(57)【要約】  本発明は、核酸分子、遺伝子構築物、ｓｉＲＮＡ分子、ならびに核酸分子および／または遺伝子構築物および／またはｓｉＲＮＡ分子を含み、内皮接着分子の発現の抑制のために使用することができる組成物に関する。また、本発明は、前記分子、組成物または構築物が塗布された、あるいはそれらを含む装置に関する。さらに本発明は、核酸分子、遺伝子構築物またはｓｉＲＮＡ分子の対応する用途、ならびに接着分子の発現を抑制する方法、管移植法、肺移植法、および肺移植片の処置法、ならびに心筋保護の範囲内で開心手術処置法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
接着分子の発現を抑制するための核酸分子であって、添付の配列表のヌクレオチド配列番号１乃至４４の少なくとも１つを含む核酸分子。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸分子と同じ核酸分子に緊縮条件下でハイブリダイズする核酸分子。
【請求項３】
請求項１または２に記載の核酸分子を含み、生体細胞、好ましくは内皮細胞のトランスフェクションに好適な遺伝子構築物。
【請求項４】
ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、プラスミド、ベクター、ウィルス、ならびにリン酸カルシウムおよびリン酸ナトリウムと複合体をなす前記群の要素からなる群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の遺伝子構築物。
【請求項５】
互いに少なくとも部分的にハイブリダイズされ、それぞれ、配列番号１および２、３および４、５および６、７および８、９および１０、１１および１２、ならびに１３および１４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む１組のＲＮＡ分子を含むｓｉＲＮＡ分子。
【請求項６】
互いに少なくとも部分的にハイブリダイズされ、それぞれ、配列番号１５および１６、１７および１８、１９および２０、２１および２２、２９および３０、号３１および３２、３３および３４、ならびに３５および３６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む１組のＲＮＡ分子を含むｓｉＲＮＡ分子。
【請求項７】
互いに少なくとも部分的にハイブリダイズされ、それぞれ、配列番号２３および２４、２５および２６、２７および２８、３７および３８、３９および４０、４１および４２、ならびに４３および４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む１組のＲＮＡ分子を含むｓｉＲＮＡ分子。
【請求項８】
安定化ｓｉＲＮＡ分子であることを特徴とする請求項５乃至７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項９】
受容細胞のＤＮＡに組み込まれた、ヘアピンｓｉＲＮＡ分子であることを特徴とする請求項５乃至８のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項１０】
請求項１もしくは２に記載の核酸分子および／または請求項３もしくは４に記載の遺伝子構築物および／または請求項５乃至９のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ分子、の少なくとも１つを含む組成物。
【請求項１１】
器官の培養用の生理溶液であり、緩衝物質と、塩と、必要であれば、他の助剤、活性剤、添加剤または防腐剤とを含むことを特徴とする請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
器官が、血管、好ましくは静脈移植片を含むことを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
器官が肺移植片を含むことを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
器官が切開された心臓を含み、溶液が心筋保護液として設計されていることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
塗膜を有する装置、特にステントであって、塗膜が、請求項１もしくは２に記載の核酸分子および／または請求項３もしくは４に記載の遺伝子構築物および／または請求項５乃至９のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ分子および／または請求項１０乃至１４のいずれか１項に記載の組成物を含むことを特徴とする装置。
【請求項１６】
塗膜が、生分解性および／もしくは生体吸収性ポリマー、好ましくは、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリラクチド、ポリグリコリド、またはマグネシウムを含むことを特徴とする請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
生分解性および／もしくは生体吸収性ポリマー、好ましくはポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリラクチド、ポリグリコリド、またはマグネシウムを含み、請求項１もしくは２に記載の核酸分子および／または請求項３もしくは４に記載の遺伝子構築物および／または請求項５乃至９のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ分子および／または請求項１０乃至１４のいずれか１項に記載の組成物を含む装置、特にステント。
【請求項１８】
ｓｉＲＮＡとしての、請求項１または２に記載の核酸分子の使用。
【請求項１９】
内皮接着分子の発現を抑制するための、請求項１もしくは２に記載の核酸分子および／または請求項３もしくは４に記載の遺伝子構築物および／または請求項５乃至９のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ分子および／または請求項１０乃至１４のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項２０】
ＩＣＡＭ−１の内皮発現を抑制するための、請求項５に記載のｓｉＲＮＡ分子の使用。
【請求項２１】
ＶＣＡＭ−１の内皮発現を抑制するための、請求項６に記載のｓｉＲＮＡ分子の使用。
【請求項２２】
Ｅ−セレクチン（ＣＤ−６２Ｅ）の内皮発現を抑制するための、請求項７に記載のｓｉＲＮＡ分子の使用。
【請求項２３】
生体細胞内の接着分子の発現を抑制する方法であって、
（ａ）生体細胞を準備する工程と、
（ｂ）請求項１もしくは２に記載の核酸分子および／または請求項３もしくは４に記載の遺伝子構築物および／または請求項５乃至９のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ分子を、生体細胞に挿入する工程と、場合によっては、
（ｃ）生体細胞を洗浄および／または単離する工程と
を含む方法。
【請求項２４】
生体細胞が、器官または器官の一部、好ましくは血管を構成することを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ｂ）における挿入が、非ウィルス一過性トランスフェクションにより行われることを特徴とする請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
患者における管移植方法であって、
（ａ）患者から管、好ましくは大伏在静脈を切除する工程と、
（ｂ）請求項１もしくは２に記載の核酸分子および／または請求項３もしくは４に記載の遺伝子構築物および／または請求項５乃至９のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ分子、を管の細胞へ、好ましくは非ウィルス一過性トランスフェクションにより、挿入する工程と、
（ｃ）好ましくはバイパス形成のために、処置した管を移植すなわち体内移植する工程と、
を含む方法。
【請求項２７】
工程（ｃ）が、工程（ａ）の終了後５時間までの間、好ましくは１時間までの間に行われることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
患者における肺移植方法であって、
（ａ）提供者から肺を切除する工程と、
（ｂ）請求項１もしくは２に記載の核酸分子および／または請求項３もしくは４に記載の遺伝子構築物および／または請求項５乃至９のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ分子を、好ましくは非ウィルス一過性トランスフェクションにより、肺の微小血管細胞へ挿入する工程と、
（ｃ）処置された肺を患者に移植すなわち体内移植する工程と、
を含む方法。
【請求項２９】
工程（ｃ）が、工程（ａ）の終了後約６〜８時間の間に行われることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
（ａ）肺移植片を準備する工程と、
（ｂ）請求項１もしくは２に記載の核酸分子および／または請求項３もしくは４に記載の遺伝子構築物および／または請求項５乃至９のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ分子を、好ましくは非ウィルス一過性トランスフェクションにより、移植片の微小血管細胞へ挿入する工程と、
を含む肺移植処置の方法。
【請求項３１】
（ａ）心臓切開手術の患者を準備する工程と、
（ｂ）請求項１もしくは２に記載の核酸分子および／または請求項３もしくは４に記載の遺伝子構築物および／または請求項５乃至９のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ分子を、好ましくは非ウィルス一過性トランスフェクションにより、心臓の内皮細胞に挿入する工程と、
を含む心筋保護の範囲内で切開された心臓を処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分子、遺伝子構築物、ｓｉＲＮＡ分子、ならびに、核酸分子および／または遺伝子構築物および／またはｓｉＲＮＡ分子を含み、特に、肺、心臓および血管の流路における内皮接着分子の発現抑制のために使用することができる組成物に関する。また、本発明は、前記分子、組成物または構築物が塗布された、あるいはそれらを含む装置に関する。さらに、本発明は、核酸分子、遺伝子構築物またはｓｉＲＮＡ分子の対応する使用、ならびに接着分子の発現を抑制する方法、血管移植法、肺移植法または肺移植片の処置法、および心筋保護の範囲内での開心治療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
西洋の先進工業国では、いわゆる冠動脈疾患は、最もよくある死因に含まれる。これは冠状血管の狭窄により心筋への不適正な血液供給が引き起こされていることを意味すると理解される。この不適正な血液供給により、主として労作時に、酸素の需要と供給の不均衡が生じる。冠動脈疾患の主な原因は、心臓の冠動脈の動脈硬化である。考え得る結果は、胸の痛みを伴う狭心症および心筋梗塞である。
【０００３】
冠動脈疾患を治療するために現在使用されている薬剤、いわゆる冠動脈疾患治療薬として、硝酸塩、これはニトロ化合物とも言われるが、ベータ遮断薬およびカルシウム拮抗剤が挙げられる。これらの物質は、心臓が機能するために必要とする酸素量を抑える、すなわち負担を軽減する効果を有する。冠動脈疾患による心臓の酸素欠乏が、ある程度代償される。
【０００４】
しかし、この薬剤治療の欠点としては、特に疾患が進行した段階にある場合、しばしば、心臓の負担を十分に取り除くことはもはや成し遂げられないことがある。また、冠動脈疾患を治療するための一般的な薬剤の多くは、望ましくない副作用を有している。
【０００５】
冠動脈疾患治療のための侵襲型アプローチとして、血管形成を行うことがある。この手法では、バルーンカテーテルを狭窄した冠状血管に誘導し、次いで、血管容積を拡張し、血管の内壁を平滑にする目的で膨らませる。血管形成は、閉塞あるいは狭窄した血管の永続的拡張を確保するために、通常、ステントの挿入と組み合わせられる。
【０００６】
しかし、この技術は、該手法が侵襲式であることに起因して、患者に非常に多くのリスクをもたらす。さらに、狭窄の著しい硬化、血液凝固障害、解剖学的に不都合な血管位置が見られる場合、この手法は禁忌である。さらに、術後出血、血栓、塞栓、穿孔、切開などが起こり得る。この手法には、血管の閉塞再発を永続的に予防する保証はないため、多くの場合、血管形成を繰り返す必要がある。そのため、患者は、上述したリスクを再度受ける。ひとたび疾患が進行すると、心臓手術が避けられないものとなる。
【０００７】
冠動脈疾患の治療に対する他の治療アプローチは、血管、たとえば自己の伏在静脈の一部をバイパスの形で移植することを含む。この治療の目的は、大動脈と冠動脈との間に移植片を挿入することにより、１以上の冠動脈の狭窄または完全閉塞を避けることにある。この手術は、今日、冠動脈疾患の侵襲型治療における標準的な方法である。該手術は、世界中で年間約１００万人の患者に対して行われ、ドイツに限っても８００００人に対して行われている。
【０００８】
使用するバイパス移植片は、術中、数多くのストレス要因、すなわち、機械的損傷、延伸、低酸素、低体温、人口心肺によるサイトカイン刺激などの影響を受ける。さらに、血管再生術が成功した後でも、元々静脈血管であったものが動脈圧に曝され、該血管には過酷な負荷がかかることになる。
【０００９】
これらの要因は全て、電撃性内皮活性化を引き起こし、細胞間接着分子が介在する白血球の経内皮移動の増加を生じさせ、内皮細胞の整合性を大きく損ない、その結果、実質的に早期のバイパス管狭窄の一因となる（Ｃｈｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）「加圧膨張は、ヒト伏在静脈移植片において内皮接着分子の発現を刺激する」Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．７６（２），４５３−４５８参照）。したがって、動脈血管使用時の１０年後のバイパス移植片開存率は、たとえば内胸動脈で、なお９２％であるのに対し、静脈血管使用時は、たとえば伏在静脈で、６０％に過ぎない。これまでのところ、当初の数日あるいは数週間以内の早期閉塞率に関して、入手できる正確なデータはない。
【００１０】
バイパス管狭窄の予防を目的とする最初の遺伝子治療技術は、すでに背景技術において記載した。たとえばＭａｅｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）「インビトロおよびインビボにおけるＥ２Ｆデコイオリゴデオキシヌクレオチドによるメサンギウム細胞増殖の抑制」Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２５８９−２５９７には、Ｅ２Ｆ転写因子に結合することができる合成オリゴヌクレオチドが記載されている。著者らは、オリゴヌクレオチドのメサンギウム細胞へのトランスフェクション後、Ｅ２Ｆ転写因子およびＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原）タンパク質の発現が抑制され、その結果これらの細胞の増殖が予防されることを示した。米国サンフランシスコのＣｏｒｇｅｎｔｅｃｈ社は、バイパス管狭窄を防ぐ治療剤として、「Ｅ２Ｆデコイ」という名称のそのようなオリゴヌクレオチドを提供している（ｗｗｗ１．ｃｏｒｇｅｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｃｇｔ／ｅｄｉｆｏｌｉｇｉｄｅ参照）。
【００１１】
しかし、Ｅ２Ｆの機能の抑制は、治療への応用において非常に危険な面がある。すなわち、Ｅ２Ｆは、内皮細胞の病的増殖のみに関与しているのではないことが知られている。実際、Ｅ２Ｆは中心的転写因子であり、細胞周期を調整するタンパク質をコードする数多くの遺伝子、たとえば、ジヒドロ葉酸還元酵素、ｃ−ｍｙｃ、ＤＮＡ−ポリメラーゼ、ｃｄｃ２およびＰＣＮＡを活性化する。したがって、Ｅ２Ｆ機能を抑制するオリゴヌクレオチドの挿入により、たとえば、血管の傷の治癒あるいは自然再生に関連する、重要な修復機構も働かなくなる。したがって、相応にトランスフェクトされたバイパス移植を受けた患者は、心筋梗塞または他の心臓疾患リスクの増加に曝されている。
【００１２】
現在知られている心血管疾患に関連する遺伝子治療測定は、Ｂｏｎａｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｋａｒｄｉｏｖａｓｋｕｌaｒｅ  Ｇｅｎｔｈｅｒａｐｉｅ−ｗａｓ  ｋａｎｎ  ｄｅｒ  Ｃｈｉｒｕｒｇ  ｄｅｒｚｅｉｔ  ｄａｖｏｎ  ｅｒｗａｒｔｅｎ？「心血管遺伝子治療−現在外科医が期待できること」Ｊ．Ｋａｒｄｉｏｌ．９，１４−２０で再検討されている。
【００１３】
さらに、呼吸器、特に肺の疾患は、現代医学および製剤研究に深刻な難題をもたらしている。そのような疾患を有する多くの患者にとって、肺移植は、生活の質の向上を得るための最後の治療に相当する。理想的な状況では、これにより運動耐性が向上し、継続的な酸素治療から脱却でき、患者の状況は大いに改善される。世界的に見れば、肺移植実施数は継続的に増加している。
【００１４】
ドイツのレイデンにあるユーロトランスプラントの公式統計によると、１９９８年以来、肺移植を待つ患者数の増加は２５０％を超えているが、移植実施数は７０％増加したにすぎない。言い換えれば、提供器官の不足が増加している。この不足の一因として、現在のところ、器官の摘出時にほとんど完全な状態の心血管を有する提供者、いわゆる心臓鼓動提供者（ＢＨＤ）からの器官しか使用されていないことが挙げられる。
【００１５】
器官不足を打開する可能性の１つとして、摘出時に心臓がもはや鼓動していない提供者、いわゆる非心臓鼓動提供者（ＮＨＢＤ）からの移植器官を使用することが提案されている。
【００１６】
いずれの場合にも、器官摘出の瞬間から被提供者への再移植まで、器官には血液が供給されず、該器官は虚血下にある。バイパス移植片に関して上述したのと同様に、この虚血状態は、肺移植においても内皮細胞の相当な活性化を誘発し、肺の微小血管の流路における炎症性接着分子の発現を誘導する。白血球は、これらの炎症性接着分子に結合する。
【００１７】
ここで、血管内腔から器官実質組織への白血球の経内皮移動が起こり、次いで肺膜の統合性障害が生じる。２０〜４０％の症例において、この障害は非常に顕著となり、臨床的に関連する肺水腫を引き起こす。これは、一次移植不全（ＰＧＦ）とも呼ばれる。ＰＧＦは、共罹患率の顕著な増加、およびそれによる不良な一次転帰に関連する（Ｍｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）「肺移植における一次移植不全および他の選択合併症：９８３人の患者の単一施設試験」，Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１２９（６），１４２１−１４２９参照）。
【００１８】
ＮＨＢＤの器官では微小血管内皮細胞の活性化がさらに電撃性であるため、移植患者の転帰が非常に悪いことが動物実験から知られているため、以前はこれらの器官を使用することはなかった。（Ｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）「非心臓鼓動ドナーから移植されたラット肺における細胞内接着分子−１発現の誘因」Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．７７（３），１０４８−１０５５参照）。ＮＨＢＤ移植器官の転帰が、薬剤治療により、ＢＨＤ移植器官の結果に匹敵するのであれば、より多くの器官が移植のために使用できるようになり、肺移植を待つ患者の数を大幅に減らすことができよう。
【００１９】
今のところ、肺移植における微小血管内皮細胞の活性化を標的として特異的影響を与え、ＰＧＦの発生率を減少させる特定の方法はない。ＤｅＭｅｅｓｔｅｒｅｔ  ａｌ．（１９９６）「抗ＩＣＡＭ１および抗ベータ２インテグリンモノクロナール抗体の組み合わせを有するラット肺同質移植片再潅流障害の減衰，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ６２（１０），１４７７−１４８５は、抗体を用いた動物実験における炎症性接着分子の阻害について記載している。この手法により、移植の転帰における著しい改善が達成されたが、この治療法は、抗体関連の無視できない副作用のため、広範な採用はなされていない。
【００２０】
心筋保護の範囲内で、開心手術において、回復可能な心停止を人工的に誘発する。この心停止は、たとえば、氷冷され、ｐＨ−中性でカリウムおよびマグネシウムを含む、いわゆる心筋保護液によって、引き起こすことができる。心停止の間、毒性の代謝産物、二酸化炭素および乳酸が心臓に蓄積されることにより、アシドーシスが起こる。これらの要因が虚血状態と組み合わさり、心筋細胞に回復不能な損傷を与える可能性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
したがって、本発明の目的は、静脈移植の早期バイパス狭窄、肺移植の一次不全および心筋保護に関連する上述した問題を回避することができる、治療効果のある物質を提供することにある。
【００２２】
特に、簡単に製造することができ、たとえば、心臓手術、バイパス手術または肺移植の間に使用し、管の狭窄あるいは移植片の不全を防止する物質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
この目的は、本発明に従い、接着分子の発現を抑制し、添付の配列表でのヌクレオチド配列番号１〜４４のうち少なくとも１種を含む核酸分子の提供により達成される。
【００２４】
驚いたことに、たとえば、いわゆるｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）分子の形で生体細胞にトランスフェクトできるそのような核酸分子を用いて、本発明者らは、管狭窄の進行、あるいは肺膜統合性障害または心筋保護中の心臓の障害を防ぐことに成功した。これらのｓｉＲＮＡ分子はリボ核酸の二本鎖構造を含み、転写後プロセスを開始することができる。該プロセスはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれ、特定の遺伝子発現の不活性化、いわゆる遺伝子サイレンシングを起こす。生体細胞に挿入されると、ｓｉＲＮＡ分子は集合し、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる、いわゆるリボヌクレアーゼ複合体となる。この複合体は、ｓｉＲＮＡ分子を介し、たとえば転写遺伝子のｍＲＮＡのような実質的な相補的構造と結合し、エンドヌクレアーゼ活性によりそれらを分解し得る。これは最終的に、ｓｉＲＮＡ分子に対して相補的であり、また分解されるｍＲＮＡをコードする対応遺伝子の発現を抑制する。
【００２５】
これまでは、接着分子の発現を抑制することによって、狭窄の進行を防ぎ、および／または肺膜統合性を維持することができることは、明らかでなかった。一方、これまで特に、冠動脈疾患または一次移植不全の進行、あるいは心筋保護中の心筋の障害を、この機構を介して意図的かつ因果的に防止するための物質は、得られなかった。
【００２６】
本発明者らは、これを可能にする核酸分子を初めて開発した。添付の配列表のヌクレオチド配列番号１および２、３および４、５および６、７および８、９および１０、１１および１２、または１３および１４を含む核酸分子は、驚くべきことに、生体細胞に挿入されると、いわゆる細胞内接着分子１（ＩＣＡＭ−１，ＣＤ５４）の発現を抑制する。
【００２７】
添付の配列表のヌクレオチド配列番号１５および１６、１７および１８、１９および２０、２１および２２、２９および３０、３１および３２、３３および３４、または３５および３６を含む核酸分子は、驚くべきことに、生体細胞に挿入された後、いわゆる血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１，ＣＤ１０６）の発現を抑制する。
【００２８】
添付の配列表のヌクレオチド配列番号２３および２４、２５および２６、２７および２８、３７および３８、３９および４０、４１および４２、または４３および４４を含む核酸分子は、驚くべきことに、生体細胞に挿入されると、内皮接着タンパク質Ｅ−セレクチン（ＣＤ−６２Ｅ）の発現を抑制する。
【００２９】
これらの遺伝子の発現が、（ある程度）静脈血管移植後の移植片狭窄の原因となることが知られている（Ｃｈｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（上記引用文献）参照）。また、これらの遺伝子の発現が肺移植片の損傷と関連することも知られている。（ＤｅＭｅｅｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（上記引用文献）；  Ｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（上記引用文献）；  Ｓｈｒｅｅｎｉｗａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）「肺同質移植片拒絶反応における接着分子（Ｅ−セレクチンおよびＩＣＡＭ−１），Ｃｈｅｓｔ，１０（５），１１４３−１１４９参照）。しかし、従来技術では、この知識を治療に応用するための手段あるいは物質を開発することは、可能ではなかった。
【００３０】
しかし、本発明者らは、たとえば前記配列の２つを含むｓｉＲＮＡ分子のような核酸分子を用いて、移植または処置すべき器官の血管中の接着分子の発現を抑制することにより、移植または心筋保護下の心臓手術終了後の開存率が顕著に増加し、対応する分子が細胞にトランスフェクトされた場合、膜統合性がよく保護されることを示すことができた。
【００３１】
そのような分子は、たとえばバイパス手術中に使用することができる。つまり、手術中に外植した伏在静脈の組織片を、バイパス移植片として使用するまで、たとえば、リンゲル乳酸液中に約１時間保存できる。この工程は、ｓｉＲＮＡとしての核酸分子を有する血管内皮細胞をトランスフェクトするために利用できる。非常に多くの種類のいわゆるｓｉＲＮＡ分子が、「カクテル」の形態で細胞にトランスフェクトされる。相当に処理された血管組織片は、次いで、バイパスとして移植される。バイパス移植における再狭窄率は、生体細胞内での接着分子の発現抑制により、顕著に減少する。
【００３２】
本発明の分子は、肺移植手術中にも使用できる。器官を摘出した後、肺を保存液で洗浄し、被移植者に再移植するまで、氷上で約６〜８時間保存する。この段階は、ｓｉＲＮＡとしての核酸分子を有する肺の内皮細胞、すなわち肺微小血管細胞をトランスフェクトするために利用できる。すでに記載したように、種々のｓｉＲＮＡ分子は、随意に、通常の保存液、たとえばＥｕｒｏ  ＣｏｌｌｉｎｓあるいはＰｅｒｆａｄｅｘを加え、カクテルの形態で調整できる。公知の移植アルゴリズムが変更されないのであれば、これは有利である。
【００３３】
さらに、本発明の分子は、心筋保護下の開心手術中に使用できる。このためには、本発明の分子は、たとえば、ｓｉＲＮＡ分子として、場合によりカクテルの形態で心筋保護液に添加される。
【００３４】
したがって、本発明者らは、他文献で最先端技術としてすでに記載されている遺伝子サイレンシングの原理を、血管および肺の移植ならびに心筋保護の処置に移入した。たとえば、Ｎｅｄｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），「ＩＣＡＭ−１発現のアンチセンスを介した抑制：ヒト歯周組織の炎症に対する治療法」Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１２（２），７１−７８には、歯周炎治療の目的でＩＣＡＭ−１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用が記載されている。
【００３５】
Ｎｉｓｈｉｗａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）、「血管内皮細胞中の内在性Ｅ−セレクチンをサイレンシングする低分子干渉ＲＮＡの導入は、白血球接着の抑制を成功させる」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１０（４），１０６２−１０６６には、Ｅ−セレクチンに対し、内皮細胞への白血球の接着を妨害するｓｉＲＮＡ分子が記載されている。
【００３６】
Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），「２１ヌクレオチドＲＮＡの二重鎖は培養哺乳類細胞におけるＲＮＡ干渉を媒介する」Ｎａｔｕｒｅ４１０（６８３６），４９４−４９８には、種々の哺乳類細胞系において内因性の異種遺伝子を抑制する種々のｓｉＲＮＡ分子が記載されている。
【００３７】
米国特許第２００４／０２２０１２９Ａ１号には、ＩＣＡＭ−１に対し、炎症性および自己免疫性疾患、糖尿病ならびにガンの治療の使用が提案されるｓｉＲＮＡ分子が記載されている。
【００３８】
国際特許第２００４／０４５５４３号は、具体的に使用範囲または臨床用途は示さずに、数多くのｓｉＲＮＡ分子について記載する。
【００３９】
国際特許第２００４／０６５５４６Ａ２号は、ＩＣＡＭ−１に対し、炎症性および自己免疫性疾患ならびに糖尿病の治療のための使用が提案されているｓｉＲＮＡ分子について記載する。
【００４０】
国際特許第０３／０９９２９８Ａ２号には、実際の分子の記載はないが、ｓｉＲＮＡ技術の一般的な説明がある。
【００４１】
最新のｓｉＲＮＡ技術の使用に関する調査が、Ｗａｄｈｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），「ＲＮＡ干渉のノウハウおよび研究と治療におけるその応用例」，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．５６７（１），７１−８４に記載されている。
【００４２】
本発明は、配列番号１〜４４を含むそのような核酸分子ばかりでなく、１つ以上の提示されたヌクレオチド配列とともに、５´または３´方向に別のヌクレオチドまたは化合物を有する核酸分子も包含する。これは、ｓｉＲＮＡ分子としての核酸分子の機能性にいかなる悪影響も有さない。逆に、別のヌクレオチドまたは化合物を加えることにより、たとえば、治療すべき生体細胞への核酸分子の取り込みを促進、またはヌクレアーゼ耐性を阻害するヌクレオチド配列によって、分子の効率は高まる。さらに、個々のヌクレオチドは、ヌクレオチド配列番号１〜４４の範囲内で、該分子が本質的に相補的なヌクレオチド配列と結合する能力を失うことなく、交換あるいは突然変異され得る。したがって、本発明の核酸分子が、十分に長い分節に渡って、実質的な緊縮条件下で、対応ｍＲＮＡのような本質的に相補的な核酸分子とハイブリダイズされ、ｓｉＲＮＡ分子が使用される場合に、ＲＩＳＣ複合体の活性を介して、対応ｍＲＮＡの開裂を引き起こすことは明白である。「緊縮条件」は、本明細書では、核酸分子の不特定な集団化が阻止される条件を意味する。該緊縮条件は、たとえば、十分に高い塩濃度、特定のｐＨ値、高温などを与えることにより作られる。これらの条件下では、十分な長さに渡って塩基対を形成することができる核酸ストランドは、互いにハイブリダイズされる。
【００４３】
また、本発明の核酸分子は、たとえばｓｉＲＮＡの構成成分であるが、細胞内のヌクレアーゼ耐性が増加するよう変性させることができる。たとえば、ＤＮＡダイマーを含み得るストランドの両端の短い突出部は、これに適することが明らかとなっている。本発明の核酸分子の好ましくは３´末端、また５´末端でもよいが、に、デオキシチミジン（ｄｔ）が繰り返し与えられたものが特に好適である。
【００４４】
本発明の核酸分子は、公知の合成法によって簡単に製造することができる（Ｋｒｅｔｓｃｈｍｅｒ−Ｋａｚｅｍｉ  Ｆａｒ  Ｒ．およびＳｃｚａｋｉｅｌ  Ｇ．（２００３），「哺乳類細胞におけるｓｉＲＮＡの活性は、構造標的接近容易性に関連する：アンチセンスオリゴヌクレオチドとの比較」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（１５）４４１７−４４２４参照）。この刊行物の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４５】
添付の配列表に、本発明の核酸分子がＲＮＡ分子である場合のヌクレオチド配列を示す。もちろん、ＤＮＡ分子であってもよい。後者の場合、ヌクレオチド配列番号１〜４４において、「ｕ」（ウラシル）は、いずれの場合にも「ｔ」（チミン）に置き換えられる。このようにして変性した配列は、本発明によれば、配列番号１〜４４に含まれる。
【００４６】
こうした背景の下、本発明はまた、添付の配列表の配列番号１〜４４のうち１つ以上のヌクレオチドを持つ核酸がハイブリダイズされるのと同じ核酸分子に、緊縮条件下でハイブリダイズされる核酸分子に関する。
【００４７】
本発明者らは、当業者が多大な経費をかけることなく、定型の合成法で同程度の特性を持つ別の分子または配列を生成できるような、あるいは、個々のヌクレオチドを随意に追加または置換することによって前記分子または配列を変性できるような、治療上価値のある核酸分子または種々のヌクレオチド配列を開発した。しかし、そのような別のまたは変性核酸分子も、ヌクレオチド配列番号１〜４４の１つをハイブリダイズする同じ核酸分子に、許容可能なわずかの喪失はあり得るが、ハイブリダイズすることが可能であるため、本発明にしたがって同様に課題を達成する。したがって、そのような任意の変性核酸分子もまた、本発明の対象である。
【００４８】
さらに、本発明は、上述した核酸分子を含み、生体細胞、好ましくは、肺微小血管細胞を含む内皮細胞のトランスフェクションに適する遺伝子構築物に関する。
【００４９】
そのような遺伝子構築物は、ヌクレオチド配列番号１〜４４またはその派生物の１つ以上に加え、さらに別の、たとえばトランスフェクションによる、構築物の生体細胞への挿入に有利に働く、ヌクレオチド配列を含むことを特徴とする。トランスフェクションに好都合なこれらのさらなるヌクレオチド配列または分節は、当業者に公知である。
【００５０】
それらの例として、Ｕ６もしくはＨ１のようなＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーターが挙げられる（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），「哺乳類細胞における低分子干渉ＲＮＡの安定発現システム」，Ｓｃｉｅｎｃｅ２９６：５５０−５５３、またはＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），「ヒト細胞におけるＨＩＶ−１逆転写を標的とする低分子干渉ＲＮＡの発現」Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５００−５０５、またはＭｉｙａｇｉｓｈｉおよびＴａｉｒａ（２００２），「ｓｉＲＮＡ発現ベクターの開発と応用」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．［Ｓｕｐｐｌ］２００２：１１３−１１４参照）。これら刊行物の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５１】
これらの分子を使用することにより、トランスフェクション分子としての適合性はさらに適正化される。したがって、該遺伝子構築物は、特に接着分子の発現を抑制するための治療ツールとして、適している。
【００５２】
遺伝子構築物は、肺微小血管細胞を含む内皮細胞のトランスフェクションを促進するよう設計することが好ましい。実際、これらの細胞は、たとえば移植における、狭窄の進行または血管膜の損傷において重要な役割を担う。とりわけ、これらの細胞における接着分子発現の増加により、内皮細胞の整合性に悪影響を及ぼす白血球の経内皮移動が起こり、狭窄状態またはＰＧＦの進行が起こり得る。これは、本発明により、効果的に是正される。本発明者らにより確認されたように、接着分子の発現の抑制は、白血球の経内皮移動を阻止し、その結果、増殖につながる炎症性刺激はもはや存在しなくなる。
【００５３】
遺伝子構築物は、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、プラスミド、ベクター、ウィルスからなる群から選択されるのが好ましい。これらの分子は、一本鎖でも二本鎖でもよく、場合によっては、ヘアピン構造を形成することもある。本発明によれば、用語「遺伝子構築物」には、リン酸カルシウムと複合体を形成する上述した分子も含まれる。この方法は、いわゆるリン酸カルシウム沈殿法により、特に簡単に、核酸分子または遺伝子構築物を生体細胞に挿入することができるという利点を有する。
【００５４】
したがって、本発明は、少なくとも一部が互いにハイブリダイズされる１組のＲＮＡ分子を有するｓｉＲＮＡ分子にも関するが、ＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１および２、３および４、５および６、７および８、９および１０、１１および１２、１３および１４、１５および１６、１７および１８、１９および２０、２１および２２、２３および２４、２５および２６、２７および２８、２９および３０、３１および３２、３３および３４、３５および３６、３７および３８、３９および４０、４１および４２、ならびに４３および４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する。
【００５５】
本発明者らによって発見されたように、これらのｓｉＲＮＡ分子は、接着分子の発現を抑制するための特に強力なツールであり、したがって血管、好ましくは移植する静脈血管の治療に使用することができる。
【００５６】
ＲＮアーゼに対して安定化したｓｉＲＮＡ分子が提供されるのが好ましい。この方法は、分子の寿命が実質的により長いという利点を有する。たとえば、安定化したｓｉＲＮＡ分子を使用すると、非安定化ｓｉＲＮＡ分子の場合の数分に対し、血清における安定性は数時間にまで増加する。安定化したｓｉＲＮＡ分子を得るには、当業者に公知の方法により、後者を化学的に変性させる。そのような方法は、米国、シカゴのＤｈａｒｍａｃｏｎ社によりｓｉＳＴＡＢＬＥ（商標）ｖ２という名称で、あるいはドイツ、ベルリンのＡｔｕｇｅｎ社によりＡｔｕＲＮＡｉという名称で市販されている。また、安定化したｓｉＲＮＡ分子については、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），「化学変性したｓｉＲＮＡの強力な持続性インビボ抗ＨＢＶ活性」，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８），１００２−１００７、Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），「ＲＮＡｉにおけるｓｉＲＮＡ機能：化学変性分析」，ＲＮＡ９（９），１０３４−１０４８にも記載されている。これら刊行物の内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【００５７】
ｓｉＲＮＡ分子としては、ヘアピンｓｉＲＮＡ分子が好ましい。これらのヘアピンｓｉＲＮＡ分子は、受容細胞のＤＮＡに組み込まれ、細胞中にｓｉＲＮＡが永久発現する。この方法は、抑制ｓｉＲＮＡ分子が常に「補充」されることにより、接着分子の発現が永続的に抑制されるという利点を有する。
【００５８】
さらに、本発明は、上述した核酸分子および／または上述した遺伝子構築物および／または前記ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも１つを含む組成物に関する。組成物は、器官、好ましくは血管または肺の移植片、を培養または保存するための生理用液が好ましく、これは必要に応じ、緩衝物質、塩および他の助剤、活性剤、添加剤または防腐剤を含む。
【００５９】
外植器官、すなわち、たとえば、移植する静脈血管または肺移植片を、手術中または手術後にそのような組成物中に置くことができ、該組成物は、カリウムおよびマグネシウムを含む心筋保護液でもあり得る。次いで、それに含まれる核酸分子および／または遺伝子構築物またはｓｉＲＮＡ分子の、血管、肺移植片、または切開した心臓の細胞への実際のトランスフェクションが、この組成物を使用して、あるいは組成物中で行うことができる。上述したように、該組成物は、本発明による核酸分子またはｓｉＲＮＡ分子の混合物を含むことができるため、多様な接着分子の阻害を抑制できる。助剤または添加剤は、器官を可能な限り注意深く確実に貯蔵および／または保存する助けとなるものであり、当業者には公知のものである。これらは、トランスフェクション媒介物質、たとえば、ドイツ、カールスルーエのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から出ているセルフェクチン、リポフェクタミン、オプチフェクトも含む。防腐剤も当業者に公知であり、汚染微生物の増殖を防止するもので、たとえば、抗生物質を含むこともあり得る。後者はトランスフェクションの成功を検証するための選択剤の役割も果たすことができる。活性剤、たとえば、治療活性のある物質の追加的供給は、トランスフェクションと並行して、また別の方法で器官に治療的な予備的処置を施すことができ、それが、バイパスまたは呼吸器官としての移植片の適合性持続を追加的に改善することができるという利点を有する。前記物質および塩もまた、細胞生物学者または移植医学の専門家に当然公知である。
【００６０】
さらに、本発明は、装置、特に塗膜を有するステントに関し、該塗膜が、前記の核酸分子および／または遺伝子構築物および／またはｓｉＲＮＡ分子および／または組成物を含むことを特徴とする。
【００６１】
一般的に金属ワイヤメッシュの小さな管状形態のステントは、閉塞または狭窄した血管を恒久的に広げるため、すなわち血管管腔の直径を広げ、および血管の崩壊または突然の再閉塞を防ぐために、使用される。したがって、ステントは、柔軟な管状格子であり、血管、特に心臓の中の血管の開存性を向上させるために血管を支持するものである。
【００６２】
たとえばバルーンカテーテルを使用して、治療する血管中に適切に配置される本発明の塗布ステントは、塗膜中に含まれる核酸分子またはｓｉＲＮＡ分子などが、その治療作用を働かせる周囲の血管に「薬剤放出」または「薬剤溶出」効果として放出されるように作成され得る。本発明のこの種のステントは、核酸分子を特定部位に限定して使用することを可能にする。これに使用する塗膜は、本発明の核酸分子を当業者に公知の物理化学的方法により安定した状態で含み、必要であれば遅延時間を有しつつ、治療する血管に放出されるリポソームナノ粒子を含むことができる。
【００６３】
本発明によれば、装置またはステントの塗膜は、生分解性および／または生体吸収性のあるポリマーから形成されるのが好ましい。そのような生体材料は、手術用途で確立されており、当業者に公知である。好適な生体材料として、ポリスルホン（ＰＳＵ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳＵ）、ポリグリコリドおよびポリラクチド、たとえばポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、マグネシウムおよびこれらの混合物が挙げられる。これらの材料は、特に、ステント用の塗膜として適している。一方、これらは、塗膜を通じたステントの機械的特性の保持および生体適合性の向上を確実にする。また一方、ポリマーは、本発明の核酸分子またはｓｉＲＮＡ分子も含むことができる。そのようなポリマーは、対応接着分子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ分子の標的放出用マトリックスとして使用することもできる。本明細書において、これらを「遺伝子サイレンシングステント」と呼び得る。生分解性ポリマーは、少なくともｓｉＲＮＡ分子が溶出している間、体内で有効性を保つ。これにより、治療する血管の整合性が、手術中ばかりでなく被移植者への再移植後一定時間、損なわれずに保たれる。
【００６４】
あるいは、ステント全体がこれらの生体材料から形成され、本発明の核酸分子および／またはｓｉＲＮＡ分子を含んでもよい。これらの吸収性ステントは、本来の血管の構造をそのまま残し、また、たとえば、心臓外科医がバイパスを任意の点に吻合できるという利点を有する。また、状況によっては、吸収性ステントは、不安定プラグ検出時に、いわゆるプラグシール、すなわち、血行動態力学的に直接関連しない狭窄を予防的にステント留置することを可能にする。現代の画像診断は、そのような構造を鮮明に示せるようになっている。吸収性ステント、特にマグネシウムステントの調査を、Ｅｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），「吸収性ステントへの道：臨床上の現実性に到達したか？」Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔ．Ｒａｄｉｏｌ．２９に見ることができる。この刊行物の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００６５】
こうした背景の下、本発明はまた、ヌクレオチド配列番号１〜４４のうち１つを含む核酸分子、または緊縮条件下で同じ核酸分子にハイブリダイズする核酸分子を、ｓｉＲＮＡとして、または後者の生成のために含む拡散分子の用途に関する。
【００６６】
本発明者らは、前記ヌクレオチド配列を持つ核酸分子を「遺伝子サイレンシング」に使用することができ、その結果、内皮接着分子の発現の抑制が選択的に行われることを初めて認識した。本発明によれば、添付の配列表のヌクレオチド配列番号１および２、３および４、５および６、７および８、９および１０、１１および１２、ならびに１３および１４を含む核酸分子、または同程度のハイブリッド化特性を有する核酸分子を、ＩＣＡＭ−１の内皮発現を抑制するために使用する。同じことが、ヌクレオチド配列番号１５および１６、１７および１８、１９および２０、２１および２２、２９および３０、３１および３２、３３および３４、ならびに３５および３６を有する核酸分子のＶＣＡＭ−１の内皮発現抑制に、およびヌクレオチド配列番号２３および２４、２５および２６、２７および２８、３７および３８、３９および４０、４１および４２、ならびに４３および４４を有する核酸分子のＥ−セレクチン（Ｃ６２−Ｅ）の内皮発現抑制について準用される。
【００６７】
すでに説明したように、同程度のハイブリッド化特性を有する核酸分子は、ヌクレオチド配列番号１〜４４から誘導されたものであり、活性がわずかに損なわれる可能性はあるが、ｓｉＲＮＡ分子と同等に機能すると理解されている。したがって、本発明の功績は、実際、次いで同一の方法で対応する核酸分子に変換される特定のヌクレオチド配列を提供することを含むことではなく、むしろｓｉＲＮＡ特性を持つ対応核酸分子用ガイディング構造としての役割を果たす基本配列を提供したことにある。したがって、本発明は、ヌクレオチド配列番号１〜４４の１つを排他的に含む核酸分子に限定されない。むしろ、列挙した配列から誘導される配列を含み、緊縮条件下で同程度のハイブリッド化特性を持つ核酸分子を含む。
【００６８】
さらに、本発明は、（ａ）生体細胞、好ましくは器官または器官の一部、さらに好ましくは血管、を準備する工程と、（ｂ）先に記載した核酸分子、遺伝子構築物またはｓｉＲＮＡ分子を生体細胞に挿入する工程と、場合によっては（ｃ）生体細胞を洗浄および／または単離する工程とを含む、生体細胞における接着分子の発現を抑制する方法に関する。
【００６９】
本発明によれば、工程（ｂ）は、たとえば、通常のトランスフェクション方法、たとえば、リン酸カルシウム沈殿法、電気窄孔法、微量注入法、リボフェクション、デンドリマーによるポリフェクション、レセプター媒介転写などにより行う（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ  Ｄ．Ｗ．（２００１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ参照。この刊行物の内容は参照により本明細書に組み入れられる）。
【００７０】
この方法によれば、単離された生体細胞および、血管切片や肺移植片のような、器官または器官の一部のいずれも、簡単な手段により、生体外で処理し、バイパス移植片の閉塞に関連する接着分子の発現を、対応する細胞内で抑制することが可能である。したがって、この方法によれば、細胞生物学者または生理学者および外科医には、生体細胞または器官の一部を正確に（予備的に）処理できる特別な方法が提供される。そのように処理された細胞または器官の一部は、細胞生物学に関連する科学的研究のために、および、たとえばバイパスまたは肺として、次の移植に使用できる。
【００７１】
この方法では、工程（ｂ）における挿入を、非ウィルス一過性トランスフェクションにより行うのが好ましい。
【００７２】
この方法は、ウィルス性ベクターの感染論的要素がこの形態のトランスフェクションには存在しないという利点を有する。非ウィルス一過性トランスフェクションも、同様に非常に効率的で、心臓手術中にも、公知の分子生物学的方法により行うことができる。
【００７３】
本発明者らはまた、（ａ）血管、好ましくは大伏在静脈を患者から切除する工程と、（ｂ）先に記載した核酸分子、遺伝子構築物またはｓｉＲＮＡ分子を、血管の細胞に、好ましくは、非ウィルス一過性トランスフェクションによって挿入する工程と、（ｃ）処理した血管、好ましくはバイパスの形成のための血管を移植すなわち体内移植する工程、とを含む、患者に対して行うことができる管移植方法も開発した。
【００７４】
従来の管移植技術とは対照的に、これは、血管の処置、核酸分子、遺伝子構築物またはｓｉＲＮＡ分子の挿入により、接着分子の発現を内皮細胞内で抑制するという利点を有する。その後移植される血管は、処理されていない移植片に比べ、格段に低い管狭窄発症率を示す。工程（ｂ）による培養中、内皮細胞のトランスフェクションは、たとえば、非ウィルス性リポソームトランスフェクションにより行われる。これにより、バイパス移植片の一過性保護が生じ、これは、特に再潅流初期の不安定な数時間にバイパス内皮細胞を保護するため、早期再狭窄率の低下に寄与する。
【００７５】
こうした背景の下、工程（ｃ）は、工程（ａ）の終了後５時間以内、好ましくは遅くとも１時間以内に行われる。
【００７６】
この方法は、切除された血管に生命力のいかなる喪失もなく、むしろその生理的機能が完全に保持されることを保証するという利点を有する。しかし、生命力の最小限の喪失は容認し得る。
【００７７】
今日まで、内皮接着分子発現を防ぐ臨床的に実用的な治療手段はなく、したがって、血管移植片を保護する手段もなかった。現在の最新技術においては、血管移植片の保護を、接着分子に対する抗体の応用による、あるいは熱ショックを与えた、保護作用を有するタンパク質の高温誘導による放出から考察した実験的アプローチに関する単発の記述がある。しかし、そのようなアプローチは、転用できないか、または転用が薬理学的に非常に問題を含んでいることが明らかとなった。
【００７８】
したがって、本発明者らは、冠動脈疾患の治療のために使用可能であり、また特に、バイパス手術における外科的ＯＰ管理に最適に一体化し得る重要なツールおよび方法を提供する。
【００７９】
さらに、本発明者らは、患者に対して行うことができる、以下の工程、すなわち、（ａ）提供者から肺を摘出する工程と、（ｂ）上述した核酸分子、遺伝子構築物またはｓｉＲＮＡ分子を、好ましくは非ウィルス一過性トランスフェクションの方法によって、肺微小血管細胞に挿入する工程と、（ｃ）該肺を患者に移植すなわち体内移植する工程と、を含む肺移植技術を開発した。提供者は、鼓動心臓提供者（ＢＨＤ）、非鼓動心臓提供者（ＮＨＢＤ）のいずれでもよい。
【００８０】
工程（ｃ）は、工程（ａ）の終了後約６〜８時間の時間間隔をおいた後に行われるのが好ましい。この方法は、肺を保存液中で保存する時間を、ｓｉＲＮＡ分子のトランスフェクションのために最適に利用するという利点を有する。
【００８１】
さらに、本発明は、（ａ）肺移植片を準備する工程と、（ｂ）上述した核酸分子、遺伝子構築物またはｓｉＲＮＡ分子を、好ましくは非ウィルス一過性トランスフェクションの方法によって、肺微小血管細胞に挿入する工程と、を含む肺移植処置または保存方法に関する。
【００８２】
さらに、本発明は、（ａ）心臓切開の患者を準備する工程と、（ｂ）先に記載した核酸分子、遺伝子構築物、またはｓｉＲＮＡ分子を、好ましくは非ウィルス一過性トランスフェクションの方法によって、心臓の内皮細胞に挿入する工程と、を含む心筋保護の範囲内で切開された心臓を処置する方法に関する。
【００８３】
次に、本発明を出願の実施例に基づいて説明するが、実施例は純粋に説明目的のためにあり、多少たりとも本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００８４】
核酸分子
本発明を導いた実験において使用した核酸分子は、当業者に周知の方法によりオリゴヌクレオチドとして合成した。二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を形成するために、センスストランドを、公知の最先端の条件下、それぞれのアンチセンスストランドによりハイブリダイズする。
【００８５】
オリゴヌクレオチドの合成およびｓｉＲＮＡの形成は、たとえば、Ｋｒｅｔｓｃｈｍｅｒ−Ｋａｚｅｍｉ（上記引用文献）中に、特に材料および方法に関する項目に記載され、該項目は、参照により本願に組み込まれる。
【００８６】
以下の表は、本発明に従って使用される核酸分子の概要を示すものである。
【表１−１】
2008526266.tif 000002
【表１−２】
2008526266.tif 000003
【００８７】
患者
血管サンプル、すなわち、大伏在静脈の切片は、冠状動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）を受けた患者から得た。これらの切片は通常、そういった手術の後、廃棄される。患者は、前もって、血管切片の科学的使用に同意していた。
【００８８】
実験は、テュービンゲン大学の倫理委員会により予め承認されていた。
【００８９】
大伏在静脈由来の内皮細胞の単離および培養
細胞を、すでに公表されている手順に従って入手し培養した（Ｎａｃｈｍａｎ，Ｒ．Ｌ．およびＪａｆｆｅ，Ｅ．Ａ．（２００４），「内皮細胞の培養：現代血管生物学の始まり，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１４（８），１０３７−１０４０、ならびにＪａｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７３），「臍静脈由来ヒト内皮細胞の培養。形態学的および免疫学的基準による同定，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５２（１１），２７４５−２７５６参照）。
【００９０】
要約すれば、全ての培養プレートおよびフラスコ（ドイツ、ハイデルベルク、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）は、４０％コラーゲン（米国インディアナ州、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ社製Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｇ，）で一晩かけて塗膜した。血管全体を、まず、ＲＰＭＩ１６４０緩衝液（ベルギー、ベルビエ、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｓ．ｐ．ｒ．ｌ．）および０．５％／ｍｌのゲンタマイシン（ドイツ、カールスルーエのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中で培養した。次いで、該血管を緩衝液（５００ｍｌのＨ２Ｏ中、１３７ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣｌ、４．２ｍＭのＮａＨＣＯ３、５ｍＭのＤ−グルコース、ｐＨ７．３、無菌）で濯いだ。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中０．１％コラゲナ−ゼ（ドイツ、ケルベ、ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて分解し、さらにＥＧＭ−２（＋バレットキット、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｅｒｖｉｅｒｓ）中で培養することにより、内皮細胞を得た。コンフルエンス状態に達した後、細胞をトリプシン（ドイツ、ハイデルベルク、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製デタッチキット）で処理することにより、それぞれ分離した。第三継代からの細胞を全ての実験で使用した。マイコプラズマによる汚染が存在しないことを立証するため、試験は、ＤＡＰＩ法（ドイツ、ハイデルベルグ、ＳＥＲＶＡ  Ｅｌｅｋｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ社）を用いて行った。単離した静脈性内皮細胞の純度は、ウィルブランド因子、ＶＥＧＦＲ−２、Ｔｉｅ−２を染色して確認した。
【００９１】
肺微小血管細胞
ヒト肺微小血管細胞は、英国バークシャー州、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ社から入手した。
【００９２】
単離した内皮細胞のトランスフェクション
トランスフェクションは全てＲＮアーゼのない条件化で行った。単離した内皮細胞を、コラーゲンコートした１２穴プレート（ドイツ、フリッケンハウゼン、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ社製）で、抗生物質を使用せずに培養した。コンフルエンス（７０〜８０％）に達した後、単離した内皮細胞を、２．０１μｌ／ｍｌのセルフェクチン（ドイツ、カールスルーエ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用してハイブリダイズしたｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。４種類の細胞処理（それぞれ２つずつ）：１．非刺激単離内皮細胞／肺微小血管細胞（トランスフェクトなし）２．刺激（ＴＮＦ−α、２．５ｎｇ／ｍｌまたは５ｎｇ／ｍｌ）単離内皮細胞／肺微小血管細胞（トランスフェクトなし）３．本発明のｓｉＲＮＡ分子で刺激し、トランスフェクトした単離内皮細胞／肺微小血管細胞、４．非特異的無作為ｓｉＲＮＡ（ドイツ、ヒルデン、ＱＩＡＧＥＮ社製）で刺激し、トランスフェクトした、単離内皮細胞／肺微小血管細胞、について並行して試験した。
【００９３】
トランスフェクション時間は２時間であり、実験は４回繰り返した。９時間後、単離した内皮細胞／肺微小血管細胞全てを、ＴＮＦ−α（２．５ｎｇ／ｍｌまたは５ｎｇ／ｍｌ）（ドイツ、フリゾイテ、Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ社製）で１５時間刺激した。
【００９４】
フローサイトメトリー（蛍光活性化細胞分類法）（ＦＡＣＳ）による分析
ＴＮＦ−α刺激の後、単離し、あるいはトランスフェクトした内皮細胞／肺微小血管細胞群の全てを、ＥＧＭ−２溶媒で洗浄した。抗体の非特異性結合を、ＦＣＳ（５％，ｐＨ７．４）で阻害した。任意にトランスフェクトした単離内皮細胞／肺微小血管細胞を染色するために、それぞれの接着分子（ドイツ、ハイデルベルク、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）、すなわち、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１またはＥ−セレクチン（ＣＤ−６２Ｅ）に対してＰＥ標識した抗体を使用した（４℃で１時間）。洗浄、分離した後、細胞をＰＢＳ中、２．５％パラホルムアルデヒドで固定した。ＦＡＣＳ分析（５０００個の細胞／１測定）をＦＡＣＳｃａｎ（商標）（ドイツ、ハイデルベルク、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）中で行い、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔＰｒｏソフトウェア（ドイツ、ハイデルベルク、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を使用して計算した。
【００９５】
これらの実験の結果を、図１〜６に示す。
【００９６】
図１および４は、単離した内皮細胞（図１）または肺微小血管細胞（図４）を、ＩＣＡＭ−１に対する、すなわち表１のＮｏ．１〜７を有するｓｉＲＮＡ分子である、本発明のｓｉＲＮＡの１つでトランスフェクトした実験の代表的な結果を示す。ＦＡＣＳ分析においては、細胞を、ヒトＩＣＡＭ−１に対する抗体を用いて相当に染色した。結果は、ｓｉＲＮＡ分子のそれぞれに関して比較可能であった。
【００９７】
図２および５は、単離した内皮細胞（図２）または肺微小血管細胞（図５）を、ＶＣＡＭ−１に対する、すなわち表１のＮｏ．８〜１１または１５〜１８を有するｓｉＲＮＡである、本発明のｓｉＲＮＡの１つでトランスフェクトした実験の代表的な結果を示す。ＦＡＣＳ分析においては、細胞を、ヒトＶＣＡＭ−１に対する抗体で、相当に染色した。これも、結果は、ｓｉＲＮＡ分子のそれぞれに関して比較可能であった。
【００９８】
図３および６は、単離した内皮細胞（図３）または肺微小血管細胞（図６）を、Ｅ−セレクチンに対する、すなわち、表１のＮｏ．１２〜１４または１９〜２２を有するｓｉＲＮＡ分子である、本発明のｓｉＲＮＡの１つでトランスフェクトした実験の代表的な結果を示す。ＦＡＣＳ分析において、細胞を、ヒトＥ−セレクチンに対する抗体で、相当に染色した。結果は、ｓｉＲＮＡ分子のそれぞれに関し比較可能であった。
【００９９】
アッセイ（１）は、それぞれ、負の対照、すなわち、トランスフェクションも刺激もないことを示す。アッセイ（２）は、それぞれ、正の対照、すなわち、トランスフェクションはないがＴＮＦ−αによる刺激があるものを示す。アッセイ（３）は、ＴＮＦ−αで刺激された内皮細胞／肺微小血管細胞中、特異的ｓｉＲＮＡによるトランスフェクションを示す。アッセイ（４）は、内皮細胞／肺微小血管細胞をＴＮＦ−αで刺激し、非特異的ｓｉＲＮＡ（表１のＮｏ．２３；配列番号４５および４６）でトランスフェクトした対照を示す。
【０１００】
アッセイ（３）のいずれにおいても、対応する内皮細胞／肺微小血管細胞内での本発明による特異的ｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションにより、それぞれの接着分子の発現が大きく抑制されたことがわかる（アッセイ（２）と比較して）。
【０１０１】
内皮細胞におけるこの抑制は、ＩＣＡＭ−１の場合、極めて顕著に現れた。ここで、発現レベルは、本発明のｓｉＲＮＡでの処理により、ほぼ９０％抑制された。ＶＣＡＭ−１の場合、発現レベルは、ほぼ７０％減少した。Ｅ−セレクチン（ＣＤ−６２Ｅ）の場合、発現レベルは、４０％以上減少した。
【０１０２】
肺微小血管細胞では、ＩＣＡＭ−１の発現レベルは、本発明のｓｉＲＮＡでの処理によりちょうど５０％抑制された。ＶＣＡＭの場合、発現レベルは、７０％以上減少した。Ｅ−セレクチンの場合、３０％を超える減少が観察された。
【０１０３】
このように、本発明者らは、本発明の核酸分子は生体細胞における接着分子の発現を抑制するための非常に強力なツールであり、したがって、特に移植治療に適していることを実証できた。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
添付の図面について以下の通り説明する。
【図１】図１は、内皮細胞におけるＩＣＡＭ発現の抑制を本発明の核酸分子により達成した、フローサイトメトリーによる分析結果を示す。
【図２】図２は、内皮細胞におけるＶＣＡＭ−１発現の抑制を本発明の核酸分子により達成した、比較実験の結果を示す。
【図３】図３は、内皮細胞におけるＥ−セレクチン（ＣＤ−６２Ｅ）の発現の抑制を本発明の核酸分子により達成した、別の比較実験の結果を示す。
【図４】図４は、ヒト肺の肺微小血管細胞におけるＩＣＡＭ発現の抑制を本発明の核酸分子により達成した、フローサイトメトリーによる分析結果を示す。
【図５】図５は、肺微小血管細胞におけるＶＣＡＭ−１発現の抑制を本発明の核酸分子により達成した、比較実験の結果を示す。
【図６】図６は、肺微小血管細胞におけるＥ−セレクチンの発現の抑制を本発明の核酸分子により達成した、比較実験の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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