(57)【要約】  アンドロゲンレセプターとβ−カテニンの間の相互作用を調節できるかどうかを決定する方法が開示される。試験化合物が、β−カテニン−Ｗｎｔシグナル化経路よりもアンドロゲンレセプターシグナル化経路を、あるいはアンドロゲンレセプターシグナル化経路よりもβ−カテニン−Ｗｎｔシグナル化経路を選択的に調節するかどうかを決定する方法も開示される。
2008545395.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験化合物がアンドロゲンレセプターとβ−カテニンの間の相互作用を調節できるかどうかを決定する方法であって：
（ａ）（ｉ）β−カテニンのＮＨ３−末端領域と融合したＤＮＡ結合ドメインを含むハイブリッドタンパク質をエンコードするＤＮＡ配列、
（ｉｉ）レポーター遺伝子と操作可能に結合し、その転写を調節する前記ＤＮＡ結合ドメインに対応する上流活性化配列を含むＤＮＡ配列、および
（ｉｉｉ）アンドロゲンレセプタータンパク質をエンコードするＤＮＡ配列
を含む細胞を提供する工程；
（ｂ）試験化合物を、任意にアンドロゲンの存在下で、細胞に導入する工程；および
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定する工程を含み、
ここで、レポーター遺伝子による発現の増加または減少は、試験化合物がアンドロゲンレセプターとβ−カテニンの間の相互作用を調節できることを示すものである、方法。
【請求項２】
（ｉ）のＤＮＡ結合ドメインがＧＡＬ−４  ＤＮＡ結合ドメインを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
（ｉｉ）のレポーター遺伝子と操作可能に結合した上流活性化配列がＧＡＬ−４  ＵＡＳを含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
レポーター遺伝子と操作可能に結合したＧＡＬ−４  ＵＡＳ配列の１つまたは複数のコピーが存在する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
レポーター遺伝子がルシフェラーゼである請求項１記載の方法。
【請求項６】
（ｉ）のβ−カテニンのＮＨ３−末端領域がヒトβ−カテニンのアミノ酸２〜４２４を含む請求項１記載の方法。
【請求項７】
（ｉ）のβ−カテニンのＮＨ３−末端領域が、配列番号１のアミノ酸２〜４２４と少なくとも６５％同一性を有するアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列を含む請求項１記載の方法。
【請求項８】
（ｉ）のβ−カテニンのＮＨ３−末端領域が、配列番号１のアミノ酸２〜４２４と少なくとも７５％同一性を有するアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列を含む請求項７記載の方法。
【請求項９】
（ｉ）のβ−カテニンのＮＨ３−末端領域が、配列番号１のアミノ酸２〜４２４と少なくとも８５％同一性を有するアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列を含む請求項８記載の方法。
【請求項１０】
（ｉ）のβ−カテニンのＮＨ３−末端領域が、配列番号１のアミノ酸２〜４２４と少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列を含む請求項９記載の方法。
【請求項１１】
（ｉ）のβ−カテニンのＮＨ３−末端領域が、以下の条件：４５℃で６×ＳＳＣ、および５０℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳで少なくとも１回の洗浄の下で配列番号１のアミノ酸２〜４２４をエンコードするヌクレオチド配列とハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
（ｉ）のβ−カテニンのＮＨ３−末端領域が、以下の条件：４５℃で６×ＳＳＣ、および５５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳで少なくとも１回の洗浄の下で配列番号１のアミノ酸２〜４２４をエンコードするヌクレオチド配列とハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
（ｉ）のβ−カテニンのＮＨ３−末端領域が、以下の条件：４５℃で６×ＳＳＣ、および６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳで少なくとも１回の洗浄の下で配列番号１のアミノ酸２〜４２４をエンコードするヌクレオチド配列とハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が真核細胞である請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が哺乳動物細胞である請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
レポーター遺伝子の発現の調節が、発現における減少である請求項１記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｂ）での前記アンドロゲンがＤＨＴである請求項１記載の方法。
【請求項１８】
（ｉ）のＤＮＡ結合ドメインが、ＧＡＬ−４  ＤＮＡ結合ドメインを含み；（ｉ）のβ−カテニンのＮＨ３−末端領域がヒトβ−カテニンのアミノ酸２〜４２４を含み；レポーター遺伝子と操作可能に結合した上流活性化配列ＧＡＬ−４  ＵＡＳの１つより多くのコピーがあり；レポーター遺伝子がルシフェラーゼであり；工程（ｂ）のアンドロゲンがＤＨＴであり；調節が発現の減少であるところの、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
β−カテニンのＮＨ３−末端領域がアルマジロ反復配列１〜１２を含む請求項１記載の方法。
【請求項２０】
β−カテニンのＮＨ３−末端領域がアルマジロ反復配列１〜７を含む請求項１記載の方法。
【請求項２１】
β−カテニンのＮＨ３−末端領域がアルマジロ反復配列１〜６を含む請求項１記載の方法。
【請求項２２】
試験化合物がアンドロゲンレセプターとβ−カテニンの間の相互作用の調節をすることができるかどうかを決定する方法であって：
（ａ）（ｉ）β−カテニンと融合したＤＮＡ結合ドメインを含むハイブリッドタンパク質をエンコードするＤＮＡ配列、
（ｉｉ）レポーター遺伝子と操作可能に結合し、その転写を調節する前記ＤＮＡ結合ドメインに対応する上流活性化配列を含むＤＮＡ配列、および
（ｉｉｉ）アンドロゲンレセプタータンパク質をエンコードするＤＮＡ配列
を含む細胞を提供する工程、
（ｂ）試験化合物を、任意にアンドロゲンの存在下で、細胞に導入する工程；および
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定する工程を含み、
ここで、レポーター遺伝子による発現の増加または減少は、試験分子がアンドロゲンレセプターとβ−カテニンの間の相互作用を調節できることを示すものである、方法。
【請求項２３】
試験化合物が、アンドロゲンレセプターシグナル化経路よりもβ−カテニン−Ｗｎｔシグナル化経路を選択的に調節するかどうかを決定する方法であって：
（ａ）ＡＲによるβ−カテニンとの相互作用を阻害することにより、遺伝子の発現を増加または減少させる試験化合物を同定し（ここで、試験化合物は、アンドロゲン−ＡＲによる転写を抑制することなく、Ｗｎｔシグナル化に対するアンドロゲン−リガンド型ＡＲ抑制を除去する）；そして
（ｂ）試験化合物が、β−カテニン非依存性アンドロゲンレセプターシグナル化経路により遺伝子の発現を増加させるか、または減少させるかを決定するために、（ａ）の試験化合物を分析することを含み；
これにより、（ａ）の試験化合物は、この試験化合物がアンドロゲンレセプターシグナル化経路により遺伝子の発現を増加または減少させることができないならば、アンドロゲン−リガンド型ＡＲのβ−カテニンと相互作用する能力を阻害することにより、β−カテニン−Ｗｎｔシグナル化経路を選択的に調節する方法。
【請求項２４】
工程（ａ）が
（Ａ）（ｉ）β−カテニンと融合したＤＮＡ結合ドメインを含むハイブリッドタンパク質をエンコードするＤＮＡ配列；
（ｉｉ）レポーター遺伝子と操作可能に結合し、その転写を調節する前記ＤＮＡ結合ドメインに対応する上流活性化配列を含むＤＮＡ配列；および
（ｉｉｉ）アンドロゲンレセプタータンパク質をエンコードするＤＮＡ配列
を含む細胞を提供する工程；
（Ｂ）試験化合物を、任意にアンドロゲンの存在下で、細胞に対して導入する工程；および
（Ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定する工程を含み、
ここで、レポーター遺伝子による発現の増加または減少は、試験分子がアンドロゲンレセプターとβ−カテニンの間の相互作用を調節することができることを示すものである、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
（ｉ）のＤＮＡ配列が、β−カテニンのＮＨ３−末端領域と融合したＤＮＡ結合ドメインを含むハイブリッドタンパク質をエンコードする、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
試験化合物が、β−カテニン−Ｗｎｔシグナル化経路よりも、アンドロゲンレセプターシグナル化経路を選択的に調節するかどうかを決定する方法であって：
（ａ）アンドロゲンレセプターシグナル化経路による遺伝子の発現を増加または減少させる試験化合物を同定する工程；および
（ｂ）試験化合物が、アンドロゲン−リガンド型ＡＲまたは非リガンド型ＡＲのβ−カテニン／Ｗｎｔシグナル化を阻害する能力を増加させるか、または減少させるかを決定するために、（ａ）の試験化合物を分析する工程を含み；
これにより（ａ）の試験化合物は、Ｗｎｔシグナル化のアンドロゲン−リガンド型ＡＲ抑制を除去することなく、アンドロゲンレセプターシグナル化経路を選択的に調節するか、またはＡＲ作用物質の不在下でＡＲとβ−カテニン間の相互作用を促進せず、その結果、β−カテニン−Ｗｎｔシグナル化経路により調節される遺伝子の発現の増加または減少において活性を有さない試験化合物が得られる方法。
【請求項２７】
工程（ｂ）が：
（Ａ）（ｉ）β−カテニンと融合したＤＮＡ結合ドメインを含むハイブリッドタンパク質をエンコードするＤＮＡ配列；
（ｉｉ）レポーター遺伝子に操作可能に結合し、レポーター遺伝子の転写を制御する前記ＤＮＡ結合ドメインに対応する上流活性化配列を含むＤＮＡ配列；および
（ｉｖ）アンドロゲンレセプタータンパク質をエンコードするＤＮＡ配列
を含む細胞を提供する工程；
（Ｂ）任意にアンドロゲンの存在下で、細胞に対して（ａ）の試験化合物を導入する工程；および
（Ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定する工程
を含み、
ここで、レポーター遺伝子による発現の増加または減少は、試験化合物がアンドロゲンレセプターとβ−カテニンの間の相互作用を調節できることを示すものである方法。
【請求項２８】
（ｉ）のＤＮＡ配列が、β−カテニンのＮＨ３−末端領域と融合したＤＮＡ結合ドメインを含むハイブリッドタンパク質をエンコードする、請求項２７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、全体として本発明の一部として参照される、２００５年５月１９日に出願された、米国仮出願番号６０／６８２，５８０の優先権を主張する。
本発明は、アンドロゲンレセプター（ＡＲ）とβ−カテニン間のアンドロゲン−依存性相互作用を調節する化合物を同定するための分析法に関する。本発明は特に、アンドロゲンレセプターとβ−カテニン間の相互作用を妨害でき、これにより、ＡＲシグナル化に対するβ−カテニンの影響を特異的に除去するか、またはβカテニンおよびＷｎｔシグナル化に対するＡＲの影響を除去する分子の同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
伝統的に、核／ステロイドレセプター結合リガンドは、試験化合物の、核／ステロイドレセプターに対して反応性のコンセンサス核レセプターＤＮＡエレメントを含有する遺伝子の転写に影響を及ぼす能力についてスクリーニングすることにより同定される。しかしながら、いくつかのステロイドレセプターも影響を及ぼし、その古典的なステロイド転写制御メカニズムに加えて、非ステロイドシグナル化経路により影響を受ける。多くの場合において、かかるレセプターと関連する非ステロイドシグナル化経路のみの調節において選択的に有効である特定化合物、またはかかるレセプターに対して伝統的に反応性である遺伝子に対するレセプターの転写活性のみの調節において選択的に有効な化合物を同定する手段を有することが有用である。かかる選択性を有する化合物は、非ステロイド経路の調節が望ましいが、古典的ステロイドレセプターによる転写の阻害が望ましくないか、またはその逆である状況において潜在的な医薬的有用性を有する。
【０００３】
例えば、ＡＲ反応性遺伝子の転写を活性化することが知られている古典的ステロイドレセプターであるアンドロゲンレセプター（ＡＲ）は、ＡＲとβ−カテニンのアンドロゲンによる相互作用によりＷｎｔシグナル化経路にも影響を及ぼすことが知られている（１，２，３）。Ｗｎｔ経路は、骨、腸、皮膚、および毛包をはじめとする様々な組織の分化および機能的活性において重要な役割を果たす。Ｗｎｔ経路における変化は、骨粗鬆症ならびに前立腺癌および結腸癌などの病状に関与している。Ｗｎｔシグナル化が変わる他の状態は、多嚢胞性卵巣症候群におけるインスリン耐性および男性ホルモン性脱毛症を包含する（４，５）。これらの状態の多くにおいて、アンドロゲンおよびＡＲは、Ｗｎｔ経路の潜在的なモジュレーターとして関与する。
【特許文献１】米国特許第５，２８３，１７３号公報
【特許文献２】米国特許第５，４６８，６１４号公報
【非特許文献１】Ｙａｎｇ  Ｆ、Ｌｉ  Ｘ、Ｓｈａｒｍａ  Ｍ、Ｓａｓａｋｉ  Ｃ、Ｌｏｎｇｏ  Ｄ、Ｌｉｍ  Ｂ、Ｓｕｎ  Ｚ．  （２００２）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７：  １３；  １１３３６−１１３４４
【非特許文献２】Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ  Ｊ、Ｅｒｔｅｌ  Ｊ、Ａｌｌｅｎ  Ｍ、Ｘｕ  Ｍ、Ｂｕｔｌｅｒ  Ｃ、Ｗｉｌｓｏｎ  Ｅ、Ｗｉｅｒｍａｎ  Ｍ．  （２００２）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７：  ２３；  ２０７０２−２０７１０
【非特許文献３】Ｓｏｎｇ  Ｌ、Ｈｅｒｒｅｌｌ  Ｒ、Ｂｙｅｒｓ  Ｓ、Ｓｈａｈ  Ｓ、Ｗｉｌｓｏｎ  Ｅ、Ｇｅｌｍａｎｎ  Ｅ．  （２００３）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２３：  ５；  １６７４−１６８７
【非特許文献４】Ｓｈａｒｍａ  Ｍ、Ｃｈｕａｎｇ  Ｗ、Ｓｕｎ  Ｚ  （２００２）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７：  ３４；  ３０９３５３０９４１
【非特許文献５】Ｔｒｕｉｃａ  Ｃ、Ｂｙｅｒｓ  Ｓ、Ｇｅｌｍａｎｎ  Ｅ．  （２０００）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６０：  ４７０９−４７１３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、アンドロゲンレセプターのβ−カテニンとの相互作用を調節する化合物を同定するための新規スクリーニング分析法を記載している。古典的なアンドロゲンによるＡＲ依存性転写の調節を測定する標準的分析法と併せて用いられる場合、本発明の分析法は、古典的ＡＲ作用物質または拮抗物質活性、例えば、ＡＲによるアンドロゲン性転写などに影響を及ぼすことなく、β-カテニンと相互作用し、その活性を調節するＡＲの能力を選択的に阻害する新種のＡＲモジュレーターを使用者が同定することを可能にする。この選択的活性を有する化合物は、古典的ＡＲ転写分析のみを用いて検出することができない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、試験化合物がアンドロゲンレセプター（ＡＲ）とβ−カテニンの間の相互作用を調節できるかどうかを決定する方法であって：
（ａ）（ｉ）β−カテニンのＮＨ３−末端領域と融合したＤＮＡ結合ドメインを含むハイブリッドタンパク質をエンコードするＤＮＡ配列、
（ｉｉ）レポーター遺伝子と操作可能に結合し、レポーター遺伝子の転写を調節する前記ＤＮＡ結合ドメインに対応する上流活性化配列を含むＤＮＡ配列、および
（ｉｉｉ）アンドロゲンレセプタータンパク質をエンコードするＤＮＡ配列を含む細胞を提供し、
（ｂ）試験化合物を、任意にアンドロゲンの存在下で、細胞に導入し；そして
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定することを含む方法を提供し、
ここで、レポーター遺伝子による発現の増加または減少は、試験化合物がアンドロゲンレセプターとβ−カテニンの間の相互作用を調節できることを示す。
【０００６】
好ましい態様において、本発明は（ｉ）のＤＮＡ結合ドメインがＧＡＬ−４  ＤＮＡ結合ドメインを含み；（ｉｉ）のレポーター遺伝子と操作可能に結合した上流活性化ＤＮＡ配列がレポーター遺伝子と操作可能に結合したＧＡＬ−４  ＵＡＳを含む方法をさらに提供する。
【０００７】
さらに好ましい態様において、本発明は、（ｉ）のＮＨ３−末端領域β−カテニンがヒトβ−カテニンのアミノ酸２〜４２４を含み；レポーター遺伝子がルシフェラーゼであり；ルシフェラーゼ遺伝子と操作可能に結合したＧＡＬ−４  ＵＡＳ配列のコピーがいくつか存在し；試験化合物により達成される調節が、ルシフェラーゼ遺伝子の発現の減少であり；工程（ｂ）のアンドロゲンがＤＨＴである方法をさらに提供する。
【０００８】
本発明のもう一つ別の態様は、試験化合物がアンドロゲンレセプターとβ−カテニンの間の相互作用を調節することができるかどうかを決定する方法であって：
（ａ）（ｉ）β−カテニンと融合したＤＮＡ結合ドメインを含むハイブリッドタンパク質をエンコードするＤＮＡ配列、
（ｉｉ）          レポーター遺伝子と操作可能に結合した前記ＤＮＡ結合ドメインに対応する上流活性化配列を含むＤＮＡ配列、および
（ｉｉｉ）アンドロゲンレセプタータンパク質をエンコードするＤＮＡ配列を含む細胞を提供し、
（ｂ）試験化合物を任意にアンドロゲンの存在下で、細胞に導入し；そして
（ｃ）レポーター遺伝子の発現を測定する工程を含む方法を提供し、
ここで、レポーター遺伝子による発現の増加または減少は、試験分子がアンドロゲンレセプターとβ−カテニンの間の相互作用を調節できることを示す。
【０００９】
もう一つ別の態様は、試験化合物が、アンドロゲンレセプターシグナル化経路よりもβ−カテニン−Ｗｎｔシグナル化経路を選択的に調節するかどうか決定する方法であって：
（ａ）β−カテニンとのＡＲ性相互作用を阻害することにより、遺伝子の発現を増加または減少させる試験化合物を同定し（ここで、試験化合物は、アンドロゲン−ＡＲ性転写を抑制することなく、Ｗｎｔシグナル化に対するアンドロゲン−リガンド型ＡＲ抑制を除去する）；
（ｂ）試験化合物が、β−カテニン非依存性アンドロゲンレセプターシグナル化経路による遺伝子発現を増加させるか、または減少させるかを決定するために、（ａ）の試験化合物を分析することを含む方法に関し、
これにより、試験化合物がアンドロゲンレセプターシグナル化経路により遺伝子の発現を増加または減少させないならば、アンドロゲン−リガンド型ＡＲのβ−カテニンと相互作用する能力を阻害することにより、（ａ）の試験化合物はβ−カテニン−Ｗｎｔシグナル化経路を選択的に調節する。
【００１０】
さらに別の態様は、試験化合物が、β−カテニン−Ｗｎｔシグナル化経路よりもアンドロゲンレセプターシグナル化経路を選択的に調節するかどうかを決定する方法であって：
（ａ）アンドロゲンレセプターシグナル化経路により遺伝子の発現を増加または減少させる試験化合物を同定し；そして
（ｂ）試験化合物が、アンドロゲン−リガンド型ＡＲまたは非リガンド型ＡＲのβ−カテニン／Ｗｎｔシグナル化を阻害する能力を増加させるか、または減少させるかを決定するために、（ａ）の試験化合物を分析することを含む方法に関し；
これにより、（ａ）の試験化合物は、Ｗｎｔシグナル化のアンドロゲン−リガンド型ＡＲ抑制を除去することなくアンドロゲンレセプターシグナル化経路を選択的に調節するか、またはＡＲ作用物質の不在下で、ＡＲとβ−カテニンの間の相互作用を促進せず、その結果、β−カテニン−Ｗｎｔシグナル化経路により調節された遺伝子の発現の増加または減少において活性を有さない試験化合物が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
出願者らは、特に、本開示において言及される全ての文献の全内容を組み入れる。さらに、量、濃度、あるいは他の値またはパラメータが範囲、好ましい範囲、あるいは好ましい上限値および好ましい下限値のリストのいずれかとして与えられる場合、これは、範囲が別に開示されているかどうかに関係なく、任意の上限または好ましい値および任意の下限または好ましい値の任意の対から形成される全ての範囲を具体的に開示すると理解するべきである。数値の範囲が本明細書において記載されている場合、特に記載しない限り、この範囲は、その終点、ならびにこの範囲内の全ての整数および有理数を含むことが意図される。本発明の範囲は、ある範囲が規定されている場合に、記載された特定の値に限定されることを意図されない。
【００１２】
本発明は、ＡＲとβ−カテニン間のアンドロゲン依存性相互作用を評価し、ｉ）β−カテニンと融合したＤＮＡ結合ドメインを含むハイブリッドタンパク質をエンコードするＤＮＡを含む第一ＤＮＡ配列、ｉｉ）（ｉ）のＤＮＡ結合ドメインを認識できる上流活性化配列を含む第二ＤＮＡ配列であって、レポーター遺伝子と操作可能に結合したもの；およびｉｉｉ）ＡＲタンパク質をエンコードする第三ＤＮＡ配列を利用する。本発明の方法は、試験化合物を、ＤＮＡ配列ｉ、ｉｉおよびｉｉｉを含み、任意にアンドロゲンの存在下で発現できる細胞に提供して、試験化合物が、レポーター遺伝子の発現の検出により測定される、β−カテニンとアンドロゲンレセプターのアンドロゲンにより刺激される相互作用を調節できるかどうかを決定することを含む。レポーター遺伝子の発現が、試験化合物を細胞に添加することにより影響を受けないならば、このような化合物は、β−カテニンのアンドロゲンレセプターとのアンドロゲン依存性相互作用を調節できない。好ましい態様において、（ｉ）のＤＮＡ結合ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインを含み；（ｉｉ）のレポーター遺伝子に操作可能に結合した上流活性化配列はＧＡＬ−４−ＵＡＳであり；レポーター遺伝子はルシフェラーゼである。本発明の最も好ましい実施形態において、複数の上流活性化配列のコピーは、レポーター遺伝子と操作可能に結合し、ＤＮＡ結合ドメインと融合した（ｉ）のβ−カテニンはヒトβ−カテニンのアミノ酸２〜４２４を含む。
【００１３】
出願者らは、その分析法が、ＡＲとβ−カテニンの間のアンドロゲン依存性相互作用の選択的測定であることを証明した。一般に、スクリーニング様式において、本発明のＤＮＡ配列で形質転換された細胞をアンドロゲン、例えば、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）で処理し、これは、ＡＲとβ−カテニンの間の相互作用を引き起こし、その結果、レポーター活性が増大する。レポーター活性を低下させる分子を同定することができ、ＡＲおよび、リガンド型ＡＲと結合し、転写の活性化または阻害を引き起こすＤＮＡ反応コンセンサスエレメント間の相互作用を妨害するその能力についての二次分析においてさらに分析することができる。このスクリーンにおいて、この方法により同定される分子は、男性ホルモン性脱毛症、前立腺癌、および多嚢胞性卵巣症候群におけるインスリン感受性の治療法として特に有用であり得る。
【００１４】
出願者らの分析法は、フィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ）ら（６，７）（ＤＮＡ結合ドメインと融合したタンパク質を含む１つのハイブリッド、および転写活性化ドメインと融合したタンパク質を含む第二ハイブリッドを使用する）の２ハイブリッド結合分析に類似している。しかしながら、現行の１ハイブリッド結合分析は、ＡＲとβ−カテニンの相互作用を妨害することができ、これによりβ−カテニンのＡＲシグナル化に対する影響およびＡＲのβ−カテニンおよびＷｎｔシグナル化に対する影響を特異的に除去する分子の同定が好ましい点で異なる。さらに、好ましい態様において、β−カテニンコーディング配列の一部のみがＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４  ＤＢＤ）と融合している。本分析法は、完全長野生型ＡＲを利用するので、全ＡＲタンパク質をターゲティングに利用可能であり、試験化合物は融合構造物によりＡＲと結合することを妨害されない。対照的に、２ハイブリッド分析法（６，７）において、２つの組み換え融合タンパク質構造物の使用は、標的タンパク質の天然の構造が融合構造物において変更されているという欠点を有する。
【００１５】
本発明の分析法は、例えば、十分に特徴づけられ、広く用いられるＣＶ−１細胞（アフリカミドリザル腎臓細胞系）またはＣＯＳ細胞（アフリカミドリザル腎臓細胞系）において行うことができるが、当業者は、他の細胞系も好適であることを認識するであろう。
【００１６】
本発明のさらに別の態様は、試験化合物が、β−カテニン−Ｗｎｔシグナル化経路をアンドロゲンレセプターシグナル化経路よりも選択的に調節するかどうかを決定する方法についてである。この方法において、試験化合物はβ−カテニン−Ｗｎｔシグナル化経路のアンドロゲン−ＡＲによる抑制を調節することにより遺伝子の発現を増加または減少させるその能力に基づいて同定される。「β−カテニン−Ｗｎｔシグナル化経路のアンドロゲンリガンドアンドロゲンレセプターによる調節」は本明細書において用いられるように、アンドロゲンレセプター／β−カテニン相互作用により開始されるＷｎｔによるシグナル化経路により調節される任意の遺伝子の転写の増加または減少をもたらすシグナル化経路を意味する（例えば、Ｍｕｌｈｏｌｌａｎｄ  ＤＪ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７：１７９３３−４３  （２００２）；  Ｙａｎｇ  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７：１１３３６−４４  （２００２）；  Ｓｏｎｇ  Ｌ−Ｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２３：１６７４−８７  （２００３）参照）。
【００１７】
アンドロゲンレセプターのβ−カテニンとの相互作用を評価する方法は、ＡＲおよびβ−カテニンの相互作用を調節することにより遺伝子の発現を増加または減少させることができ、その結果、β−カテニン−Ｗｎｔシグナル化経路に対するアンドロゲン−ＡＲによる抑制の抑制または阻害をもたらす試験化合物を同定するために優先的に使用される。細胞型特異性に関連して、ＡＲとβ−カテニン間の相互作用は、Ｗｎｔシグナル化またはＡＲによるシグナル化に対してプラスの効果を有し得る。この実施形態において、ＡＲ−β−カテニン相互作用のプラスのレギュレーターは、Ｗｎｔアクチベーターとして生じるであろう。
【００１８】
アンドロゲン−リガンド型ＡＲの、β−カテニン−Ｗｎｔ転写シグナル化を調節する能力にプラスまたはマイナスの影響を及ぼす試験化合物を次に分析して、試験化合物がアンドロゲンレセプターシグナル化経路により遺伝子の発現を増加させるか、または減少させるかを決定した。「アンドロゲンレセプターシグナル化経路」または「ＡＲシグナル化経路」は、本明細書において用いられる場合、アンドロゲンレセプターの伝統的な転写経路を意味する。リガンド結合に反応して、アンドロゲンレセプターは細胞の核に移動し、ここでホモダイマーを形成する。ホモダイマーとしてアンドロゲン反応性エレメント（ＡＲＥ）と結合すると、作用物質結合ＡＲは、ＧＲＩＰ１／ＴＩＦ２、ＣＢＰ／ｐ３００、および他のコアクチベーターを含む大酵素コアクチベーター複合体を補充することにより、転写を刺激する。加えて、リガンド結合ＡＲは、ＡＰ１、ＮＦ−κＢ、およびＥｔｓファミリーなどの転写因子複合体とのタンパク質−タンパク質相互作用により転写を抑制することもできる。
【００１９】
当業者は、ＡＲシグナル化経路評価が本発明において有用であることを認識するであろう。
【００２０】
天然の内因性または外因性アンドロゲンの存在下または不在下で、アンドロゲンシグナル化経路により遺伝子の発現を増加または減少させない試験化合物は、β−カテニン−Ｗｎｔシグナル化経路を選択的に調節する。「遺伝子の発現を増加または減少させない」とは、当業者に公知の分析技術、例えば、ノザン・ブロッティング、ウェスタン・ブロッティング、サザン・ブロッティング、プラスミドレポーター分析、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、あるいはアンドロゲンまたはβ−カテニンにより調節されることが知られているインビボ（動物）臓器系形態または機能において全体的な変化を観察することにより、遺伝子発現の増加または減少が観察されないことを意味する。アンドロゲンの公知動物モデル効果の一例は、齧歯類／哺乳動物における前立腺増殖／重量に対するＡＲモジュレーターおよびＷｎｔモジュレーターの効果であり、ここで、ＡＲ作用物質は前立腺細胞増殖および臓器重量を増大させ、ＡＲ拮抗物質は、アンドロゲンのこの効果を阻害する。
【００２１】
別の実施形態は、試験化合物がアンドロゲンレセプターシグナル化経路をβ−カテニン−Ｗｎｔシグナル化経路よりも選択的に調節するかどうかを決定する方法についてである。この方法において、試験化合物は、当業者に周知の方法により、アンドロゲンレセプターシグナル化経路により遺伝子の発現を増加または減少させるその能力に基づいて同定される。ＡＲシグナル化に対してプラスまたはマイナスの影響を及ぼす試験化合物を次いで分析して、この試験化合物が、前記のようなＡＲによるβ−カテニン−Ｗｎｔシグナル化経路により、遺伝子の発現を増加させるか、または減少させるかを決定する。
【００２２】
出願者らの開示に関連して、用語は、特に記載しない限り、慣習的な技術的意味を有する。いくつかの用語および本発明の態様を以下でさらに説明する。
【００２３】
「アンドロゲンレセプター」または「ＡＲ」なる用語は、活性または天然の構造におけるその保存アミノ酸コーディング配列により規定されるＡＲタンパク質を意味する。
【００２４】
「ハイブリッド形成」は、１以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合により安定化される複合体を形成する反応を包含する。水素結合は、ワトソン−クリック塩基対合、Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ結合、または任意の他の配列特異的方法で起こり得る。複合体は、二本鎖構造を形成する２つのストランド、マルチストランド複合体を形成する３以上のストランド、１つの自己ハイブリッド形成ストランド、またはこれらの任意の組み合わせを含む。ハイブリッド形成反応は、ＰＣＲ反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的開裂などの、より広範囲のプロセスにおける工程を構成する。
【００２５】
ハイブリッド形成反応は、異なる「ストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」の条件下で行うことができる。ハイブリッド形成反応のストリンジェンシーは、任意の２つの核酸分子が互いにハイブリッド形成する困難さを包含する。ストリンジェントな条件下で、互いに少なくとも６５％、７０％、７５％またはそれ以上の同一性を有する核酸分子は、互いにハイブリッド形成したままであり、一方、低パーセントの同一性を有する分子はハイブリッド形成したままでいることができない。非常にストリンジェントなハイブリッド形成条件の好ましい非制限的例は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃でハイブリッド形成し、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、５０℃、好ましくは５５℃、さらに好ましくは６０℃、なおいっそう好ましくは６５℃で１回以上洗浄することである。
【００２６】
ハイブリッド形成は、２つの一本鎖ポリヌクレオチド間の逆平行構造において起こり、この反応は「アニーリング」と呼ばれ、これらのポリヌクレオチドは「相補性である」と記載される。二本鎖ポリヌクレオチドは、ハイブリッド形成が第一ポリヌクレオチドおよび第二ポリヌクレオチドのストランドの１つの間で生じ得るならば、別のポリヌクレオチドと「相補性」または「相同性」であり得る。「相補性」または相同性は、一般に承認されている塩基対合則にしたがって、互いに水素結合すると予想される、相対するストランドにおける塩基の割合について定量化できる。
【００２７】
「β−カテニン」なる用語は、例えば、ヒトタンパク質において、７８１アミノ酸を含む完全長タンパク質および、例えば、図６（配列番号１）において開示されるような、β−カテニンアミノ酸配列のフラグメントも包含するために使用される。タンパク質の好ましい形態は、特に、約１〜約４２３のアミノ酸を包含する。他の実施形態において、β−カテニンタンパク質は、配列番号１において示されるアミノ酸配列またはその一部分と、少なくとも６５％、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、さらに好ましくは９０％、そしてなおいっそう好ましくは、９５％のアミノ酸同一性を有する。
【００２８】
もう一つ別の実施形態において、「β−カテニン」なる用語は、配列番号１のアミノ酸配列、あるいはそのフラグメントまたは補体をエンコードするポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成するポリヌクレオチドによりエンコードされる、完全長タンパク質またはそのフラグメントを包含するために使用される。好ましくは、条件は、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも約７０％、さらに好ましくは、少なくとも約８０％、なおいっそう好ましくは、少なくとも約８５％または９０％互いに相同性である配列が、典型的には互いにハイブリッド形成したままであるようなものである。好ましくは、ストリンジェントな条件下で、配列番号１のアミノ酸配列あるいはそのフラグメントまたは相補体をエンコードするポリヌクレオチド配列とハイブリッド形成するβ−カテニンポリヌクレオチドは天然に存在する核酸分子に対応する。
【００２９】
集団において存在し得るβ−カテニン配列の天然に存在する対立遺伝子変異体に加えて、当業者は、さらに、例えば、配列番号１のアミノ酸配列をエンコードするポリヌクレオチド配列における突然変異により、小さな変化を導入でき、これによりβ−カテニンタンパク質の機能的活性を変更することなく、エンコードされたタンパク質のアミノ酸配列における変化に至ることを理解するであろう。例えば、「非必須」アミノ酸残基でのアミノ酸置換に至るヌクレオチド置換は、配列番号１のアミノ酸配列をエンコードするポリヌクレオチドにおいて調製することができる。「非必須」アミノ酸残基は、β−カテニンポリヌクレオチドの野生型配列（例えば、配列番号１のアミノ酸配列をエンコードするポリヌクレオチド）から、β−カテニン分子の機能的活性を変更することなく、変更できる。非必須であり、従って置換を受けやすい残基の例は、当業者により、β−カテニン関連分子のアミノ酸位置合わせを行い、保存されない残基を決定することにより同定できる。このような残基は、保存されなかったので、より置換を受けやすい。
【００３０】
したがって、「β−カテニン」なる用語は、β−カテニン活性について必須でないアミノ酸残基において変化を含有する、β−カテニンタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドにも関する。このようなβ−カテニンタンパク質は、依然として本来のβ−カテニン活性を保持する配列番号１のアミノ酸配列において異なる。β−カテニンタンパク質の非天然変異体をエンコードする、単離されたポリヌクレオチドは、１以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失を、配列番号１のアミノ酸配列をエンコードするポリヌクレオチド配列中に導入して、１以上のアミノ酸置換、付加、または欠失がエンコードされたタンパク質中に導入されるようにすることにより、形成できる。突然変異は、標準的技術、例えば、部位指向性突然変異誘発およびＰＣＲによる突然変異誘発により、配列番号１中に導入することができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、１以上の非必須アミノ酸残基で行われる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野において定義され、例えば、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分岐鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を包含する。したがって、β−カテニンポリペプチド中の非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換されている。
【００３１】
別法として、別の実施形態において、突然変異は、例えば、飽和突然変異誘発などにより、β−カテニンコーディング配列の全部または一部にそってランダムに導入することができる。
【００３２】
「β−カテニンのＮＨ３−末端領域」なる用語は、アミノ酸１からアンドロゲンレセプターと相互作用できるβ−カテニンのアルマジロ繰り返し領域までの任意の連続したアミノ酸配列を含む。従って、ＮＨ３−末端領域は、例えば、アミノ酸１〜アミノ酸４２４、アミノ酸２〜アミノ酸４２４、アミノ酸３〜アミノ酸４２４、アミノ酸１〜アミノ酸４２３、アミノ酸２〜４２３、アミノ酸３〜４２３などを含む。ＮＨ３−末端領域は好ましくは、β−カテニンのアルマジロ反復配列１−６、さらに好ましくは、β−カテニンのアルマジロ反復配列１−７、なおいっそう好ましくは、β−カテニンのアルマジロ反復配列１−１２を含む。もう一つ別の好ましい実施形態において、ＮＨ３−末端領域は、ヒトβ−カテニンのアミノ酸２〜４２４を含む。ＮＨ３−末端領域は、アルマジロ繰り返し領域のみからのアミノ酸配列を含み得る。β−カテニンのＣ−末端領域の少なくとも一部と接触しているＮＨ３−末端領域アミノ酸配列を含む実施形態も、β−カテニンのＣ末端トランス活性化ドメインが不活性である限り、想定される。アミノ酸の保存的置換、欠失、または挿入も、β−カテニンとアンドロゲンレセプター間の相互作用が保持される限り想定される。
【００３３】
典型的な置換としては、例えば、アミノ酸の、類似した電荷、疎水性、または電気化学的特性を有するアミノ酸での置換が挙げられる。例えば、「保存的アミノ酸置換」は、この位置でのアミノ酸残基の極性または電荷に対してほとんどまたは全く影響がないような、天然のアミノ酸残基の非天然残基での置換を含む。所望のアミノ酸置換（保存的または非保存的に関係なく）は、当業者により、かかる置換が望ましい時点で決定することができる。例えば、アミノ酸置換は、分子配列の重要な残基を同定するために、あるいは本明細書において記載された分子の親和性を増加または減少させるために使用できる。ある実施形態において、保存的アミノ酸置換は、典型的には、生物学的系における合成よりも化学ペプチド合成により組み入れられる、天然に存在しないアミノ酸残基も包含する。
【００３４】
「アンドロゲンレセプターとの相互作用」なる用語は、ＡＲのリガンド結合ドメインとβ−カテニンのアルマジロ領域間のタンパク質−タンパク質相互作用を意味する。これらの２つのタンパク質間の相互作用は、ＡＲに対するアンドロゲン結合により刺激されるＡＲタンパク質二次／三次構造における変化により引き起こされる。
【００３５】
「調節」なる用語は、活性における減少または増加のいずれかを包含し；例えば、試験化合物は、本発明の分析においてかかる試験化合物が存在する結果、ルシフェラーゼ遺伝子の発現が減少または増加するならば、アンドロゲンレセプターとβ−カテニンの間の相互作用を調節すると考えることができる。
【００３６】
「ＤＮＡ結合ドメイン」なる用語は、配列特異的な方法で、その保存された上流活性化配列（特異的ヌクレオチド配列を含有する「ＤＮＡ反応エレメント」またはタンパク質ＤＮＡ結合ドメインにより認識される「認識配列」とも呼ばれる）と結合する保存ＤＮＡ結合モチーフを有する任意のタンパク質結合ドメインを表す。ＤＮＡ反応エレメントはレポータープラスミド中に配置され、ＤＮＡ反応エレメントと結合するタンパク質は、タンパク質−タンパク質相互作用によりレポーターと近接した転写アクチベーターと結合でき、その結果、レポーター転写が活性化される。
【００３７】
「上流活性化配列」または「ＵＡＳ」なる用語は、β−カテニンとの融合タンパク質として分析において使用するために選択された、ＤＮＡ結合ドメインと結合できる任意のＤＮＡ配列を包含する。
【００３８】
「レポーター遺伝子」なる用語は、検出でき、定量化できるタンパク質またはアミノ酸配列を発現できる任意の遺伝子コーディング配列を説明するために、当該分野において一般的に知られている方法で使用される。本発明の分析において使用できる周知のレポーター遺伝子産生の例は、例えば、酵素ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアクチルトランスフェラーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼを包含する。当業者は、多くの他の好適なレポーター遺伝子を知っているであろう。
【００３９】
「試験化合物」なる用語は、既知の化学構造を有するが、既知の機能または生物学的活性を有する必要はない化合物を包含する。試験化合物はさらに、未確認の構造を有するか、または、例えば、植物抽出物などの粗生物サンプルからの未知の化合物の混合物であってもよい。多数の化合物を、精製化合物の集団または様々な供給源からの粗抽出物の集団をさす「化学ライブラリー」からランダムにスクリーンすることができる。化学ライブラリーは、化学的に合成されたか、または天然の産物から精製された化合物を含有し得る。化合物は、無機または有機小分子またはより大きな有機化合物、例えば、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、ステロイド、脂質、リン脂質、核酸、およびリポタンパク質を含むことができる。試験される化合物の量は、化学ライブラリーに応じて変化し得るが、精製（相同性）化合物ライブラリーに関しては、１０μＭが、典型的には試験される最高の初回量である。
【００４０】
試験化合物を細胞に導入する方法は、当該分野において周知である。
【００４１】
「アンドロゲン」なる用語は、アンドロゲン活性を有するすべての公知化合物を包含する。化合物のアンドロゲン活性は、細胞ベースのＡＲ転写分析を包含する様々な方法において、および化合物が公知アンドロゲンの活性と類似した活性を有することが証明できる生物学的活性分析において決定することができる。これらの分析は、動物または組織を用いて行うことができる。例えば、前立腺においてアンドロゲン活性を有する化合物は、齧歯類において前立腺増殖を刺激できる。天然のアンドロゲン代謝物であって、生物学的活性を有するものを使用でき、例えば、テストステロン、アンドロステンジオン、アンドロスタンジオン、およびジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）を包含し、ＤＨＴが特に好ましい。
【００４２】
分析は、アンドロゲンの幅広い濃度範囲に寛容である。好ましい態様において、ＤＨＴ用量は、化合物をスクリーンするために１ｎＭである。０．１から１０ｎＭの間のアンドロゲンを初回量として用いて、細胞系における分析を最適化することができる。
【００４３】
アンドロゲンの不在下で、本発明の分析は、ＡＲとβ−カテニンの間の相互作用を刺激する化合物を同定するためにも使用できる。例えば、ＤＨＴと類似した活性を有する化合物は、ＡＲおよびβ−カテニン間の相互作用の刺激によりレポーター活性を活性化する。
【００４４】
「操作可能に結合した」なる用語は、核酸分子、すなわち、ＤＮＡ、および１以上の調節配列（例えば、プロモーターまたはその部分）が、核酸分子からのｍＲＮＡの転写を許容するか、または、適切な分子が調節配列と結合している場合に、核酸分子の産物（すなわち、ポリペプチド）の発現を許容するような方法で結合していることを意味する。
【００４５】
「発現構築物」なる用語は、ＲＮＡ、例えば、興味のある下流遺伝子またはコーディング領域（例えば、ｃＤＮＡまたはタンパク質をエンコードするゲノムＤＮＡフラグメント、あるいは興味のある任意のＲＮＡ）と操作可能に結合した少なくとも１つのプロモーターを含有する構築物を転写するために設計された二本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＲＮＡを意味する。発現構築物の受容細胞へのトランスフェクションまたは形質転換は、細胞がＲＮＡまたは発現構築物によりエンコードされるタンパク質を発現することを可能にする。発現構築物は、遺伝子組み換えプラスミド、ウイルス、あるいは、例えば、バクテリオファージ、アデノウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、またはヘルペスウイルス由来の人工染色体であるか、あるいは下記の「発現ベクター」で記載されるさらなる実施形態であってよい。発現構築物は、生細胞において複製できるか、または合成的に調製できる。本出願の目的に関して、「発現構築物」、「発現構築物」、「発現ベクター」、「ベクター」、および「プラスミド」なる用語はほとんど同じ意味で用いられて、本発明の用途は、一般に例示的な意味で、本発明を特定の種類の発現構築物に限定されることを意図しないことを示す。さらに、発現構築物またはベクターなる用語は、分析に用いられる細胞が、かかるＤＮＡ配列をすでに内因的に含む場合も包含することを意図する。
【００４６】
本明細書において用いられる場合、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」なる用語は、ほぼ同じ意味で使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、あるいはその類似体の、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を包含する。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し、既知または未知の任意の機能を果たす。以下は、ポリヌクレオチドの非制限的例である：遺伝子または遺伝子フラグメント、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含み得る。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマー構築の前または後に付与できる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断され得る。ポリヌクレオチドは重合後、標識成分との結合などにより、さらに修飾できる。この用語は、二本鎖分子および一本鎖分子の両方も包含する。特に記載するか、または必要とされない限り、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態および二本鎖形態を構成することが知られているか、または予想される２つの相補一本鎖形態のそれぞれを包含する。
【００４７】
ポリヌクレオチドは、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびポリヌクレオチドがＲＮＡである場合は、グアニンのかわりにウラシル（Ｕ）の特異的配列からなる。従って、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表記である。
【００４８】
「遺伝子」は、転写および翻訳された後に、特定のポリペプチドまたはタンパク質をエンコードできる少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを包含する。本明細書において記載される任意のポリヌクレオチド配列は、これらが関連する遺伝子の大フラグメントまたは完全長コーディング配列を同定するために使用できる。大フラグメント配列の単離法は当業者に公知であり、そのいくつかは本明細書において記載されている。
【００４９】
本明細書において用いられる場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡ中に転写され、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを包含する。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡから誘導されるならば、真核性宿主細胞が選択される場合、適当な発現はｍＲＮＡのスプライシングを含む。発現に必要な調節エレメントは、ＲＮＡポリメラーゼを結合するためのプロモーター配列およびリボソーム結合のための転写開始配列を包含する。例えば、細菌発現ベクターは、プロモーター、例えば、ｌａｃプロモーターを含み、転写開始に関して、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列および開始コドンＡＵＧを含む（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｈ、Ｅ．  Ｆ．、およびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  ２ｎｄ、ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９）。同様に、真核性発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの非相同性または相同性プロモーター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリボソームの分離のための終始コドンを包含する。かかるベクターは、商業的に入手できるか、または当該分野において周知の方法、例えば、一般にベクターの構築について下記の方法に記載されている配列により組み立てることができる。
【００５０】
本発明を以下の実施例においてさらに説明する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示のみのために提示されると理解すべきである。前記論議およびこれらの実施例から、当業者は本発明の好ましい特徴を確認し、その精神および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更および修正を行って、様々な用途および条件に適応させることができる。
【実施例１】
【００５１】
この実施例は、培養された細胞がＧＡＬ４  ＤＮＡ反応エレメント−ルシフェラーゼレポータープラスミド、ヒトβ−カテニンのアミノ酸２〜４２４のｃＤＮＡコーディング領域と融合したＧＡＬ４  ＤＢＤのコーディング領域を発現するプラスミド（ＧＡＬ４−β−カテニン）および完全長野生型ヒトＡＲを発現するプラスミドで形質転換される、好ましい実施形態を説明する（図１）。β−カテニンｃＤＮＡフラグメントは、テンプレートとしてｐｃＤＮＡ３．１β−カテニン発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびそれぞれＢａｍ  ＨＩおよびＸｂａ  Ｉ制限部位を含有する一本鎖ＤＮＡプライマーを用いて、ヒトβ−カテニンからのアミノ酸２〜４２４のＤＮＡコーディング配列のＰＣＲ増幅により調製された。増幅されたＤＮＡフラグメントを、制限酵素Ｂａｍ  ＨＩおよびＸｂａ  Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて直線状にされ、複数のクローニング部位の上流にＧＡＬ４  ＤＢＤのコーディング配列を含有する、ｐＭプラスミドの複数のクローニング部位中に挿入した。５つのＧＡＬ４上流活性化配列（ＵＡＳ）を、ルシフェラーゼのｃＤＮＡコーディング配列を含有するｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にサブクローニングすることにより、レポータープラスミドを調製した。ＡＲ発現ベクターは、Ｌｅｏｎａｒｄ  Ｆｒｅｅｄｍａｎ（Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ）から入手したｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のヒト完全長ＡＲ  ｃＤＮＡであった。ヒトＡＲのｃＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）の遺伝子配列情報ウェブサイト（受入番号Ｍ３５８８４、本発明の一部として参照される）で入手可能である。
【００５２】
ＣＶ−１細胞を９６ウェルプレート上で培養し、２４時間後、リポフェクタミン法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて発現およびレポータープラスミドでトランスフェクトした。この手順において、使用した３つの異なるプラスミド構築物を細胞培養培地およびリポフェクタミン中で混合し、製造業者の指示（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って１５分間インキュベートした。プラスミド−リポフェクタミン混合物を培地中で希釈し、細胞に添加し、４時間インキュベートした。細胞をリンスし、次いで培地で処理した。トランスフェクションの２４時間後、細胞をアンドロゲン作用物質および拮抗物質またはビヒクルで処理した。１８時間後、細胞溶解物を収穫し、ルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）および照度計（Ｗａｌｌａｃ）を用いてルシフェラーゼ活性について分析した。例えば、リン酸カルシウム沈降トランスフェクション技術をはじめとする他の公知トランスフェクション技術を用いることができる。
【００５３】
１ハイブリッド分析において用いられるプラスミド構築物を図１に示す。点線は、１ハイブリッド分析において用いられるタンパク質−タンパク質またはタンパク質−ＤＮＡ相互作用領域を示す。矢印は転写開始部位を示す。
【実施例２】
【００５４】
内因的に両タンパク質を発現する細胞系におけるＡＲおよびβ−カテニン間の相互作用を刺激するかどうかを決定するためにＬ９２９細胞を使用した。内因性ＡＲおよびβ−カテニンを発現するＬ９２９細胞を１０  ｎＭ  ＤＨＴ、３００  ｎＭヒドロキシフルタミド（ｆｌｕｔ）、ＤＨＴ＋ｆｌｕｔ、またはビヒクル（ｖｅｈ）で１７時間処理した。細胞溶解物を収穫し、タンパク質Ａ／Ｇセファロースであらかじめ清澄化し、アガロース（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に対して接合したβ−カテニンに対するヤギポリクローナルＩｇＧを用いてβ−カテニンを免疫沈降させた。免疫沈降物をポリアクリルアミドゲル電気泳動と、続いて必要に応じてＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚから得た抗体を用いてＡＲおよびβ−カテニン（β−ｃａｔ）についてのウェスタン分析により分析した（図２）。１０ｎＭのアンドロゲン作用物質ＤＨＴは、ＡＲおよびβ−カテニン間の相互作用を刺激することが判明した。ＤＨＴの不在下で、これらのタンパク質間に検出可能な相互作用はなかった。細胞をＤＨＴより３０倍過剰のＡＲ拮抗物質ヒドロキシフルタミド（３００  ｎＭ）の存在下で処理する場合、タンパク質−タンパク質相互作用が弱められた（図２）。これらの結果は、ＡＲおよびβ−カテニン相互作用はアンドロゲン作用物質ＤＨＴにより刺激されることを示す。結果は、この相互作用が小分子、例えば、ヒドロキシフルタミドによる妨害を受けやすいことも証明する。
【実施例３】
【００５５】
ＣＶ−１細胞におけるルシフェラーゼ活性についての各発現ベクターの要件を決定するために実験を行った。
【００５６】
本発明の分析は、ＡＲおよびβ−カテニン間のＤＨＴ依存性相互作用を測定することが証明される。５ＸＧＡＬ４−ＵＡＳ  ＤＮＡ反応エレメントの転写制御下でルシフェラーゼ遺伝子を含有するレポータープラスミド（ＧＡＬ４−ルシフェラーゼ）を必要に応じて、アンドロゲンレセプター発現ベクター（ＡＲ）、ＧＡＬ４−ＤＢＤ−β−カテニン融合タンパク質発現ベクター（ＧＡＬ４−β−カテニン）の存在下または不在下でＣＶ−１細胞中にトランスフェクトした。細胞を１  ｎＭ  ＤＨＴ（＋）またはビヒクル（−）で１８時間必要に応じて処理した。細胞溶解物を収穫し、ルシフェラーゼ活性について分析した。ＤＨＴ  （１  ｎＭ）は、ＡＲおよびＧＡＬ４−β−カテニン発現ベクターをどちらも５ＸＧＡＬ４−ルシフェラーゼレポーターで細胞中にトランスフェクトした場合、レポーター活性の大きな活性化を引き起こした（図３）。ＡＲおよびＤＨＴは、レポーター活性に対して、ＧＡＬ４−β−カテニン発現ベクターの不在下で影響を及ぼさず、このことは、ＧＡＬ４  プロモーター−レポーター構築物に対するＡＲおよびＤＨＴの直接的影響がないことを示す（図３）。
【実施例４】
【００５７】
エストロゲンレセプター（ＥＲ）およびプロゲステロンレセプター（ＰＲ）も、そのレポーター活性に対する影響（図４）を測定することによりβ−カテニンとの相互作用をする能力について試験し、β−カテニンと核レセプター間のタンパク質−タンパク質相互作用は、ＡＲについて特異的であることが示された。ＣＶ−１細胞を５ＸＧＡＬ４−ルシフェラーゼレポーターおよびＧＡＬ４−β−カテニン発現プラスミドで、核レセプター発現ベクターの不在下（−）で、ＡＲ、ＰＲ、またはＥＲ発現プラスミドでトランスフェクトした。細胞を１８時間、ビヒクル、１０ｎｍ  ＤＨＴ、１０ｎＭトリメゲストン（Ｔｒｉｍ）、または１０  ｎＭ  １７β−エストラジオール（Ｅ２）で必要に応じて処理した。細胞溶解物を収穫し、ルシフェラーゼ活性について分析した。ＥＲおよびＰＲレセプターはトリメゲストン、１７β−エストラジオール、またはＤＨＴの存在下、１ハイブリッド分析において活性を有さなかった。ＤＨＴをＡＲ発現細胞に添加した場合、レポーター活性において大きな増加があったが、１０  ｎＭ  １７β−エストラジオールまたはトリメゲストンに関してはなかった。これらの結果は、ＥＲおよびＰＲと比較した場合、ＡＲについて特異性であるらしい核レセプターと、この分析におけるβ−カテニンの相互作用を示す。
【実施例５】
【００５８】
本出願者らの分析が、ＡＲおよびβ−カテニンのＤＨＴ依存性相互作用を妨害する化合物を同定する可能性を有するかどうかを決定するために、酢酸シプロテロン（ＣＡ）、ＡＲ拮抗物質の影響を、ＤＨＴの存在下で試験した（図５）。
【００５９】
ＣＶ−１細胞を、図１に記載されたＡＲおよびＧＡＬ４−β−カテニン発現およびルシフェラーゼレポータープラスミドでトランスフェクトした。細胞を１８時間１  ｎＭ  ＤＨＴあり（＋）またはなし（−）、表示された濃度のＡＲ拮抗物質、酢酸シプロテロンで処理した。細胞溶解物を収穫し、ルシフェラーゼ活性について試験した。ＤＨＴにより刺激されたＡＲおよびβ−カテニン間の相互作用は、ＡＲ拮抗物質、酢酸シプロテロンにより阻害される。ＣＡの不在下で、１ｎＭのＤＨＴは、レポーター活性の大きな活性化を引き起こした。ＤＨＴのこの効果は、１から１０００  ｎＭの間のＣＡにより用量依存的に阻止された（図５）。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明の一実施形態において用いられるプラスミド構築物を表す。
【図２】ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）がＬ９２９細胞においてＡＲとβ−カテニンの間の相互作用を刺激することを示すウェスタンブロットである。
【図３】本発明の方法が、ＡＲとβ−カテニンの間のＤＨＴ依存性相互作用を測定することを示す棒グラフである。
【図４】β−カテニンと核レセプターの間のタンパク質−タンパク質相互作用がＡＲについて特異的であることを示す棒グラフである。
【図５】ＤＨＴにより刺激されたＡＲとβ−カテニンの間の相互作用は、ＡＲ拮抗物質酢酸シプロテロンにより阻害されることを示すグラフである。
【図６】ヒトβ−カテニンのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号２２０８３３２Ａ；配列番号１）を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年1月17日(2008.1.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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