(57)【要約】本発明は、炎症性腸疾患を診断するために用いることができる、および場合によっては、クローン病を有する患者から単離されたＰＢＭＣと潰瘍性大腸炎を有する患者から単離されたＰＢＭＣとを識別することができる、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの同定に関する。さらに、本発明は、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの活性を調節することができる調節剤についての、ハイスループットスクリーニング法を含む、スクリーニング法に関する。炎症性腸疾患、例えばクローン病および潰瘍性大腸炎の診断方法、予後予測方法、治療的介入方法および予防方法のための、少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤を含む、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの組成物を提供する。
2008545437.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者において炎症性腸疾患を診断する方法であって、
ａ．患者からサンプルを単離する工程；および
ｂ．少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの正常発現または異常発現を前記サンプルにおいて検出する工程；
を含み、少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの異常発現が、前記患者が炎症性腸疾患に罹患している場合があることを示す方法。
【請求項２】
前記サンプルが、末梢血単核細胞の採取物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検出工程が、ハイブリダイゼーションに基づくアッセイを用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記検出工程が、免疫アッセイを用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記検出工程が、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、定量ポリメラーゼ連鎖反応である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記検出工程が、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのパネルの発現を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのパネルが、少なくとも１つの共通バイオマーカーを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのパネルが、少なくとも１つのＩ群バイオマーカーを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのパネルがＰＡＩ−２を含む、請求項９に記載のパネル。
【請求項１１】
前記ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのパネルが、少なくとも１つのＣＤバイオマーカーを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのパネルが、少なくとも１つのＩＩ群バイオマーカーを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのパネルが、ＡＬＯＸ１２を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのパネルが、ＰＴＧＤＳを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのパネルが、リポカリン２を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのパネルが、少なくとも１つのＵＣバイオマーカーを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのパネルが、少なくとも１つのＩＩＩ群バイオマーカーを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのパネルが、ＩｇＨＧ３を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのパネルが、少なくとも１つのＣＤｖＵＣバイオマーカーを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのパネルが、少なくとも１つのＩＶ群バイオマーカーを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのパネルが、少なくとも１つの分類バイオマーカーを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのパネルが、少なくとも１つのＶ群バイオマーカーを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのパネルが、Ｉ群バイオマーカーセット、ＩＩ群バイオマーカーセット、ＩＩＩ群バイオマーカーセット、ＩＶ群バイオマーカーセットおよびＶ群バイオマーカーセットから成る群より選択されるバイオマーカーセットを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項２４】
患者において潰瘍性大腸炎を診断する方法であって、
ａ．前記患者からサンプルを単離する工程；および
ｂ．少なくとも１つの潰瘍性大腸炎関連バイオマーカーの正常発現または異常発現を前記サンプルにおいて検出する工程
を含み、少なくとも１つの潰瘍性大腸炎関連バイオマーカーの異常発現が、前記患者が潰瘍性大腸炎に罹患している場合があることを示す方法。
【請求項２５】
前記サンプルが、末梢血単核細胞の採取物である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの潰瘍性大腸炎関連バイオマーカーが、ＩＩＩ群バイオマーカーとして類別されるＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーから成る群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１つの潰瘍性大腸炎関連バイオマーカーが、ＩｇＨＧ３を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記検出工程が、ハイブリダイゼーションに基づくアッセイを用いて行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記検出工程が、免疫アッセイを用いて行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記検出工程が、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、定量ポリメラーゼ連鎖反応である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記検出工程が、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのパネルの発現を検出する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
患者においてクローン病を診断する方法であって、
ａ．患者からサンプルを単離する工程；および
ｂ．少なくとも１つのクローン病関連バイオマーカーの正常発現または異常発現を前記サンプルにおいて検出する工程
を含み、少なくとも１つのクローン病関連バイオマーカーの異常発現が、前記患者がクローン病に罹患している場合があることを示す方法。
【請求項３４】
前記サンプルが、末梢血単核細胞の採取物である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１つのクローン病関連バイオマーカーが、ＩＩ群バイオマーカーとして類別されるＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーから成る群より選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記検出工程が、ハイブリダイゼーションに基づくアッセイを用いて行われる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記検出工程が、免疫アッセイを用いて行われる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記検出工程が、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて行われる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、定量ポリメラーゼ連鎖反応である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記検出工程が、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのパネルの発現を検出する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
患者において潰瘍性大腸炎の診断とクローン病の診断を識別する方法であって、
ａ．患者からサンプルを単離する工程；および
ｂ．少なくとも１つの分類バイオマーカーの正常発現または異常発現を前記サンプルにおいて検出する工程
を含み、
クローン病を有する患者の識別に関連した少なくとも１つの分類バイオマーカーの異常発現が、前記患者がクローン病に罹患している場合があることを示す、または
潰瘍性大腸炎を有する患者の識別に関連した少なくとも１つの分類バイオマーカーの異常発現が、前記患者が潰瘍性大腸炎に罹患している場合があることを示す方法。
【請求項４２】
前記サンプルが、末梢血単核細胞の採取物である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記少なくとも１つの分類バイオマーカーが、Ｖ群バイオマーカーとして類別される分類バイオマーカーから成る群より選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記検出工程が、ハイブリダイゼーションに基づくアッセイを用いて行われる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記検出工程が、免疫アッセイを用いて行われる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記検出工程が、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて行われる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、定量ポリメラーゼ連鎖反応である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記検出工程が、分類バイオマーカーのパネルの正常発現または異常発現を前記サンプルにおいて検出することを含み、前記分類バイオマーカーのパネルが、免疫グロブリン重鎖定常領域γ１、免疫グロブリンκ定常領域、ヒト２８ＳリボソームＲＮＡ５’領域、タンパク質チロシンホスファターゼ受容体タイプＣ会合タンパク質、グランザイムＫ、ｍｕｔＬ相同体３、リポカリン２、ＣＸＣＬ５、血清欠乏性応答ホスファチジルセリン結合タンパク質、Ｈ３ヒストンファミリーメンバーＫ、インテグリンβ３（血小板糖タンパクＩＩＩａ、抗原ＣＤ  ６１）、およびＨ２ＢヒストンファミリーメンバーＱバイオマーカーを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記検出工程が、分類バイオマーカーのパネルの正常発現または異常発現を前記サンプルにおいて検出することを含み、前記分類バイオマーカーのパネルが、免疫グロブリン重鎖定常領域γ１、免疫グロブリンκ定常領域、ヒト２８ＳリボソームＲＮＡ５’領域、タンパク質チロシンホスファターゼ受容体タイプＣ会合タンパク質、グランザイムＫ、ｍｕｔＬ相同体３、リポカリン２、ＣＸＣＬ５、血清欠乏性応答ホスファチジルセリン結合タンパク質、Ｈ３ヒストンファミリーメンバーＫ、インテグリンβ３（血小板糖タンパクＩＩＩａ、抗原ＣＤ  ６１）、およびＨ２ＢヒストンファミリーメンバーＱバイオマーカーから成る群より選択される少なくとも２つの分類バイオマーカーを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
前記検出工程が、分類バイオマーカーのパネルの正常発現または異常発現を前記サンプルにおいて検出することを含み、前記分類バイオマーカーのパネルが、免疫グロブリン重鎖定常領域γ１、免疫グロブリンκ定常領域、ヒト２８ＳリボソームＲＮＡ５’領域、タンパク質チロシンホスファターゼ受容体タイプＣ会合タンパク質、グランザイムＫ、ｍｕｔＬ相同体３、リポカリン２、ＣＸＣＬ５、血清欠乏性応答ホスファチジルセリン結合タンパク質、Ｈ３ヒストンファミリーメンバーＫ、インテグリンβ３（血小板糖タンパクＩＩＩａ、抗原ＣＤ  ６１）、およびＨ２ＢヒストンファミリーメンバーＱバイオマーカーから成る群より選択される少なくとも８つの分類バイオマーカーを含む、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００５年６月６日出願の米国特許仮出願第６０／６８７，３３１号および２００５年６月２０日出願の米国特許仮出願第６０／６９２，２９５号からの優先権の恩典を主張する。前記両出願の内容は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、炎症性腸疾患を有する患者から単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の発現プロフィールの分析、ならびに２つのタイプの炎症性腸疾患、すなわちクローン病および潰瘍性大腸炎のうちの一方に罹患している患者間で識別が可能なＰＢＭＣ転写遺伝子サインの同定に関する。
【背景技術】
【０００３】
（関連する背景技術）
潰瘍性大腸炎（ＵＣ）およびクローン病（ＣＤ）は、幾つかの人口統計学的および臨床的な特性を共有する２つの一般的な慢性および再発性の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。しかし、ＵＣおよびＣＤは、組織損傷の点で重要な相違を呈し、これは、これら２つの疾患についての異なる病因病理学プロセスを示唆している。一般的に、ＩＢＤについて提案されている１つの病因は、正常な腸管腔常在菌に対する粘膜免疫系の不適切な活性化である（Podolsky (2002) N. Engl. J. Med. 347:417-29）。Ｔｈ１型応答に関連した経壁性肉芽腫性炎症プロセスがＣＤの特徴であり、これに対してＵＣにおける炎症は、粘膜に限定される傾向があり、そしてＴｈ２応答に関連していると思われる多数の免疫グロブリン分泌性形質細胞を含む（Podolsky，上記）。両疾患は、環境的要因と遺伝的要因の組み合わせにより疾患に対する個体の感受性が決定され得る複合疾患である（Bouma and Strober (2003) Nat. Rev. Immunol. 3:521-33）。
【０００４】
オリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いてＲＮＡレベルで包括的発現プロフィールを定量する能力が、ＣＤ患者およびＵＣ患者から得られた外科的に切除された胃腸組織内に存在する転写サインの調査に、最近、適用された（Lawrance et al. (2001) Hum. Mol. Genet. 10:445-56；Warner and Dieckgraefe (2002) Inflamm. Bowel. Dis. 8:140- 57も参照）。これらの研究により、ＩＢＤにおいて一般的に改変される炎症応答に関与する遺伝子が同定された。加えて、これらの研究は、ＵＣ患者およびＣＤ患者から得られた胃腸組織トランスクリプトームが、まったく異なることを証明し、ＵＣ組織とＣＤ組織を識別すると思われる遺伝子セットを同定した。
【０００５】
外科的切除または生検からの胃腸組織とは異なり、末梢血は、ＵＣとＣＤとを識別するために用いることができる細胞のはるかに入手しやすい組織供給源である。循環末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、感染および疾患の徴候について身体を広範囲に監視することができる。従って、ＰＢＭＣは、疾患の状態または重症度のマーカーとして疾患誘導遺伝子発現を評価するための代用組織としての役割を果すことができる（全般的な概要については、Rockett et al. (2004) Toxicol. Appl. Pharmacol. 194:189-99 参照）。Ｍａａｓおよび共同研究者らは、自己免疫疾患、例えば慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病および多発性硬化症の患者に共通のＰＢＭＣプロフィールを同定した（Maas et al. (2002) J Immunol. 169:5-9）。Ｔｗｉｎｅおよび共同研究者らは、非自己免疫疾患に関連して、腎細胞癌（ＲＣＣ）患者から得たＰＢＭＣが、健常なボランティアのものとは異なる疾患関連トランスクリプトームを示すことを証明した（Twine et al. (2003) Cancer Res. 63:6069-75）。Ｍａｎｎｉｃｋおよび共同研究者らは、７例のＣＤ患者および５例のＵＣ患者からのＰＢＭＣの発現プロフィールと２４００個の遺伝子のｃＤＮＡマイクロアレイを最近調査し、これらの疾患間で差次的に発現すると思われる幾つかの遺伝子を記載している（Mannick et al. (2004) Clin. Immunol 112:247-57）。他の遺伝子が、クローン病患者の末梢血単核細胞においてｍＲＮＡレベルで調節されたと以前に報告されている（Gijsbers et al. (2004) Eur. J. Immunol. 34:1992-2000； Hori et al. (2002) J. Gastroenterol. Hepatol. 17:1070-77； Gonsky et al. (1998) J. Immunol. 160: 4914-22）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
末梢性炎症成分は、両方の形態のＩＢＤに関与するという説が出ているが、健常な患者および組織学的に検証されＣＤまたはＵＣいずれかの形態でのＩＢＤであると診断された患者からの循環ＰＢＭＣの転写遺伝子プロフィールが、疾患間の識別を可能にする遺伝子分類子（classifier）を開発する上で首尾よく用いられたことはまだない。今までのところ、ＩＢＤを診断するおよび／またはＣＤとＵＣとを区別するＰＢＭＣ関連トランスクリプトームの能力は、当該分野において知られていない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＣＤおよびＵＣを有する患者のＰＢＭＣにおける遺伝子発現パターンが、ＰＢＭＣにおける遺伝子発現プロフィールのみに基づいてそれらを分類できる程度まで異なるかどうかを判定することにより、ならびにＩＢＤを有する患者と健常な被験者（および場合によってはＣＤを有する患者とＵＣを有する患者）とを識別するために用いることができるＰＢＭＣおよびＩＢＤの関連転写遺伝子発現パターンを提供することにより、この問題を解決する。従って、炎症性腸疾患ならびに／または異なる形態のＩＢＤ（すなわち、ＣＤおよびＵＣ）の診断、予後予測、および／またはモニタリングを、患者からの末梢血単核細胞の転写プロファイリングを含む本発明の比較的侵襲性の低い方法によって補助することができる。
【０００８】
（発明の要旨）
１つの態様において、本発明は、多数のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの同定および類別に基づく（これらのバイオマーカーは、例えば、表１〜４に列挙されたＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーであって、これらは、１）実質的にＩＢＤではない被験者（例えば健常な被験者）のＰＢＭＣと比較して、炎症性腸疾患を有する患者のＰＢＭＣにおいて、２）実質的にＩＢＤではない被験者（例えば健常な被験者）のＰＢＭＣと比較して、クローン病を有する患者のＰＢＭＣにおいて、３）実質的にＩＢＤではない被験者（例えば健常な被験者）のＰＢＭＣと比較して、潰瘍性大腸炎を有する患者のＰＢＭＣにおいて、および４）潰瘍性大腸炎を有する患者と比較して、クローン病を有する患者のＰＢＭＣ）において、それぞれ差次的に発現する）。本発明によって提供され、表１〜４に列挙されているＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーは、Ｉ群、ＩＩ群、ＩＩＩ群およびＩＶ群にもそれぞれ類別され、この類別は以下に基づいている。それらのバイオマーカーを最適に使用して、以下の１）〜３）の進行を診断、予測、またはモニタリングすることができるか否か（１）クローン病または潰瘍性大腸炎のいずれかの形態のＩＢＤを有する患者（Ｉ群バイオマーカー；本明細書において「共通バイオマーカー」のセットともいわれる）；２）クローン病を有する患者（ＩＩ群バイオマーカー；本明細書において「ＣＤバイオマーカー」のセットともいわれる）；もしくは３）潰瘍性大腸炎を有する患者（ＩＩＩ群バイオマーカー；本明細書において「ＵＣバイオマーカー」のセットともいわれる））、および／またはそれらを最適に使用してＩＢＤを有する患者がクーロン病または潰瘍性大腸炎を有するかどうかを識別することができるか否か（ＩＶ群；本明細書において「ＣＤｖＵＣバイオマーカー」ともいわれる）。加えて、表５に列挙されており、Ｖ群バイオマーカー（本明細書では「分類バイオマーカー」のセットとも呼ばれる）として類別されるＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを用いて、クローン病を有する患者と潰瘍性大腸炎を有する患者とを識別することもできる。そしてまた、これらのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーは、ＩＢＤ疾患経路の構成要素でもあり得、それ故、炎症性腸疾患、すなわちクローン病または潰瘍性大腸炎の処置のための新規治療ターゲットとしての役割を果すことができる。
【０００９】
従って、本発明は、炎症性腸疾患、クローン病および／または潰瘍性大腸炎のための（Ｉ群、ＩＩ群、ＩＩＩ群、ＩＶ群および／またはＶ群のバイオマーカーとして類別することができる）ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーとしての、ポリヌクレオチド、それらがコードしているポリペプチド、およびそれらのフラグメント、相同体およびアイソフォームに関する。本発明は、本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤのバイオマーカーに対する抗体、本発明のバイオマーカーを含むアレイ、ならびに／または本発明のバイオマーカーを必要とするアッセイ（例えば、マイクロアレイアッセイ、Ｑ−ＰＣＲアッセイ、核酸レポーターアッセイ（nucleic reporter assay）など）の使用にも関する。加えて、本発明は、炎症性腸疾患、クローン病および／または潰瘍性大腸炎の存在またはリスクを示すためのこれらのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの発現プロフィールの使用に関する。炎症性腸疾患、クローン病および／または潰瘍性大腸炎に関して、これらのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーは、発現レベルの違いを、不良な予後予測または好適な予後予測と相関させるためにも有用である。このＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーは、ＩＢＤに対する処置または治療の有効性の評価にも有用となる場合がある。ＩＢＤ（例えばクローン病、潰瘍性大腸炎など）に対する処置に関して、本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーは、ＩＢＤを改善することができる試験化合物をスクリーニングするためにも有用であり得、および／またはそれら自体治療薬としても有用となる場合がある。
【００１０】
１つの態様において、本発明は、それらの量または活性を示す発現レベルが、炎症性腸疾患（例えばクローン病または潰瘍性大腸炎）の存在と相関しているＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを提供する。本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーは、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ）、そのようなポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドのフラグメント、相同体およびアイソフォームであり得る。ある一定の実施形態において、本発明の方法は、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含む転写ポリヌクレオチドまたはその一部分の存在を検出することによって行われる。あるいは、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの遺伝子またはＲＮＡ種に対応する（すなわち、それらによりコードされている）タンパク質の存在を検出することによって、検出を行うことができる。これらの方法は、タンパク質レベルで行うこともできる。すなわち、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのタンパク質のタンパク質発現レベルを、診断、予後予測および／もしくはモニタリングを目的として、または試験化合物をスクリーニングするために、または治療薬として、評価することができる。
【００１１】
一部の実施形態では、１つより多くのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含むパネルが本発明の方法において使用される。１つの実施形態において、本発明は、複数のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含むパネルを提供する。１つの実施形態において、本発明のパネルは、少なくとも２つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含む。１つの実施形態において、本発明のパネルは、少なくとも３つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含む。１つの実施形態において、本発明のパネルは、少なくとも４つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含む。１つの実施形態において、本発明のパネルは、少なくとも５つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含む。１つの実施形態において、本発明のパネルは、少なくとも６つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含む。１つの実施形態において、本発明のパネルは、少なくとも７つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含む。１つの実施形態において、本発明のパネルは、少なくとも８つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含む。１つの実施形態において、本発明のパネルは、少なくとも９つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含む。１つの実施形態において、本発明のパネルは、少なくとも１０個のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含む。１つの実施形態において、本発明のパネルは、少なくとも１１個のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含む。１つの実施形態において、本発明のパネルは、少なくとも１２個のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含む。他の実施形態において、バイオマーカーパネルは、共通バイオマーカー、ＣＤバイオマーカー、ＵＣバイオマーカー、ＣＤｖＵＣバイオマーカー、および／または分類バイオマーカーを含む。Ｉ群バイオマーカー、ＩＩ群バイオマーカー、ＩＩＩ群バイオマーカー、ＩＶ群バイオマーカーおよび／またはＶ群バイオマーカーから選択されるバイオマーカーを含むバイオマーカーパネルも提供する。本発明のパネルが、任意の数および任意の組み合わせの、本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカー、特に本発明のＶ群バイオマーカーを含むことができることは、当業者には理解されるであろう。従って、本発明の他の非限定的実施形態において、本発明のパネルは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１または少なくとも１２の分類バイオマーカー、例えばＶ群の分類バイオマーカーを含む。例えば、本発明の非限定的パネルは、免疫グロブリン重鎖定常領域γ１（immunoglobulin heavy constant gammer 1）および免疫グロブリンκ定常領域（immunoglobulin kappa constant）バイオマーカーを含むことがある。本発明の別の非限定的パネルは、ヒト２８ＳリボソームＲＮＡ ５’領域、タンパク質チロシンホスファターゼ受容体タイプＣ会合タンパク質、Ｈ３ヒストンファミリーメンバーＫ、インテグリンβ３（血小板糖タンパクＩＩＩａ、抗原ＣＤ６１）、およびＨ２ＢヒストンファミリーメンバーＱバイオマ���カーを含むことがある。本発明の別の非限定的パネルは、免疫グロブリン重鎖定常領域γ１、グランザイムＫ、ｍｕｔＬ 相同体３、リポカリン２、ＣＸＣＬ５、血清欠乏性応答（serum deprivation response）ホスファチジルセリン結合タンパク質、およびＨ３ヒストンファミリーメンバーＫバイオマーカーを含むことがある。１つの実施形態において、本発明のパネルは、（ａ）患者が、（１）クローン病もしくは潰瘍性大腸炎いずれかの形態のＩＢＤ、（２）クローン病、および／または（３）潰瘍性大腸炎を有するかどうかの判定に関して、ならびに／あるいは（ｂ）ＩＢＤを有する患者が、クローン病または潰瘍性大腸炎を有するのかの識別に関して、少なくとも７０％の精度（より好ましくは、少なくとも８０％の精度、最も好ましくは、少なくとも９０％の精度）を提供する。本発明の別の態様において、本発明の１つより多くのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの発現レベルは、（例えば、処置および／または疾患の診断、その予後の判定、その経過のモニタリングなどのための）情報が望まれる特定の被験者サンプルにおいて、判定される。
【００１２】
ある一定の実施形態において、少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの発現の相対レベルの比較は、炎症性腸疾患、クローン病および／または潰瘍性大腸炎の重症度の指標となり、ならびにそのような比較により、診断、予後予測およびモニタリングの分析が可能となる。例えば、ＩＢＤ（および／またはＵＣもしくはＣＤいずれか）についての様々な疾患の進行状態のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの発現プロフィールの比較は、これらのいずれかの疾患の急発または症状発現の予測期間を含む、長期予後予測のための方法を提供する。別の例では、特定の薬物が、特定の患者における長期的予後を改善するように作用するかどうかを含めて、特定の処置レジメンの評価方法を、評価することができる。
【００１３】
ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーは、処置または治療薬のターゲットとしても有用であり得る。従って、メカニズムについては限定しないが、本発明の一部の方法は、本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの発現の調節により、実質的にＩＢＤではない被験者（例えば健常な被験者）から単離されたＰＢＭＣレベルと同様のまたは実質的に同様のレベルでそれらが発現する場合、炎症性腸疾患を改善することができるという原理に基づく。個々のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーまたはそのようなバイオマーカーのパネルについてのこれらの差次的な発現パターンの知見により、特定の発現パターンを調節する目的で、試験化合物をスクリーニングすることができる。例えば、不良な予後の発現プロフィールをより良好な予後または改善された予後の発現プロフィールに変える化合物をスクリーニングすることができる。
【００１４】
これらの実施形態に関して、一部のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーは、治療レジメンに応答して活性または発現が調節されたと判定されるバイオマーカーを含むことができる。あるいは、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの活性または発現の調節を、炎症性腸疾患、クローン病および／または潰瘍性大腸炎の診断または予後予測と相関させることができる。加えて、本発明の調節剤、例えば、少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤（例えば、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、関連するＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド（例えば、阻害性ポリヌクレオチド、阻害性ポリペプチド（例えば、抗バイオマーカー抗体））、小分子など）を治療薬として投与することができる。本発明の別の実施形態において、本発明の調節剤は、本発明の１つまたはそれ以上の他の治療組成物と併用することができる。このような化合物の医薬組成物への調合は、下で説明する。このような治療用調節剤の投与は、少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの異常発現を調節することができ、従って、炎症性腸疾患、クローン病および／または潰瘍性大腸炎を改善または抑制するために用いることができる。本発明の別の実施形態において、本発明の１つまたはそれ以上の調節剤または他の治療組成物は、１つまたはそれ以上の他の公知の治療薬または組成物と併用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
胃腸組織生検材料の発現プロフィール分析により、２つの炎症性腸疾患、すなわちクローン病（ＣＤ）または潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を識別するために用いることができる胃腸関連トランスクリプトームの存在が同定されたが、胃腸組織生検材料が必要とされることが、このような診断法を魅力のないものにしている。胃腸組織生検材料に比べて、末梢血中の細胞、特に循環末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、はるかに入手しやすい。ＰＢＭＣは、感染および疾患の徴候について身体を広範囲に監視することができ、ならびにＩＢＤは、明らかに炎症プロセスを伴うので、ＰＢＭＣは、ＩＢＤの状態または重症度を判定するために有用であり得る組織関連および疾患関連のトランスクリプトームを評価するための胃腸組織の代用物としての役割を果すことができる。
【００１６】
本発明は、患者が炎症性腸疾患に罹患しているかどうかを判定するための、ＰＢＭＣの少なくとも１つの「転写遺伝子サイン」（本明細書では「遺伝子サイン」、「発現サイン」、「トランスクリプトーム」、「プロフィール」または「遺伝子プロフィール」とも呼ばれる）、すなわちＰＢＭＣ関連転写遺伝子サイン、すなわちＰＢＭＣの発現プロフィールの利用に関する。本発明は、ＩＢＤを有する患者が、クローン病または潰瘍性大腸炎に罹患しているかを任意に判定するためのＰＢＭＣ関連トランスクリプトームの使用にも関する。本発明は、ＰＢＭＣ関連およびＩＢＤ関連のトランスクリプトーム、例えばクローン病関連および／または潰瘍性大腸炎関連のトランスクリプトームの所見に基づく。詳細には、本発明は、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの同定に基づき、これらのバイオマーカーは、ＩＢＤ、クローン病および／または潰瘍性大腸炎の診断、予後予測、モニタリングおよび／または処置におけるそれらの有用性に基づき５つの群（Ｉ群、ＩＩ群、ＩＩＩ群、ＩＶ群およびＶ群）に類別することができる。
【００１７】
本明細書で用いられる場合、用語「バイオマーカー」、「遺伝子分類子」または「ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカー」などは、実質的にＩＢＤではない被験者（例えば、健常な被験者）と比較して、炎症性腸疾患（すなわち、クローン病および／または潰瘍性大腸炎）を有する被験者の末梢血単核細胞において量の点で実質的に調節（すなわち、アップレギュレートまたはダウンレギュレート）されるポリヌクレオチド（例えば、遺伝子、転写産物、ＥＳＴなど）またはポリペプチド分子を含む。ある一定の実施形態において、本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーは、Ｉ群バイオマーカー（「共通バイオマーカー」とも呼ばれる）、ＩＩ群バイオマーカー（「クローン病関連バイオマーカー」、「ＣＤ関連バイオマーカー」、「ＣＤ特異的バイオマーカー」または「ＣＤバイオマーカー」とも呼ばれる）、ＩＩＩ群バイオマーカー（「潰瘍性大腸炎関連バイオマーカー」、「ＵＣ関連バイオマーカー」、「ＵＣ特異的バイオマーカー」または「ＵＣバイオマーカー」とも呼ばれる）、ＩＶ群バイオマーカー（「ＣＤｖＵＣバイオマーカー」とも呼ばれる）およびＶ群バイオマーカー（「分類バイオマーカー」とも呼ばれる）のポリヌクレオチド、それらに対応する遺伝子産物、ならびにそれらのフラグメント、相同体およびアイソフォームを含む。
【００１８】
本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーは、実質的にＩＢＤではない被験者のＰＢＭＣと比較してＣＤを有する患者のＰＢＭＣにおいて、および／または実質的にＩＢＤではない被験者のＰＢＭＣと比較してＵＣを有する患者のＰＢＭＣにおいて、実質的に調節（すなわち、アップレギュレートまたはダウンレギュレート）されるポリヌクレオチド、その対応する遺伝子産物、ならびにそれらのフラグメント、相同体およびアイソフォームであり得る。１つの実施形態において、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーは、Ｉ群共通バイオマーカーとして類別されるＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含む。
【００１９】
本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーは、クローン病関連バイオマーカーも含む。本明細書で用いられる場合、「クローン病関連バイオマーカー」または「ＣＤバイオマーカー」は、実質的にＩＢＤではない被験者のＰＢＭＣと比較してクローン病を有する患者の末梢血単核細胞において量の点で実質的に調節（すなわち、アップレギュレートまたはダウンレギュレート）されるポリヌクレオチド、その対応する遺伝子産物、ならびにそれらのフラグメント、相同体およびアイソフォームを含む。加えて、ＣＤバイオマーカーは、実質的にＩＢＤではない被験者のＰＢＭＣの場合と比較して潰瘍性大腸炎を有する患者の末梢血単核細胞では実質的に調節されない。ある一定の実施形態において、本発明のクローン病関連バイオマーカーは、ＩＩ群バイオマーカーとして類別されるＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含み、そのサブセットがＩＶ群およびＶ群のバイオマーカーのリストの中に類別されることもある。
【００２０】
本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーは、潰瘍性大腸炎関連バイオマーカーも含む。本明細書で用いられる場合、用語「潰瘍性大腸炎関連バイオマーカー」または「ＵＣバイオマーカー」は、実質的にＩＢＤではない被験者のＰＢＭＣと比較して潰瘍性大腸炎を有する患者の末梢血単核細胞において量の点で実質的に調節（すなわち、アップレギュレートまたはダウンレギュレート）されるポリヌクレオチド、その対応する産物、ならびにそれらのフラグメント、相同体およびアイソフォームを含む。加えて、ＵＣバイオマーカーは、実質的にＩＢＤではない被験者のＰＢＭＣと比較してクローン病を有する患者の末梢血単核細胞では量の点で実質的に調節されない。ある一定の実施形態において、本発明の潰瘍性大腸炎関連バイオマーカーは、ＩＩＩ群バイオマーカーとして類別されるＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含み、そのサブセットがＩＶ群およびＶ群のバイオマーカーのリストの中に類別されることもある。
【００２１】
本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーは、ＣＤｖＵＣバイオマーカーを含む。本明細書で用いられる場合、用語「ＣＤｖＵＣバイオマーカー」は、実質的にＩＢＤではない被験者のＰＢＭＣと比較して潰瘍性大腸炎またはクローン病いずれかを有する患者の末梢血単核細胞において量の点で実質的に調節（すなわち、アップレギュレートまたはダウンレギュレート）され、且つ、クローン病を有する患者から単離された末梢血単核細胞と潰瘍性大腸炎を有する患者から単離された末梢血単核細胞とを識別することができる、ポリヌクレオチド、その対応する遺伝子産物、ならびにそれらのフラグメント、相同体およびアイソフォームを含む。例えば、一方の炎症性腸疾患、例えば潰瘍性大腸炎を有する被験者におけるＣＤｖＵＣバイオマーカーが、他方の炎症性腸疾患、例えばクローン病を有する被験者におけるその発現と比較して、実質的に調節されることがある。あるいは、一方の炎症性腸疾患、例えば潰瘍性大腸炎を有する被験者におけるＣＤｖＵＣバイオマーカーが、他方の炎症性腸疾患、例えばクローン病を有する被験者と比較して、反対方向に調節されることがある。ある一定の実施形態において、これらの識別ＣＤｖＵＣバイオマーカーは、ＩＶ群のバイオマーカーを含み、そのサブセットが、Ｖ群バイオマーカーのリストの中に類別されることもある。
【００２２】
本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーは、類別バイオマーカーのセットであるＣＤｖＵＣバイオマーカーのより小さいセットに類別することができる。本明細書で用いられる場合、「分類バイオマーカーのセット」は、クローン病を有する患者と潰瘍性大腸炎を有する患者とを識別するために使用することができる、ポリヌクレオチド、それらの対応する遺伝子産物、ならびにそれらのフラグメント、相同体およびアイソフォームのセットを含む。ある一定の実施形態において、分類バイオマーカーのセットは、Ｖ群バイオマーカーとして類別されるセットである。
【００２３】
好ましくは、本発明のために、本発明の実質的に調節される、すなわちアップレギュレートまたはダウンレギュレートされるＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの発現レベルは、それぞれ、異常な量で増加または減少し、その発現レベルは異常であり、例えば、健常な被験者からのＰＢＭＣにおける同じＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーについての標準偏差から外れている。最も好ましくは、実質的に調節されるＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーは、健常な被験者を基準にして、少なくとも１．５倍、２倍、３倍もしくは４倍またはそれ以上の異常な変化でアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる。
【００２４】
ＵｎｉＧｅｎｅアクセッション番号、Ｉ群、ＩＩ群、ＩＩI群、ＩＶ群およびＶ群のバイオマーカーとして含まれるＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの名称、ならびにそれらの調節の方向（すなわち、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション）を下の表１、表２、表３、表４および表５にそれぞれ列挙する。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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1これらのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーは、異常発現を有し、例えば、健常な患者と比較して、ＣＤを有する患者とＵＣを有する患者の両方のＰＢＭＣにおいて実質的にアップレギュレート（↑）またはダウンレギュレート（↓）される。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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2これらのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーは、異常発現を有し、例えば、健常な患者と比較してＣＤを有する患者のＰＢＭＣにおいてのみ実質的にアップレギュレート（↑）またはダウンレギュレート（↓）される（すなわち、ＵＣを有する患者のＰＢＭＣにおいてはされない）。
【表３】
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3これらのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーは、異常発現を有し、例えば、健常な患者と比較してＵＣを有する患者のＰＢＭＣにおいてのみ実質的にアップレギュレート（↑）またはダウンレギュレート（↓）される（すなわち、ＣＤを有する患者のＰＢＭＣにおいてはされない）。
【表４−１】
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【表４−２】
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【表５】
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【００２５】
（ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの供給源）
本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、本ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを発現する被験者の任意の組織または細胞から単離することができる。好ましい非限定的実施形態において、前記組織は、血液（または、例えば、血清、血漿、血液細胞）、リンパ節、唾液、胃または腸からのものである。本ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのうちの１つまたはそれ以上を含有する組織サンプル、それら自体が、本発明の方法において有用であり、当業者は、そのようなサンプルを慣用的に入手、保管および／または保存することができる方法を認識していよう。しかし、血液、特にＰＢＭＣが、好ましい供給源として役立ち、そこからの本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの発現が、ＩＢＤ、すなわちＣＤまたはＵＣの診断、予後予測および／または進行のモニタリングのための本提示方法で評価されることは、当業者には明らかであろう。
【００２６】
（単離されたＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーポリヌクレオチド）
本発明は、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーとしての単離されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドを提供する。本発明の好ましいヌクレオチド配列としては、ゲノムの、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、および化学合成されたヌクレオチド配列が挙げられる。
【００２７】
本発明の具体例としてのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを表１〜５に列挙する。本発明は、表１〜５に列挙されているＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのポリヌクレオチド配列を包含する。本発明のポリヌクレオチド配列は、表１〜５に列挙したＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのポリヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、もしくはそれらの相補配列、ならびに／または表１〜５に列挙したＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの実質的な生物活性を保持するポリペプチド（すなわち、活性フラグメント）をコードしているポリヌクレオチドも包含する。本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも２１個の連続したヌクレオチドを含む、表１〜５に列挙したＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのポリヌクレオチド配列の連続部分も包む。
【００２８】
さらに、本発明は、表１〜５に列挙したＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのポリペプチドを包含する。本発明のポリペプチドは、少なくとも７個の連続するアミノ酸を含む、表１〜５に列挙したＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのポリペプチドの連続部分も含む。本発明の好ましい実施形態は、選択されたポリペプチドの実質的な生物活性を保持する、表１〜５に列挙したものから選択されるＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの任意のポリペプチドの任意の連続部分を含む。
【００２９】
さらに、本発明は、周知の遺伝子コード縮重のみに起因して、表１〜５に列挙したＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのポリヌクレオチド配列とは異なる、従って、表１〜５に列挙したＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーによってコードされているものと同じタンパク質をコードしている、ポリヌクレオチド分子を包含する。
【００３０】
本発明に包含されるポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーとして使用して、本開示ポリヌクレオチドをコードしているものと同じまたは同様の配列を有する核酸を同定および単離することができる。核酸を同定および単離するためのハイブリダイゼーション法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、サザンハイブリダイゼーション、インサイチューハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーションが挙げられ、そのような方法は、当業者には周知である。
【００３１】
ストリンジェンシーが異なる条件下でハイブリダイゼーション反応を行うことができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーとしては、任意の２つの核酸分子が互いにハイブリダイズすることの困難さが挙げられる。本発明は、低ストリンジェントな条件、より好ましくはストリンジェントな条件、および最も好ましくは高ストリンジェントな条件下で、本明細書に記載のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドも包含する。ストリンジェンシー条件の例を下の表６に示す：高ストリンジェントな条件は、例えば条件Ａ〜Ｆと少なくとも同様にストリンジェントである条件であり；ストリンジェントな条件は、例えば条件Ｇ〜Ｌと少なくとも同様にストリンジェントであり；および低ストリンジェントな条件は、例えば条件Ｍ〜Ｒと少なくとも同様にストリンジェントである。
【表６】
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１：前記ハイブリッド長は、ハイブリダイズするポリヌクレオチドのハイブリダイズされる領域について予想した長さである。あるポリヌクレオチドを未知の配列のターゲットポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる場合、そのハイブリッド長は、そのハイブリダイズするポリヌクレオチドの長さであると仮定する。既知配列のポリヌクレオチドをハイブリダイズする場合、そのハイブリッド長は、そのポリヌクレオチドの配列を整列させて、最適な配列相補性の領域を同定することによって、決定することができる。
２：ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液において、ＳＳＰＥ（１ｘＳＳＰＥは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、および１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４である）をＳＣＣ（１ｘＳＣＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）の代わりに使用してもよい。洗浄は、ハイブリダイゼーション完了後に１５分間行う。
ＴB*〜ＴR*：長さが５０塩基対未満であると予想されるハイブリッドに関して、ハイブリダズする温度は、そのハイブリッドの融解温度（Ｔm）より５〜１０℃低くなければならず、この場合のＴmは、次の方程式に従って決定する。長さが１８塩基対未満のハイブリッドについては、Ｔm（℃）＝２（Ａ塩基＋Ｔ塩基の＃）＋４（Ｇ塩基＋Ｃ塩基の＃）。長さが１８塩基対と４９塩基対の間のハイブリッドについては、Ｔm（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ10Ｎａ+）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、式中、Ｎは、そのハイブリッド中の塩基の数であり、Ｎａ+は、そのハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度（１ｘＳＣＣについてのＮａ+＝０．１６５Ｍ）である。
ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件の追加例は、参照により本明細書に組み込まれる、Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, chapters 9 and 11、およびCurrent Protocols in Molecular Biology, 1995, F.M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2,10 and 6.3-6.4に提供されている。
【００３２】
本発明のポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーとして使用して、相同ポリヌクレオチド、すなわち、本発明のポリペプチドおよび／または本開示ポリペプチドに相同なポリペプチドをコードしている配列を有する核酸を同定および単離することができる。これらの相同体は、本開示ポリヌクレオチドおよびポリペプチドとの有意な配列同一性を有するが、本開示ポリヌクレオチドおよびポリペプチドのものと異なる種から、または同じ種の中から単離された、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドである。好ましくは、ポリヌクレオチド相同体は、本開示ポリヌクレオチドとの少なくとも６０％の配列同一性（より好ましくは、少なくとも７５％の同一性；最も好ましくは、少なくとも９０％の同一性）を有し、これに対してポリペプチド相同体は、本開示ポリペプチドとの少なくとも３０％の配列同一性（より好ましくは、少なくとも４５％の同一性；最も好ましくは、少なくとも６０％の同一性）を有する。好ましくは、本開示ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの相同体は、哺乳動物種から単離されたものであり、最も好ましくは、ヒトから単離されたものである。
【００３３】
本発明のポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーとして使用して、表１〜５に列挙したＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのポリヌクレオチド配列の対立変異体をコードしている配列を有するＤＮＡを同定および単離することができる。対立変異体は、表１〜５に列挙した遺伝子によってコードされているポリペプチドと同一であるか、それらとの有意な類似性を有するポリペプチドをコードしている、表１〜５に列挙したＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのポリヌクレオチド配列の天然に存在する代替形態である。好ましくは、対立変異体は、本開示ポリヌクレオチドとの少なくとも９０％の配列同一性（より好ましくは、少なくとも９５％の同一性；最も好ましくは、少なくとも９９％の同一性）を有する。
【００３４】
従って、表１〜５に列挙したポリヌクレオチド配列に加えて、本発明は、表１〜５に列挙したＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの相同体および対立変異体も包含する。
【００３５】
本発明のポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーとして使用して、本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのポリペプチドを発現する細胞および組織ならびにそれらが発現する条件を同定することができる。
【００３６】
加えて、本発明のポリヌクレオチドは、細胞または生物において本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーに対応する遺伝子の発現を変更する（すなわち、調節する（例えば、強化する、減少させる、または改変する））ために使用することもできる。これらの対応する遺伝子は、本発明のゲノムＤＮＡ配列であり、この配列が転写されて、本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのポリペプチドを採取するｍＲＮＡが産生させる。
【００３７】
細胞または生物における本発明に包含されるＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの改変発現は、様々な阻害性ポリヌクレオチド、例えばアンチセンスポリヌクレオチド、本発明の遺伝子から転写されたｍＲＮＡに結合するおよび／またはそれを切断するリボザイム、遺伝子の調節領域をターゲッティングする三重鎖形成性オリゴヌクレオチド、ならびにターゲットｍＲＮＡの配列特異的分解を生じさせる短い干渉性ＲＮＡの使用により、達成することができる（例えば、Galderisi et al. (1999) J. Cell. Physiol. 181: 251-57； Sioud (2001) Curr. Mol. Med 1:575-88；Knauert and Glazer (2001) Hum. Mol. Genet. 10:2243-51；Bass (2001) Nature 411 :428-29）。
【００３８】
本発明の阻害性アンチセンスまたはリボザイムポリヌクレオチドは、本発明の遺伝子の全コーディング鎖に相補的である場合もあり、またはその一部のみに相補的である場合もある。あるいは、阻害性ポリヌクレオチドは、本発明の遺伝子のコーディング鎖の非コーディング領域に相補的である場合もある。本発明の阻害性ポリヌクレオチドは、当該分野では周知の手順を用いる化学合成および／または酵素ライゲーション反応を用いて構築することができる。化学合成ポリヌクレオチドのヌクレオシド結合は、ヌクレアーゼ媒介性の分解に耐えるそれらの能力を強化するように、ならびにそれらの配列特異性を増大させるように、改変することができる。このような結合改変としては、ホスホチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、ボラノホスフェート、モルホリノおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）結合が挙げられるが、これらに限定されない（Galderisi et al., supra； Heasman (2002) Dev. Biol 243:209-14；Mickelfield (2001) Curr. Med. Chem. 8:1157-79）。あるいは、本発明のポリヌクレオチドをアンチセンス（すなわち、逆）配向でサブクローニングした発現ベクターを使用して、アンチセンス分子を生物学的に産生させることができる。
【００３９】
さらに別の実施形態において、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド分子は、α−アノマーポリヌクレオチド分子である。α−アノマーポリヌクレオチド分子は、通常のβ−単位に反して、鎖が互いに平行に延びる相補的ＲＮＡを有する特異的２本鎖ハイブリッドを形成する。本アンチセンスポリヌクレオチド分子は、当該分野において公知である技法に従って、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチドまたはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体も含むことができる。
【００４０】
本発明に包含される阻害性三重鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）は、高い特異性および親和性で２本鎖ＤＮＡの主要な溝に結合する（Knauert and Glazer, 上記）。本発明の遺伝子の発現は、それらの遺伝子の調節領域（すなわち、プロモーターおよび／またはエンハンサー配列）に相補的なＴＦＯをターゲッティングしてそれらの遺伝子の転写を防止する三重らせん構造を形成することにより、阻害することができる。
【００４１】
本発明の１つの実施形態において、本発明の阻害性ポリヌクレオチドは、短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子である。これらのｓｉＲＮＡ分子は、ターゲットｍＲＮＡの配列特異的分解を生じさせる、短い（好ましくはヌクレオチド数１９〜２５；最も好ましくはヌクレオチド数１９または２１）の２本鎖ＲＮＡ分子である。この分解は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている（例えば、Bass (2001) Nature 411 :428-29）。当初、下等生物において同定されたＲＮＡｉは、哺乳動物細胞に有効に適用され、最近では、Ｆａｓ  ｍＲＮＡにターゲッティングされたｓｉＲＮＡ分子で処置したマウスにおいて劇症肝炎を予防することが証明された（Song et al. (2003) Nature Med. 9:347-51）。加えて、クモ膜下送達されたｓｉＲＮＡが、ラットにおける２つのモデル（作動薬誘発性疼痛モデルおよび神経障害性疼痛モデル）において疼痛応答を遮断したと、最近報告された（Dorn et al. (2004) Nucleic Acids Res. 32(5):e49）。
【００４２】
本発明のｓｉＲＮＡ分子は、２つの相補的１本鎖ＲＮＡ分子を互いにアニーリングすること（一方がターゲットｍＲＮＡの一部と整合する）（Fire et al.，米国特許第６，５０６，５５９号）により、またはそれ自体が折り返して必要な２本鎖部分を生成する１本鎖ヘアピンＲＮＡ分子の使用（Yu et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:6047-52）により、生じさせることができる。ｓｉＲＮＡ分子は、化学的に合成することができ（Elbashir et al. (2001) Nature 411 :494-98）または１本鎖ＤＮＡテンプレートを使用するインビトロでの転写により生成することができる（Yu et al., 上記）。あるいは、ｓｉＲＮＡ分子は、センスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ配列を含有する発現ベクターを使用して、一時的に（Yu et al., 上記； Sui et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5515-20）または安定的に（Paddison et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:1443-48）、生物学的に産生させることができる。最近、さらにｓｉＲＮＡにプロセッシングされるヘアピンＲＮＡを発現するアデノウイルスベクターを使用して、効率的で配列特異的な様式での初代ヒト細胞におけるターゲットｍＲＮＡのレベルの低減が実証された（Arts et al. (2003) Genome Res. 13:2325-32）。
【００４３】
本発明のポリヌクレオチドにターゲッティングさせるｓｉＲＮＡ分子は、当該分野において周知である基準（例えば、Elbashir et al. (2001) EMBO J. 20:6877-88）に基づいて設計することができる。例えば、ターゲットｍＲＮＡのターゲットセグメントは、ＡＡ（好ましい）、ＴＡ、ＧＡまたはＣＡで始まらなければならず；ｓｉＲＮＡ分子のＧＣ比は、４５〜５５％でなければならず；ｓｉＲＮＡ分子は、３つの同じヌクレオチドを連続して含有してはならず；ｓｉＲＮＡ分子は、連続して７つの混合Ｇ／Ｃを含有してはならない；ならびにターゲットセグメントは、ターゲットｍＲＮＡのＯＲＦ領域内に存在しなければならず、且つ、開始ＡＴＧの少なくとも７５ｂｐ後および停止コドンの少なくとも７５ｂｐ前に存在しなければならない。通常の当業者は、前述の基準または他の公知の基準（例えば、Reynolds et al. (2004) Nat. Biotechnol 22:326-30）を用いて、本発明のポリヌクレオチドにターゲッティングさせるｓｉＲＮＡ分子を設計することができる。
【００４４】
細胞または生物における本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの遺伝子の改変発現は、本発明のポリヌクレオチドがそのゲノムに導入された非ヒトトランスジェニック動物の産生によって達成することもできる。このようなトランスジェニック動物としては、本発明の遺伝子（すなわち、トランス遺伝子）の多数のコピーを有する動物が挙げられる。組織特異的調節配列をトランス遺伝子に作動可能に連結させて、本発明のポリペプチドを特定の細胞または特定の発達段階に向けることができる。別の実施形態では、トランス遺伝子の調節発現を可能にする選択された系を含有するトランスジェニック非ヒト動物を産生させることができる。当該分野では公知のこのような系の一例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。胚操作およびマイクロインジェクションによるトランスジェニック動物、特にマウスなどの動物の作製方法は、慣例的になっており、当該分野では周知である（例えば、Bockamp et al. (2002) Physiol. Genomics 11:115-32）。本発明の好ましい実施形態において、非ヒトトランスジェニック動物は、少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含む。
【００４５】
細胞または生物における本発明の遺伝子の改変発現は、本発明のポリヌクレオチドに対応する内在性遺伝子が外来性ポリヌクレオチド配列の挿入により破壊された動物（すなわち、ノックアウト動物）の産生によって達成することもできる。前記内在性遺伝子のコーディング領域を破壊し、それによって非機能的タンパク質を生じさせることができる。あるいは、前記内在性遺伝子の上流調節領域を破壊するか異なる調節要素で置換し、その結果、依然として機能的なタンパク質の改変発現を生じさせることができる。ノックアウト動物を作製するための方法は、相同組換えを含み、当該分野において周知である（例えば、Wolfer et al. (2002) Trends Neurosci 25:336-40）。
【００４６】
（単離されたＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーポリペプチド）
本発明の幾つかの態様は、単離されたＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのタンパク質、それらの生物活性部分、ならびに抗ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカー抗体を産生させる免疫原としての使用に適するポリペプチドフラグメントに関する。１つの実施形態では、標準的なタンパク質精製技術を用いて適切な精製計画により、細胞または組織源から天然のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカータンパク質を単離することができる。別の実施形態では、組換えＤＮＡ法によりＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカータンパク質を産生させる。組換え発現の代替的方法として、標準的なペプチド合成技術を用いてＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのタンパク質またはポリペプチドを化学合成することができる。
【００４７】
表１〜５に列挙したＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカータンパク質は、表１〜５に列挙したＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのポリヌクレオチド配列を発現制御配列（例えば、ｐＭＴ２およびｐＥＤ発現ベクター）に動作可能に連結することによって、組換え産生させることができる。組換えタンパク質を発現させる一般的な方法は、当該分野では周知である。
【００４８】
多数の細胞系が、本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーポリペプチドの組換え発現に適する宿主細胞として作用することができる。哺乳動物宿主細胞系としては、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３Ｔ細胞、Ａ４３１細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＨＬ−６０細胞、Ｕ９３７細胞、ＨａＫ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、正常２倍体細胞、ならびに一次組織および一次外植片のインビトロ培養から誘導された細胞株が挙げられる。
【００４９】
あるいは、酵母などの下等真核生物、または原核生物において本発明のポリペプチドを組換え産生させることができる。適する可能性がある酵母株としては、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）株、およびカンジダ（Candida）株が挙げられる。適する可能性がある細菌株としては、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）およびサルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）が挙げられる。本発明のポリペプチドが酵母または細菌において作られる場合、機能性を得るために、それらを、例えば適切な部位のリン酸化またはグルコシル化によって改変することが必要となる場合がある。このような共有結合は、周知の化学的方法または酵素的方法を用いて達成することができる。
【００５０】
本発明の別の実施形態において、本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーポリペプチドは、本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーポリヌクレオチドを１つまたはそれ以上の昆虫発現ベクター（例えばバキュロウイルスベクター）の中の適切な制御配列に作動可能に連結させ、昆虫細胞発現系を利用することにより、組換え産生させることもできる。バキュロウイルス／Ｓｆ９発現系についての材料および方法は、キットの形で市販されている（例えば、ＭＡＸＢＡＣ（登録商標）キット、カリフォルニア州、カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
【００５１】
適切な宿主細胞における組換え発現後、周知の精製プロセス、例えばゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィーを用いて、本発明のポリペプチドを培養培地または細胞抽出物から精製することができる。精製としては、本発明のポリペプチドに結合することが判っている物質を用いる親和性クロマトグラフィーも挙げられる。これらの精製プロセスを用いて、天然源から本発明のポリペプチドを精製することもできる。
【００５２】
あるいは、本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのポリペプチドは、同定、精製および／または検出を容易にする形態で組換え発現させることもできる。例えば、このポリペプチドは、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはチオレドキシン（ＲＴＸ）などのタンパク質との融合体として発現させることができる。このような融合タンパク質の発現および精製のためのキットは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（マサチューセッツ州、バーバリー）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（ニュージャージー州、ピスカタウェイ）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カルフォルニア州、カールスバッド）から、それぞれ、市販されている。本発明のポリペプチドを小さなエピトープでタグを付け、その後、そのエピトープに対する特異的抗体を用いて同定または精製することができる。好ましいエピトープは、ＦＬＡＧエピトープであり、これは、Ｅａｓｅｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ（コネチカット州、ニューヘーベン）から市販されている。
【００５３】
シグナル配列を用いて、分泌タンパク質または目的の他のタンパク質の分泌および単離を容易にすることができる。典型的に、シグナル配列は、１つまたはそれ以上の切断事象で分泌中に成熟タンパク質から一般的に切断される疎水性アミノ酸のコアを特徴とする。このようなシグナルペプチドは、それらが分泌経路を進むにつれて、それらの成熟タンパク質からシグナル配列を切断することができるプロセッシング部位を含有する。従って、本発明は、シグナル配列を有する前記ポリペプチドに関し、ならびにシグナル配列がタンパク質分解により切断されたポリペプチド（すなわち、切断産物）に関する。１つの実施形態において、シグナル配列をコードしているポリヌクレオチド配列を、発現ベクターにおいて目的のタンパク質（例えば、通常は分泌されないか、そうでない場合は単離が難しいタンパク質）に作動可能に連結させることができる。前記シグナル配列は、例えばその発現ベクターが形質転換される真核宿主から、タンパク質の分泌を命令し、その後、またはそれと同時に、シグナル配列が切断される。その後、そのタンパク質は、当該分野において認知されている方法によって細胞外媒体から容易に精製することができる。あるいは、前記シグナル配列は、精製を促進する配列を用いて、例えばＧＳＴドメインで、目的のタンパク質に連結させることができる。
【００５４】
表１〜５に列挙したＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーポリペプチドならびにそれらの対立遺伝子の変異体および相同体に加えて、本発明は、表１〜５に列挙したポリペプチドとは構造的に異なる（例えば、わずかに改変された配列を有する）が、本開示ポリペプチドと実質的に同じ生化学的特性を有する（例えば、機能的に必須でないアミノ酸残基のみが変化している）ポリペプチドも包含する。このような分子としては、変更、置換（substitution）、置き換え（replacement）、挿入または欠失を有する計画的に操作された変異体が挙げられるが、それらの限定されない。そのような変更、置換、、置き換え、挿入または欠失のための技術およびキットは、当業者には周知である。
【００５５】
本発明は、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカータンパク質に対する作動薬としてまたは拮抗薬として機能する、本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカータンパク質の変異体も包含する。ある一定の実施形態において、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカータンパク質の作動薬は、天然に存在する形態のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカータンパク質と実質的に同じ生物活性もしくはそのサブセットを保持することができる、またはＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカータンパク質の活性を強化することができる。ある一定の実施形態において、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカータンパク質の拮抗薬は、例えば、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカータンパク質の活性を競合的に調節することによって、天然に存在する形態のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカータンパク質の活性のうちの１つまたはそれ以上を阻害することができる。従って、限定機能の変異体での処理により、特定の生物学的作用を惹起することができる。１つの実施形態において、天然に存在する形態のタンパク質の生物活性のサブセットを有する変異体での被験者の処置は、天然に存在する形態のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカータンパク質での処置に比べて被験者における副作用が少ない。別の好ましい実施形態において、ＩＢＤの処置のために、目的の特定のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカータンパク質のアップレギュレーションが必要とされるのか、ダウンレギュレーションが必要とされるのかに依存して、１つの薬剤が、本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカータンパク質に対する作動薬としての役割を果すこともあり、または拮抗薬としての役割を果すこともある。
【００５６】
ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカータンパク質の変異体は、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカータンパク質の突然変異誘発、例えば不連続性点突然変異またはトランケーションによって、産生させることができる。あるいは、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカータンパク質作動薬としてまたはＰＢＭＣ関連およびＩＢＤに関連するバイオマーカータンパク質拮抗薬として機能するＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカータンパク質の変異体は、変異体、例えばＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカータンパク質のトランケーション変異体のコンビナトリアルライブラリーを作動薬活性または拮抗薬活性についてスクリーニングすることによって、同定することができる。１つの実施形態において、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカータンパク質変異体の多彩なライブラリーが、ポリヌクレオチドレベルでのコンビナトリアル突然変異誘発によって産生され、多彩な遺伝子ライブラリーによってコードされる。ある一定の実施形態において、このようなタンパク質は、例えば本発明の治療用タンパク質として、使用することができる。例えば、可能性のあるＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカータンパク質配列の変性したセットが、個々のポリペプチドとして、あるいはそのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカータンパク質配列セットを包含するそれより大きな融合タンパク質のセット（例えば、ファージディスプレイ用のもの）として発現できるように、遺伝子配列に合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的にライゲーションすることによって、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカータンパク質変異体の多彩なライブラリーを産生させることができる。変性オリゴヌクレオチド配列から可能性のあるＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカータンパク質変異体のライブラリーを産生させるために用いることができる様々な方法がある。変性遺伝子配列の化学合成を自動ＤＮＡ合成装置において行い、その後、その合成遺伝子を適切な発現ベクターにライゲートすることができる。遺伝子の変性セットの使用により、可能性のあるＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカータンパク質配列の所望のセットをコードしている配列のすべてを１つの混合物で得ることができる。変性オリゴヌクレオチドを合成するための方法は、当該分野において公知である。
【００５７】
本発明のポリペプチドは、公知の従来型化学合成によって産生させることもできる。本発明のポリペプチドの化学合成のための方法は、当業者には周知である。このような化学合成ポリペプチドは、天然の精製ポリペプチドと共通の生物学的特性を有することができ、従って、天然ペプチドの生物活性または免疫学的置換基として利用することができる。
【００５８】
（ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーに対する抗体）
別の態様において、本発明は、本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーに対応するまたはそれらによってコードされているタンパク質に特異的な抗体に関する。好ましくは、前記抗体は、モノクローナル抗体であり、最も好ましくは、前記抗体は、下で説明するようなヒト化抗体である。
【００５９】
本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーに対する抗体分子（抗バイオマーカー抗体）は、当業者には周知の方法によって産生させることができる。例えば、モノクローナル抗体は、公知の方法に従ってハイブリドーマを生じさせることによって、産生させることができる。このようにして形成されたハイブリドーマを、その後、標準的な方法、例えば酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）を用いてスクリーニングして、本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体を産生させる１つまたはそれ以上のハイブリドーマを同定することができる。本発明の完全長ポリペプチドを免疫原として使用してもよく、あるいは本ポリペプチドの抗原性ペプチドフラグメントを使用してもよい。本発明のポリペプチドの抗原性ペプチドは、少なくとも７つの連続するアミノ酸残基を含み、ならびにそのペプチドに対して産生された抗体がそのポリペプチドと特異的免疫複合体を形成するようなエピトープを包含する。好ましくは前記抗原性ペプチドは、少なくとも１０のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１５のアミノ酸残基、よりいっそう好ましくは少なくとも２０のアミノ酸残基、および最も好ましくは少なくとも３０のアミノ酸残基を含む。
【００６０】
モノクローナル抗体分泌性ハイブリドーマを調製するための代替的方法として、本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーに対するモノクローナル抗体は、本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーポリペプチドを伴う組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングして、それによって、そのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーに結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離することにより、同定および単離することができる。抗体ディスプレイライブラリーの作製およびスクリーニングにおける使用に特に適している方法および試薬であるような、ファージディスプレイライブラリーを産生およびスクリーニングするための技術および市販キットは、当業者には周知である。
【００６１】
ポリクローナル血清および抗体は、本発明のポリペプチドで適する被験者を免疫化することによって、産生させることができる。免疫された被験者における抗体力価を、標準的な技術により、例えば免疫化バイオマーカータンパク質を用いてＥＬＩＳＡで、経時的にモニターすることができる。所望の場合には、本発明のポリペプチドに対する抗体分子を、被験者または培地から単離し、プロテインＡクロマトグラフィーなどの周知の技術によってさらに精製して、ＩｇＧ画分を得ることができる。
【００６２】
加えて、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製することができる、ヒト部分と非ヒト部分との両方を含む組換え抗バイオマーカー抗体（例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体および１本鎖抗体）は、本発明の範囲内である。ヒト化抗体は、内在性免疫グロブリンの重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を発現することはできないが、ヒトの重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて、産生させることもできる。あるいは、誘導選択（guided selection）と呼ばれる技術を用いて、選択エピトープを認識するヒト化抗体を作製することができる。このアプローチでは、選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）を用いて、同エピトープを認識するヒト化抗体の選択を誘導する。
【００６３】
キメラ免疫グロブリン鎖を含むキメラ抗体は、当該分野では公知の組換えＤＮＡ技術によって産生させることができる。例えば、マウス（または他の種）モノクローナル抗体分子のＦｃ定常領域をコードしている遺伝子を制限酵素で消化して、そのマウスＦｃをコードしている領域を除去し、ヒトＦｃ定常領域をコードしてる遺伝子の等価部分を置換する（ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；ＥＰ １８４，１８７；ＥＰ １７１，４９６；ＥＰ １７３，４９４；ＷＯ ８６／０１５３３；米国特許第４，８１６，５６７号；ＥＰ １２５，０２３；Better et al. (1988) Science 240:1041-43；Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:3439-43；Liu et al. (1987) J Immunol. 139:3521-26；Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:214-18；Nishimura et al. (1987) Cane. Res. 47:999-1005；Wood et al. (1985) Nature 314:446-49；およびShaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-59 参照）。
【００６４】
所望の場合、抗体または免疫グロブリン鎖を、当該分野では公知の方法によって、ヒト化することができる。ヒト化免疫グロブリン鎖を含むヒト化抗体は、抗原結合に直接関与しないＦｖ可変領域の配列をヒトＦｖ可変領域からの等価配列で置換することによって、産生させることができる。ヒト化抗体を産生させるための一般的な方法は、Morrison (1985) Science 229:1202-07；Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214-21；ならびに米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号および同第５，６９３，７６２号によって提供されており、前記文献はすべて、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。それらの方法としては、重鎖または軽鎖の少なくとも一方からの免疫グロブリンＦｖ可変領域のすべてまたは一部をコードしている核酸配列の単離、操作および発現が挙げられる。このような核酸の供給源は、当業者には周知であり、例えば、所定のターゲットに対する抗体を産生するハイブリドーマから得ることができる。その後、ヒト化抗体をコードしている組換えＤＮＡまたはそのフラグメントを適切な発現ベクターにクローニングすることができる。
【００６５】
ヒト化抗体またはＣＤＲグラフト抗体分子または免疫グロブリンは、ＣＤＲグラフト化またはＣＤＲ置換（ここで、免疫グロブリン鎖の１つ、２つまたはすべてのＣＤＲを置換することができる）によって産生させることができる。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号；Jones et al. (1986) Nature 321:522-25；Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534-36；およびBeidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-60参照。前記文献はすべて、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。米国特許第５，２２５，５３９号には、本発明のヒト化抗体を調製するために用いることができるＣＤＲグラフト化法が記載されている（ＧＢ ２１８８６３８Ａも参照）。特定のヒト抗体のＣＤＲのすべてを非ヒトＣＤＲの少なくとも一部分で置換することができ、またはＣＤＲの一部のみを非ヒトＣＤＲで置換することができる。所定の抗原へヒト化抗体が結合するのに必要なＣＤＲの数を置き換えることのみが必要とされる。
【００６６】
例えば、その抗体の他の部分（例えば定常領域）を欠失、付加また置換することによって改変されているモノクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体も、本発明の範囲内である。例えば、抗体は、以下のように改変することができる：（ｉ）定常領域を欠失させる；（ｉｉ）その定常領域を、別の定常領域、例えば、その抗体の半減期、安定性もしくは親和性を増加させる意味をもつ定常領域、または別の種もしくは抗体クラスからの定常領域で、置換する；ならびに／あるいは（ｉｉｉ）その定常領域内の１つまたはそれ以上のアミノ酸を改変する、例えば、数ある中でも、グリコシル化部位の数、エフェクター細胞機能、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合、補体結合を改変する。
【００６７】
抗体定常領域を改変するための方法は、当該分野において公知である。機能が改変された（例えば、エフェクターリガンド、例えば、細胞上のＦｃＲ、または補体のＣ１成分に対する親和性が改変された）抗体は、その抗体の定常部分にある少なくとも１つのアミノ酸残基を異なる残基で置換することによって、産生させることができる（例えば、ＥＰ  ３８８，１５１  Ａ１、米国特許第５，６２４，８２１号および同第５，６４８，２６０号参照；前記特許はすべて、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる）。類似のタイプの改変をマウス免疫グロブリンまたは他の種からの免疫グロブリンに適用することもできる。例えば、指定の残基をその側鎖に適切な機能性を有する残基で置換することにより、または荷電官能基、例えばグルタメートもしくはアスパルテート、または芳香族非極性残基、例えばフェニルアラニン、チロシン、トリプトファンもしくはアラニンを導入することにより、ＦｃＲ（例えば、ＦｃガンマＲ１）に対するまたはＣ１ｑ結合に対する抗体（例えば、ヒトＩｇＧなどのＩｇＧ）のＦｃ領域の親和性を改変することができる（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号参照）。
【００６８】
加えて、本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーに対するヒト抗体は、抗原によるチャレンジに応答して、その動物の内在性抗体ではなく完全ヒト抗体を産生させるように改変されているトランスジェニック非ヒト動物を用いて、産生させることができる。例えば、ＰＣＴ公開 ＷＯ ９４／０２６０２参照。非ヒト宿主における重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖免疫グロブリンをコードしている内在性遺伝子は無能力化されており、ヒトの重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖免疫グロブリンをコードしている活性遺伝子座をその宿主ゲノムに挿入する。そのヒト遺伝子は、例えば必要なヒトＤＮＡセグメントを含有する酵母人工染色体を使用して、導入することができる。その後、改変の全補足因子（complement）より少ない補足因子を有する中間トランスジェニック動物を交雑させることにより、所望のすべての改変をもたらす動物が後代として得られる。このような非ヒト動物の１つの実施形態はマウスであり、ＰＣＴ公開 ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ ９６／３４０９６に開示されているようにＸＥＮＯＭＯＵＳＥTMと呼ばれている。この動物は、完全ヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を産生する。これらの抗体は、目的の免疫原で免疫化した後に動物から直接得ることができ（例えば、ポリクローナル抗体の作製物）、あるいは動物から採取した不死化Ｂ細胞から直接得ることができる（例えば、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ）。加えて、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードしている遺伝子を回収し、発現させて、抗体を直接得ることができ、またはさらに改変して、例えば１本鎖Ｆｖ分子などの抗体の類似体を得ることができる。
【００６９】
本発明の抗体の結合能力は、次の方法によって測定することができる：Ｂｉａｃｏｒｅ分析、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、Ｘ線結晶学、配列分析およびスキャニング突然変異誘発、ならびに当該分野において公知である他の方法。
【００７０】
他のタンパク質結合分子を利用して、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの活性を調節することもできる。このようなタンパク質結合分子としては、スモール・モジュラー・イムノファーマスーティカル（small modular immunopharmaceutical：ＳＭＩＰTM）薬（ワシントン州、シアトルのＴｒｕｂｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が挙げられる。ＳＭＩＰは、抗原またはカウンター受容体などのような同種構造のための結合ドメインと、１つのシステイン残基を有するか、システイン残基を有さないヒンジ領域ポリペプチドと、免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインとから成る１本鎖ポリペプチドである（ HYPERLINK "http://www.trubion.com" www.trubion.comも参照）。ＳＭＩＰならびにそれらの使用および用途は、例えば、米国特許公開出願第２００３／０１１８５９２号、同第２００３／０１３３９３９号、同第２００４／００５８４４５号、同第２００５／０１３６０４９号、同第２００５／０１７５６１４号、同第２００５／０１８０９７０号、同第２００５／０１８６２１６号、同第２００５／０２０２０１２号、同第２００５／０２０２０２３号、同第２００５／０２０２０２８号、同第２００５／０２０２５３４号および同第２００５／０２３８６４６号、ならびにこれらの関連パテントファミリーメンバーに開示されており、前記は、すべて、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７１】
抗バイオマーカー抗体のフラグメントは、当該分野では周知の方法に従って、抗体の切断により作製することができる。例えば、ペプシンなどの酵素で抗体を処理することにより、免疫学的に活性なＦ（ａｂ’）フラグメントおよびＦ（ａｂ’）2フラグメントを作製することができる。
【００７２】
本発明の抗バイオマーカー抗体は、上清、細胞溶解産物中の、または細胞表面上のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのポリペプチドを単離、精製および／または検出するために有用である。本発明に開示する抗体を診断において使用して、臨床検査手順の一部としてＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのタンパク質のレベルをモニターすること、または治療用モジュレーターを、その抗バイオマーカー抗体の抗原を含む細胞もしくは組織にターゲッティングすることができる。例えば、小分子を含む（しかし、これに限定されない）本発明の治療薬を抗バイオマーカー抗体に連結させて、その治療薬をＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーにターゲッティングすることができる。
【００７３】
（ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの検出）
本発明は、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの異常発現または活性レベルに直接または間接的に起因する、被験者におけるＩＢＤ（例えばクローン病または潰瘍性大腸炎）の診断、予後予測および進行のモニタリング方法を提供する。これらの方法は、そのようなＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの異常発現または活性レベルを検出することによるものであり、ヒト被験者におけるそのような方法の使用を含むが、これに限定されない。例えば、これらの方法は、例えば臨床の場で適切に使用することができる、本明細書に記載するようなＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのポリヌクレオチドおよびそれらのフラグメント、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのポリペプチドおよびその誘導体、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーに対する抗体、ならびにＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドのモジュレーターを含む群のうちの少なくとも１つを含む、包装済み診断用キットを利用することによって、行うことができる。加えて、本明細書に記載するもの以外の周知の方法によって１つまたはそれ以上のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの発現または活性レベルにおける変化を検出することもできることは、当業者には理解されるであろう。
【００７４】
本発明の診断、予後予測およびモニタリングアッセイは、生物サンプルにおけるＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの遺伝子産物の検出および定量を含む。ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの遺伝子産物としては、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ、ならびにＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されず、このような遺伝子産物は、当業者には周知の方法を用いて測定することができる。
【００７５】
例えば、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーションに基づくアッセイ、例えばノーザンハイブリダイゼーション、インサイチュウハイブリダイゼーション、ドットブロットおよびスロットブロット、ならびにオリゴヌクレオチドアレイを用いて、直接検出および定量することができる。ハイブリダイゼーションに基づくアッセイは、プローブ核酸をターゲット核酸にハイブリダイズさせるアッセイを指す。一部の形式では、そのターゲット、プローブまたは両方を免疫化する。免疫化される核酸は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、または他のオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドであってもよく、ならびに天然または非天然のヌクレオチド、ヌクレオチド類似体または骨格を包含し得る。本発明において使用するための核酸プローブ配列の選択方法は、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの核酸配列に基づくものであり、当該分野では周知である。
【００７６】
あるいは、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのｍＲＮＡを、検出および定量前に、増幅することができる。このような増幅に基づくアッセイは、当該分野において周知であり、それらには、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＰＣＲ−酵素結合免疫吸着検査法（ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、自己継続配列複製（self-sustained sequence replication）、転写増幅系、Ｑ−βレプリカーゼ、または任意の他のポリヌクレオチド増幅方法が挙げられる。当業者は、過度な実験を行うことなく、増幅されたＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの遺伝子産物を産生および検出するためのプライマーおよびプローブを、表１〜５に列挙したＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの核酸配列に基づき、容易に設計し、作製することができる。増幅されたＰＢＭＣおよびＩＢＤ関連遺伝子産物は、例えば、ゲル電気泳動法により；プローブ核酸へのハイブリダイゼーションにより；塩基配列決定法により；蛍光、リン光もしくは放射性シグナルの検出により；または様々な周知の方法のうちのいずれかにより、直接分析することができる。加えて、ターゲット核酸配列の増幅により生じるシグナルを増加させる方法は、当業者には公知である。ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連する遺伝子産物の定量が望まれる場合、いずれの増幅方法を用いるにせよ、当該分野では公知の様々な定量方法（例えば、定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）；本明細書では、「リアルタイムＰＣＲ」、「定量リアルタイムＰＣＲ」、「定量リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応」および「定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ」などとも呼ばれる））を用いることができることは、当業者には理解されるであろう。
【００７７】
本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのポリペプチド（またはそれらのフラグメント）は、上で説明した抗バイオマーカー抗体を利用する様々な周知の免疫アッセイを用いて検出することができる。免疫アッセイは、ＰＢＭＣおよびＩＢＤ関連ポリペプチド（またはそのフラグメント）に特異的に結合する抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ｓｃＦｖ抗体、およびそれらのフラグメント）を利用するアッセイを指す。本発明の実施に適するこのような周知の免疫アッセイとしては、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫沈降法、免疫蛍光法、蛍光活性化細胞分別法（ＦＡＣＳ）およびウエスタンブロッティングが挙げられる。加えて、抗バイオマーカー抗体は、標準的な画像化技術によって被験者においてその存在および位置を検出することができる放射活性バイオマーカーで標識することができる。
【００７８】
各々のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを個々に考えてもよいが、分析の信頼性を増すために本発明の方法および組成物において使用するための２つまたはそれ以上のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの組み合わせを提供することは、本発明の範囲内である。１つの実施形態において、本発明は、本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのパネル（例えばモデル）を提供する。１つのパネルは、２〜５、５〜１５、１５〜３５、３５〜５０、５０〜１００、または１００より多くのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含んでもよいし、および／または本質的にそれらから構成されてもよい。１つの実施形態において、本発明のパネルは、少なくとも２つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含む、および／またはそれらから本質的に構成される。１つの実施形態において、本発明のパネルは、少なくとも３つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含む、および／またはそれらから本質的に構成される。１つの実施形態において、本発明のパネルは、少なくとも４つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含む、および／またはそれらから本質的に構成される。１つの実施形態において、本発明のパネルは、少なくとも５つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含む、および／またはそれらから本質的に構成される。１つの実施形態において、本発明のパネルは、少なくとも６つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含む、および／またはそれらから本質的に構成される。１つの実施形態において、本発明のパネルは、少なくとも７つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含む、および／またはそれらから本質的に構成される。１つの実施形態において、本発明のパネルは、少なくとも８つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含む、および／またはそれらから本質的に構成される。１つの実施形態において、本発明のパネルは、少なくとも９つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含む、および／またはそれらから本質的に構成される。１つの実施形態において、本発明のパネルは、少なくとも１０のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含む、および／またはそれらから本質的に構成される。１つの実施形態において、本発明のパネルは、少なくとも１１のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含む、および／またはそれらから本質的に構成される。１つの実施形態において、本発明のパネルは、少なくとも１２のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含む、および／またはそれらから本質的に構成される。
【００７９】
別の実施形態において、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのパネルは、任意の１つのパネルの中のバイオマーカーがある一定の特徴を共有するように選択される。例えば、第一パネルのバイオマーカーは、実質的にＩＢＤでない被験者からのＰＢＭＣと比較して、炎症性腸疾患（すなわちクローン病または潰瘍性大腸炎）を有する患者からのＰＢＭＣにおいて量または活性の点で少なくとも１．５倍の増加を各々示すことができる。あるいは、第二パネルのバイオマーカーは、第一パネルと比較して区別的な調節を各々示すことができる。同様に、バイオマーカーの異なるパネルは、異なる機能カテゴリー（すなわち、タンパク質分解、シグナル伝達、転写など）もしくはサンプル（すなわち、血液、腎臓、脾臓、リンパ節、脳、腸、結腸、心臓、尿など）からのバイオマーカーで構成されている場合もあり、または炎症性腸疾患（すなわちクローン病もしくは潰瘍性大腸炎）の異なる段階を代表するように選択される場合もある。好ましい実施形態において、本発明のパネルは、血液および特にＰＢＭＣからのバイオマーカーを含む。本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのパネルは、Ｉ群バイオマーカーとして類別されるバイオマーカー、ＩＩ群バイオマーカーとして類別されるバイオマーカー、ＩＩＩ群バイオマーカーとして類別されるバイオマーカー、ＩＶ群バイオマーカーとして類別されるバイオマーカー、および／またはＶ群バイオマーカーとして類別されるバイオマーカーのパネルとして選択することによって作製することができる。Ｉ群、ＩＩ群、ＩＩＩ群、ＩＶ群、および／またはＶ群に類別されたバイオマーカーからバイオマーカーを独立して選択することによって、パネルを作製することもできる。好ましい実施形態において、あるパネルは、Ｖ群バイオマーカーとして類別されるＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのセットを含む、および／またはそれらから本質的に構成される。本発明のパネルが、任意の数および任意の組み合わせの本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカー、特に、本発明のＶ群バイオマーカーを含むことができる、および／またはそれらから本質的に構成することができることも当業者には理解されるであろう。例えば、本発明の非限定的パネルは、免疫グロブリン重鎖定常領域γ１ならびに免疫グロブリンκ定常領域のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含むことができる、および／またはそれらから本質的に構成することができる。本発明の別の非限定的パネルは、ヒト２８ＳリボソームＲＮＡ５’領域、タンパク質チロシンホスファターゼ受容体タイプＣ会合タンパク質、Ｈ３ヒストンファミリーメンバーＫ、インテグリンβ３（血小板糖タンパクＩＩＩａ、抗原ＣＤ６１）およびＨ２ＢヒストンファミリーメンバーＱ のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含むことができる、および／またはそれらから本質的に構成することができる。本発明の別の非限定的パネルは、免疫グロブリン重鎖定常領域γ１、グランザイムＫ、ｍｕｔＬ相同体３、リポカリン２、ＣＸＣＬ５、血清欠乏性応答ホスファチジルセリン結合タンパク質、およびＨ３ヒストンファミリーメンバーＫ ＰＢＭＣお��びＩＢＤに関連するバイオマーカーを含むことができる、および／またはそれらから本質的に構成することができる。１つの実施形態において、本発明のパネルは、患者が、（１）クローン病もしくは潰瘍性大腸炎いずれかの形態のＩＢＤ、（２）クローン病、およびに／または（３）潰瘍性大腸炎を有するかどうかの判定に関して、ならびに／あるいはＩＢＤを有する患者が、クローン病または潰瘍性大腸炎を有するかの識別に関して、少なくとも７０％の精度（より好ましくは、少なくとも８０％の精度、最も好ましくは、少なくとも９０％の精度）を提供する。
【００８０】
ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのパネルの提供に加えて、固体支持体に好都合にカップリングされるＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのパネルを提供することも本発明の範囲内である。例えば、本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのポリヌクレオチドは、当該分野で周知の方法を用いて、アレイ（例えば、ハイブリダイゼーション分析用のバイオチップ）、樹脂（例えば、カラムクロマトグラフィー用のカラムに充填することができる樹脂）、またはマトリックス（例えば、ノーザンブロット分析用のニトロセルロースマトリックス）にカップリングさせることができる。このようなアレイの製造方法、ならびにこのようなアレイとコンピューター可読媒体（本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含むもの）および／またはデータベース、例えば関係型データベースの使用を含む、このようなアレイの使用方法は、当該分野において周知である。
【００８１】
そのような支持体を提供することにより、そのパネル用に選択された各々のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのサンプル中での存在または活性について、個別の分析を検出することができる。例えば、アレイでは、当該分野では周知の方法を用いて、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのパネルの各メンバーに相補的なポリヌクレオチドをそのアレイの異なる既知の位置に個々に取り付けることができる。そのアレイを、例えば被験者からの血液サンプル（好ましくは、ＰＢＭＣサンプル）から抽出されたポリヌクレオチドと、ハイブリダイズさせることができる。アレイ上の任意の位置でサンプル由来のポリヌクレオチドとそのアレイのハイブリダイゼーションを検出することができ、従って、そのサンプルにおけるＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの存在または量を確かめることができる。従って、組織特異性のみならず、その組織におけるＩＢＤバイオマーカーのパネルの発現レベルをも確かめることができる。好ましい実施形態では、バイオチップに基づくアレイが利用される。同様に、被験者からのタンパク質サンプルとハイブリダイズさせた異なるポリペプチドバイオマーカーに特異的な免疫化抗体を用いて、ＥＬＩＳＡ分析を行うことができる。
【００８２】
別の実施形態では、レポーター核酸を利用して、本発明の１つまたはそれ以上のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの発現を検出する。このようなレポーター核酸は、末梢血単核細胞の発現プロフィールを改変する薬剤についてのハイスループットスクリーンに有用であり得る。このようなレポーターアッセイの構成および使用は、周知である。
【００８３】
例えば、本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの転写調節のためのレポーターの構築は、一般的には、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節配列、典型的にはプロモーターを必要とする。前記プロモーターは、様々な常用法によって得ることができる。例えば、ゲノムライブラリーをその核酸のコーディング領域から成る標識されたプローブとハイブリダイズさせて、プロモーター配列を含有するゲノムライブラリーのクローンを同定することができる。その単離されたクローンの塩基配列決定を行って、そのコーディング領域から上流の配列を同定することができる。別の方法は、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのポリヌクレオチドのコーディング領域の５’末端にアニーリングするプライマーを使用する増幅反応である。この増幅テンプレートは、例えば、アンカーバブルアダプター（anchor bubble adaptor）をライゲートした制限ゲノム核酸であり得る。
【００８４】
レポーターを構築するために、選択されたＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのプロモーターを、例えばその選択されたＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーポリヌクレオチドのリーディングフレームを利用することなく、レポーター核酸に動作可能に連結させることができる。その核酸構築物をトランスフェクションプロトコルによって組織培養細胞（例えば末梢血単核細胞）に形質転換させて、レポーター細胞を産生させる。
【００８５】
多くの周知のレポーター核酸を使用することができる。１つの実施形態において、前記レポーター核酸は、緑色蛍光タンパク質である。第二の実施形態において、前記レポーターは、β−ガラクトシダーゼである。他の実施形態において、前記レポーター核酸は、アルカリホスファターゼ、β−ラクタマーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、または当該分野において公知の他のレポーター核酸である。前記レポーター核酸構築物は、エピソーム上に維持することもでき、または例えば標的化相同組換え（targeted homologous recombination）を用いることにより、染色体に挿入することもできる。このようなレポーター核酸の作製および使用方法は周知である。
【００８６】
（Ｉ〜Ｖ群バイオマーカーによる分析）
本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーは、５つの異なる群に類別することが可能であるが、各々の個々のバイオマーカーが本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーであることは、当業者には理解されるであろう。加えて、これらのバイオマーカーが、特性付けのみを目的としてこのような群に類別されることは、当業者には理解されるであろう。例えば、Ｉ群のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーは、ＵＣを有する患者のＰＢＭＣと共通の、ＣＤを有する患者のＰＢＭＣにおいて差次的に発現するバイオマーカーであると判定された。従って、これらの共通バイオマーカーは、ＩＢＤを処置するための試験化合物をスクリーニングするアッセイにおいて共に都合よく使用することができる、またはそのＩＢＤがＣＤの形態であるか、ＵＣの形態であるかにかかわらず、ＩＢＤの診断、予後予測および／もしくはモニタリングに共に使用することができることを意味するように、共に類別される。ＩＩ群、ＩＩＩ群、ＩＶ群および／またはＶ群のバイオマーカーとして類別されるＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーも、そのＩＢＤがＣＤの形態であるか、ＵＣの形態であるかにかかわらず、ＩＢＤの診断、予後予測および／もしくはモニタリングのための試験化合物のスクリーニングに使用できることは、当業者には理解されるであろう。しかし、ＩＩ群バイオマーカー、すなわちＣＤバイオマーカーのセットに含まれるバイオマーカーは、そのＩＢＤがＣＤの形態であるとき、ＩＢＤの診断、予後予測および／またはモニタリングのための試験化合物のスクリーニング法に使用される最適なセットであり得ることに注目されよう。逆に、ＩＩＩ群バイオマーカー、すなわち、ＵＣバイオマーカーのセットに含まれるバイオマーカーは、そのＩＢＤがＵＣの形態であるとき、ＩＢＤの診断、予後予測および／またはモニタリングのための試験化合物のスクリーニング法に使用される最適なセットであり得る。また、ＩＶ群バイオマーカー、すなわち、ＣＤｖＵＣバイオマーカーのセットに含まれるバイオマーカー、および特にＶ群バイオマーカー、すなわち、分類バイオマーカーのセットに含まれるバイオマーカーは、ＣＤを有する患者とＵＣを有する患者を識別することが重要なとき、ＩＢＤの診断、予後予測および／またはモニタリングのための試験化合物のスクリーニング法に使用される最適なセットであり得る。
【００８７】
（スクリーニング）
ＩＢＤの診断、予後予測および進行のモニタリング方法に加えて、本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの活性を調節することができる、従って、ＩＢＤ、すなわちクローン病または潰瘍性大腸炎の症状を抑制または緩和することができる可能性がある薬物を同定する、またはそのような薬剤のためのリード化合物を同定するスクリーニングアッセイにおいて使用することができる。ハイスループットスクリーニング方法をはじめとするこのようなスクリーニングアッセイは、当該分野において周知である。例えば、ＩＢＤを有すると診断された被験者もしくはＩＢＤを有する可能性がある被験者からのサンプル、または（天然もしくは組換え、いずれかの）ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーを含有するサンプルを、複数の試験化合物（例えば、小有機分子、生物製剤）のうちの１つと接触させることができ、そしてそれらの処理サンプルの各々におけるＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの発現または活性のレベルを、未処理サンプルにおけるまたは異なる試験化合物と接触させたサンプルにおけるＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの発現または活性のレベルと比較して、以下を決定することができる：試験化合物のいずれかが、１）少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの実質的に低減された発現もしくは活性のレベルを提供する（それによって、少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの活性の阻害剤を示す）かどうか、または２）少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの実質的に上昇した発現もしくは活性のレベル（それによって、少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの活性を増大させる因子を示す）かどうかを判定することができる。好ましい実施形態において、少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの活性を調節することができる試験化合物の同定は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）（スウェーデン、ウプサラのＢｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ）またはＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー移動）およびＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）アッセイ、ならびにＥＬＩＳＡおよび細胞ベースのアッセイによって提供されるような、ハイスループットスクリーニングアッセイを用いて行うことができる。
【００８８】
加えて、本発明は、結合パートナーへのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの結合を調節することができる試験化合物をスクリーニングする方法にさらに関し、この方法は、試験化合物とＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するタンパク質と結合パートナーとを併せ、その結合パートナーとＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するタンパク質の結合が発生するかどうか、およびそのような結合が試験化合物によりどの程度正に調節されるか、または負に調節されるかを判定することによって行われる。
【００８９】
上で述べたように、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの活性を調節することができる因子は、様々な天然由来または合成の化合物、生体分子、タンパク質、ペプチド、オリゴペプチド、多糖類、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのうちのいずれであってもよい。前記試験化合物は、例えば、小分子または生物製剤であり得る。下で論じるように、試験化合物は、当該分野では周知の様々なライブラリーから得ることができる。
【００９０】
本発明の試験化合物は、天然および／または合成の化合物の系統的ライブラリーをはじめとする任意の利用可能な供給源から得ることができる。生物学的ライブラリー；ペプトイドライブラリー（ペプチドの機能性を有する分子であるが、酵素分解に対して耐性であり、しかもなお生物活性を維持している新規非ペプチド骨格を有する分子のライブラリー；例えば、Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37:2678-85参照）；空間的にアドレス可能な平行な固相または液相のライブラリー（spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries）；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「ワンビーズ、ワンコンパウンド（one-bead, one-compound）」ライブラリー法；および親和性クロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法をはじめとする、当該分野では公知のコンビナトリアルライブラリー法における非常に多数のアプローチのうちのいずれによっても、試験化合物を得ることができる。前記生物学的ライブラリーおよびペプトイドライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは小分子ライブラリーに適用することができる（一般的に、例えば、Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12(3):145-67参照）。
【００９１】
（炎症性腸疾患の診断、予後予測および進行のモニタリング方法）
「診断の」または「診断」は、病理学的状態の存在または不在の同定を意味する。診断方法は、被験者（ヒトまたは非ヒト哺乳動物）からの生体サンプルにおけるＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはポリペプチド（それらのフラグメントを含む））の試験量を決定すること、およびその試験量とそのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの遺伝子産物の正常な量または範囲（すなわち、ＩＢＤに罹患していないことが判っている個体からの量または範囲）とを比較することによって、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの実質的に調節された（すなわち、異常な）発現を検出することを含む。
【００９２】
１つの実施形態では、２つのサンプルにおいてＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのレベルを比較し、そしてその試験サンプルにおける１つまたはそれ以上のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの異常発現はＩＢＤを示す。他の実施形態では、２つ、３つ、４つまたはそれ以上のバイオマーカーの異常発現が、ＩＢＤの重症症例を示す。別の実施形態では、１つまたはそれ以上のバイオマーカーの異常発現が、ＩＢＤの可能性を示し、２つ、３つ、４つまたはそれ以上のバイオマーカーの異常発現が、ＩＢＤの可能性の増加を示す。別の態様において、本発明は、その量および活性がＩＢＤの異なる症状発現または重症度またはタイプと相関するバイオマーカーを提供する。例えば、示したように、表５におけるＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの異常発現は、クローン病または潰瘍性大腸炎の診断と相関する場合がある。その後の発現レベルをその疾患の様々な段階の異なる発現プロフィールとさらに比較して、被験者がマッチしたプロフィールを有するかどうかを確認することができる。１つの特定の診断方法によってＩＢＤの最終的診断が得られない場合もあるが、その方法が、診断を助けるポジティブな効能を提供するならば、それで十分である。
【００９３】
本発明は、少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの異常発現または活性レベルを検出することによるＩＢＤの予後予測方法も提供する。「予後（予測）の」または「予後予測」は、病理学的状態の起こりえる発現および／または重症度の予測を意味する。予後予測方法は、被験者からの生体サンプルにおける少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの遺伝子産物の試験量を決定すること、およびその試験量とそのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカー遺伝子産物についての予後予測量または範囲（すなわち、様々な重症度のＩＢＤを有する個体からの量または範囲）とを比較することを含む。試験サンプルにおけるＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの遺伝子産物の様々な量は、ＩＢＤ、クローン病および／または潰瘍性大腸炎についてのある一定の予後と一致する。特定の予後予測レベルでのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの遺伝子産物の量の検出により、被験者についての予後予測が得られる。本発明の１つの実施形態において、ＩＢＤ（または特定の形態のＩＢＤ）に関連して、１つまたはそれ以上のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの実質的にアップレギュレートされた発現または活性は、一般的に、異常な増加と相関する。本発明の別の実施形態において、ＩＢＤ（または特定の形態のＩＢＤ）に関連して、１つまたはそれ以上のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの実質的にダウンレギュレートされた発現または活性は、一般的に、異常な減少と相関する。
【００９４】
加えて、本明細書に記載する予後予測アッセイは、異常なＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの発現または活性に関連したＩＢＤを処置または予防するための薬剤（例えば、作動薬、拮抗薬、ペプチド模倣体、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、小分子または他の薬物候補）を被験者に投与することができるかどうかを判定するために用いることができる。従って、ＰＡＩ−２などの、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの正常レベル（例えば、実質的にＩＢＤではない組織と同様のレベルまたは実質的に同様のレベル）への調節により、ＩＢＤを改善することができる。
【００９５】
胃腸病学分野に関連して、予後予測アッセイを工夫して、そのような疾患のための処置を受けている被験者が長期生存または疾患進行について見通しが不良であるかどうかを判定することができる。好ましい実施形態において、予後は、診断後直ぐに、すなわち数日以内に判定することができる。発症から急性疾患まで、ＩＢＤまたは特定の形態のＩＢＤ（例えばクローン病もしくは潰瘍性大腸炎）の異なる段階の発現プロフィールを確立することにより、特定の発現プロフィールを予後不良の可能性の増加と相関する発現パターンが明らかになり得る。その後、その予後予測を利用して、慢性ＩＢＤを防ぎ、長期生存および健康の可能性を向上させるようなより積極的な処置プログラムを考案することができる。
【００９６】
本発明の好ましい実施形態において、本開示分子および方法を生体サンプルに対して用いて、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの遺伝子において、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの異常発現を生じさせることがよく知られている１つまたはそれ以上の遺伝子改変の存在を検出する。このような検出を利用して、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節された発現または活性に起因するＩＢＤの重症度の判定またはＩＢＤの可能性の予後予測を行うことができる。さらなる特定の実施形態では、１つまたはそれ以上の遺伝子改変は、ＩＢＤに対する被験者の予後予測または感受性と相関する。サンプルからのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの遺伝子における遺伝子改変は、塩基配列決定反応、電気泳動移動度アッセイおよびオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションをはじめとする（しかし、これらに限定されない）当該分野において周知の方法によって同定することができる。
【００９７】
本発明は、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの発現または活性をモニターすることによる、ＩＢＤ、クローン病および／または潰瘍性大腸炎の進行または経過のモニタリング方法も提供する。本モニタリング方法は、被験者から１回目および２回目に採取した生体サンプルにおけるＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの遺伝子産物の試験量を決定すること、およびそれらの量を比較することを含む。１回目と２回目の間のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの量の変化は、ＩＢＤの経過の変化を示す。このようなモニタリングアッセイは、（例えば、臨床試験中の）患者における特定の治療的介入の有効性の評価、すなわち、本明細書において提供する治療薬に対応するＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節の評価にも有用である。
【００９８】
本発明のアッセイ方法が、これらの方法の多数の用途に対して、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの遺伝子産物の相対値で十分であるため、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの遺伝子産物の絶対値の測定を必ずしも必要としないことは、理解されるであろう。ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの遺伝子産物の量または存在度に加えて、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの遺伝子の変異もしくは異常遺伝子産物またはそれらの発現パターン（例えば、突然変異転写産物、トランケート型ポリペプチド）を正常な遺伝子産物および発現パターンとの比較により同定できることも理解されるであろう。
【００９９】
（処置方法）
本発明は、ＩＢＤ、クローン病および／または潰瘍性大腸炎のリスクを有する、それらに罹患しやすい、またはそれらを有すると診断を受けた被験者を処置するための予防的および治療的な、両方の方法を提供する。異常なＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの発現または活性が原因または一因となるＩＢＤのリスクを有する、そのようなＩＢＤに罹患しやすい、またはそのようなＩＢＤを有すると診断を受けた被験者は、例えば、本明細書に記載するような診断もしくは予後予測アッセイのいずれか、またはそれらの組み合わせによって、同定することができる。１つの態様において、本発明は、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカータンパク質の発現または活性を調節する、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのタンパク質または薬剤を被験者に投与することによって、異常なＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの発現または活性に関連したＩＢＤを被験者において予防するための予防的方法を提供する。予防薬の投与は、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカータンパク質の差次的な発現を特徴とする症状の発現前に、ＩＢＤが予防されるか、あるいはその進行が遅延されるように行うことができる。本発明の別の態様は、治療を目的としてＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの発現または活性のレベルを調節する治療的方法に関する。従って、１つの具体例としての実施形態において、本発明のこの調節方法は、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの発現レベルまたは１つもしくはそれ以上の活性を調節する薬剤と細胞（例えば、ＰＢＭＣ）を接触させることを含む。
【０１００】
ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの発現または活性レベルを調節する薬剤、すなわち、少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤は、本明細書に記載するような薬剤、例えば、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのポリヌクレオチド（関連ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのポリヌクレオチド（例えば、阻害性ポリヌクレオチド）を含む）、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのタンパク質、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのタンパク質の天然に存在するターゲット分子（例えば、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのタンパク質基質）、抗バイオマーカー抗体、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの作動薬、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの拮抗薬、または他の小分子であり得る。適切な薬剤は、本明細書に記載するスクリーニングアッセイに基づいて決定することができる。
【０１０１】
これらの調節法は、（例えば、その薬剤と共にＰＢＭＣを培養することにより）インビトロで行ってもよいし、あるいは（例えば、被験者にその調節剤を投与することにより）インビボで行ってもよい。１つの実施形態において、本方法は、実質的に低減されたまたは異常なＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカータンパク質の発現または活性を補正するための治療として、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのタンパク質もしくはポリヌクレオチド分子、またはＰＢＭＣおよびＩＢＤ関連作動薬を投与することを含む。ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカータンパク質が実質的にダウンレギュレートされている状況、ならびに／またはＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの活性増大が、有益な効果を有する可能性が高い状況では、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカー活性の刺激またはアップレギュレーションが望ましい。
【０１０２】
別の実施形態において、本方法は、実質的に増加したまたは異常なＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの発現または活性を補正するための治療として、阻害性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの投与を含む。ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの発現もしくは活性が実質的にアップレギュレートされている状況、ならびに／またはＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの活性低減が、有益な効果を有する可能性が高い状況では、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカー活性の阻害またはダウンレギュレーションが望ましい。
【０１０３】
少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤を投与するかどうかを判定する際に考慮すべき幾つかの薬理ゲノム学的アプローチは、当業者には周知であり、そのようなアプローチとしては、ゲノムワイド関連解析（genome-wide association）、候補遺伝子アプローチ、および遺伝子発現プロファイリングが挙げられる。本発明の医薬組成物は、その意図される投与経路に適合するように調合される（例えば、経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または可食性担体を含む）。投与経路の他の非限定的な例としては、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）、経口（例えば、吸入）、直腸内、経皮（局所）、および経粘膜投与が挙げられる。意図される経路各々に適合する医薬組成物は、当該分野では周知である。
【０１０４】
少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤は、薬学的に許容される担体と併用すると、医薬組成物として使用することができる。このような組成物は、少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤および担体に加えて、様々な希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、および当該分野では周知の他の材料を含有することができる。用語「薬学的に許容される」は、活性成分の生物活性の有効性に干渉しない非毒性材料を意味する。前記担体の特徴は、投与経路に依存することになる。
【０１０５】
本発明の医薬組成物は、サイトカイン、リンフォカイン、または他の造血因子、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、Ｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子、およびエリスロポエチンも含有することがある。本医薬組成物は、抗サイトカイン抗体、血栓溶解因子もしくは抗血栓性因子、例えばプラスミノゲンアクチベーターおよび第ＶＩＩＩ因子、ならびに／または他の抗炎症薬も含むことがある。このような追加の因子および／または薬剤を本医薬組成物に含めて、少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤との相乗効果を生じさせることができ、またはその調節剤よって引き起こされる副作用を最少限にとどめることができる。加えて、本発明の組成物は、（本発明の少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤に加えて）ＩＢＤを処置するために使用されている公知の薬剤（例えば、スルファサラジン、５−ＡＳＡ、ステロイドなど）も含むことができる。逆に、少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーに対する調節剤を、特定のサイトカイン、リンフォカイン、他の造血因子、血栓溶解因子もしくは抗血栓性因子、または抗炎症薬の調合物に含めて、そのサイトカイン、リンフォカイン、他の造血因子、血栓溶解因子もしくは抗血栓性因子、または抗炎症薬の副作用を最少限にとどめることができる。
【０１０６】
本発明の医薬組成物は、リポソームの形態であることができ、ここで、他の薬学的に許容される担体に加えて、水溶液中にミセル、不溶性単層、液晶またはラメラ層（lamellar layer）として凝集形態で存在する脂質などの両親媒性薬剤と、少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤とを併せる。リポソーム調合物に適する脂質としては、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが挙げられるが、これらに限定されない。このようなリポソーム調合物の調製は、当業者には周知である。
【０１０７】
本明細書で用いられる場合、用語「治療有効量」は、有意義な患者への利点（例えば、ＩＢＤに関連した状態の症状の改善、そのような病態の治癒またはそのような病態の治癒の速度の増加など）を示すために十分である、本医薬組成物または方法の各活性成分の総量を意味する。単独で投与する個々の活性成分に適用される場合、この用語は、その成分のみを指す。併用物に適用される場合、この用語は、併用で、逐次的に投与するにせよ、または同時に投与するにせよ、結果として治療効果を生じさせる活性成分の合計量を指す。
【０１０８】
本発明の処置または使用の方法を実施する際、少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤の治療有効量を被験者（例えば哺乳動物（例えば、ヒト））に投与する。調節剤は、単独で、あるいは他の療法（例えばサイトカイン、リンフォカインもしくは他の造血因子、または抗炎症薬）を利用する治療との併用で、本発明の方法に従って投与することができる。１つまたはそれ以上の薬剤と共投与する場合、少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤は、他の薬剤（単数もしくは複数）と同時に投与してもよく、逐次的に投与してもよい。逐次的に投与する場合、その担当医が、例えば、少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤を、少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの他の調節剤との併用で、または他の薬剤との併用で投与する、適切な順序を決定することとなろう。
【０１０９】
１つの実施形態では、本発明の少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤（例えばその医薬組成物）は、併用療法で投与される。すなわち、免疫および／または炎症性の疾患などの病理学的状態または疾患の処置に有用である他の薬剤（例えば治療薬）と併用される。この文脈において、用語「併用で」は、その薬剤を、同時にまたは逐次的に、実質的に同時期に与えることを意味する。逐次的に与える場合、好ましくは、第二の化合物の投与の開始時、２つの化合物のうちの第一の化合物は、依然として有効濃度で処置部位または被験者において検出することができる。
【０１１０】
（併用療法）
併用療法は、例えば、少なくとも１つの追加の治療薬と、共に調合されるおよび／または共投与されるＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤を含むことができる。追加の薬剤としては、下でさらに詳細に説明するような、少なくとも１つのサイトカイン阻害剤、増殖因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症薬、代謝阻害剤、酵素阻害剤、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤を挙げることができる。このような併用療法は、治療薬のより低い用量での投与を有利に利用することができ、それ故、様々な単独療法に関連する毒性または合併症の可能性を回避することができる。さらに、本明細書に開示する治療薬は、ＩＢＤ傷害経路とは異なる経路に対して作用し、従って、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの少なくとも１つの調節剤の効果を強化するならびに／または相乗作用を示すと予想される。
【０１１１】
ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤と併用される治療薬は、炎症反応において異なる段階で干渉する薬剤であってもよい。１つの実施形態では、本明細書に記載するＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの少なくとも１つの調節剤は、少なくとも１つのサイトカインおよび／または増殖因子拮抗薬と、共に調合することもできるし、および／または共投与することもできる。前記サイトカインおよび／または増殖因子拮抗薬としては、可溶性受容体、ペプチド阻害剤、小分子、リガンド融合体、抗体（サイトカインもしくは増殖因子またはそれらの受容体または他の表面細胞分子に結合するもの）、ならびに「抗炎症性サイトカイン」およびその作動薬を挙げることができる。
【０１１２】
本明細書に記載するＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤と併用することができる薬剤の非限定的な例としては、少なくとも１つのインターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１およびＩＬ−２２）；サイトカイン（例えば、ＴＮＦα、ＬＴ、ＥＭＡＰ−ＩＩおよびＧＭ−ＣＳＦ）；または増殖因子（例えば、ＦＧＦおよびＰＤＧＦ）の拮抗薬が挙げられるが、これらに限定されない。前記薬剤としては、インターロイキン、サイトカインおよび増殖因子についての少なくとも１つの受容体の拮抗薬も挙げられるが、これらに限定されない。ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤は、細胞表面分子、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０（例えば、ＣＤ２０阻害剤 リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ９０もしくはそれらのリガンド（ＣＤ１５４（ｇｐ３９もしくはＣＤ４０Ｌ）を含む）、またはＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１およびＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１（Yusuf-Makagiansar et al. (2002) Med. Res. Rev. 22:146-67）の阻害剤（例えば抗体）と併用することもできる。本明細書に記載するＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤と併用することができる他の化合物としては、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１およびＩＬ−２２についての受容体の拮抗薬を挙げることができる。
【０１１３】
ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤を用いる併用療法において有用な薬剤の例としては、ＩＬ−１２拮抗薬（例えば、ＩＬ−１２に結合する抗体（例えば、ＷＯ ００／５６７７２参照））；ＩＬ−１２受容体阻害薬（例えば、ＩＬ−１２受容体に対する抗体）；ならびに可溶性ＩＬ−１２受容体およびそのフラグメントが挙げられる。ＩＬ−１５拮抗薬の例としては、ＩＬ−１５またはその受容体に対する抗体、ＩＬ−１５受容体の可溶性フラグメント、およびＩＬ−１５結合タンパク質が挙げられる。ＩＬ−１８拮抗薬の例としては、ＩＬ−１８に対する抗体、ＩＬ−１８受容体の可溶性フラグメント、およびＬＩ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ、Mallat et al. (2001) Circ. Res. 89:E41-45）が挙げられる。ＩＬ−１拮抗薬の例としては、インターロイキン−１−変換酵素（ＩＣＥ）阻害剤（例えば、Ｖｘ７４０）、ＩＬ−１拮抗薬（例えば、ＩＬ−１ＲＡ（アナキンラ（ＫＩＮＥＲＥＴTM），Ａｍｇｅｎ））、ｓＩＬ−１ＲＩＩ（Ｉｍｍｕｎｅｘ）、および抗ＩＬ−１受容体抗体が挙げられる。
【０１１４】
ＴＮＦ拮抗薬の例としては、ＴＮＦ（例えば、ヒトＴＮＦα）に対する抗体、例えば、Ｄ２Ｅ７（ヒト抗ＴＮＦα抗体、米国特許第６，２５８，５６２号、ＨＵＭＩＲＡTM，Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ）；ＣＤＰ−５７１／ＣＤＰ−８７０／ＢＡＹ−１０−３３５６（ヒト化抗ＴＮＦα抗体、Ｃｅｌｌｔｅｃｈ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；ｃＡ２（キメラ抗ＴＮＦα抗体、ＲＥＭＩＣＡＤＥTM，Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；および抗ＴＮＦ抗体フラグメント（例えば、ＣＰＤ８７０）が挙げられる。他の例としては、可溶性ＴＮＦ受容体（例えば、ヒトｐ５５またはｐ７５）フラグメントおよび誘導体、例えばｐ５５ｋＤ ＴＮＦＲ−ＩｇＧ（５５ｋＤ ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質、ＬＥＮＥＲＣＥＰＴTM）および７５ｋｄ ＴＮＦＲ−ＩｇＧ（７５ｋＤ ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質、ＥＮＢＲＥＬTM（エタネルセプト − Ｉｍｍｕｎｅｘ）が挙げられる。例えば、van der Poll et al. (1997) Blood. 89:3727-34； Mori et al. (1996) J. Immunol. 157:3178-82参照。さらなる例としては、酵素拮抗薬（例えば、ＴＮＦα変換酵素阻害剤（ＴＡＣＥ）、例えばα−スルホニルヒドロキサム酸誘導体（ＷＯ ０１／５５１１２）またはＮ−ヒドロキシホルムアミド阻害剤（ＧＷ ３３３３、−００５または−０２２，ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）およびＴＮＦ−ｂｐ／ｓ−ＴＮＦＲ（可溶性ＴＮＦ結合タンパク質、例えば、Lantz et al. (1991) J. Clin. Invest. 88:2026-31； Kapadia et al. (1995) Amer. J. Physiol. Heart Circ. Phys. 268:H517-25参照）が挙げられる。ＴＮＦ拮抗薬は、可溶性ＴＮＦ受容体（例えば、ヒトｐ５５またはｐ７５）フラグメントおよび誘導体、例えば７５ｋＤ ＴＮＦＲ−ＩｇＧ；ならびにＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤である場合もある。
【０１１５】
他の実施形態において、本明細書に記載するＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤は、次のものうちの少なくとも１つとの併用で投与することができる：ＩＬ−１３拮抗薬、例えば可溶性ＩＬ−１３受容体および／または抗ＩＬ−１３抗体；ならびにＩＬ−２拮抗薬、例えばＩＬ−２融合タンパク質（例えば、Ｓｅｒａｇｅｎによって製造されているＤＡＢ ４８６−ＩＬ２および／またはＤＡＢ３８９−ＩＬ−２、例えば、Sewell et al. (1993) Arthritis Rheum. 36:1223-33参照）および抗ＩＬ−２Ｒ抗体（例えば、抗Ｔａｃ−Ｈヒト化抗体、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ、Junghans et al. (1990) Cancer Res. 50:1495-502参照）。別の併用としては、非枯渇性（nondepleting）抗ＣＤ４阻害剤、例えばＩＤＥＣ−ＣＥ９．１／ＳＢ ２１０３９６（抗ＣＤ４抗体、ＧｒａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）との併用でのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤が挙げられる。さらに他の併用としては、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤とＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）の共刺激性経路拮抗薬（例えば、抗体、可溶性受容体または拮抗性リガンド）；Ｐ−セレクチン糖タンパクリガンド（ＰＳＧＬ）およびＰＳＧＬ−１阻害剤（例えば、ＰＳＧＬおよび／またはＰＳＧＬ−１に対する抗体ならびに小分子阻害剤）；Ｔ細胞およびＢ細胞の枯渇物質（例えば、抗ＣＤ４抗体または抗ＣＤ２２抗体）、ならびに抗炎症性サイトカインおよびそれらの作動薬（例えば、抗体）が挙げられる。抗炎症性サイトカインとしては、ＩＬ−４（例えば、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）；ＩＬ−１０（例えば、ＳＣＨ５２０００、組換えＩＬ−１０、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）；ＩＬ−１１；ＩＬ−１３；およびＴＧＦβまたはその拮抗薬（例えば、作動薬抗体）を挙げることができる。
【０１１６】
他の実施形態において、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの少なくとも１つの調節剤は、少なくとも１つの抗炎症薬、免疫抑制剤、代謝阻害剤および酵素阻害剤と共に調合する、および／またはそれらと共投与することができる。本明細書に記載するＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤と併用することができる薬物または阻害剤の非限定的な例としては、以下のものの少なくとも１つが挙げられるが、これらに限定されない：非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（アスピリン、サルサレート、ジフルニサル、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナブメトン、ピロキシカム、ナプロキセン、ジクロフェナク、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、エトドラク、ケトロラク、オキサプロジン、テニダプ（tenidap）、メロキシカム、ピロキシカム、アセクロフェナク（aceclofenac）、トルメチン、チアプロフェン酸、ニメスリドなどを含むが、これらに限定されない）；スルファサラジン；コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン）；サイトカイン抑制性抗炎症薬（ＣＳＡＩＤ）；ヌクレオチド生合成の阻害剤（例えば、プリン生合成の阻害剤（例えば、メトトレキセートなどの葉酸拮抗薬））；およびピリミジン生合成の阻害剤、例えば、ジヒドロオロテートデヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤、例えばレフルノミド（例えば、Kraan et al. (2004) Ann. Rheum. Dis. 63:1056-61参照）。少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤と併用するための治療薬としては、１つまたはそれ以上のＮＳＡＩＤ、ＣＳＡＩＤ、ＤＨＯＤＨ阻害剤（例えば、レフルノミド）、および葉酸拮抗薬（例えば、メトトレキセート）を挙げることができる。
【０１１７】
ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤と併用することができる追加の薬剤の例としては、以下のものの少なくとも１つが挙げられる：コルチコステロイド（経口用、吸入用および局所注射）；免疫抑制剤（例えば、シクロスポリンおよびタクロリムス（ＦＫ−５０６））；ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、シロリムス（ラパマイシン）またはラパマイシンの類似体および／または誘導体、例えばエステルラパマイシン誘導体、例えばＣＣＩ−７７９（例えば、Elit (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1249-53； Huang et al. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:295-304参照））；前炎症性サイトカイン、例えばＴＮＦαおよびＩＬ−１のシグナリングに干渉する薬剤（例えば、ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８またはＭＡＰキナーゼ阻害剤）；ＴＰＬ−２、Ｍｋ−２およびＮＦκｂ阻害剤；ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブ、ロフェコキシブなど、およびそれらの変異体）；ホスホジエステラーゼ阻害剤（例えば、Ｒｏｌｉｐｒａｍ）；ホスホリパーゼ阻害剤（例えば、細胞質ゾルホスホリパーゼ２（ｃＰＬＡ２）の阻害剤、例えばトリフルオロメチルケトン類似体（米国特許第６，３５０，８９２号））；血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の阻害剤；ＶＥＧＦ受容体の阻害剤；血管形成の阻害剤；ＲＡＧＥおよび可溶性ＲＡＧＥ；エストロゲン受容体β（ＥＲＢ）作動薬、ＥＲＢ−ＮＦκｂ拮抗薬；インターフェロン−β（例えば、ＩＦＮβ−１αおよびＩＦＮβ−１ｂ）；コパキソン（copaxone）；およびコルチコステロイド。
【０１１８】
ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの１つまたはそれ以上の調節剤と併用することができる他の有用な治療薬としては、以下が挙げられる：ブデノシド（budenoside）；上皮増殖因子；アミノサリチル酸塩；６−メルカプトプリン；アザチオプリン；メトロニダゾール；リポキシゲナーゼ阻害剤；メサラミン；オルサラジン（olsalazine）；バルサラジド（balsalazide）；抗酸化物質；トロンボキサン阻害剤；増殖因子；エラスターゼ阻害剤；ピリジニル−イミダゾール化合物；プレドニゾロンのグルクロニド−複合プロドラッグまたはデキストラン−複合プロドラッグ；デキサメタゾンまたはブデソニド；ＩＣＡＭ−１アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（ＩＳＩＳ ２３０２；Ｉｓｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）；可溶性補体受容体１（ＴＰ１０；Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）；徐放性メサラジン；血小板活性化因子（ＰＡＦ）の拮抗薬；シプロフロキサシン；リグノカイン（lignocaine）；シクロスポリンＡ；ヒドロキシクロロキン（ＰＬＡＱＵＥＮＩＬTM）；ミノサイクリン（ＭＩＮＯＣＩＮTM）；およびアナキンラ（ＫＩＮＥＲＥＴTM）。
【０１１９】
本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤との併用で投与するための特定の治療薬の選択は、主として、その特定の被験者、所望のターゲットおよび選択される治療期間などの因子に依存することになる。このような決定は、十分に当業者の技術および知識の範囲内である。
【０１２０】
ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤と併用することができる治療薬の追加の例としては、以下のものの１つ以上が挙げられる：６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）；アザチオプリン；スルファサラジン；メサラジン；オルサラジン（olsalazine）；クロロキン、ヒドロキシクロロキン（ＰＬＡＱＵＥＮＩＬ（登録商標））；ペニシラミン；アウロチオマレート（aurothiornalate）（筋肉内用および経口用）；アザチオプリン；コルヒチン；β−２−アドレノレセプター作動薬（サルブタモール、テルブタリン、サルメテロール）；キサンチン（テオフィリン、アミノフィリン）；クロモグリケート（cromoglycate）；ネドクロミル；ケトチフェン；イプラトロピウムおよびオキシトロピウム；ミクロフェノーレートモフェチル（mycophenolate mofetil）；アデノシン作動薬；抗血栓症薬；補体阻害剤；ならびにアドレナリン作動薬。
【０１２１】
１つの実施形態において、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤は、免疫応答の調節に関与する他のターゲットに対する１つまたはそれ以上の抗体と併用することができる。本発明のＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤と併用することができる、免疫応答を処置または予防するための薬剤の非限定的な例としては、次のものが挙げられる：ＣＤ２５（インターロイキン−２受容体−ａ）、ＣＤ１１ａ（ＬＦＡ−１）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳＬ、ＩＣＯＳ、ＣＤ８０（Ｂ７．１）および／またはＣＤ８６（Ｂ７．２）をはじめとする（しかし、これらに限定されない）他の細胞表面分子に対する抗体。さらに別の実施形態において、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤は、１つまたはそれ以上の一般的な免疫抑制剤（例えばシクロスポリンＡまたはＦＫ５０６）と併用される。別の実施形態において、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤は、ＣＴＬＡ４作動薬（例えば、ＣＴＬＡ４  Ｉｇ − アバタセプト（ＯＲＥＮＣＩＡ（登録商標）））と併用される。
【０１２２】
本発明の医薬組成物は、その意図された投与経路に適合するように調合される。投与を遂行するための方法は、当業者には公知である。局所投与もしくは経口投与することができるまたは粘膜を越えて透過することができる組成物も得ることができる。本発明の方法を実施するために本医薬組成物において使用される本発明のモジュレーターの投与は、従来の様々な経路（例えば、経口摂取、吸入、皮膚、皮下、静脈内注射、直腸内浣腸、坐剤の挿入など）で行うことができる。
【０１２３】
皮内または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、一般的に、次の成分のうちの１つまたはそれ以上を含む：滅菌希釈液、例えば、注射用蒸留水、食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化物質、例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば、アセテート、シトレートまたはホスフェート；および張度を調整するための薬剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは、酸または塩基（例えば塩酸または水酸化ナトリウム）で調整することができる。このような調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチック製の複数回分用バイアルに封入することができる。
【０１２４】
注射に適する医薬組成物としては、滅菌性の水溶液または分散液、および滅菌注射用の溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与に適する担体としては、生理食塩水、静菌水、ＣＲＥＭＡＰＨＯＲＥTMＥＬ（ニュージャージー州、ピスカタウェイのＢＡＳＦ）またはリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において、その組成物は、滅菌性でなければならず、且つ、容易に注射できる程度に流動性でなければならない。上記組成物は、製造および保管条件下で安定でなければならず、且つ、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。この担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）および適するこれらの混合物を含有する、溶媒または分散媒体であり得る。その適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤（例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸およびチメロサールなど）によって達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール（例えばマンニトール、ソルビトール）および塩化ナトリウムを組成物に含めると好適なものとなるであろう。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによって、もたらすことができる。
【０１２５】
少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤の治療有効量を経口投与するとき、その結合剤は、錠剤、カプセル、粉末、溶液またはエリキシルの形態であろう。錠剤の形態で投与するとき、本発明の医薬組成物は、固体担体、例えばゼラチンまたはアジュバントを追加として含有することがある。錠剤、カプセルおよび粉末は、約５〜９５％の結合剤、好ましくは約２５〜９０％の結合剤を含有する。液体形態で投与するときには、液体担体、例えば、水、石油、動物起源または植物起源の油、例えば（その集団における落花生アレルギーの頻度を念頭においてだが）落花生油、鉱物油、大豆油もしくはゴマ油、または合成油が、添加されることがある。液体形態の本医薬組成物は、生理食塩溶液、デキストロースもしくは他の糖類溶液、またはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールをさらに含有することができる。液体形態で投与するとき、本医薬組成物は、約０．５〜９０重量％の結合剤、好ましくは約１〜５０重量％の結合剤を含有する。
【０１２６】
少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤の治療有効量が、静脈内、皮膚または皮下注射により投与されるとき、その調節剤は、発熱物質を含まない非経口での許容される水溶液の形態であろう。ｐＨ、等張性、安定性などを顧慮する、このような非経口的に許容されるタンパク質溶液の調製は、当業者の技術の範囲内である。静脈内、皮膚または皮下注射のために好ましい医薬組成物は、少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤に加えて、等張性ビヒクル、例えば塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、デキストロース注射液、デキストロース−塩化ナトリウム注射液、乳酸化リンガー注射液、または当該分野において公知であるような他のビヒクルを含有していなければならない。本発明の医薬組成物は、安定剤、保存薬、緩衝剤、抗酸化物質、または当業者には公知の他の添加剤も含有することがある。
【０１２７】
本発明の医薬組成物中の少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤の量は、処置される状態の性質および重症度、ならびにその患者が受けた以前の処置の性質に依存することになる。最終的には、担当医が、各々の個々の患者を処置する、少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤の量を、決定することとなろう。最初、担当医は、低い用量の少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤を投与し、患者の反応を観察することとなる。その患者について最適な治療効果が得られるまで、それより多い用量のその少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤を投与することができ、そして一般的にはそれが得られた時点で投薬量をさらに増加させない。本発明の方法を実施するために使用される様々な医薬組成物は、体重１ｋｇ当たり約０．１μｇから約１００ｍｇを含有すべきであると考えられる。
【０１２８】
本発明の医薬組成物を使用する静脈内（ｉ．ｖ．）療法の継続期間は、処置される疾患の重症度、ならびに各々の個々の患者の状態および可能性のある特異体質性応答に依存して変わることになる。この少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤の各適用継続期間は、１２〜２４時間の範囲内の継続的ｉ．ｖ．投与、または何らかの他の適切な期間であり得ると考えられる。本発明の医薬組成物を使用する皮下的（ｓ．ｃ．）、坐剤などの治療法も考えられる。これらの治療薬は、１日１回、週１回、またはより好ましくは２週間に１回（biweekly）、または月１回投与することができる。この少なくとも１つのＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの調節剤が、小分子である場合、それらの治療薬は、１日１回、１日２回、１日３回などで投与することができる。最終的には、担当医が、本発明の医薬組成物を使用する治療、または小分子での治療の適切な継続期間およびその治療薬投与のタイミングを決めることとなる。
【０１２９】
（キット）
本発明は、炎症性腸疾患を有する被験者における長期生存または快適な生活についての予後を判定するためのキットも提供し、このキットは、本発明のバイオマーカーの発現を評価するための試薬を含む。診断およびモニタリング用のキットも考えられる。好ましくは、前記試薬は、１つまたはそれ以上の抗バイオマーカー抗体またはそのフラグメントを含むことができ、この抗体またはそのフラグメントは、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーに対応するタンパク質と特異的に結合する。場合により、このキットは、ポリヌクレオチドプローブを含むことがあり、このプローブは、表１〜５に列挙したＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーに対応する転写ポリヌクレオチドと特異的に結合する。このキットは、例えばＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）などのバイオチップ上にアレイとして配列することができる、ＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーのパネルを含むこともできる。
【０１３０】
本発明は、被験者における炎症性腸疾患の阻害についての複数の化合物各々の適性を評価するためのキットをさらに提供する。このようなキットは、検査すべき多数の化合物、および表１〜５に列挙したＰＢＭＣおよびＩＢＤに関連するバイオマーカーの発現を評価するための試薬（すなわち、対応するタンパク質に特異的な抗体、または対応するポリヌクレオチドに特異的なプローブもしくはプライマー）を含む。
【０１３１】
標準的な技法による、本発明の上で説明した組成物および方法に対する修飾は、当業者には容易に理解されるであろう。それらは、本発明に包含されるものとする。
【０１３２】
後続の実施例により本発明をさらに説明するが、これらの実施例は、限定的なものと解釈されるべきではない。本出願全体を通して、引用されているすべての参考文献、特許および特許出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３３】
（実施例）
後続の実施例は、本発明の理解を促すために記載するものであり、如何なる点においても本発明の範囲を限定することは意図されておらず、本発明の範囲に対する限定と解釈されるべきではない。本実施例は、健常なボランティアおよび炎症性腸疾患に罹患している患者からの末梢血単核細胞の単離などの従来の方法についての詳細な説明は含まない。そのような方法は、当業者には周知である。
【実施例１】
【０１３４】
材料および方法
実施例１．１：患者情報および臨床評価
薬理ゲノム学的分析用の血液サンプルは、北米および欧州の治験実施医療機関（clinical site）において、合計４２例の明らかに健常な人、５９例のＣＤ患者および２６例のＵＣ患者から採取した。各治験実施医療機関の施設内審査委員会（Institutional Review Board）または倫理委員会（Ethics Committee）がこの試験を承認し、各患者からインフォームドコンセントを得る前には如何なる処置も行わなかった。
【０１３５】
本試験における個々の人口統計学的特徴の比較を表７に提示する。
【表７】
2008545437.tif 000014
１：両側ｔ検定とＡＮＯＶＡ誤差推定に基づくｔ統計量とを用いて計算したｐ値。
２：群間の男性の女性に対する度数を比較する、尤度比カイ二乗検定を用いて計算したｐ値。
３：群間の白人の非白人に対する度数を比較する、尤度比カイ二乗検定を用いて計算したｐ値。
【０１３６】
健常被験者（男性２４例、女性１８例）は、主として白人であり、年齢は２５〜６０歳の範囲内であった。ＣＤ患者（男性２１例、女性３８例）は、主として白人であり、年齢は２０〜６５歳の範囲内であり、２２０から４００の間の範囲内のクローン病活性指数スコア（ＣＤＡＩ）を有し、ならびに≧２５の腹部疼痛評点および／または≧２５の下痢評点を有した。少なくとも６ヶ月間のＣＤの診断を放射線試験、内視鏡検査と組織検査、または外科的病態によって確認した。クローン病の診断を有する患者は、その診断が生検により確認された場合、組み入れた。ＵＣ患者（男性８例、女性１８例）は、主として白人であり、年齢は２５〜７３歳の範囲内であり、軽度から中等度（１または２のスコア）の範囲内のPhysicians' Global Assessment of Mayo Ulcerative Colitis Scoring System（ＭＵＣＳＳ）からのスコアを有した。標準的な臨床基準に加えて、内視鏡検査と生検により左側ＵＣの診断を得た。
【０１３７】
女性の男性に対する比率は、健常集団とＩＢＤ集団の間に有意な差があったが、２つのＩＢＤ集団の間での差はなかった。健常集団とＩＢＤ集団の間にも、２つのＩＢＤ集団の間にも、人種（白人 対 非白人）および年齢の有意な差は無かった（すべて、ｐ＜０．０５レベル）。２つのＩＢＤ集団の間での関連薬物の使用量の調査は、５−ＡＳＡもあまり頻繁に使用されない他のいずれの薬も、この試験における比較を混乱させる関連薬物（concomitant medication）とは報告されないことを示した。
【０１３８】
実施例１．２：血液サンプリングおよび処理
上記治験実施医療機関において各人から血液（８ｍＬ）がVacutainer cell preparation tube（ＣＰＴ；ニュージャージー州、フランクリンレイクスのＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に採取され、製造業者の推奨に従ってＰＢＭＣ単離のために中央処理研究所（central processing lab）に一晩かけて輸送された。本試験において分析したすべてのＰＢＭＣは、採血後２４時間以内に処理された。ＲＮＡ精製に先立ち、ＡＢＸ  Ｐｅｎｔｒａ  ６０  Ｃ＋  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（カリフォルニア州、アーバイン）を使用して精製ＰＢＭＣに関する完全細胞数のカウントを行って、好中球、リンパ球、単球、好酸球および好塩基球の絶対数ならびに割合を記録した。ＵＣ患者からの１つのＰＢＭＣのサンプルについては細胞数のカウントは行わず、従って、このプロフィールは、下で説明するＡＮＣＯＶＡ分析から除外した。この患者からの発現データは、予測モデルを開発および検査する際に組み入れた。RNeasy mini column protocol（カリフォルニア州、ヴァレンシアのＱｉａｇｅｎ）を用いて、全ＲＮＡをＰＢＭＣから精製した。
【０１３９】
実施例１．３：オリゴヌクレオチドアレイハイブリダイゼーションおよびデータ整理
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ（カリフォルニア種、サンタクララのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に従って、全ＲＮＡ（２μｇ）をビオチン化ｃＲＮＡに変換した。標識ｃＲＮＡ（１０μｇ）をフラグメント化し、以前に説明された（Twine et al., 上記）とおりハイブリダイゼーションの準備をした。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌに記載されているとおりビオチン化ｃＲＮＡをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａ  ｈｕｍａｎ  ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）ａｒｒａｙにハイブリダイズした。標準曲線として機能するように、ハイブリダイゼーション前に１：３００，０００（３ｐｐｍ）から１：１０００（１０００ｐｐｍ）の範囲内の１１のビオチン化対照転写産物を各サンプルにスパイクした（Hill et al. (2001) Genome Biol. 2(12):research 0055.1-0055.13）。ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）ＭＡＳ  ５．０ソフトウェアを用いて、特異的ハイブリダイゼーション強度を評価し、各プローブセットについてのシグナル値をコンピューター計算し、不在／存在コールを作製した。その後、標準曲線を参照することにより、各プローブセットについてのシグナル値を、１０6個の転写産物中に存在する転写産物の数を表す度数値に変換した（Hill et al. , 上記）。各転写産物を評価し、それが次の２つの厳しくない基準を満たす場合、本試験に組み入れた：「存在」とコールされること、およびサンプル（健常、ＵＣまたはＣＤ）のうちの少なくとも１つにおける１０（１０ｐｐｍ）またはそれ以上の度数値。７，９０８の配列が、これらのフィルタリング基準を満たし、それらを分析に使用した。
【０１４０】
実施例１．４：分散分析（ＡＮＯＶＡ）および共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）
これらの疾患群間の平均発現の差について検査する際、ＰＢＭＣ細胞タイプ組成の差を補正するために、共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）法を用いた。応答測度として対数変換度数を用いて、各転写産物について独立したＡＮＣＯＶＡを実行した。このＡＮＣＯＶＡモデルは、疾患群、性別、好中球パーセント、単球パーセントおよび好酸球パーセントについての項を含んでいた。このＡＮＣＯＶＡにおいて、各細胞タイプについて、その細胞タイプのパーセントと特定の遺伝子についての発現レベルの間に線形関係を描く傾きを予測し、ｔ検定を行って、その傾きが０とは有意に異なるかどうかを判定した（ここで、０の傾きは、細胞タイプパーセントと発現レベルの間に線形関係が無いことを示す）。
【０１４１】
上記ＡＮＣＯＶＡモデルに組み入れる細胞タイプの選択は、１）細胞タイプ間の相関度、２）各細胞タイプの分布に関する疾患タイプ間の相違度、および３）各細胞タイプについてのパーセントの大きさの考慮によって行った。ＡＮＣＯＶＡにおける共変量は、互いに高度に相関していてはならない。リンパ球のパーセントは、単球のパーセントおよび好中球のパーセントと強く逆相関しており、そのためこのＡＮＣＯＶＡに組み入れなかった。
【０１４２】
治療群差および細胞タイプ回帰効果についての総合検査に加えて、細胞タイプパーセントの差を補正した疾患群平均の一対比較を、両側ｔ検定を用い、ＡＮＣＯＶＡ誤差項から導出されるｔ統計量を分母として行った。最後に、女性および男性の相対的分布にも疾患群間で有意な差があったため、性別をこのＡＮＣＯＶＡに組み入れた。
【０１４３】
実行した多数の統計的検定を説明するために、上に記載した分析によって生じた生ｐ値の補正は行わなかった。α＝０．０００１の保存的有意性レベルと組み合わせた倍率変更フィルター（１．５倍）を用いて、誤ったポジティブ判定の発生を減少させた。
【０１４４】
実施例１．５：マイクロアレイ発現データを用いる遺伝子の選択および監視によるクラス予測
先に説明されており（Golub et al. (1999) Science 286:531-37）、 HYPERLINK "http://www.broad.mit.edu/cancer/software/software.html.よ" www.broad.mit.edu/cancer/software/software.html.より入手できるＧｅｎｅＣｌｕｓｔｅｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０を使用して、遺伝子選択および監視によるクラス予測を行った。これらの分析では、ストリンジェントなデータ整理フィルター（クローン病またはＵＣのサンプルにおける少なくとも５０％の存在コール、および１０ｐｐｍより大きい度数を有するクローン病またはＵＣのサンプルの少なくとも５０％）に合う４２２８の転写産物のみを使用した。各群内のサンプルを、プロフィールのトレーニングセット（７５％）または試験セット（２５％）から成るデータセット（データセットＭＢ）におけるメンバーシップに、無作為に選択した。遺伝子選択は、サンプルのトレーニングセットを使用して行い、そのトレーニングセットにおけるクラス割付けの最高総合精度を示した最も少ない遺伝子を有する分類子を、１個抜き（leave-one-out）および４分割交差検定によって同定した。その後、その予測分類モデルを試験セットにおけるサンプルに関して評価し、その試験セットにおけるサンプルについてのクラス割付の総合精度が報告された。
【０１４５】
遺伝子選択のために、トレーニングセットと試験セットの両方におけるすべての発現データを分析前に対数変換した。トレーニングデータセットにおいて、そのクラス推定量の中央値を用いたＳ２Ｎ類似度尺度（similarity metric）での（各クラスにおける特徴数が等しい）両側アプローチを用いて、漸増特徴（転写産物データ）数を有するモデルを作った。ＣＤ患者およびＵＣ患者からのＰＢＭＣプロフィールをバイナリアプローチを用いて比較した。２つの工程で２個と２００個の間の遺伝子を有する予測遺伝子分類子を１個抜きおよび４分割交差検定によって評価して、最も正確なクラス割付けを生じさせる最小予測モデルを同定した。クラスのメンバーシップの予測は、重み付き多数決法（weighted voting）アルゴリズムを用いて行った。
【０１４６】
実施例１．６：Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）ツール（カリフォルニア州、マウンテンビューのＩｎｇｅｎｕｉｔｙ）を用いて、ＡＮＣＯＶＡ分析から得られたＩＢＤ関連遺伝子、ＣＤ特異的遺伝子およびＵＣ特異的遺伝子に注釈をつけた。カノニカル経路および機能カテゴリーに関する注釈は、Ｇｅｎｅ−Ｂｙ−Ｇｅｎｅ  Ｖｉｅｗから、および／またはＳｅａｒｃｈ  ＩＰＫＢ（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｙｗａｙｓ  Ｋｎｏｕｗｌｅｄｇｅ  Ｂａｓｅ）特性を用いて、これらの遺伝子リストを検索した。
【０１４７】
実施例１．７：マイクロアレイの結果の定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）確認
クローン病（ＣＤ）を有する５９例の患者および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を有する２６例の患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のＲＮＡサンプルが入っている２つの９６ウエルプレートをＱ−ＰＣＲによって分析した。合計４５ｎｇの各ＰＢＭＣ  ＲＮＡサンプルを、サンプルの最初の順序を保つような方法で９６ウエルプレートに移した。ＣＤを有する２例の患者およびＵＣを有する１例の患者からのＰＢＭＣ  ＲＮＡサンプルは、十分なＲＮＡを含有していなかった。後に、これらの患者からのサンプルは、Ｑ−ＰＣＲ分析から除外した。High Capacity cDNA Archive kit（カリフォルニア州、サンディエゴのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、各ＲＮＡサンプルを１００μＬの反応溶液中で逆転写した。その反応溶液を２５℃で１０分間、その後、３７℃で２時間インキュベートし、増幅まで−８０℃で保管した。１２の遺伝子分類子における遺伝子のＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号（すなわち、上記表５において見出すことができるＵｎｉＧｅｎｅ  ＩＤ番号）に対応する、あらかじめ設計された遺伝子特異的ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブおよびプライマーセット（ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）遺伝子発現アッセイ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、分類バイオマーカーの相対的発現レベルを増幅し、その発現レベルを定量した。各ＲＮＡサンプルついて、４つのハウスキーピング遺伝子：（１）β２−ミクログロブリン（β２Ｍ）、（２）β−アクチン、（３）１８ＳリボソームＲＮＡ（１８Ｓ）、および（４）グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）も増幅し、定量した。目的の各転写産物について使用したＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブおよびプライマーのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）ＩＤを表８に示す。
【表８−１】
2008545437.tif 000015
【表８−２】
2008545437.tif 000016
【０１４８】
ＡＢＩ  ７９００ＨＴ配列検出システム（カリフォルニア州、サンフランシスコのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、９６ウエル ｆａｓｔ  ｂｌｏｃｋ 光反応プレートにおいて２５μＬの反応量（１Ｘ ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、１ＸＴＡＱＭＡＮ（登録商標）遺伝子発現アッセイ、および２．２５ｎｇのｃＤＮＡを含む）で、目的の各転写産物についての定量リアルタイムＰＣＲを行った。ＤＥＰＣ水のみの負の対照サンプル（テンプレート対照なし；ＮＴＣ）およびヒト ロイコパック（leukopack）ＲＮＡの正の対照サンプルを、各９６ウエルプレートに、各遺伝子特異的ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブおよびプライマーセットのために含めた。Ｄｅｆａｕｌｔ  ＡＢＩ  ７９００ＨＴ  ｆａｓｔ  ｂｌｏｃｋ サイクル条件は、次の通りであった：９５℃で２０秒間、４０サイクルの９５℃で１秒間、そして６０℃で２０秒間。このようにしてアッセイした分類バイオマーカーを表９に列挙する。
【表９−１】
2008545437.tif 000017
【表９−２】
2008545437.tif 000018
【０１４９】
合格基準は、（１）目的の各プライマー対について、ＮＴＣサンプルにおいて増幅が検出できないこと、および（２）目的の各プライマー対について、ロイコパックＲＮＡ陽性の対照サンプルにおいて遺伝子特異的な増幅が検出できることであった。各増幅反応についてのサイクル閾値（Ｃｔ）を各分類バイオマーカーおよび４つの各ハウスキーピング遺伝子について記録した。正規化するために、各ＰＢＭＣサンプルにおけるターゲット遺伝子および４つの各ハウスキーピング遺伝子についてのサイクル閾値間の差（ΔＣｔ）を計算し、適切な場合には、ＵＣとＣＤの間の発現に関する平均変動倍率（average fold change）を次の式に従って計算した： 平均差倍率(average fold difference) ＝ ２(ΔCtUC-ΔCtCD)または２(ΔCtCD-ΔCtUC)。
【０１５０】
実施例１．８：Ｑ−ＰＣＲ発現値を用いる監視によるクラス予測
判別分析のパラメトリック（線形）、非パラメトリックｋ＝３最近接、および非パラメトリックｋ＝１０最近接クラス割付け法を、（上の実施例１．７において説明した）Ｑ−ＰＣＲから得られるような４つのハウスキーピング遺伝子の各々で正規化された分類バイオマーカー発現レベル（すなわち、サイクル閾値）のトレーニングセットおよび試験サブセットに各々分割される３つのデータセット（データセットＭＢ（上の実施例１．５で説明したもの）と、トレーニングセットおよび試験サブセットへの同データの２つの択一的無作為割付け（データセット１およびデータセット２））の各々に適用した。３つすべてのデータセットにおいて、クローン病（ＣＤ）を有する５７例の患者および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を有する２５例の患者からのＰＢＭＣからのＲＮＡ発現レベルを分析した（４３のＣＤサンプルに加えて１９のＵＣサンプルをトレーニングに使用し、１４のＣＤサンプルに加えて６のＵＣサンプルを試験に用いた）。同様に、ｐ＝０．０５またはｐ＝０．１５に設定した有意性レベルでの完全モデル、逆方向、順方向および段階的ロジスティック解析法を、ハウスキーピング遺伝子１８Ｓで正規化した分類バイオマーカー発現レベルの３つのデータセットに対して実行した。ＳＡＳ（登録商標）８．２（ノースカロライナ州、ケアリー）およびＳＰＯＴＥＦＩＲＥ（登録商標）ＤＥＣＩＳＩＯＮＳＩＴＥ（商標）８．０（マサチューセッツ州、サマヴィル）ソフトウェアを用いて、この分類のトレーニングセットおよび試験セットの精度、感度、特異性、陽性適中率（ＰＰＶ）および陰性適中率（ＮＰＶ）を計算し、比較した。最後に、ハウスキーピング遺伝子１８Ｓのサイクル閾値によって正規化した１２の分類バイオマーカーについてのΔＣｔの線形判別分析を用いて作製した分類子の精度を、トレーニングセットおよび試験サブセット（トレーニングサブセットについては４３のＣＤサンプルに加えて１９のＵＣサンプル、および試験サブセットについては１４のＣＤサンプルに加えて６のＵＣサンプルを各々含有）に無作為に割付けた１２のデータセットについて同じΔＣｔロジスティック解析を用いて作製した分類子の精度と比較した。
【実施例２】
【０１５１】
実施例２．１：健常な被験者、クローン病患者および潰瘍性大腸炎患者からの精製ＰＢＭＣサンプルの細胞組成
この試験の発現プロファイリング部分の前に、３つすべての群（健常な被験者、ＣＤを有する患者およびＵＣを有する患者）において、被験者からの精製ＰＢＭＣペレットの細胞組成を測定し、その後、ＲＮＡを単離した。表１０は、それらのＰＢＭＣサンプルにおける好塩基球、好酸球、リンパ球、単球および好酸球の割合を示すものである。
【表１０】
2008545437.tif 000019
【０１５２】
健常な被験者からのＰＢＭＣとＩＢＤ患者からのＰＢＭＣを比較すると、ＰＢＭＣサンプルの細胞組成には、有意な差があった（ｐ＜０．０５）。好塩基球およびリンパ球の総割合は、ＩＢＤを有する患者からのＰＢＭＣにおいて有意に低かったが、好酸球、単球および好中球の割合は、ＩＢＤ患者からのＰＢＭＣにおいて有意に上昇した。以前の研究は、進行癌患者の末梢血におけるそれらの活性化状態の変化と関係があると思われる沈降密度の変化の変化に起因する、同様の精製プロセスによる好中球の上昇について言及している（Schmielau and Finn (2001) Cancer Res. 61 :4756-60）。全血の細胞組成には群間での有意な差がない（データは示さない）ので、好酸球、単球および好中球における選択的上昇は、ＣＰＴに基づくＰＢＭＣ単離プロセスによって捕捉される疾患関連活性化事象であり得る。
【０１５３】
対照的に、好塩基球、好酸球および単球の比率は、ＣＤ ＰＭＢＣサンプルとＵＣ ＰＢＭＣサンプルの間で有意な差がなかった（ｐ＜０．０５）。これら２つのＩＢＤ群を比較すると、好中球のみが有意に異なった（１１％ 対 １５％、ｐ＝０．０３５）。
【０１５４】
実施例２．２：健常対照と比較した全ＩＢＤ患者からのＰＢＭＣにおける発現レベルの相違
細胞組成の相違と関係があるとは思われない疾患関連遺伝子を同定するために、ＰＢＭＣサンプル間の細胞組成の変動を考慮に入れて、共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）を用いて差次的な発現転写産物を同定した。標準的発現レベルフィルターに通した７９０８の転写産物に対してＡＮＣＯＶＡを実行し、好酸球、単球および好中球の割合を共変量として組み入れた。
【０１５５】
組み入れる細胞タイプの選択は、ＡＮＣＯＶＡにおける共変量が互いに高度に相関してはならないという事実に、一部、左右された。リンパ球パーセントは、単球パーセントおよび好中球パーセントと強く逆相関しており、この理由から、ＡＮＣＯＶＡに組み入れなかった。各細胞タイプについて、細胞タイプのパーセントと個々の遺伝子についての発現レベルの間に線形関係を描く傾きを予測し、ｔ検定を行って、その傾きが０とは有意に異なるかどうかを判定した（ここで、０の傾きは、細胞タイプパーセントと発現レベルの間に線形関係が無いことを示す）。最後に、女性および男性の相対的分布も疾患群間で有意な差があったため、性別をこのＡＮＣＯＶＡに組み入れて、疾患状態に関係しているのではなく性別特異的であると思われる転写産物を同定した。
【０１５６】
ＡＮＣＯＶＡ分析により、２２０の転写産物のレベルには、クローン病 ＰＢＭＣと健常 ＰＢＭＣの間に１．５倍より大きな差があり、ＡＮＣＯＶＡに基づく一対比較では０．０００１未満の未調整のｐ値を有し、ならびに上と同じ基準を用いて、１２０の転写産物のレベルは、ＵＣ ＰＢＭＣと健常 ＰＢＭＣの間に有意な差があった。これら配列のうちの４５は、ＵＣ ＰＢＭＣとＣＤ ＰＢＭＣの両方において差次的に発現し、これらの共通のＰＢＭＣおよびＩＢＤ関連転写産物は、健常レベルと比較して、両方の疾患において同じ方向に変化した（表１、上記）。
【０１５７】
追加のフィルターを残りの遺伝子セットに適用して、一方の疾患状態においてのみ差次的に発現すると思われるＰＭＢＣ転写産物を同定した。ＣＤに関連した２２０の転写産物（≧１．５倍の変化、ｐ＜０．０００１）のうち、合計６７の配列は、ＵＣ ＰＢＭＣ 対 健常の比較において有意に改変されず（ｐ＞０．０５）、従って、ＣＤ特異的であると思われる。その６７のＣＤ特異的ＰＢＭＣ配列、すなわち、ＣＤバイオマーカーは、上の表２に提示されている。ＵＣに関連した１２０の転写産物（≧１．５倍の変化、ｐ＜０．０００１）のうち、合計２２の配列は、ＣＤ ＰＢＭＣ 対 健常の比較において有意に改変されず（ｐ＞０．０５）、従って、ＵＣ特異的であると思われる。その２２のＵＣ特異的ＰＢＭＣ配列、すなわち、ＵＣバイオマーカーは、上の表３に提示されている。
【０１５８】
有意な過表示（overrepresentation）の最も高い尤度を有するカノニカル遺伝子経路を各々の比較のために図１Ａにまとめる。この分析において、プロスタグランジン代謝のカノニカルカテゴリーに関係する転写産物は、ＣＤ遺伝子サインにおいて有意に過表示されたが、アポトーシスおよびＢ細胞シグナリングのカノニカルカテゴリーに関係するタンパク質をコードしている転写産物は、ＵＣ遺伝子サインにおいて過表示されるように見えた。図１Ｂは、健常対照に比べてクローン病において差次的に発現した転写産物に包含される様々な機能カテゴリーをまとめたものである。ＣＤ ＰＢＭＣにおいてアップレギュレートされた主機能カテゴリーとしては、プロスタグランジン代謝に関与する酵素、転写調節因子および膜貫通型受容体（幾つかのインテグリンアイソフォームを含む）が挙げられる。最後に、図１Ｃは、ＵＣ ＰＢＭＣ遺伝子発現サインに特有である、免疫グロブリン定常領域の豊富な過表示をまとめたものである。
【０１５９】
実施例２．３：クローン病および潰瘍性大腸炎を判別する遺伝子サインの同定
本試験における主目的は、ＣＤおよびＵＣを有する患者のＰＢＭＣにおける遺伝子発現パターンが、ＰＢＭＣにおける遺伝子発現プロフィールのみに基づいて分類することができる程度まで異なるかどうかを判定することであったので、２つの疾患間での遺伝子発現サインの直接比較を行った。ＣＤ ＰＢＭＣプロフィール 対 ＵＣ ＰＢＭＣプロフィールのＡＮＣＯＶＡ比較により、ＣＤ患者のＰＢＭＣとＵＣ患者のＰＢＭＣの間に有意な差があるレベルで存在する４９の転写産物を同定した（≧１．５倍の差、ｐ＜０．０００１）。これらのＣＤｖＵＣバイオマーカーは、上の表４に列挙されている。
【０１６０】
ＣＤ ＰＢＭＣ遺伝子サインとＵＣ ＰＢＭＣ遺伝子サインの直接比較で有意差を示したＡＮＣＯＶＡ結果に基づいて、監視によるクラス予測アプローチを用いて、疾患特異的分類が可能な情報提示配列（informative sequence）の小セットを同定した。ＩＢＤ患者からのＰＢＭＣサンプルを、４４のＣＤプロフィールおよび２０のＵＣプロフィールから成るトレーニングセットと１５のＣＤプロフィールおよび６のＵＣプロフィールから成る試験セットに無作為に割付けた。遺伝子分類子のパネルの増加サイズについての相対的総合精度、ＣＤ分類の精度およびＵＣ分類の精度を判定した（図２Ａ）。図２Ａに示されているように、２つの遺伝子分類子（すなわち、リポカリン２およびＩｇＨｇ３）から成るパネルは、４分割交差検定によって評価したところ、６４％の精度を示した（図２Ａ）。トレーニングセットの４分割交差検定によって評価した（図２Ａ）ところ、ＵＣ ＰＢＭＣプロフィールとＣＤ ＰＢＭＣプロフィールとを識別する最高総合精度（９１％）を有する最小予測モデルは、１４配列（１２遺伝子）の分類子であった（表５、上記）。この１４配列分類子は、１個抜き交差検定によって評価したところ、９４％の総合精度を有した（データは示さない）。表５における遺伝子分類子は、信号対雑音比の高い順に列挙されている。すなわち、クローン病を有する患者においてアップレギュレートされる、表５に列挙されている分類バイオマーカーのうち、リポカリン２（分類子遺伝子番号１）が最も高い信号対雑音比を有し、インテグリンβ−３（分類子遺伝子番号７）が最も低い信号対雑音比を有し、ならびに潰瘍性大腸炎を有する患者においてアップレギュレートされる、表５に列挙されている分類バイオマーカーのうち、ＩｇＨｇ１（分類子遺伝子番号８）が最も高い信号対雑音比を有し、ＩｇＫｃ（分類子遺伝子番号１４）が最も低い信号対雑音比を有した。分類子セットのサイズが増大しても、このレベルより上まで精度は上昇しなかった（図２Ａ）。この１２遺伝子分類子を用いて、試験セットに使わないクラスメンバーシップを１４のＣＤプロフィールおよび６のＵＣプロフィールに割付けた（図２Ｂ）。この予測モデルを用いて、試験セットにおけるすべてのサンプルを臨床診断用として適正に分類した。この分類子を用いると、各群において０．２未満の信頼度スコアは1例のみであり、これは、これらのコールが、比較的高い信頼度で、重み付き多数決法アルゴリズムによってなされたことを示している。これらの結果は、ＰＢＭＣ発現プロフィールの利用をＣＤおよびＵＣの分子診断を助けるために適用できる可能性を明示している。
【０１６１】
実施例２．４：マイクロアレイ観察の定量リアルタイム逆トランスクリプターゼポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）確認
マイクロアレイ分析から得た発現レベルのデータセットにおける最近接に基づくクラス割付けについての分類子セットの精度にもかかわらず、ＣＤ／ＵＣ分類子における転写産物の平均変動倍率は、比較的低かった。そのため、この試験では、定量リアルタイムＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を行って、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ マイクロアレイ法によりＣＤサンプルおよびＵＣサンプルについて観察された相対的発現を確認した。ターゲット遺伝子の正規化には４つの別のハウスキーピング遺伝子を用いた：β２−ミクログロブリン（β２Ｍ）、β−アクチン、ＧＡＰＤＨおよび１８ＳリボソームＲＮＡ（１８Ｓ）。この試験では、ＣＤおよびＵＣの全てのＲＮＡサンプルを、同じ逆転写カクテルおよび手順を用いてｃＤＮＡに変換した。マイクロアレイによって計算した平均変動倍率とβ２−ミクログロブリンを用いるリアルタイムＰＣＲとの比較を図３に提示する。正規化群として４つのハウスキーピング遺伝子の各々を用いた１２の分類遺伝子すべてについての相対的変動倍率は、極めて一致していた（表１１）。
【表１１】
2008545437.tif 000020
【０１６２】
当初はＣＤ／ＵＣ判別器遺伝子（すなわち、分類バイオマーカー）として同定された１２の転写産物についてのこれらの結果に基づき、２８Ｓ ｒＲＮＡフラグメントのみがマイクロアレイハイブリダイゼーションによって大幅に過大予測されたようであった。
【０１６３】
実施例２．５：Ｑ−ＰＣＲによって得られた発現値を用いる正確なクラス予測
４つのハウスキーピング遺伝子（β２Ｍ、β−アクチン、ＧＡＰＤＨおよび１８Ｓ）の各々で正規化した１２の分類バイオマーカー（表５および８に列挙したもの）についてのΔＣｔの線形判別分析（ＬＤＡ）を、トレーニングセットにおけるＣＤを有する患者から単離された４３のＰＢＭＣ ＲＮＡサンプルおよびＵＣを有する患者から単離された１９のＰＢＭＣ ＲＮＡサンプル、ならびに試験セットにおけるＣＤを有する患者から単離された１４のＰＢＭＣ ＲＮＡサンプルおよびＵＣを有する患者から単離された６のＰＢＭＣ ＲＮＡサンプルから成る３つのデータセット（データセットＭＢ、データセット１、データセット２）についての同じΔＣｔのｋ−ＮＮ判別分析と比較した。
【０１６４】
４つのハウスキーピング（β２−ミクログロブリン（β２Ｍ）、β−アクチン、ＧＡＰＤＨ、および１８ＳリボソームＲＮＡ（１８Ｓ））遺伝子の各々に正規化した分類バイオマーカーの発現レベルの３つのデータセット（データセットＭＢ、データセット１、データセット２）についてのパラメトリック（線形）、非パラメトリックｋ＝３最近接、または非パラメトリックｋ＝１０最近接判別分析法の分類性能に関する精度、感度、特異性、ＰＰＶおよびＮＰＶ測度を表１３に示す。
【表１２−１】
2008545437.tif 000021
【表１２−２】
2008545437.tif 000022
【０１６５】
この判別分類は、用いた方法にかかわらず、データセットＭＢに対して最も有効であった。これは、各方法の性能が、分析した各データセットに関連していることを示唆している（図１３）。パラメトリック法とｋ＝１０の非パラメトリック最近接法の両方は同様に有効であった、平均して、両方ともｋ＝３の非パラメーター最近接法より有効であった（表１３）。
【０１６６】
１８Ｓで正規化した分類バイオマーカーは、上記３つのデータセット間で性能の系統的な差を示した。１８Ｓは、他のハウスキーピング遺伝子よりある程度、機能が優れており；１８Ｓで正規化した分類バイオマーカーの分析は、精度、感度および特異性に関して、より高い値およびより小さいばらつきを一貫して有した（表１３）。
【０１６７】
１８Ｓは、試験した他のハウスキーピング遺伝子より機能が優れているように見えたので、その後、１８Ｓのみで正規化した分類バイオマーカーの発現レベルのロジスティック解析を行った。完全モデルロジスティック解析法、逆方向ロジスティック解析法、順方向ロジスティック解析法およびロジスティック解析の段階的選択法の中からの選択は、分類にほとんど影響を与えなかった（データは示さない）。データセットＭＢおよびデータセット１に関して、完全モデル方法は、他の縮小モデルと同じまたはそれ以上に有効であった（データは示さない）。データセット２の場合、ｐ＝０．０５に設定した有意性レベルで順方向方法または段階的方法によって選択した、１８Ｓで正規化した２つまたは３つの分類バイオマーカーを有するモデル（両方とも、ＭＬＨ３およびＩｇＫＣを含む）は、より良好なクラス予測を有した（データは示さない）。この所見は、非典型的発現レベルを有するバイオマーカーの大部分が、データセット２の試験セットに組み入れられており、一方、順方向または段階的選択からのモデルは、これらの異常発現バイオマーカーを含有しなかったという事実に起因していた。バイオマーカーの組み入れのこのばらつきは、完全モデルが最良に機能するロジスティック法でなかった理由、および１２すべての限定子が組み入れられているモデルでの判別分析の結果として不良な分類が生じた理由の説明にもなり得る。ロジスティック解析のための異なる選択方法のこの精度、感度および特異性は、異なるロジスティック選択法が同様に機能したことを示している（データは示さない）。例えば、ある方法が、あるデータセットの試験セットよりトレーニングセットに関して良好な分類を示す場合、または逆の場合も同様に、他の３つすべての方法での結果が同じ特性を示した。
【０１６８】
次に、完全モデルを用いたロジスティック解析による分類を、パラメトリック法を用いた線形判別分析による分類と比較した。２つの方法の間でのデータセットの変動が観察されたが、両方の分析によりクラス予測が適切に行われた。データセットＭＢ、データセット１およびデータセット２を用いたクラス分類は、０．８３３と０．９１７の間の精度、０．７８６と１．０００の間の感度、および０．６６７と１．０００の間の特異性という結果になった（表１４）。しかし、２０のデータセットを比較したとき、２つの方法の間に差が出た（図４）。完全モデルでのロジスティック解析は、交差検定でより有効であったが、判別分析は、試験セット分類でのほうが良好でなかった。
【表１３】
2008545437.tif 000023
【実施例３】
【０１６９】
（考察）
この研究の焦点は、（１）ＣＤおよびＵＣに関連したＰＢＭＣにおける遺伝子発現パターンの共通性と特異性の両方を判定する、ならびに（２）疾患特異的発現サインが疾患の分子診断に寄与し得るかどうかを判定するという試みであった。健常な被験者についてのプロフィールと比較して、ＣＤ患者とＵＣ患者の両方についてのプロフィールにおいて、数十の遺伝子が、差次的に発現するようである。これらの遺伝子の多くは、転写調節因子などの核タンパク質をコードし、大部分が、ダウンレギュレートされる。例としては、ＮＦＫＢ２、ＲＮＡ結合因子ＣＵＧＢＰ１およびＣＵＧＢＰ２、ＣＯＰＥＢ、およびＥＬＫ３が挙げられる。ＵＣおよびＣＤに共通の非調節炎症プロセス（disregulated inflammatory process）は、これらの転写調節因子の活性の調節の結果である場合がある。
【０１７０】
両方の炎症性腸疾患において共通して上昇した最高発現遺伝子は、プロテアーゼ阻害剤ＳＥＲＰＩＮＢ２（ＰＡＩ、プラスミノゲンアクチベーター阻害剤、タイプＩＩとも呼ばれる）であった。プラスミノゲンアクチベーターレベルの増加は、ＩＢＤ患者の粘膜病変において報告されており（de Bruin et al. (1988) Thromb. Haemost. 60:262-66）、ＩＢＤ患者の血漿においてＰＡＩ−１増加が見られた。ＰＡＩ−１とは異なるが、ＰＡＩ−２は、ｕ−ＰＡおよび、より低い程度ではあるが、ｔ−ＴＡの両方に対する酵素特異性を共有し、慢性関節リウマチの滑液においてＰＡＩ−２レベル上昇が報告されている（Kruithof et al. (1995) Blood 86:4007-24）。これらの所見は、フィブリン溶解性系および凝固系（単数および複数）の成分の変化が、血栓塞栓性合併症のリスク増加ならびに可能性としてＩＢＤ患者において見られる大腸炎および出血の一因となり得ることを示唆している（de Jong et al. (1989) Gut 30: 188-94）。ＩＢＤにおけるＰＡＩ−２の役割は報告されていないが、本研究から、ＰＢＭＣ中のＰＡＩ−２ ＲＮＡレベルの上昇が疾患に関連していることが示唆される。
【０１７１】
プロスタグランジン代謝酵素、ケモカインおよび転写レギュレーターをはじめとする転写産物の多数の機能クラスが、ＣＤ患者のＰＢＭＣでは、特異的にアップレギュレートされるようである。ＣＤ特異的ＰＢＭＣ遺伝子プロフィールは、前炎症性遺伝子発現プロフィールを示し、これは、ＵＣ特異的ＰＢＭＣ遺伝子プロフィールでは顕性でなかった。プロスタグランジンおよびロイコトリエン代謝に関与する遺伝子（例えば、アラキドン酸１２−リポキシゲナーゼ（ＡＬＯＸ１２）およびプロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ１（ＰＴＧＳ１、シクロオキシゲナーゼ１））は、ＣＤ患者からのＰＢＭＣにおいて有意に増加したが、プロスタグランジンＤ２シンターゼ（ＰＴＧＤＳ）は減少した。プロスタグランジン合成経路に対するこれらの作用は、アラキドン酸の選択プロスタグランジンへの変換を増加させると予想される。プロスタグランジン含有率は、ＩＢＤ患者の病変において高い（Schmidt et al. (1996) Hepatogastroenterology 43:1508-12）が、極最近の証拠では、少なくとも１つのプロスタグランジン（ＰＧＥ2）のレベルが、ＣＤ患者の単核細胞において実際には減少することを示唆している（Trebble et al. (2004) Clin. Nutr. 23:647-55）。ＣＤ患者のＰＢＭＣにおけるアラキドン酸代謝酵素をコードしている転写産物の相対的上昇が、この観察に機能的に関連しているかどうかは不明であるが、ＰＧＥ2は、胃腸管から採取したＴリンパ球からのサイトカインの放出の重要なモジュレーターとして文献に記載されている（Barrera et al. (1996) J. Cell. Physiol 166:130-37）。クローン病患者の循環ＰＢＭＣにおけるＰＧ代謝経路のアップレギュレーションは、この疾患において腸の粘膜固有層に入る細胞／腸の粘膜固有層から出る細胞の変化を示すことがある。
【０１７２】
幾つかのケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃリガンド４および７、血小板因子４変異体１）が、ＣＤではアップレギュレートされた。全体的に見て、本ＣＤ ＰＢＭＣセットにおいてアップレギュレートされると同定された転写産物と、Ｍａｎｎｉｃｋおよび共同研究者によって分析された７例のＣＤ患者においてアップレギュレートされたと報告されたもの（Mannick et al., 上記）との間には、驚くべきことに、ほとんど重なりが無い。これが、ここで調査した患者数がより多いことに起因するのか、質問遺伝子数がより多いことに起因するのか、遺伝子命名法の違いに起因するのか、またはこれらの研究の間における他の何らかの混乱要因に起因するのかは、不明である。しかし、Ｍａｎｎｉｃｋおよび共同研究者によって報告された、ＣＤにおいて最も強くアップレギュレートされた転写産物は、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β−誘導性転写産物（Mannick et al., 上記）をコードしていた。ここでは、ＴＳＣ−２２、別のＴＧＦ−β−誘導性転写産物も、ＣＤ ＰＢＭＣにおいてアップレギュレートされることが確認された。これらの観察は、ＴＧＦ−βシグナル伝達のアップレギュレーションが、ＣＤ ＰＢＭＣにおいて顕性であると思われることを示している。この経路における構成的上昇は、Ｓｍａｄ依存性経路のダウンレギュレーションを生じさせ、それが、その後、免疫応答を停止させるＴＧＦ−βの能力を阻害し、その結果としてＣＤの病原において原因的役割を果すことがある（Mannick et al., 上記）。
【０１７３】
クローン病関連疾患サイン遺伝子プロフィールの一部は、血小板由来である可能性がある。最近では証拠として、血小板が慢性腸炎に関与し得ることを証明しており（Danese et al. (2004) Am. J. Gastroenterol. 99:938-45）、血小板は、本研究においてＣＤ患者から単離されたＰＢＭＣとともにより高い程度まで共精製された（データは示さない）。従って、ＣＤ関連遺伝子サインにおける血小板因子４および血小板因子４変異体１の検出は、単離されたＰＢＭＣ中の共精製血小板のレベル上昇に起因し得る。しかし、血小板に関して報告された上位１０の非ミトコンドリア性転写産物（Gnatenko et al. (2003) Blood 101:2285-93）のうちの他の転写産物は、転写産物の本ＣＤ関連リストには現れず、これは、これらの無核細胞のレベルが、これらの転写産物の唯一の原因ではないことを示唆している。以前に血小板と関連付けられたＣＤ疾患サインにおける転写産物のすべてが、精製Ｔ細胞、Ｂ細胞および／または単球においても有意なレベルで発現する（データは示さない）。これは、血小板と以前に関連付けられた転写産物が、本研究で単離およびプロファイルした単核細胞から生じ得ることを示唆している。
【０１７４】
ＵＣ特異的遺伝子セットは、ＵＣ患者において観察される活性ＩｇＧ血漿細胞成分を思い出させる、免疫グロブリンコーディング配列の過発現によって特徴付けられた（Farrell et al. (2002) Lancet 359:331-40）。この所見は、ＵＣ粘膜における浸潤性リンパ球が粘膜起源ではなく末梢起源であることを証明したＢ細胞受容体遺伝子利用に関する研究（Dunn-Walters et al. (1999) Gut 44:382-86； Thoree et al. (2002) Gut 51 :44-50）と一致する。ＩｇＧ１抗体およびＩｇＧ４抗体はＵＣにおいて優勢であり、これに対してＩｇＧ２抗体は、ＣＤにおいて増加する（Kett and Brandtzaeg (1987) Gut 28:1013- 21）。ＩｇＧ１タイプの罹患率が、最近、調査され、ＵＣに特異的であること、ならびにＵＣにおいて粘膜菌のより大きなオプソニン作用および多形核白血球呼吸バーストのフィードフォワード維持を招くことが証明された（Furrie et al. (2004) Gut 53:91-98）。この研究においてＵＣ ＰＢＭＣ中で最も有意に上昇した転写産物の１つは、免疫グロブリン重鎖定常領域γ３（ＩｇＨＧ３）との注釈が付いている。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップ上のこのＩｇＨＧ３限定子に包含される領域は、免疫グロブリン重鎖定常領域γ１（Ｇ１ｍマーカー）に割当てられた幾つかの配列に実際に位置し（すなわち、ＢＬＡＳＴにより、１００％ヌクレオチド同一性を共有している）、ならびに炎症性ＵＣ胃腸上皮のマーカーとして同定されている（Warner and Dieckgraefe, 上記； Lawrance et al., 上記）。個々の患者の末梢血プロフィールにおけるＩｇＨＧ３転写産物の発現レベルの分析は、それらのレベルがＵＣとＣＤとの区別的なバイオマーカーとしての機能を果すことができることを明らかにした（データは示さない）。しかし、これらの結果は、ＵＣ患者における血清中のＩｇＧ１レベルが、ＣＤ患者におけるＩｇＧ１の血清中レベルに比べて有意に増加するという以前の観察（Gouni-Berthold et al. (1999) Hepatogastroenterology 46:1720-23）とも一致する。
【０１７５】
炎症性腸疾患を有する患者の有意なサブセットは、現行の手順によって分類することができず、「非定型的ＩＢＤ」の症例の構成要素となる（Winther et al. (1998) Drugs Today (Barc). 34:935-42； Bentley et al. (2002) J. Clin. Pathol 55:955-60； Guindi and Riddell (2004) J. Clin. Pathol. 57:1233-44）。従って、本研究の主目的の１つは、ＵＣおよびＣＤを有する患者のＰＢＭＣプロフィールが、これらの疾患の分類を可能にする程度まで異なるかどうかを判定することであった。クラス予測分析の結果は、ＰＢＭＣにおける遺伝子サインがＵＣサンプルおよびＣＤサンプルを正確に識別できることを示している。患者からのＰＢＭＣの細胞組成は、まったく同様と思われるので、転写の差は、細胞組成に起因するものではない。
【０１７６】
より大きな集団において予測的に確認が行われる可能性は高いが、本発明によって同定された疾患特異的パターンは、ＵＣおよびＣＤの分子診断の基礎を提供することができ、ならびに非定型的ＩＢＤの罹患と分類された患者の診断に寄与し得る。ＣＤおよびＵＣそれぞれの提案されたＴｈ１特性およびＴｈ２特性が、本研究における相違の主な原因である、および他のＴｈ１およびＴｈ２に基づく炎症性疾患が、ＣＤおよびＵＣについて同定されたものと同様のサインを有することがあるという可能性は相当にある。それにもかかわらず、本明細書において同定したＰＢＭＣプロフィールは、ＩＢＤにおいて臨床的有用性を有すると思われる。なぜならば、多くの場合、識別困難であり、場合によっては識別不能であるこれらの密接に関連した疾患間の判別が、本遺伝子分類子によって可能になるためである。
【０１７７】
本研究は、循環単球、Ｔ細胞およびＢ細胞における転写プロフィールが、ＩＢＤの状況下で生物の生理状態の高感度モニターの役割を果し得ることを示す。これらの細胞が、様々な組織を横断するとき、その微小環境に対する細胞反応の１つの要素は転写応答であり、そのような応答は、プロファイリングによって定量することができる。発現パターンは、疾患の病態生理に対する一次応答または二次応答の疾患メカニズムを反映し得る。ＰＢＭＣは、体中に輸送されるため、例えばＩＢＤによる影響を受ける組織および系にもかかわらず簡単に調査できない組織および系の利用しやすい代理モニターとしての役割を果すことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１−１】ＣＤ関連、ＵＣ関連として同定された、およびＵＣとＣＤとで差次的に発現した、転写産物の機能的な注釈およびカテゴリーを示す図である。Ａ）ＣＤ 対 正常のＡＮＣＯＶＡ比較（灰色棒）、ＵＣ 対 正常のＡＮＣＯＶＡ比較（黒棒）およびＵＣ 対 ＣＤのＡＮＣＯＶＡ比較（白棒）において過発現したカノニカル経路（ｘ軸）を示す。これらのパネルでは、より有意な関連を強調するためにｐ値の負対数（ｙ軸）をプロットする。問い合せた経路（ｘ軸）は、次のとおりである：（１）アミロイドプロセッシング、（２）アポトーシスシグナリング、（３）アルギニンおよびプロリン代謝、（４）Ｂ細胞受容体シグナリング（非免疫グロブリン）、（５）心臓β−アドレナリン作動性シグナリング、（６）ケモカインシグナリング、（７）死滅受容体シグナリング、（８）ＥＲＫ／ＭＡＰＫシグナリング、（９）脂肪酸代謝、（１０）細胞周期調節（Ｇ１／Ｓ）、（１１）細胞周期調節（Ｇ２／Ｍ）、（１２）Ｇタンパク質結合受容体シグナリング、（１３）グルタメート代謝、（１４）ヒスチジン代謝、（１５）ＩＧＦ−１シグナリング、（１６）ＩＬ−２シグナリング、（１７）ＩＬ−４シグナリング、（１８）イノシトールリン酸代謝、（１９）インスリン受容体シグナリング、（２０）インテグリンシグナリング、（２１）インターフェロンシグナリング、（２２）ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナリング、（２３）ＮＦ−κＢシグナリング、（２４）窒素代謝、（２５）ｐ３８ ＭＡＰＫシグナリング、（２６）ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナリング、（２７）ＰＰＡＲシグナリング、（２８）プロスタグランジンおよびロイコトリエン代謝、（２９）プリン代謝、（３０）ピリミジン代謝、（３１）デンプンおよびスクロース代謝、（３２）Ｔ細胞受容体シグナリング、（３３）トリプトファン代謝、（３４）チロシン代謝、ならびに（３５）ＶＥＧＦシグナリング。Ｂ）Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ 経路分析システム（カリフォルニア州、マウンテンビューのＩｎｇｅｎｕｉｔｙ）を用いて、ＰＢＭＣにおけるＣＤ特異的転写産物の機能的な注釈を加えたものである。ＣＤ関連遺伝子についての選択した機能カテゴリーの各々における、転写産物の相対的な配分を円グラフで提示する。Ｃ）ＰＢＭＣにおけるＵＣ特異的転写産物の機能的な注釈を加えたものであり、免疫グロブリンカテゴリー 対 非免疫グロブリンカテゴリーの中の転写産物の相対的分布を提示する。
【図１−２】ＣＤ関連、ＵＣ関連として同定された、およびＵＣとＣＤとで差次的に発現した、転写産物の機能的な注釈およびカテゴリーを示す図である。Ａ）ＣＤ 対 正常のＡＮＣＯＶＡ比較（灰色棒）、ＵＣ 対 正常のＡＮＣＯＶＡ比較（黒棒）およびＵＣ 対 ＣＤのＡＮＣＯＶＡ比較（白棒）において過発現したカノニカル経路（ｘ軸）を示す。これらのパネルでは、より有意な関連を強調するためにｐ値の負対数（ｙ軸）をプロットする。問い合せた経路（ｘ軸）は、次のとおりである：（１）アミロイドプロセッシング、（２）アポトーシスシグナリング、（３）アルギニンおよびプロリン代謝、（４）Ｂ細胞受容体シグナリング（非免疫グロブリン）、（５）心臓β−アドレナリン作動性シグナリング、（６）ケモカインシグナリング、（７）死滅受容体シグナリング、（８）ＥＲＫ／ＭＡＰＫシグナリング、（９）脂肪酸代謝、（１０）細胞周期調節（Ｇ１／Ｓ）、（１１）細胞周期調節（Ｇ２／Ｍ）、（１２）Ｇタンパク質結合受容体シグナリング、（１３）グルタメート代謝、（１４）ヒスチジン代謝、（１５）ＩＧＦ−１シグナリング、（１６）ＩＬ−２シグナリング、（１７）ＩＬ−４シグナリング、（１８）イノシトールリン酸代謝、（１９）インスリン受容体シグナリング、（２０）インテグリンシグナリング、（２１）インターフェロンシグナリング、（２２）ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナリング、（２３）ＮＦ−κＢシグナリング、（２４）窒素代謝、（２５）ｐ３８ ＭＡＰＫシグナリング、（２６）ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナリング、（２７）ＰＰＡＲシグナリング、（２８）プロスタグランジンおよびロイコトリエン代謝、（２９）プリン代謝、（３０）ピリミジン代謝、（３１）デンプンおよびスクロース代謝、（３２）Ｔ細胞受容体シグナリング、（３３）トリプトファン代謝、（３４）チロシン代謝、ならびに（３５）ＶＥＧＦシグナリング。Ｂ）Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ 経路分析システム（カリフォルニア州、マウンテンビューのＩｎｇｅｎｕｉｔｙ）を用いて、ＰＢＭＣにおけるＣＤ特異的転写産物の機能的な注釈を加えたものである。ＣＤ関連遺伝子についての選択した機能カテゴリーの各々における、転写産物の相対的な配分を円グラフで提示する。Ｃ）ＰＢＭＣにおけるＵＣ特異的転写産物の機能的な注釈を加えたものであり、免疫グロブリンカテゴリー 対 非免疫グロブリンカテゴリーの中の転写産物の相対的分布を提示する。
【図１−３】ＣＤ関連、ＵＣ関連として同定された、およびＵＣとＣＤとで差次的に発現した、転写産物の機能的な注釈およびカテゴリーを示す図である。Ａ）ＣＤ 対 正常のＡＮＣＯＶＡ比較（灰色棒）、ＵＣ 対 正常のＡＮＣＯＶＡ比較（黒棒）およびＵＣ 対 ＣＤのＡＮＣＯＶＡ比較（白棒）において過発現したカノニカル経路（ｘ軸）を示す。これらのパネルでは、より有意な関連を強調するためにｐ値の負対数（ｙ軸）をプロットする。問い合せた経路（ｘ軸）は、次のとおりである：（１）アミロイドプロセッシング、（２）アポトーシスシグナリング、（３）アルギニンおよびプロリン代謝、（４）Ｂ細胞受容体シグナリング（非免疫グロブリン）、（５）心臓β−アドレナリン作動性シグナリング、（６）ケモカインシグナリング、（７）死滅受容体シグナリング、（８）ＥＲＫ／ＭＡＰＫシグナリング、（９）脂肪酸代謝、（１０）細胞周期調節（Ｇ１／Ｓ）、（１１）細胞周期調節（Ｇ２／Ｍ）、（１２）Ｇタンパク質結合受容体シグナリング、（１３）グルタメート代謝、（１４）ヒスチジン代謝、（１５）ＩＧＦ−１シグナリング、（１６）ＩＬ−２シグナリング、（１７）ＩＬ−４シグナリング、（１８）イノシトールリン酸代謝、（１９）インスリン受容体シグナリング、（２０）インテグリンシグナリング、（２１）インターフェロンシグナリング、（２２）ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナリング、（２３）ＮＦ−κＢシグナリング、（２４）窒素代謝、（２５）ｐ３８ ＭＡＰＫシグナリング、（２６）ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナリング、（２７）ＰＰＡＲシグナリング、（２８）プロスタグランジンおよびロイコトリエン代謝、（２９）プリン代謝、（３０）ピリミジン代謝、（３１）デンプンおよびスクロース代謝、（３２）Ｔ細胞受容体シグナリング、（３３）トリプトファン代謝、（３４）チロシン代謝、ならびに（３５）ＶＥＧＦシグナリング。Ｂ）Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ 経路分析システム（カリフォルニア州、マウンテンビューのＩｎｇｅｎｕｉｔｙ）を用いて、ＰＢＭＣにおけるＣＤ特異的転写産物の機能的な注釈を加えたものである。ＣＤ関連遺伝子についての選択した機能カテゴリーの各々における、転写産物の相対的な配分を円グラフで提示する。Ｃ）ＰＢＭＣにおけるＵＣ特異的転写産物の機能的な注釈を加えたものであり、免疫グロブリンカテゴリー 対 非免疫グロブリンカテゴリーの中の転写産物の相対的分布を提示する。
【図１−４】ＣＤ関連、ＵＣ関連として同定された、およびＵＣとＣＤとで差次的に発現した、転写産物の機能的な注釈およびカテゴリーを示す図である。Ａ）ＣＤ 対 正常のＡＮＣＯＶＡ比較（灰色棒）、ＵＣ 対 正常のＡＮＣＯＶＡ比較（黒棒）およびＵＣ 対 ＣＤのＡＮＣＯＶＡ比較（白棒）において過発現したカノニカル経路（ｘ軸）を示す。これらのパネルでは、より有意な関連を強調するためにｐ値の負対数（ｙ軸）をプロットする。問い合せた経路（ｘ軸）は、次のとおりである：（１）アミロイドプロセッシング、（２）アポトーシスシグナリング、（３）アルギニンおよびプロリン代謝、（４）Ｂ細胞受容体シグナリング（非免疫グロブリン）、（５）心臓β−アドレナリン作動性シグナリング、（６）ケモカインシグナリング、（７）死滅受容体シグナリング、（８）ＥＲＫ／ＭＡＰＫシグナリング、（９）脂肪酸代謝、（１０）細胞周期調節（Ｇ１／Ｓ）、（１１）細胞周期調節（Ｇ２／Ｍ）、（１２）Ｇタンパク質結合受容体シグナリング、（１３）グルタメート代謝、（１４）ヒスチジン代謝、（１５）ＩＧＦ−１シグナリング、（１６）ＩＬ−２シグナリング、（１７）ＩＬ−４シグナリング、（１８）イノシトールリン酸代謝、（１９）インスリン受容体シグナリング、（２０）インテグリンシグナリング、（２１）インターフェロンシグナリング、（２２）ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナリング、（２３）ＮＦ−κＢシグナリング、（２４）窒素代謝、（２５）ｐ３８ ＭＡＰＫシグナリング、（２６）ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナリング、（２７）ＰＰＡＲシグナリング、（２８）プロスタグランジンおよびロイコトリエン代謝、（２９）プリン代謝、（３０）ピリミジン代謝、（３１）デンプンおよびスクロース代謝、（３２）Ｔ細胞受容体シグナリング、（３３）トリプトファン代謝、（３４）チロシン代謝、ならびに（３５）ＶＥＧＦシグナリング。Ｂ）Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ 経路分析システム（カリフォルニア州、マウンテンビューのＩｎｇｅｎｕｉｔｙ）を用いて、ＰＢＭＣにおけるＣＤ特異的転写産物の機能的な注釈を加えたものである。ＣＤ関連遺伝子についての選択した機能カテゴリーの各々における、転写産物の相対的な配分を円グラフで提示する。Ｃ）ＰＢＭＣにおけるＵＣ特異的転写産物の機能的な注釈を加えたものであり、免疫グロブリンカテゴリー 対 非免疫グロブリンカテゴリーの中の転写産物の相対的分布を提示する。
【図１−５】ＣＤ関連、ＵＣ関連として同定された、およびＵＣとＣＤとで差次的に発現した、転写産物の機能的な注釈およびカテゴリーを示す図である。Ａ）ＣＤ 対 正常のＡＮＣＯＶＡ比較（灰色棒）、ＵＣ 対 正常のＡＮＣＯＶＡ比較（黒棒）およびＵＣ 対 ＣＤのＡＮＣＯＶＡ比較（白棒）において過発現したカノニカル経路（ｘ軸）を示す。これらのパネルでは、より有意な関連を強調するためにｐ値の負対数（ｙ軸）をプロットする。問い合せた経路（ｘ軸）は、次のとおりである：（１）アミロイドプロセッシング、（２）アポトーシスシグナリング、（３）アルギニンおよびプロリン代謝、（４）Ｂ細胞受容体シグナリング（非免疫グロブリン）、（５）心臓β−アドレナリン作動性シグナリング、（６）ケモカインシグナリング、（７）死滅受容体シグナリング、（８）ＥＲＫ／ＭＡＰＫシグナリング、（９）脂肪酸代謝、（１０）細胞周期調節（Ｇ１／Ｓ）、（１１）細胞周期調節（Ｇ２／Ｍ）、（１２）Ｇタンパク質結合受容体シグナリング、（１３）グルタメート代謝、（１４）ヒスチジン代謝、（１５）ＩＧＦ−１シグナリング、（１６）ＩＬ−２シグナリング、（１７）ＩＬ−４シグナリング、（１８）イノシトールリン酸代謝、（１９）インスリン受容体シグナリング、（２０）インテグリンシグナリング、（２１）インターフェロンシグナリング、（２２）ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナリング、（２３）ＮＦ−κＢシグナリング、（２４）窒素代謝、（２５）ｐ３８ ＭＡＰＫシグナリング、（２６）ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナリング、（２７）ＰＰＡＲシグナリング、（２８）プロスタグランジンおよびロイコトリエン代謝、（２９）プリン代謝、（３０）ピリミジン代謝、（３１）デンプンおよびスクロース代謝、（３２）Ｔ細胞受容体シグナリング、（３３）トリプトファン代謝、（３４）チロシン代謝、ならびに（３５）ＶＥＧＦシグナリング。Ｂ）Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ 経路分析システム（カリフォルニア州、マウンテンビューのＩｎｇｅｎｕｉｔｙ）を用いて、ＰＢＭＣにおけるＣＤ特異的転写産物の機能的な注釈を加えたものである。ＣＤ関連遺伝子についての選択した機能カテゴリーの各々における、転写産物の相対的な配分を円グラフで提示する。Ｃ）ＰＢＭＣにおけるＵＣ特異的転写産物の機能的な注釈を加えたものであり、免疫グロブリンカテゴリー 対 非免疫グロブリンカテゴリーの中の転写産物の相対的分布を提示する。
【図２−１】ＰＢＭＣプロフィールを用いるＣＤおよびＵＣの監視によるクラス予測を示す図である。Ａ）２〜２０個の遺伝子分類子（ｘ軸）から成るパネルについての相対的総合精度（黒四角；ｙ軸）、ＣＤ分類の精度（−横棒−；ｙ軸）、およびＵＣ分類の精度（黒三角；ｙ軸）を示す。Ｂ）サンプルの試験セットにおける重み付き多数決法クラス割付け結果を示す。ＣＤのために信頼度スコアを正の値として提示し、ＵＣのためのクラス割付けの信頼度スコアは、負の値で提示する。マイクロアレイ分析によって得られたＰＢＭＣにおける発現パターンのみに基づき、クラス割付け総合精度は、試験セットでは１００％であり、ここで、１４例のクローン病患者のうち１４例が、クローン病として正確に分類され、６例のＵＣ患者のうち６例が、ＵＣとして正確に分類された。ＰＢＭＣプロフィールの実際の起源を示す（ＣＤ患者 ＝ 最初の１４本の白棒；ＵＣ患者 ＝ 最後の６本の黒棒）。
【図２−２】ＰＢＭＣプロフィールを用いるＣＤおよびＵＣの監視によるクラス予測を示す図である。Ａ）２〜２０個の遺伝子分類子（ｘ軸）から成るパネルについての相対的総合精度（黒四角；ｙ軸）、ＣＤ分類の精度（−横棒−；ｙ軸）、およびＵＣ分類の精度（黒三角；ｙ軸）を示す。Ｂ）サンプルの試験セットにおける重み付き多数決法クラス割付け結果を示す。ＣＤのために信頼度スコアを正の値として提示し、ＵＣのためのクラス割付けの信頼度スコアは、負の値で提示する。マイクロアレイ分析によって得られたＰＢＭＣにおける発現パターンのみに基づき、クラス割付け総合精度は、試験セットでは１００％であり、ここで、１４例のクローン病患者のうち１４例が、クローン病として正確に分類され、６例のＵＣ患者のうち６例が、ＵＣとして正確に分類された。ＰＢＭＣプロフィールの実際の起源を示す（ＣＤ患者 ＝ 最初の１４本の白棒；ＵＣ患者 ＝ 最後の６本の黒棒）。
【図３−１】ＣＤおよびＵＣのサンプルセットにおける分類子転写産物レベルのリアルタイムＰＣＲによる確認を示す図である。Ａ）Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ マイクロアレイハイブリダイゼーション（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ；白い柱）または定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）；黒い柱）によって検出して、ＣＤにおいてアップレギュレートされたときに検出された遺伝子分類子転写産物（ｘ軸）の平均上昇倍率（ｙ軸）を示す。Ｂ）Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ マイクロアレイハイブリダイゼーション（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ；白い柱）または定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）；黒い柱）によって検出されたＵＣにおいてアップレギュレートされたときに検出された遺伝子分類子転写産物（ｘ軸）の平均上昇倍率（ｙ軸）を示す。
【図３−２】ＣＤおよびＵＣのサンプルセットにおける分類子転写産物レベルのリアルタイムＰＣＲによる確認を示す図である。Ａ）Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ マイクロアレイハイブリダイゼーション（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ；白い柱）または定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）；黒い柱）によって検出して、ＣＤにおいてアップレギュレートされたときに検出された遺伝子分類子転写産物（ｘ軸）の平均上昇倍率（ｙ軸）を示す。Ｂ）Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ マイクロアレイハイブリダイゼーション（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ；白い柱）または定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）；黒い柱）によって検出されたＵＣにおいてアップレギュレートされたときに検出された遺伝子分類子転写産物（ｘ軸）の平均上昇倍率（ｙ軸）を示す。
【図４−１】Ｑ−ＰＣＲ分析からの転写プロフィールを用いるクローン病または潰瘍性大腸炎いずれかを有する患者の分類に関する判別分析とロジスティック解析の比較を示す図である。（Ａ）２０のトレーニングセットまたは（Ｂ）２０の関連試験セットについてのロジスティック分析または判別分析の精度（ｙ軸）を示す。
【図４−２】Ｑ−ＰＣＲ分析からの転写プロフィールを用いるクローン病または潰瘍性大腸炎いずれかを有する患者の分類に関する判別分析とロジスティック解析の比較を示す図である。（Ａ）２０のトレーニングセットまたは（Ｂ）２０の関連試験セットについてのロジスティック分析または判別分析の精度（ｙ軸）を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【国際調査報告】
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