(57)【要約】  本発明は、増加した比活性を示す修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ酵素、およびそれらをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はさらに、これらのポリヌクレオチドを含んでなるベクターおよびそのようなベクターを含有する宿主細胞に関する。本発明は、修飾された酵素を産生するための方法およびリボフラビン、リボフラビン前駆体、ＦＭＮ、ＦＡＤ、またはそれらの誘導体を産生するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩであって、ここで、
（ｉ）修飾された酵素の比活性は、対応する修飾されていない酵素と比較して増加し、および
（ｉｉ）修飾された酵素のアミノ酸配列は、配列番号２の２６１、２７０、２７６、２７９、３０８および／または３４７位に対応するアミノ酸位置において１、２、３、４、５、または６つの変異を含む１つもしくはそれ以上の変異を含んでなる、
修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ。
【請求項２】
修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩは、対応する修飾されていないＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩと比較して少なくとも約１０％高い比活性を示す、請求項１に記載の修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ。
【請求項３】
１つもしくはそれ以上の変異は１つもしくはそれ以上の置換である、請求項１または２に記載の修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ。
【請求項４】
対応する修飾されていないＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩのアミノ酸配列は、図１において列挙される、特に、アシブヤ（Ａｓｈｂｙａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、エレモセシウム（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アーケグロバス（Ａｒｃｈｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、リコペルシカム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、オリザ（Ｏｒｙｚａ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ディノコッカス（Ｄｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、フォトバクテリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）を由来とする配列から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ。
【請求項５】
修飾されていないＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩの配列は、配列番号２、３３、３５、３７、３９、４１、および４３からなる群から選択される、請求項４に記載の修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ。
【請求項６】
配列番号２の２６１位に対応するアミノ酸位置における変異、好ましくは、アラニンによるバリンの置き換えを含んでなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ。
【請求項７】
配列番号２の２７０位に対応するアミノ酸位置における変異、好ましくは、アラニンまたはアルギニンによるグリシンの置き換えを含んでなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ。
【請求項８】
配列番号２の２７６位に対応するアミノ酸位置における変異、好ましくは、スレオニンによるアラニンの置き換えを含んでなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ。
【請求項９】
配列番号２の２７９位に対応するアミノ酸位置における変異、好ましくは、アルギニンによるグルタミンの置き換えを含んでなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ。
【請求項１０】
配列番号２の３０８位に対応するアミノ酸位置における変異、好ましくは、アルギニンによるリジンの置き換えを含んでなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ。
【請求項１１】
配列番号２の３４７位に対応するアミノ酸位置における変異、好ましくは、イソロイシンによるメチオニンの置き換えを含んでなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項１３】
修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩをコードするヌクレオチド配列は、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４および２６からなる群から選択される、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
プロモーター、リボゾーム結合部位およびターミネーター配列に操作可能に結合され、前記ポリヌクレオチドは転写的に機能性である、請求項１２または１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、ベクターまたはプラスミド。
【請求項１６】
少なくとも１つのマーカー遺伝子をさらに含んでなる、請求項１５に記載のベクターまたはプラスミド。
【請求項１７】
請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、宿主細胞。
【請求項１８】
細菌細胞、真菌細胞、動物細胞、および植物細胞からなる群から選択される、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、カンジダ・フラレリ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｆｌａｒｅｒｉ）、エレモセシウム・シビィ（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ  ａｓｈｂｙｉｉ）、アシブヤ・ゴッシピィ（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からなる群から選択される、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
（ａ）適切な培地において請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養すること、および
（ｂ）場合により、培地からリボフラビン、リボフラビン前駆体、ＦＭＮ、ＦＡＤ、またはそれらの誘導体を分離すること、
を含んでなる、リボフラビン、リボフラビン前駆体、ＦＭＮ、ＦＡＤ、またはそれらの誘導体を産生するための方法。
【請求項２１】
（ａ）適切な培地において請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の宿主細胞の集団を培養すること、および
（ｂ）場合により、細胞または培地から修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩを回収すること、
を含んでなる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩを産生するための方法。
【請求項２２】
以下の工程：
（ａ）ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩをコードするポリヌクレオチドを提供すること、
（ｂ）変異型ポリヌクレオチド配列が、修飾されていないＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩより高い比活性を有し、配列番号２の２６１、２７０、２７６、２７９、３０８および／または３４７位に対応するアミノ酸位置において１、２、３、４、５、もしくは６つの変異を含む１つもしくはそれ以上の変異を含んでなる修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩをコードするように、１つもしくはそれ以上の変異をポリヌクレオチド配列に導入すること、
（ｃ）場合により、変異型ポリヌクレオチドと、プロモーター、リボゾーム結合部位およびターミネーターとを機能的に連結するか、または変異型ポリヌクレオチドをベクターもしくはプラスミドに挿入すること、
（ｄ）ポリヌクレオチド、転写的に機能的なポリヌクレオチドまたはベクターもしくはプラスミドを適切な宿主細胞に導入すること、ならびに
（ｅ）修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩの発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養すること、
を含んでなる、増加した比活性を有するＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩを産生するための方法。
【請求項２３】
リボフラビン、リボフラビン前駆体、ＦＭＮ、ＦＡＤ、もしくはそれらの誘導体の産生を増加するための請求項１〜１１のいずれか１項に記載の修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩまたは請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項２４】
（ａ）望ましくは、増加すべきである比活性を伴う第１のＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩをコードするポリヌクレオチドを提供すること、
（ｂ）比活性に対する効果を有する位置を提供すること、
（ｃ）（ｂ）において規定される野生型ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩの所定のアミノ酸の置き換えのための至適アミノ酸を規定し、変異型ポリヌクレオチド配列が新規のＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩをコードするように、１つもしくはそれ以上の変異を、（ｂ）において規定される位置で（ａ）のポリヌクレオチド配列に導入すること、
（ｄ）場合により、変異型ポリヌクレオチドをベクターまたはプラスミドに挿入すること、
（ｄ）ポリヌクレオチドまたはベクターもしくはプラスミドを適切な宿主細胞に導入すること、ならびに
（ｅ）修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩの発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養すること、
を含んでなる、増加した比活性を有するＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩの調製のための方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、それぞれの野生型酵素より高いＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ活性を伴う修飾された酵素を提供する。修飾された酵素および該酵素をコードするポリヌクレオチドは、リボフラビン、リボフラビン前駆体、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、およびそれらの誘導体の産生のために使用することができる。
【０００２】
リボフラビン（ビタミンＢ２）は、すべての植物および多くの微生物によって合成されるが、より高等な動物によっては産生されない。それは、炭水化物の酵素的酸化において必要とされるフラビンアデニンジヌクレオチドおよびフラビンモノヌクレオチドのような補酵素の前駆体であるため、リボフラビンは基礎代謝に必須である。より高等な動物では、不十分なリボフラビンにより、毛の消失、皮膚の炎症、視力低下、および発育不全を生じ得る。
【０００３】
リボフラビンの増加した割合および収量を伴うリボフラビン産生株の操作は、過去に異なる多くの方法で達成されている。例えば、（１）古典的な変異誘発を使用して、好適な生物体のゲノムにおける無作為変異を伴う変種が作製され、続いて、プリンアナログに対するより高い耐性の選択および／またはリボフラビンの産生の増加についてのスクリーニングが行われた。（２）あるいは、リボフラビン生合成の末端酵素、即ち、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）およびリブロース−５−リン酸のリボフラビンへの変換を触媒する酵素を過剰発現させ、また、標的産物へのより高い流動ももたらされた。しかし、この後者のアプローチでは、リボフラビン生合成タンパク質の強力な過剰発現は、宿主細胞に対してさらなる代謝負荷を課し、該宿主は、次いで、ストレス応答反応および細胞の生理に対する他の所望されない悪影響を誘導し得る。
【０００４】
グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）およびリブロース−５−リン酸からのリボフラビンの生合成を触媒するのに要求される酵素は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の４つの遺伝子（ｒｉｂＧ、ｒｉｂＢ、ｒｉｂＡ、およびｒｉｂＨ）によってコードされる。これらの遺伝子はオペロンにおいて局在しており、遺伝子の順序は、酵素によって触媒される酵素反応の順序とは異なる。例えば、リボフラビン生合成の第１の工程を触媒するＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩは、オペロンにおける第３の遺伝子、ｒｉｂＡによってコードされる。ｒｉｂＡ遺伝子はまた、リブロース−５−リン酸の４炭素単位３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−リン酸（ＤＨＢＰ）への変換を触媒する第２の酵素活性、即ち、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−リン酸シンターゼ（ＤＨＢＰＳ）をコードする。デアミナーゼおよびレダクターゼは、オペロンの第１の遺伝子、ｒｉｂＧによってコードされる。リボフラビン生合成における最後から２番目の工程は、ルマジンシンターゼ（最後のｒｉｂ遺伝子、ｒｉｂＨの産物）によって触媒される。経路の最後の工程を制御するリボフラビンシンターゼは、オペロンの第２の遺伝子、ｒｉｂＢによってコードされる。ｒｉｂオペロンの３’末端に局在する遺伝子の機能は、現在のところ不明である；しかし、その遺伝子産物はリボフラビン合成には必要ではない。
【０００５】
ｒｉｂＰ１プロモーターからのリボフラビンオペロンの転写は、ｒｉｂＰ１とｒｉｂＧとの間に局在する調節リーダー領域に関与する減衰機構によって制御される。このリーダー領域内のｒｉｂＯ変異は、リボフラビンオペロンの脱調節された発現をもたらす。脱調節された発現はまた、ｒｉｂＣ遺伝子のミスセンス変異を含有する株において観察される。ｒｉｂＣ遺伝子は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のフラビンキナーゼ／ＦＡＤシンターゼをコードすることが示されている（マック，Ｍ．（Ｍａｃｋ，Ｍ．）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８０：９５０−９５５、１９９８年）。脱調節変異は、ｒｉｂＣ遺伝子産物のフラボキナーゼ活性を減少し、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、リボフラビン調節系のエフェクター分子の細胞内濃度の減少をもたらす。
【０００６】
最近、短い発酵周期中に高い収量のリボフラビンを産生するように枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が遺伝子操作された（米国特許第５，８３７，５２８号明細書）。このアプローチにより、古典的な遺伝子変異選択と、遺伝子発現のレベルを脱調節および増加することによってリボフラビン生合成遺伝子の遺伝子操作での発酵改良とが組み合わされた。この系では、ｒｉｂ遺伝子の発現は、フラボキナーゼをコードするｒｉｂＣ遺伝子を変異すること、ｒｉｂ遺伝子を強力な構成性プロモーターに連結すること、およびｒｉｂ遺伝子のコピー数を増加することによって、増加された。
【０００７】
既に上記で考察したように、ｒｉｂ遺伝子の過剰発現は、潜在的に、リボフラビン前駆体、リボフラビン、ＦＭＮ、ＦＡＤ、またはそれらの誘導体の産生に対して悪影響を及ぼし得る産生株にさらなる負荷を付与する。この欠点を回避するために、本発明の主題を、増加した比活性を伴うＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ変異体について記載することとする。産生株におけるそのような変異酵素の使用は、単独または他のＲｉｂタンパク質の改良された変異体との組み合わせのいずれかで、細胞代謝に対するさらなる負荷が少ないかまたは全く伴わずに、より高い流動率を可能にする。
【０００８】
本明細書において使用する用語「ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ」は、ＧＴＰの２，５−ジアミノ−６−リボシルアミノ−４（３Ｈ）−ピリミジノン５’−リン酸（ＤＲＡＰＰ）への変換を触媒することが可能である任意の酵素を含み得る。この酵素が、例えば、リブロース−５−リン酸のＤＨＢＰへの変換のようなさらなる反応を触媒することが可能であるかどうかは関係がない。「ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ」は、そのアミノ酸配列が図１または表４に示されている１つもしくはそれ以上の酵素に相同であり得る。「相同な」は、図１または表４に示される１つもしくはそれ以上のアミノ酸配列の少なくとも約５０％同一、好ましくは少なくとも約６０％同一、より好ましくは少なくとも約７０％同一、さらにより好ましくは少なくとも約８０％同一、さらにより好ましくは少なくとも約８５％同一、さらにより好ましくは少なくとも約９０％もしくは９５％同一、および最も好ましくは少なくとも約９８％同一であるＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩを指す。
【０００９】
当該分野において公知の用語「％同一性」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の関係の程度を意味し、該事例はそのような配列のストリング間の一致によって決定され得る。「同一性」は、既知の方法、例えば、次のパラメータ：ギャップ作成ペナルティ（ｇａｐ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）８、ギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）２（デフォルトパラメータ）を使用するプログラムＢＥＳＴＦＩＴ（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．２、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．、９６８５Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州９２１２１−３７５２、米国）によって、容易に決定することができる。
【００１０】
「野生型酵素」または「野生型ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ」は、本発明に従って増加した活性を伴う変異体を設計するための開始点として使用される図１または表４に示される酵素のうちのいずれか１つに相同な任意のＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩを含み得る。本発明における「野生型」は、それらが本発明の教示のいずれかによってより活性とされ得る場合、天然から誘導可能なＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ配列ならびに合成ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ酵素の変種の両方を（それらが図１または表４において示される配列のいずれか１つに相同である限り）含み得る。用語「野生型ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ」および「修飾されていないＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ」は、本明細書において交換可能に使用される。
【００１１】
「変異体」、「変異酵素」、または「変異ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ」は、（上記の規定に従って）本発明の教示に従って、それぞれの野生型酵素より活性である所定の野生型酵素／ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩから誘導可能な任意の変種を含み得る。本発明の範囲では、変異体がどのようにして得られるかは問題ではなく；そのような変異体は、例えば、部位特異的変異誘発、サチュレーション変異誘発、無作為変異誘発／定方向進化、細胞／生物体全体の化学的またはＵＶ変異誘発、および当該分野において公知である他の方法によって得ることができる。これらの変異体はまた、例えば、合成遺伝子を設計することによって作製することができ、および／またはインビトロでの（無細胞）翻訳によって産生させることができる。比活性の試験のために、当業者に既知の方法によって、変異体を（過剰）発現させることができる。用語「変異ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ」および「修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ」は、本明細書において交換可能に使用される。このことはまた、用語「変異酵素」および「修飾された酵素」にも当てはまる。
【００１２】
本特許出願における「リボフラビン前駆体」および「リボフラビン、ＦＭＮまたはＦＡＤの誘導体」は、それらの（生）合成における中間酵素としてＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩを必要とする任意およびすべての代謝物を含み得る。本特許出願において、そのような（生）合成経路が天然であるかまたは非天然（即ち、天然には存在しないが、生物工学的に操作される経路）であるかは関係がない。好ましくは、合成経路は天然において生化学的である。リボフラビン前駆体およびリボフラビン、ＦＭＮまたはＦＡＤの誘導体として：ＤＲＡＰＰ；５−アミノ−６−リボシルアミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン−５’−リン酸；２，５−ジアミノ−６−リビチルアミノ−４（３Ｈ）−ピリミジノン−５’−リン酸；５−アミノ−６−リビチルアミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン−５’リン酸；５−アミノ−６−リビチルアミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン；６，７−ジメチル−８−リビチルルマジン（ＤＭＲＬ）；およびフラボタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。用語「リボフラビン」もまた、例えば、リボフラビン−５−リン酸および例えば、リボフラビン−５−リン酸ナトリウムのようなその塩のようなリボフラビンの誘導体を含む。
【００１３】
一般に、本発明の目的は、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ活性を有する酵素を提供することであって、前記酵素は、その触媒特性が、修飾されていないＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ酵素のそれらよりも好適である（即ち、より高い比活性を示す）方法で修飾される。
【００１４】
本発明は、対応する修飾されていないＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩと比較して、より高い（比）活性を示す修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩに関し、ここで、
（ｉ）修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩのアミノ酸配列は、対応する修飾されていないＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩのアミノ酸配列と比較する場合、少なくとも１つの変異を含有し、および
（ｉｉ）少なくとも１つの変異は、配列番号２に示される枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩのアミノ酸配列の２６１、２７０、２７６、２７９、３０８および３４７位に対応するアミノ酸位置からなる群から選択される１つもしくはそれ以上のアミノ酸位置に存在する。
【００１５】
従って、本発明の目的は、修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩを提供することであって、ここで、
（ｉ）修飾された酵素の比活性は、対応する修飾されていない酵素と比較して増加し、および
（ｉｉ）修飾された酵素のアミノ酸配列は、配列番号２の２６１、２７０、２７６、２７９、３０８および／または３４７位に対応するアミノ酸位置において１、２、３、４、５、または６つの変異を含む１つもしくはそれ以上の変異を含んでなる。
【００１６】
用語「少なくとも１つの変異」は、修飾されていない酵素と比較して増加した比活性を有する修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩをもたらす上記の位置における１つもしくはそれ以上の変異を意味する。上記の修飾された酵素は、修飾されていない酵素と比較して増加した比活性をもたらす上記で規定された位置における１、２、３、４、５または６つの変異のみからなり得るが、得られた修飾された酵素が増加した比活性を有する限り、また、他の位置においてさらなるアミノ酸変異を含んでもよい。従って、修飾された酵素は、配列番号２において示される枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩのアミノ酸配列の２６１、２７０、２７６、２７９、３０８および／または３４７位に対応するアミノ酸位置において１、２、３、４、５、または６つの変異を含む１つもしくはそれ以上の変異を含んでなる。上記で規定された位置以外の位置におけるそのような変異の例には、配列番号２のアミノ酸位置１９６、２８２、および／または３２５に対応する位置におけるアミノ酸変異がある。
【００１７】
本明細書において使用する用語「比活性」は、例えば、リッツ（Ｒｉｔｚ）ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２２２７３−２２２７７，２００１年）、コ（Ｋｏｈ）ら（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５１，５９１−５９８，１９９６年）、もしくはシュラメク（Ｓｃｈｒａｍｅｋ）ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，４４１５７−４４１６２，２００１年）において記載または実施例２において詳細に記載のような適切に規定された反応条件条件下での野生型および変異ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ酵素の反応速度を示す。「比活性」は、所定の期間において、および規定された量のタンパク質あたり、規定された温度で消費される基質および／または産生される産物の量を規定する。典型的に「比活性」は、１ｍｇのタンパク質あたり１分間あたりに消費される基質または形成される産物のμｍｏｌで表される。典型的に、μｍｏｌ／分は、Ｕ（＝単位）によって略称される。従って、μｍｏｌ／分／（タンパク質のｍｇ）またはＵ／（タンパク質のｍｇ）の比活性についての単位の規定は、本書面全体を通して交換可能に使用される。本発明において、比活性は、類似、または好ましくは同一の長さのポリペプチド鎖に基づいて比較しなければならないことが理解される。本発明は、例えば、融合タンパク質の形成を介して所定の野生型酵素のサイズを増加することにより、従って、全体の酵素の見かけの比活性を減少することによって、妨げられるべきではない。
【００１８】
本発明に従って、修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩは、対応する修飾されていない酵素の比活性より高い比活性を示す。好ましくは、本発明の修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩの比活性は、対応する修飾されていないＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩと比較して、少なくとも約５、１０、２５、４０、６０、７０、８０、８５、９０％、より好ましくは少なくとも約７０％増加する（比活性の測定については、下記を参照のこと）。好ましくは、比活性の増加は、本明細書の実施例１に記載の実験条件を指す。約０．００４〜０．０２Ｕ／ｍｌ（約４０μｇ／ｍｌの枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩまたは本明細書に記載の最も良好な変異体については２０μｇ／ｍｌに対応する）、好ましくは約０．００４Ｕ／ｍｌのＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ活性が、アッセイ混合物において存在し、反応は３７℃で行われた。
【００１９】
本発明の修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩのアミノ酸配列は、対応する修飾されていないＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩのアミノ酸配列と比較する場合、上記で規定されるような少なくとも１つの変異を含有する。前記変異は、１つもしくはそれ以上の付加、欠失および／または置換、好ましくは、１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換であってもよく、ここで、修飾されていないＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩのアミノ酸配列に存在する所定のアミノ酸は、本発明の修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩのアミノ酸配列における異なるアミノ酸と置き換えられる。修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩのアミノ酸配列は、対応する修飾されていないＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩのアミノ酸配列と比較する場合、少なくとも１つのアミノ酸置換を含有し得る、即ち、配列番号２の２６１、２７０、２７６、２７９、３０８および／または３４７位に対応するアミノ酸位置における１、２、３、４、５、または６アミノ酸置換、好ましくは、２、３、４または５アミノ酸置換を含む１つもしくはそれ以上の変異を含んでなり得る。従って、修飾された酵素は、好ましくは、対応する修飾されていないＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩのアミノ酸配列と比較する場合、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４または少なくとも５つの置換を含有する。
【００２０】
一実施形態では、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、好ましくは、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から入手可能な修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩが提供され、ここで、
（ｉ）修飾された酵素の比活性は、対応する修飾されていない酵素と比較して増加し、および
（ｉｉ）修飾された酵素のアミノ酸配列は、配列番号２の２６１、２７０、２７６、２７９、３０８および／または３４７位に対応するアミノ酸位置において１、２、３、４、５、または６つの変異を含む１つもしくはそれ以上の変異を含んでなる。
【００２１】
一実施形態では、修飾されていない酵素は、配列番号２に示される枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩに対応する。従って、野生型酵素と比較して増加した比活性を有する修飾された酵素は、配列番号２の２６１、２７０、２７６、２７９、３０８および／または３４７位に対応するアミノ酸位置において１、２、３、４、５、または６つの変異を含む１つもしくはそれ以上の変異を含んでなる。さらなる実施形態では、上記で規定された増加した比活性を有する修飾された酵素は、上記のアミノ酸位置以外のアミノ酸変異を含有し、前記さらなる変異は、１９６、２８２、２３５位、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される位置における、好ましくは、アミノ酸置換であり、より好ましくは、置換は、Ｙ１９６Ｃ（チロシンのシステインによる置き換え）、Ａ２８２Ｔ（アラニンのスレオニンによる置き換え）またはＦ３２５Ｙ（フェニルアラニンのチロシンによる置き換え）である。
【００２２】
修飾されていないＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩは、比活性を増加することが所望される任意のＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩであり得る。修飾されていないＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ酵素として、真核生物または原核生物由来、好ましくは、真菌または細菌由来の酵素のような天然から誘導され得るＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ酵素が挙げられるが、これらに限定されない。より好ましくは、修飾されていない酵素は、図１もしくは表４において示されるものから選択されるか、または図１もしくは表４において示される、特に、アシブヤ（Ａｓｈｂｙａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、エレモセシウム（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アーケグロバス（Ａｒｃｈｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、リコペルシカム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、オリザ（Ｏｒｙｚａ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ディノコッカス（Ｄｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、フォトバクテリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）およびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）からなる群から選択され、好ましくは、カンジダ・ギリエルモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、アシブヤ・ゴッシピィ（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）（エレモセシウム・シビィ（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ  ａｓｈｂｙｉｉ））（配列番号３３）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、アーケグロバス・フルギダス（Ａｒｃｈｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）Ｊ９９、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（配列番号３５）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）（配列番号３７）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）（配列番号３９）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）（配列番号４１）、バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）（配列番号４３）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、リコペルシカム・エクスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ  ｅｘｃｕｌｅｎｔｕｍ）、オリザ・サティバム（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖｕｍ）、アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）株ＫＴ２４４０、コリネ菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、フォトバクテリウム・ホスホレウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）株ＫＴ２４４０（第２の遺伝子）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（配列番号２）からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれかに相同である。最も好ましくは、修飾されていない酵素は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から入手可能である。
【００２３】
本発明の修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩは、対応する修飾されていないＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩを変異することによって入手することができる。一実施形態では、修飾されていない酵素は、配列番号２において示される枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩに対応し、修飾された酵素は、配列番号２のアミノ酸位置２６１、２７０、２７６、２７９、３０８および／または３４７において１、２、３、４、５、もしくは６つの変異を含む１つもしくはそれ以上のアミノ酸変異を含んでなり、ここで、前記修飾された酵素の比活性は、修飾されていない酵素と比較して増加する。
【００２４】
好ましくは、少なくとも１つの変異は、配列番号２に示される枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩのアミノ酸配列の２６１、２７９、３０８および３４７位に対応するアミノ酸位置からなる群から選択される１つもしくはそれ以上のアミノ酸位置に存在する。従って、一実施形態では、修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩは、配列番号２の２６１、２７９、３０８および／または３４７位に対応するアミノ酸位置において１、２、３または４つの変異を含む１つもしくはそれ以上の変異を含んでなる。好適な実施形態では、修飾された酵素は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から入手可能であり、それぞれアミノ酸Ｖ２６１、Ｑ２７９、Ｋ３０８、およびＭ３７４に対応する、配列番号２において示される変異型アミノ酸位置２６１、２７９、３０８、および／または３４７を含んでなる。
【００２５】
別の好適な実施形態では、少なくとも１つの変異は、配列番号２に示される枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩのアミノ酸配列の２７０、２７９、３０８および３４７位に対応するアミノ酸位置からなる群から選択される１つもしくはそれ以上のアミノ酸位置に存在する。従って、一実施形態では、修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩは、配列番号２の２７０、２７９、３０８および／または３４７位に対応するアミノ酸位置において１、２、３または４つの変異を含む１つもしくはそれ以上の変異を含んでなる。好ましくは、修飾された酵素は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から入手可能であり、それぞれアミノ酸Ｇ２７０、Ｑ２７９、Ｋ３０８、およびＭ３７４に対応する、配列番号２において示される変異型アミノ酸位置２７０、２７９、３０８、および／または３４７を含んでなる。
【００２６】
さらなる好適な実施形態では、少なくとも１つの変異は、配列番号２に示される枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩのアミノ酸配列の２７６、２７９、３０８および３４７位に対応するアミノ酸位置からなる群から選択される１つもしくはそれ以上のアミノ酸位置に存在する。従って、さらなる実施形態では、修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩは、配列番号２において示される枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩのアミノ酸配列の２７６、２７９、３０８および／または３４７位に対応するアミノ酸位置において１、２、３または４つの変異を含む１つもしくはそれ以上の変異を含んでなる。好ましくは、修飾された酵素は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から入手可能であり、それぞれアミノ酸Ａ２７６、Ｑ２７９、Ｋ３０８、およびＭ３７４に対応する、配列番号２において示される変異型アミノ酸位置２７６、２７９、３０８、および／または３４７を含んでなる。
【００２７】
好ましくは、修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩの１つもしくはそれ以上のアミノ酸変異は、１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換である。
【００２８】
修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩは、上記で規定されるアミノ酸位置においてただ１つの変異を含む１つもしくはそれ以上の変異を含んでなり得、そのような変異、特に、アミノ酸置換は、配列番号２に示される枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩのアミノ酸配列の２６１、２７０、２７６、２７９、３０８、または３４７位に対応するアミノ酸位置において１つの変異を含み得る。２６１位に対応する修飾されていないＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩに存在するアミノ酸はバリンであり得、２７０位に対応する修飾されていないＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩに存在するアミノ酸はグリシンであり得、２７６位に対応する修飾されていないＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩに存在するアミノ酸はアラニンであり得、２７９位に対応する修飾されていないＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩに存在するアミノ酸はグルタミンであり得、３０８位に対応する修飾されていないＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩに存在するアミノ酸はリジンであり得、３４７位に対応する修飾されていないＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩに存在するアミノ酸はメチオニンであり得る。
【００２９】
修飾されていないＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩの配列におけるアミノ酸は、２６１位に対応するアミノ酸がアラニンに変更され得（例えば、Ｖ２６１Ａ）、２７０位に対応するアミノ酸がアラニンまたはアルギニンに変更され得（例えば、Ｇ２７０ＡおよびＧ２７０Ｒ）、２７６位に対応するアミノ酸がスレオニンに変更され得（例えば、Ａ２７６Ｔ）、２７９に対応するアミノ酸がアルギニンに変更され得（例えば、Ｑ２７９Ａ）、３０８位に対応するアミノ酸がアルギニンに変更され得（例えば、Ｋ３０８Ｒ）、３４７位に対応するアミノ酸がイソロイシンに変更され得る（例えば、Ｍ３７４Ｉ）ように、変更され得る。一実施形態では、修飾された酵素は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から入手可能であり、２６１、２７０、２７６、２７９、３０８、および３４７位からなる群から選択される配列番号２の位置においてアミノ酸置換を含んでなる。好ましくは、置換は、Ｖ２６１Ａ、Ｇ２７０Ａ、Ｇ２７０Ｒ、Ａ２７６Ｔ、Ｑ２７９Ｒ、Ｋ３０８ＲまたはＭ３４７Ｉである。
【００３０】
修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩは、上記で規定されるアミノ酸位置において２つの変異を含む１つもしくはそれ以上の変異を含んでなり得、そのような変異、特に、アミノ酸置換は、上記で規定される位置のうちの２つに対応するアミノ酸位置、例えば、配列番号２において示される２６１／２７０位、２６１／２７６位、２６１／２７９位、２６１／３０８位、２６１／３４７位、２７０／２７６位、２７０／２７９位、２７０／３０８位、２７０／３４７位、２７６／２７９位、２７６／３０８位、２７６／３４７位、２７９／３０８位、２７９／３４７位、または３０８／３４７位に対応する位置の組み合わせにおける変異を含み得る。Ｖ２６１Ａ／Ａ２７６Ｔ、Ｖ２６１Ａ／Ｑ２７９Ｒ、Ｖ２６１Ａ／Ｋ３０８Ｒ、Ｖ２６１Ａ／Ｍ３４７Ｉ、Ｇ２７０Ａ／Ｑ２７９Ｒ、Ｇ２７０Ａ／Ｋ３０８Ｒ、Ｇ２７０Ａ／Ｍ３４７Ｉ、Ａ２７６Ｔ／Ｑ２７９Ｒ、Ａ２７６Ｔ／Ｋ３０８Ｒ、またはＡ２７６Ｔ／Ｍ３４７Ｉのようなアミノ酸置換が好適であり、ここで、位置は、配列番号２のアミノ酸位置に対応する。一実施形態では、そのような好適な置換は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から入手可能な修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩに含まれ、ここで、修飾されていない酵素は、配列番号２に対応する。好ましくは、配列番号２のような修飾された枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩは、置換Ｖ２６１Ａ／Ａ２７６ＴまたはＡ２７６Ｔ／Ｍ３４７Ｉを含んでなる。
【００３１】
修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩは、上記で規定されるアミノ酸位置において３つの変異を含む１つもしくはそれ以上の変異を含んでなり得、そのような変異、特に、アミノ酸置換は、上記で規定される位置のうちの３つに対応するアミノ酸位置、特に、配列番号２において示される２６１／２７９／３０８位、２６１／２７９／３４７位、２６１／３０８／３４７位、２７０／２７９／３０８位、２７０／２７９／３４７位、２７０／３０８／３４７位、２７６／２７９／３０８位、２７６／３０８／３４７位、または２７６／２７９／３４７位に対応する位置の組み合わせにおける変異を含み得る。Ｖ２６１Ａ／Ｑ２７９Ｒ／Ｋ３０８Ｒ、Ｖ２６１Ａ／Ｋ３０８Ｒ／Ｍ３４７Ｉ、Ｖ２６１Ａ／Ｑ２７９Ｒ／Ｍ３４７Ｉ、Ｇ２７０Ａ／Ｑ２７９Ｒ／Ｋ３０８Ｒ、Ｇ２７０Ａ／Ｋ３０８Ｒ／Ｍ３４７Ｉ、Ｇ２７０Ａ／Ｑ２７９Ｒ／Ｍ３４７Ｉ、Ａ２７６Ｔ／Ｑ２７９Ｒ／Ｋ３０８Ｒ、Ａ２７６Ｔ／Ｋ３０８Ｒ／Ｍ３４７Ｉ、またはＡ２７６Ｔ／Ｑ２７９Ｒ／Ｍ３４７Ｉのようなアミノ酸置換が好適であり、ここで、位置は、配列番号２のアミノ酸位置に対応する。一実施形態では、そのような好適な置換は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から入手可能な修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩに含まれ、ここで、修飾されていない酵素は、配列番号２に対応する。好ましくは、配列番号２のような修飾された枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩは、置換Ａ２７６Ｔ／Ｑ２７９Ｒ／Ｍ３４７Ｉを含んでなる。
【００３２】
修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩは、上記で規定されるアミノ酸位置において４つの変異を含む１つもしくはそれ以上の変異を含んでなり得、そのような変異、特に、アミノ酸置換は、上記で規定される位置のうちの４つに対応するアミノ酸位置、特に、配列番号２において示される２６１／２７９／３０８／３４７位、２７０／２７９／３０８／３４７位、または２７６／２７９／３０８／３４７位に対応する位置の組み合わせにおける変異を含み得る。Ｖ２６１Ａ／Ｑ２７９Ｒ／Ｋ３０８Ｒ／Ｍ３４７Ｉ、Ｇ２７０Ａ／Ｑ２７９Ｒ／Ｋ３０８Ｒ／Ｍ３４７ＩまたはＡ２７６Ｔ／Ｑ２７９Ｒ／Ｋ３０８Ｒ／Ｍ３４７Ｉのようなアミノ酸置換が好適であり、ここで、位置は、配列番号２のアミノ酸位置に対応する。一実施形態では、そのような好適な置換は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から入手可能な修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩに含まれ、ここで、修飾されていない酵素は、配列番号２に対応する。好ましくは、配列番号２のような修飾された枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩは、置換Ａ２７６Ｔ／Ｑ２７９Ｒ／Ｋ３０８Ｒ／Ｍ３４７Ｉを含んでなる。
【００３３】
表１または２において開示される変異の組み合わせが最も好適である（以下を参照のこと）。これらの例において同定されるアミノ酸位置は、例えば、図１または表４において示されるように、異なる由来のＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ酵素に転移され得る。
【００３４】
本発明の修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩは、外来性アミノ酸を、好ましくは、そのＮまたはＣ末端で含んでなり得る。「外来性アミノ酸」は、生来の（天然に存在する）ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩに存在しないアミノ酸、好ましくは、生来のＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩに存在しない少なくとも約３、少なくとも約５または少なくとも約７連続アミノ酸のストレッチを意味する。外来性アミノ酸の好適なストレッチとして、組換え的に産生される修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩの精製を容易にする「タグ」が挙げられるが、これに限定されない。そのようなタグの例として、「Ｈｉｓ６」タグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグなどが挙げられるが、これらに限定されない。比活性の算出については、値を、これらのさらなるアミノ酸について補正する必要がある（また、上記を参照のこと）。
【００３５】
別の実施形態では、修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩは、対応する修飾されていないＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩのアミノ酸配列と比較する場合、１つもしくはそれ以上、例えば、２つの欠失を含有し得る。好ましくは、欠失は、対応する修飾されていないＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩのＮまたはＣ末端アミノ酸に影響を及ぼし、酵素の機能的特性、例えば、比活性を有意に減少しない。
【００３６】
修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ酵素を含む本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離された形態で提供され得、好ましくは、均質に精製される。本明細書において使用する用語「単離された」は、材料が、その本来の環境（例えば、それが天然に存在する場合、天然の環境）から取り出されることを意味する。例えば、生存する微生物に存在する天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されないが、天然の系において共存する材料のいくつかもしくはすべてから単離される同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離される。そのようなポリヌクレオチドは、ベクターの部分であり得、および／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の部分であり得、そしてなお、そのようなベクターまたは組成物がその天然の環境の部分でないため、単離され得る。単離されたポリペプチドは、好ましくは、８０％純粋より大きく、より好ましくは、９０％純粋より大きく、さらにより好ましくは、９５％純粋より大きく、最も好ましくは、９９％純粋より大きい。純度は、当該分野において既知の方法に従って、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびその後のタンパク質染色により決定することができる。次いで、タンパク質のバンドは、デンシトメトリーによって定量することができる。純度を決定するためのさらなる方法は、当業者のレベル内にある。
【００３７】
本発明は、さらに、本発明による修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドに関する。本明細書において使用される「ポリヌクレオチド」は、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得るポリリボヌクレオチドあるいはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドとして、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、もしくはより典型的には二本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含んでなるハイブリッド分子が挙げられるが、これらに限定されない。用語「ポリヌクレオチド」は、１つもしくはそれ以上の異常塩基、例えば、イノシン、または１つもしくはそれ以上の修飾塩基、例えば、トリチル化された塩基を含んでなるＤＮＡあるいはＲＮＡを含む。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドは、修飾されていないＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩをコードするポリヌクレオチド配列を修飾することによって、容易に得ることができる。修飾されていないＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ酵素をコードするそのようなポリヌクレオチド配列の例として、図１または表４のアミノ酸配列、特に、配列番号２、３３、３５、３７、３９、４１、および４３が挙げられるが、これらに限定されない。本発明による修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ酵素をコードするポリヌクレオチドの非制限的例を、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４および２６に示す。
【００３９】
変異、例えば、付加、欠失および／または置換を、修飾されていないＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩをコードするヌクレオチド配列に導入するための方法として、部位特異的変異誘発およびＰＣＲに基づく方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
本発明のＤＮＡ配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ（Ｍｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、カリフォルニア州、米国）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｈｉｎｓｔｏｎ  Ｈａｌｌ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）、ＮＢＲＦ（Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ、ワシントン市、米国）およびＶｅｃｂａｓｅ  （Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ、ワシントン州、米国）またはインビトロでの変異誘発の方法（例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨークを参照のこと）により図１もしくは表４において開示された配列情報から得ることができる当該分野において公知のＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ酵素をコードするゲノムまたはｃＤＮＡ配列から出発して、構築することができる。本発明の実施についてもまた好適である所定のＤＮＡ配列を変異する別の可能性は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することによる変異誘発である。出発物質としてのＤＮＡは、当該分野において公知であり、例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）において記載の方法によって、それぞれの株／生物体から単離することができる。しかし、本発明に従って構築／変異しようとするＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩをコードするＤＮＡは、既知のＤＮＡ配列に基づき、例えば、（例えば、ＥＰ７４７４８３号明細書において記載のような）当該分野において既知の方法による合成遺伝子の構築によって、調製することができることが理解される。
【００４１】
本発明のポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチド、即ち、限定されないが、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡのような他の核酸配列を実質的に含まないポリヌクレオチドであってもよい。当業者に公知の従来の核酸精製方法を使用して、単離されたポリヌクレオチドを入手してもよい。該用語はまた、組換えポリヌクレオチドおよび化学的に合成されたポリヌクレオチドを包含する。
【００４２】
なお別の実施形態では、本発明は、プロモーター、リボゾーム結合部位（細菌細胞において必要であれば）、およびターミネーターが、本発明によるポリヌクレオチドに操作可能に結合される機能的ポリヌクレオチドに関する。なおさらなる実施形態では、本発明は、そのようなポリヌクレオチドを含んでなるベクターまたはプラスミドに関する。ベクターまたはプラスミドは、好ましくは、少なくとも１つのマーカー遺伝子を含んでなる。本明細書において使用される用語「操作可能に結合される」は、一方の機能が他方によって影響されるように、単一の核酸フラグメントに対する核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、それがコーディング配列の発現に影響を及ぼすことが可能である場合、該コーディング配列に操作可能に結合され、即ち、コーディング配列はプロモーターの転写制御下にある。コーディング配列は、センスまたはアンチセンス配向で調節配列に操作可能に結合され得る。用語「発現」は、ＤＮＡ配列のｍＲＮＡへの転写および／またはｍＲＮＡのアミノ酸配列への翻訳を示す。用語「過剰発現」は、遺伝子の発現を脱調節することおよび／または生物体の内部で遺伝子自体を増倍することによって、対応する修飾されていない生物体における産生のレベルを超える修飾された生物体（例えば、形質転換もしくはトランスフェクションによって修飾された）における遺伝子産物の産生を意味する。
【００４３】
一旦、本発明の完全なＤＮＡ配列が得られたら、それらは、当該分野において公知であり、例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（ｓ．ａ．）において記載の方法によって、ベクターに組み入れるか、または宿主生物体のゲノムに直接導入して、適切な宿主系において、コードされたポリペプチドを（過剰）発現させることができる。しかし、当業者は、ＤＮＡ配列自体もまた、本発明の適切な宿主系を形質転換して、コードされたポリペプチドの（過剰）発現を得るために、使用することができることを知っている。
【００４４】
適切な宿主細胞は、真核細胞であってもまたは原核細胞であってもよい。適切な宿主細胞の例として、細菌細胞、例えば、シアノバクテリア、連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｉ）、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、またはストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、例えば、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）もしくは肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株、例えば、Ｍｌ５もしくはＨＢ１０１の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。宿主細胞は、酵母細胞、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ）、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）または麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、例えば、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、アシブヤ（Ａｓｈｂｙａ）、例えば、アシブヤ・ゴッシピィ（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、エレモセシウム（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ）、例えば、エレモセシウム・シビィ（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ  ａｓｈｂｙｉｉ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、例えば、カンジダ・フラレリ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｆｌａｒｅｒｉ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、例えば、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）（ＤＳＭ５２１５）、およびクリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）の細胞を含む真菌細胞であってもよい。適切な宿主細胞は、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３、ＣＶ−１のような哺乳動物細胞、ならびにショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびヨウトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９）細胞のような昆虫細胞を含む動物細胞；ならびに裸子植物または被子植物の細胞のような植物細胞からさらに選択してもよい。
【００４５】
真菌における発現のために使用され得るベクターは当該分野において公知であり、例えば、ＥＰ４２０３５８号明細書において、またはカレン（Ｃｕｌｌｅｎ）ら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５，３６９−３７６，１９８７年）、ウォード（Ｗａｒｄ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｆｕｎｇｉ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ニューヨーク、１９９１年）、アップシャル（Ｕｐｓｈａｌｌ）ら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５，１３０１−１３０４，１９８７年）、グイネ（Ｇｗｙｎｎｅ）ら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５，７１−７９，１９８７年）、またはプント（Ｐｕｎｔ）ら（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７，１９−３４，１９９１年）によって、および酵母についてはスリークリシュナ（Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ）ら（Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８，２６５−２７８，１９８８年；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２８，４１１７−４１２５，１９８９年）、ヒッゼマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎｎ）ら（Ｎａｔｕｒｅ２９３，７１７−７２２，１９８１年）によるかまたはＥＰ１８３０７０号明細書、ＥＰ１８３０７１号明細書、ＥＰ２４８２２７号明細書、もしくはＥＰ２６３３１１号明細書において記載されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のために使用することができる適切なベクターは当該分野において公知であり、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（ｓ．ａ．）によって記載されている。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｉ）における発現のために使用することができるベクターは当該分野において公知であり、例えば、ＥＰ２０７４５９号明細書またはＥＰ４０５３７０号明細書において、ヤンスラ（Ｙａｎｓｕｒａ）およびエネ（Ｈｅｎｎｅｒ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１，４３９−４４３（１９８４年）、またはエネ（Ｈｅｎｎｅｒ）、ルグライス（Ｌｅ  Ｇｒｉｃｅ）およびナガラジャン（Ｎａｇａｒａｊａｎ）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５，１９９−２２８，１９９０年によって記載されている。Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）における発現のために使用することができるベクターは当該分野において公知であり、例えば、ゲリッセン（Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９，２９１−２９５，１９９１年において記載されている。
【００４６】
そのようなベクターはいずれも、調節エレメント、例えば、プロモーター，を既に担持するか、または本発明のポリヌクレオチドは、そのようなエレメントを含有するように操作され得る。使用することができる適切なプロモーターエレメントは当該分野において公知であり、例えば、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）についてはｃｂｈ１−またはｐｋｉ１−プロモーターであり、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）についてはａｍｙ−プロモーターであり、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）についてはｇｌａＡ−、ａｌｃＡ−、ａｐｈＡ−、ｔｐｉＡ−、ｇｐｄＡ−およびｐｋｉＡ−プロモーターである。酵母における発現のために使用することができる適切なプロモーターエレメントは当該分野において公知であり、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現についてはｐｈｏ５−もしくはｇａｐ−プロモーターであり、例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）についてはａｏｘｌ−プロモーターであり、またはＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）についてはＦＭＤ−もしくはＭＯＸプロモーターである。
【００４７】
細菌発現のための適切なプロモーターおよびベクターとしては、例えば、ジャコミニ（Ｇｉａｃｏ分ｉ）ら（Ｇｅｎｅ１４４，１７−２４，１９９４年）により記載の合成プロモーター、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のｖｅｇＩプロモーターまたは強力なバクテリオファージＴ５プロモーターが挙げられる。適切なプラスミドによるかまたはＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩをコードするＤＮＡ配列の染色体ＤＮＡへの組込みのいずれかを介する細菌における権利請求の対象とする（変異）ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ酵素の発現のための適切な教示は、多くの場所、例えば、米国特許第６，３２２，９９５号明細書において見出され得る。
【００４８】
従って、細菌、真菌、動物または植物宿主における前記ポリヌクレオチドの発現に好ましい本発明のポリヌクレオチドを含んでなるベクター、およびそのような形質転換された細菌または真菌、動物または植物宿主もまた本発明の対象である。
【００４９】
本発明はさらに、リボフラビン、リボフラビン前駆体、ＦＭＮ、ＦＡＤ、または１つもしくはそれ以上のそれらの誘導体を産生するための方法に関し、以下を含んでなる：
（ａ）本発明の宿主細胞を、適切な培地において、前記宿主細胞において修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩの発現を可能にする条件下で培養すること；および
（ｂ）場合により、培地から産物（リボフラビン、リボフラビン前駆体、ＦＭＮ、ＦＡＤ、または１つもしくはそれ以上のそれらの誘導体）を分離すること。
【００５０】
そのような方法は、１つもしくはそれ以上の次の産物：リボフラビン、リボフラビン前駆体、ＦＭＮ、ＦＡＤ、または１つもしくはそれ以上のそれらの誘導体のいずれかの生物工学的産生のために使用することができる。そのような誘導体は、フラボタンパク質を含み得る。
【００５１】
本発明による適切な宿主細胞の遺伝子および代謝操作の方法は、当該分野において公知である。同様に、リボフラビン、リボフラビン前駆体、ＦＭＮ、ＦＡＤ、または１つもしくはそれ以上のそれらの誘導体のための（潜在的に）適切な精製方法は、ファインケミカル生合成（ｆｉｎｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）および産生の領域において周知である。
【００５２】
本発明によるリボフラビン、リボフラビン前駆体、ＦＭＮ、ＦＡＤ、または１つもしくはそれ以上のそれらの誘導体の生物工学的産生のための方法は、上記のような全細胞発酵プロセスに限定されず、例えば、透過された宿主細胞、粗細胞抽出物、例えば、遠心分離もしくはろ過によって細胞残物から澄明化された細胞抽出物、またはなお単離された酵素を伴う再構成された反応経路を使用し得ることが理解される。また、そのようなプロセスの組み合わせも本発明の範囲内にある。（再構成された反応経路を伴うような）無細胞生合成の場合、単離された酵素が、インビトロ転写／翻訳、またはなお他の手段によって宿主細胞から調製および単離されているかどうかは関係ない。
【００５３】
本発明は、さらに、以下を含んでなる、本発明の修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩを産生するための方法に関する：
（ａ）本発明の宿主細胞を、本発明の修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩの発現を可能にする条件下で培養すること；および
（ｂ）細胞または培地から修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩを回収すること。
【００５４】
本発明の修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ酵素は、適切な発現系を含んでなる遺伝子操作された宿主細胞から調製してもよい。
【００５５】
本発明のポリペプチドの組換え産生のために、宿主細胞を遺伝子操作して、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターもしくはプラスミドを組み入れることができる。ポリヌクレオチドまたはベクターの宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン仲介トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質仲介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、弾丸導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および感染のような当該分野において既知の標準的な方法によって行うことができる。
【００５６】
本発明の修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ酵素を産生させるために、極めて多様な発現系を使用することができる。そのようなベクターは、とりわけ上掲において記載のものを含む。一般に、ポリヌクレオチドを維持、繁殖もしくは発現するおよび／またはポリペプチドを宿主において発現するのに適切な任意の系あるいはベクターは、これに関する発現のために使用することができる。
【００５７】
真核生物における組換え発現系では、翻訳されたタンパク質の小胞体の内腔、ペリプラズム空間または細胞外環境への分泌のために、適切な分泌シグナルを、発現されるポリペプチドに組み入れてもよい。これらのシグナルは、ポリペプチドに対して内在的であってもよく、またはそれらは異種のシグナルであってもよい。
【００５８】
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、および高速液体クロマトグラフィーを含む周知の方法によって、組換え細胞培養物から回収および精製することができる。単離および／または精製中にポリペプチドが変性する場合、タンパク質リホールディングのための周知の技術を用いて、活性なコンホメーションを再生することができる。
【００５９】
本発明のＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ酵素はまた、植物体において、例えば、ペン（Ｐｅｎ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１，８１１−８１４，１９９４年またはＥＰ４４９３７５号明細書において記載の方法に従って、好ましくは、種子において、例えば、ＥＰ４４９３７６号明細書において記載のように、発現させることができる。プロモーターおよびターミネーターのいくつかの適切な例として、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）およびカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）遺伝子由来のものが挙げられる。使用することができる効率的な植物プロモーターの１つのタイプは、高レベル植物プロモーターである。そのようなプロモーターは、本発明の遺伝子配列と操作可能な結合において、本発明の遺伝子産物の発現を促進することが可能であるべきである。本発明において使用することができる高レベル植物プロモーターとして、例えば、ダイズ由来のリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓ）のプロモーター、およびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーターが挙げられる。
【００６０】
本発明によるタンパク質の商業的産生が所望される場合、様々な培養方法論を適用することができる。例えば、組換え微生物宿主から過剰発現される特定の遺伝子産物の大規模産生は、バッチまたは連続培養方法論の両方によって、達成することができる。バッチおよび流加培養方法が当該分野において一般的かつ周知であり、例がトーマス  Ｄ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（１９８９年）、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、Ｍａｓｓ．、またはデーシュパーンデー（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ）、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６、２２７−２３４、１９９２年によって記載されている。連続培養プロセスのための栄養素および増殖因子を調節する方法ならびに産物形成の速度を最大限にするための技術については、産業微生物学の分野において周知であり、様々な方法がブロック（Ｂｒｏｃｋ）、上掲によって詳述されている。
【００６１】
発酵培地は、適切な炭素基質をさらに含有することができる。適切な基質として、グルコースおよびフルクトースのような単糖、ラクトースもしくはスクロースのようなオリゴ糖、デンプンもしくはセルロースのような多糖またはそれらの混合物および継続可能な供給原料からの非精製混合物を挙げることができるが、これらに限定されない。本発明において利用される炭素の供給源は極めて多様な炭素含有基質を包含し得、生物体の選択によってのみ制限されることが考慮される。
【００６２】
本発明は、さらに、増加した比活性を有するＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩの調製のための方法に関し、以下の工程を含んでなる：
（ａ）望ましくは、増加すべきである比活性を伴う第１のＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩをコードするポリヌクレオチドを提供すること；
（ｂ）第１のＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩと比較する場合、変異型ポリヌクレオチド配列が、１つもしくはそれ以上の変異を含んでなる修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩをコードするように、１つもしくはそれ以上の変異をポリヌクレオチド配列に導入することであって、ここで、１つもしくはそれ以上の変異は、配列番号２の２６１位、２７０位、２７６位、２７９位、３０８位および／または３４７位に対応するアミノ酸位置において１、２、３、４、５、または６つの変異を含む；
（ｃ）場合により、変異型ポリヌクレオチドをベクターまたはプラスミドに挿入すること；
（ｄ）ポリヌクレオチドまたはベクターもしくはプラスミドを適切な宿主細胞に導入すること；ならびに
（ｅ）修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩの発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養すること。
【００６３】
本発明は、さらに、増加した比活性を有するＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩの調製のための方法の供給を含み、以下の工程を含んでなる：
（ａ）望ましくは、増加すべきである比活性を伴う第１のＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩをコードするポリヌクレオチドを提供すること；
（ｂ）比活性に対する効果を有する位置を提供すること；
（ｃ）（ｂ）において規定される野生型ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩの所定のアミノ酸の置き換えのための至適アミノ酸を規定し、変異型ポリヌクレオチド配列が新規のＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩをコードするように、１つもしくはそれ以上の変異を、（ｂ）において規定される位置で（ａ）のポリヌクレオチド配列に導入すること；
（ｄ）場合により、変異型ポリヌクレオチドをベクターまたはプラスミドに挿入すること；
（ｄ）ポリヌクレオチドまたはベクターもしくはプラスミドを適切な宿主細胞に導入すること；ならびに
（ｅ）修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩの発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養すること。
【００６４】
一実施形態では、工程（ｃ）または上記の方法は、飽和変異誘発を介して実施される。しかし、これは、増加した比活性を伴う修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩを得るための、野生型ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩの所定の位置でアミノ酸を置き換えるべきアミノ酸を規定するための唯一の方法ではないことが理解される。
【００６５】
例えば、飽和変異誘発を介する上記のような修飾されていないＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩからの増加した比活性を有する修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩの調製は、図１または表４のような修飾されていないタンパク質、特に、配列番号２、３３、３５、３７、３９、４１、および４３によって同定されるもの、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはアシブヤ・ゴッシピィ（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）の修飾されていないＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩタンパク質からの変異型ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩタンパク質の調製を含むが、それに限定されない。ＰＣＲ反応のために使用されるプライマーは、一方のプライマー、例えば、センスプライマーが変異型ヌクレオチド配列を含有し得、他方のプライマー、例えば、アンチセンスプライマーが野生型ヌクレオチド配列を含有し得るようなものである。これらのプライマー対および野生型ｒｉｂＡのゲノムＤＮＡによるＰＣＲは、使用するプライマーの変異型ヌクレオチド配列に依存して、所定の位置で特定の変異を担持するＰＣＲ産物を生じ得る。例えば、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）のような標準的な方法を使用して、得られるＰＣＲ産物の精製後、ＤＮＡを、ＢａｍＢＩおよびＥｃｏＲＩのような制限酵素で切断し、適切なベクター、例えば、ｐＱＥ６０に連結し、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩについてネガティブである株に形質転換することができる。そのような株の例には、プラスミドｐＲＥＰ４を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｒｉｂ７（リクター（Ｒｉｃｈｔｅｒ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５，４０４５−４０５１，１９９３年）がある。ＤＮＡ配列決定による正確な配列の確認後、上記のように変異型ＲｉｂＡを精製し、特徴付けることができる。アシブヤ・ゴッシピィ（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）が、増加した比活性を有するＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩの作製のために使用される場合、飽和変異誘発は、後者の酵素の比活性に影響を及ぼすことが示された配列番号２のような枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩのそれぞれの残基Ｖ２６１、Ｇ２７０、Ａ２７６、Ｑ２７９、Ｋ３０８およびＭ３４７に対応するアミノ酸残基／位置Ｔ１２６、Ｇ１３５、Ａ１４１、Ｌ１４４、Ｎ１８２および１２２１で実施しなければならない（表４を参照のこと）。
【００６６】
本方法の好適な実施形態は、修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ、それらをコードするポリヌクレオチド、ベクターおよびプラスミド、宿主細胞、ならびに本明細書に記載の方法の好適な実施形態に対応する。第１および第２のＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩは、それぞれ、修飾されていないおよび修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩに対応する（上掲を参照のこと）。
【００６７】
本発明の目的は、上記のような修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩをコードする核酸配列を含んでなるポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含んでなるベクター、好ましくは、発現ベクター、そのようなポリヌクレオチドまたはベクターによって形質転換されている宿主細胞、本発明のＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩの調製のための方法であって、ここで、先に記載のような宿主細胞が適切な培養条件下で培養され、当該分野において既知の方法によって、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩがそのような宿主細胞または培養培地から単離される、方法、ならびにそのようなポリヌクレオチドもしくはベクターによって形質転換されている、および／またはそのようなポリヌクレオチドをその染色体に安定に組み入れている宿主細胞に基づく、リボフラビン、リボフラビン前駆体、ＦＭＮ、ＦＡＤ、または１つもしくはそれ以上のそれらの誘導体の生物工学的産生のための方法を提供することである。
【００６８】
また、本発明の目的は、（ｉ）本発明の特定の変異の少なくとも１つを担持するＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩをコードし、標準的な条件下で、本発明の特定の修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ酵素のＤＮＡ配列のいずれかとハイブリダイズするＤＮＡ配列、または（ｉｉ）本発明の特定の変異の少なくとも１つを担持するＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩをコードするが、遺伝子暗号の縮重のため、標準的な条件下で本発明の特定の修飾されたＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ酵素のＤＮＡ配列のいずれかとハイブリダイズするＤＮＡ配列と正確に同じアミノ酸配列を伴うポリペプチドをコードするものとはハイブリダイズしないＤＮＡ配列、または（ｉｉｉ）それがフラグメントであるポリペプチドの活性特性を維持するようなＤＮＡ配列のフラグメントであるＤＮＡ配列を提供することである。
【００６９】
ハイブリダイゼーションのための「標準的な条件」とは、本発明において、特定のハイブリダイゼーションシグナルを検出するために、当業者によって一般的に使用され、例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ１９８９年、ニューヨークに記載の条件を意味し、または好適ないわゆるストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび非ストリンジェントな洗浄条件、またはより好適ないわゆるストリンジェントなハイブリダイゼーションおよびストリンジェントな洗浄条件も当業者によく知られており、例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（ｓ．ａ．）に記載されている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の特定の例は、４２℃：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含んでなる溶液中での１晩のインキュベーション（例えば、１５時間）、続いて、ハイブリダイゼーション支持体を０．１×ＳＳＣ中、約６５℃で洗浄することである。
【００７０】
本発明のさらなる目的は、本発明の具体的に記載されたＤＮＡ配列に基づいて設計されたＰＣＲプライマーによるいわゆるポリメラーゼ連鎖反応方法（「ＰＣＲ」）によって得ることができるＤＮＡ配列を提供することである。そのようにして得られたＤＮＡ配列は、それらが設計され、匹敵する活性特性を示す変異と少なくとも同じ変異を伴うＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ酵素をコードすることが理解される。
【００７１】
本明細書に記載の本発明の多様な実施形態は互いに組み合わせることができる。
【００７２】
以下の非制限的実施例により本発明をさらに例示する。
【００７３】
実施例１：ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ活性の測定および比活性の決定
ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ活性を測定するために使用される酵素アッセイは、リッツ（Ｒｉｔｚ）ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２２２７３−２２２７７，２００１年）から適応した。最終アッセイ緩衝液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７．５ｍＭメルカプトエタノール、２．５ｍＭ  ＧＴＰおよび０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含有した。精製（実施例５を参照のこと）後、酵素を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７．５ｍＭメルカプトエタノール、および１０％グリセロールを含有する緩衝液中に保持した。基質を酵素に添加し、ＧＴＰが吸収を示さない３１０ｎｍでの吸収を、２０〜３０分間、追跡した。最終反応混合物は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）または表１もしくは２に示される変異体の１つ由来の０．０２〜０．０４ｍｇ／ｍｌの間のＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩを含有した。ＤＲＡＰＰに対する６．２８［ｍＭ−１  ｃｍ−１］の吸収係数を、活性の算出に使用した。タンパク質の決定は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ由来のＰｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（カタログ番号５００−０００２，Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＡＧ，Ｎｅｎｚｌｉｎｇｅｒｗｅｇ２，ＣＨ−４１５３Ｒｅｉｎａｃｈ、瑞国）で実施した。
【００７４】
上記の「比活性」の規定に従い、１単位は、上記の条件下で１分間あたりの１μｍｏｌのＤＲＡＰＰの形成を触媒するＲｉｂＡの量である。比活性は、上記の条件下で１分間あたりに１ｍｇのＲｉｂＡによって形成されるＤＲＡＰＰの量である。上記の規定を使用して、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＨｉｓ６タグ化ＲｉｂＡタンパク質の特定のＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ活性は、０．１１５Ｕ／ｍｇであった。
【００７５】
実施例２：酵素アッセイの質の試験
至適アッセイは、酵素濃度との直線性および時間との直線性のような多くの要件を満たすべきである。実施例１に記載の条件および２２μｇの酵素を使用して、３１０ｎｍでの吸収の増加を、２５分間、追跡した。どの範囲で、アッセイが、酵素濃度で直線であるかを試験するために、増加する酵素濃度（０〜４０μｇのＨｉｓ６−タグ化ＲｉｂＡ）に対するアッセイの依存性について試験した。アッセイは、２５分間、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の０〜４０μｇのＨｉｓ６−タグ化ＲｉｂＡで、直線であることが証明された。
【００７６】
この後、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来Ｈｉｓ６−タグ化ＲｉｂＡのＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ活性のＧＴＰ濃度に対する依存性について試験した。実施例１に記載の条件を使用した。しかし、ＧＴＰ濃度は、０．０５〜２．５ｍＭの最終濃度で変動した。データは、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＨｉｓ６−タグ化ＲｉｂＡ酵素のＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ活性について、３７℃において、０．０７ｍＭのＧＴＰに対するＫｍ値および約１１５ｍＵ／ｍｇタンパク質の比活性を示す。本実施例の実験は、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ活性アッセイが、事実上、時間および酵素（ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ）濃度で直線であり、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩについての所定の条件下で、２．５ｍＭのＧＴＰ濃度が、酵素の比活性の信頼し得る測定を可能にするのに最適であり得ることを示した。
【００７７】
実施例３：枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのゲノムＤＮＡの単離
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を、３０℃で、Ｖｅａｌ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓｐａｒｋｓ、メリーランド州２１１５２、米国）中、１晩、増殖させた。１．５ｍｌ培養物を１．５ｍｌチューブに移し、遠心分離した。
【００７８】
細胞ペレットを、０．５ｍｌ懸濁緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、１５％スクロースおよび１ｍｇ／ｍｌの新たに添加したリゾチーム）中に再懸濁した。室温での１０分間のインキュベーション後、１μｌのジエチルオキシジホルメートを添加した。次いで、１０μｌの１０％ＳＤＳ溶液を添加し、チューブを数回転倒させた。チューブを５分間、７０℃でインキュベートし、細菌ＤＮＡを放出させた。５０μｌの５Ｍ酢酸カリウムを添加し、チューブを氷上で冷却し、そこで４５分間、放置した。この後、サンプルを、３０分間、４℃で遠心分離した。上清を、新しい１．５ｍｌチューブに移し、室温でエタノールを（１．５ｍｌまで）満たした。５分間の遠心分離後、上清を捨て、ＤＮＡペレットを乾燥させた。次いで、ＤＮＡを７０％および９６％エタノールで洗浄し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１０μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＡ中に溶解した。
【００７９】
実施例４：枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ならびにその変異体由来のＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩおよびＤＨＢＰシンターゼをコードするｒｉｂＡを発現するための発現プラスミドの構築
ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩおよびＤＨＢＰシンターゼをコードする枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｒｉｂＡ遺伝子（配列番号１）のクローニングを、ＰＣＲによって行った。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のゲノムＤＮＡを、実施例３に従って単離した。このＤＮＡまたはｒｉｂＡ遺伝子の変異型をコードするテンプレートの１００ｎｇを、プライマーＲｉｂＡ１Ｓ（配列番号２７）およびＲｉｂＡ１ＡＳ（配列番号２８）を使用するＰＣＲに使用した。次のＰＣＲ条件を使用した：ＤＮＡポリメラーゼと共に供給される適切な緩衝液中の２μＭの各プライマー、０．２ｍＭの各ヌクレオチド、２．５ＵのプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｇｅｂｏｕｗ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、１１０１ＣＢ  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  Ｚｕｉｄｏｏｓｔ、蘭国）、および１００ｎｇのゲノムＤＮＡ。
【００８０】
温度調節は以下のとおりであった：
工程１：９５℃で３分間
工程２：９５℃で３０秒間
工程３：５２℃で３０秒間
工程４：７２℃で６０秒間
工程２〜４を３０回反復した。
【００８１】
１．３ｋｂのＰＣＲ産物を、プライマーＲｉｂＡ１ＳがプライマーＲｉｂＡ２Ｓ（配列番号２９）によって置き換えられたＰＣＲ２のテンプレートとして使用した。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＲｉｂＡ（配列番号４）のＮ末端Ｈｉｓ６タグ化バージョンをコードするこの反応のＰＣＲ産物（配列番号３）を、アガロースゲル電気泳動によって分離し、ゲルから溶出させ、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ消化したベクターｐＱＥ６０（Ｑｉａｇｅｎ  ＡＧ、Ｈｉｌｄｅｎ、独国）に連結した。該プラスミドをｐＱＥ６０ｒｉｂＡＮｈｉｓと称した。
【００８２】
実施例５：野生型および変異酵素の特徴付け
変異型酵素の作製を、上に記載および当業者に公知である方法を使用して、実施した。さらに調べた枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＲｉｂＡの変異体を、表１に示す。すべての変異遺伝子を、実施例４に記載のｐＱＥ６０ベクターにクローニングした。すべての最終構築物は、Ｎ末端Ｈｉｓ６−タグを含有した。
【００８３】
【表１】
2008504833.tif 000002
【００８４】
ＲｉｂＡ変異酵素を、実施例４のプラスミドから発現させ、「Ｔｈｅ  ＱｉａＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ」、Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、独国、２００１年３月、第５版において記載のように精製した。精製した酵素（ＲｉｂＡ変異体）の酵素特性を、実施例１および２に記載のとおりに分析した。表２では、ＲｉｂＡ変異体（表１を参照のこと）の特定のＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ活性を枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の野生型ＲｉｂＡのＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩの活性と比較する。実施例４に記載のように、ＲｉｂＡのＮ末端Ｈｉｓ６−タグ化酵素バージョンを使用して、活性を測定した。番号は、配列番号２におけるそれぞれのアミノ酸位置を規定する。
【００８５】
【表２】
2008504833.tif 000003
【００８６】
括弧内のアミノ酸の置き換えは、ほぼ確実に、変異体のＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ活性に対して効果がない。アミノ酸の交換Ｙ１９６Ｃは、ＲｉｂＡのプロテアーゼ感受性を減少する。
【００８７】
実施例６：より高い特定のＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ活性を示すＲｉｂＡ変異体を過剰発現する組換え枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株の構築
以下の実施例では、ＲｉｂＡ  Ｙ１９６Ｃ、Ａ２７６Ｔ、Ａ２８２Ｔ（ＰＣＲ  ＩＩＩ）、ＲｉｂＡ  Ｙ１９６Ｃ、Ａ２７６Ｔ、Ｑ２７９Ｒ、Ａ２８２Ｔ、Ｋ３０８Ｒ、Ｍ３４７Ｉ（構築物Ｃ）、およびＲｉｂＡ  Ｙ１９６Ｃ、Ａ２７６Ｔ、Ｑ２７９Ｒ、Ａ２８２Ｔ、Ｋ３０８Ｒ、Ｆ３２５Ｙ、Ｍ３４７Ｉ（構築物Ｅ）の変異型ｒｉｂＡポリヌクレオチド配列を、最初に、強力な構成性プロモーターＰｖｅｇＩを含有するベクターに導入し、次いで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてさらに操作した。ポリヌクレオチド配列およびフランキングベクター配列による天然のコンピテント枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）微生物の形質転換により、変異型ｒｉｂＡを過剰発現する枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株を生じた。標準的な組換えＤＮＡ技術を、ポリヌクレオチド配列および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株の構築に使用した。例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９年）、ならびにハーウッド（Ｈａｒｗｏｏｄ）およびカッティング（Ｃｕｔｔｉｎｇ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９０年）を参照のこと。
【００８８】
変異型ｒｉｂＡを増幅するために、ｒｉｂＡをコードする配列全体を含有する１．２−ｋｂのＤＮＡフラグメントを、変異体ＰＣＲ  ＩＩＩ、構築物Ｃまたは構築物Ｅ、およびＲｉｂＡＮｄｅ＋１（配列番号３０）を含有するプラスミド由来のＤＮＡおよびプライマーとしてＲｉｂＡ４ＡＳ（配列番号３１）を使用するＰＣＲによって増幅した。
【００８９】
ＰＣＲ反応の反応条件は、９５℃で１分間の変性、５２℃で１分間のアニーリング、および７２℃で２分間の伸長の３０サイクルからなった。Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｇｅｂｏｕｗ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，１１０１ＣＢ  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  Ｚｕｉｄｏｏｓｔ、蘭国）を使用して、ＰＣＲにより生じるエラーを最小限にした。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを使用して、二重消化した。消化したＰＣＲ産物を、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の強力な構成性ＰｖｅｇＩプロモーターのすぐ下流でのポリヌクレオチド配列のクローニングに適切な制限部位からなるｐＸＩ１６ベクター（フエムベリン（Ｈｕｅｍｂｅｌｉｎ）ら、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２，１−７，１９９９年）にクローニングした。ｐＸＩ１６ベクターもまた、Ｂ．チューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）由来のｃｒｙＴ転写ターミネーター、二重交差事象による枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ゲノムへの相同組換えのためのｓａｃＢフランキング配列、およびエリスロマイシン耐性マーカーを含有する。各プラスミドが変異型ｒｉｂＡを含有することを、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００９０】
各プラスミドをＡｐａＩで消化して、ＰｖｅｇＩプロモーターからスペーサー領域を取り出し、再連結し、再度ＦｓｐＩで消化し、天然のコンピテント枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１０１２細胞に形質転換した。形質転換体を、２μｇ／ｍｌの最終濃度でエリスロマイシンを含有するＴＢＡＢプレート（Ｔｒｙｐｔｏｓｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ａｇａｒ  Ｂａｓｅ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓｐａｒｋｓ，メリーランド州２１１５２、米国）上で選択した。ＤＮＡ配列決定により、変異型ｒｉｂＡポリヌクレオチド配列がこれらの株において正確であることを確認した。リボフラビンの過剰発現を、実施例７に従って試験した。
【００９１】
ＰｖｅｇＩプロモーターによって駆動される変異型ｒｉｂＡポリヌクレオチド配列を、一般化された形質導入によって、リボフラビン過剰産生枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＲＢ５０：：（ｐＲＦ６９）ｎ：：（ｐＲＦ９３）ｍ（パーキンス（Ｐｅｒｋｉｎｓ）ら、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：８−１８（１９９９年）において記載されている）に導入した。ハーウッド（Ｈａｒｗｏｏｄ）およびカッティング（Ｃｕｔｔｉｎｇ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９０年）に従って、バクテリオファージＰＢＳ１を使用する標準的な技術を用いた。２μｇ／ｍｌの最終濃度でエリスロマイシンを含有するＴＢＡＢプレート上で、形質転換体を選択した。ＰＣＲ分析およびＤＮＡ配列決定によって形質転換体を点検し、変異型ｒｉｂＡポリヌクレオチド配列の正確な挿入を確認した。
【００９２】
実施例７：増加した比活性を伴うＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩを使用するリボフラビンの改良された産生
ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩの比活性に影響を及ぼす変異のインビボ効果について試験するために、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ（ＲｉｂＡ）変異ＰＣＲ  ＩＩＩ、構築物Ｃ、または構築物Ｅを、株ＲＢ５０：：（ｐＲＦ６９）ｎ：：（ｐＲＦ９３）ｍ（パーキンス（Ｐｅｒｋｉｎｓ）ら、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２、８−１８、１９９９年）のようなリボフラビン過剰産生枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株に、例えば、ｓａｃＢ遺伝子座において導入した。リボフラビンの産生を、ｒｉｂＡ遺伝子における変異の有無のみが異なる枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の２つの組換え株において直接比較した。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株の培養を、実施例８に記載のとおりに行った。
【００９３】
実施例８：リボフラビン産生を評価するための培養条件
リボフラビン産生を、ＰｖｅｇＩプロモーターによって駆動されるＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ変異体ＰＣＲ  ＩＩＩ、構築物Ｃ、または構築物ＥがｓａｃＢ遺伝子座に組込まれた（実施例６を参照のこと）リボフラビン過剰産生枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＲＢ５０：：（ｐＲＦ６９）ｎ：：（ｐＲＦ９３）ｍの流加培養において試験した。株の発酵は、４０５３７０号明細書に記載のとおりに行った。
【００９４】
実施例９：リボフラビンの決定のための分析方法
リボフラビンの決定のために、以下の分析方法を使用することができる（ブレットゼル（Ｂｒｅｔｚｅｌ）ら、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２、１９−２６、１９９９年）。
【００９５】
クロマトグラフィーシステムは、バイナリーポンプ、カラムサーモスタットおよび冷却型オートサンプラーを具備したＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ１１００Ｓｙｓｔｅｍであった。ダイオードアレイ検出器および蛍光検出器の両方をラインで使用した。２つのシグナル、２８０ｎｍでのＵＶおよび励起４４６ｎｍ、発光５２０ｎｍでの蛍光トレースを記録した。
【００９６】
ステンレス製Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ  ＬＣ−８−ＤＢカラム（１５０×４．６ｍｍ、３μｍ粒度）を、ガードカートリッジと共に使用した。移動相は、１００ｍＭ酢酸（Ａ）およびメタノール（Ｂ）であった。以下のスキームに従う勾配溶出を使用した：
【００９７】
【表３】
2008504833.tif 000004
【００９８】
カラム温度を２０℃に設定し、流速は１．０ｍｌ／分であった。稼働時間は２５分間であった。
【００９９】
発酵サンプルを希釈し、ろ過し、さらなる処置を伴わずに分析した。リボフラビンを、外部標準との比較によって定量した。計算は、２８０ｎｍでのＵＶシグナルに基づいた。Ｆｌｕｋａ（９４７１Ｂｕｃｈｓ、瑞国）より購入したリボフラビンを、標準材料として使用した（純度＞９９．０％）。
【０１００】
実施例１０：枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩに相同であるＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ酵素における対応する残基の同定
ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴおよびＴｒＥＭＢＬ（図１を参照のこと）のような標準的なデータベースを使用するプログラムＢＬＡＳＴＮによって見出される９２の異なるＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ酵素の複数のアミノ酸配列アラインメントを、次のパラメータ：ギャップサクセイペナルティ（ｇａｐ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）８、ギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）２、およびブロサム６２．ｃｍｐマトリックス（ｂｌｏｓｕｍ６２．ｃｍｐ  ｍａｔｒｉｘ）（デフォルトパラメータ）を使用するプログラム「ＰＩＬＥＵＰ」（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．２、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．、９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州９２１２１−３７５２、米国）により算出した。
【０１０１】
本発明において相同なＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩは、図１において示されるＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩアミノ酸配列のいずれかと配列類似性を示し得る。図１は、下線を付している枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩの配列との９２のＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩアミノ酸配列の複数の配列アラインメントの例を提供する。図１は、一例としての役割を果たすに過ぎず、すべての既知のＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ酵素の完全な収集であることを意味するものではない。相同な残基、即ち、アミノ酸配列アラインメントにおける同じ位置に局在する（即ち、例えば、図１の同じカラムに局在する）異なるＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ酵素の残基は、各タンパク質の３Ｄ構造においても同様に位置し、各タンパク質において、匹敵する構造局面および機能機能局面を満たすことが予測される。実施例において考察される枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩのアミノ酸残基に相同なアミノ酸残基を、図１において太字で強調し、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アミノ酸配列におけるそれぞれの位置を、アラインメントのそれぞれのカラムの上部に追加する。
【０１０２】
特定のアミノ酸位置に対応する９２の異なる生物体のアミノ酸残基、即ち、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩのアミノ酸配列（配列番号２）の比活性（アミノ酸残基２６１、２７０、２７６、２７９、３０８、３４７）にポジティブな効果を及ぼすことが見出されたアミノ酸残基に相同／透過である位置を表４にまとめ、ここで、左側のカラムの数字は、使用した配列の名称、データベース受託番号、および括弧内における配列の供給源生物体で開始する生物体（図１に従う）を規定する：
（１）ｇｃｈ２＿ｂａｃｓｕ：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：ｇｃｈ２＿ｂａｃｓｕ（枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ））
（２）ｇｃｈ２＿ｃａｎｇｕ：ｇｅｎｅｓｅｑｐ：ａａｙ６９７７６（カンジダ・ギリエルモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ））
（３）ｇｃｈ２＿ａｓｈｇｏ：ＴｒＥＭＢＬ：ＣＡＡ０２９１２：（アシブヤ・ゴッシピィ（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）エレモセシウム・ゴシピィ（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ  ｇｏｓｙｐｉｉ））
（４）ｇｃｈ２＿酵母：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：ｇｃｈ２＿酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））
（５）ｇｃｈ２＿ｎｅｕｃｒ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８７１Ｂ３（アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ））
（６）ｇｃｈ２＿ｓｃｈｐｏ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ９Ｐ７Ｍ９（シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ））
（７）ｇｃｈ２＿ａｒｃｆｕ：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：ｇｃｈ２＿ａｒｃｆｕ（アーケグロバス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ））
（８）ｇｃｈ２＿ｓｔｒｃｏ：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：ｇｃｈ２＿ｓｔｒｃｏ（ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ））
（９）ｇｃｈ２＿ｈｅｌｐｊ：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：ｇｃｈ２＿ｈｅｌｐｊ（ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）Ｊ９９）
（１０）ｇｃｈ２＿ｈｅｌｐｙ：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：ｇｃｈ２＿ｈｅｌｐｙ（ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ））
（１１）ｇｃｈ２＿ｐｙｒｆｕ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８Ｕ４Ｌ７（パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ））
（１２）ｇｃｈ２＿ｔｈｅｍａ：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：ｇｃｈ２＿ｔｈｅｍａ（サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ））
（１３）ｇｃｈ２＿ｃｈｌｍｕ：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：ｇｃｈ２＿ｃｈｌｍｕ（クラミジア・ムリダルム（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｍｕｒｉｄａｒｕｍ））
（１４）ｇｃｈ２＿ｃｈｌｔｒ：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：ｇｃｈ２＿ｃｈｌｔｒ（クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）
（１５）ｇｃｈ２＿ｃｈｌｃａ：ＴｒＥＭＢＬ：ＡＡＰ０５６３５（クラミジア・キャビエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｃａｖｉａｅ）ＧＰＩＣ）
（１６）ｇｃｈ２＿ｃｈｌｐｎ：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：ｇｃｈ２＿ｃｈｌｐｎ（クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））
（１７）ｇｃｈ２＿ａｒａｔｈ：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：ｇｃｈ２＿ａｒａｔｈ（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ））
（１８）ｇｃｈ２＿ｌｙｃｅｓ：ＴｒＥＭＢＬ：ＣＡＣ０９１１９（トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））
（１９）ｇｃｈ２＿ｏｒｙｓａ：ＴｒＥＭＢＬ：ＡＡＯ７２５６０（オリザ・サティバム（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖｕｍ））
（２０）ｇｃｈ２＿ａｌｃｅｕ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ９Ｆ１８４（アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ））
（２１）ｇｃｈ２＿ｎｅｉｍａ：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：ｇｃｈ２＿ｎｅｉｍａ（髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（血清型Ａ））
（２２）ｇｃｈ２＿ｎｅｉｍｂ：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：ｇｃｈ２＿ｎｅｉｍｂ（髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（血清型Ｂ））
（２３）ｇｃｈ２＿ｐｓｅｐｋ：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：ｇｃｈ２＿ｐｓｅｐｋ（シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）（株ＫＴ２４４０））
（２４）ｇｃｈ２＿ｐｓｅｓｍ：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：ｇｃｈ２＿ｐｓｅｓｍ（シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）（ｐｖ．トマト））
（２５）ｇｃｈ２＿ａｃｔａｃ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ９ＪＲＲ０（アクチノバシラス・アクチノマイセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）（ヘモフィルス・アクチノマイセテムコミタンス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）））
（２６）ｇｃｈ２＿ｈａｅｉｎ：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：ｇｃｈ２＿ｐａｓｍｕｇｃｈ２＿ｈａｅｉｎ（インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ））
（２７）ｇｃｈ２＿ｐａｓｍｕ：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：（パスツレラ菌（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ））
（２８）ｇｃｈ２＿ｅｃＯ６：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８ＦＨＵ５（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｏ６）
（２９）ｇｃｈ２＿ｅｃｏｌｉ：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：ｇｃｈ２＿ｅｃｏｌｉ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））
（３０）ｇｃｈ２＿ｓａｌｔｙ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８ＸＦＹ７（ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））
（３１）ｇｃｈ２＿ｙｅｒｐｅ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８ＺＥＦ０（ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ））
（３２）ｇｃｈ２＿ｂｕｃａｉ：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：ｇｃｈ２＿ｂｕｃａｉ（ブフネラ・アフィディコラ（Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ）（亜種エンドウヒゲナガアブラムシ（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ））（エンドウヒゲナガアブラムシ（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ）共生細菌））
（３３）ｇｃｈ２＿ｂｕｃａｐ：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：ｇｃｈ２＿ｂｕｃａｐ（ブフネラ・アフィディコラ（Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ）（亜種ムギミドリアブラムシ（Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）））
（３４）ｇｃｈ２＿ｗｉｇｂｒ：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：ｇｃｈ２＿ｗｉｇｂｒ（ウィグルスウォルシア・グロスインディア・ブレビパルピス（Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈｉａ  ｇｌｏｓｓｉｎｉｄｉａ  ｂｒｅｖｉｐａｌｐｉｓ））
（３５）ｇｃｈ２＿ｂｕｃｂｐ：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：ｇｃｈ２＿ｗｉｇｂｒ（ブフネラ・アフィディコラ（Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ）（亜種バイゾンギア・ピスタシエ（Ｂａｉｚｏｎｇｉａ  ｐｉｓｔａｃｉａｅ）））
（３６）ｇｃｈ２＿ｍｙｃｌｅ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ９ＣＣＰ４（らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ））
（３７）ｇｃｈ２＿ｍｙｃｔｕ：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：ｇｃｈ２＿ｍｙｃｔｕ（ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））
（３８）ｇｃｈ２＿ｃｏｒｅｆ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８ＦＴ５７（コリネ菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ））
（３９）ｇｃｈ２＿ｃｏｒｇｌ：ＧＥＮＥＳＥＱＰ：ＡＡＢ７９９１３（コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））
（４０）ｇｃｈ２＿ｃｏｒａｍ：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：ｇｃｈ２＿ｃｏｒａｍ（コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）（ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）））
（４１）ｇｃｈ２＿ｓｔａａｕ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８ＮＷ１４（黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（株ＭＷ２））
（４２）ｇｃｈ２＿ｓｔａｅｐ：ＧＥＮＥＳＥＱＰ：ＡＢＰ４０２４８（表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ））
（４３）ｇｃｈ２＿ａｃｔｐｌ：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：ｇｃｈ２＿ａｃｔｐｌ（アクチノバチルス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））
（４４）ｇｃｈ２＿ｌａｃｌａ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ９ＣＧＵ７（ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ））（ストレプトコッカス・ラクティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）））
（４５）ｇｃｈ２＿ｓｔｃａｇ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８Ｅ６５８（ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（血清型ＩＩＩ））
（４６）ｇｃｈ２＿ｓｔｃｐｎ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８ＤＲＦ１（肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（株ＡＴＣＣＢＡＡ２５５／Ｒ６））
（４７）ｇｃｈ２＿ｃｌｏａｃ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ９７ＬＧ９（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）
（４８）ｇｃｈ２＿ｆｕｓｎｕ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８ＲＩＲ１（フソバクテリウム・ナクレタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）（亜種ナクレタム（ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）））
（４９）ｇｃｈ２＿ａｎａｓｐ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８ＲＩＲ１（アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）ｓｐ．（株ＰＣＣ７１２０））
（５０）ｇｃｈ２＿ｓｙｎｙ３：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：ｇｃｈ２＿ｓｙｎｙ３（シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ｓｐ．（株ＰＣＣ６８０３））
（５１）ｇｃｈ２＿ｓｙｎｅｌ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８ＤＩ６４シネココッカス・エロンガータス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）（サーモシネココッカス・エロンガータス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ））
（５２）ｇｃｈ２＿ｂａｃａｍ：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：ｇｃｈ２＿ｂａｃａｍ（バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ））
（５３）ｇｃｈ２＿ｂａｃｃｅ：ＴｒＥＭＢＬ：ＡＡＰ１１０３０（セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ１４５７９）
（５４）ｇｃｎ２＿ｂａｃｈａ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ９ＫＣＬ５（バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ））
（５５）ｇｃｈ２＿ｃｌｏｐｅ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８ＸＭＸ０（ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ））
（５６）ｇｃｈ２＿ｃｌｏｔｅ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８９７Ｑ８（破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ））
（５７）ｇｃｈ２＿ｃｈｌｔｅ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８ＫＣ３５（クロロビウム・テピダム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍ））
（５８）ｇｃｈ２＿ａｑｕａｅ：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：ｇｃｈ２＿ａｑｕａｅ（アクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ））
（５９）ｇｃｈ２＿ｌｅｐｉｎ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８Ｆ７０１（レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ））
（６０）ｇｃｈ２＿ｄｅｉｒａ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ９ＲＸＺ９（デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ））
（６１）ｇｃｈ２＿ｂａｃｔｈ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８Ａ５２８（バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ））
（６２）ｇｃｈ２＿ｃａｕｃｒ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ９Ａ９Ｓ５（カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ））
（６３）ｇｃｈ２＿ｃｏｘｂｕ：ＴｒＥＭＢＬ：ＡＡＯ９０１９１（コクシエラ・バーネッティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ）ＲＳＡ４９３）
（６４）ｇｃｈ２＿ｒｈｉｅｔ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８ＫＬ３８（リゾビウム・エティリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ））
（６５）ｇｃｈ２＿ｌａｃｐｌ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８８Ｘ１７（ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ））
（６６）ｇｃｈ２＿ｐｓｅｇｌ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８ＲＳ３８（シュードモナス・グルメ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｇｌｕｍａｅ））
（６７）ｇｃｈ２＿ｓｔｒａｖ：ＴｒＥＭＢＬ：ＢＡＣ７１８３３（ストレプトミセス・アバーミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ））
（６８）ｇｃｈ２＿ｐｈｏｐｏ：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：ｇｃｈ２＿ｐｈｏｐｏ（フォトバクテリウム・ホスホレウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍ））
（６９）ｇｃｈ２＿ａｚｏｂｒ：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：ｇｃｈ２＿ａｚｏｂｒ（アゾスピリラム・ブラシレンセ（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ））
（７０）ｇｃｈ２＿ａｇｒｔｕ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８ＵＨＣ９（アグロバクテリム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（株Ｃ５８／ＡＴＣＣ３３９７０））
（７１）ｇｃｈ２＿ｒｈｉｍｅ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ９２ＲＨ２（リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）（シノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）））
（７２）ｇｃｈ２＿ｂｒｕｍｅ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８ＹＦＬ５（マルタ熱菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ））
（７３）ｇｃｈ２＿ｂｒｕｓｕ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８Ｇ２９８（ブタ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ））
（７４）ｇｃｈ２＿ｒｈｉｌｏ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ９８５Ｚ３（リゾビウム・ロッティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）（メソルヒゾビウム・ロッティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）））
（７５）ｇｃｈ２＿ｂｒａｊａ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８９ＲＺ７（ブラジリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ））
（７６）ｇｃｈ２＿ｎｉｔｅｕ：ＴｒＥＭＢＬ：ＣＡＤ８６４６８（ニトロソモナス・エウロパエア（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｒｏｐａｅａ）ＡＴＣＣ１９７１８）
（７７）ｇｃｈ２＿ｒａｌｓｏ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８Ｙ１Ｈ７（ラルストニア・ソラナセアラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）（シュードモナス・ソラナセアラム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）））
（７８）ｇｃｈ２＿ｎｅｉｍｅ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ９ＪＺ７７（髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（血清型Ｂ、見出された第２の酵素））
（７９）ｇｃｈ２＿ｘａｎａｘ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８ＰＰＤ７（キサントモナス・アキソノポディス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ）（ｐｖ．シライ（ｃｉｔｒｉ）））
（８０）ｇｃｈ２＿ｘａｎｃａ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８ＰＣＭ８（キサントモナス・キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）（ｐｖ．キャンペストリス（ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）））
（８１）ｇｃｈ２＿ｖｉｂｐａ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８７ＲＵ５（腸炎ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ））
（８２）ｇｃｈ２＿ｖｉｂｖｕ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８ＤＦ９８（ビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ））
（８３）ｇｃｈ２＿ｖｉｂｃｈ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ９ＫＰＵ３（コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ））
（８４）ｇｃｈ２＿ｖｉｂｆｉ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８Ｇ９Ｇ５（ビブリオ・フィシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ））
（８５）ｇｃｈ２＿ｓｈｅｏｎ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８ＥＢＰ２（シェワネラ・オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ））
（８６）ｇｃｈ２＿ｐｈｏｐｈ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８Ｇ９Ｈ７（フォトバクテリウム・ホスホレウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍ））
（８７）ｒｉｂｂ＿ｐｈｏｌｅ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ９３Ｅ９３（フォトバクテリウム・レイオグナティ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｉｏｇｎａｔｈｉ））
（８８）ｇｃｈ２＿ｐｓｅｐｕ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８８ＧＢ１（シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）（株ＫＴ２４４０、見出された第２の酵素））
（８９）ｇｃｈ２＿ｐｓｅｓｙ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８８２Ｇ０（シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）（ｐｖ．トマト、見出された第２の酵素））
（９０）ｇｃｈ２＿ｐｓｅａｅ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ９ＨＷＸ４（シュードモナス・エアルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））
（９１）ｒｉｂｂ＿ｄｅｈｍｕ：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：ｒｉｂｂ＿ｄｅｈｍｕ（デハロスピリラム・マルチボランス）
（９２）ｇｃｈ２＿ｘｙｌｆａ：ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ８７Ｄ６９（キシレラ・ファスチディオサ（Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ）（株テメキュラ１／ＡＴＣＣ７００９６４））
【０１０３】
【表４】
2008504833.tif 000005
2008504833.tif 000006
2008504833.tif 000007
2008504833.tif 000008
【０１０４】
表４に示される例は、原理の例示としての役割を果たす。対応する残基は、図１または表４に示される配列のいずれか１つに相同である他のすべてのＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩアミノ酸配列について、決定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴおよびＴｒＥＭＢＬのような標準的なデータベースを使用するプログラムＢＬＡＳＴＮによって見出される９２のＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ配列（カンジダ・ギリエルモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、アシブヤ・ゴッシピィ（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、アーケグロバス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）Ｊ９９、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）、クラミジア・ムリダルム（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｍｕｒｉｄａｒｕｍ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミジア・キャビエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｃａｖｉａｅ）ＧＰＩＣ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓｔａｔｉｖａ）、アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（血清型Ａ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（血清型Ｂ、２つのＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ酵素）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）（２つのＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ酵素）、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）（２つのＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ酵素）、アクチノバシラス・アクチノマイセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）（ヘモフィルス・アクチノマイセテムコミタンス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ））、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、パスツレラ菌（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｏ６、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、ブフネラ・アフィディコラ（Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ）（亜種エンドウヒゲナガアブラムシ（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ））（エンドウヒゲナガアブラムシ（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ）共生細菌）、ブフネラ・アフィディコラ（Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ）（亜種ムギミドリアブラムシ（Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ  ｇｒａｍｉｎｕｍ））、ウィグルスウォルシア・グロスインディア・ブレビパ��ピス（Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈｉａ  ｇｌｏｓｓｉｎｉｄｉａ  ｂｒｅｖｉｐａｌｐｉｓ）、ブフネラ・アフィディコラ（Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ）（亜種バイゾンギア・ピスタシエ（Ｂａｉｚｏｎｇｉａ  ｐｉｓｔａｃｉａｅ））、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、コリネ菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）（ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ））、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、アクチノバチルス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（ストレプトコッカス・ラクティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ））、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、フソバクテリウム・ナクレタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）ｓｐｅｃ、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ｓｐｅｃ、シネココッカス・エロンガータス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）（サーモシネココッカス・エロンガータス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ））、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、クロロビウム・テピダム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍ）、アクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ）、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、コクシエラ・バーネッティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、リゾビウム・エティリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、シュードモナス・グルメ（Ｐｓｅｕｄｏ��ｏｎａｓ  ｇｌｕｍａｅ）、ストレプトミセス・アバーミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、フォトバクテリウム・ホスホレウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍ）、アゾスピリラム・ブラシレンセ（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）（シノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ））、マルタ熱菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、ブタ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ）、リゾビウム・ロッティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）（メソルヒゾビウム・ロッティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ））、ニトロソモナス・エウロパエア（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｒｏｐａｅａ）、ラルストニア・ソラナセアラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）（シュードモナス・ソラナセアラム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ））、キサントモナス・アキソノポディス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ）、キサントモナス・キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、腸炎ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・フィシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、シェワネラ・オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）、フォトバクテリウム・ホスホレウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍ）、フォトバクテリウム・レイオグナティ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｉｏｇｎａｔｈｉ）、シュードモナス・エアルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、デハロスピリラム・マルチボランス、キシレラ・ファスチディオサ（Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ））のＧＣＧプログラムパッケージのプログラムＰＩＬＥＵＰによって算出された複数配列アラインメント。番号付けは、作製されたアラインメントに関する。アミノ酸配列のいくつかは、ちょうどアシブヤ・ゴッシピィ（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）Ｊ９９、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（血清型Ａ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（血清型Ｂ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）、アクチノバシラス・アクチノマイセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｔｉ��ｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）（ヘモフィルス・アクチノマイセテムコミタンス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ））、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、パスツレラ菌（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｏ６、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、ブフネラ・アフィディコラ（Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ）（亜種エンドウヒゲナガアブラムシ（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ））（エンドウヒゲナガアブラムシ（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ）共生細菌）、ブフネラ・アフィディコラ（Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ）（亜種ムギミドリアブラムシ（Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ  ｇｒａｍｉｎｕｍ））、ウィグルスウォルシア・グロスインディア・ブレビパルピス（Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈｉａ  ｇｌｏｓｓｉｎｉｄｉａ  ｂｒｅｖｉｐａｌｐｉｓ）、ブフネラ・アフィディコラ（Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ）（亜種バイゾンギア・ピスタシエ（Ｂａｉｚｏｎｇｉａ  ｐｉｓｔａｃｉａｅ））、シュードモナス・グルメ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｇｌｕｍａｅ）、ストレプトミセス・アバーミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、またはフォトバクテリウム・ホスホレウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍ）由来の酵素のようなＧＴＰシクロヒドロラーゼＩＩ活性を有する酵素をコードする。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＲｉｂＡ酵素のような他の酵素は、さらに、ＤＨＢＰシンターゼ活性を有するドメインを含有する。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＲｉｂＡのアミノ酸配列に下線を付す。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＲｉｂＡの比活性（アミノ酸残基２６１、２７０、２７６、２７９、３０８、３４７）およびプロテアーゼ感受性（１９６）に対してポジティブな影響を有することが見出されているアミノ酸残基に相同／等価であり、以下の実施例の１つにおいて考察されている位置を太字で表す。それらの位置について使用される番号付けは、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）野生型アミノ酸配列に従って行われる。図は、使用した配列の名称、データベース受託番号、および括弧内の配列の供給源生物体で開始する。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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