(57)【要約】ヒトのオンコジーンを調節する天然に存在するｍｉＲＮＡおよびその使用方法が、記載される。本明細書中に記載される方法および組成物に使用するのに適切な核酸としては、プリｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡの生物学的活性を保持するフラグメントまたはそれらの改変体および、プリｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡ、それらのフラグメントもしくは改変体をコードするＤＮＡ、またはｍｉＲＮＡの調節エレメントが挙げられるが、これらに限定されない。核酸を含む組成物は、癌の少なくとも１つの症状もしくは発現の処置または予防を必要とする患者に投与される。１つの実施形態において、その組成物は、１種以上のオンコジーンの遺伝子発現を阻害するのに有効な量で投与される。癌の少なくとも１つの症状もしくは発現の処置または予防のための方法もまた、記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一種以上のオンコジーンの発現を阻害するための方法であって、以下：
ｍｉＲＮＡを提供する工程、または該ｍｉＲＮＡの発現を増加させる工程を包含し、該ｍｉＲＮＡは、生物体の細胞中のオンコジーンに結合し、そして該オンコジーンの発現を示す、
工程を包含する、方法。
【請求項２】
上記ｍｉＲＮＡは、プリｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡ、およびそれらのフラグメントまたはそれらの改変体からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｍｉＲＮＡは、核酸によってコードされる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記核酸は、ベクター上に配置される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージミド、ウイルス、およびウイルスの供給源または細菌の供給源に由来する他のビヒクルからなる群により選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ベクターは、１つ以上のインビボ発現エレメントをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記インビボ発現エレメントは、プロモーター、エンハンサー、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ｍｉＲＮＡは、２１ヌクレオチド長〜１７０ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ｍｉＲＮＡは、２１ヌクレオチド長〜２５ヌクレオチド長である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｍｉＲＮＡは、癌の処置もしくは予防のために患者に投与されるか、または該ｍｉＲＮＡは、癌の処置もしくは予防のために発現が、該患者の細胞において増加される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記癌は、肺癌、膵臓癌、皮膚癌、血液学的新生物、乳癌、脳の癌、結腸癌、濾胞性リンパ腫、膀胱癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭部および頚部の癌、多発性骨髄腫、肝臓癌、リンパ腫、口腔癌、骨肉腫、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、および甲状腺癌からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記オンコジーンは、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ２Ｌ２、ＴＥＲＴ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ３、ＧＲＢ２、ＲＡＦ１、ＡＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ３、ＭＥＴ、ＫＩＴ、ＴＰ７３Ｌ（ＡＩＸ）、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＭＤＭ２、ＦＥＳ、ＦＵＲＴＮ、ＩＮＳＬ３、ＣＳＦＩＲ、ＭＹＢＬ２、ＭＹＢ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＩＫ３Ｃ２Ｂ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＩＫ３Ｒ５、ＡＫＴ１、ＨＬＩＮ−４１、ＶＤＲ、ＰＸＲ、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＡＳＨ１Ｌ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＧＲ、ＧＬＩ２、１４−３−３ζ、ＭＯ２５、ＳＭＧ１、ＦＲＡＰ１、ＰＥＲ２およびＡＫＴ３からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
上記ｍｉＲＮＡは、ｅｏｒ−１、ｈａｄ−１、ｌｅｔ−６０、ｌｉｎ−３、ｌｉｎ−９、ｌｉｎ−１１、ｌｉｎ−３６、ｌｉｎ−３９、ｌｉｎ−４５、ｍｐｋ−１、およびｓｅｍ−５からなる群より選択されるオンコジーン上の部位に結合する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
上記患者は、外科手術、化学療法、放射線療法、温熱療法、免疫療法、ホルモン療法、およびレーザー療法からなる群より選択される１つ以上の癌療法を受容する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
上記生物体は、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ｍｉＲＮＡに対する癌の感受性を決定するための方法であって、該方法は、ｍｉＲＮＡを提供する工程、または該ｍｉＲＮＡの発現を増加させる工程であって、該ｍｉＲＮＡは、該癌性細胞もしくは形質転換細胞または癌性細胞もしくは形質転換細胞を有する生物体中のオンコジーンに結合する工程、および該オンコジーンの発現が阻害される場合に、癌性細胞もしくは形質転換細胞の増殖または生存が阻害されるか否かを決定する工程を包含する、方法。
【請求項１７】
１種以上のオンコジーンの発現を阻害するための治療的組成物であって、該組成物は、生物体中の形質転換細胞または癌性細胞におけるオンコジーンの発現に結合し、そして該オンコジーンの発現を示すｍｉＲＮＡの有効な量、および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、組成物。
【請求項１８】
上記ｍｉＲＮＡは、プリｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡ、およびそれらのフラグメントまたはそれらの改変体からなる群より選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
上記ｍｉＲＮＡは、プラスミド、コスミド、ファージミド、ウイルス、および他のウイルスの供給源または細菌の供給源からなる群より選択されるベクター上に配置される核酸によってコードされ、該核酸は、プロモーター、エンハンサー、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される一種以上のインビボ発現エレメントを含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ｍｉＲＮＡは、２１ヌクレオチド長〜１７０ヌクレオチド長である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ｍｉＲＮＡは、２１ヌクレオチド長〜２５ヌクレオチド長である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記癌は、肺癌、膵臓癌、皮膚癌、血液学的新生物、乳癌、脳の癌、結腸癌、濾胞性リンパ腫、膀胱癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭部および頚部の癌、多発性骨髄腫、肝臓癌、リンパ腫、口腔癌、骨肉腫、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、および甲状腺癌からなる群より選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２３】
上記オンコジーンは、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ２Ｌ２、ＴＥＲＴ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ３、ＧＲＢ２、ＲＡＦ１、ＡＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ３、ＭＥＴ、ＫＩＴ、ＴＰ７３Ｌ（ＡＩＸ）、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＭＤＭ２、ＦＥＳ、ＦＵＲＴＮ、ＩＮＳＬ３、ＣＳＦＩＲ、ＭＹＢＬ２、ＭＹＢ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＩＫ３Ｃ２Ｂ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＩＫ３Ｒ５、ＡＫＴ１、ＨＬＩＮ−４１、ＶＤＲ、ＰＸＲ、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＡＳＨ１Ｌ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＧＲ、ＧＬＩ２、１４−３−３ζ、ＭＯ２５、ＳＭＧ１、ＦＲＡＰ１、ＰＥＲ２およびＡＫＴ３からなる群より選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２４】
上記ｍｉＲＮＡは、ｅｏｒ−１、ｈａｄ−１、ｌｅｔ−６０、ｌｉｎ−３、ｌｉｎ−９、ｌｉｎ−１１、ｌｉｎ−３６、ｌｉｎ−３９、ｌｉｎ−４５、ｍｐｋ−１、およびｓｅｍ−５からなる群より選択されるオンコジーン上の部位に結合する、請求項２３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、Ｆｒａｎｋ  Ｊ．Ｓｌａｃｋ、Ｓｔｅｖｅｎ  Ｍ．Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｋｒｉｓｔｙ  Ｌ．Ｒｅｉｎｅｒｔ、およびＨｅｌｇｅ  Ｇｒｏｓｓｈａｎｓによる発明の名称「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ」である米国特許出願第６０／６０６，８５５号（２００４年９月４日出願）に基づく優先権を主張する。
【０００２】
（連邦政府研究開発活動に関する記載）
連邦政府は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈからＦｒａｎｋ  Ｊ．Ｓｌａｃｋに対する助成金番号１Ｒ０１ＧＭ０６２５９４−０１Ａ１および助成金番号１Ｒ０１ＧＭ０６４７０１−０１の効力により、本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
癌は、異常細胞の制御されていない増殖および拡散によって特徴付けられる疾患の群である。癌は、外部要因（タバコ、化学物質、放射線、および感染生物体）および内部要因（遺伝的変異、ホルモン、免疫の状態、およびＤＮＡの損傷）の両方によって引き起こされる。これらの因子は、同時か、または連続的に作用して、発癌をイニシエート（ｉｎｉｔｉａｔｅ）し、そして／または促進する。癌は、米国において、４人に１人の死因であり、そして８５歳未満の人々の死の主な原因である。米国において、全男性の約半分および全女性の少なくとも３分の１が、その人生の間に癌を発症する。現在、数百万人の人々が、癌と共に生きているか、または癌を有している。より早期に癌が発見され、そして処置が開始されるほど、長い年数を生きる可能性が高くなる。
【０００４】
肺癌は、米国において、男性および女性おいて、癌による死の主な原因である。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙによると、各年の新規に約１７０，０００の事例が診断され、約１６０，０００人の人々が、毎年この疾患によって死亡する。外科手術、化学療法、および放射線の使用にもかかわらず、患者の生存率は、非常に低いままである（５年間で１５％未満）。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙによって推定されるように、全ての癌についての５年間生存率は、１９９５年〜２０００年の間に診断された癌について、約６４％である。しかし、生存率は、癌の型および検出時の癌の段階に依存して変化する。例えば、脳の癌、乳癌、および結腸癌についての生存率は、１９９５年〜２０００年の間に診断された癌に関して、それぞれ、３３％、８８％、および６３％である。従って、外科手術、放射線、化学療法、免疫療法、およびホルモン療法を含む処置という標準的な方法の他の処置が、必要とされる。
【０００５】
細胞運命決定を制御する遺伝子の間違った制御（ｍｉｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）は、癌に寄与する。このような変化した遺伝子は、オンコジーンとして公知である。オンコジーンは、それらが正常（すなわち、変異していない）である場合、プロトオンコジーンと称される。プロトオンコジーンは、細胞の通常の増殖制御経路の成分をコードする。これらの成分のいくつかは、増殖因子、レセプター、シグナル伝達酵素、および転写因子である。
【０００６】
Ｒａｓは、１つのこのようなオンコジーンである。哺乳動物のｒａｓ遺伝子は、密接に関連する低分子タンパク質（Ｈ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓおよびＮ−ｒａｓ）をコードする。Ｒａｓは、正常細胞中に見出され、ここでＲａｓは、スイッチとして機能することによってシグナルの中継を補助する。細胞表面上のレセプターが、（例えば、ホルモンによって）刺激される場合、Ｒａｓは、細胞に増殖を呼びかけるシグナルにスイッチをいれ、そしてそのシグナルを伝達する。上記細胞表面レセプターが、刺激されない場合、Ｒａｓは、活性化されず、その結果、細胞増殖を生じる経路は、イニシエートされない。ヒトの癌の約３０％において、Ｒａｓは、それが持続的にスイッチがはいった状態であるように変異され、細胞表面上のレセプターが活性化されるか否かにかかわらず、細胞に増殖を呼びかける。ｒａｓ遺伝子変異の高い発生率は、全ての肺癌および腺癌（それぞれ、１０％および２５％（Ｋ−ｒａｓ））、膵臓の悪性腫瘍（８０〜９０％（Ｋ−ｒａｓ））、結腸直腸癌（３０−６０％（Ｋ−ｒａｓ））、非メラノーマ性皮膚癌（３０〜５０％、Ｈ−ｒａｓ）、骨髄を起源とする造血器の新形成（１８〜３０％（Ｋ−ｒａｓおよびＮ−ｒａｓ））、およびセミノーマ（２５〜４０％（Ｋ−ｒａｓ））において見出される。他の腫瘍において、変異ｒａｓ遺伝子は、より低い頻度で見出される（例えば、乳癌（０〜１２％（Ｋ−ｒａｓ））、グリア芽細胞腫および神経芽細胞腫（０〜１０％（Ｋ−ｒａｓおよびＮ−ｒａｓ））において）。
【０００７】
他のオンコジーンは、広範に研究されているＭＹＣファミリー（ｃ−ＭＹＣ、Ｎ−ＭＹＣ、およびＬ−ＭＹＣ）のメンバーを含み、そしてｍｙｃ遺伝子の増殖は、肺（ｃ−ＭＹＣ、Ｎ−ＭＹＣ、Ｌ−ＭＹＣ）、結腸（ｃ−ＭＹＣ）、乳房（ｃ−ＭＹＣ）、および神経芽細胞腫（Ｎ−ＭＹＣ）を含む種々の腫瘍の型において見出される。アポトーシスを阻害する遺伝子はまた、オンコジーンとして同定されている。これらの遺伝子の原型は、ＢＣＬ−２である。本来、濾胞性リンパ腫中の染色体の分岐点として同定され、このタンパク質は、細胞増殖を促進するよりもむしろ細胞死を阻害することが見出された。ＢＣＬ−２は、細胞内タンパク質のファミリーに属し、その役割は、ＤＮＡの分断および細胞死をもたらすカスパーゼの活性化を調節することである。メラノーマにおいて、ＢＣＬ−２は、原発性の病変および転移性の病変において過剰発現されることが報告されており、そしてこの表現型は、腫瘍の進行に関連する。
【０００８】
マイクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」といわれる）は、非翻訳の低分子ＲＮＡであり、マイクロＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物上の相補部位に結合することによって遺伝子発現を制御することが植物および動物において見出される、調節性分子のクラスに属する。ｍｉＲＮＡは、核において約７０ヌクレオチドのプレｍｉＲＮＡにプロセスされる大きいＲＮＡ前駆体（プリｍｉＲＮＡと称される）から産生され、ｍｉＲＮＡは、不完全なステム−ループ構造（非特許文献１）（図１）にフォールディングされる。プレｍｉＲＮＡは、１８ヌクレオチド長〜２５ヌクレオチド長の成熟ｍｉＲＮＡがＲＮａｓｅ  ＩＩＩ酵素（Ｄｉｃｅｒ）によってプレｍｉＲＮＡヘアピンの一方から切り出される細胞質内で、さらなるプロセシング工程を受ける（非特許文献２および非特許文献３）。ｍｉＲＮＡは、２つの方法で遺伝子発現を調節することが示されている。第１に、そのｍｉＲＮＡに厳密に相補的であるタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列に結合するｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ媒介性の干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する。メッセンジャーＲＮＡ標的は、ＲＩＳＣ複合体においてリボヌクレアーゼによって切断される。ｍｉＲＮＡ媒介性の遺伝子サイレンシングのこの機構は、主に植物において観察されている（非特許文献４および非特許文献５）が、動物からの例も知られている（非特許文献６）。第２の機構において、メッセンジャーＲＮＡ転写物上の不完全な相補部位に結合するｍｉＲＮＡは、転写後のレベルにおける遺伝子制御を指揮するが、そのｍＲＮＡ標的を切断しない。植物および動物の両方において同定されたｍｉＲＮＡはこの機構を使用して、それらの遺伝子標的の翻訳の制御を発揮する（非特許文献７）。
【０００９】
数百種のｍｉＲＮＡが、ハエ、虫、植物および哺乳動物のゲノムにおいて同定されている。ｍｉＲＮＡの大部分について生物学的役割は、これらのほぼ全てが、クローニングおよび生命情報学のアプローチによって見出されたので、不明なままである（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；および非特許文献１５）。
【００１０】
これらの特徴付けされていないｍｉＲＮＡは、発生の間に、重要な遺伝子制御因子として機能して、適切な器官の形成、胚のパターン化（ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ）、および身体の成長を調整するようである（しかし、このことは、証明する必要がある）。ゼブラフィッシュにおいて、ほとんどのｍｉＲＮＡは、器官形成が進んでから発現される（非特許文献１６および非特許文献１７）。
【００１１】
数種のｍｉＲＮＡについての生物学的役割が、解明されてきた。これらの研究は、種々の発生および代謝のプロセスにおけるこれらの調節性分子の重要性を強調する。例えば、ショウジョウバエのｍｉＲＮＡ（ｂａｎｔａｍ）は、組織の異常な増殖を引き起こす因子についての、機能獲得型遺伝子のスクリーニングにおいて同定された（非特許文献１８）。ｂａｎｔａｍは、細胞増殖を刺激すること、およびアポトーシスを阻害することの両方によってハエの組織の増殖を誘導することが見出された（非特許文献１８）。ｂａｎｔａｍについての増殖標的は、同定されていないが、アポトーシス促進遺伝子（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｇｅｎｅ）（ｈｉｄ）は、その３’ＵＴＲ中に複数のｂａｎｔａｍ相補部位を有することが示された。ｈｉｄの遺伝子発現は、上記ｂａｎｔａｍ  ｍｉＲＮＡによって抑制されるので、これは、ｈｉｄの機能を遮断することによるアポトーシスの制御におけるｂａｎｔａｍについての役割に関連する。別のショウジョウバエｍｉＲＮＡ（ｍｉｒ−１４）は、ハエの眼においてＲｅａｐｅｒ誘導性のアポトーシスを改変する因子についての遺伝子スクリーニングにおいて同定された（非特許文献１９）。ｍｉｒ−１４は、アポトーシスの強力なサプレッサーであることが示された。さらに、ｍｉｒ−１４はまた、ショウジョウバエのストレス応答、および脂肪代謝の調節に関与するようである。ｍｉＲＮＡはまた、ショウジョウバエにおけるＮｏｔｃｈ経路遺伝子を調節する（非特許文献２０）。哺乳動物のｍｉＲＮＡ（ｍｉｒ−１８１）は、ヒトＢ細胞の分化を指揮することが示され（非特許文献２１）、ｍｉｒ−３７３は、インスリン分泌を調節し（非特許文献２２）、一方、他のｍｉＲＮＡは、ウイルス感染を調節する（非特許文献２３および非特許文献２４）。
【００１２】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、ショウジョウバエおよびヒトの細胞におけるＲＮＡｉの機構を理解するための研究は、ｍｉＲＮＡおよびＲＮＡｉの経路が交差し得ることを示した（非特許文献２５および非特許文献２６）。ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡｉエフェクター複合体（ＲＩＳＣ）の成分と一緒に同時精製され、このことは、ｍｉＲＮＡとｓｉＲＮＡとの間の関連がＲＮＡｉに関係していることを示唆する（非特許文献２７；非特許文献２８；および非特許文献２９）。いくつかのタンパク質因子がｍｉＲＮＡリボ核タンパク質（ｍｉＲＮＰ）およびＲＩＳＣの両方に関与し、そして他のものは、そのｍｉＲＮＰに固有であり得るという指摘もまた存在する（非特許文献３０および非特許文献３１）。例えば、アルゴノート／ＰＡＺ／ＰＩＷＩファミリーのタンパク質は、ＲＩＳＣおよびｍｉＲＮＰの両方の成分である。これらのタンパク質をコードする遺伝子が癌に関連するという証拠も増えつつある。ｈＡｇｏ３、ｈＡｇｏ１、およびｈＡｇｏ４は、しばしばウィルムス腫瘍において喪失する領域１ｐ３４〜１ｐ３５に存在し、そしてＨｉｗｉは、精巣の胚細胞腫瘍の発症に関連している、染色体１２ｑ２４．３３上に位置する（非特許文献３１）。さらに、ｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡをプロセシングする酵素であるＤＩＣＥＲは、肺癌において十分に発現されない（非特許文献３２）。
【非特許文献１】Ｌｅｅ，Ｙ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２００３年、第４２５巻、第６９５６号、ｐ．４１５−９
【非特許文献２】Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ，Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００１年、第１２巻、ｐ．１２
【非特許文献３】Ｇｒｉｓｈｏｋ，Ａ．ら、Ｃｅｌｌ、２００１年、第１０６巻、第１号、ｐ．２３−３４
【非特許文献４】Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＡＪ．およびＤ．Ｃ．Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年、第２８６巻、第５４４１号、ｐ．９５０−２
【非特許文献５】Ｒｅｉｎｈａｒｔ，ＢＪ．ら、「ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ」、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ、２００２年、第１６巻、ｐ．１６１６−１６２６
【非特許文献６】Ｙｅｋｔａ，Ｓ．、Ｉ．Ｈ．Ｓｈｉｈ、およびＤ．Ｐ．Ｂａｒｔｅｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００４年、第３０４巻、第５６７０号、ｐ．５９４−６
【非特許文献７】Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．、Ｃｅｌｌ、２００４年、第１１６巻、第２号、ｐ．２８１−９７
【非特許文献８】Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ、２００２年、第１２巻、第９号、ｐ．７３５−９
【非特許文献９】Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、ＲＮＡ、２００３年、第９巻、第２号、ｐ．１７５−１７９
【非特許文献１０】Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００１年、第２９４号、第５５４３号、ｐ．８５３−８
【非特許文献１１】Ｌｅｅ，Ｒ．Ｃ．およびＶ．Ａｍｂｒｏｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００１年、第２９４巻、第５５４３号、ｐ．８６２−４
【非特許文献１２】Ｌａｕ，Ｎ．Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００１年、第２９４巻、第５５４３号、ｐ．８５８−６２
【非特許文献１３】Ｌｉｍ，Ｌ．Ｐ．ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、２００３年、第１７巻、第８号、ｐ．９９１−１００８
【非特許文献１４】Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，ＲＪ．およびＯ．Ｈｏｂｅｒｔ、Ｎａｔｕｒｅ、２００３年、第４２６巻、第６９６８号、ｐ．８４５−９
【非特許文献１５】Ｃｈａｎｇ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２００４年、第４３０巻、第７００１号、ｐ．７８５−９
【非特許文献１６】Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｙ．ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、２００５年、第１９巻、第１１号、ｐ．１２８８−９３
【非特許文献１７】Ｗｉｅｎｈｏｌｄｓ，Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００５年
【非特許文献１８】Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅ，Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ、２００３年、第１１３巻、第１号、ｐ．２５−３６
【非特許文献１９】Ｘｕ，Ｐ．ら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ、２００３年、第１３巻、第９号、ｐ．７９０−５
【非特許文献２０】Ｌａｉら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、２００５年、第１９巻、第９号、ｐ．１０６７−８０
【非特許文献２１】Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｚ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００４年、第３０３巻、第５６５４号、ｐ．８３−６
【非特許文献２２】Ｐｏｙ，Ｍ．Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２００４年、第４３２巻、第７０１４号、ｐ．２２６−３０
【非特許文献２３】Ｌｅｃｅｌｌｉｅｒ，Ｃ．Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００５年、第３０８巻、第５７２１号、ｐ．５５７−６０
【非特許文献２４】Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｃ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２００５年、第４３５巻、第７０４２号、ｐ．６８２−６
【非特許文献２５】Ｇｒｉｓｈｏｋ，Ａ．ら、Ｃｅｌｌ、２００１年、第１０６巻、第１号、ｐ．２３−３４
【非特許文献２６】Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ，Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００１年、第２９３巻、第５５３１号、ｐ．８３４−８
【非特許文献２７】Ｍｏｕｒｅｌａｔｏｓ，Ｚ．ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、２００２年、第１６巻、第６号、ｐ．７２０−８
【非特許文献２８】Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ，Ｇ．およびＰ．Ｄ．Ｚａｍｏｒｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２年、第２９７巻、第５５８９号、ｐ．２０５６−６０
【非特許文献２９】Ｃａｕｄｙ，Ａ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２００３年、第４２５巻、第６９５６号、ｐ．４１１−４
【非特許文献３０】Ｇｒｉｓｈｏｋ，Ａ．ら、Ｃｅｌｌ、２００１年、第１０６巻、第１号、ｐ．２３−３４
【非特許文献３１】Ｃａｒｍｅｌｌ，Ｍ．Ａ．ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、２００２年、第１６巻、第２１号、ｐ．２７３３−４２
【非特許文献３２】Ｋａｒｕｂｅ，Ｙ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ、２００５年、第９６巻、第２号、ｐ．１１１−５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、１種以上のオンコジーンの発現を阻害するために、天然に存在するｍｉＲＮＡを提供することが、本発明の目的である。
【００１４】
さらに、癌の１つ以上の症状の処置または予防のために、天然に存在する核酸を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（発明の要旨）
細胞の分化および発達を制御する遺伝子は、ヒトの癌において頻繁に変異される。これらとしては、ＲＡＳ、ｃ−ｍｙｃおよびｂｃｌ−２のようなオンコジーンが挙げられるが、これらに限定されない。天然に存在するマイクロＲＮＡ（特に、ｌｅｔ−７）は、ヒトにおいてこれらのオンコジーンをダウンレギュレートすることが見出されている。ｌｅｔ−７遺伝子のいくつかは、特定の癌において欠失される染色体領域に位置する。従って、これらの特定のマイクロＲＮＡをアップレギュレートすること、または類似の薬学的化合物を外因的に提供することは、これらのオンコジーンの活性化または過剰発現によって生じる腫瘍に対する、有効な癌療法であるはずである。プリｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡの生物学的活性を保持するフラグメントまたはそれらの改変体および、プリｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡ、それらのフラグメントもしくは改変体をコードするＤＮＡ、またはｍｉＲＮＡの調節エレメントを含むｍｉＲＮＡの核酸（特に明記しない限り、まとめて「ｍｉＲＮＡ」と称される）、が、記載される。１つの実施形態において、上記ｍｉＲＮＡの大きさの範囲は、２１ヌクレオチド〜１７０ヌクレオチドであり得るが、２０００ヌクレオチドまでのｍｉＲＮＡが、利用され得る。好ましい実施形態において、上記ｍｉＲＮＡの大きさの範囲は、７０ヌクレオチド長〜１７０ヌクレオチド長である。別の好ましい実施形態において、２１ヌクレオチド長〜２５ヌクレオチド長の成熟ｍｉＲＮＡが、使用され得る。
【００１６】
これらのｍｉＲＮＡは、診断薬および治療薬として有用である。これらの組成物は、癌の少なくとも１つの症状もしくは発現（疾患が、症状の非存在下で発生／進行し得ることに起因する）の処置または予防を必要とする患者に投与される。オンコジーンの異常な発現は、癌（例えば、肺癌）の特徴である。１つの実施形態において、これらの組成物は、１種以上のオンコジーンの発現を阻害するのに有効な量で投与される。より好ましい実施形態において、これらの組成物は、ＲＡＳ、ＭＹＣ、および／またはＢＣＬ−２の発現を阻害するのに有効な量で投与される。有効で、安全な投薬量は、モデル生物体およびヒトの試行において、当業者に周知である方法によって実験的に決定され得る。これらの組成物は、単独か、または補助の癌療法（例えば、外科手術、化学療法、放射線療法、温熱療法、免疫療法、ホルモン療法、およびレーザー療法）と組み合わせて投与されて、例えば、腫瘍の大きさを減少させるか、腫瘍の細胞増殖を減少させるか、新脈管形成を阻害するか、転移を阻害するか、あるいは他の方法で疾患の少なくとも１つの症状または発現を改善する有益な効果を提供し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本明細書中で使用される場合、用語「核酸」とは、複数のヌクレオチド（すなわち、リン酸基および置換ピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ））または置換プリン（例えば、アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））のいずれかである交換可能な有機塩基に連結される糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）を含む分子）をいう。この用語はまた、ポリヌクレオシド（すなわち、ポリヌクレオチドからリン酸を引いたもの）および任意の他の有機塩基含有ポリマーを含むものとする。プリンおよびピリミジンとしては、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、イノシン、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、ならびに他の天然に存在する核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）および天然に存在しない核酸塩基、置換および非置換の芳香族部分が挙げられるが、これらに限定されない。他のこのような改変は、当業者に周知である。従って、用語「核酸」はまた、塩基および／もしくは糖におけるような置換または改変を有する核酸を包含する。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、用語「マイクロＲＮＡ」とは、任意の型の干渉ＲＮＡをいい、これらとしては、内因性マイクロＲＮＡおよび人工のマイクロＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。内因性マイクロＲＮＡは、ゲノム中に天然に存在する小さいＲＮＡであり、これは、ｍＲＮＡの生産的な利用を調節し得る。用語「人工のマイクロＲＮＡ」は、内因性マイクロＲＮＡ以外の任意の型のＲＮＡ配列を含み、この配列は、ｍＲＮＡの生産的な利用を調節し得る。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「マイクロＲＮＡフランキング配列」とは、マイクロＲＮＡプロセシングエレメントを含むヌクレオチド配列をいう。マイクロＲＮＡプロセシングエレメントは、前駆体マイクロＲＮＡからの成熟マイクロＲＮＡの産生に寄与する最小の核酸配列である。プリｍｉＲＮＡと称される前駆体ｍｉＲＮＡは、核内で約７０ヌクレオチドのプレｍｉＲＮＡへとプロセシングされ、プレｍｉＲＮＡは、不完全なステム−ループ構造にフォールディングされる。
【００２０】
マイクロＲＮＡフランキング配列は、ネイティブなマイクロＲＮＡフランキング配列または人工のマイクロＲＮＡフランキング配列であり得る。ネイティブなマイクロＲＮＡフランキング配列は、マイクロＲＮＡ配列を含む天然に存在するシステムに関連したヌクレオチド配列である（すなわち、これらの配列は、インビボで最小マイクロＲＮＡヘアピンを囲むゲノム配列内に見出される）。人工のマイクロＲＮＡフランキング配列は、天然に存在するシステム中のマイクロＲＮＡ配列に対してフランキングであることが見出されないヌクレオチド配列である。人工のマイクロＲＮＡフランキング配列は、他のマイクロＲＮＡ配列の状況において天然に見出されるフランキング配列であり得る。あるいは、人工のマイクロＲＮＡフランキング配列は、最小のマイクロＲＮＡプロセシングエレメントから構成され得、最小のマイクロＲＮＡプロセシングエレメントは、天然に存在するフランキング配列内に見出され、そしてフランキング配列として天然に存在しないか、または天然のフランキング配列として一部にのみ存在する他のランダムな核酸配列中に挿入される。
【００２１】
前駆体マイクロＲＮＡ分子内のマイクロＲＮＡフランキング配列は、マイクロＲＮＡ配列を包含するステム−ループ構造の片側または両側に隣接し得る。好ましい構造は、ステム−ループ構造の両端上にフランキング配列を有する。上記フランキング配列は、ステム−ループ構造の一端または両端に直接隣接しても、リンカー、さらなるヌクレオチドまたは他の分子を介して上記ステム−ループ構造に連結されてもよい。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「ステム−ループ構造」とは、主に一本鎖のヌクレオチド（ループ部分）の領域によって片側に連結される二本鎖（ステム部分）を形成することが公知であるか、または予想されるヌクレオチドの領域を含む二次構造を有する核酸をいう。用語「ヘアピン」構造および「フォールド−バック」構造はまた、ステム−ループ構造をいうために本明細書中で使用される。このような構造および用語は、当該分野において周知である。ステム−ループ構造内のヌクレオチドの実際の一次配列は、その二次構造が存在する限り重要ではない。当該分野において公知であるように、上記二次構造は、正確な塩基対形成を必要としない。従って、上記ステムは、１つ以上の塩基のミスマッチを含み得る。あるいは、上記塩基対形成は、ミスマッチを全く含み得ない。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、用語「ｌｅｔ−７」とは、ｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡおよびそのホモログ、およびその中に、構造または機能に不利に影響しない保存的な置換、付加、および欠失を含むその改変体をコードする核酸をいう。好ましくは、ｌｅｔ−７とは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ由来のｌｅｔ−７（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＹ３９０７６２）をコードする核酸をいい、最も好ましくは、ｌｅｔ−７とは、ヒト由来のｌｅｔ−７ファミリーメンバー（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＪ４２１７２４、ＡＪ４２１７２５、ＡＪ４２１７２６、ＡＪ４２１７２７、ＡＪ４２１７２８、ＡＪ４２１７２９、ＡＪ４２１７３０、ＡＪ４２１７３１、ＡＪ４２１７３２およびｌｅｔ−７の生物学的に活性な配列改変体（対立遺伝子を含む）が挙げられるが、これらに限定されない）、およびｌｅｔ−７活性を示すｌｅｔ−７のインビトロで産生された誘導体をコードする核酸をいう。
【００２４】
ｌｅｔ−７の配列改変体は、以下の３つの分類のうちの１つ以上に含まれる：置換型改変体、挿入型改変体、または欠失型改変体。挿入としては、５’末端および／または３’末端の融合、ならびに単一の残基または複数の残基の内部配列への挿入が挙げられる。挿入はまた、ｌｅｔ−７の成熟配列内に導入され得る。しかし、これらは、通常、５’末端または３’末端における挿入より小さい、約１〜４残基程度の挿入である。
【００２５】
ｌｅｔ−７の挿入型配列改変体は、１または数個の残基が標的ｌｅｔ−７中の所定の部位に導入される改変体である。最も一般的な挿入型改変体は、ｌｅｔ−７の５’末端または３’末端における核酸の融合体である。
【００２６】
欠失改変体は、ｌｅｔ−７  ＲＮＡ配列からの１つ以上の残基の除去によって特徴付けられる。これらの改変体は、通常、ｌｅｔ−７をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的変異誘発（それによってその改変体をコードするＤＮＡを生成し、その後、組換え細胞の培養においてそのＤＮＡを発現する）によって調製される。しかし、改変体ｌｅｔ−７フラグメントは、インビトロ合成によって都合よく調製され得る。代表的に、上記改変体は、天然に存在するアナログと質的に同じ生物学的活性を示すが、改変体はまた、ｌｅｔ−７の特徴を改変するために選択される。
【００２７】
置換型改変体は、少なくとも１つの残基の配列が除去され、そしてその場所に異なる残基が挿入された改変体である。配列のバリエーションを導入するための部位は、予め決定されるが、その変異自体は、予め決定される必要がない。例えば、所与の部位における変異の実行を最適化するために、ランダム変異誘発が、標的領域において行なわれ得、そして発現したｌｅｔ−７改変体は、所望の活性の最適な組み合わせについてスクリーニングされる。公知の配列を有するＤＮＡ中の所定の部位における置換の変異を作製するための技術は、周知である。
【００２８】
ヌクレオチドの置換は、代表的に、単一の残基の置換であり；挿入は、通常、約１残基〜１０残基程度であり；そして欠失は、約１残基〜３０残基の範囲である。欠失または挿入は、好ましくは、隣接する対において作製される；すなわち、２残基の欠失または２残基の挿入。置換、欠失、挿入またはそれらの任意の組み合わせは、最終的な構築物に到達するために組み合わされ得る。変更が、そのｍｉＲＮＡの活性を上昇させ、その生物学的安定性または半減期などを上昇させるために行われ得る。このようなｍｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に対する全てのこのような改変が、包含される。
【００２９】
ＤＮＡ単離物（ｉｓｏｌａｔｅ）は、３’フランキング領域および／または５’フランキング領域を有するか、もしくはそれらを有さない化学的に合成されたＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを意味することが理解される。ｌｅｔ−７をコードするＤＮＡは、ａ）ｍＲＮＡを含む細胞からｃＤＮＡライブラリーを得ること、ｂ）相同配列を含むｃＤＮＡライブラリーにおいてクローンを検出するためにｌｅｔ−７またはそのフラグメントをコードする標識したＤＮＡ（通常は、１００ｂｐより大きい）を用いてハイブリダイゼーション分析を行なうこと、およびｃ）制限酵素分析および核酸配列決定を用いてそのクローンを分析して、完全長クローンを同定することによって他の供給源から得られ得る。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、核酸および／または核酸配列は、それらが天然にまたは人工的に、共通した祖先の核酸または核酸配列から誘導される場合、相同である。相同性は、一般的に、２つ以上の核酸またはタンパク質（またはそれらの配列）の間の配列類似性から推測される。相同性を確立するのに有用な配列の間の類似性の正確な％は、対象となっている核酸およびタンパク質によって変わるが、少なくとも２５％の配列類似性が、相同性を確立するために慣用的に使用される。より高いレベルの配列類似性（例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％以上）がまた、相同性を確立するために使用され得る。配列類似性の％を決定するための方法（例えば、初期設定のパラメーターを使用したＢＬＡＳＴＮ）が、一般的に利用可能である。ＢＬＡＳＴ分析を行なうためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を通じて公に利用可能である。
【００３１】
（Ｉ．組成物）
細胞の分化および発達を制御する遺伝子は、ヒトの癌において頻繁に変異される。これらとしては、ＲＡＳ、ｃ−ｍｙｃおよびｂｃｌ−２のようなオンコジーンが挙げられるが、これらに限定されない。天然に存在するマイクロＲＮＡ（特に、ｌｅｔ−７）は、ヒトにおいてこれらのオンコジーンをダウンレギュレートすることが見出されている。ｌｅｔ−７遺伝子のいくつかは、特定の癌において欠失される染色体領域中に位置する。従って、これらの特定のマイクロＲＮＡをアップレギュレートすること、または類似の薬学的化合物を外因的に提供することは、これらのオンコジーンの活性化または過剰発現によって生じる腫瘍に対する、有効な癌療法であるはずである。
【００３２】
好ましい実施形態において、ｍｉＲＮＡ処方物は、ｌｅｔ−７またはｌｉｎ−４の１つ以上の標的を発現する癌を有する個体に投与される。より好ましくは、上記処方物は、ＲＡＳ、ＭＹＣおよび／もしくはＢＣＬ−２、またはｌｅｔ−７に対する１つ以上の結合部位を有する他の標的を過剰発現する癌を有する個体に投与される。ＲＡＳ／ＭＡＰＫ経路に加えて、複数の異なる経路が、癌に関わる。多くの公知の癌遺伝子の３’ＵＴＲが、調べられており、そして可能性のあるｌｅｔ−７相補部位が、それらのうちの多くの３’ＵＴＲにおいて同定されている（図１９および表１）。これらの部位は、公知のＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｌｅｔ−７の標的において確立されたｌｅｔ−７相補部位の特徴を有する（Ｒｅｉｎｈａｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ、（２０００）、４０３：９０１−９０６；Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｃｅｌｌ、（２００５）、１２０（５）：６３５−４７；Ｇｒｏｓｓｈａｎｓら、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ、（２００５）、８（３）：３２１−３０；Ｌｉｎら、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ、（２００３）、４（５）：６３９−５０；Ｓｌａｃｋら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ、（２０００）、５：６５９−６６９；Ｖｅｌｌａら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、（２００４）、１８（２）：１３２−７）。ヒトのｃ−ＭＹＣおよびＢＣＬ−２の３’ＵＴＲ中のｌｅｔ−７相補部位（ＬＣＳ）は、同定されている（ｃ−ＭＹＣについては、図１９を参照のこと）。表１に示される多くの可能性のある標的遺伝子はまた、肺癌および他の癌においてアップレギュレートされ、このことは、ｌｅｔ−７が正常組織においてそれらの発現を抑制する原因であるという結論をもたらす。ＧＲＢ２のような他の遺伝子は、ＫＲＡＳのような公知のｌｅｔ−７標的遺伝子と同様の数のＬＣＳを有する（表１）。ＶＥＧＦはまた、ｌｅｔ−７相補部位を有することが確認されている。これらの結果は、ｌｅｔ−７が複数のオンコジーンの発現を抑制し得ることを示す。細胞増殖の阻害に加えて、ｌｅｔ−７はまた、新脈管形成を阻害し得る。従って、ｌｅｔ−７の投与は、癌細胞または腫瘍細胞の生存を促進する複数の経路（すなわち、新脈管形成、減少したアポトーシスおよび増加した細胞増殖）を阻害し得る。
【００３３】
（表１．ｌｅｔ−７結合部位を含む癌に関わる遺伝子）
【００３４】
【表１−１】
2008511678.tif 000002
【００３５】
【表１−２】
2008511678.tif 000003
（ｍｉＲＮＡはヒトの癌において公知の役割を有する）
異なる研究室からの最近の研究は、ヒトの癌におけるｍｉＲＮＡの役割を示す（ＭｃＭａｎｕｓ、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、（２００３）、１３：２５３−２５８）。ヒトのｍｉＲＮＡ（ｍｉｒ−１５およびｍｉｒ−１６）は、成人の白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病の一般的な形態を有する患者において、優先的に欠失されるかまたはダウンレギュレートされる（Ｃａｌｉｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、（２００２）、９９（２４）：１５５２４−９）。この研究は、ｍｉＲＮＡが癌抑制遺伝子として機能し得ることを示唆する。ｍｉｒ−１５５  ｍｉＲＮＡをコードするｂｉｃ遺伝子座は、ｃ−ｍｙｃと協同的に機能し、そしておそらくプロトオンコジーンとして作用してＢ細胞リンパ腫を誘導する（Ｈａａｓｃｈ，Ｄ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、（２００２）、２１７（１−２）：７８−８６）。ｍｉＲ１４２は、慢性リンパ性白血病において腫瘍抑制因子として作用する（Ｃａｌｉｎ，Ｇ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、（２００２）、９９（２４）：１５５２４−９；Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ、（２００２）、１２（９）：７３５−９）。Ｈｉｓ−１は、Ｂ細胞リンパ腫においてオンコジーンとして作用する（Ｈａａｓｃｈ，Ｄ．ら、（２００２）；Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、（２００２）；Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、（２００１）、２９４（５５４３）：８５３−８；Ｌｉら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、（１９９７）、１５０：１２９７−３０５）。ｍｉｒ−１４２遺伝子座へのｍｙｃの転座は、Ｂ細胞リンパ腫を引き起こす（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、（２００２）；Ｇａｕｗｅｒｋｙ，Ｃ．Ｅ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９８９．８６（２２）：８８６７−７１）。ｍｉｒ−１４３およびｍｉｒ−１４５は、結腸直腸癌において十分に発現されない（Ｍｉｃｈａｅｌ、Ｍ．Ｚ．ら、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、（２００３）、１（１２）：８８２−９１）。ｍｉｒ−１７遺伝子座、ｍｉｒ−１８遺伝子座、ｍｉｒ−１９遺伝子座、ｍｉｒ−２０遺伝子座の過剰発現は、マウスモデルにおいてリンパ腫を引き起こし得、そしてＭＹＣによってアップレギュレートされる（Ｈｅ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、（２００５）、４３５（７０４３）：８２８−３３；Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｋ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、（２００５）、４３５（７０４３）：８３９−４３）。
【００３６】
細胞運命決定を制御する遺伝子の間違った制御は、しばしば癌に寄与する。細胞の分化および発達を制御する遺伝子は、ヒトの癌において頻繁に変異される。モデル生物体Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓは、表皮中の幹細胞様系統（ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ  ｌｉｋｅ  ｌｉｎｅａｇｅ）における細胞分化に必要とされる遺伝子を同定するために使用されている。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの成長および発生は、胚子、幼虫および成虫と称される３つの主要な段階に分けられる。幼虫の成長は、４つの幼虫期（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４）に細分される。それぞれの幼虫期は、脱皮で終わり、そして最終的にその動物は、成虫へと成長する。段階に適した細胞分裂および細胞分化のタイミングを調節する遺伝子は、ヘテロクロニック遺伝子として公知である（Ｓｌａｃｋ，Ｆ．およびＧ．Ｒｕｖｋｕｎ、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ、（１９９７）、３１：６１１−３４；Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｄ．およびＦ．Ｓｌａｃｋ、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ、（２００２）、２４（２）：１１９−２９）。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて、ヘテロクロニック遺伝子は、細胞運命決定および分化のタイミングを制御する。ヘテロクロニック変異体において、細胞は、頻繁に末端へと分化し損ない、その代わりに、再び分裂する（癌の特徴）。
【００３７】
上記ｍｉＲＮＡファミリーの基礎をなすメンバー（ｌｉｎｅａｇｅ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ−４（ｌｉｎ−４）およびｌｅｔｈａｌ−７（ｌｅｔ−７））は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて段階に適した細胞分裂および細胞分化のタイミングを制御することが遺伝子分析によって確認された（Ｌｅｅら、Ｃｅｌｌ、（１９９３）、７５（５）：８４３−８５４；Ｒｅｉｎｈａｒｔ，Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、（２０００）、４０３：９０１−９０６；Ｓｌａｃｋ，Ｆ．およびＧ．Ｒｕｖｋｕｎ、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ、（１９９７）、３１：６１１−３４；Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｄ．およびＦ．Ｓｌａｃｋ、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ、（２００２）、２４（２）：１１９−２９）。ｌｅｔ−７およびｌｉｎ−４は、分化の決定に対する増殖のタイミングを制御する。ｌｉｎ−４およびｌｅｔ−７のようなこれらの遺伝子のいくつかは、ヒトにおいて保存されるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする。ｌｉｎ−４  ｍｉＲＮＡおよびｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡにおける変異は、それぞれ、第１の幼虫期（Ｌ１）および第４の幼虫期（Ｌ４）の運命の不適切な反復をもたらし、そしてこれらの欠損により細胞周期から抜け出せなくなる（Ｌｅｅら、Ｃｅｌｌ、（１９９３）、７５（５）：８４３−８５４；Ｒｅｉｎｈａｒｔ，Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、（２０００）、４０３：９０１−９０６）。例えば、野生型の動物において、特殊化した皮膚細胞（シーム細胞（ｓｅａｍ  ｃｅｌｌ）として公知である）は、幹細胞のパターンで分裂し、そして成虫段階の初めにおいて末端へと分化する。シーム細胞は、ｌｉｎ−４変異動物およびｌｅｔ−７変異動物において末端へと分化し損ない、その代わりに、幼虫の運命を反復し、そして再び分裂する。細胞周期制御の欠如および末端へと分化し損なうことは、癌の特徴である。
【００３８】
ｌｉｎ−４およびｌｅｔ−７についての発現パターンは、発生のタイミングを指揮する役割と相関し、ｌｉｎ−４  ＲＮＡは、Ｌ１段階の間に蓄積し、そしてｌｉｎ−１４およびｌｉｎ−２８（Ｌ１後の運命のレプレッサ）の発現を阻害することによって線虫におけるＬ１／Ｌ２の遷移を担う（Ｌｅｅら、Ｃｅｌｌ、（１９９３）、７５（５）：８４３−８５４；Ａｍｂｒｏｓ，Ｖ．およびＨ．Ｒ．Ｈｏｒｖｉｔｚ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、（１９８４）、２２６：４０９−４１６；Ｗｉｇｈｔｍａｎら、Ｃｅｌｌ、（１９９３）、７５（５）：８５５−８６２；Ｍｏｓｓら、Ｃｅｌｌ、（１９９７）、８８（５）：３７−４６；およびＦｅｉｎｂａｕｍ，Ｒ．およびＶ．Ａｍｂｒｏｓ、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、（１９９９）、２１０（１）：８７−９５）。ｌｅｔ−７  ＲＮＡは、Ｌ４段階の間に蓄積し、そしてｌｉｎ−４１、ｈｂｌ−１およびＲＡＳの発現をダウンレギュレートすることによってＬ４／成虫の遷移を担う（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｃｅｌｌ、（２００５）、１２０（５）：６３５−４７；Ｇｒｏｓｓｈａｎｓら、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ、（２００５）、８（３）３２１−３０；Ｌｉｎら、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ、（２００３）、４（５）：６３９−５０；Ｓｌａｃｋ，ＦＪ．、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ、（２０００）、５：６５９−６６９）。
【００３９】
これらの２１ヌクレオチド〜２２ヌクレオチドのｍｉＲＮＡは、それらの標的タンパク質をコードするｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）内の不完全な相補部位に結合することによって効果を発揮し、そして翻訳のレベルにおいてこれらの遺伝子の発現を抑制する（Ｌｅｅら、Ｃｅｌｌ、（１９９３）、７５（５）：８４３−８５４；Ｒｅｉｎｈａｒｔ，Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、（２０００）、４０３：９０１−９０６；Ｍｏｓｓら、Ｃｅｌｌ（１９９７）、８８（５）：６３７−４６；Ｌｉｎ，Ｓ．Ｙ．ら、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ、（２００３）、４（５）：６３９−５０；Ｓｌａｃｋ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ、（２０００）、５：６５９−６６９；Ａｂｒａｈａｎｔｅ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ、（２００３）、４（５）：６２５−３７；ならびにＯｌｓｅｎ，Ｐ．Ｈ．およびＶ．Ａｍｂｒｏｓ、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、（１９９９）、２１６（２）：６７１−８０）。ｌｉｎ−４１  ３’ＵＴＲからのｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡ相補部位（ＬＣＳ）の欠失（図２）は、Ｌ４段階および成虫段階の間の、ｌｉｎ−４１の正常なダウンレギュレーションの抑止を示し、そして最近の研究は、これらの相補部位が、単独で、ｌｉｎ−４１の調節に十分であることを示した（Ｒｅｉｎｈａｒｔ，Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、（２０００）、４０３：９０１−９０６；Ｓｌａｃｋ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ、（２０００）、５：６５９−６６９；Ｖｅｌｌａ，Ｍ．Ｃ．ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、（２００４）、１８（２）：１３２−７）。
【００４０】
ｌｅｔ−７標的遺伝子、ｌｉｎ−４１は、公知のオンコジーンに類似する。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｌｉｎ−４１機能喪失型（Ｉｆ）変異は、ｌｅｔ−７（Ｉｆ）によって認められる効果とは逆に、早発性に細胞を末端へと分化させるが、ｌｉｎ−４１の過剰発現は、ｌｅｔ−７（Ｉｆ）様のシーム細胞増殖を引き起こす（Ｒｅｉｎｈａｒｔ，Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、（２０００）、４０３：９０１−９０６；Ｓｌａｃｋ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ、（２０００）、５：６５９−６６９）。ｌｅｔ−７と同様に、ｌｉｎ−４１は、細胞増殖および細胞分化の重要な遺伝子であり、ｌｅｔ−７およびｌｉｎ−４１は一緒に働いて、細胞を適切な時期に増殖させるか、または分化させる。
【００４１】
ｌｉｎ−４１は、ＲＢＣＣ（ＲＩＮＧフィンガー、Ｂボックス、コイルドコイル（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、Ａｎｎ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、（１９９３）、６８４：１７４−１９２））ファミリーのメンバーのタンパク質をコードする。このファミリーのメンバーは、種々の提唱された機能（例えば、転写およびＲＮＡの結合）を有し、そしてＰＭＬ（Ｋａｋｉｚｕｋａ，Ａ．ら、Ｃｅｌｌ、（１９９１）、６６：６６３−６７４）、ＴＩＦ１（Ｌｅ  Ｄｏｕｒａｒｉｎ，Ｂ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、（１９９５）、１４（９）：２０２０−２０３３）およびＲｆｐプロトオンコジーンが挙げられる。前骨髄性白血病の最も一般的な形態は、ＲＡＲａ遺伝子にＰＭＬを融合させる転座を含む。ＴＩＦ１のＮ末端部分は、上記オンコジーンのタンパク質Ｔ１８においてＢ−ｒａｆに融合される（Ｌｅ  Ｄｏｕｒａｒｉｎ，Ｂ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、（１９９５）、１４（９）：２０２０−２０３３）。ｅｍｕ−ｒｅｔマウス（免疫グロブリン重鎖エンハンサーの転写制御下においてＲＦＰ／ＲＥＴ融合遺伝子を保有する）は、Ｂ系統の白血病およびリンパ腫を発症する（Ｗａｓｓｅｒｍａｎら、Ｂｌｏｏｄ、（１９９８）、９２（ｌ）：２７３−８２）。形質転換ＮＴＨ  ３Ｔ３細胞において、ＲＩＮＧフィンガーモチーフを有するＲｆｐのアミノ末端の半分は、短縮されたＲｅｔレセプターチロシンキナーゼ（Ｒｆｐ／Ｒｅｔ）に融合される（Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｎ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、（１９９６）、２２５（２）：６２７−３１）。このファミリーのメンバーは、癌の進行に関連する。哺乳動物のｌｉｎ−４１もまた、プロトオンコジーンであると予想される。
【００４２】
ｌｉｎ−４１に加えて、ｌｅｔ−７は、３’ＵＴＲ依存的に他の標的遺伝子を調節し、これらの標的遺伝としては、ｈｕｎｃｈｂａｃｋ−ｌｉｋｅ  １（ｈｂｌ−１）（Ｌｉｎ  Ｓｈｉｎ−Ｙｉ，Ｊ．ら、Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ、２００３、（４）：１−２０）およびｌｅｔ−６０（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＲＡＳオンコジーンホモログが挙げられる（実施例１を参照のこと）。表２に示されるように、ｌｅｔ−６０／ＲＡＳは、その３’ＵＴＲ中に複数のｌｅｔ−７相補（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）部位を含み、そしてｌｅｔ−６０（ｌｆ）は、ｌｅｔ−７変異を抑制する。ｌｅｔ−６０／ＲＡＳは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの陰門形成においてその役割が最も理解され、そしてｌｅｔ−６０／ＲＡＳの３’ＵＴＲは、絶対的にｌｅｔ−６０／ｒａｓ活性を必要とする陰門前駆細胞（ＶＰＣ）（一次誘導細胞、１°細胞またはＰ６．ｐ細胞）だけにｌｅｔ−６０／ＲＡＳ発現を制限するのに十分である。正常な動物において、ｌｅｔ−７ファミリーメンバー（ｍｉｒ−８４）は、一次誘導細胞を除く全てのＶＰＣにおいて発現され、そしてこれらの細胞におけるｌｅｔ−６０／ｒａｓ発現を抑制する。
【００４３】
ｌｅｔ−６０活性化変異を有する動物において、１種より多いＶＰＣが誘導されて、過剰な陰門を生じる１°細胞運命へと分化する。ｍｉｒ−８４の過剰発現は、ｌｅｔ−６０／ＲＡＳにおける活性化変異を抑える。ヒトのＮＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子およびＨＲＡＳ遺伝子における多くの活性化変異は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｌｅｔ−６０活性化変異に影響される同一のアミノ酸を変化させる。ＲＡＳは、複数のヒトの癌において変異される（Ｍａｌｕｍｂｒｅｓら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ、（２００３）、３（６）：４５９−６５）ので、ヒトのＲＡＳがヒトのｌｅｔ−７の標的であるという仮説が検証され、そしてそうであることが決定された（下の実施例１を参照のこと）。
【００４４】
ｌｉｎ−４  ｍｉＲＮＡおよびｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡは、ヒトを含む高等動物において進化的に保存され（図３）、そして時間的に発現され（下の実施例を参照のこと）、このことは、動物の発生の間のこれらのｍｉＲＮＡの普遍的な役割を暗示する（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ら、Ｍｏｕｓｅ．Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ、（２００２）、１２（９）：７３５−９およびＰａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ，Ａ．Ｅ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、（２０００）、４０８（６８０８）：８６−９）。ｌｅｔ−７オルソログは、ヒトを含む哺乳動物において同定されており、そしてｌｅｔ−７は、ノーザンブロットによって判断されるように、ヒトの肺組織中で発現される（Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ，Ａ．Ｅ．ら）。配列決定されたヒトゲノム中の成熟ｌｅｔ−７配列の３つの正確なコピー（別個のプロモーターの制御下において、ｌｅｔ−７ａ１、ｌｅｔ−７ａ２、ｌｅｔ−７ａ３と称される）、および特定のヌクレオチド位置においてｌｅｔ−７と異なる種々の近いホモログ（例えば、ｌｅｔ−７ｃ、図３を参照のこと）が存在する。線虫、ハエおよびヒトのｌｅｔ−７遺伝子は、ステムループ構造を形成すると予想される前駆体形態（プレｌｅｔ−７）からプロセシングされ、このステムループ構造はまた、保存される（図１）。同様に、ｍｉｒ−１２５ａおよびｍｉｒ−１２５ｂと命名される、ｌｉｎ−４の２つのヒトホモログおよびマウスホモログが存在する（図３）。
【００４５】
最近の研究は、マイクロＲＮＡの発現プロフィールが標準的なメッセンジャーＲＮＡの発現プロフィールより良好に、特定の癌を正確に診断し得ることを示した（Ｌｕら、Ｎａｔｕｒｅ、４３５：８３４−８３８、（２００５））。
【００４６】
（ヒトのオンコジーンを調節するのに有用なｍｉＲＮＡ）
ヒトのオンコジーン調節する天然に存在するマイクロＲＮＡ（プリｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡ、または成熟ｍｉＲＮＡの生物学的活性を保持するそれらのフラグメントもしくは改変体をコードするＤＮＡ、それらのフラグメントもしくは改変体、およびプリｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡ、またはそれらのフラグメントもしくは改変体をコードするＤＮＡあるいは上記ｍｉＲＮＡの調節エレメント）が、同定されている。上記ｍｉＲＮＡの大きさは、代表的に、２１ヌクレオチド〜１７０ヌクレオチドであるが、２０００ヌクレオチドまでのヌクレオチドが、利用され得る。好ましい実施形態において、上記プレｍｉＲＮＡの大きさの範囲は、７０ヌクレオチド長と１７０ヌクレオチド長との間であり、成熟ｍｉＲＮＡは、２１ヌクレオチド長と２５ヌクレオチド長との間である。
【００４７】
（核酸）
（一般的技術）
分子生物学的技術を記載する一般的な教科書としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）、第１巻〜第３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９７）；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｐａｒｔ  Ｉ．Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）；ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆが挙げられる。これらの教科書は、例えば、ｌｅｔ−７または任意の他のｍｉＲＮＡ活性をコードする遺伝子の生成および発現に関する、変異誘発、ベクターの使用、プロモーター、ならびに多くの他の関係のある話題を記載する。核酸、遺伝子の単離、精製および操作のための技術（例えば、ライブラリーの生成、発現ベクター中へのサブクローニング、プローブの標識、ならびにＤＮＡハイブリダイゼーションもまた、上記の教科書において記載され、そしてそれらは、当業者に周知である。
【００４８】
上記核酸（ｍｉＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、もしくはゲノムＤＮＡ、またはそれらの改変体にかかわらず）は、種々の供給源から単離されても、インビトロで合成されてもよい。本明細書中に記載されるような核酸は、ヒト、トランスジェニック動物、形質転換細胞に投与され得るか、またはそれらにおいて発現され得、この核酸は、形質転換細胞溶解物、または部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態で投与され得る。
【００４９】
核酸は、当業者に周知である多くの一般的手段によって検出され、そして定量される。これらとしては、例えば、分析的な生化学的方法（例えば、分光測光法、Ｘ線撮影、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、および高拡散クロマトグラフィー（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、種々の免疫学的方法（例えば、流体沈降反応またはゲル内沈降反応、免疫拡散（一次元または二次元）、免疫電気泳動、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイなど）、サザン分析、ノーザン分析、ドットブロット分析、ゲル電気泳動、ＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、他の核酸もしくは標的もしくはシグナルの増幅方法、放射標識、シンチレーション計数法、およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。
【００５０】
種々の型の変異誘発が、例えば、ｌｅｔ−７または他のｍｉＲＮＡ活性を有する遺伝子をコードする核酸を改変するために使用され得る。それら変異誘発としては、部位特異的変異誘発、ランダム点変異誘発（ｒａｎｄｏｍ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、相同組換え（ＤＮＡシャッフリング）、ウラシル含有テンプレートを使用した変異誘発、オリゴヌクレオチド指向型の変異誘発、ホスホロチオエート改変型のＤＮＡ変異誘発、およびギャップ入り二重鎖ＤＮＡを使用した変異誘発などが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる適切な方法としては、ポイントミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用した変異誘発、制限−選択および制限−精製、欠失変異誘発、全体の遺伝子合成による変異誘発、二本鎖切断修復などが挙げられる。例えば、キメラ構築物に関連する変異誘発もまた、本発明に含まれる。１つの実施形態において、変異誘発は、天然に存在する分子または変化したかもしくは変異した天然に存在する分子の公知の情報（例えば、配列、配列比較、物性、結晶構造など）によって導かれ得る。変更が、そのｍｉＲＮＡの活性を上昇させ、その生物学的安定性または半減期などを上昇させるために行われ得る。
【００５１】
比較ハイブリダイゼーションは、核酸の保存的なバリエーションを含む、ｌｅｔ−７または他のｍｉＲＮＡ活性を有する遺伝子をコードする核酸を同定するために使用され得る。
【００５２】
核酸は、それらが代表的には溶液中で会合する場合に、「ハイブリダイズする」。核酸は、種々の十分に特徴付けられた物理化学的な力（例えば、水素結合、溶媒排除、塩基スタッキングなど）に起因してハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ、（１９９３）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｐａｒｔ  Ｉ  ｃｈａｐｔｅｒ  ２、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ」、（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．）、およびＡｕｓｕｂｅｌ、前出に見出される。ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ、（１９９５）、Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  １  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ、（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ  １）ならびにＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ、（１９９５）、Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  ２  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ  ２）は、オリゴヌクレオチドを含むＤＮＡおよびＲＮＡの合成、標識化、検出ならびに定量化についての詳細を提供する。
【００５３】
ストリンジェントな条件下において互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが、実質的に同一である場合、既に実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが、遺伝暗号によって許容される最大コドン縮重度を使用してもたらされる場合に生じる。
【００５４】
本明細書中に記載される方法に使用するのに適した核酸としては、プリｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡ、あるいは上記ｍｉＲＮＡの生物学的活性を保持するそれらのフラグメントもしくは改変体、およびプリｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡ、それらのフラグメントもしくは改変体をコードするＤＮＡ、または上記ｍｉＲＮＡの調節エレメントをコードするＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
（ウイルスベクター）
１つの実施形態において、ｍｉＲＮＡ分子をコードする上記核酸は、ベクター上にある。これらのベクターは、成熟マイクロＲＮＡおよびインビボ発現エレメントをコードする配列を含む。好ましい実施形態において、これらのベクターは、上記プレｍｉＲＮＡが発現され、そしてインビボで成熟ｍｉＲＮＡへとプロセシングされるように、プレｍｉＲＮＡおよびインビボ発現エレメントをコードする配列を含む。別の実施形態において、これらのベクターは、上記プリｍｉＲＮＡ遺伝子およびインビボ発現エレメントをコードする配列を含む。この実施形態において、一次転写物は、最初にプロセシングされて、ステム−ループ前駆体ｍｉＲＮＡ分子を生成する。次いで上記ステム−ループ前駆体はプロセシングされて、成熟マイクロＲＮＡを生成する。
【００５６】
ベクターとしては、核酸配列の挿入もしくは組み込みによって、マイクロＲＮＡ、およびこれらの核酸配列に結合され得る遊離の核酸フラグメントを生成するように操作された、プラスミド、コスミド、ファージミド、ウイルス、ウイルス供給源または細菌供給源に由来する他のビヒクルが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターが、好ましい型のベクターであり、そしてそれらとしては、以下のウイルス由来の核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない：レトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス；マウス幹細胞ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス；マウス乳癌ウイルス；ラウス肉腫ウイルス；アデノウイルス；アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０−型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン−バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス）；およびＲＮＡウイルス（例えば、任意のレトロウイルス）。当業者は、当該分野において公知である他のベクターを容易に利用し得る。
【００５７】
ウイルスベクターは、一般的に、不必要な遺伝子が目的の核酸配列によって置換された、非細胞変性性の真核細胞に対するウイルスに基づく。非細胞変性性のウイルスとしては、レトロウイルス（その生活環は、ゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写、その後の宿主細胞ＤＮＡ中へのプロウイルスの組み込みを含む）が挙げられる。レトロウイルスは、ヒトの遺伝子治療の試行について認可されている。遺伝子操作されたレトロウイルス発現ベクターは、インビボでの核酸の高効率の形質導入について、一般的な利用性を有する。複製欠損レトロウイルスを産生するための標準的なプロトコル（外因性の遺伝子物質のプラスミドへの組み込み、プラスミドが入れられた（ｌｉｎｅｄ）パッケージング細胞のトランスフェクション、そのパッケージング細胞株による組換えレトロウイルスの産生、組織培養培地からのウイルス粒子の回収、およびウイルス粒子による標的細胞の感染の工程を含む）は、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．、「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９０）およびＭｕｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．編、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第７巻、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｌｉｆｆｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．（１９９１）において提供される。
【００５８】
（プロモーター）
「インビボ発現エレメント」は、上記マイクロＲＮＡを生成するために上記核酸の効率的な発現を容易にする、任意の調節ヌクレオチド配列（例えば、プロモーター配列またはプロモーターとエンハンサーとの組み合わせ）である。上記インビボ発現エレメントは、例えば、哺乳動物プロモーターまたはウイルスプロモーター（例えば、構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターまたは組織特異的プロモーター）であり得る。これらプロモーターの例は、当業者に周知である。構成的哺乳動物プロモーターとしては、ポリメラーゼプロモーターおよび以下の遺伝子についてのプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＴＲ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、およびβ−アクチン。真核生物細胞において構成的に機能する例示的なウイルスプロモーターとしては、シミアンウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルスおよび他のレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）由来のプロモーター、ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。他の構成的プロモーターは、当業者に公知である。誘導性プロモーターは、誘導剤の存在下において発現され、そして上記誘導性プロモーターとしては、金属誘導性プロモーターおよびステロイド調節型プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、メタロチオネインプロモーターは、特定の金属イオンの存在下において転写を促進するように誘導される。他の誘導性プロモーターは、当業者に周知である。
【００５９】
組織特異的プロモーターの例としては、クレアチンキナーゼについてのプロモーター（これは、筋肉および心臓組織における発現を指向するために使用されている）、およびＢ細胞における発現のための免疫グロブリン重鎖プロモーターまたは免疫グロブリン軽鎖プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。他の組織特異的プロモーターとしては、ヒト平滑筋α−アクチンプロモーターが挙げられる。
【００６０】
肝臓についての例示的な組織特異的発現エレメントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＨＭＧ−ＣＯＡレダクターゼプロモーター、ステロール調節エレメント１、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーター、ヒトＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）プロモーター、ヒトグルコキナーゼプロモーター、コレステロール７−αヒドロキシラーゼ（ｈｙｄｒｏｙｌａｓｅ）（ＣＹＰ−７）プロモーター、β−ガラクトシダーゼα−２，６シアリルトランスフェラーゼプロモーター、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ−Ｉ）プロモーター、アルドラーゼＢプロモーター、ヒトトランスフェリンプロモーター、およびＩ型コラーゲンプロモーター。
【００６１】
前立腺についての例示的な組織特異的発現エレメントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：前立腺性酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）プロモーター、前立腺分泌性タンパク質の９４（ＰＳＰ  ９４）プロモーター、前立腺特異的抗原複合体プロモーター、およびヒト腺性カリクレイン遺伝子プロモーター（ｈｇｔ−１）。
【００６２】
胃の組織についての例示的な組織特異的発現エレメントとしては、ヒトＨ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ  αサブユニットプロモーターが挙げられるが、これに限定されない。
【００６３】
膵臓についての例示的な組織特異的発現エレメントとしては、膵炎関連タンパク質プロモーター（ＰＡＰ）、エラスターゼ１転写エンハンサー、膵臓特異的なアミラーゼエンハンサープロモーターおよびエラスターゼエンハンサープロモーター、ならびに膵臓由来コレステロールエステラーゼ遺伝子プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
子宮内膜についての例示的な組織特異的発現エレメントとしては、ウテログロビンプロモーターが挙げられるが、これに限定されない。
【００６５】
副腎の細胞についての例示的な組織特異的発現エレメントとしては、コレステロール側鎖切断（ＳＣＣ）プロモーターが挙げられるが、これに限定されない。
【００６６】
一般的な神経系についての例示的な組織特異的発現エレメントとしては、γ−γエノラーゼ（ニューロン特異的エノラーゼ、ＮＳＥ）プロモーターが挙げられるが、これに限定されない。
【００６７】
脳についての例示的な組織特異的発現エレメントとしては、神経フィラメント重鎖（ＮＦ−Ｈ）プロモーターが挙げられるが、これに限定されない。
【００６８】
リンパ球についての例示的な組織特異的発現エレメントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ヒトＣＧＬ−１／グランザイムＢプロモーター、末端デオキシトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、λ５、ＶｐｒｅＢ、およびｌｃｋ（リンパ球特異的チロシンタンパク質キナーゼｐ５６１ｃｋ）のプロモーター、ヒトＣＤ２プロモーターおよびその３’転写エンハンサー、ならびにヒトＮＫ細胞およびヒトＴ細胞の特異的活性化（ＮＫＧ５）プロモーター。
【００６９】
結腸についての例示的な組織特異的発現エレメントとしては、ｐｐ６０ｃ−ｓｒｃチロシンキナーゼプロモーター、器官特異的ネオ抗原（ＯＳＮ）プロモーター、および結腸特異的抗原−Ｐプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
乳腺細胞についての例示的な組織特異的発現エレメントとしては、ヒトα−ラクトグロブリンプロモーターが挙げられるが、これに限定されない。
【００７１】
肺についての例示的な組織特異的発現エレメントとしては、嚢胞性線維症伝達調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子プロモーターが挙げられるが、これに限定されない。
【００７２】
目的の組織における発現の特異性を補助する他のエレメントとしては、分泌リーダー配列、エンハンサー、核移行シグナル、エンドソーム溶解（ｅｎｄｏｓｍｏｌｙｔｉｃ）ペプチドなどが挙げられ得る。好ましくは、これらのエレメントは目的の組織に由来して、特異性を補助する。
【００７３】
一般的に、上記インビボ発現エレメントは、必要な場合、転写の開始に関係する、５’非転写配列および５’非翻訳配列を含むものとする。それらは、必要に応じて、エンハンサー配列または上流活性化配列を含む。
【００７４】
（ｍｉＲＮＡの生成のための方法および材料）
上記ｍｉＲＮＡは、当業者に周知である種々の技術によって、細胞または組織から単離されても、組換え的に生成されても、インビトロで合成されてもよい。
【００７５】
１つの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、細胞または組織から単離される。細胞または組織からｍｉＲＮＡを単離するための技術は、当業者に周知である。例えば、ｍｉＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．製のｍｉｒＶａｎａ  ｍｉＲＮＡ単離キットを使用して全ＲＮＡから単離され得る。別の技術は、小さい核酸のＰＡＧＥ精製のためのｆｌａｓｈＰＡＧＥＴＭ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）を利用する。
【００７６】
上記ｍｉＲＮＡは、それらの組換えバージョンを調製すること（すなわち、遺伝子工学の技術を使用して、組換え核酸（この核酸は、その後、当業者に周知の技術を用いて単離または精製され得る）を生成すること）によって得られ得る。この実施形態は、適切な培養培地において宿主細胞の培養物を増殖させる工程、およびその細胞、またはその細胞が増殖される培養物から上記ｍｉＲＮＡを精製する工程を包含する。例えば、上記方法は、ｍｉＲＮＡをコードする核酸を含む適切な発現ベクターを有する宿主細胞が、そのコードされたｍｉＲＮＡの発現を可能にする条件下において培養される、ｍｉＲＮＡを生成するためのプロセスを包含する。好ましい実施形態において、上記核酸は、ｌｅｔ−７をコードする。上記ｍｉＲＮＡは、培養物、培養培地または宿主細胞から調製された溶解物から回収され得、そしてさらに精製され得る。上記宿主細胞は、高等真核生物の宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）、下等真核生物の宿主細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、または上記宿主細胞は、原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。上記ｍｉＲＮＡをコードする核酸を含むベクターの、上記宿主中への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ、デキストラン媒介性トランスフェクション、またはエレクトロポレーションによって達成され得る（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．ら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。
【００７７】
任意の宿主／ベクター系が、上記ｍｉＲＮＡの１種以上の発現のために使用され得る。これらとしては、真核生物細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞および酵母）、および原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。ｍｉＲＮＡは、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または上記ｍｉＲＮＡ遺伝子が適切なプロモーターの制御下にある他の細胞において発現され得る。原核生物宿主および真核生物宿主と一緒に使用するための適切なクローニングベクターならびに発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載される。好ましい実施形態において、上記ｍｉＲＮＡは、哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現系の例としては、Ｃ１２７、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、他の形質転換された霊長類細胞株、正常二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養に由来する細胞株、初代外植片、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＬ−６０細胞、Ｕ９３７細胞、ＨａＫ細胞またはＪｕｒｋａｔ細胞が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーター、ポリアデニル化部位、転写終結配列、および５’フランキング非転写配列を備える。ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列（例えば、ＳＶ４０起点、初期プロモーター部位、エンハンサー部位、スプライス部位、およびポリアデニル化部位）が使用されて、必要とされる非転写遺伝エレメントを提供し得る。可能性のある適切な酵母株としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、クルイベロミセス株、カンジダ属、またはｍｉＲＮＡを発現し得る任意の酵母株が挙げられる。可能性のある適切な細菌株としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、またはｍｉＲＮＡを発現し得る任意の細菌株が挙げられる。
【００７８】
好ましい実施形態において、ｌｅｔ−７をコードするゲノムＤＮＡが、単離され、そのゲノムＤＮＡは、哺乳動物発現系において発現され、ＲＮＡが、患者に対する投与のために、精製され、そして必要な場合、改変される。好ましい実施形態において、上記ｌｅｔ−７は、所望される場合（すなわち、安定性または細胞の取り込みを増大させるため）に改変され得るプレｍｉＲＮＡの形態である。
【００７９】
ｍｉＲＮＡのＤＮＡ配列の知識は、内因性ｍｉＲＮＡの発現を許容するか、または増加させるための、細胞の改変を可能にする。細胞は、増加したｍｉＲＮＡ発現を、異種プロモーターの全部または一部によって天然に存在するプロモーターを全体または一部において置換することによって提供するために、改変され得（例えば、相同組換えによって）、それによって上記細胞は、より高いレベルにて上記ｍｉＲＮＡを発現する。上記異種プロモーターは、そのプロモーターが所望のｍｉＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結されるような様式で挿入される。例えば、Ｔｒａｎｓｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ，Ｉｎｃ．によるＰＣＴ国際公開番号ＷＯ  ９４／１２６５０、Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｓｙｓ，Ｉｎｃ．による同ＷＯ  ９２／２０８０８、およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍｓによる同ＷＯ  ９１／０９９５５を参照のこと。細胞はまた、上記ｍｉＲＮＡを含む内因性遺伝子を、その内因性遺伝子の調節配列が相同組換えによって置換され得る場合に、誘導性調節エレメントの制御下において発現するように操作され得る。遺伝子活性化技術は、Ｃｈａｐｐｅｌの米国特許第５，２７２，０７１号；Ｓｈｅｒｗｉｎらの同第５，５７８，４６１号；ＳｅｌｄｅｎらによるＰＣＴ／ＵＳ９２／０９６２７（ＷＯ９３／０９２２２）；およびＳｋｏｕｌｔｃｈｉらによるＰＣＴ  ＵＳ９０／０６４３６（ＷＯ９１／０６６６７）に記載される。
【００８０】
上記ｍｉＲＮＡは、そのｍｉＲＮＡを発現するのに適した培養条件下で形質転換宿主細胞を培養することによって調製され得る。生じる発現したｍｉＲＮＡは、次いで、公知の精製プロセス（例えば、ゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィー）を使用してこのような培養物（すなわち、培養培地または細胞抽出物）から精製され得る。上記ｍｉＲＮＡの精製はまた、タンパク質に結合する因子を含むアフィニティーカラム；コンカナバリンＡ−アガロース、ｈｅｐａｒｉｎ−ｔｏｙｏｐｅａｒｌＴＭまたはＣｉｂａｃｒｏｍ  ｂｌｕｅ  ３ＧＡ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭのようなアフィニティー樹脂に対する１つ以上のカラム工程；フェニルエーテル、ブチルエーテル、またはプロピルエーテルのような樹脂を使用した疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む１つ以上の工程；免疫親和性クロマトグラフィー、または相補的ｃＤＮＡ親和性クロマトグラフィーを含み得る。
【００８１】
上記ｍｉＲＮＡはまた、そのｍｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む体細胞または生殖細胞によって特徴付けられるトランスジェニック動物の産物として発現され得る。ｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡおよび適切な調節エレメントを含むベクターは、動物の生殖系細胞中に相同組換えを使用して、その生殖系細胞がそのｍｉＲＮＡを発現するように挿入され得る（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８−１２９２（１９８９））。トランスジェニック動物（好ましくは、非ヒト哺乳動物）は、Ｒｏｂｉｎｓｏｎらの米国特許第５，４８９，７４３号、およびＯｎｔａｒｉｏ  Ｃａｎｃｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅによるＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９４／２８１２２に記載されるような方法を使用して生産される。ｍｉＲＮＡは、上で考察されるようなトランスジェニック動物から単離された細胞または組織から単離され得る。
【００８２】
好ましい実施形態において、上記ｍｉＲＮＡは、例えば、当業者に公知である任意の合成方法を用いて核酸を化学的に合成することによって、合成的に得られ得る。次いでその合成されたｍｉＲＮＡは、当該分野において公知である任意の方法によって精製され得る。核酸の化学合成のための方法としては、ホスホトリエステル化学反応、ホスフェート化学反応もしくはホスホラミダイト化学反応および固相技術を使用したインビトロ化学合成、またはデオキシヌクレオチド（ｄｅｏｓｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）Ｈ−ホスフェート中間体を介したインビトロ化学合成が挙げられるが、これらに限定されない（Ｂｈｏｎｇｌｅの米国特許第５，７０５，６２９号を参照のこと）。
【００８３】
いくつかの状況において、例えば、増加したヌクレアーゼ安定性が所望される場合、核酸アナログおよび／または改変型ヌクレオシド間結合を有する核酸が、好まれ得る。改変型ヌクレオシド間結合を含む核酸はまた、当該分野において周知である試薬および方法を使用して合成され得る。例えば、ホスホネートホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ポスホラミデートメトキシエチルホスホラミデート、ホルムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）、チオホルムアセタール、ジイソプロピルシリル、アセトアミデート（ａｃｅｔａｍｉｄａｔｅ）、カルバメート、ジメチレン−スルフィド（−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２）、ジメチレン（ｄｉｉｎｅｔｈｙｌｅｎｅ）−スルホキシド（−ＣＨ２−ＳＯ−ＣＨ２）、ジメチレン−スルホン（−ＣＨ２−ＳＯ２−ＣＨ２）、２’−Ｏ−アルキル、および２’−デオキシ−２’−フルオロホスホロチオエートのヌクレオシド間結合を含む核酸を合成する方法が、当該分野において周知である（Ｕｈｌｍａｎｎら、１９９０、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４３−５８４；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９０、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３１：３３５およびそれらの中に列挙される参考文献を参照のこと）。Ｃｏｏｋらの米国特許第５，６１４，６１７号および同第５，２２３，６１８号、Ａｃｅｖｅｄｏらの同第５，７１４，６０６号、Ｃｏｏｋらの同第５，３７８，８２５号、Ｂｕｈｒらの同第５，６７２，６９７号および同第５，４６６，７８６号、Ｃｏｏｋらの同第５，７７７，０９２号、Ｄｅ  Ｍｅｓｍａｅｋｅｒらの同第５，６０２，２４０号、Ｃｏｏｋらの同第５，６１０，２８９号ならびにＷａｎｇの同第５，８５８，９８８号もまた、向上したヌクレアーゼ安定性および細胞の取り込みのための核酸アナログを記載する。
【００８４】
（処方物）
上記組成物は、癌の少なくとも１つの症状もしくは発現（疾患が、症状の非存在下で発生／進行し得ることに起因する）の処置または予防を必要とする患者に投与される。オンコジーンの異常な発現は、癌の特徴である。好ましい実施形態において、上記癌は、肺癌である。１つの実施形態において、上記組成物は、１種以上のオンコジーンの発現を阻害するのに有効な量で投与される。好ましい実施形態において、これらの組成物は、ＲＡＳ、ＭＹＣ、および／またはＢＣＬ−２の発現を阻害するのに有効な量で投与される。
【００８５】
癌の少なくとも１つの症状もしくは発現の処置または予防のための方法がまた、記載され、この方法は、少なくとも１つの症状を軽減するか、または少なくとも１つの発現を減少させる核酸を含む組成物の有効な量の投与からなる。好ましい実施形態において、上記癌は、肺癌である。本明細書中に記載される組成物は、単独か、または補助の癌療法（例えば、外科手術、化学療法、放射線療法、温熱療法、免疫療法、ホルモン療法、およびレーザー療法）と組み合わせて、有効な投薬量で投与されて、例えば、腫瘍の大きさを減少させるか、腫瘍の細胞増殖を減少させるか、新脈管形成を阻害するか、転移を阻害するか、あるいは他の方法で疾患の少なくとも１つの症状または発現を改善する有益な効果を提供し得る。
【００８６】
上に記載される核酸は、好ましくは、適切な薬学的キャリアと組み合わせた治療的使用のために利用される。このような組成物は、上記化合物の有効な量、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含有する。処方物は、投与の様式に適するように作製される。薬学的に受容可能なキャリアは、投与される特定の組成物、および上記組成物を投与するために使用される特定の方法によって、部分的に決定される。従って、本明細書中に記載されるいくつかの核酸を含む薬学的組成物の、広範な種々の処方物が、存在する。
【００８７】
インビボで投与される核酸が、細胞および組織に取り込まれ、そして細胞および組織に分布することは、当業者に理解される（Ｈｕａｎｇら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、５５８（１−３）：６９−７３（２００４））。例えば、Ｎｙｃｅらは、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）が、吸入された場合、内因性サーファクタント（肺細胞によって生成される脂質）に結合し、そしてさらなるキャリア脂質を必要とすることなく肺細胞によって取り込まれることを示した（ＮｙｃｅおよびＭｅｔｚｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３８５：７２１−７２５（１９９７））。小さい核酸は、Ｔ２４膀胱癌組織培養細胞中に容易に取り込まれる（Ｍａら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．８：４１５−４２６（１９９８））。ｓｉＲＮＡは、全身投与によって、内因性遺伝子の治療的サイレンシングのために使用されている（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋら、Ｎａｔｕｒｅ、４３２、１７３−１７８（２００４））。
【００８８】
上に記載される核酸は、適切な薬学的キャリアにおける局所的（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、局所的（ｌｏｃａｌｌｙ）または全身的な投与のための処方物中にあり得る。Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１５版（Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９７５）は、代表的なキャリアおよび調製方法を開示する。上記核酸はまた、生分解性ポリマーもしくは非生分解性ポリマーまたは細胞を標的化するためのタンパク質もしくはリポリームから形成される、適切な生体適合性のマイクロカプセル、マイクロ粒子あるいはマイクロスフェア中にカプセル化され得る。このようなシステムは、当業者に周知であり、そして適切な核酸と一緒に使用するために最適化され得る。
【００８９】
核酸送達のための種々の方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載される。このような核酸送達システムは、例として、「むき出し（ｎａｋｅｄ）」の核酸のような「むき出し」の形態か、または送達に適したビヒクル（例えば、カチオン性分子もしくはリポソームを形成する脂質との複合体）中に処方されるか、またはベクターの成分もしくは薬学的組成物の成分としてかのいずれかで所望の核酸を含むが、これらに限定されない。上記核酸送達システムは、直接的（例えば、そのシステムと細胞とを接触させることによって）か、または間接的（例えば、任意の生物学的プロセスの作用を経て）かのいずれかで細胞に提供され得る。例として、上記核酸送達システムは、エンドサイトーシス、レセプター標的化、ネイティブな細胞膜フラグメントもしくは合成の細胞膜フラグメントとの結合、エレクトロポレーションのような物理的手段、上記核酸送達システムと、ポリマー性キャリア（例えば、徐放フィルムまたはナノ粒子もしくはマイクロ粒子）との組み合わせ、ベクターの使用、組織もしくはその細胞を取り囲む流体へのその核酸送達システムの注入、細胞膜を横切るその核酸送達システムの単純拡散、または細胞膜を横切る任意の能動輸送機構もしくは受動輸送機構によって細胞に提供され得るが、これらに限定されない。従って、上記核酸送達システムは、ウイルスベクターの、抗体関連性の標的化および抗体媒介性の固定化のような技術を使用して細胞に提供され得る。
【００９０】
局所投与のための処方物としては、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴剤、坐剤、スプレー、液体および粉末が挙げられ得る。従来の薬学的キャリア（水性基剤、粉末基剤または油性基剤、増粘剤など）は、所望される場合に使用され得る。
【００９１】
非経口投与（例えば、関節内（関節における）経路、静脈内経路、筋肉内経路、皮内経路、腹腔内経路、および皮下経路によるような）に適した処方物としては、水性および非水性の、等張滅菌注射溶液が挙げられ、この溶液は、酸化防止剤、緩衝液、静菌薬、および上記処方物を意図されるレシピエントの血液と等張にさせる溶質、ならびに水性滅菌懸濁物および非水性滅菌懸濁物、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、分散剤、安定化剤、および保存料を含有し得る溶液またはエマルションを含み得る。注射のための処方物は、さらなる保存料を伴って、単位投薬形態（例えば、アンプルまたは複数用量容器中に）で存在し得る。上記組成物は、このような形態をとり得る。
【００９２】
調製物としては、滅菌水性溶液または滅菌非水性溶液、滅菌水性懸濁物または滅菌非水性懸濁物および滅菌水性エマルションまたは滅菌非水性エマルションが挙げられ、これらは、特定の実施形態において被験体の血液と等張であり得る。非水性溶媒の例は、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油、ゴマ油、ヤシ油、落花生油、ピーナッツ油）、鉱油、注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）、または合成モノグリセリドもしくは合成ジグリセリドを含む不揮発性油である。水性キャリアとしては、水、生理食塩水および緩衝媒体を含むアルコール性／水性の溶液、エマルションまたは懸濁物が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、１，３−ブタンジオール、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンガー溶液または不揮発性油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体および栄養補充液、電解質補充液（例えば、リンガーデキストロースに基づくもの）などが挙げられる。保存料および他の添加剤（例えば、抗微生物剤、酸化防止剤、キレート化剤および不活性ガスなどのような）もまた、存在し得る。さらに、滅菌した不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として従来通りに利用される。この目的のために、任意の無刺激性不揮発性油が、合成モノグリセリドもしくは合成ジグリセリドを含め、利用され得る。さらに、オレイン酸のような脂肪酸は、注射剤の調製において使用され得る。キャリアの処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．に見出され得る。当業者は、過度の実験を行うことなく、上記組成物を調製し、そして処方するための種々のパラメーターを容易に決定し得る。
【００９３】
単独か、または他の適切な成分と組み合わせた上記核酸はまた、吸入を介して投与されるエアロゾル処方物（すなわち、それらは、「噴霧」され得る）にされ得る。エアロゾル処方物は、加圧された受容可能な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など）中におかれ得る。吸入による投与のために、上記核酸は、適切な噴霧剤の使用によって、加圧された容器またはネブライザーからエアロゾルスプレー調製物の形態で従来通りに送達される。
【００９４】
いくつかの実施形態において、上に記載される核酸は、処方物成分（例えば、塩、キャリア、緩衝剤、乳化剤、希釈剤、賦形剤、キレート化剤、フィラー、乾燥剤、酸化防止剤、抗微生物剤、保存料、結合剤、充填剤（ｂｕｌｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、シリカ、可溶化剤、または安定化剤）を伴う薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。１つの実施形態において、上記核酸は、細胞の取り込みを改良するために、コレステロールならびにＣ３２官能性を有するラウリル酸誘導体およびリトコール酸誘導体のような親油性の群と結合体化される。例えば、コレステロールは、ｓｉＲＮＡの取り込みおよび血清安定性を向上させることが、インビトロ（Ｌｏｒｅｎｚら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１４（１９）：４９７５−４９７７（２００４））およびインビボ（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋら、Ｎａｔｕｒｅ、４３２（７０１４）：１７３−１７８（２００４））で示されている。さらに、ステロイドと結合体化したオリゴヌクレオチドの、血流中の異なるリポタンパク質（例えば、ＬＤＬ）に対する結合は、完全性を保護し、そして体内分布を容易にすることが示されている（Ｒｕｍｐら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、５９（１１）：１４０７−１４１６（２０００））。上に記載される核酸と結合されるかまたは結合体化されて、細胞の取り込みを増大させ得る他の群としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アクリジン誘導体；架橋剤（たとえば、ソラレン誘導体、アジドフェナシル、プロフラビン、およびアジドプロフラビン）；人工エンドヌクレアーゼ；金属錯体（例えば、ＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩ）およびポルフィリン−Ｆｅ（ＩＩ））；アルキル化部分；ヌクレアーゼ（例えば、アルカリホスファターゼ）；末端トランスフェラーゼ；アブザイム；コレステリル部分；親油性キャリア；ペプチド結合体；長鎖アルコール；リン酸エステル；放射性マーカー；非放射性マーカー；炭水化物；およびポリリジンまたは他のポリアミン。Ｌｅｖｙらの米国特許第６，９１９，２０８号はまた、核酸分子の向上した送達のための方法を記載した。
【００９５】
これらの薬学的処方物は、それ自体公知である様式（例えば、従来の混合プロセス、溶解プロセス、顆粒化プロセス、研和プロセス、乳化プロセス、カプセル化プロセス、封入プロセスまたは凍結乾燥プロセスの手段によって）で製造され得る。
【００９６】
上記核酸の本明細書中に記載される処方物は、上記核酸が別の部分（例えば、標的化部分または別の治療因子）と融合される場合、上記核酸の融合体または上記核酸の改変物（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）を含む。このようなアナログは、改善された特性（例えば、活性および／または安定性）を示し得る。上記核酸に連結されてもされなくてもよい部分の例としては、例えば、特定の細胞に対する核酸の送達を提供する標的化部分（例えば、膵臓細胞に対する抗体、免疫細胞に対する抗体、肺細胞に対する抗体または任意の他の好ましい細胞型に対する抗体）、ならびに上記好ましい細胞型において発現されるレセプターおよびリガンドが挙げられる。好ましくは、上記部分は、癌細胞または腫瘍細胞を標的化する。例えば、癌細胞は、グルコースの増加した消費を有するので、上記核酸は、グルコース分子に連結され得る。癌細胞または腫瘍細胞を標的化するモノクローナルヒト化抗体は、好ましい部分であり、そして上記核酸に連結されてもされなくてもよい。癌治療薬の場合において、その標的抗原は、代表的にはその腫瘍細胞について固有および／または必須であるタンパク質（例えば、レセプタータンパク質ＨＥＲ−２）である。
【００９７】
（ＩＩ．処置の方法）
（投与の方法）
一般的に、核酸を投与する方法は、当該分野において周知である。特に、現在使用している処方物に従って、核酸治療薬について既に使用されている投与の経路は、上に記載される核酸についての投与および処方物の好ましい経路を提供する。
【００９８】
核酸組成物は、多くの経路によって投与され得、それらの経路としては、経口の手段、静脈内の手段、腹腔内の手段、筋肉内の手段、経皮の手段、皮下の手段、局所の手段、舌下の手段、または直腸の手段が挙げられるが、これらに限定されない。核酸はまた、リポソームによって投与され得る。このような投与経路および適切な処方物は、一般的に、当業者に公知である。
【００９９】
本明細書中に記載される処方物の投与は、上記ｍｉＲＮＡまたは上記ｍｉＲＮＡをコードする核酸をその標的に到達させる任意の受容可能な方法によって達成され得る。選択される特定の様式は、当然に、特定の処方物、処置される被験体の状態の重症度、および治療上の有効性のために必要とされる投薬量のような因子に依存する。本明細書中で一般に使用される場合、核酸の「有効な量」は、上記化合物または治療剤を受容しない対応する被験体と比較して、上記処方物が投与される被験体において、癌または関連疾患の１つ以上の症状を処置し得るか、癌または関連疾患の１つ以上の症状の進行を逆転し得るか、癌または関連疾患の１つ以上の症状の進行を停止させ得るか、または癌または関連疾患の１つ以上の症状の出現を予防し得る量である。薬物の実際の有効な量は、利用される特定の薬物またはその組み合わせ、処方される特定の組成物、投与の様式、および患者の年齢、体重、状態、ならびに処置される症状および状態の重症度によって変化し得る。
【０１００】
当業者に公知である任意の受容可能な方法が使用されて、処方物が上記被験体に投与され得る。上記投与は、処置される状態に依存して、局所的（すなわち、特定の領域、生理系、組織、器官、または細胞型に対して）であっても全身的であってもよい。
【０１０１】
注射は、例えば、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、または腹腔内であり得る。上記組成物は、例えば、癌の処置または予防のために皮内に注射され得る。いくつかの実施形態において、上記注射は、複数の位置において与えられ得る。移植は、移植可能な薬物送達システム（例えば、マイクロスフェア、ヒドロゲル、ポリマーレザバ、コレステロールマトリックス、ポリマーシステム（例えば、マトリックスの侵食システムおよび／または拡散システム）および非ポリマーシステム（例えば、圧縮したか、融合したか、または部分的に融合したペレット）を挿入する工程を包含する。吸入は、吸入器中のエアロゾルを用いて、単独か、または吸収され得るキャリアに結合されるかのいずれかで組成物を投与する工程を包含する。全身投与のために、上記組成物は、リポソーム中にカプセル化されることが好ましくあり得る。
【０１０２】
好ましくは、上記薬剤および／または核酸送達システムは、上記薬剤および／または核酸送達システムの組織特異的な取り込みを可能にする様式で提供される。技術としては、包帯もしくは経皮送達システムのような組織局在化デバイスまたは器官局在化デバイスを使用すること、侵襲的デバイス（例えば、血管カテーテルまたは尿路カテーテルを使用すること、およびインターベンショナルデバイス（例えば、薬物送達能力を有し、そして膨張性デバイスまたはステントグラフトのように構成されるステント）を使用することが挙げられる。
【０１０３】
上記処方物は、ポリマーマトリックスの拡散を経るか、またはポリマーマトリックスの分解によって、生体内分解性（ｂｉｏｅｒｏｄｉｂｌｅ）移植物を使用して送達され得る。特定に実施形態において、上記処方物の投与は、特定の期間（例えば、数時間、数日間、数週間、数ヶ月間または数年間）にわたる上記ｍｉＲＮＡに対する連続的な曝露をもたらすために設計され得る。これは、例えば、処方物の投与を繰り返すことによってか、または上記ｍｉＲＮＡが反復投与無しで長期にわたって送達される、持続放出もしくは徐放の送達システムによって達成され得る。このような送達システムを使用した上記処方物の投与は、例えば、経口投薬形態、ボーラス注入、経皮パッチまたは皮下移植物によるものであり得る。上記組成物の実質的に一定の濃度を維持することが、いくつかの場合において好ましくあり得る。
【０１０４】
適切な他の送達システムとしては、時間放出送達システム、遅延放出送達システム、持続放出送達システム、または徐放送達システムが挙げられるが、これらに限定されない。このようなシステムは、多くの場合において反復投与を回避し得、被験体および医師に対する利便性を増加させる。多くの型の放出送達システムが、利用可能であり、そして当業者に公知である。それらとしては、例えば、ポリマーベースのシステム（例えば、ポリ乳酸および／もしくはポリグリコール酸、ポリ無水物、ポリカプロラクトン、コポリオキサレート（ｃｏｐｏｌｙｏｘａｌａｔｅ）、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、ならびに／またはこれらの組み合わせが挙げられる。核酸を含む上述のポリマーのマイクロカプセルは、例えば、米国特許第５，０７５，１０９号に記載される。他の例としては、以下が挙げられる：ステロール（例えば、コレステロール、コレステロールエステル）および脂肪酸または天然の脂肪（例えば、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド）を含む脂質ベースであるナノポリマーシステム；ヒドロゲル放出システム；リポソームベースのシステム；リン脂質ベースのシステム；シラスティックシステム；ペプチドベースのシステム；ワックスコーティング；従来の結合剤および賦形剤を使用した圧縮錠；または部分的に融合した移植物。特定の例としては、上記ｍｉＲＮＡがマトリックス内で処方物中に含まれる侵食システム（例えば、米国特許第４，４５２，７７５号、同第４，６７５，１８９号、同第５，７３６，１５２号、同第４，６６７，０１３号、同第４，７４８，０３４号および同第５，２３９，６６０号に記載されるような）、または活性成分がその放出速度を制御する拡散システム（例えば、米国特許第３，８３２，２５３号、同第３，８５４，４８０号、同第５，１３３，９７４号、および同第５，４０７，６８６号に記載されるような）が挙げられるが、これらに限定されない。上記処方物は、例えば、マイクロスフェア、ヒドロゲル、ポリマーレザバ、コレステロールマトリックス、またはポリマーシステムとしてあり得る。いくつかの実施形態において、上記システムは、例えば、上記ｍｉＲＮＡを含む処方物の拡散または浸食／分解速度の制御によって、上記組成物の持続放出もしくは徐放を起こさせ得る。さらに、ポンプベースのハードウェア送達システムは、１つ以上の実施形態を行うために使用され得る。
【０１０５】
放出がバースト（ｂｕｒｓｔ）で起きるシステムの例としては、例えば、組成物がポリマーマトリックス中にカプセル化されるリポソーム中に封入され、そのリポソームが特定の刺激（例えば、温度、ｐＨ、光または分解酵素）に感受性であるシステム、および組成物がマイクロカプセルのコア（ｃｏｒｅ）を分解する酵素を用いてイオン的（ｉｏｎｉｃａｌｌｙ）にコーティグされたマイクロカプセルによってカプセル化されるシステムが挙げられる。インヒビターの放出が漸進的かつ継続的であるシステムの例としては、例えば、組成物がマトリックス内にある形態で含まれる侵食システム、および組成物が、例えば、ポリマーによって、制御された速度にて浸透する拡散システムが挙げられる。このような持続放出システムは、例えば、ペレット、またはカプセルの形態であり得る。
【０１０６】
長期放出移植物の使用は、いくつかの実施形態において特に適切であり得る。本明細書中で使用される場合、「長期放出」は、組成物を含む移植物が、少なくとも３０日間もしくは４５日間、および好ましくは少なくとも６０日間もしくは９０日間、またはいくつかの場合においてはさらに長く組成物の治療有効レベル送達するように構築され、そして準備されることを意味する。長期放出移植物は、当業者に周知であり、そしてそれらとしては、上に記載される放出システムのいくつかが挙げられる。
【０１０７】
特定の患者に対する投薬量は、従来の考慮事項を用いて（例えば、適切な、従来の薬理学的プロトコルによって）、当業者によって決定され得る。医師は、例えば、最初に比較的低用量を処方し、次いで適切な応答が得られるまでその用量を増加し得る。患者に投与される用量は、その適用に依存して、長い期間をかけて患者において有益な治療的応答（すなわち、例えば、症状を減少させる）、または他の適切な活性を達成するのに十分である。上記用量は、特定の処方物の効力、および利用されるｍｉＲＮＡの活性、安定性または血清半減期、および患者の状態、および処置される患者の体重または表面積によって決定される。上記用量の大きさがまた、特定の患者における特定のベクター、処方物などの投与に伴う任意の有害な副作用の存在、性質および程度によって決定される。
【０１０８】
１つ以上の核酸を含有する治療的組成物は、必要に応じて、１つ以上の適切なインビトロおよび／またはインビボの疾患の動物モデルにおいて、当該分野で周知である方法によって、効力、組織代謝を確認するためおよび投薬量を推定するために試験される。特に、投薬量は、関連したアッセイにおいて、処置対非処置の活性、安定性または他の適切な尺度（例えば、処置した細胞または動物モデル対未処置の細胞または動物モデルの比較）によって最初に決定され得る。処方物は、関連した処方物のＬＤ５０、ならびに／または、例えば、患者の質量および全体的な健康に適した種々の濃度における上記核酸の任意の副作用の観察によって決定される速度にて投与される。投与は、単一用量または分割した用量を介して達成され得る。
【０１０９】
インビトロモデルが使用されて、潜在的な癌の処置としての上記核酸の有効量を決定し得る。適切なインビトロモデルとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：培養した腫瘍細胞の増殖アッセイ、軟寒天における培養した腫瘍細胞の増殖（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、（１９８７）、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、Ｗｉｌｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．第１８章および第２１章を参照のこと）、Ｇｉｏｖａｎｅｌｌａら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎ．Ｉｎｓｔ．、５２：９２１−３０（１９７４）に記載されるようなヌードマウスにおける腫瘍系、Ｐｉｌｋｉｎｇｔｏｎら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１７：４１０７−９（１９９７）に記載されるような、Ｂｏｙｄｅｎ  Ｃｈａｍｂｅｒアッセイにおける腫瘍細胞の移動度および侵襲の可能性、ならびに新脈管形成アッセイ（例えば、Ｒｉｂａｔｔａら、Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、４０：１１８９−９７（１９９９）およびＬｉら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ、１７：４２３−９（１９９９）にそれぞれ記載されるような、ヒヨコ絨毛尿膜の血管新生の誘導または血管内皮細胞の移動の誘導）。適切な腫瘍細胞株は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎカタログから利用可能である。
【０１１０】
インビボモデルは、潜在的な癌の処置としての上に記載される核酸の有効量を決定するのに好ましいモデルである。適切なインビボモデルとしては、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍｏｕｓｅ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから入手可能である、ＫＲＡＳオンコジーン（Ｌｏｘ−Ｓｔｏｐ−Ｌｏｘ  Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ変異体、Ｋｒａｓ２ｔｍ４Ｔｙｊ）に変異を有するマウスが挙げられるが、これに限定されない。当該分野において公知であり、かつ利用可能な他のマウスモデルとしては、胃腸癌、造血器の癌（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、肺癌、乳腺の癌、神経系の癌、卵巣癌、膀胱癌、皮膚癌、子宮頚癌、口腔癌、および肉腫の癌（ｓａｒｃｏｍａ  ｃａｎｃｅｒ）についてのモデルが挙げられるが、これらに限定されない（ｈｔｔｐ：／／ｅｍｉｃｅ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ／を参照のこと）。
【０１１１】
疾患の処置または予防において投与される上記ｍｉＲＮＡの有効な量の決定において、医師は、循環血漿レベル、処方物の毒性、および疾患の進行を評価する。７０キログラムの患者に投与される用量は、代表的に、現在使用されている治療的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、サイトメガロウイルスＲＮＡの処置についてＦＤＡによって認可され、関連する組成物の変化した活性または血清半減期について調整されたＶｉｔｒａｖｅｎｅ（登録商標）（ホミビルセンナトリウム注射）の投薬量と等しい範囲である。
【０１１２】
本明細書中に記載される処方物は、任意の公知である従来の療法によって処置の状態を補い得、それらの療法としては、抗体投与、ワクチン投与、細胞傷害性薬剤、天然のアミノ酸ポリペプチド、核酸、ヌクレオチドアナログ、および生物学的応答改変因子の投与が挙げられるが、これらに限定されない。２つ以上の併用される化合物は、同時に使用されても、連続的に使用されてもよい。例えば、上記核酸はまた、抗癌カクテルの一部として治療的に有効な量で投与され得る。抗癌カクテルは、送達のための薬学的に受容可能なキャリアに加えて、上記オリゴヌクレオチドまたは調節因子と１種以上の抗癌薬との混合物である。癌の処置としての抗癌カクテルの使用は、慣用的である。当該分野で周知であり、かつ本明細書中に記載される核酸と組み合わせた処置として使用され得る抗癌薬としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アクチノマイシンＤ、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン（ｃｉｓ−ＤＤＰ）、シクロホスファミド、シタラビンＨＣｌ（アラビノシルシトシン）、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣｌ、ドキソルビシンＨＣｌ、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エトポシド（Ｖ１６−２１３）、フロクスウリジン、５−フルオロウラシル（５−Ｆｕ）、フルタミド、ヒドロキシ尿素（ヒドロキシカルバミド）、イホスファミド、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、酢酸ロイプロリド（ＬＨＲＨ−放出因子アナログ）、ロムスチン、メクロレタミンＨＣｌ（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート（ＭＴＸ）、マイトマイシン、ミトザントロンＨＣｌ、オクトレオチド、プリカマイシン、プロカルバジンＨＣｌ、ストレプトゾシン、クエン酸タモキシフェン、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、アムサクリン、アザシチジン、ヘキサメチルメラミン、インターロイキン−２、ミトグアゾン、ペントスタチン、セムスチン、テニポシド、および硫酸ビンデシン。
【０１１３】
（処置される疾患）
癌の処置は、腫瘍細胞増殖を阻害し、新脈管形成（腫瘍の増殖を補助するのに必要である新しい血管の増殖）を阻害し、そして／または腫瘍細胞の移動度または侵襲性を減少させることで転移を制止することによって腫瘍の後退を促がす。本明細書中に記載される治療的処方物は、以下を含む成人および小児の腫瘍学において有効であり得る：固形腫瘍／悪性腫瘍、局所で進行した腫瘍、ヒト軟部組織肉腫、リンパ行性転移を含む転移性癌、多発性骨髄腫、急性白血病および慢性白血病、ならびにリンパ腫を含む血液細胞の悪性腫瘍、口の癌、喉頭癌および甲状腺癌を含む頭部および頚部の癌、小細胞癌および非小細胞癌を含む肺癌、小細胞癌および腺管癌を含む乳癌、食道癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌および結腸直腸の新形成に関するポリープを含む胃腸癌、膵臓癌、肝臓癌、膀胱癌および前立腺癌を含む泌尿器の癌、卵巣癌、子宮癌（子宮内膜癌を含む）、および卵胞における固形腫瘍を含む女性生殖管の悪性腫瘍、腎細胞癌を含む腎臓癌、内因性の脳腫瘍を含む脳の癌、神経芽細胞腫、星状細胞の脳腫瘍、神経膠腫、中枢神経系における転移性腫瘍細胞の侵襲、骨腫を含む骨癌、悪性黒色腫を含む皮膚癌、ヒトの皮膚ケラチノサイトの腫瘍の進行、有棘細胞癌、基底細胞癌、血管周囲細胞腫およびカポジ肉腫。治療的処方物は、単独か、または補助の癌療法（例えば、外科手術、化学療法、放射線療法、温熱療法、免疫療法、ホルモン療法、およびレーザー療法）と組み合わせて、治療的に有効な投薬量で投与されて、例えば、腫瘍の大きさを減少させるか、腫瘍増殖速度を遅くするか、腫瘍の細胞増殖を減少させるか、癌細胞の死を促進するか、新脈管形成を阻害するか、転移を阻害するか、あるいは他の方法で必ずしも癌を根絶せずに全体的な臨床状態を改善する有益な効果を提供し得る。
【０１１４】
癌としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：胆道癌；膀胱癌；乳癌；多形性神経膠芽細胞腫および髄芽細胞腫を含む脳の癌；子宮頚癌；絨毛癌；結腸直腸癌を含む結腸癌；子宮内膜癌；食道癌；胃癌；頭部および頚部の癌；急性リンパ性白血病および骨髄性白血病、多発性骨髄腫、ＡＩＤＳ関連性白血病ならびに成人Ｔ細胞白血病リンパ腫を含む血液学的新生物；ボーエン病およびパジェット病を含む上皮内新生物；肝臓癌；小細胞肺癌および非小細胞肺癌を含む肺癌；ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫；神経芽細胞腫；有棘細胞癌を含む口腔癌；骨肉腫；上皮細胞、間質細胞、生殖細胞および間葉細胞から生じる癌を含む卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、滑膜肉腫および骨肉腫を含む肉腫；黒色腫、カポジ肉腫、基底細胞の癌、および扁平上皮癌を含む皮膚癌；胚の腫瘍（例えば、セミノーマ、非セミノーマ（奇形腫、絨毛癌）、間質の腫瘍、および生殖細胞の腫瘍）を含む精巣癌；甲状腺の腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）および髄質の癌を含む甲状腺癌；腺癌およびウィルムス腫瘍を含む移行性の癌ならびに腎臓の癌。好ましい実施形態において、上記処方物は、肺癌の処置または予防のために投与される。
【０１１５】
さらに、治療的核酸は、癌の予防的処置のために使用され得る。個体に癌を発症し易くさせる、当該分野で公知である遺伝性の状態および／または環境状況（例えば、発癌物質への曝露）が存在する。これらの状況において、癌を発症する危険を減少させるために、上記核酸の治療有効量を用いてこれらの個体を処置することが、有利であり得る。１つの実施形態において、適切な処方物中の核酸は、癌の家族歴を有する被験体、または癌についての遺伝的素因を有する被験体に投与され得る。他の実施形態において、適切な処方物中の上記核酸は、特定の年齢に達している被験体、または癌になる可能性がより高い被験体に投与される。なお他の実施形態において、適切な処方物中の上記核酸は、癌（例えば、初期かまたは進行した）の症状を示す被験体に投与される。なお他の実施形態において、適切な処方物中の上記核酸は、予防措置として被験体に投与され得る。いくつかの実施形態において、適切な処方物中の上記核酸は、人口統計もしくは疫学研究に基づく被験体、または特定の領域もくしは経歴にある被験体に投与され得る。
【実施例】
【０１１６】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することによってさらに理解される。
【０１１７】
（実施例１．ＲＡＳは、ｌｅｔ−７マイクロＲＮＡファミリーにによって調節される）
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｌｅｔ−７、ｍｉｒ−４８、ｍｉｒ−８４およびｍｉｒ−２４１は、ｌｅｔ−７ファミリーを構成する４種の発生学的に調節されたｍｉＲＮＡをコードする（Ｌａｕら、（２００１）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９４、８５８−８６２；Ｌｉｍら、（２００３）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、７７、９９１−１００８；Ｒｅｉｎｈａｒｔら、（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ、４０３、９０１−９０６）。このファミリーは、その成熟ｍｉＲＮＡの５’末端における特定の保存を伴う高い配列同一性を提示する（図１０Ａ、図１０Ｂ）。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｌｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ（ｍｉｒ−８４）は、陰門形成（ＲＡＳ／ＭＡＰキナーゼシグナル伝達を分析するためのモデル）に関与する（ＷａｎｇおよびＳｔｅｒｎｂｅｒｇ、（２００１）、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ５１、１８９−２２０）。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｌｅｔ−６０／ＲＡＳは、上記ｌｅｔ−７ファミリーのメンバーによって調節され、ｌｅｔ−７およびｍｉｒ−８４は、ｌｅｔ−６０／ＲＡＳの３’ＵＴＲにおける複数の部位と相補的である。ｌｅｔ−７およびｍｉｒ−８４は、それぞれ、皮下組織および陰門においてｌｅｔ−６０／ＲＡＳについて逆の様式で発現される。
【０１１８】
ｌｅｔ−７およびｍｉｒ−８４は、ｌｅｔ−６０／ＲＡＳと遺伝子的に相互作用し、これは、ｌｅｔ−７およびｍｉｒ−８４によるＲＡＳ発現の負の調節と一致する。この結果は、ｍｉＲＮＡがＲＡＳ（重要なヒトのオンコジーン）を調節し得るということを初めて実証する。さらに、３種全てのヒトＲＡＳ遺伝子は、細胞培養において上記オンコジーンをｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡ媒介性の調節に供するそれらの３’ＵＴＲ中にｌｅｔ−７相補部位を有する。肺腫瘍組織は、正常な肺組織と比較して、顕著に減少したレベルのｌｅｔ−７、および顕著に増加したレベルのＲＡＳタンパク質を提示し、このことは、肺の腫瘍形成におけるｌｅｔ−７の機構としてＲＡＳのｌｅｔ−７調節を示唆する。
【０１１９】
（実験手順）
プラスミド構築。ＰＳＪ８４０（ｍｉｒ−８４：：ｇｆｐ）を、プライマーＭＩＲ８４ＵＰおよびＭＩＲ８４ＤＮ（全てのプライマー配列は必要な際に入手可能である）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）使用して、Ｎ２ゲノムＤＮＡ由来の成熟ｍｉｒ−８４配列の上流の２．２ｋｂのゲノム配列（塩基対−２２０１〜−９）を増幅し、そしてＳｍａＩ部位およびＡｇｅＩ部位を、それぞれ５’末端および３’末端に付加することによって作製した。この産物を、ＳｍａＩおよびＡｇｅＩによって消化し、次いでＳｍａＩおよびＡｇｅＩによって消化したｐＰＤ９５．７０ベクターにクローニングした。ｍｉｒ−８４の上流のＤＮＡは、ｌｅｔ−７の上流のＤＮＡにも見出される種々の配列エレメントを含んだ。ＰＳＪｏ８４（ｍｉｒ−８４（＋＋＋））を、プライマーＭＩＲ８４ＵＰおよびＭＩＲ８４ＤＮ２を用いたＰＣＲを使用して、Ｎ２ゲノムＤＮＡ由来の上記ｍｉｒ−８４配列自体を含む成熟ｍｉｒ−８４配列の上流および下流の３．０ｋｂのゲノム配列（塩基対−２２０１〜＋７９２）を増幅し、そしてＳｍａＩ部位を５’末端および３’末端の両方に付加することによって作製した。この産物を、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって記載される通り、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを使用してｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターに連結した。空のＴＯＰＯコントロールベクターを、ＥｃｏＲＩによってＰＳＪｏ８４を消化し、４ｋｂのベクターバンドを抽出し、そしてそれを自己連結させることによって作製した。ｍｉＲ−８４欠失プラスミド（ｏ８４Δ８４（Δｍｉｒ−８４（＋＋＋）））を、プライマーＭＩＲ８４ＵＰと共にＤＥＬ８４ＤＮを使用し、プライマーＭＩＲ８４ＤＮ２と共にＤＥＬ８４ＵＰを使用し、そしてテンプレートとしてＰＳＪｏ８４プラスミドを使用した２つの別個のＰＣＲ反応によって開始する、オーバーラップ伸長ＰＣＲによって作製した。２つのＰＣＲ産物を精製し（ＱＩＡＧＥＮ）、次いでプライマーＭＩＲ８４ＵＰおよびＭＩＲ８４ＤＮ２を使用した最終的なＰＣＲのためのテンプレートとして一緒に使用した。この最終産物（７５ｎｔのプレｍｉＲ８４をコードする配列の欠失を除いてＰＳＪｏ８４と同一）を、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターに連結し、そしてｏ８４Δ８４と称した。ＧＦＰ６０を、プライマー３ＬＥＴ６０ＵＰおよび３ＬＥＴ６０ＤＮを用いたＰＣＲを使用して、Ｎ２ゲノムＤＮＡ由来のｌｅｔ−６０  ３’ＵＴＲをコードする８１９ｂｐのゲノム配列を増幅し、そしてＥｃｏＲＩ部位およびＳｐｅＩ部位を、それぞれその５’末端および３’末端に付加することによって作製した。この産物を、ＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩによって消化し、次いでＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩによって消化したｐＰＤ９５．７０ベクター（Ｆｉｒｅ  Ｌａｂ）にクローニングし、それによってｌｅｔ−６０  ３’ＵＴＲによってｐＰＤ９５．７０において見出されるｕｎｃ−５４  ３’ＵＴＲを置換した。次いでｌｅｔ−６０  ３’ＵＴＲが続く緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）を、プライマーＢＧＬＧＦＰおよび３ＵＴＲＮＯＴを用いたＰＣＲを使用して、このプラスミドから増��し、そしてＢｇｌＩＩ部位およびＮｏｔＩ部位を、それぞれその５’末端および３’末端に付加した。このＰＣＲ産物を、ＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩによって消化し、そしてＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩによって消化したＰＢ２５５に連結して、上記ｌｅｔ−６０  ３’ＵＴＲによってＧＦＰを駆動するｌｉｎ−３１プロモーターおよびエンハンサーを含むプラスミドＧＦＰ６０を得た。ＧＦＰ５４を、プライマーＢＧＬＧＦＰおよび３ＵＴＲＮＯＴを用いたＰＣＲを使用して、ｕｎｃ−５４  ３’ＵＴＲが続くｇｆｐをｐＰＤ９５．７０から増幅することによって作製した。このＰＣＲ産物を、消化し、そしてＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩによって消化したＰＢ２５５に連結し、ｕｎｃ−５４  ３’ＵＴＲによってＧＦＰを駆動するｌｉｎ−３１プロモーターおよびエンハンサーを含むプラスミドＧＦＰ５４を得た。ｐＧＬ３−ＮＲＡＳ  ＳおよびｐＧＬ３−ＮＲＡＳ  Ｌを、ＩＭＡＧＥ  ｃＤＮＡクローン（アクセッション番号ＡＩ６２５４４２）からのＨ．ｓ．ＮＲＡＳ  ３’ＵＴＲの１１４０ｂｐの短い形態全体、またはＨ．ｓ．ゲノムＤＮＡ由来のＨ．ｓ．ＮＲＡＳ  ３’ＵＴＲ（最初の４３ｂｐを除く）の３６１６ｂｐの長い形態全体を増幅し、そしてそれぞれ、プライマーＳＭＪ１００およびＳＭＪ１０１またはプライマーＳＭＪ１０２およびＳＭＪ１０３を用いたＰＣＲによってその末端にＮｈｅＩ部位を付加することによって作製した。これらの産物を、ＮｈｅＩによって消化し、そしてＸｂａＩによって消化したｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結し、そしてＣＩＰを用いて処理し、Ｈ．ｓ．ＮＲＡＳ  ３’ＵＴＲの短い形態全体または長い形態全体を含むＲｒｌｕｃ発現プラスミドを得た。ｃｏｌ−１０−ｌａｃＺ−ｌｅｔ−６０  ３’ＵＴＲレポーター遺伝子を含むｐＦＳ１０４７を産生するために、ｌｅｔ−６０  ３’ＵＴＲ全体を、プラスミドＢ２９（Ｗｉｇｈｔｍａｎ，Ｂ．、Ｈａ，Ｉ．、およびＲｕｖｋｕｎ，Ｇ．、（１９９３）、Ｃｅｌｌ、７５、８５５−８６２）のＳａｃＩＩ部位およびＮｃｏＩ部位にサブクローニングした。
【０１２０】
ｌｅｔ−６０；ｌｅｔ−７二重変異体。ｌｅｔ−６０（ｎ２０２１）；ｌｅｔ−７（ｍｎ１１２）二重変異体動物を、ｌｅｔ−６０（ｎ２０２１）ヘテロ接合体とｌｅｔ−７（ｍｎ１１２）ｕｎｃ−３／０；ｍｎＤｐ１ヘミ接合体（ｈｅｍｉｙｚｇｏｔｅ）とを交雑させることによって産出した。この交雑から、１８０個体のホモ接合ｌｅｔ−７（ｍｎ１１２）Ｆ２動物は、それらのＵｎｃ表現型によって決定したところ、ｕｎｃ−３に対するｌｅｔ−７（ｍｎ１１２）の緊密な結合に起因して雌性であった。これらのうちの１０個体が、成虫期まで生存し、そして卵を産んだ。これらの動物から生じた子孫は、ｌｅｔ−６０変異体動物の特徴である棒状の表現型を伴う幼虫として死亡し、それによって、これらの動物全てはｌｅｔ−６０（ｎ２０２１）変異を含むこと、および成虫の生存はｌｅｔ−６０（ｎ２０２１）変異に起因するようであることが示され、本発明者らのＲＮＡｉデータが確認された。１８０個体のＦ２から、２５％（または約４５個体の動物）は、ｌｅｔ−６０（ｎ２０２１）ホモ接合であることが予想された。これらの動物のうちの１０個体のみの生存を確認したことに起因して、これはＲＮＡｉによって観察されたものと同様に、約２２％の抑制を示す。しかし、同腹の規模は、低かった（通常は、約１０個体の孵化した幼虫および数個の孵化していない卵）こと；および幼虫の死亡率と限定的な親の生存率との組み合わせに起因して、二重変異体系は、さらなる分析について確立できなかった；全ての子孫は幼虫として死亡した。
【０１２１】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよびトランスジェニックレポーター分析。全ての動物実験を、特に明記しない限り、室温または２０℃にて行った。全ての実験プラスミドを、５０〜１００ｎｇ／μｌにて動物に注入した。２つの異なるマーカー（ｒｏｌ−６（１００ｎｇ／μｌ）およびｍｙｏ−３：：ｇｆｐ（５０ｎｇ／μｌ））を、別々に、ＰＳＪｏ８４と一緒に同時注入し：ｍｙｏ−３：：ｇｆｐ（５０ｎｇ／μｌ）を、ｏ８４Δ８４と一緒に同時注入し；そしてｍｙｏ−２：：ｇｆｐ（５ｎｇ／μｌ）を、ＧＦＰ６０およびＧＦＰ５４と一緒に同時注入した。これらの動物は、トランスジーンについてモザイクである。個体系の間の発現を比較するために、Ｐｎ．ｐ細胞の各々におけるＧＦＰの発現の％を、最も高く発現するＰｎ．ｐ細胞の発現に対して正規化し、そして動物の各個体系について最も高いエクスプレッサー（ｅｘｐｒｅｓｓｅｒ）の分画として表した。各構築物について、上記系の平均を、エラーバーとして表される各構築物についての標準偏差に従って算出した（ｍｉｒ−８４：：ｇｆｐ  ｎ＝２３９、ｇｆｐ６０  ｎ＝４２およびｇｆｐ５４  ｎ＝４０）。ｍｉｒ−８４（＋＋＋）の分析に関して、動物をＤＩＣ光学を使用して試験して、シーム細胞および陰門の解剖を記録した。ＬａｃＺレポーター分析を、記載される通りに行った（Ｖｅｌｌａら、（２００４）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１８、１３２−１３７）。上記ｌｉｎ−４１  ３’ＵＴＲを欠くそのＬＣＳ（ｐＦＳ１０３１）を、コントロールとして使用した（Ｒｅｉｎｈａｒｔら、（２０００））。ＲＮＡｉ方法は、同調Ｌ１を使用した標準的な飼育手順であった（Ｔｉｍｍｏｎｓら、（２００１）、Ｇｅｎｅ、２６３、１０３−１１２）。全てのＲＮＡｉ実験を、空ベクター（Ｌ４４４０）の飼育コントロールと並行して行った。ｌｅｔ−６０；ｌｅｔ−７二重変異体交雑の詳細については、補足実験手順を参照のこと。
【０１２２】
哺乳動物細胞のｌｅｔ−７／ＲＡＳ。１０％ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ）を補充したＤ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）中で増殖させたＨｅＬａ  Ｓ３細胞を、製造業者のプロトコルによりＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ウェル１つあたり１．０μｇのＰｐ−ｌｕｃ発現プラスミド（ＰｒｏｍｅｇａからのｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＧＬ３−ＮＲＡＳ  Ｓ  ｐＧＬ３−ＮＲＡＳ  ＬおよびｐＧＬ３−ＫＲＡＳ）およびウェル１つあたり０．１μｇのＲｒ−ｌｕｃ発現プラスミド（ＰｒｏｍｅｇａからのｐＲＬ−ＴＫ）を使用して、１２ウェルプレート中で同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、上記細胞を、収穫し、そして製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって記載される通り、Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイを使用してアッセイした。上記のように増殖させたＨｅＬａ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を使用して、３０ｐｍｏｌｅのＡｎｔｉ−ｍｉＲ  ｌｅｔ−７またはネガティブコントロール＃１インヒビター（Ａｍｂｉｏｎ）によって２４ウェルプレート中でトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、ＲＡＳ発現を、ＲＡＳタンパク質（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）に対する一次抗体と結合体化したＦＩＴＣを使用した免疫蛍光によってモニタリングした。得られた蛍光シグナルを、適切なフィルターセットを使用して分析し、そしてＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェアを使用して定量化した。１５０〜３００個の細胞の蛍光強度を、代表的に、１または数個の表示領域において測定した。前駆体およびインヒビターの両方を用いた実験を、３回行った。写真は、上記実験の１つから得た単一の視野を表し、そしてその三つ組の実験を代表するものである。完全に等しく増殖したＨｅＬａ細胞を、製造業者のプロトコルによりＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ウェル１つあたり２００ｎｇのＰｐ−ｌｕｃ発現プラスミド（ＰｒｏｍｅｇａからのｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＧＬ３−ＮＲＡＳ  Ｓ  ｐＧＬ３−ＮＲＡＳ  ＬおよびｐＧＬ３−ＫＲＡＳ）を使用して、２４ウェルプレート中で同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、上記細胞を、収穫し、そして製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって記載される通り、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイを使用してアッセイした。
【０１２３】
１０％ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ）を補充したＤ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）中で増殖させたＨｅｐＧ２細胞を、製造業者のプロトコルに従いｓｉＰｏｒｔ  Ｎｅｏ−ＦＸ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、１５ｐｍｏｌｅまたは５ｐｍｏｌｅのＰｒｅ−ｍｉＲ  Ｌｅｔ−７ｃまたはネガティブコントロール＃１前駆体ｍｉＲＮＡｓ（Ａｍｂｉｏｎ）によって２４ウェルプレート中でトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、ＲＡＳ発現を、上に記載される通り、免疫蛍光によってモニタリングした。
【０１２４】
Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．によるものを使用したｍｉＲＮＡマイクロアレイ分析手順。３人の乳癌患者、６人の結腸癌患者、および１２人の肺癌患者由来の腫瘍組織サンプルならびに隣接正常組織（ＮＡＴ）サンプルからの全ＲＮＡを、ｍｉｒＶａｎａ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して単離した。２０μｇの各全ＲＮＡサンプルを、１５％変性ポリアクリルアミドゲルを使用したポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分画し、そして各サンプルについてのｍｉＲＮＡ分画を、回収した。上記サンプルの全てからのｍｉＲＮＡを、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ反応に供し、ここでアミン改変型ウリジンを、約４０ｎｔ長の尾部の一部として組み込んだ（Ａｍｂｉｏｎ）。尾部を有する腫瘍サンプルを、アミン反応性Ｃｙ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して蛍光標識し、そして上記隣接正常細胞サンプルを、Ｃｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって標識した。蛍光標識したｍｉＲＮＡを、ガラス繊維フィルターの結合および溶出（Ａｍｂｉｏｎ）によって精製し、そして上記同じ患者由来の腫瘍サンプルおよび隣接正常組織サンプルを、混合した。各サンプル混合物を、１６７種のｍｉＲＮＡプローブが配列されたスライドと１４時間ハイブリダイズさせた。上記マイクロアレイを、２×ＳＳＣ中で３回×２分間（ｍｉｎ）洗浄し、そしてＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ（Ａｘｏｎ）を使用して走査した。各エレメントに対するＣｙ３標識サンプルおよびＣｙ５標識サンプルについての蛍光強度を、上記アレイ上の合計のＣｙ３シグナルおよびＣｙ５シグナルによって正規化した。各エレメントに関する正規化したシグナル強度を、患者サンプルの各対由来の腫瘍サンプルとＮＡＴサンプルとの間で比較し、そして隣接正常サンプルに対する腫瘍サンプルの対数比として表した。
【０１２５】
ノーザン分析。ｍｉｒ−８４のノーザンを、記載される通りに行った（Ｊｏｈｎｓｏｎら、（２００３）、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、２５９、３６４−３７９）。ヒト組織について、患者１および患者５の腫瘍組織および隣接正常組織由来の１μｇの全ＲＮＡを、１５％変性ポリアクリルアミドゲルを使用したＰＡＧＥによって分画した。上記ＲＮＡを、０．５×ＴＢＥ中で２００ｍＡにて２時間のエレクトロブロッティングによって、正に荷電したナイロンメンブレンに移した。上記ノーザンブロットを、乾燥し、次いで、１０７ｃｐｍのｌｅｔ−７ｃと相補的な放射標識転写物と一緒に、１０ｍｌのＵＬＴＲＡｈｙｂ−Ｏｌｉｇｏ（Ａｍｂｉｏｎ）中で一晩インキュベートした。上記ブロットを、２×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ中で室温にて３回×１０分間洗浄し、次いで２×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ中で４２℃にて１回×１５分間洗浄した。Ｓｔｏｒｍシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用した一晩のホスホイメージング（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｉｎｇ）は、ｌｅｔ−７ｃを示した。上記プロセスを、５Ｓ  ｒＲＮＡに対する放射標識プローブを使用して繰り返した。
【０１２６】
肺腫瘍タンパク質／ノーザン／ｍＲＮＡ分析。全ＲＮＡおよび全タンパク質を、ｍｉｒＶａｎａ  ＰＡＲＩＳ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、３人の肺癌患者由来の腫瘍組織サンプルおよび隣接正常組織サンプルから単離した。ｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡおよびＵ６  ｓｎＲＮＡを、上に記載したノーザン手順を使用して測定した。ＮＲＡＳ  ｍＲＮＡおよびＢ−アクチンｍＲＮＡならびに１８Ｓ  ｒＲＮＡを、上記標的ＲＮＡの各々に特異的なプライマーを使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した。ＲＡＳタンパク質およびＧＡＰＤＨタンパク質を、上に記載したＲＡＳ抗体およびＧＡＰＤＨ（Ａｍｂｉｏｎ）に対する抗体を使用したウェスタン分析によって測定した。
【０１２７】
アクセッション番号。以下の配列を、３’ＵＴＲ  ＬＣＳについて検索した：Ｈｓ  ＫＲＡＳ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｍ５４９６８）、Ｈｓ  ＨＲＡＳ（ＮＭ１７６７９５）、Ｈｓ  ＮＲＡＳ（ＢＣ００５２１９）。ＮＲＡＳは、２Ｋｂ形態および４．３Ｋｂ形態として存在することが公知である。ＢＣ００５２１９は、１１５１ｎｔのポリアデニル化３’ＵＴＲを有する短い形態を示す。２種のヒトＥＳＴクローン（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＢＵ１７７６７１およびＢＧ３８８５０１）を配列決定して、さらなるＮＲＡＳ  ３’ＵＴＲ配列を得た。これは、上記ＮＲＡＳ  ３’ＵＴＲが、代替的なポリアデニル化および切断部位（最初の２４９１ｎｔ下流）を利用する３６４２ｎｔのポリアデニル化３’ＵＴＲバージョンで存在することを示した。このバージョンは、おそらく長いＮＲＡＳ形態に対応する。その配列を、アクセッション番号ＡＹ９４１１００およびＡＹ９４１１０１を用いて示した。
【０１２８】
（結果）
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡのｌｅｔ−６０／ＲＡＳを含むさらなる標的。上記ｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡは、それが少なくとも２つの標的遺伝子（ｌｉｎ−４１（Ｓｌａｃｋら、（２０００）、Ｍｏｌｅｃ  Ｃｅｌｌ、５、６５９−６６９）およびｈｂｌ−１（Ａｂｒａｈａｎｔｅら、（２００３）、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ、４、６２５−６３７；Ｌｉｎら、（２００３）、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ、４、６３９−６５０））をダウンレギュレートする場合（シーム細胞の早発性の末端への分化を生じる変異）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて時間的に発現される（Ｊｏｈｎｓｏｎら、（２００３）、Ｎａｔｕｒｅ、４２６、８４５−８４９；Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉら、（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ、４０８、８６−８９；Ｒｅｉｎｈａｒｔら、（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ、４０３、９０１−９０６）。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのシーム細胞分化におけるｌｅｔ−７の役割およびヒトにおけるその潜在的な役割を十分に理解するために、ｌｅｔ−７のさらなる標的を同定した。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子についてのコンピューターによるスクリーニングを、ｌｅｔ−７ファミリーの３’ＵＴＲにおけるｌｅｔ−７ファミリー相補部位（ＬＣＳ）（Ｇｒｏｓｓｈａｎｓ，Ｈ．ら、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ、（２００５）、８（３）：３２１−３０）を用いて行った。最高スコアの遺伝子の１つは、ヒトのオンコジーンＲＡＳのＣ．ｅｌｅｇａｎｓオルソログをコードするｌｅｔ−６０であった。８種のＬＣＳを、確認されたＬＣＳのような特徴（Ｌｉｎら、（２００３）、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ、４、６３９−６５０；Ｒｅｉｎｈａｒｔら、（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ、４０３、９０１−９０６；Ｓｌａｃｋら、（２０００）、Ｍｏｌｅｃ  Ｃｅｌｌ、５、６５９−６６９；Ｖｅｌｌａら、（２００４）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１８、１３２−１３７）を有するｌｅｔ−６０の３’ＵＴＲにおいて同定した（図４Ａ）。その同定した部位の多くを、近縁の線虫Ｃ．ｂｒｉｇｇｓａｅ由来のｌｅｔ−６０の３’ＵＴＲ（Ｓｔｅｉｎら、（２００３）、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ、１、Ｅ４５）において見出した（図４Ａ、図１１および図１２）。このことは、それらの部位が生物学的に重要であるらしいことを示唆する。さらなる３つの部位を、ｌｅｔ−６０／ＲＡＳをコードする配列、およびｌｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡも結合し得る１０個の他の適合しない３’ＵＴＲ部位に見出した（図１１）。
【０１２９】
ｌｅｔ−７（ｎ２８５３ｔｓ）機能喪失型（Ｉｆ）変異体は、減少したｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡを発現し、そして非許容温度にて陰門の破裂によって死亡する（Ｒｅｉｎｈａｒｔら、（２０００）；Ｓｌａｃｋら、（２０００）、Ｍｏｌｅｃ  Ｃｅｌｌ、５、６５９−６６９）。ｌｅｔ−７、ｌｉｎ−４１およびｈｂｌ−１の２つの先に同定された標的における機能喪失型変異は、ｌｅｔ−７致死表現型を部分的に抑制する特性を有する（Ａｂｒａｈａｎｔｅら、（２００３）、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ、４、６２５−６３７；Ｌｉｎら、（２００３）、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ、４、６３９−６５０；Ｒｅｉｎｈａｒｔら、（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ、４０３、９０１−９０６；Ｓｌａｃｋら、（２０００）、Ｍｏｌｅｃ  Ｃｅｌｌ、５、６５９−６６９）。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を供給することによるｌｅｔ−６０の機能の後胚期における減少がまた、再現可能な様式でｌｅｔ−７（ｎ２８５３）を部分的に抑制したことを見出した。コントロールＲＮＡｉおいて成長したｌｅｔ−７変異体の５％が２５℃の非許容温度にて生存し（ｎ＝３０２）、一方でｌｅｔ−７（ｎ２８５３）；ｌｅｔ−６０（ＲＮＡｉ）動物の２７％が生存した（ｎ＝３４５）。従って、他の公知のｌｅｔ−７標的と同様に、ｌｅｔ−６０  Ｉｆは、ｌｅｔ−７（ｎ２８５３）致死表現型を部分的に抑制し、ｌｅｔ−７の死亡率が、少なくとも部分的に、ｌｅｔ−６０の過剰発現によって引き起こされ得ることを示唆する。しかし、ｌｅｔ−６０（ＲＮＡｉ）は、ｌｅｔ−７シーム細胞の末端への分化の欠損を抑制しないようであり、そしてシーム細胞の早発性の末端への分化を引き起こさなかった。さらに、ｌｅｔ−６０（ＲＮＡｉ）に供された野生型の動物は、ｌｅｔ−６０対立遺伝子に関連する代表的な致死的でありかつ陰門がない表現型を提示しなかった（Ｂｅｉｔｅｌら、（１９９０）、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８、５０３−５０９；Ｈａｎら、（１９９０）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１２６、８９９−９１３；ＨａｎおよびＳｔｅｒｎｂｅｒｇ、（１９９０）、Ｃｅｌｌ、６３、９２１−９３１）。ｌｅｔ−６０（ＲＮＡｉ）は、ｌｅｔ−６０  ｍＲＮＡの約８０％のノックダウンをもたらし（Ｇｒｏｓｓｈａｎｓ，Ｈ．ら、（２００５）、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ、８（３）：３２１−３０）、残りのｌｅｔ−６０が、シーム細胞分化および陰門形成に、なお十分であることを示唆した。ｌｅｔ−６０（ＲＮＡｉ）の特性を検証するために、ｌｅｔ−７（ｍｎ１１２）成虫の全てが死亡する一方で、ｌｅｔ−６０（ｎ２０２１）；ｌｅｔ−７（ｍｎ１１２）成虫が生存し得ることを示した（実験手順を参照のこと）。興味深いことに、ｌｅｔ−７（ｎ２８５３）；ｌｅｔ−６０（ＲＮＡｉ）動物は、同腹を行い、そしていくつかの卵を産むことができ、ｌｅｔ−７の陰門が破裂する表現型が、単に陰門の欠如に起因して抑制されなかったことを示唆した。
【０１３０】
ｌｅｔ−６０およびｌｅｔ−７は、皮下組織のシーム細胞において両方とも発現される（ＤｅｎｔおよびＨａｎ、１９９８、Ｐｏｓｔ−ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｏｆ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｌｅｔ−６０  ｒａｓ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ．、Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ、７２、１７９−１８２；Ｊｏｈｎｓｏｎら、２００３、Ａ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｌｅｆｔ／ｒｉｇｈｔ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ａｓｙｍｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．、Ｎａｔｕｒｅ、４２６、８４５−８４９）。ｌｅｔ−６０  ３’ＵＴＲを、皮下組織に発現するｃｏｌ−１０プロモーターによって駆動されるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのｌａｃＺ遺伝子の後方に融合した。レポーター遺伝子活性がＬ４段階付近でダウンレギュレートされ（図５Ａ）、ほぼ同時に、ｌｅｔ−７がシーム細胞において発現されることを見出した（Ｊｏｈｎｓｏｎら、（２００３）、Ｎａｔｕｒｅ、４２６、８４５−８４９）。対照的に、未調節のコントロール３’ＵＴＲに融合された同じレポーター遺伝子は、全ての段階において発現した（図５Ａ）（Ｒｅｉｎｈａｒｔら、（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ、４０３、９０１−９０６；Ｓｌａｃｋら、（２０００）、Ｍｏｌｅｃ  Ｃｅｌｌ、５、６５９−６６９；Ｖｅｌｌａら、（２００４）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１８、１３２−１３７；Ｗｉｇｈｔｍａｎら、（１９９３）、Ｃｅｌｌ、７５、８５５−８６２）。ダウンレギュレーションがｌｅｔ−７（ｎ２８５３）変異体において失敗した（図５Ｂ）ことに起因して、ｌｅｔ−６０  ３’ＵＴＲによって指揮されるレポーターのダウンレギュレーションが野生型ｌｅｔ−７遺伝子に依存することを見出した。従って、複数の傾向の証拠は、ｌｅｔ−６０がｌｅｔ−７によって負に調節されることを強力に示唆する。第１に、ｌｅｔ−６０  ３’ＵＴＲは、ｌｅｔ−７と相補的な複数のエレメントを含み；第２に、ｌｅｔ−６０  ３’ＵＴＲは、ｌｅｔ−７依存的な様式でレポーター遺伝子のダウンレギュレーションを指揮し；第３に、このダウンレギュレーションは、上記皮下組織におけるｌｅｔ−７のアップレギュレーションと相反的であり；そして最後に、ｌｅｔ−６０の機能喪失型は、ｌｅｔ−７致死表現型を部分的に抑制する。
【０１３１】
ｌｅｔ−７ファミリーメンバーｍｉｒ−８４は、陰門前駆細胞において劇的に発現される。ｌｅｔ−６０／ＲＡＳは、陰門形成におけるその役割について最もよく理解されている（ＷａｎｇおよびＳｔｅｒｎｂｅｒｇ、（２００１）、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、５１、１８９−２２０）が、ｌｅｔ−７は、陰門において発現することが報告されていない。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて、ｌｅｔ−７、ｍｉｒ−４８、ｍｉｒ−８４およびｍｉｒ−２４１は、ｌｅｔ−７ファミリーを構成する（Ｌａｕら、（２００１）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９４、８５８−８６２；Ｌｉｍら、（２００３）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１７、９９１−１００８；Ｒｅｉｎｈａｒｔら、（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ、４０３、９０１−９０６）（図１０Ａ、図１０Ｂ）。先の研究は、ｌｅｔ−７：：ｇｆｐ融合体が、ｌｅｔ−７の時間的な発現を忠実に繰り返し、そしてｌｅｔ−７変異体において影響を受けるシーム細胞中で時間的に発現されることを示した（Ｊｏｈｎｓｏｎら、（２００３）、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、２５９、３６４−３７９）。ｍｉｒ−８４（最も近縁のｌｅｔ−７類縁体）の発現パターンを、ｍｉＲ−８４をコードする配列のすぐ上流の２．２キロベース（Ｋｂ）のゲノム配列を緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）遺伝子に融合することによって試験し、ｍｉｒ−８４：：ｇｆｐを、最初に、幼虫段階１（Ｌ１）において体幹の生殖腺で観察した。Ｌ３動物において、強力な発現が、アンカー細胞（ＡＣ）を含む子宮細胞において観察され、そして弱い動的発現が、陰門前駆細胞（ＶＰＣ）において観察された（図６Ａ〜図６Ｃ）。ＶＰＣは、Ｌ３段階の間およびその後の段階に陰門を生じる多分化能の腹部皮下組織細胞である（ＳｕｌｓｔｏｎおよびＨｏｒｖｉｔｚ、（１９７７）、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、５６、１１０−１５６）。ＶＰＣは、上記ＡＣからのＥＧＦシグナル伝達に依存して３つの運命のうちの１つを選ぶ（ＷａｎｇおよびＳｔｅｒｎｂｅｒｇ、（２００１）、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、５１、１８９−２２０）。上記ＡＣに最も近い細胞（Ｐ６．ｐ）は、ほぼＬＩＮ−３／ＥＧＦシグナルを受容し（Ｋａｔｚら、（１９９５）、Ｃｅｌｌ、８２、２９７−３０７）、そしてＲＡＳ／ＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性化によって一次（１°）運命を選ぶ（Ｂｅｉｔｅｌら、（１９９０）、Ｎａｔｕｒｅ、３４８、５０３−５０９；Ｈａｎら、（１９９０）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１２６、８９９−９１３；ＨａｎおよびＳｔｅｒｎｂｅｒｇ、（１９９０）、Ｃｅｌｌ、６３、９２１−９３１）：Ｐ５．ｐおよびＰ７．ｐは、より少ないＬＩＮ−３を受容し、Ｐ６．ｐからの二次的な側方シグナルを受容し（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ、（１９８８）、Ｎａｔｕｒｅ、３３５、５５１−５５４）、そして二次（２°）運命を選択する：Ｐ３．ｐ、Ｐ４．ｐおよびＰ８．ｐは、非誘導性の三次（３°）運命を選ぶ。ｍｉｒ−８４：：ｇｆｐ発現を、発現が稀に観察されるＰ６．ｐを除き、全てのＶＰＣにおいてＬ３段階の初期から中期の間に観察した（図６Ａ）。Ｌ３段階の中期から後期におけるその後のＶＰＣ発現を、Ｐ６．ｐの娘においてＰ６．ｐｘｘへのそれらの分裂直前に最初に出現する、より弱いＧＦＰによって、Ｐ５．ｐおよびＰ７．ｐの娘（Ｐｎ．ｐｘ）を限定した。その後、等価な発現を、Ｐ５．ｐ、Ｐ６．ｐおよびＰ７．ｐの娘（Ｐｎ．ｐｘｘ）において観察した。ｍｉｒ−８４：：ｇｆｐ発現は、陰門形成におけるそれらの細胞の運命がＡＣからのシグナル伝達によって決定される場合、上記段階におけるＰ６．ｐを除き、全てのＶＰＣにおいて観察され（Ａｍｂｒｏｓ、（１９９９）、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２６、１９４７−１９５６）、これは、ｍｉｒ−８４が陰門細胞の運命決定に関連し得ることを示唆する。Ｌ４段階において、ＧＦＰ発現は、ＡＣおよび他の子宮細胞において維持され、皮下組織のシーム細胞において弱く出現し、そして多くのＰ５．ｐ〜Ｐ７．ｐの子孫において、より高いレベルにアップレギュレートされた。第２のｌｅｔ−７ファミリーメンバー（ｍｉｒ−４８）もまた、非Ｐ６．ｐ  ＶＰＣにおいて発現され、上記ＶＰＣにおけるｍｉｒ−４８とｍｉｒ−８４との間の重複性についての可能性を示唆した。
【０１３２】
ｍｉｒ−８４の過剰発現は、陰門およびシームの欠損を引き起こす。ｍｉＲ−８４を、ｍｉＲ−８４をコードする配列の２．２Ｋｂ上流から０．８Ｋｂ下流にわたる３．０ＫｂのゲノムＤＮＡフラグメントのマルチコピーアレイ（ｍｕｌｔｉ−ｃｏｐｙ  ａｒｒａｙ）を有するトランスジェニック動物（ｍｉｒ−８４（＋＋＋）と称される）を産出することによって過剰発現させた。これらの動物は、高いレベルのｍｉＲ−８４を発現し、そして陰門の突出および破裂を含む異常な陰門形成の表現型を提示した（４０％の動物、ｎ＝４０）。シーム細胞におけるｍｉｒ−８４：：ｇｆｐ発現と一致して、ｍｉｒ−８４（＋＋＋）動物はまた、Ｌ４段階におけるシーム細胞の早発性の末端への分化および翼の形成（発生のタイミングが早発性である変異体において見られる特徴）を示した。実際に、ｌｅｔ−７過剰発現株もまた、Ｌ４段階においてシーム細胞の早発性の末端への分化を示した（Ｒｅｉｎｈａｒｔら、（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ、４０３、９０１−９０６）。対照的に、予想されるプレｍｉｒ−８４（Δｍｉｒ−８４（＋＋＋））をコードする配列の７５ヌクレオチド（ｎｔ）の欠失を除いて、ｍｉｒ−８４（＋＋＋）と同一の構築物を含むアレイを保有する動物は、陰門またはシームの欠損を全く示さず、ｍｉｒ−８４（＋＋＋）において観察される表現型が、ｍｉＲ−８４配列に依存することを示した。
【０１３３】
検索を、陰門形成に関連することが公知である全ての遺伝子の３’ＵＴＲにおけるｌｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ相補配列（ＬＣＳ）について実行した（表２）。ＬＣＳは、、ｍｉｒ−８４を含むｌｅｔ−７ファミリーの全てのメンバーを結合する可能性を有する。約１１種の陰門遺伝子が、少なくとも１つのＬＣＳを含み（表２）、ｌｅｔ−７ファミリーが、陰門において複数の遺伝子を調節し得るという可能性を生じた。しかし、この分析において、ＬＣＳ部位の数の多さに起因して、ｌｅｔ−６０／ＲＡＳが際立っていた。
【０１３４】
（表２．公知の陰門遺伝子の３’ＵＴＲにおけるＬＣＳ）
【０１３５】
【表２】
2008511678.tif 000004
ｍｉｒ−８４の過剰発現は、ｌｅｔ−６０／ＲＡＳ機能獲得型の表現型を部分的に抑制する。ｌｅｔ−６０／ＲＡＳは、Ｐ６．ｐを１°の陰門運命に形質転換するＭＡＰＫシグナル伝達カスケードを活性化するアンカー細胞からのｌｉｎ−３  ＥＧＦシグナルに従って、Ｐ６．ｐにおいて活性である（ＨａｎおよびＳｔｅｒｎｂｅｒｇ、（１９９０）、Ｃｅｌｌ、６３、９２１−９３１）。ｍｉｒ−８４は、Ｐ６．ｐを除く全てのＶＰＣにおいて発現されるので、ｍｉｒ−８４が、１°運命を選ぶことが決まっていない細胞においてｌｅｔ−６０／ＲＡＳの発現を負に調節する可能性を調べた。ｌｅｔ−６０／ＲＡＳにおける変異の活性化は、複数のＶＰＣ（非Ｐ６．ｐ  ＶＰＣを含む）に、複数の陰門を有する（Ｍｕｖ）表現型をもたらす１°運命または２°運命を選ばせる（Ｈａｎら、１９９０）。ｍｉｒ−８４の過剰発現がｌｅｔ−６０（ｇｆ）変異のＭｕｖ表現型を部分的に抑制することを、見出した。この研究において、ｌｅｔ−６０（ｇａ８９）（ＥｉｓｅｎｍａｎｎおよびＫｉｍ、（１９９７）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１４６、５５３−５６５）動物の４１％（ｎ＝５１）は、Ｍｕｖ表現型を提示したが、１３％（ｎ＝１６８）のみは、マルチコピーアレイからｍｉｒ−８４を過剰発現する場合にもＭｕｖ表現型を提示した（ｐ＜＜０．０００１のχ二乗検定）。同じ抑制は、第２のｌｅｔ−６０（ｇｆ）対立遺伝子ｌｅｔ−６０（ｎ１０４６）によって観察された（Ｈａｎら、（１９９０）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１２６、８９９−９１３）：ｌｅｔ−６０（ｎ１０４６）動物の７７％（ｎ＝３９）がＭｕｖ表現型を提示した一方で、５０％（ｎ＝１１３）のみは、ｍｉｒ−８４を過剰発現する場合にもＭｕｖ表現型を提示した（ｐ＜＜０．０００１のχ二乗検定）。ｌｅｔ−６０（ｎｌ０４６）動物は、ｍｉｒ−８４を過発現するｌｅｔ−６０（ｎ１０４６）動物１個体あたり平均で０．６６個の偽陰門（ｐｓｅｕｄｏｖｕｌｖａｅ）と比較して、動物１個体あたり平均で１．５４個の偽陰門を提示した。両方のｌｅｔ−６０（ｇｆ）対立遺伝子について、ｍｙｏ−３：：ｇｆｐ同時注入マーカーに対して低いモザイク現象を示す動物は、完全に抑制され、部分的な抑制が、トランスジーンのアレイのモザイク現象に起因するようであることを示唆した。空ベクターのコントロール（ＴＯＰＯ）（ｎ＝１１１）（ｐ＝０．１４３５のχ二乗検定）およびΔｍｉｒ−８４（＋＋＋）アレイ（ｎ＝１２９）は両方とも、ｌｅｔ−６０（ｎ１０４６）のＭｕｖ表現型を抑制しなかった。全てのｌｅｔ−６０（ｇｆ）実験について、３つの独立した系は、同様の挙動を示した（図１３Ｃ）。
【０１３６】
ｌｅｔ−６０／ＲＡＳ  ３’ＵＴＲは、発現をＰ６．ｐに限定する。ｌｅｔ−６０／ＲＡＳのプロモーターは、全てのＶＰＣにおいてレポーター発現を駆動する（ＤｅｎｔおよびＨａｎ、（１９９８）、Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ、７２、１７９−１８２）。しかし、この初期の研究において使用したトランスジェニックレポーターは、ｌｅｔ−６０  ３’ＵＴＲを含まなかった。ＧＦＰを、ｌｅｔ−６０  ３’ＵＴＲに融合し、そしてＶＰＣ特異的なｌｉｎ−３１（Ｔａｎら、（１９９８）、Ｃｅｌｌ、９３、５６９−５８０）プロモーター（ｇｆｐ６０）を使用して全てのＶＰＣにおいてＧＦＰ発現を駆動した。Ｌ２段階の後期およびＬ３段階の初期において、ＧＦＰは、全てのＰｎ．ｐ細胞において発現されたが、Ｌ３段階の中期〜後期に関しては、ＧＦＰは、Ｐ５．ｐ細胞およびＰ７．ｐ細胞の子孫におけるある程度の発現を伴って、かなりＰ６．ｐ細胞に限られた（図６Ｂ）。ｌｅｔ−６０  ３’ＵＴＲが未調節のｕｎｃ−５４  ３’ＵＴＲによって置換される同様の融合構築物は、全てのＰｎ．ｐ細胞においてＧＦＰ発現を示した（図６Ｃ）。ｌｉｎ−３１プロモーターは、全てのＰｎ．ｐ細胞において活性である（Ｔａｎら、（１９９８）、Ｃｅｌｌ、９３、５６９−５８０）ので、この結果は、ｌｅｔ−６０／ＲＡＳ  ３’ＵＴＲが、非Ｐ６．ｐ細胞においてレポーター遺伝子をダウンレギュレートするのに十分であることを示す。
【０１３７】
ｌｅｔ−６０  ３’ＵＴＲを、ｌｅｔ−６０ゲノムＤＮＡフラグメント中の未調節のｕｎｃ−５４  ３’ＵＴＲを用いて置換した。ｌｅｔ−６０：：ｌｅｔ−６０（＋）：：ｌｅｔ−６０  ３’ＵＴＲ構築物を１０ｎｇ／μｌで使用して生存可能な系を産生し得たが、このｌｅｔ−６０：：ｌｅｔ−６０（＋）：：ｕｎｃ−５４  ３’ＵＴＲ構築物を０．１ｎｇ／μｌを使用してでさえ、生存可能な形質転換体を産生することはできなかった。この結果は、ｌｅｔ−６０  ３’ＵＴＲの除去が、ｌｅｔ−６０を大幅に過剰発現させ、死亡率を引き起こし得ることを示唆する。
【０１３８】
ｌｅｔ−６０／ＲＡＳは、陰門においてｍｉｒ−８４の標的であるようである。先の研究は、ＶＰＣがｌｅｔ−６０／ＲＡＳのレベルに対して感受性であることを示している（Ｂｅｉｔｅｌら、（１９９０）、Ｎａｔｕｒｅ、３４８、５０３−５０９；Ｈａｎら（１９９０））。野生型ｌｅｔ−６０／ＲＡＳ遺伝子の余分なコピーを保有する動物は、非Ｐ６．ｐ  ＶＰＣが１°運命を選び得る場合、Ｍｕｖ表現型を提示する。このデータは、ｍｉｒ−８４が非Ｐ６．ｐ  ＶＰＣにおいてｌｅｔ−６０を負に調節することを、強力に示唆する。第１に、ｍｉｒ−８４は、ｌｅｔ−６０  ３’ＵＴＲ中の複数の部位と相補的である。第２に、ｍｉｒ−８４は、ＶＰＣにおいてｌｅｔ−６０と相反する様式で発現される。ｍｉＲ−８４は、Ｐ６．ｐから大幅に欠如し、同時に、ｌｅｔ−６０  ３’ＵＴＲは、ＧＦＰ発現を主としてＰ６．ｐ細胞系列に限定する。最終的に、ｍｉｒ−８４の過剰発現は、ｌｅｔ−６０遺伝子中の変異を活性化する効果を部分的に抑制する。ｍｉｒ−８４は、非Ｐ６．ｐ  ＶＰＣにおけるｌｅｔ−６０／ＲＡＳの発現を変調し、ＲＡＳ／ＭＡＰＫシグナル経路を介してフラックスを低下させ、それによってこれらの細胞がまた、１°運命を選ぶ可能性を減少させる。しかし、ｍｉｒ−８４は、明らかに、非Ｐ６．ｐ細胞におけるｌｅｔ−６０／ＲＡＳの単なる調節因子ではなく：ｄａｆ−１２（ｒｈ６１）変異体は、いずれのＶＰＣ（ｎ＝６０、動物）においてもｍｉｒ−８４を発現せず、そしてさらに、ｄａｆ−１２（ｒｈ６１）動物は、Ｍｕｖ表現型を提示しない。他の公知の因子（例えば、ｓｙｎｍｕｖ遺伝子（Ｂｅｒｓｅｔら、（２００１）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９１、１０５５−１０５８；ＣｅｏｌおよびＨｏｒｖｉｔｚ、（００４）、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ、６、５６３−５７６；Ｈｏｐｐｅｒら、（２０００）、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ、６、６５−７５；Ｌｅｅら、（１９９４）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、８、６０−７３；ＷａｎｇおよびＳｔｅｒｎｂｅｒｇ、（２００１）、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、５１、１８９−２２０；Ｙｏｏら、（２００４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０３、６６３−６６６；Ｙｏｏｎら、（１９９５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６９、１１０２−１１０５））または未知の因子もまた、これらの細胞においてｌｅｔ−６０／ＲＡＳシグナル伝達を調節し得る。
【０１３９】
それらの合わせた結果は、ｌｅｔ−７およびｍｉｒ−８４が、シーム細胞および陰門細胞（ｌｅｔ−７およびｍｉｒ−８４が全て天然に発現される細胞）におけるその３’ＵＴＲによってｌｅｔ−６０／ＲＡＳ発現を調節するという強力な証拠を提供する。ｌｅｔ−６０／ＲＡＳの３’ＵＴＲが複数のｌｅｔ−７／ｍｉｒ−８４相補部位を含むことによって、この調節が指揮されることが予想される。
【０１４０】
ヒトのＲＡＳ  ３’ＵＴＲ中のｌｅｔ−７相補部位。多くのｍｉＲＮＡは、ヒトの癌において変更され（Ｃａｌｉｎら、（２００２）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９９、１５５２４−１５５２９；Ｃａｌｉｎら、（２００４）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０１、２９９９−３００４；Ｍｉｃｈａｅｌら、（２００３）、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１、８８２−８９１；Ｔａｍら、（２００２）、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７６、４２７５−４２８６）、そして３種の最もよく認識されれいるｍｉＲＮＡ、ｌｉｎ−４（Ｌｅｅら、（１９９３）、Ｃｅｌｌ、７５、８４３−８５４）、ｌｅｔ−７（Ｒｅｉｎｈａｒｔら、（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ、４０３、９０１−９０６）およびｂａｎｔａｍ（Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅら、（２００３）、Ｃｅｌｌ、１１３、２５−３６）の全ては、細胞増殖および細胞分化を調節する。ｌｅｔ−７およびｍｉｒ−８４の最も近縁のヒトホモログは、Ｈ．ｓ．ｌｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａら、（２００２）、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ、１２、７３５−７３９；Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉら、（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ、４０８、８６−８９）である。ｌｅｔ−６０／ＲＡＳは、ヒトＨＲＡＳ、ヒトＫＲＡＳ、およびヒトＮＲＡＳ（肺癌を含むヒトの癌において一般的に変異される（ＭａｌｕｍｂｒｅｓおよびＢａｒｂａｃｉｄ、（２００３）、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ、３、４５９−４６５））のＣ．ｅｌｅｇａｎｓオルソログである（図１３Ａ〜図１３Ｂ）。３種全てのヒトのＲＡＳ  ３’ＵＴＲが、確認されたＣ．ｅｌｅｇａｎｓのＬＣＳの特徴を有する、複数の推定ｌｅｔ−７相補部位を含むことを見出した（図４Ｂ〜図４Ｄ）。これらの多くは、げっ歯類、両生類および魚類において保存され（図１４および図１５）、このことは、機能的な関連性を示唆する。ヒトのＲＡＳ  ３’ＵＴＲにおける推定ＬＣＳの存在は、哺乳動物のｌｅｔ−７ファミリーメンバーが、ｌｅｔ−７およびｍｉｒ−８４がＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおいてｌｅｔ−６０／ＲＡＳを調節するのと同様の様式で、ヒトＲＡＳを調節し得ることを示す。
【０１４１】
ヒトのＲＡＳの発現は、細胞培養においてｌｅｔ−７によって調節される。Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．によって行った６種の異なる細胞株に対するマイクロアレイ分析は、ＨｅｐＧ２細胞が、マイクロアレイ分析によって検出されるような低いレベルでｌｅｔ−７を発現することを示した。従って、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．は、要求に応じて、ｌｅｔ−７ａ前駆体を模倣する二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡを用いてＨｅｐＧ２細胞をトランスフェクトした。ＲＡＳ発現がｌｅｔ−７によって負に調節されるという予想と一致して、ＲＡＳ特異的抗体を用いた免疫蛍光は、上記タンパク質が、外因性ｌｅｔ−７ａ  ｍｉＲＮＡによってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞において、ネガティブコントロールのｍｉＲＮＡによってトランスフェクトされた同じ細胞と比較して約７０％減少したことを示した（図７Ａ）。ＧＡＰＤＨおよびｐ２１ＣＩＰ１のタンパク質発現レベルは、トランスフェクトしたｌｅｔ−７ａ  ｍｉＲＮＡおよびネガティブコントロールのプレｍｉＲＮＡによってほとんど影響を受けず（図１６Ａ）、ｌｅｔ−７ａによる調節が、ＲＡＳに特異的であることを示した。上記ＲＡＳ抗体が、上記トランスフェクト細胞においてＲＡＳタンパク質に特異的であることを確認するために、ＨｅｐＧ２細胞をまた、ＮＲＡＳの独立した領域を標的とする２つの正確に相補的なｓｉＲＮＡを用いて、独立にトランスフェクトした。両方のｓｉＲＮＡは、ネガティブコントロールのｓｉＲＮＡによってトランスフェクトされた細胞と比較して、細胞の蛍光を６０％より大きく減少させた（図１６Ｂ）。
【０１４２】
ネイティブなｌｅｔ−７を発現する細胞は、より少ないＲＡＳタンパク質を発現し得ること、およびｌｅｔ−７の阻害は、ＲＡＳ発現の抑制解除をもたらすことが予想された。このことを試験するために、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．は、要求に応じて、内因性ｌｅｔ−７を発現するＨｅＬａ細胞（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａら、（２００１）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９４、８５３−８５８；Ｌｉｍら、（２００３）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１７、９９１−１００８）を、ｌｅｔ−７の活性を阻害するように設計されたアンチセンス分子（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒら、（２００４）、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ、２、Ｅ９８；Ｍｅｉｓｔｅｒら、（２００４）、ＲＮＡ、１０、５４４−５５０）によってトランスフェクトした。ＨｅＬａ細胞におけるｌｅｔ−７の活性の減少は、ＲＡＳタンパク質のレベルの約７０％の増加を生じた（図７Ｂ）。上で考察したプレｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡを使用する相反的な実験と組み合わせたこれらの結果は、ｌｅｔ−７がヒト細胞においてＲＡＳの発現を負に調節することを示す。
【０１４３】
ヒトＮＲＡＳの３’ＵＴＲおよびヒトＫＲＡＳの３’ＵＴＲを、ルシフェラーゼレポーター遺伝子に融合し、そしてこれらの構築物を、トランスフェクションのコントロールとともに、ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。ＮＲＡＳは、代替的なポリアデニル化部位および切断部位を利用する２つの天然に存在する３’ＵＴＲを含み、これらの３’ＵＴＲの一方は、他方より２．５ｋｂ長い。上記長いＮＲＡＳ  ３’ＵＴＲは、未調節のコントロール３’ＵＴＲと比較してレポーター発現を強力に抑制する（図８Ａ〜図８Ｂ）が、上記短いＮＲＡＳ  ３’ＵＴＲは、わずかだけであるが再現可能な、上記レポーターの抑制を生じたことを見出した。上記短い３’ＵＴＲが、４個のＬＣＳを含む一方で、上記長い形態は、９個のＬＣＳを含む。ＫＲＡＳ  ３’ＵＴＲはまた、上記ルシフェラーゼレポーターを抑制した（図８Ａ〜図８Ｂ）が、一方で、ＨＲＡＳを、試験しなかった。これらの結果は、ＮＲＡＳおよびＫＲＡＳの３’ＵＴＲが、上記レポーターをダウンレギュレートするのに十分な調節情報を含むことを示す。
【０１４４】
上に記載される内因性ＲＡＳの実験と同様に、逆の実験を行ない、ここでＨｅＬａ細胞を上記ＲＡＳ  ３’ＵＴＲレポーター構築物および上記ｌｅｔ−７ａアンチセンスインヒビター分子（またはコントロールスクランブル分子）によってトランスフェクトした。上記ｌｅｔ−７ａインヒビターによってトランスフェクトされた細胞は、コントロールのトランスフェクションと比較して、上記レポーターに対して作用する抑制を示した（図８Ｃ）。ダウンレギュレーションの程度における損失は、ｌｅｔ−７が阻害される場合に観察されるので、これらの結果は、ｌｅｔ−７が、それらの３’ＵＴＲを介して、ヒト細胞においてＮＲＡＳおよびＫＲＡＳを調節することを強力に示す。
【０１４５】
ｌｅｔ−７、ＲＡＳおよび肺癌。ｌｅｔ−６０／ｒａｓと同様に、ヒトのＲＡＳは、ＲＡＳの過剰発現がヒト細胞の腫瘍形成の形質転換を生じることに起因して、用量感受性である（ＭｃＫａｙら、（１９８６）、Ｅｍｂｏ  Ｊ、５、２６１７−２６２１；Ｐｕｌｃｉａｎｉら、（１９８５）、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、５、２８３６−２８４１）。ＲＡＳのｍｉＲＮＡによる制御の喪失がまた、ＲＡＳの過剰発現をもたらし得、そしてヒトの癌に寄与し得ると考えられる。最近の研究は、ｌｅｔ−７ファミリーメンバーを、種々の癌にかかわるヒト染色体の部位に対してマッピングした（Ｃａｌｉｎら、（２００４）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０１、２９９９−３００４）。特に、ｌｅｔ−７ａ−２、ｌｅｔ−７ｃおよびｌｅｔ−７ｇは、肺癌（ＲＡＳの誤った調節が、重要な腫瘍形成の事象であることが公知である癌型（Ａｈｒｅｎｄｔら、（２００１）、Ｃａｎｃｅｒ、９２、１５２５−１５３０；Ｊｏｈｎｓｏｎら、（２００１）、Ｎａｔｕｒｅ  ４１０、１１１１−１１１６））において削除される染色体の小さな間隔に連結されている（Ｃａｌｉｎら、（２００４）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０１、２９９９−３００４）。
【０１４６】
ｍｉＲＮＡマイクロアレイ分析をＡｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．によって行ない、２１人の異なる癌患者（有棘細胞癌（ステージＩＢまたはＩＩＡ）を有する１２人の肺癌患者を含む）由来の組織において上記ｌｅｔ−７遺伝子ファミリーのメンバーの発現レベルを調べた。付随する隣接正常組織（「ＮＡＴ」）と比較して、２１種の乳房、結腸、および肺の腫瘍におけるｌｅｔ−７の発現によって示される通り、ｌｅｔ−７は、肺腫瘍において不十分に発現される。蛍光標識したｍｉＲＮＡを、ｌｅｔ−７ａおよびｌｅｔ−７ｃに特異的なプローブを含んだマイクロアレイにハイブリダイズさせた。上記腫瘍およびＮＡＴについての蛍光強度を、全てのエレメントについての合計の蛍光シグナルによって正規化した。上記腫瘍サンプルおよび隣接正常サンプルにおけるｌｅｔ−７プローブからの相対的な平均シグナルを、対数比として表す。ｌｅｔ−７ａおよびｌｅｔ−７ｃは、２つの近縁なｍｉＲＮＡの間の交差ハイブリダイゼーションを示唆する、類似のプロフィールを有した。ｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡは、同じ患者由来の隣接正常組織サンプルと比較して、上記腫瘍の多くにおいて発現が減少した。ｌｅｔ−７は、上記肺腫瘍組織の全てにおいて、より低いレベルで発現された（図９Ａ）が、他の腫瘍型においては、散発的にのみ発現された。同様の知見が、独立して見出された（Ｔａｋａｍｉｚａｗａら、（２００４）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６４、３７５３−３７５６）。平均して、ｌｅｔ−７は、付随する正常な肺サンプルにおける発現の５０％未満にて、肺腫瘍において発現された。ノーザン分析を使用して、ＲＮＡが精製された２人の患者についての腫瘍サンプルおよびＮＡＴサンプル（図９Ｂにおいて１番目および１５番目の肺癌のバーによって表されるサンプル）におけるｌｅｔ−７ｃを測定した。Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．によるマイクロアレイの結果と一致して、ノーザン分析は、ｌｅｔ−７ｃの発現が、患者＃１の腫瘍において６５％より低く、そして患者＃５の腫瘍において２５％より低かったことを実証した。８個の調べたサンプルのうち７個はまた、上記腫瘍組織において、平均３０％未満のｌｅｔ−７ｇ発現を有した（図１７）。上記ｍｉＲＮＡアレイを使用して、全１６７種のｍｉＲＮＡに対するプローブを含めて上記肺腫瘍およびＮＡＴを比較した。これらの大多数の発現は、肺腫瘍において変化せず、ｌｅｔ−７が肺腫瘍において重要であり得ることを示した。理論的には、ｌｅｔ−７のダウンレギュレーションは、ＲＡＳのアップレギュレーションをもたらし、それによって腫瘍形成を誘導し得るか、または強め得る。
【０１４７】
この仮説を試験するために、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．は、有棘細胞癌を有する３人の新しい肺癌患者の腫瘍組織および隣接正常組織から、全ＲＮＡならびに全タンパク質を単離した。上記ＲＮＡサンプルを分割し、そして半分をノーザン分析に使用して、ｌｅｔ−７ｃおよびＵ６  ｓｎＲＮＡを測定した。上記ＲＮＡサンプルの他の半分をリアルタイムＰＣＲに使用して、ＮＲＡＳ  ｍＲＮＡ、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、およびＢ−アクチンｍＲＮＡを測定した。上記タンパク質サンプルをウェスタン分析に使用して、ＲＡＳタンパク質レベルおよびＧＡＰＤＨタンパク質レベルを評価した。ＲＡＳタンパク質は、同じ患者由来の隣接正常サンプルより、少なくとも１０倍高いレベルで上記腫瘍中に存在した。他の肺癌サンプルに関するＡｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．のｍｉＲＮＡアレイの結果と一致して、３つ全ての肺腫瘍サンプルは、対応するＮＡＴサンプルより４倍〜８倍低いｌｅｔ−７のレベルを有した。第１および第３の肺癌サンプルが、腫瘍およびＮＡＴの両方において、ＮＲＡＳ  ｍＲＮＡの同様のレベルを有した一方で、第２のサンプルの対は、上記腫瘍サンプルにおいてＮＲＡＳ  ｍＲＮＡの有意に、より高いレベルを有した。ＲＡＳタンパク質レベルは、ＮＲＡＳ  ｍＲＮＡレベルと不十分に相関するが、ｌｅｔ−７レベルとは非常に良好に相関し、このことは、上記オンコジーンの発現が、無脊椎動物におけるｌｅｔ−７の公知である機構と一致して、翻訳のレベルにおいて顕著に影響を受けることを示唆する。
【０１４８】
癌細胞におけるｌｅｔ−７とＲＡＳとの相反的な発現パターンは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよびヒトの組織培養実験において、ｌｅｔ−７およびＲＡＳによって見られるパターンと酷似する。上記肺腫瘍サンプルにおける減少したｌｅｔ−７発現と増加したＲＡＳタンパク質発現との間の相関関係は、上記ｌｅｔ−７遺伝子ファミリーの１つ以上のメンバーがインボビでＲＡＳ発現を調節すること、および上記ｍｉＲＮＡの発現のレベルが腫瘍形成の制限または腫瘍形成への寄与において重要な因子であることを示す。
【０１４９】
これらの結果は、上記ｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡファミリーが、２つの異なるＣ．ｅｌｅｇａｎｓ組織および２つの異なるヒト細胞株においてＲＡＳを負に調節することを示す。ひときわ、ｌｅｔ−７は、成人の正常な肺組織において発現されるが（Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉら、（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ、４０８、８６−８９）、肺癌細胞株および肺癌組織においては不十分に発現される（Ｔａｋａｍｉｚａｗａら、（２００４）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６４、３７５３−３７５６）。ｌｅｔ−７の発現は、肺癌組織において、ＲＡＳタンパク質の発現と逆に相関し、このことは，考えられる因果関係を示唆する。さらに、ｌｅｔ−７の過剰発現は、インビトロで肺癌細胞の増殖を阻害し（Ｔａｋａｍｉｚａｗａら、（２００４）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６４、３７５３−３７５６）、これらの細胞におけるｌｅｔ−７と細胞増殖との因果関係を示唆した。
【０１５０】
これらの結果は、上記ＲＡＳオンコジーンの発現がｌｅｔ−７によって調節されること、およびｌｅｔ−７の過剰発現が腫瘍細胞株の増殖を阻害し得ることを示す。ｌｅｔ−７発現が肺腫瘍において減少すること、数種のｌｅｔ−７遺伝子が、しばしば肺癌患者において削除されるゲノム領域にマッピングされること、ｌｅｔ−７の過剰発現が肺腫瘍細胞株の増殖を阻害し得ること、上記ＲＡＳオンコジーンの発現がｌｅｔ−７によって調節されること、およびＲＡＳが肺腫瘍サンプルにおいて著しく過剰発現されることを合わせた観察は、ｌｅｔ−７を肺組織における腫瘍抑制因子として強力に示し、そして処置の基礎を形成する機構の証拠を提供する。
【０１５１】
（実施例２．ｌｅｔ−７およびｍｉｒ−１２５の発現パターン、ｌｉｎ−４ホモログの発現パターン）
ｌｅｔ−７およびｍｉｒ−１２５の両方、ｌｉｎ−４ホモログが、肺および脳における顕著な発現と共に、成人の種々の組織において発現されることを見出した。興味深いことに、それらの両方は、膵臓および精巣において低いレベルで発現される。過去の研究は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｌｉｎ−４  ｍｉＲＮＡおよびｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡが、時間的に発現されることを示している（Ｒｅｉｎｈａｒｔ，Ｂ．ら、（２０００）、４０３：９０１−９０６ならびにＦｅｉｎｂａｕｍ，Ｒ．およびＶ．Ａｍｂｒｏｓ、（１９９９）、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、２１０（ｌ）：８７−９５）。同様に、これらのｍｉＲＮＡの哺乳動物ホモログもまた、マウスの発生の間に時間的に発現されることが示されている。ノーザンブロットは、ｌｅｔ−７およびｍｉｒ−１２５が、非常に類似した発現を有することを示す。それらの両方は、約Ｅ９．５日目で発現し始めた。興味深いことに、これは、肺の器官形成の時期、および他の主要な器官が発生し始めるときとほぼ一致する。
【０１５２】
ｌｅｔ−７ｃ  ｍｉＲＮＡのマウス配列に基づくオリゴヌクレオチドを使用したインサイチュプロトコル（このヌクレオチドは、ジゴキシゲニン標識されている）が、開発された。ｌｅｔ−７ｃがＥ１２．５にて発現されることは、ノーザン分析によって確認されているので、同様の齢の胚から採取した凍結切片を、分析した。予備的な結果は、ｌｅｔ−７が、インサイチュによって胚の上皮において発現されることを示す。他の癌に加えて、これらの結果は、ｌｅｔ−７は、ｌｅｔ−７が肺細胞における天然の化合物であることに起因して肺癌治療のための治療薬として有用であることを示す。
【０１５３】
（実施例３．肺癌細胞におけるｌｅｔ−７の阻害および過剰発現の効果）
トランスフェクション（抗ｌｅｔ−７分子を用いた）を介したＡ５４９肺癌細胞におけるｌｅｔ−７機能の阻害は、Ａ５４９肺癌細胞の細胞分裂の増加を引き起こし（図１８Ａ）、一方で、ｌｅｔ−７過剰発現（トランスフェクトしたプレｌｅｔ−７による）は、Ａ５４９の細胞数の減少を引き起こした（図１８Ｂ）。これらの結果は、ｌｅｔ−７の腫瘍を抑制する活性と一致する。さらに、ｌｅｔ−７過剰発現の表現型は、ＭＹＣのダウンレギュレーションによってもたらされる表現型と共通し（図１８Ａ）、このことは、細胞増殖に対するｌｅｔ−７の効果もまた、ＭＹＣの抑制を介し得ることを示唆した。予備的証拠は、ＭＹＣがまた、ヒト細胞においてｌｅｔ−７の直接の標的であるを示す。従って、これらの結果は、ｌｅｔ−７が、ＭＹＣの異常な発現を有する癌において有力な治療薬であり得ることを示す。
【０１５４】
（実施例４．ｌｅｔ−７は、ＭＹＣおよびＢＣＬ−２の発現に影響する）
ｌｅｔ−７は、ＲＡＳタンパク質レベル、ＭＹＣタンパク質レベルおよびＢＣＬ−２タンパク質レベルを調節し、それらの３つ全ては、主要な癌のオンコジーンである。ＨｅｐＧ２細胞（ｌｅｔ−７を内因的に生成しない）に対するｌｅｔ−７の添加は、これらの３つの重要な腫瘍性タンパク質の全ての発現を減少させる（図２０、図７Ａ、および図８）。内因性ｌｅｔ−７を生成するＨｅＬａ細胞は、抗ｌｅｔ−７インヒビターによってトランスフェクトされる場合に、３つ全ての腫瘍性タンパク質の増加したレベルを発現する（図２０Ａ、図２０Ｂおよび図７Ｂ）。これらの結果は、ｌｅｔ−７がこれらの遺伝子の発現を抑制することを示す。複数のｍｉｒ−１２５相補部位およびｍｉｒ−１４３相補部位は、ヒトのＫＲＡＳ  ３’ＵＴＲおよびＢＣＬ２  ３’ＵＴＲにおいて同定されており、そしてこれらのオンコミル（ｏｎｃｏｍｉｒ）がまた、ｌｅｔ−７によって見られる様式と類似する様式でこれらのオンコジーンを調節し得ることが、予期される。この結果は、ｌｅｔ−７が、増殖経路（ＲＡＳおよびＭＹＣ）および生存経路（ＢＣＬ２）を調節する、癌経路の優れた調節因子であることを示す。ｌｅｔ−７はまた、テロメラーゼ経路（ＴＥＲＴ）および新脈管形成経路（ＶＥＧＦ）を調節することが可能である（表１）。癌は、複数の遺伝子突然変異の結果であるので、これらの結果は、癌患者に対するｌｅｔ−７の導入が、複数のオンコジーンの発現を抑制し得、そして有効な療法（事実上、１つの薬物のカクテル）を提供し得ることを示す。
【０１５５】
記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬は変動し得るので、本開示の発明は、それらに限定されないことが、理解される。本明細書中で使用される用語法は、特定の実施形態のみを記載する目的のためのものであり、そして本発明の範囲を限定することを意図しないことも理解され、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。当業者は、本明細書中に記載される発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を、認識するか、または慣用的な実験法のみを使用して確認し得る。このような等価物は、添付の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】図１は、種々の生物体由来のｌｅｔ−７  プレｍｉＲＮＡの予想される二次構造を示す。網掛けされた残基は、Ｄｉｃｅｒによって切り出される成熟ｍｉＲＮＡ転写物を示す。
【図２】図２は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｍｉＲＮＡ（ｌｅｔ−７）と、その標的ｍＲＮＡ（ｌｉｎ−４１）との間の可能なＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖の模式図である。ｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡについての機能喪失型変異の部分（ｌｅｔ−７（ｎ２８５３））は、その二重鎖の下方の矢印によって示される。
【図３】図３は、ヒトおよびマウスを含む多様な種に由来するｌｅｔ−７ホモログを示す。ｌｉｎ−４の２種のヒトホモログ、ｍｉｒ−１２５ａおよびｍｉｒ−１２５ｂが存在する。ｍｉｒ−２３７は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｌｉｎ−４ホモログである。
【図４】図４Ａ〜図４Ｄは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｌｅｔ−６０／ＲＡＳ遺伝子および哺乳動物のＲＡＳ遺伝子中の可能性のあるＬＣＳを示す。図４Ａ：Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｌｅｔ−６０／ＲＡＳ  ｍＲＮＡ  ３’ＵＴＲ、黒い矢印は、Ｃ  ｅｌｅｇａｎｓとＣ．ｂｒｉｇｇｓａｅとの間の類似性を有する部位を示し、そして白い矢印は、非類似部位を示す。ＬＣＳ（一番上）およびｍｉＲ−８４（一番下）によって形成される予想される二重鎖は、下に示され、ｌｅｔ−７およびｍｉＲ−８４は、類似するので、大部分のｌｅｔ−７部位がまた、可能性のあるｍｉＲ−８４部位である。図４Ｂ、図４Ｃ、および図４Ｄは、Ｈ．ｓ．ＮＲＡＳ  ３’ＵＴＲ、ＫＲＡＳ  ３’ＵＴＲおよびＨＲＡＳ  ｍＲＮＡ  ３’ＵＴＲｓが、それぞれ、９個、８個および３個の可能なＬＣＳを有することを示す。黒い矢印は、哺乳動物種の間（ほとんどの場合において、ヒト、ラット、マウス、ハムスターおよびモルモット）で保存される部位を示す。ＬＣＳ（一番上）およびｌｅｔ−７ａ  ｍｉＲＮＡ（一番下）によって形成される仮定された二重鎖は、下に示される。
【図５】図５Ａは、２０℃にて成長させた５つの独立した野生型トランスジェニック系から得た発現パターンの定量的分析のグラフである。少なくとも２５％の抑制が、全ての株において観察された。ＬＣＳ（ｐＦＳ  １０３１）を欠く非調節のｌｉｎ−４１  ３’ＵＴＲ（二つ組で試験された）は、コントロールとして示される。図５Ｂは、レポーター遺伝子発現のダウンレギュレーションが許容温度（１５℃）にて成長させたｌｅｔ−７（ｎ２８５３）変異体の虫において喪失することを示すグラフである。その親（Ｎ２）の系は、三つ組で試験された；４つの同遺伝子系のｌｅｔ−７（ｎ２８５３）変異体系が、試験された。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図６−１】図６Ａ〜図６Ｃは、発現データの定量化のグラフである。ｇｆｐ５４は、ｌｉｎ−３１プロモーターによって駆動される、ｇｆｐのｕｎｃ−５４  ３’ＵＴＲへの融合体である。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図６−２】図６Ａ〜図６Ｃは、発現データの定量化のグラフである。ｇｆｐ５４は、ｌｉｎ−３１プロモーターによって駆動される、ｇｆｐのｕｎｃ−５４  ３’ＵＴＲへの融合体である。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図７】図７Ａおよび図７Ｂは、ｌｅｔ−７の存在が、ヒト細胞においてＲＡＳの発現に影響することを示すグラフ。ＨＥＰＧ２細胞は、１０ｎＭおよび３０ｎＭのｌｅｔ−７またはネガティブコントロールの前駆体ｍｉＲＮＡによってトランスフェクトされた。ＮＲＡＳ、ＶＲＡＳ、およびＫＲＡＳに特異的な抗体を使用した免疫蛍光は、ｌｅｔ−７のトランスフェクト細胞がＲＡＳタンパク質のずっと低いレベルを有することを示した。図７Ａは、トランスフェクト体の複製物から得たＲＡＳ抗体の蛍光の定量化のグラフである。あるいは、ＨｅＬａ細胞は、１００ｎＭのｌｅｔ−７インヒビターまたは１００ｎＭのネガティブコントロールインヒビターによってトランスフェクトされた。ＲＡＳの免疫蛍光は、ｌｅｔ−７インヒビターによってトランスフェクトされた細胞が、ネガティブコントロールのトランスフェクト細胞と比較して、ＲＡＳタンパク質の増加したレベルを有することを示した。図７Ｂは、トランスフェクト体の複製物から得たＲＡＳ抗体の蛍光の定量化のグラフである。
【図８】図８Ａ〜図８Ｃは、ＫＲＡＳおよびＫＲＡＳの３’ＵＴＲが、ｌｅｔ−７の調節を可能にすることを示す。図８Ａは、短いＮＲＡＳ（ＮＲＡＳ  Ｓ）３’ＵＴＲ、長いＮＲＡＳ（ＮＲＡＳ  Ｌ）３’ＵＴＲおよびＫＲＡＳ  ３’ＵＴＲを示す模式図である。矢印は、ＬＣＳを示す。黒塗りの領域は、レポーターの後方にクローニングされた配列を示す。図８Ｂは、トランスフェクションのコントロール（ウミシイタケルシフェラーゼ）に対して正規化された、ホタルルシフェラーゼ発現の相対的抑制のグラフである。ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔは、空ベクターである。図８Ｃは、ＫＲＡＳおよびＮＲＡＳに対応する３’ＵＴＲドメインを有するレポータープラスミドがｌｅｔ−７のインヒビターによって同時トランスフェクトされる場合に、コントロールインヒビターと比較した、ホタルルシフェラーゼ発現の誘導のグラフである。
【図９】図９Ａは、付随する隣接正常組織（ＮＡＴ）と比較した、２１種の乳房、結腸、および肺の腫瘍におけるｌｅｔ−７の発現のグラフである。蛍光標識したｍｉＲＮＡは、ｌｅｔ−７ａおよびｌｅｔ−７ｃに特異的なプローブを含んだマイクロアレイにハイブリダイズされた。腫瘍およびＮＡＴについての蛍光強度は、全てのエレメントについての合計の蛍光シグナルによって正規化された。腫瘍サンプルおよび隣接正常サンプルにおけるｌｅｔ−７プローブからの相対的な平均シグナルを、対数比として表す。図９Ｂは、３つの肺の有棘細胞癌由来の腫瘍組織サンプルおよび隣接組織サンプルにおける、ＲＡＳタンパク質とｌｅｔ−７ｃ発現との間の相関関係のグラフである。ＧＡＰＤＨタンパク質およびＲＡＳタンパク質は、ウェスタン分析を使用して、腫瘍組織および隣接正常組織の粗抽出物から測定された。上記２つのタンパク質は、検出のために使用される抗体を混合することによって同時に評価された。小さいＲＮＡのノーザンブロットは、ｌｅｔ−７ｃおよびＵ６  ｓｎＲＮＡに特異的な放射標識プローブを用いて連続的にアッセイされた。ｉｎ  ｔｈｅ腫瘍組織サンプルおよび隣接組織サンプル中のＮＲＡＳ  ｍＲＮＡは、リアルタイムＰＣＲによって測定された。リアルタイムデータは、種々のサンプルにおける１８Ｓ  ｒＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ検出に基づいて正規化された。隣接正常組織におけるＮＲＡＳの相対的な発現は、１００％として採用され、そして腫瘍サンプル中のＮＲＡＳのＣｔ値は、腫瘍サンプルにおけるＮＲＡＳの相対的な発現を割り当てるために使用された。
【図１０】図１０Ａは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるｌｅｔ−７ファミリーのｍｉＲＮＡの配列比較である。図１０Ｂは、ｌｅｔ−７ファミリーメンバーのデンドログラムである。
【図１１】図１１は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｍＲＮＡにおけるｌｅｔ−６０／ＲＡＳ中の可能であるＬＣＳを示す。
【図１２】図１２は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｌｅｔ−６０／ＲＡＳ  ｍＲＮＡ（一番上）およびＣ．ｂｒｉｇｇｓａｅのｌｅｔ−６０／ＲＡＳ  ｍＲＮＡ（一番下）の配列アライメントである（コンセンサス配列は、中段に示される）。ＬＣＳは、黒枠として示される。
【図１３−１】図１３Ａ〜図１３Ｃは、Ｌｅｔ−６０が、ヒトＨＲＡＳタンパク質、ヒトＫＲＡＳタンパク質、およびヒトＮＲＡＳタンパク質の、オルソログであることを示す。図１３Ａは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＬＥＴ−６０と、ヒトおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ由来の他のＲＡＳタンパク質ならびにＲＡＳ関連タンパク質との配列アライメントである。図１３Ｂは、他のＲＡＳ関連タンパク質に対するＬＥＴ−６０の相関関係を示すデンドログラムである。図１３Ｃは、ｌｅｔ−６０（ｇｆ）対立遺伝子の部分的な抑制の定量化を示すグラフである。ｏ８４−Ｘは、ｍｉｒ−８４を過剰発現する系であり、そしてＴＯＰＯ−Ｘは、空ベクターのコントロールを有する系である。３つの実験系およびコントロール系の各々の平均が、示される。
【図１３−２】図１３Ａ〜図１３Ｃは、Ｌｅｔ−６０が、ヒトＨＲＡＳタンパク質、ヒトＫＲＡＳタンパク質、およびヒトＮＲＡＳタンパク質の、オルソログであることを示す。図１３Ａは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＬＥＴ−６０と、ヒトおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ由来の他のＲＡＳタンパク質ならびにＲＡＳ関連タンパク質との配列アライメントである。図１３Ｂは、他のＲＡＳ関連タンパク質に対するＬＥＴ−６０の相関関係を示すデンドログラムである。図１３Ｃは、ｌｅｔ−６０（ｇｆ）対立遺伝子の部分的な抑制の定量化を示すグラフである。ｏ８４−Ｘは、ｍｉｒ−８４を過剰発現する系であり、そしてＴＯＰＯ−Ｘは、空ベクターのコントロールを有する系である。３つの実験系およびコントロール系の各々の平均が、示される。
【図１４−１】図１４は、げっ歯類およびヒトのＮＪＲＡＳ  ３’ＵＴＲ由来の部分配列の配列アライメントである。このアライメント中に示されるＬＣＳは、黒色で囲まれる。
【図１４−２】図１４は、げっ歯類およびヒトのＮＪＲＡＳ  ３’ＵＴＲ由来の部分配列の配列アライメントである。このアライメント中に示されるＬＣＳは、黒色で囲まれる。
【図１４−３】図１４は、げっ歯類およびヒトのＮＪＲＡＳ  ３’ＵＴＲ由来の部分配列の配列アライメントである。このアライメント中に示されるＬＣＳは、黒色で囲まれる。
【図１４−４】図１４は、げっ歯類およびヒトのＮＪＲＡＳ  ３’ＵＴＲ由来の部分配列の配列アライメントである。このアライメント中に示されるＬＣＳは、黒色で囲まれる。
【図１４−５】図１４は、げっ歯類およびヒトのＮＪＲＡＳ  ３’ＵＴＲ由来の部分配列の配列アライメントである。このアライメント中に示されるＬＣＳは、黒色で囲まれる。
【図１５】図１５は、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓのＮＲＡＳ  ３’ＵＴＲおよびＤａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏのＮＲＡＳ  ３’ＵＴＲによって形成される、可能性のあるｌｅｔ−７：：ＬＣＳ二重鎖を示す。
【図１６】図１６Ａおよび図１６Ｂは、ｌｅｔ−７の存在が、ヒト細胞において、コントロールタンパク質の発現に影響しないことを示す。図１６Ａは、ＧＡＰＤＨまたはｐ２１に特異的な抗体を使用する、ｌｅｔ−７  ｓｉＲＮＡまたはネガティブコントロールｓｉＲＮＡによってトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞の複製物から得た抗体の蛍光の定量化のグラフである。図１６Ｂは、ＮＲＡＳ  ｓｉＲＮＡのトランスフェクト体およびネガティブコントロールｓｉＲＮＡのトランスフェクト体の両方についての、５０個〜１００個の細胞の単一の視野から得た蛍光シグナルの定量化のグラフである。
【図１７】図１７は、付随する隣接正常組織（ＮＡＴ）と比較した、肺腫瘍におけるｌｅｔ−７ｃおよびｌｅｔ−７ｇの発現のグラフである。
【図１８−１】図１８Ａは、コントロールのトランスフェクションおよびコントロール抗ｍｉＲＮＡ（ｍｉｒ−１９ａ）と比較してＡ５４９の細胞数の１００％の増加を生じるｌｅｔ−７の阻害のグラフである。図１８Ｂは、コントロールのｍｉＲＮＡ（ＮＣ）と比較したＡ５４９の細胞数の減少をもたらす余分なｌｅｔ−７のグラフである。
【図１８−２】図１８Ａは、コントロールのトランスフェクションおよびコントロール抗ｍｉＲＮＡ（ｍｉｒ−１９ａ）と比較してＡ５４９の細胞数の１００％の増加を生じるｌｅｔ−７の阻害のグラフである。図１８Ｂは、コントロールのｍｉＲＮＡ（ＮＣ）と比較したＡ５４９の細胞数の減少をもたらす余分なｌｅｔ−７のグラフである。
【図１９】図１９は、ヒトＭＹＣおよび他の脊椎動物の３’ＵＴＲ、ならびにｌｅｔ−７とヒトＭＹＣとの間の可能性のある二重鎖における、可能性のあるｌｅｔ−７相補部位（囲まれる）を示す。
【図２０】図２０Ａは、外因性ｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡによって処理した細胞におけるＭＹＣおよびＢＣＬ−２タンパク質の減少した発現の、スクランブルｌｅｔ−７配列を有するコントロールｍｉＲＮＡと比較したグラフである。図２０Ｂは、抗ｌｅｔ−７分子によってトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞における、ＭＹＣおよびＢＣＬ−２の増加した発現のグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３Ａ】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年6月13日(2007.6.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一種以上のオンコジーンの発現を阻害するための組成物であって、以下：
ｍｉＲＮＡを含み、該ｍｉＲＮＡは、生物体の細胞中のオンコジーンに結合し、そして該オンコジーンの発現を阻害する、組成物。
【請求項２】
上記ｍｉＲＮＡは、プリｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡ、およびそれらのフラグメントまたはそれらの改変体からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ｍｉＲＮＡは、核酸によってコードされる、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
上記核酸は、ベクター上に配置される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
上記ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージミド、ウイルス、およびウイルスの供給源または細菌の供給源に由来する他のビヒクルからなる群により選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ベクターは、１つ以上のインビボ発現エレメントをさらに含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記インビボ発現エレメントは、プロモーター、エンハンサー、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ｍｉＲＮＡは、２１ヌクレオチド長〜１７０ヌクレオチド長である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ｍｉＲＮＡは、２１ヌクレオチド長〜２５ヌクレオチド長である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ｍｉＲＮＡは、癌の処置もしくは予防のために患者に投与されるか、または該ｍｉＲＮＡは、癌の処置もしくは予防のために発現が、該患者の細胞において増加される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記癌は、肺癌、膵臓癌、皮膚癌、血液学的新生物、乳癌、脳の癌、結腸癌、濾胞性リンパ腫、膀胱癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭部および頚部の癌、多発性骨髄腫、肝臓癌、リンパ腫、口腔癌、骨肉腫、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、および甲状腺癌からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記オンコジーンは、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ２Ｌ２、ＴＥＲＴ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ３、ＧＲＢ２、ＲＡＦ１、ＡＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ３、ＭＥＴ、ＫＩＴ、ＴＰ７３Ｌ（ＡＩＸ）、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＭＤＭ２、ＦＥＳ、ＦＵＲＴＮ、ＩＮＳＬ３、ＣＳＦＩＲ、ＭＹＢＬ２、ＭＹＢ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＩＫ３Ｃ２Ｂ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＩＫ３Ｒ５、ＡＫＴ１、ＨＬＩＮ−４１、ＶＤＲ、ＰＸＲ、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＡＳＨ１Ｌ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＧＲ、ＧＬＩ２、１４−３−３ζ、ＭＯ２５、ＳＭＧ１、ＦＲＡＰ１、ＰＥＲ２およびＡＫＴ３からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
上記ｍｉＲＮＡは、ｅｏｒ−１、ｈａｄ−１、ｌｅｔ−６０、ｌｉｎ−３、ｌｉｎ−９、ｌｉｎ−１１、ｌｉｎ−３６、ｌｉｎ−３９、ｌｉｎ−４５、ｍｐｋ−１、およびｓｅｍ−５からなる群より選択されるオンコジーン上の部位に結合する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
上記患者は、外科手術、化学療法、放射線療法、温熱療法、免疫療法、ホルモン療法、およびレーザー療法からなる群より選択される１つ以上の癌療法を受容する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
上記生物体は、ヒトである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
ｍｉＲＮＡに対する癌の感受性を決定するための組成物であって、ｍｉＲＮＡを含み、該ｍｉＲＮＡは、該癌性細胞もしくは形質転換細胞または癌性細胞もしくは形質転換細胞を有する生物体中のオンコジーンに結合し、癌性細胞もしくは形質転換細胞の増殖または生存の阻害が該オンコジーンの阻害された発現によって決定することができる、組成物。
【請求項１７】
１種以上のオンコジーンの発現を阻害するための治療的組成物であって、該組成物は、生物体中の形質転換細胞または癌性細胞におけるオンコジーンの発現に結合し、そして該オンコジーンの発現を阻害するに有効な量のｍｉＲＮＡ、および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、組成物。
【請求項１８】
上記ｍｉＲＮＡは、プリｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡ、およびそれらのフラグメントまたはそれらの改変体からなる群より選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
上記ｍｉＲＮＡは、プラスミド、コスミド、ファージミド、ウイルス、および他のウイルスの供給源または細菌の供給源からなる群より選択されるベクター上に配置される核酸によってコードされ、該核酸は、プロモーター、エンハンサー、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される一種以上のインビボ発現エレメントを含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ｍｉＲＮＡは、２１ヌクレオチド長〜１７０ヌクレオチド長である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ｍｉＲＮＡは、２１ヌクレオチド長〜２５ヌクレオチド長である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記癌は、肺癌、膵臓癌、皮膚癌、血液学的新生物、乳癌、脳の癌、結腸癌、濾胞性リンパ腫、膀胱癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭部および頚部の癌、多発性骨髄腫、肝臓癌、リンパ腫、口腔癌、骨肉腫、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、および甲状腺癌からなる群より選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２３】
上記オンコジーンは、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ２Ｌ２、ＴＥＲＴ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ３、ＧＲＢ２、ＲＡＦ１、ＡＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ３、ＭＥＴ、ＫＩＴ、ＴＰ７３Ｌ（ＡＩＸ）、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＭＤＭ２、ＦＥＳ、ＦＵＲＴＮ、ＩＮＳＬ３、ＣＳＦＩＲ、ＭＹＢＬ２、ＭＹＢ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＩＫ３Ｃ２Ｂ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＩＫ３Ｒ５、ＡＫＴ１、ＨＬＩＮ−４１、ＶＤＲ、ＰＸＲ、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＡＳＨ１Ｌ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＧＲ、ＧＬＩ２、１４−３−３ζ、ＭＯ２５、ＳＭＧ１、ＦＲＡＰ１、ＰＥＲ２およびＡＫＴ３からなる群より選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２４】
上記ｍｉＲＮＡは、ｅｏｒ−１、ｈａｄ−１、ｌｅｔ−６０、ｌｉｎ−３、ｌｉｎ−９、ｌｉｎ−１１、ｌｉｎ−３６、ｌｉｎ−３９、ｌｉｎ−４５、ｍｐｋ−１、およびｓｅｍ−５からなる群より選択されるオンコジーン上の部位に結合する、請求項２３に記載の組成物。
【国際調査報告】
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2008511678.tif 000037
2008511678.tif 000038
2008511678.tif 000039
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