(57)【要約】【課題】【解決手段】  マイコバクテリウム抗原８５Ａの翻訳産物を発現する非複製性又は複製を損傷したウイルスベクターを具えるベクターワクチンを投与することを具える宿主においてＴ細胞の免疫応答を生成する方法である。ベクターワクチン及びその使用も提供される。また、抗原又はその免疫原性断片を発現するアデノウイルスベクターを用いて抗原に対するＣＤ８及びＣＤ４のメモリーＴ細胞の応答を誘導する方法も提供される。【選択図】図１ｄ
2008526823.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト患者の少なくとも１つの抗原に対してＴ細胞の免疫応答を誘導する方法において、マイコバクテリウムのＡｇ８５Ａ遺伝子の翻訳産物を発現している非複製性又は複製を損傷したウイルスベクターを具える免疫原性組成物を前記患者に投与するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１の方法において、前記免疫原性組成物が、ベクターワクチンであることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１又は請求項２の方法において、前記Ｔ細胞の免疫応答が、ＣＣＲ７＋の応答であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載の方法において、前記非複製性又は複製を損傷したウイルスベクターが、ポックスウイルスベクター、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、フラビウイルス、及びインフルエンザウイルスから選択されることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、前記非複製性のウイルスベクターがＭＶＡであることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法において、前記非複製性のウイルスベクターがアデノウイルスベクターであることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載の方法において、前記ウイルスベクターが、Ｃ末端のＰＫタグと共にＡｇ８５Ａを発現することを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載の方法において、前記ウイルスベクターが、ＴＰＡリーダー配列と共にＡｇ８５Ａを発現することを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１項に記載の方法において、前記ウイルスベクターが、切断Ｃ末端と共にＡｇ８５Ａを発現することを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか１項に記載の方法において、前記ウイルスベクターが、配列番号５の前記翻訳産物を発現することを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法において、前記ウイルスベクターが、マイコバクテリウム種に由来する少なくとも１つの追加の抗原遺伝子の前記翻訳産物を更に発現することを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法において、前記免疫原性組成物が、少なくとも１つの追加の抗原及び／又は抗菌薬と共に投与されることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、前記少なくとも１つの追加の抗原及び／又は抗菌薬が、同時に、別々に又は順次投与されることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法において、前記応答が、抗原特異的な免疫応答であることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法において、前記応答が、治療用又は予防用であることを特徴とする方法。
【請求項１６】
患者のＴ細胞の免疫応答を誘導することによって、患者のマイコバクテリウムによる疾患の治療、又は予防のための薬物を製造するためのマイコバクテリウムのＡｇ８５Ａ遺伝子の前記翻訳産物を発現する非複製性又は複製を損傷したウイルスベクターを具えることを特徴とする免疫原性組成物の使用。
【請求項１７】
マイコバクテリウムのＡｇ８５Ａ遺伝子の前記翻訳産物を発現する非複製性又は複製を損傷したウイルスベクターと、マイコバクテリウムの疾患と前記患者のＴ細胞応答を誘導することによる少なくとも一の追加の疾患の双方の前記治療又は予防用の薬剤を製造するための少なくとも一の追加の抗原遺伝子と、を具えることを特徴とする免疫原性組成物の使用。
【請求項１８】
請求項１６又は請求項１７に記載の使用において、前記免疫原性組成物が、前記ウイルスベクターが誘導される前記ウイルスに対して、Ｔ細胞免疫応答を更に誘導することを特徴とする使用。
【請求項１９】
Ｔ細胞の免疫応答を誘導することによって、患者の少なくとも一の疾患の治療、又は予防のための薬物を製造するためのマイコバクテリウムのＡｇ８５Ａ遺伝子の前記翻訳産物を発現する非複製性又は複製を損傷したウイルスベクターを具える免疫原性組成物の使用において、前記薬物が少なくとも一の追加の抗原と共に投与されることを特徴とする使用。
【請求項２０】
Ｔ細胞の免疫応答を誘導することによって、患者の疾患の治療用薬物を製造するための抗原の使用において、マイコバクテリウムのＡｇ８５Ａ遺伝子の翻訳産物を発現する非複製性又は複製を損傷したウイルスベクターを具える免疫原性組成物と共に該薬物が投与されることを特徴とする使用。
【請求項２１】
請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法、又は請求項１６から２０のいずれか１項に記載の使用において、Ｔ細胞の応答が、結核、ハンセン氏病、マイコバクテリウム・アビウム感染、非結核性のマイコバクテリウム感染、ブルーリ潰瘍、マイコバクテリウム・ボビス感染又は疾患、天然痘、サル痘、マイコバクテリウム・パラツベルキュロシス感染、炎症性腸疾患、クローン病、自己免疫疾患、癌、及び膀胱癌から成る群より選択される疾患に対して防御的であることを特徴とする方法又は使用。
【請求項２２】
請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法、又は請求項１６から２０のいずれか１項に記載の使用において、前記患者が、小児、ＨＩＶ感染又はＡＩＤＳで免疫不全になっている、又は臓器移植を受けた患者から成る群より選択されることを特徴とする方法又は使用。
【請求項２３】
請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法、又は請求項１６から２０のいずれか１項に記載の使用において、患者が以前、マイコバクテリウムに暴露されたことがあることを特徴とする方法又は使用。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法において、患者が以前、Ｍ．ツベルキュロシスに暴露されたことがあることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２３又は請求項２４に記載の方法において、患者が潜在的にマイコバクテリウムに感染していることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法、又は請求項１６から２０のいずれか１項に記載の使用において、患者があらかじめ、ＢＣＧで治療されていることを特徴とする方法又は使用。
【請求項２７】
配列番号４のヌクレオチド配列の前記翻訳産物を発現する非複製性又は複製を損傷したウイルスベクターを具えることを特徴とするベクターワクチン。
【請求項２８】
請求項２７に記載のベクターワクチンにおいて、前記ウイルスベクターが、Ｃ末端のＰＫタグを追加で含む配列番号４のヌクレオチド配列の前記翻訳産物を発現することを特徴とするベクターワクチン。
【請求項２９】
請求項２７又は請求項２８に記載のベクターワクチンにおいて、前記ウイルスベクターがＴＰＡリーダーを追加的に含む配列番号４のヌクレオチド配列の前記翻訳産物を発現することを特徴とするベクターワクチン。
【請求項３０】
請求項２９に記載のベクターワクチンにおいて、前記ウイルスベクターが、配列番号５のヌクレオチド配列の前記翻訳産物を発現することを特徴とするベクターワクチン。
【請求項３１】
請求項２７から３０のいずれか１項に記載のベクターワクチンにおいて、前記非複製性又は複製を損傷したウイルスベクターが、ポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、フラビウイルス、及びインフルエンザウイルスから成る群より選択されることを特徴とするベクターワクチン。
【請求項３２】
請求項３１に記載のベクターワクチンにおいて、前記非複製性ウイルスベクターが、ＭＶＡであることを特徴とするベクターワクチン。
【請求項３３】
請求項３１に記載のベクターワクチンにおいて、前記非複製性ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターであることを特徴とするベクターワクチン。
【請求項３４】
請求項２７から３３のいずれか１項に記載のベクターワクチンにおいて、前記ウイルスベクターが、マイコバクテリウム種に由来する少なくとも１つの追加の抗原遺伝子の前記翻訳産物を更に発現するベクターワクチン。
【請求項３５】
抗原又はこの免疫原性フラグメントを発現するアデノウイルスベクターを用いて、抗原に対するＣＤ８及びＣＤ４メモリーＴ細胞応答の誘導方法。
【請求項３６】
前記抗原に対するＣＤ８及びＣＤ４メモリーＴ細胞応答を誘導するための薬物を製造するための抗原又はこの免疫原性フラグメントを発現するアデノウイルスベクターの使用。
【請求項３７】
請求項３６に記載の使用において、前記薬物が、マイコバクテリウムの疾患の治療、又は予防用であることを特徴とする使用。
【請求項３８】
請求項３５に記載の方法、又は請求項３６又は請求項３７に記載の使用において、前記抗原が、Ａｇ８５Ａであることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、宿主においてＴ細胞の免疫応答を生じる方法に関する。この方法は、マイコバクテリウムの抗原８５Ａの遺伝子（本明細書では「Ａｇ８５Ａ」遺伝子とも呼ぶ）の翻訳産物を発現する非複製性の又は複製を損傷したウイルスベクターを具えるベクターワクチンを投与するステップを含む。
【０００２】
本明細書で引用された全ての出版物、特許及び特許出願は、参照によって全てが援用される。
【０００３】
背景技術
結核は、呼吸器病原体、マイコバクテリウム・ツベルキュロシスが原因で起き、主として開発途上国で、毎年２００万人の人々が亡くなっている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｇｂｔ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｇｌｏｂｒｅｐ０１／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。Ｍ．ツベルキュロシスに対する唯一の認可されたワクチンであるカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）（Ｃａｌｍｅｔｔｅ，Ａ．，Ｃ．Ｇｕｅｒｉｎ，Ａｎｎ．Ｉｎｓｔ．Ｐａｓｔｅｕｒ．，３８：３７１，１９２４）は、マイコバクテリウム・ボビスの弱毒化株であり、それは、開発途上国では通常、新生児に対して単回用量で経皮投与される。多くの研究の概説は、ＢＣＧによるワクチン接種が、小児の髄膜結核及び本疾患の全身性の形成に対して防御することを示唆している。しかしながら、結核による死亡の主な世界的原因である成人の肺疾患に対しては、防御有効性には、バラツキがあり（０から８０％の範囲）（Ｇｏｌｄｉｔｚ，Ｇ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ２７１：６９８，１９９４）、それは時間とともに弱まる（Ｓｔｅｎｅ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｔｕｂｅｒｃ．Ｌｕｎｇ Ｄｉｓ．，２：２００，１９９８）。バラツキの理由は不確定である。そうであっても世界中の乳児の８０％が毎年ＢＣＧを受けている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｉｎｆ−ｆｓ／ｅｎ／ｆａｃｔ１０４．ｈｔｍｌ）。
【０００４】
マイコバクテリウム・ツベルキュロシスは、細胞内の病原体であり、それに対する防御有効性は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋双方のＴ細胞が関与する、感染への強い細胞性の応答の維持及びＴｈ１型のサイトカイン、特にＩＦＮ−γと反応する能力に関連する（Ｆｌｙｎｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｊ．Ｃｈａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９：９３，２００１）。ＢＣＧによるワクチン接種は、Ｍ．ツベルキュロシスのタンパク質と交差反応する、主としてＣＤ４＋Ｔ細胞の表現型の、ＩＦＮ−γを分泌するＴ細胞を誘導する（Ｌａｕｎｏｉｓ Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ６２（９）：３６７９−８７，１９９４）。最近の研究は、非経口で送達されるＢＣＧは、肺粘膜にてＴ細胞の免疫応答を誘導することができず、それが、肺疾患に対する防御に決定的である可能性があることを示唆している。
【０００５】
従って、マイコバクテリウムによる疾患に対する更なるワクチンを開発するニーズがある。
【０００６】
発明の開示
驚くべきことに、現在、マイコバクテリウム抗原８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）を発現するウイルスベクターは、免疫原性の組成物として投与された場合、ヒト患者のＴ細胞の免疫応答を誘導できることが見い出されている。従って、本発明は、マイコバクテリウムＡｇ８５Ａ遺伝子の翻訳産物を発現する非複製性の又は複製を損傷したウイルスベクターを具える免疫原性の組成物を患者に投与するステップを具えるヒト患者のマイコバクテリウム抗原に対してＴ細胞の免疫応答を誘導する方法を提供する。好ましくは、免疫原性組成物はベクターワクチンである。この新規のワクチン法は、Ｔ細胞の免疫応答の大きさ及び持続時間を有意に改善する。好ましくは、Ｔ細胞の応答は、メモリーＴ細胞の応答である。
【０００７】
８５Ａ抗原（Ａｇ８５Ａ）（受入番号ＣＡＡ１７８６８及びＢＸ８４２５８４）は、Ａｇ８５複合体の員である。これは、Ｍ．ツベルキュロシス、ＢＣＧ及びマイコバクテリウムのその他多数の種によって分泌される抗原、８５Ａ、８５Ｂ及び８５Ｃを具えるタンパク質のファミリーである（Ｈａｒｔｈ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６４：３０３８−３０４７，１９９６）。抗原８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）はあらゆるマイコバクテリウム種の間で保存性が高く、動物及びヒトの研究において免疫優勢である。Ａｇ８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）は、ｆｂｐＡ遺伝子によってコードされる。マイコバクテリウム・ツベルキュロシス由来の８５Ａ抗原（Ａｇ８５Ａ）は、本明細書では、配列番号１及び２に列記される。
【０００８】
結核のワクチン研究においてＴ細胞の高い応答を誘導する最近の戦略は、プラスミド、細菌又はウイルスのベクター及び組換えたんぱく質を用いた組換えＤＮＡ技術を利用してＭ．ツベルキュロシスの抗原を発現させている。Ａｇ８５ＡのＤＮＡによるマウスのワクチン接種にＡｇ８５Ａを発現するＭＶＡベクターで追加免疫することは、Ｍ．ツベルキュロシスの感作に続くＢＣＧと同等の程度の防御を生じることが示されている（ＭｃＳｈａｎｅ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，７０：１６２３−１６２６，２００２）。しかしながら、組換えＭＶＡベクター単独による単回の又は反復した免疫によって生じる免疫応答は弱かった。
【０００９】
結核のようなマイコバクテリウムによる疾患に対する長期の防御については、数十年間に渡って防御免疫を刺激し続けることができる「メモリーＴ細胞」を維持することが重要であると考えられる。
【００１０】
メモリー免疫応答は、古典的には、分化したエフェクターＴ細胞から直接生じ、均一な休止状態で生き残る長命の抗原特異的Ｔリンパ球の再活性化によるものとされる。エフェクターＴ細胞及びメモリーＴ細胞は、生体のあらゆる組織、特に、病原体に再遭遇する可能性が高い上皮表面（例えば、皮膚及び消化管）に分布すると考えられる。
【００１１】
メモリーＴ細胞は、不均質であり、異なった移動能及びエフェクター機能を持つ少なくとも２つのサブセットを具えることが示されている（Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ  Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１０：１０１−１０５，２００１）。第１のサブセットの細胞は、それらがリンパ節ホーミング受容体、Ｌ−セレクチン及びＣＣＲ７を欠き、炎症性の組織への移動のための受容体を発現するという点で一次応答で生じるエフェクター細胞に似る。抗原との再遭遇の際、これら「エフェクターメモリーＴ細胞」（ＴＥＭ）は、迅速にＩＦＮ−γ若しくはＩＬ−４を産生し、又は事前に保存していたパーフォリンを放出する。第２のサブセットの細胞は、Ｌ−セレクチン及びＣＣＲ７を発現し、迅速なエフェクター機能を欠く。これら「セントラルメモリーＴ細胞」（ＴＣＭ）は、低い活性化閾値を有し、二次リンパ系臓器にて再刺激された際、増殖し、エフェクターに分化する（Ｉｅｚｚｉ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９３：９８７−９９４，２００１）。
【００１２】
本発明者らは、Ａｇ８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）を発現している複製を損傷したウイルスベクター（この場合、「ＭＶＡ８５Ａ」によって例示される）が、ＢＣＧに感作されていない健常志願者にて単独で使用された場合、高レベルの抗原特異的インターフェロン−γ分泌メモリーＴ細胞、すなわち、エフェクターメモリーＴ細胞及びセントラルメモリーＴ細胞の双方を誘導できることを見い出した。
【００１３】
最近の１０年間に渡って、Ｔ細胞の応答を測定し、定量する新しい免疫アッセイが確立されている。抗原特異的Ｔ細胞からのＩＦＮ−γの分泌が、Ｍ．ツベルキュロシスに対する防御の最良の利用できる相関であるので、本発明者らは、ＭＶＡ８５Ａによる臨床試験の主な免疫的読み出しとして、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを利用した。更に、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、ＩＦＮ−γを分泌する抗原特異的Ｔ細胞の数を定量する、極めて再現性の高い、感度の高い方法である。
【００１４】
本発明者らは、２つのＥＬＩＳＰＯＴアッセイ：抗原と共に末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を１８時間インキュベートしてＣＣＲ７−の循環エフェクターＴ細胞のレベルを測定する生体外（新鮮）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイと、抗原と共にＰＢＭＣを１０から１４日間インキュベートしてＣＣＲ７＋のセントラルメモリーＴ細胞のレベルを測定する培養ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（Ｇｏｄｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＪＩ，２００２）とを利用した。
【００１５】
本発明者らは、ＭＶＡ８５Ａによるワクチン接種が、抗原８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）に特異的な強いセントラルメモリーＴ細胞の応答を誘導し、それは、循環エフェクターＴ細胞の応答がほとんど検出不能である、ワクチン接種後３週間でも検出可能であることを発見した。
【００１６】
これは、マイコバクテリウム抗原を発現する免疫原性組成物を投与することによって患者の長期のセントラルメモリーＴ細胞集団が有意に増強されてもよいという最初の実証である。
【００１７】
本明細書で使用するとき、「メモリーＴ細胞」は、Ｔ細胞のＣＣＲ７−（エフェクターメモリーＴ細胞）及びＣＣＲ７＋（セントラルメモリーＴ細胞）の亜集団双方を包含することが意図される。この定義はまた、クラスＩＩ拘束性ＣＤ４メモリーＴ細胞及びクラスＩ拘束性のＣＤ８メモリーＴ細胞の双方も包含する。好ましくは、本発明のベクターワクチンで誘導されるメモリーＴ細胞は、ＣＣＲ７＋の細胞表面での発現を特徴とする。これを本明細書では、セントラルメモリーＴ細胞と呼ぶ。
【００１８】
好ましくは、本発明の免疫原性組成物によって誘導されるメモリーＴ細胞の応答は、防御的Ｔ細胞応答である。防御的免疫応答は、好ましくは、抗原特異的Ｔ細胞に由来するＩＦＮ−γ分泌の免疫アッセイによって測定されてもよい。好ましくは、メモリーＴ細胞の応答は、長く続き、少なくとも、１、２、５、１０、１５、２０、２５以上持続する。更に好ましくは、防御的免疫応答は一生続く。
【００１９】
好ましくは、Ａｇ８５Ａ遺伝子は、ウイルスベクターで発現される。好ましくは、Ａｇ８５Ａ遺伝子は、非複製性の又は複製が損傷されたウイルスベクターで発現される。
【００２０】
用語「ベクターワクチン」は当該技術で周知である。本発明に係る方法で使用されるベクターは、非複製性の又は複製が損傷されたウイルスベクターである。用語「非複製性の」又は「複製が損傷された」は、本明細書で使用されるとき、正常なヒト細胞の大半においていかなる有意な程度にも複製することが可能ではないことを意味する。非複製性の又は複製が損傷されたウイルスは、確かに天然であってもよいし（すなわち、それらがそのまま天然から単離されてもよい）、又は、例えば、試験管内で繁殖させることによって、若しくは遺伝子操作によって、例えば、複製に重要な遺伝子の欠失によって人為的であってもよい。一般に、ウイルスが増殖することができる１又は２、３の細胞種があり、例えば、改変されたウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）のためのＣＥＦ細胞がある。一般に、ウイルスベクターは、Ｔ細胞の応答を刺激することが可能であるべきである。
【００２１】
この背景で有用であるウイルスベクターの例は、例えば、ＭＶＡ又はＮＹＶＡＣのようなワクシニアウイルスベクターである。好ましいウイルスベクターは、ワクシニア株ＭＶＡ又はＭＶＡに由来する株である。ワクシニアウイルスの代替には、例えば、鶏痘ウイルス又はカナリア痘ウイルスのベクターのようなアビポックスベクターを具えるその他のポックスウイルスベクターが挙げられる。アビポックスベクターとして特に好適なのは、ＡＬＶＡＣ（カナポックスとして市販）として知られるカナリア痘ウイルスの株、及びＡＬＶＡＣに由来する株、及びＦＰ９として知られる鶏痘ウイルス株である。更なる代替は、アルファウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、フラビウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びインフルエンザウイルスベクターである。
【００２２】
例えば、ベクターは、非ヒトアデノウイルスベクターであってもよい。驚くべきことに、アデノウイルスベクターの使用は、非常に強いＣＤ４メモリーＴ細胞の応答に加えて、非常に強いＣＤ８メモリーＴ細胞の応答を誘導することが見い出された。同一ワクチンによるＣＤ８及びＣＤ４双方のメモリーＴ細胞の応答の誘導は、マイコバクテリウムによる疾患の予防及び治療の双方に有益である可能性が高い。従って、抗原又はその免疫原性断片を発現するアデノウイルスベクターを用いて抗原に対してＣＤ８及びＣＤ４のメモリーＴ細胞の応答を誘導する方法も、本出願の範囲内に包含される。アデノウイルスベクターによって発現される抗原は、好ましくは上述のようなマイコバクテリウムの抗原であり、最も好ましくはＡｇ８５Ａであるが、代替的にはその他の好適な抗原のいかなるものでもよい。
【００２３】
また、本発明の範囲内に包含されるものは、抗原に対してＣＤ８及びＣＤ４のメモリーＴ細胞の応答を誘導するための薬物の製造における抗原又はその免疫原性断片を発現するアデノウイルスベクターの使用である。好ましくは、本発明は、マイコバクテリウムによる疾患の治療又は予防のための薬物の製造におけるマイコバクテリウム抗原又はその免疫原性断片を発現するアデノウイルスベクターの使用を提供する。抗原は、好ましくは上述のようなマイコバクテリウムの抗原であり、最も好ましくはＡｇ８５Ａであるが、代替的にはその他の好適な抗原のいかなるものでもよい。
【００２４】
ウイルスベクターは、ヒト患者の重篤な感染を起こすことができないことが好ましい。
【００２５】
ウイルスの複製は一般に２つの方法：１）ＤＮＡ合成、及び２）ウイルス力価で測定される。更に正確には、用語「非複製性の又は複製を損傷した」は、本明細書で使用されるとき、及びポックスウイルスに適用されるとき、以下の基準のいずれか又は双方を満たすウイルスを意味する。
１）ＭＲＣ−５細胞（ヒトの細胞株）におけるワクシニアウイルスのコペンハーゲン株に比べてＤＮＡ合成において１ログ（１０倍）の低下を示す；
２）ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株に比べて、ＨＥＬＡ細胞（ヒト細胞株）におけるウイルス力価で２ログの低下を示す。
【００２６】
この定義の範囲内に入るポックスウイルスの例は、ＭＶＡ、ＮＹＶＡＣ及びアビポックスウイルスであり、一方、定義から外れるウイルスは、弱毒化ワクシニア株Ｍ７である。
【００２７】
本発明はまた、ヒト患者のマイコバクテリウムによる疾患の治療又は予防のための薬物の製造における、マイコバクテリウムＡｇ８５Ａ遺伝子の翻訳残物を発現する非複製性又は複製を損傷したウイルスベクターを具える免疫原性組成物の使用も提供する。好ましくは、免疫原性組成物は、ベクターワクチンである。患者のＴ細胞の免疫応答を誘導することによって、免疫原性組成物及びベクターワクチンは作用する。
【００２８】
本発明に係るワクチンは、予防的（すなわち、感染を予防すること）、暴露後（すなわち、感染後ではあるが、発症前に治療すること）又は治療的（すなわち、疾患を治療すること）のいずれであってもよいが、通常、予防的又は暴露後であろう。
【００２９】
本発明のベクターワクチンによって治療又は予防することができるマイコバクテリウムによる疾患には、結核、ハンセン氏病、マイコバクテリウム・アビウム感染、非結核性のマイコバクテリウム感染、ブルーリ潰瘍、マイコバクテリウム・ボビス感染又は疾患、マイコバクテリウム・パラツベルキュロシス感染又は関連する疾患が挙げられる。その他の疾患（すなわち、マイコバクテリウムによる疾患ではない）には、炎症性腸疾患、クローン病、自己免疫疾患、癌、膀胱癌、天然痘及びサル痘が挙げられる。
【００３０】
特殊化したウイルスベクター構築物を用いて、ベクターワクチンの調製及び有用性を促進してもよい。本明細書で記載されるベクター構築物は全て本発明の態様を形成する。これらウイルス構築物を具えるベクターワクチンもまた、本発明の態様として包含される。
【００３１】
例えば、１以上の抗原遺伝子を、遺伝子のＣ末端又はＮ末端で切断してもよい。このことが、ベクターワクチンのクローニング及び構築を促進する効果を有してもよいし、代替的に、又は加えて、高い有効性につながってもよい。切断する方法は当業者に既知である。この種の切断を達成する最も簡単な方法は、抗原遺伝子のいずれかの末端でコードする核酸配列を選択的に欠失し、次いで所望のコーディング配列をウイルスベクターに挿入する、遺伝子操作の種々の周知の技法を使用することである。例えば、３’及び／又は５’エクソヌクレアーゼ戦略を選択的に用いてそれぞれ、コードする核酸の３’及び／又は５’末端を破壊することによって、候補タンパク質の切断を創る。好ましくは、親型抗原に比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のアミノ酸によって、発現される抗原が切断されるように、野生型の遺伝子配列を切断する。最も好ましくは、抗原遺伝子は、野生型Ａｇ８５Ａ抗原（配列番号３、配列番号４の発現産物）に比べてＣ末端にて１５のアミノ酸によって切断されるＡｇ８５Ａである。
【００３２】
本発明での使用に好適な抗原は、その断片が、親型抗原と共通する又は免疫的に同一視することが可能な抗原決定基又はエピトープを有するという条件で、親型抗原の断片も包含する。これらの断片をコードするポリヌクレオチドも、本発明の免疫原性組成物及びベクターワクチンでの使用に好適である。
【００３３】
本明細書で使用するとき、用語「断片」は、それが由来する親型抗原又はその機能的同等物の１つのアミノ酸配列の全てではないが、一部と同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを言う。断片は、配列から少なくともｎ個の連続したアミノ酸を具えるべきであり、特定の配列によって、ｎ個、好ましくは７個以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０以上）を具えるべきである。小型の断片が抗原決定基を形成してもよい。
【００３４】
本発明の抗原遺伝子は、親型抗原の変異体又は機能的同等物をコードしてもよい。そのような核酸分子は、例えば、天然に生じる対立遺伝子の変異体のような天然に生じる変異体であってもよく、又は、該分子は、天然に生じることが知られていない変異体であってもよい。核酸分子、細胞又は生物に適用されるものを具える突然変異誘発法によって核酸分子のそのような非天然に生じる変異体を作製してもよい。
【００３５】
中でも、この点での変異体は、ヌクレオチドの置換、欠失又は挿入によって前述の抗原遺伝子の配列とは異なる変異体である。置換、欠失又は挿入には、１以上のヌクレオチドが関与してもよい。コーディング領域又は非コーディング領域又はその双方で変異体を変化させてもよい。コーディング領域における変化が、保存的又は非保存的なアミノ酸の置換、欠失又は挿入を生じてもよい。
【００３６】
代替的に、又は遺伝子の切断に加えて、抗原をコードする遺伝子は、翻訳の際、タグポリペプチドが抗原と共有結合するようにタグポリペプチドをコードする核酸を含んでもよい。好ましくは、タグポリペプチドは、ＰＫタグ、ＦＬＡＧタグ、ＭＹＣタグ、ポリヒスチジンタグ、又は抗体によって検出することができるタグから成る群より選択される。その他の例は、当業者に明らかであろう。使用するならば、ＰＫタグは、好ましくは、配列Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐを有する。この種のタグは、抗原の発現及び抗原を発現するクローンの検出を円滑にし、代替的に、又は加えて、有効性の増大につながってもよい。
【００３７】
翻訳に続いて、タグが、発現される抗原のＣ末端若しくはＮ末端に位置するように、又は発現される抗原に対して内在的であってもよいように、タグポリペプチドをコードする核酸を位置取りさせてもよい。好ましくは、タグは、発現される抗原のＣ末端に位置する。タグポリペプチドをコードする核酸と発現される抗原をコードする核酸との間にリンカー配列をコードするヌクレオチドが挿入されてもよい。好ましくは、発現される際、リンカー配列は、アミノ酸Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅを具える。更に好ましくは、アミノ酸Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅは、発現される抗原のＮ末端抗原配列とタグとの間に挿入される。最も好ましくは、発現される抗原は、Ａｇ８５ａ（Ａｇ８５Ａ）であり、ＰＫタグはＡｇ８５ａ（Ａｇ８５Ａ）遺伝子のＣ末端に位置する。
【００３８】
抗原をコードする遺伝子はリーダー配列も具えることができる。リーダー配列は、ｍＲＮＡへの一次転写物のプロセッシング、ｍＲＮＡの安定性又は翻訳効率に影響を及ぼしてもよい。好ましくは、リーダー配列は、抗原の発現及び／又は免疫原性を高める。例えば、培養ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ及び生体外ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを介して、高められた免疫原性を判定することができる。例えば、モノクローナル抗体を用いて産生したタンパク質の量を検出することによって発現の高められたレベルを判定することができる。好ましくは、リーダー配列なしで発現された抗原に比べて発現及び／又は免疫原性が２倍、３倍以上増強される。好適なリーダー配列の例には、ｔ−ＰＡ（組織プラスミノーゲンアクチベータ）（Ｍａｌｉｎ Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ．，２（１４）：１６７７−８５，２０００ Ｎｏｖ）である。
【００３９】
好ましくは、ウイルスベクターの構築は、ＴＰＡリーダー配列に融合されたＡｇ８５ＡのＣ末端で切断された配列を具える。その上更に好ましい実施態様では、本発明のウイルスベクターは、ＴＰＡリーダー配列及びＰＫタグ配列に融合されたＡｇ８５ＡのＣ末端で切断された配列を発現する。好ましくは、リーダー配列は抗原のＮ末端に融合され、タグ配列はタンパク質の内部又はＣ末端のいずれかに融合される。特に好ましい実施態様では、ウイルスベクターの構築は、ＴＰＡ配列に融合され、配列Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＡｓｐのＰＫタグを持つ、Ｃ末端で１５アミノ酸切断されたＡｇ８５ａ（Ａｇ８５Ａ）をコードするポリヌクレオチドを含み、その際、アミノ酸残基Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅが、Ａｇ８５Ａ配列とＰＫタグ（配列番号５）との間に存在する。好ましくは、ウイルスベクターの発現産物は、配列番号６のアミノ酸配列を有する。
【００４０】
本発明者らによって言及される防御的Ｔ細胞の効果は、以前マイコバクテリウム抗原に暴露されたことがあるヒト患者で特に強力であることが見い出されている。不均質なプライム−ブースト（ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ）免疫の免疫戦略は、同一ワクチンによる均質な追加免疫よりも高レベルのエフェクターＴ細胞の応答を動物及びヒトで誘導する（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．ｍｅｄ．，４：３９７−４０２，１９９８； ＭｃＳｈａｎｅ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６９：６８１−６８６，２００１）。
【００４１】
（新生児で接種された）個体が１０から１５歳に達するにつれて、ＢＣＧの有効性を徐々に失うことの根底にあるメカニズムはほとんど理解されていない。可能性のある仮説の１つは、ＢＣＧによって生じた免疫が消失し、個体は、一次免疫を誘導するように設計された新しい候補ワクチンでワクチン接種できる免疫経験のない宿主と同等になるということである。ＢＣＧによる繰り返しのワクチン接種がＴＢに対する防御を高めるとは思われないが（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，２００５を参照）、不均質なプライム−ブースト免疫の計画にＢＣＧを組み入れることはＢＣＧの防御効果を保持することになるであろう。幾つかの動物モデルにおける、抗原８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）を発現するウイルスベクターと共にＢＣＧを追加免疫することの免疫原性及び防御効果は以前記録された（Ｇｏｏｎｅｔｉｌｅｋｅ，Ｎ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７１：１６０２−１６０９，２００３；Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，７３（６）：３８１４−６）が、防御的メモリーＴ細胞の応答の誘導は記録されなかった。
【００４２】
従って、本発明はまた、マイコバクテリウム８５ａ（Ａｇ８５Ａ）遺伝子の翻訳産物を発現している非複製性又は複製を損傷したウイルスベクターを具えるベクターワクチンと併用して、患者に少なくとも１つのマイコバクテリウム抗原を投与するステップを具えるヒト患者でＴ細胞の免疫応答を惹起する方法も提供する。好ましくは、Ｔ細胞の免疫応答は、メモリーＴ細胞の免疫応答である。
【００４３】
本発明はまた、Ｔ細胞の免疫応答を誘導するために患者に投与するための薬物の製造における、（ａ）少なくとも１つのマイコバクテリウム抗原及び（ｂ）マイコバクテリウム８５ａ（Ａｇ８５Ａ）遺伝子の翻訳産物を発現している非複製性又は複製を損傷したウイルスベクターを具えるベクターワクチンの使用も提供する。
【００４４】
マイコバクテリウム８５ａ（Ａｇ８５Ａ）遺伝子の翻訳産物を発現している非複製性又は複製を損傷したウイルスベクターを具えるベクターワクチン及びマイコバクテリウム抗原は、同時に、順次、又は別々に投与されてもよい。例えば、マイコバクテリウム抗原を投与してベクターワクチンの投与の前又は後で、患者を感作し、ベクターワクチンに対する患者の免疫応答を増強してもよい。
【００４５】
更に、本発明はまた、マイコバクテリウムＡｇ８５Ａ遺伝子の翻訳産物を発現している非複製性又は複製を損傷したウイルスベクターを具える免疫原性組成物をヒト患者に投与するステップを具えるヒト患者でＴ細胞の免疫応答を誘導する方法も提供し、その際、患者は少なくとも１つのマイコバクテリウム抗原に事前に暴露されている。好ましくは、Ｔ細胞の免疫応答は、メモリーＴ細胞の免疫応答である。
【００４６】
本発明はまた、以前マイコバクテリウム抗原に暴露されたことがあるヒト患者でマイコバクテリウムによる疾患を治療する又は予防するための薬物の製造における、マイコバクテリウム８５ａ（Ａｇ８５Ａ）遺伝子の翻訳産物を発現している非複製性又は複製を損傷したウイルスベクターを具えるベクターワクチンを具える免疫原性組成物の使用も提供する。
【００４７】
マイコバクテリウム抗原は、Ｍ．ツベルキュロシスに由来してもよく、及び／又は例えば、Ｍ．アビウム−イントラセルラーレ、Ｍ．カンサシイ、Ｍ．マリナム、及び／又はＭ．ウルセランスのような１以上のその他のマイコバクテリウムに由来してもよい。患者がたった１種の抗原に以前暴露されたことがある場合、抗原は、マイコバクテリウム感染に対する防御免疫応答を付与する抗原であってもよい。本発明の実施態様の１つでは、患者が以前暴露されたことがある抗原は、Ａｇ８５Ａではない。
【００４８】
代替的に、又は加えて、患者は以前、１以上のマイコバクテリウム自体に暴露されたことがあってもよい。例えば、少なくとも１種のマイコバクテリア抗原への患者の以前の暴露が、Ｍ．ツベルキュロシスに対する以前の暴露を含んでもよい。代替的に、又は加えて、少なくとも１種のマイコバクテリア抗原への患者の以前の暴露が、例えば、Ｍ．アビウム−イントラセルラーレ、Ｍ．カンサシイ、Ｍ．マリナム及び／又はＭ．ウルセランスのような環境でのマイコバクテリウムへの以前の暴露を含んでもよい。好ましくは、患者は潜在的にマイコバクテリウムに感染する。例えば、患者は、Ｍ．ツベルキュロシスに以前暴露されたことがあってもよく、潜在的に結核に感染していてもよい。薬物が、潜在的にマイコバクテリウムに感染している患者の治療のためである場合、治療は好ましくはマイコバクテリウム感染を根絶する。
【００４９】
代替的に、又は加えて、以前の暴露が、ＢＣＧによる新生児のワクチン接種又はＢＣＧによる以前のワクチン接種を含んでもよい。本発明者らは、ＢＣＧによって以前ワクチン接種を受け、次いで、本発明のベクターワクチンの追加免疫用量を投与された志願者では、有意に高いレベルの抗原特異的なインターフェロン−γ分泌Ｔ細胞が誘導され、ワクチン接種後２４週目で、単回ＢＣＧ接種を投与されたワクチンよりも、これらのレベルが５から３０倍高かったことを見い出している。
【００５０】
従って、本発明のこの態様は、少なくとも１種のマイコバクテリウム抗原に患者を暴露するステップ、及びマイコバクテリウム８５ａ（Ａｇ８５Ａ）遺伝子の翻訳産物を発現している非複製性又は複製を損傷したウイルスベクターを具える免疫原性組成物を具える追加免疫組成物を投与することによって免疫応答を増強するステップを具えるヒト患者のＴ細胞の免疫応答を誘導する方法を提供する。
【００５１】
本発明のこの態様はまた、以下のステップ：
ｉ）少なくとも１種のマイコバクテリウム抗原に患者を暴露するステップと；
ｉｉ）マイコバクテリウム８５ａ（Ａｇ８５Ａ）遺伝子の翻訳産物を発現している非複製性又は複製を損傷したウイルスベクターを具えるベクターワクチンを具える少なくとも１つの用量の追加免疫組成物を前記患者に投与するステップと；
を具えるヒト患者のＴ細胞の免疫応答を生成する方法にも関する。
【００５２】
本発明の実施態様の１つでは、ステップｉ）で患者がたった１種のマイコバクテリウム抗原に暴露される場合、該抗原は、防御的免疫応答を付与する抗原ではあるが、Ａｇ８５Ａではない。
【００５３】
ステップｉ）は、いかなる年齢の患者、例えば、出生後、乳児期、青年期又は成人期の患者で行われてもよい。好ましくは、患者は新生児期に、少なくとも１つのマイコバクテリウム抗原に暴露される。
【００５４】
少なくとも１種のマイコバクテリウム抗原に事前に暴露した後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０週以上、又は０．２５、０．５、０．７５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、若しくは４０年以上で、免疫原性組成物の投与が生じてもよい。好ましくは、患者が乳児期であるとき、ステップｉ）が実施される場合、ステップｉｉ）は乳児期又は青年期に実施される。
【００５５】
ステップｉｉ）が患者に１より多くの用量の追加免疫組成物を投与するステップを具える場合、１より多くの用量が、短期間に渡って又は長期間に渡って投与されてもよい。例えば、追加免疫組成物の用量を時間、日、週、月又は年の期間に渡って投与してもよい。例えば、第１の追加免疫投与の後０．５から２４時間の間に、第１の追加免疫投与の後１日から７日の間に、第１の追加免疫投与の後１週間から１ヵ月の間に、第１の追加免疫投与の後１ヵ月から６ヵ月の間に、第１の追加免疫投与の後６ヵ月から１年の間に、第１の追加免疫投与の後１から２、２から５、６から１０年以上の間に、第２の追加免疫の用量を投与してもよい。好ましくは、これらの時間間隔は、必要な変更を加えて、後に続く投与との間の期間に適用される。
【００５６】
本発明の第２の態様では、８５ａ（Ａｇ８５Ａ）抗原に対して誘導された免疫応答に加えて、ウイルスベクターが、ベクター特異的なＴ細胞の応答を刺激する。本発明のこの態様によれば、本発明のベクターワクチンの投与は、ウイルスベクターが由来するウイルスに対するＴ細胞の免疫応答を促進する。例えば、本発明のベクターワクチンにおけるＭＶＡベクターの使用は、ワクシニアウイルスに対するＴ細胞の免疫応答を促進する。好ましくは、このＴ細胞の応答は、防御的Ｔ細胞の応答である。この種の効果は今までに報告されておらず、ベクターワクチンが、第１にマイコバクテリウムによる疾患に対する防御、及び第２に、ベクターに関連するウイルスが介在する疾患に対する防御において二重の役割を有するという点で明らかに有利である。ＭＶＡベクターの場合、そのような疾患は天然痘である。
【００５７】
本発明のベクターワクチンによって治療又は予防することができるウイルスに由来する疾患は当業者に明らかであり；例として、天然痘、サル痘、及び散在性のワクシニア感染症が挙げられる。
【００５８】
従って、本発明のこの態様は、マイコバクテリウムＡｇ８５Ａ遺伝子の翻訳産物を発現している非複製性又は複製を損傷したウイルスベクターを具える免疫原性組成物をヒト患者に投与することを具えるヒト患者のマイコバクテリウム抗原及びウイルスに対するＴ細胞の免疫応答を誘導する方法を提供する。好ましくは、Ｔ細胞の免疫応答は、メモリーＴ細胞の応答である。
【００５９】
本発明のこの態様はまた、ヒト患者のマイコバクテリウム抗原及びウイルスに対するＴ細胞の免疫応答を誘導するための薬物の製造におけるマイコバクテリウムＡｇ８５Ａ遺伝子の翻訳産物を発現している非複製性又は複製を損傷したウイルスベクターを具える免疫原性組成物の使用も提供する。
【００６０】
本発明のワクチンは、免疫的に有効な量の少なくとも１種の抗原を患者に送達する。「免疫的に有効な量」によって、その量の個体への投与が、単回用量にて又はシリーズの一部としてのいずれかで、治療又は予防に有効であることを意味する。この量は、治療される個体の健康及び身体の状態、年齢、個体の免疫系の能力、所望の防御の程度、ワクチンの剤形、治療医師の医学的状況の評価、及びその他の関連因子によって異なる。量が、日常の試行を介して決定できる相対的に広い範囲に入ることが期待される。
【００６１】
本発明の第３の態様では、ウイルスベクターは、そのような追加の抗原に対して抗原特異的な免疫応答を誘導するのに使用することができる１以上の追加の抗原の翻訳産物を更に発現してもよい。免疫応答は、ＣＤ８＋、ＣＤ４＋及び／又は抗体の応答であってもよい。好ましくは、１以上の追加の抗原遺伝子は、Ｍ．ツベルキュロシス、プラスモジウムｓｐ、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、マラリア、リーシュマニア寄生虫に由来し、又は好ましくは、マイコバクテリウムｓｐｐであってもよい。好ましくは、１以上の追加の抗原遺伝子は、マイコバクテリウムに由来する抗原８５ファミリーの抗原又はマイコバクテリウムｓｐｐによって発現される任意の抗原；更に好ましくは、１６ｋＤａ抗原又はヘパリン結合血球凝集素（ＨＢＨＡ）又はＥＳＡＴ６又は７２Ｆとして知られる融合タンパク質のような１以上の潜伏抗原から成る群より選択される抗原をコードする。
【００６２】
誘導される免疫応答が腫瘍に対して向けられるように、追加の抗原が内因性に由来してもよいことも予見される。本発明と共に使用するのに好適である内因性に由来する抗原は、ヒト熱ショックタンパク質及び、例えば、ＣＥＡ、ＰＳＡ、Ｍｕｃ−１、Ｈｅｒ２ｎｅｕのような腫瘍関連抗原である。
【００６３】
Ａｇ８５Ａ遺伝子及びエピトープ鎖としての１以上の追加の抗原遺伝子を発現するようにウイルスベクターを設計してもよい。有利なことに、一連の複数のエピトープにおけるエピトープは、不必要な核酸及び／又はアミノ酸物質を回避するように配列に介在することなく一緒に連結される。エピトープ鎖の創製は好ましくは、追加の抗原をコードするＤＮＡと同一の読み取りフレームにてＡｇ８５ＡをコードするＤＮＡと共に、エピトープ鎖のアミノ酸配列をコードする組換えＤＮＡ構築物を用いて達成してもよい。或いは、Ａｇ８５Ａ及び追加の抗原は、別個のポリペプチドとして発現されてもよい。
【００６４】
本発明のこの態様は、患者のＴ細胞の応答を誘導することによってヒト患者のマイコバクテリウムによる疾患、及び少なくとも１種の追加の疾患の双方を治療する又は予防するための薬物の製造におけるマイコバクテリウムＡｇ８５Ａ遺伝子の翻訳産物、及び少なくとも１種の追加の抗原又はエピトープの遺伝子の翻訳産物を発現している非複製性又は複製を損傷したウイルスベクターを具えるベクターワクチンの使用も提供する。
【００６５】
本発明のこの態様によれば、ヒト患者のＴ細胞の免疫応答、好ましくはメモリーＴ細胞の免疫応答の誘導を介して、マイコバクテリウムによる疾患、並びにＨＩＶ，マラリア及び天然痘から成る群より選択される１以上の疾患の双方に対して防御するために、ベクターワクチンを使用してもよい。
【００６６】
本発明のベクターワクチンは単独で使用されてもよいが、追加の疾患を治療、又は予防するためにその他のワクチン接種又は治療計画と組み合わせてもよい。従って、上述のようにベクターワクチンを提供するのと同様に、本発明は、本発明のベクターワクチン及び疾患の原因となる物質に由来する１以上の更なる抗原又はエピトープを具える組成物を提供する。
【００６７】
本発明の組成物での使用に好適な抗原及びエピトープは、細菌又はウイルス起源のものであってもよい。好適な抗原は更に、タンパク質抗原、炭水化物抗原、又は複合糖質抗原として分類される。本発明の組成物は１以上の更なる抗原又はエピトープを含んでもよい。例は以下である。
−様々なマイコバクテリウム抗原又はエピトープ。
−ＨＩＶ抗原又はエピトープ。
−プラスモディウム抗原又はエピトープ。
−マラリア抗原又はエピトープ。
−肺炎球菌に由来する糖抗原。
−肺炎球菌に由来するタンパク質抗原（例えば、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０及びＳｐ１３３）。
−不活化ウイルスのようなＡ型肝炎ウイルスに由来する抗原又はエピトープ。
−表面抗原及び／又はコア抗原のようなＢ型肝炎ウイルスに由来する抗原又はエピトープ。
−Ｃ型肝炎ウイルスに由来する抗原又はエピトープ。
−インフルエンザｂ型菌に由来する糖抗原。
−ポリオ抗原又はエピトープ、例えば、ＩＰＶ。
−ジフテリアワクチン又はその構成エピトープ又は抗原又は毒素。
−破傷風ワクチン又はその構成エピトープ又は抗原又は毒素。
−麻疹、おたふくかぜ、及び／又は風疹の抗原又はエピトープ。
−インフルエンザ抗原又はエピトープ、例えば、血球凝集素及び／又はノイラミニダーゼ表面タンパク質。インフルエンザ抗原は、流行株、例えば、トリインフルエンザ、例えば、Ｈ５Ｎ１株から選択してもよい。
−黄色ブドウ球菌由来する抗原又はエピトープ。
−癌の抗原又はエピトープ。
【００６８】
糖抗原を使用する場合、好ましくは、免疫原性を高めるためにキャリアに結合させる。毒性のタンパク質抗原は、必要に応じて、例えば、化学的な手段及び／又は遺伝的な手段によって無毒化してもよい。
【００６９】
糖抗原は好ましくは抱合体の形態である。抱合体にとって好ましいキャリアタンパク質は、細菌の毒素又はトキソイド、例えば、ジフテリアトキソイド又は破傷風トキソイドである。ジフテリア毒素のＣＲＭ１９７変異体は、ジフテリアトキソイドのような特に好ましいキャリアである。その他の好適なキャリアタンパク質には、Ｎ．メニンギチジスの外部膜タンパク質、合成ペプチド、熱ショックタンパク質、百日咳タンパク質、サイトカイン、リンホカイン、ホルモン、成長因子、例えば、Ｎ１９タンパク質、インフルエンザ菌由来のタンパク質Ｄ、肺炎球菌タンパク質ＰｓｐＡ、ニューモリシン、鉄取り込みタンパク質、Ｃ．ディフィシル由来の毒素Ａ又はＢ等のような種々の病原体由来の抗原に由来する複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞のエピトープを具える人工タンパク質が挙げられる。
【００７０】
組成物における更なる抗原は、少なくともそれぞれ１μｇ／ｍＬの濃度で通常存在する。一般に、所定の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫応答を引き出すのに十分であろう。
【００７１】
混合物において更なるタンパク質抗原を使用することに対する代替として、抗原をコードする核酸を使用してもよい。従って、混合物のタンパク質成分は、タンパク質をコードする核酸（好ましくは、例えば、プラスミドの形態でのＤＮＡ）によって置き換えられてもよい。同様に、本発明の組成物は、糖抗原を模倣するタンパク質、例えば、ミモトープ又は抗イディオタイプ抗体を含んでもよい。
【００７２】
更に、本発明はまた、本発明のベクターワクチン及び１以上の抗菌化合物を具える組成物も提供する。本発明の組成物での使用に好適な抗菌薬の例は、抗結核化学療法剤、例えば、リファンピシン、イソニアジド、エタンブトール、ピリジナミド等である。
【００７３】
従って、本発明は、少なくとも１種の更なる抗原及び／又は抗菌薬との併用で、マイコバクテリウムＡｇ８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）遺伝子の翻訳産物を発現している非複製性又は複製を損傷したウイルスベクターを具えるベクターワクチンを患者に投与するステップを具えるヒト患者の少なくとも１種の抗原に対するＴ細胞の免疫応答を惹起する方法を提供する。
【００７４】
本発明はまた、Ｔ細胞の免疫応答を誘導するためにヒト患者に投与するための薬物の製造における、（ａ）マイコバクテリウムＡｇ８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）遺伝子の翻訳産物を発現している非複製性又は複製を損傷したウイルスベクターを具えるベクターワクチン及び（ｂ）少なくとも１種の更なる抗原及び／又は抗菌薬（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ）の使用も提供する。
【００７５】
マイコバクテリウムＡｇ８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）遺伝子の翻訳産物を発現している非複製性又は複製を損傷したウイルスベクターを具えるベクターワクチン並びに更なる抗原及び／又は抗菌薬は、同時に、順次、又は別々に投与されてもよい。例えば、抗原／抗菌薬の投与の前にベクターワクチンを投与して患者を感作してもよく、又は抗原の投与の後に投与してその抗原に対する患者の免疫反応を増強してもよい。ベクターワクチン及び抗原／抗菌薬は好ましくは混合物で投与される。
【００７６】
本発明はまた、患者のＴ細胞の免疫応答を誘導するための薬物の製造における少なくとも１種の抗原及び／又は抗菌薬の使用も提供し、その際、該薬物は、マイコバクテリウムＡｇ８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）遺伝子の翻訳産物を発現している非複製性又は複製を損傷したウイルスベクターを具えるベクターワクチンと共に投与される。同様に、本発明は、患者のＴ細胞の免疫応答を誘導するための薬物の製造における、マイコバクテリウムＡｇ８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）遺伝子の翻訳産物を発現している非複製性又は複製を損傷したウイルスベクターを具えるベクターワクチンの使用を提供し、その際、該薬物は、少なくとも１種の更なる抗原及び／又は抗菌薬と共に投与される。
【００７７】
本発明はまた、患者のＴ細胞の免疫応答を誘導するための薬物の製造における少なくとも１種の抗原及び／又は抗菌薬の使用も提供し、その際、該患者は、マイコバクテリウムＡｇ８５Ａ遺伝子の翻訳産物を発現している非複製性又は複製を損傷したウイルスベクターを具えるベクターワクチンによって事前に治療を受けている。本発明はまた、患者のＴ細胞の免疫応答を誘導するための薬物の製造における、マイコバクテリウムＡｇ８５Ａ遺伝子の翻訳産物を発現している非複製性又は複製を損傷したウイルスベクターを具えるベクターワクチンの使用を提供し、その際、該患者は、少なくとも１種の抗原及び／又は抗菌薬によって事前に治療を受けている。
【００７８】
本発明を使用して、上述のように種々の免疫応答を誘導し、増強してもよい。特に、マイコバクテリウムが関係するとみなされる疾患に対して免疫性を与える有効な手段を同定することは本発明の目的である。そのような疾患には、ハンセン氏病、結核、骨髄炎、クローン病、らい病、リンパ節炎、ヨーネ病が挙げられる。
【００７９】
本発明の上述の態様は、例えば、小児、ＨＩＶ、ＡＩＤＳを有する、免疫不全の／免疫抑制された、臓器移植、骨髄移植を受けた、又は遺伝的に免疫不全に罹っている患者を具える多種多様な患者に適用可能である。ワクチンが予防的用途である場合、患者は、小児（例えば、１から５歳の乳児又は小児）、大きい小児又は１０代の子供であってもよく；ワクチンが治療用途である場合、患者は好ましくは成人である。子供に意図されるワクチンは、例えば、安全性、投与量、免疫原性等を評価するために成人に投与されてもよい。
【００８０】
本発明はまた、（１）本発明の免疫原性組成物及び（２）薬学的に許容可能なキャリアを具える医薬組成物も提供する。
【００８１】
本発明は、ｉ）本発明のベクターワクチンを調製するステップ、及びｉｉ）１以上の薬学的に許容可能なキャリアと免疫原性組成物を混合するステップを具える医薬を調製する方法を提供する。
【００８２】
キャリア２）は、組成物を受け取る患者に有害な抗体の産生をそれ自体誘導しない、且つ過度の毒性なしで投与することができる任意の物質であることができる。好適なキャリアは、例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー及び不活性のウイルス粒子のような大型で代謝の遅い高分子であることができる。そのようなキャリアは当業者に周知である。薬学的に許容可能なキャリアには、例えば、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールのような液体を挙げることができる。例えば、湿潤剤又は乳化剤のような補助的物質、ｐＨ緩衝物質等もそのようなビヒクルに存在することができる。トレハロースのような安定剤、又は常温にて水溶性の糖ガラスを形成できる物質も存在してもよい。後者には、パーフルオロカーボン液体に懸濁されたミクロスフェアの形式での混合された可溶性ガラス安定化法の使用が含まれる。リポソームも好適なキャリアである。医薬キャリアの全般的な議論は、Ｇｅｎｎａｒｏ、レミングトンの「製薬学の科学と実践」第２０版、２０００年、ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２で利用可能である。
【００８３】
本発明の医薬組成物はまた、予防的に、例えば、微生物との接触が予想され、感染の確立が妨げられるべき場合、使用してもよい。例えば、外科手術に先立って組成物を投与してもよい。
【００８４】
医薬組成物は好ましくは無菌である。それは好ましくは、発熱物質を含まない。それは好ましくは、例えば、ｐＨ６からｐＨ８の間、一般的にはｐＨ７前後に緩衝化される。好ましくは、組成物は実質的にヒトと等張である。
【００８５】
本発明の組成物は、種々の異なった経路を介して投与してもよい。更に有効な応答の生成を生じるので、又は副作用を誘導する可能性を減らすので、又は投与が更に容易なので、特定の組成物に対して特定の経路が好まれる。
【００８６】
例えば、本発明で利用される組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、くも膜下、脳室内、経皮又は経皮膚塗布、皮下、腹腔内、鼻内、経腸、局所、舌下、膣内、又は直腸内の手段を具えるが、これらに限定されないいかなる数の経路によって投与されてもよい。鼻スプレー、点鼻剤、ゲル又は粉剤として、注射剤として、液体溶液又は懸濁液として鼻内投与用に組成物を調製してもよく；注射に先立った液体ビヒクル中の溶液又は懸濁液に好適な固体形態も調製してもよい。
【００８７】
組成物の直接送達は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射若しくは筋肉内注射、鼻腔内注射によって達成され、又は組織の間質空間に送達される。投与量治療は、単回用量計画であっても、複数回用量計画であってもよい。
【００８８】
以下の図面を参照して、例によって本発明の種々の態様及び実施態様が今や更に詳細に説明されるであろう。
【００８９】
例
例１
ＭＶＡ８５Ａワクチン
ＭＶＡ８５Ａの構築は以前記載された（ＭｃＳｈａｎｅ Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，７０：１６２３−１６２６，２００２）。Ｉｍｐｆｓｔｏｆｆｗｅｒｋｅ  Ｄｅｓｓａｕ−Ｔｏｒｎａｕ社の適性製造実施基準に対して臨床等級のＭＶＡ８５Ａを製造した。臨床試験でＭＶＡ８５Ａを使用するために、ロンドンの医薬品及び医療用品規制局から医師及び歯科医師免除証書が発行された。
【００９０】
臨床試験
オックスフォードシャー研究倫理委員会によって認可されたプロトコールのもとで免疫試験のために志願者が募集され、文書のインフォームドコンセントを得たのち登録された。参加者の年齢範囲は１８から５５歳であり、志願者は全て、スクリーニングの際、血清学的には、ＨＩＶ、ＨＢＶ及びＨＣＶについて陰性だった。ワクチン接種に先立って、日常的な血液学的及び生化学的な臨床検査を行い、値は全て正常限界の範囲内であった。志願者は全て、規則的な時点での採血によって６ヵ月追跡検査した。ＭＶＡ８５Ａの免疫を受けた者は、ワクチン接種後７日間、局所及び全身性の副作用及び体温を記録する日記カードを完成させた。
【００９１】
ワクチン接種
ヒーフテストを用いて判定されたＢＣＧ接種をしたことがない健常な志願者で最初の２つの試験を実施した。ヒーフテストは、ツベルクリン精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）を皮膚上に置き、次いで銃を用いて複数の穴を開けることを具える。陽性の反応は、７２時間で、穿刺部位にて４丘疹を超える。陽性の皮膚テストは、活発な結核の感染又は以前のＢＣＧワクチン接種を示す。ヒーフテスト陰性（等級０）（ツベルクリン皮膚テスト０ｍｍと同等）の志願者に、ＢＣＧ（ＢＣＧグラスゴー株の単回免疫付与、１００μＬを皮内に投与、ｎ＝１１）又はＭＶＡ８５Ａ（５ｘ１０７ｐｆｕを皮内に投与３週間離して２回免疫、ｎ＝１４）のいずれかでワクチン接種した。第３の試験では、以前ＢＣＧでワクチン接種されたことがある志願者を募集した（ｎ＝１７）。ＢＣＧワクチン接種とＭＶＡ８５Ａによる免疫との間の時間の中央値は、１８年（０．５から３８年の範囲）だった。ヒーフテストが強度で等級ＩＩより大きくない（ツベルクリン皮膚テスト＜１５ｍｍと同等）志願者を試験に登録し、ＢＣＧワクチン接種とは反対側の腕で三角筋を覆う皮膚の皮内に５ｘ１０７ｐｆｕのＭＶＡ８５Ａを単回投与で免疫した。合計３１人の健常な志願者がＭＶＡ８５Ａでワクチン接種された。１４人のＢＣＧを受けたことがない志願者のうち１１人が３週間離して２回免疫を受けた。残りの３人は単回免疫付与を受けた。ＢＣＧで感作されている１７人の志願者は全てＭＶＡ８５Ａの単回免疫付与を受けた。志願者は全員６ヵ月の追跡検査期間を完了し、これらの試験では深刻な又は重篤な有害事象はなかった。
【００９２】
免疫原性の測定
ワクチンの免疫原性を判定するために使用された主な免疫学的測定は、生体外のＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイだった。以下の時点：ツベルクリン皮膚テストに先立ったスクリーニング時、次いで、ワクチン接種後１、４、１２及び２４週で採血された血液でこれを実施した。ツベルクリンＰＰＤ（２０μｇ／ｍＬ、ＳＳＩ）、精製抗原８５（Ａｇ８５Ａ）複合体（１０μｇ／ｍＬ）及び１０アミノ酸が重複する９から１０  １５量体のペプチドの７つのプール（ＥＬＩＳＰＯＴのウエルで各ペプチドの最終濃度１０μｇ／ｍＬ）を用いて、新鮮なＰＢＭＣでこれらの測定を行った。手短に言えば、１００μＬのＲ１０（ＲＰＭＩプラス１０％ウシ胎児血清）中のウエル当たり３００，０００個のＰＢＭＣを抗原の存在下、直接ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ＭＡＩＰ  Ｓ４５１０、ミリポア）に入れ、１８時間インキュベートした。アッセイでは全て、ストレプトキナーゼ（２５０Ｕ／ｍＬ）／ストレプトドルナーゼ（１２．５Ｕ／ｍＬ）及び植物性血球凝集素（１０μｇ／ｍＬ）を陽性対照として用いた。２連一組でアッセイを行い、結果を平均した。
【００９３】
エピトープのマッピング
個々のペプチドに対する反応は、ワクチン接種後最初の試料又はその次の試料で調べた。個々のペプチドへの反応では、磁気ビーズによる除去（Ｄｙｎａｌ）を行った。氷上で２００μＬのＲ１０にてＭ−４５０（ノルウエー、オスロのＤｙｎａｌ）を用いて、５つのビーズ対１個の細胞の比率で鉄ビーズに結合したＣＤ４及びＣＤ８に対するモノクローナル抗体と共に３０分間インキュベートすることによってＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴ細胞の除去を行った。抗体で被覆された細胞を磁石（Ｄｙｎａｌ）を用いて除いた。除去なしの群、ＣＤ４＋除去群及びＣＤ８＋除去群に従って試料を分析した。細胞の除去はＦＡＣＳ走査によって確認し、常に、ＣＤ８＋Ｔ細胞については＞９０％であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞については＞９７％だった（データは示さず）。
【００９４】
免疫原性の分析
抗原又はペプチドのプール及び細胞の入ったウエルにおける平均スポット数から、培地と細胞のみの対照ウエルにおける平均スポット数を差し引くことによってＥＬＩＳＰＯＴデータを解析した。カウントが５スポット／ウエルに満たない場合は無視される。カウントが陰性対照のウエルの少なくとも２倍であれば、及び陰性対照のウエルより少なくとも５スポット多ければ、ウエルは陽性とみなされた。ペプチドプールのウエルについては、各時点で各志願者についてペプチドプール全てに渡って結果を合計した。例えば、７つのペプチドプールがあり、それぞれ９から１０のペプチドを含有する場合、各プールを２連一組で調べた。各プールについてこの２連一組の平均値を算出し、陰性対照ウエルの平均値を差し引き、そのプールの結果を得た。次いで、７つの個々のプールの結果を一緒に加えた。このことは、隣接するペプチドがある２つのプールで生じる１０量体の重複領域のいずれかに反応するＴ細胞を２回数える可能性がある。
【００９５】
統計的解析
共変量としてのスクリーニングの際のベースラインの結果を用いて、対数変換されたデータにて、反復測定値について変動の解析を行い、群間で比較した。次いで、群間のあらゆる比較にマン・ウィットニー検定を用い、ＢＣＧで感作し、ＭＶＡ８５Ａで追加免疫した群におけるスクリーニング及び２４週の試料の一対比較にはウイルコクソン検定を用いた。
【００９６】
培養ＥＬＩＳＰＯＴ法
培養ＥＬＩＳＰＯＴについては、２４穴プレートにて、１ｘ１０６個の凍結保存したＰＢＭＣを、２０μｇ／ｍＬのＭ．ｔｂＰＰＤ（「ＰＰＤ−Ｔ」）、Ｍ．アビウムＰＰＤ（「ＰＰＤ−Ａ」）又は１０μｇ／ｍＬの組換え抗原８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）で刺激した。３７℃、５％ＣＯ２の雰囲気で３日間インキュベートした後、５００μＬの細胞培養上清を取り除き、Ｒ１０中の５ＩＵ／ｍＬのリンホカルト−Ｔ（ドイツ、ドライアイヒのバイオテスト）で置き換えた。７日目にこれを繰り返した。９日目に細胞を３回洗浄し、Ｒ１０において３７℃、５％ＣＯ２の雰囲気で一晩静置した。１０日目に細胞を洗浄し、２ｍＬのＲ１０に再浮遊し、５０μＬの培養した細胞（当初播いた細胞の２．５ｘ１０４）をＥＬＩＳＰＯＴプレートの２連ウエルに移し、ＰＰＤ−Ｔ２０μｇ／ｍＬ、ＰＰＤ−Ａ２０μｇ／ｍＬ及びＡｇ８５Ａ１０μｇ／ｍＬによって１８時間刺激した。次いで前述のようにＥＬＩＳＰＯＴプレートを発色させた。
【００９７】
結果
ＭＶＡ８５Ａによる免疫は安全であり、良好に認容された（表１）。ＢＣＧ単独、ＭＶＡ８５Ａ単独及びＢＣＧで感作し、ＭＶＡ８５Ａで追加免疫したワクチン接種によって誘導された抗原特異的なＴ細胞の応答の動態及び大きさを比較した。アッセイにおいて、ＰＰＤ−Ｔ、抗原８５（Ａｇ８５Ａ）タンパク質又は抗原８５（Ａｇ８５Ａ）に由来する重複ペプチドのいずれかを用いた３種のワクチン接種計画は全て有意な免疫応答を誘導する（表２、図１）。ＰＰＤ−Ｔ（Ｆ＝３．６２４、Ｐ＝０．０３７）、抗原８５（Ａｇ８５Ａ）（Ｆ＝１６．６０５、Ｐ＜０．００１）及び合計したプール抗原８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）ペプチド群（Ｆ＝３９．９８２、Ｐ＜０．００１）においてワクチンの有意な主な効果があった。ＢＣＧによる免疫は、控えめなレベルの抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞を誘導し、そのピークは免疫後４週間だった（表２、図１ｂからｄ）。プールした抗原８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）ペプチドに対する応答は、ＢＣＧによるワクチン接種の後、顕著に弱かった。（図１ｄ）。生体外ＥＬＩＳＰＯＴアッセイでは、１１人の志願者中たった４人しか７つのペプチドプールのいずれかに応答しなかった。これらのペプチドプールへの応答は全てペプチド１２、１３、２７及び２８に起因し、ＣＤ４＋Ｔ細胞の除去によって完全に排除された。
【００９８】
表１：ＭＶＡ８５Ａによる免疫後の応答型の有害事象
ＢＣＧ経験がない群とＢＣＧで感作された群との間で報告された有害事象の頻度又は重症度のいずれかに差異はなかった。
2008526823.tif 000003
ａ全身性症状は全て７日以内に解消した。
ｂ３７．７から３８．１℃の範囲；全て２４時間以内に自然に解消した。
【００９９】
ＢＣＧの経験がない志願者では、ＭＶＡ８５Ａによる単回免疫付与は、高いレベルの抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞を誘導し、１４人の志願者中１３人でワクチン接種後７日でピークとなった（表２、図１ｂからｃ）。４週間までに、この応答は、ベースラインのほんの少し上のレベルまで低下した。３週目に投与されたＭＶＡ８５Ａによる２回目のワクチン接種による増強効果は見られなかった。志願者の１人はＭＶＡ８５Ａによる免疫後、インサート特異的Ｔ細胞を発生させなかったが、この志願者は、ワクシニアによる免疫の既往歴を有さないにもかかわらず、ＭＶＡベクターに対する特異的Ｔ細胞の応答を発生させた（データは示さず）。ＭＶＡ−ｌａｃＺ抗原を用いた生体外ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行うことによってＭＶＡ８５Ａによりワクチン接種された志願者のＭＶＡ−ｌａｃＺに対する応答を更に調べた。アッセイ法は「免疫原性の測定」にて上記で議論したとおりである。ＭＶＡ８５Ａによりワクチン接種された健常志願者は、強い抗ＭＶＡのＴ細胞応答を示し、これはワクチン接種後２４週まで続く。
【０１００】
ＢＣＧによるワクチン接種とは対照的に、ＭＶＡ８５Ａによるワクチン接種は、１３／１４の応答性志願者全てにおいて数種のペプチドプールに強い応答を誘導した（表２、図１ｄ）。抗原８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）の全長のいたる所でペプチドの広い範囲に応答は見られた。ＣＤ４＋Ｔ細胞の除去によってこれら個々のペプチドへの応答は全て完全に排除された（データは示さず）。
【０１０１】
ＢＣＧで感作し、ＭＶＡ８５Ａで追加免疫した群における１６／１７の志願者では、抗原特異的なＴ細胞の有意な上昇が、ワクチン接種後１週間で見られた（表２、図１）。免疫後１週間のピークの応答は、ＢＣＧ単独群又はＭＶＡ８５Ａ単独群に比べてＢＣＧで感作し、ＭＶＡ８５Ａで追加免疫した群で有意に高かった（図１ｂからｅ）。これらの応答は、少なくとも２４週間、ＢＣＧ単独又はＭＶＡ８５Ａ単独によるワクチン接種後よりも有意に高いレベルで持続された（図１ｅ）。スクリーニング時のベースライン応答は、予想どおり、ＢＣＧを経験したことがない群よりもＢＣＧで以前ワクチン接種された志願者において高かった。それにも関わらず、ＢＣＧで感作し、ＭＶＡ８５Ａで追加免疫した群におけるＭＶＡ８５Ａによるワクチン接種後２４週目の応答は、ＰＰＤ（ウイルコクソン：ｚ＝−３．０１０、Ｐ＝０．００３）、抗原８５（Ａｇ８５Ａ）（ウイルコクソン：ｚ＝−３．５１６、Ｐ＜０．００１）及び合計したプールペプチド（ウイルコクソン：ｚ＝−３．４０８、ｐ＝０．００１）について、この群でのベースライン値よりも有意に高かった。
【０１０２】
ＭＶＡ８５Ａ単独（示さず）及びＢＣＧで感作し、ＭＶＡ８５Ａで追加免疫した群（図１ｆ）で見られたペプチドへの応答の幅は、非常に類似した。しかしながら、反応の大きさは、ＢＣＧで感作し、ＭＶＡ８５Ａで追加免疫した群で有意に高かった（図１ｅ）。抗原８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）由来の全部で６６のペプチドによって、ＢＣＧで感作し、ＭＶＡ８５Ａで追加免疫した群における１２人の志願者のＰＢＭＣをアッセイした。５０％を超える被験者によってこれらペプチドの幾つかが認識されたということは（図１ｆ）、以前報告された（Ｌａｕｎｏｉｓ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６２：３６７９−３６８７，１９９４）ように、異なったＨＬＡクラスＩＩ分子によるこれらペプチドの無差別的な認識を説明している。
【０１０３】
表２．
2008526823.tif 000004
【０１０４】
ＭＶＡ８５Ａ単独群で見られるＴ細胞の応答の大きさは、現在まで使用されているその他の組換えＭＶＡで見られるものよりも約１０の係数分強い（ＭｃＣｏｎｋｅｙ Ｓ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，「ヒトにおける組換え改変ワクシニアウイルス、アンカラによって追加免疫したプラスミドＤＮＡワクチンによるＴ細胞免疫原性の増強」、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，９：７２９−７３５，２００３；Ｍｗａｕ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，「臨床試験におけるヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）クレードＡワクチン：ヒトにおけるＤＮＡ及び組換え改変ワクシニアウイルス、アンカラ（ＭＶＡ）ワクチンによるＨＩＶ特異的Ｔ細胞の応答の刺激」、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８５：９１１−９１９，２００４）。Ｐ．ファルシパルム由来の抗原を発現する組換えＭＶＡは、ワクチン接種の７日後、９０ＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣの平均合計ペプチド応答を誘導した（ＭｃＣｏｎｋｅｙ Ｓ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，９：７２９−７３５，２００３）。それに対して我々は、ＭＶＡ８５Ａでワクチン接種した７日後、１３６５ＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣの合計ペプチドに対する平均の応答を見ている（表２）。これに対する説明の１つは、これらの志願者は何らかの事前に存在する抗マイコバクテリウム免疫を有しており、ＭＶＡ８５Ａによる免疫によってそれが増強されているということである。このことを更に検討するために我々は、生体外ＥＬＩＳＰＯＴではなく培養ＥＬＩＳＰＯＴを用いた。培養ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、生体外ＥＬＩＳＰＯＴによって測定される活性化エフェクターＴ細胞ではなく、セントラルメモリー型のＴ細胞を測定することが以前示されている（Ｒｅｅｃｅ  Ｗ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１０：４０６−４１０，２００４；Ｇｏｄｋｉｎ Ａ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９：２２１０−２２１４，２００２）。
【０１０５】
ＭＶＡ８５Ａ単独群における４人の志願者からのワクチン接種前スクリーニングのＰＢＭＣにて培養ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。Ｍ．ｔｂのＰＰＤ、Ｍ．アビウムのＰＰＤ及び組換え抗原８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）と共に細胞を培養した。４人の志願者全員がＭ．アビウムのＰＰＤに応答し、２／４がＭ．ｔｂのＰＰＤに応答し、２／４が組換え抗原８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）に応答した（図２）。これらの志願者は、スクリーニング用生体外ＥＬＩＳＰＯＴにてＭ．ｔｂのＰＰＤ又は精製抗原８５（Ａｇ８５Ａ）のいずれに対してもいかなるベースライン応答も有さなかった。
【０１０６】
ＭＶＡ８５Ａによるワクチン接種に続くメモリーＴ細胞の応答の誘導を更に検討するために、ワクチン接種後３週目のＰＢＭＣで、生体外ＥＬＩＳＰＯＴ及び培養ＥＬＩＳＰＯＴのアッセイを行った。Ｍ．ｔｂのＰＰＤ、Ｍ．アビウムのＰＰＤ及び組換え抗原８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）と共に細胞を培養した。３週間では、生体外の応答は極めて低いか又は検出不能であるが、調べた５人の志願者全てにおいて培養ＥＬＩＳＰＯＴで強い応答があったということは、ワクチン接種による抗原８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）に特異的なセントラルメモリーＴ細胞の誘導を示している。
【０１０７】
例２
潜在的にＭ．ｔｂに感染している被験者における安全性及び免疫原性のデータ
潜在的にマイコバクテリウム・ツベルキュロシス（Ｍ．ｔｂ）に感染している９人の健常な成人にＭＶＡ８５Ａでワクチン接種した。各被験者にてワクチン接種後、規則的な間隔で血清の炎症性マーカーを１２ヵ月間に渡って測定した。ワクチン接種前及びワクチン接種後１０週目に肺の高解像ＣＴスキャンを行った。肺の炎症の不顕性の徴候を検出するためにこれらの試験を行った。９人の潜在的に感染した志願者から生じた生体外ＥＬＩＳＰＯＴの結果を図５ａに示す。
【０１０８】
この群におけるＭＶＡ８５Ａの安全性は、例１で記載される以前の試行で見られるものと同一である。局所性にも全身性にも副作用の増加は検出されなかったし、肺の炎症の徴候も検出されなかった。ワクチン接種後、炎症性のマーカーは変化しなかったし、ワクチン接種後、ＣＴスキャンによって検出可能な肺の炎症はなかった。
【０１０９】
比較のように、以前、０．５から３７年前ＢＣＧ注射を受けたことがある１７人の健常な成人に、ＭＶＡ８５Ａでのワクチン接種によって追加免疫を行った。結果は例１に記載されている。潜在的に感染した群（試行７、「Ｔ００７」）で見られるワクチン接種後の免疫応答は、ＢＣＧで感作した群（試行５、「Ｔ００５」）で見られるものと類似する大きさである。結果を図５ｂ及び５ｃに示す。
【０１１０】
開発途上国全体にわたる潜在的感染の有病性を考えると、新しいＴＢワクチンが潜在的に感染した被験者で安全であるのは重要なので、このデータは有意である。更に、有望な免疫原性は、そのような潜在的感染を撲滅することを目的として、潜在的に感染した人々に投与される暴露後ワクチンとしてのこのワクチンの適用を支持する。
【０１１１】
免疫応答の持続時間
ＢＣＧで感作した志願者におけるＭＶＡ８５Ａで追加免疫した後の生体外ＥＬＩＳＰＯＴ反応は、感作（ＢＣＧ）と追加免疫（ＭＶＡ８５Ａ）の短い間隔（１ヵ月）及び長い間隔（１０年を超える）の双方で、ワクチン接種後少なくとも１年間続く。
【０１１２】
ＢＣＧ後１０年を越えてからＭＶＡ８５Ａでワクチン接種された１２人の志願者及びＢＣＧ後１ヵ月でＭＶＡ８５Ａでワクチン接種された１０人の志願者の長期間の追跡データを図６に示す。双方の組の志願者のデータは、ワクチン接種後１年で免疫応答の持続を示し、それは、ワクチン接種後６ヵ月で見られたのと同じ大きさである。
【０１１３】
ワクチンが誘導した免疫応答の持続は、メモリー応答の誘導を示している。メモリー応答が誘導されていない限り、非複製性のワクチンによるワクチン接種の１年後、ワクチンで誘導した持続する応答を見ることを誰も期待しないだろう。
【０１１４】
プライム−ブースト免疫の間隔と免疫応答のレベルの間の相関
図３に提示されたデータは、ＭＶＡ８５Ａの追加免疫ワクチン接種の後見られるＢＣＧで誘導した免疫応答の増強は、ＢＣＧによる感作とＭＶＡ８５Ａによる追加免疫との間の間隔に依存しないことを示している。短い（１ヵ月）及び長い（１０年を超える）追加免疫との間隔で同等の増強が見られた。
【０１１５】
感作（ＢＣＧ）と追加免疫（ＭＶＡ８５Ａ）の間の間隔と、ＭＶＡ８５Ａで誘導される免疫応答のピーク（１週間）又はプラトー（６ヵ月）のいずれかとの間に相関はない（図７）。
【０１１６】
従って、ＢＣＧによるワクチン接種の直後（例えば、開発途上国では乳児期）又は更に後の時点（例えば、青年期）のいずれかでマイコバクテリウムに対する免疫を増強することは同等に実現可能である。乳児期の追加免疫及び青年期の追加免疫は双方とも、有効性の試行にとって可能性のある選択肢であり、追加免疫ＴＢワクチンに関して可能性のある適応である。
【０１１７】
アカゲザルにおけるＢＣＧ感作−ＭＶＡ８５Ａ追加免疫の免疫原性及び防御有効性
免疫原性と負荷の実験において、アカゲザルに対して（６匹／群）、ｉ）ＢＣＧ単独、ｉｉ）ＢＣＧ，次いで９週後、ＭＶＡ８５Ａによる追加免疫、又は（ｉｉｉ）生理食塩水（対照群）のいずれかによってワクチン接種した。動物は全て、ＢＣＧワクチン接種後（又は対照群については生理食塩水のワクチン接種）１８週目に気管内に負荷し、次いで安楽死させる前１６週間追跡した。免疫原性の結果は図８に示す。
【０１１８】
図８ａは、この負荷実験における全３群でのワクチン接種後のＩＦＮ−γの平均レベル（３日間のリンパ球の刺激試験によって測定されるように）を示す。ＢＣＧ群及びＢＣＧ感作ＭＶＡ８５Ａ群におけるＰＰＤに対する反応でのＩＦＮ−γのレベルは、類似であると思われるが、Ａｇ８５Ａに対する反応は、ＢＣＧ感作ＭＶＡ８５Ａ追加免疫の群で明らかに高い。従って、ＢＣＧ単独群（ｉ群）では見られない、ＭＶＡ８５Ａでワクチン接種した（ｉｉ群）後のＡｇ８５Ａ特異的なＩＦＮ−γの分泌の有意な上昇がある（図８ａ）。
【０１１９】
図８ｂは、この負荷実験における全３群での負荷後のＩＦＮ−γの平均レベル（３日間のリンパ球の刺激試験によって測定されるように）を示す。Ｍ．ｔｂで負荷した後、ＢＣＧ−ＭＶＡ８５Ａ群（ｉｉ群）は、ＢＣＧ単独群（ｉ群）よりも有意に高いＡｇ８５Ａ特異的な応答を有した。また、Ｍ．ｔｂ特異的な免疫応答（大きさは細菌負荷に関係する）であるＥＳＡＴ６／ＣＦＰ１０（早期分泌抗原標的タンパク質／培養ろ過タンパク質１０）への応答は、生理食塩水群に比べて、ＢＣＧ群及びＢＣＧ−ＭＶＡ８５Ａ群で低い。ＰＰＤへの応答はこれら２つの群間では類似する。ＥＳＡＴ６／ＣＦＰ１０の結果は、これらの抗原がＴＢ特異的であり、これらの抗原に対する免疫応答のレベルは細菌負荷に相関する（すなわち、細菌負荷が高ければ（生理食塩水群）高いほど、ＥＳＡＴ６及びＣＦＰ１０に対する免疫応答も高い）ので重要である（最下段）。ワクチンの防御的有効性は、生理食塩水群に比べてＢＣＧ群及びＢＣＧ−ＭＶＡ８５Ａ群における相対的に低いＥＳＡＴ６／ＣＦＰ１０に対する応答によって含蓄される。
【０１２０】
解剖では、ＢＣＧ単独群よりもＢＣＧ−ＭＶＡ８５Ａ群で見られる病態の方がかなり少なかった。これら２つの群での細菌負荷の低下は、ＢＣＧ−ＭＶＡ８５Ａ群では０．９７であり、ＢＣＧ群では０．４２であった。
【０１２１】
アカゲザルは、ヒト疾患の良好なモデルであり、動物の数が少ないにもかかわらず、防御有効性におけるこの有望な改善は、類似の有効な成績がヒトにおいて期待されることを示唆している。
【０１２２】
南アフリカの成人におけるフェーズＩＩ試験の安全性及び免疫原性のデータ
南アフリカの西ケープにてフェーズＩＩの安全性と免疫原性の試験が開始された。この試行は成人においてであり、標的は２４人の被験者である。潜在的に感染している被験者は本試験から除外した。今日までに、１２人の被験者にワクチン接種した。１２人の被験者は全て、ワクチン接種後１週間のＥＬＩＳＰＯＴアッセイにてＭＶＡ８５Ａが誘導した有意な免疫応答の有していた。
【０１２３】
現在までの安全性特性は、英国及びガンビアの試験で見られたものと同じである。英国での試験の結果は図１及び図９ａに示し、ガンビアでの試験の結果は図９ｂに示す。
【０１２４】
全部で、１１人のＢＣＧ経験のない志願者及び１０人のＢＣＧで感作された志願者がガンビアでワクチン接種を受けた。ＢＣＧ経験のない群（図９ｂ）の免疫原性の結果は、追跡検査期間の間中、それらがベースラインより上にとどまるという点で、英国におけるＢＣＧ感作群（図１ｂ、１ｃ、１ｄ）の免疫原性の結果に類似した。このことは、ベースラインにて環境のマイコバクテリウムによる更に程度の高い感作、及び応答を維持している環境のマイコバクテリウムへの現在進行中の暴露を反映している可能性がある。
【０１２５】
ガンビアにおいては、ＢＣＧ経験のない群とＢＣＧ感作群との間に有意差はなく、それは、上記のようにこの群における更に程度の高い環境からの感作によって説明される。それにひきかえ、英国では、ＢＣＧ経験のない群の免疫原性の結果は、追跡検査中、ベースラインに戻ったが（図９ａ、図１ｂ、１ｃ及び１ｄ）、ＢＣＧ感作群は、追跡検査の間中、ベースラインの上にとどまる（図１ｂ、１ｃ及び１ｄ）。
【０１２６】
ＢＣＧの文献全体に渡って、様々な国及び大陸のいたるところで、防御的有効性の広い変動の多くの例がある。英国、西アフリカ及び南アフリカにおけるＭＶＡ８５Ａの一貫した安全性及び免疫原性特性は非常に重要である。
【０１２７】
抗原８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）を発現するアデノウイルスのマウスにおける免疫原性
抗原８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）を発現する組換えアデノウイルス（ヒト株、Ｅ１及びＥ３を欠失）は、単独で投与されると、マウスにおいて強い免疫応答を誘導することが示されている（ＣＤ４の応答：ｃ８００スポット／１００万個の脾細胞；ＣＤ８の応答：ｃ１２００スポット／１００万個の脾細胞）。以前ＢＣＧを投与されたことがあるマウスに投与すると、抗原８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）を発現するアデノウイルスは、更に強い応答を刺激する（ＣＤ４の応答：ｃ１４００スポット／１００万個の脾細胞；ＣＤ８の応答：ｃ２５００スポット／１００万個の脾細胞）。従って、このアデノウイルスベクターは、ここで、非常に強いＣＤ４Ｔ細胞の応答に加えて、非常に強いＣＤ８Ｔ細胞の応答を誘導することが顕著に示され、同一ワクチンによるこれらの誘導は、マイコバクテリウムによる疾患の予防及び治療の双方に有益である可能性が高い。アデノウイルスベクターは以前、ＣＤ８Ｔ細胞の応答を誘導する良好な手段として見られていたが、我々は、ここで、ＣＤ４及びＣＤ８双方の応答が強く誘導されることを示す。このデータは、アデノウイルスベクターが、ＢＣＧで感作したＴ細胞の応答の強力な追加免疫でありうることを示唆している。
【０１２８】
例示のみを目的として本発明は上述されてきた。本発明の範囲を逸脱することなく、詳細の改変が行われてもよいことが十分に理解されるであろう。
【０１２９】
ＡＧ８５Ａ特定配列
【０１３０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ＡＧ８５Ａ  ポリペプチド配列）
2008526823.tif 000005
【０１３１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ＡＧ８５Ａ  ヌクレオチド配列）
2008526823.tif 000006
【０１３２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（１５アミノ酸ＡＧ８５Ａ切断ポリペプチド配列）
2008526823.tif 000007
【０１３３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４（１５アミノ酸ＡＧ８５Ａ切断ヌクレオチド配列）
2008526823.tif 000008
【０１３４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５  １１７６ヌクレオチド配列の挿入部分は、次のようである（上記の場合で発現した配列、Ａｇ８５Ａコード配列は下線が付されている）：
2008526823.tif 000009
【０１３５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６
2008526823.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１ａ】図１は、各ワクチン接種群：ＢＣＧ単独；ＭＶＡ８５Ａ単独；ＢＣＧ感作ＭＶＡ８５Ａ追加免疫におけるワクチン接種後の中央値ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ反応である。図１ａは、各群におけるワクチン接種（週）の時系列である。
【図１ｂ】図１は、各ワクチン接種群：ＢＣＧ単独；ＭＶＡ８５Ａ単独；ＢＣＧ感作ＭＶＡ８５Ａ追加免疫におけるワクチン接種後の中央値ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ反応である。図１ｂは、ツベルクリン精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）への応答である。
【図１ｃ】図１は、各ワクチン接種群：ＢＣＧ単独；ＭＶＡ８５Ａ単独；ＢＣＧ感作ＭＶＡ８５Ａ追加免疫におけるワクチン接種後の中央値ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ反応である。図１ｃは、精製抗原８５（Ａｇ８５Ａ）タンパク質への応答である。
【図１ｄ】図１は、各ワクチン接種群：ＢＣＧ単独；ＭＶＡ８５Ａ単独；ＢＣＧ感作ＭＶＡ８５Ａ追加免疫におけるワクチン接種後の中央値ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ反応である。図１ｄは、合計したプールペプチドへの応答である。
【図１ｅ】図１は、各ワクチン接種群：ＢＣＧ単独；ＭＶＡ８５Ａ単独；ＢＣＧ感作ＭＶＡ８５Ａ追加免疫におけるワクチン接種後の中央値ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ反応である。図１ｅは、測定された３種の抗原のそれぞれについて、マン−ウィットニー統計学を用いて各時点での各ワクチン群間の応答を比較した統計的に有意な比較を示す。
【図１ｆ】図１は、各ワクチン接種群：ＢＣＧ単独；ＭＶＡ８５Ａ単独；ＢＣＧ感作ＭＶＡ８５Ａ追加免疫におけるワクチン接種後の中央値ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ反応である。図１ｆは、ＢＣＧワクチン接種された個体におけるＭＶＡ追加免疫後のＴ細胞エピトープの表示である。ＣＤ４＋Ｔ細胞を除去することによって個々のペプチドへの応答は全て完全に排除された。
【図２】図２は、ワクチン接種に先立って、ＭＶＡ８５Ａ単独試験における４人の志願者から採取した血液のＭ．ｔｂのＰＰＤ、Ｍ．アビウムのＰＰＤ及び組換え抗原８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）に対する応答の培養ＥＬＩＳＰＯＴによるスクリーニングである。各志願者は、コードＴＸＸＸＸＸＸによって同定され、その際、最初の３つのＸは試行番号に相当し、最後の３つのＸは志願者番号に相当し、例えば、Ｔ００２０２２は、Ｔ００２が試行番号であり、０２２が志願者番号である。
【図３−１】図３は、ＭＶＡ８５Ａの単回免疫付与の３週間後の５人の志願者におけるＡｇ８５Ａペプチド（大文字で標識）のプールに対する応答の培養（「ｃｕｌｔｕｒｅ」と標識）ＥＬＩＳＰＯＴ及び生体外ＥＬＩＳＰＯＴである（志願者は、コードＴＸＸＸＸによって同定され、ＸＸＸＸは４つの桁数であり、１桁目は試行番号に相当し、２、３及び４桁は志願者番号に相当し、例えば、Ｔ２００３は、Ｔ２が試行番号であり、０００３が志願者番号であることを意味する（Ｔ２は、上記図２におけるＴ００２と同義である）。ワクチン接種後の応答は非常に高く、ワクチン接種前の応答よりも高い。志願者は、以前、ＢＣＧによるワクチン接種は受けなかった。
【図３−２】図３は、ＭＶＡ８５Ａの単回免疫付与の３週間後の５人の志願者におけるＡｇ８５Ａペプチド（大文字で標識）のプールに対する応答の培養（「ｃｕｌｔｕｒｅ」と標識）ＥＬＩＳＰＯＴ及び生体外ＥＬＩＳＰＯＴである（志願者は、コードＴＸＸＸＸによって同定され、ＸＸＸＸは４つの桁数であり、１桁目は試行番号に相当し、２、３及び４桁は志願者番号に相当し、例えば、Ｔ２００３は、Ｔ２が試行番号であり、０００３が志願者番号であることを意味する（Ｔ２は、上記図２におけるＴ００２と同義である）。ワクチン接種後の応答は非常に高く、ワクチン接種前の応答よりも高い。志願者は、以前、ＢＣＧによるワクチン接種は受けなかった。
【図４】図４は、１週目に１回ＭＶＡ−８５Ａで免疫された健常な志願者における生体外ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで抗原として使用したＭＶＡ−ＬａｃＺへのＴ細胞の応答の追跡検査である。志願者は以前、ＢＣＧによるワクチン接種を受けたことがあった。
【図５ａ】図５ａは、潜在的にＭ．ｔｂに感染している被験者におけるＭＶＡ８５Ａによる単回ワクチン接種後のＰＰＤ、組換え抗原８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）及び抗原８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）のペプチドプールの合計に対する応答の中央値ＥＬＩＳＰＯＴである。
【図５ｂ】図５ｂは、ＢＣＧで感作した被験者（Ｔ００５、すなわち、試行５、例１を参照のこと）及び潜在的にＭ．ｔｂに感染している被験者（Ｔ００７、すなわち、試行７）におけるＭＶＡ８５Ａが誘導した、抗原８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）のペプチドプールの合計に対する応答の比較である。
【図５ｃ】図５ｃは、ＢＣＧで感作した被験者（Ｔ００５）及び潜在的にＭ．ｔｂに感染している被験者（Ｔ００７）におけるＭＶＡ８５Ａが誘導した、組換え抗原８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）に対する応答の比較である。
【図６ａ】図６ａは、感作（ＢＣＧ）と追加免疫（ＭＶＡ８５Ａ）との間で長い（１０年を超える）間隔を持つ被験者群におけるワクチン接種後少なくとも１年間の、ＭＶＡ８５Ａが誘導した免疫応答の持続である。
【図６ｂ】図６ｂは、感作（ＢＣＧ）と追加免疫（ＭＶＡ８５Ａ）との間で短い（１ヵ月）間隔を持つ被験者群におけるワクチン接種後少なくとも１年間の、ＭＶＡ８５Ａが誘導した免疫応答の持続である。
【図７ａ】図７ａは、ＢＣＧとＭＶＡ８５Ａワクチン接種との間の間隔と、ＭＶＡ８５Ａワクチン接種の１週間後の、抗原８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）のペプチドプールの合計へのＴ細胞の応答との相関の欠如である。
【図７ｂ】図７ｂは、ＢＣＧとＭＶＡ８５Ａワクチン接種との間の間隔と、ＭＶＡ８５Ａワクチン接種の２４週間後の、抗原８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）のペプチドプールの合計へのＴ細胞の応答との相関の欠如である。
【図８ａ】図８ａは、ワクチン接種後のＩＦＮ−γの平均レベルである。
【図８ｂ】図８ｂは、負荷後のＩＦＮ−γの平均レベルである。
【図９ａ】図９ａは、英国のＢＣＧ経験のない志願者におけるＭＶＡ８５Ａに対する応答の生体外ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴである。
【図９ｂ】図９ｂは、ガンビアのＢＣＧ経験のない志願者におけるＭＶＡ８５Ａに対する応答の生体外ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴである。
【図１ａ】
2008526823.tif 000011
【図１ｂ】
2008526823.tif 000012
【図１ｃ】
2008526823.tif 000013
【図１ｄ】
2008526823.tif 000014
【図１ｅ】
2008526823.tif 000015
【図１ｆ】
2008526823.tif 000016
【図２】
2008526823.tif 000017
【図３−１】
2008526823.tif 000018
【図３−２】
2008526823.tif 000019
【図４】
2008526823.tif 000020
【図５ａ】
2008526823.tif 000021
【図５ｂ】
2008526823.tif 000022
【図５ｃ】
2008526823.tif 000023
【図６ａ】
2008526823.tif 000024
【図６ｂ】
2008526823.tif 000025
【図７ａ】
2008526823.tif 000026
【図７ｂ】
2008526823.tif 000027
【図８ａ】
2008526823.tif 000028
【図８ｂ】
2008526823.tif 000029
【図９ａ】
2008526823.tif 000030
【図９ｂ】
2008526823.tif 000031
【配列表】
2008526823000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年11月8日(2006.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト患者の少なくとも１つの抗原に対してセントラルメモリーＴ細胞の免疫応答を誘導する方法において、マイコバクテリウムのＡｇ８５Ａ遺伝子の翻訳産物を発現している非複製性又は複製を損傷したポックスウイルスベクターを具える免疫原性組成物を前記患者に投与するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１の方法において、前記免疫原性組成物が、ベクターワクチンであることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１又は請求項２の方法において、前記Ｔ細胞の免疫応答が、ＣＣＲ７＋の応答であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載の方法において、前記非複製性のウイルスベクターが、ＭＶＡであることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載の方法において、前記ウイルスベクターが、Ｃ末端のＰＫタグと共にＡｇ８５Ａを発現することを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載の方法において、前記ウイルスベクターが、ＴＰＡリーダー配列と共にＡｇ８５Ａを発現することを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載の方法において、前記ウイルスベクターが、切断Ｃ末端と共にＡｇ８５Ａを発現することを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載の方法において、前記ウイルスベクターが、配列番号５の前記翻訳産物を発現することを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１項に記載の方法において、前記ウイルスベクターが、マイコバクテリウム種に由来する少なくとも１つの追加の抗原遺伝子の前記翻訳産物を更に発現することを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか１項に記載の方法において、前記免疫原性組成物が、少なくとも１つの追加の抗原及び／又は抗菌薬と共に投与されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法において、前記少なくとも１つの追加の抗原及び／又は抗菌薬が、同時に、別々に又は順次投与されることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法において、前記応答が、抗原特異的な免疫応答であることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法において、前記応答が、治療用又は予防用であることを特徴とする方法。
【請求項１４】
患者のセントラルメモリーＴ細胞の免疫応答を誘導することによって、患者の少なくとも一の疾患の治療、又は予防のための薬物を製造するためのマイコバクテリウムのＡｇ８５Ａ遺伝子の前記翻訳産物を発現する非複製性又は複製を損傷したポックスウイルスベクターを具えることを特徴とする免疫原性組成物の使用。
【請求項１５】
請求項１４に記載の使用において、Ｔ細胞の免疫応答が、ＣＣＲ７＋の応答であることを特徴とする使用。
【請求項１６】
請求項１４又は請求項１５に記載の使用において、前記ウイルスベクターが、少なくとも１つの追加の抗原遺伝子の前記翻訳産物を更に発現し、前記薬物が、患者のマイコバクテリウムによる疾患及び少なくとも１つの追加の疾患の双方の治療又は予防のためであることを特徴とする使用。
【請求項１７】
請求項１４から１６のいずれか１項に記載の使用において、前記免疫原性組成物が、前記ウイルスベクターから誘導されるウイルスに対するＴ細胞の免疫応答を更に誘導することを特徴とする使用。
【請求項１８】
セントラルメモリーＴ細胞の免疫応答を誘導することによって、患者の少なくとも１つの疾患の治療、又は予防のための薬物を製造するためのマイコバクテリウムのＡｇ８５Ａ遺伝子の翻訳産物を発現する非複製性又は複製を損傷したポックスウイルスベクターを具える免疫原性組成物の使用において、薬物が、少なくとも１つの追加の抗原と共に投与されることを特徴とする使用。
【請求項１９】
請求項１８に記載の使用において、Ｔ細胞の免疫応答が、ＣＣＲ７＋の応答であることを特徴とする使用。
【請求項２０】
セントラルメモリーＴ細胞の免疫応答を誘導することによって、患者の疾患を治療するための薬物を製造するための抗原の使用において、マイコバクテリウムのＡｇ８５Ａ遺伝子の翻訳産物を発現する非複製性又は複製を損傷したポックスウイルスベクターを具える免疫原性組成物と共に該薬物が投与されることを特徴とする使用。
【請求項２１】
請求項２０に記載の使用において、前記Ｔ細胞の免疫応答が、ＣＣＲ７＋の応答であることを特徴とする使用。
【請求項２２】
請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法、又は請求項１４から２１のいずれか１項に記載の使用において、Ｔ細胞の応答が、結核、ハンセン氏病、マイコバクテリウム・アビウム感染、非結核性のマイコバクテリウム感染、ブルーリ潰瘍、マイコバクテリウム・ボビス感染又は疾患、天然痘、サル痘、マイコバクテリウム・パラツベルキュロシス感染、炎症性腸疾患、クローン病、自己免疫疾患、癌、及び膀胱癌から成る群より選択される疾患に対して防御的であることを特徴とする方法又は使用。
【請求項２３】
請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法又は請求項１４から２１のいずれか１項に記載の使用において、患者が、小児、ＨＩＶ感染又はＡＩＤＳで免疫不全になっている又は臓器移植を受けた患者から成る群より選択されることを特徴とする方法又は使用。
【請求項２４】
請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法又は請求項１４から２１のいずれか１項に記載の使用において、患者が以前、マイコバクテリウムに暴露されたことがあることを特徴とする方法又は使用。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法において、患者が以前、Ｍ．ツベルキュロシスに暴露されたことがあることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項２４又は請求項２５に記載の方法において、患者が潜在的にマイコバクテリウムに感染していることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法又は請求項１４から２１のいずれか１項に記載の使用において、患者が、あらかじめ、ＢＣＧで治療されていることを特徴とする方法又は使用。
【請求項２８】
配列番号４のヌクレオチド配列の前記翻訳産物を発現し、更にＣ末端のＰＫタグ及びＴＰＡリーダー配列を含む非複製性又は複製を損傷したポックスウイルスベクターを具えることを特徴とするベクターワクチン。
【請求項２９】
請求項２８に記載のベクターワクチンにおいて、前記ウイルスベクターが、配列番号５のヌクレオチド配列の前記翻訳産物を発現することを特徴とするベクターワクチン。
【請求項３０】
請求項２８又は請求項２９に記載のベクターワクチンにおいて、前記非複製性のウイルスベクターが、ＭＶＡであることを特徴とするベクターワクチン。
【請求項３１】
請求項２８から３０のいずれか１項に記載のベクターワクチンにおいて、前記ウイルスベクターが、マイコバクテリウム種に由来する少なくとも１つの追加の抗原遺伝子の前記翻訳産物を更に発現するベクターワクチン。
【国際調査報告】
2008526823.tif 000038
2008526823.tif 000039
2008526823.tif 000040
2008526823.tif 000041