(57)【要約】  本発明は、ウィルス、微生物、細胞及び多細胞生物などを含む幅広い生物の遺伝子変異性を判定する、予測する及び特徴付ける方法を提供する。従って本発明は、動物の健康にとって重要な病原性病原体、病原体内の遺伝子変異を特定する方法、並びに、このような病原体に対する予防的又は治療的介入のための方法及び組成物を提供するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
親ウィルス株及び変異型後代ウィルス株を含むあるウィルス集団中で、親ウィルス株を特定する方法であって：
ａ）前記集団中で優勢なウィルス株、又は、前記集団中で配列分岐を有するウィルス株、あるいは両者、の特定が可能な充分な数の、前記集団から分離されたウィルス株を由来とする一つ以上のウィルス遺伝子の核酸又はポリペプチド配列を得るステップと、
ｂ）前記集団中で優勢なウィルス株、又は、前記集団中で配列分岐を有するウィルス株、あるいは両者、を特定するステップであって、前記優勢なウィルス配列又は配列分岐を持つウィルス配列が親ウィルス株として特定される、ステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記優勢なウィルス配列又は配列分岐を持つウィルス配列が、複数の核酸又はポリペプチドをアライメントすることにより判定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記変異型後代ウィルス株が、コピーチョイス機序に従った組換えにより形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記親ウィルス株が、前記集団中で最も優勢な２つの配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記親株が、最も大きな配列分岐を持つ２つの株である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ウィルスがRNAウィルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記RNAウィルスが、一本鎖RNAウィルスである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記一本鎖RNAウィルスが、ポジティブ・センスRNAウィルスである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記一本鎖RNAウィルスがネガティブ・センスRNAウィルスである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記RNAウィルスが二本鎖RNAウィルスである、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記二本鎖RNAウィルスがポジティブ鎖RNAウィルスである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記二本鎖RNAウィルスがネガティブ鎖RNAウィルスである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ウィルスがDNAウィルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記DNAウィルスが一本鎖DNAウィルスである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記DNAウィルスが二本鎖DNAウィルスである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ウィルスがインフルエンザ・ウィルスである、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記ウィルスはコロナウィルスウィルスである、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
前記たんぱく質又は核酸配列がインフルエンザ・ウィルス由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記インフルエンザ核酸又はポリペプチド配列が、HA、NA、NP、PA、PB1、PB2、MP、及びNS、又はこれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸又はポリペプチド配列が、分離されたウィルス株を配列決定することにより、得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸又はポリペプチド配列が、公共で入手可能なデータベースから得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記充分な数が５又はそれ以上のウィルス配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記充分な数が１５又はそれ以上のウィルス配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記一つ以上のウィルス遺伝子が少なくとも２つの遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記一つ以上のウィルス遺伝子が少なくとも３つのウィルス遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記一つ以上のウィルス遺伝子が少なくとも４つのウィルス遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
ホスト動物を、請求項１に記載の方法に従って特定された親ウィルス株に感染させるステップと、
前記ホスト動物から、変異型後代ウィルス株を分離するステップと
を含む、ウィルスワクチンを作製する方法。
【請求項２８】
細胞株を、請求項１に記載の方法に従って特定された親ウィルス株に感染させるステップと、
前記ホスト動物から、変異型後代ウィルス株を分離するステップと
を含む、ウィルスワクチンを作製する方法。
【請求項２９】
卵を、請求項１に記載の方法に従って特定された親ウィルス株に感染させるステップと、
前記ホスト動物から、変異型後代ウィルス株を分離するステップと
を含む、ウィルスワクチンを作製する方法。
【請求項３０】
昆虫細胞を、請求項１に記載の方法に従って特定された親ウィルス株に感染させるステップと、
前記ホスト動物から、変異型後代ウィルス株を分離するステップと
を含む、ウィルスワクチンを作製する方法。
【請求項３１】
細菌細胞を、請求項１に記載の方法に従って特定された親ウィルス株に感染させるステップと、
前記ホスト動物から、変異型後代ウィルス株を分離するステップと
を含む、ウィルスワクチンを作製する方法。
【請求項３２】
ウィルス複製を支援することのできる細胞又は細胞抽出物を、請求項１に記載の方法に従って特定された親ウィルス株に感染させるステップと、
前記ホスト動物から、変異型後代ウィルス株を分離するステップと
を含む、ウィルスワクチンを作製する方法。
【請求項３３】
変異型後代ウィルス株を弱毒化して弱毒化ウィルスワクチンを作製するステップを更に含む、請求項２７乃至３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
変異型後代ウィルス株を死滅させて死菌ウィルスワクチンを作製するステップを更に含む、請求項２７乃至３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
ウィルス抗原又はその部分を変異型後代ウィルス株から分離して、サブユニットウィルスワクチンを作製するステップを更に含む、請求項２７乃至３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記ウィルスがRNAウィルスである、請求項２７乃至３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記RNAウィルスが、一本鎖RNAウィルスである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記一本鎖RNAウィルスが、ポジティブ・センスRNAウィルスである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記一本鎖RNAウィルスがネガティブ・センスRNAウィルスである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記RNAウィルスが二本鎖RNAウィルスである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記二本鎖RNAウィルスがポジティブ鎖RNAウィルスである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記二本鎖RNAウィルスがネガティブ鎖RNAウィルスである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記ウィルスがDNAウィルスである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記DNAウィルスが一本鎖DNAウィルスである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記DNAウィルスが二本鎖DNAウィルスである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
対象を免疫するのに充分な量の、請求項４３に記載の弱毒化ウィルスワクチンを対象に投与するステップを含む、ウィルスに対して対象を免疫する方法。
【請求項４７】
対象を免疫するのに充分な量の、請求項４４に記載の死菌ウィルスワクチンを対象に投与するステップを含む、ウィルスに対して対象を免疫する方法。
【請求項４８】
対象を免疫するのに充分な量の、請求項４６に記載のサブユニットウィルスワクチンを対象に投与するステップを含む、ウィルスに対して対象を免疫する方法。
【請求項４９】
前記親株がインフルエンザ・ウィルス株である、請求項３９に記載の方法。
【請求項５０】
前記親株がコロナウィルスウィルス株である、請求項３９に記載の方法。
【請求項５１】
第一親ウィルス株の代表である第一ウィルスと、第二親ウィルス株の代表である第二ウィルスとを、対象を免疫するのに充分な量、対象に投与するステップを含み、前記第一及び第二親ウィルス株が、請求項１に記載の方法に従って特定されたものである、ウィルスに対して対象を免疫する方法。
【請求項５２】
前記ウィルスがRNAウィルスである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記RNAウィルスが、一本鎖RNAウィルスである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記一本鎖RNAウィルスが、ポジティブ・センスRNAウィルスである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記一本鎖RNAウィルスがネガティブ・センスRNAウィルスである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記RNAウィルスが二本鎖RNAウィルスである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記二本鎖RNAウィルスがポジティブ鎖RNAウィルスである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５８】
前記二本鎖RNAウィルスがネガティブ鎖RNAウィルスである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５９】
前記ウィルスがDNAウィルスである、請求項５１に記載の方法。
【請求項６０】
前記DNAウィルスが一本鎖DNAウィルスである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記DNAウィルスが二本鎖DNAウィルスである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記親ウィルス株を、対象への投与前に弱毒化するステップを更に含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項６３】
前記親ウィルス株を、対象への投与前に死滅させるステップを更に含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項６４】
対象への投与前に、ウィルス抗原又はその部分を親ウィルス株から分離してサブユニットウィルスワクチンを作製するステップを更に含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項６５】
前記親株がインフルエンザ・ウィルス株である、請求項５１に記載の方法。
【請求項６６】
前記親株がコロナウィルスウィルス株である、請求項５１に記載の方法。
【請求項６７】
請求項１に記載の方法に従って特定された親ウィルス株、又は、それを由来とする抗原もしくは抗原部分、を含むウィルスワクチン組成物。
【請求項６８】
前記親ウィルス株を由来とする変異型後代ウィルス株、又は、それを由来とする抗原もしくは抗原部分を更に含む、請求項６７に記載のウィルスワクチン。
【請求項６９】
前記ワクチンが、２つのウィルス株、又は、２つのウィルス株を由来とする抗原もしくは抗原部分を含む、請求項６７に記載のウィルスワクチン。
【請求項７０】
ゲノムが同一でない核酸配列から構成されているような２つのウィルス株のコピーチョイス機序に従った組換えにより作製された変異型後代ウィルス株又はそれを由来とする抗原もしくは抗原部分を含むワクチン組成物。
【請求項７１】
前記の２つのウィルス株が、請求項１に記載の方法に従って特定された親ウィルス株である、請求項７０に記載のワクチン組成物。
【請求項７２】
変異型後代ウィルス株が、ホスト動物又はその細胞内でのコピーチョイス機序に従った組換えにより、作製される、請求項７０に記載のワクチン組成物。
【請求項７３】
変異型後代ウィルス株が、細胞培養又はその抽出物でコピーチョイス機序に従った組換えにより、作製される、請求項７０に記載のワクチン組成物。
【請求項７４】
前記ウィルスがRNAウィルスである、請求項７０に記載のワクチン組成物。
【請求項７５】
前記RNAウィルスが、一本鎖RNAウィルスである、請求項６９に記載のワクチン組成物。
【請求項７６】
前記一本鎖RNAウィルスが、ポジティブ・センスRNAウィルスである、請求項７０に記載のワクチン組成物。
【請求項７７】
前記一本鎖RNAウィルスがネガティブ・センスRNAウィルスである、請求項７０に記載のワクチン組成物。
【請求項７８】
前記RNAウィルスが二本鎖RNAウィルスである、請求項７０に記載のワクチン組成物。
【請求項７９】
前記二本鎖RNAウィルスがポジティブ鎖RNAウィルスである、請求項７８に記載のワクチン組成物。
【請求項８０】
前記二本鎖RNAウィルスがネガティブ鎖RNAウィルスである、請求項７８に記載のワクチン組成物。
【請求項８１】
前記ウィルスがDNAウィルスである、請求項７０に記載のワクチン組成物。
【請求項８２】
前記DNAウィルスが一本鎖DNAウィルスである、請求項８１に記載のワクチン組成物。
【請求項８３】
前記DNAウィルスが二本鎖DNAウィルスである、請求項８１に記載のワクチン組成物。
【請求項８４】
あるウィルス集団中のゲノムの安定性を特定する方法であって、
前記集団の充分な数の分離ウィルスを由来とする一つ以上のウィルス遺伝子の核酸又はポリペプチド配列を得るステップと、
前記分離ウィルス中の組換え型ウィルス配列の数を比較するステップと
を含み、この場合、異なるウィルス配列の数が多い程、前記ウィルスゲノムの不安定性が大きい、方法。
【請求項８５】
あるウィルス集団中のゲノムの安定性を特定する方法であって、
前記集団の充分な数の分離ウィルスを由来とする一つ以上のウィルス遺伝子の核酸又はポリペプチド配列を得るステップと、
前記分離ウィルス中のウィルス配列間の多様性を比較するステップと
を含み、この場合、多様性が大きい程、前記ウィルスゲノムの不安定性が大きい、方法。
【請求項８６】
ウィルスに対して対象を免疫する方法であって、
ゲノムが同一でない核酸配列から構成されているような２つのウィルス株のコピーチョイス機序に従った組換えにより作製された、変異型後代ウィルス株又はその抗原もしくは抗原部分を対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項８７】
ウィルスに対して対象を免疫する方法であって、
あるウィルス集団中の親ウィルス株を判定するステップと、
前記親ウィルス株に、コピーチョイス機序に従った組換えを起こさせて変異型後代ウィルス株を生じさせるステップと、
前記親ウィルス株、又は変異型後代ウィルス株、又はそれらの抗原もしくは抗原部分を、対象を免疫するのに充分な量、投与するステップと
を含む、方法。
【請求項８８】
親インフルエンザ株及び変異型後代インフルエンザ株を含む、あるインフルエンザ・ウィルス集団中の親インフルエンザ株を特定する方法であって、
ａ）前記集団から、ある数の分離インフルエンザ株を由来とする一つ以上のインフルエンザ遺伝子の核酸又はポリペプチド配列を得るステップであって、前記数は、前記集団中で優勢なインフルエンザ株、前記集団中で配列分岐を有するインフルエンザ株、又は両者、の特定が可能なものである、ステップと、
ｂ）前記集団中で優勢なインフルエンザ株、前記集団中で配列分岐を持つインフルエンザ株、又は両者、を特定するステップと
を含み、前記インフルエンザ株、又は前記配列分岐を持つインフルエンザ株が親インフルエンザ株である、方法。
【請求項８９】
インフルエンザワクチンを作製する方法であって、
請求項８８に従って特定された親インフルエンザ株にホスト動物を感染させるステップと、
前記ホスト動物から変異型後代インフルエンザ株を分離するステップと
を含む、方法。
【請求項９０】
インフルエンザ・ウィルスに対して対象を免疫する方法であって、
第一親インフルエンザ株の代表である第一インフルエンザ・ウィルスと、第二親インフルエンザ株の代表である第二インフルエンザ・ウィルスとを、前記対象を免疫するのに充分な量、対象に投与するステップを含み、前記第一及び第二親インフルエンザ株が、請求項８８に記載の方法に従って特定されたものである、方法。
【請求項９１】
ゲノムが同一でない核酸配列から構成されているような２つのインフルエンザ株のコピーチョイス機序に従った組換えにより作製された変異型後代インフルエンザ株又はその抗原もしくは抗原部分を含むワクチン組成物。
【請求項９２】
あるコロナウィルスウィルス集団中で親コロナウィルス株を特定する方法であって、
前記集団が、親コロナウィルス株及び変異型後代コロナウィルス株を含み、
ａ）前記集団から、ある数の分離コロナウィルス株を由来とする一つ以上のコロナウィルス遺伝子の核酸又はポリペプチド配列を得るステップであって、前記数は、前記集団中で優勢なコロナウィルス株、前記集団中で配列分岐を有するコロナウィルス株、又は両者、の特定が可能なものである、ステップと、
ｂ）前記集団中で優勢なコロナウィルス株、前記集団中で配列分岐を持つコロナウィルス株、又は両者、を特定するステップと
を含み、前記優勢なコロナウィルス株、又は前記配列分岐を持つコロナウィルス株が親インフルエンザ株である、方法。
【請求項９３】
コロナウィルスワクチンを作製する方法であって、
請求項９２に従って特定された特定された親コロナウィルス株に、ウィルス複製を支援することのできるホスト動物細胞、細胞株、卵細胞、昆虫細胞、細菌細胞、又は細胞抽出物を感染させるステップと、
前記細胞又は細胞抽出物から変異型後代コロナウィルス株を分離するステップと
を含む、方法。
【請求項９４】
コロナウィルスウィルスに対して対象を免疫する方法であって、
第一親コロナウィルス株の代表である第一コロナウィルスウィルスと、第二親コロナウィルス株の代表である第二コロナウィルスウィルスとを、前記対象を免疫するのに充分な量、対象に投与するステップを含み、前記第一及び第二親コロナウィルスウィルス株が、請求項８８に記載の方法に従って特定されたものである、方法。
【請求項９５】
ゲノムが同一でない核酸配列から構成されているような２つのコロナウィルス株のコピーチョイス機序に従った組換えにより作製された変異型後代コロナウィルス株又はそれを由来とする抗原もしくは抗原部分を含むワクチン組成物。
【請求項９６】
細胞又は動物を、２つの同一でないウィルス株に感染させるステップと、
コピーチョイス機序に従って前記同一でないウィルス株の組換えを起こさせるステップと
を含み、それにより変異型後代ウィルス株を作製する、ウィルスワクチン製造用の変異型後代ウィルス株を作製する方法。
【請求項９７】
前記ホスト細胞又は動物から変異型後代ウィルス株を分離するステップを更に含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記同一でないウィルス株が異なるウィルス由来である、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
異なるウィルスを由来とする前記同一でないウィルス株が、インフルエンザ及びエボラを由来とする、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
ワクチンの効験を判定する方法であって、
ウィルスワクチンで処理してある集団から、ある数の分離ウィルス株由来の一つ以上のウィルス遺伝子の核酸又はポリペプチド配列を得るステップであって、前記数は、前記集団中の変異型後代ウィルス株の数を斟酌するのに充分なものである、ステップを含み、この場合、異なる変異型後代ウィルス株配列の数が少ない程、前記ワクチンの効験が高い、方法。
【請求項１０１】
あるウィルス集団中の遺伝子多様性を観察することにより、ウィルスワクチンの効験を判定する方法であって、
ウィルスワクチンによる処理前及び処理後に、前記集団から充分な数の分離ウィルスを由来とする一つ以上のウィルス遺伝子の核酸又はポリペプチド配列を得るステップと、
処理前に分離されたウィルス中の変異型ウィルス後代株の数を、処置後に分離された変異型ウィルス後代株の数と比較するステップと
を含み、この場合、配列の遺伝子多様性の減少が、前記治療の効験の指標である、方法。
【請求項１０２】
ウィルス株のライブラリを作製する方法であって、
細胞又はホスト動物を２つ以上のウィルス株に感染させるステップと、
前記ウィルス株に、コピーチョイス機序により組換えを起こさせるステップと
を含み、それによりウィルス株のライブラリを生じさせる、方法。
【請求項１０３】
前記細胞又はホスト動物からウィルス株のライブラリを分離するステップを更に含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
抗ウィルス耐性ウィルスの遺伝子型を予測する方法であって、
抗ウィルス性化合物で処理してある細胞又はホスト動物を、２つ以上の親ウィルス株に感染させるステップと、
前記ウィルス株にコピーチョイス機序により変異型ウィルス後代株を生じさせるステップと、
前記変異型後代ウィルス株を前記細胞又はホスト動物から分離するステップと
を含み、分離された変異型後代ウィルス株が、前記抗ウィルス性化合物で処置された被感染対象集団で生じるであろう抗ウィルス耐性ウィルス株の指標である、方法。
【請求項１０５】
親ウィルス株と、コピーチョイス組換え機序を通じて前記親ウィルス株から生じた変異型後代ウィルス株とを含む、あるウィルス集団中の親ウィルス株を特定する方法であって、
ａ）前記集団中で優勢なウィルス株、又は、前記集団中で配列分岐を有するウィルス株、あるいは両者、の特定が可能な充分な数の、前記集団から分離されたウィルス株を由来とする一つ以上のウィルス遺伝子の核酸又はポリペプチド配列を得るステップと、
ｂ）前記集団中で優勢なウィルス株、又は、前記集団中で配列分岐を有するウィルス株、あるいは両者、を特定するステップであって、前記優勢なウィルス配列又は配列分岐を持つウィルス配列が親ウィルス株として特定される、ステップと
を含む、方法。
【請求項１０６】
ウィルスワクチン製造用の変異型後代ウィルス株を作製する方法であって、
細胞又は動物を２つの同一でないウィルス株に感染させるステップと、
前記同一でないウィルス株に、コピーチョイス機序に従って組換えを起こさせるステップと、
前記集団から変異型後代ウィルス株を選抜するステップと、
を含み、それにより、ウィルスワクチン製造用の変異型後代ウィルス株を作製する、方法。
【請求項１０７】
変異型後代ウィルス株が、判定可能な表現型又は遺伝子型に基づいて分離される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記観察可能な表現型が、組換え、菌力、及び向性から成る群より選択される、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
変異型後代ウィルス株中の一つ以上の遺伝子の配列を予測する方法であって、
親ウィルス株から一つ以上の遺伝子の配列を得るステップと、
可能な組換え事象の位置を判定するステップと
を含み、それにより、変異型後代ウィルス株中の一つ以上の遺伝子の配列を予測する、方法。
【請求項１１０】
前記ウィルス株が、インフルエンザ・ウィルス株、コロナウィルス株、及びHIVウィルス株から成る群より選択される、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記変異型後代ウィルス株の予測された配列を用いて、前記ウィルスに対するワクチンを開発するステップを更に含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１２】
変異型後代ウィルス株を作製する方法であって、
細胞又は動物を２つ以上の同一でないウィルス株に感染させるステップと、
前記同一でないウィルス株に、コピーチョイス機序に従って組換えを起こさせるステップと
を含み、それにより、変異型後代ウィルス株を作製する、方法。
【請求項１１３】
前記変異型後代ウィルス株を分離するステップを更に含む、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
ある組換え遺伝子集団を作製する方法であって、
細胞に２つ以上の同一でない遺伝子コピーを導入するステップと、
前記遺伝子に組換えを起こさせるステップと
を含み、それにより、組換え遺伝子集団を作製する、方法。
【請求項１１５】
前記組換えがコピーチョイス機序を通じて起きる、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記組換え遺伝子集団の一つ以上のメンバーを分離するステップを更に含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１７】
組換え型DNA分子を作製する方法であって、
２つの同一でない遺伝子コピーを細胞に導入するステップと、
組換え後のDNA分子が、前記２つの同一でない遺伝子コピーのそれぞれを由来とするDNA配列の一部分を有するように、前記遺伝子にコピーチョイス組換えを通じて組換えを起こさせるステップと
を含む、方法。
【請求項１１８】
前記遺伝子が植物遺伝子である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記遺伝子が動物遺伝子である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２０】
前記遺伝子がウィルス遺伝子である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２１】
前記遺伝子が異種遺伝子又はその断片である、請求項１１７乃至１２０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２２】
多数の組換えウィルス後代株に対して動物を免疫するために有効なウィルスワクチン。
【請求項１２３】
組換えウィルス後代株に対して有効なウィルスワクチン。
【請求項１２４】
組換えウィルス後代株に対して有効なウィルスワクチンであって、前記組換えウィルス後代株が異なる血清型を持つ親ウィルス株を由来とする、ウィルスワクチン。
【請求項１２５】
前記親ウィルス株血清型がH1N1、H1N2、H2N2、H3N2、H5N1、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2、及びH3N8から成る群より選択される、請求項１２４に記載のウィルスワクチン。
【請求項１２６】
ａ）２つ以上の同一でないウィルス株配列を選択するステップと、
ｂ）前記選択された株配列からコピーチョイス組換え機序を通じて生じる後代ウィルス株配列を予測するステップと
を含み、その結果後代ウィルス株配列が予測される、２つ以上のウィルス株の配列から後代ウィルス株配列を予測する方法。
【請求項１２７】
前記方法が、少なくとも一つの後代ウィルス株に対するワクチンを生じさせるステップを更に含む、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記方法が、前記ワクチンを対象に投与するステップを更に含む、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
組換え型DNA分子の配列を予測する方法であって、
ａ）２つの同一でない遺伝子コピーを選択するステップと、
ｂ）選択された遺伝子の、コピーチョイス組換え機序を通じた組換えをモデリングするステップと
を含み、その結果、組換え型DNA分子の配列が予測される、方法。
【請求項１３０】
２つ以上のウィルス株の配列から組換え後代ウィルス株配列を特定する方法であって、
ａ）２つ以上のウィルス株配列を選択するステップと、
ｂ）コピーチョイス組換えを通じて生じる後代ウィルス株配列を特定するステップと
を含み、その結果、組換え後代ウィルス株配列が特定される、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願
本出願は、引用をもってその内容全体をここに援用することとする、２００４年７月２日に提出された米国仮出願60/585,306号；２００４年７月１３日に出願された米国仮出願60/587,580号；２００４年７月２１日に提出された米国仮出願 60/590,162号；及び、２００５年６月１６日に提出された米国仮出願 60/xxx,xxx 号に基づく優先権を主張するものである。
【０００２】
本出願全体を通じて引用された全参考文献、特許及び公開済み特許出願の内容全体を、引用をもってここに援用することとする。
【０００３】
背景
ヒト及び動物の疾患を理解したり、病原体の遺伝子特性を決定したりするための分子遺伝学の進展に目覚しい成果があるにも係わらず、将来の疾患及び病原体の病原性を予測又は予後するための規則は依然、定義しにくい。典型的には、疾患（又は疾患易罹患性）に至る細胞ゲノムの遺伝子変化や、又は、病原性の病原体の遺伝子配列は、事後に採集され、分類された後に、診断や治療薬の決定に用いられる。従って、遺伝性疾患（又は疾患易罹患性）及び／又は病原体に罹患している対象のゲノム不安定性の続発症への治療上の対応は、典型的には、前行的ではなく反応的である。これは特に、ウィルスなどの病原体に対するヒト及び動物の応答を治療するなどの際に特に真実である。
【０００４】
ウィルスワクチンの開発により、近代医学に特有の課題が出てきた（例えばAult, A. (2004) Science,
303:1280を参照されたい）。 多くの病原体、特にウィルスは常に進化しているため、有効なワクチンの開発はしばしば困難であり、また不完全なプロセスである。ウィルスゲノムの将来的な分子進化の予測の信頼性が高くなれば、このような病原体と予防上及び治療上の両方で闘う人類の能力が進歩するだろうと期待してよいだろう。
【０００５】
ウィルスは最も小さな寄生生物であり、その増殖は感染先の細胞に完全に依存している。ヒトに感染するウィルスの中の多くが、顕性の症状なしでそれらのホストに感染するが、他のもの（例えばインフルエンザ）はよく特徴付けられた一組の症状を生じる。重要なことに、症状は感染した株の病原性によって様々であるが、同一のウィルス株が、ホストの健康及び免疫応答によっては、劇的に異なる効果を有することがある。
【０００６】
ヒト及び動物の疾患だけでなく、ウィルスなどの病原体の進化を理解するには、ゲノム不安定性につながる分子事象のより深い理解が必要である。実際に、病原体ゲノムの分子進化を予測できれば、抗病原体薬のデザインが向上するであろうと広く期待できよう。
【０００７】
発明の概要
本発明は、真核細胞、原核細胞、及びウィルスを含む幅広い種類の生物で、ゲノムの不安定性が、コピーチョイス組換えと呼ばれる、新らに明らかになった機序の働きとして起きるという発見に、少なくとも部分的に基づくものである。これまでランダム変異、遺伝子の転座、及び／又は、遺伝子アソートメントがウィルス遺伝子進化の主な機序であると考えられてきた。実際、最近まで、ウィルスの進化は、ウィルスゲノム中の小さな変異の蓄積が原因だと主に考えられてきた。しかしながら、この機序では、ウィルスの進化のうちのごく小さな部分しか説明できない。
【０００８】
ここで解説する新たに明らかになった機序は、細胞又は生物上の脈絡で二つ以上の遺伝子配列同士の間で遺伝子変異が獲得されることに説明を付けることができる。従って、ここで開示する機序は、多細胞生物、真核細胞、原核細胞、病原体、微生物、特にウィルスにおいて起こり得る変異を予測するものである。
【０００９】
理論に縛られる訳ではないが、本発明では、例えばポリメラーゼのプルーフ・リーディングエラー、自発的点変異等に基づくde novoでの遺伝子変異の導入を通じてではなく、遺伝子コピーの組換え、即ちここでコピーチョイス組換えと言及するものによる、既存の配列の組換え又は獲得に基づく遺伝子進化機序を紹介する。
【００１０】
この遺伝子変化機序は、真核細胞、原核細胞、病原体、微生物、ウィルス等のゲノム中の遺伝子変化を予測することのできる予測規則を提供するために、用意に利用することができる。従って、あるゲノム中で現れる遺伝子変化の可能性が分かれば、事前介入、即ち、遺伝性疾患又は異常や、あるいは、病原性株などの病原体株の出芽又は出現の予測又は予後が可能になるため、治療を合理的にデザインすることができる。
【００１１】
本発明の予測規則、即ちコピーチョイス組換え、には、例えば１）遺伝子変化は、より高等真核ゲノム配列で文献化されたハプロタイプに似た路で得られるという予測、２）遺伝子変化が典型的には高頻度の核酸塩基転位を含むという予測、及び／又は３）遺伝子変化は、親核酸配列を由来とする既存の遺伝子配列から得られるという予測、がある。
【００１２】
ある実施態様では、本発明の予測規則を用いて、対象の疾患又は異常の可能性あるいはファーマコゲノミック学的応答性を予測することにより、ヒト又は動物の健康を向上させることができる。
【００１３】
別の実施態様では、本発明の予測規則を用いて、病原性のウィルス株など病原体の出現又は出芽の可能性を予測することで、例えば抗ウィルス薬及び／又はワクチン（例えば受動的又は能動的ワクチン）などの抗病原体薬の投与などにより、治療的介入を可能にしてヒト又は動物の健康を向上させることができる。
【００１４】
別の実施態様では、本発明は、急速な進化に対する選択的圧力を定義及び解明するために用いることのできる、親ウィルス株とそれらの変異型後代ウィルス株との比較を提供する。組換え型の特定を用いて、インフルエンザなど、世界中で多くのウィルスに現在見られる遺伝子不安定性を特定することができる。更に親ウィルスを用いて、フィールド内分離株を検出する前に組換え型を作製することもでき、そしてこのような組換え型を用いて、畜産及びヒトの健康に著しい破壊を起こす将来の組換え型に対して防御的ワクチンを作製することができる。
【００１５】
更に別の実施態様では、本発明は、例えば単一のホスト生物内で別個の「親」ウィルス又は細菌（例えばエボラ、インフルエンザ及び／又はHIV；手足及びニューカッスル病；SARS、HIV及び／又はアストロウィルス；HIV及びコロナウィルス；別個の薬剤耐性細菌株など）が混合することで生じる遺伝子組成及び選択的には随伴する表現形質（例えば薬剤耐性）を予測するなどに、応答することのできる規則を提供するものである。
【００１６】
更に別の実施態様では、本発明は、例えばウィルスワクチンの製造や、又は、抗ウィルス性化合物の検査などで用いられる多様なウィルス配列のライブラリを作製する方法を提供する。更に本発明は、親ウィルス株を特定する方法も提供する。
【００１７】
更に本発明は、ウィルスワクチンの効験を観察するため、そしてあるウィルス集団の多様性を観察するための方法も提供する。
【００１８】
従って、本発明は、限定はしないが、以下を含むいくつかの長所を有する：
−真核生物、原核生物、及び病原体で起きる又は起きる可能性のある遺伝子変化の性質を判定するため、そして将来の遺伝子変化を予測するための規則を提供する；
−ヒト又は動物での遺伝子変化、及び／又は、ヒト又は動物のファーマコゲノミックス上の応答性、を予後する方法を提供する；
−ヒト又は動物中で調節するために適した遺伝子配列を決定し、それにより疾患又は異常を防止又は治療する方法を提供する；
−治療的介入のための合理的な候補病原体を特定する方法；及び
−ウィルス病原体などの病原体ターゲットに対するワクチン及びワクチン開発に関する方法及び組成物；
−H5N2、H5N1、H7N2、H7N3、H7N7、H1N1、H9N2、WSN/33、H6N1、H1N2、H2N2、H3N2、H3N8 及びH2N9などのインフルエンザの病原性株など、インフルエンザに対するワクチン及びワクチン開発に関する方法及び組成物。
【００１９】
本発明の他の特徴及び長所は以下の詳細な説明及び請求項から明白であろう。
【００２０】
詳細な説明
本明細書及び請求項が明確に理解されるように、便宜上、以下の定義を提供する。
【００２１】
定義
用語「親ウィルス株」は、ある集団中で遺伝物質をその集団中の変異型後代ウィルス株にコピーチョイス組換え機序を通じて供給する２つ以上のウィルス株を意味するものと、意図されている。この親ウィルス株とは、最近（例えば１ヶ月以内、２ヶ月以内、３ヶ月以内、６ヶ月以内、１２ヶ月以内、又はそれ以上など）分離されたウィルス集団中に存在する２つ以上のウィルス株である。ある局面では、親ウィルス株は、ある集団中で最も優勢な配列である。別の局面では、親ウィルス株は、ある集団中で最も多様な配列である。
【００２２】
ここで用いられる用語「変異型後代ウィルス株」は、親ウィルス株を由来とするウィルス後代を意味するものと、意図されている。ある実施態様では、変異型後代ウィルス株は、親株の提供する遺伝物質を用いたコピーチョイス組換え機序により、生まれる。ある実施態様では、変異型後代ウィルス株は、例えばヌクレオチド配列、ポリペプチド配列、菌力、ホスト範囲又は向性など、一つ以上の所望の基準に基づいてあるウィルス集団から分離される。
【００２３】
同様に、用語「親細菌株」は、ある集団中で遺伝物質をその集団中の変異型後代細菌株にコピーチョイス組換え機序を通じて供給する２つ以上の細菌株を意味するものと、意図されている。親細菌株は、最近（例えば１ヶ月以内、２ヶ月以内、３ヶ月以内、６ヶ月以内、１２ヶ月以内、又はそれ以上など）分離された細胞集団中に存在する２つ以上の細菌株である。ある局面では、親細菌株は、ある集団中で最も優勢な配列である。別の局面では、親細菌株は、ある集団中で最も多様な配列である。
【００２４】
同様に、ここで用いられる場合の用語「変異型後代細菌株」は、親細菌株を由来とする細菌後代を意味するものと、意図されている。ある実施態様では、変異型後代細菌株は、親株の提供する遺伝物質を用いたコピーチョイス組換え機序により、生まれる。ある実施態様では、変異型後代細菌株は、例えばヌクレオチド配列、ポリペプチド配列、薬物耐性、病原性、感染性など、一つ以上の所望の基準に基づいてある細菌集団から分離される。
【００２５】
ここで用いられる場合の用語「コピーチョイス組換え」は、後代ウィルス又は細菌株が、２つ以上の親ウィルス株に感染した細胞又は生物で作られ、この後代の遺伝物質が、親株の遺伝物質の混合物であるようなウィルス又は細菌組換え機序を意味するものと、意図されている。機序に縛られる訳ではないが、コピーチョイス事象は、ある一片のDNA又はRNAの複製中に、ある一つの親のDNA又はRNAで開始し、第二の親由来のDNA又はRNAに切り換わるDNA又はRNA複製機序を原因とする。このプロセスは、１回又は複数回起き得るため、２つの親株の混合物であるDNA又はRNA配列を有する後代ウィルス又は細菌が生まれる場合がある。
【００２６】
後代配列など、コピーチョイス組換えにより生ずる配列は、２つのヌクレオチド分以内か、又はそれ以上、例えば3-5、5-10、10-100、100-1kb、1kb-10kb、10kb分又はそれ以上あるいはこれらのいずれかの範囲分又は中間分などのある長さの核酸に渡って、典型的には２本以上の核酸鎖の間で起きるコピーチョイス組換えなどの組換えにより、親配列に比較して、例えば2-5、5-10、10-20、20-50、50-100、100-500、500 箇所又はそれ以上の箇所など、一箇所以上のヌクレオチド変化を含む、いずれの数のヌクレオチド変化をも含む場合がある。
【００２７】
ここで用いられる場合の用語「遷移／転換」は、ある配列がプリンのプリンへ、又は、ピリミジンのピリミジンへの置換などの遷移を有する回数、対、その配列がプリンのピリミジン、又はピリミジンのプリンへの転換を有する回数、の比を指すものとして、意図されている。ランダム・プロセスであればこの比は0.5と予測できよう。しかしながら、多数のデータ・セットを見てこの比はしばしば２以上であると判断されており、このプロセスはランダムではなく、転換よりも遷移が起き易いことが示唆されている（実施例を参照されたい）。
【００２８】
本発明は、少なくとも部分的には、de novo変異ではなく組換えがウィルス進化の駆動力であるという驚くべき観察に基づくものである。インフルエンザの後代株が、事実上、インフルエンザの分岐「親」株からのハプロタイプを由来としているというこの観察により、２つ以上の異なるウィルス株（又は、インフルエンザ及びHIVなどの異なる種類のウィルス、あるいは異なる細菌株）に一個の細胞又は生物が二重感染するとウィルス進化が加速する場合があることが分かる。従って本発明は、このような実世界又は制御された混合条件の結果を予測する規則を提供するものである。本発明のいくつかの局面では、これらの規則を、ある集団中で優勢なインフルエンザ株の遺伝的構成の知見（選択的にはリアルタイムの知見）に基づき、最適なウィルスターゲットの代表である後代インフルエンザ株を予測するために応用することができる。
【００２９】
更なる局面では、本発明の規則を、少なくとも２つの親細菌株を由来とする後代細菌株のゲノム組成、及び／又は、薬物耐性などの表現形質の予測を可能にするために応用してもよい。その後、このような細菌を、例えばその後の薬物スクリーニングステップなどで用いることもできる。
【００３０】
ある局面では、本発明は、親ウィルス株及び変異型後代ウィルス株を含むあるウィルス集団中で、親ウィルス株を特定する方法を提供するものであり、本方法は、該集団中で最も優勢なウィルス株、又は、該集団中で最も大きな配列分岐を有するウィルス株、あるいは両者、の特定が可能な充分な数の、該集団から分離されたウィルス株を由来とする一つ以上のウィルス遺伝子の核酸又はポリペプチド配列を得るステップと、該集団中で最も優勢なウィルス株、又は、該集団中で最も大きな配列分岐を有するウィルス株、あるいは両者、を特定するステップであって、前記最も優勢なウィルス配列又は最も大きな分岐を有するウィルス配列が親ウィルス株であるステップとを含む。
【００３１】
ある実施態様では、親ウィルス株は、当該集団中で最も優勢な２つの配列である。別の実施態様では、親株は、最も大きな配列分岐を持つ２つの株である。
【００３２】
ある実施態様では、本発明の方法で用いられるウィルスは、親及び変異型後代ウィルス株の特定が可能な充分な時間からのものである。例えば、分離されたウィルスを本発明の方法で用いることのできる時間は、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年、又はそれ以上であるかも知れない。ある例示的な実施態様では、本発明で用いられるウィルスは、例えばインフルエンザ・シーズンなど、一つの流行シーズンからである。
【００３３】
別の実施態様では、本発明の方法は、例えば感染したホストが相互作用する可能性が相当にあるものなど、定義された地理的区域からのウィルスを用いるものである。例えば定義された地理的区域は東南アジア、又は米国本土である。
【００３４】
ある関連する実施態様では、最も優勢なウィルス配列、又は、最も大きな配列分岐を持つウィルス配列、を、複数の核酸又はポリペプチド配列をアライメントすることで判定する。別の関連する実施態様では、変異型後代ウィルス株を、コピーチョイス機序に従った組換えにより、形成する。
【００３５】
配列のアライメントは、数学的アルゴリズムなどを用いて行うことができる。ある実施態様では、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを、GCGソフトウェア（http://www.gcg.comで入手可能）のGAPプログラムに組み込まれたNeedleman and Wunsch (J. Mol. Biol.
48:444-453 (1970)) アルゴリズムを、Blossom
62 マトリックス又はPAM250 マトリックスのいずれかを用い、ギャップ・ウェイトを16、14、12、10、8、6、又は4に、そしてレングス・ウェイトを1、2、3、4、5、又は 6にして判定する。更に別の実施態様では、２つのヌクレオチド間の同一性パーセントをGCG ソフトウェア・プログラム（http://www.gcg.comで入手可能）中のGAPプログラムを用い、NWSgapdna.CMP マトリックスを用いて、ギャップ・ウェイトを 40、50、60、70、又は80 にし、そしてレングス・ウェイトを1、2、3、4、5、又は6にして判定する。別の実施態様では、２つのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列間の同一性パーセントを、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に取り入れられた E. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)) のアルゴリズムを用い、PAM120 ウェイト残基表を用いて、ギャップ・レングス・ペナルティを12 にし、そしてギャップ・ペナルティを4にして判定する。
【００３６】
更に、データベース中に預託されたウィルス配列を自動的に比較することで、ある集団中の配列同一性を決定する、配列アライメントプログラム・ベースのアルゴリズムを開発することができる。バイオインフォーマティクス法を用いて配列多様性の量を時間及び位置の関数として観察すれば、医療従事者が彼らの介入、即ち免疫処理、の努力をいつ、増すべきかを知らせることができる。バイオインフォーマティクス法は、HIV又はインフルエンザなど、人手では、例えば日時又は位置などでアライメント及び／又は分類の難しいであろう大規模なデータベースがある場合のウィルス集団に特に有用であろう。
【００３７】
バイオインフォーマティクスを用いると、あるウィルス集団中の親ウィルス株を判定する、及び／又は、あるウィルス集団中の変異型ウィルスを判定することが、例えば同一でないヌクレオチド又はアミノ酸の数及び／又は位置などにより、それぞれ核酸又はポリペプチド配列を分類することで可能である。
【００３８】
別の局面では、バイオインフォーマティクスを用いてウィルス配列のデータベースを評価することで、ウィルス遺伝子配列中の歴史的に有意な配列のばらつきを特定することができる。前に特定されたことなる配列多型の出現は、コピーチョイス組換えの指標である。機序に縛られる訳ではないが、ある期間にわたって観察されたことのなかった配列多型があるウィルス集団中に出現することは、２つのウィルス間でコピーチョイス組換えがあったことの兆候である。この方法により、当業者であれば、例えば感染性が高いなどの問題を有すると思われる変異型後代ウィルス株をin silicoで特定することができよう。更に、ある地理的区域には通常見られない公知の配列多型の存在について、データベース中のウィルス配列を解析すると、コピーチョイス組換えが起きたことが分かる。
【００３９】
ある局面では、本発明の方法で、変異型後代ウィルス株中の複数の乗り換え点を特定するためにコンピュータ・ベースのプログラムを用いてもよい。遺伝子の中には、コピーチョイス組換えで形成される乗換え点の数を多い（しばしば遺伝子一つ当たり１０乃至１００箇所の乗り換え点）ために、乗り換え点の精確な位置を判定するにはコンピュータ・アルゴリズムが有用なツールとなるものがあるであろう。これらのコンピュータ・アルゴリズムは、変異型後代ウィルス株を生じた親ウィルス株中の乗り換え位置を判定するために、大規模なウィルス配列データベースを比較するものでもよい。これらの位置の正確なマッピングを、多様な多型の解析と組み合わせると、当業者であれば、現在用いられている血清型分類ではなく、遺伝子型に基づいてウィルスを分類することができよう。
【００４０】
ある実施態様では、コピーチョイス組換え機序をリアソートメントと組み合わせて変異型後代ウィルス株を作製することができる。別の実施態様では、リアソートメントなしのコピーチョイス組換えで変異型ウィルス後代株を作製する。
【００４１】
更に、 in vitro 又は in vivo 技術を用いて、集団中の異なるウィルス由来の個々の遺伝子を選択的に組み換えて、変異型ウィルス後代ウィルスを生じさせることができる。例えば、あるウィルス集団を由来とする多数の遺伝子を、配列アライメントなどを用いて解析することができる。当業者であれば、所望の配列を持つ遺伝子をこの集団から分離し、それらの遺伝子を用いてホスト細胞、卵、又は動物を感染させて、所望の組の組換え型を生じさせることができる。この状況では、ホストを感染させるために用いられる遺伝子は、多数の異なるウィルス（例えば3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 又はそれ以上の異なるウィルス）を由来とすることができる。
【００４２】
本発明のある局面では、本発明の方法を、対象に感染するいずれかのウィルスと一緒に用いることができる。用語「対象」には、ウィルス感染を有することのできる生物が包含されるものと、意図されている。対象の例には、哺乳動物、例えばヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット、及び非ヒトトランスジェニック動物、又は鳥類、例えばアヒル、ニワトリ、ガチョウ及び白鳥など、がある。いくつかの実施態様では、対象はヒトである。同様に、用語「ホスト」には、例えばヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラットなどの哺乳動物などや、アヒル、ニワトリ、ガチョウ及び白鳥などの鳥類や、非ヒトトランスジェニック動物など、コピーチョイス組換え等で組み替えられたウィルス株、ヌクレオチド配列を持つ生物が包含されるものと、意図されている。
【００４３】
ある実施態様では、当該ウィルスはRNAウィルスである。ある実施態様では、該RNAウィルスは、一本鎖RNAウィルスである。ある実施態様では、該一本鎖RNAウィルスは、ポジティブ・センスRNAウィルスである。別の実施態様では、該一本鎖RNAウィルスはネガティブ・センスRNAウィルスである。ある関連する実施態様では、該RNAウィルスは、二本鎖RNAウィルスである。ある関連する実施態様では、該二本鎖RNAウィルスは、ポジティブ鎖RNAウィルスである。別の実施態様では、該二本鎖RNAウィルスはネガティブ鎖RNAウィルスである。
【００４４】
別の実施態様では、当該ウィルスはDNAウィルスである。ある実施態様では、該DNAウィルスは一本鎖DNAウィルスである。別の実施態様では、該DNAウィルスは二本鎖DNAウィルスである。
【００４５】
ある実施態様では、当該ウィルスはインフルエンザ・ウィルスである。別の実施態様では、当該ウィルスはコロナウィルス、例えばSARS CoVなどである。
【００４６】
ある実施態様では、当該たんぱく質又は核酸配列はインフルエンザ・ウィルス由来である。
【００４７】
ある実施態様では、該インフルエンザ核酸又はポリペプチド配列は、HA、NA、NP、PA、PB1、PB2、MP、及びNS、又はこれらの組み合わせから成る群より選択される。ある実施態様では、本核酸又はポリペプチド配列は、分離されたウィルス株を配列決定することにより、得られる。別の実施態様では、当該の配列は、対象（例えばヒト又は動物）又は組織試料から単離された核酸分子を配列決定することにより、得られる。別の実施態様では、当該の核酸又はポリペプチド配列は、公共で入手可能なデータベースから得られる。いくつかの実施態様では、充分な数とは5、10、20、30、40、50 又はそれ以上のウィルス配列である。
【００４８】
ある実施態様では、前記の一つ以上のウィルス遺伝子は少なくとも二つ、三つ、四つ又は五つあるいはそれ以上の遺伝子である。
【００４９】
別の局面では、本発明は、ホスト動物、ホスト動物細胞、細胞株、卵細胞、細菌細胞、又は、ウィルス複製を支援する細胞抽出物を、上記の方法に従って特定された親ウィルス株に感染させるステップと、該ホスト動物細胞株、卵細胞、細菌細胞、又は、ウィルス複製を支援する細胞抽出物から、変異型後代ウィルス株を分離するステップとを含む、ウィルスワクチンを作製する方法を提供するものである。
【００５０】
本発明のウィルスワクチンは、例えば生ワクチン、死菌ワクチン、弱毒化ワクチン又はサブユニットワクチンなどであってよい（例えばFields Virology, (1996) Third Edition, Lippencott-Raven Publishers,
Philadelphia, pp. 467-469を参照されたい）。ワクチン作製の更なる例は、例えば Meadors et al. (1986)
Vaccine: 179-184, Poland et al.
(1990) J. Infect. Disease 878-882,
Fenner et al. The Biology of Animal Viruses; New
York, Academic Press, 1974:543-586, Saban et al. (1973)
J. Biol. Stand. 115-118, and Lowrie
et al., DNA Vaccines: Methods and Protocols, Humana
Press, New Jersey, 1999である。
【００５１】
弱毒化した全生物ワクチンは、所望のウィルスの非病原性型を用いるものである。非病原性は、ウィルスを異常な状態で成長させることにより誘導できよう。異常な培地で選抜される変異体は、通常、ホスト内での成長能が限られており、病原性も限られている。弱毒化ワクチンの利点は、その弱毒化した病原体が、疾患をもたらすことなく感染を刺激する点である。ウィルスはまだ生きているため、それは継続的に抗原刺激を与え、記憶細胞が生じるのに充分な時間ができる。更に、細胞媒介性免疫が通常、欲しいようなウィルスの場合、弱毒化病原体は、ホスト細胞内で複製することができる。菌力を起こす遺伝子の一つ以上を取り除くことによりこれらの不都合を避けるために、遺伝子操作技術が用いられつつある。
【００５２】
不活化全生物ワクチンは、死滅しており、ホスト内でそれ以上複製することのできないウィルスを用いるものである。このウィルスは、表面抗原が確実にインタクトのままであるようにしながら、熱又は化学的手段により不活化されている。不活化ワクチンは一般に安全ではあるが、完全にリスク・フリーなわけではない。死んだ生物がホスト内で自身を維持することはできず、また、免疫系により急速に除去されてしまうため、継続的な抗原暴露を生むためには複数回の追加刺激が必要である。
【００５３】
ウィルスにより提示される一つ以上のポリペプチド又はその断片を、ホストで免疫応答を惹起するワクチン中に調合することができる。これらの所謂「サブユニット」ワクチンは、しばしば、全ウィルスワクチンに伴う安全性の懸念を軽減する。
【００５４】
ある関連する実施態様では、本方法は、変異型後代ウィルス株を弱毒化して弱毒化ウィルスワクチンを作製するステップを更に含む。別の実施態様では、本方法は、変異型後代ウィルス株を死滅させて死菌ウィルスワクチンを作製するステップを更に含む。別の実施態様では、本方法は、ウィルス抗原又はその部分を変異型後代ウィルス株から分離して、サブユニットウィルスワクチンを作製するステップを更に含む。
【００５５】
別の実施態様では、本方法は、対象を免疫するのに充分な量の弱毒化ウィルスワクチンを対象に投与するステップを含む、ウィルスに対して対象を免疫する方法を提供するものである。ある実施態様では、当該の対象はヒト等の哺乳動物であり、別の実施態様では、当該の対象は鳥類である。
【００５６】
ある実施態様では、ウィルスに対して対象（例えばヒト又は動物）を免疫する本方法は、対象を免疫するのに充分な量の死菌又は弱毒化ウィルスワクチンを対象に投与するステップを含む。別の実施態様では、本発明は、対象を免疫するのに充分な量のサブユニットウィルスワクチンを対象に投与するステップを含む、ウィルスに対して対象を免疫する方法を提供するものである。ある実施態様では、親株はインフルエンザウィルス株である。別の実施態様では、親株はコロナウィルスウィルス株である。
【００５７】
ある局面では、本発明は、第一親ウィルス株の代表である第一ウィルスと、第二親ウィルス株の代表である第二ウィルスとを、前記対象を免疫するのに充分な量、対象に投与するステップを含み、前記第一及び第二親ウィルス株が、ここで解説された方法に従って特定されたものである、ウィルスに対して対象（例えばヒト又は動物）を免疫する方法を提供するものである。
【００５８】
ある実施態様では、親ウィルス株を、対象への投与前に弱毒化する。別の実施態様では、親ウィルス株を、対象への投与前に死滅させる。別の実施態様では、本方法は、対象への投与前に、ウィルス抗原又はその部分を親ウィルス株から分離してサブユニットウィルスワクチンを作製するステップを含む。
【００５９】
ある実施態様では、親ウィルス株はインフルエンザ・ウィルス株である。別の実施態様では、親ウィルス株はコロナウィルスウィルス株である。
【００６０】
別の局面では、本発明は、ここで解説された方法に従って特定された親ウィルス株、又は、それを由来とする抗原もしくは抗原部分、を含むウィルスワクチン組成物を提供するものである。
【００６１】
ある実施態様では、本ウィルスワクチンは、前記親ウィルス株を由来とする変異型後代ウィルス株、又は、それを由来とする抗原もしくは抗原部分を更に含む。別の実施態様では、本ワクチンは、２つのウィルス株、又は、２つのウィルス株を由来とする抗原もしくは抗原部分を含む。
【００６２】
別の実施態様では、変異型後代ウィルス株又はそれを由来とする抗原もしくは抗原部分を含む本ワクチン組成物を、そのゲノムが同一でない核酸配列から構成されているような２つのウィルス株のコピーチョイス機序に従った組換えにより、作製する。ある実施態様では、前記の２つのウィルス株は、ここで解説された方法に従って特定された親ウィルス株である。
【００６３】
ある実施態様では、変異型後代ウィルス株を、ホスト動物内でのコピーチョイス機序に従った組換えにより、作製する。別の実施態様では、変異型後代ウィルス株を、細胞培養でコピーチョイス機序に従った組換えにより、作製する。
【００６４】
ある実施態様では、ウィルスワクチンを与えるべき対象を、ある集団中の現在のウィルス株の遺伝子型に基づいて決定することができる。同様に、対象に投与すべきワクチンの種類を、ある集団中の現在のウィルス株の遺伝子型に基づいて決定することができる。例えば、現在のウィルス分離株を、それらが有する多型の数で分類することができる。ある実施態様では、前記の多型は、前の流行での分離株で特定されたものである。あるウィルス分離株集団中の配列多型の特定を用いて、暴露時間線を形成することができる。この時間線を用いれば、ウィルス感染への年齢群易罹患性を決定することができる。例えば、１９７０年に多くの多型数が特定された新しい分離株は、１９７０年よりも前に生まれた人には心配が小さいと思われるが、この同じ分離株も、１９７０年より後に生まれた対象では、より重篤な感染を生じるかも知れない。医療従事者は、この時間線に基づいて、どの対象にワクチンを投与すべきか、あるいは、ある対象にどんなワクチンを投与すべきかを決定することができる。
【００６５】
別の局面では、本発明は、あるウィルス集団中のゲノムの安定性を特定する方法を提供するものであり、本方法は、該集団の充分な数の分離ウィルスを由来とする一つ以上のウィルス遺伝子の核酸又はポリペプチド配列を得るステップと、前記分離ウィルス中の組換え型ウィルス配列の数を比較するステップとを含み、この場合、異なるウィルス配列の数が多い程、当該ウィルスゲノムの不安定性が大きい。
【００６６】
別の局面では、本発明は、あるウィルス集団中のゲノムの安定性を特定する方法を提供するものであり、本方法は、該集団の充分な数の分離ウィルスを由来とする一つ以上のウィルス遺伝子の核酸又はポリペプチド配列を比較するステップと、分離ウィルス中の親ウィルス配列間の多様性を比較するステップとを含み、この場合、異なるウィルス配列の多様性が大きい程、当該ウィルスゲノムの不安定性が大きい。
【００６７】
遺伝子安定性を用いて、遺伝子安定性に対する環境又は実験の効果を測定することができる。この測定は能動的にも、又は受動的にも、判定することができる。このように、動物を免疫した後、２つの親株に同時感染させ、その後代を観察して、発生する組換え量を調べることができる。このアプローチを用いれば、あるワクチンが組換え型を減少又は消失させる能力を測定することができる。同様に、異なる時点での天然集団の検定を用いて、組換えに対する環境の効果を測定することができる。遺伝子安定性（又は不安定性）の量を用いれば、顕性の疾患がなくとも積極的な介入が必要な場合を判別することができる。
【００６８】
別の局面では、本発明は、ウィルスに対して対象（例えばヒト又は動物）を免疫する方法を提供するものであり、本方法は、そのゲノムが同一でない核酸配列から構成されているような２つのウィルス株のコピーチョイス機序に従った組換えにより作製された、変異型後代ウィルス株又はその抗原もしくは抗原部分を対象に投与するステップを含む。
【００６９】
別の局面では、本発明は、ウィルスに対して対象（例えばヒト又は動物）を免疫する方法を提供するものであり、本方法は、あるウィルス集団中の親ウィルス株を判定するステップと、前記親ウィルス株に、コピーチョイス機序に従った組換えを起こさせて変異型後代ウィルス株を生じさせるステップと、前記親ウィルス株、又は変異型後代ウィルス株、又はそれらの抗原もしくは抗原部分を、対象を免疫するのに充分な量、投与するステップとを含む。
【００７０】
別の局面では、本発明は、親インフルエンザ株及び変異型後代インフルエンザ株を含む、あるインフルエンザ・ウィルス集団中の親インフルエンザ株を特定する方法を提供するものであり、本方法は、前記集団から、ある数の分離インフルエンザ株を由来とする一つ以上のインフルエンザ遺伝子の核酸又はポリペプチド配列を得るステップであって、前記数は、前記集団中で最も優勢なインフルエンザ株、前記集団中で最も大きな配列分岐を有するインフルエンザ株、又は両者、の特定が可能なものである、ステップと、前記集団中で最も優勢なインフルエンザ株、前記集団中で最も大きな配列分岐を持つインフルエンザ株、又は両者、を特定するステップとを含み、前記最も優勢なインフルエンザ株、又は前記最も大きな配列分岐を持つインフルエンザ株は親インフルエンザ株である。
【００７１】
ある関連する実施態様では、本発明は、インフルエンザワクチンを作製する方法を提供するものであり、本方法は、特定された親インフルエンザ株にホスト動物を感染させるステップと、前記ホスト動物から変異型後代インフルエンザ株を分離するステップとを含む。
【００７２】
ある関連する実施態様では、インフルエンザ・ウィルスに対して対象を免疫する方法を提供するものであり、本方法は、第一親インフルエンザ・ウィルス株の代表である第一インフルエンザ・ウィルスと、第二親インフルエンザ・ウィルス株の代表である第二インフルエンザ・ウィルスとを、前記対象を免疫するのに充分な量、対象に投与するステップを含み、前記第一及び第二親インフルエンザ・ウィルス株は、ここで解説された方法に従って特定されたものである。
【００７３】
ある局面では、本発明は、組換えウィルス株のライブラリを作製する方法を提供するものであり、本方法は、２つ以上のウィルス株にホスト細胞又は動物を感染させるステップと、前記２つ以上のウィルス株のコピーチョイス機序により、前記ウィルスに組換えを起こさせることで、ウィルス株のライブラリを作製するステップとを含む。ある実施態様では、組換えウィルス株の前記ライブラリは、ワクチン作製のための分離株であってよい。
【００７４】
ある関連する実施態様では、前記のウィルス株は異なる種のウィルスであってもよい。例えば第一ウィルスがインフルエンザで、第二ウィルスがSARSなどのコロナウィルスであってもよいであろう。ある関連する実施態様では、ある一つの種のゲノムから、異なる種のゲノムから派生したある一つのDNA配列が特定されれば、このDNAセグメントが、有利な特性、即ち、感染性又は菌力の向上、をこのウィルスにもたらすことの指標となる。これらのDNA領域のターゲティングは、有効な抗ウィルス治療法となるであろう。
【００７５】
ある関連する実施態様では、ウィルス株のライブラリを、抗ウィルス化合物を投与してあるホスト細胞または動物中に作製することができる。ある関連する実施態様では、抗ウィルス化合物の存在下で作製されるウィルス株は、この抗ウィルス化合物で治療された対象の集団で発生するであろう抗ウィルス性の耐性株の指標である。
【００７６】
別の局面では、本発明は、そのゲノムが同一でない核酸配列から構成されているような２つのインフルエンザ株のコピーチョイス機序に従った組換えにより作製された変異型後代インフルエンザ株又はその抗原もしくは抗原部分を含むワクチン組成物を提供するものである。
【００７７】
他の実施態様では、RNAiなど、当業で公知の遺伝子治療法を用いて、ウィルス株を、選択的にはある株特異的及び／又は配列特異的態様で、例えばmiRNA、siRNA、shRNA、又は他のこのような作用物質の使用などを介して、ターゲティングしてもよい。
【００７８】
別の局面では、本発明は、あるコロナウィルスウィルス集団中で親コロナウィルス株を特定する方法を提供するものであり、この場合、前記集団は、親コロナウィルス株及び変異型後代コロナウィルス株を含む。本方法は、前記集団からある数の分離コロナウィルス株を由来とする一つ以上のコロナウィルス遺伝子の核酸又はポリペプチド配列を得るステップであって、前記数は、前記集団中で最も優勢なコロナウィルス株、前記集団中で最も大きな配列分岐を有するコロナウィルス株、又は両者、の特定が可能なものである、ステップと、前記集団中で最も優勢なコロナウィルス株、前記集団中で最も大きな配列分岐を持つコロナウィルス株、又は両者、を特定するステップとを含み、前記最も優勢なコロナウィルス株、又は前記最も大きな配列分岐を持つコロナウィルス株は親インフルエンザ株である。
【００７９】
ある関連する実施態様では、本発明は、コロナウィルスワクチンを作製する方法を提供するものであり、本方法は、特定された親コロナウィルス株にホスト動物を感染させるステップと、前記ホスト動物から変異型後代コロナウィルス株を分離するステップとを含む。
【００８０】
別の局面では、本発明は、コロナウィルスウィルスに対して対象を免疫する方法を提供するものであり、本方法は、第一親コロナウィルス株の代表である第一コロナウィルスウィルスと、第二親コロナウィルス株の代表である第二コロナウィルスウィルスとを、前記対象を免疫するのに充分な量、対象に投与するステップを含み、前記第一及び第二親コロナウィルスウィルス株は、ここで解説された方法に従って特定されたものである。
【００８１】
ある局面では、本発明は、そのゲノムが同一でない核酸配列から構成されているような２つのコロナウィルス株のコピーチョイス機序に従った組換えにより作製された変異型後代コロナウィルス株又はその抗原もしくは抗原部分を含むワクチン組成物を提供するものである。
【００８２】
別の局面では、本発明は、ウィルスワクチン製造用の変異型後代ウィルス株を作製する方法を提供するものであり、本方法は、細胞又は動物を２つの同一でないウィルス株に感染させるステップと、コピーチョイス機序に従って前記同一でないウィルス株の組換えを起こさせることで、変異型後代ウィルス株を生じさせるステップとを含む。ある実施態様では、本方法は、前記ホスト細胞又は動物から変異型後代ウィルス株を分離するステップを更に含む。
【００８３】
ある局面では、本発明は、ワクチンの効験を判定する方法を提供するものであり、本方法は、ウィルスワクチンで処理してある集団から、ある数の分離ウィルス株由来の一つ以上のウィルス遺伝子の核酸又はポリペプチド配列を得るステップであって、前記数は、前記集団中の変異型後代ウィルス株の数を斟酌するのに充分なものである、ステップを含み、この場合、異なる変異型後代ウィルス株配列の数が少ない程、前記ワクチンの効験が高い。
【００８４】
別の実施態様では、本発明は、ある変異型後代ウィルス株中の一つ以上の遺伝子の配列を予測する方法を提供するものであり、本方法は、親ウィルス株を由来とする遺伝子のうちの一つ以上の配列を得るステップと、可能な組換え事象の位置を判定することで、変異型後代ウィルス株中の一つ以上の遺伝子の配列を予測するステップとを含む。ある関連する実施態様では、前記ウィルス株は、インフルエンザ・ウィルス株、コロナウィルス株、及びHIV ウィルス株から成る群より選択される。別の関連する実施態様では、本方法は、前記変異型後代ウィルス株の予測された配列を用いて、前記ウィルスに対するワクチンを開発するステップを更に含む。
【００８５】
別の局面では、本発明は、変異型後代ウィルス株を作製する方法を提供するものであり、本方法は、細胞又は動物を２つの同一でないウィルス株に感染させるステップと、コピーチョイス機序にしたがって前記同一でないウィルス株の組換えを起こさせることで、変異型後代ウィルス株を作製するステップとを含む。ある関連する実施態様では、本方法は、前記変異型後代ウィルス株を分離するステップを更に含む。
【００８６】
ある関連する局面では、本発明は、変異型後代ウィルス株を作製する方法を提供するものであり、本方法は、細胞又は動物を２つ以上の同一でないウィルス（例えばエボラ及びインフルエンザ）に感染させるステップと、コピーチョイス組換え型機序にしたがって前記同一でないウィルスの組換えを起こさせることで、変異型後代ウィルスを作製するステップとを含む。関連する実施態様では、本方法は、前記変異型ウィルスに対するワクチンを分離する及び／又は生じさせるステップを更に含む。
【００８７】
更なる局面では、本発明は、変異型後代細菌株を作製する方法を提供するものであり、本方法は、細胞又は動物を２つ以上の同一でない細菌株に感染させるステップと、コピーチョイス組換え型機序にしたがって前記同一でない細菌株の組換えを起こさせることで、変異型後代細菌株を作製するステップとを含む。ある関連する実施態様では、本方法は、前記変異型後代ウィルス株を分離するステップを更に含む。別の実施態様では、本方法は、変異型後代細菌の表現形質（例えば化合物スクリーニング検定などを通じて評価される薬物耐性など）を評価するステップを更に含む。
【００８８】
ある関連する局面では、コピーチョイス組換えが、シロイヌナズナ（原語：Arabidopsis）などの特定の植物における非メンデル性の遺伝の発生を担う。従って、本発明は、２つ以上の同一でない親植物を提供された植物（例えばシロイヌナズナ）中のコピーチョイス組換えを通じた非メンデル性の遺伝を予測する及び／又は行う方法を提供するものである。
【００８９】
ある関連する局面では、本発明は、変異型後代ウィルス、細菌又は植物の表現形質（例えば菌力、薬物耐性等）を、２つ以上の親ウィルス、細菌又は植物からのコピーチョイス組換えを通じて可能な変異型後代の範囲を評価することにより予測する方法を提供するものである。
【００９０】
別の局面では、本発明は、組換え遺伝子集団を作製する方法を提供するものであり、本方法は、細胞に、ある遺伝子の２つ以上の同一でないコピーを導入するステップと、前記遺伝子の組換えを起こさせることで、組換え遺伝子の集団を作製するステップとを含む。ある関連する実施態様では、前記組換えはコピーチョイス機序を通じて起きる。ある関連する実施態様では、本方法は、前記組換え遺伝子の集団の一つ以上のメンバーを分離するステップを更に含む。ある実施態様では、前記遺伝子はウィルス遺伝子である。別の実施態様では、前記遺伝子は、例えば植物又は動物などの非ウィルス種由来である。
【００９１】
実施例
本実施例全体を通じ、他に明示しない限り、以下の材料及び方法を用いた。
【００９２】
材料及び方法
概略的には、本発明の実施に当たっては、他に明示しない限り、化学、分子生物学、組換えDNA技術、免疫学（特に例えば抗体技術）、及び電気泳動法の標準的技術の従来技術を用いる。例えば Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring
Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in
Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A
Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr
(1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow
et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999); 及び Current Protocols in Molecular Biology,
eds. Ausubel et al., John Wiley &
Sons (1992) を参照されたい。 
【００９３】
実施例１：  組換えを通じたＡ型インフルエンザの出現及び進化
Ａ型インフルエンザは、点変異を通じて次第に、そしてその８つの遺伝子セグメントのリシャッフリングを通じて突然に、進化すると考えられている。ここで、Ａ型インフルエンザの進化は、２つの異なるウィルスに感染したホスト内での組換えにより引き起こされることが示されている。関係の近いウィルスの大半の多型は、たんぱく質レベルではサイレントな第三塩基コドン変化を含むバイモーフィズム（原語：bimorphism）である。組換えにより、両方の形の新生遺伝子が生まれ、両方のウィルスとも生存可能である。組換えは既存の多型を再分配するものであるため、新しいウィルスが出現する前に、それらの遺伝子組成を予測することができる。この組換え機序が通常である。それにより、流行性のH5N1 インフルエンザや、大半又はすべての、急速に進化するゲノムが生ずる。
【００９４】
浮上中のH5N1 流行性感冒が相当な注目を集めている(Peiris et al 2004; Fouchier et al 2005; Osterholm 2005)。H5N1の進化及び出現の裏にある分子機序を判定するために、ホンコンで最近分離された配列を比較して、東南アジア全体で拡がり、ベトナム、タイ、及びカンボジアでヒトの被害を出した流行株の進化の遺伝子的基盤を判定しようとした。
【００９５】
インフルエンザは分節になったゲノムを有し、８つの遺伝子のリアソートメントが、H5N1分離株を分類するために用いられてきた (Guan et al 2002, Alexandr et al 2003)。インフルエンザの遺伝子組成の変化は、ドリフト及びシフトとして解説されている
(Webster et al 1992)。ドリフトは、プルーフ・リーディング機能を欠くRNAポリメラーゼによる複製エラーが原因で起きる漸進的変化として特徴づけられている。シフトは、８つのサブゲノムRNAのリアソートメントを原因とする、遺伝子組成中のより劇的な変化を含むと考えられている。
【００９６】
H5N1 分離株の変化を解析したところ、ドリフト及びシフトの両者とも、相同組換えにより生じ、それにより、補完的なゲノムが生じたことが示された。二重感染により組換え型が生じるが、これは、２つの関係の近いウィルスが組み合わさるときの点変異に似ている。より関係の遠いウィルス間で同じ機序が起きると、遥かにより劇的な変化が起きて、補完的な、２つの生存能力あるゲノムが生じ得る。多型の大半は遷移であるため、位置は概ね２成分であり、RNA変化の大半は同義である。従って、この遺伝子集団中の多型は概ね、プリン又はピリミジンのいずれかで表されるバイモーフィズムである。遺伝暗号の重複のため、
ほとんど全ての第三塩基遷移について同義の変化が生じる。
【００９７】
数多くの変化がデータベース全体を通じて見られることは、多数の変化が生存能力ある後代を生じる得ることを示唆しているが、これらの変化は、概して、定在する遺伝子プールによって制限されており、組換え型の組成は、同時に流行している遺伝子型中の多型の優勢度に関係している。新たに形成される組換え型は、優勢な遺伝子プールにより予測することができる。
【００９８】
これらの補完的な多型は、事実上すべての生物系で用いられる。これらは急速に進化しているウィルスに共通であるが、同様な機序は細胞レベルでは多型の修復の駆動力でもある。更に、非相同組換えは、エボラ及び流行性H1N1及びH5N1インフルエンザなど、類似の病理を有するウィルスゲノムを互いに連結するために用いられる。
【００９９】
流行性H5N1の進化は、２００１年のH5N1ホンコン分離株まで辿ることができる。この生きた市場の分離株は、リアソート後の遺伝子に基づいて５つのグループを形成した(Guan et al 2002)。代表的な分離株は、マウス脳から単離された向神経性型を生じた (Alexander et al 2003)。ホンコンでの分離株は、この分離株の少なくとも２０％に存在した主要な多型を有していた。
【０１００】
８つの遺伝子すべての多型を図１に挙げる（図１Ａ−１Ｈ）。各遺伝子につき、分離株は対立遺伝子１及び対立遺伝子２と指定された２つの主要な遺伝子型に分離していった。対立遺伝子１はグループＡ、そしていくつかの遺伝子についてはグループＢからも成っていた。対立遺伝子２は一般にグループＣ−Ｅであった。これらのグループは、８つの遺伝子すべてに存在し、当該の多型は、ベトナム及びタイで見られる出現中の流行性株に関してコードされていた。２つの対立遺伝子は互いに補完的であり、大半の位置について、多型は、プリン又はピリミジンを第三塩基位置に取り入れることで同義の変化を生じたバイモーフィズムであった。
【０１０１】
このバイモーフィズムの補完的な性質は、これら２つの対立遺伝子が相同組換えを通じて生じたことを示唆していた。第三塩基位置にプリン又はピリミジンのみを用いると、同じたんぱく質について２つのRNA型が生じることになる。各遺伝子についてのこのバイモーフィズムの数は、これらの遺伝子のいくつかは、既に組換えが起きており、流行性株に対して相同性の高い一つの型と、交替のプリン又はピリミジンを含有する別の型を生じていることを示唆していた。従って、PB2、HA、NA、及びNSについては、多型の数は小さく
(11-39) 、そして流行性株に対合するバイモーフィズムは、２つの対立遺伝子間で均等に分割されていた。対照的に、PB1は既に組み換えられており、対合するバイモーフィズムの大半を対立遺伝子１に配置し、１１１の多型があった。同様に、PAも既に組み換えられており、対合するバイモーフィズムの大半は対立遺伝子２にあって、１１４の多型があった。Mは小さい遺伝子であり、遺伝学的には多様ではないため、２９の多型しかなく、流行性遺伝子に対合したものの大半は対立遺伝子２にあった。NPは幾分、普通でなかった。均等に分割された６３の多型があったが、いずれの対立遺伝子にもないが、ホンコンでのその他の分離株にとっては新規なNP遺伝子により規定されたグループＥに既にあった付加的な多型が６１、あった。
【０１０２】
更に図１に紹介した遺伝子型データは、対になった分離株に見ることのできる、より制限された組換えも示した。PAでは、ニワトリ分離株YU822.2
はグループＡからであり、対立遺伝子１に対合した。しかしながら、この２つの配列は933と1143との間で分岐していた。この領域には１８のバイモーフィズムがあり、両方の分離株で２つの位置しか、同じでなかった。分岐した１６箇所の位置については、マウス脳分離株は、すべての１６箇所の位置で対立遺伝子２と対合した。同様な乗り換え事象がPB1遺伝子で見られた。 NT873.3
はグループＥにあり、対立遺伝子２に対合した。しかしながら、この２つの配列は位置1374と1509との間で分岐していた。１０のバイモーフィズムがあり、NT873.3 は対立遺伝子１のコンセンサス配列に、すべての１０箇所の位置で対合しており、対立遺伝子１の短い領域が対立遺伝子２で検出されるという別の乗り換え事象を見せていた。
【０１０３】
図２は、２００２年から２００３年のホンコン分離株に見られる、遥かにより広範な組換えの結果を示す (Strum-Ramirez et al 2004)。パネル１は、図１と同じバイモーフィズムを含有している。しかしながら、より最近の分離株は、対立遺伝子１及び２の多型を組み換えて、流行性株に対して相同性の高い新しい対立遺伝子を生じさせている。この組換えは、８つの遺伝子すべての存在していた。更に図２は、流行性株には存在するが、２００１年からのホンコン分離株にはないバイモーフィズムを含有している。パネルＡのバイモーフィズムで組み換えられているゲノムは、２００１年のホンコンに存在していない多型の大半も有していた（パネルＢ）。このように、対立遺伝子１及び２上のバイモーフィズムが組み合わされただけでなく、その遺伝子は、ホンコンの外で獲得された可能性の高い、無かったバイモーフィズムの大半まで、このときは含有していた。パネルＣは、２００２年及び２００３年のホンコン分離株には存在しないバイモーフィズムを挙げている。これらのバイモーフィズムは、より関係の遠い哺乳動物分離株（標品中のHLN）に見ることができる。しかしながら、図２は、図１のバイモーフィズムが、２００１年のホンコンには存在しなかったバイモーフィズム大変を組み換えた上で付け加えていることを示している。
【０１０４】
図３は、付加的な組換え例を示す。最初の４枚のパネル（図３Ａ−３Ｄ９）では、複製複合体に関する四つの遺伝子の多型が挙げられている。これらのバイモーフィズムは、ホンコンで同じニワトリからの２つの分離株31.2及び31.4により定義された。多型の数が多いのは、31.2と31.4との間の相補的な関係が原因である。31.2は組み換えられており、流行性株に近い関係にある。対照的に、対応する反対のプリン又はピリミジンが31.4配列に見られる。これら２つの相補的な配列は、最初の４枚のパネルで示されたように、ホンコン生体市場で見られる付加的な組換え型の親として働く。
【０１０５】
バイモーフィズムの数は、この四つの遺伝子のそれぞれについて多く、また２つの親遺伝子は、流行性遺伝子に対して相同であったり、又は非相同であったりした。
PB1（図３Ａ）には、１８１のバイモーフィズムがあった。組換え型37.4 は31.2に位置1418で実質的に同一であった。入手可能な配列（位置1890で）の残りは、流行性株に対合した。 パネルＡには、福建省からの、31.2配列に相同なH5N1分離株が含まれている。この福建省配列は完全であり、31.2にない位置の多型を定義するために用いられた。この福建省配列は、31.2に相同な、ホンコン外の数多くの配列の一つである。
【０１０６】
PB2 （図３Ｂ）に関しては、ごく一部分の配列しか入手できなかったが、位置1023で始まるこの遺伝子の3'側半分には、１４４のバイモーフィズムがあった。この遺伝子に関しては、YU100が組換え型であり、これは流行性遺伝子に位置1665で実質的に同一であり、その後この遺伝子の残りで31.4 に対合した。比較のために、世界中の他の血清型(H7N7、H7N3、H9N1、H9N2) からの相同遺伝子をアライメントし、 交替のプリン又はピリミジンを持つ配列が拡がっており、ホンコンで見られた新規遺伝子に限られたものでないことを実証した。
【０１０７】
PA （図３Ｃ）については１９１のバイモーフィズムがあり、YU100 及び37.4 の両者とも、この遺伝子については組換え型であった。YU100 は31.4 に位置1449で対合した後、31.2 配列に切り換わっていた。対照的に、YU100は31.2に位置873 で対合した後、31.4 配列に切り換わっていた。
【０１０８】
NP（図３Ｄ）に関しては、２つのホンコン親株間の関係が切り換わっていた。31.2 は流行性株に対して相同性が高く、この流行性株に対して31.4 の関係は遠かった。37.4 はNPでは組換え型であり、31.2 と位置789でバイモーフィズムになった後、この遺伝子の3'側半分で31.4と対合していた。
【０１０９】
このように、図３Ａ−３Ｄは、ニワトリ31で見られる２つの親配列や、単一の乗り換え点を有する一つ又は二つの組換え型を示す。ニワトリ31の２つの親配列は共通である。流行性型は、遺伝子型Z分離株でアジア全域で見られ (Guan et
al, 2004) 、反対のプリン又はピリミジンを持つ配列は、H5N1
分離株でアジア全域、そして他の血清型で世界中で見られた。このように、組換えにより２つの遺伝子が生じており、これら２つの遺伝子はヌクレオチド・レベルで大きく異なるが、たんぱく質レベルでは相同性が高かった。
【０１１０】
組換えは内部遺伝子に限られていなかった。NAでの組換えの証拠を図３Ｅに示す。これらの配列は韓国でのH9N2分離株を由来とする。この遺伝子の5'側半分では、２つのブタ（S452 及びS81）が、ニワトリ配列（S1）を配列を共有しており、残りの３つのブタ配列（S83、S109、S190）は、反対のバイモーフィックな配列を形成していた。しかしながら、位置660では、これらのブタ配列のうちの２つが交替の配列に切り換わっていた。
【０１１１】
韓国鳥類分離株（S16）はPAでは組換え型であった。最初の231 bp の配列は、ホンコン／広州からの２つのH9N2分離株と実質的に同一であった。２００３年の鳥類分離株とは１塩基対分の違いしかなく、１９９９年からのヒトH9N2分離株とも２塩基対分の違いしかなかった。これらの相同性は、韓国鳥類分離株と、ホンコン分離株との間の二重感染を示すものである。この関係はS16のM遺伝子の配列で増加した。それはH9N2の１９９８年のブタ配列（10）と完全な対合であるか、又は、二番目の１９９８年のブタ分離株（9）と僅かに一塩基対分の違いがあるだけであった。
【０１１２】
組換えはヒトインフルエンザ遺伝子にも見られた。２つの韓国ブタ分離株は、ヒト研究室用株WSN/33 と２００４年韓国ブタ分離株との間でPB2の組換え型を示した。図３Ｇは、S109の、そのGenbank配列の5'側末端でのWSN/33との対合を示す。この対合は、この遺伝子の5'側末端まで延び （Sang Seo、私信）、同様な対合は、WSN/33 とS81との間でも見られた（Sang Seo、私信）。
【０１１３】
ヒト／ヒト組換えを図３Ｈで示す。２００２年韓国分離株のHAの5’側半分は、ワイオミングワクチン配列に代表される、現在のH3N2分離株と対合した。これらの韓国分離株は、１９９１年からの韓国分離株と、この遺伝子の3'側部分で対合した。１９９１年ソウル配列と関係の近い配列は、１９８０年代後半には世界中で特定されたが、組換え型として再出現するまで、１９９１年から２００２年にGenbankにあるHA配列になかった。
【０１１４】
議論
インフルエンザの進化は、一連のドリフト及びシフトとして解説されてきた。ドリフトは、エラー・プローンなポリメラーゼが生じる点変異により駆動されると考えられ、他方、シフトは、８つのサブゲノムインフルエンザRNAのリアソートメントに結び付けられてきた。しかしながら、本発明は、ドリフト及びシフトは組換えにより起こるのであり、ウィルス及び他の遺伝子系や、特にインフルエンザにおいて遺伝子多様性の機序となっていることを示す。
【０１１５】
インフルエンザサブタイプH5N1と他のサブタイプとの間のリアソートメントは以前にも観察されている。ホンコンの患者からのH5N1 1997 分離株はリアソータントであった
(Guan et al 1999)。内部遺伝子はH9N2 及びH6N1 分離株で見られる遺伝子と関係が近かった。しかしながら、遺伝子のこのような布置は、１９９７年のホンコンでのH5N1 淘汰後は見られていない。H5N1
は再度、２００３年にホンコンでヒトから分離され、これらの分離株は、Ｚ遺伝子型と呼ばれる大変異なる布置を有していた (Guan et al 2004; Chen et al 2004)。この年の遅くに、関連する布置がZ+と指定され、このグループは２００４年の初頭までにアジア全体で見られた。しかしながら、これらの分離株は地域特異的な多型を有しており、ベトナム及びタイの患者からの分離株は、これらの２つの国に固有であるか、又は、これら２つの国に共通で固有の多型を含んでいた。これらの多型は、他所で解説されることとなろうが、概略的には、この多型は他のH5N1 分離株には見られず、哺乳動物に通常見られる血清型には見られた。Z+遺伝子型間の生物学的な違いは、リアソートメントではなく、多型が原因であった。同様に、マウス脳からの分離株と親ウィルスとの間の違いは、リアソートメントではなく多型が原因であった。違いの中には、短い範囲の組換えにより明らかに生じたものもあった。
【０１１６】
他の多型は点変異のように見えたが、その多型は最近の変異が原因ではなかった。これらは哺乳動物の血清型に見られた。同様に、H5N1流行性株で見られる多型の多くは、以前に流行したH5N1分離株に見ることができた。しかしながら、ここで示すように、これらの多型は、しばしば同時に流行中のハプロタイプが関与する組換えを通じて合併した。これらの多型は概ねバイモーフィズムであり、このバイモーフィズムは組換えを通じて合併された。このプロセスの結果、第三塩基コドン位置で異なる２つのウィルスが同時に生じた。これらの違いの大半は遷移であったため、たんぱく質変化の大半は同義であった。なぜなら、６４あるコドンのうちの６０の第三塩基位置での遷移は同義変化を生じるからである。
【０１１７】
ホンコンでは２００１年に２つの主要な関係の近い遺伝子型が流行中であった。最近組換えの起きていない遺伝子では、新たに組み換えられるバイモーフィズムは点変異に見えた。対にした試料は、短い組換え部分を示した。遺伝子の中には既に組み換えられており、流行性株と対合する多数のバイモーフィズムを持つ一つのハプロタイプと、対合しない多数のバイモーフィズムを有する反対型ができていた。これらの２つの異なるハプロタイプ
間の更なる組換えでは、一方の親を由来とする遺伝子を一端に、そして別の親を由来とする他方の半分を持つキメラである新しい遺伝子が生じた。
【０１１８】
ある機序では、多数の乗り換え事象が一個体のホストにおける二重感染で起きる。別の機序では、複数の乗り換え事象が一連の二重感染を通じて蓄積する。組換え型のいくつかは、遺伝子の中央近辺での単一の乗り換えにより生じており、他のものは、１、２百塩基対の短い領域を含んでいた。その後の分離株で特定されたリアソートメント及び組換えの数は、二重感染で生じるであろう理論数よりも遥かに少ない。
【０１１９】
組換えはH5N1 又は鳥類遺伝子に限らない。ヒト遺伝子は同じ機序を用いて進化し、韓国のブタ配列では、半分がヒトで半分が鳥類の遺伝子が見つかっている。上述した例では、当該の組換えは、８０年代後期及び９０年代初期に拡がっていたウィルスで起きたが、１０年間、GenBankの配列から消えていた。このように、配列は大変安定であったり、またその集団中で後の時代になって再出現したりする。これらのデータは、組換えがなければ、複製の正確さは極めて高いことを示すものである。配列同一性のこのような保存は、進化の激しい環境中にも見ることができる。２００３年の韓国の分離株では、急速な遺伝子変化を生じた地域であるホンコンからの分離株への二重感染の証拠があった。しかしながら、ホンコンでの１９９８年ブタ分離株を由来とするM遺伝子の精確なコピーを、５年後の韓国鳥類分離株に見ることができた。これらのデータは、ポリメラーゼはエラー・プローンではないこと、あるいはエラーが修正されることを示していた。鳥類又はヒト分離株で毎年見られる多様性は、最近の変異が原因ではない。その代わりに、この変化は、組換えを通じて流通する、バイモーフィズムの集合体なのである。
【０１２０】
組換えを通じたウィルスの進化は安定である。ホンコンで２００１年株に見られた組換えは、２００４年の流行性株にもまだ存在する。ホンコン分離株は、組換えプロセスを知る機会を提供したが、同じ種類の組換えは、より早い時期で遺伝子の組み換えられた分離株を含め、他所で見られた。WSN/33など、１９３０年代に分離されたヒトH1N1 インフルエンザを、やはり１９３０年代に分離された伝統的なブタH1N1と比較したところ、 １９１８年の流行性株で見つかった補完的なバイモーフィズムが特定された。これらの関係を他所で解説することとする。
【０１２１】
これらのデータは、いくつかの実際的用途を有する。新たに形成された組換え型親遺伝子間の乗り換えにより生じたため、新たな組換え型は、その地域で優勢なゲノムに基づいて予測できるかも知れない。組換え型を２つのドミナントの遺伝子型の間でアライメントすると、この組換え型の補完型を作製することができる。変化は概して遷移であるため、バイモーフィズムを用いて組換え型の起源を判定することができ、またバイモーフィズムを用いて補完型の配列を予測することもできる。従って、一方の型は補完的な型の配列を予測するものである。これらの規則を用いて、ワクチン開発で用途のある、将来及び過去の両方のハプロタイプを特定することができる。
【０１２２】
ここで解説された規則の応用は、インフルエンザ進化にとどまらない。GenBank にあるウィルス配列は、コドン第三塩基一における急速な遷移を示している。他のウィルスもまた、急速な進化のためにバイモーフィズムを用いており、補完型のウィルスは豊富にある。これらの補完関係は SARS (Mara et al 2003; Rota et al 2003)、NL63 (va der Hoek et al 2004) 及びHKU-1 (Woo et al 2005)を含むコロナウィルスに見ることができる。これらの関係については他所で解説することとする。
【０１２３】
これらの関係は他の系にも見ることができ、シロイヌナズナHTH遺伝子について最近解説されたものなど、高等生物の遺伝子修復も説明することができる。シロイヌナズナHTH遺伝子の１１の多型が特徴付けられており (Lolle et al 2004)、１１すべてが遷移であった。しかしながら、これらの遷移は、変異誘発したストックから選抜されたものであるため、これらは第三塩基遷移ではなく、その変化は同義ではなかった (Krolikowski et al 2003)。しかし、インフルエンザと同様に、その変化はテンプレートにより惹起されるものであり、特異的だった。これらはより高頻度で、そして多様な条件下で見られた (Lolle et al 2004)。このように、二重鎖RNA型の遺伝子における組換えは、シロイヌナズナのF3後代で自己受精後に観察される非メンデル性の遺伝子を説明することができる。
【０１２４】
ウィルスゲノム中の高頻度の組換えは二重感染により駆動される。しかし、二重感染はまた、無関係のゲノムが関与する、より劇的な進化でも役割を果たすことがある。H5N1 HAの１８塩基対領域をエボラのスパイク遺伝子に見ることができる（標品中のHLN）。この特定の領域は、両方のゲノムで地域特異的なバイモーフィズムを含有する。このように、ベトナム及びタイからの分離株は、初期のH5N1分離株には見られない特異的なバイモーフィズムを有する。更に、第二の多型が１９１８年流行性HAで見られたHA配列を生む。このように、同じクラスのウィルスに感染したホストで見られる高頻度の相同組換えは、異なるクラスのウィルスにまで至り、例えばEbola、H5N1、又はH1N1に感染したヒト又は動物で見られる過剰な出血など、類似の臨床症状発現につながる配列を共有することにつながる。これらの関係の詳細を他所で紹介することとする。
【０１２５】
組換えは急速な進化の強力な駆動因子である。インフルエンザでは、組換えによりドリフト及びシフトの両方が生じることがあり、同じ機序が急速な進化上の変化に幅広く採用されてきた。
【０１２６】
実施例２：  異なるウィルス間のコピーチョイス組換え
コピーチョイス組換えのシグナチャーを、異なる種類の親ウィルスの変異型後代に観察することができる。図５では、１８ヌクレオチド長の路が、アフリカのエボラと１９１８年の流行性インフルエンザの間で、H5インフルエンザ株の中間変異型後株を通じて接続されて、保存されてきた。従って、コピーチョイス組換えが、選択的圧力と組み合わさると、異なる親ウィルス間で配列ブロックを保存する作用をすることができる。図５に示す保存された１８ヌクレオチドのブロックは、例えばmiRNAなど、機能的活性を持つ低分子RNAをコードしていると思われる。異なるウィルスを由来とする配列の同様な組換えが、SARS、IBV 及びアストロウィルス（保存された3’ 側ステム・ループ構造が共通である）；口蹄病及びニューカッスル；並びにHIV 及びコロナウィルスで観察されている。
【０１２７】
実施例３：  細菌に適用されたコピーチョイス組換え
親細菌配列の組み合わせで生じる可能性のある、細菌の変異型後代配列の組成を予測する能力を用いれば、ある表現形質（例えば薬物耐性）を持つであろう変異型後代細菌の予測及び同定を向上させることができる。どの変異型細菌が観察された形質を示すことになるかの予測を向上させることのできる本発明の規則を用いて、２つの親細菌配列を、in vitro、in vivo、又は in silico で組み合わせることができる。従って本発明は、薬物スクリーニング法などに応用することができる。
【０１２８】
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【０１２９】
均等物
当業者であれば、ごく慣例的な実験を用いるのみで、ここに解説された本発明の具体的な実施態様の均等物を数多く認識され、又は確認できることであろう。このような均等物は、以下の請求項の包含するところと意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】図１は、２つのDNAコピー間の組換えの概略図を示す。左側のパネルは単一の乗り換え事象を示し、右側のパネルは二重の乗り換え事象を示す。
【図２】図２Ａ−Ｈは、２００１年のホンコン流行株から分離されたインフルエンザ・ウィルスのそれぞれPB2、PB1、PA、HA、NP、NA、MP、及びNS 遺伝子中の多型の位置を示す。
【図３】図３Ａ−Ｈは、２００２年から２００３年の間にホンコンで分離されたインフルエンザ・ウィルスのそれぞれPB2、PB1、PA、HA、NP、NA、MP、及びNS 遺伝子中の多型の位置を示す。
【図４】図４Ａ−Ｊは、ウィルス組換えの例を示す。図４Ａ−Ｄは、ホンコンのニワトリからの２つの分離株（31.2及び31.4）中の多型を示す。図４Ｅは、韓国のH9N2分離株のNA遺伝子の組換えを示す。図４Ｆは、韓国の鳥類分離株のPA遺伝子の多型を示す。図４Ｇは、韓国のブタから分離されたPB2の多型を示し、ヒト実験室用株WSN/33及び２００４年からの韓国ブタ分離株との間の組換えを示す。図４Ｈは、２００２年に分離されたヒトHA遺伝子の組換えを示す。
【図５】図５は、保存された１８ヌクレオチド路のエボラ及びインフルエンザ株配列を示す。
【図６】図６Ａ−Ｃは、インフルエンザ株間のウィルス組換えの更なる例を示す。
【図７】図７Ａ及び７Ｂは、インフルエンザ株間のウィルス組換えの更なる例を示す。
【図８】図８Ａ及び８Ｂは、インフルエンザ株間のウィルス組換えの更なる例を示す。
【図１】
2008504839.tif 000002
【図２Ａ】
2008504839.tif 000003
【図２Ｂ−１】
2008504839.tif 000004
【図２Ｂ−２】
2008504839.tif 000005
【図２Ｂ−３】
2008504839.tif 000006
【図２Ｂ−４】
2008504839.tif 000007
【図２Ｃ−１】
2008504839.tif 000008
【図２Ｃ−２】
2008504839.tif 000009
【図２Ｃ−３】
2008504839.tif 000010
【図２Ｃ−４】
2008504839.tif 000011
【図２Ｃ−５】
2008504839.tif 000012
【図２Ｃ−６】
2008504839.tif 000013
【図２Ｄ】
2008504839.tif 000014
【図２Ｅ−１】
2008504839.tif 000015
【図２Ｅ−２】
2008504839.tif 000016
【図２Ｅ−３】
2008504839.tif 000017
【図２Ｅ−４】
2008504839.tif 000018
【図２Ｅ−５】
2008504839.tif 000019
【図２Ｆ−１】
2008504839.tif 000020
【図２Ｆ−２】
2008504839.tif 000021
【図２Ｆ−３】
2008504839.tif 000022
【図２Ｇ】
2008504839.tif 000023
【図２Ｈ】
2008504839.tif 000024
【図３Ａ−１】
2008504839.tif 000025
【図３Ａ−２】
2008504839.tif 000026
【図３Ｂ−１】
2008504839.tif 000027
【図３Ｂ−２】
2008504839.tif 000028
【図３Ｂ−３】
2008504839.tif 000029
【図３Ｂ−４】
2008504839.tif 000030
【図３Ｂ−５】
2008504839.tif 000031
【図３Ｂ−６】
2008504839.tif 000032
【図３Ｃ−１】
2008504839.tif 000033
【図３Ｃ−２】
2008504839.tif 000034
【図３Ｃ−３】
2008504839.tif 000035
【図３Ｃ−４】
2008504839.tif 000036
【図３Ｃ−５】
2008504839.tif 000037
【図３Ｃ−６】
2008504839.tif 000038
【図３Ｄ−１】
2008504839.tif 000039
【図３Ｄ−２】
2008504839.tif 000040
【図３Ｅ−１】
2008504839.tif 000041
【図３Ｅ−２】
2008504839.tif 000042
【図３Ｅ−３】
2008504839.tif 000043
【図３Ｅ−４】
2008504839.tif 000044
【図３Ｅ−５】
2008504839.tif 000045
【図３Ｅ−６】
2008504839.tif 000046
【図３Ｆ−１】
2008504839.tif 000047
【図３Ｆ−２】
2008504839.tif 000048
【図３Ｆ−３】
2008504839.tif 000049
【図３Ｇ−１】
2008504839.tif 000050
【図３Ｇ−２】
2008504839.tif 000051
【図３Ｈ−１】
2008504839.tif 000052
【図３Ｈ−２】
2008504839.tif 000053
【図４Ａ】
2008504839.tif 000054
【図４Ｂ−１】
2008504839.tif 000055
【図４Ｂ−２】
2008504839.tif 000056
【図４Ｃ】
2008504839.tif 000057
【図４Ｄ】
2008504839.tif 000058
【図４Ｅ】
2008504839.tif 000059
【図４Ｆ】
2008504839.tif 000060
【図４Ｇ−１】
2008504839.tif 000061
【図４Ｇ−２】
2008504839.tif 000062
【図４Ｈ】
2008504839.tif 000063
【図４Ｉ】
2008504839.tif 000064
【図４Ｊ】
2008504839.tif 000065
【図５−１】
2008504839.tif 000066
【図５−２】
2008504839.tif 000067
【図５−３】
2008504839.tif 000068
【図５−４】
2008504839.tif 000069
【図５−５】
2008504839.tif 000070
【図５−６】
2008504839.tif 000071
【図５−７】
2008504839.tif 000072
【図５−８】
2008504839.tif 000073
【図５−９】
2008504839.tif 000074
【図６Ａ−１】
2008504839.tif 000075
【図６Ａ−２】
2008504839.tif 000076
【図６Ａ−３】
2008504839.tif 000077
【図６Ａ−４】
2008504839.tif 000078
【図６Ａ−５】
2008504839.tif 000079
【図６Ａ−６】
2008504839.tif 000080
【図６Ａ−７】
2008504839.tif 000081
【図６Ａ−８】
2008504839.tif 000082
【図６Ｂ】
2008504839.tif 000083
【図６Ｃ−１】
2008504839.tif 000084
【図６Ｃ−２】
2008504839.tif 000085
【図６Ｃ−３】
2008504839.tif 000086
【図７Ａ−１】
2008504839.tif 000087
【図７Ａ−２】
2008504839.tif 000088
【図７Ａ−３】
2008504839.tif 000089
【図７Ａ−４】
2008504839.tif 000090
【図７Ａ−５】
2008504839.tif 000091
【図７Ｂ−１】
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【図７Ｂ−２】
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【図７Ｂ−３】
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【図８Ａ−１】
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【図８Ａ−２】
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【図８Ｂ−１】
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【図８Ｂ−２】
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【国際調査報告】
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