(57)【要約】  内卵殻膜と外卵殻膜が分離して、卵の位置を変えたとき、気室が卵内で移動できるように、卵に加速を与える。卵の外卵殻膜と内卵殻膜を分離することにより、気室は、卵殻の上部に変わる。卵は、振動、手で「軽くたたくこと」、スピン、回転、遠心分離を含むがその限りではない、本発明の実施形態による様々な方法で加速を与えることが可能である。
2008511322.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鳥卵の気室を操作する方法であって、気室は、前記卵内の内卵殻膜と外卵殻膜の間の、実質的に定位置にあり、卵の位置を変えたとき、卵内の気室の移動を可能にするために前記内卵殻膜と外卵殻膜が分離するように前記卵に加速を与えることを含む方法。
【請求項２】
前記卵は、重力加速度の少なくとも約５倍（５ｇ）の加速が与えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記卵は、卵を振動させることにより加速が与えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記卵は、手で卵を軽くたたくことにより加速が与えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記卵は、卵をスピンさせることにより加速が与えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記卵は、卵を回転させることにより加速が与えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記卵は、卵を遠心分離することにより加速が与えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記卵は、重力加速度の少なくとも約５倍（５ｇ）で遠心分離される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
鳥卵に注入する方法であって、前記卵は気室を含み、気室は、卵内の内卵殻膜と外卵殻膜の間の実質的に定位置にあり、
卵の位置を変えたとき、卵内での気室の移動を可能にするために前記内卵殻膜と外卵殻膜が分離するように前記卵に加速が与えられる工程と、
前記卵を所定の位置に配置して、気室を上側部分の前記卵殻の真下の位置に移動させる工程と、
前記卵殻の上側部分に小さい開口部を導入する工程と、
前記卵殻の小さい開口部および気室を通して装置を伸ばす工程と、
前記装置で内卵殻膜を貫通する工程と、
前記装置を前記卵から引っ込める工程と
を含む、方法。
【請求項１０】
前記卵は、重力加速度の少なくとも約５倍（５ｇ）の加速が与えられる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記卵は、卵を振動させることにより加速が与えられる、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記卵は、手で卵を軽くたたくことにより加速が与えられる、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記卵は、卵をスピンさせることにより加速が与えられる、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記卵は、卵を回転させることにより加速が与えられる、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記卵は、卵を遠心分離することにより加速が与えられる、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記卵は、重力加速度の少なくとも約５倍（５ｇ）で遠心分離される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記装置は送達装置であり、前記方法は、前記貫通工程に続いて、送達装置から物質を放出して、前記物質を前記卵内に置く工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
前記装置は、サンプリング装置であり、前記方法は、前記貫通工程に続いて、サンプルを前記卵から取り出す工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
前記装置は検出装置であり、前記方法は、前記貫通工程に続いて、前記卵の内部から情報を検出する工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項２０】
前記装置は、前記卵殻の小さい開口部を通って所定の位置まで伸ばされる、請求項９に記載の方法。
【請求項２１】
前記卵は胚盤葉を含み、前記装置は、前記卵殻の前記小さい開口部を通って、前記胚盤葉またはその近くの位置まで伸ばされる、請求項９に記載の方法。
【請求項２２】
前記卵内の細胞を障害する工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項２３】
前記卵内の細胞を障害する工程は、前記卵を加熱すること、前記卵を冷却すること、前記卵にマイクロ波エネルギーを当てること、前記卵にラジオ周波数エネルギーを当てること、前記卵に紫外線エネルギーを当てること、前記卵に赤外線エネルギーを当てること、前記卵を保存すること、前記卵にレーザーアブレーションを適用すること、前記卵に冷凍アブレーションを適用すること、前記卵に超音波処理を適用すること、および前記卵に電気ショックを加えることからなる群より選択される方法を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記卵内の細胞を障害する工程は、前記上側部分の卵殻に前記小さい開口部を導入した後に実施される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記卵内の細胞を障害する工程は、前記小さい開口部を通して挿入される装置により実施される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記卵内の細胞を障害する工程は、前記卵内の胚盤葉を障害することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記卵は概ね水平の位置に置かれ、前記卵殻の小さい開口部は前記上側部分の卵に導入される、請求項９に記載の方法。
【請求項２８】
小さい開口部を前記卵殻に導入する前記工程の前に、前記卵殻にシール材を使用する工程をさらに含み、前記小さい開口部は、前記卵殻の、前記シール材が使用される部位に導入される、請求項９に記載の方法。
【請求項２９】
前期卵は、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ガチョウ、ウズラ、キジ、インコ、オウム、バタンインコ、オカメインコ、ダチョウおよびエミュー卵からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項３０】
前記卵殻の前記小さい開口部をシールする工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項３１】
孵化するまで前記卵を孵卵する工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項３２】
前記装置は多部位注入送達装置である、請求項１７に記載の方法。
【請求項３３】
前記卵から取り出されるサンプルは、胚下腔液を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項３４】
前記卵から取り出されるサンプルは、胚盤葉細胞を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項３５】
前期検出装置は、電気センサー、光センサー、化学センサー、温度センサー、音響センサー、および圧力センサーからなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３６】
鳥卵内の気室を操作する方法であって、前記卵は胚盤葉を含み、気室は前記卵内の内卵殻膜と外卵殻膜との間の、実質的に定位置にあり、
卵の位置を変えたとき、卵内の気室の移動を可能にするために前記内卵殻膜と外卵殻膜が分離するように前記卵に加速が与えられる工程と、
前記卵を実質的に水平の位置に置いて、上側部分の前記卵殻の真下の位置に気室を移動させる工程と、
胚盤葉を気室付近に位置させるために十分な期間、前記卵を実質的に水平の位置で保存する工程と
を含む方法。
【請求項３７】
前記卵は、重力加速度の少なくとも約５倍（５ｇ）の加速が与えられる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記卵は、卵を振動させることにより加速が与えられる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記卵は、手で卵を軽くたたくことにより加速が与えられる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記卵は、卵をスピンさせることにより加速が与えられる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記卵は、卵を回転させることにより加速が与えられる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記卵は、卵を遠心分離することにより加速が与えられる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
前記卵は、重力加速度の少なくとも約５倍（５ｇ）で遠心分離される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
鳥卵内の気室を操作する方法であって、気室は前記卵内の内卵殻膜と外卵殻膜との間の、実質的に定位置にあり、
開口部を前記卵殻に導入する工程と、
装置を、前記開口部を通して前記卵内に挿入する工程と、
前記卵の位置を変えたとき、卵内の気室の移動を可能にするために、前記装置により内卵殻膜と外卵殻膜を分離する工程と
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００３年９月９日出願の米国仮出願第６０／５０１，６４４号（その開示内容を、あたかも本書に記載されているかのように、参照することにより全体として本明細書に援用する）の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は一般に卵に関し、より詳細には、卵の処理方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
家禽孵卵場および他の卵処理施設では、卵が大量に扱われ、処理される。用語「プロセッシング」は、胚がまだ卵内にある間に（すなわち、ｉｎ  ｏｖｏ（卵内）で）、生きた卵を薬物、栄養物、ホルモン類および／または他の有益な物質で処理することを含む。鳥卵への様々な物質のｉｎ  ｏｖｏ注入は、孵化後罹病率および死亡率を下げ、潜在成長率すなわち結果として生じる鳥の最終的サイズを増加するために、さらに胚の性決定を左右するためにも、使用されてきた。生きた卵への注入は、ｉｎ  ｏｖｏで鳥を免疫するために効果的に使用されてきた。
【０００４】
トリ初期胚を含む卵への注入が望ましい用途は多数ある。たとえば、初期胚、たとえば胚盤葉等に、物質を送達することが望ましいこともある。例えば、家禽業界では、発生中の胚に外来核酸分子を導入するために（すなわち、トランスジェニック鳥を作るために）、または外来細胞を導入するために（すなわち、キメラ鳥を作るために）、初期胚をｉｎ  ｏｖｏで操作することが望ましいこともある。残念ながら、鳥卵の内卵殻膜が存在する場合、胚盤葉可視性は非常に低い。さらに、胚盤葉の位置は、物質を受け取るために最も有利な位置にはないかもしれない。
【０００５】
加えて、卵からサンプルを取り出すこと（トリ初期胚からサンプルを取り出す場合を含む）が望ましい用途は多数ある。さらに、胚を含む卵の中に検知装置を挿入して、それから情報を収集することが望ましい用途は多い。
【０００６】
初期胚を含む鳥卵に装置を挿入する現行の方法は、容認できないほど低い孵化率に終わったり、他の問題、たとえば卵内への気泡の導入や、胚外膜または胚自体への損傷、またはこれらの因子の組み合わせ等を引き起こすことがあるため、望ましくない可能性がある。したがって、鳥卵内に装置を挿入する改良された方法が当該技術分野で必要である。
【発明の開示】
【０００７】
上記論考を考慮して、鳥卵内の気室を操作する方法を提供する。出願人は、鳥卵内の気室を移動することができることを予期せず発見した。従来、鳥卵の内卵殻膜と外卵殻膜は、気室以外では融合しており、両者を分離することはできないと考えられていた。内卵殻膜と外卵殻膜は連結および接続を有する可能性があるものの、両者を分離して気室を移動させることができることを、出願人は予期せず発見した。また、本発明の実施形態に従って、気室を中に移動させておき、その後、商業ベースの孵卵業務通りに孵卵した鳥卵は、孵化率低下を示さないことも、出願人は発見した。
【０００８】
本発明の実施形態によれば、卵内の内卵殻膜と外卵殻膜が分離して、卵の位置を変えたとき、気室が卵内で移動できるように卵に加速が与えられる。卵の外卵殻膜と内卵殻膜を分離することによって、卵を横に置いたととき、気室は卵殻の上部に位置が変わる。卵は、振動、手で「軽くたたくこと」、スピン、回転、遠心分離等を含むが、これらに限定されない、本発明の実施形態による様々な方法で加速を与えることが可能である。
【０００９】
本発明の実施形態による気室の移動は、卵の側面から内卵殻膜を通してアクセスすることが容易になるため望ましいこともある。卵の側面は、胚盤葉がより予想通りに位置することができる所であり、また卵の側面では（鈍端とは対照的に）内卵殻膜と卵黄の間にある卵白が少ないため、該膜を通した胚盤葉の可視性は大幅に改善される。
【００１０】
本発明の実施形態によれば、胚盤葉および気室を含む鳥卵に材料を注入する方法は、卵の位置を変えたとき、卵内の気室の移動を可能にするために、卵の内卵殻膜と外卵殻膜が分離するように卵に加速が与えられることを含む。次いで、卵を（たとえば、概ね水平または横向きの）所定の位置に置き、気室を、上側部分の卵殻の真下の位置に移動させる。卵は、胚盤葉が側面、気室の下または気室の近くに位置するように、一般に横向きの位置で、所定の期間、保存される。当業者に周知の様々な方法の１つにより、小さい開口部を卵殻の上側部分に導入する。たとえば、卵殻における開口部は、殻にドリルで穴を開け、その殻を除去し、次いで外卵殻膜の一部を除去することによって作ってもよい。あるいは、卵殻における開口部は、殻部分および外卵殻膜部分の両者が同時に除去されるように、殻および膜にドリルまたはパンチで穴を開けることによって作ってもよい。
【００１１】
次いで、卵殻の小さい開口部をから卵内に、装置を伸ばす。該装置は、気室を通って伸び、内卵殻膜を貫通する。１つまたは複数の物質が送達装置を通じて放出され、胚盤葉またはその近くに置かれる。１つまたは複数の物質はまた、卵内の他の場所にも置かれる可能性がある。気室を通過した注入が好ましく、これによって卵の位置に関係なく促進される。
【００１２】
本発明の実施形態によれば、卵に材料（たとえば、ドナー細胞）を注入する前に、レシピエント胚の細胞を障害することが望ましいこともある。細胞障害は、加熱、冷却、コアリング、放射線（たとえば、Ｘ線、紫外線、赤外線、ガンマ線、ラジオ周波数）への暴露、アンモニアおよび／または他の溶媒への暴露等を含むが、これらに限定されない、様々な方法で実現することができる。
【００１３】
本発明の実施形態によれば、卵内の１つまたは複数の位置から材料をサンプリングすることが可能である。たとえば、１つまたは複数のサンプル（たとえば、胚盤葉細胞）を、胚盤葉またはその近くから取り出すことが可能である。１つまたは複数のサンプルを、卵の胚外部分（たとえば、卵黄または卵白）から採取することが可能である。たとえば、サンプルを卵白から採取して、中の微生物汚染（たとえば、サルモネラ）の有無を決定することが可能である。サンプルを卵から取り出して、それから情報を得ることが可能である。サンプルは、たとえば、胚の雌雄鑑別方法または生存能力決定方法と関連して取り出すことが可能である。サンプルは、たとえば、形質、病原体等に関する遺伝子検査を実施するために、取り出すことが可能である。
【００１４】
本発明の実施形態によれば、検出器を卵に挿入して、卵の内部から様々なタイプの情報を得てもよい。検出器は、卵の胚外位置（たとえば、卵黄または気室）に挿入してもよい。あるいは、検出器は、胚の近くに配置してもよい。検出装置を使用して、胚のサイズ、胚の位置、胚の発達段階および／または胚の特性、胚の性別、および／または胚の生存能力を含むが、これらに限定されない、情報を収集することが可能である。該検出装置は、胚および胚下腔（ｓｕｂｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃａｖｉｔｙ）の位置に関する情報を得ることが可能である。電気センサー、光センサー、化学センサー、温度センサー、音響センサー、圧力センサー、または物理的または化学的パラメータを検出するための任意の他の装置を含むが、これらに限定されない、様々なタイプの検出器を使用することが可能である。
【００１５】
本発明の実施形態によれば、物質の注入および／または卵からのサンプルの取り出しおよび／または情報の検出後、該装置を卵から引っ込める。該卵殻の小さい開口部をシール材で密封し、孵化するかまたは他の処理に付すまで、卵を保温することが可能である。
【００１６】
本発明の他の実施形態によれば、卵に加速を与えなくとも、鳥卵の内卵殻膜と外卵殻膜を物理的に分離することができる。たとえば、卵殻内に穴を形成し、先の尖っていないプローブ（ｂｌｕｎｔ  ｐｒｏｂｅ）または他の物体を中に挿入して、内卵殻膜と外卵殻膜を卵殻の縁で分離するために使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
次に、本発明の好ましい実施形態を示す添付の図面を参照しながら、以下に、本発明をさらに十分に説明する。しかし、本発明は、多くの異なる形で具現することが可能であり、本明細書に記載の実施形態に限定されると解釈すべきではなく、むしろこれらの実施形態は、この開示内容が完璧かつ完全になり、また発明の範囲を当業者に十分に伝えるために提供される。
【００１８】
図面において、線の太さ、および構成要素は、明確にするために誇張されている可能性がある。当然のことながら、ある構成要素が別の構成要素の「上」にあると言われるとき、それは他の構成要素の直上にあってもよく、また介在する要素が存在してもよい。対照的に、ある構成要素が別の構成要素の「直上」にあると言われるとき、介在要素は存在しない。当然のことながら、ある構成要素が別の構成要素に「接続している」または「付着している」と言われるとき、それは、他の構成要素に直接接続または付着していてもよく、また介在する要素が存在してもよい。対照的に、ある構成要素が別の構成要素に「直接接続している」または「直接付着している」と言われるとき、介在する要素は存在しない。用語「上方に」、「下方に」、「垂直の」、「水平の」等々は、本明細書では説明のためのみに使用される。
【００１９】
別途定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における通常の技術者により一般に理解される意味を有する。本明細書で本発明の説明に使用される専門用語は、個々の実施形態を記述するためだけであり、本発明を限定する意図はない。本発明および添付の特許請求の範囲の記述に使用されているとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が他の状況を明確に示していない限り、複数形も含むものとする。本明細書で言及されている全ての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、全体として、参照することにより本明細書に援用する。
【００２０】
本明細書で使用されるとき、用語「および／または」は、関連した記載項目の１つまたは複数の、ありとあらゆる組み合わせを含む。
【００２１】
用語「トリ」および「トリ対象」は、本明細書で使用されるとき、あらゆるトリ種のオスおよびメスを含むことを意図するが、卵、肉のために、またはペットとして、企業的に飼育される家禽を含むことを主目的とする。したがって、用語「トリ」および「トリ対象」は、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ガチョウ、ウズラ、キジ、インコ、オウム、バタンインコ、オカメインコ、ダチョウ、エミュー等を含むが、これらに限定されない、様々な鳥類を含むことを特に意図する。
【００２２】
本明細書で使用されるとき、用語「初期胚」は、産卵時（胚盤葉期）から始原生殖細胞（ＰＧＣ）が移動している発達段階ごろまでのトリ胚を指す。特にニワトリ胚に関して、「初期胚」は、一般に胚発生期２０（Ｈ＆Ｈ）胚ごろまたはそれ以前である。ニワトリ胚の発達段階は、当該技術分野で十分に解明されており、たとえばＴｈｅ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｃｋ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｒ．Ｂｅｌｌａｉｒｓ  ＆  Ｍ．Ｏｓｍｏｎｄ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９８年を参照されたい。
【００２３】
本明細書で使用されるとき、用語「胚盤葉」は、当該技術分野で理解されている意味を有する。一般に、胚盤葉は、産卵時から原腸形成の終わりまでの胚を含む。胚盤葉は、代替呼称「胚盤（ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｄｉｓｃまたはｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｄｉｓｃ）」で呼ばれることもある。胚盤葉は、初期胚における卵割中に形成し、原腸形成の終わりまで存続する、細胞の扁平盤と記述されることもある。産卵時までに、胚盤葉の２つの主要領域、中央に位置する明域および周辺に位置する暗域が、目に見える（Ｔｈｅ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｃｋ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｒ．Ｂｅｌｌａｉｒｓ  ＆  Ｍ．Ｏｓｍｏｎｄ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９８年）。特にニワトリ胚に関して、該胚盤葉は一般的に、産卵時（すなわち、ＩＸ期またはＸ期  ＥＧ  ＆  Ｋ）からＸＩＩＩ期（ＥＧ  ＆  Ｋ）ごろまたはそれ以後までの胚として位置づけられる。
【００２４】
本明細書で使用されるとき、用語「注入」および「注入すること」は、ある物質を卵または胚の中に送達または放出する方法、物質（すなわち、サンプル）を卵または胚から取り出す方法、および／または検出装置を卵または胚に挿入する方法を含む、装置を卵または胚に挿入する方法を含む。
【００２５】
用語「キメラ鳥」または「キメラ胚」は、「ドナー」と呼ばれる別の鳥または胚由来の細胞を含む、それぞれ、レシピエント鳥または胚を指す。用語「トランスジェニック鳥」および「トランスジェニック胚」は、当該技術分野で一般的に理解されているそれらの意味に従って、本明細書で使用されている。トランスジェニック鳥またはトランスジェニック胚は、外来の核酸配列を１つまたは複数の細胞に含む。
【００２６】
本明細書で使用されるとき、用語「膜」は、卵内の組織の層を指す。卵内の典型的な膜は、外卵殻膜、内卵殻膜、絨毛尿膜、ＶＭ膜、および羊膜を含むが、これらに限定されない。
【００２７】
図１を参照すると、鳥卵１０が図解されている。図解されている卵１０は、卵殻１２、外卵殻膜１４、内卵殻膜１６、および卵１０の鈍端の内卵殻膜と外卵殻膜１４、１６の間の気室１８を含む。図解の卵はまた、内水様卵白２４ａ、外濃厚卵白２４ｂ、および外水様卵白２４ｃで囲まれた卵黄２０および胚盤葉２２も含む。図２Ａ〜２Ｂに図解されている通り、気室１８は、卵１０の位置にかかわらず、卵１０の鈍端の実質的に動かずに留まる。これは、気室１８を取り囲み、該気室１８をこの定位置に維持する外卵殻膜および内卵殻膜１４、１６のためである。
【００２８】
本発明の実施形態によれば、卵の位置を変えたとき、卵内の内卵殻膜と外卵殻膜が分離して、気室が卵内で移動できるように、卵に加速が与えられる。図３に図解されている通り、外卵殻膜と内卵殻膜１４、１６は分離して、気室１８は、水平に置かれた卵１０の卵殻１２の上部付近に、自由に位置づけることができる。外卵殻膜と内卵殻膜１４、１６を分離することにより、気室１８は、その位置を卵殻１２の上部に変える。気室１８は、卵に沿って加速度方向に移動する（すなわち、内卵殻膜および外卵殻膜は、卵の側面に沿った特定の領域で、互いに離れる）が、内卵殻膜１６は、他のあらゆる場所で、付着したままである。したがって、卵に加速を与えた後、外卵殻膜と内卵殻膜１４、１６が分離した領域が卵の最上部分になるように卵を配置すれば、気室１８は、卵内の上部のみに、その位置を変える。
【００２９】
振動、手で「軽くたたくこと」、スピン、回転、遠心分離等を含むが、これらに限られない、本発明の実施形態による様々な方法で、卵に加速が与えることが可能である。本発明の実施形態によれば、卵の内卵殻膜と外卵殻膜を、いずれの膜にも損傷を引き起こさずに分離するために、約５０〜５００ｍ／秒／秒（ｍ／ｓ2）の加速が使用される。遠心分離するのであれば、重力加速度の少なくとも約５倍の加速度（５ｇ）が使用される。
【００３０】
図４は、本発明の実施形態に従って、鳥卵に注入する方法を図解するフローチャートである。ブロック内に記載されている機能は、図４に記載の順序がバラバラで行われてもよいことに注目すべきである。連続して示されている２（またはそれより多い）ブロックは、事実上、実質的に同時に実行してもよく、また、含まれる機能性に応じて、ブロックを逆順に実行してもよい時もある。たとえば、卵の細胞を障害する工程は、開口部を卵に導入する工程の前に行われても、後で行われてもよい。
【００３１】
卵の位置を変えたとき、卵の内卵殻膜と外卵殻膜が分離して、卵内の気室が移動できるように、胚盤葉および気室を含む卵に加速を与える（ブロック１００）。上記の通り、気室は従来、卵内の内卵殻膜と外卵殻膜の間の実質的に定位置にある。卵を加速を与える様々な方法を使用することが可能である。
【００３２】
幾つかの実施形態では、ドナー細胞を導入する前に、レシピエント胚における細胞を「障害する」ことが望ましいことがある（ブロック１１０）。本明細書で使用されるとき、用語「障害する」は、内在性の細胞増殖が減速または終結するように、したがって、導入された外因性細胞が増殖して優勢になることができるように、ある一定量の損傷を胚細胞に与えることを意味する。細胞障害するは、様々な方法で実現することができる。たとえば、障害する方法の非網羅的リストは、卵を所定の温度に加熱すること（たとえば、流体浴、オーブン、孵卵器等による）、卵をアンモニアおよび／または他の溶媒に暴露すること、卵を所定の温度に冷却すること、ラジオ周波数（ＲＦ）、マイクロ波、赤外線、紫外（ＵＶ）線、ガンマ線放射線、Ｘ線等を含むが、これらに限定されない様々なタイプの電磁放射線を卵に受けさせることを含む。卵細胞を障害する他の方法としては、レーザー処理、極低温冷却、およびコアリングなどがある。特定の実施形態では、照射、加熱、化学処理、および軟Ｘ線を全卵に加えることがある。他の実施形態では、胚を障害するために、卵殻の窓を通して、紫外線、マイクロ波、熱、レーザー処理、極低温処理、機械的損傷、およびコアリングが使用されることがある。さらに、保存期間および保存温度を利用して、胚盤葉細胞を障害することも可能である。
【００３３】
図４を参照すると、次いで、卵を所定の（たとえば、水平の）位置に配置し、気室を、該卵殻の上向きの部分の下の位置に移動させる（ブロック１２０）。次いで、胚盤葉が側面、気室の下または近くに位置できるように、本発明の実施形態にしたがって、卵を横向きに保存する。
【００３４】
しばらくの間保存した後、当業者に周知のパンチまたは他の装置により、卵殻の上向きの部分に小さい開口部を導入する（ブロック１３０）。本発明の実施形態によれば、微生物の（または他の）汚染を減少させるために（たとえば、アルコールまたは他の消毒液で）、卵の表面、少なくとも注入部位周囲を消毒してもよい。しかし、本発明の実施形態に関して、注入部位を含む、卵の消毒は必要ではない。加えて、小さい開口部を卵殻に導入する前に、シール材を卵殻に使用してもよいが、必要ではない。シール材を卵殻に使用するのであれば、該シール材が位置する部位に、該小さい開口部を卵殻に導入する。卵殻に開口部を形成する工程（ブロック１３０）はまた、外卵殻膜にも開口部を形成する。しかし、特定の実施形態では、該内卵殻膜は、卵殻に開口部を形成することにより影響を受けず、それを通して装置を挿入する前は、本質的に無傷のままである。
【００３５】
該卵殻の開口部は、任意の適当な位置、たとえば、卵の側面の赤道軸付近、または卵のいずれかの端に作ってもよい。本発明のある特定の好ましい実施形態では、該卵殻の開口部は、一般に水平に置かれた卵の卵殻の上向きの部分で、かつ卵内で自由に移動することができる気室の上に導入される。初期胚（たとえば、胚盤葉）は、一般的に卵の最上部分またはその付近の領域に位置するであろうことを、当業者は十分に理解するであろう。したがって、胚を卵内の異なる位置に導くための措置が講じられなければ、該卵殻の開口部は一般に、卵の最上部の、初期胚（たとえば、胚盤葉）が位置すると予想される場所の近くに作られる。
【００３６】
次いで、卵殻の小さい開口部から卵内に、装置を伸ばす（ブロック１４０）。該装置は、気室を通って伸び、内卵殻膜を貫通する。該装置は、材料を注入し、材料をサンプリングし、および／または情報を検出することが可能である（ブロック１５０）。卵内に挿入される装置が送達装置であれば、１つまたは複数の物質が送達装置を通じて放出され、胚盤葉  またはその近くに置かれる。１つまたは複数の物質はまた、卵内の場所にも置かれる可能性がある。本発明の実施形態は、胚盤葉におけるまたは胚盤葉付近の、１つまたは複数置くことに限定されない。
【００３７】
卵内に挿入される装置がサンプリング装置であれば、１つまたは複数のサンプル（たとえば、胚盤葉細胞）を胚盤葉またはその付近から取り出すことが可能である。１つまたは複数のサンプルは、卵の胚外部分（たとえば、卵黄または卵白）から採取することも可能である。たとえば、サンプルを卵白から採取して、中の微生物汚染（たとえば、サルモネラ）の有無を決定することが可能である。
【００３８】
当業者には理解されるであろうが、該サンプリング装置は、材料（たとえば、尿膜腔液）を卵から採取するために設計された針であってもよい。たとえば、該針は、丸い先端およびその先端付近の針内部に形成された孔で終わる軸方向に伸びた管腔を具有してもよい。材料は、管腔を真空に付したとき、孔を介して管腔内に採取される。丸い先端は、管腔が材料で詰まるのを防ぐ。
【００３９】
一般的に、サンプルを卵から取り出して、それから情報を得る。サンプルは、たとえば、胚の雌雄鑑別方法または生存能力決定方法と関連して取り出すことが可能である。たとえば、細胞を含むサンプルを胚から取り出すことが可能であり、また当業者に周知の通り、（一般的に、卵から取り出した後で）該細胞を分析して、性染色体または染色体上の性特異的配列を検出することが可能である。該サンプルはまた、たとえば、関心のある特定の遺伝子または対立遺伝子が、胚に存在することを決定するために、他のＤＮＡに基づく分析に使用することも可能である。
【００４０】
幾つかの実施形態では、たとえば、米国特許第６，０３２，６１２号に記載されているような、多部位注入装置またはサンプリング装置を使用することが可能である。他の典型的な送達装置および／またはサンプリング装置としては、米国特許第５，１３６，９７９号；米国特許第４，６８１，０６３号および第４，９０３，６３５号；ならびに米国特許第４，０４０，３８８号、第４，４６９，０４７号、および第４，５９３，６４６号に記載されているものなどがある。
【００４１】
卵内に挿入される装置が検出器であれば、卵の内部からの様々なタイプの情報を検出することが可能である。該検出器は、卵の胚外位置（たとえば、卵黄または気室）に挿入してもよい。あるいは、該検出器は、（上記の通り）胚の近くに配置してもよい。他の実施形態では、該検出器は、胚の明域または暗域あるいは胚下腔に入れてもよい。該検出装置を使用して、情報を収集することが可能である。該検出装置を使用して、胚のサイズ、胚の位置、胚の発生段階および／または胚の特性、胚の性別、および／または胚の生存能力を含むが、これらに限定されない、情報を収集することが可能である。該検出装置は、胚および胚下腔の位置に関する情報を得ることが可能である。
【００４２】
情報は、検出器に接続されている機器（たとえば、コンピューターまたは他のデータ処理装置）により捕獲することが可能である。電気センサー、光センサー、化学センサー、温度センサー、音響センサー、圧力センサー、または物理的または化学的パラメータを検出するための任意の他の装置を含むがその限りではない、様々なタイプの検出器を使用することが可能である。典型的な検出器は、ヘブランク（Ｈｅｂｒａｎｋ）に付与された米国特許第６，２４４，２１４号に記載されている。
【００４３】
物質の注入および／またはサンプルの採取および／または卵からの情報検出後、該装置を卵から引っ込める（ブロック１６０）。該卵殻の小さい開口部をシール材で密封し（ブロック１７０）、孵化するまで、卵を孵卵することが可能である（ブロック１８０）。
【００４４】
本発明の方法は、たとえば、商業ベースの家禽事業で、複数の卵に実行できることを、当業者は十分に理解するであろう。さらに、本明細書に記載の方法は、完全手作業であっても、完全自動化、または半自動化されていてもよい。
【００４５】
以下の実施例では、気室を卵内で移動させるために外卵殻膜と内卵殻膜を分離するために、上記の通りに加速を与えた卵を、「ＳＭＡＣ」卵と称する。ＳＭＡＣは、「側面操作気室（ｓｉｄｅ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｅｄ  ａｉｒ  ｃｅｌｌ）」を表す。
【実施例１】
【００４６】
直立でされた（業界の通常の保温業務）、「ＳＭＡＣ」（側面操作気室）卵と呼ばれる、上記の通りに気室操作した一群の卵は、以下に示す通り、７９．７％の孵化率をもたらした。第１処理群の、気泡を有するＳＭＡＣには、気室を移動させるための加速中に、内卵殻膜が破裂した側面操作気室を有する卵がある。このため、卵を明かりに透かして見るとき、明確に視認できる、気泡が卵白中に生じる。第２処理群の、５／８”の窓を有するＳＭＡＣ卵は、側面操作気室の上の、卵の側面に、ドリルであけた直径５／８インチの穴を有していた。窓は、その後、孵化に取り掛かる前にシールされた。第３群のＳＭＡＣは、気室を移動させることによって操作しただけであり、最後の群はコントロール群であった。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
これらの結果から、内卵殻膜が無傷のままであるＳＭＡＣ卵群は、コントロールと同様の孵化を示すことが分かる。
【００４９】
直立で保温された直立で保温された（業界の通常の保温業務）最適シール材を有するＳＭＡＣ卵群は、以下に示す通り、８８．６％の孵化率をもたらした。最初の２つの処理群である、最適なシール材を有するＳＭＡＣと不良なシール材を有するＳＭＡＣには、窓を設けて、側面操作気室の上の、卵の側面に直径５／８インチの穴を作った。第１群は、バリヤーを超える水分蒸散を防止する無孔性シール材でシールした。第２群は、余分の水分蒸散を可能にする多孔性シール材でシールした。
【００５０】
【表２】
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【００５１】
これらの結果から、無孔性シール材を使用するとき、直径５／８”の穴を有するＳＭＡＣ処理は、孵化の有意な低減を示さないことが分かる。しかし、多孔性シール材は、極めて有意な孵化低減を引き起こす。
【実施例２】
【００５２】
ＳＭＡＣ卵は、内卵殻膜を通した胚盤葉可視性が、非ＳＭＡＣ卵（卵の鈍端に窓を設けた卵）より優れている。ＳＭＡＣ卵群では、胚盤葉を視認することができるため、該群のほぼ全ての卵が注入可能であった。非ＳＭＡＣ卵では、注入するには、胚盤葉が窓から遠すぎるかまたは可視性があまりにも劣っているため、かなりの数の卵が不合格とされる。ＳＭＡＣ卵は一般に、卵の鈍端に窓を有する、平滑末端を上にして保存された卵よりはるかに有利な胚盤葉位置を有する。内卵殻膜の下の胚盤葉の可視性に基づいて、異なる４つの処理群の卵を採点した。全４群で、窓を設けて、直径５／８”の穴を卵の気室上に作った。鈍端群では、穴を卵の鈍端に作り、ＳＭＡＣ群では、穴を気室を移動させた卵の側面に作ったことに注目されたい。１または不良という得点は、胚盤葉が全く視認できないことを表す。２または並という得点は、卵をゆっくり振動させることによって胚盤葉を見ることができるにすぎないことを表す。３または良好という得点は、胚盤葉の正確な位置を見ることができるが、基礎をなす構造の詳細を識別することはできないことを表す。４または優秀という得点は、胚盤葉ならびに明域および暗域等の離れた領域をはっきり見ることができることを表す。
【００５３】
【表３】
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【００５４】
これらの結果から、両ＳＭＡＣ群はともに、鈍端群より胚盤葉の可視性が優れていたことが分かる。このことは、本方法によって、卵の鈍端に窓を設けるより、容易に胚盤葉を操作できることを示す。
【実施例３】
【００５５】
ＳＭＡＣ卵は、手作業の注入で使用され、ＳＭＡＣ注入卵の孵化率は９２％であった。０群（非操作コントロール）および３群（ＳＭＡＣ非操作コントロール）を除く全群の卵が、５／８”の直径で作られた窓を、卵の気室上に有していた。１群および２群は、気室上の卵の鈍端に作られた窓を有していた。４群および５群は、側面操作気室上の卵の側面に作られた窓を有していた。２群および５群には、リン酸緩衝食塩水を注入したが、他の全群には注入しなかった。
【００５６】
【表４】
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【００５７】
これらの結果から、ＳＭＡＣ処理群は、コントロール群および鈍端と同様またはそれ以上に機能したことが分かる。このことから、上記のような気室の操作は、発生中の胚に有害な影響を及ぼさないことが分かる。
【００５８】
前述の事項は、本発明を例証するものであって、本発明を限定するものと解釈すべきではない。本発明の典型的な実施形態が２〜３記述されているが、本発明の斬新な教示および利点から実質的に逸脱することなく、典型的な実施形態で多くの修飾が可能なことを当業者は容易に理解するであろう。したがって、全てのこのような修飾は、特許請求の範囲に定義されている通り、本発明の範囲内に含まれるものとする。本発明は、以下の特許請求の範囲により明確に規定され、該特許請求の範囲の同等物は中に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】従来の鳥卵の側断面図である。
【図２】卵の位置を変えたときでも、従来の卵内の気室が移動しないことを示す図である。
【図３】本発明の実施形態にしたがって、外卵殻膜と内卵殻膜を分離するために卵に加速を与えた後の鳥卵の側断面図である。
【図４】本発明の実施形態にしたがって、卵に注入するための操作を説明するフローチャートである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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