(57)【要約】  細菌、タンパク質、ウイルス、胞子、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡなどの生物学的種を検出するためのバイオセンサーシステムを提供する。本発明のバイオセンサーシステムは、グラム陽性菌とグラム陰性菌とを鑑別することができる。ある実施形態においては、検体溶液が、検出器表面を流れ過ぎてフィルターまで到達し、そこで検体が捕捉される。次に、この検体が洗い流されて検出器表面を通過し、これによって表面に付着する検体種の数が増加する。本発明の検出器は、導波路を介して光源および光学検出器と結合した光学微小共振器を含むことができる。導波路の１つには、微小共振器内に結合したプローブ光量を増加させるため、または光学検出器によって検出される信号光の割合を増加させるために、波長選択反射板を設けることができる。
2008513776.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部容積を有する検出チャンバと；
前記検出チャンバの前記内部容積に操作可能に結合したバイオセンサーユニットであって、検体の存在を検出するバイオセンサーユニットと；
前記検出チャンバ内部にあるフィルターと；
検体溶液を前記検出チャンバ内に導入するための、前記検出チャンバへの入力部であって、前記溶液の少なくとも一部が、前記フィルターに到達する前に前記バイオセンサーユニットと相互作用するように配列され構成されている、入力部とを含む、バイオセンサーシステム。
【請求項２】
前記バイオセンサーユニットが、外面を有するマイクロキャビティ共振器を有する光バイオセンサーユニットを含み、前記マイクロキャビティ共振器の前記外面の少なくとも一部が、前記チャンバの前記内部容積に対して露出している、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
プローブ光を前記マイクロキャビティ共振器内に照射するために光結合した光源をさらに含む、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記マイクロキャビティ共振器の外面に付着した検体からの蛍光を検出するために光結合した光学的検出ユニットをさらに含む、請求項２に記載のシステム。
【請求項５】
前記光学的検出ユニットが、光導波路を介して前記マイクロキャビティ共振器に光結合している、請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
前記マイクロキャビティ共振器から自由空間を介して伝播した信号光を検出するために、前記光学的検出ユニットが、前記マイクロキャビティ共振器の近傍に配置されている、請求項４に記載のシステム。
【請求項７】
前記光学的検出ユニットからの検出信号を受信するために結合した制御ユニットをさらに含み、前記制御ユニットが前記検出信号を解析する、請求項４に記載のシステム。
【請求項８】
前記フィルターが２μｍ以下の孔径を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記フィルターが１μｍ以下の孔径を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記フィルターが０．８μｍ以下の孔径を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記フィルターが０．４５μｍ以下の孔径を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
前記バイオセンサーユニットが、細菌検体を検出するように適合し構成されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記バイオセンサーユニットが、タンパク質検体を検出するように適合し構成されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項１４】
前記バイオセンサーユニットが、ウイルス検体を検出するように適合し構成されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項１５】
前記バイオセンサーユニットが、胞子検体を検出するように適合し構成されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項１６】
前記バイオセンサーユニットが、ＤＮＡまたはＲＮＡ検体を検出するように適合し構成されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項１７】
バイオセンサーの操作方法であって：
（ａ）バイオセンサーの少なくとも１つの表面とフィルターとが収容された検出チャンバ内に、検体を含有する溶液を入れるステップと；
（ｂ）前記バイオセンサーの前記少なくとも１つの表面を通過してフィルターに到達するよう前記溶液を洗い流し、前記フィルターにおいて前記検体の少なくとも一部を捕捉するステップと；
（ｃ）前記捕捉された検体の少なくとも一部を前記フィルターから洗い流して、前記バイオセンサーの前記表面に向けて戻すステップと；
（ｄ）前記バイオセンサーの前記表面上の検体を検出するステップと、を含む方法。
【請求項１８】
前記バイオセンサーの前記表面が、マイクロキャビティ共振器の少なくとも一部を含み、前記バイオセンサーの前記表面上の検体を検出するステップが、前記マイクロキャビティ共振器の前記表面に付着した前記検体の存在を示す光学信号を検出するステップを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記捕捉された検体の少なくとも一部を洗い流すステップが、前記フィルターによって捕捉された検体を前記微小共振器キャビティに向けて洗い流すステップを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記溶液を洗い流すステップが、前記溶液をポンプで移動させるステップを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記検体を検出するステップが、前記バイオセンサーの前記少なくとも１つの表面上の細菌検体を検出するステップを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記検体を検出するステップが、前記バイオセンサーの前記少なくとも１つの表面上のウイルス検体を検出するステップを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記検体を検出するステップが、前記バイオセンサーの前記少なくとも１つの表面上のタンパク検体を検出するステップを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記検体を検出するステップが、前記バイオセンサーの前記少なくとも１つの表面上の胞子検体を検出するステップを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記検体を検出するステップが、前記バイオセンサーの前記少なくとも１つの表面上のＤＮＡまたはＲＮＡ検体を検出するステップを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
微小共振器センサー装置であって：
プローブ導波路内にプローブ光を照射するために光結合した光源と；
前記プローブ導波路の入力部結合領域において前記プローブ導波路に光結合したマイクロキャビティ共振器とを含み、前記プローブ導波路が、第１のプローブ光反射板を含み、それによって、前記マイクロキャビティ共振器内に結合せずに、前記プローブ導波路の前記入力部結合領域を介して前記光源から伝播する光が、前記入力部結合領域に向けて反射する、装置。
【請求項２７】
前記第１のプローブ光反射板が、前記入力部結合導波路内にブラッグ格子を含む、請求項２６に記載の装置。
【請求項２８】
前記プローブ導波路の前記入力部結合領域が第１のプローブ光反射板と第２のプローブ光反射板との間に位置するように配置された第２のプローブ光反射板を前記プローブ導波路がさらに含む、請求項２６に記載の装置。
【請求項２９】
前記プローブ導波路の前記入力部結合領域と前記第２のプローブ光反射板との間にある前記プローブ導波路の第２の結合領域において、前記光源からの前記プローブ光が前記プローブ導波路に光結合している、請求項２８に記載の装置。
【請求項３０】
前記マイクロキャビティ共振器からの光を検出するために結合した検出ユニットをさらに含む、請求項２６に記載の装置。
【請求項３１】
前記検出ユニットからの検出信号を受信するために結合した制御ユニットをさらに含む、請求項２６に記載の装置。
【請求項３２】
前記光源が半導体レーザーを含む、請求項２６に記載の装置。
【請求項３３】
微小共振器センサー装置であって：
プローブ光を発生させる光源と；
ウィスパリングギャラリーモードを画定し、前記ウィスパリングギャラリーモードの少なくとも１つで前記プローブ光の少なくとも一部を受信するために光結合した、マイクロキャビティ共振器と；
検出ユニットと；
前記マイクロキャビティ共振器と前記検出ユニットとの間で光結合した信号導波路とを含み、前記信号導波路を介して前記マイクロキャビティ共振器から前記検出ユニットまで信号光が伝播し、前記信号導波路内の信号光が、前記検出ユニットに向けて反射するために配置された、前記信号光の波長に対して反射性である信号光反射板を前記信号導波路が含む、装置。
【請求項３４】
前記プローブ光が、前記信号導波路を介して前記マイクロキャビティ共振器内に結合する、請求項３３に記載の装置。
【請求項３５】
前記マイクロキャビティ共振器からの前記信号光が、前記信号導波路の出力部結合領域において前記信号導波路内に結合し、前記信号導波路の前記出力部結合領域が、前記信号光反射板と前記検出ユニットとの間にある、請求項３３に記載の装置。
【請求項３６】
前記信号反射板が、前記第１の光導波路内のブラッグ反射板を含む、請求項３３に記載の装置。
【請求項３７】
前記検出ユニットが、第１の波長の信号光を検出するための第１の検出器と、前記第１の波長とは異なる第２の波長の信号光を検出するための第２の検出器とを含み、波長依存性スプリッターであって、前記マイクロキャビティ共振器からの光を受信し、前記第１の波長の光を前記第１の検出器に向け、前記第２の波長の光を前記第２の検出器に向けるための波長依存性スプリッターが配置される、請求項３３に記載の装置。
【請求項３８】
前記第１の波長が前記プローブ光の波長である、請求項３７に記載の装置。
【請求項３９】
前記光源が半導体レーザーを含む、請求項３３に記載の装置。
【請求項４０】
前記検出ユニットからの検出信号を受信するために結合した制御ユニットをさらに含む、請求項３３に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、微小共振器を使用する光学センサーを含む、細菌を検出するためのシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的種の検出は、食品産業などのいくつもの産業、環境の監視、および術後感染の予防などの健康管理において重要な分析技術の１つである。たとえば、細菌を検出するための従来方法では、微生物の培養が必要となる。これらの方法では、所望のレベルの感度が得られるが、高度に訓練された実験室職員が必要であり、通常は結果が得られるまでに数日を要する。
【０００３】
術後感染は、外科患者の最も一般的な感染である。多くの場合、皮膚に対して手術を行った後でも、皮膚上には細菌が残留する。約２０％の人びとは、皮膚上の細菌数が多く、すなわち１０００ＣＦＵ・ｃｍ−２を超え、感染の危険性が最も高い。したがって、これらの患者に対して手術を行う場合、細菌の検出が特に重要となる。皮膚上の細菌は、典型的にはグラム陽性であり、したがってグラム陽性菌と鑑別できることが重要である。他の健康管理状況においては、グラム陰性菌と陽性菌とを鑑別し、皮膚、創傷、および体液（たとえば尿）の試料から全細菌数を検出することが重要である。食品加工および臨床的状況から採取した環境試料から細菌を検出できることも重要である。これらの試料中の細菌の種類は、典型的にはグラム陰性である。グラム陰性菌は、非常に低濃度で、安定なリムルス変形細胞溶解産物（ＬＡＬ）試薬を使用して検出することができる。市販のＬＡＬとともに発色基質（ｐ−ニトロアニリン）を供給すると、リポ多糖（ＬＰＳ）の存在下で無色から黄色に変化し、分光光度計において容易に測定される。しかしＬＡＬは、細菌表面に結合したＬＰＳと溶液中の遊離した（可溶性の）ＬＰＳとを区別することができない。遊離のＬＰＳは、大部分の環境試料中に存在する。これは、通常の細菌増殖過程で放出されるか、死滅したグラム陰性菌から放出されるかのいずれかである。可溶性ＬＰＳを無傷の細菌から分離することは、非常に困難である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、細菌（グラム陽性およびグラム陰性の両方）、ウイルス、胞子、タンパク質、ならびにＤＮＡ鎖およびＲＮＡ鎖などの生物学的種を検出する方法であって、高感度であり、従来方法よりも安価であり、迅速に結果が得られる方法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一実施形態は、内部容積を有する検出チャンバと、検出チャンバの内部容積と操作可能に結合したバイオセンサーユニットとを含むバイオセンサーシステムに関する。検出チャンバ内部にはフィルターが配置される。検出チャンバは、検出チャンバ内に検体溶液を導入するための、検出チャンバへの入力部を有する。入力部は、少なくとも一部の検体溶液が、フィルターに到達する前に、細菌センサーユニットと相互作用するように、配置され構成されている。ある実施形態においては、バイオセンサーユニットが、光マイクロキャビティを有する光バイオセンサーを含むことができる。
【０００６】
本発明の別の実施形態は、バイオセンサーの操作方法に関する。この方法は、バイオセンサーの少なくとも１つの表面とフィルターとを収容する検出チャンバに検体溶液を入れるステップと、バイオセンサーの少なくとも１つの表面を通過してフィルターに到達した溶液を洗浄するステップとを含む。少なくとも一部の検体は、フィルターで捕捉される。捕捉された検体の少なくとも一部は、フィルターから洗い落とされて、バイオセンサーの表面に戻る。バイオセンサーの表面上の検体が検出される。
【０００７】
本発明の別の実施形態は、プローブ光をプローブ導波路に入射させるために光結合した光源を含む、微小共振器センサー装置に関する。プローブ導波路の入力部結合領域において、マイクロキャビティ共振器がプローブ導波路に光結合する。このプローブ導波路は、第１のプローブ光反射板を含み、これによって、光源からプローブ導波路の入力部結合領域を通って伝播するが、マイクロキャビティ共振器とは結合しない光が、反射して入力部結合領域に戻る。
【０００８】
本発明の別の実施形態は、プローブ光を発生する光源と、少なくとも一部のプローブ光を少なくとも１つのウィスパリングギャラリーモードで受信するために光結合している、ウィスパリングギャラリーモードを画定するマイクロキャビティ共振器とを含む、微小共振器センサー装置に関する。この装置はまた、検出ユニットと、マイクロキャビティ共振器と検出ユニットとの間に光結合した信号導波路とを含む。信号光は、信号導波路を介してマイクロキャビティ共振器から検出ユニットまで伝播する。信号導波路は、信号光の波長において反射性である信号光反射板を含む。信号光反射板は、信号光が信号導波路中で検出ユニットに向かって反射するように配置される。
【０００９】
本発明の上記要約は、それぞれの説明的実施形態や本発明のすべての実施を説明することを意図するものではない。図面および以下の詳細な説明は、これらの実施形態をより具体的に例示している。
【００１０】
添付の図面と関連する本発明の種々の実施形態の以下の詳細な説明を考慮することで、本発明をより十分に理解できるであろう。
【００１１】
本発明は種々の修正および変形に適用可能であるが、それらの具体例が図面によって示されており、詳細に説明される。しかし、説明される特定の実施形態に本発明が限定されることを意図するものではないことを理解されたい。逆に、添付の特許請求の範囲によって画定される本発明の意図および範囲に含まれるすべての修正、同等物、および変形を網羅することを意図している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、特に、マイクロキャビティ共振器を使用した微生物の検出に適用可能である。このような共振器は、微小共振器と呼ばれる場合もある。
【００１３】
従来の微生物検出技術に対して、高感度で、迅速で、費用対効果のある代替案が光バイオセンサーによって提供される。微小球系バイオセンサーは、微小球表面内で循環するウィスパリングギャラリーモード（ＷＧＭ）に依拠する、このような種類の光バイオセンサーの１つである。微小球は、通常、溶融シリカでできており、ＣＯ２レーザーまたは火炎処理システムを使用して製造することができる。微小球の典型的な大きさは、直径が数十ミクロンから数百ミクロンまでの範囲である。微小球は完全な球形である必要はなく、この用語は、三次元の光閉じ込めが実現されるマイクロキャビティに関して使用される。これは、同一の所有者に所有される米国特許出願第１０／８５５，４６２号明細書（この記載内容が本明細書に援用される）に記載される種類のバルジ状マイクロキャビティを含むことを意図している。これとは対照的に、板またはディスクの形状などの平坦または平面状のマイクロキャビティでは、光の閉じ込めが二次元のみとなる。
【００１４】
微小球系バイオセンサーにおいては、最初に抗体が微小球表面上に固定化される。続いて、細菌が抗体に結合すると、光学的な変換信号が発生し、これを適切な検出器を検出することができる。微小球光バイオセンサーの開発における問題の１つは、結合が起こる検出表面に細菌を効率的に送達することである。微小球バイオセンサーは表面積が小さいために、細菌試料の大部分は、球状表面の周辺に到達さえしないうちにセンサーチャンバから排出される。試料濃度が低い場合に特にこのことが言える。
【００１５】
最近になって、検出用途においてフルオロセンサー（ｆｌｕｏｒｏｓｅｎｓｏｒ）として誘電性微小球が関心が高まっている。これらのセンサーにおいては、抗原などの検体を後に捕捉するために、抗体などの分子層がセンサー表面に固定化される。直接アッセイ構成においては、センサー表面上の抗体に抗体が結合するときに、抗原が蛍光色素分子と結合し、この蛍光分子は、微小球表面と十分に接近した状態に維持されるため、微小球内を循環するエバネッセント光によって励起される。サンドイッチ型の構成においては、最初に抗原がセンサー表面上の抗体と結合し、次に蛍光色素で標識された抗体の第２の層を加えて、捕捉された抗原に結合させる。抗体の第２の層に結合した蛍光分子は、微小球ウィスパリングギャラリーモード（ＷＧＭ）で伝播する光によって生じるエバネッセント場によって励起される。励起した色素から得られる蛍光が集められ、抗原が結合したことの指標として使用される。
【００１６】
光学系
微小共振器を使用するマイクロキャビティ−導波路システム１００の一例を、図１Ａに概略的に示している。光源１０２によって、プローブ光が導波路１０４に沿って検出ユニット１０６まで向けられる。微小共振器１１０は導波路１０４に光結合している。光源１０２からのプローブ光１０８が導波路１０４内に発せられ、検出ユニット１０６に向けて伝播する。微小共振器１１０は、導波路１０４を出たプローブ光１０８の一部とエバネッセント結合して、微小共振器１１０の共振周波数の１つにおいて、出力結合した光１１２が微小共振器１１０内を伝播する。
【００１７】
光源１０２は、あらゆる好適な種類の光源であってよい。効率および感度を高めるためには、光源が、導波路１０４内と効率的に結合する光を発生すると好都合である、たとえば光源は、レーザーダイオードなどのレーザーであってもよいし、発光ダイオードであってもよい。光源１０２は、ランプと、ランプからの光を導波路１０４内に結合させるのに好適な光学系とを含むこともできる。好適な種類の光源の一部は、同一の所有者に所有される米国特許出願第１０／８５４，９１１号明細書（本明細書に援用される）により詳細に記載されている。
【００１８】
光源１０２は、所望の波長、または所望の波長範囲のプローブ光１０８を発生する。たとえば、センサー中に微小共振器が使用される場合、検出される種と相互作用する波長の光を光源１０２が発生する。ＷＧＭで伝播する光が検出される光と相互作用するように、通常、検出される種は、微小共振器１１０の表面の近くに配置される。
【００１９】
たとえば、システム１００がフルオロセンサーとして使用される場合、検体としてまたは検体の成分として微小共振器表面上に付着した蛍光色素などの蛍光分子が、微小共振器１１０内を伝播するプローブ光を吸収する。より具体的な例においては、微小共振器の表面に、所望の抗原検体に特異的な抗体を取り付けることができる。センサーシステム１００には、蛍光色素が結合した検体抗原分子が導入される。この抗原分子が、微小共振器１１０上の抗体分子と結合することによって、蛍光色素分子が微小共振器１１０に十分接近した状態で維持され、蛍光分子にエバネッセント結合した微小共振器１１０内ではプローブ光が循環している。このプローブ光を吸収して蛍光分子が励起し、次に、その分子がプローブ波長とは異なる波長の蛍光を発する。その蛍光が検出されることで、検体抗原の存在が確認される。
【００２０】
別の例においては、検体抗原分子は蛍光色素とは結合していないが、微小共振器表面に取り付けられた抗体とは結合することができる。微小共振器に取り付けられた抗体と同じものであってもよいし、異なるエピトープを有してもよい抗体であって、蛍光分子と結合するさらなる抗体を、次にセンサーに導入して、抗原と結合させる。この場合も、微小共振器１１０内を伝播するプローブ光とのエバネッセント相互作用によって蛍光分子が励起され、それによって生じる蛍光の検出を利用することで、検体の抗原が存在するか存在しないかを調べることができる。
【００２１】
光源１０２は、多数の異なる導波路内にプローブ光を向かわせることができ、導波路１０４は、そのような導波路の一例である。導波路１０４は、あらゆる好適な種類の導波路であってよく、たとえば、シリカ基体中に形成された導波路などの、基体中または基体上に形成された平面導波路またはチャネル導波路であってよい。導波路１０４光ファイバーであってもよい。
【００２２】
検出ユニット１０６は、光を検出するための光検出器、たとえばフォトダイオードまたはフォトトランジスタを含む。検出ユニット１０６は、光検出器に到達する光の波長を選択する波長感応デバイスを含むこともできる。波長選択デバイスは、たとえば、フィルターまたは分光器であってよい。波長選択デバイスは、光検出器に入射する光の波長を使用者が能動的に変化させることができるように調整可能である。
【００２３】
導波路１０４に沿って伝播する光１０８の一部が微小共振器１１０内にエバネッセント結合するように、導波路１０４と物理的に接触するか、または非常に接近させて微小共振器１１０を配置することができる。典型的には導波路１０４は、微小共振器１１０が導波路１０４に結合する場所においてはクラッドをほとんどまたは全く有さず、そのため、微小共振器１１０が導波路１０４のコアに直接結合する。
【００２４】
一部の例示的実施形態においては、検出ユニット１０６からの検出信号を受信するために、制御ユニット１１６を結合させることができる。制御ユニット１１６は、検出信号を解析し、検出ユニット１０６によって発生した検出信号の出力表示を使用者に対して行うことができる。制御ユニット１１６は、増幅器、アナログデジタル変換器、バッファ、マイクロプロセッサなどの、検出システム中に典型的に使用される素子を含むことができる。ある実施形態においては、このような出力は、単に、検出信号の大きさに対応した大きさの電圧信号であってもよい。別の実施形態においては、出力がデジタル読取値であってもよい。図１Ａに示される実施形態でのみ制御ユニットが示されているが、本明細書で議論されるあらゆる例示的実施形態にも制御ユニットを使用できることは理解できるであろう。
【００２５】
別の種類の微小共振器デバイス１５０を、図１Ｂに概略的に示している。このデバイス１５０において、微小共振器１１０からの信号光１５８は、第２の導波路１５４内に結合し、検出器１０６まで伝播する。
【００２６】
別の種類の微小共振器デバイス１７０を、図１Ｃに概略的に示している。このデバイス１７０においては、微小共振器１１０からの光を検出するために、第２の検出器１７２が微小共振器１１０の近くに配置されている。第２の検出器１７２によって検出される光は、導波路を介して第２の検出器１７２まで到達するのではなく、自由空間を伝播していると考えられる。第２の検出器１７２によって検出される微小共振器１１０からの光は、たとえば、微小共振器１１０から散乱して放出されたものであってもよいし、微小共振器１１０内を循環する光によって、微小共振器表面に取り付けられた蛍光種が励起することにより生じた蛍光であってもよい。第２の検出器１７２は、微小共振器１１０からのすべての波長の光を検出する場合もあるし、あるいは、第２の検出器１７２と微小共振器１１０との間に配置された波長選択素子１７４を使用することによって、特定の波長範囲内の光を検出する場合もある。波長選択素子１７４は、たとえば、微小共振器１１０内で共振する励起波長の光を拒絶し、蛍光波長の光を透過するフィルターであってよい。第２の検出器１７２は、図１Ｂに示されるものと同様の配置で使用することもできる。
【００２７】
本発明の他の例示的実施形態の一部について、これより図２Ａ〜２Ｃを参照しながら説明する。図２Ａに示される例示的実施形態一部２００においては、検出ユニット２０６が、第１および第２の検出器２０６ａおよび２０６ｂを含む。また、微小共振器１１０から導波路１０４にそって受信する光を分割するために波長依存性スプリッター２０６ｃが使用され、それによって、ある波長、または第１の波長範囲の光は第１の検出器２０６ａに移動し、第２の波長または第２の波長範囲の光は第２の検出器２０６ｂに移動する。波長依存性スプリッター２０６ｃには、異なる波長の光を分離するためのあらゆる好適な方法を使用することができる。たとえば、スプリッター２０６ｃには、方向性導波路結合器などの導波路を利用した波長依存性素子、またはブラッグ反射板を使用することができるし、あるいは、フィルター、プリズムなどの自由空間を利用した素子を使用することもできる。第１および第２の波長、あるいは波長範囲の値は、作業者によって変更することができる。
【００２８】
一例においては、第１の波長、または波長範囲は、光源１０２が発するプローブ光を含むことができ、一方、第２の波長、または波長範囲は、微小共振器１１０の表面に付着した検体が発する光を含むことができる。別の例では、第１および第２の波長、あるいは波長範囲の両方が、微小共振器に付着した検体種が発する光を含むことができる。この配列は、微小共振器の表面に付着した検体材料が、異なる波長の光を発する少なくとも２種類の蛍光種を含む場合に有用となりうる。
【００２９】
図１Ｂに示されるような実施形態においても検出ユニット２０６を使用することができ、この場合、微小共振器１１０からの信号光は、第１の導波路１０４とは異なる第２の導波路１５４に沿って伝播する。さらに、検出ユニット２０６は、自由空間を伝播した微小共振器からの光を検出する別の検出器とともに使用することができる。
【００３０】
導波路１０４は、異なる波長の光を優先的に反射するブラッグ格子などの１つ以上の反射板を備えることができる。たとえば、図２Ｂに概略的に示されるように、微小共振器センサーシステム２２０は、蛍光を反射する反射板２２２を有する導波路を備えることができる。したがって、光源に向かう方向で、導波路１０４の信号結合領域２２４に結合した、微小共振器１１０からの信号光は、反射板２２２によって、検出ユニット２０６に反射させることができる。信号結合領域２２４は、微小共振器からの信号光が結合する導波路の領域である。信号光は、蛍光であってもよいし、プローブ光の波長の光であってもよい。反射板２２２を使用することによって、検出ユニット２０６において検出される光信号の大きさを増加させることができる。
【００３１】
信号結合領域２２４と検出ユニット２０６との間の導波路１０４上にあるプローブ光反射板２２６を使用して、プローブ光を信号結合領域２２４に反射させることができる。この第２の反射板２２６を使用することによって、光源１０２から直接結合したプローブ成分１１２ａとは反対の方向で、微小共振器１１０内を伝播するプローブ成分１１２ｂを導入することによって、微小共振器１１０内と結合するプローブ光の量を増加させることができる。
【００３２】
導波路反射板は、他の構成で使用することもできる。たとえば、図１Ｂに示される構成において、信号光用の反射板を第２の導波路に配置することで、光を検出ユニットに向けて反射させることができる。
【００３３】
別の構成を図２Ｃに概略的に示しており、この場合では、導波路１０４が第２のプローブ反射板２２８を備えている。この構成においては、光源からの光は、方向性結合器などによって第２の結合領域２３０において導波路１０４と結合しており、入力部結合領域２３２において微小共振器内と結合している。入力部結合領域２３２は、プローブ光が微小共振器内と結合している導波路の領域である。図示されている実施形態においては、入力部結合領域２３０と信号結合領域２２４とが実質的に重なっている。しかし、プローブ光と信号光とで異なる導波路が使用される場合は、入力部結合領域が一方の導波路にあり、信号結合領域が他方の導波路にある。
【００３４】
第１のプローブ光反射板２２６は、微小共振器１１０内と結合していない光源１０２からのプローブ光を反射する。反射されたプローブ光のすべてが、その反射によって微小共振器１１０内と結合するとは限らず、したがって、第２のプローブ反射板２２８によって入力部結合領域２３２に反射させて戻すことができる。２つのプローブ反射板２２６と２２８との間に共振キャビティを配置することができる。光源１０２が発する光のコヒーレンス長、および共振キャビティのＱ因子などの一部の要素に依存して、プローブ光は、２つのプローブ反射板の間で共振することがあり、それによって入力部結合領域２３２においてプローブ光の電場が増大し、これによって、微小共振器１１０内に結合したプローブ光の量をさらに増加させることができる。ある高Ｑ因子の状況では、微小共振器１１０のモードと、プローブ反射板２２６および２２８によって形成される共振キャビティのモードと、ならびに光源１０２のモード（存在する場合）との間で、ある程度のモード整合が起こりうる。米国特許出願第１０／８５４，９１１号明細書などに記載されるような広帯域レーザーを光源として使用できることにも留意すべきである。
【００３５】
細菌の検出
上述のセンサーシステムを使用した、種々の細菌検出方法を使用することができる。たとえば、本発明のセンサーシステムは、グラム陽性菌および／またはグラム陰性菌の検出に使用することができる。以下は、様々な方法の一覧である：
１．術後感染の一般的原因となるＳｔａｐｈ  Ａｕｒｅｕｓに対する抗体など、特定の種類の細菌に対する抗体または結合性分子を微小球表面に固定化し、次に上記細菌を上記抗体に結合させ、上記細菌を蛍光色素で染色し、次に上記色素からの蛍光信号を検出する。
２．特定の種類の細菌、またはグラム陽性、またはグラム陰性菌に対する抗体または結合性分子を固定化し、次に、リソスタフィンまたはトリプシンなどの酵素、および／または洗剤および塩溶液との併用によって処理することなどによって上記細菌を溶解させ、次に溶解させた細菌を上記抗体に結合させ、上記細菌を蛍光色素で染色し、次に上記色素からの蛍光信号を検出する。
３．グラム陽性菌を微小球に固定化し、上記細菌を染色し、その染色によって得られた蛍光信号を検出する。
４．グラム陰性菌を微小球に固定化し、上記細菌を染色し、その染色によって得られた蛍光信号を検出する。
５．グラム陽性菌に対する抗体または結合性分子を微小球表面に固定化し、上記グラム陽性菌を上記抗体に結合させ、グラム陽性菌の存在を光学的に検出する。
６．グラム陰性菌に対する抗体または結合性分子を微小球表面に固定化し、上記グラム陰性菌を上記抗体に結合させ、グラム陰性菌の存在を光学的に検出する。
７．グラム陽性菌に対する抗体または結合性分子を微小球表面に固定化し、次に上記細菌を上記抗体に結合させ、上記グラム陽性菌を蛍光色素で染色し、次に上記色素からの蛍光信号を検出する。
８．グラム陰性菌に対する抗体または結合性分子を微小球表面に固定化し、次に上記細菌を上記抗体に結合させ、上記グラム陰性菌を蛍光色素で染色し、次に上記色素からの蛍光信号を検出する。
【００３６】
これらの種々の方法は、互いに独立して実施する必要はなく、これらのいくつかを同時に行うことができる。たとえば、グラム陽性菌を示す蛍光色素が、グラム陰性菌を示す蛍光色素とは異なる波長の光を発する場合には、１つの微小球を使用して、グラム陰性およびグラム陽性菌の両方の存在を同時かつ個別に検出することができる。たとえば、グラム陽性菌の存在を示すためにはクリスタルバイオレット色素が使用されることが多く、グラム陰性菌の存在を示すためには塩基性フクシンが使用される。特定の種類の細菌の存在を示すためには、特異的な抗体を使用することができる。
【００３７】
これより、上記の最初の２つの方法について、より詳細に論ずる。前述の例示的な光学センサーシステムの実施形態のいずれも、この方法に使用することができる。たとえば、Ｓｔａｐｈ  Ａｕｒｅｕｓ菌に対する抗体を、微小球の表面上に固定化する。この結合した抗体にＳｔａｐｈ  Ａｕｒｅｕｓ菌が結合することができる。結合しなかった細菌は洗い流される。次に、結合した細菌に、蛍光標識した抗Ｓｔａｐｈ  Ａｕｒｅｕｓ抗体を結合させ、蛍光強度を測定する。蛍光信号の強度は、結合した細菌の量に比例する場合がある。
【００３８】
前述の例示的な光学センサーシステムの実施形態のいずれも、第３および第４の方法に使用することができる。グラム陽性菌およびグラム陰性菌を、たとえばクリスタルバイオレットおよび塩基性フクシンなどの２種類の異なる色素で染色または／および対比染色し、続いて、たとえば風乾、または小型バーナーを使用することによって、これらを微小球表面に付着させる。あるいは、染色は、微小球表面に細菌を付着させた後で行うこともできる。
【００３９】
プローブ光は、微小球表面と近接して、ＷＧＭで微小球のまわりを循環するため、この球の表面上に吸着した細菌中の色素分子のみがプローブ光によって励起され、これより発せられた光は導波路に結合して戻る。検出ユニットにおいては、異なる波長の光を異なる検出器に向けるために波長選択スプリッターが使用される。光の強度を監視し較正することによって、微小球表面上のグラム陽性菌および／またはグラム陰性菌の数が求められる。
【００４０】
前述したように、比較的長時間の間、微小球のＷＧＭ内にプローブ光が閉じ込められる。導波路内を光が１回通過することで生じる電場と比較すると、微小球表面における局所電場が大きく増大する。Ｑ因子がわずか５０００である平面マイクロディスク系で、４０倍を超える倍率の場を得ることができる。本明細書に記載されるように、ガラス微小球では最高４×１０６のＱ因子を得ることができ、さらに大きな倍率の光場強度を得ることができる。
【００４１】
微小球からの蛍光は、光導波路を介して検出ユニットまで案内された光を使用して検出することができるし、または、たとえば微小球表面と近接して配置された高ＮＡ顕微対物レンズを使用して、自由空間を伝播した微小球の光、すなわち案内されていない微小球の光を使用することもできる。顕微鏡の対物レンズを使用することで、より高い収集効率を有することができるが、導波路に基づく収集は、小型で、可撓性で、低コストであり、遠隔測定が可能であり、より単純となる。微小球からの光を収集するための別の方法は、球の表面の近くに配置されたレンズ付きファイバーを使用することであり、さらに二色性ビームスプリッターを使用することで、異なる波長の光が分離される。これは、微小球とレンズ付きファイバーとの間をガイドされずに光が伝播するため、自由空間技術であるとも見なされる。
【００４２】
微小球内を循環するＷＧＭのエバネッセント場は、約λ／ｎの微小球の表面から１／ｅ離れた距離まで延在し、ここで、λは、プローブ光の波長であり、ｎは、微小球表面を取り囲む媒体の屈折率である。６００ｎｍの波長の光、および取り囲む媒体が水（ｎ＝１．３３）の場合、１／ｅの距離は２分の１ミクロン未満となる。微小球表面に付着する細菌の大きさは約１ミクロンであるため、エバネッセント結合の大部分は、微小球表面と接触する細菌の単層を越えてまでは延在しない。
【００４３】
微小球表面上に吸着する全細菌数は、たとえば数千と少ない場合があるが、細胞壁内の色素分子ははるかに高濃度となりうる。言い換えると、複数の色素分子が１つの細菌と結合することができる。したがって、微小球表面と近接する色素分子からの蛍光信号は、１つの細菌を検出するのに十分な強度となりうる。
【００４４】
前述の方法（５）〜（８）においては、最初に、微小球表面上に抗体または結合性分子を固定化する。続いて、抗体または結合性分子に細菌が結合すると、光学的に変換された信号が生じ、これは適切な検出器で検出することができる。抗体または結合性分子の使用について、図３を参照しながら説明する。テーパーの付いたファイバー導波路として示されている導波路３０４に微小球共振器３１０が光結合している。この微小球の表面上には抗体が取り付けられている。図示される実施形態において、異なる種類の抗体または結合性分子に対応した、２種類の異なる抗体または結合性分子３２０、３２２が存在しているが、１種類のみの抗体または結合性分子が存在する場合もあるし、３種類以上の抗体および結合性分子が存在する場合もある。第１の抗体または結合性分子３２０は、三角形の受容体を有するとして概略的に示されており、一方第２の抗体または結合性分子３２２は、正方形の受容体を有するとして概略的に示されている。
【００４５】
異なる細菌３３０および３３２の混合物が、たとえば水溶液中で、微小球共振器を取り囲んでいる。三角形で概略的に示されている第１の種類の細菌３３０は、第１の種類の抗体または結合性分子３２０に結合する。正方形で概略的に示されている第２の種類の細菌３３２は、第２の種類の抗体または結合性分子３２２と結合する。
【００４６】
細菌３３０、３３２自体が蛍光性であって、プローブ波長とは異なる波長の光を発生する場合もあるし、色素で染色することによって蛍光信号が得られる場合もある。細菌３３０、３３２は、それぞれの抗体または結合性分子３２０、３２２に結合させる前または後で、色素で染色することができる。
【００４７】
タンパク質の検出：
上記検出方法は、タンパク質の検出にも使用することができる。細菌の細胞壁の表面上に発現される特異的なタンパク質に抗体が結合するので、ある意味では、細菌の検出はタンパク質の検出に基づいている。さらに、標的タンパク質に結合する分子または抗体を、微小球上に固定化して、標的タンパク質の捕捉に使用することができる。さらなる抗体または結合性分子であって、微小共振器に付着させるものと同じであってもよく、異なるエピトープを有してもよく、蛍光分子と結合する、抗体または結合性分子を、後でセンサーに導入することができ、標的タンパク質に結合させることができる。この場合も、蛍光分子は、微小共振器内を伝播するプローブ光とのエバネッセント相互作用によって励起させることができ、これより得られる蛍光の検出を利用することで、標的タンパク質が存在するかしないかを決定することができる。この方法によって、細胞情報伝達系におけるタンパク質間の相互作用を検出する装置を提供することができる。微小球を使用したタンパク質アルブミンの検出が、同一の所有者に所有される米国特許出願第１０／８５４，９１１号明細書に記載されており、この文献によると、アレクサ・フルオル６４７（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７）色素で標識したストレプトアビジンを、微小球に付着させたウシ血清アルブミンの標識として使用している。
【００４８】
ウイルスおよび胞子の検出：
上記検出方法は、ウイルスおよび胞子の検出にも使用することができる。たとえば、結合性分子または抗体を、微小球に固定化することができる。この結合性分子または抗体は、ウイルスまたは胞子に結合することができる。さらなる抗体または結合性分子であって、微小球に付着させるものと同じであってもよく、異なるエピトープを有してもよく、蛍光分子と結合する、抗体または結合性分子を、後でセンサーに導入することができ、抗原と結合させることができる。上記蛍光分子は、微小共振器内を伝播するプローブ光とのエバネッセント相互作用によって励起させることができ、これより得られる蛍光の検出を利用することで、標的ウイルスまたは胞子が存在するかしないかを決定することができる。胞子検出の一例は、細菌のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓによって形成され、急性感染症の原因となる炭疽胞子の検出である。炭疽は、野生および家畜の下等脊椎動物（ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、アンテロープ、およびその他の草食動物）において最も一般的に発生するが、感染動物または感染動物の組織に曝露するとヒトにも発生しうる。
【００４９】
ＤＮＡの検出：
上記検出方法は、ＤＮＡ／ＲＮＡの検出にも使用することができる。たとえば、標的核酸の配列の一部と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを、微小球表面上に固定化する。標識なしのオリゴヌクレオチド検出方式を使用することもできるし、あるいは、ＤＮＡ／ＲＮＡインターカレーション色素を混入させることもでき、その検出は蛍光検出方式で行われる。
【実施例】
【００５０】
実施例−微小球を使用した細菌の検出
以下の手法を使用して細菌試料が付着した微小球を調製した。直径約１５０μｍの石英ガラス微小球をピラニア（Ｐｉｒａｎｈａ）溶液で５分間処理した後、精製水で洗浄した。このピラニア（Ｐｉｒａｎｈａ）溶液は、濃硫酸（Ｈ２ＳＯ４）と過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）との３：１の混合物であった。硫酸は、ニュージャージー州フィリップスバーグのマリンクロット・ベーカー・インコーポレイテッド（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｂａｋｅｒ，Ｉｎｃ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）供給のものであった。過酸化水素は、ニュージャージー州フィリップスバーグのマリンクロット・ラボラトリー・ケミカルズ（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）より３０％溶液で入手した。上記の清浄にしたガラス微小球を水から取り出した。次に、この微小球を、スイスのブックスのフルカ（Ｆｌｕｋａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）供給の０．５％の３−メルカプトプロピルトリメトキシシランを含有するエタノール溶液に入れた。室温で５分間反応を進行させた。微小球をこのシラン溶液から取り出し、エタノールで２回洗浄し、風乾した後、イリノイ州ロックフォードのピアス・ケミカル・カンパニー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）より供給されるＮ−スクシンイミジル−４−マレイミドブチレート（ＧＭＢＳ）の１．１ｍＭ溶液が入れられた反応容器に入れた。微小球をこのＧＭＢＳ溶液とともに５分間インキュベートした後、エタノールで洗浄した。
【００５１】
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で抗Ｓｔａｐｈ  Ａｕｒｅｕｓ  抗体の溶液を調製した。この抗Ｓｔａｐｈ  Ａｕｒｅｕｓは、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対するポリクローナル抗体であり、ニューヨーク州ウエストベリーのアキュレート・ケミカル・アンド・サイエンティフィック・コーポレーション（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）より供給されたものであった。ＰＢＳは、ニュージャージー州ギブスタウンのＥＭＤケミカルズ（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）より１０倍濃縮液として供給されたものであった。微小球をこの溶液とともに５分間インキュベートした。
【００５２】
次に、０．１％のトゥイーン２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０）（ミズーリ州セントルイスのシグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）より供給されるポリオキシチレンソルビタンモノラウレート）を含有するＰＢＳ中の、２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ミズーリ州セントルイスのシグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）より供給される）で、微小球を５分間ブロックした。続いて、Ｓｔａｐｈ  Ａｕｒｅｕｓ菌溶液（細菌株２５９２３、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、バージニア州マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）、１０７細胞／ｍｌの濃度を有する）を、上記微小球とともに５分間インキュベートして、これらの細菌を微小球に付着させた。最後に、オレゴン州ユージーンのモレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ  Ｏｒｅｇｏｎ）供給のアレクサ・フルオル６４７（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７）で標識した１０μｇ／ｍｌの濃度の抗Ｓｔａｐｈ  Ａｕｒｅｕｓ抗体を、上記微小球とともにインキュベートした。これによって、アレクサ・フルオル６４７（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７）色素で標識したＳｔａｐｈ  Ａｕｒｅｕｓ菌が付着した微小球が得られた。
【００５３】
複数のスライドガラスを互いにエポキシ接着剤で接着することによって、フローチャンバを作製した。流入経路および流出経路として機能させるために、ポリマー管材料を、この場合もエポキシを使用して接着して固定した。前述のようにシラン処理およびＧＭＢＳ処理を行った。このフローチャンバ中で以下のステップを行った。
【００５４】
微小球を細菌溶液とともにインキュベートする代わりに、微小球をＰＢＳとともにインキュベートしたことを除けば、前述のステップと同じステップを使用して、対照微小球を作製した。
【００５５】
試料微小球および対照微小球を、光バイオセンシングシステム中の微小共振器として使用した。実験の設定は、図１Ｃに示されるものと類似しており、光源によって、６３０〜６３５ｎｍの範囲内の光が、結合導波路としてのテーパー付きファイバーに通される。このファイバーのコアは、約１．５μｍ〜２．５μｍの直径にテーパーが付けられている。導波路に沿って微小球を通過した光を検出するために、第１の検出器を配置した。微小球からの自由空間発光を検出するために、第２の検出器を配置した。
【００５６】
６３５ｎｍの出力、および０．５ｎｍ（５００ｐｍ）の出力帯域幅を有するレーザーダイオードから結合した光を、マイクロキャビティに照射した。ファイバーのテーパー内に結合した光の出力は約２５０μＷであった。
【００５７】
第２の自由空間検出器によって検出された、Ｓｔａｐｈが付着した微小球および対照微小球の蛍光応答を、図４に時間の関数として示している。それぞれの場合で、最初は、励起光は、テーパー付きファイバーへの入力部においてブロックし、光が微小球内に結合しないようにした。時間ｔ＝８秒において、励起光のブロックを外すと、蛍光信号が観察された。これは、微小球内で共振する光によって励起されてフルオロフォアが発する光に対応している。レーザーダイオードからの光のチョッピングを行い、ロックイン増幅器を使用して蛍光信号を検出した。約２５〜３５秒の励起時間の間で、蛍光信号が少なくなった。この経時による信号強度の低下は、色素分子の漂白によるものであった。
【００５８】
Ｓｔａｐｈが取り付けられた微小球の初期の蛍光信号は、最初は対照試料の約２倍であり、これは、Ｓｔａｐｈ菌に色素が特異的に結合することによって、顕著な光学的効果が得られたことを示している。
【００５９】
微小球光バイオセンサーに関す課題の１つは、結合が起こる検出表面に標的を効率的に送達することである。微小球の表面積が小さいため、溶液中の大部分の標的は、球表面の近くに到達することさえできずに、チャンバから排出される場合がある。これは、試料濃度が低い場合に特に問題となる。
【００６０】
したがって、溶液中の標的の有効濃度を増加させることが有用である。センサーチャンバの遠位端に取り付けられ、微小球センサー表面の近くにあるフィルターを使用することで、この濃度増加を実現することができる。バイオセンサーシステムの例示的実施形態の１つを図５Ａ〜５Ｃに概略的に示している。システム５００は、一端にフィルター５１４を有するチャンバ５１２内に配置されたセンサーユニット５０２を含む。フィルター５１４は、検出すべき標的を捕捉するのに適切な孔径を有し、たとえば最大２μｍ、最大１μｍ、最大０．８μｍ、および／または最大０．４５μｍの孔径を有することができる。場合によっては、たとえば、タンパク質分子、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡのフラグメントを検出するためにシステムが使用される場合、フィルターが分子フィルターであってもよい。このようなフィルターは、たとえば約５ｎｍ〜１０ｎｍのさらに小さな孔隙を有し、たとえば、１０，０００などの特定の値より大きい分子量を有する分子を捕捉するよう設計することができる。さらに、このような小さな孔隙を有するフィルターを溶媒が通過する場合には、様々な種類のポンプを使用することができる。
【００６１】
センサーユニット５０２は、たとえば前述の微小球に基づく光バイオセンサーなどのバイオセンサーを含むか、あるいは表面弾性波（ＳＡＷ）に基づくバイオセンサーなどの他の種類のバイオセンサーであってもよく、同一の所有者に所有される米国仮特許出願第６０／５３３１６９号明細書および第６０／５３３１７６号明細書においてより詳細に記載されており、これらの記載内容が本明細書に援用される。
【００６２】
たとえばシリンジまたは蠕動ポンプなどのポンプを使用して、一般に矢印「Ａ」で示される方向で、標的検体を含有する試料が検出チャンバ５１２に導入される。この試料は、センサーユニット５０２によって洗い流され、標的検体５０４の一部がセンサーユニット５０２の活性表面に付着する。微小球系バイオセンサーの場合、この活性表面は、検出されるべき標的細菌、タンパク質、胞子、ウイルス、またはＤＮＡ／ＲＮＡに適した抗体または結合性分子を提供することができる微小球表面である。最初にセンサーユニット５０２に付着しなかった標的検体５０４の大部分は、溶液がチャンバ５１２を通過するときにフィルター５１４によって捕捉される。続いて、図５Ｂに概略的に示されているように、一般に矢印「Ｂ」で示される方向のバックフローを発生させることで、フィルター５１４から標的検体が回収され、標的検体５０４が洗い流されて、もう１回センサーユニット５０２を通過する。バックフローによって、より多くの検体がセンサーユニット５０２の活性表面に付着する。センサーユニット５０２に特定の種類の抗体または結合性分子が固定化される場合、対象となる検体５０４を捕捉し、未結合の、すなわち選択しなかった種はバックフローによって洗い流すことができる。
【００６３】
センサーユニット５０２全体が、チャンバ５１２内に存在する必要はない。たとえば、センサーユニット５０２が、マイクロキャビティ共振器を有する光バイオセンサーを含む場合、マイクロキャビティ共振器が、細菌を捕捉するための活性表面を提供するので、図５Ｃに概略的に示されるように、マイクロキャビティ共振器５１０のみまたは、マイクロキャビティ共振器の一部のみが、チャンバ５１２内に存在してもよい。マイクロキャビティ共振器５１０に結合する光を発する光源５０６と、光源５０６からの光をマイクロキャビティ共振器５１０に結合させる導波路５０８、検出ユニット５０９、および微小球からの光を検出ユニット５０９に結合させる任意の導波路（図示される実施形態においては導波路５０８である）とは、検出チャンバ５１２内に配置する必要はない。これによって、検出チャンバ５１２を小さくすることができ、たとえば、マイクロキャビティ共振器５１０と同程度の寸法にすることができる。センサーユニット５０２の一部の要素は、検出チャンバから制限される必要はないことが分かる。たとえば、マイクロキャビティ共振器５１０全体をチャンバ５０２内に配置することができ、微小共振器キャビティ５１０を出入りする光と結合する１つ以上の導波路を結合させるために、チャンバ５０２を出入りする光が通過する１つ以上の導波路を有することができ、光源５０６および検出ユニット５０９は検出チャンバ５１２の外側に配置することができる。
【００６４】
同様に、他の種類のバイオセンサーの場合でも、検出表面のみがチャンバ５１２内に存在し、バイオセンサーの他の要素はチャンバ５１２の外側に配置されてもよい。バックフローは、シリンジの使用またはポンプによってチャンバ５１２内に溶液を注入するなどのあらゆる好適な方法を使用して発生させることができる。さらに、チャンバ内に試料を注入するために使用したものと同じ装置を使用して、バックフローを発生させることもできる。たとえば、チャンバ５１２内に試料を入れるのにポンプが使用される場合、そのポンプを逆方向に動作させることでバックフロー発生させることができる。たとえば、蠕動ポンプは逆流を発生させるのに適している。他の種類のポンプを使用することもできる。
【００６５】
濾過捕捉法の方法は、標的検体の有効濃度を大きくするために使用することができ、これは、センサーチャンバの寸法が比較的小さい場合に特に有用である。たとえば、光バイオセンサー中に使用される微小球は、典型的には約１００μｍ〜２００μｍの直径を有する。したがって、微小球が配置されるセンサーチャンバは、約１ｍｍ３以下の容積を有することができる。フィルターの濃縮効果は非常に大きくなることがあり、濃縮率Ｒは以下のように表すことができ：
Ｒ＝（Ｖ／Ｃ）×ＲＣ×ＲＢ          （１）
上式中、Ｖは、チャンバを流れる試料の体積であり、Ｃはチャンバの容積であり、ＲＣは、フィルターの捕捉率、すなわち前方流中のフィルターによって捕捉される標的検体のパーセント値であり、これは適切に設計されたフィルターの場合典型的には約１００％であり、ＲＢは、フィルターからの回収率、すなわち、バックフローによってフィルターから洗い流されてチャンバに戻り捕捉される検体の比率である。
【００６６】
標的検体が細菌である例示的一実施形態においては、チャンバの大きさＣが１×１×１ｍｍ（１０−３ｍｌ）である。濃度１００細胞／ｍｌの流入物１ｍｌ（Ｖ＝１ｍｌ）がチャンバを通過し、フィルターが１００％の細菌を捕捉する場合、そのフィルターは１００個の細菌を捕捉する。バックフロー回収率が２０％である場合、２０個の細胞をフィルターからチャンバに戻すことができ、細胞濃度は２×１０４細胞／ｍｌとなる。したがって、バックフローフィルター技術を使用することによって、有効試料濃度を増加させることができ、その結果、感度を増大させることができる。
【００６７】
この濾過捕捉方法は、磁性粒子濃縮などの他の方法よりも、迅速で、安価で、より大きい容積へのスケールアップが容易となりうる。さらに、濾過捕捉方法は、微小球系バイオセンサーに限定する必要はなく、表面弾性波（ＳＡＷ）センサーなどの他の種類のセンサーに使用することもできる。
【００６８】
実施例−濾過捕捉
モデル系としてＳｔａｐｈ  Ａｕｒｅｕｓを使用した多数の実験を行って、濾過捕捉技術、およびその光バイオセンシングシステムにおける適合性について調べた。トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝食塩水中のＳｔａｐｈ  Ａｕｒｅｕｓの濃度は１０７細胞／ｍｌ〜１０４細胞／ｍｌの範囲である。フィルターは、０．４５μｍ、０．８μｍ、または１μｍの孔径を有するポリカーボネートおよび酢酸セルロースのフィルター膜を使用した。各実験中、ｉ）捕捉効率、すなわちフィルターによってブロックされた細菌数と、ｉｉ）回収率、すなわちバックフローによってフィルターから回収することができた全細菌の割合との２つのパラメーターを監視した。さらに、回収率測定の場合、１ｍｌのバックフローを５回連続して使用し、回収率は各バックフローの後で回収した。
【００６９】
細胞濃度が１０７細胞／ｍｌの場合には、蛍光光度計を使用して蛍光検出方法により定量を行った。濃度が１０４細胞／ｍｌの場合には、蛍光検出方法では感度が不十分であったので、その代わりに、細菌を培養し計数する方法を使用した。
【００７０】
実験Ａ−回収率、高濃度
最初に、１０７細胞／ｍｌの濃度を有するＳｔａｐｈ  Ａｕｒｅｕｓ溶液を調製した。フィルターの大きさは直径が４７ｍｍであり、孔径１μｍのポリカーボネートフィルターまたは孔径０．８μｍの酢酸セルロースフィルターのいずれかであった。表Ｉは、１ｍｌのバックフローを５回行った後のＳｔａｐｈ  Ａｕｒｅｕｓの回収率を示している。
【００７１】
【表１】
2008513776.tif 000003
【００７２】
したがって、１０７細胞／ｍｌの濃度においては、回収はほぼ完璧である。
【００７３】
実験Ｂ−回収率、低濃度
しかし、より低い濃度においては、濃度が１０７細胞／ｍｌの場合よりも回収率が低くなる。たとえば、１０４細胞／ｍｌの濃度では、回収率が２４％まで低下する。この回収率の低下の原因は、少なくとも一部は、フィルター膜に細菌が吸着することによって生じるデッドボリュームであった。より面積が小さいフィルターを使用すると回収率が増大することが分かった。たとえば、フィルターの直径を１３ｍｍまで減少させると、回収率が５３％（３回の実験の平均、以下の表ＩＩ〜ＩＶ参照）まで増加した。実際の微小球バイオセンサーチャンバにおいては、フィルター直径を１ｍｍまで小さくすることができ、そのためデッドボリュームが小さくなり、回収率が増大することに留意されたい。
【００７４】
表ＩＩ〜ＩＶは、Ｓｔａｐｈ  Ａｕｒｅｕｓ濃度を約１０４細胞／ｍｌの値で変動させた場合に、１ｍｌの各バックフローによる回収結果を示している。これらの実験では、フィルターは、ミシガン州アナーバーのゲルマン・インストルメント・カンパニー（Ｇｅｌｌｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ）より入手可能なアクロディスク（Ａｃｒｏｄｉｓｃ）（登録商標）シリンジフィルターであった。これらのフィルターは、直径が１３ｍｍであり、０．４５μｍの孔径を有する親水性ポリプロピレン製でできていた。以下の表には示していないが、捕捉効率は依然として約１００％であった。フィルターが細菌を捕捉した後、各フィルターに対して、各１ｍｌのバックフローを繰り返し行った。各バックフローの後、溶液を取り出して培養し、バックフローによってフィルターから除去された細菌を計数した。１ｍｌバックフローを５回行った後の全回収率は４０％を越えている。各表は、各バックフローステップで回収された細胞数と、その数の全細胞に対するパーセント値とともに示している。各表の最下行は、第２列の数の合計によって求められる回収された全細胞数と、回収された細胞の全パーセント値とを示している。
【００７５】
【表２】
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【００７６】
【表３】
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【００７７】
【表４】
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【００７８】
このように、フィルターに対して５回のバックフローを行うと、バックフロー回収は少なくとも４０％となった。これより、バックフロー捕捉技術を使用することによって、センサーに提供される試料濃度を効率的に増加可能なことが確認できる。
【００７９】
したがって、本発明は、以上に説明した特定の実施例に限定されるものと見なすべきではなく、添付の特許請求の範囲に明確に記載される本発明のすべての態様を含むものと理解すべきである。種々の修正、同等の方法、および本発明を適用可能な多数の構造は、本明細書を検討することによって、本発明が関連する当業者によって容易に明らかとなるであろう。特許請求の範囲は、このような修正および機構を含むことを意図している。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１Ａ】本発明の原理によるマイクロキャビティセンサーの実施態様を概略的に示している。
【図１Ｂ】本発明の原理によるマイクロキャビティセンサーの実施態様を概略的に示している。
【図１Ｃ】本発明の原理によるマイクロキャビティセンサーの実施態様を概略的に示している。
【図２Ａ】本発明の原理によるマイクロキャビティセンサーの実施態様を概略的に示している。
【図２Ｂ】本発明の原理によるマイクロキャビティセンサーの実施態様を概略的に示している。
【図２Ｃ】本発明の原理によるマイクロキャビティセンサーの実施態様を概略的に示している。
【図３】本発明の原理による、選択された細菌を引き寄せるための抗体が付着した微小球共振器の一実施形態を概略的に示している；
【図４】時間の関数としての蛍光活性を示すグラフを示している。
【図５Ａ】本発明の原理による細菌センサーシステムの実施形態を概略的に示している。
【図５Ｂ】本発明の原理による細菌センサーシステムの実施形態を概略的に示している。
【図５Ｃ】本発明の原理による細菌センサーシステムの実施形態を概略的に示している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【国際調査報告】
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