(57)【要約】本発明は、標的部位および抗−細胞増殖部位を含むキメラ癌療法分子に関する。具体的な例において、該抗−細胞増殖部位が細胞傷害性剤またはアポトーシス誘導因子を含むことができる。特別な例において、該キメラ分子の該抗−細胞増殖メカニズムはアポトーシス経路を含む。さらなる具体例において、本発明のキメラ分子は、化学療法に対して抵抗性である細胞において化学療法に対する感受性を提供する。本発明により、治療上有効量の、細胞−特異的標的化部位および抗−細胞増殖部位を含むキメラ分子を個体に投与することを含む、個体において１以上の化学療法−抵抗性癌細胞に化学感受性を付与し、または回復させる方法が、提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療上有効量の、細胞−特異的標的化部位および抗−細胞増殖部位を含むキメラ分子を個体に送達することを含む、個体において１以上の化学療法−抵抗性癌細胞に化学感受性を付与し、または回復させる方法。
【請求項２】
前記細胞−特異的標的化部位が癌細胞−標的化部位としてさらに規定される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記癌細胞−標的化部位が抗体、成長因子、ホルモン、ペプチド、アプタマーまたはサイトカインとしてさらに規定される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体が全長抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ、単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ミニボディー、ダイアボディー、トリアボディー、またはその混合物としてさらに規定される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体がｓｃＦｖである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が抗−ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗体である請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗体がｓｃＦｖ２３である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が抗−ｇｐ２４０抗原抗体である請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記抗−ｇｐ２４０抗原抗体がｓｃＦｖＭＥＬを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記癌細胞−標的化部位が１以上の成長分子を含む請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記成長因子がトランスフォーミング成長因子、表皮成長因子、インスリン−様成長因子、線維芽細胞成長因子、ヘレグリン、血小板−誘導成長因子、血管内皮細胞成長因子、または低酸素症誘導因子である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記癌細胞−標的化部位が１以上のホルモンを含む請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記ホルモンがヒト絨毛ゴナドトロピン、ゴナドトロピン放出ホルモン、アンドロゲン、エストロゲン、甲状腺−刺激ホルモン、卵胞−刺激ホルモン、黄体化ホルモン、プロラクチン、成長ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、抗利尿ホルモン、オキシトシン、甲状腺刺激ホルモン−放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、コルチコトロピン−放出ホルモン、ソマトスタチン、ドーパミン、メラトニン、チロキシン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、グルココルチコイド、ミネラロコルチコイド、アドレナリン、ノルアドレナリン、プロゲステロン、インスリン、グルカゴン、アミリン、エリスロポエチン、カルシトリオール、カルシフェロール、心房−ナトリウム利尿ペプチド、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、ニューロペプチドＹ、グレリン、ＰＹＹ３−３６、インスリン−様成長因子−１、レプチン、トロンボポエチン、アンジオテンシノーゲン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、Ｉｌ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５またはＩＬ−３６である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記癌細胞−標的化部位が１以上のサイトカインを含む請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
前記サイトカインがＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、顆粒球−コロニー刺激因子、マクロファージ−コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、白血病阻害因子、エリスロポエチン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、オンコスタチンＭ、白血病刺激因子、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＬＴ−β、ＣＤ４０リガンド、Ｆａｓリガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、４−１ＢＢＬ、ＴＧＦ−β、ＩＬ  １α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１  ＲＡ、ＭＩＦ、ＩＧＩＦ、またはその混合物である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗−細胞増殖部位がアポトーシス−誘導部位または細胞傷害性剤としてさらに規定される請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記アポトーシス−誘導部位がグランザイム、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー、チトクロームＣ、またはカスパーゼである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記グランザイムがグランザイムＡ、グランザイムＢ、グランザイムＣ、グランザイムＤ、グランザイムＥ、グランザイムＦ、グランザイムＧ、グランザイムＨ、グランザイムＩ、グランザイムＪ、グランザイムＫ、グランザイムＬ、グランザイムＭ、またはグランザイムＮである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記グランザイムがグランザイムＢである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーがＢａｘ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、Ｈｒｋ、またはＢｏｋである請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記カスパーゼがカスパーゼ−１、カスパーゼ−２、カスパーゼ−３、カスパーゼ−４、カスパーゼ−５、カスパーゼ−６、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０、カスパーゼ−１１、カスパーゼ−１２、カスパーゼ−１３、またはカスパーゼ−１４である請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞傷害性剤がＴＮＦ−α、ゲロニン、プロジギオシン、リボソーム−阻害タンパク質（ＲＩＰ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｍａｓ  エキソトキシン、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅトキシンＢ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ＶａｃＡ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ  ＹｏｐＴ、ビオラセイン、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、イロフルベン、ジフテリアトキシン、マイトギリン、リシン、ボツリヌストキシン、コレラトキシン、またはサポリン６である請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞傷害性剤が組換体である請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞−特異的標的化部位および該抗−細胞増殖部位が化学的にコンジュゲートされている請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞−特異的標的化部位および該抗−細胞増殖部位が融合ポリペプチドに含まれる請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞−特異的標的化部位および該抗−細胞増殖部位がリンカーによって連結された請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記化学療法−抵抗性癌細胞が、ＴＮＦ−α、Ｎｆ−κＢ−過剰発現、Ｎｆ−κＢシグナリング−欠陥、またはその組合せに対して抵抗性であるＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現としてさらに規定される請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記化学療法−抵抗性細胞が、化学療法剤の１以上のクラスに対して抵抗性である請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
化学療法剤の該クラスがアルキル化剤、ニトロソ尿素、抗代謝産物、抗腫瘍抗生物質、植物アルキロイド、タキサン、およびホルモン剤よりなる群から選択される請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記化学療法−抵抗性細胞が５−フルオロウラシル、シスプラチン、エトポシド、ドキソルビシン、またはゲムシタビンの１以上に対して抵抗性である請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
さらに、前記個体についてのさらなる癌療法を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記さらなる癌療法が化学療法、外科的処置、放射線、遺伝子療法、ホルモン療法、免疫療法、またはその組合せである請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記化学療法および前記キメラ分子が同時に投与される請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記化学療法および前記キメラ分子が順次に投与される請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記キメラ分子が前記化学療法に先立って投与される請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記キメラ分子が前記化学療法に引き続いて投与される請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記化学療法および前記キメラ分子が前記癌細胞に対して相乗効果を供する請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記化学療法および前記キメラ分子が前記癌細胞に対して相加的効果を供する請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記キメラ分子がネオアジュバント外科的療法としてさらに定義される請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
前記キメラ分子がポストアジュバント外科的療法としてさらに定義される請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
前記キメラ分子がｓｃＦｖＭＥＬ／Ｇｒｂである請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記キメラ分子がｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−αである請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
前記キメラ分子がｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ−αである請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
治療上有効量のキメラ分子を個体に投与することを含み、該キメラ分子は細胞−標的化部位および抗−細胞増殖部位を含む、個体における１以上の癌細胞を化学療法に対して感受性にする方法。
【請求項４５】
治療上有効量のキメラ分子を個体に投与することを含み、該キメラ分子は細胞−特異的標的化部位および抗−細胞増殖部位を含む、個体における１以上のＴＮＦ−抵抗性癌細胞においてアポトーシスを誘導する方法。
【請求項４６】
治療上有効量のキメラ分子を個体に投与することを含み、該キメラ分子は細胞−特異的標的化部位および抗−細胞増殖部位を含む、個体における１以上のＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現癌細胞においてアポトーシスを誘導する方法。
【請求項４７】
治療上有効量のキメラ分子を個体に投与することを含み、該キメラ分子は細胞−特異的標的化部位および抗−細胞増殖部位を含む、個体における１以上のｇｐ２４０抗原−陽性細胞においてアポトーシスを誘導する方法。
【請求項４８】
治療上有効量のキメラ分子を個体に投与することを含み、該キメラ分子は細胞−特異的標的化部位および抗−細胞増殖部位を含む、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ過剰発現およびＮｆ−κＢ過剰発現である、個体における癌を治療する方法。
【請求項４９】
ＮＦ−κＢシグナリングを中断することによって作用する治療上有効量の少なくとも１つの化学療法剤、ならびに細胞−特異的標的化部位および抗−細胞増殖部位を含むキメラ分子を個体に投与することを含む、個体において癌細胞を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、米国仮特許出願第６０／６４３，３３７号（２００５年１月１０日出願）に対する優先権を主張し、この米国出願は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【０００２】
本発明は、少なくとも部分的に、国防省助成金ＤＡＭＤ１７−９９−１−９２５９−３およびＤＡＭＤ１７−０２−１−０４５７−１を通して開発された。米国政府は、本発明における一定の権利を有し得る。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、細胞生物学、分子生物学、癌、生物学、および医学の分野に向けられる。さらに詳しくは、本発明は、ＴＮＦのような標的化細胞傷害性剤を含めた、癌治療用の標的化キメラ分子、例えば、グランザイム（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）のような標的化プロ−アポトーシス分子に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
癌での考慮される罹患率および死亡率は、癌の新しい発生のみならず、治療されてきた、かつ１以上の化学療法に対する耐性を発生したものについての、改良された療法に対する必要性を刺激する。効果的な癌治療についての他の有利な特徴は、害から正常な細胞を免れさせつつ、癌性細胞に対して特異的に組成物を標的化するなどして、療法からの最小な副作用を有することを含む。すなわち、有益な組成物は、１以上の癌細胞に対して有効な治療を供し、なお、正常な細胞に対する有害な効果を回避することができるものであろう。特に、有用な組成物は、別々な標的化部位および抗−細胞増殖部位を供するものを含む。本発明は、いずれのタイプの癌に対しても有用であるそのような有益な組成物を提供する。
メラノーマおよび標的化細胞傷害性分子
分子工学を介して、タンパク質は、その生物学的活性を有意に増強するように改変することができる。抗体をサイトカインと、抗体をサイトカイン受容体と、またはサイトカインをトキシンと組み合わせるように設計された融合タンパク質、例えば、プレ臨床および臨床試験において現在評価されつつある（Ｄａｖｉｓ  ａｎｄ  Ｇｉｌｌｉｅｓ，２００３；Ｖｅｅｎｅｎｄａａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。単一鎖組換え抗体（ｓｃＦｖ）は、設計されたフレキシブルなペプチド連結体によって連結された抗体ＶＬおよびＶＨドメインを含む（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。無傷ＩｇＧと比較して、ｓｃＦｖは匹敵する抗原−結合親和性と共に、より小さなサイズおよび構造的に単純性の利点を有し、それらは類似の２−鎖Ｆａｂ断片よりも安定となることができる（Ｃｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｋａｎｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２）。いくつかの研究は、ｓｃＦｖのより小さなサイズは、無傷マウス抗体のそれと比較して、腫瘍細胞への良好な浸透、改良されたファルマコキネティックス、および静脈内投与されたＦａｂで観察された免疫原性の低下を提供することを示している（Ｃｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｋａｎｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ，．１９８２；Ｍａｃｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ａｇｇａｒｗａｌ  ａｎｄ  Ｎａｔａｒａｊａｎ，１９９６）。ｓｃＦｖＭＥＬ単一鎖抗体は、例えば、ヒトメラノーマ細胞に存在するｇｐ２４０抗原の表面ドメインを認識する親ＺＭＥ−０１８抗体と同一の結合親和性および特自性を保有する（Ｂｕｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｄａｙｅｒ，２００２；Ｂｏｒｉｓ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｋｅ，２００３）。
【０００５】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、主として活性化されたマクロファージによって分泌される細胞傷害性ポリペプチドであり、それは、活性化されたリンパ球によって分泌されるもう１つのペプチドホルモンであるリンホトキシン（ＬＴまたはＴＮＦ−ベータ）に対していくらかの配列相同性（３０％）を保有する（Ｚｏｕｂｏｕｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。溶液中では、それは重合して緻密な非−ジスルフィド連結トリマーとなるが、精製された組換えヒトＴＮＦアルファは、分子量１７ｋＤａの単一鎖の非−グリコシル化ポリペプチドである。ＴＮＦは、発熱、ショック、組織負傷、腫瘍壊死、他のサイトカインおよび免疫調節分子の誘導、細胞増殖、分化、およびアポトーシスを含めた、広いスペクトルの全身および細胞応答を媒介する（Ｓｈｉｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｃｏｓｍａｎ，１９９４）。イン・ビトロでは、ＴＮＦは、例えば、ＳＫＢＲ−３乳癌およびＡ−３７５Ｍヒトミエローマを含めた、多数のヒト腫瘍細胞に対して静細胞性または細胞傷害性である（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｂａｇｌｉｏｎｉ，１９８７；Ｃａｐｐｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ，２００２）。イン・ビトロまたはイン・ビボいずれかでの全ての応答は、そのうち少なくとも１つがほとんどあらゆる細胞タイプに存在する、２つの区別される細胞受容体、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２のＴＮＦ−誘導トリマー化によって誘導される（Ｒａｏ，２００１，Ｃｏｗａｎ  ａｎｄ  Ｓｔｏｒｅｙ，２００３）。これらの２つの受容体は共に区別されかつ重複する応答を誘導するが、種々の病原体に対する細胞死滅カスケードおよび宿主応答の開始を含めたＴＮＦ効果の大部分は、ＴＮＦＲ１によって媒介されるようである（Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）。シグナルを変換するＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２の双方の能力は、それらの細胞質テイルと下流調節タンパク質との相互作用に依存する。ＴＮＦＲ２とは対照的に、ＴＮＦＲ１の細胞内ドメインは、ＴＲＡＤＤ（ＴＮＦＲ−関連死滅ドメインタンパク質）のようなアダプタータンパク質に結合するいわゆる「死滅ドメイン」を含有する。ＴＲＡＤＤは、２つのさらなるトランスデューサー、ＴＲＡＦ２（ＴＮＦＲ−関連因子−２）および受容体−相互作用タンパク質に結合する。これらのタンパク質は、今度は、キナーゼカスケードを誘導し、最後には、転写因子ＮＦ−κＢの、および／または細胞死滅経路の活性化をもたらす。ＭＡＤＤ（ＭＡＰキナーゼ−活性化死滅ドメインタンパク質）は、ＴＮＦＲ１の死滅ドメインに結合するもう１つのタンパク質である。しかしながら、対照的に、ＭＡＤＤは細胞死滅またはＮＦ−κＢ活性化を引き起こさず、マイトジェン−活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）ファミリーのメンバーを特異的に刺激する（Ｓｕｇａｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）。現在、ＭＡＰＫファミリーは３つのサブファミリー、すなわち：（ａ）細胞外シグナル−調節キナーゼ（ＥＲＫ）：（ｂ）ｃ−Ｊｕｎ  ＮＨ２−末端キナーゼ／ストレス−活性化プロテインキナーゼ（ＪＮＫ／ＳＡＰＫ）：および（ｃ）ｐ３８  ＭＡＰＫサブファミリー（Ｎｉｉｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）を含む。
【０００６】
いくつかのグループは、ヒト腫瘍細胞が細胞当たり１００および５０００の間のＴＮＦ受容体部位を呈することができるのを示している（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。しかしながら、受容体の数（または親和性）およびＴＮＦの細胞傷害性効果に対する細胞応答の間で明らかな相関は観察されておらず、これが、ポスト−受容体シグナリング事象が主としてＴＮＦの生化学的効果を変調することができるのを示唆する（Ｋｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。
【０００７】
本発明者らの従前の研究は、まず、ヒトＴＮＦおよびモノクローナル抗体の化学的コンジュケートよりなる免疫サイトカインが、天然ＴＮＦよりもはるかに優れて見える培養中の腫瘍に対する印象的な標的化細胞傷害性特性を呈することができ、ＴＮＦ−耐性腫瘍細胞に対して活性であったことを示した（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。加えて、異種移植片モデルにおける研究は、抗体−ＴＮＦコンジュケートが、腫瘍組織に容易に特異的に蓄積し、天然ＴＮＦと比較して優れたイン・ビボ抗−腫瘍活性を示すことを示唆した（非特許文献４）。これらの元々の観察に基づき、本発明者らは、ヒトメラノーマ細胞を標的とし、ヒトＴＮＦを細胞傷害性エフェクター分子として含有する、組換え単一鎖抗−ｇｐ２４０抗体ｓｃＦｖＭＥＬよりなる第二世代の組換え融合トキシンを設計し、構築した。該融合タンパク質は、天然ＴＮＦと比較して、ＴＮＦ−感受性およびＴＮＦ−抵抗性ヒトメラノーマ細胞双方のイン・ビトロ殺傷を増強することが示された。さらなる研究により、観察された効果は抗体に媒介されることが確認される。というのは、遊離抗体との競合は構築体の見掛けの細胞傷害性を低下させたからである（Ｍｕｊｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。
【０００８】
ＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌および標的化細胞傷害性分子
ＨＥＲ−２／ｎｅｕプロトオンコジーンは、表皮成長因子ファミリーに属し（Ｂａｒｇｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｃｏｕｓｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）、ヒト乳癌および卵巣癌の２０ないし３０％で過剰発現される（Ｓｌａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｔｙｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）１８５−ｋＤａ膜貫通受容体チロシンキナーゼである。ＨＥＲ−２／ｎｅｕの過剰発現は、乳癌細胞系において増殖、プロ生存および転移シグナルを増強し（Ｈｕｎｇ  ａｎｄ  Ｌａｕ，１９９９；Ｉｇｎａｔｏｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｔｚａｈａｒ  ａｎｄ  Ｙａｒｄｅｎ，１９９８）、卵巣、節−陽性、および節−陰性乳癌における貧弱な予後と関連付けられている（Ｂｅｒｃｈｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｓｌａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，１９９８）。このオンコジーンの鍵となる役割の１つは、ＴＮＦのような細胞傷害性サイトカインに対する細胞応答の変調において演じるようである（Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。種々の研究グループは、天然でＨＥＲ−２／ｎｅｕ−を過剰発現する細胞およびＨＥＲ−２／ｎｅｕでトランスフェクトされた細胞は共に、ＴＮＦの細胞傷害性効果に対して抵抗性であることを示した（Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｈｕｄｚｉａｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。ＴＮＦは免疫監視機能において中枢的な役割を演じるので（Ｓａｋｓ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ，１９９２）、乳癌におけるＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現によって媒介されるその細胞傷害性効果に対する抵抗性は、宿主防御メカニズムから逃れることによる成長の利点を形質転換細胞に可能とすることができる。
【０００９】
ユニークな標的化治療剤を形成するための分子エンジニアリングアプローチの出現に伴い、ＨＥＲ−２／ｎｅｕを認識する単一鎖抗体（ｓｃＦｖ２３）に連結されたＴＮＦを含む第二世代の組換え構築体が作成された。従前の研究は、培養中のヒト乳癌細胞に対するｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ構築体の生産、精製および生物学的特徴付けを示しており（非特許文献５）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕを標的とする融合構築体は、ＴＮＦそれ自体に対して抵抗性である細胞に対して活性であることを見出した。
【００１０】
標的化分子と膵臓癌との関連は、例えば、やはり注目に値する。膵臓癌は、合衆国および欧州において癌−関連死亡の主な原因の１つのままである（Ｈａｙｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｇｕｍｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｍａｇｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｋｕｌｋｅ  ２００２）。これは、全ての化学療法剤（Ｐｅｒｍｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）および放射線療法介入（Ｂｏｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｍａｔｓｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）に対して実質的に抵抗性である高度に攻撃的かつ転移性の腫瘍タイプである。化学療法介入についての現行の最前線のアプローチは５−フルオロウラシル（Ｆｕ）または５−ＦＵ含有養生法である（Ｌｏｋｉｃｈ  ａｎｄ  Ｓｋａｒｉｎ，１９７２；Ｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１；Ｔａｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｄｕｃｒｅｕｘ  ａｎｄ  Ｒｏｕｇｉｅｒ，１９９６）。しかしながら、最近の研究は、ゲムシタビンおよびゲムシタビン−含有養生法での治療に対するいくらかの臨床的利点を示している（ｖａｎ  Ｍｏｏｒｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｃａｒｍｉｃｈｅａｌ，１９９７；Ｍｉｃｈａｅｌ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ，１９９７；Ｃａｓｃｉｎｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【００１１】
膵臓腫瘍バイオプシー検体において、過剰に発現されるＨＥＲ−２／ｎｅｕおよびＨＥＲ−１のような多数のオンコジーンがあり（Ｔｏｍａｓｚｅｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｓａｋｏｒａｆａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｔａｍａｎａｋａ，１９９２；Ｌｅｍｏｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｏｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）、ならびにｐ５３、Ｋｉ−ｒａｓ、およびｐ−２１のような種々の遺伝子において突然変異がある（Ｙｏｋｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｈａｈｎ  ａｎｄ  Ｋｅｒｎ，１９９５；Ｄｅｒｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。これらの遺伝子の異常の多くは、攻撃的、転移性および療法−抵抗性の臨床的に提示された表現型の発達において主な役割を演じる。ワクチン（Ｇｊｅｒｔｓｅｎ  ａｎｄ  Ｇａｕｄｅｒｎａｃｋ，１９９８；Ｇｕｎｚｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｓ，２００１；Ｊａｆｆｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、またはオンコジーンタンパク質産物を標的とする抗体（Ｂｕｃｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｘｉｏｎｇ  ａｎｄ  Ａｂｂｒｅｕｚｚｅｓｅ，２００２；Ｂｕｃｈｓｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）を用いるアプローチは途上にあり、あるいは腫瘍成長のより焦点が当てられた制御を提供することは完了している。
【００１２】
ＷＯ  ９３／２１２３２は、新形成疾患の治療のための細胞標的化部位および細胞傷害性部位のコンジュゲートを記載する。具体的な例は、ｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質抗体およびゲロニンを含む。
標的化プロ−アポトーシス分子
個々の細胞の選択的破壊は、しばしば、種々の臨床的状況において望ましい。細胞におけるシグナル伝達経路の多数がその死滅および生存にリンクされており、経路の限定的および／または非常に重要な成分の送達はその破壊の点において生産的であり得る。シグナル伝達経路の古典的な例はアポトーシスであって、アポトーシス経路の種々のエレメントは死滅につき細胞を標的化するのに有用である。アポトーシス、またはプログラムされた細胞の死滅は、細胞の増殖および死滅の間のバランスを調節することによって正常な組織のホメオスタシスを制御する基本的なプロセスである（Ｖａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【００１３】
セリンプロテアーゼグランザイムＢ（ＧｒＢ）（Ｌｏｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｓｃｈｍｉｄ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｍａｎ，１９８７；Ｔｒａｐａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）は、細胞傷害性Ｔ−リンパ球（ＣＴＬ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞で見出されたリソソーム−様細胞質顆粒（または細胞溶解性顆粒）の内容物へのそれらの曝露に際して標的細胞において誘導されたアポトーシス細胞死滅に一体的に関与する（Ｈｅｎｋａｒｔ，１９８５；Ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｈｎ，１９８６；Ｓｍｙｔｈ  ａｎｄ  Ｔｒａｐａｎｉ，１９９５）。細胞傷害性リンパ球顆粒は、ペルフォリン、ポア−形成タンパク質、およびグランザイムと呼ばれるセリンプロテアーゼのファミリーを含有する。ペルフォリンは、補体タンパク質Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９、補体膜攻撃複合体のメンバーに対していくらかの構造的および機能的類似性を有する（Ｓｈｉｎｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。リンパ球−媒介細胞溶解において、ペルフォリンは標的細胞膜に挿入され、重合してポアを形成するようであり（Ｐｏｄａｃｋ，１９９２；Ｙａｇｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、これは、グランザイムＢの標的細胞細胞質へのアクセスを媒介する。一旦内部に入ると、グランザイムＢは、カスパーゼを直接的に活性化し、迅速なＤＮＡの断片化を誘導することによってアポトーシスを誘導する（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。
【００１４】
グランザイムは構造的に関連するが、多様な基質優先性を有する。アスパルテート残基後を切断するそのユニークな能力を介し、グランザイムＢはイン・ビトロにて多くのプロカスパーゼを切断することができ、それは、カスパーゼ−３（Ｄａｒｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｑｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、カスパーゼ−７（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｆｅｍａｎｄｅｓ−Ａｌｎｕｍｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、カスパーゼ−６（Ｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｆｅｍａｎｄｅｓ−Ａｌｎｅｍｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、カスパーゼ−８（Ｍｕｚｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、カスパーゼ−９（Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、およびカスパーゼ−１０ａ／ｂ（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ−Ａｌｎｅｍｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｖｉｎｃｅｎｚ  ａｎｄ  Ｄｉｘｉｔ，１９９７）の成熟化を分析するにおいて重要なツールであった。さらに、それは標的細胞に対して強い毒性を持つ（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。今日までグランザイムＢは、下流のカスパーゼ基質に対する直接的損傷によってある種の状況下で補充された直接的カスパーゼ活性化によって細胞を死滅させると推定されてきた（Ａｎｄｒａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。サイトゾルへのアクセスを獲得し、グランザイムＢは核に迅速に移動され（Ｊａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｔｒａｐａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、ときどき、カスパーゼによって好まれるものとは異なる切断部位を用い、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼおよび核マトリックス抗原を切断することができる（Ａｎｄｒａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。多くのプロカスパーゼはイン・ビトロにて効果的に切断されるが、グランザイムＢ−誘導カスパーゼ活性化は無傷細胞においてヒエラルヒー様式で起こり、カスパーゼ−３、続いてカスパーゼ−７のような実行者カスパーゼのレベルで開始する（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。これは、カスパーゼ−８のような先端カスパーゼを通じて生じる膜シグナルに依拠するＦａｓＬ−媒介殺傷とは対照的である（Ｍｕｚｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｓａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。加えて、いくつかの研究は、この経路における鍵となる基質は未だ解明されていないが、グランザイムＢもまた、非核構造に対する直接的損傷を含むカスパーゼ−非依存性メカニズムを通じて死滅を誘導することができることを示した（Ｓａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｔｒａｐａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｈｅｉｂｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【００１５】
Ｆｒｏｅｌｉｃｈおよび共同研究者による研究は、ＧｒＢが受容体−媒介エンドサイトーシスによって内部化され、ペルフォリンの役割は、エンドサイトーシス小胞からのグランザイムＢの放出を媒介することであることを提唱する。事実、ペルフォリンは、アデノウイルスによって生産されるもののような他の小胞−破壊因子によって置き換えることができる（Ｆｒｏｅｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｐｉｎｋｏｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｂｒｏｗｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【００１６】
グランザイムは、一般には、ＧｒＢに対して３８ないし６７％相同性を持ち、高度に相同性であり（Ｈａｄｄａｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）、それらはチロシンファミリーセリプロテアーゼの触媒トリアド（Ｈｉｓ−５７、Ａｓｐ−１０２、およびＳｅｒ−１９５）を含有する。他の特徴は成熟したＮ−末端Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ配列、３または４のジスルフィドブリッジ、およびやはり好中球カテプシンＧおよび肥満細胞キマーゼにおいて出現する保存されたモチーフ（ＰＨＳＲＰＹＭＡ）を含む。グランザイムの炭水化物部位はＡｓｎ−連結している（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ａｎｄ  Ｉｓａａｚ，１９９３）。グランザイムｍＲＮＡ転写体は、プレ−プロ−プロテアーゼとして翻訳される。プレ−またはリーダー配列は、小胞体においてシグナルペプチダーゼによって切断される。プロペプチドが除去されると、不活性なプログランザイム（チモーゲン）は活性なプロテアーゼとなる。グランザイムプロペプチド配列は、リーダーペプチド後に開始し、触媒立体配座に折り畳まれるプロテアーゼに必要なＮ−末端Ｉｌｅの前で終了する（Ｋａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【００１７】
これまでに同定された種々のアポトーシス因子の中で、Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーは、この死滅経路の最もよく規定されたレギュレーターのいくつかを表す。Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｃｅｄ−９、Ｂｃｌ−ｗ等を含めた、Ｂｃｌ−２ファミリーのいくつかのメンバーは、細胞生存を促進し、他方、Ｂａｘ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｂａｄ、Ｂａｋ、Ｂｉｄ、ＢｉｋおよびＢｉｍを含めた他のメンバーは、アポトーシスを増強させることが示されている（非特許文献６）。多数の多様な仮定が、これまでに、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーの可能な生物学的機能に関して提唱されている。これらはダイマーの形成（Ｏｌｔｖａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、プロテアーゼの活性化（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、ミトコンドリア膜脱分極（６）、反応性酸素中間体の発生（Ｈｏｃｋｅｎｂｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、カルシウムフラックスの調節（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｈｕｉｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、およびポア形成（Ａｎｔｏｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｍａｒｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）を含む。
【００１８】
Ｂｃｌ−２ファミリーの２１ｋＤａ死滅−促進メンバーであるＢａｘは、最初、異なる細胞系からのＢｃｌ−２と共免疫沈澱下タンパク質として同定された（Ｏｌｔｖａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。Ｂａｘの過剰発現は、広い範囲の細胞傷害性結果に応答して細胞死滅を加速する。Ｂａｘタンパク質のアミノ酸配列の決定は、それが、Ｂｃｌ−２に対して高度に相同であることを示した。Ｂａｘ遺伝子は６つのエクソンからなり、その支配的な形態は１．０ｋｂ  ｍＲＮＡをコードし、Ｂａｘ．ａｌｐｈａと命名される別の転写体を生産する。Ｂｃｌ−２、およびＢｃｌ−２ファミリーのいくつかの他のメンバーのように、Ｂａｘタンパク質は高度に保存された領域、ＢＨ１、ＢＨ２およびＢＨ３ドメインを有し、これらのタンパク質の配列のヒドロパシー分析は、それらのＣ−末端における疎水性膜貫通セグメントの存在を示す（Ｏｌｔｖａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。
【００１９】
Ｂａｘはいずれの見掛けの組織特異性もなくして広く発現されている。しかしながら、アポトーシスの誘導については、Ｂａｘはミトコンドリアに移動し、その結果、ミトコンドリアの機能不全およびチトクロームｃの放出がもたらされ、これは引き続いてカスパーゼ経路を活性化する（Ｈｓｕ  ａｎｄ  Ｙｏｕｌｅ，１９９７；Ｗｏｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。このトランスロケーションプロセスは迅速であって、アポトーシスの初期の段階で起こる（Ｗｏｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。アデノウイルス遺伝子導入を通じてのヒト卵巣癌におけるＢａｘの選択的過剰発現の結果、イン・ビボにて有意な腫瘍細胞殺傷がもたらされた（Ｔａｉ  ｅｔｔ  ａｌ．，１９９９）。ヒト肺癌腫からの培養された細胞系におけるバイナリーアデノウイルス系によるＢａｘ遺伝子の過剰発現の結果、カスパーゼの活性化、アポトーシスの誘導、および細胞成長の抑制がもたらされる。Ｂａｘ遺伝子を発現するアデノウイルスベクターの腫瘍内注射は、ヌードマウスにおいて確立されたヒト肺癌異種移植片の成長を抑制した（Ｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【００２０】
ＷＯ  ９９／４５１２８およびＡｑｅｉｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）は、細胞−標的化特異性およびアポトーシス−誘導活性を有するキメラタンパク質、特に、ＩＬ２受容体−発現細胞を特異的に標的化し、細胞−特異的アポトーシスを誘導する組換えキメラタンパク質ＩＬ−２−Ｂａｘに向けられる。
【００２１】
ＷＯ  ９９／４９０５９は、ヒト腺癌によって発現される腫瘍−関連エピトープを検出するための、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシンＡ（ＰＥ）よりなるキメラトキシンに関する。
【００２２】
ＷＯ  ９７／４６２５９は、新形成細胞に向けられた標的化部位および細胞殺傷部位を含む標的化キメラトキシンに関する。具体的な例において、キメラトキシンは、ゴナドトロピン放出ホルモンホモログおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシンＡを含む。
【００２３】
ＷＯ  ９７／２２３６４はアレルギー反応の標的化治療に取り組み、それにより、キメラサイトトキシンＦｃ２’−３−ＰＥ４０は、ＦｃεＲＩ受容体を発現する細胞の標的化排除に向けられる。
【００２４】
いくつかのキメラタンパク質組成物が記載されているが、細胞の殺傷を含む改良された療法では他の方法および組成物が必要とされる。
【非特許文献１】Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ＭＧ，Ｃｈｅｕｎｇ  Ｌ，Ｍｕｒｒａｙ  ＪＬ，Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅｗ  Ｒ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ−ａｌｐｈａ）：ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｍｍｕｎ，１９９１年，第３巻，ｐ．２１−７
【非特許文献２】Ｍｕｊｏｏ  Ｋ，Ｃｈｅｕｎｇ  Ｌ，Ｍｕｒｒａｙ  ＪＬ，Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ＭＧ．，「Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，ｔｉｓｓｕｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ＺＭＥ−ｇｅｌｏｎｉｎ．」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，１９９５年，第４０巻，ｐ．３３９−３４５
【非特許文献３】Ｈａｎａｄａ，Ｔ．，およびＹｏｓｈｉｍｕｒａ，Ａ．，「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．」，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．，２００２年，第１３巻，ｐ．４１３−４２１
【非特許文献４】Ｔａｍａｎｉｎｉ，Ａ．，Ｒｏｌｆｉｎｉ，Ｒ．，Ｎｉｃｏｌｉｓ，Ｅ．，Ｍｅｌｏｔｔｉ，Ｐ．，およびＣａｂｒｉｎｉ，Ｇ．，「ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｅ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅ  ＩＣＡＭ−１  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｈａｓｅ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．」，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００３年，第３０７巻，ｐ．２２８−２４２
【非特許文献５】Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ＭＧ，Ｈｏｒｎ  ＳＡ，Ｃｈｅｕｎｇ  ＬＨ．，「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆｕｓｉｏｎ  ｔｏｘｉｎ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ−ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ．」，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，２０００年，第８８巻，ｐ．２６７−７３
【非特許文献６】Ａｄａｍｓ，Ｇ．Ｐ．，およびＳｃｈｉｅｒ，Ｒ．，「Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９９年，第２３１巻，ｐ．２４９−２６０
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２５】
（発明の要旨）
本発明は、一般には、例えば、標的化部位および抗−細胞増殖因子を含むキメラ分子を用いる癌の治療に関する。抗−細胞増殖因子は、例えば、細胞傷害性剤、あるいはプロ−アポトーシス誘導部位としてさらに規定することができる。かくして、キメラポリペプチドは少なくとも２つの部位よりなり：１つの部位は、例えば、細胞の殺傷のための効果的な成分であり（サイトトキシンまたはプロ−アポトーシス部位）；第二の部位は、例えば、注目する細胞に対して殺傷成分を標的化するためのキメラポリペプチドの送達成分である。具体的な例において、注目するいずれの細胞も適当な標的化部位で標的化することができるが、具体的な例においては、細胞標的化部位は癌細胞を標的とする。本発明のいくつかの具体例において、該部位の少なくとも１つ、好ましくは双方はヒト起源のものであり、これは、キメラポリペプチドが投与される個体からの免疫応答を排除する。キメラ分子の二部成分はいずれいかの適当な方法で会合させることができるが、特別な具体例において、それらは一緒にコンジュゲートされる。いくつかの具体例において、２つの成分は相互に対してコンジュゲートされ、他方、他の具体例において、ポリペプチドは融合タンパク質を生産するように組換えにより作成される。コンジュゲーテッド化合物は、例えば、リンカーによって相互に結合させることができる。
【００２６】
本発明の特別な具体例において、細胞傷害性剤はＴＮＦ−αである。この分子は標的化キメラ分子の関係で先に記載したが、本発明は、それらを、例えば、化学療法−抵抗性癌細胞に対する化学感度の回復；Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ−およびＮｆ−κＢ−過剰発現癌の治療；ＴＮＦ−抵抗性癌におけるアポトーシスの誘導；およびＮｆ−κＢシグナリングの中断を介して作用する化学療法剤と共に組成物を投与することを含めた新規な治療方法で利用する。
【００２７】
本発明のもう１つの特別な具体例において、細胞−殺傷部位はプロ−アポトーシス因子である。いずれかの適当なプロ−アポトーシス因子を本発明で利用することができるが、特別な具体例において、プロ−アポトーシス因子は、例えば、Ｂａｘ、グランザイムＡ、またはグランザイムＢである。
【００２８】
いずれの適当な細胞−特異的標的化部位の本発明のキメラ分子で使用することができるが、特別な具体例において、それは１以上の特定の細胞−表面抗原、細胞マーカー、成長因子、ホルモンまたはサイトカインに対する抗体を含む。１つの態様において、キメラ組成物の標的化部位は、例えば、単一鎖抗体、抗体断片、Ｆａｂ、ミニ−ボディー、ダイアボディー、トリアボディー等のような新規な構築体のような抗体である。標的化分子の具体的な例は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕの細胞表面ドメインを認識する単一鎖抗体を含むｓｃＦｖ２３、Ｃ６．５またはＭＬ３−９；抗−ｇｐ２４０抗原単一鎖Ｆｖを含むｓｃＦｖＭＥＬ；ＡＦ−２０抗原に対する単一鎖抗体を含むｓｃＦｖＡＦ２０；およびＣＤ−３３抗原を認識するヒト／マウスキメラ抗体ＨｕＭ１９５を含む。
【００２９】
本発明の組成物は、例えば、肺、乳房、脳、前立腺、脾臓、膵臓、頸部、卵巣、頭部および首、著駆動、肝臓、皮膚、腎臓、白血病、骨、精巣、結腸、膀胱等を含めたいずれかの適当な癌に向けることができる。本発明の特別な具体例において、それらは、特定の分子病因および／または遺伝子型を有する癌に向けられる。特定の具体例において、癌病因は、それを、特定の療法に対して少なくとも最初は難治性とし、および／またはそれを１以上の療法に対する抵抗性を発生させるようにできる。さらなる特定の具体例において、治療すべき癌はＨｅｒ−２／ｎｅｕ−過剰発現であり；ＴＮＦ−α−抵抗性であり；Ｎｆ−κＢ−過剰発現であり；Ｎｆ−κＢ−シグナリング血管であり、ＥＧＦ受容体のアップレギュレーションを含む；多薬物抵抗性タンパク質（ＭＤＲ、またはＭＲＰ）のアップレギュレーションを含み；および／または、例えば、５−フルオロウラシルのような１以上の慣用的な化学療法に対して抵抗性である。さらに、本発明の組成物は、Ａｋｔリン酸化をダウンレギュレートすることによって；例えば、カスパーゼ−８、カスパーゼ−３、および／またはＡＤＰ−リボースポリメラーゼの切断を介するように、アポトーシスを誘導することによって；カスパーゼ−３の活性化を誘導することによって；Ｂｃｌ−２のような抗−アポトーシスタンパク質をダウンレギュレートすることによって；ＩκＢαを分解することによって；ｐ３８  ＭＡＰキナーゼを活性化することによって；ＳＡＰＫ／ＪＮＫ経路を活性化することによって；および／またはアポトーシス核を誘導することによるなどして、区別されるメカニズムを通じて作用することができる。
【００３０】
本発明の特別な具体例において、ＨＥＲ−２／ｎｅｕの細胞−表面ドメインを認識する単一鎖抗体ｓｃＦｖ２３に連結されたＴＮＦを含む免疫サイトカインｓｃＦｖ２３／ＴＮＦを利用する。本発明者らは、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦが、化学療法に対して高度に抵抗性であり、かつ例えば、膵臓腫瘍および乳癌のようなＨＥＲ−２／ｎｅｕを過剰発現する癌に対して効果的であることを示す。さらに詳しくは、ヒト膵臓細胞系のパネルを用い、本発明者らは、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＥＲ−１、ＴＮＦＲ−１、ＴＮＦＲ−２およびｐ−Ａｋｔの相対的発現を特徴付け、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ、ＴＮＦ、およびいくつかのクラスの化学療法剤に対する細胞のイン・ビトロ応答を評価した。ＨＥＲ−２／ｎｅｕおよびＴＮＦＲ−１の発現レベル、およびテストした剤に対する細胞応答の間には相関があって。例えば、最高レベルのＨＥＲ−２／ｎｅｕおよびＴＮＦＲ−１を発現する膵臓Ｌ３．６ｐｌ細胞は、慣用的な化学療法剤に対して最も感受性であり、他方、比較的低いレベルのＨＥＲ−２／ｎｅｕおよびＴＮＦＲ−１を発現するカパン（Ｃａｐａｎ）−２細胞はつとした薬物に対して最も抵抗性であった。ドキソルビシン、ゲムシタビンおよびｓｃＦｖ２３／ＴＮＦは最も活性な細胞傷害性剤であり、他方、全ての細胞系は５−フルオロウラシル、シスプラシン、エトポシド、およびＴＮＦに対して相対的に抵抗性であった。組合せ実験は、５−フルオロウラシルとのｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの均一な相乗効果、および全ての膵臓細胞系におけるドキソルビシンとのｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの拮抗効果を示した。メカニズムの研究は、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦおよび５−ＦＵ組合せが、特異的に、生存タンパク質ホスホ−Ａｋｔおよび抗−アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２双方のダウンレギュレーションをもたらしたことを示した。加えて、該組み合わせは、例えば、カスパーゼ−８、カスパーゼ−３、およびポリＡＤＰ−リボースポリメラーゼの切断を通じてアポトーシスを誘導した。従って、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ融合トキシンを用いるＨＥＲ−２／ｎｅｕ発現腫瘍細胞の標的化は、特に、例えば、５−フルオロウラシルのような化学療法剤と組み合わせて用いた場合に、膵臓癌のような癌についての効果的な療法である。
【００３１】
乳癌におけるＨＥＲ−２／ｎｅｕ発現およびＴＮＦ抵抗性の間の相関を分析するために、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの細胞傷害性効果に関連するユニークなシグナリング経路も特徴付けた。ＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞は３．３倍より高いレベルのＨＥＲ−２／ｎｅｕを発現し、他方、ＳＫＢＲ−３／Ｌ細胞は、各々、２．３倍および４倍より高いレベルのＴＮＦ受容体−１およびＴＮＦ受容体−２を発現した。低−ＨＥＲ−２／ｎｅｕ−発現ＳＫＢＲ−３／Ｌ細胞と比較して、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ−過剰発現ＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞はＴＮＦそれ自体に対して完全に抵抗性であったが、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦに対して感受性であった。ＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞のｓｃＦｖ２３／ＴＮＦでの処理の結果、Ａｋｔリン酸化のダウンレギュレーション、およびカスパーゼ−８、カスパーゼ−３、およびポリＡＤＰ−リボースポリメラーゼの切断を少なくとも介する誘導されたアポトーシスがもたらされた。ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−誘導細胞傷害性は、本発明のいくつかの具体例において、カスパーゼ−３の活性化に依存した。他方、ｓｃＦｖ２３およびＴＮＦ単独はＡｋｔのリン酸化を活性化したが、カスパーゼの活性化およびアポトーシスに対しては効果を有しなかった。従って、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦはＴＮＦと比較して区別される作用メカニズムを有し、ＴＮＦに対して抵抗性であるＨＥＲ−２／ｎｅｕ−過剰発現癌細胞に対して効果的である。
【００３２】
本発明の他の例示的な融合トキシンは、融合構築体ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦを含み、これは、ヒトＴＮＦに連結された抗−ｇｐ２４０抗原単一鎖Ｆｖを含む。本発明者らは、ヒトメラノーマ細胞に対するＴＮＦと比較して、抗メラノーマ融合トキシンｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの細胞傷害性効果の分子メカニズムを特徴付けた。特に、ＴＮＦそれ自体に対する細胞抵抗性を克服する構築体の能力の基礎となるメカニズム、特に、ＮＦ−κＢおよびＪＮＫ、ならびにカスパーゼ−３およびＰＡＲＰを含めたアポトーシスメディエーターのようなＴＮＦ−誘導シグナリングに関与する分子経路が同定された。さらに、ＴＮＦおよびｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ双方で処理された細胞のｃＤＮＡマイクロアレイ分析は、ＴＮＦおよびｓｃＦｖＭＥＬ／ＰＮＦの相の細胞傷害性活性のメカニズムのユニークな差を同定した。
【００３３】
特に、本発明者らは、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ融合構築体がＴＮＦ単独と比較して抗原陽性Ａ３７５−Ｍ細胞に対してより細胞傷害性であり（各々、Ｉ．Ｃ．５０〜０．１ｎＭ  ｖｓ．１．４ｎＭ）、ＴＮＦに対して完全に抵抗性であるＡＡＢ−５２７細胞に対してやはり細胞傷害性であった（Ｉ．Ｃ．５０〜２０ｎＭ）ことを示す。ＴＮＦでの、またはｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦでの処理は、Ａ３７５−ＭおよびＡＡＢ−５２７細胞双方において、時間依存的に、ＩκＢαの分解、およびｐ３８  ＭＡＰキナーゼの活性化を誘導した。ＳＡＰＫ／ＪＮＫ経路の迅速な活性化は、ＴＮＦで処理されたＴＮＦ−抵抗性ＡＡＢ−５２７細胞で開発されたが、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦでの処理の後には観察されなかった。従って、本発明の具体的な例において、ＳＡＰＫ／ＪＮＫの活性化はＴＮＦに対する観察された細胞抵抗性に寄与する。細胞傷害性データと合致して、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦは、Ａ３７５−ＭおよびＡＡＢ−５２７細胞双方においてＰＡＲＰ切断およびアポトーシス効果を誘導した。従って、ＴＮＦは、Ａ３７５−Ｍ細胞においてのみ、ＰＡＲＰ切断およびアポトーシスを誘導した。
【００３４】
これらの実験、および主として細胞表面受容体−連結シグナリング、細胞内シグナリングカスケード、細胞周期事象、およびヌクレオチド代謝調節に関与する遺伝子を含めた、ＴＮＦ処理によってではなく、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦによってメラノーマ細胞においてダウンレギュレート、またはアップレギュレートされた多くの遺伝子があるという証明に基づいて、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦは、ＴＮＦと比較してユニークな作用メカニズムを有する。より具体的には、融合構築体はＴＮＦ抵抗性を克服することができる。なぜならば、それは、ＴＮＦ曝露後に観察されたのと比較して、アポトーシスを誘導し、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ細胞生存をブロックし、遺伝子のユニークな相補体を活性化するからである。
【００３５】
本発明のもう１つの具体例において、キメラ分子はアポトーシス−誘導剤および標的化部位を含む。細胞を殺傷することができるいずれの特定のアポトーシス−誘導剤も本発明で使用することができるが、具体的な例において、アポトーシス−誘導剤は、例えば、グランザイムＢのようなグランザイムである。標的化部位は、該部位が癌細胞に対してキメラ分子を実質的に標的化するようないずれかの適当な種類とすることができる；特別な具体例において、標的化部位は、例えば、１以上の特定の細胞マーカー、成長因子、ホルモン、またはサイトカインに対する抗体である。１つの態様において、キメラ組成物の標的化部位は、単一鎖抗体、抗体断片、Ｆａｂ等のような抗体である。
【００３６】
特定の具体例において、本発明者らは、ヒトプロ−アポトーシスセリンプロテアーゼグランザイムＢ（ＧｒＢ）、およびメラノーマ細胞系および新鮮な腫瘍資料の大部分（８０％）に存在する高分子量糖タンパク質であるｇｐ２４０抗原を認識する単一鎖抗体ｓｃＦｖＭＥＬを含む、新規な融合構築体ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬを利用した。具体的には、ＥＬＩＳＡおよびフローサーイトメトリーを用いることによって、異なるメラノーマ細胞上でのｇｐ２４０抗原の発現を調べた。ｇｐ２４０はＡ３７５、ＴＸＭ−１８Ｌ、ＴＸＭ−１３およびＭＥＬ−５２６メラノ−マ細胞に存在し、しかしながら、ＴＸＭ−１メラノーマ細胞では非常に低レベルの発現があった。ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ融合構築体は、抗−ｓｃＦｖＭＥＬ抗体によって検出されるようにＴＭＸ−１細胞に対してではなく、抗レベルのｇｐ２４０抗原Ａ３７５、ＴＸＭ−１８Ｌ、ＴＸＭ−１３およびＭＥＬ−５２６に対して結合した。融合構築体は、１μＭまでの用量に応じて、対数期Ａ３７５細胞に対して〜２０ｎＭ、ＭＥＬ−５２６細胞に対して〜５０ｎＭ、ＴＸＭ−１８Ｌに対して〜１００ｎＭ、ＴＸＭ−１３細胞に対して〜２００ｎＭのＩ．Ｃ．５０、ならびにＴＸＭ−１および非−標的ＳＫＢＲ３細胞に対して最小の細胞傷害性を示した。
【００３７】
比較により、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬの細胞傷害性効果は、これらのメラノーマ細胞に対して、もう１つの融合トキシン、ｓｃＦｖＭＥＬ／ｒＧｅｌのそれとほとんど同一であった。７２時間でのＡ３７５細胞へのＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬおよび化学療法剤（例えば、ドキソルビシン、ビンクリスチン硫酸、エトポシド、シスプラチンまたはシトラビン）の共投与は、ドキソルビシン、ビンクリスチンまたはシスプラチンでの相乗的抗腫瘍活性、およびエトポシドまたはシトラビンとの組合せにおいて相加的効果を示した。ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬでの６時間の予備処理、続いての、これらの化学療法剤への７２時間の共曝露は、薬物での予備処理、続いての融合構築体での共曝露と比較して、有意に阻害された成長を示した。さらに、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ予備処理無しと比較して、Ａ３７５細胞をＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬで６時間予備処理し、続いて、化学療法剤で７２時間処理した場合に、種々の化学療法剤の細胞傷害性は有意に増大した（ｐ＜０．０１）。化学療法剤の効果は、ｇｐ２４０抗原−陽性標的化細胞に対する６時間のＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬでの予備処理によって感受性化することができた。腫瘍組織は、ＴＵＮＥＬアッセイによって評価して、Ａ３７５異種移植片腫瘍を担うマウスへの２４時間投与後にＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ処理群においてアポトーシス核を呈した。ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬの局所化または内部化は、抗−ＧｒＢまたは抗−ｓｃＦｖＭＥＬ抗体いずれかによって検出された免疫組織学染色によって評価して、腫瘍組織で観察された。Ａ３７５腫瘍を担うマウスには、１日毎にＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬまたは生理食塩水いずれかを５回投与し（静脈内尾静脈、３７．５ｍｇ／ｋｇ）、腫瘍用量を４２日間測定した。生理食塩水−処理対照腫瘍はこの期間にわたって５０ｍｍ３から１２００ｍｍ３に増大した。ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬで処理した腫瘍は５０ｍｍ３から２００ｍｍ３に増加した。かくして、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ融合構築体は印象的抗腫瘍活性を示し、ヒトメラノーマ細胞の化学療法に対する感度を増強する。
【００３８】
本発明の１つの具体例において、細胞−特異的標的化部位および抗−細胞増殖部位を含む治療上有効量のキメラ分子を個体に投与することを含む、該個体において１以上の化学療法−抵抗性癌細胞に対して化学感受性を付与し、それを回復する方法がある。具体的な例において、細胞−特異的標的化部位は癌細胞−標的化部位としてさらに規定される。さらなる具体的な例において、癌細胞−標的化部位は、例えば、抗体、成長因子、ホルモン、ペプチド、アプタマー、サイトカイン、インターフェロン、ビタミン、またはその混合物としてさらに規定される。該抗体は、例えば、全長抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ、単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ミニボディー、ダイアボディー、トリアボディー、またはその混合物としてさらに規定することができる。特別な具体例において、該抗体は、例えば、ｓｃＦｖ２３のような抗−ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗体である。追加の具体的な例において、該抗体は、例えば、ｓｃＦｖＭＥＬを含むもののような抗−ｇｐ２４０抗原抗体である。
【００３９】
他の具体的な例において、癌細胞−標的化部位は、例えば、トランスフォーミング成長因子、表皮成長因子、インスリン−様成長因子、線維芽細胞成長因子、ヘレグリン、血小板−由来成長因子、血管内皮成長因子、または低酸素症誘導因子のような１以上の成長因子を含む。追加の具体的な例において、癌細胞−標的化部位はヒト絨毛ゴナドトロピン、ゴナドトロピン放出ホルモン、アンドロゲン、エストロゲン、甲状腺−刺激ホルモン、卵胞−刺激ホルモン、黄体化ホルモン、プロラクチン、成長ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、抗利尿ホルモン、オキシトシン、甲状腺刺激ホルモン−放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、皮質刺激−放出ホルモン、ソマトスタチン、ドーパミン、メラトニン、チロキシン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、グルココルチコイド、ミネラロコルチコイド、アドレナリン、ノルアドレナリン、プロゲステロン、インスリン、グルカゴン、アミリン、エリスロポエチン、カルシトリオール、カルシフェロール、心房−ナトリウム利尿性ペプチド、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、ニューロペプチドＹ、グレリン、ＰＹＹ３−３６、インスリン−様成長因子−１、レプチン、トロンボポエチン、アンジオテンシノーゲン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５および／またはＩＬ−３６のような１以上の成長因子を含む。
【００４０】
本発明のもう１つの具体例において、癌細胞−標的部位は、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、顆粒球−コロニー刺激因子、マクロファージ−コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、白血病阻害因子、エリスロポエチン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、オンコスタチンＭ、白血病阻害因子、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＬＴ−β、ＣＤ４０リガンド、Ｆａｓリガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、４−１ＢＢＬ、ＴＧＦ−β、ＩＬ  １α、ＩＬ−１  β、ＩＬ−１  ＲＡ、ＭＩＦ、ＩＧＩＦ、および／またはその混合物のような１以上のサイトカインを含む。
【００４１】
本発明の特別な具体例において、抗−細胞増殖部位は、アポトーシス−誘導部位または細胞傷害性剤としてさらに規定される。アポトーシス−誘導部位は、例えば、グランザイム、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー、チトクロームＣ、カスパーゼ、またはその組合せであってよい。例示的なグランザイムは、例えば、グランザイムＡ、グランザイムＢ、グランザイムＣ、グランザイムＤ、グランザイムＥ、グランザイムＦ、グランザイムＧ、グランザイムＨ、グランザイムＩ、グランザイムＪ、グランザイムＫ、グランザイムＬ、グランザイムＭ、グランザイムＮ、またはその組合せを含む。他の具体的な例において、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーは、例えば、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、Ｈｒｋ、Ｂｏｋ、またはその組合せである。
【００４２】
追加の具体的な例において、該カスパーゼは、例えば、カスパーゼ−１、カスパーゼ−２、カスパーゼ−３、カスパーゼ−４、カスパーゼ−５、カスパーゼ−６、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０、カスパーゼ−１１、カスパーゼ−１２、カスパーゼ−１３、カスパーゼ−１４、またはその組合せである。具体的な例において、該細胞傷害性剤は、例えば、ＴＮＦ−α、ゲロニン、プロジギオシン、リボソーム−阻害タンパク質（ＲＩＰ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエンドトキシン、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅトキシンＢ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ＶａｃＡ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ  ＹｏｐＴ、ビオラセイン、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、インフルレン、ジフテリアトキシン、マイトゲリン、リシン、ボツリヌストキシン、コレラトキシン、サポリン６、またはその組合せである。
【００４３】
細胞傷害性剤は、本発明の具体的な例において、組換えであってよい。
【００４４】
本発明の特別な具体例において、細胞−特異的標的化部位および抗−細胞増殖部位は化学的にコンジュゲートされる。さらなる具体例において、細胞−特異的標的化部位および抗−細胞増殖部位は、融合ポリペプチドに含まれ、具体的な例においてそれらは、例えば、リンカーによって連結される。
【００４５】
本発明の具体的な例において、化学療法−抵抗性癌細胞は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現、ＴＮＦ−αに対して抵抗性、Ｎｆ−κＢ−過剰発現、Ｎｆ−κＢシグナリング−欠陥、またはその組合せとしてさらに規定され、具体的な例において、それらは例えば、アルキル化剤、ニトロソ尿素、抗代謝産物、抗腫瘍抗体、植物アルキロイド、タキサン、ホルモン剤、またはその組合せのような１以上のクラスの化学療法剤に対して抵抗性であり得る。具体的な例において、化学療法−抵抗性細胞は、例えば、５−フルオロウラシル、シスプラチン、エトポシド、ドキソルビシン、ゲムシタビン、またはその組合せの１以上に対して抵抗性である。
【００４６】
本発明の特別な具体例において、該方法は、さらに、化学療法、外科的処置、放射線、遺伝子療法、ホルモン療法、免疫療法、またはその組合せのような、個体に対するさらなる癌療法を含む。
【００４７】
特別な具体例において、該さらなる療法およびキメラ分子は同時に投与され、あるいは順次に投与される。例えば、キメラ分子は化学療法に先立って投与することができ、および／またはキメラ分子は化学療法に引き続いて投与することができる。具体的な例において、化学療法およびキメラ分子は癌細胞に対して相乗的効果を供し、あるいはそれらは癌細胞に対して相加的効果を供する。キメラ分子は、例えば、ネオアジュバント外科的療法として、またはポストアジュバント外科的療法としてさらに規定することができる。具体的な例において、キメラ分子はｓｃＦｖＭＥＬ／ＧｒＢ、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−α、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ−α、またはその組合せである。
【００４８】
本発明の追加の具体例において、治療上有効量のキメラ分子を個体に投与することを含む、個体における１以上の癌細胞を化学療法に対して感受性化する方法があり、該キメラ分子は細胞−標的化部位および抗−細胞増殖部位を含む。癌細胞はＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現、ＴＮＦ−α−抵抗性、Ｎｆ−κＢ−過剰発現、Ｎｆ−κＢシグナリング−欠陥；またはその組合せとしてさらに規定することができる。癌細胞は、例えば、５−フルオロウラシル、シスプラチン、エトポシド、ドキソルビシンまたはゲムシタビンのような化学療法に対して抵抗性であってよい。
【００４９】
本発明のもう１つの具体例において、治療上有効量のキメラ分子を個体に投与することを含む、個体において１以上のＴＮＦ−抵抗性癌細胞においてアポトーシスを誘導する方法があり、該キメラ分子は細胞−特異的標的化部位および抗−細胞増殖部位を含む。１以上の細胞におけるアポトーシスの誘導は、以下の：ＳＡＰＫ／ＪＮＫシグナル経路のブロック；Ａｋｔリン酸化の阻害；Ｂｃｌ−２のダウンレギュレーション；カスパーゼ−８の切断；カスパーゼ−３の切断；ポリＡＤＰ−リボースポリメラーゼの切断；ＩκＢ−αの分解；およびその組合せの１以上を含むものとしてさらに規定することができる。
【００５０】
本発明の追加の具体例において、治療上有効なキメラ分子を個体に投与することを含む、個体における１以上のＨＥＲ−２／ｎｅｕ−過剰発現癌細胞においてアポトーシスを誘導する方法があり、該キメラ分子が細胞−特異的標的化部位および抗−細胞増殖部位を含む。１以上の細胞においてアポトーシスを誘導することが、以下の：ＳＡＰＫ／ＪＮＫシグナル経路のブロック；Ａｋｔリン酸化の阻害；Ｂｃｌ−２のダウンレギュレーション；カスパーゼ８の切断；カスパーゼ−３の切断；ポリＡＤＰ−リボースポリメラーゼの切断；ＩκＢ−αの分解；およびその組合せの１以上を含むものとしてさらに規定される。
【００５１】
追加の具体例において、治療上有効量のキメラ分子を個体に投与することを含む、個体における１以上のｇｐ２４０抗原−陽性細胞においてアポトーシスを誘導する方法があり、該キメラ分子は細胞−特異的標的化部位および抗−細胞増殖部位を含む。
【００５２】
本発明のもう１つの具体例において、治療上有効量のキメラ分子を個体に投与することを含み、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ過剰発現およびＮｆ−κＢ過剰発現である個体において癌を治療する方法があり、該キメラ分子は細胞−特異的標的化部位および抗−細胞増殖部位を含む。
【００５３】
本発明の追加の具体例において、治療上有効量の少なくとも１つの化学療法剤を個体に投与することを含む、個体において癌を治療する方法があり、ここで、該剤はＮＦ−κＢシグナリング、およびキメラ分子によって中断することによって作用し、該キメラ分子は細胞−特異的標的化部位および抗−細胞増殖部位を含む。具体的な例において、該化学療法剤は、例えば、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、カペシタビン、サイトシン、アラビノシド、フルオキシウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、メトトレキセート、またはチオグアニンのような抗代謝産物である。
【００５４】
本発明の追加の具体例において、細胞表面の１以上のタンパク質を含めた、細胞の１以上のタンパク質のような、細胞を標的化するアプタマーを含む組成物がある。該アプタマーは細胞−特異的標的化部位と考えられることができ、特別な具体例において、それは、それに連結されたまたはコンジュゲートされたのような抗−細胞増殖部位と会合する。アプタマーは本発明のキメラ分子に連結された、またはコンジュゲートされたのように、それに会合することができ、ここで、該キメラ分子それ自体は細胞−特異的標的化部位および抗−細胞増殖部位を含む。
【００５５】
さらなる具体例において、治療上有効量のアプタマー組成物は組成物を個体に投与して、個体における１以上の化学療法−抵抗性癌細胞に対して化学的感受性を付与し、またはそれを回復する。アプタマー組成物を用いて、治療上有効量の組成物を個体に投与することによって、個体における１以上の癌細胞を化学療法に対して感受性とすることもできる。アプタマー組成物を使用して、個体における１以上のＴＮＦ−抵抗性癌細胞で、個体における１以上のＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現癌細胞において、および／または個体における１以上のｇｐ２４０抗原−陽性細胞においてアポトーシスを誘導することもできる。追加の具体例において、アプタマー組成物は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現およびＮＦ−κＢ過剰発現である癌細胞を有する個体に投与するのに利用される。
【００５６】
前記したのは、以下の本発明の詳細な記載がよりよく理解できるように、本発明の特徴および技術的利点をむしろ広く概略を説明した。本発明の追加の特徴および利点を以後記載し、それは、本発明の特許請求の範囲の主題を形成する。開示された概念および具体的な例は、本発明の同一目的を行うための他の構造を改変し、または設計するための基礎として容易に利用することができるのは当業者に認識されるべきである。また、そのような同等な構成は、添付の請求の範囲に記載された発明の精神および範囲を逸脱することがないのも当業者によって認識されるべきである。さらなる目的および利点と共に、その組織化および操作の方法双方に関する、本発明の特徴であると考えられる新規な特徴は、添付の図面と一緒に考慮して、以下の記載から良好に理解されるであろう。しかしながら、図面の各々は説明および記載のみの目的で供され、本発明の限定の定義として意図されないことは明示的に理解されるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５７】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で用いるように、「ある」は１以上を意味することができる。特許請求の範囲においてここで用いるように、用語「含む」と組み合わせて用いる場合、用語「ある」は１以外の１以上を意味することができる。本明細書中で用いるように、「もう１つの」は、少なくとも第二またはそれ以上を意味することができる。本発明のいくつかの具体例は、本発明の１以上のエレメント、方法工程、および／または方法よりなることができるか、あるいはそれより実質的になることができる。本明細書中に記載されたいずれかの方法または組成物は、本明細書中に記載されたいずれかの他の方法または組成物に関して実施することができる。
【００５８】
Ｉ．定義
本明細書中で用いる用語「ＳＡＰＫ／ＪＮＫシグナル経路のブロック」とは、該経路の１以上の成分の機能を少なくとも部分的に阻害すること、該経路の１以上の成分の半減期および／または生物学的活性を低下させること、該経路の１以上の成分の発現を低下させること、等をいう。ＳＡＰＫ／ＪＮＫシグナル経路の成分は当該分野で知られているが、例示的な具体例は、例えば、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ、ｃ−Ｊｕｎ、ＭＫＫ４、ＳＥＫ１、ｐ５４／４６  ＺＡＰ−７０、ＮｆＡＴ、ＭＥＫＫ１、ＧｒＢ２、ＭＥＫＫ  ４／７、およびビンクリン（Ｖｉｎｃｕｌｉｎ）を含む。
【００５９】
本明細書中で用いる用語「化学感受性」とは、癌療法として効果的に治療される１以上の細胞の能力をいう。特に、それは破壊される、あるいは１以上の化学療法による少なくとも低下した増殖を有する１以上の細胞の能力をいう。
【００６０】
本明細書中で用いる用語「化学療法抵抗性」とは、１以上の化学療法剤に対して難治性である癌細胞の能力をいう。１つの具体的な例において、該１以上の化学療法は該１以上の剤に対して最初は効果的（感受性）であり、他方、別の具体例においては、該１以上の化学療法は癌細胞に対して決して実質的に効果的ではなかった。
【００６１】
用語「細胞傷害性」とは、個体腫瘍のような腫瘍におけるを含めた、癌細胞のような１以上の細胞に対して毒性または歯快適効果を有する剤をいう。別の具体例において、該剤は、白血病またはリンパ腫を含めた、非−固体腫瘍におけるような、腫瘍におけるのではない癌細胞に対して破壊的である。
【００６２】
用語「Ａｋｔリン酸化の阻害」とは、１以上の分子に対するＡｋｔのリン酸化を少なくとも部分的にブロックすることをいう。該阻害は、例えば、ホスホ−Ａｋｔに対する抗体でのウェスタンブロットによるような、当該分野におけるいずれかの適当な方法によって測定することができる。
【００６３】
用語「Ｂｃｌ−２のダウンレギュレーション」とは、Ｂｃｌ−２の発現レベルを減少させることをいう。該レベルは、例えば、ウェスタンまたはノーザンによるのを含めた、当該分野においていずれかの適した方法によって測定することができる。
【００６４】
本明細書中で用いる用語「グランザイム」は、細胞のサイトゾルへの進入に際して、アポトーシスおよび／または核ＤＮＡ断片化を誘導する細胞傷害性リンパ球の顆粒からの酵素と定義される。具体的な例において、グランザイムはリンパ球セリンプロテアーゼである。いくつかの具体例において、グランザイムは全長であり、他方、他の具体例において、グランザイムは部分的である。
【００６５】
本明細書中で用いる用語「ＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現」とは、同一組織の対応する非−癌性細胞よりも２倍より高い特定の細胞における、ＨＥＲ−２／ｎｅｕの発現をいう。加えて、「ＨＥＲ−２／ｎｅｕの過剰発現に関連する癌」は、本明細書中においては、体の同一部分からの非−癌性組織よりもより多くのＨＥＲ−２／ｎｅｕを含む癌性組織をいう。ＨＥＲ−２／ｎｅｕの発現レベルは、例えば、ウェスタンブロット、ノーザンブロット、または定量的ＦＩＳＨによるような、当該分野におけるいずれかの適当な方法によって測定することができる。
【００６６】
本明細書中で用いる用語「免疫サイトカイン」とは、抗体に融合したサイトカインを含む組換え剤のクラスをいい、これらの構築体は、それらの生物学的効果が特異的細胞を標的化し、非−標的毒性を妨げるように再度仕向けるのに有用である。
【００６７】
本明細書中で用いる用語「ＮＦ−κＢ過剰発現」とは、同一組織の対応する非−癌性細胞よりも２倍より高い特定の細胞における、ＮＫ−κＢの発現をいう。加えて、「ＮＦ−κＢの過剰発現に関連する癌」とは、本明細書中においては、体の同一部分からの非−癌性組織よりも多くのＮＦ−κＢを含む癌性組織をいう。ＮＦ−κＢの発現レベルは、ウェスタンブロット、ノーザンブロット、または定量的ＦＩＳＨによるような、当該分野におけるいずれかの適当な方法によって測定することができる。
【００６８】
本明細書中で用いる用語「化学療法に対する感受性」とは、１以上の化学療法剤によって治療できることをいい、具体的な例において、１以上の特定の化学療法剤によって治療できる。
【００６９】
ＩＩ．本発明
伝統的な化学療法は、病気のしばしば薬物−抵抗性の特徴により特定の癌を治療する極端に効率的でない手段であり得る。腫瘍成長および転移を媒介する分子事象の増大する理解は、抗率を最大化し、かつ正常な組織に対する毒性を最小化する二重の希望を供する合理的に設計された標的化療法の開発に導いた（Ａｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。近年、含量方における戦略は、一般に、毒性の非特異的剤の最大許容用量の使用、ならびに種々の生物学的経路を介して腫瘍−関連分子を特異的に標的化する新しい剤の範囲の調査であった。アポトーシス経路を直接的に変調するアプローチは、例えば、メラノーマにおける新しい薬物開発の点で特に興味がある。メラノーマ細胞におけるアポトーシスメカニズムの活性化は、患者腫瘍の化学療法に対する応答、放射線療法に対する応答、および転移する傾向に直接的に関連付けられてきた。
【００７０】
本発明は、キメラ分子、および癌の治療および／または予防についてのそれらの使用に関する。さらに詳しくは、キメラ分子は、治療に対して難治性である、あるいは化学療法に対する抵抗性を発生する癌で利用される。これらの種類の癌はいずれの種類であっても良いが、特別な具体例においては、それらは、単独で用いた場合、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ過剰発現性、および／またはＴＮＦ−αに対して抵抗性である。具体的な例において、該癌は、例えば、メラノーマ、膵臓癌、または乳癌である。
【００７１】
キメラ分子は、治療部位、および細胞傷害性部位またはアポトーシス−誘導部位いずれかを含めた、少なくとも２つの成分を含む。具体的な例において、標的化部位は抗体断片である。追加の具体的な例において、該細胞傷害性部位はＴＮＦ−αを含み、アポトーシス−誘導部位はグランザイムＡ、またはグランザイムＢのようなグランザイムを含む。
【００７２】
本発明は、化学療法−傾向性細胞に化学感受性を付与し、またはそれを回復させるのに特に有用であり、具体的な例において、キメラ分子は慣用的な化学療法剤組み合わされる。具体的な例において、キメラ分子は、キメラ分子の抗−細胞増殖因子が細胞傷害性剤またはプロ−アポトーシス誘導部位であるか否かにかかわらず、アポトーシス経路を誘導することによる等して、特異的なメカニズムを介して作用する。
【００７３】
特に、本発明のキメラ分子は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰増殖性、ＴＮＦ−αに対して抵抗性、ＮＦ−κＢ欠陥、またはその組合せであるもののような、特定の細胞病因を含む癌を治療するのに有用である。
【００７４】
ＩＩＩ．化学療法に対する抵抗性
化学療法治療において特に関心があるのは、特定の化学療法剤または化学療法剤のクラスに対して治療の間に抵抗性である癌の発生である。該抵抗性は化学療法の最初の治療の間に発現し、または引き続いての化学療法治療の間に出現し得る。別の具体例において、１以上の化学療法は癌に対して決して検出可能に効果的ではない。
【００７５】
本発明の具体的な例において、特定の化学療法剤治療の間に、化学療法によって殺されない細胞のいくつかは突然変異し、特定の薬物に対して抵抗性となる。これらの細胞が一旦増殖すると、化学療法に対して感受性である細胞よりも抵抗性である細胞が存在する。化学療法剤抵抗性の他の具体例において、癌細胞が特定の遺伝子の多くのコピーを生産し、これが、抗癌薬物を効果的でなくするタンパク質の過剰生産をトリガーする場合のように、遺伝子増幅が関係する。他の具体例において、癌細胞は薬物が進むのと実質的に同等の速さで細胞から薬物をポンプで汲み出すことができ、あるいは癌細胞は薬物における接種を停止さえすることができる。なぜならば、細胞壁を横切って薬物を輸送するタンパク質は機能を終止するからである。化学療法−抵抗性メカニズムの追加の具体例において、癌細胞は、どのようにして、いくつかの抗癌薬物によって引き起こされるＤＮＡ破壊を修復するかを学習し、および／または癌細胞は例えば、薬物を不活化するメカニズムを発生させる。
【００７６】
多くの場合において、薬物抵抗性の発生はしばしば組み合わせて与えられる１つの理由であり、これは、いずれかの１つの薬物に対する抵抗性を発生する偶然を低下させることができる。１つの薬物または薬物の群に対する抵抗性の発生に際し、癌は他の薬物に対して抵抗性となるようである。本発明の特別な態様において、本発明の組成物および方法は、１を超える癌治療剤を使用する。例えば、本発明の１を超えるキメラ分子は、癌に対する抵抗性を発生する癌細胞を有することが疑われる個体のような、癌を持つ個体に投与することができ、あるいは、本発明のキメラ分子は、例えば、５−フルオロウラシルのような慣用的な化学療法剤と組み合わせて用いることができる。
【００７７】
ＩＶ．化学療法剤
本発明の具体例において、細胞−特異的標的化部位、およびアポトーシス−誘導部位または細胞傷害性剤いずれかを含むキメラ分子は、１以上の化学療法剤を組み合わせて用いる場合に効果的であり、１以上の化学療法剤に対して癌を感受性とするにおいて効果的であり、化学療法−抵抗性癌に対して感受性を付与し、またはそれを回復するのに効果的であり、あるいはその組合せである。特に、キメラ分子および化学療法剤は癌に対して相加的にまたは相乗的に作用することができる。本明細書中で用いることができる用語（相乗的）とは、それらの個々の効果の総和よりも大きなキメラ分子および化学療法剤の組合せ効果をいう。
【００７８】
本明細書中で用いる用語「化学療法剤」は、以下の例示的クラス：アルキル化剤；ニトロソ尿素：抗代謝産物；抗腫瘍抗生物質；植物アルキロイド（ａｌｋｙｌｏｉｄ）；タキサン；ホルモン剤；および雑多な剤の少なくとも慣用的な化学療法剤に関する。本発明のキメラ分子は癌療法で効果的であるが、本発明の関係では、それらは本明細書中で用いる慣用的な用語「化学療法剤」をいわない。
【００７９】
アルキル化剤は、細胞に存在する条件下で多くの電子陰性基にアルキル基を加えるそれらの能力のためそのように命名され、それにより、癌細胞が再生するのを妨げるＤＮＡ複製に干渉する。多くのアルキル化剤は細胞周期非特異的である。具体的な例において、それらは、ＤＮＡ二重−ラセンストランドにおけるグアミン塩基を架橋することによって腫瘍の成長を停止させる。その例はブスルファン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、イフォスファミド、メクロレタミン塩酸、メルファラン、プロカルバジン、チオテパ、およびウラシルマスタードを含む。
【００８０】
ニトロ素尿素は、それらがＤＮＡ修復を阻害するアルキル化のプロセスによって作用するゆえにアルキル化剤と言われる。これらのアルキル化剤は、ＤＮＡ修復に必要な酵素に干渉する代謝産物である。ニトロソ尿素は血液−脳関門を架橋することができる。従って、それらを用いて、例えば、脳腫瘍、ならびに非−ホジキンリンパ腫、多発性ミエローマ、および悪性ミエローマを治療する。ほとんどのニトロソ尿素薬物は細胞周期−非特異的である。その例はカルムスチン、ルムスチン、およびストレプトゾシンを含む。
【００８１】
抗−代謝産物は細胞周期の合成（Ｓ）相の間にＤＮＡへの塩基の取込を妨げ、正常な発生および分裂を禁止する。抗代謝産物は５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、カペシタビン、シトシンアラビノシド、フロキシウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、メトトレキセート、およびチオグアミンのような薬物を含む。
【００８２】
細胞分裂に必要な酵素に干渉することによって、あるいは細胞を囲う膜を改変することによって、細胞分裂を一般には妨げる種々の抗腫瘍抗生物質がある。このクラスには、ＤＮＡの構造を破壊することによって細胞分裂を妨げ、その機能を停止させるように作用する、ドキソルビシンのようなアントラサイクリンまでが含まれる。これらの剤は細胞周期非特異的である。抗腫瘍抗生物質はダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、マイトマイシン−Ｃ、およびマイトキサントロンを含む。
【００８３】
植物アルカロイドは、有糸分裂を阻害し、または停止させ、あるいは細胞成長に必要なタンパク質を細胞が作成するのを妨げる酵素を阻害する。しばしば用いられる植物アルカロイドは、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデスチンおよびビノレルビンを含む。
【００８４】
タキサンは、細胞機能で重要な微小管と呼ばれる細胞構造に影響する。正常な細胞成長において、細胞が分裂を開始する場合に微小管が形成されるが、一旦細胞が分裂を停止すれば、微小管は分解され、または破壊される。タキサンは、癌細胞が、微小管が余りにも詰まりすぎるようになって、それらが成長および分裂できなくなるように、微小管が破壊するのを妨げる。例示的なタキサンはパクリタキセルおよびドセタキセルを含む。
【００８５】
ホルモン剤およびホルモン−様薬物は、例えば、白血病、リンパ腫および多発性ミエローマを含めた種々のタイプの癌で利用される。それらは、しばしば、それらの有効性を増強するために他のタイプの化学療法薬物と共に使用される。６つのホルモンを用いて、雌または雄のホルモンの作用または生産を改変し、それらを用いて、例えば、乳癌、前立腺癌および内膜癌の成長を遅らせる。これらのホルモンの生産（アルマターゼ阻害剤）または作用（タモキシフェン）の阻害は、しばしば、療法に対する補助剤として用いることができる。いくつかの他の腫瘍もホルモン依存性である。タモキシフェンは、乳癌細胞の成長を促進する、エストロゲンの活性に干渉するホルモン剤の例である。
【００８６】
雑多な剤は、例えば、ブレオマイシン、ヒドロキシ尿素、Ｌ−アスパラギナーゼ、およびプロカルバジン、のような化学療法剤を含む。
【００８７】
Ｖ．キメラ分子の作成
キメラ分子は、標的化部位および抗−細胞増殖部位が会合するようないずれかの適当な方法によって生産することができる。本発明のキメラタンパク質は、例えば化学的合成方法によって、あるいは２つの部位の間の化学的結合によって生産することができ、特別な具体例においてそれらは、適切な宿主細胞における融合ポリヌクレオチドの発現を指令する調節配列の制御下で、細胞−特異的標的化部位のコーディング配列、およびアポトーシス−誘導タンパク質のコーディング配列の融合によって生産される。好ましい具体例において、キメラタンパク質の成分の各々は、（アポトーシス−誘導タンパク質のような）細胞−特異的標的化部位およびシグナル伝達経路因子であるそれらの各部分につき機能的活性を含む。キメラリンカーを使用して、細胞−標的化部位および抗−細胞増殖部位を会合させる具体例では、いずれかの適当なリンカーを本発明で利用することができる。具体的な例は、例えば、ＳＰＤＢ、ＳＭＰＴ、および／またはアビジン／ストレプトアビジン：ビオチンを含む。
【００８８】
２つの全長コーディング配列の融合は、分子生物学の分野でよく知られた方法によって達成することができる。融合ポリヌクレオチドは、２つの別々のコードされた産物の生産を回避するための第二のコーディング配列の開始コドンなくして、第一のコーディング配列の５´末端にＡＵＧ翻訳開始コドンのみを含有するのが好ましい。リーダー配列をポリヌクレオチドの５´末端に入れて、発現された産物を、宿主細胞内の特異的部位または区画に標的化させて、遺伝子発現後の分泌または引き続いての精製を容易とすることができる。２つのコーディング配列は、いずれのリンカーもなくして直接的に、あるいはペンタマーＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ反復を１ないし３回含むもののようなフレキシブルなポリリンカーを用いることによって融合することができる。そのようなリンカーは、ＶＨおよびＶＬに挿入されることによって、単一鎖抗体（ｓｃＦＶ）を構築するのに用いられてきた（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。リンカーは、単一鎖抗体の可変領域を形成する２つのベータ−シートの間の正しい相互作用を可能とするように設計される。使用できる他のリンカーは、例えば、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（配列番号：１）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）およびＬｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（配列番号：２）（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）を含む。
【００８９】
Ａ．細胞−特異的標的化部位
本発明のキメラタンパク質は細胞−特異的部位および抗−細胞増殖部位を含む。細胞−特異的標的化部位は分子への細胞−タイプ特異的結合を付与し、それは、標的化されるべき特定の細胞集団に基づいて選択される。広く種々のタンパク質は、限定されるものではないが、成長因子、ホルモンおよびサイトカインのような受容体に対するリガンド、および抗体またはその抗原−結合断片を含めた、細胞−特異的標的化部位として用いるのに適している。
【００９０】
１．抗体
本発明のいくつかの具体例において、１以上の抗体を細胞−特異的標的化部位として使用する。本明細書中で用いるように、用語「抗体」は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ，ＩｇＤおよびＩｇＥのようないずれかの免疫学的結合剤を広く言うことを意図する。一般に、Ｉｇおよび／またはＩｇＭは、それらが生理学的条件において最も普通の抗体であるゆえに、およびそれらは実験室状況において最も容易に作成されるゆえに好ましい。
【００９１】
用語「抗体」は、Ｆａｄ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単一鎖Ｆｖ）などのような抗体断片を含む。種々の抗体−ベースの構築体および断片を調製し、それを用いる技術は当該分野でよく知られている。抗体を調製し、特徴付けるための手段もまた当該分野でよく知られている。（例えば、ここで引用して援用する、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８参照）。
【００９２】
抗体は、それらが注目するいずれかの細胞表面抗原に対して作成することができるゆえに、極端に多様であって、有用な細胞−特異的標的化部位である。モノクローナル抗体は細胞表面に受容体、腫瘍−関連抗原、およびＣＤ抗原のような白血球系列−特異的マーカーに対して作成されてきた。抗体の可変領域遺伝子は、当該分野でよく知られた方法によってハイブリドーマ細胞から容易に単離することができる。
【００９３】
過去数年にわたって、いくつかのモノクローナル抗体が治療用途で認可されており、有意な臨床的および商業的成功を達成している。モノクローナル抗体の臨床的用途の多くは、それらがそれらの標的に結合する親和性および特異性、並びにそれらの比較的大きなサイズによる長い循環寿命に由来する。しかしながら、モノクローナル抗体は、短い半減期が有利である、あるいはそれらの大きなサイズがそれらが物理的に可能な治療活性の領域に到達するのを妨げる適応症で用いるのにはよく適しない。
【００９４】
さらに、ほぼ等しい量で作成され、正しく組み立てられる必要性がある２つの異なるポリペプチド鎖よりなるそれらの天然形態の抗体は、治療目的では最適な候補ではない。しかしながら、モノクローナル抗体の抗原特異的特性を保有することができる単一のポリペプチドを作成するのが可能である。
【００９５】
単一鎖抗体（ＳＣＡ）は、モノクローナル抗体で可能な治療的および診断的適用に拡大されるように設計された遺伝子工学作成タンパク質である。ＳＣＡはモノクローナル抗体の結合特異性および親和性を有し、それらの天然形態では、モノクローナル抗体のサイズの約１／５ないし１／６である、典型的には、それらに短い半減期を与える。ヒトＳＣＡは、身体中の部位を標的化するためのより特異的な位置、身体からのより速い除去、および例えば経口、鼻腔内、皮内または吸入によって用いられる良好な機会を含めた、ほとんどのモノクローナル抗体と比較して多くの利点を供する。これらの利点に加えて、十分にヒトのＳＣＡは、高架で時間を消費する「ヒト化」手法の必要性なくして、ヒトＳＣＡライブラリーから直接的に単離することができる。ＳＣＡもまた（細胞内部での）細胞内発現を介して容易に生産され、ＳＣＡ分子が細胞機能の特異的阻害剤として作用する遺伝子治療適用におけるそれらの使用を可能とする。
【００９６】
単一−鎖組換え抗体（ｓｃＦｖ）は設計されたフレキシブルなペプチド連結体によって連結された抗体ＶＬおよびＶＨドメインよりなる（Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。無傷ＩｆＧと比較して、ｓｃＦｖは匹敵する抗原−結合親和性と共により小さなサイズおよび構造的単純性の利点を有し、それらは類似の２−鎖Ｆａｂ断片よりも安定化させることができる（Ｃｏｌｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８：Ａｄａｍｓ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｅｒ，１９９９）。いくつかの研究は、ｓｃＦｖのより小さなサイズが、無傷マウス抗体のそれと比較して、腫瘍組織への良好な浸透、改良されたファルマコキネティックス、および静脈内投与されたＦａｂで観察された免疫原性の低下を提供することを示している（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｃｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｃｏｌｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ａｄａｍｓ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｅｒ，１９９９）。例えば、ｓｃＦｖＭＥＬ単一−鎖抗体は、ヒトメラノーマ細胞に存在するｇｐ２４０抗原の表面ドメインを認識する親ＺＭＥ−０１８抗体の同一結合親和性および特異性を保有する（Ｋａｎｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２；Ｍａｃｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。
【００９７】
組換え単一−鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）−ベースの剤はサイトカインの細胞−標的化送達（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、および組換えゲロニン（ｒＧｅｌ）トキシンのような高度に細胞傷害性ｎ−グリコシダーゼの細胞内送達（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）のためにプレ−臨床試験で用いられてきた。これらの抗体断片のより小さなサイズは、腫瘍組織への良好な浸透、改良されたファルマコキネティックス、および静脈内に投与されたマウス抗体で観察された免疫原性の低下を可能とすることができる。最初に、メラノーマ細胞を標的化するために、我々は、メラノーマ細胞系および新鮮な腫瘍試料の大部分（８０％）に見出される、高分子量糖タンパク質ｇｐ２４０を認識するｓｃＦｖＭＥＬと命名される組換え単一−鎖抗体を選択する（Ｋａｎｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２）。それは、異種移植片モデルを用い、イン・ビトロでｇｐ２４０担持細胞を標的化するために本発明者らによって広く用いられてきた（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。この抗体は標的細胞に結合し、効果的に内部化され、これを優れたキャリアとして、トキシンまたは他の治療ペイロードを送達する。
【００９８】
ｇｐ２４０抗原を標的化するｓｃＦｖＭＥＬの親抗体であるＺＭＥ−０１８または２２５．２８  Ｓと命名される抗体は、メラノーマ患者において広く研究されており、全身投与の後に転移性腫瘍に局所化する印象的能力を示している（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｋａｎｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｍａｃｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。この抗体はメラノーマに対する高い特異性を保有し、種々の正常な組織と最小限に反応性であり、それをさらなる研究のための有望な候補とする（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｍａｃｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｍｕｊｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。より重要なことには、ｇｐ２４０抗原は正常な細胞では発現されず、かくして、これを治療的介入のための興味深い標的とする。
【００９９】
重鎖および軽鎖（ＶＨおよびＶＬ）からの可変領域は、共に、長さがほぼ１１０アミノ酸である。それらは、例えば、２つのドメインが機能的抗原結合ポケットを組み立てるのを可能とするのに十分なフレキシビリティを有する、配列（配列番号：３）３と１５アミノ酸リンカーによって結合することができる。ある具体例において種々のシグナル配列の負荷は、ｓｃＦｖが、細胞内の異なるオルガネラに標的化され、または分泌されるのを可能とする。軽鎖定常領域（Ｃｋ）の負荷は、ジスルフィド結合を介する二量体化を可能とし、増大した安定性および活力を与える。かくして、単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ＳＣＡでは、Ｆｖ断片の２つのドメインは別々の遺伝子によってコードされるが、それらを組換え方法によって単一タンパク質鎖ｓｃＦｖ（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）として作成できるようにする合成リンカーを作成するのが可能であることが判明している。さらに、それらは、ファージディスプレイライブラリーからの単離のその容易性、および保存された抗原を認識するそれらの能力のため頻繁に用いられる（レビューについては、Ａｄａｍｓ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｅｒ，１９９９）。例えば、ｓｃＦｖを利用して、抗−ＣＥＡ  ｓｃＦｖをディスプレイするレトロベクターによって、癌腫肺抗原（ＣＥＡ）−発現腫瘍細胞に自殺遺伝子を標的化する（Ｋｕｒｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【０１００】
さらに、抗体の重鎖のＦｃ部分を用いて、ＩｇＥ抗体のＦｃ部分の肥満細胞および好中球を標的化するための使用のように、Ｆｃ受容体−発現細胞を標的化することができる。抗体−指向性療法または免疫学的指向性療法によって注目するポリペプチドまたはペプチドを標的化するための抗体の使用は現在認可されており、現在の治療市場で用いられている。
【０１０１】
Ｆａｂ抗体断片は本発明で利用することができる。Ｆａｂ断片は、ジスルフィド結合によって一緒に連結される軽鎖、および重鎖のＮ−末端部分を含む。それは、典型的には、ほぼ５０ｋｄの分子量を有し、単一の抗原結合部位を含む。Ｆａｂ断片は限定された低下によってＦ（ａｂ’）２断片から、あるいは還元剤の存在下でのカパインでの消化によって全抗体から得ることができる。
【０１０２】
２．抗体以外の部位
抗体または抗体断片以外の分子は、細胞−特異的標的化部位として使用することができる。非常に多数の細胞表面受容体が種々の系列の造血系細胞で同定されているので、これらの受容体に対して特異的なリガンドまたは抗体を細胞−特異的標的化部位として用いることができる。ＩＬ２はキメラタンパク質における細胞−特異的標的化部位として用いて、ＩＬ２Ｒ＋細胞に標的化することができる。別法として、Ｂ７−１、Ｂ７−２およびＣＤ４０のような他の分子を用いて、活性化されたＴ細胞を特異的に標的化することができる（Ｔｈｅ  Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ，１９９３，Ｂａｒｃｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ）。さらに、Ｂ細胞はＣＤ１９、ＣＤ４０およびＩＬ４受容体を発現し、ＣＤ４０リガンド、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６およびＣＤ２８のようなこれらの受容体に結合する部位によって標的化することができる。Ｔ細胞およびＢ細胞のような免疫細胞の排除は、自己免疫過敏、移植拒絶応答の治療において、およびリンパ系腫瘍の治療において特に有用である。自己免疫疾患の例は多発性硬化症、慢性関節リウマチ、インスリン−依存性真性糖尿病、全身エリテマトーデス、強皮症、およびウリアティス（ｕｖｉａｔｉｓ）である。より詳しくは、ミエリン塩基性タンパク質は多発性硬化症において免疫細胞攻撃の主な標的であることが知られているので、このタンパク質は多発性硬化症の治療のための細胞−特異的標的化部位として用いることができる（ＷＯ９７／１９１７９；Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【０１０３】
特異的細胞サブセットを標的化するのに用いることができるためサイトカインはインターロイキン（ＩＬ１ないしＩＬ１５）、顆粒球−コロニー刺激因子、マクロファージ−コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、白血病阻害因子、腫瘍壊死因子、トランスフォーミング成長因子、表皮成長因子、インスリン様成長因子および／または線維芽細胞成長因子を含む（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（ｅｄ．），１９９４，Ｔｈｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）。
【０１０４】
当業者であれば、（Ｅｐｏ（エリスロポエチン）、ＩＬ−２（Ｔ−細胞成長因子）、ＩＬ−３（マルチコロニーＣＳＦ）、ＩＬ−４（ＢＣＧＦ−１）、ＢＳＦ−１）、ＩＬ−５（ＢＣＧＦ−２）、ＩＬ−６、ＩＬ−４（ＩＦＮ−β２、ＢＳＦ−２、ＢＣＤＦ）、ＩＬ−７，ＩＬ−８，ＩＬ−９，ＩＬ−１１，ＩＬ−１３（Ｐ６００）、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１５（Ｔ−細胞成長因子）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、ＯＳＭ（ＯＭ、オンコスタチンＭ）、およびＬＩＦ（白血病阻害因子）のような）ヘマトポエチン（４−ラセン束）；（ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、およびＩＦＮ−βのような）インターフェロン；（Ｂ７．１（ＣＤ８０）、およびＢ７．２（Ｂ７０、ＣＤ８６）のような）免疫グロブリンスーパーファミリー；（ＴＮＦ−α（カケクチン）、ＴＮＦ−β（リンホトキシン、ＬＴ、ＬＴ−α）、ＬＴ−β、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＣＤ２７リガンド（ＣＤ２７Ｌ）、ＣＤ３０リガンド（ＣＤ３０Ｌ）、および４−１ＢＢＬのようなＴＮＦファミリー；および（ＴＧＦ−β、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１  ＲＡ、ＩＬ−１０（サイトカイン合成阻害剤Ｆ）、ＩＬ−１２（ＮＫ細胞刺激因子）、ＭＩＦ、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７（ｍＣＴＬＡ−８）、および／またはＩＬ−１８（ＩＧＩＦ、インターフェロン−γ誘導因子）のような）特定のファミリーに帰属しないものを含めた、種々の公知のサイトカインがあるのを認識するであろう。
【０１０５】
加えて、ヒト絨毛ゴナドトロピン受容体およびゴナドトロピン放出ホルモン受容体のようなホルモン受容体を含めた、ある種の細胞表面分子が腫瘍細胞で高度に発現されている（Ｎｅｃｈｕｓｈｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。従って、対応するホルモンを癌療法における細胞−特異的標的化部位として用いることができる。細胞−特異的標的化部位として使用することができるホルモンの例は、例えば、タンパク質、ペプチド、および改変されたアミノ酸またはステロイドを含む。特異的ホルモンはヒト絨毛ゴナドトロピン、ゴナドトロピン放出ホルモン、テストステロンのようなアンドロゲン、またはエストラジオールのようなエストロゲンを含む。さらなる特異的ホルモンは、例えば、甲状腺−刺激ホルモン、卵胞−刺激ホルモン、黄体化ホルモン、プロラクチン、成長ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、抗利尿ホルモン、オキシトシン、甲状腺刺激ホルモン−放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、コルチコトロピン−放出ホルモン、ソマトスタチン、ドーパミン）、メラトニン、チロキシン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、（例えば、コルチゾールのような）グルココルチコイド（例えば、アルドステロンのような）ミネラロコルチコイド、アドレナリン、ノルアドレナリン、プロケステロン、インスリン、グルカゴン、アミリン、エリスロポエチン、カルシトリオール、カルシフェロール、心房−ナトリウム利尿性ペプチド、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、ニューロペプチドＹ、グレリン、ＰＹＹ３−３６、インスリン−様成長ホルモン−１、レプチン、トロンボポエチン、またはアンジオテンシノーゲンを含む。
【０１０６】
加えて、インターフェロンは、例えば、細胞標的化部位として使用することができる。インターフェロン（ＩＦＮ）はサイトカインと言われる糖タンパク質の大きなクラスに属し、例えば、ウイルス、細菌、寄生虫および腫瘍細胞を含めた、外来性剤による攻撃に応答して免疫系細胞によって生じるタンパク質である。３つの主なクラスがヒトで存在する：タイプＩ、タイプＩＩ、およびタイプＩＩＩ。タイプＩ  ＩＦＮは少なくとも１３の異なるアルファイソケイタイＩＦＮＡ（１、２、４、５、６、７、８、１０、１３、１４、１６、１７、２１）；ベータ（ＩＦＮＢ１）；オメガ（ＩＦＮＷ１）；イプシロン（ＩＦＮＥ１）；およびカッパ（ＩＦＮＫ）イソ形態を含む。タイプＩＩ  ＩＦＮはＩＦＮガンマ（ＩＦＮＧ）を含む。第三のクラスは少なくとも三つの異なるイソ形態（ＩＬ２９、ＩＬ２８Ａ、およびＩＬ２８Ｂ）を有するＩＦＮ−ラムダを含む。
【０１０７】
さらに、例えば、葉酸、ビタミンＤ３、ビタミンＫ１、ビタミンＥ、および／またはビタミンＡを含めたビタミンを細胞−標的化部位として利用することができる。
【０１０８】
かくして、本発明のいくつかの具体例において、キメラポリペプチドでは抗体は利用されない。
【０１０９】
Ｂ．抗−細胞増殖部位
本発明の組成物および方法は、細胞の増殖を間接的にまたは直接的に損なう、増殖する細胞の能力を損傷し、細胞の増殖の速度および／または程度を低下させ、細胞を眠らせ；細胞を非−増殖性とし：および／細胞を死滅させ、破壊し、および／または根絶するのを少なくとも部分的に担う抗−細胞増殖部位を有するキメラ分子を利用する。具体的な例において、細胞は、個体腫瘍におけるものであってもなくてもよい癌細胞である。特別な具体例において、抗−細胞増殖部位は、１以上のアポトーシス−誘導部位または１以上の細胞傷害性部位を含む。
【０１１０】
１．アポトーシス誘導部位
新形成病の治療のための伝統的な化学療法アプローチは、ＤＮＡ複製または細胞分裂を阻害することによって迅速に増殖する細胞の標的に一般的には依拠してきた。この戦略は効果的であったが、腫瘍細胞に対する選択性のその生来の欠如の結果復帰を減少させ、許容される毒性の限界に近づいた。アポトーシスもまた、種々の抗癌剤で処理された腫瘍における細胞死滅に貢献する（Ｄｅｂａｔｉｎ，１９９９）。癌細胞の化学療法剤に対する抵抗性の発生は、抵抗性細胞におけるアポトーシルシグナリングのブロックに関係付けられてきた（Ｓｅｒｒｏｎｅ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｅｙ，１９９９；Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。乳癌の転移拡大もまた、例えば、アポトーシス経路に直接的に関係するように見える。いくつかの研究は、高い転移可能性はアポトーシスに対する増大した抵抗性に厳密に関係することを示した（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｂｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｓｉｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｌｉｐｐｏｎｅｎ，１９９９）。ｂｃｌ−２、成長因子またはそれらの受容体のようなオンコジーンの過剰発現による薬物−誘導アポトーシスの抑制（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｂｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ａｂｒａｍｏｖｉｔｃｈ  ａｎｄ  Ｗｅｒｎｅｒ，２００３；Ｒｏｗｉｎｓｋｙ，２００３）は、転移および固有の化学−および放射線−抵抗性双方の重要な原因であり得る。
【０１１１】
乳癌を持つ患者での細菌の臨床試験（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ａｒｒｉｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）は、例えば、腫瘍アポトーシス、標識指標（Ｋｉ−６７）、および化学療法養生法に対する患者の応答の間の直接的リンクを示唆する。該研究は、ＥＣＦ［エピルビシン（５０ｍｇ／ｍ２、静脈内、１日）シスプラチン（５０ｍｇ／ｍ２、静脈内、１日）および連続的注入５  Ｆｕ（２００ｍｇ／ｍ２／２４時間）６サイクル］プレ手術化学療法の直前における、手術可能な乳癌を持つ患者の組織でのアポトーシス指標（ＡＩ）、Ｋｉ６７およびＢｃｌ−２タンパク質発現の評価によって、化学療法に先立って、および治療の完了における残存抵抗性細胞集団における双方での、ヒト乳癌における増殖に対するアポトーシスおよびＢｃｌ−２タンパク質のイン・ビボ関係を評価する。化学療法の前および後の双方において、ＡＩおよびＫｉ６７の間に有意な陽性関連があった。残りの検体において、ＡＩおよびＫｉ６７は予備処理バイオプシーと比較して有意に低下し、他方、Ｂｃｌ−２発現は有意な増加を示した。これらのデータは、アポトーシスおよび増殖がイン。ビボで密接に関連することを示唆する。低下したアポトーシスおよび増大したＢｃｌ−２の表現型は、細胞傷害性化学療法に対して抵抗性の乳癌細胞に関連させることができる（Ｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。いくつかの研究は、化学療法に対する応答およびアポトーシス経路の活性化の間の直接的相関を示唆している（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ａｒｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｓｉｍｏｅｓ−Ｗｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｓｅｒｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。化学−抵抗性は、ホルモン−非依存性、侵入性、転移性、抗エストロゲン−抵抗性表現型に対するホルモン−依存性、非−転移性、抗エストロゲン−感受性表現型からの乳癌の臨床的進行をしばしば伴うように見える（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【０１１２】
かくして、いくつかの具体例において、本発明は、アポトーシスメカニズムを介する細胞の死滅をもたらす、標的細胞の内部に対するこの効果の中枢的メディエーターであるある種のプロ−アポトーシスタンパク質の送達に取り組む。アポトーシス−誘導部位は、細胞−特異的標的化部位におる標的への結合のために送達される、キメラポリペプチドの標的細胞への進入に際してプログラムされた細胞の死滅を誘導する。
【０１１３】
いずれかの適当なプロ−アポトーシス部位を本発明で使用することができる。プロ−アポトーシス部位はグランザイムＡまたはグランザイムＢのようなグランザイム、あるいはＢｃｌ−２ファミリーメンバーを含む。
【０１１４】
ＢＣＬ２ファミリーにおけるプロ−アポトーシスタンパク質もまた、本発明におけるアポトーシス−誘導部位として利用することもできる。そのようなヒトタンパク質は、細菌トキシンから構成される多くのイムノトキシンよりも優れた低下した免疫原性を有すると期待される。Ｂａｘは本発明の１つの具体例における有用なアポトーシス−誘導部位であるが、このファミリーにおける他のメンバーは本発明で用いるのに適しており、Ｂａｋ（Ｆａｒｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｃｈｉｔｔｅｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｋｉｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、Ｂｃｌ−Ｘｓ（Ｂｏｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、Ｂａｄ  （Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、Ｂｉｄ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、Ｂｉｋ（Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、Ｈｒｋ（Ｉｎｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）および／またはＢｏｋ（Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。これらのタンパク質をコードするヌクレオチド配列は当該分野で知られており、ＧｅｎＢａｎｋのようなデーターベースから容易に入手することができ、かくして、選択されたｃＤＮＡが、発現ベクター中の細胞−特異的標的化部位についてのコーディング配列との融合のために容易に得ることができる。
【０１１５】
Ｂｃｌ−２ファミリーの特定のメンバーの具体的なドメインは、それらのアポトーシス−誘導活性について研究されている。例えば、ＢａｋのＧＤドメインはアポトーシス機能に関与する（米国特許第５，６５６，７２５号）。加えて、ＢａｘおよびＢｉｐｌａは相同なドメインを共有する。従って、Ｂｃｌ−２ファミリーのいずれかの生物学的に活性なドメインを、本発明の実施のためのアポトーシス−誘導部位として用いることができる。
【０１１６】
カスパーゼはアポトーシスにおける中枢的な役割を演じ、アポトーシスのコンセンサスコアメカニズムの部分をよく構成することができる。カスパーゼはアポトーシスのメディエーターとして関連付けられる。発生的細胞死滅に必要なタンパク質であるＣＤＥ−３は、哺乳動物システインプロテアーゼインターロイキン−１ベータ−変換酵素（ＩＣＥ）に対して配列同一性を有するという認識があるので、少なくとも１０の関連するシステインプロテアーゼのファミリーが同定されている。これらのタンパク質は、Ｐ１位置におけるアスパラギン酸に対するほとんど絶対的な特異性によって特徴付けられる。全てのカスパーゼ（ＩＣＥ−様プロテアーゼ）は、保存されたＱＡＣＫＧ（ここで、ＸはＲ、ＺまたはＧである）ペンタペプチド活性−部位モチーフを含有する。カスパーゼは、１つの大きなおよび１つの小さなサブユニットと共に、Ｎ−末端ペプチド（プロドメイン）を含む不活性なプロ酵素として構成される。カスパーゼ−１およびカスパーゼ−３の双方の結晶構造は、活性酵素がヘテロテトラマーであり、２つの小さなおよび２つの大きなサブユニットを含有することを示す。アポトーシスの間におけるカスパーゼの活性化の結果、ポリ（ＡＤＰ−リオース）ポリメラーゼおよびラミンを含めた臨界的な細胞基質の切断をもたらし、従って、アポトーシスの劇的な形態学的変化を沈殿させる（Ｃｏｈｅｎ，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２６：１−１６）。従って、アポトーシス−誘導部位としてカスパーゼを用いるのはやはり本発明の範囲内にある。
【０１１７】
最近、少数の新しいタンパク質がクローン化され、アポトーシス経路に関与するタンパク質、腫としてカスパーゼの活性を媒介するのに必要な因子として同定された。１つの因子が、Ａｐａｆ−２と命名された、従前知られた電子移動タンパク質であるチトクロームｃとして同定された（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃｅｌｌ  ８６：１４７−１５７）。チトクロームｃに加えて、カスパーゼ−３の活性化は、２つの他のサイトゾル因子−Ａｐａｆ−１およびＡｐａｆ−３を必要とする。Ａｐａｆ−１はＣ．ｅｌｅｇａｎｓのＣＥＤ−４に対して相同なタンパク質であり、Ａｐａｆ−３はカスパーゼファミリーのメンバー、カスパーゼ−９として同定された。双方の因子はチトクロームｃの存在下でそれらの各ＮＨ２−末端ＣＥＤ−３相同ドメインを介して相互に結合し、これは、カスパーゼ−９活性化に導く事象である。活性化されたカスパーゼ−９は、今度は、切断されカスパーゼ−３を活性化する（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。アポトーシス経路に関与するもう１つのタンパク質はＤＮＡ断片化因子（ＤＦＦ）であり、これは、ヌクレオソームセグメントへのゲノムＤＮＡの断片化をトリガーするようにカスパーゼ−３の下流で機能する４５および４０ｋｄのサブユニットのヘテロダイマーである（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【０１１８】
２．細胞傷害性剤
本発明で有用な抗−細胞増殖部位のさらなる形態は、サイトトキシンということもできる１以上の細胞傷害性剤を含む。細胞傷害性剤は細胞−標的化部位と組み合わせて本発明の組成物および方法で使用され、特別な具体例において、細胞傷害性剤は、１以上の癌細胞のような１以上の細胞を殺し、および／またはその増殖を低下させることを実質的に担うキメラ分子の成分である。本発明の別の具体例において、細胞傷害性剤は、その代わりに、細胞の細胞活性および／または複製能力を遅らせ、阻害し、抑制する等できる静細胞剤である。
【０１１９】
いずれの有用な細胞傷害性剤もキメラ分子で用いることができ、直接的に細胞傷害性の酵素の主なタイプは、例えば、リボソーム−阻害タンパク質（ＲＩＰ）のクラス；ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシン（ＰＥ）；組換えであってよいかなり優れた植物ｎ−グリコシダーゼゲロニン（ｒＧｅｌ）；およびＴＮＦ−αを含む。ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシン（ＰＥ）およびゲロニン（ｒＧｅｌ）のようなトキシンは成功して利用されてきた。なぜならば、標的細胞に対して回復不可能に毒性であるために少数の分子しか必要でないからである（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｖｅｅｎｅｎｄａａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。最近、Ｎｅｗｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．は、主としてＲＮＡの分解を介して、ヒト腫瘍細胞系および異種移植片に対してイン・ビトロおよびイン・ビボ細胞傷害性活性を有するヒトＲＮａｓｅを含有するイムノコンジュゲートの新しいクラスを記載する（Ｎｅｗｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。細胞傷害性剤の他の例示的な具体例はネフロトキシン、ニューロトキシン、エンテロトキシン、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅトキシンＢ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ＶａｃＡ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ  ＹｏｐＴを含む。
【０１２０】
本発明の特別な具体例において、本発明の細胞傷害性剤はＴＮＦ−αであるが、別の具体例において、キメラ分子は、アポトーシスプロセスよりはむしろ壊死を通じて細胞を殺すｒＧｅｌ融合構築体を含む。
【０１２１】
本発明のいくつかの具体例において、組換え細胞傷害性剤をキメラ分子で使用する。これらは「デザイナートキシン」ということができる。これらの組換え細胞傷害性剤を提供することができ、これは、天然タンパク質配列と比較して置換され、または除去されたアミノ酸を有することなどにより、天然配列に対して改変される。組換え細胞傷害性剤は全配列または部分配列を含むことができ、部分配列は異種配列と会合させることができる。
【０１２２】
例えば、ここで引用してその全体を援用する、米国特許出願第１０／０７４５９６号に示されたように、天然ゲロニン配列に対して改変された組換えゲロニントキシンが提供される。組換えゲロニントキシンまたは本発明は天然ゲロニンのアミノ酸の全てを有しないが、いくつかの具体例において、そこの特定の配列のアミノ酸残基１１０ないし２１０として定義されるコアトキシン領域を含む。
【０１２３】
例示的な具体例のみとして、本発明の組換えゲロニントキシンは、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０またはそれ以上のアミノ酸を該トキシンが欠くように、天然配列に対して切形されたゲロニントキシンを含むことができる。本発明のいくつかの具体例において、該トキシンはコアトキシン領域を含有するが、コアトキシン領域の外側のどこかで失われたアミノ酸がある。欠失に加えて、本発明の組換えゲロニントキシンは除去されたアミノ酸の代わりにアミノ酸を有することができる。例えば、ゲロニンタンパク質配列における位置７のグリシン残基は、非−グリシンアミノ酸残基または改変されたアミノ酸で置き換えることができる。もし位置７のグリシン残基が単に除去されれば、配列番号：１における位置８のアラニン配置７となるが、置換とは考えられない。なぜならば、アミノ酸の位置は１位置によって単純にシフトされるからである。少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８，１９、２０、２５、３０、３５，４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００以上のアミノ酸を細胞傷害性剤の例示的なゲロニン具体例において置き換えることができると考えられる。
【０１２４】
ＶＩ．キメラ分子の生産
本発明のキメラ分子は当該分野におけるいずれかの適当な方法で生産することができるが、特別な具体例において、キメラ分子は融合ピリペプチドとして作成されるか、あるいはリンカーによるなどして化学的にコンジュゲートされる。
【０１２５】
Ａ．キメラ化学コンジュゲート／リンカーでのキメラコンジュゲート
化学コンジュゲーションなどのコンジュゲーションにより、またはリンカーによりキメラ分子が生産される具体例において、単一成分が提供され、または得られ、次いで、化学コンジュゲーションまたは連結方法によって会合される。
【０１２６】
例えば、キメラ分子の成分は、選択的に切断可能なリンカーまたはアミノ酸配列のような生物学的に放出可能な結合を介して接合することができる。例えば、腫瘍環境内で優先的に位置し、または活性である酵素についての切断部位を含むペプチドリンカーが考えられる。そのようなペプチドリンガーの例示的な形態は、ウロキナーゼ、プラスミン、トロンビン、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、あるいはコラゲナーゼ、ゲラチナーゼまたはストロメリシンのようなメタロプロテイナーゼによって切断されるものである。別法として、ペプチドまたはポリペプチドを補助剤に接合することができる。
【０１２７】
選択的に切断可能なリンカー、合成リンカー、または他のアミノ酸配列のようなアミノ酸を用いて、タンパク質性部位を分離することができる。加えて、トキシン部位を標的化剤とコンジュゲートするのに成功して使用することができる多数のタイプのジスルフィド−結合含有リンカーが知られているが、異なる薬理学的特徴および能力に基づき、ある種のリンカーは一般に他のリンカーよりも好ましい。例えば、立体的に「障害」となるジスルフィド結合を含有するリンカーは、イン・ビボでのそれらのより大きな安定性のため好ましく、かくして、作用部位における結合に先立ってトキシン部位の放出を妨げる。
【０１２８】
加えて、当業者に知られたいずれかの他の連結／カップリング剤および／またはメカニズムを用いて、例えば、抗体−抗原相互作用、アビジンビオチン結合、アミド結合、エステル結合、チオエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ホスホエステル結合、ホスホルアミド結合、アンヒドライド結合、ジスルフィド結合、イオンおよび疎水性相互作用、二特異的抗体および抗体断片、またはその組合せのような、本発明の成分を組み合わせることができる。
【０１２９】
血液中で合理的な安定性を有する架橋剤が使用されると考えられる。標的化および治療／予防剤をコンジュゲートするのに成功して使用することができる多数のタイプのジスルフィド−結合含有リンカーが知られている。立体的に障害となるジスルフィド結合を含有するリンカーは、イン・ビボでより大きな安定性を与え、作用部位に到達する前に標的化ペプチドの放出を妨げることが判明するであろう。これらのリンカーは、かくして、連結剤の１つのグループである。
【０１３０】
もう１つの架橋剤はＳＭＰＴであり、これは、隣接するベンゼン環およびメチル基によって「立体的に障害となる」ジスルフィド結合を含有する二官能性架橋剤である。ジスルフィド結合の立体障害は、組織および血液に存在し得るグルタチオンのようなチオレートアニオンによる攻撃から結合を保護する機能として働き、それにより、付着される剤の標的部位への送達に先立ってコンジュゲートの脱カップリングを妨げるのを助けると考えられる。
【０１３１】
ＳＭＰＴ架橋剤は、多くの他の公知の架橋剤のように、システインまたは第一級アミンのＳＨのような官能基（例えば、リシンのイプシロンアミノ基）を架橋する能力を与える。もう１つの可能なタイプの架橋剤は、スルホスクシニミジル−２−（ｐ−アジドサリシルアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネートのような切断可能ジスルフィド結合を含有するヘテロ−２官能性光反応性フェニルアジドを含む。Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル基は第一級アミノ基と反応し、フェニルアジドは（光分解に際して）いずれかのアミノ酸残基と非選択的に反応する。
【０１３２】
ヒンダード架橋剤に加えて、非−ヒンダードリンカーもここで従って使用できる。保護されたジスルフィドを含有し、またはそれを生じると考えられない他の有用な架橋剤はＳＡＴＡ、ＳＰＤＰおよび２−イミノチオランを含む（Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ  ＆  Ｔｈｏｒｐｅ，１９８７）。そのような架橋剤の使用は当該分野でよく理解されている。もう１つの具体例はフレキシブルなリンカーの使用を含む。
【０１３３】
米国特許第４，６８０，３３８号は、アミノ−含有ポリマーおよび／またはタンパク質とリガンドとのコンジュゲートを生産するのに、特に、キレーター、薬物、酵素、検出可能な標識等との抗体コンジュゲートを形成するのに有用な二官能性リンカーを記載する。米国特許第５，１４１，６４８号および第５，５６３，２５０号は、種々の温和な条件下で切断可能な不安定結合を含有する切断可能コンジュゲートを開示する。このリンカーは、注目する剤をリンカーに直接的に結合することができ、切断は活性剤の放出をもたらす点で特に有用である。好ましい使用は、遊離アミノまたは遊離スルフヒドリル基を、抗体または薬物のようなタンパク質に加えることを含む。
【０１３４】
米国特許第５，８５６，４５６号は、融合タンパク質、例えば、単一鎖抗体を作成するためのポリペプチド成分を連結するにおいて用いられるペプチドリンカーを提供する。該リンカーは長さが約５０アミノ酸までであり、荷電アミノ酸（好ましくはアルギニンまたはリシン）の少なくとも１つの発生を含み、続いて、プロリンを含み、より大きな安定性および低下した凝集によって特徴付けられる。米国特許第５，８８０，２７０号は、種々の免疫診断および分離技術で有用なアミノオキシ−含有リンカーを開示する。
【０１３５】
Ｂ．キメラ融合分子
キメラ分子が融合タンパク質を含む具体例において、キメラタンパク質、突然変異体ポリペプチド、キメラタンパク質の生物学的に活性な断片、またはその機能的同等体をコードするポリヌクレオチドを用いて、適当な宿主細胞においてキメラタンパク質、キメラペプチド断片、またはその機能的同等体の発現を指令する組換えＤＮＡ分子を生じさせることができる。
【０１３６】
遺伝暗号の固有の縮重のため、実質的に同一または機能的に同等なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を、キメラタンパク質のクローニングおよび発現の本発明の実施で用いることができる。そのようなＤＮＡ配列は、キメラ配列、またはそれらの相補的配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるものを含む。１つの具体例において、本明細書中で用いるフレーズ「ストリンジェントな条件」とは、（１）洗浄のための低いイオン強度および高温、例えば、５０℃における０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ＳＤＳを使用する；（２）ハイブリダイゼーションの間にホルムアミドのような変性剤、例えば、４２℃における７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウムと共に、ｐＨ６．５の０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルプロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を含む５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミドを使用する；または（３）０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中の４２℃の洗浄液と共に、４２℃の、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸を使用するハイブリダイジング条件をいう。
【０１３７】
本発明に従って使用することができる改変されたＤＮＡ配列は、同一または機能的に同等な融合遺伝子産物をコードする配列をもたらす、異なるヌクレオチド残基の欠失、付加または置換を含む。遺伝子産物それ自体は、キメラ配列内のアミノ酸残基の欠失、付加または置換を含むことができ、その結果、サイレントな変化がもたらされ、かくして、機能的に同等なキメラタンパク質が生産される。そのようなアミノ酸の置換は、関連する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいてなすことができる。例えば、負に荷電したアミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を含み；正に荷電したアミノ酸はリシン、ヒスチジンおよびアルギニンを含み；同様な親水性値を有する非荷電極性ヘッド基を持つアミノ酸は以下の：グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシンを含み；および非極性ヘッド基を持つアミノ酸はアラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、トリプトファンを含む。
【０１３８】
本発明のＤＮＡ配列は、限定されるものではないが、遺伝子産物のプロセッシングおよび発現を改変する改変を含めた、種々の末端についてのキメラコーディング配列を改変するように作成することができる。例えば、当該分野で良く知られた技術、例えば、部位−特異的突然変異誘発を用いて突然変異を導入して、新しい制限部位を挿入し、グリコシル化パターン、リン酸化を改変する等をすることができる。
【０１３９】
本発明の別の具体例において、キメラタンパク質のコーディング配列は、当該分野で良く知られた化学的用法を用い、前部または部分を合成することができる（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０；Ｃｒｅａ  ａｎｄ  Ｈｏｒｎ，１９８０；およびＣｈｏｗ  ａｎｄ  Ｋｅｍｐｅ，１９８１参照）。例えば、該部位の活性なドメインは固相技術によって合成し、樹脂から切断し、分取用高速液体クロマトグラフィー、続いて、化学的結合によって精製して、キメラタンパク質を形成することができる（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．ｐｐ．５０−６０参照）。合成ペプチドの組成はアミノ酸分析または配列決定によって確認することができる（例えば、エドマン分解手法；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．ｐｐ．３４−４９参照）。別法として、合成または組換え方法によって生産されたキメラタンパク質の２つの部位は、当該分野で良く知られた方法に従って化学的リンカーによってコンジュゲートすることができる（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ，１９９４）。
【０１４０】
生物学的に活性なキメラタンパク質を発現させるためには、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはその機能的同等体を適当な発現ベクター、すなわち、挿入されたコーディング配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有するベクターに挿入する。キメラ遺伝子産物ならびに組換えキメラ発現ベクターでトランスフェクトされた、または形質転換された宿主細胞または細胞系を種々の目的で用いることができる。これらは、限定されるものではないが、タンパク質のエピトープに結合して、それらの精製を容易とする抗体（すなわち、モノクローナルまたはポリクローナル）を作成することを含む。
【０１４１】
当業者に良く知られた方法を用いて、キメラタンパク質コーディング配列および適当な転写／翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法はイン・ビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびイン・ビボ組換え／遺伝子組換えを含む。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，．Ｎ．Ｙ．参照。
【０１４２】
種々の宿主−発現ベクター系を利用してキメラタンパク質コーディング配列を発現することができる。これらは、限定されるものではないが、キメラタンパク質コーディング配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌のような微生物；キメラタンパク質コーディング配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；キメラタンパク質コーディング配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた、あるいはキメラタンパク質コーディング配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系；または動物細胞系を含む。ほとんどのアポトーシス−誘導タンパク質は哺乳動物細胞においてプログラムされた細胞死滅を引き起こすので、本発明のキメラタンパク質は原核生物または下等真核生物細胞において発現させるのが好ましいことは注意すべきである。
【０１４３】
各系の発現エレメントはその長さおよび特異性が変化する。利用する宿主／ベクター系に依存して、構成的および誘導性プロモーターを含めた、多数の適当な転写および翻訳エレメントのいずれかを発現ベクターで用いることができる。例えば、細菌系でクローニングする場合、バクテリオファージλのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター；サイトメガロウイルスプロモーター）等のような誘導性プロモーターを用いることができ；昆虫細胞系においてクローニングする場合、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターのようなプロモーターを用いることができ；植物細胞系においてクローニングする場合、植物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、熱ショックプロモーター；ＲＵＢＩＳＥＯの小サブユニットのためのプロモーター；クロロフィルα／β結合タンパク質についてのプロモーター）、あるいは植物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター；ＴＭＶのコートタンパク質プロモーター）を用いることができ；哺乳動物細胞系においてクローニングする場合、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を用いることができる；キメラＤＮＡの複数コピーを含有する細胞系を作成する場合、ＳＶ４０−、ＢＰＶ−およびＥＢＶ−ベースのベクターを適当な選択マーカーと共に用いることができる。
【０１４４】
細菌系においては、発現するキメラタンパク質で意図された使用に応じて、多数の発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、大量のキメラタンパク質を生産すべき場合、容易に精製される高レベルのタンパク質産物の発現を指令するベクターが望ましいであろう。そのようなベクターは、限定されるものではないが、ｐＨＬ９０６ベクター（Ｆｉｓｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）；キメラタンパク質コーディング配列が、ハイブリッドＡＳ−ｌａｃＺタンパク質が生産されるように、ｌａｃＺコーディング領域とイン・フレームにてベクターに連結することができるＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ａｎｄ  Ｉｎｏｕｙｅ，１９８９；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，１９８９）；等を含む。
【０１４５】
キメラタンパク質を発現するのに用いることができる別の発現系は昆虫系である。１つのそのような系において、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核ポリヒドロシスウイルス（ＡｃＮＰＶ）を外来性遺伝子を発現するためのベクターとして用いる。該ウイルスはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞において増殖する。キメラタンパク質コーディング配列はウイルスの非−必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）にクローン化し、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。キメラタンパク質コーディング配列の成功した挿入の結果、ポリヘドリン遺伝子が不活化され、非−封入組換えウイルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子によってコードされるタンパク質性コートを欠如するウイルス）が生産される。次いで、これらの組換えウイルスを用いてＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を感染させ、そこで、挿入された遺伝子が発現される（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３；米国特許第４，２１５，０５１号参照）。
【０１４６】
特異的な開始シグナルもまた、挿入されたキメラタンパク質コーディング配列の十分な翻訳で必要であろう。これらのシグナルはＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列を含む。それ自身の開始コドンおよび隣接する配列を含めた全キメラ遺伝子が適当な発現ベクターに挿入される場合、さらなる翻訳制御シグナルは必要でないであろう。しかしながら、キメラタンパク質コーディング配列がそれ自身の開始コドンを含まない場合、ＡＴＧ開始コドンを含めた外来性翻訳制御シグナルが供されなければならない。さらに、開始コドンは、全インサートの翻訳を確実とするために、キメラタンパク質コーディング配列のリーディングフレームと相が同じとしなければならない。これらの外来性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは天然および合成双方の種々の起源のものとすることができる。発現の効率は、適当な転写エンハンサーエレメント、翻訳ターミネーター等を含めることによって増強することができる（Ｂｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７参照）。
【０１４７】
加えて、挿入された配列の発現を変調し、あるいは所望の特定の様式で遺伝子産物を改変し、プロセッシングする宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のそのような改変（例えば、グリコシル化）およびプロセッシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能で重要であろう。キメラタンパク質におけるコンセンサスＮ−グリコシル化部位の存在は、最適なキメラタンパク質機能のための適切な改変を必要とするであろう。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳後プロセッシングおよび改変についての特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。適切な細胞系または宿主系を選択して、キメラタンパク質の正しい改変およびプロセッシングを確実とすることができる。この目的で、キメラタンパク質の一次転写体の適当なプロセッシング、グリコシル化およびリン酸化のための細胞マシーナリーを保有する真核生物宿主細胞を用いることができる。そのような哺乳動物宿主細胞は、限定されるものではないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、Ｗ１３８等を含む。
【０１４８】
組換えキメラタンパク質の長期の高い収率の生産のためには、安定な発現が好ましい。例えば、キメラタンパク質を安定に発現する細胞系を作成することができる。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを用いるよりはむしろ、宿主細胞を、適当な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）によって制御されるキメラコーディング配列、および選択マーカーで形質転換することができる。外来性ＤＮＡの導入の後、作成された細胞を豊富化された培地中で１ないし２日成長させ、次いで、選択培地にスイッチすることができる。組換えプラスミド中の選択マーカーは選択に対する抵抗性を付与し、細胞がプラスミドをその染色体に安定に組込み、フォーカスを形成するように成長するのを可能とし、該フォーカスは、今度は、クローン化し、細胞系へ拡大培養することができる。
【０１４９】
限定されるものではないが、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ  ａｎｄ  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，１９６２）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０）遺伝子を含めた多数の選択系を、各々、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞で使用することができる。また、抗代謝産物抵抗性を、メトトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０；Ｏ’Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１）；ミコフェノール酸に対する抵抗性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，１９８１）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する抵抗性を付与するｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１）；およびヒゴロマイシンに対する抵抗性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）遺伝子についての選択の基礎として用いることができる。さらなる選択遺伝子が記載されている。すなわち、細胞がトリプロファンの代わりにインドールを利用するのを可能とするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにｈｉｓｔｉｎｏｌを利用するのを可能とするｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９８８）；およびオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯに対する抵抗性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ  Ｌ，１９８７，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｅｄ．）。
【０１５０】
ＶＩＩ．ムテイン
特別な具体例において、改変されたＴＮＦ−α分子を含めた改変されたＴＮＦ分子のような改変された分子を本発明のキメラ分子で使用する。他の分子はムテインとして使用することができ、ＴＮＦはここでは単に例示的な具体例として記載する。改変されたＴＮＦ分子はＴＮＦの突然変異体としてさらに規定することができ、これはＴＮＦムテインとして尚さらに規定することができる。ＴＮＦムテインは１以上の突然変異を有するＴＮＦ分子を含み、ここで、ＴＮＦ分子はＴＮＦ機能を保有し、これは、具体的な例において、癌細胞に対して細胞傷害性であることをいう。具体的な例において、ＴＮＦムテインは、抗癌活性および低い毒性に関するように、野生型ＴＮＦと実質的に同一の、またはそれよりも大きな活性を含む。改変はｐ７５−ＴＮＦ−受容体に対する、および／またはｐ５５−ＴＮＦ−受容体に対するＴＮＦの結合親和性に影響することができる。
【０１５１】
本発明の具体例において、ムテインは１以上のアミノ酸の置換によって改変され、具体的な例において、天然に生じるアミノ酸による。
【０１５２】
１以上の突然変異は、例えば、Ｎ−末端および／またはＣ−末端におけるものであって良い。突然変異は、例えば、点突然変異、フレームシフト突然変異、欠失、インバージョン、またはスプライシング突然変異体であって良い。突然変異は、ＴＮＦの機能的ドメインのようなＴＮＦの特定の領域におけるものであって良い。具体的な例において、突然変異は三量体化ドメインにおけるものである。ＴＮＦムテインへの改変のための例示的なＴＮＦ分子は配列番号：４に供される（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＡ６１２００）。ＴＮＦ−ムテインは、タンパク質の３−Ｄ構造、および分子モデリングアプローチに基づいて設計することができる。
【０１５３】
ＴＮＦムテインの具体的な例は、例えば、その全てをここで引用してその全体を援用する、米国特許第５，７７３，５８２号；米国特許第５，４２２，１０４号；米国特許第５，２４７，０７０号；米国特許第５，６０６，０２３号；米国特許第５，６５２，３５３号；米国特許第４，６７７，０６４号；米国特許第５，５１９，１１９号；および米国特許第５，６５２，３５３号で確認されるものを含む。
【０１５４】
ＶＩＩＩ．ポリペプチド精製
本発明のキメラタンパク質は高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニテイークロマトグラフィー等のような当該分野で適当な技術によって精製することができる。特定のタンパク質を精製するのに用いる現実の条件は、部分的には、正味の電荷、疎水性、親水性等のような因子に依存し、これは当業者に明らかであろう。
【０１５５】
アフィニティークロマトグラフィー精製では、タンパク質に特異的に結合するいずれの抗体も用いることができる。抗体の生産では、限定されるものではないが、ウサギ、マウス、ラット等を含めた種々の宿主動物をキメラタンパク質またはその断片での注射によって免疫化することができる。タンパク質は、側鎖官能基、または側鎖官能基に結合したリンカーによって、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のような適当なキャリアに結合させることができる。限定されるものではないが、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシナニン、ジニトロフェノールのような表面活性物質、およびＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｉ  Ｃａｌｍｅｔｔｅｒ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍのような潜在的に有用なヒトアジュバントを含めた種々のアジュバントを用いて、宿主種に応じて、免疫学的応答を増大させることができる。
【０１５６】
キメラタンパク質に対するモノクローナル抗体は、培養中の連続的細胞系による抗体分子の生産を供するいずれかの技術を用いて調製することができる。これらは、限定されるものではないが、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）によって元来記載されたハイブリドーマー技術、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマー技術（Ｋｏｓｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３；Ｃｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）およびＥＢＶ−ハイブリドーマー技術（Ｃｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）を含む。加えて、適当な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子と共に適当な抗原特異性のマウス抗体分子から遺伝子をスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の生産のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）を用いることができる。別法として、単一鎖抗体の生産について記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を適合させて、キメラタンパク質の精製および検出のためのキメラタンパク質−特異的単一鎖抗体を生産することができる。
【０１５７】
ＩＸ．ポリペプチドの生産
本発明の特別な態様において、ポリペプチドの形態のキメラ分子が生産され、特定の態様においては、該ポリペプチドはタンパク質である。以下に記載する例示的な手法によるなどして、該ポリペプチドが製造されると考えることができる。本発明によるキメラポリペプチド生産のためのスケールアップされたプロトコルは、癌療法のためなどの、生産および使用を容易とするであろう。
【０１５８】
特定の態様において、以下の試薬を使用した：平衡（ＥＱ）緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、２００ｍＭ  ＮａＣｌ）；および溶出緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール）。特に断りのない限り、全ての緩衝液はタンパク質安定性のため４ないし８℃で保存することができる。特に断りのない限り、全ての操作はタンパク質安定性のため４ないし８℃で行うことができる。
【０１５９】
Ａ．醗酵バッチの小スケール分析
以下のプロトコルを醗酵バッチの小スケール分析で使用することができる：
・分析のためにＯＤ６００＝１０において１０ｍｌの細胞を用いる。
・細胞を回転沈降させ、上清を捨てる。
・細胞を４ｍｌのＥＱ緩衝液に再懸濁させる。
・音波処理、３×２０秒２分間隔によって溶解させる。
・遠心機、１４，０００ｒｐｍにおいて１５分にて回転沈降させる。
・注意深く３．２ｍｌの上清を除去し、新鮮なチューブに移す。
・ｐＨをチェックして、それがほぼ８．０であることを確実とする。
・塩化コバルトでキレート化された１００μｌの金属親和性樹脂を加える。
・室温にて１５分間インキュベートし；回転させて、樹脂を懸濁液に保つ。
・懸濁液を１０ｍｌのカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，＃７３１−１５５０）に移し、それを通して流れを収集する。
・６５０μｌの溶出緩衝液を加え、溶出物を新鮮なエッペンドルフチューブに収集する。
・２０μｌのアリコットを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで流す。
・収率を見積もり、外挿して、予測されるバッチの収率を得る。
【０１６０】
Ｂ．キメラ分子の大規模精製
キメラ分子の大規模な精製に関する以下のプロトコルを使用することができる。
【０１６１】
１．細菌の溶解および回収
１．細菌細胞培養懸濁液（ほぼ１００ｇ湿潤重量の細菌ペースト）を解凍する。ＥＱ緩衝液中で１Ｌの最終容量に調整する。
【０１６２】
２．細胞培養懸濁液を、チューブ当たり２００ｍｌにて、５×２５０ｍｌの遠心チューブにアリコットする。
【０１６３】
３．各遠心機チューブ中で細胞懸濁液を音波処理当たり５×１分で音波処理し、各バースト間に氷上で１０分休止する。
【０１６４】
４．細胞抽出物を４０，０００ｒｐｍにおいて４℃にて１時間遠心する。
【０１６５】
５．注意深く上清を１Ｌメスシリンダーまたはビーカーに移す。注意：上清は４℃にて１晩保存することができる。より長い保存のためには、−２０℃で保存し、解凍の後、次の工程に先立って前記したように上清を遠心する。
【０１６６】
６．０．４５μｍフィルターを用い、カラムへの負荷に先立って、溶解物から粒状物を除去する。
【０１６７】
２・細菌溶解物の精製プロセス
Ｉ）免疫化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラム
キメラポリペプチドの精製のための調製
（カラムの寸法：巾２．５ｃｍ；高さ２０ｃｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，＃７３７−２５２１）；カラムベット高さ：８ｃｍ；カラムベット容量：４０ｍｌ）
７．４０ｍｌベッド容量のキレーティングセファロース速流樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｍｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムを調製する。カラムの流速を４ｍｌ／分に調整し、蒸留水で平衡化させる。
【０１６８】
８．少なくとも２カラム容量（ＣＶ）の蒸留水でカラムを洗浄する。
【０１６９】
９．ほぼ０．５ＣＶの塩化コバルト溶液（蒸留水中０．２Ｍ）を加える。
【０１７０】
１０．少なくとも５ＣＶの蒸留水でカラムを洗浄して、過剰の金属イオンを除去する。
【０１７１】
１１．少なくとも５ＣＶの酢酸ナトリウム溶液（０．０２Ｍ酢酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．０）でのカラムの洗浄を継続し、あるいは流出物のｐＨが３．０となるまで（通常、１ＣＶ程度）。これは現実のクロマトグラフィー工程の吸着／脱着相の間に導出するであろう緩く結合したイオンを溶出させるであろう。
【０１７２】
１２．カラムを５ＣＶのＥＱ緩衝液で平衡化させる。
【０１７３】
１３．溶解物をカラムに流し、フロースルーを収集する。
【０１７４】
１４．カラムを２ＣＶのＥＱ緩衝液で洗浄する。
【０１７５】
１５．カラムを３ＣＶの２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、０．５Ｍ  ＮａＣｌで洗浄する。
【０１７６】
１６．カラムを３ＣＶの２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾールで洗浄する。１５ｍｌの画分を収集する。
【０１７７】
１７．タンパク質を５ＣＶの２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、０．５ＭのＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾールで溶出する。１５ｍｌの画分を収集する。
【０１７８】
１８．画分を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流す（２０μｌの各画分）。タンパク質の分子量は６２ｋＤａである（モノマー）。
【０１７９】
ＩＩ）ポリヒスチジンタグの消化
１９．「ｒＥＫ緩衝液」（２０ｍＭトリス、ｐＨ８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いる一晩の透析によって、キメラポリペプチドを含有する画分をプールし、緩衝液を交換する。
【０１８０】
２０．透析物を一晩回転沈降させて、いずれの沈殿も除去する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の資料を分析し、合計キメラポリペプチドを見積もる。
【０１８１】
２１．ｍｇキメラポリペプチド当たり４ユニットの組換えエンテロキナーゼ（ｒＥＫ、Ｎｏｖａｇｅｎ）を加えることによって、チオレドキシン／ポリヒスチジンタグを除去し、室温にて消化を一晩進行させる。
【０１８２】
２２．消化効率の電気泳動分析のために２０μｌのアリコットを除去する。
【０１８３】
２３．０．５×ＰＢＳに対する一晩の透析によって、消化されたキメラポリペプチドを緩衝液交換する。
【０１８４】
ＩＩＩ）ブルーセファロースと共にイオン交換クロマトグラフィーを用いるタンパク質の精製
（カラム寸法：巾１．５ｃｍ；高さ１５ｃｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，＃７３７−１５１６）；カラムベットの高さ：６ｃｍ；カラムベットの容量：１０ｍｌ）
２４．１０ｍｌのベッド容量のブルーセファロース６速流樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムを調製する。カラムの流速を５ｍｌ／分に調整する。
【０１８５】
２５．カラムを１０ＣＶの１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２（「リン酸緩衝液」）で洗浄する。
【０１８６】
２６．カラムを３ＣＶのＰＢＳ／２Ｍ  ＮａＣｌで洗浄する。
【０１８７】
２７．カラムを１０ＣＶのリン酸緩衝液で洗浄する。
【０１８８】
２８．一晩透析されたタンパク質試料資料を回転沈降させて、いずれの沈殿も除去する。［ＮａＣｌ］が３５ｍＭとなるように、タンパク質試料をリン酸緩衝液で１：１希釈する。
【０１８９】
２９．タンパク質試料をブルーセファロースカラムに流し、フロースルーを収集する。フロースルーをカラムに再度負荷する。
【０１９０】
３０．カラムを５ＣＶのリン酸緩衝液で洗浄する。
【０１９１】
３１．カラムを６ＣＶのＰＢＳ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄する。６ｍｌの画分を収集する。
【０１９２】
３２．ＶＥＧＦ１２１／ｒＧｅｌを９ＣＶのＰＢＳ／２Ｍ  ＮａＣｌで溶出する。６ｍｌの画分を収集する。
【０１９３】
３３．電気泳動分析のために１０μｌのアリコットを取り出す。ＶＥＧＦ１２１／ｒＧｅｌの分子量は４３ｋＤａである（モノマー）。
【０１９４】
３４．ＶＥＧＦ１２１／ｒＧｅｌおよび緩衝液交換を含有する画分を、ＰＢＳに対する一晩の透析によってプールする。
【０１９５】
ＩＶ）エンドトキシン除去
（カラム寸法：巾１．５ｃｍ；高さ１５ｃｍ；カラムベッドの高さ：３ｃｍ；カラムベッドの容量：５ｍｌ）
３５．５ｍｌのベッド容量のＤｅｔｏｘｉ−ゲルエンドトキシン除去ゲル（Ｐｉｅｒｃｅ）を調製する。カラムの流れは重力によるものである。Ｅｎｄｏ−ゲルの調製および使用については製造業者の指示に従う（工程３０ないし３２）。
【０１９６】
３６．カラムを５ＣＶの１％デオキシコール酸ナトリウムで洗浄する。
【０１９７】
３７．カラムを３ないし５ＣＶのパイロジェン−非含有水で洗浄する。
【０１９８】
３８．カラムを５ＣＶのＰＢＳで洗浄する。
【０１９９】
３９．キメラポリペプチドをカラムに流し、フロースルーを収集する。カラムを３ｍｌのＰＢＳで洗浄し；この溶出物を（キメラポリペプチドを含有する）フロースルーと組み合わせる。
【０２００】
４０．Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ溶解物アッセイ（Ｃａｍｂｒｅｘ）を用いてエンドトキシンのレベルを測定する。
【０２０１】
４１．工程３０ないし３３を反復してカラムを再生し、エンドトキシンのレベルが０．６５ＥＵ／ｍｇ未満となるまでいずれの結合したエンドトキシンも除去する。
【０２０２】
Ｖ）緩衝液の交換および濃縮
４２．緩衝液を滅菌ＤＰＢＳ（ｐＨ７．４）に交換する。
【０２０３】
４３．キメラ分子を１ｍｇ／ｍｌに濃縮する。
【０２０４】
４４．他の放出仕様を評価する。
【０２０５】
４５．０．２２μｍのフィルターを用いて滅菌濾過し、タンパク質を−２０℃に貯蔵する（好ましくは、フレキシブルバック）。
【０２０６】
この例示的手法に続き、および／またはその間に、％純度および／または％収率のような純度および収率をモニターすることができる。異なる画分を電気泳動に付して、モニタリングを援助することができる。
【０２０７】
Ｃ．例示的Ｅ．ｃｏｌｉにおけるキメラポリペプチドの供給−バッチ醗酵
別法具体例において、組換え融合タンパク質を生産するためにベクターおよびＥ．ｃｏｌｉの供給−バッチ醗酵の以下の手法を使用することができる。具体的な例において、ｐＥＴベクターおよびＥ．ｃｏｌｉ  ＡＤ４９４（ＤＥ３）  ｐＬｙｓＳ−宿主系を例えば使用する。ＡＤ４９４株は、細胞質におけるジスルフィド結合形成を可能とするＫ−１２由来チオレドキシンレダクターゼ（ｔｒｘＢ）突然変異体である。ｔｒｘＢ突然変異はカナマイシンで選択可能であり；従って、この株は、アンピシリン抵抗性マーカーｂｌａを運ぶプラスミドと共に用いるのに推奨される。ｐＬｙｓＳバージョンは、Ｔ７リゾチウムをコードするクロラムフェニコール−抵抗性プラスミドを含み、これは、基礎発現レベルの良好な制御を供する。
【０２０８】
１．ベクターおよび宿主系
例示的な具体例において、キメラポリペプチドをコードするｐＥＴベクターは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＤ４９４（ＤＥ３）  ｐＬｙｓＳに含まれる。
【０２０９】
２．シード培養
１．２５０ｍＬのオートクレーブ処理されたエルレンマイヤーフラスコ中で以下のようにしてシード培地を調製する：５０ｍＬのＬＢ培地、アンピシリン２００ｍｇ／Ｌ、カナマイシン３０ｍｇ／Ｌ、およびクロラムフェニコール３０ｍｇ／Ｌ。
【０２１０】
２．−８０℃で凍結させたグリセロール細胞ストック（１ｍＬ）のバイアルをＬＢ培地に接種する。
【０２１１】
３．シード培養の条件：振盪インキュベーターにおける３７℃および２４０ｒｐｍ。
【０２１２】
４．５±０．５時間後に、５０ｍＬの細胞ブロス（ＯＤ６００ｎｍ＝１．０±０．５）を主たるファーメンターに接種する（作動容量＝１．５Ｌ）。
【０２１３】
＊大規模な醗酵では、このシード培養は２工程で改変することができる。一定の接種では、最終シード培養は、以下のパラメーターについての同一値で調製する必要がある：最終ＯＤおよび接種物サイズ（３．０％、シード容量／主たる培養の作動容量×１００）。
【０２１４】
３．２−Ｌ容器中での主たる醗酵
１．ファーメンターコントローラーに連結されたｐＨ電極を、ｐＨ４およびｐＨ７の標準溶液でキャリブレートする。
【０２１５】
２．以下の初期バッチ培地（ｉＧＹＧ）を調製する：２４．０ｇ／Ｌグリセロール；２０．０ｇ／Ｌ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ，ＵＳＡ）；７．０ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４；３．０ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４；０．５ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ；０．０１ｇ／Ｌビオチン（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）；０／５ｇ／Ｌのグリシン（６．６ｍＭ）。グリセロールおよびグリシンを別々に滅菌し、設定温度３７℃まで冷却した後に滅菌された培地を含有する主たるファーメンターに加える。１−Ｌのフィーディング培地（ｆｄＧＹＧ）では、６００．０ｇのグリセロール、６０．０ｇの酵母エキス、および３．０のグリシン。三成分は別々にオートクレーブ処理する必要がある。
【０２１６】
３．３７℃および６００ｒｐｍにおいてＤＯ（溶存酸素）電極をキャリブレートする。零合わせ（ＤＯ＝０％）のために、窒素ガスをファーメンターに１ｖｖｍ（ガスの容量／液体の容量／分）でパージする。スパンニング（ＤＯ＝１００％）のためには、空気ガスを用いる。
【０２１７】
４．構成物質を加える：最終濃度において、アンピシリン２００ｍｇ／Ｌ、カナマイシン３０ｍｇ／Ｌ、およびクロラムフェニコール３０ｍｇ／Ｌ。
【０２１８】
５．シードをファーメンターに接種し、細胞密度（ＯＤ６００ｎｍ）を分析するために試料を採取する。
【０２１９】
６．培地のｐＨは酸（４２．５％のＨ３ＰＯ４）および塩基（５０％のＮＨ４ＯＨ）溶液を用いて７．０に制御する。
【０２２０】
７．ＯＤ＝１９．００±２．０（または１２±１時間）では、μ（特異的細胞成長速度、ｈ−１）−制御フィーディング戦略にて、フィーディング溶液で供給−バッチ醗酵を開始する。容量フィード速度は以下の式：
【０２２１】
【化１】
2008526889.tif 000002
によって決定される。
【０２２２】
式中、Ｆ：培地の容量供給速度（Ｌ／ｈ）；Ｃ：修正因子（＞０）；μ：制御すべき特異的細胞成長速度（／ｈ）；Ｘ：培養ブロス中の細胞濃度（ＯＤ）；Ｖ：ファーメンター中の作動容量（Ｌ）；Ｙ：グリセロールでの細胞収率（ＯＤ／ｇ／Ｌ）；Ｓｆ：フィード溶液中のグリセロール濃度（ｇ／Ｌ）；ｔ：フィーディング期間における時間間隔（ｈ）；Ｆｓ＝ａ・Ｆ＋ｂ、ここで、Ｆｓ：フィーディングのためのポンプの設定された値；Ｆ：培地の容量供給速度（Ｌ／ｈ）；ａ（傾き）およびｂ（定数）はＦｖ．Ｆｓにおいて決定されたキャリブレーション曲線によって予め決定される。
【０２２３】
８．ＯＤ≧３５．０±５．０において、培養温度を３７℃から２３℃に変化させ、標的タンパク質の発現のためにインデューサー（ＩＰＴＧ、ＯＤ１０のために０．１ｍＭ）を加える。ポンプの設定値（Ｆｓ）を変化させて、供給速度を１．８Ｌの培養容量のために２５ｍＬ／ｈまで低下させる（１５ｇ−グリセロール／ｈまたは８．３ｇ−グルセロール／Ｌ／ｈ）。
【０２２４】
９．攪拌スピード（ＲＰＭ）を９９０まで増加させる（またはＲＰＭを制御して、ＤＯレベルを培養を通じて２０％以上に維持する）。
【０２２５】
１０．１０±１時間後に、細胞を収穫し、遠心して、細胞ペレットを分離する。
【０２２６】
１１．フリーザー（−２０℃）中での貯蔵、精製のために、細胞ペレットをトリス−緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８）に再懸濁させる。
【０２２７】
４．クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（６．５％）における発現テスト
１．細胞ペレット（ＯＤ１０、１０ｍＬ）を４ｍＬの２０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８で再懸濁させる。
【０２２８】
２．氷浴中で細胞懸濁液を音波処理する（２０秒、２または３回）。
【０２２９】
３．Ｔｉ５０．４ローターを用い、４０Ｋ、１５分および４℃において、破壊された細胞を超遠心する。
【０２３０】
４．３．２ｍＬの上清（細胞溶解物）を採取し、０．２ｍＬのＴＡＬＯＮ樹脂（２０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８中の５０％懸濁液）および０．１ｍＬの４Ｍ  ＮａＣｌ（最終濃度＝２００ｍＭ）を加える。
【０２３１】
５．室温にて３０分間結合させる。
【０２３２】
６．試料をカラムに移し、フロースルー（「ＦＴ」）を収集する。
【０２３３】
７．標的タンパク質（Ｖ３８２５）を１ｍＬの溶出緩衝液（２０ｍＭトリス、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、および５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８）（「Ｅ」）で溶出させる。
【０２３４】
８．０．２ｍＬの２０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８で、カラム内側に残るＴＡＬＯＮ樹脂を再懸濁させ、それをミクロ−遠心チューブ（「ＴＡＬ」）に移す。
【０２３５】
９．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（６．５％）に標準（各レーン当たり３ないし０．５ｕｇ）を流し、デンシトメーターによって標的タンパク質の量を分析する。
【０２３６】
１０．計算：
【０２３７】
【化２】
2008526889.tif 000003
ここで、
［Ｖ３８２５］ｓｐ：Ｖ３８２５の比生産性［ｍｇ／Ｌ／ＯＤ１０］
Ｘ：デンシトメトリー分析によって見積もった各レーン当たりの標的タンパク質の量［μｇ］
Ｖ１：ＳＤＳ−ＰＡＧＥの各ウェルにおける試料の負荷容量［μＬ］
Ｖ２：細胞ペレットを再懸濁させるのに加えた２０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８の容量［ｍＬ］
Ｖ３：細胞溶解（音波処理）および超遠心後の上清（細胞溶解物）の容量［ｍＬ］
Ｖ４：元来のサンプリング容量＝１０［ｍＬ］
［Ｖ３８２５］ｔ：Ｖ３８２５の全生産性［ｍｇ／Ｌ］
ＯＤ：ファーメンターから収集した元の試料の光学密度（６００ｎｍ）
本セクションに記載した例示的プロトコルは、例えば、本発明のいずれかのキメラ分子で用いることができ、当業者は、例えば、具体的なキメラ分子に関して最適化するためのプロトコルの態様を認識している。
【０２３８】
Ｘ．アプタマー
本発明のある具体例において、組成物および方法はアプタマーが含まれるキメラ分子を利用する。本明細書中で用いる用語「アプタマー」とは、もう１つの分子に結合することができる１以上の小分子をいう。具体的な例において、アプタマーは、オリゴヌクレオチドを含むことができるＲＮＡまたはＤＮＡを含めた核酸を含むことができ、および／またはそれらはペプチドを含むことができる。ある具体例において、アプタマーは、高度に特異的な三次元立体配座を取ることができるオリゴヌクレオチドの化学的に合成されたストランドであるもののような、オリゴヌクレオチドを含む。アプタマーは、例えば、キメラ分子がそれに対して標的化される同一分子を含めた、ある種の標的分子に向けられた適当な結合親和性および特異性を有するように設計することができる。別法具体例において、アプタマーは、１以上の抗−細胞増殖部位のための細胞−標的化部位として使用される。
【０２３９】
アプタマー分子は、当該分野におけるいずれかの適当な方法によって本発明の所望の分子にコンジュゲートすることができるが、本発明の特別な態様において、所望の分子はヘテロ二感応性架橋剤であるｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）によってアプタマーにコンジュゲートされる。
【０２４０】
アプタマーは、既に知られたアプタマーに関する当該分野における知識から得ることができ、あるいはアプタマーは、例えば、当該分野におけるルーチン的方法によるなどしてスクリーニングすることができる。かくして、本発明の具体的な例において、アプタマーは抗−細胞増殖部位に連結される。本発明の他の具体例において、アプタマーは、細胞標的化部位に連結された抗−細胞増殖部位のキメラ分子に連結され、この場合、アプタマー／キメラ分子は２つの細胞−標的化体を使用する。
【０２４１】
以下の記載は、前立腺−特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）を標的とするアプタマーを含むゲロニンコンジュゲートを使用する例示的アプタマー組成物を考えるが、当業者は、別の具体例を本発明のキメラ分子のいずれかの部分、または全部と共に、および／または別なアプタマーと共に使用できることを認識する。ＰＳＭＡは、その発現が、病気進行の間に前立腺腫瘍細胞で増大する膜貫通受容体である。このタンパク質は、腫瘍血管系の内皮では発現されるが、正常な血管系の内皮でも発現されない。アプタマーは、高い親和性および特異性でもって細胞表面腫瘍抗原のようなタンパク質に結合するよう選択される小さな核酸である。アプタマーは、細胞−標的化抗体または他の細胞−標的化リガンドの置換として働く能力を有する。
【０２４２】
本発明者らは、高い親和性でもってＰＳＭＡの外部ドメインに結合することが知られている改変されたＲＮＡアプタマーを利用した（従前に報告されたＫｉ＝２ｎＭ）。２２ｋＤａアプタマー分子は、ヘテロ二官能性架橋剤ＳＰＤＰを用いて組換えゲロニン（ｒＧｅｌ）トキシンにコンジュゲートした。次いで、イオン交換およびゲル浸透クロマトグラフィーによって、アプタマー／ｒＧｅｌコンジュゲートを精製した。最終産物は遊離アプタマーまたは遊離ｒＧｅｌによって汚染されておらず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによると単一種（〜５０ｋＤａ）として移動した。構築体の分析は、ｒＧｅｌ成分が遊離ｒＧｅｌと比較して酵素的に活性であることを示した。加えて、コンジュゲートは、ＰＳＭＡ−発現ＬＮＣＡＰ細胞に特異的に結合することが判明した。アプタマー／ｒＧｅｌコンジュゲートの細胞傷害性研究は、抗原をかなり少なく含有する、ＰＣ３細胞での３５０，０００ｎＭのＩ．Ｃ．５０と比較して、抗原−陽性ＬＮＣＡＰ細胞での３２ｎＭのＩ．Ｃ．５０を示した；標的化指標はほぼ１０，０００倍であった。内部化実験はトキシンコンジュゲートの進入の詳細を明らかにし、動物モデル実験は継続中である。これらのデータは、アプタマーを用いて、腫瘍細胞へトキシンのようなタンパク質分子を成功して送達するのに用いることができることを示し、標的化治療剤の開発に対する新規なアプローチを提供する。アプタマーは化学的に合成することができ、それにより、部位−特異的にコンジュゲートできるという事実は、それらを、標的リガンドとして特に興味深いものとする。例示的なＰＳＭＡ−ｒＧｅｌ構築体は、前立腺細胞および腫瘍血管系でのＰＳＭＡを標的化するのに有用である。
【０２４３】
ＸＩ．キメラ分子の投与
いくつかの具体例において、本発明のキメラ分子の有効量を細胞に投与する。他の具体例において、本発明のキメラ分子の治療上有効量を、病気の治療のために個体に投与される。本明細書中で用いる用語「有効量」は、それが投与される細胞または組織における生理学的変化をもたらすのに必要な、本発明のキメラ分子の量と定義される。本明細書中で用いる用語「治療上有効量」は、癌のような病気の有害効果を排除し、減少させ、遅らせ、または最小とする本発明のキメラ分子の量と定義される。当業者であれば、多くの場合において、キメラ分子は治癒を供しないかもしれないが、少なくとも１つの兆候の軽減または改良のような、部分的利点を供することができるに過ぎないことを容易に認識する。いくつかの具体例において、いくつかの利点を有する生理学的変化も治療的に利点があると考えられる。かくして、いくつかの具体例において、生理学的変化を供するキメラ分子の量は「有効量」または「治療上有効量」と考えられる。
【０２４４】
本発明のいくつかの具体例において、および当該分野における公知の方法よりも優れた利点として、キメラ分子はタンパク質として送達され、所望のポリペプチドを生じるように翻訳される核酸分子としては送達されない。さらなる利点として、いくつかの具体例において、ヒト配列を本発明のキメラポリペプチドで利用して、いずれの望まない免疫応答も外来性ポリペプチドから回避する。
【０２４５】
本発明のキメラタンパク質は、それ自体、あるいは癌、自己免疫、移植拒絶、外傷後免疫応答および感染症の治療のための医薬組成物の形態で、例えば、ＨＩＶのｇｐ１２０のようなウイルス抗原を標的化させることによって、対象に投与することができる。より詳細には、キメラポリペプチドは、リンパ腫；自己免疫、移植拒絶、移植片−対−宿主病、虚血症および発作を含めた、免疫細胞−媒介障害に関与する細胞を排除するのに有用であろう。本発明のタンパク質を含む医薬組成物は、慣用的な混合、溶解、造粒、糖衣−作成、混練、乳化、カプセル化、包括または凍結乾燥プロセスによって製造することができる。医薬組成物は、医薬的に用いることができる製剤へのタンパク質の加工を容易とする１以上の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または補助剤を用いて慣用的な手段で処方することができる。適切な処方は、選択された投与経路に依存する。
【０２４６】
局所投与では、本発明のタンパク質は、当該分野でよく知られたように、溶液、ゲル、軟膏、クリーム、懸濁液等として処方することができる。
【０２４７】
全身処方は、注射、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、くも膜下腹腔内または腹腔内注射による投与のために設計されたもの、ならびに経皮、経粘膜、吸入、経口または肺投与のために設計されたものを含む。
【０２４８】
注射では、本発明のタンパク質は水性溶液、好ましくは、ハンクスの溶液、リンゲル溶液、または生理食塩水緩衝液のような生理学的に適合する緩衝液中で処方することができる。溶液は、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤のような処方剤を含有することができる。
【０２４９】
別法として、タンパク質は、使用前に、適当なビヒクル、または滅菌パイロジェン−非含有水での復元のために粉末形態とすることができる。
【０２５０】
経粘膜投与では、浸透させるべきバリアーに適した浸透剤を処方で用いる。そのような浸透剤は一般的に当該分野で知られている。
【０２５１】
経口投与では、タンパク質は、タンパク質を当該分野で良く知られた医薬上許容される担体と合わせることによって容易に処方することができる。そのような担体は、本発明のタンパク質が、治療すべき患者による経口接種のために、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として処方するのを可能とする。例えば、粉末、カプセルおよび錠剤のような経口固体処方では、適当な賦形剤は、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールおよびソルビトールのような充填剤；トウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、ジャガイモ澱粉、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよび／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のようなセルロース調製物；顆粒剤；および結合剤を含む。所望であれば、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムのようなその塩のような崩壊剤を加えることができる。
【０２５２】
所望であれば、固体投与形態は標準的な技術を用いて糖−コーティング、または腸溶−コーティングすることができる。
【０２５３】
例えば、懸濁液、エリキシル剤および溶液のような経口液体製剤では、適当な担体、賦形剤または希釈剤は水、グリコール、油、アルコール等を含む。加えて、フレーバー剤、保存剤、着色剤を加えることができる。
【０２５４】
経頬投与では、分子は錠剤、ロゼンジ等の形態を取ることができ、慣用的な方法で処方することができる。
【０２５５】
吸入による投与では、本発明によって使用される分子は、適当なプロペラント、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガスを用い、圧縮されたパックまたはネビュライザーからのエアロゾルスプレーの形態で便宜には送達される。圧縮エアロゾルの場合には、投与単位は、バルブを供して計量した量を送達することによって決定することができる。インハーラーまたはインサフラーで用いるためのゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、タンパク質およびラクトースまたは澱粉のような適当な粉末基剤の粉末ミックスを含有するように処方することができる。
【０２５６】
キメラ分子は、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドのような慣用的な坐薬基剤を含有する、坐薬または油性停留浣腸のような直腸または膣組成物に処方することもできる。
【０２５７】
従前に記載された処方に加えて、分子はデポ製剤として処方することもできる。そのような長期作用処方は、移植（例えば、皮下または筋肉内）によって、あるいは筋肉内注射によって投与することができる。かくして、例えば、分子は（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）適当なポリマーまたは疎水性物質、あるいはイオン交換樹脂で処方することができ、あるいは貧溶解性誘導体として、例えば、貧溶解性塩として処方することができる。
【０２５８】
別法として、他の医薬送達系を使用することができる。リポソームおよびエマルジョンは、本発明のタンパク質を送達するのに用いることができる送達ビヒクルのよく知られた例である。ジメチルスルホキシドのようなある種の有機溶媒を使用することもできるが、通常は、毒性が大きい危険性がある。加えて、分子は、治療剤を含有する固体ポリマーの半浸透性マトリックスのような維持−放出系を用いて送達することができる。種々の維持−放出物質は確立されており、当業者によってよく知られている。維持−放出カプセルは、それらの化学的な性質に依存して、分子を数週間から１００日にわたって放出することができる。キメラ分子の化学的性質および生物学的安定性に依存して、分子安定化のためのさらなる戦略を使用することができる。
【０２５９】
本発明のキメラ分子のタンパク質具体例は荷電側鎖または末端を含有することができるので、それらは、遊離酸または塩基として、あるいは医薬上許容される塩として前記処方のいずれかに含めることができる。医薬上許容される塩は、遊離塩基の生物学的活性を実質的に保持し、無機酸との反応によって調製される塩である。医薬塩は、対応する遊離塩基形態である水性および他のプロトン性溶媒により可溶性である傾向がある。
【０２６０】
Ａ．効果的な用量
本発明のキメラ分子は、一般には、意図した目的を達成するのに効果的な量で用いられる。病気状態を治療または予防するのに用いるには、本発明の分子、またはその医薬組成物は、治療上有効量で投与し、または適用される。治療上有効量は、兆候を軽減し、または予防し、あるいは治療すべき患者の生存を延長するのに有効な量である。治療上有効量の決定は、特に、本明細書中に提供された詳細な開示に徴して、当業者の十分に能力内である。
【０２６１】
全身投与では、治療上有効量は、イン・ビトロアッセイから最初は見積もることができる。例えば、用量は、動物モデルにおいては、細胞培養で決定されたＩＣ５を含む循環濃度範囲を達成するように処方することができる。そのような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
【０２６２】
また、初期用量は当該分野で良く知られた技術を用い、イン・ビボデータ、例えば、動物モデルから見積もることもできる。当業者であれば、動物データに基づいてヒトへの投与を容易に最適化できよう。
【０２６３】
投与用量および間隔は、治療効果を維持するのに十分な分子の血漿中レベルを供するように個々に調整することができる。注射による投与のための通常の患者用量は、約０．１ないし５ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約０．５ないし１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療上有効な血清レベルは毎日複数用量を投与することによって達成することができる。
【０２６４】
局所投与または選択的摂取の場合には、タンパク質の有効な局所濃度は血漿濃度には関連しないであろう。当業者であれば、過度な実験なくして治療上有効な局所用量を最適化することができよう。
【０２６５】
投与される分子の量は、もちろん、治療すべき対象、対象の体重、病気の重症度、投与の方法、および主治医の判断に依存するであろう。
【０２６６】
療法は、兆候が検出可能な間に間欠的に反復することができ、あるいはそれらが検出さできない場合にさえそのようにすることができる。該療法は単独で、あるいは他の薬物と組み合わせて供することができる。自己免疫疾患の場合には、本発明のＩＬ２−Ｂａｘと組み合わせて用いることができる薬物は、限定されるものではないが、ステロイドおよび非−ステロイド抗−炎症剤を含む。
【０２６７】
Ｂ．毒性
好ましくは、本明細書中に記載されたキメラ分子の治療上有効量は、実質的な特性を引き起こすことなく治療効果を供するであろう。
【０２６８】
本明細書中に記載された分子の毒性は、細胞培養または実験動物において標準的な医薬手法によって、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的である用量）またはＬＤ１００（集団の１００％に対して致死的である用量）を決定することによって判断することができる。毒性および治療効果の間の用量の比率は治療指標である。高い治療指標を呈するタンパク質が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒトで用いるのに毒性でない容量範囲を処方するのに用いることができる。本明細書中に記載されたタンパク質の用量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性なくして有効用量を含む循環濃度の範囲内にある。該用量は、使用する投与形態、および利用される投与経路に依存してこの範囲内で変化させることができる。正確な処方、投与の経路、および用量は、患者の状態に鑑みて個々の意志によって選択することができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５，Ｉｎ：  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｈ．１，ｐ．１参照）。
【０２６９】
Ｃ．医薬製剤
本発明の医薬組成物は、有効量の１以上のポリペプチドまたはキメラポリペプチド、および、ある具体例においては、医薬上許容される担体に溶解または分散された少なくとも１つの追加の剤を含む。フレーズ「医薬上または薬理学上許容される」とは、例えば、ヒトのような動物に投与された場合に、適切には、有害な、アレルギー性または他の望まない反応を生じない分子体および組成物を言う。少なくとも１つのキメラポリペプチドまたはさらなる有効成分を含有する医薬組成物の調製は、ここで引用して援用する、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０によって例示されるように、本開示に徴して当業者に知られるであろう。さらに、動物（例えば、ヒト）投与では、製剤は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓによって要求される滅菌性、パイロジェン性、一般的な安全性および準拠の標準を満足すべきことは理解されるであろう。
【０２７０】
本明細書中で用いるように、「医薬上許容される担体」は、当業者に知られているように、いずれかおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定化剤、ゲル、バインダー、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、フレーバー剤、色素、そのような物質および組合せを含む（例えば、ここで引用して援用する、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，ｐｐ．１２８９−１３２９）。いずれかの慣用的な担体が有効成分に適合しない場合を除き、治療または医薬組成物におけるその使用が考えられる。
【０２７１】
キメラ分子は、それが固体、液体またはエアロゾル形態で投与されるべきか、および注射としての投与経路のために滅菌される必要があるか否かに依存して、異なるタイプの担体を含むことができる。本発明は、当業者に知られているように、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、器官内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜内、血管周囲内、臍帯内、眼内、経口、局所、局所的、吸入（例えば、エアロゾル吸入）、注射、注入、連続的注入、直接的に標的細胞を浴する局所化灌流、カテーテルを介して、胃管洗浄を介して、クリームで、脂質組成物（例えば、リポソーム）にて、または他の方法、または前記のいずれかの組合せによって投与することができる（例えば、ここで引用して援用する、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０参照）。
【０２７２】
動物患者に投与される本発明の組成物の現実の投与量は、体重、疾患の重症度、治療すべき病気のタイプ、従前のまたは同時の治療的介入、患者の特発症、および投与の経路のような身体的および生理学的因子によって決定することができる。投与を担う実行者は、いずれにせよ、組成物中の有効成分の濃度、および個々の対象についての適切な用量を決定するであろう。
【０２７３】
ある具体例において、医薬組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の有効成分を含むことができる。他の具体例において、活性な化合物はユニットの重量の約２％ないし約７５％の間、あるいは約２５％ないし約６０％の間、例えば、その中の誘導可能ないずれかの範囲を含むことができる。他の非限定的例において用量は投与当たり約１マイクログラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重以上、およびその中で誘導可能ないずれかの範囲を含むこともできる。ここでリストした数字から誘導可能な範囲の非限定的例において、約５ｍｇ／ｋｇ／体重ないし約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重ないし約５００ミリグラム／ｋｇ／体重等を前記した数字に基づいて投与することができる。
【０２７４】
いずれの場合においても組成物は、１以上の成分の酸化を遅らせるための種々の抗酸化剤を含むことができる。加えて、微生物の作用の予防は、限定されるものではないが、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チベロザールまたはその組合せを含めた、種々の抗菌剤および抗真菌剤のような保存剤によって実現することができる。
【０２７５】
キメラ分子は、遊離塩基、中性または塩形態で組成物に処方することができる。医薬上許容される塩は酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、または例えば、塩酸またはリン酸のような無機酸とで形成されたもの、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸またはマンデル酸のような有機酸とで形成されたものを含む。遊離カルボキシル基とで形成された塩は、例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは第二鉄のような無機塩基；あるいはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンまたはプロカインのような有機塩基に由来することもできる。
【０２７６】
組成物が液体形態である具体例において、担体は、限定されるものではないが、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコール等）、脂質（例えば、トリグリセリド、植物油、リポソーム）およびその組合せを含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって；例えば、液状ポリオールまたは脂質のような担体中への分散により必要な粒子サイズの維持によって；例えば、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤の使用によって；あるいはそのような方法の組合せによって維持することができる。多くの場合、例えば、糖、塩化ナトリウムまたはその組合せのような等張剤を含むのが好ましいであろう。
【０２７７】
他の具体例において、本発明における点眼剤、鼻溶液またはスプレイ、エアロゾルまたは吸入剤を用いることができる。そのような組成物は、一般には、標的組織タイプに適合するように設計される。非限定的例においては、鼻溶液は、通常、点剤またはスプレイにおける鼻通路に投与するように設計された水性溶液である。鼻溶液は、それらが鼻分泌に対する多くの点で同様であるように、通常の線毛作用が維持されるように調製される。かくして、好ましい具体例において、水性鼻溶液は、通常は、等張またはわずかに緩衝化されて、約５．５ないし約６．５のｐＨを維持する。加えて、目製剤、薬物、または適当な薬物安定化剤で用いるものと同様に、抗微生物保存剤は、もし必要であれば、処方に含めることができる。例えば、種々の商業的な鼻製剤が知られており、抗生物質または抗ヒスタミン剤のような薬物を含む。
【０２７８】
ある具体例において、キメラ分子は、経口摂取のような経路による投与のために調製される。これらの具体例において、固体組成物は、例えば、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル剤（例えば、ハードまたはソフトシェルドゼラチンカプセル剤）、維持放出処方、経頬組成物、トローチ、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハーまたはその組合せを含むことができる。経口組成物はダイエットの食品と共に直接的に配合することができる。経口投与用の好ましい担体は不活性な希釈剤、同化可能食用担体またはその組合せを含む。本発明の他の態様において、経口組成物はシロップまたはエリキシル剤として調製することができる。シロップまたはエリキシル剤は、例えば、少なくとも１つの活性な剤、甘味剤、保存剤、フレーバー剤、色素、保存剤、またはその組合せを含むことができる。
【０２７９】
ある好ましい具体例において、経口組成物は１以上のバインダー、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、フレーバー剤、およびその組合せを含むことができる。ある具体例において、組成物は以下の：例えば、トラガカントガム、アカシア、コーンスターチ、ゼラチンまたはその組み合わせのようなバインダー；例えば、リン酸二カルシウム、マンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムまたはその組合せのような賦形剤；例えば、コーンスターチ、ジャガイモ澱粉、アルギン酸またはその組合せのような崩壊剤；例えば、ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤；例えば、スクロース、ラクトース、サッカリンまたはその組合せのような甘味剤、例えば、ペパーミント、冬緑油、チェーリーフレーバー、オレンジフレーバー等のようなフレーバー剤；または前記のその組合せのうちの１以上を含むことができる。投与単位形態がカプセルである場合、それは、前記タイプの物質に加えて、液状担体のような担体を含有することができる。種々の他の物質をコーティングとして、あるいは投与単位の物理的形態を改変するために存在させることができる。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤をシェラック、糖または双方でコーティングすることができる。
【０２８０】
他の投与形態に適したさらなる処方は坐薬を含む。坐薬は、通常は、直腸、膣または尿管への挿入のために投薬される、種々の重量および形状の固体投与形態である。挿入後、坐薬はしばしば腔液中で融解または溶解する。一般に、坐薬では、伝統的な担体は、例えば、ポリアルキレングリコール、トリグリセリドまたはその組合せを含むことができる。ある具体例において、坐薬は、例えば、約０．５％ないし約１０％、好ましくは約１％ないし約２％の範囲の有効成分を含有する混合物から形成することができる。
【０２８１】
滅菌注射溶液は、必要な量の活性化合物を、前記した種々の他の成分と共に適当な溶媒に配合し、必要であれば、濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、基本的な分散媒体および／または他の成分を含有する滅菌ビヒクルに種々の滅菌された有効成分を配合することによって調製される。滅菌注射溶液、懸濁液またはエマルジョンの調製用の滅菌粉末の場合には、好ましい調製方法は、従前に滅菌濾過されたその液体媒体から、有効成分＋いずれかのさらなる所望の成分の粉末を生じる真空−乾燥または凍結−乾燥技術である。液状媒体は、必要であれば、適当に緩衝化すべきであり、液状希釈剤は、まず、十分な生理食塩水またはグルコースで注射に先立って等張とされる。直接的注射のための非常に濃縮された組成物の調製もまた考えられ、そこでは、溶媒としてのＤＭＳＯの使用が考えられ、極端に迅速な浸透がもたらされ、高濃度の活性剤が小さな領域に送達される。
【０２８２】
組成物は製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。エンドトキシンの汚染は安全なレベル、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満に最小に維持されるべきであるのは認識されるであろう。
【０２８３】
特別な具体例において、注射組成物の延長された吸収は、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンまたはその組合せのような吸収を遅延させる剤の組成物中での使用によって実現させることができる。
【０２８４】
ＸＩＩ．組合せ治療／癌療法
本発明のキメラ分子、またはそれについてコードする発現構築体の有効性を増大させるためには、これらの組成物を、抗癌剤のような、過剰増殖病の治療で有効な他の剤と組み合わせるのが望ましいであろう。事実、特別な具体例において、本発明のキメラ分子は、抵抗性細胞に対して化学療法剤を効果的とするように、１以上の化学療法剤と共に使用される。キメラ分子が、単独で、あるいは１以上の化学療法剤と組み合わせて、放射線、外科的処置、遺伝子治療等のようなもう１つの癌療法に加えて、癌を持つ個体に投与することができる。
【０２８５】
「抗癌」剤は、例えば、癌細胞を殺し、癌細胞におけるアポトーシスを誘導し、癌細胞の成長速度を低下させ、転移の発生または数を低下させ、腫瘍サイズを低下させ、腫瘍の成長を阻害し、腫瘍または癌細胞への血液供給を低下させ、癌細胞または種陽に対する免疫応答を促進し、癌の進行を予防または阻害し、あるいは癌を持つ対象の寿命を増大させることによって、対象において癌に負に影響できる。より一般的には、これらの他の組成物は、細胞を殺し、またはその増殖を阻害するのに有効な組合せ量にて供されるであろう。このプロセスは、細胞を同時に発現構築体および剤または複数因子と接触させることを含むことができる。これは、細胞を、双方の剤を含む単一組成物または薬理学的処方と接触させることによって、あるいは細胞を同時に２つの区別される組成物または処方と接触させることによって達成することができ、ここで、１つの組成物が発現構築体を含み、他の組成物は第二の剤を含む。
【０２８６】
化学療法および放射線療法剤に対する腫瘍細胞の抵抗性は、臨床腫瘍学において主な問題を呈する。現行の癌研究の１つの目標は、それを遺伝子治療と組み合わせることによって、化学−および放射線療法の効率を改善する方法を見つけることである。例えば、単純疱疹−チミジンキナーゼ（ＨＳ−ｔＫ）遺伝子は、レトロウイルスベクター系によって脳腫瘍に送達された場合、抗ウイルス剤ガンシクロビールに対する感受性を成功して誘導した（Ｃｕｌｖｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。本発明の関係では、キメラ分子は、他のプロ−アポトーシスまたは細胞周期調節剤に加えて、化学療法剤、放射線治療剤、遺伝子治療、または免疫治療介入と組み合わせて同様に用いることができると考えられる。
【０２８７】
別法として、該療法は数分ないし数週間の範囲の間隔だけ他の剤の治療に先行し、またはそれに遅れることができる。他の剤および発現構築体を別々に細胞に適用する具体例において、一般には、有意な時間を各送達の時間の間に消滅させず、従って、該剤および発現構築体が細胞に対する組合せ効果を有利に発揮することができるのを確実とする。そのような場合において、細胞を相互から約１２ないし２４時間以内に、より好ましくは相互から約６ないし１２時間以内に双方の様式と接触させることができる。いくつかの状況においては、治療の期間を有意に延長するのが望ましく、しかしながら、ここで、数日（２、３、４、５、６または７）ないし数週間（１、２、３、４、５、６、７または８）が各投与の間に経過する。
【０２８８】
種々の組合せを使用することができ、ここで、キメラ分子療法は「Ａ」であり、放射線−または化学療法のような第二の剤は、例えば、「Ｂ」である：
Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ
Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ
患者への本発明の治療発現構築体の投与は、もしあれば、ベクターの毒性を考慮して、化学療法剤の投与のための一般的なプロトコルに従うであろう。治療サイクルはもし必要であれば反復されるであろうと予測される。また、種々の標準的な療法、ならびに外科的介入を記載された過剰増殖細胞療法と組み合わせて適用することができるとも考えられる。
【０２８９】
Ａ．化学療法
癌療法は、化学および放射線ベースの治療双方との種々の組合せ療法も含む。組合せ化学療法は、例えば、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メルクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イフォスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソ尿素、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ピリコマイシン、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、ゲムシュタビン、ナベルビン、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金、５−フルオロウラシル、ビンクリシチン、ビンブラスチンおよびメトトレキセート、または前記のいずれかのアナログまたは誘導体変種を含む。
【０２９０】
Ｂ．放射線療法
ＤＮＡ損傷を引き起こし、広く用いられてきた他の因子は、γ−線、Ｘ−線、および／または腫瘍細胞への放射性同位体の指向性送達として通常は知られているものを含む。マイクロ波およびＵＶ−照射のような、ＤＮＡ損傷因子の他の形態も考えられる。これらの因子の全ては、ＤＮＡに対する、ＤＮＡの前駆体に対する、ＤＮＡの複製および修復に対する、および染色体の組立および維持に対する広い範囲の損傷を行うようである。Ｘ−線についての用量範囲は、長期間の（３ないし４週間）の５０ないし２００レントゲンの毎日の用量、ないし２０００ないし６０００レントゲンの単一用量の範囲である。放射線同位体についての用量範囲は広く変化し、同位体の半減期、照射される放射線の強度およびタイプ、および新形成細胞による取込に依存する。
【０２９１】
用語「接触された」および「曝露された」は、細胞に適用される場合、それによって治療構築体および化学療法剤もしくは放射線療法剤が標的細胞に送達され、標的細胞と直接的に隣接して位置されるプロセスを記載するのに本明細書中では用いる。細胞の殺傷または静止を達成するには、双方の剤を、細胞を殺傷し、またはそれが分裂するのを妨げるのに有効な組合せ量にて細胞に送達される。
【０２９２】
Ｃ．免疫療法
免疫療法は、一般には、免疫エフェクター細胞および分子を用いて癌細胞を標的化し、それを破壊するのに依拠する。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面のいくつかのマーカーに対して特異的な抗体であり得る。該抗体は、単独で、療法のエフェクターとして働くことができるか、あるいはそれは他の細胞を動員して、現実に細胞殺傷を行うことができる。抗体は薬物またはトキシン（化学療法剤、放射線核種、リシンＡ鎖、コレラトキシン、百日咳トキシン等）にコンジュゲートさせることもでき、標的化剤として単純に働かせることができる。別法として、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的にまたは間接的に相互作用する表面分子を運ぶリンパ球であっても良い。種々のエフェクター細胞は細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む。
【０２９３】
免疫療法は、かくして、遺伝子療法と組み合わせた、組合せ療法の一部として用いることができる。組合せ療法のための一般的なアプローチは後に議論する。一般に、腫瘍細胞は、標的化で使用できる、すなわち、他の細胞の大部分に存在しないいくつかのマーカーを担持しなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれかは本発明の関係で標的化に適しているであろう。通常の腫瘍マーカーは癌性胚抗原、前立腺特異的抗原、子宮腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルＬｅｗｉｓ抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、ｅｒｂＢおよびｐ１５５を含む。
【０２９４】
Ｄ．遺伝子
なおもう１つの具体例において、第二の治療は遺伝子治療であり、そこでは、治療ポリヌクレオチドが、本発明のキメラポリペプチドの前に、後に、またはそれと同時に投与される。以下の遺伝子産物の１つをコードする第二のベクターと組み合わせたキメラポリペプチドの送達は、標的組織に対して組み合わせた抗−過剰増殖効果を有する。別法として、双方の遺伝子をコードする単一ベクターを用いることができる。種々のタンパク質が本発明内に含まれ、そのいくつかは後に記載する。
【０２９５】
１．細胞増殖のインデューサー
細胞増殖を誘導するタンパク質は機能に依存して種々のカテゴリーにさらに入る。これらのタンパク質の全ての共通性は、細胞増殖を調節するそれらの能力である。例えば、ＰＤＧＦの形態であるｓｉｓオンコジーンは分泌される成長因子である。オンコジーンは稀に成長因子をコードする遺伝子から生起し、現在、ｓｉｓは唯一の公知の天然に生じるオンコジーン成長因子である。本発明の１つの具体例において、細胞増殖の特定のインデューサーに向けられたアンチセンスｍＲＮＡを用いて、細胞増殖のインデューサーの発現を妨げると考えられる。
【０２９６】
タンパク質ＦＭＳ、ＥｒｂＡ、ＥｒｂＢおよびｎｅｕは成長因子受容体である。これらの受容体に対する突然変異の結果、調節可能な機能が失われる。例えば、Ｎｅｕ受容体タンパク質の膜貫通ドメインに影響する点突然変異の結果、ｎｅｕオンコジーンがもたらされる。ｅｒｂＡオンコジーンは、甲状腺ホルモンに対する細胞内受容体に由来する。改変されたオンコジーンＥｒｂＡ受容体は、内因性甲状腺ホルモン受容体と競合し、制御されない増殖を引き起こすと考えられる。
【０２９７】
オンコジーンの最大のクラスはシグナル伝達タンパク質（例えば、Ｓｒｃ、ＡｂｌおよびＲａｓ）を含む。タンパク質Ｓｒｃは細胞質タンパク質−チロシンキナーゼであり、ある場合には、プロト−オンコジーンからオンコジーンへのその形質転換はチロシン残基５２７における突然変異を介して由来する。対照的に、ＧＴＰａｓｅタンパク質ｒａｓのプロト−オンコジーンからオンコジーンへの形質転換は、１つの例において、配列中のアミノ酸１２におけるバリンからグリシンへの突然変異に由来し、ｒａｓ  ＧＴＰａｓｅ活性を低下させる。
【０２９８】
タンパク質Ｊｕｎ、ＦｏｓおよびＭｙｃは、転写因子としての核機能に対してそれらの効果を直接的に発揮するタンパク質である。
【０２９９】
２．細胞増殖の阻害剤
腫瘍サプレッサーオンコジーンは、過剰な細胞増殖を阻害するように機能する。これらの遺伝子の不活化はそれらの阻害性活性を破壊し、その結果、調節されない増殖がもたらされる。腫瘍サプレッサーｐ５３、ｐ１６およびＣ−ＣＡＭは後に記載される。
【０３００】
高レベルの突然変異体ｐ５３が、化学癌形成、紫外線照射、およびいくつかのウイルスによって形質転換された多くの細胞で見出されている。ｐ５３遺伝子は、広く種々のヒト腫瘍における突然変異不活化の頻繁な標的であり、通常のヒト癌における最も頻繁に突然変異する遺伝子であると既に記載されている。それはヒトＮＳＣＬＣの５０％を超えて（Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）、および広いスペクトルの他の腫瘍において突然変異される。
【０３０１】
ｐ５３遺伝子は、大−Ｔ抗原およびＥ１Ｂのようなホストタンパク質とで複合体を形成することができる３９３−アミノ酸リンタンパク質をコードする。該タンパク質は正常な組織および細胞で見出されているが、形質転換された細胞または主要組織と比較することによって微小な濃度においては見出されない。
【０３０２】
野生型ｐ５３は多くの細胞型において重要な成長レギュレーターとして認識される。ミスセンス突然変異はｐ５３遺伝子で共通しており、オンコジーンのトランスフォーミング能力で必須である。点突然変異によって促進された単一遺伝子変化は、癌形成性ｐ５３を作り出すことができる。しかしながら、他のオンコジーンとは異なり、ｐ５３点突然変異は少なくとも３０の区別されるコドンで起こることが知られており、しばしば、ホモ接合性に対する低下なくして細胞表現型においてシフトを生じる優性対立遺伝子を作り出す。加えて、これらの優性陰性対立遺伝子の多くは、生物において許容され、生殖系にて継体されるようである。種々の突然変異体対立遺伝子は、最小に機能不全から、強く浸透性の優性陰性対立遺伝子の範囲であるようである（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，１９９１）。
【０３０３】
細胞増殖のもう１つの阻害剤はｐ１６である。真核生物細胞周期の主な転移はサイクリン−依存性キナーゼ、またはＣＤＫによってトリガーされる。１つのＣＤＫ、サイクリン−依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）はＧ１を通じて進行を調節する。この酵素の活性は後期Ｇ１においてＲｂをリン酸化するようである。ＣＤＫ４の活性は活性化されるユニット、Ｄ−タイプのサイクリンによって、および阻害性サブユニットによって調節され、ｐ１６ＩＮＫ４はＣＤＫ４に特異的に結合し、それを阻害するタンパク質として生化学的には特徴付けられ、かくして、Ｒｂリン酸化を調節することができる（Ｓｅｒｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｓｅｒｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。ｐ１６ＩＮＫ４タンパク質はＣＤＫ４阻害剤（Ｓｅｒｒａｎｏ，１９９３）であるので、この遺伝子の欠失はＣＤＫ４の活性を増加させることができ、その結果、Ｒｂタンパク質は過剰リン酸化される。ｐ１６はＣＤＫ６の機能を調節することも知られている。
【０３０４】
ｐ１６ＩＮＫ４は、ｐ１６Ｂ、ｐ１９、ｐ２１ＷＡＦ１、およびｐ２７ＫＩＰ１も含むＣＤＫ−阻害性タンパク質の新しく記載されたクラスに属する。ｐ１６ＩＮＫ４遺伝子は、多くの腫瘍タイプでは頻繁に欠失された染色体領域９ｐ２１にマッピングされる。ｐ１６ＩＮＫ４遺伝子のホモ接合性欠失および突然変異はヒト腫瘍細胞系において頻繁である。この証拠は、ｐ１６ＩＮＫ４遺伝子が腫瘍サプレッサー遺伝子であることを示唆する。この解釈は、しかしながら、ｐ１６ＩＮＫ４遺伝子改変の頻度は培養された細胞系におけるよりも初代の培養されていない腫瘍においてかなり低いという観察によって挑戦されてきた（Ｃａｌｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｈｕｓｓｕｓｓｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｋａｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｋａｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｎｏｂｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｏｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ａｒａｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。プラスミド発現ベクターでのトランスフェクションによる野生型ｐ１６ＩＮＫ４機能の回復は、いくつかのヒト癌細胞系によるコロニー形成を低下させた（Ｏｋａｍｏｔｏ，１９９４；Ａｒａｐ，１９９５）。
【０３０５】
本発明に従って使用することができる他の遺伝子は、Ｒｂ、ＡＰＣ、ＤＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＷＴ−１、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ｚａｃ１、ｐ７３、ＶＨＬ、ＭＭＡＣ１／ＰＴＥＮ、ＤＢＣＣＲ−１、ＦＣＣ、ｒｓｋ−３、ｐ２７、ｐ２７／ｐ１６融合、ｐ２１／ｐ２７融合、抗−血栓遺伝子（例えば、ＣＯＸ−１、ＴＦＰＩ）、ＰＧＳ、Ｄｐ、Ｅ２Ｆ、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｆｍｓ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈｓｔ、ａｂｌ、Ｅ１Ａ、ｐ３００、脈管形成に関与する遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、トロンボスポンジン、ＢＡＩ−１、ＧＤＡＩＦ、またはそれらの受容体）およびＭＣＣを含む。
【０３０６】
３．プログラムされた細胞死滅のレギュレーター
アポトーシス、またはプログラムされた細胞死滅は正常な胚発生のための必須のプロセスであり、成人組織におけるホメオスタシスを維持し、癌形成を抑制する（Ｋｅｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７２）。タンパク質のＢｃｌ−ファミリーおよびＩＣＥ−様プロテアーゼは、他の系において重要なレギュレーターおよびアポトーシスのエフェクターであることが示されている。小胞リンパ腫に関連することが見出されているＢｃｌ２タンパク質は、アポトーシスを制御し、多様なアポトーシス刺激に応答して細胞生存を促進する顕著な役割を演じる（Ｂａｋｈｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５；Ｃｌｅａｒｙ  ａｎｄ  Ｓｋｌａｒ，１９８５；Ｃｌｅａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５；Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｃｒｏｃｅ，１９８６）。進化的に保存されたＢｃｌ２タンパク質は、今日では、死滅アゴニストまたは死滅アンタゴニストとしてカテゴリー分けすることができる関連タンパク質のファミリーのメンバーであると認識される。
【０３０７】
その発見に引き続き、Ｂｃｌ２は種々の刺激によってトリガーされた細胞死滅を抑制するように作用することが示された。また、今日では、共通の構造および配列相同性を共有するＢｃｌ２細胞死滅調節タンパク質があることは明らかである。これらの異なるファミリーメンバーは、Ｂｃｌ２（例えば、ＢｃｌＸＬ、ＢｃｌＷ、ＢｃｌＳ、Ｍｃｌ−１、Ａ１、Ｂｆｌ−１）に対して同様な機能を保有し、あるいはＢｃｌ２機能に逆作用し、細胞死滅を促進することが示されている（例えば、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍ、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｈａｒａｋｉｒｉ）。
【０３０８】
Ｅ．外科的処置
癌を持つ個人のほぼ６０％は、予防、診断またはステージング、治癒的および緩和的外科的処置を含むいくつかのタイプの外科的処置を受けるであろう。治癒的外科的処置は、本発明の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫療法、および／または代替療法のような他の療法と組み合わせて用いることができる癌治療である。本発明のキメラ分子は、腫瘍サイズを再切開に先立って低下させるなどのため、ネオアジュバント外科的療法として使用することができるか、あるいは腫瘍の一部または全ての除去に続いての外科的ベッドを滅菌するなどのため、ポストアジュバント外科的療法として使用することができる。
【０３０９】
治癒的療法は、癌性組織の全てまたは部分を物理的に除去し、切除し、および／または破壊する再石灰を含む。腫瘍再切開とは、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去を言う。腫瘍再切開に加えて、外科的処置による治療はレーザー外科的処置、低温外科的処置、電気外科的処置および微視的に制御された外科的処置（Ｍｏｈｓの外科的処置）を含む。本発明は、表層癌、プレ癌、または発生量の正常な組織の除去と組み合わせて用いることができるとさらに考えられる。
【０３１０】
癌性細胞、組織または腫瘍の一部または全部の切除に際して、キャビティーを身体中に形成させることができる。治療は灌流、さらなる抗癌療法での領域の直接的注射または局所的適用によって達成することができる。そのような治療は、例えば、１、２、３、４、５、６または７日毎に、または１、２、３、４および５週間毎に、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヶ月毎に反復することができる。これらの治療は同様に種々の用量のものとすることができる。
【０３１１】
Ｆ．他の剤
他の剤を本発明と組み合わせて、治療効果を改善することができると考えられる。これらのさらなる剤は、免疫変調剤、細胞表面受容体およびＧＡＰ接合のアップレギュレーションに影響する剤、静細胞および分化剤、細胞接着の阻害剤、またはアポトーシスインデューサーに対する過剰増殖細胞の感受性を増加させる剤を含む。免疫変調剤は腫瘍壊死因子；インターフェロンアルファ、ベータおよびガンマ；ＩＬ−２および他のサイトカイン；Ｆ４２Ｋおよび他のサイトカインアナログ；またはＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１ベータ、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、および他のケモカインを含む。さらに、Ｆａｓ／Ｆａｂリガンド、ＤＲ４またはＤＲ５／ＴＲＡＩＬのような細胞表面受容体またはそれらのリガンドのアップレギュレーションは、過剰増殖性細胞に対するオートクリンまたはパラクリン効果の樹立による本発明のアポトーシス誘導能力を増強することができると考えられる。ＧＡＰ接合の数を上昇させることによる細胞シグナリングの増加は、隣接する過剰増殖性細胞集団に対する抗−過剰増殖性効果を増加させるであろう。他の具体例において、静細胞または分化剤を本発明と組み合わせて用いて、治療の抗−過剰増殖効果を改善することができる。細胞接着の阻害剤は、本発明の効率を改善すると考えられる。細胞接着阻害剤の例は病巣接着キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤およびロバスタチンである。さらに、抗体ｃ２２５のような、アポトーシスに対する過剰増殖性細胞の感受性を増加させる他の剤を本発明と組み合わせて用いて、治療効果を改善することができようとさらに考えられる。
【０３１２】
ホルモン療法もまた、本発明と組み合わせて、あるいは前記したいずれかの他の癌療法と組み合わせて用いることもできる。ホルモンの使用は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌または頚癌のようなある種の癌の治療で使用して、テストステロンまたはエストロゲンのようなある種のホルモンのレベルを降下させ、あるいは該効果をブロックすることができる。この治療は、しばしば、治療オプションとして少なくとも１つの他の癌療法と組み合わせて用いられて、あるいは転移の危険性を低下させるのに用いられる。
【０３１３】
ＸＩＩＩ．本発明のキット
本明細書中に記載された組成物のいずれかの１以上をキットに含めることができる。非限定的例において、キメラ分子、キメラ分子成分および／または１以上のさらなる剤をキットに含めることができる。キットは、かくして、適当な容器手段中に、キメラ分子、キメラ分子成分および／または本発明のさらなる剤を含むであろう。
【０３１４】
キットは、癌を持つ１以上の個体の治療で用いることができるように、標識されたまたは標識されていないかを問わず、適当にアリコットされたキメラ分子、キメラ分子成分および／または本発明のさらなる剤組成物を含むことができる。キットの１以上の成分は、水性媒体または凍結乾燥形態いずれかにパッケージングすることができる。キットの容器手段は、一般には、その中に成分を入れ、好ましくは適切にアリコットすることができる、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器手段を含む。キットには１を超える成分があるが、キットは、一般には、そこにさらなる成分を別々に入れることができる第二、第三または他のさらなる容器を含有するであろう。しかしながら、成分の種々の組合せをバイアルに含むことができる。本発明のキットは、典型的には、キメラ分子、キメラ分子成分および／またはさらなる剤を含有するための手段、および商業的販売のための密に閉じ込められたいずれかの他の試薬容器も含むであろう。そのような容器は、その中へ所望のバイアルが保持される注射またはブロー成型プラスチック容器を含むことができる。
【０３１５】
本発明の治療キットは、キメラ分子、キメラ分子成分、またはその医薬上許容される塩を含むキットである。そのようなキットは、一般には、適当な容器手段に、キメラ分子タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ドメイン、阻害剤、および／または医薬上許容される処方中の前記のいずれかを発現する遺伝子および／またはベクターの医薬上許容される処方を含有するであろう。キットは単一の容器手段を有することができ、および／またはそれは各化合物についての区別される容器手段を有することができる。
【０３１６】
キットの成分が１および／またはそれを超える液体溶液中で供される場合、液状溶液は水性溶液であってよく、滅菌水性溶液が特に好ましい。キメラ分子およびキメラ分子成分組成物もまたシリンジ可能な組成物に処方することもできる。この場合、容器手段は、それ自体、それから処方を身体の感染領域に適用し、動物に注射し、および／またはキットの他の成分と共に適用さえされ、および／またはそれと混合される、シリンジ、ピペット、および／または他のそのような装置であり得る。
【０３１７】
しかしながら、キットの成分は乾燥粉末として供することができる。試薬および／または成分が乾燥粉末として供される場合、該粉末は適当な溶媒の添加によって復元することができる。溶媒は水性または有機性であってよい。溶媒はもう１つの容器手段中に供することもできると考えられる。
【０３１８】
容器手段は、一般には、その中に、タンパク質、遺伝子および／または阻害処方であるキメラ分子および／またはキメラ分子成分が入れられ、好ましくは適切に割り当てられる、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジおよび／または他の容器手段を含むであろう。キットは、滅菌された医薬上許容される緩衝液および／または他の希釈剤を含有するための第二の容器手段も含むことができる。
【０３１９】
容器の数および／またはタイプに拘わらず、本発明のキットは、動物の身体内への最終的なキメラ分子タンパク質および／または遺伝子組成物の注射／投与および／または投入を助けるための機器を含むこともでき、および／またはそれでパッケージすることもできる。そのような機器は、例えば、シリンジ、ピペット、かん子、および／またはいずれかのそのような医学的に認可された送達ビヒクルであり得る。
【実施例】
【０３２０】
以下の実施例は、本発明の好ましい具体例を示すために含める。以下の実施例に開示された技術は本発明の実施においてよく機能する本発明者らによって発見された技術を表し、かくして、その実施のための好ましい態様を構成すると考えることができるのは当業者に認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本発明開示に徴して、本発明の概念、精神および範囲を逸脱することなく、開示された具体的な例において多くの変形をなすことができ、依然として同様なまたは類似の結果を得ることができることを認識するであろう。より詳しくは、化学的におよび生理学的に関連するある種の剤は、同一または同様な結果を達成しつつ、本明細書中に記載された剤の代わりに置き換えることができるのは明らかであろう。当業者に明らかな全てのそのような同様な置換および改変は、添付の請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念内にあると見なされる。
実施例１
実施例２ないし８のための例示的材料および方法
細胞系および培養
４つのヒト膵臓癌細胞系（ＡｓＰｃ−１、Ｃａｐａｎ−１、Ｃａｐａｎ−２、およびＬ３．６ｐｌ）を、１０％加熱不活化胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、１００ユニット／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中で成長させた。
化学療法剤およびｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ融合構築体
５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）はＲｏｃｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）からのものであった。シスプラチンおよびエトポシド（ＶＰ−１６）はＢｒｉｓｔｏｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）からのものであった。ドキソルビシンはＣｅｔｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）からのものであった。ゲムシタビンはＥｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  Ｃｏ．（Ｉｎｄｉａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）からのものであった。ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ融合構築体は、均一になるまで精製し、かつ従前に記載されているように生物学的活性につき評価された、細菌発現宿主で生産された（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。
抗体
モノクローナル抗−ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗体（Ａｂ）、ウサギポリクローナル抗−ＨＥＲ−１  Ａｂ、ウサギポリクローナル抗−ＴＮＦＲ−１  Ａｂ、ウサギポリクローナル抗−ＴＮＦＲ−２  Ａｂ、ウサギポリクローナル抗−カスパーゼ−８  Ａｂ、モノクローナル抗−カスパーゼ−３  Ａｂ、およびモノクローナル抗−ＰＡＲＰ  ＡｂはＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡから入手した。ウサギポリクローナル抗−ホスホＡｋｔ  Ａｂ、およびウサギポリクローナル抗−Ａｋｔ  Ａｂ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）はウェスタンブロット分析のために用いた。カスパーゼ−３阻害剤、ｎ−アセチル−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ａｌ、（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。
イン・ビトロ細胞傷害性アッセイおよび組合せ実験
全てのヒト膵臓癌細胞は平底９６−ウェルマイクロタイタープレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に蒔き（１×１０４／ウェル）、２４時間後、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ、ＴＮＦ、および５つの化学療法剤（５−フルオロウラシル、シスプラチン、エトポシド、ドキソルビシンおよびゲムシュタビン）を三連ウェルで加えた。組み合わせ実験のためにｓｃＦｖ２３／ＴＮＦおよび５つの化学療法剤の各々をそれらの個々のＩＣ２５濃度で組み合わせた。カスパーゼ−３の活性化による組合せ治療の相乗効果の潜在的媒介を調べるために、細胞を１００μＭカスパーゼ−３阻害剤（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ）の有りまたは無しにて３時間予備処理し、次いで、そららの個々のＩＣ２５濃度で処理した。さらに７２時間のインキュベーションの後、残りの接着性細胞を、５０μｌのクリスタルバイオレット溶液（２０％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ中０．５％ｗ／ｖ）を加えることによって染色した。色素−染色細胞を、１００μｌのソレンソン緩衝液［５０％エタノール中１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ４．２）］を加えることによって可溶化し、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を用いて吸光度を６３０ｎｍで測定した。
【０３２１】
薬物組合せの相乗的、相加的または拮抗効果を、Ｃｈｏｕ  ａｎｄ  Ｔａｌａｌａｙ（Ｃｈｏｕ  ａｎｄ  Ｔａｌａｌａｙ，１９８４）によって記載されているようにメジアン効果原理に従って評価した：ｆａ／ｆｕ＝（Ｄ／Ｄｍ）ｍ、ここで、Ｄは薬物の用量であり、ＤｍはＩＣ５０であり、ｆａは該用量によって影響される分率であり、ｆｕは影響されない分率であり、ｍは曲線のシグモイド性を決定する係数である。
ウェスタンブロット分析
ＨＥＲ−１、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＴＮＦ受容体−１、ＴＮＦ受容体−２、およびｐ−Ａｋｔの状態をチェックするために、４つのヒト膵臓癌細胞系（ＡｓＰｃ−１、Ｃａｐａｎ−１、Ｃａｐｎ−２、およびＬ３．６ｐｌ）をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、０．３ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、６０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．２％ＮＰ−４０）中で２０分間氷上で溶解させた。細胞溶解物（５０ｍｇ）を８ないし１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ  Ｉｎｃ．，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）上に移した。膜を３％ウシ血清アルブミンを含有するトリス−緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）中で２時間ブロックした。モノクローナル抗−ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  Ａｂ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ウサギポリクローナル抗−ＨＥＲ１Ａｂ、ウサギポリクローナル抗−ＴＮＦＲ−１  Ａｂ、ウサギポリクローナル抗−ＴＮＦＲ−２  Ａｂ、ウサギポリクローナル抗−ホスホＡｋｔ  Ａｂ、ウサギポリクローナル抗−Ａｋｔ、およびヤギ抗−β−アクチン  Ａｂをイムノブロッティングのために用いた。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）がコンジュゲートしたヤギ抗−マウス／ヤギ抗−ウサギまたはブタ抗−ヤギ抗体を用いて、ＥＣＬ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用い、１：４０００希釈にて免疫反応性タンパク質を可視化した。
アポトーシスの検出
アポトーシスはＴＵＮＥＬアッセイによって検出した。アポトーシスを評価するために、Ｌ３．６ｐｌ細胞をカバーグラスに乗せ、一晩接着させ、次いで、２００ｎＭ  ＴＮＦまたは２００ｎＭ  ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦへ４８時間処理した。細胞をＰＢＳで洗浄し、浸透させ（０．１％）トリトンＸ−１００，０．１％クエン酸ナトリウム）、次いで、４％パラホルムアルデヒド中で固定した。固定した細胞をイン・サイチュ細胞死滅検出キット（Ｒｏｃｈｅ）で染色した。アポトーシスを受けている細胞を蛍光顕微鏡によって同定した。
実施例２
４つのヒト膵臓癌細胞系におけるＨＥＲ−２／ＮＥＵ、ＨＲＥ−１、ＴＮＦＲ−１、ＴＮＦＲ−２、およびＰ−ＡＳＫの状態
ＨＥＲ−２／ｎｅｕは、膵臓腫瘍バイオプシー検体において過剰発現することが従前に判明しており、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ発現は、膵臓上皮内新形成において陰性予後マーカーとして提案されている（Ｔｏｍａｓｚｅｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ発現は４つの膵臓癌細胞系において測定した。全ての４つの膵臓癌細胞系（ＡｓＰｃ−１、Ｃａｐａｎ−１、Ｃａｐａｎ−２、およびＬ３．６ｐｌ）はＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＴＮＦＲ−１、ＴＮＦＲ−２、およびホスホ−Ａｋｔを発現した。ＡｓＰｃ−１細胞と比較して、Ｌ３．６ｐｌ細胞は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕの３．７倍より高いレベル、ＴＮＦＲ−１の３．１倍より高いレベル、およびＴＮＦＲ−２の１．６倍より高いレベルを発現した。４つの膵臓細胞系の３つ（Ｃａｐａｎ−１、Ｃａｐａｎ−２、およびＬ３．６ｐｌ）は、活性化されたＡｋｔの上昇したベースラインレベルを呈した。ＡｓＰｃ−１細胞と比較して、Ｃａｐａｎ−１細胞は最高レベルのｐ−Ａｋｔを発現することが判明した（図１および表１）。
【０３２２】
表皮成長因子に対する受容体（ＨＥＲ−１）は、ヒト膵臓癌腫の３３％で過剰発現することが従前に見出されている（Ｔｈｙｂｕｓｃｈ−Ｂｅｒｎｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。かくして、全ての４つの膵臓癌細胞系におけるＨＥＲ−１の状態を評価した。ＨＥＲ−１発現が３つの膵臓癌細胞系（ＡｓＰｃ−１、Ｃａｐａｎ−２、およびＬ３．６ｐｌ）において検出可能であった。Ｃａｐａｎ−１細胞は実質的にＨＥＲ−１（ＥＧＦＲ）を発現せず、他方、ＡｓＰｃ−１細胞は最高レベルのテストした４つの系を発現した（図１および表１）。
【０３２３】
（表１：ヒト膵臓癌細胞系での種々のシグナリングタンパク質の比較発現）
【０３２４】
【表１】
2008526889.tif 000004
実施例３
ヒト膵臓癌細胞系の成長に対するＳＣＦＶ２３／ＴＮＦ、ＴＮＦ、および化学療法剤の効果
イン・ビボで細胞増殖を阻害するこれらの化学療法剤の能力は、テストした４つの細胞系の中で顕著に異なった。全ての膵臓癌細胞系はＴＮＦの細胞傷害性効果に対して高度に抵抗性であった（ＩＣ５０＞１６００ｎＭ）。５−フルオロウラシル、シスプラチンおよびエトポシドは１および３００ｎＭの間を示し、他方、ドキソルビシン、ゲムシタビンおよびｓｃＦｖ２３／ＴＮＦは、６および７００ｎＭの間の範囲のＩＣ５０でもって比較的により活性であった（図２Ａないし２Ｄおよび表２）。
【０３２５】
（表２：４つの例示的なヒト膵臓癌細胞系に対する種々の剤のＩＣ５０）
【０３２６】
【表２】
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ＩＣ５０値は７２時間の薬物への曝露の後に測定し、対照細胞と比較して、処理された細胞において５０％成長阻害を引き起こす濃度と定義した。
【０３２７】
興味深いことには、Ｌ３．６ｐｌが発現している最高レベルのＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＴＮＦＲ−１、ＴＮＦＲ−２はテストした薬物に対して最も感受性であり、他方、比較的低レベルのＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＴＮＦＲ−１およびＴＮＦＲ−２を発現するＣａｐａｎ−２細胞はテストした薬物に対して最も抵抗性であった。
実施例４
４つのヒト膵臓癌細胞系の成長に対する種々の化学療法剤と組み合わせたＳＣＦＶ２３／ＴＮＦの効果
ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦおよび種々の化学療法剤を組み合わせる実験は、全ての膵臓癌細胞系における、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦと５−フルオロウラシルとの相乗的細胞傷害性効果、およびｓｃＦｖ２３／ＴＮＦとドキソルビシントの拮抗効果を示した。しかしながら、シスプラチンまたはゲムシタビンのｓｃＦｖ２３／ＴＮＦへの添加は、テストした３／４細胞系における拮抗細胞傷害性効果をもたらし、他方、エトポシドのｓｃＦｖ２３／ＴＮＦへの負荷の結果、３／４膵臓癌細胞系における相乗効果をもたらした（表３）。
【０３２８】
（表３：他の化学療法剤と組み合わせたｓｃＦｖ２３／ＴＮＦによって誘導された細胞傷害性の分析）
【０３２９】
【表３】
2008526889.tif 000006
２つの剤の間の細胞相互作用を分析するために、２つの剤の組合せ指標（ＣＩ）値のテストした組合せは、相互に排他的な薬物について、Ｃｈｏｕ  ａｎｄ  Ｔａｌａｌａｙ（１９８４）によって提案されたように計算した：ＣＩ＝（Ｄ）１／（Ｄｘ）１＋（Ｄ）２／（Ｄｘ）２。組み合わせた（Ｄ）１および（Ｄ）２が細胞のｘ％を殺す場合、（Ｄｘ）１および（Ｄｘ）２が薬物単独の見積もられた用量であり、組み合わせた薬物の同一の効果を生じさせることができる。もし１に近いＣＩが相加効果を示すならば（ＡＤＴ）、ＣＩ＞１は拮抗作用（ＡＮＴ）を示し、ＣＩ＜１は相乗効果（ＳＹＮ）を示す。
【０３３０】
これらの結果は、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ融合トキシンを用い、ＨＥＲ−２／ｎｅｕおよびＴＮＦＲ−１発現腫瘍細胞を標的化することは、５−ＦＵのような特異的化学療法剤と組み合わせて利用した場合に特に、膵臓癌に対する効果的な療法であろうことを示す。
実施例５
ＡＫＴリン酸化に対する５−フルオロウラシル、ＳＣＦＶ２３／ＴＮＦ、および５−ＦＵ＋ＳＣＦＶ２／ＴＮＦの効果
ＨＥＲ−２／ｎｅｕの過剰発現の結果、Ａｋｔキナーゼ経路のような異なる下流経路が活性化され、これは細胞増殖および細胞生存に導く。５−ＦＵまたはｓｃＦｖ２３／ＴＮＦがこの生存経路に影響するか否かを判断するために、Ｌ３．６ｐｌ細胞をＩＣ２５用量の５−フルオロウラシル、ｓｃＦｖ２３、または５−ＦＵ＋ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦで処理した。次いで、Ａｋｔに対する、およびホスホ−Ａｋｔに対する抗体を用いるウェスタンブロット分析によって、Ａｋｔキナーゼの活性化を評価した。図３に示すように、単一の剤としての５−ＦＵ、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ、あるいは組合せでの細胞の処理はＡｋｔの合計レベルに対してインパクトを有さず、他方、組合せ５−ＦＵ＋ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦはＡｋｔタンパク質のリン酸化を６４％だけ阻害した。これらの結果は、５−ＦＵ＋ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−誘導細胞傷害性が、少なくとも部分的には、Ａｋｔリン酸化事象に対する阻害効果によって媒介できることを示す。
実施例６
ＢＣＬ−２発現に対する５−フルオロウラシル、ＳＣＦＶ２３／ＴＮＦおよび５−ＦＵ＋ＳＣＦＶ２／ＴＮＦの効果
増大したレベルの抗−アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２は、シクロホルファミド、メトトレキセート、アントラサイクリン、シタラビン、パクリタキセル、およびコルチコステロイドを含めた種々の化学療法剤に対する腫瘍細胞の細胞抵抗性に寄与する（Ｗａｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。５−ＦＵ、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦまたは５−ＦＵ＋ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ効果がＢｃｌ−２の細胞レベルの変化を通じて媒介されるか否かを判断するために、Ｌ３．６ｐｌ細胞をＩＣ２５用量の５−フルオロウラシル、ｓｃＦｖ２３、ＴＮＦ、または５−ＦＵ＋ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦで処理した。図４に示すように、５−ＦＵでの細胞の処理はＢｃｌ−２の細胞レベルに対してインパクトを有さず、他方、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦおよび５−ＦＵ＋ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦは、各々、Ｂｃｌ−２発現レベルを４４％および７４％阻害した。これらの結果は、５−ＦＵ＋ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−誘導細胞傷害性がＢｃｌ−２発現の阻害によって媒介できることを示唆する。
実施例７
アポトーシス、カスパーゼ−８、カスパーゼ−３、およびＰＡＲＰ細胞レベルに対する５−フルオロウラシル、ＳＣＦＶ２３／ＴＮＦ、および５−ＦＵ＋ＳＣＦＶ２／ＴＮＦの効果
ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの細胞傷害性効果がアポトーシスに関連するか否かを判断するために、ＴＵＮＥＬ染色によってＬ３．６ｐｌ細胞をアポトーシスについてアッセイした。５−ＦＵ＋ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−処理細胞は、処理から４８時間以内にアポトーシス細胞死滅の誘導を示した。タンパク質のカスパーゼシリーズは、ＴＮＦおよび他のサイトカインのアポトーシス効果の中枢的なメディエーターであることが知られている。カスパーゼ−８およびカスパーゼ−３が５−ＦＵ＋ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−誘導細胞死滅の間にＬ３．６ｐｌ細胞において活性化されたか否かを判断するために、カスパーゼ−８、カスパーゼ−３、およびその基質ポリ（ＡＤＰ）−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断を調べた。５−ＦＵでの処理はカスパーゼ−８、カスパーゼ−３、およびＰＡＲＰ切断に対して効果を有さず、他方、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦまたはｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ＋５−ＦＵ組合せへの細胞の曝露の結果、カスパーゼ−８およびカスパーゼ−３が切断された。加えて、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ＋５−ＦＵ組合せは４８時間においてＰＡＲＰ切断を誘導した（図５）。５−ＦＵ＋ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−誘導アポトーシスがカスパーゼ−３経路の活性化に依存するか否かを判断するために、５−ＦＵ＋ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの細胞傷害性に対するカスパーゼ−３阻害剤の効果をＬ３．６ｐｌ細胞に対して調べた。図６に示すように、カスパーゼ−３阻害剤での処理は、単一剤としての５−ＦＵまたはｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの細胞傷害性効果に対して効果を有しなかった。しかしながら、該阻害剤、続いての組合せ処理（５−ＦＵ＋ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ）での予備処理は、観察された相乗的細胞傷害性効果を部分的に逆行させることができた。これは、該組み合わせの相乗的細胞傷害性効果が、少なくとも部分的には、カスパーゼ−駆動経路に依存し得ることを示唆する。
実施例８
膵臓癌におけるＴＮＦを標的化する重要性
ヒト表皮成長因子受容体−２（ＨＥＲ−２／ｅｒｂＢ−２）は４つの膜受容体（ＨＥＲ−１、ＨＥＲ−３およびＨＥＲ−４）のファミリーに属し、（Ｌｏｈｒｉｓｃｈ  ａｎｄ  Ｐｉｃｃａｒｔ，２００１；Ｙａｒｄｅｎ，２００１；Ｒｕｂｉｎ  ａｎｄ  Ｙａｒｄｅｎ，２００１）、それは、ＨＥＲファミリーシグナリング゛事象において鍵となる役割を演じ、複合体シグナリングネットワークを介して他のＨＥＲ受容体と協働して、細胞成長、分化および生存を調節する。ＨＥＲ−２／ｎｅｕの過剰発現はいくつかの癌で観察されており、そこでは、それは複数の薬物抵抗性、より高い転移能力、および減少した患者生存回数と関連付けられている（Ｔｏｍａｓｚｅｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｈｙｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｎ，１９９４；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｒｉｃｋｌｅｒ，１９９２；Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｔｏｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｓａｆｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。それが治療剤に対する臨床的応答に関連するので、膵臓癌におけるＨＥＲ−２／ｎｅｕ発現の影響を見積もるために、種々のグループは、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ標的化リボザイム（Ｉｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００：Ｔｈｙｂｕｓｃｈ−Ｂｅｒｎｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ａｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、ヒト化抗−ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗体（ハーセプチン）および化学療法処理養生法とハーセプチンとの組合せ（Ｗａｌｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｂｕｃｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｂｕｔｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）を用いることを含めた、いくつかのＨＥＲ−２／ｎｅｕ標的化戦略を用いた。
【０３３１】
本発明の特別な具体例のアプローチは、抗−ＨＥＲ−２／ｎｅｕ単一鎖抗体を使用して、ＴＮＦを直接的に腫瘍細胞に送達する治療剤として、腫瘍細胞表面でのＨＥＲ−２／ｎｅｕ発現を利用するものであった（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。本発明者による従前の研究は、このアプローチがイン・ビボでＴＮＦを腫瘍細胞に向けるにおいてかなり効果的であり得ることを示し、ＴＮＦを含有する融合構築体が、ＴＮＦそれ自体に対して抵抗性である腫瘍細胞に対してさえかなり細胞傷害性であることがさらに示された。ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ構築体のメカニズム効果は４つの膵臓癌細胞系のパネルで調べられており、これは、種々のレベルのオンコジーン発現、および化学療法剤に対する比較応答に特徴的であった。
【０３３２】
この例示的研究で利用された化学療法剤は、異なる細胞標的のスペクトルを表すように選択され、治療値を持つ剤の主なクラスの代表である。化学療法剤と組み合わせたＴＮＦの腫瘍−標的化送達の潜在的組合せは十全には調べられていない。ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦおよび種々の化学療法剤を組み合わせることは、全ての膵臓腫瘍細胞系におけるｓｃＦｖ２３／ＴＮＦおよび５−ＦＵの均一な相乗効果を明らかに示した。ＨＥＲ−２／ｎｅｕおよびＴＮＦＲ−１の発現、およびｓｃＦｖ２３／ＴＮＦと組み合わせた化学療法剤に対してより感受性であるＬ３．６ｐｌのようなＨＥＲ−２／ｎｅｕ−過剰発現細胞についての応答の間に相関があった。Ｐｅｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，は、５−ＦＵが、抗−ＨＥＲ−２／ｎｅｕモノクローナル抗体と組み合わせてイン・ビトロで拮抗効果を有し、他方、シスプラチン、エトポシド、およびドキソルビシンは、十全には、ハーセプチンと組み合わせて相乗的または相加的効果を示したと報告した（Ｐｅｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。しかしながら、本発明者らは、５−ＦＵと組み合わせたｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの均一な相乗効果、および全ての４つの膵臓癌細胞系に対する、ドキソルビシンと組み合わされたｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの拮抗効果を見出した（表３）。
【０３３３】
ＨＥＲ−２／ｎｅｕの過剰発現は、Ａｋｔ経路を活性化し、多くの治療薬物によって誘導されたアポトーシスに対する抵抗性を付与することが知られている（Ｋｎｅｕｆｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。４つのヒト膵臓腺癌細胞系のうち３つは、活性化されたＡｋｔの上昇したベースラインレベルを呈し、ＨＥＲ−２／ｎｅｕおよびｐ−Ａｋｔ発現の間に相関があった。特に、Ｃａｐａｎ−１およびＬ３．６ｐｌ細胞系は高レベルのＨＥＲ−２／ｎｅｕおよび活性化されたＡｋｔを有する。Ｌ３．６ｐｌ細胞の組合せ５−ＦＵ＋ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦでの処理の結果、Ａｋｔリン酸化が有意に低下した。これは、５−ＦＵ＋ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−誘導細胞傷害性は、少なくとも部分的には、Ａｋｔ生存シグナリング経路の阻害によって媒介され得ることを示す。
【０３３４】
Ｂｃｌ−２の過剰発現は、シクロホスファミド、メトトレキセート、アントラサイクリン、シタラビン、パクリタキセル、およびコルチコステロイドを含めた種々の化学療法薬物の細胞抵抗性に寄与することが示されている（Ｗｕｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．は癌細胞におけるＢｃｌ−２のレベルは５−ＦＵ効率のインジケーターであることを報告した（Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。本発明者らは、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦおよび５−ＦＵ＋ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦが、各々、４４％および７４％阻害したことを示した；しかしながら、細胞の５−ＦＵでの処理はＢｃｌ−２のレベルに対してインパクトを有しなかった。ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦによるＢｃｌ−２のダウンレギュレーションは、Ｌ３．６ｐｌ細胞の感受性が５−ＦＵに対してより感受性であるように誘導した。従って、５−ＦＵと組み合わせたｓｃＦｖ２３／ＴＮＦは、Ｂｃｌ−２発現の阻害を加速する。
【０３３５】
また、本発明者らは、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ細胞傷害性の媒介におけるもう１つの臨界的な因子はカスパーゼ活性化カスケードであると決定した。ＴＮＦのＴＮＦＲ−１への結合はシグナリング複合体、ＴＮＦ−Ｒ１−ＴＲＡＤＤ−ＦＡＤＤ−プロ−カスパーゼ−８の形成を誘導することができ、その結果、カスパーゼ−８が活性化される（Ｎａｇａｔａ，１９９７）。カスパーゼ−８の活性化は、他のカスパーゼのタンパク質分解活性化をもたらすと考えられる（Ｍｅｄｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。カスパーゼ−３の活性化は，ＨＥＲ−２／ｎｅｕ−過剰発現ＳＫＯＶ３．ｉｐ１５９におけるパクリタキセル−誘導アポトーシスおよびイムノトキシン−誘導アポトーシスに寄与する（Ｋｅｐｐｌｅｒ−Ｈａｆｋｅｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ単独、および５−ＦＵ＋ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦでの処理の結果、カスパーゼ−３およびＰＡＲＰの最終的な切断と共にカスパーゼ−８の活性化がもたらされた。本発明者らは、組み合わせ５−ＦＵ＋ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦが、カスパーゼ−８、カスパーゼ−３、およびＰＡＲＰ切断の活性化を通じて相乗的細胞障害性を引き起こすことができると判断した。
【０３３６】
５−ＦＵ、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ、および５−ＦＵ＋ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦのシグナル伝達効果を表４にまとめる。
【０３３７】
（表４：例示的Ｌ３．６ｐｌ細胞に対する５−フルオロウラシル、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ、およびその組合せのシグナル伝達効果のまとめ）
【０３３８】
【表４】
2008526889.tif 000007
＊ＮＥは効果がないことを表す。
【０３３９】
かくして、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ融合トキシンを用いる、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ発現腫瘍細胞へのサイトカインＴＮＦの送達は、化学療法剤と組み合わせて利用する場合に特に、膵臓癌に対する効果的な療法である。
実施例９
実施例１０ないし１４についての方法および材料
材料
モノクローナル抗−ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗体（Ａｂ）、ウサギポリクローナル抗−ＴＮＦＲ１  Ａｂ、ウサギポリクローナル抗−ＴＮＦＲ２  Ａｂ、ウサギポリクローナル抗−カスパーゼ−８  Ａｂ、モノクローナル抗−カスパーゼ−３  Ａｂ、モノクローナル抗−ＰＡＲＰ  Ａｂ、ウサギポリクローナル抗−ＴＲＡＤＤ  Ａｂ、ウサギポリクローナル抗−ＴＲＡＦ２  Ａｂ、ウサギポリクローナル抗−ＩκＢ−α  Ａｂは、全て、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡから入手した。ウサギポリクローナル抗−ホスホＡｋｔ  Ａｂ、およびウサギポリクローナル抗−Ａｋｂ  Ａｂ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）はウェスタンブロット分析で用いた。中和アッセイでは、モノクローナル抗−ＴＮＦＲ−１  ＡｂはＯｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。Ｎ−アセチル−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ａｌ（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。細胞成長ＸＴＴアッセイキットはＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入した。
細胞系および培養
ＳＫＢＲ−３細胞は、１０％加熱不活化胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００ユニット／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補足した、ＭｃＣｏｙの５Ａ改変培地で成長させた。我々の実験で用いた大量のＨＥＲ−２／ｎｅｕを発現するＳＫＢＲ−３低継体細胞（ＳＫＢＲ−３／Ｈ）は継体５および８の間であり、他方、用いたＳＫＢＲ−３高継体細胞は継体４０および４５の間であり、比較的低レベルのＨＥＲ−２／ｎｅｕを呈した（ＳＫＢＲ−３／Ｌ）。
イン・ビトロ細胞障害性アッセイ
ＳＫＢＲ−３細胞を平底９６−ウェルマイクロタイタープレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に蒔き（１×１０４／ウェル）、２４時間後に、ｓｃＦｖ２３、ＴＮＦ、およびｓｃＦｖ２３／ＴＮＦを三連ウェルに加えた。ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの細胞傷害性に対するカスパーゼ−３阻害剤の効果を調べるために、ＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞を、１００μＭカスパーゼ−３阻害剤（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ）の有りまたは無しで３時間予備処理し、次いで、種々の濃度のｓｃＦｖ２３／ＴＮＦで処理した。７２時間後、５０μｌのＸＴＴ標識混合物（Ｒｏｃｈｅ）を各ウェルに加え、その後、細胞をさらに４時間インキュベートした。分光光度吸光度は、ＥＬＩＳＡリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を用いて４５０ｎｍで測定した。
ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−処理ＳＫＢＲ−３細胞成長に対する抗−ＴＮＦＲ−１抗体の中和効果
ＳＫＢＲ−３細胞を平底９６−ウェルマイクロタイタープレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に蒔き（１×１０４／ウェル）、２４時間後に、種々の濃度のＴＮＦＲ−抗体で２時間予備処理し、次いで、ＴＮＦおよびｓｃＦｖ２３／ＴＮＦを三連ウェルに加えた。７２時間後、細胞生存率をＸＴＴアッセイによって検出した（Ｒｏｃｈｅ）。
アポトーシスの検出
アポトーシスは、ＤＮＡ断片化およびＴＵＮＥＬアッセイによって検出した。ＤＮＡ断片化を見積もるために、ＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞を５×１０５細胞／６０ｍｍペトリ皿にて蒔き、一晩成長させ、次いで、２００ｎＭ  ＴＮＦまたは２００ｎＭ  ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦで処理した。２４時間および４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０μｇ／ｍｌ  ＲＮＡｓｅ、および０．２５％ＳＤＳを含有するＤＮＡ抽出緩衝液に再懸濁させ、次いで、３７℃にて１時間インキュベートした。タンパク質を除去するために、再懸濁させた細胞溶解物を１００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫで５０℃にて３時間処理した。フェノールおよびクロロホルムを用いてＤＮＡを抽出し、続いてエタノール沈殿した。ゲノムＤＮＡをトリス−ＥＤＴＡに際懸濁させ（ｐＨ８）、臭化エチジウムを含有する１％アガロースゲルでの電気泳動によって分画した。
【０３４０】
アポトーシスを評価するために、ＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞をカバーグラスに乗せ、一晩接着させ、次いで、２００ｎＭ  ＴＮＦまたは２００ｎＭ  ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦで２４時間および４８時間処理した。細胞をＰＢＳで洗浄し、浸透させ（０．１％トリトンＸ−１００、０．１％クエン酸ナトリウム）、次いで、４％パラホルムアルデヒド中で固定した。固定した細胞をイン・サイチュ細胞死滅検出キット（Ｒｏｃｈｅ）で染色した。アポトーシスを受けている細胞は、蛍光顕微鏡によって同定した。
ウェスタンブロット分析
ＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞を５×１０５細胞／６０ｍｍペトリ皿に蒔き、一晩成長させ、次いで、２００ｎＭ  ｓｃＦｖ２３、２００ｎＭ  ＴＮＦまたは２００ｎＭ  ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦで処理した。処理後、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、０．３ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、６０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．２％ＮＴ−４０）中で氷上で２０分間溶解させた。細胞溶解物（５０μｇ）を８ないし１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、電気泳動によりＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ  Ｉｎｃ．，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）に移した。膜を、３％ウシ血清アルブミンを含有するトリス−緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）中で２時間ブロックし、次いで、種々の抗体（モノクローナル抗−ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  Ａｂ、ウサギポリクローナル抗−ＴＮＦＲ１  Ａｂ、ウサギポリクローナル抗−ＴＮＦＲ２  Ａｂ、ウサギポリクローナル抗−カスパーゼ−８  Ａｂ、モノクローナル抗−カスパーゼ−３  Ａｂ、モノクローナル抗−ＰＡＲＰ  Ａｂ、ウサギポリクローナル抗−ＴＲＡＤＤ  Ａｂ、ウサギポリクローナル抗−ＴＲＡＦ２  Ａｂ、ウサギポリクローナル抗−ＩκＢＮ−α  Ａｂ、ウサギポリクローナル抗−ホスホＡｋｔ  Ａｂ、およびウサギポリクローナル抗−Ａｋｔ  Ａｂ）でプローブした。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）とコンジュゲートしたヤギ抗−マウス／ヤギ抗−ウサギまたはブタ抗−ヤギ抗体を用いて、ＥＣＬ検出試薬（Ａｍｅｒｃｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用い、１：４０００希釈にて免疫反応性タンパク質を可視化した。
実施例１０
シグナリングタンパク質発現およびＳＣＦＶ２３／ＴＮＦに対する感度の間の相関
ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＴＮＦＲ−１、およびＴＮＦＲ−２発現レベル、およびＴＮＦおよびｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの細胞傷害性効果の間に相関が存在するか否かを判断するために、我々は、ウェスタンブロット分析によって、ＳＫＢＲ−３／Ｈおよび３／Ｌ細胞系での、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＴＮＦ受容体−１（ＴＮＦＲ−１）、およびＴＮＦ受容体−２（ＴＮＦＲ−２）の発現の相対的レベルを調べ（図７Ａ）、表５におけるデンシトメトリー分析によって定量した。図７Ａおよび表５に示すように、ＳＫＢＲ−３細胞系は共にＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＴＮＦＲ−１、およびＴＮＦＲ−２を発現した。
【０３４１】
（表５：ＳＫＢＲ−３ヒト乳癌細胞系における、比較感受性およびシグナリングタンパク質の発現）
【０３４２】
【表５】
2008526889.tif 000008
興味深いことには、ＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞は、ＳＫＢＲ−３／Ｌ細胞よりも３．３倍より高いレベルのＨＥＲ−２／ｎｅｕを発現した。他方、ＳＫＢＲ−３／Ｌ細胞は、ＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞と比較して、各々、２．３倍および４倍より高いレベルのＴＮＦ受容体−１およびＴＮＦ受容体−２を発現した。より高いレベルのＨＥＲ−２／ｎｅｕを発現するＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞は、６μＭまでの用量においてＴＮＦそれ自体に対して完全に抵抗性であったが、これらの細胞はｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの細胞傷害性効果に対して感受性であった（ＩＣ５０＝１５０ｎＭ）。いずれかの細胞系でのｓｃＦｖ２３それ自体での処理は効果を有しなかった。しかしながら、より低いレベルのＨＥＲ−２／ｎｅｕおよび高レベルのＴＮＦＲ−１およびＴＮＦＲ−２を発現するＳＫＢＲ−３／Ｌ細胞は、ＴＮＦそれ自体およびｓｃＦｖ２３／ＴＮＦに対して同様なＩＣ５０を示した（各々、１０ｎＭおよび４ｎＭ）（図７Ｂ）。これらの結果は、ＳＫＢＲ−３細胞系の継続培養の結果、ＴＮＦＲ−１およびＴＮＦＲ−２受容体のアップレギュレーション、およびＨＥＲ−２／ｎｅｕの同時のダウンレギュレーションがもたらされることを示す。これらのデータは、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ融合構築体が、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ−誘導ＴＮＦ抵抗性を克服することを示す。
実施例１１
ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−誘導成長阻害に対する受容体−１の中和効果
ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ構築体の細胞傷害性効果が細胞−表面ＴＮＦＲ−１受容体との相互作用を全く介して媒介されたか否かを判断するために、ＳＫＢＲ−３細胞に対するｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの細胞傷害性に対する抗−ＴＮＦＲ−１中和抗体の効果を調べた。図８に示すように、２５μｇ／ｍｌ抗体の用量でのＳＫＢＲ−３／Ｌ細胞の処理は、ＴＮＦ−誘導細胞傷害性を完全になくすることができた。対照的に、ＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞に対するｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの細胞傷害性は、５０μｇ／ｍｌ抗−ＴＮＦＲ−１  Ａｂの濃度が達成されるまで影響されなかった。ＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞に対するｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの細胞障害性効果の完全な排除は、抗−ＴＮＦＲ−１中和抗体の添加によって達成することができなかったであろう。
実施例１２
ＩκＢ−ＡおよびＡＫＴ経路に対するｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ、ＴＮＦおよびｓｃＦｖ２３の効果
腫瘍細胞表面のＴＮＦ受容体への結合の後、ＴＮＦ−αの細胞傷害性効果は、プログラムされた細胞死滅を開始するシグナリング経路を活性化することによって直接的に媒介することができる。ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ誘導アポトーシスが、天然ＴＮＦと比較して同様なシグナル伝達プロセスに従ったか否かを判断するために、ＩκＢ−α  ＴＲＡＤＤ、およびＴＲＡＦ２発現に対するこれらの３つの剤の効果を調べた。ＨＥＲ−２／ｎｅｕー過剰発現ＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞を２００ｎＭのｓｃＦｖ２３、ＴＮＦまたはｓｃＦｖ２３／ＴＮＦで種々の時間処理し、次いで、細胞溶解物を収穫し、ウェスタンブロット分析に付した。図９に示すように、ｓｃＦｖ２３、ＴＮＦまたはｓｃＦｖ２３／ＴＮＦでの細胞の処理は、ＴＲＡＦ−２レベルに対してインパクトを有しなかった。１８０分間のｓｃＦｖ２３／ＴＮＦでの処理の結果、ＴＲＡＤＤが中程度減少した。３０分後、ＩκＢ−αはＴＮＦ−およびｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−処理細胞双方で分解し、他方、ｓｃＦｖでの処理はＩκＢ−α分解の効果を有しなかった。ＴＮＦまたはｓｃＦｖ２３／ＴＮＦいずれかの添加から３時間後、ＩκＢ−αのレベルは基礎レベルにおいて増加した。これは、ＩκＢ−α経路が、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−媒介シグナリング変換に関与し得るが、これはｓｃＦｖ２３成分の効果ではないことを示す。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現の結果、Ａｋｔキナーゼ経路のような異なる下流経路の活性化がもたらされ、これは、細胞増殖および細胞生存に導く。ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦがこのＡｋｔ生存経路に影響するか否かを判断するために、ＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞をｓｃＦｖ２３、ＴＮＦまたはｓｃＦｖ２３／ＴＮＦで処理した。次いで、Ａｋｔおよびホスホ−Ａｋｔに対する抗体を用い、ウェスタンブロット分析によって、Ａｋｔキナーゼの活性化を評価した。図１０Ａおよび１０Ｂに示すように、ｓｃＦｖ２３またはＴＮＦいずれかでの処理は、４８時間の曝露の後にＡｋｔのリン酸化を活性化した。他方、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦでの細胞の処理の結果、薬物投与後まもなく（３０分）およびかなり後（４８時間）、リン酸化Ａｋｔのダウンレギュレーションがもたらされた。これは、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ−誘導ＴＮＦ抵抗性は、少なくとも部分的には、Ａｋｔ生存シグナリング経路によって媒介され、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−誘導細胞傷害性はＡｋｔリン酸化の阻害によって媒介されることを示す。
実施例１３
アポトーシス、カスパーゼ−８、カスパーゼ−３、およびＰＡＲＰ切断に対するｓｃＦｖ２３／ＴＮＦおよびＴＮＦの効果
ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの細胞傷害性がアポトーシスに関連するか否かを判断するために、ＤＮＡをＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞から、２００ｎＭ  ＴＮＦまたはｓｃＦｖ２３／ＴＮＦいずれかへの曝露から２４時間および４８時間後に抽出した。該ＤＮＡを１％アガロースゲルでの電気泳動に付した。アポトーシスに特徴的なＤＮＡ断片パターンが、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−処理でＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞で検出されたが、ＴＮＦ−処理ＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞では検出されなかった（図１１Ａ）。また、ＴＵＮＥＬ染色によって、ＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞をアポトーシスについてアッセイした。図１１Ｂに示すように、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−処理細胞は、４８時間の曝露において、ＤＮＡ断片化ならびにアポトーシス細胞死滅に典型的な核凝縮を示した。タンパク質のカスパーゼシリーズは、ＴＮＦおよび他のサイトカインのアポトーシス効果の中枢的なメディエーターであることが知られている。ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−誘導細胞死滅の間に、カスパーゼ−８およびカスパーゼ−３がＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞で活性化されるか否かを判断するために、カスパーゼ−８、カスパーゼ−３、およびその基質ポリ（ＡＤＰ）−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断を調べた。ＴＮＦでの処理はカスパーゼ−８、カスパーゼ−３、およびＰＡＲＰ切断に対して効果を有しなかった。対照的に、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦでの処理の結果、４８時間においてカスパーゼ−８、カスパーゼ−３、およびＰＡＲＰの切断がもたらされた（図１２）。ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−誘導アポトーシスがカスパーゼ−３経路の活性化に依存するか否かを判断するために、ＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞に対するｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの細胞傷害性に対するカスパーゼ−３阻害剤の効果を調べた。図１３は、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−誘導細胞傷害性がカスパーゼ−３阻害剤（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ）によって阻害されたことを示す。ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−誘導アポトーシスがカスパーゼ−８および−３経路の活性化に依存するか否かを調べるために、ＳＫＢＲ−３／ＬＰ細胞に対するｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの細胞傷害性に対するカスパーゼ阻害剤の効果を調べた。図１４は、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−誘導細胞傷害性が一般的なカスパーゼ阻害剤（Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ）、カスパーゼ−８阻害剤（Ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫ）、およびカスパーゼ−３阻害剤（Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ）によって阻害されたことを示す。この結果は、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦが、少なくとも部分的には、カスパーゼ−８および−３依存性カスケードを通じて媒介されるように見えるアポトーシス応答を誘導することを示す。
実施例１４
ＨＥＲ−２／ＮＥＵ−過剰発現細胞におけるＳＣＦＶ２３／ＴＮＦのユニークなアポトーシスシグナリングの重要性
腫瘍細胞へのサイトカインの特異的送達についての抗体の使用は、ＴＮＦ、インターフェロン、ＩＬ−２、およびリンホトキシンを用いて多数のグループによって示されている（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。これらの実験のいくつかは、抗体−標的化サイトカインが元来のサイトカインよりも効果的であることを示した。ＴＮＦを含有する抗体構築体を利用し、本発明者らは、ＴＮＦを含有する組換え単一−鎖抗体融合構築体を用いて腫瘍細胞へのＴＮＦの送達、およびｇｐ２４０およびＨＥＲ−２／ｎｅｕの標的化が、イン・ビトロにてＴＮＦに対する腫瘍細胞の抵抗性を克復できることを最初に示した（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【０３４３】
ＨＥＲ−２／ｎｅｕの過剰発現は生存利点に、および少なくとも乳房、卵巣、およびＨＥＲ−２−トランスフェクト細胞系におけるＴＮＦ抵抗性に関連するように見える（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｈｕｄｚｉａｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。他方、ＨＥＲ−２／ｎｅｕのダウンレギュレーションは、ドキソルビシン−抵抗性腫瘍細胞系においてＴＮＦの細胞傷害性に対する増強した感受性を付与することが示されている（Ｓｌｅｉｊｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。研究は、乳房および頸部癌腫細胞におけるＥＧＦシグナリングがＴＮＦの細胞傷害性効果をやはり変調できることを加えて示した（Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。
【０３４４】
本発明者らは、ＳＫＢＲ−３細胞系の継続的培養の結果、ＨＥＲ−２／ｎｅｕのダウンレギュレーション、および少量のＨＥＲ−２／ｎｅｕ−発現ＳＫＢＲ−３／Ｌ細胞に対する付与されたＴＮＦ感受性がもたらされ、ＴＮＦに融合された抗−ＨＥＲ−２／ｎｅｕ単一鎖抗体よりなるｓｃＦｖ２３／ＴＮＦが、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ−過剰発現ＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞におけるＨＥＲ−２−誘導ＴＮＦ抵抗性を克服できると判断した。ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−誘導細胞傷害性に寄与する２つの重要な因子はＡｋｔおよびカスパーゼである。セリン／スレオニンタンパク質キナーゼＡｋｔは、細胞周期進行（Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｍｕｉｓｅ−Ｈｅｌｍｅｒｉｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｇｉｌｌ  ａｎｄ  Ｄｏｗｎｗａｒｄ，１９９９）、脈管形成（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、アポトーシスの阻害（Ｓａｂｂａｔｉｎｉ  ａｎｄ  ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，１９９９；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、および細胞成長（Ｖｅｒｄｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）において中枢的な役割を有することが示されている。ＨＥＲ−２／ｎｅｕの過剰発現は、Ａｋｔ経路を活性化し、多くの治療薬物によって誘導されたアポトーシスに対する抵抗性を付与することが知られている（Ｙｕ  ａｎｄ  Ｈｕｎｇ，２０００；Ｋｎｕｅｆｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＨＥＲ−２／ｎｅｕの過剰発現するＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞は、内因性レベルのｐ−ＡｋｔおよびＡｋｔを有した。ＴＮＦまたはｓｃＦｖ２３抗体単独でのこれらの細胞の処理は細胞成長に対して効果を有しなかったが、曝露から４８時間後にＡｋｔリン酸化を誘導することが示された。ＴＮＦの効果とは対照的に、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ処理の結果、Ａｋｔリン酸化が有意に低下した。該結果は、Ａｋｔリン酸化が、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ−過剰発現ＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞に対するＴＮＦ−抵抗性を付与するのに重要な役割を演じ、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−誘導細胞傷害性は、少なくとも部分的には、Ａｋｔ生存シグナリング経路の阻害剤によって媒介することができることを示唆する。
【０３４５】
ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ細胞傷害性の媒介におけるもう１つの臨界的な因子は、カスパーゼ活性化カスケードである。ＴＮＦのＴＮＦ−Ｒ１への結合は、シグナリング複合体、ＴＮＦ−Ｒ１−ＴＲＡＤＤ−ＦＡＤＤ−プロ−カスパーゼ−８の形成を誘導することができ、その結果、カスパーゼ−８が活性化される（Ｎａｇａｔａ，１９９７）。カスパーゼ−８の活性化は、他のカスパーゼのタンパク質分解活性化をもたらすと考えられる（Ｍｅｄｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。カスパーゼ−３の活性化は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ−過剰発現ＳＫＯＶ３．ｉｐｌにおけるパクリタキセル−誘導アポトーシス（Ｕｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）およびイムノトキシン−誘導アポトーシス（Ｋｅｐｐｌｅｒ−Ｈａｆｋｅｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）に寄与する。ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦでの処理の結果、各々、２４時間および４８時間におけるカスパーゼ−３およびＰＡＲＰの最終的な切断と共に時間−依存的なカスパーゼ−８の活性化がもたらされた。データは、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−誘導細胞傷害性メカニズムが、カスパーゼ−８、カスパーゼ−３およびＰＡＲＰ切断の活性化を通じてアポトーシスカスケードを誘導することによって達成されたことを示す。
【０３４６】
１つの具体例において、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−誘導細胞傷害性およびＴＮＦ受容体の発現の間の相関は、融合構築体が天然ＴＮＦのそれとは異なる様式でＴＮＦＲ−１と物理的に相互作用するためである。別法として、あるいは加えて、ｓｃＦｖ２３抗体は効果的に細胞に内部化するので、これは、それが細胞内ＴＮＦＲ−１との相互作用で利用できるだろう細胞質へＴＮＦを送達できよう。
【０３４７】
ＴＮＦおよびｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの間のシグナリング事象の観察された差は表６に供される。
【０３４８】
（表６：例示的ＨＥＲ−２過剰発現ＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞に対するｓｃＦｖ２３、ＴＮＦ、およびｓｃＦｖ２３／ＴＮＦのシグナル伝達効果のまとめ）
【０３４９】
【表６】
2008526889.tif 000009
イン・ビトロメカニズム研究は、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦがＴＮＦに対する抵抗性であるＨＥＲ−２／ｎｅｕ−過剰発現癌細胞に対して効果的な細胞傷害性剤であることを示す。
実施例１５
実施例１６ないし２０についての例示的な材料および方法
材料
モノクローナル抗−ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗体（Ａｂ）、ウサギポリクローナル抗−ＴＮＦ−Ｒ１  Ａｂ、ウサギポリクローナル抗−ＴＮＦ−Ｒ２  Ａｂ、ウサギポリクローナル抗−カスパーゼ−８  Ａｂ、モノクローナル抗−カスパーゼ−３  Ａｂ、モノクローナル抗−ＰＡＲＰ  Ａｂ、ウサギポリクローナル抗−ＴＲＡＤＤ  Ａｂ、ウサギポリクローナル抗−ＴＲＡＦ２  Ａｂ、およびウサギポリクローナル抗−ＩκＢ−α  Ａｂは、全て、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡから入手した。ウサギポリクローナル抗−ホスホＡｋｔ  Ａｂ、およびウサギポリクローナル抗−Ａｋｔ  Ａｂ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）をウェスタンブロット分析で用いた。阻害アッセイでは、組換えヒトＴＮＦ−Ｒ１：Ｆｃ融合タンパク質はＡｌｅｘｉｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。一般的なカスパーゼ阻害剤（Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ）、カスパーゼ−８阻害剤（Ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫ）、およびカスパーゼ−３阻害剤（Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ）はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。ハーセプチンはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）から購入した。細胞成長ＸＴＴアッセイキットはＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入した。
細胞系および培養
ＳＫＢＲ−３細胞は、１０％加熱不活化胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００ユニット／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足したＭｃＣｏｙの５Ａ改変培地（ＤＭＥＭ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中で成長させた。我々の実験で用いた多量のＨＥＲ−２／ｎｅｕを発現するＳＫＢＲ−３低継代細胞（ＳＫＢＲ−３−ＬＰ）は継代５および８の間であり、他方、用いたＳＫＢＲ−３高継代細胞は継代４０および４５の間であり、比較的低いレベルのＨＥＲ−２／ｎｅｕを呈した（ＳＫＢＲ−３−ＨＰ）。Ｌ３．６ｐｌヒト膵臓癌細胞系はＤｒ．Ｋｉｌｌｉａｎ（Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｈｏｕｓｔｏｍ，ＴＸ）によって親切にも贈られ、１０％加熱不活化ＦＢＳ、１００ユニット／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）中で成長させた。
イン・ビトロ細胞傷害性アッセイ
ＳＫＢＲ−３細胞を平底９６−ウェルマイクロタイタープレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）中に蒔き（１×１０４／ウェル）、２４時間後に、ｓｃＦｖ２３、ＴＮＦ、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ、またはハーセプチン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を三連ウェルに加えた。ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの細胞傷害性に対するカスパーゼ阻害剤の効果を調べるために、ＳＫＢＲ−３−ＬＰ細胞を、２００μＭの一般的カスパーゼ阻害剤（Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ）、カスパーゼ−８阻害剤（Ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫ）、またはカスパーゼ−３阻害剤（Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ）（Ｒ＆Ｄ）の有りまたは無しに２時間予備処理し、次いで、種々の濃度のｓｃＦｖ２３／ＴＮＦで処理した。７２時間後、５０μｌのＸＴＴ標識混合物（Ｒｏｃｈｅ）を各ウェルに加え、その後、細胞をさらに４時間インキュベートした。分光光度吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を用いて４５０ｎｍで測定した。
ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ細胞傷害性におけるＴＮＦ−Ｒ１の役割の評価
ＳＫＢＲ−３細胞を平底９６−ウェルマイクロタイタープレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）中に蒔き（１×１０４／ウェル）、２４時間後、組換えヒトＴＮＦ−Ｒ１：Ｆｃ融合タンパク質（Ａｌｅｘｉｓ）で２時間予備処理し、次いで、ＴＮＦ、ハーセプチン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、またはｓｃＦｖ２３／ＴＮＦを三連ウェルに加えて処理した。７２時間のインキュベーションの後、ＸＴＴアッセイ（Ｒｏｃｈｅ）によって細胞生存率を検出した。
アポトーシスの検出
アポトーシス細胞死滅の発生はＤＮＡ断片化によって、およびＴＵＮＥＬアッセイによって検出した。ＤＮＡ断片化を見積もるために、ＳＫＢＲ−３−ＬＰ細胞を５×１０５細胞／６０ｍｍペトリ皿で蒔き、一晩接着させ、次いで、２００ｎＭ  ＴＮＦまたは２００ｎＭ  ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦで処理した。２４時間および４８時間の曝露の後、細胞をＰＢＳで洗浄し、５ｍＭからトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０  ｇ／ｍｌ  ＲＮＡｓｅ、および０．２５％ＳＤＳを含有するＤＮＡ抽出緩衝液に再懸濁させ、次いで、３７℃にて１時間インキュベートした。タンパク質を除去するために、再懸濁された細胞溶解物を１００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫで５００℃にて３時間処理した。フェノールおよびクロロホルムを用いてＤＮＡを抽出し、続いて、エタノール沈殿を行った。ゲノムＤＮＡをトリス−ＥＤＴＡ（ｐＨ８）に再懸濁させ、臭化エチジウムを含有する１％アガロースゲルでの電気泳動によって分画した。
【０３５０】
ＴＵＮＥＬアッセイを用いてアポトーシスを評価するためにＳＫＢＲ−３−ＬＰ細胞をカバーガラス上で平板培養し、一晩接着させ、次いで、２００ｎＭ  ＴＮＦまたは２００ｎＭ  ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦで２４時間および４８時間処理した。細胞をＰＢＳで洗浄し、浸透させ（０．１％トリトンＸ−１００、０．１％クエン酸ナトリウム）、次いで、４％パラホルムアルデヒド中で固定した。固定した細胞をイン・サイチュ細胞死滅検出キット（Ｒｏｃｈｅ）で染色した。アポトーシスを受けている細胞を、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，Ｊａｐａｎ）によって同定した。
ウェスタンブロット分析
ＳＫＢＲ−３およびＬ３．６ｐｌ細胞系を５×１０５細胞／６０ｍｍペトリ皿で蒔き、一晩成長させ、次いで、２００ｎＭ  ｓｃＦｖ２３、２００ｎＭ  ＴＮＦ、２００ｎＭ  ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦまたは１０ｍｇ／ｍｌのペスセプチンで処理した。処理の後、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、０．３ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、６０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．２％ＮＰ−４０）中で氷上で２０分間溶解した。細胞溶解物（５０μｇ）を８ないし１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、電気泳動により、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ  Ｉｎｃ．，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）に移した。膜を、３％ウシ血清アルブミンを含有するトリス−緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）中で２時間ブロックし、次いで、種々の抗体（モノクローナル抗−ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  Ａｂ、ウサギポリクローナル抗−ＴＮＦ−Ｒ１  Ａｂ、ウサギポリクローナル抗−ＴＮＦ−Ｒ２  Ａｂ、ウサギポリクローナル抗−カスパーゼ−８  Ａｂ、モノクローナル抗−カスパーゼ−３  Ａｂ、モノクローナル抗−ＰＡＲＰ  Ａｂ、ウサギポリクローナル抗−ＴＲＡＤＤ  Ａｂ、ウサギポリクローナル抗−ＴＲＡＦ２  Ａｂ、ウサギポリクローナル抗−ＩκＢ−α  Ａｂ、ウサギポリクローナル抗−ホスホＡｋｔ  Ａｂ、およびウサギポリクローナル抗−Ａｋｔ  Ａｂでプローブした。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）でコンジュゲートしたヤギ抗−マウス／ヤギ抗−ウサギまたはブタ抗−ヤギ抗体を用いて、ＥＣＬ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用い、１：４０００希釈にて免疫反応性タンパク質を可視化した。データは、β−アクチンに対して正規化されたタンパク質バンドの相対的密度として表した。バンドの強度はヒストグラムを用いて定量した。
実施例１６
ＳＣＦＶ２３／ＴＮＦに対する感受性、およびＨＥＲ−２／ＮＥＵ、ＴＮＦ−Ｒ１、およびＴＮＦ−Ｒ２発現との相関
本発明者らの実験室における研究は、ヒト乳癌細胞系ＳＫＢＲ−３が、イン・ビトロでの延長された継代後にＨＥＲ−２／ｎｅｕ細胞発現をダウンレギュレートするように見えることを従前に示している。ウェスタンブロット分析（図１５Ａ）により、高継代細胞（ＳＫＢＲ−３−ＨＰ、継代＞４０）が、より低い継代細胞（ＳＫＢＲ−３−ＬＰ、継代１０未満）と比較して、６倍より低いレベルのＨＥＲ−２／ｎｅｕを発現することが確認される。加えて、ＳＫＢＲ−３−ＨＰ細胞もまた、２．３倍より高いレベルのＴＮＦ−Ｒ２を発現したが、同等レベルのＴＮＦ−Ｒ１を発現した。発明者は、次に、ハーセプチン、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ、またはＴＮＦの細胞傷害性効果に対するこれらの２つの細胞系の応答を見積もった。低レベルのＨＥＲ−２／ｎｅｕを発現するＳＫＢＲ−３−ＨＰ細胞系と比較して、より高いレベルのＨＥＲ−２／ｎｅｕｗを発現するＳＫＢＥＲ−３−ＬＰ細胞はハーセプチンの細胞傷害性効果に対してより感受性であった。他方、ＳＫＢＲ−３−ＨＰ細胞は、ＳＫＢＲ−３−ＬＰ細胞と比較してＴＮＦの細胞傷害性効果に対してより感受性であり、かくして、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現がＴＮＦに対する抵抗性に相関することを示唆する従前の研究が確認される。対照的に、双方のＳＫＢＲ−３細胞系はｓｃＦｖ２３／ＴＮＦに対して実質的に同一の感受性を示した（図１５Ｂ）。これらの結果は、ＳＫＢＲ−３細胞系の継続的な培養の結果、ＨＥＲ−２／ｎｅｕのダウンレギュレーションおよびＴＮＦ−Ｒ２の同時のアップレギュレーションをもたらされることを示す。他のグループによる研究（Ｓａｃｃａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ａｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）は、ＴＮＦ−Ｒ１が、主として、ＴＮＦ細胞傷害性シグナルを媒介することを担うことを示す。これらの観察が、原因として、ＳＫＢＲ−３細胞におけるＴＮＦ細胞傷害性効果に対する細胞抵抗性に関連し、または相関するか否かは明らかでない。しかしながら、これらのデータは、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ免疫サイトカインが、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現に関連するＴＮＦ細胞抵抗性を克服することができることを示す。さらに、ＳＫＢＲ−３−ＬＰ細胞に対するｓｃＦｖ２３／ＴＮＦおよびＴＮＦそれ自体の間の生物学的活性で観察された有意な差は、これらの観察の原因となり得るメカニズム的程度を比較する機会を提供した。
実施例１７
ＳＣＦＶ２３／ＴＮＦ−誘導成長阻害剤についてのＴＮＦ−Ｒ１の役割
ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの細胞傷害性が細胞−表面ＴＮＦ−Ｒ１との相互作用を通じて媒介されるか否かを判断するために、発明者らは、ＴＮＦ−Ｒ１：Ｆｃ融合タンパク質を用い、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ融合構築体のＴＮＦ成分のＴＮＦ−Ｒ１への結合を特異的にブロックした。図１６に示すように、ＴＮＦ−Ｒ１：Ｆｃの付加は、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦまたはＴＮＦ−誘導細胞傷害性を無くすることができたが、ＳＫＢＲ−３−ＬＰまたは−ＨＰ細胞に対するハーセプチン−誘導細胞傷害性を無くすることはできなかった。ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの細胞傷害性効果の阻害は、加えたＴＮＦ−Ｒ１：Ｆｃ融合タンパク質の濃度に直接的に依存した。該結果が、本発明の具体的な例において、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−誘導細胞傷害性が、細胞表面ＴＮＦ−Ｒ１との相互作用によって原理的には媒介されることを示す。
実施例１８
ＴＮＦ−Ｒ発現に対するＳＣＦＶ２３／ＴＮＦの効果
免疫サイトカインｓｃＦｖ２３／ＴＮＦがＴＮＦ−Ｒ１の細胞発現を変調できるか否かを次に調べた。ＳＫＢＲ−３−ＬＰ細胞をｓｃＦｖ２３、ＴＮＦ、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦまたはハーセプチンで処理した。ＳＫＢＲ−３−ＬＰ細胞の、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦまたはｓｃＦｖ２３抗体単独いずれかでの処理は、ＴＮＦ−Ｒ１発現のアップレギュレーションを時間に依存的に誘導した。これは、ｓｃＦｖ２３成分の効果であるように見えた。というのは、ＴＮＦ処理はＴＮＦ−Ｒ１のレベルを低下させたからである。ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ処理は、ＳＫＢＲ−３−ＬＰ細胞におけるＴＮＦ−Ｒ１発現の５倍増加を誘導することが判明したので、我々は、次に、ＴＮＦ−Ｒ１のｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−媒介アップレギュレーションが腫瘍細胞の特定のタイプに限定されるか否かを調べた。ＴＮＦ−抵抗性ＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現Ｌ３．６ｐｌヒト膵臓癌細胞に対するｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの効果を調べた。Ｌ３．６ｐｌ細胞のｓｃＦｖ２３／ＴＮＦでの処理もまた、ＳＫＢＲ−３−ＬＰ細胞で見出されたものと同じように、ＴＮＦ−Ｒ１のアップレギュレーションを劇的に誘導することが判明した（図１７Ａ）。これらの結果は、ＴＮＦ−Ｒ１の細胞発現レベルが、本発明の特定の態様において、ＴＮＦ−抵抗性ＨＥＲ−２／ｎｅｕ−過剰発現腫瘍細胞系におけるｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ細胞傷害性効果と直接的に相関することを示す。
【０３５１】
ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの使用に加えて、ハーセプチンのような他のＨＥＲ−２／ｎｅｕ標的化分子が、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現ＳＫＢＲ−３−ＬＰ細胞でのＴＮＦ−Ｒ１またはＴＮＦ−Ｒ２の発現を変調できるか否かを調べた。図１７Ｂに示されるように、発明者らは、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦまたはハーセプチンでの処理がＴＮＦ−Ｒ２の発現に対して効果を有さず、他方、ハーセプチンが、対照と比較して、１．８倍誘導し、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦはＴＮＦ−Ｒ１の７．３倍高い発現を誘導したことを見出した。この結果が、ＴＮＦ−Ｒ２ではなくＴＮＦ−Ｒ１の発現および機能が、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現ＳＫＢＲ−３−ＬＰ細胞におけるＴＮＦ抵抗性に関与することを示す。
【０３５２】
データは、抗−ＨＥＲ−２／ｎｅｕ単一鎖抗体（ｓｃＦｖ２３）がＴＮＦ−Ｒ１のアップレギュレーションを誘導できることを示したが、細胞成長に対するｓｃＦｖ２３の効果を調べた。発明者らは、ＳＫＢＲ−３−ＬＰ細胞を、ｓｃＦｖ２３単独、またはＴＮＦとの組み合わせで処理し、これをＴＮＦまたはｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ細胞傷害性と比較した。ｓｃＦｖ２３およびＴＮＦの組合せはＴＮＦ単独よりもかなり細胞傷害性であり、ＴＮＦ−抵抗性ＳＫＢＲ−３−ＬＰに対するｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ融合構築体の効果と同様であった（図１８）。従って、結果は、ｓｃＦｖ２３またはｓｃＦｖ２３／ＴＮＦいずれかでの処理によるＴＮＦ−Ｒ１発現の誘導は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現癌細胞においてＴＮＦ感受性を調節するにおいて非常に重要な役割を演じることを示す。
【０３５３】
実施例１９
生存経路に対するＳＣＦＶ２３／ＴＮＦの効果
ＴＮＦ−Ｒ１への結合の後に、ＴＮＦは生存経路およびアポトーシス経路双方を活性化することによってデュアル生物学的機能を発揮する。ＴＮＦ−Ｒ１の活性化の結果、ＮＦ−κＢの活性化（ＩκＢ−αの分解）、およびＴＲＡＤＤおよびＴＲＡＦ２を含めた経路によるＮＦ−κＢ調節抗−アポトーシル因子の誘導をもたらす（Ｗａｊａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦのＴＮＦ成分が天然ＴＮＦと比較して抗−アポトーシス経路を活性できるか否かを判断するために、発明者は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現ＳＫＢＲ−３−ＬＰ細胞を２００ｎＭのｓｃＦｖ２３、ＴＮＦ、またはｓｃＦｖ２３／ＴＮＦで種々の時間処理し、細胞を収穫し、細胞溶解物をウェスタンブロット分析に付した。図１９に示されるように、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦでの１８０分間の処理の結果、ＴＲＡＤＤの中程度の減少がもたらされた。ｓｃＦｖ２３、ＴＮＦ、またはｓｃＦｖ２３／ＴＮＦでの細胞の処理が、ＴＲＡＦ２のレベルに対してインパクトを有しなかった。他方、処理の３０分後に、ＩκＢ−αはＴＮＦ−またはｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−処理細胞双方において分解し；他方、ｓｃＦｖ２３での処理はＩκＢ−α分解に対して効果を有しなかった。これは、効果が、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ構築体のＴＮＦ成分に関連したことを示す。ＴＮＦまたはｓｃＦｖ２３／ＴＮＦいずれかの添加から３時間後に、ＩκＢ−αのレベルはバックから基礎レベルまで増大するように見えた。これらの結果は、ＩκＢ−α経路がｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−媒介シグナリング変換に関与でき、この効果はｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ構築体のｓｃＦｖ２３成分の効果であるようには見えないことを示す。
【０３５４】
ＨＥＲ−２／ｎｅｕの過剰発現は、Ａｋｔキナーゼ経路のような異なる下流経路の活性化をもたらすことを示し、これは、細胞増殖および細胞生存に導く。ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ処理がＡｋｔ生存経路に影響するか否かを判断するために、ＳＫＢＲ−３−ＬＰ細胞をｓｃＦｖ２３、ＴＮＦまたはｓｃＦｖ２３／ＴＮＦで処理した。次いで、Ａｋｔに対する、およびホスホ−Ａｋｔに対する抗体を用いるウェスタンブロット分析によって、Ａｋｔキナーゼの活性化を評価した。図１９に示すように、ｓｃＦｖ２３またはＴＮＦいずれかでの処理は合計細胞内容物またはリン酸化Ａｋｔに対して効果を有しなかった。他方、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦでの細胞の処理の結果、薬物投与から３０分後にリン酸化されたＡｋｔのダウンレギュレーションがもたらされた。これは、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦがこの生存経路を見かけ上変調できることを示す。これは、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ構築体に対して特異的であるように見える。というのは、ｓｃＦｖ２３またはＴＮＦ処理単独いずれか。
実施例２０
ＳＣＦＶ２３／ＴＮＦ効果の有意性
ＨＥＲ−２／ｎｅｕの過剰発現は生存の利点、ならびに乳房、卵巣、およびＨＥＲ−２／ｎｅｕ−トランスフェクト細胞系におけるＴＮＦ抵抗性に関連するように見える（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｈｕｄｚｉａｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。他方、ＨＥＲ−２／ｎｅｕのダウンレギュレーションが、ドキソルビシン−抵抗性腫瘍細胞系におけるＴＮＦの細胞傷害性に対する増強した感受性を付与することが示されている（Ｓｌｅｉｊｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。研究は、加えて、乳房および頸部癌腫細胞におけるＥＧＦシグナリングもまたＴＮＦの細胞傷害性効果を変調できることを示した（Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。
【０３５５】
該研究において、ＴＮＦに融合した抗−ＨＥＲ−２／ｎｅｕ単一鎖抗体よりなるｓｃＦｖ２３／ＴＮＦは、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現ＳＫＢＲ−３−ＬＰ細胞におけるＨＥＲ−２／ｎｅｕ−誘導ＴＮＦ抵抗性を克服できる。これは、ＴＮＦ−Ｒ１発現、カスパーゼ活性化、およびＡｋｔリン酸化が、ＴＮＦ−抵抗性ＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現ＳＫＢＲ−３−ＬＰ細胞においてｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−誘導細胞傷害性に寄与する３つの臨界的な因子であることを示す。
【０３５６】
まず、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ細胞傷害性の媒介における臨界的な因子はＴＮＦ受容体−１の変調であるように見える。ＨＥＲ−２／ｎｅｕオンコジーンの増幅は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のＴＮＦに対する抵抗性に導くことを示し、これはＴＮＦ受容体結合のダウンレギュレーションに相関する（Ｈｕｄｚｉａｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。プロテインキナーゼＣによるＴＮＦ−結合能力のダウンレギュレーションもまた、ＴＮＦ感受性の減少に関連することが示されている（Ｕｎｇｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。従って、ＴＮＦ−Ｒ１の発現に対するｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの効果を調べた。ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦは、ＴＮＦ−Ｒ１のアップレギュレーションを時間依存的に誘導でき、ＴＮＦ受容体−１へのｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの結合のブロックは、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−誘導細胞傷害性を無くすることができ、これは、免疫サイトカイン、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦがＴＮＦ受容体−１の変調を介してＴＮＦ−抵抗性ＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現ＳＫＢＲ−３−ＬＰをＴＮＦに対して感受性とすることを示す。膵臓腫瘍細胞におけるＨＥＲ−２／ｎｅｕのＴＮＦ−媒介ダウンレギュレーションは、ＴＮＦ感受性の増加に関連することが示されている（Ｋａｌｔｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。本発明において、ＳＫＢＲ−３−ＬＰ細胞のｓｃＦｖ２３／ＴＮＦでの処理の結果、４８時間の曝露において、ＨＥＲ−２／ｎｅｕリン酸化の阻害をもたらし、他方、ＴＮＦでの処理はＨＥＲ−２／ｎｅｕリン酸化に対して効果を有しなかった（データは示さず）。具体的な例において、従って、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦによるＨＥＲ−２／ｎｅｕリン酸化のダウンレギュレーションはＴＮＦ受容体−１のアップレギュレーションに導く。
【０３５７】
第二に、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ細胞傷害性の媒介における臨界的な因子は、種々のカスパーゼが関連するように見えた。ＴＮＦ−誘導アポトーシスは主としてＴＮＦ−Ｒ１によって媒介される（Ｔａｒｔａｇｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。ＴＮＦのＴＮＦ−Ｒ１への結合はシグナリング複合体、ＴＮＦ−Ｒ１−ＴＲＡＤＤ−ＦＡＤＤ−プロ−カスパーゼ−８の形成を誘導することができ、その結果、カスパーゼ−８が活性化される（Ｎａｇａｔ，１９９７）。カスパーゼ−８の活性化は、他のカスパーゼのタンパク質分解活性化をもたらすと考えられる（Ｍｅｄｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。カスパーゼ−３の活性化はＨＥＲ−２／ｎｅｕ−過剰発現ＳＫＯＶ３．ｉｐｌにおけるパクリタキセル−誘導アポトーシス（Ｕｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）およびイムノトキシン−誘導アポトーシス（Ｋｅｐｐｌｅｒ−Ｈａｆｋｅｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）に寄与する。ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦでの処理の結果、カスパーゼ−８、カスパーゼ−３およびＰＡＲＰ切断の時間依存的活性化をもたらした。データは、ＴＮＦ−Ｒ１を介してカスパーゼ−８、カスパーゼ−３およびＰＡＲＰ切断の活性化を通じてアポトーシスカスケードを誘導することによって、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−誘導細胞傷害性メカニズムが伴うことを示す。
【０３５８】
最後に、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ細胞傷害性の媒介におけるもう１つの重要な因子はＡｋｔリン酸化の変調である。セリン／スレオニンプロテインキナーゼＡｋｔは、細胞周期進行（Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｍｕｉｓｅ−Ｈｅｌｍｅｒｉｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｇｉｌｌｅ  ａｎｄ  Ｄｏｗｎｗａｒｄ，１９９９）、脈管形成（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、アポトーシスの阻害（Ｓａｂｂａｔｉｎｉ  ａｎｄ  ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，１９９９；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、および細胞成長（Ｖｅｒｄｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）において中枢的な役割を有することが示されている。ＨＥＲ−２／ｎｅｕの過剰発現は、Ａｋｔ経路を活性化し、多くの治療薬物によって誘導されたアポトーシスに対する抵抗性を付与することが知られている（Ｙｕ  ａｎｄ  Ｈｕｎｇ，２０００；Ｋｎｅｕｆｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＨＥＲ−２／ｎｅｕを過剰発現させるＳＫＢＲ−３−ＬＰ細胞は内因性レベルのｐ−ＡｋｔおよびＡｋｔを有した。ｓｃＦｖ２３またはＴＮＦいずれかでの処理は合計細胞内容物またはリン酸化Ａｋｔに対して効果を有しなかった。他方、細胞のｓｃＦｖ２３／ＴＮＦでの処理の結果、リン酸化されたＡｋｔのダウンレギュレーションがもたらされた。結果は、Ａｋｔリン酸化が、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現ＳＫＢＲ−３−ＬＰ細胞にＴＮＦ−抵抗性を付与するにおいて重要な役割を演じ、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−誘導細胞傷害性が、少なくとも部分的には、Ａｋｔ生存シグナリング経路の阻害によって媒介されえることを示す。
【０３５９】
一緒にすると、発明者は、免疫サイトカインｓｃＦｖ２３／ＴＮＦでのＳＫＢＲ−３−ＬＰ細胞の処理の結果、ＴＮＦ−Ｒ１発現のアップレギュレーション、Ａｋｔリン酸化のダウンレギュレーション、およびカスパーゼ−８、カスパーゼ−３、ポリＡＤＰ−リボースポリメラーゼの切断を介するＴＮＦ−誘導アポトーシスをもたらしたことを観察した。ＴＮＦおよびｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの間のシグナリング実証の観察された差を図２０にまとめる。イン・ビトロメカニズム研究は、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦが、ＴＮＦ受容体−１の過剰発現を介してＴＮＦ−抵抗性ＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現ＳＫＢＲ−３−ＬＰ細胞をＴＮＦ−誘導アポトーシスに対して感受性とすることを示し、具体的な例において、ＨＥＲ−２／ｎｅｕを標的とするｓｃＦｖ２３／ＴＮＦは、ＴＮＦに対して固有に抵抗性であるＨＥＲ−２／ｎｅｕ−過剰発現癌細胞に対して効果的な細胞傷害性剤であり得る。加えて、免疫サイトカインｓｃＦｖ２３／ＴＮＦは、中間レベルのＨＥＲ−２／ｎｅｕを発現するＭＣＦ−７乳癌細胞系に対するＴＮＦそれ自体よりも細胞傷害性であった（データは示さず）。本発明の特別な態様において、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ免疫サイトカインはＨＥＲ−２／ｎｅｕ−過剰発現細胞におけるＴＮＦ抵抗性を克服できるのみならず、それは、全ての乳癌腫瘍、ＨＥＲ−２／ｎｅｕの中程度の量を発現するものさえに対する優れた候補であり得る。イン・ビボファルマコキネティック、組織性質および異種移植片治療研究は、例えば、この剤の臨床的開発を助ける。
実施例２１
実施例２２ないし３２についての例示的な材料および方法
細胞系
ヒトメラノーマ細胞系Ａ３７５−ＭおよびＡＡＢ−５２７はＤｒ．Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，ＵＴＭＤＡＣＣ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）およびＤｒ．Ｂ．Ｇｉｏｖａｎｅｌｌａ  （ｔｈｅ  Ｓｔｅｈｌｉｎ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から入手した。Ａ３７５−Ｍ細胞は、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、非必須アミノ酸（０．０１ｍＭ）、グルタミン（２ｍＭ）、ＭＥＭビタミンを補足したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で成長させた。ＡＡＢ−５２７細胞は１０％ＦＢＳ、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）を含むＤＭＥＭ中で培養した。ヒト神経膠腫Ｈ４細胞はＤｒ．Ｂｒｙａｎｔ  Ｄａｒｎａｙ（ＵＴＭＤＡＣＣ）から入手した。Ｈ４細胞は、１０％ＦＢＳ、４．５ｇ／Ｌグルコースを補足したＤＭＥＭ中で培養した。ヒト乳癌細胞系ＳＫ−ＢＲ３はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。細胞は１０％ＦＢＳ、グルタミン（２ｍＭ）で改変されたＭｃＣｙｓの５Ａ培地中で成長させ、継代によって毎週２回対数期に維持した。
ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ融合タンパク質の発現および精製
ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ融合遺伝子は、ＰＣＲ−ベースの構築方法を用いて構築した。融合遺伝子は最後には細菌発現ベクターｐＥＴ３２ａ（＋）にクローン化し、可溶性融合タンパク質を従前に記載されているように発現させ、精製した（Ｍｕｊｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。最終の精製されたタンパク質を４℃で貯蔵した。
発現ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析
還元条件下での１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの電気泳動によってタンパク質試料を分析し、クーマシーブルーでの染色によって可視化した。ウェスタン分析は、（ＭＤＡＣＣ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｙから作成した）ウサギ抗−ｓｃＦｖＭＥＬ抗体を用い、あるいはウサギ抗−ｈｕＴＮＦａ抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて行い、次いで、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−標識ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（１：５００希釈）と共にインキュベートし、増強されたケミルミネセンス（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）検出系によって検出し、Ｘ−線フィルムに曝露した。
細胞傷害性アッセイ
対数基培養におけるヒト細胞に対する種々の剤の細胞傷害性はクリスタルバイオレット染色（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）によって評価した。簡単に述べると、ウェル当たり４×１０３細胞の密度にて細胞を９６−ウェルプレートで平板培養し、５％ＣＯ２中で３７℃にて２４時間接着させた。２４時間後、異なる濃度のＴＮＦまたは精製されたｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦいずれかを含有する培地で該培地を置き換えた。７２時間後、培養中の腫瘍細胞の成長に対するＴＮＦおよびｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの効果をクリスタルバイオレット染色によって測定し、染色された細胞の光学密度を、９６−ウェルマルチスキャナーオートリーダーを用いて５９５ｎｍで測定した。
ウェスタンブロットによるＩκＢαの測定
細胞をｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦまたはＴＮＦで種々の時間処理し、細胞を、５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＤＴＴ、１％トリトンＸ１００、２μｇ／ｍｌロイペプチンおよび２μｇ／ｍｌアプロプニンを含有する溶解緩衝液によって洗浄し、溶解した。等量の合計タンパク質を８．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付加し、標準ウェスタンブロット分析を行い、１：３０００希釈の抗−ＩκＢα抗体を用いて検出した。膜をＰＢＳＴで洗浄し、ＨＲＰにコンジュゲートした二次抗体で処理した。抗原−抗体反応はＥＣＬ検出系によって可視化した。
ｐ３８−ＭＡＰＫ活性化アッセイ
細胞をｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦまたはＴＮＦいずれかの用量で種々の時間処理し、細胞を収穫し、溶解緩衝液によって溶解した。等量（５０μｇ合計タンパク質）を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷し、標準ウェスタンブロッティングを行い、ウサギにおいて生起した（１：３００希釈）、ＭＫＫ３、ホスホ−ＭＫＫ３／ＭＫＫ６、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ、ホスホ−ｐ３８ＭＡＰキナーゼ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｒｙ１８２）、ＡＴＦ−２に対する抗体またはホスホ−ＡＴＦ−２−抗体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて検出した。次いで、ＨＲＰ−ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：５０００希釈）を用い、ウェスタンブロットを可視化し、続いてＥＣＬ検出を行った。
ＳＡＰＫ／ＪＮＫ活性化アッセイ
対数基細胞を同一濃度のＴＮＦまたはｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦで３７℃にて異なる時間処理した。細胞溶解物を細胞溶解緩衝液で抽出した。５０−μｇアリコットのタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの各レーンで解像し、ニトロセルロース膜へ電気移動し、ＭＫＫ４、ホスホ特異的抗−ＳＥＫ１／ＭＫＫ４、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ、ホスホ特異的抗−ｐ５４／４６ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５）、ｃ−Ｊｕｎまたはホスホ−ｃＪｕｎ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に対するウサギポリクローナル抗体（１：３０００希釈）でプローブした。次いで、膜をＨＲＰ−ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（１：５０００希釈）と共にインキュベートし、ＥＣＬ検出系を用いてバンドを検出した。
ＰＡＲＰ切断の分析
簡単に述べれば、各々、Ａ３７５−Ｍについては１ｎＭおよびＡＡＢ−５２７については２００ｎＭの濃度にて、２×１０６細胞／ｍｌをＴＮＦで２４時間処理し、あるいはＡ３７５−Ｍについては０．１ｎＭ、およびＡＡＢ−５２７細胞については２０ｎＭの濃度にてｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦで２４時間処理した。インキュベーションに続き、細胞を０．０５ｍｌの細胞溶解緩衝液中の氷上で３０分間インキュベートすることによって細胞抽出物を調製した。各上清からの５０−μｇタンパク質試料を、７．５％ゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解像し、ニトロセルロース膜に移した。移したタンパク質を抗−ＰＡＲＰ抗体（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）でプローブし、ＨＲＰ−ヤギ抗−マウスＩｇＧによって検出し、ＥＣＬによって可視化した。抗体によって認識される切断された（８６ｋＤａ）および切断されていない（１１６ｋＤａ）タンパク質双方の検出によって、ＰＡＲＰ分解を表した。
カスパーゼ−３活性化
細胞を、Ｉ．Ｃ．５０濃度にてｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦまたはＴＮＦで種々の時間（１時間、４時間、８時間、１６時間および２４時間）処理した。次いで、同一量の合計タンパク質（５０μｇ）を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷し、標準ウェスタンブロットを行い、切断されたカスパーゼ−３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に対するモノクローナル抗体によって検出し、次いで、さらに、ＨＲＰ−ヤギ抗マウスＩｇＧと共にインキュベートし、ＥＣＬ検出系によって検出した。
イン・サイチュ細胞死滅検出（ＴＵＮＥＬ）
１６−ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ）中の細胞（ウェル当たり１０，０００細胞）をＩ．Ｃ．５０にてｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦまたはＴＮＦで２４時間処理し、ＰＢＳで軽く洗浄した。細胞を、３．７％ホルムアルデヒドの添加によって室温にて１０分間固定し、０．１％トリトンＸ−１００、０．％クエン酸ナトリウムによって氷上で２分間浸透させた。細胞をＴＵＮＥＬ反応混合物（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）と共に３７℃にて６０分間インキュベートした。最終の洗浄工程の後、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＳ−１００蛍光顕微鏡下で細胞を分析した。
ウェスタンブロッティングによるメラノーマ細胞でのＴＮＦ受容体およびＴＮＦ受容体シグナリング関連タンパク質の検出
細胞溶解物の同一量合計タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷し、標準ウェスタンブロッティング分析を行った。タンパク質を一次抗体でプローブして、ＴＮＦ  Ｒ１、ＴＮＦ  Ｒ２、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ２、ＲＩＰおよびβ−アクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を検出し、次いで、ＨＲＰ−コンジュゲーテッド二次抗体と共にインキュベートし、ＥＣＬ検出系で最後に検出し、Ｘ−線フィルムに曝露した。
ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの内部化
細胞を１６−ウェルチャンバースライドに平板培養し（ウェル当たり１×１０４細胞）、２５μｇ／ｍｌの抗−ＴＮＦＲ１抗体の添加によって１時間プレ−ブロックし、次いで、Ｉ．Ｃ．５０濃度のｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦで４時間、１時間など処理した。細胞表面結合を、グリシン緩衝液（５００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１Ｍグリシン，ｐＨ２．５）への曝露によって除去し、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５で中和し、免疫蛍光二重染色を行った。簡単に述べれば、細胞を３．７％ホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中の０．１％トリトンＸ−１００で浸透させた。０．５％ＢＳＡでブロックした後、細胞をウサギ抗−ｈｕＴＮＦまたはウサギ抗ｓｃＦｖＭＥＬ抗体と共に室温にて３０分間インキュベートし、次いで、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ，２．５μｇ／ｍｌ）を含有するＦＩＴＣ−コンジュゲート抗−ウサギＩｇＧ（１：１００希釈，Ｓｉｇｍａ）と共に暗所にて室温にて３０分間インキュベートした。試料をＰＢＳで洗浄し、封緘した。スライドを、１ｍｇ／ｍｌのＰＩを含有する抗フェードＤＡＢＣＯ設置培地で設置し、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＳ−１００蛍光顕微鏡下で分析した。
マイクロアレイ分析のためのＲＮＡ調製
ヒトメラノーマＡＡＢ５２７細胞をＩ．Ｃ．５０濃度にてｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦまたはＴＮＦで２４時間処理し、処理されていない細胞を対照として用いた。ＲＮＡを、製造業者の指示に従って、ＴＲＩｚｏＬ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）でほぼ１×１０７細胞から単離した。全ＲＮＡの量を、変性ホルムアルデヒド／アガロースゲル電気泳動によって評価した。Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｒｅ  ＬａｂおよびＢｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸによって、マイクロアレイ分析を行った。
実施例２２
ＳＣＦＶＭＥＬ／ＴＮＦ融合タンパク質をコードするプラスミドの発現
ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ融合遺伝子をＰＣＲによって構築し、細菌タンパク質発現ベクターｐＥＴ３２に連結した（図２１）。融合タンパク質を、Ｔ７プロモータの制御下のＥ．ｃｏｌｉ株ＡＤ４９４（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳを用いて発現させ、ＩＰＴＧの添加によって標的タンパク質の合成を誘導した。可溶性タンパク質をＴＡＬＯＮ−金属アフィニティークロマトグラフィによって精製し、Ｈｉｓ−タグを組換えエンテロキナーゼ（ｒＥＫ）への曝露によって標的タンパク質から切断した。次いで、Ｑ−セファロース  ＦＦイオン交換クロマトグラフィーを通して融合構築体をさらに精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｔａｌｏｎクロマトグラフィーが６２ｋＤａの予測される分子量において移動する標的タンパク質を高度に精製したことを示した。１７ｋＤａタグを酵素により切断し、還元条件下で４５ｋＤａにおいて移動する天然ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦタンパク質を得た（図２２Ａ）。最終融合タンパク質の組成は、ウサギ抗−ｈｕＴＮＦ（図２２Ｂ）またはウサギ抗−ｓｃＦｖＭＥＬ抗体（図２２Ｃ）いずれか用いるウェスタンブロットによって確認した。構築体の構造は、加えて、ＤＮＡ配列分析によって確認した。
実施例２３
培養中のメラノーマ細胞におけるＳＣＦＶＭＥＬ／ＴＮＦおよびＴＮＦの細胞傷害性効果
ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの細胞傷害性を、各々、対数期抗原−陽性のＴＮＦ−感受性ヒトメラノーマＡ３７５−Ｍ細胞および抗原−陽性のＴＮＦ−抵抗性ヒトメラノーマＡＡＢ−５２７細胞に対して評価した。効果を抗原−陰性のＴＮＦ−感受性ヒト乳癌ＳＫ−ＢＲ３−ＨＰおよび抗原−陰性のＴＮＦ−抵抗性ヒト神経膠腫Ｈ４細胞と比較した。結果は、抗原−陽性のＡ３７５−Ｍ細胞に対して、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ（Ｉ．Ｃ．５０  ０．１ｎＭ）が天然ＴＮＦ（Ｉ．Ｃ．５０  １．４ｎＭ）よりもほぼ１０倍活性であるように見えたことを示した（ｐ＜０．０００１）。ＴＮＦ−感受性の抗原−陰性ＳＫ−ＢＲ３−ＨＰ細胞に対して、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ（Ｉ．Ｃ．５０  ２．５ｎＭ）の細胞傷害性は、標品ＴＮＦ（Ｉ．Ｃ．５０  ２．７ｎＭ）のそれと同様な用量−応答曲線を示した（ｐ＞０．０５）。抗原−陰性のＴＮＦ−抵抗性Ｈ４細胞に対し、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦは１００ｎＭまでの用量において細胞傷害性効果を示さなかった。しかしながら、抗原−陽性のＴＮＦ−抵抗性ヒトメラノーマＡＡＢ−５２７細胞に対して、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦは有意な用量−関連細胞傷害性効果を示した（Ｉ．Ｃ．５０  ２０ｎＭ）。対照的に、これらのＡＡＢ−５２７細胞は、５０００ｎＭまでの濃度においてＴＮＦの細胞傷害性効果に対して抵抗性であった（表７）。
【０３６０】
（表７：異なる細胞系に対するｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ  ｖｓ  ＴＮＦの細胞傷害性ａ）
【０３６１】
【表７】
2008526889.tif 000010
ａ：７２時間処理
ｂ：３つの独立した実験からのデータ
ｃ：示された濃度において細胞傷害性効果無し
ｄ：標的化指標＝ＴＮＦのＩＣ５０／ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦのＩＣ５０
実施例２４
ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦおよびＴＮＦ双方はＩκＢＡの分解を誘導することができる。
【０３６２】
ウェスタンブロット分析を用いて、ＩκＢαの分解を調べた。ＮＦ−κＢは細胞質においてその不活性な状態で存在し、そこでは、それはＩκＢ−αに結合している。ＩκＢ−αの分解はＮＦ−κＢの活性化、および核へのトランスローケーションで非常に重要である。ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ処理の後および前における細胞質中のＩκＢ−αのレベルのウェスタンブロット分析は、Ａ３７５−ＭおよびＡＡＢ−５２７細胞にて、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ処理は１５分において始まるＩκＢ−αの分解を引き起こした。それは３０分において完全に分解され、６０分までに再度合成された。同様なプロフィールは、ＴＮＦ単独での処理の後にこれらの細胞で観察された（図２３Ａ）。抗体ＺＭＥ−０１８はｓｃＦｖＭＥＬ組み換え断片についての親マウス抗体である。双方の剤は、ヒトメラノーマ細胞表面に提示されるｇｐ２４０標的抗原上の同一抗原性ドメインを認識する（Ｂｕｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｄａｙｅｒ，２００２；Ｂｏｒｉｓ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｋｅ，２００３；Ｂｈａｒｔｉ  ａｎｄ  Ａｇｇａｒｗａｌ，２００２；Ｏｒｌｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｂａｌｄｉｎ，２００２；Ｓｕｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，２００２）。Ａ３７５−ＭおよびＡＡＢ−５２７細胞をＺＭＥ−０１８で４時間予備処理し、次いで、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦで処理し、細胞質中のＩκＢαのレベルを検出すると、抗体予備処理は、ＩκＢαのｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ誘導分解に対して有意な効果を有しなかった（図２３Ｂ）。
実施例２５
Ｐ３８−ＭＡＰキナーゼ経路に対するＴＮＦおよびＳＣＦ部位ＭＥＬ／ＴＮＦの効果
ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ経路は、Ａ３７５−ＭまたはＡＡＢ５２７細胞いずれかでのｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦおよびＴＮＦ曝露双方によって活性化された。ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ処理で観察された活性化事象は、ＴＮＦ処理で観察されたものよりも幾分遅く起こった。ＭＫＫ３は、Ａ３７５−Ｍ細胞では、３０分までにＴＮＦによって活性化され、および４５分においてｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦによって活性化された。ＭＫＫ３はＴｈｒ１８０およびＴｙｒ１８２におけるリン酸化によってｐ３８  ＭＡＰキナーゼを活性化する。活性化されたｐ３８  ＭＡＰキナーゼは転写因子ＡＴＦ−２等をリン酸化することが示されている（図２４）。
実施例２６
ＳＣＦＶＭＥＬ／ＴＮＦによってではなくＴＮＦによるＳＡＰＫ／ＪＮＫ経路の活性化
ＴＮＦへの曝露はヒトメラノーマＡ３７５−ＭおよびＡＡＢ−５２７細胞双方においてＳＡＰＫ／ＪＮＫ活性化を迅速に刺激した。ＡＡＢ５２７細胞において、ＭＫＫ４は曝露後５分において出発するＴＮＦ処理によってリン酸化された。活性化されたＭＫＫ４は、やはり５分においてＴｈｒ１８３およびＴｙｒ１８５提示細胞質ｐ５４／ｐ４６におけるリン酸化によってＳＡＰＫ／ＪＮＫを活性化することが示されている。活性化されたＳＡＰＫ／ＪＮＫはｃ−Ｊｕｎ転写因子のＮ−末端領域に結合し、その結果、ｃ−Ｊｕｎがリン酸化された。ｐ５４／ｐ４６のＴＮＦ誘導リン酸化シグナルは、ＴＮＦ抵抗性ＡＡＢ５２７細胞におけるよりもＴＮＦ感受性Ａ３７５−Ｍにおいてかなり低かった。しかしながら、ＡＡＢ−５２７またはＡ−３７５Ｍメラノーマ細胞いずれかをｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦで処理すると、ＭＫＫ４、ＳＡＰＫ／ＪＮＫまたはｃ−Ｊｕｎのリン酸化は観察されなかった（図２５）。
実施例２７
ＴＮＦではなくＳＣＦＶＭＥＬ／ＴＮＦでの処理は、抗原−陽性のＴＮＦ−抵抗性メラノーマ細胞でアポトーシスを誘導する。
【０３６３】
抗原−陽性のＴＮＦ−感受性Ａ３７５−Ｍメラノーマ細胞は、ＴＮＦ（１ｎＭ）またはｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ（０．１ｎＭ）いずれかで２４時間処理した場合、成長が阻害され、ＰＡＲＰ切断を示した。対照的に、ＴＮＦ−抵抗性ＡＡＢ−５２７メラノーマ細胞は、２００ｎＭまでの濃度のＴＮＦで２４時間処理した場合、ＰＡＲＰ切断は示さなかった。対照的に、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ（２０ｎＭ）でのこれらの細胞の処理から２４時間後に、ＰＡＲＰ切断は明瞭に観察された（図２６Ａ）。ＴＮＦおよびｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ双方での処理の結果、処理から４時間後に、Ａ３７５−Ｍ細胞でカスパーゼ−３が活性化された。ＴＮＦではなくｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦでの処理の結果、処理の８時間後にＡＡＢ−５２７細胞においてカスパーゼ−３が活性化された（図２６Ｂ）。ＴＵＮＥＬアッセイは、２４時間後に、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦまたはＴＮＦ処理Ａ３７５−Ｍ細胞いずれかにおいてアポトーシス核を示し、他方、陽性アポトーシス核は、ＴＮＦでの処理の後ではなく、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦで処理されたＡＡＢ−５２７細胞で見出されたに過ぎなかった（図２６Ｃ）。
実施例２８
ヒトメラノーマＡ３７５−ＭおよびＡＡＢ−５２７細胞双方はＴＮＦ受容体およびＴＮＦ受容体シグナリング−関連タンパク質を発現する。
【０３６４】
ＴＮＦ  Ｒ１およびＴＮＦ  Ｒ２はウェスタンブロッティングによってＡ３７５−ＭおよびＡＡＢ−５２７で検出された。ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ２およびＲＩＰもまたメラノーマ細胞で検出された。ＴＲＡＦ２のレベルは、Ａ３７５−Ｍ細胞を１６時間後にｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦで処理した場合に減少し、２４時間後にＴＮＦで処理した場合に減少した。ウェスタン結果は、ＴＲＡＤＤおよびＲＩＰが１６時間後にｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦで処理したＡＡＢ−５２７細胞で減少したが、それらの細胞をＴＮＦで処理した場合には有意な変化は観察されなかったことを示した（図２７）。
実施例２９
Ａ３７５−Ｍ細胞でのｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの細胞傷害性に対する中和抗−ＴＮＦＲ１抗体の効果
抗−ＴＮＦＲ１抗体（２５μｇ／ｍｌ，Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて、抗原−陽性のＴＮＦ−感受性Ａ３７５−Ｍ細胞または抗原−陰性のＴＮＦ−感受性ＳＫＢＲ３−ＨＰ細胞いずれかでのＴＮＦ受容体−誘導細胞傷害性を中和した。結果（図２８）は、抗−ＴＮＦＲ１がＳＫＢＲ３−ＨＰ（１００％）またはＡ３７５−Ｍ細胞（１００％）いずれかでＴＮＦ誘導細胞傷害性を中和できることを示した。重要なことには、抗−ＴＮＦＲ１はＳＫＢＲ３−ＨＰ（１００％）でｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの細胞傷害性を中和することができるが、Ａ３７５−ＭではｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの細胞傷害性を中和できなかった。これは、標的細胞で観察されたｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ構築体の細胞傷害性効果は、ＴＮＦＲ１受容体との相互作用を介してのみ起こり得ることを示す。
実施例３０
共焦点顕微鏡によって評価した、抗原−陽性のＡ３７５−Ｍ細胞へのｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの内部化
ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦのＴＮＦ部位は、免疫蛍光顕微鏡によって示されるように、１時間もと短い曝露の間のｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦでの処理の後にＡ３７５−Ｍ細胞へのサイトゾルに効果的に送達された。サイトゾルにおける蛍光シグナル強度は４時間の曝露の後に増大し、しかる後２４時間まで一定なままであった。
実施例３１
マイクロアレイ分析によって評価されたＳＣＦＶＭＥＬ／ＴＮＦおよびＴＮＦの効果
ｃＤＮＡマイクロアレイの分析を使用して、未処理ＴＮＦ−抵抗性ＡＡＢ５２７細胞およびＴＮＦまたはｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦいずれかで２４時間処理されたものの試料の間で異なる発現を呈する遺伝子を同定した。２５００遺伝子のアレイ分析は、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦおよびＴＮＦ処理双方によってダウンレギュレートされた６７の遺伝子、およびアップレギュレートされた６３の遺伝子があることを示した。加えて、１５５の遺伝子は、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦによってユニークにダウンレギュレートされ、１３２遺伝子はアップレギュレートされた。それらの同定された遺伝子は、主として、細胞−表面受容体−連結シグナリング、細胞内シグナリングカスケード事象、ストレス応答、および細胞内タンパク質のトラフィッキングおよび輸送に関与する。ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ融合タンパク質は、細胞周期および細胞増殖に関与する特異的遺伝子、ならびにヌクレオチド代謝を調節する遺伝子をダウンレギュレートすることが示された（表８）。
【０３６５】
（表８：マイクロアレイ分析後にＡＡＢ−５２７細胞にてＴＮＦではなくｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦによってダウンレギュレートまたはアップレギュレートされた遺伝子）
【０３６６】
【表８】
2008526889.tif 000011
【０３６７】
【表９】
2008526889.tif 000012
実施例３２
ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦによるＴＮＦ抵抗性を克服する重要性
悪性メラノーマは高度に転移性であって、化学療法γ−照射を含めた種々の治療に対して貧弱にしか応答しない癌の主な例である（Ｂｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。本発明者らは、ヒトメラノーマ細胞の８０％に存在するｇｐ２４０抗原の表面ドメインを認識する抗体ｓｃＦｖＭＥＬから構成されるｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦと命名される融合抗体を従前に報告した（Ｍｕｊｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。ＴＮＦの、メラノーマ細胞の細胞表面への抗体−特異的送達の結果、ＴＮＦ単独で比較して増大した細胞傷害性がもたらされた。加えて、本発明者らは、抗体−ＴＮＦ化学コンジュゲートおよび融合構築体がＴＮＦをイン・ビボで腫瘍に送達することができることを示した（Ｔａｍａｎｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。さらに、ＴＮＦの化学コンジュゲートはＴＮＦに対して抵抗性であるメラノーマ細胞に対して高度に細胞傷害性であった（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｔａｍａｎｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。しかしながら、本発明者らは、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦがＴＮＦ単独に対して抵抗性であるヒトメラノーマ細胞に対する細胞傷害性を示し、天然ＴＮＦと比較して感受性細胞に対してより活性であることを確認する。予測されるように、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの細胞傷害性、および抗原−陰性細胞上のＴＮＦのそれの間で差は同定されなかった。
【０３６８】
メカニズム研究を行って、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦがどのようにしてＴＮＦ細胞抵抗性を克服できるかを理解するのに重要なシグナリング事象を同定した。従前の研究（Ａｄａｍｓ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｅｒ，１９９９）は、ＴＮＦ−誘導細胞傷害性における鍵となるシグナリング事象がＮＦ−κＢの活性化、およびアポトーシスの誘導に導くＭＡＰキナーゼ活性化であることを示した。正常な条件下では、ＮＦ−κＢは、ｐ５０、ｐ６５およびＩκＢ−αよりなるヘテロトリマーとしてその不活性な状態で細胞質に存在する。活性化に際し、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、マトリックスメタロプロテアーゼ−９、ｃＩＡＰ２（アポトーシスについての細胞阻害剤）のようないくつかの成長−調節遺伝子は、全て、ＮＦ−κＢ活性化によって調節される（Ｌｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ；Ｍｉｎａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｈａｒｉｍａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｓｃｈｏｅｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。従って、ＮＦ−κＢはホメオスタシスの中枢的なレギュレーター、および癌薬物開発のための潜在的標的であるように見える（Ｌｉｎ，２００３；Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。しかしながら、ＮＦ−κＢの活性化は、それ自体がアポトーシスを引き起こし得る広く種々のストレス刺激によって開始される（Ｍａｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。本発明者らは、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦおよびＴＮＦ双方は、３０分以内に、ＴＮＦ−感受性およびＴＮＦ−抵抗性ヒトメラノーマ細胞双方でのＩκＢ−αの分解を誘導したことを示した。さらに、ＴＲＡＦ２またはＲＩＰのようなＮＦ−κＢ活性化についてのアダプタータンパク質は、各々、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦまたはＴＮＦでの１６時間の処理後におけるＡ３７５−Ｍ細胞にて、あるいはｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦで１６時間後に処理したＡＡＢ−５２７細胞で共に減少した。これは、初期および一過性ＮＦ−κＢ活性化が、抵抗性細胞においてさえＴＮＦによって誘導できることを示唆する。ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦによるＮＦ−κＢの活性化はＴＮＦリガンド−受容体相互作用を介して起こることが判明した。というのは、ＺＭＥ−０１８とｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦとの共投与は、ＩκＢ−αの活性化を妨げることはできなかったからである。研究は、ＮＦ−κＢ転写因子が、細胞のタイプに依存して細胞生存を促進し、およびアポトーシスを誘導することができ、およびＮＫ−κＢ活性化およびアポトーシスは直接的に関連しており、しかしながら、ＮＦ−κＢの構成的活性化はアポトーシスに対する抵抗性を引き起こすことができることを示唆した（Ｈｅｈｌｇａｎｓ  ａｎｄ  Ｍａｎｎｅｌ，２００２）。従って、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦによって誘導されたアポトーシスを、カスパーゼ−３およびＰＡＲＰ切断に関してヒトメラノーマ細胞での天然ＴＮＦと比較した。ＰＡＲＰはカスパーゼ３の基質であり（ＣＰＰ−３２）、ＰＡＲＰの特異的切断は細胞アポトーシスのホールマークである（Ｌｉｐｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ構築体は、ＴＮＦ−感受性およびＴＮＦ−抵抗性ヒトメラノーマ細胞双方においてＰＡＲＰ切断およびアポトーシス（ＴＵＮＥＬ）を誘導した。しかしながら、天然ＴＮＡはＴＮＦ−��受性メラノーマ細胞においてのみＰＡＲＰ切断を誘導したが、ＴＮＡ−抵抗性メラノーマ細胞では誘導しなかった。これは、融合構築体が、部分的には、アポトーシス経路に関連するシグナリングを通じてＴＮＦ抵抗性を克服できることを示す。
【０３６９】
ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ融合タンパク質の細胞傷害性のメカニズムは、ｐ３８ＭＡＰキナーゼおよびＳＡＰＫ／ＪＮＫ生存経路の活性化を調べることによってさらに特徴付けた。ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦおよびＴＮＦはｐ３８  ＭＡＰキナーゼ経路を活性化したが、ＴＮＦは細胞質ＭＫＫ４のリン酸化を早く（５分以内に）迅速に誘導し、その結果、ＳＡＰＫ／ＪＮＫの活性化／リン酸化がもたらされた。さらに、予測されるように、ＳＡＰＫ／ＪＮＫのＴＮＦ−誘導リン酸化は、ＴＮＦ−感受性細胞におけるよりもＴＮＦ−抵抗性メラノーマ細胞においてより高かった。他方、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ構築体での処理の結果、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ経路の低下した活性化がもたらされ、これは、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ生存経路の活性化が、ＴＮＦ曝露で細胞生存性を増大させることによって、ＴＮＦ細胞傷害性に対する観察された細胞抵抗性に寄与することを示唆する。これらの研究は、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ融合構築体の細胞傷害性が、主として、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ生存シグナリングに対するその効果においてＴＮＦのそれとは異なることを示す。
【０３７０】
反対経路の活性化はＴＮＦ文献で良く知られている（Ｌｉｎ，２００３）。いくつかの細胞系において、ＴＮＦへの曝露の結果、ＳＡＰＫ／ＪＮＫカスケードの活性化、およびプログラムされた細胞死滅の開始がもたらされる。Ｍａｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．による研究（Ｍａｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）は、ＪＡＫ／ＳＡＰＫ経路のアップレギュレーションが細胞型および状況によって大いに決定される種々の効果に関連するが、ＳＡＰＫがヒトメラノーマ細胞系におけるＴＮＦ−誘導シグナリングに有意に影響できることを示唆する。本発明の具体的な例において、アポトーシスをもたらすＳＡＰＫ／ＪＮＫ活性の低下は、融合構築体がＴＮＦ−感受性細胞に対する改良された細胞傷害性、ならびにＴＮＦ−抵抗性細胞に対する活性を示す重要なメカニズムである。
【０３７１】
本発明の具体的な例において、ＴＮＦおよび本明細書中に記載された例示的な融合構築体の間のシグナリング事象のそのような区別される差は、該構築体が、ＴＮＦのそれとは幾分異なる様式でＴＮＦＲ−１表面受容体と相互作用できることである。本発明者らは、抗−ＴＮＦＲ−１抗体が、抗原陰性または抗原陽性細胞いずれかに対するＴＮＦ誘導細胞傷害性を効果的に中和することができることを示した。この中和抗体は、抗原陰性細胞に対するｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの細胞傷害性を中和したが、それは抗原陽性細胞に対する細胞傷害性を中和することはできなかった。あるいは、このデータは、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの細胞傷害性の効果が、細胞表面ＴＮＦ受容体との相互作用を通じて完全には起こらないであろうことを示唆し得る。ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの内部化実験は、融合構築体のＴＮＦ部位が、１時間の曝露の後にヒトメラノーマ細胞のサイトゾルに送達されたことを示した。天然ＴＮＦと比較してｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦによって誘導された、細胞傷害性、細胞内シグナリング、および遺伝子のユニークなプロフィールに対する異なる効果を仮定すれば、これらの異なる効果についての１つの可能な説明は、細胞内区画に送達されたＴＮＦが細胞内ＴＮＦＲ１または他の細胞内タンパク質と相互作用して、ユニークなシグナルを変換できるであろうということである。この具体例は、（Ａ−３７５およびＡＡＢ５２７メラノーマ細胞を含めた）多くの細胞が高い細胞内プールレベルのＴＮＦＲ１を呈し（Ｈｅｈｌｇａｎｓ  ａｎｄ  Ｍａｎｎｅｌ，２００２）、およびマイクロアレイ分析が、ＴＮＦと比較してｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ融合構築体によって調節されたユニークな遺伝子を同定したという観察によって裏付けられる。
【０３７２】
かくして、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ融合タンパク質は、天然ＴＮＦ単独と比較してイン・ビトロでメラノーマ細胞に対してより細胞傷害性であり、ＴＮＦに対して抵抗性である細胞に対して細胞傷害性である。該融合構築体は、同時にアポトーシス事象を誘導し、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ生存経路をダウンレギュレートした。これは、生存およびアポトーシス事象双方を誘導したＴＮＦそれ自体の作用から区別される。細胞へのＴＮＦの抗体−媒介送達は、マイクロアレイ分析によって評価して、ＴＮＦ単独と比較して多数の異なる細胞内経路を活性化し、本発明の具体的な例においては、この差は、ＴＮＦのそれとは異なった様式でＴＮＦ受容体との相互作用に少なくとも部分的にはよるものである。
実施例３３
実施例３４ないし３６についての例示的な材料および方法
細胞系
Ａ３７５−Ｍ（ヒトメラノーマ、ｇｐ２４０抗原陽性、ＴＮＦ−感受性）、ＡＡＢ−５２７（ヒトメラノーマ、ｇｐ２４０抗原陽性、ＴＮＦ−抵抗性）、ＳＫＢＲ３−ＨＰ（ヒト乳癌、ｇｐ２４０陰性、ＴＮＦ−感受性）、Ｈ４（ヒト神経膠腫、ｇｐ２４０陰性、ＴＮＦ−抵抗性）は、抗生物質（０．０５ｍｇ／ｍｌ）を含有し、特に、ＡＡＢ−５２７およびＡ３７５−Ｍについてはグルタミン（２００ｍＭ）およびピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭ）、および特にＡ３７５−Ｍ細胞については非必須アミノ酸（１０ｍＭ）およびＭＥＭビタミンを加えた、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコのＭＥＭ（ＤＭＥＭ）を用いて培養で維持した。これらの培養基および補充物はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。
トランスフェクションおよび安定なＡ３７５ＧＦＰ細胞系
プラスミドｐｃＤＮＡ３−ＥＧＦＰは、ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰからの増強された緑色傾向タンパク質（ＥＧＦＰ）コーディング配列を含有するＨｉｎｄ  ＩＩＩ／ＸｈｏＩ断片を、ｐｃＤＮＡ３．１の同一部位に挿入することによって作成した。６０ないし７０％密集が達成されるまで、細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地の１ｍｌ／ウェルにて６−ウェルプレートで２４時間培養した。リポソームＤＮＡ（リポフェクタミン−ｐｃＤＮＡ３−ＧＦＰ複合体）または非リポソームＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ３）を２μｇのＤＮＡ／１０６細胞の比率で培養プレートに直接的に加えた。安定にＥＧＦＰを発現するＡ３７５細胞を生産するために、Ｇ４１８（４００μｇ／ｍｌ）選択をトランスフェクションから２４時間後に開始した。Ｇ４１８での選択から１０日後に、蛍光顕微鏡によって生存する細胞を調べた。蛍光コロニーを拾い、拡大培養した。蛍光／可視光線顕微鏡設定を用いてＧＦＰの細胞発現を評価して、蛍光を発する合計細胞のパーセンテージを直接的に評価した。
ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ、ｓｃＦｖＭＥＬ、および組換えヒトＴＮＦの生産
ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ融合遺伝子は、ＰＣＲ−ベースの構築方法を用いて構築した。融合遺伝子を最終的に細菌発現ベクターｐＥＴ３２ａ（＋）にクローン化し、可溶性融合タンパク質を発現させ、従前に記載されているように精製した（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０３７３】
プラスミドｐＥＴ３２ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦからのヒト組換えＴＮＦ遺伝子をｐＥＴ３２ａ（＋）ベクターにサブクローンし、タンパク質をＥ．ｃｏｌｉ  Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＭＩ）で発現させた。ＴＮＦの発現および精製は、融合タンパク質ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦのそれと同一であった。ＴＮＦの生物学的活性は標準アッセイを用いることによって測定し、これは、従前に記載されているようにＬ−９２９マウス線維芽細胞における細胞傷害性に依存する（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）からのｒＨｕＴＮＦαを標準として用いた。最終の精製されたｈｕＴＮＦの生物学的活性は２×１０７Ｕ／ｍｇタンパク質であった。
【０３７４】
ｓｃＦｖＭＥＬ遺伝子はプラスミドｐＥＴ３２ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦからのＰＣＲによって増幅し、遺伝子はｐＥＴ２１ｂベクターおよび形成されたプラスミドｐＥＴ２１ｓｃＦｖＭＥＬにクローン化した。タンパク質ｓｃＦｖＭＥＬをＥ．ｃｏｌｉ  ＡＤ４９４（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳで発現させた。Ｓｔｅｉｎｌｅ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．（Ｓｔｅｉｎｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）による処方に基づいて封入体から再度折り畳むことによって得られた生物学的に機能的なｓｃＦｖＭＥＬタンパク質。最終の精製されたｓｃＦｖＭＥＬタンパク質は、ＥＬＩＳＡによって検出された特異的結合活性を有する。
ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦおよびＴＮＦのイン・ビトロ細胞傷害性
ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦおよびＴＮＦの細胞傷害性を調べるために、細胞をウェル当たり３０００細胞の密度にて９６−ウェルプレートに平板培養し、５％ＣＯ２中で３７℃にて２４時間接着させた。２４時間後、異なる濃度のｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦまたはＴＮＦいずれかを含有する培地で該培地を置き換えた。培養中の腫瘍細胞の成長に対するｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦおよびＴＮＦの効果は、従前に記載されているようにクリスタルバイオレット染色によって測定した（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ｌ．，１９９１）。細胞プレートは６３０ｎｍで読んだ（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，Ｖｔ）。吸光度を対照ウェル（培地のみ）と比較した。
Ｐ−ヨードベンゾエートを用いるタンパク質の標識
従前に記載されているＰ−ヨードベンゾエート方法によって、タンパク質を１２５Ｉ（Ｄｕｐｏｎｔ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）で標識した（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。
動物モデル実験
ファルマコキネティック研究
４ないし６週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスにマウス当たり２μＣｉの、２００μｌのノーマルセーライン中の５μｇ合計タンパク質を注射した。注射から１、２、４、８，２４、４８、７２時間後に、各アッセイ時間において２匹のマウスの頸部脱臼によって犠牲にした。血液試料を胸腔から取り出し、重量を測定し、カウントして、ガンマカウンターで合計放射能を測定した（Ｐａｃｋａｒｄ，モデル５３６０）。血液試料は、また、遠心し、血漿をデカントし、カウントして放射能を測定した。放射能の血漿測定からの結果は、最小二乗非直線回帰（ＭｉｃｒｏＭａｔｈ，Ｉｎｃ．からのＰＫ解析）プログラムによって解析した。
イン・ビボ毒性実験
雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの５つの群（４ないし６週齢、群当たり５匹のマウス）を、生理食塩水（ビヒクル対照，群１）で５日間毎日１回、または４つの異なる用量の薬物（群２ないし５）で注射した（静脈内、尾静脈）。各群において送達された合計用量は１、２、３、および４ｍｇ／ｋｇであり、これは、確立された最大許容用量（ＭＴＤ）２５、５０、７５および１００％に対応した。最後の注射（１２日）から７日後に、実験動物を二酸化炭素で犠牲にし、完全血液カウント（ＣＢＣ）を含めた血液学的パラメータ、合計ビリルビン、リン、ＡＳＴ（ＳＧＯＴ）、ＡＬＴ（ＳＧＰＴ）合計タンパク質、アルブミン、グロブリン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、塩化物、Ａｌｋホスファターゼ、クレアチニン、ＢＵＭを含めた臨床化学分析のために最後に血液を採取し、心臓、肺、脾臓、腎臓、および肝臓等を含めた完全な剖検に付し、中性−緩衝化１０％ホルマリン溶液中への浸漬によって固定した。組織をパラフィンブロック中に包埋し、それから、２−ないし４−μｍセクションを切り出し、Ｈ＆Ｅで染色し、これは、Ｔｅｘａｓ  Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  ＣｅｎｔｅｒのＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって行った。
イン・ビボ効率実験
４ないし６週齢のＢＡＢＬ／ｃヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスに、右脇腹に、３×１０６Ａ３７５ＧＦＰ対数期メラノーマ細胞を皮下注射した。療法の開始に先立って腫瘍を２週間樹立し、マウスを４つの群に分けた。各群は、３０−ないし５０−ｍｍ３の樹立した腫瘍を持つ５匹のマウスを有した。マウスに生理食塩水、ｓｃＦｖＭＥＬ（２．５ｍｇ／ｋｇ）、ｓｃＦｖＭＥＬ（０．２ｍｇ／ｋｇ）＋ＴＮＦ（０．２ｍｇ／ｋｇ）またはｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ（２．５ｍｇ／ｋｇ）で５日間毎日注射した（静脈内、尾静脈）。群の他の組は、１００−ないし２００−ｍｍ３の良く樹立された腫瘍を持つ５匹のマウスを有した。マウスに、同一用量のｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦを５日間毎日注射した（静脈内、尾静脈）。療法の最後において、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  ２００  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍによって毎週、キャリパーによって２ないし３日毎に腫瘍をモニターした。
実施例３４
イン・ビトロでのＳＣＦＶＭＥＬ／ＴＮＦの細胞傷害性
ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの細胞傷害性を、各々、対数期抗原−陽性のＴＮＦ−感受性ヒトメラノーマＡ３７５−Ｍ細胞および抗原−陽性ＴＮＦ−抵抗性ヒトメラノーマＡＡＢ−５２７細胞に対して評価した。また、我々は、これらの効果を、抗原−陰性のＴＮＦ−感受性ヒト乳癌ＳＫＢＲ３−ＨＰおよび抗原−陰性のＴＮＦ−抵抗性ヒト神経膠腫Ｈ４細胞と比較した。結果は、抗下−陽性Ａ３７５−Ｍ細胞に対して、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ（Ｉ．Ｃ．５０  ０．１ｎＭ）が天然ＴＮＦ（Ｉ．Ｃ．５０  １．４ｎＭ）よりもほぼ１０倍より活性であるように見えた（ｐ＜０．０００１）。ＴＮＦ−感受性の抗原−陰性ＳＫＢＲ３−ＨＰ細胞に対して、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ（Ｉ．Ｃ．５０  ２．５ｎＭ）の細胞傷害性は、表皮ＴＮＦ（Ｉ．Ｃ．５０  ２．７ｎＭ）のそれと同様な用量−応答曲線を示した（ｐ＞０．０５）。抗原−陰性のＴＮＦ−抵抗性Ｈ４細胞に対して、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦは１０００ｎＭまでの用量において細胞傷害性効果を示さなかった。しかしながら、抗原−陽性のＴＮＦ−抵抗性ヒトメラノーマＡＡＢ−５２７細胞に対して、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦは有意な用量−関連細胞傷害性効果を示した（Ｉ．Ｃ．５０  ２０ｎＭ）。対照的に、これらのＡＡＢ−５２７細胞は５０００ｎＭまでの濃度においてＴＮＦの細胞傷害性効果に対して抵抗性であった（表９）。
【０３７５】
（表９  種々のヒト細胞系に対するｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ  ｖｓ  ＴＮＦの細胞傷害性＊）
【０３７６】
【表１０】
2008526889.tif 000013
＊７２時間処理
＊＊標的化指標  ＝ＴＮＦのＩ．Ｃ．５０／ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦのＩ．Ｃ．５０
＊＊＊示した濃度において細胞傷害性効果無し
実施例３５
ＳＣＦＶＭＥＬ／ＴＮＦのイン・ビボファルマコキネティックス
実施例３４に記載したように、従前に記載されたｐ−ヨードベンゾエートを用いてｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦを放射性標識した。図面は、各時点におけるデータの平均±ＳＥＭを示す。曲線はこれらの点を通る最小二乗、ベスト−フィット線を表す。データは、三相曲線が、各々、α−、β−、およびγ−相について０．３８時間、３．９時間、１７．６時間の計算された半減期とフィットすることを示した（図２９）。しかしながら、放射性標識ＴＮＦ、化学コンジュゲートＺＭＥ−ＴＮＦならびに無傷抗体ＺＭＥの血漿クリアランスは二相性であり、開いた２−区画数学モデルに密接にフィットした（γ２＞０．９４）。比較として、表１０に示すように、全長抗体ＺＭＥ−０１８および化学コンジュゲートＺＭＥ−ＴＮＦについての半減期が、各々、このモデルにおいて同様であり、各々、１．３９時間および１．２時間のβ−相半減期であった。
【０３７７】
（表１０  １２５Ｉ−ＺＭＥ、ＺＭＥ−ＴＮＦ、ＴＮＦ、およびｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦのファルマコキネティックパラメータ）
【０３７８】
【表１１】
2008526889.tif 000014
Ｖｄ：分布の容量
Ｃ×ｔ：濃度曲線下面積
Ｃｌｐ：血漿クリアランス速度
加えて、β−相の半減期は、各々、４１．３時間および３１．６時間においてやはり同様であった。対照的に、このモデルにおける遊離ＴＮＦのクリアランスは相対的に速く、各々、２７．１分および２．７時間のα−およびβ−相の半減期であった。ＺＭＥ−０１８単独についての分布（Ｖｄ）の直後に明らかな容量は血液容量（１．９ｍｌ）に近似され、他方、ＴＮＦ単独は幾分より大きなＶｄ（３．９ｍｌ）を有し、他方、ＺＭＥ−ＴＮＦ化学コンジュゲートはＺＭＥ−０１８またはＴＮＦいずれかよりも高いＶｄ（１１．６ｍｌ）を呈し、これは、血管系の外側にあるより大きな分布を示唆する。融合構築体ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦは、とりわけ、最高のＶｄ（１９．５ｍｌ）を示し、これは、その成分剤の全てにおける最も広範な過剰な血管配置を示唆する。ＴＮＦについての濃度曲線（ｃ×ｔ）下の面積は、その比較的短い血漿半減期のためＺＭＥ−０１８単独のそれよりも実質的に低かった（１３９．６μＣｉｍｌ−１分と比較して３．５）。融合構築体ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦについてのｃ×ｔは、血管系外部のその比較的大きな分布のため、ＴＮＦおよび化学コンジュゲートＺＭＥ−ＴＮＦ双方のそれよりも実質的に大きく、およびＺＭＥ−０１８のそれよりも低かった。
実施例３６
ＢＡＬＢ／ＣマウスにおけるＳＣＦＶＭＥＬ／ＴＮＦの毒性研究
死亡率、肉眼病理学および器官重量：
この実験では死滅は起こらなかった。用量−関連肉眼病理学の知見は観察されなかった。少数の肉眼病巣が観察され、これは偶然であり、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの投与とは関係ないと考えられた。ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦは、１、２、３および４ｍｇ／ｋｇの用量において（体重に対する）相対的脾臓重量の用量−関連増加を引き起こす（図３０）。該増加の大きさは３ｍｇ／ｋｇにおいてプラトーとなる。脾臓重量の増加は、赤色脾髄における増大した髄外造血、および白色脾髄における小胞過形成と相関する。
臨床的病理学：
血液学パラメータ（表１１）および臨床的化学パラメータ（表１２）においてテスト物質−関連変化は認められなかった。
【０３７９】
（表１１  血液学パラメータについての群平均）
【０３８０】
【表１２】
2008526889.tif 000015
（表１２  臨床的化学パラメータについての群平均）
【０３８１】
【表１３】
2008526889.tif 000016
対照群平均と比較した場合、２、３および４ｍｇ／ｋｇの群における平均ＡＳＴおよびＡＬＰレベルの非常に僅かな増加があるが、依然として、子の実験室についての参照範囲内にある。これらの処理した群における平均でのこれらの最小上昇は、各群における単一動物のためであった。これらの動物においてのいずれにおいても組織病理学的相関は観察されず、これは、これらの３つの動物における上昇が見せかけのものであり得ることを示唆する。
組織病理学：
ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ全身投与の結果、Ｂａｌｂ／ｃ雌マウスの肝臓、肺および脾臓における見掛けの用量依存性病巣をもたらす（表１３）。
【０３８２】
（表１３  発生率のまとめ：ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ−関連病巣＊および病巣平均ブレード＊＊）
【０３８３】
【表１４】
2008526889.tif 000017
＊器官形態学診断
＊＊群における病巣の発生率
グレード１＝中程度、稀５ないし１０％
グレード２＝温和、頻繁でない１０ないし２０％
グレード３＝中低度、頻繁２０ないし５０％
グレード４＝重症、広範囲＞５０％
＊＊＊＃Ｐ／Ｔ、陽性マウス／合計マウスの数
これらの病巣の発生率および重症度は用量−依存性であるように見え、２、３および４ｍｇ／ｋｇ  ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ以上の用量における肝臓および脾臓の増大した髄外造血、４ｍｇ／ｋｇ  ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ以上の用量における肺フィブリン血栓、および１、２、３および４ｍｇ／ｋｇ  ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ以上の用量における脾臓白色脾質の小胞過形成を含む。ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ−関連効果の最も感受性のインジケーターは脾臓の小胞リンパ系過形成である。この実験の条件下でのｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦについての観察されない有害効果レベル（ＮＯＡＥＬ）は３ｍｇ／ｋｇである。
ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦのイン・ビボ抗腫瘍効果
樹立された（３０ないし５０ｍｍ３）Ａ３７５ＧＦＰ異種移植片を担うマウスの群を生理食塩水、ｓｃＦｖＭＥＬ（２．５ｍｇ／ｋｇ）、ｓｃＦｖＭＥＬ（０．２ｍｇ／ｋｇ）＋ＴＮＦ（０．２ｍｇ／ｋｇ）またはｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ（２．５ｍｇ／ｋｇ）で５日間毎日（１ないし５日）処理した（静脈内、尾静脈）。マウスを観察し、それらの腫瘍をＸｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ２００イメージングシステム（図３１）によってイメージし、２または３日毎にキャリパー（図３２）によって測定した。初期段階（５０ｍｍ３）での２．５ｍｇ／ｋｇ用量におけるｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの処理は、優れた抗腫瘍活性を示し、キャリパー測定によってモニターすると、２１日における５匹のうち３匹の腫瘍−なし、および完全な腫瘍退行、４３日における５匹のうち５匹の腫瘍−なしを示した。他方、生理食塩水、ｓｃＦｖＭＥＬ単独、またはｓｃＦｖＭＥＬ＋ヒト組換えＴＮＦいずれかで処理した全てのマウスは迅速な腫瘍成長を有した。より遅い段階（１５０ｍｍ３）において処理したマウスもまた、腫瘍退行を示した（４４日に３／５腫瘍なし）。腫瘍なしとされたマウスからの腫瘍の引き続いての外植はなかった。これらのデータは、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦがイン・ビボでメラノーマ細胞を標的化でき、顕著な抗−メラノーマ効果をもたらすことができることを示す。
実施例３７
ＳＣＦＶＭＥＬ／ＴＮＦの効果の有意性
悪性メラノーマは、高度に転移性であって、化学療法およびγ−照射を含めた種々の治療に対して貧弱に応答する癌の主な例である（Ｈｅｌｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。メラノーマを標的とする新規な治療戦略が現在いくつかの研究所で開発中である（Ｌｅｏｎｇ，２００３）。発明者らは、従前に、ヒトメラノーマ細胞の８０％で存在するｇｐ２４０抗原の表面ドメインを認識する抗体ｓｃＦｖＭＥＬから構成されるｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦと命名される融合構築体を従前に報告した（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ＴＮＦの、メラノーマ細胞を細胞表面への抗体−特異的送達の結果、ＴＮＦ単独と比較して細胞傷害性が増加した。加えて、抗体−ＴＮＦ化学コンジュゲートおよび融合構築体はイン・ビボにてＴＮＦを腫瘍に送達することができたことが示された（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。この実験において、我々は、融合構築体ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦがイン・ビボ投与後に優れた抗腫瘍活性を有することを示した。加えて、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ融合構築体について見積もられたＭＴＤ（４ｍｇ／ｋｇ）はＴＮＦそれ自体について報告されたＭＴＤ（０．３ｍｇ／ｋｇ）（Ｋｕｒｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）よりもほとんど１０倍高いことが判明し、これは、標的化構築体が活性なＴＮＦサイトカインを腫瘍細胞へ向け、毒性を引き起こす組織部位から離れさせることができることを示唆する。
【０３８４】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は腫瘍細胞に対する直接的細胞傷害性を保有するのみならず、腫瘍血管破壊を誘導することが知られている（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。しかしながら、ＴＮＦタンパク質の全身投与は、有意な抗腫瘍効果を示すことなく有意な宿主毒性をもたらすことが示されている（Ｍｏｒｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｂｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。種々の戦略が、この剤の抗−腫瘍特性を利用し、同時に、抗体−媒介送達（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｓｃｈｅｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）または腫瘍細胞へのＴＮＦ遺伝子の導入（Ｋｏｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）を含めた全身副作用を低下させるために提唱されている。
【０３８５】
標的化治療剤のための治療的ペイロードとしてのＴＮＦは、我々のグループおよび他のグループによる広範な前−臨床評価を受けた（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｒｏｓｅｎｄｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｃｕｒｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。より最近では、新規な免疫サイトカインｓｃＦＶ２３／ＴＮＦ標的化Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ過剰発現悪性疾患が、ＴＮＦ−誘導アポトーシスに対してＴＮＦ−抵抗性Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ過剰発現乳癌細胞を感受性としたことが示されている（Ｌｙｕ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ，２００５）。これらのデータは、腫瘍細胞に標的化されたＴＮＦが、ＴＮＦそれ自体のそれと比較して、融合構築体によって発揮される細胞効果において基本的な差を有するであろうことを示す。
【０３８６】
サイトカインの標的化送達のための抗体は、イン・ビボ投与後の腫瘍組織に対する増強された局所化を供するのみならず、それらは治療剤の血漿半減期を増大させる能力を有する（Ｍｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。この研究で示すように、ＴＮＦは、モノクローナル抗体のそれと比較して比較的短い血清半減期を有する（半減期、典型的には２０ないし４０時間）。ＴＮＦに化学的にカップリングした全長ＩｇＧ抗体ＺＭＥ−０１８よりなる化学コンジュゲートＺＭＥ−ＴＮＦは、かなり長い血清半減期を呈し、それにより、生物学的に活性なＴＮＦの循環時間を増大させた。
【０３８７】
メラノーマのような固体腫瘍の効果的な臨床的管理は一般には長期間の治療養生法を必要とするので、この分子の免疫原性は関心事である。全長抗体を含有する抗体−サイトカインの免疫原性は、少なくとも部分的には、抗体それ自体の大きなサイズ、および構築体の長い循環時間によるものである。融合構築体ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの血清半減期は、化学コンジュゲートのそれよりもかなり短く、これは、単一−鎖免疫サイトカインが、比較により、その小さなサイズ、および循環からの相対的に迅速なクリアランスキネティックスにより有意に免疫原性が低いはずであることを示唆する。これらの特性に加えて、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦは、最高のＶｄ（１９．５ｍｌ）、およびＴＮＦおよび化学コンジュゲートＺＭＥ−ＴＮＦ双方のそれよりも実質的に大きなｃ×ｔ（９６μＣｉ／ｍｌ×分）を示し、これは、血管系外部のその相対的により大きな分布を示唆する。ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ構築体の組織分布研究（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）は、構築体の腫瘍局所化が効率的に起こり、７２時間までに、融合構築体の濃度は遊離ＴＮＦのそれと比較して腫瘍組織において最高となることを示した。構築体の腫瘍−標的化能力は、ＴＮＦのそれと比較して、構築体の分布の見掛けの容量（Ｖｄ）の増加を説明することができる。加えて、より大きなＺＭＥ−ＴＮＦコンジュゲートと比較したｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ構築体のより小さなサイズは、その比較的容易な血管外配置を担うことができる。この構築体で観察された短い半減期は、２４または４８時間の投与間隔が、腫瘍組織における剤の最適濃度を達成するのに最適なように見えることを示唆する。
【０３８８】
ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの結局の臨床的開発にとって臨界的に重要なものの打ち、良く特徴付けられたヒトメラノーマ異種移植片モデルにおける最大許容用量（ＭＴＤ）毒性プロフィールの調査、およびこの融合構築体の効率実験である。融合構築体ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦのＭＴＤは５連続日の間毎日の体重１ｋｇ辺り０．８ｍｇであり、それは、４ｍｇ／ｋｇ合計用量のＭＴＤに対応した。融合構築体でイン・ビボで観察された臨床的抗腫瘍効果は、ＭＴＤ用量のほぼ６０％である２．５ｍｇ／ｋｇの用量で得られ、これは、我々の毒性学実験から決定されたＮＯＡＥＬ用量（３ｍｇ／ｋｇ）未満であったことに注意するのは重要である。
【０３８９】
結果は、有意な有害効果または器官毒性は，ＭＴＤ（４ｍｇ／ｋｇ）の１００％までの用量におけるｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの静脈内注射に関連したことを示す。ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ構築体は、ＭＴＤの７５％（３．０ｍｇ／ｋｇ）までの用量でのこのスケジュールで安全に投与することができた。用量−関連髄外造血が肝臓および脾臓で認められ、および小胞細胞（リンパ系）過形成は脾臓で認められたが、これらの病巣のいずれも有害効果と考えられなかった。加えて、これらの効果の多くは生理食塩水−処理対照で認められた。加えて、血液学パラメータの有意な変化はなく、あるいはＭＴＤの１００％で処理した場合においてでさえ、マウスにおいて臨床化学パラメータ変化があった。肺組織における単一の再カニューレ化血栓が、ＭＴＤ用量レベルにおいて５匹のマウスのうち３匹で観察された。これらの血栓は１つの血管においてのみ起こり、肺機能を危うくしなかったが、それらは生物学的に有害であると考えられ、この理由で，３ｍｇ／ｋｇ（７５％ＭＴＤ）用量レベルにおいて観察された有害効果（ＮＯＡＥＬ）は評価されなかった。
【０３９０】
マウスにおけるｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦのＭＴＤは，ｒｈｕＴＮＦ単独のそれよりも有意に高いことが判明した（０．３ｍｇ／ｋｇ）（Ｋｕｒｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。しかしながら、ｒｈｕＴＮＦはＭＴＤにおいてひどい毒性を誘導した。というのは、静脈内投与されたＴＮＦは正常な組織微小血管系の破壊に導くからである（Ｋｕｒｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｋｕｒｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。現在の研究においては、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦは、園より高い抗腫瘍能力に拘わらずマウスにおいて有意な正常期間負傷を示さなかった。かくして、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦは、ｒｈＴＮＦについてのむしろ非特異的毒性プロフィールと比較して、より選択的な腫瘍に向けての活性を有するように見える。
【０３９１】
かくして、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ構築体のファルマコキネティックスの注意深い評価は、最適投与スケジュールを設計するための理論的根拠を提供した。このスケジュールの治療効率の評価は、かなり進んだ小さな樹立された病巣および腫瘍双方に対するメラノーマ異種移植片に対する印象的な長期の抗腫瘍効果を示す。組織病理学、臨床化学、および臨床化学パラメータに対する効果と組み合わせたこれらの効率実験は、ｇｐ２４０陽性腫瘍を持つ患者における相Ｉ試験を設計するための理論的根拠を提供する。
実施例３７
実施例３８ないし４２についての例示的材料および方法
細胞培養
ヒトメラノーマ細胞はＭ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸのＤｒ．Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒから入手した。ＴＸＭ−１、ＴＸＭ−１３、ＴＸＭ−１８Ｌ細胞は最小必須培地（ＭＥＭ）中で培養し、Ａ３７５−Ｍは、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含有し、ピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭ）、非必須アミノ酸（１０ｍＭ）、グルタミン（２００んＭ）およびＭＥＭビタミンを加えたダルベッコのＭＥＭ中で培養した。ＭＥＬ−５２６は、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０中で培養した。全ての培養は７×１０６細胞／Ｔ−７５フラスコの密度でルーチン的に成長させ、１週間当たり２回継体培養し、ルーチン的にテストし、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅアッセイキットを用いてＭｙｃｏｐｌａｓｍａ汚染がないことが判明した。
ＥＬＩＳＡ
接着性メラノーマ細胞（ウェル当たり５×１０４細胞）を含有する９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する溶液の添加によって１時間ブロックした。ｇｐ２４０抗原の検出のために、細胞をモノクローナル抗体ＺＭＥ−０１８  ＩｇＧ２ａと共にインキュベートし、続いて、ヤギ抗−マウス／ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート（ＨＲＰ−ＧＡＭ）と共にインキュベートした。ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬの結合活性については、細胞を種々の濃度の精製されたＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬと共に室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。それらを洗浄した後、細胞をウサギ抗−ｓｃＦｖＭＥＬ抗体と共にインキュベートし、続いて、ヤギ抗−ウサギ／ＨＲＰコンジュゲート（ＨＥＰ−ＧＡＲ）抗体を加えた。最後に、１μｌ／ｍｌの３０％Ｈ２Ｏ２を含有する基質（２，２’−アジノ−ビス−３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸、ＡＢＴＳ）溶液をウェルに加えた。４０５ｎｍにおける吸光度は３０分後に測定した。
抗原ｇｐ２４０染色およびＦＡＣＳ分析
１×１０６細胞よりなる試料を、まず、モノクローナル抗体ＺＭＥ−０１８  ＩｇＧ２ａで４℃にて２０分間処理し、続いて、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）−コンジュゲーテッドヤギ−抗−マウス抗体（ＢＤ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，ＣＡ）で４℃にてさらに２０分間染色し、双方を、１００μｌのＦＡＣＳ染色緩衝液（２％ＦＣＳ／ＤＰＢＳ）に再懸濁させた。陰性染色対照として、細胞を、ｇｐ２４０に対する抗体と同一濃度の無関係な特異性のイソタイプ−合致対照抗体（マウスＩｇＧ２ａ，ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で染色した。染色に続き、細胞をＤＰＢＳで２回洗浄し、次いで、５００μｌの１％パラホルムアルデヒド溶液に最懸濁し、暗所中で氷上で貯蔵した。ＦＡＣＳ分析はＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｅｒサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で直後に行った。ＡＰＳ蛍光はＦＬ−４チャネルで検出した。各細胞系では、１０，０００事象を獲得した。分析はＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  ＰｒｏＴＭソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行った。
メラノーマ細胞に対するイン・ビトロでの細胞障害性アッセイ
メラノーマ細胞単相での標準的な７２時間の細胞増殖アッセイを用い、および従前に記載されているクリスタルバイオレット染色手法を用い、試料（ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬまたはｓｃＦｖＭＥＬ／ｒＧｅｌ）をアッセイした（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。対照のパーセントとは、対照（未処理）細胞のそれと比較した薬物−処理ウェルにおける細胞のパーセンテージをいう。
ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬと化学療法剤との組合せ実験
指数関数的増殖相における細胞を９６−ウェルプレートに平板培養した。２４時間後、細胞を薬物−含有培地で処理した。示されたインキュベーション時間の最後に、クリスタルバイオレット染色によって増殖阻害を評価した。配列決定の効果を測定するために、細胞を異なる２つの配列で処理した。
【０３９２】
配列Ｉ（Ｃ１）：細胞を化学療法剤で６時間予備処理し、次いで、化学療法剤およびＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬを７２時間共投与した。
【０３９３】
配列ＩＩ（Ｃ２）；細胞をＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬで６時間予備処理し、次いで、化学療法剤およびＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬを７２時間強投与した。
【０３９４】
配列ＩＩＩ：配列をＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬで６時間予備処理し、続いて化学療法剤で７２時間処理した。
【０３９５】
配列ＩＶ：細胞を、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ予備処理なくして、種々の化学療法剤で７２時間処理した。
【０３９６】
化学療法剤はドキソルビシン（ＤＯＸ）、ビンクリスチン（ＶＣＲ）、エトポシド（ＶＰ−１６）、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、シタラビン（ＡｒａＣ）および５−ＦＵを含む。
ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬと放射線療法との組合せ実験
細胞をウェル当たり４０００細胞の密度にて三連で蒔いた。異なる用量のγ−照射は、各々、２Ｇｙ、４Ｇｙおよび６Ｇｙの用量率にて１３７Ｃｓ源によって送達した。細胞を単独で、あるいは種々の濃度のＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ融合構築体の添加の後に照射して、一方が他方を感受性とするか否かを判断した。７２時間後、細胞をクリスタルバイオレットによって染色した。
動物モデル実験
Ａ３７５−Ｍ異種移植片モデルの樹立
４ないし６週齢の無胸腺（ｎｕ／ｎｕ）マウスはＨａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．から入手した。動物を特異的−病原体−なし条件下で維持し、６ないし８週齢で用いた。動物に３×１０６対数期Ａ３７５−Ｍメラノーマ細胞を静脈内注射し（右脇腹）、腫瘍を樹立させた。一旦腫瘍が測定可能となれば（〜３０ないし５０ｍｍ３）、動物を生理食塩水（対照）またはＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ融合構築体いずれかで処理した（尾静脈を介して静脈内）。
【０３９７】
全身投与後におけるＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬの局所化
Ａ３７５−Ｍ異種移植片腫瘍を担うマウスにＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬを投与した。２４時間後に、動物を犠牲にし、代表的な組織セクションを取り出し、ホルマリン固定し、Ｈ＆Ｅによって染色し、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬについての免疫組織化学染色を抗−Ｇｒｂまたは抗−ｓｃＦｖＭＥＬ抗体いずれかによって検出した。
【０３９８】
アポトーシスを検出するためのＴＵＮＥＬアッセイ
腫瘍組織セクションは、イン・サイチュ細胞死滅検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いるＴＵＮＥＬによって染色した。簡単に述べれば、パラフィン−包埋組織の予備処理を行って、脱ワックスし、再水和し、次いで、プロテイナーゼＫと共にインキュベートし、続いて、固定および浸透化を行った。組織セクションを、湿潤化チャンバー中で、末端でオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ−媒介ニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）反応混合物と共に３７℃にて６０分間インキュベートし、次いで、スライドをＰＢＳで３回濯いだ。試料をＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＳ１００蛍光顕微鏡下で分析し，スコープ設置Ｎｉｋｏｎデジタルカメラ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で写真を撮った。
【０３９９】
イン・ビボ細胞傷害性実験
一旦腫瘍が測定可能なサイズ（〜３０ないし５０ｍｍ３）まで樹立されれば、動物を生理食塩水（対照）またはＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ融合構築体（３７．５ｍｇ／ｋｇ）いずれかで１日おきに５回処理した（尾静脈を介して静脈内）。動物をモニターし、腫瘍をさらに２８日間測定した。
実施例３８
異なるメラノーマ細胞での抗原ＧＰ２４０発現
（Ａ３７５−Ｍ、ＴＸＭ−１８、ＴＸＭ−１３、ＭＥＬ５２６およびＴＸＭ−１）
メラノーマＡ３７５−Ｍ、ＴＸＭ−１８、ＴＸＭ−１３、ＭＥＬ５２６およびＴＸＭ−１細胞でのｇｐ２４０抗原の発現を調べるために、ｇｐ２４０抗原に特異的に結合する親モノクローナル抗体ＺＭＥ−０１８  ＩｇＧ２ａをＥＬＩＳＡ（図３３）およびフローサイトメトリー（図３４）で用いた。結果は、ｇｐ２４０抗原はＡ３７５−Ｍ、ＴＸＭ−１８Ｌ、ＴＸＭ−１３およびＭＥＬ−５２６細胞で存在したが、ＴＸＭ−１細胞では非常に低いレベルの発現があったことを示した。
実施例３９
ＥＬＩＳＡによるＧＲＢ／ＳＣＦＶＭＥＬのＳＣＦＶＭＥＬ融合タンパク質部位の結合活性
ＥＬＩＳＡを行って、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ融合構築体のメラノーマ細胞への結合活性を測定した。ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬは、抗レベルｇｐ２４０抗原発現メラノーマＡ３７５−Ｍ、ＴＸＭ−１８Ｌ、ＴＸＭ−１３およびＭＥＬ−５２６細胞に結合した。さらに、結合活性はＡ３７５−ＭおよびＭＥＬ−５２６、続いて、ＴＸＭ−１８ＬおよびＴＸＭ−１３においてより強かった。しかしながら、タンパク質は、抗−ｓｃＦｖＭＥＬウサギモノクローナル抗体によって検出して、非常に低いレベルのｇｐ２４０抗原の発現を有するＴＸＭ−１に結合しなかった（図３５Ａおよび３５Ｂ）。
実施例４０
異なるメラノーマ細胞に対するＧＥＢ／ＳＣＦＶＭＥＬのイン・ビトロ細胞傷害性（ＩＣ５０比較）
ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬの細胞傷害性は、培養中の対数期Ａ３７５−Ｍ、ＴＸＭ−１８Ｌ、ＴＸＭ−１３、ＭＥＬ−５２６およびＴＸＭ−１細胞に対して評価した。５０％増殖阻害効果は、各々、Ａ３７５−Ｍ細胞では〜２０ｎＭ、ＭＥＬ−５２６細胞では〜５０ｎＭ、ＴＸＤＭ−１８Ｌでは〜１００ｎＭ、ＴＣＭ−１３では〜２００ｎＭの濃度で見出された。しかしながら、１μＭまでの用量ではＴＸＭ−１細胞で細胞傷害性効果は見出されなかった（図３６）。比較により、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬの細胞傷害性効果は、これらのメラノーマ細胞では、もう１つの融合トキシン、ＭＥＬ  ｓＦｖ／ｒＧｅｌのそれとほぼ同一であった（表１４）。
【０４００】
（表１４：異なるヒトメラノーマ細胞系に対するＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ  ｖｓ  ＭＥＬ  ｓＦｖ／ｒＧｅｌの細胞傷害性（Ｉ．Ｃ．５０，ｎＭ））
【０４０１】
【表１５】
2008526889.tif 000018
これらのデータは、ｇｐ２４０抗原陽性細胞へのＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬの結合活性の程度が融合タンパク質の細胞傷害性と一体化することを示した。
実施例４１
Ａ３７５−Ｍでの慣用的化学療法剤とＧＥＢ／ＳＣＦＶＭＥＬとの組合せ実験
Ａ３７５細胞への７２時間でのＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬおよび化学療法剤（ドキソルビシン、ビンクリスチン硫酸、エトポシド、シスプラチンまたはシタラビン）の共投与は、アドリアマイシン、ビンクリスチンまたはシスプラチンとの相乗抗腫瘍活性、およびエトポシドまたはシタラビンと組み合わせた相加的効果を示した。ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬでの６時間の予備処理、続いての、７２時間のこれらの化学療法剤への共曝露（配列ＩＩ−Ｃ２）は、薬物での予備処理、続いての、融合構築体の共曝露（配列Ｉ−Ｃ１）と比較して有意に増殖を阻害した（図３７）。さらに、種々の化学療法剤の細胞傷害性は、Ａ３７５細胞をＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬで６時間予備処理し、続いて、７２時間化学療法剤で処理した場合（配列ＩＩＩ）、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ予備処理無し（配列ＩＶ）と比較して、有意に増加した（ｐ＜０．０１）（表１５）。
【０４０２】
（表１５：７２時間曝露後におけるＡ３７５−Ｍ細胞に対する化学療法剤の細胞傷害性：６時間のＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬでの予備処理は、化学療法剤の細胞傷害性を有意に増加させることができる。）
【０４０３】
【表１６】
2008526889.tif 000019
配列ＩＩＩ  ｖｓ．  配列ＩＶ
・配列ＩＩＩ：細胞を６時間ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬで予備処理し、続いて、化学療法剤で７２時間処理した。
・配列ＩＶ：ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ予備処理なくして、細胞を種々の化学療法剤で７２時間処理した。
＊＊％細胞傷害性
＊＊＊ｐ＜０．０５統計学的に有意な差
結果は、化学療法剤の効果は、ｇｐ２４０抗原陽性標的化細胞についての６時間でのＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬで予備処理によって感受性とすることができたことを示した。
実施例４２
ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬのイン・ビボ動物実験（Ａ３７５−Ｍ異種移植片モデル）
Ａ３７５−Ｍ異種移植片腫瘍を担うマウスにＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬを投与した。２４時間後に、動物を犠牲にし、代表的な組織セクションを取り出し、ホルマリン固定し、Ｈ＆ＥおよびＴＵＮＥＬによって染色した。腫瘍組織は処理群においてアポトーシス核を呈した。
【０４０４】
抗−ＧｒＢまたは抗−ｓｃＦｖＭＥＬ抗体いずれかによって検出されたＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬについての免疫組織化学染色を行った。ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬの局所化または内部化が腫瘍組織で観察された。
【０４０５】
ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬのイン・ビボ抗−腫瘍効果を調べるために、Ａ３７５−Ｍヒトメラノーマ腫瘍異種移植片で実験を行った。腫瘍を担うマウスをＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬまたは生理食塩水いずれかで１日おきに５回処理した（静脈内、尾静脈）。腫瘍の容量を４２日間測定した。生理食塩水−処理対照腫瘍はこの器官にわたって５０ｍｍ３から１２００ｍｍ３まで増大した。ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ（３７．５ｍｇ／ｋｇ）で処理した腫瘍は５０ｍｍ３から２００ｍｍ３まで増加した（図３８）。
実施例４３
実施例４４ないし５０についての例示的材料および方法
本実施例は、例示的なＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬキメラ分子に関する例示的な坐寺領および方法を供する。
細胞培養
ヒトメラノーマ細胞はＤｒ．Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ（Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から入手した。ＴＸＭ−１、ＴＸＭ−１８Ｌ細胞は最小必須培地（ＭＥＭ）中で培養し、Ａ３７５−Ｍは、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含有し、ピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭ）、非必須アミノ酸（１０ｍＭ）、グルタミン（２００ｎＭ）およびＭＥＭビタミンを加えたダルベッコのＭＥＭ中で培養した。ＭＥＬ−５２６は１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０中で培養した。全ての細胞は７×１０６細胞／Ｔ−７５フラスコの密度にてルーチン的に増殖させ、１週間当たり２回継体培養し、ルーチン的にテストし、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅアッセイキットを用いてＭｙｃｏｐｌａｓｍａ汚染がないことが判明した。
ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬの発現および精製
ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬの構築、発現および精製は従前に記載されている（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。融合タンパク質は−２０℃にて滅菌１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中に保存した。
抗原ｇｐ２４０染色およびＦＡＣ分析
１×１０６細胞よりなる試料をまずＺＭＥ−０１８  ＩｇＧ２ａで４℃にて２０分間処理し、次いで、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）−コンジュゲーテッドヤギ−抗−マウス抗体（ＢＤ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｒｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，ＣＡ）で４℃にてさらに２０分間染色し、双方を１００μｌのＦＡＣ染色緩衝液（２％ＦＣＳ／ＤＰＢＳ）中に再懸濁した。陰性染色対照として、細胞を、ｇｐ２４０に対する抗体と同一濃度の無関係特異性のイソタイプ−合致対照抗体（マウスＩｇＧ２ａ、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で染色した。染色に続き、細胞をＤＰＢＳで２回洗浄し、次いで、５００μｌの１％パラホルムアルデヒド溶液に再懸濁させ、暗所中で氷上で貯蔵した。ＦＡＣ分析を、その直後に、ＦＡＣｓ  Ｃａｌｉｂｅｒサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で行った。ＡＰＣ蛍光をＦＬ−４チャネルで検出した。各細胞系について、１０，０００事象を獲得した。分析はＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  ＰｒｏＴＭソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）で行った。
ＥＬＩＳＡアッセイ
接着性メラノーマ細胞（ウェル当たり５×１０４細胞）を含有する９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを従前に記載されたように用いた（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬの結合活性を検出するために、細胞を、種々の濃度の精製されたＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬと共に室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。それらを洗浄した後、細胞をウサギ抗−ｓｃＦｖＭＥＬ抗体と共にインキュベートし、続いて、ヤギ抗−ウサギ／ＨＲＰコンジュゲート（ＨＲＰ−ＧＡＲ）抗体を加えた。最後に、１μｌ／ｍｌの３０％Ｈ２Ｏ２を含有する基質（２，２’−アジノ−ビス−３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸，ＡＢＴＳ）をウェルに加えた。４０５ｎｍにおける吸光度を３０分後に測定した。
免疫蛍光による内部化分析
細胞をウェル当たり１×１０４細胞の密度にて１６−ウェルチャンバースライド（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）に平板培養した。細胞をＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ（４０ｎＭ）で１時間処理した。細胞表面へのタンパク質結合はグリシン緩衝液（０．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．１Ｍグリシン，ｐＨ２．５）との軽いインキュベーションによって除去し、従前に記載されているように免疫蛍光染色を行った（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。簡単に述べれば、細胞を３．７％ホルムアルデヒド中で固定し、０．２％トリトンＸ−１００中に浸透させた。試料を３％ＢＳＡでブロックし、ヤギ抗−ＧｒＢ  ｍＡｂと共にインキュベートし、次いで、ＦＩＴＣ−カップルド抗−ヤギＩｇＧおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ，２．５μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。スライドに、１μｇ／ｍｌのＰＩを含有するＤＡＢＣＯを設置し、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＳ−１００蛍光顕微鏡下で分析した。スコープ−設置カメラで写真を撮った。
イン・ビトロ細胞障害性アッセイ
ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬまたはＭＥＬ／ｓＦｖ／ｒＧｅｌの細胞傷害性を調べるために、メラノーマ細胞をウェル当たり４×１０３細胞の密度にて９６−ウェルプレート上で平板培養し、５％ＣＯ２中で３７℃にて２４時間接着させた。２４時間後、培地を、種々の濃度の融合タンパク質を含有する培地で置き換えた。培養中の腫瘍細胞の増殖に対する効果をクリスタルバイオレット（２０％メタノール中０．５％）染色によって測定し、従前に記載されているように［１９］ソレンソンの緩衝液（０．１Ｍクエン酸ナトリウム，５０％エタノール中ｐＨ４．２）で可溶化した。対照のパーセントとは、対照（未処理）ウェルのそれと比較した薬物−処理ウェル中の細胞のパーセンテージをいう。
ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬと化学療法剤との組合せ実験
指数関数的増殖相における細胞を９６−ウェルプレートに平板培養した。２４時間後、細胞を薬物−含有培地で処理した。示したインキュベーション時間の最後に、クリスタルバイオレット染色によって増殖阻害を評価した。ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬまたは化学療法剤いずれかのＩ．Ｃ．２５用量を組合せ実験で用いた。配列決定の効果を測定するために、細胞を２つの異なる配列で処理し：配列Ｉ：細胞を化学療法剤で６時間予備処理し、続いて、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬを７２時間で共投与した。配列ＩＩ：細胞をＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬで６時間予備処理し、続いて、化学療法剤を７２時間で共投与した。化学療法剤はドキソルビシン（ＤＯＸ）、ビンクリスチン（ＶＣＲ）、エトポシド（ＶＰ−１６）、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、シタラビン（Ａｒａ  Ｃ）および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を含む。
クローン原性生存アッセイ：
ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬおよび電離放射線の組合せの有効性をクローン原性アッセイによって評価した。メラノーマ細胞をＰＢＳで処理し、あるいはＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ（１０ｎＭ）で１６時間予備処理した。次いで、細胞を種々の用量の電離放射線を照射し、次いで、クローン原性細胞生存アッセイのために処理した。処理に続き、細胞をトリプシン処理し、カウントした。基地の数を三連で再度平板培養し、インキュベーターに戻して、巨視的コロニー発生を行った。コロニーをクリスタルバイオレット溶液で染色し、ほぼ１４日後にカウントした。パーセンテージ平板培養効率および与えられた処理で生き残った分率を、問題の剤で処理した非−照射細胞の生存に基づいて計算した。
腫瘍細胞侵入（マトリゲル）アッセイ：
密集下Ａ３７５ＤＲ細胞をトリプシン処理によって集め、培養基中に再懸濁させ、培養皿の蓋の上に２０μｌ（１００，０００細胞）で蒔いた。次いで、蓋を、２ｍｌの培養基を満たした皿の上に置き、３７℃にて４８時間インキュベートした。マトリゲル溶液（１００μｌ、２．７ｍｇ／ｍｌ）をピペットで２４−ウェル培養皿のウェルのそこに入れ、３７℃にて放置した。細胞凝集物をクッションの上に移し、次いで、１００μｌのマトリゲルを重ねた。マトリゲルへの凝集物を、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ（５０ｎＭ）の存在下または不存在下で４００μｌの培養基で被覆した。次いで、凝集物を光学顕微鏡下で毎日観察し、インキュベーション時間の最後に、凝集物の写真を撮った。凝集物の周りのマトリゲルに侵入した細胞の密度をＡｌｐｈａＥａｓｅ（登録商標）ＦＣソフトウェア（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ，Ｓａｍ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）によって分析し、侵入のパーセントを２つの群の細胞密度に基づいて計算し、１００％侵入としての非−処理対照群の値によって標準化した。
動物モデル実験
（１）Ａ３７５−Ｍ異種移植片モデルおよび療法実験設計
４ないし６週齢の無胸腺（ｎｕ／ｎｕ）マウスはＨａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．から入手した。動物を特異的−病原体−なし条件下で維持し、６ないし８週齢において用いた。動物を３×１０６で対数期Ａ３７５−Ｍメラノーマ細胞で皮下注射し（右脇腹）、腫瘍を樹立させた。一旦腫瘍が測ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ定可能（〜３０ないし５０ｍｍ３）となると、動物を生理食塩水（対照）または融合構築体いずれかで静脈内尾静脈を介して処理した。融合タンパク質ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬを０．２ｍｌの容量で静脈内にて与えた。本明細書中で言及した用量は、５用量についての１日おきに１回投与された合計用量である（ｑｏｄ）。用量は、２０ｇの平均体重のマウスに基づいてｍｇ／ｋｇで報告する。例えば、７５０μｇのＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬを与えた２０ｇのマウスは３７．５ｍｇ／ｋｇの用量を受けるであろう。
（２）全身投与後のＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬの局所化
Ａ３７５−Ｍ異種移植片腫瘍を担うマウスにＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ（３７．５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。２４時間後、動物を犠牲にし、代表的な組織セクションを取り出し、ホルマリン固定し、抗−ＧｒＢまたは抗−ｓｃＦｖＭＥＬ抗体いずれかによって検出されるＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬについての、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）および免疫組織化学染色によって染色した。
（３）アポトーシスを検出するためのＴＵＮＥＬアッセイ
腫瘍組織セクションを、イン・サイチュ細胞死滅検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いるＴＵＮＥＬによって染色した。簡単に述べれば、パラフィン−包埋組織の予備処理を行って、脱ワックスし、再水和し、次いで、プロテイナーゼＫと共にインキュベートし、続いて、固定および浸透化を行った。組織セクションを、湿潤化チャンバー中にてターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ−媒介ニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）反応混合物と共に３７℃にて６０分間インキュベートし、スライドをＰＢＳで３回濯いだ。試料をＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＳ１００蛍光顕微鏡下で分析し、スコープ−設置Ｎｉｋｏｎデジタルカメラ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で写真に撮った。
（４）イン・ビボ細胞傷害性実験
一旦腫瘍を測定可能なサイズ（〜３０ないし５０ｍｍ３）まで樹立すれば、動物を生理食塩水（対照）またはＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ融合構築体いずれかで１日おきに５回処理した（静脈内、尾静脈を介する）（３７．５ｍｇ／ｋｇ）。腫瘍の成長は、２つの垂直な腫瘍直径を２または３日毎にさらに２８日間キャリパー−測定することによってモニターし、腫瘍の容量は式：腫瘍容量＝（幅）２×長さ／２から計算した（Ｏｓｂｏｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）。
統計学的解析
データは対ｔ検定を用いて解析した（Ｐｒｉｓｍ  ３．０）。データは平均±ＳＥとして表す。差はもしｐ＜０．０５であれば有意とみなした。
実施例４４
メラノーマ細胞での抗原ＧＯ２４０発現、ＧＲＢ／ＳＣＦＶＭＥＬのＳＣＦＶＭＥＬ成分の細胞結合活性、およびＧＲＢ／ＳＣＦＶＭＥＬの内部化
メラノーマ細胞系でのｇｐ２４０抗原の発現を調べるために、１×１０６よりなるメラノーマ細胞を、ｇｐ２４０抗原に特異的に結合する親モノクローナル抗体ＺＭＥ−０１８  ＩｇＧ  ２ａで２０分間、およびＡＰＣコンジュゲーテッドヤギ−抗−マウス抗体で４℃にてさらに２０分間染色した。陰性染色対照として、細胞を、ｇｐ２４０に対する抗体と同一濃度の無関係特異性のイソタイプ−合致対照抗体（マウスＩｇＧ２ａ）で染色した。ｇｐ２４０の発現レベルは、メラノーマ細胞系Ａ３７５−Ｍ、ＭＥＬ−５２６、ＴＸＭ−１８およびＴＸＭ−１について実線としてＦＡＣｓアッセイによって評価し、その際、ｇｐ２４０陽性のパーセント（％陽性）は、各々、９８．９、９７．８、４０．９および４．６であった。これらのデータは、ｇｐ２４０抗原がＡ３７５−Ｍ、ＭＥＬ−５２６細胞でかなり高度に発現され、ＴＸＭ−１８細胞で高度に発現されたが、ＴＸＭ−１細胞ではｇｐ２４０抗原は非常に低レベルの発現であったことを示し、これは、実線がイソタイプ対照を表す点線と重なることを示す（図３４）。
【０４０６】
ｇｐ２４０抗原はメラノーマＡ３７５−Ｍ、ＭＥＬ−５２６、ＴＸＭ−１８Ｌ細胞でかなり存在するが、ＴＸＭ−１細胞ではそうではないので、我々は、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ融合構築体が抗原陽性細胞に結合するかをさらに調べた。ＥＬＩＳＡを行って、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ融合構築体のメラノーマ細胞への結合活性を測定した。結果は、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬが、高レベルｇｐ２４０抗原発現メラノーマＡ３７５−Ｍ、ＭＥＬ−５２６、およびＴＸＭ−１８Ｌに結合したことを示した。さらに、結合活性はＡ３７５−ＭおよびＭＥＬ−５２６、続いて、ＴＸＭ−１８Ｌでより強かった。しかしながら、該タンパク質は、抗−ｓｃＦｖＭＲＬウサギモノクローナル抗体によって検出された非常に低いレベルのｇｐ２４０抗原の発現を有するＴＸＭ−１には結合しなかった（図３９）。
【０４０７】
融合構築体のＧｒＢ部位は、ヤギ抗−ＧｒＢ抗体を用いて検出された免疫蛍光染色によって評価して、１時間のＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬでの処理の後にｇｐ２４０抗原陽性Ａ３７５−Ｍ、ＭＥＬ−５２６、ＴＸＭ−１８メラノーマ細胞のサイトゾルへ効果的に送達された。これは、腫瘍細胞表面でのｇｐ２４０発現、およびｇｐ２４０抗原への構築体の結合がＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ融合構築体の内部化を担うことを有効に示す。
実施例４５
種々のメラノーマ細胞系に対するＧＲＢ／ＳＣＦＶＭＥＬのイン・ビトロ細胞傷害性
ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬの細胞傷害性を、培養中の対数期Ａ３７５−Ｍ、ＭＥＬ−５２６、ＴＸＭ−１８ＬおよびＴＸＭ−１細胞に対して評価した。５０％増殖阻害効果は、各々、Ａ３７５−Ｍ細胞では〜３０ｎＭ、ＭＥＬ−５２６細胞では〜５０ｎＭ、ＴＸＭ−１８Ｌでは〜１５０ｎＭの濃度で見出された。しかしながら、１μＭまでの用量では細胞傷害性効果はＴＸＭ−１細胞では見出されなかった（図３６、表１６）。比較により、標的細胞に対するＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬの細胞傷害性効果は、従前に記載されたＭＥＬ  ｓＦｖ／ｒＧｅｌのそれと同様であった（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）（表１６）。
【０４０８】
（表１６  種々のヒトメラノーマ細胞系に対するＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ  ｖｓ  ＭＥＬ  ｓＦｖ／ｒＧｅｌの細胞傷害性＊）
【０４０９】
【表１７】
2008526889.tif 000020
＊試料（ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ、ＭＥＬ  ｓＦｖ／ｒＧｅｌ）は、標準７２時間細胞増殖アッセイを用い、およびクリスタルバイオレット染色を用いてアッセイした。ＩＣ．５０値を計算し、平均±ＳＥＭ（ｎＭ）として示した。
＊＊陽性（％陽性）ＦＡＣＳ分析のパーセント
＊＊＊１０００ｎＭまでの用量において細胞傷害性効果は観察されなかった。
【０４１０】
これらのデータは、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬの改良された細胞結合に導くｇｐ２４０の高い発現、および融合タンパク質の比較的多き細胞傷害性をもたらすことの間で相関があるように見えることを示す。加えて、発明者の実験室における実験は、コンパニオン構築体ＭＥＬ  ｓＦｖ／ｒＧｅｌが、アポトーシスプロセスよりはむしろ壊死を介して細胞に対する細胞傷害性効果を生じることを示す。これらの比較実験は、ＧｒＢペイロードの細胞傷害性／アポトーシス効果が、ｒＧｅｌ−含有融合トキシンの頑強な細胞傷害性／壊死効果を合致させることができることを示す。
実施例４６
Ａ３７５−Ｍでの慣用的化学療法剤とＧＲＢ／ＳＣＦＶＭＥＬとの組合せ実験
細胞アポトーシスプロセスは化学療法に対する応答／抵抗性を媒介するように見えるので、（Ｓｉｍｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｓｏｅｎｇａｓ  ａｎｄ  Ｌｏｗｅ，２００３）、発明者は、次に、標的細胞に対する種々の化学療法剤と組み合わせたＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬの効果を調べた。ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬおよび種々のクラスの化学療法剤のＡ３７５−Ｍ細胞への７２時間の共投与は、アドリアマイシン（ＤＯＸ）、ビンクリスチン（ＶＣＲ）またはシスプラチン（ＣＤＤＰ）との相乗抗腫瘍活性、およびエトポシド（ＶＰ１６）、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）または５−ＦＵとの組合せでの相加的効果を示した。ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬでの６時間の予備処理、続いての、これらの化学療法剤への７２時間の共曝露（配列ＩＩ）は、薬物での予備処理、続いての、融合構築体への共曝露（配列Ｉ）と比較して有意に阻害された増殖を示した（図３７）。結果は、化学療法剤の細胞傷害性効果が、ｇｐ２４０抗原−陽性メラノーマ細胞に対するＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬでの６時間の予備処理によって顕著に増強し得ることを示した。ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬは、１μＭまでの濃度において抗原陰性ＴＸＭ−１細胞に対して細胞傷害性ではなかった。発明者は、ＴＸＭ−１細胞を１μＭのＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬで６時間予備処理し、次いで、Ｉ．Ｃ．５０またはＩ．Ｃ．２５用量の種々の化学療法剤を共投与した。予測されるように、種々の化学療法剤の細胞傷害性効果はＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬでの６時間の予備処理によって増強されなかった。
実施例４７
Ａ３７５−ドキソルビシン抵抗性（Ａ３７５ＤＲ）サブラインに対するＧＲＢ／ＳＣＦＶＭＥＬの細胞傷害性
ドキソルビシンに対する細胞抵抗性もまたＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ融合構築体に対して交差−抵抗性を引き起こすかを調べるために、Ａ３７５−ドキソルビシン抵抗性（Ａ３７５ＤＲ）細胞系を、まず、対数期親Ａ３７５−Ｍ細胞の増加させる濃度のドキソルビシンへの継続的曝露、続いての、系列希釈およびコロニーのクローン選択によって樹立した。Ａ３７５ＤＲと命名された１つのクローンは、親Ａ３７５細胞系と比較してドキソルビシンに対して４００倍抵抗性であった（Ｉ．Ｃ．５０：Ａ３７５ＤＲに対して２００ｎＭ  ｖｓ  Ｉ．Ｃ．５０：親Ａ３７５細胞系に対して０．５ｎＭ）。Ａ３７５ＤＲ細胞の処理は、親Ａ３７５細胞と比較して４．５倍高いＩ．Ｃ．５０を示したに過ぎなかった（Ｉ．Ｃ．５０：Ａ３７５ＤＲに対して６３．６ｎＭ  ｖｓ  Ｉ．Ｃ．５０：Ａ３７５に対して１４．５ｎＭ）（図４０、表１７）。ｇｐ２４０抗原の発現は、ｇｐ２４０抗原を特異的に認識するＺＭＥ−０１８抗体を用いるＥＬＩＳＡによって評価した。この実験は、相対的ｇｐ２４０発現が親Ａ３７５およびＡ３７５ＤＲ細胞におけると実質的に同一であったことを示した（データは示さず）。該データは、ドキソルビシンに対する細胞抵抗性はＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬに対する僅かな交差−抵抗性に関連することを示した。
【０４１１】
（表１７  親Ａ３７５細胞およびＡ３７５ドキソルビシン−抵抗性（Ａ３７５ＤＲ）実験に対するＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬおよびドキソルビシンの細胞傷害性効果の比較）
【０４１２】
【表１８】
2008526889.tif 000021
＊抵抗性指標は（Ａ３７５ＤＲに対するＩ．Ｃ．５０）／（Ａ３７５に対するＩ．Ｃ．５０）として定義される。
実施例４８
ヒトメラノーマＡ３７５−Ｍ細胞における放射線感受性に対するＧＲＢ／ＳＣＦＶＭＥＬでの予備処理の効果
ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬによるアポトーシスの誘導が、外部−ビーム電離放射線に対するメラノーマ細胞の感受性にインパクトを与えるか否かを判断するために、Ａ３７５、Ａ３７５ＤＲおよび抗原陰性ＳＫＢＲ３細胞を、まず、１０ｎＭのＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬで１６時間予備処理し、次いで、細胞を照射し、クローン原性細胞生存のために平板培養した。図４１は、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ処理がＡ３７５およびＡ３７５ＤＲ細胞双方のクローン原性生存を抑制することを示した。２、４および６Ｇｙの放射線量において生存するコロニーの数は、Ａ３７５放射線−単独対照群における、各々、ほぼ３４．８±０．２３％、１６．０±０．０６％、および５．６±０．５５％から、各々、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ＋放射線処理群における２３．１±１．５９％、８．２±０．４９％、および２．８±０．５２％まで低下した（図４１Ａ、表１８Ａ）。
【０４１３】
（表１８Ａ  放射線単独（対照）  ｖｓ  照射およびＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬでの処理で処理したＡ３７５細胞のクローン原性生存（％）生存）
【０４１４】
【表１９】
2008526889.tif 000022
観察された感受性化は、２、４および６Ｇｙ量の群において統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５）。Ａ３７５ＤＲ細胞の照射単独での処理の後、量４および６Ｇｙでのコロニー生存は、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬおよび放射線で共処理した群における、各々、９．４±０．２９％および２．８±０．１２％と比較して、各々、１３．８±０．３２％、および６．９±０．６４％であった（図４１Ｂ、表１８Ｂ）。
【０４１５】
（表１８Ｂ  照射単独（対照）  ｖｓ  照射およびＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬでの処理で処理したＡ３７５ＤＲ細胞のクローン原性生存（％生存））
【０４１６】
【表２０】
2008526889.tif 000023
Ａ３７５ＤＲ群における観察された感受性化は、各々、４および６Ｇｙにおいてｐ＜０．０５でもって統計学的に有利であった。しかしながら、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ−処理細胞、続いての、２、４および６Ｇｙでの照射と比較して、照射で処理した抗原−陰性ＳＫＢＲ３細胞では統計学的に有意な感受性化は観察されなかった（ｐ＞０．０５）（図４１Ｃ、表１８Ｃ）。従って、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬでの処理は、抗原−陽性Ａ３７５およびＡ３７５ＤＲドキソルビシン−抵抗性細胞双方を電離放射線に対して感受性とする。このラジオ−感受性化はｇｐ２４０抗原の発現に依存するように見える。というのは、我々は、抗原−陰性細胞で放射線感受性化を観察しなかったからである。
【０４１７】
（表１８Ｃ  照射単独（対照）  ｖｓ  照射およびＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬでの処理で処理されたＳＫＢＲ３−ＨＰ細胞のクローン原性生存（％生存））
【０４１８】
【表２１】
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実施例４９
Ａ３７５ＤＲ細胞の転移能力に対するＧＲＢ／ＳＣＦＶＭＥＬの効果
次いで、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ融合構築体がメラノーマ細胞の転移能力に影響するか否かを調べた。というのは、細胞アポトーシス状態は、細胞侵入および転移能力を媒介するのを担うことが知られている因子の１つだからである（Ｇｌｉｎｓｋｙ  ａｎｄ  Ｇｌｉｎｓｋｙ，１９９６；Ｇｌｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｒｕｂｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｓｉｍｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。復元された基底膜のマトリックス（マトリゲル）に侵入するＡ３７５ＤＲ細胞の能力に対するＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬの効果を実験した。ハンギング−ドロップ技術によって調製した場合、Ａ３７５ＤＲ細胞はマトリゲル中に細胞凝集物を自然に形成する。Ａ３７５ＤＲ細胞は能動的に凝集体から去り、４および６日においてマトリゲル調製物に侵入する（図４２Ａ）。凝集物の周りのマトリゲルに侵入した細胞の密度をＡｌｐｈａＥａｓｅ（登録商標）ＦＣソフトウェア（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）によって分析し、侵入のパーセントを２つの群の細胞密度に基づいて計算し、１００％侵入としての非−処理対照群の値によって標準化した。Ａ３７５ＤＲ細胞のＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬでの処理はマトリゲルのＡ３７５ＤＲ侵入を阻害する。細胞の侵入の能力は４日における５０．０±２．８９％および６日における４５．０±１．１６％まで有意に低下した（図４２Ａおよび４２Ｂ）。
実施例５０
ＧＲＢ／ＳＣＦＶＭＥＬのイン・ビボ動物実験（Ａ３７５−Ｍ異種移植片モデル）
Ａ３７５−Ｍ異種移植片腫瘍を担うマウスにおけるＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ融合構築体の内部化または局所化をまず特徴付けた。２４時間後におけるＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬの投与後に、マウスを犠牲にし、代表的な組織セクションを取り出し、ホルマリン固定し、ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨおよびＥ）によって染色し、抗−ＧｒＢ抗体または抗−ｓｃＦｖＭＥＬ抗体いずれかによって検出した。ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬの局所化または内部化が腫瘍組織で観察された。
【０４１９】
ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬのイン・ビボ抗−腫瘍効果を調べるために、Ａ３７５−Ｍヒトメラノーマ腫瘍異種移植片で実験を行った。腫瘍を担うマウスをＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬまたは生理食塩水いずれかで１日おきに５回処理した（静脈内、尾静脈）。生理食塩水処理対照群の腫瘍は２８日にわたって２４倍増加した（５０ｍｍ３から１２００ｍｍ３）。対照的に、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ処理腫瘍は４倍増加した（５０ｍｍ３から２００ｍｍ３）（図４３）。ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ融合構築体は印象的な抗腫瘍活性を示す。腫瘍組織核はＴＵＮＥＬアッセイによって生殖された。結果は、腫瘍組織は、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ処理群においてアポトーシス核を呈することを明らかに示した（図４０）。
実施例５１
例示的臨床実験
本実施例は特別であるが例示的な具体例におけるｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦを見るが、当業者であれば、本発明の他のキメラ分子で例示的プロトコルを使用できることを認識するであろう。さらに、当業者であれば、当該分野でルーチン的に行われるもう１つのキメラ分使用のプロトコルを適合させた場合に、この例示的プロトコルを最適化できることを認識するであろう。
【０４２０】
本発明の具体的例において、例えば、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦのような本発明のキメラ分子の安全性および許容性は、例えば、メラノーマおよび小葉乳癌を含めたｇｐ２４０−陽性進行悪性疾患を持つ患者におけるように評価される。さらなる具体例において、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦのような本発明のキメラ分子のファルマコキネティックプロフィールは、ｇｐ−２４０悪性疾患を持つ患者のような個体に投与された場合に評価される。さらなる具体例において、例えば、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦのような、本発明のキメラ分子の最大許容用量（ＭＴＤ）および用量制限毒性（ＤＬＴ）が確立される。
【０４２１】
ｓｃＦｖＭＥＬは、悪性メラノーマ、小葉乳癌および恐らくは他のタイプの腫瘍で見出されるｇｐ２４０表面糖タンパク質に対して向けられるマウス抗体である。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は１７，０００ＭＷ細胞障害性ポリペプチドであって、腫瘍壊死およびアポトーシスを含めた、全身および細胞応答の広いスペクトルを媒介する。ＴＮＦはイン・ビトロにて多数のヒト腫瘍細胞に対して静細胞または細胞傷害性である。癌療法におけるＴＮＦの使用は、ひどい毒性によって制限される。種々の戦略が、この剤の抗腫瘍特性を利用し、同時に、抗体−媒介送達を含めた全身副作用を低下させるのに提案されている。ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦは、組換えＴＮＦにそのＣ−末端で融合した単一鎖マウスモノクローナル抗体（ｓｃＦｖＭＥＬ）よりなる融合タンパク質である。ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦは、ｇｐ２４０発現する悪性メラノーマ腫瘍のほぼ８０％に、細胞傷害量のＴＮＦを送達することができる。この新規な免疫サイトカインは、臨床試験における開発のための魅力的かつ有望な化合物を構成する。
【０４２２】
例示的な適格性基準は以下のものを含む：１）組織病理学によって確認された悪性メラノーマと診断された１２歳を超える年齢の成人；２）利用可能な病理学試料における腫瘍細胞の２０％を超えるものが、膜または細胞質いずれかにおいていくらかの検出可能な染色を示さなければならない；３）書かれた同意書を理解し、署名することを条件とした参加者の精神的および情緒的能力；４）適切な行動状態（Ｋａｒｎｏｆｓｋｙスケール６０％／ＥＣＯＧ≦２）；５）主な外科的処置、細胞傷害性化学療法、免疫療法インターロイキン−２またはインターフェロン、または抗−癌ワクチン接種；および／または６）以下のパラメータによって反映される腎臓、肝臓および免疫学的系の適切な機能：＜２．０ｍｇ／ｄＬのクレアチニン；アッセイを行う参照研究所の通常の上限の＜２．５倍のＡＳＴ／ＡＬＴ；もし肝臓転移が記録されていれば正常な上方範囲の＜６×のＡＳＴまたはＡＬＴ；もし肝臓転移が記録されていれば正常な上方範囲の＜６×の＜２．５ｍｇ／ｄＬ  ＡＳＴまたはＡＬＴ；末梢血液中の血小板カウント＞１００，０００細胞／ｕＬ；絶対好中球カウント＞１．５細胞／ｕＬ；患者は実験を通じて追跡することができる少なくとも１つの測定可能なまたは評価可能な病巣を有しなければならない。測定可能でないが依然として評価可能な病巣（たと小さな容量の複数皮膚沈積）を持つ患者は実験でエンターすることができる。排除される個体は以下の：妊娠した、または授乳中の婦人；同意プロセスの間に適切な理解および決定を妨げる痴呆症または他の精神的乱れ；免疫抑制投薬の同時使用（すなわち、コルチコステロイド、シクロスポリン、タクロリムス等）；他の同時原発性悪性疾患の履歴；および／または細胞傷害性または免疫学的剤（ヒドロキシ尿素、タモキシフェン等）の同時使用を含む。
【０４２３】
ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの全てのサイクルは外来患者状況で投与されるであろう。患者の初期コホールトは各２８日周期の１ないし５日および８ないし１２日（２連続週の各々のＭＯＮ−ＦＲＩ）に１時間の静脈内注入として与えられる３ｍｇ／ｍ２を受けるであろう。もし対象が治療の間に許容できない毒性（グレード３ないし４）または病気の進行を発生しないならば、療法を引き続いて継続することができる。目に見えるまたは触知可能な腫瘍の応答の評価は各サイクルの最後に反復されるであろう；イメージングによってのみ検出可能な腫瘍の応答の評価は２サイクルごとに最後に行われるであろう。実験薬物でのさらなる処理は主たる調査者の裁量であり、その時点に利用できる全ての安全性および有効性データの見積もりに基づくであろう。
ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦは高度に選択的な免疫サイトカインである。
【０４２４】
融合構築体ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ免疫サイトカインは、ＥＬＩＳＡによって評価して、ｇｐ２４０抗原陽性メラノーマ細胞への特異的な高レベルの結合を示したが、ｇｐ２４０抗原−陰性の他の細胞に対しては低いレベルの結合を示し、または結合を示さなかった。ｇｐ２４０抗原陽性のＴＮＦ−感受性ヒトメラノーマＡ３７５−Ｍ細胞への放射性標識−ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの結合のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析は、細胞表面での２つの結合部位の存在を明らかにし、１つは、１．９ｎＭの解離定数（Ｋｄ）およびかつ細胞当たりほぼ４０００結合部位を持ち、他のものは１５．６ｎＭのＫｄおよび細胞当たりほぼ１．６×１０５結合部位を持つものである（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０４２５】
ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦは溶液中でトリマーである（１３５，０００ダルトン）。サイズ−排除ＦＰＬＣによるｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの分析は、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ融合構築体が、注射されたタンパク質の９３％においてほぼ１３５ｋＤａの見掛けのサイズで移動したことを示した。これは、４５ｋＤａ融合構築体のトリマー構造の予測されるサイズの密接に合致する。従って、融合構築体は、天然ＴＮＦのそれと同様にトリマー構造へと溶液中で自己凝集するようである。注射された物質の〜７％を含む小さなピークが観察され、ほぼ４５ｋＤａの見掛けの分子量で移動した。これは、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦモノマーの予測されるサイズである（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦのＴＮＦ部位は効率的に内部化された。
【０４２６】
ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの結合および内部化は、Ａ３７５−Ｍ細胞の免疫蛍光によって評価した。細胞を抗−ＴＮＦＲ１抗体で予めブロックし、次いで、３７℃にてｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦで処理した。示した時間において、細胞表面を洗浄し、低ｐＨ（ｐＨ２．５）グリシン緩衝液によってストリップして、過剰の融合タンパク質を除去した。細胞を固定し、浸透させ、続いて、非特異的結合をブロックした。さらなる細胞をウサギ抗−ｈｕＴＮＦ抗体と共にインキュベートし、ＦＩＴＣ−カップルド抗ウサギＩｇＧで検出した。蛍光顕微鏡下で、ＴＮＦのシグナルが１時間処理細胞のサイトゾルで観察されたが、処理されていない細胞のサイトゾルでは観察されなかった。サイトゾルにおけるＴＮＦの量は、構築体への曝露の持続に依存した。
融合構築体におけるＴＮＦ成分の生物学的活性は天然ＴＮＦのそれと同一である。
【０４２７】
ＴＮＦの生物学的活性は、Ｌ−９２９細胞における細胞傷害性に依存する標準的アッセイを用いることによって測定した。天然ＴＮＦは２６．７×１０６ユニット／ｍｇタンパク質の特異的活性を有した。融合構築体ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦのＴＮＦ成分の生物学的活性は実質的に無傷のままであった。なぜならば、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの特異的活性（１０×１０６ユニット／ｍｇタンパク質）は天然ＴＮＦのそれとほぼ同一だったからである。ＴＮＦが抗体構造に融合すると、活性の喪失は起こらなかった。
免疫サイトカインの特異性
ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ精製融合タンパク質を、天然ＴＮＦ単独と比較して、抗原−陽性のＴＮＦ−感受性ヒトメラノーマＡ３７５−Ｍ細胞、抗原−陽性ＴＮＦ−抵抗性ヒトメラノーマＡＡＢ５２７細胞、抗原−陰性のＴＮＦ−感受性ヒト乳癌ＳＫＢＲ３−ＨＰ細胞、および抗原−陰性のＴＮＦ−抵抗性ヒト神経膠腫Ｈ４細胞に対する特異的細胞傷害性についてテストした。抗原−陽性のＴＮＦ−感受性Ａ３７５−Ｍ細胞に対する免疫サイトカインの細胞傷害性効果は天然ＴＮＦよりも１０倍より活性であった。抗原−陰性のＴＮＦ−感受性ＳＫＢＲ３−ＨＰ細胞に対して、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの細胞傷害性は天然ＴＮＦのそれと同様な用量−応答曲線を示した。抗原−陰性のＴＮＦ−抵抗性細胞に対して、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦは１００ｎＭまでの用量で細胞傷害性効果を示さなかった。しかしながら、抗原−陽性のＴＮＦ−抵抗性ＡＡＢ−５２７細胞に対して、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦは有意な用量−関連細胞傷害効果を示した。ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦはＴＮＦ抵抗性を克服することができる。
マウスにおけるｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの前−臨床薬理学実験
マウスにおけるｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの薬理学実験は、各々、アルファ、ベータおよびガンマ半減期について０．３８、３．９および１７．６時間の計算された血漿半減期を持つ三相クリアランス曲線を示す。ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの分布の直後の見掛けの容量（Ｖｄａ）は１９．５０ｍｌであった。濃度曲線下面積（ＡＵＣ）は４．０μｇ／ｍｌ×時間と計算された。平均滞留時間は８．３時間であることが判明した。
マウスにおけるｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦのＬＤ、ＭＴＤおよび毒性学実験
マウスを５日間毎日の６つに分割した処理で０．５ないし１６．７ｍｇ／ｋｇの範囲の合計用量のｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦで処理した（静脈内）。８．３ｍｇ／ｋｇの用量はＬＤ１００であることが判明し、他方、ＬＤ２５は４．８ｍｇ／ｋｇであることが判明した。ＭＴＤを定義する最高非致死用量はこのスケジュールにおいて４ｍｇ／ｋｇ合計用量であることが判明した。
【０４２８】
Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける毒性実験は、ＭＴＤの１００％（４ｍｇ／ｋｇ）、７５％ＭＴＤ（３ｍｇ／ｋｇ）、５０％ＭＴＤ（２ｍｇ／ｋｇ）および２５％ＭＴＤ（１ｍｇ／ｋｇ）を含めた種々の用量で行った。これらの用量において臨床化学パラメータで認められる有意な効果は無かった。血液学的効果で認められた有意な効果は無かった。観察されなかった有害効果レベル（ＮＯＡＥＬ）は３ｍｇ／ｋｇ（９ｍｇ／ｍ２）であると判断された。従って、患者における出発用量はＮＯＡＥＬ用量の１／３または３ｍｇ／ｍ２であろう（各２８日サイクルの１ないし５日および８ないし１２日において０．３ｍｇ／ｍ２／日として与えられた合計用量）。
ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦのイン・ビボ効果
初期段階（５０ｍｍ３）での２．５ｍｇ／ｋｇ用量におけるｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの処理は、優れた抗腫瘍活性を示し、キャリパー測定によってモニターすると、２１日において５匹のマウスのうち３匹の腫瘍−なし、および完全な腫瘍退行、４３日における５匹のマウスのうち５匹の腫瘍−なしを示す。後期段階（２００ｍｍ３）において処理されたマウスもまた腫瘍退行、４４日における５匹のうち３匹の腫瘍−なしを示した。腫瘍なしとされたマウスからの腫瘍の引き続いての外植はなかった。これらのデータは、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦがイン・ビボにてメラノーマ細胞を標的とすることができ、顕著な抗−メラノーマ効果をもたらすことができることを示す。
実験の設計
これは、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの安全性、許容性、ＰＫおよび有効性を評価するための相Ｉの開いた−標識の用量上昇実験である。一旦ＭＴＤが定義されたならば、さらなる患者をこの用量においてエンターして、推奨される相Ｉ用量をさらに吟味する。出発用量は、２８日サイクルの１ないし５日および８ないし１２日の各々に与えられた０．３ｍｇ／ｍ２（マウスＮＯＡＥＬ用量の１／３）であろう。
用量の上昇
用量の上昇は以下のように進行させる：（軽い悪心および吐き気を除いた）いずれかの生物学的活性が観察されるまで１００％上昇；その後グレード２有害事象（ＡＥ）が観察されるまで５０％上昇；その後制限される毒性が起こる用量に遭遇するまで２５％上昇。これは、６人の患者のうち２人以上がグレード３の非−血液学的またはグレード４の血液学的有害事象をこうむる用量と定義される。最大許容用量（ＭＴＤ）は次に低い用量レベルと定義される。一旦ＭＴＤが確認されれば、少なくとも３人の患者はその用量において少なくとも３サイクルを受けて、累積的毒性があるか否かを確認する。少なくとも６人の患者は最大許容用量において実験する。
【０４２９】
１人の患者はグレード２有害事象（ＡＥ）が発生するまで用量レベル当たりで処理し；その後、３人の患者は用量レベル当たり記録する。もし３人の患者のうち１人がいずれかの与えられた用量レベルでグレード≧３以上のＡＥをこうむるならば、３人の患者はその用量レベルにおいてエンターされる。もし６人の患者のうち≧２がグレード３の非−血液学的またはグレード４の血液学的ＡＥをこうむるならば、さらなる用量上昇は行わない。この用量レベルは最大許容用量（ＭＴＤ）と定義されるであろう。
【０４３０】
一旦用量レベル当たり３人の患者のエントリーを必要とする用量に到達したならば、患者を次のより高い用量レベルでエンターすることができ、一旦先行する用量レベルにおいて３人の患者のうち１人が１４日＋２週間追跡にわたって１０注入を受け、かつ先行用量レベルにおける残りの２人の患者がすくなくとも５の注入を受け、それらの６番目の注入について資格があれば、毒性を制限する容量（ＤＬＴ）の発生がない全てとする。
【０４３１】
用量上昇は、引き続いてのサイクルの間に同一の患者において許容される。但し、ＡＥグレード＞１が先行サイクルの間に観察されないものとする。しかしながら、もしグレード２以上のＡＥが起こり、かつ患者がさらなるサイクルを受ける資格があれば、患者はさらなる用量上昇なくしてｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦを継続的に受けるであろう。
【０４３２】
用量上昇についての全ての決定は、医療モニターと相談して主たる調査者によってなされるであろう。計画された用量上昇レベルは、試験からの情報が利用可能になれば変化させることができる。
【０４３３】
もし改善（安定な病気、または腫瘍細部の減少、兆候救済）の証拠があって、非−血液学有害事象がグレード２以下であれば、患者はｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦのさらなるサイクルを受ける資格がある。患者は、実験調査者の裁量で合計５のさらなるサイクルまで受けることができる。引き続いてのサイクルで用いるべき用量は、その時点で利用可能な全ての情報に基づいて実験調査者によって決定されるであろう。
【０４３４】
＞１サイクルを受ける個々の患者についての用量調整は有害事象に依存するであろう。もし患者が先行サイクルで研究薬物−関連のグレード３のＡＥをこうむるならば、ＡＥが予備処理ベースラインとなるまで、引き続いての用量は維持されるであろう。
用量制限毒性（ＤＬＴ）の定義
ＤＬＴは以下のＮＣＩ共通毒性基準：血液学的毒性：グレード４好中球減少症≧５日、グレード４の血小板減少症、好中球減少症感染；非−血液学的毒性：悪心、吐き気、下痢および脱毛症を除いたグレード３または４の非−血液学的毒性を満足する「研究薬物におそらくはまたははっきりと関連する有害反応」と定義される。
統計学的解析
この臨床試験の性質を仮定すれば、正規の記載的統計学をその解析のために用いる。
処理の計画
ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの全てのサイクルを外来患者設定で投与する。患者の最初のコホールトは、各２８日サイクルの１ないし５日および８ないし１２日（２連続週の各々のＭＯＮ−ＦＲＩ）に１時間静脈注入として与えられた３ｍｇ／ｍ２を受けるであろう。もし対象が処理の間に許容できない毒性（グレード３ないし４）または病気の進行を発生させないならば、療法を引き続いて継続することができる。目に見えるまたは触知可能腫瘍の応答の評価は各サイクルの最後に反復されるであろう；イメージングによってのみ検出可能な腫瘍の応答の評価は各２サイクルの最後に行われるであろう。実験薬物でのさらなる処理は主たる調査者の裁量であり、その時点で入手可能な全ての安全性および有効性データの評価に基づくであろう。
【０４３５】
患者を臨床にて毎週観察し、その時点で、彼らの兆候および症状、観察可能な腫瘍および同時投薬の変化を記録し、血液学的パラメータおよび血清化学の決定のために血液を得る。反復腫瘍バイオプシーは、第一の周期の第三週の始まりにおいて得られる（日１６±３）。腫瘍サイズを評価するためのイメージング実験は、各他の周期の最後に反復されるであろう。
ファルマコキネティックスについての血液サンプリング
全ての患者は、実験薬物レベルの測定、および各周期での抗体レベルの測定のために血液サンプリングを受けるであろう。周期１ではかなりのサンプリングがされるであろう；あまり多くないサンプリングは各引き続いての周期で行われるであろう。各血液試料は、ヘパリン処理試験管へ吸われる１０ｍｌの血液よりなる。全ての血液試料はただちに４℃で遠心し、血漿を取り出し、３アリコットで凍結させる。これらの試料のタイミングを、最初の少数の患者の分析に基づいて改変して、最適なファルマコキネティックパラメータを獲得することができる。
【０４３６】
周期１、１日では：実験薬物注入の開始にちょうど先立って、実験薬物注入の最後において、および薬物注入の最後の後の以下の時点において：５、１０、２０、４０、８０、１６０および３２０分。２ないし５日および８ないし１２日では：各毎日の薬物注入の最後のちょうど前および直ちに。周期２および引き続いての周期、１ないし５日および８ないし１２日では：各毎日の薬物注入の最後においてちょうど前および直ちに。
腫瘍バイオプシーの組織学評価
アクセス可能な腫瘍のバイオプシーは、実験薬物の最初の注入に先立って、および最初の周期の第３週の開始において（日１６±３）再度得られるであろう。ルーチン的な病理学的調査に加えて、免疫組織化学およびイン・サイチュウハイビリダイゼーションアッセイを用いて予備処理および後処理試料双方について以下のパラメータを評価する：ｇｐ２４０の発現、増殖速度（抗Ｋｉ６７）および（ＴＵＮＥＬ技術での）アポトーシスの程度、ＴＮＦの腫瘍含有量、および壊死の程度。
【０４３７】
全てのデータは、半定量的に収集し、カイ−二乗検定およびスチューデントｔ−検定を用いて比較する。
毒性の評価
毒性は、Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｃｏｍｏｎ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａバージョン２．０（ＣＴＣｖ２．０）に従ってモニターし、評点を付ける。ＣＴＣｖ２．０に含めない有害事象は適当なカテゴリー内の「他の」有害事象下で報告し、評点を付ける。ＣＴＣｖ２．０のコピーはＣＴＥＰホームページからダウンロードすることができる。
応答についての基準
腫瘍応答はこの臨床研究の予期される二次的最終点であろう。この研究における目的の腫瘍応答は、Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ  Ｇｒｏｕｐ（ＲＥＣＩＳＴ）（Ｔｈｅｒａｓｓｅ，Ａｒｄｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．）を用いて評価されるであろう。容易に観察可能な皮膚病巣はキャリパーで測定され；身体に対して内部の腫瘍塊は、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ａｔ  Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒによって開発されたプロトコルガイドラインを用い、ＣＴ、ＭＲＩまたは超音波を用いて評価されるであろう。評価の同一方法および同一技術を用いて、ベースラインおよび追跡の間に各同定され報告された病巣を特徴づける。
定義：ベースラインにおいて、腫瘍病巣は以下のようにカテゴリー分けされる。
【０４３８】
測定可能：慣用的技術で＝２０ｍｍとして、またはラセンＣＴスキャンで＝１０ｍｍとして少なくとも１つの方向［記録された最も長い直径］において正確に測定することができる全ての病巣。測定可能な病気は、この記載により少なくとも１つの病巣の存在によって定義される。
【０４３９】
測定不能：慣用的技術で＜２０ｍｍ、またはラセンＣＴスキャンで＜１０ｍｍの最長直径を持つ全ての病巣、および真に測定できない病巣（軟膜病、腹水、胸膜または心臓周囲滲出、骨病、リンパ管炎）。
【０４４０】
標的および非−標的病巣：全ての関連器官の代表である、器官当たり最大５までの病巣、および合計１０病巣の全ての測定可能な病巣は標的病巣として同定し、記録し、およびベースラインにおいて測定すべきである。標的病巣は、正確な反復測定（イメージング実験または臨床的いずれか）のためのサイズ（最長直径を持つもの）およびそれらの適当性によって選択すべきである。全ての標的病巣についての最長直径の合計を計算し、ベースライン合計最長直径として報告される。ベースライン合計最長直径は、目的腫瘍応答を特徴付けるために参照として用いられるであろう。全ての他の病巣は、非−標的病巣として同定し、ベースラインにおいて記録すべきである。
総じての応答
標的病巣の評価：全ての標的病巣の消失が起これば完全な応答が起こる；イメージング実験または臨床評価が、参照としてベースライン合計最長直径を採用し、標的病巣の最長直径の合計の少なくとも３０％減少を示すと、部分的応答が起こる；参照として記録された最小合計最長直径を採用し、開始した処置または１以上の新しい病巣の出現以来標的病巣の最長直径の合計の少なくとも２０％増加が示されれば、進行性病気が起こる；部分的応答の資格がある十分な収縮、または進行性病気の資格があるサイズの十分な増加が存在すれば常に、安定な病気が起こる。
【０４４１】
非−標的病巣の評価：完全な応答は全ての非−標的病巣の消失であり；不完全な応答／安定な病気は１以上の非−標的病巣の執拗な存在であり；進行性病気は１以上の新しい病気の出現および／または存在する非−標的病巣の明白な進行である；最良な総じての応答の評価：最良な総じての応答は（進行性病気についての参照として、開始した処置以来記録された最小測定を採用し）病気進行／再発までの処置の開始から記録された最良の応答である。その時点において病気進行の客観的証拠がない療法の中断を必要とするその健康状態の劣化がある患者は、「兆候的劣化」を有するとして分類すべきである。各努力を成して、処置の中断後においてさえ客観的病気進行を記録すべきである。もし病巣の完全な解決が起こり、かつ残存する病気を正常な組織から区別するのが困難であれば、残存する異常性組織学的評価は、完全な応答状態を確認する前に微小な針アスピレートで調査されなければならない。
マウスにおけるｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦのファルマコキネティック実験
マウスにおけるｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの例示的ファルマコキネティックスを決定した。Ｐ−ヨードベンゾエートを用いる１２５Ｉ−放射性標識ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦを使用する例示的方法を利用した。この方法はＮ−スクシンイミジルｐ−ヨードベンゾエートをタンパク質にコンジュゲートさせる。簡単に述べれば、３７．５μｌの１％ＨＯＡｃ／ＭｅＯＨ、ＭｅＯＨ中の１０μｌの１ｍｇ／ｍｌ  Ｎ−クロロスクシンイミド、および１０μｌのＰＢＳを、１２．５μｌのＨＯＡｃ／ＭｅＯＨ中のＮ−スクシンイミジル４−トリ−ｎ−ブチルスタニルベンゾエート（Ｎｅｏｒｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）（１２．５ｍｇ）を含有するセプタムラバーをフィットさせた反応バイアルに引き続いて加えた。１２５Ｉ（Ｄｕｐｏｎｔ）の１−ｍＣｉアリコットを反応溶液に加え、５分後、１０μｌの０．１Ｍ  ＮａＨＳＯ３の添加によって反応をクエンチした。ＭｅＯＨ溶媒をＮ２流下で１０分間蒸発させた。１００ｍｌのＰＢＳ中のタンパク質の５００μｇ試料を１００μｌの０．５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．３）と混合し、次いで、反応バイアルに加えた。室温にてコンジュゲーションを５分間進行させた。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（ＰＤ−１０）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）でのクロマトグラフィーによって未反応放射性要素を除去した。放射化学収率は４０％ないし６０％であった。トリクロロ酢酸沈殿によって測定したタンパク質への放射性標識の取り込みは９０％よりも大であった。放射性標識タンパク質の比活性は０．４μＣｉ／μｇであった。
【０４４２】
例示的ファルマコキネティックス実験は以下の通りである。４ないし６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスをマウス当たり２μＣｉ、２００μｌのノーマルセーライン中の５μｇの合計タンパク質を注射した。注射から１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間後に、各アッセイ時間において２匹のマウスを頸部脱臼によって犠牲にした。血液試料を胸腔から取り出し、重量を測定し、カウントして、ガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ，モデル５３６０）にて合計放射能を測定した。また、血液試料を遠心し、血漿をデカントし、カウントして、放射能を測定した。放射能の血漿測定からの結果を、最小二乗非直線回帰（ＭｉｃｒｏＭａｔｈ，Ｉｎｃ．からのＲＳＴＲＩＰ）プログラムによって分析して、ファルマコキネティックパラメータを決定した。
【０４４３】
データをグラフ化し、各時点におけるデータの平均±ＳＥＭを決定した。データは、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ構築体が、静脈内投与後１７．６時間の最終半減期でもって循環から除去されることを示した。ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの分布の直後の見掛けの容量（Ｖｄａ）は１９．５０ｍｌであった。濃度曲線下面積（ＡＵＣ）は４．０ｍｇ／ｍｌ×時間であると計算された。平均滞留時間は８．３時間であると決定された。
ヌードマウスにおけるｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ免疫サイトカインについての最大許容用量（ＭＴＤ）および致死用量（ＬＤ）の決定
ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ免疫サイトカインのＭＴＤおよびＬＤを決定した。ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）を６つの異なるケージに割当て、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ（２ｍｇ／ｍｌ）免疫サイトカインを毎日５回尾静脈によって投与した。マウスにおけるｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦのＬＤ２５はほぼ４．８ｍｇ／ｋｇである。マウスにおけるｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦのＬＤ１００はほぼ８．３ｍｇ／ｋｇである。マウスにおけるｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦのＭＴＤはほぼ４．０ｍｇ／ｋｇである。
ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの生物学的活性の維持のための最適貯蔵条件を決定するための処方実験
ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの最適生物学的活性を維持するための最適緩衝液組成、ｐＨ、貯蔵温度およびさらなるタンパク質含有量を決定した。
【０４４４】
ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの試料をｐＨ６．５、７．０および７．５においてリン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ）に加えた。０．１％ＨＳＡを含有する二連試料も調製し、全ての６つの試料を４℃またはマイナス２０℃で貯蔵した。経時的に（８週間）、試料を取り出し、培養中のＡ３７５−Ｍ細胞に対する比較細胞傷害性について以下のようにテストした：
細胞を、４×１０３細胞／ウェルの密度にて９６−ウェルプレートに平板培養し一晩接着させた。次いで、培地を、異なる濃度のｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦを含有する培地で置き換えた。７２時間後、培養中の腫瘍細胞の成長に対するｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの効果をクリスタルバイオレット染色を用いて測定した。簡単に述べれば、細胞を固定し、２０％メタノール中の０．５％クリスタルバイオレット（０．０５ｍｌ／ウェル）を加えることによって３０分間染色した。プレートを脱イオン水中ですすぎ、０．２ｍｌのソレンソン緩衝液／ウェル（０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．２、５０％エタノール中）を加えることによってクリスタルバイオレットを接着性細胞から抽出した。細胞プレートを室温にて３０分間渦巻かせ、吸光度を６３０ｍｌで読み（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，Ｖｔ）、対照ウェル培地単独と比較した。
【０４４５】
ｐＨ６．５、７．０または７．５の緩衝液中で４℃にて貯蔵した試料の間のｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの細胞傷害性効果の有効な差はなかった。ｐＨ６．５、７．０または７．５で処方し、かつ−２０℃で貯蔵した試料の間でｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの細胞傷害性効果の有効な差はなかった。ｐＨ６．５、７．０および７．５における、４℃または−２０℃で貯蔵した処方における０．１％ＨＳＡの添加は効果を有しなかった。従って、このデータに基づき、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦについての最適な処方条件はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のｐＨ７．５である。この処方についての最適な貯蔵条件は、生物学的活性の検出可能な喪失またはタンパク質構造の崩壊なくしての三ヶ月までの−２０℃である。
用量距離計：５回の毎日の静脈内注射後における雌Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの毒性
ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦでの多用量静脈内距離計実験をＢａｌｂ／ｃ雌マウスにおいて行った。群当たり５匹の雌マウスを毎日、０．２、０．４、０．６および０．８ｍｇ／ｋｇ／日ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦで５日間静脈内注射した（群２ないし５）。送達した合計用量は１、２、３および４ｍｇ／ｋｇであり、これは、従前に確立された最大許容用量（ＭＴＤ）の２５、５０、７５および１００％に対応した。ビヒクル対照群（群１）は生理食塩水よりなるものであった。最後の注射（１２日）から７日後に、実験中の動物を二酸化炭素で殺し、血液学および臨床化学分析のために最後に採血し、完全な剖検に付した。
【０４４６】
この実験条件下で、主な知見は、死滅が起こらず；血液学または臨床化学パラメータにおけるテスト物質−関連変化は認められず；組織検体のテスト物質−関連肉眼的変化は認められず；相対的脾臓重量の用量−関連増加が全ての投与群で認められ、赤色脾髄の髄外造血および白色脾髄の小胞細胞過形成の増加に相関し；顕微鏡的テスト物質−関連知見が肝臓、脾臓および肺に存在したことであった。用量−関連髄外造血は肝臓および脾臓で認められ、小胞細胞（リンパ系）過形成が脾臓で認められた。これらの病巣のいずれも有害とは考えられなかった。単一の再カニューレ化血栓が最高用量レベルで３／５マウスで観察された。これらの血栓は１つの血管においてのみ起こり、肺機能を危うくしなかった。しかしながら、それらは生物学的に有害だと考えられる。
【０４４７】
非−観察−有害−効果レベル（ＮＯＡＥＬ）は、この実験の条件下で雌マウスでは０．６ｍｇ／ｋｇ／日であった。この用量レベルは、従前に確立されたＮＴＤの７５％と同等である３ｍｇ／ｋｇの合計用量を送達する。
【０４４８】
この実験での例示的材料および方法は以下の通りである。計画された犠牲１２日に、動物を二酸化炭素で殺し、心臓から最後に血液採取し、完全な剖検調査に付した。臨床的病理学では、血液は完全な血液カウント（ＣＢＣ）のためにＥＤＴＡ容器に集め、血清を収穫して臨床化学を行うために、全血を血餅チューブに入れた。
血液学：ＣＢＣ
臨床化学：  全ビリルビン            カルシウム
リン                    ナトリウム
ＡＳＴ（ＳＧＯＴ）      カリウム
ＡＬＴ（ＳＧＰＴ）      塩化物
全タンパク質                Ａｌｋホスファターゼ
アルブミン              クレアチニン
グロブリン              ＢＵＮ
剖検論点について、完全な剖検は身体、全ての開口、頭蓋、胸および腹腔の外部表面、およびそれらの内容物の調査と定義される。以下の組織を設計によって犠牲にした全てのマウスから収集した：肝臓、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、唾液腺、膵臓を含めた消化器系；心臓および大動脈を含めた心血管系；器官および肺を含めた呼吸器系；腎臓および膀胱を含めた泌尿器系；脾臓、胸腺、腸間膜リンパ節、下顎リンパ節、骨髄（大腿／胸骨）を含めた造血系；下垂体腺、甲状腺、副甲状腺、副腎腺を含めた内分泌系；脳（大脳、中脳、小脳、延髄／橋）、脊髄（頸部、胸、腰部）、坐骨神経を含めた神経系；骨格筋、大腿／膝関節、胸骨を含めた筋骨格系；精巣上体、前立腺、精液小胞、卵巣、子宮（頸部、本体、角）を含めた生殖系、および皮膚、乳腺、目、注射部位および肉眼的病巣を含めたその他。
【０４４９】
全ての組織を固定剤としての１０％中性緩衝化ホルマリンに入れた。設計により犠牲にしたマウスは以下の器官＊重量を有した：肝臓、腎臓および脾臓。相対的器官重量（最終身体重量のパーセント）を計算した。群１および５から収集した全ての組織を処理してスライドに移し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、顕微鏡により調べた。群２ないし４からの肝臓、腎臓、肺および脾臓を処理してスライドに移し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、顕微鏡により調べた。
結論
当業者であれば、同様なルーチン的手法を本発明のいずれかのキメラ分子で行うことができることを認識する。
【０４５０】
（特許および特許出願）
米国特許第４，６７７，０６４号
米国特許第５，２４７，０７０号
米国特許第５，４２２，１０４号
米国特許第５，５１９，１１９号
米国特許第５，６０６，０２３号
米国特許第５，６５２，３５３号
米国特許第５，６５２，３５３号
米国特許第５，７７３，５８２号
ＷＯ  ９３／２１２３２
ＷＯ  ９７／２２３６４
ＷＯ  ９７／４６２５９
ＷＯ  ９９／４５１２８
ＷＯ  ９９／４９０５９
（刊行物）
Ａ．Ｐ．Ｓｉｍｏｅｓ−Ｗｕｓｔ，Ｔ．Ｓｃｈｕｒｐｆ，Ｊ．Ｈａｌｌ，Ｒ．Ａ．Ｓｔａｈｅｌ  ａｎｄ  Ｕ．Ｚａｎｇｅｍｅｉｓｔｅｒ−Ｗｉｔｔｋｅ，Ｂｃｌ−２／ｂｃｌ−ｘＬ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ，ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ａｎｄ  ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．７６，ｐｐ．１５７−１６６（２００２）．
Ａ．Ｓｉｅｒｒａ，Ｘ．Ｃａｓｔｅｌｌｓａｇｕｅ，Ａ．Ｅｓｃｏｂｅｄｏ，Ｂ．Ｌｌｏｖｅｒａｓ，Ｍ．Ｇａｒｃｉａ−Ｒａｍｉｒｅｚ，Ａ．Ｍｏｒｅｎｏ  ａｎｄ  Ａ．Ｆａｂｒａ，Ｂｃｌ−２  ｗｉｔｈ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｌｌｏｗｓ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ：ａ  ｐａｔｈｗａｙ  ｔｏ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８９，ｐｐ．１４２−１４７（２０００）．
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Ｂａｊｅｔｔａ  Ｅ，Ｄｅｌ  Ｖｅｃｃｈｉｏ  Ｍ，Ｂｅｒｎａｒｄ−Ｍａｒｔｙ  Ｃ，Ｖｉｔａｌｉ  Ｍ，Ｂｕｚｚｏｎｉ  Ｒ，Ｒｉｘｅ  Ｏ，Ｎｏｖａ  Ｐ，Ａｇｌｉｏｎｅ  Ｓ，Ｔａｉｌｌｉｂｅｒｔ  Ｓ，ａｎｄ  Ｋｈａｙａｔ  Ｄ（２００２）．Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ：ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２９，４２７−４４５．
Ｂａｒｇｍａｎ  ＣＩ，Ｈｕｎｇ  ＭＣ，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ＲＡ．Ｔｈｅ  ｎｅｕ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ  １９８６；３１９：２２６−３０．
Ｂｅｌｋａ  Ｃ，Ｈｅｉｎｒｉｃｈ  Ｖ，Ｍａｒｉｎｉ  Ｐ，Ｆａｌｔｉｎ  Ｈ，Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｏｓｔｈｏｆｆ  Ｋ，Ｂａｍｂｅｒｇ  Ｍ，ａｎｄ  Ｂｕｄａｃｈ  Ｗ（１９９９）．Ｉｏｎｉｚｉｎｇ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｓｐａｓｅ−８  ｉｎ  ｈｉｇｈｌｙ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｂｉｏｌ  ７５，１２５７−１２６４．
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Ｂｏｚ  Ｇ，Ｄｅ  Ｐａｏｌｉ  Ａ，Ｉｎｎｏｃｅｎｔｅ  Ｒ．，Ｒｏｓｓｉ  Ｃ．，Ｔｏｓｏｌｉｎｉ  Ｇ．，Ｐｅｄｅｒｚｏｌｉ  Ｐ，Ｔａｌａｍｉｎｉ，Ｒ，Ｔｒｏｖｏ，ＭＧ．Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ    ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏｎｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ  ２００１；５１：７３６−４０．
Ｂｒｅｎｎａｎ  Ｐ，Ｂａｂｂａｇｅ  ＪＷ，Ｂｕｒｇｅｒｉｎｇ  ＢＭ，Ｇｒｏｎｅｒ  Ｂ，Ｒｅｉｆ  Ｋ，Ｃａｎｔｒｅｌｌ  ＤＡ．Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−ｋｉｎａｓｅ  ｃｏｕｐｌｅｓ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９７；７：６７９−８９．
Ｂｕｃｈｌｅｒ  Ｐ，Ｒｅｂｅｒ  ＨＡ，Ｂｕｃｈｌｅｒ  ＭＣ，Ｒｏｔｈ  ＭＡ，Ｂｕｃｈｌｅｒ，ＭＷ，Ｆｒｉｅｓｓ  Ｈ，Ｉｓａｃｏｆｆ，ＷＨ，Ｈｉｎｅｓ，ＯＪ．Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉ−ＨＥＲ２  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）．Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｓｕｒｇ  ２００１；５：１３９−４６．
Ｂｕｃｈｓｂａｕｍ  ＤＪ，Ｂｏｎｎｅｒ  ＪＡ，Ｇｒｉｚｚｌｅ  ＷＥ，Ｓｔａｃｋｈｏｕｓｅ  ＭＡ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  Ｍ，Ｈｉｃｋｌｉｎ  ＤＪ，Ｂｏｈｌｅｎ，Ｐ，Ｒａｉｓｃｈ，ＫＰ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｒｂｉｔｕｘ（ＩＭＣ−Ｃ２２５）ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ，ａｎｄ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ  ２００２；５４：１１８０−９３．
Ｂｕｒｇｅｒ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｄａｙｅｒ，Ｊ．Ｍ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，ａｃｕｔｅ−ｐｈａｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａｎｄ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ：ＩＬ−１  ａｎｄ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｎｔａｃｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９６６：４６４−４７３，Ｒｅｖｉｅｗ，２００２．
Ｂｕｔｅｒａ  Ｊ，Ｍａｌａｃｈｏｖｓｋｙ  Ｍ，Ｒａｔｈｏｒｅ  Ｒ，Ｓａｆｒａｎ  Ｈ．Ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  １９９８；３：Ｅ２２６−Ｅ２２９．
Ｃ．Ｂｏｔｔｉ，Ｓ．Ｂｕｇｌｉｏｎｉ，Ｍ．Ｂｅｎｅｖｏｌｏ，Ｄ．Ｇｉａｎｎａｒｅｌｌｉ，Ｐ．Ｐａｐａｌｄｏ，Ｆ．Ｃｏｇｎｅｔｔｉ，Ｐ．Ｖｉｃｉ，Ｆ．Ｄｉ  Ｆｉｌｉｐｐｏ，Ｆ．Ｄｅｌ  Ｎｏｎｎｏ，Ｆ．Ｍ．Ｖｅｎａｎｚｉ，Ｐ．Ｇ．Ｎａｔａｌｉ  ａｎｄ  Ｍ．Ｍｏｔｔｏｌｅｓｅ，Ａｌｔｅｒｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＦＡＳ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ｓｔａｇｅ  Ｉ−ＩＩ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０，ｐｐ．１３６０−１３６５（２００４）．
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Ｃａｐｐｅｌｌｏ，Ｐ．，Ｎｏｖｅｌｌｉ，Ｆ．，Ｆｏｒｎｉ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｇｉｏｖａｒｅｌｌｉ，Ｍ．Ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２５：１−１５，２００２．
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Ｃｏｃｈｅｒ，Ｄ．，Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．，Ｒｏｓｅｌｌｉ，Ｍ．，Ｈａｒｄｍａｎ，Ｋ．Ｄ．，Ｈｏｈｎｓｏｎ，Ｓ．，Ｐｏｐｅ，Ｓ．，Ｄｏｄｄ，Ｓ．Ｗ．，Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏ，Ｍ．Ｗ．，Ｍｉｌｅｎｉｃ，Ｄ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｌｏｍ，Ｊ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｕｍｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８２：１１９１−１１９７，１９９０．
Ｃｏｌｃｈｅｒ  Ｄ，Ｂｉｒｄ  Ｒ，Ｒｏｓｅｌｌｉ  Ｍ，Ｈａｒｄｍａｎ  ＫＤ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｓ，Ｐｏｐｅ  Ｓ，Ｄｏｄｄ  ＳＷ，Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏ  ＭＷ，Ｍｉｌｅｎｉｃ  ＤＥ，Ｓｃｈｌｏｍ  Ｊ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｕｍｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  １９９０；８２：１１９１−１１９７．
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Ｃｏｕｓｓｅｎｓ  Ｌ，Ｙａｎｇ−Ｆｅｎｇ  ＴＬ，Ｌｉａｏ  ＹＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｈａｒｅｓ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｎｅｕ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８５；２３０：１１３２−９．
Ｃｏｗａｎ，Ｋ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｓｔｏｒｅｙ，Ｋ．Ｂ．  Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅｓ：ｎｅｗ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｓｔｒｅｓｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．，２０６：１１０７−１１１５，２００３．
Ｃｕｒｎｉｓ  Ｆ，Ｇａｓｐａｒｒｉ  Ａ，Ｓａｃｃｈｉ  Ａ，Ｌｏｎｇｈｉ  Ｒ，Ｃｏｒｔｉ  Ａ．Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｗｉｔｈ  ａｌｐｈａＶ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｉｔｓ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００４；６４：５６５−５７１．
Ｄ．Ｌ．Ｎｅｗｔｏｎ，Ｈ．Ｊ．Ｈａｎｓｅｎ，Ｈ．Ｌｉｕ，Ｄ．Ｒｕｂｙ，Ｍ．Ｓ．Ｉｏｒｄａｎｏｖ，Ｂ．Ｅ．Ｍａｇｕｎ，Ｄ．Ｍ．Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｓ．Ｍ．Ｒｙｂａｋ，Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＤ２２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ  ｗｉｔｈ  ＲＮＡ  ｄａｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３９，ｐｐ．７９−８６（２００１）．
Ｄａｄａｃｈｏｖａ  Ｅ，Ｎｏｓａｎｃｈｕｋ  ＪＤ，Ｓｈｉ  Ｌ，Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ  ＡＤ，Ｆｒｅｎｋｅｌ  Ａ，Ｎｏｓａｎｃｈｕｋ  ＪＳ，Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ  Ａ．Ｄｅａｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｔｕｍｏｒｓ  ｐｒｏｖｉｄｅ  ａｂｕｎｄａｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｉｏｎｉｚｉｎｇ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｍＡｂ  ｔｏ  ｍｅｌａｎｉｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２００４；１０１：１４８６５−１４８７０．
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Ｄｅｌｌ’Ｅｒｂａ  Ｌ，Ｃａｌｏ−Ｇａｂｒｉｅｌｉ  Ｇ，Ｃａｒｕｓｏ  ＭＬ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｒ，Ｃｏｒｔｉｎｏ  Ｇ，Ｖａｌｅｎｔｉｎｉ  ＡＭ，Ｍｕｔｏ  Ｐ，Ａｌｂｒｉｚｉｏ  Ｍ，Ｐａｓｔｅｎａ  ＭＩ，Ｌａｓｔｏｒｉａ  Ｓ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｍｅｌａｎｏｍａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ２２５．２８Ｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｉｏｐｓｉｅｓ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００１；２１：９２５−９３０．
Ｄｅｒｇｈａｍ  ＳＴ，Ｄｕｇａｎ  ＭＣ，Ｊｏｓｈｉ  ＵＳ，Ｃｈｅｎ  ＹＣ，Ｄｕ  Ｗ，Ｓｍｉｔｈ  ＤＷ，Ａｒｌａｕｓｋａｓ，Ｐ，Ｃｒｉｓｓｍａｎ，ＪＤ，Ｖａｉｔｋｅｖｉｃｉｕｓ，ＶＫ，Ｓａｒｋａｒ，ＦＨ．Ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ−１）ａｎｄ  ｐ５３  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ  １９９７；８０：３７２−８１．
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Ｆ．Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ａｒｒｉｂａｓ，Ｍ．Ｊ．Ｎｕｎｅｚ−Ｖｉｌｌａｒ，Ａ．Ｒ．Ｌｕｃａｓ，Ｊ．Ｓａｎｃｈｅｚ，Ａ．Ｔｅｊｅｒｉｎａ  ａｎｄ  Ｊ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｂｃｌ−２  ａｎｄ  Ｂａｘ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｆｒｅｓｈ  ｔｕｍｏｒ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｆｒｏｍ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２３，ｐｐ．５６５−５６８（２００３）．
Ｆｒｅｙ  Ｃ，Ｔｗｏｍｅｙ  Ｐ，Ｋｅｅｈｎ  Ｒ，Ｅｌｌｉｏｔｔ  Ｄ，Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｇ．Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ５−ＦＵ  ａｎｄ  ＣＣＮＵ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ：ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ．Ｃａｎｃｅｒ  １９８１；４７：２７−３１．
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Ｇｊｅｒｔｓｅｎ  ＭＫ，Ｇａｕｄｅｒｎａｃｋ  Ｇ．Ｍｕｔａｔｅｄ  Ｒａｓ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ  １９９８；７４（２）：４８９−９５．
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Ｇｒａｆ  ＬＨ，Ｊｒ．ａｎｄ  Ｆｅｒｒｏｎｅ  Ｓ．Ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｓｅｒ  １９８９；４３：６４３−６７９．
Ｇｕｍｂｓ  ＡＡ，Ｍｏｏｒｅ  ＰＳ，Ｆａｌｃｏｎｉ  Ｍ，Ｂａｓｓｉ  Ｃ，Ｂｅｇｈｅｌｌｉ  Ｓ，Ｍｏｄｌｉｎ  Ｉ，Ｓｃａｒｐａ，Ａ．Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ，ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ，ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｎｅｏｐｌａｓｍｓ．Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ  ２００２；８１：４５−５３．
Ｇｕｎｚｂｕｒｇ  ＷＨ，Ｓａｌｍｏｎｓ  Ｂ．Ｎｏｖｅｌ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２００１；７：３０−７．
Ｈａｈｎ  ＳＡ，Ｋｅｒｎ  ＳＥ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｅｘｏｃｒｉｎｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｎｅｏｐｌａｓｍｓ．Ｓｕｒｇ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  １９９５；７５：８５７−６９．
Ｈａｎａｄａ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ａ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．，１３：４１３−４２１，Ｒｅｖｉｅｗ，２００２．
Ｈａｒｉｍａｙａ，Ｋ．，Ｔａｎａｋａ，Ｋ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｙ．，Ｓａｔｏ，Ｈ．，Ｍａｔｓｕｄａ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｉｗａｍｏｔｏ，Ｙ．  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ＴＮＦａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ  ｃｅｌｌｓ：ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＮＦｋａｐｐａＢ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，８：１２１−１２９，２０００．
Ｈａｙｃｏｘ  Ａ，Ｌｏｍｂａｒｄ  Ｍ，Ｎｅｏｐｔｏｌｅｍｏｓ  Ｊ，Ｗａｌｌｅｙ  Ｔ．Ｒｅｖｉｅｗ  ａｒｔｉｃｌｅ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｍａｌ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ａｌｉｍｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  １９９８；１２：９４９−６４．
Ｈｅｈｌｇａｎｓ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｍａｎｎｅｌ，Ｄ．Ｎ．Ｔｈｅ  ＴＮＦ−ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３８３：１５８１−１５８５，２００２．
Ｈｅｌｍｂａｃｈ  Ｈ，Ｒｏｓｓｍａｎｎ  Ｅ，Ｋｅｒｎ  ＭＡ，Ｓｃｈａｄｅｎｄｏｒｆ  Ｄ．Ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００１；９３：６１７−６２２．
Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｍ，Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｍ，Ｗｅｌｓ  Ｗ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  １９９８；４７：１６７−７５．
Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ＨＲ，Ｒａｕｓ  ＪＣ，Ｖｏｌｃｋａｅｒｔ  Ｇ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ：ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｈｙｂｒｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９９１；１０９６：３４５−３５４．
Ｈｕｄｚｉａｋ  ＲＭ，Ｌｅｗｉｓ  ＧＤ，Ｓｈａｌａｂｙ  ＭＲ，ｅｔ  ａｌ．Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＥＲ／ＥＲＢＢ２  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  α  ｉｎ  ＮＩＨ  ３Ｔ３  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８８；８５：５１０２−６．
Ｈｕｍｂｅｒｔ  Ｍ，Ｄｅｖｅｒｇｎｅ  Ｏ，Ｃｅｒｒｉｎａ  Ｊ，Ｒａｉｎ  Ｂ，Ｓｉｍｏｎｎｅａｕ  Ｇ，Ｄａｒｔｅｖｅｌｌｅ  Ｐ，Ｄｕｒｏｕｘ  Ｐ，Ｇａｌａｎａｕｄ  Ｐ，ａｎｄ  Ｅｍｉｌｉｅ  Ｄ（１９９２）．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ｌｕｎｇ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｓ．Ａｍ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｄｉｓ  １４５，１１７８−１１８４．
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Ｈｙｎｅｓ  ＮＥ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｎ  ＤＦ．Ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｅｒｂＢ−２／ｎｅｕ／ＨＥＲ−２  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９９４；１１９８：１６５−１８４．
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Ｊａｆｆｅｅ  ＥＭ，Ｈｒｕｂａｎ  ＲＨ，Ｂｉｅｄｒｚｙｃｋｉ  Ｂ，Ｌａｈｅｒｕ  Ｄ，Ｓｃｈｅｐｅｒｓ  Ｋ，Ｓａｕｔｅｒ  ＰＲ，Ｇｏｅｍａｎｎ，Ｍ，Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｊ，Ｇｒｏｃｈｏｗ，Ｌ，Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒ，ＲＣ，Ｌｉｌｌｅｍｏｅ，ＫＤ，Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｖｅｌ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ：ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００１；１９：１４５−５６．
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Ｊｉａｎｇ  ＢＨ，Ｚｈｅｎｇ  ＪＺ，Ａｏｋｉ  Ｍ，Ｖｏｇｔ  ＰＫ．Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−ｋｉｎａｓｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０００；９７：１７４９−５３．
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Ｋｎｕｅｆｅｒｍａｎｎ  Ｃ，Ｌｕ  Ｙ，Ｌｉｕ  Ｂ，Ｊｉｎ  Ｗ，Ｌｉａｎｇ  Ｋ，Ｗｕ  Ｌ，Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｍ，Ｍｉｌｌｅｓ  ＧＢ，Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ  Ｊ，Ｆａｎ  Ｚ．ＨＥＲ２／ＰＩ−３Ｋ／Ａｋｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ａ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００３；２２：３２０５−１２．
Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．，Ｅｎｄｏ，Ｋ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｙ．，Ｓａｇａ，Ｔ．，Ｓａｋａｈａｒａ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｉｎｄｉｕｍ−１１１−ｌａｂｅｌｅｄ  ＺＭＥ−０１８  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｊｐｎ．Ｊ．ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，７９：９７３−９８１，１９８８．
Ｋｏｓｈｉｔａ  Ｙ，Ｌｕ  Ｙ，Ｆｕｊｉｉ  Ｓ，Ｎｅｄａ  Ｈ，Ｍａｔｓｕｙａｍａ  Ｔ，Ｓａｔｏｈ  Ｙ，Ｉｔｏｈ  Ｙ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｍ，Ｋａｔｏ  Ｊ，Ｓａｋａｍａｋｉ  Ｓ，．Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ  ｇｅｎｅ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｕｍｏｒ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９５；６３：１３０−１３５．
Ｋｒａａｎ  ＭＣ，Ｈａｒｉｎｇｍａｎ  ＪＪ，Ｗｅｅｄｏｎ  Ｈ，Ｂａｒｇ  ＥＣ，Ｓｍｉｔｈ  ＭＤ，Ａｈｅｒｎ  ＭＪ，Ｓｍｅｅｔｓ  ＴＪ，Ｂｒｅｅｄｖｅｌｄ  ＦＣ，ａｎｄ  Ｔａｋ  ＰＰ（２００４）．Ｔ  ｃｅｌｌｓ，ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ  ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅｓ，ａｎｄ  ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ＋  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｊｏｉｎｔ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｅｎｔ  ｏｎｓｅｔ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ６３，４８３−４８８．
Ｋｒｅｉｔｍａｎ  ＲＪ（１９９９）．Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１，５７０−５７８．
Ｋｕｌｋｅ  ＭＨ．Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｕｒｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｏｐｔｉｏｎｓ  Ｏｎｃｏｌ  ２００２；３：４４９−５７．
Ｋｕｒｏｄａ  Ｋ，Ｍｉｙａｔａ  Ｋ，Ｆｕｊｉｔａ  Ｆ，Ｋｏｉｋｅ  Ｍ，Ｆｕｊｉｔａ  Ｍ，Ｎｏｍｕｒａ  Ｍ，Ｎａｋａｇａｗａ  Ｓ，Ｔｓｕｔｓｕｍｉ  Ｙ，Ｋａｗａｇｏｅ  Ｔ，Ｍｉｔｓｕｉｓｈｉ  Ｙ，Ｍａｙｕｍｉ  Ｔ．Ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｍｕｔａｎｔ  ＲＧＤ−Ｖ２９（Ｆ４６１４）ｓｈｏｗｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｅｄ  ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  ２０００；１５９：３３−４１．
Ｋｕｒｏｄａ  Ｋ，Ｍｉｙａｔａ  Ｋ，Ｓｈｉｋａｍａ  Ｈ，Ｋａｗａｇｏｅ  Ｔ，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｋ，Ｔａｋｅｄａ  Ｋ，Ｓａｋａｅ  Ｎ，Ｋａｔｏ  Ｍ．Ｎｏｖｅｌ  ｍｕｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｌｅｓｓ  ｌｅｔｈａｌ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９５；６３：１５２−１５７．
Ｋｕｒｓｃｈｕｓ  ＦＣ，Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ  Ｍ，Ｆｅｌｌｏｗｓ  Ｅ，Ｄｏｒｎｍａｉｒ  Ｋ，Ｒｕｄｏｌｐｈ  Ｒ，Ｌｉｌｉｅ  Ｈ，ａｎｄ  Ｊｅｎｎｅ  ＤＥ（２００４）．Ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｅｒｆｏｒｉｎ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５６２，８７−９２．
Ｌ．Ｍ．Ｖｅｅｎｅｎｄａａｌ，Ｈ．Ｊｉｎ，Ｓ．Ｒａｎ，Ｌ．Ｃｈｅｕｎｇ，Ｎ．Ｎａｖｏｎｅ，Ｊ．Ｗ．Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．Ｔｈｏｒｐｅ  ａｎｄ  Ｍ．Ｇ．Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ，Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ＶＥＧＦ１２１／ｒＧｅｌｏｎｉｎ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｆｕｓｉｏｎ  ｔｏｘｉｎ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９９，ｐｐ．７８６６−７８７１（２００２）．
Ｌ．Ｓｅｒｒｏｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｈｅｒｓｅｙ，Ｔｈｅ  ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ：ａｎ  ｕｐｄａｔｅ，Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ．９，ｐｐ．５１−５８（１９９９）．
Ｌｅｍｏｉｎｅ  ＮＲ，Ｈｕｇｈｅｓ  ＣＭ，Ｂａｒｔｏｎ  ＣＭ，Ｐｏｕｌｓｏｍ  Ｒ，Ｊｅｆｆｅｒｙ  ＲＥ，Ｋｌｏｐｐｅｌ  Ｇ，Ｈａｌｌ，ＰＡ，Ｇｕｌｌｉｃｋ，ＷＪ．Ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １９９２；１６６：７−１２．
Ｌｅｏｎｇ，Ｓ．Ｐ．Ｆｕｔｕｒｅ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｏｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｓｕｒｇ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．，８３（２）：４５３−４５６，Ｘ，Ｒｅｖｉｅｗ，２００３．
Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ  Ａ，Ｂｅｒｅｎｓｏｎ  Ｊ，Ｇｅｒａ  ＪＦ，Ｗａｌｄｂｕｒｇｅｒ  Ｋ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｍａｚａ  Ｏ，Ｂｅｒｅｋ  ＪＳ．Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９０；５０：７３６４−７０．
Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ  Ａ，Ｇｅｒａ  ＪＦ，Ａｎｄｒｅｗｓ  Ｊ，Ｂｅｒｅｎｓｏｎ  Ｊ，Ｗａｒｅ  ＣＦ．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｔｈｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９１；１４６：２０５２−８．
Ｌｉｎ，Ａ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＪＮＫ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ：ｂｒｅａｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｒａｋｅ  ｏｎ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，２５：１７−２４，Ｒｅｖｉｅｗ，２００３．
Ｌｉｐｐｋｅ，Ｊ．Ａ．，Ｇｕ，Ｙ．，Ｓａｒｎｅｃｋｉ，Ｃ．，Ｃａｒｏｎ，Ｐ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｓｕ，Ｍ．Ｓ−Ｓ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＰＰ３２／Ｍｃｈ２  ｈｏｍｏｌｏｇ  １，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ＣＰＰ３２．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１８２５−１８２８，１９９６．
Ｌｉｕ  Ｙ，Ｃｈｅｕｎｇ  ＬＨ，Ｈｉｔｔｅｌｍａｎ  ＷＮ，Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ＭＧ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｉｇｈｌｙ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｇｅｎｔｓ．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２００３；２：１３４１−１３５０．
Ｌｉｕ  Ｙ，Ｃｈｅｕｎｇ  ＬＨ，Ｍａｒｋｓ  ＪＷ，Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ＭＧ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｕｓｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００４；１０８：５４９−５５７．
Ｌｉｕ  Ｙ，Ｃｈｅｕｎｇ  ＬＨ，Ｔｈｏｒｐｅ  Ｐ，ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ＭＧ（２００３）．Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｔｏｘｉｎ  ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）１２１  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ：ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｅｖｅｎｔｓ  ｉｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２，９４９−９５９．
Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｃｈｅｕｎｇ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ，Ｍ．Ｇ．Ｔｈｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｎ  ｏｖｅｒｃｏｍｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ＴＮＦａ．Ｐｒｏｃ．Ｏｆ    ＡＡＣＲ（Ａｂｓｔｒａｃｔ  ＃  １２３７）４１：１９４，２０００．
Ｌｏｃｋｓｌｅｙ  ＲＭ，Ｋｉｌｌｅｅｎ  Ｎ，Ｌｅｎａｒｄｏ  ＭＪ．Ｔｈｅ  ＴＮＦ  ａｎｄ  ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｉｅｓ  ｉｎｔｅｒｇｒａｔｉｎｇ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｃｅｌｌ  ２００１；１０４：４８７−５０１．
Ｌｏｈｒｉｓｃｈ  Ｃ，Ｐｉｃｃａｒｔ  Ｍ．Ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ＨＥＲ２．Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００１；２８：３−１１．
Ｌｏｋｉｃｈ  Ｊ  Ｊ，Ｓｋａｒｉｎ  ＡＴ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ（５−ＦＵ；ＮＳＣ−１９８９３）ａｎｄ  １，３−ｂｉｓ（２−ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌ）−１−ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ（ＢＣＮＵ；ＮＳＣ−４０９９６２）ｆｏｒ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｒｅｐ  １９７２；５６：６５３−５７．
Ｌｙｕ  ＭＡ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ＭＧ．Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ−ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＳＫＢＲ−３  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）ｖｉａ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２００５；４：１２０５−１２１３．
Ｍ．Ｇ．Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ，Ｌ．Ｈ．Ｃｈｅｕｎｇ，Ｙ．Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｊ．Ｗ．Ｍａｒｋｓ，ＩＩＩ，Ｄｅｓｉｇｎ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｍｅｌａｎｏｍａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｕｓｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｔｏｘｉｎ  ｇｅｌｏｎｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３，ｐｐ．３９９５−４００２（２００３）．
Ｍ．Ｊ．Ｓｅｒｒａｎｏ，Ｐ．Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒｏｖｉｒａ，Ｉ．Ａｌｇａｒｒａ，Ａ．Ｊａｅｎ，Ａ．Ｌｏｚａｎｏ  ａｎｄ  Ｊ．Ｊ．Ｇａｆｏｒｉｏ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ−ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ−ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｓｃｈｅｄｕｌｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｅｘｔｅｎｔ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９３，ｐｐ．５５９−５６６（２００２）．
ＭａｃＤｏｎａｌｄ  Ｇ，Ｓｈｉ  Ｌ，Ｖａｎｄｅ  ＶＣ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  Ｊ，ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ＡＨ（１９９９）．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  −ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８９，１３１−１４４．
Ｍａｃｅｙ  ＤＪ，Ｄｅｎａｒｄｏ  ＳＪ，Ｄｅｎａｒｄｏ  ＧＬ，Ｇｏｏｄｎｉｇｈｔ  ＪＫ，Ｕｎｇｅｒ  ＭＷ．Ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ｉｎｄｉｕｍ−１１１−ｌａｂｅｌｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＺＭＥ−０１８  ａｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｓｉｚｅ  ｉｎ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  １９８８；３：１−６．
Ｍａｇｅｅ  ＣＪ，Ｇｈａｎｅｈ  Ｐ，Ｎｅｏｐｔｏｌｅｍｏｓ  ＪＰ．Ｓｕｒｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ２００２；１６：４３５−５５．
Ｍａｒｔｉ，Ａ．，Ｌｕｏ，Ｚ．，Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｃ．，Ｏｈｔａ，Ｙ．，Ｈａｒｔｗｉｇ，Ｊ．，Ｓｔｏｓｓｅｌ，Ｔ．Ｐ．，Ｋｙｒｉａｋｉｓ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ  Ａｖｒｕｃｈ，Ｊ．Ａｃｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２８０  ｂｉｎｄｓ  ｔｈｅ  ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ（ＳＡＰＫ）ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＳＥＫ−１  ａｎｄ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＡＰＫ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：２６２０−２６２８，１９９７．
Ｍａｔｓｕｎｏ  Ｓ，Ｅｇａｗａ  Ｓ，Ａｒａｉ  Ｋ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ  Ｐａｎｃｒｅａｔ  Ｓｕｒｇ  ２００１；８：５４４−４８．
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Ｍｅｄｅｍａ  ＪＰ，Ｓｃａｆｆｉｄｉ  Ｃ，Ｋｉｓｃｈｋｅｌ  ＦＣ，ｅｔ  ａｌ．ＦＬＩＣＥ  ｉｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＣＤ９５  ｄｅａｔｈ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ（ＤＩＳＣ）．ＥＭＢＯ  Ｊ  １９９７；１６：２７９４−８０４．
Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｍ，Ｍｏｏｒｅ  Ｍ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｈｕｎｔｉｎｇｔ）１９９７；１１：１６１５−２２．
Ｍｉｈａｒａ  Ｍ，Ｋｏｉｓｈｉｈａｒａ  Ｙ，Ｆｕｋｕｉ  Ｈ，Ｙａｓｕｋａｗａ  Ｋ，Ｏｈｓｕｇｉ  Ｙ．Ｍｕｒｉｎｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩＬ−６  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｌｏｎｇｓ  ｔｈｅ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ  ｉｎ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ｔｈｕｓ  ｐｒｏｌｏｎｇｓ  ｔｈｅ  ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ−６  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９１；７４：５５−５９．
Ｍｉｎａｍｉ，Ｔ．，Ａｂｉｄ，Ｍ．Ｒ．，Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，Ｋｉｎｇ，Ｇ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｔ．，ａｎｄ  Ａｉｒｄ，Ｗ．Ｃ．Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１  ｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ（ＰＫＣ）−ｄｅｌｔａ−ＮＦ−ｋａｐｐａ  Ｂ  ａｎｄ  ＰＫＣ−ｚｅｔａ−ＧＡＴＡ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：６９７６−６９８４，２００３．
Ｍｏｒｉｔｚ  Ｔ，Ｎｉｅｄｅｒｌｅ  Ｎ，Ｂａｕｍａｎｎ  Ｊ，Ｍａｙ  Ｄ，Ｋｕｒｓｃｈｅｌ  Ｅ，Ｏｓｉｅｋａ  Ｒ，Ｋｅｍｐｅｎｉ  Ｊ，Ｓｃｈｌｉｃｋ  Ｅ，Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＣＧ．Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  １９８９；２９：１４４−１５０．
Ｍｕｉｓｅ−Ｈｅｌｍｅｒｉｃｋｓ  ＲＣ，Ｇｒｉｍｅｓ  ＨＬ，Ｂｅｌｌａｃｏｓａ  Ａ，Ｍａｌｓｔｒｏｍ  ＳＥ，Ｔｓｉｃｈｌｉｓ  ＰＮ，Ｒｏｓｅｎ  Ｎ（１９９８）Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ  ｖｉａ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｌｏ  ３−ｋｉｎａｓｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：２９８６４−２９８７２．
Ｍｕｉｓｅ−Ｈｅｌｍｅｒｉｃｋｓ  ＲＣ，Ｇｒｉｍｅｓ  ＨＬ，Ｂｅｌｌａｃｏｓａ  Ａ，Ｍａｌｓｔｒｏｍ  ＳＥ，Ｔｓｉｃｈｌｉｓ  ＰＮ，Ｒｏｓｅｎ  Ｎ．Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ  ｖｉａ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｌｏ  ３−ｋｉｎａｓｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９８；２７３：２９８６４−７２．
Ｍｕｊｏｏ  Ｋ，Ｃｈｅｕｎｇ  Ｌ，Ｍｕｒｒａｙ  ＪＬ，Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ＭＧ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，ｔｉｓｓｕｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ＺＭＥ−ｇｅｌｏｎｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  １９９５；４０：３３９−３４５．
Ｍｕｒｐｈｙ  ＪＲ，Ｌａｋｋｉｓ  ＦＧ，ｖａｎｄｅｒＳｐｅｋ  ＪＣ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｐ，Ｓｔｒｏｍ  ＴＢ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｉａｇｎ  Ｔｈｅｒ  １９９２；７：３６５−３８２．
Ｍｕｓｔｉｋａ  Ｒ，Ｂｕｄｉｙａｎｔｏ  Ａ，Ｎｉｓｈｉｇｏｒｉ  Ｃ，Ｉｃｈｉｈａｓｈｉ  Ｍ，ａｎｄ  Ｕｅｄａ  Ｍ（２００５）．Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｐａｆ−１  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １８，５９−６２．
Ｎａｇａｔａ  Ｓ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ｄｅａｔｈ  ｆａｃｔｏｒ．Ｃｅｌｌ  １９９７；８８：３５５−６５．
Ｎｉｉｔｓｕ，Ｙ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｎ．，Ｓｏｎｅ，Ｈ．，Ｎｅｄａ，Ｈ．，Ｙａｍａｕｃｈｉ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｕｒｕｓｈｉｚａｋｉ，Ｉ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ．Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，７６：１１９３−１１９７，１９８５．
Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．，Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ，Ｍ．Ｇ．，Ｎｅｗｍａｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐａｎｄｉｔａ，Ｔ．Ｋ．，Ｈｉｔｔｅｌｍａｎ，Ｗ．Ｎ．，ａｎｄ  Ｄｏｎａｔｏ，Ｎ．Ｊ．Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５２：４７５８−４７６５，１９９２．
Ｏｒｌｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ｚ．，ａｎｄ  Ｂａｌｄｗｉｎ，Ａ．Ｓ．Ｊｒ．ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，８：３８５−３８９，Ｒｅｖｉｅｗ，２００２．
Ｏｒｔｈ  Ｋ，Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ  ＡＭ，Ｇａｒｇ  Ｍ，Ｆｒｏｅｌｉｃｈ  ＣＪ，ａｎｄ  Ｄｉｘｉｔ  ＶＭ（１９９６）．Ｔｈｅ  ＣＥＤ−３／ＩＣＥ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｍｃｈ２  ｉｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｌｅａｖｅｓ  ｔｈｅ  ｄｅａｔｈ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｌａｍｉｎ  Ａ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１，１６４４３−１６４４６．
Ｏｓｂｏｒｎｅ  ＣＫ，Ｈｏｂｂｓ  Ｋ，ａｎｄ  Ｃｌａｒｋ  ＧＭ（１９８５）．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｅｓｔｒｏｇｅｎｓ  ｏｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａｔｈｙｍｉｃ  ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４５，５８４−５９０．
Ｏｚａｗａ  Ｓ，Ｕｅｄａ  Ｍ，Ａｎｄｏ  Ｎ，Ａｂｅ  Ｏ，Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｎ．Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｏｆ  ｅｓｏｐｈａｇｕｓ，ｌｕｎｇ，ｐａｎｃｒｅａｓ，ｃｏｌｏｒｅｃｔｕｍ，ｂｒｅａｓｔ  ａｎｄ  ｓｔｏｍａｃｈ．Ｊｐｎ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９８８；７９：１２０１−０７．
Ｐ．Ａ．Ｅｌｌｉｓ，Ｉ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ，Ｓ．Ｄｅｔｒｅ，Ｓ．Ａ．Ｂｕｒｔｏｎ，Ｊ．Ｓａｌｔｅｒ，Ｒ．Ａ’Ｈｅｒｎ，Ｇ．Ｗａｌｓｈ，Ｓ．Ｒ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ａｎｄ  Ｍ．Ｄｏｗｓｅｔｔ，Ｒｅｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｂｃｌ−２  ｉｎ  ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．４８，ｐｐ．１０７−１１６（１９９８）．
Ｐ．Ｌｉｐｐｏｎｅｎ，Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｗｉｔｈ  ｏｔｈｅｒ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ６，ｐｐ．１３−１６（１９９９）．
Ｐａｋ  ＢＪ，Ｌｅｅ  Ｊ，Ｔｈａｉ  ＢＬ，Ｆｕｃｈｓ  ＳＹ，Ｓｈａｋｅｄ  Ｙ，Ｒｏｎａｉ  Ｚ，Ｋｅｒｂｅｌ  ＲＳ，ａｎｄ  Ｂｅｎ  Ｄａｖｉｄ  Ｙ（２００４）．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｎａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｄｏｐａｃｈｒｏｍｅ  ｔａｕｔｏｍｅｒａｓｅ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３，３０−３８．
Ｐａｓｔａｎ  Ｉ  ａｎｄ  Ｋｒｅｉｔｍａｎ  ＲＪ．Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  ２００２；３：１０８９−１０９１．
Ｐａｓｔａｎ  Ｉ，Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ  ＭＣ，ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ  ＤＪ（１９８６）Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ．Ｃｅｌｌ  ４７：６４１−６４８．
Ｐａｓｔａｎ  Ｉ．Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ  Ａ：ａ  ｓｈｏｒｔ  ｈｉｓｔｏｒｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２００３；５２：３３８−３４１．
Ｐｅｇｒａｍ  ＭＤ，Ｌｏｐｅｚ  Ａ，Ｋｏｎｅｃｎｙ  Ｇ，Ｓｌａｍｏｎ  Ｄ  Ｊ．Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｄｒｕｇ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｓｙｎｅｒｇｉｅｓ．Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０００；２７：２１−５．
Ｐｅｒｍｅｒｔ  Ｊ，Ｈａｆｓｔｒｏｍ  Ｌ，Ｎｙｇｒｅｎ  Ｐ，Ｇｌｉｍｅｌｉｕｓ  Ｂ．Ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ａｃｔａ  Ｏｎｃｏｌ  ２００１；４０：３６１−７０．
Ｐｒｐｉｃ  ＭＬ，Ｋａｓｔｅｌａｎ  Ｍ，Ｇｒｕｂｅｒ  Ｆ，Ｌａｓｋａｒｉｎ  Ｇ，Ｓｏｔｏｓｅｋ  Ｔ，Ｖ，Ｓｔｒｂｏ  Ｎ，Ｚａｍｏｌｏ  Ｇ，Ｚａｕｈａｒ  Ｇ，ａｎｄ  Ｒｕｋａｖｉｎａ  Ｄ（２００４）．Ｐｅｒｆｏｒｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｓｋｉｎ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｌｉｃｈｅｎ  ｐｌａｎｕｓ．Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １５１，４３３−４３９．
Ｒ．Ａ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｐ．Ｂｈａｔ−Ｎａｋｓｈａｔｒｉ，Ｎ．Ｍ．Ｐａｔｅｌ，Ｄ．Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｏｕ，Ｓ．Ａｌｉ  ａｎｄ  Ｈ．Ｎａｋｓｈａｔｒｉ，Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−ｋｉｎａｓｅ／ＡＫＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ：ａ  ｎｅｗ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ａｎｔｉ−ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，ｐｐ．９８１７−９８２４（２００１）．
Ｒａｏ，Ｋ．Ｍ．  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．，６９：３−１０，Ｒｅｖｉｅｗ，２００１．
Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ＲＡ，Ｂｅｃｋｅｒ  ＪＣ，Ｇｉｌｌｉｅｓ  ＳＤ．Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：ａ  ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ  １９９７；７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ９９−１０６．
Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ＲＡ，Ｇｉｌｌｉｅｓ  ＳＤ，Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ  Ｊ，Ｖａｒｋｉ  ＮＭ，Ｂｅｃｋｅｒ  ＪＣ．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ  ｉｎ  ａｔｈｙｍｉｃ  ｎｕ／ｎｕ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９６；５６：１７０７−１２．
Ｒｉｅｕｘ−Ｌａｕｃａｔ  Ｆ，Ｌｅ  Ｄｅｉｓｔ  Ｆ，ａｎｄ  Ｄｅ  Ｓａｉｎｔ  ＢＧ（２００５）．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ａｎｄ  ｐｅｒｆｏｒｉｎ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５２，３０６−３０７．
Ｒｏ  ＪＳ，Ｅｌ−Ｎａｇｇａｒ  Ａ，Ｒｏ  ＪＹ，ｅｔ  ａｌ．Ｃ−ｅｒｂＢ−２  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｏｄｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９８９；４９：６９４１−４．
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Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ＭＧ，Ｃｈｅｕｎｇ  Ｌ，Ｋｉｍ  ＳＫ，Ｍｕｊｏｏ  Ｋ，Ｄｏｎａｔｏ  ＮＪ，Ｍｕｒｒａｙ  ＪＬ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ＺＭＥ−ｇｅｌｏｎｉｎ  ａｎｄ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  １９９６；４２：１１５−１２１．
Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ＭＧ，Ｃｈｅｕｎｇ  Ｌ，Ｍｕｊｏｏ  Ｋ，Ｍｕｒｒａｙ  ＪＬ．Ａｎ  ａｎｔｉｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ：ｔｉｓｓｕｅ  ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ，ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ，ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  １９９５；４０：３２２−３２８．
Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ＭＧ，Ｃｈｅｕｎｇ  Ｌ，Ｍｕｒｒａｙ  ＪＬ，Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅｗ  Ｒ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ−ａｌｐｈａ）：ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９９１；３：２１−７．
Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ＭＧ，Ｃｈｅｕｎｇ  ＬＨ，Ｌｉｕ  Ｙ，Ｍａｒｋｓ  ＪＷ，ＩＩＩ．Ｄｅｓｉｇｎ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｍｅｌａｎｏｍａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｕｓｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｔｏｘｉｎ  ｇｅｌｏｎｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００３；６３：３９９５−４００２．
Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ＭＧ，Ｈｏｒｎ  ＳＡ，Ｃｈｅｕｎｇ  ＬＨ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆｕｓｉｏｎ  ｔｏｘｉｎ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ−ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０００；８８：２６７−７３．
Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ＭＧ，Ｌｅｖｉｎ  Ｂ，Ｒｏｈ  Ｍ，Ｈｏｈｎ  Ｄ，ＭｃＣａｂｅ  Ｒ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｌ，Ｃｈｅｕｎｇ  Ｌ，Ｍｕｒｒａｙ  ＪＬ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  １３１Ｉ−ｌａｂｅｌｅｄ  ａｎｔｉｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＬｉＣＯ  １６．８８．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  １９９４；３９：３９７−４００．
Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ＭＧ，Ｍａｒｋｓ  ＪＷ，Ｃｈｅｕｎｇ  ＬＨ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｅｉｔｈｅｒ  ｎａｔｕｒａｌ  ｏｒ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｅｌｏｎｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １９９９；４４：３４３−３４８．
Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ＭＧ，Ｍｕｒｒａｙ  ＪＬ，Ｃｈｅｕｎｇ  Ｌ，Ｒｉｆｋｉｎ  Ｒ，Ｓａｌｍｏｎ  Ｓ，Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅｗ  Ｒ．Ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＺＭＥ−０１８  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｌａｎｔ  ｔｏｘｉｎ  ｇｅｌｏｎｉｎ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｈｅｒ  １９９１；３：６−１３．
Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ＭＧ，Ｖｅｒｓｃｈｒａｅｇｅｎ  ＣＦ，Ｍｕｒｒａｙ  ＪＬ，Ｋｕｄｅｌｋａ  ＡＰ，Ｇａｎｏ  Ｊ，Ｃｈｅｕｎｇ  Ｌ，Ｋａｖａｎａｇｈ  ＪＪ．Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ９０Ｙ−ｌａｂｅｌｅｄ  Ｂ７２．３  ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ：ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｄｏｓｅ  ａｎｄ  ＥＤＴＡ  ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９；５：９５３−９６１．
Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ，Ｍ．Ｇ．，Ｃｈｅｕｎｇ，Ｌ．，Ｋｉｍ，Ｓ．Ｋ．，Ｍｕｊｏｏ，Ｋ．，Ｄｏｎａｔｏ，Ｎ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｍｕｒｒａｙ，Ｊ．Ｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ＺＭＥ−ｇｅｌｏｎｉｎ  ａｎｄ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，４２：１１５−１２１，１９９６．
Ｒｏｓｓ  ＪＳ，Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  ＪＡ．Ｔｈｅ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ，ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ，ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  １９９８；３：２３７−５２．
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Ｒｕｂｉｏ  Ｎ，Ｅｓｐａｎａ  Ｌ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  Ｙ，Ｂｌａｎｃｏ  Ｊ，ａｎｄ  Ｓｉｅｒｒａ  Ａ（２００１）．Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｂｃｌ−ｘ（Ｌ）ｇｅｎｅ：ａ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｄｏｒｍａｎｃｙ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８１，７２５−７３４．
Ｓ．Ａｂｒａｍｏｖｉｔｃｈ  ａｎｄ  Ｈ．Ｗｅｒｎｅｒ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＢＲＣＡ１  ａｎｄ  ｐ５３  ｉｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＧＦ−ＩＲ  ｇｅｎｅ，Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｓ．３５，ｐｐ．７５８−７６２（２００３）．
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Ｓ．Ｊ．Ｐａｒｋ，Ｃ．Ｈ．Ｗｕ  ａｎｄ  Ａ．Ｒ．Ｓａｆａ，Ａ  Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−  ａｎｄ  ＭＲＰ１−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭＣＦ−７  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｗｉｔｈ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｃａｓｐａｓｅ−６，−７，−８，−９  ａｎｄ  −１０  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２４，ｐｐ．１２３−１３１（２００４）．
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Ｓａｂｂａｔｉｎｉ  Ｐ，ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ  Ｆ．Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ  ３−ＯＨ  ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）ａｎｄ  ＰＫＢ／Ａｋｔ  ｄｅｌａｙ  ｔｈｅ  ｏｎｓｅｔ  ｏｆ  ｐ５３−ｍｅｄｉａｔｅｄ，ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９９；２７４：２４２６３−９．
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Ｓａｆｒａｎ  Ｈ，Ｓｔｅｉｎｈｏｆｆ  Ｍ，Ｍａｎｇｒａｙ  Ｓ，Ｒａｔｈｏｒｅ  Ｒ，Ｋｉｎｇ  ＴＣ，Ｃｈａｉ  Ｌ，Ｂｅｒｚｅｉｎ，Ｋ，Ｍｏｏｒｅ，Ｔ，Ｌａｎｎｉｔｔｉ，Ｄ，Ｒｅｉｓｓ，Ｐ，Ｐａｓｑｕａｒｉｅｌｌｏ，Ｔ，Ａｋｅｒｍａｎ，Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００１；２４：４９６−９９．
Ｓａｋｏｒａｆａｓ  ＧＨ，Ｌａｚａｒｉｓ  Ａ，Ｔｓｉｏｔｏｕ  ＡＧ，Ｋｏｕｌｌｉａｓ  Ｇ，Ｇｌｉｎａｔｓｉｓ  ＭＴ，Ｇｏｌｅｍａｔｉｓ  ＢＣ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ  １９９５；２１：２５１−５３．
Ｓａｋｓ  Ｓ，Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  Ｍ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ：ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ｅａｒｌｙ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｓｅｒ  １９９２；５６：５６７−８７．
Ｓａｓａｋｉ  Ｍ，Ｋｕｍａｚａｋｉ  Ｔ，Ｔａｎｉｍｏｔｏ  Ｋ，ａｎｄ  Ｎｉｓｈｉｙａｍａ  Ｍ．Ｂｃｌ−２  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ａ  ｐｒｅｄｉｃａｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ．２００３；２２：１８１−８６．
Ｓｃｈａｆｅｒ  Ｊ，Ｂａｃｈｔｌｅｒ  Ｊ，Ｅｎｇｌｉｎｇ  Ａ，Ｌｉｔｔｌｅ  ＪＢ，Ｗｅｂｅｒ  ＫＪ，ａｎｄ  Ｗｅｎｚ  Ｆ（２００２）．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ＴＰ５３  ｓｔａｔｕｓ．Ｒａｄｉａｔ  Ｒｅｓ  １５８，６９９−７０６．
Ｓｃｈｅｒｆ  Ｕ，Ｂｅｎｈａｒ  Ｉ，Ｗｅｂｂｅｒ  ＫＯ，Ｐａｓｔａｎ  Ｉ，Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｕ．Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−Ｂ１（Ｆｖ）ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｎ  ＬｅＹ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９６；２：１５２３−１５３１．
Ｓｃｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｍ．Ｈ．，Ｒｏｓ，Ｊ．Ｅ．，Ｈｏｍａｎ，Ｍ．，Ｔｒａｕｔｗｅｉｎ，Ｃ．，Ｌｉｓｔｏｎ，Ｐ．，Ｐｏｅｌｓｔｒａ，Ｋ．，ｖａｎ  Ｇｏｏｒ，Ｈ．，Ｊａｎｓｅｎ，Ｐ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｍｏｓｈａｇｅ，Ｈ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏ−  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ：ＮＦ−ｋａｐｐａＢ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（ｃＩＡＰ２）ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．，３６：７４２−７５０，２００２．
Ｓｈｉ  Ｌ，Ｋｒａｕｔ  ＲＰ，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ  Ｒ，ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ＡＨ（１９９２）．Ａ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｇｒａｎｕｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈａｔ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７５，５５３−５６６．
Ｓｈｉｏｈａｒａ  Ｍ，Ｇｏｍｂａｒｔ  ＡＦ，Ｂｅｒｍａｎ  ＪＤ，Ｋｏｉｋｅ  Ｋ，Ｋｏｍｉｙａｍａ  Ａ，Ｋｏｅｆｆｌｅｒ  ＨＰ．Ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ＴＮＦａｌｐｈａ  ｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ｐ２１ＷＡＦ１．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９９７；１５：１６０５−１６０９．
Ｓｉｍｓｔｅｉｎ  Ｒ，Ｂｕｒｏｗ  Ｍ，Ｐａｒｋｅｒ  Ａ，Ｗｅｌｄｏｎ  Ｃ，ａｎｄ  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｂ（２００３）．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ａｎｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＭＣＦ−７  ｃｅｌｌ  ｍｏｄｅｌ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ（Ｍａｙｗｏｏｄ  ）２２８，９９５−１００３．
Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ＴＰ，Ｓｔｒｉｃｋｌｅｒ  ＪＧ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃ−ｅｒｂＢ−２（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ）ｏｎｃｏｇｅｎｅ．Ｐａｔｈｏｌ  Ａｎｎｕ  １９９２；２７：１６５−９０．
Ｓｌａｍｏｎ  ＤＪ，Ｃｌａｒｋ  ＧＭ，Ｗｏｎｇ  ＳＧ，Ｌｅｖｉｎ  ＷＪ，Ｕｌｌｒｉｃｈ  Ａ，ＭｃＧｕｉｒｅ  ＷＬ．Ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｌａｐｓｅ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｗｉｔｈ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８７；２３５：１７７−８２．
Ｓｌａｍｏｎ  ＤＪ，Ｇｏｄｏｌｐｈｉｎ  Ｗ，Ｊｏｎｅｓ  ＬＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ａｎｄ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８９；２４４：７０７−１２．
Ｓｌｅｉｊｆｅｒ  Ｓ，Ａｓｓｃｈｅｒｔ  ＪＧＷ，Ｔｉｍｍｅｒ−Ｂｏｓｓｃｈａ  Ｈ，Ｍｕｌｄｅｒ  ＮＨ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α  ｉｎ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｃ−ｅｒｂＢ２．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９８；７７：１０１−６．
Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ａ．，ａｎｄ  Ｂａｇｌｉｏｎｉ，Ｃ．  Ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓ  ａ  ｔｒｉｍｅｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：６９５１−６９５４，１９８７．
Ｓｍｙｔｈ  ＭＪ，ａｎｄ  Ｔｒａｐａｎｉ  ＪＡ（１９９５）．Ｇｒａｎｚｙｍｅｓ：ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｄｕｃｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １６，２０２−２０６．
Ｓｍｙｔｈ  ＭＪ，Ｂｒｏｗｎｅ  ＫＡ，Ｔｈｉａ  ＫＹ，Ａｐｏｓｔｏｌｉｄｉｓ  ＶＡ，Ｋｅｒｓｈａｗ  ＭＨ，ａｎｄ  Ｔｒａｐａｎｉ  ＪＡ（１９９４）．Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ：ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｇｒａｎｕｌｅ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｔｏ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２１，６７−７０．
Ｓｍｙｔｈ  ＭＪ，Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  ＭＤ，ａｎｄ  Ｔｒａｐａｎｉ  ＪＡ（１９９６）．Ｇｒａｎｚｙｍｅｓ：ａ  ｖａｒｉｅｔｙ  ｏｆ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｓｕｂｆａｍｉｌｉｅｓ．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ６０，５５５−５６２．
Ｓｏｅｎｇａｓ  ＭＳ，ａｎｄ  Ｌｏｗｅ  ＳＷ（２００３）．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２，３１３８−３１５１．
Ｓｐａｅｎｙ−Ｄｅｋｋｉｎｇ  ＥＨ，Ｈａｎｎａ  ＷＬ，Ｗｏｌｂｉｎｋ  ＡＭ，Ｗｅｖｅｒ  ＰＣ，Ｋｕｍｍｅｒ  ＡＪ，Ｓｗａａｋ  ＡＪ，Ｍｉｄｄｅｌｄｏｒｐ  ＪＭ，Ｈｕｉｓｍａｎ  ＨＧ，Ｆｒｏｅｌｉｃｈ  ＣＪ，ａｎｄ  Ｈａｃｋ  ＣＥ（１９９８）．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｇｒａｎｚｙｍｅｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ：ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｉｖｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ＣＴＬ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６０，３６１０−３６１６．
Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉ  Ｉ，Ｓｅｌａ  Ｍ，Ｙａｒｄｅｎ  Ｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ−２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｓ  １９９４；７１：１６１−９１．
Ｓｔｅｉｎｌｅ  Ａ，Ｌｉ  Ｐ，Ｍｏｒｒｉｓ  ＤＬ，Ｇｒｏｈ  Ｖ，Ｌａｎｉｅｒ  ＬＬ，Ｓｔｒｏｎｇ  ＲＫ，Ｓｐｉｅｓ  Ｔ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＮＫＧ２Ｄ  ｗｉｔｈ  ｉｔｓ  ｌｉｇａｎｄｓ  ＭＩＣＡ，ＭＩＣＢ，ａｎｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ＲＡＥ−１  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｙ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００１；５３：２７９−２８７．
Ｓｕｇａｒｍａｎ，Ｂ．Ｊ．，Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｂ．Ｂ．，Ｈａｓｓ，Ｐ．Ｅ．，Ｆｉｇａｒｃｉ，Ｉ．Ｓ．，Ｐａｌｌａｄｉｎｏ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｓｈｅｐａｒｄ，Ｈ．Ｍ．  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ：ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：９４３−９４５，１９８５．
Ｓｕｎ，Ｚ．，ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｒ．ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｓｈｏｃｋ，１８：９９−１０６，２００２．
Ｓｕｔｔｏｎ  ＶＲ，Ｄａｖｉｓ  ＪＥ，Ｃａｎｃｉｌｌａ  Ｍ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ  ＲＷ，Ｒｕｅｆｌｉ  ＡＡ，Ｓｅｄｅｌｉｅｓ  Ｋ，Ｂｒｏｗｎｅ  ＫＡ，ａｎｄ  Ｔｒａｐａｎｉ  ＪＡ（２０００）．Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｄｉｒｅｃｔ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｂｉｄ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｄｉｒｅｃｔ  ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃａｓｐａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２，１４０３−１４１４．
Ｓｕｚｕｋｉ  Ｔ，Ａｎｄｅｒｅｇｇ  Ｂ，Ｏｈｋａｗａ  Ｔ，Ｉｒｉｅ  Ａ，Ｅｎｇｅｂｒａａｔｅｎ  Ｏ，Ｈａｌｋｓ−Ｍｉｌｌｅｒ  Ｍ，Ｈｏｌｍ，ＰＳ，Ｃｕｒｉｅｌ，ＤＴ，Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ，Ｍ，Ｓｃａｎｌｏｎ，ＫＪ．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０００；７：２４１−４８．
Ｔ．Ｌｉｎ，Ｌ．Ｚｈａｎｇ，Ｊ．Ｄａｖｉｓ，Ｊ．Ｇｕ，Ｍ．Ｎｉｓｈｉｚａｋｉ，Ｌ．Ｊｉ，Ｊ．Ａ．Ｒｏｔｈ，Ｍ．Ｘｉｏｎｇ  ａｎｄ  Ｂ．Ｆａｎｇ，Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＲＡＩＬ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｎｄ  ａｎｔｉｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒｓ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．８，ｐｐ．４４１−４４８（２００３）．
Ｔａｋａｄａ  Ｔ，Ｋａｔｏ  Ｈ，Ｓａｓａｋｉ  Ｍ，Ｍａｔｓｕｓｈｉｒｏ  Ｔ，Ｙａｍａｕｃｈｉ  Ｈ，Ｋａｊｉｈａｒａ  Ｔ，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｇ，Ｈａｎａｕｅ，Ｈ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＦＡＭ（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ（５−ＦＵ）＋  ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ  ＋  ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ）ｖｅｒｓｕｓ  ５−ＦＵ  ａｌｏｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｎｄ  ｂｉｌｉａｒｙ  ｔｒａｃｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ（ｔｈｅ  １ｓｔ  ｔｒｉａｌ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ）．Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐａｎｃｒｅａｓ  ａｎｄ  Ｂｉｌｉａｒｙ  Ｔｒａｃｔ．Ｇａｎ  Ｔｏ  Ｋａｇａｋｕ  Ｒｙｏｈｏ  １９９２；１９：１２９５−１３０１．
Ｔａｍａｎｉｎｉ，Ａ．，Ｒｏｌｆｉｎｉ，Ｒ．，Ｎｉｃｏｌｉｓ，Ｅ．，Ｍｅｌｏｔｔｉ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｃａｂｒｉｎｉ，Ｇ．ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｅ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅ  ＩＣＡＭ−１  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｈａｓｅ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３０７：２２８−２４２，２００３．
Ｔａｎｇ  Ｐ，Ｈｕｎｇ  ＭＣ，Ｋｌｏｓｔｅｒｇａａｒｄ  Ｊ．ＴＮＦ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ．Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ  １９９４；１３：１１７−２３．
Ｔａｒｔａｇｌｉａ  ＬＡ，Ｒｏｔｈｅ  Ｍ，Ｈｕ  ＹＦ，Ｇｏｅｄｄｅｌ  ＤＶ．Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ’ｓ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｓ  ｓｉｇｎａｌｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐ５５  ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｃｅｌｌ  １９９３；７３：２１３−６．
Ｔｈｙｂｕｓｃｈ−Ｂｅｒｎｈａｒｄｔ  Ａ，Ａｉｇｎｅｒ  Ａ，Ｂｅｃｋｍａｎｎ  Ｓ，Ｃｚｕｂａｙｋｏ  Ｆ，Ｊｕｈｌ  Ｈ．Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＨＥＲ−２  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００１；３７：１６８８−９４．
Ｔｈｙｂｕｓｃｈ−Ｂｅｒｎｈａｒｄｔ  Ａ，Ｂｅｃｋｍａｎｎ  Ｓ，Ｊｕｈｌ  Ｈ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥＧＦ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨＥＲ−４  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｆａｖｏｕｒａｂｌｅ  ｔｕｍｏｒ  ｓｔａｇｅ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  ２００１；２：３９３−４００．
Ｔｏｍａｓｚｅｗｓｋａ  Ｒ，Ｏｋｏｎ  Ｋ，Ｎｏｗａｋ  Ｋ，Ｓｔａｃｈｕｒａ  Ｊ．ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ．Ｐｏｌ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ１９９８；４９：８３−９２．
Ｔｏｒｒｅ  ＥＡ，Ｓａｌｉｍｂｅｎｉ  Ｖ，  Ｆｕｌｃｏ  ＲＡ．Ｔｈｅ  ｅｒｂＢ  ２  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ：ａ  ｍｉｎｉ−ｒｅｖｉｅｗ．Ｊ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  １９９７；９：５１−５．
Ｔｒａｐａｎｉ  ＪＡ，Ｂｒｏｗｎｅ  ＫＡ，Ｓｍｙｔｈ  ＭＪ，ａｎｄ  Ｊａｎｓ  ＤＡ（１９９６）．Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ．Ａ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１，４１２７−４１３３．
Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｙｉｐ，Ｙ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｖｉｌｃｅｃｋ，Ｊ．Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：７６２６−７６３０，１９８５．
Ｔｙｓｏｎ  ＦＬ，Ｂｏｙｅｒ  ＣＭ，Ｋａｕｆｍａｎ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（ｃ−ｅｒｂＢ−２）ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｉｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｏｖａｒｉａｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １９９１；１６５：６４０−６．
Ｔｚａｈａｒ  Ｅ，Ｙａｒｄｅｎ  Ｙ．Ｔｈｅ  ＥｒｂＢ−２／ＨＥＲ２  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ：ｆｒｏｍ  ｏｒｐｈａｎ  ｈｏｏｄ  ｔｏ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｌｉｇａｎｄｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９９８；１３７７：Ｍ２５−Ｍ３７．
Ｕｃｈｉｄａ  Ｈ，Ｓｈｉｎｏｕｒａ  Ｎ，Ｋｉｔａｙａｍａ  Ｊ，Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｔ，Ｎａｇａｗａ  Ｈ，ａｎｄ  Ｈａｍａｄａ  Ｈ（２００２）．Ｃａｓｐａｓｅ−８  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ａｕｇｍｅｎｔｓ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ＤＬＤ−１  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９２，３４７−３５４．
Ｕｅｎｏ  ＮＴ，Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅｕｓｚ  Ｃ，Ｈｅｒｒｍａｎｎ  ＪＬ，Ｅｓｔｒｏｖ  Ｚ，Ｓｈａｏ  Ｒ，Ａｎｄｒｅｅｆｆ  Ｍ，Ｐｒｉｃｅ  Ｊ，Ｐａｕｌ  ＲＷ，Ａｎｋｌｅｓａｒｉａ  Ｐ，Ｙｕ  Ｄ，Ｈｕｎｇ  ＭＣ．Ｅ１Ａ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ−ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ＳＫＯＶ３．ｉｐ１  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃａｓｐａｓｅ−３  ｐａｔｈｗａｙ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０００；６：２５０−５９．
Ｕｎｇｌａｕｂ  Ｒ，Ｍａｘｅｉｎｅｒ  Ｂ，Ｔｈｏｍａ  Ｂ，Ｔｈｏｍａ  Ｂ，Ｐｆｉｚｅｎｍａｉｅｒ  Ｋ，Ｓｃｈｅｕｒｉｃｈ  Ｐ．Ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｖｉａ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＮＦ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９８７；１６６：１７８８−９７．
ｖａｎ  Ｍｏｏｒｓｅｌ  ＣＪ，Ｐｅｔｅｒｓ  Ｇ  Ｊ，Ｐｉｎｅｄｏ  ＨＭ．Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ：Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ａｇｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  １９９７；２：１２７−３４．
Ｖｅｅｎｅｎｄａａｌ  ＬＭ，Ｊｉｎ  Ｈ，Ｒａｎ  Ｓ，Ｃｈｅｕｎｇ  Ｌ，Ｎａｖｏｎｅ  Ｎ，Ｍａｒｋｓ  ＪＷ，Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒ  Ｊ，Ｔｈｏｒｐｅ  Ｐ，Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ＭＧ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ＶＥＧＦ１２１／ｒＧｅｌｏｎｉｎ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｆｕｓｉｏｎ  ｔｏｘｉｎ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２００２；９９：７８６６−７８７１．
Ｖｅｒｄｕ  Ｊ，Ｂｕｒａｔｏｖｉｃｈ  ＭＡ，Ｗｉｌｄｅｒ  ＥＬ，Ｂｉｒｎｂａｕｍ  ＭＪ．Ｃｅｌｌ−ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｂｙ  Ａｋｔ／ＰＫＢ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９９９；１：５００−６．
Ｖｏｌｍ  Ｍ，ａｎｄ  Ｋｏｏｍａｇｉ  Ｒ（１９９９）．Ｔｈｅ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｆｏｒ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ  ６，３７３−３７６．
Ｗ．Ｗｕ，Ｓ．Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ，Ｄ．Ｒ．Ｂｒｉｃｋｌｅｙ，Ｄ．Ｐａｎｇ，Ｔ．Ｋａｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓ．Ｄ．Ｃｏｎｚｅｎ，Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４，ｐｐ．１７５７−１７６４（２００４）．
Ｗａｊａｎｔ  Ｈ，Ｇｒｅｌｌ  Ｍ，Ｓｃｈｅｕｒｉｃｈ  Ｐ．ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  １９９９；１０：１５−２６．
Ｗａｌｄｍａｎｎ  ＴＡ，Ｌｅｖｙ  Ｒ，Ｃｏｌｌｅｒ  ＢＳ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ：Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｅｄｕｃ  Ｐｒｏｇｒａｍ）２０００；３９４−４０８．
Ｗａｌｌａｃｈ  Ｄ，Ｖａｒｆｏｌｏｍｅｅｖ  ＥＥ，Ｍａｌｉｎｉｎ  ＮＬ，Ｇｏｌｔｓｅｖ  ＹＶ，Ｋｏｖａｌｅｎｋｏ  ＡＶ，Ｂｏｌｄｉｎ  ＭＰ．Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  Ｆａｓ  ｓｉｇｎａｌｉｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９；１７：３３１−６７．
Ｗａｒｄ  Ｓ，Ｍｏｒｒｉｓ  Ｅ，Ｂａｎｓｂａｃｋ  Ｎ，Ｃａｌｖｅｒｔ  Ｎ，Ｃｒｅｌｌｉｎ  Ａ，Ｆｏｒｍａｎ  Ｄ，Ｌａｒｖｉｎ，Ｍ，Ｒａｄｓｔｏｎｅ，Ｄ．Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ａｎｄ  ｃｏｓｔ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｓｓｅｓｓ  ２００１；５：１−７０．
Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｎ，Ｎｉｉｔｓｕ  Ｙ，Ｕｍｅｎｏ  Ｈ，Ｋｕｒｉｙａｍａ  Ｈ，Ｎｅｄａ  Ｈ，Ｙａｍａｕｃｈｉ  Ｎ，Ｍａｅｄａ  Ｍ，Ｕｒｕｓｈｉｚａｋｉ  Ｉ．Ｔｏｘｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｎ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９８８；４８：２１７９−２１８３．
Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＴＭ，Ｗｅｉｎｅｒ  ＤＢ，Ｇｒｅｅｎｅ  ＭＩ，Ｍａｇｕｉｒｅ  ＨＣ，Ｊｒ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃ−ｅｒｂＢ−２  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９１；５９：４６−５２．
Ｗｏｗｋ  ＭＥ，ａｎｄ  Ｔｒａｐａｎｉ  ＪＡ（２００４）．Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｔｏｘｉｎ  ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ  ６，７５２−７５８．
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Ｚｏｕｂｏｕｌｉｓ  ＣＣ，Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  Ｋ，Ｇａｒｂｅ  Ｃ，Ｋｒａｓａｇａｋｉｓ  Ｋ，Ｋｒｕｇｅｒ  Ｓ，Ｏｒｆａｎｏｓ  ＣＥ．Ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｏｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍａｙ  ｒｅｓｕｌｔ  ｉｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １９９０；９５：２２３Ｓ−２３０Ｓ．
Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ  ＪＥ，Ｍｕｒｒａｙ  ＪＬ，Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ＭＧ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ａ（ｒＩＦＮ−α  Ａ）ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｔｏ  ａｎ  ａｎｔｉ−ｍｅｌａｎｏｍａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＺＭＥ−０１８）．Ｐｒｏ  Ａｍｅｒ  Ａｓｓｏｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９８７；Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．１０６０．
本発明およびその利点を詳細に記載してきたが、添付の請求の範囲によって定義される発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の変形、置換および改変をここで成すことができることは理解されるべきである。さらに、本出願の範囲は本明細書中に記載されたプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法および工程の特別な具体例に制限されることを意図しない。当業者であれば、本発明の開示から、本明細書中に記載された対応する具体例と同一の具体例と実質的に同一の機能を行い、または実質的に同一の結果を達成する現在または後に開発すべきプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法、または工程を本発明に従って利用できることを容易に認識できるであろう。従って、添付の請求の範囲は、その範囲内に、そのようなプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法または工程を含むことを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０４５１】
さて、本発明のより完全な理解のために、添付の図面と組み合わせて取られる以下の記載を参照する。
【図１】図１は、４つのヒト膵臓細胞系におけるＨＥＲ−２／ｎｅｃ、ＨＥＲ−１、ＴＮＦＲ−１、ＴＮＦＲ−２、およびｐ−Ａｋｔの発現パターンを示す。４つの膵臓癌細胞系（ＡｓＰｃ−１、Ｃａｐａｎ−１、Ｃａｐａｎ−２、およびＬ３．６ｐ１）を５×１０５細胞／φ６０ｍｍペトリ皿にて蒔き、２４時間インキュベートし、その後、細胞溶解物を収集した。全細胞溶解物（５０μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および抗−ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＴＮＦ受容体−１、ＴＮＦ受容体−２、およびｐ−Ａｋｔ抗体でのイムノブロッティング、続いての、抗−マウスまたは抗−ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼ−標識抗体とのインキュベーション、およびケミルミネセント検出によって分析した。アクチンをタンパク質負荷のための負荷対照として用いた。
【図２Ａ】図２Ａないし２Ｄは、４つの膵臓癌細胞系についてのＴＮＦ、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ、５−フルオロウラシル、シスプラチン、エクトポシド、ドキソルビシン、およびゲムシタビンの用量−応答曲線を供する。ＡｓＰｃ−１（図２Ａ）、Ｃａｐａｎ−１（図２Ｂ）、Ｃａｐａｎ−２（図２Ｃ）、およびＬ３．６ｐ１（図２Ｄ）。細胞を異なる薬物で７２時間処理し、次いで、クリスタルバイオレット染色によって成長阻害を評価した。値は少なくとも４つの独立した曝露からの平均±ＳＤである。
【図２Ｂ】図２Ａないし２Ｄは、４つの膵臓癌細胞系についてのＴＮＦ、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ、５−フルオロウラシル、シスプラチン、エクトポシド、ドキソルビシン、およびゲムシタビンの用量−応答曲線を供する。ＡｓＰｃ−１（図２Ａ）、Ｃａｐａｎ−１（図２Ｂ）、Ｃａｐａｎ−２（図２Ｃ）、およびＬ３．６ｐ１（図２Ｄ）。細胞を異なる薬物で７２時間処理し、次いで、クリスタルバイオレット染色によって成長阻害を評価した。値は少なくとも４つの独立した曝露からの平均±ＳＤである。
【図２Ｃ】図２Ａないし２Ｄは、４つの膵臓癌細胞系についてのＴＮＦ、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ、５−フルオロウラシル、シスプラチン、エクトポシド、ドキソルビシン、およびゲムシタビンの用量−応答曲線を供する。ＡｓＰｃ−１（図２Ａ）、Ｃａｐａｎ−１（図２Ｂ）、Ｃａｐａｎ−２（図２Ｃ）、およびＬ３．６ｐ１（図２Ｄ）。細胞を異なる薬物で７２時間処理し、次いで、クリスタルバイオレット染色によって成長阻害を評価した。値は少なくとも４つの独立した曝露からの平均±ＳＤである。
【図２Ｄ】図２Ａないし２Ｄは、４つの膵臓癌細胞系についてのＴＮＦ、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ、５−フルオロウラシル、シスプラチン、エクトポシド、ドキソルビシン、およびゲムシタビンの用量−応答曲線を供する。ＡｓＰｃ−１（図２Ａ）、Ｃａｐａｎ−１（図２Ｂ）、Ｃａｐａｎ−２（図２Ｃ）、およびＬ３．６ｐ１（図２Ｄ）。細胞を異なる薬物で７２時間処理し、次いで、クリスタルバイオレット染色によって成長阻害を評価した。値は少なくとも４つの独立した曝露からの平均±ＳＤである。
【図３】図３は、Ａｋｔおよびホスホ−Ａｋｔの発現に対するｓｃＦｖ２３、ＴＮＦ、およびｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの効果を示す。Ｌ３．６ｐ１細胞を５−ＦＵ、ｓｃＦｖ２３、および５−ＦＵ＋ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ組合せのＩＣ２５で処理した。処理の後、細胞溶解物（５０μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および抗−Ａｋｔおよびホスホ−Ａｋｔ抗体でのイムノブロッティング、続いての、抗−ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼ−標識抗体とのインキュベーション、およびケミルミネセント検出によって分析した。アクチンを負荷対照として用いた。
【図４】図４は、Ｂｃｌ−２の発現に対するｓｃＦｖ２３、ＴＮＦ、およびｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの効果を示す。Ｌ３．６ｐ１細胞を５−ＦＵ、ｓｃＦｖ２３、および５−ＦＵ＋ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ組合せのＩＣ２５で処理した。処理の後、細胞溶解物（５０μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および抗−Ｂｃｌ２抗体でのイムノブロッティング、続いての、抗−ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼ−標識抗体とのインキュベーション、およびケミルミネセント検出によって分析した。アクチンを負荷対照として用いた。
【図５】図５は、カスパーゼ−８、カスパーゼ−３およびＰＡＲＰ切断の活性化に対する５−フルオロウラシル、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ、および組合せの効果を示す。Ｌ３．６ｐ１細胞を５−ＦＵ、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ、および組合せのＩＣ２５で４８時間処理した。処理の後、細胞溶解物（５０μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および抗−カスパーゼ−８、カスパーゼ−３、およびＰＡＲＴ抗体でのイムノブロッティング、続いての、抗−マウスホースラディッシュペルオキシダーゼ−標識抗体とのインキュベーション、およびケミルミネセント検出によって分析した。アクチンを負荷対照として用いた。
【図６】図６は、組合せ５−ＦＵ＋ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−処理Ｌ３．６ｐ１細胞の生存性に対するカスパーゼ−３阻害剤の影響を示す。Ｌ３．６ｐ１細胞を、１００μＭカスパーゼ−３阻害剤（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ）の有りまたは無しで３時間予備処理し、次いで、５−ＦＵ、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ、および組合せのＩＣ２５で処理した。７２時間の曝露の後、生存率をＸＴＴアッセイを用いて測定した。
【図７】図７Ａないし７Ｂは、ＳＫＢＲ−３乳癌細胞系に対するｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの効果を示す。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＴＮＦ受容体１、ＴＮＦ受容体２の発現パターンが示される。ＳＫＢＲ−３／ＨおよびＳＫＢＲ−３／Ｌ細胞系を５×１０５細胞／φ６０ｍｍペトリ皿で蒔き、２４時間インキュベートし、その後、細胞溶解物を収集した。全細胞溶解物（５０μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および抗−ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＴＮＦ受容体−１、およびＴＮＦ受容体−２抗体でのイムノブロッティング、続いての、抗−マウスまたは抗−ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼ−標識抗体とのインキュベーション、およびケミルミネセント検出によって分析した。アクチンを負荷対照として用いた（図７Ａ）。ＴＮＦまたはｓｃＦｖ２３／ＴＮＦいずれかのＳＫＢＲ−３／ＨおよびＳＫＢＲ−３／Ｌ細胞における成長阻害。ＳＫＢＲ−３／Ｈおよび−３／Ｌ細胞を種々の濃度のＴＮＦまたはｓｃＦｖ２３／ＴＮＦで処理した。７２時間の曝露の後、ＸＴＴアッセイを用いて生存率を測定した（図７Ｂ）。
【図８】図８は、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−誘導成長阻害に対するＴＮＦ受容体−１抗体の中和効果を示す。２００ｎＭ  ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ処理の２時間前に、ＳＫＢＲ−３細胞を抗−ＴＮＦ受容体−１  Ａｂ（２５および５０μｇ／ｍｌ）に曝露した。７２時間の曝露の後、ＸＴＴアッセイを用いて生存率を測定した。
【図９】図９は、ＩκＢ−α、ＴＲＡＤＤ、およびＴＲＡＦ２の発現に対するｓｃＦｖ２３、ＴＮＦ、およびｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの効果を供する。ＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞を、示した時間コースにて、２００ｎＭ  ｓｃＦｖ２３、２００ｎＭ  ＴＮＦまたは２００ｎＭ  ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦで示した回数処理した。処理の後、細胞溶解物（５０μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および抗−ＩκＢ−α、ＴＲＡＤＤ、およびＴＲＡＦ２抗体でのイムノブロッティング、続いての、抗−ウサギまたは抗−マウスホースラディッシュペルオキシダーゼ−標識抗体とのインキュベーション、およびケミルミネセント検出によって分析した。アクチンを負荷対照として用いた。
【図１０】図１０は、Ａｋｔおよびホスホ−Ａｋｔの発現に対するｓｃＦｖ２３、ＴＮＦ、およびｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの効果を示す。ＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞を、２００ｎＭ  ｓｃＦｖ２３、２００ｎＭ  ＴＮＦ、または２００ｎＭ  ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦで示された回数処理した。処理の後、細胞溶解物（５０μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および抗−Ａｋｔおよびホスホ−Ｋｋｔ抗体でのイムノブロッティング、続いての、抗−ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼ−標識抗体とのインキュベーション、およびケミルミネセント検出によって分析した。アクチンを負荷対照として用いた（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。
【図１１】図１１Ａないし１１Ｂは、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ−過剰発現ＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞におけるアポトーシスに対するＴＮＦおよびｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの効果を示す。アポトーシス細胞の顕微鏡分析を示す。ＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞を２００ｎＭ  ＴＮＦまたは２００ｎＭ  ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦに２４時間および４８時間曝露した。処理の後、細胞をＰＢＳで洗浄し、浸透溶液（０．１％トリトンＸ−１００、０．１％クエン酸ナトリウム）中で浸透化し、次いで、４％パラホルムアルデヒド中で固定した。固定された細胞をイン・サイチュ細胞死滅検出キット（Ｒｏｃｈｅ）で染色した。アポトーシスを受けている細胞を、蛍光顕微鏡（×  ２００）によって決定した（図１１Ａ）。アポトーシス細胞のＤＮＡ断片化。２００ｎＭ  ＴＮＦまたは２００ｎＭ  ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦに２４時間および４８時間曝露したＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞を溶解した。ＤＮＡを抽出し、電気泳動によって分画し、臭化エチジウムによって染色した（図１１Ｂ）。
【図１２】図１２は、カスパーゼ−８、カスパーゼ−３、およびＰＡＲＰ切断の活性化に対するｓｃＦｖ２３、ＴＮＦ、およびｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの効果を示す。ＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞を、２００ｎＭ  ｓｃＦｖ２３、２００ｎＭ  ＴＮＦ、または２００ｎＭ  ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦで２４時間および４８時間示した回数処理した。処理の後、細胞溶解物（５０μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および抗−カスパーゼ−８、カスパーゼ−３、およびＰＡＲＰ抗体でのイムノブロッティング、続いての、抗−マウスホースラディッシュペルオキシダーゼ−標識抗体とのインキュベーション、およびケミルミネセント検出によって分析した。アクチンを負荷対照として用いた。
【図１３】図１３は、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−処理ＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞の生存率に対するカスパーゼ−３阻害剤の影響を示す。ＳＫＢＲ−３／Ｈ細胞を、１００μＭカスパーゼ−３阻害剤（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ）の有りまたは無しにて３時間予備処理し、次いで、種々の濃度のｓｃＦｖ２３／ＴＮＦで処理した。７２時間の曝露の後、ＸＴＴアッセイを用いて生存率を測定した。
【図１４】図１４は、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−処理ＳＫＢＲ−３／ＬＰ細胞の生存率に対するカスパーゼ阻害剤の影響を示す。ＳＫＢＲ−３−ＬＰ細胞を、２００μＭの一般的なカスパーゼ阻害剤（Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ）、２００μＭカスパーゼ−８阻害剤（Ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫ）、または２００μＭカスパーゼ−３阻害剤（Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ）の有りまたは無しにて２時間予備処理し、次いで、種々の濃度のｓｃＦｖ２３／ＴＮＦで処理した。７２時間の曝露の後、ＸＴＴアッセイを用いて生存率を測定した。
【図１５Ａ】図１５Ａないし１５Ｂは、シグナリングタンパク質の発現、およびＳＫＢＲ−３乳癌細胞系についての比較感度を示す。図１５Ａにおいては、ＳＫＢＲ−３−ＬＰおよびーＨＰ細胞系におけるＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＴＮＦ−Ｒ１、およびＴＮＦ−Ｒ２のウェスタンブロット分析がある。ＳＫＢＲ−３−ＬＰおよびＳＫＢＲ−３−ＨＰ細胞系を５×１０５細胞／φ６０ｍｍペトリ皿で蒔き、２４時間インキュベートし、その後、細胞溶解物を収集した。全細胞溶解物（５０μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および抗−ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＴＮＦ受容体−１、およびＴＮＦ受容体−２抗体でのイムノブロッティング、続いての、抗−マウスまたは抗−ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼ−標識抗体とのインキュベーション、およびケミルミネセント検出によって分析した。アクチンを負荷対照として用いた。図１５Ｂにおいては、ＳＫＢＲ−３−ＬＰおよびＳＫＢＲ−３−ＨＰ細胞におけるハーセプチン、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ、およびＴＮＦの成長阻害がある。ＳＫＢＲ−３−ＬＰおよび−３−ＨＰ細胞を種々の濃度のＴＮＦまたはｓｃＦｖ２３／ＴＮＦで処理した。７２時間の曝露の後、ＸＴＴアッセイを用いて生存率を測定した。
【図１５Ｂ】図１５Ａないし１５Ｂは、シグナリングタンパク質の発現、およびＳＫＢＲ−３乳癌細胞系についての比較感度を示す。図１５Ａにおいては、ＳＫＢＲ−３−ＬＰおよびーＨＰ細胞系におけるＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＴＮＦ−Ｒ１、およびＴＮＦ−Ｒ２のウェスタンブロット分析がある。ＳＫＢＲ−３−ＬＰおよびＳＫＢＲ−３−ＨＰ細胞系を５×１０５細胞／φ６０ｍｍペトリ皿で蒔き、２４時間インキュベートし、その後、細胞溶解物を収集した。全細胞溶解物（５０μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および抗−ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＴＮＦ受容体−１、およびＴＮＦ受容体−２抗体でのイムノブロッティング、続いての、抗−マウスまたは抗−ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼ−標識抗体とのインキュベーション、およびケミルミネセント検出によって分析した。アクチンを負荷対照として用いた。図１５Ｂにおいては、ＳＫＢＲ−３−ＬＰおよびＳＫＢＲ−３−ＨＰ細胞におけるハーセプチン、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ、およびＴＮＦの成長阻害がある。ＳＫＢＲ−３−ＬＰおよび−３−ＨＰ細胞を種々の濃度のＴＮＦまたはｓｃＦｖ２３／ＴＮＦで処理した。７２時間の曝露の後、ＸＴＴアッセイを用いて生存率を測定した。
【図１６】図１６は、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ−誘導成長阻害に対するＴＮＦ受容体の役割を示す。ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ、ハーセプチン、またはＴＮＦの細胞傷害性効果が、細胞−表面ＴＮＦ受容体−１との相互作用によって完全に媒介されるか否かを判断するために、ＴＮＦＲ１：Ｆｃ融合タンパク質（１および１０φｇ／ｍｌ）を用い、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦのＴＮＦ受容体−１への結合をブロックした。７２時間の曝露の後、ＸＴＴアッセイを用いて生存率を測定した。
【図１７Ａ】図１７Ａないし１７Ｂは、ＴＮＦ受容体−１発現の変調に対するｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの効果を示す。ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦがＴＮＦ−Ｒ１の発現を変調できるか否かを判断するために、我々は、ＳＫＢＲ−３−ＬＰおよびＬ３．６ｐｌ細胞を、ｓｃＦｖ２３、ＴＮＦ、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ（図１７Ａ）、またはハーセプチン（図１７Ｂ）で処理した。全細胞溶解物（５０μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および抗−ＴＮＦ受容体−１、およびＴＮＦ受容体−２抗体でのイムノブロッティング、続いての、抗−マウスまたは抗−ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼ−標識抗体とのインキュベーション、およびケミルミネセント検出によって分析した。アクチンを負荷対照として用いた。
【図１７Ｂ】図１７Ａないし１７Ｂは、ＴＮＦ受容体−１発現の変調に対するｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの効果を示す。ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦがＴＮＦ−Ｒ１の発現を変調できるか否かを判断するために、我々は、ＳＫＢＲ−３−ＬＰおよびＬ３．６ｐｌ細胞を、ｓｃＦｖ２３、ＴＮＦ、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ（図１７Ａ）、またはハーセプチン（図１７Ｂ）で処理した。全細胞溶解物（５０μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および抗−ＴＮＦ受容体−１、およびＴＮＦ受容体−２抗体でのイムノブロッティング、続いての、抗−マウスまたは抗−ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼ−標識抗体とのインキュベーション、およびケミルミネセント検出によって分析した。アクチンを負荷対照として用いた。
【図１８】図１８は、ＳＫＢＲ−３−ＬＰ細胞におけるＴＮＦ感度の変調を示す。ＴＮＦ−Ｒ１の過剰発現がＨＥＲ−２／ｎｅｕ−過剰発現ＳＨＢＲ−３−ＬＰ細胞におけるＴＮＦ感度を変調できるか否かを判断するために、ＳＫＢＲ−３−ＬＰ細胞をＴＮＦ、ｓｃＦｖ２３、ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦ、あるいはｓｃＦｖ２３と組み合わせたＴＮＦで処理した。７２時間の曝露の後、ＸＴＴアッセイを用いて生存率を測定した。
【図１９】図１９は、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ−２、Ｉκ−Ｂ、Ａｋｔ、およびｐ−Ａｋｔの発現に対するｓｃＦｖ２３、ＴＮＦ、およびｓｃＦｖ２３／ＴＮＦの効果を示す。ＳＫＢＲ−３−ＬＰ細胞を２００ｎＭ  ｓｃＦｖ２３、２００ｎＭ  ＴＮＦ，または２００ｎＭ  ｓｃＦｖ２３／ＴＮＦで示した回数処理した。処理の後、細胞溶解物（５０μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および抗−ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ−２、Ｉκ−Ｂ、Ａｋｔまたはホスホ−Ａｋｔ抗体でのイムノブロッティング、続いての、抗−ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼ−標識抗体とのインキュベーション、およびケミルミネセント検出によって分析した。アクチンを負荷対照として用いた。
【図２０】図２０は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ−過剰発現ＳＫＢＲ−３−ＬＰ細胞に対するＴＮＦおよびｓｃＦｖ２３／ＴＮＦのシグナル伝達効果のまとめを示す。
【図２１】図２１は、ｓｃＦｖＭＥＬ遺伝子がフレキシブルな連結体Ｇ４Ｓを介して連結されたヒトＴＮＦ遺伝子に融合されたことを示す。融合構築体ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦを、マルチクローニング部位におけるＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにおいて細菌発現ベクターｐＥＴ３２ａ（＋）にクローン化した。
【図２２】図２２Ａないし２２Ｃは、ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング分析を示す。図２２Ａは、還元条件下での８．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブルー染色を表する。レーン１、タンパク質マーカー。レーン２、非−誘導全溶解物。レーン３、誘導された全溶解物。レーン４、ＩＭＡＣによって精製。レーン５、ｒＥＫ消化後。レーン６、最終的な精製されたｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ。図２２Ｂおよび２２Ｃは、ウサギ抗−ｈｕＴＮＦ抗体；（図２２Ｂ）またはウサギ抗−ｓｃＦｖＭＥＬ抗体によって検出されたウェスタンブロッティングを示す；（図２２Ｃ）、レーン１、ＺＭＥ−０１８。レーン２、ＩＭＡＣによって精製されたｈｉｓ−タグを持つ発現されたタンパク質。レーン３、ｒＥＫ消化の後における最終的な精製された発現タンパク質。レーン４、組換えｈｕＴＮＦ。
【図２３】図２３Ａないし２３Ｂは、ウェスタンブロッティング分析ＩκＢ−α分解を示す。図２３Ａにおいては、細胞（２×１０５細胞／ウェル）を６−ウェルプレートに設定し、Ｉ．Ｃ．５０濃度のＴＮＦまたはｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦで、２、５、１５、３０、４５および６０分の時間コースに付き処理した。全溶解物を抽出し、３０μｇの全タンパク質を８．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷し、標準ウェスタンブロッティングを行い、ＩκＢα抗体（１：３０００希釈）によって検出した。図２３Ｂにおいて、細胞をＺＭＥ−０１８（４０μｇ／ｍｌ）で４時間予備処理し、次いで、Ｉ．Ｃ．５０濃度のｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦで示した時間コースで処理した。同一量の細胞溶解物を図２３Ａにおけるように分析して、ＩκＢ−α分解を検出した。
【図２４】図２４は、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ経路のウェスタンブロッティング分析を示す。ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦまたはＴＮＦでの異なる時間コース処理からの細胞溶解物を抽出した。５０μｇの量の合計タンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷し、ＭＫＫ３、ホスホ−ＭＫＫ３／ＭＫＫ６、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ、ホスホ−ｐ３８、ＭＡＰキナーゼ（Ｔｈｒ  １８０／Ｔｙｒ  １８２）、ＡＴＦ−２またはホスホ−ＡＴＦ−２抗体でプローブしたウェスタンブロッティングによって分析した。
【図２５】図２５は、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ経路のウェスタンブロッティング分析を示す。ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦまたはＴＮＦでの異なる時間コース処理からの細胞溶解物の５０μｇの量の合計タンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷し、ＭＫＫ４、ホスホ−ＳＥＫ１／ＭＫＫ４、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ、ホスホ−ｐ５４／４６  ＳＡＪＫ／ＪＮＫ（Ｔｈｒ  １８３／Ｔｙｒ  １８５）、ｃ−Ｊｕｎまたはホスホ−ｃ−Ｊｕｎ抗体でプローブしたウェスタンブロッティングによって分析した。
【図２６】図２６Ａないし２６Ｃは、アポトーシスプロフィールを示す：図２６Ａにおいては、ＰＡＲＰ切断を示す。細胞（２×１０６細胞／ｍｌ）を、各々、Ａ３７５−Ｍでの１ｎＭおよびＡＡＢ−５２７での２００ｎＭのＴＮＦで、あるいはＡ３７５−Ｍでの０．１ｎＭおよびＡＡＢ−５２７細胞での２０ｎＭのｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦで２４時間処理した。細胞溶解物の５０μｇの量の全タンパク質を７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷し、切断された（８６ｋＤａ）および切断されていない（１１６ｋＤａ）タンパク質双方を認識する抗−ＰＡＲＰ抗体でプローブされたウェスタンブロッティングによって分析した。図２６Ｂにおいては、切断されたカスパーゼ−３を示す。細胞をｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦまたはＴＮＦで１、４、８、１６および２４時間処理した。細胞溶解物の５０μｇの量の全タンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷し、切断されたカスパーゼ−３モノクローナル抗体でプローブされたウェスタンブロッティングによって分析した。図２６Ｃはアポトーシス細胞のイン・サイチュ細胞死滅（ＴＵＮＥＬ）分析を示す。１６−ウェルチャンバースライドにおけるウェル当たり１０，０００細胞をＩ．Ｃ．５０濃度のｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦまたはＴＮＦで２４時間処理し、ＰＢＳで軽く洗浄した。細胞を３．７％ホルムアルデヒドによって室温にて１０分間固定し、氷上の０．１％トリトンＸ−１００、０．１％クエン酸ナトリウムによって２分間浸透化させた。細胞をＴＵＮＥＬ反応混合物と共に３７℃にて６０分間インキュベートした。最終洗浄の後、細胞を、４００×倍率のＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＳ−１００蛍光顕微鏡下で分析した。
【図２７】図２７は、メラノーマ細胞でのＴＮＦ受容体およびＴＮＦ受容体シグナリング関連タンパク質のウェスタンブロッティング分析を示す。ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦまたはＴＮＦでの異なる時間コース処理からの細胞溶解物の同一量の全タンパク質（３０μｇ）を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷し、抗−ＴＮＦＲ１、抗−ＴＮＦＲ２、抗−ＴＲＡＤＤ、抗−ＴＲＡＦ２、抗−ＲＩＰおよび抗−β−アクチン抗体でプローブされたウェスタンブロッティングによって分析した。
【図２８】図２８は、抗−ＴＮＦＲ１  ＡｂによるｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの中和細胞傷害性を示す。Ａ３７５−Ｍ細胞ＳＫＢＲ３−ＨＰ細胞（ウェル当たり４０００細胞）を、細胞をＩ．Ｃ．濃度のｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦまたはＴＮＦで７２時間処理する前に、２５μｇ／ｍｌの抗−ＴＮＦＲ１  Ａｂで２時間予備処理した。培養中の腫瘍細胞の成長に対するｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦおよびＴＮＦの効果をクリスタルバイオレット染色を用いて測定し、次いで、５９５ｎｍの光学密度を測定した。
【図２９】図２９は、マウスにおける１２５Ｉ−標識ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦのファルマコキネティックスを示す。放射性標識した融合構築体をＢａｌｂ／ｃマウスに投与した（静脈内、尾静脈）。群（５／群）を投与後種々の時点で犠牲にした。血漿中の放射能を評価し、結果を最小二乗非直線回帰によって分析した（ＰＫ  Ａｎａｌｙｓｔ；ＭｉｃｒｏＭａｔｈ，Ｉｎｃ．）。データは、各々、α−、β−およびγ−相につき０．３８時間、３．９時間および１７．６時間の計算された半減期を持つ三相曲線フィットを示した。
【図３０】図３０は、群平均終末体重（ＴＢＷ）および相対的器官重量を供する。群当たり５匹のマウスに、０．２、０．４、０．６および０．８ｍｇ／ｋｇ／日のｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦを毎日５日間静脈注射した（群２ないし５）。送達された合計用量は１、２、３、４ｍｇ／ｋｇであり、これは確立されたＭＴＤの２５、５０、７５および１００％に対応する。ビヒクル対照群（群１）は生理食塩水よりなるものであった。最後の注射（１２日）から７日後に、マウスをＣＯ２への曝露によって犠牲にした。肝臓、腎臓、脾臓等を含めた完全な剖検を行う前に、各マウスの終末体重（ＴＢＷ）中性−緩衝化１０％ホルマリン溶液中への浸漬によって器官を固定する前に、個々のマウスの器官重量を測定した。（体重に対する）相対的器官重量は対照のパーセントとして計算した（器官ＷＴ／ＴＢＷ×１００）。ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦは、（体重に対する）相対的脾臓重量の用量−関連増加を引き起こす。
【図３１】図３１は、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ２００イメージングシステムによってモニターされたＡ３７５ＧＦＰ腫瘍異種移植片に対するｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦの抗腫瘍活性を示す。右側脇腹で成長する緑色−蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で安定にトランスフェクトされた確立された（５０ｍｍ３）ヒトメラノーマ（Ａ３７５ＧＦＰ）腫瘍を担うヌードマウスを、生理食塩水（対照）または２．５ｍｇ／ｋｇのｓｃＦｖＭＥＬまたはｓｃＦｖＭＥＬ（０．２ｍｇ／ｋｇ）＋ＴＮＦ（０．２ｍｇ／ｋｇ）または２．５ｍｇ・ｋｇ（合計用量）のｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦいずれかで５連続日処理した（静脈内、尾静脈）。マウスを５０ｍｇ／ｋｇ（腹腔内）のネムブタールで処理後に１週間につき１回麻酔した後に、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  ２００イメージングシステムを用いて腫瘍をモニターした。
【図３２】図３２は、生理食塩水（対照）または２．５ｍｇ／ｋｇのｓｃＦｖＭＥＬ、またはｓｃＦｖＭＥＬ（０．２ｍｇ／ｋｇ）＋ヒト組換えＴＮＦ（０．２ｍｇ／ｋｇ）、または２．５ｍｇ／ｋｇ（合計用量）のｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦいずれかで５連続日（矢印）静脈内処理した（尾静脈）ヒトメラノーマ（Ａ３７５ＧＦＰ）腫瘍を担うヌードマウスを示す。２．５ｍｇ／ｋｇの用量のｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦでの確立された（５０ｍｍ３）腫瘍を担うマウスの処理の結果、優れた腫瘍抑制、および全ての病巣の完全な腫瘍寛解がもたらされた（４３日に５／５マウス腫瘍なし）。対照的に、生理食塩水、ｓｃＦｖＭＥＬ単独、またはｓｃＦｖＭＥＬ＋ＴＮＦいずれかで処理した全てのマウスが、迅速な腫瘍成長を示した。より大きな腫瘍（１５０ｍｍ３）を担うマウスは腫瘍緩解（４４日に３／５腫瘍なし）を示した。
【図３３】図３３は、ＥＬＩＳＡによって検出された異なるメラノーマ細胞でのｇｐ２４０抗原の発現を示す。メラノーマＡ３７５−Ｍ、ＴＸＭ−１８、ＴＸＭ−１３、ＭＥＬ  ５２６およびＴＸＭ−１細胞でのｇｐ２４０抗原の発現を調べるために、ｇｐ２４０抗原に特異的に結合する親モノクローナル抗体ＺＭＥ−０１８  ＩｇＧ２ａをＥＬＩＳＡで用いた。接着性メラノーマ細胞（ウェル当たり５×１０４細胞）を含有する９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する溶液の添加によって１時間ブロックした。細胞を（我々の中核研究所によって生産された）モノクローナル抗体ＺＭＥ−０１８  ＩｇＧ２ａと共に細胞をインキュベートし、続いて、ヤギ抗−マウス／ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート（ＨＲＰ−ＧＡＭ）と共にインキュベートした。１ｍｌ／ｍｌ  ３０％Ｈ２Ｏ２を含有する基質溶液ＡＢＴＳをウェルに加えた。４０５ｎｍにおける吸光度を３０分後に測定した。結果は、ｇｐ２４０抗原がＡ３７５−Ｍ、ＴＸＭ−１８Ｌ、ＴＸＭ−１３、およびＭＥＬ−５２６細胞に存在したが、ＴＸＭ−１細胞でのｇｐ２４０抗原の非常に低レベルの発現が観察されたことを示した。
【図３４】図３４は、ＦＡＣＳアッセイによって検出されたメラノーマ細胞系でのｇｐ２４０発現を示す。１×１０６細胞よりなるメラノーマ細胞、まず、モノクローナル抗体ＺＭＥ−０１８  ＩｇＧ２ａで４℃にて２０分間処理し、次いで、アロフィコシアニンン（ＡＰＣ）−コンジュゲーテッドヤギ−抗−マウス抗体（ＢＤ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＣＡ）で４℃にてさらに２０分間染色し、双方を、１００ｍｌのＦＡＣＳ染色緩衝液（２％ＦＣＳ／ＤＰＢＳ）に再懸濁させた。陰性染色対照として、細胞を、ｇｐ２４０に対する抗体と同一濃度の無関係特異性のイソタイプがマッチした対照抗体（マウスＩｇＧ２ａ，ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で染色した。染色に続いて、細胞をＤＰＢＳで２回洗浄し、次いで、５００ｍｌの１％パラホルムアルデヒド溶液に再懸濁させ、氷上で暗所で保存した。ＦＡＣＳ分析をＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｅｒサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）にて直後に行った。ＡＰＣ蛍光をＦＬ−４チャネルで検出した。各細胞系について、１０，０００事象が獲得された。分析はＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  ＰｒｏＴＭソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行った。ｇｐ２４０の発現は全ての５つのメラノーマ細胞系（Ａ３７５Ｍ、ＴＸＭ１３、ＴＸＭ１８、ＭＥＬ５２６およびＴＸＭ１）についての実線として示し、また、それらはイソタイプ対照を表す点線によって重ねた。
【図３５Ａ】図３５Ａおよび３５Ｂは、ＥＬＩＳＡによるＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ融合タンパク質のｓｃＦｖＭＥＬ部位の結合活性を示す。接着性メラノーマ細胞（ウェル当たり５×１０４細胞）を含有する９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する溶液の添加によって１時間ブロックした。ＧｒＢ／ｓｖＦｖＭＥＬの結合活性を検出するために、細胞を、種々の濃度の精製されたＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬと共に室温（ＲＴ）にて１時間インキュベートした。それらを洗浄した後、細胞をウサギ抗−ｓｃＦｖＭＥＬ抗体と共にインキュベートし、続いて、ヤギ抗−ウサギ／ＨＲＰコンジュゲート（ＨＲＰ−ＧＡＲ）抗体を加えた。最後に、１ｍｌ／ｍｌ  ３０％Ｈ２Ｏ２を含有する基質溶液ＡＢＴＳをウェルに加えた。４０５ｎｍにおける吸光度を３０分後に測定した。図３５Ａにおいては、吸光度のプロフィールは、異なるメラノーマ細胞系について異なる濃度のＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬの結合活性を示した。図３５Ｂにおいては、異なるメラノーマ細胞系につき、同一ＩＣ５０濃度のＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬの吸光度がある。結果は、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬが、高レベルのｇｐ２４０の抗原を発現するメラノーマＡ３７５−Ｍ、ＴＸＭ−１８Ｌ、ＴＸＭ−１３およびＭＥＬ−５２６細胞に結合したことを示した。さらに、結合活性が、Ａ３７５−ＭおよびＭＥＬ−５２６、続いて、ＴＸＭ−１８ＬおよびＴＸＭ−１３においてより強かった。しかしながら、タンパク質は、ｇｐ２４０抗原の非常に低レベルの発現を有するＴＸＭ−１には結合しなかった。
【図３５Ｂ】図３５Ａおよび３５Ｂは、ＥＬＩＳＡによるＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ融合タンパク質のｓｃＦｖＭＥＬ部位の結合活性を示す。接着性メラノーマ細胞（ウェル当たり５×１０４細胞）を含有する９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する溶液の添加によって１時間ブロックした。ＧｒＢ／ｓｖＦｖＭＥＬの結合活性を検出するために、細胞を、種々の濃度の精製されたＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬと共に室温（ＲＴ）にて１時間インキュベートした。それらを洗浄した後、細胞をウサギ抗−ｓｃＦｖＭＥＬ抗体と共にインキュベートし、続いて、ヤギ抗−ウサギ／ＨＲＰコンジュゲート（ＨＲＰ−ＧＡＲ）抗体を加えた。最後に、１ｍｌ／ｍｌ  ３０％Ｈ２Ｏ２を含有する基質溶液ＡＢＴＳをウェルに加えた。４０５ｎｍにおける吸光度を３０分後に測定した。図３５Ａにおいては、吸光度のプロフィールは、異なるメラノーマ細胞系について異なる濃度のＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬの結合活性を示した。図３５Ｂにおいては、異なるメラノーマ細胞系につき、同一ＩＣ５０濃度のＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬの吸光度がある。結果は、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬが、高レベルのｇｐ２４０の抗原を発現するメラノーマＡ３７５−Ｍ、ＴＸＭ−１８Ｌ、ＴＸＭ−１３およびＭＥＬ−５２６細胞に結合したことを示した。さらに、結合活性が、Ａ３７５−ＭおよびＭＥＬ−５２６、続いて、ＴＸＭ−１８ＬおよびＴＸＭ−１３においてより強かった。しかしながら、タンパク質は、ｇｐ２４０抗原の非常に低レベルの発現を有するＴＸＭ−１には結合しなかった。
【図３６】図３６は、メラノーマ細胞に対するイン・ビトロでの細胞傷害性アッセイを示す。試料（ＧｒＢ／ｓｖｃＦｖＭＥＬまたはＭＥＬ  ｓＦｖ／ｒＧｅｌ）を、メラノーマ細胞単層での標準的な７２時間細胞増殖アッセイを用い、およびクリスタルバイオレット染色を用いてアッセイした。対照のパーセントとは、対照（未処理）のウェルのそれと比較した薬物−処理ウェルにおける細胞のパーセンテージをいう。棒線は、異なるメラノーマ細胞系でのＩＣ５０値を示した。高度に発現されたｇｐ２４０抗原であるＡ３７５Ｍ、ＭＥＬ５２６、ＴＸＭ−１８ＬおよびＴＸＭ１３に対する細胞傷害性効果がある。しかしながら、１μＭまでの用量においては、細胞傷害性効果はＴＸＭ−１細胞では見出されなかった。
【図３７】図３７は、種々の化学療法剤と組み合わせたＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬの実験を供する。抗原−陽性（Ａ３７５Ｍ）細胞を、種々の化学療法剤で６時間（ＩＣ２５用量で）予備処理し、続いて、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬを加えた（ＩＣ２５）。次いで、細胞を合計７２時間インキュベートした（系列Ｃ１）。別法として、細胞をまずＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬで６時間処理し、次いで、種々の化学療法剤を７２時間加えた（系列Ｃ２）。化学療法剤は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、ビンクリスチン（ＶＣＲ）、エトポシド（ＶＰ−１６）、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、シタラビン（ＡｒａＣ）および５−Ｆｕを含む。Ａ３７５細胞へのＣｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬおよび化学療法剤の７２時間の共投与は、ＤＯＸ、ＶＣＲまたはＣＤＤＰとの相乗的抗腫瘍活性、およびＶＰ−１６またはＡｒａＣと組み合わせた相加的効果を示した。ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬでの６時間の予備処理、続いて、これらの化学療法剤への７２時間の共曝露（Ｃ２）は、薬物で予備処理し、続いて、融合構築体に共曝露した（Ｃ１）ことと比較して、有意に阻害された成長を示した。
【図３８】図３８は、イン・ビボでのＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬの抗腫瘍活性を供する。６ないし８週齢の雌の無胸腺（ｎｕ／ｎｕ）マウスに、３×１０６対数期Ａ３７５−Ｍ細胞を右脇腹に皮下注射し、腫瘍を樹立させた。一旦腫瘍が測定可能なサイズ（〜３０ないし５０ｍｍ３）に到達すれば、動物を、静脈内尾静脈を介し、生理食塩水（対照）またはＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ融合構築体（３７．５ｍｇ／ｋｇ合計用量）いずれかで１日おきに５回処理した。動物をモニターし、腫瘍をさらに２８日間測定した。生理食塩水−処理対照腫瘍は２８日間にわたって（５０ｍｍ３から１２００ｍｍ３まで）２４倍増加した。対照的に、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ（３７．５ｍｇ／ｋｇ）処理腫瘍は（５０ｍｍ３から２００ｍｍ３まで）４倍増加した。
【図３９】図３９は、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬはＥＬＩＳＡによって評価して、ｇｐ２４０抗原陽性メラノーマ細胞系に特異的に結合することを示す。接着性メラノーマ細胞（ウェル当たり５×１０４細胞）を含有する９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する溶液の添加によって１時間ブロックした。ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬの結合活性を検出するために、細胞を、種々の濃度の精製されたＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬと共に室温にて１時間インキュベートした。それらを洗浄した後、細胞をウサギ抗−ｓｃＦｖＭＥＬ抗体と共にインキュベートし、続いて、ヤギ抗−ウサギ／ＨＲＰコンジュゲート（ＨＲＰ−ＧＡＲ）抗体を加えた。最後に、１μｌ／ｍｌの３０％Ｈ２Ｏ２を含有する基質溶液ＡＢＴＳをウェルに加えた。４０５ｎｍにおける吸光度を３０分後に測定した。ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬは、高レベルのｇｐ２４０抗原を発現するメラノーマＡ３７５−Ｍ、ＭＥＬ−５２６、ＴＸＭ−１８に結合したが、ｇｐ２４０抗原の非常に低レベルの発現を有するＴＸＭ−１には結合しなかった。
【図４０】図４０は、ドキソルビシンに対する細胞抵抗性は、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬに対する僅かな交差−抵抗性に関連することを示す。Ａ３７５−ドキソルビシン抵抗性（Ａ３７５ＤＲ）細胞は、親Ａ３７５細胞と比較してドキソルビシンに対して４００倍抵抗性である。対数期Ａ３７５ＤＲ細胞を、種々の用量のＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬで７２時間処理した。対照のパーセントとは、対照（未処理）細胞のそれと比較した薬物−処理ウェル細胞における細胞のパーセンテージをいう。Ａ３７５ＤＲ細胞は、親Ａ３７５細胞と比較してＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬに対して４．５倍の抵抗性を示したに過ぎなかった（６３．６  ｖｓ．１４．５ｎＭのＩ．Ｃ．５０）。
【図４１】図４１Ａないし４１Ｃは、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬはイオン化放射線に対してメラノーマ細胞を感受性とすることを示す。ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬによる放射線感受性は、クローン原性細胞生存アッセイに基づいた。Ａ３７５（図４１Ａ）、Ａ３７５ＤＲ（図４１Ｂ）、およびＳＫＢＲ３−ＨＰ（図４１Ｃ）細胞をＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬで予備処理し（１０ｎＭ、１６時間）、薬物を洗浄除去し、細胞を種々の用量で照射し、クローン原性細胞生存アッセイのために平板培養した。観察された感受性は、Ａ３７５細胞については２、４および６Ｇｙ用量において（ｐ＜０．０５）、Ａ３７５ＤＲ細胞においては４および６Ｇｙ用量群において（各々、ｐ＜０．０５および０．００５）統計学的に有意であった。ｇｐ２４０抗原陰性ＳＫＢＲ３細胞においては統計学的に有意な感受性は観察されなかった（ｐ＞０．０５）。
【図４２】図４２Ａおよび４２Ｂは、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬがマトリゲルのＡ３７５ＤＲ細胞の侵入を阻害することを示す。Ａ３７５ＤＲ細胞凝集体は、材料および方法セクション下に記載されているように調製した。細胞凝集体をマトリゲルクッション上に移し、次いで、さらなる１００μｌのマトリゲルを重ねた。マトリゲルへの凝集体をＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ（５０ｍＬ）の存在または不存在下で４００μｌの培養基で被覆した。次いで、凝集体を光学顕微鏡下で毎日観察した（図４２Ａ）。Ａ３７５ＤＲ細胞は活動的に凝集体を去り、４および６日にマトリゲル調製物に侵入する。Ａ３７５ＤＲ細胞のＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬの処理は、４および６日においてマトリゲルのＡ３７５ＤＲ侵入を阻害する。凝集体の周りのマトリゲルに侵入した細胞の密度はＡｌｐｈａＥａｓｅ（登録商標）ＦＣソフトエアによって分析し、侵入のパーセントは、２つの群の細胞密度に基づいて計算し、１００％侵入としての非−処理対照群の値によって標準化した（図４２Ｂ）。
【図４３】図４３は、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬが、腫瘍組織においてアポトーシスを誘導することによって異種移植片メラノーマモデルに対して抗−腫瘍活性を示すことを示す。Ａ３７５−Ｍ異種移植片腫瘍に対するＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬの抗−腫瘍効果。６ないし８週齢の雌無胸腺（ｎｕ／ｎｕ）マウスに、３×１０６対数期Ａ３７５−Ｍ細胞を右脇腹に皮下注射し、腫瘍を樹立させた。一旦腫瘍が測定可能なサイズ（〜５０ｍｍ３）に到達すれば、動物に、生理食塩水（対照）またはＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ融合構築体いずれかを１日おきに５回静脈内投与した（３７．５ｍｇ／ｋｇ合計用量）。動物をモニターし、腫瘍をさらに２８日間測定した。生理食塩水−処理対照腫瘍は２８日間にわたって（５０ｍｍ３から１２００ｍｍ３まで）２４倍増加した。対照的に、ＧｒＢ／ｓｃＦｖＭＥＬ処理腫瘍は（５０ｍｍ３から２００ｍｍ３まで）４倍増加した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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