(57)【要約】  生体粒子を含有する水性懸濁液からの、生体粒子の吸着に基づく分離方法であって、その方法が、ａ）該水性懸濁液を、その表面上に分離される生体粒子の表面上の受容体と特異的又は非特異的に相互作用可能なリガンドを保有するマクロ多孔性のクリオゲルモノリスと接触させ、該生体粒子を該マクロ多孔性のクリオゲルモノリスに吸着させること；及びｂ）溶出によって該マクロ多孔性のクリオゲルモノリスから該生体粒子を遊離させ、ここで該マクロ多孔性のクリオゲルモノリスが溶出媒体への暴露と連動して物理的変形に供されること、を含む方法が開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体粒子を含む水性懸濁液からの、そのような生体粒子の吸着に基づく分離方法であって、その方法が、
ａ）該水性懸濁液を、分離される生体粒子の表面上の受容体と特異的又は非特異的に相互作用可能なリガンドをその表面上に保有するマクロ多孔性のクリオゲルモノリスと接触させ、該生体粒子を該マクロ多孔性のクリオゲルモノリスに吸着させること；及び
ｂ）溶出によって該マクロ多孔性のクリオゲルモノリスから該生体粒子を遊離させ、ここで該マクロ多孔性のクリオゲルモノリスが溶出媒体への暴露と連動して物理的変形に供されること、
を含む方法。
【請求項２】
該物理的変形が、該溶出の間にマクロ多孔性のクリオゲルを圧縮することによってもたらされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該マクロ多孔性のクリオゲルモノリスが、その表面上にリガンドを保有するポリアクリルアミドクリオゲルモノリスである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
該リガンドが、イオン交換基、固定化金属親和性リガンド、タンパク質リガンド、免疫グロブリン結合タンパク質、合成リガンド又は修飾ペプチド若しくはタンパク質リガンド、核酸等からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該水性懸濁液から分離される生体粒子が、哺乳類細胞、細菌、細胞小器官、ウイルス、封入体、ラテックス粒子、エアロゾル、有機若しくは無機組成物又は二者の複合物の粒子からなる群より選択され、その寸法がナノからマイクロメートルの範囲内である、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項６】
マクロ多孔性のクリオゲルモノリスが、溶出媒体の存在下において、その最初の容積の２５〜３０％より小さい容積、好ましくはその最初の容積の２０％より小さい容積、最も好ましくはその最初の容積の１％より小さい容積に圧縮される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体粒子を含む水性懸濁液からの、そのような生体粒子の吸着に基づく分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生態のいたるところで生じている生体粒子（細菌、細胞小器官、細胞、ウイルス）間の相互作用及び親和性に基づく分離における細胞の表面への吸着は、多価の性質を有する。多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）又は多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）相互作用は、生体粒子の表面上の複数の受容体の、別の表面上の複数のリガンドへの同時の結合によって特徴付けられ、対応する一価の相互作用よりも集合的にずっと強くあり得る。
【０００３】
多価の相互作用を破壊する困難性は、細胞分離の親和性技術を設計することにおける主要な問題の一つである。理論的な研究は、相互作用の数が＞１０である状況では、合理的な濃度の可溶性の一価の競合剤（生体特異的な溶出剤）が、結合の平衡状態を移動させ得る見込みはないことを示してきた。典型的なクロマトグラフィーの条件（ｃｍ２あたり１０１０〜１０１２のリガンド及び受容体、並びに１０−１０〜１０−８ｃｍ２の接触領域）下では、特異的結合相互作用の数は、１〜１０，０００の間であり得る。したがって、ほとんどの場合、複数の結合を同時に破壊し、特異的に吸着した細胞を脱着させるためには、外部の力が必要である。親和性表面上での細胞の保持は、協同効果をもたらす一方で、個別の受容体−リガンド結合の親和性及び表面リガンドの濃度と相関し、付着した細胞を除去するために必要な力を減少させる競合的結合阻害剤の存在に感受性である。細胞放出のために現在用いられるアプローチにおいて、脱着力は気液界面の通過によって発生される（X. Cao, R. Eisenthal, J. Hubble, 親和性吸着細胞の脱着戦略, Enzyme. Microbial. Technol. 31 (2002) 153-160; C. Gomez- Suarez, H. J. Busscher, H. C. Van der Mei, 気液界面の通過による基層表面からの細菌脱着の解析, Appl . Environ. Microbiol. 67 (2001) 2531-2537）か、又は流動誘導性せん断力を用いることによって発生される（F. Ming, W. J. D. Whish, J. Hubble, 細胞−表面相互作用のためのパラメータの推定：最大の結合力及び脱着定数, Enzym. Microb. Technol. 22 (1998) 94-99; C. Cozens-Roberts, J. A. Quinn, D. A. Lauffenburger, 受容体媒介性細胞付着及び脱着キネティクス．ＩＩ．放射状流脱着アッセイでの実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｌ）モデル研究, Biophys. J. 58 (1990) 857-872）。後者は、溶出細胞の高度の希釈をもたらし、細胞障害のリスクを含む。
【０００４】
細胞表面の高い不均一性のため、親和性相互作用とともに細胞表面界面での細胞行動を制御し、細胞分離のための親和性吸着剤を設計する場合に考慮しなくてはならない他の因子（例、疎水性及び静電気的相互作用、ファンデルワールス引力）が存在し得る。最近まで、細胞接着の研究は、ポリスチレン、テフロン（登録商標）及びガラスのような堅い支持体への微生物の接着性という、表面化学及び局所分布への細胞応答に主に集中していた。生物学的な系において、細胞はしばしば柔らかい表面（例、弾性の変化を経得る組織又は細胞外基質（例、創傷治癒））と接触する。しかし、最近になってやっと、細胞接着に対する基質力学の影響の体系的な研究が行われ、表面の柔軟性及び弾性が、細胞−表面相互作用を調整する重要なパラメータであることが示された（M. T. Madigan, J. M. Martinko, J. Parker, Brock Biology of Microorganisms. 9-th ed. Upper Saddle River, NJ, USA: Prentice-Hall, Inc., 2000; R. J. Pelham, Y. L. Wang, 細胞遊走及び接着点は、基質可動性によって調節される, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 13661-13665; J. Y. Wong, J. B. Leach, X. Q. Brown,細胞−生体材料界面における化学、局所分布、及び力学のバランス：細胞応答に対する基質力学の役割を評価するための課題及び挑戦, Surf. Sci. 570 (2004) 119-133.）。例えば、異なる型の細胞と、ポリアクリルアミド及びアルギン酸ベースの表面の弾性との関係の調査は、基質剛性の低下に続く細胞行動におけるいくつかの共通の変化（すなわち、細胞伸展の減少及び細胞表面相互作用の減退）を明らかにした（R. J. Pelham, Y. L. Wang, 細胞遊走及び接着点は、基質可動性によって調節される, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 13661-13665; A. Engler, L. Bacakova, C. Newman, A. Hategan, M. Griffin, D. Discher, ゲル応答に対する細胞における基質コンプライアンス対リガンド密度, Biophys. J. 86 (2004) 617-628; N. G. Genes, J. A. Rowley, D. J. Mooney, L. J. Bonassar. 改良アルギン酸表面への軟骨細胞接着に対する基質力学の影響, Arch. Biochem. Biophys. 422 (2004) 161-167）。興味深いことに、これらの傾向は、接着性のリガンドとは独立している。吸着剤の力学に対する、細胞行動のそのような依存性の重要な意味は、細胞親和性分離における軟質材料の使用が、非特異的細胞−表面相互作用を回避する又は低下させる助けとなり得ることである。
【０００５】
ポリアクリルアミドベースのクリオゲルモノリスが最近、生体分離における適用のために開発されており（V. I. Lozinsky, F. M. Plieva, I.Yu. Galaev, B. Mattiasson, 生体分離における重合体クリオゲルの潜在能力, Bioseparation 10 (2002) 163-188. I. Yu. Galaev, M. B. Dainiak, F. M. Plieva, R. Hatti-Kaul, B. Mattiasson, マイクロタイター（マルチウェル）プレート形式で超マクロ多孔性弾性モノリスを用いる微粒子含有サンプルのハイスループットスクリーニング, J. Chromatogr. A 1065 (2005) 169-175）、高い多孔率及び弾性によって特徴付けられている。孔のサイズ（１０〜１００μｍ）及び相互接続した構造並びに吸着剤との非特異的相互作用の欠如によって、細胞は親和性リガンドをもたない素のクリオゲルを自由に通過する（P. Arvidsson, F. M. Plieva, I. N. Savina, V. I. Lozinsky, S. Fexby, L. Bulow, I. Yu. Galaev, B. Mattiasson, 連続して超マクロ多孔性親和性カラム及びイオン交換カラムを用いた微生物細胞のクロマトグラフィ, J. Chromatogr. A 977 (2002) 27-38; A. Kumar, F. M. Plieva, I. Yu. Galaev, B. Mattiasson, 超マクロ多孔性モノリスクリオゲルを用いたリンパ球の親和性分取, J. Immunol. Methods 283 (2003) 185- 194）。どちらかといえば脆性な伝統的なポリアクリルアミドゲルと異なり、ポリアクリルアミドベースのクリオゲルは、機械的に損傷されることなく簡単に圧縮され得る、弾性の軟質なスポンジ様の材料である。モノリスが保持する毛管力のため、モノリス内の液体は、排液から保護される。その結果、溶出によって分離される生体粒子の表面上の受容体と特異的又は非特異的に相互作用可能なリガンドをその表面に保有するポリアクリルアミドベースのクリオゲルに吸着した材料の遊離における有効性（完全に吸着した細胞のうち回収された細胞の％として算出した）は、溶出工程の有効性を上昇させるために流動誘導性せん断力を加えた場合であっても低いことが、本発明者らによって見出された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
その理由のため、本発明の目的は、マクロ多孔性のクリオゲルモノリスに吸着した生体粒子を溶出する場合に取得すべき吸着した材料の遊離において改良された有効性を可能とする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の説明
本発明は、マクロ多孔性のクリオゲルモノリスに吸着した生体粒子の放出が、該マクロ多孔性のクリオゲルモノリスを、溶出媒体への暴露と連動させて物理的変形に供することによって実質的に改良されるという驚くべき発見に基づく。
【０００８】
したがって、本発明は、生体粒子を含む水性懸濁液からの、そのような生体粒子の吸着に基づく分離方法に関するものであり、その方法は、
ａ）該水性懸濁液を、その表面上に分離される生体粒子の表面上の受容体と特異的又は非特異的に相互作用可能なリガンドを保有するマクロ多孔性のクリオゲルモノリスと接触させ、該生体粒子を該マクロ多孔性のクリオゲルモノリスに吸着させること；及び
ｂ）溶出によって該マクロ多孔性のクリオゲルモノリスから該生体粒子を遊離させ、ここで該マクロ多孔性のクリオゲルモノリスが溶出媒体への暴露と連動して物理的変形に供されること、
を含む。好ましくは、該物理的変形は、該溶出中にマクロ多孔性のクリオゲルを圧縮することによってもたらされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の方法において用いられ得るマクロ多孔性のクリオゲル及びそれらの製造の方法は、例えば、ＷＯ  ０３／０４１８３０  Ａ２及びＷＯ  ０３／０３１０１４  Ａｌ中に記載されており、モノリスの形態のマクロ多孔性のクリオゲルの製造の方法は、例えば、ＷＯ  ２００４／０８７２８５  Ａｌ中に記載されており、それらの参考文献の開示は全体として、参照によって本明細書中に組み込まれるものとする。
【００１０】
ポリアクリルアミドベースのクリオゲルモノリスはまた、Ｐｒｏｔｉｓｔａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＢ，Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎから市販されている。
【００１１】
本発明の方法において用いられるべきマクロ多孔性のクリオゲルモノリスは、好ましくはその表面上にリガンドを保有するポリアクリルアミドクリオゲルモノリスである。
【００１２】
クリオゲルを、そこへ１個以上のリガンドを導入することによって修飾する方法は、文献から（例、上記のＷＯ  ０３／０４１８３０  Ａ２から）公知である。
【００１３】
本発明の方法と関連して用いられても良いリガンドの例としては、イオン交換基、固定化金属親和性リガンド、タンパク質リガンド（コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）のようなレクチン等）、免疫グロブリン結合タンパク質（プロテインＡのような）、抗体、抗原、受容体、合成リガンド、修飾ペプチド又はタンパク質リガンド、核酸等が挙げられるが、それらに限定されない。
【００１４】
本発明によれば、本発明の方法を手段として水性懸濁液から分離される生体粒子は、哺乳類細胞、細菌、細胞小器官、ウイルス、封入体、ラテックス粒子、エアロゾル、有機もしくは無機組成物又は二者の複合物の粒子からなる群より選択されてもよく、その寸法はナノからマイクロメートルの範囲内である。
【００１５】
用いられるマクロ多孔性のクリオゲルモノリスの具体的な材料に依存して、該モノリスの容積は、本発明の方法による物理的変形に供されている時に、異なる最大の程度まで減少されてもよい。原則として、マクロ多孔性のクリオゲルモノリスは、各具体的な事例において用いられる器具と関連して、可能な最大の程度まで圧縮されるべきである。一般的には、マクロ多孔性のクリオゲルモノリスは、溶出媒体の存在下において、その最初の容積の２５〜３０％より小さい容積、好ましくはその最初の容積の２０％より小さい容積、そして最も好ましくは（実際に可能である場合）その最初の容積の１％より小さい容積に圧縮されるべきである。
【００１６】
ＷＯ  ９１／１７８３０  Ａｌは、過剰な緩衝液を除去するため、そして後のクロマトグラフィーの実行においてスポンジ吸着剤から溶出緩衝液を採取するための、圧縮の利用を開示する。しかしながら、この事例において、スポンジの圧搾は、溶出効率を改良しない。圧搾は、液体の取り扱いを改良するため（すなわち、基質におけるデッドボリュームを低下させ、したがってより小さい容積の溶出された可溶性タンパク質を取得するため）に、例外的に用いられた。この従来技術の方法において、溶出剤の非存在下におけるスポンジ吸収剤の圧搾は、結合したタンパク質の溶出をもたらさない。実際には、それが、結合したタンパク質を緩めるリスクなしに、洗浄の状態で圧搾を使用することを可能とした。
【００１７】
その一方で、本発明の場合、圧搾は、結合した生体粒子の溶出の主要な駆動力として用いられる。生体粒子は、溶出剤の非存在下においても、圧搾によってクリオゲルモノリスから放出され得る。しかし、溶出剤の存在下における圧搾は、結合した粒子の放出をより効率的にする。したがって、本発明の方法によれば、特異的に結合した生体粒子をもつクリオゲル吸着剤を圧搾することは、ＷＯ  ９１／１７８３０  Ａｌから予想できるように液体の取り扱いを改良したことのみならず、予測外の結合粒子の改良された溶出もまたもたらした。
【００１８】
これから、本発明を幾つかの具体的な実施例によってさらに説明するが、これら実施例は、本発明の範囲を限定するものとしてみなされるべきではない。続く実施例のうち、調製例Ａ〜Ｄは、本発明の方法において用いられるマクロ多孔性ハイドロゲルモノリスの製造に関するのに対し、実施例１〜４は、本発明の方法を説明する。
【実施例】
【００１９】
調製例Ａ
エポキシ含有ポリアクリルアミド（ｐｏｌｙＡＡｍ）クリオゲルモノリスの製造
反応混合液中５及び６％の共単量体の溶液を用いて、２種類のエポキシ活性化ｐｏｌｙＡＡｍクリオゲルモノリスを製造した。 アクリルアミド（１．２１又は１．０１ｇ）、Ｎ，Ｎ’−メチレン−ビス（アクリルアミド）（０．４３又は０．３６ｇ）及びアリルグリシジルエーテル（０．１７０又は０．１４２ｍｌ）を、３０ｍｌの脱イオン水に溶解した。混合物を、１０分間減圧下で脱気し、溶解した酸素を除いた。Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（２１又は１８μｌ）及び過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ、１８又は１５ｍｇ）を添加することによって、フリーラジカル重合を開始させ、反応混合物を２０秒間穏やかに撹拌した（混合物は、ＡＰＳの添加に１５分間先立って、氷浴中で冷却した）。次いで、０．５ｍｌの反応混合物を、シリコンキャップで底部を閉じたガラス管（３９×７．１ｍｍ内径）に迅速に添加した。ガラス管は、標準的なマイクロタイタープレートのウェルの内径よりもわずかに大きな内径を有した。溶液を、３０分以内にＡＲＣＴＥＳＴ冷却チャンバー中で、−１２℃にて凍結させ、一晩−１２℃にて凍結を保ち、次いで室温にて解凍した。シリコンキャップを除去し、クリオゲルモノリスを脱イオン水で徹底的に洗浄した。
【００２０】
調製例Ｂ
Ｉ．固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）リガンドでのクリオゲルモノリスの調製
調製例Ａにしたがって調製したエポキシ活性化クリオゲルモノリス（１６プラグ） を、０．５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３で洗浄し、ｐＨ１０．０の１．０Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３中で、０．５Ｍ  イミノ二酢酸（ＩＤＡ）で平衡化し、３０ｍｌのこの溶液中で２４時間、室温にて穏やかな振とう下でインキュベートした。ＩＤＡ−クリオゲルモノリスを、各ウェルの底部にドリルで開けた穴（直径０．３ｃｍ）をもつ９６ウェルプレートのウェル中へと配置し、ｐＨが中性になるまで水で洗浄した。２ｍｌの０．２５Ｍ  ＣｕＳＯ４又はＮｉＣｌ２それぞれを、各ウェルを通過させることによって、Ｃｕ（ＩＩ）及びＮｉ（ＩＩ）イオンを、ＩＤＡ−クリオゲルモノリスへと結合させた。最後に、各ウェルを水で洗浄し、ＩＤＡ−クリオゲルモノリスを、ｐＨ７．０の０．２Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳで平衡化した。
ＩＩ．クリオゲルモノリス上のリガンド密度の決定
固定化されたＩＤＡの量を、結合したＮｉ（ＩＩ）イオンの量を、以下のように測定することによって決定した：２ｍｌの２５ｍＭ  ＮｉＣｌ２及び２ｍｌの脱イオン水を、上記ＩからのＩＤＡクリオゲルモノリスの中を通過させた。加えたＮｉＣｌ２溶液中及び流出液中のＮｉ（ＩＩ）イオンの量を、Ｄｒ．Ｌａｎｇｅキット（Ｄｒ．Ｂｒｕｎｏ  Ｌａｎｇｅ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて決定した。サンプルは、解析に先立って、脱イオン水で１：１０００に希釈した。結合したＮｉ（ＩＩ）の量は、加えたＮｉ（ＩＩ）と非結合Ｎｉ（ＩＩ）との量の間の差異として算出した。
【００２１】
調製例Ｃ
Ｉ．ＣｏｎＡ−クリオゲルモノリスの調製
調製例Ａに従って調製したエポキシ活性化クリオゲルモノリスを、１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むｐＨ９．０の０．０５Ｍ  炭酸バッファー中のコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）溶液（２ｍｇ／ｍｌ）で平衡化し、ＣｏｎＡの新鮮な溶液で室温にて穏やかな振とう下で２４時間インキュベートした。未反応のエポキシ基を、１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むｐＨ９．０の０．０５Ｍ  炭酸バッファー中の０．１Ｍ  エタノールアミンとともに、クリオゲルモノリスを室温にて穏やかな振とう下で２時間インキュベートすることによってブロックした。ＣｏｎＡ−クリオゲルモノリスを、各ウェルの底部にドリルで開けた直径０．３ｃｍの穴をもつ９６ウェルプレートのウェル中へと配置し、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むｐＨ６．５の０．１Ｍ  酢酸バッファーで洗浄した。
ＩＩ．クリオゲルモノリス上のリガンド密度の決定
クリオゲルモノリス上に固定化されたＣｏｎＡの量を、改良ビシンコニン酸アッセイ （A. Kumar, F. M. Plieva, I.Yu. Galaev, B. Mattiasson, 超マクロ多孔性モノリスクリオゲルを用いたリンパ球の親和性分取, J. Immunol. Methods 283 (2003) 185-194）によって決定した。１５ｍｇの、乾燥されかつ微細に粉砕されたＣｏｎＡ−クリオゲルモノリスを、４００μｌの脱イオン水中に懸濁した。５０及び１００μｌのＣｏｎＡ−クリオゲル懸濁液へ、２ｍｌのビシンコニン酸（ＢＣＡ）溶液を添加し、混合物を徹底した振とう下で２時間、室温にてインキュベートした。５０及び１００μｌの微細に粉砕した自然なクリオゲルモノリスの懸濁液（４００μｌの脱イオン水中、１５ｍｇの粉砕した粉末）へ、ＣｏｎＡへの定量的な添加を用いて、検量線を作成した。吸光度を、サンプルを遠心して、及び遠心しない両方で、５６２ｎｍにて測定した。
【００２２】
調製例Ｄ
プロテインＡ−クリオゲルモノリスの調製
調製例Ａに従って調製したエポキシ活性化クリオゲルモノリスを、０．２Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３中の０．５Ｍ  エチレンジアミンで平衡化し、この溶液の新鮮な一部で、一晩、室温にて、穏やかな振とう下でインキュベートした。水及びｐＨ７．２の０．１Ｍ  リン酸ナトリウムバッファーで洗浄した後、クリオゲルモノリスを、同一のバッファー中のグルタルアルデヒド溶液（５％  ｖ／ｖ）で平衡化し、この溶液の新鮮な一部で、５時間、室温にて、穏やかな振とう下でインキュベートした。官能性アルデヒド基で誘導体化されたクリオゲルモノリスを、プロテインＡ溶液（０．１Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー中２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．２）で平衡化し、この溶液の新鮮な一部で、４８時間、４℃にて、穏やかな振とうにてインキュベートした。最後に、クリオゲルモノリスを、３０ｍｌの新たに調製したＮａＢＨ４溶液（炭酸ナトリウムバッファー中０．１Ｍ、ｐＨ９．２）で３時間、穏やかな振とうにてインキュベートし、タンパク質とアルデヒド含有基質との間に形成されたシッフ塩基を減少させた。
【００２３】
クリオゲルモノリス上に固定化されたプロテインＡの量を、改良ビシンコニン酸アッセイ（A. Kumar, F. M. Plieva, I. Yu. Galaev, B. Mattiasson, 超マクロ多孔性モノリスクリオゲルを用いたリンパ球の親和性分取, J. Immunol. Methods 283 (2003) 185-194）によって決定した。１５ｍｇの、乾燥されかつ微細に粉砕されたタンパク質プロテインＡ−クリオゲルモノリスを、４００μｌの脱イオン水中に懸濁した。５０及び１００μｌのプロテインＡ−クリオゲル懸濁液へ、２ｍｌのビシンコニン酸（ＢＣＡ）溶液を添加し、混合物を徹底した振とう下で２時間、室温にてインキュベートした。５０及び１００μｌの微細に粉砕した自然なクリオゲルモノリスの懸濁液（４００μｌの脱イオン水中、１５ｍｇの粉砕した粉末）へのプロテインＡの定量的な添加を用いて、検量線を作成した。吸光度を、サンプルを遠心して、及び遠心しない両方で、５６２ｎｍにて測定した。
【００２４】
実施例１
親和性クリオゲルモノリスを用いた酵母細胞及びラテックス粒子の結合及び回収
一定分量（２００μｌ）の酵母細胞（地元の供給業者からのパン酵母）の懸濁液（ＤＤ６００＝１．０３）及びポリ（Ｎ−ビニルイミダゾール−ｃｏ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ポリ（ＶＩ−ＮＩＰＡＭ））ラテックス粒子（ＯＤ４５０＝０．６７４）を、ｐＨ７．４の０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２及び５ｍＭ  ＭｇＣｌ２並びにｐＨ７．０の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．２Ｍ  ＮａＣｌそれぞれで平衡化したＣｏｎＡ−クリオゲルモノリス（調製例Ｃに従って調製した）及びＣｕ（ＩＩ）−ＩＤＡ−クリオゲルモノリス（調製例Ｂに従って調製した)（共単量体の６％溶液を用いて調製した０．５ｍｌの吸着剤）に加えた。加えた粒子との異なる期間のインキュベーション後、親和性クリオゲルモノリスを、対応するランニングバッファーの１２カラム容積で、流速２１ｃｍ／ｈにて洗浄し、非結合粒子を除去した。結合した粒子の量は、加えた懸濁液中の粒子の量とフロースルー画分中の粒子の量との間の差異として算出した。
【００２５】
本実験では、親和性クリオゲルモノリス（０．５ｍｌ；ロッド１２．５×７．１ｍｍ直径）は、ポンプに連結したカラム（７×２０ｍｍ内径）中へと配置した。新たな親和性クリオゲルモノリスを、各試験において用いた。
【００２６】
下の表１によって示されるように、酵母細胞の効率的な捕獲には、ＣｏｎＡ−クリオゲルモノリスとのインキュベーションが必要であったものの、Ｃｕ（ＩＩ）−ＩＤＡ−クリオゲルモノリスに結合したポリ（ＶＩ−ＮＩＰＡＭ）ラテックスの量は、加えた粒子と吸着剤との接触の時間とは独立していた。ＣｏｎＡ−又はＣｕ（ＩＩ）−ＩＤＡ−クリオゲルモノリス上に加えた酵母細胞又はラテックスの量の増加は、結合の増加はもたらさず、加えた粒子の過剰分はフロースルー中にあった（データ示さず）。
【００２７】
結合した粒子の放出のために２種類の異なる戦略を用いた：バッファー及び対応する溶出剤（酵母細胞の場合には１．５ｍｌのα−Ｄ−マンノ−ピロシド（ｐｙｒｏｓｉｄｅ）（又はグルコース）、ラテックス粒子の場合にはＥＤＴＡ（又はイミダゾール））のパルスを続けて４３０ｃｍ／ｈの速度で通過させることによってせん断力を加えること（流動誘導性脱着）、並びにクリオゲルモノリスの機械的な圧縮（圧搾）によってせん断力を加えること。流動誘導性脱着の間のバッファー及び溶出剤のパルスの持続時間を最適化し、前工程によってそれ以上の細胞が回収できなくなったときに次の脱着工程を適用した。流動誘導性脱着工程後、カラムをポンプから取り外し、モノリス性吸着剤をガラスロッドで圧縮し、新たな一部（０．５ｍｌ）の溶出剤を添加することによって再膨張させ、再び圧縮した。圧搾された液体（総容積０．７０〜０．７５ｍｌ）を採取し、濁度測定（６００又は４５０ｎｍでの吸光度）によって解析した。
【００２８】
洗浄工程に先行するＣｏｎＡ−クリオゲルモノリス内の酵母細胞の接触時間が、相互作用の強度に対して明白な効果を有し、その結果流動誘導性脱着の効率に対しても明白な効果を有した（表１）。インキュベーション工程なしで行われた試験においては、捕獲された酵母細胞の２９％及び３６％が、それぞれ０．３Ｍ  α−Ｄ−マンノ−ピラノシドなしで及び０．３Ｍ  α−Ｄ−マンノ−ピラノシド存在下で加えられた流動によって脱着した。細胞を親和性吸着剤内にて３０分間インキュベートした試験においては、結合した細胞の９％のみが第一のパルスによって放出され、９％が特定の溶出剤の存在下で加えられたせん断によって放出された。結果は、親和性基質への異なる結合強度によって特徴付けられる、いくつかの画分の捕獲された酵母細胞があることを示す。高めた流速によって脱着させることのできない強力に結合した細胞の画分が、細胞と親和性吸着剤との接触時間が増加するとともに、大きくなっている。酵母細胞とＣｏｎＡコートされた表面との相互作用の強度に対する時間依存的な影響もまた、Ｌａｍ等によって観察された（A. Lam, X. Cao, R. Eisenthal, J. Hubble, 細胞の表面への親和性媒介性吸着に対する、接触時間及び阻害剤濃度の効果, Enzym. Microb. Technol. 29 (2001)）。安定化現象は、表面上の親和性リガンドによる細胞の最初のアンカリングに引き続く時間依存的な様式での結合のさらなる形成の可能性によって説明されている（J. Hubble, 親和性細胞分離：問題点及び見通し. Trends Biotechnol. 15(1997) 249-255）。細胞の集団と親和性表面との間に形成される結合の数の分布に起因して、付着強度の分布があることが観察されている（F. Ming, R. Eisenthal, W. J. D. Whish, J. Hubble, 親和性媒介性細胞−表面付着のキネティクス, Enzym. Microb. Technol. 26 (2000) 216-221）。特定の溶出剤の存在下においても、せん断力によって放出されなかった酵母細胞の画分を含むＣｏｎＡ−クリオゲルモノリスの圧縮は、その細胞の画分の完全な回収をもたらした（表１）。
【００２９】
ポリ（ＶＩ−ＮＩＰＡＭ）ラテックスとＣｕ（ＩＩ）−ＩＤＡ−クリオゲルモノリスとの相互作用のキネティクスは迅速であり、付着の強度は接触時間と独立していた：捕獲されたインキュベーション前工程あり又はなしのラテックスの１２％以下が、４３０ｃｍ／ｈの速度にて加えられた０．３Ｍ  イミダゾールのパルスでカラムから出てきた（表１）。捕獲されたラテックス粒子の約６０％が、Ｃｕ（ＩＩ）−ＩＤＡ−クリオゲルモノリスを圧搾することによって脱着した。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
上記に記載されたデータは、クリオゲルモノリス吸着剤の機械的圧縮が、結合した粒子と親和性クリオゲルの表面との間の複数の結合の破壊、及び圧搾された液体の流動での脱着した粒子の回収をもたらすことを実証する。親和性クリオゲルモノリスによって捕獲された細胞は、孔の壁の素の「平らな」部分に結合しており、「デッドフロー」の帯域中に捕捉されているのではないことが、走査型電子顕微鏡の研究により、以前に実証されていた（P. Arvidsson, F. M. Plieva, I. N. Savina, V. I. Lozinsky, S. Fexby, L. Bulow, I. Yu. Galaev, B. Mattiasson, 連続して超マクロ多孔性親和性カラム及びイオン交換カラムを用いた微生物細胞のクロマトグラフィ, J. Chromatogr. A 977 (2002) 27-38）。親和性結合の破壊の考えられる理由は、機械的圧縮によって起こった素の面の変形又は／及び親和性リガンドの不活化であり得る。リガンドの不活化の可能性を、圧搾工程後に再生された親和性クリオゲルモノリスを用いた吸着試験において研究した（表２）。サイクルＩにおいて、解析した粒子の懸濁物を、対応する親和性クリオゲルモノリスへと加え（酵母細胞は、吸着剤内で１５分間インキュベートした）、非結合粒子を洗浄によって除去し、モノリスを溶出剤（酵母細胞及びポリ（ＶＩ−ＮＩＰＡＭ）ラテックスそれぞれの場合に、０．３Ｍ  α−Ｄ−マンノ−ピラノシド及び０．３Ｍ  イミダゾール）で平衡化した。結合した粒子を、前記の圧搾工程によって放出させた。脱着工程後、１２カラム容積の対応するランニングバッファーで洗浄することによってカラムを再生し、サイクルを繰り返した。表２に示される結果は、圧搾工程が、ＣｏｎＡ−及びＣｕ（ＩＩ）−ＩＤＡ−クリオゲルモノリスの結合特性及びサイクルＩＩにおける脱着効率に対して明白な効果を有しなかったことを実証し、サイクルＩにおいて行われた機械的圧縮が、リガンドの不活化を引き起こしたのではないであろうことを示している。したがって、表面からの粒子の圧搾誘導性脱着に関与する主な機構は、おそらく親和性リガンドを保有する表面の微視的な変形による細胞の物理的な取り外し及び圧搾された液体の流動であろう。吸着剤の孔における特定の溶出剤の存在は、結合の平衡数を低下させ、脱着した粒子がカラムから抜け出る際の再配向及び再吸着を防止することによって、脱着に寄与しているかもしれない。
【００３２】
【表２】
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【００３３】
実施例２
プロテインＡ−クリオゲルモノリスを用いた封入体の結合及び回収
組換え大腸菌において封入体として発酵された３３ｋＤのモデルタンパク質、並びに３３ｋＤ標的タンパク質のアミノ末端上の１５アミノ酸及びカルボキシル末端上の１７アミノ酸に対するＩｇＧ抗Ａ１５及び抗Ｂ１７を、本実験において用いた。封入体スラリーを、ｐＨ７．２の５０ｍＭ  ＰＢＳ中で８又は３０倍に希釈し、０．５ｍｌの希釈したスラリーを、４０μｌの抗体溶液（１．０ｍｇ  ｍｌ−１）で氷上で１５分間インキュベートした。混合物を、１０，０００ｇで２分間遠心し、ペレットを０．５ｍｌの５０ｍＭ  ＰＢＳ中に再懸濁し、もう一度２分間遠心した。ペレットを１又は４ｍｌのｐＨ７．２の５０ｍＭ  ＰＢＳ中に再懸濁し、懸濁物（０．１５０〜０．２２０ｍｌ）を、ｐＨ７．２の５０ｍＭ  ＰＢＳで平衡化したプロテインＡ−クリオゲルモノリス（調製例Ｄにしたがって調製した）に加えた。モノリスを、処置した封入体懸濁物と１５分間インキュベートし、次いで２ｍｌのｐＨ７．２の５０ｍＭ  ＰＢＳで洗浄し、非結合の材料を除去した。結合した封入体の回収は、プロテインＡ−クリオゲルモノリスを圧搾することによって行った。
【００３４】
実施例３
Ｉ  大腸菌細胞ホモジネートの調製
ハイブリッドＬａｍＢ−Ｈｉｓ６モノマーをコードするプラスミドｐＬＨ２をもつ大腸菌Ｋ１２株（Ｈｉｓ６−Ｅ．ｃｏｌｉ）を、本実験で用いた。述べられた大腸菌Ｋ１２株及びＨｉｓ６−ＬＤＨを産生する大腸菌ＴＧｌ株（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧｌ）を、３０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコール又は１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンをそれぞれ追加したＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地（トリプトン  １０ｇ／１、酵母エキス  ５ｇ／１、ＮａＣｌ  １０ｇ／１）中で、３７℃にて、振とうインキュベータ中、１７５ｒｐｍにて生育した。Ｈｉｓ６−Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、対数期の中間で、５８００ｇにて５分間遠心することによって収穫した。細胞ペレットは、氷上に保ち、吸着試験に先立って、ｐＨ７．０の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ中に懸濁した。 細胞は、培養後１〜２日間以内に用いた。
【００３５】
Ｈｉｓ６−ＬＤＨの発現を、以下のように行った：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧｌ細胞培養液（一晩培養した培養物１０ｍｌを播種した２００ｍｌ）の６００ｎｍでの吸光度が０．７に達したとき、ＩＰＴＧ及び別の一部のアンピシリンを、最終濃度がそれぞれ４８及び１００ｍｇ／ｌとなるように添加した。３．５時間後、細胞を収穫し（５８００ｇで５分間）、５０ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中に再懸濁し、超音波処理した。得られた細胞ホモジネートを小さな画分へと分割し、−２０℃にて保存した。
【００３６】
II  Ｃｕ（ＩＩ）−ＩＤＡ−クリオゲルモノリスを用いた、Ｈｉｓ６−ＬＤＨの結合及び回収
Ｈｉｓ６−ＬＤＨを含む大腸菌細胞ホモジネート（０．２ｍｌ）を、バッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．２Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０））で平衡化したＣｕ（ＩＩ）−ＩＤＡ−クリオゲルモノリス（調製例Ｂにしたがって調製した）に加えた。１０分間のインキュベーション後、Ｃｕ（ＩＩ）−ＩＤＡ−クリオゲルモノリスを、３．５ｍｌの上記バッファーで洗浄し、非結合タンパク質及び細胞細片を除去した。
【００３７】
結合したＨｉｓ６−ＬＤＨを、上記バッファー中、ＥＤＴＡ又はイミダゾールで溶出した。Ｃｕ（ＩＩ）−ＩＤＡ−クリオゲルモノリスの圧搾は、前記のように行った。流出液及び溶出液中のＨｉｓ６−ＬＤＨを、酵素特異的活性を測定することによって検出した。回収率を、精製したプール中に溶出した結合活性ユニットの割合として決定した。
【００３８】
ＬＤＨ活性の測定を、１．０ｍＭ  ピルベート及び０．２２５ｍＭ  β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元（ＮＡＤＨ）を含む０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．３）中で、３４０ｎｍでのＮＡＤＨの吸光度の低下をモニタリングすることによって行った。１酵素ユニットは、１分当たり１μｍｏｌのピルベートの還元を表す。
【００３９】
実施例４
上記実施例１に従って観察された親和性表面の機械的変形による細胞放出の現象を、特定の溶出剤の濃度及び性質、生体粒子の表面での結合基の密度及び親和性、粒子の異なるサイズ及び外形、並びにクリオゲル孔壁の剛性のような異なるパラメータの、圧搾工程の効率への影響を解析することによって、さらに研究した。この目的のために、種々の固定化された親和性リガンドをもつ２種類のクリオゲルモノリス（５及び６％の共単量体の溶液をそれぞれ用いて調製された、「柔らかい」及び「高密度（ｄｅｎｓｅ）な」モノリス）を、各セルの底部において丸い開口部（直径３ｍｍ）で改良された、９６ウェルマイクロタイタープレートのオープンエンドのウェル中へと挿入した。本研究において用いたクリオゲルモノリスは、標準的な９６ウェルプレートのウェル（直径７ｍｍ）中へと完璧に収まるサイズ（１２．５×７．１ｍｍ直径）を有する。クリオゲルモノリスの排液防止的な性質が、それらをマルチウェル形式での適用に適させ、それが大きな数のサンプルの平行的な解析の可能性を提供する。
【００４０】
実験の本セットにおいて、実施例１のモデル系に加えて２つのさらなるモデル系（すなわち実施例２及び３のモデル系）もまた研究した。
【００４１】
流動誘導性脱着の戦略は、９６ウェル形式には適用できなかった。したがって、結合した粒子の脱着は、従来の溶出によって（すなわち、３カラム容積の適当な溶出剤を、ウェルを通すことによって（液体は、マルチチャンネルピペットでクリオゲルの上部に加えた））、又は異なる濃度の溶出剤で平衡化された吸着剤を圧搾することによって行った。予想通り、ＣｏｎＡ−クリオゲルモノリス上に捕獲された酵母細胞の２０％及び３８％以下が、グルコース及びα−Ｄ−マンノ−ピラノシドそれぞれの０．３Ｍ溶液で溶出された。捕獲されたＨｉｓ６−Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の１０〜２０％のみが、５０ｍＭ  ＥＤＴＡでの溶出によってＮｉ（ＩＩ）−ＩＤＡ−クリオゲルモノリスから回収された一方で、ポリ（ＶＩ−ＮＩＰＡＭ）−ラテックス粒子は、高い濃度のＥＤＴＡをもってしても、従来の溶出によってまったく脱着し得なかった。ポリ（ＶＩ−ＮＩＰＡＭ）ラテックスがコントロールの素のクリオゲルモノリスとは相互作用しない（データ示さず）が、Ｃｕ（ＩＩ）−ＩＤＡ−クリオゲルモノリス上に捕獲されたラテックス粒子が、Ｃｕ（ＩＩ）イオンを除去するＥＤＴＡ処置後に吸着剤へ結合したままであるという事実は、特異的な結合が、吸着剤へのマイクロゲル粒子の非特異的な接着をさらに促進することを示す。
【００４２】
結合した細胞の４０〜８０％が、平衡化バッファー中、溶出剤の非存在下においても、圧搾によって脱着した。ガラスロッドでの手動の圧縮は約１〜２秒かかり、３６５〜３７５μＬの液体の圧搾をもたらす。したがって、脱着した細胞は、高い速度で流動中へと入り、それによって細胞の大きな画分を再吸着から防ぐ。放出された細胞の量は、ランニングバッファー中の特定の溶出剤の濃度の上昇とともに増加した。孔壁の剛性及びクリオゲルモノリスの多孔率は、基質を圧搾することによる細胞の回収の効率に影響する別のパラメータである。圧搾の効果は、「高密度な」（６％）クリオゲルモノリスと比較してより高い多孔率及び弾性を有する「柔らかい」（５％）クリオゲルモノリスの場合に、特に明白であった。実質的に全ての結合した酵母細胞及び組換え大腸菌細胞が、「柔らかい」ＣｏｎＡ−及びＮｉ(ＩＩ)−ＩＤＡ−クリオゲルモノリスを、１０ｍＭ  α−Ｄ−マンノ−ピラノシド及び３ｍＭ  ＥＤＴＡそれぞれの存在下で圧搾することによって放出された。圧搾による酵母細胞の定量的な放出は、４０〜６０ｍＭ  グルコースの存在下で達成された。グルコースは、ＣｏｎＡリガンドへのより低い親和性をもつ溶出剤であり、したがってα−Ｄ−マンノ−ピラノシドでの実験と比較して、より高い濃度が必要であった。「高密度な」ＣｏｎＡ−クリオゲルモノリスを圧搾することによる酵母細胞の定量的な回収を、０．５Ｍ  α−Ｄ−マンノ−ピラノシドで観察し、０．７Ｍ  グルコースの存在下では、８０％のみが回収された。圧搾によって回収された組換え大腸菌細胞は、それらの生存能を保持し、クロラムフェニコール含有寒天プレート上で生育したことに注目することが重要である。平衡化バッファー中の溶出剤の濃度が、圧搾によって放出されたマイクロゲル粒子の量に影響した。ラテックス粒子の約４０％が０．３Ｍ  イミダゾール又は２０ｍＭ  ＥＤＴＡの存在下での圧搾後に、吸着剤に結合したままであった。溶出剤の濃度のさらなる上昇は、回収されたラテックスの量における増加はもたらさず、これは、上記の非特異的相互作用に起因し得る。孔壁の密度及び親和性クリオゲルモノリスの多孔率は、酵母及びＨｉｓ６−Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の場合における圧搾によるマイクロゲル粒子の回収と比較して、そのような回収の効率に対し、より少ない顕著な効果を有した。圧搾に対するクリオゲルモノリスの構造の最も明白な効果は、研究された最も大きな粒子（すなわち、酵母細胞）の場合に観察された。
【００４３】
プロテインＡと種々の哺乳類ＩｇＧ分子との間の結合は強力であり、２．０〜３．０の範囲におけるｐＨのような過酷な条件が、プロテインＡ吸着剤上に捕獲されたＩｇＧの溶出のために一般的に用いられる。プロテインＡ−クリオゲルモノリス上に捕獲された、特定の抗体である抗Ａ１５又は抗Ｂ１７で標識された封入体は、ｐＨ７．０での圧搾手法によって放出可能であった。抗Ｂ１７で標識された封入体の場合に、より強力な結合が観察された。抗Ａ１５及び抗Ｂ１７が、抗原に対して異なる親和性を有し、封入体の表面上のＩｇＧの異なる密度をもたらしている可能性がある。最も低い回収率は、標識された封入体の場合、異なる条件下において（すなわち、より高い量のＩｇＧの存在下において）ＩｇＧで標識された封入体の場合に観察された。これは、抗Ｂ１７標識封入体の放出の効率が、粒子表面上の結合基の数を上昇させることによって負に影響されたことを示唆する。
【００４４】
コントロールの実験として、Ｃｕ（ＩＩ）−ＩＤＡ−クリオゲルモノリス上に一価の相互作用を介して捕獲された標的高分子（Ｈｉｓ６−ＬＤＨ）の放出に対する圧搾の効果を研究した。Ｃｕ（ＩＩ）−ＩＤＡ−クリオゲルモノリスからのタンパク質の十分な脱離が、２００〜３００ｍＭ  イミダゾールでの従来の溶出の態様によって達成された。Ｃｕ（ＩＩ）−ＩＤＡ−クリオゲルモノリスの圧縮は、用いたイミダゾールのいかなる濃度においても、結合したタンパク質（Ｈｉｓ６−ＬＤＨ）の回収率のいかなる上昇をももたらさなかった。
【国際調査報告】
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