(57)【要約】  本発明は、交配種を得るために交配され得るホモ接合性非ヒト型生物を、ヘテロ接合性非ヒト型生物から生成する方法に関するものであり、ヘテロ接合性開始生物を供給し、第２分裂復元から生じるＳＤＲ−０細胞を生成することを該生物に許容し、ＳＤＲ−０細胞からＳＤＲ−０生物を再生し、かつ、これにより得られたＳＤＲ−０生物からホモ接合性生物を生成する。また、本発明は、交配種を生成する方法に関し、上記方法で生成した第１ホモ接合性生物を、第２ホモ接合性生物に交配する。さらに、本発明は、これらの方法によって得られたホモ接合性非ヒト型生物および交配種非ヒト型生物を提供する。本発明は、特に植物に関するものである。【選択図】図２【特許請求の範囲】
【請求項１】
交配種を得るために交配され得るホモ接合性非ヒト型生物を、ヘテロ接合性非ヒト型生物から生成する近逆育種方法であって、
ａ）ヘテロ接合性開始生物を供給し、
ｂ）第２分裂復元から生じるＳＤＲ−０細胞を生成することを前記生物に許容し、
ｃ）前記ＳＤＲ−０細胞からＳＤＲ−０生物を再生し、かつ、
ｄ）このように得た前記ＳＤＲ−０生物から前記ホモ接合性生物を生成する
ことを特徴とする近逆育種方法。
【請求項２】
前記ＳＤＲ−０細胞は、前記開始生物に干渉することなく生成される請求項１に記載の近逆育種方法。
【請求項３】
前記ＳＤＲ−０細胞を生成する前記生物は、平均以上の第２分裂復元を示すために選択される請求項１に記載の近逆育種方法。
【請求項４】
前記ＳＤＲ−０細胞を生成する前記生物は、平均以上の第２分裂復元を示すために遺伝子組み換えされる請求項１に記載の近逆育種方法。
【請求項５】
前記遺伝子組み換えは、一時的である請求項４に記載の近逆育種方法。
【請求項６】
前記遺伝子組み換えは、前記生物における第２分裂復元事象の数を増やす遺伝子要素のゲノムへの安定した混入によるものである請求項５に記載の近逆育種方法。
【請求項７】
前記ＳＤＲ−０細胞を生成する前記生物は、平均以上の第２分裂復元を示すために、環境ストレスにさらされる請求項１に記載の近逆育種方法。
【請求項８】
前記環境ストレスは、熱応力、ＮＯ２、亜酸化窒素Ｎ２Ｏ、またはそれらの組み合わせから選択される請求項７に記載の近逆育種方法。
【請求項９】
前記ホモ接合性生物は、倍加半数体技術、近親交配、第２分裂復元、またはそれらの組み合わせによって生成される請求項１に記載の近逆育種方法。
【請求項１０】
交配種を生成する近逆育種方法であって、請求項１ないし９のいずれかに記載の方法により生成された第１ホモ接合性生物を第２ホモ接合性生物に交配することを特徴とする近逆育種方法。
【請求項１１】
前記第２ホモ接合性生物は、結果的に生じる前記交配種が前記ヘテロ接合性開始生物に類似するように、前記第１ホモ接合性生物に対して少なくとも部分的に相補的である請求項１０に記載の近逆育種方法。
【請求項１２】
前記ヘテロ接合性開始生物の類似体は、前記開始生物の少なくとも５０％のヘテロ接合性を有する交配種を含んでいる請求項１１に記載の近逆育種方法。
【請求項１３】
前記類似体のヘテロ接合性は、５０％〜１００％のパーセンテージである請求項１１または１２に記載の近逆育種方法。
【請求項１４】
前記類似体のヘテロ接合性は、５０％〜６０％のパーセンテージであり、好ましくは６０％〜７０％のパーセンテージであり、より好ましくは７０％〜８０％のパーセンテージであり、さらに好ましくは８０％〜９０％のパーセンテージであり、最も好ましくは９０％〜１００％のパーセンテージである請求項１１ないし１３のいずれかに記載の近逆育種方法。
【請求項１５】
前記第２ホモ接合性生物は、結果的に生じる前記交配種が前記ヘテロ接合性開始生物より優れているように選択される請求項１０に記載の近逆育種方法。
【請求項１６】
前記第２ホモ接合性生物は、それの染色体の部分集合のみが前記第１ホモ接合性生物の対応する前記染色体に対して相補的になるように選択される請求項１０に記載の近逆育種方法。
【請求項１７】
前記染色体の残留物は、前記第１ホモ接合性生物と第２ホモ接合性生物との間で同一である請求項１６に記載の近逆育種方法。
【請求項１８】
所望の遺伝子背景を伴った生物の形質を遺伝子移入する近逆育種方法であって、
ａ）所望の前記遺伝子背景を有する第１生物を、ヘテロ接合性開始生物を得るために所望の前記形質を有する第２生物に交配するステップと、
ｂ）第２分裂復元から発生したＳＤＲ−０細胞を生成することを前記生物に許容するステップと、
ｃ）前記ＳＤＲ−０細胞からＳＤＲ−０生物を再生するステップと、
ｄ）所望の前記形質および前記背景を有する前記ＳＤＲ−０生物を選択するステップと、
ｅ）選択された前記ＳＤＲ−０生物からホモ接合性生物を生成するステップと
を含むことを特徴とする近逆育種方法。
【請求項１９】
前記ＳＤＲ−０細胞は、請求項２ないし８のいずれかで定義された方法によって得られる請求項１８に記載の近逆育種方法。
【請求項２０】
前記ホモ接合性生物は、倍加半数体技術、近親交配、第２分裂復元、またはそれらの組み合わせによって生成される請求項１８または１９に記載の近逆育種方法。
【請求項２１】
前記選択は、視覚的検査に基づいて、または分子マーカー手段によって行われる請求項１８ないし２０のいずれかに記載の近逆育種方法。
【請求項２２】
前記生物は、植物である請求項１ないし２１のいずれかに記載の近逆育種方法。
【請求項２３】
請求項１ないし９のいずれかに記載の方法によって得られるホモ接合非ヒト型生物。
【請求項２４】
請求項１０ないし２１のいずれかに記載の方法によって得られる交配種非ヒト型生物。
【請求項２５】
前記生物は、植物である請求項２３または２４に記載の非ヒト型生物。
【請求項２６】
請求項２３、２４あるいは２５に記載の生物から生じる子孫。
【請求項２７】
請求項２３、２４あるいは２５に記載の生物、または請求項２６に記載の子孫から生じる細胞。
【請求項２８】
請求項２３、２４あるいは２５に記載の生物、または請求項２６に記載の子孫から生じる組織。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、交配種を得るために交配され得るホモ接合性非ヒト型生物を、ヘテロ接合性非ヒト型生物から生成する方法に関する。本発明は、特に植物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
品種改良は、人類の基本的な業の一つであり、世界中の人々に食糧を供給する栽培種を提供する上で極めて重要である。品種改良の歴史は古く、そもそもは個々に局所的選択領域において優れている植物を選択および繁殖することをベースとしていた。
【０００３】
現代の植物の品種改良は、遺伝子の知識に高く依存しており、倍加半数体（ＤＨ）（非特許文献１参照）や分子マーカ（非特許文献２参照）のような方法によって技術的に支持されている。
【０００４】
有性生殖における遺伝子メカニズムは、環境の変化における種の生存率を高める遺伝子の種類を増加させている。この点において、減数分裂組み換え、独立染色体分類、および交配様式は、主な関与因子である。しかしながら、遺伝子的ヘテロ接合植物が高度な農業または園芸価値を有すると確認された場合には、品種改良におけるこれらのメカニズムは、特にこのようなケースにおいて逆効果を生じる。遺伝因子の再交配は、遺伝子的異種の生成およびそれに起因する異種植物をもたらし、結果的に営利的に望ましい形質の損失をもたらす。
【０００５】
この効果に対抗するために、数々のテクノロジーが品種改良に利用されている。１つの例として、繁殖が有糸分裂を介して排他的に生じた際にそれらの遺伝的構成物の完全な保存をもたらす増殖性植物を繁殖させることが挙げられる。多くの植物種では、インビトロ式組織培養方法が植物を発育的に繁殖するのに用いられているが、インビボ式伐採法のような他の方法もよく適用される。
【０００６】
種からの繁殖と比した増殖性繁殖の不利点は、実験室の集約性および、それによりコストがかかるという事実である。さらに、論理的な問題を引き起こす長期間の植物の保管は困難であり、かつ、ウィルスのような病原体が植物体に感染するリスクが、種から繁殖した植物体の場合に比べて非常に大きい。
【０００７】
また別の方法では、増殖性植物は、アポミクシスとして通常参照されている無性種の構成によって達成される。多くの種で自然発生するアポミクシスは、遺伝子工学によって有性の繁殖植物種を誘発する。しかしながら、近年、アポミクシスの異なるステップに関与している遺伝子、すなわちアポメイオシス、単為生殖、自立的胚乳発達などは、未だに確立されておらず、また、複雑な規則で互いに影響しあっている。このため、植物の品種改良のためのアポミクシス技術のポテンシャルは、既に長い間広範に認識されていたが、依然として概念の証明が待たれている。
【０００８】
また、さらに別の方法として、特許文献１に開示されるような逆育種技術を使うことができる。逆育種は、遺伝子工学による減数分裂組み換えの抑制と、非組み換え親染色体を含む胞子から派生する倍加半数体（ＤＨ）の後発生成物とに基づいている。これら倍加半数体は、減数分裂において生じた独立型親性染色体類の結果、遺伝的組成に関して異なる。したがって、一つの同族優性遺伝子を使うことは十分であり、倍加半数体もしくはそれらから派生した系統を決定するために、染色体当たりの多型マーカーは、オリジナル開始植物の遺伝子構成を再構築する交配を介して組み合わせれるべきである。このように、逆育種技術の適用は、たとえ遺伝子組織が周知でないものであっても、種から選択されたあらゆる繁殖力を有する植物の遺伝子保存を許容する。
【０００９】
しかしながら、この技術の不利点は、減数分裂組み換えの完全抑制がキアズマの欠如を生じ、かつ、それによって、配偶子の異性化をもたらすとともに、それによる還元繁殖能力をもたらす減数分裂Ｉにおいて不適切な染色体分離を生じる、という事実である。減数分裂Ｉの間でキアズマが全く形成されていない場合、あらゆる染色体は、極のいずれかに移動するため、５０％の独立確率を有する。これは、十分な染色相補体を有する胞子を生成する理論上の確率が、（１／２）ｘ（ｘ：半数体染色体の数）であることを意味している。このようにバランスの取れた配偶子の頻度は、半数染色体の数が増えるにつれて減少する。
【００１０】
多くの作物種は、比較的少ない染色体数である（例えば、キュウリは半数体ゲノム当たり７個の染色体数であり、ほうれん草は６個のみである）が、最大数の野菜作物の一つであるトマトのように、比較的多い染色体数を有する経済的に重要な種もあり、このトマトは、半数体ゲノム当たり１２個の染色体を有している。この技術的な制約は、逆育種技術の効率を著しく低下させている。したがって、その技術の明確な必要性が、有性子孫における遺伝子組織の保存を許容する代わりの方法に関して存在している。
【特許文献１】国際特許公開０３０１７７５３号パンフレット
【非特許文献１】Haploids  in  Crop  Improvement  II  eds;   Palmer  C,  Keller  W,  and  Kasha  K  (2005)  in:  Biotechnology  in  Agriculture  and  Forestry  56  Eds;  Nagata  T,  Lorz  H,  and  Widholm  J.  Springer-Verlag  Berlin  Heidelberg  New  York,  ISBN  3-500-22224-3．
【非特許文献２】De  Vienne  ed.  (2003)  “Molecular  Markers  in  Plant  Genetics  and  Biotechnology.”  Science  publishers  Inc.  Enfield,  NH  USA.  ISBN  1-57808-239-0．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記事情に鑑みて、本発明の目的は、親生物、特に親植物の遺伝子組織を保存する方法を提供することにある。
【００１２】
本発明をもたらした研究では、例えば『ＳＤＲ−０』と呼ばれる第２分裂復元（ＳＤＲ）の結果として得られるような、非還元胞子から再生された植物を用いることにより、
このような方法を提供することができる、という驚愕の事実が発見された。また、この方法は、菌類や魚類など、植物以外の他の非ヒト型生物においても実行され得るものであり、かつ、配偶子などのような他の生殖細胞でも実行され得るものである。
【００１３】
したがって、本発明は、交配種を得るために交配され得るホモ接合性非ヒト型生物を、ヘテロ接合性非ヒト型生物から生成する方法に関するものであり、ａ）ヘテロ接合性開始生物を供給し、ｂ）第２分裂復元から生じるＳＤＲ−０細胞を生成することを前記生物に許容し、ｃ）前記ＳＤＲ−０細胞からＳＤＲ−０生物を再生し、かつ、ｄ）このように得た前記ＳＤＲ−０生物から前記ホモ接合性生物を生成する。
【００１４】
この方法は、ここでは「近逆育種」と呼ばれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
非還元胞子は、第２減数分裂の削除の結果として、選択的に形成される。このような自然現象は、第２分裂復元またはＳＤＲとして知られている。ＳＤＲは、植物の優性生殖において正常の減数分裂事象と同時に生じる。本発明の近逆育種技術は、特に、天然的または人工的な再生用ＳＤＲを介して生成された非還元胞子を明確に選択することによって、ＳＤＲ事象を有効利用している。この結果生じる植物は、ＳＤＲ−０植物と呼ばれ、概ねホモ接合性であり、好ましい実施形態では、倍加半数体を生成するのに用いられている。その一方で、ＳＤＲ−０植物のホモ接合性レベルも、近親交配段階や二次ＳＤＲ事象、あるいはそれらの組み合わせを介して増大され得る。
【００１６】
開始植物の父性ゲノムと母性ゲノムとの間で多型である分子マーカーは、それらの遺伝子組織を本質的に相互補完するとともに、交配においてオリジナル開始植物の遺伝子生成に係る近完全復元をもたらすＳＤＲ−０植物、およびそれらから生じた倍加半数体を特定するのに使用され得る。
【００１７】
その復元は、ＳＤＲ−０事象の形成、およびそれらから生じる倍加半数体の形成における減数分裂復元の結果として、「近完全」である。その復元交配種は、相互と同様に、オリジナル開始交配植物とある程度遺伝子的に異なる。しかしながら、この差異は、倍加半数体が正常の減数分裂事象から生じる場合と比較すると、著しく減少される。さらに、その倍加半数体は、さらなる選択の余地が全くないという意味で、遺伝子的に不変である。
【００１８】
この処理におけるＳＤＲ事象を統合することの利点は、遺伝子に関する選択が２つのステップ処理において相補的に発生することである。第１ステップは、染色体の近位領域に集約され、つまり動原体を含んでいる。第２ステップは、染色体の遠位端、すなわち組み換えのために交換されたそれらの領域に向けられている。この遅発性の遺伝子固定は、複雑さを減少させ、特に、分子マーカーが選択に利用できる場合には、相補的な遺伝子型を見つける機会を増加させる。
【００１９】
この方法のさらなる利点は、ＳＤＲが、有性再生中に生じるとともに、有性再生処理への干渉をさらに必要としないものとして用いることができる天然的な処理である、という事実である。
【００２０】
図１および図２は、正常な減数分裂事象（以下、倍加半数体の形成）とＳＤＲ事象との間の差異を模式的に示す。両図において、４個の染色体ペアが描写されており、各同族体が明暗で示され、暗いロッドは、そのロッド上の黒丸が動原体を表す構造になっている。
これらの図は、本発明の原理を説明するのに単に役立つものである。実際のところ、関連する染色体の数が関連する種に依存しているということは、当業者にとっては自明である。したがって、交差のポイントは、それらの数／染色体、およびそれらの染色体における位置に応じて変化する。
【００２１】
図１は、正常の減数分裂と、双方の減数分裂が起こった後の染色体の（自発的あるいは誘発的な）倍加を示している。この場合、交差は、１ペアにつき２つの親染色体および２つの再生染色体の発生をもたらしている。さらに、各ペアの２つの同族染色体の独立組み合わせにより、多くの遺伝子的に異なる胞子／配偶子が形成されることは、明らかである。
【００２２】
図１には、この処理の３つの任意な結果のみが描写されている。このような胞子から植物を再生した後に、倍加半数体が得られる。半数体の生成は、現代の品種改良において最重要であり、ほとんどの作物について確立した技術として適用される。２倍体胞子から再生された植物は、ＤＨ−０、すなわち正常の減数分裂事象から生じる自発的または誘発的な倍加胞子から主に再生されたものとして、倍加半数体とさらに命名される。「ＳＤＲ−０」という用語は、第２減数分裂を欠いた細胞または胞子から主に再生されるものに用いられる。自己受粉した場合のＤＨ−０植物は、遺伝的に１００％同一で、全対立遺伝子に完全に固定された子孫（ＤＨ−Ｉ）植物をもたらす。よって、ＤＨ−０植物において形成された胞子（配偶子）は、減数分裂および再生を再度受けても、遺伝子の再配列は起こらない。すなわち、これは、分離が全くできないという事実により、この『純系統』とよばれるものが不死化である、ということを意味している。このような系統は、低温や高温などの異なる条件下、または、例えば異なる気候区分で発育する場合に、遺伝子的に異なる様相を示すことができる。観測することができる差異は、系統の全ての『要素』に有効であり、言い換えれば『系統内』の変化がない、ということである。しかしながら、異なる純系統（ＤＨ−１）の間には差異があり、これは『系統内』変異と呼ばれる。
【００２３】
図２は、ＳＤＲ事象を示す。図１とは対照的に、自発的あるいは誘発的な染色体倍加が減数分裂完了後に起こる場合、胞子の２倍体生成は、第２減数分裂の欠如によって引き起こされる。
【００２４】
倍加半数体と２倍体ＳＤＲ植物との間の基本的な差異は、ヘテロ接合性セグメントがＳＤＲ植物の異なる染色体に存在しているのに対して、倍加半数体は完全にホモ接合性である、という事実によって説明される。ＳＤＲ植物において、全ての染色体ペアは、それらの動原体領域に対してホモ接合であるということは、特筆すべき点である。ヘテロ接合性があるとすれば、染色体の遠心端に存在している。このことは、第１減数分裂の欠如を特徴とし、全ての染色体ペアに対して動原体領域におけるヘテロ接合をもたらす第１減数分裂またはＦＤＲと呼ばれる別の異常減数分裂事象とは大きく異なる。
【００２５】
図２に示される理論的なケースでは、倍加半数体および第２減数分裂の発現のために用いられた開始植物（ドナー植物）は、それぞれ、完全にヘテロ接合である同族体を含んでいる。これは、それらの染色体によって引き起こされる遺伝子の全対立遺伝子が多型である、ことを意味している。しかしながら、実際には、これは殆ど有り得ないことなので、このケースは、最も極端なヘテロ接合状態を例示している。
【００２６】
図２より、ＳＤＲ事象に関して、各染色体ペアの交差ポイントがホモ接合座とヘテロ接合座の比率を決定している、ということは明らかである。この比率は、平均的にテロメアに向けて配された交差位置を有するＳＤＲ事象においては増加し、一方、平均的により動原体側にその交差位置が配されている場合には減少する。十分な分子マーカーの有用性により、これらの交差ポイントは、各ＳＤＲ事象において容易に決定される。
【００２７】
各染色体腕における交差の拡張は、動原体の位置によって限界がある。残留ヘテロ接合体が比較的少ない場合には、ＳＤＲ事象がヘテロ接合の構造以外にＲＩＬとＢＩＬに類似している、ということは特筆されるべき点である。
【００２８】
第２分裂復元は、前記非還元胞子／配偶子の上位類の一例にすぎない。ヴェイルレックス（Veilleux,  Plant  Breeding  Reviews  3,  253-288  (1985)）は、非還元配偶子が形成されるメカニズムについて説明し、作物植物における非還元配偶子の発生リストを提供している。当時、主に２つの異なる非還元配偶子の類、すなわち第２分裂復元（ＳＤＲ）と第１分裂復元（ＦＤＲ）が認識されていた。近年、非還元配偶子の第３類が不定減数分裂復元（ＩＭＲ）と名付けられて公開された（Lim  et  al.  (2001)  Theor.  Appl.  Genet.  103:219-230）。
【００２９】
本発明の目的については、ＳＤＲのみ関連している。ＳＤＲは、ヴェイルレックス、スープラ、およびその他の独自の研究によって作り出されたリストで実証されているように、広範な作物において自然に生じる（Lim  K  et  al.  (2004)  Breeding  Science  54:  13-18）。興味深いことに、コショウにおいて、植物を１１°Ｃで４８時間さらすことによって、ＳＤＲ２ｎ配偶子（花粉）の頻度が（平均で）１％から１０．５％まで増加する、ということを判明した（Zhang  X  et  al.  (2002)  Journal  of  Horticultural  Science  &  Biotechnology  78:  (1)  84-88）。ＳＤＲ発生率の最大値は、８１．３％まで測定された。すなわち、外部刺激によって、ＳＤＲ事象の数を増加させることは可能である。
【００３０】
２ｎ胞子または配偶子の発生は、雄性配偶体に限定されず、これが雌性配偶体のレベルで起こるという証拠も存在する。例えば、ザゴルチェヴァ（Zagorcheva  L  Genetics  and  Plant  Breeding  9(5),  386-399  (1976)）は、キュウリにおける大胞子および大胞子形成の偏移の発生を報告した。
【００３１】
近逆育種は、ヘテロ接合性開始植物の遺伝子組成を復元するために、ＳＤＲがもたらす非還元胞子の発生を活用する。基本的に、オリジナル交配種植物を復元するために、各染色体の動原体領域に対して相補的であるＳＤＲ−０植物の選択を開始する。これは、多型分子マーカーを用いて各染色体における動原体領域を遺伝子表現型化することによって達成される。ＳＤＲ−０再生体が動原体領域においてホモ接合性である場合、完全（または一部）相補的植物は、このような方法で確認される。１つの任意のＳＤＲ−０植物が選択された場合、相補的なＳＤＲ−０植物を見つけられる確率（動原体相補性に基づいて、残留ヘテロ接合体は数に入れない）は、染色体の数をｘとすると（１／２）ｘである。
【００３２】
オリジナルの親系統が復元されることになっている場合、１つの親を見つける確率は、（１／２）ｘ−１であり、かつ、他の親についての確率は、（１／２）ｘである。また、前述のように、この「近親性」は、両親において遺伝子混入セグメントが生成される戻し交配近交系（ＢＩＬ’ｓ）とみなされる。その後、これらの相補的植物は、オリジナル交配種植物の遺伝子型を復元するために交配される。
【００３３】
しかしながら、減数分裂組み換えにより、ＳＤＲ−０植物の染色体腕の末端領域がヘテロ接合（１染色体腕あたり単一交差の場合）になっているため、復元された交配種では分離が生じる。組み換えが比較的末端領域で生じ、それにより遺伝子含量が少ないため、または、対立遺伝子変異が表現型変異にほとんど関与していないため、復元された交配種は、遺伝子情報が表現型変異に対してほとんど関与していない際には、比較的同一である。
【００３４】
本発明の実施形態では、ＳＤＲ−０事象は、減数分裂組み換えが染色体の極限テロメア領域において単独で生じる状態で引き起こされる。このような事象では、染色体は、物理的に組み換えられるだけではなく、遺伝子的にも組み換えられる。
【００３５】
遺伝子的に完全にホモ接合である復元交配種植物を得るために、倍加半数体は、各相補的ＳＤＲ−０事象から生成される。図３に模式的に示されるこの原理は、図２のＳＤＲ−０事象３から再生された植物で生じる胞子／配偶子の構成を示している。
【００３６】
形成された胞子が再生され、かつ、染色体の倍加に際して、倍加半数体が生成される。分子マーカーを用いることによって、親系統のいずれか一方に非常に類似している倍加半数体を選択することができる。これは、倍加された染色体セットによって図４に示されている。
【００３７】
分離により、これらの倍加半数体植物の染色体の末端（組み換え分岐点から短鎖重合体まで）は、各親の遺伝子情報の平均で５０％を含んでいる。相補的ＳＤＲ−０事象から生じる、任意に選択された２つの倍加半数体植物が交配を介して組み合わされる場合には、復元された交配種植物において、基端腕領域が１００％のヘテロ接合性であるのに対して、末端腕領域は５０％のヘテロ接合性である。ＳＤＲ−０事象が平均で６０％のホモ接合性であるとみなされる場合（Carputo,  D.  et  al.  (2003)  Genetics  163,  287-294）、相補的事象を伴う復元は、平均で８０％のヘテロ接合性（１００％×６０％＋５０％×４０％）と２０％のホモ接合性をもたらす。基端と末端の交差ポイント間におけるホモ接合性は、この領域でホモ接合性であったＳＤＲ−０再生体の遺伝子型に偏っており、一方、末端交差ポイントより末端側では、ホモ接合性は、両方の親の表現型と同一である。
【００３８】
ヘテロ接合性に関する上記数字が極値を表していること、すなわち、１００％のヘテロ接合性である（その染色体上にある遺伝子が全て対立遺伝子であることを意味する）植物から開始することが多様であることは、当業者にとっては自明である。実際には、これはほとんどありえないので、ヘテロ接合性のパーセンテージは、平均するともっと低くなる。
【００３９】
また、本発明は、交配種を生成する方法に関するものであり、本発明により生成された第１ホモ接合性生物を第２ホモ接合性生物に交配することを含んでいる。本発明によれば、オリジナルの交配種の遺伝子形成を復元することは可能であり、一方で、さらに、オリジナルの交配種の遺伝子形成を手引きする変異体が得られる。
【００４０】
本発明の実施形態において、第２ホモ接合性生物は、第１ホモ接合性生物に対して少なくとも部分的に相補的であるので、結果的に生じる交配種は、ヘテロ接合性開始生物に類似している。適切には、ヘテロ接合性開始生物の類似体は、開始生物の少なくとも５０％のヘテロ接合性を有する交配種を含んでいる。好ましくは、この類似体のヘテロ接合性は、５０％〜１００％の間のいずれかの割合であり、より具体的にはこの類似体のヘテロ接合性は、５０％〜６０％であり、好ましくは６０％〜７０％であり、より好ましくは７０〜８０％、さらに好ましくは８０％〜９０％であり、最も好ましくは９０％〜１００％である。特定の割合が明確に言及されてはいないが、「いずれかの割合」という用語には、上述された範囲中のあらゆる割合を対象とすることが意図されている。
【００４１】
また別の方法では、第２ホモ接合性生物は、結果的に生じる交配種がヘテロ接合性開始生物より優れているように選択されている。「オリジナルのヘテロ接合性生物」は、請求項１のステップａ）で用いられる生物である。
【００４２】
復元された交配種植物におけるその親の起源と同様、ホモ接合性の関連レベルの変化は、それぞれの親に係る各染色体腕中の交差ポイントに依存している。分子マーカーを用いることにより、両方のＳＤＲ−０事象は、それらから生じる倍加半数体と同様、ホモ接合性のレベルが比較的低いＦ１交配種をもたらす交配に際して選択される。
【００４３】
この実施形態では、ＳＤＲ−０事象においては、平均的により多くの末端交配ポイントを有するものを選択するべきだが、倍加半数体においては、ほぼ相補的であるものを選択すべきである。
【００４４】
一方、しかしながら、いずれかの親に偏っているＦ１交配種にホモ接合性を取り込むために、基端と末端の交差ポイントの間の距離が比較的大きい事象を選択することが望ましい。
【００４５】
以上のことから、近逆育種が、植物育種人による広範囲にわたる交配種の復元を可能にする一方で、ホモ接合性である対立遺伝子の異なるレベルおよび起源による顕著な変異が、実験的なＦ１交配種の間で得られることは、明白である。
【００４６】
また、染色体の任意のサブセットに対してのみ相補的である交配種を生成することは可能である。これは、それらの動原体遺伝子型に基づいて、所望の染色体ペアに対して相補的であるとともに、他のものに関しては同一であるＳＤＲ−０事象を選択することによって、実行される。近置換系統とよばれるものから生成されたこの交配種は、相補的染色体ペアと比べると、非相補的染色体ペアに関してヘテロ接合性と同じレベルでほとんどホモ接合性である。最極端な形態では、ヘテロ接合性が染色体の末端部分に制限されている交配植物をもたらし、ほとんど非相補的である倍加半数体に交配することができる。
【００４７】
近逆育種に関してＳＤＲを活用するために、ＳＤＲ事象の自発的発生を使用することができ、あるいは例えば遺伝子工学を介してＳＤＲ事象を誘発させることができる。
【００４８】
本発明の別の形態は、戻し交配に関連している。戻し交配は、当業者にとっては周知である品種改良用語であり、（遺伝的背景と呼ばれる）所望の遺伝子構成を伴う植物系統に特異形質が遺伝子移入される手法を参照している。この手法の所望の成果は、開始植物系統に対して遺伝子的にほぼ同一であるが、所望の形質の基礎となる遺伝因子のみが組み換えを介して加えられる植物系統である。この目的を達成するために、所望の遺伝的背景および所望の形質をもたらす植物が交配され、かつ、その子孫は、その形質と同様、できるだけ多くの遺伝的背景をもたらす植物として選択される。戻し交配周期に伴う所望の遺伝的背景の増加が平均的に半分になる場合、実際には、戻し交配手法を完成させるには４ないし５の繁殖周期を要する。
【００４９】
ホモ接合状態に至るための手法が２つのステップのみを要する場合、近逆育種は、戻し交配のスピード化を図ることができる。最初のステップは、従来の戻し交配手法、すなわち、所望の遺伝的背景および所望の形質をもたらす植物の交配と同じである。結果として生じる交配種は、表現型またはマーカー利用に基づく所望の形質、および遺伝的背景に対して特異的な動原体マーカーに基づく所望の遺伝的背景に関して選択されるＳＤＲ事象を発現させるために用いられる
【００５０】
第２ステップは、分子マーカーを用いる遺伝的背景の上限として選択される倍加半数体の生成を伴って生じる。近逆育種は、ホモ接合に達するための手法に関連するものであるが、２つの選択ステップを許容している。十分な遺伝子マーカーが利用できる場合には、従来の方法と比べて、繁殖周期に費やす時間の多くが顕著に削減されるので、所望の戻し交配生成がより効果的に得られる。
【００５１】
本発明の近逆育種方法では、細胞質雄性不捻性（ＣＭＳ）は、所望の背景に効果的に遺伝子移入される。ＣＭＳ移入に近逆育種を適用するためには、ＣＭＳドナー系統は、多くの核遺伝子マーカーに関して雄性不稔に変換されなければならない系統に対して、好ましくは遺伝子的に異なるので、ＣＭＳの染色体と繁殖力に富むドナーとの間の差異は、より容易に究明される。
【００５２】
純系統または所望の近交配系統（ホモ接合性または近ホモ接合性）を類似系統だがＣＭＳ背景を伴っているものに変換するためには、最初の交配は、所望の系統の花粉を有する前記ＣＭＳの授粉によって成される。この結果生じるＦ１子孫は、ＣＭＳと所望の系統の染色体の５０％とを含んでいる。Ｆ１子孫植物は、窒素酸化物などの化学物質または低温などのストレス環境のいずれかの処理によって、雌性発生におけるＳＤＲ減数分裂の実行をもたらす。また、ＳＤＲは、雌性発生において自発的に発生する。
【００５３】
雄核発生が適用される場合には、細胞質をもたらす雄性不稔の効果を抑制することができる復元遺伝子を使用しなければならない。
【００５４】
結果的に生じるＳＤＲ−０植物は、Ｆ１交配種の動原体領域において多型であるＤＮＡマーカーを用いて遺伝子的に分析される。ＣＭＳに変換されなくてはならない系統の動原体領域をもっぱら含むＳＤＲ−０植物が選択される。ゲノムをカバーしている多くの特異なマーカーが利用可能な場合には、染色体上に最基端の交差ポイントを平均的に有するＳＤＲ−０事象を選択することができる。これは、単一のステップで、選択された系統をＣＭＳに概ね変換する。必要に応じて、この戻し交配周期は繰り返される。
【００５５】
ＳＤＲ事象の自発的発生は、高温または低温衝撃のような特定の偶発的ストレス環境によって高められる。このようなストレス環境は、非還元型の２倍体胞子の形成を強化するものとして知られている（Zhang  X  et  al.  (2002)  Journal  of  Horticultural  Science  &  Biotechnology  78:  (1)  84-88）。また、亜酸化窒素ガスを適用することによって、２ｎ花粉の形成を誘発することが可能である（Okazaki,  K.  et  al.  (2005)  Euphytica,  143,  101-114）。
【００５６】
２倍体胞子が雄性減数分裂を介して生成される場合、フローサイトメトリーおよび蛍光活性化細胞分裂を介してこれらの細胞を富化することが可能である。このような技術は、当業者によく知られており、過去に小胞子で適用されている（Deslauriers  C  et  al.,  (1991)  Flow  cytometric  characterisation  and  sorting  of  cultured  Brassica  napus  microspores.  Biochem.  Biophys.  Acta:  1091,  165-17）。
【００５７】
また、２倍体胞子あるいは花粉がそれらの半数体ピアよりもサイズが大きい、ということは知られている（Lernmi  G  and  Negri  V.  (1994)  Research  on  2n  pollen  production  in  Lotus  tenuis  an  I.M.G.V.  of  Perugia  University.  Lotus  newsletter  Vol;  25,  pp  24-27）。驚いたことに、２倍体胞子が半数体胞子と物理的に異なるという単なる事実は、フローサイトメトリーおよび蛍光活性化細胞分裂を介して２倍体胞子を特異的に富化することを可能にする。
【００５８】
さらに、２倍体胞子の形成を促す環境条件の最適化は、異なる分類技術を用いて容易に行われる。
【００５９】
非還元性胞子の再生は、還元胞子の再生と同様の有棘受粉により、雄核発生、雌性発生、または単為生殖を介して生じる。有棘受粉による単為生殖が適用される場合、２倍体花粉、特に胚乳中の父性ゲノムに対する母性の割合の変化に関して低い耐性を有する種を用いることは有効である。全ての作物ではないが、大部分に関しては、これらの再生プロトコルは、学術論文で説明され、かつ、当業者にとっては周知である。
【００６０】
２倍体胞子から植物が再生されると、ＳＤＲあるいはＦＤＲ事象に関する診断基準である染色体ペアの動原体領域のホモ接合性あるいはヘテロ接合性を判断するために、分子マーカーが利用される。この場合、ＳＤＲ事象は、容易に選択される。
【００６１】
当業者に周知である異なる遺伝子的手法として、減数分裂の第２細胞分裂に関わる細胞因子に干渉させるものがある。この干渉は、突然変異または遺伝子組み換えを介して生じる。遺伝仕組み換えの手法は、ＳＤＲ型の２倍体胞子をもたらす減数分裂の第２分裂が変異する安定的または一時的なＤＮＡフラグメントの導入を得ようとしている。この変異は、減数分裂処理に関連している遺伝因子、特に第２細胞分裂に関連しているものへの干渉を介して生じる。この干渉は、転写後型遺伝子不活性化（ＰＴＧＳ）に基づく、遺伝子発現の特定のダウン・レギュレーションを介して生じる。ＰＴＧＳは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）またはウイルス誘発型遺伝子不活性化（ＶＩＧＳ）を介して生じる。
【００６２】
さらに、別の手法では、この干渉は、減数分裂の第２減数分裂において優性阻害効果を及ぼすタンパク質の過剰発現を介して生じる。
【００６３】
採用された手法の如何にかかわらず、標的遺伝子は、分子レベルで知られている必要がある。劣性突然変異体の数は、減数分裂したＳＤＲ型をもたらすジャガイモ（ｐｃｐｃ，ｏｓｏｓ，ｆｃｆｃ型）で説明されている（Carputo,  D.  et  al.  (2003)  Genetics  163,  287-294）。また、トウモロコシに関しては、伸長変異型が減数分裂ＩＩの欠如をもたらしている（Barell,  PJ  and  Grossniklaus,  U.  (2005)  Plant  J.  43,  309-320）。
【００６４】
これらの具体例において変異された遺伝子は、分子レベルではまだ特定されていないが、当業者は、そのようにすることができ、よって、これらおよび他のまだ未知の遺伝子は、分子抑圧技術を用いて標的種におけるＳＤＲをもたらす優秀な候補である。本発明は、近逆育種の遺伝子原理に関するものであり、開始植物においてＳＤＲを引き起こす全ての可能な実施形態が説明されているわけではないという事実は、本発明に関連していない。
【００６５】
シロイヌナズナで説明され、突然変異により異常な減数分裂をもたらすＤＵＥＴ（Venkata  Reddy  et  al.  (2003)  Development  130,  5975-5987）やＣＹＣ１；２（Wang  et  al.  (2004)  Plant  Physiology  136,  4127-4135）のような遺伝子において、別の手段を見つけることができる。
【００６６】
これらの突然変異における２倍体減数分裂生成は、ＳＤＲのようであり、このことから、ＤＵＥＴおよびＣＹＣ１；２は、他の植物種におけるそれらの機能的相同体と同様、減数分裂のＳＤＲ型をもたらす候補標的遺伝子である。
【００６７】
さらに別の候補標的遺伝子は、不活性化により減数分裂後に細胞分裂の欠如をもたらす四分胞子／スタッド（Yang  et  al  (2003)  Plant  J.  34,  229-240）である。四分胞子／スタッド変異体の小胞子の２倍体再生は、ＳＤＲに類似している。
【００６８】
ＳＤＲ−０植物が得られるとすぐに、それらはさらに分子的に特性化される。まず、ＳＤＲ−０植物間においてホモ接合性染色体の相補性レベルで識見を提供する動原体領域の半数体型が見つけ出される。この適用により、全体的または部分的に相補的であるＳＤＲ−０植物を選択することができる。その後、ＳＤＲ植物は、より緻密なハプロタイプ・マップを生成するのに使用される。これは、当業者にとって周知である分子タイピング技術を用いることで達成される。例としては、ＲＦＬＰ（“Restriction  Fragment  Length  Polymorphism”  Beckmann,  J.  S.  and  Soller,  M  (1983)  Theor.  and  Appl.  Genet.  67,  35-43）、ＲＡＰＤ（“Amplified  Polymorphic  DNA”  Welsh,  J.  and  McClelland,  M.  (1990)  Nucleic  Acids  Res.  19,  961-866）、ＡＦＬＰ（“Amplified  Fragment  Length  Polymorphism”  Vos,  P.  et  al  (1995)  Nucleic  Acids  Res.  23,  4407-4414）、あるいはＳＦＰ（“Single  Feature  Polymorphism”  Borovitz,  J.  et  al  (2003)  Genome  Research  13,  513-523）がある。これらの技術は、ＤＮＡポリモフィズムの性質に関する知識がなくても使うことができる。
【００６９】
例えばＳＮＰなどのように、ＤＮＡポリモフィズムが特性化される場合には、多くのＳＮＰ検出技術が使用される（Kwok,  P.  Y.  and  Chen,  X  (2003)  Curr.  Issues  Mol.  Biol.  5,  43-60）。ハプロタイプ・マップは、ＤＨ生成における植物を選択するのに使用される。この得られた半数体は、ＳＤＲ−０開始植物においてヘテロ接合性である領域に関してハプロタイプ化される。この分析は、Ｆ１交配種におけるヘテロ接合性／ホモ接合性の割合を操作するのに用いられる遺伝子情報を提供し、かつ、Ｆ１交配種のゲノムのホモ接合性領域に係る、いずれかの親の起源を選択する可能性を提供する。
【００７０】
２つのホモ接合性生物に係る少なくとも１つの相補的な組み合わせ（交配後に開始生物を「再合成」できる組み合わせ）を見つける確率は、所定の種の半数染色体の数ｘと、ＳＤＲが生じるヘテロ接合性開始生物から生成されたホモ接合性生物の数ｋに依存する。
【００７１】
所定の作物種の半数染色体の数をｘで表すと、交差ポイントの染色体領域末端部のみを考慮する場合、すなわち、染色体領域を含む場合に、その作物種の植物から得られる遺伝子型の最大数は、２ｘである。この集団から任意に選択される１つのＳＤＲ−０植物のペア、またはそれらから派生するＤＨが、交配によって、ＳＤＲ−０事象を生成する遺伝子型（オリジナルの遺伝子型）にほぼ一致する遺伝子型を有するＦ１交配種をもたらす確率は、（２ｘ−１）／２ｘである。総数ｋのＳＤＲ−０植物が生成される場合、交配され得る２つの遺伝的に異なるＳＤＲ−０植物、またはそれらから派生するＤＨ植物の組み合わせ数は、１／２ｋ（ｋ−１）である。相補的になるように任意に選択される２つのＳＤＲ−０植物、またはそれらから派生するＤＨ植物の組み合わせに関する確率は、（１／２）ｘである。したがって、相補的ではない２つのＳＤＲ−０植物、またはそれらから形成されるＤＨ植物が任意に選択される確率は、１−（１／２）ｘ＝（２ｘ−１）／２ｘである。ＳＤＲ−０植物またはそれらから生じたＤＨ植物がｋの場合、（１／２）ｋ（ｋ−１）個の組み合わせが生成され、これにより、このＳＤＲ−０集合体、またはそれらから派生するＤＨ植物集合体において、非相補的な植物が見つかる確率は、（（２ｘ−１）／２ｘ）（（１／２）ｋ（ｋ−１））であり、この結果、２つのＳＤＲ−０植物、またはそれらから派生するＤＨ植物の少なくとも１つの組み合わせが見つかる確率は、１−（（２ｘ−１）／２ｘ）（（１／２）ｋ（ｋ−１））である。この分析の結果は、表１に示される。
【表１】
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【００７２】
この分析は、キュウリのような半数染色体数が７である植物に対して４８個のＳＤＲ−０植物またはそれらから派生するＤＨ植物を用いた場合、カリフラワーのような半数染色体数が９である植物に対して１２８個を用いた場合、ならびにトマト、メロンおよびシシトウのような半数染色体数が１２である植物に対して２５６個を用いた場合に、オリジナルの遺伝子型が、本発明に係るＦ１交配種として高確率で概ね再合成されることを示している。これらの数字は、これらの作物種についての近逆育種を適用するために要求されるＳＤＲ−０植物の数が比較的少なく、この結果、特に工業環境においては、この数の生成が非常に実現しやすい、という事実を示している。倍加染色体数が周知であるあらゆる作物種においても、このような計算が実行可能であることは、当業者にとっては明らかである。
【００７３】
本明細書中で使用される「ＳＤＲ−０植物または細胞」は、非還元配偶子から生じる植物および配偶子に関連していることを意図している。この非配偶子は、第２分裂復元（ＳＤＲ）事象によって順次生じるが、２倍体をもたらす減数分裂の異常形成によっても生成される。
【００７４】
したがって、本発明は、例えば、遺伝子型を復元すること、近相補的親系統を生成すること、近染色体置換系統を作り出すこと、ならびに、ホモおよびヘテロ接合性遺伝子セグメントの移入によりＦ１交配種を最適化することを目的とし、ＳＤＲまたはＳＤＲのような非還元配偶子から再生される生物、特に植物を使用するための手段を提供する。
【００７５】
本発明は、以下の図を参照にしながら、後述の非限定例でさらに説明される。
【００７６】
図５は、キュウリの典型的なＦ２植物のＡＦＬＰパターンを示す。全ての横線は、１つの個体植物を表している。全ての垂直柱は、連鎖群を表している。薄灰色セグメントは、ヘテロ接合領域を表し、黒色および暗い領域は、それぞれホモ接合領域を表している。
【００７７】
図６は、キュウリにおける典型的なＤＨ系統のＡＦＬＰ分析を示す。全ての横線は、１つの個体植物を表している。全ての垂直柱は、連鎖群を表している。ＤＨ系統においては、予想どおり黒く暗い領域のみが存在し、薄灰色セグメントは存在していない。
【００７８】
図７は、キュウリにおける典型的なＳＤＲ−０植物のＡＦＬＰ分析を示す。全ての横線は、１つの個体植物を表している。全ての垂直柱は、連鎖群を表している。薄灰色セグメントは、ヘテロ接合領域を表している。黒く暗い領域は、ホモ接合領域を表している。
【００７９】
図８は、低温で取り扱われたコショウ植物から採取された花粉を示す。図８Ａは、光顕微鏡を通して観測される、その寒冷処理された植物の花粉を示し、一方、図８Ｂは、対照植物の花粉を示す。
【実施例１】
【００８０】
「雌性細胞から得られるキュウリにおけるヘテロ接合性の比較的低いレベルの発生についての証明」
【００８１】
期待倍加半数体において、所定の割合が、半数体大胞子に基づいているのではなく、むしろ非還元大胞子（２ｎ）基づいている点を証明しているということが、ＡＦＬＰ分析（欧州特許出願０５３４８５８で実行）を用いることによって発見された。このことは、最初に推定された倍加半数体（図６）がヘテロ接合性セクタをまだ含んでいる点が示されている図５、図６および図７で十分に立証され、この点は当然ながら真性倍加半数体では起こり得ないことである。
【００８２】
この実施例は、キュウリにおける雌性細胞を介して、倍加半数体が得られるだけではなく、さらにヘテロ接合性であるいくつかの領域を示す植物が得られる、ということを示している。このヘテロ接合性のレベルは、Ｆ２世代と比べると著しく低減され、このことから、おそらくＳＤＲ類似メカニズムによって引き起こされている。
【実施例２】
【００８３】
「シシトウにおける非還元胞子／配偶子の形成の増進」
【００８４】
非還元胞子／配偶子形成の頻度を増加させるために、誘導因子として低温ストレスが適用された。この目的のために、チャン・エックス他（Zhang  X  et  al.  (2002)  Journal  of  Horticultural  Science  &  Biotechnology  78(1),  84-88）によると、前減数分裂花芽を備え、２３°Ｃで発育するシシトウの顕花植物が、１１°Ｃに２日間さらされた。この低温衝撃の後に、芽が採取され、かつ、解剖用の鉗子およびメスを用いて葯を開くことにより、花粉が抽出された。その後、花粉は、実質的に顕微鏡のスライド・ガラス上に移され、１滴のアセトカルミンを用いて生存染色された。スライド・カバーは、光顕微鏡法を用いて調査される検査液の上に置かれた。対照物として、２３°Ｃで育てられたシシトウから花粉が採取された。
【００８５】
図８は、寒冷処理植物（図８Ａ）と対照植物（図８Ｂ）とから採取された花粉の形態の比較例を示す。同図に示すように、非還元胞子から派生し、サイズ増大の兆候を有する花粉の数は、寒冷処理植物においては顕著に増大する。この部分的な例では、寒冷処理により非還元胞子のパーセンテージが最大で２５まで上昇することが推定された。以上のように、熱応力による非還元胞子の形成の増進は、大いに実現可能である。
【実施例３】
【００８６】
「フローサイトメトリーによるブロッコリー（キャベツ類）の２倍体胞子の自然発生の強化」
【００８７】
ブロッコリー（およびその類縁体）に関しては、２倍体胞子が半数体胞子よりも大きいことが知られている。フローサイトメトリーを用いて２倍体胞子を富化できるか否かを判断するために、異なる混合体が、２倍体および４倍体植物から得られる胞子から生成された。胞子は、花芽（３〜４ｍｍのサイズ）を緩衝液（８．２ｇ／ＬのＮａＣｌ、１．９ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．３ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、ｐＨ＝７．４）中で粉砕し、その後１１０μｍのフィルタを介してろ過することによって、単離された。その細胞は、抽出緩衝液で２度洗浄され、計数された。
【００８８】
以下の混合体は、半数体と倍数体細胞との比が、１：１、１０：１、および１００：１で構成された。分類は、粒度、生命力、およびサイズのパラメータに基づいて実行された。２倍体細胞の強化は、全ての比で得られ、３つのパラメータの各々に基づいていた。次の実験では、半数体小胞子の自然個体群が、上述したパラメータに基づいて分類された。小胞子個体群において０．７％の頻度で存在すると推定される２倍体小胞子は分類可能である、ということが発見された。図９は、光顕微鏡を介して観察された、この実験で得られた純性２倍体小胞子（下段横列）を、通常の半数体小胞子と比較して示している。写真は、ライデンのオランダ応用研究機構（TNO  Leiden）のエム・ヴェンニック技師（Ing.  M.  Vennik）のご厚意により、得られたものである。
【実施例４】
【００８９】
「四分胞子の候補標的遺伝子を下方制御するのに利用可能なＲＮＡ干渉ベクターの構築」
【００９０】
特定の植物種における候補標的遺伝子の活性化を下方制御するために、ＲＮＡ干渉を用いることができる。そのために、シロイヌナズナの四分胞子のＤＮＡフラグメントは、ｐＫＡＮＮＩＢＡＬ（Wesley  et  al.  (2001)  The  Plant  Journal  27,  581-590）中に移入され、その結果、植物の発現において、同族体ＲＮＡの特異的分解をもたらすヘアピン構造を形成しながら、それ自体に折り重なることができるＲＮＡ分子が形成される。
【００９１】
そのｐＫＡＮＮＩＢＡＬベクターは、ＣａＭＶ−３５Ｓプロモータの下流で、かつ、オクトピン・シンターゼ・ポリアデニル化信号より上流に配されたイントロンを含んでいる。そのイントロンの片側には、相互に対して逆方向であるＲＮＡ干渉標的に応じて、ＤＮＡの左右の腕を容易に挿入することができる多重クローニング部位が配されている。転写において、イントロンは、スプライシングによって取り除かれ、かつ、ＤＮＡの左右の腕は、二重鎖ＲＮＡを形成しながら互いに折り重なる。
【００９２】
２つの相補ＤＮＡは、遺伝子の５´端部（５８８ｂｐ、  前方のプライマ：５´−ＡＣＣ  ＴＣＣ  ＧＡＧ  ＡＡＣ  ＴＣＣ  ＧＴＴ  ＡＡＧ−３´、逆プライマ：５´−ＴＧＣ  ＣＴＧ  ＣＴＴ  ＴＣＴ  ＡＣＣ  ＡＣＴ  ＴＣ−３´）および遺伝子の中間部分（６７９ｂｐ、  前方のプライマ：５´−ＴＴＣ  ＴＣＡ  ＡＧＴ  ＧＧＣ  ＡＡＧ  ＧＴＧ  ＴＣ−３´、逆プライマ：５´−ＡＴＣ  ＣＣＴ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＴＧＧ  ＡＧＴ  ＡＧ−３´）に応じて単離された。制限酵素認識部位は、ｐＫＡＮＮＩＢＡＬにおいて逆方向反復である場合に、相補ＤＮＡフラグメントの挿入を許容する各フラグメントの両側で生成された。両フラグメントにおける左腕は、ＸｈｏＩ−ＫｐｎＩフラグメントとして組み換えられ、一方、両フラグメントの右腕は、ＨｉｎｄＩＩ−ＸｂａＩフラグメントとして組み換えられる。最終ステップでは、逆方向反復の際に両方の四分胞子配列を含んでいる完全なヘアピン・カセットは、植物の形質転換における選択マーカーとしてネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ第２遺伝子を含んでいるｐＡＲＴ２７と呼ばれる二値ベクターのトランスファーＤＮＡ中に別々に挿入される。トランスファーＤＮＡの完全性は、配列解析によって確認された。
【００９３】
この結果として生じる、５´フラグメントでｐＲＺ２２６と命名された二値ベクター、および３´フラグメントでｐＲＺ２１９と命名された二値ベクターは、３親間交配手法を用いてアグロバクテリウム腫脹体へ移される。クレーンの候補標的遺伝子のフラグメントとＲＮＡ干渉によって下方制御される必要がある特異遺伝子との間において、配列同相性が低すぎる場合、上述した方法は、下方制御される必要がある遺伝子に対して十分に相同であるＤＮＡフラグメントを含んでいる類似組成体を生成するのに用いることができる。
【実施例５】
【００９４】
「ｐＲＺ２２６とｐＲＺ２１９を有するシロイヌナズナの形質転換」
【００９５】
植物形質転換ベクターｐＲＺ２２６とｐＲＺ２１９を含んでいるアグロバクテリウム腫脹体菌株Ｃ５８は、ベクターについて選択するためのストレプチノマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）およびスペクチノマイシン（３００ｍｇ／Ｌ）、ならびにアグロバクテリウム腫脹体Ｃ５８について選択するためのリファンピシン（４０ｍｇ／Ｌ）およびゲンタマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）を含んでいるＬＢ培地において、２９°Ｃで一晩培養された。
【００９６】
遺伝子組み換え植物を生成するためには、デヒュー他（Desfeux  et  al.  (2000)  Plant  Physiology  123,  895-904）で説明されるように、シロイヌナズナ花芽ディップ法が概ね使用された。そのバクテリア細胞は、（１リットルＭｉｌｌｉＱ水あたり５０ｇのショ糖と５００マイクロリットルのシルウエットＬ−７７界面活性剤を含む）花芽ディップ溶液中で再懸濁された。複数の花芽を含む抽薹植物は、５〜１０秒間の緩やかな攪拌において１．０〜１．５のＯＤ値でアグロバクテリウム細胞を含んでいる花芽ディップ溶液に沈められた。植菌後、その植物は、暗い光条件の下で高い湿度を保つために、プラスチック容器中に１日間収容され、その後、種子がその植物で培養された。
【００９７】
形質転換体は、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有する半強化ＭＳプレート上に重ねられた０．１％のアガロースで種子を消毒する表面を発生させることにより、選択された。カナマイシン抵抗性苗木は、温室の中の土に移された。
【実施例６】
【００９８】
「キャベツ（Brassica  oleracea）におけるＳＤＲ事象の自然発生」
【００９９】
遠縁交配を介してオグラ細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）をもたらす赤キャベツ（Brassica  oleracea）上で生成された交配種は、オリジナルの赤キャベツＣＭＳ植物と表現型上ほぼ同一であり、ひいてはインビボ雌性発生の産物である２倍体植物の発生について、スクリーニング（検査）された。これらの植物は、それらの表現型に基づいて真性交配種植物と容易に区別され得るものであり、実に低い頻度で確認された。
【０１００】
このような植物は、自然倍加された還元配偶子または非還元配偶子から、単為生殖を介して派生したものである。これらの可能性を区別するために、これらの植物から抽出されたＤＮＡは、ＡＦＬＰ（欧州特許５３４８５８号で実行）を用いて分析された。この分析は、この植物が非還元配偶子を起源としていることを示唆しているヘテロ接合座の存在が比較的に低い頻度である点を証明した。この実施例は、キャベツにおけるインビボ雌性発生を通じて、植物が、ＳＤＲ類似メカニズムによって引き起こされる比較的低いレベルのヘテロ接合度で得られる、ということを示している。
【０１０１】
図１０は、非還元配偶子から派生したキャベツ植物のＡＦＬＰ指紋を示す。灰色線は、片親からのホモ接合マーカー細胞を示し、濃灰色は、その他からのものを示している。薄灰色は、交配種マーカー座を示している。
【実施例７】
【０１０２】
「トウモロコシの近逆育種」
【０１０３】
トウモロコシのゲノムにおける核酸の混入は、通常的な手法であり、かつ、これを達成する方法は、既に開示されている（欧州特許８０１１３４号、米国特許５，４８９，５２０号、欧州特許９７．１１４６５４．３号）。これらの特許出願に開示される形質転換方法のいずれかを用いる場合には、特異的な遺伝子阻害効果、または、第２減数分裂に関与するとともに、結果としてＳＤＲ型の異常減数分裂事象の発生をもたらす遺伝子、特に伸長体（Barell,  PJ  and  Grossniklaus,  U.,  (2005)  Plant  J.  43,  309-320）を与える核酸配列が導入された。得られるＳＤＲ事象の頻度は、遺伝子組み換え核酸配列の統合に係る異なるゲノム部位の結果により、独立形質転換体の間でしばしば異なる。
【０１０４】
別の実験では、ＳＤＲ胞子の頻度は、トウモロコシ植物の低温処理、または、カトウ・エーおよびバーチラー（Kato,  A  and  Birchler,  JA  (2006)  J.  Hered.  1,  39-44）で説明されるような亜酸化窒素ガスを適用することによって高められた。
【０１０５】
上記阻害核酸の活性化、または、低温あるいは亜酸化窒素処理の適用の結果、ＳＤＲ型である多数の小胞子、各大胞子がそれぞれ生成された。
【０１０６】
これにより生成された細胞集合は、ＳＤＲ小胞子が正常の半数体小胞子に比べてサイズが大きいという事実に基づいて、フローサイトメトリーまたは蛍光活性化細胞分類を用いることにより、ＳＤＲ小胞子の存在を富化された。
【０１０７】
ＳＤＲ事象の結果として生成された小胞子または大胞子は、２倍体セットを含んでいる。これらの２倍体小胞子または大胞子は、ＳＤＲ−０再生体を生成するための開始要素であった。
【０１０８】
また、半数体トウモロコシ植物は、いわゆる半数体誘導因子を自然的または人工的に受粉した後に得られた。この場合、半数体胚を含む種子が得られる（Rotarenco  V  (2002)  Production  of  matroclinous  maize  haploids  following  natural  AND  artificial  pollination  with  a  haploid  inducer,  Maize  Genetics  Cooperation  News
Letter  76:  16）。また、ＤＨトウモロコシ植物を生成する上記手順は、ＳＤＲ−０細胞からＳＤＲ−０トウモロコシ植物を生成するのに適用され、その形成は、この実施例で明示された処理によって引き起こされた。また、ＳＤＲ−０穀粒の内胚乳で母性および父性のゲノム間における適性バランスを得るために、４倍体誘導因子系統を用いることもできる。
【０１０９】
ＳＤＲを誘発するために遺伝子組み換えが適用される特別実験では、トランス遺伝子の単一配列を含む形質転換体が推奨されていた。第２減数分裂をほぼ阻害する核酸組成物を含むトランス遺伝子を得た後、この系統は、反復形質転換事象を避けるために、交配に用いられた。その場合、半数体配偶子を含む普通の花粉の頻度は低かったが、交配に用いるには十分であった。
【０１１０】
別の実験では、例えばデキサメタゾンにより化学的に誘発性であるプロモーター遺伝子によって制御される阻害核酸組成物が用いられた（Bohner,  S.  et  al.  (1999)  Plant  J.  19,  87-95）。
【０１１１】
トウモロコシにおける半数体は、通常、小胞子から得られた（Pescitelli  S  and  Petolino  J,  (1988)  Plant  Cell  Reports  7:  441-444;  Coumans  M  et  al.,  (1989)  Plant  Cell  Reports  7:  618-621;  Pescitelli  S  et  al.,  (1989)  Plant  Cell  Reports  7:  673-676;  Buter  B  (1997)  In  vitro  haploid  production  in  maize.  In:  In  Vitro  Haploid  Production  in  Higher  plants,  vol  4,  37-71.  Kluwer  Academic  Publishers.  Eds.  S  Jain,  S  Sopory  &  R  Veilleux）。
【０１１２】
半数体トウモロコシ植物は、半数体誘導因子を自然的および人口的に受粉した後に得られた（Rotarenco  V  (2002)  Maize  Genetics  Cooperation  News  Letter  76:  16）。この場合、半数体胚を含む種子が得られた。
【０１１３】
また、半数体トウモロコシ植物を生成する上記手順は、ＳＤＲ−０細胞からＳＤＲ−０トウモロコシ植物を生成するのに適用され、その形成は、遺伝子組み換え、またはこの実施例で明示されたその他の処理によって引き起こされた。
【０１１４】
ＳＤＲ植物は、各染色体の動原体領域について遺伝子的に特性化され、この際に、オリジナル開始植物のこれらの領域において多型である分子マーカーが用いられた。多型の検出には、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、ｔａｑｍａｎ法から選択される異なる技術が使用された。
【０１１５】
これにより、動原体領域のマーカースコアに関わる全ての染色体ペアに対して相補的であるＳＤＲ−０トウモロコシ植物の組み合わせが確認された。そして、このＳＤＲ−０トウモロコシ植物の組み合わせは、各ＳＤＲ−０相補的植物において倍加半数体植物を生成するのに使用された。各ＳＤＲ−０相補的植物から得られる個別半数体は、対で交配され、すなわち、トウモロコシＦ１交配種を生成するのに用いられる２つの倍加半数体は、相補的ＳＤＲ−０事象のいずれか一方を起源としていた。これらの交配は、相互的に作り出された。これにより生成されたＦ１交配種は、対照として開始Ｆ１交配種を用いる農業生産力における現場試験で診断された。
【０１１６】
本発明に係る近逆育種を通じて得られた交配種の農業生産力は、オリジナルの交配種の生産力と同程度である、ということが分かった。
【実施例８】
【０１１７】
「キュウリの近逆育種」
【０１１８】
雌性発生は、キュウリにおいて定着している技術であり、欧州特許０３７４７５５号に記載される方法に従って実行されている。欧州特許０３７４７５５号に記載の方法を適用した場合に、雌性発生において生じる自発的なＳＤＲ事象は、いくらかの残留ヘテロ接合性を有する倍加再生体の形成をもたらした。これらのＳＤＲ−０キュウリ植物は、欧州特許５３４８５８号で提供された方法に従って実行されるＡＦＬＰ分析を用いて確認された。
【０１１９】
これにより得られたＳＤＲ−０キュウリ植物は、各染色体の動原体領域について遺伝子的に特性化され、この際に、オリジナル開始植物のこれらの領域において多型である分子マーカーが用いられた。多型の検出には、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、ｔａｑｍａｎ法から選択される異なる技術が使用された。この結果、動原体領域のマーカースコアに関わる全ての染色体ペアに対して相補的であるＳＤＲ−０キュウリ植物の組み合わせが確認された。そして、このＳＤＲ−０キュウリ植物の組み合わせは、欧州特許０３７４７５５号に記載される方法に従って、各ＳＤＲ−０相補的植物で倍加半数体植物を生成するのに使用された。
【０１２０】
別のステップでは、自発的に生じるＳＤＲ事象が不要であり、真性倍加半数体のみが使用された。倍加半数体が得られた場合、染色体の数が、例えばコルヒチンによって倍加される。この染色体倍加は、自発的にも起こり得る。各ＳＤＲ−０相補的植物から得られる個別半数体は、対で交配され、すなわち、キュウリＦ１交配種を生成するのに用いられる２つの倍加半数体は、相補的ＳＤＲ−０事象のいずれか一方を起源としていた。これらの交配は、相互的に作り出された。これにより生成されたＦ１交配種は、対照として開始Ｆ１交配種を用いる農業生産力における試験で診断された。
【０１２１】
本発明に係る近逆育種を通じて得られた交配種の農業生産力は、オリジナルの交配種の生産力と同程度である、ということが分かった。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１Ａ】完全へテロ接合交配種の４組の染色体に関する正常な減数分裂の発生を示す。
【図１Ｂ】完全へテロ接合交配種の４組の染色体に関する正常な減数分裂の発生を示す。
【図２】交配種の減数分裂を示すものであり、第２分裂が生じない状態（すなわち、第２分裂非還元の場合）を示す。
【図３Ａ】図２のＳＤＲ−０事象３から再生された植物において生じる胞子／配偶子の構成を示す。
【図３Ｂ−１】図２のＳＤＲ−０事象３から再生された植物において生じる胞子／配偶子の構成を示す。
【図３Ｂ−２】図２のＳＤＲ−０事象３から再生された植物において生じる胞子／配偶子の構成を示す。
【図３Ｂ−３】図２のＳＤＲ−０事象３から再生された植物において生じる胞子／配偶子の構成を示す。
【図３Ｂ−４】図２のＳＤＲ−０事象３から再生された植物において生じる胞子／配偶子の構成を示す。
【図３Ｂ−５】図２のＳＤＲ−０事象３から再生された植物において生じる胞子／配偶子の構成を示す。
【図４】倍加された染色体セットを示す。
【図５】キュウリにおける典型的なＦ２系のＡＦＬＰパターンを示す。
【図６】キュウリにおける典型的なＤＨ系統のＡＦＬＰ分析を示す。
【図７】キュウリにおける典型的なＳＤＲ−０植物のＡＦＬＰ分析を示す。
【図８Ａ】光顕微鏡を通して観測される寒冷処理された植物の花粉を示す。
【図８Ｂ】光顕微鏡を通して観測される対照植物の花粉を示す。
【図９】４倍体植物のブロッコリー小胞子が、２倍体植物の小胞子に混入された実験の結果を示す。
【図１０】非還元配偶子から派生したキャベツ植物のＡＦＬＰ指紋を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ−１】
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【図３Ｂ−２】
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【図３Ｂ−３】
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【図３Ｂ−４】
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【図３Ｂ−５】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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