(57)【要約】  本発明は、終末糖化産物受容体（ＡＧＥＲ）のＮ末端のドメインの同定、機能性及び使用に関する。前記ドメインは、表記受容体多量体化エピトープ（ＲＭＥ）と、全てのＡＧＥＲタンパク質配列において高度に保存されている。前記ドメインは、ＡＧＥＲの自己会合及び他のタンパク質とのヘテロマー化のための媒介物質に相当する。本発明は、ＡＧＥＲのＣ末端に由来するペプチド（ＡＧＥＲ−ＣＤＰ）の同定、機能性及び使用にも関する。本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ及びＡＧＥＲ−ＣＤＰは、個体の能動又は受動免疫法のための免疫原として天然リガンド交換効果を調節するＡＧＥＲリガンドを同定するための標的として、免疫原性反応を同定するために使用される診断手段として、及びＡＧＥＲを伴うタンパク質−タンパク質交換効果を調節するために使用されるペプチドリガンドとして適切である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰに対するポリクローナル抗血清又はモノクローナル抗体を調製するための免疫原としての、ペプチド断片を含み、自己多量体化可能な、最終糖化産物受容体（ＡＧＥＲ）の、Ｎ末端ＡＧＥＲ外部ドメインの、又はＡＧＥＲＩｇ様Ｃドメイン由来のペプチド（ＡＧＥＲ−ＣＤＰ）の、又はＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰの機能的免疫原性均等物の受容体多量体化エピトープ（ＲＭＥ）の使用。
【請求項２】
Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｒｅｆ．  Ｓｅｑ．配列ＮＭ ００１１３６に示されているアミノ酸配列を有するヒトＡＧＥＲ外部ドメイン又は機能的に均等な外部ドメイン、特に前記ヒトＡＧＥＲ外部ドメインのＶドメインに由来する、約８ないし５０アミノ酸残基の長さを有するＡＧＥＲ−ＲＭＥが使用される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ＡＧＥＲ−ＲＭＥが、以下の配列：
【化１】
2008526243.tif 000018
を含む、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
ＡＧＥＲ−ＲＭＥが、
【化２】
2008526243.tif 000019
から選択される配列を含む、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
ＡＧＥＲ−ＲＭＥが、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４
（Ｘ１は、水素原子又はアミノ酸Ｑ又はジペプチドＤＱであり；
Ｘ２は、ＮＩＴＡＲＩＧ（Ｋ／Ｅ）ＰＬ（Ｖ／Ｍ）Ｌ（Ｎ／Ｓ／Ｋ）（配列番号５）；
Ｘ３は、請求項３又は４に記載の配列であり；及び
Ｘ４は、ペプチド配列ＷＫＬＮである。）
から選択される配列を含む、請求項３又は４に記載の使用。
【請求項６】
ＡＧＥＲ−ＲＭＥが、配列番号１、２、３及び５並びに一般式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４（Ｘ１ないしＸ４は、上記定義のとおりである。）の配列から選択される、請求項３ないし５の何れか１項に記載の使用。
【請求項７】
Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｒｅｆ．  Ｓｅｑ．配列ＮＭ ００１１３６に示されているアミノ酸配列を有するヒトＡＧＥＲ外部ドメイン又は機能的に均等な外部ドメイン、特に前記ヒトＡＧＥＲ外部ドメインのＣ様ドメインに由来する、約５ないし５０アミノ酸残基の長さを有するＡＧＥＲ−ＣＤＰが使用される、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
ペプチドが、以下の配列：
【化３】
2008526243.tif 000020
の１つを含む、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
ＡＧＥＲ−ＣＤＰが、配列番号３１、３２又は３３から選択される、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰが環状ペプチドの形態である、請求項１〜９の何れか１項に記載の使用。
【請求項１１】
ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰに対する自己抗体が生じる疾病又は疾病の段階の診断のための、請求項１〜１０の何れか１項に記載のＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰの使用。
【請求項１２】
ＡＧＥＲによって媒介される疾病又は疾病の段階の診断又は治療用医薬組成物を製造するための、請求項１〜６の何れかに記載のＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰの、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｒｅｆ．  Ｓｅｑ．配列ＮＭ ００１１３６に示されているアミノ酸配列を有するＡＧＥＲ外部ドメイン及びそのN末端細断片の、並びにこれらのＡＧＥＲ分子の変異タンパク質及び誘導体の、又はＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ結合リガンドの使用。
【請求項１３】
ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰ結合リガンドが使用される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
疾病又は疾病の段階が、ＡＧＥＲ／ＡＧＥＲ、ＡＧＥＲ／リガンド、ＡＧＥＲ／受容体、ＡＧＥＲ／受容体／リガンド、ＡＧＥＲ／受容体／共受容体及び／又はＡＧＥＲ／受容体／カウンター受容体の相互作用と関連する、請求項１２又は１３に記載の使用。
【請求項１５】
疾病又は疾病の段階が、
ａ）頭部及び脊髄の機械的損傷、
ｂ）虚血性障害、
ｃ）神経変性疾患、炎症性疾患及び自己免疫疾患から選択される慢性疾患、
ｄ）糖尿病の続発症、
ｅ）腫瘍の進行及び転移、
ｆ）過剰な神経突起の発芽及び／又は病的シナプス形成によって引き起こされる、精神障害及び疼痛の慢性的状態を伴う変化を受けた神経新生過程、
ｇ）神経細胞の再生の、軸索の発芽の、神経突起伸長の、及び神経細胞の可塑性の障害、
ｈ）中枢／末梢性アミロイド疾患、並びに
ｉ）動脈硬化症、
から選択される、請求項１２〜１４の何れか１項に記載の使用。
【請求項１６】
ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰ結合リガンドが抗ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又は抗ＡＧＥＲ−ＣＤＰ抗体である、請求項１２〜１５の何れか１項に記載の使用。
【請求項１７】
ＡＧＥＲ結合リガンドの検出又は同定のための標的としての、請求項１〜１０の何れかに記載のＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰの使用。
【請求項１８】
能動又は受動免疫法のための免疫原としての、請求項１〜９の何れかに記載のＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰの使用。
【請求項１９】
請求項１〜１０の何れかに記載のＡＧＥＲ−ＲＭＥペプチド又はＡＧＥＲ−ＣＤＰの抗原量で哺乳動物を免役化することによって取得できるポリクローナル抗ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又は抗ＡＧＥＲ−ＣＤＰ抗血清。
【請求項２０】
適宜ヒト化された形態の、モノクローナル抗ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又は抗ＡＧＥＲ−ＣＤＰ抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２１】
以下の特性の少なくとも１つ：
ａ）請求項１〜１０の何れかに記載のＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰに対する改善された特異性、
ｂ）請求項１〜９に記載のＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰの関与を伴って形成された新規エピトープに対する改善された特異性、
ｃ）ｓＲＡＧＥ又は抗ＡＧＥＲ−ＲＭＥ抗体を用いた、ＡＧＥＲ−ＲＭＥによって媒介される多量体化の阻害、
ｄ）ＡＧＥＲリガンドによって誘導されるｓＲＡＧＥの受容体状態の特異的認識、
ｅ）ｓＲＡＧＥへのＡＧＥＲリガンドの結合を調節するｓＲＡＧＥの受容体立体配置の誘導、
を有する、請求項１９に記載の抗血清又は請求項２０に記載の抗体。
【請求項２２】
ａ）請求項２０又は２１に記載のモノクローナル抗体に由来する第一の抗原結合ドメインと、及び
ｂ）ＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰと相互作用することが可能である細胞表面受容体に対して特異性を有する、又はこれらの受容体の１つに対するリガンド、共受容体若しくはカウンター受容体に対して特異性を有する第二の抗原結合ドメインと、
を含むモノクローナル二重特異性抗体又は適宜ヒト化された形態の、その抗原結合断片。
【請求項２３】
請求項１〜９の何れかに記載のＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰを含むハイブリッドタンパク質。
【請求項２４】
免疫グロブリン及びその断片から選択されるタンパク質の機能的部分をさらに含む、請求項２３に記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項２５】
ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰに機能的に連結されたＩｇＦｃ断片を含む、請求項２３に記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項２６】
ＰＥＧ化された形態の、又はマーカーに結合された、請求項１〜９の何れかに記載のＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰを含む、ＡＧＥＲ−ＲＭＥ誘導体又はＡＧＥＲ−ＣＤＰ誘導体。
【請求項２７】
ａ）請求項１〜１０の何れかに記載のＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰ、
ｂ）請求項１〜１０の何れかに記載のＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰをコードする核酸配列；
ｃ）請求項１９〜２１の何れか１項に記載のモノクローナル又はポリクローナル抗ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又は抗ＡＧＥＲ−ＣＤＰ抗体；
ｄ）請求項２２に記載の二重特異性抗体、並びに
ｅ）請求項２３〜２５の何れか１項に記載のハイブリッドタンパク質及び誘導体
から選択される少なくとも１つの活性成分を、医薬として許容される担体中に含む医薬組成物。
【請求項２８】
請求項１９〜２１の何れかに記載の、少なくとも１つのモノクローナル又はポリクローナル抗ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又は抗ＡＧＥＲ−ＣＤＰ抗体を含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
ａ）神経栄養因子、イノシン、ニューロイムノフィリン、コンドロイチン硫酸、プロテオグリカン分解酵素；
ｂ）神経突起成長阻害剤、Ｎｏｇｏ−Ａ、ＭＡＧ、Ｏｍｇｐ及び／又はこれらの受容体に対する抗体、
ｃ）可溶性ＮｇＲ断片、Ｎｏｇｏ−Ａペプチド断片、
ｄ）ｐ７５によって媒介されるシグナルカスケードの阻害剤、
ｅ）ｃＡＭＰ及び機能的類縁体、タンパク質キナーゼＡ、アルギナーゼＩ、ポリアミン、毛様体神経栄養因子（ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｓ  ｆａｃｔｏｒ）
から選択される活性物質を、活性成分としてさらに含む、請求項２７又は２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
髄腔内、静脈内、皮下、経口又は非経口、経鼻及び吸入投与のための、請求項２７〜２９の何れか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
医薬として許容される担体中に、及び場合により、能動免疫のためのアジュバントとともに、請求項１〜１０の何れかに記載のＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰを含む免疫原。
【請求項３２】
その中にエフェクターが疑われている試料が、請求項１〜１０の何れかに記載のＡＧＥＲ−ＲＭＥポリペプチド又はＡＧＥＲ−ＣＤＰとともにインキュベートされ、及びエフェクター−ＡＧＥＲ−ＲＭＥ複合体又はエフェクター−ＡＧＥＲ−ＣＤＰ複合体の形成について混合物が調査される、ＡＧＥＲ受容体のエフェクターを検出するための方法。
【請求項３３】
少なくとも１つの制御核酸配列に作動可能に連結された、請求項１〜９の何れかに記載のＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰに対する少なくとも１つのコード核酸配列を含む発現ベクター。  
【請求項３４】
少なくとも１つの請求項３３に記載のベクターを有する組換え微生物。
【請求項３５】
請求項１９〜２１の何れかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株。
【請求項３６】
請求項３４に記載の組換え微生物が培養され、及び産生されたタンパク質産物が培養物から単離される、請求項１〜９の何れか１項に記載のＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又は請求項２３〜２５の何れか１項に記載のハイブリッドタンパク質を調製するための方法。
【請求項３７】
請求項３５に記載のハイブリドーマ細胞株が培養され、及び産生されたタンパク質産物が培養物から単離される、請求項１９〜２１の何れか１項に記載のモノクローナル抗体を生産するための方法。
【請求項３８】
配列番号６に対して１００％未満の相同性を有する、請求項１〜６の何れかに記載のＡＧＥＲ−ＲＭＥの機能的均等物。
【請求項３９】
以下の特性の少なくとも１つ：
ａ）アクチン細胞骨格再編成（ＡＣＲ）アッセイにおけるシグナル伝達の阻害；
ｂ）ＡＧＥＲリガンドとの結合に対するｓＲＡＧＥとの競合；
ｃ）自己多量体化又はＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はｓ−ＲＡＧＥとの多量体化；
を有する、請求項３８に記載のＡＧＥＲ−ＲＭＥの機能的均等物。
【請求項４０】
以下の一般式：
ＺＸ１ＺＺＸ２Ｚ
（残基Ｚは、互いに独立に、正に帯電した側鎖を有するアミノ酸残基であり；並びに
残基Ｘ１及びＸ２は、互いに独立に、正に帯電した側鎖を有しない何れかの１〜５個の同一又は別異のアミノ酸である。）
の、高い正電荷密度を有する中核配列を有する、請求項３８又は３９に記載のＡＧＲＥ−ＲＭＥの機能的均等物。
【請求項４１】
抗原特異性が異なる少なくとも２つのモノクローナル抗体の組み合わせであり、少なくとも１つの第一のモノクローナル抗体が、ＡＧＥＲのＩｇ様Ｖドメインの配列領域から全体的に又は部分的に形成される抗原に結合し、及び少なくとも１つの第二のモノクローナル抗体が、前記Ｉｇ様Ｖドメインとは異なるＡＧＥＲドメインの配列領域によって全体的に又は部分的に形成される抗原に結合する、前記組み合わせ。
【請求項４２】
請求項４１に記載の抗体の組み合わせであり、ＩｇＧ様Ｖドメインと異なるＡＧＥＲドメインがＡＧＥＲのＩｇ様Ｃドメインである、前記抗体の組み合わせ。
【請求項４３】
請求項４１又は４２に記載の抗体の組み合わせであり、少なくとも１つの第一のモノクローナル抗体、及び適宜少なくとも１つの第二のモノクローナル抗体が、ＡＧＥＲの又はその可溶性均等物の、結合対との結合と競合する、前記抗体の組み合わせ。
【請求項４４】
前記結合対がＡβ球状体（Ａβ  ｇｌｏｂｕｌｏｍｅｒ）である、請求項４３に記載の抗体の組み合わせ。
【請求項４５】
医薬として使用するための、請求項４１〜４４の何れか１項に記載の抗体の組み合わせ。
【請求項４６】
請求項４１〜４４の何れか１項に記載の抗体の組み合わせを含む医薬組成物。
【請求項４７】
請求項１４及び１５の何れかに記載の疾病又は病的状態の治療用医薬組成物を製造するための、請求項４１〜４４の何れか１項に記載の抗体の組み合わせの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、終末糖化産物受容体（ＡＧＥＲ又はＲＡＧＥ）のＮ末端から得られるドメインの同定、機能性及び使用に関する。受容体多量体化エピトープ（ＲＭＥ；ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ）と呼ばれるこれらのドメインは、全てのＡＧＥＲタンパク質配列において高度に保存されている。これらのドメインは、ＡＧＥＲ自己会合及び他のタンパク質とのヘテロマー化に対する媒介物質の役割を担っている。本発明は、同様に、ＡＧＥＲのＣドメインに由来するペプチド（ＡＧＥＲ−ＣＤＰ）の同定、機能性及び使用に関する。本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ及びＡＧＥＲ−ＣＤＰは、天然リガンドの相互作用を調節するＡＧＥＲリガンドを同定するための標的として、個体の能動又は受動免疫法のための免疫原として、免疫原性反応を同定するための診断手段として、及びＡＧＥＲを伴うタンパク質−タンパク質相互作用を調節するためのペプチドリガンドとして適している。
【背景技術】
【０００２】
多数のヒト疾患が、ＡＧＥＲ又はＡＧＥＲ結合リガンドの発生の増加を伴うことが、従来技術から公知である（Ｊｅｒｕｍｓ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ：Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ２００３  Ｎｏｖ  １  ；４１９（１）：５５−６２．；Ｂｕｃｃｉａｒｅｌｌｉ  ＬＧ  ｅｔ  ａｌ：Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ２００２  Ｊｕｌ；５９（７）：１１１７−２８；  Ｈｏｆｍａｎｎ  ＨＳ  ｅｔ  ａｌ．：Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．  ２００４  Ｓｅｐ  １  ；１７０（５）：５１６−９；  Ｌｏｔｚｅ  ＭＴ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ．  ２００３  Ｄｅｃ；４（１２）：１４０５−９）。
【０００３】
ＷＯ−Ａ−２００４／０１６２２９号は、リガンド結合可能なＮ末端ＡＧＥＲ断片（ＲＡＧＥ−ＬＢＥ）を記載しており、特に、ＡＧＥＲ関連疾患の治療のための（免疫グロブリン要素との融合タンパク質としての）それらの使用を提案している。このような疾患の例として挙げられているのは、アミロイドーシス、癌、関節炎、クローン病、慢性炎症疾患、急性炎症疾患、心血管疾患、糖尿病、糖尿病の合併症、プリオン関連疾患、脈管炎、腎障害、網膜症及び神経障害である。具体的に挙げられているＡＧＥＲ関連疾患は、アルツハイマー病、関節リウマチ、骨関節炎、腸疾患、多発性硬化症、乾癬、狼瘡、自己免疫疾患全般、敗血症、動脈硬化症及び再狭窄である。１１８−３４４アミノ酸の長さを有するＡＧＥＲ断片（各事例において、受容体の最初のＮ末端残基から始まる。）が使用されることが、国際特許出願中に特に提案されている。より短い断片は記載されていない。本ＷＯ明細書は、ＡＧＥＲアミノ酸配列のエピトープと特異的に免疫反応性を有する単離された抗体が治療に有用である可能性についても、一般的に言及している。具体的なエピトープは提案されておらず、産生される具体的な抗体も提案されていない。
【０００４】
従って、本発明の目的は、ＡＧＥＲ関連疾患の治療に対する新規治療的アプローチを提供することである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
驚くべきことに、上記目的は、ＡＧＥＲの特異的な受容体多量体化エピトープ（ＲＭＥ）及びＡＧＥＲのＩｇ様Ｃドメインのペプチドを単離及び性質決定することによって達成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
Ｉ．発明の具体的な態様
本発明の第一の態様は、ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰに対するポリクローナル抗血清又はモノクローナル抗体を調製するための免疫原としての、ペプチド断片を含み、自己多量体化可能な、終末糖化産物受容体（ＡＧＥＲ）の、Ｎ末端ＡＧＥＲ外部ドメインの、又は特にＩｇ様Ｃドメイン（特に、Ｉｇ様Ｃ２ドメイン、１型及び／又はＩｇ様Ｃ２ドメイン２型など）などの非ＶドメインＡＧＥＲドメイン由来のペプチド（ＡＧＥＲ−ＣＤＰ）の、又はＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰの機能的免疫原性均等物の受容体多量体化エピトープ（ＲＭＥ）の使用に関する。
【０００７】
本事例で使用されるＡＧＥＲ−ＲＭＥは、特に、約８〜５０アミノ酸残基の長さを有し、及びＧｅｎｂａｎｋ  Ｒｅｆ．  Ｓｅｑ．配列ＮＭ ００１１３６に示されているアミノ酸配列を有するヒトＡＧＥＲ外部ドメイン又は機能的に均等な外部ドメインに、特にＶ型のＩｇ様ドメイン（Ｖドメイン）に由来する。
【０００８】
ＡＧＥＲ−ＲＭＥは、例えば、以下の配列を含む。
【０００９】
【化４】
2008526243.tif 000002
ＡＧＥＲ−ＲＭＥは、好ましくは
【００１０】
【化５】
2008526243.tif 000003
から選択される配列を含む。
【００１１】
本発明に従って使用することができるＡＧＥＲ−ＲＭＥは、しかしながら、以下の一般式の配列：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４
（Ｘ１は、水素原子又はアミノ酸Ｑ又はジペプチドＤＱであり；
Ｘ２は、ＮＩＴＡＲＩＧ（Ｋ／Ｅ）ＰＬ（Ｖ／Ｍ）Ｌ（Ｎ／Ｓ／Ｋ）（配列番号５）であり；
Ｘ３は、配列番号１、２、３又は４に記載の配列であり；及び
Ｘ４は、ペプチド配列ＷＫＬＮである。）
も含み得る。
【００１２】
例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｒｅｆ．  Ｓｅｑ．配列ＮＭ ００１１３６に示されているアミノ酸配列を有するヒトＡＧＥＲ外部ドメイン又は機能的に均等な外部ドメイン、特にＩｇ様Ｃドメイン、特にそのＣ２ドメイン１型及び／又は２型（図１も参照）に由来する、約５〜５０アミノ酸残基の長さを有するＡＧＥＲ−ＣＤＰが、本発明に従って使用される。
【００１３】
適切なＡＧＥＲ−ＣＤＰペプチドは、以下の配列の１つを含む。
【００１４】
ＤＧＫＰＬＶＰＮＥＫＧＶＳＶＫＥＱＴＲＲＨＰＥＴＧＬＦＴＬＱ（配列番号３１）
ＴＬＱＳＥＬＭＶＴＰＡＲＧＧＤＰＲＰＴＦＳＣＳＦＳＰＧＬＰＲ（配列番号３２）及び
ＬＰＲＨＲＡＬＲＴＡＰＩＱＰＲＶＷＥＰＶＰＬＥＥＶＱＬＶＶＥ（配列番号３３）。
【００１５】
あるいは、ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰ、特に上記配列の１つを有するＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰは、環状ペプチドの形態であり得る。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、診断マーカーとしての、例えば、ＡＧＥＲ−ＲＭＥに対する自己抗体が生じる疾病又は疾病の段階の診断のための捕捉抗原としての、上記ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰの使用に関する。
【００１７】
本発明のさらなる態様は、ＡＧＥＲによって媒介される疾病又は疾病の段階の診断又は治療用医薬組成物を製造するための、上記のＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰの、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｒｅｆ．  Ｓｅｑ．配列ＮＭ ００１１３６に示されているアミノ酸配列を有するＡＧＥＲ外部ドメイン及びそのN末端細断片の、並びにこれらのＡＧＥＲ分子の変異タンパク質及び誘導体の、又はＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ結合リガンドの使用に関する。
【００１８】
本発明に従って治療することが可能な疾病又は疾病の段階は、ＡＧＥＲ／ＡＧＥＲ、ＡＧＥＲ／リガンド、ＡＧＥＲ／受容体、ＡＧＥＲ／受容体／リガンド、ＡＧＥＲ／受容体／共受容体及び／又はＡＧＥＲ／受容体／カウンター受容体の相互作用と関連する疾病又は疾病の段階である。
【００１９】
ＡＧＥＲ／ＡＧＥＲ相互作用と関連するとして挙げることができる疾患の例は、アルツハイマー病及びアミロイドーシスであり、ＡＧＥＲ／リガンド相互作用と関連する疾患として挙げられる例は、アルツハイマー性認知症及びＨＩＶ関連認知症であり、ＡＧＥＲ／受容体相互作用と関連する疾患として挙げられる例は、脊髄損傷及び頭部外傷であり、ＡＧＥＲ／受容体／共受容体及び／又はＡＧＥＲ／受容体／カウンター受容体相互作用と関連する疾患として挙げられる例は、多発性硬化症、敗血症、動脈硬化症である。
【００２０】
本発明に従って治療し、及び／又は診断することができる疾病又は疾病の段階は、さらに、以下の群から選択され得る。
【００２１】
ａ）頭部及び脊髄の機械的損傷、
ｂ）卒中などの虚血性障害、
ｃ）特に、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、ＨＩＶ−１関連認知症などの神経変性疾患、炎症性疾患及び自己免疫疾患から選択される慢性疾患、
ｄ）糖尿病性腎障害、糖尿病性神経障害及び糖尿病性脈管障害などの糖尿病の続発症、
ｅ）腫瘍の進行及び転移、
ｆ）うつ病及び統合失調症などの精神障害並びに切断後の幻想痛などの過剰な神経突起の発芽及び／又は病的シナプス形成によって引き起こされる、疼痛の慢性的状態を伴う変化を受けた神経新生過程、
ｇ）神経細胞の再生の、軸索の発芽の、神経突起伸長の、及び神経細胞の可塑性の障害、
ｈ）中枢／末梢性アミロイド疾患、及び
ｉ）動脈硬化症。
【００２２】
特定の実施形態において、ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰ結合リガンドは、抗ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又は抗ＡＧＥＲ−ＣＤＰ抗体である。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、ＡＧＥＲ結合リガンドの検出又は同定のための標的としての、上記ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰの使用に関する。
【００２４】
本発明のさらなる態様は、能動又は受動免疫法のための免疫原としての、上記ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰの使用に関する。
【００２５】
本発明は、さらに、上記ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰペプチドの抗原量とともに哺乳動物の免疫化によって取得できるポリクローナル抗ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又は抗ＡＧＥＲ−ＣＤＰ抗血清に関する。
【００２６】
本発明は、さらに、適宜ヒト化された形態の、モノクローナル抗ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又は抗ＡＧＥＲ−ＣＤＰ抗体又はその抗原結合断片に関する。
【００２７】
好ましい抗体又は抗血清は、以下の特性の少なくとも１つを有する。
【００２８】
ａ）上記ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰに対する改善された特異性、上記ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰの関与を伴って形成された新規エピトープに対する改善された特異性、
ｂ）（特に、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ又はアッセイにおいて観察されるべき）ｓＲＡＧＥ又は抗ＡＧＥＲ−ＲＭＥ抗体による、ＡＧＥＲ−ＲＭＥによって媒介される多量体化の阻害、
ｃ）ＡＧＥＲリガンドによって誘導される、例えば、Ａβ１−４２によって誘導されるｓＲＡＧＥの受容体状態の特異的認識、
ｄ）例えば、例えばＡβ１−４２、Ａβ２０−４２、Ａβ１２−４２及びそれらの球状体、アミロイド、ＡＧＥから選択されるＡＧＲリガンドのｓＲＡＧＥへの結合を調節する（例えば促進するなど）ｓＲＡＧＥの受容体立体配置の誘導。
【００２９】
本発明は、さらに、
ａ）上記モノクローナル抗体に由来する第一の抗原結合ドメイン、及び
ｂ）例えば、ＡＧＥＲ、ＮｇＲなどのＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰと相互作用することが可能である少なくとも１つの細胞表面受容体に対して特異性を有する、又はこれらの受容体の１つに対するリガンド、共受容体若しくはカウンター受容体に対して特異性を有する第二の抗原結合ドメインと、
を含むモノクローナル二重特異性抗体又は適宜ヒト化された形態のその抗原結合断片に関する。
【００３０】
本発明は、さらに、上記ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰを含むハイブリッドタンパク質に関する。このようなハイブリッドタンパク質は、さらに、免疫グロブリン、及び、例えば、例えばＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰのＣ末端に機能的に連結されたＩｇＦｃ断片などの免疫グロブリンの断片から選択されるタンパク質の機能的な一部を含む。
【００３１】
本発明は、ＰＥＧ化された形態の、又は、例えば光学的、酵素的又は放射性マーカーに結合された、上記ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰを含む、ＡＧＥＲ−ＲＭＥ誘導体又はＡＧＥＲ−ＣＤＰ誘導体にも関する。
【００３２】
本発明のさらなる態様は、
ａ）上記ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰ、
ｂ）上記ＡＧＥＲ−ＲＭＥをコードする核酸配列、
ｃ）上記モノクローナル又はポリクローナル抗ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又は抗ＡＧＥＲ−ＣＤＰ抗体；
ｄ）上記二重特異性抗体、及び
ｅ）上記ハイブリッドタンパク質及び誘導体
から選択される少なくとも１つの活性成分を、医薬として許容される担体中に含む医薬組成物に関する。
【００３３】
本発明の医薬組成物は、さらなる活性成分として、
ａ）例えば、ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＢＮＤＦなどの神経成長因子などの神経栄養因子；イノシン；ＦＫ５０６、ＧＰＩ１０４６などのニューロイムノフィリン；コンドロイチナーゼＡＢＣなどのコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素；
ｂ）神経突起成長阻害剤に対する抗体、抗体ＩＮ−１、７Ｂ１２などのＮｏｇｏ−Ａ；ＭＡＧ；Ｏｍｇｐ及び／又は抗ＮｇＲ及び抗ｐ７５抗体などのこれらの受容体；
ｃ）可溶性ＮｇＲ断片、ＮＥＰ１−４０及びＮｏｇｏ６６などのＮｏｇｏ−Ａペプチド断片；
ｄ）ＲＨＯ  Ａ阻害剤、Ｙ−２７６３２などのＲＯＣＫ阻害剤などのｐ７５によって媒介されるシグナルカスケードの阻害剤、
ｅ）ｃＡＭＰ及び機能的類縁体、タンパク質キナーゼＡ、アルギナーゼＩ、ポリアミン、毛様体神経栄養因子（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｓ  ｆａｃｔｏｒ）
から選択される活性物質をさらに含み得る。
【００３４】
この種の医薬組成物は、例えば、髄腔内、静脈内、皮下、経口又は非経口、経鼻及び吸入投与に適している。
【００３５】
本発明は、さらに、医薬として許容される担体中に、及び、適宜、活性な免疫化のためのアジュバントとともに、上記ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰを含む免疫原に関する。
【００３６】
本発明は、その中にエフェクターが懸濁されている試料が、上記ＡＧＥＲ−ＲＭＥポリペプチド又はＡＧＥＲ−ＣＤＰポリペプチドとともにインキュベートされ、及びエフェクター−ＡＧＥＲ−ＲＭＥ複合体又はエフェクター−ＡＧＥＲ−ＣＤＰ複合体の形成について混合物が調査される、ＡＧＥＲ受容体のエフェクターを検出するための方法にも関する。
【００３７】
本発明は、さらに、少なくとも１つの制御核酸配列に作動可能に連結された、上記直鎖ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰに対する少なくとも１つのコード核酸配列を含む発現ベクターに関する。
【００３８】
本発明は、さらに、少なくとも１つのこのようなベクターを有する組換え微生物に関する。
【００３９】
本発明は、上記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株にも関する。
【００４０】
本発明は、さらに、上記組換え微生物が培養され、及び産生されたタンパク質産物が培養物から単離される、上記ＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又は後者を含むハイブリッドタンパク質を作製するための方法に関する。
【００４１】
本発明は、さらに、上記ハイブリドーマ細胞株が培養され、及び産生されたタンパク質産物が培養物から単離される、上記モノクローナル抗体を生産するための方法に関する。
【００４２】
本発明は、さらに、配列番号６に対して１００％未満の相同性を有する、上記ＡＧＥＲ−ＲＭＥの機能的均等物、特に免疫原性均等物を含む。
【００４３】
ＡＧＥＲ−ＲＭＥの本発明の機能的均等物は、以下の特性：
ａ．アクチン細胞骨格再編成（ＡＣＲ）アッセイにおけるシグナル伝達の阻害；
ｂ．例えば、Ａβ球状体、Ａβ１−４２、Ａβ２０−４２、Ａβ１２−４２、アミロイド、ＡＧＥなどのＡＧＥＲリガンドとの結合についてｓＲＡＧＥと競合；
ｃ．自己多量体化又はＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はｓ−ＲＡＧＥとの多量体化；
の少なくとも１つを有する。
【００４４】
ＡＧＥＲ−ＲＭＥの本発明に係る機能的均等物は、以下の一般式：
ＺＸ１ＺＺＸ２Ｚ
（残基Ｚは、互いに独立に、正に帯電した側鎖を有するアミノ酸残基（特に、リジン及びアルギニンなど）であり；並びに
残基Ｘ１及びＸ２は、互いに独立に、正に帯電した側鎖を有しない何れかの１〜５個の同一又は別異のアミノ酸である。）
の、高い正電荷密度を有する中核配列をさらに有し得る。
【００４５】
本発明のさらなる態様は、抗原特異性が異なる少なくとも１つの第一のモノクローナル抗体と少なくとも１つの第二のモノクローナル抗体の組み合わせであり、少なくとも１つの第一のモノクローナル抗体（又は例えば、２、３若しくは４個の第一のモノクローナル抗体などの２若しくはそれ以上の群）が、ＡＧＥＲ（又はｓＲＡＧＥ）のＩｇ様Ｖドメインの配列領域から全体的に又は部分的に形成される抗原に結合し、及び少なくとも１つの第二のモノクローナル抗体（又は例えば、２、３若しくは４個の第二のモノクローナル抗体などの２若しくはそれ以上の群）が、このＩｇ様Ｖドメインとは異なるＡＧＥＲドメイン（非Ｖドメイン）の配列領域から全体的に又は部分的に形成される抗原に結合する、前記組み合わせに関する。
【００４６】
このＩｇＧ様Ｖドメインと異なるＡＧＥＲドメインがＡＧＥＲのＩｇ様Ｃドメイン（例えば、Ｃ２の１型及び／又はＣ２の２型を含む。）である抗体の組み合わせが、特に記載される。
【００４７】
少なくとも１つの第一のモノクローナル抗体が、及び適宜少なくとも１つの第二のモノクローナル抗体が、ＡＧＥＲの又はその可溶性均等物の、ＡＧＥＲ結合対（例えば、Ａβ球状体など）との結合と競合する、前記抗体の組み合わせも記載されている。
【００４８】
本発明は、このような抗体の組み合わせの、医薬としての使用にも関する。
【００４９】
本発明は、さらに上記抗体の組み合わせを含む医薬組成物に関する。
【００５０】
本発明は、上記疾病又は病的状態の治療用医薬組成物を製造するための本発明の抗体の組み合わせの使用に関する。
【００５１】
ＩＩ．一般的な用語の説明
本発明の文脈において、「受容体」という表記は、細胞膜に結合されており、及び、例えば可溶性の、リガンドと相互作用することが可能であり、この相互作用の結果として、例えば細胞の内部に誘導されるシグナル又はシグナルカスケードを開始させることができる（シグナル伝達とも称される。）表面分子に対して特に与えられる。
【００５２】
「共受容体」という表記は、受容体と同じ細胞中に位置する膜構造要素に対して与えられる。共受容体は、受容体の機能性を規定及び／又は調節するために必要である。
【００５３】
「カウンター受容体」という表記は、２つの異なる（隣接する）細胞上に位置し、及び相互接触した状態になることができ、これによりシグナル伝達を開始することができる膜結合型表面分子に対して与えられる。
【００５４】
「リガンド」という表記は、「受容体」に対する、天然の、すなわちインビボで産生された、又は人工的に生成された低分子量又は高分子量結合対に対して与えられる。リガンドは、好ましくは、細胞外環境中で自由誘導をすることができる。
【００５５】
「受容体多量体化エピトープ（ＲＭＥ）」は、特に、自己多量体化が可能であり、従って、二量体、三量体、四量体などの複合体を、実質的に同じアミノ酸配列を有するオリゴペプチド又はポリペプチドとともに形成することが可能なペプチド断片を意味する。ＲＭＥは、さらに、ヘテロ多量体化が可能であり得、ＲＭＥとは異なる少なくとも１つのオリゴペプチド又はポリペプチドと複合体を形成し得る。複合体形成は、例えば、適宜、例えば、タンパク質生化学の慣用法を用いた架橋による複合体の安定化後における、ゲルクロマトグラフィー、未変性ゲル電気泳動によって検出することが可能である。
【００５６】
「免疫原」という表記は、免疫原に対する抗体の形成を誘導するのに適している、グリコシル化された形態又はグリコシル化されていない形態の本発明のペプチド断片に対して与えられる。巨大分子担体への免疫原の（ハプテンとしての）結合は、適宜、有利であり得る。
【００５７】
「エピトープ」又は抗原決定基という表記は、例えば、タンパク質などの抗原の抗体特異性を規定する領域に対して与えられる。このエピトープが、タンパク質のセグメント中に新たに形成されるか、又は、例えば、タンパク質のリガンドとの相互作用などの、例えば外部的影響を通じて接近可能な分子表面上に発現されれば、使用される用語は「ネオエピトープ」である。
【００５８】
タンパク質又は抗体の「ドメイン」という表記は、αヘリックス及び／又はβプリーツシート要素によって形成され、並びにタンパク質内で区切られた複雑な構造に対して与えられる。図１に図示されているように、ｓＲＡＧＥは、例えば、Ｖ型のＩｇ様ドメイン並びにＣ２の１型及びＣ２の２型ドメインを含む。
【００５９】
「ｓＲＡＧＥ」は、例えば、配列番号３７に示されているようなｓＲＡＧＥ１−３３１などのＡＧＥＲ外部ドメインの可溶性形態を含む。別段の記載がなければ、ｓＲＡＧＥは、特に、ｓＲＡＧＥ１−３３１を意味する。
【００６０】
ＡＧＥＲ「Ｖドメイン」は、特に、図１中のヒト配列の残基２３−１１５（Ａｌａ２３−Ｖａｌ１１５）に対応する部分的配列などの様々なＡＧＥＲ分子に対して図１に図示されているように、ＡＧＥＲ分子のＮ末端の領域中に見出されるＩｇ様配列セグメントを表す。ＡＧＥＲ「非Ｖドメイン」は、ＡＧＥＲ分子中の上記ＶドメインのＣ末端に見出される。このような非Ｖドメインの例は、様々なＡＧＥＲ分子について図１に図示されているように、Ｉｇ様Ｃドメイン、特に、１型及び２型のＣ２ドメインである。
【００６１】
ＩＩＩ．本発明の実施に関するさらなる情報
１．ポリペプチド
本発明は、特に、ペプチド断片を含み、自己多量体化可能な、終末糖化産物受容体（ＡＧＥＲ）の、Ｎ末端ＡＧＥＲ外部ドメインの、又はＡＧＥＲ−ＲＭＥの機能的免疫原性均等物の自己多量体化可能な受容体多量体化エピトープ（ＲＭＥ）に関する。本発明において好ましいＡＧＥＲ−ＲＭＥは、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｒｅｆ．  Ｓｅｑ．配列ＮＭ ００１１３６に示されているアミノ酸配列を有するヒトＡＧＥＲ外部ドメイン又は機能的に均等な外部ドメインに由来する、約８ないし５０アミノ酸残基の長さを有する直鎖又は環状ペプチドである。
【００６２】
好ましいＡＧＥＲ−ＲＭＥは、以下の配列：
【００６３】
【化６】
2008526243.tif 000004
及び、特に、以下の配列の１つ
【００６４】
【化７】
2008526243.tif 000005
を含み得る。
【００６５】
本発明は、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｒｅｆ．  Ｓｅｑ．配列ＮＭ ００１１３６に示されているアミノ酸配列を有するヒトＡＧＥＲ外部ドメイン又は機能的に均等な外部ドメイン、特にこれらのＩｇ様Ｃドメインに由来する、約５ないし５０アミノ酸残基の長さを有するＡＧＥＲ−ＣＤＰにも関する。
【００６６】
適切なＡＧＥＲ−ＣＤＰペプチドの例は、以下の配列の１つを含む。
【００６７】
【化８】
2008526243.tif 000006
本発明は、同様に、具体的に開示されている新規ポリペプチドの「機能的均等物」も含む。
【００６８】
具体的に開示されているＡＧＥＲ−ＲＭＥポリペプチドの「機能的均等物」又は類縁体は、本発明において、例えば、配列番号６（Ｎｔｅｒｍ３１）又は配列番号３（Ｎｔｅｒｍ１３）に対して１００％未満の相同性を有するものなど、具体的に開示されているＡＧＥＲ−ＲＭＥポリペプチドとは異なるが、例えば、アクチン細胞骨格再編成（ＡＣＲ）アッセイ、ＡＧＥＲリガンドとの結合に対するｓＲＡＧＥとの競合、自己多量体化又はＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はｓＲＡＧＥとの多量体化などの所望の生物活性を有し続けるポリペプチドである。
【００６９】
具体的に開示されているＡＧＥＲ−ＣＤＰポリペプチドの「機能的均等物」又は類縁体は、本発明において、例えば、配列番号３１、３２又は３３に対して１００％未満の相同性を有するものなど、具体的に開示されているＡＧＥＲ−ＣＤＰポリペプチドとは異なるが、例えば、実施例に記載されている、ｓＲＡＧＥ−Ａβ−１−４２オリゴマー結合の阻害などの所望の生物活性を有し続けるポリペプチドである。
【００７０】
しかしながら、ＡＧＥＲ−ＲＭＥの機能的均等物は、以下の一般式：
ＺＸ１ＺＺＸ２Ｚ
（残基Ｚは、互いに独立に、正に帯電した側鎖を有するアミノ酸残基であり；並びに
残基Ｘ１及びＸ２は、互いに独立に、正に帯電した側鎖を有しない何れかの１〜５個の同一又は別異のアミノ酸である。）
の、高い正電荷密度を有する特徴的な中核配列又はリード構造も有し得る。
【００７１】
本発明において、「機能的均等物」とは、特に、上記具体的な配列の配列位置の少なくとも１つに、具体的に挙げられているものとは異なるアミノ酸を有するが、それにも拘らず、本明細書に挙げられている生物活性の１つを有する変異体を意味する。従って、「機能的均等物」は、１つ又はそれ以上のアミノ酸付加、置換、欠失及び／又は反転によって取得可能な変異体を含み、前記変化が本発明の特性のプロファイルを有する変異体をもたらす限り、前記変化はあらゆる配列位置に起こることが可能である。機能的均等物は、特に、変異体と非修飾ポリペプチド間に、反応性パターンの定性的な一致が存在する場合、すなわち、例えば、同一の生物学的効果が観察されるべきであるが、発現のレベルが大幅に異なる場合にも存在する。アミノ酸残基の適切な置換の例は、以下のとおりである。
【００７２】
【表１】
2008526243.tif 000007
【００７３】
上記意味での「機能的均等物」は、記載されているポリペプチドの前駆体、並びにポリペプチドの機能的誘導体及び塩でもある。「塩」という用語は、本発明のタンパク質分子のカルボキシル基の塩及びアミノ基の酸付加塩の両方を意味する。カルボキシル基の塩は、それ自体公知の様式で調製されることが可能であり、例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄及び亜鉛塩などの無機塩、並びに、例えば、トリエタノールアミン、アルギニン、リジン、ピペリジンなどのアミンなどの有機塩基との塩を含む。例えば、塩酸又は硫酸などの無機酸との塩などの酸付加塩並びに酢酸及びシュウ酸などの有機酸との塩は、同様に、本発明の一態様である。
【００７４】
本発明のポリペプチドの「機能的誘導体」は、同様に、公知技術の補助を得て、機能的アミノ酸側鎖基又はそれらのＮ末端若しくはＣ末端上に調製することも可能である。これらの種類の誘導体は、例えば、アンモニアとの又は第一級もしくは第二級アミンとの反応によって取得可能な、カルボン酸基の脂肪族エステル、カルボン酸基のアミド；アシル基との反応によって調製される遊離のアミノ基のＮ−アクリル誘導体；又はアシル基との反応によって調製される遊離の水酸基のＯ−アシル誘導体を含む。
【００７５】
もちろん、「機能的均等物」は、他の生物から取得可能なポリペプチド、及び天然に存在するバリアントも含む。例えば、相同的配列領域のエリアは、配列比較によって見出すことが可能であり、均等な酵素は、本発明の具体的な要件に基づいて確立することが可能である。
【００７６】
「機能的均等物」は、さらに、上記ポリペプチド配列又は該配列から得られる機能的均等物の１つと、及び機能的なＮ末端又はＣ末端結合での、これらとは機能的に異なる少なくとも１つのさらなる異種配列とを有する融合タンパク質である（すなわち、融合タンパク質の部分の相互の機能的損傷が無視できる。）。このような異種配列の非限定的な例は、例えば、酵素及び免疫グロブリンである。
【００７７】
同じく本発明によって含まれる「機能的均等物」は、具体的に開示されているタンパク質の相同体である。これらは、「Ｐｅａｒｓｏｎ  ｕｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ，  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）  ８５（８），  １９８８，  ２４４４−２４４８」のアルゴリズムによって計算された、具体的に開示された配列の１つに対して、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、特に少なくとも８５％、例えば、９０％、９５％又は９９％の相同性を有する。本発明の相同性ポリペプチドのパーセント相同性は、特に、本明細書に具体的に記載されているアミノ酸配列の１つの完全長に基づく、アミノ酸残基のパーセント同一性を意味する。
【００７８】
本発明において、「誘導された」アミノ酸配列とは、別段の記載がなければ、最初の配列と、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、特に９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％の同一性を有する配列を意味する。
【００７９】
２つの配列間の「同一性」とは、各事例において、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧ，  Ｓｈａｒｐ  ＰＭ  Ｆａｓｔ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｏｎ  ａ  ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｒ．  Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１９８９  Ａｐｒ；５（２）：１５１−１）を使用し、以下のパラメータ：
ギャップオープニングペナルティー  １０
ギャップ伸長ペナルティー  １０
ギャップ分離ペナルティー範囲  ８
ギャップ分離ペナルティー  オフ
アラインメントの遅延に対する％同一性  ４０
残基特異的ギャップ  オフ
親水性残基ギャップ  オフ
遷移重み付け  ０
ペアワイズアラインメントパラメータ：
ＦＡＳＴアルゴリズム  オン
Ｋ−ｔｕｐｌｅサイズ  １
ギャップペナルティー  ３
ウィンドウサイズ  ５
最良対角数  ５
を設定して、Ｉｎｆｏｒｍａｘ（ＵＳＡ）から得られるＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ７．１  Ｓｏｆｔｗａｒｅの補助を得た比較によって計算された同一性など、配列の完全長にわたるアミノ酸残基の同一性を意味する。
【００８０】
タンパク質のグリコシル化が可能な場合には、本発明の均等物は、脱グリコシル化された形態又はグリコシル化された形態の上記種類のタンパク質及びグリコシル化パターンを変化させることによって取得できる修飾された形態を含む。
【００８１】
本発明のペプチドの相同物は、例えば、末端切断変異体など、変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定することが可能である。例えば、例えば合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵素的連結によるなど、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異導入によって、ペプチドバリアントの多様化ライブラリーを生成することが可能である。縮退オリゴヌクレオチド配列から得られ得る相同体のライブラリーを作製するために使用できる数多くの方法が存在する。縮退遺伝子配列の化学的合成は、自動ＤＮＡ合成装置中で行うことが可能であり、次いで、合成遺伝子は、適切な発現ベクター中に連結することができる。遺伝子の縮退群の使用により、存在し得るタンパク質配列の所望される組をコードする全ての配列を１つの混合物中に提供することが可能となる。縮退オリゴヌクレオチドを合成するための方法は、当業者に公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，  Ｓ．Ａ．（１９８３）  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；  Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５３：３２３；  Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；  Ｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：４７７）。
【００８２】
２．核酸
本発明は、さらに、上記ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰペプチドをコードする核酸配列及び該核酸配列から誘導される核酸配列に関する。
【００８３】
本発明の全ての核酸配列（例えば、ｃＤＮＡ及びｍＲＮＡなどの一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡ配列）は、例えば、二重螺旋の重複する各相補的核酸単位の断片縮合によるなど、ヌクレオチド単位からの化学合成によって、それ自体公知の様式で調製することが可能である。オリゴヌクレオチドの化学的合成は、例えば、ホスホアミダイト法（Ｖｏｅｔ，  Ｖｏｅｔ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｗｉｌｅｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐａｇｅｓ８９６−８９７）により、公知の様式で行うことが可能である。合成オリゴヌクレオチドの付加及びＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片と連結反応を用いたギャップの充填、及び一般的なクローニング方法は、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ」に記載されている。
【００８４】
本発明において、「誘導された」アミノ酸配列とは、別段の記載がなければ、最初の配列と、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、特に９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％の同一性を有する配列を意味する。
【００８５】
２つの核酸間の「同一性」とは、核酸の完全長にわたるヌクレオチドの同一性を意味し、特に、各事例において、Ｃｌｕｓｔａｌ法（上記参照）を用いて、Ｉｎｆｏｒｍａｘ（ＵＳＡ）から得られるＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ７．１  Ｓｏｆｔｗａｒｅの補助を得た比較による同一性を意味する。
【００８６】
本発明は、上記ペプチドの１つ、及び例えば、人工ヌクレオチド類縁体の使用によって取得することができるそれらの均等物をコードする核酸配列にも関する。  
本発明は、本発明のペプチド又は生物学的に活性なそのセグメントをコードする単離された核酸分子、及び例えば、本発明のコード核酸を同定又は増幅するためのハイブリダイゼーションプローブ又はプライマーとして使用できる核酸断片の両方に関する。
【００８７】
本発明の核酸分子は、さらに、遺伝子のコード領域の３’及び／又は５’末端から得られる未翻訳配列を含み得る。
【００８８】
「単離された」核酸分子は、核酸の天然源中に存在する他の核酸分子から分離されており、さらに、それが組換え技術によって調製される場合には、他の細胞材料又は細胞培地を実質的に含まないか、又はそれが化学的に合成される場合には、化学的前駆体若しくはその他の化学物質を含まないことがあり得る。
【００８９】
本発明の核酸分子は、分子生物学の標準的な技術及び本発明によって提供される配列情報を用いて単離することが可能である。例えば、ｃＤＮＡは、（例えば、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．Ｆ．  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８９」に記載されているとおり）具体的に開示されている完全な配列又はそのセグメントの１つをハイブリダイゼーションプローブとして使用し、及び標準的なハイブリダイゼーション技術を使用することによって、適切なｃＤＮＡライブラリーから単離することが可能である。さらに、本発明の配列の１つ又はそのセグメントを含む核酸分子は、この配列に基づいて構築されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって単離することが可能である。このようにして増幅された核酸は、適切なベクター中にクローニングし、ＤＮＡ配列分析によって性質決定することが可能である。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成装置を用いて、標準的な合成方法によって調製することも可能である。
【００９０】
本発明は、さらに、具体的に記載されたヌクレオチド配列又はそのセグメントに対して相補的な核酸分子を含む。
【００９１】
本発明のヌクレオチド配列によって、他の細胞種及び生物中に相同な配列を同定及び／又はクローニングするために使用することができるプローブ及びプライマーを作製することが可能である。このようなプローブ及びプライマーは、通常、本発明の核酸配列のセンス鎖の、又は対応するアンチセンス鎖の少なくとも約１２個、好ましくは少なくとも約２５個（例えば約４０、５０又は７５などの）の連続するヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。
【００９２】
さらなる本発明の核酸配列は、本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ及びＡＧＥＲ−ＣＤＰに対するコード配列から誘導され、１つ又はそれ以上のヌクレオチドの付加、置換、挿入又は欠失によって本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ及びＡＧＥＲ−ＣＤＰに対するコード配列とは異なるが、なお、所望される特性のプロファイルを有するペプチドをコードする。
【００９３】
本発明は、いわゆるサイレント変異を含む核酸配列も含み、又は特定の元の生物又は宿主生物のコドン使用に従い、具体的に挙げられた配列と比較して修飾された核酸配列、並びに、例えば、これらのスプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントなどの天然に存在するバリアントも含む。保存的ヌクレオチド置換（すなわち、当該アミノ酸が、同じ電荷、サイズ、極性及び／又は溶解度のアミノ酸によって置換される。）によって取得できる配列が、同様に、一態様である。
【００９４】
本発明は、配列多型を通じて、具体的に開示されている核酸から誘導される分子にも関する。これらの遺伝的多型は、集団内の個体間における自然の変動のために存在し得る。これらの自然の変動は、通常、遺伝子のヌクレオチド配列中に、１から５％までの変動をもたらす。
【００９５】
本発明は、さらに、上記コード配列とハイブリダイズし、又はこれに相補的である核酸配列も含む。これらのポリヌクレオチドは、ゲノムライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって見出すことができ、適宜、適切なプライマーを用いたＰＣＲによって、そこから増幅し、続いて、例えば適切なプローブを用いて単離することが可能である。さらなる可能性は、微生物を増幅することにより、ポリペプチドを増幅し、続いて、ポリペプチドを単離するために、本発明のポリヌクレオチド又はベクターを用いて適切な微生物を形質転換することである。さらなる可能性は、化学的な経路によって、本発明のポリヌクレオチドを合成することである。
【００９６】
ポリヌクレオチド上に「ハイブリダイズ」できるという特性は、ストリンジェントな条件下で、非相補的な対の間に非特異的な結合が存在しつつ、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドが、ストリンジェントな条件下で、ほとんど相補的な配列に結合できることを意味する。この目的のために、配列は、７０−１００％、好ましくは９０−１００％相補的とすべきである。互いに特異的に結合できる相補的配列の特性は、例えば、ノーザン若しくはサザンブロッティング技術において、又はＰＣＲ若しくはＲＴ−ＰＣＲでのプライマー結合において使用される。通常、３０塩基対又はそれ以上の長さを有するオリゴヌクレオチドが、この目的のために使用される。ストリンジェントな条件とは、例えば、ノーザンブロッティング技術において、非特異的にハイブリダイズしたｃＤＮＡプローブ又はオリゴヌクレオチドを溶出するために、洗浄溶液、例えば、０．１％ＳＤＳ（２０×ＳＳＣ：３ＭのＮａＣｌ、０．３Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）を有する０．１×ＳＳＣ緩衝液を、５０−７０℃で、好ましくは６０−６５℃で使用することを意味する。この場合、上述のように、相補性の高い程度を有する核酸のみが、互いに結合した状態を保つ。ストリンジェントな条件の設定は当業者に公知であり、例えば、「Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８９），  ６．３．１−６．３．６．」に記載されている。
【００９７】
本発明のさらなる態様は、「アンチセンス」核酸に関する。これは、コード「センス」核酸に対して相補的であるヌクレオチド配列を含む。アンチセンス核酸は、全体のコード鎖に対して相補的であり得、又はそのセグメントに対してのみ相補的であり得る。さらなる実施形態において、アンチセンス核酸分子は、ヌクレオチド配列のコード鎖の非コード領域に対してアンチセンスである。「非コード領域」という用語は、５’及び３’非翻訳領域と称される配列セグメントに関する。
【００９８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０ヌクレオチド長であり得る。本発明のアンチセンス核酸は、本分野で公知の方法を用いて、化学合成及び酵素的連結反応によって構築することが可能である。分子の生物学的安定性を増加させるように、又はアンチセンス核酸とセンス核酸の間で形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるように設計された天然に存在するヌクレオチド又は様々に修飾されたヌクレオチドを用いて、アンチセンス核酸を化学的に合成することが可能である。使用可能な例は、ホスホロチオアート誘導体及びアクリジン置換されたヌクレオチドである。アンチセンス核酸を生成するために使用できる修飾されたヌクレオチドの例は、特に、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、メチルウラシル−５−オキシアセタート、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ及び２，６−ジアミノプリンである。アンチセンス核酸は、アンチセンス方向でその中に核酸がサブクローニングにされている発現ベクターを使用することによっても、生物学的に作製し得る。
【００９９】
３．発現構築物及びベクター
本発明は、さらに、制御核酸配列の遺伝的調節下において、本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又は機能的均等物若しくは免疫グロブリンをコードする核酸配列を含む発現構築物に関し、及びこれらの発現構築物の少なくとも１つを含むベクターに関する。
【０１００】
好ましくは、本発明のこのような構築物は、特定のコード配列から５’上流に存在するプロモーター及び３’下流に存在するターミネーター配列を含み、及び、適宜、その他の通常の制御要素、特に、それぞれコード配列に作動可能に連結された制御要素を含む。「作動的連結」とは、制御要素の各々が、コード配列の発現に対して意図されるその機能に合致できるように、プロモーター、コード配列、ターミネーター、及び、適宜その他の制御配列が、順次配置されていることを意味する。作動可能に連結できる配列の例は、ターゲッティング配列及びエンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどである。他の制御要素は、選択可能なマーカー、増幅シグナル、複製起点などを含む。適切な制御配列は、例えば、「Ｇｏｅｄｄｅｌ，  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  （１９９０）」に記載されている。
【０１０１】
人工の制御配列の他に、実際の構造遺伝子の前に、天然の制御配列がなお存在することが可能である。この天然の制御は、適宜、遺伝的修飾によって停止させることが可能であり、遺伝子の発現は、増加又は減少させることが可能である。しかしながら、遺伝子構築物は、より単純な構造を有することも可能であり、すなわち、構造遺伝子の前に、さらなる制御シグナルが挿入されず、その制御を有する天然プロモーターは欠失されない。代わりに、制御がもはや起こらず、遺伝子発現が増強又は減弱されないように、天然の制御配列が変異を受ける。核酸配列は、遺伝子構築物中において、１つ又はそれ以上のコピーで存在し得る。  
使用可能なプロモーターの例は、グラム陰性細菌中で有利に使用される、ｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｌａｃｌｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ＳＰ６、λ−ＰＲ又はλ−ＰＬプロモーターであり、グラム陽性プロモーターａｍｙ及びＳＰＯ２、酵母プロモーターＡＤＣ１、ＭＦα、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ又は植物プロモーターＣａＭＶ／３５Ｓ、ＳＳＵ、ＯＣＳ、ｌｉｂ４、ｕｓｐ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ｎｏｔ又はユビキチン若しくはファセオリンプロモーターである。例えば、光誘導性及び特に、ＰｒＰｌプロモーターなどの温度誘導性プロモーターなどの誘導性プロモーターの使用が特に好ましい。原則として、それらの制御配列とともに全ての天然プロモーターを使用することが可能である。さらに、合成プロモーターを有利に使用することも可能である。
【０１０２】
前記制御配列は、核酸配列の特異的発現及びタンパク質発現を可能とすることが意図されている。これは、例えば、宿主生物に応じて、遺伝子が、誘導後のみに発現若しくは過剰発現されること、又は即座に発現及び／又は過剰発現されることを意味し得る。
【０１０３】
制御配列又は因子は、さらに、好ましくは、プラスの影響を与えることができ、従って、発現を増加又は減少させ得る。従って、制御要素の増強は、プロモーター及び／又はエンハンサーなどの強い転写シグナルを使用することによって、転写のレベルで有利に起こり得る。しかしながら、例えば、ｍＲＮＡの安定性を改善することによって、翻訳を増強することも可能である。
【０１０４】
発現カセットは、適切なコードヌクレオチド配列に及びターミネーターシグナル又はポリアデニル化シグナルに、適切なプロモーターを融合させることによって作製される。例えば「Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ＣｏＩｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  （１９８９）」及び「Ｔ．Ｊ．  Ｓｉｌｈａｖｙ，  Ｍ．  Ｌ．  Ｂｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｌ．Ｗ．  Ｅｎｑｕｉｓｔ，  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ（１９８４）」及び「Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）」に記載されているように、この目的のために、組換え及びクローニングの慣用技術が使用される。
【０１０５】
適切な宿主生物中で発現させるために、組換え核酸構築物又は遺伝子構築物は、宿主特異的ベクター中に有利に挿入され、これにより、宿主中での遺伝子の最適な発現が可能となる。ベクターは、当業者にとって周知であり、例えば、「“Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”（Ｐｏｕｗｅｌｓ  Ｐ．  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ，  １９８５）に見出すことが可能である。ベクターは、プラスミドのみならず、例えば、ファージ、ＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルス及びアデノウイルスなどのウイルス、トランスポゾン、ＩＳ要素、ファスミド、コスミド及び直鎖又は環状ＤＮＡなどの、当業者に公知の他の全てのベクターも意味する。これらのベクターは、宿主生物中での自己複製又は染色体複製を行い得る。
【０１０６】
適切な発現ベクターとして挙げられ得る例は、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．  ａｎｄ  Ｊｏｈｓｏｎ，  Ｋ．Ｓ．（１９８８）Ｇｅｎｅ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）などの慣用の融合発現ベクターであり、これらを用いることにより、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質及びプロテインＡが組換え標的タンパク質に融合される。
【０１０７】
ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）  Ｇｅｎｅ６９：３０１−３１５）及びｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）６０−８９）などの非融合タンパク質発現ベクター。
【０１０８】
ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８７）  Ｅｍｂｏ  Ｊ．  ６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）  Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）及びｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）など、酵母Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で発現するための酵母発現ベクター。糸状菌などの他の真菌での使用に適したベクターを構築するためのベクター及び方法は、「ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．  ＆  Ｐｕｎｔ，  ＰＪ．（１９９１  ）“Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ，  ｉｎ：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｆｕｎｇｉ，  Ｊ．  Ｆ．  Ｐｅｂｅｒｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｒｓｇ．，  Ｓ．  １−２８，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ」中に詳しく記載されているものを含む。
【０１０９】
培養された昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）中でのタンパク質の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターは、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８３）  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３：２１５６−２１６５）及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ  （１９８９）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）を含む。
【０１１０】
「Ｂｅｃｋｅｒ，  Ｄ．，  Ｋｅｍｐｅｒ，  Ｅ．，  Ｓｃｈｅｌｌ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｍａｓｔｅｒｓｏｎ，  Ｒ．  （１９９２）  “Ｎｅｗ  ｐｌａｎｔ  ｂｉｎａｒｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｌｏｃａｔｅｄ  ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｌｅｆｔ  ｂｏｒｄｅｒ”，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２０：１１９５−１１９７；及び「Ｂｅｖａｎ，  Ｍ．Ｗ．  （１９８４）  “Ｂｉｎａｒｙ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｐｌａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ”，  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：８７１１−８７２１」に詳細に記載されているものなどの植物発現ベクター。
【０１１１】
ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）などの哺乳動物の発現ベクター。
【０１１２】
原核細胞及び真核細胞用のさらなる適切な発現系は、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．Ｆ．  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ＣｏＩｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８９」の１６章及び１７章に記載されている。
【０１１３】
４．組換え宿主生物：
本発明のベクターは、例えば、少なくとも１つの本発明のベクターで形質転換されている組換え生物を作製するために使用することが可能であり、本発明のポリペプチドを生産するために使用することが可能である。上記本発明の組換え構築物は、適切な宿主系の中に、有利に導入及び発現される。特定の発現系中で前記核酸の発現をもたらすために、例えば、共沈、プロトプラスト融合、電気穿孔、レトロウイルス形質移入などの当業者に周知のクローニング及び形質移入法が好ましく使用される。適切な系は、例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｆ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ，  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９７」又は「Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８９」に記載されている。
【０１１４】
適切な宿主生物は、原則として、本発明の核酸、それらの対立遺伝子バリアント、それらの機能的均等物又は誘導体の発現を可能とする全ての生物である。宿主生物は、例えば、細菌、真菌、酵母、植物又は動物細胞を意味する。好ましい生物は、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などのエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の細菌、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）又はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）などの細菌、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）などの真核微生物、動物又は植物由来のより高等な真核細胞（例えば、Ｓｆ９又はＣＨＯ細胞）である。
【０１１５】
首尾よく形質転換された生物は、同じように、ベクター中又は発現カセット中に存在するマーカー遺伝子を通じて選択することが可能である。このようなマーカー遺伝子の例は、抗生物質耐性に対する遺伝子及び形質転換された細胞の染色を引き起こす呈色反応を触媒する酵素に対する遺伝子である。これらは、次いで、自動細胞選別によって選択することが可能である。ベクターで首尾よく形質転換されており、及び適切な抗生物質耐性遺伝子（例えば、Ｇ４１８又はハイグロマイシン）を有する微生物は、適切な抗生物質含有培地又は栄養素培地によって選択することが可能である。細胞の表面上に存在するマーカータンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーによって選択するために使用することが可能である。
【０１１６】
所望であれば、遺伝子産物は、特に、マウス、ヒツジなどのトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物などのトランスジェニック生物中で発現させることも可能である。
【０１１７】
本発明は、さらに、ペプチド産生組換え宿主細胞が培養され、ポリペプチドの発現が適宜誘導され、それらが培養物から単離される、本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰペプチド又は生物学的に活性なこれらの機能的断片の組換え産生法に関する。ペプチドは、所望であれば、このようにして、産業的な規模で製造することも可能である。
【０１１８】
組換え宿主は、公知の方法によって、培養及び発酵することが可能である。細菌は、例えば、ＴＢ又はＬＢ培地中、及び２０〜４０℃の温度及び６から９までのｐＨで増殖させることが可能である。適切な培養条件の詳細は、例えば、「Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  （１９８９）」に記載されている。
【０１１９】
ポリペプチドが培地中に分泌されなければ、次いで、細胞を破壊し、公知のタンパク質単離方法によって、可溶化液から産物を取得する。あるいは、細胞は、高周波の超音波によって、高圧によって（例えば、フレンチ圧力セル中などで）、浸透圧溶解によって、界面活性剤、溶解酵素若しくは有機溶媒の作用によって、ホモゲナイザーによって、又は上記方法の複数の組み合わせによって破壊され得る。
【０１２０】
ペプチドは、Ｑ−セファロースクロマトグラフィーなどの分子篩クロマトグラフィー（ゲルろ過）、イオン交換クロマトグラフィー及び疎水性クロマトグラフィーなどの公知のクロマトグラフィー法によって、又は限外ろ過、結晶化、塩析、透析及び非変性ゲル電気泳動などの他の通常の方法によって精製することが可能である。適切な方法は、例えば、「Ｃｏｏｐｅｒ，  Ｆ．  Ｇ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｃｈｅ  Ａｒｂｅｉｔｓｍｅｔｈｏｄｅｎ，  Ｖｅｒｌａｇ  Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ，  Ｂｅｒｌｉｎ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ」又は「Ｓｃｏｐｅｓ，  Ｒ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ」に記載されている。  
組換えペプチドの単離のために、特定のヌクレオチド配列によってｃＤＮＡを伸長し、従って、例えば、より単純な精製に役立つ修飾されたポリペプチド又は融合タンパク質をコードするベクター系又はオリゴヌクレオチドを使用することが特に有利である。この種の適切な修飾は、例えば、例えばヘキサヒスチジンアンカーとして知られる修飾などのアンカーとして、又は抗体によって抗原として認識され得るエピトープとして作用するいわゆるタグである（例えば、Ｈａｒｌｏｗ，  Ｅ．  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ｄ．，  １９８８，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  （Ｎ．Ｙ．）  Ｐｒｅｓｓに記載されている。）。例えば、例えばクロマトグラフィーカラム中に充填でき、又はマイクロタイタープレート若しくは別の支持体上で使用できるポリマーマトリックスなどの固相支持体にペプチドを付着させるために、これらのアンカーを使用することが可能である。
【０１２１】
これらのアンカーは、同時に、ペプチドの認識のために使用することも可能である。ペプチドの認識のために、単独で、又はペプチドを誘導化するためのアンカーと組み合わせた、蛍光色素、基質との反応後に検出可能な反応産物を形成する酵素マーカー又は放射性標識などの慣用マーカーを使用することも可能である。
【０１２２】
５．免疫グロブリン
５．１定義
本発明は、本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又はこれらの誘導体／均等物に特異的に結合するモノクローナル又はポリクローナル抗体、すなわち、本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はその誘導体又は均等物に対して特異性を有する抗体に関する。本発明は、これらの抗体の一部、特に、その抗原結合部分、すなわち、本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又はその誘導体／均等物を結合する抗体断片にも関する。
【０１２３】
ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰの「誘導体／均等物」は、これに関連して、例えば、対応する結合対とのこれらの分子の相互作用により、一時的に又は恒常的に誘導される様々な立体構造状態のＡＧＥＲ又はｓＲＡＧＥ又はその他のＡＧＥＲスプライスバリアントなどの前駆体も意味する。
【０１２４】
本発明の抗体は、好ましくは、本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はその誘導体／均等物への特異的結合に対して、特定の結合速度論（例えば、高い親和性、低い解離、低い解離速度、強い中和活性）を有するように選択される。
【０１２５】
従って、本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又はその誘導体／均等物に対して、ＫＤ＝１０−６−１０−１２Ｍの領域の親和性を有する抗体を提供することが可能である。
【０１２６】
さらなる態様によれば、本発明の抗体は、０．１ｓ−１又はそれ未満のＫｏｆｆ速度定数で、ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰ又はその誘導体／均等物を結合するように選択することが可能である。
【０１２７】
抗体は、好ましくは、単離された抗体である。さらなる態様によれば、抗体は、中和抗体である。本発明の抗体には、特に、モノクローナル及び組換え抗体が含まれる。本発明の抗体は、単一の種から完全に由来するアミノ酸配列を含むことができ、従って、例えば、ヒト抗体又はマウス抗体であり得る。さらなる実施形態によれば、抗体は、キメラ抗体又はＣＤＲグラフト抗体又はヒト化抗体の別の種類であり得る。
【０１２８】
「抗体」という用語は、４つのポリペプチド鎖（２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖）から形成されている免疫グロブリン分子を表すものとする。鎖は、通常、ジスルフィド結合によって一緒に連結されている。全ての重鎖は、重鎖の可変領域（ここでは、ＨＣＶＲ又はＶＨと略する。）及び重鎖の定常領域から構成される。重鎖の定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３から形成される。各軽鎖は、軽鎖の可変領域（ここでは、ＬＣＶＲ又はＶＬと略する。）及び軽鎖の定常領域から構成される。軽鎖の定常領域は、ＣＬドメインから形成される。ＶＨ及びＶＬ領域は、さらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称され、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が間に分散されている超可変領域に分割され得る。各ＶＨ及びＶＬ領域は、３つのＣＤＲと４つのＦＲから形成されており、これらは、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でＮ末端からＣ末端へと配置されている。
【０１２９】
抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）という用語は、本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又はこれらの誘導体／均等物に対して特異性を有する抗体の１つ又はそれ以上の断片を表し、断片は、ＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又はその誘導体／均等物を特異的に結合できる能力をなお有する。抗体の抗原結合機能は、完全な抗体の断片によって担われ得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語の意味の中に含まれる結合断片の例は、（ｉ）Ｆａｂ断片、すなわち、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインから構成される一価の断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、すなわち、ヒンジ領域中で、ジスルフィド架橋により、一緒に連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインから構成されるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインから構成されるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメイン又はＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２，ＤＨ３又はＶＨ、ＣＨ２、ＣＨ３からなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）、並びに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）である。Ｆｖ断片の２つのドメイン（すなわち、ＶＬ及びＶＨ）は、別個の遺伝子によってコードされているが、さらに、それらは、組換え法の使用によって、合成リンカーにより一緒に接続することが可能であり、組換え法により、Ｆｖ断片の２つのドメインは、一価の分子（一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）として知られる。）を形成するために、ＶＬ及びＶＨ領域がその中に一緒に存在する単一のタンパク質鎖として作製され得る（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照。）。このような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語によって包含されるものとする。二重特異性抗体などの一本鎖抗体の他の種類も、同様に、「抗原結合部分」に属する。二重特異性抗体とは、ＶＨ及びＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されているが、２つのドメインが同じ鎖上に一緒に存在するには短すぎるリンカーを使用しており、従って、これらのドメインが、別の鎖の相補的ドメインと対を成し、２つの抗原結合部位を形成するように強制されている二価の二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；  Ｐｏｌｊａｋ，  Ｒ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３参照）。
【０１３０】
さらなる可能性は、抗体又はその抗原結合部分が、１つ又はそれ以上のさらなるタンパク質又はペプチドとの、抗体又は抗体部分の共有又は非共有的会合によって形成されている、より大きな免疫接着分子の一部であることである。このような免疫接着分子は、四量体ｓｃＦｖ分子を産生するためにストレプトアビジンコア領域を使用し（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，  Ｓ．  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：９３−１０１）、並びに二価の及びビオチン化されたｓｃＦｖ分子を作製するために、マーカーペプチドのシステイン残基及びＣ末端ポリヒスチジンタグを使用する（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，  Ｓ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３１：１０４７−１０５８）。
【０１３１】
Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片などの抗体部分は、パパイン又はペプシンでの消化などの慣用技術を用いることによって、完全な抗体から作製することが可能である。さらに、標準化された組換えＤＮＡ技術を使用することによって、抗体、抗体部分及び免疫接着分子を取得することも可能である。「本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又はその誘導体／均等物に対して特異性を有する単離された抗体」は、本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又はその誘導体／均等物に対して特異性を有し、及び異なる抗原特異性を有する他の抗体が実質的に存在しない抗体のことを言う。
【０１３２】
「中和抗体」という用語は、特定の抗原への結合が、抗原の生物活性の阻害を引き起こす抗体のことを言う。抗原の生物活性のこの阻害は、適切なインビトロ又はインビボアッセイを用いて、抗原の生物活性の１つ又はそれ以上の指標を測定することによって評価することが可能である。
【０１３３】
「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマに由来する抗体（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの標準化されたハイブリドーマ法などのハイブリドーマ技術を用いて産生されたハイブリドーマによって分泌される抗体）のことを言う。ハイブリドーマに由来し、本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又はその誘導体／均等物に対して特異性を有する抗体は、従って、モノクローナル抗体と称される。
【０１３４】
「組換え抗体」という用語は、宿主細胞中に形質移入された組換え発現ベクターを用いることによって発現された抗体など、組換え手段によって産生され、発現され、生成され、若しくは単離された抗体；組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体；ヒト免疫グロブリン遺伝子が遺伝子導入されている動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，  Ｌ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２０：６２８７−６２９５参照）；又は、他の何らかの方法で、産生され、発現され、生成され、若しくは単離された抗体であり、その中で、特定の免疫グロブリン配列（ヒト免疫グロブリン遺伝子配列など）が他のＤＮＡ配列と組み合わされている抗体のことを言う。組換え抗体には、例えば、キメラ、ＣＤＲグラフト及びヒト化抗体が含まれる。
【０１３５】
「ヒト抗体」という用語は、例えば、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ９１−  ３２４２）に記載されているように、その可変領域及び定常領域が、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に対応し、又はこれに由来する抗体のことを言う。しかしながら、本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ中、特にＣＤＲ３中に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムな若しくは部位特異的な突然変異導入によって、又はインビボでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含み得る。本発明の組換えヒト抗体は、可変領域を有し、及びヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する定常領域も含み得る（Ｋａｂａｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）。しかしながら、特定の実施形態によれば、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列が、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に本来存在しない配列であるように（但し、それらは、ヒト生殖系列のＶＨ及びＶＬ配列に関連し、又はヒト生殖系列のＶＨ及びＶＬ配列に由来する。）、このような組換えヒト抗体は、インビトロでの突然変異導入に（又は、ヒトＩｇ配列のために遺伝子導入されている動物が使用される場合には、体細胞インビボ突然変異導入に）供される。特定の実施形態によれば、このような組換え抗体は、選択的な突然変異導入若しくは逆突然変異又は両方の結果である。
【０１３６】
「逆突然変異」という用語は、相同な生殖系列抗体配列の対応する生殖系列残基によって、ヒト抗体の体細胞変異されたアミノ酸の一部又は全部を置き換える方法を表す。本発明のヒト抗体の重鎖及び軽鎖の配列は、最も大きな相同性を有する配列を同定するために、ＶＢＡＳＥデータベース中の生殖系列配列と別々に比較される。本発明のヒト抗体中の異常は、このような異常なアミノ酸をコードする所定のヌクレオチド位置における突然変異によって、生殖系列配列へと復帰する。このようにして、逆突然変異の候補、抗原結合の候補として同定された各アミノ酸の直接的又は間接的な重要性が調べられ、変異後に、ヒト抗体の所望の特性を損なうアミノ酸は、最終的なヒト抗体中に含めるべきではなかった。逆突然変異のためのアミノ酸の数を最小化するために、第二の生殖系列配列の対応するアミノ酸配列と同一であるが、最も近い生殖系列配列とは異なるアミノ酸位置を変化しないまま放置することが可能である（但し、第二の生殖系列配列は、問題のアミノ酸の両側で、少なくとも１０、好ましくは１２アミノ酸が本発明のヒト抗体の配列と同じであり、且つ同一線上にあるものとする。）。逆突然変異は、抗体の最適化におけるあらゆる段階で行うことができる。
【０１３７】
「キメラ抗体」という用語は、分子の各部分が異なる種に由来する抗体を含む。従って、キメラ抗体は、これに限定されるものではないが、例えば、ある種からの重鎖及び軽鎖の可変領域に対する配列を含むが、その中において、ＶＨ及び／又はＶＬ由来のＣＤＲ領域の１つ又はそれ以上の配列が別の種のＣＤＲ配列によって置換されている抗体である。このような抗体中の可変領域は、マウスＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）の１つ又はそれ以上がヒトＣＤＲ配列によって置換されているマウス重鎖及び軽鎖を有し得る。
【０１３８】
「ヒト化抗体」という用語は、ヒト以外の種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ラクダ科の動物、ヤギ）由来の重鎖及び軽鎖の可変領域の配列を含むが、その中において、ＶＨ及び／又はＶＬ配列の少なくとも１つの一部が、「よりヒト様である」ようにするために、すなわち、ヒト生殖系列の可変領域配列のようにするために修飾されている抗体のことを言う。ヒト化抗体の１つの種類は、対応する非ヒトＣＤＲ配列を置換するために、ヒトＣＤＲ配列が非ヒトＶＨ及びＶＬ中に挿入されているＣＤＲグラフト抗体である。
【０１３９】
抗体の結合速度論を測定するための方法は、いわゆる表面プラズモン共鳴に基づいている。「表面プラズモン共鳴」という用語は、バイオセンサーマトリックス、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ  ａｎｄ  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）を用いて、タンパク質濃度の変化を検出することによって、生物特異的相互作用を分析することが可能な光学現象を表す。さらなる説明については、「Ｊｏｎｓｓｏｎ，  Ｕ．，  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ａｎｎ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｌｉｎ．  ５１：１９−２６；  Ｊｏｎｓｓｏｎ，  Ｕ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１  ）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１  ：６２０−６２７；  Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，  Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．  ８：１２５−１３１；ａｎｄ  Ｊｏｈｎｎｓｏｎ，  Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８−２７７」を参照されたい。
【０１４０】
「Ｋｏｆｆ」という用語は、抗体／抗原複合体からの抗原の解離に対する解離速度定数のことを言う。
【０１４１】
「Ｋｄ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数のことを言う。  
本発明の抗体の結合親和性は、ＥＬＩＳＡ又はＢＩＡｃｏｒｅ分析などの標準化されたインビトロイムノアッセイを使用することによって評価することが可能である。
【０１４２】
５．２免疫グロブリンの作製
５．２．１ポリクローナル抗体の作製
本発明は、ポリクローナル抗ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又は抗ＡＧＥＲ−ＣＤＰ抗体及びその作製に関する。
【０１４３】
この目的のために、本発明の少なくとも１つのＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又はそれらの誘導体／均等物で宿主を免疫し、免疫化に応じて形成された宿主の抗体含有血清が得られる。
【０１４４】
使用すべきＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰが弱い免疫原性を有するに過ぎないか、又は免疫原性を全く有しない場合には、これらの免疫原性は、担体、好ましくはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、リムルス・ポリフェムス（Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ｐｏｌｙｐｈｅｎｕｓ）ヘモシアニン（ＬＰＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はオボアルブミン（ＯＶＡ）などの担体タンパク質にそれらを結合することによって増加させることが可能である。多数の結合の可能性が当業者に利用可能であり、一般的に公知である。好ましくは、例えば、例えばＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰを、水中又は水性溶媒中の適切なペプチド又はペプチド混合物とともにインキュベートすることによる、グルタルアルデヒドとの反応を用いることが可能である。この反応は、周囲温度（一般に室温を意味する。）で都合よく実施することが可能である。しかしながら、冷却又は穏やかな加熱も適切であり得る。反応は、通常、数時間以内に所望の結果をもたらし、例えば、２時間の反応時間が正常な範囲にある。グルタルアルデヒド濃度は、通常、ｐｐｍ〜％の範囲、適切には１０ｐｐｍから１％、好ましくは１００ｐｐｍから０．５％である。反応パラメータの最適化は、当業者の範疇に属する。
【０１４５】
抗原に加えて、組成物は、通常、さらなる賦形剤、特に、免疫化のために通常用いられるアジュバント、例えば、フロイントのアジュバントを含む。特に、完全フロイントアジュバントは、第一の免疫化のために使用されるのに対して、全てのさらなる免疫化は、不完全フロイントアジュバントを用いて実施される。免疫化カクテルは、抗原（免疫原）を、好ましくは、上記成分混合物として、賦形剤に添加することによって作製される。この場合、抗原は、通常、乳化される。
【０１４６】
宿主として適切なのは、特に、げっ歯類あるいはウサギである。これら又はその他の適切な宿主は、好ましくは皮下に、免疫化カクテルを注射される。抗体力価は、例えば、宿主ＩｇＧに対して誘導されたヒツジ抗血清及び標識されたＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰを用いて拮抗的に、イムノアッセイを用いて測定することが可能である。従って、ある宿主が抗体を取得するのに適しているかどうかを、免疫化の終わり頃に決定することが可能である。例えば、４つの免疫化が実施される場合には、３回目の免疫化の後に、抗体力価を測定することができ、次いで、十分な抗体力価を示す動物から抗体を取得することが可能である。
【０１４７】
好ましくは、形成された抗体を得るために、数週又は数ヶ月にわたって、宿主から血液を採取する。最後に、宿主を放血させることが可能である。所望の抗体を含む血清は、このようにして得られた血液から、それ自体公知の様式で取得することが可能である。このようにして得られた全血清は、必要であれば、その中に存在する抗体画分、特に、ＡＧＥＲ−ＲＭＥ−又はＡＧＥＲ−ＣＤＰ−認識抗体を濃縮するために、当業者に公知の様式でさらに精製することが可能である。
【０１４８】
本方法の具体的な実施形態において、免疫原として使用されるＡＧＥＲ−ＲＭＥ、ＡＧＥＲ−ＣＤＰ又はこれらの誘導体／均等物を特異的に認識する血清の少なくとも１つの抗体が選択される。この文脈において、特異性とは、免疫原に対する抗体の結合親和性が、他の（特に免疫原として関連する）タンパク質（ＡＰＰ（アミロイド前駆体タンパク質）など）に対する抗体の結合親和性に比べてより高いことを意味する。
【０１４９】
５．２．２モノクローナル抗体の作製
本発明において有用な免疫グロブリンは、それ自体公知の方法を用いて取得することが可能である。従って、ハイブリドーマ技術によって、目的の抗原に対して単一特異的な抗体を作製することができる。さらに、抗体ライブラリーのインビトロスクリーニングなど、組換え抗体技術が開発されており、同様に、このような特異的抗体を作製するために使用することが可能である。
【０１５０】
従って、例えば、目的の抗原で動物を免疫化することが可能である。このインビボアプローチは、動物のリンパ球又は脾細胞から得た一連のハイブリドーマを確立すること、及び抗原を特異的に結合する抗体を分泌するハイブリドーマを選択することをさらに含み得る。免疫化されるべき動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ラクダ科の動物若しくはヒツジ、又は上記動物の１つのトランスジェニック様式（例えば、抗原刺激後にヒト抗体を作製するヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウス）であり得る。免疫化できる動物のさらなる種類には、ヒト末梢単核血液細胞で又はリンパ球系細胞若しくはその前駆体で再構成された重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）を有するマウス（キメラｈｕ−ＰＢＭＣ−ＳＣＩＤマウス）及び致死的な全身放射線照射での処理に続いて、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）を有するマウスから得た骨髄細胞で照射から保護され、続いて、機能的ヒトリンパ球が移植されたマウス（いわゆるトリメラ系）が含まれる。免疫化されるべき動物のさらなる種類は、この動物が、抗原での免疫化後に、当該抗原を外来として認識するように、例えば、相同性組換えによって、目的の抗原をコードする内在性遺伝子がそのゲノム中で機能停止されている（「ノックアウト」）動物（例えば、マウス）である。これらの方法によって作製されるポリクローナル又はモノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡ技術を含む（但し、これに限定されない。）公知のスクリーニング法を用いることによって性質決定され、選択されることは当業者に自明である。
【０１５１】
さらなる実施形態によれば、組換え抗体ライブラリーは、抗原を用いてスクリーニングされる。組換え抗体ライブラリーは、例えば、バクテリオファージの表面上又は酵母細胞の表面上又は細菌細胞の表面上に発現させることが可能である。組換え抗体ライブラリーは、例えば、ｓｃＦＶライブラリー又はＦａｂライブラリーとすることができる。さらなる実施形態において、抗体ライブラリーは、ＲＮＡ−タンパク質融合物として発現させることが可能である。
【０１５２】
本発明の抗体を作製するためのさらなるアプローチは、インビボ及びインビトロアプローチの組み合わせを含む。例えば、インビボで、抗原により動物を免疫化した後、動物のリンパ球系細胞から作製された組換え抗体ライブラリー又は単一ドメイン抗体ライブラリー（例えば、重鎖及び／又は軽鎖を有する。）のインビボスクリーニングのために抗原を使用することによって、抗体レパートリーに対して、抗原を作用させることが可能である。
さらなるアプローチによれば、動物をインビボで抗原により免疫化した後、動物のリンパ球系細胞から作製された組換え抗体ライブラリー又は単一ドメインライブラリーをアフィニティー成熟に供することによって、抗体レパートリーに対して、抗原を作用させる。さらなるアプローチによれば、インビボで、動物を抗原で免疫化した後、続いて、目的の抗体を分泌する単一の抗体産生細胞を選択し、並びに（例えば、ＰＣＲによって）重鎖及び軽鎖の可変領域に対してｃＤＮＡをこれらの選択された細胞から取得し、並びに哺乳動物宿主細胞中、インビトロで重鎖及び軽鎖の可変領域を発現させて（これは、リンパ球抗体選択法又は選択されたリンパ球抗体法（ＳＬＡＭ）と称される。）、選択された抗体遺伝子配列をさらに選択及び操作することを可能にすることにより、抗体レパートリーに対して、抗原を作用させる。モノクローナル抗体は、さらに、哺乳動物細胞中で、重鎖及び軽鎖に対する抗体遺伝子を発現させ、所望の結合親和性を有する抗体を分泌する哺乳動物細胞を選択することによる発現クローニングによって選択することが可能である。
【０１５３】
本発明は、スクリーニング及びカウンタースクリーニングのために、ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰの形態で利用可能な所定の抗原を作製する。従って、本発明によれば、例えば、ＡＧＥＲによって誘導された受容体状態を特異的に認識するために、本発明に従って所望される特性のプロファイルを示すポリクローナル及びモノクローナル抗体を選択することが可能である。
【０１５４】
抗体を作製するための本発明の方法は、抗体の様々な種類を作製するために使用することが可能である。これらには、実質的に、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及びＣＤＲグラフト抗体及びその抗原結合部分が含まれる。
【０１５５】
本発明の抗体を作製するための方法は、以下に記載されている。この文脈において、インビボアプローチ、インビトロアプローチ又はこの２つの組み合わせの間で区別が為される。
【０１５６】
インビボアプローチ：
インビボで生成された抗体を産生する細胞から開始して、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）によって最初に記載されたハイブリドーマ技術などの標準化された技術により、モノクローナル抗体を作製することが可能である（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２７：５３９−４６；  Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５５：４９８０−８３；Ｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）  ＰＮＡＳ  ７６：２９２７−３１；及びＹｅｈ  ｅｔ  ａｌ（１９８２）Ｉｎｔ  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２９：２６９−７５も参照されたい。）。モノクローナル抗体ハイブリドーマを作製するための技術は、十分に周知である（一般的に、Ｒ．Ｈ．Ｋｅｎｎｅｔｈ，  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８０）；Ｅ．Ａ．Ｌｅｒｎｅｒ  （１９８１）  Ｙａｌｅ  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．，  ５４：３８７−４０２；  Ｍ．  Ｌ．  Ｇｅｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９７７）  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．，  ３：２３１−３６を参照されたい。）。この目的のために、不死化された細胞株（典型的には、骨髄腫）が、本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又はこれらの誘導体／均等物で免疫化された哺乳動物のリンパ球（典型的には、脾細胞又はリンパ節細胞又は末梢血リンパ球）に融合され、本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰに対して、又はこれらの誘導体／均等物に対して特異性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを特定するために、得られたハイブリドーマ細胞の培養上清はスクリーニングされる。この目的のために、リンパ球及び不死化された細胞株を融合するための十分に周知な多くのプロトコールのうち何れかを使用することが可能である（Ｇ．  Ｇａｌｆｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７７）  Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：５５０−５２；  Ｇｅｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ，（上で引用）；  Ｌｅｒｎｅｒ，  ＹａＩｅ  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．，（上で引用）；  Ｋｅｎｎｅｔｈ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（上で引用）も参照）。さらに、当業者は、同様に使用することが可能な、このような方法の多くの異なる変法に想到する。典型的には、不死化された細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）は、リンパ球と同じ哺乳動物種に由来した。例えば、本発明の免疫原性調製物で免疫化されたマウスから得られるリンパ球を、不死化されたマウス細胞株と融合することによって、マウスハイブリドーマを確立することが可能である。好ましい不死化細胞は、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含む培地に対して感受性を有するマウス骨髄腫細胞株である。例えば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１−、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３−又はＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４−骨髄腫株など、多くの骨髄腫細胞株の任意の１つを、融合対として、標準的な様式で使用することが可能である。これらの骨髄腫細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから取得することができる。典型的には、ＨＡＴ感受性のマウス骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて、マウス脾細胞に融合される。次いで、非融合骨髄腫細胞と非生産的に融合された骨髄腫細胞を死滅させるＨＡＴ培地を用いて、融合によって生じたハイブリドーマ細胞を選択する（非融合脾細胞は、形質転換されていないので、数日後に死滅する。）。このような抗体のハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって、例えば、本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又はその誘導体／均等物を特異的に結合できる抗体を選択するために標準的なＥＬＩＳＡアッセイを使用することによって、本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又はその誘導体／均等物を特異的に認識するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を同定する。
【０１５７】
所望の抗体の性質に応じて、様々な宿主動物をインビボ免疫化のために使用することが可能である。それ自体、目的の抗原の内在性バージョンを発現する宿主を使用することが可能である。あるいは、目的の抗原の内在性バージョンを欠失させた宿主を使用することが可能である。例えば、対応する内在性遺伝子に対する相同的組換えによって、特定の内在性タンパク質が欠失されたマウス（すなわち、ノックアウトマウス）は、マウスを免疫化したタンパク質に対して液性応答を生じ、従って、このタンパク質に対する高親和性モノクローナル抗体を作製するために使用することが可能である（例えば、Ｒｏｅｓ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３：２３１−２３７；  Ｌｕｎｎ，  Ｍ．  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ７５：４０４−４１２参照）。
【０１５８】
多くの非ヒト動物が、本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又はその誘導体／均等物に対する非ヒト抗体を産生するための抗体作製用宿主として適している。これらには、マウス、ラット、ニワトリ、ラクダ科の動物、ウサギ及びヤギ（及びこれらのノックアウト様式）が含まれるが、ハイブリドーマ産生のためには、マウスが好ましい。さらに、二重特異性を有するヒト抗原に対する実質的にヒト抗体を産生するためのヒト抗体レパートリーを発現する非ヒト宿主動物を使用することが可能である。このような非ヒト動物には、以下に詳しく記載されている、ヒト免疫グロブリン導入遺伝子を有するトランスジェニック動物（例えば、マウス）（キメラｈｕ−ＰＢＭＣ−ＳＣＩＤマウス）及びヒト／マウス照射キメラが含まれるが含まれる。
【０１５９】
一実施形態によれば、本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又はその誘導体／均等物で免疫された動物は、ヒト以外の哺乳動物、好ましくは、非ヒト哺乳動物が抗原刺激後にヒト抗体を作製するように、ヒト免疫グロブリン遺伝子によって遺伝子導入されているマウスである。典型的には、ヒト生殖系列配置を有する重鎖及び軽鎖に対する免疫グロブリン導入遺伝子をこのような動物中に導入し、重鎖及び軽鎖に対する内在性の坐が不活性であるように動物を改変する。抗原での（例えば、ヒト抗原での）このような動物の刺激は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体（すなわち、ヒト抗体）の産生をもたらす。ヒトモノクローナル抗体は、標準化されたハイブリドーマ技術を用いて、このような動物のリンパ球から作製することが可能である。ヒト免疫グロブリンを有するトランスジェニックマウス及びヒト抗体の産生におけるそれらの使用のさらなる記述については、例えば、米国特許第５，９３９，５９８号、ＷＯ  ９６／３３７３５、ＷＯ  ９６／３４０９６、ＷＯ  ９８／２４８９３及びＷＯ  ９９／５３０４９（Ａｂｇｅｎｉｘ  Ｉｎｃ．）、米国特許第５，５４５，８０６号、米国特許第５，５６９，８２５号、米国特許第５，６２５，１２６号、米国特許第５，６３３，４２５号、米国特許第５，６６１，０１６号、米国特許第５，７７０，４２９号、米国特許第５，８１４，３１８号、米国特許第５，８７７，３９７号及びＷＯ  ９９／４５９６２  （Ｇｅｎｐｈａｒｍ  Ｉｎｃ．）を参照されたい。同様に、ＭａｃＱｕｉｔｔｙ，  ＪＪ．  ａｎｄ  Ｋａｙ，  Ｒ．Ｍ．  （１９９２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１１８８；  Ｔａｙｌｏｒ，  ＬＤ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０：６２８７−６２９５；  Ｌｏｎｂｅｒｇ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９；  Ｌｏｎｂｅｒｇ，  Ｎ．  ｕｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，  Ｄ．  （１９９５）  Ｉｎｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３：６５−９３；  Ｈａｒｄｉｎｇ，  Ｆ．Ａ．  ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，  Ｎ．  （１９９５）  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｅｉ．  ７６４：５３６−５４６；  Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，  Ｄ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１；  Ｍｅｎｄｅｚ，  Ｍ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６；  Ｇｒｅｅｎ，  Ｌ．Ｌ．  ｕｎｄ  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，  Ａ．  （１９９８）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８８：４８３−４９５；  Ｇｒｅｅｎ，  Ｌ．Ｌ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１−２３；  Ｙａｎｇ，  Ｘ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｊ．  Ｌｅｕｋｏｃ．  Ｂｉｏｌ．  ６６：４０１−４１０；  Ｇａｌｌｏ，  Ｍ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３０：５３４−５４０を参照されたい。
【０１６０】
さらなる実施形態において、本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又はこれらの誘導体／均等物で免疫化された動物は、ヒト末梢単核血液細胞又はリンパ球系細胞又はこれらの前駆体で再構成された重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）を有するマウスであり得る。キメラｈｕ−ＰＢＭＣ−ＳＣＩＤマウスと称されるこのようなマウスは、抗原刺激後に、ヒト免疫グロブリン応答を生じることが示されている。これらのマウス及び抗体を生成するためのそれらの使用のさらなる記載については、例えば、Ｌｅａｄｅｒ，  Ｋ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７６：２２９−２３４；  Ｂｏｍｂｉｌ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．１９５：３６０−３７５：Ｍｕｒｐｈｙ，  Ｗ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｓｅｍｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ８：２３３−２４１；  Ｈｅｒｚ，  Ｕ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｉｎｔ．  Ａｒｃｈ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１３：１５０−１５２；  Ａｌｂｅｒｔ，  Ｓ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５９：１３９３−１４０３；  Ｎｇｕｙｅｎ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４１：９０１−９０７；  Ａｒａｉ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２１７：７９−８５；  Ｙｏｓｈｉｎａｒｉ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ａｒａｉ，  Ｋ．  （１９９８）  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １７：４１−４５；  Ｈｕｔｃｈｉｎｓ，  Ｗ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １８：１２１−１２９；  Ｍｕｒｐｈｙ，  Ｗ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９０：２２−２７；  Ｓｍｉｔｈｓｏｎ，  Ｓ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３６：１１３−１２４；  Ｃｈａｍａｔ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １８０：２６８−２７７；  ａｎｄ  Ｈｅａｒｄ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｍｏｌｅｃ．  Ｍｅｄ．  ５：３５−４５を参照されたい。  
さらなる実施形態において、本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又はこれらの誘導体／均等物で免疫化された動物は、致死的な全身照射で処理された後に、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）を有するマウスから得られた骨髄細胞で照射に対して保護され、続いて、機能的ヒトリンパ球が移植されたマウスである。トリメラ系と称されるキメラのこの種類は、目的の抗原でマウスを免疫し、続いて、標準化されたハイブリドーマ技術を用いてモノクローナル抗体を作製することによりヒトモノクローナル抗体を産生するために使用される。これらのマウス及び抗体を生成するためのそれらの使用のさらなる記載については、例えば、  Ｅｒｅｎ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９３：１５４−１６１；  Ｒｅｉｓｎｅｒ，  Ｙ  ａｎｄ  Ｄａｇａｎ，  Ｓ．  （１９９８）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２４２−２４６；  Ｉｌａｎ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２９：５５３−５６２；ａｎｄ  Ｂｏｃｈｅｒ，  Ｗ．Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９６：６３４−６４１を参照されたい。
【０１６１】
インビトロアプローチ：
免疫化及び選択による本発明の抗体の作製に対する代替法として、本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又はこれらの誘導体／均等物で組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーをスクリーニングして、ＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又はこれらの誘導体／均等物に特異的に結合する免疫グロブリンライブラリーの要素を単離することにより、本発明の抗体を同定及び単離することが可能である。ディスプレイライブラリーを生成及びスクリーニングするためのキットが市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａから得られるＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，  ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．２７−９４００−０１；及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅから得られるｔｈｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ（Ｒ）  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｋｉｔ，  ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．２４０６１２）。多くの実施形態において、ディスプレイライブラリーは、ｓｃＦＶライブラリー又はＦａｂライブラリーである。組換え抗体ライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ技術は、十分に詳しく記載されている。抗体ディスプレイライブラリーの生成及びスクリーニングにおいて特に有利に使用することが可能な方法及び化合物の例は、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ＷＯ  ９２／０１０４７、米国特許第５，９６９，１０８及びＥＰ  ５８９  ８７７（特に、ｓｃＦｖのディスプレイについて記載している。）、Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  米国特許第５，２２３，４０９号、米国特許第５，４０３，４８４号、米国特許第５，５７１，６９８号、米国特許第５，８３７，５００号及びＥＰ  ４３６  ５９７（例えば、ｐＩＩＩ融合物について記載している。）；Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＷＯ  ９１／１７２７１、米国特許第５，４２７，９０８号、米国特許第５，５８０，７１７号及びＥＰ  ５２７  ８３９（特に、Ｆａｂのディスプレイについて記載している。）；  Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  国際公開ＷＯ  ９２／２０７９１及びＥＰ  ３６８，６８４（特に、可変免疫グロブリンドメインに対する配列のクローニングについて記載している。）；  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，  米国特許第５，８８５，７９３号及びＥＰ  ５８９  ８７７  （特に、組換えライブラリーを用いた、ヒト抗原に対するヒト抗体の単離について記載している。）；  Ｇａｒｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ＷＯ  ９２／０９６９０（特に、ファージ発現技術について記載している。）；  Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ＷＯ  ９７／０８３２０（ヒト組換え抗体ライブラリーＨｕＣａｌについて記載している。）；Ｓａｌｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ＷＯ  ９７／２９１３１（ヒト抗原（ヒト腫瘍壊死因子α）に対する組換えヒト抗体の作製及び組換え抗体のインビトロアフィニティー成熟について記載している。）及びＳａｌｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，米国仮特許出願第６０／１２６，６０３号及びこれを基礎とする特許出願（同様に、ヒト抗原（ヒトインターフェロン−１２）に対する組換えヒト抗体の作製及び組換え抗体のインビトロアフィニティー成熟について記載している。）中に見出すことができる。
【０１６２】
組換え抗体ライブラリーのスクリーニングについてのさらなる記述は、Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；  Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；  Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４；  Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２６：８８９−８９６；  Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１  ）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；  Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）  ＰＮＡＳ  ８９：３５７６−３５８０；  Ｇａｒｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；  Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１  ）  Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３−４１３７；  Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  ＰＮＡＳ  ８８：７９７８−７９８２；  ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  （１９９０）  ３４８：５５２−５５４；及びＫｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９６：５７−８６などの科学的な刊行物中に見出される。
【０１６３】
バクテリオファージディスプレイ系の使用に対する代替法として、酵母細胞又は細菌細胞の表面上に組換え抗体ライブラリーを発現させることが可能である。酵母細胞の表面上に発現されたライブラリーを作製及びスクリーニングするための方法は、ＷＯ９９／３６５６９に記載されている。細菌細胞の表面上に発現されたライブラリーを作製及びスクリーニングするための方法は、ＷＯ９８／４９２８６に詳しく記載されている。
【０１６４】
目的の抗体がコンビナトリアルライブラリーから同定されたら直ちに、抗体の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡが、分子生物学の標準化された技術によって、例えば、ライブラリーのスクリーニング中に単離されたディスプレイパッケージ（例えば、ファージ）からＤＮＡをＰＣＲ増幅することによって単離される。ＰＣＲプライマーを作製するために使用できる軽及び重抗体鎖に対する遺伝子のヌクレオチド配列は、当業者に公知である。このような配列の多くは、例えば、Ｋａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２及びヒト生殖系列ＶＢＡＳＥの配列に対するデータベースに対して記載されている。
【０１６５】
本発明の抗体又は抗体の一部は、宿主細胞中での、軽及び重免疫グロブリン鎖に対する遺伝子の組換え発現によって作製することが可能である。抗体の組換え発現のために、軽鎖及び重鎖が宿主細胞中で発現され、好ましくは、宿主細胞がその中で培養される培地中に軽鎖及び重鎖が分泌されるように、抗体の軽及び重免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡ断片を有する１つ又はそれ以上の組換え発現ベクターで宿主細胞が形質移入される。抗体は、この培地から取得することができる。標準化された組換えＤＮＡ法は、重及び軽抗体鎖に対する遺伝子を得るために、これらの遺伝子を組換え発現ベクター中に挿入するために、及びベクターを宿主細胞中に導入するために使用される。この種の方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  （ｅｄｉｔｏｒ），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  （１９８９），  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ（ｅｄｉｔｏｒ）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９）及びＢｏｓｓらの米国特許第４，８１６，３９７号に記載されている。
【０１６６】
目的の抗体のＶＨ及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られたら直ちに、例えば、可変領域に対する遺伝子を、完全長の抗体鎖に対する遺伝子に、Ｆａｂ断片に対する遺伝子に、又はｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準化された組換えＤＮＡ技術を用いて、これらのＤＮＡ断片をさらに操作することが可能である。これらの操作は、さらなるタンパク質（例えば、定常抗体領域又は柔軟なリンカー）をコードするさらなるＤＮＡ断片への、ＶＬ又はＶＨをコードするＤＮＡ断片の作動的連結をもたらす。「作動的連結」という用語は、本明細書において、２つのＤＮＡ断片によってコードされたアミノ酸配列がリーディングフレーム中に保たれるように（インフレーム）、２つのＤＮＡ断片が一緒に接続されることを意味するものとする。
【０１６７】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、重鎖の定常領域をコードするさらなるＤＮＡ分子（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）への、ＶＨ領域をコードするＤＮＡの作動的連結のために、完全長の重鎖に対する遺伝子へと変換することが可能である。ヒト重鎖の定常領域に対する遺伝子の配列は、十分に周知であり、（例えば、Ｋａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）、これらの領域を貫くＤＮＡ断片は、標準化されたＰＣＲ増幅によって取得することができる。重鎖の定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤから得られる定常領域であり得、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４から得られる定常領域が好ましい。重鎖のＦａｂ断片に対する遺伝子は、重鎖の定常領域ＣＨ１のみをコードするさらなるＤＮＡ分子との、ＶＨをコードするＤＮＡの作動的連結によって取得することが可能である。
【０１６８】
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、軽鎖の定常領域ＣＬをコードするさらなるＤＮＡ分子との、ＶＬをコードするＤＮＡの作動的連結によって、完全長の軽鎖に対する遺伝子（及びＦａｂ軽鎖に対する遺伝子）へと変換することが可能である。ヒト軽鎖の定常領域に対する遺伝子の配列は、十分に周知であり（Ｋａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）、及びこれらの領域を貫くＤＮＡ断片は、標準化されたＰＣＲ増幅によって取得することができる。軽鎖の定常領域は、定常κ又はλ領域であり得、定常κ領域が好ましい。
【０１６９】
ＶＨ及びＶＬ配列が連続した単一鎖のタンパク質として発現されるように（ＶＬ及びＶＨ領域は、柔軟なリンカーによって一緒に接続されている。）、柔軟なリンカー（例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３）をコードするさらなる断片への、ＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ断片の作動的連結によってｓｃＦｖ遺伝子を生成することが可能である（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；  Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；  ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  （１９９０）  ３４８：５５２−５５４）。
【０１７０】
本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又はその誘導体／均等物に対して特異性を有するＶＨ及びＶＬ単一ドメインは、上記方法を用いて、単一ドメインライブラリーから単離することが可能である。本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又はその誘導体／均等物を結合するために、所望の特異性を有する、２つのＶＨ単一ドメイン鎖（ＣＨ１あり又はなし）又は２つのＶＬ鎖又はＶＨ鎖とＶＬ鎖の対を使用することができる。
【０１７１】
本発明の組換え抗体又は抗体部分は、部分的又は完全長軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡを発現ベクター中に挿入して、転写及び翻訳調節配列への遺伝子の作動的連結をもたらすことによって発現させることができる。この文脈において、「作動的連結」という用語は、ベクター内の転写及び翻訳調節配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を制御するという所期の機能を達成するように、抗体遺伝子がベクター中に連結されていることを意味するものとする。
【０１７２】
発現ベクター及び発現調節配列が、発現のために使用される宿主細胞と適合的であるように、発現ベクター及び発現調節配列が選択される。軽抗体鎖に対する遺伝子及び重抗体鎖に対する遺伝子は、別個のベクター中に挿入することが可能であり、又は、両遺伝子は同一の発現ベクター中に挿入され、これが一般的である。抗体遺伝子は、標準化された方法（例えば、抗体遺伝子断片及びベクター上の相補的制限切断部位の連結、又は、制限切断部位が存在しない場合、平滑末端の連結）によって、発現ベクター中に挿入される。発現ベクターは、軽鎖及び重鎖に対する配列を挿入する前に、定常抗体領域に対する配列を既に有する場合があり得る。例えば、１つのアプローチは、ベクター内にＶＨセグメントのＣＨセグメントの作動的連結が存在し、及びベクター内にＶＬセグメントのＣＬセグメントへの作動的連結も存在するように、それぞれ、重鎖及び軽鎖の定常領域を既にコードしている発現ベクター中にＶＨ及びＶＬ配列を挿入することにより、ＶＨ及びＶＬ配列を完全長抗体遺伝子へと変換することである。さらなる可能性又は別の可能性は、組換え発現ベクターが宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることである。リーディングフレーム中でシグナルペプチドが抗体鎖に対する遺伝子のＮ末端と連結されるように、抗体鎖に対する遺伝子をベクター中にクローニングすることが可能である。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種のシグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質から得られるシグナルペプチド）であり得る。抗体鎖に対する遺伝子のほかに、本発明の発現ベクターは、抗体鎖に対する遺伝子の宿主細胞中での発現を調節する制御配列を有し得る。「制御配列」という用語には、プロモーター、エンハンサー及び抗体鎖に対する遺伝子の転写又は翻訳を調節するさらなる発現調節要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）が含まれるものとする。このような制御配列は、例えば、「Ｇｏｅｄｄｅｌ，  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  （１９９０）」に記載されている。制御配列の選択を含む発現ベクターの設計は、タンパク質発現の所望の強度など、形質転換されるべき宿主細胞の選択などの要因に依存し得ることは、当業者に自明である。哺乳動物宿主細胞中での発現のための好ましい制御配列には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えば、後期アデノウイルス主要プロモーター（（ＡｄＭＬＰ（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｍａｊｏｒ  Ｌａｔｅ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）及びポリオーマに由来するプロモーター及び／又はエンハンサーなどの、哺乳動物細胞中での強いタンパク質発現をもたらすウイルス要素が含まれる。ウイルスの制御要素及びその配列のさらなる記載については、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉの米国特許第５，１６８，０６２号、Ｂｅｌｌらの米国特許第４，５１０，２４５号及びＳｃｈａｆｆｎｅｒらの米国特許第４，９６８，６１５号を参照されたい。
【０１７３】
抗体鎖及び制御配列に対する遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中でベクターの複製を制御する配列（例えば、複製起点）及び選択可能なマーカー遺伝子などのさらなる配列を有し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、その中にベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，６３４，６６５号及び第５，１７９，０１７号参照、全てＡｘｅｌら）。例えば、選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターがその中に挿入されている宿主細胞を、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの活性物質に対して耐性にするのが通常である。好ましい選択可能なマーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）に対する遺伝子（メトトレキサート選択／増幅を有するｄｈｆｒ−宿主細胞中で使用するため）及びネオ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）が含まれる。
【０１７４】
軽鎖及び重鎖の発現の場合、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターは、標準化された技術を用いて、宿主細胞中に形質移入される。「形質移入」という用語の様々な形態は、原核又は真核宿主細胞中に外来ＤＮＡを導入するために通常使用される多数の技術（例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン形質移入など）を包含するものとする。理論的には、原核又は真核宿主細胞中の何れでも、本発明の抗体を発現させることが可能であるが、真核細胞中、特に哺乳動物細胞中では、原核細胞中に比べて、正しく折り畳まれ、免疫学的に活性な抗体が組み立てられ、分泌される可能性がより高いので、真核細胞中での抗体の発現、特に、哺乳動物宿主細胞中での抗体の発現が好ましい。抗体遺伝子の原核生物による発現は、活性抗体の大きな収率の産生には不十分であることが報告されている（Ｂｏｓｓ，  Ｍ．Ａ．  ａｎｄ  Ｗｏｏｄ，  Ｃ．  Ｒ．  （１９８５）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ６：１２−１３）。
【０１７５】
本発明の組換え抗体の発現に好ましい哺乳動物の宿主細胞には、ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，  （１９８０）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０）に記載されており、例えば、Ｒ．Ｊ．  Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．  Ｓｈａｒｐ  （１９８２）  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５９：６０１−６２１に記載されているようなＤＨＦＲ選択可能なマーカーとともに使用されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む。）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞が含まれる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物の宿主細胞中に導入される場合には、抗体が宿主細胞中で発現され、又は好ましくは、宿主細胞がその中で増殖している培地中に抗体が分泌されるまで、宿主細胞を培養することによって、抗体が作製される。抗体は、タンパク質を精製するための標準化された方法を用いることにより、培地から抗体を取得することができる。
【０１７６】
同様に、Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖ分子などの、完全な状態の抗体の一部を作製するために、宿主細胞を使用することが可能である。もちろん、本発明は、上記手法の変法も含む。例えば、本発明の抗体の軽鎖又は重鎖の一方（但し、両方ではない。）をコードするＤＮＡで宿主細胞を形質移入することが望ましい場合があり得る。目的の抗原の結合にとって不要な軽鎖又は重鎖が存在する場合には、１つのこのような軽鎖若しくは１つのこのような重鎖の何れか又は両鎖をコードするＤＮＡは、組換えＤＮＡ技術を用いて、部分的に又は完全に欠失される。このような末端切断されたＤＮＡ分子によって発現される分子は、同様に、本発明の抗体に属する。さらに、標準的な化学的方法によって本発明の抗体を第二の抗体と架橋することにより、一方の重鎖及び一方の軽鎖が本発明の抗体であり、並びに他方の重鎖及び軽鎖が目的の抗原以外の抗原に対して特異性を有する二重機能性抗体を作製することが可能である。
【０１７７】
本発明の抗体又はその抗原結合部分の組換え発現のための好ましい系では、リン酸カルシウムによって媒介されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞中への形質移入によって、重抗体鎖及び軽抗体鎖の両方をコードする組換え発現ベクターが導入される。遺伝子の強固な転写をもたらすために、重及び軽抗体鎖に対する遺伝子の組換え発現ベクター内には、各事例において、制御ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター要素中への作動的連結が存在する。組換え発現ベクターは、メトトレキサート選択／増幅を用いることにより、ベクターで形質移入されたＣＨＯ細胞を選択するために使用することができるＤＨＦＲ遺伝子も有する。選択された被形質転換宿主細胞は、重及び軽抗体鎖が発現され、完全な状態の抗体が培地から得られるように培養される。組換え発現ベクターを作製し、宿主細胞を形質移入し、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、及び培地から抗体を得るために、分子生物学の標準化された技術が使用される。従って、本発明は、本発明の組換え抗体が合成されるまで、本発明の宿主細胞を適切な培地中で培養することにより、本発明の組換え抗体を合成する方法に関する。本方法は、さらに、培地から組換え抗体を単離することを含み得る。
【０１７８】
ファージディスプレイによる組換え抗体ライブラリーのスクリーニングに対する代替法として、本発明の抗体を同定するために、巨大なコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための当業者に公知のさらなる方法を使用することが可能である。代替的な発現系の１つの種類において、組換え抗体ライブラリーは、ＳｚｏｓｔａｋとＲｏｂｅｒｔｓのＷＯ９８／３１７００及び「Ｒｏｂｅｒｔｓ，  Ｒ．Ｗ．  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，  Ｊ．Ｗ．  （１９９７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４：１２２９７−１２３０２」に記載されているようなＲＮＡ−タンパク質融合物の形態で発現される。この系では、共有結合による融合は、ｍＲＮＡとこれがコードするペプチド又はタンパク質との間に、それらの３’末端にピューロマイシン（ペプチジルアクセプター抗生物質）を有する合成ｍＲＮＡのインビトロ翻訳により生成される。従って、本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又はその誘導体／均等物への抗体又はその一部の結合など、コードされるペプチド又はタンパク質の（例えば、抗体又はその一部の）特性に基づいて、ｍＲＮＡの複雑な混合物（例えば、コンビナトリアルライブラリー）から特異的なｍＲＮＡを濃縮することが可能である。抗体又はその一部をコードし、及びこのようなライブラリーのスクリーニングから得られる核酸配列は、上述されている様式で（例えば、哺乳動物の宿主細胞中で）組換え手段によって発現させることが可能であり、さらなるラウンドでｍＲＮＡ−ペプチド融合物をスクリーニングするか（この場合には、元の選択された配列中に変異が導入される。）、又は上記様式で組換え抗体のインビトロアフィニティー成熟のための他の方法を用いることによって、さらなるアフィニティー成熟へさらに供することが可能である。
【０１７９】
インビボ及びインビトロアプローチの組み合わせ：
本発明の抗体は、同様に、ＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又は誘導体／均等物結合抗体の産生を刺激するために、まず、宿主動物中、インビボで、本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又はその誘導体／均等物を抗体レパートリーに対して作用させ、続いて、１つ又はそれ以上のインビトロ技術の補助を得て、さらなる抗体選択及び／又は抗体成熟（すなわち、最適化）が達成される方法など、インビボ及びインビトロアプローチの組み合わせを適用することによって作製することができる。一実施形態によれば、このような組み合わされた方法は、抗原に対する抗体応答を刺激するために、まず、本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又はその誘導体／均等物で、ヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ラクダ科の動物、ヤギ又はこれらのトランスジェニック様式又はキメラマウス）を免疫すること、及び、続いて、ＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又はその誘導体／均等物のインビボでの作用を通じて、インビボで刺激されたリンパ球から得られた免疫グロブリン配列を用いて、ファージディスプレイ抗体ライブラリーを作製及びスクリーニングすることを含み得る。この組み合わされた手法の第一の段階は、インビボアプローチに関して上述した様式で実施することができるのに対して、本手法の第二の段階は、インビトロアプローチに関して上述した様式で実施することができる。刺激されたリンパ球から産生されたファージディスプレイライブラリーのインビトロスクリーニングをその後に行うヒト以外の動物の超免疫化のための好ましい方法には、ＢｉｏＳｉｔｅ  Ｉｎｃ．，によって記載されている方法が含まれ、例えば、ＷＯ  ９８／４７３４３、ＷＯ  ９１／１７２７１、米国特許第５，４２７，９０８号及び米国特許第５，５８０，７１７号を参照されたい。
【０１８０】
さらなる実施形態によれば、組み合わされた方法は、まず、ＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又はその誘導体／均等物に対する抗体応答を刺激するために、本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又はその誘導体／均等物で、ヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ラクダ科の動物、ヤギ又はこれらのノックアウト及び／又はトランスジェニック様式又はキメラマウス）を免疫すること、及び、（例えば、免疫された動物から作製された）ハイブリドーマをスクリーニングすることによって、所望される特異性を有する抗体を産生するリンパ球を選択することを含む。抗体又は単一ドメイン抗体に対する遺伝子は、（逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応などの標準化されたクローニング方法によって）選択されたクローンから単離され、選択された１つの抗体の又は選択された複数の抗体の結合特性を改善するために、インビトロアフィニティー成熟に供される。この手法の第一の段階は、インビボアプローチに関して上述した様式で完結することができるのに対して、本手法の第二の段階は、特に、ＷＯ９７／２９１３１号及びＷＯ００／５６７７２号に記載されているものなどのインビトロアフィニティー成熟の方法を使用することにより、インビトロアプローチに関して上述した様式で完結することができる。
【０１８１】
さらなる組み合わされた方法において、組換え抗体は、リンパ球抗体選択法（ＳＬＡＭ）のような当業者に公知で、米国特許第５，６２７，０５２号、ＷＯ９２／０２５５１号及びＢａｂｃｏｃｋ，  Ｊ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：７８４３−７８４８に記載されている手順を用いることによって、単一の単離されたリンパ球から生成される。この方法において、まず、ＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又は誘導体／均等物に対する免疫応答を刺激するために、本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又はその誘導体／均等物で、ヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ラクダ科の動物、ヤギ又はこれらのトランスジェニック様式又はキメラマウス）をインビボで免疫し、次いで、抗原特異的溶血プラークアッセイを用いることによって、目的の抗体を分泌する単一細胞を選択する。この目的のために、ビオチンなどのリンカーを用いてＡＧＥＲ−ＲＭＥ若しくはＡＧＥＲ−ＣＤＰ又はこれらの誘導体／均等物又は構造的に関連した目的分子をヒツジの赤血球に結合することが可能であり、ここで、適切な特異性の抗体を分泌する各細胞は、溶血プラークアッセイを用いることによって同定することが可能である。目的の抗体を分泌する細胞の同定に続いて、逆転写酵素ＰＣＲによって、軽鎖及び重鎖の可変領域に対するｃＤＮＡを細胞から取得し、次いで、これらの可変領域は、ＣＯＳ又はＣＨＯ細胞などの哺乳動物宿主細胞中で、適切な定常免疫グロブリン領域（例えば、ヒト定常領域）とともに発現させることができる。インビボで選択されたリンパ球由来の増幅された免疫グロブリン配列で形質移入された宿主細胞は、次いで、所望の特異性を有する抗体を発現する細胞を単離するために、例えば、形質移入された細胞を増殖させることによって、さらなるインビトロでの分析及び選択に供することができる。増幅された免疫グロブリン配列は、さらに、インビトロで操作することが可能である。
【０１８２】
６．医薬組成物
６．１総論
本発明は、本発明のタンパク質（ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰ；抗ＡＧＥＲ−ＲＭＥ又は抗ＡＧＥＲ−ＣＤＰ抗体、二重特異性抗体、上述のようなハイブリッドタンパク質などのＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰ結合リガンド；ＡＧＥＲ外部ドメイン及びN末端細断片）又はコーディングＡＧＥＲ−ＲＭＥ核酸配列を活性物質として含み、及び、適宜、医薬として許容される担体を含む医薬組成物にも関する。本発明の医薬組成物は、少なくとも１つのさらなる治療剤、例えば、本明細書に記載されている疾患の１つの治療のための１つ又はそれ以上の追加の治療剤をさらに含み得る。
【０１８３】
医薬として許容される担体には、生理的に適合的である限り、全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗微生物剤、等張化剤及び吸収を遅延させる因子などが含まれる。
【０１８４】
医薬として許容される担体には、例えば、水、生理的食塩水溶液、リン酸緩衝化された生理的食塩水溶液、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギナート、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ及びメチルセルロースが含まれる。製剤は、さらに、潤滑剤、例えば、獣脂、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油；湿潤剤；乳化剤及び懸濁剤；ヒドロキシ安息香酸メチル及びプロピルなどの防腐剤；抗酸化剤；抗刺激剤；キレート剤；コーティング補助；エマルジョン安定化剤フィルム形成剤；ゲル形成剤；匂い遮蔽剤、風味遮蔽剤、樹脂：親水コロイド；溶媒；可溶化剤；中和剤；浸透促進剤；顔料；四級アンモニウム化合物；再脂肪剤及び過脂肪剤；軟膏、クリーム又は油性基剤；シリコーン誘導体；拡散補助剤；安定化剤；滅菌剤；坐薬基剤；結合剤、充填剤、潤滑剤、崩壊剤又はコーティングなどの錠剤賦形剤；噴射剤；乾燥剤；乳白剤；濃縮剤；蝋；可塑剤；白油などの医薬として許容される担体又は慣用の賦形剤を含み得る。これに関する準備は、例えば、「Ｆｉｅｄｌｅｒ，  Ｈ．Ｐ．，  Ｌｅｘｉｋｏｎ  ｄｅｒ  Ｈｉｌｆｓｓｔｏｆｆｅ  ｆｕｒ  Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，  Ｋｏｓｍｅｔｉｋ  ｕｎｄ  ａｎｇｒｅｎｚｅｎｄｅ  Ｇｅｂｉｅｔｅ，  ４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａｕｌｅｎｄｏｒｆ：ＥＣＶ−Ｅｄｉｔｉｏ−Ｋａｎｔｏｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  １９９６」に記載されているような専門知識に基づく。Ｈａｇｅｒの「Ｈａｎｄｂｕｃｈ  ｄｅｒ  Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓｃｈｅｎ  Ｐｒａｘｉｓ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ」も比較されたい。
【０１８５】
医薬組成物は、例えば、非経口投与に適切であり得る。この目的のために、例えば、抗体などの活性物質は、好ましくは、０．１−２５０ｍｇ／ｍｌの活性物質含量を有する注射可能溶液として調製される。注射可能溶液は、液体又は凍結乾燥された形態で、剤形として、フリントガラス又はバイアル、アンプル又は充填された注射器の中に調製することが可能である。
【０１８６】
緩衝液は、Ｌ−ヒスチジン（１−５０ｍＭ、好ましくは５−１０ｍＭ）を含み、５．０−７．０のｐＨ、好ましくは６．０のｐＨを有し得る。さらなる適切な緩衝液には、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム又はリン酸カリウム緩衝液が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１８７】
０−３００ｍＭ（液体剤形の場合、好ましくは１５０ｍＭ）の濃度になるように、溶液の張度を調整するために、塩化ナトリウムを使用することが可能である。凍結乾燥された剤形の場合、例えば、スクロース（例えば、０−１０％、好ましくは０．５−１．０％（ｗ／ｗ））などの凍結保護剤を含めることが可能である。さらなる適切な凍結保護剤には、トレハロース及びラクトースが含まれる。凍結乾燥された剤形の場合、充填剤、例えば、マニトール（例えば、１−１０％、好ましくは２−４％（ｗ／ｗ））を含めることが可能である。安定化剤、例えば、Ｌ−メチオニン（例えば、５１−５０ｍＭ、好ましくは５−１０ｍＭ）は、液体及び凍結乾燥された剤形の両方で使用することができる。さらなる適切な充填剤には、グリシン及びアルギニンが含まれる。同様に、界面活性剤、例えば、ポリソルバート８０（例えば、０−０．０５％、好ましくは、０．００５−０．０１％（ｗ／ｗ））を使用することが可能である。さらなる界面活性剤には、ポリソルバート２０及びＢＲＩＪ界面活性剤が含まれる。
【０１８８】
本発明の組成物は、多数の形態を採り得る。これらには、液体溶液（例えば、注射及び注入可能な溶液、ローション、点眼薬及び点耳薬）、リポソーム、分散液又は懸濁液並びに経口粉末、散布剤、顆粒、錠剤、トローチ、におい袋、カシェー（ｃａｃｈｅｔ）、コートされた錠剤、硬及び軟ゼラチンカプセルなどのカプセル、坐薬又は膣医薬形態などの固体形態、軟膏、クリーム、ヒドロゲル、ペースト又はパッチなどの半固体医薬形態のような、液体、半固体又は固体剤形が含まれる。本発明の活性物質を投与するために、埋め込まれた送達装置を使用することも可能である。好ましい形態は、予定される投与の様式及び治療的使用に依存する。典型的には、注射可能又は注入可能溶液の形態の組成物が好ましい。適切な投与経路は、例えば、非経口（例えば、静脈内、皮内、腹腔内、筋肉内）である。好ましい実施形態において、活性物質は、静脈内注入又は注射によって投与される。さらなる好ましい実施形態によれば、活性物質は、筋肉内又は皮下注射によって投与される。
【０１８９】
治療組成物は、典型的には、無菌でなければならず、製造及び保存の条件下で安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム構造又は高い活性物質濃度に適したさらなる秩序だった構造として調合され得る。無菌の注射可能溶液は、適切であれば、先述の成分の１つ又は組み合わせとともに、必要とされる量の活性化合物（例えば、抗体など）を適切な溶媒中に導入し、必要に応じて、続いて、ろ過により滅菌することによって作製することができる。分散液は、通常、基礎分散媒を含み、適宜、さらなる必要な成分を含む無菌ビヒクル中に活性化合物を導入することによって調製される。無菌の注射可能溶液を調製するための滅菌された凍結乾燥粉末の場合には、好ましい製造方法は、活性成分の粉末、及び、適宜、ろ過によって予め滅菌された溶液から得たさらなる所望の成分をもたらす真空乾燥及び噴霧乾燥である。溶液の正しい流動性は、必要とされる粒径を維持する分散液の場合には、例えば、レシチンなどのコーティングを用いることによって、又は界面活性剤を用いることによって維持することが可能である。注射可能な組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる物質、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物中に取り込ませることにより達成することができる。
【０１９０】
本発明の活性物質は、当業者に公知である多数の方法を用いて投与することが可能であるが、皮下注射、静脈内注射又は注入が多くの治療的適用に対して、好ましい投与様式である。当業者であれば、投与の経路及び／又は様式は所望の結果に応じて使い分けられることが自明である。ある種の実施形態によれば、活性化合物は、化合物を急速な放出から保護する担体を用いて調製することが可能である（例えば、インプラント、経皮パッチ及びミクロ封入された送達系を含む、徐放製剤）。エチレン−酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸などの生物分解可能な生体適合性ポリマーを使用することが可能である。このような製剤を調製するための方法は、当業者に一般的に公知であり、例えば、「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｕｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｊ．  Ｒ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  ｅｄ．，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７８」を参照されたい。
【０１９１】
ある種の実施形態によれば、本発明の活性物質は、例えば、不活性希釈剤又は吸収可能な食用担体に入れて、経口投与することができる。活性物質（及び、必要であればさらなる成分）は、硬若しくは軟ゼラチンカプセル中に封入し、錠剤へと圧縮し、又は食物に直接添加することも可能である。経口治療投与の場合、活性物質は賦形剤と混合され、嚥下可能な錠剤、口腔錠、カプセル、エリキシル、坐薬、シロップなどの形態で使用することができる。本発明の活性成分が非経口以外の経路によって投与されるべき場合には、材料のコーティングを選択する必要がある場合があり得、これにより、材料の不活化が抑制される。
【０１９２】
本発明の活性物質は、上記疾患の治療において使用することが可能な１つ又はそれ以上のさらなる治療剤と一緒に投与することが可能である。
【０１９３】
本発明の医薬組成物は、通常、本発明の少なくとも１つの活性物質の治療的有効量又は予防的有効量を含む。所望される処置に応じて、例えば、治療的又は予防的治療が望まれるか否かにより、投薬計画を選択し、適合させることが可能である。例えば、治療的な状況の必要性に応じて、単回投薬、経時的に分配される複数の分離した投薬、又は上昇若しくは減少する投薬量を投与することが可能である。投与を促進し、投薬量の均一性を確保するために、単位剤形の非経口組成物を調合することが特に有利である。
【０１９４】
担当医は、具体的な治療及び具体的な活性物質に最も適した剤形、投与様式及び投薬量を、困難なく決定することが可能である。
【０１９５】
本発明の活性物質の治療的又は予防的有効量は、例えば、０．１−２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１−１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得るが、これらに限定されるものではない。もちろん、緩和されるべき症状の性質及び重篤度に応じて、これらの量は変えることが可能である。  
６．２ワクチン
本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ又はＡＧＥＲ−ＣＤＰ及びその誘導体／均等物は、治療されるべき患者のワクチン接種のための免疫原として使用することが可能である。
【０１９６】
この目的のために使用することができるワクチンは、一般的には、少なくとも１つの本発明のＡＧＥＲ−ＲＭＥ及び／又はＡＧＥＲ−ＣＤＰ及び／又は少なくとも１つの本発明のこれらの誘導体／均等物を含む医薬組成物である。組成物は、生理的に許容される担体をさらに含み得、適宜、さらなる賦形剤、例えば、免疫刺激物質を含み得る。
【０１９７】
原則として、所望に応じて適切な担体を選択できるのに対して、担体の性質は、一般的には、投与の経路によって支配される。従って、本発明のワクチンは、特に、非経口、例えば、静脈内、筋肉内及び皮下投与に適した形態で調合することが可能である。これらの場合には、担体は、好ましくは、水、生理的食塩水溶液、アルコール、脂肪、蝋及び／又は緩衝液を含む。
【０１９８】
本発明のワクチンには、多数の免疫刺激物質のあらゆる１つを使用することが可能である。例えば、アジュバントを含めることが可能である。ほとんどのアジュバントは、水酸化アルミニウム又は鉱物油及びリピドＡに由来するタンパク質、ボルタデラ・パーチュシス（Ｂｏｒｔａｄｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）又はミコバクテリウム・チュバキュロシスなどの抗原を急速な分解から保護するための物質を含む。適切なアジュバント、例えば、完全若しくは不完全なフロイントアジュバント；ＡＳ−２；水酸化アルミニウム（適宜ゲルとして）若しくはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；カルシウム、鉄若しくは亜鉛塩；アシル化されたチロシンの不溶性懸濁物；アシル化された糖、陽イオン若しくは陰イオンとして誘導化された多糖；ポリホスファゼン；生物分解可能なミクロスフェア；モノホスホリルリピドＡは、通常市販されている。ＧＭ−ＣＳＦ又はインターロイキン−２、−７若しくは−１２などのサイトカインも、同様に、アジュバントとして使用することが可能である。
【０１９９】
７．治療的方法
７．１ＡＧＥＲ関連疾患
「ＡＧＥＲ関連」疾患の診断及び／又は治療のための前提条件が、本発明により、初めて改善され、又は作出される。  「Ａｇｅｒ関連」疾患は、特に、ＡＧＥＲ／ＡＧＥＲ、ＡＧＥＲ／リガンド、ＡＧＥＲ／受容体、ＡＧＥＲ／受容体／リガンド、ＡＧＥＲ／受容体／共受容体及び／又はＡＧＥＲ／受容体／カウンター受容体の相互作用と関連する疾病である。「Ａｇｅｒ関連」疾患は、ＡＧＥＲ又はＡＧＥＲリガンドの増加した発現又はその他の形成によって、さらに特徴付けられ得る。
【０２００】
特に挙げるべきＡＧＥＲ関連疾患は、ＷＯ２００４／０１６２２９号及び／又は以下の文献に記載されている以下の疾病：
アミロイドーシス、癌、関節炎、クローン病、慢性炎症性疾患、急性炎症性疾患（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＡＭ  ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２００１  Ｏｃｔ；１０８（７）：９４９−５５）、心血管疾患、糖尿病、糖尿病合併症（Ｙａｎ  ＳＤ  ｅｔ  ａｌ：Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  １９９７  Ｍａｒ；２７（３）：１７９−８１）、プリオン関連疾患（Ｓａｓａｋｉ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ：Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ．  ２００２  Ｊｕｎ  ２８；３２６（２）：１１７−２０）、脈管炎、腎症、網膜症及び神経障害（Ｔｈｏｒｎａｌｌｅｖ  ＰＪ．：Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．  ２００２；５０：３７−５７）である。アルツハイマー病（Ｗｅｌｄｏｎ  ＤＴ  ｅｔ  ａｌ：Ｇｅｒｉａｔｒｉｃｓ．  １９９７  Ｓｅｐ；５２  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１３−６；  Ｙａｎ  ＳＤ  ｅｔ  ａｌ：Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．  ２０００  Ｊｕｌ  ２６；  １５０２（１）：１４５−５７）、関節リウマチ、骨関節炎（Ｄｒｉｎｄａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  Ｉｎｔ．  ２００４  Ｍａｒ  ２６）、腸疾患（Ｆｏｅｌｌ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ：Ｇｕｔ．  ２００３  Ｊｕｎ；５２（６）：８４７−５３）、多発性硬化症（Ｙａｎ  ＳＤ  ｅｔ  ａｌ：Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  ２００３  Ｍａｒ；９（３）：２８７−９３）、乾癬（Ｆｏｅｌｌ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ：Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  （Ｏｘｆｏｒｄ）．  ２００３  Ｎｏｖ；４２（１１）：１３８３−９．）、狼瘡（Ｔａｎｊｉ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒａｌ．  ２０００  Ｓｅｐ；１１（９）：１６５６−６６）、自己免疫疾患全般、敗血症（Ｌｉｌｉｅｎｓｉｅｋ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２００４  Ｊｕｎ；１１３（１１）：１６４１−５０）、動脈硬化症及び再狭窄（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＡＭ  ｅｔ  ａｌ：Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．  １９９９  Ｍａｒ  １９；８４（５）：４８９−９７）。
【０２０１】
７．２治療的アプローチ
本発明の治療的アプローチは、上記治療剤の少なくとも１つが、治療されるべき疾患と関連する、以下の種類：ＡＧＥＲ／ＡＧＥＲ、ＡＧＥＲ／リガンド、ＡＧＥＲ／受容体、ＡＧＥＲ／受容体／リガンド、ＡＧＥＲ／受容体／共受容体及びＡＧＥＲ／受容体／カウンター受容体の相互作用を調節する効果を基礎としている。
【０２０２】
これに関して、本発明に従って実施される治療とともに観察される治療的効果は、これらの相互作用の少なくとも１つに対する、アゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト又は逆アゴニスト効果を基礎とし得る。
【０２０３】
これに関して、治療的効果は、特に、
ａ）シグナル経路の誘導、部分的阻害又は完全な中断；及び／又は
ｂ）身体によってよりよく除去され得るか、又は生理的／病態生理的に無効である複雑な構造の形成
を基礎としている。
【０２０４】
８．診断方法
本発明に従って挙げられるべき診断剤は、特に、ＡＧＥＲ−ＲＭＥ及びＡＧＥＲ−ＣＤＰ並びに上記誘導体／均等物並びに抗ＡＧＥＲ−ＲＭＥ及び抗ＡＧＥＲ−ＣＤＰ抗体である。
【０２０５】
従って、特に、疾病に典型的な抗原又は抗体を検出することによって、定性的又は定量的な改善を伴って、上記病的状態を決定することが、本発明により可能となる。
【０２０６】
決定は、好ましくは、免疫学的方法を用いて行われる。これは、原則として、抗体が使用されるあらゆる分析的又は診断的検査方法を用いて行うことが可能である。これらには、凝集及び沈降技術、イムノアッセイ、免疫組織化学的方法及びイムノブロッティング技術、例えば、ウェスタンブロッティング又はドットブロット法が含まれる。インビボ法、例えば、画像検査法も含まれる。
【０２０７】
イムノアッセイにおける使用が有利である。適切なものは、競合的イムノアッセイ（すなわち、抗体と標識された抗体（トレーサー）が抗体結合を競合する。）及びサンドイッチイムノアッセイ（すなわち、抗原への特異的抗体の結合が、第二の、通常は標識された抗体を用いて検出される。）の両方である。これらのアッセイは、均一（すなわち、固相及び液体相への分離がない。）又は不均一（すなわち、結合された標識が、結合されていない標識から、例えば、固相結合した抗体によって分離される。）の何れでもよい。標識化及び測定の方法に応じて、様々な不均一及び均一イムノアッセイフォーマットは、特定のクラスに、例えば、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＦＩＡ（蛍光イムノアッセイ）、ＬＩＡ（発光イムノアッセイ）、ＴＲＦＩＡ（時間分解ＦＩＡ）、ＩＭＡＣ（免疫活性化（ｉｍｍｕｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ））、ＥＭＩＴ（酵素増倍免疫検査）、ＴＩＡ（免疫比濁法）、Ｉ−ＰＣＲ（イムノ−ＰＣＲ）に割り振ることができる。
【０２０８】
本発明の抗原測定に対しては、競合イムノアッセイが好ましい。この場合には、標識された抗原（トレーサー）は、定量されるべき試料の抗原と、使用される抗体への結合を競合する。試料中の抗原の量、すなわち、抗原の量は、標準曲線の補助を得て、置換されたトレーサーの量から求めることができる。
【０２０９】
これらの目的のために利用できる標識のうち、酵素が有利であることが明らかとなっている。例えば、ペルオキシダーゼ、特に西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びβ−Ｄ−ガラクトシダーゼに基づく系を使用することができる。これらの酵素に対して、特異的な基質を使用することが可能であり、それらの変換は、例えば、測光法によって追跡することができる。適切な基質系は、アルカリホスファターゼについては、ｐ−ニトロフェニルホスファート（ｐ−ＮＰＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＰＴ）、ファーストレッド／ナフトール−ＡＳ−ＴＳホスファート；ペルオキシダーゼについては、２，２−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリンー６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＴ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジン（ＴＭＢ）、ｏ−ジアニシジン、５−アミノサリチル酸、３−ジメチルアミノ安息香酸（ＤＭＡＢ）及び３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）；β−ガラクトシダーゼについては、ｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトシド（ｏ−ＮＰＧ）、ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトシド及び４−メチルウンベリフェニルβ−Ｄ−ガラクトシド（ＭＵＧ）に基づく。これらの基質系は、多くの場合、即座に使用できる形態、例えば、錠剤の形態で市販されており、これは、適切な緩衝液などのさらなる試薬も含み得る。
【０２１０】
トレーサーを調製するための、ペプチド又は抗体への標識のカップリングは、それ自体公知の様式で起こり得る。さらに、タンパク質への抱合のために適切に修飾された多数の標識、例えば、ビオチン−、アビジン−、エクストラビジン−又はストレプトアビジン−抱合された酵素、マレイミド活性化された酵素などを使用することができる。これらの標識は、本発明に従って使用されるべき分子と直接反応させることが可能である。
【０２１１】
不均一なイムノアッセイフォーマットを選択する場合、抗原抗体複合体は、分離の目的で、例えば支持体に結合された抗イディオタイプ抗体（例えば、ウサギＩｇＧに対して誘導された抗体）を介して、支持体へ結合させることが可能である。適切な抗体でコートされた支持体、特にマイクロタイタープレートは、公知であり、市販されている。
【０２１２】
本発明は、さらに、上記少なくとも１つの抗体及びさらなる成分を有する免疫アッセイセットに関する。これは、本発明のＡＧＥＲ測定を実施するための手段の集まりを、通常は、パック単位として含む。使用の簡便さを最大限にするために、これらの手段は、好ましくは、実質的に、そのまま使用できるように提供される。有利な配置は、キット形態のイムノアッセイによって提供される。キットは、通常、成分を分離して配置するために、複数の容器を含む。全ての成分は、そのまま使用できる希釈状態で、希釈用濃縮物として、又は溶解若しくは懸濁するための乾燥物質若しくは凍結乾燥物質として提供することが可能であり、使用されるまで、単一の成分又は全ての成分を凍結し、又は周囲温度で保存し得る。これらの事例において、イムノアッセイが、好ましくは、使用前に凍結温度に保たれなければならないように、血清は、好ましくは、例えば、−２０℃で、ショック凍結される。
【０２１３】
イムノアッセイに添加されるさらなる成分は、標準的なタンパク質、トレーサー；対照血清、マイクロタイタープレート、好ましくは抗体でコートされたマイクロタイタープレート、緩衝液、例えば、検査用緩衝液、洗浄用緩衝液又は基質を反応させるための緩衝液、及び酵素基質そのものであり得る。
【０２１４】
イムノアッセイの一般的な原理並びに研究室及び臨床的な補助具としての抗体の生成及び使用は、例えば、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｈａｒｌｏｗ，  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ｄ．，  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８８）中に見出される。
【０２１５】
９．スクリーニング法
本発明は、その中にエフェクターが疑われている（ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ）試料が、ＡＧＥＲ−ＲＭＥポリペプチド又はＡＧＥＲ−ＣＤＰとともにインキュベートされ、及びエフェクターＡＧＥＲ−ＲＭＥ複合体又はエフェクター−ＡＧＥＲ−ＣＤＰ複合体の形成について混合物が調査される、ＡＧＥＲ受容体のエフェクターを検出するための方法にも関する。
【０２１６】
このようなエフェクターは、アゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト又はインバースアゴニスト効果を有し得る。これらは、例えば、合成低分子量物質、合成ペプチド、天然若しくは合成抗体分子又は天然物質であり得る。
【０２１７】
本発明のこのような方法は、通常、異なる多数の物質から将来の使用に関連して最も有望であると思われる物質を選択することが可能なインビトロスクリーニング方法として実施される。  
例えば、多数の活性物質候補を含む大規模な物質ライブラリーは、コンビナトリアル化学を用いて準備することができる。所望の活性を有する物質に対するコンビナトリアル物質ライブラリーのスクリーニングは、自動化することができる。好ましくはマクロタイタープレート上に配置された各アッセイの効率的な評価のために、ロボットスクリーニング装置が使用される。従って、本発明は、スクリーニング法、すなわち、好ましくは下記の方法の少なくとも１つが使用される一次及び二次スクリーニング法の両方にも関する。複数の方法が使用される場合には、これは、調査されるべき物質の１つ及び同一の試料に対して、又は異なる試料に対して、順次に又は同時に行うことができる。
【０２１８】
このような方法を実施するための効率的な技術は、活性物質スクリーニングの分野において公知であるシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡと略される。）である。本アッセイを実施するためのキット及び成分は、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈから商業的に購入することができる。原則として、可溶化された又は膜結合された受容体が、シンチラントを含む小さな蛍光微小球上に固定化される。例えば、放射性リガンドが、固定化された受容体に結合する場合、シンチラント及び放射性リガンドが空間的に近接するので、シンチラントは励起されて光を発する。
【０２１９】
このような方法を実施するためのさらなる効率的な技術は、活性物質スクリーニングの分野において公知のＦｌａｓｈＰｌａｔｅＲ技術である。本アッセイを実施するためのキット及び成分は、例えば、ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓから商業的に購入することができる。本原理は、同様に、シンチラントでコートされたマイクロタイタープレート（９６又は３８４ウェル）を基礎としている。
【０２２０】
本明細書に記載されているアクチン細胞骨格再編成（ＡＣＲ）アッセイを用いたスクリーニング法も、同様に、適用可能である。
【０２２１】
これらの方法によって同定可能な物質又は物質混合物の一部は、同様に、本発明の態様である。
【０２２２】
ここで、以下の製造及び使用の非限定的な例を参照しながら、さらに詳しく、本発明を説明する。
【０２２３】
実験の部
Ｉ．一般的な情報
ａ）培地の構成成分
ＲＰＭＩ−Ｇｌｕｔａｍａｘ（ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＵＳＡ）
ゲネチシン（Ｇ４１８）；（抗生物質；選択マーカー）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）透析されている、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
抗生物質−抗真菌剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
ゼオシン（抗生物質；選択マーカー）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
ｂ）細胞
ヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）（ＡＴＣＣ＝アメリカン・ティシュー・カルチャー・コレクション、注文番号：ＣＲＬ−１５７３）を、ＲＨＯで（ＨＥＫ２９３−ＲｈｏＡ）、又は受容体複合体ＮｇＲ／ｐ７５と組み合わせたＲｈｏで（ＨＥＫ２９３−ＲｈｏＡ／ＮｇＲ／ｐ７５）安定的に形質移入した。５％の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｍＭ）及びネオマイシン（ＨＥＫ２９３−ＲｈｏＡ）又はゼオシンと組み合わせたネオマイシン（ＨＥＫ２９３−ＲｈｏＡ／ＮｇＲ／ｐ７５）を補充したＲＰＭＩ−Ｇｌｕｔａｍａｘ培地中に細胞を維持した。
【０２２４】
ｃ）試薬
【０２２５】
【表２】
2008526243.tif 000008
【０２２６】
ｄ）一般的なアッセイ法
１）免疫蛍光測定を用いたＡＣＲアッセイ
刺激の２日前に、９６ウェルを有するマイクロタイタープレート中に、１×１０４個の細胞を導入した。５％ＦＣＳを含む培地（ＲＰＭＩ−Ｇｕｔａｍａｘ）中の適切な試薬（例えば、ＬＰＡ又はＡＰ−Ｎｏｇｏ−６６）で細胞を刺激した。５〜１０分の刺激期間後、冷たいＰＢＳで活性化を停止した。３−４％強度のパラホルムアルデヒド溶液で細胞を固定し、０．２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳで浸透させ、３０−４５分間、ファロイジンＡｌｅｘａ５６８又は４８８とともにインキュベートした。さらに、核染色のために、ＤＡＰＩとのインキュベーションを５分間行った。落射蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ２５）の補助を得て、細胞を可視化した。蛍光顕微鏡写真は、冷却されたＺｅｉｓｓのＣＣＤカメラを用いて記録した。
【０２２７】
２）ＦＡＣＳ分析
試薬：
【０２２８】
【表３】
2008526243.tif 000009
【０２２９】
操作：
まず、ＰＢＳで、ＨＥＫ２９３細胞を洗浄した。５ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳで、接着性細胞を剥離させた。続いて、２×１０６個の細胞をＥｐｐｅｎｄｏｒｆｆ容器中に導入し、１３００ｒｐｍで２分間遠心した。１％ＢＳＡ（１ｍＬ／容器）を含むＰＢＳ中に細胞を再懸濁し、１３００ｒｐｍで２分間遠心した。
【０２３０】
一次抗体（マウス抗ヒトｐ７５  １：１００、又はヤギ抗ヒトＮｏｇｏＲ  １：５０）を含むＰＢＳ／１％ＢＳＡの０．１ｍＬでペレットを再び再懸濁し、４℃で９０分間インキュベートした。続いて、ＰＢＳ／１％ＢＳＡの０．１ｍＬを添加し、混合し、１３００ｒｐｍで２分間遠心した。  
１％ＢＳＡ（０．１ｍＬ／容器）及び二次抗体（抗マウス−ＦＩＴＣ１：１００、又はヤギ−ＦＩＴＣ１：１００）を含むＰＢＳ中にペレットを再懸濁し、４℃で６０分間インキュベートした。
【０２３１】
１％ＢＳＡ（１ｍＬ／容器）を含むＰＢＳを添加し、混合し、１３００ｒｐｍで２分間遠心した。遠心後、死滅した細胞を検出するために、ＰＢＳ／０．１％ヨウ化プロピジウム中にペレットを再度再懸濁した。再懸濁後に、ＦＡＣＳ分析（ＦＡＣＳｃａｎ，  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を行った。
【０２３２】
ＩＩ．調製例
調製例１：ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６の調製：
ａ）ｈＮｏｇｏＡのＮｏｇｏ６６断片のクローニング
出発点は、公開されているｈＮｏｇｏＡ配列（ＮＣＢＩ）：ＡＦ１４８５３７であった。以下の２つの合成オリゴヌクレオチドは、公開された配列から誘導された。
【０２３３】
Ｍｅｚ４０２：ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧＡＴＡＴＡＣＡＡＧＧＧＴＧＴＧＡＴＣＣ（配列番号：９）；開始ＡＴＧ（下線）及びＫｏｚａｋ配列（太字）を有する、アミノ酸Ｒ１０５５（斜線）からのオリゴ
Ｍｅｚ４０４ＣＴＴＣＡＧＡＧＡＡＴＣＡＡＣＴＡＡＡＴＣＡＴＣ（配列番号１０）；アミノ酸Ｋ１１２０（太字）までのオリゴ
前頭皮質ｃＤＮＡ中のこれらの２つのオリゴをテンプレートとして用いて、ＰＣＲを実施した（ＲＴ−ＰＣＲに対するＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ第一鎖合成システム；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡを用いて調製）（Ｎｏｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ，２００２，１０７（２）：１８３−１８９）。反応は、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  ＪｏＩＩａ，  ＵＳＡ）を用いて、Ｉｎｎｉｓら（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９０））のような標準的方法によって実施した。２０７ｂｐのサイズを有する得られたＤＮＡ断片は、製造業者によって指定されているとおりに、ＱＩＡＥＸＩＩゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製した。増幅され、精製された断片を、ｐｃＤＮＡ３．１Ｖ５−ＨｉｓＴＯＰＯ（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ，  ＃Ｋ４８００−０１）中に入れた。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  （１９８９））に記載されているような標準的方法によって、Ｅ．コリＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を形質転換するために、このようにして得られた構築物ｐｃＤＮＡ３．１Ｖ５−ＨｉｓｈＮＯＧＯ６６を使用した。プラスミドを有する細胞の選択は、抗生物質アンピシリンによって達成した。
【０２３４】
ＰＣＲによる９個のクローンの同定により、３つのクローンに対する２０７ｂｐの正しいサイズのバンドが示された。配列の正しさは、配列分析によってチェックした。
【０２３５】
上記プラスミドｐｃＤＮＡ３．１Ｖ５−ＨｉｓｈＮＯＧＯ６６からコーディングＮｏｇｏ６６配列を切断し、ＸｂａＩを用いて、プラスミドｐＡＰ−ｔａｇ５（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ，  Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，  ＴＮ，  ＵＳＡ）中にクローニングした。図２に図示されているプラスミドｐＡＰ−ｔａｇ５／ＰＰＣ／ｈＮＯＧＯ６６番号５（配列番号１１）が得られる。
【０２３６】
ｂ）安定な細胞株の調製：
３７℃及び５％ＣＯ２で、増殖培地（ペニシリン／ストレプトマイシンを加えた１０％ウシ胎児血清を有するＤＭＥＭ）中にて、ＨＥＫ２９３細胞を培養した。形質移入のために、６ウェルを有するプレート中に細胞を播種し（１×１０６／ウェル）、一晩インキュベートした。製造業者によって記載されているとおりに、プラスミドＤＮＡ（ｐＡＰ−ｔａｇ５／ＰＰＣ／ｈＮＯＧＯ６６番号５）１μｇ及びＦｕｇｅｎｅ６の３μＬ（ＲＯＣＨＥ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ）から構成されるカクテルで、細胞を形質移入した。２日後、トリプシンでの処理によって細胞を剥離させ、１７５ｃｍ２のベース領域を有する細胞培養瓶中に移し、増殖培地に１５０μｇ／ｍＬのゼオシンを添加することによって、選択を開始した。約４週後、増殖したゼオシン耐性細胞コロニーをトリプシンで剥離し、細胞ソーターを用いて、９６ウェルプレート中に単離した。約３週後に、この時点で集密度が５％と８５％の間と推測される増殖した単一細胞コロニーの媒地上清の分取試料を、ピペットでニトロセルロース上に加えた。ＮＢＴ（ンイトロブルーテトラゾリウム塩）及びＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファート）の溶液を添加することにより、生じた染色に基づき、アルカリホスファターゼの活性を用いてタンパク質発現を検出した。
【０２３７】
ｃ）：ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６の発現：
培養瓶中での複数継代（約２０）によって、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６を産生するＨＥＫ２９３クローン（クローン番号５）を培地（ＲＰＭＩ  Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１０％ＦＣＳ、１５０μｇ／ｍＬゼオシン、抗生物質／抗真菌剤）中で増殖させた。ドットブロットアッセイ（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ試薬を用いる。）において、２又は３回の継代ごとに、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６の発現をチェックした。  
無血清培地中でＡＰ−Ｎｏｇｏ６６を産生するために、まず、ほぼ集密状態になるまで、三重フラスコ中で、細胞を培養し、次いで、培地を発現培地（Ｐｒｏ２９３ａ−ＣＤＭ培地（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ；＃１２−７６４Ｑ）、２ｍＭグルタミン、抗生物質／抗真菌剤）に変更した。次いで、これらの細胞を、３７℃で３〜４日間培養し、上清を除去し、遠心（１５００ｒｐｍ、５分）した。−８０℃で、上清を収集した。さらなる処理のために、上清を融解し、プロテイナーゼ阻害剤（ＰＭＳＦ０．１ｍＭ、Ｐｅｆａｂｌｏｃ  ＳＣ１ｍＭ）と混合し、Ａｍｉｃｏｎチューブ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で濃縮し、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６濃度を測定した（約３μｇ／ｍＬ）（ＳＤＳゲル中での、単量体ＡＰの分子量：６７ｋＤａ及び単量体ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６の分子量約７５ｋＤａ）。
【０２３８】
抗ＡＰ−アガロースを用いて、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６プールを免疫沈降させた。５％メルカプトエタノールの存在下、９５℃で、１０分間加熱することによって沈殿を変性させて、アガロースビーズから除去し、最後にＡＰ及びＮｏｇｏ６６に対して特異性を有する抗体を用いるＷｅｓｔｅｒｎ分析によって確認した。ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６は二量体として移動し、約１４０ｋＤａの分子量を有することが、ゲルクロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、移動相：２０ｍＭリン酸ナトリウム、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ  ７．４）によって決定された。ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６は機能的に活性であるが、ＧＳＴ−Ｎｏｇｏ６６は機能的に活性でないことが、予備実験において見出された。従って、ＮｇＲリガンドは、機能的であるために、全て、おそらく、二量体の形態でなければならないと推測される。アルカリホスファターゼの結晶構造によって示されるように、二量体化はＡＰタグによって誘導される（実験は示さず。）。
【０２３９】
調製例２：機能的なアクチン細胞骨格再編成（ＡＣＲ）アッセイを実施するための組換えＨＥＫ細胞株の調製
１．必要とされる構築物の調製
ａ）ｈｐ７５のクローニング：ｐｃＤＮＡ３．１（Ｖ５−Ｈｉｓ）ｈｐ７５番号１６の調製（図３ｄ）
出発点は、ヒトｐ７５：ＮＭ ００２５０７；Ｍ１４７６４（これらは、何れも１００％同一である。）に対して公開された配列であった。以下のオリゴヌクレオチドは、公開された配列から誘導された。
【０２４０】
Ｍｅｚ３６：ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＧＣＡＧＧＴＧＣＣＡＣＣ（配列番号１３）；開始コドン（太字）を有し、Ｋｏｚａｋ配列（斜字体）を有するオリゴ
Ｍｅｙ３５：ＴＣＡＣＡＣＴＧＧＧＧＡＴＧＴＧＧＣＡＧ（配列番号１２）；オリゴが公開されたラット配列から誘導されるので、Ｃの代わりにＴ（下線）の塩基交換が為された、停止コドン（太字）を有するオリゴ
Ｍｅｚ７１：ＧＣＡＧＣＣＣＣＡＴＣＡＧＴＣＣＧＣ（配列番号１４）；ＡＴＧの前に６４塩基対から始まるオリゴ
次いで、細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ヒト神経芽細胞腫細胞株ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−２２６６）から得られたｃＤＮＡ中で、プライマー対Ｍｅｙ３５／７１を用いて、（Ｎｏｇｏ６６クローニング、例１と同様に）ＰＣＲを実施した。Ｍｅｙ３５／７１を用いたＰＣＲは、１３４８ｂｐの断片を与えた。これを精製した。
【０２４１】
Ｍｅｙ３５／７１断片中でプライマー対Ｍｅｙ３５／３６を用いたその後のＰＣＲにより、明瞭なバンド（断片サイズ：１２８４ｂｐ）が得られた。これを精製した。次いで、切断されていないｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−ＨｉｓＴＯＰＯベクター（配列番号１５）（ｐｃＤＮＡ３．１（Ｖ５−Ｈｉｓ）ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ｋ４８００−０１）中にこのバンドを挿入した（トポイソメラーゼ原理）。標準的な方法（Ｎｏｇｏ６６クローニング、例１と同様）によってＴＯＰ１０細胞を形質転換するために、このようにして得られた構築物（ｐｃＤＮＡ３．１ｈｐ７５）を用いた。
【０２４２】
この形質転換の１３個のクローンをチェックし、正しい配位を有する４つのクローン（１３、１５、１６及び１８）を同定することができた。クローン１６をさらに使用した。含有された構築物（ｐｃＤＮＡ３．１（Ｖ５−Ｈｉｓ）ｈｐ７５番号１６；図３ｄも参照）の配列は、配列番号１６に図示されている。この配列に対するさらなる情報は、以下の部に要約されている。
【０２４３】
【表４】
2008526243.tif 000010
【０２４４】
ｂ）ｐＩＲＥＳｈｐ７５の調製：
ＤＮＡ５μｇ、ＸｂａＩ２μＬ、ＮｏｔＩ２μＬ、１０×緩衝液Ｈ（Ｒｏｃｈｅ）４μＬ及び二重蒸留水３２μＬを含む制限混合物（４０μＬ；３７℃で１．５時間）を用いて、ＸａｂＩ及びＮｏｔＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）でプラスミドｐＩＲＥＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＵＳＡ）を切断した。切り出された断片は、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いて、ＤＮＡゲルから、慣用の様式で単離した。
【０２４５】
ＤＮＡ５μｇ、ＳｐｅＩ２μＬ、ＮｏｔＩ２μＬ、１０×緩衝液Ｈ（Ｒｏｃｈｅ）４μＬ及び二重蒸留水３２μＬを含む制限混合物（４０μＬ；３７℃で１．５時間）を用いて、ＳｐｅＩ及びＮｏｔＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で、上述のようにして調製されたプラスミドｐｃＤＮＡ３．１ｈｐ７５を切断した。切り出された断片は、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いて、ＤＮＡゲルから、慣用の様式で単離した。
【０２４６】
以下の混合物：ｈｐ７５構築物５μＬ、切断されたｐＩＲＥＳ２μＬ、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ）１．５μＬ、１０×緩衝液Ｔ４（Ｒｏｃｈｅ）３μＬ、二重蒸留水２０．５μＬを用いて、このようにして調製された制限断片を１６℃で一晩連結した。次いで、細菌株ＳｕｐｅｒＣｏｍｐＸＬ２Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に、この連結物（ｐＩＲＥＳ  ｈｐ７５と称する。）を形質転換した。
【０２４７】
ｃ）ｐＩＲＥＳ  ｈＮｇＲ  ｈｐ７５の調製（図３ａ）
ＤＮＡ５μｇ、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）１．５μＬ、１０×緩衝液Ｂ（Ｒｏｃｈｅ）１．５μＬ及び二重蒸留水１０μＬ（平滑末端）を含む１３μＬの制限混合物を、３７℃で１時間使用して、ＲＺＰＤ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｎｚｅｎｔｒｕｍ  ｆｕｒ  Ｇｅｎｏｍｆｏｒｓｃｈｕｎｇ  ＧｍｂＨ，  ｃｌｏｎｅ  Ｎｏ．：ＩＲＡＬ−ｐ９６２Ｌ１４２７Ｑ２）から商業的に取得した、ヒトＮｏｇｏ受容体（ｈＮｇＲ）に対するコード配列を含むｐｃＤＮＡ  ｈＮｇＲ  ＣＤＳ１を消化した。切り出された断片は、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いて、ＤＮＡゲルから、慣用の様式で単離した。
【０２４８】
Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、１０×緩衝液Ｔ４（Ｒｏｃｈｅ）１０μＬ、１００ｍＭのＤＴＴ（Ｇｉｂｃｏ）１μＬ、２０ｍＭのＮＴＰミックス（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）１０μＬ及び二重蒸留水７７μＬを含む混合物（１００μＬ；３０分１１℃）中で、切断されたｐｃＤＮＡ  ｈＮｇＲ  ＣＤＳ１構築物２０μＬをインキュベートすることによって、末端を補充した。Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いて、ＤＮＡゲルから、Ｔ４補充物を単離した。
【０２４９】
平滑末端の再連結を回避するための脱リン酸化のために、ｈＮｇＲ  ＣＤＳ１構築物のＴ４補充物５０μＬを、アルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ）２μＬ、１０×（Ｒｏｃｈｅ）１０μＬ及び二重蒸留水３８μＬとともに、まず、３７℃で３０分間、次いで、６５℃で１５分間インキュベートした。このようにして得られた脱リン酸化構築物は、最後に、Ｑｉａｇｅｎ  Ｈｉｔクリーンアップを用いて精製した。
【０２５０】
次いで、（Ｑｉａｇｅｎ  Ｈｉｔ  ｃｌｅａｎ−ｕｐからの）溶出物１０μＬ、ＥｃｏＲＩ（Ｒｏｃｈｅ）１．５μＬ、１０×緩衝液Ｈ（Ｒｏｃｈｅ）１．５μＬ及び二重蒸留水２．０μＬを含む制限混合物（１５μＬ；３７℃で１時間）を用いて、精製されたｐｃＤＮＡ  ｈ  ＮｇＲ  ＨｉｎｄＩＩ平滑断片をＥｃｏＲＩで消化し、制限消化後、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いてＤＮＡゲルから単離した。
【０２５１】
ＤＮＡ５μｇ、ＥｃｏＲＩ１．５μＬ、ＨｉｎｄＩＩＩ１．５μＬ、１０×緩衝液Ｈ（Ｒｏｃｈｅ）４μＬ及び二重蒸留水２０μＬを含む制限混合物（２７μＬ；３７℃で１．５時間）を用いて、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで、（上述のようにして調製された）ｐＩＲＥＳ  ｈｐ７５を開環した。制限消化後、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いて、ＤＮＡゲルから所望のｈＰ７５断片を単離し、ＮｇＲ構築物５μＬ、切断されたｐＩＲＥＳ  ｈｐ７５の２μＬ、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ）１．５μＬ、１０×緩衝液Ｔ４（Ｒｏｃｈｅ）３μＬ及び二重蒸留水２０．５μＬを含む連結混合物を用いて、１６℃で一晩、上記調製されたｈＮＧＲ構築物と連結した。次いで、細菌株ＳｕｐｅｒＣｏｍｐＸＬ２Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に、得られた構築物ｐＩＲＥＳ  ｈＮＧＲ  ｈｐ７５（図３ａ；配列番号１８）を形質転換した。
【０２５２】
ｐＩＲＥＳ  ｈＮｇＲ  ｈｐ７５に関するさらなる配列情報は、以下の部に要約されている。
【０２５３】
ＣＭＶ  ｐｒｏｍ．  １０８  −８５７
ＮＯＧＯ  Ｒ  １２０２−２６２０
ＩＲＥＳ  ２６５８−３２３８
ｈｐ７５  ３２９４−４５７４
ＳＶ４０ｐＡ  ４６４８−４８６９
ｆ１ｏｒｉ  ４９６４−５４１９
Ｎｅｏ  ５４８３−６８５６
ａｍｐ  ７２６１−８１２１
ｐＵＣ  ｏｒｉ  ８２６６−９３  ｃｏｍｐｌ。
【０２５４】
ｄ）ｐｃＤＮＡ４（ｍｙｃＨｉｓ）Ａ  ｈＲｈｏＡ  ｗｔ（図３ｃ）の調製
ＤＮＡ５μｇ、ＥｃｏＲＩ１．５μＬ、ＸｈｏＩ（Ｒｏｃｈｅ）１．５μＬ、１０×緩衝液Ｈ（Ｒｏｃｈｅ）３μＬ及び二重蒸留水１９μＬを含む制限混合物（２５μＬ、３７℃で１．５時間）を用いて、ヒトＲｈｏＡＧＴＰアーゼに対するコード配列を含むプラスミドｐＯＴＢ７  ＲｈｏＡ（ＲＺＰＤ、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｎｚｅｎｔｒｕｍ  ｆｕｒ  Ｇｅｎｏｍｆｏｒｓｃｈｕｎｇ  ＧｍｂＨ，  クローン番号：ＩＲＡＬ−ｐ９６２Ａ１７４）から商業的に取得した。）を消化した。
【０２５５】
第二の混合物において、ＤＮＡ５μｇ、ＥｃｏＲＩ１．５μＬ、ＸｈｏＩ（Ｒｏｃｈｅ）１．５μＬ、１０×緩衝液Ｈ（Ｒｏｃｈｅ）３μＬ及び二重蒸留水１９μＬを含む制限混合物（２５μＬ；３７℃で１．５時間）を用いて、ｐｃＤＮＡ４（ｍｙｃＨｉｓ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）を同様に消化した。
【０２５６】
次いで、切断された断片を上述のように精製及び連結し、プラスミドｐｃＤＮＡ４（ｍｙｃＨｉｓ）Ａ  ｈＲｈｏＡ  ｗｔ（図３ｃ：配列番号２１参照）を得る。次いで、細菌株ＳｕｐｅｒＣｏｍｐ  ＸＬ２  Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に、得られた構築物を形質転換した。
【０２５７】
ｐｃＤＮＡ４（ｍｙｃＨｉｓ）Ａ  ｈＲｈｏＡ  ｗｔに関するさらなる配列情報は、以下の部に要約されている。
ＣＭＶ  ｐｒｏｍ．  １９７−８５１
ＲｈｏＡ  １０５８−１６３６
Ｈｉｓ  ２４３７−２４５４
ｍｙｃ  ２３９２−２４２１
Ｂｇｈ  ｐＡ  ２４８０−２７０７
ＳＶ４０  ｐＡ  ４１４３−４２７３
ｆ１ｏｒｉ  ２７５３−３１８１
ａｍｐ  ５４７７−６３３４  ｃｏｍｐｌ．
ｐＵＣ  ｏｒｉ  ４６５６−５３２９
Ｚｅｏ  ３６３９−４０１０
ＥＭ７  ｐｒｏｍ．  ３５６５−３６２０
ＳＶ４０  ｐｒｏｍ．  ３２０９−３５１７
ｄ）ｐｃＤＮＡ３  ｈＲｈｏＡ  ｗｔ（図３ｂ）の調製
調製は、ｐｃＤＮＡ４（ｍｙｃＨｉｓ）Ａ  ｈＲｈｏＡ  ｗｔと同様に行うが、ｐｃＤＮＡ４（ｍｙｃＨｉｓ）の代わりに、上記プラスミドｐｃＤＮＡ３．１Ｖ５−ＨｉｓＴＯＰＯを用いる。
【０２５８】
ｐｃＤＮＡ３  ｈＲｈｏＡ  ｗｔ（図３ｂ；配列番号２３参照）に関するさらなる配列情報は、以下の部に要約されている。
【０２５９】
ＣＭＶ  ｐｒｏｍ．  ６１２４−６７７８
ｈ  ＲｈｏＡ  １２７−７０５
Ｂｇｈ  ｐＡ  １４７８−１７１８
ＳＶ４０  ｐＡ  ３４０２−３５９７  
ＳＶ４０  ｏｒｉ  ２２５９−２５８４
ＣｏｌＥ１  ｏｒｉ  ４１４１−４５１５
ｆ１ｏｒｉ  １７８８−２２０１
Ｎｅｏ  ２６２０−３４１１
ａｍｐ  ４９１９−５７７９  ｃｏｍｐｌ。
【０２６０】
２．安定な組換えＨＥＫ細胞株の生成
ａ）二重形質移入体ＨＥＫ２９３ＮｇＲ／ｐ７５の調製
第一の形質移入工程において、ＨＥＫ２９３野生型細胞（ＲＰＭＩ  Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１０％透析ＦＣＳ＋１％抗生物質−抗真菌剤中で培養）をプラスミドｐＩＲＥＳ  ｈＮｇＲ  ｈｐ７５で形質移入した。この目的のために、各混合物について、無血清ＲＰＭＩ−Ｇｕｔａｍａｘ培地１００μＬ中に、及び１０個のウェルを有する培養皿中の無血清ＲＰＭＩ−Ｇｕｔａｍａｘ培地１００μＬ中のＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ１２μＬ中の２×１０６個細胞に、プラスミドＤＮＡ２μｇを混合し、室温で、１５〜２０分間インキュベートした。次いで、無血清培地を用いて、各形質移入混合物について、総容量を最大１ｍＬとした。続いて、無血清ＲＰＭＩ−Ｇｌｕｔａｍａｘ培地２ｍＬを各皿に添加し、３７℃で６時間、インキュベーションを行った。次いで、培地を、ＲＰＭＩ−Ｇｌｕｔａｍａｘ＋５％の透析されたＦＣＳに変更し、３７℃で１日間、インキュベーションを行った。次いで、（様々な希釈：１：１０、１：５０、１：１００、１：２５０、１：５００、１：１０００；１混合物／皿／希釈で）（ＲＰＭＩ−Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１０％の透析されたＦＣＳ＋１％抗生物質−抗真菌剤＋Ｇ４１８；８００μｇ／ｍＬ）皿の内容物を、分割した。
【０２６１】
希釈からクローンを単離し、これにより、第一の分離されたクローンが得られた。滅菌したピンセットを用いて、無菌ガラスミニシリンダー（ＢＡＳＦ）の一端を、無菌ワセリン（ＢＡＳＦ）中に、注意深く浸した。ガラスミニシリンダーのワセリンで湿った末端を、既に選択した単一クローン上に注意深く配置した。この単一クローンは、ガラスミニシリンダーによって、完全に取り囲むべきである。次いで、無菌の先端を有するＥｐｐｅｎｄｏｒｆピペットを使用して、トリプシン（Ｇｉｂｃｏ，トリプシン−ＥＤＴＡ）４０μＬをガラスマイクロシリンダーに添加した。トリプシンを、１〜２分間細胞に作用させた。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆピペット（無菌の先端）で、数回（３〜４回）、トリプシンを吸引及び放出することによって、細胞を再懸濁した。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆピペットを用いて、再懸濁された細胞を、ガラスミニシリンダーから２４ウェル（組織培養プレート、Ｆａｌｃｏｎ、  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、各ウェルは、ＲＰＭＩ−Ｇｌｕｔａｍａｘ培地＋５％の透析されたＦＣＳ１ｍＬを含有した。）中へ完全に移した。  
上述のように、ＦＡＣＳにより、陽性クローンを検出した。さらに、細胞表面上での受容体ＮｇＲ及びｐ７５の過剰発現を測定した（結果は示さず。）。
【０２６２】
ｂ）三重形質移入体ＨＥＫ２９３  ＲｈｏＡ／ＮｇＲ／ｐ７５の調製
同様の様式で、ａ）で調製された細胞株ＨＥＫ２９３  ＮｇＲ／ｐ７５の陽性クローン（クローン５）に、プラスミドｐｃＤＮＡ４（ｍｙｃＨｉｓ）Ａ  ｈＲｈｏＡを形質移入する。最後の工程において、ＲＰＭＩ−Ｇｌｕｔａｍａｘ（＋１０％の透析されたＦＣＳ＋１％抗生物質−抗真菌剤＋Ｇ４１８；８００μｇ／ｍＬ、＋ゼオシン１２５μｇ／ｍＬ）中に混合物を分割する。
【０２６３】
イムノブロッティングによりそれらのＲｈｏＡ発現を調べることによって、並びにＦＡＣＳ分析によりＮｇＲ及びｐ７５受容体の発現を調べることによって、陽性クローンを検出した。
【０２６４】
ＲｈｏＡを検出するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動（ＮｕＰＡＧＥポリアクリルアミドゲル４−１２％、１．５ｍｍ厚（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）；５％メルカプトエタノールでタンパク質試料を変性させた。）によって、特定のクローンに由来する細胞ホモジネートを分画し、イムノブロッティング後、標準的な方法により、モノクローナルマウス抗ＲｈｏＡ抗体を用いて検査した。典型的な結果が、図４ａに示されている。約２１ｋＤの分子量を有するＲｈｏＡバンドは、陽性クローンとともに観察されている。
【０２６５】
上述のようにＦＡＣＳ分析を実施することによって、ＮｇＲ及びｐ７５の発現を検出した。典型的な結果が、図４ｂに示されている。
【０２６６】
調製例３：組換えヒトｓＲＡＧＥタンパク質及びＮ末端が切断されたｓＲＡＧＥの調製
ａ）ｓＲＡＧＥタンパク質（ｓＲＡＧＥ１−３３１）（配列番号３７）の調製
組換えｓＲＡＧＥタンパク質の発現及び精製のための基礎は、ベクターｐｃＤＮＡ３（−）６．１Ｃ  ＨＩＳ  Ａで安定に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞株「２９３／６．１ｓＲＡＧＥ  Ｈｉｓ６」であった。
【０２６７】
この細胞株の調製を、まず、以下に記載する。分子生物学の標準的な技術は、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｄ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：２ｎｄ．  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ」に従って実施した。
【０２６８】
オリゴヌクレオチドプライマー
【０２６９】
【化９】
2008526243.tif 000011
を用いて、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｒｅｆ．  Ｓｅｑ．配列ＮＭ ００１１３６に記載されているＲＡＧＥ  ｃＤＮＡを増幅するために、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＵＳＡ）を用いて、リンパ球（ＰＢＬ）から得た総ＲＮＡを逆転写にかけた。ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたゲル精製の後、新たなゲル精製後に、ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲ１で同様に切断されたベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＵＳＡ）中に連結するために、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ１及びＸｈｏＩでｃＤＮＡを切断した。Ｅ．コリＸＬ−１青細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＵＳＡ）中に形質転換した後、陽性組換えクローンを増幅し、配列を確認し、Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ−Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｈｉｌｄｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてプラスミドＤＮＡを単離した。ｐｃＤＮＡ３／ＲＡＧＥ２．６と称するこのプラスミドから出発し、プライマー
【０２７０】
【化１０】
2008526243.tif 000012
を用いて、可溶性ＲＡＧＥ（ｓＲＡＧＥ）のｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｒｅｆ．Ｓｅｑ．配列ＮＭ ００１１３６）を増幅した。ＥｃｏＲ１及びＫｐｎ１制限エンドヌクレアーゼで、ＰＣＲ産物を切断し、上記精製後、ＥｃｏＲ１／Ｋｐｎ１で直鎖化されたベクター「ｐｃＤＮＡ３．１（−）Ｍｙｃ  ＨＩＳ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）中に連結した、製造業者に記述に従い、形質移入試薬「Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ」（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、このようにして新たに作製されたプラスミドベクター「ｐｃＤＮＡ３（−）６．１Ｃ  ＨＩＳ  Ａ」をＨＥＫ２９３中に形質移入した。ＭＥＭ培地（＃Ｍ４５２８，  Ｓｉｇｍａ，  Ｍｕｎｉｃｈ  Ｇｅｒｍａｎｙ）＋１０％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＵＳＡ）中の８００μｇ／ｍＬのＧ４１８で「陽性」細胞を選択した後、単一クローンから開始して、細胞株「２９３／６．１ｓＲＡＧＥ  Ｈｉｓ６」を同定できるように、細胞懸濁物の系列希釈を調製した。
【０２７１】
ＲＡＧＥ特異的抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ；＃ｓｃ５５６３）を用いたウェスタンブロット中で、ｓＲＡＧＥ発現の同定と培地中へのタンパク質の分泌をチェックした。
【０２７２】
タンパク質産生のために、血清含有ＭＥＭ（上記参照）中の４×２０Ｌタンクの束でこの細胞株を増殖させた。次いで、培地上清を除去し、「ＨｅｍｏｌｆｌｏｗＦシリーズＨｉｇｈ−Ｆｌｕｘ」カラム（Ｆｒｅｓｅｎｉｓｕｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  ＡＧ，Ｂａｄ  Ｈｏｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を通して１４００ｍＬまで濃縮する前に、３７℃で３日間、無血清培地（Ｐｒｏ２９３ａ−ＣＤＭ（＃１２−７６４Ｑ，ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｖｅｒｖｉｅｒ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）中で細胞を培養した。
【０２７３】
「固定化された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）」によってタンパク質を精製し、Ｄｉａｒｅｃｔ  ＡＧ（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって実施した。用いたＮｉＮＴＡカラム材料は、「キレーティングセファロースＦＦ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｕｐｓａｌａ，  Ｓｃｈｗｅｄｅｎ）であった。平衡化、カラムマトリックスへの結合及び精製は、製造業者の記述に従って行った。増加するイミダゾール濃度を用いて、タンパク質を段階的に溶出した。抗ＨＩＳ抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、ｓＲＡＧＥタンパク質の含量について、様々な画分を調べた。精製されたｓＲＡＧＥタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｒｅｆ．  Ｓｅｑ．配列ＮＭ ００１１３６）は、２５０〜５００ｍＭのイミダゾールで特異的に溶出された。このようにして得られた画分を合わせ、濃縮し、ＰＢＳに対して３回（２×４時間、１×１６時間）透析した。
【０２７４】
ｂ）Ｎ末端切断されたｓＲＡＧＥタンパク質（ｓＲＡＧＥ１０２−３３１）（配列番号３４）の調製
プライマー
【０２７５】
【化１１】
2008526243.tif 000013
を使用し、プラスミド「ｐｃＤＮＡ３／ＲＡＧＥ２．６」（調製例３ａ参照）から出発して、Ｎ末端切断されたＲＡＧＥ外部ドメインのｃＤＮＡを増幅した。
【０２７６】
ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたゲル精製の後、新たなゲル精製後に、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩで同様に切断されたベクターｐｓｅｃＴＡＧ２Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＵＳＡ）中に連結するために、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩでｃＤＮＡを切断した。Ｅ．コリ「ＴＯＰ１０  Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ」細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＵＳＡ）中に形質転換した後、陽性組換えクローンを増幅し、配列を確認し、プラスミドミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｈｉｌｄｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてプラスミドＤＮＡを単離した。
【０２７７】
製造業者の記述に従い、「ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ」形質移入システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＵＳＡ）を用いて、このようにして新たに作製されたプラスミドベクター「ｐｓｅｃＴＡＧ／Ｎ−Ｃ  ｔｒｕｎｃ  ｓＲＡＧＥ１」を発現させた。９６時間後、細胞を遠沈させ、タンパク質精製のために無血清上清（６０ｍＬ）を使用した。
【０２７８】
タンパク質精製は、固定化された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって行った。ＮｉＮＴＡカラム材料として、ＮｉＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｈｉｌｄｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた。平衡化及びカラムマトリックスへの結合は、製造業者の記述に従って行った。溶出緩衝液［ＰＢＳ、１６０ｍＭのＮａＣｌ、１５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０］中にタンパク質を溶出した。Ｎ−Ｃ末端切断されたｓＲＡＧＥタンパク質の含量について、ＰＡＧＥ中で、様々な画分をチェックした。最初の３つの２５０μＬ画分を合わせ、濃縮し、ＴＢＳに対して透析した。測光法により、最終タンパク質濃度を測定した。
【０２７９】
調製例４：ｓＲＡＧＥペプチド断片
標準的なペプチド合成方法により、以下のペプチドを調製した。
【０２８０】
【化１２】
2008526243.tif 000014
調製例５：Ｈｉｓ−ＮｏｇｏＲ融合タンパク質の調製：
組換えＨｉｓ−ＮｏｇｏＲ融合タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＮＭ ０２３００４）の発現及び精製のための基礎は、ベクター「ｐｃＤＮＡ４／ｈＮｏｇｏＲ−ＴＭ６」で安定に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞株「ＣＨＯ」であった。
【０２８１】
まず、この細胞株の調製を、以下に記載する。分子生物学の標準的な技術は、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）」に従って実施した。
【０２８２】
ＮｇＲ−ＨＩＳ発現プラスミドを調製するための出発点は、ＲＺＰＤ  ＧｍｂＨ（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入したｃＤＮＡクローンｐＯＴＢ７  ＩＲＡＬｐ９６２Ｌ１４２７Ｑ２であった。
【０２８３】
オリゴヌクレオチドプライマー：
【０２８４】
【化１３】
2008526243.tif 000015
を用いて、ＰＣＲによって、プラスミドＤＮＡから、所望されるコードヌクレオチド配列を増幅した。
【０２８５】
ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたゲル精製の後、新たなゲル精製後に、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲ１で同様に切断されたベクターｐｃＤＮＡ４／ＭｙｃＨＩＳ  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＵＳＡ）中に連結するために、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲ１でｃＤＮＡを切断した。Ｅ．コリＴｏｐ  １０  Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＵＳＡ）中に形質転換した後、陽性組換えクローンを増幅し、配列を確認し、Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ−Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｈｉｌｄｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてプラスミドＤＮＡを単離した。
【０２８６】
製造業者の記述に従い、形質移入試薬「Ｆｕｇｅｎｅ６」（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、このようにして新たに作製されたプラスミドベクター「ｐｃＤＮＡ４／ｈＮｏｇｏＲ−ＴＭ６」をＣＨＯ−Ｋ１中に形質移入した。  １０％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＵＳＡ）を含むＭＥＭ培地（＃Ｍ４５２８，  Ｓｉｇｍａ，  Ｍｕｎｉｃｈ  Ｇｅｒｍａｎｙ）中の８００μｇ／ｍＬのＧ４１８で「陽性」細胞を選択した後、単一クローンから開始して、細胞株「ＣＨＯ−Ｋ１／」を同定できるように、細胞懸濁物の系列希釈を調製した。
【０２８７】
抗ＨＩＳ特異的抗体（＃１９２２４１６，Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたドットブロット中で、Ｎｏｇｏ受容体発現の同定と培地中へのタンパク質の分泌をチェックした。
【０２８８】
通常の細胞媒条件下で細胞クローンを増殖させ、タンクの束の中に播種した。ＦＣＳ下で２１日間増殖させた後、培地を新鮮な無血清培地と交換した。３日後、無血清細胞培養上清４０Ｌを得た。Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｈｅｍｏｆｌｏｆ  Ｆ６０を用いて、この上清を１Ｌまで（４０倍）濃縮した。次いで、予めＰＢＳで平衡化されたＮｉ−ＮＴＡ−Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  Ｂｅａｄｓ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）５０ｍＬを濃縮物に添加し、４℃で３時間撹拌した。撹拌機を停止させることにより、ビーズを沈降させ（４℃で一晩）、上清を廃棄し、Ｎｉ−ＮＴＡビーズをカラム中に充填した。２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０の３倍カラム容量で、室温にて、ビーズを洗浄した。続く洗浄工程は、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０の５倍カラム容量で行った。２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、３００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０を用いて、結合したヘキサＨｉｓタグ付きＮｇＲを溶出した。２５ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．０に対して、溶出液を一晩透析した。室温で、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１．６×３ｃｍ；容積６ｍＬ）に、透析物を入れた。次いで、以下の緩衝液を使用した。
【０２８９】
緩衝液Ａ：５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ；ｐＨ７．０；
緩衝液Ｂ：５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ；１ＭのＮａＣｌ；ｐＨ７．０。
【０２９０】
２ｍＬ／分の流速での溶出のために、以下のグラジエント：
０％緩衝液Ｂを５カラム容積；１２カラム容積の０−５０％緩衝液Ｂ；２カラム容積の５０−１００％緩衝液Ｂ；及び５カラム容積の１００％緩衝液Ｂ、
を使用した。
【０２９１】
カラム容積当り２つの画分を得た。標準的なＳＤＳゲル電気泳動によって、これらを分析した。高グリコシル化受容体（分子量約１１０，０００〜１２０，０００）の部分に対して、及び低グリコシル化受容体（分子量約７５，０００〜９０，０００）の部分に対して、最大のＮｇＲ純度を有する画分を合わせた。４℃で一晩、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４に対して、合わせた画分を透析した。次いで、０．２μｍの滅菌フィルターを通じて透析物をろ過し、４℃で保存した。
【０２９２】
調製例６：モノクローナル抗ＮｔｅｒｍＲ３１抗体の調製
ＮｔｅｒｍＲ３１に対するモノクローナル抗体を生成するために、以下の戦略を選択した。免疫原として、（スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラートに由来する）マレイミド基を有するウシサイログロブリン（ＢＴＧ、Ｓｉｇｍａ、Ｔ−１００１）にペプチドを抱合した。生成された抗ペプチド抗体を検出するために、異なる化学構造の（スクシンイミジル−６−［（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノアートに由来する）マレイミド基を同様に有する同じペプチドを、ウシサイログロブリン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ、Ａ−７９０６）に抱合した。２つの異なる架橋を介して、２つの異なる高分子量担体へ同ペプチドを抱合することにより、ペプチドに対して特異性を有するモノクローナル抗体を選択することが可能となる。
【０２９３】
ａ）免疫化抗原の調製
スルフヒドリル基反応性のヘテロ二官能性架橋剤スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシラート（スルホーＳＭＣＣ）を用いて、ＮｔｅｒｍＲ３１をＢＴＧに抱合した。抱合は、以下の二段階法を用いて行った。
【０２９４】
１．担体タンパク質のマレイル化
４℃のＨＥＰＥＳ緩衝化された生理的食塩水溶液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−Ｎａ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中の担体タンパク質溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）２ｍＬに、水（１０ｍｇ／ｍＬ）中のスルホＳＭＣＣ４ｍｇを添加した。４℃で３０分間、反応混合物をインキュベートした後、さらに３０分間２５℃でインキュベートした。インキュベーション時間後、同じ緩衝液で平衡化されたＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラム（１．５×１４ｃｍ）上で、反応混合物を脱塩した。脱塩時間後、マレイル化されたＢＴＧ溶液８ｍＬを、２．５ｍｇ／ｍＬの濃度で得た。
【０２９５】
２．マレイル化されたＢＴＧの、ペプチドＮｔｅｒｍＲ３１へのカップリング
ＨＥＰＥＳ緩衝化された生理的食塩水溶液中のペプチドＮｔｅｒｍＲ３１（１０ｍｇ／ｍＬ）の溶液１．２ｍＬを、同じ緩衝液中のマレイル化されたＢＴＧ溶液（２．５ｍｇ／ｍＬ）５ｍＬに添加し、４℃で２時間インキュベートした後、室温で４時間インキュベートした。１０ｍＭの最終濃度の２−メルカプトエタノールで、未反応のマレイミド基をブロックし、一晩のインキュベーションを行った。これに続いて、４℃のリン酸緩衝化された生理的食塩水溶液（ＰＢＳ，１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）に対する透析と４回の緩衝液交換（ＭＷ排除１０，０００）を行った。
【０２９６】
ｂ）ＥＬＩＳＡ抗原の調製
スルフヒドリル基反応性のヘテロ二官能性架橋剤スクシンイミジル−６−［（β−マレイミド−プロピオンアミド）ヘキサノアート］（ＳＭＰＨ）を用いて、ペプチドＮｔｅｒｍＲ３１をＢＳＡに抱合した。抱合は、以下の二段階法によって行った。
【０２９７】
１．担体タンパク質のマレイル化
４℃のＨＥＰＥＳ緩衝化された生理的食塩水溶液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−Ｎａ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中の担体タンパク質溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）２ｍＬに、水（１０ｍｇ／ｍＬ）中のＳＭＰＨ４ｍｇを添加した。４℃で３０分間、反応混合物をインキュベートした後、さらに３０分間２５℃でインキュベートした。インキュベーション時間後、同じ緩衝液で平衡化されたＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラム（１．５×１４ｃｍ）上で、反応混合物を脱塩した。脱塩時間後、マレイル化されたＢＳＡ溶液８ｍＬを、２．５ｍｇ／ｍＬの濃度で得た。
【０２９８】
２．マレイル化されたＢＳＡの、ＮｔｅｒｍＲ３１へのカップリング
ＨＥＰＥＳ緩衝化された生理的食塩水溶液中のペプチドＮｔｅｒｍＲ３１（１０ｍｇ／ｍＬ）の溶液１．２ｍＬを、同じ緩衝液中のマレイル化されたＢＳＡ溶液（２．５ｍｇ／ｍＬ）５ｍＬに添加し、４℃で２時間インキュベートした後、室温で４時間インキュベートした。１０ｍＭの最終濃度の２−メルカプトエタノールで、未反応のマレイミド基をブロックし、一晩のインキュベーションを行った。これに続いて、４℃のリン酸緩衝化された生理的食塩水溶液（ＰＢＳ，１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）に対する透析と４回の緩衝液交換（ＭＷ排除１０，０００）を行った。
【０２９９】
ｃ）免疫化
フロイントの完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ、Ｆ−５８８１）中に乳化されたＢＴＧ−ペプチド抱合体１００μｇの注射によって、５匹のマウス（８週齢）を処理した。注射は、融合の９０日前に、腹腔下に行った。他の全ての注射は、以下のスキームに従って、腹腔内に投与した。Ｓｉｇｍａから得たフロイントの不完全アジュバント（カタログ番号Ｆ−５５０６）を使用した。
【０３００】
【表５】
2008526243.tif 000016
ｄ）骨髄腫細胞株
使用した骨髄腫細胞株は、「Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ」から得たＳＰ２／０−Ａｇ１４であった。本細胞は、イムノグロブリン鎖を全く合成又は分泌せず、アザグアニン（８−ＡＺＧ、２０μｇ／ｍＬ）に対して耐性があり、ＨＡＴ（ヒポキサンチン１０−４Ｍ、アミノプテリン１０−５Ｍ及びチミジン４×１０−５Ｍ）培地中で増殖しない。標準的な培地中、組織培養フラスコ中でＳＰ２／０細胞を培養した（ＨＧＰＲＴ＋復帰突然変異株を死滅させるために、２０μｇ／ｍＬの８−ＡＺＧが補充されたＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ））。融合の１週間前に、８−ＡＺＧを加えてない標準的な媒地中にＳＰ２／０細胞を維持した。
【０３０１】
ｅ）細胞融合及び播種
免疫化されたマウスから得た３個の脾臓臓器を無菌状態で摘出し、細かく砕いた。ここから単一細胞懸濁液を調製した。ポリエチレングリコール３３５０の存在下で、ＳＰ２／０骨髄腫細胞株（比率：５リンパ球／１ＳＰ２／０）に脾臓リンパ球を融合した。ＨＡＴ及び２０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中に、このようにして産生された細胞を再懸濁した。支持細胞層として腹腔滲出液から得られた細胞を含む８つの９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ）中に細胞を播種した。５％二酸化炭素を含む湿った雰囲気中、３７℃で１０日間、プレートをインキュベートした。この期間中に、細胞に、ＨＡＴ培地を２回与えた。
【０３０２】
Ｔフラスコ中で、１０日間、脾臓細胞懸濁液の一部を培養した。
【０３０３】
ｆ）スクリーニングアッセイ
ＩｇＧを検出するために設計された間接ＥＬＩＳＡを用いて、細胞培養上清をスクリーニングした。９６ウェルを有する平底ポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，カタログ番号７５６０７１）中で、以下のようにアッセイを実施した。４μｇ／ｍＬのＢＳＡ−ＮｔｅｒｍＲ３１抱合体（ＢＳＡを基礎とする。）を含む、０．５Ｍカルボナート／バイカルボナート緩衝液ｐＨ９．６の溶液の分取試料１００μＬを、プレートの各ウェルに添加した。湿度室中、４℃で一晩のインキュベーション後、０．０１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むｔｒｉｓ緩衝化された生理的食塩水溶液（ＴＢＳ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．８）（洗浄緩衝液）で、プレートを４回洗浄し、ＴＢＳ（ブロッキング緩衝液）中２％強度のゼラチン（冷水魚の皮膚由来、ＳｉｇｍａＧ−７７６５）の２００μＬ／ウェルで、室温（ＲＴ）で１時間ブロッキングした。洗浄緩衝液でプレートを洗浄し、細胞培養上清１００μＬを各ウェルに添加した。ＳＰ２／０骨髄腫細胞から得た細胞培養上清を陰性対照として使用した。脾細胞培養上清を陽性対照として用いた。
【０３０４】
室温で１時間、プレートをインキュベートした。数回の洗浄工程後、アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ、Ａ−２４２９）に抱合されたヤギ抗マウスＩｇＧ（マウスＦｃ特異的）（５０μＬ／ウェル、ブロッキング緩衝液中に希釈、１：５０００）とともに、室温で１時間、ＥＬＩＳＡプレートをインキュベートした。さらなる洗浄工程の後、基質緩衝液１５０μＬ／ウェル（５％ジエタノールアミン＋０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．８中の２ｍＭの４−ニトロフェニルホスファート（ＳＩＧＭＡ，Ｎ３２５４））をプレートに添加した。４０５ｎｍの波長で、１２チャンネルのＤｙｎｅｘ  Ｏｐｓｙｓ  ＭＲマイクロプレートリーダー中において、基質変換を検出した。
【０３０５】
ｇ）産生された安定な工程の選択
融合から１０日後に、第一のスクリーニングを実施した。陽性ＩｇＧ産生ウェルから得た細胞を、２４ウェルを有するプレートのウェル中に導入し、４日間培養した。目的の抗体を産生する培養物を決定するために、ＢＳＡ−Ｎｔｅｒｍ３１に対するＥＬＩＳＡを実施した。３日後及び５日後に、この増殖プロセスを繰り返した。このようにして、とりわけ、内部名称「クローン３７」を有する抗ＮｔｅｒｍＲ３１  Ａｂを単離した。
【０３０６】
ｈ）ハイブリドーマ細胞の低温保存
低温溶媒（９０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド）１．０ｍＬ中に、各ハイブリドーマの分取試料を再懸濁し、凍結チューブの中に導入した。次いで、容器を直ちに冷却室の中に移した（冷却速度１℃／分）。温度が−６０℃未満に達した後、保存のために、細胞を液体窒素中に移した。  
ＩＩＩ．典型的な実施形態
典型的な実施形態１：ヒト血漿中のｓＲＡＧＥのＮ末端ペプチドＮｔｅｒｍＲ３１に対する自己抗体のＥＬＩＳＡ測定
ａ）材料：
−マイクロタイタープレート：ＳｉｇｍａＳｃｒｅｅｎ；Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｐｌａｔｅ（Ｓｉｇｍａ，Ｍ−４０５８；９６ウェル（黒））；
−Ｎｔｅｒｍ３１（配列番号６）（Ｌｅａｄｅｒ−Ｐｅｐｔｉｄなしの成熟ＲＡＧＥの３１Ｎ末端アミノ酸を含む。）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ＧｍｂＨによってビオチン化；Ｕｌｍ；ＯＲ１８３５３９／２）、溶解、３．９ｍｇ／ｍＬ；使用のため、１μｇ／ｍＬになるようにＴＢＳ中にさらに希釈、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０；０．１％ＢＳＡ
−洗浄緩衝液：ＴＢＳ０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０
−ＴＢＳ、Ｔｒｉｓ緩衝化された生理的食塩水；２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４；０．９％ＮａＣｌ
−基質：４−ニトロフェニルホスファート：Ｒｏｃｈｅから；Ｎｏ．７２６９２３；１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ９．８の１００ｍＬ中に１錠を溶解
−抗体：
・アルカリホスファターゼに抱合された（ＡＰ抱合体）、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（完全な分子）；Ｓｉｇｍａ  Ａ−３８１２；ＥＬＩＳＡ中での希釈、ＴＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中で１：５０００；０．１％ＢＳＡ
・アルカリホスファターゼに抱合された（ＡＰ抱合体）、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）；Ｓｉｇｍａ  Ａ−９５４４；ＥＬＩＳＡ中での希釈、ＴＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中で１：５０００；０．１％ＢＳＡ
・ペプチド＝抗３１マー８５０８で数回免疫されたウサギから得たポリクローナル抗血清；（動物６３０４）、８．６．２００４の２０ｍＬ；０．０２％チメロサールと混合（ウサギポリクローナルＡＢ１：５００）；血清の免疫化及び取得は、ＢｉｏＴｒｅｎｄ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって実施した。
【０３０７】
・アルツハイマー性認知症（ＡＤ）患者から得た血漿は、Ｈｅｎｎ教授（Ｚｅｎｔｒａｌｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｆｕｒ  ｄｉｅ  ｓｅｅｌｉｓｃｈｅ  Ｇｅｓｕｎｄｈｅｉｔ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）から得た：非ＡＤ対照；女性：対照血漿；
患者からの血漿：ＡＰ２３  ＭＣＩＦ０６．７女性；ＬＡＰ３０アルツハイマー性認知症女性００．０早発性；ＬＡＰ３９  ＭＣＩ  Ｆ０６．７女性；ＬＡＰ４５  ＭＣＩｆ０６．７男性；ＬＡＰ５３  ＭＣＩ  Ｆ０６．７女性；ＬＡＰ６０アルツハイマー性認知症晩発性男性。
【０３０８】
ＴＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０；０．１％ＢＳＡ中のＥＬＩＳＡ中に試料をさらに希釈した。
【０３０９】
ｂ）検査手順：
希釈されたＮｔｅｒｍＲ３１ペプチドの１００μＬ部分を、マイクロタイタープレートの各ウェル中にピペットで加えた。この後、室温で２時間、インキュベーションを行った。上清を廃棄し、洗浄緩衝液で、プレートをそれぞれ３回洗浄した。ウサギ血清（陽性対照）の１００μＬ部分又は様々な血漿の１００μＬ部分を、各事例において、プレート中の各ウェル中において、様々な希釈で、室温で３時間インキュベートした。上清を廃棄し、洗浄緩衝液で、プレートをそれぞれ３回洗浄した。次いで、酵素標識された適切な抗体（ヒト血漿試料に対しては抗ヒト、ウサギ抗血清に対しては抗ウサギ）の１００μＬ部分を、各事例において、各ウェル中にピペットで加え、室温で１時間インキュベートした。次いで、洗浄緩衝液で、再び、それぞれを３回洗浄した。次いで、各ウェルは、基質溶液１００μＬを含んだ。約１０分の展開時間後、ウェル当り１ＭのＮａＯＨ５０μＬを添加することによって酵素反応を停止させた。ウェルからの液体を、透明なマイクロタイタープレート（柔軟なプレート；Ｆａｌｃｏｎ  Ｎｏ．３５３９１２）中に移した。適切な光度計中で、マイクロタイタープレートのウェル中の吸収を４０５ｎｍで測定した。
【０３１０】
ｃ）結果
このＥＬＩＳＡの補助を得て、免疫化されたウサギの血清中にＮ末端ペプチドに対する抗体を検出することができた（図５参照）。従って、ＥＬＩＳＡは、ヒトＲＡＧＥのＮ末端ペプチドＮｔｅｒｍＲ３１に対する抗体を検出するのに適している。
【０３１１】
様々な患者の血清で得られた結果が、図６に図示されている。血漿の１：３希釈での吸収の比率が示されている。早発性のアルツハイマー病患者の血漿は、反応の倍増を示している。従って、Ｎ末端ＲＡＧＥペプチドＮｔｅｒｍＲ３１に対する抗体が、この血漿中には、顕著により多く検出できる。
【０３１２】
典型的な実施形態２：ポリクローナル抗ＮｔｅｒｍＲ３１血清及びモノクローナル抗Ｎｔｅｒｍ３１抗体の性質決定
ａ）材料
−ニトロセルロース膜（０．４５μｍ孔径、＃ＬＣ２００１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）
−ブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；＃  １９２１６７３）
−ＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液（１０ｍｌのＨ２Ｏ中に１錠；Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，＃  １６９７  ４７１）
タンパク質／ペプチド試料
ＮｔｅｒｍＲ３１（上記参照）
ＳｃｒａＮｔｅｒｍＲ３１（上記参照）
ＳｃｒａＮｔｅｒｍＲ１３（上記参照）ＮｔｅｒｍＲ１３（上記参照）ｓＲＡＧＥ−６×ＨＩＳ（ＡＡ２３−３５２、ＮＰ ００１１２７）ヒトｓＲＡＧＥ／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；＃１１４５−ＲＧ；ＡＡ−３４４）
ヒトｓＲＡＧＥ／Ｆｃ（ＡＡ１−１３０）
マウスｓＲＡＧＥ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；＃Ｃｕｓｔｏｍ０３）
ラットｓＲＡＧＥ／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；＃１６１６−ＲＧ；ＡＡ  １−３４２）
−抗体
Ｂｉｏｔｒｅｎｄ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入したポリクローナル抗ＮｔｅｒｍＲ３１血清及び免疫前血清（典型的な実施形態１参照）、二次抗体Ｓｈｐ×Ｒｂ  ＩｇＧ  ＡｌｋＰｈｏｓ（Ｃｈｅｍｉｋｏｎ，＃ＡＰ３０４Ａ）
ｂ）ポリクローナル血清に対する検査手順：
ポリクローナル抗ＮｔｅｒｍＲ３１血清の性質決定は、ドットブロット法の補助を得て実施した。上掲のタンパク質又はペプチド試料５又は５０ｎｇを、０．５μＬの容量で、ニトロセルロース膜上に配置した。１×ブロッキング試薬中、４℃で一晩、膜をブロッキングした。次いで、０．５％ブロッキング試薬中に１：１０００で希釈した、ウサギ６３０４から得た免疫前血清及び抗血清ＮｔｅｒｍＲ３１とともに、膜を１時間インキュベートした。室温での１×ＰＢＳ中での３回の洗浄工程後、０．５％ブロッキング試薬中、室温で１時間、二次抗体Ｓｈｐ×Ｒｂ  ＩｇＧＡｌｋＰｈｏｓとともにインキュベーションを行った。ＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液で染色する前に、５分間×３回、再度、膜をＰＢＳ中で洗浄した。所望のシグナル／バックグラウンド比に達した後、染色溶液を吸引除去し、膜を水で濯いだ。
【０３１３】
ｃ）ポリクローナル血清に対する結果：
検査結果は、図７ａ）に図示されている。予想されたとおり、ポリクローナル抗ＮｔｅｒｍＲ３１抗血清は、実施されたドットブロットにおいて、ペプチドＮｔｅｒｍＲ３１を認識する。タンパク質の５ｎｇ部分の染色によって示されるように、タンパク質ｓＲＡＧＥ−６×ＨＩＳ（ＡＡ２３−３５２、ＮＰ ００１１２７）、ヒトｓＲＡＧＥ／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；＃１１４５−ＲＧ）及びヒトｓＲＡＧＥ／Ｆｃ（１−１３０ＡＡ）も、高い感度で認識される。これらのタンパク質は各々、Ｎ末端部分にＮｔｅｒｍＲ３１の完全な部分配列を含むので、結果は、再度、予想に対応する。高度に保存されたマウス及びラット（ｒａｔｅ）ＲＡＧＥタンパク質が、同様に、顕著に認識されたので、マウス及びラットＲＡＧＥとの交叉反応性は本抗血清に帰することができる。
【０３１４】
驚くべき発見は、ＮｔｅｒｍＲ３１の部分配列（中核配列）であり、均一結合アッセイ（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ；以下参照）において相当な結合活性を示すＮｔｅｒｍＲ１３中のペプチドがほとんど又は全く検出されないことである。この結果の考えられる説明は、ポリクローナル抗体によって、ＮｔｅｒｍＲ３１中の立体構造エピトープが好ましく認識されることであり得る。分子内相互作用を通じて、ペプチドがこの立体構造を採る場合にのみ、ペプチドは抗血清によって明確に認識される。より短いＮｔｅｒｍＲ１３部分ペプチドは、この空間的構造を採ることができず、従って、認識されない。３１アミノ酸を含む完全な配列又はこの配列を含むペプチドは、従って、免疫原として特に適切である。
【０３１５】
さらなる可能な説明は、ＮｔｅｒｍＲ３１の非重複領域（領域１−１４；領域２８−３１）と比べて、ペプチドＮｔｅｒｍＲ３１の免疫原性が明確に異なりことであリ得る。しかしながら、抗体産生用抗原性ペプチド配列を選択するために使用されるＡｂｉｅ  Ｐｒｏ３．０ソフトウェアパッケージ（ＣｈａｎｇＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）によるペプチド配列の分析は、この説明とは矛盾する。Ａｂｉｅ  Ｐｒｏ３．０によるＮｔｅｒｍＲ３１の分析は、優れた抗原性特性を有する４つの１３マーペプチドが予測され、１つのペプチドは、配列Ｎｔｅｒｍ１３に正確に対応することを示している。他の３つのペプチドは、それぞれ、これらの事例の各々においてＮｔｅｒｍＲ３１と大きな重複が存在するように、１つのアミノ酸によってＮ末端が置換されている。ＮｔｅｒｍＲ１３の免疫原性が著しく弱いことは、従って、むしろ可能性が低く、３Ｄ立体構造の仮説が可能性のある仮説であるとみなされるべきである。同様に、この立体構造は、無作為化されたペプチドによって採ることができないので、これは、ウェスタンドットブロットでのそれらの不認識を説明する。
【０３１６】
ｄ）モノクローナル抗ＮｔｅｒｍＲ３１抗体に対する検査手順
クローン３７の細胞培養上清から得られたモノクローナル抗ＮｔｅｒｍＲ３１の性質決定は、ドットブロット法の補助を得て実施した。上掲のタンパク質又はペプチド試料５又は５０ｎｇを、０．５μＬの容量で、３つ組みにて、ニトロセルロース膜（０．４５μｍ孔径；＃ＬＣ２００１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより）上に加えた。１×ブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；＃１９２１６７３）中、４℃で一晩、膜をブロッキングした。次いで、Ｂｉｏｔｅｒｎｄ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を通じて購入され、０．５％ブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；＃１９２１６７３）中に１：１０で希釈した細胞培養上清とともに、膜を１時間インキュベートした。室温での１×ＰＢＳ中での３回の洗浄工程後、０．５％ブロッキング試薬中、１：５０００希釈して、室温で１時間、二次抗体Ｓｈｐ×Ｍｓ  ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２ＡＰ（Ｃｈｅｍｉｋｏｎ，＃ＡＱ３３０Ａ）とともにインキュベーションを行った。ＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液（Ｈ２Ｏ１０ｍＬ中に１錠；Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，＃１６９７  ４７１）で染色する前に、５分間×３回、再度、膜をＰＢＳ中で洗浄した。所望のシグナル／バックグラウンド比に達した後、染色溶液を吸引除去し、膜を水で濯いだ。
【０３１７】
ｅ）モノクローナル血清に対する結果：
結果は、図７ｂに図示されている。これは、抗ＮＴｅｒｍＲ３１ｍＡｂの特異性（ＮｔｅｒｍＲ３１の認識、無作為化された対照及びＮｔｅｒｍＲ３１への反応の欠如並びにヒト、ラット、マウス間の種交叉反応の欠如）が、ポリクローナルウサギ抗血清と同等であることを示している。
【０３１８】
典型的な実施形態３：ペプチドＮｔｅｒｍＲ３１及びＮｔｅｒｍＲ１３とのｓＲＡＧＥの相互作用のＡｌｐｈａＳｃｒｒｅｅｎ測定
ａ）材料
ＲＡＧＥ受容体へのＮｔｅｒｍＲ３１又はＮｔｅｒｍＲ１３の結合は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｓｈｅｌｔｏｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）から購入したＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭＳｙｓｔｅｍ（注文番号：６７６０６１０Ｍ）を使用することによって測定した。
【０３１９】
ＮｔｅｒｍＲ１３ビオチン化（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，  Ｕｌｍ）
ＮｔｅｒｍＲ３１ビオチン化（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，  Ｕｌｍ）
ｂ）検査手順
２０μＬの容量の、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４及び０．１％ＢＳＡ中で、完全な均一アッセイを実施した。混合物は、融合タンパク質ｓＲＡＧＥ−６×ＨＩＳ（アミノ酸２３−３５２、ＮＰ ００１１２７）２．５ｎｇ／μＬ、抗ＨＩＳアクセプタービーズ２０ｎｇ／μＬ、ストレプトアビジンドナービーズ２０ｎｇ／μＬ並びに０、１、５、１０、２５、５０、１００、１５０及び３００ｎＭの濃度のＮｔｅｒｍＲ１３又はＮｔｅｒｍＲ３１ペプチドから構成された。
【０３２０】
所定の時間系列で各成分を一緒にした。まず、ｓＲＡＧＥ  ６×ＨＩＳを、アクセプタービーズとともに、３０分間インキュベートした。次いで、ペプチドの様々な量を順に添加して、さらに３０分後、ドナービーズを添加した。さらに６０分後、１秒のタイムラグを用いて、Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒのＡｌｐｈａＱｕｅｓｔ装置中で蛍光を測定した。各測定点は、３つ組みとして測定した。結果の分析及びグラフ表示は、ＧｒａｐｈＰｒｉｓｍ４．０ソフトウェアパッケージを用いて行った。
【０３２１】
ｃ）結果
結果は、図８に図示されている。ペプチドＮｔｅｒｍＲ３１及びＮｔｅｒｍＲ１３は、本明細書に記載されている検査において、ｓＲＡＧＥタンパク質に、高い親和性で結合する。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ結合アッセイにおいて見出されたＥＣ５０値は、それぞれ、６２及び６６ｎＭである。
【０３２２】
典型的な実施形態４：対照ペプチドとのｓＲＡＧＥのＡｌｐｈａＳｃｒｒｅｅｎ測定
ａ）材料
ＲＡＧＥ受容体への結合は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｓｈｅｌｔｏｎ、ＣＴ、ＵＳＡ）から購入したＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭＳｙｓｔｅｍ（注文番号：６７６０６１０Ｍ）を使用することによって測定した。
【０３２３】
以下のペプチドは、ビオチン化された形態で使用した。
【０３２４】
アミロイドＡβ−１−４２オリゴマー（ＷＯ２００４  ０６７５６１に開示されているとおりに調製）
無作為化されたＮｔｅｒｍＲ１３：Ｇ  Ｋ  Ｐ  Ｒ  Ａ  Ｐ  Ｋ  Ｃ  Ｌ  Ｋ  Ｐ  Ｅ  Ｑ
ＮｔｅｒｍＲ１３：Ｃ  Ｋ  Ｇ  Ａ  Ｐ  Ｋ  Ｋ  Ｐ  Ｐ  Ｑ  Ｒ  Ｌ  Ｅ
ＡｌｔｅｒＣｈａｒｇｅ１：Ｆ  Ｓ  Ｒ  Ｉ  Ｒ  Ａ  Ｔ  Ｈ  Ｗ  Ｒ  Ｖ  Ｄ  Ｇ
非極性：Ｆ  Ｐ  Ｖ  Ｉ  Ｐ  Ａ  Ｌ  Ｆ  Ｗ  Ｉ  Ｖ  Ｌ  Ｍ
Ｐｌｕｓ７：Ｒ  Ｌ  Ｋ  Ｒ  Ｇ  Ｈ  Ａ
Ｍｉｎｕｓ７：Ｅ  Ｔ  Ｅ  Ｄ  Ｓ  Ｄ  Ｔ
下線：正に帯電したアミノ酸
斜字体：負に帯電したアミノ酸
ｂ）検査手順
２０μＬの容量の、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４及び０．１％ＢＳＡ中で、製造業者のプロトコールにより、アッセイを実施した。混合物は、融合タンパク質ｓＲＡＧＥ−６×ＨＩＳ（アミノ酸２３−３５２、ＮＰ ００１１２７）２．５ｎｇ／μＬ、抗ＨＩＳアクセプタービーズ２０ｎｇ／μＬ、ストレプトアビジンドナービーズ２０ｎｇ／μＬ及び０、１、５、１０、２５、５０、１００及び３００ｎＭの濃度のビオチン化されたペプチドから構成された。Ａβ１−４２オリゴマーを除くペプチドは、生じ得る凝集を弱めるために、検査の直前に、５０℃で１０分間加熱した。
【０３２５】
所定の時間系列で各成分を一緒にした。まず、ｓＲＡＧＥ  ６×ＨＩＳを、アクセプタービーズとともに、３０分間インキュベートした。次いで、ペプチドの様々な量を添加して、さらに３０分後、ドナービーズを添加した。さらに６０分後、１秒のタイムラグを用いて、Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒのＡｌｐｈａＱｕｅｓｔ装置中で蛍光を測定した。各測定点は、３つ組みとして測定した。結果の評価及びグラフ表示は、ＧｒａｐｈＰｒｉｓｍ４．０ソフトウェアパッケージを用いて行った。
【０３２６】
ｃ）結果
検査結果は、図９に図示されている。本検査で使用した対照ペプチドは、ＮｔｅｒｍＲ３１及びＮｔｅｒｍＲ１３のＲＡＧＥへの結合の性質を解明することを予定している。ＡβオリゴマーのＲＡＧＥへの結合は、陽性対照としての役割を果たした。
【０３２７】
完全に非極性及び中性のペプチド「Ｕｎｐｏｌ１３」及び負に帯電したペプチド「Ｍｉｎｕｓ７」は何れも、これらのペプチドに対する殆ど見えない低い曲線（Ｘ軸上を走行している。）によって示されるように、本実験において、受容体への結合を全く示さない。正の電荷が結合に必要であるという仮説は、ペプチド「ＳｃｒａＮｔｅｒｍＲ１３」、「ＡｌｔｅｒＣｈａｒｇｅ１」及び「Ｐｌｕｓ７」によって、見事に確認される。最高の電荷密度は、Ｈｅｐｔａｍｅｒ  Ｐｌｕｓ７によって保有され、これは、ＳｃｒａＮｔｅｒｍＲ１３と一緒に、本検査において、最高の最大シグナル強度に達する。ＳｃｒａＮｔｅｒｍＲ１３は、ＮｔｅｒｍＲ１３と同一のアミノ酸から構成されるが、無作為の配列である。対照は、同じか、又は僅かに高い親和性でｓＲＡＧＥに結合するので、現在入手可能なデータによれば、正の電荷が特定の密度で存在しなければならない程度まで、アミノ酸配列が関連しているに過ぎない。結合のために、正電荷担体の特異的な組み合わせが必要ですらないという事実は、ペプチドＡｌｔｅｒＣｈａｒｇｅ１（これらは、１３マーとして、４つの正電荷を有するが、ＮｔｅｒｍＲ１３の場合では、３つのリジンと１つのアルギニンに由来するのではなく、３つのアルギニンと１つのヒスチジンに由来する。）によって示される。
【０３２８】
要約すると、ペプチドＮｔｅｒｍＲ１３中の正電荷を介したイオン性ペプチド／受容体相互作用は、ＲＡＧＥへの結合にとって明瞭に十分であると述べることができる。しかしながら、このような正電荷の凝集は、ポリペプチド／タンパク質（例えば、ｓＲＡＧＥ）の表面上での特定の３Ｄ折り畳みによって相対的に大きなポリペプチド中に提示されている場合に限り、特に、結合プロセスに関与する。
【０３２９】
典型的な実施形態５：ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６競合アッセイ：
ａ）材料：
マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ，Ｎｕｎｃ）
ＡｔｔｏＰｈｏｓ基質（Ｒｏｃｈｅ番号１６８１９８２、Ｇｅｒｍａｎｙ）
Ｈｉｓ−ＮｏｇｏＲ：ＣＨＯ−Ｋ１細胞中で発現され、精製後には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで８０ｋＤａの分子量を有する低グリコシル化Ｎｏｇｏ受容体の＞９０％純度を有する
ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６（上記参照）
ｓＲＡＧＥ（上記参照）
Ｎｔｅｒｍ３１（上記参照）
ＮｔｅｒｍＲ１３（上記参照）
ｓｃｒａＮｔｅｒｍＲ１３（上記参照）
ｓｃｒａＮｔｅｒｍＲ３１（上記参照）
ｂ）検査手順：
マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂ）を、Ｈｉｓ−ＮｏｇｏＲの溶液０．１ｍＬ（炭酸ナトリウム緩衝液中、ｐＨ９、５μｇ／ｍＬ）で、４℃で一晩コートした。この後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２中の２％強度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）による、室温での１時間のブロッキング工程を行った。Ｈｉｓ−ＮｏｇｏＲ、ｓＲＡＧＥ及びＮｔｅｒｍＲ３１の溶液を、２００ｎＭの初期濃度となるように調整した。次いで、これらの原液を３倍希釈した。ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６（３μｇ／ｍＬ）を、緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２及び０．１％ＢＳＡ）で、０．２ｎＭまで希釈した。ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６（０．２ｎＭ）０．０５ｍＬを、タンパク質の各希釈液（０．０５ｍＬ）に添加し、周囲温度で９０分間インキュベートした。各最終濃度は、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６の場合、０．１ｎＭ並びにＨｉｓ−ＮｏｇｏＲ、ｓＲＡＧＥ及びＮｔｅｒｍＲ３１の場合、１００、３３．３、１１．１、３．７及び１．２ｎＭであった。
【０３３０】
各インキュベーション工程後、プレートを洗浄緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２及び０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で洗浄した。アルカリホスファターゼに対する基質ＡｔｔｏＰｈｏｓ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＡＰ−Ｎｏｇｏ６６の結合を検出し、Ｐｏｌａｒｓｔａｒ機器（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて蛍光単位を測定した。タンパク質についての結果は図１０Ａに、ペプチドＮｔｅｒｍ３１についての結果は図１０Ｂに図示されている。
【０３３１】
ｃ）結果：
２ｎＭのＩＣ５０を有する同じ可溶性リガンドによって、マイクロタイタープレートに結合されたＮｇＲへのＡＰ−Ｎｏｇｏ６６の結合が遮断された。驚くべきことに、ｓＲＡＧＥタンパク質は、３．５ｎＭのＩＣ５０という類似の濃度範囲でＡＰ−Ｎｏｇｏ６６結合を遮断する（図１０Ａ）。ペプチドＮｔｅｒｍＲ３１を用いても、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６の結合の著しい遮断（５０ｎＭのＩＣ５０）が認められた（図１０Ｂ）。
【０３３２】
典型的な実施形態６：機能的細胞骨格再編成（ＡＣＲ）競合アッセイ：
ａ）材料：
Ｈｅｋ２９３  ＲｈｏＡ／ＮｇＲ／ｐ７５（上記参照）
ＮｔｅｒｍＲ１３（上記参照）
ＮｔｅｒｍＲ３１（上記参照）
ｓＲＡＧＥ（上記参照）
ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６（上記参照）
Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｎ  ｓｃｒ；（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，  Ｕｌｍ，ＤＥ）
（ＮＨ２ＣｙＳ（ＤＹＳＳＳ）ＫＳＫＫＶＥＡＶＫＫＡＫＡＧＧＫＰＫＤＲＡＡＹＡＫＥＹＩＤＫＬＥＫＫ−ＣＯＯＨ）
９６ウェルを有するＭＴＰ  Ｂｉｏｃｏａｔマイクロタイタープレート
ＲＰＭＩ−Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ  Ａｌｅｘａ  ５６８又は４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＵＳＡ）
ＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｅｕｇｅｎｅ，  ＵＳＡ）
ｂ）検査手順：
検査を実際に開始する２日前に、９６ウェルを有するＭＴＰ  Ｂｉｏｃｏａｔマイクロタイタープレート中に、１×１０４個のＨｅｋ２９３  ＲｈｏＡ／ＮｇＲ／ｐ７５細胞を導入した。様々な濃度（０．２μＭ、１μＭ、５μＭ）の各ＲＡＧＥペプチド（ＮｔｅｒｍＲ１３、ＮｔｅｒｍＲ３１、ｓＲＡＧＥ）とともに、又は対照ペプチド（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｎ  ｓｃｒ；濃度＝０．２、１、５μＭ）とともに、このようにして得られた細胞株をプレインキュベートした。５％ＦＣＳを含む培地中のＮｇＲリガンドＡＰ−Ｎｏｇｏ−６６（９．６μｇ／ｍＬ）で細胞を刺激した。検査の各系列に対して、刺激されていない対照混合物（ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６なし）を調製した。５〜１０分の刺激期間後、冷たいＰＢＳで活性化を停止した。３−４％強度のパラホルムアルデヒド溶液で細胞を固定し、０．２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳで浸透させ、３０−４５分間、ファロイジンＡｌｅｘａ５６８又は４８８とともにインキュベートした。さらに、核染色のために、ＤＡＰＩとのインキュベーションを５分間行った。落射蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ２５）の補助を得て、細胞を可視化した。冷却したＺｅｉｓｓのＣＣＤカメラで蛍光顕微鏡写真を記録し、総細胞計数に基づく、収縮した細胞のパーセント含量を見出した。
【０３３３】
ｃ）結果：
ＮｔｅｒｍＲ３１及びｓＲＡＧＥに対する検査結果が、図１１Ｂに図示されている。収縮したＨＥＫ細胞のパーセント含量の濃度依存的減少が、両ペプチドに対して観察されている。これは、ＮｔｅｒｍＲ３１及びｓＲＡＧＥが、濃度の増加とともに、ＨＥＫ細胞の細胞収縮のＮｇＲ依存的刺激を次第に軽減すること、すなわち、Ｎｏｇｏ−６６のその受容体ＮｇＲへの結合を遮断することを示している。図１１Ａは、刺激されていないＨＥＫ２９３ＲｈｏＡ／ＮｇＲ／ｐ７５細胞及びＡＰ−Ｎｏｇｏ６６によって刺激されたＨＥＫ２９３ＲｈｏＡ／ＮｇＲ／ｐ７５細胞の顕微鏡写真を示している。ＡＰ−Ｎｏｇｏ−６６での刺激後に、収縮したＨＥＫ細胞の含量が増加することが、極めて明瞭である。
【０３３４】
典型的な実施形態７：トランスジェニックＡＰＰマウス脳での抗ＲＡＧＥを用いたＦＩＨＣ分析
ａ）材料
ＴＢＳＴ洗浄溶液（Ｔｗｅｅｎ２０を加えたＴｒｉｓ緩衝化された生理的食塩水溶液、１０×濃縮物；ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ；Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ  Ｓ３３０６）蒸留水で１：１０に希釈。
【０３３５】
ロバ血清（Ｓｅｒｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ、Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ、ＤＥ）ＴＢＳＴ中５％
一次抗体：
−ウサギ抗ＲＡＧＥ（Ａｂｃａｍ，Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｏｒ：Ａｃｒｉｓ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｄｄｅｎｈａｕｓ，ＤＥ，；ａｂ３６１１）ＴＢＳＴ中に１：２００で希釈
−ウサギ抗ＲＡＧＥ（Ｂｉｏｔｒｅｎｄ；Ｃｏｌｏｇｎｅ，ＤＥ；抗−３１−マー−８５０８）、ＴＢＳＴ中に１：２００で希釈；本発明の抗ＮｔｅｒｍＲ３１血清；
二次抗体：
−ロバ抗ウサギＣｙ３（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ，ＤｉｓｔｒｉｂｕｔｏｒＤｉａｎｏｖａ  ＧｍｂＨ，  Ｈａｍｂｕｒｇ，ＤＥ）、ＴＢＳＴで１：５００希釈
Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  ｈａｒｄｓｅｔ封入溶媒（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；  Ｂｕｒｌｉｇａｍｅ，  ＵＫ  Ｈ−１４００）
−ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）に対する遺伝子を有するＴｇ２５７６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｍ＆Ｂ  Ａ／Ｓ，Ｒｙ，Ｄｅｎｍａｒｋ）
ｂ）検査手順
１０週齢又は１１月齢のＴｇ２５７６マウスの歯状回から作製された４０μｍ厚を有する凍結切片を、ロバ血清とともに２０分間、及び一次抗体の１つとともに一晩インキュベートした。ＴＢＳＴ緩衝液中での３回の洗浄工程後、ロバ抗ウサギＣｙ３二次抗体とともに、６０分間、切片をインキュベートし、最後に、ＴＢＳＴ緩衝液で３回洗浄した。次いで、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓガラススライド上に切片を置き、風乾し、カバーガラスで覆った。Ａｘｉｏｐｌａｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｋｒｏｓｋｏｐ  Ａｘｉｏｐｌａｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ２；Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，  Ｊｅｎａ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）中で、薄い切片の蛍光画像を分析した。．
ｃ）結果：
検査結果は、添付の図１２に図示されている。
【０３３６】
ＡＰＰトランスジェニックマウスは、アミロイド斑がまだ形成されていない時点で、膜結合型ＲＡＧＥの莫大な刺激を示している。アミロイドの顕著な形成が存在し、斑が産生されている場合には（９−１２月齢）、可溶性ＲＡＧＥが顕著になり、膜結合型ＲＡＧＥは消失し、これは、血漿中で測定することが可能である。したがって、より老齢の動物は、特に高いｓＲＡＧＥ血漿レベルを有する。
【０３３７】
免疫組織化学は、抗ＮｔｅｒｍＲ３１抗血清（図１２ｂ）がＡｂｃａｍ血清（図１２ａ）などの市販の抗ＲＡＧＥ抗血清とは異なるという事実のさらなる証拠を提供する。Ａｂｃａｍ抗血清とは異なり、抗ＮｔｅｒｍＲ３１抗血清は若いＴｇ２５７６動物に対しては染色しないが、老齢の動物では同等の染色を示すという事実は、結合されたリガンド（すなわち、Ｔｇ２５７６の場合のアミロイドβ）の場合にのみ、ＡＧＥＲ−ＲＭＥのエピトープが効率的に提示され、抗体に接近できることを意味するものと解釈できる。しかしながら、若いＴｇ２５７６では、あまり多くのアミロイドβは、まだ形成されていない。文献（Ｕｊｉｉｅ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，：Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００３  Ｄｅｃ；１０（６）：４６３−７０）に従って、動物は、わずか１０ヶ月以降から、アルツハイマー斑を形成し始め、より遅い時点でのみ増加したアミロイドが形成されること、従って、ＡＧＥＲ−ＲＭＥの免疫原性に関する本発明の仮説が裏付けられることを示唆している。
【０３３８】
典型的な実施形態８：ＥＬＩＳＡによるマウス血漿中でのｓＲＡＧＥの検出
ａ）材料
マイクロタイタープレート（柔軟なプレート、９６ウェル、平底、Ｆａｌｃｏｎ）
ヤギ抗マウスＲＡＧＥ抗体；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＡＦ１１７９
トランスジェニックマウス（Ｔｇ２５７６）
ストレプトアビジン−ＡＰ抱合体（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｎｏ．１０８９１６１
ＡｔｔｏＰｈｏｓ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｅｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｎｏ．１６８１９８２）
組換え可溶性マウスＲＡＧＥ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ；Ｃｕｓｔｏｍ０３）
ｂ）検査手順：
各事例において、抗体溶液（ヤギ抗マウスＲＡＧＥ；原溶液：１００μｇ／ｍＬ；５０ｍＭのＮａＨＣＯ３中の１μｇ／ｍＬの濃度で希釈して使用）１００μＬで、マイクロタイタープレートを４℃で一晩コートした。次いで、ＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で、ウェルをそれぞれ３回洗浄した。各事例において、ＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中の１％ＢＳＡ溶液１００ｍＬとともに、室温で１時間インキュベートすることにより、吸着効果を最小限に抑えた。この後、ＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で、各事例において、上述のように３回洗浄した。
【０３３９】
１０週齢及び１２月齢のトランスジェニックマウス（Ｔｇ２５７６）からの血漿並びに非トランスジェニック株Ｃ５７Ｂ１６のマウスからの血漿を、可溶性マウスＲＡＧＥに対する試料として用いた。各事例において、１００μＬの容量で、ＴＢＳ／０１％Ｔｗｅｅｎ２０中に１：２０希釈して、血漿を使用した。次いで、上述のように、各々を３回洗浄した。各事例において、検出抗体として、ビオチン化されたヤギ抗体マウスＲＡＧＥ抗体（原溶液：ＴＢＳ／０．１％ＢＳＡ中５０μｇ／ｍＬ；ＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／０．１％ＢＳＡ中で１：２００の希釈で希釈して用いた。）を各ウェルに添加した。室温で６０分間のインキュベーションに続いて、新たな洗浄を行った（上述のとおり）。これに続いて、各事例において、ＴＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中で１：２５００の希釈したストレプトアビジン−ＡＰ抱合体１００μＬとともに、２時間インキュベーションを行った。再度、３回の洗浄を実施した。ＡｔｔｏＰｈｏｓ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｅｔの１００μＬ部分の補助を得て、酵素の量を検出した。９０分間のインキュベーション後、４４０ｎｍでの励起及び５４０ｎｍでの発光を用いたＰｏｌａｒｓｔａｒ装置中で蛍光を測定した。
【０３４０】
組換え可溶性マウスＲＡＧＥ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ；Ｃｕｓｔｏｍ０３）を、ＥＬＩＳＡに対する対照として用いた。  
ｃ）結果：
図１３は、１２月齢（１）及び１０週齢（２）のトランスジェニックＴｇ２５７６マウスの血漿中でのｓＲＡＧＥの測定の結果を示している。ｓＲＡＧＥが、老齢のマウスの血漿中で上昇していることは明らかである。これは、動物の年齢が増加するにつれて、特に、アミロイド産生の機能として、ＲＡＧＥの発現が膜結合型（若い動物）から可溶性形態（老齢の動物）へと切り替わるという事実によって説明することができる。この結果は、ＮｔｅｒｍＲ３１抗血清が、市販の抗血清によっては規定されない「活性な受容体状態」を認識するという本発明の知見を支持する（典型的な実施形態７、図１２参照）。非トランスジェニック系統Ｃ５７Ｂ１６の血漿は、若いトランスジェニック動物と同等のｓＲＡＧＥ血漿濃度を示した（データは示さず。）。
【０３４１】
典型的な実施形態９：抗ＮｔｅｒｍＲ３１及び抗ｓＲＡＧＥ抗体によるｓＲＡＧＥ／Ａβオリゴマー相互作用の競合
ａ）材料及び検査手順
ＣＩＳ  Ｂｉｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｂａｇｎｏｌｓ，Ｆｒａｎｃｅ）の均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）技術を用いて、ｓＲＡＧＥ−アミロイドβオリゴマー（球状体）結合の抗体による置換について検査を実施した。ＨＴＲＦドナー及びアクセプター成分、抗６ＨＩＳ−ユーロピウムクリプタート（ＣＩＳ  Ｂｉｏカタログ番号：：６１ＨＩＳＫＬＡ；５００ウェル／１３μｇ）及びストレプトアビジンＸＬ−６６５（ＣＩＳ  Ｂｉｏカタログ番号：６１１ＳＡＸＬＡ、５００ウェル／２５０μｇ）を、それぞれ、ｄｄＨ２Ｏの２５０μＬ中に溶解した。これら原溶液から出発して、７．４ｎＭ抗６Ｈｉｓ−クリプタート及びＰＢＳ、ｐＨ７．４中の１２１．２ｎＭストレプトアビジンＸＬ−６６５の最終濃度で、１：５０の作業希釈液を調製した。
【０３４２】
ウサギＩｇＧ（注文番号：Ｉ５００６；Ｓｉｇｍａ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）は、本検査において、陰性対照としての役割を果たした。ポリクローナル抗ＲＡＧＥ抗体ＡＦ１１４５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を陽性対照として使用した。用いた抗ＮｔｅｒｍＲ３１免疫グロブリンは、他の箇所に既に記載したように、Ｂｉｏｔｒｅｎｄ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を通じて取得した。
【０３４３】
本検査を実施するために、まず、各事例において、室温で一時間、７．１４μＭ、３．５７μＭ、１．７８μＭ、０．８９２μＭ、０．４４６μＭ、０．２２３μＭ、０．１１２μＭ、０．０５６μＭ及び０μＭの濃度で、検査すべき抗体溶液４μＬまたはＩｇＧ対照とともに、組換えｓＲＡＧＥタンパク質（記載のとおり調製及び精製、濃度１μＭ）４μＬを別個の混合物中でインキュベートした。  
次いで、Ａβ１／５ビオチン球状体の４μＭ原液４μＬを混合物に添加し（最終濃度８００ｎＭ）、室温で、さらに一時間インキュベートした。ここに記したＡβ１／５ビオチン球状体の濃度は、（ＷＯ２００４  ０６７５６１に従って）球状体を調製するために使用したＡβ１−４２単量体に基づいている。上記７．４ｎＭの抗６Ｈｉｓクリプタート溶液及び１２１．２ｎＭのストレプトアビジン２μＬ部分を添加し、次いで、ここでは４℃で、さらに２時間、この混合物をインキュベートした。２ＭのＫＦ原溶液４μＬを添加した後、ＨＴＲＦモードのＢＭＧ  Ｐｈｅｒａｓｔａｒ蛍光測定装置（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ，Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で完全な混合物を測定した。計算された％ＤｅｌｔａＦ値をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）に転送し、評価した。グラフに記された濃度は、完全な２０μＬの混合物の最終濃度に基づいている。
【０３４４】
ｂ）結果
検査の結果は、図１４に示されている。予想通り、ｓＲＡＧＥなしの対照混合物では、抗体濃度が増加するにつれて、測定される蛍光レベルには変化が観察されないことを示している。ｓＲＡＧＥの存在下で、ウサギ対照血清の添加は、蛍光の減少をもたらさず、従って、ｓＲＡＧＥ−Ａβ相互作用の阻害をもたらさない。これに対して、ポリクローナル抗ｓＲＡＧＥ抗体（約５０ｎＭ以上）及びポリクローナル抗ＮｔｅｒｍＲ３１抗体（約８００ｎＭ以上）の濃度が増加するにつれて、ｓＲＡＧＥ−Ａβ相互作用の著しい阻害が観察される。
【０３４５】
典型的な実施形態１０：興奮性シナプス伝達及び長期増強に対するＮｔｅｒｍＲ３１の効果
ａ）序言
長期増強（ＬＴＰ）は、学習及び記憶の細胞モデルである。本明細書において使用された誘導方法（シータバースト刺激）は、数時間後には初期レベルに復帰する、いわゆる「弱い」ＬＴＰを誘導する。ＬＴＰは、短期増強とは異なり、より長時間持続する後シナプス変化（例えば、後シナプス膜の受容体組成の修飾）も含むシナプスの強化を原因とする。ＬＴＰ様の状態は、動物内での記憶形成中に測定されており、逆に、ＬＴＰ誘導は、動物における記憶性能に影響を与える。物質への接近性がより優れているために、シナプス伝達及びＬＴＰは、脳切片で測定された。記録は、海馬のＣＡ１領域中で為された。
ｂ）物質と方法
組織切断機を用いて、７〜８週齢の雄のＷｉｓｔａｒラット（Ｈａｒｌａｎ  Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ，Ｂｏｃｈｕｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た４００μｍ厚の横断海馬切片を調製し、少なくとも１時間、３３℃で、以下の組成：ＮａＣｌ：１２４ｍＭ；ＫＣｌ  ４．９ｍＭ；ＭｇＳＯ４  １．３ｍＭ；ＣａＣｌ２  ２．５ｍＭ；ＫＨ２ＰＯ４  １．２ｍＭ；ＮａＨＣＯ３  ２５．６ｍＭ；グルコース１０ｍＭ；ｐＨ７．４の、Ｃａｒｂｏｇｅｎ気体を与えた人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）中で平衡化させた。同じ組成の、Ｃａｒｂｏｇｅｎ気体を与えた人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）中に浸漬された切片から、記録を行った。
【０３４６】
二相パルス（電圧域１〜５Ｖ）を有する単極刺激電極を用いて、放線状層中のシャッファー側枝の刺激を行った。塩化銀参照電極（槽）に対するａＣＳＦ充填されたガラス電極を用いて、放線状層中で、興奮性後シナプス電位（ＥＰＳＰ）を記録した。これらは、特に、グルタミン作動性シナプス伝達の強度を反映する。
【０３４７】
値は、ＬＴＰ誘導の１２０前及び１２０分後の期間にわたり、５分毎に記録されたフィールドＥＰＳＰの勾配から求めた。ＬＴＰは、いわゆるシータバースト刺激（１０ｍｓの二重パルス間隔を有する２００ｍｓの間隔で４×２パルス）によって誘導した。強直誘発の１００分前に、物質を洗浄した。
【０３４８】
ｃ）結果
シナプス伝達及びＬＴＰに対するＮｔｅｒｍＲ３１の効果を調べた。５００ｎＭのＮｔｅｒｍＲ３１の付与は、短期及び長期増強の両方を顕著に抑制する。強化されたシグナルの減少は、後強直誘発測定期間の全体にわたり、有意である（ｐ＝０．０１６；反復測定ＡＮＯＶＡ）（図１５参照）。対照ペプチド（ｓｃｒａＮｔｅｒｍＲ３１、同じアミノ酸組成であるが、配列が異なる。）中での洗浄は、短期及び長期増強に対して効果がない（ｐ＝０．７９４；反復測定ＡＮＯＶＡ）（図１６参照）。従って、ＮｔｅｒｍＲ３１ペプチドの効果は、アミノ酸配列に対して特異的である。短期増強は、ＬＴＰ曲線から誘導されることができ、強化の最初の分に相当する。
【０３４９】
ＮｔｅｒｍＲ３１投与は、基礎シナプス伝達に対して効果がない。９０分にわたるＮｔｅｒｍＲ３１の付与は、ＥＰＳＰのサイズを変化させず、従って、正常なグルタミン作動性神経伝達は影響を受けないままである（図１５参照）。入力／出力比は、ＮｔｅｒｍＲ３１によっても影響を受けず（図１７参照）、同様に、このペプチドへの曝露時にシナプス伝達が正常であることを示している。この軌跡中には複数集団事象の証拠は存在しないので、規則的なＧＡＢＡ作動性伝達は損なわれていないと推測される。従って、総合すると、ＮｔｅｒｍＲ３１はＬＴＰに対して特異的に作用すると推測できる。この結果は、ＮｔｅｒｍＲ３１が、学習と記憶に関連する可能性があると考えられている可塑的シナプス過程に特異的に介在しているということである。
【０３５０】
典型的な実施形態１１：ＡＧＥＲ−ＣＤＰによるｓＲＡＧＥ／Ａβ球状体相互作用の競合
ａ）物質と方法
ＷＯ２００４  ０６７５６１に開示されているとおりに調製した、ビオチン化されたＡβ−１−４２球状体
以下の合成ＡＧＥＲ−ＣＤＰを使用した。
【０３５１】
【化１４】
2008526243.tif 000017
ＣＩＳ  Ｂｉｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｂａｇｎｏｌｓ，Ｆｒａｎｃｅ）均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）技術によって、ｓＲＡＧＥ−Ａβ球状体結合のＲＡＧＥペプチドによる置換について実験を行った。ＨＴＲＦドナー及びアクセプター成分、抗６ＨＩＳ−ユーロピウムクリプタート（ＣＩＳ  Ｂｉｏカタログ番号：：６１ＨＩＳＫＬＡ；５００ウェル／１３μｇ）及びストレプトアビジンＸＬ−６６５（ＣＩＳ  Ｂｉｏカタログ番号：６１１ＳＡＸＬＡ、５００ウェル／２５０μｇ）を、それぞれ、ｄｄＨ２Ｏの２５０μＬ中に溶解した。これらの原溶液から出発して、ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４中の、７．４ｎＭ抗６Ｈｉｓ−クリプタート及び１２１．２ｎＭストレプトアビジンＸＬ−６６５の最終濃度で、１：５０の作業希釈物を調製した。
【０３５２】
２００μＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１２．５μＭ、６．２５μＭ、３．１２５μＭ、１．５６μＭ及び０．７８μＭの濃度で、ペプチド６及び７の作業溶液を調製した。
【０３５３】
検査を実施するために、まず、ペプチド６及び７のそれぞれ及び緩衝液対照の作業溶液４μＬを、Ａβ１／５ビオチン球状体の４μＭ原溶液４μＬと混合し（最終アッセイ濃度８００ｎＭ）、室温で１時間インキュベートした。ここに記したＡβ１／５ビオチン球状体の濃度は、球状体を調製するために使用したＡβ１−４２単量体に基づいている。次いで、組換えｓＲＡＧＥタンパク質４μＬ（調製例３ａのとおりに調製及び精製；濃度１μＭ）をアッセイに添加し、室温で１時間、混合物を再びインキュベートした。
【０３５４】
上記７．４ｎＭの抗６Ｈｉｓクリプタート２μＬ部分及び１２１．２ｎＭのストレプトアビジン溶液２μＬ部分を添加し、次いで、ここでは４℃で、さらに２時間、この混合物をインキュベートした。２ＭのＫＦ原溶液４μＬを添加した後、ＨＴＲＦモードのＢＭＧ  Ｐｈｅｒａｓｔａｒ蛍光測定装置（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ，Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で完全な混合物を測定した。最大シグナルの曲線に対して、ペプチドなしの別個の測定を実施した。バックグラウンド曲線については、測定は、各事例において、ＡｎｔｉＧＨＩＳクリプタート及びストレプアビジンＸＬ溶液のみを用いた。計算された％ＤｅｌｔａＦ値をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）に転送し、評価した。グラフに記された濃度は、完全な２０μＬの混合物の最終濃度に基づいている。
【０３５５】
ｂ）検査結果：
結果は、添付の図１８に図示されている。ヒトｓＲＡＧＥのＩｇ様Ｃ２ドメインに由来するペプチド６及び７の濃度が増加するにつれて、ｓＲＡＧＥへのＡβオリゴマー結合の阻害が観察される。阻害活性は、ペプチド７の方がより顕著である。
【０３５６】
典型的な実施形態１２：Ｎ末端切断されたｓＲＡＧＥ断片のＡβオリゴマーへの結合
ａ）物質と方法
以下のｓＲＡＧＥペプチドを用いた。
【０３５７】
ｓＲＡＧＥ１−３３１（完全なＲＡＧＥ外部ドメインを含む。）（調製例３ａ参照）
ｓＲＡＧＥ１０２−３３１（Ｎ末端が切断されたＲＡＧＥ外部ドメインを含む。）（調製例３ｂ参照）
ＣＩＳ  Ｂｉｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｂａｇｎｏｌｓ，Ｆｒａｎｃｅ）の均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）技術を用いて、ｓＲＡＧＥ１−３３１及びｓＲＡＧＥ１０２−３３１のＡβ球状体の直接結合を実施した。ＨＴＲＦドナー及びアクセプター成分、抗６ＨＩＳ−ユーロピウムクリプタート（ＣＩＳ  Ｂｉｏカタログ番号：６１ＨＩＳＫＬＡ；５００ウェル／１３μｇ）及びストレプトアビジンＸＬ−６６５（ＣＩＳ  Ｂｉｏカタログ番号：６１１ＳＡＸＬＡ、５００ウェル／２５０μｇ）を、それぞれ、ｄｄＨ２Ｏの２５０μＬ中に溶解した。これらの原溶液から出発して、ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４中の、３．７ｎＭの抗６Ｈｉｓ−クリプタート及び６０．６ｎＭストレプトアビジンＸＬ−６６５の最終濃度で、１：１００の作業希釈物を調製した。
【０３５８】
１０μＭ、５μＭ、２．５μＭ、１．２５μＭ、０．６２５μＭ、３１２．５ｎＭ、１５６．２５ｎＭの濃度で、Ａβ１／５ビオチン球状体の作業溶液を調製した。
【０３５９】
各事例において、これらの作業溶液の各々４μＬ及び緩衝液対照４μＬを、１μＭのＲＡＧＥ１−３３１又は１０２−３３１ＲＡＧＥ原溶液４μＬと混合し、室温で１時間インキュベートした。ここに記したＡβ１／５ビオチン球状体の濃度は、球状体を調製するために使用したＡβ１−４２単量体に基づいている。
【０３６０】
上記３．７ｎＭの抗６Ｈｉｓクリプタートの４μＬ部分及び６０．６ｎＭのストレプトアビジン溶液の４μＬ部分をそれぞれ添加し、次いで、ここでは４℃で、さらに２時間、この混合物をインキュベートした。２ＭのＫＦ原溶液４μＬを添加した後、ＨＴＲＦモードのＢＭＧ  Ｐｈｅｒａｓｔａｒ蛍光測定装置（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ，Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で完全な混合物を測定した。バックグラウンド曲線については、各事例において、ＡｎｔｉＧＨＩＳクリプタート及びストレプアビジンＸＬ溶液のみを用いて実施した。計算された％ＤｅｌｔａＦ値をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）に転送し、評価した。グラフに記された濃度は、完全な２０μＬの混合物の最終濃度に基づいている。
【０３６１】
ｂ）検査結果：
結果は、添付の図１９に図示されている。この事例では、ｓＲＡＧＥのＩｇ様Ｎ末端ドメインがＡβオリゴマーの結合に関与するのみならず、ｓＲＡＧＥのＩｇ様Ｃ２ドメインも、Ａβオリゴマーに対して結合親和性を有することが観察される。２つの結合親和性は、同等の強度である。
【０３６２】
調製例１３：モノクローナル抗ＲＡＧＥ抗体の調製及び性質決定
ａ）抗体調製
１．マウスの免疫化：
Ｂａｌｂ／ｃ及びＡ／Ｊマウス（６〜８週齢）を、完全フロイントアジュバント中のｓＲＡＧＥ−ＨＩＳ抗原３０μｇで皮下に免疫した。次いで、これらの免疫化のために、各事例において、ＩｍｍｕｎｅａｓｙＴＭ（Ｑｉａｇｅｎより）中に存在するｓＲＡＧＥ抗原３０μｇを、３週の間隔で３回、再び動物に注射した。融合の４日前に、最後に、もう一度、ｓＲＡＧＥ１０μｇをマウスの静脈内に接種した。
【０３６３】
２．細胞融合及びハイブリドーマのスクリーニング：
標準的な方法により、５：１の比率で、免疫化された動物から得た脾細胞をＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞に融合した。融合のためにＰＥＧ３０００を使用し、アザセリン及びヒポキサンチンを含む培地中で選択を実施した。融合から７〜１０日後に、肉眼で見えるコロニーが出現した時点で、抗ｓＲＡＧＥ−ＨＩＳ抗体に対するＥＬＩＳＡにおいて、及び安定に形質移入されたｓＲＡＧＥ発現ＨＥＫ−２９３細胞を用いたＦＡＣＳにおいて、細胞培養上清を検査した。ＥＬＩＳＡ／ＦＡＣＳ分析から得られた陽性細胞をさらに増殖させ、系列希釈によってクローニングした。
【０３６４】
３．ＥＬＩＳＡプロトコール：
ＰＢＳ中、４℃で一晩、ＥＬＩＳＡプレートをｓＲＡＧＥタンパク質（１μｇ／ｍＬ）でコートした。プレートをミルクでブロッキングした後、１×ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）中に、マウス血清及びハイブリドーマ上清を希釈した。希釈は、１：５００の比から開始して、連続的に行った。スクリーニングのために、１：５希釈を使用した。血清又は細胞培養上清５０μＬを、各ウェル中に、ピペットで添加し、室温で１時間インキュベートした。１×ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ中での３回の洗浄工程後、各事例において、ＰＢＳ中に１：５０００希釈された抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）５０μＬを添加し、室温でさらに１時間インキュベートした。３回の洗浄工程後、ＡＢＴＳ基質（Ｓｉｇｍａ）５０μＬを添加した。室温で５分後、２ＮのＨ２ＳＯ４溶液５０μＬを添加することによって反応を停止し、４５０ｎｍで、プレートを読み取った。
【０３６５】
４．ＦＡＣＳプロトコール：
ＲＡＧＥを発現している２９３ＨＥＫ細胞又は非形質移入対照細胞を、細胞培養プレートから採取し、１×ＰＢＳ，０．１％のＢＳＡ溶液中で１回洗浄した。氷上で１時間、ハイブリドーマ上清とともに、細胞をインキュベートした。新たに細胞を２回洗浄した後、氷上で１時間、ヤギ抗マウスＩｇ−ＰＧとともにインキュベーションを行った。細胞を再び洗浄し、再懸濁し、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎ装置中で結合を検出した。
【０３６６】
５．モノクローナル抗体の作製及び精製：
５％ウシ胎児血清（低ＩｇＧ含量、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた培地中で、ハイブリドーマ細胞株を増殖させた。上清を採取し、濃縮した。プロテインＡクロマトグラフィー及びＰＢＳ中でのその後の透析によって、モノクローナル抗ＲＡＧＥ抗体を精製した。
【０３６７】
このようにして、例えば、ＭＬ３７−１１Ｈ８及びＭＬ３７−６Ａ６と表記された抗体を取得し、さらに性質を決定した。
【０３６８】
ｂ）ドットブロット法での性質決定
このようにして生成されたモノクローナル抗ＲＡＧＥ抗体の性質決定のために、完全なｓＲＡＧＥタンパク質（１−３３１ｓＲＡＧＥ  ＨＩＳ）及びＮ末端が切断された様式（１０２−３３１−ｓＲＡＧＥ−ＨＩＳ）を用いて、ドットブロットを調製した。各事例において、２つ組で、１×ＰＢＳの１μＬの容量で、タンパク質の以下の量：３０ｎｇ、１０ｎｇ、３ｎｇ、１ｎｇ、０．３ｎｇ、０．１ｎｇ、０．０３ｎｇ及び０．０１ｎｇをＨｙｂｏｎｄ  ＥＣＬニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＲＰＮ６８Ｄ）上にかけた。次いで、乾燥された膜を、一定の速度で、１時間、Ｗｅｓｔｅｒｎブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ，Ｎｏ．１９２１６７３）中で振盪し、その後、７．１４ｎＭの濃度のモノクローナル抗体ＭＬ３７−６Ａ６及びＭＬ３７−１１Ｈ８とともに、同じ条件下で、さらに１時間、インキュベートした、。それぞれ、１×ＰＢＳ中で、５分間の洗浄工程４回の後、１時間、１：２０００倍の希釈で、二次ヤギ抗マウスＩｇＧ  ＡＰ抗体（ＳｉｇｍａＮｏ．Ａ−７４３４）を含むＷｅｓｔｅｒｎブロッティング試薬（Ｒｏｃｈｅ，Ｎｏ．１９２１７３）中でフィルターを振盪した。それぞれ、さらに、１×ＰＢＳ中で、５分間の洗浄工程４回の後、製造業者による記載に従って構築したＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質溶液（Ｒｏｃｈｅ，Ｎｏ．１６９７４７１）中でフィルターをインキュベートした。１０分後に、蒸留水で呈色反応を停止させた。
【０３６９】
結果は、両抗体が完全な１−３３１ｓＲＡＧＥ−ＨＩＳタンパク質（列（１））を認識することを示している（図２０参照）。これらの抗体の差は、Ｎ末端切断された１０２−２２１ｓＲＡＧＥ−ＨＩＳタンパク質の検出（列２）に関して明瞭である。ＭＬ３７−６Ａ６抗体は、Ｎ末端切断された様式も結合するが、ＭＬ３７−１１Ｈ８抗体は結合しない。
【０３７０】
ｃ）ｓＲＡＧＥ−Ａβ球状体結合の競合による性質決定
ＣＩＳ  Ｂｉｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｂａｇｎｏｌｓ，Ｆｒａｎｃｅ）均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）技術を用いて、ｓＲＡＧＥ−Ａβ球状体結合のモノクローナル抗ＲＡＧＥ抗体による置換について実験を行った。ＨＴＲＦドナー及びアクセプター成分、抗６ＨＩＳ−ユーロピウムクリプタート（ＣＩＳ  Ｂｉｏカタログ番号：：６１ＨＩＳＫＬＡ；５００ウェル／１３μｇ）及びストレプトアビジンＸＬ−６６５（ＣＩＳ  Ｂｉｏカタログ番号：６１１ＳＡＸＬＡ、５００ウェル／２５０μｇ）を、それぞれ、二重蒸留されたＨ２Ｏの２５０μＬ中に溶解した。これら原溶液から出発して、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の、１０．２５ｎＭの抗６Ｈｉｓ−クリプタート及び１５１．５ｎＭストレプトアビジンＸＬ−６６５の最終濃度で、１：４０の作業希釈物を調製した。本検査における陰性対照は、マウスＩｇＧ１及びマウスＩｇＧ２ａ（それぞれ、注文番号：Ｍ−５２８４及びＭ−５４０９；Ｓｉｇｍａ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）であった。
【０３７１】
本検査を実施するために、まず、各事例において、室温で一時間、２μＭ、１μＭ、０．５μＭ、０，２５μＭ、０．１２５μＭ、６２．５ｎＭ、３１．２５ｎＭ、１５．６２ｎＭ、７．８１ｎＭ、３．９ｎＭの濃度で、検査すべき抗体溶液４μＬまたはＩｇＧ対照とともに、組換えｓＲＡＧＥタンパク質（記載のとおり調製及び精製、濃度１μＭ）４μＬを別個の混合物中でインキュベートした。バックグラウンド対照は、ｓＲＡＧＥタンパク質及び抗体を全く含有せず、最大シグナル対照はｓＲＡＧＥを含有し、抗体を含有しない。結合緩衝液（１×ＰＢＳ  ｐＨ７．４；０．１％ＢＳＡ）の適切な量によって、容積の喪失を補填した。
【０３７２】
その後、Ａβ１／５ビオチン球状体の４μＭ原液４μＬを混合物に添加し（最終濃度８００ｎＭ）、室温で、さらに一時間インキュベートした。ここに記したＡβ１／５ビオチン球状体の濃度は、球状体を調製するために使用したＡβ１−４２単量体に関する。各事例において、上記１０．２５ｎＭの抗６Ｈｉｓクリプタート溶液２μＬ及び１５１．５ｎＭのストレプトアビジン−ＸＬ２μＬを添加し、次いで、さらに１時間、この混合物をインキュベートした。２ＭのＫＦ原溶液４μＬを添加した後、ＨＴＲＦモードのＢＭＧ  Ｐｈｅｒａｓｔａｒ蛍光測定装置（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ，Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で完全な混合物を測定した。計算された％ＤｅｌｔａＦ値をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）でプロットし、分析した。グラフに記された濃度は、完全な２０μＬの混合物の最終濃度に関する。
【０３７３】
ＭＬ３７−１１Ｈ８抗体及びＭＬ３７−６Ａ６抗体は何れも、Ａβ球状体―ｓＲＡＧＥ結合と効率的に競合できることが明らかである（図２１）。ドットブロット分析に示されているように、抗体は、ｓＲＡＧＥタンパク質の異なる部分を認識し、ｓＲＡＧＥのＣ末端及びＮ末端領域がともに、拮抗的な治療試薬による付着点として機能し得ることを明確に示している。
【図面の簡単な説明】
【０３７４】
【図１】図１は、ヒト、マウス、ラット及びウシＲＡＧＥの配列比較（ＣｌｕｓｔＡｌｌ  Ｗアラインメント）を示している。ＮｔｅｒｍＲ３１に対応する配列セグメントは、“｜＋．．．＋｜”によって特定されている。配列の一致の表記は、それぞれの事例で、配列ブロックの最後の行中に見出される。同一のアミノ酸位置は、“＊”によって特定されるのに対して、“．”及び“：”は、類似のアミノ酸を表す。一致が存在しない場合には、空欄（“  ”）が入力されている。Ｖ型のＩｇ様ドメイン（Ｖドメイン）は、太い下線によって、ヒト配列に対して強調されており、Ｉｇ様ドメインＣ２の１型は、破線の下線によって、ヒト配列に対して強調されており、Ｉｇ様ドメインＣ２の２型は、太い破線の下線によって、ヒト配列に対して強調されている。
【図２】図２は、本発明に従って使用されるプラスミドｐＡＰ−ｔａｇ５／ＰＰＣ／ｈＮＯＧＯ６６番号５のプラスミドマップを示している。
【図３ａ】図３は、本発明に従って使用される様々なプラスミドのプラスミドマップを示している。  ｐＩＲＥＳ  ｈＮＧＲ  ｈｐ７５  ＮｇＲ（配列番号１８）（図３ａ）  ｐｃＤＮＡ３  ｈＲｈｏＡ  ｗｔ（配列番号２３）（図３ｂ）  ｐｃＤＮＡ４  Ｈｉｓ  Ｍｙｃ（ｍｙｃＨｉｓ）Ａ  ｈＲｈｏＡ  ｗｔ（配列番号２１）（図３ｃ）  ｐｃＤＮＡ３．１（Ｖ５−Ｈｉｓ）ｈｐ７５番号１６（配列番号１６）（図３ｄ）
【図３ｂ】図３は、本発明に従って使用される様々なプラスミドのプラスミドマップを示している。  ｐＩＲＥＳ  ｈＮＧＲ  ｈｐ７５  ＮｇＲ（配列番号１８）（図３ａ）  ｐｃＤＮＡ３  ｈＲｈｏＡ  ｗｔ（配列番号２３）（図３ｂ）  ｐｃＤＮＡ４  Ｈｉｓ  Ｍｙｃ（ｍｙｃＨｉｓ）Ａ  ｈＲｈｏＡ  ｗｔ（配列番号２１）（図３ｃ）  ｐｃＤＮＡ３．１（Ｖ５−Ｈｉｓ）ｈｐ７５番号１６（配列番号１６）（図３ｄ）
【図３ｃ】図３は、本発明に従って使用される様々なプラスミドのプラスミドマップを示している。  ｐＩＲＥＳ  ｈＮＧＲ  ｈｐ７５  ＮｇＲ（配列番号１８）（図３ａ）  ｐｃＤＮＡ３  ｈＲｈｏＡ  ｗｔ（配列番号２３）（図３ｂ）  ｐｃＤＮＡ４  Ｈｉｓ  Ｍｙｃ（ｍｙｃＨｉｓ）Ａ  ｈＲｈｏＡ  ｗｔ（配列番号２１）（図３ｃ）  ｐｃＤＮＡ３．１（Ｖ５−Ｈｉｓ）ｈｐ７５番号１６（配列番号１６）（図３ｄ）
【図３ｄ】図３は、本発明に従って使用される様々なプラスミドのプラスミドマップを示している。  ｐＩＲＥＳ  ｈＮＧＲ  ｈｐ７５  ＮｇＲ（配列番号１８）（図３ａ）  ｐｃＤＮＡ３  ｈＲｈｏＡ  ｗｔ（配列番号２３）（図３ｂ）  ｐｃＤＮＡ４  Ｈｉｓ  Ｍｙｃ（ｍｙｃＨｉｓ）Ａ  ｈＲｈｏＡ  ｗｔ（配列番号２１）（図３ｃ）  ｐｃＤＮＡ３．１（Ｖ５−Ｈｉｓ）ｈｐ７５番号１６（配列番号１６）（図３ｄ）
【図４ａ】図４ａは、三重形質移入体ＨＥＫ２９３ＲｈｏＡ／ＮｇＲ／ｐ７５（クローン１〜９）の本発明に従って単離された陽性クローン（＃１〜＃８）、ｐｃＤＮＡ４（ｍｙｃＨｉｓ）Ａ  ｈＲｈｏＡ  ｗｔの１００ｎｇを用いた一過性形質移入によって得られた陽性対照による、発現されたＲｈｏの免疫学的検出を示している。使用したマーカー（Ｍ）は、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｐｒｅｓｔａｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、注文番号＃１０７４８−０１０であった。
【図４ｂ】図４ｂは、各事例において、抗ｐ７５抗体及び抗ＮｇＲ抗体を用いた分析のための、本発明に従って産生されたＨＥＫ２９３三重形質移入体（クローン＃４及び＃８）の、及び形質転換されていないＨＥＫ２９３細胞（上）の発現された細胞表面受容体ｈＮｇＲ及びｈｐ７５に対するＦＡＣＳ分析の結果を示している。
【図５】図５は、免疫化されたウサギ抗Ｎ末端ペプチドＮｔｅｒｍＲ３１抗体の血清を検出したＥＬＩＳＡの結果を示している。
【図６】図６は、様々な患者の血清中の抗ＮｔｅｒｍＲ３１抗体の相対量を検出したＥＬＩＳＡの結果を示している。１：健康な対照；２：ＡＰ２３、ＭＣＩＦ０６．７．Ｆ；３：ＬＡＰ３０、アルツハイマー性認知症、Ｆ００．０、早発型、Ｆ；４：ＬＡＰ３９、ＭＣＩＦ０６．７，Ｆ；５：ＬＡＰ４５、ＭＣＩＦ０６．７．Ｍ；６：ＬＡＰ５３、ＭＣＩＦ０６．７、Ｆ；７：ＬＡＰ６０、アルツハイマー性認知症、遅発型、Ｍ。
【図７ａ】図７ａは、本発明に従って産生された様々なペプチド及びｓＲＡＧＥ形態を加えたポリクローナル抗ＮｔｅｒｍＲ３１血清（下半分）を性質決定するためのドットブロット法の結果を示している。上半分は、免疫前血清を加えた対応する対照混合物を示している。混合物の説明：１：ＮｔｅｒｍＲ３１；２：ＳｃｒａＮｔｅｒｍＲ３１；３：ＳｃｒａＮｔｅｒｍＲ１３；４：ＮｔｅｒｍＲ１３；５：ｓＲＡＧＥ−６×ＨＩＳ（ＡＡ２３−３５２，ＮＰ−００１１２７）；６：ヒトＲＡＧＥ／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；＃１１４５−ＲＧ；ＡＡ１−３４４）；７：ヒトＲＡ−ＧＥ／Ｆｃ（１−１３０ＡＡ）；８：マウスｓＲＡＧＥ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ；＃Ｃｕｓｔｏｍ０３）；９：ラットＲＡＧＥ／Ｆｃ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ；＃１６１６：ＲＧ；  ＡＡ  １−３４２）
【図７ｂ】図７ｂは、モノクローナル抗ＮｔｅｒｍＲ３１抗体「クローン３７」を用いた対応する実験の結果を示している。混合物の説明：１：ＮｔｅｒｍＲ１３；２：ＮｔｅｒｍＲ３１；３：ＳｃｒａＮｔｅｒｍＲ１３；４：ＳｃｒａＮｔｅｒｍＲ３１；５：Ｎ／Ｃ末端切断（ｓＲＡＧＥ−６×ＨＩＳ）（ＡＡ１０２−３５２、ＮＰ ００１１２７）；６ヒトｓＲＡＧＥ／Ｆｃ（ＡＡ１−１３０）；７：ヒトｓＲＡＧＥ／Ｆｃ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ；＃１１４５−ＲＧ；ＡＡ１−３４４）；８：ヒトｓＲＡＧＥ−６×ＨＩＳ（ＡＡ２３−３５２、ＮＰ ００１１２７）；９：マウスｓＲＡＧＥ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；＃Ｃｕｓｔｏｍ０３）；１０：ラットＲＡＧＥ／Ｆｃ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ；＃１６１６：ＲＧ；ＡＡ１−３４２）。
【図８】図８は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイにおけるＮｔｅｒｍＲ３１及びＮｔｅｒｍＲ１３のｓＲＡＧＥへの結合を、用いたペプチド濃度の関数として示している。
【図９】図９は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイにおける様々な対照ペプチドのｓＲＡＧＥへの結合を、ペプチド濃度の関数として示している。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ｓＲＡＧＥ（丸）及び可溶性ｈｉｓ−ＮｏｇｏＲ（三角）による、ＡＰ−Ｎｏｇｏー６６（０．１ｎＭ）のＮｏｇｏ受容体（ＮｏｇｏＲ）への結合に対する競合を、それぞれの競合物質の濃度の関数として示している。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＮｔｅｒｍＲ３１による、ＡＰ−Ｎｏｇｏ−６６（０．１ｎＭ）のＮｏｇｏ受容体への結合に対する競合を、それぞれの競合物質の濃度の関数として示している。
【図１１Ａ】図１１Ａは、刺激されていないＨＥＫ２９３ＲｈｏＡ／ＮｇＲ／ｐ７５細胞及びＡＰ−Ｎｏｇｏ６６によって刺激されたＨＥＫ２９３ＲｈｏＡ／ＮｇＲ／ｐ７５細胞の顕微鏡写真を示している。ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６での刺激後には、収縮による細胞の形状の著しい変化が観察される。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＮｔｅｒｍＲ３１及びｓＲＡＧＥの様々な濃度による、収縮したＨＥＫ細胞のパーセント含量の濃度依存的な減少を示している。各棒のペアのうち色が薄い左側の棒は、それぞれに割り当てられた非刺激対照混合物（ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６なし）に対する実験の結果を示している。列１〜７の説明：１：断片なし、２：ＮｔｅｒｍＲ３１（０．２μＭ）；３：ＮｔｅｒｍＲ３１（１μＭ）；４：ＮｔｅｒｍＲ３１（５μＭ）；５：ｓＲＡＧＥ（０．２μＭ）；６：ｓＲＡＧＥ（１μＭ）；７：ｓＲＡＧＥ（５μＭ）。
【図１２ａ】図１２ａは、市販の抗ＲＡＧＥ抗体を用いた、トランスジェニックＡＰＰマウス脳の薄い切片に対する免疫組織学的検査を示している。アミロイド斑がまだ形成されていない時点で、１０週齢のマウスの歯状回（左側の写真）中に膜結合型ＲＡＧＥの強い刺激が見られる。アミロイドの大規模な形成と斑の発達が存在する時には（９月齢から１２月齢）、可溶性ＲＡＧＥが顕著になり、膜結合型ＲＡＧＥは消失する。これは、１１月齢のマウスにおける顕著に弱い染色を説明する（右側の写真）。
【図１２ｂ】図１２ｂは、本発明のＮｔｅｒｍＲ３１抗血清（「Ｂｉｏｔｒｅｎｄ」）は若い動物（１０週齢）では染色されない（左側の図）が、老齢の動物（１０月齢）中での市販の抗血清と類似のパターンで染色される（右側の図）ことを示している。
【図１３】図１３は、マウス血漿中でｓＲＡＧＥを検出したＥＬＩＳＡの結果を示している。１２月齢の動物（棒１）に認められるｓＲＡＧＥ血漿濃度は、１０週齢の若い動物（棒２）より、著しく高いことが明瞭である。
【図１４】図１４は、抗ＮｔｅｒｍＲ３１抗体（円）及び抗ｓＲＡＧＥ抗体（四角）（ＡＦ１１４５）による、ｓＲＡＧＥ／Ａβ−オリゴマー相互作用の競合実験の結果を、ＨＴＲＦアッセイで用いられた免疫グロブリン濃度（ｎＭ）の関数として示している。さらに、ウサギＩｇＧ非免疫血清（三角）を対照として使用した。ｓＲＡＧＥなしの対照混合物（破線）は、抗体濃度が増加するにつれて、蛍光の測定されるレベルが変化しないことを示している。ｓＲＡＧＥの存在下で、ウサギ対照血清の添加は、蛍光の減少をもたらさず、従って、ｓＲＡＧＥ−Ａβ相互作用の阻害をもたらさない。これに対して、ポリクローナル抗ｓＲＡＧＥ抗体及びポリクローナル抗ＮｔｅｒｍＲ３１抗体の濃度が増加するにつれて、ｓＲＡＧＥ−Ａβ相互作用の著しい阻害が観察される。
【図１５】図１５は、雄のＷｉｓｔａｒラットの海馬切片中での長期増強（ＬＴＰ）に対する５００ｎＭのＮｔｅｒｍＲ３１の影響を示している。対照切片ｎ＝１１、６匹の動物、Ｎｔｅｒｍ処理された切片ｎ＝７、４匹の動物、ｐ＝０．０１６、反復測定ＡＮＯＶＡ。
【図１６】図１６は、雄のＷｉｓｔａｒラットの海馬切片中でのＬＴＰに対する５００ｎＭのＳｃｒａＮｔｅｒｍ３１の影響を示している。対照切片ｎ＝７、４匹の動物、ＳｃｒａＮｔｅｒｍ処理された切片ｎ＝１０、５匹の動物、ｐ＝０．７９４、反復測定ＡＮＯＶＡ。
【図１７】図１７は、雄のＷｉｓｔａｒラットでのＬＴＰの調査におけるＩ／Ｏ比に対する５００ｎＭのＮｔｅｒｍＲ３１の影響を示している。
【図１８】図１８は、本発明のＡＧＥＲ−ＣＤＰペプチド６及び７によるｓＲＡＧＥ−Ａβオリゴマー相互作用の競合的阻害を示している。
【図１９】図１９は、ｓＲＡＧＥ（１−３３１）及びＮ末端が切断されたｓＲＡＧＥ（１０２−３３１）（もはや、機能的Ｖドメインを持たない。）によるＡβオリゴマー結合を示している。
【図２０】図２０は、完全なｓＲＡＧＥタンパク質（１−３３１ｓＲＡＧＥ−ＨＩＳ）（各事例で、縦の列１）及びＮ末端が切断された様式（１０２−３３１−ｓＲＡＧＥ−ＨＩＳ）（各事例で、縦の列２）を用いたドットブロットにおける、本発明の２つのモノクローナル抗ＲＡＧＥ抗体（ＭＬ３７−１１Ｈ８及びＭＬ３７−６Ａ６）の性質決定の結果を示している。
【図２１】図２１は、非特異的マウスＩｇＧ１及び２ａと比較した、モノクローナル抗ＲＡＧＥ抗体ＭＬ３７−６Ａ６及びＭＬ３７−１１Ｈ８との、ｓＲＡＧＥ−Ａβ球状体（ｇｌｏｂｕｌｏｍｅｒ）結合の競合を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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