(57)【要約】  DNA断片が大規模並列合成操作で共通の基板上に作製でき、続いて基板から前記断片を放出し、前記断片を標的DNA分子に構築することは、すでに開示されている。ここでは、DNA１次構成物が十分に長く、適切に設計されている場合、１次構成物のコピー数が１次構成物の両端で鋳型領域として使用されるPCRプロセスによって必要とされる程度に増幅されることを教示する。フランキング領域と呼ばれる末端領域は、またそれらが増幅産物から容易に切断できるように設計できる。次いで、標的DNAは、切断された断片から構築できる。数十万のオリゴヌクレオチドは、このプロセスによって、相対的に早く、かつ、効率のよいプロセスで、多くの異なる別個の遺伝子に合成及び構築できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む標的DNA配列の製造方法：
（ａ）複数の１本鎖DNA１次構成物を同時に合成する工程、ここで各１次構成物は、内部領域とこの内部領域に隣接するフランキング領域とを含み、各フランキング領域は、内部領域とフランキング領域との各接合部で１次構成物を切断する制限酵素のための認識部位を含む；
（ｂ）１次構成物のフランキング領域に位置づけられるプライマーを用いて１次構成物についてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を行うことによって、複数の１次構成物を増幅して増幅された１次構成物のプールを生成する工程；
（ｃ）１次構成物の増幅プールを制限酵素で消化して増幅された構成物の前記プールの内部領域をフランキング領域から切断する工程；及び
（ｄ）ポリメラーゼ及びdNTPを工程（ｃ）の生成物に添加し、変性、アニーリング及び伸長手順を繰り返し行って伸長した生成物から標的配列を構築することによって、標的配列の構築を行う工程。
【請求項２】
自動遺伝子合成機を用いて共通の基板上のマイクロアレイにおいて１本鎖DNAプローブとして１次構成物を構成し、次いで前記基板から１次構成物を分離することによって、工程（ａ）が実施される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
すべての１次構成物の末端にあるフランキング領域が同じであり、工程（ｂ）において、一組のPCRプライマーが１次構成物のすべてを増幅するために使用される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
工程（ｃ）で使用する制限酵素がMly Iである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）が複数の異なる組のプライマーを用いて複数回実施される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
工程（ｃ）が複数の異なる制限酵素を用いて複数回実施される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
２つを除く１次構成物のそれぞれについて、１次構成物の内部領域を２つに分けた半分の配列について、その配列が別の１次構成物の内部領域の半分の配列に相補的である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
さらに、生成した最も長いDNA分子を、工程（ｄ）の生成物から単離する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
以下の工程を含む標的DNA配列の製造方法：
（ａ）複数の１本鎖DNA１次構成物をマイクロアレイで同時に合成する工程、ここで各１次構成物は長さが少なくとも70ヌクレオチドであり、少なくとも40ヌクレオチドの内部領域とこの内部領域に隣接するフランキング領域とを含み、各フランキング領域は、少なくとも15ヌクレオチドの領域であって、内部領域とフランキング領域との各接合部で１次構成物を切断する制限酵素のための認識部位を含む；
（ｂ）１次構成物のフランキング領域に位置づけられるプライマーを用いて１次構成物についてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を行うことによって、複数の１次構成物を増幅して増幅された１次構成物のプールを生成する工程；
（ｃ）増幅された１次構成物のプールを制限酵素で消化して増幅された構成物の前記プールの内部領域をフランキング領域から切断する工程；及び
（ｄ）ポリメラーゼ及びdNTPを工程（ｃ）の生成物に添加し、変性、アニーリング及び伸長手順を繰り返し行って伸長した生成物から標的配列を構築することによって、標的配列の構築を行う工程。
【請求項１０】
自動遺伝子合成機を用いて共通の基板上のマイクロアレイにおいて１本鎖DNAプローブとして１次構成物を構成し、次いで前記基板から１次構成物を分離することによって、工程（ａ）が実施される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
すべての１次構成物の末端にあるフランキング領域が同じであり、工程（ｂ）において、一組のPCRプライマーが１次構成物のすべてを増幅するために使用される、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｃ）で使用する制限酵素がMly Iである、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）が複数の異なる組のプライマーを用いて複数回実施される、請求項９記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｃ）が複数の異なる制限酵素を用いて複数回実施される、請求項９記載の方法。
【請求項１５】
２つを除く１次構成物のそれぞれについて、１次構成物の内部領域を２つに分けた半分の配列について、その配列が別の１次構成物の内部領域の半分の配列に相補的である、請求項９記載の方法。
【請求項１６】
さらに、生成した最も長いDNA分子を、工程（ｄ）の生成物から単離する工程を含む、請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連特許）
本件出願は、2004年６月９日に出願された米国仮特許出願第60/578195号の優先権を主張するものである。
（合衆国政府によって委託された研究又は開発に関する説明）
本発明は、次の機関：DOD ARPA DAAD19-02-2-0026によって与えられた合衆国政府補助によってなされた。合衆国は、この発明において一定の権利を有する。
（発明の背景）
本発明は、分子生物学の分野に関するものであり、定義された又は所望の配列のDNA分子の製造のための技術及び装置に関するものである。DNA分子のエキソビボ製造は、任意の所望のペプチド、タンパク質若しくはタンパク質の構築又は核酸の組合せ（所望されている場合）を合成するために、及び生体において種々の遺伝学に関する実験を行うためにインビボで前記DNA分子を使用することを可能にする。
【背景技術】
【０００２】
現代のバイオテクノロジーでは、化学的に、すなわち生体から離れてDNA配列を生成することが一般的である。DNA配列は、無細胞技術を用いてインビトロで構築及び複製されており、最終的に生物学的な目的のために生体に挿入できるDNA配列に組み換えられ、又は再構築される。個々のヌクレオシドから直接短いDNA配列（オリゴヌクレオチドと呼ばれる）を合成すること、及びより小さいオリゴヌクレオチドからより大きなDNA配列を構成することは、一般的である。
また、より小さいが、適切に設計された多くのDNA分子を同時に製造し、次いで前記より小さな分子（又は断片）が自己組織化して、より長いオリゴヌクレオチドを製造することを可能にすることによって、より大きなDNA分子を生成できることが提案されている。これは、国際公開第99/42813号パンフレットに開示されたタイプのマスクレスアレイ合成（MAS）機を用いて大規模並列合成操作で多量の１本鎖DNA配列を生成することによって、最も有利に行うことができる。こうして生成された１本鎖DNA配列は、次いで構築され、はるかに大きなDNA断片をアニール及び形成することを可能にする基板から切断できる。この方法及びその操作の一般的な原理は、公開されたPCT出願PCT/US02/15951に記載されている（その開示は、参照により本明細書に組み込まれるものとする）。この方法について、特に興味のあるMAS機器の特有の性質は、アレイに付着したオリゴヌクレオチドが非常に長い（60〜100ヌクレオチド程度）マイクロアレイを生成できることである。この種類のマイクロアレイ装置のみが、マイクロアレイにおいてこの長さのオリゴヌクレオチドの合成を可能にすると考えられている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
これらの方法は、MASタイプの機器の大規模並列合成能力を用いて、長いDNA断片の合成を可能にするが、前記公開されたPCT出願に記載された方法には１つの欠点がある。他の手順を含まないで、この合成によって構築されるDNAの量は、相対的に少ない。DNAの量は、物理的に測定することが困難である程度に少ないが、約20ピコモルのDNAは、MAS機器で製造される典型的なDNAマイクロアレイで合成されると考えられる。DNAの量が少ないという事実は、物理的な取り扱い及びDNAの増幅を相対的に複雑な手順にする。DNAは、DNAが大抵のDNA反応条件と一致する濃度で取り扱われる場合に、その容量が大抵の液体取り扱い操作における取り扱いに適している容量よりもはるかに少なくなるような少量となる。逆に言えば、その溶液が適度な容量に希釈される場合、DNA分子は、DNAを変化させ、操作するために使用される正常な酵素及び他の媒介物がDNAの希釈のために使用することが困難であるように溶液中で希釈される。したがって、DNA断片の大規模並列合成方法は、方法論がそのような方法の生成物であるDNAの量を劇的に増加させるために存在する場合、改善されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要約）
本発明は、標的DNA配列の製造方法において概要を述べる。前記方法は、多量の１本鎖DNA１次構成物を同時に合成する工程により始まり、各１次構成物は内部領域とこの内部領域の両端にあるフランキング領域とを含み、各フランキング領域は、内部領域とフランキング領域との各接合部で１次構成物を切断する制限酵素のための認識部位を含む。次の工程は、１次構成物のフランキング領域に位置づけられるプライマーを用いて１次構成物についてPCR反応を行うことによって、１次構成物を増幅し、増幅された１次構成物のプールを生成する。次の工程は、増幅された１次構成物のプールを制限酵素で消化して増幅した構成物の前記プールの内部領域を、フランキング領域から切断することである。最後に、ポリメラーゼ及びdNTPを先の工程の生成物に添加し、変性、アニーリング及び伸長手順を繰り返し行って伸長した生成物から標的配列を構築することによって、標的配列の構築を行う。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の目的は、小さい断片の大規模並列化学合成及び続く小さい断片をより大きなDNA配列に構築することによって、DNA配列の合成方法を本質的に改善することである。
本発明の方法の利点は、DNA構築手順で利用可能なDNAの量を増加させるために合成されたDNAのコピーの数の増幅を可能にする点である。
本発明の他の目的、利点及び特徴は、本明細書の記載から明らかとなるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、大規模並列DNA合成操作において構成されるオリゴヌクレオチドの収量を増加させる方法に関するものである。前記方法は、相対的に長いオリゴヌクレオチド（本明細書において、１次構成物と呼ぶ）の合成を可能にする１本鎖DNA並列合成技術で最もよく使用される。１次構成物は、典型的には70mers又はそれよりも長いオーダーである１本鎖DNA分子（マイクロアレイで製造される典型的なオリゴヌクレオチドよりも長い）である。本発明の概念を理解するために、１次構成物の一般的な配列を図１に示す（例示的であるが、任意のDAN配列）。各１次構成物は、内部領域（図１に40merであることが示されている）及び２つのフランキング領域（それぞれ、図１に15merとして示される）から構成される。１次構成物の内部領域は、構成される標的DNA配列に組み込むことを目的としたDNA配列である。フランキング領域は、１次配列において機能的であることを目的とした領域であり、PCRプライマー部位及び制限酵素認識部位の両方を含み、そのため１次構成物を増幅し、次いでフランキング領域を切断することができる（以下により詳細に説明される）。この方法の中核となる考えは、基板から１次構成物を分離することに続いて、１本鎖１次構成物の混合プールを生成することであり、１次構成物のすべてについてフランキング領域におけるプライマー領域を認識するプライマーを用いてPCR反応を行うことである。これは、多数の１次構成物のそれぞれのコピー数を同時に増幅する。次いで、増幅された１次構成物は、制限酵素によりすべて消化され、フランキング領域を切断する。この時点で、内部領域（40mers）は、独立して放出され、標的DNAの構築において使用できる。
【０００７】
本明細書に記載される方法の理解を容易にするために、本明細書において共通の用語の一貫した使用が適切である。本明細書において、「標的配列」は、最終的なDNA構成物を意味し、その合成は、本明細書の全方法の目的である。「自動遺伝子合成機」すなわち「AGS」機器は、典型的には共通の基板上で（必ずしもこれに限られないが）多くの異なるオリゴヌクレオチドを同時に製造できる機器を意味する。「１次構成物」は、自動遺伝子合成機によって生成され、溶液中に放出される１本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。「内部領域」及び「フランキング領域」は、１次構成物の領域である（本明細書に示される）。構築方法は、前記内部領域から標的配列を構築するために使用される方法論を意味する。
標的配列を構成する方法は、自動遺伝子合成機から始める。この機器は、大規模並列DNA合成方法において、多量の１本鎖DNA分子を化学的に合成することを目的とした装置である。１本の長い１本鎖DNA（60mersよりも長い）を生成できる今日使用されている、商業的に使用されるDNAマイクロアレイ合成機は、すべてこの目的に適合できる。DNAマイクロアレイは、市販されており、その業界では、会社による特注である。しかしながら、好ましいアプローチは、特に米国特許第6375903号明細書に記載されているタイプの機器を使用することである（その開示は、参照により本明細書に組み込まれるものとする）。本来はDNAマイクロアレイを製造するために設計されたこのタイプの機器は、個々の特注及び固有のマイクロアレイを製造するためにコンピュータ制御のもとでマイクロミラーデバイスを使用する。機器及びそれによって使用される化学は、１本鎖オリゴヌクレオチドの製造が、このタイプの機器が786000個の異なるオリゴヌクレオチド（それぞれ長さが最大100ヌクレオチド又はそれを超える）を同時に、かつ、およそ数時間ですべて製造できる程度に効率的であるように最適化できる。マイクロアレイの各製造は、それがコンピュータ制御のもとにあるため、固有であり、カスタマイズされている。前記機器は、１日当たり複数のマイクロアレイを製造することを可能にし、それぞれ個々に設計及びカスタマイズされる。これは、本明細書に記載されている方法のための自動遺伝子合成機として使用されるのに適している技術である。そのような機器によって合成されるマイクロアレイは、結果として共通の基板上に固定される同様の１本鎖オリゴヌクレオチドの多くの別個のグループとなる。本明細書の方法において１次構成物として前記オリゴヌクレオチドを使用するために、前記オリゴヌクレオチドは、基板から分離され、こうして溶液中で遊離した、この方法で使用される１次構成物を製造する。基板からのこの分離は、単にオリゴヌクレオチドと基板との間の塩基又は酸に不安定な結合を用い、次いで塩基又は酸を用いて１次構成物を放出することによって行うことができる。
【０００８】
本発明の方法全体の記載に戻ると、１次構成物は、自動遺伝子合成機を用いて同時に合成され、次いで１次構成物は、基板から切断される。先に簡単に述べたように、１次構成物は特別な性質を有する。生成される各１次構成物は、その両端に２つのフランキング領域を有し、その内部に内部領域を有する。内部領域の配列は、標的DNAの配列によって決定され、DNA構成物は、本発明の方法全体で製造される。内部配列は、PCT/US02/15951（上記参照により本明細書に組み込まれている）の開示においてDNA分子断片と呼ばれる配列の機能を与える。こうして各内部領域は、標的配列全体の一部を構成し、各内部領域は、他の１次構成物における２つの他の内部領域の一部に相補的である。フランキング領域が２つの重要な特性を有するように設計される配列を有することは、考慮されている。その１つは、フランキング領域がPCRプライマーのためのプライマー認識部位を含んでいることである。もう１つは、フランキング領域がII型制限酵素、すなわちその認識部位ではない切断部位でDNA配列を切断する制限酵素のための切断認識部位を含んでいることである。これも、図１に示される。ここで留意すべきは、図１の例示的な１次構成物は、各フランキング領域に配列GAGTCを含むことである。これは、制限酵素Mly Iのための認識部位である。制限酵素Mly Iの切断部位は、また図１に示され、ここで留意すべきは、この部位は、認識部位から数塩基離れていることである。これと同じ概念は、酵素の認識部位内ではなく、酵素の認識部位に隣接した部位でDNAを切断する任意の制限酵素で使用できる。Mly Iは、２本鎖DNAのその切断が結果として平滑末端を生じるために、好ましい。
【０００９】
かさねて、本発明の方法は、自動遺伝子合成機での１次構成物の合成及び基板からの１次構成物の放出から始める。この時点で、１本鎖DNA分子の溶液が得られるが、少量の分子が製造される。本発明の方法の次工程は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）DNA増幅反応を行うことである。PCR反応を実施するための手順は、技術的に周知である。PCR増幅で使用されるプライマーは、１次構成物のフランキング領域におけるプライマー認識部位に結合するように選択される。PCR反応を複数回行い、こうして１次構成物のコピー数を、コピー数が本発明の方法の残りの工程に便利であるように増幅する。１次構成物のすべてについてフランキング領域が同じであるため、１次構成物のすべては、ほぼ同じ割合で増幅される。この発想は変更を加えてもよい。１つの変更は、基板から回収されるプールされた１次構成物のすべての単一増幅が得られるように、すべてのPCRプライマー及びすべての１次構成物について同じである認識部位に関するものであることが考えられる。他の変更は、単にその特定のサブセット又はグループを標的とするPCRプライマーを用いることによって１次構成物のサブセット又はグループの選択的増幅を可能にするPCRプライマーの組又はグループ及び認識部位を有することである。
【００１０】
この時点で予想されるように、増幅工程後、本発明の方法の次工程は、制限酵素を使用して１次構成物からフランキング領域を切断することである。増幅された１次構成物のプール全体は、一緒に完全に消化される。かさねて、認識部位と異なる部位でDNAを切断するII型制限酵素が好ましい。図１の例を参照すると、Mly I酵素は、フランキング領域におけるモチーフGAGTCを認識し、認識部位のC塩基から５塩基ずれた位置で分子を切断する。Mly Iの使用は、切断後、平滑末端を残すために、好ましい。これは、明らかに１次構成物のフランキング領域全体を切断して内部領域のみを残す。BciVI、BmrI、FauI、BsrDI、AlwI及びPleIなどの多くの他の適した制限酵素を使用してもよいが、これらの分子は、オーバーハングが内部領域又はフランキング領域にあることを意図するか否かに応じて、切断されるか、又は補体と一致していなければならないオーバーハングしている塩基を残してもよい。この工程の結果は、DNA断片のプールであり、内部領域の各大きさである。前記プールは、初期のプール又は１次構成物において示された各内部領域の複数のコピーを含む。
ここで留意すべきは、MAS又はAGS機器の使用がオリゴヌクレオチドの前記配列を可能にするので、それは完全に調整可能な構成物であることである。したがって、各内部領域の前記配列は、完全に選択可能であり、本発明の方法を始める前にユーザーによって正確に定義できる。ここで、こうして製造した構成物の前記プールは、標的配列への構築のためにユーザーによって選択される配列から構成される内部領域の増幅されたプールからなる。
【００１１】
前記内部領域が前記フランキング領域から切断されると、切断された断片は分離でき、それは、いくつかのDNA分離技術のいずれかによって行うことができる。しかしながら、以下の実施例から明らかになるように、この段階で任意の分離を行うことは必ずしも必要ではない。代わりに、ここで、独立した内部領域は、構築プロセスを始めることができる。PCT/US02/15951に記載される方法のように、内部領域のDNA配列は、それぞれプール中の他種の内部領域中の配列と相補的である。しかしながら、公開されたPCT出願における情況とは異なり、前記構築プロセスは、ここから２本鎖（１本鎖ではない）DNA分子のプールにより始める。そのため、本明細書に記載した方法においては、構築プロセスは、反応中のDNAポリメラーゼでの、一連の変性、アニーリング及び伸長工程によって補助されることが好ましい。換言すれば、前記プロセスは、PCR反応と同様であるが、新しいプライマーを添加せず、そのため増幅は起こらない。各アニーリング及び伸長工程において何が起こっているか考える。内部領域はその補体を見つけるので、いくつかの40merの内部領域はその正確な40mer補体と一致するが、次いでそのアニーリングによって生成される２本鎖DNA分子はDNAポリメラーゼによって影響されないであろう。他の内部領域は、ほんの一部（すなわち、標的配列の構築における第１工程）で第１内部領域と重複する異なる内部領域とハイブリダイズするであろう。それが生じる場合、こうして生成された複合体は、部分的に２本鎖であり、かつ、部分的に１本鎖であり、DNAポリメラーゼは、両１本鎖の補体をその端部に加える。40merであり、20塩基で別の40merと重複する内部領域の例において、２つのハイブリダイズした鎖は、それぞれ２本鎖60merを生成するように伸長された鎖を有するであろう。このプロセスは、次いで何度も繰り返すことができ、前記プロセスにおいて、より長い構築された分子を生じ、最終的には全長標的分子を生じる。このプロセスによって生成される最も長い分子は、所望の適した標的配列であろう。
【００１２】
なぜフランキング領域がPCRプライマー部位を含むのかと思うかもしれない。すべてのDNAを増幅することを意図する一般化されたPCRプライマーのためのキットを購入できる。しかしながら、この方法は、PCRバイアスに供され、そこでは、いくつかの配列が他のものよりも良く増幅するかもしれない。共通の反応において増幅されるフランキング領域のすべてにおいて共通のPCRプライマーを用いることによって、前記増幅プロセスにおけるバイアスの可能性が最小化される。また、バイアスは、たとえそれらは配列が異なっていても、同じ長さ（例えば、40塩基対）である内部領域配列をすべて有することによって低減される。
【実施例】
【００１３】
（実施例）
（１次構成物の合成）
自動遺伝子合成機（AGS-1）を用いて２つの60merのオリゴヌクレオチドを含むチップを塩基に不安定なリンカーに作製した。増幅及び続く遺伝子構築のために、１次構成物オリゴヌクレオチドを設計し、そしてそれは、制限部位（Mly I；GAGTC(N)5）を含む(2)フランキング15merプライマー部位及び続く遺伝子構築で使用される内部30mer断片からなる。
生成後、30分間NH4OHでマイクロアレイ全体を処理することによって、１次生成物オリゴヌクレオチドをマイクロアレイから切断した。次いで、得られた溶液をマイクロアレイの基板から除去して、チューブに移し、16時間放置して塩基保護基の除去を可能にした。次いで、前記溶液を高速真空遠心分離機において乾燥させ、続いて沈殿を５μlの滅菌ミリＱ水に懸濁した。
制限酵素部位（Mly I）を含む２つの15merのPCRプライマーを用い、Pfuポリメラーゼの存在下でのPCR増幅のために、マイクロアレイ溶出液アリコート（0.2μl）を用いた。増幅生成物を、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて32Pで標識化し、1XTBE 20％PAGE Ureaゲルでのゲル電気泳動によって分析した。1500Ｖでの１時間の電気泳動後、前記ゲルをホスフォイメージャーカセットに置き、STORM Molecular Dynamicsシステムを用いてスキャンした。結果は、意図したDNAの回収を示した。
モノヒドロキシシランスライドを用いること及びそのスライドの表面からオリゴヌクレオチドを切断するためにNH4OHで60分間そのスライドを処理することを除いて、上述のとおりに、これと同じプロセスを、うまく繰り返した。これは、このプロセスが複数のタイプの表面で成功することを示すために行った。
【００１４】
（100bpの配列の合成及び構築）
自動遺伝子合成機（AGS-1）を用いて４つの70merのオリゴヌクレオチドを含むチップを塩基に不安定なリンカーに作製した。かさねて、増幅及び続く遺伝子構築のために、１次構成物オリゴヌクレオチドを設計し、そしてそれは、制限部位（Mly I；GAGTC(N)5）を含む(2)フランキング15merプライマー部位及び続く遺伝子構築で使用される内部40mer断片からなる。４つの１次構成物の配列は、以下の通りである。
【化１】
2008502367.tif 000002
【００１５】
上で示した配列では、内部領域は小文字であり、フランキング領域は大文字である。Mly Iの認識部位には、下線が付されている。Mly Iの切断部位は大文字と小文字の間である。ここで留意すべきは、フランキング領域は、各１次構成物で同一であることである。また、留意すべきは、40F1aの内部領域の3'側半分は、40Rev9bの内部領域の3'側半分と相補的である。40Rev9bの内部領域の5'側半分は、40Rev9aの内部領域の5'側半分と相補的であり、49Rev9aの内部領域の3'側半分は、40F2aの内部領域の3'側半分と相補的である。40F1a及び40Rev9aの内部領域の5'末端は一致しない。
マイクロアレイでの生成後、30分間NH4OHで処理して、１次構成物オリゴヌクレオチドをマイクロアレイの基板から切断した。次いで、溶液をマイクロアレイから除去し、チューブに移し、16時間放置して塩基保護基の除去を可能にした。次いで、溶出液を高速真空遠心分離機で乾燥させ、続いて沈殿を５μlの滅菌ミリＱ水に懸濁し、遺伝子構築で使用した。
制限酵素部位（Mly I）を含む２つの15merのPCRプライマーでのPCR増幅で、チップ溶出液アリコート（0.2μl）を用いた。PCR増幅後、生成物を、制限エンドヌクレアーゼMly Iで一晩消化して、すべてのDNA鎖についてすべてのフランキング領域を除去し、４つの40merの内部領域の複数のコピーを残した。次いで、未精製の制限酵素消化物断片を続く遺伝子構築及び増幅反応で用いた。
初期標的配列構築は、反応において消化されたPCR生成物及びPfuポリメラーゼの画分、バッファー、及びdNTPを混合し、遺伝子断片を変性、アニール及び伸長することを繰り返すことによって行った。次いで、構築された配列を、Pfuポリメラーゼの存在下でのPCRにより増幅し、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて32Pで標識化し、1XTBE 20％PAGE Ureaゲルでのゲル電気泳動によって分析した。1500Ｖでの１時間の電気泳動後、前記ゲルをホスフォイメージャーカセットに置き、STORM Molecular Dynamicsシステムを用いてスキャンした。前記ゲル上の100bpのDNA断片の構築が注目される。この断片は、内部領域の構築及びポリメラーゼによる伸長から生じる標的配列のみであった。
【００１６】
（180bpの配列の合成及び構築）
自動遺伝子合成機（AGS-1）を用いて８つの異なる70merのオリゴヌクレオチドプライマー構成物を含むチップをモノヒドロキシシランスライドに作製した。増幅及び続く遺伝子構築のために、オリゴヌクレオチド１次構成物を設計し、それぞれ15merのプライマー部位及び制限部位（Mly I；GAGTC(N)5）を含む(2)フランキング領域（そのすべてが同一である）からなる。また、各１次構成物は、続く遺伝子構築で使用される40merの内部領域を含む。６つの１次構成物について、その内部領域の各半分は、別の１次構成物の内部領域の１つの半分と相補的である。２つの１次構成物は、その領域の１つの半分についてのみ、別の１次構成物の内部領域と相補的である内部領域を有する。
使用されるこのチップの周囲に品質管理標的を含めて、オリゴヌクレオチド合成の品質を評価した。こうして、このチップについて、合成後のプロセスは、チップ上のオリゴから側鎖保護基を除去するためのEDA/EtOH中への２時間の浸漬、QC標的のcy3標識化補体による45℃で２時間のハイブリダイゼーション、合成結果の確認のためのスキャン、75℃で30分間の変性によるQC標識化プローブの除去、及びNH4OHで１時間の標準的な切断とその後直ちにスピードバック（speedvac）で乾燥することからなる（側鎖保護基はあらかじめ２時間のEDA/EtOH浸漬で除去されているので、16時間の脱保護は必ずしも必要ではない）。続いて沈殿を５μlの滅菌ミリＱ水に懸濁し、遺伝子構築で使用した。
制限酵素部位（Mly I）を含む２つの15merのPCRプライマーでのPCR増幅で、チップ溶出液アリコート（0.3μl）を用いた。PCR増幅後、生成物を、Mly Iで一晩消化して、フランキング領域を除去し、４つの40merの構築内部領域を残した。次いで、未精製の制限酵素消化物断片を続く遺伝子構築及び増幅反応で用いた。オリゴの数を増やして構築をうまく行うために、多量の未精製制限酵素で消化したDNAが構築反応で必要となることが分かった。
Pfuポリメラーゼにより消化したPCR生成物の画分、バッファー及びdNTPを反応容器で混合し、遺伝子断片の変性、アニール及び伸長を繰り返することにより、初期遺伝子構築を行った。他のプライマーは加えなかった。次いで、PfuポリメラーゼでのPCRによって、構築された配列を増幅し、3.5％のアガロース1XTBEゲルでのゲル電気泳動により分析した。110Ｖで45分間の電気泳動後、ゲルを臭化エチジウムで染色し、分析した。ゲルは、予想される180塩基対のDNA生成物を示した。
【００１７】
（340bpの配列の合成及び構築）
上述の方法を用いて、340塩基対のDNA配列の構築を、１次構成物として16の１次オリゴヌクレオチド構成物により行い、PCR反応のために４つの異なるプライマーセットを用いた。
【００１８】
（100の異なるプライマーセットを用いた400の配列の合成及び増幅）
上述の自動遺伝子合成機（AGS）を用いて、700の異なる１本鎖DNA配列（それぞれ長さが70ヌクレオチド（70mer））を含むマイクロアレイを作製した。各70merは、最終構成物のための40merの内部領域及びプライマー部位を含む２つのフランキング15merを含む。400の配列は、４オリゴの100セットからなり、各セットは特有のプライマー部位対を用いる。これらのサブセットを次いでそれぞれのプライマーセットで増幅し、結果物をゲル上で移動させた。ゲルは、100のオリゴヌクレオチドのそれぞれについて、予想される70merのバンドを示した。オリゴのサブセット（４オリゴの８セット）を、次いで既に記載した方法を用いて構築し、結果物をゲルにより分析した。ゲルは、８セットのそれぞれについて、100merの消費されたバンドを示した。これは、前記方法が多量のプライマーセットで同時に使用できることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明で使用する可能な１次構成物のDNA配列を示す。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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