(57)【要約】【課題】単一の反応槽において処理される生体試料中に存在する、標的の核酸の標識及び精製方法の提供。【解決手段】本発明は、処理される生体試料中に存在する標的の核酸の標識及び精製方法であって、以下：・単一の反応槽の使用、・生体試料、核酸用の少なくとも１つの標識試薬、上記核酸を吸着できる少なくとも１つの固体支持体、並びに、核酸の標識及び／又は支持体上への上記核酸の固定に必要な任意の成分の、反応槽中への導入、・反応槽内容物のインキュベート、並びに、・上記で標識された核酸の分離：を含むことを特徴とする方法に関する。本発明は、診断分野で使用されることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
処理される生体試料中に存在する標的の核酸の標識及び精製方法であって、
以下：
・単一の反応槽の使用、
・以下；
−  生体試料、
−  核酸用の少なくとも１つの標識試薬（この標識試薬は、加熱に対して安定であり、かつ、式（０）のものであり：
【化１】
2008507263.tif 000034
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、
・Ｒ３及びＲ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示し、
・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは０から２まで、好ましくは０又は１の整数であり、かつ、
・−Ｙ−Ｘ−は、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＨ２Ｏ−又は−ＣＨ２Ｓ−を表す））、
−  前記核酸を吸着できる少なくとも１つの固体支持体、
−  核酸の標識及び／又は支持体上への前記核酸の固定に必要な任意の成分；の反応槽中への導入、
・反応槽内容物のインキュベート、並びに、
・前記で標識された核酸の分離：を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
処理された核酸が、一本鎖及び／又は二本鎖からなる、合成及び／又は天然のＤＮＡ及び／又はＲＮＡからなる
ことを特徴とする請求項１に記載の標識及び精製方法。
【請求項３】
前記標識試薬の導入によって、以下：
−  核酸の非特異的な断片化による、多数の核酸断片の生成、及び、
−  これら多数の断片の、断片化中に遊離した、３’及び／又は５’末端に位置する末端リン酸塩の標識：が可能になる
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の標識及び精製方法。
【請求項４】
核酸断片の３’又は５’末端の標識は、リボースの２’位、３’位又は環状２’−３’−モノリン酸塩位に位置するリン酸塩の標識により生成した反応性基の付着によって実施される
ことを特徴とする請求項３に記載の標識及び精製方法。
【請求項５】
核酸断片の３’又は５’末端の断片化及び／又は標識は、リボースの２’位、３’位又は環状２’−３’−モノリン酸塩位に位置するリン酸塩の標識により生成した求核基、求電子性基又はハロゲン基の付着によって実施される
ことを特徴とする請求項３に記載の標識及び精製方法。
【請求項６】
核酸の断片化は以下：
−  酵素的手段（ヌクレアーゼ）、
−  化学的手段（Ｍｇ＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｃｕ＋＋、Ｃｏ＋＋及び／又はＺｎ＋＋イオン等の金属陽イオンを、単独で、又は、例えばＮ−メチルイミダゾール等の化学的触媒、若しくは、ＲＮＡ親和性がありかつイミダゾール核若しくは置換類似体を有する任意の化学分子と併用して）、又は、
−  物理的手段（超音波処理又は放射線による）：によって実施される
ことを特徴とする請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ＲＮＡ断片の３’又は５’末端の標識は、リボースの２’位、３’位又は環状２’−３’−モノリン酸塩位に結合するリン酸結合への分子Ｒ−Ｘの付着によって実施され、Ｒは標識からなり、Ｘは標識とＲＮＡの結合剤であり、例えば水酸基、アミン基、ヒドラジン基、アルコキシアミン基、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化フェニルメチル基、ヨウ化アセトアミド基又はマレイミド基等である
ことを特徴とする請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
リン酸基の標識は、５−（ブロモメチル）フルオレセインを用いて実施される
ことを特徴とする請求項３〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
標識試薬と核酸とを均質溶液中で本質的に水性のバッファー中で接触させ、前記標識試薬は加熱に対して安定であり、かつ、式（０）のものである
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の標識及び精製方法。
【請求項１０】
前記標識試薬は式（１）のものである：
【化２】
2008507263.tif 000035
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、
・Ｒ３及びＲ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示し、かつ、
・−Ｙ−Ｘ−は、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＨ２Ｏ−又は−ＣＨ２Ｓ−を表す。）：
ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記試薬は式（２）のものである：
【化３】
2008507263.tif 000036
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、かつ、
・Ｒ３及びＲ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示す。）：
ことを特徴とする請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記試薬は式（３）のものである：
【化４】
2008507263.tif 000037
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、かつ、
・Ｒ３及びＲ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示す。）：
ことを特徴とする請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記試薬は式（４）のものである：
【化５】
2008507263.tif 000038
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、かつ、
・Ｒ３及びＲ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示す。）：
ことを特徴とする請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記試薬は式（２１）のものである：
【化６】
2008507263.tif 000039
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、
・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは１であり、かつ、
・Ｒ３及びＲ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示す。）：
ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記試薬は式（２２）のものである：
【化７】
2008507263.tif 000040
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、
・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは１であり、かつ、
・Ｒ３及びＲ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示す。）：
ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記試薬は式（２３）のものである：
【化８】
2008507263.tif 000041
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、
・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは１であり、かつ、
・Ｒ３及びＲ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示す。）：
ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
使用される前記標識試薬は、Ｒ３及びＲ４（これらは、独立していて以下；Ｈ、ＮＯ２、ＯＣＨ３、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）４−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２；を示す）を含む
ことを特徴とする請求項９〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記試薬は式（７）のものである：
【化９】
2008507263.tif 000042
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、かつ、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数である。）：
ことを特徴とする請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記試薬は式（２４）のものである：
【化１０】
2008507263.tif 000043
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、かつ、
・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは１である。）：
ことを特徴とする請求項９〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記試薬の構造Ｒ２−（Ｌ）ｎ−は式（５）のものである：
【化１１】
2008507263.tif 000044
（式中、
・Ｒ２は検出用標識を表し、
・ｍは１〜１００の整数であり、かつ、
・ｐは１〜１０の整数である。）：
ことを特徴とする請求項９〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
処理される生体試料中に存在する標的の核酸の標識及び精製方法であって、
以下：
・単一の反応槽の使用、
・以下；
−  生体試料、
−  核酸用の少なくとも１つの標識試薬（この標識試薬は、均質溶液中で本質的に水性のバッファー中で核酸と接触していて、加熱に対して安定であり、かつ、式（６）のものであり：
【化１２】
2008507263.tif 000045
（式中、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｒ３は、Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）を示し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、かつ、
・−Ｙ−Ｘ−は、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＨ２Ｏ−又は−ＣＨ２Ｓ−を表す。）  ）、
−  前記核酸を吸着できる少なくとも１つの固体支持体、
−  核酸の標識及び／又は支持体上への前記核酸の固定に必要な任意の成分；の反応槽中への導入、
・反応槽内容物のインキュベート、並びに、
・前記で標識された核酸の分離：を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項２２】
処理される生体試料中に存在する標的の核酸の標識及び精製方法であって、
以下：  
・単一の反応槽の使用、
・以下；
−  生体試料、
−  核酸用の少なくとも１つの標識試薬（この標識試薬は、均質溶液中で本質的に水性のバッファー中で核酸と接触していて、加熱に対して安定であり、かつ、式（２５）のものであり：
【化１３】
2008507263.tif 000046
（式中、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｒ３は、Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）を示し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、
・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは１であり、かつ、
・−Ｙ−Ｘ−は、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＨ２Ｏ−又は−ＣＨ２Ｓ−を表す。））、
−  前記核酸を吸着できる少なくとも１つの固体支持体、
−  核酸の標識及び／又は支持体上への前記核酸の固定に必要な任意の成分；の反応槽中への導入、
・反応槽内容物のインキュベート、並びに、
・前記で標識された核酸の分離：を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項２３】
前記試薬は式（１４）のものである：
【化１４】
2008507263.tif 000047
（式中、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、かつ、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数である。）：
ことを特徴とする請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記試薬は式（２６）のものである：
【化１５】
2008507263.tif 000048
（式中、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは１であり、かつ、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数である。）：
ことを特徴とする請求項９〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記試薬は式（１５）のものである：
【化１６】
2008507263.tif 000049
（式中、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、かつ、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数である。）：
ことを特徴とする請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記試薬は式（２７）のものである：
【化１７】
2008507263.tif 000050
（式中、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは１であり、かつ、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数である。）：
ことを特徴とする請求項９〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記試薬の構成成分Ｌは、−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）−部位を、１〜２０回、好ましくは１〜１０回、さらに好ましくは２〜５回繰り返して含む
ことを特徴とする請求項９〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
処理される生体試料中に存在する標的の核酸の標識及び精製方法であって、
以下：
・単一の反応槽の使用、
・以下；
−  生体試料、
−  核酸用の少なくとも１つの標識試薬（この標識試薬は、一本鎖又は二本鎖の核酸の標識及び断片化を、以下の工程： 
＊  核酸の断片化、
＊  式（１９）の化合物から選択される標識試薬による、少なくとも１つの断片への標識の付着：
【化１８】
2008507263.tif 000051
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｚは検出用標識を含む）：によって実施し得、
（前記試薬は共有結合で、主として前記断片の少なくとも１つのリン酸塩に結合している）、
−  前記核酸を吸着できる少なくとも１つの固体支持体、
−  核酸の標識及び／又は支持体上への前記核酸の固定に必要な任意の成分；の反応槽中への導入、
・反応槽内容物のインキュベート、並びに、
・前記で標識された核酸の分離：を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項２９】
前記標識試薬は式（２０）の化合物から選択される：
【化１９】
2008507263.tif 000052
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識であり、
・Ｌは、少なくとも２個の共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１であり、かつ
・Ｚは以下； 
【化２０】
2008507263.tif 000053
（式中、
・Ｒ３及びＲ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示し、かつ、
・−Ｙ−Ｘ−は、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＨ２Ｏ−又は−ＣＨ２Ｓ−を表す））：
ことを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
Ｚは：
【化２１】
2008507263.tif 000054
：である
ことを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
断片化及び標識は２工程で実施される
ことを特徴とする請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
断片化及び標識は１工程で実施される
ことを特徴とする請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
標識は本質的に水性の均質溶液中で実施される
ことを特徴とする請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
断片化は酵素的、物理的又は化学的手段によって実施される
ことを特徴とする請求項２８〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
処理される生体試料中に存在する標的の核酸の標識及び精製方法であって、
以下：
・単一の反応槽の使用、
・以下；
−  生体試料、
−  核酸用の少なくとも１つの標識試薬（この標識試薬は、均質溶液中で本質的に水性のバッファー中で核酸と接触していて、加熱に対して安定であり、かつ、式（８）のものであり：
【化２２】
2008507263.tif 000055
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、
・Ｒ３及びＲ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＯＲ、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）４−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２（Ｒ＝アリール基又はアルキル基）；を示し、
・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは０から２まで、好ましくは０又は１の整数であり、
・−Ｙ−Ｘ−は、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＨ２Ｏ−又は−ＣＨ２Ｓ−を表し、
・−Ｚ−は、−ＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−又は−Ｏ−を表し、
・ｍは１〜１０、好ましくは１〜３の整数であり、かつ、
・ｐは１〜１０、好ましくは１〜３の整数である。））、
−  前記核酸を吸着できる少なくとも１つの固体支持体、
−  核酸の標識及び／又は支持体上への前記核酸の固定に必要な任意の成分；の反応槽中への導入、
・反応槽内容物のインキュベート、並びに、
・前記で標識された核酸の分離：を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項３６】
前記試薬は式（９）のものである：
【化２３】
2008507263.tif 000056
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、
・Ｒ３及びＲ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＯＲ、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）４−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示し、
・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは０から２まで、好ましくは０又は１の整数であり、
・−Ｙ−Ｘ−は、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＨ２Ｏ−又は−ＣＨ２Ｓ−を表し、
・ｍは１〜１０、好ましくは１〜３の整数であり、かつ、
・ｐは１〜１０、好ましくは１〜３の整数である。）：
ことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記試薬の式中、ｐはｍより小さい、又は、ｍと同じである
ことを特徴とする請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記試薬は式（１０）のものである：
【化２４】
2008507263.tif 000057
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、
・Ｒ３及びＲ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＯＲ、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２ＣＨ２）３−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）４−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示し、かつ、
・ｑは１〜１０、好ましくは１〜３の整数である。）：
ことを特徴とする請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記試薬は式（１１）のものである：
【化２５】
2008507263.tif 000058
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ基、アルキル基、アリール基、又は、置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、かつ、
・Ｒ３及びＲ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＯＲ、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）４−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）を示す。）：
ことを特徴とする請求項３５〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
Ｒ２は式（１２）：
【化２６】
2008507263.tif 000059
：のＤ−ビオチン残基を含む
ことを特徴とする請求項３５〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
Ｒ１はＣＨ３を含み、Ｒ３及びＲ４はそれぞれＨを表す
ことを特徴とする請求項３５〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記試薬の構造−（Ｌ）ｎ−は以下：
・スペルミン若しくはＮ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）−１，４−ジアミノブタン；ＮＨ２−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２、又は、
・スペルミジン若しくはＮ−（３−アミノプロピル）−１，４−ブタンジアミン；Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）４−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２、又は、
・アラニン部位を含む誘導体；ＮＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ：を含む
ことを特徴とする請求項３５〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
処理される生体試料中に存在する標的の核酸の標識及び精製方法であって、
以下：
・単一の反応槽の使用、
・以下；
−  生体試料、
−  核酸用の少なくとも１つの標識試薬（加熱に対して安定な前記標識試薬は、水性バッファー中で均質溶液中で接触していてよく、かつ、式（１３）のものである：
【化２７】
2008507263.tif 000060
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、
・Ｒ３及びＲ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＯＲ、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）４−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示し、
・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは０から２まで、好ましくは０又は１の整数であり、
・−Ｙ−Ｘ−は、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＨ２Ｏ−又は−ＣＨ２Ｓ−を表し、
・−Ｚ−は、−ＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−又は−Ｏ−を表し、
・ｍは１〜１０、好ましくは１〜３の整数であり、かつ、
・ｐは１〜１０、好ましくは１〜３の整数である。））、
−  前記核酸を吸着できる少なくとも１つの固体支持体、
−  核酸の標識及び／又は支持体上への前記核酸の固定に必要な任意の成分；の反応槽中への導入、
・反応槽内容物のインキュベート、並びに、
・前記で標識された核酸の分離：を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項４４】
前記試薬は式（１６）のものである：
【化２８】
2008507263.tif 000061
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ基、アルキル基、アリール基、又は、置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、
・Ｒ３及びＲ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＯＲ、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）４−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示し、
・−Ｙ−Ｘ−は、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＨ２Ｏ−又は−ＣＨ２Ｓ−を表し、
・−Ｚ−は、−ＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−又は−Ｏ−を表し、
・ｍは１〜１０、好ましくは１〜３の整数であり、かつ、
・ｐは１〜１０、好ましくは１〜３の整数である。）：
ことを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記試薬の構成成分Ｌは、−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）−部位を、１〜２０回、好ましくは１〜１０回、さらに好ましくは２〜５回繰り返して含み、従って−Ｚ−は−ＮＨ−、−ＮＨＣＯ−又は−ＣＯＮＨ−で表される
ことを特徴とする請求項３５〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記固体支持体はシリカ粒子からなる
ことを特徴とする請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記固体支持体はシリカで覆われた磁性粒子からなる
ことを特徴とする請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
固体支持体を有するシリカ粒子は、粒子径が０．１〜５００μｍ、好ましくは１〜２００μｍである
ことを特徴とする請求項４６又は４７に記載の方法。
【請求項４９】
標識を可能にする添加成分のうちの１つは、アルコール、好ましくはイソプロパノールからなる
ことを特徴とする請求項１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
イソプロパノールは最終混合物の７０％（ｖ／ｖ）含まれる
ことを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
細胞遊離を可能にすることによって固体支持体上への核酸の吸着を可能にする添加成分の１つは、カオトロピック薬剤からなる
ことを特徴とする請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
使用される前記カオトロピック薬剤は、グアニジウム塩、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、（イソ）チオシアン酸ナトリウム、尿素、又は、これらの誘導体の混合物である
ことを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
使用されるグアニジウム塩は、（イソ）チオシアン酸グアニジウムである
ことを特徴とする請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
固体相−核酸複合体は、堆積させて上清を除去した後、カオトロピック物質を含む洗浄バッファーで複合体を洗浄することによって、液体から分けられる
ことを特徴とする請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
固体相−核酸複合体は、洗浄バッファーで洗浄した後、１種又は数種の有機溶媒で再び洗浄し、その後乾燥させる
ことを特徴とする請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
固体相−核酸複合体中に存在する核酸は、複合体を洗浄及び乾燥させた後で、溶出バッファーを使用して溶出する
ことを特徴とする請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
こうして得られた固体相−核酸複合体は、核酸を増幅するための成分を含む混合物を前記固体相に付着させて、あるいは、そこから溶出して、この混合物と接触させる
ことを特徴とする請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
インキュベート工程は、処理サンプルを５〜４５分間、好ましくは１５〜３５分間、さらに好ましくは２５分間、温度４５〜８５℃、好ましくは５５〜７５℃、さらに好ましくは６５℃で維持することを含む
ことを特徴とする請求項１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
インキュベート工程の後、前記サンプルは、少なくとも数分間、好ましくは５分間で室温に戻す
ことを特徴とする請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
処理された核酸が、一本鎖及び／又は二本鎖からなる、合成及び／又は天然のＤＮＡ及び／又はＲＮＡからなる
ことを特徴とする請求項２１、２２、２８、３５又は４３に記載の標識及び精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つの固体支持体の存在下で核酸を標識する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術によれば、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、又は、核酸の標識方法が数多く示されている。ある方法は、塩基が天然のものであるか修飾されたものであるかに関わらず、塩基に標識を付着させることからなる。別の方法は、糖に標識を付着させることを提示しているが、ここでも、塩基は天然のものでも修飾されたものでも構わない。更に別の方法は、標識をリン酸塩に付着させることを目的とする。特に、塩基に標識を付着させることは、直接標識されたヌクレオチドを取り込むことによって核酸を標識する方法において利用されている。糖に標識を付着させることは、化学合成によって調製された核酸プローブの場合に利用されることが多い。リン酸塩に標識を付着させることも、オリゴヌクレオチドの化学合成の過程で、官能化されたアーム及び標識を導入するために利用されてきた。
【０００３】
実際、ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ又は核酸を標識する必要のある当業者は、この付着を塩基又は糖に対して行う傾向があり、それによって、より優れた利便性、及び、より多くの代替法がもたらされる。その上、例えば塩基については、特許文献１〜９、また糖については、特許文献１０等、数多くの文献を調べてみれば明らかになることである。
【０００４】
標識をリン酸塩に付着させるのは、特に、リン酸塩の反応性が弱いため、塩基又は糖を官能化させることからなる技術よりも複雑で、ほとんど用いられてこなかった（例えば、非特許文献１参照）。同様に、プローブをオリゴヌクレオチド断片に導入する方法に関する非特許文献２では、ヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合を効果的にアルキル化することは不可能であると考えられている。
【０００５】
特許文献１１は、リボ核酸（ＲＮＡ）の断片化、及び、末端リン酸塩の標識からなる、合成又は天然のＲＮＡを標識する方法を開示している。この文献は、断片化と併用した標識に利用することができる一定数の官能基、例えばヒドロキシル基、アミン基、ヒドラジン基、アルコキシアミン基、ハロゲン化アルキル基、ベンジル型ハロゲン化アルキル基等、特に、５−（ブロモメチル）フルオロセイン誘導体を開示している。これらの官能基によれば核酸の標識が可能になるが、この標識は断片化過程で遊離するリン酸塩上でなされるため、効率的に標識するためには断片化工程と組み合わせる必要がある。更に、効率的に標識するためには、ＲＮＡに対して過剰量の標識試薬を添加しなければならないが、こうすると、過剰な標識によるバックグラウンドノイズの発生という問題が発生する。結局のところ、この方法は、２本鎖ＤＮＡに対しては効率的に機能しない。
【０００６】
標識効率という観点においてより効率的な新規の試薬が現れた。これらは標識位置について特異的であって、かつ、特に、水素結合を介して二本鎖形成に関与する塩基のハイブリダイゼーション特性に影響を与えることなく、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方に使用することができ、また、最終的に、天然、又は、酵素増幅により調製可能なヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又は核酸を無差別に標識することができる。
【０００７】
本出願人は、上記条件を満たす標識であって、標識するための反応性基としてジアゾメチル基を用いる新規の標識を既に提示している。これは、例えば、特許文献１２〜１４、又は、非特許文献３の事例であり、そのような成分の合成方法及び使用方法をより明確に理解するために読者は参照することが可能である（上記した文献の内容は、本明細書中に参照する）。
【０００８】
更に、先行技術は、具体的にはシリカ製の、より具体的には粉末状、ゲル状又は磁性粒子状の、固体支持体を使用することにより、標識前又は標識後に核酸を精製して、特異的ハイブリダイゼーション（ＤＮＡチップに関連するが、ＥＬＯＳＡプレート又は迅速試験型でもある）によって検出することについて記載している。標識する前に精製すると標識効率を大幅に改善でき、また、標識した後に精製するとハイブリダイゼーション率及びシグナル／ノイズ比を明白に改善できるため、試験感度を良好にするためには必要である。
【０００９】
特許文献１５の場合は、複雑な出発生物原料を含む核酸を単離するための方法を提案するものであり、この方法は出発原料とカオトロピック性物質及び固体相との混合を含み、この固体相は核酸を付着させることができて、その後洗浄又は溶出することによって、生成した複合体の残渣から取り除くことができるものである。この特許の内容は本明細書中に参照する。
【特許文献１】欧州特許出願公開第０３２９１９８号明細書
【特許文献２】欧州特許出願公開第０３０２１７５号明細書
【特許文献３】欧州特許出願公開第００９７３７３号明細書
【特許文献４】欧州特許出願公開第００６３８７９号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第５４４９７６７号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第５３２８８２４号明細書
【特許文献７】国際公開第９３／１６０９４号パンフレット
【特許文献８】独国特許出願公開第３９１０１５１号明細書
【特許文献９】欧州特許出願公開第０５６７８４１号明細書
【特許文献１０】欧州特許出願公開第０２８６８９８号明細書
【特許文献１１】国際公開第９９／６５９２６号パンフレット
【特許文献１２】国際公開第０２／０９０３１９号パンフレット
【特許文献１３】国際公開第０２／０９０５８４号パンフレット
【特許文献１４】仏国特許出願未公開第０４／５０６００号明細書（２００４年３月２６日フランス出願）“Ｒｅａｃｔｉｆｓ  ｄｅ  ｍａｒｑｕａｇｅ，  ｐｒｏｃｅｄｅｓ  ｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｅ  ｄｅ  ｔｅｌｓ  ｒｅａｃｔｉｆｓ  ｅｔ  ｐｒｏｃｅｄｅｓ  ｄｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｄｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｑｕｅｓ”
【特許文献１５】欧州特許出願公告第０３８９０６３号明細書
【非特許文献１】Ｊｅｎｃｋｓ  Ｗ．Ｐ．ら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．，８２，１７７８−１７８５，１９６０
【非特許文献２】Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌ  ａｎｄ  Ｍｃ  Ｌａｕｇｈｌｉｎ，“Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｒｏｕｐｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ”，ｐ２１６−２４３  ｉｎ  “Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ”，Ｅｄ  Ｈｅｃｈｔ  Ｓ．Ｍ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６
【非特許文献３】Ｌａａｙｏｕｎら，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００３，１４，１２９８−１３０６  ａｎｄ  ｅｎｔｉｔｌｅｄ：”Ａｒｙｌｄｉａｚｏｍｅｔｈａｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｎ  ＤＮＡ  Ｃｈｉｐｓ”
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
実際、これらの２つの技術は独立して使用される、すなわち、精製工程及び標識工程は、別々の使い捨て容器中で別々の操作方法により実施される。このように２つの工程が存在すると、液体を移す必要があり、潜在的な汚染因子及び材料のロスを伴い、一般的には適度に自動化する必要がある。
【００１１】
一方、標識とシリカ上での精製とを組み合わせると多くの利点があるが、これはまだ当業者の知るところではない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
第一の利点は、反応媒体中において標識反応とシリカ磁気ビーズ上での核酸の捕獲（例えば吸着による）とを同時に行うことができる本発明の方法によれば、標識効率は全く減少せず、従って、その標識も磁気シリカの存在による影響を受けないという点である。
【００１３】
第二の利点は、この方法は比較的、標識及び精製という別々の２工程を行う方法よりも操作が非常に早いという点である。
【００１４】
本発明の第三の利点は、標識された核酸をごく少量（約０．１〜１０μｌ）まで濃縮することができ、核酸がビーズに付着していて、かつ、溶出バッファーを使用しなくても単純で標準的なハイブリダイゼーションバッファーによる溶出が可能であるという点である。従って、希釈工程を完全に省いて、かつ、方法の感度が改善されることによって、核酸がハイブリダイゼーション中に更に濃縮され得る。
【００１５】
さらに、この方法は、磁気ビーズの使用が順応的であり、かつ、過程（加熱、洗浄、溶出）が比較的単純であるために、容易に自動化することができ、これは第四の利点である。特に、磁気ビーズを使用すれば、ビーズの使用量を単純に変えるだけで、系の捕獲キャパシティーを非常に容易に変えることができる。この方法は、連続的に流動させる系においても使用することができ、これによって、洗浄工程を単純化することができる。この方法では、液体をピペットで移すことはない。
【００１６】
この方法の第五の利点は、実際、固体状の核酸を移すことができ、言いかえれば、シリカ磁気ビーズ上に吸着させることができ、これによって、近年急速に進歩している技術であるマイクロコンポーネント（ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）において容易に利用できるという点である。
【００１７】
最後に、第六の利点は、特に、方法の自動化（上述：第四の利点）にも関連するが、この方法によれば、核酸の精製から、標識、チップ上のハイブリダイゼーションまでを、１本のチューブの中で完全に統合できるということであるが、言うまでもなく、これは、増幅工程を必要としない方法の範囲内にこの方法が含まれる場合にあてはまる。この方法によれば、汚染危険性が低減され、かつ、使用される使い捨て容器を減らすことにつながる。
【００１８】
本発明は本質的に、処理される生体試料中に存在する標的の核酸の標識及び精製方法であって、以下：  
・単一の反応槽の使用、
・以下；
−  生体試料、
−  核酸を標識するための少なくとも１つの試薬、
−  上記核酸を吸着できる少なくとも１つの固体支持体、
−  核酸の標識及び／又は支持体上への上記核酸の固定に必要な任意の成分；の反応槽中への導入、
・反応槽内容物のインキュベート、並びに、
・上記で標識された核酸の分離：を含む
ことを特徴とする方法に関する。
【００１９】
本発明の第一の実施形態によれば、上記の標識及び精製方法は、処理された核酸が、一本鎖及び／又は二本鎖からなっていてもよく、合成及び／又は天然のＤＮＡ及び／又はＲＮＡからなっていてもよいということを特徴とする。
【００２０】
本発明の第二の実施形態によれば、上記の標識及び精製方法は、上記標識試薬が以下：  
−  核酸の非特異的な断片化による、多数の核酸断片の生成、及び、
−  これら多数の断片の、断片化中に遊離した、３’及び／又は５’末端に位置する末端リン酸塩の標識：を可能にし得るということを特徴とする。
【００２１】
また、本発明のこの第二の実施形態によれば、核酸断片の３’又は５’末端の標識は、リボースの２’位、３’位又は環状２’−３’−モノリン酸塩位に位置するリン酸塩の標識により生成した反応性基の付着によって実施できる。
【００２２】
また、本発明のこの第二の実施形態によれば、核酸断片の３’又は５’末端の断片化及び／又は標識は、リボースの２’位、３’位又は環状２’−３’−モノリン酸塩位に位置するリン酸塩の標識により生成した求核基、求電子性基又はハロゲン基の付着によって実施できる。
【００２３】
本発明のこの第二の実施形態の選択肢としての方法によれば、核酸の断片化は以下：
−  酵素的手段（ヌクレアーゼ）、
−  化学的手段（Ｍｇ＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｃｕ＋＋、Ｃｏ＋＋及び／又はＺｎ＋＋イオン等の金属陽イオンを、単独で、又は、例えばＮ−メチルイミダゾール等の化学的触媒、若しくは、ＲＮＡ親和性がありかつイミダゾール核若しくは置換類似体を有する任意の化学分子と併用して）、又は、
−  物理的手段（超音波処理又は放射線による）：によって実施できる。
【００２４】
いずれの実施形態においても、ＲＮＡ断片の３’又は５’末端の標識は、リボースの２’位、３’位又は環状２’−３’−モノリン酸塩位に結合するリン酸結合への分子Ｒ−Ｘの付着によって実施することができ、Ｒは標識からなり、Ｘは標識とＲＮＡの結合剤であり、例えば水酸基、アミン基、ヒドラジン基、アルコキシアミン基、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化フェニルメチル基、ヨウ化アセトアミド基又はマレイミド基等である。
【００２５】
いずれの実施形態においても、リン酸基の標識は、５−（ブロモメチル）フルオレセインを用いて実施することができる。
【００２６】
特定の実施形態によれば、本発明による標識及び精製方法は、標識試薬と核酸とを均質溶液中で本質的に水性のバッファー中で接触させることができ、上記標識試薬は加熱に対して安定であり、かつ、式（０）のものであることを特徴とする。
【００２７】
【化１】
2008507263.tif 000002
【００２８】
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、
・Ｒ３及びＲ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示し、
・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは０から２まで、好ましくは０又は１の整数であり、かつ、
・−Ｙ−Ｘ−は、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＨ２Ｏ−又は−ＣＨ２Ｓ−を表す。）
【００２９】
この特定の実施形態によれば、上記標識試薬は式（１）のものであってよい。
【００３０】
【化２】
2008507263.tif 000003
【００３１】
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、
・Ｒ３及びＲ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示し、かつ、
・−Ｙ−Ｘ−は、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＨ２Ｏ−又は−ＣＨ２Ｓ−を表す。）
【００３２】
上記２つの特性によれば、上記試薬は式（２）のものであってよい。
【００３３】
【化３】
2008507263.tif 000004
【００３４】
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、かつ、
・Ｒ３及びＲ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示す。）
【００３５】
上記２つの実施形態の第一の変形形態によれば、上記試薬は式（３）のものであってよい。
【００３６】
【化４】
2008507263.tif 000005
【００３７】
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、かつ、
・Ｒ３及びＲ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示す。）
【００３８】
上記２つの実施形態の第二の変形形態によれば、上記試薬は式（４）のものであってよい。
【００３９】
【化５】
2008507263.tif 000006
【００４０】
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、かつ、
・Ｒ３及びＲ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示す。）
【００４１】
上記２つの実施形態の第一のものの別の変形形態によれば、上記試薬は式（２１）のものであってよい。
【００４２】
【化６】
2008507263.tif 000007
【００４３】
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、
・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは１であり、かつ、
・Ｒ３及びＲ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示す。）
【００４４】
上記２つの実施形態の第一のもののまた別の変形形態によれば、上記試薬は式（２２）のものであってよい。
【００４５】
【化７】
2008507263.tif 000008
【００４６】
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、
・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは１であり、かつ、
・Ｒ３及びＲ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示す。）
【００４７】
上記２つの実施形態の第一のものの更に別の変形形態によれば、上記試薬は式（２３）のものであってよい。
【００４８】
【化８】
2008507263.tif 000009
【００４９】
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、
・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは１であり、かつ、
・Ｒ３及びＲ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示す。）
【００５０】
上記試薬の上記２つの実施形態のすべての変形形態によれば、Ｒ３及びＲ４は、独立していてもよく、以下；Ｈ、ＮＯ２、ＯＣＨ３、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）４−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２；を示し得る。
【００５１】
上記の実施形態の別の変形形態によれば、上記試薬は式（７）のものであってよい。
【００５２】
【化９】
2008507263.tif 000010
【００５３】
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、かつ、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数である。）
【００５４】
上記の実施形態のまた別の変形形態によれば、上記試薬は式（２４）のものであってよい。
【００５５】
【化１０】
2008507263.tif 000011
【００５６】
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、かつ、
・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは１である。）
【００５７】
上記の実施形態のいずれの変形形態においても、上記試薬の構造Ｒ２−（Ｌ）ｎ−は式（５）のものであってよい。
【００５８】
【化１１】
2008507263.tif 000012
【００５９】
（式中、
・Ｒ２は検出用標識を表し、
・ｍは１〜１００の整数であり、かつ、
・ｐは１〜１０の整数である。）
【００６０】
上記の実施形態のいずれの変形形態においても、上記試薬は式（６）のものであってよい。
【００６１】
【化１２】
2008507263.tif 000013
【００６２】
（式中、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｒ３は、Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）を示し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、かつ、
・−Ｙ−Ｘ−は、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＨ２Ｏ−又は−ＣＨ２Ｓ−を表す。）
【００６３】
上記の実施形態のいずれの変形形態においても、上記試薬は式（２５）のものであってよい。
【００６４】
【化１３】
2008507263.tif 000014
【００６５】
（式中、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｒ３は、Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）を示し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、
・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは１であり、かつ、
・−Ｙ−Ｘ−は、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＨ２Ｏ−又は−ＣＨ２Ｓ−を表す。）
【００６６】
上記の実施形態のいずれの変形形態においても、上記試薬は式（１４）のものであってよい。
【００６７】
【化１４】
2008507263.tif 000015
【００６８】
（式中、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、かつ、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数である。）
【００６９】
上記の実施形態のいずれの変形形態においても、上記試薬は式（２６）のものであってよい。
【００７０】
【化１５】
2008507263.tif 000016
【００７１】
（式中、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは１であり、かつ、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数である。）
【００７２】
上記の実施形態のいずれの変形形態においても、上記試薬は式（１５）のものであってよい。
【００７３】
【化１６】
2008507263.tif 000017
【００７４】
（式中、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、かつ、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数である。）
【００７５】
上記の実施形態のいずれの変形形態においても、上記試薬は式（２７）のものであってよい。
【００７６】
【化１７】
2008507263.tif 000018
【００７７】
（式中、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは１であり、かつ、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数である。）
【００７８】
上記の実施形態の変形形態の全体によれば、上記試薬の構成成分Ｌは、−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）−部位を、１〜２０回、好ましくは１〜１０回、さらに好ましくは２〜５回繰り返して含んでいてよい。
【００７９】
一番最初の２つの実施形態によれば、上記標識試薬は、一本鎖又は二本鎖の核酸の標識及び断片化を、以下の工程： 
−  核酸の断片化、
−  式（１９）の化合物から選択される標識試薬による、少なくとも１つの断片への標識の付着：
【００８０】
【化１８】
2008507263.tif 000019
【００８１】
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｚは検出用標識を含む）：によって実施し得、
上記試薬は共有結合で、主として上記断片の少なくとも１つのリン酸塩に結合している。
【００８２】
上記実施形態によれば、上記標識試薬は式（２０）の化合物から選択され得る。
【００８３】
【化１９】
2008507263.tif 000020
【００８４】
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識であり、
・Ｌは、少なくとも２個の共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１であり、かつ
・Ｚは以下； 
【００８５】
【化２０】
2008507263.tif 000021
【００８６】
（式中、
・Ｒ３及びＲ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲ（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示し、かつ、
・−Ｙ−Ｘ−は、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＨ２Ｏ−又は−ＣＨ２Ｓ−を表す。）
【００８７】
上記方法の一変形形態によれば、Ｚ基は以下からなっていてよい。
【００８８】
【化２１】
2008507263.tif 000022
【００８９】
上記方法の別の変形形態によれば、断片化及び標識は２工程で実施することができる。
【００９０】
上記方法の別の変形形態によれば、断片化及び標識は１工程で実施することができる。
【００９１】
上記方法の別の変形形態によれば、標識は本質的に水性の均質溶液中で実施することができる。
【００９２】
上記方法の別の変形形態によれば、断片化は酵素的、物理的又は化学的手段によって実施することができる。
【００９３】
最初の２つの実施形態によれば、上記標識試薬は、本質的に水性のバッファー中で均質溶液中で接触していてよく、上記標識試薬は加熱に対して安定であり、かつ、式（８）のものである。
【００９４】
【化２２】
2008507263.tif 000023
【００９５】
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、
・Ｒ３及びＲ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＯＲ、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）４−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２（Ｒ＝アリール基又はアルキル基）；を示し、
・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは０から２まで、好ましくは０又は１の整数であり、
・−Ｙ−Ｘ−は、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＨ２Ｏ−又は−ＣＨ２Ｓ−を表し、
・−Ｚ−は、−ＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−又は−Ｏ−を表し、
・ｍは１〜１０、好ましくは１〜３の整数であり、かつ、
・ｐは１〜１０、好ましくは１〜３の整数である。）
【００９６】
上記実施形態の一変形形態によれば、上記試薬は式（９）のものであってよい。
【００９７】
【化２３】
2008507263.tif 000024
【００９８】
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、
・Ｒ３及びＲ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＯＲ、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）４−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示し、
・−Ｙ−Ｘ−は、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＨ２Ｏ−又は−ＣＨ２Ｓ−を表し、
・ｍは１〜１０、好ましくは１〜３の整数であり、かつ、
・ｐは１〜１０、好ましくは１〜３の整数である。）
【００９９】
上記２つの実施形態によれば、上記試薬の式中、ｐはｍより小さくてもよいし、ｍと同じであってもよい。
【０１００】
上記３つの実施形態によれば、上記試薬は式（１０）のものであってよい。
【０１０１】
【化２４】
2008507263.tif 000025
【０１０２】
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、
・Ｒ３及びＲ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＯＲ、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２ＣＨ２）３−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）４−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示し、かつ、
・ｑは１〜１０、好ましくは１〜３の整数である。）
【０１０３】
上記４つの実施形態によれば、上記試薬は式（１１）のものであってよい。
【０１０４】
【化２５】
2008507263.tif 000026
【０１０５】
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ基、アルキル基、アリール基、又は、置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、かつ、
・Ｒ３及びＲ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＯＲ、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）４−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）を示す。）
【０１０６】
上記試薬の一実施形態によれば、Ｒ２は式（１２）のＤ−ビオチン残基からなっていてよい。
【０１０７】
【化２６】
2008507263.tif 000027
【０１０８】
上記試薬の上記６つの実施形態によれば、Ｒ１はＣＨ３を含み、Ｒ３及びＲ４はそれぞれＨを表す。
【０１０９】
上記７つの実施形態によれば、上記試薬の構造−（Ｌ）ｎ−は以下：  
・スペルミン若しくはＮ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）−１，４−ジアミノブタン；ＮＨ２−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２、又は、
・スペルミジン若しくはＮ−（３−アミノプロピル）−１，４−ブタンジアミン；Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）４−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２、又は、
・アラニン部位を含む誘導体；ＮＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ：からなっていてよい。
【０１１０】
最初の２つの実施形態によれば、加熱に対して安定な上記標識試薬は、水性バッファー中で均質溶液中で接触していてよく、かつ、式（１３）のものである。
【０１１１】
【化２７】
2008507263.tif 000028
【０１１２】
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ、又は、アルキル基、アリール基若しくは置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、
・Ｒ３及びＲ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＯＲ、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）４−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示し、
・Ａは、ジアゾ基が芳香環と共役することを可能にする少なくとも１つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは０から２まで、好ましくは０又は１の整数であり、
・−Ｙ−Ｘ−は、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＨ２Ｏ−又は−ＣＨ２Ｓ−を表し、
・−Ｚ−は、−ＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−又は−Ｏ−を表し、
・ｍは１〜１０、好ましくは１〜３の整数であり、かつ、
・ｐは１〜１０、好ましくは１〜３の整数である。）
【０１１３】
上記実施形態の一変形形態によれば、上記試薬は式（１６）のものであってよい。
【０１１４】
【化２８】
2008507263.tif 000029
【０１１５】
（式中、
・Ｒ１は、Ｈ基、アルキル基、アリール基、又は、置換アリール基を表し、
・Ｒ２は、検出用標識、又は、少なくとも１つの多量体構造によって連結されている少なくとも２つの検出用標識を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは０又は１の整数であり、
・Ｒ３及びＲ４は独立していて以下；Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２−（Ｌ）ｎ−Ｙ−Ｘ−、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＯＲ、−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２又は−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）４−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２（Ｒ＝アルキル基又はアリール基）；を示し、
・−Ｙ−Ｘ−は、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＨ２Ｏ−又は−ＣＨ２Ｓ−を表し、
・−Ｚ−は、−ＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−又は−Ｏ−を表し、
・ｍは１〜１０、好ましくは１〜３の整数であり、かつ、
・ｐは１〜１０、好ましくは１〜３の整数である。）
【０１１６】
上記１０つの実施形態によれば、上記試薬の構成成分Ｌは、−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）−部位を、１〜２０回、好ましくは１〜１０回、さらに好ましくは２〜５回繰り返して含んでいてよく、従って−Ｚ−は−ＮＨ−、−ＮＨＣＯ−又は−ＣＯＮＨ−で表すことができる。
【０１１７】
いずれの実施形態においても、上記固体支持体はシリカ粒子からなっていてよい。
【０１１８】
いずれの実施形態においても、上記固体支持体はシリカで覆われた磁性粒子からなっていてよい。
【０１１９】
上記２つの実施形態によれば、固体支持体を有するシリカ粒子は、粒子径が０．１〜５００μｍ、好ましくは１〜２００μｍであってよい。
【０１２０】
いずれの実施形態においても、標識を可能にする添加成分のうちの１つは、アルコール、好ましくはイソプロパノールからなっていてよい。
【０１２１】
上記実施形態によれば、イソプロパノールは最終混合物の７０％（ｖ／ｖ）含まれていてよい。
【０１２２】
いずれの実施形態においても、細胞放出を可能にすることによって固体支持体上への核酸の吸着を可能にする添加成分の１つは、カオトロピック薬剤からなっていてよい。
【０１２３】
上記実施形態によれば、使用される上記カオトロピック薬剤は、グアニジウム塩、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、（イソ）チオシアン酸ナトリウム、尿素、又は、これらの化合物の混合物であってよい。
【０１２４】
上記実施形態によれば、使用されるグアニジウム塩は、（イソ）チオシアン酸グアニジウムであってよい。
【０１２５】
いずれの実施形態においても、固体相−核酸複合体は、堆積させて上清を除去した後、カオトロピック物質を含む洗浄バッファーで複合体を洗浄することによって、液体から分けることができる。
【０１２６】
上記実施形態によれば、固体相−核酸複合体は、洗浄バッファーで洗浄した後、１種又は数種の有機溶媒で再び洗浄し、その後乾燥させることができる。
【０１２７】
上記実施形態によれば、固体相−核酸複合体中に存在する核酸は、複合体を洗浄及び乾燥させた後で、溶出バッファーを使用して溶出することができる。
【０１２８】
いずれの実施形態においても、こうして得られた固体相−核酸複合体は、核酸を増幅するための成分を含む混合物を上記固体相に付着させて、あるいは、そこから溶出して、この混合物と接触させることができる。
【０１２９】
いずれの実施形態においても、インキュベート工程は、処理サンプルを５〜４５分間、好ましくは１５〜３５分間、さらに好ましくは２５分間、温度４５〜８５℃、好ましくは５５〜７５℃、さらに好ましくは６５℃で維持することを含んでよい。
【０１３０】
上記実施形態によれば、インキュベート工程の後、上記サンプルは、少なくとも数分間、好ましくは５分間で室温に戻すことができる。
【０１３１】
「多量体構造」という用語は、化学的又は生物学的なシントンの繰り返し単位から形成される重合体を意味するものとする。国際公開第０２／０９０３１９号パンフレットの明細書の実施例３４．２に一例が記載されている。当業者は、以下で展開される情報が、本件を完全に理解するのに不十分であると思ったならば、この文献を参照する必要がある。本発明において利用できる構造体の多くの改変型、例えば、以下のもの等が知られている。・線状重合体（欧州特許出願公開第０５６１７２２号明細書、欧州特許出願公開第０６６９９９１号明細書）、
・分岐重合体（国際公開第０１／９２３６１号パンフレット）、
・粒子（欧州特許出願公開第０８２７５５２号明細書）、
・デンドリマー（米国特許出願公開第４５０７４６６号明細書；米国特許出願公開第４５６８７３７号明細書；米国特許出願公開第６０８３７０８号明細書）、
・ポリヌクレオチド、及び、
・ポリペプチド。
必要であることが明らかであれば、本件を完全に理解するために、当業者はこれらの文書を参照することもできる。
【０１３２】
「検出用標識」という用語は、検出可能なシグナルを直接的に生成することができる少なくとも１つの標識を意味するものとする。例えば、ビオチンは、後に標識ストレプトアビジンと組み合わせることができる場合であっても、検知可能であることから、直接標識と見なされる。これらの標識の非限定的な一覧は以下の通りである。
・例えば、比色測定、蛍光又は発光によって検出可能なシグナルを生成する酵素、例えば、ホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又は、グルコース−６−リン酸エステルデヒドロゲナーゼ等、
・蛍光化合物、発光化合物又は染料等の発色団、
・電子顕微鏡によって、又は、伝導性、電流測定、ボルタンメトリー若しくはインピーダンス等の電気的特性によって検出可能な電子密度を有する基、
・検出可能基、例えば、物理的及び／又は化学的な特徴の検出可能な変化を誘発するのに十分な大きさをもつ分子（このような検出は、回折、表面プラズモン共鳴、表面変化又は接触角変化等の光学的方法、又は、原子間力分光法若しくはトンネル効果等の物理的方法によって行われ得る）、
・３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等の放射性分子。
好ましくは、放射標識に関連した安全性の問題を回避するために、標識は放射性標識ではない。
【０１３３】
本発明の特定の実施形態において、上記標識は電気化学的に検出可能であり、具体的には、上記標識はフェロセン等の鉄錯体の誘導体である。
【０１３４】
「核酸」という用語は、例えば、イノシン、メチル−５−デオキシシチジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、デオキシウリジン、ジアミノ−２，６−プリン、ブロモ−５−デオキシウリジン、又は、その他ハイブリダイゼーションを可能にする任意の修飾塩基等の修飾塩基を含む、少なくとも１つのヌクレオチド等の、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを任意に含み得る、少なくとも２つのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの鎖を意味するものである。また、このポリヌクレオチドは、例えばホスホロチオエート、Ｈ−ホスホネート若しくはアルキルホスホネート等のヌクレオチド間結合のレベルで、又は、例えば、アルファ−オリゴヌクレオチド（仏国特許出願公開第２６０７５０７号明細書）若しくはＰＮＡ（Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４，１８９５−１８９７，１９９２）若しくは２’−Ｏ−アルキルリボース及びＬＮＡ  （ＢＷ，  Ｓｕｎら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４１６０−４１６９，  ４３，  ２００４）等の、骨格のレベルで修飾することができる。核酸は、天然若しくは合成のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸断片、リボソームＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、又は、以下のような酵素的増幅技術によって得られる核酸であってよい：
・米国特許出願公開第４６８３１９５号明細書、米国特許出願公開第４６８３２０２号明細書、及び、米国特許出願公開第４８００１５９号明細書に記載されているＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖反応法）、及び、その派生技術であるＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ法）、特に、欧州特許第０５６９２７２号明細書に記載されたような１工程方式で行われるＲＴ−ＰＣＲ法、
・例えば、欧州特許出願公開第０２０１１８４号明細書に開示されているＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応法）、
・国際公開第９０／０１０６９に記載されているＲＣＲ法（修復連鎖反応法）、
・国際公開第９０／０６９９５による３ＳＲ法（自己保持性配列複製法（Ｓｅｌｆ  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ））、
・国際公開第９１／０２８１８によるＮＡＳＢＡ法（核酸配列増幅法）
・米国特許出願公開第５３９９４９１号明細書によるＴＭＡ法（転写介在増幅法）、並びに、
・ＲＣＡ法（ローリングサークル増幅法）（米国特許出願公開第６５７６４４８号明細書）。
次に、「アンプリコン」という用語は、酵素増幅法によって生成された核酸を表すために用いられる。
【０１３５】
これらの修飾物のそれぞれは、少なくとも１つのリン酸塩が核酸に存在するかぎり、組み合わせることができる。
【０１３６】
「ポリペプチド」という用語は、少なくとも２個のアミノ酸の鎖を意味するものとする。
「アミノ酸」という用語は、以下のものを意味するものとする：
・タンパク質をコードする第一級アミノ酸、
・トランス−４−ヒドロキシプロリン等の、酵素作用後に得られるアミノ酸、
・ノルバリン、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、スタリン（ｓｔａｌｉｎｅ）（Ｈｕｎｔ  Ｓ．  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ，Ｂａｒｅｔｔ  Ｇ．Ｃ．，ｅｄ．，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８５参照）等の、天然であるがタンパク質には存在しないアミノ酸、及び、
・固体支持体合成法又は液相合成法で使用できる化学基によって保護されたアミノ酸、及び、非天然型アミノ酸。
【０１３７】
「精製工程」という用語は、具体的には、微生物、及び、核酸精製に先行する溶解工程で放出される細胞構成成分から核酸を分離することを意味するものである。これらの溶解工程はよく知られており、一例としては、以下の特許出願に記載されている溶解法を用いることができる：
・超音波処理による溶解法に関する国際公開第００／６００４９号パンフレット、
・磁気的及び機械的な混合型溶解法に関する国際公開第００／０５３３８号パンフレット、
・電気的溶解法に関する国際公開第９９／５３３０４号パンフレット、及び、
・機械的溶解法に関する国際公開第９９／１５６２１号パンフレット。
当業者は、熱ショック若しくは浸透圧ショック、又は、グアニジウム塩類等のカオトロピック剤を用いる処理（米国特許出願公開第５２３４８０９号明細書）等の他の公知な溶解法を用いることもできる。
【０１３８】
一般的に、この工程によって、核酸を濃縮することが可能となる。例として、磁性粒子を用いることができ（この点については、米国特許出願公開第４６７２０４０号明細書及び米国特許出願公開第５７５０３３８号明細書参照）、従って、これらの磁性粒子に付着した核酸を洗浄工程により精製することが可能となる。この核酸精製工程は、前記核酸を引き続き増幅したい場合に、特に有利である。これらの磁性粒子の特に興味深い実施形態は、国際公開第９７／４５２０２号パンフレット及び国際公開第９９／３５５００号パンフレットに記載されている。
【０１３９】
本明細書で用いられている「固体支持体」という用語は、核酸が付着することができるすべての物質を含む。場合によっては化学的に修飾されていてもよいが、合成された物質又は天然物質を固体支持体として使用することができ、具体的には、例えば紙等、セルロースを用いる材料、セルロースアセテート若しくはニトロセルロース等のセルロース誘導体、又は、デキストラン等のポリサッカライド；ポリマー、具体的にはスチレン型モノマーを用いたコポリマー、綿等の天然繊維、及び、ナイロン等の合成繊維；シリカ、水晶、ガラス、セラミックス等の無機材料；ラテックス；磁性粒子；金属誘導体、ゲル等が、固体支持体として用いられる。固体支持体は、微量滴定用プレート、膜、粒子、又は、実質的に平面のガラス若しくはシリコンのプレートという形であってもよく、又は、派生物でもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１４０】
添付の実施例は、具体的な実施形態を代表するものであって、本発明の範囲を制限するものと見なすべきではない。
【実施例１】
【０１４１】
＜ＰＣＲ増幅産物の固体相上における標識及び開裂、これに続くアフィメトリックス製チップ上の分析＞
Ａ  −  Ｍｙｃｏ  １６  Ｓ  ＰＣＲ
この実験は「Ｍｙｃｏ  １６Ｓ」と呼ばれるモデル上で実施される。
【０１４２】
この名前は、結核菌の１６ＳリボゾームＲＮＡをコードする遺伝子の断片に由来する１８０塩基配列の、ＰＣＲによる増幅産物を指す。
【０１４３】
結核菌（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）の培養及び抽出、並びに、増幅プライマーに関する条件は、Ａｌａｉｎ  Ｔｒｏｅｓｃｈの文献（”Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｉｆａｍｐｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅ  ａｒｒａｙｓ”  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９９９，  ３７，  ｐａｇｅｓ  ４９  ｔｏ  ５５）中に記載されている。
【０１４４】
ＰＣＲは、ゲノムＤＮＡ（ＰＣＲによりコピー数１０３）の組織標本を出発鋳型とし、ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（スイス  バーゼル）、照会Ｎｏ．：  ０３  ５５３  ４２６  ００１）により、デソキシリボヌクレオチド（ｄｅｓｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）それぞれを０．２ｍＭ、プライマー０．３μＭ、及び、酵素０．４μＬを使用して実施される。
【０１４５】
ＰＣＲサイクルのパラメータは以下の通りである：９５℃４分間、その後、次のプロトコルに従って３５サイクル：９５℃３０秒間、次に５５℃３０秒間、最後に７２℃３０秒間。その後、混合物を４℃で保持して、系を停止させる。
【０１４６】
上記ＰＣＲによって得られる増幅産物は、用語「１６Ｓ  ＰＣＲ」として下記に参照される。
【０１４７】
Ｂ  −  均質相（コントロール）中における標識
均質相中における標識は、本発明の参照技術として使用され、「コントロール」と呼ぶこととする。
【０１４８】
キット中の増幅バッファー中で１／５に希釈した１６Ｓ  ＰＣＲの容量５０μＬを、メタビオチンフェニルメチルジアゾメタン（以下で「ｍ−ＢｉｏＰＭＤＡＭ」と呼ぶ）（以下で「ＤＭＳＯ」と呼ぶジメチルスルホキシド中に５０ｍＭ）７５μＬ及びＨ２Ｏ  １０２．５μＬと混合し、その後、９５℃で２５分間インキュベートする。その後、０．１Ｍ  ＨＣｌ  ２２．５μＬを反応媒体に添加し、続いて９５℃で５分間再びインキュベートする。
【０１４９】
その後、ＱＩＡＱｕｉｃｋキット（キアゲン社（ドイツ  ヒルデン）、照会Ｎｏ．２８  ３０６）を供給元のプロトコルに従って使用して反応媒体を精製し、続いてＤＮＡチップ（アフィメトリクス社、カリフォルニア州サンタクララ）上にハイブリダイズさせる。ＤＮＡチップは、結核菌の１６Ｓ  ＤＮＡのＭ２０９４０配列（ＧｅｎＢａｎｋ照会Ｎｏ．）の２１３−４１５領域を分析するためのものを使用する。このＤＮＡチップは、対応するハイブリダイゼーションプロトコルと共に、Ａ．  Ｔｒｏｅｓｃｈらの文献中に記載されている（”Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｉｆａｍｐｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅ  ａｒｒａｙｓ”  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９９９，  ３７，  ｐａｇｅｓ  ４９  ｔｏ  ５５）。
【０１５０】
Ｃ  −  不均一相中における標識及び開裂
並行して、下記に記載されるプロトコルによって、ＰＣＲ産物を処理する。
【０１５１】
（パラグラフＢ中に記載されるコントロールと同量のＰＣＲ産物を使用するために）ＰＣＲ産物の容量１０μＬを、ｍ−ＢｉｏＰＭＤＡＭ（ＤＭＳＯ中で５０ｍＭ）２５μＬ、０．２Ｍ  ＨＣＬ  ５μＬ、イソプロパノール１４０μＬ（最終％＝７０％（ｖ／ｖ））、ＭａｇＰｒｅｐ磁気シリカビーズ（メルク社（ドイツ  ダルムシュタット）、照会Ｎｏ．１．０１１９３．０００１）２０μＬと混合する。
【０１５２】
この混合物を、６５℃で２５分間、続いて室温で５分間インキュベートする。その後、磁気残基を、７０％イソプロパノール２５０μＬ（Ｈ２Ｏ中で３０％（ｖ／ｖ））で３回洗浄し、続いてシリカ上に吸着された核酸を、ＥＢバッファー（溶出バッファー、キアゲン社、照会Ｎｏ．１９０８６）１００μＬにハイブリダイゼーションバッファー（６Ｘ  ＳＳＰＥ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ、６０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、６ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４））及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０５％（ｖ／ｖ）を混合したもので溶出する。このバッファーは、上記パラグラフ中に記載したＡ．  Ｔｒｏｅｓｃｈらの文献中に記載されるプロトコルに従って調製され、コントロールに対する条件を再現する。
【０１５３】
Ｄ  −  結果と結論
相同％、シグナル強度（Ｉ）及びバックグラウンドノイズ（Ｎ）で示した結果を、下記表１中にまとめる。
【０１５４】
表１：本発明を使用する方法、及び、本発明を使用しないコントロールにおける、相同％、シグナル強度（Ｉ）及びバックグラウンドノイズ（Ｎ）の比較
【０１５５】
【表１】
2008507263.tif 000030
【０１５６】
結論として、本発明による反応方法で得られた結果は、別個の２工程（精製及び標識）を用いる「より古典的な」方法で得られた結果と類似している。さらに、この反応方法は、固体相上の標識及び開裂にかかる時間が約５０％も短縮され、非常に短い（すなわち、３０分から１５分になる）。
【０１５７】
また、強度の測定値が実際に同じであることも分かる。このことから、２通りの精製方法（ＱＩＡｑｕｉｃｋ又は磁気ビーズ）のいずれを用いても精製収率が同様であることが示される。
【実施例２】
【０１５８】
＜２つのビオチン基を有する標識分子の存在下における固体相上の標識及び開裂＞
Ａ  −  均質相（コントロール）中における標識
増幅バッファー中で１／１０に希釈した１６Ｓ  ＰＣＲの容量５０μＬを、ＤＭＳＯ中の１９０ｍＭ  Ｎ，Ｎ’−ビス（１３−ビオチニルアミノ−４，７，１０−トリオキサトリデシル）−５−（ジアゾメチル）イソフタルアミド（以下で「ｂｉｓＢｉｏＰＤＡＭ」と呼ぶ）３９．５μＬ、ＤＭＳＯ  １１０．５μＬ及びＨ２Ｏ  １５μＬと混合し、その後９５℃で２５分間インキュベートする（上記の希釈は、増幅産物の濃度を低くして試験の感度を試験するために実施する）。その後、０．１Ｍ  ＨＣｌ  ３５μＬを反応媒体に添加し、続いて９５℃で５分間再びインキュベートする。
【０１５９】
その後、ＱＩＡｑｕｉｃｋキットを供給元のプロトコルに従って使用して反応媒体を精製し、続いて、実施例１と同様の方法でＤＮＡチップ（アフィメトリクス社（カリフォルニア州サンタクララ））上にハイブリダイズさせる。
【０１６０】
Ｂ  −  不均一相中における標識及び開裂
並行して、１／１０に希釈した同じＰＣＲ産物を、別のプロトコルによって処理する。ＰＣＲ産物の容量５０μＬを、ＤＭＳＯ中の１９０ｍＭ  ｂｉｓＢｉｏＰＤＡＭ３９．５μＬ、０．４Ｍ  ＨＣＬ  ５μＬ、イソプロパノール１７５μＬ（最終％＝７０％（ｖ／ｖ））、ＤＭＳＯ  ６．５μＬ、及び、ＭａｇＰｒｅｐ磁気シリカビーズ２０μＬの残りと混合する。
【０１６１】
この混合物を、８０℃で１５分間、続いて室温で５分間インキュベートする。その後、磁気残基を、７０％イソプロパノール２５０μＬ（Ｈ２Ｏ中で３０％（ｖ／ｖ））で３回洗浄し、続いてシリカ上に吸着された核酸を、ＥＢバッファー（上記参照）１００μＬにハイブリダイゼーションバッファー４００μＬを混合したもので溶出する。ハイブリダイゼーションは、実施例１と同様の方法で実施される。
【０１６２】
Ｃ  −  結果と結論
相同％、シグナル強度（Ｉ）及びバックグラウンドノイズ（Ｎ）で示した結果を、下記表２中にまとめる。
【０１６３】
表２：本発明を使用する方法、及び、本発明を使用しないコントロールにおける、相同％、シグナル強度（Ｉ）及びバックグラウンドノイズ（Ｎ）の比較
【０１６４】
【表２】
2008507263.tif 000031
【０１６５】
結論として、本発明による反応方法で得られた結果は、希釈ＰＣＲ産物に対してｂｉｓＢｉｏＰＤＡＭを使用した場合に、別個の２工程（精製及び標識）を用いる「古典的な」方法で得られた結果より良好である。
【０１６６】
また、ｍ−ＢｉｏＰＭＤＡＭより可溶性が高くてビオチン基を２つ有するこの分子を使用することによって、固体支持体上での標識を用いる試験の感度を改善できる。これについては、強度値（Ｉ）及び信号対雑音比（Ｉ／Ｎ）が「古典的な」方法と比較して改善されていることが認識できる。
【０１６７】
従って、反応方法及びｂｉｓＢｉｏＰＤＡＭを使用することによって、少ないコピー数についてロバスト検定を実施することができる（強度値が高く、試験間での差異に対する感度が低い）。
【実施例３】
【０１６８】
＜固体相上のＰＣＲ増幅産物の標識、これに続くアジレント社製チップ上の定量分析＞
Ａ  −  ＨＢＶ  ＰＣＲ
下記の記載において、用語「ＨＢＶ  ＰＣＲ」は、Ｂ型肝炎ウイルスのゲノム由来の３２００塩基対の断片のＰＣＲ増幅産物を指し、これは次の方法で作成される。
【０１６９】
細胞培養由来の上清の容量１５μＬ中に含有される肝炎（ＨＢＶ）ＤＮＡの約１０３コピーを、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（スイス  バーゼル）、照会Ｎｏ．１７３２６４１）を使用して、ＰＣＲによって増幅する。
【０１７０】
ここで、キット中で使用される最終反応媒体は、ＭｇＣｌ２  １．５ｍＭ、各ｄＮＴＰ  ２００μＭ、及び、Ｔａｑ及びＰｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼの混合物２．６ユニットを含む；プライマーＰ１及びＰ２  ０．３μＭ（配列は以下：
Ｐ１：５’−ＣＣＧＧＡＡＡＧＣＴＴＧＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＡＣＣＴＣＴＧＣＴＡＡＴＣＡ−３’
Ｐ２：５’−ＣＣＧＧＡＡＡＧＣＴＴＧＡＧＣＴＣＴＴＣＡＡＡＡＡＧＴＴＧＣＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧ−３’）を上記混合物に添加し、これによって、推定される３２００ヌクレオチド断片を増幅することができる。
【０１７１】
ＰＣＲについての上記記載は、文献中に記載されている（Ｇｕｎｔｈｅｒ  Ｓ．ら、”Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｈｏｌｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ  ｐｅｒｍｉｔｓ  ｒａｐｉｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ”，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９５，  ｐａｇｅｓ  ５４３７  ｔｏ  ５４４４）。
【０１７２】
このＨＢＶ  ＰＣＲを使用すれば、ｍｙｃｏモデルのものよりずっと長い核酸配列（ｍｙｃｏ  １６Ｓでは１８０であるところ、３２００塩基）に作用するＰＣＲを使用することができ、これによって、２つの全く異なるモデル上における磁気ビーズの捕獲率を研究することができる。
【０１７３】
Ｂ  −  捕獲率の測定
実施例１中に記載する方法と同様に増幅したマイコプラズマ結核の１６Ｓ遺伝子の一部のＰＣＲ増幅産物と、並行してＨＢＶ  ＰＣＲ産物とを、次の方法で処理する。
【０１７４】
ＰＣＲ産物の容量１０μＬを、ｍ−ＢｉｏＰＭＤＡＭ（ＤＭＳＯ中で５０ｍＭ）、Ｈ２Ｏ  ５μＬ、イソプロパノール１４０μＬ（最終％＝７０％（ｖ／ｖ））、及び、ＭａｇＰｒｅｐ磁気シリカビーズ２０μＬと混合する。
【０１７５】
この混合物を、６５℃で２５分間、続いて室温で５分間インキュベートする。その後、磁気残基を、７０％イソプロパノール２５０μＬ（Ｈ２Ｏ中で３０％（ｖ／ｖ））で３回洗浄し、続いてシリカ上に吸着された核酸を、ＥＢバッファー５０μＬで溶出する。
【０１７６】
並行して、同じＰＣＲ溶液を同じプロトコル（イソプロパノールをＨ２Ｏで置き換える）に従って標識し、その後、ＱＩＡｑｕｉｃｋプロトコルに従って精製して、最終容量５０μＬ中に溶出する。
【０１７７】
精製物質、及び、最初のＰＣＲ産物を、ＢｉｏＡｎａｌｙｓｅｒ  ２１００（アジレント社（米国カリフォルニア州パロアルト）、照会Ｎｏ．Ｇ２９４０ＣＡ）を使用して、供給元のプロトコルに従って分析し、これらを定量する。
【０１７８】
Ｃ  −  結果と結論
得られた値を、下記表３中に示す。
【０１７９】
表３：先行技術の古典的方法と本発明による方法との、反応媒体中の核酸の捕獲率の比較
【０１８０】
【表３】
2008507263.tif 000032
【０１８１】
結論すると、これらの結果と、チップ上で得られた結果とから、反応媒体中への核酸の再有利が少ないことが示される。ＱＩＡｇｅｎキットに関して、捕獲の大部分は小断片上で生じるため、ハイブリダイズした開裂物質と共に使用することができる（ＤＮＡチップ上のハイブリダイゼーションにはＰＣＲ産物の開裂が必要な場合がある（例えば、Ｚｈａｎｇ  Ｙ．ら、”Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ  ａｎｄ  ｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅ  ｐｒｏｂｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ”，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２００１，  ２９，  ｅ６６参照）。本例中に示す結果によれば、磁気ビーズと共に使用するプロトコルによって、大きさが広範囲に渉る断片を捕獲可能であるということが示され得る。これによって技術の順応性が高くなる、というのは、大きさが非常に広範囲に渉るＰＣＲ産物から、開裂の改変によって、特別の技術的拘束もなく、使用目的に好適な大きさの標識ＤＮＡ断片を得ることができるからである。
【実施例４】
【０１８２】
＜ゲノムＤＮＡの固体相上における標識及び開裂、これに続くアフィメトリックス製チップ上の分析＞
Ａ  −  ゲノムＤＮＡの調製
ゲノムＤＮＡ（以下に「ｇＤＮＡ」と呼ぶ）を、Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ  ｓｏｙａ  ｍｅｄｉｕｍ（ビオメリュー社（フランス、マルシー）：照会Ｎｏ．４１１４６）中の黄色ブドウ球菌の１８時間液体培養物から抽出する。
【０１８３】
「Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｔｉｐｓ  ５００」イオン交換カラム（キアゲン社、照会Ｎｏ．１０２６２）上で供給元のプロトコルに従ってｇＤＮＡを精製し、２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量する。
【０１８４】
Ｂ  −  ｇＤＮＡの標識及びハイブリダイゼーション
細菌ゲノムを約１０９コピー含むｇＤＮＡの容量１０μＬを、ｍ−ＢｉｏＰＭＤＡＭ  ２５μＬ（ＤＭＳＯ中で５０ｍＭ）、酢酸ナトリウム５μＬ（ｐＨ＝３）、イソプロパノール１４０μＬ（最終％＝７０％（ｖ／ｖ））、及び、ＭａｇＰｒｅｐ磁気シリカビーズ２０μＬ（メルク社）と混合する。
【０１８５】
この混合物を、６５℃で２５分間、続いて室温で５分間インキュベートする。その後、磁気残基を、７０％イソプロパノール２５０μＬ（Ｈ２Ｏ中で３０％（ｖ／ｖ））で３回洗浄し、続いてシリカ上に吸着された核酸を、ＥＢバッファー１００μＬにハイブリダイゼーションバッファー４００μＬを混合したもので溶出する（テトラメチルアンモニウムクロリド  ３Ｍ、Ｔｒｉｓ  １０ｍＭ、ｐＨ７．８：０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、アセチル化ウシ血清アルブミン５００μｇ／ｍＬ、及び、ニシン精子ＤＮＡ  １００μｇ／ｍＬ）。このバッファーは、アフィメトリクス社提供のユーザーマニュアル中のプロトコルに従って調製する（ＣｕｓｔｏｍＳｅｑ  ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ａｒｒａｙ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）。
【０１８６】
この混合物を、１６Ｓ遺伝子を分析するためのアフィメトリクス社製チップ上でハイブリダイズさせ、その特性及び操作プロトコルは文献中に記載される（Ｇ．  Ｖｅｒｎｅｔら、”Ｓｐｅｃｉｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ”，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ２００４，  ９６，  ｐａｇｅｓ  ５９  ｔｏ  ６８、並びに、Ｃ．  Ｊａｙら、”１６Ｓ  ｒＲＮＡ  ｇｅｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅ  ａｒｒａｙ”，  １０ｔｈ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ  ａｎｄ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，  Ｔｓｕｋｕｂａ，  ｏｆ  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００２）。
【０１８７】
Ｃ  −  結果と結論
相同％、シグナル強度（Ｉ）及びバックグラウンドノイズ（Ｎ）で示した結果を、下記表４中にまとめる。
【０１８８】
表４：本発明を使用するｇＤＮＡ処理方法についての、相同％、シグナル強度（Ｉ）及びバックグラウンドノイズ（Ｎ）の結果
【０１８９】
【表４】
2008507263.tif 000033
【０１９０】
結論として、この結果は非常に良好である。相同％が９３％であることにより、分析された細菌種を理想的な方法で識別でき、かつ、チップ上で識別可能な他の種からこれらを区別することができる。
【０１９１】
標識ＤＮＡの精製に使用するものと同じ磁気ビーズ上でｇＤＮＡを精製できることが分かったため、プロトコルの全体（細菌コロニーから、ＤＮＡのハイブリダイズ準備まで）を１本のチューブ中で実施して、手動で又は自動装置中で処理することができる。
【０１９２】
本発明の観点から見て同様の結果が、ＲＮＡアンプリコンを直接生成するＮＡＳＢＡ又はＴＭＡ等の他の増幅技術を用いても得ることができる。
【国際調査報告】
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