(57)【要約】【課題】癌および異形成の検出、治療、および／または取扱いの方法を提供する。【解決手段】本発明は、限定的ではないが、ほ乳類の体液および子宮頸部擦過標本を含むがそれに限定されない、生体試料中のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）をシングルコピーレベルまで検出、同定、および定量するシステム、方法、および組成を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ほ乳類の生体試料におけるＨＰＶ-ＤＮＡの検出、同定、および／または定量のための方法において、
ほ乳類の生体試料からＤＮＡを抽出する段階と、
少なくとも一つの競合配列の存在下で、前記抽出されたＤＮＡの少なくとも一部のＰＣＲによる一次増幅を実施する段階であって、
前記競合配列が、既知のＨＰＶタイプのＤＮＡ配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含み、
前記競合配列が、前記ＨＰＶ-ＤＮＡ配列中に存在しないヌクレオチド置換を有する、
段階と、
前記既知のＨＰＶタイプに対する少なくとも一つの伸長プライマー、および、少なくとも二つの異なるジデオキシヌクレオチドの存在下で、ＰＣＲによる二次増幅を実施する段階と、
前記既知のＨＰＶタイプに対する任意の増幅された伸長プライマーのレベルを質量分析法によって測定する段階と、
を含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
前記ほ乳類の生体試料が、体液または組織試料である、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、
前記測定段階が、約２００アトモル未満の濃度の任意の増幅された伸長プライマーの検出を含む、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、
前記一次増幅が、異なる既知のＨＰＶタイプのＤＮＡ配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを各々が含む複数の競合配列タイプの存在を含み、
前記競合配列タイプが、前記個別のＨＰＶ-ＤＮＡ配列中に存在しないヌクレオチド置換を有し、
前記二次増幅が、各々が異なる既知のＨＰＶタイプに対する複数の外部プライマータイプの存在を含む、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、
前記複数の既知のＨＰＶタイプが、ＨＰＶタイプ１６、１８、２３、２６、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５３、５６、５８、５９、６６、６８、７３、および８２のうちの二つ以上を含む、方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法において、
前記複数の既知のＨＰＶタイプが、少なくともＨＰＶタイプ１６、１８、２３、２６、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５３、５６、５８、５９、６６、６８、７３、および８２を含む、方法。
【請求項７】
請求項４に記載の方法において、
淋菌またはトラコーマクラミジアのＤＮＡ配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含む少なくとも一つの競合配列の存在下で、前記抽出されたＤＮＡの少なくとも一部のＰＣＲによる一次増幅を実施する段階であって、前記競合配列が、前記淋菌またはトラコーマクラミジアのＤＮＡ配列中に存在しないヌクレオチド置換を有する、段階と、
前記淋菌またはトラコーマクラミジアに対する少なくとも一つの伸長プライマー、および少なくとも二つの異なるジオキシヌクレオチドの存在下で、ＰＣＲによる二次増幅を実施する段階と、
質量分析法によって淋菌またはトラコーマクラミジアに対する任意の増幅された伸長プライマーのレベルを測定する段階と、
をさらに含む、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法において、
前記一次増幅が、ｅｒｂＢ-２遺伝子のＤＮＡ配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含む少なくとも一つの競合配列の存在を含み、
前記競合配列が、前記ｅｒｂＢ-２遺伝子中に存在しないヌクレオチド置換を有する、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法において、
前記測定段階の後に、ほ乳類における子宮頸癌、子宮頸部異形成、子宮頸部上皮内新生物、肛門癌、肛門上皮内新生物、頭頸部癌、住血吸虫症に関連した膀胱癌、またはパピローマを診断、モニタリング、または評価する追加の段階、
を含む、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法において、
少なくとも一つの競合配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８４、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８５からなる群から選択される、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法において、
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８６、８７、および８８からなる群から選択された、少なくとも一つの競合配列をさらに含む、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法において、
前記一次増幅が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４０、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４１からなる、前記既知のＨＰＶタイプに対する、少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組を含む、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、
前記一次増幅が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４３、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４４からなる群から選択された少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組をさらに含む、方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法において、
少なくとも一つの伸長プライマーが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６２、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６３からなる群から選択される、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法において、
前記二次増幅が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６５、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６６からなる群から選択される、少なくとも一つの伸長プライマーをさらに含む、方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法において、
前記一次増幅が、前記既知のＨＰＶタイプに関連した少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組を含み、
それら配列が各々、少なくとも一つのイノシン塩基を含む、方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法において、
少なくとも一つの伸長プライマーが、少なくとも一つのイノシン塩基を含む、方法。
【請求項１８】
ほ乳類の体液の非細胞画分におけるＨＰＶ-ＤＮＡの検出、同定、および／または定量のための方法において、
ほ乳類の体液の非細胞画分からＤＮＡを抽出する段階と、
少なくとも一つの競合配列の存在下で、前記抽出されたＤＮＡの少なくとも一部のＰＣＲによる一次増幅を実施する段階であって、
前記競合配列が、既知のＨＰＶタイプのＤＮＡ配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含み、
前記競合配列が、前記ＨＰＶ-ＤＮＡ配列中に存在しないヌクレオチド置換を有する、
段階と、
前記既知のＨＰＶタイプに対する少なくとも一つの伸長プライマー、および、少なくとも二つの異なるジデオキシヌクレオチドの存在下で、ＰＣＲによる二次増幅を実施する段階と、
前記既知のＨＰＶタイプに対する任意の増幅された伸長プライマーのレベルを質量分析法によって測定する段階と、
を含む、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法において、
前記体液が、血漿、血清、尿、脳脊髄液、汗、唾液、痰、または涙である、方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載の方法において、
前記測定段階が、約２００アトモル未満の濃度の任意の増幅された伸長プライマーの検出を含む、方法。
【請求項２１】
請求項１８に記載の方法において、
前記一次増幅が、異なる既知のＨＰＶタイプのＤＮＡ配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを各々が含む複数の競合配列タイプの存在を含み、
前記競合配列タイプが、前記個別のＨＰＶ-ＤＮＡ配列中に存在しないヌクレオチド置換を有し、
前記二次増幅が、異なる既知のＨＰＶタイプに対する複数の外部プライマータイプの存在を含む、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法において、
前記複数の既知のＨＰＶタイプが、ＨＰＶタイプ１６、１８、２３、２６、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５３、５６、５８、５９、６６、６８、７３、および８２のうちの二つ以上を含む、方法。
【請求項２３】
請求項２１に記載の方法において、
前記複数の既知のＨＰＶタイプが、少なくともＨＰＶタイプ１６、１８、２３、２６、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５３、５６、５８、５９、６６、６８、７３、および８２を含む、方法。
【請求項２４】
請求項２１に記載の方法において、
淋菌またはトラコーマクラミジアのＤＮＡ配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含む少なくとも一つの競合配列の存在下でＰＣＲによる一次増幅を実施する段階であって、前記競合配列が、前記淋菌またはトラコーマクラミジアのＤＮＡ配列中に存在しないヌクレオチド置換を有する、段階と、
前記淋菌またはトラコーマクラミジアに対する少なくとも一つの伸長プライマー、および少なくとも二つの異なるジオキシヌクレオチドの存在下で、ＰＣＲによる二次増幅を実施する段階と、
質量分析法によって淋菌またはトラコーマクラミジアに対する任意の増幅された伸長プライマーのレベルを測定する段階と、
をさらに含む、方法。
【請求項２５】
請求項１８に記載の方法において、
前記一次増幅が、ｅｒｂＢ-２遺伝子のＤＮＡ配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含む少なくとも一つの競合配列の存在を含み、
前記競合配列が、前記ｅｒｂＢ-２遺伝子中に存在しないヌクレオチド置換を有する、方法。
【請求項２６】
請求項１８に記載の方法において、
前記測定段階の後に、ほ乳類における子宮頸癌、子宮頸部異形成、子宮頸部上皮内新生物、肛門癌、肛門上皮内新生物、頭頸部癌、住血吸虫症に関連した膀胱癌、またはパピローマを診断、モニタリング、または評価する追加の段階、
を含む、方法。
【請求項２７】
請求項１８に記載の方法において、
少なくとも一つの競合配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８４、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８５からなる群から選択される、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法において、
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８６、８７、および８８からなる群から選択された、少なくとも一つの競合配列をさらに含む、方法。
【請求項２９】
請求項１８に記載の方法において、
前記一次増幅が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４０、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４１からなる、前記既知のＨＰＶタイプ関連する、少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組を含む、方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法において、
前記一次増幅が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４３、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４４からなる群から選択された少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組を含む、方法。
【請求項３１】
請求項１８に記載の方法において、
少なくとも一つの伸長プライマーが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６２、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６３からなる群から選択される、方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法において、
前記二次増幅が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６５、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６６からなる群から選択された、少なくとも一つの伸長プライマーをさらに含む、方法。
【請求項３３】
請求項１８に記載の方法において、
前記一次増幅が、前記既知のＨＰＶタイプに関連した少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組を含み、
それら配列が各々、少なくとも一つのイノシン塩基を含む、方法。
【請求項３４】
請求項１８に記載の方法において、
少なくとも一つの伸長プライマーが、少なくとも一つのイノシン塩基を含む、方法。
【請求項３５】
ほ乳類の生体試料におけるＨＰＶ-ＤＮＡの検出、同定、および／または定量のための方法において、
ほ乳類の生体試料からＤＮＡを抽出する段階と、
少なくとも一つの競合配列の存在下で、前記抽出されたＤＮＡの少なくとも一部のＰＣＲによる一次増幅を実施する段階であって、
前記競合配列が、既知のＨＰＶタイプのＤＮＡ配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含み、
前記競合配列が、前記ＨＰＶ-ＤＮＡ配列中に存在しないヌクレオチド置換を有する、
段階と、
前記既知のＨＰＶタイプに対する少なくとも一つの伸長プライマー、および、少なくとも二つの異なるジデオキシヌクレオチドの存在下で、ＰＣＲによる二次増幅を実施する段階と、
前記既知のＨＰＶタイプに対する任意の増幅された伸長プライマーのレベルを質量分析法によって測定する段階と、
を含み、
前記一次増幅が、少なくとも一つの競合配列で実質的に対応する既知のＨＰＶタイプに対する少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組を含み、
少なくとも一つの伸長プライマーが、同じ前記既知のＨＰＶタイプと関連する、方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法において、
少なくとも一つの競合配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８４、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８５からなる群から選択され、
少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４０、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４１からなる群から選択され、
少なくとも一つの伸長プライマーが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６２、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６３からなる群から選択される、方法。
【請求項３７】
請求項３５に記載の方法において、
前記一次増幅が、前記既知のＨＰＶタイプに関連した少なくとも一つの順方向および逆方向プライマー配列の組を含み、
それら配列が各々、少なくとも一つのイノシン塩基を含む、方法。
【請求項３８】
請求項３５に記載の方法において、
少なくとも一つの伸長プライマーが、少なくとも一つのイノシン塩基を含む、方法。
【請求項３９】
請求項３５に記載の方法において、
前記測定段階が、約２００アトモル未満の濃度の任意の増幅された伸長プライマーの検出を含む、方法。
【請求項４０】
請求項３５に記載の方法において、
前記測定段階の後に、ほ乳類における子宮頸癌、子宮頸部異形成、子宮頸部上皮内新生物、肛門癌、肛門上皮内新生物、頭頸部癌、住血吸虫症に関連した膀胱癌、またはパピローマを診断、モニタリング、または評価する追加の段階、
を含む、方法。
【請求項４１】
請求項３５に記載の方法において、
前記一次増幅が、異なる既知のＨＰＶタイプのＤＮＡ配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを各々が含む複数の競合配列タイプの存在を含み、
前記競合配列タイプが、前記個別のＨＰＶ-ＤＮＡ配列中に存在しないヌクレオチド置換を有し、
前記二次増幅が、異なる既知のＨＰＶタイプに対する複数の外部プライマータイプの存在を含む、方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の方法において、
前記複数の既知のＨＰＶタイプが、ＨＰＶタイプ１６、１８、２３、２６、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８、７３、および８２のうちの二つ以上を含む、方法。
【請求項４３】
請求項４１に記載の方法において、
前記複数の既知のＨＰＶタイプが、少なくともＨＰＶタイプ１６、１８、２３、２６、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５３、５６、５８、５９、６６、６８、７３、および８２を含む、方法。
【請求項４４】
請求項４１に記載の方法において、
淋菌またはトラコーマクラミジアのＤＮＡ配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含む少なくとも一つの競合配列の存在下でＰＣＲによる一次増幅を実施する段階であって、前記競合配列が、前記淋菌またはトラコーマクラミジアのＤＮＡ配列中に存在しないヌクレオチド置換を有する、段階と、
前記淋菌またはトラコーマクラミジアに対する少なくとも一つの伸長プライマー、および少なくとも二つの異なるジオキシヌクレオチドの存在下で、ＰＣＲによる二次増幅を実施する段階と、
質量分析法によって淋菌またはトラコーマクラミジアに対する任意の増幅された伸長プライマーのレベルを測定する段階と、
をさらに含む、方法。
【請求項４５】
請求項３５に記載の方法において、
前記一次増幅が、ｅｒｂＢ-２遺伝子のＤＮＡ配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含む少なくとも一つの競合配列の存在下で前記抽出されたＤＮＡを含み、
前記競合配列が、前記ｅｒｂＢ-２遺伝子中に存在しないヌクレオチド置換を有する、方法。
【請求項４６】
請求項３５に記載の方法において、
前記一次増幅が、
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８７、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８８からなる群から選択された、少なくとも一つの競合配列と、
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４３、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４４からなる群から選択された少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組と、
を含み、
前記二次増幅が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６５、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６６からなる群から選択された、少なくとも一つの伸長プライマーを含む、方法。
【請求項４７】
合成ポリヌクレオチドにおいて、
生体試料中の微生物ＤＮＡの検出、同定、および／または定量のための競合配列であって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８７、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８８からなる群から選択された、競合配列、
を含む、合成ポリヌクレオチド。
【請求項４８】
一対の合成ポリヌクレオチドにおいて、
生体試料中の微生物ＤＮＡの検出、同定、および／または定量のための順方向および逆方向プライマーであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４３、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４４からなる群から選択された、順方向および逆方向プライマー、
を含む、合成ポリヌクレオチド。
【請求項４９】
合成ポリヌクレオチドにおいて、
生体試料中の微生物ＤＮＡの検出、同定、および／または定量のための伸長プライマーであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６５、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６６からなる群から選択される、伸長プライマー、
を含む、合成ポリヌクレオチド。
【請求項５０】
生体試料中の微生物ＤＮＡ検出のためのキットにおいて、
容器と、
請求項４７、４８、および４９に記載の合成ポリヌクレオチドのうちの一つ以上と、
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔関連する出願への相互参照〕
本出願は、全体を参照して本明細書に組み入れられる、２００５年１月１４日に出願された米国仮特許出願第６０／６４４，３７４号に基づく、優先権を主張する。
【０００２】
〔助成金情報〕
本発明の基調を成す研究は、一部はミシガン・ライフサイエンス・コリドー（Michigan Life Science Corridor）（ＭＥＤＣ-４１０）、ミシガン・トリテクノロジー・コリドー（Michigan Tri-Technology Corridor）、ＮＩＨ（Ｒ２１  ＤＫ６９８７７、Ｒ２１  ＤＫ０７０２３７、ＣＡ１０４８３０、およびＣＡ９４３２８）、ＮＩＨ頭頸部癌研究拠点特別プログラム（Head/Neck Cancer SPORE）（１  Ｐ５０  ＣＡ９７２４８）、およびＭＤＲＴＣ細胞分子生物学コア（Cell and Molecular Biology Core）（ＤＫ２０５７２）による援助を受けた。政府が本発明において一定の権利を有する可能性もある。
【０００３】
〔発明の分野〕
本発明は、生体試料における微生物病原体の検出および取扱いの分野に関する。
【０００４】
〔発明の背景〕
最近の研究は、ヒトパピローマウイルス（human papillomavirus「ＨＰＶ」）が、子宮頸癌、頭頸部癌、肛門癌、および住血吸虫症に関連した膀胱癌のかなりの割合に関連していることを示している。子宮頸癌および肛門癌は、ほぼ一様にＨＰＶ感染と関連している。発表された報告についての近年の総説は、頭頸部腫瘍におけるＨＰＶのＤＮＡの全体的な保有率が３５％であることを見いだした。さらに最近、ある研究グループは、これらの知見を腫瘍試料２５３件の大規模な研究で裏付けるために、定量ＰＣＲ（Qunantitative PCR「ＱＰＣＲ」）を用い、検体の２５％にＨＰＶのＤＮＡを検出した。またＨＰＶは、肛門異形成および癌にも関連している。別の研究グループは、住血吸虫症に起因する膀胱癌の５０％近くが、ＨＰＶのＤＮＡを持つことをインサイチューハイブリダイゼーション法（in situ hybridization）により見いだした。
【０００５】
ＨＰＶタイプ１６および１８は、その存在が前癌病変部および癌腫に関連しているために、「高リスク」ウイルスタイプに含まれている。対照的に、「低リスク」タイプ、最も一般的にはＨＰＶタイプ６および１１は、典型的に良性病変に関連している。ＨＰＶの発癌誘発の可能性は、主に二つのウイルスの癌タンパク質、Ｅ６およびＥ７に起因している。ＨＰＶタイプの間の発癌誘発性の違いは、Ｅ６およびＥ７タンパク質のタイプ特異的な違いが原因であると考えられてきた。発癌性のＨＰＶ株（HPV strain）のＥ６タンパク質は、ｐ５３タンパク質と相互作用し、ユビキチン依存性経路（ubiquitin-dependent pathway）を介してｐ５３タンパク質の分解を促進することが示された。癌タンパク質のＥ７は、同様に網膜芽細胞腫（Ｒｂ）タンパク質と複合体を形成して不活性化させることができる。ｐ５３およびＲｂは、共に重要な癌抑制遺伝子であり、その遺伝子産物は細胞周期を調節し、ＤＮＡ修復過程を統合し、プログラム細胞死またはアポトーシスに関わる。これらの癌抑制遺伝子タンパク質のＨＰＶによる混乱は、突然変異（mutational change）および細胞不死化の伝播を引き起こす。
【０００６】
癌細胞の異常ゲノムに対する血清ＤＮＡ検査の技術が、癌の分子検査の可能性として研究されてきた。一部の研究者は、タックマン（TaqMan）定量ＰＣＲ法が、頭頸部癌および子宮頸癌患者由来の血清中のＨＰＶのＤＮＡを検出可能であることを見いだしたものの、この技術では、臨床ツールとして多くの対象において有用な程度に、十分な量の血清およびその他の生体部位で、ＨＰＶのＤＮＡは検出されなかった。
【０００７】
現在の制限の例として、現時点で標準的なＨＰＶテストであるダイジーン（Digene）テスト［１］への対処に伴う問題は、後述の問題を含む。
【０００８】
１．  ダイジーンテストは、既知の病原性タイプ以外のＨＰＶタイプと非特異的に交差反応する［２］。従って、ダイジーンテストによる偽陽性は避けられない。
【０００９】
２．  ダイジーンテストは、陽性と読み取るためには少なくとも数千のＨＰＶ分子が必要である［１］。この必要条件のために、存在する分子数がこれよりも少ない血清および／または血液のスクリーニングができない。
【００１０】
３．  さらに、ダイジーンテストは、どのＨＰＶタイプが子宮頸部のシンプレップ（ThinPrep）で見つかったかを明らかにしない。シグナルの原因となったＨＰＶのタイプが同定されなければ、非病原性タイプＨＰＶが偽陽性結果となることから、このことは重要である。
【００１１】
これらのおよびその他の制限ならびに技術的な欠点を考慮すると、現在利用可能な方法で検出不可能なレベルでの、生体試料における個別のＨＰＶ種の検出および同定のためのシステム、方法、および組成の満たされていないニーズが残っている。
【００１２】
〔発明の概要〕
本発明は、限定的ではないが、癌および異形成の検出、治療、および／または管理を目的とする、ほ乳類の体液および子宮頸部の擦過標本（scrapings）などを限定的でなく含む生体試料における、ＨＰＶのシングルコピー（single copy）レベルに至るまでの検出、同定、および定量のためのシステム、方法、および組成などを含む。いくつかの好ましい実施態様においては、本発明は、個別のＨＰＶ配列を同定し、ＨＰＶ-ＤＮＡの検出感度を向上させ、いくつかの腫瘍タイプと血清および／または末梢血ＨＰＶ-ＤＮＡとのより高頻度な関連性をもたらす、より高感度の質量分析手法を含む。従って、本発明は、ＨＰＶが関与する症例での遺残腫瘍または異形成のマーカーとして、ＨＰＶ-ＤＮＡに関する末梢血および血漿のスクリーニングを可能にするシステム、方法、および組成を含む。
【００１３】
本発明の別の側面は、以下の図面および詳細な説明を精査すれば、当業者には明らかである。
【００１４】
ここで、添付の図面を参照しつつ、本発明についての例を説明する。
【００１５】
〔発明の詳細な説明〕
限定的ではないが、いくつかの実施態様では、本発明は、腫瘍または異形成組織由来の癌または異形成と関連する、ＨＰＶの一つ以上のタイプの解析および判定を同時に行うためのシステム、方法、および組成を含む。本発明を用いると、この解析および判定は、ＨＰＶの検出のために現在米国食品医薬品局（「ＦＤＡ」）に認可されている１０００〜５０００コピーが必要な試験［１］より感受性が高く、ＨＰＶコピー数を１００以下にまで下げても実施されることが可能である。本発明は、所定の個別のＨＰＶ配列の探索によって感度をさらに向上させることにより、１ａＭ（いくつかの実施態様で用いられる、５μＬのＰＣＲ容量中の個別の分子）までの検出が可能である。向上したこの感度は、その他の生体試料のうち血液および血清中の病原性ＨＰＶを検出することもできる。
【００１６】
さらに、本発明は、現在用いられている特定の方法［１］であって、多数のプローブの組合せを分析する、定量的ではない方法では不可能な、所定の腫瘍に関連するＨＰＶタイプの細部を詳しく説明する、高感度の特異的で定量的なシステム、方法、および組成を含む。
【００１７】
いくつかの実施態様では、限定的ではないが、本発明に従ってＨＰＶタイプが判定された時点で、本発明は、高感度で特異的なスクリーニングをも支援することにより、ほ乳類の体液等を限定的でなく含む生体試料中に、シングルコピーレベルで存在する当該ＨＰＶを検出する。このように高感度で特異的なシングルコピーレベルでのスクリーニングは、従来可能ではなかった。それは、血清および／または血液中のＨＰＶの存在が、正常な対象には見られない異形成または癌と特異的に関連していることにより、過去に立証されなかった自然の状態を明らかにする。参考文献［４］に見られるように、前述のスクリーニングにおける偽陽性の欠如により、前述のスクリーニングは、異形成または癌の検出に非常に適している。
【００１８】
いくつかの好適な実施態様では、限定的ではないが、本発明は、生体試料中に存在する病原性ＨＰＶのタイプおよび量を単回の試験で検出するためのシステム、方法、および組成を含む。いくつかの実施態様では、本発明は、高程度または中程度リスクの一つ以上のＨＰＶタイプのために、質量分析アッセイシステム（massspectroscopic assay system）を用いて構築されたプローブを含む。このような高程度または中程度リスクのＨＰＶタイプは、子宮頸部擦過標本のＨＰＶ分析のために現在ＦＤＡが承認するテストである、ダイジーンのシンプレップテスト［１］を用いた同定に従って選択されてもよい。本発明のいくつかの実施態様では、ダイジーンテストのＨＰＶ１３タイプに、子宮頸癌および肛門癌を引き起こす危険が高い可能性もある、別の６タイプのＨＰＶを加える［５，６］。この判定は、陽性になるには数千のＨＰＶ分子が必要な現在のダイジーン法［１］よりもさらに一桁感度が高く、少なくとも１００ａＭ（およそ３００分子）まで実施可能である。さらに、本発明は、腫瘍または異形成に、ひいては、腫瘍に直接由来する材料（例えば、子宮頸部シンプレップ）中に、どのタイプのＨＰＶが存在するかの判定を可能にする。最後に、本発明のいくつかの実施態様は、限定的ではないが、定性のみの従来の試験と比較して、定量解析のためのシステム、方法、および組成を含む。臨床的悪性度は、異なる解剖学的位置でのＨＰＶのコピー数を反映する可能性があり、本発明に従ったこの定量判定とＨＰＶタイプ確認との組合せは、特記すべき臨床的有用性を有する可能性もある［６］。
【００１９】
いくつかの実施態様によれば、限定的ではないが、腫瘍または細胞抽出物中の一つ以上の病原性ＨＰＶタイプの存在は、高感度で特異的な質量分析アッセイにより検出される（［８-１０］、図１）。概して、本発明の質量分析アッセイは、ＨＰＶ中に見いだされた短いヌクレオチド断片のＰＣＲによる増幅、プライマーおよびヌクレオチドの消化、および「入れ子状態（nested）」の質量分析アッセイプライマーの適切なジデオキシヌクレオチド（dideoxynucleotides）による伸長を伴う。この結果、一次ＰＣＲ反応からの所定のＨＰＶテンプレートが存在する場合に限り、質量分析アッセイ伸長配列（extension sequence）に単一のジデオキシヌクレオチドの取り込みをもたらす。
【００２０】
いくつかの実施態様によれば、スクリーニングは、所定のＨＰＶタイプに対して陽性の場合に特有のシグナルを生じる識別可能なプローブを用いて、各試料が個別に一つ以上の病原性ＨＰＶタイプ、単なる一例としては１９の病原性ＨＰＶタイプに対して試験されるという方法で構成される。このスクリーニングは、当初スクリーニングされていた中心的な１３タイプ（図１、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、および６８［１］）に、病原性である可能性があるＨＰＶタイプ２３、２６、５３、６６、７３、および８２［５］に加えた、合計１９のＨＰＶタイプに対するスクリーニングを可能にする。
【００２１】
いくつかの実施態様は、ヒト全ゲノムＤＮＡ（total human genomic DNA）のシングルコピー断片に対するプローブ（例えば、限定的ではないが、ｅｒｂＢ-２遺伝子のイントロンのシングルコピー断片に対するプローブ）も含む。少なくとも１００アトモル（ａＭ＝１０-18Ｍ）レベルまでの高感度スクリーニングに加えて、本発明は、所定の腫瘍または異形成に関連したＨＰＶタイプの判定を可能にする。さらに、有用な予後データも与える可能性もある［７］、ＨＰＶ配列のコピー数の判定が実現される。
【００２２】
いくつかの実施態様では、前述のこの一次スクリーニングが陽性だった場合、体液中のＨＰＶの存在は、一次スクリーニングで陽性だったＨＰＶタイプに対するプローブのみを用いる、さらに一層高感度の質量分析アッセイにより検出される。このアッセイは、所定の腫瘍または異形成に存在するＨＰＶタイプを詳細に明らかにする前回のスクリーニングの利用によって可能になる。この手法は、血液検査および／または血清検査により、腫瘍の再発スクリーニングの可能性を提供する。
【００２３】
血清および／または血液におけるシングルコピーレベルでのＨＰＶの高感度検出は、予想外で過去に正しく評価されていない結果をもたらす。すなわち、
【００２４】
１．本発明に従えば、血清および／または血液のスクリーニングによって、子宮頸部異形成の検出が可能性である。相当な割合の正常症例を異常とする結果をもたらす不正確さを引き起こすタックマンに基づく手法を用いる場合を除いて［４］、これは、過去には実際に実証されなかった。対照的に、本発明は、相当な割合の子宮頸部異形成症例が血清および／または血中のＨＰＶに関連しているという、予想外で過去に正しく評価されていない結果を示す。比較すると、正常なコントロール試料および治療に成功した子宮頸部異形成の試料では、血清および／または血中にはＨＰＶは含まれない。本発明以前、血清および血液の個別の有益性は、正しく評価されなかった。このことは恐らく、これらの事象の相異なる発症機序（pathogenesis）、つまり、血液中のＨＰＶは、無傷の腫瘍細胞の循環または腫瘍細胞の（消化不十分な）食作用（phagocytosis）のいずれかの結果から生じるのに対して、血清中のＨＰＶは、細胞溶解（cellular lysis）から生じることに起因している。
【００２５】
２．本発明によれば、住血吸虫症（schistosomiasis）に関連した膀胱癌は、一律にＨＰＶと関連していることが予想外に示されている。以前は、これらの癌のわずか半数のみが、ＨＰＶから引き起こされると考えられていた［１１］。シングルコピーレベルでの本発明の高感度解析への向上は、血清（２６／２７症例）および尿沈渣（１５／２４）が共に診断に有用であることをも示した。血清ＨＰＶは、２６／２７症例で陽性だったものの、血液ＨＰＶは、存在しなかった。
【００２６】
３．本発明を用いて、血液および血清の両方の解析が、ＨＰＶにより引き起こされる頭頸部癌の診断および治療のモニタリングに有用であることが示されている。従来は、しばしば腫瘍に存在した高レベルのＨＰＶがこの解析を可能にしていたものの、低レベルの検出が不可能なことから、血液および血清の解析は、血清について調査したほとんどの症例が陰性であったように［３］、実用的ではなかった。対照的に、本発明に従った検出は、かなりの割合の腫瘍が、血清および／または血液で検出され得るＨＰＶに関連していることを示した。様々な病原性ＨＰＶタイプに拡大されたこの検出は、臨床的に重要でないＨＰＶタイプが解析を妨げないことから、本スクリーニングが臨床的価値を有することを証明する。
【００２７】
４．また、本発明を用いて、試験された正常尿沈渣の全４０件、正常血清試料の全２７件、正常血液試料の全２０件、および胎盤の全９件を含む、試験された全ての正常コントロールが、陰性だったことが示された。
【００２８】
いくつかの実施態様では、限定的ではないが、本発明は、単一分子レベルまでの検出に十分な、高感度かつ特異的な二段階のスクリーニング方法を含む。第一段階は、一連の全１９の病原性ＨＰＶタイプでの腫瘍性または異形成細胞のスクリーニングを含む。一旦ＨＰＶタイプが明らかになったら、そのタイプは、全１９配列が同時に使用された場合よりも、さらに高感度での関連する体液のスクリーニングに用いることができる。結果として、感度および特異性が向上した体液のスクリーニングは、臨床的有用性が向上する。このようなスクリーニングにおいて、血清および血液は、別個に情報を提供し、これらの体液中のＨＰＶをもたらす異なる発症機序を反映している。血清中のＨＰＶの存在は、ＨＰＶを有する異常細胞の溶解に起因する。血液中のＨＰＶの存在は、循環している腫瘍細胞および／または完全に消化されていないＨＰＶ配列の検出を伴う異常細胞の食作用の存在に起因する。即ち、有用な情報は、血液および血清の別個の問合せ（query）に由来する。本発明は、全ての体液（例えば、尿、脳脊髄液、汗、唾液、涙など）にまでおよぶシステム、方法、および組成を含む。
【００２９】
〔実施例〕
本発明のいくつかの実施態様の以下の例は、本発明を、本明細書に述べられた実施態様のみに限定せずに提供される。
【００３０】
いくつかの好適な実施態様に基づき、限定的ではないが、本発明は、競合的ＰＣＲ、プライマー伸長法（primer extension reaction）、およびＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ  ＭＳの特徴と組み合わせた、定性的および定量的な遺伝子発現解析のためのマトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（matrix-assisted laser desorption ionization - time of flight、「ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ」）質量分析法（「ＭＳ」）の使用を含む（概して、図２を参照）。生体試料から単離されたＨＰＶのＤＮＡを含むと考えられる試料は、対象配列の概ね中心にある一塩基を除いて、対象ＨＰＶのＤＮＡ配列の一部と同一または実質的に対応している配列を伴う、およそ１００ｎｔ長の合成オリゴヌクレオチド（競合物）でスパイクされる。いくつかの実施態様では、競合物は、既知の濃度で添加される。競合物および対象ＤＮＡは、順方向および逆方向のプライマー存在下でＰＣＲにより共に増幅される。過剰なｄＮＴＰおよびプライマーは、ＰＣＲの後に、当業者に既知の方法、限定的ではない単なる一つの例としては、酵素消化および適切な洗浄によって除去される。次に、塩基伸長反応（base extention reaction）が、伸長プライマー、および異なるｄｄＮＴＰの組合せ（単なる一例としては、ＧおよびＣ）で実施される。伸長プライマーは、変異部位のすぐ隣にハイブリダイズし、分子量が異なる二つのオリゴヌクレオチド産物が生じるように、２つのｄｄＮＴＰ塩基のうち少なくとも一つが、競合物およびＤＮＡに対して個別に添加される。約５，０００ダルトン〜約８，５００ダルトン（Ｄａ）の典型的な分子量の領域（window）では、二つのオリゴヌクレオチドの差がおよそ２０Ｄａ以上異なる場合には、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ  ＭＳは、二つのオリゴヌクレオチドを容易に識別する。本発明に従って、これらの異なる伸長産物は定性的に同定され、その濃度はＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ  ＭＳからの比との関連で定量されることも可能であり、単なる一例としては、添加された競合物配列の濃度が既知である場合である。いくつかの実施態様では、望ましい分子量スペーシングは、本明細書でさらに述べられるように、要求に応じ、塩基伸長プライマーの５'末端へスペーサー分子を付加することによってさらに達成されるが、これに限定されない。
【００３１】
＜試料からのＤＮＡの精製と定量＞
腫瘍、血清、末梢血、および尿沈渣試料が、腫瘍の生体組織検査の際に個別の癌患者から単離された。血清および／または末梢血は、ＨＰＶに曝露されていない正常コントロールから、住血吸虫症の個人（既知の膀胱癌の有無にかかわらず）から、腫瘍の外科的除去後の住血吸虫症に関連した膀胱癌の個人から、頭頸部癌の個人から、および、子宮頸癌または肛門癌もしくは子宮頸部異形成の個人から、単離された。尿沈渣は、住血吸虫症に関連した膀胱癌の被験者から、および膀胱の腫瘍を持たないコントロール被験者（control subjects）から、単離された。尿沈渣は、ベックマン（Beckman）Ｊ２-２１Ｍ遠心管で、約８，０００ｒｐｍで約１０分間の尿の遠心後に、ペレットとして単離された。胎盤は、正常分娩後に入手された。組織、末梢血、および尿沈渣のＤＮＡは、ＺＲゲノミックＤＮＡ  Ｉキット（ZR Genomic DNA I kit）（カリフォルニア州オレンジのザイモリサーチ社（Zymo Research Corp））を用いて単離された。ＤＮＡは、約０．３ｍＬ〜５ｍＬの血清から、ＺＲゲノミックＤＮＡ単離キット（ZR Serum DNA Isolation kit）を用いて単離された。
【００３２】
子宮頸部試料は、シンプレップ・プリザーブサイト（ThinPrep PreservCyt）溶液（メリーランド州ガイサースバーグのダイジーン社（Digene Corporation））で採取された。患者の結果の報告後、検体は患者の識別名を外され、小分注が調製され、質量分析ＰＣＲ法により試験された。我々はＤＮＡを約５ｍＬのシンプレップ溶液から、ＺＲ血漿ＤＮＡ単離キット（Serum DNA isolation kit）のザイモ（Zymo）ビーズ約１０μＬと回転させることで単離した。ビーズは試料に添加され、約４倍体積のゲノミック溶解緩衝液（Genomic Lysis Buffer）（ザイモリサーチ社）が添加された。混合物は、約４℃で一晩転倒混和（tumbled）された。ＤＮＡは、ビーズからメーカーの指示に従って調製された。最終的な懸濁液は、少量（約２０μＬ）の溶出緩衝液（Elution Buffer）中だった。試料は、メーカーの取扱説明書［１，１２］に従ってダイジーンＨＣ２およびロシュ（Roche）解析（リバースラインブロット（reverse line blotting）を含む）が実施された。次に試料は、本発明に従って、盲検的に（blindly）質量分析解析に供された。
【００３３】
所定の試料中のＤＮＡ量を判定するために、我々はｅｒｂＢ-２遺伝子中の固有のイントロンに対して、バイオラド・アイサイクラー（Bio-Rad iCycler）でタックマン蛍光ＱＰＣＲ［１３］を用いた。我々は、５'ＡＣＣＴＴＣＴＣＴＴＧＡＣＣＴＴＴＣＡＧＡＡＴＡＴＧＴ-３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２９）および５’-ＡＧＡＧＡＧＴＣＴＴＧＧＣＣＣＴＴＴＣＣＡ-３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２９）のプライマーと共に、５'-ＡＧＡＧＧＧＣＣＣＴＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＣ-３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３０）のタックマンプローブを用いた。我々は、実験的に得られた７．７ｘ１０3半数体ゲノム相当／蛍光単位の値のｅｒｂＢ-２プローブを用いた。
【００３４】
＜ＨＰＶ-ＤＮＡのタックマン縮退プローブの作成＞
ＨＰＶ-ＤＮＡの縮退ＰＣＲプローブは、ウイルスのＬ１領域内に作成された［１３］。ＧＰ５＋およびＧＰ６＋プライマーの出典は、デ・ローダ・フスマン（de Roda Husman）ら［１５］である。ＭＹ１８およびＭＹ１０１９プライマーの出典は、ネルソン（Nelson）ら［１６］である。縮退タックマン［１３］セットの構築に、我々はタックマンセットを得る二つの外側のプライマー（ＧＰ５＋およびＧＰ６＋に基づく）およびプローブ（ＭＹ１８およびＭＹ１０１９に基づく）配列を組み合わせた。融解温度（Ｔｍ）は、キアゲン（Qiagen、http://www.operon.com/oligos/toolkit.php?）のオリゴ計算機（oligo calculator）を用いて得た。
【００３５】
プライマー１（ＧＰ５＋アナログ）：
ＧＰ５＋アナログは、下に挙げる４プライマーそれぞれの等量の組合せによって作成された。
2008526248.tif 000003
【００３６】
2008526248.tif 000004
【００３７】
プローブ：
ＭＹ１０１９最終プローブは、等量のＭＹ１０１９アナログ１およびＭＹ１０１９アナログ２を混合することで作成された。最終プローブは、等量のＭＹ１８アナログおよびＭＹ１０１９最終アナログから作成された。
【００３８】
2008526248.tif 000005
【００３９】
ＭＹ１０１９最終アナログは、以下の１／１混合物から作成された。
【００４０】
2008526248.tif 000006
【００４１】
2008526248.tif 000007
【００４２】
プライマーおよびプローブは、我々の依頼でバイオリサーチによって合成された。プローブは、５’末端を蛍光６-ＦＡＭで、３’末端をブラックホール・クエンチャー１（Black Hole Quencher1）で標識された。我々は、ＨＰＶ-１６またはＨＰＶ-１８配列（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection））のいずれかを含むプラスミドで回収された縮退プライマー・プローブを、個別に試験した。縮退プローブを用いて、我々はいずれのプラスミドでも同等の増幅を得た。
【００４３】
＜縮退タックマンプローブのＰＣＲ増幅＞
全ての正常血清は少量の正常ゲノムＤＮＡを含むため［１６］、我々は、血清ＤＮＡが全てタックマンｅｒｂＢ-２ゲノミックＤＮＡプローブ［１３］を含む試料から調製されたものであることの検証を行った。同様の方法で、我々は、ＤＮＡが全て、用いられた別の試料から単離された事を確認した。約９５℃で約５分間の変性後、ｅｒｂＢ-２の増幅のために、約９５℃で約１５秒間の変性および約６０℃で約３０秒間のアニーリングの２段階のプログラム、４０サイクルが用いられた。約９５℃で約５分間の変性後、ＨＰＶ-ＤＮＡのＱＰＣＲ増幅のために、我々が至適化後にパーキンエルマーモデル７７００（Perkin-Elmer model 7700）で用いた条件は、約５２℃で約６０秒間（アニーリングおよび伸長）、および約９５℃で約１５秒間の変性の２段階のプログラム、４０サイクルだった。また我々は、質量分析ＰＣＲ法の最後の増幅段階で用いられる５５サイクルと対応させるために、多数の試料でこの条件を約５５サイクル行った。通常のアニーリングおよび伸長の温度である約５２℃よりも低いことは、我々が縮退プローブを使用していることを反映している。縮退ＨＰＶ-ＤＮＡプローブでのタックマン反応のために、各数値は、４通りに（quadruplicate）反復された。試料は、パーキンエルマーモデル７７００でタックマン法［１３］により解析された。ＤＮＡシーケンシングは、ミシガン大学コア（University of Mishigan Core）のシーケンシング施設により行われた。
【００４４】
＜ＨＣ２法の増幅＞
ＨＣ２反応は、ＨＰＶの１３の各高リスクタイプのＤＮＡに相補的なＲＮＡプローブを含む。ＨＰＶ-ＤＮＡおよび任意の相補的ＲＮＡプローブの間のハイブリダイゼーションは、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを標的とする捕捉抗体［１］を用いて検出される。最初の試験で、相対発光量の切り捨て率（relative light unit (RLU) cuttoff ratio）≧１０の検体を、陽性と見なした。ＲＬＵ切り捨て率＜約０．８の検体は、陰性とみなされた。ＲＬＵ切り捨て率が約０．８〜９．９９の検体は、再度試験された。反復的にＲＬＵ切り捨て率≧１だった場合、試料は陽性と見なされた。陽性として反復しなかった不明瞭な検体は、本研究には含めなかった。試料は、２群（ＨＣ２（＋）およびＨＣ２（−））に分けられ、匿名化され、余剰のシンプレップ材料が、マスアレイ（MassARRAY）手法により研究された。
【００４５】
＜ＨＰＶタイプの別の解析方法＞
示されたように我々は、リバースラインブロット解析のロシュ法［１２］によって選択された試料のＨＰＶタイプを得た。別法として、我々はＨＰＶのＬ１領域内の縮退プライマーで増幅される可能性がある最も多くのＨＰＶ配列を検出するために、ＨＰＶのＬ１領域内の縮退プライマーを用いた［１５，１７］。この手法は、ＨＰＶ５２（我々の試験では、ＨＰＶ５２および縮退プライマーの間の相違が、プライマーが結合するには大きすぎた）を除くＨＰＶ病原性タイプ１３種類の全てで目的通りに機能した。
【００４６】
＜ヒトゲノムＤＮＡの測定＞
所定の試料中のＤＮＡ量を測定するために、我々はｅｒｂＢ-２遺伝子内固有のイントロンに対して、バイオラド・アイサイクラーでタックマン蛍光ＱＰＣＲ［１２］を用いた。プライマーは、５'-ＡＣＣＴＴＣＴＣＴＴＧＡＣＣＴＴＴＣＡＧＡＡＴＡＴＧＴ-３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．  １３９）および５'-ＡＧＡＧＡＧＴＣＴＴＧＧＣＣＣＴＴＴＣＣＡ-３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．  １４０）であり、タックマンプローブは、５'-ＡＧＡＧＧＧＣＣＣＴＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＣ-３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．  １４１）だった。我々は、７．７ｘ１０3半数体ゲノム当量（haploid genome equivalents）／蛍光単位の値のｅｒｂＢ-２プローブを得た。また我々は、このイントロンに対して質量分析法で解析され（表１）、もはやアイサイクラーでの分離解析の必要がないプローブを、２２プローブの混合物に組み入れた。
【００４７】
＜ＰＣＲ解析の定量質量分析法＞
いくつかの実施態様に従い、限定的ではないが、本発明は、数分子ほどの初期の分子を検出するために、マトリックスシリコンチップアレイ（matrix-loaded silicon chip array）上の産物を分離する、リアルタイム競合ＰＣＲ（ｒｃＰＣＲ）、プライマー伸長、およびＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ  ＭＳの複数段階の過程を含む［８］。ＰＣＲのためのＨＰＶ標的配列に適合させるために、合成中に導入される競合物中の単一塩基変異以外の競合ヌクレオチドテンプレート（単なる一例として、およそ１００ｎｔ）が合成される。次に、単一塩基変化は、ＳＮＰ遺伝子型決定で行われるのと同様に、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ  ＭＳでの産物の質量分解（product resolution）（数ダルトンに）した状態でのプライマー伸長反応を用いて、ＨＰＶ標的対立遺伝子から区別することもできる［１０］。好ましくは、限定的ではないが、競合テンプレートは、ＰＣＲ反応に既知の量で添加され、従って、標的ＤＮＡ量の測定のための標準曲線を作成するために、滴定されることもできる。標的対立遺伝子および競合テンプレート対立遺伝子のピーク面積が等しい場合、二つの分子の濃度は、およそ１：１の比率であり、反応液中の標的ＤＮＡの量を表す。質量分析解析は、この例示的な実施態様において非常に特異的であり、所定のプライマー伸長産物が、およそ２０ダルトンの分解能まで識別された。従って、任意の混入物産物が偽陽性シグナルを生じるには、この特定のサイズでなければならない。内部標準（競合プレート）の存在は、ＰＣＲに必要な酵素が機能していること、および、試料がＰＣＲの阻害剤を含まないように精製されたことを確認するためにも役立つ。
【００４８】
＜ＤＮＡのリアルタイム競合ＰＣＲおよび質量分析解析によるＨＰＶタイプおよび量の決定＞
いくつかの実施態様に従い、プライマー３（Primer3）ソフトウェア（http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi）を用いて様々なＨＰＶ系統のＥ６領域から、最初のＰＣＲおよび伸長プライマー配列を抽出することによって、１３単位のＨＰＶアッセイが設計された。これらの配列は、次に、マスアレイアッセイデザイナーソフトウェアｖ３．０（カリフォルニア州サンディエゴのシーケノム社（Sequenom, Inc.））［８］に用いるための投入配列の境界を明らかにするために用いられた。この方法で、我々は高リスクＨＰＶ（図１）の個々の１３タイプのそれぞれを識別することができた［１］。順方向および逆方向のプライマー、伸長プライマー、および競合配列は、表２に開示されている。いくつかの実施態様は、この目的のためにカスタマイズされ、我々が綿密に作成した別のソフトウェアを用いる、さらに徹底的なスクリーニングも含む。このソフトウェアを用いて、我々は、オリジナルのＨＰＶの１３タイプ、追加のＨＰＶ６タイプ、所定の小分注でヒトＤＮＡの量の定量が可能なゲノムＤＮＡシングルコピープローブ、ならびに淋菌（Neisseria gonorrhoea）およびトラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis）のプローブを含む、２２の配列タイプを含むプローブを作成した（例えば、表１Ａ〜表１Ｃを参照）。一次ＰＣＲ反応のための温度は、約６０℃で、二次プライマー伸長反応のための温度は、約５８℃である。
【００４９】
多重ｒｃＰＣＲ（multiplexed rcPCR）質量分析解析のためのＰＣＲ条件は、前述の通りである［１８，１９］。反応は、９６ウェル（well）のマスタープレートを作成することで開始され、このマスタープレートからマルチメック（MultiMek）ロボットを用いて３８４ウェルの反応プレートを設けた。０ａＭ（アトモル＝１０-18Ｍ）の所定の競合物が４ウェル、および各ＨＰＶ系統に対して１ａＭの所定の競合物が４ウェルあった。特定のＨＰＶ配列に対して陽性だった反応は、次にそれぞれの陽性ＨＰＶに対して定量された。我々は、１０ａＭ、１００ａＭ、および１ｆＭ（フェムトモル＝１０-15Ｍ）の競合物を用いて、反応物を定量した。反応が滴定不能な程度に過度に陽性だった場合には、検体は１／１００に希釈され、再度滴定された。
【００５０】
マスアレイは均質なアッセイではないため、反応物を用意する際には注意が払われる必要がある。我々は、反応物を用意するために、また混入を最低限にするために、二台のロボット（最初のＰＣＲ前および後）を用いた。正常試料が陰性を示している全てのプレート中の常用コントロール（routine control）は、混入を防ぐためのこれらの手法が効果的だったことを裏付けた。本明細書に報告された全ての値は、少なくとも８つの独立のデータポイントの解析を表す。
【００５１】
＜コントロール試料＞
我々は、組織、血清、末梢血、および尿沈渣に対する、一連のコントロールを試験した。組織コントロールは、正常胎盤由来のＤＮＡ試料だった。血清および末梢血のコントロールは、ＨＰＶに対する曝露の有無が不明な匿名の被験者の血清および末梢血から、我々が単離したＤＮＡ試料だった。尿沈渣は、正常なボランティアからのＤＮＡ試料だった。本明細書で報告された全ての例では、タックマンによるｅｒｂＢ-２コントロールプローブでの反応は陽性であり、ＱＰＣＲ品質のＤＮＡが存在していたことが確認された。コントロール試料は、通常縮退ＨＰＶ-ＤＮＡプローブに対して４ウェル全てで陰性であり、また稀に１／４ウェルで陽性だった。従って、我々は慎重を期して、≧３／４ウェルで陽性に反応した試料のみを使用した。
【００５２】
パーキンエルマーモデル７７００で分析された試料について前述の定義を用いると、縮退ＨＰＶ-ＤＮＡは、０／４０件の正常尿沈渣、０／２７件の正常血清試料、０／２０件の正常末梢血試料、および０／９件の胎盤（正常組織試料のコントロール）と反応した。さらに、質量分析ＰＣＲシステムによるより一層高感度の解析も、これらの正常試料のいずれにもＨＰＶ-ＤＮＡが存在しないことを示した。
【００５３】
ＤＮＡシーケンシングの開始プライマーとして、高度に保存された逆方向プライマー（ＧＰ６＋アナログ）を用いることで、我々はＨＰＶ-ＤＮＡタイプをジデオキシシーケンシング（dideoxy sequencing）によって決定することができた。我々は、以下の点を認めた。すなわち、
【００５４】
縮退プローブは、全てのコントロール組織で適切に陰性だった。
【００５５】
また、我々は住血吸虫症に関連した膀胱癌（表３）、頭頸部癌（表４）、および子宮頸癌（表５）における、ＨＰＶ-ＤＮＡ関与の証拠を見た。これは、ＨＰＶ-ＤＮＡの関与を示唆する多数の文献と一致する。
【００５６】
単なる追加の例の目的で、本発明の潜在的な実施態様を限定することなしに、腫瘍または子宮頸部シンプレップは、任意の病原性ＨＰＶの異なる１３タイプを１回の反応で個別に特定するために、本発明の質量分析アッセイを用いて、最初の段階で１３種類の病原性タイプの一つに対してスクリーニングされた［１］。ＨＰＶが細胞を変質させるために存在しているに違いない、ＨＰＶのＥ６領域由来の配列が得られた。発ガン性のＨＰＶ系統のＥ６タンパク質は、ｐ５３タンパク質と相互作用し、その変性を、ユビキチン依存性経路を介して促進する［２０］。配列は、ヒトの癌に対して発ガン性である１３種類の各ＨＰＶタイプのＥ６領域から得られ（http://hpv-web.lanl.gov/）、少なくとも一つの既存の方法であるダイジーンスクリーニングにより知られている［１、表２］。
【００５７】
いくつかの実施態様では、限定的ではないが、配列は、良好な分子量スペーシングを得るために、ＰＣＲの至適温度を変化させ得る不適切なプライマーサイズの変化なしに調製される。我々は、表１Ａ〜表１Ｃに詳説されたように、２２のプローブを用いるさらに進展させた我々のスクリーニングに、この方法論を用いた。いくつかの実施態様では、デオキシグアノシン（deoxyguanosine）、デオキシアデニン（deoxyadenine）、またはデオキシチミジン（deoxythymidine）を「ワイルドカード」塩基であるデオキシイノシン（deoxyinosine）と置換することによって、１５以下の隣接する塩基の利用がある。この構想は、１６以上の塩基（およそ４16）によって提供される置換の数がヒトゲノムのサイズより大きいように、ヒトゲノムのサイズに関連して導き出される。このような実施態様を用いることで、我々は内部デオキシイノシンの置換が、ＰＣＲ条件またはＰＣＲアッセイの性能に影響しないことを見いだした。２２の標的配列に我々が用いたプライマーは、表１に列挙されている。従って、これらの実施態様において、ヒトゲノム中の所定の配列に関連しない限り、我々は＞１５ヌクレオチド長の配列は用いなかった（配列がヒトゲノム中で独自に表されるには、この長さでなければならない）。従って、いくつかの実施態様では、用いられた連続した配列は、ヒトゲノム中で独自に表されるには小さすぎる。
【００５８】
さらに、いくつかの実施態様では、限定的ではないが、望ましい分子量スペーシングは、利用された質量分析アッセイアプローチに用いられた内部プライマーであるマスエクステンド（MassEXTEND）プライマー（例えば、表１Ｂおよび表１Ｄ）の５’末端へのスペーサー分子を要求に応じて付加することによっても実現された［８］。これは、ＰＣＲ条件に影響するようなプライマー長の大きな変化なしに、つまり、ＰＣＲを至適化する均一条件での全てのプライマーセットの至適なＰＣＲ条件を維持したまま、我々のプライマー配列の望ましいスペーシングを実現する。総合すれば、デオキシイノシンおよび修飾因子を用いるアプローチは、いくつかの実施態様で用いられているように、このアプローチに適合したプライマーセットを作成することができる。
【００５９】
いくつかの実施態様では、伸長されていないプライマーに対応する配列、野生型遺伝子（wild type gene）、および１９種類の異なるＨＰＶタイプそれぞれに対する内部競合物の間の分子量の重複＜およそ２０にならないように、配列が選択された。我々は、この手法の最後に１９種類のＨＰＶタイプが検出および定量できるように、どれだけのゲノムＤＮＡが解析されたかを読み出すための基準であり、またクラミジアおよび淋病による感染の決定因子であるトラコーマクラミジアおよび淋菌のプローブも追加した。合計で、前記のシステムは、３ｘ２２＝６６の異なる各ピーク（質量分析法で識別されるピークは、伸長されていないプライマー、伸長されていないプライマー＋野生型遺伝子配列（遺伝子の次のヌクレオチドによって、ＣまたはＧのいずれかを加えた伸長されていないプライマー）、および伸長されていないプライマー＋内部競合配列（競合物の次のヌクレオチドによって、ＣまたはＧのいずれかを加えた伸長されていないプライマー））を識別する。これらの識別は、二つの分子量間のおよそ２０ダルトンの分離を識別するという、質量分析法に基づく方法の能力に基づいている。
【００６０】
図１は、本発明に従った、ダイジーン試験［１］でスクリーニングされる１３種類の病原性ＨＰＶタイプ（ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６８）についての質量分析アッセイスクリーニングの分析結果を表す。１３の異なる高リスクＨＰＶタイプ（ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、および６８［３］）のそれぞれに対するマスエクステンドプライマー［１６］の分子量に対応する、１３の異なるピークが示される。ピークを伴わない線は、マスエクステンド競合物および遺伝子産物が位置する場所を表す（見込まれる合計３ｘ１３＝３９の重複しないピークを表し、簡単にするために、１３の伸長されないピークのみが示されている）。
【００６１】
図１は、様々なＨＰＶ-ＤＮＡ配列を検出および識別する、本発明の能力を表す。いくつかの実施態様では、我々は、外部プライマーの適切なセット、および適切な伸長されていないプライマーであるマスエクステンド配列（およそ２０ｎｔ）を、それぞれおよそ１００ｎｔのＨＰＶのＥ６配列、ゲノムＤＮＡ基準、トラコーマクラミジア、および淋菌に対して用いた。およそ１００ｎｔの配列それぞれに対応するオリゴヌクレオチドは、１塩基を変更して（ＧをＣに、またはＣをＧに）合成された。合成は、例えば、市販のオリゴヌクレオチド合成機（例えば、インテクレーテッドＤＮＡテクノロジー（Integrated DNA Technologies、ＩＤＴ）が提供するサービス）を用いて行われた。およそ１００ｎｔ長のオリゴヌクレオチドは、１９種の異なるＨＰＶタイプそれぞれの内部競合配列、ゲノムＤＮＡ基準、トラコーマクラミジア、および淋菌に対応する配列を用いて合成された。およそ２０ｎｔのプライマーである２２の配列のそれぞれについては（これらには、図１に示された質量分析の分析結果との抵触を排除するために、タグが付加された）、これらの約１００ｎｔ長のオリゴヌクレオチドの右および左の端に、対応して合成された。最後に、質量分析アッセイの伸長プライマーは、この１つのヌクレオチドの違いを利用して、ＧまたはＣに直接隣接する配列を含んで合成された（この場合、内部競合物は、野生型遺伝子配列を内部競合配列から識別可能なように、個別にＧまたはＣの組み込みをもたらした）。
【００６２】
いくつかの実施態様では、プライマー配列は、野生型遺伝子配列および内部競合物と同一である。野生型遺伝子配列および内部競合物の間の唯一の違いは、伸長されていないプライマー配列に隣接する１つのヌクレオチドである。配列のこの同一性を前提とすると、野生型遺伝子配列および内部競合物の両方は、同じ効率で増幅される。結果として、内部競合物の既知の量の増幅は、本発明において、増幅された野生型遺伝子配列の量の定量に利用されることができる。
【００６３】
いくつかの実施態様では、限定的ではないが、伸長されていないプライマー、伸長されていないプライマー＋グアノシン、および伸長されていないプライマー＋シトシン（cytosine）（３ｘ２２プライマー＝合計６６プライマー）は、約５０００ダルトンおよび約８５００ダルトンの間の分子量スペースに全て適合し、およそ２０ダルトンの最低距離で隔てられなければならない。同時に、プライマーの長さは、狭い温度範囲内で全ての増幅が同じ温度で得られるように、プライマーがテンプレートとして結合および機能する要件を満たすように制限される。これらの目的を達成するために、我々は、伸長されていないプライマーの５’末端に様々な不活性スペーサー分子（inert spacer molecules）を付加する新規な戦略を開発した。
【００６４】
いくつかの実施態様では、限定的ではないが、一次ＰＣＲ増幅に用いられた増幅プライマーは、表１Ａに示される。ＰＣＲを介した伸長に用いられるプライマーは、表１Ｂに示される。競合物の配列は、表Ｃに示される。我々が用いたスペーサーは、表１Ｄに詳説される。プライマー配列は、ＨＰＶタイプ１６、１８、２３、２６、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５３、５６、５８、５９、６６、６８、７３、および８２について示されている。我々は、ｅｒｂＢ-２遺伝子のイントロン、および婦人科上の意味を持つ二つの感染症に対するプローブ（トラコーマクラミジア、および淋菌）を用いた、全ゲノムＤＮＡの投入量の測定も含める。プライマー配列が試験され、利用可能であることが見いだされた。結果として、本発明は、１９種類のＨＰＶタイプについての同時スクリーニング、全ゲノムＤＮＡの測定、ならびにトラコーマクラミジアおよび淋菌の感染に対する試験を含む。
【００６５】
本実施態様の方法論は、腫瘍形成を含むがそれに限定されない原因による、血清および／または血液中に存在するＨＰＶのタイプおよび量を測定するために、本明細書に述べられた本発明の別の側面と一体的に使われる可能性もある。選択されたＨＰＶプローブをスクリーニングする場合、血清および／または血液中のスクリーニング手法は最大限に感度が高いため、ＨＰＶが存在するかどうか、および存在するならどのタイプのＨＰＶかを判定するために、腫瘍および／またはシンプレップのスクリーニングが用いられる場合もある。そのＨＰＶタイプは、次に、最大効率の血液および／または血清のスクリーニングに用いられ、もし数種類のＨＰＶが存在する場合には、各タイプが独立にスクリーニングされる場合もある。本発明のこの実施態様の成功は、血清および／または血液中よりも高い濃度で存在している腫瘍またはシンプレップ中のＨＰＶの存在を活用している。一度ＨＰＶタイプが判定されれば、血清および／または血液は、腫瘍中に見いだされたＨＰＶタイプに対して最大限の感度でスクリーニングされることも可能である。
【００６６】
前述の通り考察されたように、ダイジーン試験は、どのＨＰＶタイプが子宮頸部シンプレップ中に見いだされるかは明らかにしない。このことは、１３種類の病原性ＨＰＶタイプ全てに対する全般的なスクリーニングではなく、既知の単一病原性ＨＰＶタイプのみに対するスクリーニングの場合、いくつかの実施態様で血清および／または血液に適用されたように、本発明が最も感度が高いために、重要になる。癌および異形成の症例の血清および血液中に、ほんのわずかなＨＰＶ-ＤＮＡしか存在しないことがしばしばあることを考慮すると、本発明の高感度質量分析アッセイ解析［３］であっても、利用者は感度を上げるために、一度に一つのＨＰＶプローブのみでこのスクリーニングを行うことを望む可能性もある。
【００６７】
限定的ではないが、本発明のいくつかの好ましい実施態様は、以下の方法によりダイジーン反応の短所に取り組む。
【００６８】
１．質量分析アッセイスクリーニングの多重機能の適用を含む。
【００６９】
２．各ＨＰＶのタイプ特異的な反応産物の分子量が、±およそ２０ダルトン以内の正確さであり、所定のＨＰＶタイプの配列に対して特異的であるために、関連したＨＰＶ配列由来の交差反応がない正確な診断が実現する。実際、本発明の質量分析アッセイ試験は、ダイジーンスクリーニングで別のＨＰＶウイルスと交差反応なしに、検出可能な１３種類の病原性ＨＰＶの各タイプを識別する（図１）。
【００７０】
３．本発明の質量分析アッセイは、個々の分子レベルまで陽性である（このレベルでは、期待されるポアソン分布が見られる可能性もある）。
【００７１】
４．また、本発明の質量分析アッセイ反応は、子宮頸部シンプレップ中に、どのＨＰＶタイプが存在しているかを識別する。選択されたＨＰＶプローブがスクリーニングされた場合には、血清および／または血液のスクリーニング手法は最大限に高感度であるため、腫瘍および/またはシンプレップのスクリーニングは、ＨＰＶが存在するかどうか、および存在するならどのＨＰＶタイプかを、判定するために用いられる。その特定のＨＰＶタイプは、次に、血液および／または血清の最大限の効率でのスクリーニングに用いられる。このスクリーニングの成功は、血清および／または血液中よりも高い濃度で存在している子宮頸部擦過標本または腫瘍のシンプレップ中のＨＰＶの存在を活用している。シンプレップまたは腫瘍中で一度ＨＰＶタイプが判定されれば、血清および／または血液は、腫瘍中に見いだされたＨＰＶタイプに対して最大限の感度でスクリーニングされることも可能である。
【００７２】
いくつかの好ましい実施態様では、限定的ではないが、本発明の第二段階（段階２）において一度ＨＰＶタイプが特定されれば、体液（例えば血清および血液）または再発腫瘍、もしくは反復シンプレップが、段階１で判定されたＨＰＶタイプを用いてスクリーニングされる。これらの研究は、ＨＰＶのタイプおよび持続性に、限定を伴わない単なる一例としては、過去に疾患を治療した個人において遺残膿瘍が存在しているかどうかを判定する上で、予後の用途があるかどうかを検討するために、長期的に実施されてもよい。たとえ解析にタックマン手法が用いられたとしても、血清および／または血液中のＨＰＶの解析は十分の感度または特異性がないため、本発明無しにはこのような研究は不可能である。対照的に、本発明を用いた我々の現在の研究は、本発明の高感度で特異的な質量分析アッセイ手法での、血清および血液両方の研究の実行可能性を示している。
【００７３】
別の例として、限定的ではないが、質量分析アッセイシステムを含むいくつかの実施態様では、ＨＰＶ１６ＤＮＡは、そのＤＮＡが調製された住血吸虫症に関連した膀胱腫瘍の２４件全てで検出された（表３の右側）。これらのサンプルの一つを除く全てでは、対応する血清も陽性だった。腫瘍ＤＮＡが入手できなかった追加の３症例では、血清は、ＨＰＶ１６ＤＮＡに対して陽性だった。ＨＰＶ１６ＤＮＡは、住血吸虫症に関連した膀胱癌の症例の、全てではないが大部分の尿沈渣で検出された。これらのデータは、住血吸虫症に関連した膀胱癌における、ＨＰＶ１６感染の関与を意味する。比較すると、リアルタイムタックマンＱＰＣＲは、いくつかの実施態様の質量分析アッセイ解析（表３の右側）ほどには高感度ではなかった（表３の左側）。これらの症例由来の血液（軟膜）は、リアルタイムＱＰＣＲおよび質量分析アッセイの両方で、一律に陰性だった（データは示されていない）。ＨＰＶ-ＤＮＡの存在を示す正常でない測定値は、ボールド体で示した。アトモル（ａＭ）＝１０-18Ｍ、フェムトモル（ｆＭ）＝１０-15Ｍ、ＰＣＲには５μＬを用いた。１ａＭはおよそ３分子に相当する。
【００７４】
本発明の質量分析アッセイ結果（表３の右側）の、旧来のインサイチューハイブリダイゼーションのデータ［１０］および標準的な４０サイクルでのタックマンのデータ（表３の左側）との比較は、インサイチューハイブリダイゼーションまたはタックマンＱＰＣＲのいずれよりも本発明がより高感度であることを示している。表３の左側のデータの再現性の欠如（データは示されていない）は、タックマン手法がその感度の限界で行われており、正確でないことを示している。さらに、タックマン手法は、腫瘍、血清、および尿沈渣の間で、量的な区別ができない。いくつかの実施態様の質量分析アッセイ法を正確に反映するために、５５サイクルのタックマンＲＴ-ＱＰＣＲも試みられた。シグナルおよびノイズの間の改善は見られず、タックマン手法の限界が強調された。対照的に、本発明から得られた表３の右側の値は、血清および／または尿沈渣よりも腫瘍がより陽性であるという、期待された知見と矛盾がない。
【００７５】
この実施例において、特異性および感度の両方が、本発明の実施態様である質量分析アッセイにおいて維持された。本発明を用いることで、試験された全ての住血吸虫症に関連した膀胱癌（２４／２４）、これらの症例由来のほぼ全ての血清（２６／２７）、およびこれらの症例由来の尿沈渣の大部分（１５／２４）で、ＨＰＶ１６ＤＮＡが検出された。これらの症例からの血液は、検出可能なＨＰＶ-ＤＮＡを含まなかった（データは示されていない）。
【００７６】
関連した実施例では、ＨＰＶ-ＤＮＡの存在が、単純に住血吸虫症によるものではないことが示された。住血吸虫症が存在し、膀胱癌の疑いがあるが臨床的に証明されなかった、１０症例が試験された。症例のうち８例では、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８ＤＮＡは血清中に認められず、症例中２例では、ＨＰＶ１６ＤＮＡが認められた。このことは、ＨＰＶ-ＤＮＡは、住血吸虫症自体とは関連していないが、むしろ膀胱癌を伴う住血吸虫症症例における腫瘍の成長に関連していることを示す。このことは、臨床データが示唆的であるが決定的ではない曖昧な症例において、本発明の利用により診断を補助できることを例証している。
【００７７】
このことは、腫瘍除去後に、血清のＨＰＶ１６ＤＮＡが急速に消失することも示す。住血吸虫症の７人の被験者の血清は、癌性膀胱の外科的除去後２週間以内に検査された。７症例全てにおいて、血清中にはＨＰＶ１６ＤＮＡは検出されなかった。外科処置前の血清は入手できなかったものの、ＨＰＶ１６に対して腫瘍が一貫して陽性である性質は（表３）、ＨＰＶがおそらく存在したが外科処置によって根絶された事を示す。
【００７８】
頭頸部癌の診断時に得た対応した腫瘍、血液、および血清の試料に、ＨＰＶ-ＤＮＡが存在するかどうかも検討された。各試料について、原発腫瘍部位は与えられている。タックマン蛍光ＱＰＣＲでの解析も試みられたが、血液および血清中にＨＰＶ-ＤＮＡを検出せず、タックマン手法は臨床的に有用となるには感度が十分ではないという、他の研究による知見と一致した［３，２１］。対照的に、本発明に従った質量分析アッセイ解析は、表４に要約された結果をもたらした。ＨＰＶ１６ＤＮＡの存在を示す測定値は、ボールド体で示した。
【００７９】
腫瘍、血清、および血液が、頭頸部癌の症例から単離された（全ての被験者に対して全ての試料の種類が入手可能ではなかった。欠けている試料は空欄で表される）。ＨＰＶ１６ＤＮＡの質量分析アッセイ判定は、これらの腫瘍、血清、および血液試料で行われ、ＨＰＶ１８ＤＮＡプローブでは、これらの試料のいずれも陽性は無かったが、我々がＤＮＡシーケンシングを行った別の頭頸部腫瘍試料は、ＨＰＶ１８ＤＮＡに対して陽性だった。ＨＰＶ-ＤＮＡの存在を表す異常測定値は、ボールド体で示した。アトモル（ａＭ）＝１０-18Ｍ、フェムトモル（ｆＭ）＝１０-15Ｍ。
【００８０】
頭頸部前部器官（例えば、舌、扁桃腺）の腫瘍については、ＨＰＶに対して陽性であり、後部器官（例えば、喉頭、声門上領域）の腫瘍については、ＨＰＶに対して陰性であるという、顕著な偏りがある。それは、過去の報告［２２〜２９］と一貫している。我々は、ＨＰＶ１６ＤＮＡおよびＨＰＶ１８ＤＮＡに対して陰性だった口腔腫瘍を（１６症例中）３例のみ認めた（陰性の口腔腫瘍は、他のＨＰＶタイプに対して陽性である可能性も依然としてある）。我々は、口腔後部でＨＰＶ１６に陽性だった症例を、（下咽頭部腫瘍）１０症例中１腫瘍のみ認めた。腫瘍が陽性で、血液および血清の両方が解析可能だった９試料からは、腫瘍がＨＰＶ-ＤＮＡに対して陽性の例があり、ここではＨＰＶ-ＤＮＡが、血清のみで、血液のみで、または血清および血液の両方で識別された。
【００８１】
子宮頸癌は、ほぼ一様にＨＰＶと関連している［１６，２２］。子宮頸部腫瘤および異形成における１３種類の高リスクヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）配列に対して、本発明に従った質量分析アッセイを用いることで、我々は以下の点を認めた。
【００８２】
１．  実質的に全ての腫瘍は、１３種類の病原性ＨＰＶタイプの一つを有することが実証され、病原性ＨＰＶタイプの量は、継続的にゼロへと減少していた。非病原性ＨＰＶは、異形成に認められたが、基本的に腫瘍は存在せず、ＨＰＶタイプの限られたグループが子宮頸部の発癌に関与しているという概念を支持している。数ウイルスのレベルまで検出する質量分析アッセイの他とは異なる能力は、他の方法では実現不可能な極めて低いレベルであっても、病原性ＨＰＶタイプの検出を可能にした。
【００８３】
２．  子宮頸部腫瘍では、ＨＰＶタイター（titers）は、通常１ＨＰＶ分子／半数体腫瘍ゲノム未満であり、異形成で見られる最も高い値よりも数桁低い値である。これは、ＨＰＶ感染は異形成の成長に必要であるが発癌には不十分であるという「ヒット・アンド・ラン（hit-and-run）」モデルと一致している。
【００８４】
３．  実質的に全ての病理的に異常な（ＣＩＮ１または２）子宮頸部異形成は、１３種類の病原性ＨＰＶタイプの一つを示した。我々は、異なるタイターでの複数タイプの病原性ＨＰＶをしばしば認めた。病原性ＨＰＶによるこれらの多重感染は、病理的に異常な異形成の場合、腫瘍の場合よりも一般的だった（７２％対１７％）。さらに、他の方法論を利用することで、我々はしばしば、その他のＨＰＶタイプが高タイターで異形成に存在するのを検出した。しかし、我々はこれらのタイプを腫瘍中に検出せず、腫瘍形成は、我々の質量分析アッセイの範囲になっている一連の限られたＨＰＶタイプに起因するということを示している。
【００８５】
４．  さらに、現在、臨床的に用いられているダイジーンＨＣ２法によるその他のＨＰＶタイプの検出は、この試験から生じる偽陽性に関与している。質量分析アッセイは、この問題を軽減する。
【００８６】
現在の子宮頸部疾患の検出方法は、１．剥離した子宮頸部細胞の細胞学的異常の検出で、Ｇ．Ｎ．パパニコロウ（G.N.Papanicolaou）博士により開発された「パップ（Pap）」スメア検査［３０］、および、２．ＨＰＶ感染の検出［１］、の主に二つの手法に依存している。細胞学の主要な欠点は、試験を実施するにあたって、不確かな観察者間の信頼性、限定された感度（≦８５％）、および高度に訓練された個人への依存である［３０，３１］。実際、反復スクリーニングによってのみ、パップスメア検査の感度が、臨床的な目的に十分となると考えられている。従って、個人の定期的な追跡検査の失敗、および繰り返された細胞学的パップ検査でも子宮頸部異常がある個人全員を検出することはできないことの両方が原因で、スクリーニングが実施された集団でも子宮頸癌が発生する。
【００８７】
細胞学的な方法に代わる別の方法は、実質的に全ての子宮頸癌の必要原因であるＨＰＶの直接的な検出を行うことである［１，５，３２］。ＨＰＶは現在、子宮頸部悪性腫瘍に関連する１３種類の高リスクＨＰＶの検出にタイプ特異的なハイブリダイゼーションプローブのカクテルを用い、縮退オリゴヌクレオチド［１５，３３，３４］を用いるＰＣＲである、ＦＤＡ承認済みのＨＣ２テスト（商標）（メリーランド州ガイサースバーグのダイジーン社）［１］、または、存在しているＨＰＶを検出し、型を検査するロシュ［３５］による一連の診断試験［１］のいずれかによって検出される。これらの方法の主な欠点は、感度、特異性、および定量的な能力が限定される点である。感度は、これらの試験で検出されるにはおよそ１０2〜１０3分子が必要であるとされる感度に限定されている［１，１３］。特異性は、ＨＣ２と非高リスクのＨＰＶ系統との交差反応のために限定されている。およそ１０％のチャンスで、非高リスクのＨＰＶ系統との交差反応が生じる［２］［２，３６］。さらに、ＨＣ２テストは、正確な定量は容易にはできない。ＨＣ２による定量的な区別は、総細胞含量に対する標準化は滅多に行われないために限られ、試験のばらつきは限定され、複数のＨＰＶ配列が存在する場合には、どのＨＰＶタイプが観察されたシグナルに関与しているかを定量するのは不可能である。これらの制限に対処するためにロシュの一連の手法を用いた場合、複数タイプのテストが必要であり、試験を成し遂げるのがさらに難しくなる。これらの難しさのために、定量は複雑で、ほとんど実施されない。
【００８８】
対照的に、我々は、子宮頸部ＨＰＶのタイプ特異的な識別および定量が、最終的に血液および血清試験と組み合わされることもできる、子宮頸部異形成を監視するための質量分析アッセイに基づくアプローチを含む、発明を開示する。我々の研究のいくつかでは、ＦＤＡ承認のＨＣ２法で検出された高リスク系統と同じ１３種類のＨＰＶタイプ（ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、および６８）を用いた［１］。プライマー配列および分子量、ならびに競合配列は、表２に示されている。
【００８９】
いくつかの実施態様の質量分析アッセイを用いて、３５件の血液コントロール試料において、１３種類のＨＰＶタイプに対するプローブで調査した際、我々は、ＨＰＶが適切に、全く存在しないことを認めた（データは示されていない）。これは、きわめて感度の高い手法が、偽陽性のバックグラウンドを生じないことを示す。我々のデータから、いくつかの点が浮かび上がる。第一に、我々は、質量分析アッセイにおいてＨＰＶタイプ間の交差反応がないよう、１３種類の各病原性ＨＰＶタイプで独立に試料を観察した。この点を裏付けるように、複数タイプが存在した場合に、他のＨＰＶタイプと共に見いだされるものと一致したＨＰＶタイプは、見いだされなかった。第二に、質量分析アッセイは、これらの最も低いレベルでのポアソン分布により裏付けられるように、個々の分子レベルでの感度を実現する。第三に、これらの１３タイプのＨＰＶの多重感染は、ＨＣ２陽性の病変（３２％＝３６／１１３）よりも、ＣＩＮ  Ｉ／ＩＩの異形成（７２％＝７０／９７）でより一般的である。第四に、細胞当たりのウイルスタイターは、腫瘍よりも異形成でより高い（腫瘍に対する値は、一様に半数体ゲノム相当あたりに＜１コピーのＨＰＶを示すのに対して（図３Ａ）、パップ試験陽性の異形成では、半数体ゲノム相当あたりに約１０3コピーのＨＰＶ（図３Ｂ）、およびＨＣ２陽性の異形成では、半数体ゲノム相当あたり１０4コピーのＨＰＶ（図３Ｃ）までの範囲の値である）。従って、試料に対して最も多いＨＰＶ配列の中央値は、ＨＣ２陽性の試料では約８．４ｘ１０0、ＣＩＮ  Ｉ／ＩＩの試料では約３．０ｘ１０-1、および腫瘍では約２．９ｘ１０-2だった。このように、ＨＰＶタイターの中央値は、腫瘍では、異形成よりも一桁から二桁の規模で低い。比較すると、パップスメア検査で正常の女性由来の試料の大部分は、ＨＰＶを持たないか、あるいは低いタイターのＨＰＶがあっただけだった（図３Ｄ）。第四に、１３種類の病原性ＨＰＶタイプの一つが、全ての子宮頸部腫瘍に実際に存在した（８１／８２、表５）。全ての例で、病原性ＨＰＶの量は、ゼロコピー／半数体ゲノムまで間断なく様々な値をとった。
【００９０】
この結果は、最も低いタイターでは、質量分析アッセイのみがＨＰＶタイプの検出のために十分高感度だった腫瘍試料を含んでいた。我々は、他の感度が劣る手法では不可能だった、非常に少量（約１ａＭ＝個別分子まで）のＨＰＶを質量分析アッセイにより検出した。実質的に全ての腫瘍が１３種類の病原性ＨＰＶタイプの一つを保持していたという知見は、材料および方法で述べられたような縮退プライマーで開始されたＤＮＡシーケンシングで確認された（表５）。ＤＮＡシーケンシングに利用可能な分子数が不十分だったことによるＤＮＡシーケンシングの失敗を除き、関連したＨＰＶタイプが１３種類の高リスクＨＰＶタイプの一つだった質量分析アッセイの結果を、我々は常に確認した。
【００９１】
質量分析アッセイにより検出されたＨＰＶタイプおよび縮退ＤＮＡシーケンシングによって検出されたタイプとの間には、優れた一致があった。二つの手法は別々の標的を持ち、ゆえに異なっていることから、予期され得るわずかな不一致があった。質量分析アッセイでの、ＨＰＶ３１がわずか約２ａＭという結果の例では、ＤＮＡシーケンシングは、１３種類の病原性ＨＰＶタイプには見あたらないタイプ（しかし、１９種類のＨＰＶタイプを対象とする我々の新しいスクリーニングには含まれている）であるＨＰＶ７３を検出した。従って、この腫瘍は、ＤＮＡシーケンシングの検出能以下の病原性ＨＰＶ３１と共に、両方のＨＰＶタイプを有していた。その他に質量分析アッセイおよびＤＮＡシーケンシングの結果の間に、３つの不一致の例があったが、いずれの例においても、ＤＮＡシーケンシングによって、１３の病原性タイプのグループに属するＨＰＶタイプのみが同定された。
【００９２】
＜病理学的子宮頸部異形成における、質量分析アッセイ、リバースラインブロット、および縮退ＤＮＡシーケンシング＞
我々は、子宮頸部上皮内新生物ＣＩＮ  ＩまたはＣＩＮ  ＩＩに分類される異形成があると判定された病理学的に異常な試料に対する、質量分析アッセイおよびリバースラインブロット［１２］の結果の比較を行った。４９試料に対して、質量分析アッセイ手法が約４０ａＭ以上の濃度で１３種類の病原性ＨＰＶタイプの一つの存在を示した場合には、質量分析アッセイおよびリバースラインブロットの間には完全な一致があった（データは示されていない）。しかし、さらに少量のＨＰＶでは、この一致は崩れた（表６）。ＤＮＡシーケンシングおよびリバースラインブロット法が共に＜約４０ａＭの量では、１３種類の高度病原性のＨＰＶタイプの検出に失敗するか、または別のＨＰＶタイプを検出したが、質量分析アッセイ解析は、一貫して＜約４０ａＭの量で１３種類の病原性ＨＰＶタイプの一つを検出した（表６）。我々は、リバースラインブロットで認められたＨＰＶタイプまたは別の非病原性のＨＰＶタイプのいずれかを示したこの結果（一部分のみが重複するリバースラインブロットおよびＤＮＡシーケンシングによって検出されたＨＰＶタイプの範囲は、なぜこれらの二つの手法が異なる答えを与える可能性があるのかを説明する。しかし、両方の手法は、１３種類全ての病原性ＨＰＶタイプに利用可能である（縮退シーケンシング法を用いると十分に増幅しないＨＰＶ５２を除く））を、縮退ＤＮＡシーケンシングによって確認した。その他の感度が劣る方法では正しく評価され得ない低タイターについてのこの結果が、コントロールの血液試料（ＨＰＶは存在せず）またはパップテスト陰性試料（試料の大部分にはＨＰＶは存在せず（図３Ｄ））と異なる点に留意されたい。このことは、過去に顕著だったが現在は消滅しつつあるＨＰＶ感染の消失しつつある痕跡を表すと思われる、これらの過去に正しく評価されなかった病原性ＨＰＶの低タイターの重要性を、強く主張する。これは、大部分のＨＰＶ感染が、６ヶ月〜２年後に完治するという観察と一致する。同時にこのことは、長期的に追跡することが可能であったならば、自然に症状が治まった（self-limited）であろう病巣を切除するための数多くの外科的処置を回避し得る、長期的なタイターを得ることの重要性を主張する。
【００９３】
＜ＨＣ２陽性の異形成における、質量分析アッセイ、リバースラインブロット、および縮退ＤＮＡシーケンシング＞
病理学的に異常な子宮頸部異形成の試料と同様に、質量分析アッセイは、リバースラインブロット法、縮退ＤＮＡシーケンシング法、またはＨＣ２よりも、一層高感度である。約５０コピー以上の病原性ＨＰＶタイプが識別される場合には、質量分析アッセイとリバースラインブロット法との間に、約５００コピー以上の病原性ＨＰＶタイプが識別される場合には、質量分析アッセイと縮退ＤＮＡシーケンシング法との間に、および約５０００コピー以上の病原性ＨＰＶタイプが識別される場合には、ＨＣ２と質量分析アッセイとの間に、優れた一致がある。３つの手法全てにわたる良好な一致は、質量分析アッセイで約５０００コピーを超える試料により解析されたＨＣ２陽性の試料９８／１２５件のうち、これらの例で観察された（表７）。病原性ＨＰＶのタイター＜約５０００コピーの残りの２７／１２５件のＨＣ２（＋）の例では、リバースラインブロットおよび／または縮退ＤＮＡシーケンシング法は、我々の質量分析アッセイで検出された１３種類の高度病原性タイプ以外のＨＰＶタイプを検出した（表８）。これらは、偽陽性であるＨＣ２によって同定された異形成の中で、有意の割合を含んでいると思われる［２，３６］。
【００９４】
ＤＮＡシーケンシングで検出されるＨＰＶを含まない試料は、単一のＨＰＶタイプからＤＮＡ配列を得るのを妨げる、類似した濃度の複数のＨＰＶタイプを含む試料、プライマーとあまりに異なるために縮退プライマーで増幅できないＨＰＶタイプを含む試料、および／または増幅を得るのに十分なＨＰＶを含んでいない試料から構成されている可能性もある。
【００９５】
子宮頸部腫瘍が検出可能なＨＰＶ１６ＤＮＡを有する１８例中１７例では、我々は、血清および／または血液も、検出可能なＨＰＶ１６ＤＮＡを有することを見いだした。腫瘍がＨＰＶ１６ＤＮＡおよびＨＰＶ１８ＤＮＡに対して陰性だった３例はいずれも、血清および／または血液中に、ＨＰＶ１６ＤＮＡまたはＨＰＶ１８ＤＮＡのどちらも検出されなかった。頭頸部癌で我々が観察したように、血液および血清は、多くの子宮頸癌症例で結果が異なった。腫瘍で陽性だった１８試料のうち、８例は血清および血液の両方で陽性、５例は血清で陽性だったが血液では陽性でなく、４例では血液で陽性だったが血清で陽性でなく、１例は血清および血液の両方で陰性だった。
【００９６】
子宮頸部異形成の女性由来の血清および血液試料は、次に本発明に従って分析された。これらの女性は誰も、血清または血液において、縮退プローブを用いるタックマン解析で検出可能なＨＰＶ-ＤＮＡを有していなかった。対照的に、一部の実施態様を含む質量分析アッセイ解析は、子宮頸癌（表９）または高度の異形成（表１０）の個人の小集団からの血清および／または血液中に、少量のＨＰＶ１６ＤＮＡを検出した。子宮頸部の高度異形成の５例のうち４例は、ＨＰＶ１６ＤＮＡに対して陽性だった。ＨＰＶ１６ＤＮＡが、重篤度は不明の異型扁平上皮細胞がある個人、ならびに悪性度１の外陰上皮内新生物および低悪性度の子宮頸部異形成と診断された別の対象からの血清中にも検出された。活性な病巣を持たない個人の血清または血液中には、ＨＰＶ１６ＤＮＡは検出されなかった。さらに、インサイチューの過去の高悪性度の異形成または上皮内癌の除去に成功した後の血清または血液でのＨＰＶ１６ＤＮＡに対する質量分析アッセイ試験は、常に陰性だった（症例４、５、６、１５、１６、１７、２２、２４、２７、４４）。これらの症例では、異形成除去前は、試料が入手できなかった。血清または血液にＨＰＶ-ＤＮＡを含まない高悪性度の子宮頸部異形成のあった一人の対象（症例１）は、その時に用いたＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８プローブ以外のＨＰＶタイプを保有していた可能性もある。
【００９７】
我々は次に、子宮頸部異形成の個人の血液および／または血清中のＨＰＶ１６もしくは１８以外のＨＰＶタイプを我々が識別できたことを確認するために、これらの知見を拡張した。表１１に示されるように、相当な割合の血液および／または血清試料は、子宮頸部異形成にウイルスが存在する場合には、ＨＰＶに対して陽性だった。これは、ＨＰＶタイプが１６または１８以外のいくつかの症例を含んでいた。これは、個別の分子レベルまで検出可能な高感度手法での、血液および／または血清モニタリングの臨床的利用の可能性を強調する。
【００９８】
これは、考えられる実施態様の範囲を限定せずに、本発明のいくつかの実施態様を含む、高感度で特異的な定量的質量分析アッセイの有用性を示している。研究は、異形成中よりも腫瘍中に存在するＨＰＶがより少なく、また、少量の病原性ＨＰＶが、ＨＰＶが存在していない場合、もしくは他の低病原性または非病原性のＨＰＶタイプが存在している可能性がある場合のいずれかの場合に、多くの腫瘍および異形成に存在するという重要な点を示している。具体的には、基本的に全ての腫瘍における、ゼロへと継続的に量が減少する病原性ＨＰＶについての知見は、腫瘍を引き起こす別のＨＰＶタイプのリスクは非常に低い、限られた一連の病原性ＨＰＶタイプが存在するという仮説を支持する。最後に、血液および／または血清中の非常にタイターが低いＨＰＶが正しく評価されたのは、この高感度手法の応用によってのみである。この知見は、異形成または癌の人々でのみ生じ、異形成の除去で消失するため、これらの病巣の検出および／またはこれらの病巣を除去する手法の治療効果をモニターする優れた方法を意味するはずである。
【００９９】
限定的ではないが、本発明のいくつかの実施態様に従えば、このレベルのＨＰＶの識見に達するための手法開発は、高感度で特異的な方法での、量が少ないＨＰＶ配列を検出する能力を含む。従って、本発明は、個別のＨＰＶコピーの診断に必要な感度および特異性を達成する能力ならびに有用性を初めて含む。従って、本発明は、このレベルの感度および特異性を達成するシステム、組成、および／または方法を含み、子宮頸部異形成は血液および／または血清中の検出可能なＨＰＶと関連しているが、正常であることは、血液および／または血清中の検出可能なＨＰＶと関連しないといった知見など、以前は十分に評価され得なかった事象の検出を可能にする。このことは、頻繁な偽陽性［４］、および血清ＨＰＶが検出される場合には偽陰性（我々の未発表の結果による）を生じる、不十分なタックマン手法の利用を回避する。
【０１００】
本発明のさらなる利点は、感度および特異性と同様に、子宮頸部試料（全ＤＮＡに対する標準化後）［７］、血清、および／または血液における、より高いレベルに反映されるより高いＨＰＶ負荷と恐らく関連している、より大きいまたはより活発な腫瘍により、腫瘍の負担の判定が可能になるように、定量的であることである。さらに、血清および／または血液が冒されているかどうかの判定から享受する、臨床的利点があると思われる。例えば、血行性散布（hematogenous spread）している腫瘍は、血液中の存在の上昇と関連しており、また一方で、溶解が進展しつつある腫瘍は、血清中の存在の上昇と関係していると思われる。要するに、質量分析アッセイ手法は、完全な特異性をもたらすと同時に、より高感度である。この有用性は、これらの腫瘍を発症するリスクがある集団のメンバー、および過去に腫瘍が診断されて現在観察下にある個人の両方に対して及ぶ。
【０１０１】
限定的ではないが、本発明の好適な実施態様は、ヒトの患者における、本明細書に述べられた癌を検出するシステム、方法、および組成を含み、これらは、例えば限定的ではないが、血液、血清、尿試料、およびその二つ以上の組合せなどの生体試料を患者から得る段階、例えばダイジーン試験といった現在承認されたあらゆる試験を上回る検出感度を有する手法であって、限定的ではないが本明細書に記載された手法などの手法に従って試料中のＨＰＶゲノムのコピー数を検出する段階、および、本発明に教示されたように、シングルコピーレベル並に低い試料中のＨＰＶの存在が患者における癌を示す場合に、試料の、既知の体積中のＨＰＶゲノムのコピー数またはその他の濃度基準（concentration measure）を計算する段階によって、検出する。単なる一例として、限定的ではないが、ダイジーンテストは血清試料あたり５０００コピー未満の検出は不可能であるが、本発明は、シングルコピーレベルまでの検出能力を含む。
【０１０２】
本発明は、従来は不可能だった本明細書で述べられた観察を可能にした、非常に高感度レベルでの検出を達成するためのシステム、組成、および／または方法を含む。従って、本発明は、体液中の少量のＨＰＶが、癌または異形成に関連しており、その後の腫瘍または異形成の除去によって除去され得るという知見を含んだ。実際、子宮頸部異形成が検出可能な異常を血清および血液に生じるが、正常なコントロールの血清および血液は陰性であるという知見は、全く新規なものである。過去の特許請求は、偽陰性を防ぐのに十分に高感度ではない手法、および／または、偽陽性を防ぐのに特異性が十分に高くなかった手法による血液のスクリーニングを用いていたために、血液が頭頸部癌および子宮頸癌の両方に有用である、本発明に従った判定も、新規性を有する。血清中のＨＰＶを検出する過去の取り組みは、十分に高感度および／または特異的ではなかった手法のいずれかを用いた。本発明の、より高感度で特異的な質量分析アッセイシステムを用いることで、限定された、また測定可能な血清ＨＰＶレベルと関連する住血吸虫症に関連した膀胱癌、子宮頸癌、頭頸部癌を、高い比率でＨＰＶ検出することも可能である。
【０１０３】
本発明は、シングルコピーレベルまで検出する十分に高感度で特異的な分析方法（にもかかわらず、非常に少数において、ポワソン分布固有の不確実性によって与えられる避けられない限界は、複数の解析を行うことで回避されることもできる）を用いた場合、尿沈渣、血清、および／または血液の非常に高感度で特異的な解析は、癌または異形成においてＨＰＶに対して陽性であることが示され得るという知見を含む。さらに、血清および／または血液中のＨＰＶは、子宮頸部異形成の場合では検出されることもあり、その後異形成が切除された場合には消失する。総合すると、本発明は、リスクがある対象もしくは異形成または癌の治療を受けた対象において、ＨＰＶに関連した癌が存在しているかどうかの判定を可能にする。
【０１０４】
全ての参照文献は、本明細書中に全てが示されたものとして、完全に参照されて組み込まれる。
【０１０５】
本発明は、前述の好ましい他に採り得る実施態様に対する参考資料と共に、具体的に示され述べられてきたものの、本発明の実践において、特許請求の範囲で定義された本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書で述べられた本発明の実施態様に代わる様々な手段が採用される可能性があることは、当業者には理解されるべきである。本発明のこの説明は、本明細書で述べられた要素の新規で非自明な組合せの全てを含むことは理解されるべきであり、またこれらの要素の新規で非自明なあらゆる組合せについての特許請求の範囲は、本出願または後の出願において提示される可能性もある。前述の実施態様は例証であり、いずれの特徴または要素も、本出願または後の出願において特許請求される可能性もある全ての組合せに必須ではない。請求項が、その均等物の「一つの（a）」または「第１の（a first）」要素を列挙する場合、このような請求項は、二つ以上のかかる要素を必要とするのでも除外するのでもなく、一つ以上のかかる要素の組み込みを含むことは、理解されるべきである。特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義すること、および、これらの特許請求の範囲内のシステム、方法、および組成、ならびにこれらの均等物が、特許請求の範囲によって対象とされることが、意図されている。
【０１０６】
〔参考文献〕
2008526248.tif 000008
2008526248.tif 000009
2008526248.tif 000010
【０１０７】
〔実施の態様〕
（１）  ほ乳類の生体試料におけるＨＰＶ-ＤＮＡの検出、同定、および／または定量のための方法において、
ほ乳類の生体試料からＤＮＡを抽出する段階と、
少なくとも一つの競合配列（competitor sequence）の存在下で、前記抽出されたＤＮＡの少なくとも一部のＰＣＲによる一次増幅を実施する段階であって、
前記競合配列が、既知のＨＰＶタイプのＤＮＡ配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致（homologous）したポリヌクレオチドを含み、
前記競合配列が、前記のＨＰＶ-ＤＮＡ配列中に存在しないヌクレオチド置換を有する、
段階と、
前記既知のＨＰＶタイプに対する少なくとも一つの伸長プライマー（extension primer）、および、少なくとも二つの異なるジデオキシヌクレオチドの存在下で、ＰＣＲによる二次増幅を実施する段階と、
前記既知のＨＰＶタイプに対する任意の増幅された伸長プライマーのレベルを質量分析法によって測定する段階と、
を含む、方法。
（２）  実施態様１に記載の方法において、
前記ほ乳類の生体試料が、体液または組織試料である、方法。
（３）  実施態様１に記載の方法において、
前記測定段階が、約２００アトモル未満の濃度の任意の増幅された伸長プライマーの測定を含む、方法。
（４）  実施態様１に記載の方法において、
前記一次増幅が、異なる既知のＨＰＶタイプのＤＮＡ配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを各々が含む複数の競合配列タイプの存在を含み、
前記競合配列タイプが、前記個別のＨＰＶ-ＤＮＡ配列中に存在しないヌクレオチド置換を有し、
前記二次増幅が、各々が異なる既知のＨＰＶタイプに対する複数の外部プライマータイプの存在を含む、方法。
（５）  実施態様４に記載の方法において、
前記複数の既知のＨＰＶタイプが、ＨＰＶタイプ１６、１８、２３、２６、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５３、５６、５８、５９、６６、６８、７３、および８２のうちの二つ以上を含む、方法。
（６）  実施態様４に記載の方法において、
前記複数の既知のＨＰＶタイプが、少なくともＨＰＶタイプ１６、１８、２３、２６、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５３、５６、５８、５９、６６、６８、７３、および８２を含む、方法。
（７）  実施態様４に記載の方法において、
淋菌またはトラコーマクラミジアのＤＮＡ配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含む少なくとも一つの競合配列の存在下で、前記抽出されたＤＮＡの少なくとも一部のＰＣＲによる一次増幅を実施する段階であって、前記競合配列が、前記淋菌またはトラコーマクラミジアのＤＮＡ配列中に存在しないヌクレオチド置換を有する、段階と、
前記淋菌またはトラコーマクラミジアに対する少なくとも一つの伸長プライマー、および少なくとも二つの異なるジオキシヌクレオチドの存在下で、ＰＣＲによる二次増幅を実施する段階と、
質量分析法によって淋菌またはトラコーマクラミジアに対する任意の増幅された伸長プライマーの濃度を測定する段階と、
をさらに含む、方法。
（８）  実施態様１に記載の方法において、
前記一次増幅が、ｅｒｂＢ-２遺伝子のＤＮＡ配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含む少なくとも一つの競合配列の存在を含み、前記競合配列が、前記ｅｒｂＢ-２遺伝子中に存在しないヌクレオチド置換を有する、方法。
（９）  実施態様１に記載の方法において、
前記測定段階の後に、ほ乳類における子宮頸癌、子宮頸部異形成、子宮頸部上皮内新生物、肛門癌、肛門上皮内新生物、頭頸部癌、住血吸虫症に関連した膀胱癌、またはパピローマを診断、モニタリング、または評価する追加の段階、
を含む、方法。
【０１０８】
（１０）  実施態様１に記載の方法において、
少なくとも一つの競合配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８４、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８５からなる群から選択される、方法。
（１１）  実施態様１０に記載の方法において、
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８６、８７、および８８からなる群から選択された、少なくとも一つの競合配列をさらに含む、方法。
（１２）  実施態様１に記載の方法において、
前記一次増幅が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４０、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４１からなる、前記既知のＨＰＶタイプに対する、少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組を含む、方法。
（１３）  実施態様１２に記載の方法において、
前記一次増幅が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４３、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４４からなる群から選択された少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組をさらに含む、方法。
（１４）  実施態様１に記載の方法において、
少なくとも一つの伸長プライマーが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６２、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６３からなる群から選択される、方法。
（１５）  実施態様１４に記載の方法において、
前記二次増幅が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６５、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６６からなる群から選択される、少なくとも一つの伸長プライマーをさらに含む、方法。
（１６）  実施態様１に記載の方法において、
前記一次増幅が、前記既知のＨＰＶタイプに関連した少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組を含み、
それら配列が各々、少なくとも一つのイノシン塩基を含む、方法。
（１７）  実施態様１に記載の方法において、
少なくとも一つの伸長プライマーが、少なくとも一つのイノシン塩基を含む、方法。
【０１０９】
（１８）  ほ乳類の体液の非細胞画分におけるＨＰＶ-ＤＮＡの検出、同定、および／または定量のための方法において、
ほ乳類の体液の非細胞画分からＤＮＡを抽出する段階と、
少なくとも一つの競合配列の存在下で、前記抽出されたＤＮＡの少なくとも一部のＰＣＲによる一次増幅を実施する段階であって、
前記競合配列が、既知のＨＰＶタイプのＤＮＡ配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含み、
前記競合配列が、前記ＨＰＶ-ＤＮＡ配列中に存在しないヌクレオチド置換を有する、
段階と、
前記既知のＨＰＶタイプに対する少なくとも一つの伸長プライマー、および、少なくとも二つの異なるジデオキシヌクレオチドの存在下で、ＰＣＲによる二次増幅を実施する段階と、
前記既知のＨＰＶタイプに対する任意の増幅された伸長プライマーのレベルを質量分析法によって測定する段階と、
を含む、方法。
（１９）  実施態様１８に記載の方法において、
前記体液が、血漿、血清、尿、脳脊髄液、汗、唾液、痰、または涙である、方法。
（２０）  実施態様１８に記載の方法において、
前記測定段階が、約２００アトモル未満の濃度の任意の増幅された伸長プライマーの検出を含む、方法。
（２１）  実施態様１８に記載の方法において、
前記一次増幅が、異なる既知のＨＰＶタイプのＤＮＡ配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを各々が含む複数の競合配列タイプの存在を含み、
前記競合配列タイプが、前記個別のＨＰＶ-ＤＮＡ配列中に存在しないヌクレオチド置換を有し、
前記二次増幅が、異なる既知のＨＰＶタイプに対する複数の外部プライマータイプの存在を含む、方法。
（２２）  実施態様２１に記載の方法において、
前記複数の既知のＨＰＶタイプが、ＨＰＶタイプ１６、１８、２３、２６、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５３、５６、５８、５９、６６、６８、７３、および８２のうちの二つ以上を含む、方法。
（２３）  実施態様２１に記載の方法において、
前記複数の既知のＨＰＶタイプが、少なくともＨＰＶタイプ１６、１８、２３、２６、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５３、５６、５８、５９、６６、６８、７３、および８２を含む、方法。
（２４）  実施態様２１に記載の方法において、
淋菌またはトラコーマクラミジアのＤＮＡ配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含む少なくとも一つの競合配列の存在下でのＰＣＲによる一次増幅を実施する段階であって、前記競合配列が、前記淋菌またはトラコーマクラミジアのＤＮＡ配列中に存在しないヌクレオチド置換を有する、段階と、
前記淋菌またはトラコーマクラミジアに対する少なくとも一つの伸長プライマー、および少なくとも二つの異なるジオキシヌクレオチドの存在下で、ＰＣＲによる二次増幅を実施する段階と、
質量分析法によって淋菌またはトラコーマクラミジアに対する任意の増幅された伸長プライマーのレベルを測定する段階と、
をさらに含む、方法。
（２５）  実施態様１８に記載の方法において、
前記一次増幅が、ｅｒｂＢ-２遺伝子のＤＮＡ配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含む少なくとも一つの競合配列の存在を含み、
前記競合配列が、前記ｅｒｂＢ-２遺伝子中に存在しないヌクレオチド置換を有する、方法。
【０１１０】
（２６）  実施態様１８に記載の方法において、
前記測定段階の後に、ほ乳類における子宮頸癌、子宮頸部異形成、子宮頸部上皮内新生物、肛門癌、肛門上皮内新生物、頭頸部癌、住血吸虫症に関連した膀胱癌、またはパピローマを診断、モニタリング、または評価する追加の段階、
を含む、方法。
（２７）  実施態様１８に記載の方法において、
少なくとも一つの競合配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８４、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８５からなる群から選択される、方法。
（２８）  実施態様２７に記載の方法において、
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８６、８７、および８８からなる群から選択された、少なくとも一つの競合配列をさらに含む、方法。
（２９）  実施態様１８に記載の方法において、
前記一次増幅が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４０、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４１からなる、前記既知のＨＰＶタイプ関連する、少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組を含む、方法。
（３０）  実施態様２９に記載の方法において、
前記一次増幅が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４３、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４４からなる群から選択された少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組を含む、方法。
（３１）  実施態様１８に記載の方法において、
少なくとも一つの伸長プライマーが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６２、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６３からなる群から選択される、方法。
（３２）  実施態様３１に記載の方法において、
前記二次増幅が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６５、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６６からなる群から選択された、少なくとも一つの伸長プライマーをさらに含む、方法。
（３３）  実施態様１８に記載の方法において、
前記一次増幅が、前記既知のＨＰＶタイプに関連した少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組を含み、
それら配列が各々、少なくとも一つのイノシン塩基を含む、方法。
（３４）  実施態様１８に記載の方法において、
少なくとも一つの伸長プライマーが、少なくとも一つのイノシン塩基を含む、方法。
【０１１１】
（３５）ほ乳類の生体試料におけるＨＰＶ-ＤＮＡの検出、同定、および／または定量のための方法において、
ほ乳類の生体試料からＤＮＡを抽出する段階と、
少なくとも一つの競合配列の存在下で、前記抽出されたＤＮＡの少なくとも一部のＰＣＲによる一次増幅を実施する段階であって、
前記競合配列が、既知のＨＰＶタイプのＤＮＡ配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含み、
前記競合配列が、前記ＨＰＶ-ＤＮＡ配列中に存在しないヌクレオチド置換を有する、
段階と、
前記既知のＨＰＶタイプに対する少なくとも一つの伸長プライマー、および、少なくとも二つの異なるジデオキシヌクレオチドの存在下で、ＰＣＲによる二次増幅を実施する段階と、
前記既知のＨＰＶタイプに対する任意の増幅された伸長プライマーのレベルを質量分析法によって測定する段階と、
を含み、
前記一次増幅が、少なくとも一つの競合配列で実質的に対応する既知のＨＰＶタイプに対する少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組を含み、
少なくとも一つの伸長プライマーが、同じ前記既知のＨＰＶタイプと関連する、方法。
（３６）  実施態様３５に記載の方法において、
少なくとも一つの競合配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８４、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８５からなる群から選択され、
少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４０、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４１からなる群から選択され、
少なくとも一つの伸長プライマーが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６２、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６３からなる群から選択される、方法。
（３７）  実施態様３５に記載の方法において、
前記一次増幅が、前記既知のＨＰＶタイプに関連した少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組を含み、
それら配列が各々、少なくとも一つのイノシン塩基を含む、方法。
（３８）  実施態様３５に記載の方法において、
少なくとも一つの伸長プライマーが、少なくとも一つのイノシン塩基を含む、方法。
（３９）  実施態様３５に記載の方法において、
前記測定段階が、約２００アトモル未満の濃度の任意の増幅された伸長プライマーの検出を含む、方法。
【０１１２】
（４０）  実施態様３５に記載の方法において、
前記測定段階の後に、ほ乳類における子宮頸癌、子宮頸部異形成、子宮頸部上皮内新生物、肛門癌、肛門上皮内新生物、頭頸部癌、住血吸虫症に関連した膀胱癌、またはパピローマを診断、モニタリング、または評価する追加の段階、
を含む、方法。
（４１）  実施態様３５に記載の方法において、
前記一次増幅が、異なる既知のＨＰＶタイプのＤＮＡ配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを各々が含む複数の競合配列タイプの存在を含み、
前記競合配列タイプが、前記個別のＨＰＶ-ＤＮＡ配列中には存在しないヌクレオチド置換を有し、
前記二次増幅が、異なる既知のＨＰＶタイプに対する複数の外部プライマータイプの存在を含む、方法。
（４２）  実施態様４１に記載の方法において、
前記複数の既知のＨＰＶタイプが、ＨＰＶタイプ１６、１８、２３、２６、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８、７３、および８２のうちの二つ以上を含む、方法。
（４３）  実施態様４１に記載の方法において、
前記複数の既知のＨＰＶタイプが、少なくともＨＰＶタイプ１６、１８、２３、２６、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５３、５６、５８、５９、６６、６８、７３、および８２を含む、方法。
（４４）  実施態様４１に記載の方法において、
淋菌またはトラコーマクラミジアのＤＮＡ配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含む少なくとも一つの競合配列の存在下でＰＣＲによる一次増幅を実施する段階であって、前記競合配列が、前記淋菌またはトラコーマクラミジアのＤＮＡ配列中に存在しないヌクレオチド置換を有する、段階と、
前記淋菌またはトラコーマクラミジアに対する少なくとも一つの伸長プライマー、および少なくとも二つの異なるジオキシヌクレオチドの存在下で、ＰＣＲによる二次増幅を実施する段階と、
質量分析法によって淋菌またはトラコーマクラミジアに対する任意の増幅された伸長プライマーのレベルを測定する段階と、
をさらに含む、方法。
（４５）  実施態様３５に記載の方法において、
前記一次増幅が、ｅｒｂＢ-２遺伝子のＤＮＡ配列中のポリヌクレオチドに実質的に一致したポリヌクレオチドを含む少なくとも一つの競合配列の存在下で前記抽出されたDNAを含み、
前記競合配列が、前記ｅｒｂＢ-２遺伝子中に存在しないヌクレオチド置換を有する、方法。
（４６）  実施態様３５に記載の方法において、
前記一次増幅が、
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８７、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８８からなる群から選択された、少なくとも一つの競合配列と、
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４３、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４４からなる群から選択された少なくとも一つの対応する順方向および逆方向プライマー配列の組と、
を含み、
前記二次増幅が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６５、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６６からなる群から選択された、少なくとも一つの伸長プライマーを含む、方法。
【０１１３】
（４７）  合成ポリヌクレオチドにおいて、
生体試料中の微生物ＤＮＡの検出、同定、および／または定量のための競合配列であって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８７、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８８からなる群から選択された、競合配列、
を含む、合成ポリヌクレオチド。
（４８）  一対の合成ポリヌクレオチドにおいて、
生体試料中の微生物ＤＮＡの検出、同定、および／または定量のための順方向および逆方向プライマーであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４３、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４４からなる群から選択された、順方向および逆方向プライマー、
を含む、合成ポリヌクレオチド。
（４９）  合成ポリヌクレオチドにおいて、
生体試料中の微生物ＤＮＡの検出、同定、および／または定量のための伸長プライマーであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５６、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６５、およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６６からなる群から選択される、伸長プライマー、
を含む、合成ポリヌクレオチド。
（５０）  生体試料中の微生物ＤＮＡ検出のためのキットにおいて、
容器と、
実施態様４７、４８、および４９に記載の合成ポリヌクレオチドのうちの一つ以上と、
を含む、キット。
【表１】
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【表２−１】
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【表２−２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８−１】
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【表８−２】
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【表９】
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【表１０−１】
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【表１０−２】
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【表１０−３】
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【表１０−４】
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【表１０−５】
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【表１０−６】
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【表１０−７】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】本発明に従った単一反応での１３の異なるＨＰＶタイプのスクリーニングの質量分析の結果を表す。
【図２】限定的ではないが、本発明のいくつかの実施態様に従った段階の、一般化された作業工程表を表す。
【図３Ａ】腫瘍におけるＨＰＶタイターを示す。
【図３Ｂ】Ｐａｐ陽性検体を示す。
【図３Ｃ】ＨＣ２陽性検体を示す。
【図３Ｄ】Ｐａｐ陰性検体を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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