(57)【要約】  本発明は、Ｌ−スレオニン生産菌株でＬ−メチオニンの生合成に関与するタンパク質を過発現させ、Ｌ−メチオニン生産菌株を製造する方法、この方法で製造された菌株、及びこの菌株を用いてＬ−メチオニンを生産する方法を開示する。
2008504048.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−スレオニン生産菌株を、スレオニンデヒドラターゼ、Ｏ−サクシニルホモセリンリアーゼ、シスタチオニンベータリアーゼ、５，１０−メチレンテトラヒドロホレートレダクターゼ及びセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの中から選択された２個〜５個のタンパク質を発現する組み換えベクターで形質転換させることを特徴とする、Ｌ−メチオニン生産菌株を製造する方法。
【請求項２】
Ｏ−サクシニルホモセリンリアーゼと、シスタチオニンベータリアーゼ及びスレオニンデヒドラターゼの中から選択されたいずれか一つ又は２つとを発現する組み換えベクターでＬ−スレオニン生産菌株を形質転換させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
５，１０−メチレンテトラヒドロホレートレダクターゼ及びセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを発現する組み換えベクターでＬ−スレオニン生産菌株を形質転換させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｌ−スレオニン生産菌株を、Ｏ−サクシニルホモセリンリアーゼとシスタチオニンベータリアーゼ及びスレオニンデヒドラターゼの中から選択されたいずれか一つ又は２つとを発現する組み換えベクター、及び５，１０−メチレンテトラヒドロホレートレダクターゼとセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを発現する組み換えベクターで共同−形質転換させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｌ−スレオニン生産菌株がＬ−メチオニン非要求性であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
Ｌ−メチオニン非要求性のＬ−スレオニン生産菌株がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＦ００１（ＫＣＣＭ−１０５６８）であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法で製造されたＬ−メチオニン生産菌株。
【請求項８】
Ｌ−メチオニン生産Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＦ００１（ＫＣＣＭ−１０５６８）菌株。
【請求項９】
請求項７に記載のＬ−メチオニン生産菌株を培養することを特徴とする、Ｌ−メチオニンを生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、Ｌ−メチオニンの生産に係り、具体的には、Ｌ−スレオニン生産菌株でＬ−メチオニンの生合成に関与するタンパク質を過発現させ、Ｌ−メチオニン生産菌株を製造する方法、この方法で製造された菌株、及びこの菌株を用いてＬ−メチオニンを生産する方法に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
メチオニンは、生体内の必須アミノ酸の一種であって、飼料及び食品添加剤として広く用いられるうえ、薬液及び医薬品の合成原料などとしても用いられる。メチオニンは、例えばコリン（レシチン）やクレアチンなどの化合物の前駆体として作用し、システインとタウリンの合成原料としても使われる。また、メチオニンは、硫黄を提供する役割も果たす。Ｓ−アデノシル−メチオニンは、Ｌ−メチオニンに由来し、生体内でメチル基を提供する役割を果たし、脳の各種神経伝達物質(neurotransmitter)の合成に関与している。メチオニン及び／又はＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）は、生体内で肝と動脈の脂肪蓄積を抑制し、憂鬱、炎症、肝疾患及び筋肉痛を緩和するなどの様々な役割を果たす。
【０００３】
これまで知られているメチオニン及び／又はＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの生体内役割は、次の通りである。
【０００４】
１）脂肪代謝を促進する肝と動脈の脂肪沈着を抑制し、脳、心臓及び腎臓の血流を増進させる役割を果たす(J Hepatol. Jeon BR et al., 2001 Mar; 34(3): 395-401)。
【０００５】
２）消化を促進し、毒性物質の解毒及び排泄を促進するうえ、鉛などの重金属の排泄を促進する。
【０００６】
３）メチオニンは毎日１日付き８００〜１，６００ｍｍｇの投与によって優れた抗憂鬱作用をすると知られている(Am J Clin Nutr. Mischoulon D. et al., 2002 Nov; 76(5): 1158S-61S)。
【０００７】
４）肝疾患における肝機能の向上作用をする(FASEB J. Mato JM., 2002 Jan; 16(1): 15-26)。特に、アルコールによる肝疾患に効果的である(Cochrane Database Syst Rev., Rambaldi A., 2001; (4): CD002235)。
【０００８】
５）骨関節疾患に対する抗炎効果が優れるうえ、関節の回復を促進する(ACP J Club. Sander O., 2003 Jan-Feb; 138(1): 21, J Fam Pract., Soeken KL et al., 2002 May; 51(5): 425-30)。
【０００９】
６）メチオニンは毛髪の必須栄養素である。壊れやすい毛髪に栄養を供給し、脱毛を防止する(Audiol Neurootol., Lockwood DS et al., 2000 Sep-Oct; 5(5): 263-266)。
【００１０】
前述したように、メチオニンを、動物飼料を始めとした食品と医薬品に用いるためには、化学合成と生物学的合成によって生産することができる。
【００１１】
化学合成は、主に、５−（β−メチルメルカプトエチル）ヒダントイン(5-(β-methylmercaptoethyl)-hydantoin)を加水分解させる反応によってＬ−メチオニンを生産する。ところが、このような化学合成によって生産されたメチオニンは、Ｌ型とＤ型とが混合された形であるという欠点がある。
【００１２】
生物学的工程は、メチオニンの生成に関与するタンパク質を用いる方法である。Ｌ−メチオニンの生合成は、ｍｅｔＡ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｍｅｔＥ、ｍｅｔＨ遺伝子から発現する酵素タンパク質の作用によってホモセリンからメチオニンに変換することにより達成される。具体的に、ｍｅｔＡは、メチオニン生合成の第１酵素であるホモセリンアセチルトランスフェラーゼ(homoserine acetyltransferase)をコードする遺伝子であって、ホモセリンをＯ−サクシニル−Ｌ−ホモセリンに変換する機能をする。ｍｅｔＢによってコードされるＯ−サクシニルホモセリンリアーゼ(O-succinylhomoserine lyase)酵素は、Ｏ−サクシニル−Ｌ−ホモセリンをシスタチオニン(cystathionine)に変換する機能をする。ｍｅｔＣによってコードされるシスタチオニンベータリアーゼ(cystathionine beta lyase)酵素は、シスタチオニンをＬ−ホモシステインに変換する機能をする。ｍｅｔＥによってコードされるコバラミン非依存性メチオニンシンターゼ、及びｍｅｔＨによってコードされるコバラミン依存性メチオニンシンターゼは、Ｌ−ホモシステインをＬ−メチオニンに変換させる。この際、ｍｅｔＦによってコードされる５，１０−メチレンテトラヒドロホレートレダクターゼ(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase)と、ｇｌｙＡによってコードされるセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(serine hydroxymethytransferase)は、共に作用し、Ｌ−メチオニンの合成に必要なメチル基を提供するＮ（５）−メチルテトラヒドロホレート(N(5)-methyltetrahydrofolate)を合成する機能をする。
【００１３】
Ｌ−メチオニンは、前記酵素による一連の有機的な反応によって合成される。前記タンパク質と、前記タンパク質に影響を与えるタンパク質に遺伝的な操作を加える場合、Ｌ−メチオニンの合成及びその調節に有用に利用できる。例えば、日本特開２０００−１３９４７１号には、エシェリキア(Escherichia)属に属し、ゲノム遺伝子上のｔｈｒＢＣ、ｍｅｔＪを除去し、ｍｅｔＢＬを過発現し、ｍｅｔＫをリーキ型に製作してＬ−メチオニンを生産する方法が開示されている。また、米国特許出願公開ＵＳ２００３／００９２０２６Ａｌ号には、コリネバクテリウム(Corynerbacterium)属に属し、Ｌ−メチオニン合成の阻害因子であるｍｅｔＤ遺伝子を除去した微生物を用いる方法が開示されている。米国特許出願公開ＵＳ２００２／００４９３０５号には、５，１０−メチレンテトラヒドロホレートレダクターゼ（ｍｅｔＦ）の発現を増加させてＬ−メチオニンの生産を増加させる方法が開示されている。
【００１４】
このような生物学的工程によって生産されるメチオニンは、Ｌ型であるという利点があるが、その量が極めて微量である。生物学的工程によるＬ−メチオニンを始めとしたＬ−アミノ酸の生産量を、発酵学的工程、栄養培地の組成及びクロマトグラフィーなどの分離工程の改善によって増加させようとしたが、これのみでは根本的な改善ははかれない。
【００１５】
また、メチオニンが一定の水準以上に合成されると、最終産物であるメチオニンが、メチオニンの合成を開始する初期タンパク質ｍｅｔＡ遺伝子の転写をフィードバックで抑制する。ｍｅｔＡ遺伝子は、転写段階ではメチオニンによって阻害を受け、解毒段階では細胞内のタンパク質分解酵素によって分解されるメカニズムでメチオニンの量を調節するので、ｍｅｔＡ遺伝子の高発現のみではメチオニンの量を一定の水準以上に増加させることができない(Dvora Biran, Eyal Gur, Leora Gollan and Eliora Z. Ron: Control of methionine biosynthesis in Escherichia coli by proteolysis: Molecular Microbiology (2000) 37(6), 1436-1443)。
【００１６】
かかる問題点を克服するために、本発明者らは、ｍｅｔＢ遺伝子によってコードされるＯ−サクシニルホモセリンリアーゼ酵素が、メチオニンの生合成でＯ−サクシニル−Ｌ−ホモセリンをシスタチオンに変換する機能の他にも、スレオニンの分解産物である２−オキソブタノエートを基質として用いてメチオニン生合成の中間体であるＯ−サクシニル−Ｌ−ホモセリンを合成することができるという報告(Markus C. Wahl et al., FEBS Letters, Volume 414, Issue 3, 15 September 1997, Pages 492-496, Hiroshi Kanzaki et al., FEMS Microbiology Letters, Volume 33, Issue 1, January 1986, Pages 65-68)に着目して、Ｌ−スレオニン高生産菌株を用いてＬ−メチオニンを生産しようとし、且つ前記Ｌ−スレオニン高生産菌株に由来した、メチオニン非要求性菌株でスレオニンデヒドラターゼ、Ｏ−サクニシルホモセリンリアーゼ、シスタチオニンベータリアーゼを過発現した。その結果、ｍｅｔＡタンパク質を用いた従来の方法に比べて、高濃度のメチオニンの下でもその合成が阻害されないながらメチオニンを高収率で生産することができた。
【００１７】
また、Ｌ−スレオニン高生産菌株において、メチオニン生合成経路上でメチル基の供与に関与するタンパク質である５，１０−メチレンテトラヒドロホレートレダクターゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを同時発現させた結果、メチオニン要求性が解除され、Ｌ−スレオニン高生産菌株に由来した、メチオニン非要求性菌株でｇｌｙＡ及びｍｅｔＦ遺伝子を過発現させてメチオニンを高収率で生産することができた。
【００１８】
ひいては、Ｌ−メチオニンの生合成過程に関与する遺伝子とメチル基の提供に関与する遺伝子とを共に適用した結果、メチオニンをより高い収率で生産することができた。
【００１９】
〔発明の開示〕
本発明の目的は、スレオニンデヒドラターゼ、Ｏ−サクシニルホモセリンリアーゼ、シスタチオニンベータリアーゼ、５，１０−メチレンテトラヒドロホレートレダクターゼ、及びセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの中から選択された２個〜５個のタンパク質を発現する組み換えベクターでＬ−スレオニン生産菌株を形質転換させ、高収率でＬ−メチオニンを生産するＬ−メチオニン生産菌株を製造する方法を提供することにある。
【００２０】
本発明の他の目的は、前記方法によって製造された菌株を提供することにある。
【００２１】
本発明の別の目的は、前記菌株を用いてＬ−メチオニンを生産する方法を提供することにある。
【００２２】
〔図面の簡単な説明〕
図１は本発明の詳細図である。
【００２３】
図２はメチオニン含有及び非含有培地における、突然変異によってメチオニン要求性が解除されたＣＪＭ００２菌株、メチオニン要求性菌株であるＴＦ４０７６がｇｌｙＡ−ｍｅｔＦで形質転換されてメチオニン要求性が解除された培養結果を示す写真である。
【００２４】
図３はｔｄｃＢ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ遺伝子をｔｄｃＢ−ｍｅｔＢ、ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢＣオペロンの形で製作したプラスミドｐＳＥ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢ、ｐＳＥ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢＣ、ｐＣＬ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢとオペロン製作の際に鋳型として用いられたプラスミドｐＳＥｔｄｃＢ、ｐＳＥｍｅｔＢ、ｐＳＥｍｅｔＣである。
【００２５】
図４はｉｌｖＢ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ遺伝子をオペロンの形で製作したプラスミドｐＳＥ ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢ、ｐＳＥ ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢＣと、オペロン製作の際に鋳型として用いられたプラスミドｐＳＥｉｌｖＡである。
【００２６】
図５はｇｌｙＡ、ｍｅｔＦ遺伝子をｇｌｙＡ−ｍｅｔＦオペロンの形で製作したプラスミドｐＳＥ ｇｌｙＡ−ｍｅｔＦと、オペロン製作の際に鋳型として用いられたプラスミドｐＳＥｇｌｙＡ、ｐＳＥｍｅｔＦである。
【００２７】
〔発明を実施するための最良の様態〕
一つの様態として、本発明は、スレオニンデヒドラターゼ、Ｏ−サクシニルホモセリンリアーゼ、シスタチオニンベータリアーゼ、５，１０−メチレンテトラヒドロホレートレダクターゼ及びセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの中から選択された２個〜５個のタンパク質を発現する組み換えベクターでＬ−スレオニン生産菌株を形質転換させることを特徴とする、Ｌ−メチオニン生産菌株を製造する方法を提供する。
【００２８】
一つの好ましい様態において、本発明は、Ｌ−スレオニン生産菌株を、Ｏ−サクシニルホモセリンリアーゼと、シスタチオニンベータリアーゼ及びスレオニンデヒドラターゼの中から選択されたいずれか一つ又は２つとを過発現する組み換えベクターで形質転換させ、Ｌ−メチオニンを高収率で生産する菌株を製造する。
【００２９】
具体的な様態において、本発明は、Ｌ−スレオニン生産菌株でスレオニンデヒドラターゼとＯ−サクシニルホモセリンリアーゼを過発現させるか、或いはＬ−スレオニン生産菌株でＯ−サクシニルホモセリンリアーゼとシスタチオニンベータリアーゼを過発現させるか、或いはＬ−スレオニン生産菌株でスレオニンデヒドラターゼとＯ−サクシニルホモセリンリアーゼとシスタチオニンベータリアーゼを過発現させ、Ｌ−メチオニンを高収率で生産する菌株を提供する。
【００３０】
本願において、スレオニンデヒドラターゼは、下記反応式に示したように、スレオニンを２−オキソブタノエートに分解する活性を有し、このような活性を有する遺伝子は、ｔｄｃＢ(Datta P, Goss TJ, Omnaas JR, Patil RV (1987), Proc Natl Acad Sci U S A 1987; 84(2); 393-7)、ｉｌｖＡ(Lawther RP, Wek RC, Lopes JM, Pereira R, Taillon BE, Hatfield GW (1987)), Nucleic Acids Res 1987; 15(5); 2137-55)、ｓｄａＡ、Ｂがある。
【００３１】
Ｌ−スレオニン ＋ Ｈ2Ｏ ⇔ ２−オキソブタノエート ＋ Ｈ2Ｏ ＋ ＮＨ3
Ｏ−サクシニルホモセリンリアーゼは、下記反応式に示すように、Ｏ−サクシニル−Ｌ−ホモセリンからシスタチオニンを合成する活性、及び２−オキソブタノエート（２−ケト酪酸塩、２−オキソ酪酸、α−オキソ酪酸、α−ケト酪酸塩、α−ケト酪酸、２−オキソ−酪酸塩、２−ケト−酪酸塩、２−ケト酪酸）からＯ−サクシニル−Ｌ−ホモセリンを合成する活性を有し(Clausen T, Huber R, Prade L, Wahl MC, Messerschmidt A, EMBO J. 1998 Dec 1; 17(23): 6827-38)、このような活性を有する遺伝子は、ｍｅｔＢ(Martel A, Bouthier de la Tour C, Le Goffic F (1987), Biochem Biophys Tes Commun 1987; 147(2); 565-71)などがある。
【００３２】
Ｌ−システイン ＋ Ｏ−サクシニル−Ｌ−ホモセリン ⇔ サクシネート ＋ シスタチオニン
２−オキソブタノエート ＋ サクシネート ＋ ＮＨ3 ⇔ Ｏ−サクシニル−Ｌ−ホモセリン ＋ Ｈ2Ｏ
シスタチオニンベータリアーゼは、下記反応式に示したように、Ｏ−サクシニルホモセリンリアーゼによって合成されたシスタチオニンをホモシステインに代謝する活性を有し、このような活性を有する遺伝子は、ｍｅｔＣ(Dwivedi CM, Ragin RC, Uren JR (1982). Biochemistry 1982; 21(13); 3064-9. PMID: 7049234)などがある。
【００３３】
シスタチオニン ＋ Ｈ2Ｏ ⇔ ピルビン酸塩 ＋ ＮＨ3 ＋ ホモシステイン
前述したような活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにクローニングされており、文献(Blattner et. al., Science 277: 1453-1462 (1997))に開示されたＥ．ｃｏｌｉのゲノム配列から得ることができる（受託番号ＡＡＣ７５８７６）。また、前記遺伝子配列は、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）及び日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）などのデータベースからも得ることができる。
【００３４】
生物学的に同等な活性を示すタンパク質を発現することができる限りは、前述したような遺伝子の断片及び前記遺伝子の変形体も本発明に使用することができる。
【００３５】
前述した方法において、それぞれの酵素タンパク質の過発現は、これらをコードする遺伝子（例えば、ｔｄｃＢ、ｉｌｖＡ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ）を含む組み換えベクターによって達成される。このような組み換えベクターは、ｐＳＥ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢ、ｐＣＬ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢ、ｐＳＥ ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢ、ｐＣＬ ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢ、ｐＳＥ ｍｅｔＢ−ｍｅｔＣ、ｐＣＬ ｍｅｔＢ−ｍｅｔＣ、ｐＳＥ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢＣ、ｐＳＥ ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢＣ、ｐＣＬ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢＣ、ｐＣＬ ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢＣ等を含む。
【００３６】
前述した組み換えベクターでＬ−スレオニン生産菌株を形質転換させてＬ−メチオニン生産菌株を製造することができる。
【００３７】
本発明において、「Ｌ−スレオニン生産菌株」とは、Ｌ−スレオニンを生物体内で生産することが可能な原核及び真核微生物菌株をいう。例えば、Ｌ−スレオニンを生産するエシェリキア(Escherichia)属、エルヴィニア(Erwinia)属、セラシア(Serratia)属、プロビデンシア(Providencia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属及びブレビバクテリウム(Brevibacterium)属に属する微生物菌株が含まれる。好ましくは、エシェリキア(Escherichia)属に属する微生物菌株、より好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉがＬ−メチオニンの生産に使用される。
【００３８】
また、Ｌ−スレオニン生産菌株は、天然微生物菌株だけでなく、変異微生物も含む。このような変異微生物の例には、イソロイシンリーキ型要求性、Ｌ−リジン類似体に対する耐性及びα−アミノ酪酸耐性を持つ微生物；内在的ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）遺伝子がゲノム含有遺伝子の他にさらに１コピー以上染色体ＤＮＡの中に挿入された変異微生物；Ｌ−メチオニン生合成中間体であるオキサロ酢酸（ＯＡＡ）をホスホエノールピルビン酸塩（ＰＥＰ）に転換するのに関与するｐｃｋＡ遺伝子が不活性化された微生物；Ｌ−メチオニンの生合成に関与するｔｙｒＢ遺伝子の発現を抑制するｔｙｒＲ遺伝子が不活性化された微生物；及び糖の伝達に関連したｇａｌＰ遺伝子の発現を抑制するｇａｌＲ遺伝子が不活性化された微生物が含まれる。前記Ｌ−リジン類似体は、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン及びδ−メチル−Ｌ−リジンよりなる群から選択される少なくとも一つの化合物であリ得る。本発明の具体例では、Ｌ−スレオニンを生産するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ変異菌株ＴＦ４０７６（ＫＦＣＣ １０７１８、韓国特許公告第９２−８３６５号）を変異させた、Ｌ−スレオニン生産及びＬ−メチオニン非要求性のＣＪＭ００２を使用した。ＴＦ４０７６は、メチオニン要求性、メチオニン類似体（例えばα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸、ＡＨＶ）に対する耐性、リジン類似体（例えば、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン、ＡＥＣ）に対する耐性、イソロイシン類似体（例えば、α−アミノ酪酸）に対する耐性、メチオニンの類似体（例えば、エチオニン）に対する耐性などの特性を持っている。
【００３９】
別の好ましい様態において、本発明は、Ｌ−スレオニン生産菌株を、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼと５，１０−メチレンテトラヒドロホレートレダクターゼを過発現する組み換えベクターで形質転換させ、Ｌ−メチオニンを高収率で生産する菌株を製造する。
【００４０】
本願において、前記５，１０−メチレンテトラヒドロホレートレダクターゼとセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼは、下記反応式に示したように、ｍｅｔＨタンパク質が、ホモシステインからメチオニンへの合成の際にホモシステインにメチル基を伝達する活性に関与しており(Sheppard CA, Trimmer EE, Matthews RG (1999), J Bacteriol 1999; 181(3); 718-25., Shostak K, Schirch V (1988), Biochemistry 1988; 27(21); 8007-14)、５，１０−メチレンテトラヒドロホレートレダクターゼの遺伝子は、ｍｅｔＦ(Saint-Girons I, Duchange N, Zakin MM, Park I, Margarita D, Ferrara P, Cohen GN (1983), Nucleic Acids Res 1983; 11(19)などがあり、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの遺伝子は、ｇｌｙＡ(Plamann MD, Stauffer LT, Urbanowski ML, Stauffer GV (1983), Nucleic Acids Res 1983; 11(7); 2065-75)などがある。
【００４１】
ＮＡＤＨ ＋ ５，１０−メチル−ＴＨＦ ⇔ ＮＡＤ ＋ ５−メチル−ＴＨＦ
Ｌ−セリン ＋ ＴＨＦ ⇔ ５，１０−メチル−ＴＨＦ ＋ グリシン ＋ Ｈ2Ｏ
前述したような活性を持つタンパク質をコードする遺伝子は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにクローニングされており、文献(Blattner et. al., Science 277: 1453-1462 (1997))に開示されたＥ．ｃｏｌｉのゲノム配列から得ることができる（受託番号ＡＡＣ７５８７６）。また、前記遺伝子配列は、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）及び日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）などのデータベースからも得ることができる。
【００４２】
生物学的に同等な活性を示すタンパク質を発現することができる限りは、前述したような遺伝子の断片及び前記遺伝子の変形体も本発明に使用することができる。
【００４３】
前述した方法において、それぞれの酵素タンパク質の過発現は、これらをコードする遺伝子（例えば、ｇｌｙＡ、ｍｅｔＦ）を含む組み換えベクターによって達成される。このような組み換えベクターは、好ましくはｐＳＥ ｇｌｙＡ−ｍｅｔＦ、ｐＣＬ ｇｌｙＡ−ｍｅｔＦなどを含む。
【００４４】
前記組み換えベクターでＬ−スレオニン生産菌株を形質転換させてＬ−メチオニン生産菌株を製造することができる。
【００４５】
別の好ましい様態において、本発明は、Ｌ−スレオニン生産菌株を、スレオニンデヒドラターゼ、Ｏ−サクシニルホモセリンリアーゼ、シスタチオニンベータリアーゼ、５，１０−メチレンテトラヒドロホレートレダクターゼ、及びセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの中から選択された２個〜３個のタンパク質を発現する相異なる２つ以上の組み換えベクターで共同−形質転換させ、Ｌ−スレオニンを高収率で生産する菌株を製造する。
【００４６】
具体的な様態において、本発明は、Ｌ−スレオニン菌株を、Ｏ−サクシニルホモセリンリアーゼとシスタチオニンベータリアーゼ及びスレオニンデヒドラターゼの中から選択されたいずれか一つ又は二つとを発現する第１組み換えベクター、及び５，１０−メチレンテトラヒドロホレートレダクターゼとセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを発現する第２組み換えベクターで共同−形質転換させ、Ｌ−スレオニンを高収率で生産する菌株を製造する。
【００４７】
より具体的な様態において、本発明は、Ｌ−スレオニン生産菌株を、スレオニンデヒドラターゼ（ｔｄｃＢ、ｉｌｖＡ）とＯ−サクシニルホモセリンリアーゼを発現する第１組み換えベクター、及びセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼと５，１０−メチレンテトラヒドロホレートレダクターゼを発現する第２組み換えベクターで共同−形質転換させ、Ｌ−メチオニンを高収率で生産する菌株を製造する。また、Ｌ−スレオニン生産菌株を、Ｏ−サクシニルホモセリンリアーゼとシスタチオニンベータリアーゼを発現する第１組み換えベクター、及びセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼと５，１０−メチレンテトラヒドロホレートレダクターゼを発現する第２組み換えベクターで共同−形質転換させ、Ｌ−メチオニンを高収率で生産する菌株を製造する。また、Ｌ−スレオニン生産菌株を、スレオニンデヒドラターゼとＯ−サクシニルホモセリンリアーゼとシスタチオニンベータリアーゼを発現する第１組み換えベクター、及びセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼと５，１０−メチレンテトラヒドロホレートレダクターゼを発現する第２組み換えベクターで共同−形質転換させ、Ｌ−メチオニンを高収率で生産する菌株を製造する。
【００４８】
より好ましい様態において、本発明は、Ｌ−スレオニン生産菌株をスレオニンデヒドラターゼとＯ−サクシニルホモセリンリアーゼを発現する第１組み換えベクター、及びセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼと５，１０−メチレンテトラヒドロホレートレダクターゼを発現する第２組み換えベクターで共同−形質転換させ、Ｌ−メチオニンを過発現させる。
【００４９】
最も好ましい様態において、本発明は、Ｌ−スレオニン生産菌株を、スレオニンデヒドラターゼとＯ−サクシニルホモセリンリアーゼとシスタチオニンベータリアーゼを発現する第１組み換えベクター、及びセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼと５，１０−メチレンテトラヒドロホレートレダクターゼを発現する第２組み換えベクターで共同−形質転換させ、Ｌ−メチオニンを過発現させる。
【００５０】
前述した方法において、それぞれの酵素タンパク質をコードする遺伝子（ｔｄｃＢ、ｉｌｖＡ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｇｌｙＡ、ｍｅｔＦ）を含む組み換えベクターのうち、第１組み換えベクターは、好ましくはｐＳＥ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢ、ｐＣＬ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢ、ｐＳＥ ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢ、ｐＣＬ ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢ、ｐＳＥ ｍｅｔＢ−ｍｅｔＣ、ｐＣＬ ｍｅｔＢ−ｍｅｔＣ、ｐＳＥ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢＣ、ｐＳＥ ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢＣ、ｐＣＬ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢＣ又はｐＣＬ ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢＣを含み、第２組み換えベクターは、ｐＳＥ ｇｌｙＡ−ｍｅｔＦ又はｐＣＬ ｇｌｙＡ−ｍｅｔＦを含む。
【００５１】
好ましくは、第１組み換えベクターとしてｐＳＥ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢＣ、ｐＳＥ ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢＣ、ｐＣＬ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢＣ又はｐＣＬ ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢＣを使用し、第２組み換えベクターとしてｐＳＥ ｇｌｙＡ−ｍｅｔＦ又はｐＣＬ ｇｌｙＡ−ｍｅｔＦを使用してスレオニンデヒドラターゼ、Ｏ−サクシニルホモセリンリアーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ及び５，１０−メチレンテトラヒドロホレートレダクターゼを全て過発現させる。
【００５２】
前述したような本発明のＬ−メチオニン生産菌株の製造方法において、Ｌ−スレオニン生産菌株は、Ｌ−メチオニン非要求性のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉが好ましく、メチオニン要求性のＴＦ４０７６菌株からＮＴＧによって突然変異された、メチオニン非要求性のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＣＪＭ００２がより好ましく使用できる。
【００５３】
別の様態として、本発明は、前述した方法で製造されたＬ−メチオニン生産菌株、及び前記菌株を用いてＬ−メチオニンを生産する方法を提供する。
【００５４】
具体的な実施様態において、遺伝子組み換えによるＬ−メチオニン生産菌株の製造及びこれを用いたＬ−メチオニン生産は、次の段階を含む。
【００５５】
（１）Ｌ−メチオニン生合成過程に関与する遺伝子、及び／又はメチル基の提供に関与するｔｄｃＢ、ｉｌｖＡ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｍｅｔＦ、ｇｌｙＡなどの遺伝子を分離し、ＰＣＲによって増幅する。
【００５６】
Ｌ−スレオニンを生産することが可能な菌株からゲノムＤＮＡを分離し、これを鋳型としてｔｄｃＢ、ｉｌｖＡ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｍｅｔＦ、ｇｌｙＡ遺伝子を増幅する。ｔｄｃＢ、ｉｌｖＡ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｍｅｔＦ、ｇｌｙＡ遺伝子を増幅するために、このような遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ増幅方法を利用することができる。ＰＣＲ増幅方法は、本分野によく知られている(PCR Protocols: A Guide to Method and Application, Ed. M. Innis et al., Academic Press (1990))。ＰＣＲは、ゲノムＤＮＡ、適切な酵素、プライマー及び緩衝液を含み、便宜上、ＤＮＡサーマルサイクラー(Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Conn. USA)で行う。陽性ＰＣＲ結果は、例えば適切なサイズのＤＮＡ切片をアガロースゲル電気泳動によって検出することにより決定される。
【００５７】
本発明において、過発現のためのｔｄｃＢ、ｉｌｖＡ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｍｅｔＦ、ｇｌｙＡをコードする遺伝子は、前記遺伝子を含むポリヌクレオチド配列だけでなく、前記遺伝子によってコードされるタンパク質と同等な活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ断片を含み、また、類似活性を示す限りは、置換、欠失、挿入などによる変異体も含む。
【００５８】
（２）前記遺伝子をタンパク質発現ベクターに挿入して組み換えベクターを製作する。
【００５９】
前記収得されたｔｄｃＢ、ｉｌｖＡ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｍｅｔＦ、ｇｌｙＡなどの遺伝子を適切なＴ−ベクター内にクローニングし、形成された組み換えベクターを形質転換によってＥ．ｃｏｌｉなどの宿主細胞内に導入する。形質転換体を培養し細胞を分離した後、これらからｔｄｃＢ、ｉｌｖＡ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｍｅｔＦ、ｇｌｙＡ遺伝子を持つ組み換えベクターを分離する。
【００６０】
分離された組み換えベクターを、プライマー製作の際に挿入した制限酵素ＮｈｅI、ＳａｃIで切断してｔｒｃプロモータ含有ベクターに挿入する。このように製作されたｔｄｃＢ、ｉｌｖＡ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｍｅｔＦ、ｇｌｙＡ遺伝子をｔｄｃＢ−ｍｅｔＢ、ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢＣ、ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢ、ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢＣ、ｇｌｙＡ−ｍｅｔＦなどのオペロンの形で製作した。
【００６１】
（３）組み換えベクターをＬ−スレオニン生産菌株に導入して形質転換菌株を製作する。
【００６２】
前記ポリヌクレオチド配列を、Ｌ−スレオニン、Ｌ−メチオニンを生産することが可能な菌株に電気穿孔法などの通常の技術によって流入させた後、抗生剤耐性を持つ菌株を選別することにより、ｔｄｃＢ、ｉｌｖＡ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｍｅｔＦ、ｇｌｙＡ遺伝子が過発現された菌株を分離する。
【００６３】
本発明者らは、組み換えプラスミドｐＳＥ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢ、ｐＳＥ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢＣ、ｐＳＥ ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢ、ｐＳＥ ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢＣ、ｐＳＥ ｇｌｙＡ−ｍｅｔＦを製作し、前記プラスミドを、イソロイシンリーキ型要求性、Ｌ−リジン類似体に対する耐性、及びα−アミノ酪酸に対する耐性を有し且つメチオニン要求性を有するＴＦ４０７６菌株からＮＴＧによって突然変異されたメチオニン非要求性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＣＪＭ００２にそれぞれ電気穿孔法で流入させた。その結果、母菌株であるＣＪＭ００２に比べて高濃度のＬ−メチオニンを生成することを確認した。
【００６４】
Ｌ−スレオニン生産菌株であるＴＦ４０７６（ＫＦＣＣ １０７１８、韓国特許公告第９２−８３６５号）は、メチオニン要求性、メチオニン類似体（例えば、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸、ＡＨＶ）に対する耐性、イソロイシン類似体（例えば、α−アミノ酪酸）に対する耐性、メチオニンの類似体（例えば、エチオニン）に対する耐性などの特性を持っている。前記韓国特許の全体内容は、引用によって本明細書に含まれる。このようなＴＦ４０７６は、メチオニン要求性菌株であって、細胞内でメチオニンは合成することができない。本発明者らは、このようなメチオニン要求性を解除してメチオニン生産菌株として用いるために、ＮＴＧによる人工突然変異法を用いてメチオニン要求性が解除されたスレオニン生産菌株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＣＪＭ００２を製造した。
メチオニン非要求性のスレオニン生産菌株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＣＪＭ００２は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＦ００１の名称でＫＣＣＭ（Korean Culture Center of Microorganism、韓国ソウル市西大門区弘済１洞３６１−２２１ユリムビル）に２００４年４月９日付けで第ＫＣＣＭ−１０５６８号で寄託した。
【００６５】
前記ｔｄｃＢ、ｉｌｖＡ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｍｅｔＦ、ｇｌｙＡ遺伝子又はその断片を含む組み換えベクターの宿主細胞内に導入する過程は、例えば、形質転換(transformation)、接合(conjugation)、形質導入(transduction)又は電気穿孔(electroporation)によって行われるが、これらの例に限定されるものではない。
【００６６】
（４）前記形質転換菌株を培養し、その培養物からＬ−メチオニンを生産する。
【００６７】
前記製造されたＬ−メチオニン過発現微生物の培養過程は、当業界に知られている適切な培地と培養条件によって行われ得る。このような培養過程は、当業者であれば、選択される菌株に応じて容易に調整して使用することができる。前記培養方法の例には、回分式培養、連続式培養及び流加式培養が含まれるが、これらに限定されない。このような各種培養方法は、例えば文献("Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176)に開示されている。
【００６８】
培養に用いられる培地は、特定な菌株の要求条件を適切に満足させなければならない。多様な微生物の培地は、例えば文献("Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., U. S. A., 1981)に開示されている。前記培地は、多様な炭素源、窒素源及び微量元素成分を含む。使用可能な炭素源の例には、ブドウ糖、蔗糖、乳糖、果糖(fructose)、マルトース、澱粉、セルロースなどの炭水化物；大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ココナット油などの脂肪；パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸などの脂肪酸；グリセロール及びエタノールなどのアルコール；及び酢酸などの有機酸が含まれる。これらの炭素源は、単独で又は組み合わせて使用できる。使用可能な窒素源の例には、例えばペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液（ＣＳＬ）及びソイビーンなどの有機窒素源、及び例えば尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源が含まれる。これらの窒素源は、単独で又は組み合わせて使用できる。前記培地には、リン源として、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、及び対応するナトリウム含有塩が含まれ得る。また、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄などの金属塩が含まれてもよい。この他に、アミノ酸、ビタミン及び適切な前駆体などが含まれてもよい。これらの培地又は前駆体は、培養物に回分式又は連続式で添加できる。
【００６９】
また、培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸及び硫酸などの化合物を培養物に適切な方式で添加して培養物のｐＨを調整することができる。また、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡の生成を抑制することができる。また、培養物の好気状態を維持するために、培養物内に酸素又は酸素含有気体（例えば、空気）を注入する。培養物の温度は、通常２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃である。培養期間は、所望のＬ−メチオニンの生成量が得られるまでであり、好ましくは１０〜１６０時間である。
【００７０】
Ｌ−スレオニンを高生産する微生物においてスレオニンデヒドラターゼ、Ｏ−サクシニルホモセリンリアーゼ、シスタチオニンベータリアーゼ、５，１０−メチレンテトラヒドロホレートレダクターゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを過発現させるために、前記タンパク質をコードする遺伝子の発現を調節するプロモータをｔｒｃ、ｔａｃなどの過発現プロモータで交替し、及び／又はｍｅｔＪ不活性化、ｍｅｔＲ化発現、ｔｄｃＲ、ｔｄｃＡ過発現などの転写因子の発現調節によって菌株を製作することができる。
【００７１】
本発明によって生産されるメチオニンはＬ型である。Ｌ型は、生体内で合成される形であり、生物体が直ちに利用可能な形なので、Ｄ型より有用である。Ｌ−メチオニンは、飼料及び食品添加物、医薬原料、硫黄源、医薬品などとして用いられる。
【００７２】
Ｌ−メチオニンは、その主要代謝経路中の一つがアデノシル化(adenosylation)によってＳ−アデノシル−メチオニンを形成することなので、Ｌ−メチオニンの合成が増加すると、その主要代謝産物であるＳ−アデノシル−メチオニンの合成も共に増加する。
【００７３】
したがって、別の様態として、本発明は、Ｓ−アデノシル−メチオニンの生産、具体的にＳ−アデノシル−メチオニン生産菌株の製造方法、この方法で製造された菌株、及びこの菌株を用いたＳ−アデノシル−メチオニンの生産方法を提供する。
【００７４】
以下、本発明を実施例によってより詳細に説明する。ところが、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲を限定するものではない。
【００７５】
実施例１：ＴＦ４０７６菌株におけるメチオニン要求性の解除
１−１）人工突然変異によるメチオニン要求性の解除
人工的な変異菌株であるＴＦ４０７６（ＫＦＣＣ１０７１８、韓国特許公告第９２−８３６５号）は、メチオニンに対して要求性を有する菌株である。ＴＦ４０７６のメチオニン要求性を解除するために、ＴＦ４０７６菌株に対してＮＴＧ(1-Methyl-3-Nitro-1-Nitrosoguanidine)を用いた人工突然変異実験を行った。ＴＦ４０７６菌株をＬＢ液体培地で一晩培養した後、新しいＬＢ液体培地に移して６時間培養した。培養した培養液を遠心分離して菌体を得て食塩水に２回再懸濁し、さらに、遠心分離によって得られた菌体をシトレート緩衝液で再懸濁した後、濃度４００μｇ／ｍｌのＮＴＧを添加し、その後３０分間培養した。培養によって得られた突然変異株を遠心分離して菌体を分離し、分離された菌体を食塩水で２回再懸濁し、Ｍ９最小寒天培地（Ｎａ2ＨＰＯ4１２．８ｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4３ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ０．５ｇ／Ｌ、ＮＨ4Ｃｌ１ｇ／Ｌ、２０％グルコース１０ｍｌ／Ｌ、１Ｍ ＣａＣｌ2０．１ｍｌ／Ｌ、１Ｍ ＭｇＳＯ4２ｍｌ／Ｌ）で培養して生長するメチオニン非要求性株を選別した。図２はメチオニン要求性が解除された菌株を示す図である。このようにメチオニン要求性が解除されたスレオニン生産菌株をＣＪＭ００２と命名した。
【００７６】
メチオニン要求性が解除されたスレオニン生産菌株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＣＪＭ００２は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＦ００１の名称でＫＣＣＭに２００４年４月９日付けで第ＫＣＣＭ−１０５６８号で寄託した。
【００７７】
１−２）遺伝子置換によるメチオニン要求性の解除
人工的な変異菌株であるＴＦ４０７６は、メチオニンに対して要求性を有する菌株である。ＴＦ４０７６のメチオニン要求性を解除するために、野性型のメチオニン生合成遺伝子とＴＦ４０７６菌株のメチオニン生合成遺伝子間のＤＮＡ塩基配列を比較し、これらのうち野生型遺伝子ＤＮＡと大きい差を示すＴＦ４０７６の遺伝子であるｇｌｙＡ、ｍｅｔＦ遺伝子を野性型の遺伝子で置換した。その結果、ｇｌｙＡ、ｍｅｔＦの２つの遺伝子を野生型の遺伝子で置換したＴＦ４０７６菌株はメチオニン要求性が解除されたことを確認した。メチオニン要求性の解除の際に使用されたプラスミドｐＳＥ ｇｌｙＡ−ｍｅｔＦの製作については、実施例３で詳細に後述する。図２はメチオニン要求性が解除された菌株を示す図である。
【００７８】
実施例２：ｔｄｃＢ、ｉｌｖＡ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｍｅｔＦ、ｇｌｙＡを含有した組み換えプラスミドの製作
本実施例では、Ｅ．ｃｏｌｉ(Escherichia coli)内のスレオニンデヒドラターゼ、Ｏ−サクシニルホモセリンリアーゼ、シスタチオニンベータリアーゼ、５，１０−メチレンテトラヒドロホレートレダクターゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｔｄｃＢ、ｉｌｖＡ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｍｅｔＦ、ｇｌｙＡ遺伝子をｔｒｃプロモータで交替し、これを含むベクターを製造した。
【００７９】
まず、ゲノミックチップシステム(genomic-tip system)（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてスレオニン生産Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＦ４０７６菌株（ＫＦＣＣ １０７１８）からゲノムＤＮＡを分離した。Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡを鋳型(template)とした重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、ｔｄｃＢ、ｉｌｖＡ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｍｅｔＦ、ｇｌｙＡ遺伝子のＯＲＦ(Open Reading Frame)ＤＮＡ切片、約１００３ｂｐ、１５５８ｂｐ、１１６１ｂｐ、１１８５ｂｐ、９０３ｂｐ、１２６６ｂｐを得た。この際、使用されたプライマーの配列番号は下記表のとおりであり、変性(denaturation)段階は９４℃で３０秒間、アニーリング段階は６０℃で３０秒間、延長段階は７２℃で１分〜３分３０秒間行い、これらの段階を３０回行った。
【００８０】
【表１】
2008504048.tif 000003
【００８１】
こうして得られたＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、１００３ｂｐ、１５５８ｂｐ、１１６１ｂｐ、１１８５ｂｐ、９０３ｂｐ、１２６６ｂｐサイズのバンドからＤＮＡを精製した。精製されたＤＮＡをｐＣＲ２．０クローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．社）に１６℃で一晩連結させた。その結果得られた組み換えプラスミドｐＴｏｔｄｃＢ、ｐＴｏｉｌｖＡ、ｐＴｏｍｅｔＢ、ｐＴｏｍｅｔＣ、ｐＴｏｇｌｙＡ、ｐＴｏｍｅｔＦをＥ．ｃｏｌｉ ＮＭ５２２に形質転換させ、カルベニシリン（５０ｍｇ／Ｌ）入り固体培地に塗抹して３７℃で一晩培養した。
【００８２】
コロニーを白金耳でカルベニシリン入り液体ＬＢ培地３ｍＬに接種して一晩培養した後、ミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドＤＮＡを分離した。プラスミドＤＮＡを制限酵素ＮｈｅIとＳａｃIで処理した後、各遺伝子のＯＲＦ部分を含有した断片を得た。こうして得られた断片は、ｔｒｃプロモータを含有したベクターであるｐＳＥ３８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．）を、ＮｈｅIとＳａｃIで切断された断片と１６℃で一晩連結させた。こうして得られた組み換えプラスミドｐＳＥ ｔｄｃＢ、ｐＳＥ ｉｌｖＡ、ｐＳＥ ｍｅｔＢ、ｐＳＥ ｍｅｔＣ、ｐＳＥ ｇｌｙＡ、ｐＳＥ ｍｅｔＦをＥ．ｃｏｌｉ ＮＭ５２２に形質転換させ、カルベニシリン（５０ｍｇ／Ｌ）入り固体培地に塗抹して３７℃で一晩培養した。
【００８３】
組み換えプラスミドｐＳＥ ｔｄｃＢ、ｐＳＥ ｉｌｖＡ、ｐＳＥ ｍｅｔＢ、ｐＳＥ ｍｅｔＣ、ｐＳＥ ｍｅｔＦ、ｐＳＥ ｇｌｙＡをＥ．ｃｏｌｉ ＮＭ５２２に形質転換させ、カルベニシリンとカナマイシン（それぞれ５０ｍｇ／Ｌと５０ｍｇ／Ｌ）が含有された固体ＬＢ培地に塗抹して３２℃で一晩培養した。コロニーを白金耳でカルベニシリン入り液体培地３ｍＬに接種して一晩培養した後、ミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドＤＮＡを分離した。図３は、製作された組み換えプラスミドｐＳＥ ｔｄｃＢ、ｐＳＥ ｉｌｖＡ、ｐＳＥ ｍｅｔＢ、ｐＳＥ ｍｅｔＣ、ｐＳＥ ｍｅｔＦ、ｐＳＥ ｇｌｙＡのプラスミド地図である。
【００８４】
実施例３：ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢ、ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢＣ、ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢ、ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢＣ、ｇｌｙＡ−ｍｅｔＦオペロン構造を含有したプラスミドの製作
本実施例では、Ｅ．ｃｏｌｉ内のスレオニンデヒドラターゼ、Ｏ−サクシニルホモセリンリアーゼ、シスタチオニンベータリアーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、５，１０−メチレンテトラヒドロホレートレダクターゼを同時に過発現させるために、前記のｔｄｃＢ遺伝子とｍｅｔＢ遺伝子、ｔｄｃＢ遺伝子とｍｅｔＢＣ遺伝子、ｉｌｖＡ遺伝子とｍｅｔＢ遺伝子、ｉｌｖＡ遺伝子とｍｅｔＢＣ遺伝子、ｇｌｙＡ遺伝子とｍｅｔＦ遺伝子をオペロン構造で製作し、これを含有したベクターを製作し、製作されたベクターをＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞に形質転換した後、スレオニンデヒドラターゼとＯ−サクシニルホモセリンリアーゼ、スレオニンデヒドラターゼとＯ−サクシニルホモセリンリアーゼとシスタチオニンベータリアーゼ、５，１０−メチレンテトラヒドロホレートレダクターゼとセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを同時に過発現するプラスミドを製作した。
【００８５】
実施例２で製作されたプラスミドを用いて、ｔｒｃプロモータで交替されたオペロン構造のｔｄｃＢ−ｍｅｔＢ、ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢ、ｇｌｙＡ−ｍｅｔＦを製作するために、ｍｅｔＢとｍｅｔＦ遺伝子を含有したプラスミドであるｐＳＥ ｍｅｔＢ、ｐＳＥ ｍｅｔＦを鋳型として重合酵素連鎖反応を行い、ｔｒｃプロモータのリボソーム結合部位を含んだｍｅｔＢとｍｅｔＦのＯＲＦ ＤＮＡ切片約１２７９ｂｐと９０３ｂｐを得た。プライマーとして配列番号１３と配列番号６、配列番号１３と配列番号１２のオリゴヌクレオチドを使用した。変性(denaturation)段階は９４℃で３０秒間、アニーリング(annealing)段階は６０℃で３０秒間、延長(extension)段階は７２℃で１分〜１分３０秒間行い、これらの段階を３０回行った。
【００８６】
こうして得られたＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、１２７９ｂｐ、９０３ｂｐサイズのバンドからＤＮＡを精製した。精製されたＤＮＡをｐＣＲ２．０クローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．社）に１６℃で一晩連結させた。その結果得られた組み換えプラスミドｐＴＲｍｅｔＢ、ｐＴＲｍｅｔＦをＥ．ｃｏｌｉ ＮＭ５２２に形質転換させ、カルベニシリン（５０ｍｇ／Ｌ）入り固体培地に塗抹して３７℃で一晩培養した。
【００８７】
コロニーを白金耳でカルベニシリン入り液体ＬＢ培地３ｍＬに接種して一晩培養した後、ミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを分離した。プラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃIで処理した後、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＦ遺伝子のＲＢＳ及びＯＲＦ部分を含有した断片を得た。こうして得られた断片は、ｔｒｃプロモータ含有ベクターであるｐＳＥ ｔｄｃＢ、ｐＳＥ ｉｌｖＡ、ｐＳＥ ｇｌｙＡを、ＳａｃIで切断された断片と１６℃で一晩連結させた。その結果得られた組み換えプラスミドｐＳＥ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢ、ｐＳＥ ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢ、ｐＳＥ ｇｌｙＡ−ｍｅｔＦをＥ．ｃｏｌｉ ＮＭ５２２に形質転換させ、カルベニシリン（５０ｍｇ／Ｌ）入り固体培地に塗抹して３７℃で一晩培養した。
【００８８】
コロニーを白金耳でカルベニシリンとカナマイシン入り液体培地３ｍＬに接種して一晩培養した後、ミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドＤＮＡを分離した。
【００８９】
また、実施例２で製作されたプラスミドを用いて、ｔｒｃプロモータで交替されたオペロン構造のｔｄｃＢ−ｍｅｔＢＣとｉｌｖＡ−ｍｅｔＢＣを製作するために、ｍｅｔＣ遺伝子含有プラスミドであるｐＳＥ ｍｅｔＣを鋳型として重合酵素連鎖反応を行い、ｔｒｃプロモータのリボソーム結合部位を含んだｍｅｔＣ ＯＲＦ ＤＮＡ切片約１３０６ｂｐを得た。プライマーとして配列番号１４と配列番号８のオリゴヌクレオチドを使用した。変性段階は９４℃で３０秒間、アニーリング段階は６０℃で３０秒間、延長段階は７２℃で１分〜１分３０秒間行い、これらの段階を３０回行った。
【００９０】
こうして得られたＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、１３０６ｂｐサイズのバンドからＤＮＡを精製した。精製されたＤＮＡをｐＣＲ２．０クローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．社）に１６℃で一晩連結させた。その結果得られた組み換えプラスミドｐＴＲｍｅｔＣをＥ．ｃｏｌｉＮＭ５２２に形質転換させ、カルベニシリン（５０ｍｇ／Ｌ）入り固体培地に塗抹して３７℃で一晩培養した。
【００９１】
コロニーを白金耳でカルベニシリン入り液体ＬＢ培地３ｍＬに接種して一晩培養した後、ミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを分離した。プラスミドＤＮＡを制限酵素ＸｈｏIで処理した後、ｍｅｔＣ遺伝子のＲＢＳ及びＯＲＦ部分を含有した断片を得た。こうして得られた断片は、ｔｒｃプロモータ含有ベクターであるｐＳＥ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢとｐＳＥ ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢをＸｈｏIで切断した断片それぞれと１６℃で一晩連結させた。その結果得られた組み換えプラスミドｐＳＥ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢＣとｐＳＥ ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢＣをＥ．ｃｏｌｉ ＮＭ５２２にそれぞれ形質転換させ、カルベニシリン（５０ｍｇ／Ｌ）入り固体培地に塗抹して３７℃で一晩培養した。
【００９２】
コロニーを白金耳でカルベニシリンとカナマイシン入り液体培地３ｍＬに接種して一晩培養した後、ミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドＤＮＡを分離した。
【００９３】
図３、図４及び図５は、製作された組み換えプラスミドｐＳＥ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢ、ｐＳＥ ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢ、ｐＳＥ ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢＣ、ｐＳＥ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢＣ、ｐＳＥ ｇｌｙＡ−ｍｅｔＦのプラスミド地図である。
【００９４】
組み換えプラスミドｐＳＥ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢＣ、ｐＳＥ ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢＣ及びｐＳＥ ｇｌｙＡ−ｍｅｔＦは、それぞれＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＣＪＭ００４（ｐＳＥ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢＣ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＣＪＭ００５（ｐＳＥ ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢＣ）及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＣＪＭ００６（ｐＳＥ ｇｌｙＡ−ｍｅｔＦ）の名称でＫＣＣＭ（Korean Culture Center of Microorganism、韓国ソウル市西大門区弘済１洞３６１−２２１ユリムビル）に２００４年６月１４日付けで第ＫＣＣＭ−１０５７７号、ＫＣＣＭ−１０５７８号及びＫＣＣＭ−１０５７９号で寄託した。
【００９５】
実施例４：ｐＳＣ１０１ ＯｒｉとｔｄｃＢ−ｍｅｔＢオペロンを含有した組み換えプラスミドの製作
前記製作されたｔｄｃＢ−ｍｅｔＢオペロンと、メチオニン生合成過程でメチルリサイクリングに関与するｇｌｙＡ−ｍｅｔＦオペロンとを２つのプラスミドによって生産菌株内で同時に発現させるために、ｐＳＥ３８０プラスミドとは異なる組み換え起源を含有したベクターであるｐＣＬ１９２０にｔｄｃＢ−ｍｅｔＢオペロンをクローニングしようとした。
【００９６】
実施例３で製作されたｐＳＥ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢプラスミドを制限酵素ＰｖｕIIとＨｉｎｄIIIで切断し、スペクチノマイシン耐性遺伝子とｐＳＣ１０１ Ｏｒｉを含有したベクターｐＣＬ１９２０を制限酵素ＳｍａIとＨｉｎｄIIIで切断し、切断された産物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、約３．４ｋｂと４．５ｋｂサイズのバンドからＤＮＡを精製した。精製されたＤＮＡを１６℃で一晩連結させた。その結果得られた組み換えプラスミドｐＣＬ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢをＥ．ｃｏｌｉ ＮＭ５２２に形質転換させ、カルベニシリン（５０ｍｇ／Ｌ）及びスペクチノマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）入り固体培地に塗抹して３７℃で一晩培養した。
【００９７】
コロニーを白金耳でカルベニシリンとスペクチノマイシン入り液体培地３ｍＬに接種して一晩培養した後、ミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを分離した。
【００９８】
図３は、製作された組み換えプラスミドｐＣＬ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢのプラスミド地図である。
【００９９】
実施例５：組み換えプラスミドｐＳＥ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢ、ｐＳＥ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢＣ、ｐＳＥ ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢ、ｐＳＥ ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢＣ、ｐＳＥ ｇｌｙＡ−ｍｅｔＦを含有したメチオニン生産菌株の製作
実施例３で製作された組み換えプラスミドｐＳＥ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢ、ｐＳＥ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢＣ、ｐＳＥ ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢ、ｐＳＥ ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢＣ、ｐＳＥ ｇｌｙＡ−ｍｅｔＦを、メチオニン要求性の解除されたスレオニン生産菌株であるＣＪＭ００２に電気穿孔法を用いて形質転換させ、形質転換された菌株をカルベニシリン（５０ｍｇ／Ｌ）入り固体培地に塗抹して３７℃で一晩培養してコロニーを得た。
【０１００】
実施例６：組み換えプラスミドｐＳＥ ｇｌｙＡ−ｍｅｔＦ、ｐＣＬ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢを同時に含有したメチオニン生産菌株の製作
実施例３、４で製作された組み換えプラスミドｐＳＥ ｇｌｙＡ−ｍｅｔＦ、ｐＣＬ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢを、メチオニン要求性の解除されたスレオニン生産菌株であるＣＪＭ００２に電気穿孔法を用いて形質転換させ、形質転換された菌株をカルベニシリン（５０ｍｇ／Ｌ）及びスペクチノマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）入り固体培地に塗抹して３７℃で一晩培養してコロニーを得た。
【０１０１】
実施例７：製作された菌株に対する三角フラスコにおけるメチオニン生産力価の比較実験
実施例５、６で示したように、抗生剤のカルベニシリン、カルベニシリンとスペクチノマイシンが含有された固体培地に塗抹して選別した各菌株に対するコロニー３０株ずつを選抜し、表２に示したメチオニン力価培地を用いて三角フラスコでメチオニン生産性を比較した。
【０１０２】
【表２】
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【０１０３】
３１℃の培養器でＬＢ固体培地中に一晩培養した単一コロニーを、２５ｍＬの力価培地に１つの白金耳で接種し、３１℃で２００ｒｐｍで４８時間培養した。
【０１０４】
培養物からＬ−メチオニンをＨＰＬＣによって分析した。分析結果を下記表３に示した。表２に示したように、母菌株であるＥ．ｃｏｌｉ ＣＪＭ００２菌株は４８時間の発酵時間に５ｍｇ／Ｌ以下であるが、これに対し、プラスミドｐＳＥ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢ、ｐＳＥ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢＣ、ｐＳＥ ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢ、ｐＳＥ ｇｌｙＡ−ｍｅｔＦを含有した菌株は、４８時間の発酵時間にそれぞれ４０、６６、４８、５０、４７．７ｍｇ／Ｌのメチオニンを生産し、ｐＣＬ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢとｐＳＥ ｇｌｙＡ−ｍｅｔＦの２つのプラスミドを含有した菌株は、１６０ｍｇ／Ｌのメチオニンを生産した。
【０１０５】
【表３】
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【０１０６】
前記結果から確認されるように、スレオニン生産菌株におけるスレオニンデヒドラターゼ、Ｏ−サクシニルホモセリンリアーゼ、シスタチオニンベータリアーゼタンパク質の過発現によって微生物のＬ−メチオニン生合成能が向上した。これは、スレオニンデヒドラターゼによって分解された、分解産物である２−オキソブタノエートがＯ−サクシニルホモセリンリアーゼとシスタチオニンベータリアーゼによってメチオニンの合成に用いられてメチオニンの生合成が増加するものと思われる。また、メチオニン生合成経路上のメチルリサイクリングに関与するタンパク質である５，１０−メチレンテトラヒドロホレートレダクターゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを高発現した場合にも、メチオニン生合成能が向上した。特に、スレオニンデヒドラターゼとＯ−サクシニルホモセリンリアーゼ（又はスレオニンデヒドラターゼとＯ−サクシニルホモセリンリアーゼとシスタチオニンベータリアーゼ）を発現する第1プラスミド、及び５，１０−メチレンテトラヒドロホレートレダクターゼとセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを発現する第２プラスミドを使用した２つのプラスミド形態で同時に発現する場合、Ｌ−メチオニン生合成能が著しく向上した。
【０１０７】
以上の説明より、本発明の属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想又は必須的特徴を変更せず、他の具体的な形で実施され得ることを理解することができるであろう。これに関連し、前述した実施例が全ての面で例示的なものに過ぎず、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は、前述した説明よりは特許請求の範囲の意味及び範囲、並びにその等価概念から導入される全ての変更又は変形形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されなければならない。
【０１０８】
〔産業上の利用可能性〕
本発明によって製造されたＬ−メチオニン生産菌株を用いてＬ−メチオニンを高収率で生産することにより、飼料及び食品添加剤、医薬用及び医薬品の原料などの多様な分野に広く使用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は本発明の詳細図である。
【図２】図２はメチオニン含有及び非含有培地における、突然変異によってメチオニン要求性が解除されたＣＪＭ００２菌株、メチオニン要求性菌株であるＴＦ４０７６がｇｌｙＡ−ｍｅｔＦで形質転換されてメチオニン要求性が解除された培養結果を示す写真である。
【図３】図３はｔｄｃＢ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ遺伝子をｔｄｃＢ−ｍｅｔＢ、ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢＣオペロンの形で製作したプラスミドｐＳＥ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢ、ｐＳＥ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢＣ、ｐＣＬ ｔｄｃＢ−ｍｅｔＢとオペロン製作の際に鋳型として用いられたプラスミドｐＳＥｔｄｃＢ、ｐＳＥｍｅｔＢ、ｐＳＥｍｅｔＣである。
【図４】図４はｉｌｖＢ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ遺伝子をオペロンの形で製作したプラスミドｐＳＥ ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢ、ｐＳＥ ｉｌｖＡ−ｍｅｔＢＣと、オペロン製作の際に鋳型として用いられたプラスミドｐＳＥｉｌｖＡである。
【図５】図５はｇｌｙＡ、ｍｅｔＦ遺伝子をｇｌｙＡ−ｍｅｔＦオペロンの形で製作したプラスミドｐＳＥ ｇｌｙＡ−ｍｅｔＦと、オペロン製作の際に鋳型として用いられたプラスミドｐＳＥｇｌｙＡ、ｐＳＥｍｅｔＦである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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