(57)【要約】生物材料からのＤＮＡの精製のための試薬、方法およびキットが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも約１Ｍの濃度のリチウム塩；
少なくとも一種類の界面活性剤；および
緩衝剤
：を含む、ＤＮＡを単離および精製するための処方物。
【請求項２】
さらにキレート剤を含む、請求項１の処方物。
【請求項３】
キレート剤がＥＤＴＡまたはクエン酸塩であることを特徴とする請求項２の処方物。
【請求項４】
処方物がカオトロープおよび／または強いカオトロピック物質を欠くことを特徴とする請求項１〜３のうちいずれかの処方物。
【請求項５】
リチウム塩が塩化リチウムであることを特徴とする請求項１〜４のうちいずれかの処方物。
【請求項６】
リチウム塩が約２〜１０Ｍの濃度であることを特徴とする請求項１〜５のうちいずれかの処方物。
【請求項７】
処方物が約７を上回るｐＨを有することを特徴とする請求項１〜６のうちいずれかの処方物。
【請求項８】
処方物が約７ないし約９のｐＨを有することを特徴とする請求項１〜６のうちいずれかの処方物。
【請求項９】
界面活性剤が約１０〜４０％ｖ／ｖの濃度で存在することを特徴とする請求項１〜８のうちいずれかの処方物。
【請求項１０】
少なくとも一種類の界面活性剤がジエチルグリコールモノエチルエーテル（ＤＧＭＥ）であることを特徴とする請求項１〜９のうちいずれかの処方物。
【請求項１１】
ＤＧＭＥが約５％ないし約３５％ｖ／ｖの濃度で存在することを特徴とする請求項１０の処方物。
【請求項１２】
少なくとも一種類の界面活性剤が洗浄剤であることを特徴とする請求項１〜１１のうちいずれかの処方物。
【請求項１３】
洗浄剤が陰イオン性、陽イオン性、双性イオン性または非イオン性洗浄剤、またはその混合物であることを特徴とする請求項１２の処方物。
【請求項１４】
洗浄剤が陰イオン性および非イオン性洗浄剤の混合物であることを特徴とする請求項１２または１３の処方物。
【請求項１５】
陰イオン性洗浄剤がＳＤＳであることを特徴とする請求項１３または１４の処方物。
【請求項１６】
ＳＤＳが０．０５〜０．２％ｖ／ｖの濃度で存在することを特徴とする請求項１５の処方物。
【請求項１７】
洗浄剤がトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−Ｘであることを特徴とする請求項１２または１３の処方物。
【請求項１８】
洗浄剤が０．０５〜５．０％ ｖ／ｖの濃度で存在することを特徴とする請求項１７の処方物。
【請求項１９】
（ａ）ＤＮＡを含む生物材料をＤＮＡ溶解溶液と接触させて混合物を形成し、ＤＮＡ溶解溶液は７より大のｐＨで緩衝されており、およびＤＮＡ溶解溶液はリチウム塩および少なくとも一種類の界面活性剤を含み；
（ｂ）混合物をＤＮＡ添加溶液と接触させ；
（ｃ）生物材料中に存在するＤＮＡが固相担体へ結合するように、混合物を固相担体と接触させ；
（ｄ）固相担体を洗浄溶液で洗浄し；および
（ｅ）ＤＮＡをＤＮＡ溶出溶液で溶出する
：段階を含む、実質的に純粋なおよび未分解のＤＮＡを生物材料から単離するための方法。
【請求項２０】
ＤＮＡ添加溶液がイソプロパノール、エタノールおよび／またはメタノールを含むことを特徴とする請求項１９の方法。
【請求項２１】
ＤＮＡ添加溶液がアルコールの混合物を含むことを特徴とする請求項１９または２０の方法。
【請求項２２】
ＤＮＡ添加溶液が１００％イソプロパノールを含むことを特徴とする請求項１９または２０の方法。
【請求項２３】
ＤＮＡ添加溶液が１Ｍより多いアルカリ金属塩を含むことを特徴とする請求項１９〜２２のうちいずれかの方法。
【請求項２４】
生物材料が頸部細胞試料であることを特徴とする請求項１９〜２３のうちいずれかの方法。
【請求項２５】
生物材料が全血であることを特徴とする請求項１９〜２３のうちいずれかの方法。
【請求項２６】
生物材料が培養細胞、固定細胞、および／または組織試料であることを特徴とする請求項１９〜２３のうちいずれかの方法。
【請求項２７】
洗浄溶液が約７より高いｐＨで緩衝されていることを特徴とする請求項１９〜２６のうちいずれかの方法。
【請求項２８】
溶解および／または洗浄溶液がカオトロープおよび／または強いカオトロピック物質を欠くことを特徴とする請求項１９〜２７のうちいずれかの方法。
【請求項２９】
ＤＮＡ溶解溶液がさらにキレート剤を含むことを特徴とする請求項１９〜２８のうちいずれかの方法。
【請求項３０】
固相担体がシリカ、セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、またはポリフッ化ビニリデン、またはその組み合わせの成分を含むことを特徴とする請求項１９〜２９のうちいずれかの方法。
【請求項３１】
固相担体が、生物材料を固相担体と接触させる前に、ＲＮアーゼ 溶液で前処理されていることを特徴とする請求項１９〜３０のうちいずれかの方法。
【請求項３２】
溶解溶液のリチウム塩が塩化リチウムまたは臭化リチウムであることを特徴とする請求項１９〜３１のうちいずれかの方法。
【請求項３３】
溶解溶液のリチウム塩が約１Ｍより高い濃度で存在することを特徴とする請求項１９〜３２のうちいずれかの方法。
【請求項３４】
溶解溶液のリチウム塩が２Ｍないし８Ｍの濃度で存在することを特徴とする請求項１９〜３３のうちいずれかの方法。
【請求項３５】
溶解溶液がさらにキレート剤を含むことを特徴とする請求項１９〜３４のうちいずれかの方法。
【請求項３６】
キレート剤がＥＤＴＡまたはクエン酸塩であることを特徴とする請求項３５の方法。
【請求項３７】
ＤＮＡ溶解溶液が界面活性剤を約２５〜３５％ｖ／ｖの濃度で含むことを特徴とする請求項１９〜３６のうちいずれかの方法。
【請求項３８】
界面活性剤が洗浄剤であることを特徴とする請求項１９〜３７のうちいずれかの方法。
【請求項３９】
洗浄剤が非イオン性洗浄剤であることを特徴とする請求項３８の方法。
【請求項４０】
非イオン性洗浄剤がツイーン（Ｔｗｅｅｎ）、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）、イゲパール（Ｉｇｅｐａｌ）またはテルジトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）であることを特徴とする請求項３９の方法。
【請求項４１】
洗浄剤が陰イオン性洗浄剤であることを特徴とする請求項３８の方法。
【請求項４２】
陰イオン性洗浄剤がＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）またはＮ−ラウロイルサルコシンであることを特徴とする請求項４１の方法。
【請求項４３】
界面活性剤が洗浄剤の混合物、または洗浄剤と可溶化界面活性剤の混合物であることを特徴とする請求項１９〜３７のうちいずれかの方法。
【請求項４４】
可溶化界面活性剤がＤＧＭＥであるであることを特徴とする請求項４３の方法。
【請求項４５】
（ａ）ＤＮＡを含む生物材料をＤＮＡ溶解溶液で前処理された固相担体と接触させ、ＤＮＡ溶解溶液は７より大のｐＨで緩衝されており、およびＤＮＡ溶解溶液は界面活性剤およびリチウム塩を含み；
（ｂ）ＤＮＡ添加溶液を生物材料へ加え；
（ｃ）実質的に未分解のＤＮＡおよび非核酸生物物質を含む核酸を放出するために、生物材料を固相担体と接触させ、実質的に未分解のＤＮＡを含む核酸が固相担体と結合し；
（ｄ）固相担体を洗浄溶液で洗浄して未分解のＤＮＡを含む結合した核酸以外の生物材料を除去し；および
（ｅ）結合した未分解のＤＮＡを固相担体からＤＮＡ溶出溶液で溶出する
：段階を含む、実質的に純粋なおよび未分解のＤＮＡを生物材料から精製するための方法。
【請求項４６】
（ａ）ＤＮＡを含む生物材料を第一のＤＮＡ溶解溶液と接触させ、第一のＤＮＡ溶解溶液は約７より大のｐＨで緩衝されておりおよび約５〜１５％ｖ／ｖの濃度の界面活性剤および１Ｍより高い濃度のＤＮＡ錯体化塩を含み；
（ｂ）生物材料を第二のＤＮＡ溶解溶液と接触させ、第二のＤＮＡ溶解溶液は界面活性剤および１Ｍより高いＤＮＡ錯体化塩を含むことを特徴とし；
（ｃ）混合物をＤＮＡ添加溶液と接触させ；
（ｄ）混合物を固相担体と接触させ、生物材料由来の実質的に未分解のＤＮＡを含む核酸が固相担体と結合し；
（ｅ）固相担体をＤＮＡ洗浄溶液で洗浄して実質的に未分解のＤＮＡを含む結合した核酸以外の生物材料を除去し、ＤＮＡ洗浄溶液はＤＮＡ錯体化塩およびアルコールを含み；および
（ｆ）実質的に未分解のＤＮＡを固相担体からＤＮＡ溶出溶液で優先的に溶出すること
：を含む、赤血球溶解段階を使用せずに、実質的に純粋なおよび未分解のＤＮＡを生物材料から精製するための直接溶解方法。
【請求項４７】
第二のＤＮＡ溶解溶液がさらにキレート剤を含むことを特徴とする請求項４６の方法。
【請求項４８】
（ａ）ＤＮＡを含む生物材料を約７より大のｐＨで緩衝されたＤＮＡ溶解溶液と接触させ、ＤＮＡ溶解溶液は界面活性剤および１Ｍより高い濃度でＤＮＡ錯体化塩を含み；
（ｂ）生物材料を固相担体と接触させ、実質的に未分解のＤＮＡを含む核酸が固相担体と結合し；
（ｃ）固相担体をＤＮＡ添加溶液と接触させ；
（ｄ）固相担体をＤＮＡ洗浄溶液で洗浄して未分解のＤＮＡを含む結合した核酸以外の生物材料を除去し、ＤＮＡ洗浄溶液はＤＮＡ錯体化塩およびアルコールを含み；および
（ｅ）実質的に未分解のＤＮＡを固相担体からＤＮＡ溶出溶液で優先的に溶出すること
：を含む、実質的に純粋なおよび未分解のＤＮＡを生物材料から精製するための方法。
【請求項４９】
（ａ）ＤＮＡを含む固定頸部細胞を含む生物材料を約７より大のｐＨで緩衝されたＤＮＡ溶解溶液と接触させ、ＤＮＡ溶解溶液は約２５〜３５％ｖ／ｖの濃度の界面活性剤、キレート剤、および１Ｍより高いＤＮＡ錯体化塩を含み；
（ｂ）混合物へアルコールを含む随意的なＤＮＡ添加溶液を加え；
（ｃ）実質的に未分解のＤＮＡを含む核酸および非核酸生物物質を放出させるために、生物材料を固相担体と接触させ、実質的に未分解のＤＮＡを含む核酸を固相担体と結合させ；
（ｄ）固相担体をＤＮＡ洗浄溶液で洗浄して未分解のＤＮＡを含む結合した核酸以外の生物材料を除去し；および
（ｅ）実質的に純粋なおよび未分解のＤＮＡを得るために、結合した未分解のＤＮＡを固相担体からＤＮＡ溶出溶液で優先的に溶出すること
：の段階を含む、実質的に純粋なおよび未分解のＤＮＡを固定頸部細胞試料から精製するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府資金による研究または開発に関する説明
本文書に関する研究は米国立衛生研究所グラント１ Ｒ４３ ＣＡ１０６１２４−０１によって支援された。米国政府は本発明に一定の権利を有しうる。
【０００２】
関連出願へのクロスリファレンス
本文書は、参照により本開示に含まれる、２００１年１０月１２日出願の米国特許出願公開第０９／９７４，７９８号明細書の継続出願である２００３年４月１６日出願の米国特許出願公開第１０／４１８，１９４号明細書の一部継続出願である２００４年８月２日出願の米国特許出願公開第１０／９０９，７２４号明細書の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）といった核酸は分子生物学の分野で研究および臨床分析に広く用いられている。液相および固相精製の二つの一般的分類に該当する、多数の核酸精製方法がある。液相精製では、ＤＮＡは液相に残る一方、不純物は沈澱および／または遠心分離によって除去される。固相精製では、ＤＮＡは固相担体に結合し、一方、不純物は選択的に溶出される。従来の液相および固相精製戦略は、多数の段階および危険な試薬を必要とする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ここでは核酸を単離および／または精製するための処方物が記載される。その処方物は、少なくとも約１Ｍの濃度のリチウム塩、少なくとも一種類の界面活性剤、および緩衝剤を含む。その処方物はさらに、ＥＤＴＡまたはクエン酸塩といったキレート剤を含みうる。その処方物は、カオトロープおよび／または強いカオトロピック物質を欠いている可能性がある。強いカオトロピック物質の例は、グアニジニウム塩、尿素、アンモニウム、セシウム、ルビジウム、カリウム、またはヨウ化物塩である。処方物中に存在するリチウム塩は塩化リチウムでありうる。リチウム塩は、２Ｍ〜１０Ｍの濃度、または２Ｍ〜６Ｍの濃度で存在しうる。一部の実施形態では、リチウム塩の濃度は、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍ、６Ｍ、７Ｍ、８Ｍ、９Ｍまたは１０Ｍ、またはその間の任意の範囲（たとえば５．５Ｍ）でありうる。処方物は、たとえば約７ないし約９（たとえば、ｐＨ約８、約８．５、または約９）といった、約７を上回るｐＨを有しうる。一部の実施形態では、単離および／または精製される核酸はＤＮＡである。
【０００５】
本処方物の界面活性剤は、処方物の総容量の約１０％〜約４０％（またはその間の任意の割合）の濃度で存在しうる。処方物中の界面活性剤または界面活性剤は洗浄剤でありうる。洗浄剤は、陰イオン性、陽イオン性、双性イオン性または非イオン性洗浄剤でありうる。一実施形態では、界面活性剤は非イオン性洗浄剤である。適当な非イオン性洗浄剤の例は、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）、イゲパール（Ｉｇｅｐａｌ）またはテルジトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）を含む。たとえば洗浄剤はトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−Ｘでありうる。さらに、界面活性剤はジエチルグリコールモノエチルエーテル（ＤＧＭＥ）でありうる。ＤＧＭＥは、処方物の総容量の約５％〜約３５％（またはその間の任意の割合）の濃度で存在しうる。一般的に、処方物の他の成分の濃度が増加するにつれ、その他の成分の溶解度を高めるためにＤＧＭＥの量も増やされる。一部の実施形態では、界面活性剤はトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−ＸおよびＤＧＭＥの混合物である。一実施形態では、界面活性剤は５％ｖ／ｖトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−Ｘおよび５％ｖ／ｖＤＧＭＥの混合物である。一実施形態では、界面活性剤は処方物の終容量の約１０％ｖ／ｖの濃度で存在する。
【０００６】
一実施形態では、界面活性剤は陰イオン性洗浄剤である。適当な洗浄剤の例は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはＮ−ラウロイルサルコシンを含む。一実施形態では、ＳＤＳが陰イオン性洗浄剤である。一実施形態では、洗浄剤は約０．０５〜０．２％（またはその間の任意の割合）の濃度で存在する。一実施形態では濃度は約０．１％である。
【０００７】
一部の実施形態では、処方物は二種類以上の界面活性剤の混合物を０．１％ＳＤＳおよび３０％ＤＧＭＥの濃度で含む。
【０００８】
処方物の緩衝剤は少なくとも約８のｐＫａを有しうる。キレート剤はＥＤＴＡまたはクエン酸塩でありうる。
【０００９】
一実施形態では、核酸を単離および精製するための処方物は、少なくとも約１Ｍの濃度のリチウム塩、界面活性剤、緩衝剤、および随意的なキレート剤を含み、溶液が約７を上回るｐＨを有することを特徴とする。
【００１０】
別の一実施形態では、核酸を単離および精製するための処方物は本質的に、少なくとも約１Ｍの濃度のリチウム塩、少なくとも一種類の界面活性剤、緩衝剤、および随意的なキレート剤から成る。
【００１１】
さらに別の一実施形態では、処方物は本質的に、リチウム塩、少なくとも一種類の界面活性剤、緩衝剤、および随意的なキレート剤から成り、処方物が約７を上回るｐＨを有することを特徴とする。
【００１２】
さらに別の一実施形態は本質的に、少なくとも約１Ｍの濃度のリチウム塩、界面活性剤、緩衝剤、および随意的なキレート剤から成り、処方物が約７を上回るｐＨを有することを特徴とする。
【００１３】
実質的に純粋なおよび未分解のＤＮＡを生物材料から精製するための方法もまた提供される。使用する生物材料は、粗試料または核酸の部分精製された混合物でありうる。生物材料の例は、真核細胞、原核細胞、微生物細胞、細菌細胞、植物細胞、マイコプラズマ、原虫、細菌、真菌、ウイルス、酵母、またはリケッチアの試料、またはそのホモジネートを含む。生物材料のその他の例は、全血、骨髄、頸部(cervical)スワブ、ろ紙血、血清、血漿、バフィーコート調製物、唾液、脳脊髄液、または固形動物組織を含む。生物材料のその他の例は、糞便、尿、涙、または汗を含む。生物材料はまた、空気、水、堆積物または土壌から採取した環境試料でありうる。生物材料は、たとえば、培養細胞、固定細胞、および／または組織を含むさまざまな種類の試料でありうる。一実施形態では、生物試料は頸部(cervical)細胞試料である。別の一実施形態では、生物試料は全血である。
【００１４】
使用する固相担体は、シリカ、セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、またはポリフッ化ビニリデン、またはその組み合わせの成分を含みうる。固相担体は容器に入っていてよく、その容器は遠心管、スピンチューブ、シリンジ、カートリッジ、チャンバー、マルチウェルプレート、または試験管、またはその組み合わせでありうる。固相担体は、生物材料を固相担体と接触させる前に、ＲＮアーゼ溶液で前処理されうる。
【００１５】
ＤＮＡ溶解溶液のリチウム塩は、ＤＮＡ錯体化塩である。使用されうるリチウム塩の例は、塩化リチウムまたは臭化リチウムを含む。ＤＮＡ溶解溶液のＤＮＡ錯体化塩は、約１Ｍより高い濃度で存在しうる。一実施形態では、ＤＮＡ錯体化塩は２Ｍないし８Ｍの濃度で存在しうる。一部の実施形態では、ＤＮＡ錯体化塩の濃度は、約２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍ、６Ｍ、７Ｍ、または８Ｍの濃度、またはその間の任意の濃度（たとえば約５．５Ｍ）である。
【００１６】
溶解溶液は、随意的に、ＥＤＴＡまたはクエン酸塩といったキレート剤を含みうる。
【００１７】
生物材料をＤＮＡ溶解溶液と接触させて混合物を生じ、ここでＤＮＡ溶解溶液は７より大のｐＨで緩衝され、およびＤＮＡ溶解溶液はリチウム塩および少なくとも一種類の界面活性剤を含むことを特徴とし；混合物をＤＮＡ添加溶液(spiking solution)と接触させ；生物材料中に存在するＤＮＡが固相担体と結合するように、混合物を固相担体と接触させ；固相担体を洗浄溶液で洗浄して、結合した実質的に未分解のＤＮＡ以外の生物材料を除去し；および実質的に純粋なおよび未分解のＤＮＡを得るために、ＤＮＡをＤＮＡ溶出溶液で溶出する段階を含む方法もまた提供される。「実質的に未分解のＤＮＡが固相担体と結合する」とは、実質的に未分解のＤＮＡが固相担体と結合する一方、生物試料中に見出される他の細胞または非細胞成分（たとえば細胞膜またはタンパク質）はおおむね固相担体と結合しないことを意味する。
【００１８】
ＤＮＡを含む生物材料をＤＮＡ溶解溶液で前処理した固相担体と接触させ、ここでＤＮＡ溶解溶液は約７より大のｐＨで緩衝され、およびＤＮＡ溶解溶液は界面活性剤およびリチウム塩を含むことを特徴とし；ＤＮＡ添加溶液を生物材料へ加え；実質的に未分解のＤＮＡおよび非核酸生物物質を含む核酸を放出するために、生物材料を固相担体と接触させ、ここで実質的に未分解のＤＮＡを含む核酸が固相担体と結合することを特徴とし；未分解のＤＮＡを含む結合した核酸以外の生物材料を除去するために、固相担体を洗浄溶液で洗浄し；および結合した未分解のＤＮＡを固相担体からＤＮＡ溶出溶液で溶出する段階を含む、実質的に純粋なおよび未分解のＤＮＡを生物材料から精製するための方法もまた提供される。洗浄溶液は、約７より大のｐＨで緩衝されうる。一部の実施形態では、洗浄溶液は約７ないし約９（たとえば、ｐＨ約８、約８．５、または約９）で緩衝されうる。本方法および／または処方物で使用される溶解および／または洗浄溶液は、カオトロープおよび／または強いカオトロピック物質を欠いてもよい。
【００１９】
ＤＮＡ添加溶液は、アルコールを含みうるかまたはアルコールでありうる。アルコールは、イソプロパノール、エタノール、メタノールなどでありうる。アルコールは、アルコールの混合物でありうる。一実施形態では、ＤＮＡ添加溶液は１００％イソプロパノールである。
【００２０】
界面活性剤は洗浄剤でありうる。洗浄剤は、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）、イゲパール（Ｉｇｅｐａｌ）またはテルジトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）といった非イオン性洗浄剤でありうる。洗浄剤は、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）またはＮ−ラウロイルサルコシンといった陰イオン性洗浄剤でありうる。界面活性剤は、洗浄剤の混合物、またはＤＧＭＥのような可溶化界面活性剤と洗浄剤の混合物でありうる。
【００２１】
ＤＮＡ添加溶液は、リチウム塩といったアルカリ金属塩を含みうる。ＤＮＡ添加溶液は、７より大のｐＨで緩衝されうる。一部の実施形態では、ＤＮＡ添加溶液は約７ないし約９（たとえば、ｐＨ約８、約８．５、または約９）で緩衝されうる。ＤＮＡ添加溶液は界面活性剤を含みうる。一実施形態では、界面活性剤はＤＧＭＥである。
【００２２】
（ａ）ＤＮＡを含む生物材料を、ＤＮＡ溶解溶液が固相担体と結合するように約７より大のｐＨで緩衝されたＤＮＡ溶解溶液で前処理した固相担体と接触させ、ここでＤＮＡ結合溶液がＤＮＡ錯体化塩を含むことを特徴とし；（ｂ）随意的なＤＮＡ添加溶液を混合物へ加え；（ｃ）実質的に未分解のＤＮＡを含む核酸が固相担体と結合するように、生物材料を固相担体と接触させ；（ｄ）実質的に未分解のＤＮＡを含む結合した核酸以外の生物材料を除去するために、固相担体をＤＮＡ洗浄溶液で洗浄し；および（ｅ）実質的に純粋なおよび未分解のＤＮＡを得るために、結合した実質的に未分解のＤＮＡを固相担体からＤＮＡ溶出溶液で優先的に溶出する段階を含む、実質的に純粋なおよび未分解のＤＮＡを生物材料から精製するための方法もまた提供される。
【００２３】
（ａ）ＤＮＡを含む生物材料を、ＤＮＡ溶解溶液が固相担体と結合するように約７より大のｐＨで緩衝されたＤＮＡ溶解溶液で前処理した固相担体と接触させ、ＤＮＡ結合溶液は界面活性剤およびＤＮＡ錯体化塩を含み；（ｂ）生物試料へ随意的なＤＮＡ添加溶液を加え；（ｃ）実質的に未分解のＤＮＡおよび非核酸生物物質を含む核酸を放出するために、生物材料を固相担体と接触させて、実質的に未分解のＤＮＡを含む核酸を固相担体と結合させ；（ｄ）未分解のＤＮＡを含む結合した核酸以外の生物材料を除去するために、固相担体をで洗浄し；および（ｅ）実質的に純粋なおよび未分解のＤＮＡを得るために、結合した未分解のＤＮＡを固相担体からＤＮＡ溶出溶液で優先的に溶出する段階を含む、実質的に純粋なおよび未分解のＤＮＡを生物材料から精製するための方法もまた提供される。
【００２４】
ＤＮＡを含む生物材料を第一のＤＮＡ溶解溶液と接触させ、ここで第一のＤＮＡ溶解溶液は約７より大のｐＨで緩衝されおよび濃度約５〜１５％ｖ／ｖで界面活性剤を、および１Ｍより大の濃度でＤＮＡ錯体化塩を含むことを特徴とし、生物材料を第二のＤＮＡ溶解溶液と接触させ、ここで第二のＤＮＡ溶解溶液は界面活性剤および１Ｍより大のＤＮＡ錯体化塩を含むことを特徴とし；混合物をＤＮＡ添加溶液と接触させ；混合物を固相担体と接触させ、ここで生物試料由来の実質的に未分解のＤＮＡを含む核酸が固相担体と結合することを特徴とし；実質的に未分解のＤＮＡを含む結合した核酸以外の生物材料を除去するために、固相担体をＤＮＡ洗浄溶液で洗浄し、ＤＮＡ洗浄溶液はＤＮＡ錯体化塩および界面活性剤を含み；および実質的に未分解のＤＮＡを固相担体からＤＮＡ溶出溶液で優先的に溶出する段階を含む、生物材料、たとえば全血から、赤血球（ＲＢＣ）溶解段階無しに、実質的に純粋なおよび未分解のＤＮＡを精製するための直接溶解方法もまた提供される。一部の実施形態では、第二のＤＮＡ溶解溶液は約７より大のｐＨで緩衝される。一部の実施形態では、第二のＤＮＡ溶解溶液中の界面活性剤の濃度は、約２５〜３５％ｖ／ｖである。一部の実施形態では、第二のＤＮＡ溶解溶液はまたキレート剤を含む。
【００２５】
ＤＮＡを含む生物材料を、約７より大のｐＨで緩衝されたＤＮＡ溶解溶液と接触させ、ＤＮＡ溶解溶液は界面活性剤および１Ｍより大のＤＮＡ錯体化塩を含み；混合物へ、アルコールを含む随意的なＤＮＡ添加溶液を加え；実質的に未分解のＤＮＡおよび非核酸生物物質を含む核酸を放出するために、生物材料を固相担体と接触させて、実質的に未分解のＤＮＡを含む核酸を固相担体と結合させ；未分解のＤＮＡを含む結合した核酸以外の生物材料を除去するために、固相担体をＤＮＡ洗浄溶液で洗浄し；および実質的に純粋なおよび未分解のＤＮＡを得るために、結合した未分解のＤＮＡを固相担体からＤＮＡ溶出溶液で優先的に溶出する段階を含む、実質的に純粋なおよび未分解のＤＮＡを、たとえば固定頸部細胞試料のような生物材料から精製するための方法もまた提供される。一部の実施形態では、ＤＮＡ溶解溶液中の界面活性剤の濃度は約２５〜３５％ｖ／ｖである。一部の実施形態では、ＤＮＡ溶解溶液はまたキレート剤を含む。
【００２６】
ここでは、「実質的に純粋な」とは、核酸定量、制限酵素消化、ＤＮＡ配列決定、サザンブロッティングなどといったハイブリダイゼーション技術、および、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列準拠増幅（ＮＡＳＢＡ）、自己維持的配列複製（ＳＳＲまたは３ＳＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および転写媒介増幅（ＴＭＡ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）といった増幅方法、またはその他のＤＮＡ分析のような当業者に公知である以降の分析にＤＮＡが使用されうるように、ＲＮＡ、糖質、タンパク質、脂質不純物を実質的に含まないことを意味する。
【００２７】
ここでは、「実質的に未分解の」ＤＮＡとは、非消化または無処理ＤＮＡを意味し、当業者によって標準的方法を用いて容易に決定されうる。「実質的に未分解の」ＤＮＡは、本明細書に記載の精製方法中に、酵素的、物理的または化学的方法によって損傷されていない。
【００２８】
試薬、方法およびキットは、幅広い生物起源および生物形態にわたって実質的に純粋なおよび未分解のＤＮＡを単離するのに用いることができ、そのすべてが広い分子量範囲にわたって回収されうる。得られた実質的に純粋なおよび未分解のＤＮＡは、純度、収率、サイズ、逆転写酵素または他のハイブリダイゼーション処理、増幅、ハイブリダイゼーション能力などについて評価されうる。生物試料は、たとえば、細胞またはウイルス懸濁液およびその沈澱、体液、頸部細胞スワブおよび組織ホモジネートなどを含む。生物試料が細胞またはウイルスを含む場合は、細胞またはウイルスは計数されうる。計数は、たとえば電子細胞計数装置（たとえばＣＢＣ５コールターカウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ）、コールター社（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐ．）、フロリダ州ハイアリア（Ｈｉａｌｅａｈ））または目視計数チャンバー（たとえば血球計算盤ブライトライン（Ｂｒｉｇｈｔ Ｌｉｎｅ）、アメリカン・オプティカル社（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｐｔｉｃａｌ）、ニューヨーク州バッファロー（Ｂｕｆｆａｌｏ））といった標準的な細胞計数方法を用いて実施されうる。
【００２９】
不定冠詞「ａ」および「ａｎ」および定冠詞「ｔｈｅ」は、特許文書で一般的である通り、文脈で明示されない限り、一つ以上という意味で用いられることに注意すべきである。さらに、本文書では「または」の語は、特許出願書類で一般的である通り、離接接続詞「または」または合接接続詞「および．」という意味で用いられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
核酸の結合および精製のためのカオトロピック塩の使用は本分野でよく知られている。たとえば、クロイタ（Ｋｕｒｏｉｔａ）他（米国特許第５，９９０，３０２号明細書）は、生物材料をリチウム塩およびグアニジニウムイソチオシアナート（ＧＩＴＣ）といったカオトロピック剤を含む酸性溶液中で溶解でき、その後ＲＮＡをシリカといった核酸結合キャリヤーと接触させることを開示する。ＲＮＡはその後、低イオン強度緩衝液中でシリカから溶出することによって精製される。この方法は、カオトロピック塩のグアニジンイソチオシアナートといった危険な物質の使用の点で不利益である。
【００３１】
４Ｍより大のイオン強度のグアニジンイソチオシアナート、グアニジン塩酸塩、ヨウ化ナトリウム、および尿素混合物といったカオトロピック物質の、シリカを基礎とするキャリヤーと併用する組み合わせは、ＲＮＡ精製のために本分野で教示されている。たとえば、ヒルブラント（Ｈｉｌｌｅｂｒａｎｄ）他（ＷＯ９５／３４５６９）は、ＲＮＡを結合させるためにカオトロピック物質を加えるシリカビーズのスラリーを含む一段階法を記載する。
【００３２】
カオトロープの使用に対する見かけ上反対の手法は、ＲＮＡを単離するためのアンチカオトロープ（本分野で別名「コスモトロープ」）の使用である。ヒルブラント（Ｈｉｌｌｅｂｒａｎｄ）他（ＵＳ２００１／００４１３３２）は、開始試料を溶解しおよび洗浄剤／アルコール混合物と共に固相担体と結合するために、塩化アンモニウム（またセシウム、ナトリウムおよび／またはカリウム塩が言及される）といった「アンチカオトロープ」の、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）と組み合わせた使用を記載する。セシウムおよびカリウムは低い電荷密度および弱い水和特性のために明らかにカオトロープであると考えられている一方でアンモニウムは限界カオトロープであると考えられていることが一般的に知られているという事実の上（コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ），Ｋ．生物系における粘着性イオン（Ｓｔｉｃｋｙ Ｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ），ＰＮＡＳ，９２ （１９９５），５５５３−５５５７；ウィッギンズ（Ｗｉｇｇｉｎｓ），Ｐ．Ｍ．高密度および低密度細胞内水（Ｈｉｇｈ ａｎｄ Ｌｏｗ 密度 Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｗａｔｅｒ），Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４７ （５），７３５−７４４）、ヒルブラントの方法にはいくつかの不利益が存在する。第一に、その方法はＰＶＰを使用するが、ＰＶＰは発がん性物質として調査されている。次に、溶解および溶出のために６５〜７０℃の加熱段階が必要である。そのような加熱は、非特異的分解または消化による核酸への損傷を生じる可能性があり、結果として、たとえば制限消化物またはブロット分析に不適といった以降の用途の限定を生じうる。
【００３３】
核酸および他の生物材料を含む溶液から核酸を選択的に沈澱する方法は、溶液中のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を選択的に結合する固相を用いる方法とは物理的に異なることに注意すべきである。「沈澱」現象は「溶解」現象の逆である。溶解は、ＤＮＡのような溶質の、溶媒によって囲まれた分子への分離による分解を含む。沈澱は、溶媒の除去、および個々のＤＮＡ分子の、溶媒から分離する固体への凝集を含む。これらの沈澱および溶解現象は、溶液環境内で起こり、および、ＤＮＡ精製および分離が起こる個々の異なる固相には依存しない。
【００３４】
ＤＮＡ試料調製の分野を前進させるために、固相ＤＮＡ精製戦略が必要とされている。また、固相精製戦略に適用可能で、および、自動化への適用可能性を最大化するために、簡単および迅速であるだけでなく範囲が一般的である試薬および方法もまた必要とされている。一般的に低濃度で、室温にて（すなわち２０〜２５℃）安定であり、危険性がより低く（たとえば腐食性、可燃性、または毒性がより低い）、混合の必要性を無くすために非粒子性であり、およびＤＮＡ品質を保護する試薬もまた必要とされている。含水でも乾燥でも、さまざまな生物開始材料を用いて実施できる少数の段階しかない、特に臨床試験施設で見られるように定型の試験に用いられるような方法もまた必要とされている。試薬はＰＣＲ緩衝液の緩衝能を妨害することによって以降のＤＮＡ分析手順を阻害してはならず、またはＤＮＡ増幅に用いられるポリメラーゼ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドの分解を引き起こしてはならない。含水でも乾燥でも、さまざまな生物開始材料を用いて実施できる少数の段階しかない、特に臨床試験施設で見られるように定型の試験に用いられるような方法もまた必要とされている。固相精製戦略に用いられる試薬および方法はまた、核酸操作の標準的な実験および／または診断法を妨害してはならない。
【００３５】
加えて、核酸を単離および精製することは、より困難な試料型の発見に伴ってより困難になっている。たとえば、ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）用の分子に基づく試験での使用のための頸部細胞からＤＮＡを単離および精製することは、頸部がんにおけるＨＰＶ感染の役割が明らかになっているため臨床検査施設で急速に採用されている。分子診断試験施設は現在、年間６００万件のＨＰＶ診断検査を実施する。しかし、分子試験のための頸部試料からのＤＮＡの調製は、増大する需要についてきていない。標準的な操作では、剥離した頸部上皮細胞を、たとえばシュアパス（ＳｕｒｅＰａｔｈ）（商標）保存液（トリパス・イメージング社（ＴｒｉＰａｔｈ Ｉｍａｇｉｎｇ）、ノースカロライナ州バーリントン（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ））またはシンプレップ（ＴｈｉｎＰｒｅｐ）（登録商標）パップテスト（Ｐａｐ Ｔｅｓｔ）（商標）（サイティック社（Ｃｙｔｙｃ），マサチューセッツ州ボックスボロ（Ｂｏｘｂｏｒｏｕｇｈ））のような保存料を含む液体培地に採取し、および試料はしばしばさまざまな細胞および非細胞成分が混入しており、単離および精製を困難にする。これらの混入物は、粘液、白血球、赤血球、およびタンパク質を含みうる。現在の手作業によるＤＮＡ精製方法は、分子に基づくＨＰＶ診断薬の臨床検査施設でのさらなる採用を妨げるいくつかの重大な不利益を有する。剥離した頸部細胞を含む試料からのＤＮＡの精製のための、より効率的および効果的な方法が現在緊急に必要とされている。
【００３６】
新鮮、凍結、および乾燥生物試料から、実質的に純粋なおよび未分解のＤＮＡを単離するための固相担体を組み込んだ試薬、方法、およびキットがここでは提供される。精製されたＤＮＡは、核酸定量、制限酵素消化、ＤＮＡ配列決定、サザンブロッティングなどといったハイブリダイゼーション技術、および、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列準拠増幅（ＮＡＳＢＡ）、自己維持的配列複製（ＳＳＲまたは３ＳＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および転写媒介増幅（ＴＭＡ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）といった増幅方法、または他のＤＮＡ分析といった広く用いられている分析および診断方法での使用に適している。
【００３７】
生物材料および／または試料
生物試料からＤＮＡを精製するための試薬、方法およびキットがここでは提供される。そのような生物試料は、典型的には含水混合物または乾燥の、ＤＮＡを含む生物材料を含み、原核または真核細胞の複雑な生物混合物を含む。典型的には、生物材料はまた、ＲＮＡ、糖質、タンパク質、および脂質を含む。生物材料は、下記を含むがそれらに限定されない：全血のような体液、骨髄、ろ紙血、血清、血漿、バフィーコート調製物、唾液および脳脊髄液、口腔スワブ、培養細胞、固定細胞、頸部細胞スワブ、細菌の細胞懸濁液または組織ホモジネート、たとえば心臓、肝臓および脳のような固形動物組織、糞便および尿のような体老廃物、空気、水、堆積物または土壌から採取された環境試料、植物組織、酵母、細菌、ウイルス、マイコプラズマ、真菌、原虫、リケッチア、および他の小型微生物細胞。これらの生物材料の溶解物、ホモジネート、または部分精製試料もまた使用されうる。一実施形態では、生物材料は核酸の粗混合物または部分精製混合物である。
【００３８】
試薬
試薬の４つの分類がここでは開示される。これらは、ＤＮＡ溶解溶液、ＤＮＡ添加溶液、ＤＮＡ洗浄溶液、およびＤＮＡ溶出溶液である。これらの試薬は、適当な固相担体と併用され、実質的に純粋なおよび混入物を含まない未分解ＤＮＡを生じるために用いられる。フェノール、およびクロロホルムといった危険な物質、またはグアニジニウム塩、尿素などといった危険なカオトロピック物質を使用せずに、さまざまな生物材料からＤＮＡを精製するために使用されうる試薬。
【００３９】
（１）ＤＮＡ溶解溶液：ＤＮＡ溶解溶液は、核酸を放出するための生物試料の効率的な溶解を可能にし、および効果的にＤＮアーゼ活性を阻害する。ＤＮＡ溶解溶液は下記の成分を有する：リチウム塩；緩衝剤；界面活性剤、たとえば洗浄剤または洗浄剤／界面活性剤混合物；および随意的にキレート試薬。ＤＮＡ溶解溶液は、グアニジニウム塩、尿素などといった強いカオトロピック物質の添加を必要としない点で独特である。グアニジニウム塩および尿素は、水の構造を破壊する強いカオトロピック塩であり、およびしたがって疎水性相互作用の力を減少させる傾向があり、結果として他の溶質分子に対して強力な作用を生じる。たとえば、尿素は、水に溶解した場合、タンパク質の二次、三次、および四次構造を破壊し、および続いてＤＮＡからのタンパク質の解離を引き起こす。グアニジニウム塩および尿素は、吸熱反応で水に溶解する。グアニジニウム塩および尿素は両方とも、相対カオトロピック強度に従って陽イオンおよび陰イオンを順位づける広く用いられている系であるホフマイスター系列によって定義される通り、強いカオトロピック塩と考えられている（Ｆ．ホフマイスター（Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ），塩の作用の理解に関して（Ｏｎ ｔｈｅ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓａｌｔｓ ），Ａｒｃｈ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｐｈａｒｍａｋｏｌ．（Ｌｅｉｐｚｉｇ） ２４ （１８８８） ２４７−２６０）。
【００４０】
強いカオトロピック塩とは異なり、リチウム塩（たとえば塩化リチウムおよび臭化リチウム）の水中での反応は発熱反応であり、および強いコスモトロピックなリチウムイオンによって示される甚だしいイオン−双極子相互作用、および結果として生じる大きな溶解性を示す。これらのような違いは、グアニジニウム塩といった強いカオトロピック物質と、アルカリ金属塩、特に塩化リチウムとの間の違いを示す。
【００４１】
たとえば塩化リチウムおよび臭化リチウムを含む、リチウム塩の使用がここで開示される。リチウムイオンは、その高い表面電荷密度および強い水和特性のため、非常にコスモトロピックと考えられている。リチウムイオンは、やはりアルカリ金属類に見られるナトリウム、カリウム、ルビジウムおよびセシウムイオンの半径と比較して小さい半径を有する点で独特である。このことは、表面電荷密度をこの群のその他のイオンよりも大きくする。より大きな表面電荷密度は、水分子とのリチウムイオンの甚だしい相互作用の原因である。これは、リチウムイオンの周囲での水分子の組織化、および第一水和圏を超えてさえこの構造を維持する原因となる。
【００４２】
適当なＤＮＡ錯体化塩は、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウムおよびセシウムといったアルカリ金属イオンを含むものを含み、なぜならこれらの陽イオンのすべてがＤＮＡ分子のリン酸基と特異的に錯体形成するからである。この錯体化およびその後のＤＮＡ分子の中和は、ＤＮＡ分子の水系環境での不安定化を引き起こし、および固相への結合を促進する。一実施形態はリチウム塩を使用する。リチウム塩は、塩化リチウムおよび臭化リチウムを含むがそれらに限定されない。フッ化リチウムおよびヨウ化リチウムは、コストが塩化および臭化リチウム塩のコストの約５倍であるため、より望ましくないアルカリ塩である。加えて、リチウムイオンは、前述の一覧の中で唯一の明らかにコスモトロピックなイオンである。ナトリウムイオンは境界線上のコスモトロープであり、一方カリウム、ルビジウムおよびセシウムイオンはカオトロピックイオンである（コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ），Ｋ．生物系における粘着性イオン（Ｓｔｉｃｋｙ Ｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２（１９９５），５５５３−５５５７）。塩化セシウムは、それ以外のアルカリ金属塩化物塩よりも約５倍高いコストであり（表１）および塩化および臭化リチウム塩よりも限定された溶解度挙動を有する。加えて、塩化ナトリウム、カリウムおよびアンモニウム塩は、水中のリチウム塩によって示される溶液の大きな発熱によって示される通り、塩化および臭化リチウム塩と比較してさらにより限定された溶解度挙動を有する（ＣＲＣ化学および物理学ハンドブック第６２版、ＣＲＣプレス社、フロリダ州ボカラトン（ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ，６２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌ．））。
【００４３】
固相担体へのＤＮＡの結合は、溶解および／または添加溶液中のアルカリ金属塩の高濃度によって促進される。アルカリ金属塩は２〜１０Ｍの濃度でありうる。実施例２では、溶解溶液において、塩化アンモニウムおよびカリウム塩はそれぞれ３Ｍおよび３Ｍ未満の最大溶解度を有するが、一方で塩化セシウムおよびナトリウム塩は４Ｍまで容易に溶解することが観察される。表２に見られるように、これらの塩の値は、塩化アンモニウムの値以外は、水溶液で予想される値とほぼ一致する（ＣＲＣ化学および物理学ハンドブック第６２版、ＣＲＣプレス社、フロリダ州ボカラトン（ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ，６２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ））。
【００４４】
コスモトロピックなマグネシウムおよびカルシウムイオンを含むアルカリ土類金属塩は、ＤＮＡと塩錯体を形成する性質もまた有しているが、ＤＮＡを固相担体へ結合するのに必要な高濃度で可溶でない。加えて、たとえば、アルカリ土類金属のベリリウムはアルカリ金属塩の塩化リチウムまたは臭化リチウムよりも約２０倍高価であり、およびしたがって本発明における使用のためには現実的でない。
【００４５】
ＤＮＡ溶解溶液は、ＤＮＡが吸着機構によって明確な固相に結合するように、リチウム塩を含む。固相へのＤＮＡの吸着を生じさせるためのリチウム塩の使用は、ＤＮＡの沈澱のためのリチウムの使用とは異なる。吸着過程において、溶媒分子はＤＮＡ分子から分離される。ＤＮＡと固相との間の相互作用は、ＤＮＡ分子相互作用のものよりもエネルギー的に有利であり、そのため沈澱の代わりに固相への吸着が起こる。適当な固相の一例はホウケイ酸である。
【００４６】
ＤＮＡ溶解溶液は、生物材料中の他の材料と比較して、塩化リチウムまたは臭化リチウムといったＤＮＡ錯体化リチウム塩の、緩衝液中の、および界面活性剤の存在によって、グアニジニウム塩、尿素などといった危険なカオトロピック物質を使用せずに、固相担体へのＤＮＡの結合を達成する。リチウムイオンは、ＤＮＡといった核酸の荷電したリン酸骨格と結合し、高いリチウムイオン濃度ではＤＮＡをより溶けにくくする（カザコフ（Ｋａｚａｋｏｖ） Ｓ．Ａ．，金属イオンによる核酸結合および触媒反応（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ ｂｙ Ｍｅｔａｌ Ｉｏｎｓ）、『生物有機化学：核酸』（ＢｉｏｏｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ），ヘクト（Ｈｅｃｈｔ），Ｓ．Ｍ．編，オックスフォード大学出版会（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ），ＮＹ および Ｏｘｆｏｒｄ，１９９６）。このように、ＤＮＡ錯体化塩は、ＤＮＡといった核酸に独自の結合特性を与え、そのため核酸はタンパク質、リン脂質などといった他の夾雑物よりも、固相担体へ結合できる。
【００４７】
ＤＮＡ溶解溶液の第二の成分は、溶液のｐＨを維持する緩衝剤である。さまざまな試料型からの最大のＤＮＡ収率のための、独自の中〜高ｐＨのＤＮＡ溶解溶液の使用がここで教示される。たとえば、ＤＮＡ溶解溶液は、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約８．５、または少なくとも約９さえのｐＨを維持するように緩衝されうる。緩衝剤は少なくとも約８のｐＫａを有することができ、および１０〜１００ｍＭの濃度で使用されうる。適当な緩衝剤の一例は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス（Ｔｒｉｓ））である。随意的に、ＤＮＡ溶解溶液のｐＨを調製するために塩基が使用されうる。塩基は、溶液のｐＨを少なくとも７に上げることができるものでありうる。塩基は、アルカリ金属水酸化物でありうる。そのようなアルカリ金属水酸化物は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、および水酸化リチウムを含む。
【００４８】
ＤＮＡ溶解溶液は、一つ以上の界面活性剤をさらに含む。界面活性剤は、液体の表面張力を低減する分子を含み、および同様の極性および構造の分子間の引力を低減することによって異なる極性および構造の分子間の可溶化を可能にする。一実施形態では、界面活性剤は、生物材料の溶解を助ける、洗浄剤、または洗浄剤／界面活性剤混合物である。洗浄剤は、細胞膜の溶解およびホモジナイズ処理を円滑にする目的で、脂質およびタンパク質といった膜成分を可溶化するために存在する。界面活性剤は、溶液の溶解性を補助するためおよび溶液の保存性を高めるために存在する。陰イオン性、陽イオン性、非イオン性および双性イオン性洗浄剤はすべて使用されうる。一部の場合には、ＤＮＡ単離は非イオン性洗浄剤の使用によって最適に達成され、一方で他の場合には、ＤＮＡ単離は陰イオン性洗浄剤の使用によって最適に達成される。任意の非イオン性または陰イオン性洗浄剤が使用されうるが、非イオン性洗浄剤の例は、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）類のもの（ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−４０、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−６０、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−８０など）、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）類（Ｘ−１００、Ｘ−１１４、ＸＬ−８０Ｎなど）、テルジトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）（ＸＤ、ＴＭＮ−６など）およびノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）またはイゲパール（Ｉｇｅｐａｌ）（ＮＰ−４０など）であり、および陰イオン性洗浄剤の例はＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）またはＮ−ラウロイルサルコシンである。非イオン性洗浄剤は、５〜１５％、たとえば約１０％の濃度で使用されうる。陰イオン性洗浄剤は、０．０５〜０．２％の濃度で使用されうる。別の一実施形態では、洗浄剤および界面活性剤の組み合わせが使用されうる。一実施形態では、界面活性剤はＤＧＭＥ（ジエチルグリコールモノエチルエーテル）である。一実施形態では、洗浄剤トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−Ｘおよび界面活性剤ＤＧＭＥの組み合わせが用いられる。その組み合わせは、５〜１５％、たとえば約１０％の濃度でありうる。一例では、組み合わせは５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−Ｘおよび５％ＤＧＭＥである。さらに別の一実施形態では、組み合わせは、２５〜３５％、たとえば約３０％の濃度でありうる。一例では、組み合わせは０．１％ＳＤＳおよび３０％ＤＧＭＥである。
【００４９】
中性から高ｐＨ緩衝液中でのリチウム塩および洗浄剤または界面活性剤の組み合わせはまた、一般的に生物材料に随伴するＤＮアーゼといった酵素を変性させるのに役立つ。随意的に、ＤＮＡ溶解溶液はまた、外来の金属イオンを錯体化するキレート剤を含みうる。キレート剤は、１〜１００ｍＭの濃度で、または１〜１０ｍＭの濃度で存在しうる。キレート剤の例はＥＤＴＡまたはクエン酸塩である。ＤＮＡ溶解溶液は、他の記載された試薬に対して顕著な長所を有する。ＤＮＡ錯体化リチウム塩および洗浄剤の中性〜高ｐＨ緩衝液中での独特の組み合わせは、フェノール、クロロホルム、およびグアニジニウム塩といった試薬の使用無しにＤＮＡに有害な酵素（たとえばＤＮアーゼ）を不活性化する一方、ＤＮＡ添加溶液と組み合わせて使用する際に生物材料の完全な溶解および結合過程の促進を可能にする。
【００５０】
（２）ＤＮＡ添加溶液(spiking solution)：ＤＮＡの固相への定量的結合を生じるようにＤＮＡ分子を脱水するのに用いることができる、ＤＮＡ添加溶液の使用が本文書で教示される。ＤＮＡ添加溶液はアルコールでありうる。アルコールの例はイソプロパノール、エタノール、またはメタノールである。一実施形態では、ＤＮＡ添加溶液は、たとえば１００％イソプロパノールのような、１００％アルコールである。ＤＮＡ添加溶液は、代替的に、アルカリ金属塩を含みうる。アルカリ金属塩ＤＮＡ添加溶液は、たとえば７より大のｐＨで、緩衝されてもされなくてもよい。アルカリ金属塩ＤＮＡ添加溶液は、随意的な洗浄剤または界面活性剤を追加で含みうる。一実施形態では、界面活性剤はＤＧＭＥである。
【００５１】
ＤＮＡ添加溶液は、ＤＮＡの固相への定量的結合を生じるようにＤＮＡ分子を脱水する。ＬｉＣｌは、他の塩が十分可溶でない極めて高濃度（１３ｍｏｌａｌ）にて溶液からＤＮＡを沈澱させることが観察されている（エマヌエル（Ｅｍａｎｕｅｌ），Ｃ．Ｆ．高塩溶媒に溶解されたデオキシリボ核酸のいくつかの物理的性質：塩濃色効果（Ｓｏｍｅ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｉｎ ａ Ｈｉｇｈ−Ｓａｌｔ Ｍｅｄｉｕｍ： Ｓａｌｔ Ｈｙｐｅｒｃｈｒｏｍｉｃｉｔｙ，）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，４２，９１−９８ （１９６０））。より高濃度の塩またはアルコールは、ガラス繊維に結合したＤＮＡのより高い収率を結果として生じる。ＬｉＣｌの漸増濃度では、水分子は核酸水和圏から引き離され、代わりに溶液中のＬｉ+と優先的に結合する。一つの研究は、ＬｉＣｌの十分高い濃度では、最終的にＤＮＡ構造と結合して残る水分子は無いことを示す（チャトラジ（Ｃｈａｔｔｏｒａｊ），Ｄ．Ｋ．およびビルディ（Ｂｉｒｄｉ），Ｋ．Ｓ．『生物高分子による水蒸気の吸着』（Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｗａｔｅｒ Ｖａｐｏｒ ｂｙ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，）、『吸着およびギブズ表面過剰』より（Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ｇｉｂｂｓ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｅｘｃｅｓｓ），プレナム・プレス社（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ），ＮＹおよびロンドン，１９８４）。脱水作用およびその後の表面の中和は、ＤＮＡ分子が高度に規則化された水溶液から疎水性の増大のために追い出されおよび固相へ結合する原因となる。シリカ固相へのＤＮＡ吸着はまた、部分的に、脱水過程中に水分子がＤＮＡ分子およびシリカ固相表面の両方から放出される際に起こるエントロピーの増大によってエネルギー的に推進される（メルザック（Ｍｅｌｚａｋ），Ｋ．Ａ．他『過塩素酸溶液中のシリカへのＤＮＡ吸着のための推進力』（Ｄｒｉｖｉｎｇ Ｆｏｒｃｅｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｔｏ Ｓｉｌｉｃａ ｉｎ Ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ），Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８１，６３５−６４４ （１９９６））。高塩濃度または高いアルコール組成のどちらかを有するＤＮＡ添加溶液の使用は、ＤＮＡ分子を溶液からより完全に脱水または塩析し、固相への吸着を引き起こす。
【００５２】
一実施形態では、ＤＮＡ添加溶液は、リチウム塩といったアルカリ金属塩の高濃度を含む。一実施形態では、アルカリ金属塩は１０〜１５Ｍの濃度である。ＤＮＡ添加溶液は、ｐＨ少なくとも７で緩衝されうる。ＤＮＡ添加溶液は、塩および緩衝剤の溶解度を補助するための界面活性剤を含みうる。界面活性剤はＤＧＭＥでありうる。
【００５３】
（３）ＤＮＡ洗浄溶液：核酸を固相担体へ結合したままにさせる一方で、タンパク質およびリン脂質といった非核酸混入物または不純物を除去する目的で、核酸が結合した固相担体を洗浄するためのＤＮＡ洗浄液もまたここで教示される。洗浄溶液は、アルコール、および緩衝剤、塩またはキレート剤（たとえばＥＤＴＡ）を含む。緩衝剤組成物は、たとえばｐＨ６〜８のトリスＨＣｌでありうる。緩衝剤濃度は５０〜１５０ｍＭ（たとえば１００ｍＭ）でありうる。アルコールはエタノールでありうる。アルコール濃度は２５〜１００％でありうる。ＥＤＴＡ濃度は１〜２０ｍＭ（たとえば５〜１０ｍＭ）でありうる。
【００５４】
（４）ＤＮＡ溶出溶液：固相担体と結合したＤＮＡは、ＤＮＡ溶出溶液を用いて溶出されうる。生物材料の溶解およびＤＮＡの固相担体への結合に、および固相担体の洗浄に用いられる試薬の単純さは、単純なＤＮＡ溶出溶液に適する。当業者に公知であるその他のＤＮＡ溶出溶液もまた使用されうる。たとえば、使用されうるＤＮＡ溶出溶液がベルサジーン（Ｖｅｒｓａｇｅｎｅ）（商標）ＤＮＡ溶出溶液（ジェントラ・システムズ社（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ミネソタ州ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ））である。代替的に、トリス−ＥＤＴＡ（ＴＥ）が使用されうる。
【００５５】
固相担体
さまざまな固相担体が使用されうる。適当な固相担体は、ガラス繊維といったシリカを基礎とする担体、またはセルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、ポリフッ化ビニリデンといったその他の材料、およびその組み合わせを含む。固相担体は、プラグフローまたは連続流ＤＮＡ単離方法を可能にする容器に入れるかまたは固定することができる。代替的に、固相担体の材料は、チューブまたはプレートといった適当な容器に入れるかまたは固定することができる膜、ディスク、またはシリンダーといった独立の固相担体を作製するために、充填されうる。一実施形態では、固相担体は、生物材料との最適の接触を可能にするために、繊維状または粒子状である。固相担体の、試薬との使用に適したサイズは、生物材料の量に従って変化しうる。たとえば、ガラス繊維膜は、さまざまな量のＤＮＡの結合、精製および溶出を可能にするためにさまざまなサイズに切ることができる。
【００５６】
一実施形態では、固相担体は、ここに記載のＤＮＡ溶解溶液の存在下で、他の生物混入物でなく核酸の固相担体への結合を可能にする材料でありうる。そのような固相担体は、シリカを基礎とするかまたはホウケイ酸ガラス繊維材料でありうる。ガラス繊維材料は、正に帯電したケイ素およびホウ素原子への特異的結合特性のため、およびケイ酸表面の水素結合特性のために、より良い収率を提供する。核酸に対するシリカの特異性のために、他の混入物と相対的により多くのＤＮＡが結合し、および溶出する産物はより実質的に純粋になる。
【００５７】
試薬との使用に適した固相担体の形状は、たとえば、シート、カット済みディスク、シリンダー、単繊維、または粒子状物質から成る固相担体でありうる。固相担体の材料は、適当な容器に固定化するかまたは入れることができる膜、ディスク、またはシリンダーといった独立の固相担体を作製するために、充填されうる。必要に応じて、固相担体は適当な容器、たとえば、紙状（たとえば血液スポットカード）、微量遠心管、スピンチューブ、９６ウェルプレート、チャンバー、またはカートリッジに入れられる。固相担体が繊維を含む場合、繊維を適当に充填し、最適な核酸結合、およびタンパク質、リン脂質などといった混入物の洗い去りを可能にするための、適当な容器に入れることができる。
【００５８】
固相担体は、生物試料中に存在するＤＮＡを分解するために、ＲＮアーゼ溶液で前処理されうる。加えて、前処理カラムを用いることは、従来の方法では典型的には必要である、別個のＲＮアーゼ消化段階の必要を無くする。
【００５９】
随意的に、精製は、ＲＮアーゼ処理カラム（ジェントラ・システムズ社（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．））の使用によって改善されうる。ＲＮアーゼ処理カラムは、生物試料中に存在するＲＮＡを分解する。加えて、前処理カラムを用いることは、従来の方法では典型的には必要である、別個のＲＮアーゼ消化段階の必要を無くする。
【００６０】
別の一実施形態では、ＤＮＡ溶解溶液は、固相担体の作製に用いられる材料（たとえば繊維など）へ直接加えられ、および利用者が使用可能な最終形態（たとえば紙、スワブ、ディスク、プラグ、カラムなど）に加工される前に乾燥されうる。ＲＮアーゼ処理カラム（ジェントラ・システムズ社（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．））の使用は、精製工程中の段階数およびＤＮＡ試料を処理するための時間を低減する。
【００６１】
本発明がよりよく理解されうるように、固相担体を入れる容器の具体的実施形態をより詳細にここで記載する。一実施形態では、容器は、一つ以上の入口ポートまたは貫通可能なセプタムを上端に備えたカートリッジである。入口ポートは、試料または試薬の入った上流の容器と、メスルアーロックといったコネクタを通じて接続されうる。一つの入口の試料ポートは、生物試料の固相担体への添加に使用されうる。試料ポートの随意的な機能は、試料が試料ポートを通じて移送された後に試料ポートを封じる自己シール機構である。第二の入口は試薬ポートの機能を果たしうる。両方の入口ポートについての随意的な機能は、保護用分離シールである。さらに、入口ポート、分離シールおよび拡散器は随意的なスクリューキャップ内に入れることができる。
【００６２】
ＤＮＡ溶解溶液の汎用性および有効性は、ＤＮＡ単離のための二つの実行可能な選択的方法を与える。第一の方法では、生物材料は固相担体と接触させられる前にＤＮＡ溶解溶液と接触させられる。一実施形態では、生物材料が細胞またはウイルス材料を含む場合、ＤＮＡ溶解溶液が、細胞を溶解しおよびＤＮＡを含む核酸を放出するために用いられる。第二の方法では、ＤＮＡ溶解溶液が固相担体へ直接加えられおよび固相担体と結合させられ、それによって一段階を削除し、およびさらに方法を簡略化する。この後者の方法では、処理された固相担体と生物材料を接触させる前に、ＤＮＡ溶解溶液は固相担体へ直接加えられおよび次いで固相担体上で乾燥される。
【００６３】
固相担体の底に、細胞破片、タンパク質および脂質分子の分散および通過に適した孔径を有する随意的な拡散器がある。拡散器は、カートリッジの断面にわたって均一な生物材料の横断を可能にし、および固相担体の上または下のどこでも生物材料の不均一な蓄積を防ぐ。カートリッジの出口は、先細の容器上にきちんと適合する保護キャップを備えている。精製されたＤＮＡは、簡易なおよび混入の無い保存のためのスナップキャップを有するコニカルチューブを含む回収チューブに回収される。容器全体は、処理すべき試料のサイズおよび以降の分析に必要な収量に応じてサイズ変更されうる。
【００６４】
別の一実施形態では、容器は固相担体が充填された挿入部品を保持するように設計されたスピンチューブである。固相担体は、シリカ基礎、セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、ポリフッ化ビニリデン、およびその組み合わせでありうる。一実施形態では、担体はシリカ基礎のホウケイ酸ガラス繊維膜である。挿入部品は、スピンチューブに挿入部品を保持するための縁付き上部、および固相担体を支持する一方で液体を通過させる穴あき底部を有しうる。スピンチューブに繋がれたキャップが、挿入部品を覆うために使用されうる。溶液、たとえば、非核酸混入物を含むＤＮＡ溶解溶液、ＤＮＡ洗浄溶液、またはＤＮＡを含むＤＮＡは、溶液を引き出す遠心力によって穴あき底部を通過しおよびスピンチューブの底に回収される。
【００６５】
さらに別の一実施形態では、容器は各ウェルに固相担体が充填されたマルチウェルプレート、たとえば、６、１２、２４、４８、９６、または３８４ウェルプレートでありうる。各ウェルの底は、混入物または精製ＤＮＡを含む溶液が通過できる出口ポートを有しうる。
【００６６】
独自の試薬（ＤＮＡ溶解溶液、ＤＮＡ添加溶液、ＤＮＡ洗浄溶液、およびＤＮＡ溶出溶液）との最適な固相担体の独自の組み合わせは、実質的に純粋な、未分解のＤＮＡの単離を結果として生じる。記載の通りＤＮＡ溶解および添加溶液の性質は、核酸の優れた溶解および固相担体への結合を可能にする一方、ＤＮＡ溶出溶液および随意的なＲＮアーゼ処理カラムは、固相担体からのＤＮＡの優先的な溶出を可能にする。
【００６７】
実質的に純粋なおよび未分解のＤＮＡを生物試料および下記のうち一つ以上（たとえばすべて）から調製するための説明方法を含む、ＤＮＡを精製するためのキットもまた提供される：別個の溶液としてまたは固相担体上に前処理されたＤＮＡ溶解溶液、ＤＮＡ溶解溶液で処理していないかまたは処理された固相担体、ＤＮＡ添加溶液、ＤＮＡ洗浄溶液、ＤＮＡ溶出溶液またはその任意の組み合わせ。加えて、キットは、プロテイナーゼＫ溶液、固相担体を入れるための容器、実質的に純粋なおよび未分解のＤＮＡを入れるための容器、およびその組み合わせといった付加的構成要素を含みうる。実質的に純粋な、未分解のＤＮＡは、当業者に公知である以降の分析、たとえば、核酸定量、制限酵素消化、ＤＮＡ配列決定、サザンブロッティングなどといったハイブリダイゼーション技術、および、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列準拠増幅（ＮＡＳＢＡ）、自己維持的配列複製（ＳＳＲまたは３ＳＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および転写媒介増幅（ＴＭＡ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）といった増幅方法、またはその他のＤＮＡ分析における使用に適したＤＮＡである。
【００６８】
試薬、方法およびキットは、相対的に混入ＲＮＡまたは他の不純物をほとんど含まずそのためＤＮＡをたとえば核酸定量、制限酵素消化、ＤＮＡ配列決定、サザンブロッティングなどといったハイブリダイゼーション技術、および、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列準拠増幅（ＮＡＳＢＡ）、自己維持的配列複製（ＳＳＲまたは３ＳＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および転写媒介増幅（ＴＭＡ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）といった増幅方法、またはその他のＤＮＡ分析といった下流の処理に使用できる、実質的に純粋なおよび未分解のＤＮＡを提供する。
【００６９】
方法
ここではＤＮＡを生物材料から精製するための方法が提供される。試薬および固相担体は、選択的な単離方法を与える。
【００７０】
方法の一実施形態では、生物材料は生物材料は固相担体と接触させられる前にＤＮＡ溶解溶液と接触させられる。ＤＮＡ溶解溶液は、固相担体へ加えられる前に、生物材料を溶解しおよびＤＮＡを放出するのに用いられる。加えて、ＤＮＡ溶解溶液は、ＤＮアーゼのような有害な酵素の有害作用を防ぐ。ＤＮＡ溶解溶液は、沈澱中の培養細胞または白血球を溶解するために、または標準の９６ウェルプレートのような培養プレートに接着しているかまたはそれへ回収された細胞を溶解するために成功裡に使用されうる。生物材料は組織塊または小粒子から成り、ＤＮＡ溶解溶液は有効な溶解能力のために、そのような組織塊を潰してスラリーにするために効果的に使用されうる。ＤＮＡ溶解溶液の容量は、細胞数または組織サイズに応じて拡大または縮小されうる。生物材料が一旦溶解されると、Ｄ
ＮＡ添加溶液を溶解物に加えることができ、および次いで固相担体へ加えることができる。
【００７１】
別の一実施形態では、ＤＮＡ溶解溶液を固相担体へ直接加えることができ、それによって一段階を削除し、およびさらに方法を簡略化する。この後者の方法では、処理された固相担体と生物材料を接触させる前に、ＤＮＡ溶解溶液は固相担体へ加えられおよび次いで固相担体上で乾燥されうる。
【００７２】
ＲＮアーゼを、カラムを前処理するために固相担体へ直接、または生物試料中に存在するＲＮＡを分解するために溶解溶液へ加えることができる。前処理カラムおよび／または溶解溶液に加えられたＲＮアーゼを用いて、従来の方法では典型的には必要である別個の溶解および／またはＲＮアーゼ消化段階の必要を無くす。
【００７３】
生物材料が細胞またはウイルス材料を含む場合、ＤＮＡ溶解溶液との直接接触、またはＤＮＡ溶解溶液および／またはＲＮアーゼ溶液で前処理された固相担体との接触は、細胞膜および核膜、またはウイルス外被が可溶化および／または破壊する原因となり、それによって核酸および、タンパク質、リン脂質などといった他の混入物質を放出する。
【００７４】
三つめの実施形態では、試薬はたとえば全血について有用でありうる直接溶解方法に使用できる。この方法は、他のほとんどの全血精製方法に共通する赤血球溶解段階を実施する必要性を無くす。この方法では、第一のＤＮＡ溶解溶液が生物材料へ加えられる。第一のＤＮＡ溶解溶液は、アルカリ金属塩および非イオン性洗浄剤を含む。第二のＤＮＡ溶解溶液はアルカリ金属塩を含み、および陰イオン性洗浄剤が生物材料へ加えられる。２種類の溶解溶液の使用は、大量の血液の直接溶解中にすべての血球の溶解および可溶化に成功するために有用である。
【００７５】
本方法の四つめの実施形態では、ＤＮＡはたとえば固定細胞または頸部スワブ培地または固定頸部細胞から効果的に精製されうる。陰イオン性洗浄剤を含む溶解溶液は単に生物材料へ加えられ、ピペットで上下して細胞を溶解およびタンパク質を変性する。溶解段階後に、プロテイナーゼＫ溶液を用いることは、たとえば頸部スワブ培地のようなある種類の試料に必須でありうる。これらの試料については、プロテイナーゼＫが添加されおよび試料はボルテックスで混合される。試料は２〜３時間６５℃にてインキュベートされうる。
【００７６】
上記の方法のうちいずれかの溶解段階の後、たとえば固相へのＤＮＡの定量的結合を生じるため、ＤＮＡ分子を脱水するのにＤＮＡ添加溶液が使用されうる。次に、核酸が固相担体と結合して残るように、生物材料は随意的に、たとえば遠心分離、ピペッティング、圧力、減圧のような適当な方法によって、またはこれらの方法とＤＮＡ洗浄溶液との併用によって除去される。タンパク質、リン脂質などを含む非核酸生物材料の残りは、まず遠心分離によって除去されうる。これを行うことによって、溶解物中の結合していない混入物は固相担体から分離される。
【００７７】
その後、結合したＤＮＡは、当業者に公知であるＤＮＡ溶出溶液の適当な量を用いて溶出されうる。固相担体は次いで、固相担体からＤＮＡを放出するために遠心分離、または加圧または減圧に供することができ、および次いで適当な容器へ回収されうる。
【００７８】
別の一態様として、具体的な手順を含に、ここに記載の試薬および随意的に固相担体と組み合わされた、ここで開示される方法にしたがって生物材料からＤＮＡを精製するのに使用されうるキットが提供される。
【００７９】
本発明は下記の詳細な実施例を参照することによってさらに説明される。これらの実施例はさまざまな具体的および例示的な実施形態および方法をさらに説明するために提供される。しかし、本発明の範囲内に留まる一方で多数の変形および改変が実施されうることが理解されるべきである。
【００８０】
下記で言及されるすべての原材料はシグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミズーリ州セントルイス）といった販売元から容易に入手可能である。すべてのパーセンテージは、特記されない限り、試薬の総容量に基づく容量当たり容量である。
【実施例】
【００８１】
実施例１：コスト分析
最高品質の固相ＤＮＡ精製製品を製造するために、製品はいくつかの点で極めて良好に機能すべきである。固相ＤＮＡ精製製品は、効果的に純粋なＤＮＡ試料をさまざまな試料型から単離しおよびＤＮＡの可能な最高収率を結果として生じるべきである。使い勝手が良いべきであり、つまり段階はあまり煩わしくてはならず、および成分は毒性であってはならずおよび容易に処分できる。さらに、本製品は利用者にとって経済的であるべきである。従って、溶液のための費用効果の高い成分を見出すことが最も重要であった。表１はここで評価された塩それぞれについてコストを示す。
【００８２】
【表１】
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【００８３】
リチウム塩は本方法に有効に働くが、リチウム塩ＬｉＦおよびＬｉＩは高価であり、および加えて、ＬｉＦは大変危険である。ＬｉＣｌおよびＬｉＢｒは共に本方法に有効に働きおよび５００グラム当たり６０〜６５ドルとほぼ同額である。ＫＣｌ、ＮａＣｌ、およびＮＨ4Ｃｌはすべて経済的であるが、しかし望まれるＤＮＡ収率を結果として生じない。
【００８４】
実施例２：塩化物塩についてのデータの溶解度および熱、および固相ＤＮＡ精製手順に関するＬｉＣｌおよびＬｉＢｒ塩との比較
いくつかの塩化物塩の溶解度および性能を検討し、および２種類のリチウム塩すなわち塩化リチウムおよび臭化リチウムと比較した。緩衝剤および洗浄剤を基礎とするＤＮＡ溶解溶液の両方で得られる最大の溶解度を検討するため、ＤＮＡ溶解溶液をその他の塩化物塩を用いて調製した。表２はこの研究で測定されたほぼ最大溶解度を示し、および『化学および物理学ハンドブック』（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ）（第６２版、ＣＲＣプレス社（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）、フロリダ州ボカラトン（Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ））から得られた２０℃へ外挿された溶解度データ表および溶液データの熱の表と比較する。
【００８５】
溶解溶液中で試験した塩化物塩の大部分の溶解度は、塩化カリウムおよび塩化アンモニウムの溶解度を除き、リチウムの塩化物および臭化物塩と濃度４Ｍで同等であった。塩化カリウムの予測される溶解度は、水溶液中ではそれ以外の塩の溶解度と比較した場合塩約３Ｍだけで低かった。その他の塩は水溶液中で塩４Ｍよりよく溶解すると予測されたが、しかし塩化アンモニウム塩は、約７Ｍの予測溶解度と比較して、約３Ｍまでしか溶解しないことが観察された。これは、溶液中の界面活性剤、たとえばトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（５％）およびＤＧＭＥ（５％）の存在が原因である可能性があり、なぜなら溶液中のこれらの成分の組み合わせは１０％であったからである。塩以外では、ＤＮＡ溶解溶液の残りはすべての溶液で一定に保たれ、および５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、５％ＤＧＭＥ（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＴＣＥＰ、１％タングステン酸ナトリウムを含み、１００ｍＭ ＴＲＩＺＭＡ ｐＨ ８．８に溶解した。
【００８６】
水中での塩化リチウムおよび臭化リチウムのついての溶液の大きな発熱は、リチウム塩によって一般的に示される大きな溶解度に関して実証を提供した。本実施例ではその他の塩化物塩は溶液の吸熱を示し、これらの塩の溶媒和はリチウム塩に関してほどには水溶液中で有利でないことを示す。
【００８７】
【表２】
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＊注：『化学および物理学ハンドブック』（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ）の表データから２０℃へ外挿したデータ
【００８８】
実施例３：ＤＮＡ精製のための洗浄剤の評価
適当に細胞を溶解し、およびまたＤＮＡ溶解溶液中で可溶なままである洗浄剤が特定された。ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、テルジトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）およびイゲパール（Ｉｇｅｐａｌ）類の洗浄剤を、いくつかの界面活性剤化合物と共に調べた。
【００８９】
これらの洗浄剤処方物のうち多数が、ＤＮＡ溶解溶液のその他の成分と混合した場合、経時的に鹸化または分解しおよび溶液から沈澱したことが明らかになった。たとえば、これは１０％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０（ポリオキシレンソルビタンモノラウレート）で起こった。同様の性能が、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）およびツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０の等混合物を用いて見出されたが、この混合物はより長い期間にわたって安定であった。この混合物は、しかし、最終的に鹸化しおよび分離した。ＤＧＭＥ（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）が、塩および洗浄剤の組み合わせの溶解を助ける界面活性剤としての試験に選択された。５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−Ｘおよび５％ＤＧＭＥの混合物が、第一のＤＮＡ溶解溶液の溶解度を維持するために特に良好に働くことが見出された。
【００９０】
頸部細胞からのＤＮＡ抽出は、この型の試料からのＤＮＡの頑健な回収にはプロテイナーゼＫ消化が必要であるため、特に困難であることが明らかになった。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在は、最高のプロテイナーゼＫ活性を得るために、溶解溶液中で非常に良く作用した。最適濃度は、さまざまなＤＮＡ溶解溶液をプロテイナーゼＫ処理と共に系統的に試験することによって決定された。より高濃度のＳＤＳ（０．１％ＳＤＳ終濃度より大）は、室温前後の温度で溶解溶液から析出し、プロテイナーゼＫ活性が必要より低い原因となる。より低濃度のＳＤＳ（０．１％終濃度より小）は完全なプロテイナーゼＫ活性を許さず、これは頸部細胞のような固定細胞調製物の完全な溶解に有用である。ＳＤＳおよびＬｉＣｌ塩が溶解、添加および結合処理を通じて可溶なままでいられるように、ＤＧＭＥもまたこの第二のＤＮＡ溶解溶液に含められた。
【００９１】
全血のための直接溶解処理の開発に関して主な技術的問題は、全血における洗浄剤の溶解効率であった。最初の試験は、細胞溶解のための非イオン性洗浄剤トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００の使用に焦点を当てた。この洗浄剤の使用は、おそらく溶液中に存在する赤血球および赤血球溶解物の妨害が原因で、直接溶解方法での低いＤＮＡ回収を結果として生じた。トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００はタンパク質変性剤ではなく、および高いレベルの細胞混入のために、立証されたタンパク質変性剤である洗浄剤を試すことが決められた。溶解効率を高めるために、陰イオン性洗浄剤のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を、非イオン性洗浄剤の代わりに試験した。これはＤＮＡ回収を高めたがしかし、精製膜の目詰まりを結果として生じた。細胞沈澱を用いた試験は、両方の洗浄剤の組み合わせがＤＮＡ回収の増加を結果として生じたことを実証した。直接溶解方法における両方の洗浄剤の使用は、ＤＮＡ回収の増加および膜目詰まりの消失を結果として生じた。洗浄剤添加の順序（陰イオン性／非イオン性に対して非イオン性／陰イオン性）の試験は、最適なＤＮＡ回収のためには非イオン性洗浄剤を陰イオン性洗浄剤の前に加えなければならないことを示した。
【００９２】
実施例４：直接溶解方法による血液からのＤＮＡの単離
等容の第一のＤＮＡ溶解溶液（６Ｍ ＬｉＣｌ、５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、５％ＤＧＭＥ（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１００ ｍＭトリス、ｐＨ ８．８）を全血 試料へ加えた。完全なホモジナイズを達成するため、結果として生じる溶液をピペッティングで５回上下し、高速にて５回パルスボルテックスし、ピペッティングで２０回上下し、および次いで再び５回パルスボルテックスした。ホモジナイズ後、血液の２倍容の第二のＤＮＡ溶解溶液（２５ｍＭクエン酸塩、２Ｍ ＬｉＣｌ、０．１％ ＳＤＳ、３０％ＤＧＭＥ、を含む５ ｍＭトリス、ｐＨ ９．１）を試料へ加えた。試料は第一のＤＮＡ溶解溶液について記載したのと同一の過程を経て混合した。２種類の溶解溶液を用いたホモジナイズおよび溶解後、血液の４倍容のＤＮＡ添加溶液（１０Ｍ ＬｉＣｌ、１０％ＤＧＭＥ、１００ｍＭトリス、ｐＨ７．９）を各試料に加えた。結果として生じる溶液を混合するためピペッティングで５回上下した。
【００９３】
ホモジナイズ後、ホモジナイズしたそれぞれの細胞溶解物６００μＬをそれぞれの精製カラムへピペットで加えた。精製カラムではホウケイ酸ガラス繊維膜（ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）Ｄガラス繊維膜）がバスケット内に入っており、および減圧溶出器の中に入れた。溶解物は減圧ろ過を用いて膜を通って吸引された。残りの溶解物をカラムへ１回に６００ｍＬ加え、および減圧ろ過を用いて除いた。
【００９４】
各溶解物の減圧ろ過およびその後のホウケイ酸膜表面へのＤＮＡの結合後、４００μＬのＤＮＡ洗浄溶液（５ｍＭ ＥＤＴＡ、７０％エタノールを含む１００ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．６）をカラム材料に加えおよび３０秒間減圧して除去した。ＤＮＡ洗浄溶液添加および減圧ろ過段階を、同一の溶出チューブへ１回繰り返した。
【００９５】
ＤＮＡを固相担体から溶出するために、膜の入ったバスケットを微量遠心管へ移し、および５０μＬのＤＮＡ溶出溶液（１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５）溶液をカラム材料へ加え、５分間インキュベートし、および最高速度にて１分間遠心した。ＤＮＡ溶出溶液の添加、５分間のインキュベートおよび遠心分離段階を１回繰り返した。５種類の血液量（３００ｍＬ、５００ｍＬ、１ｍＬ、１．５ｍＬおよび３ｍＬ）からの精製を実施し、および電気泳動し、および２００ｎｇのラムダＨｉｎｄ ＩＩＩラダーと比較した。結果は、広い範囲の全血開始容量から直接溶解方法を用いて、未変化の高分子量ＤＮＡを全血から精製できたことを示した。
【００９６】
実施例５：ＲＢＣ溶解方法を用いた血液からのＤＮＡの単離
全血試料からのＤＮＡの単離に用いられる一実施形態は、まず血液試料中の赤血球を溶解し、次いで結果として生じる赤血球溶解物から遠心分離を用いて白血球を沈澱する。赤血球溶解物上清を流去しおよび白血球沈澱を洗浄および再沈澱した後、２００μＬのＤＮＡ溶解溶液（６Ｍ ＬｉＣｌ、５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、５％ＤＧＭＥ（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１００ｍＭトリス、ｐＨ８．８）を沈澱へ加えて、試料を完全にホモジナイズするためにＤＮＡ溶解溶液中でボルテックスおよびピペッティングによって白血球を溶解する。ホモジナイズ後、４００μＬのＤＮＡ添加溶液（１０Ｍ ＬｉＣｌ、１０％ＤＧＭＥ、１００トリス、ｐＨ７．９）を白血球溶解物へ加え、および混合物を、バスケット内にホウケイ酸ガラス繊維
膜（ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）Ｄガラス繊維膜）が入った精製カラムへ加え、および２ｍＬ微量遠心管の中に入れた。微量遠心管を次いで７０００×ｇにて１分間遠心した。溶解物の遠心分離後、４００μＬのＤＮＡ洗浄溶液（５ｍＭＥＤＴＡ、７０％エタノールを含む１００ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．６）をカラム 材料へ加え、および微量遠心機で最高速度にて１分間遠心した。ＤＮＡ洗浄溶液添加および遠心分離段階を１回繰り返した。ＤＮＡを固相担体から溶出するために、膜の入ったバスケットを新しい微量遠心管へ移し、および５０μＬのＤＮＡ溶出溶液（１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５）をカラムへ加え、および微量遠心機で最高速度にて１分間遠心した。同一の溶出チューブへ、ＤＮＡ溶出溶液添加および遠心分離段階を１回繰り返した。
【００９７】
キアンプ（ＱＩＡａｍｐ）血液ＤＮＡミディキット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）、ドイツ）との直接比較において、ベルサジーン（Ｖｅｒｓａｇｅｎｅ）血液ＤＮＡ平均収率は、２ｍＬ血液試料について図１に示す通りキアンプ平均収率値の約２倍である（関連統計値について表３を参照）。
【００９８】
【表３】
2008507994.tif 000004
理論収率計算のパーセントは、白血球１個当たり６ｐｇのゲノムＤＮＡが存在するという仮定に基づく。予測される理論収率の７０〜８０％の高さの収率が一部の例でＲＢＣ溶解方法を用いて図２に示す通り２ｍＬ血液試料を用いて得られ、ここでＤＮＡ溶解溶液処方物はｐＨおよびＬｉＣｌ濃度について変化させた（関連統計値について表４を参照）。
【００９９】
【表４】
2008507994.tif 000005
【０１００】
実施例６：頸部(cervical)細胞からのＤＮＡの単離
頸部細胞スワブ培地または固定頸部細胞から核酸を抽出することは典型的には困難であるため、それはここで開示される組成物および方法の効率を説明するために効果的に使用できる。しかし、当業者は、開示される組成物および方法はまた、広い範囲の生物試料を用いて効果的に使用でき、および本発明はいかなる試料型での使用にも限定されないことを理解する。
【０１０１】
頸部細胞試料はシンプレップ（ＴｈｉｎＰｒｅｐ）（登録商標）パップテスト（Ｐａｐ Ｔｅｓｔ）（商標）（サイティック社（Ｃｙｔｙｃ），マサチューセッツ州ボックスボロ（Ｂｏｘｂｏｒｏｕｇｈ））に回収され、および２，２００×ｇにて５分間遠心沈降され、および次いで細胞を洗浄するためにＰＢＳに再懸濁された。再懸濁された細胞を微量遠心管に入れ、および１４，０００×ｇにて１５秒間遠心沈降させた。ＰＢＳ上清を頸部細胞沈澱から除去した。細胞を再懸濁するために各チューブを強くボルテックスした；これは細胞溶解を大きく促進した。２００μＬの溶解溶液（２５ｍＭクエン酸塩、２Ｍ ＬｉＣｌ、０．１％ＳＤＳ、３０％ＤＧＭＥを含む２５ｍＭトリス、ｐＨ９．１）を試料に加えて細胞を再懸濁し、および細胞を溶解およびタンパク質を変性するためにピペッティングで上下させた。１．０μＬのプロテイナーゼＫ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を細胞溶解物に加え、および短いボルテックスによって混合し；次いで試料を６５℃にて２〜３時間インキュベートした。４００μＬの１００％イソプロパノールＤＮＡ添加溶液を試料に加えた。試料を３０秒間パルスボルテックスし、および次いでカラムへの負荷前に２分間静置した。試料を前処理したＲＮアーゼＡ処理精製カラム（ジェントラ・システムズ社（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．））に負荷した。試料を７，０００×ｇにて１分間遠心分離した。精製カラムの入ったバスケットを新しい透明チューブへ移した。２００μＬのＤＮＡ洗浄溶液（５ｍＭ ＥＤＴＡ、７０％エタノールを含む１００ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．６）を各精製カラムへ加えた。精製カラムを次いで７，０００×ｇにて１分間遠心分離した。追加の２００μＬのＤＮＡ洗浄溶液を各精製カラムへ加えた。精製カラムを次いで７，０００×ｇにて２分間遠心分離した。精製カラムの入ったバスケットを新しい透明チューブへ注意深く移した。５０μＬのＤＮＡ溶出溶液（１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５）を各精製カラムへ加え、および室温にて５分間インキュベートした。精製カラムを次いで１４，０００×ｇにて１分間遠心分離した。
【０１０２】
ピュアジーン・リキッド・ケミストリ（Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（ジェントラ・システムズ社（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．））との直接比較において、ベルサジーン（Ｖｅｒｓａｇｅｎｅ）固相ＤＮＡケミストリ（ジェントラ・システムズ社）平均収率は、下記の表に示される通り、開始頸部試料型にかかわらず同様である。
【０１０３】
【表５】
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【０１０４】
【表６】
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【０１０５】
【表７】
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【０１０６】
本明細書で引用されたすべての出版物、特許および特許出願は参照により本開示に含まれる。前述の明細書では本発明はその特定の好ましい実施形態に関して説明され、および多数の詳細が説明のために示されている一方、本発明は追加の実施形態が可能でありおよびここに記載の詳細のうち一部は本発明の基本原理を離れることなく相当に変化されうることが当業者に明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】図１は、キアンプ（ＱＩＡａｍｐ）血液ＤＮＡミディキット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）ドイツ）およびベルサジーン（Ｖｅｒｓａｇｅｎｅ）血液ＤＮＡキット（ジェントラ・システムズ社（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ミネソタ）を比較した理論ＤＮＡ収率の割合を示すグラフである。
【図２】図２は、溶解溶液のリチウム塩およびｐＨを比較した理論ＤＮＡ収率の割合を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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