(57)【要約】  混合物質における、ビタミン、アミノ酸、あるいはその他の生命に必要な物質の定量方法であって、それによって、培養容器、微小滴定プレートのキャビティの中に、それぞれの場合で、適切な微生物の所定の数の生きた細胞が、長持ちするように調整されている。この目的のために、細胞は、２００〜５００ｍＭトレハロース／スクロースを含有する凍結溶液中で、−８０℃で急速凍結され、それから凍結乾燥される。凍結溶液は好ましくは試験媒体である。培養容器は好ましくは微小滴定プレートのくぼみである。
2008507964.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物学的成長及び代謝測定のための培養容器中で、適切な微生物の所定の数の生きた細胞が、保存糖の添加、急速凍結及び凍結乾燥の後で、乾燥貯蔵されることで特徴付けられる、混合物質における、ビタミン、アミノ酸、あるいはその他の生命上生命に必要な物質それぞれの微生物学的定量方法。
【請求項２】
２００〜５００ｍＭのトレハロース／スクロース、好ましくは２００〜２５０ｍＭのトレハロースを含有する凍結溶液中で、前記細胞が急速凍結及び凍結乾燥される
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記凍結溶液は微生物学的測定の試験媒体である
請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が、−１０〜−１００℃の間、好ましくは−１８〜−８０℃の温度で急速凍結されて、凍結乾燥される
請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
測定される前記物質が、ビタミンＢ３（ナイアシン、ニコチン酸、ニコチン酸アミド）、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン（cyanocobalamain）、ヒドロキシコバラミン）、葉酸（葉酸、プテロイルグルタミン（pteroylglutaminic）酸、葉酸共役）、ビオチン、パントテン酸（パントテン（panonthenic）酸、パンテノール（panhenol））、ビタミンＢ１（チアミン、チアミンピロリン酸）、ビタミンＢ２（リボフラビン、リン酸リボフラビン）、ビタミンＢ６（ピリドキシン、ピリドキサール、ピリドキサミン、ピリドキサール−５’−リン酸）、リシン、メチオニン、シスチン、コリン、イノシトールから選択される
請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記微生物が、Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis、Enterococcus hirae、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus fermenti、Lactobacillus halveticus、L. veridescenc、Streptococcus faecalisから選択される
請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記培養容器が微小滴定プレートである
請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
微生物学的成長及び代謝測定のための培養容器を有し、
前記培養容器中に、適切な微生物の所定の数の生きた細胞が含まれ、
前記培養容器は、請求項１〜７のいずれかに係る、保存糖の添加、急速凍結及び凍結乾燥を通しての耐久性があるように形成されている、
混合物質における、ビタミン、アミノ酸、あるいはその他の生命に必要な物質それぞれの微生物学的定量のための試験キット。
【請求項９】
測定される前記物質が、ビタミンＢ３（ナイアシン、ニコチン酸、ニコチン酸アミド）、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン（cyanocobalamain）、ヒドロキシコバラミン）、葉酸（葉酸、プテロイルグルタミン（pteroylglutaminic）酸、葉酸共役）、ビオチン、パントテン酸（パントテン酸、パンテノール）、ビタミンＢ１（チアミン、チアミンピロリン酸）、ビタミンＢ２（リボフラビン、リン酸リボフラビン）、ビタミンＢ６（ピリドキシン、ピリドキサール、ピリドキサミン、ピリドキサール−５’−リン酸）、リシン、メチオニン、シスチン、コリン、イノシトールから選択される
請求項８に記載の試験キット。
【請求項１０】
前記微生物が、Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis、Enterococcus hirae、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus fermenti、Lactobacillus halveticus、L. veridescenc、Streptococcus faecalisから選択される
請求項８または９に記載の試験キット。
【請求項１１】
前記培養容器が、微小滴定プレート、好ましくは９６のくぼみを有する微小滴定プレートのくぼみである
請求項１１〜１４のいずれかに記載の試験キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般には混合物質における、特に、食料、飼料、化粧品、医薬、薬学生成物、体液、医療及び他の分析試料における、生命に重要な物質の定量のための方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生命に必要な物質がビタミンによって理解され、生物はそれを食品から摂らなければならない。バランスのよい飲食物で、ビタミンに対するヒトの一日の必要量は完全に満たされる。不完全なまたは誤った飲食物、あるいは吸収の乱れの場合には、ビタミン欠乏が起こりえて、壊血病、脚気、夜盲症などの疾病や死にさえ至らしめうる。それゆえ、幼児のための豆乳などの補助食品生成物は、ビタミンが補われている。食品もまた、別なようにビタミンが補われている。ビタミンの生物学的活性は構造に依存する；それは重量単位または国際単位（ＩＥまたはＥＵ）で示される。しかし、試料のビタミン含有量は、測定するのが困難であり、時間がかかる。これは特に、水溶性のビタミン、微量（trace）ビタミンＢ１２、葉酸及びビオチンに適合する。
【０００３】
混合物質中のビタミン含有量を(i)化学物理的方法、例えば高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）で測定することができる。これらは、ビタミンＢ１２、葉酸及びビオチンなどの微量ビタミンに対してはあまりに感度が低い（insensitive）。(ii)免疫学的方法による。それらは、マトリックス効果のために、多くの測定に対して十分に正確ではなく、各試料マトリックスに適応しなければならない。それによって、特に幼児用の食品、猫用の飼料、血清及び血液の場合には、他のマトリックス成分との干渉が簡単に起こる。(iii)さらに、動物試験においてビタミン含有量を測定できるが、それは実際面で適切ではなく、また、(iv)微生物学的方法により測定できる。ここで、特定的に欠乏し、試料またはビタミン標準が補われた栄養溶液の中で、それに対して測定すべきビタミンが基幹的である微生物が成長し、その成長または代謝がインターバル（interval）において、例えば滴定により、重量測定法で、濁りで、あるいはネフェロメトリにより（nephelometrically）、測定される。微生物学的測定の背景に関連して、さらなる次の刊行物が挙げられる：非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４。
【０００４】
微生物学的測定においては、培養時間の終わりに成長または代謝の値が並列（parallel）標準濃度シリーズの測定範囲に入るように、複数の希釈シリーズを適用しなければならない。各試験において、この試験にのみ有効な標準曲線が形成される必要がある。さらに、安全と精度の理由で、標準シリーズと試料シリーズの各濃度段階は、少なくとも３回適用されるべきである。試料のビタミン濃度は、それで、並列標準シリーズの既知のビタミン含有量との比較によって測定される。一般に、有効な精度の表示は可能ではないが、しかし、変動係数は１０％以下程度であるべきである。標準及び試料シリーズの植菌のための微生物懸濁液は貯蔵できず、各成長試験において新たに成長されなければならない。このように、植菌懸濁液が正しく成長したかどうか、あるいは微生物が望まれる感度及び選択性を持つかどうか、常に不確かさがある。ビタミンの微生物学的測定は非常に労力と時間を要求し、少なからぬ研究室組織を必要とする。食品分野における大変少ない研究室のみがこの種の分析を専門としてきた。今日までに、生物学的に活性なビタミン含有量の測定のための同等に良い方法が得られていないにもかかわらず、多大な経費のために、研究室のドクターはヒトの診断にこの方法を用いることを中断した。微生物学的測定は、しかしながら、依然として他の全ての方法に対する標準的方法である。
【非特許文献１】GORIN, G. et al. Appl. Microbiol., 1970, 20, 641-642
【非特許文献２】KELLEHER, BP et al., J. Clin. Pathol., 1991, 44(7), 592-595
【非特許文献３】BUI, M. H., J. Vitam. Nutr. Res., 1999, 69(5), 362-366
【非特許文献４】MOLOY, A. M. et al., Methods Enzymol., 1997, 281, 43-53
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、技術事情の不利益はなく、基本的にオートメーション化可能である、
改善された方法と、ビタミン、アミノ酸、特にリシン、メチオニン、あるいはシスチン、及び、コリンあるいはイノシトールなどの他の生命に重要な物質の微生物学的測定用キットを利用できるようにすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この目的は、成長と代謝の微生物学的測定のための培養容器中で、適切な微生物の所定の数の生きた細胞（vital cells）が、保存糖（conserving sugars）の添加、急速凍結（shock freezing）及び凍結乾燥の後で、ともに乾燥して貯蔵される、混合物質中の、個々のビタミン、アミノ酸、あるいは他の生命に必要な物質の微生物学的定量方法によって達成される。この目的のために、細胞は、追加の２００〜５００ｍＭのトレハロース／スクロース、好ましくは２００〜２５０ｍＭのトレハロースを含む凍結溶液中で急速凍結及び凍結乾燥される。凍結溶液は、好ましくは生物学的測定のための試験媒体である。この方法において、−１０〜−１００℃、好ましくは−１８〜−８０℃の温度で急速凍結される。本発明に係る試験装置（test equipment）またはキットは、微生物学的測定における１つまたはそれ以上の成長試験のための培養容器中で、所定の数でこのようにして保存された微生物を含む。培養容器は好ましくは微小滴定（microtitration）プレートのくぼみ（wells）である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明に係る方法は、細胞が室温でより長い期間保存できるように、また、液体の添加後に全ての細胞が均一にさらに成長するように、非還元性の保存糖及び分析独自の栄養媒体の存在下で、適切な細胞の正確な数が、試験容器中で保存されることによって特徴付けられる。微生物が−８０℃で急速凍結され、それから小さな体積へ、好ましくは０．５〜１００マイクロリットル、特に好ましくは１〜１０マイクロリットルへと凍結乾燥されるところの凍結乾燥を通して、乾燥と保存は生物に依存してわずかな改変で影響を受ける。非還元性の保存糖は、好ましくはトレハロースである。微生物への乾燥ダメージに対抗するため、サッカロース（サクロース）及びデキストロースなどの単糖を添加することもできる。好ましく用いられる濃度は、２００〜５００ｍＭのトレハロース（スクロースあり、またはなし）、好ましくは２００〜３５０ｍＭのトレハロース／スクロース、特に好ましくは２００〜２５０ｍＭのトレハロース／スクロースである。トレハロース濃度は少なくとも２００ｍＭの量であるべきである。Ｃａ２＋などの２価イオンの乾燥への添加は、成長の開始を改善する。凍結乾燥及び乾燥貯蔵において微生物が不足した環境に代謝を合わせてしまうのを避けるために、それらは好ましくは、当然測定される物質がない状態の後の検査媒体（later assay medium）中で急速凍結され、凍結乾燥される。それを通して、測定される物質、ビタミンなしで成長できる微生物が、凍結乾燥及び乾燥貯蔵中に生成されることが防止される。そのような微生物は、他の方法で発生し、高い測定背景へと導き、個々の場合には偽の結果へと導く。
【０００８】
キットは、本発明に係る方法の中間の生成物として提供される。ビタミンの微生物学的測定に対する試験キットは、較正された標準としての調製された試薬及び成長曲線の生成（preparation）のための栄養溶液を含む。微生物の代謝はエタノールあるいは乳酸などの代謝最終生成物で測定できることが当業者に知られている。それから、試験キッドは、例えば適したカラー反応による、これらの代謝最終生成物の検出のための試薬を含む。バクテリアの成長は、ルシフェリン（luciferin）及びルシフェラーゼ（luciferase）の追加を通して、バクテリア壁（bacterial wall）の分離の後で、ＡＴＰ含有量を通してケモルミニメトリカリー（chemoluminimetrically）に適格に測定することができる。
【０００９】
本発明に係る方法は、全てのビタミン、ビタミン先駆体、ビタミン誘導体、アミノ酸、及び他の生命に重要な物質の微生物学的測定のために適した原理に基づいている。特に、トレースビタミンの検出に対して推奨される。例として、以下に言及される：
【００１０】
検出のための微生物
最も重要な生物学的ビタミン活性物質はそれぞれの場合でかっこ内に示される。
【００１１】
ビタミンＢ１２（シアノコバラミン、ヒドロキシコバラミン）  Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactis, (L. leichmanii) ATCC 7830
【００１２】
葉酸（葉酸、プテロイルグルタミン酸、葉酸共役）  Enterococcus hirae ATTC 8043, Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469
【００１３】
ビオチン  Lactobacillus planatarum ATCC 8014
【００１４】
パントテン酸（パントテン酸、パンテノール）  Lactobacillus planatarum ATTC 8014
【００１５】
ナイアシン（ニコチン酸、ニコチン酸アミド）  Lactobacillus planatarum
【００１６】
ビタミンＢ１（チアミン、チアミンピロリン酸）  Lactobacillus fermentus ATCC 9338, Weisella (lactobacillus) viridescens ATCC 12706
【００１７】
ビタミンＢ２（リボフラビン、リン酸リボフラビン）  Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469, Lactobacillus halveticus
【００１８】
ビタミンＢ６（ピリドキシン、ピリドキサール、ピリドキサミン、ピリドキサール−５’−リン酸）  Saccharomyces cerevisiae ATCC 9080, Saccharomyces faecalis
【００１９】
コリン  Neurospora crassa ATCC 9277
【００２０】
イノシトール  Saccharomyces cerevisiae ATCC 9080
【００２１】
リシン、メチオニン、シスチン  Pediococcus acisilactici ATCC 8042
【００２２】
本発明に係るビタミン測定の格別の利点は、仕事と時間の縮小と並んで、全ての生物学的に類似して作用する化合物が測定されることである。これは、食品及び人の診断の分野に対して多くの利点を有する：
【００２３】
食品分野、ニコチン酸及びニコチン酸アミドの例で。両形態とも類似してビタミン活性である。ビタミンの両形態が存在する場合でも、一般にはニコチンのみが申告される。微生物学的測定は両形態とも検出する。
【００２４】
人の診断：ここで、また、微生物学的分析が有利である。従来の方法はビタミンの個々の形態のみを検出することから、今に至るまで血清分析が誤って解釈されてきた。微生物学的分析が真の生物学的に活性なビタミン含有量をもたらす。
【００２５】
驚くべきことに、本発明に係る方法は、標準試料と試料の再生できる成長曲線を提供する。数十年間、微生物はグリセリン、他の凍結溶液あるいは液体窒素中に保持されてきた。また、微生物及びスプーア（spoors）の凍結乾燥及び乾燥が知られた。技術の状態はさらに、閉じたコールドチェーン（closed cold chain)が避けられるのであれば、例えば微小滴定プレートのくぼみで、トレハロース及び２価の陽イオンの存在下での原核生物の微生物またはウイルスの乾燥及び貯蔵を教示する（米国特許６６１０５３１号；５１４９６５３号を参照）。しかし、これらの貯蔵方法のゴールは、微生物の基本的な生存可能性と、遺伝的及び免疫学的同一性の保持である。一方で、例えば凍結容器中でのより長い貯蔵の後で、代謝及び成長が発生するまでに微生物はそれぞれに長い期間が必要であるということも知られた。凍結の後で、微生物が培養溶液に移されると、一般的には（than as a rule）、最も速く再生し、最初に成長を始めた微生物が、溶液中の他の全ての微生物よりも早く成長する。最も速く成長する微生物では、通常成長する生物とは異なる生物が優先される。今までに、さらに、どのような形態の長期間貯蔵も、再構成（reconstitution）によってそれぞれに長い成長遅延へ導くと推測される。微生物学的ビタミン測定と、微小滴定プレートのくぼみまたはエッペンドルフ（Eppendorf）型容器などの培養容器中でのトレハロースなどの保存糖の存在下での正確な数の微生物の凍結乾燥の組み合わせは知られていなかった。水と栄養媒体の添加後、これらの微生物が全体として遅延なしに成長し始め、それで、微生物学的ビタミン測定において影響されるように、制御された成長試験に用いることができることも知られていなかった。
【００２６】
本発明に係る方法の利点は、ビタミン測定のための微生物がもはや新しく成長する必要がなく、しかし、定められた数及び構造で、微小滴定プレートのくぼみに存在していることに基づいている。それらをもって、試験を行う研究室のために、全ての成長及び希釈工程の手間が省かれる。必要なのは、正確な量のビタミンが欠けた栄養媒体と、試料または標準濃度のビタミンが、微小滴定プレートの個々のくぼみに添加されることにみである。微小滴定プレートを横切るくぼみの中の微生物は常に同じであるため、計測範囲は全体でより可変ではない（less variable）。それは、ある培養期間、微小滴定プレートが構成できることを意味する。また、必要なのは最終的に試料が簡単な工程で希釈されることだけであるので、希釈の失敗のリスクもより少ない。測定される、固定された標準濃度のビタミンの溶液は、キットに含まれていてもよい。これによって、標準曲線がより信頼できる。不純物の危険性は低減される。このように、微生物の数、成長の状態、微生物の遺伝子型及び試験媒体は検査されており、微小滴定プレート、微生物及び試験媒体に対して少なくとも１２ヶ月の貯蔵期間が保証されているので、ビタミン測定は直ちに開始できる。プレート及び原料は、乾燥され、菌がなく（germ-free）、室温で、理想的には４℃で貯蔵されることだけが必要である。
【００２７】
微小滴定プレートによって、測定はさらに通常のＥＬＩＳＡ及びＲＩＡ方法に適用される。微小滴定プレート技術は大きな数の試料、自動ピペット装置の採用、及び、微生物の成長と代謝レベルの自動化された読み取り及び測定を許容する。
【００２８】
この方法の技術によれば、微生物懸濁液が、トレハロース及び／またはスクロースが存在し、特定のビタミンが不足した溶液中で、急速凍結、凍結乾燥される。本来、微生物もまた、ガラス状の糖層のある完全な乾燥から自分自身を保護して、生き残る。この自然の生き残りメカニズムが本発明に利用される。
【００２９】
凍結された貯蔵とは対照的に、本発明に係るトレハロース／スクロース乾燥貯蔵に関して、液体または水の添加で細胞は直ちに再び活性となる。細胞への通常の凍結衝撃（freezing shock）は、起こらない。細胞の安定性は、トレハロース／スクロースの凍結及び貯蔵媒体への添加を通して保証される。トレハロースとスクロースは細胞のタンパク質と水素結合を形成し、細胞は天然の乾燥条件で数ヶ月保存される。これらの細胞に、マグネシウム、カルシウム、カリウム、ナトリウムなどのアルカリ及びアルカリ土類イオンが提供されることが明らかである。それぞれの種に対して、乾燥貯蔵及び微生物の再構成に対するバッファが最適化される。一般に、今まで、１０ｍＭのＭｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋を有する従来のトリス−及びＰＢＳ−溶液は、貯蔵バッファとして用いられてきた。それらを用いることができるが、それらは、凍結乾燥と乾燥貯蔵のストレスに促進されて、ある微生物が不足した環境に順応し、変化し、さもなければ再構成し、それによって、水または試料の添加時にビタミンなしで成長できる微生物が存在する、という不利益がある。このように、−８０℃、保存トレハロース／スクロースの存在下で、（測定される物質なしで）検査媒体中で微生物の急速凍結及び凍結乾燥は有利である。そのように保存された微生物の測定は室温で数ヶ月の期間に渡って安定であり、変化せず、試料あり及びなしの検査媒体をそこに添加した後で測定される物質を必要とするこれらの微生物のみを成長させる。このような手順を通して、ビタミンあるいは測定される物質なしで成長できる微生物は存在しないという事実のために、成長は流出（run-off）法で測定できる。換言すると、水とビタミンを含む試料の添加の４８時間後に、測定される物質が全て消費されるまでは、微生物はそれから、例えば完全に（exactly）増殖する。成長に必要な他の全ての物質は過剰に存在している。測定すべき物質が消費されると、微生物は成長しなくなる。終点の測定は非常に誤りやすくなく、相対的な成長速度の測定よりも簡便であり、これを通して、測定は全体でより精密に、より再生可能になる。
【００３０】
本発明に係る乾燥微生物微小滴定プレートの利点は、次に基づいている。（i）大量生産で、くぼみ毎の細胞の数の詳細な較正が手配可能である、（ii）前もって調製された乾燥微生物微小滴定プレートは、前もって機能及び最適または最小培養回数のために試験でき、これらの値は乾燥部生物微小滴定プレートの特性としてユーザが入手可能である、（iii）９６のくぼみを持つ標準微小滴定プレートは、複数の測定及び試料と比較標準との比較シリーズを同時に許容する。研究室に対しては、このように調製工程（承認研究、分析精度の試験、標準及び試験媒体の評価）を省略できるだけでなく、全ての工程もまた、自動化プロセスに、または自動解析装置に手配できる。
【００３１】
追加の水または栄養媒体を通して、微小滴定プレートのくぼみで植えつけられた微生物は、即時の成長試験のために均一に活力が与えられうる。これをもって、微生物学的ビタミン測定のための全ての試薬をすぐに使える（ready-to-use）キットで売り物に出すことができる。成長試験を直ちに始めることができるだけでなく、手動の検査の場合には、これは概して、実施される仕事の品質及び精度を向上させての実質体な簡易化を表す。微小滴定プレート技術は、さらに、全及び半自動分析装置への適応も許容する。本発明のさらなる利点、目的及び実施形態は、以下の実施例及び図面から理解できる。
【００３２】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
実施例
実施例１−ナイアシン測定（ビタミンＢ３）
１．微小滴定プレートの調製
グリセロールストックからのLactobacillus plantarum (ATCC 8014)の培養物を１０ｍｌの乳酸菌（Lactobacillus）媒体に植菌し、３６時間培養した。培養を遠心分離（２５００Ｇ、５分）して対数期で停止し、得られた細胞ペレットを０．８５％ＮａＣｌ溶液で３回（３ｘ）洗浄し、２００ｍＭトレハロース及び１０ｍＭＣａＣｌ２の１０ｍｌ中に懸濁し、それから、カザミノ酸１２．０ｇ／Ｌ、デキストロース４０．０ｇ／Ｌ、酢酸ナトリウム２０．０ｇ／Ｌ、Ｌ−シスチン０．４ｇ／Ｌ、ＤＬ−トリプトファン０．２ｇ／Ｌ、硫酸アデニン２０．０ｍｇ／Ｌ、塩酸グアニン２０．０ｇ／Ｌ、ウラシル２０．０ｍｇ／Ｌ、塩酸チアミン２００．０μｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム２００．０μｇ／Ｌ、塩酸ピリドキシン４００．０μｇ／Ｌ、リボフラビン４００．０μｇ／Ｌ、ｐ−アミノ安息香酸２００．０μｇ／Ｌ、ビオチン０．８μｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１．０ｇ／Ｌ、リン酸二水素ナトリウム１．０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．４ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム２０．０ｍｇ／Ｌ、硫酸鉄２０．０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン２０．０ｍｇ／Ｌ、及び２００ｍＭトレハロース、１０ｍＭＣａＣｌ２を含有する、Ｄｉｆｃｏ（商標）ナイアシン検査媒体で約１〜１０倍に希釈した。希釈は、１ｍｌの微生物懸濁液が１０７の生きた微生物を含むように設定した。３μｌの微生物懸濁液を、微小滴定プレートのくぼみのそれぞれに導入し、くぼみ中の微生物懸濁液を−８０℃のフリーザで急速凍結し、真空の印加によりくぼみのベース上で（on the base）微生物ペレットを凍結乾燥した。微小滴定プレートの各くぼみは、このように、同じ成長段階における、正確に３×１０４の微生物、Lactobacillus plantarumを含み、これが微小なトレハロース／糖／塩ペレットへとパックされた。粘着性のペレットが得られるように注意が払われ、これは、さもなければ輸送時にペレットがくぼみから落ちてしまうかもしれないからである。さもなければ、サッカロースまたはデキストロースなどの粘着性の糖を凍結溶液に添加することができる。プレートを、遮光して乾燥剤（Ｓｉｃａ）とともに増殖しないようにパックする。そのように調製された微小滴定プレートは、室温で長期間、微生物の成長可能性に影響を与えることなく、保持することができた。
【００３３】
２．微生物学的測定
ナイアシン（ニコチン酸及びニコチン酸アミド）を食品において定量した。この方法は、抗生物質（antibiotics）または成長妨害（growth hindering）物質を含む試料には使用できない。ナイアシチン（niacytine）はLactobacillus plantarum (ATCC 8014)によって消費されない。ナイアシン濃度は、バクテリア成長によって生じる濁りによって標準シリーズと比較して測定される。
【００３４】
材料：希釈シリーズのための全てのガラス容器及び装置を、約１％のＴｗｅｅｎ（商標）８０溶液で手で前もって洗浄し、それから塩酸（０．１Ｍ）及び塩化ナトリウム溶液（０．１Ｍ）で処理し、水道水で熱く、また冷たく３回リンスし、最後に蒸留水で洗浄した。容器及び装置を乾燥し、適切なふた（金属キャップ、アルミニウムホイル）を供し、ラップして、少なくとも２５０℃で１時間以上の間処理した。
【００３５】
試料貯蔵：液体（liquors）及び腐りやすい試料を冷却して試験の時まで貯蔵した。
【００３６】
ビタミン標準：正確な計量秤で１０ｍｇのナイアシンを適切なガラス容器に計量し、攪拌し、１００ｍｌの水に溶解した。このように形成された基本溶液の濃度はミリリットルあたり０．１ｍｇナイアシン（＝１０００００ｎｇ／ｍｌ）であった。その後、この溶液を２段階で、最初に１：１００、それから１：１２５で、最終的な濃度の４０ｎｇナイアシン／ｍｌに希釈した。さらなる希釈を行った（０．６ｎｇ／１５０μｌ、１．２ｎｇ／１５０μｌ、３．６ｎｇ／１５０μｌ、４．８ｎｇ／１５０μｌ、６．０ｎｇ／１５０μｌ＝標準シリーズ）。
【００３７】
試料調製：１〜１０ｇの間の試料をガラス容器に計量し、攪拌して１００ｇの水で仕上げた（topped off）。容器を閉じ、１２０℃で２時間殺菌した。それから、予期されるナイアシン濃度が１．２ｎｇ／１５０μｌ程度となるように、試料を希釈した。この目的で、異なる試料希釈のシリーズで試料を２つ抽出した。
【００３８】
培養：微小滴定プレートのくぼみに、１５０μｌの標準及び試料溶液と１５０μｌのナイアシンの異なる２倍の濃度の検査媒体（ナイアシン媒体）を加え、空気及び水を通さないホイルで閉じた。培養は培養器で３７℃の温度で４８時間作用させた。選択された温度を±０．５℃の範囲内で一定に保った。媒体の添加と培養の開始の間は３０分以下であった。
【００３９】
評価：培養の終了後、微小滴定プレートの標準及び試料の濁りをＥＬＩＳＡリーダ（ＥＬＩＳＡフォトメータ）で６３０ｎｍ（または５４０ｎｍ）で測定した。試み（attempt）の評価から、関係する濃度状態に対して媒体の値を算出した。
【００４０】
較正曲線の形成：標準シリーズの消滅の値をミリメートル紙（millimeter paper）にプロットし、あるいは、適切なソフトウェアによりグラフで表示した。測定したデータポイントに係る４次の関数（fourth order function）のポリノミック傾向線（trend line）を算出した。相関係数値の自乗は０．９９０を超えなければならない。それにより、相関係数は以下のように算出される：
【００４１】
【数１】
2008507964.tif 000003
【００４２】
濃度：測定された試料消滅の値を関数方程式のｙに代入し、ｐｑ−式によって、関連するｘ値が算出できる。さらに、求められるｘ値をグラフで作成された較正曲線から読み取ることもできる。より強い自己懸濁（self-turbidity）を有する試料希釈により、これまた実施された殺菌コントロール（sterile control）の測定値と比較して、測定されたｙ値を、修正した。修正曲線は、水浴中での培養の後での殺菌コントロールと植菌されて（濁らされて）いない試料の間の測定の差によって得られる。
【００４３】
それぞれ５番目の試験の場合には、品質コントロールのための測定として定義された試料を実施することを推奨する。結果を平均値の規定チャート（regulation chart）に入力することができる；このチャートを現在の生データとともに蓄積することができる。
【００４４】
図１は、ナイアシン検査媒体中での５×１０４の乾燥細胞の４８時間の培養後の測定された標準曲線を示す。微小滴定プレートでの凍結乾燥及び乾燥微生物微小滴定プレートの室温での４週間の貯蔵にもかかわらず、Lactobacillus plantarumと一致した成長曲線が得られ、標準及び試料中のビタミンＢ３の測定を許容した。
【００４５】
さらなる比較試験において、同じ数のLactobacillus plantarumの細胞を、ＰＢＳ，２０％グリセリン中で７２時間凍結した。続く成長試験において、グリセリンで安定化された細胞は生きているけれども、測定された成長は検査媒体中のナイアシンの量と全く関係がなかった。むしろ、全てのナイアシン濃度を通して、実質的に均一な成長が測定された。ここで、成長はいかなる場合でもこのように、いくつかの開始細胞から、換言すれば溶液中で開始の利点を持ついくつかの細胞から始まった。
【００４６】
本発明に従って保存糖の存在下で乾燥されたLactobacillus plantarumの微生物の場合には、これは違っている（otherwise）。ここで、濃度に依存する成長曲線が示すように、全ての細胞は添加された標準及び試料溶液中で活性及び成長に寄与する。それで成長曲線は存在するナイアシンのみに依存する。
【００４７】
【表１】
2008507964.tif 000004
【００４８】
濃度の表示は、食品及び化学に内容での通常の表示に従っている。ここで、１ｇの重量の試料からビタミンを１００ｍｌの水で抽出し、１５０μｍの抽出物を微小滴定プレートのくぼみに移し、増やして濃縮された試験媒体（multiply concentrated test medium）を添加して、ビタミンの量が決められて最終的に１００ｇの試料に調節された。標準は対応して適用された。
【００４９】
実施例２−葉酸測定
微小滴定プレートの調製と葉酸（プテロイルグルタミン酸及び他の葉酸共役）の測定が、試験生物としてLactobacillus rhamnosus ATCC 7469を用いることを除いて、実施例１のように達成された。検査媒体として、活性化された炭素で処理され、膵臓で消化されたカゼイン１０．０ｇ／Ｌ、デキストロース４０．０ｇ／Ｌ、酢酸ナトリウム４０．０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．０ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１．０ｇ／Ｌ、ＤＬ−トリプトファン０．２ｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン０．６ｇ／Ｌ、塩酸Ｌ−システイン０．５ｇ／Ｌ、硫酸アデニン１０．０ｍｇ／Ｌ、塩酸グアニン１０．０ｇ／Ｌ、ウラシル１０．０ｍｇ／Ｌ、キサンチン（xanthin）２０．０ｍｇ／Ｌ、ポリソルベート（Polysorbate）−８０  ０．１ｇ／Ｌ、グルタチオン（還元された）５．０ｍｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム２０．０ｍｇ／Ｌ、硫酸鉄２０．０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１５．０ｍｇ／Ｌ、リボフラビン１．０ｍｇ／Ｌ、ｐ−アミノ安息香酸２．０ｍｇ／Ｌ、塩酸ピリドキシン４．０ｍｇ／Ｌ、塩酸チアミン４００．０μｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム８００．０μｇ／Ｌ、ニコチン酸８００．０μｇ／Ｌ、ビオチン２０．０μｇ／Ｌ、０．０５％アスコルビン酸を含有する、Ｄｉｆｃｏ（商標）葉酸−カゼイン媒体を用いた。貯蔵媒体は２００ｍＭトレハロースを含んだ。葉酸標準を１００ｍモルリン酸カリウムバッファ、ｐＨ６．１、０．１％アスコルビン酸中で溶解した。
【００５０】
【表２】
2008507964.tif 000005
【００５１】
測定された標準曲線は図２にグラフで図解される。
【００５２】
実施例３−ビタミンＢ１２測定
微小滴定プレートの調製とビタミンＢ１２（シアノコバラミン、ヒドロキシコバラミン）の測定が、試験生物としてLactobacillus delbrueckii subsp. Lactis (L. leichmanii) ATCC 7830を用いることを除いて、実施例１のように達成された。検査媒体として、カザミノ酸１５．０ｇ／Ｌ、デキストロース４０．０ｇ／Ｌ、アスパラギン０．２ｇ／Ｌ、酢酸ナトリウム２０．０ｇ／Ｌ、アスコルビン酸４．０ｇ／Ｌ、Ｌ−システイン４．０ｇ／Ｌ、ＤＬ−トリプトファン０．４ｇ／Ｌ、硫酸アデニン２０．０ｍｇ／Ｌ、塩酸グアニン２０．０ｍｇ／Ｌ、ウラシル２０．０ｍｇ／Ｌ、キサンチン２０．０ｍｇ／Ｌ、ポリソルベート−８０  ２．０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム（無水）０．４ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム２０．０ｍｇ／Ｌ、硫酸鉄２０．０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン２０．０ｍｇ／Ｌ、リボフラビン１．０ｍｇ／Ｌ、ｐ−アミノ安息香酸２．０ｍｇ／Ｌ、塩酸ピリドキシン４．０ｍｇ／Ｌ、塩酸チアミン１．０ｍｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム１．０ｍｇ／Ｌ、ナイアシン２．０ｍｇ／Ｌ、ビオチン１０．０μｇ／Ｌ、塩酸ピリドキシン４．０ｍｇ／Ｌ、塩酸ピリドキサール４．０ｍｇ／Ｌ、塩酸ピリドキサミン８００．０μｇ／Ｌ、葉酸２００．０ｐｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．０ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１．０ｇ／Ｌを含有する、Ｄｉｆｃｏ（商標）Ｂ１２検査媒体を用いた。貯蔵媒体はさらに２００ｍＭトレハロースを含んだ。
【００５３】
【表３】
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【００５４】
測定されたビタミンＢ１２標準曲線は図３にグラフで図解される。
【００５５】
実施例４−ビオチン測定
微小滴定プレートの調製とビオチンの測定が、Lactobacillus planatarum ATCC 8014を用いて実施例１のように達成された。検査媒体として、カザミノ酸１２．０ｇ／Ｌ、デキストロース４０．０ｇ／Ｌ、酢酸ナトリウム２０．０ｇ／Ｌ、Ｌ−システイン０．２ｇ／Ｌ、ＤＬ−トリプトファン０．２ｇ／Ｌ、硫酸アデニン２０．０ｍｇ／Ｌ、塩酸グアニン２０．０ｍｇ／Ｌ、ウラシル２０．０ｍｇ／Ｌ、塩酸チアミン２．０ｍｇ／Ｌ、リボフラビン２．０ｍｇ／Ｌ、ナイアシン２．０ｍｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム２．０ｍｇ／Ｌ、塩酸ピリドキシン４．０ｍｇ／Ｌ、ｐ−アミノ安息香酸０．２ｍｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム（無水）０．４ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム２０．０ｍｇ／Ｌ、硫酸鉄２０．０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン２０．０ｍｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．０ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１．０ｇ／Ｌを含有する、Ｄｉｆｃｏ（商標）ビオチン検査媒体を用いた。貯蔵媒体はさらに２００ｍＭトレハロースを含んだ。測定された標準曲線は図４に示される。
【００５６】
【表４】
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【００５７】
関連する標準曲線は図４に示される。
【００５８】
実施例５−Ｂ６ピリドキシン測定
微小滴定プレートの調製とビタミン６ピリドキシンの測定が、Saccharomyces cerevisae ATCC 9080を用いて実施例１のように達成された。検査媒体として、デキストロース４０．０ｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン４．０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム４．０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム３．０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム１．０ｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．４９ｇ／Ｌ、ＤＬ−メチオニン４０．０ｍｇ／Ｌ、ＤＬ−トリプトファン４０．０ｍｇ／Ｌ、ＤＬ−イソロイシン４０．０ｍｇ／Ｌ、ＤＬ−バリン４０．０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−塩酸ヒスチジン２０．０ｍｇ／Ｌ、リボフラビン２０．０ｍｇ／Ｌ、ビオチン８．０ｍｇ／Ｌ、イノシトール５．０ｍｇ／Ｌ、硫酸鉄５００μｇ／Ｌ、塩酸チアミン４００．０μｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム４００．０μｇ／Ｌ、ニコチン酸４００．０μｇ／Ｌ、ホウ酸２００．０μｇ／Ｌ、ヨウ化カリウム２００．０μｇ／Ｌ、モリブデン酸アンモニウム４０．０μｇ／Ｌ、硫酸マンガン８０．０μｇ／Ｌ、硫酸銅９０．０μｇ／Ｌ、硫酸亜鉛８０．０μｇ／Ｌを含有する、Ｄｉｆｃｏ（商標）ピリドキシン−Ｙ−媒体を用いた。貯蔵媒体はさらに２００ｍＭトレハロースを含んだ。測定された標準曲線は図５に示される。
【００５９】
【表５】
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【００６０】
実施例６−パントテン酸カルシウム測定
微小滴定プレートの調製とパントテン酸カルシウムの測定が、Lactobacillus plantarum ATCC 8014を用いて実施例１のように達成された。検査媒体として、カザミノ酸１０．０ｇ／Ｌ、デキストロース４０．０ｇ／Ｌ、酢酸ナトリウム２０．０ｇ／Ｌ、Ｌ−シスチン０．４ｇ／Ｌ、ＤＬ−トリプトファン０．２ｇ／Ｌ、硫酸アデニン２０．０ｍｇ／Ｌ、塩酸グアニン２０．０ｍｇ／Ｌ、ウラシル２０．０ｍｇ／Ｌ、塩酸チアミン２００．０μｇ／Ｌ、リボフラビン２００．０μｇ／Ｌ、ナイアシン１．０ｍｇ／Ｌ、ピリドキシン８００μｇ／Ｌ、ｐ−アミノ安息香酸２００．０μｇ／Ｌ、ビオチン１．０μｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．０ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１．０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．４ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム２０．０ｍｇ／Ｌ、硫酸鉄２０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン２０．０ｍｇ／Ｌを含有する、Ｄｉｆｃｏ（商標）パントテン酸検査媒体を用いた。貯蔵媒体はさらに２００ｍＭトレハロースを含んだ。測定された標準曲線は図６に示される。
【００６１】
【表６】
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【００６２】
実施例７−リボフラビン測定
微小滴定プレートの調製とリボフラビンの測定が、試験生物としてLactobacillus rhamnosus ATCC 7469を用いることを除いて、実施例１のように達成された。検査媒体として、カザミノ酸１０．０ｇ／Ｌ、デキストロース２０．０ｇ／Ｌ、酢酸ナトリウム１５．０ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１．０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．０ｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン０．６ｇ／Ｌ、Ｌ−シスチン０．２ｇ／Ｌ、ＤＬ−トリプトファン０．２ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．４ｇ／Ｌ、硫酸アデニン２０．０ｍｇ／Ｌ、塩酸グアニン２０．０ｍｇ／Ｌ、ウラシル２０．０ｍｇ／Ｌ、キサンチン２０．０ｍｇ／Ｌ、硫酸鉄２０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン２０．０ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム２０．０ｍｇ／Ｌ、塩酸ピリドキシン４．０ｍｇ／Ｌ、塩酸ピリドキサール４．０ｍｇ／Ｌ、ｐ−アミノ安息香酸２．０ｍｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム８００μｇ／Ｌ、葉酸８００μｇ／Ｌ、ニコチン酸８００μｇ／Ｌ、塩酸チアミン４００．０μｇ／Ｌ、ビオチン１．０μｇ／Ｌを含有する、Ｄｉｆｃｏ（商標）リボフラビン検査媒体を用いた。貯蔵媒体はさらに２００ｍＭトレハロースを含んだ。
【００６３】
【表７】
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【００６４】
測定された標準曲線は図７に示される。
【００６５】
実施例７−チアミン（ビタミンＢ１）測定―仮説
微小滴定プレートの調製とリボフラビンの測定が、試験生物としてWeissella virdescens ATCC 12706を用いることを除いて、実施例１のように達成された。検査媒体として、チアミンゼロのイースト抽出物１０．０ｇ／Ｌ、チアミンゼロのトリプトン２０ｇ／Ｌ、デキストロース２０．０ｇ／Ｌ、クエン酸ナトリウム１０．０ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１０．０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０．０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム１．６ｇ／Ｌ、硫酸鉄０．０８ｇ／Ｌ、硫酸マンガン０．２８ｇ／Ｌ、ポリソルベート−８０  ２．０ｇ／Ｌを含有する、Ｄｉｆｃｏ（商標）チアミン検査媒体ＬＶを用いた。凍結媒体は追加で２００ｍＭトレハロースを含んだ。
【００６６】
本発明の保護の範囲は、同様に本開示に属する以下の請求項により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】それぞれの場合の試験媒体中の種々のビタミンの濃度に依存する、本発明に係る種々の微小プレート乾燥微生物の成長のグラフの図解である。
【図２】それぞれの場合の試験媒体中の種々のビタミンの濃度に依存する、本発明に係る種々の微小プレート乾燥微生物の成長のグラフの図解である。
【図３】それぞれの場合の試験媒体中の種々のビタミンの濃度に依存する、本発明に係る種々の微小プレート乾燥微生物の成長のグラフの図解である。
【図４】それぞれの場合の試験媒体中の種々のビタミンの濃度に依存する、本発明に係る種々の微小プレート乾燥微生物の成長のグラフの図解である。
【図５】それぞれの場合の試験媒体中の種々のビタミンの濃度に依存する、本発明に係る種々の微小プレート乾燥微生物の成長のグラフの図解である。
【図６】それぞれの場合の試験媒体中の種々のビタミンの濃度に依存する、本発明に係る種々の微小プレート乾燥微生物の成長のグラフの図解である。
【図７】それぞれの場合の試験媒体中の種々のビタミンの濃度に依存する、本発明に係る種々の微小プレート乾燥微生物の成長のグラフの図解である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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