(57)【要約】  本発明は、T型カルシウムチャネルを介した細胞外カルシウムの流入と関連した哺乳動物における疾患または状態を治療するための方法であって、治療学的有効量のT型カルシウムチャネル阻害剤、そのプロドラッグ、または前記阻害剤もしくはプロドラッグの薬学的に許容可能な塩を哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。ここで、T型カルシウムチャネル阻害剤は、T型カルシウムチャネルのα1Hアイソフォームまたはそのδ25スプライス変異体を遮断する。また、T型カルシウムチャネル阻害剤は、式（I）によって表わされた構造を有する：【化１】2008510730.tif 000006  式中、  R1は、C1-C4アルキル、ヒドロキシおよびC1-C4アルコキシからなる群から選択され；  Xは、NおよびCHからなる群から選択され；  Zは、NH、O、SおよびCH2からなる群から選択され；  R2は、H、ハロ、NH2、C1-C4アルキル、ヒドロキシおよびC1-C4アルコキシからなる群から選択され；および  R3は、H、ハロ、NH2、C1-C4アルキル、ヒドロキシおよびC1-C4アルコキシからなる群から選択される。一実施態様において、R1は、C1-C4アルキル、ヒドロキシおよびC1-C4アルコキシからなる群から選択され、XはNであり、ZはOまたはCH2であり、R2はH、ハロ、NH2またはヒドロキシであり、かつR3はHである。【選択図】図１
2008510730.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
T型カルシウムチャネルを介した細胞外カルシウムの流入と関連した哺乳動物における疾患または状態を治療するための方法であって、治療学的有効量のT型カルシウムチャネル阻害剤、そのプロドラッグ、または前記阻害剤もしくはプロドラッグの薬学的に許容可能な塩を哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項２】
前記疾患または状態が、不安定狭心症、高血圧症、てんかん、神経障害性痛覚、小発作、欠神発作、加齢性黄斑変性、癌および前癌性状態からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記T型カルシウムチャネル阻害剤が、T型カルシウムチャネルのα1Hアイソフォームまたはそのδ25スプライス変異体を遮断する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記T型カルシウムチャネル阻害剤が、式（I）によって表わされた構造を有する請求項１に記載の方法：
【化１】
2008510730.tif 000005
式中、
R1は、C1-C4アルキル、ヒドロキシおよびC1-C4アルコキシからなる群から選択され；
Xは、NおよびCHからなる群から選択され；
Zは、NH、O、SおよびCH2からなる群から選択され；
R2は、H、ハロ、NH2、C1-C4アルキル、ヒドロキシおよびC1-C4アルコキシからなる群から選択され；および
R3は、H、ハロ、NH2、C1-C4アルキル、ヒドロキシおよびC1-C4アルコキシからなる群から選択される。一実施態様において、R1は、C1-C4アルキル、ヒドロキシおよびC1-C4アルコキシからなる群から選択され、XはNであり、ZはOまたはCH2であり、R2はH、ハロ、NH2またはヒドロキシであり、かつR3はHである。
【請求項５】
T型カルシウムチャネル阻害剤を投与することを含む電気的に非興奮性の細胞の増殖を減少させるための方法であって、前記T型カルシウムチャネル阻害剤が、T型カルシウムチャネルのα1Hアイソフォームまたはそのδ25スプライス変異体を遮断する方法。
【請求項６】
T型カルシウムチャネル阻害剤を投与することを含む電気的に非興奮性の細胞へのカルシウムの流入を阻害するための方法であって、前記T型カルシウムチャネル阻害剤が、T型カルシウムチャネルのα1Hアイソフォームまたはそのδ25スプライス変異体を遮断する方法。
【請求項７】
治療学的有効量の請求項４に記載された式（I）の化合物、前記化合物のプロドラッグまたは前記化合物もしくはプロドラッグの薬学的に許容可能な塩と、薬学的に許容可能なキャリア、ビヒクルまたは希釈剤とを含む薬学的組成物。
【請求項８】
治療学的有効量の請求項４に記載された式（I）の化合物、前記化合物のプロドラッグまたは前記化合物もしくはプロドラッグの薬学的に許容可能な塩を、一以上の抗腫瘍薬剤と組み合わせて哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における癌または前癌状態の治療のための方法。
【請求項９】
治療学的有効量の請求項４に記載された式（I）の化合物、前記化合物のプロドラッグまたは前記化合物もしくはプロドラッグの薬学的に許容可能な塩と、一以上の抗腫瘍薬剤との組み合わせを含む薬学的な組み合わせ組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
細胞外カルシウムの流入は、多くの生命に関する細胞プロセスにとって危機的である。カルシウムの流入は、一般にカルシウムチャネルによって媒介される。カルシウムチャネルは、いくつかのファミリーに分けられ、その一つがT型カルシウムチャネルファミリーである。T型カルシウムチャネルの機能の薬学的調節は、内科の診療において非常に重要である；例えば、T型カルシウムチャネル阻害剤は、神経系疾患(例えばてんかん、小発作、アブサンス発作、ニューロパシー痛覚など)および心疾患(例えば高血圧症、不安定狭心症など)の治療において幅広く使用されている。例えば、ミベフラジル(T型カルシウム阻害剤)は、高血圧症および不整脈の治療において臨床的に有効である。研究はまた、T型カルシウムチャネルが加齢黄斑変性症において重要な役割を果たすかもしれないことを示唆する。最近、我々は、T型カルシウムチャネルのα1Hおよびδ25アイソフォームが癌細胞系統において存在することを示し、このチャネルを介したカルシウム流入を遮断し、癌細胞増殖を抑制するための新規な化学薬剤が合成され得ることを示した。
【０００２】
Ca2+流入が細胞周期の重要な制御成分となり、かつその阻害が増殖を遮断することが一時期知られていた。しかしながら、Ca2+流入が生じる機構にはいくつかの議論すべき内容が残されている。Ni2+阻害に対する電気的に非興奮性の細胞におけるCa2+流入経路の既知の感受性は、Ca2+流入を阻害し、その結果として癌細胞系統の増殖を阻害する顕著な効力を示す新規化合物の有向性の化学合成を可能にする戦略を開発するために使用された。これらの新規な化合物は、Ca2+の流入および増殖の立体選択的な阻害を示す。T型Ca2+チャネルのα1Hアイソフォームを通したCa2+流の同じような立体選択的な阻害がまた、観察された。本発明の化合物は、異種で発現されたα1H Ca2+チャネルを通したCa2+流を遮断する。さらに、感受性の癌細胞系統は、α1H T型Ca2+チャネルアイソフォームまたはそのδ25スプライス変異体についての情報を発現した。これらの観察は、ヒト癌の異種移植モデルの使用を通した本明細書中に記載されたこれらのCa2+チャネルと相互作用する能力に基づいて臨床的に有用な薬剤を設計できることを示唆する。
【０００３】
電圧ゲート制御されたカルシウムチャネルは、カルシウム流入の活性化のための、活動電位と呼ばれる膜電位の急速な変化を必要とする。電気的に非興奮性の細胞、例えば癌細胞型の大多数が活動電位を示さない。結果的に、電圧ゲート制御されたカルシウムチャネルは、電気的に非興奮性の細胞においては役割を有しないものと考えられる(Venkatachalam,K., Van Rossum,D.B., Patterson,R.L., Ma,H. T., and Gill,D.L. 2002. The cellular and molecular basis of store operated calcium entry. Nat. Cell BioI. 4:E263 E272)。しかしながら、カルシウムの流入は、カルシウム流入の阻害が細胞性塞栓をもたらす電気的に非興奮性の癌細胞の増殖に必要である(Berridge,M.J., Lipp,P., and Bootman,M.D. 2000. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol Cell BioI. 1 :11 21)。結果的に、電気的に非興奮性の細胞におけるカルシウム流入の機構の知見は、癌細胞の増殖を細胞増殖抑制的に停止または遅延させるのに役立つであろう。
【０００４】
電圧ゲート制御されたT型カルシウムチャネルの阻害剤によれば、インビトロで電気的に非興奮性の癌細胞の増殖を遮断することができる。さらに、T型チャネル遮断薬は、ヒト癌の異種移植モデルにおいて癌細胞の増殖を阻害する (Haverstick,D.M., Heady,T.N., Macdonald,T.L., and Gray,L.S. 2000. Inhibition of human prostate cancer proliferation in vitro and in a mouse model by a compound synthesized to block Ca2+ entry. Cancer Res 60:1002 1008)。これと同一の化合物が、異種で発現したα1H T型カルシウムチャネルアイソフォームを通してカルシウム流入を遮断する。このカルシウム流入の遮断は特異的である。なぜなら、キラルな化合物が、それらが電気的に非興奮性の癌細胞系統の増殖を阻害するときに異種で発現されたα1Hカルシウムを通してカルシウムを遮断する同じランクの効力を有するからである。
【０００５】
要約すると、本発明は、T型カルシウムチャネルのα1Hアイソフォームおよびそのδ25スプライス変異体の同定、ならびに増殖の阻害によって癌を治療する意図を有する、電気的に非興奮性の癌細胞タイプの増殖を調整するその使用に関する。
【発明の概要】
【０００６】
従って、本発明は、T型カルシウムチャネルを介した細胞外カルシウムの流入に関係した、哺乳動物の疾患または状態を治療するための方法を提供する。該方法には、治療学的有効量のT型カルシウムチャネル阻害剤、そのプロドラッグ、または前記阻害剤もしくはプロドラッグの薬学的に許容可能な塩を哺乳動物に投与することが含まれる。好ましくは、疾患または状態は、不安定狭心症、高血圧症、てんかん、ニューロパシー痛覚、小発作、アブサンス発作、加齢黄斑変性症、癌、および前癌状態からなる群から選択される。
【０００７】
本発明はまた、T型カルシウムチャネルを介した細胞外カルシウムの流入に関係した、哺乳動物における疾患または状態を治療する方法を提供する。該方法には、治療学的有効量のT型カルシウムチャネル阻害剤、そのプロドラッグ、または前記阻害剤もしくはプロドラッグの薬学的に許容可能な塩を哺乳動物に投与することが含まれる。ここで、T型カルシウムチャネル阻害剤は、T型カルシウムチャネルのα1Hアイソフォームまたはそのδ25スプライス変異体を遮断する。
【０００８】
好ましくは、上述したT型カルシウムチャネル阻害剤は、式(I)によって表わされた構造を有する：
【化１】
2008510730.tif 000003
【０００９】
式中
R1は、C1-C4 アルキル、ヒドロキシ、およびC1-C4 アルコキシからなる群から選択され；
Xは、NおよびCHからなる群から選択され；
Zは、NH、O、SおよびCH2からなる群から選択され；
R2は、H、ハロ、NH2、C1-C4アルキル、ヒドロキシおよびC1-C4アルコキシからなる群から選択され；および
R3は、H、ハロ、NH2、C1-C4アルキル、ヒドロキシおよびC1-C4アルコキシからなる群から選択される。一実施態様において、R1は、C1-C4アルキル、ヒドロキシおよびC1-C4アルコキシからなる群から選択され、XはNであり、ZはOまたはCH2であり、R2はH、ハロ、NH2またはヒドロキシであり、かつR3はHである。
【００１０】
他の側面において、本発明は、T型カルシウムチャネル阻害剤を投与することを含む、電気的に非興奮性の細胞の増殖を減少させる方法を提供する。ここで、T型カルシウムチャネル阻害剤は、T型カルシウムチャネルのα1Hアイソフォームまたはそのδ25スプライス変異体を遮断する。
【００１１】
他の側面において、本発明は、T型カルシウムチャネル阻害剤を投与することを含む、電気的に非興奮性の細胞へのカルシウムの流入を阻害する方法を提供する。ここで、T型カルシウムチャネル阻害剤は、T型カルシウムチャネルのα1Hアイソフォームまたはそのδ25スプライス変異体を遮断する。
【００１２】
他の側面において、本発明は、上述した式(I)の治療学的有効量の化合物、前記化合物のプロドラッグまたは前記化合物もしくはプロドラッグの薬学的に許容可能な塩；および薬学的に許容可能なキャリア、ビヒクルまたは希釈剤を含む薬学的組成物を提供する。
【００１３】
他の側面において、本発明は、上述した式(I)の治療学的有効量の化合物、そのプロドラッグまたは前記化合物もしくはプロドラッグの薬学的に許容可能な塩を、一以上の抗腫瘍薬剤と組み合わせて哺乳動物に投与することを含む、癌または前癌状態の治療のための方法を提供する。
【００１４】
他の側面において、本発明は、治療学的有効量の上述した式(I)の化合物、そのプロドラッグ、または前記化合物もしくはプロドラッグの薬学的に許容可能な塩；または一以上の抗腫瘍薬剤の組み合わせを提供する。
【定義】
【００１５】
本発明の記載およびクレームにおいて、次の技術用語は、以下に示した一連の定義に従って使用される。
【００１６】
本明細書中において使用されたとき、用語「精製された」および類似の用語は、自然環境中の分子または化合物に一般的に付随した他の成分と関連した分子または化合物の濃縮に関する。用語「精製された」は、特定の分子の完全な純化がプロセス中に達成されたことを必ずしも示しません。本明細書中に使用された「高度に精製された」化合物とは、90%以上純粋な化合物を意味する。
【００１７】
本明細書中に使用されたとき、用語「治療」は、特定の障害、疾患、創傷または状態と関連した症状を防止、治療、または緩和／防止する療法を適用することを含む。例えば、癌の治療には、腫瘍の阻害または完全な増殖の抑止、腫瘍細胞の数の減少、腫瘍サイズの減少、周辺器官／組織への腫瘍細胞浸潤の阻害、転移の阻害、および前記障害と関連した一以上の症状のある程度の軽減が含まれる。
【００１８】
癌の治療にはまた、腫瘍細胞の病理を直接的に減少させ、腫瘍細胞を他の治療学的薬剤による治療に対してより感受性にする治療学的薬剤の投与が含まれる。本明細書中で使用されたとき、用語「治療」には、特異的な障害または状態の予防、または特異的な障害または状態と関連した症状の軽減および／または前記症状の防止または除去が含まれる。
【００１９】
本明細書中で使用されたとき、用語「薬学的に許容可能なキャリア、ビヒクルまたは希釈剤」には、全ての標準的な薬学的キャリア、例えばリン酸緩衝液、生理食塩水、水、エマルジョン、例えば油／水または水／油エマルジョン、および様々な種類の湿潤剤が含まれる。該用語にはまた、ヒトを含む動物において使用するための、米国連邦政府の規制当局によって承認された全ての薬剤または米国薬局方において挙げられた全ての薬剤が包含される。
【００２０】
用語「治療学的有効量」は、特定の疾患または状態を寛解、減衰または除去する、あるいは特定の疾患または状態の開始を遅延させる本発明の化合物の量を意味する。
【００２１】
「哺乳動物」とは、例えば、霊長類、例えばヒトおよびサルを含む全ての哺乳動物を意味する。本明細書中に含まれる他の哺乳動物の例は、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ヒツジおよびウマである。好ましくは、哺乳動物は女性または男性のヒトである。
【００２２】
単語「本発明の化合物」または「式（I）の化合物」には、他に特別な状態がない限り、例えば、その遊離形態、例えば遊離酸または塩基形態、およびまた、全てのプロドラッグ、多形、水和物、溶媒和物、互変異性体、およびこれらに類するもの、および全ての薬学的に許容可能な塩を含む、このような化合物の全ての活性形態が含まれることが理解される。また、このような化合物の適切な活性代謝産物が本発明の範囲内にあることが理解されるであろう。
【００２３】
表現「プロドラッグ」は、幾つかの化学的または生理学的プロセスを介してインビボで薬剤を投与、放出する薬剤前駆体である化合物を意味する（例えば、プロドラッグは生理学的pHに至らされ、酵素作用を通して所望の薬剤形態に転換される）。
【００２４】
表現「前癌状態」とは、悪性ではないが治療を施さなければそうなるであろう増殖状態を意味する。「前癌状態」とはまた、当業者によれば「悪性前状態」としても知られる。
【００２５】
本明細書中で使用されたとき、用語「抗腫瘍薬剤」は、腫瘍性疾患を治療するための有用性を有することが実証された、当業者に知られた薬剤に関する。例えば、抗腫瘍薬剤には、これらに限定されないが、抗体、毒素、化学療法、酵素、サイトカイン、放射性核種、光感作薬剤、および血管形成阻害剤が含まれる。毒素には、リシンＡ鎖、変異シュードモナス外毒素、ジフテリア類毒素、ストレプトニグリン、ボアマイシン（boamycin）、サポリン（saporin）、ゲロニン（gelonin）、およびヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が含まれる。化学療法薬剤には、5-フルオロウラシル(5-FU)、ダウノルビシン、シスプラチナム、ブレオマイシン、メルファラン、タクソール、タモキシフェン、マイトマイシン-Ｃ、および)メトトレキセートおよび化学療法薬剤になる米国特許第6,372,719に記載された全ての化合物（これらの開示は参照によって本明細書中に組み込まれる）が含まれる。放射性核種には、放射性金属が含まれる。光感作薬剤には、ポルフィリンおよびその誘導体が含まれる。血管形成阻害剤は当業者に周知である。該阻害剤には、天然および合成の生物分子、例えばパクリタキセル、O-(クロロアセチル-カルボミル)フマギロール（「TNP-470」または「AGM1470」）、トロンボスポンジン-1、トロンボスポンジン-2、アンジオスタチン、血管形成（「hCHIAMP」）のヒト軟骨細胞誘導阻害剤、軟骨誘導型の血管形成阻害剤、血小板因子-4、グロ-ベータ(gro-beta)、ヒトインターフェロン誘導型タンパク質10（「IP10」）、インターロイキン12、Ro 318220、トリシクロデカン-9-イルザンテート(「D609」)、イルソグラジン、8,9-ジヒドロキシ-7-メチル-ベンゾ[b]キノリジニウムブロミド(「GPA 1734」)、メドロキシプロゲステロン、ヘパリンとコルチゾンとの組み合わせ、グルコシダーゼ阻害薬、ゲニステイン、サリドマイド、ジアミノアントラキノン、ヘルビマイシン、ウルソール酸、およびオレアノール酸が含まれる。抗腫瘍治療には、抗腫瘍薬剤または他の治療の投与、例えば、癌を治療するのに有用であると報告されている放射線治療が含まれる。
【００２６】
本明細書中で使用されたとき、用語「ハロゲン」または「ハロ」には、ブロモ、クロロ、フルオロおよびヨードが含まれる。
【００２７】
本明細書中で使用された用語「ハロアルキル」は、少なくとも一つのハロゲン置換基、例えばクロロメチル、フルオロエチルまたはトリフルオロメチルおよびこれらに類するものを有するアルキルラジカルを意味する。
【００２８】
用語「C1-Cnアルキル」(nは本明細書で使用されたとき整数である)は、１〜特定の数の炭素原子を有する枝分かれしたまたは鎖状のアルキル基を表わす。典型的にはC1-C6アルキル基には、これに限定されないが、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、ヘキシルおよびこれらに類するものが含まれる。
【００２９】
用語「C2-Cnアルケニル」（nは本明細書で使用されたとき整数である)は、２〜特定の数の炭素原子と少なくとも一つの二重結合とを有するオレフィン型不飽和の枝分かれしたまたは鎖状の基を表わす。このような基の例には、これらに限定されないが、1-プロペニル、2-プロペニル、1,3-ブタジエニル、1-ブテニル、ヘキセニル、ペンテニルおよびこれらに類するものが含まれる。
【００３０】
用語「C2-Cnアルキニル」（nは整数である)は、２〜特定の数の炭素原子と少なくとも一つの三重結合とを有する不飽和の枝分かれしたまたは鎖状の基を表わす。このような基の例には、これらに限定されないが、1-プロピニル、2-プロピニル、1-ブチニル、2-ブチニル、1-ペンチニル、およびこれらに類するものが含まれる。
【００３１】
用語「C3-Cnシクロアルキル」（n＝4〜8）は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチルを表わす。
【００３２】
本明細書中で使用されたとき、用語「任意的に置換された」は、0〜4の置換基を意味する（置換基は各々独立して選択される）。独立して選択された置換基の各々は、他の置換基と同じかまたは異なっていてもよい。
【００３３】
本明細書中で使用されたとき、用語「アリール」は、これらに限定されないが、フェニル、ベンジル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、インデニルおよびこれらに類するものを含む一つまたは二つの芳香族環を有する単環式または二環式の炭素環系を意味する。
【００３４】
用語「ヘテロ環基」は、ヘテロ原子が酸素、硫黄および窒素からなる群から選択される1〜3のヘテロ原子を含む単環式または二環式の炭素環系を意味する。
【００３５】
用語「薬学的に許容可能な塩」は、本発明の化合物の生物学的有効性および性質を保持する塩ならびに生物学的または他の点で望ましい塩を意味する。多くの場合において、本発明の化合物は、アミノおよび／またはカルボキシル基またはこれらに類似の基の存在によって酸および／または塩基の塩を形成することができる。
【００３６】
また、「T型カルシウムチャネル阻害剤」が「T型カルシウムチャネル阻害剤」として知られていることは、当業者に理解される。
【発明の詳細な説明】
【００３７】
最近、Ca +流入を仲介する候補チャネルの同定における進展が得られている (Li,S.W., Westwick,J., and Poll,C.T. 2002. Receptor-operated Ca2+ influx channels in leukocytes: a therapeutic target? Trends Pharmacol.Sci. 23:63-70; Mori,Y., Wakamori,M., Miyakawa,T., Hermosura,M., Hara,Y., Nishida,M., Hirose,K., Mizushima,A., Kurosaki,M., Mori,E. et al. 2002. Transient receptor potential 1 regulates capacitative Ca2+ entry and Ca2+ release from endoplasmic reticulum in B lymphocytes. J Exp.Med. 195:673-681; Tsavaler,L., Shapero,M.H., Morkowski,S., and Laus,R. 2001. Trp-p8, a novel prostate-specific gene, is up-regulated in prostate cancer and other malignancies and shares high homology with transient receptor potential calcium channel proteins. Cancer Res. 61:3760-3769; Peng,J.B., Zhuang,L., Berger,U.V., Adam,R.M., Williams,B.J., Brown,E.M., Hediger,M.A., and Freeman,M.R. 2001. CaT1 expression correlates with tumor grade in prostate cancer. Biochem.Biophys.Res.Commun. 282:729-734; Benham,C.D., Davis,J.B., and Randall,A.D. 2002. Vanilloid and TRP channels: a family of lipid-gated cation channels. Neuropharmacology 42:873-888)。しかしながら、これらのCa2+チャネルは、電気的に非興奮性の細胞におけるCa2+流入経路についての基準を完全に満たさない(Clapham,D.E. 2002. Sorting out MIC, TRP, and CRAC Ion Channels. J.Gen.Physiol 120:217-220; Densmore,J.J., Haverstick,D.M., Szabo,G., and Gray,L.S. 1996. A voltage operable current is involved in activation-induced Ca2+ entry in human lymphocytes whereas ICRAC has no apparent role. Am.J.Physiol. 271:C1494-C1503)。この知見の欠如は、多数のファクターの結果になり得る。電気的に非興奮性の細胞におけるCa2+流入の仲介のための幾つかの候補は分子レベルで特徴づけられたが(Putney,J.W., Jr. and McKay,R.R. 1999. Capacitative calcium entry channels. Bioessays 21:38-46)、共通して許容可能な候補、ICRAC (Clapham,D.E. 2002. Sorting out MIC, TRP, and CRAC Ion Channels. J.Gen.Physiol 120:217-220; Cahalan,M.D., Wulff,H., and Chandy,K.G. 2001. Molecular properties and physiological roles of ion channels in the immune system. J Clin Immunol. 21:235-252)は、約十年前に初めて同定されたものの、分子レベルでは特徴づけられていない(Hoth,M. and Penner,R. 1993. Calcium release-activated calcium current in rat mast cells. J.Physiol. 465:359-386; Hoth,M. and Penner,R. 1992. Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells. Nature 355:353-356)。また、電気的に非興奮性の細胞についての特異的なCa2+流入遮断薬の欠如のために、これらのチャネルの機能と癌細胞系統の増殖の阻害とを結びつけることは難しい。Ca2+選択的蛍光色素によって決定されたときのCa2+流入と、電気生理学的方法によって測定されたときのCa2+流入との間に不可避的な乖離が存在する。パッチクランプ技術は、イオンチャネルの機能の生物物理学的詳細を試験するための非常に強力な技術である(Neher,E. and Sakmann,B. 1992. The patch clamp technique. Scientific American March:44-51)。しかしながら、達成および必要性の両方についてそれを制御する膜のレベルは、チャネルの生理学的役割を同定するのに適していない。蛍光技術は生理学的詳細を得るには非常に制限され、むしろ生理学的役割を研究するのに適している。この断絶は、生理学的に関連のある刺激の作用が（蛍光測定によって決定されたとき）、電気生理学的レベルで再現される場合、それを決定することを難しくする。
【００３８】
本発明に基づけば、電気的に非興奮性の細胞におけるCa2+流入のメカニズムは、電圧ゲート制御されたCa2+チャネルのＴ型ファミリーの特徴を共有するCa2+チャネルに関与することが予測される ( Densmore,J.J., Haverstick,D.M., Szabo,G., and Gray,L.S. 1996. A voltage operable current is involved in activation-induced Ca2+ entry in human lymphocytes whereas ICRAC has no apparent role. Am.J.Physiol. 271:C1494-C1503; Densmore,J.J., Szabo,G., and Gray,L.S. 1992. A voltage-gated calcium channel is linked to the antigen receptor in Jurkat T lymphocytes. FEBS Lett. 312:161-164; Haverstick, D. M. and Gray, L. S. Increased intracellular Ca2+ induces Ca2+ influx in human T lymphocytes. Molecular Biology of the Cell 4, 173-184. 1993; Haverstick,D.M., Densmore,J.J., and Gray,L.S. 1998. Calmodulin regulation of Ca2+ entry in Jurkat T cells. Cell Calcium 23:361-368)。活動電位を有さない細胞における電圧ゲート制御されたCa2+チャネルについての生理学的役割を予測することが難しいことが議論され得る。しかしながら、この議論は、電圧ゲート制御されたCa2+チャネルが活動電位によってのみ活性化され得るという仮説に基づいている。このような仮説は演繹的に偽である。なぜなら、タンパク質が課された実験条件によって制御され得る手段が、それが生理学的に制御されるメカニズムと同一または類似している必要はないからである。膜電位による制御に二次的であるが、多様な系における電圧ゲート制御されたCa2+チャネルの既知の生化学的制御 (Heady,T.N., Gomora,J.C., Macdonald,T.L., and Perez-Reyes,E. 2001. Molecular pharmacology of T-type Ca2+ channels. Jpn.J.Pharmacol. 85:339-350; Hockerman,G.H., Peterson,B.Z., Johnson,B.D., and Catterall,W.A. 1997. Molecular determinants of drug binding and action on L-type calcium channels. Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol. 37:361-396; Slish,D.F., Schultz,D., and Schwartz,A. 1992. Molecular biology of the calcium antagonist receptor. Hypertension 19:19-24) はまた、Ca2+チャネルの電気的制御と生化学的制御との間の分類上の区別がいくぶん単純になり得ることを示す。
【００３９】
我々は、電気的に非興奮性の細胞においてCa2+流入経路を分析する代替の方法を取得した。我々は、蛍光技術によって測定されたとき、最初にNi2+によるCa2+流入遮断薬を利用し(Merritt,J.E. and Rink,T.J. 1987. Regulation of cytosolic free calcium in fura-2-loaded rat parotid acinar cells. J.Biol.Chem. 262:17362-17369; Merritt,J.E., Jacob,R., and Hallam,T.J. 1989. Use of manganese to discriminate between calcium influx and mobilization from internal stores in stimulated human neutrophils. J.Biol.Chem. 264:1522-1527; Skryma,R., Mariot,P., Bourhis,X.L., Coppenolle,F.V., Shuba,Y., Abeele,F.V., Legrand,G., Humez,S., Boilly,B., and Prevarskaya,N. 2000. Store depletion and store-operated Ca2+ current in human prostate cancer LNCaP cells: involvement in apoptosis. J.Physiol.(Lond.) 527 Pt 1:71-83)、同様の能力を有する刊行された文献における化合物を同定する。これらの既知の化合物の構造／活性の関係は、Ca2+の流入および幾つかの癌細胞系統の増殖を遮断する増強された効力を有する新規な化合物の合成を導くために使用された。その後、二つの代表的な新規な化合物が、Ｔ型Ca2+チャネルの異種発現のα1Hアイソフォームを通してCa2+電流を遮断することが示された。重要なことに、新規化合物に対して感受性の細胞系統が、α1H、そのδ25スプライス変異体、またはその両方についての情報を発現する。これらの観察は、Ca2+流入を阻害しかつその結果として癌細胞の増殖を阻害する化合物の指向性の化学合成の可能性を上昇させる。
【００４０】
一実施態様に従って、Ca2+流入を阻害する新規な化合物、およびそれによる癌細胞の増殖が提供される。化合物は通常の構造を有する：
【化２】
2008510730.tif 000004
【００４１】
式中、
R1 は、C1-C4アルキル、ヒドロキシおよびC1-C4アルコキシからなる群から選択される；
Xは、NおよびCHからなる群から選択され；
Zは、NH、O、SおよびCH2からなる群から選択され；
R2は、H、ハロ、NH2、C1-C4アルキル、ヒドロキシおよびC1-C4アルコキシからなる群から選択され；およびR3は、H、ハロ、NH2、C1-C4アルキル、ヒドロキシおよびC1-C4アルコキシからなる群から選択される。一実施態様において、R1は、C1-C4アルキル、ヒドロキシおよびC1-C4アルコキシからなる群から選択され、XはNであり、ZはOまたはCH2であり、R2はH、ハロ、NH2またはヒドロキシであり、R3はHである。
【００４２】
本発明の新規な化合物は、標準的な薬学的に許容可能なキャリアまたは他の既知の抗腫瘍および化学療法的薬剤と組み合わせることができる。
【材料および方法】
【００４３】
TH-1177の合成:
TH-1177は、文献(Haverstick,D.M., Heady,T.N., Macdonald,T.L., and Gray,L.S. 2000. Inhibition of human prostate cancer proliferation in vitro and in a mouse model by a compound synthesized to block Ca2+ entry. Cancer Res 60:1002-1008) に記載された三つの単純な工程において合成された。L−プロリンメチルエステルは、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシトリピロリジンホスホニウムを使用して4-メトキシフェニル酢酸とカップリングし、メチル 1-[2-(4メトキシフェニル)アセチル]ピロリジン-2-カルボキシラート（黄色油）を生成した。続けて、得られたアミドは、テトラヒドロフラン中のLiAlH4およびAlCl3でアミノアルコールに還元された。得られた無色の油は、還流するトルエンにおいて触媒的p-トルエンスルホン酸を有するウィリアムソン条件下で4-クロロベンズヒドロールとカップリングされた。最後の茶色油はカラムクロマトグラフィーによって単離され、その構造は各磁気共鳴および質量分光測定法によって確認された。TH-1177は、使用のためにDMSOに溶解された。
【００４４】
細胞系統および維持：
癌細胞系統は、American Type Culture Collection (Manassas, VA) から得られた。細胞系統は、グルタミンおよびSerXtend (Irvine Scientific)を含む5％ウシ胎仔血清を補充されたRPMI1640において維持された。培養のために使用されたウシ胎仔血清は、1時間にわたって56℃で血清を維持することによって熱不活性化された。
【００４５】
[Ca2+]i 濃度の測定：
細胞は、37℃で1時間にわたってCa2+感受性蛍光色素indo-1 (indo-1/AM; Molecular Probes, Eugene, OR)のアセトキシメチルエステルの1μＭを含む成長培地中にインキュベートされた。細胞は、バッファーＡ [10 mM HEPES (pH 7.4)、1 mM MgCl2、3 mM KCI、1 mM CaCl2、140 mM NaCl、0.1%グルコース、および1%ウシ胎仔血清] において三回にわたって洗浄され、106 細胞/miの最終濃度まで懸濁された。刺激前、細胞は37℃に暖められた。[Ca2+]iの変化は、先に刊行された以下の情報を使用してSLM 8100C分光蛍光光度計(SLM/Aminco; Urbana, IL)においてモニターされた(Densmore,J.J., Haverstick,D.M., Szabo,G., and Gray,L.S. 1996. A voltage operable current is involved in activation-induced Ca2+ entry in human lymphocytes whereas ICRAC has no apparent role. Am.J.Physiol. 271:C1494-C1503; Haverstick,D.M., Densmore,J.J., and Gray,L.S. 1998. Calmodulin regulation of Ca2+ entry in Jurkat T cells. Cell Calcium 23:361-368)。
【００４６】
細胞増殖の測定：
ともに100 I.JIの最終容積において、2.5×104細胞／ウェルのLNCaP細胞または5×104細胞／ウェルのPC-3細胞が、薬剤またはビヒクル(DMSO)の存在中において標準的な平板底の96ウェル組織培養プレートに三重に静置された。他に指示がない限り、細胞はCO2 インキュベーターにおいて37℃で48時間にわたって増殖した。相対的な細胞増殖が、自動化されたプレートリーダーを使用して製造業者によって記載されたようにCellTiter 96水細胞増殖アッセイ(Promega, Madison, WI)で決定された。結果は、盲目方法において計算され、三重決定の手段である。
【００４７】
結果
新規な化学的ライブラリーの構築:
細胞外Ni2+は、電気的に非興奮性の細胞においてCa2+の流入経路を遮断し(Merritt,J.E., Jacob,R., and Hallam,T.J. 1989. Use of manganese to discriminate between calcium influx and mobilization from internal stores in stimulated human neutrophils. J.Biol.Chem. 264:1522-1527; Jones,G.R.N. 1985. Cancer therapy: Phenothiazines in an unexpected role. Tumori 71:563-569)、かつT型Ca2+チャネルを通した電流を遮断する(Lee,J.-H., Gomora,J.C., Cribbs,L.L., and Perez-Reyes,E. 2000. Nickel block of three cloned T-type Ca channels: low concentrations selectively block α1H. Biophys.J. 77:3042)。我々は、これらの事実を使用して、Ni2+によるCa2+流入の阻害に感受性を示した全ての系におけるCa2+流入を遮断する化合物についてのMedlineデータベースの検索を行った。その後、同定された化合物は、反復配列についての基礎として使用された。この戦略は、戻された引用が既に検索されたものと重なり、データベースが飽和状態を示すまで続けられた。表１（図７）に列挙される薬剤のいくつかは、細胞の増殖およびJurkatヒト癌細胞系統へのCa2+の流入を遮断する能力について試験された。これらの化合物は、Jurkat細胞系統で得られた結果と同様の結果（データは示さず）を示す様々な癌細胞系統（「材料および方法」）において試験された。ICso’sとして発現された、Jurkat細胞系統におけるこれらの二つの阻害活性間の相関関係は、図１、パネルＡにおいて示される。得られた構造-活性関係（SAR）は、新規な化学的薬剤を合成するガイドとして使用された。これらの新規な化合物は、Ca2+および増殖の増強された阻害を示す（表２（図８））。増殖を阻害しかつCa2+流入を遮断する新規化合物の能力間の回帰直線の勾配は0.97であるかまたは既知の薬剤についての0.73の勾配（〜=0.79）（図１、パネルA）と比較して〜0.93の値（図１、パネルB）に非常に近い。Ca2+流入は増殖のために必要であるため(Berridge,M.J., Lipp,P., and Bootman,M.D. 2000. The versatility and universality of calcium signalling. Nat.Rev.Mol Cell Biol. 1:11-21)、0.97の勾配は、大部分がBayesian方法において適切に解釈されるべきである。このBayesian分析は、増殖についてのこれらの化合物の全ての効果が、Ca2+の流入の阻害を通して仲介されることを示す。
【００４８】
Ca2+ イオノフォア イオノマイシンは、TH-1177の効果を部分的に克服する。我々は、他のもののプロトタイプとして、我々の化合物TH-1177の一つを使用した (Haverstick,D.M., Heady,T.N., Macdonald,T.L., and Gray,L.S. 2000. Inhibition of human prostate cancer proliferation in vitro and in a mouse model by a compound synthesized to block Ca2+ entry. Cancer Res 60:1002-1008)。TH-1177がCa2+流入の阻害を介して作用する場合、その効果は、Ca2+イオノフォアを使用する[Ca2+]iの直接的な上昇によって少なくとも部分的に逆転されるであろう。図２、パネルＡに示されるように、30 nM イオノマイシン単独の増殖についての効果はなかったが、イオノマイシンは、TH-1177によるCa2+流入の阻害を濃度依存的方法において克服した。イオノマイシンはまた、30 μM イオノマイシンの存在中における4.6 μMからその欠如下における17.8 μMまで、TH-1177のIC50を増加させる増殖を阻害するTH-1177の能力を減少させた（図２、パネルB）。これは、TH-1177が、Ca2+流入の阻害によって増殖を阻害する作用を示すことを示唆する。これは、図１に示されたCa2+流入と増殖との間の関係と一致する。
【００４９】
我々の薬剤に対して感受性を示す癌細胞系統は、α1H Ca2+チャネルまたはそのb25スプライス変異体についての情報を発現する。
【００５０】
我々は、T型Ca2+チャネルファミリーの一員が、電気的に興奮性の細胞においてCa2+流入を仲介する役割を果たすことを示すデータを以前から提示してきた (Densmore,J.J., Haverstick,D.M., Szabo,G., and Gray,L.S. 1996. A voltage operable current is involved in activation-induced Ca2+ entry in human lymphocytes whereas ICRAC has no apparent role. Am.J.Physiol. 271:C1494-C1503; Densmore,J.J., Szabo,G., and Gray,L.S. 1992. A voltage-gated calcium channel is linked to the antigen receptor in Jurkat T lymphocytes. FEBS Lett. 312:161-164; Haverstick, D. M. and Gray, L. S. Increased intracellular Ca2+ induces Ca2+ influx in human T lymphocytes. Molecular Biology of the Cell 4, 173-184. 1993; Haverstick,D.M., Densmore,J.J., and Gray,L.S. 1998. Calmodulin regulation of Ca2+ entry in Jurkat T cells. Cell Calcium 23:361-368)。前立腺癌系統がT型Ca2+チャネルのα1Hアイソフォームを異なる状態で変化するレベルで発現することが最近示された (Mariot,P., Vanoverberghe,K., Lalevee,N., Rossier,M.F., and Prevarskaya,N. 2002. Overexpression of an alpha 1H (Cav3.2) T-type calcium channel during neuroendocrine differentiation of human prostat
e cancer cells. J Biol.Chem 277:10824-10833)。同じプライマーを使用して、我々は、癌細胞系統において二つの異なる単位複製配列（amplicon）を同定した（図３）。悪性T細胞系統Jurkatにおいて見出された170塩基の単位複製配列は、T型Ca2+チャネルアイソフォームα1H (UniGene cluster Hs.122359) と類似している。Jurkat 細胞のフォワードおよびリバース方向の両方において3e-79の期待値を示す。DU145についてフォワード方向における期待値は1e-67であり、リバース方向における期待値は1e-70であった。神経芽細胞腫細胞株SK-N-SH 由来の320塩基の単位複製配列は、825スプライス変異体(GenBank accession number AF223563)と類似し、リバース方向において1e-141の期待値を示し、フォワード方向において1e-135の期待値を示す。また、図３に示された結果は、HL60ヒト白血病細胞系統から得られた情報を使用するRT-PCRアッセイの結果である。検出可能なPCR生成物の欠如は、細胞系統の抵抗性と一致し、我々の新規な化合物によって増殖またはCa2+流入を阻害する（データは示さず）。GenBankデータベースに対する二つの単位複製配列のBlastアライメントの結果が図４に示される。表３（図９）に示されたように、幾つかの癌細胞系統がα1H、δ25スプライス変異体、または両方についての情報を発現する。これらの観察は、α1Hおよびδ25生成物が、少なくとも幾つかの癌細胞系統においてCa2+流入を媒介するための候補になることを示し、かつそれらの発現が我々の新規な化学薬剤に対する感受性のために必要とされる。
【００５１】
ジアステレオマーTH-1177およびTH-1211は、PC3前立腺癌細胞の増殖を阻害し、かつ同じ立体選択性でα1Hを遮断する。
【００５２】
TH-1177は、二つのキラル中心を有し、TH-1211はそれらの一つについての立体異性体である（図５、パネルＡ）。図５、パネルＢにおいて示されたように、14 μMのIC50を示すTH-1177は、42 μMのIC50を示すTH-1211と比較してPC3前立腺癌細胞の増殖を阻害する点でより強力である。TH-1177およびTH-1211は、異種発現の正準のα1H Ca2+チャネルを遮断する能力について同じランクのオーダーを示す(図６)。TH-1177によって形質移入されたα1Hの阻害についてのIC50は2.8 μMであったが、TH-1211についての値は24 μMであった。従って、Ca2+選択的蛍光染色によって測定されたとき、Ca2+流入は、これらがα1Hによって仲介されたCa2+電流であったとき、TH-1177およびTH-1211で同様の感受性であった。重要なことに、Ca2+流入のこれらの測定の各々は、立体異性体に対する感受性において同じ相対的差異を示した。これは、従来の手段によって測定されたときの容量性Ca2+流入と、電気生理学的方法によって測定されたときのα1Hによって仲介されたCa2+流入との間の薬理学的一致を示す。
【００５３】
議論
我々は、T型Ca2+チャネルのα1Hアイソフォームまたはそのδ25スプライス変異体が、Ca2+の流入および電気的に非興奮性の細胞の増殖における役割を有する可能性を示した。我々のデータは、新規な化合物が、Ni2+に対して感受性を示す系においてCa2+の流入を阻害することが知られている化合物から生成されたSARに基づいて作製され得ることを示す。重要なことに、これらの新規な化合物による幾つかの癌細胞系統の増殖の阻害は、大部分がCa2+流入の遮断を介してもたらされる。我々の薬剤に対して感受性を示す同じ細胞系統は、α1H Ca2+チャネル、そのδ25スプライス変異体、またはその両方についての情報を発現する。前記化合物が、α1H Ca2+チャネルによって仲介されたCa2+電流を阻害することが示された。TH-1177およびTH-1211は、Ca2+の流入および癌細胞系統の増殖を選択的に阻害し、かつ正準なα1Hの同じ立体選択的遮断を示す。これらのデータは、α1H Ca2+チャネルおよびそのδ25スプライス変異体が、これらの研究において試験された癌細胞系統におけるCa2+の流入に関与することを強く示している。
【００５４】
生理学的機能（例えば増殖）に対するCa2+チャネル機能の生物物理学的分析は、挑戦をもたらし得る。我々は、我々の化合物が異種発現のCa2+チャネルを遮断し、かつ前記チャネルまたはそのスプライス変異体についての情報を有する癌細胞系統のみが、同じ薬剤による阻害に対する感受性を示すことを実証した。さらに、TH-1177は、生物物理学的技術によって測定されたとき、その立体異性体TH-1211と比較して、発現したα1Hを介したCa2+流入を阻害する点でより強力である。TH-1177およびTH-1211はまた、これらがより一般的に使用された生化学的方法によってアッセイされるとき、癌細胞系統における増殖およびCa2+流入を阻害する能力について同じランクオーダーを示す。IC50値によって測定された薬剤の絶対的作用強度は、生物物理学的な方法によって測定されようと生化学的な方法によって測定されようと著しく類似する。従って、実験的手法の組み合わせからの結果が、従って、実験手法の組み合わせからの結果は、いくつかの癌細胞におけるCa2+流入のメカニズムの像に合成された。
【００５５】
α1H Ca2+チャネルの発現は、LNCaP細胞において実証され、発現レベルが異なる状態で相関する (Mariot,P., Vanoverberghe,K., Lalevee,N., Rossier,M.F., and Prevarskaya,N. 2002. Overexpression of an alpha 1H (Cav3.2) T-type calcium channel during neuroendocrine differentiation of human prostate cancer cells. J Biol.Chem 277:10824-10833)。δ25スプライス変異体の配列はGenBankに登録されているが(受託番号AF223563)、その機能は我々の知識に記載されていなかった。しかしながら、これらは共に配列相同性によってT型Ca2+チャネルファミリーの膜であり、NCBIデータベース内のHs.122359 UniGeneクラスターに割り当てられた。T型Ca2+チャネルの生理学的役割は、心臓および中枢神経系におけるペースメーカーとしての役割を担い得るが、現時点で完全には明らかではない (Chemin,J., Monteil,A., Perez-Reyes,E., Bourinet,E., Nargeot,J., and Lory,P. 2002. Specific contribution of human T-type calcium channel isotypes (α1G, α1H and α1I) to neuronal excitability. J.Physiol.(Lond.) 540:3-14; McDonald,T.F., Pelzer,S., Trautwein,W., and Pelzer,D.J. 1994. Regulation and modulation of calcium channels in cardiac, skeletal, and smooth muscle cells. Physiol Rev 74:365-507)。これらのCa2+チャネルの発現はまた、発生的に制御されるものと思われる (Brooks,G., Harper,J.V., Bates,S.E., Haworth,R.S., Cribbs,L.L., Perez-Reyes,E., and Shattock,M.J. 1999. Over expression of the voltage-gated T-type calcium channel induces vascular smooth muscle cell proliferation. Circulation 100:I-209(Abstr.); Clozel,J.P., Ertel,E.A., and Ertel,S.I. 1999. Voltage-gated T-type Ca2+ channels and heart failure. Proc.Assoc.Am Physicians 111:429-437; Harper,J.V., McLatchie,L., Perez-Reyes,E., Cribbs,L.L., Shattock,M.J., and Brooks,G. 2000. T-type calcium channel expression is necessary for G1-S progression in vascular smooth muscle. Circulation 102:II-48 (Abstr.); Monteil,A., Chemin,J., Bourinet,E., Mennessier,G., Lory,P., and Nargeot,J. 2000. Molecular and functional properties of the human α1G subunit that forms T-type calcium channels. J Biol.Chem. 275:6090-6100)。そして、ここで報告されたデータが、正準α1Hおよびそのδ25スプライス変異体が、幾つかの癌細胞系統の増殖のために必要とされるCa2+流入の原因であることを示す。
【００５６】
ここに記載された合成化合物は、異種移植されたヒトPC3前立腺癌細胞を有するマウスのTH-1177での治療が、彼らの寿命を著しく延長した (Haverstick,D.M., Heady,T.N., Macdonald,T.L., and Gray,L.S. 2000. Inhibition of human prostate cancer proliferation in vitro and in a mouse model by a compound synthesized to block Ca2+ entry. Cancer Res 60:1002-1008)。従って、Ca2+ チャネル流入阻害剤は、臨床医に癌の治療のための医療設備への付加を提供することを可能にする。これらの結果はまた、電気的に非興奮性の細胞におけるCa2+流入のメカニズムについての合理的かつ試験可能な仮説を見渡す可能性を上昇させる。本明細書中に示された観察は、この領域におけるさらなる発展のための基礎になる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１。Ca2+流入および増殖を遮断する既知の化合物の同定、ならびに増加した効力を示す新規な化合物の設計。増殖およびCa2+流入は、「材料および方法」において以下に記載されたようにJurkat 癌細胞中において決定された。各活性および化合物についての個々の濃度反応曲線が構築され、IC50値が計算された。実線および破線で示された一つの傾斜を有する線として示された算出された最小二乗法回帰。パネルＡ：ガイドとしてNi2+感受性を使用し、Jurkat 細胞においてCa2+流入および増殖を遮断する既知の化合物が同定された。パネルＢ：SARは、Ca2+流入およびJurkat 細胞増殖を遮断する新規な化合物の合成を誘導するパネルＡにおいて示されたデータから開発された。
【図２】図２。Ca2+イオノフォア イオノマイシンは、Ca2+流入およびTH-1177によって生成されたJurkat細胞の増殖の阻害を克服する。パネルＡ：Jurkat細胞へのCa2+の流入は、「材料および方法」に記載されたように決定した。示された濃度のイオノマイシンが30秒で加えられ、分裂促進的モノクローナル抗体OKT3は、60秒で1μg/mLの濃度で加えられた。2.5 mMのEGTAまたは示された濃度のTH-1177が、150秒で加えられた。パーセンテージ阻害は、「材料および方法」に記載されたように決定された。パネルＢ。Jurkat細胞は、30 nMイオノマイシンの存在下（開記号）または欠如下（閉記号）および示された濃度のTH-1177において48時間にわたって増殖した。パーセントコントロール増殖は、「材料および方法」において記載されたように決定された。
【図３】図３。二つのサイズの単位複製配列が、α1H Ca2+チャネル特異的PCRプライマーを使用してJurkatおよびSK-N-SF癌細胞系統において同定された。メッセンジャーRNAが抽出され、かつ先に記載されたプライマーを使用して「材料および方法」において記載されたように増幅された (Mariot,P., Vanoverberghe,K., Lalevee,N., Rossier,M.F., and Prevarskaya,N. 2002. Overexpression of an alpha 1H (Cav3.2) T-type calcium channel during neuroendocrine differentiation of human prostate cancer cells. J Biol.Chem 277:10824-10833)。得られた生成物はゲル電気泳動法によって単離され、かつエチジウムブロマイドの染色によって可視化され、UVイルミネーションによって可視化された。
【図４】図４。図４に示した単位複製配列は、α1Hまたはそのδ25スプライス変異体と実質的に同一である。図４に示した単位複製配列は、「材料および方法」に記載されたようにシークエンスされた。GenBankデータベースは、その後に問合わせを受け、示されたアライメントが得られた。
【図５】図５。TH-1177およびTH-1211は、二つのキラル中心のうちの一つについての立体異性体である。これらは、PC3前立腺癌細胞の増殖を阻害する異なる能力を有する。パネルＡ： TH-1177およびTH-1211の構造は、「材料および方法」に記載されたように決定された。ジアステレオマーは、ベンズヒドロール中心（黒矢印）でラセミになり、かつプロリン中心（白矢印）でエナンチオマーになる。TH-1177はS立体配置を有し、TH-1211はRを有する。パネルＢ：PC3ヒト前立腺癌細胞の増殖が、「材料および方法」に記載されたように決定された。TH-1177についてのIC50は14μM(白四角)、TH-1211についてのIC50は42μM(逆三角)であった。
【図６】図６。TH-1177およびTH-1211は、形質移入されたα1Hチャネルを通してCa2+電流を阻害する異なる能力を有する。形質移入されたα1H Ca2+チャネルによって運ばれた電流は、「材料および方法」において記載されたように決定された。TH-1177およびTH-1211についての濃度応答は、図６Ｄにおいて示される。TH-1177についてのIC50は0.8μM、TH-1211についてのIC50は7μMであった。
【図７】表１を示す図。
【図８】表２を示す図。
【図９】表３を示す図。
【図１】
2008510730.tif 000007
【図２】
2008510730.tif 000008
【図３】
2008510730.tif 000009
【図４】
2008510730.tif 000010
【図５】
2008510730.tif 000011
【図６】
2008510730.tif 000012
【図７】
2008510730.tif 000013
【図８】
2008510730.tif 000014
【図９】
2008510730.tif 000015