(57)【要約】  実施の形態は、好ましくはＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープに対する免疫応答、好ましくは多価応答を誘導、増強及び持続するための方法並びに組成物に関する。本方法及び組成物は、予防又は治療目的のために用いられる。
2008526763.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫感作法であって、
第１の抗原の少なくとも一部分を含むか又はコードする第１の免疫原を含む第１の組成物、及び第２の抗原の少なくとも一部分を含むか又はコードする第２の免疫原を含む第２の組成物を哺乳類に送達すること、及びその後に
第１の抗原のエピトープに対応する第１のペプチドを含む第３の組成物を前記哺乳類のリンパ系に直接投与すること
を含み、該第３の組成物が第１又は第２の組成物と異なる方法。
【請求項２】
第１及び第２の組成物が同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
単一巨大分子が前記第１及び第２の免疫原を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
送達ステップの後に、第２の抗原のエピトープに対応する第２のペプチドを含む第４の組成物を哺乳類のリンパ系に直接投与すること
をさらに含み、該第４の組成物が第１又は第２の組成物と異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
第３及び第４の組成物のそれぞれが第１及び第２のペプチドを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第１及び第２の組成物を異なる部位に送達する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
第１及び第２のペプチドを異なる部位に投与する、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
第１の免疫原を第１のペプチドを投与する部位と同一の部位に送達する、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
第１及び第２のペプチドをほぼ同時に投与する、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
第１及び第２のペプチドを異なる日に投与する、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
第１の抗原がチロシナーゼ、Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＳＳＸ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦ−Ａ及びＰＬＫ１から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
リンパ系への直接投与が、鼠径部リンパ節への投与を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
免疫感作がＣＴＬ応答の誘導を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
送達ステップが、投与ステップの第１のペプチドと同一のエピトープペプチドの送達を含み、第３の組成物が少なくとも大用量のエピトープペプチドを含むことにより、第１又は第２の組成物と区別される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
送達ステップが免疫増強剤を送達することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
免疫増強剤を第１の組成物及び第２の組成物の少なくとも一方とともに送達する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
免疫感作法であって、
複数の抗原に対する免疫応答を同調させる手段を哺乳類に送達すること、及びその後に、
該抗原のうちの１つのエピトープに対応する１つ又は複数のペプチドを哺乳類のリンパ系に直接投与すること
を含み、投与ステップで使用される組成物が、送達ステップで使用されるいかなる組成物とも異なる免疫感作法。
【請求項１８】
前記手段が、３〜４個の抗原に対する免疫応答を同調させる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
免疫感作方法であって、
複数の抗原の少なくとも一部分を含むか又はコードする１つ又は複数の組成物を哺乳類に送達すること、及びその後に、
該抗原に対する応答を増幅するステップ
を含む、免疫感作法。
【請求項２０】
請求項１記載の方法による免疫感作サイクルの反復を含む治療方法。
【請求項２１】
サイクル反復が医学的要求を達成するのに有効な免疫応答を維持するのに十分な期間継続される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
サイクル反復が免疫応答の多価性を改善する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
２つ以上の各抗原の１つ又は複数の同調用量及び少なくとも１つの増幅用量を含む、哺乳類における免疫応答を誘導するための免疫原性組成物のセットであって、前記各抗原の同調用量は、前記抗原の少なくとも一部分を含む免疫原又は該免疫原をコードする核酸と、免疫増強剤とを含み、前記増幅用量はペプチドエピトープを含むセット。
【請求項２４】
少なくとも１つの組成物が多価である、請求項２３記載の免疫原性組成物セット。
【請求項２５】
免疫原をコードする核酸が免疫増強剤としての機能を果たす免疫刺激配列をさらに含む、請求項２３記載の免疫原性組成物セット。
【請求項２６】
免疫増強剤がＴＬＲリガンド、免疫刺激配列、ＣｐＧ含有ＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、エンドサイトーシスパターン認識受容体（ＰＲＲ）リガンド、ＬＰＳ、キラヤサポニン、ツカレソール及び炎症誘発性サイトカインから成る群から選択される、請求項２３記載の免疫原性組成物セット。
【請求項２７】
前記用量がリンパ節内送達に適合される、請求項２３記載の免疫原性組成物セット。
【請求項２８】
前記同調用量のうちの少なくとも１つが核酸を含む、請求項２７記載の免疫原性組成物セット。
【請求項２９】
前記核酸の１日の用量が約２５μｇ〜２５００μｇである、請求項２８記載の免疫原性組成物セット。
【請求項３０】
前記増幅用量が、対象となるレシピエント１ｋｇあたり約５μｇ〜５０００μｇのペプチドである、請求項２７記載の免疫原性組成物セット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の背景］
［発明の分野］
本明細書中に開示される本発明の実施の形態は、ＭＨＣクラスＩ拘束性免疫応答を誘導し、応答の性質及び大きさを制御し、且つ発病過程における有効な免疫学的治療を促進するための方法及び組成物に関する。特に実施の形態は、免疫原性組成物、それらの性質、並びにそれらが有効に用いられる投与の順序、時期及び経路に関する。
【０００２】
[関連出願の相互参照]
本出願は、「予防又は治療目的のＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープに対する免疫応答の誘導、増強及び保持方法」と題され、その開示全体が本明細書に参照により援用される、米国特許仮出願第６０／６４０，４０２号に対して米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づく優先権を主張する。
【０００３】
［関連技術分野の説明］
主要組織適合複合体及びＴ細胞標的認識
Ｔリンパ球（Ｔ細胞）は、特定の抗原シグナルに対する応答において機能する抗原特異的免疫細胞である。Ｂリンパ球及びそれらが産生する抗体も抗原特異的なものである。しかしながらＢリンパ球とは違って、Ｔ細胞は、遊離又は可溶性形態では抗原に応答しない。Ｔ細胞が抗原に応答するには、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）として知られている提示複合体に抗原が結合することを必要とする。
【０００４】
ＭＨＣタンパク質は、Ｔ細胞が天然又は「自己」細胞を外来細胞から区別する手段を提供する。ＭＨＣ分子は、Ｔ細胞によりその後モニターされる潜在的ペプチドエピトープを提示する免疫受容体の一種である。２種類のＭＨＣ、即ちクラスＩ  ＭＨＣ及びクラスＩＩ  ＭＨＣが存在する。ＣＤ４+Ｔ細胞は、クラスＩＩ  ＭＨＣタンパク質と相互作用し、主にヘルパー表現型を有し、一方、ＣＤ８+Ｔ細胞は、クラスＩ  ＭＨＣタンパク質と相互作用し、主に細胞溶解性表現型を有するが、それらは各々、調節機能、特に抑制機能も示すことがある。両ＭＨＣは、それらの構造の大部分が細胞の外表面ある、膜貫通型タンパク質である。さらに両クラスのＭＨＣは、それらの外側部分にペプチド結合溝を有する。天然又は外来のタンパク質の小断片が結合され、細胞外環境に提示されるのは、この溝においてである。
【０００５】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）と呼ばれる細胞は、ＭＨＣを用いてＴ細胞に抗原を提示する。ＭＨＣ上に提示される場合、Ｔ細胞は抗原を認識する。これはＭＨＣ拘束性と呼ばれる。抗原が認識可能ＭＨＣにより提示されない場合、Ｔ細胞は認識せず、抗原シグナルに作用しない。認識可能ＭＨＣに結合したペプチドに特異的なＴ細胞は、これらのＭＨＣ−ペプチド複合体と結合して、免疫応答の次の段階に移行する。
【０００６】
見かけ上のＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ拘束性エピトープに対応するペプチドは、Ｔ細胞応答を誘導、増幅し、そうでなければ操作する目的で送達され得る最も簡単な形態の抗原のうちの1つである。ペプチドエピトープはｉｎ  ｖｉｖｏプライム化Ｔ細胞株、クローン又はＴ細胞ハイブリドーマをｉｎ  ｖｉｔｒｏで再刺激する際に有効であることが示されている、という事実にもかかわらず、それらのｉｎ  ｖｉｖｏにおける効果は非常に制限されている。これは、以下の２つの主な要因のためである：
（１）急速な腎クリアランス及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏ分解により引き起こされ、Ａ
ＰＣへのアクセスを制限する、ペプチドの不十分な薬物動態（ＰＫ）プロフィール；
（２）強力且つ持続的免疫応答、特にＴｃ１又はＴｈ１細胞（ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−アルファを産生する）から成る応答を誘導又は増幅するためだけの抗原誘導性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）依存性シグナル伝達単独（シグナル１）の不足。さらに、ペプチドに関連した限られたＰＫを回避するための、大用量のペプチド又はデポーアジュバントの使用は、ある種の免疫増強又は変調アジュバントが一緒に用いられない限り、種々の程度の非応答性又は「免疫偏向」を誘発し得る。
【発明の開示】
【０００７】
［発明の概要］
本発明の実施の形態は、ＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープに対する免疫応答を操作、特に誘導、同調及び／又は増幅するための方法及び組成物を包含する。
【０００８】
いくつかの実施の形態は、免疫感作法に関する。この方法は、例えば、第１の抗原の少なくとも一部分を含むか又はコードする免疫原を含む第１の組成物を哺乳類に送達すること、及び第１の抗原のエピトープに対応する増幅ペプチドを含む第２の組成物を哺乳類のリンパ系に投与することを含んでもよく、第１の組成物及び第２の組成物は異なものである。本方法は、エフェクターＴ細胞応答を得て、それをアッセイ又は検出するステップをさらに含み得る。
【０００９】
第１の組成物は抗原又はその免疫原性断片をコードする核酸を含む。第１の組成物はｐＡＰＣ中のエピトープを発現する核酸を含む。核酸は原生動物、細菌、ウイルス又はウイルスベクターの一構成成分として送達される。第１の組成物は、例えば免疫原性ポリペプチド及び免疫増強剤を含む。免疫増強剤はサイトカイン、トール様受容体リガンド等である。アジュバントは免疫刺激配列、ＲＮＡ等を含む。
【００１０】
免疫原性ポリペプチドは増幅ペプチドであり得る。免疫原性ポリペプチドは第１の抗原であり得る。免疫原性ポリペプチドは原生動物、細菌、ウイルス、ウイルスベクター又はウイルス様粒子等の一構成成分として送達される。アジュバントは原生動物、細菌、ウイルス、ウイルスベクター又はウイルス様粒子等の一構成成分として送達される。第２の組成物はアジュバント無含有及び免疫増強剤無含有である。送達ステップは哺乳類のリンパ系への直接投与を含む。哺乳類のリンパ系への直接投与はリンパ節又はリンパ管への直接投与を含む。直接投与は２つ以上のリンパ節又はリンパ管に対してである。リンパ節は、例えば、鼠径部、腋窩、頚部及び扁桃リンパ節である。エフェクターＴ細胞応答は細胞傷害性Ｔ細胞応答であり得る。エフェクターＴ細胞応答は炎症誘発性サイトカインの産生を包含し、サイトカインは、例えば（ガンマ）γ−ＩＦＮ又はＴＮＦ−α（アルファ）である。エフェクターＴ細胞応答は例えばＲＡＮＴＥＳ又はＭＩＰ−１α等のＴ細胞ケモカインの産生を包含してもよい。
【００１１】
エピトープは、例えば、ハウスキーピングエピトープ又は免疫エピトープである。送達ステップ又は投与ステップは、例えば、１回のボーラス注射、反復ボーラス注射を包含し得る。送達ステップ又は投与ステップは連続注入を包含してもよく、注入は、例えば、約８〜約７日間の持続期間を有し得る。この方法は、送達ステップの終了と投与ステップの開始の間の間隔を包含してもよく、間隔は少なくとも約７日間である。間隔はまた、例えば約７〜約１４日間、約１７日間、約２０日間、約２５日間、約３０日間、約４０日間、約５０日間、又は約６０日間である。間隔は約７５日、約８０日、約９０日、約１００日を上回ることができる。
【００１２】
第１の抗原は疾患関連抗原であってもよく、疾患関連抗原は、腫瘍関連抗原、病原体関連抗原であり得る。実施の形態は、上述した免疫感作法を利用して疾患を治療する方法を
包含する。第１の抗原は標的関連抗原である。標的は新生細胞、病原体感染細胞等である。例えば、いかなる新生細胞も標的となる。病原体感染細胞は、例えば細菌、ウイルス、原生動物、真菌等に感染した、又は、例えば、プリオンに冒された細胞を包含する。
【００１３】
エフェクターＴ細胞応答は、例えばサイトカインアッセイ、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ、細胞傷害性アッセイ、四量体アッセイ、ＤＴＨ応答、臨床応答、腫瘍縮小、腫瘍クリアランス、腫瘍進行の抑制、病原体力価減少、病原体クリアランス及び疾患症候の改善等の少なくとも１つの指標により検出される。本方法は、第１の抗原に対するエフェクターＴ細胞応答を得て、それを検出又はアッセイすることをさらに包含する。
【００１４】
さらなる実施の形態は、第１の抗原又はその免疫原性断片をコードする核酸を含む第１の組成物を哺乳類に送達すること、及び第１の抗原のエピトープに対応するペプチドを含む第２の組成物を哺乳類のリンパ系に直接投与することを含む、免疫感作法に関する。本方法は、抗原に対するエフェクターＴ細胞応答を得て、それを検出又はアッセイすることをさらに含む。
【００１５】
また、実施の形態は、存在する抗原特異的免疫応答の増大方法に関する。本方法は、抗原のエピトープに対応するペプチドを含む、免疫応答を誘導するために用いられていない組成物を哺乳類のリンパ系に直接投与することを含み得る。本方法は、抗原特異的免疫応答を増大させ、それを検出又はアッセイすることをさらに含み得る。この増大は応答を長時間持続すること、静止Ｔ細胞を再活性化すること、抗原特異的Ｔ細胞の数を増大すること等を包含し得る。いくつかの態様では、この組成物は免疫増強剤を含まない。
【００１６】
他の実施の形態は、第１の抗原の少なくとも一部分及び第２の抗原の少なくとも一部分を含むか又はコードすることができる免疫原を含む第１の組成物を哺乳類に送達すること、及び、第１の抗原のエピトープに対応する第１のペプチドを含む第２の組成物、及び第２の抗原のエピトープに対応する第２のペプチドを含む第３の組成物を哺乳類のリンパ系に直接投与することを含む免疫感作法に関する。ここで、第１の組成物は第２の又は第３の組成物とは異なるものである。本方法は、第１及び第２の抗原に対するエフェクターＴ細胞応答を得て、それを検出又はアッセイすることをさらに包含し得る。第２及び第３の組成物のそれぞれは第１の及び第２のペプチドを含み得る。第２及び第３の組成物は単一組成物の一部分であり得る。
【００１７】
さらに別の実施の形態は、抗原特異的寛容原性又は調節性免疫応答を生成する方法に関する。本方法は、抗原のエピトープに対応するアジュバント無含有ペプチドを含む組成物を、エピトープ処理を受けていない哺乳類のリンパ系に直接、定期的に投与することを含み得る。本方法は、寛容原性又は調節性Ｔ細胞免疫応答を得て、それを検出又はアッセイすることをさらに包含する。免疫応答は、例えば、炎症性障害を治療する助けとなる。炎症性障害は、例えば、クラスＩＩ  ＭＨＣ拘束性免疫応答である。免疫応答は免疫抑制性サイトカインの産生を含んでもよく、サイトカインは、例えば、ＩＬ−５、ＩＬ−１０又はＴＧＢ−β等である。
【００１８】
実施の形態は、少なくとも１つの同調用量及び少なくとも１つの増幅用量を含む一連の用量の免疫原を哺乳類のリンパ系に直接投与することを含み、同調用量は免疫原をコードする核酸を含んでもよく、増幅用量は任意のウイルス、ウイルスベクター又は複製−コンピテントベクターを含有しない免疫感作法に関する。本方法は、抗原特異的免疫応答を得ることをさらに含み得る。本方法は、例えば、１〜６以上の同調用量を含む。本方法は、複数の同調用量を投与することを包含してもよく、用量は１日〜約７日間の行程にわたって投与される。同調用量、増幅用量、又は同調及び増幅用量は複数対の注射で投与され、対の第１の構成物質は、対の第２の構成物質の約４日以内に投与されてもよく、異なる対
の第１の構成物質間の間隔は少なくとも約１４日間であり得る。最後の同調用量の投与及び最初の増幅用量の投与間の間隔は、例えば約７〜約１００日である。
【００１９】
その他の実施の形態は、１〜６つ以上の同調用量及び少なくとも１つの増幅用量を含む、哺乳類において免疫応答を誘導するための免疫原性組成物のセットに関し、同調用量は免疫原をコードする核酸を含んでもよく、増幅用量はペプチドエピトープを含んでもよく、エピトープは核酸を発現するｐＡＰＣにより提示される。１つの用量はアジュバント、例えばＲＮＡをさらに含み得る。同調用量及び増幅用量は、リンパ系、リンパ節等への直接投与に適した担体中に存在する。核酸はプラスミドであってもよい。エピトープは、例えば、表１〜表４に列挙されるクラスＩ  ＨＬＡエピトープである。ＨＬＡは好ましくはＨＬＡ−Ａ２である。免疫原はエピトープアレイを含んでもよく、エピトープアレイは遊離配列を含み得る。免疫原は本質的に標的関連抗原から成る。標的関連抗原は腫瘍関連抗原、微生物抗原、他のいかなる抗原等である。免疫原はエピトープクラスターを含むことができる標的関連抗原の断片を含み得る。
【００２０】
さらなる態様は、１〜６つの同調用量及び少なくとも１つの増幅用量を含む、哺乳類においてクラスＩ  ＭＨＣ拘束性免疫応答を誘導するための免疫原性組成物のセットを含んでもよく、同調用量は免疫原又は免疫原をコードする核酸及び免疫刺激物質を含むことができ、増幅用量はペプチドエピトープを含むことができ、エピトープはｐＡＰＣにより提示される。免疫原をコードする核酸は、さらに、免疫刺激剤として機能することができる免疫刺激配列を含み得る。免疫原は、ウイルス、又は免疫増強剤を含むか誘導し得る複製コンピテントベクターであり得る。免疫原は細菌、細菌溶解物又は精製細胞壁構成成分であり得る。細菌細胞壁構成成分はまた、免疫増強剤として機能し得る。免疫増強剤は、例えば、ＴＬＲリガンド、免疫刺激配列、ＣｐＧ含有ＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、エンドサイトーシスパターン認識受容体（ＰＲＲ）リガンド、ＬＰＳ、キラヤサポニン、ツカレソール及び炎症誘発性サイトカイン等である。多価応答の促進のためのいくつかの好ましい実施形態では、セットは、各投与のための種々の各抗原又は抗原の組合せに対応する複数の同調用量及び／又は複数の増幅用量を含み得る。複数の同調用量を、単一の組成物の一部分又は複数の組成物の一部分として投与することができる。増幅用量を、例えば、別個の時間及び／又は複数の部位に投与することができる。
【００２１】
その他の実施の形態は、種々のサイトカインプロフィールの生成方法に関する。本発明のいくつかの実施の形態では、ペプチドの結節内投与はプラスミドＤＮＡワクチンを用いて初期誘導された応答を増幅するのに有効である。さらに、サイトカインプロフィールは、プラスミドＤＮＡ誘導／ペプチド増幅に関して異なり、一般にＤＮＡ／ＤＮＡ又はペプチド／ペプチドプロトコルより大きいケモカイン（化学誘引物質サイトカイン）並びにより少ない免疫抑制サイトカイン産生を生じることができる。
【００２２】
種々の実施形態で使用される増幅ペプチドは、免疫感作抗原のエピトープに対応する。いくつかの実施形態では、対応は、エピトープの天然配列の正確な反復を含む。いくつかの実施形態では、対応は、１つ又は複数のアミノ酸が修飾若しくは置換されているか又はエピトープの長さが変化した天然配列のアナログである対応配列を含む。このようなアナログは、エピトープの免疫原機能を保持し得る（すなわち、機能的に類似する）。好ましい実施形態では、アナログは、天然配列と比較して、１つ又は複数のクラスＩ  ＭＨＣ分子との結合が類似しているか改善されている。他の好ましい実施形態では、アナログは、天然配列と比較して、免疫原性が類似しているか改善されている。アナログを作製するための戦略は、当該技術分野で広く知られている。このような戦略の例示的考察は、全体が本明細書に参照により援用される、共に「エピトープ配列」と題された、２００２年４月４日出願の米国特許出願第１０／１１７，９３７号（公開番号２００３−０２２０２３９Ａ１）及び２００３年９月５日出願の１０／６５７，０２２号（公開番号２００４０１８
０３５４）、共に「ＳＳＸ−２ペプチドアナログ」と題された、２００４年６月１７日出願の米国特許仮出願第６０／５８１，００１号及び２００５年６月１７日出願の米国特許出願第１１／１５６，２５３号（公開番号      ）、並びに、共に「ＮＹ−ＥＳＯペプチドアナログ」題された、２００５年６月１７日出願の米国特許仮出願第６０／５８０，９６２号及び米国特許出願第１１／１５５，９２９号（公開番号      ）に見出すことができる。
【００２３】
なお、さらなる実施形態は、同調及び増幅免疫感作プロトコルで使用されるアジュバント無含有薬の製造におけるペプチドの使用に関する。組成物、キット、免疫原及び化合物を、本明細書中に記載のように、種々の疾患の治療、免疫応答の増幅、及び特定のサイトカイプロフィールの生成等のための薬物処理で使用することができる。実施形態は、免疫応答の増幅方法におけるアジュバント無含有ペプチドの使用に関する。
【００２４】
実施形態は、ＭＨＣに対して特異性を有するエピトープに関連する方法、使用、療法及び組成物を対象とし、例えば、表１〜４に列挙したものが含まれる。他の実施形態は、表１〜４に列挙したＭＨＣのうちの１つ又は複数、あるいはそれらの組合せを含む一方で、他の実施形態は、ＭＨＣのうちの任意の１つ又は複数、あるいはそれらの組合せを特異的に除外する。表３〜４は、列挙したＨＬＡ抗原の頻度を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態は、免疫応答の発生方法に関する。本方法は、第１の抗原（抗原Ａ）の少なくとも一部分及び第２の抗原（抗原Ｂ）の少なくとも一部分を含むか又はコードする免疫原を含む第１の組成物（組成物１）を哺乳類に送達すること、第１のペプチド（ペプチドＡ）を含む第２の組成物（組成物２）及び第２のペプチド（ペプチドＢ）を含む第３の組成物（組成物３）を哺乳類のリンパ系に直接投与することを含むことができ、ペプチドＡは抗原Ａのエピトープに対応し、ペプチドＢは抗原Ｂのエピトープに対応し、組成物１は組成物２又は組成物３と同一ではない。本方法は、さらに、抗原の一方又は両方に対するエフェクターＴ細胞応答を得ることを包含し得る。
【００２６】
いくつかの態様では、組成物２及び組成物３のそれぞれはペプチドＡ及びペプチドＢを含む。ペプチドＡ及びＢを、例えば、異なる回数で投与することを含み、別個の部位又は同一の部位に投与することができる。組成物１は、抗原Ａ及び抗原Ｂの両方又はその一部分をコードする核酸分子を含み得る。また、組成物１は、２核酸分子（例えば、抗原Ａをコードする核酸又はその一部分及び抗原Ｂをコードする核酸又はその一部分）を含み得る。
【００２７】
第１及び第２の抗原は任意の抗原である。好ましくは、第１及び第２の抗原は、黒色腫抗原、ＣＴ抗原、癌関連抗原、ＣＴ抗原及び間質抗原、ＣＴ抗原及び血管新生抗原、ＣＴ抗原及び分化抗原、並びに癌関連抗原及び間質抗原である。種々の抗原の組合せは、全体が本明細書に参照により援用される、「種々の癌型のための組成物における腫瘍関連抗原の組合せ」と題された、２００４年６月１７日出願の米国特許出願第１０／８７１，７０８号（公開番号２００５０１１８１８６）、並びに、「種々の癌型のための組成物における腫瘍関連抗原の組合せ」と題された、２００４年１２月２９日出願の米国特許仮出願第６０／６４０，５９８号、及び本出願と同じ日付で出願の米国特許出願第      ／      号(公開番号      )(代理人整理番号ＭＡＮＮＫ．０４９Ａ)に開示されている。好ましくは、抗原Ａ又はＢを含む抗原は、ＳＳＸ−２、Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ＰＳＭＡ、ＰＲＡＭＥ又はＮＹ−ＥＳＯ−１等である。多数の他の抗原は、当業者に公知である。この実施形態及び他の実施形態では、３つ以上の組成物、免疫原、抗原、エピトープ、及び／又はペプチドを使用することができると理解すべきである。例えば、上記のうちの任意の１つ又は複数の３つ、４つ、５つ又はそれ以上を使用することができる。
【００２８】
他の実施形態は、免疫応答の発生方法であって、例えば、第１の抗原（抗原Ａ）の少なくとも一部分を含むか又はコードすることができる免疫原（免疫原１）を含む第１の組成物（組成物１）、及び第２の抗原（抗原Ｂ）の少なくとも一部分を含むかコードすることができる第２の免疫原（免疫原２）を含む第２の組成物（組成物２）を哺乳類に送達すること、抗原Ａのエピトープに対応する第１のペプチド（ペプチドＡ）を含む第３の組成物（組成物３）及び抗原Ｂのエピトープに対応する第２のペプチド（ペプチドＢ）を含む第４の組成物（組成物４）を哺乳類のリンパ系に直接投与することを含むことができ、組成物１は組成物２又は組成物３とは異なるものである、免疫応答の発生方法を提供する。
【００２９】
いくつかの態様では、例えば、組成物２は組成物３と異なるものである。組成物１及び組成物３を同一部位に送達することができ、例えば、部位は、鼠径部リンパ節である。また、組成物２及び組成物４を、組成物１及び組成物３と異なる部位、例えば、別の鼠径部リンパ節に送達することができる。
【００３０】
なお、さらなる実施形態は、免疫応答の発生方法であって、例えば、第１の抗原及び第２の抗原に対する免疫応答を同調させる手段を含む第１の組成物を送達させること、第１の抗原のエピトープに対応する第１のペプチドを含む第２の組成物、及び第２の抗原のエピトープに対応する第２のペプチドを含む第３の組成物を哺乳類のリンパ系に直接投与することを含むことができ、第１の組成物は第２の組成物又は第３の組成物と異なるものである、免疫応答の発生方法に関する。免疫応答を同調させる手段には、抗原又はその一部分を発現させる手段が含まれる。
【００３１】
また、いくつかの実施形態は、免疫感作法であって、例えば、第１の抗原の少なくとも一部分及び第２の抗原の少なくとも一部分を含むか又はコードすることができる免疫原を含む第１の組成物を哺乳類に送達すること、及び抗原に対する応答を増幅するステップを包含する免疫感作法に関する。好ましくは、抗原に対する応答を増幅するステップは、第１の抗原の少なくとも一部分に対応する第１のペプチドを二次リンパ器官に投与すること、及び第２の抗原の少なくとも一部分に対応する第２のペプチドを異なる二次リンパ器官に投与することを包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明の実施形態は、例えば標的細胞に特異的な免疫細胞を生成するための、標的細胞に対して有効な免疫応答を発生させるための、又は炎症性障害に作用／治療するための方法及び組成物を提供する。この方法及び組成物は、例えば免疫原性組成物、例えばワクチン及び治療薬、並びに予防的及び治療的方法を包含する。本明細書中で開示されるのは、抗原の形態、配列、並びにそれが投与される時期を選択し、二次リンパ系器官に直接抗原を送達することにより、免疫応答の大きさだけでなく性質が管理される、新規の予期せぬ発見である。
【００３３】
いくつかの好ましい実施形態は、Ｔ細胞応答を同調、増幅するための組成物及び方法に関する。例えばこのような方法は、核酸をコードする免疫原を含む組成物が動物に送達される同調ステップを包含する。組成物は、動物の種々の部位に送達されるが、好ましくはリンパ系、例えばリンパ節に送達される。同調ステップは、例えば一定期間にわたって分散するか又は一定期間にわたる連続方式での組成物の１回又は複数回の送達を包含する。好ましくは本方法は、ペプチド免疫原を含む組成物を投与することを包含する増幅ステップをさらに含む。増幅ステップは、例えば一定期間にわたる間隔で、１回大量投与で、又は一定期間にわたって連続的に、１回又は複数回実施される。全ての実施形態で必要であるというわけではないが、いくつかの実施形態は、免疫増強剤又はアジュバントを含む組成物の使用を含む。
【００３４】
全ての方法、図、及び組成物を含む以下の応用形態の各開示は、その全体が本明細書に参照により援用される：「ＭＨＣクラスＩ拘束性免疫系の調節方法」と題された、２００３年６月１７日出願の米国特許仮出願第６０／４７９，３９３号、並びに、「予防又は治療目的のためのＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープに対する免疫応答を誘導、増強、保持する方法」と題された、２００４年６月１７日出願の米国特許出願第１０／８７１，７０７号（公開番号２００５００７９１５２）、２００４年１２月２９日出願の米国特許仮出願第６０／６４０，４０２号、本出願と同じ日付に出願の米国特許出願第      ／      号(公開番号      )(代理人整理番号ＭＡＮＮＫ．０４７Ａ)号、並びに、「種々の癌型のための組成物における腫瘍関連抗原の組合せ」と題された、２００４年６月１７日出願の米国特許出願第１０／８７１，７０８号（公開番号２００５０１１８１８６）、共に「種々の癌型のための組成物における腫瘍関連抗原の組合せ」と題された、２００４年１２月２９日出願の米国特許仮出願第６０／６４０，５９８号、及び米国特許出願第      ／    
号(公開番号      )(代理人整理番号ＭＡＮＮＫ．０４９Ａ)。また、以下の出願は、本発明の方法及び組成物とともに使用することができる方法及び組成物を含む。プラスミド及びプラスミド設計の原理は、その全体が本明細書に参照により援用される、「標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター及びその設計方法」と題された、米国特許出願第１０／２９２，４１３号(公開番号２００３０２２８６３４  Ａ１)に開示され、さらなる方法論、組成物、ペプチド及びペプチドアナログは、それぞれその全体が本明細書に参照により援用される、「ＳＳＸ−２ペプチドアナログ」と題された、２００４年６月１７日出願の米国特許仮出願第６０／５８１，００１号、米国特許出願第１１／１５６，２５３号(公開番号      )、並びに、それぞれその全体が本明細書に参照により援用される、「ＮＹ−ＥＳＯペプチドアナログ」と題された、２００４年６月１７日出願の米国特許仮出願第６０／５８０，９６２号、２００５年６月１７日出願の米国特許出願第１１／１５５，９２９号(公開番号      )、並びに、それぞれその全体が本明細書に参照により援用される、「エピトープ配列」と題された、２００２年４月４日出願の米国特許出願第１０／１１７，９３７号（公開番号２００３０２２０２３９）及び２００３年９月５日出願の同第１０／６５７，０２２号（公開番号２００４０１８０３５４）に開示されている。
【００３５】
いくつかの実施形態では、免疫原の性質及び置かれた状況によって、誘導される免疫応答はその特定の活性及び構成が異なる。特に、ペプチドを用いた免疫感作は細胞傷害性／細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を発生し得るが、さらなる注入によりこの応答をさらに増幅する試みは、調節性Ｔ細胞数の増大及び観察可能なＣＴＬ活性の減少をもたらし得る。したがって付加的免疫増強活性を伴わずにリンパ節内の細胞表面に高ＭＨＣ／ペプチド濃度を付与する組成物は、調節性又は寛容原性応答を意図的に促進するために用いることができる。これに対して、十分な免疫増強シグナルを提供する免疫原性組成物（例えばトール様受容体リガンド（又はそれらが誘導するサイトカイン／自己分泌因子））は、限定抗原のみを提供する場合でさえ、応答を誘導するだけでなく、応答を十分に同調させ、その結果、その後の大量の抗原（例えば注入ペプチド）との接触により、観察された活性の性質を変えることなく応答を増幅する。したがっていくつかの実施形態は、免疫応答プロフィール、例えば、得られた応答の種類並びに産生されたサイトカインの種類の制御に関する。いくつかの実施形態は、ＣＴＬの拡大又はさらなる拡大を促進するための方法及び組成物に関し、例えばＣＴＬよりむしろ調節細胞の増大を促進するための方法及び組成物に関する実施形態が存在する。
【００３６】
開示された方法は、ペプチドのみを用いるか、又は同調及び増幅方法に従わない多数のプロトコルに対して有益である。上記のように、多数のペプチドベースの免疫感作プロトコル及びベクターベースのプロトコルは、欠点を有する。それにもかかわらず、うまくいった場合、ペプチドベースの免疫感作又は免疫増幅戦略は、他の方法、例えば特に特定の微生物ベクターと比べて有利である。これは、より多くの複合ベクター、例えば生弱毒化ウイルス又は細菌ベクターは、有害な副作用、例えばｉｎ  ｖｉｖｏ複製又は組換えを誘
導し得るか、又はベクターそれ自体に対する中和抗体の生成のために反復投与時に無力になる、という事実のためである。さらに、強力な免疫原とするために利用される場合、ペプチドは、プロテアソーム媒介性プロセシングの必要性を回避することができる（タンパク質又はより複雑な抗原を用いる場合と同様に、「交差プロセシング」又はその後の細胞感染の状況において）。それは、ＭＨＣクラスＩ拘束性提示のための細胞性抗原プロセシングは、非主要エピトープを上回る主要な（好ましい）エピトープを固有に選択して、妥当な標的に対応するエピトープの免疫原性を潜在的に妨害する現象のためである。最後に、有効なペプチドベースの免疫感作は、免疫療法の開発の過程を簡単にし、短縮する。
【００３７】
したがって有効なペプチドベースの免疫増幅方法、特に例えば本明細書中に記載される方法は、免疫療法（例えば癌及び慢性感染のための）又は予防的ワクチン接種（ある種の感染性疾患に対する）に対しかなりの利益を有し得る。付加的な利益は、特に厄介な、安全でない又は複雑なアジュバント手法の同時使用により回避することにより達成され得るが、このような技法は本明細書中に記載される種々の実施形態に利用され得る。
【００３８】
定義：
本明細書中の用語の使用状況から明らかである場合を除いて、以下の列挙された用語は、一般に本明細書の目的のために示された意味を有するであろう。
【００３９】
プロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）−Ｔ細胞同時刺激分子を有し、Ｔ細胞応答を誘導し得る細胞。十分に特性化されたｐＡＰＣとしては、樹状細胞、Ｂ細胞及びマクロファージが挙げられる。
【００４０】
末梢細胞−ｐＡＰＣでない細胞。
【００４１】
ハウスキーピングプロテアソーム−普通は末梢細胞中で活性であり、一般的にはｐＡＰＣ中に存在しないか又は強活性でないプロテアソーム。
【００４２】
免疫プロテアソーム−ｐＡＰＣにおいて一般に活性であるプロテアソーム。免疫プロテアソームは感染組織中、又はインターフェロンへの曝露後のいくつかの末梢細胞中でも活性である。
【００４３】
エピトープ−免疫応答を刺激し得る分子又は物質。好ましい実施形態では、本定義によるエピトープとしては、ポリペプチド及びポリペプチドをコードする核酸が挙げられ、この場合、ポリペプチドは免疫応答を刺激し得るが、必ずしもこれらに限定されない。その他の好ましい実施形態では、この定義によるエピトープとしては、細胞の表面上に提示されるペプチドが挙げられ、ペプチドは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用し得るよう、クラスＩ  ＭＨＣの結合溝に非共有結合的に結合されるが、必ずしもこれに限定されない。クラスＩ  ＭＨＣにより提示されるエピトープは、未成熟又は成熟形態であり得る。「成熟」とは、ハウスキーピングエピトープを含むか又は本質的にそれらから成り得るが、非限定的にプロセシングや、プロテアソーム消化、Ｎ末端トリミング又は外因性酵素活性の作用単独または組合わせにより除去される一次翻訳産物中の他の配列も含む任意の前駆体（「未成熟」）と区別してＭＨＣエピトープを指す。したがって成熟エピトープは、やや長いポリペプチド中に埋め込まれて提供されることができ、その免疫学的可能性は、少なくとも一部は、埋込みエピトープによるものである。同様に、成熟エピトープは、ＴＣＲにより認識されるＭＨＣ結合溝中で結合され得るその最終形態で提供され得る。
【００４４】
ＭＨＣエピトープ−哺乳類クラスＩ又はクラスＩＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に対する既知の又は予測される結合親和性を有するポリペプチド。いくつかの十分に特性化されたクラスＩ  ＭＨＣ分子は、表１〜表４に示されている。
【００４５】
ハウスキーピングエピトープ−好ましい実施形態では、ハウスキーピングエピトープは、ＭＨＣエピトープであり、ハウスキーピングプロテアソームが主に活性である細胞上に提示されるポリペプチド断片と定義される。別の好ましい実施形態では、ハウスキーピングエピトープは、上記の定義による、即ち１〜数個のさらなるアミノ酸が隣接したハウスキーピングエピトープを含有するポリペプチドと定義される。別の好ましい実施形態では、ハウスキーピングエピトープは、上記の定義によるハウスキーピングエピトープをコードする核酸と定義される。例示的なハウスキーピングエピトープは、２００２年４月４日出願の米国特許出願第１０／１１７，９３７号（公開番号２００３０２２０２３９Ａ１）及び２００５年２月２５日出願の同第１１／０６７，１５９号（公開番号２００５−０２２１４４０Ａ１）、２００５年２月２５日出願の同第１１／０６７，０６４号（公開番号２００５−０１４２１４４Ａ１）、及び２００３年９月５日出願の同第１０／６５７，０２２号（公開番号２００４−０１８０３５４Ａ１）、並びに２００３年５月９日出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２７７０６号（公開番号ＷＯ２００４／０２２７０９Ａ２）、並びに２００１年４月６日出願の米国特許仮出願第６０／２８２，２１１号、２００１年１１月７日出願の同第６０／３３７，０１７号、２００２年３月７日出願の同第６０／３６３，２１０号及び２００２年９月６日出願の同第６０／４０９，１２３号に提示されている。列挙された出願は各々、「エピトープ配列」と表題を付けられている。このパラグラフで述べた出願はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【００４６】
免疫エピトープ−好ましい実施形態では、免疫エピトープはＭＨＣエピトープであり、免疫プロテアソームが主に活性である細胞上に提示されるポリペプチド断片と定義される。別の好ましい実施形態では、免疫エピトープは上記の定義による、即ち１〜数個のさらなるアミノ酸により隣接される免疫エピトープを含有するポリペプチドと定義される。別の好ましい実施形態では、免疫エピトープはクラスＩ  ＭＨＣに対する既知又は予測される親和性を有する少なくとも２つのポリペプチド配列を有するエピトープクラスター配列を含むポリペプチドと定義される。さらに別の好ましい実施形態では、免疫エピトープは上記の定義のいずれかによる免疫エピトープをコードする核酸と定義される。
【００４７】
標的細胞−好ましい実施形態では、標的細胞は、例えばウイルス又はその他の細胞内寄生生物に感染した細胞、又は新生細胞等の、免疫系の構成成分により作用される病原状態に関連した細胞である。別の実施形態では、標的細胞は本発明のワクチン及び方法により標的化される細胞である。この定義による標的細胞の例としては、新生細胞及び細胞内寄生生物、例えばウイルス、細菌又は原生動物が寄生する細胞が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。標的細胞としては、適正なエピトープ遊離並びに免疫プロテアソームを発現する細胞によるプロセシングを決定又は確定するため、さらに、対象のエピトープに対するＴ細胞特異性又は免疫原性を確定するためのアッセイの一部としてＣＴＬにより標的化される細胞も挙げられる。このような細胞は遊離配列を発現するよう形質転換することができ、又は細胞は単にペプチド／エピトープでパルス標識される。
【００４８】
標的関連抗原（ＴＡＡ）−標的細胞中に存在するタンパク質又はポリペプチド。
【００４９】
腫瘍関連抗原（ＴｕＡＡ）−標的細胞が新生細胞であるＴＡＡ。
【００５０】
ＨＬＡエピトープ−ヒトクラスＩ又はクラスＩＩ  ＨＬＡ複合体分子に対する既知又は予測される結合親和性を有するポリペプチド。特に十分に特性化されたクラスＩ  ＨＬＡは、表１〜表４に示されている。
【００５１】
抗体−生化学的に得られるか、又は組換えＤＮＡの使用によるか又は任意のその他の手段によるものであれ、Ｉｇ結合ドメインから成る天然免疫グロブリン（Ｉｇ）、ポリ又は
モノクローナル、あるいは任意の分子の全部又は一部。例としては、とりわけ、Ｆ（ａｂ）、一本鎖Ｆｖ、及びＩｇ可変部−ファージ被覆タンパク質融合物が挙げられる。
【００５２】
実質的類似性−この用語は、配列の検査により判定した場合に、重要でない様式で参照配列と異なる配列を指すために用いられる。同一アミノ酸配列をコードする核酸配列は、縮重位置の違い又は任意の非コード領域の長さ又は組成の小差にもかかわらず、実質的に類似する。保存的置換又はわずかな長さ変動のみが異なるアミノ酸配列は、実質的に類似している。さらに、Ｎ末端隣接残基の数が異なるハウスキーピングエピトープ、あるいはいずれかの末端の隣接残基の数が異なる免疫エピトープ及びエピトープクラスターを含むアミノ酸配列は実質的に類似する。実質的に類似のアミノ酸配列をコードする核酸は、それ自体も実質的に類似する。
【００５３】
機能的類似性−この用語は、生物学的又は生化学的特性試験により判定した場合に、重要でない様式で参照配列と異なる配列を指すために用いられるが、配列は実質的に類似しない場合がある。例えば２つの核酸は、同一配列のためのハイブリダイゼーションプローブとして有用であり得るが、異なるアミノ酸配列をコードする。交差反応性ＣＴＬ応答を誘導する２つのペプチドは、それらが非保存的アミノ酸置換により異なる場合でも、機能的に類似する（したがって、実質的類似性の定義内ではない）。同一エピトープを認識する抗体対又はＴＣＲは、どんな構造的差異が存在しようと、互いに機能的に類似である。免疫原性の機能的類似性に関する試験は、「変性」抗原で免疫感作し、標的抗原を認識する誘発応答、例えば非限定的に抗原応答、ＣＴＬ応答、サイトカイン産生等の能力を試験することにより実行される。したがって２つの配列は、同一機能を保持しながら、ある点で異なるよう設計される。開示された又は特許請求された配列のこのように設計された配列変異体は、本発明の実施形態の１つである。
【００５４】
発現カセット−プロモーター並びにその他の転写及び翻訳制御素子、例えば非限定的に、エンハンサー、終了コドン、内部リボソーム進入部位及びポリアデニル化部位に操作可能的に連結されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列。カセットは、一宿主分子から別の分子にそれを動かすのを促す配列も包含し得る。
【００５５】
埋込みエピトープ−いくつかの実施形態では、埋込みエピトープは、長いポリペプチド内に全体的に含まれるエピトープである。他の実施形態では、この用語は、エピトープが長いポリペプチドに関して内部の全体的に存在しないよう、Ｎ末端又はＣ末端のみが埋め込まれるエピトープも包含する。
【００５６】
成熟エピトープ−エピトープがＭＨＣペプチド結合溝中に結合される場合に存在するのみで、付加的配列を有さないペプチド。
【００５７】
エピトープクラスター−共有ＭＨＣ拘束性因子に対する結合親和性を有する２つ以上の既知又は予測されるエピトープを含むタンパク質配列、例えばネイティブタンパク質配列の一セグメントであるポリペプチド又はそれをコードする核酸配列。好ましい実施形態では、クラスター内のエピトープの密度は、完全タンパク質配列内の共有ＭＨＣ拘束性因子に対する結合親和性を有する全ての既知又は予測エピトープの密度より大きい。エピトープクラスターは、参照によりその全体が本明細書に援用される、「エピトープクラスター」と題された、２０００年４月２８日出願の米国特許出願第０９／５６１，５７１号に開示され、より詳細に定義されている。
【００５８】
遊離配列−例えば免疫プロテアソーム活性、Ｎ末端トリミング及び／又はその他の工程又は活性単独又は任意の組合せといったプロセシング活性により、ハウスキーピングエピトープを遊離させる、大型配列中に埋め込まれたハウスキーピングエピトープを含むか又
はコードする、設計又は工学処理された配列。
【００５９】
ＣＴＬｐ−ＣＴＬ前駆体は、細胞溶解活性を示すために誘発され得るＴ細胞である。ＣＴＬｐが一般的に観察される二次ｉｎ  ｖｉｔｒｏ溶解活性は、ナイーブ、エフェクター及びメモリーＣＴＬのｉｎ  ｖｉｖｏでの任意の組合せから生じる。
【００６０】
メモリーＴ細胞−抗原により予め活性化されたＴ細胞は、身体中の位置とは関係なく、静止中の生理学的状態にあり、エフェクター機能を獲得するために抗原への再曝露を要する。表現型的には、それらは一般にＣＤ６２Ｌ-ＣＤ４４hiＣＤ１０７α-ＩＧＮ−γ-ＬＴβ-ＴＮＦ−α-であり、そして細胞周期のＧ０にある。
【００６１】
エフェクターＴ細胞−抗原との接触時に、エフェクター機能を容易に示すＴ細胞。エフェクターＴ細胞は一般に、リンパ系を出て、免疫学的末梢に進入する。表現型的には、それらは一般にＣＤ６２Ｌ-ＣＤ４４hiＣＤ１０７α+ＩＧＮ−γ+ＬＴβ+ＴＮＦ−α+であり、活発に循環中である。
【００６２】
エフェクター機能−一般に、細胞溶解性活性の獲得及び／又はサイトカイン分泌を一般に含むＴ細胞活性化。
【００６３】
Ｔ細胞応答の誘導−多数の実施形態においては、非免疫感作細胞、又はいくつかの状況では静止中細胞からＴ細胞応答を発生して、Ｔ細胞を活性化する過程を包含する。
【００６４】
Ｔ細胞応答の増幅−多数の実施形態においては、細胞の数、活性化細胞の数、活性のレベル、増殖の速度、又は特定の応答に関与するＴ細胞の類似のパラメーターを増大する過程を包含する。
【００６５】
同調−多数の実施形態においては、Ｔ細胞の誘導性結合の免疫プロフィールに特定の安定性を付与する誘導を包含する。さまざまな実施形態においては、用語「同調」は「誘発」及び／又は「開始」に相当する。
【００６６】
トール様受容体（ＴＬＲ）−トール様受容体（ＴＬＲ）は、微生物の特定の構成成分及びある種の宿主分子により活性化されるパターン認識受容体の一ファミリーである。生得の免疫系の一部として、それらは多数の病原体に対する最前線の防御に寄与するだけでなく適応免疫においても役割を果たす。
【００６７】
トール様受容体（ＴＬＲ）リガンド−トール様受容体を結合し、活性化し得る任意の分子。例としては、インターフェロンを誘導することが知られているポリＩＣ  Ａ合成二本鎖ＲＮＡが挙げられるが、これに限定されない。ポリマーは、ポリイノシン酸及びポリシチジル酸の各々の一鎖、二本鎖ＲＮＡ、非メチル化ＣｐＧオリゴデオキシリボヌクレオチド又はその他の免疫刺激配列（ＩＳＳ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、β−グルカン及びイミダゾキノリン、並びにその誘導体及びアナログから作られる。
【００６８】
免疫増強アジュバント−ｐＡＰＣ又はＴ細胞を活性化するアジュバント、例えば：ＴＬＲリガンド、エンドサイトーシスパターン認識受容体（ＰＲＲ）リガンド、キラヤサポニン、ツカレソール、サイトカイン等を含む。いくつかの好ましいアジュバントは、参照によりその全体が本明細書に援用される、Marciani, D.J. Drug Discovery Today 8: 934-943, 2003に開示されている。
【００６９】
免疫刺激配列（ＩＳＳ）−一般に非メチル化ＣｐＧ配列を含有するオリゴデオキシリボヌクレオチド。ＣｐＧは、細菌性産生ＤＮＡ、特にプラスミド中にも埋め込まれる。さら
なる実施形態は、種々のアナログを包含する。特に好ましい実施形態は、１つ又は複数のホスホロチオエート結合又は非生理学的塩基を有する分子である。
【００７０】
ワクチン−好ましい実施形態では、ワクチンは、疾患の予防を提供するか又は手助けする免疫原性組成物である。他の実施形態では、ワクチンは、疾患の治癒を提供するか又は手助けする組成物である。他の実施形態では、ワクチン組成物は、疾患の改善を提供するか又は手助けする。ワクチン免疫原性組成物のさらなる実施形態は、治療薬及び／又は予防薬として用いられる。
【００７１】
免疫感作−疾患に対する部分的又は完全防御を誘導するための方法。代替的には抗原に対する免疫系応答を誘導又は増幅するための方法。第２の定義では、この方法は、防御的免疫応答、特に炎症誘発性又は能動免疫を意味し得るが、調節的応答も含む。したがっていくつかの実施形態では、免疫感作は寛容化（免疫系が炎症誘発性又は能動免疫の産生を回避する方法）とは区別され、一方、他の実施形態では、この用語は寛容化を包含する。
【００７２】
【表１−１】
2008526763.tif 000003
【表１−２】
2008526763.tif 000004
【表１−３】
2008526763.tif 000005
【００７３】
【表２−１】
2008526763.tif 000006
【表２−２】
2008526763.tif 000007
【００７４】
【表３】
2008526763.tif 000008
【００７５】
【表４−１】
2008526763.tif 000009
【表４−２】
2008526763.tif 000010
【００７６】
【表５−１】
2008526763.tif 000011
【表５−２】
2008526763.tif 000012
【表５−３】
2008526763.tif 000013
【００７７】
以下の考察は、本発明の態様の実施についての本発明の理解又は所見を記述する。しかしながらこの考察は、特許請求の範囲に記述されていない実施についてのいかなる特定の理論にも本特許を限定するものではない。
【００７８】
腫瘍過程又は微生物感染の有効な免疫媒介性制御は一般に、移動、エフェクター機能及
びメモリー細胞への分化といったような多数の能力を付与された抗原特異的Ｔ細胞の誘導及び増大を包含する。免疫応答の誘導は、種々の方法により試みられ、そして異なる形態の抗原の投与を包含し、免疫応答の大きさ及び質に種々の作用を及ぼす。免疫応答の制御を達成する場合の一限定因子は、プロセシングし、その結果生じるエピトープを特定Ｔ細胞に有効に提示し得るｐＡＰＣをターゲッティングすることである。
【００７９】
この問題の解決は、二次リンパ系器官、ｐＡＰＣに富む微小環境及びＴ細胞への直接抗原送達である。抗原は、例えばポリペプチド又は発現抗原として、任意の種々のベクターにより送達される。免疫の大きさ及び質に関する結果は、例えばベクターの投与量、処方、性質、並びに分子環境を含めた因子により制御される。本発明の実施形態は、免疫応答の制御を強化することができる。免疫応答の制御は、例えば調節的応答から炎症誘発性応答まで、必要に応じて異なる種類の免疫応答を誘導する能力を包含する。好ましい実施形態は、能動免疫療法のための大きな関心であるＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープに対する応答の大きさ及び質の制御強化を提供する。
【００８０】
従来の免疫感作法は、一定の重要な制限を示した。第１に、非常にしばしば、ワクチンの力価に関する結論は、超高感度読み出しアッセイのうちの１つ、又は非常に限定されたパネルから得られた免疫原性データから推定された。しばしば、予防接種レジメンにおける力価が推測によるものであるにもかかわらず、臨床応答は大き過ぎないか又は最適状態であった。第２に、免疫感作後、Ｔ調節細胞は、より慣用的なＴエフェクター細胞とともに、生成され及び／又は増大し、このような細胞は対象の免疫応答の機能を妨害する可能性がある。能動免疫療法におけるこのようなメカニズムの重要性は、近年認識されてきたに過ぎない。
【００８１】
免疫原の結節内投与は、免疫応答の大きさ及びプロフィールの制御のための基礎を提供する。このような投与の結果として得られるｐＡＰＣの有効ｉｎ  ｖｉｖｏ負荷は、その最も簡単な形態で、即ちペプチドエピトープで、そうでなければ一般に不十分な薬物動態に関連した抗原を用いることによってさえ、実質的な大きさの免疫を与えることを可能とする。応答の質は、免疫原の性質、ベクター及び免疫感作のプロトコルにより、さらに制御される。このようなプロトコルは、慢性感染又は腫瘍過程における応答を増強し／変更するために適用される。
【００８２】
免疫感作は従来、免疫応答の大きさを増大するために抗原の反復投与によってきた。ＤＮＡワクチンの使用は、高い質の応答を生じたが、反復追加免疫用量を用いた場合でさえ、このようなワクチンを用いて高度の大きさの応答を得ることは困難であった。応答の両特質、即ち高い質及び低い大きさは、これらのベクターを用いて達成されるＭＨＣ上の相対的に低レベルのエピトープ負荷によるものと思われる。その代わりに、臨床的有用性に必要とされる応答の高度の大きさを達成するために、生ウイルスベクター中にコードされた抗原を用いてこのようなワクチンを追加免疫することは、より一般的になってきた。しかしながら生ベクターの使用は、例えば潜在的安全性問題、前の投与により誘導されたベクターに対する体液性応答のための後期の追加免疫の有効性低減、並びに作製及び製造の経費を含めたいくつかの欠点を伴う可能性がある。したがって生ベクター又はＤＮＡ単独の使用は、高い質の応答を誘導するが、応答の大きさ又は継続性の限定を生じる可能性がある。
【００８３】
本明細書中に開示されるのは、ペプチドに適用される場合、それらを免疫療法ツールとして有効にさせるプロトコルに並びに方法に関する実施形態である。このような方法は、ペプチドのＰＫ欠乏性を回避し、しばしば特定のより複雑なレジメンの状況で適用される場合、免疫応答の強固な増幅及び／又は制御を生じる。好ましい実施形態では、リンパ系器官へのペプチドの直接投与は、Ｔｃｌ細胞から成る強力な免疫応答、中等度の免疫応答
、又は軽度の免疫応答さえ（従来の技法による検出のレベルで又はそれより低いレベルで）誘導するプライミング剤の後に、免疫応答の予期せぬ強力な増幅を生じる。本発明の好ましい実施形態は、免疫感作の全ての段階で抗原のリンパ内投与を用いる一方、アジュバント無含有ペプチドのリンパ内投与が最も好ましい形態である。リンパ内投与を利用するペプチド増幅は、予め誘導されているであろう現存の免疫応答に適用される。先の誘導は、抗原への天然曝露により、又は一般的に用いられる投与経路、非限定的に、例えば皮下、皮内、腹腔内、筋肉内及び粘膜投与により生じる。
【００８４】
本明細書に示すように、特異的Ｔ細胞が増大をもたらすのに最適な開始は、同時刺激が十分に行われるような状況下（リンパ節等）での限られた量の抗原（しばしばプラスミドコード抗原の発現の制限に起因する）への非免疫感作Ｔ細胞の曝露によってより良好に達成することができる。これにより、抗原提示細胞上でのＭＨＣ−ペプチド複合体を高親和性で認識するＴ細胞受容体を保有するＴ細胞を活性化し、その後の刺激に対してより高い反応性を示す記憶細胞を生成することができる。免疫増強剤の使用によって有利な同時刺激環境を、増大又は確立することができ、利点があるが、全ての実施形態で免疫応答の開始にリンパ内投与が必要というわけではない。誘導／同調のためのエピトープペプチドの使用を含む実施形態では、特に直接リンパ内投与を使用する場合、提示が拘束されるように比較的低投薬量のペプチド（増幅用量又はＭＨＣ飽和濃度と比較した場合）を使用することができることが好ましい。このような実施形態は、一般に、同調を達成するための免疫増強剤の含有を包含する。
【００８５】
遊離ペプチドの薬物動態が十分でないことにより、ほとんどの投与経路においてそれらの使用が妨げられたが、２次リンパ系器官、特にリンパ節への直接投与は、連続注入又は高頻度（例えば毎日）注射により多少継続的に抗原のレベルが保持される場合、有効であることが立証された。ＣＴＬの生成のためのこのような結節内投与は、参照によりその全体が本明細書に援用される、米国特許出願第０９／３８０，５３４号及び同第０９／７７６，２３２号（公開番号２００２０００７１７３Ａ１）、現在は２００５年１２月１９日出願の米国特許第６，９７７，０７４号及び      ／      （公開番号      ）（代理人整理番号第ＭＡＮＮＫ．００１ＣＰ２Ｃ１）、並びに「ＣＴＬ応答の誘導方法」と題されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２８９（公開番号ＷＯ９９０２１８３Ａ２）に開示されている。本発明のいくつかの実施形態では、ペプチドの結節内投与は、プラスミドＤＮＡワクチンで最初に誘導された応答を増幅するのに有効であった。さらにサイトカインプロフィールは異なり、プラスミドＤＮＡ誘導／ペプチド増幅に関しては、一般にＤＮＡ／ＤＮＡ又はペプチド／ペプチドプロトコルよりも大きいケモカイン（化学誘引物質サイトカイン）及びより低い免疫抑制性サイトカイン産生を生じた。
【００８６】
したがって、このようなＤＮＡ誘導／ペプチド増幅プロトコルは、癌及び慢性感染症のための治療ワクチンを含む組成物の有効性を改善することができる。このような免疫療法のための有利なエピトープ選択原理は、全体が本明細書に参照により援用される、「抗原提示細胞におけるエピトープ同調」と題された、２００１年１１月７日出願の米国特許出願第０９／５６０，４６５号、同第１０／０２６，０６６号（公開番号２００３０２１５４２５Ａ１）、１０／００５，９０５号、及び２００４年７月２０日出願の同第１０／８９５，５２３号（公開番号２００５−０１３０９２０Ａｌ）、及び２００４年７月２０日出願の同第１０／８９６，３２５号（公開番号      ）、並びに、「エピトープ発見方法」と題された、２００４年１０月１日出願の、現在、米国特許第６，８６１，２３４号である米国特許出願第０９／５６１，０７４号及び同第１０／９５６，４０１号（公開番号２００５−００６９９８２Ａｌ）、並びに、「エピトープクラスター」と題された、２０００年４月２８日出願の同第０９／５６１，５７１号、並びに、「癌のための抗新脈管系」と題された、２００２年３月７日出願の１０／０９４，６９９号（公開番号２００３００４６７１４Ａ１）及び２００５年６月３０日出願の同第１１／０７３，３４７号（公開
番号      ）、並びに、「エピトープ配列」と題された、２００２年４月４日出願の同第１０／１１７，９３７号（公開番号２００３０２２０２３９Ａ１）、２００５年２月２５日出願の同第１１／０６７，１５９号（公開番号２００５−０２２１４４０Ａ１）、２００５年２月２５日出願の同第１０／０６７，０６４号（公開番号２００５−０１４２１１４Ａｌ）、同第１０／６５７，０２２号（公開番号２００４−０１８０３５４Ａｌ）、及びＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２７７０６号（公開番号ＷＯ０４／０２２７０９Ａ２）に開示されている。ワクチンプラスミドの全体的設計の態様は、全体が本明細書に参照により援用される、「標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター」と題された、２０００年４月２８日出願の米国特許出願第０９／５６１，５７２号及び２００２年８月２０日出願の同第１０／２２５，５６８号（公開番号２００３−０１３８８０８Ａｌ）、並びに、「標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター及びそれらの設計方法」と題された、２００４年２月１０日出願の同第１０／２９２，４１３号（公開番号２００３０２２８６３４Ａ１）、同第１０／７７７，０５３号（公開番号２００４−０１３２０８８  Ａｌ）及び２００４年４月３０日出願の同第１０／８３７，２１７号（公開番号      ）；並びに、「プラスミド増殖における望ましくない複製中間体の回避」と題された、２００３年５月１３日出願の同第１０／２２５，５６８号（公開番号２００３−０１３８８０８Ａ１）、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２６２３１（公開番号ＷＯ２００４／０１８６６６）及び米国特許第６，７０９，８４４号、及び米国特許出願第１０／４３７，８３０号（公開番号２００３−０１８０９４９Ａｌ）に開示されている。特定の癌に対して免疫応答を誘導する場合に特定の利点を有する特異抗原組合せは、全体が本明細書に参照により援用される、「種々の種類の癌のためのワクチン中の腫瘍関連抗原の組合せ」と題された、２００３年６月１７日出願の米国特許仮出願第６０／４７９，５５４号、２００４年６月１７日出願の米国特許出願第１０／８７１，７０８号（公開番号２００５−０１１８１８６Ａｌ）、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１９５７１号（公開番号ＷＯ２００４／１１２８２５）、２００５年１２月２９日出願の米国特許仮出願第６０／６４０，５９８号、及び本出願と同じ日付に出願の米国特許出願第    ／  
，      号（公開番号      ）（代理人整理番号：ＭＡＮＮＫ．０４９Ａ）に開示されている。ＢＲＭのリンパ内投与の使用及び利点は、全体が本明細書に参照により援用される、「リンパ器官への生物学的応答調節物質の標的化投与によって免疫応答を誘発、維持、操作する方法」と題された、２００５年１２月２９日出願の米国特許仮出願第６０／６４０，７２７号及び本出願と同じ日付に出願の米国特許出願第    ／      ，      号(公開番号      )(代理人整理番号ＭＡＮＮＫ．０４６Ａ)に開示されている。さらなる方法論、組成物、ペプチド及びペプチドアナログは、全体が本明細書に参照により援用される、「抗原の商品化方法」と題された、２００１年１１月７日出願の米国特許出願第０９／９９９，１８６号、並びに「免疫応答の誘導におけるＣＤ４+細胞の迂回方法」と題された、２００５年１２月２９日出願の米国特許仮出願第６０／６４０，８２１号及び本出願と同じ日付に出願の米国特許出願第    ／      ，      号（公開番号      ）(代理人整理番号ＭＡＮＮＫ．０４８Ａ)に開示されている。
【００８７】
他の関連する開示は、本明細書に参照により援用される、「エピトープアナログ」と題された、２００５年６月１７日出願の米国特許出願第１１／１５６，３６９号(公開番号
)及び米国特許仮出願第６０／６９１，８８９号に存在する。同様に、全体が本明細書に参照により援用される、「癌細胞及び腫瘍基質上に発現した主要及び非主要エピトープに対する多価免疫応答を誘導するための方法及び組成物」と題された、２００５年６月１７日出願の米国特許仮出願第６０／６９１，５７９号、及び「癌腫のための多価同調−増幅免疫療法」と題された、２００５年６月１７日出願の同第６０／６９１，５８１号も関連する。
【００８８】
意外にも、従来の初回抗原免疫−追加免疫スケジュールによるペプチドの反復結節内注射は、初回投与単独後に観察された応答と比較して、細胞溶解性応答の大きさの低減を生
じた。免疫応答プロフィールの検査は、これが、非応答性というよりむしろ免疫調節（抑制）の誘導の結果であることを示す。これは、ＤＮＡコード化免疫原、典型的にはプラスミドを包含する誘導及び増幅プロトコルと対照を成す。抗原の結節内注射によるｐＡＰＣの直接負荷は一般に、他の非経口経路を介して送達される抗原の薬物動態を矯正するために一般的に用いられるアジュバントに対する必要性を減少するか又は不要にする。したがって一般に炎症誘発性であるこのようなアジュバントがなければ、ペプチド免疫感作を用いて従来観察されているもの（即ち調節性又は寛容原性）と異なる免疫応答プロフィールの誘導を促し得る。応答は、以下の実施例に示されるように、初回注射部位から離れた二次リンパ系器官で測定されるため、このような結果は、進行中の炎症反応を調節（抑制）するための本発明の実施形態による方法及び組成物の使用を支持する。このアプローチは、同一抗原又は炎症の部位に関連した任意の適切な抗原をターゲッティングし、免疫抑制性サイトカインにより媒介される第三者作用に頼ることにより、クラスＩＩ  ＭＨＣ拘束性病因を有する炎症性障害にも有用であり得る。
【００８９】
反復ペプチド投与が細胞溶解性免疫応答を徐々に低減する、という事実にもかかわらず、非複製組換えＤＮＡ（プラスミド）のような作因による誘導はその後の投与に実質的影響を及ぼし、組換えＤＮＡ及びペプチドにより発現されるエピトープに対する免疫の強固な増幅を可能にし、その細胞溶解性を同調させる。実際、組換えＤＮＡベクター又はペプチドの１回又は多数回投与が別々に免疫応答を達成しないか又は適度の免疫応答を達成した場合、ＤＮＡによる誘導及びペプチドによる増幅は、応答数の比率及び応答の大きさとして、実質的により高い応答を達成した。示された例では、組換えＤＮＡ誘導／ペプチド増幅プロトコルを用いることにより、応答速度は少なくとも二倍であり、そして応答の大きさ（平均及び中央値）は少なくとも三倍であった。したがって好ましいプロトコルは、リンパ系及び非リンパ系器官内で、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗原細胞を取扱い得る免疫（Ｔｃｌ免疫）の誘導を生じる。ほとんどの癌免疫療法における一限定因子は、おそらくはＭＨＣ／ペプチド提示低減のための、免疫媒介性攻撃に対する腫瘍細胞の感受性の制限である。好ましい実施形態では、免疫の強固な増大は、ＤＮＡ誘導／ペプチド増幅により達成され、毒性微生物による感染後に一般に観察されるのとほぼ等しいか又はそれ以上の免疫応答の大きさを伴う。この大きさの増大は、不十分なＭＨＣ／ペプチド提示を補償するのに役立ち、例えばＨＬＡトランスジェニックマウスのような特殊化前臨床モデルにおいて示されるようなヒト腫瘍細胞のクリアランスを生じる。
【００９０】
組換えＤＮＡ同調投与の特定の配列とその後のリンパ系器官に投与されたペプチド追加免疫を包含するこのような誘導及び増幅プロトコルは、例えば、感染性又は新生物性疾患の予防又は治療のための、強力なＴ細胞応答の誘導、増幅及び保持の目的のために有用である。このような疾患は、癌腫（例えば腎臓、卵巣、乳房、肺、結腸直腸、前立腺、頭部及び頚部、膀胱、子宮及び皮膚）、黒色腫、種々の起源の腫瘍、並びに概して、限定腫瘍関連抗原又は限定可能な腫瘍関連抗原を発現する腫瘍、例えば腫瘍胎児性（例えばＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＣＲＤ−ＢＰ、Ｄａｓ−１、５Ｔ４及びＴＡＧ−７２等）、組織分化（例えばＭｅｌａｎＡ、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＰＳＡ及びＰＳＭＡ等）又は癌−精巣抗原（例えばＰＲＡＭＥ、ＭＡＧＥ、ＬＡＧＥ、ＳＳＸ−２及びＮＹ−ＥＳＯ−１等；表５参照）である。癌−精巣遺伝子及びがん治療に関するそれらの関連性は、参照によりその全体が本明細書に援用される、Scanlon et al., Cancer Immunity 4: 1-15, 2004で検討されている。腫瘍新脈管系に関連する抗原（例えばＰＳＭＡ、ＶＥＧＦＲ２、Ｔｉｅ−２）も、参照によりその全体が本明細書に援用される、「癌のための抗新脈管系調製」と題された、２００５年６月３０日出願の米国特許出願第１０／０９４，６９９号（公開番号２００３００４６７１４Ａ１）及び同第１１／０７３，３４７号（公開番号      ）に開示されているように、癌性疾患との結びつきにおいても有用である。この方法及び組成物は、種々の生物体及び疾患状態をターゲッティングするために用いられ得る。例えば標的生物体としては、細菌、ウイルス、原生動物、真菌等が挙げられ得る。標
的疾患は、例えばプリオンにより引き起こされるものを包含し得る。例示的な疾患、生物体及び抗原、並びに標的生物体、細胞及び疾患に関連したエピトープは、参照によりその全体が本明細書に援用される、米国特許出願第０９／７７６，２３２号（公開番号２００２０００７１７３Ａ１）、現在は米国特許第６，９７７、０７４号に記載されている。検討される感染性疾患の中には、慢性感染（ＨＩＶ、単純ヘルペスウイルス、ＣＭＶ、Ｂ及びＣ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス等）を確立する傾向がある作因により引き起こされるもの、及び／又は急性感染（例えばインフルエンザウイルス、麻疹、ＲＳＶ、エボラウイルス）と結び付けられるものがある。興味深いのは、予防又は治療の見地から発癌能力を有するウイルス、例えばパピローマウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス及びＨＴＬＶ−１である。これらの感染性作因は全て、ペプチドエピトープのような組成物を設計するための基礎として用いられ得る限定抗原又は限定可能な抗原を有する。
【００９１】
このような方法の好ましい用途（例えば図１９参照）としては、好ましくは免疫学的に不活性な担体又は処方物中（用量範囲１ｎｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．００５〜５ｍｇ／ｋｇ）の、組換えＤＮＡ（用量範囲０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．００５〜５ｍｇ／ｋｇ）の多数回（例えば１〜１０又はそれ以上、２〜８、３〜６、好ましくは約４又は５）の投与と、その後のペプチドの１回又は複数回（好ましくは約２）の投与で開始する１つ又は複数のリンパ節への注射又は注入が挙げられる。用量は必ずしも被験体のサイズに伴って直線状に決められるわけではなく、ヒトに関する用量はより低い方に向かう傾向があり、マウスに関する用量は高い方に向かう可能性があり、これらの部分は多岐にわたる。注射時のプラスミド及びペプチドの好ましい濃度は、一般に約０．１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌであり、最も好ましい濃度は約１ｍｇ／ｍｌであり、一般に被験体のサイズ又は種とは関係ない。しかしながら特に強力なペプチドは、この範囲の低末端方向に、例えば１〜１００μｇ／ｍｌに最適濃度を有する。寛容を促進するためにペプチドのみのプロトコルが用いられる場合、これらの範囲の高い方の末端に向かう用量が一般に好ましい（例えば０．５〜１０ｍｇ／ｍｌ）。この配列は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの強力な免疫応答を保持する必要がある限り反復される。さらに、ＤＮＡの最終同調投与とペプチドの最初の増幅投与間の時間は重要でない。好ましくはそれは約７日又はそれ以上であり、数ヶ月を超え得る。ＤＮＡ及び／又はペプチドの多数回の注射は、数日間（好ましくは２〜７日）継続する置換注入により低減され得る。注射として投与されるものと同様の物質のボーラスを用いた注入を開始し、その後、緩徐注入（ＤＮＡに関して約２５〜２５００μｇ／日を送達するために２４〜１２０００μｌ／日、ペプチドに関して０．１〜１００００μｇ／日）するのが有益である。これは、手動で、又はプログラム可能なポンプ、例えばインスリンポンプの使用により成し遂げられる。このようなポンプは当該技術分野で既知であり、いくつかの実施形態において必要とされる周期的スパイク及びその他の投与量プロフィールを可能にする。
【００９２】
本発明は、一般に、１つの用量及び開始用量の投与を含む１サイクルの免疫感作及びその後の１つ又は複数の増幅用量の投与を記載している。本発明のさらなる実施形態は、反復投与サイクルを必要とする。このような反復サイクルを使用して、応答の大きさをさらに増大させることができる。また、多価応答が求められる場合、全ての個体は、１免疫感作サイクルの結果として各標的化抗原に対する実質的応答を必ずしも達成しない。特定の個体が各標的化抗原に対して適切な応答を達成するまで免疫感作サイクルを繰り返すことができる。個々の免疫感作サイクルを変更して、投与される各個々の成分の投与の順序、時期、又は数の調整によってよりバランスの取れた応答を得ることもできる。複数回投与サイクルを使用して、応答を長期間維持することもできる。例えば、疾患又は他の病状の治療に合わせて有利となるように実質的に同一に増幅すべき応答の活性なエフェクター段階を維持することができる。
【００９３】
なお、この方法はタンパク質の接合、アジュバントの付加等を伴わずに首尾よくペプチ
ドを使用するが、増幅過程では、このような構成成分の非存在は必要とされない、ということに留意すべきである。したがって接合ペプチド、アジュバント、免疫増強剤等が実施形態において用いられる。種々の形態のペプチドエピトープ又は抗原から成るか又はそれらを包含する、ペプチドパルス標識樹状細胞、懸濁液、例えばリポソーム処方物、凝集物、乳濁液、マイクロ粒子、ナノ結晶を含めた、リンパ節に投与されるあるいはリンパ系に向かわせる能力を有するペプチドのより複雑な組成物は、当該方法における遊離ペプチドに置換される。逆に言えば、結節内投与によるペプチド追加免疫は、控えめなレベルでさえ、Ｔメモリー細胞の誘導を達成する任意の手段及び／又は経路により初回免疫の後に実施され得る。
【００９４】
抗原発現のモザイク現象又は抗原の変異若しくは喪失に起因する耐性の発生を減少させるために、複数（好ましくは２〜４種）の抗原に対して同時に免疫感作することが有利である。抗原の任意の組合せを使用することができる。特定の腫瘍の抗原発現プロフィールを使用して、どの抗原又は抗原の組合せを使用するのかを決定することができる。例示的方法は、それぞれその全体が本明細書に参照により援用される、「種々の癌型の診断における腫瘍関連抗原の組合せ」と題された、２００４年６月１７日出願の米国特許仮出願第６０／５８０，９６９号、２００５年６月１７日出願の米国特許出願第１１／１５５，２８８号、及び本出願と同じ日付に出願の米国特許出願第    ／      ，      号(公開番号      )(代理人整理番号ＭＡＮＮＫ．０５０ＣＰ１)に見出される。選択された癌の治療に特に適切な抗原の特定の組合せは、上記引例で引用及び援用される、米国特許仮出願第６０／４７９，５５４号、米国特許出願第１０／８７１，７０８号（公開番号２００５−０１１８１８６Ａｌ）、及びＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１９５７１号に開示されている。複数の抗原又は１抗原由来のエピトープに対する免疫応答を誘発するために、これらの方法を使用して、複数の免疫原性物質を個別又は混合物として送達させることができる。免疫原を個別に送達させる場合、異なる物質を異なるリンパ節に、異なる時間で同一のリンパ節に、又は同時に同一のリンパ節に投与することが好ましい。これは、特に、全ての成分ペプチドに溶解性又は安定性を付与する１処方物を考案することが困難であり得るペプチド送達に関連する。１核酸分子は、複数の免疫原をコードし得る。あるいは、粘度が問題となる高濃度の核酸を必要とすることなく目的の用量を提供することができる限り、複数の抗原についての１つ又は全成分の小集団をコードする複数の核酸分子を混合することができる。
【００９５】
好ましい実施形態では、本方法はリンパ系への直接投与を要する。好ましい実施形態では、これはリンパ節への直接投与である。輸入リンパ管が同様に好ましい。リンパ節の選択は重要でない。鼠径部リンパ節がそれらのサイズ及び接近可能性のために好ましいが、腋窩及び頚部リンパ節並びに扁桃が同様に有益である。単一リンパ節への投与は、免疫応答を誘導するか又は増幅するのに十分である。多数のリンパ節への投与は、応答の信頼性及び大きさを増大し得る。多価応答を促進し、それにより、複数の増幅ペプチドが使用される実施形態のために、１ペプチドのみを任意の特定の場合に任意の特定のリンパ節に投与することが好ましい。したがって、例えば、第１のペプチドを右鼠径部リンパ節に投与し、第２のペプチドを同時に左鼠径部リンパ節に投与することができる。Ｔリンパ球が移動するため開始及び増幅用量を同一部位に投与することが不可欠ではないので、他のリンパ節が誘導部位に存在しない場合でも、さらなるペプチドを他のリンパ節に投与することができる。あるいは、任意のさらなるペプチドを、数日後に、例えば、前に投与した増幅ペプチドのために使用した同じリンパ節に投与することができる。このことは、誘導から増幅までの間隔が一般に重要なパラメーターではないからであるが、好ましい実施形態では、時間間隔は約１週間を超え得る。増幅ペプチドの投与の分離は、一般に、そのＭＨＣ結合親和性が類似している場合はあまり重要ではないが、親和性が異なるようになるにつれて重要になり得る。種々のペプチドの配合が適合しない場合も、分離投与が好ましくなり得る。
【００９６】
このような免疫感作法から利益を得ることができる患者は、ＭＨＣタンパク質発現プロフィール及び全身レベルの免疫応答性を明らかにすることにより集められた。さらに彼等の免疫レベルは、末梢血へのアクセスとともに標準技術を用いてモニタリングされる。最後に、治療プロトコルは、誘導又は増幅期に対する応答性、並びに抗原発現における変動に基づいて調整される。例えば反復同調用量は、好ましくは検出可能な応答が得られるまで投与することができ、数組の同調用量後に増幅するというのではなく、次に増幅ペプチド用量を投与する。同様に、予定された増幅又は維持用量のペプチドは、それらの有効性が徐々に弱まり、抗原特異的調節Ｔ細胞数が増大し、又は寛容のいくつかの他の証拠が観察されたならば、中断され、そしてさらなる同調が施された後、ペプチドによる増幅を再開し得る。免疫感作法により免疫応答性を評価し、モニターするための診断手法の組込みは、全体が本明細書に参照により援用される、「診断方法を治療方法と一本化することによる能動免疫療法の効力改善」と題された、２００４年６月１７日出願の米国特許仮出願第６０／５８０，９６４号及び米国特許出願第１１／１５５，９２８号（公開番号      ）により完全に考察されている。
【００９７】
本発明の多数の方法論的実施形態の実施は、少なくとも２つの異なる組成物の使用を含み、特に、複数の標的抗原が存在する場合、数種の組成物を共に及び／又は異なる時間で投与することを含む。したがって、本発明の実施形態は、免疫原性組成物のセット及びサブセット並びにその個別の用量を含む。多価免疫原、１価免疫原の組合せを含む組成物の使用、１つ又は複数の１価免疫原若しくはその種々の組合せを含む組成物の調整された使用により、多価性を達成することができる。このような方法によって特定の治療計画又は治療プロトコルで使用するために製造された複数の組成物は、免疫治療製品を限定する。いくつかの実施形態では、製品の全て又はサブセットを、キット中に共に包装する。いくつかの例では、１エピトープ又はエピトープセットをターゲティングする誘導及び増殖組成物を、共に包装することができる。他の例では、複数の誘導組成物を一方のキットに集め、対応する増幅組成物を他方のキットに集めることができる。あるいは、組成物を包装し、どのようにして組成物を互いに組合せて使用すれば本発明の方法の有利な結果を得ることができるのかについて記載した印刷用紙の形態又は機械読み取り可能な媒体の形態の説明書と共に個別に販売することができる。さらなるバリエーションが当業者に明らかである。全体が本明細書に参照により援用される、「種々の癌型の診断における腫瘍関連抗原の組合せ」と題された、２００４年６月１７日出願の米国特許仮出願第６０／５８０，９６９号、２００５年６月１７日出願の米国特許出願第１１／１５５，２８８号（公開番号      ）、及び２００５年１２月２９日に出願の米国特許出願第    ／      ，      号 (代理人整理番号ＭＡＮＮＫ．０５０ＣＰ１)、並びに、「診断方法を治療方法と一本化することによる能動免疫療法の効力改善」と題された、米国特許仮出願第６０／５８０，９６４号及び米国特許出願第１１／１５５，９２８号（公開番号      ）に記載のように、特定のプロトコル又はレジメンで使用することができる全てではない組成物を含む種々の包装スキームの使用により、例えば、腫瘍抗原発現又は免疫治療薬若しくはその種々の成分に対する応答の所見に基づいて、治療の個人化が容易になる。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本発明のある特定のいくつかの実施形態を説明及び主張するために使用される成分の量、分子量及び反応条件等の性質を示す数は、いくつかの場合、「約」という用語で修飾されると理解すべきである。したがって、いくつかの実施形態では、説明文及び添付の特許請求の範囲に記載の数のパラメーターは近似値であり、これらは、特定の実施形態によって得られると考えられる目的の性質に応じて変化し得る。いくつかの実施形態では、数のパラメーターは、記載された有効数字に照らし、通常の四捨五入の適用によって解釈すべきである。本発明のいくつかの実施形態の広い範囲を示す数値域及びパラメーターは近似値であるが、特定の例に記載の数値は実用可能に正確に記載している。本発明のいくつかの実施形態に示す数値は、一定の誤差を含む可能性があり、こ
の誤差は必然的にその各試験での測定で見出された標準偏差に起因する。
【００９９】
いくつかの実施形態では、用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」、並びに本発明の特定の実施形態を説明する文脈（特に、以下の特許請求の範囲の一定の文脈）で使用される類似の指示対象は、単数又は複数の両方を対象とすると解釈することができる。本明細書中の値の範囲の列挙は、範囲内に含まれる１つ１つの別個の値について言及する簡便な方法としての機能を果たすことを意図するに過ぎない。本明細書中の他で示さない限り、各個々の値は、本明細書中で個別に引用されているかのように本明細書中に組み込まれる。本明細書中の他で示さない限り、又は文脈上明確に矛盾しない限り、本明細書中に記載の全ての方法を任意の適切な順序で行うことができる。本明細書中の一定の実施形態に関して提供される任意及び全ての実施形態又は例示の用語（例えば、「〜等」）の使用は、本発明をより明確に説明することを意図するに過ぎず、特許請求の範囲に記載の他の本発明の範囲を限定しない。明細書中に記載されていない事項は、本発明の実施に不可欠な、特許請求の範囲に記載していない任意の要素を示すと解釈すべきである。
【０１００】
本明細書中に開示されている本発明の別の要素又は実施形態のグループは、本発明を制限すると解釈すべきではない。各グループのメンバーを、個別に、又はグループの他のメンバー若しくは本明細書中で見出される他の要素との任意の組合せを言及し、主張することができる。利便性及び／又は特許性の理由で、グループの１つ又は複数のメンバーを、グループに含めるかグループから削除することができると予想される。任意のこのような含有又は削除が起こる場合、明細書は、修正されたグループを含み、それにより、添付の特許請求の範囲で使用される全てのマーカッシュグループの記載を満たすと見なされる。
【０１０１】
本発明の好ましい実施形態を本明細書中に記載しており、これらには、本発明者らに既知の、発明実施の最良の形態が含まれる。これらの好ましい実施形態の変形形態は、上記説明を読んだ際に当業者に明らかとなるであろう。当業者は必要に応じてこのような変形形態を使用することができ、本明細書中に具体的に記載されていない別の方法で本発明を実施することができることが意図される。したがって、本発明の多数の実施形態には、適用法によって許容される場合、添付の特許請求の範囲に引用した主題の全ての修正形態及び等価物が含まれる。さらに、他に示されないか、又は文脈上明確に矛盾しない限り、全ての可能な変形形態における上記要素の任意の組合せは、本発明に含まれる。
【０１０２】
さらに、本明細書の至るところに、特許及び刊行物への多数の言及がなされている。上記の各参考文献及び刊行物は、その全体が本明細書に参照により個別に援用される。
【０１０３】
最後に、本明細書中に開示の本発明の実施形態は、本発明の原理を例示すると理解すべきである。使用することができる他の修正形態は、本発明の範囲内に含まれる。したがって、制限されないが、例として、本明細書中の教示に従って本発明の別の形態を使用することができる。したがって、本発明は、正確に表示及び説明した発明に限定されない。
【０１０４】
以下の実施例は例証のためにすぎず、いかなる点でも本発明又はその種々の実施形態の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１０５】
実施例１：リンパ内免疫感作による免疫応答の高効率誘導
ヒトＭＨＣクラスＩ（Ａ*０２０１、「ＨＨＤ」と呼ばれる；参照によりその全体が本明細書に援用されるPascolo et al. J. Exp. Med. 185(12):2043-51, 1997を参照）のキメラ一本鎖バージョンを発現する導入遺伝子を有するマウスを、以下のように結節内投与により免疫感作した。誘導のためにＭｅｌａｎ−Ａ  ２６〜３５  Ａ２７Ｌアナログを発現するプラスミド（ｐＳＥＭ）を用いて、５グループのマウス（ｎ＝３）を、異なる注射
経路：皮下（ｓｃ）、筋肉内（ｉｍ）及びリンパ内（ｉｎ、鼠径部リンパ節中への直接接種を使用）を用いることにより、免疫感作し、１週間後に増幅した。免疫感作及び投与量のスケジュールを、図１Ａに示す。増幅１週間後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を調製して、タグ付けした抗ＣＤ８ｍＡｂ及びＭｅｌａｎＡ  ２６〜３５特異的Ｔ細胞受容体を認識する四量体を用いて染色した。代表的データを図１Ｂに示す。一方、皮下及び筋肉内投与は、約１％又はそれ未満の四量体＋ＣＤ８+Ｔ細胞の頻度を達成し、プラスミドのリンパ内投与は６％より多い頻度を達成した。さらに脾臓細胞をＭｅｌａｎ−Ａペプチドを用いてｅｘ  ｖｉｖｏで刺激して、種々のＥ：Ｔ比で51Ｃｒ標識標的細胞（Ｔ２細胞）に対して試験した（図１Ｃ）。リンパ節内注射により免疫感作された動物からの脾臓細胞は、この標準細胞傷害性アッセイを用いて、種々のＥ：Ｔ比で最高レベルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ溶解を示した。
【０１０６】
実施例２：異なる形態の免疫原が投与される順序の作用
プラスミド（ｐＳＥＭ）又はペプチド（Ｍｅｌ  Ａ；ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ；配列番号１）を種々の順序で結節内投与することにより、ＨＨＤマウスを免疫感作した。ｐＳＥＭによりコードされる免疫原性ポリペプチドは、参照によりその全体が本明細書に援用される、「標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター及びそれらの設計方法」と題された米国特許出願第１０／２９２，４１３号（公開番号２００３０２２８６３４Ａ１）に開示されている。
【０１０７】
免疫感作のプロトコル（図２）は、以下の通りである：
ｉ）誘導期／誘導用量：０日目及び４日目での、２５μｇ（マイクログラム）のプラスミド又は５０μｇ（マイクログラム）のペプチドを含有する２５μｌ（マイクロリットル）の滅菌生理食塩水の両側鼠径部リンパ節へ注射。
ｉｉ）増幅用量：実施例１に上記したように、誘導期の完了後２週間に開始される。
【０１０８】
脾臓細胞の単離と、ｐＡＰＣの存在下でのコグネイトペプチドを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激の後に、標準手法により免疫応答を測定した。多数のアッセイから得られた結果を考慮に入れ、種々のエフェクター及び調節機能の評価を促し、応答のより全体的な見地を提供することにより、免疫応答のプロフィールを描くのが好ましい。用いられるアッセイの種類に対する考慮はなされてもよく、単にそれらの数に対しては考慮されない。例えば異なる炎症誘発性サイトカインに関する２つのアッセイは、あるアッセイにケモカイン又は免疫抑制サイトカインに関するアッセイをプラスしたものと同じ情報を提供するというわけではない。
【０１０９】
実施例３：実施例２に記載したように免疫感作されたマウスのＥＬＩＳＰＯＴ分析
ＥＬＩＳＰＯＴ分析は、サイトカイン産生性のペプチド特異的Ｔ細胞の頻度を測定する。図３は、二重反復試験における代表例を示し、図４は、サイトカイン産生細胞の数／１０6個の応答細胞として個々に表されるデータの要約を示す。結果は、ペプチドで免疫感作されたマウスとは対照的に、プラスミド感作又はプラスミド同調／ペプチド増幅マウスにおいては、ＭｅｌａｎＡペプチドを認識するＩＦＮ−γ（ガンマ）産生Ｔ細胞の頻度が増大した。プラスミドで同調させ、ペプチドで増幅させた４匹のマウスのうちの４匹が、１／２０００を上回る頻度を示した。これに対して、プラスミドを用いたプロトコルにより免疫感作された４匹のマウスのうち２匹が、１／２０００を上回る頻度を示した。免疫原としてペプチドのみを用いたマウスのうち、ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞内で応答増大を始めたものはなかった。実際、ペプチドを反復投与した場合は、プラスミドによる同調後に投ペプチドを投与した場合と明らかな対照を成して、このように細胞の頻度が減少した。
【０１１０】
実施例４：実施例２に記載したように免疫感作されたマウスの細胞溶解活性の分析
各グループからプールした脾臓細胞を調製し（採取し、細かく刻み、赤血球溶解した脾
臓）、ｒＩＬ−２の存在下で７日間、ＬＰＳ刺激化ＭｅｌａｎＡペプチド被覆同一遺伝子型ｐＡＰＣとともにインキュベートした。細胞を洗浄し、ＭｅｌａｎＡペプチド（ＥＬＡ）でパルス標識した51Ｃｒタグで付けしたＴ２標的細胞を異なる比率で用いて、４時間インキュベートした。上清中に放出された放射能を、γ（ガンマ）計数器を用いて測定した。応答を、溶解％＝（試料シグナル−バックグラウンド）／（最大シグナル−バックグラウンド）×１００として定量し、式中、バックグラウンドは、アッセイ培地中でインキュベートした場合に標的細胞単独により放出される放射能を表し、最大シグナルは、界面活性剤で溶解した標的細胞により放出される放射能である。図５は、上記の細胞傷害性アッセイの結果を例示する。ペプチドによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激後に達成された細胞溶解活性のレベルは、誘導用量としてペプチドを受容したものより、ｉｎ  ｖｉｖｏでの誘導用量としてＤＮＡを受容したグループに関する方が非常に大きかった。上記のＥＬＩＳＰＯＴデータと一致して、ＤＮＡ組成物を用いた免疫応答の誘導は安定した、増幅可能なエフェクター機能をもたらしたが、一方、ペプチドのみを用いる免疫感作は、より応答が低く、その大きさは反復投与時にさらに減少した。
【０１１１】
実施例５：交差反応性
脾臓細胞を調製し、３つの異なるペプチド：ＭｅｌａｎＡアナログ免疫原、並びにそれに対応するヒト及びネズミエピトープで被覆された標的細胞に対して、実施例４に記載したように用いた。図６に示したように、３つの標的の全てにおいて同様の細胞溶解活性が観察されたが、これは、天然配列に対する応答の交差反応性を示す。
【０１１２】
実施例６：リンパ節へのペプチドの反復投与は免疫偏向及び調節Ｔ細胞を誘導する
上記の（そして図２に記載した）免疫感作手順により生成される特異的Ｔ細胞のサイトカインプロフィールを、ＥＬＩＳＡ又はＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）（ルミネックス（登録商標）分析は、多様な方式で培養中のＴ細胞により産生されるサイトカインを測定する方法である）により評価した。上記のようにして生成した混合リンパ球培養物の７日目の上清を、以下の生物学的応答変更因子を測定するために用いた：ＭＩＰ−Ｉα、ＲＡＮＴＥＳ及びＴＧＦ−β（抗サイトカイン抗体、及びビオチンタグ化抗体、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ及び比色基質といった特定の試薬を被覆したプレートを使用した捕捉ＥＬＩＳＡ；R & D Systems）。他のサイトカインは、専門の製造業者（BD Pharmingen）により提供されるＴ１／Ｔ２及びＴ炎症キットを用いて、ルミネックス（登録商標）により測定した。
【０１１３】
図７Ａのデータは、３つの異なる免疫感作プロトコルを比較し、免疫応答のプロフィールに及ぼすプロトコルの予期しない作用を示す。プラスミド同調は炎症誘発性サイトカインを分泌するＴ細胞の誘導を可能にしたが、一方、反復ペプチド投与は調節性又は免疫抑制サイトカイン、例えばＩＬ−１０、ＴＧＦ−ベータ及びＩＬ−５を生成した。ペプチドのみのプロトコルのために用いられた免疫感作スケジュールは、応答のエフェクター期を延長するリンパ系内のエピトープの継続的というよりむしろ周期的存在を提供した、と理解されるべきである。最後に、ペプチド増幅後のプラスミド同調は、Ｔ細胞ケモカインＭＩＰ−１α及びＲＡＮＴＥＳの産生の増大をもたらした。Ｔ細胞ケモカイン、例えばＭＩＰ−１α及びＲＡＮＴＥＳは、腫瘍又は感染部位に対する情報交換を調節するのに重要な役割を果たし得る。免疫的監視中、標的関連抗原に特異的なＴ細胞は、コグネイトリガンドに接触、増殖し、媒介物質、例えばケモカインを産生し得る。これらは、抗原が認識される部位でＴ細胞の動員を増幅することができ、より強力な応答を可能にする。データは、バルク培養物から得られた上清から生成した（二重反復試験の平均＋ＳＥ、２つの個々の測定値）。
【０１１４】
標準方法により肺間質組織及び脾臓から細胞を取り出して、ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＢに対する抗体を、四量体作用物質と一緒に用いて染色し、ＭｅｌａｎＡ特異的
Ｔ細胞を同定した。図７Ｂのデータは、ＣＤ８+四量体＋Ｔ細胞のゲート集団を表す（ｙ軸ＣＤ４５ＲＢ及びｘ軸ＣＤ６２Ｌ）。
【０１１５】
同時に、結果は、ペプチドのみを注射した動物における免疫偏向を明らかにする（ＩＦＮ−γ低減、ＴＮＦ−α産生、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β及びＩＬ−５増大、ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲｂｌｏｗＣＤ８+四量体＋調節細胞の強力な誘導）。
【０１１６】
実施例７：リンパ節に投与される非複製プラスミド（同調）とペプチド（増幅）を交互に用いることによる免疫応答の高効率誘導
ヒトＭＨＣクラスＩＨＬＡ．Ａ２遺伝子に関してトランスジェニックであるＨＨＤマウスの３グループを、ＭｅｌａｎＡ腫瘍関連抗原に対するリンパ内投与により免疫感作した。ｐＳＥＭプラスミド（２５μｇ／リンパ節）又はＥＬＡペプチド（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１）、ＭｅｌａｎＡ  ２６〜３５  Ａ２７Ｌアナログ）（２５μｇ／リンパ節）のどちらかを用いた鼠径部リンパ節への直接接種により動物を初回免疫（誘導）し、３日後に、二次注射した。１０日後、同一の方法でｐＳＥＭ又はＥＬＡを用いてマウスを追加免疫し、その後、３日後に最終追加免疫して、応答を増幅し（同様の免疫感作スケジュールに関する図１１Ａ参照）、以下の誘導＆増幅の組合せを行った：ｐＳＥＭ＋ｐＳＥＭ、ｐＳＥＭ＋ＥＬＡ及びＥＬＡ＋ＥＬＡ（マウス１２匹／グループ）。１０日後、ＭｅｌａｎＡ特異的四量体試薬（ＨＬＡ−Ａ*０２０１ＭＡＲＴ１（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１））−ＰＥ、Beckman Coulter）を用いて、免疫応答をモニタリングした。後眼窩洞静脈を介して個々のマウスを採血し、２０００ｒｐｍで２５分間、密度勾配遠心分離（Lympholyte Mammal, Cedarlane Labs）を用いてＰＢＭＣを単離した。ＣＤ８に対するマウス特異的抗体（BD Biosciences）及びＭｅｌａｎＡ四量体試薬を用いてＰＢＭＣを同時染色し、ＦＡＣＳ口径フローサイトメーター（BD）を用いてフローサイトメトリーにより具体的なパーセンテージを確定した。異なる初回免疫／追加免疫の組合せにより生成されたＭｅｌａｎＡ特異的ＣＤ８+細胞のパーセンテージを、図８Ａ及び８Ｂに示す。プラスミド−初回免疫／ペプチド−追加免疫グループ（ｐＳＥＭ＋ＥＬＡ）は、全ての動物間で、４．６の平均四量体パーセンテージを有する強力な免疫応答を誘導した。応答したマウスは２以上の四量体パーセンテージを示すことが明らかになったが、これは、非免疫感作対照グループの平均＋標準偏差（ＳＥ）の３倍と等しい値を表す。このような値は、当該技術分野で非常に強力な応答と考えられ、通常は、複製ベクターを用いてのみ達成され得る。ｐＳＥＭ＋ＥＬＡ免疫感作グループは、１２匹のマウスのうちの１０匹の応答体を含有したが、これは、対照グループと比較した場合に十分な有意差を表す（ｐ（フィッシャー）＝０．０３６）。その他の２つの免疫感作シリーズ：ｐＳＥＭ＋ｐＳＥＭ及びＥＬＡ＋ＥＬＡは、１２匹のうち６匹の応答体を生じたが、０．０５より大きいｐ値を有し、統計学的有意を低下させた。これらのマウスの免疫を測定するために、ペプチド被覆標的細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで用いて動物を攻撃誘発した。脾臓細胞を同腹対照ＨＨＤマウスから単離し、２０μｇ／ｍＬのＥＬＡペプチドとともに２時間インキュベートした。次に、これらの細胞をＣＦＳＥhi蛍光で染色し（４．０μＭ、１５分間）、ペプチドとともにインキュベートされていない、ＣＦＳＥlo蛍光（４．０μＭ）で染色された対照脾臓細胞を同一比で用いて、免疫感作マウスに静脈内同時注射した。１８時間後、脾臓、リンパ節、ＰＢＭＣ及び肺を攻撃誘発動物（５匹／グループ）から除去し、フローサイトメトリーによりＣＦＳＥ蛍光を測定することにより、標的細胞の特異的排除を測定した。結果を図８Ｃに示す。ｐＳＥＭ＋ＥＬＡ初回免疫／追加免���群では、５匹のうちの４匹が強固な免疫応答を示し、試験した組織の各々において標的物の約５０％が除かれた。各実験グループに関する代表的ヒストグラムを同様に示す（ＰＢＭＣ）。
【０１１７】
実施例８：ＤＮＡで誘導され、四量体レベルがベースラインに近づくまで静止された動物における免疫メモリー細胞を、ペプチド追加免疫は有効に再活性化する
図９Ａに記載したようにして免疫感作後のマウス（５匹／グループ）において、Ｍｅｌ
ａｎＡ四量体レベルを測定した。免疫感作スケジュールの完了後５週間までに、四量体レベルはベースライン近くに戻っていた。ＥＬＡペプチドを用いて６週目に動物を追加免疫して、免疫応答が回復され得たか否かを確認した。予めｐＳＥＭプラスミドの免疫感作を受けた動物（ＤＮＡ／ＤＮＡ、図９Ｃ）は、ＥＬＡ増幅後のＭｅｌａｎＡ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の先例がないほどの増大を実証し、レベルは１０％より大きい範囲であった。他方、ＥＬＡペプチドの注射前に摂取する動物（図９Ａ）は、より低頻度の四量体染色細胞により示されるように、ＥＬＡ追加免疫によりほとんど影響を受けなかった。ＤＮＡを摂取し、その後初回免疫感作としてペプチドを摂取したマウスは、他のグループと比較して、ペプチド増幅を受けた時点で、有意ではあるが、中程度の増幅を示した（図９Ｂ）。これらの結果は、ＤＮＡ／ＤＮＡ−同調及びペプチド−増幅免疫感作戦略に関する強力な論理的根拠を明瞭に実証する。
【０１１８】
実施例９：リンパ系及び非リンパ系器官において高頻度の特異的Ｔ細胞の頻度を達成するための免疫感作の最適化
図９Ａ〜図９Ｃに記載したように、プラスミド注射の一連の２つのクラスターによる同調免疫感作とその後のペプチドによる増幅に付されたマウスは、強力な免疫応答を生じた。これに関するさらなる証拠は、ペプチド投与の前（図１０Ａ）及び後（図１０Ｂ）の四量体レベルを例示する図１０Ａ〜図１０Ｃに示されている。個々のマウスにおける四量体レベルは明瞭に見られ、ＤＮＡ／ＤＮＡ／ペプチド免疫感作プロトコルを受けているマウスにおけるＴ細胞の全ＣＤ８+集団の３０％までを表す。これらの結果を図１０Ｃのグラフに要約する。さらに高い四量体レベルは、この厳密な免疫感作プロトコルを受けている動物の血液、リンパ節、脾臓及び肺中で疑いなく明らかである（図１０Ｄ）。
【０１１９】
このプロトコルによって生成されたＣＴＬの表現型を特徴づけるために複数のさらなる実験を行った。このような条件下で開始される免疫プロフィールは刷り込まれなかったが、これはペプチド追加免疫によってＣＤ４３+、ＣＤ４４+、ＣＤ６９+、ＣＤ６２Ｌ-、ＣＤ４５ＲＢｄｉｍ、ペプチド−ＭＨＣクラスＩ特異的Ｔ細胞集団が実質的に増大されたからである。これらの特異的Ｔ細胞は、非リンパ器官をコロニー形成し、さらなる特異的刺激の際、刺激ペプチド複合体の密度に依存して、ＣＤ１０７α及びＩＦＮ−γの発現を迅速に獲得した。
【０１２０】
実施例１０：プラスミド及びペプチド免疫原の正確な投与順序は免疫応答の大きさを決める
マウスの６グループ（ｎ＝４）を、鼠径部リンパ節への直接接種による初回免疫及び増幅を用いて、ＭｅｌａｎＡ  ２６〜３５  Ａ２７Ｌアナログ（ｐＳＥＭ）又はＭｅｌａｎＡペプチドを発現するプラスミドで免疫感作した。免疫感作のスケジュールを図１１Ａに示す（５０μｇのプラスミド又はペプチド／リンパ節の用量、両リンパ節）。２グループのマウスをプラスミドを用いて開始し、プラスミド又はペプチドで増幅した。逆に、２グループのマウスは、ペプチドを用いて開始し、ペプチド又はプラスミドで増幅した。最後に２グループの対照マウスを、ペプチドか又はプラスミドで開始したが、増幅しなかった。最終接種後４週目に、脾臓を採取し、脾臓細胞懸濁液を調製、プールして、抗ＩＦＮ−γ抗体で被覆されたＥＬＩＳＰＯＴプレート中でＭｅｌａｎＡペプチドで刺激した。インキュベーション後４８時間目にアッセイを展開し、ＭｅｌａｎＡを認識したサイトカイン産生Ｔ細胞の頻度を自動的に計数した。データを、特異的Ｔ細胞／１００万個の応答体細胞の頻度（三重反復試験の平均＋ＳＤ）として図５Ｂに表した。データは、プラスミド及びペプチドの開始及び増幅用量の順序を逆にすると応答の全体的大きさに実質的作用を及ぼし、一方、プラスミド同調とその後のペプチド増幅は最大応答を生じ、ペプチドの開始用量とその後のプラスミド増幅は、ペプチドの反復投与と同様の、有意に弱い応答を誘導することを示した。
【０１２１】
実施例１１：免疫応答と免疫感作のプロトコルとの相関、並びにリンパ系及び非リンパ系器官内の標的細胞の除去により明示されるｉｎ  ｖｉｖｏ効力
同調及び増幅プロトコルにより得られた免疫応答を評価するために、４グループの動物（ｎ＝７）をｉｎ  ｖｉｖｏでＭｅｌａｎＡ被覆標的細胞を用いて攻撃誘発した。脾臓細胞を同腹対照ＨＨＤマウスから単離し、２０μｇ／ｍＬのＥＬＡペプチドとともに２時間インキュベートした。次に、これらの細胞をＣＦＳＥhi蛍光で染色し（４．０μＭ、１５分間）、ＣＦＳＥlo蛍光（０．４μＭ）で染色された対照脾臓細胞を同一比で用いて、免疫感作マウスに静脈内同時注射した。１８時間後、脾臓、リンパ節、ＰＢＭＣ及び肺を攻撃誘発動物から取り出し、フローサイトメトリーによりＣＦＳＥ蛍光を測定することにより、標的細胞の特異的排除を測定した。図１２Ａ及び図１２Ｂは、非免疫感作対照動物又はペプチド／ペプチド、ＤＮＡ／ペプチド若しくはＤＮＡ／ＤＮＡの免疫感作プロトコルを受けている動物の組織からのＣＦＳＥヒストグラムプロットを示す（２匹の代表的マウスを各グループから示す）。ＤＮＡ−同調／ペプチド−増幅グループは、リンパ系、並びに非リンパ系器官中の標的細胞の高レベルな特異的死滅を示し（図１２Ｃ）、四量体レベルとの特定の相関を示した免疫感作プロトコルのみを表す（図１２Ｄ、試験した全組織に関してｒ2＝０．８１又はそれ以上）。
【０１２２】
実施例１２：厳密な同調及び増幅プロトコルにより免疫感作された動物中のヒト腫瘍細胞のクリアランス
厳密なプロトコルを用いた免疫感作後にヒト黒色腫腫瘍細胞を用いてマウスを攻撃誘発することにより、ＭｅｌａｎＡ抗原に対する免疫をさらに試験した。図１３Ａは、試験した３つのグループに関して用いられた厳密な免疫感作戦略を示す。免疫感作マウスは、図１３Ｂに例示したようにＣＦＳＥloで標識した等比率の６２４．２８ＨＬＡ．Ａ２-対照細胞と混合されたＣＦＳＥhi蛍光で標識したヒト標的細胞６２４．３８ＨＬＡ．Ａ２+の２回の静脈内注射を受けた。１４時間後、マウスを屠殺し、肺（ヒト標的が蓄積する器官）を、フローサイトメトリーにより標的細胞の特異的溶解に関して分析した。図１３Ｃは、各グループからのマウス由来の代表的ＣＦＳＥヒストグラムプロットを示す。ＤＮＡ−同調と、その後のペプチド−増幅は、肺中の標的の約８０％の特異的死滅により示されるように、ヒト腫瘍細胞に対してマウスを明らかに免疫感作した。より長い一連のＤＮＡ−同調注射も、ＭｅｌａｎＡ四量体と反応性であるＣＤ８+細胞のさらなる頻度増大をもたらした。
【０１２３】
実施例１３：ＤＮＡ−同調、ペプチド−増幅戦略はＳＳＸ−２由来エピトープＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（ＳＳＸ−２41〜49）に対する強力な免疫を生じる
図１４Ａに明示された免疫感作スケジュールを用いてＳＳＸ−２腫瘍関連抗原に対して免疫感作された動物は、強力な免疫応答を示した。図１４Ｂは、ｐＣＢＰプラスミドで初回免疫（同調）され、ＳＳＸ−２  ４１〜４９Ｋ４１Ｆ又はＫ４１Ｙペプチドアナログで追加免疫された（増幅された）マウスの代表的四量体染色を示す。これらのアナログは、ＳＳＸ−２  ４１〜４９エピトープに特異的なＴ細胞と交差反応性である。これらの例は、同調及び増幅プロトコルが、利用可能なＣＤ８Ｔ細胞の８０％に近いＳＳＸ−２抗原特異性を誘導し得る、ということを示す。ｐＣＢＰプラスミド及びその設計原理は、全体が本明細書に参照により援用される、「標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター及びそれらの設計方法」と題された米国特許出願第１０／２９２，４１３号（公開番号２００３０２２８６３４Ａ１）に開示されている。さらなる方法論、組成物、ペプチド及びペプチドアナログは、全体が本明細書に参照により援用される、「ＳＳＸ−２ペプチドアナログ」と題された、２００４年６月１７日に出願の米国特許仮出願第６０／５８１，００１号及び２００５年６月１７日に出願の米国特許出願第１１／１５６，２５３号に開示されている。さらなる方法論、組成物、ペプチド及びペプチドアナログは、全体が本明細書に参照により援用される、「ＮＹ−ＥＳＯペプチドアナログ」と題された、２００４年６月１７日に出願の米国特許仮出願第６０／５８０，９６２号及び２００５年６月１７
日に出願の米国特許出願第１１／１５５，９２９号に開示されている。
【０１２４】
実施例１４：同調及び増幅戦略を用いて同時に異なる抗原上に位置するエピトープに対する免疫応答を誘導し得る
４グループのＨＨＤマウス（ｎ＝６）を、ｐＳＥＭ単独；ｐＣＢＰ単独；ｐＳＥＭ及びｐＣＢＰを混合物として用いて；又は左リンパ節にｐＳＥＭ及び右リンパ節にｐＣＢＰを用いて、リンパ節内注射を介して免疫感作した。これらの注射の１０日後に、同一の方法でＥＬＡ又はＳＳＸ−２ペプチドのどちらかで追加免疫を実施した。全免疫感作マウスを、非免疫感作対照と比較した。同時に２つの抗原標的物の特異的溶解の評価を可能にする三重ピークＣＦＳＥｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性アッセイを用いて、ＥＬＡ又はＳＳＸ−２ペプチドで被覆されたＨＨＤ同腹子脾臓細胞を用いてマウスを攻撃誘発した。同数の対照−ＣＦＳＥlo、ＳＳＸ−２−ＣＦＳＥmed及びＥＬＡ−ＣＦＳＥhi細胞を免疫感作マウス中に静脈内注入し、１８時間後、マウスを屠殺して、フローサイトメーターを用いたＣＦＳＥ蛍光により標的細胞の排除を脾臓（図１５Ａ）及び血液（図１５Ｂ）中で測定した。図１５Ａ及び１５Ｂは、個々のマウスからのＳＳＸ−２及びＭｅｌａｎＡ抗原標的物の特異的溶解パーセントを示し、図１５Ｃは、棒グラフの形で結果を要約する。２つのワクチンの混合物による動物の免疫感作は、両抗原に対する免疫を引き起こし、ＭｅｌａｎＡに関して３０＋／−１１及び９７＋／−１の脾臓中の平均ＳＳＸ−２特異的溶解パーセントを示す最大の免疫応答を生じた。
【０１２５】
多価応答（非主要エピトープに対する応答が含まれる）の誘導についての変形形態を、実施例２４〜３４にさらに例示する。
【０１２６】
実施例１５：ＤＮＡ同調及びペプチド増幅の反復サイクルは強力な免疫を達成、保持する
３グループの動物（ｎ＝１２）は、２サイクルの以下の免疫感作プロトコルを受けた：ＤＮＡ／ＤＮＡ／ＤＮＡ；ＤＮＡ／ペプチド／ペプチド又はＤＮＡ／ＤＮＡ／ペプチド。免疫感作の各サイクル後のマウスにおいてＭｅｌａｎＡ四量体レベルを測定し、図１６に示す。初期ＤＮＡ／ＤＮＡ／ペプチド免疫感作サイクルは、平均２１．１＋／−３．８パーセントの四量体+ＣＤ８+Ｔ細胞を生じ、これは他の２つのグループの約２倍高い。２回目の同調及び増幅免疫感作サイクル後、ＤＮＡ／ＤＮＡ／ペプチドグループに関する平均四量体パーセンテージは３２．６＋／−５．９に５４．５％増大したが、これはＤＮＡ／ペプチド／ペプチドレベルの２．５倍、ＤＮＡ／ＤＮＡ／ＤＮＡ群レベルの８．２５倍高い。さらにこれらの条件下で、他の免疫感作スケジュールは、四量体陽性Ｔ細胞の頻度の増大をほとんどもたらさなかった。
【０１２７】
実施例１６：互換性プラスミド及びペプチドベクター内にある免疫誘導及び増幅レジメンにより誘発される長期持続メモリーＴ細胞
４匹のＨＨＤトランスジェニック動物（３５６３、３５５３、３５６１及び３５７７）は、２サイクルの以下の同調及び増幅プロトコルを受けた：ＤＮＡ／ＤＮＡ／ペプチド。最初のサイクルは、−３１、−２８、−１７、−１４、−３、０日目における免疫感作を包含した。第２サイクルは、１４、１７、２８、３１、４２及び４５日目における免疫感作を包含した。１２０日目にペプチドを用いてマウスを追加免疫した。各サイクルの免疫感作後７〜１０日目と２回目の免疫感作サイクル後９０日まで定期的に、マウスにおいてＭｅｌａｎ−Ａ四量体レベルを測定した。グラフ中の矢印は、サイクルの完了に対応する（図１７Ａ）。４匹の動物は全て最終追加免疫（増幅）後の応答を見せたが、これは寛容の誘導というよりむしろ免疫メモリーの持続性を示す。
【０１２８】
５匹のＨＨＤトランスジェニック動物（３５５５、３５５８、３５６６，３５９８及び３５７０）は、２サイクルの以下の同調及び増幅プロトコルを受けた：ＤＮＡ／ペプチド／ペプチド。前と同様に、最初のサイクルは、−３１、−２８、−１７、−１４、−３、
０日目における免疫感作を包含した。第２サイクルは、１４、１７、２８、３１、４２及び４５日目における免疫感作を包含した。１２０日目にペプチドを用いてマウスに追加免疫した。各サイクルの免疫感作後７〜１０日目と２回目の免疫感作サイクル後９０日まで定期的に、マウスにおいてＭｅｌａｎＡ四量体レベルを測定した（図１７Ｂ）。比較すると、各サイクルにおける後期ＤＮＡ注射の代わりにペプチドを置き換えるこの同調及び増幅プロトコルは、この実験では、免疫メモリーの低減又は応答性の低減をもたらした。
【０１２９】
実施例１７：実質的増大能力を有する長期持続メモリーＴ細胞は結節内ＤＮＡ投与により生成される
７匹のＨＨＤトランスジェニック動物は、２サイクルの以下の免疫感作プロトコルを受けた：ＤＮＡ／ＤＮＡ／ＤＮＡ。最初のサイクルは、−３１、−２８、−１７、−１４、−３、０日目における免疫感作を包含した。第２サイクルは、１４、１７、２８、３１、４２及び４５日目における免疫感作を包含した。１２０日目にペプチドを用いてマウスに追加免疫した。各サイクルの免疫感作後７〜１０日目と２回目の免疫感作サイクル後９０日まで定期的に、マウスにおいてＭｅｌａｎＡ四量体レベルを測定した（図１８）。７匹の動物は全て、２回の免疫感作サイクル中又はその後に四量体＋細胞のボーダーラインの頻度％を示したが、ペプチド追加免疫後に強力な応答を見せ、これは、実質的免疫メモリーを示す。
【０１３０】
実施例１８：抗原＋免疫増強アジュバントの種々の組合せはＣＴＬ応答の同調のために有効である
ペプチドの結節内投与は、ＴＬＲのようなアジュバントを含むか又はそれに関連した作因（複製性又は非複製性）のリンパ内投与により誘発される免疫応答を増幅するための非常に強力な手段である。
【０１３１】
被験体（例えばマウス、ヒト又はその他の哺乳類）を、ベクター、例えばプラスミド、ウイルス、ペプチド＋アジュバント（ＣｐＧ、ｄｓＲＮＡ、ＴＬＲリガンド）、組換えタンパク質＋アジュバント（ＣｐＧ、ｄｓＲＮＡ、ＴＬＲリガンド）、死微生物又は精製抗原（例えば免疫増強活性を有する細胞壁構成成分）を用いた結節内注入又は注射により同調し、アジュバントを含有しないペプチドの結節内注射により増幅する。四量体染色及びその他の方法により追加免疫前及び後に測定した免疫応答は、実質的な増大を示す。これに対比して、他の経路によるアジュバントを含有しないペプチドを利用する追加免疫は、免疫応答の同一の増大をもたらさない。
【０１３２】
実施例１９：ペプチドの結節内投与は、任意の投与経路による抗原＋免疫増強アジュバントにより誘発される免疫応答を増幅するための非常に強力な手段である
被験体（例えばマウス、ヒト又はその他の哺乳類）を、ベクター、例えばプラスミド、ウイルス、ペプチド＋アジュバント（ＣｐＧ、ｄｓＲＮＡ、ＴＬＲリガンド）、組換えタンパク質＋アジュバント（ＣｐＧ、ｄｓＲＮＡ、ＴＬＲリガンド）、死微生物又は精製抗原（例えば免疫増強活性を有する細胞壁構成成分）の非経口的又は粘膜投与により免疫感作し、アジュバントを含有しないペプチドの結節内注射により増幅する。四量体染色及びその他の方法により追加免疫前及び後に測定した免疫応答は、実質的な増大を示す。これに対比して、結節内以外の経路によるアジュバントを含有しないペプチドを利用する追加免疫は、免疫応答の同一の増大をもたらさない。
【０１３３】
実施例２０：同調及び増幅免疫感作プロトコルを用いた寛容性破壊
寛容性を破壊するか又は自己抗原（例えば腫瘍関連抗原）に対する免疫応答性を回復するために、被験体（例えばマウス、ヒト又はその他の哺乳類）を、ベクター、例えばプラスミド、ウイルス、ペプチド＋アジュバント（ＣｐＧ、ｄｓＲＮＡ、ＴＬＲ擬態）、組換えタンパク質＋アジュバント（ＣｐＧ、ｄｓＲＮＡ、ＴＬＲ擬態）、死微生物又は精製抗
原で免疫感作し、アジュバントを含有しないペプチド（自己エピトープに対応する）の結節内注射により追加免疫する。四量体染色及びその他の方法により追加免疫前及び後に測定した免疫応答は、免疫応答の実質的な増大を示す（「寛容性破壊」）。
【０１３４】
実施例２１：同調及び増幅免疫感作のための臨床的実行
臨床及び実験室判定基準を用いて、新生物又は感染性疾患のための治療を要すると患者を診断し、最前線療法を用いて治療を行い又は行わず、能動免疫療法に関する評価に言及する。疾患の性質及び治療物質の特質によって、付加的判定基準（抗原プロファイリング、ＭＨＣハプロタイプ分類、免疫応答性）に基づいて、登録を行なう。正確な順序でのベクター（プラスミド）及びタンパク質抗原（ペプチド）のリンパ内注射又は注入（ボーラス、プログラム可能なポンプ又はその他の手段）により、治療（図１９）を実行する。最も好ましいプロトコルは、プラスミド同調とその後のペプチドの増幅投与を含む反復周期を包含する。このようなサイクルの頻度及び継続は、免疫学的、臨床的及びその他の手段により測定される応答によって調整し得る。投与される組成物は、一価又は多価であり、多数のベクター、抗原又はエピトープを含有し得る。投与は、１つ又は複数のリンパ節に同時に行うか、あるいは互い違いに行うことができる。この療法を受けている患者は、症候の改善を示す。
【０１３５】
実施例２２：病原性Ｔ細胞の免疫偏向又は非活性化の誘導のための臨床的実行
自己免疫又は炎症性障害を有する患者を、臨床及び実験室判定基準を用いて診断し、最前線療法を用いて治療を行い又は行わず、能動免疫療法に関する評価に言及する。疾患の性質及び治療物質の特質によって、付加的判定基準（抗原プロファイリング、ＭＨＣハプロタイプ分類、免疫応答性）に基づいて、登録を行なう。Ｔ１促進アジュバントを欠くか及び／又は免疫偏向を増幅する免疫修飾物質を伴うペプチドのリンパ内注射又は注入（ボーラス、プログラム可能なポンプ又はその他の手段）により、治療を実行する。しかしながらペプチドボーラス注射は、この方法により免疫偏向を生成するための好ましい方式である。ペプチドを用いた治療は、免疫に及ぼす目的の作用又は臨床状態が得られるまで、毎週、２週間毎に又は低頻度で（例えば毎月）実行し得る。このような治療は、１回投与、又は図２のグループ２の場合のような多数回の近い間隔での投与を包含し得る。その後、低頻度の注射を包含する調整レジメンを用いて、維持療法を開始し得る。投与される組成物は、一価又は多価であり、複数のエピトープを含有し得る。組成物は、リンパ系中のペプチドの存在を延長する任意の構成成分を含有しないのが好ましい。投与は、１つ又は多数のリンパ節に同時に行うか、あるいは互い違いに行うかであり、免疫感作ペプチドに特異的なＴ細胞又は無関連エピトープ（「エピトープ拡散」）を、関連臨床方法に加えて測定することにより、応答をモニタリングし得る。
【０１３６】
実施例２３：免疫原性組成物（例えばウイルスワクチン）
以下のスケジュール：０、３、１４及び１７日目に従って、鼠径部リンパ節の両側に、２５μｇのプラスミドベクターを、６グループ（ｎ＝６）のＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスに注射する。ベクターは、ＨＩＶｇａｇからの３つのＡ２拘束性エピトープ（ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ（配列番号３）、ＶＬＡＥＡＭＳＱＶ（配列番号４）、ＭＴＮＮＰＰＩＰＶ（配列番号５））、ｐｏｌからの２つ（ＫＬＶＧＫＬＮＷＡ（配列番号６）、ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ（配列番号７））及びｅｎｖからの１つ（ＫＬＴＰＬＣＶＴＬ（配列番号８））をコードする。最終回の同調の最終サイクルの２週間後、これら５つのペプチド全てを包含する混合物をマウスに注射する（５μｇ／ペプチド／結節、両側、３日おき）。並行して、５グループのマウスに個々のペプチドを注射する（５μｇ／ペプチド／結節、両側、３日おき）。７日後に、マウスを採血し、各ペプチドに対する四量体染色により応答を評価する。その後、マウスの半数に、ｅｎｖ、ｇａｇ又はｐｏｌを発現する組換えワクシニアウイルスで攻撃誘発し（１０3ＴＣＩＤ50／マウス）、７日目に、慣用的プラークアッセイを用いて卵巣で、ウイルス力価を測定する。他の半数を屠殺し、脾臓細胞をペ
プチドで５日間刺激して、ペプチドで被覆された標的細胞に対する細胞傷害活性を測定する。対照として、マウスにプラスミド又はペプチド単独を注射した。プラスミドで同調させ、ペプチドで増幅させたマウスは、四量体染色及び細胞傷害性により、５つのペプチド全てに対するより強力な免疫を示す。
【０１３７】
より一般的に、寛容性を破壊し、免疫応答性を回復し、又は非自己抗原、例えばウイルス、細菌、寄生生物又は微生物に対する免疫を誘導するために、被験体（例えばマウス、ヒト又はその他の哺乳類）を、ベクター、例えばプラスミド、ウイルス、ペプチド＋アジュバント（ＣｐＧ、ｄｓＲＮＡ、ＴＬＲ擬態）、組換えタンパク質＋アジュバント（ＣｐＧ、ｄｓＲＮＡ、ＴＬＲ擬態）、死微生物又は精製抗原（例えば細胞壁構成成分）で免疫感作し、アジュバントを含有しないペプチド（標的エピトープに対応する）の結節内注射により追加免疫する。四量体染色及びその他の方法により追加免疫前及び後に測定した免疫応答は、免疫応答の大きさの実質的な増大をもたらす。このような戦略を用いて、感染に対して防御するか、あるいはＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶ、ＣＭＶ、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ＲＳＶ等のような作因により引き起こされる慢性感染を治療し得る。
【０１３８】
実施例２４：以下の２つのプラスミドでの免疫感作スケジュール：ＳＳＸ−２  ４１〜４９を発現するｐＣＢＰ及びＭｅｌａｎ−Ａ  ２６〜３５（Ａ２７Ｌ）を発現するｐＳＥＭ
図２０に示すように、２グループのＨＨＤマウス（ｎ＝４）を、リンパ節内注射によってｐＳＥＭ及びｐＣＢＰの混合物で免疫感作するか、又は０日目及び４日目に２回、左鼠径部リンパ節にｐＳＥＭで免疫感作し、右鼠径部リンパ節をｐＣＢＰで免疫感作した。プラスミド量は、２５μｇ／プラスミド／投与であった。２週間後、動物を屠殺し、ペプチドでパルスしているかパルスしていないＴ２細胞に対する細胞傷害性を測定した。
【０１３９】
実施例２５：ベクター分離は、非主要エピトープの免疫原性を回復する
実施例２４に記載のように免疫感作された動物を屠殺し、グループ毎に脾臓細胞をプールし、２つのペプチド（Ｍｅｌａｎ−Ａ  ２６〜３５（Ａ２７Ｌ）又はＳＳＸ−２  ４１〜４９）のうちの１つで並行して刺激した。５１Ｃｒ負荷したペプチドパルスＴ２標的細胞とのインキュベーションによって細胞傷害性を測定した。図２１中のデータは、種々の標的細胞に対する特異的細胞傷害性（ｎ＝４／グループ）の平均を示す。
【０１４０】
結果は、プラスミド混合物の使用によりｐＣＢＰプラスミドによって誘導された応答が妨害されたことを示すが、投与部位に関連する２つのプラスミドの分離によってｐＣＢＰの活性が回復された。異なる抗原を有する異なるベクターの同時投与により、免疫原性に関するヒエラルキーが確立される。ベクターの分離により、非主要成分の免疫原性が回復され、多価応答が得られる。
【０１４１】
実施例２６：免疫感作プロトコルへのペプチド増幅ステップの付加
図２２に示すように、４グループのＨＨＤマウス（ｎ＝６）を、リンパ節内注射によってｐＳＥＭ及びｐＣＢＰの混合物で免疫感作するか、又は０日目及び４日目に２回、左鼠径部リンパ節にｐＳＥＭで免疫感作し、右鼠径部リンパ節をｐＣＢＰで免疫感作した。対照として、マウスを、ｐＳＥＭプラスミド又はｐＣＢＰプラスミドのいずれかのみで免疫感作した。プラスミド量は、２５μｇ／プラスミド／投与であった。２週間後、１４日目及び１７日目に、動物をＭｅｌａｎ−Ａペプチド及び／又はＳＳＸ−２ペプチドで追加免疫し、用量及び組合せに関してプラスミド免疫感作をミラーリングした。２週間後、２８日目に、ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性評価のために、動物を、ＣＦＳＥで染色し、Ｍｅｌａｎ−Ａ（ＥＬＡ）又はＳＳＸ−２ペプチドでパルスしているかパルスしていない脾臓細胞で攻撃誘発した。
【０１４２】
実施例２７：ベクター及びペプチドをそれぞれ混合物として使用した場合でさえも、ペプチド追加免疫によって非主要エピトープの免疫原性が回復される
動物を実施例２６に記載のように免疫感作し、同時に２つの抗原標的物の特異的溶解の評価を可能にする三重ピークＣＦＳＥｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性アッセイを用いて、ＥＬＡペプチド又はＳＳＸ−２ペプチドで被覆されたＨＨＤ同腹子脾臓細胞を用いて攻撃誘発した。同数の対照−ＣＦＳＥlo細胞、ＳＳＸ−２−ＣＦＳＥmed細胞及びＥＬＡ−ＣＦＳＥhi細胞を免疫感作マウス中に静脈内注入し、１８時間後、マウスを屠殺して、フローサイトメトリーを用いたＣＦＳＥ蛍光により標的細胞排除を脾臓（図２３）中で測定した。図は、各グループについての個々のマウスからのＳＳＸ−２抗原標的物及びＭｅｌａｎＡ抗原標的物の特異的溶解パーセント、平均及びＳＥＭを示す。
【０１４３】
興味深いことに、最初にプラスミドを含み、その後にペプチドを含む２つのワクチンの混合物による動物の免疫感作は、両抗原に対する免疫を誘導し、ＭｅｌａｎＡに関して３０±１１及び９７±１の脾臓中の平均ＳＳＸ−２特異的溶解パーセントを示す最大の免疫応答を生じた。したがって、図２３に示すように、ペプチド追加免疫は、ベクター及びペプチドをそれぞれ混合物として使用した場合でさえも、非主要エピトープの免疫原性を回復することができる。
【０１４４】
実施例２８：同調及び増幅免疫感作のための臨床的実行
強い多価応答の誘導について、以下の２つのシナリオを図２４に示す。第１のシナリオ（Ａ）では、増幅用ペプチドの使用により、プラスミド及びペプチドを混合物として使用した場合でさえも、多価免疫応答が修復される。第２のシナリオ（Ｂ）では、それぞれのプラスミド成分及びペプチド成分の分離により、多価免疫応答が誘導される。共通のエピトープのための同調プラスミドが投与される同一のリンパ節にペプチドを投与することが好ましい。しかし、Ｔ記憶細胞はＣＤ６２Ｌ発現を喪失し、それにより、他のリンパ器官にコロニーを形成するので、これは絶対に必要なわけではない。図２４に示す同調から増幅までの時間間隔はあった方がよいが、重要であるとは見なされない。大幅に短い間隔はあまり好ましくないが、さらにより長い間隔は十分に許容される。
【０１４５】
実施例２９：多価応答を誘導する１プラスミド
図２５及び以下の表に記載したプラスミドｐＳＥＭは、読み取り枠（「シンクロトープポリペプチドコード配列」）内に隣接する２つの異なる抗原由来の複数のペプチド（Ｍｅｌａｎ−Ａ及びチロシナーゼ）を含む。したがって、複数のエピトープに対する免疫感作を発現及び誘導する可能性を有する。コードされるペプチド配列を以下に示す：チロシナーゼ１〜９、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１  ２６〜３５（Ａ２７Ｌ）、チロシナーゼ３６９〜３７７、及びＭｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１  ３１〜９６。
【０１４６】
プラスミド中のポリペプチドのｃＤＮＡ配列は、サイトメガロウイルス由来のプロモーター／エンハンサー配列（ＣＭＶｐ）の調節下にあり、抗原提示細胞による取り込みの際にポリペプチドのメッセンジャーを有効に転写する。コード配列の３’末端のウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢＧＨｐｏｌｙＡ）は、メッセンジャーのポリアデニル化のためのシグナルを送り、その安定性及び核から細胞質への転位を増大させる。核へのプラスミド輸送を容易にするために、サルウイルス４０由来の核輸送配列（ＮＩＳ）を、プラスミド骨格に挿入した。１コピーのＣｐＧ免疫刺激モチーフで、免疫応答をさらに促進するようにプラスミドを操作する。最後に、プラスミド中の２つの原核生物の遺伝要素は、大腸菌中でのカナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）及びｐＭＢ細菌複製起点の増幅を担う。ｐＳＥＭのさらなる説明は、上記で参照として援用される米国特許出願第１０／２９２，４１３号で見出すことができ、ｐＭＡ２Ｍ及びｐＶＡＸＭ３と様々に命名されている。
【０１４７】
【表６】
2008526763.tif 000014
【０１４８】
実施例３０：多価ベクターの使用による開始後の非主要エピトープに対する免疫応答を「回復」又は増幅するためのプロトコル
新規に操作された場合あるエピトープが免疫誘導に関して主要な役割を果たすと予想されるのに対して他のエピトープは非主要となる（特に、このようなエピトープが同一のＭＨＣ拘束性エレメントに結合する場合）ことが、治療的に関連するエピトープを共発現するベクターを非常に制限している。
【０１４９】
図２６では、このようなプロトコルを記載している。８グループのＨＨＤマウス（ｎ＝４）を、０、３、１４、及び１７日目に、リンパ節内注射によってｐＳＥＭで免疫感作した。プラスミド量は、２５μｇ／プラスミド／投与であった。２８及び３１日目に、マウスに、Ｍｅｌａｎ−Ａ  ２６〜３５（図２７Ａ）又はチロシナーゼ３６９〜３７７（図２７Ｂ）のいずれかに対応する増幅ペプチドを、同様の２５μｇペプチド／用量でリンパ節内投与した。免疫応答を、Ｍｅｌａｎ−Ａ特異的試薬又はチロシナーゼ特異的試薬を使用した免疫感作完了から２週間後の末梢血中のＣＤ８+Ｔ細胞の四量体染色によって測定した。
【０１５０】
図２７中の結果は、ｐＳＥＭでの初回免疫によってＭｅｌａｎ−Ａに対して有意な応答が誘導される一方で、チロシナーゼに対する応答は検出できなかったことを示す。並行して、ペプチドで免疫感作した動物のみがいずれのエピトープに対する検出可能な四量体応答も示さなかった。まとめると、これらのデータは、Ｍｅｌａｎ−Ａエピトープがチロシナーゼエピトープと比較して免疫的に主要な役割を果たすと予想されることを証明する。しかし、ｐＳＥＭ初回免疫後にＭｅｌａｎ−Ａペプチドで免疫感作した動物において、チ
ロシナーゼ（「天然ペプチド」）での追加免疫後、チロシナーゼに対する免疫応答（図２７Ｂ、第１の集団）は、Ｍｅｌａｎ−Ａに対して達成されたレベル（図２７Ａ、第２の集団及び第４の集団）と比較して同程度の大きさであった。
【０１５１】
まとめると、チロシナーゼペプチドのリンパ節内投与により、ｐＳＥＭによって開始されたこのエピトープに対する免疫応答が回復され、応答開始のために使用されたベクター（ｐＳＥＭ）の状況で、Ｍｅｌａｎ−Ａエピトープと比較したその非主要が克服された。
【０１５２】
実施例３１：多価ベクターの使用による開始後の非主要エピトープに対する免疫応答を「回復」又は増幅するためのプロトコル：細胞傷害性免疫の評価
実施例３０に記載のように免疫感作を行った。８グループのＨＨＤマウス（ｎ＝４）を、０、３、１４、及び１７日目に、リンパ節内注射によってｐＳＥＭで免疫感作した。プラスミド量は、２５μｇ／投与であった。２８及び３１日目に、マウスに、Ｍｅｌａｎ−Ａ  ２６〜３５（図２８Ａ）エピトープ又はチロシナーゼ３６９〜３７７（図２８Ｂ）エピトープのいずれかに対応するペプチドをリンパ節内投与し（２５μｇペプチド／用量）、免疫感作した。免疫感作完了から１４日後、Ｍｅｌａｎ−Ａエピトープペプチド又はチロシナーゼエピトープペプチドでの脾臓細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ再刺激後の細胞傷害性アッセイによって免疫を評価した。簡潔に述べれば、脾臓細胞を準備し（脾臓を採取し、細かく刻み、赤血球を溶解する）、ＬＰＳ刺激したＭｅｌａｎ−Ａペプチド（図２８Ａ）ペプチド又はチロシナーゼ（図２８Ｂ）ペプチドで被覆された同系ｐＡＰＣで、ｒＩＬ−２の存在下で７日間インキュベートした。細胞を洗浄し、５１Ｃｒ標識Ｍｅｌａｎ−Ａ＋、チロシナーゼ＋６２４．３８標的細胞と異なる比率で４時間インキュベートした。上清中に放出された放射能を、γ（ガンマ）計数器を用いて測定した。応答を、溶解％＝（試料シグナル−バックグラウンド）／（最大シグナル−バックグラウンド）×１００として定量し、式中、バックグラウンドは、検定培地中でインキュベートした場合に標的細胞単独により放出される放射能を表し、最大シグナルは、界面活性剤で溶解された標的細胞により放出される放射能である。
【０１５３】
実施例３０に示すように、図２８の結果は、リンパ節内ペプチド追加免疫による、免疫開始ベクター（ｐＳＥＭ）において非主要なエピトープ（チロシナーゼ）に対する免疫の回復／増幅を証明する。
【０１５４】
実施例３２：一方は主要であり、他方は非主要である２つのエピトープを有する開始ベクターに対する免疫応答を同時に誘導及び増幅するためのプロトコル
前の２つの実施例では、主要エピトープに対する応答の増幅の非存在下での非主要エピトープに対する応答の回復を証明した。次に、両応答の同時増幅を試みた。
【０１５５】
図２９では、このようなプロトコルを記載している。４グループのＨＨＤマウス（ｎ＝６）を、０、３、１４、及び１７日目に、リンパ節内注射によってｐＳＥＭで免疫感作した。プラスミド量は、２５μｇ／投与であった。２８及び３１日目に、Ｍｅｌａｎ−Ａ  ２６〜３５エピトープ（左鼠径部リンパ節）及びチロシナーゼ３６９〜３７７エピトープ（右鼠径部リンパ節）に対応するペプチドで、２５μｇペプチド／用量にてマウスを同時に免疫感作した。Ｍｅｌａｎ−Ａ（図３０Ａ）又はチロシナーゼ（図１１Ｂ）特異的試薬を使用した免疫感作完了から２週間後の末梢血中のＣＤ８+Ｔ細胞の四量体染色によって、免疫応答を測定した。データを、ＣＤ８+サブセット内の四量体＋細胞の平均％として示した。ｐＳＥＭプラスミドで初回免疫し、ペプチドアナログであるＭｅｌａｎ−Ａ  ２６〜３５  Ａ２７Ｎｖａ｛Ｅ（Ｎｖａ）ＡＧＩＧＩＬＴＶ；配列番号９｝（左リンパ節）及びチロシナーゼ３６９〜３７７  Ｖ３７７Ｎｖａ｛ＹＭＤＧＴＭＳＱ（Ｎｖａ）；配列番号１０｝（右リンパ節）で増幅した動物は、多色四量体染色によって測定したところ（図３０Ｃ）、各エピトープに特異的な多価免疫応答を示した。ドットプロットは、末梢血
由来の総ＣＤ８陽性細胞をゲーティングし、各マウスにおける二重免疫応答を示す。四量体レベルを、ＣＤ８陽性Ｔ細胞のパーセントとして計算した。
【０１５６】
図３０に示す結果は、ＭｅｌａｎＡペプチド及びチロシナーゼペプチドの同時投与によって、免疫開始ベクター（ｐＳＥＭ）中の主要／非主要関係のＭｅｌａｎＡエピトープ及びチロシナーゼエピトープの両方に対する免疫応答を同時増幅することができることを示す。
【０１５７】
実施例３３：一方は主要であり、他方は非主要である開始ベクター中の２エピトープに対する、ペプチド混合物を使用した細胞溶解応答の同時誘導及び増幅
簡素化した製剤をさらに調査するために、主要及び非主要エピトープを発現する２価プラスミドの使用を合わせ、その後、前の実施例に記載したようにペプチドを別個に投与するのではなく、主要ペプチド及び非主要ペプチドの混合物の同時投与により各エピトープに対する応答を増幅させるという代替の方法を試験した。
【０１５８】
以下のスケジュールを使用して、６グループのＨＨＤマウス（ｎ＝６）を、前の実施例に記載のように、ｐＳＥＭプラスミドで免疫感作し（又はそれぞれ免疫感作せず）、１２．５μｇ／ペプチド／投与の用量の（Ｍｅｌａｎ−Ａペプチド＋種々のチロシナーゼペプチドの混合物）ペプチドで、リンパ節内に追加免疫した：０、３日目にプラスミドで免疫感作し、１４及び１７日目にペプチドで追加免疫し、２週間後にこのサイクルを１回繰り返す。使用したチロシナーゼペプチドは上記のＴｙｒ３６９〜３７７、プラスミドによってコードされるが形質転換細胞によって提示されないＴｙｒ１〜９、及びプラスミドによってコードされないＴｙｒ２０７〜２１５である。
【０１５９】
上記のように、免疫感作計画の完了から２週間後に、ＣＦＳＥアッセイによって免疫応答を測定した。簡潔に述べれば、脾臓細胞を同腹対照ＨＨＤマウスから単離し、２０μｇ／ｍＬのＥＬＡ又は２０μｇ／ｍＬのチロシナーゼペプチドとともに２時間インキュベートした。次に、これらの細胞をＣＦＳＥhi蛍光及びＣＦＳＥmed蛍光で染色し、ＣＦＳＥlo蛍光で染色された対照脾臓細胞を同一比で用いて、免疫感作マウスに静脈内同時注射した。１８時間後、脾臓を取り出し、フローサイトメトリーを使用して標的細胞の特異的排除を測定し、以下の式によってｉｎ  ｖｉｖｏ特異的溶解率を計算した。
｛［ｌ−（％ＣＦＳＥhi又ハmed／％ＣＦＳＥlo）］−［１−（％ＣＦＳＥhi又ハmed対照／％ＣＦＳＥlo対照）］]×１００
ここで、式中の各％は、各ピークによって示される総試料の比率を示す。
【０１６０】
概して、図３１に示した結果（Ｍｅｌａｎ−Ａエピトープ被覆脾臓細胞又はチロシナーゼエピトープ被覆脾臓細胞に対する％ｉｎ  ｖｉｖｏ特異的溶解；ｘ軸は追加免疫のために使用したペプチドを示す）は、プラスミド開始／ペプチド増幅のレジメンの増幅段階におけるペプチド混合物の使用によって主要エピトープ（Ｍｅｌａｎ−Ａ）及び非主要エピトープ（チロシナーゼ３６９〜３７７）に対する免疫の同時増幅が起こったことを示す。さらに、ペプチドのみの使用では有効な応答は得られなかった。このペプチドの組合せについて、両方のエピトープに対して有意な応答が得られた。しかし、種々のペプチドのＭＨＣ結合親和性が類似する場合、ペプチド混合物によって成功すると期待され、親和性が異なるにつれて期待されなくなることに留意すべきである。
【０１６１】
実施例３４：より高次の多価性を有する応答の誘導
本研究では、２つの２価プラスミドを使用して免疫を誘導し、４つのペプチドエピトープアナログを使用して増幅した。前述のように、プラスミドｐＳＥＭを使用して、Ｍｅｌａｎ−Ａエピトープ及びチロシナーゼエピトープに対する免疫を誘導し、アナログ（Ｍｅｌａｎ−Ａ（Ａ２７Ｎｖａ）及びチロシナーゼ（Ｖ３７７Ｎｖａ））を使用して応答を増
幅させた。プラスミドｐＢＰＬを使用して、エピトープＳＳＸ−２  ４１〜４９、ＮＹ−ＥＳＯ−１  １５７〜１６５に対する免疫も誘導した。ｐＢＰＬによってコードされた免疫原性ポリペプチドは、全体が本明細書に参照により援用される、「標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター及びそれらの設計方法」と題された米国特許出願第１０／２９２，４１３号(公開番号２００３０２２８６３４  Ａ１)に開示されている。増幅には、ペプチドエピトープアナログＳＳＸ−２  ４１〜４９（Ａ４２Ｖ）及びＮＹ−ＥＳＯ−１  １５７〜１６５（Ｌ１５８Ｎｖａ、Ｃ１６５Ｖ）を使用した。エピトープアナログのさらなる考察は、上記で引用され参照によって援用されたエピトープアナログに関する特許出願に示されている。これらのアナログは、一般に、天然の配列と比較した場合、ＭＨＣ結合に対する優れた親和性及び安定性を有するが、天然配列を認識するＴＣＲと交差反応性を示す。
【０１６２】
３グループの雌ＨＨＤ−Ａ２マウスを、両側の鼠径部リンパ節に投与したｐＳＥＭ／ｐＢＰＬの混合物（１００μｇの各プラスミド／日、２５μｌ／注射リンパ節）で免疫感作した。１、４、１５、１８、２８、３２、４９、及び５３日目の注射によって、グループ１（ｎ＝１０）にプロトコルに従いプラスミドのみを投与した。グループ２及びグループ３（それぞれｎ＝２５）に、１、４、１５及び１８日目にプラスミドを注射し、それ以降の日にペプチドを注射した。２５日目に、免疫感作した動物から採血し、ＣＤ８+Ｔ細胞を、ＭＨＣ四量体アッセイを使用したフローサイトメトリーによって分析した。応答を、非免疫感作同腹子対照マウス（ｎ＝５）と比較した。
【０１６３】
グループ２のマウスを、２８、３２、４９、及び５３日目に、右リンパ節へのペプチドチロシナーゼＶ３７７Ｎｖａ（２５μｇ／日）の投与及び左リンパ節へのＳＳＸ−２  Ａ４２Ｖ（２５μｇ／日）の投与によって追加免疫した。グループ３の動物を、２８及び３２日目に、右リンパ節へのペプチドチロシナーゼＶ３７７Ｎｖａ（２５μｇ／日）の投与及び左リンパ節へのＳＳＸ−２  Ａ４２Ｖ（２５μｇ／日）の投与、続いて４９及び５３日目に、右リンパ節へのＮＹ−ＥＳＯ−１  Ｌ１５８Ｎｖａ、Ｃ１６５Ｖ（１２．５μｇ／日）の投与及び左リンパ節へのＭｅｌａｎ−Ａ  Ａ２７Ｎｖａ（２５μｇ／日）の投与によって追加免疫した。全ての注射は、２５μｌ／注射リンパ節であった。３９及び６０日目に、各グループから採血し、ＣＤ８+Ｔ細胞分析を、四量体アッセイを使用して行った。応答を、非免疫感作同腹子対照マウス（ｎ＝５）と比較した。
【０１６４】
４１及び６３日目に、各グループから選択された動物を屠殺し、脾臓細胞懸濁液に対するＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ分析のために脾臓を取り出した。
【０１６５】
６２日目に、各グループから選択された動物に、静脈内注射によって４つ全ての腫瘍関連抗原を発現するＣＦＳＥ標識６２４．３８ヒト黒色腫細胞を投与し、免疫感作マウスにおけるＳＳＸ−２特異的ＣＴＬ、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＴＬ、チロシナーゼ特異的ＣＴＬ及びＭｅｌａｎＡ特異的ＣＴＬの標的として使用した。
【０１６６】
プラスミドを、臨床緩衝液（１２７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、０．８８ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、０．２５ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ、０．５%  ＥＴＯＨの水溶液；２ｍｇ／ｍｌの各プラスミド、全部で４ｍｇ／ｍｌ）中に配合した。Ｍｅｌａｎ−Ａ  ２６〜３５（Ａ２７Ｎｖａ）アナログ、チロシナーゼ３６９〜３７７（Ｖ３７７Ｎｖａ）アナログ、及びＳＳＸ−２  ４１〜４９（Ａ４２Ｖ）アナログを、１．０ｍｇ／ｍｌでＰＢＳ中に配合した。免疫感作のためのＮＹ−ＥＳＯ  １５７〜１６５（Ｌ１５８Ｎｖａ、Ｃ１６５Ｖ）ペプチドアナログを、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で５％ＤＭＳＯを含むＰＢＳ中に調製した。サイトメトリーデータを、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用して収集し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用してリンパ球集団のゲーティングによって分析した。ＰＢＭＣを、ＦＩＴＣ抱合抗マウスＣＤ８ａ（Ｌｙ−２）モ
ノクローナル抗体（BD Biosciences, 553031）及び以下のＭＨＣ四量体で同時染色した：ＨＬＡ−Ａ*０２０１  ＳＳＸ−２（ＫＡＳＥＫＩＦＹ（配列番号１１））−ＰＥ  ＭＨＣ四量体（Beckman Coulter,T02001）、ＨＬＡ−Ａ*０２０１  ＮＹ−ＥＳＯ（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）（配列番号１２）−ＡＰＣ  ＭＨＣ四量体（Beckman Coulter,T02001）、ＨＬＡ−Ａ*０２０１Ｍｅｌａｎ−Ａ（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１））−ＰＥ  ＭＨＣ四量体（Beckman Coulter,T02001）、又はＨＬＡ−Ａ*０２０１チロシナーゼ（ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号１３））−ＡＰＣ  ＭＨＣ四量体（Beckman Coulter,T02001）。
【０１６７】
ＩＦＮ-γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを以下のように行った。２７及び６２日目に、安楽死させた動物から脾臓を取り出し、単核細胞を、密度勾配遠心分離(Lympholyte Mammal, Cedarlane Labs)によって単離し、ＨＬ−１培地に再懸濁した。脾臓細胞（５又は３×１０5細胞／ウェル）を、１０μｇのＭｅｌａｎ−Ａ  ２６〜３５  Ａ２７Ｌ、チロシナーゼ３６９〜３７７、ＳＳＸ−２  ４１〜４９、又はＮＹ−ＥＳＯ−１  １５７〜１６５ペプチドとともに、９６ウェルフィルター膜プレート(Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ  ＩＰ  膜９６ウェルプレート、Millipore)の３連のウェル上でインキュベートした。試料を、５％ＣＯ2及び湿度１００％にて３７℃で４２時間インキュベートし、その後に発色させた。マウスＩＦＮ−γ被覆抗体を使用して、フィルターを被覆し、その後に脾臓細胞とインキュベートし、ビオチン化検出抗体を添加し、細胞を溶解して水でフィルター上の細胞を洗い流した後にシグナルを発色させた（ＩＦＮ−γ抗体対、Ucytech）。Ucytech製のＧＡＢＡ抱合体及び独自仕様の基材を、ＩＦＮ−γスポット発色に使用した。免疫感作動物におけるＣＴＬ応答を、ＩＦＮ−γスポット分析のために校正したＥＬＩＳｐｏｔ  Ｒｅａｄｅｒソフトウェアバージョン３．２．３を使用して、AID Internationalプレートリーダーにて発色から２４時間後に測定した。
【０１６８】
６１日目に、以下のようにｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性アッセイを行った。ヒト６２４．３８（ＨＬＡ  Ａ*０２０１pos）培養黒色腫細胞を、ＣＦＳＥhi（Ｖｙｂｒａｎｔ  ＣＦＤＡ  ＳＥ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｃｅｒ  ｋｉｔ, Molecular Probes）蛍光（１．０μＭで１５分間）で染色し、６２４．３８  ＨＬＡ−Ａ２（ＨＬＡ  Ａ*０２０１neg）を、ＣＦＳＥlo蛍光（１．０μＭで１５分間）で染色した。高四量体レベルに基づいて選択した各グループ（図１、２、及び３）由来の２匹のマウス及び２匹の非免疫感作対照マウスに、２０×１０6個のＣＦＳＥlo標識６２４．３８（ＨＬＡ  Ａ*０２０１neg）と混合した２０×１０6個のＣＦＳＥhi標識６２４．３８（ＨＬＡ  Ａ*０２０１pos）ヒト黒色腫細胞を２アリコートに分割して２時間間隔で送達させる静脈内注射によって投与した。ＨＬＡ
Ａ*０２０１posヒト標的細胞の特異的排除を、マウスの屠殺、肺組織の除去、１細胞懸濁液の作製、及びフローサイトメトリーによるＣＦＳＥ蛍光の測定によって約１４時間後に測定した。特異的溶解パーセントを、上記のように計算した。
【０１６９】
得られた免疫応答を、プロトコル中の種々の測定点で評価した。図３２は、３つ全てのグループに共通する第４のプラスミド注射から７日後の四量体分析による判断によって得られた応答を示す。チロシナーゼエピトープを除く全てに対する実質的応答が認められた。Ｍｅｌａｎ−Ａ  ２６〜３５及びＮＹ−ＥＳＯ−１  １５７〜１６５は、主要エピトープであることが明らかとなった。よりバランスの取れた四量体免疫応答を誘導するために、非主要エピトープに対する応答を、グループ２及び３へのチロシナーゼＶ３７７Ｎｖａペプチドエピトープアナログ及びＳＳＸ−２  Ａ４２Ｖペプチドエピトープアナログの投与によって増幅させた。グループ１に、プラスミド混合物を使用した別ラウンドの免疫感作を行った。図３３に認められるように、プラスミドのみでのさらなる免疫感作（グループ１）により、主要エピトープに対する応答が促進された。対照的に、２つの非主要エピトープに対応するペプチドの投与により、４つ全てのエピトープに対する実質的且つよりバランスの取れた応答が得られた。図３４は、真に４価の応答を誘導することができるこ
とを証明する選択された各動物の応答を示す。２７日目に屠殺したマウス小集団のＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔ分析により、四量体データから認められた一般的パターンが確認された（図３５Ａ）。５９日目に終了し、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔ分析に供したさらなる増幅ラウンド後の６２日目に別のマウス集団を屠殺した（図３５ｂ）。グループ１について、最終免疫感作ラウンドは、プラスミド混合物を再度使用し、応答パターンは、初期のラウンド後に認められたパターンと類似したままであった。非主要エピトープに対応するペプチドのみの使用により（グループ２）、４つのエピトープに対する比較的バランスの取れた応答が維持された。４つ全てのエピトープに対応するペプチドを、グループ３に投与した。Ｍｅｌａｎ−Ａエピトープの主要度は、チロシナーゼエピトープに対する応答を見かけ上犠牲にして再度出現したが、このエピトープに対する有意な応答は依然として認められた。２つの時点で屠殺した動物集団の一般的応答性が異なるので、図３５Ａ及びＢに示される応答の絶対的な大きさを直接比較できないことに留意すべきである。４つ全ての標的化抗原を発現するＣＦＳＥ標識ヒト腫瘍細胞での攻撃誘発によってｉｎ  ｖｉｖｏ細胞溶解活性も評価した。これらの腫瘍細胞は細胞株６２４．３８の誘導体であり、これは、天然にＳＳＸ−２、ＰＲＡＭＥ、チロシナーゼ及びＭｅｌａｎ−Ａを発現し、ＮＹ−ＥＳＯ−１も安定に発現するようにプラスミドベクターを使用して形質転換されている。ＥＬＩＳｐｏｔ分析によってバックグラウンドレベルのみの四量体又はＩＦＮ−γ応答を有する非免疫感作マウスで予想されるように、ＨＬＡ−Ａ２-対照と比較して、ＨＬＡ−Ａ２+腫瘍細胞は特異的に減少しない（図３６Ａ）。しかし、実質的な四量体応答を示すマウスでは特異的な減少が認められ、よりバランスの取れた応答からより良好な結果が得られた。図３６Ｂ（７１％特異的溶解）及び３６Ｃ（９５％特異的溶解）について四量体及びＥＬＩＳｐｏｔ分析によって認められたエピトープ特異的応答を比較した。実質的に１価の応答を有するマウスについても特異的溶解は認められなかった。１価の応答に起因するｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性が上記で認められたが（実施例７）、この実験における標的細胞は、エピトープ発現が有意により高かった。したがって、多価応答は低標的抗原発現レベルの保護効果を克服することが認められた。
【０１７０】
実施例３５：多価免疫を誘導するための包括的方法
本方法は、以下の過程を含んでもよい（図３７に示す）。
【０１７１】
異なる抗原又は同一の抗原由来のエピトープの同定。このようなエピトープは、互いに、主要／非主要関係（例えば、非常に異なる範囲の発現又は提示、ＴＣＲレパートリーの偏り等に起因する）を有し得るか、又はその天然の状況下で共主要を示し得る。
【０１７２】
このようなエピトープに関連した配列の回収、及び同一のリーディングフレーム内又は同一のベクター内にこのようなエピトープを含む発現ベクターの構築。新規の状況は、天然の状況と比較した場合、互いに免疫的な主要／非主要の関係をもたらすか変化させることができる。
【０１７３】
他方に対する一方（主要エピトープ）の特異性によって決定される応答の開始をもたらす、ベクターでの免疫感作。
【０１７４】
対応するペプチドの投与による非主要エピトープに対する応答の増幅。ペプチドは、天然の配列又はそのアナログであり得る。ペプチドを単独で投与するか、又は主要エピトープ及び／又は非主要エピトープに対応する他のペプチドと同時に同一の部位、若しくはより好ましくは別個の部位に投与することができる。
【０１７５】
実施例及び本明細書中の他の場所に記載の方法のいずれかは、異なる組成物、抗原、エピトープ、アナログ等を含むように修正することができるか、又は修正される。例えば、任意の他の癌抗原を使用することができる。また、多数のエピトープを変更し、本明細書
中に開示、記載又は組み込まれたエピトープアナログを含むエピトープアナログを使用することができる。本方法を使用して、種々の疾患及び疾病に対する多価免疫応答を含む免疫応答を誘導することができる。
【０１７６】
本発明の多数の変形形態及び代替的な実施形態が開示されている。なお、さらなる変形形態及び代替の要素が、当業者に明らかであろう。本発明の種々の実施形態は、これらの変形形態又は要素のいずれかを具体的に含むか排除することができる。
【０１７７】
本明細書中に引用した各引例は、その全体が本明細書に参照により援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１Ａ】リンパ内免疫感作による免疫応答の誘導を示す図である。
【図１Ｂ】リンパ内免疫感作による免疫応答の誘導を示す図である。
【図１Ｃ】リンパ内免疫感作による免疫応答の誘導を示す図である。
【図２】抗原の標的化（リンパ節）送達によるＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープに対する免疫を制御するか又は操作するためのプロトコルの例を示す図である。
【図３】図４に記載されたデータに対応する代表的ウェルに関する視覚的透視図を表す図である。
【図４】ＥＬＩＳＰＯＴにより測定し、ペプチドを認識するＩＦＮ−γ（ガンマ）産生Ｔ細胞の数（頻度）として表した、図２に記載されたプロトコルの適用に起因する免疫応答の大きさを示す図である。
【図５】図２に示したような抗原の標的化送達により生成されたＴ細胞の細胞傷害性プロフィールを示す図である。
【図６】図２に示したプロトコルにより生成したＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞の交差反応性を示す図である。
【図７Ａ】３クラスの生物学的応答改変因子（炎症誘発性サイトカイン、ケモカイン又は化学誘引物質、並びに免疫調節又は抑制ケモカイン）のメンバーを産生するリンパ球の能力として表される免疫のプロフィールと、その後の図２に記載した免疫感作プロトコルの適用を示す図である。
【図７Ｂ】図２に記載した免疫感作プロトコルにより生成されたＴ細胞に関するフローサイトメトリーにより表現型分けされる細胞表面マーカーを示す図である。リンパ節へのペプチドの反復投与は、免疫偏向及び調節Ｔ細胞を誘導する。
【図８Ａ】ＤＮＡ、ペプチド、あるいはＤＮＡ及びペプチドの同調／増幅配列で免疫感作したマウスにおける、四量体により測定した特異的Ｔ細胞の頻度を示す図である。
【図８Ｂ】ＤＮＡ、ペプチド、あるいはＤＮＡ及びペプチドの同調／増幅配列で免疫感作したマウスにおける、四量体により測定した特異的Ｔ細胞の頻度を示す図である。
【図８Ｃ】ＤＮＡ（「ｐＳＥＭ」）、ペプチド（「ＥＬＡ」＝ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１））、あるいはＤＮＡ及びペプチドの同調／増幅配列で免疫感作したマウスにおける、種々のリンパ系及び非リンパ系器官におけるｉｎ  ｖｉｖｏで生じる特異的細胞傷害を示す図である。
【図９Ａ】ペプチドで免疫感作し、ペプチドで増幅した動物における循環四量体染色Ｔ細胞の持続性／崩壊を、ペプチド追加免疫後の再生応答とともに示す図である。
【図９Ｂ】ＤＮＡで同調し、ペプチドで増幅した動物における循環四量体染色Ｔ細胞の持続性／崩壊を、ペプチド増幅後の再生応答とともに示す図である。
【図９Ｃ】ＤＮＡで免疫感作し、ＤＮＡで増幅した動物における循環四量体染色Ｔ細胞の持続性／崩壊を、ペプチド追加免疫後の再生応答とともに示す図である。
【図１０Ａ】種々の２サイクル免疫感作プロトコルを用いた抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の拡大を示す図である。
【図１０Ｂ】種々の３サイクル免疫感作プロトコルを用いた抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の拡大を示す図である。
【図１０Ｃ】種々のプロトコルを用いて初回免疫され、ペプチドで増幅された動物における四量体染色により検出される循環抗原特異的Ｔ細胞の増大を示す図である。
【図１０Ｄ】リンパ系及び非リンパ系器官における、種々の免疫感作レジメン後の、そして四量体染色により検出された抗原特異的Ｔ細胞の増大を示す図である。
【図１１Ａ】プラスミドＤＮＡ及びペプチドを用いてマウスを免疫感作する予定表の一例を示す図である。
【図１１Ｂ】ＥＬＩＳＰＯＴ分析により確定した、種々の免疫感作プロトコル（それぞれの又は逆の順序でのＤＮＡ及びペプチドの変更）により引き起こされた免疫応答を示す図である。
【図１２Ａ】プラスミド及びペプチドで免疫感作したマウスにおける、血液及びリンパ節における抗原性標的細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ欠乏を示す図である。
【図１２Ｂ】プラスミド及びペプチドで免疫感作したマウスにおける、脾臓及び肺における抗原性標的細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ欠乏を示す図である。
【図１２Ｃ】図１２Ａ、図１２Ｂに提示された結果の要約を示す図である。
【図１２Ｄ】種々のプロトコルにより免疫感作したマウスにおける特異的Ｔ細胞の頻度及び抗原性標的細胞のｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス間の相関を示す図である。
【図１３Ａ】プラスミドＤＮＡ及びペプチドでマウスを免疫感作する予定表、並びにそれらのマウスにおいて実施する測定の性質を示す図である。
【図１３Ｂ】免疫感作マウスにおけるヒト腫瘍細胞のｉｎ  ｖｉｖｏクリアランスの確定のために用いられるプロトコルに関連した予定表を記載する図である。
【図１３Ｃ】プラスミド及びペプチドで免疫感作したマウスにおける、肺における抗原性標的細胞（ヒト腫瘍細胞）のｉｎ  ｖｉｖｏ欠乏を示す図である。
【図１４Ａ】図１４Ｂに示す抗ＳＳＸ−２応答を生成するために用いる免疫感作プロトコルを示す図である。
【図１４Ｂ】四量体染色により検出した、循環ＳＳＸ−２特異的Ｔ細胞の増大と、その後のＤＮＡ同調／ペプチド増幅レジメンの適用を示す図である。
【図１５Ａ】ＭｅｌａｎＡ（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１））及びＳＳＸ−２（ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号２））のエピトープに対して同時に免疫感作するために種々の同調及び増幅プロトコルを受けたマウスの脾臓中の抗原性標的細胞のｉｎ  ｖｉｖｏクリアランスを示す図である。
【図１５Ｂ】ＭｅｌａｎＡ（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１））及びＳＳＸ−２（ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号２））のエピトープに対して同時に免疫感作するために種々の同調及び増幅プロトコルを受けたマウスの血液中の抗原性標的細胞のｉｎ  ｖｉｖｏクリアランスを示す図である。
【図１５Ｃ】図１５Ａ、図１５Ｂに詳細に示した結果を要約する図である。
【図１６】２サイクルの種々の同調及び増幅プロトコルを受けているマウスにおける、四量体染色により測定した循環抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の増大を示す図である。
【図１７Ａ】ＤＮＡ／ＤＮＡ／ペプチド（Ａ）から成る２サイクルの同調及び増幅プロトコルを受けている動物における、循環抗原特異的Ｔ細胞の持続性を示す図である。
【図１７Ｂ】ＤＮＡ／ペプチド／ペプチド（Ｂ）から成る２サイクルの同調及び増幅プロトコルを受けている動物における、循環抗原特異的Ｔ細胞の持続性を示す図である。
【図１８】ＤＮＡ／ＤＮＡ／ＤＮＡから成る２サイクルの同調及び増幅プロトコルを受けている動物における持続性記憶を示す図である。
【図１９】ＤＮＡ／ペプチド同調及び増幅プロトコルを用いた患者の登録及び処置のための臨床実行スキームを示す図である。
【図２０】以下の２つのプラスミドを使用した免疫感作スケジュールを示す図である：ＳＳＸ−２  ４１〜４９を発現するｐＣＢＰ及びＭｅｌａｎＡ  ２６〜３５を発現するｐＳＥＭ
【図２１】２プラスミドの混合物の投与によって誘導された特異的細胞障害性対別個の部位への個別の投与によって誘導された特異的細胞障害性を示す図である。
【図２２】図２０に記載の免疫感作プロトコルへのペプチド追加免疫過程の付加を示す図である。
【図２３】ペプチド追加免疫が、ベクター及びペプチドをそれぞれ混合物として使用した場合でさえも、非主要エピトープの免疫原性を回復することを示すデータを提示する図である。
【図２４Ａ】臨床的実行における強い多価応答を誘導するための代替の免疫感作プロトコルを示す図である。
【図２４Ｂ】臨床的実行における強い多価応答を誘導するための別の免疫感作プロトコルを示す図である。
【図２５】多価応答を引き出すことができるプラスミドを示す図である。
【図２６】多価プラスミドを使用した免疫応答の開始及びペプチドのリンパ節内投与による非主要エピトープに対する応答の回復のためのプロトコルを示す図である。
【図２７Ａ】多価プラスミドでの初回免疫及びペプチドのリンパ節内投与による主要エピトープ（Ｍｅｌａｎ−Ａ）に対する応答の増幅によって得た特異的Ｔ細胞の頻度を示す図である。
【図２７Ｂ】多価プラスミドでの初回免疫及びペプチドのリンパ節内投与による非主要エピトープ（チロシナーゼ３６９〜３７７）に対する応答の増幅によって得た特異的Ｔ細胞の頻度を示す図である。
【図２８Ａ】多価プラスミドでの初回免疫及びペプチドのリンパ節内投与による主要エピトープ（Ｍｅｌａｎ−Ａ）に対する応答の増幅によって得た特異的細胞傷害性を示す図である。
【図２８Ｂ】多価プラスミドでの初回免疫及びペプチドのリンパ節内投与による非主要エピトープ（チロシナーゼ３６９〜３７７）に対する応答の増幅によって得た特異的細胞傷害性を示す図である。
【図２９】多価プラスミドでの初回免疫及び同時の主要及び非主要エピトープに対する応答の増幅を含む免疫感作プロトコルを示す図である。
【図３０Ａ】多価プラスミドでの初回免疫及びペプチドのリンパ節内投与による主要エピトープ（Ｍｅｌａｎ−Ａ）及び非主要エピトープ（チロシナーゼ）に対する応答の増幅によって得たＭｅｌａｎ−Ａ特異的Ｔ細胞の頻度を示す図である。
【図３０Ｂ】多価プラスミドでの初回免疫及びペプチドのリンパ節内投与による主要エピトープ（Ｍｅｌａｎ−Ａ）及び非主要エピトープ（チロシナーゼ）に対する応答の増幅によって得たチロシナーゼ特異的Ｔ細胞の頻度を示す図である。
【図３０Ｃ】ｐＳＥＭで初回免疫し、Ｍｅｌａｎ−Ａペプチド及びチロシナーゼペプチドの両方で増幅したＭｅｌａｎ−Ａ及びチロシナーゼ特異的Ｔ細胞の両方の頻度を示す。２つの個別のマウス由来の結果を示す図である。
【図３１】多価プラスミド及びその後の主要エピトープ（ＭｅｌａｎＡ  ２６〜３５）及び非主要（チロシナーゼ３６９〜３７７）エピトープの混合物に対応するペプチドのリンパ節内投与によって同時開始及び増幅されたＴ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性データを示す図である。
【図３２】増幅前のｐＳＥＭ／ｐＢＰＬ免疫感作動物の二重多色四量体分析を示す図である。
【図３３】プラスミドｐＳＥＭとｐＢＰＬの混合物で誘導し、ＳＳＸ−２及びチロシナーゼペプチドエピトープアナログで増幅させたマウスの免疫応答の二重多色四量体分析を示す図である。
【図３４】プラスミドｐＳＥＭとｐＢＰＬとの混合物で誘導し、ＳＳＸ−２及びチロシナーゼペプチドエピトープアナログで増幅させた３匹の個別のマウスの免疫応答の二重多色四量体分析を示す図である。
【図３５Ａ】第１ラウンドの増幅後のＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ分析を示す図である。
【図３５Ｂ】第２ラウンドの増幅後のＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ分析を示す図である。
【図３６Ａ】４つ全ての腫瘍関連抗原を発現するヒト黒色腫細胞でのＣＦＳＥ  ｉｎ  ｖｉｖｏ攻撃誘発を示す図である。パネルＡ〜Ｄは、それぞれ、四量体分析、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔ分析、及びプロトコル完了後に個別のマウスを屠殺したｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍細胞を示す。パネルＡは、非免疫感作対照マウス由来のデータを示す。
【図３６Ｂ】４つ全ての腫瘍関連抗原を発現するヒト黒色腫細胞でのＣＦＳＥ  ｉｎ  ｖｉｖｏ攻撃誘発を示す図である。パネルＡ〜Ｄは、それぞれ、四量体分析、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔ分析、及びプロトコル完了後に個別のマウスを屠殺したｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍細胞を示す。パネルＢ〜Ｃは実質的な４価免疫を達成したグループ３及びグループ２由来の２匹のマウス由来のデータをそれぞれ示す。
【図３６Ｃ】４つ全ての腫瘍関連抗原を発現するヒト黒色腫細胞でのＣＦＳＥ  ｉｎ  ｖｉｖｏ攻撃誘発を示す図である。パネルＡ〜Ｄは、それぞれ、四量体分析、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔ分析、及びプロトコル完了後に個別のマウスを屠殺したｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍細胞を示す。パネルＢ〜Ｃは実質的な４価免疫を達成したグループ３及びグループ２由来の２匹のマウス由来のデータをそれぞれ示す。
【図３６Ｄ】４つ全ての腫瘍関連抗原を発現するヒト黒色腫細胞でのＣＦＳＥ  ｉｎ  ｖｉｖｏ攻撃誘発を示す図である。パネルＡ〜Ｄは、それぞれ、四量体分析、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔ分析、及びプロトコル完了後に個別のマウスを屠殺したｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍細胞を示す。パネルＤはグループ３由来のマウス由来のデータを示し、その免疫が実質的に１価であった。
【図３７】多価免疫を誘導するための包括的方法を示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３６Ｄ】
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【図３７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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