例えばアンピシリン）の存在下で細胞を増殖させる。次に、同時発現させたコグネイトシンテターゼによりアミノアシル化され、このセレクターコドンに応答してアミノ酸を挿入することができるｔＲＮＡを選択する。一般に、これらの細胞は非機能的ｔＲＮＡ、又は該当シンテターゼにより効率的に認識することができないｔＲＮＡを含む細胞に比較して高い抑圧効率を示す。非機能的ｔＲＮＡ、又は該当シンテターゼにより効率的に認識されないｔＲＮＡを含む細胞は抗生物質に感受性である。従って、（ｉ）内在宿主（例えば大腸菌）シンテターゼの基質ではなく；（ｉｉ）該当シンテターゼによりアミノアシル化することができ；（ｉｉｉ）翻訳で機能的なｔＲＮＡは両者選択後に生存している。
【００７５】
従って、スクリーニングされる状況に応じて同一マーカーがポジティブマーカーにもネガティブマーカーにもなる。即ち、マーカーがポジティブスクリーニングされる場合にはポジティブマーカーであり、ネガティブスクリーニングされる場合にはネガティブマーカーである。
【００７６】
上記方法における選択（例えばポジティブ選択、ネガティブ選択又はポジティブ選択とネガティブ選択の両者）のストリンジェンシーは場合により選択ストリンジェンシーの変動を含む。例えば、バルナーゼは極毒性蛋白質であるので、異なる数のセレクターコドンをバルナーゼ遺伝子に導入するか及び／又は誘導プロモーターを使用することによりネガティブ選択のストリンジェンシーを制御することができる。別の例では、選択又はスクリーニング物質の濃度（例えばアンピシリン濃度）を変動させる。本発明の１側面では、初期ラウンド中の所望活性は低いと思われるのでストリンジェンシーを変動させる。即ち、初期ラウンドでは低ストリンジェンシー選択条件を適用し、後期ラウンドの選択では高ストリンジェンシー条件を適用する。所定態様では、ネガティブ選択、ポジティブ選択又はネガティブ選択とポジティブ選択の両方を複数回反復する。複数の異なるネガティブ選択マーカー、ポジティブ選択マーカー又はネガティブ選択マーカーとポジティブ選択マーカーの両方を使用することができる。所定態様では、ポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーを同一にすることができる。
【００７７】
本発明ではセレクターコドンに応答して非天然アミノ酸（例えばＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸）を負荷する直交翻訳成分（例えばＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ、及びＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対）を作製するために他の型の選択／スクリーニングも使用することができる。例えば、ネガティブ選択マーカー、ポジティブ選択マーカー又はポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーの両方として、適切な反応体の存在下で蛍光発光するか又は発光反応を触媒するマーカーを使用することができる。別の態様では、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）又は発光によりマーカーの産物を検出する。場合により、マーカーはアフィニティースクリーニングマーカーを含む。Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｊ．Ａ．ら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１０４４４−８も参照。
【００７８】
組換え直交ｔＲＮＡの他の作製方法も例えば国際特許出願第ＷＯ２００２／０８６０７５号、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｔＲＮＡ−ａｍｉｎｏａｃｙｌｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｐａｉｒｓ）」；ＷＯ２００４／０９４５９３号、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」；及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２１８７号（出願日２００４年７月７日）に記載されている。Ｆｏｒｓｔｅｒら，２００３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００（１１）：６３５３−６３５７；及びＦｅｎｇら，２００３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００（１０）：５６７６−５６８１も参照。
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）
【００７９】
本発明のＯ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡ（例えば下記実施例に記載するようなロイシルＯ−ｔＲＮＡ又はチロシルＯ−ｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸（例えばＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸）で優先的にｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏアミノアシル化する。（例えば下記実施例及び配列表に記載するような）本発明のＯ−ＲＳはＯ−ＲＳを含むポリペプチド及び／又はＯ−ＲＳ又はその一部をコードするポリヌクレオチドにより翻訳系（例えば細胞）に提供することができる。例えば、Ｏ−ＲＳの１例は本明細書（例えば下記配列表及び実施例）に記載するアミノ酸配列、又はその保存変異体を含む。別の例では、Ｏ−ＲＳ、又はその一部は本明細書（例えば配列表）又は下記実施例に記載する配列を含むアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列によりコードされる。代表的Ｏ−ＲＳ分子の配列については例えば下記表及び実施例参照。「核酸及びポリペプチド配列と変異体」のセクションも参照。
【００８０】
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）、例えばＯ−ｔＲＮＡと併用するためのＯ−ＲＳの同定方法も本発明の特徴である。例えば、１方法は第１の種の細胞集団について選択（例えばポジティブ選択）を実施する段階を含み、前記細胞は１）複数のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）のメンバー（例えば複数のＲＳは突然変異体ＲＳ、第１の種以外の種に由来するＲＳ又は突然変異体ＲＳと第１の種以外の種に由来するＲＳの両方を含むことができる）と；２）（例えば１種以上の種に由来する）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；３）（例えばポジティブ）選択マーカーをコードし、少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを各々含む。複数のＲＳのメンバーを含まないか又はその量の少ない細胞に比較して抑圧効率の高い細胞について細胞を選択又はスクリーニングする。抑圧効率は当分野で公知の技術及び本明細書に記載するように測定することができる。抑圧効率の高い細胞はＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する活性ＲＳを含む。第１の種に由来する第１組のｔＲＮＡの活性ＲＳによる（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ）アミノアシル化レベルを第２の種に由来する第２組のｔＲＮＡの活性ＲＳによる（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ）アミノアシル化レベルと比較する。アミノアシル化レベルは検出可能な物質（例えば標識アミノ酸又は非天然アミノ酸、例えば標識ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸）により測定することができる。第１組のｔＲＮＡに比較して第２組のｔＲＮＡをより効率的にアミノアシル化する活性ＲＳを一般に選択することにより、Ｏ−ｔＲＮＡと併用するための効率的（最適化）直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが得られる。この方法により同定されたＯ−ＲＳも本発明の特徴である。
【００８１】
アミノアシル化を測定するためには多数のアッセイの任意のものを使用することができる。これらのアッセイはｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができる。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアミノアシル化アッセイは例えばＨｏｂｅｎ  ａｎｄ  Ｓｏｌｌ（１９８５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，；１１３：５５−５９に記載されている。アミノアシル化は直交翻訳成分と共にレポーターを使用し、蛋白質をコードする少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを発現する細胞でレポーターを検出することにより測定することもできる。ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」；ＷＯ２００４／０９４５９３；国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１７８６号（出願日２００４年４月１６日）；及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２２１８７号（出願日２００４年７月７日）も参照。
【００８２】
同定されたＯ−ＲＳを更に操作し、所望非天然アミノ酸（例えばＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸）のみをＯ−ｔＲＮＡに負荷し、２０種の標準アミノ酸を負荷しないようにシンテターゼの基質特異性を改変することができる。非天然アミノ酸に対して基質特異性をもつ直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの作製方法は例えばシンテターゼの活性部位、シンテターゼの編集メカニズム部位、各種シンテターゼドメインを組み合わせることによる各種部位等でシンテターゼを突然変異させる段階と、選択プロセスを適用する段階を含む。ポジティブ選択後にネガティブ選択を行う併用に基づくストラテジーを使用する。ポジティブ選択では、ポジティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンが抑圧されると、細胞はポジティブ選択圧下で生存する。従って、天然及び非天然アミノ酸両者の存在下で生存細胞は直交サプレッサーｔＲＮＡに天然又は非天然アミノ酸を負荷する活性シンテターゼをコードする。ネガティブ選択では、ネガティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンが抑圧されると、天然アミノ酸特異性をもつシンテターゼは除去される。ネガティブ選択とポジティブ選択の生存細胞は直交サプレッサーｔＲＮＡを非天然アミノ酸のみでアミノアシル化（負荷）するシンテターゼをコードする。その後、これらのシンテターゼを例えばＤＮＡシャフリング又は他の帰納的突然変異誘発法により更に突然変異誘発することができる。
【００８３】
突然変異体Ｏ−ＲＳのライブラリーは当分野で公知の種々の突然変異誘発技術を使用して作製することができる。例えば、突然変異体ＲＳは部位特異的突然変異、ランダム点突然変異、相同組換え、ＤＮＡシャフリング又は他の帰納的突然変異誘発法、キメラ構築又はその任意組み合わせにより作製することができる。例えば、突然変異体ＲＳのライブラリーは２種以上の他の例えばサイズとダイバーシティーの小さい「サブライブラリー」から作製することができる。ＲＳのキメラライブラリーも本発明に含まれる。なお、場合により各種生物（例えば真正細菌又は古細菌等の微生物）に由来するｔＲＮＡシンテターゼのライブラリー（例えば天然ダイバーシティーを含むライブラリー）（例えば米国特許第６，２３８，８８４号（Ｓｈｏｒｔら）；米国特許第５，７５６，３１６号（Ｓｃｈａｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒら）；米国特許第５，７８３，４３１号（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら）；米国特許第５，８２４，４８５号（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら）；米国特許第５，９５８，６７２号（Ｓｈｏｒｔら）参照）を構築し、直交対についてスクリーニングしてもよい。
【００８４】
シンテターゼにポジティブ及びネガティブ選択／スクリーニングストラテジーを実施した後、これらのシンテターゼを更に突然変異誘発させることができる。例えば、Ｏ−ＲＳをコードする核酸を単離することができ；（例えばランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、組換え又はその任意組み合わせにより）突然変異Ｏ−ＲＳをコードする１組のポリヌクレオチドを核酸から作製することができ；Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸（例えばＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸）で優先的にアミノアシル化する突然変異Ｏ−ＲＳが得られるまでこれらの個々の段階又はこれらの段階の組み合わせを繰り返すことができる。本発明の１側面では、前記段階を複数回、例えば少なくとも２回実施する。
【００８５】
Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ、又はその対を作製するための本発明の方法では、付加レベルの選択／スクリーニングストリンジェンシーを使用することもできる。選択又はスクリーニングストリンジェンシーはＯ−ＲＳを作製するための方法の一方又は両方の段階で変動させることができる。これは例えば選択／スクリーニング物質の使用量等の変動とすることができる。付加ラウンドのポジティブ及び／又はネガティブ選択を実施することもできる。選択又はスクリーニングは更にアミノ酸浸透率の変化、翻訳効率の変化、翻訳忠実度の変化等の１種以上を含むこともできる。一般に、１種以上の変化は蛋白質を生産するために直交ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼ対を使用する生物における１個以上の遺伝子の突然変異に基づく。
【００８６】
Ｏ−ＲＳの作製と、シンテターゼの基質特異性の改変に関するその他の一般的な詳細についてはＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｔＲＮＡ−ａｍｉｎｏａｃｙｌｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｐａｉｒｓ）」；及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１７８６号（出願日２００４年４月１６日）を参照されたい。
資源及び宿主生物
【００８７】
本発明の直交翻訳成分（Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳ）はＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ成分と宿主系が直交に作用するという条件で他の任意種に由来する宿主翻訳系で使用するために任意生物（又は生物組み合わせ）に由来することができる。Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは同一生物に由来する必要はない。各種側面において、直交成分は真正細菌宿主系で使用するには古細菌遺伝子（即ち古細菌）に由来することができ、真核宿主系で使用するには真正細菌遺伝子に由来することができる。
【００８８】
例えば、直交Ｏ−ｔＲＮＡは原核（非真核）生物（又は生物組み合わせ）、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ（Ｍｍ）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の古細菌や、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌に由来することができ、直交Ｏ−ＲＳは生物（又は生物組み合わせ）、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の古細菌や、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌に由来することができる。所定態様では、例えば植物、藻類、原生動物、真菌類、酵母（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、動物（例えば哺乳動物、昆虫、節足動物等）等の真核資源もＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ資源として使用することができる。
【００８９】
Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の個々の成分は同一生物に由来するものでも異なる生物に由来するものでもよい。所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対は同一生物に由来する。あるいは、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対のＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは異なる生物に由来する。１特定態様では、例えば酵母系翻訳系で大腸菌のロイシルシンテターゼ／ｔＲＮＡ対を直交対として使用する。本明細書に記載するように、この対はアンバーセレクターコドンを認識するように修飾することができ、Ｏ−ｔＲＮＡに非天然アミノ酸（例えばＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸）を負荷するように修飾することができる。この直交対（又はその修飾形）を上記直交対（例えば他のセレクターコドンを認識するように修飾された例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来する直交対）と組み合わせてもよい。こうして、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対により各々認識される２個以上のセレクターコドンを含む前記蛋白質のコーディング核酸を付加することにより、該当翻訳系に２種の異なる非天然アミノ酸を含む蛋白質を生産することができる。他の態様は更に対をもつことができ、例えば実施例２は真正細菌（大腸菌）翻訳系で直交対として使用されるＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（古細菌）に由来する直交対を含む。下記参照。
【００９０】
Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ又はＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対はｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで選択又はスクリーニングすることができ、及び／又はＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、もしくは光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）又は他の該当非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを生産するために細胞（例えば非真核ないし原核細胞、又は真核細胞）で使用することができる。非真核細胞は種々の資源の任意のものに由来することができ、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌や、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ（Ｍｍ）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の古細菌が挙げられる。真核細胞は種々の資源の任意のものに由来することができ、例えば植物（例えば単子葉植物、又は双子葉植物等の複雑な植物）、藻類、原生生物、真菌、酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、動物（例えば哺乳動物、昆虫、節足動物等）等が挙げられる。本発明の翻訳成分を導入した細胞の組成物も本発明の特徴である。
【００９１】
別の種で使用するためにある種でＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳをスクリーニングする方法については、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１７８６号（出願日２００４年４月１６日）も参照。
セレクターコドン
【００９２】
本発明のセレクターコドンは蛋白質生合成機構の遺伝コドン枠を拡張する。例えば、セレクターコドンとしては例えばユニーク３塩基コドン、ナンセンスコドン（例えばアンバーコドン（ＵＡＧ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）等の終止コドン）、非天然コドン、少なくとも４塩基のコドン（例えばＡＧＧＡ）、レアコドン等が挙げられる。例えば１個以上、２個以上、３個以上等の多数のセレクターコドンを所望遺伝子に導入することができる。複数の異なるセレクターコドンを使用することにより、これらの異なるセレクターコドンを使用して複数の異なる非天然アミノ酸（例えばＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸）の同時部位特異的組込みを可能にする複数の直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対を使用することができる。
【００９３】
１態様では、本方法はＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸を細胞にｉｎ  ｖｉｖｏ組込むために終止コドンであるセレクターコドンを使用する。例えば、下記実施例１に記載するように、アンバーコドン（酵母のアンバーナンセンスコドン）を認識し、Ｏ−ＲＳによりＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステイン等の光調節型アミノ酸でアミノアシル化されるＯ−ｔＲＮＡを作製する。このＯ−ｔＲＮＡは翻訳系の内在アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼにより認識されない。慣用部位特異的突然変異誘発を使用して該当ポリペプチドをコードするターゲットポリヌクレオチドの該当部位にセレクターコドンを導入することができる。例えばＳａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．ら（１９８８），“５’，３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，７９１−８０２も参照。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ及び該当ポリペプチドをコードする核酸を例えばｉｎ  ｖｉｖｏで併用すると、セレクターコドンに応答してＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸が組込まれ、特定位置にＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸を含むポリペプチドが得られる。
【００９４】
非天然アミノ酸（例えばＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸）のｉｎ  ｖｉｖｏ組込みは宿主細胞をさほど撹乱せずに実施することができる。例えば、大腸菌等の非真核細胞では、終止セレクターコドンであるＵＡＧコドンの抑圧効率はＯ−ｔＲＮＡ（例えばアンバーサプレッサーｔＲＮＡ）と（ＵＡＧコドンと結合してリボソームから成長中のペプチドの放出を開始する）放出因子１（ＲＦ１）の競合に依存するので、例えばＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の発現レベルを増加するか又はＲＦ１欠損株を使用することにより抑圧効率を調節することができる。真核細胞では、ＵＡＧコドンの抑圧効率はＯ−ｔＲＮＡ（例えばアンバーサプレッサーｔＲＮＡ）と（終止コドンと結合してリボソームから成長中のペプチドの放出を開始する）真核放出因子１（例えばｅＲＦ）の競合に依存するので、例えばＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の発現レベルを増加することにより抑圧効率を調節することができる。更に、例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）等の還元剤のように、放出因子作用を調節する付加成分も加えてもよい。
【００９５】
非天然アミノ酸（例えばＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸）はレアコドンでコードすることもできる。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ蛋白質合成反応でアルギニン濃度を下げると、レアアルギニンコドンＡＧＧはアラニンでアシル化された合成ｔＲＮＡによるＡｌａの挿入に有効であることが分かっている。例えばＭａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：７９３９（１９９３）参照。この場合には、合成ｔＲＮＡは大腸菌に少量種として存在する天然ｔＲＮＡＡｒｇと競合する。更に、生物によっては全三重項コドンを使用しないものもある。Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓで割り当てられないコドンＡＧＡがｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳抽出物へのアミノ酸挿入に使用されている。例えばＫｏｗａｌ  ａｎｄ  Ｏｌｉｖｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２５：４６８５（１９９７）参照。本発明の成分はこれらのレアコドンをｉｎ  ｖｉｖｏ使用するために作製することができる。
【００９６】
セレクターコドンは更に拡張コドン（例えば４、５、６塩基以上のコドン等の４塩基以上のコドン）も含むことができる。４塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、ＣＣＣＵ等が挙げられる。５塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、ＵＡＧＧＣ等が挙げられる。本発明の方法はフレームシフト抑圧に基づく拡張コドンの使用を含む。４塩基以上のコドンは例えば１又は複数の非天然アミノ酸（例えばＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸）を同一蛋白質に挿入することができる。他の態様では、アンチコドンループは例えば少なくとも４塩基コドン、少なくとも５塩基コドン、又は少なくとも６塩基コドン又はそれ以上をデコードすることができる。４塩基コドンは２５６種が考えられるので、４塩基以上のコドンを使用すると同一細胞で複数の非天然アミノ酸をコードすることができる。Ａｎｄｅｒｓｏｎら（２００２）“Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｌｉｍｉｔｓ  ｏｆ  Ｃｏｄｏｎ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ  Ｓｉｚｅ，”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９：２３７−２４４；及びＭａｇｌｉｅｒｙ（２００１）“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｏｆ  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  “Ｓｈｉｆｔｙ”  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７：７５５−７６９も参照。
【００９７】
例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生合成法を使用して非天然アミノ酸を蛋白質に組込むために４塩基コドンが使用されている。例えばＭａら，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，７９３９；及びＨｏｈｓａｋａら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：３４参照。２個の化学的にアシル化されたフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを用いて２−ナフチルアラニンとリジンのＮＢＤ誘導体をストレプトアビジンに同時にｉｎ  ｖｉｔｒｏ組込むためにＣＧＧＧとＡＧＧＵが使用されている。例えばＨｏｈｓａｋａら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１２１９４参照。ｉｎ  ｖｉｖｏ試験では、ＭｏｏｒｅらはＮＣＵＡアンチコドンをもつｔＲＮＡＬｅｕ誘導体がＵＡＧＮコドン（ＮはＵ、Ａ、Ｇ又はＣであり得る）を抑圧する能力を試験し、四重項ＵＡＧＡはＵＣＵＡアンチコドンをもつｔＲＮＡＬｅｕにより１３〜２６％の効率でデコードすることができるが、０又は−１フレームでは殆どデコードできないことを見出した。Ｍｏｏｒｅら，（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９８：１９５参照。１態様では、レアコドン又はナンセンスコドンに基づく拡張コドンを本発明で使用し、他の望ましくない部位でのミスセンス読み飛ばしとフレームシフト抑圧を減らすことができる。
【００９８】
所与系では、セレクターコドンは更に天然３塩基コドンの１種を含むことができ、内在系はこの天然塩基コドンを使用しない（又は殆ど使用しない）。例えば、天然３塩基コドンを認識するｔＲＮＡをもたない系、及び／又は３塩基コドンがレアコドンである系がこれに該当する。
【００９９】
セレクターコドンは場合により非天然塩基対を含む。これらの非天然塩基対は更に既存遺伝子アルファベットを拡張する。塩基対が１個増えると、三重項コドン数は６４から１２５に増す。第３の塩基対の性質としては安定的且つ選択的な塩基対合、高い忠実度でポリメラーゼによるＤＮＡへの効率的な酵素組込み、及び未完成非天然塩基対の合成後の効率的な持続的プライマー伸長が挙げられる。方法と組成物に適応可能な非天然塩基対については、例えばＨｉｒａｏら，（２００２）“Ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｆｏｒ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：１７７−１８２に記載されている。Ｗｕ，Ｙ．ら（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１４６２６−１４６３０も参照。他の関連文献は本明細書の他の箇所に挙げる。
【０１００】
ｉｎ  ｖｉｖｏ使用では、非天然ヌクレオシドは膜透過性であり、リン酸化され、対応する三リン酸塩を形成する。更に、増加した遺伝情報は安定しており、細胞内酵素により破壊されない。Ｂｅｎｎｅｒらによる従来の報告はカノニカルワトソンクリック対とは異なる水素結合パターンを利用しており、そのうちで最も注目される例はイソＣ：イソＧ対である。例えばＳｗｉｔｚｅｒら，（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１１：８３２２；Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉら，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４３：３３；及びＫｏｏｌ，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２参照。これらの塩基は一般に天然塩基とある程度まで誤対合し、酵素複製することができない。Ｋｏｏｌらは水素結合を塩基間の疎水性パッキング相互作用に置き換えることにより塩基対の形成を誘導できることを立証した。Ｋｏｏｌ，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２；及びＧｕｃｋｉａｎ  ａｎｄ  Ｋｏｏｌ，（１９９８）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３６，２８２５参照。上記全要件を満足する非天然塩基対を開発する目的でＳｃｈｕｌｔｚ，Ｒｏｍｅｒｂｅｒｇらは一連の非天然疎水性塩基を体系的に合成し、試験した。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対は天然塩基対よりも安定しており、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント（ＫＦ）によりＤＮＡに効率的に組込むことができる。例えばＭｃＭｉｎｎら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１１５８６；及びＯｇａｗａら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：３２７４参照。生体機能に十分な効率と選択性でＫＦにより３ＭＮ：３ＭＮ自己対を合成することができる。例えばＯｇａｗａら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：８８０３参照。しかし、どちらの塩基も後期複製用チェーンターミネーターとして作用するものである。ＰＩＣＳ自己対を複製するために使用できる突然変異体ＤＮＡポリメラーゼが最近開発された。更に、７ＡＩ自己対も複製することができる。例えばＴａｅら，（２００１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３：７４３９参照。Ｃｕ（ＩＩ）と結合すると安定な対を形成する新規メタロ塩基対Ｄｉｐｉｃ：Ｐｙも開発された。Ｍｅｇｇｅｒｓら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：１０７１４参照。拡張コドンと非天然コドンは天然コドンに本質的に直交性であるので、本発明の方法は天然コドンに直交性のｔＲＮＡを作製するためにこの性質を利用することができる。
【０１０１】
翻訳バイパス系を使用してＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸又は他の非天然アミノ酸を所望ポリペプチドに組込むこともできる。１翻訳バイパス系では、大きい配列が遺伝子に挿入されるが、蛋白質に翻訳されない。この配列はリボソームに配列を飛び越させて挿入の下流の翻訳を再開するための合図として機能する構造を含む。
非天然アミノ酸
【０１０２】
本明細書で使用する非天然アミノ酸とはセレノシステイン及び／又はピロリジンと２０種の遺伝的にコードされる以下のα−アミノ酸、即ちアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトフアン、チロシン、バリン以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸又はアミノ酸類似体を意味する。α−アミノ酸の一般構造は式Ｉ：
【化１】
2008513040.tif 000002
により表される。
【０１０３】
非天然アミノ酸は一般に式Ｉをもつ任意構造であり、式中、Ｒ基は２０種の天然アミノ酸で使用されている以外の任意置換基である。２０種の天然アミノ酸の構造については、例えばＬ．Ｓｔｒｙｅｒ著Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版，１９８８，Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照。なお、本発明の非天然アミノ酸は上記２０種のα−アミノ酸以外の天然化合物（又は、当然のことながら人工的に製造した合成化合物）でもよい。
【０１０４】
本発明の非天然アミノ酸は一般に側鎖が天然アミノ酸と異なるので、天然蛋白質と同様に他のアミノ酸（例えば天然又は非天然アミノ酸）とアミド結合を形成する。一方、非天然アミノ酸は天然アミノ酸と異なる側鎖基をもつ。
【０１０５】
本発明では非天然アミノ酸（例えばＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸）が特に重要である。
【０１０６】
他の非天然アミノ酸では、例えば、式ＩにおけるＲは場合によりアルキル、アリール、アシル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ、スルホニル、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミン基等又はその任意組合せを含む。他の該当非天然アミノ酸としては限定されないが、光架橋基をもつアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合性アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基をもつアミノ酸、他の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸、フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸、ビオチン又はビオチン類似体を含有するアミノ酸、ケト含有アミノ酸、グリコシル化アミノ酸、ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学分解性又は光分解性アミノ酸、天然アミノ酸に比較して延長側鎖（例えばポリエーテル又は例えば約５もしくは約１０炭素長を上回る長鎖炭化水素等）をもつアミノ酸、炭素結合糖含有アミノ酸、レドックス活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、及び１個以上の毒性部分を含むアミノ酸が挙げられる。所定態様では、非天然アミノ酸は光架橋基をもつ。１態様では、非天然アミノ酸はアミノ酸側鎖に結合した糖部分及び／又は他の糖鎖修飾をもつ。
【０１０７】
新規側鎖を含む非天然アミノ酸に加え、非天然アミノ酸は場合により例えば式ＩＩ及びＩＩＩ：
【化２】
2008513040.tif 000003
の構造により表されるような修飾主鎖構造も含み、上記式中、Ｚは一般にＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’又はＳ−Ｒ’を含み、ＸとＹは同一でも異なっていてもよく、一般にＳ又はＯであり、ＲとＲ’は場合により同一又は異なり、一般に式Ｉをもつ非天然アミノ酸について上記に記載したＲ基と同一の基及び水素から選択される。例えば、本発明の非天然アミノ酸は場合により式ＩＩ及びＩＩＩにより表されるようにアミノ又はカルボキシル基に置換を含む。この種の非天然アミノ酸としては限定されないが、例えば２０種の標準天然アミノ酸に対応する側鎖又は非天然側鎖をもつα−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシレートが挙げられる。更に、α炭素の置換は場合によりＬ、Ｄ又はα，α−ジ置換アミノ酸（例えばＤ−グルタミン酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、アミノ酪酸等）を含む。他の代替構造としては環状アミノ酸（例えばプロリン類似体や、３、４、６、７、８及び９員環プロリン類似体）、β及びγアミノ酸（例えば置換β−アラニン及びγ−アミノ酪酸）が挙げられる。本発明のその他の非天然アミノ酸構造としては例えばメチレン又はアミノ基がα炭素に隣接してサンドイッチされているホモβ型構造が挙げられ、例えばホモβ−チロシン、α−ヒドラジノチロシンの異性体が挙げられる。
【化３】
2008513040.tif 000004
【０１０８】
多くの非天然アミノ酸は天然アミノ酸（例えばチロシン、グルタミン、フェニルアラニン等）をベースとする。例えば、チロシン類似体としてはパラ置換チロシン、オルト置換チロシン、及びメタ置換チロシンが挙げられ、置換チロシンはアセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６−Ｃ２０直鎖又は分岐鎖炭化水素、飽和又は不飽和炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基等を含む。更に、多置換アリール環も考えられる。本発明のグルタミン類似体としては限定されないが、α−ヒドロキシ誘導体、γ置換誘導体、環状誘導体及びアミド置換グルタミン誘導体が挙げられる。フェニルアラニン類似体の例としては限定されないが、パラ置換フェニルアラニン、オルト置換フェニルアラニン、及びメタ置換フェニルアラニンが挙げられ、置換基はヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド又はケト基等を含む。非天然アミノ酸の特定例としては限定されないが、ホモグルタミン、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、及びイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン等が挙げられる。各種非天然アミノ酸の構造は例えばＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）」の図１６、１７、１８、１９、２６及び２９並びに国際出願公開第ＷＯ２００４／０９４５９３号、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」に記載されている。
非天然アミノ酸の化学的合成
【０１０９】
上記非天然アミノ酸の多くは例えばＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）やＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から市販されている。市販されていないものは場合により各種刊行物に記載されている方法や当業者に公知の標準方法を使用して合成される。有機合成技術については例えばＦｅｓｓｅｎｄｏｎとＦｅｓｓｅｎｄｏｎ著Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２，第２版，Ｗｉｌｌａｒｄ  Ｇｒａｎｔ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．）；Ｍａｒｃｈ著Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版，１９８５，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；及びＣａｒｅｙとＳｕｎｄｂｅｒｇ著Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版，Ｐａｒｔｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ，１９９０，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。非天然アミノ酸の合成について記載しているその他の刊行物としては例えばＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）」；Ｍａｔｓｏｕｋａｓら，（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８，４６６０−４６６９；Ｋｉｎｇ，Ｆ．Ｅ．＆  Ｋｉｄｄ，Ｄ．Ａ．Ａ．（１９４９）“Ａ  Ｎｅｗ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｏｆ  γ−Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｃ  Ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  Ｐｈｔｈｙｌａｔｅｄ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ”Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３３１５−３３１９；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｏ．Ｍ．＆  Ｃｈａｔｔｅｒｒｊｉ，Ｒ．（１９５９）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ  Ａｇｅｎｔｓ”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，３７５０−３７５２；Ｃｒａｉｇ，Ｊ．Ｃ．ら（１９８８）“Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ  ｏｆ  ７−Ｃｈｌｏｒｏ−４［［４−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−１−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）”Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５３，１１６７−１１７０；Ａｚｏｕｌａｙ，Ｍ．，Ｖｉｌｍｏｎｔ，Ｍ．＆  Ｆｒａｐｐｉｅｒ，Ｆ．（１９９１）“Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ａｓ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｓ”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６，２０１−５；Ｋｏｓｋｉｎｅｎ，Ａ．Ｍ．Ｐ．＆  Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．（１９８９）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ｐｒｏｌｉｎｅｓ  ａｓ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ”Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４，１８５９−１８６６；Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，Ｂ．Ｄ．＆  Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．（１９８５）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ  Ｐｕｒｅ  Ｐｉｐｅｃｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ（＋）−Ａｐｏｖｉｎｃａｍｉｎｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｃａｒｂｏｎｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｉｎｉｕｍ  Ｉｏｎ  Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ”Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８９：１８５９−１８６６；Ｂａｒｔｏｎら，（１９８７）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  α−Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｌ−ａｎｄ  Ｄ−α−Ａｍｉｎｏ−Ａｄｉｐｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｌ−α−ａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ  Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ”Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４３：４２９７−４３０８；及びＳｕｂａｓｉｎｇｈｅら，（１９９２）“Ｑｕｉｓｑｕａｌｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  ２−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｔ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ  ｓｉｔｅ”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：４６０２−７が挙げられる。国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／４１３４６号、発明の名称「蛋白質アレー（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｒａｙｓ）」（出願日２００３年１２月２２日）も参照されたい。
非天然アミノ酸の細胞取込み
【０１１０】
細胞による非天然アミノ酸取り込みは例えば蛋白質に組込むように非天然アミノ酸を設計及び選択する場合に一般に考慮される問題の１つである。例えば、α−アミノ酸は電荷密度が高いため、これらの化合物は細胞に浸透しにくいと思われる。天然アミノ酸は異なる程度のアミノ酸特異性を示すことが多い一連の蛋白質輸送システムにより細胞に取り込まれる。非天然アミノ酸が細胞に取り込まれる場合にはどの非天然アミノ酸が取り込まれるかを判断する迅速なスクリーニングを実施することができる。例えば国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／４１３４６号、発明の名称「蛋白質アレー（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｒａｙｓ）」（出願日２００３年１２月２２日）；及びＬｉｕ，Ｄ．Ｒ．＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（１９９９）“Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：４７８０−４７８５における毒性アッセイ参照。取込みは種々のアッセイで容易に分析されるが、細胞取込み経路に利用可能な非天然アミノ酸を設計する代替方法は、アミノ酸をｉｎ  ｖｉｖｏ生産する生合成経路を提供する方法である。
非天然アミノ酸の生合成
【０１１１】
細胞にはアミノ酸と他の化合物を生産するために多数の生合成経路が元々存在している。特定非天然アミノ酸の生合成法は自然界（例えば細胞中）には存在しないと思われるが、本発明はこのような方法を提供する。例えば、非天然アミノ酸の生合成経路は場合により新規酵素を付加するか又は既存宿主細胞経路を改変することにより宿主細胞で作製される。付加新規酵素は場合により天然酵素又は人工的に進化させた酵素である。例えば、（ＷＯ２００２／０８５９２３、前出の実施例に記載されているような）ｐ−アミノフェニルアラニンの生合成は他の生物に由来する公知酵素の組合せの付加に依存している。これらの酵素の遺伝子はこれらの遺伝子を含むプラスミドで細胞を形質転換することにより細胞に導入することができる。これらの遺伝子は細胞で発現されると、所望化合物を合成するための酵素経路を提供する。場合により付加される酵素種の例は例えばＧｅｎｂａｎｋに登録されている。人工的に進化させた酵素も場合により同様に細胞に付加する。このように、非天然アミノ酸を生産するように細胞機構と細胞資源を操作する。
【０１１２】
実際に、生合成経路で使用する新規酵素を生産するため又は非天然アミノを生産するように既存経路をｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏで進化させるためには種々の方法の任意のものを使用することができる。非天然アミノ酸を生産するため（又は、実際に新規基質特異性もしくは他の該当活性をもつようにシンテターゼを進化させるため）には、酵素又は他の生合成経路成分を進化させる方法として入手可能な多数の方法を本発明に適用することができる。例えば、非天然アミノ酸を生産（又は新規シンテターゼを生産）するように新規酵素及び／又は前記酵素の経路をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで開発するためには、場合によりＤＮＡシャフリングを使用する。例えばＳｔｅｍｍｅｒ（１９９４）“Ｒａｐｉｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ”Ｎａｔｕｒｅ  ３７０（４）：３８９−３９１；及びＳｔｅｍｍｅｒ，（１９９４）“ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒａｎｄｏｍ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１０７４７−１０７５１参照。関連アプローチは所望特性をもつ酵素を迅速に進化させるために関連（例えば相同）遺伝子のファミリーをシャフリングする。このような「ファミリー遺伝子シャフリング」法の１例はＣｒａｍｅｒｉら（１９９８）“ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，”Ｎａｔｕｒｅ，３９１（６６６４）：２８８−２９１に記載されている。（生合成経路成分であるか又はシンテターゼであるかを問わずに）新規酵素は例えばＯｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９）“Ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｈｙｂｒｉｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １７：１２０５に記載されているような「ハイブリッド酵素作製用インクリメンタルトランケーション（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ：ＩＴＣＨＹ）として知られるＤＮＡ組換え法を使用して作製することもできる。このアプローチは１種以上のｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ組換え法の基質として使用することができる酵素又は他の経路変異体のライブラリーを作製するために使用することもできる。Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９）“Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｙ  Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：３５６２−６７，及びＯｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９）“Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ，”  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅ���ｉｓｔｒｙ，７：２１３９−４４も参照。別のアプローチは例えば非天然アミノ酸（又は新規シンテターゼ）の生産に関連する生合成反応を触媒する能力について選択する酵素又は他の経路変異体のライブラリーを作製するために指数的集合突然変異誘発を使用する。このアプローチでは、該当配列中の小群の残基を並行してランダム化し、機能的蛋白質をもたらすアミノ酸を各変異位置で同定する。非天然アミノ酸（又は新規シンテターゼ）の生産用新規酵素を作製するように本発明に応用することができるこのような方法の例はＤｅｌｅｇｒａｖｅ  ＆  Ｙｏｕｖａｎ（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：１５４８−１５５２に記載されている。更に別のアプローチでは、例えばＡｒｋｉｎ  ａｎｄ  Ｙｏｕｖａｎ（１９９２）“Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｔｏ  ｅｎｃｏｄｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｅｍｉ−ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２９７−３００；又はＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら（１９９１）“Ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：５６４−８６の一般突然変異誘発法を使用することにより、酵素及び／又は経路成分操作にドープ又は縮重オリゴヌクレオチドを使用するランダム又は半ランダム突然変異誘発を使用することができる。ポリヌクレオチドリアセンブリと部位飽和突然変異誘発を使用する更に別のアプローチ（「非確率論的」突然変異誘発と呼ぶことが多い）を使用すると、酵素及び／又は経路成分を作製した後に、（例えば非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ生産のための）１種以上のシンテターゼ又は生合成経路機能を実施する能力についてスクリーニングすることができる。例えばＳｈｏｒｔ“Ｎｏｎ−Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，”ＷＯ００／４６３４４参照。
【０１１３】
このような突然変異法の代替方法は生物の全ゲノムを組換え、得られた子孫を特定経路機能について選択する方法である（「全ゲノムシャフリング」と呼ぶことが多い）。このアプローチは、例えばゲノム組換えと非天然アミノ酸（又はその中間体）の生産能に関する生物（例えば大腸菌又は他の細胞）の選択により本発明に適用することができる。例えば、非天然アミノ酸をｉｎ  ｖｉｖｏ生産するように細胞で既存及び／又は新規経路を進化させるための経路設計には、以下の刊行物に教示されている方法を適用することができる：Ｐａｔｎａｉｋら（２００２）“Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｃｉｄ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０（７）：７０７−７１２；及びＺｈａｎｇら（２００２）“Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｒａｐｉｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ”Ｎａｔｕｒｅ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ７，４１５（６８７２）：６４４−６４６。
【０１１４】
例えば所望化合物を生産するための他の生物及び代謝経路設計技術も利用可能であり、同様に非天然アミノ酸の生産に適用することができる。有用な経路設計アプローチを教示している刊行物の例としては、Ｎａｋａｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ（２００３）“Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  １，３  ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（５）：４５４−９；Ｂｅｒｒｙら（２００２）“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｂｏｔｈ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｄｉｇｏ”Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８：１２７−１３３；Ｂａｎｔａら（２００２）“Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ａｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ２，５−ｄｉｋｅｔｏ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（２０），６２２６−３６；Ｓｅｌｉｖｏｎｏｖａら（２００１）“Ｒａｐｉｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｒａｉｔｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ”Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６７：３６４５、及び他の多数の文献が挙げられる。
【０１１５】
使用する方法に関係なく、一般に本発明の人工生合成経路を使用して生産される非天然アミノ酸は効率的な蛋白質生合成に十分な濃度（例えば天然細胞量）で生産されるが、他の細胞内アミノ酸濃度を有意に変化させたり細胞資源を枯渇させる程ではない。このようにｉｎ  ｖｉｖｏ生産される典型的な濃度は約１０ｍＭ〜約０．０５ｍＭである。特定経路に所望される酵素を生産するように細胞を設計し、非天然アミノ酸を作製したら、場合によりｉｎ  ｖｉｖｏ選択を使用してリボソーム蛋白質合成と細胞増殖の両方に適合するように非天然アミノ酸の生産を更に最適化させる。
【０１１６】
当然のことながら、各種非天然アミノ酸は更に光調節型アミノ酸を含むことができる。下記参照。更に、本発明の選択的態様では、該当アミノ酸｛例えば本発明のｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対によりペプチド鎖に付加されるアミノ酸）はアゾベンジル−Ｐｈｅ側鎖、アゾベンジル−Ｐｈｅ、又はジフェニルジアゼンを含むことができる。下記参照。
光調節型非天然アミノ酸
【０１１７】
例えば酵素、受容体、イオンチャネル等の活性を直接調節するか、又は各種シグナル伝達分子の細胞内濃度を調節することにより、光調節型アミノ酸（例えば光発色性、光分解性、光異性化可能等）を使用して各種生体プロセスを空間的及び時間的に制御することができる。例えばＳｈｉｇｅｒｉら，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ．，２００１，９１：８５＋；Ｃｕｒｌｅｙら，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ．，１９９９，８２：３４７＋；Ｃｕｒｌｅｙら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．，１９９９，３：８４＋；“Ｃａｇｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｍａｒｒｉｏｔｔ，Ｇ．，Ｅｄ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９８，Ｖ．２９１；Ａｄａｍｓら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９３，５５：７５５＋；及びＢｏｃｈｅｔら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，Ｐｅｒｋｉｎ  １，２００２，１２５＋参照。本発明の各種態様では、組成物及び方法は光調節型アミノ酸を含む。例えば、下記実施例１に例証するように、ｏ−ニトロベンジルシステイン（フォトケージドアミノ酸）は本発明のＯ−ＲＳ／Ｏ−ｔＲＮＡ対の一部のアミノ酸であり、実施例２は光異性化可能なアミノ酸であって露光により異性体形に転換するアゾベンジル−Ｐｈｅを使用している。
【０１１８】
「光調節型アミノ酸」は一般に例えば感光性アミノ酸である。光調節型アミノ酸一般は所定方法で光（例えばＵＶ、ＩＲ等）により制御されるアミノ酸である。従って、例えば、光調節型アミノ酸が生体活性をもつペプチドに含まれる場合には、照射によりアミノ酸を改変し、ペプチドの生体活性を変化させることができる。光調節型アミノ酸には、「フォトケージドアミノ酸」、「感光性アミノ酸」、「光感受性アミノ酸」、「光異性化可能なアミノ酸」等も含まれる。ケージドアミノ酸やケージドペプチド等の「ケージド種」は大きな部分（例えば分子）の内側にトラップされ、特定照射を受けると遊離する種である。例えばＡｄａｍｓら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９３，５５：７５５−７８４参照。アミノ酸の「ケージング」基は（例えばターゲット分子との相互作用を通常は安定化させる結合を切断するか、特定側鎖の疎水性又はイオン特性を変化させるか、あるいは立体障害等により）分子（例えばこのようなアミノ酸を含むペプチド）内の生体活性を阻害又は隠蔽することができる。「光異性化可能な」アミノ酸は露光により異性体形に転換することができる。このようなアミノ酸の各種異性体は蛋白質に他の側鎖が組込まれると、各種相互作用を生じる可能性がある。実施例２参照。このように光調節型アミノ酸はそれらが存在するペプチドの生体活性を（活性化、部分活性化、不活化、部分不活化、変形活性化等により）制御することができる。光調節型アミノ酸及び分子の詳細な定義と例についてはＡｄａｍｓ前出と本セクションの他の引用文献参照。
【０１１９】
多数の光調節型アミノ酸が当業者に公知であり、多数のものが市販されている。光調節分子をアミノ酸と結合及び／又は会合する方法も公知である。このような光調節型アミノ酸一般は本発明の各種態様に利用可能である。当然のことながら、本明細書には考えられる多数の光調節部分（例えばフォトケージング基等）と多数の光調節型アミノ酸を挙げるが、これらの例は限定的であるとみなすべきではない。従って、本発明は本明細書に具体的に記載しない光調節部分及び光調節型アミノ酸にも利用可能である。
【０１２０】
上記のように、光調節型アミノ酸を作製するために場合により多数の方法が適用可能である。従って、例えば、光調節型アミノ酸（例えばフォトケージドアミノ酸）はそのα−アミノ基をＢＯＣ（ブチルカルボニル）等の化合物で保護し、α−カルボキシル基をｔ−ブチルエステル等の化合物で保護することにより作製することができる。このような保護後にクロロギ酸２−ニトロベンジル、臭化α−カルボキシル２−ニトロベンジルメチルエステル、又は２−ニトロベンジルジアゾエタン等の反応形の２−ニトロベンジル等の光感受性ケージング基とアミノ酸側鎖を反応させることができる。光感受性ケージ基を付加した後に標準手順により保護基を脱離することができる。例えばＵＳＰＮ５，９９８，５８０参照。
【０１２１】
別例として、クロロギ酸２−ニトロベンジルを使用してリジン残基をケージングし、ε−リジンアミノ基を誘導体化し、正電荷を除去することもできる。あるいは、α−カルボキシ２−ニトロベンジルオキシカルボニルケージング基の使用により（このようなリジンをもつ）ペプチドに負電荷を導入することによりリジンをケージングすることもできる。更に、ホスホアミノ酸又はホスホペプチドを１（２−ニトロベンジル）ジアゾエタンで処理することによりホスホセリンとホスホスレオニンをケージングすることもできる。例えばＷａｌｋｅｒら，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７２：２８８−３０１，１９８９参照。例えばセリン、スレオニン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸及びグルタミン酸等の他の多数のアミノ酸も容易に標準ケージング化学に適用可能である。例えばＷｉｌｃｏｘら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：１５８５−１５８９，１９９０参照。この場合も当然のことながら、特定光調節型（アミノ酸及び／又は光調節形に変換可能なアミノ酸）の記載は必ずしも限定的とみなすべきではない。
【０１２２】
アミノ酸残基は他の方法で光調節型（例えば感光性又は光感受性）にすることができる。例えば、特定アミノ酸残基をもつペプチド主鎖を放射線により開裂するように、所定アミノ酸残基を作製することができる。例えば、光感受性グリシンである２−ニトロフェニルグリシンはこのように機能することができる。例えばＤａｖｉｓら，１９７３，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１６：１０４３−１０４５参照。２−ニトロフェニルグリシンを含むペプチドに放射線を照射すると、２−ニトロフェニルグリシンのα炭素とα−アミノ基の間のペプチド主鎖は開裂する。２−ニトロベンジル基をα炭素とα−アミノ基の間に挿入するならば、グリシン以外のアミノ酸にこのような開裂ストラテジーを一般に適用することができる。
【０１２３】
このような基を他の分子（例えばアミノ酸）と共有結合させるために使用される多数の光調節基（例えばケージング基）及び多数の反応性化合物が当分野で周知である。光調節（例えば光感受性、ケージング）基の例としては限定されないが、ニトロインドリン；Ｎ−アシル−７−ニトロインドリン；フェナシル；ヒドロキシフェナシル；臭素化７−ヒドロキシクマリン−４−イルメチル（例えばＢｈｃ）；ベンゾインエステル；ジメトキシベンゾイン；メタフェノール；２−ニトロベンジル；１−（４，５−ジメトキシ−２−ニトロフェニル）エチル（ＤＭＮＰＥ）；４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジル（ＤＭＮＢ）；α−カルボキシ−２−ニトロベンジル（ＣＮＢ）；１−（２−ニトロフェニル）エチル（ＮＰＥ）；５−カルボキシメトキシ−２−ニトロベンジル（ＣＭＮＢ）；（５−カルボキシメトキシ−２−ニトロベンジル）オキシ）カルボニル；（４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジル）オキシ）カルボニル；デオキシベンゾイニル等が挙げられる。例えばＵＳＰＮ５，６３５，６０８（Ｈａｕｇｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｇｅｅ）（１９９７年６月３日）、発明の名称「α−カルボキシケージド化合物（α−ｃａｒｂｏｘｙ  ｃａｇｅｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）」Ｎｅｕｒｏ  １９，４６５（１９９７）；Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ５０８．３，８０１（１９９８）；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８８  Ｓｅｐ，８５（１７）：６５７１−５；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９７  Ｆｅｂ  １４，２７２（７）：４１７２−８；Ｎｅｕｒｏｎ  ２０，６１９−６２４，１９９８；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｖｏｌ．２８：２００１：３１７−３２５；Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３９２，１９９８：９３６−９４１；Ｐａｎ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｂａｙｌｅｙ，Ｈ．“Ｃａｇｅｄ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ”ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４０５：８１−８５（１９９７）；Ｐｅｔｔｉｔら（１９９７）“Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｗｏ−ｐｈｏｔｏｎ  ｕｎｃａｇｉｎｇ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ”Ｎｅｕｒｏｎ  １９：４６５−４７１；Ｆｕｒｕｔａら（１９９９）“Ｂｒｏｍｉｎａｔｅｄ  ７−ｈｙｄｒｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎ−４−ｙｌｍｅｔｈｙｌｓ：ｎｏｖｅｌ  ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐｓ  ｗｉｔｈ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｕｓｅｆｕｌ  ｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｗｏ  ｐｈｏｔｏｎ  ｐｈｏｔｏｌｙｓｉｓ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６（４）：１１９３−１２００；Ｚｏｕら“Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ａ  ｃａｇｅｄ  ａｔ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｒｅｏｎｉｎｅ”Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００２）１２４：８２２０−８２２９；Ｚｏｕら“Ｃａｇｅｄ  Ｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．（２００１）４０：３０４９−３０５１；Ｃｏｎｒａｄ  ＩＩら“ｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎａｃｙｌ  Ｐｈｏｔｏｔｒｉｇｇｅｒｓ：Ｔｈｅ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｅｘｃｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅ  ｏｆ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｐｈｏｔｏｒｅｌｅａｓｅ”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２０００）１２２：９３４６−９３４７；Ｃｏｎｒａｄ  ＩＩら“Ｎｅｗ  Ｐｈｏｔｏｔｒｉｇｇｅｒｓ  １０：Ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  π，π＊  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ”Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．（２０００）２：１５４５−１５４７；Ｇｉｖｅｎｓら“Ａ  Ｎｅｗ  Ｐｈｏｔｏｔｒｉｇｇｅｒｓ  ９：ｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎａｃｙｌ  ａｓ  ａ  Ｃ−Ｔｅｒｍｉｎｕｓ  Ｐｈｏｔｏｒｅｍｏｖａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅｓ”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２０００）１２２：２６８７−２６９７；Ｂｉｓｈｏｐら“４０−Ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ−２，２０−ｂｉｐｙｒｉｄｙｌ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ（Ａｂｃ）ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ：Ｎｏｖｅｌ  Ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｍｅｔａｌ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  Ｓｉｔｅ  Ｗｉｔｈｉｎ  ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ”Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２０００）５６：４６２９−４６３８；Ｃｈｉｎｇら“Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ａｓ  Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｔｅｔｈｅｒｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｈｏｔｏｌｙｔｉｃ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  Ｅｎａｂｌｉｎｇ  Ｌａｓｅｒ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ／Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  Ｂｏｕｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９６）７：５２５−８；ＢｉｏＰｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２００２，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．刊；及びＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｎｉｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ又はＷｅｂ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ刊、並びにその引用文献参照。各種分子のケージング用の多数の化合物、キット等が例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ）から市販されている。その他の情報は例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３４１（１９８６）及びＣｏｒｒｉｅ，Ｊ．Ｅ．Ｔ．ａｎｄ  Ｔｒｅｎｔｈａｍ，Ｄ．Ｒ．（１９９３）Ｉｎ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｗｉｔｃｈｅｓ，ｅｄ．，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｈ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２４３−３０５に記載されている。適切な感光性ケージング基の例としては限定されないが、２−ニトロベンジル、ベンゾインエステル、Ｎ−アシル−７−ニトロインドリン、メタフェノール、及びフェナシルが挙げられる。
【０１２４】
所定態様では、光調節（例えばケージング）基は第２の結合部分と結合することができる第１の結合部分を場合により含むことができる。例えば、市販ケージドホスホロアミダイト［１−Ｎ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−５−（６−ビオチンアミドカプロアミドメチル）−１−（２−ニトロフェニル）−エチル］−２−シアノエチル−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．，ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓ．ｃｏｍ製品ＰＣ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍａｄｉｔｅ）は光感受性基とビオチン（第１の結合部分）を含む。従って、第２の結合部分（例えばストレプトアビジン又はアビジン）がケージング基と結合し、その嵩とケージング効力を増すことができる。所定態様では、ケージド成分は第１の結合部分を各々含む２個以上のケージング基を含み、第２の結合部分は２個以上の第１の結合部分と同時に結合することができる。例えば、ケージド成分は少なくとも２個のビオチン化ケージング基を含むことができ、ストレプトアビジンが複数のケージド成分分子上の複数のビオチン部分と結合し、ケージド成分を相互に結合して大きな網状構造とする。ビオチンを前記成分と結合する光感受性基が開裂すると、網状構造は解離する。
【０１２５】
ケージドポリペプチド（例えば抗体や転写因子等のペプチド基質及び蛋白質を含む）を作製する「従来」方法としては、例えばポリペプチドをケージング化合物と反応させる方法や、ポリペプチドの合成中にケージドアミノ酸を組込む方法がある。例えばＵＳＰＮ５，９９８，５８０（Ｆａｙら）（１９９９年１２月７日）発明の名称「感光性ケージド巨大分子（Ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｃａｇｅｄ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」；Ｋｏｓｓｅｌら（２００１）ＰＮＡＳ  ９８：１４７０２−１４７０７；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ（１９９９）４：３３０−３３４；ＰＮＡＳ（１９９８）９５：１５６８−１５７３；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００２）１２４：８２２０−８２２９；Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（２００１）９１：８５−９２；及びＡｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．（２００１）４０：３０４９−３０５１参照。（例えば蛋白質形質導入ドメイン及びセンサー等を結合するための）光感受性ポリペプチドリンカーは例えばＵＳＰＮ５，９９８，５８０に記載されているもの等の光感受性アミノ酸を含むことができる。
【０１２６】
光を照射すると、例えばこのようなアミノ酸を含むペプチドの活性に重要なアミノ酸の側鎖残基を遊離させることができる。更に、所定態様では、ケージ解除したアミノ酸はアミノ酸を含むペプチドのペプチド主鎖を開裂し、従って、例えば環状ペプチドを開環し、別の生物学的性質等をもつ線状ペプチドとすることができる。
【０１２７】
ケージドペプチドの活性化は当業者に公知の任意標準方法により光調節型アミノ酸上の感光性ケージング基の破壊により実施することができる。例えば、感光性アミノ酸は（例えばＵＶ域又は赤外域で発光する）レーザー等の適切な慣用光源に暴露することによりケージ解除又は活性化することができる。本発明で使用するもの等の光調節型アミノ酸と併用するために適用可能な適切な波長及びエネルギーのその他の多数のレーザー並びに適切な適用プロトコール（例えば照射時間等）は当業者に自明である。光調節型ケージドアミノ酸の遊離はこのようなアミノ酸を含むペプチドの制御を可能にする。このような制御は位置と時間の両者で可能である。例えば、集束レーザー照射は他の位置のアミノ酸をケージ解除せずに、ある位置のアミノ酸をケージ解除することができる。
【０１２８】
当業者に自明のとおり、光調節型アミノ酸の活性を評価するためには各種アッセイ（例えば下記実施例に記載するアッセイ）を使用することができる。光調節型アミノ酸を組込んだペプチドを細胞又は組織に導入する前後と、光調節型分子の遊離後に多様な例えば細胞機能、組織機能等をアッセイすることができる。
【０１２９】
本発明の組成物及び方法は多数の側面で利用することができる。例えば、光調節型アミノ酸の遊離又は活性化／不活化／等は標的光照射等により局在化することができるので、（例えばペプチド中の）光調節型アミノ酸は治療用組成物を身体の個別位置に送達することができる。同様に当然のことながら、本発明の方法、構造、及び組成物は光調節型天然アミノ酸（例えば光調節部分を結合／会合したアミノ酸）の組込み／使用にも適用可能である。
【０１３０】
最近、３０種を上回る非天然アミノ酸がユニーク三重項及び四重項コドンに応答して原核生物と真核生物の両者で遺伝的にコードされている。例えばＣｈｉｎら，ＰＮＡＳ，２００２，９９：１１０２０−４；Ｃｈｉｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，２００２，１２４：９０２６−７；Ａｌｆｏｎｔａら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，２００３，１２５：１４６６２−３；Ｗａｎｇら，ＰＮＡＳ，２００３，１００：５６−６１；Ｚｈａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，３０３：３７１−３；Ｘｉｅら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，２００４（印刷中）；Ｗａｎｇら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，２００４（印刷中）；Ｃｈｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３，３０１：９６４−７；及びＡｎｄｅｒｓｏｎら，ＰＮＡＳ，２００４，１０１：４５６６−７１参照。これらのアミノ酸としてはグリコシル化アミノ酸、ケト、アジド、アルキニル、及びヨード基をもつアミノ酸、光反応性アミノ酸、並びにレドックス活性アミノ酸が挙げられる。この「拡張」遺伝コードの構造的ダイバーシティを更に増すためには、例えば下記実施例に記載するもの等の付加的なユニークｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対が必要である。
【０１３１】
酵素（例えばＷｅｓｔｍａｒｋら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９３，１１５：３４１６−１９及びＨｏｈｓａｋａら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９４，１１６：４１３−４参照）、受容体（例えばＢａｒｔｅｌｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，１９７１，６８：１８２０−３；Ｌｅｓｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  １９７７，２６６：３７３−４：Ｃｒｕｚら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，２０００，１２２：８７７７−８；及びＰｏｌｌｉｔｔら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ，１９９８，３７：２１０４−７参照）、又はイオンチャネル（例えばＬｉｅｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９６，１１８：１２２２２−３；Ｂｏｒｉｓｅｎｋｏら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００，１２２：６３６４−７０；及びＢａｎｇｈａｒｔら，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００４，７：１３８１−６参照）の活性を直接調節するか、あるいは各種シグナル伝達分子の細胞内濃度（例えばＡｄａｍｓら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９３，５５：７５５−８４参照）を調節することにより、光発色性及び光分解性基を使用して各種生体プロセスを空間的及び時間的に制御することができる。一般に、このためには蛋白質又は小分子をアゾベンゼンやニトロベンジル基等の光反応性リガンドで化学的に修飾する必要がある。光反応性アミノ酸を直接生体の蛋白質の規定部位に遺伝的に組込むことができるならば、この技術の範囲は有意に拡大するであろう。例えばＷｕら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４，１２６：１４３０６−７参照。
光調節型アミノ酸（ｏ−ニトロベンジルシステイン及びアゾベンジル−Ｐｈｅ）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、及びα−アミノカプリル酸を組込むための直交成分
【０１３２】
本発明はセレクターコドン（例えばアンバーコドン、終止コドン、ナンセンスコドン、４塩基以上のコドン等）に応答して成長中のポリペプチド鎖に光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、及びα−アミノカプリル酸を例えばｉｎ  ｖｉｖｏで組込むための直交成分を作製する組成物及び方法を提供する。例えば、本発明は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）及びその対を提供する。これらの非限定的な例は例えば下記実施例のセクションに記載する。これらの対は成長中のポリペプチド鎖に光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、及びα−アミノカプリル酸を組込むために使用することができる。
【０１３３】
本発明の組成物は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み、前記Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、又はα−アミノカプリル酸で優先的にアミノアシル化する。所定態様では、Ｏ−ＲＳは下記実施例のセクション及び配列表に表示／記載するものを含むアミノ酸配列又は前記任意配列の保存変異体を含む。本発明の所定態様では、Ｏ−ＲＳは下記実施例のセクション及び／又は配列表に表示／記載するもののアミノ酸配列を含むポリペプチドの効率の少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。
【０１３４】
Ｏ−ＲＳを含む組成物は場合により更に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含むことができ、前記Ｏ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識する。一般に、本発明のＯ−ｔＲＮＡは下記配列表及び実施例に記載するポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡの抑圧効率に比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の抑圧効率を含む。１態様では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率はＯ−ＲＳの不在下のＯ−ｔＲＮＡの抑圧効率の例えば５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍又はそれ以上である。１側面では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率はＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来する直交チロシルｔＲＮＡシンテターゼ対の抑圧効率の少なくとも４５％であり、別の側面では、大腸菌に由来する直交ロイシルｔＲＮＡシンテターゼ対の抑圧効率の少なくとも４５％である。
【０１３５】
Ｏ−ｔＲＮＡを含む組成物は場合により細胞（例えば大腸菌細胞等の原核（非真核）細胞、又はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等の真核細胞）、及び／又は翻訳系を含むことができる。
【０１３６】
本発明は翻訳系を含む細胞（例えば原核（非真核）細胞、又は真核細胞）も提供し、前記翻訳系は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸を含む。一般に、Ｏ−ＲＳは本明細書、例えば下記実施例のセクションに記載する配列のアミノ酸配列を含むポリペプチドの効率の少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。Ｏ−ｔＲＮＡは第１のセレクターコドンを認識し、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡをＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。１態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは下記実施例及び配列表に記載するポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる。１態様では、Ｏ−ＲＳは下記実施例及び配列表（例えば配列番号５〜１７の１種以上）に記載するアミノ酸配列又はその保存変異体を含む。
【０１３７】
本発明の細胞は場合により異なる付加Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対と第２の非天然アミノ酸を更に含むことができ、例えばこのＯ−ｔＲＮＡは第２のセレクターコドンを認識し、このＯ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。場合により、本発明の細胞は該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含み、前記ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。
【０１３８】
所定態様では、本発明の細胞は直交−ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、非天然アミノ酸（例えばＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸）と、該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む原核細胞（例えば大腸菌細胞）又は真核細胞（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含み、前記ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。本発明の所定態様では、Ｏ−ＲＳは本明細書（例えば下記実施例及び配列表）に記載する任意Ｏ−ＲＳ配列のアミノ酸配列を含むポリペプチドの効率の少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。
【０１３９】
本発明の所定態様では、本発明のＯ−ｔＲＮＡは本明細書の配列及び実施例に記載するポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる。本発明の所定態様では、Ｏ−ＲＳは本明細書の配列及び実施例に記載するアミノ酸配列、又はその保存変異体を含む。１態様では、Ｏ−ＲＳ又はその一部は本明細書の配列又は実施例に記載するアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列によりコードされる。
【０１４０】
本発明のＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳは種々の生物（例えば真核及び／又は原核（非真核）生物）の任意のものに由来することができる。
【０１４１】
ポリヌクレオチドも本発明の特徴である。本発明のポリヌクレオチドは本明細書の配列及び実施例に記載するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む人工（例えば人為的に作製され、天然には存在しない）ポリヌクレオチドを含むか、及び／又は前記ポリヌクレオチド配列に相補的である。本発明のポリヌクレオチドは更に核酸の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下で上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸も含むことができる。本発明のポリヌクレオチドは更に天然に存在するｔＲＮＡ又は対応するコーディング核酸のポリヌクレオチドと例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上一致するポリヌクレオチドを含み（但し、本発明のポリヌクレオチドは天然に存在するｔＲＮＡ又は対応するコーディング核酸以外のものである）、前記ｔＲＮＡはセレクターコドン（例えばアンバーコドン）を認識する。上記任意ポリヌクレオチドと例えば少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上一致する人工ポリヌクレオチド及び／又は上記任意ポリヌクレオチドの保存変異体を含むポリヌクレオチドも本発明のポリヌクレオチドに含まれる。
【０１４２】
本発明のポリヌクレオチドを含むベクターも本発明の特徴である。例えば、本発明のベクターはプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、発現ベクター及び／又は同等物を含むことができる。本発明のベクターを含む細胞も本発明の特徴である。
【０１４３】
Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の成分の作製方法も本発明の特徴である。これらの方法により作製された成分も本発明の特徴である。例えば、細胞に対して直交性である少なくとも１種のｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）の作製方法は突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーを作製する段階と；セレクターコドンを認識できるように突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーの各メンバーのアンチコドンループを突然変異させることにより、潜在的Ｏ−ｔＲＮＡのライブラリーを提供する段階と、潜在的Ｏ−ｔＲＮＡのライブラリーのメンバーを含む第１の種の第１の細胞集団についてネガティブ選択を実施する段階を含む。ネガティブ選択は細胞に内在性のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される潜在的Ｏ−ｔＲＮＡライブラリーのメンバーを含む細胞を排除する。こうして、第１の種の細胞に対して直交性のｔＲＮＡプールが得られ、それにより少なくとも１種のＯ−ｔＲＮＡが得られる。本発明の方法により作製されたＯ−ｔＲＮＡも提供する。
【０１４４】
所定態様では、前記方法は更に第１の種の第２の細胞集団についてポジティブ選択を実施する段階を含み、前記細胞は第１の種の細胞に対して直交性のｔＲＮＡプールのメンバーと、コグネイトアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと、ポジティブ選択マーカーを含む。ポジティブ選択を使用し、コグネイトアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによりアミノアシル化され、ポジティブ選択マーカーの存在下で所望応答を示すｔＲＮＡプールのメンバーを含む細胞について細胞を選択又はスクリーニングすることにより、Ｏ−ｔＲＮＡを得る。所定態様では、第２の細胞集団はネガティブ選択により排除されなかった細胞を含む。
【０１４５】
ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸をＯ−ｔＲＮＡに負荷する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの同定方法も提供する。例えば、方法は第１の種の細胞集団に選択を実施する段階を含み、前記細胞は、１）複数のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）（例えば複数のＲＳは突然変異体ＲＳ、第１の種以外の種に由来するＲＳ、又は突然変異体ＲＳと第１の種以外の種に由来するＲＳの両方を含むことができる）のメンバーと；２）（例えば１種以上の種に由来する）直交−ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；３）ポジティブ選択マーカーをコードし、少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを各々含む。
【０１４６】
複数のＲＳのメンバーを含まないか又はその量の少ない細胞に比較して抑圧効率の高い細胞について細胞（例えば宿主細胞）を選択又はスクリーニングする。これらの選択／スクリーニングした細胞はＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する活性ＲＳを含む。この方法により同定された直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼも本発明の特徴である。
【０１４７】
光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、又はα−アミノカプリル酸を特定位置に組込んだ蛋白質を細胞（例えば大腸菌細胞等の原核（非真核）細胞、又はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等の真核細胞）で生産する方法も本発明の特徴である。例えば、１方法は、少なくとも１個のセレクターコドンを含み、蛋白質をコードする核酸を含む細胞を適当な培地で増殖させる段階と、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸を提供する段階と、少なくとも１個のセレクターコドンによる核酸の翻訳中に蛋白質の特定位置に光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、又はα−アミノカプリル酸を組込むことにより、蛋白質を生産する段階を含む。細胞は更に、細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（ロイシルＯ−ｔＲＮＡやチロシルＯ−ｔＲＮＡ等のＯ−ｔＲＮＡ）と；Ｏ−ｔＲＮＡをＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ、例えばロイシルＯ−ＲＳ又はチロシルＯ−ＲＳ）を含む。この方法により生産された蛋白質も本発明の特徴である。
【０１４８】
本発明は例えば光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、又はα−アミノカプリル酸を組込んだ蛋白質を含有する組成物も提供する。所定態様では、蛋白質は公知蛋白質（例えば治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分）のアミノ酸配列と少なくとも７５％一致するアミノ酸配列を含む。場合により、組成物は医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する。
新規シンテターゼライブラリー及びライブラリースクリーニング方法
【０１４９】
本発明は特定宿主細胞で対応する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と共働する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）である新規アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ変異体の同定に使用される新規ポリヌクレオチドライブラリーとライブラリースクリーニング方法を提供する。これらの試薬と方法はそのパートナーＯ−ｔＲＮＡに任意所望非天然アミノ酸を負荷する能力をもつ所望Ｏ−ＲＳ種を同定するために使用することができる。
【０１５０】
本発明のシンテターゼライブラリーはアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含む。所定態様では、これらのシンテターゼ変異体は古細菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ遺伝子に由来する。古細菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ配列の資源は特に限定されない。例えば、資源材料は野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードするポリヌクレオチドに由来するものでもよいし、他の任意古細菌種、例えばＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔ）、又はＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（Ｐｈ）、又は他の任意古細菌種に由来するものでもよい。更に他の態様では、シンテターゼ変異体は真正細菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ遺伝子に由来する。真正細菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ配列の資源は特に限定されない。例えば、資源材料は野生型大腸菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードするポリヌクレオチドに由来するものでもよいし、他の任意真正細菌種、例えばＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するものでもよい。
【０１５１】
下記実施例に記載するように、コグネイトｔＲＮＡにチロシンを負荷する野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＭｊＴｙｒ−ＲＳ）を出発材料として使用して変異体シンテターゼライブラリーを作製することができる。同様に実施例に記載するように、コグネイトｔＲＮＡにロイシンを負荷する野生型大腸菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＥｃＬｅｕ−ＲＳ）を出発材料として使用して変異体シンテターゼライブラリーを作製することもできる。しかし、本発明は出発材料としてチロシル特異的アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼに限定するものではない。任意アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを使用することができる。所定態様では、ライブラリー構築の出発材料として選択される特定アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは該当特定非天然アミノ酸の影響を受ける場合がある。例えば、該当非天然アミノ酸が芳香族Ｒ基をもつ場合には、チロシン又はフェニルアラニンに特異的なＲＳをコードする出発材料ポリヌクレオチドを使用して変異体シンテターゼライブラリーを構築すると有利である。
【０１５２】
変異体ＲＳライブラリーはＲＳにアミノ酸結合ポケットを形成するアミノ酸位置のコドンをランダム化することにより作製される。この情報は一般にＲＳの結晶構造の分析により得られる。例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳ−ｔＲＮＡ（Ｔｙｒ）−Ｌ−チロシン複合体の結晶構造（例えばＫｏｂａｙａｓｈｉら，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ，１０：４２５−４３２（２００３）参照）に基づき、ＭｊＴｙｒ−ＲＳシンテターゼのアミノ酸結合ポケット内の特定位置をランダム化した。これらの残基はチロシン結合部位のＴｙｒ−３２、Ｌｅｕ−６５、Ｐｈｅ−１０８、Ｇｌｎ−１０９、Ａｓｐ−１５８及びＬｅｕ−１６２であった。この選択的にランダム化したライブラリーは芳香族側鎖をもつ非天然アミノ酸（限定されないが、例えばアゾベンジル−フェニルアラニン（本明細書では「アゾベンジル−Ｐｈｅ」とも言う））をｔＲＮＡに負荷するシンテターゼ変異体を選択し、非天然アミノ酸を排除するのに有利であると期待された。標的コドンのランダム化はコドンの１、２又は全３個のヌクレオチド位置をランダム化することにより実施することができる。
【０１５３】
ランダム化に選択されるアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸位置はＭｊＴｙｒ−ＲＳのこれらの６個のアミノ酸位置に厳密に限定されない。例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ以外の種に由来するシンテターゼ（例えばＭｊＴｙｒ−ＲＳオーソログ）を突然変異誘発に使用する場合には、シンテターゼオーソログのアミノ酸配列はＭｊＴｙｒ−ＲＳと１００％一致しない場合がある。しかし、Ｔｙｒ−ＲＳ構造は保存され、ＭｊＴｙｒ−ＲＳオーソログに予測することができる。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  Ｔｙｒ−ＲＳのアミノ酸結合ポケット内のアミノ酸に空間的に対応するＭｊＴｙｒ−ＲＳオーソログ内のアミノ酸位置（例えばＴｙｒ−３２、Ｌｅｕ−６５、Ｐｈｅ−１０８、Ｇｌｎ−１０９、Ａｓｐ−１５８及びＬｅｕ−１６２位）はＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  Ｔｙｒ−ＲＳの既知結晶構造に基づいて決定することができる。例えば、ＭｊＴｙｒ−ＲＳの６５位（配列番号４参照）のロイシンはオーソロガスＴｙｒ−ＲＳ（例えばＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍに由来するＴｙｒ−ＲＳ又はＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉに由来するＴｙｒ−ＲＳ）の別のロイシン位置に空間的に対応し得る。当然のことながら、大腸菌ＲＳを含む実施例１のライブラリーの構築にも対応する論理が存在する。
【０１５４】
変異体シンテターゼライブラリーのダイバーシティを最大にすることが好ましい。例えば、所定側面では、変異体ＲＳライブラリーはシンテターゼ変異体をコードする１０９個以上のユニークポリヌクレオチドメンバーをもつことができる。
【０１５５】
当分野で認識されている通り、ポリヌクレオチド配列のライブラリーは適切な宿主に形質転換後に操作（例えば増殖、拡大、培養又はプレーティング）することが多い。下記実施例に記載するような所定側面では、適切な宿主は大腸菌等の真正細菌細胞とすることができる。しかし、適切な真正細菌宿主は大腸菌に限定されず、他の真正細菌宿主も本発明で利用することができる。更に、他の各種態様では、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等の真核生物が適切な宿主細胞を構成することができる。
【０１５６】
本発明は更に該当非天然アミノ酸を組込む所望直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を同定する目的で上記ライブラリー等のライブラリーをスクリーニングする方法も提供する。これらの方法はコグネイトＯ−ｔＲＮＡに該当非天然アミノ酸を負荷し、他の天然アミノ酸は負荷しない能力をもつ変異体シンテターゼをライブラリーから検出する段階を含む。好ましい変異体の選択は一般にポジティブ選択段階とネガティブ選択段階の両者の組合わせを使用するが、所定態様ではポジティブ選択スキームのみを利用することができる。
【０１５７】
１種のポジティブ選択スキームでは、コグネイトｔＲＮＡとセレクターコドン（例えば内部アンバーセレクターコドン）をもつ同時形質転換したクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子も含む形質転換宿主細胞として変異体シンテターゼライブラリーをプレーティングする。他の態様は（例えばウラシル不含培地又はアミノトリアゾールを補充したヒスチジン不含培地での増殖を使用して）実施例１に示すように宿主細胞をスクリーニング／選択することができる。このポジティブ選択スキームでは、非天然アミノ酸（例えばアゾベンジル−フェニルアラニン）とクロラムフェニコールの存在下で細胞を増殖させた場合に細胞生存はアンバーコドンの抑圧に依存する。
【０１５８】
ｔＲＮＡに天然アミノ酸を負荷することが可能なポジティブ選択後のシンテターゼクローンを排除するように、ポジティブ選択スキームを場合によりネガティブ選択スキームと組合わせることができる。例えば、直交ｔＲＮＡと毒性バルナーゼ蛋白質をコードする遺伝子を含む細胞にポジティブ選択後に同定されたクローン変異体シンテターゼ候補を１個以上のセレクターコドンと共に形質転換するか、又はフルオロオロチン酸の存在下でｕｒａ３遺伝子産物を発現させる。これらの細胞を非天然アミノ酸（例えばアゾベンジル−フェニルアラニン）の不在下で増殖させる。これらの条件下で非天然アミノ酸の不在下に増殖できないシンテターゼ変異体クローンはＯ−ｔＲＮＡに天然アミノ酸を負荷するか、又はセレクターコドンが非天然アミノ酸の不在下で毒性レポーターを発現させるのを何らかの方法で妨げると予想されるのでこれらのシンテターゼクローンはそれ以上分析しない。このストラテジーの所定態様では、変異体シンテターゼ候補にポジティブ選択とネガティブ選択を複数ラウンド実施する。
【０１５９】
本発明はポジティブ選択マーカーとしてクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの使用に限定されず、また、本発明はネガティブ選択マーカーとしてバルナーゼの使用に限定されない。任意所与遺伝子産物の発現又は発現の欠如をモニターするために容易に適用可能な代替選択ストラテジーも当業者に認識されよう。これらの代替選択試薬及び方法も本発明の範囲に含まれる。
核酸及びポリペプチド配列と変異体
【０１６０】
上記及び下記に記載するように、本発明は核酸ポリヌクレオチド配列（例えばＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ）及びポリペプチドアミノ酸配列（例えばＯ−ＲＳ）と、前記配列を含む例えば組成物、系及び方法を提供する。前記配列（例えばＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ）の例を本明細書に開示する（本明細書の配列及び実施例参照）。しかし、当業者に自明の通り、本発明は例えば実施例や配列表に記載する厳密な配列に限定されない。当業者に自明の通り、本発明は例えば本明細書に記載する機能をもつ（例えば適切なＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳをコードする）多数の関連及び非関連配列も提供する。
【０１６１】
本発明はポリペプチド（Ｏ−ＲＳ）とポリヌクレオチド（例えばＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ又はその部分をコードするポリヌクレオチド、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼクローンを単離するために使用されるオリゴヌクレオチド等）を提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、１個以上のセレクターコドンをもつ本発明の該当蛋白質又はポリペプチドをコードするものが挙げられる。更に、本発明のポリヌクレオチドとしては、例えば本明細書の配列（例えば配列番号２０〜３２）及び実施例に記載するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；そのポリヌクレオチド配列に相補的であるか又は前記配列をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは更に本明細書の配列（例えば配列番号５〜１７）又は実施例に記載するアミノ酸配列のいずれかを含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドは更に本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。同様に、核酸の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下で上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズする（天然ポリヌクレオチド以外の）人工核酸も本発明のポリヌクレオチドである。１態様では、組成物は本発明のポリペプチドと賦形剤（例えば緩衝液、水、医薬的に許容可能な賦形剤等）を含有する。本発明は本発明のポリペプチドに対して特異的に免疫反応性の抗体又は抗血清も提供する。人工ポリヌクレオチドとは人為的に作製され、天然には存在しないポリヌクレオチドである。
【０１６２】
本発明のポリヌクレオチドは天然に存在するｔＲＮＡ又は本明細書の配列表もしくは実施例に記載する任意ｔＲＮＡもしくはそのコーディング核酸のポリヌクレオチドと例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上一致する人工ポリヌクレオチド（但し、天然に存在するｔＲＮＡ以外のもの）も含む。ポリヌクレオチドは天然に存在するｔＲＮＡのポリヌクレオチドと例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上一致する人工ポリヌクレオチドも含む。
【０１６３】
所定態様では、ベクター（例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス等）に本発明のポリヌクレオチドを組込む。１態様では、ベクターは発現ベクターである。別の態様では、発現ベクターは本発明のポリヌクレオチドの１種以上と機能的に連結されたプロモーターを含む。別の態様では、本発明のポリヌクレオチドを組込んだベクターを細胞に導入する。
【０１６４】
同様に当業者に自明の通り、開示配列の多数の変異体も本発明に含まれる。例えば、機能的に同一配列となる開示配列の保存変異体も本発明に含まれる。少なくとも１種の開示配列とハイブリダイスし、セレクターコドンを認識する核酸ポリヌクレオチド配列の変異体も本発明に含むものとする。例えば標準配列比較法により本明細書に開示する配列のユニークサブ配列であると判断される配列も本発明に含まれる。
保存変異
【０１６５】
遺伝コードの縮重により、「サイレント置換」（即ちコードされるポリペプチドに変化を生じない核酸配列の置換）はアミノ酸をコードする全核酸配列の暗黙の特徴である。同様に、「保存アミノ酸置換」はアミノ酸配列中の１又は数個のアミノ酸を高度に類似する特性をもつ別のアミノ酸で置換するものであり、このような置換も開示構築物と高度に類似することが容易に認められる。各開示配列のこのような保存変異は本発明の特徴である。
【０１６６】
特定核酸配列の「保存変異」とは同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味し、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列を意味する。当業者に自明の通り、コードされる配列中の単一アミノ酸又は低百分率（一般に５％未満、より一般には４％、２％又は１％未満）のアミノ酸を置換、付加又は欠失させる個々の置換、欠失又は付加の結果としてアミノ酸を欠失するか、アミノ酸が付加されるか、又はアミノ酸が化学的に類似するアミノ酸で置換される場合には、これらの変異は「保存修飾変異」である。従って、本発明のポリペプチド配列の「保存変異」としては、ポリペプチド配列のアミノ酸の低百分率、一般に５％未満、より一般には２％又は１％未満が同一保存置換基のアミノ酸で置換される場合が挙げられる。最後に、非機能的配列の付加のように核酸分子のコードされる活性を変えない配列の付加も基本核酸の保存変異である。
【０１６７】
機能的に類似するアミノ酸を示す保存置換表は当分野で周知であり、このようなアミノ酸では、あるアミノ酸残基が同様の化学的性質（例えば芳香族側鎖又は正荷電側鎖）をもつ別のアミノ酸残基に置換しているため、ポリペプチド分子の機能的性質は実質的に変化しない。化学的性質が類似する天然アミノ酸を含む代表的グループを以下に示すが、これらのグループ内の置換は「保存置換」である。
【表１】
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核酸ハイブリダイゼーション
【０１６８】
本発明の核酸の保存変異体を含めて本明細書の配列及び実施例に記載するような本発明の核酸を同定するためには比較ハイブリダイゼーションを使用することができ、この比較ハイブリダイゼーション法は本発明の核酸を無関係の核酸から識別する１つの方法である。更に、高、超高及び超々高ストリンジェンシー条件下で本明細書の配列表（例えば配列番号２０〜３２）及び実施例の配列により表される核酸とハイブリダイズするターゲット核酸も本発明の特徴である。このような核酸の例としては所与核酸配列と比較して１又は数個のサイレント又は保存核酸置換をもつものが挙げられる。
【０１６９】
試験核酸が完全にマッチする相補的ターゲットに比較して少なくとも１／２の割合でプローブとハイブリダイズする場合、即ちマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍〜１０倍で完全にマッチするプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合する条件下におけるプローブとターゲットのハイブリダイゼーションに比較してシグナル対ノイズ比が少なくとも１／２である場合に試験核酸はプローブ核酸と特異的にハイブリダイズすると言う。
【０１７０】
核酸は一般に溶液中で会合するときに「ハイブリダイズ」する。核酸は水素結合、溶媒排除、塩基スタッキング等の種々の十分に特性決定された物理化学的力によりハイブリダイズする。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｐａｒｔ  Ｉ  ｃｈａｐｔｅｒ  ２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ，”（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）及びＡｕｓｕｂｅｌ，後出に記載されている。Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  １  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  １）及びＨａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  ２  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ２）はオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡとＲＮＡの合成、標識、検出及び定量について詳細に記載している。
【０１７１】
サザン又はノーザンブロットで１００個を上回る相補的残基をもつ相補的核酸のハイブリダイゼーションをフィルター上で行うためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件の１例は、５０％ホルマリンにヘパリン１ｍｇを加え、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施する。ストリンジェント洗浄条件の１例は６５℃、０．２×ＳＳＣで１５分間洗浄する（ＳＳＣ緩衝液の説明についてはＳａｍｂｒｏｏｋ，後出参照）。多くの場合には高ストリンジェンシー洗浄の前に低ストリンジェンシー洗浄を実施してバックグラウンドプローブシグナルを除去する。低ストリンジェンシー洗浄の１例は４０℃、２×ＳＳＣで１５分間である。一般に、シグナル対ノイズ比が特定ハイブリダイゼーションアッセイで無関係プローブに観測される比の５倍（以上）である場合に特異的ハイブリダイゼーションが検出されたとみなす。
【０１７２】
サザン及びノーザンハイブリダイゼーション等の核酸ハイブリダイゼーション実験において「ストリンジェントハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存性であり、各種環境パラメーターにより異なる。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３），前出やＨａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  １及び２に記載されている。ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件は任意試験核酸について経験により容易に決定することができる。例えば、高ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件を決定するには、一連の選択基準に合致するまで（例えばハイブリダイゼーション又は洗浄における温度上昇、塩濃度低下、界面活性剤濃度増加及び／又はホルマリン等の有機溶媒濃度増加により）ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を徐々に増加する。例えば、マッチしないターゲットとプローブのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍でプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合するまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件を徐々に増加する。
【０１７３】
「超ストリンジェント」条件は特定プローブの熱融点（Ｔｍ）に等しくなるように選択される。Ｔｍは（規定イオン強度及びｐＨ下で）試験配列の５０％が完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度である。本発明の目的には、一般に規定イオン強度及びｐＨで特定配列のＴｍよりも約５℃低くなるように「高ストリンジェント」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を選択する。
【０１７４】
「超高ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブの結合に観測されるシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増加する条件である。完全にマッチする相補的ターゲット核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下にプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
【０１７５】
同様に、該当ハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を徐々に増加することにより更に高いレベルのストリンジェンシーを決定することもできる。例えば、完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブの結合に観測されるシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、１００倍又は５００倍以上になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増加する条件である。完全にマッチする相補的ターゲット核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下にプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超々高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
【０１７６】
ストリンジェント条件下で相互にハイブリダイズしない核酸でも、これらの核酸によりコードされるポリペプチドが実質的に同一である場合には実質的に同一である。これは、例えば遺伝コードに許容される最大コドン縮重を使用して核酸のコピーを作製する場合に該当する。
ユニークサブ配列
【０１７７】
１側面では、本発明は本明細書（例えば下記実施例及び配列表参照）に開示するＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの配列から選択される核酸中にユニークサブ配列を含む核酸を提供する。ユニークサブ配列は従来公知の任意Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ核酸配列に対応する核酸に比較してユニークである。例えばデフォルトパラメーターに設定したＢＬＡＳＴを使用してアラインメントを実施することができる。任意ユニークサブ配列は例えば本発明の核酸を同定するためのプローブとして有用である。
【０１７８】
同様に、本発明は本明細書（例えば下記実施例及び配列表参照）に開示するＯ−ＲＳの配列から選択されるポリペプチド中にユニークサブ配列を含むポリペプチドを含む。この場合には、ユニークサブ配列は従来公知の任意ＲＳ配列に対応するポリペプチドに比較してユニークである。
【０１７９】
本発明はＯ−ＲＳの配列から選択されるポリペプチド中のユニークサブ配列をコードするユニークコーディングオリゴヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするターゲット核酸も提供し、この場合には、ユニークサブ配列は対照ポリペプチド（例えば本発明のシンテターゼを例えば突然変異により誘導した元の親配列）の任意のものに対応するポリペプチドに比較してユニークである。ユニーク配列は上記のように決定する。
配列比較、一致度及び相同度
【０１８０】
２種以上の核酸又はポリペプチド配列に関して「一致」又は「一致度」百分率なる用語は２種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、以下に記載する配列比較アルゴリズム（又は当業者に入手可能な他のアルゴリズム）の１種を使用するか又は目視により測定した場合に相互に同一であるか又は同一のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの百分率が特定値であることを意味する。
【０１８１】
２種以上の核酸又はポリペプチド（例えばＯ−ｔＲＮＡもしくはＯ−ＲＳをコードするＤＮＡ又はＯ−ＲＳのアミノ酸配列）に関して「実質的に一致」なる用語は２種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、配列比較アルゴリズムを使用するか又は目視により測定した場合にヌクレオチド又はアミノ酸残基一致度が少なくとも約６０％、約８０％、約９０〜９５％、約９８％、約９９％又はそれ以上であることを意味する。このような「実質的に一致」する配列は一般に実際の起源が記載されていなくても「相同」であるとみなす。少なくとも約５０残基長の配列の領域、より好ましくは少なくとも約１００残基長の領域にわたって「実質的一致」が存在していることが好ましく、少なくとも約１５０残基又は比較する２配列の全長にわたって配列が実質的に一致していることが最も好ましい。
【０１８２】
蛋白質及び／又は蛋白質配列は共通の祖先蛋白質又は蛋白質配列から天然又は人工的に誘導される場合に「相同」である。同様に、核酸及び／又は核酸配列は共通の祖先核酸又は核酸配列から天然又は人工的に誘導される場合に相同である。例えば、１個以上のセレクターコドンを含むように任意天然核酸を利用可能な任意突然変異誘発法により改変することができる。この突然変異誘発した核酸は発現されると、１種以上の光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、又はα−アミノカプリル酸（例えば非天然アミノ酸）を含むポリペプチドをコードすることができる。突然変異法は当然のことながら更に１個以上の標準コドンを変異させ、得られる突然変異体蛋白質の１個以上の標準アミノ酸も変異させることができる。相同性は一般に２種以上の核酸又は蛋白質（又はその配列）間の配列類似度から推定される。相同性の判定に有用な配列間類似度の厳密な百分率は該当核酸及び蛋白質により異なるが、通常は２５％程度の低い配列類似度を使用して相同性を判定する。例えば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％以上のより高レベルの配列類似度を使用して相同性を判定することもできる。配列類似度百分率の決定方法（例えばデフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ）は本明細書に記載し、一般に入手可能である。
【０１８３】
配列比較及び相同性判定には、一般にある配列を参照配列としてこれに試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、試験配列と参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。こうすると、配列比較アルゴリズムは指定プログラムパラメーターに基づいて参照配列に対して試験配列の配列一致度百分率を計算する。
【０１８４】
比較のための最適な配列アラインメントは例えばＳｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性探索法、これらのアルゴリズムのコンピューターソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視（一般にＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（２００４年補遺）参照）により実施することができる。
【０１８５】
配列一致度及び配列類似度百分率を決定するのに適したアルゴリズムの１例はＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公共入手可能である。このアルゴリズムはデータベース配列中の同一長さの単語と整列した場合に所定の正の閾値スコアＴと一致するか又はこれを満足するクエリー配列中の長さＷの短い単語を識別することによりまず高スコア配列対（ＨＳＰ）を識別する。Ｔを隣接単語スコア閾値と言う（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，前出）。これらの初期隣接単語ヒットをシードとして検索を開始し、これらの単語を含むもっと長いＨＳＰを探索する。次に、累積アラインメントスコアを増加できる限り、単語ヒットを各配列に沿って両方向に延長する。ヌクレオチド配列の場合にはパラメーターＭ（１対のマッチ残基のリウォードスコア、常に＞０）及びＮ（ミスマッチ残基のペナルティースコア、常に＜０）を使用して累積スコアを計算する。アミノ酸配列の場合には、スコアリングマトリクスを使用して累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Ｘだけ低下するか、累積スコアが１カ所以上の負スコア残基アラインメントの累積によりゼロ以下になるか、又はどちらかの配列の末端に達したら各方向の単語ヒットの延長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸはアラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は語長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列用として、ＢＬＡＳＴＰプログラムは語長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスをデフォルトとして使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５参照）。
【０１８６】
配列一致度百分率の計算に加え、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２配列間の類似性の統計分析も実施する（例えばＫａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７（１９９３）参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１尺度は２種のヌクレオチド又はアミノ酸配列間に偶然にマッチが起こる確率を示す最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸を参照核酸に比較した場合の最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に核酸は参照核酸に類似しているとみなす。
突然変異誘発及び他の分子生物学技術
【０１８７】
本発明のポリヌクレオチドとポリペプチド及び本発明で使用されるポリヌクレオチドとポリペプチドは分子生物学技術を使用して操作することができる。分子生物学技術について記載している一般教科書としてはＢｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（２００３年補遺）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」））が挙げられる。これらの教科書は突然変異誘発、ベクターの使用、プロモーター及び他の多くの関連事項について記載しており、例えばＯＭｅ−Ｌ−チロシン、又はα−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸、直交ｔＲＮＡ、直交シンテターゼ及びその対を含む蛋白質を生産するためのセレクターコドンを含む遺伝子の作製についても記載している。
【０１８８】
例えばｔＲＮＡ分子を突然変異させるため、ｔＲＮＡのライブラリーを作製するため、シンテターゼのライブラリーを作製するため、光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、又はα−アミノカプリル酸をコードするセレクターコドンを該当蛋白質又はポリペプチドに挿入するために、本発明では各種突然変異誘発を使用する。これらの例としては限定されないが、部位特異的、ランダム点突然変異誘発、相同組換え、ＤＮＡシャフリング又は他の帰納的突然変異誘発法、キメラ構築、ウラシル含有鋳型を使用する突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップデュプレクスＤＮＡを使用する突然変異誘発等、又はその任意組み合わせが挙げられる。他の適切な方法としては点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用する突然変異誘発、制限−選択及び制限−精製、欠失突然変異誘発、完全遺伝子合成による突然変異誘発、２本鎖切断修復等が挙げられる。例えばキメラ構築物を使用する突然変異誘発も本発明に含まれる。１態様では、天然分子又は改変もしくは突然変異させた天然分子の既知情報（例えば配列、配列比較、物性、結晶構造等）に基づいて突然変異誘発を行うことができる。
【０１８９】
本発明のポリヌクレオチド又は本発明のポリヌクレオチドを組込んだ構築物（例えばクローニングベクター又は発現ベクター等の本発明のベクター）で宿主細胞を遺伝子組換え（例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクション）する。例えば、直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡシンテターゼ、及び誘導体化すべき蛋白質のコーディング領域を所望宿主細胞で機能的な遺伝子発現制御エレメントに機能的に連結する。典型的なベクターは転写及び翻訳ターミネーターと、転写及び翻訳開始配列と、特定ターゲット核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは場合により少なくとも１個の独立ターミネーター配列と、真核生物又は原核生物又は両者（例えばシャトルベクター）でカセットの複製を可能にする配列と、原核系と真核系の両者の選択マーカーを含む包括的発現カセットを含む。ベクターは原核生物、真核生物、又は好ましくは両者での複製及び／又は組込みに適している。Ｇｉｌｉｍａｎ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ  ８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６４３５：１０（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｂｅｒｇｅｒ（いずれも前出）参照。ベクターは例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。ベクターはエレクトロポレーション（Ｆｒｏｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，５８２４（１９８５））、ウイルスベクターによる感染、核酸を小ビーズもしくは粒子のマトリックスに埋込むか又は表面に付着させて小粒子形態で高速射入する方法（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２７，７０−７３（１９８７））、及び／又は同等方法等の標準方法により細胞及び／又は微生物に導入する。
【０１９０】
クローニングに有用な細菌とバクテリオファージのカタログは例えばＡＴＣＣから入手でき、例えばＡＴＣＣから刊行されたＴｈｅ  ＡＴＣＣ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ（１９９６）Ｇｈｅｒｎａら（編）が挙げられる。その他のシーケンシング、クローニング及び分子生物学の他の側面の基本手順と基礎理論事項もＳａｍｂｒｏｏｋ（前出），Ａｕｓｕｂｅｌ（前出）及びＷａｔｓｏｎら（１９９２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，ＮＹに記載されている。更に、Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ  ｍｃｒｃ．ｃｏｍ）、Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒａｍｏｎａ，ＣＡ，世界ウェブｇｅｎｃｏ．ｃｏｍ参照）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，世界ウェブｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍ参照）、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）及び他の多数の企業等の各種販売会社からほぼ任意核酸（及び標準又は標準外を問わずほぼ任意標識核酸）をオーダーメード又は標準注文することができる。
【０１９１】
遺伝子組換えした宿主細胞は例えばスクリーニング段階、プロモーター活性化又は形質転換細胞選択等の操作に合うように適宜改変した慣用栄養培地で培養することができる。これらの細胞は場合によりトランスジェニック生物で培養することができる。（例えば後期核酸単離のための）例えば細胞単離及び培養に関する他の有用な文献としてはＦｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第３版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋとその引用文献；Ｐａｙｎｅら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（ｅｄｓ）（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）及びＡｔｌａｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ（ｅｄｓ）Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬが挙げられる。
該当蛋白質及びポリペプチド
【０１９２】
例えば少なくとも１種の光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）、又はＯＭｅ−Ｌ−チロシン、又はα−アミノカプリル酸を組込んだ該当蛋白質又はポリペプチドと、２種以上の異なる非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドも本発明の特徴である。賦形剤（例えば医薬的に許容可能な賦形剤）も蛋白質に添加することができる。場合により、本発明の蛋白質は翻訳後修飾を含む。
【０１９３】
ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸又は他の非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ蛋白質を細胞で生産する方法も本発明の特徴である。例えば、１方法は、少なくとも１個のセレクターコドンを含み且つ蛋白質をコードする核酸を導入した細胞を適当な培地で増殖させる段階と、光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、又はα−アミノカプリル酸又は他の非天然アミノ酸を提供する段階を含み；細胞は更に、細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；Ｏ−ｔＲＮＡを光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、又はα−アミノカプリル酸又は他の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは本明細書の配列及び実施例に記載するポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡに比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の抑圧効率を含む。この方法により生産された蛋白質も本発明の特徴である。
【０１９４】
本発明はＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸を組込んだ蛋白質を含有する組成物も提供する。所定態様では、蛋白質は治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分等のアミノ酸配列と少なくとも７５％一致しており、例えば光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、又はα−アミノカプリル酸等の１種以上の非天然アミノ酸の導入によりターゲット蛋白質と相違するアミノ酸配列を含む。
【０１９５】
本発明の組成物と本発明の方法により作製された組成物は場合により細胞に導入する。その後、本発明のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対又は個々の成分を宿主系の翻訳機構で使用することができ、その結果として、光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、又はα−アミノカプリル酸は蛋白質に組込まれる。国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１７８６号、出願日２００４年４月１６日、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」；及びＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」はこのプロセスを記載しており、参考資料として本明細書に組込む。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を宿主（例えば大腸菌又はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に導入すると、前記対はセレクターコドンに応答して外部から増殖培地に添加することができる合成アミノ酸（例えばＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸）のｉｎ  ｖｉｖｏ蛋白質組込みを誘導する。場合により、本発明の組成物はｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系に導入してもよいし、ｉｎ  ｖｉｖｏ系に導入してもよい。
【０１９６】
本発明の細胞は非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を大量の有用な量で合成することができる。１側面では、組成物は場合により、光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、又はα−アミノカプリル酸又は複数の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を例えば少なくとも１０μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも７５μｇ、少なくとも１００μｇ、少なくとも２００μｇ、少なくとも２５０μｇ、少なくとも５００μｇ、少なくとも１ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ以上、又はそれ以上、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏ蛋白質生産方法で達成可能な量で含有する（組換え蛋白質生産及び精製に関する詳細は本明細書に記載する）。別の側面では、蛋白質は場合により例えば細胞溶解液、緩衝液、医薬緩衝液、又は他の懸濁液中（例えば約１ｎｌ〜約１００Ｌの任意の容量中）に例えば少なくとも１０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも５０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも７５μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも１００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも２００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも２５０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも５００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも１ｍｇ蛋白質／ｌ、又は少なくとも１０ｍｇ蛋白質／ｌ以上の濃度で組成物中に存在する。少なくとも１種の光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、又はα−アミノカプリル酸を組込んだ蛋白質を細胞で大量（例えば他の方法、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳で一般に可能な量よりも多量）に生産することも本発明の特徴である。
【０１９７】
ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸又は他の非天然アミノ酸の組込みは例えば寸法、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼ標的部位接近性、（例えば蛋白質アレーのための）部分へのターゲット等を変化させるように例えば蛋白質構造及び／又は機能の変化を調整するために実施することができる。光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、又はα−アミノカプリル酸を組込んだ蛋白質は触媒性又は物性を強化するか又は全く新規にすることができる。例えば、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸又は他の非天然アミノ酸を蛋白質に組込むことにより、場合により毒性、生体分布、構造的性質、分光学的性質、化学及び／又は光化学的性質、触媒能、半減期（例えば血清半減期）、他の分子との（例えば共有又は非共有）反応性等の性質を改変する。少なくとも１種の光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、又はα−アミノカプリル酸を組込んだ蛋白質を含有する組成物は例えば新規治療、診断、触媒酵素、産業用酵素、結合蛋白質（例えば抗体）、及び例えば蛋白質構造と機能の研究に有用である。例えばＤｏｕｇｈｅｒｔｙ，（２０００）Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｓ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：６４５−６５２参照。更に、１種以上の非天然アミノ酸をポリペプチドに組込み、例えばポリペプチドを固体支持体に固定するための分子タグを提供することができる。非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを使用してアレーを作製する方法の詳細については、例えばＷａｎｇとＳｃｈｕｌｔｚの２００３年１２月２２日付け出願、発明の名称「蛋白質アレー（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＡＲＲＡＹＳ）」、代理人整理番号５４−０００８１０ＰＣ参照。
【０１９８】
本発明の１側面では、組成物は少なくとも１個、例えば少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、又は少なくとも１０個以上の非天然アミノ酸（例えば光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、又はα−アミノカプリル酸及び／又は他の非天然アミノ酸）を組込んだ少なくとも１種の蛋白質を含有する。非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよく、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０種以上の異なる非天然アミノ酸を含む１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上の異なる部位が蛋白質に存在することができる。別の側面では、組成物は蛋白質に存在する特定アミノ酸の全部よりは少ないが少なくとも１個がＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸で置換された蛋白質を含有する。２個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよい（例えば蛋白質は２個以上の異なる型の非天然アミノ酸を組込んでもよいし、２個の同一非天然アミノ酸を組込んでもよい）。３個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよいし、同一種の複数の非天然アミノ酸と少なくとも１個の別の非天然アミノ酸の組み合わせでもよい。
【０１９９】
本明細書に記載する組成物と方法を使用して光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、又はα−アミノカプリル酸等の非天然アミノ酸を組込むか、又は複数の異なる非天然アミノ酸（及び例えば１個以上のセレクターコドンを含む対応する任意コーディング核酸）をコードするほぼ任意蛋白質（又はその部分）を生産することができる。数十万種の公知蛋白質を同定しようとするのではなく、例えば該当翻訳系に１個以上の適当なセレクターコドンを含むように入手可能な任意突然変異法を調整することにより、１種以上の非天然アミノ酸を組込むように公知蛋白質の任意のものを改変することができる。公知蛋白質の一般的な配列寄託機関としてはＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ及びＮＣＢＩが挙げられる。他の寄託機関もインターネットを検索することにより容易に確認できる。
【０２００】
一般に、蛋白質は入手可能な任意蛋白質（例えば治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分等）と例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％以上一致しており、１種以上の非天然アミノ酸を含む。１種以上の光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、又はα−アミノカプリル酸を組込むように改変することができる治療用、診断用、及び他の蛋白質の例としては限定されないが、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１７８６号、出願日２００４年４月１６日、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」；及びＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」に記載されているものが挙げられる。１種以上のホモグルタミンを組込むように改変することができる治療用、診断用、及び他の蛋白質の例としては限定されないが、例えばα１アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、抗体、アポリポ蛋白質、アポ蛋白質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン（例えばＴ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ−４、ＭＩＧ）、カルシトニン、ＣＣケモカイン（例えば単球化学誘引蛋白質−１、単球化学誘引蛋白質−２、単球化学誘引蛋白質−３、単球炎症性蛋白質−１α、単球炎症性蛋白質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２）、ＣＤ４０リガンド、Ｃキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン（例えば上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（「ＥＰＯ」）、表皮剥離毒素Ａ及びＢ、ＩＸ因子、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、増殖因子、ヘッジホッグ蛋白質（例えばソニック、インディアン、デザート）、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インターフェロン（例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２等）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成蛋白質、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチド���ルモン（例えばヒト成長ホルモン）、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱外毒素Ａ、Ｂ及びＣ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体（ＩＬ−１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５）、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原即ちブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、毒素性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）、チモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）、ウロキナーゼ及び他の多数の蛋白質が挙げられる。
【０２０１】
本明細書に記載するＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ組込み用組成物及び方法を使用して生産することができる蛋白質の１類としては転写モジュレーター又はその部分が挙げられる。転写モジュレーターの例としては細胞増殖、分化、制御等を調節する遺伝子及び転写モジュレーター蛋白質が挙げられる。転写モジュレーターは原核生物、ウイルス及び真核生物（例えば真菌、植物、酵母、昆虫、及び哺乳動物を含む動物）に存在し、広範な治療ターゲットを提供する。当然のことながら、発現及び転写アクチベーターは例えば受容体との結合、シグナル伝達カスケードの刺激、転写因子の発現調節、プロモーターやエンハンサーとの結合、プロモーターやエンハンサーと結合する蛋白質との結合、ＤＮＡ巻き戻し、プレｍＲＮＡスプライシング、ＲＮＡポリアデニル化及びＲＮＡ分解等の多数のメカニズムにより転写を調節する。
【０２０２】
本発明の蛋白質（例えば１種以上のＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸を組込んだ蛋白質）の１類としては発現アクチベーター（例えばサイトカイン、炎症性分子、増殖因子、その受容体、及び腫瘍遺伝子産物、例えばインターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８等）、インターフェロン、ＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＳＣＦ／ｃ−キット、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１及びヒアルリン／ＣＤ４４）；シグナル伝達分子及び対応する腫瘍遺伝子産物（例えばＭｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ及びＭｅｔ）；並びに転写アクチベーター及びサプレッサー（例えばｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、及びステロイドホルモン受容体（例えばエストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、アルドステロン、ＬＤＬ受容体リガンド及びコルチコステロン））が挙げられる。
【０２０３】
少なくとも１種のＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸を組込んだ酵素（例えば産業用酵素）又はその部分も本発明により提供される。酵素の例としては限定されないが、例えばアミダーゼ、アミノ酸ラセマーゼ、アシラーゼ、デハロゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、ジアリールプロパンペルオキシダーゼ、エピメラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ハロペルオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼ（例えばｐ４５０類）、リパーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、スブチリシン、トランスアミナーゼ及びヌクレアーゼが挙げられる。
【０２０４】
これらの蛋白質の多くは市販されており（例えばＳｉｇｍａ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  ２００３カタログ及び価格表参照）、対応する蛋白質配列と遺伝子及び、一般に多くのその変異体も周知である（例えばＧｅｎｂａｎｋ参照）。例えば１種以上の該当治療、診断又は酵素特性に関して蛋白質を改変するように本発明に従って１種以上の光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、又はα−アミノカプリル酸又は他の非天然アミノ酸を挿入することにより前記蛋白質の任意のものを改変することができる。治療関連特性の例としては血清半減期、貯蔵半減期、安定性、免疫原性、治療活性、（例えば非天然アミノ酸（例えば光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、又はα−アミノカプリル酸）へのレポーター基（例えばラベル又はラベル結合部位）の付加による）検出性、ＬＤ５０又は他の副作用の低減、胃管を経由して体内に導入できること（例えば経口利用性）等が挙げられる。診断特性の例としては貯蔵半減期、安定性、診断活性、検出性等が挙げられる。該当酵素特性の例としては貯蔵半減期、安定性、酵素活性、産生能等が挙げられる。
【０２０５】
他の各種蛋白質も本発明の１種以上のＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸又は他の非天然アミノ酸を組込むように改変することができる。例えば、本発明は例えば感染性真菌（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ種）；細菌、特に病原細菌モデルとして利用できる大腸菌や医学的に重要な細菌（例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ（例えばａｕｒｅｕｓ）又はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ（例えばｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））；原生動物（例えば胞子虫類（例えばＰｌａｓｍｏｄｉａ）、根足虫類（例えばＥｎｔａｍｏｅｂａ）及び鞭毛虫類（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ、Ｇｉａｒｄｉａ等））；ウイルス（例えば（＋）ＲＮＡウイルス（例えばポックスウイルス（例えばワクシニア）、ピコルナウイルス（例えばポリオ）、トガウイルス（例えば風疹）、フラビウイルス（例えばＨＣＶ）、及びコロナウイルス）、（−）ＲＮＡウイルス（例えばラブドウイルス（例えばＶＳＶ）、パラミクソウイルス（例えばＲＳＶ）、オルトミクソウイルス（例えばインフルエンザ）、ブンヤウイルス及びアレナウイルス）、ｄｓＤＮＡウイルス（例えばレオウイルス）、ＲＮＡ→ＤＮＡウイルス（即ちレトロウイルス、例えばＨＩＶ及びＨＴＬＶ）、及び所定のＤＮＡ→ＲＮＡウイルス（例えばＢ型肝炎））に由来する蛋白質において、１種以上のワクチン蛋白質中の１種以上の天然アミノ酸を光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、又はα−アミノカプリル酸で置換することができる。
【０２０６】
昆虫耐性蛋白質（例えばＣｒｙ蛋白質）、澱粉及び脂質産生酵素、植物及び昆虫毒素、毒素耐性蛋白質、マイコトキシン解毒蛋白質、植物成長酵素（例えばリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ、「ＲＵＢＩＳＣＯ」）、リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）及びホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシラーゼ等の農業関連蛋白質もＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸又は他の非天然アミノ酸修飾の適切なターゲットである。
【０２０７】
所定態様では、本発明の方法及び／又は組成物における該当蛋白質又はポリペプチド（又はその部分）は核酸によりコードされる。一般に、核酸は少なくとも１個のセレクターコドン、少なくとも２個のセレクターコドン、少なくとも３個のセレクターコドン、少なくとも４個のセレクターコドン、少なくとも５個のセレクターコドン、少なくとも６個のセレクターコドン、少なくとも７個のセレクターコドン、少なくとも８個のセレクターコドン、少なくとも９個のセレクターコドン、１０個以上のセレクターコドンを含む。
【０２０８】
該当蛋白質又はポリペプチドをコードする遺伝子は例えば光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、又はα−アミノカプリル酸を組込むために１個以上のセレクターコドンを付加するように本明細書の「突然変異誘発及び他の分子生物学技術」のセクションに記載する当業者に周知の方法を使用して突然変異誘発することができる。例えば、１個以上のセレクターコドンを付加するように該当蛋白質の核酸を突然変異誘発し、１種以上のＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸を挿入できるようにする。本発明は例えば少なくとも１種の光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、又はα−アミノカプリル酸を組込んだ任意蛋白質のこのような任意変異体（例えば突然変異体、変形）を含む。同様に、本発明は対応する核酸、即ち１種以上のＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸をコードする１個以上のセレクターコドンをもつ任意核酸も含む。
【０２０９】
光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、又はα−アミノカプリル酸を組込んだ蛋白質を生産するためには、直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対による光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、又はα−アミノカプリル酸のｉｎ  ｖｉｖｏ組込みに適した宿主細胞及び生物を使用することができる。直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡシンテターゼ、及び誘導体化すべき蛋白質をコードするベクターを発現する１種以上のベクターで宿主細胞を遺伝子組換え（例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクション）する。これらの成分の各々を同一ベクターに配置してもよいし、各々別々のベクターに配置してもよいし、２成分を第１のベクターに配置し、第３の成分を第２のベクターに配置してもよい。ベクターは例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。
免疫反応性によるポリペプチドの定義
【０２１０】
本発明のポリペプチドは（例えば本発明の翻訳系で合成される蛋白質の場合にはＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸を含み、例えば新規シンテターゼの場合には標準アミノ酸の新規配列を含む）種々の新規ポリペプチド配列を提供するので、ポリペプチドは例えばイムノアッセイで認識することができる新規構造特徴も提供する。本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗血清の作製及び前記抗血清と結合するポリペプチドも本発明の特徴の１つである。本明細書で使用する「抗体」なる用語は限定されないが、検体（抗原）と特異的に結合してこれを認識する１又は複数の免疫グロブリン遺伝子又はそのフラグメントにより実質的にコードされるポリペプチドを意味する。例としてはポリクローナル、モノクローナル、キメラ、及び１本鎖抗体等が挙げられる。Ｆａｂフラグメントやファージディスプレイを含む発現ライブラリーにより生産されるフラグメント等の免疫グロブリンフラグメントも本明細書で使用する「抗体」なる用語に含まれる。抗体構造及び用語については、例えばＰａｕｌ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．，１９９９，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照。
【０２１１】
イムノアッセイ用抗血清を作製するためには、免疫原性ポリペプチドの１種以上を本明細書に記載するように作製し、精製する。例えば、組換え蛋白質を組換え細胞で生産することができる。（マウスの仮想遺伝子一致により結果の再現性が高いのでこのアッセイで使用する）近交系マウスに標準マウス免疫プロトコールに従って標準アジュバント（例えばフロイントアジュバント）と共に免疫原性蛋白質を免疫する（抗体作製、イムノアッセイフォーマット及び特異的免疫反応性を測定するために使用可能な条件の標準解説については例えばＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。蛋白質、抗体、抗血清等に関するその他の詳細はＵＳＳＮ６０／４７９，９３１、６０／４６３，８６９、及び６０／４９６，５４８、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」；２００３年１月１６日付け特許出願、発明の名称「糖蛋白質合成（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、ＵＳＳＮ６０／４４１，４５０；並びに２００２年１２月２２日付け特許出願、発明の名称「蛋白質アレー（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｒａｙｓ）」、代理人整理番号Ｐ１００１ＵＳ００に記載されている。
Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ及びＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の使用
【０２１２】
本発明の組成物と本発明の方法により作製された組成物は場合により細胞に導入する。本発明のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対又は個々の成分をその後、宿主系の翻訳機構で使用することができ、その結果として、光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、又はα−アミノカプリル酸は蛋白質に組込まれる。特許出願ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（Ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ）」、発明者Ｓｃｈｕｌｔｚらは本発明で使用可能なプロセスを記載しており、参考資料として本明細書に組込む。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を宿主（例えば大腸菌又は酵母）に導入すると、前記対はセレクターコドン（例えばアンバーナンセンスコドン）に応答して外部から増殖培地に添加することができる光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、又はα−アミノカプリル酸のｉｎ  ｖｉｖｏ蛋白質（例えばミオグロビン又は治療用蛋白質）組込みを誘導する。場合により、本発明の組成物はｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系に導入してもよいし、ｉｎ  ｖｉｖｏ系に導入してもよい。光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、又はα−アミノカプリル酸を組込んだ蛋白質は治療用蛋白質として使用することもできるし、蛋白質構造、他の蛋白質との相互作用、蛋白質中の電子移動プロセス等の研究を助長するために使用することもできる。
キット
【０２１３】
キットも本発明の特徴である。例えば、少なくとも１種のＯＭｅ−Ｌ−チロシン、α−アミノカプリル酸、又はｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ等の光調節型アミノ酸を組込んだ蛋白質を細胞で生産するためのキットが提供され、前記キットはＯ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、及び／又はＯ−ｔＲＮＡ、及び／又はＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチド配列、及び／又はＯ−ＲＳを収容する容器を含む。１態様では、キットは更に光調節型アミノ酸（例えばｏ−ニトロベンジルシステインやアゾベンジル−Ｐｈｅ）、ＯＭｅ−Ｌ−チロシン、又はα−アミノカプリル酸を含む。別の態様では、キットは更に蛋白質を生産するための説明書を含む。キット形態の生産に適した包装材料（例えば容器等）と本発明の任意組成物、系又は装置を組み合わせることもできる。
【０２１４】
以下、実施例により本発明を例証するが、発明を限定するものではない。特許請求の範囲に記載する発明の範囲から逸脱せずに変更可能な種々の非必須パラメーターが当業者に自明である。
【実施例１】
【０２１５】
直交シンテターゼ／ｔＲＮＡ対の作製
本実施例はアンバーナンセンスコドンＴＡＧに応答してＯ−Ｍｅ−Ｌ−チロシン、Ｃ８アミノ酸としてα−アミノカプリル酸、及びフォトケージドアミノ酸としてｏ−ニトロベンジルシステインを酵母の蛋白質に選択的に組込むために使用した新規直交大腸菌ｔＲＮＡＬｅｕ／ロイシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＬＲＳ）対の作製について記載する。更に、アポトーシス促進性システインプロテアーゼであるカスパーゼ３の活性を光調節するために最後のアミノ酸、即ちｏ−ニトロベンジルシステインを使用できることを示す。前記及び他の直交ｔＲＮＡシンテターゼ対の開発により、細菌、酵母等の蛋白質に選択的に導入可能なアミノ酸の種類と個数が更に拡大する。
【０２１６】
相同Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓロイシルｔＲＮＡシンテターゼ（ｔｔＬＲＳ）の結晶構造（Ｃｕｓａｃｋら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０００，１９：２３５１−６３）に基づき、多様なアミノ酸側鎖を受容するように大腸菌ロイシルシンテターゼ（ｅｃＬＲＳ）活性部位を進化させることができるのではないかと期待された。ロイシン結合部位は側鎖から構成される比較的大きなキャビティであり、主鎖エレメントがないため、多数の突然変異体活性部位配置が可能になる。更に、大腸菌ロイシルｔＲＮＡとコグネイトシンテターゼから誘導されるアンバーサプレッサーｔＲＮＡシンテターゼ対は酵母で直交性であり、即ちこの対は宿主ｔＲＮＡ又はシンテターゼのいずれとも相互作用しないのではないかと期待された。例えばＳｏｍａら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９８，２６：４３７４−８１；Ｓｏｍａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９６，２６３：７０７−１４；及びＡｓａｈａｒａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９３，２３１：２１９−２９参照。この条件では、（内在アミノ酸ではなく）非天然アミノ酸のみがアンバーコドンにより指定される蛋白質の部位に組込まれ、他の部位には組込まれないようにすることができると思われる。
【０２１７】
アンチコドンループにＵ３５とＡ３７をもつ大腸菌ロイシルサプレッサーｔＲＮＡＣＵＡ（Ｌｅｕ５ＣＵＡ）（図１Ａ）と対応するｅｃＬＲＳの直交性をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの選択株［ＭａＶ２０３：ｐＧＡＤＧＡＬ４（２ＴＡＧ）］でｉｎ  ｖｉｖｏ試験した。Ｃｈｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３，３０１：９６４−７参照。この株は転写アクチベーターＧＡＬ４を含み、２個の許容部位（Ｔｈｒ４４及びＡｒｇ１１０）にアンバーコドンを含む。両者部位の効率的抑圧により３種のレポーター遺伝子ｌａｃＺ、ｈｉｓ３、及びｕｒａ３が発現される。Ｌｅｕ５ＣＵＡ又はｅｃＬＲＳ単独の存在下では、形質転換細胞からの溶解液中に残留活性を上回る有意β−ガラクトシダーゼ活性は検出されなかった。他方、Ｌｅｕ５ＣＵＡとｅｃＬＲＳの両者を同時に発現させると、従来報告されている大腸菌ｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡ／ｅｃＹＲＳアンバーサプレッサー対の活性と同様に１０４倍を上回る活性増加を生じた。同書参照。これらの結果から、このロイシル対は直交性であり、酵母でＴＡＧコドンに応答してロイシンを放出するように効率的に機能できることが示唆された。
【０２１８】
非天然アミノ酸に特異的なロイシルシンテターゼを開発するために、残基Ｍｅｔ４０、Ｌｅｕ４１、Ｔｙｒ４９９、Ｔｙｒ５２７、及びＨｉｓ５３７（ｔｔＬＲＳにおける対応残基はＭｅｔ４０、Ｐｈｅ４１、Ｔｙｒ５０７、Ｔｙｒ５３５、及びＨｉｓ５４５である）を同時にランダム化し、〜１０７個の突然変異体を含む活性部位ライブラリーを作製した。図１Ｂ及びＣｈｉｎら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００３，１０：５１１−９参照。図１Ｂには、ロイシルスルファモイルアデニル酸阻害剤１００（ＰＤＢエントリー１Ｈ３Ｎ）が結合したｔｔＬＲＳ活性部位を示す。実施例１のシンテターゼライブラリーの作製でランダム化した残基１１０はそのアミノ酸記号で示す。ＬＲＳの触媒ドメインは一次配列の２個の不連続部分であるＮ末端側の１２０とＣ末端の１３０から構成される。これらの残基はロイシン側鎖の１個のγ−メチル基の周囲の大きな疎水性ポケットを形成し、細菌ＬＲＳで高度に保存されている。異なる電子及び立体特性をもつ３種の非天然アミノ酸としてＯ−メチルチロシン（ＯｍｅＹ、本明細書ではＯｍｅ−Ｌ−チロシンとも言う）、α−アミノカプリル酸（Ｃ８）、及びｏ−ニトロベンジルシステイン（ｎｂＣ）を選択し、ＬＲＳ活性部位の適応性を調べた（図１Ｃ参照）。α−アミノカプリル酸の脂肪族側鎖は他の疎水性アミノ酸に対して明白なパッキング性をもつと思われ、蛋白質を膜に局在させると思われる。ｏ−ニトロベンジルシステインは光分解し、ミリ秒単位で遊離システインを発生するため、多数の生体プロセスを光開始するために使用することができ、Ｏ−メチルチロシンは蛋白質を選択的に同位体標識するために使用することができる（例えばＮＭＲ及びＩＲプローブを導入できる）。特に直交ｔＲＮＡ／ロイシルｔＲＮＡシンテターゼ対はシンテターゼ活性部位の寸法が大きいので、場合によりこの直交対を含む付加ライブラリーを更に作製し、更に立体的に嵩高な他の官能基を選択することができる。このように、ロイシンシンテターゼの許容性により、嵩高な側鎖をもつ非天然アミノ酸（例えばダンシル及びクマリン誘導体等のフルオロフォア）に特異的なシンテターゼをこのようなライブラリーから単離することができる。
【０２１９】
酵母のｇａｌ４遺伝子の４４及び１１０位のアンバーコドンの抑圧に基づいて各非天然アミノ酸に特異的な突然変異体シンテターゼを選択した。具体的には、突然変異体シンテターゼにより非天然アミノ酸（１ｍＭ濃度で培地に添加）又は内在アミノ酸をＬｅｕ５ＣＵＡに負荷すると、２０ｍＭ  ３−アミノトリアゾール（３−ＡＴ，ＨＩＳ３蛋白質の競合的阻害剤）を添加したヒスチジン不含（−Ｈｉｓ）培地、又はウラシル不含（−ｕｒａ）培地のいずれかで増殖する。非天然アミノ酸の不在下では、内在アミノ酸を利用するシンテターゼを含む細胞はＵＲＡ３により毒性化合物に変換される０．１％  ５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）を添加した培地で増殖速度の低下を示す。Ｃｈｉｎら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００３，１０：５１１−９参照。各非天然アミノ酸にポジティブ選択とネガティブ選択を交互に３ラウンド実施した。最終ラウンド後に、１ｍＭ非天然アミノ酸を補充した−ｕｒａ及び−ｈｉｓ／２０ｍＭ  ３−ＡＴプレートに対するクローンの厳密な増殖依存性を選択した。次に酵母で非天然アミノ酸の存在下と不在下にＣ末端ヘキサヒスチジンタグを含むヒトスーパーオキシドジスムターゼの許容部位３３（ｈＳＯＤ−３３ＴＡＧ−Ｈｉｓ６）におけるアンバーコドンの抑圧についてこれらのクローンを試験した。表２参照。最良のシンテターゼクローン（Ｃ８ＲＳ，ＯＭｅＹＲＳ，及びｎｂＣＲＳ）はそれらの対応する非天然アミノ酸の存在下のみで蛋白質を産生した（図２Ａ及び表３参照）。図２ＡはＮｉ−ＮＴＡ精製後にクーマシーブルーと抗Ｈｉｓ６抗体の両者で検出した１ｍＭ非天然アミノ酸の存在下（＋レーン）及び不在下（−レーン）におけるｈＳＯＤ−３３ＴＡＧ−Ｈｉｓ６の発現を示す。いずれの場合も、精製蛋白質の収量は野生型直交サプレッサーｔＲＮＡ／シンテターゼ対により産生された収量（〜０．６ｍｇ／Ｌ）と同等である。更に、エレクトロスプレーイオン化イオントラップ質量分析の結果、無傷のｈＳＯＤ蛋白質の総質量はアンバーコドンに応答する非天然アミノ酸の部位特異的組込みに一致することが判明した（表３）。これらの結果から、全３種のアミノ酸は高い効率と非常に高い忠実度で蛋白質に組込まれることが明らかである。
【０２２０】
ｏ−ニトロベンジルシステインの効率的で選択的な生合成的蛋白質組込みは、必須システイン残基による蛋白質の時間的及び空間的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ光調節を可能にすると思われる。例えばＳｅｌｆら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１９９６，２：８１７−２０；Ｐｈｉｌｉｐｓｏｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００１，２８１：Ｃ１９５−２０６；及びＰｏｌｌｉｔｔ，Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ，１９９８，３７：２１０４−７参照。ｎｂＣ−３３−ｈＳＯＤ突然変異体にＵＶランプで２０分間ＵＶ照射した結果、ベンジルＣ−Ｓ結合が開裂した後、遊離チオール基とｏ−ニトロベンゼンアルデヒドが遊離した。ＲＰＬＣと全長質量分析によりケージ解除ｈＳＯＤへの７０％変換が検出された。ｈＳＯＤ−３３Ｃｙｓの質量実測値１６５８４．２Ｄａは計算値１６５８５．２Ｄａに一致する。ｎｂＣ−３３−ｈＳＯＤ以外に蛋白質は観測されなかった。これはＢｏｃ−ｎｂＣの光脱保護の従来の研究に一致する。例えばＳｍｉｔｈら，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，２００２，４：４０４１−４；及びｏ−ニトロベンジルシステインの光調節を模式的に示す図３参照。
【０２２１】
ｏ−ニトロベンジルシステインの有用性を更に例証するために、ヒトアポトーシス促進性蛋白質カスパーゼ３の活性部位システインをｏ−ニトロベンジルシステインで置換した。アポトーシスに関与する他のカスパーゼと同様に、この酵素はサイトゾルに不活性チモーゲンとして存在する。活性型カスパーゼ３又はセリンプロテアーゼグランザイムＢ等の他のプロテアーゼにより内部アスパラギン酸残基で厳密な開裂後に２本鎖成熟型酵素が生成される。Ｔｒａｐａｎｉ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．，２００１，２（１２），ＲＥＶＩＥＷＳ３０１４．１−３０１４．７参照。カスパーゼ３活性をフォトケージングするために、触媒Ｃｙｓ１６３残基のコドンをＴＡＧに突然変異させ、１ｍＭ  ｏ−ニトロベンジルシステイン、ｎｂＣＲＳ、及びＬｅｕ５ＣＵＡの存在下で誘導性ガラクトースプロモーターの制御下に蛋白質を発現させた。１０分間照射し、グランザイムＢを加えて更にインキュベーション後又はインキュベーションせずに細胞溶解液でカスパーゼ３活性を測定した。グランザイムＢの存在下と不在下のいずれでも光分解後のみに検出可能なプロテアーゼ活性が細胞溶解液中に検出された（図２Ｂ）。これらの条件下で、ケージドカスパーゼの約４０％が活性酵素に変換された。更に、野生型カスパーゼ３の発現は酵母に毒性であるが、ｎｂＣ１６３カスパーゼ突然変異体の発現は増殖率に影響がなかった。図２Ｂは未処理細胞溶解液中（ｎｂＣ）、照射後（ｎｂＣ／ＵＶ）、グランザイムＢの存在下で照射後（ｎｂＣ／ＵＶ／グランザイムＢ）、及びカスパーゼ３阻害剤の存在下（ｎｂＣ／Ｉｎｈ）における７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン基質（４０５ｎｍ吸収）によるカスパーゼ３活性の測定を示す。市販組換えカスパーゼ３を陽性対照とし、グランザイムＢを陰性対照として使用した。
【０２２２】
プロトコール、材料及び方法Ｐ
進化型シンテターゼ：
【表２】
2008513040.tif 000006
【表３】
2008513040.tif 000007
【０２２３】
特に明記しない限り、本実施例の全ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）はＲｏｃｈｅ（Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）製品Ｅｘｐａｎｄ  ＰＣＲキットを製造業者の指示に従って使用して実施した。ｅｃＬＲＳライブラリーを含む全酵母形質転換はＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｔ．Ｖｉｅｗ，ＣＡ）製品ＹＥＡＳＴＭＡＫＥＲ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ２を製造業者の指示に従って使用して実施した。
【０２２４】
ライブラリー構築及び選択：４種のプライマー：
Ｅｃｔ１−
ＧＡＴＣＡＣＣＧＧＴＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＡＡＧＧＧＡＧＣＡＧＧＣＣＡＧＴＡＡＡＡＡＧＣＡＴＴＡＣＣＣＣＧＴＧＣＣ
Ｅｃｔ２−
ＧＧＡＴＴＴＡＧＡＡＴＣＣＣＴＴＧＴＧＴＣＴＡＣＣＧＡＴＴＣＣＡＣＣＡＴＣＣＧＧＧＣＡＣＧＧＧＧＴＡＡＴＧＣ
Ｅｃｔ３−
ＡＧＧＧＡＴＴＣＴＡＡＡＴＣＣＣＴＣＧＧＣＧＴＴＣＧＣＧＣＴＧＴＧＣＧＧＧＴＴＣＡＡＧＴＣＣＣＧＣＴＣＣＧＧ
Ｅｃｔ４−
ＴＴＡＧＧＣＴＡＧＣＧＧＧＡＡＧＴＴＣＡＧＧＧＡＣＴＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＧＧＴＡＣＣＣＧＧＡＧＣＧＧＧＡＣＴＴＧ
を使用してオーバーラップＰＣＲによりフランキング配列と共にｔＲＮＡＬｅｕＣＵＡ（アクセション番号Ｋ００２２５）（Ｙａｍａｉｚｕｍｉら，１９８０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５（５）：２２２０−５参照）に基づくアンバーサプレッサーｔＲＮＡ  Ｌｅｕ５ＣＵＡを構築した。
【０２２５】
増幅したＤＮＡを制限酵素ＡｇｅＩ及びＮｈｅＩで消化し、ｐＡ５／ｔＲＮＡＣＵＡ（Ｃｈｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００３，３０１，９６４−７及びＣｈｉｎら，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２００３，１０，５１１−９参照）の対応部位に挿入し、プラスミドｐＡ５／Ｌ５ＣＵＡを作製した。ＬｅｕＲＳを大腸菌ゲノムＤＮＡから増幅し（プライマーＥＣＦ−ＧＣＧＣＧＡＡＴＴＣＡＧＴＡＴＧＧＡＡＧＡＧＣＡＡＴＡＣＣＧＣＣＣＧＧＡＡＧＡＧ及びＥＣＲ−ＧＣＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＧＣＣＡＡＣＧＡＣＣＡＧＡＴＴＧＡＧＧＡＧ）、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化し、プラスミドｐＡ５／Ｌ５ＣＵＡの対応部位にライゲーションし、プラスミドｐＥｃＬＲＳ／Ｌ５ＣＵＡを得た。ｅｃＴｙｒＲＳライブラリー（上記Ｃｈｉｎ参照）の構築と同様に、酵素逆ポリメラーゼ連鎖反応（ＥＩＰＣＲ）（Ｓｔｅｍｍｅｒら，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３（２）：２１４−２０参照）を使用して５個のランダム化残基（Ｍｅｔ４０，Ｌｅｕ４１，Ｔｙｒ４９９，Ｔｙｒ５２７，及びＨｉｓ５３７）をもつＬｅｕＲＳライブラリーを構築した。全構築物とライブラリーのダイバーシティをＤＮＡシーケンシングにより確認した。
【０２２６】
β−ガラクトシダーゼアッセイ：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）製品Ｇａｌａｃｔｏ−Ｓｔａｒ（登録商標）化学発光システムを製造業者の指示に従って使用して細胞溶解液中でβ−ガラクトシダーゼ活性の迅速で高感度の検出を実施した。このアッセイは精製酵素２ｆｇ〜２０ｎｇのダイナミックレンジをもつ。１５ｍｌ培養液（ＯＤ６００＜２）からの細胞を凍結−解凍サイクルにより溶解した。Ａｎａｌｙｓｔ（登録商標）ＡＤ  ９６．３８４（ＬＪＬ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して化学発光を測定した。５回の平行測定から標準偏差を得た。サンプル間の相対活性を溶解液中の総蛋白質濃度で正規化した。
【０２２７】
ｏ−ニトロベンジルシステインの合成：この非天然アミノ酸は公知手順に従って合成した（Ｓｍｉｔｈら，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔ．２００２，４，４０４１−４４参照）。他の非天然アミノ酸はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から入手した。
【０２２８】
非天然アミノ酸を含む蛋白質の発現及び分析：ｈＳＯＤ蛋白質は従来記載されているように発現及び精製した（上記Ｃｈｉｎ参照）。ウェスタン分析のために、蛋白質を抗Ｈｉｓ６（Ｃ末端）抗体（Ｒ９３０−２５，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ及びｓｃ−２３０８，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）で検出し、ＥＣＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で可視化した。
【０２２９】
質量分析：無傷の脱塩蛋白質の純度と一次構造をエレクトロスプレーイオン化イオントラップ質量分析（Ｂｒｕｋｅｒ  ３０００）により評価した。全実験測定質量は標準偏差１ａｍｕ未満である。
【０２３０】
カスパーゼ３アッセイ：野生型ヒトカスパーゼ３遺伝子はＪｅｎｎｉｆｅｒ  Ｈａｒｒｉｓにより寄贈された。Ｃｙｓ１６３のコドンをオーバーラップＰＣＲによりＴＡＧに突然変異させ、突然変異体遺伝子をｐＹＥＳ２酵母発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位に挿入し、ｐＹＥＳ２−カスパーゼ３ＴＡＧを得た。このプラスミドをｐＥｃｐＣ７／ｔ１と共にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＩｎｖＳｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に同時形質転換した。蛋白質発現のために、ＳＤ培地＋ラフィノース−Ｔｒｐ−ｕｒａ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で増殖させた飽和細胞培養液を使用し、１ｍＭ  ｎｂＣを補充したＳＤ＋ラフィノース＋ガラクトース−Ｔｒｐ−ｕｒａ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＯＤ６００＝０．４まで接種した。７〜８時間誘導後に細胞をペレット化し、洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、凍結−解凍サイクルで溶解した。細胞破片のペレット化後に、０．２２μｍフィルターを使用して溶解液を清澄化した。次に溶解液をハンドヘルドＵＶランプ（Ｍｏｄｅｌ  ＥＮＦ−２４０Ｃ，Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）で長波長（＞３６５ｎｍ）にて１０分間光分解した。処理後の溶解液の一部に次にグランザイムＢ（Ｂｉｏｍｏｌ，ＳＥ−２３８，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）１００Ｕを加えて３０℃で３０分間インキュベートした。ＣＡＳＰＡＳＥ−３  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  ＰＬＵＳ（Ｂｉｏｍｏｌ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）を製造業者の指示に従って使用するカスパーゼ３アッセイでこれらの溶解液を未処理サンプルと共に使用した。反応はＳｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で４０５ｎｍにて連続的にモニターした。
【０２３１】
本実施例は新規直交対が酵母で作製され、この新規直交対を使用してフォトケージドシステインを含む３種の構造的に異なる非天然アミノ酸が蛋白質に効率的に組込まれたことを示す。より長波長でｉｎ  ｖｉｖｏ脱保護することができるケージドアミノ酸（例えばニトロベラトリルＣｙｓ，Ｔｙｒ，又はＳｅｒ）や、フルオロフォアや、スピン標識アミノ酸を含む他の非天然アミノ酸を組込むようにＬＲＳ突然変異体を進化させることが可能であると思われる。
【実施例２】
【０２３２】
大腸菌の蛋白質への光異性化可能なアミノ酸の組込み
本実施例はアンバーコドンＴＡＧに応答して光異性化可能なアミノ酸であるフェニルアラニン−４’−アゾベンゼン（アゾベンジル−Ｐｈｅとも言う）を大腸菌の蛋白質に選択的に組込むことができる直交ｔＲＮＡアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対の作製を示す。更に、本実施例はそのプロモーターに対する大腸菌転写因子の結合親和性を光調節するためにアゾベンジル−Ｐｈｅを使用できることを示す。当然のことながら、「アゾベンジル−Ｐｈｅ」は本明細書（本実施例及び明細書全体）では光異性化可能なアミノ酸であるフェニルアラニン−４’−アゾベンゼンを表すために使用する。場合により本明細書で使用する他の等価用語又は代替学名としては、例えば４−アゾベンゼン−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アゾベンゼン−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニン−４’−アゾベンゼン、及びｐ−アゾベンジル−Ｌ−フェニルアラニンが挙げられる。
【０２３３】
アゾベンゼンは可逆的シス−トランス光化学的異性化が可能である。３２０〜３４０ｎｍの放射線は熱力学的安定性の高いトランス異性体をシス異性体に変換し、シス形は熱又は≧４２０ｎｍ照射により元に戻る。例えばＺｉｍｍｅｒｍａｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９５８，８０：３５２８−３１，及びＲａｕ，Ｈ．Ｉｎ  Ｐｈｏｔｏｃｈｒｏｍｉｓｍ：ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄｕｅｒｒ，Ｈ．Ｂｏｕａｓ．−Ｌａｕｒｅｎｔ，Ｈ．Ｅｄｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈ：１９９０，ｐｐ  １６５−９２参照。図４Ａも参照。これらの２種の異性体は形状と最大吸収が有意に相違するので、アゾベンゼン部分を酵素、受容体又はイオンチャネルの基質又はリガンド結合部位に近接配置すると、蛋白質の結合親和性、従って活性を可逆的に調節することができる。アゾベンゼン部分を蛋白質に生合成的に組込むために、非天然アミノ酸であるアゾベンジル−Ｐｈｅを使用した。図４Ａ参照。アゾベンジル−ＰｈｅはニトロソベンゼンをＮ−Ｂｏｃ−ｐ−アミノフェニルアラニンとカップリングした後にＢｏｃ脱保護することにより合成した。アゾベンジル−Ｐｈｅ（中心構造，４１０，図４Ａにも示す）とアゾベンジル−Ｐｈｅ−ＰＴＨ（構造，４２０）の合成を示す図４Ｂ参照。図４Ｂの合成段階は（ａ）ＰｈＮＯ，氷酢酸，室温；（ｂ）１，４Ｎ  ＨＣｌ，ジオキサン，０℃；及び（ｃ）ＰｈＮＣＳ，ピリジン−Ｈ２Ｏ，４０℃→１Ｎ  ＨＣｌ，８０℃を含む。図４Ａの構造はアゾベンゼン部分とＣα炭素の間の距離が短いため、側鎖の配座異性体の数が最小限になり、その結果、活性部位構造に及ぼすシス−トランス異性化の効果の差が大きくなると思われる。
【０２３４】
アゾベンジル−Ｐｈｅを大腸菌の蛋白質の規定部位に選択的に組込むために、アンバーＴＡＧコドンに応答して図４Ａの構造を固有に指定する直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔ−ＲＮＡシンテターゼ対を開発した。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＭｊＴｙｒＲＳ）と突然変異体チロシルアンバーサプレッサーｔＲＮＡ（ＭｊｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡ）は大腸菌で蛋白質翻訳に効率的に機能するが、内在ｔＲＮＡ又はシンテターゼと交差反応しないことが従来報告されている。Ｗａｎｇら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ．，２０００，１２２：５０１０−１１参照。アゾベンジル−Ｐｈｅを選択的に認識するように（且つ内在アミノ酸を認識しないように）ＭｊＴｙｒＲＳシンテターゼの特異性を改変するために、ＴｙｒＲＳのチロシン結合部位の６個の残基（Ｔｙｒ−３２，Ｌｅｕ−６５，Ｐｈｅ−１０８，Ｇｌｎ−１０９，Ａｓｐ−１５８及びＬｅｕ−１６２）をランダム化することにより１０９個のＴｙｒＲＳ突然変異体のライブラリーを作製した。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳのｘ線結晶構造（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２００３，１０：４２５−３２及びＺｈａｎｇら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２００５，１４：１３４０−９参照）によると、これらの残基はいずれも結合チロシンのアリール環に近接している（Ｔｙｒ−３２とＡｓｐ−１５８はチロシンのヒドロキシル基と水素結合を形成する）。次にＭｊＴｙｒＲＳライブラリー（ｐＢＫ−ｌｉｂ２）にポジティブ選択とネガティブ選択を適用した。Ｓａｎｔｏｒｏら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００２，２０：１０４４−８及びＷａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００１，２９２：４９８−５００参照。ポジティブ選択では、ｐＢＫ−ｌｉｂ２とｔＲＮＡＴｙｒで同時形質転換した細胞を１ｍＭ  アゾベンジル−Ｐｈｅとクロラムフェニコールの存在下で増殖させた場合に細胞生存はクロラムフェニコールアシルトランスフェラーゼ遺伝子の許容部位に導入されたアンバーコドンの抑圧に依存した。次に直交ｔＲＮＡと３個の許容部位に導入されたアンバー突然変異をもつ毒性バルナーゼ遺伝子をコードする遺伝子を含む細胞に生存細胞からのシンテターゼクローンを形質転換した。これらの細胞をアゾベンジル−Ｐｈｅの不在下で増殖させ、内在アミノ酸を利用するクローンを除去した。
【０２３５】
５ラウンドの選択（ポジティブ３ラウンドとネガティブ２ラウンド）後に、アゾベンジル−Ｐｈｅの存在下で１２０ｕｇ／ｍＬクロラムフェニコールまでとこの非天然アミノ酸の不在下で２０ｕｇ／ｍＬクロラムフェニコールまで細胞を生存させたシンテターゼクローン１０個が同定された。全１０個のシンテターゼクローンには同一突然変異：Ｔｙｒ３２Ｇｌｙ、Ｌｅｕ６５Ｇｌｕ、Ｐｈｅ１０８Ａｌａ、Ｇｌｎ１０９Ｇｌｕ、Ａｓｐ１５８Ｇｌｙ及びＬｅｕ１６２Ｈｉｓがあった。野生型シンテターゼ構造に基づき、これらの突然変異はアゾベンゼン部分を受容するための拡大チロシン結合ポケットを形成すると考えられた。例えば、野生型シンテターゼのＴｙｒ３２及びＰｈｅ１０８の嵩高なアミノ酸側鎖はアゾベンジル−ＰｈｅＲＳではグリシン又はアラニン残基に置換された。更に、結合チロシンのフェノールヒドロキシルとの水素結合に関与するＴｙｒ３２及びＡｓｐ１５８の側鎖はグリシンに置換された。
【０２３６】
アゾベンジル−Ｐｈｅの蛋白質組込みの忠実度と効率を調べるために、Ｃ末端Ｈｉｓ６タグを含むマッコウクジラミオグロビンの残基７５をアンバーコドンに置換した。蛋白質発現は１ｍＭアゾベンジル−Ｐｈｅを補充した最小培地で増殖させた大腸菌で選択シンテターゼ（アゾベンジル−ＰｈｅＲＳ）とＭｊｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡの存在下で実施した。陰性対照として、アゾベンジル−Ｐｈｅの不在下で同時に蛋白質発現を実施した。精製蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロットにより分析した結果、蛋白質は図４Ａの構造の存在下のみで発現されることが判明した。図７は遺伝的にコードされる非天然アミノ酸アゾベンジル−Ｐｈｅを含む突然変異体蛋白質の特性を示す。１ｍＭ非天然アミノ酸（ＵＡＡ＝アゾベンジル−Ｐｈｅ）の存在下（＋ＵＡＡ）と不在下（−ＵＡＡ）における突然変異体ミオグロビン（Ｍｙｏ４ＴＡＧ及びＭｙｏ７５ＴＡＧ、矢印７００で示す）及び突然変異体ＣＡＰ（ＣＡＰ１２５ＴＡＧ、矢印７１０で示す）の発現をＮｉ−ＮＴＡ精製後にＧｅｌｃｏｄｅ  Ｂｌｕｅ（登録商標）と抗Ｈｉｓ６抗体の両者で検出した。突然変異体ミオグロビンのＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離−飛行時間）両者の質量分析によると、平均質量実測値は１８５３４Ｄａであり、平均質量理論値１８５３５．３３Ｄａに近似していた。ミオグロビン−７５ＴＡＧへの標準アミノ酸の組込みに起因する他のピークは質量スペクトルに観測されなかった。図８参照。更に、アミノ酸４をアゾベンジル−Ｐｈｅに置換した突然変異体ミオグロビンを精製し、Ｎ末端蛋白質シーケンシングに付した。エドマン分解によると、４位は非標準アミノ酸のみにより占有され（２０種の標準アミノ酸は全く認められない）、その溶出時間は独立して合成したアゾベンジル−Ｐｈｅのフェニルチオヒダントイン誘導体の溶出時間と一致した。図９参照。
【０２３７】
アゾベンジル−Ｐｈｅを含む蛋白質の光化学的性質を更に特性決定するために、このアミノ酸を大腸菌カタボライト活性化蛋白質（ＣＡＰ）に導入した。ＣＡＰは大腸菌で多数のカタボライト感受性オペロンを調節するホモダイマー細菌転写アクチベーターである。例えばＢｕｓｂｙら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９９，２９３：１９９−２１３；Ｌａｗｓｏｎら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２００４，１：１０−２０；及びＳｃｈｕｌｔｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１，２５３：１００１−７参照。ｃＡＭＰがＣＡＰと結合すると、蛋白質にコンフォーメーション変化が生じ、そのプロモーターとの結合親和性が増加し、ＣＡＰ依存性プロモーターからの転写が増加する。二量化界面の残基Ｖａｌ１２５の代わりにアンバーコドンを導入した。Ｃ末端Ｈｉｓ６タグを付加し、この突然変異体を１ｍＭアゾベンジル−Ｐｈｅ、アゾベンジル−ＰｈｅＲＳ及びＭｊｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡの存在下にリッチ培地で発現させた。Ｎｉ−ＮＴＡ精製後に、野生型ＣＡＰ約３ｍｇ／Ｌに対して培養細胞１リットル当たり約１．５ｍｇの突然変異体ＣＡＰが得られた。この突然変異体蛋白質のＵＶ−可視スペクトル（図５）は図４Ａのトランス−アゾベンゼンクロモフォアに対応する３３４ｎｍの明白な吸収ピークを示す。突然変異体ＣＡＰに２５℃で３３４ｎｍ光を照射すると、３３４ピークは減り、４２０ｎｍの吸収が増加し、トランス→シス異性化に一致し、約４５％トランス、５５％シスアゾベンゼンの光定常状態が得られた。図５。次に異性化突然変異体に４２０ｎｍ光を照射すると、３３４ｎｍバンドに完全に逆変換した。図５の線５００は５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０バッファー中の突然変異体ＣＡＰ（ＣＡＰ１２５ＴＡＧ；５０ｕＭ）の吸収スペクトルを示す。線５１０はＮｉ−ＮＴＡ精製後、光照射前の吸収を示す。線５２０は３３４ｎｍで４０分間光照射後の吸収を示す。４２０ｎｍ光を４０分間照射すると可逆的に転換した。図５の挿入図は＞４００ｎｍ範囲の拡大図である。これらの結果から、アゾベンジル−Ｐｈｅは高い忠実度で蛋白質に選択的に組込むことができ、適当な波長の光を照射すると、可逆的シス−トランス異性化が可能であることが明らかである。
【０２３８】
ＣＡＰのＤＮＡ結合親和性を光調節するためにアゾベンジル−Ｐｈｅを使用できるか否かを調べるために、Ｉｌｅ７０をアゾベンジル−Ｐｈｅに置換した。ＣＡＰ−ｃＡＭＰ−ＤＮＡ複合体の結晶構造（例えばＷｅｂｅｒら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８７，１９８：３１１−２６；及びＭｃＫａｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８２，２５７：９５１８−２４参照）によると、Ｉｌｅ７０はｃＡＭＰとの相互作用の複雑な網目構造を形成する残基Ｇｌｕ７２、Ａｒｇ８２、Ｔｈｒ２７及びＳｅｒ１２８と近接している（Ｆｒｉｅｄら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８４，１７２：２４１−６２参照）。従って、トランス異性体とシス異性体はＣＡＰに対するｃＡＭＰの結合親和性、従って、そのプロモーターに対するＣＡＰの親和性に対して異なる作用をもつと思われる。突然変異体蛋白質を発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡで精製した後に２５ｍＭ  ＮａＣｌ→１ｍＭ  ＮａＣｌ勾配を使用してｍｏｎｏ−Ｓカラムで２０分間ＦＰＬＣ精製した。図１０。次に、３３４ｎｍで照射前後に一次ＣＡＰ結合部位を含む精製ｌａｃプロモーターに対する突然変異体ＣＡＰ蛋白質の結合定数（Ｋｂ）を測定した（図６）。図６は２０ｕＭ  ｃＡＭＰを含むバッファー中でラクトースプロモーターフラグメント（３３ｎＭ）と結合するＣＡＰ（野生型又は突然変異体ＣＡＰ７０ＴＡＧ；１６０ｎＭ）を測定するためのゲル移動度シフトアッセイを示す。レーン１はＤＮＡ単独である。レーン２はＤＮＡ＋ＣＡＰ野生型であり、レーン３はＤＮＡ＋ＣＡＰ７０ＴＡＧ（３３４ｎｍ光照射）である。レーン４は３３４ｎｍ光照射前のＤＮＡ＋ＣＡＰ７０ＴＡＧである。系列希釈技術とゲルシフトアッセイを使用した処、ｃＡＭＰ（２０μＭ）の存在下でトランスＣＡＰ７０アゾベンジル−Ｐｈｅ突然変異体（Ｋｂ〜４．０×１０６Ｍ−１）ではｗｔ  ＣＡＰ（Ｋｂ〜１．６×１０７Ｍ−１）に比較して４倍のＫｂが観察された。３３４ｎｍで光照射後、突然変異体ＣＡＰのＫｂは４分の１に減少し、１．０×１０６Ｍ−１となった。これはホモダイマーの７５％がｃＡＭＰに対して有意に低い親和性をもつシス形態のサブユニットを少なくとも１個もつ５０％シスの光定常状態に一致する。次に、≧４２０ｎｍの光を使用して異性化ＣＡＰ７０アゾベンジル−Ｐｈｅサンプルを主にトランス状態に逆転換し、４℃でインキュベートした。このサンプルのゲルシフトアッセイ分析の結果、ＣＡＰのトランス形は完全に回復し、Ｋｂは４．０×１０６Ｍ−１であった。図１１は一次ｌａｃ結合部位に対するＣＡＰ結合親和性のＥＭＳＡ測定法を示す。ＤＮＡが部分的に結合した各ＣＡＰ蛋白質濃度について、デンシトメーターを使用して遊離ＤＮＡと蛋白質−ＤＮＡバンドをの両者の強度を測定した。遊離ＣＡＰ、遊離ＤＮＡ及びＣＡＰと結合したＤＮＡの濃度を測定した。次にｌｏｇ（［ＣＡＰ結合ＤＮＡ］／［遊離ＤＮＡ］）に対してｌｏｇ［ＣＡＰ］をプロットした。ｘ切片のＣＡＰの補間濃度を使用して結合定数Ｋｂを決定した。これらの結果によると、アゾベンジル−Ｐｈｅはそのプロモーター配列に対する転写因子の結合親和性を光調節するために使用できることが明らかである。吸収スペクトルがオーバーラップするため、トランスアゾベンジル−Ｐｈｅからシス形への完全な変換を得ることはできないが、これらの結果はアゾベンジル−Ｐｈｅの遺伝的蛋白質組込みがｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び生きた細胞で各種生体プロセスを時間的に調節するのに有用であることを強く示唆している。
プロトコール、材料、及び方法
【０２３９】
本実施例の全化学物質は商業ソースから入手し、それ以上精製せずに使用した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルはＢｒｕｋｅｒ  ＡＭＸ−４００計器で記録し、残留ＣＨＣｌ３（７．２５ｐｐｍ）、残留ＨＯＤ（４．８０ｐｐｍ）、又は残留ＣＨ３ＯＤ（３．３０ｐｐｍ）に対する化学シフトを報告した。質量スペクトルはＳｃｒｉｐｐｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）とＭａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）で取得した。
Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニン−４’−アゾベンゼンの合成
【０２４０】
Ｌ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−ｐ−アミノフェニルアラニン（１ｇ，３．６ｍｍｏｌ）を室温で氷酢酸（２００ｍＬ）に溶かした。この溶液にニトロソベンゼン（５７８ｍｇ，５．４ｍｍｏｌ）を一度に加え、混合物を８時間撹拌した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液（３００ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。次に有機層を合わせて乾燥（無水ＭｇＳＯ４）し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。次に粗材料をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ．９０：１０）により精製した。こうして最終生成物がオレンジ色固体として得られた（９００ｍｇ，６８％）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ１．３０（ｓ，９Ｈ），２．９３（ｄｄ，Ｊ＝９，１４Ｈｚ，１Ｈ），３．１９（ｄｄ，Ｊ＝５，１４Ｈｚ，１Ｈ），４．３３（ｄｄ，Ｊ＝５，９Ｈｚ，１Ｈ），７．３５（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ），７．４４（ｍ，３Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ２０Ｈ２３Ｎ３Ｏ４Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ＋）の計算値３９２．１５８６，実測値３９２．１５７８。
Ｌ−フェニルアラニン−４’−アゾベンゼンの合成
【０２４１】
Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニン−４’−アゾベンゼン（図４Ａに示すようなアゾベンジル−Ｐｈｅ）（５４６ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ）の０℃ジオキサン（６ｍＬ）溶液に４Ｎ  ＨＣｌ（２ｍＬ）を加え、混合物を３時間撹拌した。次にロータリーエバポレーターで濃縮し、十分に減圧乾燥（Δ，Ｐ２Ｏ５サイドアーム）すると、最終生成物がオレンジ色固体として得られた（３８０ｍｇ，９４％）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ２．４６（ｄｄ，Ｊ＝１，１０Ｈｚ，１Ｈ），２．８３（ｄｄ，Ｊ＝１，１２Ｈｚ，１Ｈ），３．２３（ｄｄ，Ｊ＝１０，１２Ｈｚ，１Ｈ），７．００（ｍ，５Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１５Ｈ１４Ｎ３Ｏ２（Ｍ−Ｈ）−の計算値２６８．１０９２，実測値２６８．１０８３。
フェニルチオヒダントイン−フェニルアラニン−４’−アゾベンゼン（ＰＴＨ−アゾベンジル−Ｐｈｅ）の合成
【０２４２】
アミノ酸Ｌ−フェニルアラニン−４’−アゾベンゼン（アゾベンジル−Ｐｈｅ）（２００ｍｇ，０．７４ｍｍｏｌ）をピリジン−水（１：１；５ｍＬ）に溶かし、２Ｎ  ＮａＯＨを使用してｐＨを８．６に調整した。混合物を４０℃で撹拌し、フェニルチオシアン酸塩（２００ｕＬ，１．４８ｍｍｏｌ）を滴下した。１時間後に混合物をトルエン（３×５ｍＬ）で抽出し、水層を氷冷し、２Ｎ  ＨＣｌの添加によりｐＨ〜１まで酸性化した。得られた沈殿を濾過し、乾燥（減圧）すると、フェニルチオカルバミル−Ｌ−フェニルアラニン−４’−アゾベンゼン（ＰＴＣ−アゾベンジル−Ｐｈｅ）（粗材料２３９ｍｇ）が得られた。次にＰＴＣ−アゾベンジル−Ｐｈｅを１Ｎ  ＨＣｌ（２．５ｍＬ）に溶かし、溶液を８０℃に１０分間加熱した後に周囲温度まで冷却した。次に反応混合物を酢酸エチル（３×５ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせて乾燥（ＭｇＳＯ４）した。粗材料をフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ．９０：１０）に付すと、標記化合物（５０ｍｇ，１８％）が得られた；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ３．１８（ｄｄ，Ｊ＝１，１４Ｈｚ，１Ｈ），３．４５（ｄｄ，Ｊ−４，１４Ｈｚ，１Ｈ），４．６０（ｄｄ，Ｊ＝４，７Ｈｚ，１Ｈ），７．１２（ａｐｐ  ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，１Ｈ），７．２５（ｍ，２Ｈ），７．４０−７．５５（ｍ，７Ｈ），７．９３（ａｐｐ  ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，４Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ２２Ｈ１８Ｎ４ＯＳＮａ（Ｍ＋Ｎａ＋）の計算値４０９．１０９９，実測値４０９．１１０６。
プラスミド及び細胞株
【０２４３】
実施例２では以下のプラスミドと細胞を使用した。ｐＢＫ−ｌｉｂ２，残基Ｔｙｒ３２、Ｌｅｕ６５、Ｐｈｅ１０８、Ｇｌｎ１０９、Ａｓｐ１５８及びＬｅｕ１６２をランダム化したＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔ−ＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）変異体のライブラリーをコードし、Ｋｎｒマーカーを含むプラスミドＤＮＡ；ｐＲＥＰ（２）／ＹＣ，ｍｕ  ｔＲＮＡＣＵＡＴｙｒと、Ａｓｐ１１２にアンバーＴＡＧをもつクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子と、Ｔ７プロモーターとそのコグネイトアンバー突然変異体Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの制御下のＧＦＰ遺伝子をコードし、Ｔｅｔｒマーカーを含むプラスミド；ｐＬＷＪ１７Ｂ３，ｌｐｐプロモーターとｒｒｎＣターミネーターの制御下でｍｕ  ｔＲＮＡＣＵＡＴｙｒを発現し、ａｒａプロモーターの制御下でＧｌｎ２、Ａｓｐ４４及びＧｌｙ６５に３個のアンバーコドンをもつバルナーゼ遺伝子を発現し、Ａｍｐｒマーカーを含むプラスミド；ｐＢＡＤ／ＪＹＡＭＢ−７５ＴＡＧ−Ｍｙｏ，ｐＢＡＤ／ＪＹＡＭＢ−４ＴＡＧ−Ｍｙｏ，アラビノースプロモーターとｒｒｎＢターミネーター上に突然変異体マッコウクジラミオグロビン遺伝子（蛋白質の７５又は４位のいずれかのアミノ酸に対応するアンバー突然変異の存在）を含み、ｌｐｐプロモーターとｒｒｎＣターミネーター上にｍｕ  ｔＲＮＡｔｙｒＣＵＡを含み、更にテトラサイクリン耐性マーカーを含むプラスミド；ｐＢＡＤ／ＪＹＡＭＢ−１２５ＴＡＧ−ＣＡＰ，ｐＢＡＤ／ＪＹＡＭＢ−７０ＴＡＧ−ＣＡＰ，１２５及び７０位のアミノ酸に対応するアンバー突然変異をもつ大腸菌カタボライト活性化蛋白質（ＣＡＰ）遺伝子を含む以外は前記と同様のプラスミド；ｐＢＡＤ／ＪＹＡＭＢ−６０１ＴＡＧ−βＧａｌ，蛋白質のアミノ酸Ｐｈｅ６０１に対応するアンバー突然変異をもつβ−ガラクトシダーゼ遺伝子ｌａｃＺを含む以外は上記ｐＢＡＤ／ＪＹＡＭＢ構築物と同様のプラスミド；及びＧｅｎｅＨｏｇ（登録商標）−Ｆｉｓ  Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），Ｆ−  ｍｃｒＡ  Δ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ）８０ｌａｃＺΔＭ１５  ΔｌａｃＸ７４  ｒｅｃＡ１  ｅｎｄＡ１  ａｒａＤ１３９  Δ（ａｒａ−ｌｅｕ）７６９７  ｇａｌＵ  ｇａｌＫ  λｒｐｓＬ（ＳｔｒＲ）ｎｕｐＧ，ｆｉｓ：：Ｔｒｎ７（ＤＨＦＲ）。
アゾベンジル−Ｐｈｅをコードする突然変異体シンテターゼの遺伝的選択
【０２４４】
オーバーラッピングフラグメントＰＣＲアプローチにより約１０９個のＴｙｒＲＳ独立クローンから構成されるｐＢＫ−ｌｉｂを構築した。全ＰＣＲにＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）製品Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａを製造業者の指示に従って使用した。ｐＲＥＰ（２）／ＹＣプラスミドを含む大腸菌ＤＨ１０Ｂをポジティブ選択用宿主株として使用し、出発材料ｐＢＫ−ｌｉｂ２を形質転換した。形質転換細胞をＳＯＣ中で１時間回収した後に、ロイシン添加グリセロール最小培地（ＧＭＭＬ）で冷温下に２回洗浄した後、夫々５０ｕｇ／ｍＬ、６０ｕｇ／ｍＬ及び１２ｕｇ／ｍＬのカナマイシン、クロラムフェニコール及びテトラサイクリンを補充したＧＭＭＬ−寒天プレートにプレーティングした。更に、アゾベンジル−Ｐｈｅを最終濃度１ｍＭで添加した。全体で、アゾベンジル−Ｐｈｅを添加したＧＭＭＬ−寒天プレート６枚と対照プレート（アゾベンジル−Ｐｈｅ不添加）１枚を使用した。プレートを３７℃で６０時間インキュベートした。生存細胞をプレート６枚（アゾベンジル−Ｐｈｅ添加）からプールし、プラスミドＤＮＡを抽出した。次に、生存クローンを表すｐＢＫ−ｌｉｂ２  ＤＮＡをポジティブ選択プラスミドｐＲＥＰ（２）／ＹＣからアガロースゲル電気泳動により分解した。次に、ｐＬＷＪ１７Ｂ３プラスミドを含むエレクトロコンピテントネガティブ選択株に形質転換し、ＬＢ  １ｍＬ中で１時間回収した後、アラビノース（０．２％ｗｔ／ｖｏｌ）とアンピシリン（５０ｕｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ−寒天プレート（合計６枚）にプレーティングした。次に、プレートを３７℃で１２時間インキュベートした。得られた生存クローンのｐＢＫ−ｌｉｂ２  ＤＮＡを再び上記方法により回収した。次に、このｐＢＫ−ｌｉｂ２  ＤＮＡを次ラウンドのポジティブ選択（アゾベンジル−Ｐｈｅを添加したＧＭＭＬ−寒天プレート６枚を使用し、クロラムフェニコールを８０ｕｇ／ｍＬまで増加）に付した後にネガティブ選択（ＬＢ−寒天プレート６枚）に付し、最後にポジティブ選択（ＧＭＭＬ−寒天プレート４枚；クロラムフェニコール１００及び１２０ｕｇ／ｍＬを２枚に各々添加）１ラウンドに付した。この段階で９６個の独立シンテターゼクローンを選択し、各々９６ウェルプレートでＧＭＭＬ１００ｕＬに懸濁した。次に９６個のウェルの各々について懸濁液２ｕＬの容量をＧＭＭＬプレート２組にレプリカスポットした。一方の組のＧＭＭＬ−寒天プレートにはテトラサイクリン（１２ｕｇ／ｍＬ）と、カナマイシン（５０ｕｇ／ｍＬ）と、濃度８０、１００及び１２０ｕｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを補充した。更に、非天然アミノ酸アゾベンジル−Ｐｈｅを１ｍＭ添加した。他方の組のプレートはテトラサイクリンとカナマイシンについては同様としたが、アゾベンジル−Ｐｈｅは添加しなかった。更に、使用したクロラムフェニコール濃度は０、１０、２０及び４０ｕｇ／ｍＬとした。４８時間３７℃でインキュベーション後に１０個のシンテターゼ変異体を更に分析するために選択した。これらの突然変異体シンテターゼを含む細胞は１ｍＭアゾベンジル−Ｐｈｅの存在下で１２０ｕｇ／ｍＬまで、この非天然アミノ酸の不在下で２０ｕｇ／ｍＬまでのクロラムフェニコール依存性増殖を示した。全１０個の突然変異体シンテターゼをコードするプラスミドの標準ＤＮＡ配列分析法の結果、単一の突然変異体シンテターゼ配列（Ｇｌｙ３２，Ｇｌｕ６５，Ａｌａ１０８，Ｇｌｕ１０９，Ｇｌｙｌ５８，Ｈｉｓ１６２）に収束することが判明した。フェニルアラニン−４’−アゾベンゼン（アゾベンジル−Ｐｈｅ）に特異的に負荷するこの突然変異体シンテターゼ（アゾベンジル−ＰｈｅＲＳと言う）をｐＢＫ−ｌｉｂ２から上記のように選択した。
突然変異体ミオグロビンとカタボライト活性化蛋白質（ＣＡＰ）の発現
【０２４５】
アゾベンジル−ＰｈｅＲＳを発現するｐＢＫベクター（ｐＢＫ−ＡｚｏＰｈｅＲＳ）と共にプラスミドｐＢＡＤ／ＪＹＡＭＢ−７５ＴＡＧ−ＭｙｏをＧｅｎｅＨｏｇ（登録商標）−Ｆｉｓ大腸菌細胞に同時形質転換した。カナマイシン（４０ｕｇ／ｍＬ）とテトラサイクリン（２４ｕｇ／ｍＬ）を補充したＬＢ培地（５ｍＬ）で細胞を増幅した後、ＰＢＳで（２回）洗浄した。スターター培養液（８ｕＬ）を使用して適当な抗生物質とアゾベンジル−Ｐｈｅ（１ｍＭ）を補充した液体ＧＭＭＬ１５０ｍＬを接種した。次に、（０．０２％アラビノースの添加により蛋白質発現を誘導した場合にはＯＤ６００＝０．５まで）細胞を３７℃で増殖させた。更に８時間増殖後、これらの細胞を遠心により回収した。次に、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して非変性条件下でＣ末端ヘキサヒスチジンタグにより突然変異体蛋白質（７５位にアゾベンジル−Ｐｈｅをもつミオグロビン）を精製した。サンプルを脱塩し、水に溶出させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に付した。Ｍａｖｇ予想値１８５３５．１７２；Ｍａｖｇ実測値１８５３４。ＥＳＩ分析によると、Ｍａｖｇ実測値１８５３５であった。アゾベンジル−Ｐｈｅの不在下で上記と全く同様に同時に対照発現を実施した。
【０２４６】
４位にアゾベンジル−Ｐｈｅをもつ突然変異体マッコウクジラミオグロビン蛋白質を上記と同様にプラスミドｐＢＡＤ／ＪＹＡＭＢ−４ＴＡＧ−Ｍｙｏから発現させた。次にこの突然変異体ミオグロビンの蛋白質配列をＵＣＳＤ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦａｃｉｌｉｔｙにてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＰＲＯＣＩＳＥ  ４９４ＨＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＳｅｑｕｅｎａｔｏｒでＮ末端から６番目までのアミノ酸について分析した。上記のように合成したＰＴＨ−アゾベンジル−Ｐｈｅ（即ちフェニルチオヒダントイン−フェニルアラニン−４’−アゾベンゼン）を標準として使用した。ＰＴＨアミノ酸のＨＰＬＣプロフィルを２６９ｎｍで分析した。勾配は溶媒Ａ（溶媒Ａ９６０ｍｌ当たりＡＢＩ’ｓ  Ｐｒｅｍｉｘバッファー濃縮液２０ｍｌ、水中１％アセトン９００μｌ、ＴＦＡ７５μｌ、１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４  １００μｌを含有する３．５％テトラヒドロフラン水溶液）→溶媒Ｂ（アセトニトリル中１２％イソプロパノール）とした。
【０２４７】
０．００２％アラビノース誘導の存在下でリッチ培地（２ＹＴ）発現を実施した以外は突然変異体ミオグロビン蛋白質と同様にｐＢＡＤ／ＪＹＡＭＢ−１２５ＴＡＧ−ＣＡＰからＬｅｕ１２５アゾベンジル−Ｐｈｅ突然変異をもつ大腸菌のカタボライト活性化蛋白質（ＣＡＰ）を発現させた。この突然変異体ＣＡＰの収率は細胞培養液１リットル当たり１．５〜１．７５ｍｇであった。次にダブルビームＵＶ−可視分光光度計（Ｋｏｎｔｒｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂｌｅｔｃｈｌｅｙ，ＵＫ製品Ｕｖｉｋｏｎ  ９３３）で突然変異体ＣＡＰの暗順応（主にトランス）及び光照射サンプルの両者のＵＶ−可視吸収スペクトルを測定した。搭載型ロングパス光フィルター（３２０ｎｍ；Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｈｙｓｉｃｓ製品）と交換型狭帯域干渉フィルター（３３４ｎｍ及び４２０ｎｍ；帯域幅±５ｎｍ；Ｅｄｍｕｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓ，Ｂａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＮＪ製品）を取付た高圧水銀灯（５００Ｗ；Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｍｔ．Ｖｉｅｗ，ＣＡ製品）を使用し、アゾベンジル−Ｐｈｅを組込んだ突然変異体ＣＡＰに２５℃で光照射した。
蛋白質−ＤＮＡ相互作用のｉｎ  ｖｉｔｒｏ光調節
【０２４８】
一次ＣＡＰ結合部位を含む大腸菌ラクトースプロモーターセグメントの単離。Ｈｕｄｓｏｎら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９１，１７３：５９−６６参照。大腸菌ＤＨ１０Ｂで増殖させたプラスミドｐＵＣ１９をＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で精製した。ｐＵＣ１９のＨｉｎｆ１制限消化と分取ポリアクリルアミドゲル電気泳動後に一次及び二次両者のＣＡＰ結合部位を含む２１４ｂｐラクトースプロモーターフラグメントが単離された。２１４ｂｐフラグメントをＨｐａＩＩにより更にエンドヌクレアーゼ消化した後に１０％ポリアクリルアミド−ＴＢＥゲル（４０ｃｍ×２０ｃｍ−長さ×幅）で分離すると、ＣＡＰ一次結合部位のみを含む１１８ｂｐラクトースプロモーターフラグメントが単離された。５’リン酸を除去するために、次に１１８ｂｐフラグメントを仔ウシ腸由来アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｋｉｔを使用して精製した。１１８ｂｐフラグメントの５’末端をＭａｘａｍとＧｉｌｂｅｒｔの方法に従って３２Ｐで標識した。Ｍａｘａｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９７７，７４：５６０−４参照。
【０２４９】
突然変異体ＣＡＰ蛋白質発現。０．００２％アラビノース誘導の存在下でリッチ培地（２ＹＴ）発現を実施した以外は突然変異体ミオグロビン蛋白質と同様に（プラスミドｐＢＫ−アゾベンジル−ＰｈｅＲＳを含むＧｅｎｅＨｏｇ（登録商標）−Ｆｉｓ大腸菌細胞に同時形質転換しておいた）プラスミドｐＢＡＤ／ＪＹＡＭＢ−７０ＴＡＧ−ＣＡＰからＩｌｅ７０アゾベンジル−Ｐｈｅ突然変異をもつ光転換可能なＣＡＰ突然変異体を発現させた。ｐＢＡＤ／ＪＹＡＭＢ−ＣＡＰＷＴプラスミドを使用してＣＡＰ野生型蛋白質も単離した。精製した蛋白質を５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（＋３００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ８）に交換し、蛋白質濃度を分光光度法により測定した（ε２８０＝３．５×１０４Ｍ−１ｃｍ−１／ＣＡＰダイマー）。Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９７１，２４６：５９２９−３７参照。
【０２５０】
ＣＡＰ−ＤＮＡ複合体の形成及び分析。一般に、一次ＣＡＰ結合部位を含む５’３２Ｐ標識ｌａｃプロモーターフラグメント３３ｎＭに突然変異体又は野生型ＣＡＰ１６０ｎＭを加えることにより蛋白質−ＤＮＡ結合反応を開始した。インキュベーションは２５℃で１時間実施した。結合反応用バッファーは１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．５）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｕＭ  ＥＤＴＡ、５００ｕＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４％グリセロール及び２０ｕＭ  ｃＡＭＰから構成した。インキュベーション後に結合反応物をローディングバッファーと混合した後、２０ｕＭ  ｃＡＭＰを更に加えたランニングバッファー（０．０８９Ｍ  Ｔｒｉｓ  Ｂａｓｅ、０．０８９Ｍ硼酸、及び０．００２Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）で予備泳動（３０分、１５０Ｖ）させておいた６％  ＴＢＥ−ＰＡＧＥゲルのウェルに直接ロードした。結合反応サンプルのゲル電気泳動は１５０Ｖで４５分間実施した。完了したらゲルから過剰のバッファーを拭い、プラスチックラップで覆った後、保存蛍光スクリーンに１時間暴露した。その後、スクリーンをＳｔｏｒｍ（登録商標）  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で撮像した。
【０２５１】
光転換可能な蛋白質によるゲルシフトアッセイでは、ラクトースプロモーターフラグメントとの結合の前に５０ｍＭリン酸バッファー，ｐＨ８中の突然変異体ＣＡＰ（Ｉｌｅ７０アゾベンジル−Ｐｈｅ）のサンプルに０℃で４０分間３３４ｎｍで光照射した。
【０２５２】
ｌａｃプロモーター上のその一次結合部位に対するＣＡＰ（野生型又は突然変異体ＣＡＰ７０アゾベンジル−Ｐｈｅ）の結合定数（Ｆｒｉｅｄら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８４，１７２：２４１−６２参照）を測定するために、１．６×１０−６Ｍの出発濃度から蛋白質の典型的３倍系列希釈液を調製した。ｌａｃプロモーターフラグメントとｃＡＭＰは夫々３３ｎＭ及び２０ｕＭの一定濃度に維持した。各希釈段階で平衡に達するまでＣＡＰをＤＮＡフラグメントと結合反応させ、上記のようにゲル電気泳動により分析した。電気移動度シフトアッセイで放射性バンドの相対強度から、結合ＤＮＡ（ＰＣ／Ｐ０）と遊離ＤＮＡ（Ｐ／Ｐ０）の割合を決定した（式中、Ｐ０は総ＤＮＡを表し、ＰＣはＣＡＰと結合したＤＮＡを表し、ＰはＤＮＡ−ＣＡＰ平衡後の遊離ＤＮＡを表す）。更に、Ｃ０とＣは夫々総蛋白質と未結合蛋白質を表す。ｌｏｇ［Ｃ］に対するｌｏｇ（［ＰＣ］／［Ｐ］）のプロットの直線回帰分析により、ｘ軸補間からＣＡＰ−ＤＮＡ相互作用の結合定数（Ｋｂ）が得られる。
【０２５３】
以上、明確に理解できるように本発明を多少詳細に記載したが、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や細部に種々の変更が可能であることは以上の開示から当業者に自明である。例えば、上記全技術及び装置は種々に組合せて使用することができる。本明細書に引用した全刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献はその開示内容全体を全目的で参考資料として組込み、各刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献を全目的で参考資料として組込むと個々に記載しているものとして扱う。
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表４−７】
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【表４−８】
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【表４−９】
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【表４−１０】
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【表４−１１】
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【表４−１２】
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【表４−１３】
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【表４−１４】
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【図面の簡単な説明】
【０２５４】
【図１Ａ】（Ａ）ロイシルサプレッサーｔＲＮＡ，Ｌｅｕ５ＣＵＡの一次配列；（Ｂ）ロイシルスルファモイルアデニル酸阻害剤が結合したｔｔＬＲＳ活性部位（１００，ＰＤＢエントリー１Ｈ３Ｎ）；（Ｃ）Ｏ−メチルチロシン（ＯＭｅ−Ｌ−チロシンとも言う）、α−アミノカプリル酸及びｏ−ニトロベンジルシステインの構造を示す。
【図１Ｂ】（Ａ）ロイシルサプレッサーｔＲＮＡ，Ｌｅｕ５ＣＵＡの一次配列；（Ｂ）ロイシルスルファモイルアデニル酸阻害剤が結合したｔｔＬＲＳ活性部位（１００，ＰＤＢエントリー１Ｈ３Ｎ）；（Ｃ）Ｏ−メチルチロシン（ＯＭｅ−Ｌ−チロシンとも言う）、α−アミノカプリル酸及びｏ−ニトロベンジルシステインの構造を示す。
【図１Ｃ】（Ａ）ロイシルサプレッサーｔＲＮＡ，Ｌｅｕ５ＣＵＡの一次配列；（Ｂ）ロイシルスルファモイルアデニル酸阻害剤が結合したｔｔＬＲＳ活性部位（１００，ＰＤＢエントリー１Ｈ３Ｎ）；（Ｃ）Ｏ−メチルチロシン（ＯＭｅ−Ｌ−チロシンとも言う）、α−アミノカプリル酸及びｏ−ニトロベンジルシステインの構造を示す。
【図２】図２Ａ〜Ｂは（Ａ）１ｍＭ非天然アミノ酸の存在下（＋レーン）及び不在下（−レーン）におけるｈＳＯＤ−３３ＴＡＧ−Ｈｉｓ６の発現、（Ｂ）未処理細胞溶解液中（ｎｂＣ）、照射後（ｎｂＣ／ＵＶ）、グランザイムＢの存在下で照射後（ｎｂＣ／ＵＶ／グランザイムＢ）、及びカスパーゼ３阻害剤の存在下（ｎｂＣ／Ｉｎｈ）におけるカスパーゼ３活性を示す。
【図３】不活性フォトケージド酵素（ｏ−ニトロベンジルシステイン）と照射後の機能的システイン酵素の比較を示す。
【図４】図４Ａ及びＢはトランスアゾベンジル−Ｐｈｅとシスアゾベンジル−Ｐｈｅの変換（図４Ａ）及びアゾベンジル−Ｐｈｅの合成（図４Ｂ）を模式的に示す。
【図５】遺伝的にコードされるアゾベンジル−Ｐｈｅを含む突然変異体ＣＡＰのスペクトル特性を示す。
【図６】ラクトースプロモーターフラグメントと結合するＣＡＰ（野生型又は突然変異体ＣＡＰ７０ＴＡＧ；１６０ｎＭ）を測定するためのゲル移動度シフトアッセイを示す。
【図７】遺伝的にコードされるアゾベンジル−Ｐｈｅを含む突然変異体蛋白質の特性を示す。
【図８】７５位に光調節性アゾベンジル−Ｐｈｅをもつ発現された突然変異体ミオグロビンのＥＳＩ質量スペクトルを示す。
【図９】図９Ａ〜Ｇは２０種の天然アミノ酸のＰＴＨアミノ酸標準（図９Ａ）と、突然変異体ミオグロビン（Ｍｙｏ４ＴＡＧ）の蛋白質配列のＮ末端から６番目までのアミノ酸のＨＰＬＣ分析を示す。
【図１０】直線回帰を使用して結合定数を決定するための定濃度プロモーター（３３ｎＭ）の存在下におけるＣＡＰ（野生型及び突然変異体、光転換後又は未転換）の系列希釈液のゲルアッセイを示す。
【図１１】一次ｌａｃ結合部位に対するＣＡＰ結合親和性のＥＭＳＡ測定法を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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