(57)【要約】  本発明は、植物中でプロモーター活性を示すイネツングロ杆菌状ウイルス（ＲＴＢＶ）由来の新規なヌクレオチド配列の単離及び特徴付けに関する。本発明はさらに、完全長及び欠損型のＲＴＢＶプロモーター配列を細菌のレポーター遺伝子ＧＵＳと融合させることによるＲＴＢＶプロモーターの機能ドメインの分析に関する。本発明はまた、異なる発生段階中の遺伝子組換えイネ及びタバコの様々な組織中でのレポーター遺伝子の発現を研究することに関する。本発明はまた、構成的又は組織特異的状態で機能して単子葉植物と双子葉植物の両方、細胞並びに組織中で非相同核酸配列の発現を動かすＲＴＢＶプロモーター及びその欠損について説明する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示したヌクレオチド配列の断片からなるイネツングロ杆菌状ウイルス由来の単離したプロモーター（ＲＴＢＶプロモーター）。
【請求項２】
少なくとも配列番号１の塩基１〜２５４を含む、請求項１に記載の単離したプロモーター。
【請求項３】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５からなる群から選択される、請求項１に記載のプロモーターに基づく単離したプロモーター。
【請求項４】
請求項１に記載のプロモーターが、対象の非相同核酸配列に動作可能に結合した、キメラプラスミドＤＮＡ構築体。
【請求項５】
請求項３に記載のプロモーターが、対象の非相同核酸配列に動作可能に結合した、キメラプラスミドＤＮＡ構築体。
【請求項６】
前記非相同核酸配列が、改良された農業形質を植物に付与することが可能なポリペプチドをコードする、請求項４に記載のキメラプラスミドＤＮＡ構築体。
【請求項７】
前記非相同核酸配列が、改良された農業形質を植物に付与することが可能なポリペプチドをコードする、請求項５に記載のキメラプラスミドＤＮＡ構築体。
【請求項８】
前記プラスミドが植物形質転換ベクターである、請求項４に記載のキメラプラスミドＤＮＡ構築体。
【請求項９】
前記プラスミドが植物形質転換ベクターである、請求項５に記載のキメラプラスミドＤＮＡ構築体。
【請求項１０】
請求項４に記載のキメラプラスミドＤＮＡ構築体を含む組換え細胞。
【請求項１１】
請求項５に記載のキメラプラスミドＤＮＡ構築体を含む組換え細胞。
【請求項１２】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）から選択される、請求項１０に記載の組換え細胞。
【請求項１３】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）から選択される、請求項１１に記載の組換え細胞。
【請求項１４】
請求項１に記載のプロモーターに動作可能に結合した非相同核酸配列を含む形質転換植物又は細胞。
【請求項１５】
請求項３に記載のプロモーターに動作可能に結合した非相同核酸配列を含む形質転換植物又は細胞。
【請求項１６】
請求項１４又は１５に記載の遺伝子導入植物由来の子孫。
【請求項１７】
請求項１４又は１５に記載の遺伝子導入植物由来の種。
【請求項１８】
単子葉植物又は双子葉植物である、請求項１４又は１５に記載の遺伝子導入植物。
【請求項１９】
前記単子葉植物種が、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ及びモロコシからなる群から選択される、請求項１４又は１５に記載の遺伝子導入植物。
【請求項２０】
前記双子葉植物種が、タバコ、トマト、エンドウマメ、ダイズ、アブラナ類、ヒヨコマメ、綿及びキマメからなる群から選択される、請求項１４又は１５に記載の遺伝子導入植物。
【請求項２１】
ａ）請求項９に記載のキメラプラスミドＤＮＡ構築体を構築するステップ、
ｂ）ステップ（ａ）の構築体をアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株に動員して、組換えアグロバクテリウム株を生成するステップ、
ｃ）植物形質転換用の植物から適当な外植片を得るステップ、
ｄ）ステップ（ｃ）の外植片とステップ（ｂ）の組換えアグロバクテリウム株を共培養して、形質転換植物細胞を生成するステップ、
ｅ）ステップ（ｄ）の形質転換植物細胞を選択するステップ、
ｆ）ステップ（ｅ）の形質転換植物細胞から苗条を得るステップ、
ｇ）ステップ（ｆ）の苗条から発根した小植物を得るステップ、
ｈ）ステップ（ｇ）の発根した小植物を育てて、形質転換植物を生成するステップ
を含む、植物中のＲＴＢＶプロモーターに動作可能に結合した非相同核酸を発現させるための方法。
【請求項２２】
前記ＲＴＢＶプロモーターが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５からなる群から選択される、請求項２１に記載の発現の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入植物中でプロモーター活性を示すイネツングロ杆菌状ウイルス（ＲＴＢＶ）由来の新規なヌクレオチド配列の単離に関する。これはさらに、構成的又は組織特異的状態で機能して単子葉植物と双子葉植物の両方、細胞並びに組織中で非相同核酸配列の発現を動かすＲＴＢＶプロモーターの機能ドメインの特徴付けに関する。
【背景技術】
【０００２】
米は、大多数の人間にとって食事カロリーの主要な供給源であるので、世界中で最も重要な食用作物と考えられている。今後増加しつつある米食人口に十分なカロリーを提供し続けるために、且つ米中心の料理の質を向上させるために、稲を改良して、雑種強勢を利用することによって収率を上げ、害虫、病気、干ばつ、洪水、塩度及び異常温度などの好ましくない条件に耐性をつけ、且つ追加栄養素を取り込ませる必要がある。これらの改良の大部分では、導入遺伝子として一般に知られている他の生物由来の遺伝子をイネに導入し、且つ発現させなければならない。
【０００３】
農学的観点から、優れたイネ品種を生成するために、望ましい遺伝形質を与える複数の遺伝子を同じ遺伝子組換えバックグラウンドに導入する必要がある。しかし、遺伝子ピラミィディングを達成するのは容易なことではない。
【０００４】
導入遺伝子の安定な発現を確実にするために、それらは、遺伝子発現の最も重要な段階である遺伝子からのｍＲＮＡの生成のための制御ユニットとして機能するプロモーターとして知られている特異的なＤＮＡエレメントと融合させなければならない。これらの配列は、転写のプロセスを開始し、転写の速度を調節し得るという意味では本質的に調節性である。植物中で導入遺伝子を発現させるのに、比較的少数のプロモーターが一般に使用されている。さらに、双子葉植物と単子葉植物の両方で高レベルの構成的発現を動かすことができるプロモーターの数はさらに少ない。また、組織又は器官特異的発現を動かしているプロモーターは、ほんの一握りしかない。したがって、現在の科学的挑戦は、所望の空間時間的ｍＲＮＡ発現パターンを達成する点に関してより多くの多用性を導入するための新規な調節エレメントの同定にある。
【０００５】
研究は、同じプロモーターを用いて同じ植物中で２つの異なる非相同遺伝子の発現を動かすことにより、遺伝子サイレンシングが生じ得ることを示した。しかし、この問題は、それぞれの非相同遺伝子に対して異なるプロモーターを用いることによって回避することができる。したがって、組織及び／又は発生特異的発現を示すことができ、様々な植物中で導入遺伝子発現に使用できる新しいプロモーターの同定が必要とされている。この文書は、インドの西ベンガルの田畑で育ったウイルスに感染した稲から単離及び改変したイネツングロ杆菌状ウイルス（ＲＴＢＶ）から同定及び特徴付けした新しいプロモーターに関するかかる情報を提供する。
【０００６】
カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ  ３５Ｓ）及びその誘導体は、この目的で最も一般に使用されるプロモーターの中の１つである。ＣａＭＶ  ３５Ｓは、双子葉植物中では活性だが、その相対強度は、双子葉植物中よりも単子葉植物中で実質的に低い。他の双子葉植物プロモーターも単子葉植物形質転換に使用されてきたが、活性は単子葉植物プロモーターに関してより低い傾向がある（Ｗｉｌｍｉｎｋら、１９９５）。いくつかのプロモーター、例えばイネＡｃｔ１プロモーター（ＭｃＥｌｒｏｙら、１９９１）、イネｒｂｃＳプロモーター（Ｋｙｏｚｕｋａら、１９９３）、トウモロコシＵｂｉ１プロモーター（Ｔｏｋｉら、１９９２；Ｃｏｒｎｅｊｏら、１９９３）及びイネシトクロムＣ遺伝子プロモーターＯｓＣｃ１（Ｊａｎｇら、２００２）は、単子葉植物中で高レベルの導入遺伝子発現を動かすことが確認されている。これらのうち、ＣａＭＶ  ３５Ｓ（Ｔｅｒａｄａ及びＳｈｉｍａｍｏｔｏ、１９９０）、イネＡｃｔ１、トウモロコシＵｂｉ１及びイネＯｓＣｃ１だけが本質的に構成的である。ほんの僅かな組織特異的プロモーターしかイネでは同定されていない。例えば、イネ種子貯蔵タンパク質グルテリン（Ｇｔ１）プロモーターは、イネ種子中で導入遺伝子を発現するために使用されており（Ｙｅら、２０００）、イネＧｌｕ−Ｂ１プロモーターは、ダイズフェリチン遺伝子の内乳特異的発現に使用されている（Ｇｏｔｏら、１９９９）。イネで特徴付けられている他のプロモーターのいくつかには、傷害誘導性であることが示されているジャガイモｐｉｎ２プロモーター（Ｘｕら、１９９３）、嫌気条件下に根で強く誘導されるトウモロコシＡｄｈ１プロモーター（Ｋｙｏｚｕｋａら、１９９１）並びに葉肉特異的なトウモロコシｐｅｐ及びｒｂｃＳプロモーター（Ｍａｔｓｕｏｋａら、１９９４）がある。
【０００７】
Ｂｅａｃｈｙ，Ｒｏｇｅｒ  Ｎ．及びＢｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ，Ｍａｉｔｒａｙｅｅは、フィリピンで単離されたＲＴＢＶからプロモーターを同定及び特徴付けした（米国特許：５，８２４，８５７）。このプロモーターの有用性は、遺伝子導入植物中で導管特異的発現を動かすことに関与していることであった。しかし、本研究は、これまでに特徴付けられたＲＴＢＶプロモーターと重要な相同性がない、インドの西ベンガルで単離されたＲＴＢＶ由来のプロモーター断片の同定及び特徴付けを扱っている。この完全長クローンのＤＮＡ配列は、ＥＭＢＬ配列データベースに寄託しており、以下のアクセッション番号：ＡＪ３１４５９６が指定されているが、これまでにこのＤＮＡ配列に対する機能は指定されていなかった。本発明は、ＲＴＢＶ（西ベンガル分離株）由来の新しいプロモーターの同定及び植物中での導入遺伝子発現のためのそれらの使用を扱っている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の主な目的は、配列表中の配列番号１に示したように、ヌクレオチド配列を有する、イネツングロ杆菌状ウイルス（ＲＴＢＶ）から単離したプロモーターを提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、配列表中に示した配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５を有する欠損型のＲＴＢＶプロモーターを提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、対象の非相同核酸配列に動作可能に結合したＲＴＢＶプロモーター（完全長、ＦＬ）又はその欠損型ＵＤ１、ＵＤ２、ＵＤ３、ＵＤ４、ＵＤ５及びＵＤ６（上流欠損、ＵＤ）並びにＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６、ＤＤ７及びＤＤ８（下流欠損、ＤＤ）を含むキメラ植物形質転換ベクターを提供することである。
【００１１】
本発明のさらに別の目的は、上記のＲＴＢＶプロモーター及びその誘導体に動作可能に結合している非相同核酸配列が改良された農業形質又は病気若しくは昆虫への耐性を植物に付与することが可能なポリペプチドをコードする、キメラ植物形質転換ベクターを提供することである。
【００１２】
本発明のさらに別の目的は、非相同核酸配列と融合した様々なＲＴＢＶプロモーター配列（配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５）で形質転換させた植物細胞、組織、器官及び植物（単子葉植物又は双子葉植物）を提供することである。
【００１３】
本発明のさらに別の目的は、ＲＴＢＶ（ＦＬ）又は上流欠損（ＵＤ１、ＵＤ２、ＵＤ３、ＵＤ４、ＵＤ５、ＵＤ６）又は下流欠損（ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６、ＤＤ７及びＤＤ８）プロモーター配列の調節制御下での対象の１種又は複数の非相同核酸配列の発現の方法を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに別の目的は、ＲＴＢＶ（ＦＬ）又は上流欠損（ＵＤ１、ＵＤ２、ＵＤ３、ＵＤ４、ＵＤ５、ＵＤ６）又は下流欠損（ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６、ＤＤ７及びＤＤ８）プロモーター配列の制御下で非相同核酸配列を発現している遺伝子組換え単子葉植物又は双子葉植物を生成するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、植物中でプロモーター活性を示しているイネツングロ杆菌状ウイルス（ＲＴＢＶ）からの新規なヌクレオチド配列の単離に関する。本明細書において提供している核酸配列（ＲＴＢＶから単離）は、単子葉植物と双子葉植物の両方の細胞、組織及び器官中で動作可能に結合したヌクレオチド配列の発現を導く。
【００１６】
本発明は、配列番号１（配列表）に示したヌクレオチド配列を有するＲＴＢＶプロモーター（ＦＬ、８７６ｂｐ）を提供する。また、本発明は、ＵＤ１（８１８ｂｐ、配列番号２）；ＵＤ２（７８９ｂｐ、配列番号３）；ＵＤ３（７５４ｂｐ、配列番号４）；ＵＤ４（７１８ｂｐ、配列番号５）；ＵＤ５（６８１ｂｐ、配列番号６）；ＵＤ６（６７１ｂｐ、配列番号７）；ＤＤ１（８６２ｂｐ、配列番号８）；ＤＤ２（７９３ｂｐ、配列番号９）；ＤＤ３（６９１ｂｐ、配列番号１０）；ＤＤ４（５８１ｂｐ、配列番号１１）；ＤＤ５（４２６ｂｐ、配列番号１２）；ＤＤ６（３２５ｂｐ、配列番号１３）；ＤＤ７（２８９ｂｐ、配列番号１４）及びＤＤ８（２５４ｂｐ、配列番号１５）である欠損型のＲＴＢＶプロモーターを提供する。
【００１７】
本発明はさらに、完全長及び欠損型のＲＴＢＶ配列を細菌のレポーター遺伝子ＧＵＳと融合させることによる配列番号１に示したＲＴＢＶプロモーターの機能ドメインの分析並びに異なる発生段階中の遺伝子組換えイネ及びタバコの様々な組織中でのレポーター遺伝子の発現を研究することに関する。
【００１８】
好ましい実施形態では、配列番号１に示した、長さが８７６ｂｐのＦＬと指定したＲＴＢＶ由来のプロモーター配列、それぞれ配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７に示したＵＤ１、ＵＤ２、ＵＤ３、ＵＤ４、ＵＤ５及びＵＤ６などのＦＬの上流欠損を同定した。さらに、それぞれ配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５に示したＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６、ＤＤ７及びＤＤ８などのＦＬ配列の下流欠損を同定した。これらの配列を利用してイネ及びタバコ、細胞、組織及び器官中での細菌のレポーターＧＵＳ遺伝子の発現を導いた。
【００１９】
本発明はまた、構成的又は組織特異的状態で機能して単子葉植物及び双子葉植物、細胞、器官並びに組織中で非相同核酸配列の発現を動かすＲＴＢＶプロモーター及びその欠損に関する。
【００２０】
本発明の別の態様は、イネの中で、組織特異的状態で予想通りに（ＦＬ、ＵＤ１、ＵＤ２、ＵＤ３、ＵＤ４、ＵＤ５、ＤＤ３及びＤＤ４）又は構成的に（ＤＤ７及びＤＤ８）発現するＲＴＢＶ完全長プロモーター（ＦＬ）並びにその上流及び下流欠損を提供することである。
【００２１】
本発明の別の態様は、対象の非相同核酸配列と融合したＦＬ、上流及び下流欠損プロモーター配列を含むキメラ植物形質転換ベクターを構築することを含む。本発明はさらに、非相同構造遺伝子と融合したＲＴＢＶプロモーター配列（ＦＬ又は上流若しくは下流欠損のいずれか）を含むキメラ植物形質転換ベクターを植物細胞中に導入することによって遺伝子導入植物（単子葉植物又は双子葉植物）を生成するための方法を提供する。
【００２２】
本発明はまた、前記ＲＴＢＶプロモーター配列（ＦＬ又は上流若しくは下流欠損のいずれか）の調節制御下において遺伝子導入植物中で、改良された農業形質又は病気若しくは昆虫への耐性を植物に付与することが可能な機能を達成する非相同核酸配列を発現させるための方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、前記ＲＴＢＶプロモーター配列（ＦＬ又は上流若しくは下流欠損プロモーター変異体のいずれか）の調節制御下において、単子葉植物、例えばイネ、コムギ又はトウモロコシである遺伝子導入植物中で非相同遺伝子を発現させるための方法を提供する。
【００２４】
本発明はまた、前記ＲＴＢＶプロモーター配列（ＦＬ又は上流若しくは下流欠損変異体のいずれか）の調節制御下において、双子葉植物、例えばタバコ、綿又はトマトである遺伝子導入植物中で非相同遺伝子を発現させるための方法を提供する。
【００２５】
本発明はまた、ＲＴＢＶプロモーター並びにＲＴＢＶ（ＦＬ）又は上流欠損（ＵＤ１、ＵＤ２、ＵＤ３、ＵＤ４、ＵＤ５及びＵＤ６）又は下流欠損（ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６、ＤＤ７及びＤＤ８）プロモーター配列の制御下の非相同核酸配列を含む植物、細胞又は組織を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の好ましい実施形態は、配列番号１に示したヌクレオチド配列を有する、単子葉植物及び双子葉植物細胞、組織並びに器官中で動作可能に結合した核酸配列の発現を導くことが可能なイネツングロ杆菌状ウイルス（ＲＴＢＶ）由来のプロモーターの単離及び特徴付けに関する。
【００２７】
本発明の別の実施形態は、配列番号２に示した配列番号１の少なくとも５９〜８７６ｂｐ（ＵＤ１）を含む欠損型（ＵＤ１、ＵＤ２、ＵＤ３、ＵＤ４、ＵＤ４、ＵＤ５、ＵＤ６、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６、ＤＤ７及びＤＤ８）のＲＴＢＶプロモーターを提供することに関する。様々な欠損型のＲＢＴＶプロモーターの命名法及び配列番号は、以下のように付けている：配列番号３に示したＵＤ２（配列番号１の８８〜８７６ｂｐ）。配列番号４に示したＵＤ３（配列番号１の１２３〜８７６ｂｐ）。配列番号５に示したＵＤ４（配列番号１の１５９〜８７６ｂｐ）。配列番号６に示したＵＤ５（配列番号１の１９６〜８７６ｂｐ）。配列番号７に示したＵＤ６（配列番号１の２０６〜８７６ｂｐ）。配列番号８に示したＤＤ１（配列番号１の１〜８６２ｂｐ）。配列番号９に示したＤＤ２（配列番号１の１〜７９３ｂｐ。配列番号１０に示したＤＤ３（配列番号１の１〜６９１ｂｐ）。配列番号１１に示したＤＤ４（配列番号１の１〜５８１ｂｐ）。配列番号１２に示したＤＤ５（配列番号１の１〜４２６ｂｐ）、配列番号１３に示したＤＤ６（配列番号１の１〜３２５ｂｐ）。配列番号１４に示した配列番号１のＤＤ７（１〜２８９ｂｐ）。配列番号１５に示した配列番号１のＤＤ８（１〜２５４ｂｐ）。
【００２８】
本発明の別の実施形態は、イネの中で、組織特異的状態で予想通りに（ＵＤ１、ＵＤ２、ＵＤ３、ＵＤ４、ＵＤ５、ＤＤ３及びＤＤ４）又は構成的に（ＤＤ７及びＤＤ８）発現するＦＬ並びにその上流及び下流欠損を提供することに関する。
【００２９】
本発明の別の実施形態は、対象の非相同核酸配列に動作可能に結合したＲＴＢＶプロモーター（ＦＬ、ＵＤ１、ＵＤ２、ＵＤ３、ＵＤ４、ＵＤ５、ＵＤ６、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６、ＤＤ７及びＤＤ８）を含むキメラ植物形質転換ベクターを提供することに関する。
【００３０】
本発明のさらに別の好ましい実施形態は、改良された農業形質又は病気若しくは昆虫への耐性を植物に付与することが可能なポリペプチドをコードしている非相同遺伝子に結合した前記ＲＴＢＶプロモーター（ＦＬ、ＵＤ１、ＵＤ２、ＵＤ３、ＵＤ４、ＵＤ５、ＵＤ６、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６、ＤＤ７及びＤＤ８）を含むキメラ植物形質転換ベクターの生成に関する。
【００３１】
本発明のさらに別の実施形態は、単子葉植物及び双子葉植物中の形質転換させた植物細胞、組織及び器官を提供することに関する。
【００３２】
本発明のさらに別の実施形態は、イネ、コムギ及びトウモロコシなどのイネ科由来である遺伝子導入植物を提供することに関する。
【００３３】
本発明のさらに別の実施形態は、タバコ、綿及びトマトなどの双子葉植物である遺伝子導入植物を提供することに関する。
【００３４】
本発明のさらに別の実施形態は、
（ａ）対象の非相同核酸配列に動作可能に結合した、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５のいずれかに示したプロモーター配列を含むキメラプラスミドＤＮＡ構築体（植物形質転換ベクター）を生成するステップ
（ｂ）ステップ（ａ）からのプラスミドを適当な宿主細胞に導入するステップ
（ｃ）ステップ（ｂ）の細胞を用いて植物細胞又は組織を形質転換させて、前記非相同核酸配列を発現している遺伝子導入植物を生成するステップ
を含む、ＲＴＢＶ（ＦＬ、ＵＤ１、ＵＤ２、ＵＤ３、ＵＤ４、ＵＤ５、ＵＤ６、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６、ＤＤ７及びＤＤ８）プロモーターを含む１種又は複数の対象の非相同核酸配列の発現の方法を提供することに関する。
【００３５】
本発明のさらに別の実施形態は、前記非相同核酸配列が、改良された農業形質を植物に付与することが可能なポリペプチドをコードする、発現の方法に関する。
【００３６】
本発明のさらに別の実施形態は、前記非相同核酸配列が、改良された農業形質又は病気若しくは昆虫への耐性を植物に付与することが可能なポリペプチドをコードし、前記遺伝子導入植物が単子葉植物である、発現の方法を提供することに関する。
【００３７】
本発明のさらに別の実施形態は、前記非相同核酸配列が、改良された農業形質又は病気若しくは昆虫への耐性を植物に付与することが可能なポリペプチドをコードし、前記遺伝子導入植物がイネ科、例えば、イネ由来である、発現の方法に関する。
【００３８】
本発明のさらに別の実施形態は、前記非相同核酸配列が、改良された農業形質又は病気若しくは昆虫への耐性を植物に付与することが可能なポリペプチドをコードし、前記遺伝子導入植物がタバコなどの双子葉植物である、発現の方法に関する。
【００３９】
ＲＴＢＶ（西ベンガル分離株）のＤＮＡを、実施例１に示したように精製した。上記ＤＮＡの断片をプロモーター活性について特徴付けた。プロモーター活性の分析のために上記プロモーター断片に対して様々な上流及び下流欠損を実施し、その詳細を実施例２に示した。
【００４０】
ＲＴＢＶプロモーターの完全な配列を図１に示す。プライマーは、フォワードプライマーの場合には５’塩基、或いはリバースプライマーの場合には３’塩基の上に示している。ＲＴＢＶ  ＦＬプロモーターについて得た様々な欠損は、図２に概略的に表している。フォワードプライマーはＦＰ１からＦＰ７、またリバースプライマーはＲＰ１からＲＰ９と表している。長方形ボックスは、ＲＴＢＶゲノムの〜９００ｂｐ部分を示す。矢印はおおよそのプライマー位置を、それらにつながっている横線は予想されたＰＣＲ断片を示す（図２を参照のこと）。
【００４１】
ＦＬ  ＲＴＢＶプロモーター配列（８７６ｂｐ、配列番号１）は、オリゴヌクレオチドプライマーＦＰ１（配列番号１６）及びＲＰ１（配列番号２３）を使用することによって増幅した。ＦＬ断片は、その５’と３’両方のプロモーター欠損断片を生成するのに使用した。５’欠損断片は、ＵＤ１、ＵＤ２、ＵＤ３、ＵＤ４、ＵＤ５及びＵＤ６である。３’欠損断片は、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６、ＤＤ７及びＤＤ８である。ＵＤ１断片（８１８ｂｐ、配列番号２）は、プライマーＦＰ２（配列番号１７）及びＲＰ１（配列番号２３）を用いて増幅した。ＵＤ２断片（７８９ｂｐ、配列番号３）は、プライマーＦＰ３（配列番号１８）及びＲＰ１を用いて増幅した。ＵＤ３断片（７５４ｂｐ、配列番号４）は、プライマーＦＰ４（配列番号１９）及びＲＰ１を用いて増幅した。ＵＤ４断片（７１８ｂｐ、配列番号５）は、プライマーＦＰ５（配列番号２０）及びＲＰ１を用いて増幅した。ＵＤ５断片（６８１ｂｐ、配列番号６）は、プライマーＦＰ６（配列番号２１）及びＲＰ１を用いて増幅した。ＵＤ６断片（６７１ｂｐ、配列番号７）は、プライマーＦＰ７（配列番号２２）及びＲＰ１を用いて増幅した。
【００４２】
ＤＤ１欠損断片（８６２ｂｐ、配列番号８）は、プライマーＦＰ１（配列番号１６）及びＲＰ２（配列番号２４）を使用することによって増幅した。ＤＤ２欠損断片（７９３ｂｐ、配列番号９）は、プライマーＦＰ１及びＲＰ３（配列番号２５）を用いて増幅した。ＤＤ３欠損断片（６９１ｂｐ、配列番号１０）は、プライマーＦＰ１及びＲＰ４（配列番号２６）を用いて増幅した。欠損断片ＤＤ４（５８１ｂｐ、配列番号１１）は、プライマーＦＰ１及びＲＰ５（配列番号２７）を用いて増幅した。欠損断片ＤＤ５（４２６ｂｐ、配列番号１２）は、プライマーＦＰ１及びＲＰ６（配列番号２８）を用いて増幅した。欠損断片ＤＤ６（３２５ｂｐ、配列番号１３）は、プライマーＦＰ１及びＲＰ７（配列番号２９）を用いて増幅した。欠損断片ＤＤ７（２８９ｂｐ、配列番号１４）は、プライマーＦＰ１及びＲＰ８（配列番号３０）を用いて増幅した。欠損断片ＤＤ８（２５４ｂｐ、配列番号１５）は、プライマーＦＰ１及びＲＰ９（配列番号３１）を用いて増幅した。様々な欠損断片の詳細、それらのサイズ、これらの断片を生成するために使用したプライマー及びそれらの配列番号は、表１に示している。
【００４３】
様々なＤＮＡ断片を、ｐＣＡＭＢＩＡ１３８１ｚなどのプロモーターを持たない植物形質転換ベクターバックボーン中にクローン化して、イントロンを持ったＧＵＳ遺伝子の発現を動かした。植物形質転換ベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３８１ｚの左右の境界の間のＴ−ＤＮＡ領域の概略図を図３に示す。プロモーターを持たないベクター、ｐＣＡＭＢＩＡ１３８１ｚは、イネ中でクローニングするためにハイグロマイシン耐性マーカー遺伝子と一緒に、或いはタバコ中でクローニングするためにカナマイシン耐性マーカー遺伝子と一緒に使用した。それぞれが異なるＤＮＡ断片、すなわちＦＬ、ＵＤ１、ＵＤ２、ＵＤ３、ＵＤ４、ＵＤ５、ＵＤ６、ＤＤ１、ＤＤ２、ＤＤ３、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６、ＤＤ７及びＤＤ８をＧＵＳ（イントロン）遺伝子の上流に含んだ、ｐＣＡＭＢＩＡ１３８１ｚバックボーンを有する様々なキメラ植物形質転換ベクターを得た。これらのベクター構築体は、実施例３に示したようにアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＥＨＡ１０５中に動員した。アグロバクテリウム株は、タバコ及びイネなどの植物を形質転換するために使用した。イネの形質転換は、実施例４に示したように実施した。タバコの形質転換は、実施例５に示したように実施した。形質転換植物は、続いて実施例６に示した標準的な手順を用いてＧＵＳ活性について分析した。
【００４４】
配列番号１に示した８７６塩基対完全長（ＦＬ）プロモーター、並びにそれぞれ配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６に示した上流欠損プロモーター変異体ＵＤ１、ＵＤ２、ＵＤ３、ＵＤ４及びＵＤ５について、イネ中のプロモーター活性の発現パターンを研究した。配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５に示した下流欠損変異体ＤＤ３、ＤＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６、ＤＤ７及びＤＤ８を同定し、イネ中の細菌のレポーターＧＵＳ遺伝子の発現を分析するのに使用した。手で切った形質転換イネ組織ＧＵＳ活性を図４に示し、青色がプロモーター活性を一般に示している。
【００４５】
配列番号１に示したＦＬプロモーター、それぞれ配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６に示した上流欠損プロモーター断片ＵＤ１、ＵＤ２、ＵＤ３、ＵＤ４及びＵＤ５、並びに配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５に示した下流欠損変異体ＤＤ５、ＤＤ６、ＤＤ７及びＤＤ８を使用してタバコを形質転換し、組織を使用して細菌のレポーターＧＵＳ遺伝子の発現を動かした。形質転換タバコ組織のＧＵＳ活性を分析して様々な組織中での発現を研究した。
【００４６】
イネの場合、ＦＬ（配列番号１）プロモーター断片は、発芽後７日目（ｄｐｇ）に表皮及び根端を除いて苗条及び根の全ての細胞中でレポーター遺伝子活性の強い構成的発現を示した。発現は、組織の老化と共に次第に低減し、３０ｄｐｇで篩部及び維管束鞘のような導管組織で強く持続した。発現は、１００ｄｐｇまでに弱から無視できるほどになった。同様の発現パターンが構築体ＵＤ１、ＵＤ２、ＵＤ３、ＵＤ４、ＵＤ５、ＤＤ３及びＤＤ４で見られた。しかし、その下流欠損型のうちの２つ、ＤＤ７及びＤＤ８では、第２のパターンの発現が観察された。これら２つの構築体では、プロモーター活性は、発現がなかった表皮及び根端を除いて植物の一生を通して構成的であった。別のセットの下流欠損構築体ＤＤ５及びＤＤ６は、第３のパターンの発現を示し、この場合植物のどの発生段階においても視覚的に検出可能なＧＵＳ活性がなかった。イネの若い苗条及び成熟した葉の外植片中のＲＴＢＶプロモーターのＦＬ及びその様々な欠損断片の発現パターンを図４に示す。
【００４７】
イネの場合、花序において、内花穎及び外花穎は、ＦＬ、ＵＤ１、ＵＤ２、ＵＤ３、ＵＤ４、ＵＤ５、ＤＤ３及びＤＤ４に関してＧＵＳ活性を通導組織でしか示さなかったが、ＤＤ７及びＤＤ８では、葉脈間組織でも検出可能であった。これら全ての構築体において、雄しべの花糸及び結合組織は、プロモーター活性を示したが、葯葉及び花粉は示さなかった。雌ずい群では、プロモーター活性が羽毛状の柱頭及び２分の花柱に限られていたが、子房ではなかった。
【００４８】
イネ中の遺伝子組換え体（Ｔ１）の二代目の若葉組織のＧＵＳ活性評価は、ＲＴＢＶプロモーターが、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターと同様に発現の程度においてうまく樹立されたトウモロコシＵｂｉ１に匹敵することを示唆しており、値は１時間当りタンパク質１ｍｇ当り４−ＭＵ（４−メチルウンベリフェロン）〜２５，０００ｎｍｏｌで比較可能であった。
【００４９】
ＲＴＢＶプロモーターもタバコのような非相同系で活性であることが判明したが、ＲＴＢＶプロモーター遺伝子組換えイネとは異なり、ＦＬ、ＵＤ１、ＵＤ２、ＵＤ３、ＵＤ４、ＤＤ５、ＤＤ６、ＤＤ７及びＤＤ８からの発現は、若い組織においても茎、葉及び根中の脈管構造に限られており、成熟ＦＬイネ遺伝子組換え体について正しいパターンであった。ところが、ＤＤ７及びＤＤ８では、子葉だけが構成的にＧＵＳ活性を発現し、この発現はその後植物が成熟するにつれて導管組織に限られた。イネとは異なり、発現は、ＵＤ５ではどの組織にも見られなかった。ＦＬ、ＵＤ又はＤＤでは花の発現特徴に異なる差は観察されず、この発現は、がく片及び花弁中の導管組織に限られていた。構築体のいずれかの雄ずい群又は雌ずい群においてもプロモーター活性は観察されなかった。
【００５０】
遺伝子組換え稲では、フィリピン由来の完全長ＲＴＢＶプロモーターの篩部特異的活性が以前に報告されているが（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ−Ｐａｋｒａｓｉら、１９９３；Ｙｉｎ及びＢｅａｃｈｙ、１９９５；Ｙｉｎら、１９９７）、同定されたプロモーター配列は、本研究（インド、西ベンガル）とは異なる分離株（フィリピン）由来であった。後に、２７８ヌクレオチドの下流プロモーター配列（ｄｐｓ）の封入後、同じＲＴＢＶプロモーターが、ｄｐｓの不在下でこれまでに観察されたものより広い範囲の細胞中で活性を示すことが報告された（Ｋｌｏｔｉら、１９９９）。プロモーター活性は、主に若い組織で検出され、植物が老化するにつれて次第になくなった。
【００５１】
本研究では、３’欠損（ＤＤ７及びＤＤ８）は、稲の一生を通して全ての組織で非相同遺伝子を構成的に発現するプロモーター配列を表している。こうした活性は、ＲＴＢＶプロモーターイネ遺伝子組換え体において以前に報告されていない。これまでに報告された全てのＲＴＢＶプロモーターでは、完全長プロモーターの活性は、植物の老化と共に低減し、より老化が進むと極めて低くなり、導管組織に限られる。それとは対照的に、ここで報告したプロモーター構築体のいくつか（ＤＤ７及びＤＤ８）は、成熟植物でも活性なままであった。ＦＬ、ＵＤ１、ＵＤ２、ＵＤ３、ＵＤ４、ＵＤ５、ＤＤ３及びＤＤ４では、発現パターンがＫｌｏｔｉら（１９９９）によって記載されたものと類似していた。さらに、本発明のプロモーターの組織特異性は、別の形でこれまでに報告されたＲＴＢＶプロモーターとも異なっていた；ＤＤ５及びＤＤ６に相当する２つの構築体は、植物の一生を通して発現を示さなかった。これらの結果は、細胞のトランス作用性因子と併せてプロモーターの強度及び組織特異性を決定するいくつかのポジティブ及びネガティブなエレメントの存在を表す。したがって、ここで説明したプロモーターの活性は、イネの中で、予想可能な組織特異的状態で（ＦＬ、ＵＤ１、ＵＤ２、ＵＤ３、ＵＤ４、ＵＤ５、ＤＤ３及びＤＤ４）又は構成的に（ＤＤ７及びＤＤ８）導入遺伝子を発現するのに極めて有用であろうことが感じられる。しかし、タバコ中での発現は、組織限定的であり、活性は導管組織に限られていた。これらの、特異な発現パターンは、異なるタンパク質が異なる植物系の同じキメラＤＮＡ配列（ＲＴＢＶプロモーター）と相互作用していることを示唆する。発現パターンを表２にまとめて示す。
【実施例】
【００５２】
示した実施例は、本発明中で特許請求している使用、プロセス及び生成物の例示に過ぎず、本発明自体の実施は、記載した実施例に限定しない、又はそれによって限定されない。
【００５３】
（実施例１）
ＤＮＡ抽出及びプロモーターの同定
ウイルス感染物質をＢｉｄｈａｎ  Ｃｈａｎｄｒａ  Ｋｒｉｓｈｉ  Ｖｉｓｗａｖｉｄｙａｌａｙａ、Ｋａｌｙａｎｉ、西ベンガル、インドの試験農場から捕集した。Ｊｏｎｅｓら（１９９１）の方法に基づいて粗製ウイルス製剤を用いてＲＴＢＶ  ＤＮＡを単離した。
【００５４】
次いでウイルスＤＮＡをいくつかの制限酵素で消化して完成させ、標準的な手順を用いてｐＵＣ１９中にクローン化した。入れ子状の欠損とプライマーウォーキングの組合せを利用して、ＢａｍＨＩクローン（Ｎａｔｈら、２００２）である完全長ＲＴＢＶクローンの完全配列を導出した。完全長クローンのＤＮＡ配列をＥＭＢＬ配列データベースに寄託し、次のアクセッション番号：ＡＪ３１４５９６を割り当てられた。
【００５５】
（実施例２）
プロモーター分析
ＲＴＢＶ完全長プロモーターの完全配列（配列番号１）を図１に示し、ＰＣＲによって様々なプロモーター変異体を生成するのに使用したプライマー番号を５’末端（フォワードプライマー）又は３’末端（リバースプライマー）の上に示す。
【００５６】
全てのプライマーの全配列、ＲＴＢＶ（ＦＬ）及びＲＴＢＶ欠損（ＵＤ及びＤＤ）配列もＰａｔｅｎｔ−Ｉｎソフトウェアによって配列表として示している。
【００５７】
完全長（８７６ｂｐ）構築体のために合成したプライマーのセットの配列は以下の通りである：
ＦＰ１（配列番号１６）５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＴＣＡＡＴＧ−３’
ＲＰＩ（配列番号２３）５’−ＡＡＣＴＧＣＡＧＴＣＡＡＴＡＴＴＴＧＡＧＡＡＡＧＴＡＡＧＡＴＣＣＣＴＣ−３’。
【００５８】
３’欠損ＤＤ１（８６２ｂｐ）構築体の場合、フォワードプライマー、ＦＰ１は同じだが、リバースプライマー配列は以下の通りである：
ＲＰ２（配列番号２４）５’−ＡＡＣＴＧＣＡＧＴＡＡＧＡＴＣＣＣＴＣＴＴＣＡＧＡＡＣＡＴＡＴＧＴ−３’。
【００５９】
３’欠損ＤＤ２（７９３ｂｐ）構築体の場合、フォワードプライマー、ＦＰ１は同じだが、リバースプライマー配列は以下の通りである：
ＲＰ３（配列番号２５）５’−ＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＣＡＴＣＧＣＴＣＴＧＡＴＡＣＣＡＧＡＴＧ−３’
【００６０】
３’欠損ＤＤ３（６９１ｂｐ）構築体の場合、フォワードプライマー、ＦＰ１は同じだが、リバースプライマー配列は以下の通りである：
ＲＰ４（配列番号２６）５’−ＡＡＣＴＧＣＡＧＣＧＴＧＡＴＧＡＧＧＡＡＧＡＧＣＴＡＣＴＴＧ−３’
【００６１】
３’欠損ＤＤ４（５８１ｂｐ）構築体の場合、フォワードプライマー、ＦＰ１は同じだが、リバースプライマー配列は以下の通りである：
ＲＰ５（配列番号２７）５’−ＡＡＣＴＧＣＡＧＣＴＴＧＴＴＣＣＣＴＴＧＧＣＡＴＣＡＣ−３’
【００６２】
３’欠損ＤＤ５（４２６ｂｐ）構築体の場合、フォワードプライマー、ＦＰ１は同じだが、リバースプライマー配列は以下の通りである：
ＲＰ６（配列番号２８）５’−ＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＡＴＡＡＧＴＴＣＴＴＧＡＴＧ−３’
【００６３】
３’欠損ＤＤ６（３２５ｂｐ）構築体の場合、フォワードプライマー、ＦＰ１は同じだが、リバースプライマー配列は以下の通りである：
ＲＰ７（配列番号２９）５’−ＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＴＡＡＴＣＣＴＴＣＴＴＴＧＡＡＧＡＧＧ−３’
【００６４】
３’欠損ＤＤ７（２８９ｂｐ）構築体の場合、フォワードプライマー、ＦＰ１は同じだが、リバースプライマー配列は以下の通りである：
ＲＰ８（配列番号３０）５’−ＡＡＣＴＧＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＧＣＴＣＴＴＧＴＧＧＡＡＧ−３’
【００６５】
３’欠損ＤＤ８（２５４ｂｐ）構築体の場合、フォワードプライマー、ＦＰ１は同じだが、リバースプライマー配列は以下の通りである：
ＲＰ９（配列番号３１）５’−ＡＡＣＴＧＣＡＧＣＴＣＴＧＧＧＴＧＴＧＴＧＧＡＴＴＴＣＧ−３’
【００６６】
５’欠損ＵＤ１（８１８ｂｐ）構築体の場合、リバースプライマー、ＲＰ１は同じだが、フォワードプライマー配列は以下の通りである：
ＦＰ２（配列番号１７）５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＣＣＡＡＡＧＡＴＡＡＡＧＧＡＡＣＡＡＡＧ−３’
【００６７】
５’欠損ＵＤ２（７８９ｂｐ）構築体の場合、リバースプライマー、ＲＰ１は同じだが、フォワードプライマー配列は以下の通りである：
ＦＰ３（配列番号１８）５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＡＴＣＡＡＴＡＡＡＡＧＡＡＧＡＣＴＧＡＡＧ−３’
【００６８】
５’欠損ＵＤ３（７５４ｂｐ）構築体の場合、リバースプライマー、ＲＰ１は同じだが、フォワードプライマー配列は以下の通りである：
ＦＰ４（配列番号１９）５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＧＧＡＡＴＣＣＡＣＴＴＴＡＡＡＴＴＡＴＴＧＴＡＣＣＴＣ−３’
【００６９】
５’欠損ＵＤ４（７１８ｂｐ）構築体の場合、リバースプライマー、ＲＰ１は同じだが、フォワードプライマー配列は以下の通りである：
ＦＰ５（配列番号２０）
５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＧＴＡＡＧＡＧＴＧＴＧＴＡＡＡＡＴＣＴＡＧＣＣＴＡＣＣ−３’
【００７０】
５’欠損ＵＤ５（６８１ｂｐ）構築体の場合、リバースプライマー、ＲＰ１は同じだが、フォワードプライマー配列は以下の通りである：
ＦＰ６（配列番号２１）５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＴＡＴＡＡＧＧＡＧＡＡＧＴＡＧＴＣＴＧＣＡＴＧ−３’
【００７１】
５’欠損ＵＤ６（６７１ｂｐ）構築体の場合、リバースプライマー、ＲＰ１は同じだが、フォワードプライマー配列は以下の通りである：
ＦＰ７（配列番号２２）５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＧＧＡＧＡＡＧＴＡＧＴＣＴＧＣＡＴＧＴＡＡＴＡＧＧＣ−３’
【００７２】
全てのプライマー配列において、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩ酵素部位に下線を引いた。
【００７３】
ＲＴＢＶ完全長プロモーターの完全配列を図１に示す。異なるプロモーター変異体を生成するのに使用したプライマー番号を５’末端（フォワードプライマー）又は３’末端（リバースプライマー）の上に示す。クローン化ＲＴＢＶ  ＤＮＡ由来のＤＮＡをテンプレートとして使用して、以下の条件下でＨｉ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ドイツ）を用いてプロモーター断片を増幅した：９４℃で５分間の初期変性、続いて３０秒間の９４℃熱変性、３０秒間の５８℃アニーリング及び１分間の７２℃の伸長を１０サイクル、続いて３０秒間の９４℃熱変性、３０秒間の５８℃アニーリング及び１分間の７２℃の伸長及び１サイクル当りの伸長毎に５秒ずつの増加を２５サイクル、最後に７分間の伸長を行った。ＰＣＲ断片をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）によって精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩを用いて終夜消化し、続いて選択マーカーとしてＧＵＳレポーター遺伝子（カタラーゼイントロンを含む）及びハイグロマイシン耐性を有する、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで消化したプロモーターを持たない植物形質転換ベクター、ｐＣＡＭＢＩＡ１３８１ｚ中にクローン化した。ハイグロマイシン耐性はタバコ中の形質変換体を選択するのに有効に使用できないので、プロモーターを持たないベクター、ｐＣＡＭＢＩＡ１３８１ｚ由来のハイグロマイシン耐性遺伝子を制限酵素ＸｈｏＩで切り出し、ｐＣＡＭＢＩＡ２３００由来のカナマイシン耐性遺伝子を特定しているＸｈｏＩ断片をベクター中に導入した。プロモーターを持たないベクターのＴ−ＤＮＡ領域を図３に示す。
【００７４】
異なる欠損プロモーター断片を溶出し、新しく構築したベクターバックボーンと連結して、選択マーカーとしてカナマイシンを用いてタバコ形質転換用の一連のＲＴＢＶプロモーター欠損構築体を生成した。ＰＣＲ生成ＲＴＢＶプロモーター欠損断片の概略図を図２に示す。
【００７５】
（実施例３）
アグロバクテリウム中へのバイナリーベクター／構築体の形質転換
凍結融解法（Ａｎら１９８８）によってこれらのキメラ植物形質転換ベクターをアグロバクテリウム株ＥＨＡ１０５中に動員した。約１μｇプラスミドＤＮＡをコンピテントアグロバクテリウム細胞と混合し、次いで液体窒素中で凍結し、これに続いて３７℃で５分間のインキュベーションを行った。これらの形質転換細胞にルリアベルターニ（ＬＢ）ブロス１ｍｌを加え、内容物を２８℃で４〜５時間インキュベートした。続いて細菌懸濁液をペレットにし、適切な抗生物質を含むＬＢ寒天プレート上に伸ばした。プレートを２８℃で２日間保持し、標準的なプロトコルによって正しい構築体が存在するかどうか単一コロニーを分析した。
【００７６】
（実施例４）
イネ中での形質転換
２８℃の暗所で１カ月半、カルス誘導培地、ＣＩＭ［２ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）を含み、０．８％寒天によって固めたＮ６Ｂ５培地（Ｃｈｕ、１９７８；Ｇａｍｂｏｒｇら、１９６８）］上で二次培養したイネ品種ＰＢ１からの胚盤由来カルスを、Ｗａｎｇら（１９９７）のプロトコルに基づいてアグロバクテリウム媒介形質転換にかけた。イネカルスを、最終細胞密度２×１０８細胞／ｍｌの、１００μＭアセトシリンゴン及び２ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄを含む液体Ｎ６Ｂ５培地のアグロバクテリウム細胞懸濁液に２０分間感染させた。次いでカルスを、２８℃の暗所で２日半、共培養培地（１００μＭアセトシリンゴンを含むＣＩＭ）に置いた。静菌薬、オーグメンチンを１５０ｍｇ／ｌで用いて洗浄し、カルスを暗所で１〜１カ月半、選択培地（３０ｍｇ／ｌハイグロマイシン及び１５０ｍｇ／ｌオーグメンチンを含むＣＩＭ）上に置いた。クリーム色の推定上形質転換したカルスをさらに５〜６日間選択プレート上に置いたままにしてから、再生前培地（０．５ｍｇ／ｌベンジルアミノプリン［ＢＡＰ］、１０μＭアブシジン酸、３０ｍｇ／ｌハイグロマイシン及び１５０ｍｇ／ｌオーグメンチンを含むＮ６Ｂ５培地）に１週間移し、インキュベーションは暗所で３日間及び明所で４日間であった。次いで小植物が現れ始めるまでカルスを再生培地（１ｍｇ／ｌ  ＢＡＰ、３０ｍｇ／ｌハイグロマイシン及び１５０ｍｇ／ｌオーグメンチンを含むＮ６Ｂ５培地）に移した。続いてこれらを、再生培地を含む培養試験管に移した。よく発達した根系（硬化）を確実にするために、推定上の遺伝子組換え体を液体ＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｃｏｏｇ、１９６２）培地に移し、ｓｏｉｌｒｉｔｅと土を１：１の割合で含む鉢に最終的に植え、成熟するまで温室に移動した。
【００７７】
（実施例５）
タバコ中での形質転換
リーフディスク法をタバコ形質転換用に使用した（Ｓａｖｄａ及びＢｉｎｎｓ、２０００）。大きさ約１ｃｍ２のリーフディスクを、無菌条件下でジャム瓶中のＭＳ培地上で育てた３〜４週齢のタバコの上部２〜３葉から切り取り、アグロバクテリウム媒介形質転換用の外植片として使用した。これらのリーフディスクを、液体ＭＳ培地中のＯＤ６００約０．６でプロモーター構築体を含むアグロバクテリウム細菌懸濁液中で２０分間共培養した。続いてリーフディスクを無菌の３ＭＭ  Ｗｈａｔｍａｎシートピース上にブロットし、散光中２８℃で２日半、０．１ｍｇ／ｌナフタレン酢酸（ＮＡＡ）及び１ｍｇ／ｌ  ＢＡＰを含む０．８％寒天上に固めたＭＳ培地上に置いた。５００ｍｇ／ｌの静菌薬、セフォタキシム（ｃｅｐｈｏｔａｘｉｍｅ）でリーフディスクを徹底的に洗浄し、ディスクを明所で１カ月半、選択培地（０．１ｍｇ／ｌ  ＮＡＡ及び１ｍｇ／ｌ  ＢＡＰ、５００ｍｇ／ｌ  セフォタキシム及び５０ｍｇ／ｌカナマイシンを含む０．８％寒天で固めたＭＳ培地）上に置いた。推定上の遺伝子組換え苗条芽を切除し、発根のために５０ｍｇ／ｌカナマイシンを含む０．８％寒天で固めたＭＳ培地上に置いた。発根した植物を切除し、少なくとも１節を有する茎の切片をさらに発根培地上で２回目の選択にかけた。次いで再度発根した植物を、成熟するまで温室中の鉢に移した。
【００７８】
（実施例６）
形質転換体の分析
遺伝子又はプロモーター特異的プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、Ｔ−ＤＮＡ領域が存在するかどうか推定上の遺伝子導入植物をチェックした。次いでＤｅｌｌａｐｏｒｔａら（１９８３）のプロトコルを用いてゲノムＤＮＡを単離した。異なる組織中のレポーター遺伝子の活性を検出するために、手で切った葉身／根の切片をＸ−Ｇｌｕｃ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−グルクロニド）溶液中３７℃で終夜染色し、続いてクロロフィルが完全に除去されるまで１：３のアセトン：エタノール中で脱染し、複式顕微鏡下で撮影した（図４）。ＧＵＳ蛍光光度分析には、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ（１９８７）によって記載されているように葉組織約１００ｍｇを使用した。
【００７９】
本発明の利点
１．単子葉植物と双子葉植物の両方で活性なプロモーターの同定
２．イネ中での構成的発現に関して強いプロモーターの同定
３．組織特異的発現を示しているプロモーターの同定
４．同じプロモーターが２つの異なる遺伝子を動かしている場合に遺伝子サイレンシングを妨げるために遺伝子ピラミィディングを達成すべき場合の遺伝子の発現を動かすためのプロモーターの同定
【００８０】
引用文献
出典
米国特許文献
【表１】
2008511307.tif 000002
【００８１】
他の参考文献
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４．  Ｃｏｒｎｅｊｏ，Ｍ．Ｊ．，Ｌｕｔｈ、Ｄ．，Ｂｌａｎｋｅｎｓｈｉｐ，Ｋ．Ｍ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｏ．Ｄ．及びＢｌｅｃｈｌ，Ａ．Ｅ．（１９９３）．「遺伝子組換えイネ中のトウモロコシユビキチンプロモーターの活性（Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｍａｉｚｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｒｉｃｅ）」．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：  ５６７〜５８１．
５．  Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａ，Ｓ．Ｌ．，Ｗｏｏｄ，Ｊ．及びＨｉｃｋｓ，Ｊ．Ｂ．（１９８３）．「植物ＤＮＡミニプレパレーション（Ａ  ｐｌａｎｔ  ＤＮＡ  ｍｉｎｉｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）」，Ｖｅｒ．ＩＩ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ１  １９〜２１．
６．  Ｇａｍｂｏｒｇ，Ｏ．Ｌ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｒ．Ａ．，及びＯｊｉｍａ，Ｋ．（１９６８）．「ダイズ根細胞の懸濁培養の栄養素要求量（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｓｏｙｂｅａｎ  ｒｏｏｔ  ｃｅｌｌｓ）」．Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ５０，１５１〜１５８．
７．  Ｇｏｔｏ，Ｆ．，Ｙｏｓｈｉｈａｒａ，Ｔ．，Ｓｈｉｇｅｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｔｏｋｉ，Ｓ．及びＴａｋａｉｗａ，Ｆ．（１９９９）．「ダイズフェリチン遺伝子によるイネ種子の鉄添加（Ｉｒｏｎ  ｆｏｒｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｏｙｂｅａｎ  ｆｅｒｒｉｔｉｎ  ｇｅｎｅ）」．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：２８２〜２８６．
８．  Ｊａｎｇ，Ｉ．Ｃ．，Ｃｈｏｉ，Ｗ．Ｂ．，Ｌｅｅ、Ｋ．Ｈ．，Ｓｏｎｇ，Ｓ．Ｉ．，Ｎａｈｍ，Ｂ．Ｈ．及びＫｉｍ，Ｊ．Ｋ．（２００２）．「遺伝子導入植物中のイネシトクロムｃ遺伝子ＯｓＣｃ１の高レベル及び遍在発現並びにそのプロモーター活性は、単子葉植物の遺伝子導入に有用なプロモーターを提供する（Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ａｎｄ  ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｉｃｅ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｇｅｎｅ  ＯｓＣｃ１  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ａ  ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｏｔｓ）」．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２９：  １４７３〜１４８１．
９．  Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．（１９８７）．「植物中のキメラ遺伝子の分析：ＧＵＳ遺伝子融合システム（Ａｓｓａｙｉｎｇ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ：  Ｔｈｅ  ＧＵＳ  ｇｅｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）」．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｒｅｐ．５：  ３８７〜４０５．
１０．  Ｊｏｎｅｓ，Ｍ．Ｃ．，Ｇｏｕｇｈ、Ｋ．，Ｄａｓｇｕｐｔａ，Ｉ．、Ｓｕｂｂａ  Ｒａｏ，Ｓ．Ｌ．，Ｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．，Ｑｕ，Ｒ．，Ｓｈｅｎ，Ｐ．，Ｋａｎｉｅｗｓｋａ，Ｍ．，Ｂｌａｋｅｂｒｏｕｇｈ，Ｍ．，Ｄａｖｉｅｓ，Ｊ．Ｗ．，Ｂｅａｃｈｙ，Ｒ．Ｎ．及びＨｕｌｌ，Ｒ．（１９９１）．「イネツングロ疾患はＲＮＡ及びＤＮＡウイルスが原因である（Ｒｉｃｅ  ｔｕｎｇｒｏ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ａ  ＤＮＡ  ｖｉｒｕｓ）」．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：７５７〜７６１．
１１．  Ｋｌｏｔｉ，Ａ．，Ｈｅｎｒｉｃｈ，Ｃ．，Ｂｉｅｒｉ，Ｓ．，Ｈｅ，Ｘ．，Ｃｈｅｎ，Ｇ．，Ｂｕｒｋｈａｒｄｔ，Ｐ．Ｋ．，Ｗｉｎｎ、Ｊ．，Ｌｕｃｃａ，Ｐ．，Ｈａｈｎ，Ｔ．，Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ．及びＦｕｔｔｅｒｅｒ，Ｊ．（１９９９）．「上流及び下流配列エレメントは、イネツングロ杆菌状ウイルスプロモーターの特異性を決定し、転写開始後のＲＮＡ生成に影響を及ぼす（Ｕｐｓｔｒｅａｍ  ａｎｄ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｉｃｅ  ｔｕｎｇｒｏ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｎｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ＲＮＡ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）」．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０：  ２４９〜２６６．
１２．  Ｋｙｏｚｕｋａ，Ｊ．，Ｆｕｊｍｏｔｏ，Ｈ．，Ｉｚａｗａ，Ｔ．及びＳｈｉｍａｍａｔｏ，Ｋ．（１９９１）．「遺伝子組換え稲及びそれらの子孫中のトウモロコシＡｄｈ１プロモーターの嫌気導入並びに組織特異的発現（Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｉｚｅ  Ａｄｈ１  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｒｉｃｅ  ｐｌａｎｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｐｒｏｇｅｎｙ）」．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２８：  ４０〜４８．
１３．  Ｋｙｏｚｕｋａ，Ｊ．，ＭｃＥｌｒｏｙ，Ｄ．，Ｈａｙａｋａｗａ，Ｔ．，Ｘｉｅ  Ｙ．，Ｗｕ，Ｒ．及びＳｈｉｍａｍａｔｏ，Ｋ．（１９９３）．「遺伝子組換えイネ中のトマトｒｂｃＳ−ｇｕｓＡ及びイネｒｂｃＳ−ｇｕｓＡ融合遺伝子の光制御及び細胞特異的発現（Ｌｉｇｈｔ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｍａｔｏ  ｒｂｃＳ−ｇｕｓＡ  ａｎｄ  ｒｉｃｅ  ｒｂｃＳ−ｇｕｓＡ  ｆｕｓｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｒｉｃｅ）」．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：  ９９１〜１０００．
１４．  Ｍａｔｓｕｏｋａ，Ｍ．，Ｋｙｏｚｕｋａ，Ｊ．，Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，Ｋ．及びＫａｎｏ−Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｙ．（１９９４）．「Ｃ３植物（イネ）中のＣ４植物（トウモロコシ）直接的細胞特異的、光制御発現の２つのカルボキシラーゼのプロモーター（Ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｓ  ｉｎ  ａ  Ｃ４  ｐｌａｎｔ  （ｍａｉｚｅ）  ｄｉｒｅｃｔ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｌｉｇｈｔ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｃ３  ｐｌａｎｔ  （ｒｉｃｅ））」．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６（３）：  ３１１〜３１９．
１５．  ＭｃＥｌｒｏｙ，Ｄ．，Ｂｌｏｗｅｒｓ，Ａ．Ｄ．，Ｊｅｎｅｓ，Ｂ．及びＷｕ，Ｒ．（１９９１）．「単子葉植物形質転換に使用するイネアクチン１（Ａｃｔ１）５’領域に基づく発現ベクターの構築（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｉｃｅ  ａｃｔｉｎ１  （Ａｃｔ１）  ５’  ｒｅｇｉｏｎ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｍｏｎｏｃｏｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３１：  １５０〜１６０．
１６．  Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｔ．及びＳｃｏｏｇ，Ｆ．（１９６２）．「迅速発育のために変更した培地及びタバコ組織培養によるバイオアッセイ（Ａ  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｂｉｏ  ａｓｓａｙｓ  ｗｉｔｈ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ）」．Ｐｌａｎｔａ  １５７，３８５〜３９１．
１７．  Ｎａｔｈ，Ｎ．，Ｍａｔｈｕｒ，Ｓ．及びＤａｓｇｕｐｔａ，Ｉ．（２００２）．「インドからの２つの完全イネツングロ杆菌状ウイルス配列の分子分析（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｒｉｃｅ  ｔｕｎｇｒｏ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍ  ｖｉｒｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｉｎｄｉａ）」．Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４７：  １１７３〜１１８７．
１８．  Ｓａｖｄａ，Ｍ．及びＢｉｎｎｓ，Ａ．Ｎ．（２０００）．「遺伝子導入法における植物へのＤＮＡの導入（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」ｐｇ．１５９〜１９２，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｎｏｒｔｏｎ，Ｐ．Ａ．及びＳｔｅｅｌ，Ｌ．Ｆ．Ｅａｔｏｎ  ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ，ＵＳＡ．
１９．  Ｔｅｒａｄａ，Ｒ．及びＳｈｉｍａｍａｔｏ，Ｋ．（１９９０）．「遺伝子組換え稲中のＣａＭＶ  ３５Ｓ−ＧＵＳ遺伝子の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣａＭＶ  ３５Ｓ−ＧＵＳ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｒｉｃｅ  ｐｌａｎｔｓ）」．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２０：  ３８９〜３９２．
２０．  Ｔｏｋｉ，Ｓ．，Ｔａｋａｍａｔｓｕ，Ｓ．，Ｎｏｊｉｒｉ，Ｃ．，Ｏｏｂａ，Ｓ．，Ａｎｚａｉ，Ｈ．，Ｉｗａｔａ，Ｍ．，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ａ．Ｈ．，Ｑｕａｉｌ，Ｐ．Ｈ．及びＵｃｈｉｍｉｙａ，Ｈ．（１９９２）．「遺伝子組換え稲中のトウモロコシユビキチン遺伝子プロモーター−ｂａｒキメラ遺伝子の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｉｚｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｂａｒ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｒｉｃｅ  ｐｌａｎｔｓ）」．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００：  １５０３〜１５０７．
２１．  Ｗａｎｇ，Ｍ．Ｂ．，Ｕｐａｄｈｙａｙａ，Ｎ．Ｍ．，Ｂｒｅｔｔｅｌｌ，Ｒ．Ｉ．Ｓ．及びＷａｔｅｒｈｏｕｓｅ，Ｐ．Ｍ．（１９９７）．「アグロバクテリウム  ツメファシエンスを用いた植物形質転換用の選択マーカー遺伝子のイントロン媒介改良（Ｉｎｔｒｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｐｌａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）」．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．Ｂｒｅｅｄ．５１：  ３２５〜３３４．
２２．  Ｗｉｌｍｉｎｋ、Ａ．，ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｅｎ，Ｂ．Ｃ．及びＤｏｎｓ，Ｊ．Ｊ．（１９９５）．「ユリ科由来の様々な種における構成的プロモーターの活性（Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｉｎ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）」．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８：  ９４９〜９５５．
２３．  Ｘｕ，Ｄ．，ＭｃＥｌｒｏｙ，Ｄ．，Ｔｈｏｒｎｂｕｒｇ，Ｒ．Ｗ．及びＷｕ，Ｒ．（１９９３）．「損傷、ジャスモン酸メチル、及びアブシジン酸によるジャガイモｐｉｎ２プロモーターの遺伝子組換え稲中への体系的誘導（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｏｔａｔｏ  ｐｉｎ２  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｂｙ  ｗｏｕｎｄｉｎｇ，ｍｅｔｈｙｌ  ｊａｓｍｏｎａｔｅ，ａｎｄ  ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｒｉｃｅ  ｐｌａｎｔｓ）」．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：  ５７３〜５８８．
２４．  Ｙｅ，Ｘ．，Ａｌ−Ｂａｂｉｉｉ，Ｓ．，Ｋｌｏｔｉ，Ａ．，Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，Ｌｕｃｃａ，Ｐ．，Ｂｅｙｅｒ，Ｐ．及びＰｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ．（２０００）．「（カロテノイドを含まない）イネ内乳中へのプロビタミンＡ（β−カロチン）生合成経路のエンジニアリング（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｏｖｉｔａｍｉｎ  Ａ  （ｂｅｔａ−ｃａｒｏｔｅｎｅ）  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎｔｏ  （ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ−ｆｒｅｅ）  ｒｉｃｅ  ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ）」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：  ３０３〜３０５．２１．
２５．  Ｙｉｎ，Ｙ．及びＢｅａｃｈｙ，Ｒ．Ｎ．（１９９５）．「イネ中のイネツングロ杆菌状ウイルスプロモーターの調節領域及び相互作用する核因子（Ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｉｃｅ  ｔｕｎｇｒｏ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｒｉｃｅ  （Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．））」．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．７（６）：  ９６９〜９８０．
２６．  Ｙｉｎ，Ｙ．，Ｃｈｅｎ，Ｌ．及びＢｅａｃｈｙ，Ｒ．Ｎ．（１９９７）．「イネ中のＲＴＢＶプロモーター由来の篩部特異的遺伝子発現に必要とされるプロモーターエレメント（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｐｈｌｏｅｍ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＲＴＢＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｉｎ  ｒｉｃｅ）」．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１２（５）：  １１７９〜１１８８．
【００８２】
【表２】
2008511307.tif 000003
表１
【００８３】
【表３】
2008511307.tif 000004
表２
【００８４】
イネ及びタバコ遺伝子組換え体中のＲＴＢＶプロモーター構築体について栄養組織中で観察された発現パターンである。
イネにおけるＦＬタイプ：若齢期には構成的発現を示し、成熟期では導管特異的である。
タバコにおけるＦＬタイプ：導管特異的発現だけを示す。
タバコにおけるＦＬタイプ＋：子葉だけが構成的発現を示すが、栄養組織の残りは導管特異的発現を示す。
「−」：特異的構築体によって形質転換しなかった植物を示す。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】ＰＣＲ増幅のために使用したフォワードプライマー（ＦＰ）又はリバースプライマー（ＲＰ）の位置を示した配列番号１の完全長ＲＴＢＶプロモーター配列を示す図である。
【図２】ＰＣＲ生成ＲＴＢＶプロモーター欠損断片の概略図である。
【図３】プロモーターを持たないベクター、ｐＣＡＭＢＩＡ１３８１ｚのＴ−ＤＮＡ領域の概略図である。
【図４】様々な構築体によるＧＵＳ活性を示した遺伝子組換えイネ組織の切片を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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