(57)【要約】  本発明は、ミコフェノール酸（ＭＰＡ）と低分子量脂肪族アルコールとのエステルが、カンジダ・アンタークチカ・リパーゼの存在下でＮ−（２−ヒドロキシエチル）モルホリンでエステル交換され、及びＭＰＡエステル化反応が、カンジダ・アンタークチカ・リパーゼの存在下で溶媒として対応するアルコールを使用して行われるミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）の調製方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）の調製方法であって、
ミコフェノール酸（ＭＰＡ）と低分子量脂肪族アルコールとのエステルは、カンジダ・アンタークチカ・リパーゼの存在下においてＮ−（２−ヒドロキシエチル）モルホリンでエステル交換されることを特徴とする調製方法。
【請求項２】
前記低分子量脂肪族アルコールは、Ｃ1〜Ｃ4アルキルアルコールまたはそのハロゲン化誘導体であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｃ1〜Ｃ4アルキルアルコールまたはそのハロゲン化誘導体は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、２，２，２−トリフルオロエタノール、２，２，２−トリクロロエタノール、ｎ−プロパノール、またはｎ−ブタノールから選択されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記エステル交換反応は、非プロトン性極性有機溶媒中で行われることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記非プロトン性極性有機溶媒は、ｌｏｇＰが０．５未満であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記非プロトン性極性有機溶媒は、ＴＨＦおよびジオキサンから選択され、好ましくはＴＨＦであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記エステル交換反応は、いずれの界面活性剤もなしで行われることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記リパーゼの量は、基質１ｍｍｏｌ当たり５０〜１５０ｍｇ、好ましくは１０７ｍｇであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記基質の濃度は、０．１〜０．３Ｍ、好ましくは０．２５Ｍであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＭＰＡエステルと前記Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）モルホリンのモル比は、０．２〜０．４、好ましくは０．３であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記エステル交換反応は、撹拌下で１５〜４５℃、好ましくは２５〜３０℃の温度で行われることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＭＰＡエステル化反応は、カンジダ・アンタークチカ・リパーゼの存在下で、溶媒として対応するアルコールを使用して行われることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記リパーゼの量は、ＭＰＡ１ｍｍｏｌ当たり２０〜６０ｍｇ、好ましくは５３ｍｇであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＭＰＡの濃度は、０．０５〜０．２Ｍ、好ましくは０．１Ｍであることを特徴とする請求項１２および１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記エステル化反応は、撹拌下で１５〜４５℃、好ましくは３０℃の温度で行われることを特徴とする請求項１２〜１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記エステル化反応は、界面活性剤なしで行われることを特徴とする請求項１２〜１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ；登録番号１２８７９４−９４−５）、すなわち、ミコフェノール酸（ＭＰＡ；登録番号２４２８０−９３−１）とＮ−（２−ヒドロキシエチル）モルホリン（登録番号６２２−４０−２）とのエステルは、腎移植を受けた患者の治療に現在使用されている免疫抑制薬である。
【０００２】
【化１】
2008511309.tif 000002
【０００３】
経口投与後、ＭＭＦはＭＰＡについて加水分解され、これはイノシン一リン酸脱水素酵素の強力な阻害剤なので、実際の免疫抑制剤になる（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
ＭＭＦは、特許文献１に初めて記載された（１９８７年：この特許は、特許文献２に相当する）。この特許では、ＭＭＦの調製は、ＭＰＡをＮ−（２−ヒドロキシエチル）モルホリンでエステル化する従来の方法によって説明されている。これらの方法は、ＭＰＡの塩化アシルを用いて、または例えばジシクロヘキシルカルボジイミドなどの縮合剤を使用することによって、ＭＰＡとＮ−（２−ヒドロキシエチル）モルホリンの間の縮合を実現する。しかし、これらの合成法には、分子上にカルボキシル基の他にフェノール性ヒドロキシルおよびラクトン官能基が同時に存在するために、所望の生成物とは別に、一連の副次的なＭＰＡ重縮合生成物を生じるという欠点がある。
【０００５】
この問題を克服するために、ＭＭＦを調製する代替方法が最近開発されている。いくつかの方法は、生体触媒法を使用して、酵素触媒作用によってＭＰＡとＮ−（２−ヒドロキシエチル）モルホリンを反応させるＭＭＦの調製について報告している（例えば、特許文献３および特許文献４参照）。最近市販品として容易に入手することができる多くの加水分解酵素、例えば、リパーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼなどが、有機溶媒中で実験条件（水分量、ｐＨ、温度、界面活性剤および水補足剤の存在）を正確に制御して使用すると、非天然基質の加水分解を行うだけでなく、エステルの合成を触媒することができることが知られている（例えば、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４参照）。
【０００６】
しかし、これらの酵素法も完全に満足できるものではない。というのは、エステル化反応中に生成され、反応媒体に含まれる水の存在は、反応の進行レベルにかなり影響を及ぼすものであり、一方、反応媒体での界面活性剤の使用は、粗反応生成物からＭＭＦを精製する後続操作を複雑にする恐れがあるからである。さらに、使用する有機溶媒のタイプは、反応速度および酵素の触媒効率に強い影響を及ぼす可能性があり、したがって、いくつかのケースでは、重要な工業的製造においてその適用に許容されうる反応の進行レベルを得るために反応時間が長くなる。
【０００７】
【特許文献１】米国特許第４，７５３，９３５号明細書
【特許文献２】欧州特許第０２８７１３号明細書
【特許文献３】国際公開第００／３４５０３号パンフレット（２０００年）
【特許文献４】国際公開第０３／０４２３９３号パンフレット（２００３年）
【非特許文献１】B.J.Bornes, A.E.Eakin, R.A.Izydore and I.H.Hall Biochemical Pharmacology, 62, (2001), p.91-100
【非特許文献２】Klibanov A.M. CHEMTECH, 1986, 16, 354
【非特許文献３】Schopineau J., McCafferty F.D., Therisod M., Klibanov A.M. Biotechnol. and Bioeng. 1988, 31, 208
【非特許文献４】Therisod M., Klibanov A.M. Journal of Chemical American Society, 1987, 109, 3977
【非特許文献５】E.Santaniello, P.Ferraboschi and P.Grisenti. Enzyme Microb. Technol. 1993, vol 15, p.367-382
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、酵素を使用することによって、界面活性剤を加えず、ｐＨ条件および反応媒体中の水の存在を正確に制御することなく操作してＭＭＦの調製を行うことができる適切な実験条件を見つけることが不可能であるかどうか確認することに決定した。リパーゼによって触媒される酵素エステル交換反応の有機化学における多数の応用例が文献に記載されているので、この手法がＭＭＦの調製にもうまく適用されるかどうか確認することに決定した（例えば、非特許文献５参照）。これを行うために、単純なアルコールとのＭＰＡエステル化反応と、続くＮ−（２−ヒドロキシエチル）モルホリンとのエステル交換反応のどちらも行う最も適切な加水分解酵素を特定する必要がある。本発明者らは、驚くべきことに、ＭＰＡと様々な脂肪族アルコールとの酵素エステル化に関する様々な反応条件を研究し、酵素触媒として様々なリパーゼ（トリアシルグリセロール・リパーゼ（ＥＣ３．１．１．３））を使用することによって、カンジダ・アンタークチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼ（ＣＡＬ  Ｂ、Ｎｏｖｏｚｙｍ４３５）が触媒する、ＭＰＡと低分子量脂肪族アルコール、例えばエタノールやメタノールなどとのエステル化が、３０〜４０時間で対応するエチルまたはメチルエステルを定量的に生じることを確認した。唯一の反応溶媒と同じ脂肪族アルコール（すなわち、メタノールまたはエタノール）を使用するこの方法は、反応環境中で生じる水の形成に大きな影響を受けず、界面活性剤の使用を必要としない。
【０００９】
さらに、反応溶媒としてイソプロパノール、２，２，２−トリフルオロエタノール、２，２，２−トリクロロエタノール、ｎ−プロパノールおよびｎ−ブタノールを使用してみたが、本発明者らが使用した実験条件下のＣＡＬ  Ｂは、メタノールおよびエタノールの使用と同じように、対応するＭＰＡエステルを得ることができた。
【００１０】
さらにＣＡＬ  Ｂが触媒する、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中でのこれらのＭＰＡエステルとＮ−（２−ヒドロキシエチル）モルホリンとの後続のエステル交換反応は、界面活性剤を使用することなく、かつ無水環境で行うことなく、定量的にＭＭＦを生じることができることが明らかとなった（化２）。
【００１１】
【化２】
2008511309.tif 000003
【００１２】
同じ実験条件下で、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａ）リパーゼ（ＰＣＬ）やカンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼ（ＣＲＬ）などその他のリパーゼは、対応するメチルまたはエチルエステルを生じることができず、あるいはＮ−（２−ヒドロキシエチル）モルホリンとのエステル交換反応を触媒できないことが明らかになったことから、ＭＰＡとＣＡＬ  Ｂの間の特異性は一層驚くべきものであることに留意されたい。
【００１３】
文献で周知の、非天然基質に対するエステル化およびエステル交換反応を触媒することができるこれらのリパーゼは、本発明者らが使用した実験条件下では明らかにＭＰＡをその活性部位に受容させることができない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
このＭＰＡエステル化反応は、酵素としてＣＡＬ  Ｂを、溶媒として適切なアルコール、好ましくはＣ1〜Ｃ4アルキルアルコールまたはそのハロゲン化誘導体を使用する典型的な方法で行われる。使用する酵素の好ましい量は、ＭＰＡ１ｍｍｏｌ当たり２０〜６０ｍｇ、好ましくは５３ｍｇである。ＭＰＡの濃度は、０．０５〜０．２モル濃度（Ｍ）、好ましくは０．１Ｍである。反応は、撹拌しながら１５〜４５℃、好ましくは３０℃の温度で３０〜４０時間の間行われる。この反応は、酵素をろ過で除去し、ろ液を減圧下で濃縮することによって終了される。
【００１５】
ＭＰＡエステルとＮ−（２−ヒドロキシエチル）モルホリンとのエステル交換反応は、酵素としてＣＡＬ  Ｂ、および非プロトン性極性有機溶媒、好ましくはｌｏｇＰが０．５未満のもの、さらに好ましくはＴＨＦまたは１，４−ジオキサンを使用する典型的な方法で行われる。
【００１６】
使用する酵素の好ましい量は、基質１ｍｍｏｌ当たり５０〜１５０ｍｇ、好ましくは１０７ｍｇである。基質の濃度は、０．１〜０．３Ｍ、好ましくは０．２５Ｍである。ＭＰＡエステルとＮ−（２−ヒドロキシエチル）モルホリンのモル比は、０．２〜０．４、好ましくは０．３である。反応は、撹拌しながら１５〜４５℃、好ましくは２５〜３０℃の温度で２４〜３６時間の間行われ、次いで、酵素をろ過で除去し、ろ液を減圧下で濃縮することによって終了される。あるいは、ＭＰＡエステル化反応、および後続のＮ−（２−ヒドロキシエチル）モルホリンとのエステル交換反応を、「新鮮な」酵素の使用に比べて見たところ酵素活性がいずれも低下していない同じ酵素を再使用して行うことができる。
【００１７】
さらに、前述の実験条件下でのＣＡＬ  Ｂを、エステル化反応とエステル交換反応のどちらにおいても触媒活性がたいして低下することなくより多くの使用サイクルで使用することができる。
【実施例１】
【００１８】
ミコフェノール酸エチルエステル（２）の調製
ＭＰＡ１．０１ｇ（３．１５ｍｍｏｌ）を無水エタノール３７．５ｍｌ中に３０℃の温度で撹拌しながら溶解させ、次いで、１７０ｍｇのＣＡＬ  Ｂを添加する。反応混合物を、激しく撹拌しながら３０℃の温度で４０時間維持し、次いで反応を終了させる。酵素をろ過で除去し、ろ液を減圧下で濃縮して、オイル状残渣を得る。このオイル状残渣をジクロロメタン（２０ｍｌ）に溶解し、得られた有機溶液を、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１５ｍｌ）、次いで水の順で洗浄する。次いで、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮して、ミコフェノール酸エチルエステル（２）（１．０４２ｇ、２．９９ｍｍｏｌ、収率９５％）を得、これをさらに精製することなく次の合成ステップで直接使用する。
【００１９】
元素分析：Ｃ19Ｈ24０6として理論値：Ｃ＝６５．５０、Ｈ＝６．９４、Ｏ＝２７．５５；実測値：Ｃ＝６５．４２、Ｈ＝６．９０、Ｏ＝２７．４４
質量スペクトル（分析フラグメント）：３４９（ｍ＋１）、３４８（分子イオン）、３０３（ｍ−４５）
1H-NMR (500 MHz) CDCl3: 1.16 (t, 3H, CH3-CH2-), 1.76 (s, 3H, CH3-C=), 2.15(s, 3H, CH3-Ar), 2.26 (m, 2H, CH2-C=), 2.35 (m, 2H, CH2CO), 3.35 (d, 2H, CH2Ar), 3.75 (s, 3H, OCH3), 4.04 (q, 2H, CH3-CH2O), 5.16 (s, 2H, ArCH2O), 5.20 (t, 1H, CH=)。
【００２０】
また、以下のＭＰＡエステルも類似した方法で調製した：メチルエステル、２，２，２−トリフルオロエチルエステル、２，２，２−トリフルオロエチルエステル、プロピルエステル、ｉ−プロピルエステル、ｎ−ブチルエステル。
【００２１】
メチルエステル（１）
元素分析：Ｃ18Ｈ22０6として理論値：Ｃ＝６４．６６、Ｈ＝６．６３、Ｏ＝２８．７１；実測値：Ｃ＝６４．５９、Ｈ＝６．５４、Ｏ＝２８．６５
質量スペクトル（分析フラグメント）：３３５（ｍ＋１）、３３４（分子イオン）、３０３（ｍ−３１）
ｎ−プロピルエステル（３）
元素分析：Ｃ20Ｈ26Ｏ6として理論値：Ｃ＝６６．２８、Ｈ＝７．２３、Ｏ＝２６．４９；実測値：Ｃ＝６６．１８、Ｈ＝７．１５、Ｏ＝２６．３７
質量スペクトル（分析フラグメント）：３６３（ｍ＋１）、３６２（分子イオン）、３１９（ｍ−４３）
イソプロピルエステル（４）
元素分析：Ｃ20Ｈ26Ｏ6として理論値：Ｃ＝６６．２８、Ｈ＝７．２３、Ｏ＝２６．４９；実測値：Ｃ＝６６．２０、Ｈ＝７．１７、Ｏ＝２６．４０
質量スペクトル（分析フラグメント）：３６３（ｍ＋１）、３６２（分子イオン）、３１９（ｍ−４３）
２，２，２−トリフルオロエチルエステル（５）
元素分析：Ｃ19Ｈ21Ｆ3Ｏ6として理論値：Ｃ＝５６．７２、Ｈ＝５．２６、Ｆ＝１４．１７、Ｏ＝２３．８６；実測値：Ｃ＝５６．６３、Ｈ＝５．１８、Ｆ＝１４．１１、Ｏ＝２３．８０
質量スペクトル（分析フラグメント）：４０３（ｍ＋１）、４０２（分子イオン）、３０３（ｍ−９９）
２，２，２−トリクロロエチルエステル（６）
元素分析：Ｃ19Ｈ21Ｃｌ3Ｏ6として理論値：Ｃ＝５０．５２、Ｈ＝４．６９、Ｃｌ＝２３．５４、Ｏ＝２１．２５；実測値：Ｃ＝５０．４３、Ｈ＝４．６５、Ｃｌ＝２３．４５、Ｏ＝２１．１４
質量スペクトル（分析フラグメント）：４５８（ｍ＋６）、４５６（ｍ＋４）、４５４（ｍ＋２）、４５２（分子イオン）、３０３（ｍ−１４９）
ｎ−ブチルエステル（７）
元素分析：Ｃ21Ｈ28Ｏ6として理論値：Ｃ＝６７．００、Ｈ＝７．５０、Ｏ＝２５．５０；実測値：Ｃ＝６６．９２、Ｈ＝７．４２、Ｏ＝２５．４０
質量スペクトル（分析フラグメント）：３７７（ｍ＋１）、３７６（分子イオン）、３０３（ｍ−７３）
【実施例２】
【００２２】
ミコフェノール酸エチルエステルのエステル交換反応によるＭＭＦの調製
ミコフェノール酸エチルエステル１９５ｍｇ（０．５６ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（２ｍｌ）中に２５〜３０℃の温度で撹拌しながら溶解する。次いで、ＣＡＬ  Ｂ６０ｍｇおよびＮ−（２−ヒドロキシエチル）モルホリン０．２３ｍｌ（２４９ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）を添加する。反応混合物を、激しく撹拌しながら２５〜３０℃の温度で３５時間維持する。この期間の後、反応を終了させる。酵素をろ過で除去し、ろ液を減圧下で濃縮して、オイル状残渣を得る。このオイル状残渣をジクロロメタン（２０ｍｌ）に溶解し、得られた有機溶液を、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１５ｍｌ）、次いで水の順で洗浄する。次いで、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮して、ＭＭＦ２０６ｍｇ（０．４５ｍｍｏｌ、収率８２％）を得る。分析目的用に、この生成物を、シリカゲル（ｐ／ｐ＝１／１００）でのクロマトグラフィーによって、ジクロロメタン／メタノール＝９６／４（体積／体積）で溶出させて精製し、精製されたＭＭＦ（１４３ｍｇ）を回収する。
1H-NMR (500 MHz) CDCl3: 1.80 (s, 3H, CH3-C=), 2.18(s, 3H, CH3-Ar), 2.20-2.45 (m, 4H, CH2-NおよびCH2-C=), 2.48 (m, 4H, 2 CH2-N), 2.60 (m, 2H, CH2CO), 3.40 (d, 2H, CH2Ar), 3.78(m, 4H, CH2O), 3.80 (s, 3H, OCH3), 4.20 (t, 2H, CH2O), 5.15-5.30 (m, 3H, CH2OおよびCH=)。
【００２３】
また、以下のＭＰＡエステルからもエステル交換反応を行うことによって、類似した方法でＭＭＦを調製した：メチルエステル、２，２，２−トリフルオロエチルエステル、２，２，２−トリクロロエチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｉ−プロピルエステル、ｎ−ブチルエステル。
【国際調査報告】
2008511309.tif 000004
2008511309.tif 000005