(57)【要約】神経障害（有害なタンパク質の凝集、異常なタンパク質の折り畳みに関連する神経変性障害（脳アミロイド形成疾患など）および／または神経変性自己免疫障害が含まれる）の治療に有用な組成物を記載する。前記組成物の使用方法も記載する。特に、プロテオソームおよび／または酢酸グラチラマー（ＧＡはサブミクロンのエマルジョンまたはナノエマルジョンである）を使用したアルツハイマー病などの神経変性障害および多発性硬化症などの神経変性自己免疫障害の治療方法を意図する。
2008504299.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の神経疾患または神経障害を治療する方法であって、このような治療を必要とする該哺乳動物に治療有効量のプロテオソームベースの組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項２】
同一の処方物または個別の処方物のいずれかで前記プロテオソームベースの組成物と共に治療有効量の酢酸グラチラマーを投与する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記神経疾患または神経障害が、有害なタンパク質の凝集を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記神経疾患または神経障害が多発性硬化症である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記神経疾患または神経障害が、早発性アルツハイマー病、遅発性アルツハイマー病、前駆症状性アルツハイマー病、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）アミロイドーシス、プリオン病、遺伝性アイスランド症候群、老化、および多発性骨髄腫からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記神経疾患または神経障害の治療により、可溶性アミロイドβペプチドまたは不溶性アミロイドβペプチドが減少し、前記不溶性アミロイドβペプチドが線維性アミロイドβペプチドを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記アミロイドβペプチドが不溶性である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記神経疾患または神経障害がアミロイド疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記アミロイド疾患がアルツハイマー病である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記アミロイド疾患を治療する工程が、脳内のアミロイド負荷増加を防止する工程、現在の該アミロイド負荷を維持する工程、または該アミロイド負荷を減少する工程を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記アミロイドがβ−アミロイドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アミロイド負荷には、総アミロイド負荷および線維性負荷が含まれる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記プロテオソームベースの組成物が、内因性リポポリサッカリドを含むプロテオソームベースのアジュバントおよび外因性リポポリサッカリドを含むプロテオソームベースのアジュバントからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記プロテオソームおよび前記リポポリサッカリドを同一の細菌属から得る、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記プロテオソームおよび前記リポポリサッカリドを異なる細菌属から得る、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記プロテオソームがＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓに由来し、前記リポポリサッカリドＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉに由来する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤、安定剤、またはキャリアをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
哺乳動物の神経疾患または神経障害を治療する方法であって、このような治療を必要とする該哺乳動物に、治療有効量のサブミクロンのエマルジョンまたはナノエマルジョンの酢酸グラチラマーを投与する工程を含む、方法。
【請求項１９】
前記神経疾患または神経障害が、細胞媒介性自己免疫疾患または細胞媒介性自己免疫障害である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞媒介性自己免疫疾患または細胞媒介性自己免疫障害が、多発性硬化症である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
サブミクロンのエマルジョンまたはナノエマルジョンの酢酸グラチラマーを含む組成物。
【請求項２２】
酢酸グラチラマーおよびプロテオソームベースの組成物を含む組成物。
【請求項２３】
哺乳動物の神経疾患または神経障害を治療する方法であって、該哺乳動物における抗体独立性応答を誘発する、治療有効量の組成物を投与する工程を含み；
該組成物が以下；
プロテオソームベースの組成物；
酢酸グラチラマー組成物と組み合わされるかまたは処方されたプロテオソームベースの組成物；
サブミクロンのエマルジョンで処方された酢酸グラチラマー組成物；または
ナノエマルジョンで処方された酢酸グラチラマー組成物
のうちのいずれかを含む、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府によって支援された研究および開発の下で行われた発明に対する権利に関する陳述）
本発明は、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓによって授与された助成金の下で、政府の支援を受けて行われた。
【０００２】
（関連出願の引用）
本出願は、２００４年６月２５日出願の米国仮特許出願第６０／５８２，９９９号（その全体が記載されているかのように、本明細書に参考として援用される）の優先権の利益を主張する。
【０００３】
（発明の分野）
神経障害（有害なタンパク質の凝集、異常なタンパク質の折り畳みに関連する神経変性障害および／または神経変性自己免疫障害（脳アミロイド形成（ａｍｙｌｏｇｅｎｉｃ）疾患など）が含まれる）の治療に有用な組成物を記載する。前記組成物の使用方法も記載する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
神経疾患は、一般に、１つまたは複数の中枢神経系領域由来のニューロンの喪失によって特徴づけられる。神経疾患の例には、アルツハイマー病、神経線維腫症、ハンチントン病、うつ病、筋萎縮性側索硬化症、多発性軟化症、脳卒中、パーキンソン病、および多発脳硬塞性痴呆が含まれる。これらは、起源および進行の両方が複雑であり、最も治療が困難な疾患型のいくつかであることが判明している。実際、いくつかの神経疾患について、有意な治療上の利点が得られる利用可能な薬物は存在しない。治療が困難であることは、これらの疾患がその犠牲者に与える破滅的影響を考えると、一層悲劇的である。
【０００５】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、重度の精神衰退を引き起こし、最終的には死に至る、記憶、認知、推理、判断、情動安定性の進行性の喪失によって臨床的に特徴づけられる変性脳障害である。ＡＤは、高齢者における精神不全（ｍｅｎｔａｌ  ｆａｉｌｕｒｅ）（痴呆）の非常に一般的な原因であり、米国における４番目の最も一般的な医学的死亡原因に相当すると考えられている。ＡＤは、世界中の全ての人種および民族で認められており、主な現在のおよび将来的なさらなる公衆衛生問題となっている。この疾患は、現在、米国のみで約４００万人の個体に影響を与えていると見積もられている。ＡＤは、現在、治癒不可能である。一定の治療薬の投与を使用して、ヒトのＡＤの症状を処置している。しかし、ヒトのＡＤを有効に防止するかその症状または経過を逆転させる治療は現在のところ知られていない。
【０００６】
ＡＤ個体の脳は、老人斑と呼ばれる特徴的な病変および神経原線維変化を示す。ＡＤに特徴的な老人斑は、細胞外に最も頻繁に局在する一方で、神経原線維変化は、細胞内に最も頻繁に局在する。多数のこれらの病変は、一般に、ＡＤ患者の記憶および認知機能に重要なヒト脳のいくつかの領域で見出される。より限局した解剖学的分布におけるより少数のこれらの病変は、ときおり、臨床的ＡＤではない高齢者の脳で見出される。ＡＤに特徴的な老人斑および血管アミロイド沈着（アミロイド血管症）の主な化学成分は、アミロイド−βペプチド（Ａβ）と呼ばれるタンパク質であり、βＡＰ、ＡβＰ、またはβ／Ａ４ともいうことができる。Ａβを含む細胞外斑は、密集（ｄｅｎｓｅ）または散在し得る。密集した斑は、しばしば、線維性斑という。Ａβは最初に精製され、非特許文献１で報告された部分的アミノ酸配列である。最初の２８アミノ酸についての単離手順および配列データは、特許文献１に記載されている。４０個を超えるアミノ酸を有するＡβ形態は、非特許文献２によって最初に報告された。
【０００７】
神経病理学的に、ＡＤは、様々な程度に、以下の４つの主な病変によって特徴づけられる：ａ）神経原線維変化（ＮＦＴ）のニューロン内細胞質沈着物、ｂ）老人斑（ｎｅｕｒｉｔｉｃ  ｐｌａｑｕｅ）と呼ばれる実質性アミロイド沈着物、ｃ）脳血管Ａβアミロイドーシス（例えば、アミロイド血管症）、ならびにｄ）シナプスおよびニューロンの喪失。ＡＤの重要事象の１つは、脳血管壁周囲に細胞外老人斑および沈着物が生じる不溶性線維塊（アミロイド形成）としてのアミロイド（例えば、Ａβペプチド）の沈着である。老人斑および脳アミロイド血管症の主な構成要素はＡβであるにも関わらず、これらの沈着物は、グリコサミノグリカンおよびアポリポタンパク質などの他のタンパク質を含み得る。
【０００８】
非特許文献３は、ＡβのＮ末端に対するモノクローナル抗体がＡβ−ペプチドの既存の集合体に結合して脱凝集し、そして／またはインビトロでの原線維凝集を防止してニューロン細胞培養物に対する毒性を防止することができることを示した。非特許文献４は、アミロイド−βでの免疫により、アミロイド−β沈着およびアルツハイマー病様神経病変の動物モデルとして使用したＰＤＡＰＰトランスジェニックマウスにおけるアルツハイマー病様病変が軽減することを証明した。彼らは、アルツハイマー病型神経病変の発症前の幼若動物の免疫によってβ−アミロイド斑形成、神経突起ジストロフィ、およびアストログリオーシスの発症が本質的に防止されるのに対して、アルツハイマー病型神経病変の発症後の高齢の動物の処置によってこれらの神経病変の範囲および進行が減少すると報告している。末梢に投与したＡβに対する抗体が脳実質性アミロイド負荷を軽減させることが示されているので、この効果は抗体によって媒介される（非特許文献５）。さらに、新たに可溶化したＡβ１−４０での鼻腔内免疫により、脳アミロイド負荷が軽減される（非特許文献６）。動物モデル系を使用して非特許文献７および非特許文献８によって行われた２つの研究は、ワクチン接種誘導性の脳アミロイド沈着の減少により認知が改善されることを示した。さらなる研究では、同一トピックの種々の態様（非特許文献９および非特許文献１０が含まれる）に取り組んだ。Ａβワクチン接種がＡＤの動物モデルを使用した種々の研究でいくらか成功していることが示されているにもかかわらず、髄膜脳炎などの副作用が有害および／または受け入れられないほどの高い頻度で生じるので、アジュバント（ＱＳ２１）中で処方されたＡβ１−４０／４２ペプチドで免疫したヒト臨床研究を終了させた。したがって、ＡＤおよびタンパク質凝集に関連する関連神経変性障害の治療および／または防止のための治療的に許容可能な方法が必要である。
【０００９】
自己免疫疾患は、自己組織または自系組織に対する異常な免疫応答によって特徴づけられる。関与する免疫応答型（免疫反応型）に基づいて、哺乳動物の自己免疫疾患を、一般に、以下の２つの異なる型に分類することができる：細胞性（すなわち、Ｔ細胞媒介性）または抗体媒介性障害。多発性硬化症（ＭＳ）は、Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患である（非特許文献１１）。世界中で１，０００，０００人を超える３０歳と４０歳との間の年齢の若年成人がＭＳに罹っている。ＭＳは、中枢神経系の最も一般的な疾患であり、若年成人の神経障害の最も一般的な原因である。病態生理学的に、自己反応性Ｔ細胞の循環が、ＭＳ患者で認められる多くの中枢神経系破壊を媒介する（非特許文献１２）。
【００１０】
ＭＳでは、Ｔ細胞は、中枢神経系のミエリンの成分であるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）と反応する。ＭＢＰに特異的な活性化Ｔ細胞をＭＳ患者から単離することができることが証明されたことは、ＭＳが、Ｔ細胞が自己神経組織または自系神経組織を破壊する自己免疫疾患であるという主張を支持する（非特許文献１３）。
【００１１】
ＭＳは、現在、一定の抗炎症薬および免疫調節薬で治療されており、このような薬剤には、（ｉ）免疫調節効果および免疫抑制効果の両方を有する副腎皮質ステロイド、（ｉｉ）インターフェロン−β、（ｉｉｉ）酢酸グラチラマー（ＧＡ）、（ｉｖ）アザチオプリン（細胞性免疫および体液性免疫の両方を抑制するプリンアナログ）、（ｖ）静脈内免疫グロブリン、（ｖｉ）ジヒドロ葉酸還元酵素を阻害して細胞性免疫および体液性免疫を抑制するメトトレキセート、（ｖｉｉ）シクロホスファミド（細胞傷害効果および免疫抑制効果を有するアルキル化剤）、および（ｖｉｉｉ）Ｔ細胞活性化による強い免疫抑制効果を有するシクロスポリンが含まれる。このような抗炎症薬または免疫抑制薬を使用した治療にもかかわらず、５０％を超えるＭＳ患者は、脊髄、小脳、および大脳皮質の局所性破壊の結果として確実に悪化する。
【００１２】
ＭＳ治療のために現在使用されている多くの薬物は、部分的に長期的有効性が制限されており、これは、これらの薬物の細胞傷害効果が高いためである。例えば、シクロホスファミドでの長期治療により、脱毛症、悪寒、嘔吐、出血性膀胱炎、白血球減少症、心筋炎、不妊症、および肺間質線維症を生じ得る。免疫抑制薬での治療により、最終的に、処置患者で「完全な」免疫抑制が誘導される可能性があり、感染症のリスクが非常に高まる。長期の完全な免疫抑制に供された患者は、悪性疾患、腎不全、および糖尿病などの治療由来の重症合併症を発症するリスクが増加する。
【００１３】
ＭＳ治療の別のアプローチは、ＭＳに関連し得るＴ細胞免疫応答を調整するためのＭＢＰの静脈内投与または経口投与の使用である。ＭＢＰまたはＭＢＰの免疫優性エピトープを含むフラグメントの静脈内投与により、クローンアネルギーまたはＭＢＰに特異的なＴ細胞を不活化するＴ細胞の非応答性によって免疫系が抑制される。最終結果として、ＭＢＰ特異的Ｔ細胞がもはやＭＢＰに応答して増殖しなくなる。Ｔ細胞が増殖できないことにより、神経組織のＴ細胞媒介性破壊が減少する。
【００１４】
ＭＳ治療で使用されるＭＢＰの免疫化学的アナログは、酢酸グラチラマー（ＧＡ）またはコポリマー−１（ＣＯＰ−１）である（特許文献２、特許文献３）。ＧＡは、その市販されている形態では、６．０：１．９：４．７：１．０のモル比でＬ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、およびＬ−チロシンから構成されるランダムな合成ポリペプチドの混合物である。これは、ＭＢＰの免疫化学的模倣物として最初に合成された。例えば、ＧＡに対する一定のモノクローナル抗体は、ＭＢＰと交差反応する（非特許文献１４）。また、ＧＡは、ＭＢＰに特異的なサプレッサーＴ細胞を誘導することが見出されている（非特許文献１５）。マウス実験では、ＧＡが実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の中枢神経系組織の破壊に関与するＭＢＰ特異的Ｔ細胞も特異的に阻害することが示されている（非特許文献１６）。
【００１５】
ＧＡ投与により、（ｉ）ＮＫ細胞の比率を増加することができ、（ｉｉ）血清ＩＬ−２レセプターを減少させることができ、（ｉｉｉ）ＴＮＦ−αを抑制することができ、（ｉｖ）ＴＧＦ−βおよびＩＬ−４を増加させることができる（非特許文献１７）。
【００１６】
ＧＡの非経口投与によってＭＳ患者が比較的首尾よく治療されているにも関わらず（非特許文献１８）、現在の治療計画および全体的な効果を改善することができる。
【００１７】
上記書類の引用は、上記書類のいずれかが適切な先行技術であることを認めることを意図しない。これらの書類の日付に関する全記載および内容に関する表現は、出願人が利用可能な情報に基づいており、これらの書類の日付または内容が正確であると認めているわけではない。
【特許文献１】米国特許第４，６６６，８２９号明細書
【特許文献２】米国特許第３，８４９，５５０号明細書
【特許文献３】国際出願公開ＷＯ９５／３１９９０号パンフレット
【非特許文献１】Ｇｌｅｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２０：８８５−８９０
【非特許文献２】Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：７３３−７３６
【非特許文献３】Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ＰＮＡＳ  ９４（８）：４１０９−１２
【非特許文献４】Ｓｃｈｅｎｋ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４００（６７４０）：１７３−１７７（１９９９）
【非特許文献５】Ｂａｒｄ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６（８）：９１６−９
【非特許文献６】Ｗｅｉｎｅｒ，Ｈ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏ．４８（４）：５６７−７９
【非特許文献７】Ｍｏｒｇａｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０８（６８１５）：９８２−５
【非特許文献８】Ｊａｎｕｓ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０８（６８１５）：９７９−８２
【非特許文献９】Ｄｏｄａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５（５）：４５２−７
【非特許文献１０】Ｋｏｔｉｌｉｎｅｋ，Ｌ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２２（１５）：６３３１−５
【非特許文献１１】Ｔｒａｐｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３８（５）：２７８（１９９８）
【非特許文献１２】Ｒｕｄｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３７：１６０４（１９９７）
【非特許文献１３】Ａｌｌｅｇｒｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ：２４７：７７８（１９９０）
【非特許文献１４】Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：９２５８（１９９１）
【非特許文献１５】Ｌａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３：２１５６（１９７９）
【非特許文献１６】Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ  ８５：９７２４（１９９５）
【非特許文献１７】Ａｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ３（５），Ｓ０５３（１９９７）
【非特許文献１８】Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，３４８  （１９８７）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
（発明の要旨）
本発明は、治療を必要とする哺乳動物の神経疾患または神経障害を治療するための方法および組成物を提供する。神経疾患または神経障害は、タンパク質もしくはタンパク質性物質の全身もしくは局所的沈着（例えば、アミロイドーシス）、有害なタンパク質の凝集（タンパク質の誤折り畳み）、および／または神経変性自己免疫に関連し得る。アルツハイマー病および／または他の脳アミロイド形成疾患（プリオン関連疾患、ハンチントン病、パーキンソン病、および脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）が含まれる）が特に興味深い（Ｒｅｖｅｓｚ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．６２（９）：８８５−９８）。前記アミロイド関連疾患の治療は、総アミロイド負荷（可溶性および不溶性Ａβ）または線維性Ａβ−アミロイド負荷の決定によって測定される新規のアミロイド斑（沈着）の防止、現在のアミロイド斑レベルの維持、および／または既存のアミロイド斑量もしくは総脳アミロイドタンパク質量（斑中に沈着し得るＡβが含まれる）の減少を含み得る。前記神経疾患または神経障害は、多発性硬化症などの細胞媒介性自己免疫疾患に関連し得る。前記自己免疫障害の治療は、自己反応性ｔ細胞の形成の防止、既存の自己反応性Ｔ細胞濃度の維持、および／または自己反応性Ｔ細胞濃度の減少を含み得る。
【００１９】
本発明は、哺乳動物の神経疾患または神経障害（Ａβ斑関連疾患またはＡβ斑関連障害および細胞媒介性自己免疫疾患または自己免疫障害が含まれる）を治療するための治療薬としての、任意選択的に、サブミクロンのエマルジョンまたはナノエマルジョン中でのプロテオソームベースの組成物および／またはＧＡ組成物の種々の形成を主張し、使用する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（発明実施の形態）
用語「神経疾患」は、神経系のニューロン細胞が関わる疾患または障害をいう。詳細には、以下が含まれる：プリオン病（例えば、クロイツフェルト−ヤコブ病）；発達中の脳の病変（例えば、アミノ酸代謝の先天性欠損（アルギニノコハク酸尿症、シスタチオニン尿症、高ヒスチジン血症、ホモシスチン尿症、高アンモニア血症、フェニルケトン尿症、チロシン血症、および脆弱Ｘ症候群など）；成熟脳の病変（例えば、神経線維腫症、ハンチントン病、うつ病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症）；成人期に襲われる症状（例えば、アルツハイマー病、クロイツフェルト−ヤコブ病、レビー小体病、パーキンソン病、ピック病）；および脳の他の病変（例えば、脳の事故（ｍｉｓｈａｐ）、脳損傷、昏睡、種々因子による感染症、食事性欠乏症、脳卒中、多発性梗塞性痴呆、および心血管の事故）。
【００２１】
本発明の好ましい疾患または障害は、成熟脳に影響を及ぼす疾患（多発性硬化症など）および典型的には成人期に襲われる疾患（アルツハイマー病など）である。
【００２２】
本明細書中で「ＡＤ」と略される、用語「アルツハイマー病」は、中枢神経系の神経変性疾患をいう。大まかに言って、この疾患は、以下の２つのカテゴリーに分類される：老齢期（典型的には、６５歳より高齢）に発症する遅発性および老年期以前（例えば、３５歳と６０歳との間）に発症する早発性。両疾患型では、病変は類似しているが、より早期に発症する場合、より重篤且つ広範囲にわたる傾向がある。ＡＤは、海馬および皮質などの脳の一定の脆弱領域に集中した細胞外に局在化した脳アミロイド（例えば、Ａβペプチド）の蓄積、アミロイド斑（密集性または散在性にさらに区別することができる）、および細胞外に局在化した神経原線維変化によって特徴づけられる。ＡＤは、老人性痴呆に至る進行性疾患である。アミロイド斑は、脳組織切片の顕微鏡分析によって視覚可能な中心に細胞外アミロイド−β（Ａβ）沈着物を有する直径１５０ｍｍまでの好中球に会合し得る非組織化神経原線維領域である。神経原線維変化は、２つ１組になって互いによじれた２つのフィラメントからなるτタンパク質（しばしば、高リン酸化されている）の細胞外沈着物である。ＡＤは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のタンパク質分解性プロセシングの変化に起因するＡβペプチドの異常な蓄積に関連する。Ａβペプチドの異常な蓄積は、その後にγ（ガンマ）またはβ（ベータ）セクレターゼのタンパク質分解活性に影響を与え、それにより、例えば、Ａβ１−４２のレベルが増加する種々の変異（常染色体優性ＡＰＰ変異およびプレセニリン１（ＰＳ１）およびプレセニリン２（ＰＳ２）と呼ばれるタンパク質をコードする遺伝子の変異など）と相関している一方で、α（アルファ）セクレターゼのタンパク質分解活性がおそらくＡＰＰの正常なプロセシングに関連する。ＡＤで種々の斑型が見出されており、異常な異栄養性神経突起に関連する老人斑が含まれるが、これらに限定されない。ＣＮＳにおける炎症反応の存在（活性化小膠細胞および星状細胞が含まれる）もこの疾患の特徴である。神経障害に関連する機能不全性タンパク質（例えば、Ａβおよびプリオンタンパク質）の凝集体の蓄積は、一定の神経障害の発症に起因または寄与し、そうでなければ影響を与えると考えられるＩｎｇｅｌｓｓｏｎ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｙｍａｎ  Ｂ．Ｔ．（２００２）Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｍｅｄ．３４：２５９−２７１）。有害なタンパク質凝集に関連する神経変性障害には、アルツハイマー病、ピック病、パーキンソン病、プリオン病、ハンチントン病、および運動ニューロン障害が含まれる（Ｓｈａｓｔｒｙ，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２００２，４３：１−７）。
【００２３】
用語「アミロイド」は、タンパク質凝集体の細胞外（例えば、Ａβ、プリオン病、および多発性骨髄腫軽鎖疾患）または細胞内（例えば、ＡＤにおけるτタンパク質の神経原線維変化およびパーキンソン病におけるα−シヌクレイン）沈着をいう（Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ  Ｊ．Ｑ．ａｎｄ  Ｍａｔｈｓｏｎ  Ｍ．Ｐ．（２００３）Ｎｅｕｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：１−５）。アミロイド沈着は、ＡＤ患者およびダウン症候群患者の脳ならびに中枢神経系の動脈、細動脈、毛細管、および静脈中に見出すことができる。アミロイド沈着物を、コンゴレッドおよびチオフラビンＳなどの色素に結合し、原線維（交差したβ−プリーツシート高次構造が含まれる）を形成する能力によって認識することができる。
【００２４】
用語「アミロイドーシス」は、誤折り畳みタンパク質（タンパク質凝集体が含まれる）であり得る、通常は可溶性タンパク質の異常な不溶性沈着物によって特徴づけられる障害の広範な異質の（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ）群をいう。
【００２５】
アルツハイマー病（ＡＤ）、早発性アルツハイマー病、遅発性アルツハイマー病、および前駆症状性アルツハイマー病に加えて、アミロイド沈着物によって特徴づけられる他の疾患は、例えば、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）アミロイドーシス、遺伝性アイスランド症候群、多発性骨髄腫、プリオン病など、または他の脳アミロイド形成疾患（Ｒｅｖｅｓｚ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．６２（９）：８８５−９８）を、本明細書中に記載の組成物および方法にしたがって治療することができる。動物における最も一般的なプリオン病は、ヒツジおよびヤギのスクレイピーならびにウシのウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）である（Ｗｉｌｅｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９９１）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：２２−３８）。以下の４つのプリオン病がヒトで同定されている：（ｉ）クールー、（ｉｉ）クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）、（ｉｉｉ）ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）、および（ｉｖ）致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）（Ｇａｊｄｕｓｅｋ，Ｄ．Ｃ．（１９７７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９７（４３０７）：９４３−６０およびＭｅｄｏｒｉ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２６（７）：４４４−９）。
【００２６】
老人斑の主な構成要素は、Ａβペプチドである。Ａβペプチドは、前駆体タンパク質ＡＰＰの３９〜４３アミノ酸の内部フラグメントである。ＡＰＰタンパク質内のいくつかの変異は、アルツハイマー病の存在と相関している（例えば、Ｇｏａｔｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９（６３１１）：７０４−６，Ｍｕｒｒｅｌｌ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４（５０２８）：９７−９，Ｍｕｌｌａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．ｌ（５）：３４５−７を参照のこと）。
【００２７】
本明細書中で使用される、用語「β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）」を、第２１染色体長腕上のヒトに局在した同名の遺伝子によってコードされ、且つ、そのカルボキシル側の１／３（ｔｈｉｒｄ）内にＡβを含むポリペプチドと定義する。ＡＰＰは、多数の哺乳動物組織中の広範な種々の細胞で発現するグリコシル化された１回膜貫通タンパク質である。
【００２８】
ＡＰＰ変異は、ＡＰＰからＡβへのタンパク質分解性プロセシング、特に、ＡＰＰの増量したＡβの長鎖形態（すなわち、Ａβ１−４２およびＡβ１−４３）へのプロセシングの増加または変化によってアルツハイマー病の発症に影響を与えると考えられる。プレセニリン遺伝子（ＰＳ１およびＰＳ２）などの他の遺伝子の変異は、長鎖形態のＡβ量を増加するためのＡＰＰのタンパク質分解性プロセシングに間接的に影響を与えると考えられる（Ｈａｒｄｙ，Ｊ．（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０（４）：１５４−９を参照のこと）。これらの所見は、Ａβ、特にその長鎖形態は、アルツハイマー病の原因成分であることを示す。
【００２９】
本明細書中で使用される、用語「ＡＰＰフラグメント」は、ＡβまたはＡβフラグメントのみからなるもの以外のＡＰＰのフラグメントをいう。すなわち、ＡＰＰフラグメントには、インタクトなＡβまたはＡβのフラグメントを形成するアミノ酸配列に加えてＡＰＰのアミノ酸配列が含まれる。
【００３０】
用語「ベータ−アミロイドペプチド」は、「β−アミロイドペプチド」、「βＡＰ」、「βＡ」、および「Ａβ」と同義である。これらの全用語は、アミロイド前駆体タンパク質のフラグメント由来の斑形成ペプチドをいう。
【００３１】
本明細書中で使用される、用語「線維性Ａβ」および「総Ａβ」の定義を以下に示す。「線維性」Ａβは、細胞外アミロイド沈着物中に含まれるＡβペプチドであり、Ａβ斑ともいうことができ、いくつかの場合、Ａβ斑を、散在性または密集性にさらに区別することができる。「総」アミロイド負荷または総Ａβ負荷は、可溶性および不溶性（例えば、線維性）Ａβの和であり、そのほとんどが細胞外であると推定される。細胞外非線維性Ａβが線維性アミロイドになり得るＡβの供給源を示すことができる場合、可溶性Ａβと不溶性Ａβとの間に動的関係が存在することが認識される。
【００３２】
本明細書中で使用される、用語「実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）」は、ＭＳの一次動物モデルである。適切なアジュバント中でのＭＢＰによる免疫またはＣＤ４＋ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の受動伝達によって小哺乳動物でＥＡＥを容易に誘導することができる（Ａｌｖｏｒｄ  Ｊｒ，Ｅ．Ｃ，ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｌｌｅｒｇｉｃ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ａ  Ｕｓｅｆｕｌ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８４；Ｍａｋｈｔａｒｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：３５６（１９８４）；Ｂｅｎ−Ｎｕｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９：３０３（１９８２））。マウスおよびラットの両方でＥＡＥを誘導するＴ細胞は、クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子上の抗原提示細胞によって提示されたＭＢＰの免疫優性領域に対応するペプチドを認識する。
【００３３】
本発明の１つの態様によれば、哺乳動物の神経疾患または神経障害を治療する方法を提供する。本発明のこの態様の方法は、治療有効量のＧＡおよびプロテオソームベースの組成物を必要とする被験体へのその組成物の投与によって実施することができる。本発明のさらなる態様は、神経疾患または神経障害がアミロイド斑形成疾患またはアミロイド斑形成障害である場合である。本発明の１つの態様のＧＡおよびプロテオソームベースの組成物で処置した最も顕著な神経疾患または神経障害は、アルツハイマー病および多発性硬化症である。上記神経疾患または神経障害の治療のためのプロテオソームと組み合わせたＧＡの治療組成物に加えて、さらなる実施形態には、以下の治療組成物の使用が含まれるが、これらに限定されない：ＧＡ組成物を含まないプロテオソームベースの組成物、ＧＡを含むサブミクロンのエマルジョン組成物、ＧＡを含むナノエマルジョン組成物。前の実施形態はまた、任意の薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤、安定剤、またはキャリアも含むであろう。
【００３４】
本発明のさらなる態様は、哺乳動物における神経疾患または神経障害の治療が、哺乳動物中で抗体独立応答を誘発する治療有効量のＧＡおよびプロテオソームベースの組成物を投与する工程を含むことである。
【００３５】
本発明のさらなる実施形態は、アルツハイマー病であり得るアミロイド疾患の治療方法からなる。例えば、脳内の線維性アミロイド負荷の増加の防止、総アミロイド負荷の増加の防止、既存の線維性アミロイド負荷および／または総アミロイド負荷の維持、または線維性アミロイド負荷および／または総アミロイド負荷の減少によってアミロイド疾患の治療を行うことができる。アミロイドタンパク質は全身に存在し得ることが公知であるので、本発明の実施形態は、脳アミロイドに制限されない。さらに、本発明は特にβ−アミロイドを考察しているが、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、プリオン病、遺伝性アイスランド症候群、ハンチントン病、パーキンソン症候群、ダウン症候群、および脳アミロイド血管症などの他のアミロイドクラスが本発明の範囲内と見なされる。上記アミロイド疾患によれば、以下の治療組成物のうちの１つの投与によって治療することができる：治療有効量のＧＡおよびプロテオソームベースの組成物、ＧＡ組成物を含まないプロテオソームベースの組成物、ＧＡを含むサブミクロンのエマルジョン組成物、および／またはＧＡを含むナノエマルジョン。前の実施形態はまた、任意の薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤、安定剤、またはキャリアを含むであろう。
【００３６】
（酢酸グラチラマー）
多発性硬化症（ＭＳ）の治療に有効なＭＢＰの免疫学的アナログは、酢酸グラチラマー（ＧＡ）（すなわち、コポリマー−１（Ｃｏｐ−１））である（米国特許第３，８４９，５５０号、ＰＣＴ出願ＷＯ／９５／３１９９０）。ＧＡは、その市販されている形態では、６．０：１．９：４．７：１．０のモル比でＬ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、およびＬ−チロシンから構成されるランダムな合成ポリペプチドの混合物である。これは、ＭＢＰの免疫化学的模倣物として最初に合成された。例えば、ＧＡに対する一定のモノクローナル抗体は、ＭＢＰと交差反応する（Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：９２５８（１９９１））。また、ＧＡは、ＭＢＰに特異的なＴ抑制細胞を誘導することが見出されている（Ｌａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３：２１５６（１９７９））。マウス実験では、ＧＡがＥＡＥの中枢神経系組織の破壊に関与するＭＢＰ特異的Ｔ細胞も特異的に阻害することが示されており（Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ  ８５：９７２４（１９９５））；およびＡｎｇｅｌｏｖ，Ｄ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  １００（８）：４７９０−４７９５（２００３））は、ＧＡを使用して筋萎縮性側索硬化症を治療することができ、十分に調節された自己免疫応答の誘導が、ＧＡの投与によって増強することができる抗自己Ｔ細胞応答の存在下での生存に影響を与えるようであることを示している。
【００３７】
本発明によれば、ＧＡを、当該分野で公知の方法によって調製することができる。例えば、ＧＡを、チロシン、アラニン、γ−グルタミン酸ベンジル、およびε−Ｎ−トリフルオロ−アセチルリジンのＮ−カルボキシアンヒドリドを、周囲温度にてインヒビターとしてジエチルアミンを使用して無水ジオキサン中で重合させる、米国特許第３，８４９，５５０号に開示の過程によって調製することができる。臭化水素を含む氷酢酸を使用してグルタミン酸のγ−カルボキシル基の脱ブロッキングを行い、その後、１Ｍピペリジンによってリジン残基からトリフルオロアセチル基を除去する。得られたポリペプチド混合物は、本質的に、約６：２：５：１のモル比のアラニン、グルタミン酸、リジン、およびチロシンからなる。
【００３８】
ＧＡはまた、Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｋｆａｒ−Ｓａｂａ，Ｉｓｒａｅｌから市販されている。
【００３９】
ＧＡを、その治療有用性を維持する任意の形態にて本発明で使用するために調製することができる。これらには、種々の分子量範囲のペプチドの混合物が含まれる。所望の分子量範囲を有するＧＡを、当該分野で公知の方法によって得ることができる。このような方法には、ＷＯ／９５／３１９９０に開示の高分子量種を除去するためのＧＡのゲル濾過高速液体クロマトグラフィが含まれる。１つの実施形態では、ＧＡは、そのポリマー種の約７５％が約２ＫＤａ〜約２０ＫＤａの分子量範囲内である。別の実施形態では、ＧＡの平均分子量は、約４ＫＤａ〜９ＫＤａである。公知の方法にしたがって、従来のＧＡと長さが異なるか修飾されているポリマー種を含めるためにＧＡを酵素または他の分解に供することができると理解される。
【００４０】
（ＧＡおよびプロテオソーム）
プロテオソーム（例えば、ＩＶＸ−９０８またはプロトリン）を配合したＧＡを、例えば、注射によるか鼻腔内に投与することができる。注射によって送達した場合、このような送達は、１回の注射（組み合わせた同時投与）であり得る。あるいは、ＧＡ組成物およびプロテオソームベースの組成物を、個別に送達させることができるか、第１の部位にＧＡ組成物（プロテオソームを含まない）のみを投与し、第２の部位にプロテオソームベースの組成物（すなわち、ＧＡを含まない）のみを投与する、同時または一過性に異なる時間で起こり得る複数の部位への注射によって送達させることができる。ＧＡを注射によって投与し、それと同時または別に、プロテオソームベースの組成物を、例えば、鼻腔内投与することができることも意図される。したがって、本発明の１つの実施形態では、ＧＡ組成物を注射によって送達させ、個別に、プロテオソームベースの組成物を鼻腔内に送達させる。
【００４１】
本発明のＧＡペプチドを、プロテオソームとの非共有結合を増強すると予想される疎水性アンカー配列部分を含むように調製することもできる。全身および粘膜両方の抗体応答を誘導するための非経口投与または特に粘膜投与（消化管投与が含まれる）のいずれかのためにデザインしたプロテオソーム両親媒性決定基ワクチンの産生および製造は、米国特許第６，４７６，２０１号で考察されている。両親媒性決定基は、プロテオソームを適切に配合した場合にプロテオソームと組み合わされて被験体における免疫応答を誘発する複合体を形成する疎水性領域および親水性領域を有する分子である。典型的な両親媒性決定基には、糖脂質、リポサッカリド（解毒リポ多糖類が含まれる）、リポペプチド、膜貫通ドメイン、エンベロープもしくはトキソイド化（ｔｏｘｏｉｄｅｄ）タンパク質、または内因性疎水性アミノ酸アンカーのタンパク質もしくはペプチドが含まれる。
【００４２】
（乳濁液組成物）
それぞれ米国特許第５，９６１，９７０号または同第５，７１６，６３７号に記載のように、ＧＡを含むサブミクロンのエマルジョンまたはナノエマルジョンを投与するか、ＧＡをこれらに配合することができる。組成物は、水性連続相として約０．５〜約５０％の油、約０．１〜約１０％の乳化剤、約０．０５〜約５％の非イオン性界面活性剤、および約０．００００１〜約１．０％のＧＡを含む水中油滴型サブミクロンのエマルジョンを含む。サブミクロンのエマルジョンの平均液滴サイズは、約０．０３μｍと約０．５μｍ、好ましくは０．０５μｍと０．２μｍとの間の範囲である。
【００４３】
ナノエマルジョンアプローチにより、少なくとも１つのリン脂質二重層に囲まれた脂質コアを有する粒子のナノエマルジョンを含むワクチン組成物が得られる。粒子の平均直径は、重量に基づいて決定したところ、約１０〜約２５０ｎｍの範囲であり、均質化過程前に内因的にか均質化過程後に外因的にＧＡを粒子中に組み込む。粒子を、典型的に、水性連続相に懸濁し、各脂質粒子は、脂質が約２５℃またはそれを超える温度で大量に固体または液晶である脂質コアを含む。通常、ＧＡの捕捉量は、約０．００１〜約５％である。あるいは、ＧＡを、プロテオソームに配合し、そして／またはナノエマルジョンは、生体接着性高分子または粘液接着性高分子をさらに含み得る。
【００４４】
（提案される機構）
本発明はまた、例えば、プロテオソームベースの組成物と共に処方したＧＡまたはＧＡを含まないプロテオソームベースの組成物で哺乳動物を免疫する工程と、前記ペプチド、そのフラグメント、または誘導体の減少または阻害が、抗体が生成されることなく起こることと、本明細書中でＢ細胞欠損（μＭＴ）マウスを使用して証明したところ、抗体応答を誘発することができないこととを含む、アミロイド−βペプチド（可溶性および／または不溶性）、そのフラグメントまたは誘導体のレベルを阻害または減少させる方法を含む。理論に拘束されることを望まないが、好ましくは、アミロイド（例えば、Ａβアミロイド）の阻害または減少は、脳または周辺部で見出すことができる脳局在化小膠細胞、好中球、および／またはマクロファージなどの免疫細胞の活性化を介し、これらの細胞の活性化は、任意の抗体または抗原に特異的な機構と無関係である。哺乳動物において実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）（髄膜脳炎が含まれる）を発症することなく減少または阻害されることが最も好ましい。
【００４５】
アミロイド負荷（例えば、線維性斑を含むＡβおよび斑に沈着しない非線維性Ａβ）の減少は、アミロイド沈着および／またはＡβ斑形成の減少に比例し、それにより、ＡＤおよび関連する疾患またはアミロイド生成疾患もしくはアミロイド生成障害が治療される。本発明の種々の態様が任意の特定の理論または機構に制限されるべきではないが、活性化小膠細胞がアミロイド斑と同時局在化し、小膠細胞の活性化がアミロイド沈着の存在に依存し、沈着によって内因性小膠細胞の活性化が刺激されると考えられる。したがって、活性化小膠細胞は、アミロイド（例えば、Ａβ斑）沈着に関与する。可能性のあるＡＤ機構についてのさらなる情報は、Ｓｃｈｅｎｋ，Ｄ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ３：８２４−８２８で見出される。Ａβの沈着およびアミロイド斑の形成は、複雑な炎症および神経毒カスケードを伴うようである。したがって、抗炎症機構の治療が有利であると考えられる。このような抗炎症機構過程は、しばしば、抗炎症性ＩＬ−４／ＩＬ−１０（Ｔｈ２）およびＴＧＦ−β（Ｔｈ３）免疫応答の発現と一致する。その結果として、プロテオソームが炎症誘発性免疫応答に関連するＴｈ１型免疫（サイトカイン）応答の刺激に非常に関連し、Ｔｈ２免疫応答と同等および特有であることが以前に提唱されたので、プロテオソームベースの組成物およびＧＡを含む本発明の処方物が、非抗体媒介性免疫応答を刺激してＡβ−アミロイド含有斑を減少させるという驚くべきかつ予測外の所見が得られる。それにもかかわらず、Ｔｈ１型サイトカインＩＮＦ−γ（７５％超が未処置）による小膠細胞の食作用の増加も、ＣＮＳにおける炎症性浸潤のクリアランス加速のフィードバック機構が示唆され得る（Ｃｈａ，Ａ．ｅｔ．ａｌ．（２００１）ＧＬＩＡ  ３３（１）：８７−  １．０  ９５）。さらに、ＩＮＦ−γ自体によってもβ−アミロイド前駆体タンパク質の転写が阻害され得る（Ｒｉｎｇｈｅｅｉｍ  Ｇ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ（１９９６）２２４（１）：２４６−５１）。
【００４６】
（プロテオソームベースの組成物）
米国特許第６，４７６，２０１号および同第５，９６１，９７０号の主題は、多価サブユニットワクチン各成分に対する至適な免疫応答を刺激するために、どのようにして適切な成分を適切に関連させ、それぞれが免疫系の細胞によって有効に認識およびプロセシングされることができるような免疫系を利用することができるのかについて記載している。このような認識およびプロセシングには、例えば、鼻上皮内に存在する膜細胞（Ｍ細胞）による取り込みおよびその後の内在する宿主免疫系細胞への送達が含まれ得る。このような非共有結合によって複合体化したワクチンの主な例には、広範な種々の抗原（ペプチド、リポペプチド、膜貫通タンパク質、トキソイド化タンパク質、ポリサッカリド、またはリポポリサッカリド（ＬＰＳ））と非共有結合的に複合体化ナイセリア外膜タンパク質からなり得るプロテオソームベースのワクチンが含まれる（さらなる概説については、以下の引例を参照のこと：米国特許第５，７２６，２９２号、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ｏｒａｌ  ｏｒ  Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ２ａ  ａｎｄ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ  Ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ−Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ；Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１：２３９０；Ｍａｌｌｅｔｔ，Ｃ．Ｐ．，Ｔ．Ｌ．Ｈａｌｅ，Ｒ．Ｋａｍｉｎｓｋｉ，Ｔ．Ｌａｒｓｅｎ，Ｎ．Ｏｒｒ，Ｄ．Ｃｏｈｅｎ，ａｎｄ  Ｇ．Ｈ．Ｌｏｗｅｌｌ．（１９９５））；Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｏｒ  ｉｎｔｒａｇａｓｔｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ−Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｌｅｔｈａｌ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｓｈｉｇｅｌｌｏｓｉｓ（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：２３８２−２３８６；Ｌｏｗｅｌｌ  Ｇ  Ｈ，Ｋａｍｉｎｓｋｉ  Ｒ  Ｗ，Ｇｒａｔｅ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６））；Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ−ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ｂ（ＳＥＢ）ｔｏｘｏｉｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｌｅｔｈａｌ  ＳＥＢ  ｉｎｔｏｘｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ（Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．６４：１７０６−１７１３；Ｌｏｗｅｌｌ，Ｇ．Ｈ．（１９９０））；Ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅｓ，Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ａｎｃｈｏｒｓ，Ｉｓｃｏｍｓ  ａｎｄ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，（ｉｎ  Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｇ．Ｃ．Ｗｏｏｄｒｏｗ  ａｎｄ  Ｍ．Ｍ．Ｌｅｖｉｎｅ，ｅｄｓ．（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ）Ｃｈａｐｔｅｒ  １２（ｐｐ．１４１−１６０））；およびＰｒｏｔｅｏｓｏｍｅ−ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ｍａｌａｒｉ���  ＣＳ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ；（Ｌｏｗｅｌｌ，Ｇ．Ｈ．，Ｗ．Ｒ．Ｂａｌｌｏｕ，Ｌ．Ｆ．Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ａ．Ｗｉｒｔｚ，Ｗ．Ｄ．Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗ．Ｔ．Ｈｏｃｋｍｅｙｅｒ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：８００））。
【００４７】
本明細書中で使用される、「プロテオソームベースの組成物」は、細菌抗原またはウイルス抗原などの免疫原のためのキャリアまたはアジュバントとして有用なナイセリア属などのグラム陰性細菌由来の外膜タンパク質（ＯＭＰ、ポリンとしても公知）の調製物をいう（例えば、Ｌｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：６５８，１９８８；Ｌｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：８００，１９８８；Ｌｙｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．４５：１０４，１９８４；Ｌｏｗｅｌｌ，ｉｎ  「Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｂａｓｉｌ，Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ，ｐａｇｅｓ  １９３，１９９７；米国特許第５，７２６，２９２号；同第４，７０７，５４３号を参照のこと）。上記のように調製したプロテオソームは、ＯＭＰポリンを産生するために使用された細菌（例えば、ナイセリア属）由来の内因性リポポリサッカリド（ＬＰＳ）も含む。小胞または小胞様形態（１つまたは複数のＯＭＰの多分子膜構造または融解球形様ＯＭＰ組成物が含まれる）の外膜タンパク質成分が得られる任意の調製方法が、プロテオソームの定義の範囲内に含まれる。
【００４８】
本明細書中で使用される、「リポサッカリド」は、グラム陰性細菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉもしくはＰｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ  ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓなど）または他のグラム陰性細菌（アルカリゲネス種（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、バクテロイデス種（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ボルデテラ種（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ブルセラ種（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、シトロバクター種（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エドヴァルシエラ種（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）、エーリキア種（Ｅｈｒｌｉｃｈａ）、エンテロバクター種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、フランキセラ種（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、フゾバクテリウム種（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ガードネレラ種（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）、ヘモフィルス種（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｌｕｓ）、ヘリコバクター種（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、レジュネラ種（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、モラクセラ種（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、モルガネラ種（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、ナイセリア種（Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ）、パスツレラ種（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、プロテウス種（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、プロビデンス種（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、他のプレシオモナス種（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ）、ポルフィロモナス種（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リケッチア種（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、サルモネラ菌種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、霊菌種（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、他の赤痢菌種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、スピリルム種（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ベーヨネラ種（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、ビブリオ種（Ｖｉｂｒｉｏ）、またはエルシニア種（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）が含まれる）由来の天然または修飾されたリポポリサッカリドまたはリポオリゴサッカリド（集合的に、「ＬＰＳ」ともいう）をいう。本明細書中で使用されるＬＰＳは解毒されていなくても解毒されていてもよいことに留意すべきである。
【００４９】
他の実施形態では、プロテオソームを調製した同一または異なる細菌から単離した外因性ＬＰＳを混合することができ、１つのこのようなプロテオソームベースの組成物を、本明細書中でＩＶＸ−９０８という（プロトリンともいうことができる）。言い換えれば、ＩＶＸ−９０８型のプロテオソームは、ＯＭＰ−ＬＰＳ組成物を得るために少なくとも１種類のリポサッカリドと混合したＯＭＰの調製物（免疫刺激組成物として機能することができる）である。したがって、ＯＭＰ−ＬＰＳ（ＩＶＸ−９０８）アジュバントは、以下の基本成分から構成され得る：（１）髄膜炎菌などのグラム陰性細菌から調製したプロテオソームの外膜タンパク質調製物および（２）１つまたは複数のリポサッカリドの調製物。ＩＶＸ−９０８の成分は、脂質、糖脂質、糖タンパク質、または小分子などであり得るかこれらを含み得ることも意図される。
【００５０】
本明細書中に開示のプロテオソームベースの組成物は、少なくとも一部が宿主の免疫系を刺激する能力を有するアジュバントとして機能する１つまたは複数の成分を含み得る。このようなプロテオソーム成分には、グラム陰性細菌の外膜タンパク質（ＯＭＰ）成分（その融合タンパク質またはフラグメント）および同一または異なるグラム陰性細菌のリポポリサッカリド（ＬＰＳ）成分が含まれ得ると認識される。このような成分は、例えば、ワクチンレシピエントの１つまたは複数の宿主細胞によって産生された一定のレセプター（例えば、Ｔｏｌｌ様レセプター）との相互作用によって宿主免疫応答を刺激するリガンドとして機能することができる。
【００５１】
理論に拘束されることを望まないが、本明細書中に開示のワクチン処方物の１つまたは複数の成分は、ワクチンレシピエントの先天性免疫応答および／または適応的免疫応答に関連するＴｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）と相互作用することができる。少なくとも１０種のＴＬＲが存在する（Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００３）２１：３３５−７６を参照のこと）。ＴＬＲ８およびＴＬＲ１０以外の一定のＴＬＲと相互作用し、その後に活性化する１つまたは複数のリガンドが同定されている。髄膜炎菌の外膜タンパク質（例えば、ＯＭＰ２）（ＰｏｒＢともいわれる）はＴＬＲ２と相互作用する一方で、ほとんどであるが全てではないグラム陰性細菌のＬＰＳはＴＬＲ４と相互作用する。したがって、本明細書中に記載のワクチン処方物が生物学的作用に寄与し得る１つの実施形態には、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４の一方または両方の活性化が含まれる。しかし、本発明の別の態様では、他のＴＬＲ（ＴＬＲ２およびＴＬＲ４以外）の活性化が類似の機能を果たすか、発現したサイトカインの定性的および／または定量的プロフィールをさらに増強することができ、宿主Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫応答に関連し得ることが同様に可能である。
【００５２】
１つまたは複数のＴＬＲの定性的および／または定量的活性化は、ヒト抗体応答が付随するか付随せずにＴｈ１および／またはＴｈ２免疫応答の相対的刺激（均衡または不均衡）を誘発するか影響を与えると予想される。
【００５３】
ＴＬＲ２およびＴＬＲ４以外のＴＬＲと相互作用するリガンドを、本明細書中に記載のワクチン組成物で使用することもできる。本明細書中に記載のように、このようなワクチン成分を単独または組み合わせて使用して、アミロイド形成疾患の治療または防御に十分な宿主免疫応答の発生に影響を与えることができる。このようなＴＬＲおよび関連リガンドには、リスト１に示すリガンドが含まれるが、これらに限定されない。
【表Ａ−１】
2008504299.tif 000003
【００５４】
【表Ａ−２】
2008504299.tif 000004
【００５５】
同定されたＴＬＲ（リスト１）のいずれか１つまたは組み合わせを、本明細書中で意図されるワクチンのＴＬＲリガンド成分のいずれか１つまたは組み合わせによって活性化することができる。ＴＬＲのいずれか１つまたは複数を投与経路（例えば、鼻腔内、注射など）に適切な濃度のＴＬＲリガンドのいずれか１つまたは複数を使用して刺激することがさらに認識される。
【００５６】
したがって、本発明によれば、ワクチン処方物は、外因的にリポポリサッカリド成分を含むか含まない、抗原ワクチン成分と組み合わせた（任意選択的に、ＣＤ１４レセプターを含む）ＴＬＲリガンドのいずれか１つまたは複数（組換えリガンド（その融合タンパク質またはフラグメント）が含まれる）を含み得ると理解される。
【００５７】
本発明の１つの態様では、ＴＬＲリガンドのいずれか１つまたは複数のＴＬＲ結合部分のみを、例えば、組換えＤＮＡテクノロジーによって単離することができ、アルツハイマー病または類似の疾患もしくは障害の治療上の処置および／または予防としてＧＡを配合するか配合しない。このようなポリペプチドを、当業者に周知の１つまたは別の合成手順によって調製することもできる。理論に拘束されることを望まないが、１つのこのような単離結合ドメインを、ＴＬＲ２への結合が疑われるポリンＢと呼ばれる髄膜炎菌外膜タンパク質の一部から単離することができる。ＴＬＲの他のこのようなポリペプチドリガンド結合ドメインを、単独または１つまたは別の組み合わせにて類似の様式で使用することもできる。プロテオソーム−ＧＡ処方物の投与を必要とするか必要とせずにこのような処方物を使用することができるか、プロテオソーム−ＧＡ処方物の投与後に使用することができる。変異形がＴＬＲに結合（および活性化）する能力を維持する限り、このようなＴＬＲリガンドのＴＬＲ結合部分の変異形（例えば、保存的アミノ酸置換）を使用してＴＬＲを活性化することができると認識される。本発明のさらなる態様では、このようなＴＬＲリガンドのＴＬＲ結合部分を組換えＤＮＡテクノロジーを使用して１回または複数回繰り返して、このような結合部分の複数のコピーを含むポリペプチドまたは同一もしくは異なるＴＬＲリガンドの多結合ドメインを含む多価（すなわち、ハイブリッド）ポリペプチドを調製することができる。
【００５８】
一定のプロテオソームベースの組成物では、ワクチン処方物の１つまたは複数の構成部分はに共有結合的に複合体化される必要はないが、むしろ、プロテオソーム組成物（例えば、ＩＶＸ−９０８、プロトリン）と混合することができる。プロジュバント（Ｐｒｏｊｕｖａｎｔ）と呼ばれるプロテオソームベースの組成物は、少量の内因性ＬＰＳ（またはリポオリゴサッカリド（ＬＯＳ））のみを含む一方で、ＩＶＸ−９０８／プロトリンプロテオソームベースの組成物は、ＯＭＰ成分と同一であるか異なるグラム陰性細菌種に由来し得るさらなる外因性ＬＰＳを含むか、１つを超えるグラム陰性細菌由来のＬＰＳの混合物であり得る。
【００５９】
１つの実施形態では、総プロテオソームタンパク質の重量％としての最終リポサッカリド含有量は、約１％〜約５００％の範囲、より好ましくは約２０％〜約２００％の範囲、約３０％〜約１５０％の範囲、または約１０％〜約１００％の範囲であり得る。本発明の好ましい実施形態は、プロテオソームベースの組成物を髄膜炎菌から調製し、最終リポサッカリド含有量が総プロテオソームタンパク質の５０重量％〜１５０重量％である免疫刺激組成物である。最終ＬＰＳ含有量を、内因性ＬＰＳ（例えば、ＬＯＳ）と外因的に添加したＬＰＳ（またはＬＯＳ）との組み合わせと示すことができる。別の実施形態では、プロテオソームベースの組成物（例えば、プロジュバント）を、総ＯＭＰの約０．５％から約５％までの範囲の髄膜炎菌由来の内因性リポオリゴサッカリド（ＬＯＳ）含有量を使用して調製する。本発明の別の実施形態により、総ＯＭＰの約１２％〜約２５％の範囲、好ましい実施形態では約１５％と約２０％の間の範囲の内因性リポサッカリドを含むプロテオソームが得られる。本発明はまた、プロテオソーム供給源である同一のグラム陰性細菌種または異なる細菌種に由来し得る任意のグラム陰性細菌種由来のリポサッカリドを含む組成物を提供する。
【００６０】
米国特許第６，４７６，２０１号は、全身（血清）および粘膜（呼吸器および腸が含まれる）抗体応答の両方を誘導するための非経口投与または粘膜投与のいずれかのためのプロテオソーム両親媒性決定基ワクチンの産生および製造に関する。粘膜投与が好ましく、呼吸器（例えば、鼻腔内、咽頭内、および肺内が含まれる）、胃腸管（例えば、経口または直腸が含まれる）、または局所（例えば、結膜または耳）への投与が含まれるが、これらに限定されない。両親媒性決定基は、プロテオソームを適切に配合した場合にプロテオソームと組み合わされて被験体における免疫応答を誘発する複合体を形成する疎水性領域および親水性領域を有する分子である。典型的な両親媒性決定基には、糖脂質、リポサッカリド（解毒リポ多糖類が含まれる）、リポペプチド、膜貫通タンパク質、エンベロープタンパク質、もしくはトキソイド化（ｔｏｘｏｉｄｅｄ）タンパク質、または内因性疎水性アミノ酸アンカーのタンパク質もしくはペプチドが含まれる。これらの決定基材料を、グラム陰性細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａが含まれる）から得ることができる。より詳細には、髄膜炎菌外膜タンパク質プロテオソーム調製物（髄膜炎菌、淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、または他のナイセリア属の任意の株から調製される）が天然または解毒した赤痢菌属またはナイセリアのリポポリサッカリドまたはリポオリゴサッカリドと非共有結合的に複合体化してワクチンを形成するプロテオソームワクチンを、複合体のいずれかの構成成分を含むグラム陰性細菌（髄膜炎菌または赤痢菌が含まれる）に起因する疾患から防御するためにデザインする。より詳細には、プロテオソームワクチンは、Ｓｈｉｇｅｌｌａリポポリサッカリドの型特異的体細胞ポリサッカリドＯ抗原を認識する抗体応答を誘導し、それにより、細菌性赤痢に対する相同的保護を付与するＬＰＳを含む。プロテオソームと複合体化した場合、リポポリサッカリドは、抗ｓｈｉｇｅｌｌａ防御免疫応答を誘導する。Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ（または３ａなど）、Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉなどに起因する細菌性赤痢に対する相同免疫を付与するための相同的または抗原的交差反応生物由来のＬＰＳを使用して、プロテオソームワクチンを、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ疾患に対する免疫のためのＳｈｉｇｅｌｌｅａ  ｓｏｎｎｅｉまたはＰｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ  ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ疾患に対する免疫のためのＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａなどから調製および精製する。さらに、米国特許第６，４７６，２０１号は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ疾患用）およびＰｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ  ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓまたはＳｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ疾患用）由来の赤痢菌ＬＰＳ抗原を使用した独立して作製された２つのプロテオソームワクチンを共に投与し、それにより、２つの生物を認識する抗体が誘導され、それにより、２つの疾患型��対する防御が付与されるという点で多価であるプロテオソーム−赤痢菌ワクチンの投与を記載している。さらに、Ｂ群２ｂ型髄膜炎菌由来のプロテオソームを、中空糸ダイアフィルトレーションテクノロジーを使用してＰｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ  ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ  ＬＰＳと複合体化して粘膜呼吸器および／または胃腸管経路によって投与されるワクチンを産生し、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉの体細胞Ｏ抗原ＬＰＳを認識する抗体を誘導するプロテオソーム−赤痢菌ＬＰＳワクチンを使用して細菌性赤痢から防御する。
【００６１】
例示であるが制限されない本発明のプロテオソームベースの組成物は、髄膜炎菌外膜タンパク質（プロテオソーム）と外因的に添加したＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉから調製したＬＰＳとの非共有結合処方物であるプロテオソームベースの粘膜アジュバントＩＶＸ−９０８（プロトリン）である。
【００６２】
（処方物および投与）
以下に、交換可能に使用することができる、用語「生理学的に許容可能なキャリア」および「薬学的に許容可能なキャリア」は、生物が著しい炎症を引き起こすことがなく、且つ投与した化合物の生物活性および性質を排除しないキャリアまたは希釈剤をいう。
【００６３】
本明細書中の用語、「賦形剤」は、有効成分の投与を容易にするために薬学的組成物に添加される不活性物質をいう。賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖型およびデンプン型、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、およびポリエチレングリコールが含まれるが、これらに限定されない。
【００６４】
薬物の処方および投与技術を、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎに見出すことができる。
【００６５】
適切な投与経路には、例えば、経口、直腸、経粘膜、経鼻、腸、または非経口の送達（筋肉内、皮下、および脊髄内への注射が含まれる）、髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または癌内への注射が含まれ得るが、プロテオソームの好ましい投与経路は鼻腔内である。
【００６６】
サブミクロンのエマルジョンまたはナノエマルジョン中にプロテオソームベースの組成物を含むＧＡ処方物を、非経口、経口、鼻腔内、または局所的に投与するか、本明細書中に示すように、任意のその組み合わせにおいて投与することができる。にもかかわらず、一定の実施形態では、非経口または粘膜に投与することが好ましい。
【００６７】
二投与経路または多投与経路も本明細書中に含まれる。二投与経路には、例えば、プロテオソームベースの調製物を調製して鼻腔内に投与するが、ＧＡとは別に投与し、ＧＡはプロテオソームの鼻腔内投与と同時または異なる時間に注射によって投与することができることが含まれ得る。プロテオソーム（プロジュバント）またはプロテオソーム：ＬＰＳ（すなわち、ＩＶＸ−９０８）組成物（ＧＡは存在しない）を、ＧＡと同時または別の注射によって投与することができる。注射のために、本発明の有効成分を、生理学的に許容可能なキャリア、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液、または生理食塩水などの生理学的に適合する緩衝液中で処方することができる。経皮投与および場合によっては経粘膜投与のために、バリアを透過するのに適切な浸透剤を処方で使用することができる。このような浸透剤は、一般に、当該分野で公知である。
【００６８】
経口投与のために、化合物を、当該分野で周知の薬学的に許容可能なキャリアとの活性化合物の組み合わせによって容易に処方することができる。このようなキャリアにより、本発明の化合物を、患者が経口摂取するための錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリーおよび、懸濁液などに処方することができる。経口用の薬学的調製物を、固体賦形剤を使用して任意選択的に得られた混合物の磨砕により作製し、所望ならば適切な助剤を添加後に粒子混合物を処理して錠剤または糖衣錠コアを得ることができる。適切な賦形剤は、特に、糖（ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールが含まれる）などの充填剤；セルロース調製物（例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなど）；および／または生理学的に許容可能なポリマー（ポリビニルピロリドンなど）である。所望ならば、崩壊剤（架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）など）を添加することができる。
【００６９】
鼻投与のために、本発明で使用される有効成分を、例えば、適切な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、または二酸化炭素）を使用した加圧パックまたは噴霧器からのエアゾールスプレーの形態で都合良く送達させることができる。加圧エアゾールの場合、投薬単位を、一定量を送達させるためのバルブを装着することによって決定することができる。例えば、調剤で使用するためのゼラチン製のカプセルおよび薬包を、化合物の粉末混合物およびラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤を含むように処方することができる。
【００７０】
本明細書中に記載の調製物を、例えば、ボーラス注射または持続注入による非経口投与のために処方することができる。注射用処方物を、単位投薬形態（例えば、任意選択的に防腐剤を添加したアンプルまたは複数回投与用コンテナ）に入れることができる。組成物は、油性または水性賦形剤を含む懸濁液、溶液、または乳濁液であってよく、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤などの処方剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）を含み得る。
【００７１】
本発明の薬学的組成物を、被験体の体内のいたるところ（特に、脳内）に存在するアミロイド（例えば、Ａβ）の産生および／またはその沈着に関連する疾患の予防および／または治療上の処置のために投与することができる。治療への適用では、薬学的組成物を、既に罹患しており、且つ治療を必要とする哺乳動物に投与する。薬学的組成物を、Ａβの
斑へのさらなる沈着および／または既に形成していることが明らかな斑を阻害または減少させ、そして／または既存のＡβ凝集体の除去を刺激し、そして／または斑内に含まれないかもしれないＡβの減少を刺激するのに十分な量で投与する。これを達成するための適量を、「治療有効用量または治療有効量」と定義する。
【００７２】
予防への適用のために、本発明の薬学的組成物を、アミロイド関連疾患（例えば、Ａβ関連アルツハイマー病）に感受性を示すが、このような疾患に依然として罹患していない哺乳動物に投与する。このような哺乳動物被験体を、医学論文（例えば、Ｇｏａｔｅ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：７０４−７０６）に記載の遺伝子検査および臨床分析によって同定することができる。薬学的組成物は、例えば、症状が初期段階、好ましくは、β−アミロイド関連疾患の初期段階でさえも、Ａβの斑へのアミロイド沈着を阻害、防止、または減少させることができる。予防有効投薬量と呼ばれるこのような予防治療に必要な化合物の量は、一般に、治療上の処置のための上記量と同一であり得るが、必ずしもそうではない。
【００７３】
本明細書および添付の特許請求の範囲のために、用語「患者」、「被験体」、および「レシピエント」を、交換可能に使用する。これらには、予防、実験、または治療上の処置の対象物であるヒトおよび他の哺乳動物（例えば、ウシおよび他のウシ）が含まれる。
【００７４】
本明細書中で使用される、用語「治療」には、統計的に有意な様式での疾患の阻害、遅延、または進行の逆転、疾患の臨床症状の実質的な改善または疾患の臨床症状の出現の実質的な防止が含まれる。
【００７５】
処置すべき容態の重症度および反応性に依存して、１つまたは複数の部位または送達手段で１回または複数回投与することができ、治療単位を数日から数週間または治癒するか病状の統計的に有意な縮小が達成されるまで継続する。投与すべき治療量は、勿論、治療を受ける被験体、苦痛の重症度、投与様式、主治医の判断などに依存する。統計的有意性の計算方法は、関連分野で公知である。
【００７６】
ＭＳの「治療」は、自己免疫攻撃の寛解および自己免疫組織の破壊の防止または遅延による、多発性硬化症の任意の発現、臨床的または準臨床的（例えば、組織学的）症状の防止または遅延のための治療、およびその発現後の症状の治療による抑制または緩和を含むことが意図される。自己免疫攻撃または自己免疫反応の「寛解」、「抑制」、または「減少」は、攻撃または反応の１つまたは複数の症状の部分的軽減または改善を含む。「免疫反応」の「実質的に」増加した抑制効果（または寛解もしくは軽減）は、ＭＳの１つまたは複数のマーカーまたは組織学的もしくは臨床的指標の有意な減少を意味する。制限されない例は、四肢麻痺スコアの少なくとも１単位の減少である。
【００７７】
ＭＳの治療のために、ＧＡを、一般に、０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ／日の用量で投与する。１つの実施形態では、０．５〜５０ｍｇの範囲の投薬量を使用する。しかし、本発明の１つの態様によれば、本明細書中に記載の１つまたは複数のアジュバント（またはその混合物）を、ＧＡを含む組成物に配合して使用することができ、それにより、ＧＡのより低いまたはより高い用量または投与頻度での使用が可能になり、必ずしもＧＡの用量のみが影響を与えるとは限らないと予想される。
【００７８】
有効投薬量範囲および至適量の確立は、この項で与えられた情報を考慮すれば十分に当業者の範囲内である。例えば、哺乳動物の投薬量（特に、ヒトへの投薬量）を、比較的低用量のＧＡ（例えば、１ｍｇ／日）から開始して、段階的に増加させ（例えば、対数的に）、治療に対する生体反応を測定すること（例えば、（ｉ）調節細胞（ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋）の誘導の測定（Ｃｈｅｎ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：１２３７（１９９４））、（ｉｉ）循環Ｔ細胞上のクラスＩＩ表面マーカーの減少の測定、（ｉｉｉ）ＴＧＦ−β発現細胞数または検出可能なＴＧＦ−βの相対量の測定、（ｉｖ）血中の免疫攻撃Ｔ細胞の数および活性化の評価（例えば、限界希釈分析および増殖能力による）、または（ｖ）周知の採点法による疾患重症度の採点（例えば、攻撃、関節の腫れ、握力、硬直、視力、投薬を減少または中断する能力による））によって至適化する。有効投薬量は、３つのマーカーのうちの１つを少なくとも統計的または臨床的に有意に軽減させる任意の用量、好ましくは、投与研究時のＭＳに特徴的な少なくとも１つの症状を軽減させる任意の用量である。
【００７９】
ＭＳの疾患重症度を、疾患型に依存した周知の方法にしたがって評価することができる。このような方法には、以下が含まれるが、これらに限定されない：長期にわたる攻撃の重症度および数；身体障害の進行性の蓄積（例えば、拡大障害状態尺度によって測定することができる）；脳内病変の数および範囲（例えば、核磁気共鳴映像法によって明らかとなる）；および自己反応性Ｔ細胞の頻度。
【００８０】
ここに本発明を一般的に記載したが、以下の実施例を参照して本発明がより容易に理解され、実施例は例示を目的として記載し、明記しない限り、本発明を制限することを位としない。
【実施例】
【００８１】
アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）トランスジェニックマウスを、ミエリン希突起神経膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）ペプチド（アミノ酸３５〜５５）を含むフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）で免疫し、その後に百日咳毒素（ＰＴ）を投与（注射）して、その非トランスジェニック同腹子と比較した実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）に対する感受性を決定した。コントロールとして、動物を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはヒトβ−アミロイドペプチド（Ａβアミノ酸１〜４０）で免疫した。ＡＰＰトランスジェニック動物（（Ｍｕｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（７７７）８２−８８（１９９６））およびその非トランスジェニック同腹子で同一の程度にＥＡＥが発症し、Ａβ１−４０またはＢＳＡで免疫した動物ではＥＡＥは認められなかった。しかし、神経病理学的に脳を試験した場合、ＥＡＥを発症した動物でのＡβ染色は少なかった。チオフラビンＳを使用した海馬に置けるＡβ原線維の染色量の定量により、ＭＯＧ免疫したマウスではコントロールと比較して９２％減少し（ｐ＝０．００１）、Ａβ１−４０で免疫したマウスと比較して７３％減少した（ｐ＝０．０３）（表１、図１を参照のこと）。ＥＬＩＳＡによる総脳Ａβ含有量の定量により、ＭＯＧ免疫したマウスではコントロール群と比較して９４％減少し（ｐ＜０．００１）、Ａβ１−４０で免疫したマウスと比較して８６％減少した（ｐ＝０．０３）（表１、図１を参照のこと）。
【００８２】
ＭＯＧ誘導性ＥＡＥに対する効果が固有であるかどうかを決定するために、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）ペプチド（アミノ酸１３９〜１５１）を含むＣＦＡでＥＡＥを誘導した。ＰＬＰ誘導性ＥＡＥ動物においてＡβ原線維染色の７６％減少およびＡβレベルの７０％減少が認められた（ｐ＜０．０２）（表２、図３Ａを参照のこと）。ＰＬＰでＥＡＥを誘導するために、Ｈｓｉａｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４（５２８４）：９９−１０２（１９９６）に記載のＢ６／ＳＪＬバックグラウンドを有するＴｇ２５７６マウスを使用した。ＭＯＧ−ＥＡＥを誘導するためのＭｕｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（７７７）８２−８８（１９９６）に記載のＴｇ２５７６マウスおよびＪ２０免疫したマウスで類似の結果が見出された（表１を参照のこと）。これらの結果は、所見がＥＡＥ誘導に使用した抗原、研究したＡＤの動物モデル、動物の遺伝的背景、性別（５０％雄／雌）に関連しないことを証明している。ＢＳＡを含むＣＦＡで免疫した動物に変化は認められなかった。１６月齢を超えるＴｇ２５７６マウスと比較した場合、１３月齢を超えるＪ２０マウスにおける総Ａβ（アミロイド）負荷が相違しないことに注目すべきである。
【００８３】
動物をＣＦＡ中に配合したＡβペプチドで免疫したマウスＡＤモデルの治療についての以前の免疫アプローチ研究では、抗凝集βアミロイド抗体は、アミロイド負荷の減少におけるインビトロでのＳｏｌｏｍｏｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９４：４１０９−１２（１９９７）に記載の役割およびインビボでのＷｅｉｎｅｒ，Ｈ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ４８，５６７−７９（２０００）およびＳｃｈｅｎｋ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４００，１７３−７（１９９９）に記載の役割の両方を有することが認められ、その活性は、ＡβのＮ末端領域中の特定のエピトープに関連する（Ｆｒｅｎｋｅｌ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ  ８８，８５−９０（１９９８）およびＦｒｅｎｋｅｌ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７，１１４５５−９（２０００））。ＭＯＧまたはＰＬＰで免疫した動物におけるＡβに対する抗体レベルを測定して、Ａβで免疫した動物と比較してＡβとの交差反応性およびＡβ抗体の力価が存在するかどうかを決定した。表１および２に示すように、ＭＯＧまたはＰＬＰで免疫した動物中に抗Ａβ抗体は検出されなかった。抗体が役割を果たさないことを決定的に確立するために、μＭＴ  Ｂ細胞欠損マウスと交配した１６月齢のＪ２０マウスを、ＭＯＧ３５〜５５を含むＣＦＡで免疫し、その後に百日咳毒素を投与した。表１および図１に示すように、μＭＴ  Ｂ細胞欠損ＡＰＰ＋マウスは、ＴｈＳ染色（ｐ＜０．００１）または総脳アミロイドについてのＥＬＩＳＡ（ｐ＜０．００１）のいずれかによって測定したところ、コントロールと比較してアミロイドが９０％減少した。これらの結果は、ＭＯＧ免疫後のＡβの減少が抗体と無関係の機構によって起こることを示す。
【００８４】
以前の研究により、活性化小膠細胞はインビボでのＡβのクリアランスで重要な役割を果たし得ることが示唆されている（Ｓｃｈｅｎｋ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４００，１７３−７（１９９９），Ｒｏｇｅｒｓ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｉａ  ４０，２６０−９（２００２），Ｍｉｔｒａｓｉｎｏｖｉｃ，Ｏ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ  ２４，８０７−１５（２００３），Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｓ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  １６１，１２７−３８（２０００），Ｂａｃｓｋａｉ，ＢＪ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２２，７８７３−８（２００２），Ｎｉｃｏｌｌ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，４４８−５２（２００３），Ａｋｉｙａｍａ，Ｈ．＆  ＭｃＧｅｅｒ，Ｐ．Ｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １０，１１７−８；ａｕｔｈｏｒ  ｒｅｐｌｙ  １１８−９（２００４））。活性化小膠細胞（または小膠細胞様細胞）を、脳の外側（すなわち、末梢）に由来するか起源とすることに基づいてさらに区別することができる（好中球およびマクロファージなど）。脳由来小膠細胞を末梢好中球およびマクロファージに区別する手段は、当該分野で公知である。Ａβクリアランスにおける小膠細胞活性化の潜在的役割を調査するために、ＭＯＧ／ＣＦＡで免疫したＡＰＰｔｇマウスの脳を、ＣＤ１１ｂ（活性化小膠細胞のマーカー）で染色した。図３Ａおよび４ならびに表４に示すように、ＡＰＰｔｇＭＯＧ免疫したマウスの免疫染色により、アミロイド斑と同時局在化した活性化小膠細胞数の増加が明らかとなった（３４９±３４．３細胞／海馬領域）（表４）。ＢＳＡ／ＣＦＡで免疫したコントロール動物での染色は最小でしかなかった（７６±１７細胞／海馬領域）（表４）。Ａβ／ＣＦＡで免疫した動物では、中程度のレベルの小膠細胞活性化が認められた（１０６±２７細胞／海馬領域）。さらに、μＭＴ  Ｂ細胞欠損マウス（ｐ＜０．００１）およびＰＬＰで免疫された動物（ｐ＜０．００１）での小膠細胞活性化レベルの増加が認められた（図３Ａ、表４）。
【００８５】
直前に記載した第１の実験によれば、ＭＯＧ／ＰＬＰ＋ＣＦＡの投与（その後の百日咳毒素の投与）は、Ａβの減少に関連するが、望ましくないＥＡＥを同時に発症した。これらの実験では、百日咳毒素を使用して、脳へのＣＦＡ配合化合物の送達のために血液脳関門を開かせる。したがって、Ａβの減少がＥＡＥの誘導に直接関連するかどうかを評価するために、そしてＭＳ関連ＥＡＥに関してＭＯＧ、ＰＬＰ、およびＧＡを研究しているので、アラニン、リジン、グルタミン酸、およびチロシンのランダムなアミノ酸コポリマーであり、ＥＡＥの抑制に有効であり、且つＭＳの再発形態の治療のために承認されており、且つ広く使用されている治療薬である（Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ  Ｓｕｐｐｌ  ４９，８５−９１（１９９７））酢酸グラチラマー（ＧＡ）を使用したＡＰＰマウスの免疫効果を評価した。
【００８６】
最初に実施されたように、本明細書中に提供した一定の抗原／アジュバント混合物の投与後に百日咳毒素を投与（注射）したにもかかわらず、百日咳毒素を投与することなく本明細書中に記載の一定の他の組成物を投与することができることが完全に認識される。実際、百日咳毒素を投与することなく、ＧＡを含むか含まないＩＶＸ−９０８などのプロテオソームベースの組成物を投与する。実際、本明細書中に記載の任意のプロテオソームベースの組成物の鼻送達のために、常に百日咳毒素を使用しなかった。
【００８７】
したがって、マウスを、１００μｇＧＡを含むＣＦＡで免疫し（足蹠注射による）、その直後および４８時間後に１５０ｎｇの百日咳毒素をｉ．ｐ．注射した。免疫後５０日目に、マウスを屠殺した。酢酸グラチラマーでの免疫により、未処置コントロールに対して海馬領域中のアミロイド原線維は９２％減少し（ｐ＜０．０１）、総アミロイド負荷が７０％減少した（ｐ＜０．０１）（表１、図１を参照のこと）。ＧＡ／ＣＦＡ＋百日咳毒素で免疫した動物で臨床的ＥＡＥは認められなかった。
【００８８】
ＣＦＡをヒト被験体に投与することができないので、ＣＦＡ以外のアジュバントを使用したマウスＡＤモデルにおける酢酸グラチラマーでの鼻ワクチン接種効果を調査した。動物に酢酸グラチラマーを単独か粘膜アジュバントと共に鼻に投与して処置した。ヒト（Ｆｒｉｅｓ，Ｌ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６９：４５４５−５３（２００１））およびマウス（Ｐｌａｎｔｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０，２１８−２５（２００１））の両方で使用されている、髄膜炎菌外膜タンパク質（プロテオソーム）およびＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来のＬＰＳの非共有結合処方物から構成されるプロテオソームベースの粘膜アジュバントＩＶＸ−９０８（プロトリン）を調製した。第１週目にマウスをプロテオソームアジュバントで複数回処置し、その後の５週間毎週追加免疫し、その後に神経病理学的分析を行った。コントロールとして、動物の鼻をＩＶＸ−９０８＋ＢＳＡ、ＩＶＸ−９０８のみ、またはＧＡのみで処置した。予想外に、ＩＶＸ−９０８を配合したＧＡの鼻投与により、海馬中のチオフラビン陽性線維性アミロイドが８４％減少し（コントロールに対してｐ＜０．００１）、ＩＶＸ−９０８のみと比較して７０％減少した（ｐ＜０．０１）（表３）。脳Ａβレベルに関しては、酢酸グラチラマーを含むＩＶＸ−９０８の鼻投与後に７３％減少し（コントロールに対してｐ＜０．００１）、ＩＶＸ−９０８のみを使用して４５％減少した（ｐ＜０．００２）（表３、図２）。さらに、処置動物中のアミロイド斑周辺に活性化小膠細胞が検出された。ＧＡのみの鼻投与はＡβ原線維に影響を与えなかったが、脳内の総Ａβレベルがわずかに減少した（コントロールに対してｐ＝０．０４４）。ＢＳＡ＋ＩＶＸ−９０８またはＩＶＸ−９０８のみの鼻投与により、総アミロイド負荷が５０％減少したが（コントロールに対してｐ＝０．０２）、線維性Ａβ染色に効果はなかった。ＣＦＡ注射と対照的に、ＩＶＸ−９０８のみまたはＧＡもしくはＢＳＡとの処方物の鼻投与は、これらの実験でのいかなる動物においてもＥＡＥを誘導しなかった。
【００８９】
以下のいずれの免疫プロトコールにおいても、ＡＰＰ非トランスジェニックマウスの小膠細胞活性化は見出されなかった：ＣＦＡ／ＰＴ＋ＧＡの非経口投与、ＩＶＸ−９０８＋ＧＡの鼻投与（図３Ｂを参照のこと）、またはＩＶＸ−９０８のみの鼻投与。これらの結果により、ＩＶＸ−９０８を配合したＧＡまたはＩＶＸ−９０８のみの投与（免疫）後の小膠細胞の活性化が、活性化のために内因性小膠細胞を準備刺激するのに役立ち得るアミロイド沈着の存在に依存し得ることが示唆される。
【００９０】
ＧＡとＡβとの間の交差反応性が知られておらず、且つ、ＧＡ処置動物またはＥＡＥ動物のいずれにも抗Ａβ抗体が認められないにもかかわらず、ＧＡ＋ＩＶＸ−９０８での免疫によってＡβ反応性Ｔ細胞を準備刺激することができることが可能である。Ａβ（１〜４０）での脾臓Ｔ細胞の刺激によってＧＡ＋ＩＶＸ−９０８で毎週７週間処置した後に（その時点で実験を終了する）、Ｔ細胞増殖応答およびサイトカイン産生（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６）を測定した。増殖によって測定したところ、Ａβ反応性Ｔ細胞の準備刺激は見出されなかった：以下についての１分間あたりのＡβ数：未処置＝３３１５±１６８２ｃｐｍ；ＧＡ＋ＩＶＸ−９０８＝４５１６±１４１２ｃｐｍ（バックグラウンド数は、１００〜３００であった）。刺激指標（ＧＡ＋ＩＶＸ−９０８／未処置）＝１．３７；２．５を超える最小刺激指標は、陽性と見なす。さらに、これらの培養物においてバックグラウンドを超えるＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６の分泌は見出されなかった。抗体産生にはＴ細胞の補助が必要であるので、Ａβに対するこのＴ細胞応答の欠如は、抗Ａβ抗体が検出されなかったことと一致する。同様に、ＥＡＥ動物におけるＡβに対する準備刺激は見出されなかった。
【００９１】
海馬以外の他の脳部位に対するＧＡ＋ＩＶＸ−９０８処置の効果を試験するために、嗅球および小脳を調査した。Ａβ、ＣＤ１１ｂ、およびフィブリノゲンについて嗅球を染色し、海馬で認められた結果と類似の結果を得た（図８）。ＧＡ＋ＩＶＸ−９０８の鼻投与後、コントロールと比較して活性化小膠細胞数が増加していることが見出された。ＥＡＥ動物でも活性化されたが、フィブリノゲン染色によって測定したところ、血液脳関門（ＢＢＢ）の漏れに関連していた。
【００９２】
小脳を試験した場合、ＧＡ＋ＩＶＸ−９０８処置動物において小膠細胞染色活性化の増加は見出されず、活性化の増加はＡβ沈着領域に制限されることが示唆された。さらに、ＧＡ＋ＩＶＸ−９０８後の非トランスジェニック同腹子の脳内のどこにも小膠細胞の活性化は認められず、活性化の増加がＡβ沈着領域に制限されることがさらに証明された（図３ｂを参照のこと）。
【００９３】
認められたクリアランス機構をより深く理解するために、脳小膠細胞とは対照的に末梢由来の活性化マクロファージ上で高度に発現されるＣＤ６８発現を染色した。図９に示すように、ＧＡ＋ＩＶＸ−９０８で処置した動物と比較してＥＡＥ動物でＣＤ６８がより染色された。この染色パターンは、脈絡叢から脳実質（小脳および皮質が含まれる）へのマクロファージの移動を示す。ＧＡ＋ＩＶＸ−９０８処置では、主に脈絡叢腔でＣＤ６８発現が増加する。これにより、ＥＡＥ動物におけるＡβクリアランスの担うＣＤ１１ｂ＋細胞が末梢からＣＮＳに移動して神経毒性に関連するのに対して、ＧＡ＋ＩＶＸ−９０８処置動物におけるＣＤ１１ｂ＋細胞は主に内因性小膠細胞であり、Ａβクリアランスに関連するが、直接有毒である証拠はないことが示唆される。この解釈のさらなる裏付けとして、本発明者らは、ＥＡＥ動物の小脳でＣＤ６８＋細胞の発現が増加するが、ＧＡ＋ＩＶＸ−９０８処置動物または未処置動物では増加しないことを見出した（示さず）。さらに、ＧＡ＋ＩＶＸ−９０８処置後に、アミロイドが蓄積された領域のみで活性化ＣＤ１１ｂ＋細胞が見出された。
【００９４】
表４および図４に示すように、海馬中のＡβ原線維の減少は、ＣＤ１１ｂ染色によって示されるように、両方の活性化小膠細胞数の増加と強く相関した（ｒ＝−０．７  ＣＤ１１ｂ対Ａβ原線維およびＩＦＮ−γ対Ａβ原線維）。ＣＤ１１ｂ＋細胞とＩＦＮ−γ細胞との間の強い相関が存在し、コントロールと比較して処置動物でマクロファージコロニー刺激因子レセプター（Ｍ−ＣＳＦＲ）に免疫反応を示す小膠細胞数の増加が認められた（ｐ＜０．０２）（表４）。海馬領域中のＴＧＦ−βおよびＡβ原線維の減少が認められた（ｒ＝０．９１）。コントロールとＧＡ＋ＩＶＸ−９０８処置動物との間でＩＬ−１０免疫反応細胞の有意な変化は認められなかったが、ＥＡＥ動物のＩＬ−１０はコントロールより少なかった。
【００９５】
ＧＡ＋ＩＶＸ−９０８での処置によって神経細胞傷害性または他の潜在的な負の効果が誘導されるかどうかを評価するために、以下の実験を行った：ｉ）ＧＦＡＰレベル（神経細胞の損傷と一致する星状細胞増加症の基準）の決定、ｉｉ）ＳＭＩ３２レベル（神経フィラメントのリン酸化のマーカーであって、神経細胞の損傷と共に増加することが知られている）の測定、ｉｉｉ）アポトーシス性細胞死測定の基準としてのＴＵＮＥＬアッセイの実施、およびｉｖ）ｉＮＯＳ（神経細胞ストレス条件下でアップレギュレーションされることが示されている酵素）レベルの決定。
【００９６】
ＧＦＡＰアッセイの結果は、未処置のコントロール動物で星状細胞増加症が起こることを示す（ＧＦＡＰ＋細胞によって測定された海馬中の活性化星状細胞領域）（図５）。ＧＡ＋ＩＶＸ−９０８を鼻投与した場合に星状細胞増加症が軽減された（３．１％；ｐ＝０．０３９対コントロール）。対照的に、ＥＡＥ動物では星状細胞増加症は軽減されなかった。これらの結果は、ＥＡＥがＡβ沈着物の減少にも関連するにもかかわらず、ＧＡ＋ＩＶＸ−９０８での処置の結果としてのＡβクリアランスが、ＥＡＥ動物で見出されるＡβクリアランスよりも毒性が低い（星状細胞増加症に関連する）ことを示す。
【００９７】
ＳＭＩ３２を測定する実験の結果（図６）は、異常な卵形のＳＭＩ３２陽性細胞が未処置コントロール動物の老人斑に関連することを示す。ＥＡＥ動物は、（老人斑が認められないが）小脳が含まれる脳全体の異常な卵形のＳＭＩ３２陽性細胞（炎症に関連する）の増加を示す。対照的に、ＧＡ＋ＩＶＸ−９０８で処置した動物は、老人斑に関連するＳＭＩ３２陽性細胞数が減少する。これらの実験により、ＳＭＩ３２によって測定したところ、ＧＡ＋ＩＶＸ−９０８処置は毒性に関連しないことが示唆される。
【００９８】
標準的なＴＵＮＥＬアッセイを使用したアポトーシス性細胞死を測定する実験の結果（図６）は、コントロール動物ではＴＵＮＥＬ染色は認められず、ＥＡＥ動物の皮質ではＴＵＮＥＬ染色が増加することを示す。ＧＡ＋ＩＶＸ−９０８処置動物ではＴＵＮＥＬ染色は認められなかった。さらに、ｉＮＯＳを測定するアッセイは、ｉＮＯＳはＥＡＥマウスでアップレギュレーションされるが、ＧＡ＋ＩＶＸ−９０８で処置した動物ではアップレギュレーションされないことを示す。ＧＡ＋ＩＶＸ−９０８処置動物またはＥＡＥ動物のいずれにおいても血管構造の損傷は認められなかった。
【００９９】
まとめると、これらのデータは、ＥＡＥ動物およびＧＡ＋ＩＶＸ−９０８で処置した動物においてＡβのクリアランスが認められたにもかかわらず、後者は神経細胞毒性に関連しないことを示す（表４および図６）。
【０１００】
しかし、ＩＶＸ−９０８のみでの免疫後の小膠細胞の活性化がＡβ沈着物の存在に必要なようであるにもかかわらず、このような免疫によってこのようなＡβ沈着物（活性化小膠細胞による）は除去されず、むしろ、総アミロイド負荷量が優先的に減少した。このような結果により、活性化することができる２つの小膠細胞集団が存在する可能性、または小膠細胞を異なる程度に活性化することができるという別の可能性（部分的または完全に、完全に活性化された小膠細胞が既存のＡβ斑を除去することができ、部分的に活性化された小膠細胞が可溶性Ａβペプチドの隔離（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）に関与する）を示唆することができる。可溶性Ａβが不溶性Ａβ斑に凝集するという考えを考慮して、ＩＶＸ−９０８のみでの処置により、Ａβ斑の持続的形成を遅延または防止することができ、これは、罹患被験体に有利である。
【０１０１】
表４および図３Ｂは、海馬中のＡβ原線維の減少が活性化小膠細胞数（ＣＤ１１ｂ＋免疫組織学的染色によって示される）およびＩＦＮ−γ分泌細胞数の増加に相関することを証明する。さらに、マクロファージコロニー刺激因子レセプター（Ｍ−ＣＳＦＲ）陽性小膠細胞数が増加した。マウスおよびヒトの小膠細胞上のＭ−ＣＳＦＲ発現の増加により、マクロファージスカベンジャーレセプターおよびＦｃＲγレセプターの小膠細胞発現の増加の両方によって凝集アミロイドの食作用が促進されると報告されている（Ｍｉｔｒａｓｉｎｏｖｉｃ，Ｏ．Ｍ．＆  Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．Ｍ．，Ｊｒ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ  ２４，８０７−１５（２００３））。しかし、μＭＴ  Ｂ細胞欠損マウス中のアミロイドのクリアランスにより、Ｍ−ＣＳＦＲ染色も増加し、それにより、認められた効果は、非Ｆｃ媒介機構を介する（Ｂａｃｓｋａｉ，ＢＪ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２２，７８７３−８（２００２））。ＩＦＮ−γの増加と関連して、ＴＧＦ−β発現が減少し、ＴＧＦ−βが可溶性Ａβを斑に凝集する能力を幾らか調整すると示唆され、さらに、ＴＧＦ−βがアミロイド沈着の増加に関連すると考えられる（Ｗｙｓｓ−Ｃｏｒａｙ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８９，６０３−６（１９９７））。ＴＧＦ−βの減少はまた、アミロイドクリアランスを促進し得る。ＩＬ−１０発現の有意な変化は認められなかった。小膠細胞の活性化はＴ細胞数の増加に関連する可能性があり、Ｔ細胞数とＩＦＮ−γ分泌細胞数とが相関したので、小膠細胞活性化の促進で役割を果たすかもしれない。
【０１０２】
これらの実験で検出されたＣＤ１１ｂ＋細胞は、活性化されたマクロファージまたは小膠細胞であるが、好中球ではないことを確認するために、サンプルを、Ｆ４／８０（活性化マクロファージおよび小膠細胞の表面上で検出することができるが、好中球（多形核白血球）上で検出することができない細胞表面構造）を認識するモノクローナル抗体と共にインキュベートした。Ｆ４／８０の発現は、マクロファージおよび小膠細胞の成熟とともに増加する。これらの実験の結果は、これらの実験で検出されたＣＤ１１ｂ＋細胞もＦ４／８０に対して陽性染色されることを示し（示さず）、それにより、これらのＣＤ１１ｂ＋細胞は活性化されたマクロファージまたは小膠細胞であるが、好中球ではないことを示す。さらに、Ｈ＆Ｅ染色（図４）によってＡβ斑と同時局在化したＣＤ１１ｂ＋細胞は、単核形態を有し、好中球に特徴的な多形核形態ではない。
【０１０３】
さらに別の一連の実験では、ＣＤ３染色によって決定したところ、ＧＡ＋ＩＶＸ−９０８の鼻投与後の小膠細胞の活性化は、Ｔ細胞数の増加に相関することを示した。これらの結果により、検出されたＴ細胞数とＩＦＮ−γ分泌細胞数の間に相関関係が存在するので（ｒ＝０．８８）（表４）、小膠細胞活性化の促進におけるＴ細胞の可能な役割が示唆される。さらに、ＴＧＦ−βはＡＰＰｔｇ−マウスにおいてＡβ原線維形成を増加または減少させることができると報告されている（Ｗｙｓｓ−Ｃｏｒａｙ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  ３８９，６０３−６（１９９７）；Ｗｙｓｓ−Ｃｏｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７：６１２−８（２００１））。ここに報告されている実験では、コントロールと比較してＭＯＧ（ｐ＜０．００１）およびＧＡ＋ＩＶＸ−９０８（ｐ＜０．００１）処置マウスでＴＧＦ−β発現の減少が認められ（表４）、海馬領域中のＴＧＦ−βの減少とＡβ原線維の比率との間に強い相関関係があった（ｒ＝０．９５）。ＩＬ−１０免疫反応性細胞では有意な変化は認められなかった（示さず）。
【０１０４】
ＩＶＸ−９０８のみを鼻に投与した場合に総脳Ａβレベルの減少が見出されたが（表３）（未処置に対してｐ＝０．０２）、ＧＡを配合したＩＶＸ−９０８と異なり、ＩＶＸ−９０８のみではチオフラビン陽性Ａβ原線維のクリアランスに効果はなかった。ＩＶＸ−９０８は、髄膜炎菌外膜タンパク質（ＯＰＭ）および外因的に添加したリポポリサッカリド（ＬＰＳ）から構成されるプロテオソームベースのアジュバントである。髄膜炎菌ＯＭＰ２（ポリンＢ）およびＬＰＳ／ＬＯＳは、先天性免疫系および／または養子免疫系に関連する一定の細胞型の表面上に提示されたＴＬＲと相互作用することが公知である。本明細書中に記載のように、このような相互作用は、少なくとも部分的に、ＩＶＸ−９０８および／またはＩＶＸ−９０８を配合したＧＡの活性が認められることが可能である。ＩＶＸ−９０８を使用して認められた効果は、ＬＰＳの海馬への直接注射によって非原線維Ａβ負荷を減少させることができるが、原線維Ａβ沈着を減少させることはできないという報告と関連し得る（ＤｉＣａｒｌｏ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ  ２２，１００７−１２（２００１））。しかし、これらの実験における投与経路（脳への直接注射）は、本明細書中に記載のプロテオソームベースの処方物の送達のための鼻投与経路と非常に異なることに留意しなければならない。対照的に、他の報告は、腹腔内に投与したＬＰＳ（炎症）は小膠細胞の活性化を刺激することができ、総アミロイドの増加が認められ、ＬＰＳ誘導性神経炎症がアミロイド前駆体タンパク質およびＡβペプチドの細胞内蓄積を増大させることを示している（Ｓｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ  １４：１３３−１４５（２００３）およびその参考文献）。さらに、ＬＰＳの直接注射は有毒であると予想されることが認識されている。
【０１０５】
上記で考察した実験では、Ｆ４／８０シグナルが存在しないことにより、ＣＤ１１ｂ＋細胞は、活性化された小膠細胞またはマクロファージであるが、好中球ではないことが示された。しかし、これらのＣＤ１１ｂ＋細胞を活性化マクロファージと対立するものとして活性化小膠細胞としてさらに区別することができるかどうかを決定するために、サンプルを、ＣＤ６８（末梢由来の活性化マクロファージ上に高度に発現されるが、脳由来の小膠細胞表面上にはあまり発現されない細胞マーカー）の存在について評価した。図８および９に示すように、ＧＡ＋ＩＶＸ−９０８で処置した動物由来のサンプルと比較してＥＡＥ動物中のＣＤ６８（マクロファージはＣＤ１１ｂ＋およびＣＤ６８＋である）がより染色され、これらのＣＤ１１ｂ＋ＣＤ６８＋細胞が、末梢（くも膜下腔）から脳実質（小脳および皮質が含まれる）に移動したマクロファージであることを示す。対照的に、ＧＡ−ＩＶＸ−９０８での処置後、ＣＤ６８発現マクロファージが増加したが、これらの細胞は主にくも膜下腔に局在したままである。これらの実験結果により、ＥＡＥ動物中のＡβクリアランスに関与するＣＤ１１ｂ＋細胞が末梢からＣＮＳに移動神経毒性に関連するのに対して、ＧＡ−ＩＶＸ−９０８での処置後に検出されたＣＤ１１ｂ＋細胞は主に内因性の小膠細胞であり、Ａβクリアランスに関連するが、直接有毒である証拠はないことが示唆される。この解釈のさらなる裏付けとして、本発明者らは、ＥＡＥ動物の小脳でＣＤ６８＋細胞の発現が増加するが、ＧＡ−ＩＶＸ−９０８処置動物または未処置動物では増加しないことを見出した（データ示さず）。さらに、ＧＡ−ＩＶＸ−９０８処置後に、アミロイドが蓄積された領域のみで活性化ＣＤ１１ｂ＋細胞が見出された。
【０１０６】
本発明者らは、未処置動物と比較した場合、ＧＡ＋ＩＶＸ−９０８を投与した動物の血清中のＡβレベルの増加も見出し、これにより、ＧＡ＋ＩＶＸ−９０８により脳領域からＡβがクリアランスされ、このＡβを末梢で見出すことができることが示唆された。しかし、ＥＡＥを有する動物でこのようなＡβの再分布は認められず、上記のように、活性化ＣＤ１１ｂ＋細胞の供給源に関連し得る。さらに、ＧＡ−ＩＶＸ−９０８を投与した動物における脳毛細血管の内側を覆うＣＤ１１ｂ＋ＣＤ６８＋活性化マクロファージおよび脈絡叢の数は、未処置動物と比較して増加した（図９）。これらの所見は、ＧＡ−ＩＶＸ−９０８処置動物から得られた血清サンプルで検出されたＡβレベルの増加と一致し、ＣＤ１１ｂ＋細胞に関してＧＡ−ＩＶＸ−９０８で処置した動物でアミロイド血管症の減少を伴う（図８）。
【０１０７】
予想外に、アミロイド（例えば、Ａβ斑）クリアランスの最終の共通経路は活性化小膠細胞を介し得るようである。ＥＡＥでは、  ＩＦＮ−γＴｈ１型ミエリン反応性Ｔ細胞は、ＭＯＧまたはＰＬＰ＋ＣＦＡでの免疫によって末梢で見かけ上活性化され、これらのＴ細胞が脳に移動してＩＦＮ−γ（Ｔｈ１サイトカイン）を放出し、小膠細胞を活性化する。結果として、動物の脳脊髄炎および麻痺は、ミエリンおよびその下にある軸索への損傷によって引き起こされる。ＢＳＡ特異的Ｔｈ１型細胞は脳内に蓄積しないので、末梢におけるＢＳＡ／ＣＦＡでの免疫によってＡβクリアランスは起こらない。酢酸グラチラマーを含むＣＦＡでの末梢免疫によって、ＧＡ特異的Ｔ細胞が誘導させ、ＧＡのＭＢＰとの交差反応性によって脳内に蓄積される。この細胞は、ＩＦＮ−γを分泌することができ、それにより、小膠細胞を活性化することができるが、ＭＢＰに対する親和性の変化およびそれに伴う抗炎症性サイトカインの分泌により、ＥＡＥを発症することができない。
【０１０８】
本発明者らは、小膠細胞活性化に関連するＡβのクリアランスを証明した。小膠細胞の活性化は、正の効果および負の効果の両方を示すことができることを指摘すべきである（Ｍｏｎｓｏｎｅｇｏ，Ａ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，Ｈ．Ｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０２：８３４−８３８（２００３））。小膠細胞は、タンパク質が凝集する天然の機構を示し、破片を脳から除去することができ、Ａβ免疫または脳卒中後の小膠細胞の活性化によってＡβをクリアランスすることができるという報告が存在する（Ｎｉｃｏｌｌ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｆｔｅｒ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ  ｐｅｐｔｉｄｅ：ａ  ｃａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔ，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．，９：４４８−４５２（２００３）；Ａｋｉｙａｍａ，Ｈ．，ａｎｄ  ＭｃＧｅｅｒ，Ｐ．Ｌ．，Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｐｌａｑｕｅ  ｒｅｍｏｖａｌ  ａｆｔｅｒ  Ａ  ｂｅｔａ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．，１０：１１７−１１８；ａｕｔｈｏｒ  ｒｅｐｌｙ  １１８−１１９（２００４）；およびＷｙｓｓ−Ｃｏｒａｙ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｍｉｎｅｎｔ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｍｉｃｅ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，９９：１０８３７−１０８４２（２００２）を参照のこと）。動物研究では、Ｗｙｓｓ−Ｃｏｒａｙおよびその同僚は、同年齢の野生型ＡＤマウスよりも小膠細胞があまり活性化しない補体阻害ＡＤマウスモデルで顕著な神経変性および斑形成の減少が認められることを証明した。これは、ＡＤマウスモデルにおいて、活性化小膠細胞が高い神経毒性を示すことのないアミロイド負荷の減少で有利な役割を果たすという概念を支持する。
【０１０９】
ＩＶＸ−９０８は小膠細胞を活性化することができるので、ＩＶＸ−９０８のみの鼻投与によってアミロイドを減少させ、ＧＡを配合したＩＶＸ−９０８組成物ほど有効ではないが、さらに、Ｔ細胞を活性化することができる。非トランスジェニック動物において、ＣＦＡと共に末梢に投与するか、ＩＶＸ−９０８と共に鼻腔内に投与したＧＡを使用して小膠細胞の活性化は認められなかった。Ａβ沈着によってＡβ斑を取り囲む小膠細胞がわずかに活性化され、この活性化は小膠細胞がＩＶＸ−９０８＋ＧＡによってさらに活性化されるために必要なようであると報告されている。小膠細胞のわずかな活性化が、さらなる活性化のために小膠細胞を準備刺激するＩＦＮ−γまたはＴｏｌｌ様レセプターの発現に関連する可能性がある（Ｓａｓａｋｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ．，４４１（４）：３５８−６７（２００２））。
【０１１０】
これらの所見は、Ａβ１−４２を含むＴｈ１型アジュバント（ＱＳ２１）での免疫後にヒトで認められる斑除去の潜在的な機構に関連する。Ｎｉｃｏｌｌ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，４４８−５２（２００３）は、広範な髄膜脳炎を引き起こし、マクロファージが脳に浸潤し、そして新皮質中のアミロイド沈着物が減少するというアジュバントＱＳ２１と共に非経口投与したＡβ１−４２でワクチン接種したＡＤ患者由来の所見を報告している。ＡｋｉｙａｍａおよびＭｃＧｅｅｒは、ＡＤの場合に不完全な虚血が影響を及ぼした皮質領域中の老人斑の類似の減少を報告しており、その所見およびＮｉｃｏｌｌ  ｅｔ  ａｌによって報告された所見が抗体依存様式で高反応性小膠細胞によるアミロイドの食作用に関連し得ることを示唆する。さらに、ＴＵＮＥＬ染色（アポトーシス細胞のマーカー）またはＮｅＵＮ免疫染色（ニューロン生存のマーカー）の使用により、未処置マウスと比較して、ＧＡ＋ＩＶＸ−９０８またはＩＶＸ−９０８のみでの免疫が有毒である証拠はなかった。
【０１１１】
抗体と無関係であり、且つ活性化小膠細胞によって媒介されるアルツハイマー病治療のための新規の免疫治療アプローチを本明細書中に提供する。多発性硬化症の治療で使用される薬物と鼻アジュバント（ＩＶＸ−９０８）との組み合わせにより、他の適用のために以前にヒトで使用されていた毒性のない２つの組成物（ＧＡおよびプロテオソームベースのアジュバント）を使用して、小膠細胞は、透明なＡβ−原線維斑に活性化され、総アミロイド負荷が減少されるようである。動物研究によってＡβ斑の減少が認知の改善に関連することが証明されたと仮定すると、ＧＡを配合したＩＶＸ−９０８での鼻ワクチン接種は、アルツハイマー病患者に有効な治療法である。
【０１１２】
（表１：Ｊ２０  ＡＰＰトランスジェニックマウスの脳内の総Ａβおよび線維性Ａβに対する皮下免疫の効果）
【０１１３】
【表１】
2008504299.tif 000005
＊  結果を、１：５００  ＩｇＧの力価でのＯＤレベルとして示す。
＊＊コントロールは、未処置（ｎ＝５）およびＢＳＡ／ＣＦＡ処置（ｎ＝３）動物を組み合わせており、これは、これらの群の間で差異が認められなかったためである。総脳Ａβについて、未処置＝１２６．７±１９．５；ＢＳＡ／ＣＦＡ  １２３．７±３３．２。チオフラビン陽性Ａβ斑領域の％：未処置：２．８±０．５；ＢＳＡ／ＣＦＡ＝２．２±０．９。
ａ  コントロールに対してｐ＜０．０５。
ｂ  コントロールに対してｐ＜０．００１；Ａβに対してｐ＜０．０５
ｃ  コントロールに対してｐ＜０．０１
ｄ  コントロールに対してｐ＜０．０１；Ａβに対してｐ＝０．０５。
【０１１４】
（表２：Ｔｇ２５７６  ＡＰＰトランスジェニックマウスの脳内の総Ａβおよび線維性Ａβに対するＰＬＰ免疫の効果）
【０１１５】
【表２】
2008504299.tif 000006
＊  結果を、１：５００  ＩｇＧの力価でのＯＤ４５０レベルとして示す
ａ  コントロールに対してｐ＜０．０２（未処置マウス）
ｂ  コントロールに対してｐ＜０．００２。
【０１１６】
（表３：Ｊ２０  ＡＰＰトランスジェニックマウスの脳における総Ａβおよび繊維状Aβに対する経鼻免疫の効果）
【０１１７】
【表３】
2008504299.tif 000007
＊  結果を、１：５０  ＩｇＧの力価でのＯＤ４５０レベルとして示す。
ａ  コントロールに対してｐ＜０．０２、ＧＡに対してｐ＜０．０２
ｂ  コントロールおよびＧＡに対してｐ＜０．００１、ＩＶＸ−９０８に対してｐ＜０．０４
ｃ  コントロールに対してｐ＜０．００１、ＧＡに対してｐ＜０．００２、ＩＶＸ−９０８に対してｐ＜０．００２。
【０１１８】
（表４：免疫した動物における海馬の免疫組織化学）
【０１１９】
【表４】
2008504299.tif 000008
（表４脚注）
＊  データは、各処置についての３つの切片およびコントロールについての６つの切片（３つの未処置＋表１のように処置した３つのＢＳＡ／ＣＦＡ）の定量を示す。
ａ  ｒ＝−０．７  ＣＤ１１ｂ対Ａβ原線維領域の％
ｂ  ｒ＝−０．６５  ＣＤ３対Ａβ原線維領域の％；ｒ＝０．７４  ＣＤ３対ＣＤ１１ｂ
ｃ  ｒ＝−０．７  Ｍ−ＣＳＦＲ対Ａβ原線維領域の％；ｒ＝０．９２  Ｍ−ＣＳＦＲ対ＣＤ１１ｂ
ｄ  ｒ＝−０．８  ＩＦＮ−γ対Ａβ原線維領域の％；ｒ＝０．９  ＩＦＮ−γ対ＣＤ１１ｂ；ｒ＝０．８５  ＩＦＮ−γ対ＣＤ３
ｅ  ｒ＝０．９１  ＴＧＦ−β対Ａβ原線維領域の％；ｒ＝−０．７７  ＴＧＦ−β対ＣＤ１１ｂ；ｒ＝−０．６ＴＧＦ−β対ＣＤ３
ｆ  ｒ＝０．６７  ＩＬ−１０対Ａβ原線維領域の％；ｒ＝−０．４  ＩＬ−１０対ＣＤ１１ｂ
ｇ  ｐ＝０．０００７  ＣＤ１１ｂ対ＧＡ；ｐ＜０．０５  ＩＦＮ−γ対ＧＡ；ｐ＝０．００１１  ＴＧＦ−β対ＧＡ
ｉ  コントロールに対してｐ＜０．０５
ｉｉ  コントロールに対してｐ＜０．０２
ｉｉｉ  コントロールに対してｐ＜０．００１
ｉｖ  コントロールに対してｐ＜０．００１。
【０１２０】
（材料と方法）
マウス。（Ｂ６ＸＤ２）Ｆ１（平均年齢は１４月齢）または（Ｂ６ＸＳＪＬ）Ｆ１  ＡＰＰ＋（ＷＴまたはμＭＴ）（平均年齢は１６月齢）ＡＰＰトランスジェニックマウスを、全ての適用可能なガイダンスにしたがって、Ｂｒｉｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｏｍａｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの無発熱物質施設に収容し、使用した。
【０１２１】
材料。ＩＶＸ−９０８（プロトリン）は、髄膜炎菌外膜タンパク質（プロテオソーム）およびヒトで安全に試験されたＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来のＬＰＳの非共有結合処方物であり、ＩＤ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａから入手した。酢酸グラチラマー（Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標））は、ＭＳの再発形態のための承認されており、且つ広く使用されているアラニン、リジン、グルタミン酸、およびチロシンの無作為なアミノ酸コポリマーであり、Ｂｒｉｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｐｈａｒｍａｃｙから入手した。ＭＯＧ（３５〜５５）およびＰＬＰ（１３９〜１５１）を、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｂｒｉｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌで合成した。
【０１２２】
ＡＰＰ＋マウスにおけるＥＡＥの誘導および臨床評価。（Ｂ６Ｄ２）Ｆ１または（Ｂ６ＸＳＪＬ）Ｆ１  ＡＰＰ＋（ＷＴまたはＢ細胞欠損μＭＴ）および非ｔｇ同複子の後足蹠に、１００μｇのＭＯＧ（３５〜５５）、ＰＬＰ  １３９〜１５１、または１００μｇ  β−アミロイドペプチド（１〜４０）を含むＣＦＡで免疫した。その直後および４８時間後に１５０ｎｇの百日咳毒素を含む０．２ｍｌ  ＰＢＳを、ｉ．ｐ．注射した。動物をＥＡＥの症状についてモニタリングし、これを免疫後から７日目から開始し、以下のように記録した：０、疾患なし；１、尾の麻痺；２、後肢の衰弱；３、後肢の麻痺；４、後肢および前肢の麻痺；および５、瀕死状態。
【０１２３】
鼻ワクチン接種。酢酸グラチラマー：２５μｇを、最初の１週間は１日目、２日目、４日目、および５日目に投与し、その後の６週間は週に１回投与した。ＩＶＸ−９０８：１μｇ／マウスを、最初の１週間は１日目および５日目に投与し、その後の６週間は週に１回投与した。ＢＳＡ＋ＩＶＸ−９０８：２５μｇのＢＳＡ＋１μｇ  ＩＶＸ−９０８を、最初の１週間は１日目および５日目に投与し、２５μｇのＢＳＡのみを２日目および４日目に投与し、その後の６週間はＢＳＡ＋ＩＶＸ−９０８の組み合わせで追加免疫した。ＧＡ＋ＩＶＸ−９０８：２５μｇのＧＡ＋１μｇ  ＩＶＸ−９０８を、最初の１週間は１日目および５日目に投与し、２５μｇのＧＡのみを２日目および４日目に投与し、その後の６週間はＧＡ＋ＩＶＸ−９０８の組み合わせで追加免疫した。
【０１２４】
アミロイドの定量。アミロイド負荷を定量するために、右半球を、５．０Ｍ塩酸グアニジン（ｐＨ８）中にて室温で３時間抽出した。希釈物を使用して、サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって不溶性（アミロイド関連）Ａβ４０およびＡβ４２レベルを測定した。Ａβ原線維を測定するために、左半球を、４％Ｂｒａｉｎで一晩固定し、次いで４．５％スクロースに４時間浸漬し、その後、４℃で２０％スクロースに一晩浸漬した。脳を、ＯＣＴパラホルムアルデヒドの存在下で凍結させ、１４μｍの縦断面に切断し、免疫組織染色およびアミロイド原線維の定量のために使用した。十分に定義した海馬領域（ブレグマ−１．３４）を、チオフラビン−Ｓ染色を使用した斑中のアミロイド原線維の定量のために選択した。これらの切片由来の画像（２０倍）を、３ＣＣＤカラービデオカメラから回収し、適切なソフトウェア（ＮＩＨ；Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して分析した。アミロイド原線維量を、このソフトウェアによって測定した１ｍｍ２の海馬領域あたりの比率として示した。
【０１２５】
免疫組織学。以下のマーカーを使用して染色を行った：Ｔ細胞（ＣＤ３；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ：５５３０５７）、小膠細胞／マクロファージ（ＣＤ１１ｂ；Ｓｅｒｏｔｅｃ：ＭＣＡ７４Ｇ）、（Ｃ−ＭＦＲ；Ｃｙｍｂｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ：２１０８００９６）、ＩＦＮ−γ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ：５５９０６５）、ＩＬ−１０（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ：５５９０６３）、およびＴＧＦ−β（ＲＤ：ＡＢ−２０−ＰＢ）。抗アミロイド抗体（Ｒ１２８２）は、Ｄｅｎｎｉｓ  Ｓｅｌｏｋｅから譲渡された。脳切片を、ヘマトキシリン染色にさらに供した。切片を、盲検様式で評価し、コントロールは、前記のアイソタイプ適合ｍＡｂを使用した。各処置のために、３つの異なる脳切片の海馬領域を定量した（同一領域、ブレグマ−１．３４、ＴｈＳ染色のために使用）。結果を、各マーカーについて標識された細胞の平均として示す。
【０１２６】
神経病理学。神経毒性を試験するために、左半球を、４℃で、４％パラホルムアルデヒドで一晩固定し、その後に４．５％スクロースに４時間浸漬し、その後に２０％スクロースに一晩浸漬した。脳を、ＯＣＴパラホルムアルデヒドの存在下で凍結させ、１４μｍの縦断面に切断し、免疫組織染色ために使用した。本発明者らは、神経ストレスおよび血液脳関門の完全性のために使用した以下の４つのマーカーを染色した：ＧＦＡＰ（Ｓｉｇｍａ；Ｇ９２６９）、ＳＭＩ３２（Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ＴＵＮＥＬ（Ｒｏｃｈｅ  １  ６８４  ８１７）、ｉＮＯＳ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ：ＡＢ５３８２）、およびＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎ（Ｄａｋｏ：Ａ００８０）。星状細胞増加症を、星状細胞で被覆された１ｍｍ２の海馬細胞あたりの比率として示す。ｉＮＯＳ、ＳＭＩ３２、およびフィブリノゲンを、以前に記載のように染色した（２９）。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）染色を、製造者（Ｒｏｃｈｅ  １  ６８４  ８１７）の説明書にしたがって行った。計数した細胞の形態を同定するために、Ｈ＆Ｅ染色を行った。不偏立体解析学的アプローチにおけるＮＩＨのＩｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｓｏｆｔｗａｒｅを使用した盲検様式で動物あたり２つの連続切片および群あたり４匹の動物を染色した。一次運動皮質（ブレグマ側面の１．４４ｍｍ）由来の群あたりの染色を、図６に示す。
【０１２７】
データ分析。全ての連続順序および順序データを、平均±ｓｅｍと示す。２群を比較する場合はスチューデントｔ検定を使用してデータを比較し、３群またはそれ以上を分析する場合は一元配置のＡＮＯＶＡ分析を行った。０．０５未満の値を、統計的に有意と見なした。Ｅｘｃｅｌ統計プログラムを使用してｒ値を計算した。
【０１２８】
本明細書中に引用した全ての引用文献（特許、特許出願、および刊行物が含まれる）は、以前に具体的に援用されているかにかかわらず、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０１２９】
ここに本発明を完全に記載しているが、当業者は、本発明を、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、且つ過度の実験を行うことなく広範な等価のパラメーター、濃度、および条件を使用して本発明を実施することができることを認識している。
【０１３０】
本発明を特定の実施形態と組み合わせて記載しているが、本発明をさらに修正することができると理解される。本出願は、一般に、本発明の原理に従って本発明の任意の変形形態、使用、または適用を対象とし、本発明が属する分野内での公知または慣習的な作業の範囲内であり、前記の基本的な特徴に適用することができる場合、このような本開示からの逸脱を含むことを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】脳内の総Ａβレベルに対する皮下免疫の効果。アミロイド負荷を定量するために、右半球を、５．０Ｍ塩化グアニジン（ｐＨ８）中にて室温で３時間抽出した。希釈物を使用して、サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってＡβ４０およびＡβ４２レベルを測定した。
【図２】脳内の総Ａβレベルに対する鼻腔内免疫の効果。サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、鼻腔内治療後の各マウス由来のＡβ４０およびＡβ４２の総Ａβ濃度レベルを測定した。
【図３】ＣＤ１１ｂ＋細胞の活性化により、非経口および鼻腔内で処置したマウスでＡβ原線維がクリアランスされる。（Ａ）皮下免疫後のチオフラビン−Ｓでの海馬領域中のＡβ原線維の染色（１０倍）または抗Ａβ抗体（Ｒ１２８８）および抗ＣＤ１１ｂ（小膠細胞／マクロファージ）での総Ａβの同時染色（４０倍）。（Ｂ）鼻腔内免疫後の抗Ａβ抗体（Ｒ１２８８）および抗ＣＤ１１ｂ（小膠細胞／マクロファージ）での同時染色（海馬領域中、４０倍）。
【図４】ＭＯＧ皮下免疫および鼻腔内酢酸グラチラマーワクチン接種後の脳切片の免疫組織学。未処置または免疫後５０日目の免疫マウス由来の海馬領域の連続切片を、抗ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３、ＩＦＮ−γ、およびＴＧＦ−β抗体を使用して標識した（２０倍、挿入図は６０倍）。
【図５】ＧＡ＋ＩＶＸ−９０８の鼻腔内投与後の星状細胞増加症の軽減。十分に定義された海馬領域（ブレグマ−１．４４ｍｍ）を、ＧＦＡＰ染色を使用した活性化星状細胞の定量のために選択した。星状細胞活性化レベルを、１ｍｍ２の海馬領域あたりの比率として示したｐ＝０．０３９ＧＡ＋ＩＶＸ−９０８対コントロール；ｐ＝０．０２対ＥＡＥ（ＭＯＧ）。
【図６】ＭＯＧ皮下免疫および鼻腔内酢酸グラチラマーワクチン接種後の脳切片の神経病理学。未処置または免疫後５０日目の処置マウス由来の皮質の連続切片を、以下の神経毒マーカーを使用して標識した：ＳＭＩ３２、ＴＵＮＥＬ、およびｉＮＯＳ（元の倍率は２０倍）。矢印は、研究したマーカーの標識を示す。ＥＡＥ動物で神経毒性マーカーの標識が認められたが、ＧＡ−ＩＶＸ−９０８処置マウスでは認められなかった。
【図７】ＭＯＧ皮下免疫および鼻腔内酢酸グラチラマーワクチン接種後の海馬切片の脳血液関門の完全性。未処置または免疫後５０日目の処置マウス由来の皮質の連続切片を、血漿染色フィブリノゲンマーカーを使用して標識した。ＥＡＥ動物でフィブリノゲンマーカーの標識が認められたが、ＧＡ−ＩＶＸ−９０８処置マウスでは認められなかった（２０倍、小さい図は４０倍）。
【図８】ＭＯＧ皮下免疫および鼻腔内酢酸グラチラマーワクチン接種後の嗅神経切片の神経病理学。未処置または免疫後５０日目の処置マウス由来の皮質の連続切片を、以下の原線維アミロイドマーカーを使用して標識した：ＴｈＳ、小膠細胞活性化ＣＤ１１ｂ、ＢＢＢ完全性、フィブリノゲン（２０倍）。
【図９】未処置マウス、ＭＯＧ免疫マウス、およびＧＡ＋ＩＶＸ−９０８処置マウスにおけるＣＮＳ中のＣＤ６８＋細胞の染色。矢印は、ＧＡ＋ＩＶＸ−９０８処置マウスにおいてＥＡＥにおいてＣＮＳを浸潤するが、脈絡叢に局在したままであるＣＤ６８＋細胞を示す。未処置マウスで染色は認められなかった。小脳から切片を採取する（２０倍）。
【図１】
2008504299.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
2008504299.tif 000018
2008504299.tif 000019
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