(57)【要約】  本発明は、試料を光学測定する方法に関する。電磁信号（２）が、試料に向かって一時的に繰り返し向けられて、試料中の物質が、第１電子状態（１）から第２電子状態（３）に遷移される。この場合、この物質の少なくとも一部が、第２状態（３）から光子を放射し、これらの光子は、試料を光学測定するために使用される。この場合、電磁信号（２）は、或る繰り返し期間で試料の同じ領域に向けられる。この場合、電磁信号（２）のこの繰り返し期間は、物質からの光子の量に関して最適化されている値に設定される。第２状態の寿命が1nsの大きさを有する物質での電磁信号の繰り返し期間は、少なくとも0.1μsの値に設定される。
2008544235.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を光学測定する方法にあって、
−この場合、電磁信号が、試料に向かって一時的に繰り返し向けられて、試料中の物質が、第１電子状態から第２電子状態に遷移され、
−この場合、この物質の少なくとも一部が、第２状態から光子を放射し、これらの光子は、試料を光学測定するために使用され、
−この場合、電磁信号は、或る繰り返し期間で試料の同じ領域に向けられ、
−この場合、電磁信号のこの繰り返し期間は、物質からの光子の量に関して最適化されている値に設定される方法において、
−第２状態の寿命が1nsの大きさを有する物質での電磁信号の繰り返し期間は、少なくとも0.1μsの値に設定されることを特徴とする方法。
【請求項２】
物質の第２状態の寿命は、0.1nsより大きくかつ10nsより小さく、特に0.5〜5nsであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
繰り返し期間の値で最適化された物質からの光子の量は、物質全体の所定の量から得られた光子の量であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
電磁信号（２）の繰り返し期間の値が、第３状態（５）の寿命より大きく、試料（７）中の物質の大部分が、この電磁信号（２）に起因して第３状態（５）に付随的に遷移され、
−この場合、第３状態の寿命は、少なくとも１つの大きさだけ第２状態の寿命より大きく、
−この場合、物質は、電磁信号（２）によって第３状態（５）から第４状態（６）に遷移可能であり、この物質は、第３状態（５）の寿命の百倍より長い期間に対しては第４状態から第１状態（１）又は第２状態（３）に戻らないことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
物質の大部分は、電磁信号（２）の１回の入射時に物質の少なくとも１×10-4、特に１×10-2であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
物質が第４状態（６）から第１状態（１）又は第２状態（３）に戻らない期間は、１分、特に10分、全体では特に１時間より長いこと、又は、物質は、第４状態から第１状態（１）又は第２状態（３）にもはや戻らないことを特徴とする請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
繰り返し期間の値は、少なくとも１μsであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
試料が、ｎ個の測定点で同時に測定される方法において、光学信号の繰り返し周波数は、少なくとも100kHz/nであり、試料のさらなる光学測定時にこの光学信号によってこの試料の任意の領域に向けられることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
電磁信号は、試料の空間的に限定された少なくとも１つの領域にその都度向けられる方法において、繰り返し期間の値は、走査速度によって設定され、試料（７）は、空間的に限定された少なくとも１つの領域によってこの走査速度で空間的に走査されることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
試料からの光子が、１次元の光センサアレイ又は２次元の光センサアレイによって記録され、試料の少なくとも一部が、この光センサアレイ上に時間一定に投影される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
電磁信号は、少なくとも１つの連続部分を有することを特徴とする請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
電磁信号（２）は、物質を励起する励起光及び物質を空間的に限定して非励起にする非励起光を含むことを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
電磁信号（２）は、物質を多光子励起する励起光を含むことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
電磁信号（２）は、物質を非線形に多光子散乱する光を含むことを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
電磁信号はそれぞれ、同じ波長の多数の単一パルスを有することを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
電磁信号中の同じ波長の多数の単一パルスは、１個〜100個の範囲内にあることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
試料を光学測定する装置にあって、
−この場合、この装置は、光学信号を一時的に繰り返し試料に向けて、試料中の物質を第１電子状態から第２電子状態に遷移させ、
−この場合、この装置は、試料を光学測定するために物質の少なくとも一部からの光子を使用し、これらの光子は、第２状態から放射され、
−この場合、この装置は、電磁信号を或る繰り返し期間で試料の同じ領域に向け、
−この場合、電磁信号の最適化された繰り返し期間を調整する調整装置が設けられていて、電磁信号の繰り返し期間の値が、この調整装置によって少なくとも0.1μsに調整可能であり、この場合
−電磁信号によって試料を空間的に走査する走査装置が設けられている装置において、
繰り返し期間の値を調整するため、走査装置の走査速度が、調整装置によって調整可能であることを特徴とする装置。
【請求項１８】
電磁信号の繰り返し期間の値は、調整装置によって少なくとも１μsに調整可能であることを特徴とする請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
電磁信号の繰り返し期間の値を最適化する最適化装置が設けられていて、
−この最適化装置は、調整装置によって電磁信号の繰り返し期間を変化させ、これに伴って現れる物質からの光子の量の変化を記録し、
−この最適化装置は、物質からの光子の量に関して最適化された繰り返し期間の値を算出することを特徴とする請求項１７又は１８に記載の装置。
【請求項２０】
記録された物質からの光子の量は、物質全体の所定の量によって得られた光子の量を含むことを特徴とする請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
最適化装置は、調整装置によって試料をさらに光学測定するために繰り返し期間の算出された最適値を自動的に調整する請求項１９又は２０に記載の装置。
【請求項２２】
最適化装置は、繰り返し間隔の算出された最適値を出力することを特徴とする請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２３】
試料からの光子用の記録装置が、１次元の光センサアレイ又は２次元の光センサアレイを有し、試料の少なくとも一部が、この光センサアレイ上に時間一定に投影されることを特徴とする請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２４】
光学信号（２）を提供する連続波レーザーが、設けられていることを特徴とする請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２５】
請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の装置を蛍光顕微鏡としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料を光学測定する方法に関する。この場合、この方法は、請求項１に記載の上位概念の特徴を有する。さらに本発明は、請求項１９に記載の上位概念の特徴によって試料を光学測定する装置に関する。
【０００２】
試料を第１状態から第２状態に移動させる電磁信号は、特に光である。
【背景技術】
【０００３】
試料を光学測定する方法及びこの方法を実施するＳＴＥＤ顕微鏡とも呼ばれる装置が、ドイツ連邦共和国特許出願公開第101 54 699号明細書から公知である。試料を蛍光顕微鏡で検査するため、試料中の色素が、最初に励起光によって励起されたエネルギー状態に移される。この光学励起の場合、光学方法時の空間分解能に対する通常の限界は、λ／2nである。この場合、λは、使用された光の波長であり、ｎは、試料の屈折率である。この限界を下回るため、色素の光学励起された状態が、非励起光によって希望する測定点まで再び非励起される。非励起光の強度分布が、この測定点で零点を有する；すなわち、色素が、非励起光によって測定点の外側のいたる所で刺激放出される。非励起光が、希望する測定点の外側で刺激放出による非励起時に飽和する程度の高い強度で試料に照射されることによって、結果として生じる蛍光を発する測定点のサイズ、すなわち残留している蛍光の空間分解能が、光学分解能の通常の限界より明らかに下に低下され得る。したがって試料中の色素は、蛍光を発する状態の非励起光の強度分布の零点の周りの非常に狭く限定された領域内だけに存在する。非励起光の低い平均強度で済むようにするため、非励起光及び励起光が、パルス化される。ＳＴＥＤ顕微鏡でパルス化された非励起光を使用する別の理由は、色素が励起されていない時でも、強い非励起光が試料に負荷をかけることを阻止するためである。１つの測定点内の色素分子が僅かである場合でも、測定信号をバックグラウンドノイズからさらに十分に際立たせるため、光によるこの照射は、僅かな繰り返し間隔で試料の同じ領域に対して何度も繰り返される。この僅かな繰り返し間隔は、色素の蛍光を発する状態の一般に１nsに相当する半地幅の時間より十分上にあって10nsの大きさを有する。この場合、試料の同じ領域内に入射する励起光及び非励起光の複数のパルスが、80MHzの一般的な繰り返し率(Wiederholungsrate)を有する。
【０００４】
非励起光の飽和に対して必要である高い強度の場合、試料中の色素が減少する可能性、すなわち試料中の色素が蛍光をもはや放射しないように変化する可能性が、非常に高い。したがって、色素の寿命、すなわち色素からの蛍光が記録され得る回数が著しく減少する。このことは、実際の試料からの蛍光の量を制限する。この実際の試料では、当然に限られた数の色素分子しか利用できない。
【０００５】
パルス光によって作動されるその他の蛍光顕微鏡法の場合でも、特により多くの光子が高い光強度で励起されるような場合、及び、例えば蛍光体の寿命を測定する（ライフタイムイメージング）ような、試料を光学測定する別の方法の場合でも、試料の光学測定時の光子の量に関する類似の問題が発生する。
【０００６】
試料を光学測定する方法時の光子の量を改良するため、試料からの光子が記録される検出器の応答率(Ansprechwahrscheinlichkeit)が、多大な経費を伴って改良された。すなわち、高価な検出器の応答率をこの10〜15年間に約20％から40〜60％に上げることに成功した。しかしながら、この結果としての光子の量の最大で３倍の上昇が、検出器の極端なコスト上昇と同時に発生する。
【０００７】
検出器のこの進歩にもかかわらず、光子の総量は依然として有限である。光子のこの有限な総量は、蛍光に基づくほとんどの測定方法の限界を決める。蛍光顕微鏡では、蛍光色素からの全ての光子の有限な数、すなわち褪色(Bleichen)まで放射された光子の有限な数が、ほぼ恒常的な主な問題である。褪色前の蛍光放出の数の増加による各絶対信号の明らかな上昇が、蛍光顕微鏡に対して基本的に重要である。
【０００８】
請求項１に記載の上位概念の特徴を有する試料を光学測定する方法及び請求項１９に記載の上位概念の特徴を有するこの方法を実施する共焦点走査型顕微鏡とも呼ばれる装置が、米国特許出願公開第2002/0027202号明細書から公知である。この二光子顕微鏡の場合、励起光の強度分布による蛍光色素の遷移確率(Ubergangswahrscheinlichkeit)の２乗特性(quadratischen Abhangigkeit)が、分解能を上げるために利用される。２つの光子を吸収してその基底状態からその励起された蛍光状態に遷移するため、この蛍光色素は、この２乗特性を有する。この場合、蛍光の量を可能な限り大きく得るため、励起光が、高い強度のパルスに集中される。励起光の強度による蛍光色素の遷移確率の２乗特性に起因して、高い強度のこれらのパルスは、励起光の平均出力が同じ場合により僅かな強度に対応するより多くの数のパルスより多い蛍光を放つ。さらにこの米国特許出願公開第2002/0027202号明細書は、個々のパルス間の蛍光を発する状態の励起の飽和によって生じうる蛍光の量に関する悪影響を考察し、蛍光の量に関するこの悪影響が全く起こらないように、パルスの強度を励起光の同じに残留する出力の場合のこれらのパルスの繰り返し率によって調整することを提唱する。蛍光色素の褪色の危険は考慮されない。この米国特許出願公開第2002/0027202号明細書は、繰り返し率で基本的に可能な範囲としてGHz〜kHzの範囲を挙げる。この場合、この繰り返し率は、蛍光色素の寿命に適合されなければならない。しかし数字の例が、これに対して与えられていない。
【０００９】
比較的低い出力の励起光を使用するにもかかわらず、例えば0.1μs(1×10-7ｓ)の長い平均寿命を有するランタニドキレートの形態の非常に特殊な蛍光色素に合わせられた比較的長いパルスの励起光が、この蛍光色素に照射されることによって、二光子顕微鏡で比較的高い量の蛍光を得ることが、ヨーロッパ特許第0666 473号明細書から公知である。これらの長いパルスの繰り返し率は、この示されている寿命に応じて10MHz(1×107Hz)未満近辺にある。
【００１０】
蛍光顕微鏡で通常使用される蛍光色素の蛍光を発する状態の寿命は、１nsの大きさにある、すなわち10ns未満である。
【特許文献１】ドイツ連邦共和国特許出願公開第101 54 699号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第2002/0027202号明細書
【特許文献３】ヨーロッパ特許第0666 473号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、使用される検出器の応答率を、費用をかけて上げることなしに光子の量が大幅に上昇する、請求項１に記載の上位概念の特徴を有する試料を光学測定する方法及び請求項２０に記載の上位概念の特徴を有する装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この課題は、請求項１に記載の特徴を有する方法及び請求項１９の特徴を有する装置によって解決される。この新規の方法及びこの新規の装置の好適な構成は、従属請求項中に記載されている。従属請求項２５は、この新規の装置を蛍光顕微鏡として使用することに関する。
【００１３】
物質からの光子の量が、信号の最適化された繰り返し間隔の場合に最適に達することが、予想外に分かっている。この繰り返し間隔は、この物質の光子を放射する状態の寿命より明らかに長い。信号が、試料の同じ領域内の物質に新たに向かう前に、信号によってこの物質のさらに別の状態に直接又は間接に励起されることがあり得る。これらの状態は、より長い寿命を有しかつより考えられた方法で初めて消失する。従来のアプローチを放棄して、試料の光学測定時のデットタイムが、可能な限り短い繰り返し間隔によって、すなわち物質の光子を放射する状態の寿命に近づけられた繰り返し間隔によって光子の量を増大することが必要である。本発明の場合、信号の２つの繰り返し間のデットタイムの主な部分が、むしろ甘受される。これによって、物質からの光子の量が増大する。この場合、繰り返し間隔を任意に長くすることは有益でないことが自明である。何故ならこのことは、光学測定の全体の期間の負担になるからである。したがって最適化された繰り返し間隔は、物質からの光子の最大量と光学測定の合わせられている全体の期間との妥協である。
【００１４】
繰り返し間隔が、少なくとも0.1μs〜2μsの範囲内で変化する場合、物質からの光子の量が、繰り返し間隔を大きくすることによって最も激しい増大する。
【００１５】
繰り返し間隔が変化する場合、個々の信号のエネルギーは、一定に保持されてもよい。しかしこのことは、強制ではない。むしろ、最適化された繰り返し間隔の場合の個々の信号のエネルギーは、信号による物質の褪色の上昇した危険が存在することなしに、より短い繰り返し間隔に比べて一般に明らかに増大され得る。
【００１６】
繰り返し間隔は、観察された物質からの格子の量の異なる変動に基づいて最適化され得る。観測した物質からの格子の量が、信号の所定の繰り返し数によって得られた物質からの光子の量である場合、一般にこの量は、各繰り返し間隔を大きくすることによって増える。信号の１回の繰り返し当たりの光子の量も、信号の所定の繰り返し数によって得られた物質からの光子の量の一部である。このとき、最適化された繰り返し間隔に対する基準は、最大量の例えば90％分の所定のパーセンテージに達することでもよい。
【００１７】
観測した物質からの光子の量が、試料の光学測定の所定の期間に得られた物質からの光子の量である場合、最適化された繰り返し間隔は、最大量がプリセットされている時間内に得られる繰り返し間隔である。
【００１８】
観測した物質からの光子の量は、所定量の物質全体によって得られた光子の量、すなわち物質が褪色するまでに得られた光子の量でもよい。物質からの光子のこの総量の場合、各繰り返し間隔を大きくすることによって、増大が再び期待できる。これに応じて、最適化された繰り返し間隔は、物質からの光子の最大総量の例えば90％分の所定のパーセンテージに達することでもよい。
【００１９】
本発明にしたがって求められた最適化された繰り返し間隔が好ましい方法で試料の別の光学測定に合わせられることは自明である。新規の装置の場合、このことは、自動的に実施できるか、又は、最適化装置が、最適化された１つの繰り返し間隔又は異なる基準にしたがって最適化された多数の繰り返し間隔を出力できる。これらの最適化された繰り返し間隔のうちの１つの繰り返し間隔が、この新規の装置のユーザによって選択され、次いで最適化装置によって又は繰り返し間隔自体を任意に調整する調整装置のユーザによって試料の別の光学測定に合わせられる。
【００２０】
特別な観点では、この新規の方法の場合、繰り返し期間が、第３状態の寿命より大きく設定される。試料中の物質を第１電子状態から第２電子状態に遷移させるため、電磁信号、例えば光学的な光信号が、この繰り返し期間で試料の同じ領域に一時的に繰り返し向けられる。試料中の物質の大部分が、この電磁信号に起因してこの第３状態に付随的に遷移される。特に、繰り返し期間は、このような第３状態の寿命に関して確定され得る。物質は、電磁信号によって第３状態から第４状態に遷移可能である。物質は、光学測定の期間より長い期間に対しては第４状態から第１状態又は第２状態に戻らない。この場合、試料中の物質の不活性化の重大な危険は、物質が電磁信号によって第３状態から第４状態に遷移可能であり、物質は、第３状態に付随的に達し、しかしこの物質自体は、比較的早く第３状態から第１状態又は第２状態に再び戻り、この物質は、第４状態から第１状態又は第２状態に長期間戻らないか又はもはやほとんど戻らないことから出発するという特出した認識に、本発明は基づく。電磁信号を試料の同じ領域に非常に頻繁に繰り返し向ける場合に、試料中の物質の大部分が第４状態に遷移して持続して不活性にある状況の確率は、非常に小さい。本発明の理論にしたがって、電磁信号の繰り返し間隔が、第３状態の寿命より大きく選択される場合、電磁信号を試料にその次に向けるごとに、物質の重要な部分が、第３状態にもはや存在しない。すなわち物質の重要な部分が、電磁信号によって第３状態から第４状態にもはや遷移せず、したがって不活性にならない。
【００２１】
物質が第３状態に達する大部分は、電磁信号の１回の入射で第３状態に遷移されるこの物質の１×10-2〜１×10-4によって見かけ上非常に小さくできる。試料の測定の間の電磁信号の一般的に非常に多い繰り返し回数によって、例えば第３状態の寿命が、第１状態又は第２状態の有効な寿命より明らかに大きい場合でも、第３状態に遷移される物質のより小さい割合が、物質の褪色の危険をより著しく増大させる。その結果、第３状態にある物質が累積する。信号が物質を第３状態から第４状態に遷移する確率が比較的大きい場合、褪色は、当然に同様に強くなる。
【００２２】
第４状態は、本発明のここで説明した観点に対する特別な重要性を有する。物質が、電磁信号によって第３状態からこの第４状態に達することができる。この物質は、１分より長い、特に10分より長い、全体では特に１時間より長い期間に対しては第４状態から第１状態又は第２状態に戻らない。物質が試料を光学測定するために光学測定の期間に実際にもはや利用できない間は、物質の少なくとも重要な部分が第４状態にポテンシャル的に留まるので、物質がこの期間の経過後に第４状態から第１状態又は第２状態に戻るか又は戻らないかは、本発明による試料の光学測定に対しては多くの場合にもはや重要でない。
【００２３】
第３状態の寿命又は物質が第４状態から第１状態又は第２状態に戻らない期間から言えることは、第３状態又は第４状態のその都度の半減期がこれによって推測されていることである。非常に長い半減期の場合でも、物質の一部が、はるか遅くに初めて又は既にはるかに早くにその都度の状態から離れることは、当業者にとって明らかである。何故なら、一定の時点に対して遷移しない遷移確率がこれらの遷移を根拠にするからである。
【００２４】
本発明の手段は、信号が最適を得るまで試料の同じ領域に向けられる繰り返し間隔を簡単に実現しかつ新規の装置の機器経費を実際に多くかけずに済むにもかかわらず、本発明の効果は予想外に大きい。すなわち、高い強度の光が、繰り返し信号の各々によって試料中の蛍光色素に印加される場合、試料を光学測定する方法での光子の量は、十倍よりはるかに大きくなる。これに関する具体的な例は、ドイツ連邦共和国特許出願公開第101 54 699号明細書中に記されているＳＴＥＤ顕微鏡及び多光子励起による蛍光顕微鏡である。ＳＴＥＤ顕微鏡の場合、非励起光が、特に高い強度を有する。蛍光顕微鏡の場合は、同様に非常に高い光強度で動作される必要がある。しかし根本的な利点は、例えばパルス光によるライフタイムイメージングのような試料を光学測定する別の方法でも得られる。
【００２５】
例えば光信号のような電磁信号が、本発明の定義の範囲内で異なる要素、すなわち例えば異なる波長の成分又は時間的に相前後して続く構成要素を有し得ることを指摘することが重要である。電磁信号に対する繰り返し間隔が、本発明によって確定される。この電磁信号は、少なくとも１つの測定点の１回の光学測定に対して試料に向けられる。
【００２６】
電磁信号の最適化された繰り返し間隔は、本発明の場合は少なくとも0.1μsである。これは、10MHzの最大繰り返し率に相当する。電磁信号が、この最大繰り返し率で試料の同じ領域に向けられる。電磁信号の繰り返し間隔が、少なくとも1μｓであることが好ましい。これは、1MHz未満の繰り返し率に相当する。繰り返し間隔に相当する繰り返し率を決定する場合、その都度の電磁信号の期間をさらに考慮することも必要である。その結果、若干低い値が、繰り返し率の逆数としてその都度発生する。
【００２７】
既に説明したように、本発明の場合、繰り返し周波数を任意に低くすることを目的としない。電磁信号が、この繰り返し周波数で試料の或る領域に向けられて、これらの領域を光学的に測定する。これによって、光学測定の期間が著しく増大する。光子の所定の絶対量が、この期間内に得られる。その結果、Ｓ／Ｎ比が低下しうるか又は安定性の問題が発生しうる。それ故に、電磁信号の繰り返し周波数が、少なくとも100kHzであることが好ましい。しかしながら、試料がｎ個の測定点で同時に光学測定される場合は、これより明らかに低い繰り返し周波数が甘受され得る。何故なら、単位時間当たりの光子の量が、これによってｎ倍だけ増大するからである。これに応じて信号の繰り返し周波数は、100kHz/nに下げられ得る。電磁信号が、試料の例えば全面に印加され、カメラによって観測される場合、カメラの像点の数が、ｎと同じにされ得る。その結果、ｎは、適切に大きくしてもよい。しかし、1/nに比例する繰り返し周波数の低減によって、試料中の物質からの光子の最大量に関する重要な利点は、物質が褪色するまでもはや得られない。電磁信号の繰り返し間隔を増大した場合、これらの利点は、物質に応じて約0.1μs〜10μsに適応する。
【００２８】
本発明に具体的に置換するため、試料に向けられる光学信号の繰り返し周波数が下に合わせられ得て、繰り返し間隔を増大する。光学信号が、試料に繰り返し向けられる多くの光学方法の場合、このような繰り返し周波数は、現在80MHzの大きさにある。本発明を実施するため、この繰り返し周波数は、例えば500kHzに低下される。
【００２９】
電磁信号が、試料の空間的に限定された少なくとも１つの領域にその都度向けられる場合、電磁信号の繰り返し周波数を下げる代わりに、繰り返し期間を大きくするため走査速度を上げてもよい。試料が、この走査速度で電磁信号によって空間的に走査される。繰り返し間隔を本発明の値へ高く設定するため、両手段、すなわち繰り返し周波数の低減及び走査速度の増大が一緒に利用されてもよい。本発明の最低限を保持する電磁信号が、この繰り返し間隔で試料の同じ領域に繰り返し印加されるこの繰り返し間隔が重要である。これに対して電磁信号による試料の非常に速い走査は、電磁信号が試料の同じ領域に２回相前後して入射するのではなくて、光学信号がその都度入射した領域が重ならないことに寄与する。この場合、単位時間当たりの光子の量が低下することなしに、繰り返し間隔が非常に大きくされ得る。電磁信号が、この繰り返し間隔で試料の同じ領域に向けられる。
【００３０】
試料が、電磁信号によって走査される場合、試料からの光子が、特に１次元光センサアレイ又は２次元センサアレイによって記録される。試料の少なくとも一部が、このセンサアレイ上に時間一定に投影される。したがって、試料の走査時にこの試料に対向して移動する電磁信号の空間的に限定された各領域が、この光センサアレイの別の光センサ上に持続して投影される。この場合、同じ光センサが、試料の同じ領域からの光子を常に記録する。したがって、試料の異なる領域から光子を分離するときの問題が、本発明にしたがう試料の速い走査に結びつかない。光線さアレイは、カメラ、例えばＣＣＤカメラ又はＣＭＯＳカメラのような特に電子式カメラでもよい。
【００３１】
電磁信号によって試料を十分速く走査する場合、信号は、それどころか連続する成分を有してもよいし又は全体的に連続する信号でもよい。それにもかかわらずこの信号は、試料が走査される高い走査速度に起因して試料の個々の領域に一時的にだけ向けられる。したがって光学信号の全体又はその一部が、連続波レーザーを光源としてもよい。
【００３２】
当業者は、試料自体の走査から利点を予測しなかったので、高いラスター速度(Rastergeschwindigkeiten)による非常に速い走査に起因した信号の上昇は、当業者によって同様に予想外である。この間違った理解は、十分な信号が収集されるまで一点で測定する必要があるといった間違った観念によって助長される。それ故にこの速い走査は、当業者にとってはさしあたって不要な複雑化としてしか見えない。
【００３３】
新規の方法は、蛍光顕微鏡の分野で置換できる。信号は、具体的にはＳＴＥＤ方法で物質を励起し、空間的に限定して再び非励起にする励起光及び非励起光を含み得る。同様に信号は、試料中の物質としての蛍光色素又は一般的な蛍光体を特に多光子励起する励起光を含み得る。
【００３４】
物質が電磁信号によって第２状態に遷移され、この物質がこの第２状態から光子を放射するこの第２状態は、試料中の分子の仮想状態（非固有状態）でもよい。この仮想状態は、確かに極めて寿命が短い（＜1fs）ものの、それにもかかわらず入射された電磁信号の（非線形な）散乱過程に関与する。この場合、散乱過程を通じて（非線形な）散乱によって生成された散乱光が、測定信号として使用される。このような非線形な散乱光は、特により高い高調波（第２高調波及び第３高調波）及びカース（ＣＡＲＳ）を含む。
【００３５】
本発明にしたがう繰り返し間隔で試料に繰り返し向けられる信号の強度変化は、異なってもよい。この信号は、個々の単一パルスから構成されてもよく、多数の単一パルスから構成されてもよい。この場合、ここでは、ＳＴＥＤ顕微鏡の場合のような異なる波長のパルスの既に説明した組み合わせだけを意味しない。信号は、例えば衝撃（バースト）の形態の同じ波長の多数の単一パルスを有してもよい。これらの衝撃では、単一パルスの周波数が、100MHz以上の通常の大きい程度を有する。この場合、信号の同じ波長の単一パルスの数が、例えば２個〜100個範囲内にある。しかしながら、物質の大部分が、上記信号を既に超えて上述した第３状態に遷移された時に、信号が終了し、繰り返し間隔が開始することが重要である。第３状態への遷移確率が小さい場合、個々の信号中の同じ波長の単一パルスの数は、100個より大きくてもよい。どんな場合でも、第３状態にある物質の割合が、十分な時間の後続する繰り返し間隔の間に再び徐々に減少する。
【００３６】
本発明の好適なその他の構成は、従属請求項及び全ての説明に記載されている。その他の特徴は、図面−特に示された幾何構造，多数の構成部分の相対的な寸法，これらの構成部分の相対配置及び作用結合−から読み取れる。これらの選択された関係と異なる本発明の異なる実施形の特徴の組み合わせ又は異なる請求項の特徴の組み合わせが、同様に可能であってこれによって提案される。このことは、個々の図面に示されているか又はこれらの図面で列挙される特徴に関する。これらの特徴は、異なる請求項の特徴と結合されてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
図１中に概略的に示されている蛍光色素の電子状態は、大体においてかつその一重項状態Ｓでこの蛍光色素の最も低いエネルギーに相当する基底状態１を含む。蛍光色素が、電磁信号２によって励起状態３に遷移され得る。この励起状態３は、同様に蛍光色素の一重項状態に属する。この一重項状態は、蛍光色素の興味の対象となる蛍光を発する状態である。蛍光色素は、この一重項状態から記録可能な蛍光４を照射しながら基底状態１に戻ることができる。蛍光色素が、第３状態５に達する或る一定の確率が同時に存在する。この第３状態５は、三重項状態内の最も低いエネルギーを有する状態である。図１中には、蛍光色素が状態３から状態５に達することが示されている。しかし、蛍光色素が、信号２に基づいて状態１から第３状態５に直接達することも可能である。蛍光色素が第３状態５から基底状態１又は励起状態３に戻ることを決定する寿命は、信号２の繰り返し間隔より大きいので、状態５は、信号２の速い繰り返しによって或る一定の程度までポンピングされる。この程度は、状態５への遷移確率と状態５の寿命と信号２の繰り返し間隔との状況によって決定されている。すなわち、蛍光色素の一般に数パーセントの割合の分子が、常に状態５にあり、このため蛍光４の放射に対して一時的に使用できない。しかしながら、状態５にある蛍光色素のこれらの分子は、基本的に依然として使用できず、状態１又は状態３に戻った後に蛍光４を再び放射する。それ故に状態５にある蛍光色素は、褪色されたとみなす必要はない、すなわち試料の光学測定に対してもはや使用できないとみなす必要がある。しかしながらこれとは違って、蛍光色素の一部が、第３状態５から信号２によって励起しながら第４状態６に到達され得る場合、この第４状態は、非常に長い寿命を有するか又はこの第４状態６から化学変化が起きる、すなわち蛍光色素が分解するので、蛍光色素のこれらの一部は、第４状態から基底状態１又は励起状態３にもはや戻らない。
【００３８】
蛍光色素の蛍光を発する状態２の一般的な寿命は、１nsの大きさにある。ここで考察した状態５の寿命は、一般にこれよりも大きい少なくとも１つの大きさにある。蛍光色素がほぼ戻る場合、この蛍光色素が状態６から状態５又は別の経路を経由して状態１及び状態３のうちの一方の状態に戻るのに伴う半減期は、数十乗大きい。その結果、蛍光色素が状態５に達し、そしてこの状態５から状態６に達する数字的に僅かな確率も、蛍光色素が褪色する前に、すなわち何らかの方法で活動しなくなる前に、蛍光色素が蛍光４を放射できる回数に多大に影響する。
【００３９】
しかしながら、信号２の繰り返し期間が、第３状態５の寿命を超えて増大することによって、蛍光色素が状態６に達したときのこの蛍光色素の褪色は、本発明にしたがって抑制される。一方では状態５の重要でない占有がほとんどなくなり、このため、他方では信号２が状態５にある蛍光色素の重要な部分に印加され、これらの部分が状態６に達するという危険が取り除かれている。
【００４０】
信号２が、この信号２の繰り返し間隔の考察に対して蛍光色素の同じ分子だけに達するので、すなわち信号２が、非常に高い繰り返し率で試料の同じ領域に当たらないので、繰り返し周波数の低減に相当する信号２の繰り返し間隔の増大の代わりに、信号２が、その固有の繰り返し周波数で試料の同じ領域に当たらないように、信号２が向かう試料の領域が、速く変更されてもよい。図２は、１つの測定点８による試料７の走査を示す。この測定点８は、信号２が試料７に印加される領域に相当する。信号２が、上述したようにその繰り返しごとに試料７の同じ領域にもはや当たらないように、測定点８が、示された方向で試料７の上を速く移動する場合、信号２の繰り返し周波数自体が減少する場合と同じ効果が得られる。測定点８が、試料７の上を十分速く移動する場合、信号２は、連続する信号でもよく、それにもかかわらず個々の測定点８で通過する信号のように作用する。
【００４１】
図３は、信号２の繰り返し周波数が、測定点８の各々に対して低減される場合でも、単位時間当たりの光子の総量が、試料７を走査する測定点８の数を増やすことによってどのくらい増大され得るかを示す。この示された10個の測定点８の場合、繰り返し周波数が低減されない測定点８に比べて図１の信号２による試料７の励起に対する損失を示すことなしに、信号２の繰り返し周波数が、各測定点８で10分の１に低減され得る。図１の状態５又は状態６に達する蛍光色素の相対的な割合が減少するときだけ、各測定点８の光子の量が、信号２の繰り返し周波数の説明した低減によって反比例して同時に低下するので、信号２の10倍の周波数による１つの測定点の代わりの10個の測定点の場合の単位時間当たりの光子の量は、それどころか最初からより大きい。蛍光色素のほとんどの分子が、もはや状態６に達せず、このため試料７の光学測定に対して持続して利用されないので、この差は、時間と共にむしろ増大する。
【００４２】
試料に特有の印加される電磁信号の繰り返し率が、光子の最大総量を提供することが、本発明の理論の一部である。この場合、繰り返し率の範囲が重要である。光子の最大総量の全部又は一部が、この繰り返し率の範囲内でほぼ得られる。この繰り返し率の範囲内では、しかし可能な限り高い繰り返し率を選択することが好ましい。この可能な限り高い繰り返し率の場合、蛍光総量が高いだけではなくて、全体の測定期間も可能な限り短い。500kHz〜1MHzの繰り返し率が、良好な選択であることが、図４中に示された色素Atto532（励起波長 470 nm; １光子吸収）に対する測定リストから分かる。この繰り返し率の場合、色素の蛍光からの光子の総量が、従来の技術に対して一般的な40MHzの繰り返し率に比べて6.5〜7.7倍だけ上がっている。
【００４３】
色素Atto532の蛍光からの光子の最大量を算出する測定が、32個の異なる位置（４×８）から構成されたラスターブロックパターン内の固定されたAtto532の色素層に対して実施された。その結果が、図４中に示されている。各ブロックでは、各行の出力が、下に向かうごとに２倍になる。その結果、最も暗い区画は、最も高いレーザー出力に相当する。しかし出力の上昇及びラスラー自体は、ここでは重要でない。ラスターブロックが、異なるレーザーパルス率：40MHz,10MHz,1MHz及び500kHzによって撮影された点が重要である。この場合、同じ総数のパルスが各点に印加されるように、１つの位置での撮影時間が、これらの繰り返し率に応じて適合された。したがって、パルス間の期間だけが変化するものの、全体の照射負荷は一定である。40MHzの場合、最大出力は、40μWである。これらの経時変化が、４つのレーザーパルス繰り返し率の場合に測定された色素の分子に対する同じピーク出力でパルスの同じ総数のときの試料の１つの一定場所に対する蛍光の量を示す。測定時間にわたる積分が、40MHzの場合の測定と500kHzの場合の測定との間で7.7倍だけの蛍光の量の増大を示す。同時に、繰り返し率の低減による色素の褪色の低減が、これらの図中で明白である。
【００４４】
蛍光顕微鏡に対して非常に重要な緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）で900nmの波長の２光子励起を実施する場合、励起光パルスの繰り返し率が、通常の40MHzの場合の代わりに500kHz〜1MHzの間隔で設定されるときに、それどころか光子の総量が10〜14.3倍だけ増大することが、図５から分かる。
【００４５】
測定が、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の固定された層に対して実施された。これらの測定の結果が、図５中に示されている。図４の先の結果の場合のように、同じピーク出力ごとにかつ適合されている撮影時間の繰り返し率に応じて測定された（40MHzの場合で最大出力４mW）。パルスの繰り返し間隔が最適化されると、40MHzの場合の測定と500kHzの場合の測定との間の比較で、光子の量が、ＧＦＰに対して14.3倍だけ増大する。蛍光体の褪色の低減が、この場合でも褪色図(Bleichbilder)によって直接確認できる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】蛍光色素の異なる電子エネルギー状態を示す。
【図２】試料の光学測定時の単一の測定点によるこの試料の走査を示す。
【図３】試料の光学測定時の多数の測定点によるこの試料の走査を示す。
【図４】470nmでかつ100ピコ秒の一定のパルス期間の場合の１光子吸収による一般的な蛍光体のパルス励起時の光子の総量が、繰り返し周波数を40MHzから500kHzに低減することによって7.7倍だけ増大したことを示す。
【図５】900nmでかつ約200フェムト秒のパルス期間の場合の２光子吸収による緑色蛍光蛋白質ＧＦＰのパルス励起時の光子の総量が、繰り返し周波数を40MHzから500kHzに低減することによって14.3倍だけ増大したことを示す。
【符号の説明】
【００４７】
１  基底状態
２  信号
３  状態
４  蛍光
５  状態
６  状態
７  試料
８  測定点
【図１】
2008544235.tif 000003
【図２】
2008544235.tif 000004
【図３】
2008544235.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成20年2月15日(2008.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図４】
2008544235.tif 000006
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図５】
2008544235.tif 000007
【国際調査報告】
2008544235.tif 000008
2008544235.tif 000009
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