(57)【要約】  本発明は、造血器型プロスタグランジンＤ２合成酵素（ｈＰＧＤＳ）の活性を減少させる、または阻害するそれらの能力に関して化合物および物質を分析するための、新規で有用な方法に関する。具体的には、本発明は、ｈＰＧＤＳ阻害剤の効力、特異性および毒性を測定するための分析に関する。【選択図】  図１
2008507980.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞におけるｈＰＧＤＳ阻害化合物の効力、特異性および毒性をスクリーニングする方法であって、次の段階：
ｉ）該哺乳動物細胞と、アラキドン酸の放出を増加させる刺激分子とを接触させ、
ii）該哺乳動物細胞を、化合物で処理し、
iii）該哺乳動物細胞またはその上清におけるＰＧＤ２のレベルを測定し、
iv）該哺乳動物細胞におけるＰＧＤ２のレベルと、該化合物で処理されていないコントロール哺乳動物細胞におけるＰＧＤ２のレベルとを比較して、該化合物の効力を決定し、
ｖ）該哺乳動物細胞におけるＰＧＥ２のレベルを測定し、
vi）該哺乳動物細胞におけるＰＧＤ２のレベルとＰＧＥ２のレベルとを比較し、ここで、ＰＧＤ２のレベルがＰＧＥ２のレベルより低いという結果は、化合物がｈＰＧＤＳに特異的な阻害活性を有することを示すものとし、
vii）化合物で処理された哺乳動物細胞の細胞毒性の量と、コントロール哺乳動物細胞の細胞毒性の量を測定し、処理された哺乳動物細胞における細胞毒性レベルと、コントロール哺乳動物細胞における細胞毒性レベルとを比較し、ここで、化合物で処理された細胞における細胞毒性の結果は、細胞増殖の阻害の指標であるものとすること、
を含む、上記方法。
【請求項２】
哺乳動物細胞は、肥満細胞、抗原提示細胞、巨核球、およびＴＨ２リンパ球からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳動物細胞は、ラット好塩基球性白血病（ＲＢＬ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
刺激分子は、カルシウムイオノフォア、イオノマイシン、ホルボールエステル、増殖因子、サイトカイン、発癌プロモーター、およびカルシウムチャンネル動員分子からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
カルシウムイオノフォアは、Ａ２３１８７である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
カルシウムチャンネル動員分子は、ＢＡＹ  Ｋ−８６４４である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
刺激分子は、アラキドン酸である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物および物質を、造血器型プロスタグランジンＤ２合成酵素（ｈＰＧＤＳ）の活性を減少させる、または阻害するそれらの能力に関して分析するための、新規で有用な方法に関する。具体的には、本発明は、ｈＰＧＤＳ阻害剤の効力、特異性および毒性を測定するための分析法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロスタグランジンは、多様な生物学的作用を有するエイコサノイドの一種である。プロスタグランジンは、心臓血管系、血小板凝集に対する薬理効果、胃腸系、腎臓機能および尿生成に作用する平滑筋に対する効果、中枢神経系、内分泌系に対する効果、代謝に対する効果を有し、炎症および免疫反応において重要な役割を果たすことが示されている。従って、プロスタグランジンは、広範な治療上の有用性を有する可能性を示す。プロスタグランジンはアラキドン酸から合成され、アラキドン酸の鎖の一部を形成していた炭素原子の５員環を有する。典型的には、プロスタグランジンは、局所的に、すなわちそれらの合成部位の近傍で作用する。
【０００３】
プロスタグランジンＤ２（ＰＧＤ２）は、気道アレルギー性疾患の主要な媒介物質である抗原の攻撃に応答して活性化された肥満細胞によって生産される主要なプロスタノイドである。特に、ＰＧＤ２は、とりわけ、気管支収縮、気管支過敏性、鼻充血、ならびに好酸球およびＴＨ２細胞の浸潤を引き起こす。また、抗原によって刺激された肥満細胞および好塩基球から放出されたＰＧＤ２は、喘息における即時型過敏性、気道炎症、またはリモデリングを誘発すると考えられている。
【０００４】
酵素プロスタグランジンＤ合成酵素（ＰＧＤＳ）は、プロスタグランジンＨ２（ＰＧＨ２）の、ＰＧＤ２への変換を触媒する。２種のＰＧＤ２合成酵素が既知である。第一は、主に中枢神経系で見出されるリポカリン型（Ｌ−ＰＧＤＳ）であり、第二は、主に末梢組織で見出される造血器型ＰＧＤＳ（ｈＰＧＤＳ）である。Ｌ−ＰＧＤＳはグルタチオン（ＧＳＨ）非依存性であるが、一方、ｈＰＧＤＳはＧＳＨ依存性である。その上、Ｌ−ＰＧＤＳとｈＰＧＤＳとの構造的な相同性はほとんどない。
【０００５】
ＰＧＤ２は炎症において重要な役割を果たすため、それらの生産を阻害することが可能な化合物をスクリーニングするための分析を開発しようとする試みがなされてきた。特に、ＰＧＤ２合成阻害剤は、アレルギー性鼻炎、喘息の治療、さらに場合によっては慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療に有用である可能性がある。また、その治療用途は、多発性硬化症、アルツハイマー病、および虚血再潅流傷害、脳腫瘍によって引き起こされる障害の治療ならびにプロスタグランジンで調節される生物学的プロセスにおける治療用途に拡大される可能性がある。
【０００６】
化合物または物質の、ＰＧＤ２の生産を減少させる、阻害する、強化する、または調節する能力を決定するために、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）（または酵素免疫検査法（ＥＩＡ）として知られている）、または、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）のような技術を用いて、ＰＧＤ２の生産量を定量することができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これまでに、効力、特異性および毒性の評価は、異なる実験パラダイムに分けられてきた。さらに特異性の測定は生化学分析において最も適しているが、多くの場合細胞中に存在する複雑な生物学的状態は模倣できなかった。従って、同じ実験サンプルからのＰＧＤＳモジュレーターの効力、特異性および毒性を測定する細胞ベースの分析を設計することが望ましい。このような設計は、一般的に二次スクリーニングを必要とする工程を短縮し、さらに、インビボでの細胞状態により密接に関連した情報を提供することになる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ｈＰＧＤＳモジュレーターに関し、効力、特異性および細胞毒性を同時に評価することができる、単一の細胞ベースの分析を確立する。ｈＰＧＤＳの活性を調節する化合物は、炎症の治療、および免疫応答の薬理学的な処置のための新規の治療アプローチを提供する。このような分析の設計は、ｈＰＧＤ２が発現されるあらゆる哺乳動物細胞系に使用するのに適しており、例えば肥満細胞、抗原提示細胞、巨核球、およびＴｈ２リンパ球である。本発明において、哺乳動物細胞は、アラキドン酸の放出を高める刺激分子で処理される。本発明で意図される分子は、カルシウムイオノフォア、例えばＡ２３１８７、イオノマイシン、ホルボールエステル、増殖因子、サイトカイン、発癌プロモーター、またはカルシウムチャンネル動員分子、例えばＢＡＹ  Ｋ−８６４４である。特定の一実施形態において、アラキドン酸は、細胞に直接添加してもよい。
【０００９】
ｈＰＧＤＳを調節する化合物をスクリーニングするのに用いられる細胞を試験化合物および刺激分子で処理して、アラキドン酸の放出を誘導する。試験化合物の存在下で、ＰＧＤ２の生産レベルを測定し、試験化合物で前処理していない場合のＰＧＤ２レベルと比較する。試験化合物の効力を測定することに加えて、本発明は、上記細胞ベースの分析系に一体化された、特異性および細胞毒性の測定を提供する。これは、ＰＧＥ２に関する第二の計測値を評価することによって設計される。例えば、試験化合物がｈＰＧＤＳ活性を特異的に阻害する場合、その試験化合物は、ＰＧＥ２に関するＩＣ５０より有意に低いＰＧＤ２に関するＩＣ５０を発生させることになる。それに対して、試験化合物が非特異的であるか、または、細胞毒性である場合、その試験化合物は、ＰＧＤ２とＰＧＥ２とで類似したＩＣ５０値を発生させることになる。追加の細胞毒性試験を用いて、これらの値が、試験化合物の毒性によるものなのか、またはプロスタノイド合成の非特異的な阻害によるものなのかを決定することができる。
【００１０】
本発明の上記の形態およびその他の形態、特徴および利点は、添付の図を共に参照しながら、以下の詳細な説明によりさらによく理解できると思われる。
【００１１】
図面の簡単な説明
図１は、特異的なＰＧＤ２阻害剤と、非特異的なＰＧＤ２阻害剤とを区別するための細胞ベースの分析の結果を示す。化合物Ａ００００５０３５０は、ＲＢＬ細胞におけるＰＧＤ２生産を特異的に阻害するが、それに対して、化合物Ａ０００１２７３４８は、ＲＢＬ細胞におけるＰＧＤ２生産とＰＧＥ２生産の両方を非特異的に阻害する。
図２は、細胞毒性の評価を示すグラフであり、これは、セルタイター９６アクオス・ワン・ソリューション・セル・プロリフェレーション・アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）を用いて、数種の濃度のＰＧＤＳ試験化合物で処理したラット好塩基球性白血病（ＲＢＬ）細胞の細胞増殖を測定することによってなされた。
【００１２】
本発明は、造血器型ＰＧＤ２合成酵素（ｈＰＧＤＳ）を調節する化合物をスクリーニングするための細胞ベースの分析に関する。本分析は、生きた細胞中で試験化合物の効力、特異性および毒性を評価する。本発明は、多くの炎症性疾患を治療するための薬物として使用可能な阻害化合物の同定を可能にし、このような炎症性疾患としては、例えば、これらに限定されないが、喘息、アレルギー性鼻炎、ＣＯＰＤ、多発性硬化症、アルツハイマー病、および虚血再潅流傷害により生じたその他の障害が挙げられる。
【００１３】
本発明は、概して、単一の細胞ベースの分析中で、ｈＰＧＤＳ活性を調節する試験化合物の効力、特異性および細胞毒性を測定するために用いられる細胞ベースの分析に関する。測定は、迅速に行うことができ、さらに、規模を大きくして多種の様々な化合物を同時に試験することができる。
【００１４】
分析することができる化合物に関して格別な限定はない。例としては、小分子量化学分子、合成低分子化合物のライブラリー、精製タンパク質、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成ペプチドライブラリー、細胞抽出物、および培養上清が挙げられる。
【００１５】
本発明では、ｈＰＧＤＳを発現する哺乳動物細胞系であればどのような哺乳動物細胞系を用いてもよい。例えば、これらに限定されないが、肥満細胞、抗原提示細胞、巨核球、およびＴｈ２リンパ球が挙げられる。加えて、ラット好塩基球性白血病（ＲＢＬ）のような哺乳動物細胞系を用いてもよい。さらなる例としては、ヒトやマウスのような異なる種の一次肥満細胞、または異なる種のＴ細胞サブタイプが挙げられる。本発明では、ｈＰＧＤＳまたは改変ｈＰＧＤＳを、発現または過剰発現するように加工された細胞も包含されるものとする。
【００１６】
選択された哺乳動物細胞は、アラキドン酸の放出を高める刺激分子で処理される。本発明での使用に包含されるものとする分子は、カルシウムイオノフォア、例えばＡ２３１８７、イオノマイシン、ホルボールエステル、増殖因子、サイトカイン、発癌プロモーター、およびカルシウムチャンネル動員分子、例えばＢＡＹ  Ｋ−８６４４である。本発明のその他の特定の実施形態において、アラキドン酸は、選択された哺乳動物細胞に直接添加してもよい。
【００１７】
本発明において効力を測定するために、細胞を試験化合物で処理し、続いて刺激分子を添加してアラキドン酸の放出を高める。刺激分子と様々な濃度の試験化合物で処理した細胞中のＰＧＤ２の生産レベルを測定する。これらのレベルと、刺激で処理したが試験化合物に暴露させていない細胞で生産されたＰＧＤ２のレベルとを比較する。
【００１８】
本発明はまた、同じ細胞ベースの分析に、特異性および細胞毒性を測定する能力を提供する。これは、プロスタノイド生産の第二の計測値（例えば細胞上清中のＰＧＥ２のレベル）を評価することによって設計される。試験化合物がｈＰＧＤＳ活性を特異的に阻害する場合、その試験化合物は、ＰＧＥ２に関するＩＣ５０より有意に低いＰＧＤ２に関するＩＣ５０を発生させることになる。それに対して、試験化合物が非特異的であるか、または細胞毒性である場合、その試験化合物は、ＰＧＤ２とＰＧＥ２とで類似したＩＣ５０値を発生させることになる。非特異的な阻害が、試験化合物の毒性によるものなのかどうかを決定するために、追加の細胞毒性分析は、上述の細胞ベースの分析と同じサンプルを用いてその後に行ってもよいし、または上述の細胞ベースの分析と同じ条件を用いて別々に行ってもよい。細胞増殖の阻害の結果は、試験された化合物の標的外の活性の測定と考察される。
【００１９】
本発明で使用可能な細胞毒性分析としては、これらに限定されないが、ＭＴＳ、ＭＴＴおよびＬＤＨ分析のような分析が挙げられ、いずれも、例えばプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から市販されている。
【００２０】
化合物のＰＧＤ２のレベルを調節する能力は、単に阻害化合物の存在下と非存在下で測定を行うだけでなく、それらの様々な濃度で測定を行うことによっても決定される。様々な化合物濃度で測定を行うことによって、そのＩＣ５０のような特定の特徴を計算することが可能である。ＩＣ５０は、化合物が５０％阻害を引き起こす濃度と定義される。逆に言えば、本発明の分析は、閾値下の量の刺激分子を用いることによる、または刺激分子を用いないことによる、ＰＧＤ２生産を刺激する化合物に関する分析に、容易に修正可能である。
【００２１】
また当然ながら、本発明の分析はまた、単一点分析として行い、１種のみの濃度の試験化合物を用いて、ＰＧＤ２およびＰＧＥ２生産に対する化合物の阻害を評価してもよい。単一点のスクリーニングとＩＣ５０決定はいずれも、ハイスループットスクリーニングに適している。ハイスループットスクリーニングシステムは、市販されている（例えば、ザイマーク社（Ｚｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐ．，ホプキントン，マサチューセッツ州）；エアー・テクニカル・インダストリーズ（Ａｉｒ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，メンター，オハイオ州）；ベックマン・インスツルメンツ社（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，フラトン，カリフォルニア州）；プレシジョン・システムズ社（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，ナティック，マサチューセッツ州）などを参照）。これらのシステムは、典型的には、全てのサンプルおよび試薬のピペッティング、液体の分配、時間制御されたインキュベーション、および分析に適した最終的な検出器におけるサンプルの読み取りなどの全手順を自動化している。これらの設定可能なシステムは、ハイスループットおよび迅速なスタートアップ、同様に、高度のフレキシビリティーおよびカスタマイゼーションを提供する。このようなシステムの製造元は、様々なハイスループット分析のための詳細なプロトコールを提供する。
【００２２】
ＰＧＤ２およびＰＧＥ２の濃度を測定する方法は当技術分野でよく知られている。例えば、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィーマススペクトロメトリー（ＧＣ−ＭＳ）、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）（また、酵素免疫検査法（ＥＩＡ）としても知られている）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡｓ）、および蛍光偏光法（ＦＰ）が挙げられる。また、シンチレーション近接分析も、ＰＧＤ２およびＰＧＥ２レベルの測定において有用であり得る。
【００２３】
本発明は、本明細書で説明されている特定の実施形態による範囲に限定されない。実際に、本明細書で説明されているものに加えて、本発明の様々な改変が、当業者であれば前述の説明と添付の図から明白になると予想される。このような改変は、添付の請求項の範囲内にあるものとする。
【００２４】
本明細書で引用された全ての参考文献は、それらの全体を参照により本明細書に組み入れる。
【００２５】
〔実施例〕
実施例１：カルシウムイオノフォアでの細胞処理ならびに試験化合物およびコントロール化合物とのインキュベート
この実施例において、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞（アメリカン・ティッシュー・カルチャー・センター（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ）から入手）を、トリプシン処理（１０％ウシ胎仔血清、Ｌ−グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンが添加された調製ＭＥＭ培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）１１０９５−０８０）中の０.０５％トリプシンＥＤＴＡ）して、単一細胞の懸濁液にした。９６ウェルプレート中に、ＲＢＬ細胞を２×１０4細胞／ウェルで蒔いた。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。
【００２６】
ＨＢＳＳ緩衝液（ギブコ／インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１４０２５−０９２）を、基準化合物または試験化合物に含まれるＤＭＳＯの最高濃度に等しいＤＭＳＯ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｄ−８７７９）で希釈した。使用前に、化合物プレートと基準コントロールを融解し、よく混合した。この実施例において、ＣＯＸ−１阻害剤ＳＣ５６０を基準として用い、ケイマン・ケミカル（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）から購入した。
【００２７】
試験化合物と基準ＳＣ５６０の希釈液は、以下に示すＥＩＡテンプレートに従って、コースター（Ｃｏｓｔａｒ）（３９６０、またはそれと同等のもの）分析ブロックを用いて製造した。カラム１のウェル（ブランク、ＴＡ＝総活性、ＮＳＢ＝非特異的な結合、および、Ｂｏ＝バックグラウンド）、ならびにカラム２および３は、細胞の処理には用いずに、ＥＩＡ分析のための標準を充填した。コントロール１、２、５および６は、カルシウムイオノフォアを含むが化合物を含まないポジティブコントロールである。コントロール３、４、７および８は、カルシウムイオノフォアまたは化合物を含まないネガティブコントロールである。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
試験化合物を以下のように希釈した：ＨＢＳＳ（ＤＭＳＯ非含有）１ｍｌを、分析ブロックのウェルＡ４〜Ａ１０［３０μＭ］に添加した。ＨＢＳＳ（０.３％ＤＭＳＯ含有）６２０μｌを、ウェルＢ４〜Ｂ１０からＨ４〜Ｈ１０に添加した。化合物ストック３μｌ［１０ｍＭ］を、ウェルに３０μＭで添加した。よく混合した。Ａ列［３０μＭ］からＢ列［１０μＭ］の３１０μｌを添加した。よく混合した。上述のようにして希釈を続け、以下の濃度［３０、１０、３.３、１.１、０.３７、０.１２、０.０４、および、０.０１４μＭ］を作製した。
【００３０】
基準ＳＣ５６０を以下のように希釈した：ＨＢＳＳ（ＤＭＳＯ非含有）１ｍｌを、ウェルＡ１１に添加した。ＨＢＳＳ（０.３％ＤＭＳＯ含有）６２０μｌを、ウェルＢ１１〜Ｈ１１に添加した。予め希釈したストック３μｌ［１ｍＭ，１００％ＤＭＳＯ中］を、ウェルＡ１１に添加した［３μＭ］。よく混合した。ウェルＡ１１［３μＭ］からウェルＢ１１［１μＭ］に３１０μｌを添加した。よく混合した。希釈を続け、以下の濃度［３μＭ、１μＭ、０.３３μＭ、０.１１μＭ、０.０３７μＭ、０.０１２μＭ、０.００４１μＭ、および、０.００１３μＭ］を作製した。
【００３１】
カルシウムイオノフォア（Ａ２３１８７シグマ番号Ｃ−７５２２）とメトキシム化試薬（ｍｅｔｈｏｘｉｍａｔｅ  ｒｅａｇｅｎｔ）（ケイマンのキット番号５１２０１１の説明に従って製造）を添加するための自動化した細胞の処理を、ザイマークのサイクローン・デッキ（ＳｃｉＣｌｏｎｅ  Ｄｅｃｋ）を用いて設計した。
【００３２】
以下に概略を説明するように、本発明の自動化（Ａ）プロトコールは、多数の工程を手動（Ｍ）で行うことが必要である。
【００３３】
（Ａ）オーバーナイト培地（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  ｍｅｄｉａ）を除去し、ＨＢＳＳ緩衝液２００μｌで１回洗浄した。細胞からＨＢＳＳ緩衝液を除去し、テンプレートに従って、２００μｌ／ウェルの希釈した化合物とコントロールで置換した。（Ｍ）カバーをして、細胞プレートを３７℃に戻した。１５分間インキュベートした。細胞プレートのカバーをはずし、デッキに戻した。（Ａ）ポジティブコントロールを含む２００μｌの細胞処理物のウェルに、２０倍濃度１０μｌを添加した。ここで、ネガティブコントロールウェルには、カルシウムイオノフォアの添加がないことに留意。（Ｍ）空のチップボックスを除去し、デッキ位置Ｂ２、Ｂ３およびＢ４に２００μｌチップで置き換えた。（Ｍ）カバーをして、細胞プレートを３７℃に戻した。１５分間インキュベートした。（Ｍ）プレートを１０００×ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞プレートのカバーをはずし、デッキに戻した。（Ａ）上清２５μｌを回収し、ＰＧＤ２−ＭＯＸ  ＥＩＡキット（ケイマン番号５１２０１１、またはそれと同等のもの）に従って、ＭＯＸ試薬２５μｌで（１：１の比率）化学的にメトキシム化した。以下の実施例を参照。（Ｍ）ＭＯＸ分析プレートのカバーをして、６０℃で３０分間インキュベートした。（Ｍ）追加の分析プレートを、ＰＧＥ２解析のために回収される上清用にデッキ位置Ｄ２、Ｄ３およびＤ４に置いた（Ａ）残存する上清１７５μｌを回収して、ＰＧＥ２に関して評価した。メトキシム化された（ＰＧＤ２について）、およびメトキシム化されていない（ＰＧＥ２について）上清は、−８０℃で３ヶ月まで保存することができる。
【００３４】
実施例２：プロスタグランジンＤ２レベルの定量化：酵素免疫検査法
この実施例において、ＰＧＤ２の濃度を、酵素免疫検査法（ＥＩＡ）を用いて測定した。ＰＧＤ２を測定するためのＥＩＡは、商業的に入手可能である。例えば、ＰＧＤ２ＥＩＡキットは、ケイマン・ケミカルより入手可能である。
【００３５】
この分析は、限られた数のＰＧＤ２−ＭＯＸ特異的ウサギ抗血清結合部位に関する、ＰＧＤ２−メトキシム（ｍｅｔｈｏｘｉｍｅ）（ＭＯＸ）と、ＰＧＤ２−ＭＯＸ−アセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ）結合体（ＰＧＤ２−ＭＯＸトレーサー）との競合に基づく。ＰＧＤ２−ＭＯＸトレーサーの濃度は一定に保たれるが、ＰＧＤ２−ＭＯＸの濃度は変動するため、ウサギ抗血清に結合することができるＰＧＤ２−ＭＯＸトレーサーの量は、ウェル中のＰＧＤ２−ＭＯＸの濃度に反比例する。このウサギ抗血清−ＰＧＤ２−ＭＯＸ複合体は、予めウェルに結合させたマウスモノクローナル抗ウサギＩｇＧに結合する。プレートを洗浄した後、エルマン試薬（ＡｃｈＥに対する基質を含む）をウェルに添加した。その酵素生成物は、４１２ｎｍで強く吸光する明瞭な黄色であった。この色の強度は、ウェルに結合したＰＧＤ２−ＭＯＸトレーサーの量に比例し、インキュベート中にウェル中に存在する遊離のＰＧＤ２−ＭＯＸの量に反比例する。
【００３６】
ＥＩＡと洗浄緩衝液を、市販の説明書に従って作製した。サンプルを前述の実施例に従って製造した。プロスタグランジンレベルは変動する可能性があるため、上清をＥＩＡ緩衝液で希釈して、標準曲線の直線範囲内のプロスタグランジンレベルを得た。全般的に使用するＰＧＤ２の希釈率は、１：１２.５であった。
【００３７】
製造元の説明書に従って、メチルオキシム化試薬、ＰＧＤ２−ＭＯＸ発現ＥＩＡ標準、ＰＧＤ２−ＭＯＸ  ＡｃｈＥ発現トレーサー、ＰＧＤ２−ＭＯＸ発現抗血清、およびＰＧＤ２−ＭＯＸ発現ＥＩＡメトキシル化コントロールを調製した。製造元の説明書に従って分析を行い、４１２ｎｍの波長でプレートを読んだ。
【００３８】
８種の濃度の試験化合物で処理した細胞のプロスタグランジンレベルを決定した後、化合物濃度の対数スケールに対するプロスタグランジンレベルの片対数プロットを行うことによって、化合物のＩＣ５０を得た。また、この分析は、１種のみの化合物濃度を用いてＰＧＤ２生産に対する化合物の阻害を評価する単一点分析として行ってもよい。
【００３９】
実施例３：プロスタグランジンＥ２レベルの定量化
この実施例において、ＰＧＥ２濃度を、酵素免疫検査法（ＥＩＡ）を用いて測定した。ＰＧＥ２を測定するためのＥＩＡは、商業的に入手可能である。例えば、ＰＧＥ２ＥＩＡキットは、アッセイ・デザインズ（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ）より入手可能である。ＰＧＥ２ＥＩＡは、ＰＧＥ２に特異的なマウスモノクローナル抗体を用いた。溶液中の遊離のＰＧＥ２は、既知の量のＰＧＥ２トレーサーと競合して、限られた量の抗ＰＧＥ２抗体と結合する。ＰＧＥ２トレーサーは、ＰＧＥ２とアセチルコリンエステラーゼとの結合体である。次に、ヤギ抗マウスＩｇ抗体を用いて抗ＰＧＥ２抗体を固定した。次に、固定した抗体を、アセチルコリンエステラーゼの基質を含むエルマン試薬で展開させた。この反応によって生成した生成物は黄色を有し、４１２ｎｍで強く吸光した。高濃度のＰＧＥ２が存在する場合、ＰＧＥ２が、トレーサーに打ち勝つことになり、得られたサンプルは、４１２ｎｍで弱い吸光度を有するものとなる。逆に、低い濃度のＰＧＥ２が存在する場合、トレーサーが、ＰＧＥ２に打ち勝つことになり、得られたサンプルは、４１２ｎｍで強い吸光度を有するものとなる。この分析を行う際、４１２ｎｍでの吸光度を、既知の濃度のＰＧＥ２の吸光度の標準と比較した。
この分析は、当業者によって、例えばザイマークのサイクローン・デッキを用いることによって自動化様式に容易に変換することもできる。
【００４０】
実施例４：特異的な化合物と非特異的な化合物とを区別するための、ＰＧＤ２およびＰＧＥ２の定量化
この実施例は、特異的な化合物と非特異的な化合物とを区別するために上記のＰＧＤ２およびＰＧＥ２細胞ベースの分析がどのようにして用いられるかを示す。図１で示されるように、化合物Ａ０００５０３５０は、ＰＧＤ２阻害に関して２.６５μＭのＩＣ５０値を生じるが、ＰＧＥ２の阻害では示さなかったことから、Ａ００５０３５０は、有力で特異的なＰＧＤ２合成阻害剤であることを示唆した。それに対して、化合物Ａ０００１２７３４８は、ＰＧＤ２とＰＧＥ２に関して類似のＩＣ５０値（それぞれ０.３３μＭおよび０.４１μＭ）を生じたことから、Ａ０００１２７３４８は、非特異的な化合物、または、細胞毒性の化合物であることを示唆した。それに続く細胞毒性試験により、化合物Ａ０００１２７３４８は、試験条件下で細胞増殖に影響を与えることが確認された。
【００４１】
この実施例において、細胞ベースの分析の場合と同じ条件下で（ただしＡ２３１８７を添加しなかったことを除く）、ＲＢＬ細胞をＰＧＤＳ化合物で４５分間処理した。起り得る細胞毒性を、セルタイター９６アクオス・ワン・ソリューション・セル・プロリフェレーション・アッセイ（ＭＴＳ）（プロメガ，マディソン，ウィスコンシン州，カタログ番号Ｇ３５８２）で決定した。この分析を、製造元の説明書に従って行った。
【００４２】
０.０１μＭ〜３０μＭの範囲の８種の濃度の各化合物の細胞毒性を決定した。試験濃度は、０.０１４μＭ、０.０４１μＭ、０.１２３μＭ、０.３７０μＭ、１.１１１μＭ、３.３３３μＭ、１０μＭ、および３０μＭであった（図２を参照）。化合物Ａ０００１２７３４８、およびその他のＰＧＤＳ化合物、Ａ０００１２３３８３は毒性であり、同じプロット中に示された多数の非毒性の試験化合物と区別された。ポジティブコントロールとして、ゲネチシンを用いた。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】特異的なＰＧＤ２阻害剤と、非特異的なＰＧＤ２阻害剤とを区別するための細胞ベースの分析の結果を示す。
【図２】細胞毒性の評価を示すグラフである。
【図１】
2008507980.tif 000004
【図２】
2008507980.tif 000005
【国際調査報告】
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