(57)【要約】本発明は、生物学的効果を必要とする哺乳類の抹消神経系及び中枢神経系の再生応答を促進する方法に関する。該方法は、傷害又は変性した神経細胞の再生を制御する特異的なポリペプチドの活性度又は定常状態レベルを変化させることを含む。好ましくは、該特異的ポリペプチドの活性度又は定常状態レベルは、該ポリペプチドの発現を増大又は減少するための核酸を導入することによって変化される。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経細胞の発生又は再生を促進する方法であって、該方法は、神経細胞中でポリペプチドの活性度又は定常状態レベルを変化させる工程を含み、ここにおいて該ポリペプチドは、下記から選択される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む：
（ａ）配列番号：１〜146から選択される配列と少なくとも80％の同一性を有する核酸配列；及び、
（ｂ）配列番号：１〜146から選択される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列。
【請求項２】
前記ポリペプチドの活性度又は定常状態レベルが、前記神経細胞中で前記ポリペプチドをコードする核酸の発現レベルを制御することによって変更される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記神経細胞の再生が、下記から選択される核酸配列によってコードされるポリペプチドの活性度又は定常状態レベルを増大させることによって促進される、請求項１又は２に記載の方法：
（ａ）配列番号：23, 35, 45, 65, 14, 32, 43, 72, 11, 12, 28, 8, 51, 4, 3, 42, 48, 52, 61, 5, 6, 10, 17, 49, 55, 58, 64, 70, 73, 27, 40, 96, 108, 118, 138, 87, 105, 116, 145, 84, 85, 101, 81, 124, 77, 76, 115, 121, 125, 134, 78, 79, 83, 90, 122, 128, 131, 137, 143, 146, 100,及び113から選択される配列と少なくとも80％の同一性を有する核酸配列；及び、
（ｂ）配列番号：23, 35, 45, 65, 14, 32, 43, 72, 11, 12, 28, 8, 51, 4, 3, 42, 48, 52, 61, 5, 6, 10, 17, 49, 55, 58, 64, 70, 73, 27, 40, 96, 108, 118, 138, 87, 105, 116, 145, 84, 85, 101, 81, 124, 77, 76, 115, 121, 125, 134, 78, 79, 83, 90, 122, 128, 131, 137, 143, 146, 100,及び113から選択される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列。
【請求項４】
前記ポリペプチドの活性度又は定常状態レベルが、前記神経細胞中に核酸構築物を導入することによって増大され、ここにおいて、該核酸構築物が、前記ポリペプチドをコードする核酸配列を含み、また、前記核酸配列は、前記神経細胞中で該核酸配列の発現を推進することができるプロモーターの制御下にある、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記神経細胞の再生が、下記から選択される核酸配列によってコードされるポリペプチドの活性度又は定常状態レベルを減少することによって促進される、請求項１又は２に記載の方法：
（ａ）配列番号：31, 69, 53, 18, 21, 26, 30, 36, 39, 44, 46, 60, 66, 71, 13, 19, 25, 47, 24, 9, 1, 20, 22, 63, 67, 2, 7, 15, 16, 34, 37, 38, 41, 50, 54, 56, 57, 62, 68, 29, 59, 33, 104, 142, 126, 91, 94, 99, 103, 109, 112, 117, 119, 133, 139, 144, 86, 92, 98, 120, 97, 82, 74, 93, 95, 136, 140, 75, 80, 88, 89, 107, 110, 111, 114, 123, 127, 129, 130, 135, 141, 102, 132,及び105から選択される配列と少なくとも80％の同一性を有する核酸配列；及び、
（ｂ）配列番号：31, 69, 53, 18, 21, 26, 30, 36, 39, 44, 46, 60, 66, 71, 13, 19, 25, 47, 24, 9, 1, 20, 22, 63, 67, 2, 7, 15, 16, 34, 37, 38, 41, 50, 54, 56, 57, 62, 68, 29, 59, 33, 104, 142, 126, 91, 94, 99, 103, 109, 112, 117, 119, 133, 139, 144, 86, 92, 98, 120, 97, 82, 74, 93, 95, 136, 140, 75, 80, 88, 89, 107, 110, 111, 114, 123, 127, 129, 130, 135, 141, 102, 132, 及び105から選択される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列。
【請求項６】
前記ポリペプチドの活性度又は定常状態レベルが、該神経細胞中に核酸構築物を導入することによって減少され、ここにおいて該核酸構築物は、前記ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を阻害できるアンチセンス核酸配列を含み、また、任意に、該アンチセンス核酸配列は、前記神経細胞中で該アンチセンス核酸配列の発現を推進することができるプロモーターの制御下にある、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記神経細胞が再生を必要としている神経細胞である、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記神経細胞が、中枢神経系の細胞であり、好ましくは皮質脊髄路の神経細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記プロモーターが、神経細胞特異的プロモーターである、請求項４又は６〜８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記プロモーターが、配列番号：31, 69, 53, 18, 21, 26, 30, 36, 39, 44, 46, 60, 66, 71, 13, 19, 25, 47, 24, 9, 1, 104, 142, 126, 91, 94, 99, 103, 109, 112, 117, 119, 133, 139, 144, 86, 92, 98, 120, 97, 82,及び74から選択される配列を含むmRNAをコードする遺伝子のプロモーターである、請求項４又は６〜８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
被験者における神経外傷性傷害又は神経変性疾患を治療する方法であって、該方法は、該被験者の傷害された神経細胞で、請求項１で定義された核酸配列によってコードされるポリペプチドの活性度又は定常状態レベルを薬理学的に変化させることを含み、該変化が前記傷害された神経細胞又は変性した神経細胞の（軸索）発生又は再生を誘導するのに十分であることを特徴とする方法。
【請求項１２】
前記神経外傷性傷害が、神経組織の破壊、裂離及び／又は挫傷を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記神経外傷性傷害が、中枢神経系の神経を含み、好ましくは皮質脊髄路の神経を含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記神経変性疾患が、脳血管障害(CVA)、アルツハイマー病 (AD)、血管関連痴呆、クロイツフェルト-ヤーコプ病(CJD)、ウシ海綿状脳症 (BSE)、パーキンソン病(PD)、脳外傷、多発性硬化症 (MS)、筋萎縮性側索硬化症(ALS-ルー・ゲーリック病)及びハンチントン舞踏病から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、請求項４又は６で定義された核酸構築物を含む治療的有効量の医薬組成物を前記被験者に投与する工程を含む、請求項１１〜１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸構築物が、アデノウイルス、アデノ関連性ウイルス (AAV)、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス及びレトロウイルスに基づく遺伝子療法ベクターから選択される、ウイルス性遺伝子療法ベクターである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記医薬組成物が、神経の傷害又は変性の部位において投与される、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
好ましくは請求項１〜１０で定義された方法における神経細胞の再生を促進するための医薬の製造のための、請求項１で定義された核酸配列の使用。
【請求項１９】
好ましくは請求項１１〜１７の何れか一項で定義された方法における神経外傷性傷害又は神経変性疾患の治療のための医薬の製造のための、請求項１で定義された核酸配列の使用。
【請求項２０】
被験者における神経の発生又は再生の状態を診断する方法であって、以下の工程を含む方法：
（ａ）被験者の発生又は再生した神経において、請求項１で定義された核酸配列の発現レベルを測定すること；及び、
（ｂ）前記核酸配列の発現レベルを、該核酸配列の発現レベルの基準値と比較すること、該基準値は好ましくは、健康な個体の神経における発現レベルの平均値である。
【請求項２１】
前記核酸配列の発現レベルが、該核酸配列によってコードされるポリペプチドの量を定量することによって間接的に測定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記発現レベルが、前記被験者から得られたサンプルにおいて生体外で測定される、請求項２０〜２１の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３】
以下から選択される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸構築物：
（ａ）配列番号１〜１４６から選択される配列と少なくとも80％の同一性を有する核酸配列；及び、
（ｂ）配列番号１〜１４６から選択される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列、
ここにおいて、該核酸配列は、前記神経細胞中で該核酸配列の発現を推進できるプロモーターと作動可能に連結される。
【請求項２４】
前記核酸配列が以下から選択される、請求項２３に記載の核酸構築物：
（ａ）配列番号：23, 35, 45, 65, 14, 32, 43, 72, 11, 12, 28, 8, 51, 4, 3, 42, 48, 52, 61, 5, 6, 10, 17, 49, 55, 58, 64, 70, 73, 27, 40, 96, 108, 118, 138, 87, 105, 116, 145, 84, 85, 101, 81, 124, 77, 76, 115, 121, 125, 134, 78, 79, 83, 90, 122, 128, 131, 137, 143, 146, 100,及び113から選択される配列と少なくとも80％の同一性を有する核酸配列；及び、
（ｂ）配列番号：23, 35, 45, 65, 14, 32, 43, 72, 11, 12, 28, 8, 51, 4, 3, 42, 48, 52, 61, 5, 6, 10, 17, 49, 55, 58, 64, 70, 73, 27, 40, 96, 108, 118, 138, 87, 105, 116, 145, 84, 85, 101, 81, 124, 77, 76, 115, 121, 125, 134, 78, 79, 83, 90, 122, 128, 131, 137, 143, 146, 100,及び113から選択される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列。
【請求項２５】
以下から選択される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現を阻害できるRNAi剤をコードする核酸配列を含む核酸構築物：
（ａ）配列番号：１〜１４６から選択される配列と少なくとも80％の同一性を有する核酸配列；及び、
（ｂ）配列番号：１〜１４６から選択される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列、
ここにおいて、任意に、該RNAi剤をコードする核酸配列は、前記神経細胞中において該核酸配列の発現を推進できるプロモーターに作動可能に連結される。
【請求項２６】
前記核酸配列が以下から選択される、請求項２５に記載の核酸構築物：
（ａ）配列番号：31, 69, 53, 18, 21, 26, 30, 36, 39, 44, 46, 60, 66, 71, 13, 19, 25, 47, 24, 9, 1, 20, 22, 63, 67, 2, 7, 15, 16, 34, 37, 38, 41, 50, 54, 56, 57, 62, 68, 29, 59, 33, 104, 142, 126, 91, 94, 99, 103, 109, 112, 117, 119, 133, 139, 144, 86, 92, 98, 120, 97, 82, 74, 93, 95, 136, 140, 75, 80, 88, 89, 107, 110, 111, 114, 123, 127, 129, 130, 135, 141, 102, 132,及び105から選択される配列と少なくとも80％の同一性を有する核酸配列；及び、
（ｂ）配列番号：31, 69, 53, 18, 21, 26, 30, 36, 39, 44, 46, 60, 66, 71, 13, 19, 25, 47, 24, 9, 1, 20, 22, 63, 67, 2, 7, 15, 16, 34, 37, 38, 41, 50, 54, 56, 57, 62, 68, 29, 59, 33, 104, 142, 126, 91, 94, 99, 103, 109, 112, 117, 119, 133, 139, 144, 86, 92, 98, 120, 97, 82, 74, 93, 95, 136, 140, 75, 80, 88, 89, 107, 110, 111, 114, 123, 127, 129, 130, 135, 141, 102, 132,及び105から選択される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列。
【請求項２７】
前記プロモーターが、神経細胞に特異的なプロモーターである、請求項２３〜２６の何れか一項に記載の核酸構築物。
【請求項２８】
前記プロモーターが、GAP43プロモーター、FGF受容体プロモーター及び神経特異的エノラーゼプロモーターから選択される、請求項２７に記載の核酸構築物。
【請求項２９】
前記プロモーターが、配列番号：１〜１４６から選択される配列を含むmRNAをコードする遺伝子のプロモーターである、請求項２３〜２６の何れか一項に記載の核酸構築物。
【請求項３０】
前記プロモーターが、配列番号：31, 69, 53, 18, 21, 26, 30, 36, 39, 44, 46, 60, 66, 71, 13, 19, 25, 47, 24, 9, 1, 104, 142, 126, 91, 94, 99, 103, 109, 112, 117, 119, 133, 139, 144, 86, 92, 98, 120, 97, 82,及び74から選択される配列を含むmRNAをコードする遺伝子のプロモーターである、請求項２９に記載の核酸構築物。
【請求項３１】
前記核酸構築物が、アデノウイルス、アデノ関連性ウイルス(AAV)、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス及びレトロウイルスに基づく遺伝子療法ベクターから選択されるウイルス性遺伝子療法ベクターである、請求項２３〜３０の何れか一項に記載の核酸構築物。
【請求項３２】
神経細胞の再生を促進できる物質の同定方法であって、以下の工程を含む方法：
（ａ）請求項１で定義されたポリペプチドをコードする核酸配列を発現できる試験細胞集団を用意すること；
（ｂ）前記試験細胞集団を前記物質と接触させること；
（ｃ）前記物質と接触された前記試験細胞集団における、前記核酸配列の発現レベル又は前記ポリペプチドの活性度又は定常状態レベルを測定すること；
（ｄ）前記（ｃ）で測定された発現、活性度又は定常状態レベルを、前記物質と接触していない試験細胞集団における前記核酸配列又は前記ポリペプチドの発現、活性度又は定常状態レベルと比較すること；及び、
（ｅ）前記物質と接触した試験細胞集団と、前記物質と接触していない試験細胞集団との間で、前記核酸配列又は前記ポリペプチドの発現レベル、活性度又は定常状態レベルにおける相違を生じさせる物質を同定すること。
【請求項３３】
二以上の核酸配列又は二以上のポリペプチドの発現レベル、活性度又は定常状態レベルが比較される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記試験細胞集団が、初生感覚性(primairy sensoric)神経細胞（例えば、DRG神経細胞）又は感覚神経細胞株の細胞を含み、好ましくは初生感覚性神経細胞（例えば、DRG神経細胞）、例えばF11細胞株のような感覚神経細胞細胞株の細胞を含む、請求項３２又は３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記試験細胞集団が哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞を含む、請求項３２〜３４の何れか一項に記載の方法。
【請求項３６】
請求項３２〜３５の何れか一項に記載の方法において同定された物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その発現が、坐骨神経の粉砕障害によって誘発される修復性の応答を起こしている後根神経節の細胞中で調節される、核酸及びそれによってコードされるポリペプチドに関する。そのようなポリペプチドは本明細書において転写因子(TF)と称する。それらの核酸は、神経外傷性傷害、例えば神経組織の破壊、裂離又は挫傷の後の、ヒトの治療を含むそのような生物学的効果を必要とする哺乳類における、抹消神経系及び中枢神経系の再生応答を制御する方法において有用である。
【背景技術】
【０００２】
ヒトにおけるほとんどの脊椎損傷は、道路交通事故、業務上の事故又はスポーツ中の事故によって引き起こされ、(i) 脊椎の挫傷及び皮質脊髄路(CST)を含む、主要な上行路及び下行路の破損をもたらす椎骨の骨折又は脱臼、及び／又は、(ii) 後根及び／又は腹根の裂離、それによる抹消神経からの脊椎の連絡切断を含む。長経路及び局所的な神経根傷害の何れの傷害も、患者にとって重大な結果を有する。全ての脊椎が傷害した患者の約50％が四肢麻痺（両手足が発症）であり、残り半分は対麻痺（両足は発症するが腕は発症しない）である。脊椎傷害は、大部分は若い、労働力の一部で生産的な生をリードする健康な個体に発症する。急性の脊椎傷害で生存したほとんどの患者は、車椅子に拘束され、数十年の平均余命を有する。今日まで、脊椎又は脊髄根の傷害の有効な治療は得られていない。前根裂離の場合において、剥皮根の脊椎への外科的再置換術による幾つかの成功が報告されている。この神経外科的処置の結果としての腕及び肩部の機能の回復は、しかしながら極めて限られている。
【０００３】
抹消神経への外傷性傷害は、脊椎又は根の裂離破壊よりもいくらかはよい見通しを有する。傷害した抹消神経の近位及び遠位の切れ残り(stumps)が、脳神経外科医によって縫い合わされることのできる場合もある。著しい数の患者において、近位及び遠位の切れ残りの間のギャップを橋渡しするために、自家神経移植が用いられている。傷害した軸索は、移植片を介して成長し、多くの実例において、それらの軸索のいくつかは筋肉又は皮膚に再結合して、機能のいくらかの回復をもたらす。しかしながら、外科的な抹消神経修復後の機能的回復は通常完全ではなく、改善に対する著しい要求がある。
【０００４】
傷害したCNSが有する自己修復能力は極めて限られていることは明らかである。CNSにおいて、神経は、増殖に必要な遺伝子の発現を誘導できず、また、神経の傷跡のグリア細胞は、神経突起成長阻害剤を発現する。反対に、PNSにおいて神経は、抹消神経（シュワン細胞）支援再生において傷害した軸索及びグリア細胞の再生を上手く推進する、遺伝子発現のプログラムを開始する。細胞生物学及び分子研究は、(1) 神経性（又は内在性）及び(2) グリア（又は「環境性」）の因子が、神経再生プロセスにおいて重大な役割を果たすことを証明している。
【０００５】
今までに、神経細胞の遺伝子のスモールセットは、傷害した抹消神経においては上方制御されるが、傷害したCNS神経においては上方制御されないかより少ない程度で制御されることが確認されている。従って、再生についてのPNS神経とCNS神経の間の二分法は、分子的な相違によって起こされる。我々や他の研究者は、遺伝子組換えマウスの神経において最初の「増殖関連」遺伝子(GAP-43及びCAP-23)の二つを過剰発現させた。結果として、傷害後の新しい神経突起の拡張（extent）能力が増大した。これらの知見は、傷害したCNS神経細胞が、「再生関連」神経遺伝子の発現を増大させることによって、再生を引き起こすことができるという極めて重大な見解をもたらした。
【０００６】
CNS及びPNS神経細胞は、内因的な再生能力の面から挙動が相違し、極めて異なる環境に曝される。CNSにおける状況とは対照的に、破壊されたPNS神経は、傷害した神経の遠位の神経の切れ残りに存在するシュワン細胞とともに軸索を再生する。いくらかの神経腫及び傷跡の形成が抹消神経に生じるにもかかわらず、CNSにおいて見られるように広範な傷跡の形成は大きな問題ではない。さらにその上、PNSにおける再生は、増殖を促進するシュワン細胞の存在によって生じる。科学的な観点からはPNSの再生は、成功した増殖に寄与する要因への洞察をさらに増すことに役立つとはいえ、臨床的な展望からは、PNSにおける機能的回復は、ほとんどの場合、完全にはほど遠い。
【０００７】
最近の幾つかの研究において、傷害後の後根神経節(DRG)神経細胞における大規模な遺伝子発現の変化が特徴づけられている。それらの研究は、時点、破壊のタイプ、組織分析、及びマイクロアレイのプラットフォームの使用において異なり、それらのほとんどが、ガラニン及びNP-Yのような神経ペプチドの著しい上方制御、炎症に関連する遺伝子の上方制御及び神経伝達と付随している遺伝子の下方制御を見出している(Boeshore et al., 2004 J Neurobiol. 59(2):216-35; Costigan et al., 2002, BMC Neurosci. 3(1):16; Wang et al., 2002, Neuroscience. 114(3):529-46; Xiao et al., 2002, Neuroreport. 13(15):1903-7)。細胞周期に関連する転写の上方制御についても三つの研究が報告している(Boeshore et al., 2004, supra; Cameron et al., 2003 J Cell Biochem. 88(5):970-85; Wang et al., 2002, supra)。細胞周期及び炎症関連遺伝子における変化は恐らく、破壊された組織におけるマクロファージの増殖を反映し(Schreiber et al., 2002, J Neurobiol. 53(1):68-79)、一方、遺伝子の下方制御は、正常な生理が変化する間、成体の神経細胞の増殖状態への脱分化のための神経伝達ポイントに関与する。上述の研究は、幾つかの理由のために成功した再生の根底にある分子プロセスにおける新規の仮説を導いていない。第一に、それらの研究のほとんどが、時間経過における遺伝子発現を分析していない。Xiaoらによる研究は例外であるが、しかし、14d 切除及びコントロールDRGのcDNAライブラリーに存在する遺伝子の発現を分析するそれらのアプローチのために、該プロセスの初期段階において一過性に上方制御された遺伝子の検出が不可能である。第二に、ほとんどの研究が切除パラダイムを用いるが (Boeshore et al., 2004, supra; Bonilla et al., 2002, J Neurosci. 22(4):1303-15; Costigan et al., 2002, supra; Tanabe et al., 2003, J Neurosci. 23(29):9675-86)、ところが、神経の粉砕がより強い再生応答を誘導することが示されている(Nguyen et al., 2002, Nat Neurosci. 5(9):861-7; Pan et al., 2003)。第三に、用いられたプラットフォームのために、又は統計学が適用できないとき用いられる（厳密な）フォールド-チェンジ・カットオフの何れかのために、制御された遺伝子の分析された数が小さい研究もある(Bonilla et al., 2002, supra; Cameron et al., 2003, supra; Fan et al., 2001, Cell Mol Neurobiol. 21(5):497-508; Schmitt et al., 2003, BMC Neurosci. 4(1):8.; Tanabe et al., 2003, supra; Xiao et al., 2002, supra)。第四に、坐骨神経 (SN)破壊がパラダイムでのみ分析された場合、傷害と再生関連遺伝子が識別できない。
【０００８】
よって、上記の技術における欠点を克服し、神経修復のプロセスにおいて鍵となるタンパク質及び／又はコード核酸を提供することが本発明の目的である。また、神経外傷患者における機能の回復をもたらす修復プロセスを促進する、それらのタンパク質及び／又は核酸に基づいた療法を提供することも本発明のさらなる目的である。
【発明の説明】
【０００９】
上記で議論したような、ほとんどの従来技術の遺伝子発現分析は、極めて複雑な再生の生物学的プロセスの単純なスナップショットを提供するものである。それ故、特定の時点で制御される遺伝子が、成長プロセスの開始に重要な遺伝子であるかどうか、軸索の伸長に役割を果たすか否か、或いは、感覚性の接触のターゲットの発見又は回復に関与するかどうかを決定することはできない。このプロセスの一部に遺伝子を結びつけるために、遺伝子発現分析は、時間経過で行われるべきである。
【００１０】
加えて、遺伝子発現データの生物学的解釈は、第二の、関連するが異なるプロセスが同時に分析された場合に、大きく促進される。この点において、DRG神経細胞は、坐骨神経（SN-粉砕）における強い成長応答及び後根（DR-粉砕）における弱い成長応答の間の遺伝子発現変化を比較するための珍しい機会を提供する。この比較は、分析される組織サンプルが互いに極めて類似し、唯一の生物学的相違が神経突起に加えられた傷害の局在性のみであるという利点を保持する。これは、例えば、破壊されたCNSでの遺伝子発現を、DRG神経細胞での遺伝子発現と比較する場合ではない。また、差次的遺伝子発現分析が、いずれのパラダイムにおいても類似し得るストレス及び傷害関連遺伝子発現変化の除去を可能にする。何れの傷害によっても類似した様式で制御される遺伝子がさらなる分析から排除されれば、真に再生に関連する遺伝子を高めるチャンスである。それ故、成功した再生に関与する核酸を解明するために、DR及びSN粉砕後の遺伝子発現変化の高分解能の時間経過分析が本発明者らによって用いられた。
【００１１】
内因性の神経細胞遺伝子のスクリーンが、ラットDRG初生の感覚神経細胞において行われた（下記参照）。それらの神経細胞は、成功した再生及び不成功の再生を研究するために比類なく適している。それらの神経細胞の細胞体は、後根神経節に位置しており、それらの神経細胞は二つの分枝を有する：末梢的に突出し皮膚を神経支配するもの及び脊椎へ中枢的に突出する分枝。抹消性の分枝は力強く再生する一方、中枢性の分枝は実質的に再生しない。抹消と中枢の破壊後の遺伝子発現における変化を比較することにより、我々は、抹消性分枝の破壊後に上方制御又は下方制御され、中枢性分枝の破壊後には制御されない、新規の内在性遺伝子を同定した。このスクリーンの能力は、抹消と中枢の再生を比較することのみではなく、再生応答の最初の6〜72時間（5つの時点）の間の遺伝子発現が特異的に試験されるという事実にもある。そのようにすることにより、及び、従来の進行型のターゲット発見技術を用いることにより、ヒト及びげっ歯類のゲノム計画の結果として発達し、神経細胞の応答に関与する新規の遺伝子のラージセットが発見された。特に、我々は、成功する再生を推進する神経の遺伝子プログラムを開始する鍵となる因子を発見できた。
【発明の詳細な説明】
【００１２】
一つの観点において、本発明は、神経細胞の発生又は再生の促進又は制御のための方法に関する。神経細胞の発生又は再生を促進又は制御するための第一の方法は、神経細胞中で又は発生（再生）を必要とする神経細胞の指示環境中の細胞中、例えば支持グリア細胞中で、ポリペプチドの活性度又は定常状態レベルを変化させる工程を含む（下記参照）。活性度又は定常状態レベルが変化されるポリペプチドは、好ましくは、以下から選択される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドである：(a) 配列番号：１〜１４６から選択される核酸配列と少なくとも60, 70, 80, 85, 90, 95, 98又は99%の配列同一性を有する核酸配列；及び、(b) 配列番号：１〜１４６から選択される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも60, 70, 80, 85, 90, 95, 98又は99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列。該ポリペプチドは、本明細書においては、本発明のポリペプチド、TFポリペプチド、又は簡単にTFとも称する。本発明のTFポリペプチドは好ましくは、転写因子又は遺伝子転写のモジュレーターであり、好ましくはその発現レベルは、少なくとも再生の初期段階（及び好ましくは後期段階）において変化される。TFは好ましくは、神経細胞が上手く再生するかどうかを決定する。TFの活性度又は定常状態レベルにおける変化は、強い神経突起の成長及び機能的回復のために必要とされる、遺伝子発現状態の変化をもたらす。好ましくは本発明のTFは、従って、損傷した神経細胞の再生が成功するかしないかを決定する鍵となるスイッチである。
【００１３】
ポリペプチドの活性度又は定常状態レベルの変化」は、本明細書において、健康な個体における正常な活性度又は定常状態と比較したとき、該ポリペプチドによって発揮される生物学的活性度における、又は該ポリペプチドの定常状態レベルにおける、任意の検出可能な変化を意味するように理解される。
【００１４】
神経細胞の発生又は再生は、神経細胞の成長の開始、神経細胞の成長、軸索伸長、ターゲットの発見及び感覚性接触の再確立、欠損した運動性又は感覚性神経細胞の機能の回復を含む一以上のプロセスを意味するように理解される。神経細胞の発生又は再生のための適切なアッセイは実施例において、例えば実施例IIに提供されている。該アッセイは、本発明のポリペプチドの活性度又は定常状態レベルの変化が、神経突起成長を誘導でき、それによって、神経細胞の再生を誘導又は促進できるかどうかを決定するために用いられ得る。
【００１５】
本発明の方法において、本発明のポリペプチドの活性度又は定常状態レベルは、例えば、本発明のポリペプチドを外来源から神経細胞に供給することによって、或いは、例えば、該TFポリペプチドに対する抗体のような、該ポリペプチドのアンタゴニスト又は阻害剤を該神経細胞に加えることによって、ポリペプチド自体のレベルが変化させられ得る。外来源からのTFポリペプチドの供給のために、TFポリペプチドは、下記に記載するように、適切な宿主細胞中でポリペプチドをコードする核酸の発現によって都合よく生成され得る。本発明のポリペプチドに対する抗体は、下記に記載するように得ることができる。
【００１６】
好ましくは、しかしながら、TFポリペプチドの活性度又は定常状態レベルは、該ポリペプチドをコードする核酸配列の発現レベルを制御することによって変化される。好ましくは、核酸配列の発現レベルは、神経細胞中で制御される。本発明のポリペプチドの発現レベルは、発現構築物（又はベクター）を該神経細胞中に導入することによって上方制御され、ここで該発現ベクターは、TFポリペプチドをコードする核酸配列を含み、また、該核酸配列は、該神経細胞中で該核酸配列の発現を推進できるプロモーターの制御下にある。また、TFポリペプチドの発現レベルは、該神経細胞への発現構築物の導入によって上方制御されることができ、ここで、該構築物は、TFポリペプチドをコードする内在性の核酸配列のトランス活性化の可能な因子をコードする核酸配列を含む。
【００１７】
或いは、神経（再）発生が非常に必要である場合に、
本発明のポリペプチドの発現レベルは、該神経細胞にアンチセンス分子を供給することによって下方制御され得、ここで該アンチセンス分子は、該TFポリペプチドをコードする核酸配列の生合成（通常、翻訳）を阻害することができる。アンチセンス又は妨害RNA分子を提供することによって遺伝子発現を減少させることは、本明細書で後述し、また、例えば、「Famulok et al. (2002, Trends Biotechnol., 20(11): 462-466)」に概説されている。該アンチセンス分子は、そのように前記細胞に供給されてよく、或いは、前記神経細胞中に発現構築物を導入することによって供給されることもでき、ここで該発現構築物は、TFポリペプチドをコードする核酸配列の発現を阻害できるアンチセンス核酸配列を含み、また、該アンチセンス核酸配列は、前記神経細胞中で該アンチセンス核酸配列の転写を推進できるプロモーターの制御下にある。TFポリペプチドの発現レベルもまた、前記神経細胞中に発現構築物を導入することによって下方制御でき、ここで該発現構築物は、TFポリペプチドをコードする内在性の核酸配列のトランス抑圧（trans-repression）できる因子をコードする核酸配列を含む。
【００１８】
本発明の方法において、該神経細胞の再生は、好ましくは、以下から選択される核酸配列によってコードされるポリペプチドの活性度又は定常状態レベルを増大させることによって促進される：(a) 配列番号：23, 35, 45, 65, 14, 32, 43, 72, 11, 12, 28, 8, 51, 4, 3, 42, 48, 52, 61, 5, 6, 10, 17, 49, 55, 58, 64, 70, 73, 27, 40, 96, 108, 118, 138, 87, 105, 116, 145, 84, 85, 101, 81, 124, 77, 76, 115, 121, 125, 134, 78, 79, 83, 90, 122, 128, 131, 137, 143, 146, 100,及び113から選択される配列と少なくとも80％の同一性を有する核酸配列；及び、(b) 配列番号：23, 35, 45, 65, 14, 32, 43, 72, 11, 12, 28, 8, 51, 4, 3, 42, 48, 52, 61, 5, 6, 10, 17, 49, 55, 58, 64, 70, 73, 27, 40, 96, 108, 118, 138, 87, 105, 116, 145, 84, 85, 101, 81, 124, 77, 76, 115, 121, 125, 134, 78, 79, 83, 90, 122, 128, 131, 137, 143, 146, 100,及び113から選択される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列。より好ましい選択は、配列番号：23, 35, 45, 65, 14, 32, 43, 72, 11, 12, 28, 96, 108, 118, 138, 87, 105, 116, 145, 84, 85,及び101を含み；及び最も好ましい選択は、配列番号：8, 51, 4, 3, 42, 48, 52, 61, 5, 6, 10, 17, 49, 55, 58, 64, 70, 73, 27, 40, 81, 124, 77, 76, 115, 121, 125, 134, 78, 79, 83, 90, 122, 128, 131, 137, 143, 146, 100,及び113を含む。前記ポリペプチドの活性度又は定常状態レベルは、好ましくは、核酸構築物を該神経細胞中に導入することによって増大され、該核酸構築物は、該神経細胞中で該核酸配列の発現を推進できるプロモーターの制御下にある核酸配列（がコードするポリペプチド）を含む。神経細胞中での発現に適したプロモーターは、さらに後記で特定される。
【００１９】
或いは、本発明の方法において、神経細胞の再生は、好ましくは、以下から選択される核酸配列によってコードされるポリペプチドの活性度又は定常状態レベルを減少させることによって促進される：(a) 配列番号：31, 69, 53, 18, 21, 26, 30, 36, 39, 44, 46, 60, 66, 71, 13, 19, 25, 47, 24, 9, 1, 20, 22, 63, 67, 2, 7, 15, 16, 34, 37, 38, 41, 50, 54, 56, 57, 62, 68, 29, 59, 33, 104, 142, 126, 91, 94, 99, 103, 109, 112, 117, 119, 133, 139, 144, 86, 92, 98, 120, 97, 82, 74, 93, 95, 136, 140, 75, 80, 88, 89, 107, 110, 111, 114, 123, 127, 129, 130, 135, 141, 102, 132,及び105から選択される配列と少なくとも80％の同一性を有する核酸配列；及び、(b) 配列番号：31, 69, 53, 18, 21, 26, 30, 36, 39, 44, 46, 60, 66, 71, 13, 19, 25, 47, 24, 9, 1, 20, 22, 63, 67, 2, 7, 15, 16, 34, 37, 38, 41, 50, 54, 56, 57, 62, 68, 29, 59, 33, 104, 142, 126, 91, 94, 99, 103, 109, 112, 117, 119, 133, 139, 144, 86, 92, 98, 120, 97, 82, 74, 93, 95, 136, 140, 75, 80, 88, 89, 107, 110, 111, 114, 123, 127, 129, 130, 135, 141, 102, 132,及び105から選択される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列。より好ましい選択は、配列番号：31, 69, 53, 18, 21, 26, 30, 36, 39, 44, 46, 60, 66, 71, 13, 19, 25, 47, 24, 9, 1, 104, 142, 126, 91, 94, 99, 103, 109, 112, 117, 119, 133, 139, 144, 86, 92, 98, 120, 97, 82,及び74を含み；及び最も好ましい選択は、配列番号：20, 22, 63, 67, 2, 7, 15, 16, 34, 37, 38, 41, 50, 54, 56, 57, 62, 68, 29, 59, 33, 93, 95, 136, 140, 75, 80, 88, 89, 107, 110, 111, 114, 123, 127, 129, 130, 135, 141, 102, 132,及び105を含む。前記ポリペプチドの活性度又は定常状態レベルは、好ましくは、アンチセンス又は妨害核酸分子を該神経細胞中に導入することによって減少される。該アンチセンス又は妨害核酸分子は、前記細胞中に任意に、適切な処方で、「例えば」直接導入されることができ、又は、それは、該ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を阻害できる（アンチセンス又は妨害）核酸配列を含む発現構築物を該細胞中に導入することによって、該細胞のインサイチューで生成されることができ、ここで、任意に、該アンチセンス又は妨害核酸配列は、該神経細胞中で核酸配列の発現を推進できるプロモーターの制御下にある（下記参照）。
【００２０】
本発明の方法において、該神経細胞は、好ましくは、発生又は再生の必要な神経細胞である。そのような細胞は、外傷性の挫傷、裂離、圧迫、及び／又は切除又は他の物理的傷害、又は、外科的な方法によって誘発されたか又は外科的な方法の結果の何れかの組織障害、血管性の薬理的な又は出血性の又は虚血性の障害を含む他の傷害、又は神経変性の又は他の神経学的な疾病から生じた神経系の破壊において見出される。発生又は再生を必要とする神経細胞は、抹消神経系(PNS)の神経細胞であってよいが、しかし、好ましくは、中枢神経系(CNS)の細胞であり、特に、皮質脊髄路(CST)の神経細胞である。本発明の方法において発生又は再生を必要とする細胞が通常は神経細胞であるとはいえ、神経細胞の周囲（近傍）における他のタイプの細胞も、（再）発生に対する神経細胞の能力に影響し得る。それ故、本発明は、（再）発生を必要とする神経細胞の環境における細胞中での、本発明のポリペプチドの活性度又は定常状態レベルを変化させることに関する側面も明確に含む。そのような環境細胞は、例えば、グリア細胞、シュワン細胞、軟膜腫瘍(scleptomeningeal)線維芽細胞、破壊中心に侵入する血液由来の細胞、星状細胞及び髄膜細胞を含む。
【００２１】
さらなる側面において、本発明は、被験者における神経外傷性傷害又は神経変性疾患を治療するための方法に属する。該方法は、好ましくは、被験者の傷害又は損傷した神経細胞中で、上記で定義されたような本発明のポリペプチドの活性度又は定常状態レベルを薬理学的に変化させることを含む。好ましくは、該変化は、該傷害または損傷した神経細胞の（軸索の）発生又は再生を誘導するのに十分である。本発明の方法において、神経外傷性傷害は上記で記載されたようなものであり、同様に、被験者における傷害又は変性された神経細胞は、PNS、CNS及び／又はCSTの神経細胞であり得る。
【００２２】
本発明の方法において、該神経変性疾患は、脳血管障害(CVA)、アルツハイマー病 (AD)、血管関連痴呆、クロイツフェルト-ヤーコプ病(CJD)、ウシ海綿状脳症 (BSE)、パーキンソン病(PD)、脳外傷、多発性硬化症 (MS)、筋萎縮性側索硬化症(ALS-ルー・ゲーリック病)及びハンチントン舞踏病から選択される疾患であり得る。
【００２３】
本発明の方法は、好ましくは、本明細書で定義されるようなTFポリペプチドの活性度又は定常状態レベルを調節するための核酸構築物を含む治療的有効量の医薬組成物を、該被験者に投与する工程を含む。該核酸構築物は、後述でさらに特定されるような発現構築物であってよい。好ましくは、該発現構築物は、アデノウイルス、アデノ関連性ウイルス(AAV)、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス及びレトロウイルスに基づく遺伝子療法ベクターから選択されるウイルス性遺伝子療法ベクターである。好ましいウイルス性遺伝子療法ベクターは、AAV又はレンチウイルスベクターである。或いは、該核酸構築物は、RNA干渉の可能なアンチセンス分子又はRNA分子のような、本発明のTFポリペプチドの発現を阻害するためのものであり得る（下記参照）。該方法において、該核酸構築物を含む医薬組成物は、好ましくは神経細胞の傷害又は変性の部位において投与される。
【００２４】
さらなる側面において、本発明は、上記定義のTFポリペプチドの活性度又は定常状態レベルを調節するため、好ましくは、上記定義の本発明の方法において、神経細胞の再生を促進するための医薬の製造のための、核酸構築物の使用に関する。好ましくは、該核酸構築物は、好ましくは上記で定義された本発明の方法における、神経外傷性傷害又は神経変性疾患の治療のための医薬の製造のために用いられる。
【００２５】
さらなる側面において、本発明は、被験者における神経細胞の発生又は再生の状態を診断する方法に属する。該方法は、(a) 被験者の発生又は再生した神経細胞における、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の発現レベルを測定すること；及び、(b) 該核酸配列の発現レベルを、該核酸配列の発現レベルの基準値と比較すること、該基準値は好ましくは、健康な個体の神経細胞中の該発現レベルの平均値である；工程を含む。好ましくは、該方法において、該核酸配列の発現レベルは、該核酸配列によってコードされるポリペプチドの量を定量することによって間接的に測定される。より好ましくは、該発現レベルは、被験者から得られるサンプルにおいてエキソビボで測定される。
【００２６】
本発明のさらなる側面は、核酸構築物に関連する。該核酸構築物は、以下から選択される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列の全部又は一部を含む：(a) 配列番号：１〜１４６から選択される核酸配列と少なくとも60, 70, 80, 85, 90, 95, 98又は99%の同一性を有する核酸配列；及び、(b) 配列番号：１〜１４６から選択される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも60, 70, 80, 85, 90, 95, 98又は99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列。好ましくは、該核酸配列は、該神経細胞中で核酸配列の発現を推進できるプロモーターに作動可能に連結される。
【００２７】
好ましい核酸構築物において、該核酸配列は次から選択される：(a) 配列番号：23, 35, 45, 65, 14, 32, 43, 72, 11, 12, 28, 8, 51, 4, 3, 42, 48, 52, 61, 5, 6, 10, 17, 49, 55, 58, 64, 70, 73, 27, 40, 96, 108, 118, 138, 87, 105, 116, 145, 84, 85, 101, 81, 124, 77, 76, 115, 121, 125, 134, 78, 79, 83, 90, 122, 128, 131, 137, 143, 146, 100,及び113から選択される配列と少なくとも60, 70, 80, 85, 90, 95, 98又は99%の同一性を有する核酸配列；及び、(b) 配列番号：23, 35, 45, 65, 14, 32, 43, 72, 11, 12, 28, 8, 51, 4, 3, 42, 48, 52, 61, 5, 6, 10, 17, 49, 55, 58, 64, 70, 73, 27, 40, 96, 108, 118, 138, 87, 105, 116, 145, 84, 85, 101, 81, 124, 77, 76, 115, 121, 125, 134, 78, 79, 83, 90, 122, 128, 131, 137, 143, 146, 100,及び113から選択される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも60, 70, 80, 85, 90, 95, 98又は99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列。より好ましい選択は、配列番号：23, 35, 45, 65, 14, 32, 43, 72, 11, 12, 28, 96, 108, 118, 138, 87, 105, 116, 145, 84, 85,及び101を含み；及び最も好ましい選択は、配列番号：8, 51, 4, 3, 42, 48, 52, 61, 5, 6, 10, 17, 49, 55, 58, 64, 70, 73, 27, 40, 81, 124, 77, 76, 115, 121, 125, 134, 78, 79, 83, 90, 122, 128, 131, 137, 143, 146, 100,及び113を含む。
【００２８】
或いは、本発明の核酸構築物は、RNAi剤、即ち、RNA干渉できるRNA分子又はRNA干渉できるRNA分子の部分、をコードする核酸配列を含むか又はそれから成る。そのようなRNA分子は、siRNA（スモールインターフェリングRNA、例えば、ショートヘアピンRNAを含む)と称される。該RNAi剤をコードする核酸は、好ましくは、以下から選択される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現を阻害できる細胞性の核酸配列と、十分な相補性を有する：(a) 配列番号：１〜１４６から選択される核酸配列と少なくとも 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98又は99%の同一性を有する核酸配列；及び、(b) 配列番号：１〜１４６から選択される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも60, 70, 80, 85, 90, 95, 98又は99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列。好ましい核酸構築物において、該核酸配列は、次から選択される：(a) 配列番号：31, 69, 53, 18, 21, 26, 30, 36, 39, 44, 46, 60, 66, 71, 13, 19, 25, 47, 24, 9, 1, 20, 22, 63, 67, 2, 7, 15, 16, 34, 37, 38, 41, 50, 54, 56, 57, 62, 68, 29, 59, 33, 104, 142, 126, 91, 94, 99, 103, 109, 112, 117, 119, 133, 139, 144, 86, 92, 98, 120, 97, 82, 74, 93, 95, 136, 140, 75, 80, 88, 89, 107, 110, 111, 114, 123, 127, 129, 130, 135, 141, 102, 132,及び105から選択される配列と少なくとも60, 70, 80, 85, 90, 95, 98又は99%の同一性を有する核酸配列；及び、(b) 配列番号：31, 69, 53, 18, 21, 26, 30, 36, 39, 44, 46, 60, 66, 71, 13, 19, 25, 47, 24, 9, 1, 20, 22, 63, 67, 2, 7, 15, 16, 34, 37, 38, 41, 50, 54, 56, 57, 62, 68, 29, 59, 33, 104, 142, 126, 91, 94, 99, 103, 109, 112, 117, 119, 133, 139, 144, 86, 92, 98, 120, 97, 82, 74, 93, 95, 136, 140, 75, 80, 88, 89, 107, 110, 111, 114, 123, 127, 129, 130, 135, 141, 102, 132,及び105から選択される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも60, 70, 80, 85, 90, 95, 98又は99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列。より好ましい選択は、配列番号：31, 69, 53, 18, 21, 26, 30, 36, 39, 44, 46, 60, 66, 71, 13, 19, 25, 47, 24, 9, 1, 104, 142, 126, 91, 94, 99, 103, 109, 112, 117, 119, 133, 139, 144, 86, 92, 98, 120, 97, 82,及び74を含み；及び最も好ましい選択は、配列番号：20, 22, 63, 67, 2, 7, 15, 16, 34, 37, 38, 41, 50, 54, 56, 57, 62, 68, 29, 59, 33, 93, 95, 136, 140, 75, 80, 88, 89, 107, 110, 111, 114, 123, 127, 129, 130, 135, 141, 102, 132,及び105を含む。任意に、RNAi剤をコードする該核酸配列は、前記神経細胞中で該核酸配列の発現を推進できるプロモーターと作動可能に連結される。
【００２９】
本発明の核酸構築物において、該プロモーターは好ましくは、神経細胞に特異的なプロモーターである。神経細胞に特異的なプロモーターは、他のタイプの細胞よりも神経細胞においてより高い転写率を有するプロモーターである。神経細胞中のプロモーターの転写率は好ましくは、非神経細胞中よりも少なくとも1.1、1.5、2.0又は5.0倍高い。
【００３０】
本発明の核酸構築物中で使用するのに適し、神経細胞中での発現を推進できるプロモーターは、以下から選択される核酸配列を含むmRNAをコードする遺伝子のプロモーターを含む：(a) 配列番号：１〜１４６から選択される核酸配列と少なくとも60, 70, 80, 85, 90, 95, 98又は99%の同一性を有する核酸配列；及び、(b) 配列番号：１〜１４６から選択される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも60, 70, 80, 85, 90, 95, 98又は99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列。好ましくは、該核酸配列は、配列番号：31, 69, 53, 18, 21, 26, 30, 36, 39, 44, 46, 60, 66, 71, 13, 19, 25, 47, 24, 9, 1, 20, 22, 63, 67, 2, 7, 15, 16, 34, 37, 38, 41, 50, 54, 56, 57, 62, 68, 29, 59, 33, 104, 142, 126, 91, 94, 99, 103, 109, 112, 117, 119, 133, 139, 144, 86, 92, 98, 120, 97, 82, 74, 93, 95, 136, 140, 75, 80, 88, 89, 107, 110, 111, 114, 123, 127, 129, 130, 135, 141, 102, 132,及び105から選択される；より好ましくは、該核酸配列は、配列番号：31, 69, 53, 18, 21, 26, 30, 36, 39, 44, 46, 60, 66, 71, 13, 19, 25, 47, 24, 9, 1, 104, 142, 126, 91, 94, 99, 103, 109, 112, 117, 119, 133, 139, 144, 86, 92, 98, 120, 97, 82,及び74から選択される。本発明の核酸構築物において使用され、神経細胞中での発現を推進できる他の適切なプロモーターは、GAP43プロモーター、FGF受容体プロモーター及び神経細胞特異的エノラーゼプロモーターを含む。本発明のDNA構築物中で使用するためのプロモーターは、好ましくは、哺乳類起源のものであり、より好ましくはヒト起源のものである。
【００３１】
好ましい態様において、該核酸構築物は、アデノウイルス、アデノ関連性ウイルス(AAV)、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス及びレトロウイルスに基づく遺伝子療法ベクターから選択されるウイルス性遺伝子療法ベクターである。好ましいウイルス性遺伝子療法ベクターは、AAV又はレンチウイルスベクターである。そのようなベクターは、以下にさらに詳細に記載する。
【００３２】
またさらなる側面において、本発明は、神経細胞の再生を促進できる物質の同定の方法に関する。該方法は好ましくは、次の工程を含む：(a) 本発明のTFポリペプチドをコードする核酸配列を発現できる試験細胞集団を用意すること；(b) 該試験細胞集団を前記物質に接触させること；(c) 前記物質と接触した前記試験細胞集団における核酸配列の発現レベル又は前記ポリペプチドの活性度又は定常状態レベルを測定すること；(d) 前記(c)で測定された発現、活性度又は定常状態レベルを、前記物質と接触していない試験細胞集団における核酸配列又は前記ポリペプチドの発現、活性度又は定常状態レベルと比較すること；及び、(e) 前記物質と接触した試験細胞集団と、前記物質と接触していない試験細胞集団との間で、前記核酸配列又は前記ポリペプチドの発現レベル、活性度又は定常状態レベルにおける相違を生じさせる物質を同定すること。好ましくは、該方法において、二以上の核酸配列又は二以上のポリペプチドの発現レベル、活性度又は定常状態レベルが比較される。好ましくは、該方法において、該試験細胞集団は、例えば、F11細胞株及び／又は本明細書の実施例に記載された他の細胞又は細胞株のような、初生(primairy)感覚性神経細胞（例えば、DRG神経細胞）、感覚神経細胞株の細胞を含む。該試験細胞集団は好ましくは、哺乳類細胞を含み、より好ましくはヒト細胞を含む。一つの側面において、本発明はまた、上記方法において同定された物質に属する。
【００３３】
配列同一性
「配列同一性(Sequence identity)」は本明細書において、二以上のアミノ酸（ポリペプチド又はタンパク質）配列又は二以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列の間の、該配列を比較することによって決定される関係として定義される。当該分野において、「同一性」とは、そのような配列のストリングスの間のマッチによって決定されるような、アミノ酸又は核酸配列の間の配列の関連性の程度も意味する。二つのアミノ酸配列の間の「類似度(Similarity)」は、アミノ酸配列と、一つのポリペプチドと第二のポリペプチドの配列の保存されたアミノ酸置換を比較することによって決定される。「同一性(Identity)」及び「類似度」は、既知の方法によって容易に算出可能であり、それには、これらに限定されないが、「Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988」、「Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993」、「Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994」、「Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987」及び「Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988)」に開示された方法が含まれる。
【００３４】
同一性を決定する好ましい方法は、試験された配列間で最大の一致を与えるように設計される。同一性及び類似度を決定するための方法は、公的に入手可能なコンピュータープログラムにおいて体系化されている。二つの配列間の同一性及び類似度を決定するための好ましいコンピュータープログラムは、例えば、GCGプログラムパッケージ(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984))、BestFit、BLASTP、BLASTN、及びFASTA (Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)を含む。BLAST Xプログラムは、NCBI及び他の提供元 (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990) から公に入手可能である。周知のスミス・ウォーターマン・アルゴリズム(Smith Waterman algorithm)もまた、同一性の決定に使用可能である。
【００３５】
ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメーターは、以下を含む：アルゴリズム：Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970)；比較マトリクス：BLOSSUM62 from Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992)；ギャップペナルティ：12；及び、ギャップ長さペナルティ：4。それらのパラメーターによる有用なプログラムは、「Oギャップ」プログラムとしてジェネティクス・コンピューター・グループ（located in Madison, WI.）から公的に入手可能である。上述のパラメーターは、アミノ酸比較のためのデフォルトパラメーターである（末端ギャップについてはペナルティなし）。
【００３６】
核酸比較に好適なパラメーターは、以下を含む：アルゴリズム：Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970)；比較マトリクス：一致＝+10、不一致＝0；ギャップペナルティ：50；ギャップ長さペナルティ：3。上記で与えられる入手可能なギャッププログラム（Genetics Computer Group, located in Madison, Wis.）は、核酸比較のためのデフォルトパラメーターである。
【００３７】
任意に、アミノ酸の類似度の程度を決定するために、技術者は、技術者には明らかな、いわゆる「保存された」アミノ酸置換を考慮にいれ得る。保存されたアミノ酸置換は、同様の側鎖を有する残基の可換性を指す。例えば、脂肪族の側鎖を有するアミノ酸のグループはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループはセリン及びスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループはアスパラギン及びグルタミンであり；芳香族の側鎖を有するアミノ酸のグループはフェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり；塩基性の側鎖を有するアミノ酸のグループはリジン、アルギニン、及びヒスチジンであり；及び、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループはシステイン及びメチオニンである。好ましい保存されたアミノ酸置換グループは、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リジン-アルギニン、アラニン-バリン、及びアスパラギン-グルタミンである。ここで開示されたアミノ酸配列の置換の変形は、該開示された配列の少なくとも一つの残基が除かれ、異なる残基がその場所に置かれたものである。好ましくは、該アミノ酸変化は保存される。天然のアミノ酸のそれぞれについて好適な保存された置換は、次の通りである：Alaからserへ；Argからlysへ；Asnからgln又はhisへ；Aspからgluへ；Cysからser又はalaへ；Glnからasnへ；Gluからaspへ；Glyからproへ；Hisからasn又はglnへ；Ileからleu又はvalへ；Leuからile又はvalへ；Lysからargへ；gln又はglu；Metからleu又はileへ；Pheからmet、leu又はtyrへ；Serからthrへ；Thrからserへ；Trpからtyrへ；Tyrからtrp又はpheへ；及び、Valからile又はleuへ。
【００３８】
ポリペプチドの組換え産生のための組換え技術及び方法
本発明において用いるポリペプチドは、組換え技術を用いて調製することができ、これは、興味のポリペプチドをコードする核酸配列が適切な宿主細胞中で発現される。本発明は従って、上記で定義された核酸分子又は核酸配列を含むベクターの使用にも関する。好ましくは、該ベクターは、該ベクターに適する宿主中で該ベクターの増殖を保証する複製開始点（又は自己複製配列）を含む複製ベクターである。或いは該ベクターは、例えば、相同性組換え又はその他によって該宿主細胞のゲノムに組込まれることができる。特に好ましいベクターは、上記定義のポリペプチドをコードする核酸配列が、該ベクターのための宿主細胞中で該コーディング配列の発現を指示できるプロモーターに作動可能に連結された発現ベクターである。
【００３９】
ここで用いられるように、「プロモーター」という用語は、一以上の遺伝子の転写を制御するために機能し、該遺伝子の転写開始部位の転写方向に関して上流に位置し、DNA依存性RNAポリメラーゼ、転写開始部位及びこれらに限定されないが、転写因子結合部位、レプレッサー及び活性化因子タンパク質結合部位を含む任意の他のDNA配列、及び、該プロモーターからの転写の量を制御するために直接的に又は間接的に働く、当該分野の技術者に周知の任意の他のヌクレオチド配列、のための結合部位の存在によって構造的に確認される、核酸断片を指す。「構成的」プロモーターは、ほとんどの生理的及び発生的な条件下で活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、生理的又は発生的な条件に依存して制御されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、好ましくは神経細胞又は組織のような、特定のタイプの分化した細胞／組織においてのみ活性である。
【００４０】
発現ベクターは、組換え技術を用いて上記定義のような本発明のポリペプチドを調製することを可能にし、Ausubelらの「Current Protocols in Molecular Biology」（Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987)）及び「Sambrook and Russell (2001, supra)」（いずれもその全てが参照によって本明細書に援用される）に開示されたように、所望のポリペプチドをコードするその核酸配列は、適切な細胞、例えば培養細胞又は多細胞生物の細胞中で発現される。「Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:488」（部位特異的変異誘発を記載）及び「Roberts et al. (1987) Nature 328:731-734」又は「Wells, J.A., et al. (1985) Gene 34: 315」（カセット変異誘発を記載）もまた参照される。
【００４１】
典型的には、所望のポリペプチドをコードする核酸は、発現ベクター中で用いられる。「発現ベクター」という句は、一般に、そのような配列と適合性の宿主中で遺伝子の発現に影響できる核酸配列を指す。それらの発現ベクターは、典型的には、少なくとも適切なプロモーター配列、及び任意に、転写終結シグナルを含む。発現に影響するために必要であるか又はそれに役立つさらなる因子も、ここで記載されたように使用されることができる。DNAがコードするポリペプチドは、インビトロ細胞培養中に導入され、その中で発現されることができるＤＮＡ構築物中に組込まれる。特に、DNA構築物は、原核生物の宿主、例えば大腸菌のような細菌中での複製に適合性であるか、又は、培養された哺乳類、植物、昆虫の、例えばSf9、酵母、真菌又は他の真核生物の細胞株中に導入されることができる。
【００４２】
特定の宿主細胞中に導入されるために調製されたDNA構築物は、典型的には、宿主によって認識される複製システム、所望のポリペプチドをコードする意図されたDNAセグメント、及び、ポリペプチド-コーディング配列に作動可能に連結された、転写及び翻訳開始及び終結制御配列を含む。DNAセグメントは、それが他のDNAセグメントとの機能的な関係に置かれる場合、「作動可能に連結される(operably linked)」。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、それが該配列の転写を刺激する場合、コーディング配列に作動可能に連結される。シグナル配列のためのDNAは、それが、該ポリペプチドの分泌に関与する前タンパク質として発現される場合、ポリペプチドをコードするDNAに作動可能に連結される。一般に、作動可能に連結されるDNA配列は近接され、シグナル配列の場合は、近接されるとともにリーディングフレーム内である。しかしながら、エンハンサーは、それが転写を制御するコーディング配列と近接される必要がない。連結は、従来の制限部位又はそれらの代わりに挿入されたアダプター又はリンカーにおいて、ライゲーションによって達成される。
【００４３】
適切なプロモーター配列の選択は、一般に、該DNAセグメントの発現のために選択された宿主細胞に依存する。適切なプロモーター配列の例は、当該分野で周知の原核生物及び真核生物のプロモーターを含む（例えば、Sambrook and Russell, 2001, supraを参照）。転写制御配列は、典型的には、宿主によって認識される異種性のエンハンサー又はプロモーターを含む。適切なプロモーターの選択は宿主に依存するが、trp、lac及びファージプロモーターのようなプロモーター、tRNAプロモーター及び解糖酵素プロモーターが知られており利用可能である（例えば、Sambrook and Russell, 2001, supraを参照）。発現ベクターは、複製システム並びに転写及び翻訳調節配列を、該ポリペプチドコーディングセグメントを使用可能にする挿入部位と共に含む。細胞株と発現ベクターの作動可能な組合せの例は、「Sambrook and Russell (2001, supra)」及び「Metzger et al. (1988) Nature 334: 31-36」に開示されている。例えば、適した発現ベクターは、酵母、例えばS.cerevisiae、例えば昆虫細胞、例えばSf9細胞、哺乳類細胞、例えばCHO細胞及び細菌細胞、例えばE. coli中で発現可能である。宿主細胞は、例えば、原核生物又は真核生物の宿主細胞であってよい。宿主細胞は、液体又は固体培地での培養に適する宿主細胞であってよい。宿主細胞は、上記定義のような本発明のポリペプチドを生産するための方法において用いられる。該方法は、該ポリペプチドの発現の助けとなる条件下で宿主細胞を培養する工程を含む。任意に該方法は、該ポリペプチドの回収を含み得る。該ポリペプチドは、例えば、当該分野で既知の種々のクロマトグラフィー方法を含む、標準的なタンパク質精製技術によって該培養培地から回収され得る。
【００４４】
或いは、該宿主細胞は、遺伝子組換え植物又は動物、好ましくは非ヒト動物のような多細胞生物の部分である細胞である。遺伝子組換え植物は、その細胞の少なくとも一部に、上記定義のようなベクターを含む。遺伝子組換え植物を生成する方法は、例えば、U.S. 6,359,196及びそれに挙げられる参照文献に開示されている。そのような遺伝子組換え植物は、上記定義のような本発明のポリペプチドを生産するための方法において用いることができ、該方法は、その細胞中に該ベクターを含み、それによって該植物部分が該ポリペプチドを含む遺伝子組換え植物の一部、或いは、そのような遺伝子組換え植物の子孫の一部を回収する工程を含み、任意に、該植物部分からの該ポリペプチドの回収を含む。そのような方法もU.S. 6,359,196及びそれに挙げられる参照文献に開示されている。同様に、遺伝子組換え動物は、上記で定義されたようなベクターをその体細胞及び胚細胞中に含む。該遺伝子組換え動物は、好ましくは非ヒト動物である。遺伝子組換え動物を生成するための方法は、例えば、WO 01/57079及びそれに挙げられる参照文献に開示されている。そのような遺伝子組換え動物は、上記で定義された本発明のポリペプチドを生産するための方法において用いられることができ、該方法は、該ベクターを含む遺伝子組換え動物またはそれらの雌の子孫から体液を回収する工程を含み、ここで該体液は該ポリペプチドを含み、及び任意に、該体液からのポリペプチドの回収を含む。そのような方法も、WO 01/57079及びそれに挙げられる参照文献に開示されている。該ポリペプチドを含む体液は好ましくは血液であり、より好ましくは乳である。
【００４５】
ポリペプチドを調製するための他の方法は、インビトロ転写／翻訳システムを用いる。DNAがコードするポリペプチドは、上述の発現ベクター中にクローン化される。該発現ベクターは、次いで、インビトロで転写され翻訳される。翻訳産物は直接、使用されることができ、または最初に精製される。インビトロ翻訳で得られたポリペプチドは、固有なミクロソームの存在のために、幾つかの翻訳後修飾が生じ得るにもかかわらず、典型的には、インビボで合成されたポリペプチド上に存在する翻訳後修飾を含まない。インビトロ翻訳によるポリペプチドの合成方法は、例えば、「Berger ＆ Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1987」に記載されている。
【００４６】
遺伝子療法
本発明の幾つかの側面は、上記で定義される核酸配列を含む核酸構築物または発現ベクターの使用に関し、ここで該ベクターは、遺伝子療法に適したベクターである。遺伝子療法に適したベクターは、以下に開示されている：Anderson 1998, Nature 392: 25-30; Walther及びStein, 2000, Drugs 60: 249-71; Kay et al., 2001, Nat. Med. 7: 33-40; Russell, 2000, J. Gen. Virol. 81: 2573-604; Amado and Chen, 1999, Science 285: 674-6; Federico, 1999, Curr. Opin. Biotechnol.10: 448-53; Vigna及びNaldini, 2000, J. Gene Med. 2: 308-16; Marin et al., 1997, Mol. Med. Today 3: 396-403; Peng and Russell, 1999, Curr. Opin. Biotechnol. 10: 454-7; Sommerfelt, 1999, J. Gen. Virol. 80: 3049-64; Reiser, 2000, Gene Ther. 7: 910-3；及びそれらで挙げられた参照文献。
【００４７】
特に好適な遺伝子療法ベクターは、アデノウイルス及びアデノ関連性ウイルス(AAV)ベクターを含む。それらのベクターは、神経細胞を含む極めて多くの数の分裂及び非分裂の細胞タイプに感染する。さらに、アデノウイルスベクターは、高レベルの導入遺伝子発現が可能である。しかしながら、細胞侵入後のアデノウイルス及びAAVベクターのエピソームの性質のために、それらのウイルスベクターは、上記で示したような導入遺伝子(Russell, 2000, J. Gen. Virol. 81: 2573-2604; Goncalves, 2005, Virol J. 2(1):43) の一過性の発現のみを必要とする治療上の適用のために最も適している。好ましいアデノウイルスベクターは、Russell (2000, supra)によって概説されたように、宿主応答を減少させるように改変される。AAVベクターを用いた神経細胞遺伝子療法のための方法は、「Wang et al., 2005, J 遺伝子Med. March 9 (Epub ahead of print), Mandel et al., 2004, Curr Opin Mol Ther. 6(5):482-90」及び「Martin et al., 2004, Eye 18(11):1049-55」に開示されている。神経細胞遺伝子導入AAV血清型2は有効なベクターであり、それ故、好ましいAAV血清型である。
【００４８】
本発明で適用される好ましいレトロウイルスベクターは、レンチウイルスに基づく発現構築物である。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染する独特の能力を有する(Amado and Chen, 1999 Science 285: 674-6)。レンチウイルスに基づく発現構築物の作成及び使用の方法は、米国特許第6,165,782号、同第6,207,455号、同第6,218,181号、同第6,277,633号及び同第6,323,031号、及び「Federico (1999, Curr Opin Biotechnol 10: 448-53)」及び「Vigna et al. (2000, J Gene Med 2000; 2: 308-16)」に記載されている。
【００４９】
一般に、遺伝子療法ベクターは、それらが発現されるべき本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含み、該核酸配列が上記の適切な調節配列と作動可能に連結されるという意味で、上記の発現ベクターである。そのような調節配列は、少なくともプロモーター配列を含む。遺伝子療法ベクターのポリペプチドをコードする核酸配列の発現に適したプロモーターは、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)介在(intermediate)初期プロモーター、マウスモロニー白血病ウイルス(MMLV)  ラウス肉腫ウイルス、又はHTLV-1のようなウイルス性ロングターミナルリピートプロモーター(LTRs)、シミアンウイルス40(SV 40)初期プロモーター及び単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターを含む。適切な神経細胞のプロモーターは上記で記載している。
【００５０】
幾つかの誘導性プロモーターシステムは、小さい有機化合物又は無機化合物の投与によって誘導され得ることが開示されている。そのような誘導性プロモーターは重金属によって制御されるものを含み、例えば、メタロチオネインプロモーター (Brinster et al. 1982 Nature 296: 39-42; Mayo et al. 1982 Cell 29: 99-108)、RU-486 (プロゲステロンアンタゴニスト) (Wang et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8180-8184)、ステロイド(Mader and White, 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5603-5607)、テトラサイクリン(Gossen and Bujard 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551；米国特許第5,464,758号；Furth et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9302-9306；Howe et al. 1995 J. Biol. Chem. 270: 14168-14174; Resnitzky et al. 1994 Mol. Cell. Biol. 14: 1669-1679; Shockett et al. 1995 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6522-6526)及びVP16の活性化ドメインとして、tetRポリペプチドで構成される多キメラのトランス活性化因子に基づくtTAER系、及びエストロゲン受容体のリガンド結合ドメイン(Yee et al., 2002, US 6,432,705)である。
【００５１】
RNA干渉（下記参照）による特異的な遺伝子のノックダウンのためのスモールRNAをコードする核酸配列のための適切なプロモーターは、上記のポリメラーゼIIプロモーターに加えて、ポリメラーゼIIIプロモーターを含む。RNAポリメラーゼIII（pol III)は、多様性の大きい、5S、U6を含む小核及び細胞質の非コーディングRNA、アデノウイルスVA1、Vault、テロメラーゼRNA、及びtRNAの合成の原因である。それらのRNAをコードする非常に多くの遺伝子のプロモーター構造は決定されており、RNA pol IIIプロモーターは３つの種類の構造に分かれていることが発見されている（概説には「Geiduschek and Tocchini-Valentini, 1988 Annu. Rev. Biochem. 57: 873-914; Willis, 1993 Eur. J. Biochem. 212: 1-11; Hernandez, 2001, J. Biol. Chem. 276: 26733-36」を参照されたい）。siRNAの発現のために特に適切なものは、RNA pol IIIプロモーターの３型であり、それによって、5'-隣接領域（即ち、転写開始部位の上流）においてのみ発見されるシス作動性の要素によって転写が推進される。上流配列要素は、伝来の（traditional）TATAボックス(Mattaj et al., 1988 Cell 55, 435-442)、近位の配列要素及び遠位の配列要素(DSE; Gupta and Reddy, 1991 Nucl Res. 19, 2073-2075)を含む。3型pol IIIプロモーターの制御下にある遺伝子の例は、U6小核RNA (U6 snRNA)、7SK、Y、MRP、H1及びテロメラーゼRNA遺伝子（例えばMyslinski et al., 2001, Nucl. Acids Res. 21: 2502-09を参照）である。
【００５２】
遺伝子療法ベクターは、任意に、第二の又はさらなるタンパク質をコードする、第二の又は一以上のさらなる核酸配列を含んでよい。第二の又はさらなるタンパク質は、発現構築物を含む細胞の同定、選択及び／又はスクリーニングを可能にする（選択可能）マーカータンパク質であってよい。この目的に適切なマーカータンパク質は、例えば、蛍光タンパク質GFP、及び選択可能マーカー遺伝子HSVチミジンキナーゼ（HAT培地上での選択用）、細菌性ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ（ハイグロマイシンBでの選択用）、Tn5 アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（G418での選択用）、及びジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)（メトトレキセートでの選択用）、CD20、低親和性神経成長因子遺伝子である。それらのマーカー遺伝子を得るための出所及びそれらの使用方法は、「Sambrook and Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York」に提供されている。
【００５３】
或いは、第二の又はさらなる核酸配列は、必要な場合に、遺伝子組換え細胞から被験者を治癒することを可能にする絶対安全なメカニズムを提供するタンパク質をコードし得る。そのような核酸配列は、しばしば自殺遺伝子とも呼ばれるが、プロドラッグを毒性物質に転換できるタンパク質をコードし、該毒性物質は、該タンパク質が発現された遺伝子組換え細胞を死滅させることができるものである。そのような自殺遺伝子の適切な例は、例えば、E.coliシトシン脱アミノ酵素遺伝子又は単純性疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス及び水痘帯状疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子の一つを含み、この場合、ガンシクロビルは、前記被験者におけるIL-10遺伝子組換え細胞を死滅させるプロドラッグとして用いられ得る（例えば、Clair et al., 1987, Antimicrob. Agents Chemother. 31: 844-849を参照）。        
該遺伝子療法ベクターは好ましくは、下記のような適切な医薬品担体を含む医薬組成物中に処方される。
【００５４】
RNA干渉
本発明の特異的なポリペプチドの発現のノックダウンのために、遺伝子療法ベクター又は他の発現構築物が、好ましくはRNAi剤、即ち、RNA干渉の能力があるか又はRNA干渉の能力があるRNA分子の一部であるRNA分子をコードする所望の核酸配列の発現のために用いられる。そのようなRNA分子は、siRNAと称される（ショート・インターフェリングRNA、例えば、ショート・ヘアピンRNAを含む）。或いは、該siRNA分子は直接、例えば医薬組成物中で、神経細胞の傷害又は変性の部位において投与される。
【００５５】
所望の核酸配列は、ターゲット遺伝子mRNAの領域に対して作られたアンチセンスRNAをコードするアンチセンスコードDNA、及び／又はターゲット遺伝子mRNAの同じ領域に対して作られたセンスRNAをコードするセンスコードDNAを含む。本発明のDNA構築物において、該アンチセンス及びセンスコードDNAは、該アンチセンス及びセンスRNAをそれぞれ発現できる上記で定義された一以上のプロモーターに作動可能に連結される。「siRNA」は、哺乳類細胞中で毒性でない、短い長さの二重鎖RNAであるスモールインターフェリングRNA(small interfering RNA)を意味する(Elbashir et al., 2001, Nature 411: 494-98; Caplen et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 9742-47)。その長さは、必ずしも限定されないが２１〜２３ヌクレオチドである。毒性を示さない限り、siRNAの長さは特に限定されない。「siRNAs」は、例えば、少なくとも15、18又は21のヌクレオチドであり、及び25、30、35又は49までのヌクレオチド長であってよい。或いは、発現されるべきsiRNAの最終転写産物の二重鎖RNA部分が、例えば少なくとも15、18又は21のヌクレオチド及び25、30、35又は49までのヌクレオチド長であってよい。
【００５６】
「アンチセンスRNA」は、ターゲット遺伝子mRNAと相補的な配列を有するRNA鎖であり、該ターゲット遺伝子mRNAに結合することによってRNAiを誘導すると見なされている。「センスRNA」は、アンチセンスRNAと相補的な配列を有し、その相補的なアンチセンスRNAにアニールしてsiRNAを形成する。用語「ターゲット遺伝子」は、この文脈において、このシステムによって発現されるsiRNAのために、その発現が沈黙される遺伝子を指し、任意に選択されることができる。このターゲット遺伝子として、例えば、その配列が既知であるが、その機能が解明されていない遺伝子、及び、その発現が疾病の原因であると思われる遺伝子が好ましくは選択される。ターゲット遺伝子は、少なくとも１５ヌクレオチドかそれ以上を有する該遺伝子のmRNAの部分的な配列（これはsiRNAの鎖（アンチセンスRNA鎖）の一つに結合できる長さである）が決定されている限り、そのゲノム配列が完全には解明されていないものであってよい。それ故、そのある程度の配列（好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド）が解明されていない、遺伝子、発現された配列タグ（EST）及びmRNAの部分は、それらの完全長の配列が決定されていないとしても「ターゲット遺伝子」として選択され得る。
【００５７】
二つのRNA鎖が一対になるsiRNAの二重鎖RNA部分は、完全に対になるものに限定されず、ミスマッチ（対応するヌクレオチドが相補的ではない）、ふくらみ(bulge)（鎖上の対応する相補的なヌクレオチドが欠損している）等による対にならない部分を含み得る。対にならない部分は、siRNAの形成を妨害しない程度で含むことができる。「ふくらみ」とは、ここにおいて、好ましくは１〜２の非対ヌクレオチドを含み、二つのRNA鎖が対になる、siRNAの二重鎖RNA領域は、好ましくは１〜７、より好ましくは１〜５のふくらみを含む。さらに、ここで用いられる「ミスマッチ」は、二つのRNA鎖が対になる、siRNAの二重鎖ＲＮＡ領域に、好ましくは１〜７、より好ましくは１〜５の数が含まれる。好適なミスマッチにおいて、ヌクレオチドの一つはグアニンであり、もう一つはウラシルである。そのようなミスマッチは、センスＲＮＡをコードするＤＮＡにおけるＣからＴ、ＧからＡへ又はそれらの混合の突然変異ためであるが、特にはそれらに限定されない。さらにその上、本発明において、二つのRNA鎖が対になるsiRNAの二重鎖RNA領域は、ふくらみとミスマッチの両方を含んでもよく、その合計数は、好ましくは１〜７であり、より好ましくは１〜５である。そのような非対部分（ミスマッチ又はふくらみなど）は、アンチセンス及びセンスコードDNAの間の後述の組換えを抑制でき、下記のsiRNA発現系を安定させることができる。さらにその上、二つのRNA鎖が対になるsiRNAの二重鎖RNA領域において非対部分を含んでいないステムループDNAを配列決定することが困難であるにもかかわらず、該配列決定は、上記のミスマッチ又はふくらみを導入することによって可能になる。さらにその上、対になった二重鎖RNA領域内にミスマッチ又はふくらみを含むsiRNAは、E. coli又は動物細胞中で安定であると言う利点を有する。
【００５８】
siRNAの末端構造は、siRNAが、そのRNAi効果のために前記ターゲット遺伝子発現を沈黙させることができる限り、平滑末端又は突出末端（オーバーハンギング）の何れかであってよい。突出（オーバーハンギング）末端構造は、3'オーバーハングに限らず、それが該RNAi効果を誘導できる限り、5'オーバーハンギング構造も含まれ得る。さらに、オーバーハンギングヌクレオチドの数は、既に報告されている２又は３に限定されず、該オーバーハングがRNAi効果を誘導できる限り任意の数であってよい。例えば、該オーバーハングは、１〜８のヌクレオチドからなり、好ましくは２〜４のヌクレオチドからなる。ここに、突出末端構造を有するsiRNAの全体の長さは、該対になった二重鎖部分の長さと、両端における突出した一本鎖からなる対の長さの合計として表される。例えば、両末端に４ヌクレオチドの突出を有する、１９bpの二重鎖RNA部分の場合、その全長は、２３ｂｐとして表される。さらにその上、この突出配列はターゲット遺伝子に低い特異性を有するために、ターゲット遺伝子配列に相補的（アンチセンス）又は同一（センス）である必要がない。さらにその上、siRNAがそのターゲット遺伝子上での遺伝子サイレンス効果を維持することができる限り、siRNAは低分子量RNA（tRNA、rRNA又はウイルス性RNAのような天然のRNA分子、又は人工的なRNA分子であり得る）を、例えばその一端の突出部分において含み得る。
【００５９】
さらに、「siRNA」の末端構造は、上記のような両末端における構造のカットオフが必要であり、二重鎖RNAの一方の側の末端がリンカーRNAによって連結される、ステムループ構造を有し得る（「shRNA」）。二重鎖RNA領域（ステムループ部分）の長さは、例えば、少なくとも15、18又は21のヌクレオチド及び25、30、35又は49までのヌクレオチドの長さであってよい。或いは、発現されるべきsiRNAの最終転写産物である該二重鎖RNA領域の長さは、例えば、少なくとも15、18又は21のヌクレオチド及び25、30、35又は49までのヌクレオチドの長さである。さらに、リンカーの長さは、それがステム部分の対形成を邪魔しない長さである限りは特に限定されない。例えば、ステム部分の安定な対形成及びタンパク質をコードするDNA間の組換えの抑制のために、該リンカー部分はクローバー型tRNA構造を有し得る。該リンカーが、ステム部分の対形成を邪魔する長さを有したとしても、例えば、該リンカー部分が、該イントロンが前駆体RNAの処理の間に切除されて成熟RNAになり、これによって、該ステム部分の対形成が可能になるようなイントロンを含むように構成することが可能である。ステムループsiRNAの場合、ループ構造を有さない何れの末端（頭部又は尾部）のRNAも、低分子量RNAを有し得る。上記したように、この低分子量RNAは、tRNA、rRNA、snRNA又はウイルス性RNAのような天然RNA分子、又は人工的なRNA分子であってよい。
【００６０】
アンチセンス及びセンスコードDNAからのアンチセンス及びセンスRNAのそれぞれの発現のために、本発明のDNA構築物は、上記で定義したプロモーターを含む。該構築物中の該プロモーターの数及び位置は、基本的に、それがアンチセンス及びセンスコードDNAを発現できる限りは任意に選択される。本発明のDNA構築物の単純な例として、直列型の発現系を形成でき、ここではプロモーターがアンチセンス及びセンスコードDNAの両方の上流に位置する。この直列型の発現系は、両端に上述のカットオフ構造を有するsiRNAを生成できる。ステムループsiRNA発現系（ステム発現系）において、アンチセンス及びセンスコードDNAは、反対方向に配列され、それらのDNAはリンカーDNAを介して構成ユニットに連結される。プロモーターはこのユニットの一方の側に結合されて、ステムループsiRNA発現系を構成する。ここで、リンカーDNAの長さ及び配列は特に限定されず、その配列が終止配列でなく、また、その長さ及び配列が、上記のような成熟RNA生成の間のステム部分対形成を邪魔しない限りは、任意の長さ及び配列を有してよい。上述のtRNAをコードするDNAが例であり、これはリンカーDNAとして用いられることができる。
【００６１】
直列型及びステムループ発現系の両方の場合において、5'末端はプロモーターによる転写を促進できる配列を有し得る。さらに詳細には、直列型のsiRNAの場合、siRNA生成の効率は、アンチセンス及びセンスコードDNAの5'末端におけるプロモーターの転写を促進できる配列を追加することによって改善され得る。ステムループsiRNAの場合、そのような配列は、上記のユニットの5'末端に追加されることができる。そのような配列からの転写は、siRNAによるターゲット遺伝子のサイレンシングが邪魔されない限り、siRNAに結合された状態で用いられ得る。この状態が遺伝子のサイレンシングを邪魔する場合、トリミング手段（例えば、当該分野で既知のリボザイム）を用いて転写物のトリミングを行うことが好ましい。前記アンチセンス及びセンスRNAが同じベクター内で又は異なるベクター内で発現されうることは当業者には明らかである。センス及びアンチセンスRNAの下流の過剰配列の追加を避けるために、それぞれの鎖（アンチセンス及びセンスRNAをコードする鎖）の3'末端における転写のターミネーターを置くことが好ましい。該ターミネーターは、４以上の連続したアデニン(A)ヌクレオチドの配列であってよい。
【００６２】
抗体
本発明の幾つかの側面は、上記定義の本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体又は抗体断片の使用に関する。与えられたポリペプチドに特異的に結合する抗体又は抗体断片の生成方法は、例えば「Harlow and Lane (1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)」及びWO 91/19818；WO 91/18989；WO 92/01047；WO 92/06204；WO 92/18619；及びUS 6,420,113及びそれらの中で挙げられた参考文献に記載されている。「特異的に結合する」という用語は本明細書で用いられる場合、低い親和性及び高い親和性の特異的結合の何れをも含む。特異的な結合は、例えば、少なくとも約10-4 MのKdを有する低親和性の抗体又は抗体断片によって示されることができる。特異的結合はまた、例えば、少なくとも約10-7 M、少なくとも約10-8 M、少なくとも約10-9 M、少なくとも約10-10 MのKdを有する抗体又は抗体断片のような高親和性抗体又は抗体断片によって示されることができ、或いは、少なくとも約10-11 M又は10-12 M以上のKdを有することができる。
【００６３】
ペプチド擬態
ペプチド様分子（ペプチド擬態と称する）又は非ペプチド分子は、本発明のポリペプチド又はその受容体ポリペプチドに特異的に結合し、本発明のポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストとしてここで定義されるような本発明の任意の方法に置いて適用されることができ、それらは、例えば、US 6,180,084（参照によって本明細書に援用される）において詳細に記載されているように、当該分野で周知の方法を用いて同定され得る。そのような方法は、例えばペプチド擬態のライブラリー、ペプチド、ＤＮＡ又はｃＤＮＡ発現ライブラリー、コンビナトリアルケミストリー及び特に有用な、ファージディスプレイライブラリーのスクリーニングを含む。それらのライブラリーは、本発明の実質的に精製されたポリペプチド、それらの断片又はそれらの構造的類似体に、該ライブラリーを接触させることによって、TFポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストをスクリーニングすることができる。
【００６４】
医薬組成物
本発明はさらに、活性成分として上記定義のポリペプチド、抗体又は遺伝子療法ベクターを含む医薬製剤に関する。該組成物は好ましくは、少なくとも薬剤的に許容される担体を該活性成分に加えて含む。
【００６５】
幾つかの方法において、哺乳類、昆虫又は微生物の細胞培養物から、遺伝子組換え哺乳類の乳から、又は他の原料から精製された、本発明のポリペプチド又は抗体は、精製された形態で医薬組成物として医薬担体と共に投与される。ポリペプチドを含む医薬組成物の生成方法は、米国特許第5,789,543号及び同第6,207,718号に開示されている。好ましい形態は、投与及び治療的な施用の意図される様式に依存する。
【００６６】
医薬担体は、該ポリペプチド、抗体又は遺伝子療法ベクターを該患者に送達するのに適する、任意の適合性で非毒性の物質であってよい。滅菌水、アルコール、脂肪、ワックス及び不活性固体が、担体として使用可能である。薬剤的に許容されるアジュバント、緩衝剤、分散剤なども、医薬組成物中に組み入れられ得る。
【００６７】
該医薬組成物中の本発明のポリペプチド又は抗体の濃度は極めて広範であり、即ち、約0.1重量％未満から、通常は少なくとも約1重量％まで、20重量％程度かそれ以上である。
【００６８】
経口投与のために、活性成分は、カプセル、錠剤、及び粉末のような固体剤形、又は、エリキシル、シロップ、及び懸濁液のような液体剤形中に投与されることができる。活性成分は、不活性成分及び、グルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、スターチ、セルロース又はセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ナトリウムサッカリン、タルカム、炭酸マグネシウムなどのような粉末担体と共に、ゼラチンカプセル中に封入されることができる。所望の色、味、安定性、緩衝容量、分散又は他の既知の所望の特徴を加え得る、さらなる不活性成分の例は、酸化鉄（red iron oxide）、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、可食白インクなどである。同様の希釈剤が、錠剤を圧縮するために用いら得る。錠剤及びカプセルは何れも、数時間の期間の後に薬物の連続的な放出を提供するための、持続性放出産物として製造されることができる。圧縮された錠剤は、何れかの不快な味覚を遮蔽し、該錠剤を大気から保護するために、糖被覆又はフィルム被覆されることができ、又は胃腸管における選択的な分解に対して腸溶コーティングされることができる。経口投与のための液体剤形は、患者の認容性を増大させるための色及び味を含むことができる。
【００６９】
該ポリペプチド、抗体又は遺伝子療法ベクターは、好ましくは、非経口的に投与される。非経口的な投与のための製剤のためのポリペプチド、抗体又はベクターは、滅菌されなければならない。滅菌は、凍結乾燥及び再構成の前又はそれに続いて、滅菌濾過膜を濾過することによって容易に達成される。該ポリペプチド、抗体又はベクターの投与のための非経口経路は、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病巣内、頭蓋内、くも膜下腔内による注射又は注入、経皮的、経鼻、頬側、直腸又は膣経路のような既知の方法に従う。ポリペプチド、抗体又はベクターは、注入によって又は大量瞬時投与によって、連続的に投与される。静脈内注入のための典型的な組成物は、任意に20% アルブミン溶液を補充された、10〜50 mlの滅菌0.9% NaCl又は5% グルコース及び1〜50 μgの該ポリペプチド、抗体又はベクターを含んで調製できる。筋肉内注射のための典型的な医薬組成物は、例えば、1〜10 mlの滅菌緩衝水及び1〜100 μgの本発明のポリペプチド、抗体、又はベクターを含んで調製される。非経口的に投与可能な組成物を調製する方法は、当該分野で周知であり、例えば、「Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing, Easton, PA, 1980)（参照によって、全ての目的のためにその全ての内容が本明細書に援用される）」を含む種々の情報源により詳細に記載されている。
【００７０】
治療的施用のために、該医薬組成物は、神経外傷性傷害又は神経変性疾患を被っている患者に、その症状の重篤度を減少する及び／又はさらなる症状の発達を予防又は抑止するのに十分な量で投与される。これを達成するのに適切な量は、「治療的に有効な投与量」又は「予防的に有効な投与量」として定義される。そのような有効な服用量は、状態の重篤度及び患者の健康の一般的な状態に依存する。一般に、治療的又は予防的有効投与量は、好ましくは、該症状を逆転にするのに十分な用量、即ち、感覚性及び／又は運動性の神経の機能を許容されるレベル、好ましくは、正常な影響を受けない健康な個体で見られる平均レベルに（近い）までに回復するのに十分な用量である。
【００７１】
本方法において、該ポリペプチド又は抗体は、通常、週に約1 μg/患者の体重kg又はそれ以上の投与量で患者に投与される。しばしば、投与量は、週に10 μg/kgよりも大きい。投与量措置は、週に10 μg/kgから週に少なくとも1 mg/kgまでである。典型的な投与量措置は、週に10 μg/kg、週に20 μg/kg、週に30 μg/kg、週に40 μg/kg、週に60 μg/kg、週に80 μg/kg及び週に120 μg/kgである。好ましい療法において、10 μg/kg、20 μg/kg又は40 μg/kgが週に一回、二回又は三回、投与される。処置は、好ましくは非経口経路で投与される。
【００７２】
マイクロアレイ
本発明の他の側面は、上記で定義した核酸、ポリペプチド又は抗体を含むマイクロアレイ（又は他の高処理量スクリーニングデバイス）に関する。マイクロアレイは、核酸又はアミノ酸配列又はそれらの混合物を分析するための、一以上の固定化された核酸又はポリペプチド断片を含む固体支持体又は担体である（例えば、WO 97/27317、WO 97/22720、WO 97/43450、EP 0 799 897、EP 0 785 280、WO 97/31256、WO 97/27317、WO 98/08083及びZhu及びSnyder, 2001, Curr. Opin. Chem. Biol. 5: 40-45を参照）。該核酸を含むマイクロアレイは、例えば、上記のような遺伝子型又は発現パターンを分析するための方法において適用され得る。ポリペプチドを含むマイクロアレイは、該ポリペプチドと相互作用する基質、リガンド又は他の分子の適切な候補を検出するために用いられ得る。抗体を含むマイクロアレイは、上記のポリペプチドの発現パターンを分析する方法において用いられ得る。
【００７３】
一般
本明細書及び請求の範囲において、「含む(to comprise)」及びその活用は、その語の次の項目が含まれることを意味するように、非限定的な意味で用いられ、特に言及されない項目を除外しない。加えて、不定冠詞による要素の言及は、該内容が一つの及び唯一の要素であることを要求しない限り、二以上の要素が存在する可能性を排除しない。不定冠詞は従って、通常は「少なくとも一つ」を意味する。
【実施例】
【００７４】
１．実施例I：神経再生に関与する遺伝子転写の転写因子及び／又はモジュレーターの同定
１．１  外科的方法
成体のオスのウィスターラット(± 220g) (Harlan, The Netherlands)をグループケージに収容し、12時間の明/12時間の暗周期を維持し、飼料及び水を自由に利用可能にした。坐骨神経粉砕のために、1.8% イソフルランを用いてラットを麻酔した（0.3 l/min O2; 0.6 l/min N2O中)。坐骨神経を中間大腿レベル（mid-thigh level）で曝露し、溝付あごを有する止血鉗子を30秒間、閉めることによって、粉砕した。後根の粉砕のために、ラットをヒュプノルム(Hypnorm) (クエン酸フェンタニール/フルアニソン：0.06 ml/100g体重；Janssen Pharmaceuticals, Beerse, Belgium)の筋肉内注射で麻酔し、ドルミカム(ミダゾラム：0.015 ml/100g体重；Roche, Almere, The Netherlands)の筋肉内注射で鎮静させた。左腰髄の脊髄根椎を弓切除術によりL2のレベルで曝露した。L4、L5及びL6の後根を、不透明な破壊部位が可視されるまで、滑らかなあごを有する鉗子を該根上で閉じることによって粉砕した。皮膚及び筋肉の切開を層中で閉じた。動物を、術後6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、7日及び14日で、CO2中での鎮静後に断頭することによって屠殺した。コントロールの組織を、傷害を受けていない動物から採取した。遺伝子発現における変化が、概日周期に起因する可能性を防ぐために、全ての動物を一日のうちの同じ時間に屠殺した。後根神経節(DRG)をレベルL4、L5及びL6で解剖し、凍結し、使用まで-80℃で貯蔵した。
【００７５】
１．２  ＲＮＡ単離及び逆転写
動物１匹につき３つのDRGからChomczynski及びSacchi (1987, Anal Biochem. 162(1):156-9)の方法を用いてＲＮＡを単離した。しかしながら、あわ立ちを防ぐために、GTC溶液中のサルコシル（sarcosyl）は割愛した。サルコシルは、ホモジナイズの後に、0.05%の最終容量で添加した。さらなるクロロホルム抽出を行い、微量のフェノールを除去した。RNAを、完全性についてゲル電気泳動でチェックし、写真分光器によって定量した。さらに、３匹の動物の等モル量のRNAをプールし、次いで、cDNA合成のためのバッチ、Cy5標識のためのバッチ、及びCy3標識のためのバッチに分割した。cDNA合成は、オリゴdTプライマー及びスーパースクリプト（Superscript）IIを用いて行い、Cy3及びCy5標識は、アジレント蛍光リニア増幅キット(Agilent Fluorescent Linear Amplification kit)(G2554A)を製造者の説明書に従って用いて行った。
【００７６】
１．３  マイクロアレイ及びハイブリダイゼーション方法
アジレント注文品の8.5K 60-merのアレイを用いた。アレイは、少なくとも一つのmRNA (UG build 101)から成る全〜4500の単遺伝子(UniGene)クラスターを含むように設計した。さらに、DNA結合ドメイン及びLIMドメインがブラストクス(blastx)(Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25(17):3389-402)を用いて同定されたように、恐らくタンパク質ドメインを含有するESTは、我々の生物学的な研究問題に関連する。神経組織中で高度に発現されたか、又は神経組織中に独特であるESTは、NCBIライブラリーブラウザを用いて同定した。ラット、マウス又はヒトにおける既知の配列との類似を示すESTのみを含むクラスターを得るために、残りの8091遺伝子を、単遺伝子（UniGene）中、検索文字列「高度に類似(highly similar)」及び「中程度に類似(moderately similar)」を用いて選択した。アレイのハイブリダイゼーションは、製造者の説明書に従って行った。手短に言えば、0.5 μgのCy5標識化cRNA及びCy3標識化cRNAターゲットを混合し、30分間ハイブリダイズさせた。アレイを、1×ハイブリダイゼーション溶液(Agilent technologies)中で、60℃で18時間、回転性ハイブリダイゼーションチャンバー中で、それらのターゲットと共にインキュベートした。アレイを6×SSC/0.005% トリトンX-102中、10分間室温で、及び、0.1XSSC /0.005% トリトンX-102中、5分間4℃で洗浄し、ファルコン50mLチューブの内側に置き、遠心分離機で回して乾燥した。アレイはアジレント(Agilent)スキャナーを用いてスキャンした。
【００７７】
１．４  マイクロアレイ上で発現及び制御された遺伝子の数
遺伝子が「発現した」と呼ぶ判定基準として、我々はスポット中の画素の強度が局所的なバックグラウンドにおけるピクセルの強度と等しいｐ値を用いた。20merのシロイヌナズナ特異的配列から成るネガティブコントロールスポットを用い、我々のフィルターの効率を評価した。1.0E-5のカットオフにおいて、全てのスポット（一つはネガティブコントロールスポット）を、用いた全２４アレイ上でフィルタードアウト（filtered out）した。このカットオフは、DR及びSNデータセットの両方に存在する7107遺伝子を与える。次に、我々は、シグナル強度の規格化ログレーション（logratios）の線形モデルをフィッティングさせることにより、全ての時点と時点0 (未破壊のコントロール)の間の遺伝子発現の相違を算出した。ボンフェローニ（bonferroni）の矯正されたt-試験を、制御された遺伝子をろ過するために用いた。合計で、7107中1836の遺伝子(26%)が、SN又はDR破壊後の一以上の時点で制御された（表２）。
【００７８】
制御された遺伝子の量を絞るため、我々は、我々のデータの時間面を使用した。間に24時間かそれ以下を有する時点について、少なくとも２つの連続した時点で制御された遺伝子を選択した。これは、1340遺伝子になった。
【表２】
2008545388.tif 000002
【００７９】
１．５  マイクロアレイ分析による遺伝子のさらなる選択
我々は、坐骨神経(SN)への障害後のラットの後根神経節(DRG)神経細胞の、注文設計のアジレントマイクロアレイを用いた大規模な遺伝子発現プロファイリングを行い、これは再生に成功し、また、後根(DR)に対しても行い、これは再生に成功しなかった。我々は、坐骨神経再生後又は後根破壊後の少なくとも２つの連続した時点において制御された、1,340の遺伝子を同定した。最初の24時間に制御された遺伝子は、遺伝子転写(TF)の転写因子又はモジュレーターから成る代表の多すぎるグループのものだった。これは、初期段階（及び恐らく後期段階でも）の再生におけるTFの発現レベルにおける変化が、神経細胞が上手く再生するか否かを決定するという考え、及び、それらの変化が、強い神経突起成長及び機能的な回復のために必要である、変化した遺伝子発現状態をもたらすという考えによって並べられる。
【００８０】
配列の記注、公的に利用可能な、遺伝子存在論(ontology)データベース検索、タンパク質モチーフ検索、及び遺伝子描写キーワード濾過アプローチを含む戦略を併用して用いて、我々は、アレイ上で分析された転写因子の合計数が548であることを見出した。このうち484 (88%)は、アレイのハイブリダイゼーション後に存在することが要求された。484の存在するTFのうち、220のTFは、坐骨神経再生後又は後根破壊後の少なくとも２つの連続した時点で制御される1340遺伝子に区別することができる。それらのうち、０時点と比較して、粉砕後の6時間、12時間、24時間、48時間及び72時間の５つの時点の何れかにおいて、何れの再生パラダイムにおいても、著しく制御された発現を示す94 TFが選択された。初期発現を示す遺伝子は、それらが成功する再生を開始するためにうまくターゲティングされ得るために重要なものであると考えられる。我々は次いで、SNとDRの粉砕パラダイムの間で特異的に制御されないTFを除去した。最初の５つの時点にかけて、平均制御(P＜0.16)が著しく異なる遺伝子のみを選択し、73の遺伝子のグループを得た（表２）。
【００８１】
用いられた全てのTFの制御された発現は、DRGについて及びF11細胞（ラットDRG及びマウス神経芽細胞種のハイブリドーマ）についてもqPCR分析によって確認される。このために、我々は、我々の研究に関連する時点においてのみ、粉砕パラダイムを繰り返した（坐骨神経粉砕は必ず、好ましくは後根粉砕も；n＝8)。６つのRNAサンプルが、選択した候補TFのqPCR決定のために単離される。RNAも他の将来の候補遺伝子の分析のために貯蔵される。
【００８２】
表３は、上記のように選択された73の遺伝子（表２）、それらの配列番号、データベースのアクセス番号及び記注を一覧にした。表４は、統計学的な分析パラメーターを提供する。表５は、坐骨神経(SN)、再生する神経の０時点に関して測定された発現値(log2値)を一覧にした。表６は、後根(DR)、再生しない神経の０時点に関して測定した発現値(log2値)を一覧にした。表７は、それらの配列番号、データベースアクセス番号及び記注を含む、73のラットの配列のヒトの相同分子種(orthologues)を一覧にした。ヒト配列のより詳細な情報は、付録Ａに提供される。
【００８３】
２．実施例II：制御された神経遺伝子の機能に基づくスクリーン
２．１  神経突起成長の定量化
第一に、我々は、主要なDRG神経細胞及びRNAiベクターで処理されたラットF11細胞において、神経突起成長の大規模な定量化を行った。DRG神経細胞は自発的に成長し、関連する遺伝子の遺伝子ノックダウンは、成長の障害をもたらした。F11細胞は、成長応答を発生するためにcAMP経路の刺激を必要とする。大規模スクリーニングのために、我々は、自動化された細胞画像処理設備(Kineticscan from Cellomics)を使用する。この装置は、VUAに存在し、多ウェル形式（例えば96ウェル）でのアッセイを可能にする。複数の写真が各ウェルから撮影され、データベースに保存される。細胞成長は、時間系列でモニターされ、それによって、より細かい成長表現型の相違が明らかにされる。この分析は典型的には、神経突起の長さ、成長速度、分枝点の数を評価する。
【００８４】
siRNAスクリーンは、以前に同定された神経細胞の遺伝子、特にTFのセットに対する機能性に基づくフィルターを提供し、再生の神経突起成長が関連する側面における役割を有するそれらの遺伝子(TF)を同定する。このアプローチは公平なものであり、成長応答に関与するより大きい神経細胞の遺伝子(TF)のネットワークの構成を同定する。このネットワークの再構成は、神経細胞の再生の開始及び促進を制御する鍵となる遺伝子の同定を促進し得る。
【００８５】
さらに、同じタイプのアッセイを用いて、我々は、機能のゲインを得点する。特にF11細胞は、それらが自発性の成長を示さず、その活性化が成長に必須である特定の遺伝子がこの方法において容易に明らかになるために、これに極めて適している。全長神経細胞遺伝子(TF)をコードするアデノウイルスベクターがこの目的のために作成される。
【００８６】
２．１．１  神経突起成長アッセイ１：分離成体後根神経節神経細胞
神経細胞遺伝子の役割は、成体ウィスターラットの培養した後根神経節神経細胞に基づいて、神経突起成長アッセイにおいて研究される。分離されたDRG神経細胞は、96ウェル組織培養プレート中に蒔かれ、適切なアデノウイルスベクターで形質導入される。ノックダウンの効果は、本発明の選択された神経細胞の遺伝子のそれぞれの過剰発現に加えて、短い時点（12、24、36時間）及び長い時点（６日まで）で、培養物中で測定される。
【００８７】
２．１．２  神経突起成長アッセイ２：OEG又はSCの単層上の胚性後根神経節に基づく
神経突起成長における同定されたグリアの遺伝子の役割が、嗅覚の鞘性(ensheething)グリア細胞(OEG)又はSCの単層上に置かれた胚性後根ガングリアの共培養において研究される。96ウェルプレートはPLLで被覆され、8.5 x 103 OEG又はSCを播種される。細胞は、PEX及びフォルスコリンを含む培地中で培養される。細胞は、本発明の選択された神経細胞の遺伝子の発現のノックダウン又は活性化のための、異なるアデノウイルスベクターを形質導入される。各ウェルは、一つの遺伝子を分析するための単一のバイオアッセイとして用いられ、各遺伝子は三通りで分析される。３日後、後根神経節(DRG)を妊娠中のラットの胚性14日(E14)の胚から取り出す。各ウェルにおいて、一つのDRGが、形質導入したOEG又はSCの単層の上層に置かれる。OEG又はSCの、DRGとの共培養は、DMEM中、10% FCS/ 1% PSで、24時間増殖させる。神経突起成長を可視化させるため、培養物をPBS中4% PFAで固定し、ラット神経フィラメントに対する抗体2H3と共にインキュベートされ、続いて、Cy3-接合体二次抗体と共にインキュベートされる。各ウェルからの神経突起成長は、細胞スクリーン装置及び先に記載されたソフトウェアを用いた高処理量方法で定量化される。非感染のOEG又はSCにおけるDRG成長のコントロールアッセイも、神経突起成長の比較に含まれる。
【００８８】
2.1.3 神経突起成長アッセイ３：F-11 後根神経節細胞株に基づく
F11細胞は、ラット胚性DRG神経細胞及びマウスの神経芽細胞腫細胞株N18TG2 (Platika et al., PNAS, 1985)のハイブリドーマである。F-11細胞は、標準的な培養条件下で維持される；10% FCS、100U/mlペニシリン及び100 mg/mlストレプトマイシンを補充されたDMEM、37℃、5% CO2。分化を誘導するために、細胞は0.5% FCS及び0.5 mM db-cAMP又は10 μM フォルスコリンを含むDMEM中でインキュベートされる。F-11細胞は、複数ウェルの形式で培養される。
【００８９】
３．実施例III：細胞及び遺伝子療法による、損傷した脊椎、腹側根及び坐骨神経の修復
我々及び他の研究者は、傷害後の脊椎において形成された神経の傷跡の非許容的なテライン（terrain）を改変するために、細胞性移植片及び遺伝子療法（生体外の遺伝子療法）を併用した。それらの研究の目的は、阻害性の神経傷跡を通して及びそれを超えて、損傷した軸索の再生を促進することである。
【００９０】
生体外遺伝子療法に加えて、我々は、ヒトにおける腕神経叢傷害のモデルである前根裂離破壊後の直接的な遺伝子導入の有効性を実証した。前根裂離後、運動神経細胞は通常、２〜４週間以内に死ぬ。我々は、アデノ関連ウイルスベクターが媒介する成長因子GDNFの発現を裂離した運動性神経細胞中に配向することによって、著しい数の運動性神経細胞を救出することができた。それらの研究における科学的な文献は、付録Ｂに一覧表記する。近年の研究において、我々は、シュワン細胞を、成長因子NGFを発現させるウイルスベクターにより、傷害の遠位に形質導入することにより、切断されたラットの抹消神経の再生を促進することができた。NGF発現ベクターを受けた動物は、コントロールベクターで処置した動物よりも、後足の感覚性機能がより早く回復することを示した。臨床的な適用に向けての次のステップとして、我々は、ヒト神経の生検が、培養物において遺伝的に改変され得ること、及びその結果として、高レベルの神経栄養性の因子が分泌されることを示した。
【００９１】
それらの研究をまとめると、細胞及び遺伝子療法によって、傷害した中枢神経細胞及び抹消神経細胞の修復性の応答を増強することが可能であるという原理の広範な証明が提供される。同様の研究で新たに同定された本発明の配列を用いて、我々は、解剖学的なレベル及び機能的なレベルの両方における再生のレベルが、著しく改善されることを示す。新たに同定された配列による遺伝子療法の可能性は、以下の動物モデルにおいて実証される。
【００９２】
３．１  脊椎切除
二つの主要な下降脊髄運動性路は、脊椎の半側切断により破壊される。これは、後足の持続性の運動麻痺を引き起こし、ヒトの脊椎傷害についての動物モデルである。オスのウィスターラットは、深く麻酔し、動物を脊椎固定(fixator)におく。脊椎へのアクセスは、頚部筋系の開裂後、第四頚椎のレベルで背側の椎弓切除を介して得る。脊椎の曝露後、硬膜及び軟膜を、小さい小刀ナイフを用いて開口する。続いて、脊椎の背側の半側切断を、微小剪刀対を用いて脊髄の表面と同じく1 mm腹側へ行う。これは結果として二つの主要な脊椎路、皮質脊髄路及び赤核脊髄路の完全な切除となる。TFポリペプチドをコードする配列又はRNAi剤の、神経細胞中でその発現をノックダウンする効果は、皮質における脊髄の神経細胞の細胞体の近く、及び、赤核脊髄の核における赤核脊髄の神経細胞の細胞体の近くの、関連する配列を含むAAVベクターを定位的に注入することによって評価される。「環境的な」又はグリアのターゲット細胞における影響は、神経傷跡の周囲の及びそれから遠位の関連する配列の発現によって評価される。さらにその上、「環境的な」標的細胞の影響は、関連する配列を過剰発現する改変されたOEG（oliphactory ensheeted cells)が移植された、生体外のアプローチによって決定される。
【００９３】
３．２  腹側根及び後根裂離
腹側及び背側の脊髄の根は、後足が機能するのに必須な脊椎と大抹消神経（坐骨神経）との間の連絡を形成する。これらの根の裂離は、後足の永久麻痺をもたらし、これはヒトでしばしば発生する腕神経叢傷害及び根裂離破壊のモデルである。腹側及び背側の脊髄の根の神経外科的裂離は、脊柱をT13〜L2椎骨のレベルで開口することによって達成される。時計工の鉗子(watchmakers forceps)で牽引することによる、根の裂離後、該根は、顕微手術方法によって脊椎中に再移植される。TFポリペプチドをコードする配列又はRNAi剤の、神経ターゲット細胞中でその発現をノックダウンする効果は、定位的にAAVベクターを脊椎の前角に注射する（坐骨神経の運動性神経細胞を形質導入する）ことによって又はAAVベクターを坐骨神経の感覚性神経細胞の細胞体を含む後根神経節中に注射することによって研究される。TFポリペプチドをコードする配列又はRNAi剤の、環境的なターゲット細胞上でのその発現をノックダウンする効果は、該再移植された腹側又は背側の根における発現によって測定され評価される。
【００９４】
３．３  抹消神経切除
坐骨神経は後足を神経支配し、その坐骨神経の切除は、ヒトにおける抹消神経傷害のモデルである。実験動物の切除された坐骨神経は、ヒトでの場合のようにある程度再生し、切除された神経の神経外科的な修復は、機能の回復に著しく有益な効果をもたらす。成体のウィスターラットの坐骨神経は、中程度-大腿レベルで曝露され切除される。近位の及び遠位の神経の切れ残り（stumps）は、神経外科的に修復される。TFポリペプチドをコードする配列又はRNAi剤の、神経のターゲット細胞中でのその発現をノックダウンする効果は、AAVベクターを腹側の脊椎中に定位的に注入すること（運動性神経細胞の形質導入）によって又はDRG形質導入した脊椎の感覚性神経細胞中に注射することによって研究される。環境的細胞遺伝子における効果は、神経突起成長における影響を評価するための遠位の神経の切れ残りにおける過剰発現によって測定される。
【００９５】
全３モデルにおける神経再生プロセスは、解剖学的なレベル及び機能的なレベルで研究される。解剖学的な研究は、神経線維の免疫組織化学的な染色、蛍光色素を用いた神経線維の追跡、及び、神経の傷跡の形成及び破壊部位での脊髄組織の保存における局所的効果の分析を含む。長期的な機能的研究は、「狭い通路」（ガラスプレート上の通路中での、動物の歩行のビデオ画像を用いた、運動性能のコンピュータ処理分析）及び「ロープ試験」（二つのプラットフォームの間に伸ばされた4 cm厚さのロープをわたって動物が歩行する性能を分析する試験）における動物の性能を試験することによって行われる。
【００９６】
各モデルにおける遺伝子及び細胞療法研究は、二つの工程で行われる。第一の工程は、ウイルスベクターの最適な送達のための条件を決定すること及び送達の部位における導入遺伝子の発現の必要なレベルを決定することを必要とする試験的な研究からなる。それらの研究は、破壊時点後の少数の限られた数の動物において行われ、第二の工程の基礎を形成し、該第二の工程は、各個体ターゲット遺伝子の遺伝子療法治療の長期的な機能的試験及び解剖学的な分析を含む大規模な実験である。
【表３−１】
2008545388.tif 000003
【表３−２】
2008545388.tif 000004
【表３−３】
2008545388.tif 000005
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【表７−１】
2008545388.tif 000015
【表７−２】
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【表７−３】
2008545388.tif 000017
付録 A
NM_205834
Hs.466507
Liver-specific bHLH-Zip transcription factor
LISCH7
||LISCH7||liver-specific bHLH-Zip transcription factor||
receptor activity
NM_006941
Hs.376984
SRY (sex determining region Y)-box 10
SOX10
||SOX10||SRY-BOX 10||SRY-RELATED HMG-BOX GENE 10||DOMINANT MEGACOLON, MOUSE, HOMOLOG OF||SRY (sex determining region Y)-box 10||
This gene encodes a member of the SOX (SRY-related HMG-box) family of transcription factors involved in the regulation of embryonic development and in the determination of the cell fate. The encoded protein may act as a transcriptional activator after forming a protein complex with other proteins. This protein acts as a nucleocytoplasmic shuttle protein and is important for neural crest and peripheral nervous system development. Mutations in this gene are associated with Waardenburg-Shah and Waardenburg-Hirschsprung disease.
DNA binding|RNA polymerase II transcription factor activity|morphogenesis|nucleus|perception of sound|regulation of transcription from RNA polymerase II promoter|transcription|transcription coactivator activity
NM_198723
Hs.505004
Transcription elongation factor A (SII), 2
TCEA2
||TCEA2||TRANSCRIPTION ELONGATION FACTOR A, 2||transcription elongation factor A (SII), 2||
The protein encoded by this gene is found in the nucleus, where it functions as an SII class transcription elongation factor. Elongation factors in this class are responsible for releasing RNA polymerase II ternary complexes from transcriptional arrest at template-encoded arresting sites. The encoded protein has been shown to interact with general transcription factor IIB, a basal transcription factor. Two transcript variants encoding different isoforms have been found for this gene.
RNA elongation|RNA elongation|defense response|nucleus|regulation of transcription, DNA-dependent|transcription|transcription elongation factor complex|transcription factor activity|transcriptional elongation regulator activity
NM_003476
Hs.83577
Cysteine and glycine-rich protein 3 (cardiac LIM protein)
CSRP3
||MLP||CRP3||CSRP3||CYSTEINE-RICH PROTEIN 3||LIM DOMAIN PROTEIN, CARDIAC||CYSTEINE- AND GLYCINE-RICH PROTEIN 3||CLP LIM DOMAIN PROTEIN, MUSCLE||cysteine and glycine-rich protein 3 (cardiac LIM protein)||
This gene encodes a member of the CSRP family of LIM domain proteins, which may be involved in regulatory processes important for development and cellular differentiation. The LIM/double zinc-finger motif found in this protein is found in a group of proteins with critical functions in gene regulation, cell growth, and somatic differentiation. Mutations in this gene are thought to cause heritable forms of hypertrophic cardiomyopathy (HCM) and dilated cardiomyopathy (DCM) in humans.
cell differentiation|myogenesis|nucleus|zinc ion binding
NM_013260
Hs.546381
Transcriptional regulator protein
HCNGP
||HCNGP||Transcriptional regulator protein||
NM_014648
Hs.409210
Zinc finger DAZ interacting protein 3
DZIP3
||DZIP3||KIAA0675||DAZ-INTERACTING PROTEIN 3||zinc finger DAZ interacting protein 3||
RNA binding|ligase activity|protein ubiquitination|ubiquitin ligase complex|ubiquitin-protein ligase activity|zinc ion binding
NM_000238
Hs.188021
Potassium voltage-gated channel, subfamily H (eag-related), member 2
KCNH2
||HERG||LQT2||KCNH2||ETHER-A-GO-GO-RELATED GENE, HUMAN||HUMAN ETHER-A-GO-GO-RELATED GENE||ERG1 LONG QT SYNDROME 2||ACQUIRED LONG QT SYNDROME, SUSCEPTIBILITY TO||POTASSIUM CHANNEL, VOLTAGE-GATED, SUBFAMILY H, MEMBER 2||potassium voltage-gated channel, subfamily H (eag-related), member 2||
This gene encodes a voltage-activated potassium channel belonging to the eag family. It shares sequence similarity with the Drosophila ether-a-go-go (eag) gene. Mutations in this gene can cause long QT syndrome type 2 (LQT2). Transcript variants encoding distinct isoforms have been identified.
cation transport|delayed rectifier potassium channel activity|integral to membrane|membrane|membrane fraction|muscle contraction|perception of sound|potassium ion transport|regulation of heart contraction rate|two-component sensor molecule activity|two-component signal transduction system (phosphorelay)|voltage-gated potassium channel complex
NM_014391
Hs.448589
Ankyrin repeat domain 1 (cardiac muscle)
ANKRD1
||ANKRD1||Ankyrin repeat domain 1 (cardiac muscle)||
The protein encoded by this gene is localized to the nucleus of endothelial cells and is induced by IL-1 and TNF-alpha stimulation.  Studies in rat cardiomyocytes suggest that this gene functions as a transcription factor.
DNA binding|defense response|nucleus|signal transduction
NM_006186
Hs.165258
Nuclear receptor subfamily 4, group A, member 2
NR4A2
||NOT||NURR1||NR4A2||TINUR||NUCLEAR RECEPTOR-RELATED 1||TRANSCRIPTIONALLY INDUCIBLE NUCLEAR RECEPTOR||NUCLEAR RECEPTOR OF T CELLS||nuclear receptor subfamily 4, group A, member 2||
This gene encodes a member of the steroid-thyroid hormone-retinoid receptor superfamily. The encoded protein may act as a transcription factor. Mutations in this gene have been associated with disorders related to dopaminergic dysfunction, including Parkinson disease, schizophernia, and manic depression. Misregulation of this gene may be associated with rheumatoid arthritis. Four transcript variants encoding four distinct isoforms have been identified for this gene. Additional alternate splice variants may exist, but their full length nature has not been determined.
antimicrobial humoral response (sensu Vertebrata)|ligand-dependent nuclear receptor activity|nucleus|nucleus|regulation of transcription, DNA-dependent|signal transduction|steroid hormone receptor activity|transcription|transcription factor activity
NM_153427
Hs.92282
Paired-like homeodomain transcription factor 2
PITX2
||ARP1||RIEG1||PITX2||PTX2||SOLURSHIN||PITUITARY HOMEOBOX 2||ALL1-RESPONSIVE GENE 1||Paired-like homeodomain transcription factor 2||RIEG BICOID-RELATED HOMEOBOX TRANSCRIPTION FACTOR 1||
This gene encodes a member of the RIEG/PITX homeobox family, which is in the bicoid class of homeodomain proteins. This protein acts as a transcription factor and regulates procollagen lysyl hydroxylase gene expression. Mutations in this gene are associated with Axenfeld-Rieger syndrome (ARS), iridogoniodysgenesis syndrome (IGDS), and sporadic cases of Peters anomaly. This protein plays a role in the terminal differentiation of somatotroph and lactotroph cell phenotypes. This protein is involved in the development of the eye, tooth and abdominal organs. This protein acts as a transcriptional regulator involved in basal and hormone-regulated activity of prolactin. A similar protein in other vertebrates is involved in the determination of left-right asymmetry during development. Three transcript variants encoding distinct isoforms have been identified for this gene.
determination of left/right symmetry|development|nucleus|organogenesis|regulation of transcription, DNA-dependent|transcription factor activity
NM_012456
Hs.235750
Translocase of inner mitochondrial membrane 10 homolog (yeast)
TIMM10
||TIM10A||TIMM10||Translocase of inner mitochondrial membrane 10 homolog (yeast)||TRANSLOCASE OF INNER MITOCHONDRIAL MEMBRANE 10, YEAST, HOMOLOG OF||
TIMM10 belongs to a family of evolutionarily conserved proteins that are organized in heterooligomeric complexes in the mitochondrial intermembrane space. These proteins mediate the import and insertion of hydrophobic membrane proteins into the mitochondrial inner membrane.[supplied by OMIM]
inner membrane|mitochondrial inner membrane protein import|mitochondrial inner membrane protein insertion complex|mitochondrion|protein transport
NM_002180
Hs.503048
Immunoglobulin mu binding protein 2
IGHMBP2
||SMUBP2||CATF1||IGHMBP2||CARDIAC TRANSCRIPTION FACTOR 1||Immunoglobulin mu binding protein 2||
ATP binding|DNA helicase activity|DNA recombination|DNA repair|DNA replication|hydrolase activity|nucleus|regulation of transcription, DNA-dependent|single-stranded DNA binding|transcription
NM_032957
Hs.434878
Homo sapiens regulator of telomere elongation helicase 1
RTEL1
||RTEL1||Homo sapiens regulator of telomere elongation helicase 1||
NM_004838
Hs.410683
Homer homolog 3 (Drosophila)
HOMER3
||HOMER3||HOMER 3||homer homolog 3 (Drosophila)||
This gene encodes a member of the homer family of dendritic proteins. Members of this family regulate group 1 metabotrophic glutamate receptor function. The encoded protein may be involved in cell growth.
cellular_component unknown|metabotropic glutamate receptor signaling pathway|protein binding|protein targeting
NM_006884
Hs.55967
Short stature homeobox 2
SHOX2
||SHOX2||SHOT||Short stature homeobox 2||SHOX HOMOLOGOUS GENE ON CHROMOSOME THREE||
SHOX2 is a member of the homeo box family of genes that encode proteins containing a 60-amino acid residue motif that represents a DNA binding domain. Homeo box genes have been characterized extensively as transcriptional regulators involved in pattern formation in both invertebrate and vertebrate species. Several human genetic disorders are caused by aberrations in human homeo box genes. SHOX is a pseudoautosomal homeo box gene that is thought to be responsible for idiopathic short stature and implicated to play a role in the short stature phenotype of Turner syndrome patients. SHOX2 (also called SHOT for SHOX homologous gene on chromosome 3) has two alternatively spliced transcript variants, SHOX2a and SHOX2b, that have identical homeodomains and share a C-terminal 14-amino acid residue motif characteristic for craniofacially expressed homeodomain proteins. The differences between SHOX2a and SHOX2b reside within the N-termini and an alternatively spliced exon in the C termini. SHOX2 maps to 3q25-q26.1 and is considered to be a candidate gene for Cornelia de Lange syndrome.
development|heart development|neurogenesis|nucleus|regulation of transcription, DNA-dependent|skeletal development|transcription factor activity
NM_020843
Hs.458986
Zinc finger protein 291
ZNF291
||ZNF291||Zinc finger protein 291||
nucleic acid binding|nucleus|zinc ion binding
NM_030762
Hs.177841
Basic helix-loop-helix domain containing, class B, 3
BHLHB3
||DEC2||BHLHB3||SHARP1, RAT, HOMOLOG OF||basic helix-loop-helix domain containing, class B, 3||BASIC HELIX-LOOP-HELIX DOMAIN-CONTAINING PROTEIN, CLASS B, 3||
cell differentiation|cell proliferation|nucleus|organogenesis|regulation of transcription, DNA-dependent|transcription|transcription factor activity
NM_130799
Hs.423348
Multiple endocrine neoplasia I
MEN1
||MEN1||ZES||MEA I||MEN I||ZOLLINGER-ELLISON SYNDROME||ENDOCRINE ADENOMATOSIS, MULTIPLE||WERMER SYNDROME MENIN||multiple endocrine neoplasia I||MULTIPLE ENDOCRINE NEOPLASIA, TYPE I||
This gene encodes menin, a putative tumor suppressor associated with a syndrome known as multiple endocrine neoplasia type 1. In vitro studies have shown menin is localized to the nucleus, possesses two functional nuclear localization signals, and inhibits transcriptional activation by JunD, however, the function of this protein is not known. Two messages have been detected on northern blots but the larger message has not been characterized. Two variants of the shorter transcript have been identified where alternative splicing affects the CDS. Five variants where alternative splicing takes place in the 5' UTR have also been identified.
negative regulation of transcription from RNA polymerase II promoter|nucleus|protein binding|regulation of transcription, DNA-dependent
NM_053023
Hs.524920
Zinc finger protein 91 homolog (mouse)
ZFP91
||||ZFP91||Zinc finger protein 91 homolog (mouse)||
The protein encoded by this gene is a member of the zinc finger family of proteins. The gene product contains C2H2 type domains, which are the classical zinc finger domains found in numerous nucleic acid-binding proteins. In addition to the monocistronic transcript originating from this locus, a co-transcribed variant composed of ZFP91 and CNTF sequence has been identified. The monocistronic and co-transcribed variants encode distinct isoforms. The co-transcription of ZFP91 and CNTF has also been observed in mouse.
DNA binding|nucleus|regulation of transcription, DNA-dependent|transcription|zinc ion binding
NM_001130
Hs.515053
Amino-terminal enhancer of split
AES
||AES-1||ESP1||AES||AES-2||TLE5||GRG5||Amino-terminal enhancer of split||amino-terminal enhancer of split isoform a||amino-terminal enhancer of split isoform b||amino-terminal enhancer of split isoform c||
The protein encoded by this gene is similar in sequence to the amino terminus of Drosophila enhancer of split groucho, a protein involved in neurogenesis during embryonic development. The encoded protein, which belongs to the groucho/TLE family of proteins, can function as a homooligomer or as a heteroologimer with other family members to dominantly repress the expression of other family member genes. Three transcript variants encoding different isoforms have been found for this gene.
Wnt receptor signaling pathway|development|nucleus|organogenesis|regulation of transcription, DNA-dependent|transcription
NM_005269
Hs.436288
Glioma-associated oncogene homolog 1 (zinc finger protein)
GLI1
||GLI1||ONCOGENE GLI||glioma-associated oncogene homolog (zinc finger protein)||Glioma-associated oncogene homolog 1 (zinc finger protein)||
This gene encodes a protein which is a member of the Kruppel family of zinc finger proteins.  The function of this gene has not been determined; however, it may play a role in normal development gene transcription.  Mouse mutation studies indicate possible involvement in human foregut malformation.
DNA binding|RNA polymerase II transcription factor activity|development|nucleus|regulation of smoothened signaling pathway|regulation of transcription from RNA polymerase II promoter|signal transduction|transcription|zinc ion binding
NM_021926
Hs.436055
Aristaless-like homeobox 4
ALX4
||ALX4||Aristaless-like homeobox 4||ARISTALESS-LIKE 4, MOUSE, HOMOLOG OF||
development|nucleus|regulation of transcription, DNA-dependent|skeletal development|skeletal development|transcription factor activity
NM_030588
Hs.191518
DEAH (Asp-Glu-Ala-His) box polypeptide 9
DHX9
||DDX9||RHA||LKP||NDHII||DHX9||NDH II||DEAD/H BOX 9||ATP-dependent RNA helicase A||DEAH (Asp-Glu-Ala-His) box polypeptide 9||DEAH (Asp-Glu-Ala-His) box polypeptide 9 isoform 2||DEAH (Asp-Glu-Ala-His) box polypeptide 9 isoform 1||DEAD/H (Asp-Glu-Ala-Asp/His) box polypeptide 9 (RNA helicase A)||DEAD/H box-9 (nuclear DNA helicase II; RNA helicase A)||DEAD/H (Asp-Glu-Ala-Asp/His) box polypeptide 9 (RNA helicase A, nuclear DNA helicase II; leukophysin)||
DEAD box proteins, characterized by the conserved motif Asp-Glu-Ala-Asp (DEAD), are putative RNA helicases. They are implicated in a number of cellular processes involving alteration of RNA secondary structure such as translation initiation, nuclear and mitochondrial splicing, and ribosome and spliceosome assembly. Based on their distribution patterns, some members of this family are believed to be involved in embryogenesis, spermatogenesis, and cellular growth and division. This gene includes 2 alternatively spliced transcripts encoding 2 different isoforms. The larger isoform is a DEAD box protein with RNA helicase activity. It may participate in melting of DNA:RNA hybrids, such as those that occur during transcription, and may play a role in X-linked gene expression. It contains 2 copies of a double-stranded RNA-binding domain, a DEXH core domain and an RGG box. The RNA-binding domains and RGG box influence and regulate RNA helicase activity. The smaller isoform is a lymphocyte granule protein. It lacks RNA-binding domains and DEXH core domain, but contains an RGG box, which may render this isoform RNA binding function.
ATP binding|ATP-dependent DNA helicase activity|ATP-dependent RNA helicase activity|ATP-dependent helicase activity|DNA binding|cytoplasm|double-stranded RNA binding|hydrolase activity|nucleus
NM_018223
Hs.507336
Checkpoint with forkhead and ring finger domains
CHFR
||CHFR||Checkpoint with forkhead and ring finger domains||CHECKPOINT PROTEIN WITH FHA AND RING FINGER DOMAINS||
cell cycle|cytokinesis|ligase activity|mitosis|mitotic checkpoint|nucleus|protein ubiquitination|ubiquitin ligase complex|ubiquitin-protein ligase activity|zinc ion binding
NM_003709
Hs.471221
Kruppel-like factor 7 (ubiquitous)
KLF7
||KLF7||UKLF||UBIQUITOUS KRUPPEL-LIKE FACTOR||Kruppel-like factor 7 (ubiquitous)||
nucleus|regulation of transcription from RNA polymerase II promoter|transcription|transcription coactivator activity|transcription factor activity|zinc ion binding
NM_133476
Hs.103315
Zinc finger protein 384
ZNF384
||ZNF384||Zinc finger protein 384||
This gene contains long CAG trinucleotide repeats coding consecutive glutamine residues. The gene product may function as a transcription factor, with a potential role in the regulation of neurodevelopment or neuroplasticity. Studies in mouse suggest that nuclear matrix transcription factors (NP/NMP4) may be part of a general mechanical pathway that couples cell construction and function during extracellular matrix remodeling. Multiple transcript variants have been detected for this gene, but their full-length natures have not been determined.
DNA binding|neurogenesis|nucleic acid binding|nucleus|regulation of transcription, DNA-dependent|transcription|zinc ion binding
NM_002228
Hs.525704
V-jun sarcoma virus 17 oncogene homolog (avian)
JUN
||JUN||ENHANCER-BINDING PROTEIN AP1||ONCOGENE JUN ACTIVATOR PROTEIN 1||V-JUN AVIAN SARCOMA VIRUS 17 ONCOGENE HOMOLOG||V-jun sarcoma virus 17 oncogene homolog (avian)||
This gene is the putative transforming gene of avian sarcoma virus 17. It encodes a protein which is highly similar to the viral protein, and which interacts directly with specific target DNA sequences to regulate gene expression. This gene is intronless and is mapped to 1p32-p31, a chromosomal region involved in both translocations and deletions in human malignancies.
RNA polymerase II transcription factor activity|nuclear chromosome|regulation of transcription, DNA-dependent|transcription|transcription factor activity|transcription factor binding
NM_006980
Hs.532216
Transcription termination factor, mitochondrial
MTERF
||MTERF||Transcription termination factor, mitochondrial||
This gene encodes a mitochondrial transcription termination factor. This protein participates in attenuating transcription from the mitochondrial genome; this attenuation allows higher levels of expression of 16S ribosomal RNA relative to the tRNA gene downstream. The product of this gene has three leucine zipper motifs bracketed by two basic domains that are all required for DNA binding. There is evidence that, for this protein, the zippers participate in intramolecular interactions that establish the three-dimensional structure required for DNA binding.
RNA transcription termination from mitochondrial promoter|double-stranded DNA binding|mitochondrion|regulation of transcription, DNA-dependent|transcription|transcription termination factor activity
NM_002167
Hs.76884
Inhibitor of DNA binding 3, dominant negative helix-loop-helix protein
ID3
||HEIR1||ID3||inhibitor of DNA binding 3, dominant negative helix-loop-helix protein||
Members of the ID family of helix-loop-helix (HLH) proteins lack a basic DNA-binding domain and inhibit transcription through formation of nonfunctional dimers that are incapable of binding to DNA.[supplied by OMIM]
development|nucleus|transcription corepressor activity
NM_016107
Hs.435231
Zinc finger RNA binding protein
ZFR
||ZFR||zinc finger RNA binding protein||
nucleic acid binding|nucleus|zinc ion binding
NM_001005291
Hs.190284
Smith-Magenis syndrome chromosome region, candidate 6
SREBF1
||||SREBF1||Smith-Magenis syndrome chromosome region, candidate 6||
This gene encodes a transcription factor that binds to the sterol regulatory element-1 (SRE1), which is a decamer flanking the low density lipoprotein receptor gene and some genes involved in sterol biosynthesis. The protein is synthesized as a precursor that is attached to the nuclear membrane and endoplasmic reticulum. Following cleavage, the mature protein translocates to the nucleus and activates transcription by binding to the SRE1. Sterols inhibit the cleavage of the precursor, and the mature nuclear form is rapidly catabolized, thereby reducing transcription. The protein is a member of the basic helix-loop-helix-leucine zipper (bHLH-Zip) transcription factor family. This gene is located within the Smith-Magenis syndrome region on chromosome 17. Two transcript variants encoding different isoforms have been found for this gene.
Golgi apparatus|RNA polymerase II transcription factor activity|cholesterol metabolism|endoplasmic reticulum membrane|integral to membrane|lipid metabolism|nuclear membrane|regulation of transcription from RNA polymerase II promoter|steroid metabolism|transcription|transcription factor activity
NM_015129
Hs.496666
Septin 6
SEPT6
||SEPT6||Septin 6||
This gene is a member of the septin family of GTPases. Members of this family are required for cytokinesis. One version of pediatric acute myeloid leukemia is the result of a reciprocal translocation between chromosomes 11 and X, with the breakpoint associated with the genes encoding the mixed-lineage leukemia and septin 2 proteins. This gene encodes four transcript variants encoding three distinct isoforms. An additional transcript variant has been identified, but its biological validity has not been determined.
GTP binding|cell cycle|cellular_component unknown|cytokinesis|protein binding
NM_203353
Hs.533040
PDZ and LIM domain 7 (enigma)
PDLIM7
||LMP1||PDLIM7||LIM DOMAIN PROTEIN ENIGMA||LIM MINERALIZATION PROTEIN 1||PDZ and LIM domain 7 (enigma)||
The protein encoded by this gene is representative of a family of proteins composed of conserved PDZ and LIM domains. LIM domains are proposed to function in protein-protein recognition in a variety of contexts including gene transcription and development and in cytoskeletal interaction. The LIM domains of this protein bind to protein kinases, whereas the PDZ domain binds to actin filaments. The gene product is involved in the assembly of an actin filament-associated complex essential for transmission of ret/ptc2 mitogenic signaling. The biological function is likely to be that of an adapter, with the PDZ domain localizing the LIM-binding proteins to actin filaments of both skeletal muscle and nonmuscle tissues. Alternative splicing of this gene results in multiple transcript variants.
protein binding|receptor mediated endocytosis|zinc ion binding
NM_003601
Hs.135705
SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily a, member 5
SMARCA5
||SNF2H||WCRF135||SMARCA5||SUCROSE NONFERMENTING, YEAST, HOMOLOG OF||SWI/SNF-RELATED, MATRIX-ASSOCIATED, ACTIN-DEPENDENT REGULATOR OF CHROMATIN, SUBFAMILY A, MEMBER 5||SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily a, member 5||
The protein encoded by this gene is a member of the SWI/SNF family of proteins. Members of this family have helicase and ATPase activities and are thought to regulate transcription of certain genes by altering the chromatin structure around those genes. The protein encoded by this gene is a component of the chromatin remodeling and spacing factor RSF, a facilitator of the transcription of class II genes by RNA polymerase II. The encoded protein is similar in sequence to the Drosophila ISWI chromatin remodeling protein.
ACF complex|ATP binding|ATPase activity|DNA binding|RNA polymerase II transcription factor activity|chromatin remodeling|helicase activity|hydrolase activity|nucleoplasm|nucleosome assembly|regulation of transcription from RNA polymerase II promoter
NM_004083
Hs.505777
DNA-damage-inducible transcript 3
DDIT3
||CHOP10||DDIT3||MGC4154||CEBPZ||C/EBP-HOMOLOGOUS PROTEIN||C/EBP zeta||CHOP/FUS FUSION GENE||DNA-damage-inducible transcript 3||C/EBP homologous protein||GADD153 MYXOID LIPOSARCOMA||DNA DAMAGE-INDUCIBLE TRANSCRIPT 3||GROWTH ARREST- AND DNA DAMAGE-INDUCIBLE GENE GADD153||
cell cycle arrest|nucleus|regulation of transcription, DNA-dependent|response to DNA damage stimulus|transcription|transcription corepressor activity|transcription factor activity
NM_017443
Hs.108112
Polymerase (DNA directed), epsilon 3 (p17 subunit)
POLE3
||YBL1||POLE3||CHRAC17||POLYMERASE, DNA, EPSILON-3||NFYB-LIKE PROTEIN 1||CHROMATIN ACCESSIBILITY COMPLEX, 17-KD SUBUNIT||POLYMERASE, DNA, EPSILON, 17-KD SUBUNIT||polymerase (DNA directed), epsilon 3 (p17 subunit)||
POLE3 is a histone-fold protein that interacts with other histone-fold proteins to bind DNA in a sequence-independent manner. These histone-fold protein dimers combine within larger enzymatic complexes for DNA transcription, replication, and packaging.[supplied by OMIM]
DNA binding|DNA replication|epsilon DNA polymerase activity|nucleus|transferase activity
NM_002202
Hs.505
ISL1 transcription factor, LIM/homeodomain, (islet-1)
ISL1
||ISL1||ISLET 1 GENE||ISL1 transcription factor, LIM/homeodomain, (islet-1)||
ISL1 encodes islet 1, a transcription factor containing two amino-terminal LIM domains and one carboxy-terminal homeodomain. ISL1 plays an important role in the embryogenesis of pancreatic islets of Langerhans. In addition, mouse embryos made deficient in ISL1 fail to undergo neural tube motor neuron differentiation.
development|nucleus|regulation of transcription, DNA-dependent|transcription factor activity|zinc ion binding
NM_002166
Hs.180919
Inhibitor of DNA binding 2, dominant negative helix-loop-helix protein
ID2
||ID2||INHIBITOR OF DIFFERENTIATION 2||inhibitor of DNA binding 2, dominant negative helix-loop-helix protein||
The protein encoded by this gene belongs to the inhibitor of DNA binding (ID) family, members of which are transcriptional regulators that contain a helix-loop-helix (HLH) domain but not a basic domain. Members of the ID family inhibit the functions of basic helix-loop-helix transcription factors in a dominant-negative manner by suppressing their heterodimerization partners through the HLH domains. This protein may play a role in negatively regulating cell differentiation. A pseudogene has been identified for this gene.
development|nucleus
NM_001923
Hs.290758
Damage-specific DNA binding protein 1, 127kDa
DDB1
||XPCE||UV-DDB1||DDB1||XAP1||DDBA||XPE-BF||DDB p127 subunit||DDB, p127 SUBUNIT||DNA DAMAGE-BINDING PROTEIN 1||damage-specific DNA binding protein 1 (127kD)||damage-specific DNA binding protein 1, 127kDa||
This gene encodes the large subunit of DNA damage-binding protein which is a heterodimer composed of a large and a small subunit. This protein functions in nucleotide-excision repair. Its defective activity causes the repair defect in the patients with xeroderma pigmentosum complementation group E (XPE). However, it remains for mutation analysis to demonstrate whether the defect in XPE patients is in this gene or the gene encoding the small subunit. In addition, Best vitelliform mascular dystrophy is mapped to the same region as this gene on 11q, but no sequence alternations of this gene are demonstrated in Best disease patients.
damaged DNA binding|nucleotide-excision repair|nucleus|ubiquitin cycle
NM_001003688
Hs.549050
SMAD, mothers against DPP homolog 1 (Drosophila)
SMAD1
||MADH1||SMAD1||MADR1||BSP1||TGF-BETA SIGNALING PROTEIN 1||MAD, DROSOPHILA, HOMOLOG OF||SMA- AND MAD-RELATED PROTEIN 1||MOTHERS AGAINST DECAPENTAPLEGIC, DROSOPHILA, HOMOLOG OF, 1||SMAD, mothers against DPP homolog 1 (Drosophila)||
The protein encoded by this gene belongs to the SMAD, a family of proteins similar to the gene products of the Drosophila gene 'mothers against decapentaplegic' (Mad) and the C. elegans gene Sma. SMAD proteins are signal transducers and transcriptional modulators that mediate multiple signaling pathways. This protein mediates the signals of the bone morphogenetic proteins (BMPs), which are involved in a range of biological activities including cell growth, apoptosis, morphogenesis, development and immune responses. In response to BMP ligands, this protein can be phosphorylated and activated by the BMP receptor kinase. The phosphorylated form of this protein forms a complex with SMAD4, which is important for its function in the transcription regulation. This protein is a target for SMAD-specific E3 ubiquitin ligases, such as SMURF1 and SMURF2, and undergoes ubiquitination and proteasome-mediated degradation. Alternatively spliced transcript variants encoding the same protein have been observed.
BMP signaling pathway|embryonic pattern specification|integral to membrane|integral to membrane|nucleus|nucleus|receptor signaling protein activity|receptor signaling protein activity|regulation of transcription, DNA-dependent|signal transduction|signal transduction|transcription|transcription factor activity|transcriptional activator activity|transcriptional activator activity|transforming growth factor beta receptor signaling pathway|transforming growth factor beta receptor signaling pathway
NM_005238
Hs.369438
V-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1 (avian)
ETS1
||ETS1||EWSR2||ETS-1||ONCOGENE ETS1||ETS1 ONCOGENE||ets protein||Avian erythroblastosis virus E26 (v-ets) oncogene homolog-1||v-ets avian erythroblastosis virus E2 oncogene homolog 1||v-ets avian erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1||v-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1 (avian)||v-ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1  (avian)||
RNA polymerase II transcription factor activity|immune response|negative regulation of cell proliferation|nucleus|regulation of transcription, DNA-dependent|transcription|transcription factor activity|transcription from RNA polymerase II promoter
NM_001239
Hs.146607
Cyclin H
CCNH
||p37||CAK||CCNH||p34||CDK-activating kinase||MO15-associated protein||cyclin H||cyclin-dependent kinase-activating kinase||
The protein encoded by this gene belongs to the highly conserved cyclin family, whose members are characterized by a dramatic periodicity in protein abundance through the cell cycle. Cyclins function as regulators of CDK kinases. Different cyclins exhibit distinct expression and degradation patterns which contribute to the temporal coordination of each mitotic event. This cyclin forms a complex with CDK7 kinase and ring finger protein MAT1. The kinase complex is able to phosphorylate CDK2 and CDC2 kinases, thus functions as a CDK-activating kinase (CAK). This cyclin and its kinase partner are components of TFIIH, as well as RNA polymerase II protein complexes. They participate in two different transcriptional regulation processes, suggesting an important link between basal transcription control and the cell cycle machinery.
DNA repair|nucleus|regulation of cyclin dependent protein kinase activity|regulation of transcription, DNA-dependent|transcription
NM_005612
Hs.401145
RE1-silencing transcription factor
REST
||NRSF||REST||NEURON-RESTRICTIVE SILENCER FACTOR||RE1-silencing transcription factor||
This gene encodes a transcriptional repressor which represses neuronal genes in non-neuronal tissues. It is a member of the Kruppel-type zinc finger transcription factor family. It represses transcription by binding a DNA sequence element called the neuron-restrictive silencer element. The protein is also found in undifferentiated neuronal progenitor cells, and it is thought that this repressor may act as a master negative regular of neurogenesis. Alternatively spliced transcript variants have been described; however, their full length nature has not been determined.
nucleic acid binding|nucleus|regulation of transcription, DNA-dependent|transcriptional repressor activity|zinc ion binding
NM_181054
Hs.509554
Hypoxia-inducible factor 1, alpha subunit (basic helix-loop-helix transcription factor)
HIF1A
||HIF1-ALPHA||HIF1A||MOP1||PASD8||HIF-1alpha||ARNT interacting protein||member of PAS superfamily 1||hypoxia-inducible factor 1, alpha subunit isoform 1||hypoxia-inducible factor 1, alpha subunit isoform 2||Hypoxia-inducible factor 1, alpha subunit (basic helix-loop-helix transcription factor)||
Hypoxia-inducible factor-1 (HIF1) is a transcription factor found in mammalian cells cultured under reduced oxygen tension that plays an essential role in cellular and systemic homeostatic responses to hypoxia. HIF1 is a heterodimer composed of an alpha subunit and a beta subunit. The beta subunit has been identified as the aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (ARNT). This gene encodes the alpha subunit of HIF-1. Overexpression of a natural antisense transcript (aHIF) of this gene has been shown to be associated with nonpapillary renal carcinomas. Two alternative transcripts encoding different isoforms have been identified.
RNA polymerase II transcription factor activity, enhancer binding|electron transport|histone acetyltransferase binding|homeostasis|nucleus|nucleus|protein heterodimerization activity|protein heterodimerization activity|regulation of transcription, DNA-dependent|response to hypoxia|signal transducer activity|signal transduction|signal transduction|transcription factor activity
NM_005648
Hs.546305
Transcription elongation factor B (SIII), polypeptide 1 (15kDa, elongin C)
TCEB1
||TCEB1||ELONGIN, 15-KD SUBUNIT||TRANSCRIPTION ELONGATION FACTOR B, 1||transcription elongation factor B (SIII), polypeptide 1 (15kDa, elongin C)||
This gene encodes the protein elongin C, which is a subunit of the transcription factor B (SIII) complex. The SIII complex is composed of elongins A/A2, B and C. It activates elongation by RNA polymerase II by suppressing transient pausing of the polymerase at many sites within transcription units. Elongin A functions as the transcriptionally active component of the SIII complex, whereas elongins B and C are regulatory subunits. Elongin A2 is specifically expressed in the testis, and capable of forming a stable complex with elongins B and C. The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein binds to elongins B and C, and thereby inhibits transcription elongation.
nucleus|protein binding|regulation of transcription from RNA polymerase II promoter|transcription|transcriptional elongation regulator activity|ubiquitin cycle
NM_003200
Hs.371282
Transcription factor 3 (E2A immunoglobulin enhancer binding factors E12/E47)
TCF3
||TCF3||E2A/PBX1 FUSION GENE||IMMUNOGLOBULIN ENHANCER-BINDING FACTORS E12/E47||ITF1 E2A/HLF FUSION GENE||IMMUNOGLOBULIN TRANSCRIPTION FACTOR 1||transcription factor 3 (E2A immunoglobulin enhancer binding factors E12/E47)||
nucleus|regulation of transcription, DNA-dependent|transcription|transcription factor activity
NM_178439
Hs.293971
Germ cell-less homolog 1 (Drosophila)
GCL
||GCL||germ cell-less homolog 1 (Drosophila)||
This gene encodes a nuclear envelope protein that appears to be involved in spermatogenesis, either directly or by influencing genes that play a more direct role in the process. This multi-exon locus is the homolog of the mouse and drosophila germ cell-less gene but the human genome also contains a single-exon locus on chromosome 5 that contains an open reading frame capable of encoding a highly-related protein.
cell differentiation|nucleus|protein binding|spermatogenesis
NM_005604
Hs.182505
POU domain, class 3, transcription factor 2
POU3F2
||POU3F2||POUF3||OCT7||N-OCT-3 GENE||BRN2, MOUSE, HOMOLOG OF||OCTAMER BINDING TRANSCRIPTION FACTOR 7||POU domain, class 3, transcription factor 2||
N-Oct-3 is a protein belonging to a large family of transcription factors that bind to the octameric DNA sequence ATGCAAAT. Most of these proteins share a highly homologous region, referred to as the POU domain, which occurs in several mammalian transcription factors, including the octamer-binding proteins Oct1 (POU2F1; MIM 164175) and Oct2 (POU2F2; MIM 164176), and the pituitary protein Pit1 (PIT1; MIM 173110). Class III POU genes are expressed predominantly in the CNS. It is likely that CNS-specific transcription factors such as these play an important role in mammalian neurogenesis by regulating their diverse patterns of gene expression.[supplied by OMIM]
nucleus|regulation of transcription, DNA-dependent|transcription factor activity
NM_004220
Hs.115284
Zinc finger protein 213
ZNF213
||CR53||ZNF213||Zinc finger protein 213||
C2H2 zinc finger proteins, such as ZNF213, have bipartite structures in which one domain binds DNA or RNA and the other modulates target gene expression.[supplied by OMIM]
nucleus|regulation of transcription, DNA-dependent|transcription|transcription factor activity|zinc ion binding
NM_001010926
Hs.57971
Hairy and enhancer of split 5 (Drosophila)
HES5
||HES5||HAIRY/ENHANCER OF SPLIT, DROSOPHILA, HOMOLOG OF, 5||hairy and enhancer of split 5 (Drosophila)||
DNA binding|regulation of transcription, DNA-dependent
NM_001674
Hs.460
Activating transcription factor 3
ATF3
||ATF3||ATF3deltaZip3||ATF3deltaZip2c||Activating transcription factor 3||activating transcription factor 3 long isoform||activating transcription factor 3 delta Zip isoform||
Activating transcription factor 3 (ATF3)is a member of the mammalian activation transcription factor/cAMP responsive element-binding (CREB) protein family of transcription factors.  It encodes a protein with a calculated molecular mass of 22 kD. ATF3 represses rather than activates transcription from promoters with ATF binding elements. An alternatively spliced form of ATF3 (ATF3 delta Zip) encodes a truncated form ATF3 protein lacking the leucine zipper protein-dimerization motif and does not bind to DNA. In contrast to ATF3, ATF3 delta Zip stimulates transcription presumably by sequestering inhibitory co-factors away from the promoter.  It is possible that alternative splicing of the ATF3 gene may be physiologically important in the regulation of target genes.
DNA binding|nucleus|regulation of transcription, DNA-dependent|transcription|transcription corepressor activity|transcription factor activity
NM_005804
Hs.311609
DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 39
DDX39
||DDX39||DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 39||
DEAD box proteins, characterized by the conserved motif Asp-Glu-Ala-Asp (DEAD), are putative RNA helicases. They are implicated in a number of cellular processes involving alteration of RNA secondary structure, such as translation initiation, nuclear and mitochondrial splicing, and ribosome and spliceosome assembly. Based on their distribution patterns, some members of the DEAD box protein family are believed to be involved in embryogenesis, spermatogenesis, and cellular growth and division. This gene encodes a member of this family. The function of this member has not been determined. Alternative splicing of this gene generates 2 transcript variants encoding different isoforms.
ATP binding|ATP-dependent RNA helicase activity|ATP-dependent helicase activity|hydrolase activity|mRNA-nucleus export|nuclear mRNA splicing, via spliceosome|nucleic acid binding|nucleus|protein binding
NM_004454
Hs.43697
Ets variant gene 5 (ets-related molecule)
ETV5
||ERM||ETV5||Ets variant gene 5 (ets-related molecule)||
nucleus|regulation of transcription, DNA-dependent|transcription factor activity
NM_002128
Hs.434102
High-mobility group box 1
HMGB1
||HMGB1||AMPHOTERIN||High-mobility group box 1||NONHISTONE CHROMOSOMAL PROTEIN HMG1||CHROMOSOMAL PROTEIN, NONHISTONE, HMG1||HIGH MOBILITY GROUP PROTEIN 1||HIGH MOBILITY GROUP BOX 1||
DNA bending activity|DNA recombination|DNA repair|DNA unwinding|base-excision repair, DNA ligation|chromatin|condensed chromosome|establishment and/or maintenance of chromatin architecture|negative regulation of transcriptional preinitiation complex formation|nucleus|regulation of transcription from RNA polymerase II promoter|transcription factor binding
NM_005078
Hs.287362
Transducin-like enhancer of split 3 (E(sp1) homolog, Drosophila)
TLE3
||ESG3||TLE3||ENHANCER OF SPLIT GROUCHO 3||transducin-like enhancer of split 3 (E(sp1) homolog, Drosophila)||
frizzled signaling pathway|nucleus|organogenesis|regulation of transcription, DNA-dependent|signal transduction
NM_006237
Hs.211588
POU domain, class 4, transcription factor 1
POU4F1
||POU4F1||BRN3.0, MOUSE, HOMOLOG OF||POU-DOMAIN TRANSCRIPTION FACTOR BRN3A||POU domain, class 4, transcription factor 1||
axonogenesis|development|nucleus|regulation of transcription from RNA polymerase II promoter|synaptogenesis|transcription factor activity
NM_014819
Hs.483036
Praja 2, RING-H2 motif containing
PJA2
||PJA2||praja 2, RING-H2 motif containing||
protein ubiquitination|ubiquitin ligase complex|ubiquitin-protein ligase activity|zinc ion binding
NM_003687
Hs.424312
PDZ and LIM domain 4
PDLIM4
||PDLIM4||LIM DOMAIN PROTEIN RIL||PDZ and LIM domain 4||PDZ AND LIM DOMAIN PROTEIN 4||
protein binding|zinc ion binding
NM_005230
Hs.46523
ELK3, ETS-domain protein (SRF accessory protein 2)
ELK3
||SAP2||ELK3||ERP||NET||ETS-RELATED PROTEIN||ELK3 protein||ELK3, ETS-domain protein (SRF accessory protein 2)||
The protein encoded by this gene is a member of the ETS-domain transcription factor family and the ternary complex factor (TCF) subfamily. Proteins in this subfamily regulate transcription when recruited by serum response factor to bind to serum response elements. This protein is activated by signal-induced phosphorylation; studies in rodents suggest that it is a transcriptional inhibitor in the absence of Ras, but activates transcription when Ras is present.
RNA polymerase II transcription factor activity|nucleus|regulation of transcription from RNA polymerase II promoter|regulation of transcription, DNA-dependent|signal transduction|transcription|transcription cofactor activity|transcription factor activity|transcription factor activity
NM_006706
Hs.443465
Transcription elongation regulator 1
TCERG1
||TAF2S||TCERG1||TRANSCRIPTION FACTOR CA150||Transcription elongation regulator 1||TATA BOX-BINDING PROTEIN-ASSOCIATED FACTOR 2S||TBP-ASSOCIATED FACTOR, RNA POLYMERASE II, 150-KD||
This gene encodes a protein required for transactivation by the HIV-1 transactivator Tat. Although the encoded protein is not a TBP-associated factor (TAF), it is associated with the RNA polymerase II holoenzyme and is involved in the regulation of transcription elongation. This gene product has motifs found in transcription factors that permit protein-protein interactions, including a glutamine-alanine repeat not observed in mammalian transcription factors.
RNA polymerase II transcription factor activity|nucleus|regulation of transcription, DNA-dependent|transcription|transcription coactivator activity|transcription from RNA polymerase II promoter
NM_030751
Hs.124503
Transcription factor 8 (represses interleukin 2 expression)
TCF8
||TCF8||DELTA-EF1||NIL2A||T-LYMPHOCYTE-SPECIFIC INTERLEUKIN 2 INHIBITOR||Transcription factor 8 (represses interleukin 2 expression)||
TCF8 encodes a human zinc finger transcription factor that represses T-lymphocyte-specific IL2 gene (MIM 147680) expression by binding to a negative regulatory domain 100 nucleotides 5-prime of the IL2 transcription start site (Williams et al., 1991).[supplied by OMIM]
cell proliferation|immune response|negative regulation of transcription from RNA polymerase II promoter|nucleic acid binding|nucleus|regulation of transcription, DNA-dependent|transcription|transcription coactivator activity|transcription corepressor activity|transcription factor activity|transcription factor activity|zinc ion binding|zinc ion binding
NM_003305
Hs.150981
Transient receptor potential cation channel, subfamily C, member 3
TRPC3
||TRPC3||TRP3||TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL CHANNEL 3||TRANSIENT RECEPTOR POTENTIAL, DROSOPHILA, HOMOLOG OF, 3||transient receptor potential cation channel, subfamily C, member 3||
calcium ion transport|cation transport|integral to plasma membrane|membrane|phototransduction|store-operated calcium channel activity
NM_145805
Hs.444677
ISL2 transcription factor, LIM/homeodomain, (islet-2)
ISL2
||ISL2||ISL2 transcription factor, LIM/homeodomain, (islet-2)||
development|nucleus|regulation of transcription, DNA-dependent|transcription factor activity|zinc ion binding
NM_004235
Hs.376206
Kruppel-like factor 4 (gut)
KLF4
||GKLF||EZF||KLF4||GUT-ENRICHED KRUPPEL-LIKE FACTOR||Kruppel-like factor 4 (gut)||ENDOTHELIAL KRUPPEL-LIKE ZINC FINGER PROTEIN||
mesodermal cell fate determination|negative regulation of cell proliferation|negative regulation of transcription, DNA-dependent|negative regulation of transcription, DNA-dependent|nucleic acid binding|nucleus|transcription|transcription factor activity|transcription factor activity|transcriptional activator activity|transcriptional activator activity|transcriptional repressor activity|transcriptional repressor activity|zinc ion binding|zinc ion binding
NM_006963
Hs.462693
Zinc finger protein 22 (KOX 15)
ZNF22
||ZNF22||KOX15||zinc finger protein 22 (KOX 15)||
DNA binding|nucleus|odontogenesis|regulation of transcription, DNA-dependent|zinc ion binding
NM_002746
Hs.861
Mitogen-activated protein kinase 3
MAPK3
||MAPK3||p44ERK1||PRKM3||p44MAPK||EXTRACELLULAR SIGNAL-REGULATED KINASE 1||Mitogen-activated protein kinase 3||PROTEIN KINASE, MITOGEN-ACTIVATED, 3||
ATP binding|ATP binding|MAP kinase activity|MAP kinase activity|cellular_component unknown|protein amino acid phosphorylation|protein amino acid phosphorylation|protein serine/threonine kinase activity|regulation of cell cycle|transferase activity
NM_004089
Hs.522074
TSC22 domain family 3
DSIPI
||GILZ||TSC-22R||DKFZp313A1123||hDIP||DSIPI||TSC22D3||TSC-22 related protein||glucocorticoid-induced leucine zipper protein||TSC22 domain family 3||DELTA SLEEP-INDUCING PEPTIDE, IMMUNOREACTOR||DSIP-immunoreactive leucine zipper protein||delta sleep inducing peptide, immunoreactor||TSC22 domain family 3 isoform 1||TSC22 domain family 3 isoform 3||TSC22 domain family 3 isoform 2||
The protein encoded by this gene shares significant sequence identity with the murine TSC-22 and Drosophila shs, both of which are leucine zipper proteins, that function as transcriptional regulators. The expression of this gene is stimulated by glucocorticoids and interleukin 10, and it appears to play a key role in the anti-inflammatory and immunosuppressive effects of this steroid and chemokine. Transcript variants encoding different isoforms have been identified for this gene.
regulation of transcription, DNA-dependent|transcription factor activity
NM_000321
Hs.408528
Retinoblastoma 1 (including osteosarcoma)
RB1
||p105-Rb||RB1||RB OSTEOSARCOMA, RETINOBLASTOMA-RELATED||Retinoblastoma 1 (including osteosarcoma)||
Retinoblastoma (RB) is an embryonic malignant neoplasm of retinal origin. It almost always presents in early childhood and is often bilateral. Spontaneous regression ('cure') occurs in some cases.[supplied by OMIM]
cell cycle checkpoint|chromatin|negative regulation of cell cycle|negative regulation of protein kinase activity|negative regulation of transcription from RNA polymerase II promoter|nucleus|nucleus|protein binding|regulation of transcription, DNA-dependent|regulation of transcription, DNA-dependent|transcription|transcription factor activity
NM_000842
Hs.147361
Glutamate receptor, metabotropic 5
GRM5
||mGlu5||GPRC1E||MGLUR5A||MGLUR5B||GRM5||Glutamate receptor, metabotropic 5||GLUTAMATE RECEPTOR, METABOTROPIC, 5||
L-glutamate is the major excitatory neurotransmitter in the central nervous system and activates both ionotropic and metabotropic glutamate receptors.  Glutamatergic neurotransmission is involved in most aspects of normal brain function and can be perturbed in many neuropathologic conditions. The metabotropic glutamate receptors are a family of G protein-coupled receptors, that have been divided into 3 groups on the basis of sequence homology, putative signal transduction mechanisms, and pharmacologic properties.  Group I includes GRM1 and GRM5 and these receptors have been shown to activate phospholipase C.  Group II includes GRM2 and GRM3 while Group III includes GRM4, GRM6, GRM7 and GRM8.  Group II and III receptors are linked to the inhibition of the cyclic AMP cascade but differ in their agonist selectivities.  Alternative splice variants of GRM8 have been described but their full-length nature has not been determined.
G-protein coupled receptor protein signaling pathway|integral to plasma membrane|membrane|metabotropic glutamate receptor, phospholipase C activating pathway|metabotropic glutamate, GABA-B-like receptor activity|receptor activity|signal transduction|synaptic transmission
NM_005955
Hs.471991
Metal-regulatory transcription factor 1
MTF1
||MTF1||Metal-regulatory transcription factor 1||
nucleus|regulation of transcription from RNA polymerase II promoter|response to metal ion|transcription coactivator activity|transcription factor activity|zinc ion binding
NM_139276
Hs.463059
Signal transducer and activator of transcription 3 (acute-phase response factor)
STAT3
||APRF||STAT3||Signal transducer and activator of transcription 3 (acute-phase response factor)||
The protein encoded by this gene is a member of the STAT protein family. In response to cytokines and growth factors, STAT family members are phosphorylated by the receptor associated kinases, and then form homo- or heterodimers that translocate to the cell nucleus where they act as transcription activators. This protein is activated through phosphorylation in response to various cytokines and growth factors including IFNs, EGF, IL5, IL6, HGF, LIF and BMP2. This protein mediates the expression of a variety of genes in response to cell stimuli, and thus plays a key role in many cellular processes such as cell growth and apoptosis. The small GTPase Rac1 has been shown to bind and regulate the activity of this protein. PIAS3 protein is a specific inhibitor of this protein. Three alternatively spliced transcript variants encoding distinct isoforms have been described.
JAK-STAT cascade|acute-phase response|calcium ion binding|cell motility|cytoplasm|hematopoietin/interferon-class (D200-domain) cytokine receptor signal transducer activity|intracellular signaling cascade|negative regulation of transcription from RNA polymerase II promoter|neurogenesis|nucleus|nucleus|regulation of transcription, DNA-dependent|signal transducer activity|transcription|transcription factor activity|transcription factor activity
NM_006569
Hs.546335
Cell growth regulator with EF hand domain 1
CGREF1
||CGREF1||CGR11||CELL GROWTH REGULATORY GENE 11||cell growth regulator with EF hand domain 1||
calcium ion binding|cell cycle|cell cycle arrest|negative regulation of cell proliferation|response to stress
NM_005384
Hs.79334
Nuclear factor, interleukin 3 regulated
NFIL3
||E4BP4||NFIL3A||NFIL3||NUCLEAR FACTOR, INTERLEUKIN 3-REGULATED||Nuclear factor, interleukin 3 regulated||
immune response|nucleus|regulation of transcription, DNA-dependent|transcription corepressor activity|transcription factor activity|transcription from RNA polymerase II promoter
付録B
Hu, Y., Leaver, S.G., Plant, G.W., Hendriks, W.T.J., Niclou, S.P., Verhaagen, J., Harvey, A.R., Ciu, Q., (2005) Lentiviral vector-mediated transfer of ciliary neurotrophic factor to Schwann cells within reconstructed peripheral nerve grafts enhances survival and axonal regeneration of adult retinal ganglion cells, Molec. Therapy. In press.
Ruitenberg, M.J., Levinson, D.B., Voon Lee, S., Verhaagen, J., Harvey, A.R., Plant, G.W., (2005) NT-3 expression from engineered olfactory ensheathing glia promotes spinal sparing and regeneration. Brain, In press.
Willis D, Li KW, Zheng JQ, Chang JH, Smit AB, Kelly T, Merianda TT, Sylvester J, van Minnen J, Twiss JL. (2005) Differential transport and local translation of cytoskeletal, injury-response, and neurodegeneration protein mRNAs in axons. J Neurosci. 25(4):778-91.
Jimenez CR, Stam FJ, Li KW, Gouwenberg Y, Hornshaw MP, De Winter F, Verhaagen J, Smit AB. (2005) Proteomics of the injured rat sciatic nerve reveals protein expression dynamics during regeneration. Mol Cell Proteomics. 4: 120-32.
Spijker S, Houtzager SW, De Gunst MC, De Boer WP, Schoffelmeer AN, Smit AB. (2004) Morphine exposure and abstinence define specific stages of gene expression in the rat nucleus accumbens. FASEB J. 18: 848-50.
Hendriks, W.T.J., Ruitenberg, M.J., Boer, G.J., Verhaagen, J. (2004) Viral vector-mediated gene transfer of neurotrophins to promote regeneration of the injured spinal cord. Progr. Brain Res. 146:451-76.
Ruitenberg, M.J., Blits, B., Dijkhuizen, P.A., te Beek, E.T., Bakker, A., van Heerikhuize, J.J., Pool, C.W., Hermens, W.T.J., Boer, G.J., Verhaagen, J. (2004) Adeno-associated viral vector-mediated gene transfer of brain-derived neurotrophic factor reverses atrophy of rubrospinal neurons following both acute and chronic spinal cord injury. Neurobiol. of Disease, 15: 394-406.
Ahmed, B., Chakravarthy, S., Eggers, R., Hermens, W.T.J.M.C., Zhang, J.Y., Niclou, S.P., Levelt, C., Sablitzky, F., Anderson, P.N., Lieberman, A.R., Verhaagen, J. (2004)  Efficient delivery of Cre-recombinase to neurons in vivo and stable transduction of neurons using adeno-associated and lentiviral vectors. BMC Neuroscience 5: 4.
Blits,B., Carlstedt,T.P., Ruitenberg,M.J., de Winter,F., Hermens,W.T.J.M.C., Dijkhuizen,P.A., Claasens,J.W.C., Eggers,R., van der Sluis,R., Tenenbaum,L., Boer,G.J., and Verhaagen,J., Rescue and sprouting of motoneurons following ventral root avulsion and reimplantation combined with intraspinal adeno-associated viral vector-mediated expression of glial cell line-derived neurotrophic factor or brain-derived neurotrophic factor., Exp.  Neurol. 189 (2004) 303-16.
Blits, B., Oudega, M., Boer, G.J., Bunge, M., Verhaagen, J. (2003) Adeno-associated viral vector-mediated neurotrophin gene transfer improves hindlimb function in the injured adults rat spinal cord. Neuroscience 118: 271-81.
Ruitenberg, M.J., Plant, G.W., Hamers, F.P.T., Wortel, J., Blits, B., Dijkhuizen, P.A., Gispen, W.H., Boer, G.J., Verhaagen, J. (2003) Ex vivo adenoviral vector-mediated neurotrophin gene transfer to olfactory ensheathing glia: effects on rubrospinal tract regeneration, lesion size and functional recovery following implantation in the injured rat spinal cord. J. Neurosci. 23: 7045-58.
Harvey, A.R., Kamphuis, W., Eggers, R., Symons, N.A., Blits, B., Niclou, S., Boer, G.J., Verhaagen, J. (2002) Intravitreal injection of adeno-associated viral vectors results in the transduction of different types of retinal neurons in neonatal and adult rats: a comparison with lentiviral vectors. Mol. Cell. Neurosci. 21: 141-57.
Blits, B., Boer, G.J., Verhaagen, J. (2002) Pharmacological, cell, and gene therapy strategies to promote spinal cord regeneration. Cell Transplantation 11: 593-613.
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Ruitenberg, M.J. Plant, G.W., Christensen, C.L., Blits, B., Niclou, S., Harvey, A.R., Boer, G.J., Verhaagen, J. (2002) Viral vector-mediated expression in olfactory ensheathing glia  implants in the lesioned rat spinal cord. Gene Therapy 9: 135-46.
Blits, B., Dijkhuizen, P.A., Hermens, W.T.J.M.C. Hermens, Esseveldt, L.E., Boer, G.J., Verhaagen, J. (2000). Use of adenoviral vectors and ex vivo transduced neurotransplants: towards promotion of neuroregeneration. Cell Transplantation 9: 169-78.
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Holtmaat, A.J.G.D., Hermens, W.T.J.M.C., Sonnemans, M.A.F., Giger, R.J., Van Leeuwen, F.W.,  Kaplitt, M.G., Oestreicher, A.B., Gispen, W.H., Verhaagen, J. (1997) Adenoviral vector-mediated expression of B-50/GAP-43 induces alterations in the membrane organization of olfactory axon terminals in vivo. J. Neurosci. 17: 6575-86.
Dijkhuizen, P.A., Hermens, W.T.J.M.C., Teunis, M., Verhaagen, J. (1997) Adenoviral vector directed expression of neurotrophin-3 in rat dorsal ganglion explants results in a robust neurite outgrowth response. J. Neurobiol. 33: 172-84.
Buffo, A., Holtmaat, A.J.G.D., Savio, T., Verbeek, S., Oberdick, J.O., Oestreicher, A.B., Gispen, W.H., Verhaagen, J., Rossi, F., Strata, P. (1997) Targeted overexpression of the neurite growth-associated protein B-50/GAP-43 in cerebellar Purkinje cells induces sprouting in response to axotomy, but does not allow axon regeneration into growth permissive transplants. J. Neurosci. 17: 8778-91.
Holtmaat, A.J.G.D., Dijkhuizen, P.A., Oestreicher, A.B., Romijn, H.J., Van der Lugt, N.M.T., Berns, A., Margolis, F.L., Gispen, W.H. and Verhaagen, J. (1995) Directed expression of the growth-associated protein B-50/GAP-43 to olfactory neurons in transgenic mice results in changes in axon morphology and extraglomerular fiber growth. J. Neurosci. 15: 7953-65.
【配列表】
2008545388000001.app
【国際調査報告】
2008545388.tif 000018
2008545388.tif 000019
2008545388.tif 000020
2008545388.tif 000021
2008545388.tif 000022
2008545388.tif 000023
2008545388.tif 000024
2008545388.tif 000025
2008545388.tif 000026
2008545388.tif 000027