(57)【要約】  本発明は、HIV-特異的な遺伝子治療のためのベクターコンストラクトに関する。導入遺伝子の発現は、HIVでの細胞の感染と関連しており、導入遺伝子の転写は、HIVに由来する転写制御領域による制御される。加えて、導入遺伝子は、ヌクレオチド配列を改変することによって、RNA安定性および発現効率に関して改良されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
改善した誘導性遺伝子発現のための方法であって、
(i)発現させる標的核酸配列を提供すること、
(ii)発現の増加を達成するように、発現させる標的核酸配列を改変すること、
(iii)誘導性転写制御配列と、改変した標的核酸配列とを操作可能に連結すること、
(iv)適切な発現システムにおいて、トランス活性因子によって、改変した標的核酸配列を発現すること、
を含む方法。
【請求項２】
前記誘導性転写制御配列のために、天然の誘導性ウイルスプロモーターまたは人工的な誘導性プロモーターを使用する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記誘導性転写制御配列が、ウイルスの転写制御配列、特に、以下のウイルス：レトロウイルス、HCV、HBV、HSV、EBV、SV40、AAV、アデノウイルス、パピローマウイルス、エボラウイルスの転写制御配列から選択される、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
トランス活性因子としてのレトロウイルスTatまたはTaxタンパク質により誘導することができる誘導性転写制御配列を使用する、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記発現させる標的核酸配列のコドン使用頻度を、発現システムに適合させる、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記コドン使用頻度を、哺乳類のコドン使用頻度に適合させる、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記コドン使用頻度を、ヒトのコドン使用頻度に適合させる、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記発現させる標的核酸配列のGC含量を、発現システムのGC含量に適合させる、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記発現させる標的核酸配列のGC含量を、哺乳類のGC含量について最適化させる、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記発現させる標的核酸配列における転写に負の影響を与えるモチーフを除去する、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記発現させる標的核酸配列の改変を、対応するアミノ酸配列を実質的に変更すること無しに実施する、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
治療用および/または診断用タンパク質をコードする、発現させる核酸標的配列を使用する、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記治療用および/または診断用タンパク質が、毒性遺伝子産物、自殺因子、アポトーシス誘導タンパク質、メッセンジャー物質、トランス活性因子、レギュレータータンパク質、トランスドミナント-ネガティブ タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、インターフェロンα、RANTES、MIP1α、TNF、チミジンキナーゼ、ヌクレアーゼ、FAS、FASリガンド、カスパーゼおよび転写因子から選択される、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
ウイルスのトランスドミナント-ネガティブ（TDN）タンパク質をコードする、発現させる核酸標的配列を使用する、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
レトロウイルスのTDNタンパク質をコードする、発現させる核酸標的配列を使用する、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
Gag、Env、Tat、Rev、Nef、Vpr、Vpv、リバーストランスクリプターゼ、プロテアーゼおよびインテグラーゼからなる群から選択されるレンチウイルスのTDNタンパク質をコードする、発現させる核酸標的配列を使用する、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
真核細胞において、レンチウイルスのトランスドミナント-ネガティブ（TDN）タンパク質の発現のための、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法であって、
(a)レンチウイルスのTDNタンパク質をコードし、そのコドン使用頻度を哺乳類のコドン使用頻度に適合させた、発現させる標的核酸配列と、標的核酸配列と操作可能に連結しており、レンチウイルスのTatタンパク質によって誘導されるプロモーター配列とを含むベクターを、真核細胞に導入すること、
(b)前記標的核酸配列の発現を誘導するように、Tatタンパク質を提供すること、
を含む方法。
【請求項１８】
(a)発現させる標的核酸配列、
(b)発現させる標的核酸配列と操作可能に組み合わせた、トランス活性因子によって誘導される転写制御配列、
を含む核酸ベクターであって、前記(a)の配列が、発現の増加が達成されるように、核酸レベルで改変されている核酸ベクター。
【請求項１９】
前記(a)の配列が、対応するアミノ酸配列を変更しないように改変されている、請求項18に記載のベクター。
【請求項２０】
前記(a)の配列のコドン使用頻度を、哺乳類のコドン使用頻度に適合させる、請求項18または19に記載のベクター。
【請求項２１】
前記(a)の配列が、そのGC含量を哺乳類のGC含量について最適化させるように改変されている、請求項18から20のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２２】
前記(a)の配列が、そのGC含量をヒトのGC含量について最適化させるように改変されている、請求項21に記載のベクター。
【請求項２３】
前記(a)の配列が、治療用タンパク質および/または診断用タンパク質および/またはウイルスのトランスドミナント-ネガティブ（TDN）タンパク質、特にレンチウイルスのTDNタンパク質をコードする、請求項18から22のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２４】
前記治療用および/または診断用タンパク質が、毒性遺伝子産物、自殺因子、アポトーシス誘導タンパク質、メッセンジャー物質、トランス活性因子、レギュレータータンパク質、トランスドミナント-ネガティブ タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、インターフェロンα、RANTES、MIP1α、TNF、チミジンキナーゼ、ヌクレアーゼ、FAS、FASリガンド、カスパーゼおよび転写因子から選択される、請求項23に記載のベクター。
【請求項２５】
前記ウイルスのTDNタンパク質が、Gag、Env、Tat、Rev、Nef、Vpv、Vpu、リバーストランスクリプターゼ、プロテアーゼおよびインテグラーゼからなる群から選択される、請求項23に記載のベクター。
【請求項２６】
前記レンチウイルスのTDNタンパク質が、Gagタンパク質である、請求項25に記載のベクター。
【請求項２７】
前記レンチウイルスのTDNタンパク質が、p24領域が欠失したGagタンパク質である、請求項25または26に記載のベクター。
【請求項２８】
前記(a)の配列が、配列番号1、16および18の配列を含む、請求項18から27のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２９】
前記プロモーター配列が、レンチウイルスのLTR配列またはその機能的な部分配列である、請求項18から28のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項３０】
そのコドン使用頻度を哺乳類のコドン使用頻度に適合させたタンパク質コード領域において、1つまたは複数のサイレント変異を含む改変したゲノムを含む、改変したレンチウイルス。
【請求項３１】
請求項18から30のいずれか一項に記載のベクターまたは改変したレンチウイルスを含む細胞。
【請求項３２】
活性物質として、請求項18から31のいずれか一項に記載のベクター、改変したレンチウイルスまたは細胞を含む医薬。
【請求項３３】
請求項18から31のいずれか一項に記載のベクターおよび/または改変したレンチウイルスおよび/または細胞の、遺伝子治療および/または診断目的の医薬の製造のための使用。
【請求項３４】
レトロウイルス感染における遺伝子治療および/または診断のための、請求項33に記載の使用。
【請求項３５】
レンチウイルス感染の治療および/または診断のための、請求項33に記載の使用。
【請求項３６】
HIV感染の治療および/または診断のための、請求項33に記載の使用。
【請求項３７】
HIVに感染したヒトに由来するPMLのex vivo形質導入のための、請求項33に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、誘導性遺伝子発現のための方法であって、発現させる標的核酸配列が、発現の増加が達成されるように核酸レベルで改変され、このように改変された核酸配列を、誘導性転写制御配列の制御下で発現させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くのタイプのウイルスが、完全にはスプライシングされていない転写産物を、感染した宿主細胞の細胞核から能動的に輸送している。これは、ウイルス転写産物におけるシス位のRNAシグナル（構成的な輸送エレメント）の使用を介して生じるか、あるいは、ウイルスのタンパク質の利用により生じる。
【０００３】
シス活性輸送エレメントは、例えば、MPMV-CTE（Mason-Pfizer Monkey Virusの構成的な輸送エレメント）、SRV-CTE（Simian Retrovirusの構成的な輸送エレメント）、B型肝炎ウイルスPRE（転写後調節エレメント）およびHSV（Herpes Simplex Virus）（TK（チミジンキナーゼ）遺伝子における）から由来して使用する。これらのRNAエレメントは、細胞因子および排出経路を補強し、ウイルス転写産物の核外輸送を可能とする。
【０００４】
代替手段として、ウイルスの転写産物内の標的配列に特異的に結合し、細胞因子と協働してこれらを細胞質へと輸送する輸送因子を介しても、核外輸送を行なうことができる。それ故、例えば、Ad-5（アデノウイルス5）転写産物は、34KおよびE4orf6タンパク質の協力により輸送され、EBV（エプスタイン-バー ウイルス）転写産物は、EB2タンパク質の協力により輸送され、リスザルのヘルペスウイルスの転写産物は、ORF 57遺伝子産物の協力により輸送され、HSV転写産物は、ICP 27タンパク質の協力により輸送され、HTLV-1およびII（ヒトT-細胞白血病ウイルスIおよびII）転写産物は、Rexタンパク質の協力により輸送され、EIAV(ウマ伝染性貧血ウイルス)、SIV（リスザル免疫不全ウイルス）ならびにHIV-1およびHIV-2（ヒト免疫不全ウイルス1および2）転写産物は、Revタンパク質の協力により輸送される。
【０００５】
HIV-1転写産物のRev媒介性核外輸送は、最も研究されている。全てのレンチウイルスのように、HIV-1は、たった1つのプロウイルスマトリクスから幾つかの遺伝子を活性化し、特定の順番でそれらを発現させる。代替的なスプライシング、および、RNAレベルで生じる更なる調節機構によって、異なる遺伝子が、たった1つの〜9kb長の一次転写産物から産生される。これらのウイルス転写産物は、大きさにより3つのクラスに更に分けることができる、すなわち、〜9kbのスプライシングを受けていないRNA（gag、pol）、〜4kbの一回スプライシングを受けたRNA（env、vif、vrp、vpu）および〜2kbの複数回スプライシングを受けたRNA(rev、tat、nef)。
【０００６】
不完全に複数回スプライシングを受けた転写産物な発生は別として、これら異なるRNA種の発現の時間系列も観察することができる。それ故、感染した細胞の細胞質における複製の早期段階では、複数回スプライシングを受けた〜2kb RNA、ならびにその遺伝子産物Rev、TatおよびNefのみを検出することができる。時間が経過した後にのみ、スプライシングを受けていない（〜9kb）転写産物および一回スプライシングを受けた（〜4kb）転写産物、ならびにそれらの遺伝子産物Gag、PolおよびEnvが観察される。
【０００７】
活性なRevタンパク質を欠失したウイルス変異体に感染した細胞においては、一回スプライシングを受けた転写産物およびスプライシングを受けていない転写産物を検出することができるが、細胞質内では決して検出されない。その場合、スプライシングを受けていない転写産物および一回スプライシングを受けた転写産物は、核に蓄積され、それらを翻訳した構造タンパク質（Gag、Env）および酵素（Pol）を形成することができない。それ故、ウイルスのRevタンパク質は、ウイルス遺伝子の時間制御発現に必須に関与している。
【０００８】
前記したRNA輸送分子と同類であるHIV-1 Revは、ウイルスの転写産物内に位置するRNA標的配列との相互作用を介して、ウイルスRNAを核から細胞質へと輸送するシャトルタンパク質である。それ故、HIV-1 Revは、核内で、そのRNAの標的構造であるRRE、すなわち「Rev-responsive-element」に特異的に結合する。この351ヌクレオチド（nt）長の領域は、Envのリーディングフレームに位置し、それ故、スプライシングを受けていない全ての転写産物および一回スプライシングを受けた全ての転写産物の構成要素である。このリボヌクレオタンパク質（RNP）複合体は、その後、細胞因子との相互作用を介して細胞核から輸送される。この目的のために、C末端に位置するロイシンリッチな配列（核外輸送配列NESとして、細胞内機構を使用して、Revタンパク質の核移行を媒介する）が必要である（Pollard et al., 1998）。
【０００９】
Revの不存在下で後期転写産物が核内に残る（このことは、Rev依存のための必須の前提条件であり、それ故、gag、polおよびenvの時間で調節された発現のための必須の前提条件である）理由は、未だに争点となっている。特に、後期転写産物の核内の保持に関して2つの主な代替案が存在する。
【００１０】
細胞の転写産物は、スプライシング工程が完全に行われ、全ての活性スプライシング部位が一次転写産物から取り除かれることができた時にのみ、細胞核を離れることができると推測される。後期ウイルス転写産物は、イントロンを含む不完全にスプライシングされたpre-mRNAである。このpre-mRNAは、RevおよびRREの協力により細胞質へと輸送される。この理由のために、後期転写産物の核内保持に対する細胞内スプライシング機構の影響を、始めのころに調査された（Mikaelian et al., 1996）（Kjems et al., 1991; Kjems et al., 1993; Chang et al., 1989; Powell et al., 1997; Lu et al., 1990; O’Reilly et al., 1995）。様々な活性スプライシング部位が存在するために、HIV-1転写産物のスプライシング工程は、次善の策としてのみ生じると考えられている。それ故、研究者の幾つかのグループからは、Revにより、不十分なスプライシング複合体の形成が原因で、スプライシング機構において維持することができる転写産物の輸送を可能となることが示唆されている。
【００１１】
一方、しかしながら、例えばenvなどの後期HIV-1遺伝子が、活性スプライシング部位が存在しない場合でも、その発現を抑制し続けることが示されており、それ故、スプライシング機構の影響は、より間接的であると考えられている（Nasioulas et al., 1994）。この理由のために、発現に対してマイナスに影響を与える、リーディングフレーム中のいわゆる阻害配列（INS）またはシス活性リプレッサーエレメント（CRS）が仮説として考えられている（Nasioulas et al., 1994; Olsen et al., 1992; Schwartz et al., 1992b; Maldarelli et al., 1991）。しかしながら、コードmRNA内に存在するこれらのリプレッサー配列は、例えば不安定なGM-CSF mRNAの3’-UTRにおけるAUUUA不安定モチーフのような、共通の配列モチーフも有していない（Chen et al., 1995）が、常に高いA/U含量については注目すべきである。それ故、後期遺伝子（gagおよびenvなど）のリーディングフレームに由来する、仮説として考えられるINS含有断片の、CAT-レポーターシステムとの融合により、レポーター活性の減少がもたらされた（Cochrane et al., 1991; Rosen et al. 1988）。このgagおよびpolの発現の減少は、ある程度、「ゆらぎ（wobble）」部位における複数の点変異によって、再び取り消すことができた（Schwartz et al., 1992a, Schneider et al., 1997）。それ故、スプライシングを受けないHIV-1 mRNAおよび一回スプライシングを受けたHIV-1 mRNAは、シス活性リプレッサーエレメント、すなわち、複数回スプライシングを受けることによって取り除かれるか、または、Rev/RRE-媒介性核外輸送によって克服するシス活性リプレッサーエレメントを含むと思われる。
【００１２】
HIV転写産物のRev依存性を迂回するための洗練された方法が、前記したように、HIV遺伝子のリーディングフレームの部分的変化の形態で、SchwartzおよびSchneiderによって開発された。このコンセプトの結果として生じる改良により、合成オリゴヌクレオチドを用いた、コドン-最適化HIV-gag-pol遺伝子の合成が導かれた（Wagner et al., 2000; Graf et al., 2000）。このタイプのG/C含量および哺乳類細胞のコドン使用頻度の適合によって、哺乳類において、多量のGag-Polポリタンパク質の構成的な合成が可能となった。このようにタンパク質合成をRev依存性から脱却させる基本的な機構は、mRNAの核外輸送を変化させることである。HIVの野生型RNAは、HIVシャトルタンパク質Revに依存して、Crmlタンパク質によって特徴付けられる代替的な輸送経路で処理されるが、合成mRNAは、細胞内mRNAについての通常の核外輸送経路により、構成的に細胞質へと輸送される。このHIVタンパク質の構成的な発現により、遺伝子レベルでのHIV治療の新規な方法への展望が開けた。
【００１３】
しかしながら、Graf et al. (2000)による出版物には、トランス活性因子の助けをかりた誘導が可能である遺伝子発現についての方法は開示されていない。
【００１４】
前記したGraf et al.のように、DE 1 053 781 A1も、細胞核から細胞質へのRNA輸送に関する。それ故、この特許出願は、核外輸送を介したリポーター遺伝子の発現を調節することができるために、Revに依存したリポーター遺伝子の調製に関する。
【００１５】
Rev依存性およびRRE依存性は、HIVに基づくベクターの開発に対する制限をもたらすことから、Kotsopoulou et al., (2000)は、コドン-最適化HIV-1-gag-pol遺伝子を合成した。この遺伝子を、哺乳類発現ベクターへと導入し、Rev依存性について調べた。しかしながら、著者らは、トランス活性因子の助けをかりた誘導が可能であるプロモーターは使用していなかった。したがって、本発明による方法は、開示されていない。
【００１６】
細胞内での抗-HIV遺伝子の発現は、HIV複製の細胞内阻害のために有効に使用することができる（Bunnell et al., 1998）。今のところ、特異的にRNAを分解するリボザイムやRNA干渉を介したアンチセンスコンストラクトやRNAデコイから、HIVに由来するトランスドミナントネガティブに働く(transdominant-negative)タンパク質にいたる様々なHIV遺伝子治療方法が開発されている。HIV複製工程での標的化する方法により干渉するこれら細胞内の阻害因子とは別に、遺伝子治療の範囲においては、細胞の再感染または子孫ウイルスの増殖も防ぐことができる。様々なアプローチが、分泌可能な抗-HIVタンパク質の発現、免疫刺激または非特異的抗ウイルス因子に関係しており、そして、特に、感染に続く細胞毒性因子の発現に関係している（概要として、Mautino et al., 2002参照）。
【００１７】
これらのむしろ非特異的な阻害方法とは別に、HIV自身のタンパク質誘導体を使用した非常に特異的な方法でウイルスの放出を防ぐことにより、ウイルス増殖を生じさせることができる。Gagにおける欠失は、子孫ウイルスの新規の形成および放出に対して、トランスドミナントネガティブ（TDN）に働く効果をもたらす（von Poblotzki et al., Trono et al., 1989; Smythe et al., 1994; Furuta et al., 1997）。これらの欠失は、p17MAに、p17MA/p24CAの転移領域に、および、p24CAのC末端ドメインに存在する。トランスドミナントネガティブに働く効果の正確な作用機構は、まだ明らかにされていない。しかしながら、幾つかの証拠は、変異したp24CAのシクロフィリンA結合能力の減少（Chiu et al., 2002）、および、p17MAの欠失による細胞膜から小胞体膜への膜標的の変更（Facke et al., 1993; Gallina et al., 1994; Ono et al., 2004）が示唆されている。Gagは、非常に強固に多重結合しているポリタンパク質であり、正確なクラスタリングは、HIV粒子の正確な形成のために必要であることから（Wilk et al. 2001）、機能的なアセンブリドメイン（p24CAのC-末端ドメイン）を有するTDN Gag欠失誘導体は、野生型Gagタンパク質へと結合することによって、HIVキャプシドのアセンブリを直接的に妨害し、それ故、確実にHIV複製の阻害をもたらすことが明らかである。
【００１８】
しかしながら、特に、最後の方法は、構成的なタンパク質発現に関して幾つかの問題を有する。それ故、外来遺伝子の発現により、細胞毒性、細胞機能の誤った調節、転写調節の減少をもたらすことがあり、そして、特にHIVに由来するタンパク質の場合、望まない免疫応答をもたらすことがある（Smythe et al., 1994）。これらの問題を回避するために、HIV感染に依存した導入遺伝子を発現させるための様々な方法がとられている。
【００１９】
様々なアプローチにおいては、Tat-、Rev-およびTat/Rev-依存性発現が調べられており、幾つかの場合において、HIV複製のin vitro阻害が開示されている（Caruso et al., 1992; Harrison et al., 1992; Liu eu al., 1994）。このことと一致して、チミジンキナーゼの発現（Marcello et al., 1998）およびインターフェロンα2の発現（Ragheb et al., 1999）を、Tatによって、それぞれ5倍および4倍増やすことができ、Revによって、それぞれ3.3倍および<2倍増やすことができる。しかしながら、TatおよびRevを組み合わせた添加によっては、非常に異なる結果が導かれた：チミジンキナーゼの発現は7倍に増えるのに対して、インターフェロンα2については、>300倍の発現増加が報告された。HIV-1 TDN Gag誘導体については、（低い基礎活性を有する）Revが媒介する明確なタンパク質合成の誘導が見出され、これは、HIV複製の広範囲な阻害と関連していた（94%まで）（Smythe et al., 1994; Furuta et al., 1997）。Tat依存的およびRev依存的なTDN Gag発現の組み合わせについて、tat-発現プラスミドおよびrev-発現プラスミドの共トランスフェクションによって、タンパク質合成の急激な増加がもたらされた（Ding et al., 2002; Cara et al., 1998）。しかしながら、HIV複製の阻害が部分的であり（Cara et al., 1998）、様々な阻害方法と組み合わせることによってのみ、阻害が高いレベルで得られる（Ding et al., 2002; Cara et al., 1998）ことが見出された。これとは対照的に、TKなどの自殺遺伝子のLTR/Tat-誘導性発現によって、多くの場合において、ウイルス複製の阻害がもたらされた（Marcello et al., 1998; Miyaka et al., 2001; Ragheb et al., 1999）。
【００２０】
基礎活性については、Rev依存性は、タンパク質合成の完全な防止をもたらさないことが示されている。Revは、細胞核からのRNA輸送に影響を及ぼし、対応するシス活性の残留配列（INS、前記参照）およびシスに位置する認識配列（RRE）と組み合わせた場合にのみ機能的である。単離され、サイズが減少した（それ故、INSのサイズも減少した）Gag遺伝子は、対応する活性なプロモーター（例えば、CMV）の存在下で、効率的に転写され、RNAの特定の部分が細胞質に達し、Revのサポート無しに翻訳されることは明らかである。
【００２１】
LTR/Tatによる制御に関する明白なデータは存在しない。大部分の報告が、LTR制御下での遺伝子の基礎活性を開示している（Caruso et al., 1992; Ding et al., 2002; Muratori et al., 2002; Cara et al. 1998）。Tat不在下でのこの発現についての説明として可能性のあるのは、対応する形質導入された細胞から分泌するTNFαによるLTRプロモーターの活性化（Muratori et al., 2002）、または、HIVに由来するベクターコンストラクトのエレメントの活性化である（Miyake et al., 2001）。
【００２２】
また、使用するLTRの長さが、制御に影響しているかもしれない。それ故、最小のLTRを用いることにより、Tat不在下での完全に転写が停止することが見出された（Miyake et al., 2001）、すなわち、「タイトな」誘導性プロモーターが開示されていた。
【００２３】
それ故、HIV依存的な導入遺伝子発現については、LTR/Tatシステムは、より重要なスイッチ分子であると考えられる；なぜならば、Revによる誘導がTatによる誘導の下流であるからである。Revによる誘導は、導入遺伝子による阻害を生じさせることができる直前に、最初のウイルス増殖がもたらされる。それ故、とりわけ、観察されたRev誘導後の複製の不完全な阻害が、説明される（Smythe et al., 1994）。
【００２４】
しかしながら、トランスドミナントネガティブに働く（TDN）Gag誘導体のTat-誘導性発現については、自殺遺伝子とは対照的に、HIV複製の十分な阻害が、いまでに検出されていない（前記参照）。これには、以下の様々な説明が考えられる：
i)TDNの作用が、TDNタンパク質の量と相関している、すなわち、有効な介入を達成するためには、ある限界を超えなければならない。しかしながら、タンパク質の量は、大部分は、プロモーター活性に依存する。高い活性のウイルスプロモーター（例えばCMV SV40）と比較して、プロモーター活性は、HIV-1 LTRにおいては比較的に僅かであり、それ故、恐らくは十分ではない。
ii)使用されるTDN誘導体は、HIV-1野生型ゲノムに由来し、その結果、INSモチーフを含み、それ故、Rev-媒介性核外輸送に依存する。前記したように、実際の阻害作用は、細胞核内でのRev存在下でのみ開始され、それにより、最初のHIV転写産物が、妨害されずに細胞質へと移行し、複製を完全に行なうことができる。それ故、両方の制御システムを組み合わせることによって、非常に効率が悪いHIV複製阻害がもたらされることは驚くべきことではない（Cara et al., 1998）。
【特許文献１】DE 1 053 781 A1
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
LTR-tatシステム以外に、多くの他の誘導性ウイルスプロモーターが知られている。また、他の誘導性発現システムが、この業界で知られている。しかしながら、遺伝子発現の望む程度は、誘導性システムを使用しても、なかなか得ることができない。従って、本発明の目的は、誘導性遺伝子発現のための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
この目的は、
(i)発現させる標的核酸配列の提供、
(ii)発現の増加を達成するような、発現させる標的核酸配列の改変、
(iii)誘導性転写制御配列と、改変した標的核酸配列との操作可能な連結、
(iv)適切な発現システムでの、トランス活性因子による改変した核酸配列の発現、
を含む、誘導性遺伝子発現のための方法により達成される。
【００２７】
一方で、核酸レベルで配列を改変して、遺伝子発現の増加を達成し、他方で、トランス活性因子により誘導可能な転写制御配列の制御下で、標的核酸を発現させた場合に、驚くべきことに、発現させる標的核酸配列におけるコード遺伝子（以後は、導入遺伝子と称する）の誘導性発現が、顕著に改良することができることを見出した。
【００２８】
例えば毒性遺伝子産物を使用する場合、誘導性遺伝子発現は必須であり、他にも、治療的に利用可能な遺伝子は、構成的な発現に比較して、重要な利点を有する：
-  非感染の細胞は、生理学的行動において、付加的な因子の高い発現がもたらすストレスを受けない、
-  遺伝子産物の非特異的なまたは予測不可能な相互作用は、隣接する細胞、組織または生物全体において、活性化、増殖等の生理学的改変をもたらす可能性がある。
-  HIVに由来するタンパク質が、HIV感染環境下で、免疫細胞に認識され、対応するタンパク質-発現細胞が除去される、
-  毒性因子の場合、構成的な産生は避けなければならない。
【００２９】
転写制御配列は、操作可能に連結して、核酸配列（特に遺伝子の核酸配列）の発現を可能とする核酸配列である。これに関しては、転写制御配列はプロモーターとすることができ、加えて、例えばエンハンサー等の更なるエレメントを含む。好ましくは、誘導性転写制御配列は、誘導性プロモーターである。これに関しては、特に、この業界で知られているそれぞれの誘導性プロモーターシステムが適している。例えば、テトラサイクリンによって誘導可能なプロモーター（Tet オン/Tet オフ システム）などの天然または人工的な誘導性プロモーターを使用することができる。しかしながら、更にその上、誘導性ウイルスプロモーターも、使用することができる。
【００３０】
転写制御配列は、トランス活性因子によって誘導される。トランス因子とは、トランスに作用し、転写に影響を及ぼす因子である。トランス活性因子は、好ましくは転写因子である。特に好ましくは、トランス活性因子は、ウイルス性トランス活性因子である。
【００３１】
好ましくは、誘導性転写制御配列は、ウイルス性トランス活性因子によって誘導されることができる。ウイルス性トランス活性因子によって誘導することができるウイルス誘導性転写制御配列は、任意のウイルスに由来することができる。レトロウイルス、HCV（C型肝炎ウイルス）、HBV（B型肝炎ウイルス）、HSV（単純ヘルペスウイルス）、EBV（エプステイン-バーウイルス）、SV40（シミアンウイルス40）、AAV（アデノ関連ウイルス）、アデノウイルス、パピローマウイルスまたはエボラウイルスが、好ましくは、この目的のために使用される。関連して使用されるトランス活性因子は、従って、例えば、これらに限定されないが、以下のウイルス因子：NS5A(HCV)、HB X(HBV)、VP16/ICP4(EBV)、EBNA1/Rta(EBV)、ART(HHV8)、Large T-Antigen(SV40)、Rep78/68(AAV)、E1A(アデノウイルス)、E2(パピローマウイルス)およびVP30(エボラウイルス)から選択される。
【００３２】
レトロウイルスLTRプロモーターまたはその機能性部分配列を、好ましくは、ウイルス性トランス活性因子によって誘導することができる誘導性転写制御配列として使用する。好ましくは、それ故、トランス活性因子は、レトロウイルスのTatまたはTaxタンパク質である。LTRプロモーターは、HIV-1、HIV-2、SIV、HTLV、およびLTRプロモーターを含む他の関連するレトロウイルスのLTRから選択される。特に、レンチウイルスのプロモーター、特にはHIVのプロモーターが好ましい。
【００３３】
それ故、本発明の意味におけるトランス活性因子とは、好ましくは、トランス活性因子が誘導性転写制御配列と相互作用することにより、転写に対ししてトランスに影響を与える因子である。それ故、このようなトランス活性因子の例は、前記したTatタンパク質である。
【００３４】
遺伝子発現を改良するために、発現させる標的核酸配列を改変する。これは、核酸レベルで行なわれ、好ましくは、対応するアミノ酸配列を改変しないように、または実質的には改変しないように行なう。アミノ酸配列を、遺伝子発現を増加させるために、核酸配列の改変で変更させるならば、この変更は、得られるタンパク質の機能に影響を及ぼさないようにするべきである。
【００３５】
遺伝子発現を増加させるための標的核酸配列の改変は、幾つかの方法で実施することができる。
【００３６】
一方では、導入遺伝子のコドン使用頻度(codon usage)を、使用する発現システムに合わせることが可能である。真核発現システム、特に哺乳類に基づく発現システムが好ましく、特には哺乳類細胞に基づく発現システム、好ましくはヒト細胞に基づく発現システムである。それ故、導入遺伝子のコドン使用頻度は、好ましくは哺乳類細胞のコドン使用頻度に合わせ、より好ましくは、ヒト細胞のコドン使用頻度に合わせる。
【００３７】
本発明により、そして好ましくは遺伝子治療に適する改変した標的核酸配列は、例えば、輸送される細胞のmRNAで生じるコドン分布を選択することによって、産生することができる。好ましくは、これに関連して、コドン選択は、哺乳類細胞において、最も高い頻度で、または次に高い頻度で使用されるように、行うべきでる（Ausubel et al., 1994）。更により好ましくは、コドン選択は、活性に発現した哺乳類遺伝子のコドンに合わせるべきである。好ましくは、核酸配列は、遺伝子最適化手法を使用して、哺乳類における最適な発現のために改変する（独国特許出願DE 102 60 805.9, PCT/EP03/14850）。
【００３８】
しかしながら、コドン選択を適合させることに代えて、または適合させることに加えて、GC含量を最適化することも可能である。これは、好ましくは、導入遺伝子のGC量を、使用する発現システムのGC含量とできるだけ正確に適合させることによって達成される。これに関連して、GC含量を増す目的のための核酸の変更により、アミノ酸配列の変更をもたらさないように、遺伝子コードの縮重を好ましくは利用する。発現させる配列のGおよびCヌクレオチドの最適な含量割合は、前記したように、配列を発現させる各生物および細胞に依存する。例えば、哺乳類細胞における核酸の最適なGC含量は、約50%である。当業者が、様々な生物および細胞について最適なGC含量を探し出すことができるという参照文献は、既に存在する。定期的にアップデートされるコドン使用頻度データーベースが、Kazusa DNA Research InstituteにおけるY. Nakamuraのwww.Kazusa.or.jp/codon/に存在する（Nakamura, Y et al., (2000) Nucl. Acids Res. 28, 292を参照）。それ故、GC含量に関して、当業者が、発現させる標的核酸の核酸配列を最適化するための問題は生じない。
【００３９】
GC含量の最適化またはコドン使用頻度の適合は、好ましくは、サイレント変異によって、または、導入遺伝でコードされるタンパク質の活性に影響を与えない変異によって行なう。コドン使用頻度は、前記遺伝子のGC含量が既に50%を超えている場合は、必ずしも適合させる必要は無い。野生型と異なるコドン使用頻度を有する遺伝子は、前記したように、段階的なポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって長いオリゴヌクレオチドから産生することができる。
【００４０】
発現を改良することを目的とした、発現させる標的核酸配列を改変する更なる可能性ある方法は、前記可能性の代わりに、またはこれらに加えて、転写に負の影響を与えるモチーフを意図的に取り除くことである。これには、例えば、当業者に既に知られているpoly-A配列などの核酸モチーフの欠失が含まれる。発現にネガティブな影響を与える更なるそのようなモチーフには、RNA不安定化モチーフ、アデニン-リッチ モチーフ、エンドヌクレアーゼのための認識モチーフ、RNAの二次構造に影響を与えるモチーフ等が含まれる。
【００４１】
発現させる標的配列は、好ましくは、治療用および/または診断用タンパク質をコードする。このようなタンパク質は、例えば、毒性遺伝子産物、自殺因子、アポトーシス誘導タンパク質、メッセンジャー物質（messenger substance）、トランス活性因子、レギュレータータンパク質、トランスドミナントネガティブ タンパク質、サイトカイン、ケモカイン等から選択することができる。具体的な例としては、インターフェロンα、SDF-I RANTES、MIP1α、TNFおよびインターロイキン、特にはインターロイキン2、6、10、12、15および28である。好ましくは、発現させる標的核酸配列は、LTR/Tatシステムを使用する場合には、例えば、HIV感染による活性化後に、隣接した細胞の元来備わっている防御機構を誘導することができるタンパク質、または、対応するレセプターに結合することによって、HIVとの感染を防止することができるタンパク質を産生する遺伝子をコードする。HIVの場合、これらは、特にCD4、CCR5またはCXCR4である。
【００４２】
更なる例は、例えばチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カルボキシルエステラーゼ、ニトロレダクターゼ、ペルオキシダーゼ、キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、チミジンホスホリラーゼ等のような酵素である。
【００４３】
ヘルペスウイルスに由来するチミジンキナーゼ、ヌクレアーゼまたはアポトーシス誘導タンパク質（例えばFAS/FASリガンド、カスパーゼ等）などの毒性遺伝子産物の発現方法が、特に適している。カスパーゼ以外に、TNF-関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）、プロテインキナーゼC（PKC）、腫瘍壊死因子（TNF）、アポトーシス誘導因子（AIF）等も適する。HIVとの感染後、この場合に、遺伝子の発現が誘導され、細胞は損傷を受け、それ故、子孫ウイルスの新たな産生および増殖は防がれる。
【００４４】
更にその上、導入遺伝子は、細胞内での誘導発現後、モレキュラースイッチ分子として作用し、他の遺伝子の発現を開始または停止させるレギュレーター遺伝子とすることができる。転写因子をコードする遺伝子は、例えば、そのようなレギュレーター遺伝子として使用することができる。当然なことながら、これらの実施可能な使用は、HIVの感染に限らず、当業者は、他の感染のためにも対応するシステムを使用することができる。
【００４５】
導入遺伝子は、好ましくはウイルス遺伝子である。
【００４６】
更にその上、発現させる標的核酸配列は、また、トランスドミナントネガティブ（TDN）に働くタンパク質のための遺伝子とすることができる。好ましくは、この場合、発現させる標的核酸配列は、ウイルスのTDNタンパク質、好ましくはレトロウイルスのTDNタンパク質、最も好ましくはレンチウイルスのTDNタンパク質である。
【００４７】
これに関連して、例えば、Pr55gag、Gp41、Gp120、Rev、プロテアーゼ、インテグラーゼ、リバーストランスクリプターゼ、Nef、Vpr、Vpv、または、レンチウイルス（特にHIV）の複製サイクルを妨げることができるか、ウイルス粒子の放出もしくは分裂を防止することができる他のレンチウイルスタンパク質などのレンチウイルスのTDNタンパク質は、特に適する。
【００４８】
好ましくは、HIV-1 gag（group-specific antigen）は、導入遺伝子として使用され、この場合、そのコドン選択は、ヒト遺伝子で見られるコドン選択に適合させる。
【００４９】
特に好ましくは、更に欠失を含むgag遺伝子を使用する。これにより、更にTDN作用を強めることができる。好ましくは、この場合においては、p24領域における、または独立したドメインもしくは複数でアセンブリするドメインにおける更なる欠失が含まれる。
【００５０】
例えば、gag遺伝子産物のアミノ酸配列から、ヒト遺伝子のコドン選択を使用して、合成したGagをコードするリーディングフレームが得られる。「syngag」として知られるこのリーディングフレームを、長鎖オリゴヌクレオチドおよび段階的PCRを使用して、完全な合成リーディングフレームとして構築した。syngagリーディングフレームを、その後、発現ベクターへとクローニングした。産生したsyngagベクターは、HIV gagの発現において、Revタンパク質、RRE配列、5'非翻訳領域（UTR）またはスプライシング部位の存在から完全に独立していると考えられた。しかしながら、そのコドン選択がHIV-1野生型遺伝子（wtgag）に対応する産生gag遺伝子は、その発現において、Rev RREおよび5’-UTRを包括するスプライシングドナーに依存していると考えられた（Graf et al., 2000）。
【００５１】
更にその上、本発明は、好ましくは、トランスドミナントネガティブに働く（TDN）レンチウイルスタンパク質の、真核細胞における発現のための方法であって、
(a) TDNレンチウイルスタンパク質をコードし、そのコドン使用頻度が哺乳類のコドン使用頻度と適合している、発現させる標的核酸配列と、標的核酸配列と操作可能に連結したレンチウイルスTatタンパク質によって誘導されるプロモーター配列とを含むベクターを、真核細胞に導入すること、
(b)前記標的核酸配列の発現を誘導するように、Tatタンパク質を提供すること、
を含む方法に関する。
【００５２】
前記したように、TDN誘導体の発現がRev/RREに依存していない場合は、驚くべきことに、LTR/Tatシステムは、前記した制限にも関わらず使用することができる。
【００５３】
本発明においては、これは、使用頻度を、哺乳類細胞の使用頻度に合わせることで達成される。
【００５４】
LTRと合成HIVリーディングフレームとの組み合わせにおいては、（HIV感染の早期の段階での）TDN遺伝子の早期発現は、HIV-自身の構造タンパク質および標的タンパク質が産生する前の、（RNA安定化に加えて）有効な核外輸送と関連し、それ故、タンパク質生合成に関係している。全般的に、この組み合わせにより、i)高いTDNタンパク質量とともに、ii)動力学的に好ましい発現様式、およびiii)非常に効率的な誘導性がもたらされる。
【００５５】
前記した方法に関する区切りとして、i)発現の誘導性がTatの存在に制限され、それにより、導入コンストラクトにおけるHIV RRE/Revの必要性が避けられ、そして、ii)転写産物のRev依存性が、導入コンストラクトの適切なコドン選択によって保障される。
【００５６】
導入遺伝子のための転写制御配列は、好ましくは、同じように天然発生に位置する。
【００５７】
プロモーターの誘導は、トランス活性因子として作用するレンチウイルスのTatタンパク質によって、好ましくはHIVのTatタンパク質によって行われる。これにより、ベクターを含む細胞の感染によるプロモーターの誘導を、レンチウイルス（特にはHIV）自身により生じさせることができる。このようなトランス活性因子は、本発明の意味においては、単一のタンパク質およびタンパク質複合体であると理解される。
【００５８】
RNAの安定化および核外輸送特性の改良だけでなく、RRE/Rev相互作用（HIV由来タンパク質の場合）に対するタンパク質産生の非依存性は、RNA安定性に影響を及ぼすモチーフを考慮し、例えば、対応するコドン選択により達成することができる。
【００５９】
更にその上、本発明は、
(a)発現させる標的核酸配列、
(b)発現させる標的核酸配列と操作可能に組み合わせた、トランス活性因子によって、好ましくはウイルス性トランス活性因子によって誘導される転写制御配列、
を含む核酸ベクターであり、(a)の配列が、発現の増加が達成されるように、核酸レベルで改変されている核酸ベクターに関する。
【００６０】
これに関連して、核酸ベクターは、適切な発現システム（例えば細胞、生物またはin vitroシステム）で、含まれる標的核酸配列を発現することができ、そして、少なくとも1つの発現させる標的核酸配列と、操作可能に組み合わせた誘導性転写産物制御配列とを含む核酸コンストラクトを定義すると理解される。このようなベクターは、更なるコドン配列（例えば選択マーカー遺伝子等）を含むこともできる。当業者は、また、適した市販のプラスミドベクター等または自己構築ベクター（self-constructed vector）内で、転写制御配列と組み合わせて、発現させる標的核酸配列を使用することができる。
【００６１】
発現させる標的核酸配列および誘導性転写制御配列は、また、この場合、前記したように選択することができる。また、配列の改変は、前記したように実施することができる。
【００６２】
好ましい実施態様は、HIV遺伝子治療に使用することができ、HIVによる細胞感染後にのみ発現する治療用遺伝子をコードすることを特徴とするベクターに関する。対応する遺伝子の転写は、これに関しては、HIV-自身のLTR(long terminal repeat)領域によって制御され、HIV-Tatタンパク質の存在下で転写が行われる。また、好ましくは、ヒト遺伝子での発現に適合させた合成リーディングフレームは、治療用遺伝子のために、遺伝子発現を増加するために、特にRNA安定性およびRNA核外輸送を増加するために使用する。これらの遺伝子は、好ましくは、HIV翻訳サイクルの異なる工程に対して標的化し、細胞の感染、HIVの複製または子孫ウイルスの増殖を妨害することができる。
【００６３】
本発明によるベクターは、加えて、好ましくは治療用遺伝子、治療用および/または診断用タンパク質をコードする更なる導入遺伝子を含むことができる。この更なる導入遺伝子は、同じように、LTRプロモーター（例えば、(a)の配列と同じプロモーター）の制御下にある。しかしながら、構成的または誘導性とすることができる別々のプロモーターによって制御することができる。
【００６４】
ベクターは、例えば、ウイルス性（例えば、アデノ関連ウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス等）もしくは細菌起源とすることができ、またはプラスミドとすることができる。特に好ましくは、誘導性転写制御配列は、外来遺伝子の発現がHIV-1 Tatタンパク質の存在に依存するように選択される。Tatトランス活性を再構築できる場合は、好ましくは、Tat依存性遺伝子の発現が、少なくとも3倍、好ましくは5倍、更により好ましくは10倍を超えて増加する。
【００６５】
ベクターは、好ましくは、配列番号1、16または17の配列を含む。
【００６６】
本発明は、更にその上、適切な誘導性転写制御配列と操作可能に連結する場合に遺伝子発現を増加させる、改変した標的核酸配列を提供する。好ましくは、これらの改変した標的核酸配列は、本発明の実施例で示した、および配列プロトコールで特定した配列から選択される。配列番号1、16および17から選択される改変した標的核酸配列が、最も好ましい。
【００６７】
本発明は、更にその上、前記した核酸またはベクターで形質転換し、核酸配列が転写可能な形態で存在する細胞、好ましくは真核細胞、より好ましくは哺乳類細胞、最も好ましくはヒト細胞を提供する。核酸およびベクターは、例えば、エピソームとして存在することができ、または、染色体へと安定に一体化することができる。この場合、細胞は、1つまたは複数のコピーを含むことができる。
【００６８】
本発明は、更にその上、本明細書に記載するベクターおよび改変したレンチウイルスおよび細胞に基づく医薬に関する。本発明による医薬は、治療用途および診断用途に適し、特に、ウイルス関連疾患および/または腫瘍の診断、予防もしくは治療に適する。これらの適用については、発現させる標的核酸配列は、例えば、特に自殺遺伝子等とすることができる。
【００６９】
医薬は、例えば、治療目的で、好ましくはレンチウイルス（例えばHIVおよびSIV、特にHIV-1およびHIV-2）感染の治療目的で使用することができる。当業者は、プロモーター配列を、発現を行うシステムに適合させることができる。感染したヒトをin vitroで、ex vivoで、そして当然のことながらin vivoで処理することによって、例えば、本発明による核酸配列またはベクターを、これらの患者に由来するPMLへ、または分化の異なる段階のT細胞へ、または幹細胞へと導入することによって、レンチウイルス感染を制御することができる。
【００７０】
本発明を、以下の図面および実施例を参照に、より詳細に以下に開示する。
【実施例】
【００７１】
（実施例１：独立したTat-依存性、Rev-依存性およびTat-およびRev-依存性gag遺伝子誘導体の産生）
HIV-1のトランスドミナント（TDN）に働くgag誘導体を、構成的に、Tat-、Rev-またはTat/Rev依存的に発現する遺伝子コンストラクトとして産生させた。Rev依存性は、HIV Rev応答性エレメント（RRE）と結合した5’-非翻訳領域（UTR）を含むHIV野生型（wt）遺伝子配列を使用することによって得た。Rev依存性は、合成した、GCリッチな遺伝子配列によって可能であった。コードアミノ酸配列は、両方のコンストラクトで同一であった。Tatに対する依存性は、転写制御としてHIV-1のLTRを使用することによって達成した。他方で、CMV-プロモーター/エンハンサーを、構成的転写のために使用した。エレメントを適切に組み合わせることによって、（タンパク質レベルで）同一のTDN gag誘導体の構成的発現（CMV-syngag）、Tat-依存性（LTR-syngag）発現、Rev-依存性（CMV-UTR-wtgag-RRE）発現、ならびに、Tat-およびRev-依存性（LTR-UTR-wtgag-RRE）発現を生じさせた。
【００７２】
HIV-1 group-specific antigen(gag)のリーディングフレーム（GenBank Accession Nubmer: M15654.1 HIVBH102, nucleotides 112-1650; 参照：Ratner L, Haseltine W, Patarca R, Livak KJ, Starcich B, Josephs SF, Doran ER, Rafalski JA, Whitehorn EA, Baumeister K, et al., Complete nucleotide sequence of the AIDS virus, HTLV-III. Nature. 1985 Jan 24-30; 313 (6000): 277-84）は、ヒト細胞で見られるようなコドン選択を使用して、人工的に構築すべきである。この目的のために、Gagタンパク質のアミノ酸配列（GenBank Accession Number: M15654 JIVBH102, nucleotides 112-1408に対応する）にヌクレオチド304-489の欠失を供したものを、対応するヌクレオチドに変換した。対応するソフトウェアパッケージ（GeneOptimizer）を、コドン最適化およびRNA配列の最適化のために使用した。サブクローニングのため、および、非転写領域における更なる配列エレメントの付加のために、更なるリストリクションインターフェイス（restriction interface）を挿入した。インターフェイスを含むヌクレオチド配列を、配列番号1で示す。
【００７３】
この配列は、既に開示された方法（Zolotukhin et al., 1996）に従い、合成オリゴヌクレオチドを使用して、完全に合成した遺伝子として産生した。
【００７４】
TDsyngag（哺乳類遺伝子に由来するコドン選択）およびTDwtgag（HIV構造遺伝子に由来するコドン選択）の核酸配列の比較を、図6に示す。この方法で産生されるTDgagコードDNA断片（「TDsyngag」）を、サイトメガロウイルス（CMV）初期プロモーター/エンハンサーの転写制御下のインターフェイスEcoRIおよびXhoIを使用して、発現ベクターpcDNA3.1(+)（Invitrogen）へと挿入した（「pc-CMV-TDsysngag」）。
【００７５】
類似の発現プラスミドを産生するために、コドン選択をHIV野生型に適合させながら、5’-非翻訳領域（UTR）を含むHIV-1 gagのコード領域をサブクローニングし、Rev-媒介性核外輸送のための条件に適合させるために、RNA標的配列（RRE）を、wtgag-コード領域へと結合させた（Graf et al., 2000）。この標的配列は、RNAレベルで、ウイルスの核外輸送タンパク質（HIV-1の場合は、Revタンパク質）および細胞内核外タンパク質と相互作用する。
【００７６】
タンパク質レベルでの適合を確実なものとするために、2つの連続した停止コドンを、gagリーディングフレームへと導入することによって（372Fおよび373Lのコドンを変異させた）、野生型コンストラクトをC末端で短くした。オリゴヌクレオチドgag-stop1およびgag-stop2を使用し、定方向突然変異誘発（QuickChange site-directed mutagenesis kit, Stratagene）によって、変異を導入した。得られたコンストラクトは、pc-CMV-UTR-wtgag-RREとした。オリゴヌクレオチドDe11およびDe12を使用して、同じように、ヌクレオチド304から489までの欠失をこのコンストラクトへ導入し、TDsyngag（pc-UTR-TDwtgag-RRE）とした。コドン配列を、配列番号3に示す。
【００７７】
gagタンパク質誘導体のTat依存性を達成するために、コード配列を、HIVプロモーターの転写制御下に置いた。HIV-1のlong terminal repeat(LTR)は、このようなプロモーターを含む。この領域を、プロウイルスHIV-1 DNAに由来するオリゴヌクレオチドltr1およびltr2（HX10、Ratner et al., 1987を参照）を使用したPCRによって増幅し、pc-CMV-TDsyngagにおけるgagをコードするリーティングフレームのATGの5’上流側に直接位置するインターフェイスMluIおよびEcoRIを使用してクローニングして、CMVプロモーターを、LTRに置換した。wt gagコンストラクトにおけるプロモーターの置換のために、HIVゲノムの一部を、オリゴヌクレオチドltr1およびltr3を使用してPCRで増幅し、pc-CMR-UTR-TDwtgag-RREにおけるCMRプロモーターのインターフェイスMluIおよびCiaIを使用して置換した。同時に、（配列LTR、UTR、gagを有する）HIVプロウイルスの天然のリーディングフレームを再度産生した。得られたコンストラクトを、以後は、「pc-LTR-TDsyntgag」および「pc-LTR-UTR-TDwtgag-RRE」と定義する。
【００７８】
全ての産生したGagをコードするコンストラクトを、図1に図示する。
【００７９】
（実施例２：TDgagコンストラクトの発現は、HIV制御タンパク質によって制御することができる）
Life Technologies(Karlsruhe)により、全ての細胞培養生成物を得た。全ての哺乳類細胞ラインを、37℃および5%CO2環境下で培養した。ヒトの肺癌細胞ラインH1299を、L-グルタミン、D-グルコース（4.5mg/ml）、ピルビン酸ナトリウム、10%非働化ウシ胎児血清、ペニシリン（100U/ml）およびストレプトマイシン（100μg/ml）を加えたダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）で培養した。細胞を、コンフルエンスが十分になった後で、1:10の比率で二次培養した。
【００８０】
1×106の細胞を、ペトリディッシュ（直径100mm）に移し、24時間後に、30μgのTDgagプラスミドおよび15μgのpc-tat（Tat発現プラスミド）またはpc-rev（Rev発現プラスミド）またはpcDNA3.1ベクター（参照プラスミド）を用いたリン酸カルシウム共沈法によってトランスフェクトした（Graham et al., 1973）。gag、tatおよびrevの共トランスフェクションでは、15μgのプラスミドを、それぞれについて使用した。細胞および培養液上清を、トランスフェクト後48時間で回収した。トランスフェクトした細胞を、氷冷したPBS（10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4、137mM NaCl、2.7mM KCl）を用いて2回洗浄し、氷冷したPBSを用いて剥ぎ取り、10分間300Gで遠心分離し、氷上で30分間リシスバッファー（50mM Tris-HCl、pH8.0、0.5% Triton X-100(w/v)）を用いて溶解させた。細胞溶解液の不溶性成分を、30分間10000G、4℃で遠心して除去した。上清のタンパク質の総量を、Bio-Rad protein assay(Bio-Rad, Munich)を用いて、取扱説明書に従って測定した。
【００８１】
同じ量のdouble sample buffer(Laemmli, 1970)をサンプルに加えて、5分間95℃で加熱した。細胞溶解液に由来する50μgの総タンパク質を、12.5% SDS/ポリアクリルアミドゲル（Laemmli, 1970）を用いて分離し、ニトロセルロース膜へと電気的に写し取り、p24-特異的モノクローナル抗体13-5（Wolf et al., 1990）を用いて分析し、AP（アルカリホスファターゼ）が結合した二次抗体を用いて検出し、色素発色によって同定した（図2a）。
【００８２】
これに加えて、細胞溶解液を、市販のp24 ELISAテスト（NEN）で定量した。1μgの細胞溶解液を、取扱説明書に従って評価し、HIV-1 p24の総濃度を求めた（図2B）。
【００８３】
H1299細胞を、gagコンストラクトを用いて、一過的にフィックスした。その発現を、TatまたはRevの存在下および非存在下で分析した（図2）。pc-CMV-TDsyngagについては、TDgagの構成的な発現が、TatまたはRevに非依存的に検出された（図2A、レーン2、および図2B、レーン2）。TDgagの発現が、pc-CMV-UTR-TDwtgag-RREコンストラクトについては、Revにより7倍上昇し（図2A、レーン3および4、ならびに図2B、レーン3および4）、pc-LTR-TDsyngagコンストラクトについては、pc-tatとの共-トランスフェクションにより2.5倍上昇した（図2A、レーン5および6、ならびに図2B、レーン5および6）。Tgag発現の基礎活性は、pc-CMV-UTR-TDwtgag-RREに比べて、pc-LTR-TDsyngagコンストラクトでは幾分低く、しかしながら、両方のコンストラクトについては、pc-CMV-TDsyngagに比べて顕著に減少しており、ネガティブコントロールよりも僅かに高いのみであった（計算、pc-CMV-UTR-TDwtgag-RREについては2.5倍、pc-LTR-TDsyngagについては1.5倍；図2B）。pc-LTR-UTR-TDwtgag-RREの遺伝子産物は、これらの方法によって検出することができなかった。Gagにおける欠失により、モノクローナル抗体により認識が減少し、非常に制限された発現と相まって、得られたTDgagの量は、抗体が検出するには不十分であった。従って、TatおよびRev依存性を、参照コンストラクト（完全なwtgag配列）で調べた。このコンストラクト（pc-LTR-UTR-wtgag-RRE）は、TatだけではなくRevにも依存していた。Tat単独では、発現が4倍に増え、Rev単独では発現が16倍に増え、TatおよびRevの組み合わせでは47倍に増えた（図3）。
【００８４】
（実施例３：TDgagコンストラクトは、HIV粒子放出に対してトランスドミナントネガティブな作用を有する）
H1299を、実施例1に記載したプラスミドの組み合わせを用いて、一過的にトランスフェクトした。トランスフェクトについては、15μgのHX10プロウイルスDNAおよび30μgのTDgagコンストラクトまたは30μgのpcDNA3.1を、複製の非阻害についてのコントロールとして使用した。48時間後、細胞培養液上清を回収し、細胞成分を遠心（10分間10000G）により沈殿させ、10%のTriton×100溶液（5%）を用いて、15分間室温で上清をインキュベートし、上清のHIV粒子を溶解させた。処理した上清を、p24 ELISAテスト（NEN）における対応する希釈で使用し、p24量を定量した。p24量の減少は、HIVプロウイルスを用いたトランスフェクション後の粒子放出の阻害と直接的に相関している。求めたp24の量を、コントロール（pcDNA3.1との共トランスフェクション、非阻害）と比較し、阻害割合（％）を計算した。少なくとも6つの独立したバッチを用いて、それぞれの組み合わせについて試験した。
【００８５】
図4Aで示すように、全ての処理したTDgagコンストラクトは、かなりの粒子放出阻害をもたらした。TDsyngag(TDsg)コンストラクトは、上流のプロモーターとは非依存的に、かなり高い阻害をもたらした。しかしながら、TDwtgag(TDwtg)コンストラクトの阻害作用は、プロモーター領域に依存していた。粒子放出の阻害は、HIV LTRプロモーター制御下よりも、CMVプロモーター制御下の方がより顕著に高かった。
【００８６】
（実施例４：TDgagコンストラクトは、HIV感染に対してトランスドミナントネガティブな作用を有する）
H1299細胞を、実施例3に示したプラスミドの組み合わせでトランスフェクトし、48時間後に、上清を回収して精製した。感染性子孫ウイルスの放出に対するTDgagコンストラクトの影響を調べるために、調整済みの採用培養液上清を、対応する指標細胞ライン（MAGI）（Kimpton et al., 1992）で試験した。
【００８７】
真核MAGI（multinuclear activation of a galactosidase indicator）細胞は、HIV感染によって誘導することができるリポーター遺伝子カセットを含む指標細胞ラインである。MAGI細胞は、UK Medical Research Council(MRC)から購入することができる。このカセットにおいては、ウイルスLTR(long terminal repeat)プロモーターは、E.coliのβ-ガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ）の上流に存在する。従って、lacZの発現は、ウイルスのTatによるLTRプロモーターの転写活性に依存する。
【００８８】
感染については、300μlの培地（48穴プレート）当り3×104細胞を、前の日から前培養した。トランスフェクトしたH1299細胞の上清を回収した後、MAGI細胞を、バッチ当り100μlの上清を用いて感染させて、48時間培養した。
【００８９】
感染性を評価するために、培地を沈殿させ、ウェルをPBSで洗浄した。モノレイヤーを、200μlの固定化溶液（PBS中1%ホルムアルデヒド、0.2%グルタルアルデヒド）で固定化し、5分間室温でインキュベーションした後に、PBSで再度洗浄した。その後に、200μlの染色溶液（4mlのDMSO中16mgのX-gal、40mlのPBSを加える；400μlのκフェリシアニド（400mM）、400μlのκフェロシアニド（400mM）および8μlのMgCl2（1M））を、細胞に添加した。インキュベーションを、37℃で15分から3時間行った。青い細胞を、光学顕微鏡でカウントした。
【００９０】
阻害は、青い細胞の減少として測定し、ポジティブコントロールにおける青い細胞の数を、感染の阻害％として示す。結果は、粒子放出の結果と実質的に関連している（図4B）。実質的に完全な阻害は、コンストラクトpc-CMV-TDsyngag、pc-LTR-TDsyngagおよびpc-CMV-UTR-TDwtgag-RREについて見られたのに対して、コンストラクトpc-LTR-UTR-TDwtgag-RREは、約50%の阻害を示した（2つの独立したバッチを用いた典型的な実施例の結果を図4Bに示す）。
【００９１】
（実施例５：p24の更なる欠失を有するTat-依存性TDgag誘導体のトランスドミナントネガティブに働く作用）
コンストラクトpc-CMV-TDsyngag、pc-LTR-TDsyngag、pc-CMV-UTR-TDwtgag-RREおよびpc-LTR-UTR-TDwtgag-RREから開始して、更なる欠失を、オリゴヌクレオチドDe13およびDe14（syngag）ならびにDe15およびDe16（wtgag）を使用して、gagリーディングフレームへと導入した。この欠失は、非常に多くのCTLエピトープが同定されている領域であるアミノ酸230から300に関する。新規に調製したコンストラクトpc-CMV-TDsyngagd2、pc-LTR-TDsyngagd2、pc-CMV-UTR-TDwtgagd2-RREおよびpc-LTR-UTR-TDwtgagd2-RRE（概略図、図1を参照）を用いた、H1299の感染後においては、対応するTDN Gag誘導体の発現が、検出することができなかった。なぜならば、修飾が、利用可能なgag-特異的抗体のアフィニティに影響を与えるからであり、それ故、ウェスタンブロットでもp24 ELSIA特異的シグナルでも検出することができなかった。
【００９２】
実施例3で示したように、H1299細胞を、HX10（15μg）およびTDsyngagd2またはpcDNA3.1の組み合わせを用いてトランスフェクトし（それぞれの場合において、30μgのプラスミドDNA）、TDN効果を求め、そして、上清について、実施例3で示すようなp24 ELISAテストで、および、実施例4で示すようなMAGI細胞によって評価した。粒子放出の阻害（p24 ELISAの結果、図5A、少なくとも6つの独立したバッチ）および子孫ウイルスの感染性（MAGI評価の結果、図5B、2つの独立したバッチ）は、全ての使用したコンストラクトで観察された。阻害（粒子放出）効果の順番は、この場合、pc-CMV-TDsyngagd2（98.45%）、pc-LTR-TDsyngagd2（97.49%）、pc-CMV-UTR-TDwtgagd2-RRE（80.99%）およびpc-LTR-UTR-TDwtgagd2-RRE（73.69%）であり、それ故、TDgag実験の結果に実質的に対応する。そして、合成したリーディングフレームは、粒子放出の阻害に関しても、明らかに優れている。しかしながら、感染性子孫ウイルスの減少は、この実験バッチにおいて同程度であった（図5B）。Rev依存性とTat依存性との比較により、合成したリーディングフレームとLTRの組み合わせは、明確な利点を示した。
【００９３】
【表１】
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【００９４】
[参考文献]
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【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図1は、全ての産生したgagをコードするコンストラクトを図式的に示す。
【図２】図2は、H1299細胞における、様々なgagをコードするコンストラクトの発現の結果を示す。図2Aは、トランスフェクトした細胞のHIV-1 p24特異的なウェスタンブロットを示す。図2Bは、p24 ELISAテストを示す。
【図３】図3は、Tatおよび/またはRev存在下および非存在下での、野生型gag発現コンストラクトの発現結果を示す。図3Aは、トランスフェクトした細胞のHIV-1 p24特異的なウェスタンブロットを示す。図3Bは、ELISAテストを示す。
【図４】図4は、HIV粒子の放出に対する、トランスドミナントネガティブに働くgagタンパク質の効果を示す。図4Aは、p24 ELISAテストによる、粒子の放出の阻害割合を示す。図4Bは、放出したウイルス粒子の感染の阻害割合を示す。
【図５】図5は、p24の更なる欠失を有するトランスドミナントネガティブに働くgagコンストラクトの存在下で形成した、ウイルス粒子の放出の阻害割合を示す。図5Aは、放出の阻害割合を示す。図5Bは、感染の阻害割合を示す。
【図６】図6は、TDsyngagおよびTDwtgagの配列だけでなく、TDwtgagとTDsyngagの間の配列比較を示す。
【図７】図7は、TDsyngag delta 2およびTDsyngag delta 2 delta p7の核酸配列を示す。配列番号1：TDsyngagの核酸配列を示す。配列番号2：TDsyngagのアミノ酸配列を示す。配列番号3：TDwtgagの核酸配列を示す。配列番号4：TDwtgagのアミノ酸配列を示す。配列番号5から15：様々なオリゴヌクレオチドを示す。配列番号16：TDsyngag delta 2の核酸配列を示す。配列番号17：TDsyngag delta 2のアミノ酸配列を示す。配列番号18：TDsyngag delta 2 delta p7の核酸配列を示す。配列番号19：TDsyngag delta 2 delta p7のアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年7月4日(2006.7.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞において、レンチウイルスのトランスドミナント-ネガティブ（TDN）タンパク質の改善した誘導性遺伝子発現のための方法であって、
(i)レンチウイルスのTDNタンパク質をコードする、発現させる標的核酸配列を提供すること、
(ii)発現の増加を達成するように、発現させる標的核酸配列を改変することであって、そのコドン使用頻度を、哺乳類のコドン使用頻度に適合させること、
(iii)レンチウイルスのTatタンパク質によって誘導されるプロモーター配列と、改変した標的核酸配列とを操作可能に連結すること、
(iv)適切な発現システムにおいて、標的核酸配列の発現が誘導されるように、Tatタンパク質の提供によって、改変した標的核酸配列を発現すること、
を含む方法。
【請求項２】
前記コドン使用頻度を、ヒトのコドン使用頻度に適合させる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記発現させる標的核酸配列のGC含量を、発現システムのGC含量に適合させる、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記発現させる標的核酸配列のGC含量を、哺乳類のGC含量について最適化させる、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記発現させる標的核酸配列における転写に負の影響を与えるモチーフを除去する、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記発現させる標的核酸配列の改変を、基本的には、対応するアミノ酸配列を変更すること無しに実施する、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
Gag、Env、Tat、Rev、Nef、Vpr、Vpv、リバーストランスクリプターゼ、プロテアーゼおよびインテグラーゼからなる群から選択されるレンチウイルスのTDNタンパク質をコードする、発現させる核酸標的配列を使用する、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
(a)レンチウイルスのTDNタンパク質をコードし、そのコドン使用頻度を哺乳類のコドン使用頻度に適合させた、発現させる標的核酸配列、
(b)発現させる標的核酸配列と操作可能に連結した、レンチウイルスのTatタンパク質によって誘導されるプロモーター配列、
を含む核酸ベクターであって、前記(a)の配列が、発現の増加が達成されるように、核酸レベルで改変されている核酸ベクター。
【請求項９】
前記(a)の配列が、対応するアミノ酸配列を変更しないように改変されている、請求項8に記載のベクター。
【請求項１０】
前記(a)の配列のコドン使用頻度を、哺乳類のコドン使用頻度に適合させる、請求項8または9に記載のベクター。
【請求項１１】
前記(a)の配列が、そのGC含量を哺乳類のGC含量について最適化させるように改変されている、請求項8から10のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１２】
前記(a)の配列が、そのGC含量をヒトのGC含量について最適化させるように改変されている、請求項11に記載のベクター。
【請求項１３】
前記ウイルスのTDNタンパク質が、Gag、Env、Tat、Rev、Nef、Vpv、Vpu、リバーストランスクリプターゼ、プロテアーゼおよびインテグラーゼからなる群から選択される、請求項8から12のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１４】
前記レンチウイルスのTDNタンパク質が、Gagタンパク質である、請求項13に記載のベクター。
【請求項１５】
前記レンチウイルスのTDNタンパク質が、p24領域が欠失したGagタンパク質である、請求項13または14に記載のベクター。
【請求項１６】
前記(a)の配列が、配列番号1、16および18の配列を含む、請求項8から15のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１７】
前記プロモーター配列が、レンチウイルスのLTR配列またはその機能的な部分配列である、請求項8から16のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１８】
請求項8から17のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１９】
活性物質として、請求項8から18のいずれか一項に記載のベクターまたは細胞を含む医薬。
【請求項２０】
請求項8から18のいずれか一項に記載のベクターおよび/または細胞の、遺伝子治療および/または診断目的の医薬の製造のための使用。
【請求項２１】
レトロウイルス感染における遺伝子治療および/または診断のための、請求項20に記載の使用。
【請求項２２】
レンチウイルス感染の治療および/または診断のための、請求項20に記載の使用。
【請求項２３】
HIV感染の治療および/または診断のための、請求項20に記載の使用。
【請求項２４】
HIVに感染したヒトに由来するPMLのex vivo形質導入のための、請求項20に記載の使用。
【国際調査報告】
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