(57)【要約】  本発明は、生物学的試料中のＧＰＩｂαの存在、濃度および結合活性を検出するための新規なアッセイ系を提供する。生物学的試料中のＧＰＩｂαの存在を測定する方法は、（ａ）ＧＰＩｂαを含む物質を用意すること；（ｂ）工程（ａ）由来の物質を、ＧＰＩｂαに結合する結合タンパク質と接触させること；（ｃ）ＧＰＩｂαに特異的な検出化合物を添加すること；（ｄ）工程（ｂ）由来の結合タンパク質に結合する複合体化化合物を添加すること；および（ｅ）工程（ｃ）由来の検出化合物を検出することを含み、ここで、正の検出シグナルは、生物学的試料中のＧＰＩｂαの存在を示す。
2008538610.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料中のＧＰＩｂαの存在を検出する方法であって、（ａ）ＧＰＩｂαを含む物質を用意すること；（ｂ）工程（ａ）由来の物質を、ＧＰＩｂαに結合する結合タンパク質と接触させること；（ｃ）ＧＰＩｂαに特異的な検出化合物を添加すること；（ｄ）工程（ｂ）由来の結合タンパク質に結合する複合体化化合物を添加すること；および（ｅ）工程（ｃ）由来の検出化合物を検出すること、ここで、正の検出シグナルは生物学的試料中のＧＰＩｂαの存在を示すものである、を含む方法。
【請求項２】
ＧＰＩｂαを含む生物学的試料が血漿である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
血漿が哺乳類由来である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
哺乳類がヒトである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ＧＰＩｂαを含む生物学的試料が細胞系由来の上清である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
細胞系がＣＨＯ細胞系である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
検出化合物が抗体を含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
検出化合物がＦａｂ断片を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
結合タンパク質が請求項７記載の抗体の結合部位とは異なる結合部位を有するタンパク質を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
結合タンパク質がフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）の断片である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
断片がｖＷＦのＡ１ドメインである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
結合タンパク質が完全ｖＷＦタンパク質である、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
結合タンパク質がビオチン化されている、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
ｖＷＦのＡ１ドメインがＨｉｓタグ付けされている、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
ｖＷＦがビオチン化されている、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
結合タンパク質に結合する複合体化化合物がストレプトアビジン被覆磁気ビーズである、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
結合タンパク質に結合する複合体化化合物が抗Ｈｉｓ被覆磁気ビーズである、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
ＧＰＩｂαに特異的な検出化合物が化学発光物質で標識されている、請求項７記載の方法。
【請求項１９】
ＧＰＩｂαに特異的なＦａｂ断片が化学発光物質で標識されている、請求項８記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｅ）における検出化合物の検出がさらに化学発光物質を露光すること、および化学発光物質の励起を測定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
生物学的試料中のＧＰＩｂαのタンパク質濃度の測定方法であって、（ａ）ＧＰＩｂαを含む物質を用意すること；（ｂ）工程（ａ）由来の物質を、ＧＰＩｂαに結合する結合タンパク質と接触させること；（ｃ）ＧＰＩｂαに特異的な検出化合物を添加すること；（ｄ）工程（ｂ）由来の結合タンパク質に結合する複合体化化合物を添加すること；および（ｅ）工程（ｃ）由来の検出化合物を検出すること、ここで、既知の標準曲線と比べた検出シグナルは、生物学的試料中のＧＰＩｂαのタンパク質濃度を示すものである、を含む方法。
【請求項２２】
検出化合物の検出がさらに化学発光物質を露光すること、および既知の標準曲線と比べた場合にＧＰＩｂαのタンパク質濃度を示す化学発光物質の励起を測定することを含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
生物学的試料中のＧＰＩｂαの結合活性の検出方法であって、（ａ）ＧＰＩｂαを含む物質を用意すること；（ｂ）工程（ａ）由来の物質を、ＧＰＩｂαに結合する結合タンパク質と接触させること；（ｃ）ＧＰＩｂαに特異的な検出化合物を添加すること；（ｄ）工程（ｂ）由来の結合タンパク質に結合する複合体化化合物を添加すること；（ｅ）工程（ｃ）由来の検出化合物を検出すること、ここで、既知の標準曲線と比べた検出シグナルは生物学的試料中のＧＰＩｂαのタンパク質濃度を示す；および（ｆ）ＧＰＩｂαの結合活性を計算すること、を含む方法。
【請求項２４】
（ｆ）の結合活性Ｘが（Ａ／Ｂ）×１００％［式中、Ａは、ｖＷＦの相互作用によりＧＰＩｂαについて測定されたタンパク質濃度であり、Ｂは、タンパク質Ａ  ＨＰＬＣまたはＦｃ捕捉イムノアッセイにより測定されたタンパク質濃度である］により計算される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
生物学的試料中のＧＰＩｂαのアイソフォームの結合活性を測定することによるＧＰＩｂαのアイソフォームの検出方法であって、（ａ）ＧＰＩｂαを含む物質およびＧＰＩｂα様物質を用意すること；（ｂ）工程（ａ）由来の物質を、ＧＰＩｂαに結合する結合タンパク質と接触させること；（ｃ）ＧＰＩｂαに特異的な検出化合物を添加すること；（ｄ）工程（ｂ）由来の結合タンパク質に結合する複合体化化合物を添加すること；（ｅ）工程（ｃ）由来の検出化合物を検出すること、ここで、既知の標準曲線と比べた検出シグナルは生物学的試料中のＧＰＩｂαのタンパク質濃度を示す；（ｆ）ＧＰＩｂαのアイソフォームの結合活性を計算すること；および（ｇ）アイソフォームの結合活性を既知のＧＰＩｂα対照の結合活性と比較すること、を含む方法。
【請求項２６】
（ｆ）の結合活性Ｘが（Ａ／Ｂ）×１００％［式中、Ａは、ｖＷＦの相互作用によりＧＰＩｂαについて測定されたタンパク質濃度であり、Ｂは、タンパク質Ａ  ＨＰＬＣまたはＦｃ捕捉イムノアッセイにより測定されたタンパク質濃度である］により計算される、請求項２５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００５年４月２２日に提出された米国仮出願第６０／６７３９２６号の優先権を主張するものであり、その仮出願は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる。
【０００２】
本発明は、特にタンパク質を測定するための生化学アッセイ系の分野に属する。さらに具体的には、本発明は、糖タンパク質Ｉｂα（ＧＰＩｂα）タンパク質の検出および定量に関する。
【背景技術】
【０００３】
血管のバイオロジーにおいて、血小板の機能は適切なホメオスタシスおよび止血の礎石である。血小板は血管の完全性の維持および傷害後の出血の制御により正常な血液循環の持続に寄与する（Ｒｕｇｇｅｒｉ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：５５９〜５６４（１９９７））。血小板血栓の形成は生存に必要な防御メカニズムであるが、特にアテローム性動脈硬化症の微小環境では心筋梗塞などの疾患の一因にもなるおそれがある（Ｆｕｓｔｅｒ、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２６：２４２〜２５０（１９９２））。さらに、先進国における罹患率および死亡率の主な原因の１つは、急性血栓性動脈閉塞である（Ｒｕｇｇｅｒｉ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：４５５９〜５６４（１９９７））。これは、血管傷害に対する血小板の反応メカニズムを解明すること、およびこの複雑な経路の構成要素を検出するための商業的な手段に焦点を当てた研究の関連性を強調している。
【０００４】
血小板反応についてのメカニズムに重要であるのは、その受容体複合体である糖タンパク質（ＧＰ）Ｉｂ／ＩＸ／Ｖである。この血小板受容体は、損傷した血管壁への架橋を形成するフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）に直接結合する（Ｍｉｕｒａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：７５３９〜７５４６（２０００））。この作用は、内皮下マトリックスと関連したｖＷＦにより誘発され、微小血管中の血流によりもたらされる剪断応力により調節される（Ｔｕｒｉｔｔｏ、Ｂｌｏｏｄ  ６５：８２３〜８２９（１９８５））。この事象の結果として、損傷した血管壁由来のコラーゲン受容体と血小板との間のさらなる相互作用が生じ、血小板活性化、血小板凝固、および内皮の傷害を封鎖し血液漏出を防止する止血血栓の形成が生じる（Ｇｉｒｍａ、Ｂｌｏｏｄ  ７０：６０５〜６１５（１９８７））。
【０００５】
ｖＷＦ−コラーゲンマトリックスに結合する血小板受容体であるＧＰＩｂ／ＩＸ／Ｖは、４つのサブユニット、すなわちＧＰＩｂα、ＧＰＩｂβ、ＧＰＩＸおよびＧＰＶから構成される（Ｍｏｄｄｅｒｍａｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：３６４〜３６９（１９９２））。機能性およびサイズに基づく、これらのサブユニットのうち最も重要なものは、１５０ｋＤａのＧＰＩｂα鎖である（Ｕｆｆ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３５６５７〜３５６６３（２００２））。ＧＰＩｂαはｖＷＦのＡ１ドメイン上の様々な部位に結合することにより、ｖＷＦへの初期接着に関与する。ＧＰＩｂαの突然変異は、出血性障害、ベルナールスーリエ症候群（ＢＳＳ）およびｖＷＦウィルブランド病（Ｐｔ−ｖＷＤ）をもたらし得る。ｖＷＦはＧＰＩｂαの主リガンドであるが、この糖タンパク質に結合する、トロンビン、キニノーゲン、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、Ｐ−セレクチンおよびＭａｃ−１を含む他のタンパク質が同定されている（Ｕｆｆ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３５６５７〜３５６６３（２００２））。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＧＰＩｂαの生物学的重要性は明らかであることから、ＧＰＩｂαを同定および定量するための簡便で確定的なバイオアッセイの必要性が明らかとなっている。ＧＰＩｂαを定量するための現在利用できるバイオアッセイは、時間がかかり、手間を要し、ある種のアイソフォームに限られ、運用が高価である。ｉｎ  ｖｉｖｏ法には、ラット尾静脈出血モデルおよびＦｏｌｔｓのイヌ動物モデルがあるが、リストセチン誘導性血小板凝固アッセイ（ＲＩＰＡ）は現在利用できるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを構成している（Ｆｏｌｔｓ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８３：ＩＶ３〜ＩＶ１４（１９９１）、Ｄｅｊａｎａ、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．４８：１０８〜１１１（１９８２）、Ｗｅｉｓｓ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５２：２７０８〜１６（１９７３））。これらのアッセイは高いバックグラウンドノイズ、限られた感度、高いコスト、集中的な作業の必要性を伴い、アッセイ間に有意なばらつきを与える。したがって、いくつかの種類の生物学的試料で広範囲のＧＰＩｂαレベルを正確かつ迅速に検出および定量可能なアッセイ系が必要とされている。さらに具体的には、実験室環境で、ならびに臨床および診断の領域で正確かつ効率的にＧＰＩｂαを測定可能な方法が必要とされている。簡便、正確および高度の再現性を有する、ＧＰＩｂαの生物学的活性を検出する新規方法が大いに望ましい。
【０００７】
本発明はこれらの必要性を満たし、関連する利点もまた提供する。本発明のさらなる目的および利点は、一部には以下の説明に示され得、一部にはその説明から明らかであり得、本発明の実施により確認されてもよい。本発明の目的および利点は、添付の特許請求の範囲で特に示される要素および組合せにより認識され達成されるであろう。
【０００８】
前記の一般的な説明および以下の詳細な説明は、共に例示および解説のためのものにすぎず、請求の範囲に記載された本発明を制限するものではないことを了解されたい。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の簡単な説明
血管のバイオロジーにおけるＧＰＩｂαの重要性は十分に認識されているが、それを検出するか、またはその生物学的活性を測定する、簡便で効率的な検査または診断アッセイはない。本明細書に記載される発明は、ＧＰＩｂαの生物学的活性を検出および定量するための効率的で、再現性のある、安価なアッセイ法の開発に関する。本発明は、臨床および実験室環境の両方に適用される。本発明は、ＧＰＩｂαの異なるアイソフォームの高感度で特異的な識別もまた可能にするため、品質管理の実施およびＧＰＩｂαの産生レベルのモニタリングに極めて有用でありうる。当該アッセイの感度および特異性には、ＧＰＩｂαの産生および精製プロセスに混入している可能性のあるアイソフォームの決定が非限定的に含まれ、活性なＧＰＩｂα−Ｆｃ融合タンパク質と非活性タンパク質との識別を可能にする。
【００１０】
本発明は、生物学的試料中のＧＰＩｂαの存在を測定するアッセイ法を対象とし、該方法は、（ａ）ＧＰＩｂαを含む物質を用意すること；（ｂ）工程（ａ）由来の物質を、ＧＰＩｂαに結合する結合タンパク質と接触させること；（ｃ）ＧＰＩｂαに特異的な検出化合物を添加すること；（ｄ）工程（ｂ）由来の結合タンパク質に結合する複合体化化合物を添加すること；および（ｅ）工程（ｃ）由来の検出化合物を検出することを含み、ここで、正の検出シグナルは、生物学的試料中のＧＰＩｂαの存在を示す。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、生物学的試料中のＧＰＩｂαのタンパク質濃度を検出するアッセイ法を対象とし、その方法は、（ａ）ＧＰＩｂαを含む物質を用意すること；（ｂ）工程（ａ）由来の物質を、ＧＰＩｂαに結合する結合タンパク質と接触させること；（ｃ）ＧＰＩｂαに特異的な検出化合物を添加すること；（ｄ）工程（ｂ）由来の結合タンパク質に結合する複合体化化合物を添加すること；および（ｅ）工程（ｃ）由来の検出化合物を検出することを含み、ここで、既知の標準曲線と比べた検出シグナルは、生物学的試料中のＧＰＩｂαのタンパク質濃度を示す。
【００１２】
なお別の実施形態では、本発明は、生物学的試料中のＧＰＩｂαの生物学的活性を検出するアッセイ法を対象とし、その方法は、（ａ）ＧＰＩｂαを含む物質を用意すること；（ｂ）工程（ａ）由来の物質を、ＧＰＩｂαに結合する結合タンパク質と接触させること；（ｃ）ＧＰＩｂαに特異的な検出化合物を添加すること；（ｄ）工程（ｂ）由来の結合タンパク質に結合する複合体化化合物を添加すること；（ｅ）工程（ｃ）由来の検出化合物を検出すること、ここで、既知の標準曲線と比べた検出シグナルは、生物学的試料中のＧＰＩｂαのタンパク質濃度を示す；および（ｆ）ＧＰＩｂαの結合活性を計算することを含む。
【００１３】
なお別の実施形態では、本発明は、生物学的試料中のＧＰＩｂαのアイソフォームの結合活性を測定することによりＧＰＩｂαのアイソフォームを検出するアッセイ法を対象とし、その方法は、（ａ）ＧＰＩｂαを含む物質およびＧＰＩｂα様物質を用意すること；（ｂ）工程（ａ）由来の物質を、ＧＰＩｂαに結合する結合タンパク質と接触させること；（ｃ）ＧＰＩｂαに特異的な検出化合物を添加すること；（ｄ）工程（ｂ）由来の結合タンパク質に結合する複合体化化合物を添加すること；（ｅ）工程（ｃ）由来の検出化合物を検出すること、ここで、既知の標準曲線に比べた検出シグナルは、生物学的試料中のＧＰＩｂαのタンパク質濃度を示す；（ｆ）ＧＰＩｂαのアイソフォームの結合活性を計算すること；および（ｇ）そのアイソフォームの結合活性を既知のＧＰＩｂα対照の結合活性と比較すること含む。
【００１４】
本明細書に組み込まれその一部を構成する添付の図面は、本明細書の説明と共に本発明の原理の説明に役立つものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
特に定義しない限り、本明細書に使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の技術者に通例理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものに類似しているか、またはそれと等価な方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料は下に記載する。本明細書に記載した全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、出典明示によりその全てが本明細書の一部となる。そのうえ、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定を意図しない。本発明のその他の特徴および利点は、詳細な説明、図面および特許請求の範囲から明白であろう。
【００１６】
略語および定義
以下の略語を本明細書に使用する。「ＡＴＣＣ」はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを意味し、「ｖＷＦ」はフォンウィルブランド因子を意味し、「ＧＰＩｂα」は糖タンパク質１ｂ−αを意味し、「ＣＨＯ」はチャイニーズハムスター卵巣を意味し、「ＮＩＨ  ３Ｔ３」はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ３Ｔ３を意味する。
【００１７】
本明細書に使用する用語「抗体」は、非限定的にポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、遺伝子操作した抗体、二重特異性抗体、抗体断片、および抗体の反応性部分を表す一本鎖を意味する。上に言及した抗体形態のそれぞれの製造法は、当技術分野において周知である。
【００１８】
本明細書に使用する用語「生物学的試料」は、非限定的に任意の細胞、原核生物もしくは真核生物、任意の組織もしくは器官、またはその組換え技法もしくは遺伝子操作の任意の産物を意味する。「生物学的試料」は、血漿試料、細胞培養上清、または精製プロセス由来の緩衝液であってもよい。血漿の場合、その起源は、サル、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、アレチネズミ、ブタ、イヌ、ウマおよびヒトを非限定的に含む任意の哺乳類であり得る。血漿は、可溶性タンパク質を含む全血の一部である。あるいはアッセイは、血漿を分離せずに全血で行うことができる。細胞培養上清は、ＧＰＩｂαを発現する任意の細胞培養系から単離することができる。細胞系は、いずれもＧＰＩｂαを発現するように操作されたＣＨＯ細胞系、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞系、またはＡＴＣＣから得られる任意の細胞系から選択することができる。
【００１９】
本明細書に使用する用語「アイソフォーム」は、非限定的に低分子量（ＬＭＷ）ＧＰＩｂα、高分子量（ＨＭＷ）ＧＰＩｂα（図１１参照）、その他の変異体形態（Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３）、および非限定的に完全硫酸化または部分硫酸化ＧＰＩｂαタンパク質を含む小分子のＧＰＩｂαを意味する（図１０参照）。
【００２０】
説明
本発明は、生物学的試料中のＧＰＩｂαまたはＧＰＩｂα様混入物の存在を特異的かつ高感度に検出および定量する方法である。一実施形態では、このアッセイは、（ａ）ＧＰＩｂαを含む物質を用意すること；（ｂ）工程（ａ）由来の物質を、ＧＰＩｂαに結合する結合タンパク質と接触させること；（ｃ）ＧＰＩｂαに特異的な検出化合物を添加すること；（ｄ）工程（ｂ）由来の結合タンパク質に結合する複合体化化合物を添加すること；および（ｅ）工程（ｃ）由来の検出化合物を検出することを含み、ここで、正の検出シグナルは、生物学的試料中のＧＰＩｂαの存在を示す。
【００２１】
一実施形態において、ＧＰＩｂαを含む生物学的物質は、血漿、細胞系由来の上清、または緩衝液であり得る。別の実施形態では、血漿はサル、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ウマまたはヒトから選択される哺乳類に由来し得る。上清は、ＣＨＯ細胞系、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞系、またはＡＴＣＣから得られる細胞に由来し得る。
【００２２】
なお別の実施形態では、ＧＰＩｂαに特異的な検出化合物は、抗体、またはより好ましくは抗体のＦａｂ断片である。別の実施形態では、ＧＰＩｂαに特異的な結合タンパク質は、前記抗体の活性結合部位とは異なる活性結合部位を有するタンパク質である。別の実施形態では、ＧＰＩｂαに特異的な結合タンパク質は、ｖＷＦのＡ１ドメインなどの、ｖＷＦの断片である。この断片は、ｖＷＦのＡ１ドメインの組換え形態であり得る。あるいは、ＧＰＩｂαに特異的な結合タンパク質は完全ｖＷＦタンパク質である。別の態様では、ＧＰＩｂαに特異的な結合タンパク質はビオチン化されているか、またはＨｉｓタグ付けされている。
【００２３】
なお別の実施形態では、工程（ｄ）の結合タンパク質に結合する複合体化化合物は、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズまたは抗Ｈｉｓ被覆磁気ビーズである。
【００２４】
別の実施形態は、化学発光物質を用いて標識されているＧＰＩｂαに特異的な検出化合物を対象とする。さらに具体的には、ＧＰＩｂαに特異的な抗体のＦａｂ断片は、化学発光物質を用いて標識される。
【００２５】
別の態様では、工程（ｅ）の結合タンパク質に結合する検出化合物の検出は、化学発光物質を露光すること、およびＧＰＩｂαの存在と相関する化学発光物質の励起を測定することを含む。
【００２６】
本発明のさらなる実施形態であるストレプトアビジン被覆磁気ビーズは、分析物または生物学的試料中のＧＰＩｂαに結合し得るビオチン化ｖＷＦと接触して配置される（図１）。化学発光物質を用いてタグ付けされ、ＧＰＩｂα上の別の抗原性部位に特異的な抗体をこのビオチン化ｖＷＦに２時間接触させる（図１）。この工程の後で、ビーズをビオチン化ｖＷＦに３０分間接触させる。最大で２工程だけであり、洗浄工程が必要ないことから、この手順はＥＬＩＳＡと区別される。接触部位はＧＰＩｂαとｖＷＦのＡ１ドメインとの間である（図２）。結合したＧＰＩｂαの検出は、（ストレプトアビジン被覆ビーズ、ビオチン化ｖＷＦ、ＧＰＩｂαおよびタグ付きＧＰＩｂα特異的化学発光抗体からなる）複合体全体を露光すること、ならびに検出器上に放出された光シグナルを測定することにより行われる（図１）。
【００２７】
本発明の別の実施形態では、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズは抗Ｈｉｓ被覆磁気ビーズに置き換えられる。これらのビーズは、生物学的試料中のＧＰＩｂαに結合し得るＨｉｓ標識Ａ１ドメインと接触して配置される。化学発光物質を用いてタグ付けされ、ＧＰＩｂα上の別の抗原性部位に特異的な抗体である。結合したＧＰＩｂαの検出は、（ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ、ビオチン化ｖＷＦ、ＧＰＩｂαおよびタグ付きＧＰＩｂα特異的化学発光抗体からなる）複合体全体を露光すること、ならびに検出器に発された光シグナルを測定することにより行われる（図１）。
【００２８】
本発明において、生物学的試料または分析物は、非限定的に血漿、細胞培養上清、または精製プロセス由来の緩衝液から選択され得る。血漿の場合は、その起源は、非限定的にサル、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ウマおよびヒトを含む任意の哺乳類に由来し得る。血漿は、可溶性タンパク質を含む全血の一部である。あるいは、アッセイは、血漿を分離していない全血で実施され得る。細胞培養上清は、ＧＰＩｂαを発現する任意の細胞培養系から単離され得る。細胞系は、いずれもＧＰＩｂαを発現するように操作されたＣＨＯ細胞系、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞系、またはＡＴＣＣから得られる任意の細胞系からなる群から選択され得る。ＧＰＩｂαを含む精製緩衝液は、ＴＲＩＳ、ＴＲＩＳ塩化ナトリウム、グリシン、グリシン−塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、ヒスチジン緩衝液、および塩化ナトリウムを有するヒスチジン緩衝液から選択され得、スクロースおよびＴｗｅｅｎ  ＥＤＴＡもまた分析物として使用され得る。
【００２９】
本発明の別の態様は、生物学的試料中のＧＰＩｂαのタンパク質濃度を測定する方法であり、その方法は、（ａ）ＧＰＩｂαを含む物質を用意すること；（ｂ）工程（ａ）由来の物質を、ＧＰＩｂαに結合する結合タンパク質と接触させること；（ｃ）ＧＰＩｂαに特異的な検出化合物を添加すること；（ｄ）工程（ｂ）由来の結合タンパク質に結合する複合体化化合物を添加すること；および（ｅ）工程（ｃ）由来の検出化合物を検出することを含み、ここで、既知の標準曲線と比べた検出シグナルは、生物学的試料中のＧＰＩｂαのタンパク質濃度を示す。
【００３０】
一実施形態において、ＧＰＩｂαを含む生物学的物質は、血漿、細胞系由来の上清、または緩衝液から選択され得る。別の態様では、血漿は、非限定的にサル、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ウマまたはヒトを含む哺乳類に由来し得る。上清は、ＣＨＯ細胞系、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞系、またはＡＴＣＣから得られる細胞系に由来し得る。
【００３１】
別の実施形態では、ＧＰＩｂαに特異的な検出化合物は、抗体であるか、または抗体のＦａｂ断片である。別の実施形態では、ＧＰＩｂαに特異的な結合タンパク質は、上記抗体の活性結合部位とは異なる活性結合部位を有するタンパク質である。別の実施形態では、ＧＰＩｂαに特異的な結合タンパク質は、ｖＷＦのＡ１ドメインなどのｖＷＦの断片である。この断片は、ｖＷＦのＡ１ドメインの組換え形態であり得る。あるいは、ＧＰＩｂαに特異的な結合タンパク質は、完全なｖＷＦタンパク質である。別の実施形態では、ＧＰＩｂαに特異的な結合タンパク質は、ビオチン化されているか、またはＨｉｓタグ付けされている。
【００３２】
別の態様では、工程（ｄ）の結合タンパク質に結合する複合体化化合物は、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズまたは抗Ｈｉｓ被覆磁気ビーズである。
【００３３】
別の実施形態では、ＧＰＩｂαに特異的な抗体は、化学発光物質を用いて標識されている。さらに具体的には、ＧＰＩｂαに特異的なＦａｂ断片は、化学発光物質を用いて標識されている。
【００３４】
本発明の別の実施形態では、ＧＰＩｂαのタンパク質濃度は、ｖＷＦ（図３）またはｖＷＦの組換えＡ１ドメイン（図４）のいずれかに結合した既知量のＧＰＩｂαを用いて標準曲線を作製すること、および未知の生物学的試料からの光学密度の読取り値を、既知の標準の読取り値と比較することにより決定される。ストレプトアビジン被覆磁気ビーズは、分析物中のＧＰＩｂαに結合し得るビオチン化ｖＷＦと接触して配置される。抗体は、化学発光物質を用いてタグ付けされ、ＧＰＩｂα上の別の抗原性部位に特異的である。結合したＧＰＩｂαの検出および定量は、複合体全体を露光すること、および検出器に発された光シグナルを測定することにより行われる。次に、測定値（光学密度）を既知の標準から生成した値と比較し、未知のＧＰＩｂαの濃度が外挿され得る（図３および図４）。
【００３５】
本発明の別の態様では、ビオチン化され、生物学的試料中のＧＰＩｂαと結合させるために使用されるｖＷＦは、Ｖ１、Ｖ２およびＶ３の３つの変異体形態の１つであり得る。これらの３つの変異体形態の全ては、野生型形態のｖＷＦを超えるさらなる結合活性を有し、結合活性はＶ３＞Ｖ２＞Ｖ１である（図５）。変異体形態のＡ１と結合する能力を試験した場合に同様の傾向が観察されるが、変異体と全結合活性との間の差は、ｖＷＦ全体を用いた場合よりも著しくない（図５）。
【００３６】
本発明の別の態様では、対照ＧＰＩｂαの低分子量（ＬＭＷ）および高分子量結合活性である（図６）。本発明のこの態様は、品質管理下でＧＰＩｂαを産生および精製する場合に特に興味深いプロセスである、ＧＰＩｂαと他の近縁アイソフォームとの識別を可能にする。図６は、野生型対照ＧＰＩｂαと比較した、ＧＰＩｂαの４つの異なる開裂されたＬＭＷアイソフォームの結合パーセント（Ｃｌｉｐ産物として表す）の差を示す。このアッセイにおける結合活性は４２．５％に減少し、Ｆｃ部分または結合タンパク質を有さない他のＬＭＷアイソフォームについては、シグナルがほぼ全く発生せず、これは、開裂された種とインタクトな分子とを識別可能であることを実証する。
【００３７】
図７Ａおよび７Ｂにおいて、ＧＰＩｂαの薬物原体（ＢＤＳ）を４℃で異なる時間保存した。時間が長くなるにつれ、高分子量（ＨＭＷ）の試料のパーセントが増加した。結合アッセイにおいて、４℃でより長い時間保存された試料は、減少した結合活性を示した。この逆相関により、本発明は、試料中のＧＰＩｂαの％ＨＭＷの凝集レベルをモニターするために使用可能となる（すなわち、高パーセントのＨＭＷを有する試料は、より低い結合活性を示した）。
【００３８】
本発明のなお別の態様では、硫酸化形態のＧＰＩｂαは示差的な結合活性を有し、完全に硫酸化されたＧＰＩｂαは非硫酸化ＧＰＩｂαよりも高い結合活性を有する（図８および図９）。
【００３９】
本発明の別の態様は、生物学的試料中のＧＰＩｂαの結合活性を計算する方法であり、その方法は、（ａ）ＧＰＩｂαを含む物質を用意すること；（ｂ）工程（ａ）由来の物質を、ＧＰＩｂαに結合する結合タンパク質と接触させること；（ｃ）ＧＰＩｂαに特異的な検出化合物を添加すること；（ｄ）工程（ｂ）由来の結合タンパク質に結合する複合体化化合物を添加すること；（ｅ）工程（ｃ）由来の検出化合物を検出すること、ここで、既知の標準曲線と比べた検出シグナルは、生物学的試料中のＧＰＩｂαのタンパク質濃度を示す；および（ｆ）ＧＰＩｂαの結合活性を計算することを含む。
【００４０】
一態様では、ＧＰＩｂαを含む生物学的物質は、血漿、細胞系由来の上清、または緩衝液から選択され得る。別の実施形態では、血漿は、サル、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ウマまたはヒトを非限定的に含む哺乳類に由来し得る。上清は、ＣＨＯ細胞系、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞系、またはＡＴＣＣから得られる細胞系に由来し得る。
【００４１】
別の実施形態では、ＧＰＩｂαに特異的な検出化合物は抗体であるか、または抗体のＦａｂ断片である。別の実施形態では、ＧＰＩｂαに特異的な結合タンパク質は、前記抗体の活性結合部位と異なる活性結合部位を有するタンパク質である。別の実施形態では、ＧＰＩｂαに特異的な結合タンパク質は、ｖＷＦのＡ１ドメインなどのｖＷＦの断片である。この断片は、ｖＷＦのＡ１ドメインの組換え形態であり得る。さらに好ましくは、ＧＰＩｂαに特異的な結合タンパク質は、完全なｖＷＦタンパク質である。別の実施形態では、ＧＰＩｂαに特異的な結合タンパク質は、ビオチン化されているか、またはＨｉｓタグ付けされている。
【００４２】
別の実施形態では、工程（ｄ）において結合タンパク質に結合する複合体化化合物は、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズまたは抗Ｈｉｓ被覆磁気ビーズである。
【００４３】
本発明のいくつかの態様では、ＧＰＩｂαに特異的な検出化合物は化学発光物質を用いて標識されている。さらに具体的には、ＧＰＩｂαに特異的なＦａｂ断片は、化学発光物質を用いて標識されている。別の実施形態では、工程（ｅ）において結合タンパク質に結合する検出化合物の検出は、化学発光物質を露光すること、およびその化学発光物質の励起を測定することをさらに含み、その測定結果は、既知の標準曲線に比べた場合にＧＰＩｂαのタンパク質濃度を示す。別の実施形態では、工程（ｆ）の結合活性Ｘは、（Ａ／Ｂ）×１００％［式中、ＡはｖＷＦの相互作用によりＧＰＩｂαについて測定されたタンパク質濃度であり、Ｂは、限定されないがプロテインＡ  ＨＰＬＣまたはＦｃ捕捉イムノアッセイにより測定されたタンパク質濃度である］により計算される。
【００４４】
本発明のなお別の態様では、ＧＰＩｂαの結合活性は、最初にＧＰＩｂαの濃度を計算すること、次に、式Ａ／Ｂ×１００％［式中、ＡはｖＷＦの相互作用によりＧＰＩｂαについて測定されるタンパク質濃度であり、Ｂは、非限定的にプロテインＡ  ＨＰＬＣまたはＦｃ捕捉イムノアッセイにより被験参照について測定されたタンパク質濃度である］を適用することにより測定される。
【００４５】
当技術分野の現状に勝るこれらの利益は意義深い。利用できるＧＰＩｂα検出アッセイには、ｉｎ  ｖｉｖｏプロトコルとｉｎ  ｖｉｔｒｏプロトコルとの両方がある。ＧＰＩｂα−Ｆｃタンパク質活性を測定するために以前に報告された一方法は、実施例４に記載したラット尾静脈出血モデルである。ＧＰＩｂαはホメオスタシス、具体的には凝固／出血カスケードに不可欠であることから、ｉｎ  ｖｉｖｏ出血時間を測定することは、ＧＰＩｂα活性を測定する間接的な方法である。この動物モデルを使用する不利益は、その間接性、時間を要すること、手間がかかること、コストを要すること、および％偏差が大きいこと（少なくとも３０％範囲）である。
【００４６】
以前に報告された別の方法は、Ｆｏｌｔｓのイヌ動物モデルである。実施例５に記載するこの方法は、ＧＰＩｂαの機能が極めて重大と考えられる不安定狭心症を研究するために特異的である。この方法は、ＧＰＩｂαの機能を直接測定することができるが、時間、手間、コストおよび正確さの問題を含む同様の不利益もまたこの方法に伴う。
【００４７】
ＧＰＩｂα結合活性を検出するために使用される別の方法は、表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）アッセイである。この方法は、２つのタンパク質の間の結合事象を測定することができる。しかし、この方法は非常に時間がかかり、低い感度を伴う。ＳＰＲアッセイは、典型的には対数の差１をバックグラウンドノイズとみなす。
【００４８】
従来のＥＬＩＳＡもまた、ＧＰＩｂαを検出するための可能性のあるアッセイとして試験された。ＥＬＩＳＡは作業を最小限にしたが、特に捕捉抗原がｖＷＦである場合に、その結果は、非常に非特異的で多様であった。
【００４９】
本発明の重要な態様は、多量体形式のｖＷＦの「接着性」が認識されているために、生理的に適切な試薬として多量体形式のｖＷＦをｉｎ  ｖｉｔｒｏの状況で使用するという難題を克服することであった。発明の工程は、動員された条件よりも天然のコンフォメーションで、ｖＷＦをＧＰＩｂαに結合させる同種結合反応を開発することであった。捕捉ビーズは反応の最後の３０分にだけ添加され、次に混合物全体が最終インキュベーションの直後に読取り機で読み取られた。この計画で、ｖＷＦはその他の非特異的分子にも表面にも結合する機会をほとんど有さなかった。これは、特異的かつ効率的にＧＰＩｂαの活性を測定可能な唯一のｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合活性アッセイである。さらに、凝集を始める必要性の代わりに、硫酸化アッセイ、このアッセイを使用して、発現したＧＰＩｂα−Ｆｃ融合タンパク質を、迅速かつ精密にモニターすることができる。このアッセイは阻害剤からの影響に非常に敏感であることから、さらなる利点は、ＧＰＩｂαに標的付けられた小分子についてスクリーニングするための本発明の使用である。
【００５０】
本発明の新規なアッセイ法は、現存するＧＰＩｂα検出系に比べていくつかの利点を有する：（１）本明細書に記載する本発明は、ＧＰＩｂαを測定する１工程または２工程直接アッセイを利用し、ＧＰＩｂα活性を決定するために１工程しか必要としない。（２）このアッセイは、非特異的結合形成の代わりに、捕捉プロセスに特異的で確定した化学結合形成を利用する。（３）検出部位は、電気化学発光（ＥＣＬ）技法を使用した安定な部位である。（４）検出基質は再循環され、読取りシグナルを有意に増幅させる。（５）このアッセイは洗浄工程を欠くため、高いアッセイ処理量を有する。（６）このアッセイは、高い特異性の試薬を利用するため、最小のマトリックス干渉を有する。（７）このアッセイは増大した特異性の試薬を利用するため、高い感度を有する。（８）本発明の新規なアッセイ系は、ＧＰＩｂαについてのその他の現存する検出アッセイよりも２〜５倍大きいシグナル対バックグラウンド比をもたらす。（９）本発明の新規なアッセイ系は、２対数にわたる有意な直線性尺度をもたらす。全般的に、提案される本発明は、当技術分野で利用できる任意の検出法に比べて、速く、安価で、再現性があり（図１２参照）、特異性が高く（図１３Ａおよび１３Ｂ）、高感度で、活性ＧＰＩｂα−Ｆｃ融合タンパク質を非活性形態と識別することができる（図５および６）。
【実施例】
【００５１】
以下の実施例は、本発明の理解を助けるために示されるものであり、もちろん本明細書に記載および請求された本発明を具体的に限定するものとして解釈されるものではない。現在公知であるか後に開発される、当業者の範囲内であろう全ての等価物の代用を含めた、本発明のそのような変形形態、および処方の変更または実験計画の変更は、本明細書に含まれる本発明の範囲内に入るとみなすべきである。
【００５２】
実施例１：標準曲線の作成
標準曲線緩衝液は、緩衝液（ＰＢＳ  ｗ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０および０．５％  ＢＳＡ）３０ｍｌにＲ５ＣＤ１培地１５μｌを添加することにより作成する。この緩衝液は、９０枚の（９６ウェルプレートに基づく）アッセイプレートに十分である。標準溶液を調製するために、標準曲線緩衝液２０ｍｌに標準原液４μｌを添加する。これは、濃度０．２μｇ／ｍｌの標準溶液をもたらす。調製した標準溶液２ｍｌを採取し、標準曲線緩衝液１ｍｌを添加することにより連続希釈液を調製する。これは、８枚のアッセイプレートに十分である。９６ウェルプレートに５０μｌ／ウェルを分配する。各プレートをプレートリーダーで処理し、既知の標準溶液の濃度に対して光学密度（透過）をプロットすることにより標準曲線を作成する。
【００５３】
実施例２：対照の調製
濃度０．０８μｇ／ｍｌを有する対照試料は、培地１０５μｌにＧＰＩｂα参照標準溶液２０μｌを添加することにより得る。次に、上記対照５μｌを採取し、それを緩衝液１０ｍｌに添加することにより１：２０００希釈液を作製する。これは、１８枚の（９６ウェルプレートに基づく）アッセイプレートに十分である。９６ウェルプレートに５０μｌ／ウェルを分配する。
【００５４】
実施例３：ＧＰＩｂα−ｖＷＦ結合アッセイプロトコル
以下のプロトコルは、生物学的試料からＧＰＩｂαレベルを検出および定量する方法を概略する。このプロトコルは、ＧＰＩｂαの存在を検出し、ＧＰＩｂαのタンパク質濃度および結合活性を測定するプロセスに使用する試薬、方法、機器およびソフトウェアを含む。
【００５５】
９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ／Ｃｏｓｔａｒ、ウィルクスバリ、ペンシルベニア州）にＧＰＩｂα標準溶液（濃度１ｍｇ／ｍｌ；社内で作った組換えタンパク質）を５０μｌ／ウェルの容量で分配する。次に、上記のように対照を調製し、５０μｌ／ウェルで分配する。試料の調製のために、各試料から少なくとも５μｌを採取し、終容量約１ｍｌ（少なくとも５００μｌを作製）の緩衝液中にその試料を０．０８および０．０４μｇ／ｍｌに希釈し、５０μｌ／ウェルで分配する。ビオチン−ｖＷＦを調製するために、アッセイプレート１枚あたり緩衝液６ｍｌあたりビオチン−ｖＷＦ原液（濃度１．３１ｍｇ／ｍｌ、社内での結合体。ｖＷＦ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、グレニッチ、コネチカット州。ビオチン：Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）２μｌを採取する。ストレプトアビジンビーズを調製するために、アッセイプレート１枚あたり６ｍｌにビーズ原液（濃度１０ｍｇ／ｍｌ、ＩＧＥＮ（Ｂｉｏｖｅｒｉｓ、ゲーサーズバーグ、メリーランド州）またはＤｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（レークサクセス、ニューヨーク州）から入手）１９２μｌを添加し、５０μｌ／ウェルで分配する。
【００５６】
全ての標準溶液および対照はＲ５ＣＤ１培地に希釈するものとする。以下の方法により、プレートに試薬および試料を分配する。標準溶液（０．２μｇ／ｍｌから０．００５μｇ／ｍｌ）、対照または試料５０μｌを添加し、終濃度０．４μｇ／ｍｌで抗Ｆｃ  ＯＲＩ−ＴＡＧ  Ａｂ  ５０μｌを添加する（抗Ｆｃ  ＯＲＩ−ＴＡＧ抗体、原液濃度１．０７ｍｇ／ｍｌ、元々の材料：Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（ウェストグローブ、ペンシルベニア州）の「ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的」）。タグ付き抗体の後にｂ−ｖＷＦ（終濃度０．１μｇ／ｍｌ）５０μｌおよびｂ−ｖＷＦ（終濃度０．１μｇ／ｍｌ）５０μｌを添加する。室温で２時間インキュベートし、混合する。インキュベーション後に、ストレプトアビジン結合ビーズ（終濃度１６μｇビーズ／ウェル）５０μｌを添加し、混合しながら室温で３０分間インキュベートする。Ｍ８またはＭ３８４分析装置でマイクロタイタープレートを読み取る。
【００５７】
Ｍ８またはＭ３８４分析装置を使用するためには、最初にその分析装置を較正する必要がある。これを達成するために、「水制御」９６ウェルプレートで実施する。全てのウェルにＲＯＤｉ水２５０μＬを添加することにより９６ウェルマイクロプレートを調製する。分析装置にプレートを置き、プレート読み取りを開始する。全てのウェルの結果は同様であるべきである。次に、陽性標準物質２５０ｕＬをカラム１、２、３、７、８および１２のウェルに添加することによって９６ウェルマイクロプレートを調製する。陰性標準物質２５０ｕＬをカラム４、５、６、９、１０および１１のウェルに添加する。分析装置にプレートを置き、プレート読み取りを開始する。情報が正確な場合にはプレートの読み取りを継続する。陽性標準物質の全ＣＶが７％未満で、値が８００００カウント±１０％である場合には、品質管理（ＱＣ）は許容されるものである。右側のウインドウに警告が示されてはならない。ＱＣがこれらのガイドラインから外れる場合には、トラブルシューティングの示唆を求めてユーザマニュアルを見直す。機械が適切に較正されたならば、処理する試料を有するプレートをスタッカーに配置し、実施すべきプロトコルを選択し、プレート読み取り機を始動させる。全てのデータを保存する。
【００５８】
収集したデータを解析するために、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌのファイルを開き、Ｓｏｆｔｍａｘ−Ｐｒｏにデータをダウンロードする。下記プレートマップに準じたテンプレートの設定を使用してデータを解析する。以下は、アッセイのための方眼地図を表す。標準（ｓｔｄ）、対照および試料（Ｓ）が含まれる。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
標準の許容ガイドラインは以下の通りである：８つの標準のうち少なくとも６つで反復する標準点間の読取り値のＣＶは≦２０％でなければならない。対照の許容ガイドラインは、対照の回復が８０から１２０％の範囲内の必要があることが要求される。試料の許容ガイドラインでは、反復する試料間の読取り値のＣＶが≦２０％であるべきことが要求される。範囲内の読取り値だけが考慮されるであろう。
【００６１】
実施例４：ラット尾静脈出血
以下の実施例は、ＧＰＩｂαの有効性と、観察されたｉｎ  ｖｉｔｒｏデータがｉｎ  ｖｉｖｏ試験と相関するかどうかとを決定するためのｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを表す。雄Ｗｉｓｔｅｒラット３５匹（１〜２月齢、２００〜２３０グラム；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．、ウィルミントン、マサチューセッツ州）を各群動物７匹の５群に分ける。この５群のラットに下記表１に記載の異なる投与計画を実施する。
【００６２】
【表２】
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【００６３】
各ラットをラットホルダー中に固定し、滅菌したカミソリの刃を用いて、ラットの後端基部から１．５インチの尾に皮下切開を行う。同時に、等用量（重量に基づき容量を変える）を切開部位付近に静脈内注射する。次の１５分間にわたり、出血時間および結合パーセントを記録する。各群についてのデータを平均し、平均±標準偏差（ＳＤ）としてプロットする。図８に見ることができるように、ｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルの出血時間はｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイの結果と相関する。図８では、未処置、ＬＶＷ、負荷、完全硫酸化、および０硫酸化は、それぞれＧＰＩｂαの低分子量アイソフォーム、ＡＥＸ（陰イオン交換）カラムに使用した出発材料、６つの硫酸化部位が占有されたもの、および硫酸化部位が全く占有されていないものを表す。図８は、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイとラット尾出血動物モデルとの間の相関を実証している。
【００６４】
実施例５：Ｆｏｌｔｓのイヌ動物モデル
以下の実施例は、不安定狭心症の外観を研究するためのモデルとして広く受け入れられているＦｏｌｔｓのイヌモデルを表す。これは、不安定狭心症の臨床的状況での抗血小板剤および抗血栓剤の成功を相当に予測するものである。このモデルには、開胸準備があり、左冠状動脈回旋枝の隔離を伴う。リアルタイムで冠状動脈血流をモニターするために、超音波フロープローブを動脈に配置する。重傷の狭窄および血管傷害の二重侵襲により、血小板の蓄積および血栓の形成を開始させる。血流ゼロに示されるように、動脈が完全に閉塞した場合には、閉塞している血栓を振動させることにより、血小板血栓を機械的に破壊する。冠状動脈血流における周期的な流動減少（ＣＦＲ）により、反復する血栓形成をモニターする。一貫したＣＦＲを５回観察したら、ＧＰＩｂαおよび比較のための他の薬剤を治療的に投与する。この反応を０〜４の尺度で評点付けする（図９）。図９では、未処置、単量体、ＬＭＷ、負荷、完全硫酸化および０硫酸化は、それぞれ無処理、非開裂ＧＰＩｂα、ＧＰＩｂαの低分子量アイソフォーム、ＡＥＸ（陰イオン交換）カラムで使用した出発物質、６つの硫酸化部位が占有されたもの、および硫酸化部位が全く占有されていないものを表す。図８と同様に、図９は本発明と、利用できるｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ系との間の有意な相関を実証している。
【００６５】
本明細書に引用した刊行物、特許、特許出願を含め全ての参考文献は、出典明示によりその全てが本明細書の一部となる。出典明示により本明細書の一部となる刊行物および特許または特許出願が本明細書の開示内容と矛盾する限りにおいて、本明細書は、そのような任意の矛盾する材料に優先し、および／またはそれに先行することが意図される。
【００６６】
本明細書および特許請求の範囲に使用される成分の量、反応条件などを示す全ての数字は、全ての場合において、用語「約」により修飾されていると理解すべきである。したがって、反対の指示がない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に示される数値パラメータは、本発明により獲得が探求された所望の性質に応じて変動し得る近似値である。最低限でも、そして特許請求の範囲に対する均等物の原理の適用を制限するものではないが、各数値パラメータは、有効数字の数および通常の丸めのアプローチに照らして解釈すべきである。
【００６７】
当業者には明らかであるが、本発明の多数の修飾形態および変形形態がその精神および範囲から逸脱することなく作成され得る。本明細書に記載する特定の実施形態は、単なる例として提供され、限定を意味するものでは決してしない。明細書および実施例は単なる例示とみなされ、本発明の真の範囲および精神は、添付した特許請求の範囲により示されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】ＧＰＩｂα結合アッセイ形式の略図である。ビオチンｖＷＦ、ＧＰＩｂα−Ｆｃ融合タンパク質、およびＢＶタグ付き抗ヒトＦｃ抗体を最初に混合し、室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後に、ストレプトアビジン（ＳＡ）ビーズをこの混合物に添加し、さらに３０分間インキュベートした。
【図２】ｖＷＦ上のＧＰＩｂα結合領域の略図である。
【図３】ＧＰＩｂα−ｖＷＦ結合アッセイについての標準曲線を示すグラフである。このアッセイについてのバックグラウンドに対するシグナル（Ｓ／Ｂ）の比は１０に近いが、ＥＬＩＳＡ  ＧＰＩｂα結合アッセイのＳ／Ｂは最大で２であり、１ｌｏｇの直線性を有する。
【図４】ＧＰＩｂα−Ａ１結合アッセイについての標準曲線を示すグラフである。
【図５】産生物変異体の結合活性を示すグラフである。ＷＴは野生型ＧＰＩｂαに対応する。Ｖ１、Ｖ２およびＶ３はＧＰＩｂαの機能獲得型変異体である。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験結果によると、機能獲得型変異体はＧＰＩｂと結合する能力の増大を有した。ｖＷＦ結合アッセイでは、Ｖ３、Ｖ２、Ｖ１およびＷＴの間の差は容易に観察することができるが、Ａ１結合アッセイでは変異体間の差は非常に限定的であった。
【図６】ｖＷＦ結合アッセイに関する４つの異なる低分子量（ＬＭＷ）アイソフォームの結合活性を示すグラフである。対照は未開裂のＧＰＩｂα分子である。Ｃｌｉｐ、Ｃｌｉｐ１−２７６、Ｃｌｉｐ１−２８２、およびＣｌｉｐ  Ｆｃは、ＧＰＩｂαの異なる開裂アイソフォームを表す。
【図７Ａ】ＧＰＩｂα試料の安定性試験を示すグラフである。ＧＰＩｂαの薬物原体（ＢＤＳ）を４℃で保存し、高分子量（ＨＭＷ）のパーセントを時間の関数としてモニターした。
【図７Ｂ】ＧＰＩｂα試料の安定性検査を示すグラフである。ＧＰＩｂαの薬物原体（ＢＤＳ）を４℃で保存し、結合活性のパーセントを時間の関数としてモニターした。
【図８】ラット尾静脈反応時間アッセイからのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏデータの比較を示すグラフである。試験試料には、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験用の未処置動物対照；ＬＭＷ、ＧＰＩｂαの低分子量（典型的なｃｌｉｐ）；負荷、陰イオン交換（ＡＥＸ）カラム分離前の対照試料；完全硫酸化、全ての硫酸化部位が硫酸化されているＧＰＩｂα；および０硫酸化、硫酸化部位が全く硫酸化されていないＧＰＩｂαが含まれる。
【図９】ｆｏｌｔｓのイヌ動物モデルからのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏデータの比較を示すグラフである。試験試料には、ｉｎ  ｖｉｖｏ検査用の未処置動物対照；単量体、開裂していない無傷のＧＰＩｂα；ＬＭＷ１およびＬＭＷ２、ＡＥＸカラム分離からのＧＰＩｂαの低分子量画分；完全硫酸化、全ての硫酸化部位が硫酸化されているＧＰＩｂα；および０硫酸化、硫酸化部位が全く硫酸化されていないＧＰＩｂαが含まれる。
【図１０】ＡＥＸ−ＨＰＬＣで分離された硫酸化アイソフォームを示すグラフである。
【図１１】ＳＥＣ−ＨＰＬＣでサイズにより分離されたＧＰＩｂαのアイソフォームを示すグラフである。
【図１２】ＧＰＩｂαアッセイの再現性および計算された分散パーセントを示すグラフである。
【図１３Ａ】対照に対するＧＰＩｂαアッセイの結合特異性を示すグラフである（Ｆｃ部分１）。
【図１３Ｂ】対照に対するＧＰＩｂαアッセイの結合特異性を示すグラフである（Ｆｃ部分２およびＦｃ部分３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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