(57)【要約】  Ｔ細胞エピトープの全自動選択および／または最適化方法が開示されている。本発明は、特定主要組織適合クラスＩ対立遺伝子に結合する既知エピトープの情報内容に基づくエピトープ選択行列を計算するための、配列ベースの統計的パターン認識を利用するデータ処理システムを提供する。得られたベイズ補正スコア化行列を使用して自己または外来起原の免疫適格抗原に由来の候補Ｔ細胞エピトープの相対的結合親和性を予測する。本発明の１つの観点において、既知または予測Ｔ細胞エピトープ中の修飾の分析的同定方法が記載されており、該修飾はより効率的にプロセシングおよび／またはＴ細胞提示されるので、エピトープにはより強力な細胞性免疫応答誘発能が付与される。開示したエピトープ同定アルゴリズムは感染性疾患、癌および自己免疫疾患用ワクチンの設計ならびに細胞性免疫のｉｎｖｉｔｒｏ評価方法の開発に応用できる。
2008545180.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
問題のＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に結合し易いＴ細胞エピトープを予測するための、
ａ）問題のＭＨＣ対立遺伝子を選択する段階と、
ｂ）ＭＨＣ対立遺伝子に結合する既知のペプチド配列を含むトレーニングセットを収集し管理する段階と、
ｃ）実験的結合スコア行列を決定する段階と、
ｄ）ベイズ補正スコア化行列を計算する段階と、および
を含み、段階ｄ）で計算したベイズ補正スコア化行列を、標的タンパク質由来の候補Ｔ細胞エピトープを評価および格付けする結合フィルターとして使用する、コンピュータにより補助された方法。
【請求項２】
ＭＨＣ対立遺伝子がＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃから成るグループから選択されるクラスＩ対立遺伝子である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的タンパク質がウイルス起原または非ウイルス起原の外来抗原に由来する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
標的タンパク質が自己抗原に由来する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ソースタンパク質が腫瘍関連抗原である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
各位置の１つのアミノ酸含有の配列クラスターの割合を決定する前に、トレーニングセット加入を選択したペプチド配列を配列相似性に基づいてクラスター化する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
６５％配列相似閾値を使用してペプチド配列をクラスターに割当てる請求項６に記載の方法。
【請求項８】
コンピュータにより補助された方法が場合によって天然プロセシングフィルターを含み、該フィルターは、位置Ｐ１またはＰ１’のプロリン残基または位置Ｐ１’のロイシン残基を有するならば候補Ｔ細胞エピトープを排除するというルールで運用される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
コンピュータにより補助された方法が場合によっては自己相似性フィルターを含み、
該フィルターは、
ａ）適正参照配列データベース中の別のタンパク質が候補Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列に一致するアミノ酸配列を含むならば、または、
ｂ）適正参照配列データベース中の別のタンパク質が候補Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列から１または２個のアミノ酸が違ったアミノ酸配列を含み、ミスマッチが候補エピトープおよび参照配列のＭＨＣアンカー残基に限定されているならば、
候補Ｔ細胞エピトープを排除するルールで運用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
標的タンパク質に由来の天然出現ペプチド配列が問題のＭＨＣ対立遺伝子に結合するか否かを予測するための、
ａ）問題のＭＨＣ対立遺伝子に結合する既知のＴ細胞エピトープに由来の親和性情報を使用してベイズ補正スコア化行列を決定する段階と、
ｂ）前項ａ）のベイズ補正スコア化行列の情報内容に基づいて標的タンパク質に由来の一連の候補ペプチドの結合スコアを計算する段階と、
ｃ）予測した結合スコアの数値に基づいてペプチドをリストに格付けする段階と、
を含み、ペプチドの結合スコアが高いほどペプチドがＭＨＣ対立遺伝子に高い結合親和性を有すると特性付ける予測方法。
【請求項１１】
標的タンパク質がウイルスタンパク質、非ウイルス病原性タンパク質または腫瘍関連抗原から成るグループから選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
候補ペプチドが標的タンパク質に存在し得るすべての９量体および１０量体を表す請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
場合によって、ｄ）位置Ｐ１またはＰ１’のプロリン残基または位置Ｐ１’のロイシン残基を有するならば候補Ｔ細胞エピトープペプチドを排除する段階を含み、段階ｄ）で使用する天然プロセシングフィルターが、抗原提示細胞によって効率的にプロセスまたは提示され難い候補ペプチドを除去すべく機能する請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
場合によって、ｅ）適正参照配列データベース中の別のタンパク質が候補Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列に一致するアミノ酸配列を含むならば、または、適正参照配列データベース中の別のタンパク質が候補Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列から１または２個のアミノ酸が違ったアミノ酸配列を含み、ミスマッチが候補エピトープおよび参照配列のＭＨＣアンカー残基に限定されているならば、候補Ｔ細胞エピトープを排除するルールで実行される段階を含み、段階ｅ）で実行されるルールが標的タンパク質に唯一的でない候補ペプチドを除去すべく機能する請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ａ）先天性予測Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列の固定アンカー類似体のセットをｉｎ  ｓｉｌｉｃｏに設計する段階と、
ｂ）請求項１または請求項１０に記載のスコア化行列を使用して各類似体の結合スコアを計算する段階と、
ｃ）段階ａ）で最高結合スコアをもつＴ細胞エピトープを候補アンカー修飾免疫原性類似体として選択する段階と、
を含み、アンカー修飾免疫原性類似体が先天性エピトープに対して増強免疫応答を誘発する、先天性ＭＨＣクラスＩ制限Ｔ細胞エピトープのアンカー修飾免疫原性類似体を同定するためのコンピュータを用いる方法。
【請求項１６】
標的抗原が、ウイルスタンパク質、非ウイルスタンパク質または腫瘍関連抗原から成るグループから選択される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
結合親和性フィルター、天然プロセシングフィルターおよび自己相似性フィルターを通過した予測エピトープだけを総合的に考察する請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
位置Ｐ１またはＰ１’のプロリン（ｐｒａｌｉｎｅ）残基または位置Ｐ１’のロイシン残基を有するならば候補Ｔ細胞エピトープを排除する天然プロセシングフィルターを運用し、天然にプロセスまたは提示され難い候補ペプチドを前記フィルターで除去する段階を含む、抗原提示細胞がペプチドのプロセスまたは提示をどの程度効率的に予測するかに基づいて候補Ｔ細胞エピトープのセットを格付けするコンピュータを用いる方法。
【請求項１９】
ａ）請求項１５に記載の方法によって同定されたＭＨＣクラスＩ制限Ｔ細胞エピトープのアンカー修飾類似体のアミノ酸配列を含むように標的タンパク質のアミノ酸配列を修飾する段階を含む、標的タンパク質の免疫原性増強方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫情報科学と呼ばれる生物情報科学の分野に関する。より詳細には本発明は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の分子に対する免疫適格抗原由来ペプチドの結合親和性を予測および／または最適化するデータ処理システムおよび方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
エピトープワクチンは、個体の免疫系による感染性疾患の治療と予防および癌性細胞の破壊促進に有力な手段を提供する。ＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が哺乳類免疫系による感染性疾患および腫瘍細胞の根絶に重要な役割を果たすことはもはや定説になっている。ＭＨＣクラスＩ制限エピトープワクチンは、その防御効果が動物モデルで証明され、広範囲の効果的で人種的に偏りのない集団的防御を実現できるヒトＨＬＡ−制限ＣＴＬエピトープをコードするエピトープワクチンの開発が可能であると信じられている。
【０００３】
エピトープ利用のワクチンはいくつかの有利な特徴を有している。すなわち、急速に突然変異する病原体（ＨＣＶまたはＨＩＶなど）の多くの保存エピトープを標的とする設計に構築できる強力な免疫原を示すこと、亜優性エピトープに対する免疫応答を誘発できること（例えば、優性エピトープに寛容が存在する状態の腫瘍関連抗原の場合）、寛容を破壊するようにまたは免疫原性を増強するように類似体化できること、および、それらの使用は原形タンパク質または弱化病原体の使用に付随する安全上の危険を最小にとどめること、などである。
【０００４】
免疫系は、生物の内因性分子（“自己”分子）を生物への外来または異質物質（“非自己”分子）から識別する機能を果たす。ヒトの免疫系は、病原性タンパク質（細菌、ウイルスまたは寄生病原体の細胞内感染の結果として産生される。）および異常自己タンパク質（癌性プロセスの結果として発現された突然変異自己タンパク質）のようなそれ自体の細胞によって産生された抗原を主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によって認識する。より詳細には、ＭＨＣ分子／ＭＨＣペプチド複合体が抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用し、エフェクターＴ細胞が抗原を認識できる情況を与える。エフェクターＴ細胞の活性化が免疫応答を誘発する。
【０００５】
ＭＨＣ／ペプチド複合体は抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に表示され、大抵の場合、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子のポケット様凹部に保持された短いタンパク質セグメント（すなわち、Ｔ細胞エピトープ）から構成されている。典型的には、ＭＨＣクラスＩリガンドは、８−１１個のアミノ酸を含み、細胞質プロテアーゼによって分解される内在発現タンパク質に由来する。ＭＨＣクラスＩ分子は、ＣＤ８＋細胞に優先的制限を示す（Ａ．Ａｂｂａｓら，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄ．２０００，Ｃｈａｐｔｅｒ  ４，ｐｐ６３−７３）。Ｔ細胞エピトープが高度に免疫原性であるためには、Ｔ細胞エピトープが、活性化を生じさせる十分に安定なＴＣＲ結合を促進するだけでなく、多数のＴＣＲ分子が同じペプチド−ＭＨＣ複合体と順次に相互作用できるように、ＴＣＲが十分に高いオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を有していなければならない（Ａ．Ｋａｌｅｒｇｉｓら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００１，２：２２９−２３４）。
【０００６】
免疫適格抗原を発現している細胞に対する特異的免疫応答を誘発するためには、３者間相互作用、すなわち、１）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と、２）主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子と、３）上記の２）に結合した病原物質または癌性細胞に由来の抗原性ペプチドとの３者間相互作用が極めて重要である。ＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の表面に見出されるＴＣＲがＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体を認識すると、免疫応答が活性化し、この免疫応答が最終的にペプチド提示細胞の破壊（例えば、アポトーシス）をもたらす。
【０００７】
タンパク質配列解析からワクチン開発にいたる経路には、特定ＭＨＣ分子に対する候補エピトープの親和性を試験する結合アッセイの開発、Ｔ細胞応答を評価する適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの確立、および、特定免疫原性組成物の免疫原性および有効性の最終的ｉｎ  ｖｉｖｏ試験が必要である。Ｔ細胞エピトープは、ペプチド地図作製、組合せペプチドライブラリーのスクリーニング、問題の組織に由来の発現ライブラリーの作製およびスクリーニング、または、ＭＨＣ分子からの天然出現ペプチドの溶離および配列決定を含む多数の実験方法によって実験的に決定できる。標的タンパク質の性質次第では、実験的決定は、時間、労力および資源の面であまりにも費用がかかるので実用的でない。このため、実験作業に代替できる高処理量方法としてデータ駆除型計算方法の使用が盛んに奨励されている。
【０００８】
Ｔ細胞エピトープを同定するための様々な配列利用方法が存在しているが、既知または予測されたＴ細胞エピトープを同定および／または修飾する分析的な方法を提供するデータ処理システムへの要望はまだ満たされていない。特に、より効率的な抗原のプロセシングおよび／または提示ができるのでＴ細胞エピトープにより強力な細胞性免疫応答誘発能を与える修飾を同定することが必要である。
【発明の開示】
【０００９】
発明の要旨
本発明は、個々のＭＨＣ対立遺伝子の結合優先性をモデル化するために外来または自己起原のアミノ酸配列の情報内容を利用するＴ細胞エピトープ予測および免疫増強用計算ツールを開示する。より詳細には本発明は、ＭＨＣクラスＩエピトープ予測および／または最適化用エピトープ同定用アルゴリズムを提供する。開示したデータ処理システムの使用によって当業者は、予測されたＭＨＣクラスＩ対立遺伝子への結合能に基づいて免疫適格抗原に由来のアミノ酸配列を同定および格付けできる。本文中に記載の本発明は、コンピュータハードウェアまたはソフトウェアまたは双方の組合せを使用して実施できる。Ｔ細胞エピトープを全自動的に選択および／または最適化するための開示した計算方法の使用は、改良された免疫診断薬および免疫治療薬（例えば、免疫原性組成物またはワクチン）の設計および開発を促進するであろう。
【００１０】
１つの観点によれば本発明は、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子への予測された結合能に基づいて候補Ｔ細胞エピトープを評価および格付けするために使用できるエピトープ選択行列または結合フィルターを提供する。本発明はまた、天然プロセシング（ｐｒｏｅｓｓｉｎｇ）フィルター、自己相似性フィルターおよび免疫原性増強フィルターを提供する。これらのいずれかまたは全ては単独で使用されてもよく、または、開示した結合フィルターと併用されてもよい。特定実施態様では、天然プロセシングフィルター、自己相似性フィルターまたは免疫原性増強フィルターは、別の方法によって同定された既知のＴ細胞エピトープを最適化する独立計算ツールとして使用できる。開示した方法およびフィルターを使用して同定および／または最適化されたＴ細胞エピトープは、遺伝子に基づく、タンパク質に基づく、ベクターに基づくまたは細胞に基づくワクチンの部分として、感染性疾患または癌の治療または予防に使用でき、あるいは、標的抗原に由来の１つ以上のＴ細胞エピトープを含む免疫原性組成物の投与によって誘導されたｉｎ  ｖｉｖｏ細胞性免疫応答を測定する設計の免疫診断アッセイの一部として使用できる。
【００１１】
エピトープワクチンおよび免疫原性組成物の治療的使用では、患者の免疫系を刺激して感染細胞または形質転換細胞に対する患者自身の免疫応答を増強させるペプチド配列（すなわち、Ｔ細胞エピトープ）を同定する必要がある。この目標に到達すべく、問題のＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に結合し易いＴ細胞エピトープのコンピュータにより補助された予測（例えば同定）方法の基礎として使用できる結合フィルターを提供することも本発明の１つの目的である。要約すると、選択プロセスは、問題のＭＨＣ対立遺伝子を選択する段階と、ＭＨＣ対立遺伝子（すなわちＭＨＣペプチド）に結合する既知のペプチド配列を含むトレーニング（ｔｒａｉｎｉｎｇ）セットを収集および管理する段階と、トレーニングペプチドを配列相似性に基づいてクラスターに配分する段階と、実験的結合スコア行列を決定する段階と、ベイズ（Ｂａｙｅｓ）補正スコア化行列（ｍａｔｒｉｘ）を計算する段階とを含む。トレーニングセットペプチドの情報内容から導出されたスコア化行列をエピトープ選択行列として使用し、標的タンパク質から実験的にまたはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏアルゴリズムを使用して導出された候補Ｔ細胞エピトープを評価および格付けする。
【００１２】
開示したエピトープ選択行列（結合フィルター）は、外来抗原（例えばウイルスまたは非ウイルスタンパク質）または自己抗原に由来の標的タンパク質中のＴ細胞エピトープを同定するために使用できる。従って、本発明の１つの観点では、標的タンパク質に由来の天然出現ペプチド配列が問題のＭＨＣ対立遺伝子に結合するか否かを予測する方法を提供する。より詳細には本発明は、問題のＭＨＣ分子に結合すると予測される標的タンパク質の可能なすべての９量体および１０量体を表す候補エピトープのセットから推定Ｔ細胞エピトープを同定する方法を提供する。要約すると、この方法は、問題のＭＨＣ対立遺伝子に結合する既知のクラスターＭＨＣペプチドに由来の結合情報からベイズ補正スコア化行列を計算する段階、および、得られた行列を候補Ｔ細胞エピトープの結合スコアの決定に使用する段階を含む。
【００１３】
代替的な観点では、本発明は、アンカー−修飾免疫原性類似体のような類似体化した合成ペプチド配列のソースである親（天然出現またはモデル化した）ペプチド配列よりも強力な免疫応答を誘導し易いか否かを予測する方法を提供する。要約すると、類似体化配列の評価は実施例８に記載したように、提案された最適化配列（すなわち類似体）の結合スコアを計算するために結合フィルターを使用する段階と、得られた類似体のスコアを親配列の決定スコアに比較する段階とを含む。
【００１４】
本発明の代替的観点は、細胞プロセシングの損傷が原因でＴ細胞に提示され難い候補Ｔ細胞エピトープを同定し排除するために使用できる天然プロセシングフィルターを提供する。ＨＬＡ分子に関係した抗原提示はＴ細胞による認識の先要条件であるから、１つ以上の同定された損傷モチーフを有しているペプチドはエピトープ基剤のワクチンに含ませる亜最適候補であると考えられる。本文中に開示した天然プロセシングフィルターは、候補エピトープのフランキング残基について細胞表面の抗原提示細胞（ＡＰＣ）の抗原プロセシングおよび／または提示の減少傾向に関連する数種のアミノ酸モチーフの１つの存在を分析するために利用される。実際、天然プロセシングフィルターによって当業者は、良好なＴ細胞エピトープ候補であると考えられるがｉｎ−ｖｉｖｏで非免疫原性になり易いペプチドをペプチドスコアのみに基づいて同定し得る。
【００１５】
本発明の天然プロセシングフィルターは、位置Ｐ１またはＰ１’にプロリン残基を有するかまたは位置Ｐ１’にロイシン残基を有するならば候補Ｔ細胞エピトープペプチドを排除するルールで運用される。従って本発明の代替的観点は、既知または予測されたＴ細胞エピトープ中の修飾、すなわち、Ｔ細胞に対するより効率的なプロセシングおよび／または提示によってより強力な細胞性免疫応答誘発能を被修飾エピトープに与えている修飾を同定する分析方法を記載する。データ処理システムの構成要素として使用される以外にも、開示した天然プロセシングフィルターはまた独立型フィルターとして使用でき、実験的測定または代替的ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ方法を使用して同定した候補Ｔ細胞エピトープセットを、ＡＰＣによるペプチドの効率的なプロセスまたは表示の見込みに基づいて格付けする。
【００１６】
免疫原性組成物が先天的形態の自己相似ペプチドを含むとき、標的外（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）自己免疫応答が誘発されることは公知である。例えば、免疫治療後のメラノサイト（ｖａｎ  Ｅｌｓａｓら，ＪＥＭ  １９９９，１９０：３５５−３６６）および膵島β−細胞（Ｌｕｄｅｗｉｇら，ＪＥＭ  ２０００，１９１：７９５−８０４）のＴ細胞性破壊を報告する発表論文は、望まれない標的外免疫応答をｉｎ  ｖｉｖｏ誘発する自己相似ペプチドを含む免疫原性組成物の投与結果を例示している。
【００１７】
開示した方法に基づいて配合される免疫原性組成物の特異性を改善するために、本発明はまた自己相似性フィルターを提供する。実際、開示した自己相似性フィルターによって研究者は、標的抗原に唯一的でない候補エピトープを除去し得る。特定実施態様では、自己相似性フィルターは場合によっては、腫瘍関連抗原のＴ細胞エピトープを同定するように設計された選択プロセスの構成要素として使用できる。あるいは、上記の天然プロセシングフィルターの場合と同様に、本発明の自己相似性フィルターは、標的抗原に唯一的かつ特異的なＴ細胞エピトープを同定するために独立型フィルターとして使用できる。
【００１８】
本発明の自己相似性フィルターは、非標的タンパク質に存在する天然出現アミノ酸配列に一致するかまたは高度に相似である候補エピトープを同定し標識することによって機能する。アルゴリズムにこのフィルターを含ませることによって当業者は、非標的タンパク質に相似のアミノ酸配列をもつ候補エピトープを除去することによって（結合スコアに基づく）ペプチドの格付けリストを管理できる。実際、自己相似性フィルターは、適正参照配列データベースの別のタンパク質に含まれるアミノ酸配列が、１）候補Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列に一致するならば、または、２）候補Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列から１個または２個のアミノ酸だけ違っており、ミスマッチがＭＨＣ結合凹部の内部に埋伏しており従ってＴ細胞認識に影響しないＭＨＣアンカー位置（たいていのクラスＩ対立遺伝子では位置２および９／１０）のアミノ酸配列に限定されているならば、候補Ｔ細胞エピトープを排除するルールで運用される。
【００１９】
付加的観点では本発明はまた、天然出現親アミノ酸配列によって誘発された免疫応答に比べて増強された免疫応答を誘発するアンカー修飾免疫原性類似体の同定方法を提供する。本発明の免疫増強フィルターは、非修飾の天然出現（すなわち、野生型）ペプチドよりも強力な免疫応答誘発能を推定Ｔ細胞エピトープに付与し易いアンカー残基のアミノ酸置換を同定するために使用できる。実際には、免疫原性増強フィルターは、野生型ペプチドによって誘発された応答と交差反応性の増強免疫応答を誘発すると予測される類似体を調製するために候補Ｔ細胞エピトープに導入できるアミノ酸修飾を同定および評価するために使用できる。交差反応性は、修飾ペプチド特異的Ｔ細胞がＴＣＲ接触領域のアミノ酸残基一致によって野生型ペプチドを認識するという仮定を前提にして予測される［Ｋｅｏｇｈら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１，１６７：７８７−７９６］。従って、類似体が交差反応性免疫応答を誘発すると仮定することは妥当である。典型的には、免疫増強フィルターは、ＨＬＡ分子への結合を改善するために、管理した候補配列中に自己相似配列を排除するような修飾を提案するために使用される［Ｍ．Ｐａｒｋｈｕｒｓｔら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９６，１５７：２５３９−２５４８］。類似体の予測結合強度は、上述の結合フィルターを使用して評価できる。
【００２０】
また別の代替的観点では本発明は、問題の病原性または腫瘍関連タンパク質に対するワクチン誘導細胞性免疫応答を評価するように設計されたｉｎ−ｖｉｔｒｏアッセイに使用する標的を同定するために使用できるコンピュータ利用方法を提供する。例えば、開示した方法によって研究者らは、１つ以上のＴ細胞エピトープを含む免疫原性組成物でワクチン接種する前および後の抗原特異的細胞性免疫を評価するように設計されたｉｎ−ｖｉｔｒｏ診断アッセイ（たとえば、力価アッセイ）に使用するペプチドを合理的に選択できる。より詳細には、ワクチン接種の前および後の抗原特異的Ｔ細胞の量および／または機能活性は、テトラマー、ＥＬＩＳＰＯＴまたはＩＣＳアッセイのような標準Ｔ細胞活性化アッセイにプローブとして予測Ｔ細胞エピトープ（類）を使用することによって測定できる。
【００２１】
本発明の開示に引用した参考文献は、特許請求の範囲に記載の本発明の先行技術であると認めるものではない。
【００２２】
発明の詳細な説明
異なる定義がなければ、本文中に使用した技術的および科学的用語は、本発明所属分野の平均的な当業者が常識的に理解する意味を有している。当業者は、本発明の教示の実施に使用できる本文中に記載の方法および材料に相似または等価の他の方法および材料を想到できるであろう。本文中に提示した教示が本文中に記載の方法またはプロセスを限定する意図はないことを理解されたい。本発明に使用した以下の用語を次のように定義する。
【００２３】
本文中に使用した“９量体”および“１０量体”という用語は、標的抗原中に存在する９または１０アミノ酸の直鎖配列を表す。一般的に、親配列中の存在可能なすべての９量体および１０量体を含む配列の集団はそれぞれ８または９残基だけ重なり合う配列を含むと理解される。
【００２４】
本文中に使用した“アンカー残基”という用語は、ＭＨＣ分子のペプチド結合凹部に嵌合する側鎖を含むペプチドフラグメントのアミノ酸残基を表す。
【００２５】
本文中に使用した“抗原”という用語は、Ｔ細胞または抗体によって認識できる生物物質または巨大分子物質を表す。
【００２６】
本文中に使用した“結合モチーフ”という用語は、特定されたＨＬＡ対立遺伝子または血清型への結合能に相関関係のあるタンパク質配列内のアンカー残基の特異的パターンまたは組合せを表す。
【００２７】
本文中に使用した“主要組織適合複合体（ＭＨＣ）”および“ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）”という用語は、互換的に使用されており、Ｔ細胞受容体によって特異的に認識されるように様々な種類のペプチドを細胞表面に提示するタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子座を表す。クラスＩのＭＨＣ分子と呼ばれるＭＨＣ遺伝子のサブクラスは、ＣＤ８＋Ｔ細胞にペプチドを提示する。
【００２８】
本文中に使用した“免疫原”という用語は免疫応答を誘導または刺激し得る特異的抗原を表す。必ずしも全ての抗原が免疫原性ではない。
【００２９】
本文中に使用した“増強免疫原性”という用語は、親ペプチドによって誘発された免疫応答に比較したときに免疫系の活性化能が増加していることを表す。変異体ペプチドまたは類似体が、標準ｉｎ−ｖｉｔｒｏＴ細胞活性化アッセイで測定して親ペプチドによって誘導された活性化レベルに比べて高いＴ細胞活性化レベルを誘導するならば、これらは“増加免疫原性”を有していると言うことができる。好ましい実施態様では、免疫増強類似体の投与によるワクチン誘導エピトープ特異的Ｔ細胞の頻度数は、親ペプチドによる免疫感作で誘導されたＴ細胞活性化レベル（すなわち、エピトープ特異的ＣＴＬの数）に比べて、少なくとも１０倍の増加となるであろう。Ｔ細胞活性の５０倍増が特に好ましい免疫増強レベルである。
【００３０】
本文中に使用した“免疫原性類似体”という用語は、野生型アミノ酸配列の１つ以上の残基が開示した方法の免疫増強フィルターによって同定された代替アミノ酸配列で置換されたペプチドを表す。天然ペプチドの免疫原性を調節または修飾（例えば、増加）するためにしばしば配位置換が行われる。
【００３１】
本文中に使用した“トレーニングフェーズ”という用語は、特定データセット内で適格な直接関連パターンを発見するための体系的および分析的プロセスを表す。
【００３２】
本文中に使用した“実験スコア化行列（ＥＳＭ）”または“位置特異的スコア化行列（ＰＳＳＭ）”という用語は、指示された固定長さのペプチドセット中の各位置における種々のアミノ酸残基の出現頻度を示す数列を意味する。
【００３３】
本文中に使用した“予測”および“予測する”という用語は、推定Ｔ細胞エピトープを表すアミノ酸配列の特性（例えば、ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子への結合能、ＡＲＣによる効率的プロセスおよび提示の見込み、標的抗原に対する唯一性、免疫原性）を評価するために本発明の教示を使用することを意味する。
【００３４】
本文中に使用した“エピトープ”という用語は、免疫応答を刺激できるアミノ酸配列を含むペプチドを意味する。本文中に開示した方法およびプロセスによって同定されたＭＨＣクラスＩエピトープは、標的抗原指向性免疫応答を刺激する組成物（例えば、ワクチン）に使用できる。好ましい実施態様では、この定義に合致するエピトープは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）との相互作用を促進するように抗原提示細胞の表面のクラスＩ  ＭＨＣ分子の結合凹部に非共有結合的に結合し易いペプチドを表す。
【００３５】
本文中に使用した“ＭＨＣクラスＩバインダー”および“ＭＨＣペプチド”という用語は、哺乳類のクラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に対する高い結合親和性が判明しているかまたは予測されるペプチドを意味する。
【００３６】
本文中に使用した“標的抗原”という用語は、免疫応答の指向または刺激の対象となる抗原を意味しており、その非限定例は病原性（例えば、病原物質に由来の）抗原または腫瘍抗原を含む。
【００３７】
本文中に使用した“病原物質”という用語は、哺乳類宿主体内に存在するときに病的症状を生じさせる生物体を意味する。従って病原物質は非限定的に、感染性物質（例えば、ウイルス、プリオン、細菌、酵母または他の真菌類、マイコプラズマ、または、寄生原生動物、寄生線虫もしくは寄生吸虫のような寄生真核生物）、または、腫瘍細胞（例えば、肺癌または乳癌細胞）などである。
【００３８】
本文中に使用した“免疫原性組成物”および“免疫刺激配列”という用語はそれぞれ、免疫応答、反応、効果および／またはイベントを誘導できる組成物およびペプチド配列を意味する。いくつかの実施態様では、このような応答、反応、効果および／またはイベントをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで誘導できる。例えば、ＣＴＬのような細胞性免疫に関与する細胞の誘導、活性化または膨張は免疫応答、効果またはイベントを表す。代表的な免疫原性組成物は免疫増強した全長標的抗原またはミニジーンワクチンである。
【００３９】
本文中に使用した“ワクチン”という用語は、疾患を予防、治癒または軽減する予防的および／または治療的応答を誘発できる免疫原性組成物を意味する。
【００４０】
本文中に使用した“エピトープワクチン”という用語は、同じまたは異なる病原体または腫瘍細胞の１つ以上の標的タンパク質に由来し１つ以上の問題の対立遺伝子に特異的な複数のエピトープの組成物全般を意味する。使用されるエピトープのリストは、天然プロセシング、免疫原性、唯一性（例えば、他の自己抗原との相似性の欠如）、集団防御および予測疾患適性に最適化されたエピトープを含むであろう。エピトープ間に追加アミノ酸（“スペーサー”）を伴うかまたは伴わずに互いに連結された少なくとも１つの標的抗原に由来する２つ以上の推定Ｔ細胞エピトープを含む免疫原性組成物はエピトープワクチンとして使用できる。従って、エピトープワクチンは、１つ以上の抗原の単一または多エピトープを指向する免疫応答を刺激できる。
【００４１】
背景
１．生物情報科学
生物情報科学の分野は、生物体が同定できるパターンを含み、これらのパターンから得られた情報が哺乳類免疫系のような複合生物系の様相を理解するために使用できるという考え方を前提としている。最近では、免疫系の理解の向上に焦点を絞った生物情報科学研究の分野を表すために“免疫情報科学”という新造語が登場した。
【００４２】
免疫応答は、特定抗原が細胞のプロセシング装置によってどのようにしてペプチドに分解されるか、プロテアソーム（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）またはＥＲ常在プロテアーゼによって生成された特定ペプチドが抗原提示細胞の表面に提示されるか否か、特定ペプチド／ＭＨＣ複合体がＴ細胞受容体によって認識されるか否か、どのエフェクターＴ細胞が活性化されるのか、免疫応答が生じるとすればどのようなタイプの免疫応答が開始されるのか、などのような一連の判断ポイントを含む。これらの各判断の結果は部分的には、推定免疫刺激配列の情報内容（ペプチドの各位置のアミノ酸残基の一致）によって決定される。同じＭＨＣ分子に結合できるペプチドが配列相似性によって類縁であることは公知である。この観察から研究者らは、特定ＭＨＣ分子に結合する既知のペプチド配列の位置合せから得られたアミノ酸配列モチーフおよび位置特異的スコア化行列（ＰＳＳＭ）または分布に基づいた計算方法の開発を目指すことになる。
【００４３】
概して、免疫情報科学は、免疫学的巨大分子およびプロセスの研究に計算ツールおよびデータ処理システムを応用することを意味する。ＭＨＣ分子の結合優先性が主としてその分子構造によって決定されるという事実が、エピトープ利用ワクチン設計のプロセスは特に生物情報学ツールの使用に導く。抗原のプロセシング／提示経路の各段階が抗原選択の特異性に寄与すると考えられるが、ＭＨＣ配列／構造が抗原認識の根拠とする最も重要な点がＭＨＣ／ペプチド複合体へのＴ細胞エピトープの取込み／結合であることは広く認められている。従って、計算方法は伝統的に、自己起原または外来起原の標的抗原に由来の候補ペプチド配列のＭＨＣ親和性の予測に焦点を絞っている。
【００４４】
２．Ｔ細胞／ＭＨＣ
免疫応答の開始および調節には複数のプロセシング、提示および認識イベントが関与し、これらは多くの刺激性／阻害性シグナルの相互作用、複数の異なる型の細胞の配位相互作用から生じる。タンパク質抗原由来のアミノ酸配列がＴ細胞性免疫応答を誘発するためには、出発タンパク質がプロセスされる必要があり（例えば、プロテアソーム開裂、次いでＥＲ常在ペプチダーゼによるＮ−末端除去によって）、プロセスされたペプチドがＭＨＣ分子に結合する必要があり、得られたＭＨＣ／ペプチド複合体にＴ細胞活性化が生じる十分な親和性で結合するＴＣＲが存在する必要がある。
【００４５】
従って、Ｔ細胞エピトープの同定に適したすべての計算モデルの基本構成要素が、候補アミノ酸配列のＭＨＣ分子結合能を予測する解析ツールである。理論的根拠は、強力なＭＨＣ結合が免疫原性エピトープの先要条件である［Ａ．Ｓｅｔｔｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９４，１５３：５５８６−５５９２］という前提に立脚する。
【００４６】
ヒト主要組織適合複合体（ＭＨＣ）は、細胞性および体液性双方の免疫応答に重要な高度に多形性の細胞表面抗原の異なる２つのクラス（すなわち、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ）をコードする７つの遺伝子座を含む多くの遺伝子座から構成されている。クラスＩおよびクラスＩＩの分子は循環Ｔリンパ球に結合しプロセスされたペプチド（類）を提示する。ＭＨＣ遺伝子はいかなる哺乳類の系においても既知の最も多形性の遺伝子を表す。クラスＩ  ＭＨＣ分子は、分子が認識できる全部のペプチドの結合に利用される結合部位を１つだけ含む。各ＭＨＣ分子は多くの異なるペプチドと結合できるので、結合相互作用は縮重性であると言われる。
【００４７】
単一のＴ細胞エピトープが種々のＭＨＣ分子に対して様々な親和性を有しており、あるものには強力に結合し、他のものにはゆるやかに結合し、また他のものには判別できるほどの結合を生じない。ＭＨＣ対立遺伝子は伝統的に、同型の異なる対立遺伝子間で違っているペプチド結合溝の構造を反映しない血清反応性に従って分類されている。Ｔ細胞エピトープが高度に免疫原性になるためには、活性化を生じさせる十分に安定なＴＣＲ結合を促進するだけでなく、多数のＴＣＲ分子が同じペプチド−ＭＨＣ複合体と順次に相互作用できるような十分に低いオフレートをＴＣＲが有していなければならない（Ａ．Ｋａｌｅｒｇｉｓら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００１，２：２２９−２３４）。
【００４８】
ヒトＭＨＣの多形性の１つの結果は、異なるＭＨＣ分子のおのおのがそれ自体のペプチド結合ルールを有しており、各対立遺伝子が異なるペプチドに優先的に結合することである。しかしながら通常は大半の集団を包含する比較的少数の対立遺伝子を選択できる。例えば、３種類のクラスＩ対立遺伝子、ＨＬＡ−Ａ２、Ｃｗ７およびＣｗ４だけで北米人口の＞８５％を包含する（すなわち、米国大陸の＞８５％人口がこれらの３つの対立遺伝子の少なくとも１つを有している）。ＨＬＡ遺伝子型と疾病罹患性との間には既知の関係が存在する。例えば、クラスＩ対立遺伝子Ｂ２７の存在は、強直性脊椎炎（ＡＳ）の発症に密接に関連している［Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  １９９７，４９：１１６−２３］。すなわち、ＨＬＡ−Ｂ２７は個体の８−１０％に出現するが、ＡＳ患者の＞９０％がこの対立遺伝子を有している［Ｊ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓｕｅｉｒｏら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｘｐｅｒ．Ｒｈｅｕｍａｔ  ２００４，２２：４６５−４６８］。
【００４９】
ＭＨＣ分子の主な機能は、免疫エフェクター細胞によって認識され得る立体配置の唯一的エピトープの細胞表面提示を促進することである。ＭＨＣ分子は、Ｔ細胞の免疫認識および活性化のプロセスに特異性を付与する機能を果たす。一般に、ＭＨＣクラスＩ分子は感染性病原物質または腫瘍形成によって調節を失った自己分子に由来の内因性ペプチドフラグメントを収集し、これらのペプチドを細胞表面に表示する。プロセスされたペプチドと相互作用する提示構造は主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によってコードされている。この要件を“ＭＨＣ制限”と呼び、これはＴ細胞が“自己”を“非自己”から識別するメカニズムである。プロセスされたペプチドが宿主の内因性ＭＨＣ分子によって表示されないとき、宿主のＴ細胞はペプチドを認識または応答しないであろう。対照的に、プロセスされ提示されたペプチド（ＭＨＣ／ペプチド複合体）が抗原特異的ＴＣＲを発現しているＴ細胞によって認識されるならば免疫応答が開始される。
【００５０】
Ｔリンパ球（例えば、Ｔ細胞）は、哺乳類免疫系と免疫刺激抗原との相互作用から生じる一連のイベントおよびシグナルに応答して機能する抗原特異的免疫細胞である。Ｔ細胞認識は、内因性ＭＨＣ分子が提示できるペプチドに限定されている。Ｔ細胞認識は、ＡＰＣの細胞溶解、Ｔ細胞によるリンホカイン分泌、または、ナチュラルキラー細胞へのシグナル伝達に導く細胞プログラム活性化の第一段階である。ＴＣＲとの相互作用はペプチドおよびＭＨＣ分子の双方に依存する。ＣＴＬは、クラスＩ  ＭＨＣ遺伝子産物に結合しているペプチドを全般的に認識するＴ細胞のサブセットである。
【００５１】
クラスＩ  ＭＨＣ分子は、非共有結合的に結合した、ＭＨＣコードＨ鎖（または、α鎖）と、非ＭＨＣコードβ２−ミクログロブリンＬ鎖とのヘテロダイマーである。４つの個別領域が存在する：１）ペプチド結合領域、２）免疫グロブリン様領域、３）トランスメンブラン領域および、４）細胞質領域。ペプチド結合領域は、８−１０個のアミノ酸残基のペプチドリガンドを収容する機能を果たす溝である。この溝はアルファ１およびアルファ２領域から形成され、これらの領域は相互作用して、アルファヘリックスの平行鎖から成る２つの対向“壁”と共に８鎖βプリーツシートの“床”を形成している。
【００５２】
ペプチド−クラスＩ  ＭＨＣ相互作用の親和性を決定する因子は、ＭＨＣタンパク質から抽出したペプチドおよび天然ペプチドライブラリーの配列決定のような生化学的および構造的方法を使用して特性決定された。クラスＩ  ＭＨＣリガンドは典型的には、８−１１アミノ酸の長さである。より一般的に、クラスＩ制限ペプチドは、２つのαヘリックスとβプリーツシートによって形成されたクラスＩ  ＭＨＣ構造の溝に結合するオクタ−またはノナペプチドである。クラスＩ  ＭＨＣ分子はまた、ペプチド主鎖の原子と相互作用する。このペプチドの配向は、このペプチドのＮ−およびＣ−末端残基と相互作用するＭＨＣ  Ｉタンパク質の保存側鎖によって決定される。一般的に言えば、ペプチド結合モチーフが、所与のＨＬＡ分子との良好な嵌め合い（および推定された高親和性結合）に関連するアンカー残基の特定の組合せを規定する。例えば、ＨＬＡ対立遺伝子Ｂ＊０７０２は、位置２のプロリンおよびＣ−末端の脂肪族アミノ酸に明らかな優先性を示すが、対立遺伝子Ａ＊０１０１は位置２のセリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）およびＣ−末端の芳香族アミノ酸を優先的に採択する［Ａ．Ｓｅｔｔｅら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９９，５０：２０１−２１２］。
【００５３】
ＭＨＣクラスＩ−ペプチド結合部位の幾何学的形状は比較的十分に特性決定されている。ＭＨＣクラスＩ分子は２つのポリペプチド鎖から構成され、大きいほうのα鎖はＭＨＣ遺伝子座にコードされ、小さいほうの非共有結合的に会合した鎖、β２−ミクログロブリンは多形性でなく、ＭＨＣ遺伝子座にコードされていない。完全分子は４つのドメインから構成され、３つのドメインがα鎖から形成され、１つがβ２−ミクログロブリンによって与えられている。ペプチド結合凹部は分子の表面に出現しており、α１およびα２ドメインの折り畳まれたαヘリカルセグメントから形成されている。Ｔ細胞受容体はこの複合リガンドと相互作用し、ＭＨＣ分子およびペプチド抗原フラグメントの双方に接触する。
【００５４】
ペプチド／ＭＨＣ分子複合体の結合エネルギーの大半は、ＭＨＣ分子とペプチドのＮ−およびＣ−末端との保存残基間の主鎖接触から生じる。付加的な主鎖接触も生じるが、ＭＨＣ対立遺伝子毎に違っている。配列特異性は、ペプチドの残基サブセット（例えば、アンカー残基）とやはりＭＨＣ対立遺伝子毎に違っているポケットとの側鎖接触によって与えられる。
【００５５】
ＭＨＣ結合溝へのペプチドリガンドの結合は特異的であり、ペプチドの遊離アミノ末端およびカルボキシル末端の原子とすべてのＭＨＣクラスＩ分子の凹部の各端部に見出される不変部位との接触によって両端で安定化されている。これらの位置のアミノ酸側鎖はＭＨＣ分子のポケットに挿入されてペプチドをＭＨＣ分子に固定する機能を果たすので、アンカー残基という通称で呼ばれている。結合したペプチドは溝に沿った長いコンホメーションで存在する。アンカー残基は一次および二次に分類できる。一次アンカー位置は、比較的明確に定義されたアミノ酸残基セットに高い優先性を示す。二次位置はもっと弱いおよび／またはもっと明確でない優先性を示し、これは、有利というよりもむしろ不利な残基に優先性を示すと記述したほうがしばしば適切である。
【００５６】
さらに、いくつかの二次アンカー位置の残基は必ずしもＭＨＣ分子のポケットに接触するように配置されない。従って、特定のＭＨＣ分子に結合し問題の位置で側鎖ポケット接触を有しているペプチドのサブセットが存在し、また、同じＭＨＣ分子に結合しているがＭＨＣ分子のペプチド結合溝でペプチドが形成するコンホメーションに依存しない結合を示す別のサブセットが存在する。Ｃ−末端残基は好ましくは一次アンカー残基である。より十分に特性決定されたＨＬＡ分子の多くでは（例えば、Ａ２、Ａ６８、Ｂ２７、Ｂ７、Ｂ３５およびＢ５３）、二次位置（Ｐ２）もアンカー残基である。しかしながら、ＨＬＡ−Ｂ８にはＰ３およびＰ５を含む中央アンカー残基も観察された。
【００５７】
アンカー残基は相互作用に配列選択性および結合特異性を付与する。ヒトＨＬＡクラスＩ分子の主要アンカー残基はペプチドの位置２およびＣ−末端に出現する。クラスＩ  ＭＨＣ遺伝子産物の多形性がペプチド結合溝のα１およびα２配列のアミノ酸の違いを生み出す。概して、ペプチドが特定ＭＨＣ分子に結合するためには、ペプチドが定位置に１つ以上の特異的アミノ酸を有している必要があり、この位置は大抵の場合ペプチドの末端または端から二番目のアミノ酸である。一般には、結合が安定なほど免疫原性が改善されるので、類似体の設計には、アンカー残基がそれらの位置にかかわりなく保存または最適化されるのが好ましい。
【００５８】
３．免疫情報科学
背景技術
予防または治療ワクチンの効果的な接種には、免疫応答を増強させる１つ以上のエピトープを含む免疫原性組成物またはワクチンの投与が必要である。従って、Ｔ細胞エピトープを同定するための免疫情報科学的方法の第一段階は、潜在的免疫刺激性のパターンをそうでないパターンから識別することである。ＲｏｔｚｓｃｈｋｅおよびＦａｌｋは、ＭＨＣ分子に結合する既知のペプチドに含まれているアミノ酸のパターンを記述した最初の研究者であると認められている（Ａ．Ｄｅ  Ｇｒｏｏｔら，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００１，１９：４３８５−４３９５）。彼らはこれらのパターンを“ＭＨＣ結合モチーフ”と呼び、特定のＭＨＣ分子に結合する既知のペプチドのアミノ酸配列に存在するモチーフが、ＭＨＣに結合し、Ｔ細胞受容体を引き付け、エフェクターＴ細胞を活性化できる可能性のあるＴ細胞エピトープの同定に使用できると示唆した（Ｆａｌｋ，Ｋ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  １９９１，３５１：２９０−２９６およびＲｏｔｚｓｃｈｋｅ  Ｏ．ら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９１，２１：２８９１−２８９４）。
【００５９】
ＭＨＣ結合モチーフの発見は、エピトープ利用ワクチン設計のプロセスに使用するための適切な生物情報科学的パターン整合（ｍａｔｃｈｉｎｇ）ツールの開発を促進した。最初のＭＨＣ−結合モチーフ利用アルゴリズムは１９９０年代の初期に記載された［Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ，Ｈ．ら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９５，４１：１７８−２２８］。ＭＨＣ結合モチーフは、ペプチド配列中の特定位置に規定の残基が出現することを必要とする。概して、結合モチーフは、制限アミノ酸セットに高い優先性で優性アンカー位置に関する種々のＭＨＣ対立遺伝子のペプチド特異性を決定する。例えば、最も研究の進んだヒトクラスＩ対立遺伝子ＨＬＡ−Ａ＊０２０１はペプチド位置Ｐ２（ロイシンおよびメチオニンを受容）およびＰ９（バリンおよびロイシンを受容）にアンカー残基を有している。
【００６０】
配列利用モチーフが対象ＨＬＡ分子に結合し易い天然出現ペプチドの正しい目録を適正に表してはいないことが明らかになり［Ｂｕｃｈｓｂａｕｍ，Ｓ．ら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００３，５５：１７２−１７６］、ペプチドのＭＨＣ分子結合能は数個のアンカー残基の有無だけでは説明できないと理解されている。概して、結合モチーフに基づくアルゴリズムは、バインダーの６０−７０％だけしかモチーフを含んでいないので予測精度が低い。さらに、モチーフ要件を満たす候補ペプチドの同定にペプチドモチーフを使用したとき、複数の候補エピトープの相互間の順位付けや格付けを行うことができない。従って、モチーフは理解し易いので広く使用されてきたが、二分決定しかできなく、その効用には限りがある。候補ペプチドはバインダーであるか否かとだけ予測される。従って、モチーフ利用選択方法を使用する研究者には実験的検証が必要な膨大な数の候補エピトープが残される。
【００６１】
従来技術のアルゴリズムおよび本文中に開示したアルゴリズムの基礎となる原理は本質的に、ペプチドのＭＨＣ結合親和性が高いほどペプチドがＴ細胞エピトープを表す可能性が高いことである。一般に、行列利用の方法は、ＭＨＣ対立遺伝子へのエピトープの結合強度がペプチドの各アミノ酸の個々の結合力の総和によって与えられると想定する。従って、この方法は基本的に、ペプチドの結合エネルギーが各位置の各アミノ酸の結合エネルギーの総和であると想定する。結合強度は典型的には実験によって、ＩＣ５０値（すなわち、半数の結合部位で基準ペプチドの結合を阻害するペプチドの濃度）またはＭＨＣ／ペプチド複合体の結合の半減期として決定される。
【００６２】
行列は本質的に、ＭＨＣ結合性ペプチドのすべての位置のすべての残基を考察するより精密なモチーフである。種々のＨＬＡ制限のＴ細胞エピトープを予測するプロフィル行列利用の方法は公知であり、例えば、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｕｂｉｎｇｅｎ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ）［Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９９，４８：８９−９７］およびＢＩＭＡＳ（“Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ”，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ  ｂｉｎｄ）［Ｋ．Ｐａｒｋｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９４，１５２：１６３−１７５］がある。
【００６３】
ＳＹＦＰＥＩＴＨＩは、ＭＨＣ結合溝に沿った特定位置のある種のアミノ酸の存在に基づくスコアを提供する。この方法は、天然リガンドのプール配列および単一ペプチド解析に基づく改良モチーフから演繹されたモチーフ行列を使用する。種々のヒトＭＨＣクラスＩ分子に対する推定結合性配列を一次および二次アンカーアミノ酸と有利なおよび不利なアミノ酸との存在に従って格付けする。
【００６４】
ＢＩＭＡＳは、問題のＨＬＡ分子（類）に対する予測結合親和性スコア（すなわち、ＨＬＡ−Ａ２行列の場合、ＭＨＣ／ペプチド複合体の理論的解離半減期）に基づいて潜在的Ｔ細胞エピトープを同定し格付けする。しかしながら、通常はペプチドのリストをそれ以上削減しないので、科学者は以後の研究のエピトープ候補を選択するために予測結合データに頼るしかない。
【００６５】
４．エピトープ同定アルゴリズム
概論
本文中に開示したエピトープ同定アルゴリズム（ＥＩＡ）は、病原性または腫瘍関連標的抗原（類）に由来のペプチドの特定ＭＨＣクラスＩ分子結合親和性を予測するための新規な行列利用方法を提供する。開示した方法は、より効率的なプロセシング、（先天性エピトープに比べて）増進されたＴ細胞への提示、および／または、自己免疫性を誘発し得る標的外免疫応答誘発リスクの減少を特徴とする合成免疫原性類似体含有ワクチンを設計できる追加分析用ツール（例えば、フィルター）を研究者らに提供するので、従来技術のアルゴリズムに追加の利点を与える。
【００６６】
開示した方法およびエピトープ同定アルゴリズム（ＥＩＡ）は、既存の計算ツールに比べて改善されたＴ細胞エピトープ予測能力を開示の選択／最適化プロセスに与えるいくつかの著明な特徴を有している。本文中に開示のように、本発明のＥＩＡは、潜在的Ｔ細胞エピトープ候補のセットを削減するために様々な組合せで使用できる３つの追加段階（フィルター）を記載している。より詳細には本発明は、自己相似性フィルター、免疫増強フィルターおよび天然プロセシングフィルターを提供する。
【００６７】
本文中に開示した結合親和性フィルターは本質的に、従来技術の行列トレーニング方法からいくつかの重要な観点で異なった独特の方法に従って強バインダーを予測するようにトレーニングされたプロファイル行列である（Ｓ．Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９７，２５：３３８９−３４０２）。これらの違いは結合親和性フィルターを記載する項に詳細に説明する。要約すると、われわれは、トレーニングデータに存在する情報をよりよく捕獲するためにデータクラスター化およびベイズ統計学を使用して、すぐれた結合親和性予測モデルを得る。
【００６８】
本文中に開示した結合フィルターは、問題のＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に結合し易いＴ細胞エピトープを予測（例えば、同定）するためのコンピュータにより補助された方法の基礎として使用できる。本発明はまた、細胞プロセシングの損傷が理由でＴ細胞に提示され難い候補Ｔ細胞エピトープを同定し排除するために使用できる天然プロセシングフィルターを提供する。本発明はさらに、開示のコンピュータにより補助された方法に任意に使用できる自己相似性フィルターを提供する。実際、本発明の自己相似性フィルターによって研究者は、標的抗原に唯一的でない候補エピトープを除去できる。付加的観点では本発明はまた、先天性エピトープに比べて増強された免疫応答を誘発する、ＭＨＣクラスＩ制限Ｔ細胞エピトープのアンカー修飾免疫原性類似体の同定方法を提供する。
【００６９】
開示したスコア化行列は、対立遺伝子の結合優先性のすべての様相をコードしており、既知のエピトープの一次／二次アンカー残基の情報内容に限定されない。本文に示したように、開示した方法に基づく予測は実験的研究の結果を報告する公表データと十分な相関関係を有している。従って、開示したアルゴリズムは、対立遺伝子特異的結合モチーフの使用に比べて有意な利点を提供し、また、人的資源および財政的資源を有意に節減できるという利点を有している。
【００７０】
本文中に開示した方法によって同定または最適化された候補Ｔ細胞エピトープは、感染性疾患、癌および自己免疫疾患に有効なワクチンの設計、また、細胞性免疫のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価方法の開発に使用できる。従ってこれらエピトープは、抗原特異的Ｔ細胞免疫応答の誘発を所期の目的とする遺伝子−、ベクター−、ペプチド−、タンパク質−または細胞−ベースの予防用または治療用ワクチンの基剤として独立にまたは組合せて使用し得る。１つの実施態様で、開示したデータ処理システムは、本文中に開示した免疫増強フィルターおよび結合フィルターによって標的抗原の免疫原性を増強し易いとされた１つ以上のアミノ酸置換を組込むように操作した組換え全長タンパク質抗原を設計するために使用できる。代替的実施態様では、開示した方法は、少なくとも１つの標的抗原に由来の１つ以上のエピトープまたは１つ以上の免疫原性類似体を含む合成の多エピトープワクチンを設計するために使用できる。
【００７１】
５．フィルター
結合フィルター
本文中により十分に説明するように、開示した方法は、問題のタンパク質に由来の候補エピトープをＨＬＡクラスＩ対立遺伝子に対する予測結合親和性に基づいて同定し格付けするプロセスに利用できるベイズ補正スコア化行列利用の方法を提供する。本文中に開示した方法を使用し、候補Ｔ細胞エピトープを以下の判断規準に基づいて同定できる：１）問題のＨＬＡ対立遺伝子に対する予測結合親和性、２）標的抗原に対する特異性、３）プロテアソームによって配列が天然プロセシングされる可能性、４）免疫増強修飾の実現性。開示した方法によって研究者らは、標的外自己免疫活性のリスクが最小で防御免疫応答を誘発する治療用および予防用のＴ細胞ワクチンを合理的に設計できる。
【００７２】
１つの実施態様では本発明は、問題の免疫適格タンパク質に存在する候補Ｔ細胞エピトープの全自動優先化用コンピュータ利用方法に関係した結合親和性予測アルゴリズムを利用するデータ処理システムを提供する。結合親和性予測アルゴリズム（ＢＳＭ）トレーニングフェーズは、３つの段階を含む：１）入力データを収集および管理する、２）実験スコア化行列（ＥＳＭ）を計算する、３）ベイズ補正スコア化行列（ＢＳＭ）を計算する。
【００７３】
トレーニングフェーズの入力は複数の公的データベースからプールした強バインダーのセットである。考え方は位置的プロファイルスコア化行列（ＰＳＳＭ）と同様であるが、トレーニングペプチドの配列情報から開示ＥＳＭを計算する方法は有意に違っている。この違いがわれわれのアルゴリズムの性能改善の一因であるとわれわれは考えている。トレーニングフェーズの最終産物がベイズ補正スコア化行列（ＢＳＭ）である。特定理論に制約されることは本意ではないが、ＥＳＭを得るためにトレーニングペプチドの情報内容をどのように使用するかの違いが、従来技術のアルゴリズムの性能に比べて改善されたＴ細胞エピトープ予測精度を開示した方法に与えると考えられる。さらに、この改善された精度が一因となって、開示した方法の性能が従来技術のＴ細胞同定アルゴリズムよりも向上したと考えられる。
【００７４】
従って、開示したアルゴリズムは、ベイズ補正スコア化行列に関係した生物情報科学ツールを提供する。本文中ではこれを結合フィルターとも呼び、トレーニングセットに含まれた配列情報の情報内容に基づいて候補ペプチドの相対的結合親和性を予測するために使用できる。エピトープ選択行列は、問題の単一ＨＬＡ対立遺伝子の結合特異性を集約する。開示したエピトープ選択プロセスは、ペプチドのトレーニングセットを準備できる十分なデータがあるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢまたはＨＬＡ−Ｃから成るグループから選択されたクラスＩ対立遺伝子に対するＨＬＡクラスＩ制限Ｔ細胞を予測するために使用できる。当業者は、対立遺伝子選択が、所与の集団の防御範囲を最大にするという到達目標を原動力として行われること、または、特定のＨＬＡ対立遺伝子と特定の疾病の罹患率または疾病進行過程との間の既知の関連（例えば強直性脊椎炎におけるＨＬＡ−Ｂ２７の存在）に基づいて行われることを理解されるであろう。
【００７５】
１）トレーニングフェーズ
図１は、モデル化された対立遺伝子への強バンイダーである既知の対立遺伝子特異的ペプチドを含むトレーニングペプチドセットの情報内容に基づく特定のＭＨＣ対立遺伝子の結合優先性のモデル化に含まれる段階の概略図である。トレーニングセットに加入させるとして選択されたペプチドのアミノ酸配列に含まれた情報内容およびパターンをエピトープ選択行列（ＥＳＭ）の決定に使用する。次いで得られたＥＳＭを利用して、免疫適格抗原に由来の候補ペプチドを特定ＨＬＡクラスＩ分子への結合能について同定および格付けする。問題の特定ＨＬＡ対立遺伝子に結合する既知のペプチドの結合親和性に関する情報を提供する入力データは公的にアクセス可能なエピトープデータベースから得ることができ、それらの非限定例は、
ＪｅｎＰｅｐ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｅｎｎｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｊｅｎｐｅｐ２／）、
ＭＨＣＢＮ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｔｅｃｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ／ｍｈｃｂｎ／）、および
ＦＩＭＭ（ｈｔｔｐ：／／ｓｄｍｃ．ｌｉｔ．ｏｒｇ．ｓｇ：８０８０／ｆｉｍｍ／）
である。
【００７６】
いくつかの実施態様で、トレーニングセットに加入させるペプチドを選択するために利用されるデータは、アミノ酸配列情報と定量的結合親和性データとの組合せである。別の場合、このデータは、配列情報と文献に報告された知見に基づく定量的結合データとの組合せである。当業者は、公的アクセス可能なデータベースに報告されたＨＬＡバインダーが慣例的に強、中または弱バインダーに分類できることを容易に理解するであろう。これらの分類は、著者の記述に基づくデータベースキュレーターによって行われる。これらのデータベースの大部分のペプチドにはＩＣ５０のような定量的結合情報が欠如していることに注目されたい。さらに、ＩＣ５０値は被験ペプチドに関して測定され被験ペプチドは論文ごとに異なるので、一定のＩＣ５０閾値に基づいて強バインダーを選択することが正しいとは考えられない。従って、データベースキュレーターは、一般に、ペプチドを強、中、弱バインダーまたは非バインダーとして分類するために著者の記述に依存している。この定性的注釈から、例えば問題のＨＬＡ対立遺伝子に対する強バインダーだけをダウンロードすることが可能である。例えば、対立遺伝子ＨＬＡ−Ａ２に対する強バインダーを得ることが可能である。
【００７７】
公的利用可能な情報に基づいて、特定のＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に結合する既知の長さ９または１０アミノ酸の唯一的天然出現ペプチド（それぞれ９および１０量体）
を含むトレーニングセットを同定する。選択した配列を検査し、天然出現ペプチドを表すことを確認する（例えば、配列がペプチド採取ソースである野生型タンパク質に出現することを確認するために、選択した配列を野生型タンパク質に比較する。）。そのソースタンパク質の野生型バージョンに出現しないアミノ酸配列を含むペプチドはトレーニングセットに加えない。このキュレーションプロセスの結果として、確認された“天然出現”配列だけがトレーニングセットに保持される。例えば、問題の特定対立遺伝子についてトレーニングセットに含ませることが可能なトレーニングセットペプチドは、ｈｔｔｐ：／／ｎｐｓａ−ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｎｐｓａ  ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ＝／ＮＰＳＡ／ｎｐｓａ  ｐａｔｔｉｎｐｒｏｔ．ｈｔｍｌでオンライン入手できるパターンサーチツールＰａｔｔｌｎＰｒｏｔを使用しＳｗｉｓｓＰｒｏｔタンパク質データベースの一致ペプチドを探索することによって確認および管理できる。この探索の適正パラメーターは：Ｐｒｏｔｅｉｎ＿Ｄａｔａｂａｓｅ＝‘ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ’；Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ＿Ｌｅｖｅｌ＝１００％である。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔに正確な整合が存在しない場合、ペプチドをトレーニングセットから除去する。得られたトレーニングセットは、問題のＭＨＣ分子に強バインダーであることが確認された（例えば、管理された）天然出現ペプチド配列（例えば、エピトープ）の集団を表す。結合フィルターが最低許容レベルの精度を提供する場合、トレーニングセットは（例えば４０以上の）唯一的ペプチドを少なくとも含むであろう。もっと少数のペプチドを含むトレーニングセットも使用できることを理解されたい。しかしながら、本文に提供したデータに基づくと、約４０よりも少ない（例えば、３７、３８、３９、４０未満）ペプチドを含むトレーニングセットから得られた予測の正当性を信頼できるとは考えられない。
【００７８】
２）実験スコア化行列の計算
以下に定義する実験スコア化行列（ＥＳＭ）は、トレーニングペプチドセットの各位置の２０アミノ酸のおのおのの出現頻度を集約する。本文中に開示し特許請求の範囲に記載した方法から得られたＥＳＭは、２０×９行列である。位置的プロファイルスコア化行列（ＰＳＳＭ）と考え方は似ているが、本発明のＥＳＭをトレーニングセットから計算する方法が有意に違っている［Ｇｒｉｂｓｋｏｖら，ＰＮＡＳ  １９８７，８４：４３５５−８。位置的プロファイルスコア化行列で、Ｐはその（ｉｊ）ｔｈの入力がトレーニングセット中の位置ｊのアミノ酸ｉの出現頻度を含む行列である。言い換えると、
【００７９】
【数１】
2008545180.tif 000003
【００８０】
トレーニングセットが互いに極めて高い配列相似のペプチドを含むとき（ＨＬＡ分子に対する強バインダーでは極めて頻繁に生じる。）、一致アミノ酸がＰＳＳＭに複数回寄与する。これは、ＨＬＡ分子への結合に潜在的に不適格な位置の繰り返しアミノ酸に不釣合いに大きいウェートを与える結果になる。
【００８１】
ＰＳＳＭに固有の制約を回避するために、われわれは、最初に配列相似性に基づいて相似ペプチドをクラスターに集める。典型的には、６５％配列一致をクラスター決定の閾値として使用する。実際には、配列一致の適正閾値は約６０％−約９５％配列一致の範囲である。従って、適正閾値の非限定例は、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％および９５％を含む。次に、各アミノ酸および各位置について、該位置のアミノ酸を含むクラスターの割合を計算する。その結果が実験スコア化行列Ｆである。
【００８２】
数学的に（ｉｊ）ｔｈの入力Ｆは、
【００８３】
【数２】
2008545180.tif 000004
によって与えられる。式中の、ｎ（ｉ，ｊ）は位置ｊのアミノ酸ｉを含むクラスターの数であり、Ｎｊ＝Σｉｎ（ｉ，ｊ）である。ペプチドが１００％配列一致でクラスター化されるとき、等式（２）が１の値に約分できることに注目されたい。本文に開示の実施例１の段階２（ネズミのクラスＩ対立遺伝子Ｈ−２Ｋｄの結合データからのベイズ補正スコア化行列の導出）は、ＥＳＭの計算に使用するためにトレーニングペプチドセットをクラスター化する方法を示している。
【００８４】
トレーニングセットは９量体および１０量体の双方のペプチドを含むであろうから、全部のペプチドの情報内容が１つの２０×９ＥＳＭに適正に集まるように特別に配慮しなければならない。実際、行列の列はトレーニングペプチドの以下の位置を表す：ａ）ＥＳＭの列１−４は９量体および１０量体の位置に対応する；ｂ）ＥＳＭの列５は９量体の位置５および１０量体の位置５または６に対応する；ＥＳＭの列６−９は９量体の６−９および１０量体の７−１０の位置に対応する。
【００８５】
フランキング位置（９量体の１−４および６−９、１０量体の１−４、７−１０の位置）のＥＳＭの値は等式（２）によって計算する。これは、ｉが１−４および６−９のときの値Ｆ（ｉ，ｊ）を与える。
【００８６】
Ｆ（ｉ，５）を計算するために、中央位置（９量体の位置５；１０量体の５および６）を組合せる。
【００８７】
【数３】
2008545180.tif 000005
【００８８】
３）ベイズ補正スコア化行列の計算
各位置のアミノ酸の相対頻度は、われわれの方法で調整されたとはいえ、対応位置のその存在が強いＨＬＡ結合にどの程度必要であるかを示す最適指針とはなり得ない。実際、トレーニングセットの特定位置に頻繁に出現する残基は単に、一般的に高頻度で出現するアミノ酸であるにすぎない。従って、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔのようなタンパク質データベース中の出現頻度によって正規化アミノ酸スコアを調整することが当業界では普通である。
【００８９】
調整したスコア化行列Ｆ’は、ＦをＳｗｉｓｓＰｒｏｔ頻度で正規化することによってスコア化行列Ｆから得られる：
【００９０】
【数４】
2008545180.tif 000006
式中のＳｉは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｓｐｒｏｔ／ｒｅｌｎｏｔｅｓ／ｒｅｌｓｔａｔ．ｈｔｍｌのリストにあるようにＳｗｉｓｓＰｒｏｔのアミノ酸ｉの頻度である。
【００９１】
実験スコアの別の問題は、“過大適合”の問題である。過大適合の一例を以下に挙げる：トレーニングセットの所与の位置で１つのアミノ酸が全く出現しないとき（小さいデータベースセットではよくある。）、対応する位置にこのアミノ酸を有する実際のＴ細胞エピトープが低スコアになり、モデルから誤って排除されるであろう。一般に、過大適合は得られるモデルの精度の低下を意味する。この問題を解決するために、当業界ではしばしば、［Ｓ．Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７，２５：３３８９−３４０２］に記載されているようなｐｓｅｕｄｏ−ｃｏｕｎｔｓを使用して実験スコアを調整する。
【００９２】
開示したＥＳＭがトレーニングセットデータに過大適合する可能性を最小にするために、ベイズ統計学［Ｄ．Ｈｅｃｋｅｒｍａｎ，Ａ  ｔｕｔｏｒｉａｌ  ｏｎ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｂａｙｅｓｉａｎ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ，Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈ  Ｒｅｐ  １９９５，ＭＳＲ−ＴＲ−９５−０６  ｐｐ．２−５］を使用して過大適合の問題とアミノ酸の不等分布との問題を同時にほぼ解決する。
【００９３】
詳細には、各アミノ酸ｉおよび位置ｊについて、
【００９４】
【数５】
2008545180.tif 000007
を計算する。
【００９５】
ここに、Ｆ（ｉ，ｊ）、ＳｉおよびＮｊは前記と同義であり、ｅは観察（実験）頻度と予測（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）頻度との釣合いを調整する単一パラメーターである。ｅ＝０の場合は（３）に対応する。われわれの計算にはｅ＝１０を使用する。
【００９６】
（４）に自然対数を採用すると、ベイズ補正スコア化行列Ｂ、またはＢＳＭが得られる。
【００９７】
【数６】
2008545180.tif 000008
【００９８】
４）結合予測
ＢＳＭの計算後、得られたエピトープスコア化行列を使用し、モデル化されている特定ＨＬＡ対立遺伝子にアミノ酸配列が結合する予測見込みに基づいて候補Ｔ細胞エピトープを同定し格付けする。開示した方法の結合予測段階の結果は、問題のＨＬＡ対立遺伝子に対して強バインダーであると予測されたペプチドの格付け順位リストである。
【００９９】
結合予測方法を図２に概略的に示す。可能なすべての９量体および１０量体ペプチド（殆んどのクラスＩ  ＨＬＡ結合ペプチドは９−１０アミノ酸の長さなのでもっと長いおよびもっと短いフレームは考慮しない。）を標的タンパク質（すなわち、抗原）から導出し、ＢＳＭの値を使用して各候補Ｔ細胞エピトープペプチドの予測結合スコアを計算する。
【０１００】
図３ａおよび３ｂは、それぞれ９量体および１０量体の候補Ｔ細胞エピトープについて結合スコアを計算する方法を示す。要約すると、スコアは以下のように計算する：９量体ａ１．．．ａ９のおのおのでは、そのスコアはＢＳＭの適正入力の単純加算によって得られる：
【０１０１】
【数７】
2008545180.tif 000009
【０１０２】
図３（ａ）では、９量体ペプチドＡＹＣＲＷＧＬＮＬに、表４のＢＳＭに基づくスコアが割当てられている。
【０１０３】
スコア［ＡＹＣＲＷＧＬＮＬ］
＝Ｂ（Ａ，１）＋Ｂ（Ｙ，２）＋Ｂ（Ｃ，３）＋Ｂ（Ｒ，４）＋Ｂ（Ｗ，５）＋Ｂ（Ｇ，６）＋Ｂ（Ｌ，７）＋Ｂ（Ｎ，８）＋Ｂ（Ｌ，９）
＝０．１７＋２．５０−１．１０−０．０３−１．１０−０．２１−０．３８＋０．６５  ＋１．６５＝２．１５。
【０１０４】
１０量体ａ１．．．ａ１０のおのおのでは、そのスコアは８つのフランキングアミノ酸との２つの中間位置のスコアの平均との加算によって得られる：
【０１０５】
【数８】
2008545180.tif 000010
【０１０６】
図３（ｂ）では、１０量体ペプチドＡＹＣＲＷＴＧＬＮＬに、同じ表４のＢＳＭに基づくスコアが割当てられている。
【０１０７】
スコア［ＡＹＣＲＷＴＧＬＮＬ］
＝Ｂ（Ａ，１）＋Ｂ（Ｙ，２）＋Ｂ（Ｃ，３）＋Ｂ（Ｒ，４）＋｛Ｂ（Ｗ，５）＋Ｂ（Ｔ，５）｝／２＋Ｂ（Ｇ，６）＋Ｂ（Ｌ，７）＋Ｂ（Ｎ，８）＋Ｂ（Ｌ，９）
＝０．１７＋２．５０−１．１０−０．０３＋｛−１．１０−０．０６｝／２−０．２１−０．３８＋０．６５＋１．６５＝２．６７。
【０１０８】
実際には、上述の結合フィルターの適用によりそれらのＢＳＭスコアによって格付けされた９量体および１０量体エピトープ候補のリストを作成する。所与のスコアに対応する百分位数はその下のスコアを有するランダム出現ペプチドの割合である。概して、９５番目の百分位数以上のスコアによって特性決定されるペプチドは強バインダーと考えられる。それらの結合スコアまたはそれらの百分位数によって順位付けされたペプチドが同一のエピトープ候補格付けリストを生じることに注目されたい。
【０１０９】
天然プロセシングフィルター
クラスＩ  ＭＨＣ分子に結合する前に、タンパク質抗原は“プロセス”される。これは、ペプチドフラグメントを生成するためにタンパク質が限定タンパク質分解的に開裂処理されることを意味する。プロテアソームはクラスＩ経路のための抗原プロセシングを行う。ＨＬＡクラスＩ制限Ｔ細胞エピトープは完全タンパク質のプロテアソーム開裂次いで得られたフラグメントのＥＲ常在アミノペプチダーゼによるＮ−末端切除によって作製される（Ｈ．Ｓｎｙｄｅｒら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９４，１８０：２３８９−２３９４）。プロテアソームによって効率的に開裂されないペプチドまたは不適切に切除されたペプチドは、細胞表面に搬出されない。抗原提示細胞の細胞表面提示がＴ細胞による認識の先要条件であるから、提示が不十分になり易いペプチドはエピトープ利用ワクチンに含ませる亜最適候補である。エピトープワクチンは典型的には高いＭＨＣ結合親和性および明確な免疫原性をもつ１つ以上のエピトープを含むように設計されるので、エピトーププロセシング効率はワクチン効力の発揮を支配する可変項である。従って、エピトープのプロセシングおよび提示の効率は多エピトープワクチン設計の極めて重要な一面である。
【０１１０】
従って、本発明の別の目的は、細胞プロセシングの損傷が理由でＴ細胞に提示され難いペプチドを同定しふるい落とすために上述の結合親和性フィルターと併用できる天然プロセシングフィルターを提供することである。個々のＣＴＬエピトープの側面にある特定アミノ酸がタンパク質分解性開裂に対する抗原の感受性を変質させることは公知である。本文中に開示したフイルターは、候補エピトープの側面残基について細胞表面提示が減少傾向であることを示すと考えられる数種類のアミノ酸モチーフの１つの存在を探索することによって作製した。ＨＬＡ分子に関係した細胞表面提示はＴ細胞による認識の先要条件なので、これらの妨害モチーフの１つ以上を所有しているペプチドはエピトープ利用ワクチンに加入させる亜最適候補である。
【０１１１】
天然プロセスされたペプチドである可能性が低いペプチド配列を同定するために、統計技術を使用して、ペプチドのＮ−末端に存在するときにプロセスされる可能性が低いことに関連した指標モチーフを決定する。この情報を使用して、１つ以上のこれらの指標モチーフの存在に基づいて潜在的Ｔ細胞エピトープをスクリーニングできる“天然プロセシングフィルター”を設計した。
【０１１２】
天然プロセシングフィルターのトレーニング段階を図１ｃに示す。要約すると、１）天然プロセスされたクラスＩ制限Ｔ細胞エピトープを、起原（ウイルス、細菌、哺乳類、など）、長さおよびクラスＩ対立遺伝子特異性にかかわりなく、上記のエピトープデータベースから抽出した；２）Ｎ−末端（位置Ｐ１’）およびＮ−末端の左側の３つの連続位置（Ｐ３−Ｐ１）の各アミノ酸の出現頻度を取得した；３）各位置の各アミノ酸について、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ中のこのアミノ酸の出現頻度に基づく統計的検査を実行した；４）有意性検定から得られたｐ−値を１６０倍することによって多数試験に補正した（各位置のアミノ酸あたり２回の試験）。
【０１１３】
例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ中のプロリンの頻度は０．０４９である。従って、７０４ペプチド中で所与のいずれかの位置に平均で７０４×０．０４９＝３３のプロリンを予測できる。このデータセット中のＰ１のプロリンの実際の数は実質的にもっと少なく、７である。可能な７０９のアミノ酸から７以下のプロリンを観察する確率は平均０．０４９およびＮ＝７０９の二項分布の部分和によって与えられる。すなわち、２．２×１０８である。これは二項検定の片側ｐ値である。低いｐ値は、ペプチドのＰ１のプロリンの存在が天然プロセシングの減少傾向に関連することを示す。
【０１１４】
この手順に基づき、われわれは、０．０１レベルで統計的に有意なＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正ｐ値をもつ３つのアミノ酸／位置の組み合わせを同定した。３つ全部が天然プロセシングの減少傾向に関連していた。組合せは：（１）Ｎ−末端のプロリン（ｐ＜１０−１０）；（２）Ｎ−末端のロイシン（ｐ＜１０−４）および（３）Ｎ−末端の直前位置のプロリン（（ｐ＜１０−５）。従って、開示したコンピュータにより補助された方法は場合によっては、Ｐ１またはＰ１’にプロリンまたはＰ１’にロイシンをもつときは候補エピトープを排除する、というルールに基づいて天然プロセシングフィルターを運用するように修正できる。
【０１１５】
自己相似性フィルター
ベイズ補正スコア化行列は、潜在的Ｔ細胞エピトープとして同定されたペプチドのリストを作成する。結合フィルターによって同定されたペプチドのあるものは他のヒトタンパク質のフラグメントに一致するかまたは高度に相似である。言い換えると、ペプチドのあるものは標的タンパク質に唯一的でない。われわれは、他の非標的タンパク質のフラグメントに一致するかまたは高度に相似であるペプチドを“自己相似ペプチド”と呼ぶ。例えば、問題のタンパク質が腫瘍関連抗原ならば、そのフラグメントのあるものは他の自己タンパク質中に出現するであろう。
【０１１６】
ペプチド配列に関して、“配列一致”という用語はまた、比較窓の２つのペプチド配列が（アミノ酸対アミノ酸対応で）一致することを意味する。アミノ酸配列一致のパーセンテージ（またはアミノ酸配列相似のパーセンテージ）は同様に、最適位置合せした２つのアミノ酸配列の比較窓を比較し、双方のアミノ酸配列で一致アミノ酸残基が出現する位置の数を測定して整合位置の数を得る。整合位置の数を比較窓の位置の総数で除算し、その結果に１００を乗算して配列一致のパーセンテージ（または配列相似のパーセンテージ）を計算する。“パーセント一致”、“パーセント一致の”、“配列一致のパーセンテージ”および“パーセント配列一致”という用語は互換的に使用されている。
【０１１７】
比較的短い配列（約３０残基未満）の位置合せおよび比較は通常は簡単であり、比較的短いアミノ酸配列間の一致は目視検査によって容易に決定できる。より長い配列の比較には２つの配列の最適位置合せを得るためにより複雑な方法が必要である。適正アルゴリズムによる分析は典型的には、通常はより長い配列間の一致を決定するために使用されるコンピュータソフトウェアによって促進される。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験配列および参照配列は典型的にはコンピュータの入力であり、必要ならばサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次に配列比較アルゴリズムが指定されたプログラムパラメメーターに基づいて参照配列に対する被験配列（類）のパーセント配列一致を計算する。２つ以上の配列間の最適位置合せを迅速に達成し一致を計算する複数の数学的アルゴリズムが公知であり、複数の可用なソフトウェアプログラムに組込まれている。このようなプログラムの例は、アミノ酸配列解析用のＭＡＴＣＨ−ＢＯＸ；ＭＵＬＴＡＩＮ，ＧＣＧ，ＦＡＳＴＡおよびＲＯＢＵＳＴプログラム、ヌクレオチド配列用のＳＥＶＩ，ＧＡＰ，ＮＡＰ，ＬＡＰ２，ＧＡＰ２およびＰＩＰＭＡＫＥＲプログラムである。アミノ酸および配列解析用の適切なソフトウェア解析プログラムは、ＡＬＩＧＮ，ＣＬＵＳＴＡＬＷ（およびＢＬＡＳＴプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ  ２．１，ＢＬ２ＳＥＱおよびそれらの最新バージョン）を含む。
【０１１８】
ワクチン組成物中に先天性形態の自己相似ペプチドを含ませると、標的外自己免疫応答を誘発するリスクがある。例えば、免疫治療後のメラノサイトまたは膵島β−細胞のＴ細胞性破壊を報告する公表論文は、非標的抗原に対する自己相似性が原因で標的外タンパク質に望まない自己免疫応答を誘導するペプチドを使用した望ましくない結果の例を示している［Ｖａｎ  Ｅｌｓａｓら，Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９９，１９０：３５５］［  Ｌｕｄｅｗｉｇら，７．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０００，１９１：７９５−８０４］。開示した自己相似性フィルターを使用することによって研究者は、遺伝子−、タンパク質−、ベクター−または細胞基剤の癌ワクチンの成分として標的抗原に唯一的でないペプチドを使用するリスクに伴う安全上の懸念を解決できる。
【０１１９】
また、多くの自己タンパク質中に出現するペプチド配列（例えば、エピトープ）が特異的Ｔ細胞の欠失または失活をいっそう誘導し易く、従って細胞性免疫応答の誘発に有効でなくなることも認められている。Ｔ細胞のエデュケーション（ｅｄｕｃａｔｉｏｎ）およびクローン欠失という結果が、保存された自己相似エピトープを同定し、提案した免疫原性組成物からこれを除去する第二の理由を提供する。
【０１２０】
本文中に示したように、本発明の自己相似性フィルターは、結合フィルターの使用から得られた候補エピトープのリストから自己相似エピトープを同定し除去するために使用できる。実際には、候補エピトープのリストの９量体および１０量体ペプチドのおのおの（“照会ペプチド”）を全ヒトゲノムに適合させる。１つのフラグメントは、別のヒトタンパク質が照会ペプチドに一致するならば、または、最高で２アミノ酸だけ違っており後者の場合にミスマッチがＭＨＣアンカー残基（すなわち、残基２および９または１０）に限定されているフラグメントを含むならば自己相似であると考えられる。
【０１２１】
所与のペプチドが自己相似であるか否かは、公的に入手可能ないくつかのツールを用いてこのペプチドをタンパク質データベースに照会することによって同定できる。このようなツールの非限定例は以下を含む：（ａ）ＰＡＴＴＩＮＰＲＯＴ（ｈｔｔｐ：／／ｎｐｓａ−ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｎｐｓａ  ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ  ｐａｔｔｉｎｐｒｏｔｈｔｍｌ）、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔタンパク質データベース内部の整合を見出すソフトウェアツール；および、（ｂ）ＢＬＡＳＴｐ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｒｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｐｒｏｄｕｃｔｔａｂｌｅ．ｓｈｔｍｌｔｆｂｅｇｉｎ）、これは、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔに加えて“ｎｒ”および“ｒｅｆｓｅｑ”のような複数のデータベースを探索できる。
【０１２２】
免疫原性増強フィルター
本文中に使用した２０種類の慣用アミノ酸およびそれらの略号は従来の慣用に従う。本文中に使用した“アミノ酸”という用語は、天然に出現する２０種類のアミノ酸およびｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳後に修飾されたアミノ酸例えばヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンやその他の珍しいアミノ酸、非限定的に２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノル−バリン、ノル−ロイシンおよびオルニチンを含むことを理解されたい。さらに、“アミノ酸”という用語は、Ｄ−およびＬ−アミノ酸の双方を含む。
【０１２３】
天然に出現する２０種類のアミノ酸は共通側鎖特性に基づいて普通は６クラスＩ分類される：１）疎水性：ノルロイシン（Ｎｏｒ）、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。保存性アミノ酸置換は、これらのクラスのうちの１つの構成員と同クラスの別の構成員との交換を含む。非保存性置換は、これらのクラスのうちの１つの構成員と別のクラスの構成員との交換を含む。このような交換を行わせるときは、いくつかの実施態様ではアミノ酸の疎水親水指数が考慮されるであろう。タンパク質に相互作用性生物機能を与えるためにアミノ酸の疎水親水指数が重要であることは当業界で理解されている（参照：例えば、Ｋｙｔｅら，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３１）。ある種のアミノ酸が同様の疎水親水指数またはスコアを有している別のアミノ酸に置換して同様の生物活性を維持できることは知られている。疎水親水指数に基づいて変換するとき、いくつかの実施態様では、疎水親水指数が＋−２以内のアミノ酸の置換が含まれる。いくつかの実施態様では、＋−１以内のアミノ酸の置換が含まれる。また、いくつかの実施態様では、＋−０．５以内のアミノ酸の置換が含まれる。
【０１２４】
各アミノ酸にはその疎水性および電荷特性値に基づく疎水親水指数が割当てられている。これらは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）である。
【０１２５】
また、特に置換によって創出される生物機能性タンパク質またはペプチドの所期用途が本文中に開示したような免疫的な実施態様である場合、親水性に基づいた同様のアミノ酸の効果的な置換が可能であることは当業界で理解されている。いくつかの実施態様では、隣接アミノ酸の親水性に左右される１つのタンパク質の最大局部的平均親水性は免疫原性および抗原性、すなわち、該タンパク質の生物特性と相関関係を有している。当業者は、公知の指針および技術を使用して候補Ｔ細胞エピトープの適切な変異体を決定できるであろう。
【０１２６】
アンカー位置（ペプチドの位置２およびＣ−末端位置）で修飾されたＨＬＡ  クラスＩバインダーはＨＬＡ分子への結合が改善されているのでしばしば野生型ペプチドよりも免疫原性であることは公知である（Ｇ．Ｌｉｐｆｏｒｄら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９５，８４：２９８−３０３）。また、突然変異がＴ細胞受容体に接触しない残基に限定されているので、修飾ペプチドに特異的なＴ細胞は一般に野生型ペプチドも認識する。この知識に基づいて、われわれは、アンカー位置のペプチド／ＭＨＣ結合相互作用を最適化する置換／突然変異を含むアンカー修飾類似体を同定するための免疫原性増強フィルターを本発明の一部として導入する。
【０１２７】
実際には、本発明の免疫増強フィルターは、問題のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子に結合すると予測され本発明の自己相似性フィルターを通過した候補Ｔ細胞エピトープのアンカー残基（典型的にはＨＬＡクラスＩ対立遺伝子アンカー位置の位置２およびＣ−末端位置）の２０種類の天然出現アミノ酸のおのおのの置換効果を評価するために使用される。実際、各アンカー位置にアミノ酸置換を導入した効果は各類似体の予測結合親和性に基づいて評価される。提案された置換は順次に（すなわち、各位置で一回に１個）評価される。分析の過程で各アンカー残基の２つの位置のおのおのに２０種類の各アミノ酸を置換して一回に１個ずつ評価する。置換含有ペプチド（例えば、推定免疫原性類似体）の結合スコアを上述の結合親和性フィルター（すなわち、ベイズ補正スコア化行列）を使用して計算し、親ペプチドの予測結合スコアに比較する。一般的に、最高スコアのペプチドを免疫原性類似体として選択する。提案された置換／交換のいずれもが親ペプチドの結合スコアよりも高い結合スコアを有していると予測されないならば、類似体は示唆されない。
【０１２８】
実際には、開示した免疫増強フィルターは、Ｔ細胞エピトープ候補の免疫原性を改善するためにそれらのアンカー残基内部の置換を同定するために使用できる。１つの実施態様では、本発明のこの特徴は、腫瘍関連抗原のような自己タンパク質由来の抗原に由来するエピトープの免疫原性を増強するために使用できる。腫瘍関連抗原は多くの場合、ＴＣＲ集団の中枢および末梢の寛容効果があるので亜最適ＭＨＣ親和性であるという特性を有しており、一般には免疫原性に乏しいと考えられる。従って、効果的な癌ワクチンを設計するためには、推定クラスＩ制限腫瘍関連抗原の免疫原性を増強することが必要であろう。当業者は、標的抗原に交差反応性の免疫応答を誘発できる免疫原性類似体の使用は弱い免疫原性の自己エピトープの使用よりも好ましいことを認めるであろう。
【０１２９】
コンピュータハードウェアおよびソフトウェア
標的タンパク質中のＴ細胞エピトープ予測方法におけるコンピュータの必要な段階は、（ａ）キーボード、ディスケットまたはテープなどの入力デバイスから、モデル化した特定のＨＬＡ対立遺伝子に結合する既知のペプチドのトレーニングセットに関係した情報を利用するベイズ補正スコア化行列を計算するために使用できるデータを入力する段階と、（ｂ）プロセッサを使用し、スコア化行列の値に基づいて標的タンパク質に由来の各候補Ｔ細胞エピトープの結合スコアを決定する段階とを最小限含む。
【０１３０】
本文中に記載の発明は、コンピュータハードウェアまたはソフトウェアまたは双方の併用によって実行できる。概して、本文中に記載のエピトープ同定アルゴリズムの様々な実施態様は、コンピュータ読取り可能なフォームで命令を提供するコンピュータプログラムを使用して遂行できる。例えば本発明は、おのおのが１つのプロセッサと少なくとも１つの入力デバイスとを含む１つ以上のプログラマブルコンピュータで１つ以上のコンピュータプログラムを実行することによって実施できる。コンピュータは好ましくはまた、データ記憶システム（揮発性および不揮発性メモリおよび／または記憶素子）と少なくとも１つの出力デバイスとを含む。
【０１３１】
上述の機能を実行し出力情報を作成するためにプログラムコードを入力データに適用する。出力情報は公知の方式で１つ以上の出力デバイスに適用される。コンピュータは例えば、パーソナルコンピュータ、マイクロコンピュータ、または、慣用の設計の作業端末でよい。当業者は、コンピュータ読取り可能フォーマットで命令を与えるために様々なタイプのコンピュータ言語を使用できることを容易に認識する。例えば、適切なコンピュータプログラムは、Ｍａｔｌａｂ、Ｓ＋、Ｃ／Ｃ＋＋、ＦＯＲＴＲＡＮ、ＰＥＲＬ、ＨＴＭＬ、ＪＡＶＡ（登録商標）、ＵＮＩＸ（登録商標）、または、ＣシェルスクリプトなどのＬＩＮＵＸシェルコマンド言語のような様々な言語およびこれらの言語の種々の派生言語で書込みできる。コンピュータシステムと交信するために各プログラムが高レベルの手続き型または目的向きプログラミング言語で実行されるのが好ましい。しかしながら所望ならばプログラムをアセンブリ言語または機械言語で実行してもよい。いずれの場合にも、言語を翻訳済みまたは解釈済みの言語にできる。
【０１３２】
各コンピュータプログラムは好ましくは、汎用または特殊目的プログラマブルコンピュータによる読取りが可能な記憶媒体またはデバイス（例えば、ＲＯＭまたは磁気ディスケット）に格納される。コンピュータプログラムは、プログラムがコンピュータによって読取られたときに本文中に記載の手続きを実行するようにコンピュータを構成し動作させる機能を果たす。本発明の方法はまた、コンピュータプログラムで構成されたコンピュータで読取り可能な記憶媒体によって実施できる。その場合、このように構成された記憶媒体が、予定した特定の方式で本文中に記載の機能を実行するようにコンピュータを動作させる。
【０１３３】
本文中に記載のアルゴリズムを実施するプログラムを実行するために様々なタイプのコンピュータを使用できる。例えば、開示したアルゴリズムを使用してＴ細胞エピトープを予測するコンピュータプログラムは、十分な記憶および処理容量を有しているコンピュータで実行できる。適当なコンピュータの一例は、２００ＭＨＺ以上のＩｎｔｅｌ  Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）主体のプロセッサを有しており６４ＭＢのメインメモリをもつコンピュータである。同等の優れたコンピュータシステムが当業界で公知である。
【０１３４】
様々なタイプのコンピュータに標準オペレーティングシステムを使用できる。Ｉｎｔｅｌ  Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）主体のプロセッサ用オペレーティングシステムの例は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）の種類、例えば、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ＮＴ、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ＸＰ、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ２０００およびＬＩＮＵＸを含む。Ｍａｃｉｎｔｏｓｈコンピュータ用オペレーティングシステムの例は、ＯＳＸ、ＵＮＩＸ（登録商標）およびＬＩＮＵＸオペレーティングシステムである。他のコンピュータおよびオペレーティングシステムが当業界で公知である。本発明の様々な特徴を示す本文中に提示したデータは、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ＸＰオペレーティングシステムで動作する５１２Ｍｂのｒａｍをもつ６００ＭＨｚのＩｎｔｅｌ−ｂａｓｅｄコンピュータにＭａｔｌａｂプログラミング言語で書き込まれたソフトウェアを使用して作成した。
【０１３５】
本文中に記載したアルゴリズムの具体的使用にどのフィルターを使用するかに従って、得られるデータは様々なフォーマットで提示できる。この方法はさらに、モニター、プリンタまたは他の出力デバイスに出力する段階を含み得る。加えて、データ記憶システムに格納されたＴ細胞エピトープのコンピュータデータベースにデータを比較できる。例えば、データをリスト、テーブルまたは図形フォーマットで提示できる。１つの実施態様ではデータを予測結合スコアの順に格付けされた候補ペプチドのリストとして提示できる。代替実施態様ではデータをスクリーンに映写またはプリンタに印刷したタンパク質内部のエピトープに下線を付ける、すなわち別の手段で強調することによって提示できる。
【０１３６】
標的タンパク質の特定セットに由来のペプチドを使用して本発明を説明してきたが、本発明が本文中に例示した抗原の使用に限定されないことを理解されたい。より詳細には、本発明は、外来および自己抗原の双方の抗原からＭＨＣクラスＩ結合エピトープを同定するために開示したアルゴリズムを使用することを考察する。適当な標的抗原は、哺乳類宿主に感染する多様な種類の病原物質（非限定例はウイルス、寄生虫、細菌および真菌類）または癌もしくは腫瘍細胞から得られる。例えば、本発明のエピトープ同定アルゴリズムが、１つの感染性物質に特異的な細胞性免疫応答を誘発する目的の免疫原性組成物（例えばワクチン）中に使用するエピトープを選択するために使用される場合、病原体由来タンパク質に由来のペプチド配列（例えば９量体および１０量体）を利用するのが適切である。
【０１３７】
１つの実施態様では、ワクチン使用に選択された１つ以上のエピトープが、結合親和性フィルターによって特定のＨＬＡ対立遺伝子に結合し易いと予測された天然出現ペプチドを表す。本発明の天然プロセシングフィルターは場合によっては、所期宿主の細胞プロテアーゼによってプロセスされ易いエピトープを含むペプチド配列を設計するために、エピトープ選択行列と併用できる。
【０１３８】
１つの代替的観点によれば、ワクチン使用に選択されたエピトープは、実施例８に記載したように、本発明の最適化フィルターと本発明のエピトープ選択行列との併用によって得られたデータに基づいて最適化された天然出現ペプチドの免疫原性類似体でもよい。より詳細には、免疫原性組成物の使用に選択された類似体がアンカー修飾類似体を表してもよい。
【０１３９】
１つの観点よれば、本発明は、病原体特異的免疫応答を誘導するように設計されたワクチンに使用するのに適したペプチド配列を同定するために使用できるエピトープ同定／最適化方法を提供する。例えば、１つの用途では、ヒトおよび／またはヒト以外の動物種に感染するウイルスに対する免疫応答を誘発するのが望まれる。予防的および／または治療的免疫応答が望まれるウイルスファミリーの例は、アフトウイルス、カルジオウイルス、エンテロウイルス、ヘパトウイルス、パレコウイルス、ライノウイルスのような異なる６つの属を含むピコナウイルス科である。免疫応答が望まれるピコナウイルスの例は、口蹄疫ウイルス、脳心筋炎ウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、ヒト肝炎Ａウイルス、ヒトパレコウイルス、ライノウイルスである。カルシウイルス科は、ノーウォークウイルス群によって発症するヒトの表皮性胃腸炎に関連する種々の属、および、ウサギ出血性疾患ウイルスに関連するウサギの出血性疾患またはネコカルシウイルスによって発症する呼吸器疾患のような動物の他の症候群に関連する属を含む。
【０１４０】
免疫応答の誘発が望まれる別のウイルスファミリーは、ヒトおよび異なる多くの動物種から単離されたウイルスを含むアストロウイルス属である。ヒトアストロウイルスは胃腸炎および幼児の下痢に関連する。あるいは、アルファウイルスおよびルビウイルスという２つの属を含むトガウイルス科の構成員に対する免疫を哺乳類宿主に与えることが望まれる。アルファウイルスは、関節炎（すなわち、チクングンヤ・ウイルス、シンドビス・ウイルス）または脳炎（すなわち、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス、西部ウマ脳脊髄炎ウイルス）のようなヒトおよび動物の疾患に関連する。
【０１４１】
風疹ウイルスは、発熱およびリンパ腺症に関連する軽症発疹性疾患の発症の原因であるルビウイルス属の唯一構成員である。また、妊娠初期母体の風疹ウイルス感染は胎児の奇形に関連する。フラビウイルス科は３つの属、フラビウイルス、ペスティウイルスおよびヘパシウイルスから成る別のウイルスファミリーであり、ヒトおよび動物の重大な病原体を含む。フラビウイルス属の構成員の多くは、発熱、脳炎および出血熱を含む様々な疾患を生じさせる節足動物媒介のヒト病原体である。デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルスは世界的規模でまたは局地的に（風土病）懸念される病原体である。ペスティウイルス属は、ウシの下痢症ウイルス、古典的ブタ熱ウイルス、国境病ウイルスのような経済的に重要な主要動物の病原体である。Ｃ型肝炎ウイルスは急性および慢性肝炎の原因となるヘパシウイルス属の唯一構成員である。組換えアデノウイルスによって発現されたＨＣＶタンパク質は、世界で１７億の人々を冒すウイルス感染後の問題を減らす防御または治療免疫応答を誘発できる。
【０１４２】
あるいは、コロナウイルス科の構成員に由来のタンパク質について、特定のＭＨＣクラスＩ分子に結合すると予測されるエピトープの存在を分析できる。例えば、重篤な急性呼吸症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ−Ｃｏウイルス）は、１つ以上のＳＡＲＳ−ＣｏＶタンパク質エピトープを含む多エピトープワクチンで免疫感作することによって防御できる。ＳＡＲＳ−ＣｏＶタンパク質エピトープの非限定例は、ヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質、ポリメラーゼ（Ｐ）タンパク質、膜（Ｍ）糖タンパク質、スパイク（Ｓ）糖タンパク質、小エンベロープ（Ｅ）タンパク質、または、ウイルスによって発現された他のポリペプチドのいずれかから得られた天然出現または最適化ペプチドである。狂犬病ウイルスを含むラブドウイルス科の構成員は、ウイルスタンパク質を発現する組換えワクチンの標的となり得る。
【０１４３】
他の可能な標的は、重篤な出血性発熱の原因であるエボラ様ウイルスおよびマールブルク様ウイルス属を含むフィロウイルス科；最も流行性のウイルス、例えば、ヒトの麻疹ウイルス、呼吸性合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、および、ニューカッスル病ウイルスおよび牛疫ウイルスのような獣医学的に重要なウイルスのいくつかを含むパラミクソウイルス科；インフルエンザＡ、Ｂ、Ｃウイルスを含むオルトミクソウイルス科；主として節足動物によって脊椎動物宿主に伝搬され、リフトバレー熱、Ｓｉｎ  Ｎｏｍｂｒｅ、Ｈａｎｔａａｎ、Ｐｕｕｍａｌａウイルスのような重大なヒトの病原体を含むブンヤウイルス科；リンパ球性脈絡髄膜炎、ラッサ熱、アルゼンチン出血熱、ボリビア出血熱ウイルスを含むアレナウイルス科；主としてウマおよびヒツジの中枢神経系疾患を生じるボルナウイルス科；世界中の小児および幼児の重篤な下痢性疾患の最大原因となるロタウイルス、ヒトおよび他の哺乳動物の双方を冒すオルビウイルス（青舌病ウイルス、動物の流行性出血病ウイルス）を含むレオウイルス科；ヒト免疫不全ウイルス１型および２型（ＨＴＶ−１およびＨＴＶ−２）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型および２型（ＨＴＬＶ  １および２）のような重要なヒト病原体や、ヒト以外のレンチウイルス、例えば、ヒツジおよびヤギに感染するマエディ／ビスナウイルス、ウマに感染するウマ感染性貧血ウイルス、ウシに感染するウシ免疫不全ウイルス、ネコに感染するネコ免疫不全ウイルスを含むウイルスの大グループであるレトロウイルス科；小ＤＮＡ発癌性ウイルスのグループで、基本型ウイルスはポリオーマとマウスおよびアカゲザルに感染するＳＶ４０（ＳＶ４０に極めて近いＢＫおよびＪＣウイルスがヒト患者から単離された）であるポリオーマウイルス科；ヒトを含む高等脊椎動物に感染してイボおよびコンジローマの原因になるＤＮＡウイルスのグループから成るパピローマウイルス科を含む。パピローマウイルス感染はヒトおよび動物の双方で癌の発症に関連する。ヒトのパピローマウイルスは子宮頸癌、膣癌および皮膚癌に関連する。ヘルペスウイルス科は、ヒトおよび他の哺乳類の多くの重要な病原体に分類されるサブファミリーを含む。好適な抗原ソースの非限定例は、単純ヘルペスウイルス１型および２型、水痘・帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バールウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス６Ａ、６Ｂおよび７、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスである。別の好適な抗原ソースは、ポックスウイルス科の構成員、例えば、サル痘ウイルス、伝染性軟疣ウイルス、天然痘ウイルス；ヘパドナウイルス科の基本型構成員であるＢ型肝炎ウイルス、ならびに、デルタ肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルスのような急性および／または慢性肝炎を発症させる他のウイルスである。
【０１４４】
本発明のエピトープ予測アルゴリズムはまた、細菌、真菌、寄生病原体のような非ウイルス病原体によって発現されるタンパク質に対するヒトまたは動物の免疫応答を誘導し易いアミノ酸配列の同定に適している。例えば、本文中に開示したアルゴリズムは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｅｒｉａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびｌｅｐｒａｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓおよびＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｆｉｌａを非限定例とする非ウイルス病原体に対して免疫を与えるように設計されたワクチンに使用するエピトープの同定に使用できる。予防用または治療用ワクチンの製造が望まれる真菌類および哺乳動物寄生虫の例は、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ  ｃｒｕｚｉおよびｂｒｕｃｅｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ、ｍａｎｓｏｎｉおよびｊａｐｏｎｉｃｕｍ；Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、および、ヒトのフィラリア症の原因であることが判明している多くのＦｉｌａｒｉａ種を含む。
【０１４５】
癌は典型的には、細胞周期の維持または細胞増殖の調節に寄与するポリペプチド（例えば、成長因子、癌遺伝子、受容体および腫瘍サプレッサー）をコードする遺伝子の調節異常を含む。癌に関与する多くの遺伝子の産物は多様な種類の腫瘍細胞の表面に発現される。ＴおよびＢリンパ球によって認識される様々な腫瘍抗原がヒトおよび動物の癌で同定された。抗癌ワクチン治験に使用するための適当なヒト腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の大多数は、腫瘍細胞に発現されることに加えて正常組織および／または胎児発生中にも発現されるので“自己抗原”と記述される。多くの癌ワクチンの無効が立証された理由は、ＴＡＡに対する標的集団の免疫寛容によると説明できる。
【０１４６】
従って、本発明のエピトープ同定アルゴリズムを癌ワクチン用エピトープの選択に使用するならば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）のような異常に発現された自己抗原を表すタンパク質から適正アミノ酸配列を得ることができる。異常自己抗原に由来のペプチド配列の場合、適正配列は、ＴＡＡへの宿主寛容を破壊するため、および、発癌または腫瘍進行を十分に防止する長期間持続（例えば記憶）応答を誘発するために十分な免疫応答を誘発できるエピトープを含んでいた。
【０１４７】
本発明に有利に使用できると知見された腫瘍関連抗原は一般に、癌遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子、および、腫瘍細胞特有の突然変異または再編成を生じた他の遺伝子のタンパク質産物、再活性化胚遺伝子産物（例えば、癌胎児性抗原）、組織特異的分化抗原、成長因子受容体、細胞表面糖質残基、外来ウイルスタンパク質および多数の他の自己タンパク質から選択され得る。
【０１４８】
腫瘍抗原は、正常細胞遺伝子の発癌性突然変異体、変質した原癌遺伝子または腫瘍サプレッサー遺伝子によって産生される。Ｒａｓ、ｐ５３またはＢｃｒ−Ａｂｌタンパク質は、Ｔ／Ｂ細胞応答を刺激できる変質細胞タンパク質の例である。腫瘍抗原は腫瘍細胞中で過剰発現されている正常細胞タンパク質（チロシナーゼ、ＧＰ１００、ＭＡＲＴは、メラノサイト中で低レベル発現され、メラノーマ中で過剰発現されている。）であるか、または、腫瘍細胞中で異常発現されている正常細胞タンパク質（ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥは、メラノーマおよび多くの癌腫で発現されるが、正常には精巣および胎盤で発現される。）である。腫瘍抗原が発癌ウイルスの産物のこともある：パピローマウイルスＥ６およびＥ７タンパク質は子宮頸癌によって発現される；ＥＢＶ  ＥＢＮＡ−１タンパク質はＥＢＶ＋リンパ腫および鼻咽喉癌腫によって発現される；ＳＶ４０  Ｔ抗原はＳＶ４０誘導実験腫瘍中で発現される。癌胎児性抗原は癌細胞および正常発生組織（胎児）で高レベルに発現されるが成人組織では発現されない。癌胚性抗原（ＣＥＡ）およびアルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）は十分に特性決定された癌胎児性抗原の例である。
【０１４９】
最近の証拠は、免疫応答を誘発できるＴＡＡが存在し、このクラスの抗原をワクチン治療に適した免疫原とする考え方を支持する。しかしながら抗原のクラスとしてＴＡＡは著しく劣った免疫原であり、ＴＡＡに高度に特異的なＴ細胞はＴ細胞発生中に欠失するかまたは無感作になる。従って、腫瘍のある宿主の特定ＴＡＡに対する免疫応答は極度に弱いと予想される。標的ＴＡＡに対する宿主寛容を破壊することが本来的に必要なので、実験用臨床ワクチンの研究は特に、ＴＡＡ特異的Ｔ細胞応答を増強する免疫戦略の開発に焦点を絞っている。
【０１５０】
概して、有効な癌ワクチンは、免疫寛容を克服しまた宿主の免疫応答を予防および／または防御のレベルに増強しなければならない。多くの実験用ワクチン試験で抗腫瘍効果はＴＡＡに対するＴ細胞応答と相関関係を有していた。癌ワクチンは予防にも治療にも使用できる。癌ワクチンの予防的使用の根拠は、ＴＡＡが極めて弱い免疫原であるかまたは腫瘍患者の体内で機能的に免疫原性でないという一般的仮説である。
【０１５１】
代替実施態様では、本発明は、腫瘍抗原に対する免疫応答を誘導するように設計された免疫原性組成物（例えば癌ワクチン）に使用するペプチド配列を選択するために開示したエピトープ同定アルゴリズムを使用することを考察する。有効な癌ワクチンの開発には、ワクチン接種患者体内で能動免疫感作の終了後に存続する抗原特異的免疫性を誘発する戦略を見極める必要がある。戦略の成功は、測定可能な標的抗原指向性免疫応答が癌の出現または再発の防御に相関関係を示すか否かにかかっている。
【０１５２】
特に重要な目標抗原は、免疫原性に乏しいかまたは免疫原性でない腫瘍に由来の自己タンパク質である。これらは免疫応答を惹起する適切な抗原刺激を提供することができないので特別な抗原投与法を用いる。これらの場合、例えば組織特異的分化抗原のような正常および癌性の双方の組織に共通の自己抗原を標的にできる。本発明のこの目的によれば、抗原に対する免疫寛容を破壊し、自己抗原を発現しているＴ細胞に対する自己反応性末梢Ｔ細胞応答を刺激するために腫瘍関連自己抗原調製物を含む癌ワクチンを患者に投与する。本発明のこの目的の特定実施態様では、本発明の結合フィルターを、本文中に開示し特許請求の範囲に記載した天然プロセシングフィルター、自己相似性フィルターおよび免疫原性増強フィルターと併用するのが有利であろう。
【０１５３】
実験系から得られたデータは、抗原特異的Ｔ細胞は腫瘍細胞を除去するための最も強力な免疫メカニズムであることを示唆する。エフェクターＴ細胞による腫瘍特異的抗原（例えば、ＴＡＡ類）の認識がＴＡＡを排除腫瘍抗原として機能させていると予測される。公表された研究は、最適な腫瘍クリアランスを達成するためにＣＤ８＋およびＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞応答の刺激が重要であると示唆している（Ｐ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９１，４９：２８１−３５５；Ｄ．Ｐａｒｄｏｌｌら，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８，１０：５８８−９４）。臨床応答（すなわち、効力）はインターフェロンγを分泌する細胞障害性Ｔ細胞の増加に呼応していた。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのようなアッセイの出現によって研究者らはワクチン接種レジメンに対するＴ細胞応答を測定できるようになり、これによって癌ワクチンの開発が促された。
【０１５４】
より詳細には、癌免疫学の分野では癌患者の免疫治療としてワクチンを使用できる。従って、癌ワクチンは、先存の腫瘍または悪性腫瘍によって発現されているＴＡＡを指向する免疫応答を誘発するように設計できる。従って特定実施態様では、治療用癌ワクチンは、従来の治療レジメンに耐性が生じた腫瘍患者または従来の治療後の再発の確率が高い腫瘍患者に使用することを意図する。
【０１５５】
癌ワクチンに使用するための適当なＴＡＡはいくつかの特性を有していなければならない。例えば、標的ＴＡＡは有利な発現プロファイルを有していなければならない。これは、標的ＴＡＡが正常組織に比べて腫瘍または悪性組織で優先的に発現または過剰発現しなければならないことを意味する。さらに、腫瘍形成に１つの役割を果たすＴＡＡは癌進行の種々の段階中に維持され易いので、適正な標的ＴＡＡもまた腫瘍の進行および転移中に維持されなければならない。適正な標的ＴＡＡはまた、腫瘍内部全体に均質に発現されなければならない。第三に、適正な標的ＴＡＡは絶対的免疫寛容の対象になってはならない。より詳細には、問題のＴＡＡを認識し応答できるＴ細胞が宿主のＴ細胞集団から完全に除去されていないという何らかの証拠が必要である（Ｎ．Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００２，２０：２１９７−２２０７）。
【０１５６】
開示したエピトープ同定アルゴリズムはまた、特定のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子に極めて結合し易いと予測されるＴＡＡ由来ペプチド配列を同定するために使用できる。１つの実施態様では、候補エピトープ配列は、標的ＭＨＣ分子への強い結合を表す結合スコアを有すると判定された天然出現アミノ酸配列である。代替実施態様では、結合フィルター（すなわち、エピトープ選択行列）によって同定された一連の候補エピトープセットは、本発明の自己相似性フィルターを任意に結合フィルターと併用することによってさらに分類できる。本発明の自己相似性フィルターを使用すると研究者らは、他の自己タンパク質との交差反応性免疫応答を誘発する可能性が低いと予測される候補エピトープを選択できる。別の代替実施態様では、癌ワクチン用に選択されたエピトープは、本発明の最適化フィルターを使用して得られるデータに基づいてペプチドの免疫原性増強が予測されるように最適化されている、天然出現ペプチドの免疫原性類似体でもよい。上述のように、本文中に開示した最適化フィルターは、単独使用でもよく、または、本発明の自己相似性フィルターおよび／または天然プロセシングフィルターと併用してもよい。
【０１５７】
癌胚性抗原（ＣＥＡ）は、抗癌ワクチン用の標的抗原として好適なＴＡＡとなり得る多くの特徴を有している。該抗原は有利な発現パターンを特徴とするＩｇスーパーファミリーの構成員である。該抗原はヒトのすべての癌の５０％以上で発現されており、腫瘍形成プロセスに関与している。これは、その発現が癌進行過程で選択され保存される得ることを意味する。さらに、ＣＥＡに対する免疫寛容が絶対ではないことが立証された。公表された研究は、ヒトＴ細胞が、ＣＥＡを発現する癌細胞を認識し、癌細胞に対して活性化され、癌細胞を溶解することを確証する（Ｎ．Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００２，２０：２１９７−２２０７）。例えば、組換えワクシニアウイルス発現ＣＥＡによる患者の免疫感作は、以後のペプチド利用のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激と組合せると、自家腫瘍を溶解できるＣＤ８＋  ＭＨＣ−制限ＣＴＬを生成した（Ｋ．Ｔｓａｎｇら，Ｊ  Ｎａｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  １９９５，８７：９８２−９９０）。あるいは、外科手術後の結直腸癌患者を組換えＣＥＡで免疫感作すると、組換えＣＥＡに対する弱い抗体および細胞性免疫が誘導されると報告された（Ａ．Ｓａｍａｎｃｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  １９９８，４７：１３１−１４２）。さらに、結直腸癌と診断された患者に抗ＣＥＡ抗イディオタイプ抗体を投与すると、抗ＣＥＡ抗体およびイディオタイプ特異的Ｔ細胞増殖が生じた（Ｌ．Ｆｏｏｎら．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９５，９６：３３４−３４２）。該文献はまた、癌患者のＣＥＡ寛容が、異なるいくつかのワクチン（すなわち、組換えＣＥＡまたは組換えオルトポックスもしくはアビポックス−ＣＥＡウイルスによるワクチン接種、抗イディオタイプ抗体の投与、ＣＥＡアゴニストエピトープによる樹状細胞のパルス化）接種方法で克服できることを示している。
【０１５８】
ＣＥＡは、正常胎児の結腸で発現され、正常結腸粘膜ではるかに低度に発現される癌胎児性糖タンパク質である。ＣＥＡはまた、大多数の腺癌、特に、結腸、膵臓、乳房、肺、直腸および胃の腺癌に過剰発現される。多くの結直腸癌およびいくつかの癌腫は、血清中で測定可能な高レベルでＣＥＡを産生し、従ってＣＥＡは特に結直腸癌の患者で最も広く使用される血清学的悪性腫瘍マーカーになっている。
【０１５９】
多エピトープ癌ワクチン用に選択できる候補エピトープのソースになる適正な標的抗原を提供する第二のＴＡＡは、ＨＥＲ２／ｅｒｂ−２（ｎｅｕとも呼ぶ）原癌遺伝子の産物である。ＨＥＲ２／ｎｅｕはＣＥＡと同様に、有利な発現パターンを有しており、絶対的寛容の対象でない。より詳細には、ＨＥＲ２／ｎｅｕ転写物の低レベル発現および１８５ｋＤポリペプチド産物は、健常成人の皮膚および乳房を含む種々の組織、胃腸、生殖器および尿道の組織の上皮細胞で検出される。胚発生中の対応する胎児組織ではもっと高いレベルの発現が検出される（Ｐｒｅｓｓら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５：９５３−９６２（１９９０）。いくつかの系列の証拠が、ＨＥＲ−２の増幅とヒトの乳房、肺、前立腺、卵巣、子宮および結直腸腫瘍の新生物形質転換とのつながりを示唆している（Ｄｉｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｅｖｅｒ，Ａｄｖ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７１：３４３−３７１（１９９７）。概して、ＨＥＲ２／ｎｅｕの過剰発現は癌患者の思わしくない予後およびより高い再発率に相関関係を有している（Ｓｌａｍｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：７０７−７１２（１９８９）。従って、ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質に特異的なワクチンは、多くの様々なヒト悪性腫瘍の疾患再発の予防に広い用途および有用性を有し得る。
【０１６０】
ＨＥＲ２／ｎｅｕは、固有チロシンキナーゼ活性を有しており上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体に広汎な相同性を示すトランスメンブラン糖タンパク質をコードしている（Ａｋｉｙａｍａ，Ｔら，（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：１６４４−１６４６）。ＨＥＲ２を癌免疫治療の標的として使用した最初の臨床試験の１つでは、乳癌の治療にＨＥＲ２特異的モノクローナル抗体Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎを使用した（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ＭＭ（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．２１：３０９−３１８）。これが、有効な抗腫瘍応答を誘発するために免疫系のＴ細胞アームの標的としてＨＥＲ２を使用することに焦点を絞った以後の研究につながり、これには、自家抗原提示細胞を活性化するためにＨＥＲ２ドメインを含む組換え融合タンパク質を使用することが含まれる。公表された研究は、ｎｅｕ−発現乳癌および卵巣癌に罹っている多数の癌患者の体内でＨＥＲ２／ｎｅｕ癌遺伝子のタンパク質産物に対する免疫応答が増強される（例えば、抗原特異的抗体およびＴ細胞が産生される）ことを立証している。
【０１６１】
実際に、本発明のエピトープ同定アルゴリズムは、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＥＡ、Ｈｅｐｃａｍ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、テロメラーゼ、ｇｐ１００、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、Ｍｕｃ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ストロメライシン３、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ３、ＣＭＬ６８、ＣＭＬ６６、ＯＹ−ＴＥＳ−１、ＳＳＸ−２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２、ＳＡＲＴ−３、ＮＹ−ＣＯ−５８、ＮＹ−ＢＲ−６２、ｈＫＬＰ２、ＶＥＧＦのような自己抗原の組合せに由来のエピトープを含み得る多エピトープ癌ワクチンを設計するために使用できる。癌ワクチンに使用するのに適した標的である追加の自己抗原は当業者に公知であり、発現クローニングのような当業界に公知の方法によって同定でき、既知の分布の所定抗原に対する免疫感作を可能にし、より焦点を絞った免疫応答を提供する。
【０１６２】
開示した方法によって科学者は、ワクチン候補から他のヒトタンパク質のフラグメントに一致するかまたは高度に相似であるフラグメントを選択的に修飾しおよび／または欠失させることによって標的外自己免疫活性の可能性が最小の微生物または腫瘍ワクチンを設計できる。本発明を使用して同定された候補細胞エピトープは、感染性疾患または癌を治療しまたは予防するための遺伝子に基づく、タンパク質に基づく、ベクターに基づくまたは細胞に基づくの免疫原性組成物の部分として使用できる。同定されたＴ細胞エピトープはまた、ワクチン候補によって誘導される細胞性免疫応答をモニターし評価するアッセイの一部として使用できる。例えば、エピトープまたは天然出現エピトープの最適化類似体は、予測Ｔ細胞エピトープを含むエピトープワクチンによる免疫感作の前後に個体から採取したリンパ球を使用する標的特異的細胞性免疫を測定するための確立されたｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの基礎として使用できる。
【０１６３】
本発明はまた、Ｔ細胞に対するより効率的なプロセシングおよび／またはＴ細胞でのより効率的な提示による、より強力な細胞性免疫応答を誘発する能力を有する類似体を与え得る既知または予測Ｔ細胞エピトープの修飾を同定する分析方法を提供する。遺伝子に基づく、タンパク質に基づく、ベクターに基づくまたは細胞に基づく免疫原性組成物に関係した免疫増強によって同定された類似体の使用は、標的抗原に交差反応性の（非修飾野生型エピトープに比べて）増強された免疫応答を誘発できると考えられる。例えば、開示した免疫増強フィルターと対立遺伝子特異的結合フィルターとの併用によって得られたデータは、免疫原性Ｔ細胞エピトープのｉｎ  ｖｉｖｏでの生成をもたらすと予測される、１つ以上のアミノ酸置換を組込んでいる組換え全長免疫増強標的抗原を設計するために使用できる。
【０１６４】
本文中に記載のアルゴリズムによって同定され、場合によって最適化された候補Ｔ細胞エピトープは、“ストリングオブビーズ”（“ｓｔｒｉｎｇ−ｏｆ−ｂｅａｄｓ”）としてエピトープをコードするミニジーンに関係した遺伝子ワクチンに組込むことができる。複数の研究機関が、ネズミＭＨＣ分子によって制限されるＣＴＬおよびＢ細胞免疫応答を誘導するために１１個という多数のエピトープをコードする構築物の使用を記述した報告を公表した。多エピトープミニジーンをコードするミニジーンを含む発現構築物は、精製ＤＮＡの注射（例えば、静脈内または皮内）により、組換えアデノウイルスまたはワクシニア感染によりｉｎ  ｖｉｖｏ送達できる。
【０１６５】
多数のエピトープを同時に指向する広い免疫応答を誘導できるワクチンの設計では、複数の重大な疾患に有効なワクチンの開発を考えることが重要である。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のような突然変異によって宿主の免疫応答を巧妙に逃れる病原体に対しては、高度に保存された多数のエピトープに対する活発なＣＴＬ応答の誘導に到達できるワクチンを設計するのが有利である。
【０１６６】
多エピトープワクチンの最も簡単な設計は、一連のエピトープがスペーサー配列を介在なしで互いに連結している“ビーズオブストリング”設計である。多エピトープワクチンのプロセス効率は、レシピエントの天然プロセシング経路によって容易に生成するように設計されたスペーサー残基の使用によって最適化できることが認められている。免疫原性組成物に含ませるように選択されたエピトープは、同じまたは異なる病原体または腫瘍細胞の多重標的タンパク質に由来し得、ＣＴＬ認識を逃れるように適合された突然変異の結果として発生した既知または予測された複数のエピトープ変異体を包含するように選択し得る。
【０１６７】
次第に数を増す実験的証拠は、多エピトープを同時送達できる多くの異なる方法が可能であることを示している。多エピトープワクチンの好ましい投与手段は、１つまたは多数のエピトープを含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むミニジーン構築物を利用することである。多エピトープミニジーンの使用は後述するが、例えば、Ａｎ，Ｌ．ａｎｄ  Ｗｈｉｔｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２２９２，１９９７；  Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｓ．Ａ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：８２２，１９９６；Ｗｈｉｔｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３４８，１９９３；Ｈａｎｋｅ，Ｒ．ら，Ｖａｃｃｉｎｅ  １６：４２６，１９９８に記載されている。例えば、ＨＢＶおよびＨＴＶのポリメラーゼ、エンベロープおよびコアタンパク質、ＰＡＤＲＥ．ＴＭ．ＵｎｉｖｅｒｓａｌヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）エピトープ、および、ＥＲ−転座シグナル配列に由来の９個の優性ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−およびＡ１１−制限エピトープをコードする多エピトープＤＮＡプラスミドが作製された。概して、ミニジーンを設計するときの主目的は、選択Ｔ細胞エピトープを内包する可能な最小ペプチドを作製することである。
【０１６８】
例えば、ヒト細胞中で発現するように選択したエピトープ（ミニジーン）をコードするＤＮＡ配列を創製するために、エピトープのアミノ酸配列を逆翻訳する。各アミノ酸コドン選択の手引きとしてヒトコドン利用表を使用できる。これらのエピトープコードＤＮＡ配列を、翻訳されたときに連続ポリペプチド配列が創製されるように直接的に連結する。発現および／または免疫原性を最適化するために、追加エレメントをミニジーン設計に組込んでもよい。逆翻訳されてミニジーン配列に含まれるアミノ酸配列の例は、ＨＬＡクラスＩエピトープ、ＨＬＡクラスＩＩエピトープ、ユビキチン化シグナル配列、リーダー配列、および／または、小胞体ターゲッティングシグナルを含む。さらに、ＣＴＬおよびＨＴＬエピトープのＨＬＡ提示は、ＣＴＬまたはＨＴＬエピトープに隣接の合成（例えば、ポリ−アラニン）または天然出現フランキング配列を含ませることによって改善され得る。
【０１６９】
標的細胞中の発現を確保するために当業者に公知の標準調節配列をベクターに含ませるのが好ましい。数種類の望ましいベクターエレメントが存在する：下流にミニジーン挿入用クローニング部位を有するプロモーター；効率的転写終結用ポリアデニル化シグナル；大腸菌複製起点；および大腸菌選択可能マーカー（例えば、アンピシリン耐性またはカナマイシン耐性）。この目的で多くのプロモーター、例えばヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターを使用できる。他の適当なプロモーター配列に関しては例えばＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，５８０，８５９および５，５８９，４６６を参照するとよい。
【０１７０】
ミニジーン配列は、ミニジーンのプラス鎖およびマイナス鎖をコードするオリゴヌクレオチドの組立によってＤＮＡに変換できる。重なり合っているオリゴヌクレオチド（３０−１００塩基の長さ）を公知の技術を使用して適正条件下で合成し、リン酸化し、精製し、アニーリングする。オリゴヌクレオチドの両端は、例えばＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用して連結できる。エピトープポリペプチドをコードしているこの合成ミニジーンを次に所望の発現ベクターにクローニングする。
【０１７１】
ミニジーンの発現および免疫原性を最適化するために追加のベクター修飾が望ましい。いくつかの場合、効率的な遺伝子発現にはイントロンが必要であり、１つ以上の合成または天然出現イントロンをミニジーンの被転写領域に組込む。ミニジーン発現を増進するためにｍＲＮＡ安定化配列および哺乳類細胞中の複製配列を組込むことも考察できる。さらに、免疫刺激配列（ＩＳＳ類またはＣｐＧ類）はＤＮＡワクチンの免疫原性に１つの役割を果たすと考えられる。これらの配列は、免疫原性の増強を望む場合にはミニジーンコーデイング配列外部でベクターに組込む。
【０１７２】
発現ベクターの選択後、ミニジーンをプロモーター下流のポリリンカー領域にクローニングする。このプラスミドで適正な大腸菌株を形質転換し、標準技術を使用してＤＮＡを調製する。ミニジーンの配向およびＤＮＡ配列とベクターに組込んだ他の全エレメントを制限地図作製およびＤＮＡ配列解析を使用して確認する。正しいプラスミドを担持する細菌細胞をマスター細胞バンクおよび作動細胞バンクとして保存する。
【０１７３】
標的細胞感作はミニジーンにコードされたＣＴＬエピトープの発現およびＨＬＡクラスＩ提示をそれぞれ検定する機能アッセイとして使用できる。例えば、標準ＣＴＬクロム放出アッセイの適当な標的となる哺乳類細胞系にプラスミドＤＮＡを導入する。使用されるトランスフェクション法は最終配合物に依存する。“ネーキッド（ｎａｋｅｄ）”ＤＮＡには電気穿孔を使用でき、カチオン性脂質は直接のｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質移入が可能である。蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現しているプラスミドを共形質移入すると、形質移入細胞を富化できる。次にこれらの細胞をクロム−５１（５１Ｃｒ）標識し、エピトープ特異的ＣＴＬ系の標的細胞として使用する。５１Ｃｒ放出によって検出された細胞溶解はミニジーンにコードされたＣＴＬエピトープのＨＬＡ提示が生じたことを示す。
【０１７４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫原性はミニジーンＤＮＡ配合物を機能試験する第二の手段である。適正なヒトＨＬＡタンパク質を発現しているトランスジェニックマウスをＤＮＡ産物で免疫感作する。用量および投与経路は配合物に従属する（例えばＰＢＳ中のＤＮＡはＩＭ、脂質複合体形態のＤＮＡはＩＰ）。免疫感作の２１日後、脾細胞を採取し、各被験エピトープをコードするペプチドの存在下で１週間再刺激する。ＣＴＬエフェクター細胞の場合、アッセイは、標準技術を使用し、ペプチド負荷したクロム−５１標識標的細胞の細胞溶解を検定する。ミニジーンにコードされたエピトープに対応するペプチドのＨＬＡ負荷によって感作された標的細胞の溶解が、ＣＴＬのｉｎ  ｖｉｖｏ誘導に関するＤＮＡワクチンの機能を証明する。
【０１７５】
精製プラスミドＤＮＡは、多様な配合物を使用して注射用に調製できる。これらのうちで最も簡単な形態は、滅菌リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）による凍結乾燥ＤＮＡの復元である。“ネーキッドＤＮＡ”（“ｎａｋｅｄ  ＤＮＡ”）として知られたこの方法は臨床治験の筋肉内（ＩＭ）投与に現用されている。ミニジーンＤＮＡワクチンの免疫治療効果を最大にするためには代替的な精製プラミスドＤＮＡの配合方法が望ましい。様々な方法が記載されており、新しい技術も利用可能になるであろう。カチオン性脂質も配合物に使用できる（参照：例えばＷＯ  ９３／２４６４０；Ｍａｎｎｉｎｏ  ＆  Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６（７）：６８２（１９８８）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，２７９，８３３；ＷＯ  ９１／０６３０９；およびＦｅｉｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３（１９８７）の記載）。さらに、糖脂質、紡錘体形成（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）リポソーム、ペプチド、および、防御的、相互作用的、非縮合的（ＰＩＮＣ）と総称される化合物も安定性、筋肉内分散性または特定器官または細胞種への輸送性などの変動要素を左右するために精製プラスミドＤＮＡと複合体を形成できる。あるいは、例えばＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，２０４，２５３に記載されているような弾道デリバリーを使用して核酸を投与することもできる。この技術を使用すると、ＤＮＡだけから成る粒子が投与される。別の代替実施態様では、ＤＮＡを金粒子のような粒子に付着させる。
【０１７６】
ワクチン開発の対象となる病原体または細胞標的の種類次第では、単一ミニジーン構築物中で高親和性および低親和性の双方のＭＨＣクラスＩバインダーであると予測される複数のエピトープを組合せるのが有利であろう。様々な結合親和性をもつことが判っている複数の優性エピトープを含む標的抗原に関してはこの配慮が特に適切であろう。免疫原性組成物に含ませるために選択されたエピトープのセットを、天然プロセシング、免疫原性、唯一性（例えば、他の自己抗原との相似性の欠如）、集団包含範囲、および、予測される疾患適性について最適化する。
【０１７７】
当業者は、提案された多エピトープワクチンの効力を評価するための適当なｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの免疫原性アッセイを容易に同定し確立できる。例えば、ＨＬＡトランスジェニックマウスは、本文中に記載したエピトープ同定アルゴリズムで同定したエピトープに基づく組成物の免疫原性を評価するために使用できる。
【０１７８】
本発明の様々な特徴をさらに説明するために実施例を以下に示す。実施例はまた、本発明の実施に有用な方法を説明する。これらの実施例が特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定する意図はないことを理解されたい。
【０１７９】
当業者に公知のいかなる適当な材料および／または方法も本発明の実施に利用できる。しかしながら、好ましい材料および／または方法を記載する。以下の実施例で言及した材料、試薬などは、異なる注釈がないならば市販ソースから得ることができる。トレーニングセットおよび候補Ｔ細胞エピトープの構築に使用したペプチドに関する配列情報は公的利用できるデータベースから取得した。当業者は、本文中の記載に基づいて本発明を十分に利用できると考えられる。本願に引用したすべての参考（参照文献、許諾特許、公開特許出願、同時係属特許出願）の記載内容全部は参考によって明示して本発明に含ませる。
【実施例１】
【０１８０】
ネズミのクラスＩ分子Ｈ−２Ｋｄの結合データからのベイズ補正スコア化行列の導出
この実施例は、ネズミのＭＨＣクラスＩ対立遺伝子Ｈ−２Ｋｄのベイズ補正スコア化行列を導出するために開示の本発明の方法をどのように使用するかを説明する。
【０１８１】
段階１：Ｈ−２Ｋｄに対する強バインダーの同定
２００５年１月３０日現在の時点で、Ｈ−２Ｋｄに対して５１の唯一的強バインダーが上記エピトープデータベース（Ｊｅｎｐｅｐ、ＭＨＣＢＮおよびＦＴＭＭ）から入手可能である。３つのデータベースのおのおののオプション“Ｒｅｐｏｒｔ  ｓｔｒｏｎｇ  ｂｉｎｄｅｒｓ  ｔｏ  Ｈ−２Ｋｄ”を選択することによってペプチドを入手した。同定したペプチドを表１に挙げる（それぞれ配列９０−９９（８量体）、配列１−３８（９および１０量体）および配列１００（１１量体）、配列１０１（１２量体）および配列１０２（１３量体））。強バインダーのうちの３８ペプチドが９量体および１０量体（配列１−３８）であり、これらを以後の解析用に保留した。データベースに報告された他の１３のペプチドは９アミノ酸残基よりも短いか（配列９０−９９）または１０残基よりも長かったので（１００−１０２）、トレーニングセットから除去した。
【０１８２】
【表１】
2008545180.tif 000011
【０１８３】
段階２：選択ペプチドのクラスター
このデータを６５％配列一致の閾値でクラスター化すると、異なる２０のクラスターが得られる。ペプチドおよびそれらの割当てクラスターを表２にまとめる。
【０１８４】
【表２】
2008545180.tif 000012
【０１８５】
段階３：実験スコア化関数の計算
公式（２）を使用して実験スコア化関数Ｆを計算する。より詳細には、各位置の各アミノ酸について、該位置にアミノ酸を含むクラスターの割合を計算した。これらの計算から得られた実験スコア化関数Ｆを表３に示す。
【０１８６】
【表３】
2008545180.tif 000013
【０１８７】
（２）に示した実験スコア化関数公式と当業界で標準の“出現頻度”法（１）との違いを説明するために、位置３のロイシン（Ｌ）の出現について考察する。Ｌはこのデータセットの３８ペプチド中に９回出現する。従って、その出現頻度は９／３８、すなわち２４．７％である。しかしながら、位置３のロイシンの出現はいずれも、高度に相似のペプチドから構成された単一クラスター（＃１７）に関係していることに注目されたい。（２）を使用すると位置３のロイシンの実験スコアは１／２０、すなわち５％である。クラスター１７のペプチドは単一ペプチドに由来し、従ってロイシンの一回の出現に関する証拠を構成するだけであるから、標準法は位置３のロイシンのＫｄの優先性を５倍も誇張する。
【０１８８】
段階４：ベイズ補正スコア化行列の計算
公式（４）を使用してＦ（実験スコア化関数）からベイズ補正スコア化行列を計算し、表４に示す。
【０１８９】
【表４】
2008545180.tif 000014
【実施例２】
【０１９０】
候補ペプチドをスコア化するためのベイズ補正スコア化行列の使用
段階１：標的タンパク質の候補ペプチドの決定
可能な９量体および１０量体フレーム全部（クラスＩのＨＬＡ分子に対する殆んどのバインダーが９−１０の長さをもつのでより長いおよびより短いフレームは考察しない。）を問題の標的タンパク質のアミノ酸配列からｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで決定する。
【０１９１】
段階２：候補ペプチドのスコア化および格付け
以下のようなＢＳＭを使用して各フラグメントをスコア化する。
【０１９２】
各９量体ａ１．．．ａ９については、ＢＳＭの適正入力の単なる加算によってそのスコアが得られる：
【０１９３】
【数９】
2008545180.tif 000015
【０１９４】
各１０量体については、８つのフランキングアミノ酸のスコアと中央の２つの位置のスコアの平均とを加算することによってそのスコアが得られる：
【０１９５】
【数１０】
2008545180.tif 000016
【０１９６】
結合親和性フィルターの出力は、それらのスコアによって格付けされた９量体および１０量体のペプチドフラグメントのリストである。
【実施例３】
【０１９７】
ＨＣＶ−１中のＴ細胞エピトープの発見
本発明に記載の結合親和性フィルターの妥当性検査のために、［Ｐ．Ｓｃｏｇｎａｍｉｇｌｉｏら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９，１６２：６６８１−６６８９］から発表されたＨＣＶウイルス由来の１２のＡ２制限エピトープを入手した。各エピトープのＨＬＡ−Ａ２に対する結合親和性を放射性標識プローブペプチドに対する標準競合的阻害アッセイで測定した（プロトルの詳細は上記参考文献参照）。エピトープ（それぞれ配列３９−５０）およびそのＩＣ５０値を表５に示す。
【０１９８】
【表５】
2008545180.tif 000017
【０１９９】
これとは別に、実施例１および結合親和性フィルターの項に記載したデータ抽出および計算のプロトコル（エピトープデータベースの選択、強バインダーの選択基準、クラスター化閾値、などを含む。）に従って、２８９の唯一的天然出現強バインダーのセットから、ＨＬＡ−Ａ２のベイズ補正スコア化行列を導出した。得られたＨＬＡ−Ａ２ベイズ補正スコア化行列を表６に示す。
【０２００】
【表６】
2008545180.tif 000018
【０２０１】
実施例２に記載のプロトコルおよび開示したスコア化技術に従って、表５に挙げた１２のＨＣＶエピトープ（配列３９−５０）および表６に与えたベイズ補正ＨＬＡ−Ａ２スコア化行列を使用し、表７に挙げた１２のＨＣＶエピトープについて結合スコアおよび百分位数を決定した。百分位数はスコアｘに対応する。１１／１２のＨＣＶエピトープが９５％の無作為作成ペプチドよりも高いスコアを有していた。
【０２０２】
【表７】
2008545180.tif 000019
【０２０３】
概して、最も高い百分位数の範囲にスコアをもつペプチドを強バインダーと考える。スコアまたは百分位数のカットオフ値の選択は通常、結合親和性および／または免疫原性を決定するために続行される実験の容量次第である。例えば、当業者は９５ｔｈの百分位数以上（または、９０ｔｈの百分位数以上）の範囲の全部のペプチドを候補エピトープとして選択し得る。
【実施例４】
【０２０４】
ＨＩＶ−１中のＴ細胞エピトープ発見
別の妥当性検査実験として、われわれは、表６のＨＬＡ−Ａ２ベイズ補正スコア化行列を使用し、ＬＡＮＬ  ＨＴＶ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙデータベース［Ｂｅｔｔｅ  Ｔ．Ｍら，Ｅｄｓ，ＨＩＶ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００２，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ，Ｎｅｗ  Ｍｅｘｉｃｏ．ＬＡ−ＵＲ  ０３−５８１６］（ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ｉｎｄｅｘ）から探し出した１８の公表Ａ２−制限ＨＩＶ−１エピトープ（それぞれ配列５１−６８）をスコア化した。該エピトープおよびそれらのスコアと百分位数を表８に示す。公表された１８のＨＬＡ−Ａ２−制限ＨＩＶ−１エピトープのうちの１４のエピトープのスコアが全ペプチドの上位５％に入っていることが判明する。
【０２０５】
【表８】
2008545180.tif 000020
【実施例５】
【０２０６】
自己相似性フィルターは標的抗原に唯一的でないペプチドを同定するために使用できる。
【０２０７】
位置５４を起点とする前立腺特異的抗原ＰＳＡ（ＰＳＡ．５４と呼ぶ）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ０７２８８）（配列７０）のフラグメントを表す候補ペプチドＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡ（配列６９）はＨＬＡクラスＩ対立遺伝子Ａ＊０２０１に結合すると予測される。開示した結合フィルターは、該ペプチドが２．４６という結合スコア（百分位数＝９８．４９％）を有することを示す。しかしながら、開示した自己相似性フィルターの使用から得られる情報は、該ペプチドが標的抗原に唯一的でなく、その結果として、免疫原性組成物に使用できると考えるべきでないことを示す。実際、自己相似性フィルターの項で言及した探索ツールのいずれかを使用するＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースの探索は、ヒトタンパク質トリプターゼデルタ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｑ９ＢＺＪ３）（配列７２）の位置６３を起点とする９量体フラグメント（トリプターゼデルタ６３）（配列７１）が、ＭＨＣ接触位置である位置２以外はＰＳＡ．５４に一致することを示す。
【０２０８】
ＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡ  ＰＳＡ．５４
ＬＩＨＰＱＷＶＬＴＡ  トリプターゼデルタ６３。
【０２０９】
従って、開示した自己相似性フィルターを結合フィルターと併用すると、研究者は、Ａ＊０２０１に強い結合が予測されるにもかかわらずＰＳＡ．５４を前立腺癌ワクチンに使用する候補Ｔ細胞エピトープから除外できる。
【実施例６】
【０２１０】
細胞性プロセシングの損傷が理由でＴ細胞に提示され難いＴ細胞エピトープを同定するための天然プロセシングフィルターの使用
エプスタイン・バールウイルスの２つのフラグメント（すなわち、ペプチド）、ＥＢＮＡ３Ｃ．８８１（ＱＰＲＡＰＩＲＰＩ）（配列７３）およびＥＢＮＡ３Ａ．３７９（ＲＰＰＩＦＩＲＲＬ）（配列７４）は双方とも、位置２にプロリン、Ｃ−末端に脂肪族アミノ酸を含む典型的なＨＬＡ−Ｂ７結合モチーフを有している。本発明の結合フィルターは、ＨＬＡ−Ｂ７の結合スコアをＥＢＮＡ  ３Ｃペプチドに対して２．０８およびＥＢＮＡ  ３Ａペプチドに対して１．９３と予測する。しかしながら、２つのペプチドに対するＰＢＭＣ−由来ＣＴＬの反応性を測定するＥＬＩＳＰＯＴアッセイで作成されたデータに基づくと、ＥＢＮＡ  ３Ａ．３７９だけがＨＬＡ−Ｂ７−陽性ＥＢＶ−血清陽性個体から単離されたメモリＴ細胞によって認識されると報告される（ＰＮＡＳ  １９９９，９６：１２０３３−１２０３８）。
【０２１１】
ＥＢＮＡ  ３Ａフラグメントが免疫原性であるのにもっと高いスコアのＥＢＮＡ  ３Ｃフラグメントがそうでないという知見は、結合スコアだけの考察では予見されなかったことである。しかしながらこの結果は、ＥＢＮＡ  ３ＣペプチドのＮ−末端に隣接のアミノ酸残基がプロリン残基であるという観察に矛盾しない。本文中に示したように、位置Ｐ１’のプロリンは、天然にプロセスされ難いペプチドを表す。対照的に、ＥＢＮＡ  ３ＡフラグメントのＮ−末端の残基は同様の結合を有していないリシンである。開示した結合フィルターと天然プロセシングフィルターとを併用したこれらの２つのペプチドの分析から、ＥＢＮＡ  ３Ａフラグメントは免疫原性フラグメントであるがＥＢＮＡ  ３Ｃフラグメントはそうでないと示唆する候補エピトープの管理リストが得られるであろう。ＥＢＮＡ  ３Ｃペプチドは、天然プロセシングフィルターが候補Ｔ細胞エピトープのリストからこれを排除するように演算したという理由で除去されるであろう。
【０２１２】
この実施例は、結合スコアだけに基づくと良好なＴ細胞候補と考えられるが不適正な細胞プロセシングが理由でｉｎ  ｖｉｖｏでは免疫原性になり難いペプチドを同定するために本発明の天然プロセシングフィルターがどのような演算を実行するかを示している。
【実施例７】
【０２１３】
候補Ｔ細胞エピトープを同定し格付けするための結合フィルターと自己相似性および天然プロセシングフィルターの併用
本文中に開示したエピトープ同定アルゴリズムを腫瘍関連抗原ＰＳＡ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ０７２８８）（配列７５）に由来のＴ細胞エピトープ候補を同定するために応用した。このタンパク質は以下の配列を有している：
【０２１４】
【化１】
2008545180.tif 000021
【０２１５】
表６に示したようにＨＬＡ対立遺伝子Ａ＊０２０１に基づく上述の結合親和性フィルターを使用し、ＰＳＡ配列からｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ作製した２５３の９量体および２５２の１０量体の全部について結合スコアを決定した。予測した結合スコアに基づいて、最も高い予測結合親和性をもつ１０個のペプチドを以後のプロセシング用に選択した。表９はそれらのペプチド（それぞれ配列７６−８５）、これらの結合スコアおよび標的タンパク質中のこれらの位置のリストである。
【０２１６】
１０個のうちの３個のペプチド（ＶＬＶＨＰＱＷＶＬ，配列７９、ＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡ，配列８３およびＧＶＬＶＨＰＱＷＶ，配列８４）が別のヒトタンパク質のフラグメントとの高度な相似性に基づいて排除される。
【０２１７】
自己相似性フィルターを通過した第四のペプチド（ＰＳＡ．２１７）（ＬＶＣＮＧＶＬＱＧＩ，配列８２）は天然プロセシングフィルターによって排除された。
【０２１８】
６つのペプチド（ＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶ，配列７６；ＫＬＱＣＶＤＬＨＶ，配列７７；ＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶ，配列７８；ＦＬＴＬＳＶＴＷＩ，配列８０；ＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶ，配列８１およびＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩ，配列８５）が候補Ｔ細胞エピトープとして同定された。
【０２１９】
表９に与えたデータは、２つの候補Ａ＊０２０１−制限ＰＳＡ  Ｔ細胞エピトープ（ＰＳＡ．１６５およびＰＳＡ．１７８）（配列７６および７８）を含む。これらはこれまでにも文献にＰＳＡ  Ｔ細胞エピトープであると報告されていた（Ｐ．Ｃｏｒｒｅａｌｅら，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  １９９７，８９：２９３−３００）。
【０２２０】
【表９】
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【実施例８】
【０２２１】
候補Ｔ細胞エピトープの免疫原性類似体を同定するための本発明の免疫増強フィルターの使用
本文中に開示したように、本発明の免疫増強フィルターは本発明の結合フィルター、自己相似性フィルターおよび天然プロセシングフィルターと併用してもよく、または、候補Ｔ細胞エピトープを最適化する独立型ツールとして使用してもよい。要約すると、候補Ｔ細胞エピトープの固定アンカー免疫原性類似体は以下のように同定できる：
（１）問題の対立遺伝子によって制限されたＴ細胞エピトープを同定する、
（２）予測Ｔ細胞エピトープの固定アンカー類似体を計算する、
（３）予測Ｔ細胞エピトープをそれらの免疫原性類似体で置換することによって問題の抗原の配列を修飾する。
【０２２２】
多エピトープワクチンとして使用する免疫原性組成物に１つ以上の免疫増強クラスＩ制限Ｔ細胞エピトープを組込むことができる。あるいは、開示された方法に基づいて開示ＥＩＡが免疫増強クラスＩ制限Ｔ細胞エピトープを産生すると予測した免疫増強アンカー修飾類似体のアミノ酸配列に基づいたアミノ酸置換を野生型親配列に導入することによって全長標的抗原の免疫増強改良形を設計できる。実施例７のＰＳＡについて同定された６つのＡ＊０２０１制限Ｔ細胞エピトープ候補のうちの３つが免疫原性修飾可能であった。特に、ＰＳＡ．１７８、ＰＳＡ．７およびＰＳＡ．１７０（１０量体）はそれぞれ
【０２２３】
【化２】
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に免疫増強できる（修飾残基は太字で示す。）。エピトープまたはそれらの類似体または双方について免疫原性を試験し、ＰＳＡ発現腫瘍細胞に対する細胞性免疫応答を誘発するためのエピトープに基づく、遺伝子に基づく、タンパク質に基づく、ベクターに基づくまたは細胞に基づくワクチンに使用できる。
【０２２４】
例えば、２つの候補ＰＳＡ、Ｔ細胞エピトープＰＳＡ．７およびＰＳＡ．１７０（１０量体）の固定アンカー類似体の修飾配列を組込んだＰＳＡの免疫増強改良形は以下の配列を有するであろう（配列８９）。
【０２２５】
【化３】
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【実施例９】
【０２２６】
エピトープ同定アルゴリズムによって選択された候補Ｔ細胞エピトープの結合親和性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価
免疫原性組成物に含ませる前に、本発明のエピトープ同定／最適化アルゴリズムによって選択されたペプチドの適正ＨＬＡ対立遺伝子結合能をさらにｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験した。ＨＬＡ分子への結合親和性を試験するために多くの無細胞または細胞ベースアッセイが当業界で使用され、当業者は公表されたプロトコルに従って実施できる。例えば、ＨＬＡ対立遺伝子に対する候補ペプチドの相対的親和性およびペプチド／ＭＨＣ複合体の安定性は以下のアッセイのいずれかを使用して測定できる。
１）“Ｔ２アッセイ”：適正ＨＬＡ対立遺伝子を発現しているＴＡＰ欠損Ｔ２細胞（例えば１０５−１０６／ｍｌ）を種々の濃度のペプチド（例えば０．１−１００ｕＭ）およびβ２ｍと共に室温でインキュベートする。ペプチド誘導ＭＨＣ／ペプチド複合体を蛍光標識抗体で検出する。相対的親和性は、ペプチドインキュベートＴ２細胞の平均蛍光から対照ペプチドと共にインキュベートしたＴ２細胞の平均蛍光を減算した差として計算する。解離速度は、初期蛍光の５０％減少までに要した時間として測定する。アッセイの詳細は、Ａ．Ｓｃａｒｄｉｎｏ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００１，３１：３２６１−３２７０に記載されている。
【０２２７】
２）ｉＴｏｐｉａ結合アッセイ。このアッセイでは、折り畳まれていないＨＬＡ分子を種々の濃度の被験ペプチドおよびβ２ｍと組合せる。適切に折り畳まれたＨＬＡ／ペプチド複合体が蛍光標識抗体を使用して検出される。相対的親和性および解離速度はＴ２アッセイと同様にして測定する。ｉＴｏｐｉａアッセイの詳細は、Ｒ．Ｒａｙｎｏｒ，Ｃｏｎｔｉｎｕｉｔｙ  ｏｆ  Ｔ−ＣｅＩｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｒｏｍ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  Ｅｐｉｔｏｐｅｓ，Ｗｏｒｌｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ２００３，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ／ｒａｖｎｏｒｌ．ａｓｐ．に記載されている。
【０２２８】
本文中に提供した開示に基づいて、開示したエピトープ同定アルゴリズムによって選択または同定された候補Ｔ細胞エピトープの結合親和性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ定量／キャラクタリゼーションに適した他のアッセイを鑑定することは十分に研究者らの技量の範囲内である。
【実施例１０】
【０２２９】
エピトープ同定アルゴリズムによって選択された候補Ｔ細胞エピトープの免疫原性のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ評価
ワクチン構築物（すなわち、ミニジーン）に含ませる前に、開示した方法によって選択されたＴ細胞エピトープをコードするポリヌクレオチド配列の免疫原性をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ評価した。例えば、特異的ＣＤ８＋細胞を誘導するミニジーンの能力は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで評価できる。当業界ではこの目的で多くのアッセイが使用されており、当業者は公表されたプロトコルに従って実施できる。例えば、本文中に開示した方法に従って選択または最適化された候補Ｔ細胞エピトープの免疫原性は（特に）以下のアッセイの１つによって評価できよう。
【０２３０】
（１）ｉｎ−ｖｉｔｒｏ  Ｔ細胞刺激（ＩＶＳ）。このアッセイでは、健常個体または疾病個体からＣＴＬを抽出し、自家ペプチドパルスした末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）で刺激する。週一回ずつ数回（例えば４回）再刺激後、ペプチドに対するＴ細胞の反応性をＨＬＡ整合ペプチドパルス細胞、または、ペプチドのソースタンパク質を発現している細胞を使用して試験する。詳細なプロトコルは、Ｅ．Ｋｅｏｇｈ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｆｏｕｒ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｔｕｍｏｒ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ：Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  Ｅｐｉｔｏｐｅｓ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ＨＬＡ−ＡＷ２０１−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００１，１６７：７８７０−７９６に見出される。該文献の教示は参照によって本発明に含まれるものとする。
【０２３１】
（２）トランスジェニックマウスの免疫感作。このアッセイでは、問題の対立遺伝子にトランスジェニックのマウスにアジュバント使用または不使用でペプチドを週一回の注射で数回（例えば４回）注射する。最終注射の後、ＨＬＡ整合ペプチドパルス細胞またはペプチドのソースタンパク質を発現しているＨＬＡ整合細胞を免疫マウスのＰＢＭＣが認識する能力をｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験する。手順の詳細な記載は、Ｈ．Ｆｉｒａｔ，Ｈ−２  Ｃｌａｓｓ  １  ｋｎｏｃｋｏｕｔ，ＨＬＡ−Ａ２．１−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ：ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９，２９：３１１２−３１２１に見出される。
【０２３２】
本文中に提供した開示に基づいて、開示した方法によって選択または同定された候補Ｔ細胞エピトープの免疫原性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ定量／キャラクタリゼーションに適した他のアッセイを鑑定することは十分に研究者の技量の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０２３３】
【図１Ａ】データ選択およびスコア化行列計算のプロセス（図１ａ）、結合親和性フィルター（図１ｂ）および天然プロセシングフィルター（図１ｃ）のトレーニングプロセスをまとめたフローチャートである。
【図１Ｂ】データ選択およびスコア化行列計算のプロセス（図１ａ）、結合親和性フィルター（図１ｂ）および天然プロセシングフィルター（図１ｃ）のトレーニングプロセスをまとめたフローチャートである。
【図１Ｃ】データ選択およびスコア化行列計算のプロセス（図１ａ）、結合親和性フィルター（図１ｂ）および天然プロセシングフィルター（図１ｃ）のトレーニングプロセスをまとめたフローチャートである。
【図２】免疫適格抗原から候補Ｔ細胞エピトープまたは類似体を同定および格付けするための、開示したエピトープ同定アルゴリズムの使用をまとめたフローチャートである。
【図３Ａ】９量体（図３Ａ）および１０量体（図３Ｂ）の候補Ｔ細胞エピトープの結合スコアの計算方法を示す。
【図３Ｂ】９量体（図３Ａ）および１０量体（図３Ｂ）の候補Ｔ細胞エピトープの結合スコアの計算方法を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【配列表】
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