(57)【要約】  本発明は、細胞増殖の阻害及び／又は細胞アポトーシスの誘発をなし得るキノロンアナログを提供する。更に、本発明は、キノロンアナログの調製方法及びキノロンアナログの使用方法を提供する。
2008513485.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）を有する化合物及びその医薬的に許容可能な塩、エステル及びプロドラッグ；
2008513485.tif 000227
ここに、Ｂ、Ｘ、Ａ又はＶは、Ｚ２、Ｚ３及びＺ４が夫々Ｎの場合は、不存在、及び、独立に、Ｚ２、Ｚ３及びＺ４がＣの場合は、Ｈ、ハロ、アジド、Ｒ２、ＣＨ２Ｒ２、ＳＲ２、ＯＲ２又はＮＲ１Ｒ２；又は
ＡとＶ、ＡとＸ、又はＸとＢは、夫々任意的に（（サイクリック）環で）置換され及び／又は（サイクリック）環（cyclic ring）と融合していてもよい炭素環、複素環、アリール又はヘテロアリールを形成してもよい；
ＺはＯ、Ｓ、ＮＲ１、ＣＨ２又はＣ＝Ｏ；
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３及びＺ４は、任意の２つのＮが隣接していない場合、Ｃ又はＮ；
Ｗは、Ｎ及びＺと共に、任意的に置換される飽和又は不飽和環に融合される任意的に置換される５又は６員環を形成する；該飽和又は不飽和環は、ヘテロ原子を含んでいてもよく、かつ単環であるか又は炭素若しくは複素単環若しくは多重環と融合している；
ＵはＲ２、ＯＲ２、ＮＲ１Ｒ２、ＮＲ１−（ＣＲ１２）ｎ−ＮＲ３Ｒ４、又はＮ＝ＣＲ１Ｒ２であり、Ｎ＝ＣＲ１Ｒ２におけるＲ１及びＲ２は、Ｃと共に、環を形成してもよい、
ＵがＨでない場合、及びＵがＯＨ、ＯＲ２又はＮＨ２の場合、Ｚ１〜Ｚ４の少なくとも１つはＮ；
各ＮＲ１Ｒ２におけるＲ１とＲ２は、Ｎと共に、任意的に置換される環を形成してもよい；
ＮＲ３Ｒ４におけるＲ３とＲ４は、Ｎと共に、任意的に置換される環を形成してもよい；
Ｒ１及びＲ３は、独立に、Ｈ又はＣ１−６アルキル；
各Ｒ２はＨ、又は夫々任意的にハロゲン、１又は２以上の非隣接へテロ原子、炭素環、複素環、アリール若しくはヘテロアリールで置換されるＣ１−１０アルキル若しくはＣ２−１０アルケニルであり、各環は任意的に置換される；又はＲ２は任意的に置換される炭素環、複素環、アリール又はヘテロアリール；
Ｒ４はＨ、又はＮ、Ｏ及びＳから選択される１又は２以上の非隣接へテロ原子を任意的に含み及び任意的に炭素環又は複素環で置換されるＣ１−１０アルキル又はＣ２−１０アルケニル；又はＲ３とＲ４は、Ｎと共に、任意的に置換される環を形成してもよい；
各Ｒ５は環Ｗ上の任意の位置の置換基；及びＨ、ＯＲ２、アミノ、アルコキシ、アミド、ハロゲン、シアノ又は無機置換基；又はＲ５はハロ、カルボニル、１又は２以上の非隣接へテロ原子によって夫々任意的に置換されるＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、−ＣＯＮＨＲ１；又は隣接する２つのＲ５は結合されて、任意的に置換される５又は６員の炭素環又は複素環を形成し、該炭素環又は複素環は任意的に置換される更なる炭素環又は複素環に融合されてもよい；及び
ｎは１〜６
である。
【請求項２】
Ｗは、Ｎ及びＺと共に、任意的に置換される５又は６員環を形成し、該５又は６員環は任意的に置換されるアリール又はヘテロアリールに融合され、該アリール又はヘテロアリールは以下の群から選択される：
2008513485.tif 000228
2008513485.tif 000229
ここに、各Ｑ、Ｑ１、Ｑ２及びＱ３は、独立に、ＣＨ又はＮ；
Ｙは、独立に、Ｏ、ＣＨ、Ｃ＝Ｏ又はＮＲ１；
ｎ及びＲ５は請求項１と同様；又は
Ｗは、Ｎ及びＺと共に、以下の群から選択される環を形成する：
2008513485.tif 000230
ここに、ＺはＯ、Ｓ、ＣＲ１、ＮＲ１又はＣ＝Ｏ；
各Ｚ５はＣＲ６、ＮＲ１又はＣ＝Ｏであり、ＺとＺ５は、隣接している場合、何れもＮＲ１ではない；
各Ｒ１はＨ、Ｃ１−６アルキル、ＣＯＲ２又はＳ（Ｏ）ＰＲ２であり、Ｐは、１又は２；
Ｒ６はＨ、又はヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、ハロ、アミノ又はアミドを含むがこれらに限定されない本技術分野で既知の置換基；及び
環Ｓ及び環Ｔは飽和又は不飽和の何れであってもよい
請求項１の化合物。
【請求項３】
Ｗは、Ｎ及びＺと共に、フェニルに融合される５又は６員環を形成する
請求項１の化合物。
【請求項４】
ＵはＮＲ１Ｒ２であり、Ｒ１はＨ、Ｒ２はヘテロ原子、Ｃ３−６シクロアルキル、アリール又は１又は２以上のＮ、Ｏ又はＳを含む５〜１４員複素環で任意的に置換されるＣ１−１０アルキルであり；又はＲ１及びＲ２は、Ｎと共に、任意的に置換されるピペリジン、ピロリジン、ピペラジン、モルフォリン、チオモルフォリン、イミダゾール、又はアミノジチアゾールを形成する
請求項１の化合物。
【請求項５】
Ｒ２はモルフォリン、チオモルフォリン、イミダゾール、アミノジチアダゾール、ピロリジン、ピペラジン、ピリジン又はピペリジンで置換されたＣ１−１０アルキルである
請求項４の化合物。
【請求項６】
ＵはＮＲ１−（ＣＲ１２）ｎ−ＮＲ３Ｒ４；ｎは１〜４；及びＮＲ３Ｒ４におけるＲ３及びＲ４は、（Ｎと）共に、任意的に置換されるピペリジン、ピロリジン、ピペラジン、モルフォリン、チオモルフォリン、イミダゾール、又はアミノジチアゾールを形成する
請求項１の化合物。
【請求項７】
ＵはＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ３Ｒ４であり、Ｒ３及びＲ４は、Ｎと共に、任意的に置換されるピロリジンを形成する
請求項１の化合物。
【請求項８】
Ｕは２−（Ｎ−メチルピロリジン−２−イル）エチルアミノ又は（２−ピロリジン−１−イル）エタンアミノである
請求項１の化合物。
【請求項９】
Ａ及びＸは、独立に、ハロ又はＳＲ２、ここに、Ｒ２は、ヘテロ原子、炭素環、複素環、アリール又はヘテロアリールによって任意的に置換されるＣ０−１０アルキル又はＣ２−１０アルケニルである
請求項１の化合物。
【請求項１０】
Ｒ２は、フェニル又はピラジンで置換されたＣ０−１０アルキルである
請求項９の化合物。
【請求項１１】
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３及びＺ４は、夫々、Ｃである
請求項１の化合物。
【請求項１２】
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３及びＺ４の何れか３つはＣであり、他の１つはＮである
請求項１の化合物。
【請求項１３】
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３及びＺ４の何れか２つはＣであり、他の２つは非隣接窒素である
請求項１の化合物。
【請求項１４】
Ｚ１及びＺ３はＣ、かつＺ２及びＺ４はＮ；又は
Ｚ１及びＺ３はＮ、かつＺ２及びＺ４はＣ；又は
Ｚ１及びＺ４はＮ、かつＺ２及びＺ３はＣである
請求項１１の化合物。
【請求項１５】
Ｚ１はＮである
請求項１の化合物。
【請求項１６】
前記化合物は、式（２Ａ）又は（２Ｂ）：
2008513485.tif 000231
ここに、Ａ、Ｂ、Ｖ、Ｘ、Ｕ、Ｚ、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４及びｎは上に同じ；
Ｚ５はＯ、ＮＲ１、ＣＲ６、又はＣ＝Ｏ；
Ｒ６はＨ、Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、ハロ、アミノ又はアミド；及び
Ｚ及びＺ５は任意的に二重結合を形成してもよい
請求項１の化合物。
【請求項１７】
ＺはＮＲ１で、Ｒ１はＣ１−６アルキルである
請求項１の化合物。
【請求項１８】
Ｒ１はメチルである
請求項１７の化合物。
【請求項１９】
Ｂ、Ａ、Ｘ又はＶの少なくとも１つはハロであり、かつ対応する隣接Ｚ１−Ｚ４はＣである
請求項１の化合物。
【請求項２０】
ＶはＨである
請求項１の化合物。
【請求項２１】
ＵはＯＨではない
請求項１の化合物。
【請求項２２】
請求項１の化合物と、医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項２３】
細胞増殖の減少及び／又は細胞増殖障害の寛解のための方法であって、
細胞増殖の減少及び／又は細胞増殖障害の寛解を必要とする系又は被検体に、請求項１の化合物の有効量又はその医薬組成物を、任意的に細胞増殖の減少及び／又は細胞増殖障害の寛解を惹起するための処置及び／又は化学療法剤と共に、投与すること
を含む方法。
【請求項２４】
前記細胞増殖障害は、腫瘍又は癌である
請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記系は細胞又は組織であり、前記被検体は人間又は動物である
請求項２３の方法。
【請求項２６】
微生物価の減少及び／又は微生物感染の寛解のための方法であって、
微生物価の減少及び／又は微生物感染の寛解を必要とする系又は被検体に、請求項１の化合物の有効量又はその医薬組成物を、任意的に微生物価の減少及び／又は微生物感染の寛解を惹起するための抗菌剤と共に、接触させること
を含む方法。
【請求項２７】
前記系は細胞又は組織であり、前記被検体は人間又は動物である
請求項２６の方法。
【請求項２８】
前記微生物価及び／又は前記微生物感染は、ウイルス価、細菌価又は真菌価である
請求項２６の方法。
【請求項２９】
細胞死の誘導及び／又はアポトーシスの誘導をするための方法であって、
細胞死の誘導及び／又はアポトーシスの誘導を必要とする系又は被検体に、請求項１の化合物を含む組成物の有効量又はその医薬組成物を、任意的に細胞死の誘導及び／又はアポトーシスの誘導を惹起するための処置及び／又は化学療法剤と共に、投与すること
を含む方法。
【請求項３０】
前記系は細胞又は組織であり、前記被検体は人間又は動物である
請求項２９の方法。
【請求項３１】
前記化学療法剤はゲムシタビンである
請求項２９の方法。
【請求項３２】
前記処置は放射線処置又は外科的処置である
請求項２９の方法。
【請求項３３】
以下の式の化合物：
2008513485.tif 000232
2008513485.tif 000233
【請求項３４】
請求項３３の化合物と、医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項３５】
式（１）又は（１Ａ）の化合物の調製方法であって、
2008513485.tif 000234
式（３）又は（４）のエステルと、式ＮＨＲ１Ｒ２のアミンと、式ＭＬｎ、但しＬはハロゲン原子又は有機ラジカル、ｎは３〜５、及びＭは第３族元素の原子、第４族元素の原子、Ａｓ、Ｓｂ、Ｖ又はＦｅであるルイス酸を接触することを含む調製方法：
2008513485.tif 000235
ここに、Ａ、Ｖ、及びＸは、独立に、Ｈ、ハロ、アジド、Ｒ２、ＣＨ２Ｒ２、ＳＲ２、ＯＲ２又はＮＲ１Ｒ２；
又は
ＡとＸ又はＡとＶは、夫々任意的に（（サイクリック）環で）置換され及び／又は（サイクリック）環と融合していてもよい炭素環、複素環、アリール又はヘテロアリールを形成してもよい；
ここに、ＮＲ１Ｒ２におけるＲ１及びＲ２は任意的に置換される環を形成してもよい；
各ＺはＣＨ２、Ｏ、Ｓ、又はＮＲ１；
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ６、Ｚ７、及びＺ８は、独立に、Ｃ又はＮであり、任意の２つのＮは隣接していない；
Ｚ５はＣ又はＮであり、ＺがＯ、Ｓ又はＮＲ１の場合Ｚ５はＣ、かつ更に、Ｚ５がＮの場合Ｚ及びＺ６はＮでない；
各Ｒ１はＨ又はＣ１−６アルキル；
各Ｒ２はＨ、又はＮ、Ｏ及びＳから選択される１又は２以上の非隣接へテロ原子を任意的に含み及び炭素環又は複素環によって任意的に置換されるＣ１−１０アルキル又はＣ２−１０アルケニル；又はＲ２は任意的に置換される炭素環、複素環、アリール又はヘテロアリール；
各ＢはＨ又はハロ；
Ｗは、Ｎ及びＺと共に、任意的に置換されるアリール又はヘテロアリールに融合される任意的に置換される５又は６員環を形成し、該アリール又はヘテロアリールは、単環であるか又は単環若しくは多重環と融合されていてもよく、該環は任意的にヘテロ原子を含む；
Ｗ１は任意的に置換されるアリール又はヘテロアリールであり、該アリール又はヘテロアリールは単環であるか又は任意的にヘテロ原子を含む単環若しくは多重環と融合されてもよい；及び
各Ｒ５はＷ又はＷ１上の任意の位置の置換基；及びＨ、ＯＲ２、ＮＲ１Ｒ２、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニルであり、夫々任意的にハロ、Ｃ＝Ｏ又は１又は２以上のヘテロ原子で置換される；又はＲ５は無機置換基；又は隣接する２つのＲ５は結合されて、５又は６員の飽和又は不飽和炭素環又は複素環を形成し、任意的に更なる飽和又は不飽和炭素環又は複素環に融合される。
【請求項３６】
前記エステル、アミン、及びルイス酸は、室温で接触される
請求項３５の方法。
【請求項３７】
前記エステルとアミンを有機溶媒中で接触して溶液を生成し、及び該溶液とルイス酸を接触する
請求項３５の方法。
【請求項３８】
前記有機溶媒は、塩化メチレンである
請求項３７の方法。
【請求項３９】
前記エステルに対し過剰量のアミンが使用される
請求項３５の方法。
【請求項４０】
エステル対アミンの比は１：２；又は１：１．５；又は１：１．２５である
請求項３９の方法。
【請求項４１】
等モル量のルイス酸とアミンが使用される
請求項３５の方法。
【請求項４２】
式１又は式２の前記化合物を単離すること、及び任意的に式１又は式２の単離された化合物を生成すること、を更に含む
請求項３５の方法。
【請求項４３】
前記単離化合物は、カラムクロマトグラフィ又は再結晶又はカラムクロマトグラフィ及び再結晶によって精製される
請求項４２の方法。
【請求項４４】
前記単離化合物の純度は９０〜９９％、又は９０〜９５％である
請求項４３の方法。
【請求項４５】
前記エステルは、式ＮＨＲ１Ｒ２を有する前記アミンと接触される、
ここに、
Ｒ１は（ＣＲ３２）ｎ基；
Ｒ２はＮＲ３Ｒ４；
Ｒ３はＨ又はＣ１−６アルキル；
ｎは１〜６；及び
Ｒ４はＨ、又はＮ、Ｏ及びＳから選択される１又は２以上の非隣接へテロ原子を任意的に含み及び炭素環又は複素環によって任意的に置換されるＣ１−１０アルキル又はＣ２−１０アルケニル；及びＮＲ３Ｒ４におけるＲ３及びＲ４は任意的に置換される環を形成してもよい
請求項３３の方法。
【請求項４６】
前記ルイス酸は、ＢＬ３、Ａｌ３、Ｆｅ３、ＧａＬ３、ＳｂＬ５、ＩｎＬ３、ＺｒＬ４、ＳｎＬ４、ＴｉＬ４、ＴｉＬ３、ＡｓＬ３、又はＳｂＬ３であり、Ｌはハロ又はアルキルである
請求項３５の方法。
【請求項４７】
前記ルイス酸は、塩化アルミニウムである
請求項４６の方法。
【請求項４８】
以下の群から選択される化合物を調製するための請求項３５の方法：
2008513485.tif 000236
2008513485.tif 000237
2008513485.tif 000238
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、米国特許出願第１１／１４９，００７号（提出日２００５年６月９日）、並びに米国仮出願第６０／６１１，０３０号（提出日２００４年９月１７日）、同第６０／６８８，９８６号（提出日２００５年６月９日）、同第６０／６３８，６０３号（提出日２００４年１２月２２日）、及び同第６０／６８８，７９６号（提出日２００５年６月９日）に基づく。これらの出願の内容は、引用をもって本書に繰り込みここに記載されているものとみなす。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、キノロンアナログ及びその使用に関する。更に、本発明は、キノロンアナログの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
クロモソームのテロメア末端や癌遺伝子調節領域を含むゲノムの特殊な領域に４重鎖構造がインビボで存在し得ることを示唆する証拠がある（Han, et al., Trends Pharm. Sci. (2000) 21:136-142）。４重鎖構造は、核酸のプリンリッチ鎖に形成され得る。２重鎖の核酸では、或る種のプリンリッチ鎖は、典型的な二重らせん構造と、巻戻されかつ非Ｂ型領域との間の緩徐な平衡に関与することができる。これらの巻戻された非Ｂ型は、「平行（並行）構造」と称することができる。幾つかの形状は、Ｓ１ヌクレアーゼ消化感受性と関連を有するが、これは、「ヌクレアーゼ過感受性因子」又は「ＮＨＥ」と称することができる。４重鎖は、平行構造の典型的な一例であり、或る種のＮＨＥは、４重鎖構造をとることができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、細胞増殖の阻害及び／又は細胞アポトーシスの誘発をなし得るキノロンアナログを提供する。更に、本発明は、キノロンアナログの調製方法及びキノロンアナログの使用方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第１の視点において、本発明は、以下の一般式を有する化合物及びその医薬的に許容可能な塩、エステル及びプロドラッグを提供する：
2008513485.tif 000003
ここに、Ｂ、Ｘ、Ａ又はＶは、Ｚ２、Ｚ３又はＺ４が夫々Ｎの場合は不存在、Ｚ２、Ｚ３又はＺ４が夫々Ｃの場合は独立してＨ、ハロ、アジド、Ｒ２、ＣＨ２Ｒ２、ＳＲ２、ＯＲ２又はＮＲ１Ｒ２；又は
ＡとＶ、ＡとＸ又はＸとＢは、夫々任意的に置換及び／又はサイクリック環（cyclic ring）と融合していてもよい炭素環、複素環、アリール又はヘテロアリールを形成してもよい；
Ｚは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１、ＣＨ２又はＣ＝Ｏ；
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３及びＺ４は、任意の２つのＮが隣接していない場合、Ｃ又はＮ；
ＷとＮ及びＺは、任意的に置換される飽和又は不飽和環に融合される任意的に置換される５員環又は６員環を形成する；該飽和又は不飽和環は、ヘテロ原子を含んでいてもよく、かつ単環であるか又は単一若しくは複数の炭素環若しくは複素環と融合している；
Ｕは、Ｒ２、ＯＲ２、ＮＲ１Ｒ２、ＮＲ１−（ＣＲ１２）ｎ−ＮＲ３Ｒ４、又はＮ＝ＣＲ１Ｒ２、ここに、Ｎ＝ＣＲ１Ｒ２に関し、Ｒ１及びＲ２はＣと共に環を形成してもよい、
ＵがＨでない場合、及びＵがＯＨ、ＯＲ２又はＮＨ２の場合、Ｚ１〜Ｚ４の少なくとも１つはＮ；
各ＮＲ１Ｒ２に関し、Ｒ１とＲ２はＮと共に任意的に置換される環を形成してもよい；
ＮＲ３Ｒ４に関し、Ｒ３とＲ４はＮと共に任意的に置換される環を形成してもよい；
Ｒ１及びＲ３は、独立に、Ｈ又はＣ１−６アルキル；
各Ｒ２は、Ｈ、又は夫々任意的にハロゲン、１又は２以上の非隣接へテロ原子、炭素環、ヘテロ環、アリール若しくはヘテロアリールで置換されるＣ１−１０アルキル若しくはＣ２−１０アルケニル、なお、各環は任意的に置換される；又はＲ２は、任意的に置換される炭素環、複素環、アリール又はヘテロアリール；
Ｒ４は、Ｈ、又はＮ、Ｏ及びＳから選択される１又は２以上の非隣接へテロ原子を任意的に含み及び任意的に炭素環又は複素環で置換されるＣ１−１０アルキル又はＣ２−１０アルケニル；又はＲ３とＲ４はＮと共に任意的に置換される環を形成してもよい；
各Ｒ５は、環Ｗ上の任意の位置の置換基；及びＨ、ＯＲ２、アミノ、アルコキシ、アミド、ハロゲン、シアノ又は無機置換基；又はＲ５は、ハロ、カルボニル、１又は２以上の非隣接へテロ原子によって夫々任意的に置換されるＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、−ＣＯＮＨＲ１；又は隣接する２つのＲ５は結合されて任意的に置換される５又は６員の炭素環又は複素環を形成し、該炭素環又は複素環は、任意的に置換される更なる炭素環又は複素環に融合されてもよい；及び
ｎは１〜６
である。
【０００６】
上式（１）において、Ｂは、Ｚ１がＮの場合は不存在であってよく、Ｚ１がＣの場合はＨ又はハロゲンである。
【０００７】
上式（１）において、Ｗは、Ｎ及びＺと共に、任意的に置換される５又は６員環を形成する。該環は、任意的に置換されるアリール又はヘテロアリールに融合される。該アリール又はヘテロアリールは、以下の群から選択される：
2008513485.tif 000004
2008513485.tif 000005
ここに、各Ｑ、Ｑ１、Ｑ２及びＱ３は、独立に、ＣＨ又はＮ；
Ｙは、独立に、Ｏ、ＣＨ、Ｃ＝Ｏ又はＮＲ１；
ｎ及びＲ５は、上記定義と同様である。
【０００８】
他の実施形態では、Ｗは、Ｎ及びＺと共に、以下の群から選択される式を有する群を形成する：
2008513485.tif 000006
ここに、Ｚは、Ｏ、Ｓ、ＣＲ１、ＮＲ１又はＣ＝Ｏ；
各Ｚ５は、ＣＲ６、ＮＲ１又はＣ＝Ｏ、但し、ＺとＺ５は、隣接している場合、何れもＮＲ１ではない；
各Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、ＣＯＲ２又はＳ（Ｏ）ＰＲ２、但しＰは１又は２；
Ｒ６は、Ｈ、又はヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、ハロ、アミノ又はアミドを含むがこれらに限定されない本技術分野で既知の置換基；及び
環Ｓ及び環Ｔは、飽和又は不飽和の何れであってもよい。
【０００９】
幾つかの実施形態では、Ｗは、Ｎ及びＺと共に、フェニルに融合される５又は６員環を形成する。他の実施形態では、ＵがＮＲ１Ｒ２であるがＮＨ２でない場合、Ｗは、Ｎ及びＺと共に、任意的に他の環に融合される５又は６員環を形成する。或る実施形態では、ＵがＮＲ１Ｒ２（例えばＮＨ２）である場合、Ｗは、Ｎ及びＺと共に、他の環に融合されない５又は６員環を形成する。
【００１０】
更なる他の実施形態では、本発明の化合物は、以下の一般式（２Ａ）及び（２Ｂ）を有する：
2008513485.tif 000007
ここに、Ａ、Ｂ、Ｖ、Ｘ、Ｕ、Ｚ、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４及びｎは、上に示したものと同様である；
Ｚ５は、Ｏ、ＮＲ１、ＣＲ６又はＣ＝Ｏ；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、ハロ、アミノ又はアミド；及び
ＺとＺ５は、任意的に、２重結合を形成してもよい。
【００１１】
上式（１）、（２Ａ）及び（２Ｂ）において、Ｕは、ＮＲ１Ｒ２であってよい。但し、Ｒ１は、Ｈ、Ｒ２は、ヘテロ原子、Ｃ３−６シクロアルキル、アリール又は１又は２以上のＮ、Ｏ又はＳを含む５〜１４員複素環で任意的に置換されるＣ１−１０アルキルである。例えば、Ｒ２は、任意的に置換されるモルフォリン、チオモルフォリン、イミダゾール、アミノジチアダゾール、ピロリジン、ピペラジン、ピリジン又はピペリジンで置換されたＣ１−１０アルキルであってもよい。他の例では、Ｒ１及びＲ２は、Ｎと共に、任意的に置換されるピペリジン、ピロリジン、ピペラジン、モルフォリン、チオモルフォリン、イミダゾール、又はアミノジチアゾールを形成する。
【００１２】
他の実施形態では、ＵはＮＲ１−（ＣＲ１２）ｎ−ＮＲ３Ｒ４；ｎは１〜４；及びＮＲ３Ｒ４におけるＲ３及びＲ４は、（Ｎと）共に、任意的に置換されるピペリジン、ピロリジン、ピペラジン、モルフォリン、チオモルフォリン、イミダゾール、又はアミノジチアゾールを形成する。幾つかの例では、ＵはＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ３Ｒ４であり、Ｒ３及びＲ４は、Ｎと共に、任意的に置換されるピロリジンを形成し、ピロリジン環の任意の位置において（ＣＨ２）ｎに結合されてもよい。一実施形態では、Ｒ３及びＲ４は、Ｎと共に、Ｎ−メチル置換ピロリジンを形成する。幾つかの実施形態では、Ｕは２−（Ｎ−メチルピロリジン−２−イル）エチルアミノ又は（２−ピロリジン−１−イル）エタンアミノである。
【００１３】
上記式（１）、（２Ａ）及び（２Ｂ）において、ＺはＳ又はＮＲ１であってもよい。幾つかの実施形態では、Ｂ、Ｘ、又はＡの少なくとも１つはハロであり、Ｚ１、Ｚ２、及びＺ３はＣである。他の実施形態では、Ｚ２及びＺ３がＣの場合、Ｘ及びＡは夫々Ｈではない。上記式（１）、（２Ａ）及び（２Ｂ）において、ＶはＨであってもよい。特別な実施形態では、ＵはＯＨではない。
【００１４】
一実施形態では、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３及びＺ４は、夫々、Ｃである。他の実施形態では、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３及びＺ４の何れか３つはＣであり、他の１つはＮである。例えば、Ｚ１、Ｚ２、及びＺ３がＣであり、Ｚ４がＮである。或いは、Ｚ１、Ｚ２、及びＺ４がＣであり、Ｚ３がＮである。他の例では、Ｚ１、Ｚ３、及びＺ４がＣであり、Ｚ２がＮである。更に他の例では、Ｚ２、Ｚ３、及びＺ４がＣであり、Ｚ１がＮである。
【００１５】
他の実施形態では、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３及びＺ４の何れか２つはＣであり、他の２つは非隣接窒素である。例えば、Ｚ１及びＺ３がＣで、Ｚ２及びＺ４がＮであってもよい。或いは、Ｚ１及びＺ３がＮで、Ｚ２及びＺ４がＣであってもよい。他の例では、Ｚ１及びＺ４がＮで、Ｚ２及びＺ３がＣである。特別な例では、Ｗは、Ｎ及びＺと共に、フェニルに融合される５又は６員環を形成する。
【００１６】
幾つかの実施形態では、Ｂ、Ｘ、Ａ、及びＶは夫々Ｈであり、Ｚ１〜Ｚ４はＣである。多くの実施形態では、Ｂ、Ｘ、Ａ、及びＶの少なくとも１つはＨであり、対応する隣接Ｚ１〜Ｚ４原子はＣである。例えば、Ｂ、Ｘ、Ａ、及びＶの任意の２つはＨであってもよい。一例では、Ｖ及びＢは何れもＨであってもよい。他の例では、Ｂ、Ｘ、Ａ、及びＶの任意の３つがＨであり、対応する隣接Ｚ１〜Ｚ４原子はＣである。
【００１７】
或る実施形態では、Ｂ、Ｘ、Ａ、及びＶの１つがハロゲン（例えばフッ素）であり、対応する隣接Ｚ１〜Ｚ４原子はＣである。他の実施形態では、Ｘ、Ａ、及びＶの２つがハロゲン又はＳＲ２であり、ＳＲ２は、ヘテロ原子、炭素環、複素環、アリール又はヘテロアリールによって任意的に置換されるＣ０−１０アルキル又はＣ２−１０アルケニルであり、対応する隣接Ｚ２〜Ｚ４はＣである。例えば、Ｘ及びＡは夫々ハロゲンであってもよい。他の例では、Ｘ及びＡは、存在する場合、夫々、ＳＲ２であってよく、フェニル又はピラジンで置換されたＣ０−１０アルキルである。更に他の例では、Ｖ、Ａ及びＸは、アルキニル、ＣＦ３、ＣＨ２ＣＦ３のようなフッ化アルキル、過フッ化アルキル等；シアノ、ニトロ、アミド、スルホニルアミド、又はＣＯＲ２のようなカルボニル化合物であってもよい。
【００１８】
上式の夫々において、Ｕ及びＸ、Ｖ及びＡは、存在する場合、独立に、ＮＲ１Ｒ２であり、Ｒ１はＨ、Ｒ２はヘテロ原子で任意的に置換されるＣ１−１０アルキル、Ｃ３−６シクロアルキル、アリール又は１又は２以上のＮ、Ｏ又はＳを含む５〜１４員複素環である。本発明の化合物に、２以上のＮＲ１Ｒ２成分が存在する場合、上記式の何れか１つで表される化合物においてＡ及びＵが何れもＮＲ１Ｒ２である場合と同様に、個々のＲ１と、個々のＲ２は、独立に選択される。一例では、Ｒ２は、任意的に置換される５〜１４員複素環で置換されたＣ１−１０アルキルである。例えば、Ｒ２は、モルフォリン、チオモルフォリン、イミダゾール、アミノジチアダゾール、ピロリジン、ピペラジン、ピリジン又はピペリジンで置換されたＣ１−１０アルキルであってもよい。或いは、Ｒ１及びＲ２は、Ｎと共に、１又は２以上のＮ、Ｏ又はＳを含む任意的に置換される複素環を形成してもよい。例えば、Ｒ１及びＲ２は、Ｎと共に、ピペリジン、ピロリジン、ピペラジン、モルフォリン、チオモルフォリン、イミダゾール、又はアミノジチアゾールを形成してもよい。
【００１９】
任意的に置換される複素環の具体例には以下のものが含まれるが、それらに限定されない：テトラヒドロフラン、１，３−ジオキソラン、２，３−ジヒドロフラン、テトラヒドロピラン、ベンゾフラン、イソベンゾフラン、１，３−ジヒドロ−イソベンゾフラン、イソキサゾール、４，５−ジヒドロイソキサゾール、ピペリジン、ピロリジン、ピロリジン−２−オン、ピロール、ピリジン、ピリミジン、オクタヒドロ−ピロロ［３，４−ｂ］ピリジン、ピペラジン、ピラジン、モルフォリン、チオモルフォリン、イミダゾール、アミノジチアダゾール、イミダゾリジン−２，４−ジオン、ベンズイミダゾール、１，３−ジヒドロベンズイミダゾール−２−オン、インドール、チアゾール、ベンゾチアゾール、チアジアゾール、チオフェン、テトラヒドロ−チオフェン１，１−ジオキシド、ジアゼピン、トリアゾール、ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプタン、２，５−ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプタン、及び２，３，４，４ａ，９，９ａ−ヘキサヒドロ−１Ｈ−β−カルボリン。
【００２０】
一実施形態において、本発明は、式（１）、（２Ａ）又は（２Ｂ）を有する化合物であって、
Ａ、Ｖ及びＢは、夫々、存在する場合は、独立に、Ｈ又はハロゲン（例えばクロロ又はフルオロ）；
Ｘは−（Ｒ５）Ｒ１Ｒ２であり、Ｒ５はＣ又はＮ、及び、−（Ｒ５）Ｒ１Ｒ２の夫々において、Ｒ１及びＲ２は共に任意的に置換されるアリール又はヘテロアリール環を形成してもよい；
ＺはＮＨ又はＮ−アルキル（例えばＮ−ＣＨ３）；
Ｗは、Ｎ及びＺと共に、任意的に置換されるアリール又はヘテロアリール環と融合される任意的に置換される５又は６員環を形成する；及び
Ｕは−Ｒ５Ｒ６−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨＲ２−ＮＲ３Ｒ４であり、Ｒ６はＨ又はＣ１−１０アルキル及び−ＣＨＲ２−ＮＲ３Ｒ４成分において、Ｒ３又はＲ４は、夫々、Ｃと共に、任意的に置換される複素環又はヘテロアリール環を形成してもよく、或いは−ＣＨＲ２−ＮＲ３Ｒ４成分において、Ｒ３又はＲ４は、夫々、Ｎと共に、任意的に置換される炭素環、複素環、アリール環又はヘテロアリール環を形成してもよい、
化合物を提供する。
【００２１】
他の実施形態では、本発明は、式（１）、（２Ａ）又は（２Ｂ）を有する化合物であって、
Ａは、存在する場合、Ｈ又はハロゲン（例えばクロロ又はフルオロ）；
Ｘは、存在する場合、−（Ｒ５）Ｒ１Ｒ２であり、Ｒ５はＣ又はＮ、及び、−（Ｒ５）Ｒ１Ｒ２の夫々において、Ｒ１及びＲ２は共に任意的に置換されるアリール又はヘテロアリール環を形成してもよい；
ＺはＮＨ又はＮ−アルキル（例えばＮ−ＣＨ３）；
Ｗは、Ｎ及びＺと共に、任意的に置換されるアリール又はヘテロアリール環と融合される任意的に置換される５又は６員環を形成する；及び
Ｕは−Ｒ５Ｒ６−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨＲ２−ＮＲ３Ｒ４であり、Ｒ６はＨ又はアルキル及び−ＣＨＲ２−ＮＲ３Ｒ４成分において、Ｒ３又はＲ４は、夫々、Ｃと共に、任意的に置換される複素環又はヘテロアリール環を形成してもよく、或いは−ＣＨＲ２−ＮＲ３Ｒ４成分において、Ｒ３又はＲ４は、夫々、Ｎと共に、任意的に置換される炭素環、複素環、アリール環又はヘテロアリール環を形成してもよい、
化合物を提供する。
【００２２】
上記式の夫々において、任意的に置換される成分は、夫々、１又は２以上のハロ、ＯＲ２、ＮＲ１Ｒ２、カルバメート、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、これらは夫々ハロ、Ｃ＝Ｏ、アリール又は１又は２以上のヘテロ原子で任意的に置換される；無機置換基、アリール、炭素環又は複素環によって置換されてもよい。その他の置換基には以下のものが含まれるが、それらに限定されない：アルキニル、シクロアルキル、ＣＦ３、ＣＨ２ＣＦ３、過フッ化アルキル等のフッ化アルキル；ＯＣＦ３又はＣＨ２ＣＦ３等の酸素化されたフッ化アルキル；シアノ、ニトロ、ＣＯＲ２、ＮＲ２ＣＯＲ２、スルホニルアミド；ＮＲ２ＳＯＯＲ２；ＳＲ２、ＳＯＲ２、ＣＯＯＲ２、ＣＯＮＲ２２、ＯＣＯＲ２、ＯＣＯＯＲ２、ＯＣＯＮＲ２２、ＮＲＣＯＯＲ２、ＮＲＣＯＮＲ２２、ＮＲＣ（ＮＲ）（ＮＲ２２）、ＮＲ（ＣＯ）ＮＲ２２、及びＳＯＯＮＲ２２、ここに、Ｒ２は、夫々、式（１）で定義されたものと同様。
【００２３】
本発明は、更に、上記式の何れか１つで表される化合物、及び医薬的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物を提供する。一例では、該組成物は、緩衝液中の、上記式の何れか１つで表される化合物、ポリエチレングリコール、及びプロピレングリコールを含む。
【００２４】
更に、本発明は、細胞増殖の減少（抑制）及び／又は細胞死の誘導のための方法であって、系と、上記式の何れか１つで表される化合物の有効量又はその医薬組成物を、任意的に該系に細胞増殖の減少（抑制）及び／又はアポトーシスないしプログラム細胞死のような細胞死の誘導を惹起する化学療法剤と組み合せて、接触させることを含む方法を提供する。系は、細胞又は組織であってもよい。一実施形態では、系は、被検体又は培養細胞（例えばインビトロないしエキソビボ）からの細胞のような膵細胞を含む。特別な実施形態では、系は、膵癌細胞を含む。一実施形態では、系は、ＰＣ３、ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９、ＭＩＡ Ｐａｃａ−２、ＨＰＡＣ、Ｈｓ７００Ｔ、Ｐａｎｃ１０．０５、Ｐａｎｃ０２．１３、ＰＬ４５、ＳＷ１９０、Ｈｓ７６６Ｔ、ＣＦＰＡＣ−１及びＰＡＮＣ−１のような細胞株である。
【００２５】
本発明は、更に、細胞増殖障害の寛解のための方法であって、細胞増殖障害の寛解を必要とする被検体に、上記式の何れか１つで表される化合物の有効量又はその医薬組成物を、任意的に細胞増殖障害の寛解を惹起するための化学療法剤と組み合せて、投与することを含む方法を提供する。例えば、細胞増殖が減少（抑制）されてもよく、及び／又はアポトーシスないしプログラム細胞死のような細胞死が誘導されてもよい。細胞増殖障害は、人間又は動物被検体の腫瘍又は癌であってもよい。特別な一実施形態では、癌は、非内分泌及び内分泌腫瘍を含む膵癌である。非内分泌腫瘍の具体例には以下のものが含まれるがそれらに限定されない：腺癌、腺房細胞癌、腺扁平上皮癌、巨細胞腫瘍、管内乳頭粘液性腫瘍、粘液性嚢胞腺癌、膵芽腫、漿液性嚢胞腺腫、及びsolid-pseudopapillary tumor（ＳＰＴ）。内分泌腫瘍は、島細胞腫瘍であってもよい。
【００２６】
細胞増殖の減少（抑制）及び／又は細胞死の誘導のための上記の方法は、更に、処置及び／又は化学療法剤と組み合せて実施してもよい。本発明の方法と組み合せて使用することができる処置の例には、放射線療法又は外科手術が含まれるが、これらに限定されない。或る実施形態では、本発明の化合物は、ゲムシタビンと組み合せて投与され、細胞増殖の減少（抑制）、細胞死の誘導及び／又は細胞増殖障害の寛解に使用される。
【００２７】
更に、本発明は、微生物価の減少のための方法であって、系に、上記式の何れか１つで表される化合物の有効量又はその医薬組成物を、任意的に微生物価の減少を惹起するための抗菌剤と共に、接触させることを含む方法を提供する。系は、細胞又は組織であってもよい。本発明は、更に、微生物感染の寛解のための方法であって、微生物感染の寛解を必要とする被検体に、上記式の何れか１つで表される化合物の有効量又はその医薬組成物を、任意的に微生物感染の寛解を惹起するための抗菌剤と共に、接触させることを含む方法を提供する。被検体は、人間又は動物であってもよい。微生物価は、ウイルス価、細菌価又は真菌価であってもよい。
【００２８】
本発明は、更に、上記式の何れか１つで表される化合物と、４重鎖構造形成能を有する核酸との間の相互作用選択性を決定するための方法であって、ａ）化合物を、競合分子の不存在下で、４重鎖構造形成能を有する３又は４以上の核酸と接触させること、但し、核酸は、何れも、テロメア核酸ではない；ｂ）該化合物と該３又は４以上の核酸との間の直接的相互作用を測定すること；及びｃ）相互作用の測定結果を比較して相互作用選択性を決定すること、を含む方法を提供する。一例では、３又は４以上の核酸は、癌遺伝子核酸配列の５’側核酸配列を含む。癌遺伝子は、ＭＹＣ、ＨＩＦ、ＶＥＧＦ、ＡＢＬ、ＴＧＦ、ＰＤＧＦα、ＭＹＢ、ＳＰＡＲＣ、ＨＥＲ、ＶＡＶ、ＲＥＴ、Ｈ−ＲＡＳ、ＥＧＦ、ＳＲＣ、ＢＣＬ−１、ＢＣＬ−２、ＤＨＦＲ又はＨＭＧＡであってもよい。相互作用選択性の決定においては、化合物は、前記３又は４以上の核酸の各々と、それぞれ異なる容器で、別々に接触させてもよい。更に、相互作用選択性は、ＩＣ５０値の比較から決定してもよい。
【００２９】
本発明の化合物は、４重鎖を形成可能なＤＮＡの領域と相互作用させてもさせなくてもよい。或る実施形態では、本発明の化合物は、プロペラ状４重鎖に結合及び／又は安定化し得る。プロペラ状４重鎖の例には以下のものが含まれるがそれらに限定されない：Ｈ−ＲＡＳ、ＲＥＴ、ＢＣＬ−１、ＤＨＦＲ、ＴＧＦ−β、ＨＩＦ−１α、ＶＥＧＦ、ｃ−Ｍｙｃ又はＰＤＧＦα。 他の実施形態では、化合物は、ＢＣＬ−２に結合及び／又は安定化し得る。
【００３０】
本発明は、更に、プログラム細胞死（アポトーシス）のような細胞死を誘導するための方法であって、細胞死の誘導を必要とする系又は被検体に、上記式の何れか１つで表される化合物の有効量又はその医薬組成物を、任意的に化学療法剤と共に、投与することを含む方法を提供する。本発明は、更に、ｃ−Ｍｙｃ過剰発現のような癌遺伝子過剰発現によって媒介される障害を治療又は寛解するための方法であって、癌遺伝子過剰発現によって媒介される障害の治療又は寛解を必要とする系又は被検体に、上記式の何れか１つで表される化合物の有効量又はその医薬組成物を、任意的に化学療法剤と共に、投与することを含む方法を提供する。被検体は人間又は動物であってもよく、系は細胞又は組織であってもよい。
【００３１】
本発明は、他の一視点において、以下の式（３）又は式（４）で表される化合物の調製方法であって、
2008513485.tif 000008
2008513485.tif 000009
エステルと、ＮＨＲ１Ｒ２と、ルイス酸とを接触させることを含む方法を提供する。ここに、エステルは、以下の式（５）又は式（６）で表され、
2008513485.tif 000010
2008513485.tif 000011
Ａ、Ｂ、Ｖ、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｚ、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４及びｎは式（１）関し上述したものと同じ；
Ｗは、Ｎ及びＺと共に、任意的に置換されるアリール又はヘテロアリールに融合される任意的に置換される５又は６員環を形成し、該アリール又はヘテロアリールは、単環であるか又は単環若しくは多重環と融合されていてもよく、該環は任意的にヘテロ原子を含む；
Ｗ１は任意的に置換されるアリール又はヘテロアリールであり、該アリール又はヘテロアリールは、単環であるか又は任意的にヘテロ原子を含む単環若しくは多重環と融合されてもよい；
Ｚ５はＣ又はＮであり、ＺがＯ、Ｓ又はＮＲ１の場合Ｚ５はＣ、かつ更に、Ｚ５がＮの場合Ｚ及びＺ６はＮでない；
Ｚ６、Ｚ７、及びＺ８は、独立に、Ｃ又はＮであり、任意の２つのＮは隣接していない。
【００３２】
式（３）で表される化合物を調製するための本発明の方法は、塩化アルミニウムのようなルイス酸の存在下でエステルとアミンとのアミド結合を生成する。好適なルイス酸は、試験反応を実行し、後述するような、生成された反応産物の量を観察することによって選択してもよい。本発明の方法は、アミド結合を生成する前に、エステルを加水分解してカルボン酸にする必要はない。従って、本発明の方法は簡単である。実施例２９に示すように、本発明の方法は、更に、エステルの酸への加水分解を必要とする従来の方法よりも高収率（収量）及び高純度を提供する（実施例３０）。
【００３３】
一実施形態では、ルイス酸は、式ＭＬｎを有する。ここに、Ｌはハロゲン原子又は有機ラジカル、ｎは３〜５、Ｍは第３族元素の原子、第４族元素の原子、Ａｓ、Ｓｂ、Ｖ又はＦｅである。
【００３４】
上記の方法においては、接触工程は、室温で実行してもよい。或いは、エステル、アミン及びルイス酸は、当業者により任意に決定可能な室温よりも低い又は高い温度で接触してもよい。
【００３５】
一例では、接触工程は、有機溶媒中でエステルとアミンとを接触して溶液を生成すること、及びその溶液とルイス酸とを接触することを含む。一例では、有機溶媒は、塩化メチレンである。反応は、当業者に既知の他の好適な溶媒を用いて実行してもよい。
【００３６】
一実施形態では、エステルに対し過剰（量）のアミンを使用してもよい。例えば、エステル対アミンの比は、１：２、１：１．５又は１：１．２５であってもよい。
【００３７】
他の実施形態では、等モル量のルイス酸とアミンを使用してもよい。或いは、使用するルイス酸の量は、多くても少なくてもよい。
【００３８】
上記の方法は、更に、上記式の何れか１つで表される化合物を単離することを含む。単離化合物は、更に、当業者に既知の任意の方法を用いて精製してもよい。例えば、単離化合物は、カラムクロマトグラフィ、再結晶法、又はこれら両方の方法によって精製してもよい。
【００３９】
上記の方法において、単離化合物の純度は、９０〜９９％であり得る。例えば、単離化合物は、９０〜９５％の純度を有し得る。
【００４０】
上記の方法において、エステルは、ＮＨＲ１Ｒ２と接触されてもよい。ここに、
Ｒ１は（ＣＲ３２）ｎ基；
Ｒ２はＮＲ３Ｒ４；
Ｒ３はＨ又はＣ１−６アルキル；
ｎは１〜６；及び
Ｒ４はＨ又はＮ、Ｏ及びＳから選択される１又は２以上の非隣接へテロ原子を任意的に含みかつ炭素環又は複素環で任意的に置換されるＣ１−１０アルキル又はＣ２−１０アルケニルであり、
ＮＲ３Ｒ４において、Ｒ３及びＲ４は、上述したもののような任意的に置換される環を形成してもよい。
【００４１】
定義
本書において、用語「アルキル」は、炭素含有化合物をいうものとし、１又は２以上のヘテロ原子を含有する化合物がこれに含まれることもある。更に、用語「アルキル」には、１又は２以上の置換基によって置換されたアルキルが含まれることがある。該置換基としては、例えば、ＯＲ１、アミノ、アミド、ハロ、＝Ｏ、アリール、複素環基又は無機置換基が含まれるが、これらに限定されない。
【００４２】
本書において、用語「炭素環」は、環（の骨格）内に炭素原子のみを含む環状化合物をいうものとし、これに対し、用語「複素環」は、ヘテロ原子を含む環状化合物をいうものとする。炭素環及び複素環構造には、単環系、二環系又は多環系を有する化合物が含まれることもある。
【００４３】
本書において、用語「アリール」は、多価不飽和、典型的には芳香族炭化水素置換基をいうものとし、これに対し、「ヘテロアリール」又は「複素環式芳香族」は、ヘテロ原子を含有する芳香環をいうものとする。アリール及びヘテロアリール構造には、単環系、二環系又は多環系を有する化合物が含まれることもある。
【００４４】
本書において、用語「ヘテロ原子」は、炭素又は水素以外の任意の原子、例えば窒素、酸素又は硫黄をいうものとする。
【００４５】
複素環の具体例には以下のものが含まれるがそれらに限定されない：テトラヒドロフラン、１，３−ジオキソラン、２，３−ジヒドロフラン、ピラン、テトラヒドロピラン、ベンゾフラン、イソベンゾフラン、１，３−ジヒドロ−イソベンゾフラン、イソキサゾール、４，５−ジヒドロイソキサゾール、ピペリジン、ピロリジン、ピロリジン−２−オン、ピロール、ピリジン、ピリミジン、オクタヒドロ−ピロロ［３，４−ｂ］ピリジン、ピペラジン、ピラジン、モルフォリン、チオモルフォリン、イミダゾール、イミダゾリジン−２，４−ジオン、１，３−ジヒドロベンズイミダゾール−２−オン、インドール、チアゾール、ベンゾチアゾール、チアジアゾール、チオフェン、テトラヒドロ−チオフェン１，１−ジオキシド、ジアゼピン、トリアゾール、グアニジン、ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプタン、２，５−ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプタン、２，３，４，４ａ，９，９ａ−ヘキサヒドロ−１Ｈ−β−カルボリン、オキシラン、オキセタン、テトラヒドロピラン、ジオキサン、ラクトン、アジリジン、アゼチジン、ピペリジン、ラクタム。複素環の具体例には、更に、ヘテロアリールが含まれることがある。ヘテロアリールの他の具体例には、フラン、ピロール、ピリジン、ピリミジン、イミダゾール、ベンズイミダゾール及びトリアゾールが含まれるがこれらに限定されない。
【００４６】
本書において、用語「無機置換基」は、炭素を含有しない置換基又は水素以外の成分（元素の原子）に結合した炭素（例えば、炭素原子、一酸化炭素、二酸化炭素、及び炭酸塩）を含有しない置換基をいうものとする。無機置換基の例には、ニトロ、ハロゲン、スルホニル、スルフィニル、リン酸基等が含まれるがこれらに限定されない。
【００４７】
本書において、用語「治療する」、「治療」及び「治療効果」は、細胞増殖速度の減少（抑制）又は停止（例えば腫瘍増殖の減速又は停止）又は増殖する癌細胞の数の減少（例えば腫瘍の一部又は全部の除去）をいうものとする。また、これらの用語は、微生物が感染した系（即ち細胞、組織、又は被検体）の微生物価の減少、微生物伝播（増殖）速度の減少、微生物感染に関係する症候の数又は症候の効果の減少（抑制）、及び／又は系からの検出可能量の微生物の除去にも適用することができる。微生物の例には、ウイルス、細菌及び真菌が含まれるがこれらに限定されない。
【００４８】
本書において、用語「化学療法剤」は、腫瘍ないし癌のような細胞増殖障害の治療又は寛解に使用可能な治療剤をいうものとする。化学療法剤の例には以下のものが含まれるがそれらに限定されない：抗悪性腫瘍剤、アルキル化剤、植物アルカロイド、抗菌剤、スルホンアミド、抗ウイルス剤、白金製剤及び当業者に既知のその他の抗癌剤。化学療法剤の特別な例には以下のものが含まれるがそれらに限定されない：シスプラチン、カルボプラチン、ブスルファン、メトトレキセート、ダウノルビシン、ドクソルビシン、シクロホスファミド、メファラン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、クロラムブシル、パクリタキセル、ゲムシタビン、及び当業者に既知のその他の化学療法剤（例えば、Goodman & Gilman's, The Pharmacological Basis of Therapeutics (9th Ed) (Goodman, et al., eds.) (McGraw-Hill) (1996); 及び 1999 Physician's Desk Reference (1998) 参照）。
【００４９】
本書において、用語「アポトーシス」は、内因性細胞自殺（自己破壊）ないし自殺プログラムをいうものとする。トリガリング刺激（triggering stimulus）に応じて、細胞には、細胞縮小、細胞膜泡状突起形成、及びクロマチン凝縮及び細胞核断片化を含む一連の現象が起こる。これらの現象の結果、細胞は、一群の膜に包まれた断片（アポトーシス小体）に変換され、その後、アポトーシス小体は、マクロファージに貪食される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
本発明は、式（１）、（２Ａ）及び（２Ｂ）で表されるキノロン化合物、及びその医薬的に許容可能な塩、エステル及びプロドラッグに関する。更に、本発明は、例えばスクリーニング及び治療における、本書に開示した化合物の使用方法に関する。本発明の化合物は、４重鎖形成能を有するＤＮＡの領域と相互作用をしてもしなくてもよい。
【００５１】
式（１）、（２Ａ）及び（２Ｂ）で表される本発明の化合物を以下に再度示す：
2008513485.tif 000012
2008513485.tif 000013
ここに、Ａ、Ｂ、Ｖ、Ｘ、Ｕ、Ｚ、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｘ２及びｎは上に同じ；
【００５２】
本発明の化合物を調製するための合成方法は、スキーム１及び実施例において説明する。本発明の化合物を調製するために、当業者に既知の合成方法の他のバリエーションを使用することも可能である。例えば、種々の保護基を、側鎖１に示した中間体の調製に使用することができる。（例えば実施例３１参照。）
2008513485.tif 000014
【００５３】
本発明の化合物は、キラルであってもよい。本書において、キラル化合物とは、その鏡像（体）とは異なる化合物をいい、鏡像異性体を含む。更に、本発明の化合物は、ラセミ（体）であってもよく、又は単離された鏡像異性体又は立体異性体であってもよい。キラル化合物の合成方法及び鏡像異性体のラセミ混合物の分離方法は、当業者に周知である。例えば、March, “Advanced Organic Chemistry”, John Wiley and Sons, Inc., New York, (1985) 参照。この文献の内容は引用をもって本書に繰り込みここに記載されているものとする。
【００５４】
本発明の化合物は、本書に記載したもののようなスクリーニングアッセイを用いて試験した。図１〜図１０は、ＨＣＴ−１１６結腸直腸癌異種移植（片）モデルにおける本発明の化合物の一実施例の活性を示す。化合物の幾つかは、所与の投与量（用量）においては活性を示さなかった。
【００５５】
上記式で表される化合物の具体例は、表１Ａ〜表１Ｃ及び実施例に示されている。本発明は、表１Ａ〜表１Ｃ及び実施例に例示されている置換基から独立に選択される置換基Ｕ、Ａ、Ｘ、Ｖ及びＢを含む、式（１）、（２Ａ）及び（２Ｂ）の何れか１つで表される他の化合物も含む。例えば、表１Ａに示した最後の２つの化合物のイソプロピル置換基は、アセチル置換基で置換されてもよく、又は融合環のＮ−ＣＨ３は、ＮＨ基で置換されてもよい。即ち、本発明は、以下の種々の実施形態に記載された置換基の特定の組み合せに限定されない。
2008513485.tif 000015
2008513485.tif 000016
2008513485.tif 000017
2008513485.tif 000018
2008513485.tif 000019
2008513485.tif 000020
2008513485.tif 000021
2008513485.tif 000022
2008513485.tif 000023
2008513485.tif 000024
2008513485.tif 000025
2008513485.tif 000026
2008513485.tif 000027
2008513485.tif 000028
2008513485.tif 000029
2008513485.tif 000030
2008513485.tif 000031
2008513485.tif 000032
2008513485.tif 000033
2008513485.tif 000034
2008513485.tif 000035
2008513485.tif 000036
2008513485.tif 000037
2008513485.tif 000038
2008513485.tif 000039
2008513485.tif 000040
2008513485.tif 000041
2008513485.tif 000042
2008513485.tif 000043
2008513485.tif 000044
2008513485.tif 000045
2008513485.tif 000046
2008513485.tif 000047
2008513485.tif 000048
2008513485.tif 000049
2008513485.tif 000050
2008513485.tif 000051
2008513485.tif 000052
2008513485.tif 000053
2008513485.tif 000054
2008513485.tif 000055
2008513485.tif 000056
2008513485.tif 000057
2008513485.tif 000058
2008513485.tif 000059
2008513485.tif 000060
2008513485.tif 000061
2008513485.tif 000062
2008513485.tif 000063
2008513485.tif 000064
2008513485.tif 000065
2008513485.tif 000066
2008513485.tif 000067
2008513485.tif 000068
2008513485.tif 000069
2008513485.tif 000070
2008513485.tif 000071
2008513485.tif 000072
2008513485.tif 000073
2008513485.tif 000074
2008513485.tif 000075
2008513485.tif 000076
2008513485.tif 000077
2008513485.tif 000078
2008513485.tif 000079
2008513485.tif 000080
2008513485.tif 000081
2008513485.tif 000082
2008513485.tif 000083
2008513485.tif 000084
2008513485.tif 000085
2008513485.tif 000086
2008513485.tif 000087
【００５６】
本書に記載された前記化合物は、４重鎖を形成可能な核酸領域と相互作用し得る。４重鎖を形成可能なＤＮＡ領域は癌遺伝子の転写のような生物学的過程の制御因子なので、４重鎖生物活性の修飾因子は癌の薬物療法学において利用可能である。４重鎖を形成可能なＤＮＡ領域と相互作用する分子は、ある種の細胞増殖性障害及び関連する状態に対し、治療効果を発揮し得る。とりわけ、異常に増加した癌遺伝子発現は、細胞増殖性障害を惹起し得、そして、４重鎖構造は、通常は癌遺伝子発現を下方制御する。癌遺伝子の例には、ＭＹＣ、ＨＩＦ、ＶＥＧＦ、ＡＢＬ、ＴＧＦ、ＰＤＧＦＡ、ＭＹＢ、ＳＰＡＲＣ、ＨＵＭＴＥＬ、ＨＥＲ、ＶＡＶ、ＲＥＴ、Ｈ−ＲＡＳ、ＥＧＦ、ＳＲＣ、ＢＣＬ１、ＢＣＬ２、ＤＨＦＲ、ＨＭＧＡ、及び、当業者既知のその他の癌遺伝子を含むがこれらに限定されない。さらに、本書に記載された前記化合物は、細胞死（例えば、アポトーシス）を誘発してよく、且つ、４重鎖を形成可能なＤＮＡ領域と相互作用しなくてもよい。
【００５７】
４重鎖を形成可能なＤＮＡ領域と結合する分子は、様々な機序（例えば、該機序には、天然４重鎖構造の安定化、鎖切断の遮断による天然４重鎖の２重鎖ＤＮＡへの転換抑制、及び、４重鎖不安定化ヌクレオチド置換及びその他の配列特異的相互作用を有する天然４重鎖構造の安定化が含まれる）に従って、生物学的効果を発揮し得る。したがって、本書に記載された４重鎖を形成可能なＤＮＡ領域と結合する化合物は、癌遺伝子転写を下方制御し、それによって細胞増殖性障害を治療する目的で、細胞、組織、又は生物体に投与され得る。
【００５８】
前記４重鎖を形成可能な天然ＤＮＡの生物活性が、細胞、組織、又は生物体において、調節されるか否かの判定は、４重鎖生物活性のモニタリングによって行う。４重鎖を形成可能なＤＮＡ領域の生物活性は、例えば、前記４重鎖形成ＤＮＡと分子との接触に対する応答における遺伝子転写の減少又は増加を検出することにより、細胞、組織、又は生物体において、モニタリングし得る。転写は、当業者既知の方法である、ＲＮＡ転写物の直接的な観察によるか、又は、転写物から翻訳されたポリペプチドの観察によって、検出し得る。
【００５９】
４重鎖形成ＤＮＡ及び４重鎖形成核酸と結合する分子は、多くの細胞増殖性障害の治療に利用し得る。細胞増殖性障害には、例えば、直腸結腸癌及び造血性新生物疾患（すなわち、骨髄系、リンパ系又は赤血球系の細胞又はそれらの前駆細胞から生じるような、造血性起源の過形成性／新生物細胞に関わる疾患）を含む。前記疾患は、不十分な分化型の急性白血病（例えば、赤芽球性白血病及び急性巨核芽球性白血病）から生じ得る。更なる骨髄性障害には、急性前骨髄白血病（acute promyeloid leukemia）（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）が含まれるがこれらに限定されるものではない（Vaickus, Crit. Rev. in Oncol./Hemotol. 11:267297 (1991)）。リンパ系腫瘍には、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）（該ＡＬＬは、Ｂ細胞系譜ＡＬＬ及びＴ細胞系譜ＡＬＬを含む）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＬＬ）、及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症（ＷＭ）が含まれるがこれらに限定されるものではない。更なる型の悪性リンパ腫としては、非ホジキンリンパ腫及びそれらの変異体、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、成体Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚のＴ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病、並びに、リードシュテルンベルク病が含まれるがこれらに限定されるものではない。細胞増殖性障害にはまた、結腸直腸、乳房、肺、肝臓、膵臓、リンパ節、結腸、前立腺、脳、頭部及び首、皮膚、肝臓、腎臓、並びに心臓の癌を含む。４重鎖を形成し得るＤＮＡ領域と相互作用する化合物はまた、対象における血管新生を抑制することによって、増加した血管新生のような癌関連のプロセス及び状態を標的とするのに利用され得る。
【００６０】
本発明は、上記式の任意の一つを有する化合物と、４重鎖領域を形成可能な天然ＤＮＡを有する系とを接触させることを含む、細胞増殖を減弱するための、又は、細胞増殖を伴う疾患群を治療若しくは軽減させるための方法を、提供する。前記システムは、一群の細胞、又は１若しくはそれ以上の組織であり得る。一つの実施形態において、前記システムは、細胞増殖を伴う疾患を治療する必要のある対象（例えば、マウス、ラット、サル、又はヒトのような哺乳動物）であり得る。また、本発明は、治療の必要のある対象に、ｃ−ＭＹＣ ４重鎖形成領域と相互作用する化合物を投与することによって、それにより結腸直腸癌の細胞増殖を減弱させ、該結腸直腸癌を治療する方法を、提供する。さらに、本発明は、血管新生阻害及び血管新生を伴う癌の任意的な治療のための方法を提供するものであって、該方法は、治療の必要のある対象に、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の４重鎖形成領域と相互作用する化合物を投与することを含み、それによって、血管新生を減弱させ、及び血管新生を伴う癌を任意的に治療する。
【００６１】
４重鎖形成領域のＤＮＡと相互作用する化合物は、ウイルス感染症のような微生物感染症を減弱させるのにも使用し得る。レトロウイルスは、Ｇ−４重鎖薬物療法にとって、潜在力に富んだ標的である。Ｇ−４重鎖構造は、ＨＩＶ中のウイルスＲＮＡ若しくはＤＮＡ、その二量体リンカー構造（ＤＬＳ）、及び、その中心ＤＮＡフラップ（ＣＤＦ）によって形成される少なくとも２つの二次構造中で、機能的エレメントとして、関与している。更に、分子間又は分子内４重鎖構造の何れかをとり得るＤＮＡアプタマーは、ウイルス複製を抑制することが出来る。一つの例において、ＤＮＡアプタマーは、ウイルスの外被糖タンパク質を標的化することにより、ウイルス複製を抑制することが出来る（推定的）。もう一つの例において、ＤＮＡアプタマーはまた、前記ＨＩＶのインテグラーゼの標的化によりウイルス複製を抑制し、インテグラーゼ酵素と相互作用する天然４重鎖構造の関与が示唆される。
【００６２】
全てのレトロウイルスで一般的な二量体リンカー構造は、ウイルスゲノムの２つのコピーを、該２つのウイルスＲＮＡ配列の２つの５`末端の間の非共有結合性相互作用により、一緒に結合させるのに役立つ。前記ゲノムの二量体は、成熟ウイルス粒子中において、そのｇａｇタンパク質と安定的に会合する。ＨＩＶの場合、非共有結合の起源として、少なくとも２つの連続したグアニンの幾つかの続き（run）を含む９８塩基対配列（例えば、試験管内でＲＮＡ二量体形成においての３’）に、たどり着く。試験管内での前記二量体の形成及び安定性に対する陽イオン（カリウム）依存が観察されるのに加え、アンチセンス配列の効率的な二量体化が成功しないことから、最も可能性の高い結合構造が分子間Ｇ−４重鎖であることが明らかになった。
【００６３】
前記宿主ゲノムへの組込みの前に、逆転写されたウイルスＤＮＡは、少なくとも二つの主要なウイルスタンパク質であるインテグラーゼ及び逆転写酵素と、組込み前複合体（ＰＩＣ）を形成し、該複合体は引き続いて核内に輸送される。前記中心ＤＮＡフラップ（ＣＤＦ）は、前記ウイルスの二本鎖ＤＮＡの中心近くに生じる＋鎖の９９塩基長の一本鎖テイルであり、前記ＰＩＣの核内移行において役割を果たすことが知られている。前記ＣＤＦのオリゴヌクレオチド模倣体は、無細胞システムにおいて、分子間Ｇ−４重鎖を形成することが示されている。
【００６４】
それゆえ、４重鎖形成領域を認識する化合物は、前記二量体リンカー構造を安定化するのに使用し得、それにより、該二つのＲＮＡ鎖の脱会合を防ぎ得る。また、前記ＣＤＦによる前記４重鎖構造への結合により、前記ＰＩＣの核移行に関するタンパク質の認識及び／又は結合事象は、崩壊され得る。いずれの場合においても、その他の抗ウイルス性薬物療法を上回る利点が存在し得る。最近の高活性な抗レトロウイルス治療（ＨＡＡＲＴ）法は、前記ＨＩＶプロテアーゼ及びＨＩＶインテグラーゼを標的とした薬剤組み合わせの使用に依存している。多剤投薬法に求められていることは、単独使用の際に通常急速に発生するであろう耐性の出現を、最小化することにある。そのような急速な抵抗性の原因は、凡そ１０，０００塩基対毎に１回の割合で突然変異が生じる前記逆転写酵素の不安定性（infidelity）にある。タンパク質を標的とする事に対する、ウイルス４重鎖構造を標的とする事の利点は、この抵抗性の発生が緩徐であるか又は不可能であることにある。前記標的４重鎖の点変異は、前記４重鎖構造の完全性を損ない、前記ウイルスの機能性の無いコピーが生じる。この概念に基づいた単独治療剤は、コストの減少と有害な薬剤／薬剤相互作用の除去という付随的な利点により、現在行われている前記の多剤投薬法に置き換わり得る。
【００６５】
本発明は、天然ＤＮＡ４重鎖形成領域を有する系と、上述の式の何れか一つを有する化合物とを接触させることを含む、系における微生物の力価を減少させる方法を提供する。前記系は、一つ以上の細胞又は組織であり得る。微生物の力価の例としては、ウイルス、細菌、又は真菌の力価を含むがこれらに限定されない。特定の実施形態において、前記系は、ウイルス感染症に対する治療を必要とする対象（例えば、マウス、ラット、サル、又はヒトのような哺乳動物）である。ウイルス感染症の例には、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型又はＣ型肝炎）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ライノウイルス、帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、単純ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ１又はＨＳＶ２）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、脳炎ウイルス、ハンタウイルス、アルボウイルス、ウエストナイルウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エプスタインバールウイルス、及び呼吸器合胞体ウイルスによる感染症を含む。本発明はまた、ＨＩＶ感染症を治療する方法を提供するが、該方法は、上述の式の何れか一つを有する化合物を治療の必要のある対象に投与し、それによって該ＨＩＶ感染症を減弱させる。
【００６６】
ＤＮＡの４重鎖形成領域に結合可能な化合物の同定
ここに記述された化合物は、ＤＮＡの４重鎖形成領域に結合する可能性があり、この領域の生物活性は該化合物を含んでいる系において産生され、しばしば「信号（シグナル）」と表現されるが、このシグナルは、該化合物を含んでいない系において生産されるものとは異なっている。バックグラウンドシグナルは、新しい分子を探索するたびに前記のアッセイによって評価してもよいが、該バックグラウンドシグナルの検出を、新しい分子をアッセイするたびに、行う必要はない。
【００６７】
４重鎖形成ヌクレオチド配列の例は、以下の表２に詳しく説明されている。
表２
2008513485.tif 000088
【００６８】
テスト分子、又はテスト核酸が、異なったシグナルを生じさせるかどうかを決定することに加えて、前記核酸と前記化合物の間の相互作用の親和性を測定することも可能である。ＩＣ５０、Ｋｄ、又はＫｊの閾値は、各相互作用についての前記の測定されたＩＣ５０又はＫｄ値と比較することができ、そして、それによって、テスト分子が４重鎖に相互作用する分子として、或いはテスト核酸が４重鎖を形成する核酸として同定される。例えば、ＩＣ５０又は、Ｋｄ閾値には１０μＭ以下、１μＭ以下、及び１００ｎＭ以下などの濃度がしばしば利用される。また別の例では、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、１００ｐＭ以下、及び１０ｐＭ以下などの閾値が４重鎖相互作用分子や４重鎖形成核酸の同定に利用される。
【００６９】
ＤＮＡの４重鎖形成領域に親和性を持つ化合物の探索には、利用可能な多くのアッセイが存在する。これらアッセイのいくつかにおいて、前記の生物学的な活性とは前記の４重鎖核酸が化合物に結合することであり、そして、結合は、シグナルとして測定される。また、別のアッセイにおいて、前記の生物学的な活性とは４重鎖核酸のポリメラーゼ停滞機能であり、そして、該停滞の程度は、シグナルの減少として測定される。あるアッセイにおいて、前記の生物学的な活性とは転写であり、そして、転写のレベルを、シグナルとして定量化することができる。もう１つ別のアッセイにおいて、前記の生物学的な活性とは細胞死であり、そして、細胞死を起こす細胞の数を定量化する。別のアッセイは、ガン細胞の分裂増殖する割合を、モニターする。これらアッセイ例としては、蛍光結合アッセイ、ゲル移動度シフトアッセイ（例えば、 Jin & Pike, MoL Endocrinol. (1996) 10:196-205を参照）、ポリメラーゼ停滞アッセイ、転写レポーターアッセイ、ガン細胞の分裂増殖アッセイ、そして、アポトーシスアッセイ（例えば、 Amersham Biosciences (Piscataway, New Jersey)を参照）、そして、そのようなアッセイの具体例を以下に記述する。さらに、前記の４重鎖結合分子が、トポイソメラーゼ経路にかかわる活性を持っているかどうかを判断するために、トポイソメラーゼアッセイを利用することもできる。（例えば、 TopoGEN, Inc. (Columbus, Ohio)を参照）
【００７０】
ゲル電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
ＥＭＳＡ法は、核酸が４重鎖を形成するかどうか、及び核酸配列が４重鎖を不安定化するかどうかを決定するのに役に立つ。ＥＭＳＡ法は、すでに記載された方法（Jin & Pike、MoI. Endocrinol. 10: 196-205 (1996)）に少し改変を加えて行う。一般的に、合成一本鎖オリゴヌクレオチドは該５’−末端を、[γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（１０００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、アマシャムライフサイエンス） の存在下で、Ｔ４−キナーゼを作用させて標識し、そしてセファデックスカラムを通して精製する。３２Ｐ−標識したオリゴヌクレオチド（約３００００ｃｐｍ）は次に、１０ｍＭのＴｒｉｓｐＨ７．５、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭジチオスレイトール、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭ塩化マグシウム、１０％グリセリン、０．０５％ＮｏｎｅｄｉｔＰ−４０、及び０．１ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ（ｄｌ−ｄＣ）（ファルマシア）を含有するバッファーからなる２０μｌの反応系において、さまざまな濃度のテスト化合物が、共存したり、しなかったりする状況下で保温する。室温で２０分間保温した後、結合反応液を、０．２５ｘトリス−ホウ酸−ＥＤＴＡバッファー（０．２５ｘＴＢＥ、１ｘＴＢＥは、８９ｍＭトリス−ホウ酸、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）のなかで、５％ポリアクリルアミドゲルに負荷する。前記のゲルを乾燥し、各々のバンドをフォスフォイメージャーで定量化する。
【００７１】
ＤＭＳメチル化保護アッセイ
化学的フットプリンティング試験は、４重鎖構造を評価する手段として有用である。４重鎖構造については、核酸中のどのヌクレオチドが化学的修飾から保護されるか又は保護されないかを、各々、化学修飾試薬と反応可能か、又は反応不能かの結果として、決定することで、評価される。ＤＭＳメチル化保護アッセイは、化学的フットプリンティングアッセイの一例である。このようなアッセイにおいては、ＥＭＳＡからのバンドを単離し、ＤＭＳ誘発性の切断処理に供する。解析対象となる各バンドは、電気泳動的移動度シフトアッセイのゲルから切り出され、１００ｍＭのＫＣｌ溶液（３００μｌ）の中に４℃で６時間浸漬される。その浸漬液を濾過（微量遠心分離機を使用）し、そして（一反応系当たり）３０，０００ｃｐｍ分のＤＮＡ溶液を１００ｍＭのＫＣｌを含んだ０．１ｘＴＥでさらに（一反応系当たり）総量７０μｌになるように希釈する。１μｌのサケ精子ＤＡＮ溶液（０．１ｇ／μｌ）の添加後、その反応混合液を１μｌのＤＭＳ溶液（ＤＭＳ：エタノール；４：１；ｖ：ｖ）とともに所定の時間インキュベートする。各反応溶液は、１８μｌの反応停止バッファー［β−メルカプトエタノール：水：３Ｍ酢酸ナトリウム；１：６：７；ｖ：ｖ：ｖ］を添加して反応を停止させる。エタノール沈殿（二回）とピペリジン切断の後に、その反応液を調製用ゲル（１６％）で分離し、そして、フォスフォイメージャーを使って視覚化する。
【００７２】
ポリメラーゼ停滞アッセイ
停滞アッセイは、４重鎖形成配列を含むかもしれない鋳型核酸、及び該４重鎖形成配列の５’側の該鋳型核酸とハイブリダイゼーションするプライマー核酸から構成される。前記プライマーは、ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）によって伸長される、但し、該ポリメラーゼは、プライマーから前記の鋳型核酸に沿って進行する。このアッセイにおいて、４重鎖構造は前記酵素の前記進行を遮断もしくは停滞させることができ、その結果、より短めの転写産物断片が生成されることになる。また、前記停滞アッセイは、４５℃と６０℃を含む種々の温度で、そして、種々のイオン濃度で、行うことができる。
【００７３】
前記Ｔａｑポリメラーゼ停止アッセイの一例は、 Han, et al., Nucl. Acids Res. (1999) 27:537-542に記述されており、これはWeitzmann, et al., J. Biol. Chem. (1996) 271:20958-20964で用いられていたアッセイを改変したものである。短く要約すると、鋳型ＤＮＡ（５０ｎＭ）、トリス塩酸（５０ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）、ＤＴＴ（０．５ｍＭ）、ＥＤＴＡ（０．１ｍＭ）、ＢＳＡ（６０ｎｇ）、及び、５’−末端標識４重鎖核酸（〜１８ｎＭ）からなる反応混合液を、９０℃で５分間加熱した後、３０分かけて室温まで冷却する。Ｔａｑポリメラーゼ（１μｌ）をその反応混合液に添加後、その反応液を３０分間一定の温度に維持する。１０μｌの反応停止バッファー［ホルムアミド（２０ｍｌ）、１ＭのＮａＯＨ（２００μｌ）、０．５ＭのＥＤＴＡ（４００μｌ）、及び、ブロモフェノールブルー（１０ｍｇ）］を添加した後に、該反応液を分離用ゲル（１２％）によって分離し、そして、フォスフォイメージャーを使って視覚化する。アデニンの配列決定（前記ゲルの上端に「Ａ」で示されている）は、ライフテクノロジー社からのdouble-stranded DNA Cycle Sequencing Systemを用いて行う。前記鋳型鎖の一般的配列は、ＴＣＣＡＡＣＴＡＴＧＴＡＴＡＣ−挿入断片−ＴＴＡＧＣＧＡＣＡＣＧＣＡＡＴＴＧＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡであり、ここで「挿入断片」とは、４重鎖形成配列を含む核酸配列を指している（例えば、表２を参照されたい）。前記ゲル上でより遅い移動度を示すバンド（複数）は、４重鎖形成（体）を示す。
【００７４】
高い処理能力を持ったポリメラーゼ停滞アッセイが開発済みである。前記アッセイは、鋳型核酸（多くの場合ＤＮＡ）をプライマー（これも多くの場合ＤＮＡ）と接触させる工程、前記のプライマー／鋳型複合体をここで記述した化合物（「テスト化合物」と呼ばれているもの）と接触させる工程、前記のプライマー／鋳型複合体をポリメラーゼと接触させる工程を含み、そして、反応生成産物を分離する。前記アッセイは、多くの場合、前記のプライマー／鋳型複合体を変性して再生する工程を含み、これは多くの場合、前記システムにテスト化合物を添加する前に行う。多くの場合、さまざまに濃度を変えたテスト化合物を用いて多重アッセイが行われる、例えば、ＩＣ５０値は、このようにして得る事ができる。多くの場合前記の反応生成産物は、異なった長さに伸長したプライマーを含んでいる。テスト化合物が、前記鋳型の４重鎖構造と十分に相互作用しないところでは、多くの場合前記プライマーは、前記鋳型の末端まで伸長する。
【００７５】
テスト化合物が、前記鋳型の４重鎖構造と十分に相互作用しているところでは、多くの場合、前記プライマーは、前記鋳型の４重鎖構造部分までしか伸長せず、それ以上先には伸びない。従って、テスト化合物が前記の鋳型の中で４重鎖構造と相互作用しているときは、多くの場合、前記の反応混合液は、少なくとも２種類の反応生成産物を含んでいる、１つは完全に伸長したプライアマー、そして、もう１つは不完全に伸長したプライアマーである、そして、これら２つの反応生成産物を、分離する。前記の反応生成産物は、マススペクトロメトリーや、一つの具体例を挙げるならば、キャピラリー電気泳動のような便利な方法を用いて分離できる。
【００７６】
前記の反応生成産物は、しばしば前記のプライマーに結合した検出標識によって同定する。前記の検出標識は、前記プライマーの５’末端に非−共有結合的に結合させることも可能である（例えば、ビオチン分子は、該プライマーの５’末端に共有結合的に結合しているが、検出標識と連結しているアビジン分子とは、非共有結合的に結合している）。前記の検出標識は、時には前記プライマーをシステムに添加する前、前記プライマーが伸長した後、前記反応産物を分離した後、といった、前記アッセイのさまざまな段階で、連結させることが可能である。多くの場合、前記の検出標識は、該検出標識の持つ化学基の性質に基づいて選択した手法を用い、前記プライマーに共有結合的に連結される。
【００７７】
検出可能な標識を核酸に共有結合で連結する多くの方法が利用可能である。例えば、アリルアミン−誘導体化ヌクレオチドを、検出標識のスクシニイミジル−エステル誘導体に化学的にカップリング反応させる、該標識ヌクレオチドを用いてプライマーを合成する（Nature Biotech (2000) 18:345-348と、http address info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/n_coupling.htmlを参照）。時には前記検出標識と前記ヌクレオチドの間に、スペーサー（しばしば炭素原子５〜１６個分の長さ）を組み入れることがある。放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３２Ｐ、１４Ｃ又は３Ｈ）、光散乱標識（例えば、金や銀の球状粒子を使った標識、Genicon Sciences社、サンディエゴ、カリフォルニア、及び、米国特許No. 6,214,560）、酵素やタンパク質を使った標識（例、ＧＦＰやペルオキシダーゼ）を含む多くの便利な検出標識も利用できるがこれらに限定されない。また、時々、それらとは別の色素生産性標識や色素も利用される。多くの場合、蛍光標識が利用される（例えば、アミノ−メチルクマリン（ＡＭＣＡ）、ジエチルアミノメチルクマリン（ＤＥＡＣ）、カスケードブルー（ＣＢ）、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、オレゴングリーン（ＯＧ）、アレキサ４８８（Ａ４８８）、ローダミングリーン（ＲＧｒ）、ランタニドキレート（例えば、ユウロピウム）、カルボキシ−ローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テキサスレッド（ＴｘＲ）、Ｃｙ３、Ｃｙ３.５、Ｃｙ５、Ｃｙ５.５及びカルボキシナフトフルオレセイン（ＣＮＦ）、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、並びに、２，４−ジニトロフェニル（ＤＮＰ））。他のフルオロフォアと、それらに付随する励起波長、及び、放射波長については、Anantha, et al、 Biochemistry (1998) 37:2709-2714と、Qu & Chaires、Methods Enzymol (2000) 321:353-369に、記述されている。
【００７８】
１つの実施形態において、共有結合で蛍光標識を連結したプライマーオリゴヌクレオチドが、鋳型DNAと接触する。前記の結果できた複合体は、まず、テスト分子と接触して、次に、前記プライマーを伸長させる能力を持ったポリメラーゼと接触する。前記の反応産物は、次に、キャピラリー電気泳動法で分離され、検出される。反応に使うプライマーが、共有結合で連結したフルオロフォアを含んでいない場合や、反応産物の分離にキャピラリー電気泳動法が利用できない状況で、この実験を行う場合には、普段より長いプライマー配列を用いた。デオキシヌクレオチドを前記の分離操作前のさまざまな段階で添加する、多くの場合は、該プライマーが、前記の鋳型DNAと接触するときに添加する。多くの場合、前記の鋳型DNA／プライマ複合体に対して、テスト化合物を添加する前に、変性（例えば、該反応系の温度を上昇させる）と、再生（例えば、該反応系を冷却する）の操作が行われる。
【００７９】
４重鎖結合アッセイ
一般的には、５’−蛍光−標識した（ＦＡＭ）プライマー（Ｐ４５、１５ｎＭ）を、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び、０．１ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸組成物（ｄＮＴＰ’ｓ）を含んだトリス塩酸バッファー（１５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５）の中で鋳型ＤＮＡ（１５ｎＭ）と混合する。一例を挙げると、前記プライマーＦＡＭ−Ｐ４５（５’−６ＦＡＭ−ＡＧＴＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＴＡＣＧＴＡＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＣＡＡＴＴ−３’）（配列番号１７）及び、前記のｃ−Ｍｙｃ鋳型ＤＮＡ（５’−ＴＣＣＡＡＣＴＡＴＧＴＡＴＡＣＴＧＧＧＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＡＡＧＧＴＴＡＧＣＧＡＣＡＣＧＣＡＡＴＴＧＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＧＣＴＡＣＧＴＡＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＡＣＴ−３’）（配列番号１８）は、アプライドバイオシステムズ社によって合成、ＨＰＬＣ精製されたものである。前記の組成物を、９５℃で５分間変性して、室温まで冷ました後、３７℃にて１５分間保温した。
【００８０】
室温まで冷ました後、１ｍＭ  ＫＣｌ２と、（さまざまな濃度の）前記テスト化合物を添加して、該混合溶液を室温で１５分間保温した。前記のプライマー伸長反応は、１０ｍＭ  ＫＣｌと、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／反応、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を添加して、７０℃で３０分間保温して行った。前記反応は、１μｌの該反応混合液を、１０μｌのＨｉ−Ｄｉホルムアミドと混合して反応を停止させ、そして、そこにＬＩＺ１２０サイズスタンダード０．２５μｌを入れた。Ｈｉ−Ｄｉホルムアミドと、ＬＩＺ１２０サイズスタンダードはアプライドバイオシステムズ社より購入した。４重鎖部分で伸長停滞を起こし、部分的にしか伸長しなかった前記の産物は、６１又は６２塩基対の長さであるのに対して、該産物が完全長まで伸長した場合の長さは、９９塩基対である。前記の反応産物は、キャピラリー電気泳動法によって分離、解析を行った。キャピラリー電気泳動法は、ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzerを用いて行った。前記アッセイは、先に記載した化合物を使って行われたものであり、その結果は、表１に示されている。表１に報告されている濃度μＭは、前記アッセイにおいて、５０％のＤＮＡが伸長の停滞を起こした濃度である（例えば、完全長まで伸長したＤＮＡと、短く部分的にしか伸長しなかった（伸長の停滞を起こしたＤＮＡ）の比率が１：１であるということ）。
【００８１】
転写レポーターアッセイ
転写レポーターアッセイでは、４重鎖構造の形成や安定化が、レポーターシグナルを調節できるように、テスト４重鎖ＤＮＡを、レポーターシステムに繋ぐ。そのような実験系の一例がレポーター発現系であり、その系の中では、ルシフェラーゼや緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）といったポリペプチドが、前記の潜在的４重鎖形成核酸に操縦可能な形で連結した遺伝子から発現され、その結果、該ポリペプチドが検出できるようになる。ここで使われている「操縦可能な形で連結した」という言いまわしは、前記の潜在的４重鎖形成核酸を含む配列によって制御されているヌクレオチド配列について言及したものである。ある配列が操縦可能な形で連結しているというとき、前記の４重鎖ＤＮＡと同一核酸上にある場合と、別の核酸上にある場合がありうる。ここでは、代表的なものとして、ルシフェラーゼレポーター系について記述した。
【００８２】
前記の４重鎖形成の研究には、多くの場合He, et al、Science (1998) 281:1509-1512に記載されているルシフェラーゼアッセイが利用される。とりわけ、前記のアッセイに利用されているベクターについては、前記He, et alの論文の参考文献１１の中で述べられている。このアッセイでは、ＨｅＬａ細胞を、リポフェクタミン２０００（インビトロジェン社）を用いた系で、製造元のプロトコルに従い、０．１μｇのｐＲＬ−ＴＫ（ウミシイタケシフェラーゼプラスミド）と、０．９μｇの前記の４重鎖形成プラスミドでトランスフェクションする。ホタル及び、ウミシイタケのルシフェラーゼ活性は、前記のDual Luciferase Reporter Assay System（プロメガ社）を使い、製造元のプロトコルにしたがって９６穴プレート形式でアッセイする。
【００８３】
円偏光二色性アッセイ
円偏光二色性（ＣＤ）は、４重鎖核酸に別の分子が相互作用しているかどうかを決定するときに利用される。ＣＤは、とりわけＰＮＡやＰＮＡ−ペプチド結合体が、試験管内で４重鎖核酸とハイブリダイズしているかどうかを決定するときに役に立つ。３７℃で、ＰＮＡプローブを、１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．２）と１０又は２５０ｍＭのＫＣｌとを含むバッファーに入った４重鎖ＤＮＡ（各５μＭ）に添加した、そして、スペクトルの記録に先駆けて、５分間、同温度に静置した。ＣＤは、熱電気的に制御された単一セルホルダーを備えた、ＪａｓｃｏのＪ−７１５型旋光分散計で記録する。通常ＣＤの強度は、２２０ｎｍと３２０ｎｍの間で検出するものであり、相互作用の有無を決定するために、４重鎖ＤＮＡ単独、ＰＮＡ単独、及び、ＰＮＡと一緒の４重鎖ＤＮＡについて、比較スペクトルが作成される。（例えば、Datta, et al、JACS (2001) 123:9612-9619を見られたし）スペクトルは、１００ｎｍ／分に記録された８回分のスキャンの平均を表すように取り決める。
【００８４】
蛍光結合アッセイ
蛍光結合アッセイの例を挙げると、それは４重鎖核酸、シグナル分子、及びテスト分子で構成される実験系である。前記シグナル分子は、前記の４重鎖核酸に結合したときに、蛍光シグナルを発生させる（例、Ｎ−メチルメソポルフィリンＩＸ（ＮＭＭ））、そして該シグナルは、テスト物質が該４重鎖核酸に対して結合する該シグナル分子と競合したときに変化する。テスト分子があるときに対して、テスト化合物が存在しないときにおける前記シグナルの変化を比較して、該テスト化合物を４重鎖に相互作用している化合物として同定する。
【００８５】
５０μｌの４重鎖核酸、又は４重鎖形成能力が無い核酸を９６穴プレートに添加する。テスト化合物もさまざまな濃度で添加する。典型的なアッセイは、１００μｌの２０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．０、１４０ｍＭのＮａＣｌ、及び１００ｍＭのＫＣｌ中で行う。そして、前記のシグナル分子ＮＭＭ５０μｌを、最終濃度が３μＭとなるように添加する。ＮＭＭは、Frontier Scientific株式会社、Logan,Utahから購入する。蛍光は、蛍光測定装置ＦｌｕｒｏＳｔａｒ２０００（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）を用いて、励起波長４２０ｎｍ、放射波長６６０ｎｍで測定する。多くの場合、蛍光は前記のテスト化合物、又は４重鎖を標的とした核酸の濃度の作用としてプロットされ、そしてＮＭＭについての最大蛍光シグナルがそれらの分子が存在しない状況下で評価される。
【００８６】
細胞増殖アッセイ
ガン細胞増殖アッセイでは、該細胞の培養液に添加された、テスト化合物の、異なった濃度における機能を、細胞の増殖率で評価する。どんなタイプのガン細胞でも、前記のアッセイに利用することができる。ひとつの具体的実験例では、大腸ガン細胞を試験管内で培養して、そして、テスト化合物を該培養液にさまざまな濃度で添加する。役に立つ大腸ガン細胞にcolo320がある、それは、大腸腺ガン由来の細胞株であり、アメリカ国立衛生研究所に、アクセス番号JCRB0225として寄託されている。そのような細胞に使われるパラメーター類は、http address cellbank.nihs.go.jp/cell/data/jcrb0225.htmから入手可能である。
【００８７】
化合物の製剤化
ここで用いられているように「医薬として許容され得る塩、エステル、及びアミド」という用語は、前記化合物のカルボン酸塩、アミノ酸添加塩、エステル、及びアミド、並びにそれらの双性イオン形体であって、ヒト及び動物に好適に使用されるものとして当業者に公知のものを含むがこれらに限定されない（例えば、Gerge, S.M., et al、"Pharmaceutical Salts," J. Pharm. Sd. (1977) 66:1-19を参照されたし、なおこれは、参照により本書に組み込まれる）。
【００８８】
本書に記述された前記の化合物については、任意の好適な製剤化を準備することができる。化合物が、安定な無毒の酸性又は塩基性の塩を形成するのに十分に酸性又は塩基性である場合、おそらく、前記の化合物は塩として投与されるのが適当であろう。医薬品として許容し得る塩の例としては、生理学的に許容し得る陰イオンを形成する酸類と共に形成される有機酸付加塩、例えば、トシル酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩、及び、α−グリセロリン酸塩がある。好適な無機塩は、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、炭酸水素塩、及び、炭酸塩を含んで形成され得る。医薬品として許容し得る塩は、当技術においてよく知られた標準手法を用いて得られる。例えば、医薬品として許容し得る塩は、アミンのように十分に塩基性の化合物を、生理学的に許容し得る陰イオンを供給する好適な酸と共に反応させることで得てもよい。カルボン酸のアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム又はリチウム）又は、アルカリ土類金属（例えば、カルシウム）との塩も作成される。
【００８９】
化合物は、医薬品の組成物として製剤され、そして、そのような治療を必要とする哺乳類宿主に投与されてもよい。１つの実施形態として、前記の哺乳類宿主とはヒトである。任意の好適な投与経路を用いることが可能であり、これには経口的、非経口的、静脈内、筋肉内、局所的、及び皮下への投与を含むがこれらに限定されない。
【００９０】
１つの実施形態において、化合物は、不活性な希釈液、又は吸収性の可食担体のような医薬品として許容し得る媒体と組み合わせて、全身的に（例えば、経口で）投与される。それらは、硬い又はやわらかいゼラチンカプセルの殻に封入したり、錠剤に押し固めたり、患者の食事に直接入れ込まれたりすることも可能である。治療を目的とした、経口投与においては、前記の活性を持った化合物は、１以上の賦形剤と組み合わされ、経口摂取できる錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、及び、ウェハース等の形態で使用される。そのような組成物及び製剤には、少なくとも０．１％の活性化合物を含有させるべきである。前記の組成物と製剤の百分率は可変であり、通常、与えられた単位剤形の重量の、約２から約６０％の範囲内である。そのような治療上有用な組成物における前記活性化合物の量は、効果的な投与レベルが得られるであろう量である。
【００９１】
錠剤類、トローチ類、丸薬類、及び、カプセル類等はまた、トラガカントガム、アカシア、コーンスターチ又はゼラチンのような結合剤；リン酸二カルシウムのような賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、及び、アルギン酸等のような分解剤；ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤；並びに、ショ糖、果糖、乳糖、又は、アスパルテームのような甘味剤を含んでもよく、或いは、ペパーミント、ウインターグリーン（wintergreen）油、又はサクランボ風味のような風味剤が添加されてもよい。前記単位剤形がカプセルの場合、上に列挙した物質に加えて、植物油、又は、ポリエチレングリコールといった、液体性の担体を含ませてもよい。コーティング、又はそれ以外に固体の単位剤形の物理的形体を修正するために、他のさまざまな別の物質が存在していてかまわない。例えば、錠剤類、丸薬類、又は、カプセル類は、ゼラチン、ワックス、セラック、又は糖類等によって被覆されてもよい。シロップ、又はエリキシル剤には、前記の活性物質と共に、ショ糖、又は果糖を甘味剤として、メチル、及びプロピルパラベンを保存剤として、色素や、サクランボ、又はオレンジといった風味も含有させることができる。医薬として許容されるものであり、そして、用いられる量において実質的に無毒であれば任意の単位剤形を作成するにあたり任意の物質が使われている。さらに、前記の活性化合物を徐放剤や、そういった装置に組み入れてもかまわない。
【００９２】
前記の活性化合物はまた、点滴又は注射によって静脈内又は腹腔内に投与することも可能である。活性化合物又はその塩の溶液は、緩衝溶液中で調製され、多くの場合それはリン酸緩衝生理食塩水であり、任意的に毒性の無い界面活性剤と混合される。また分散液は、グリセリン、液体ポリエチレングリコール類、トリアセチン、そして、それらの混合液及び、油類の中で、調製することができる。通常の条件下における保存、及び、使用のために、これらの製剤類は、微生物の生育を妨げるための保存剤を含んでいる。前記の化合物は、（例えば、リポソーム、又は、マイクロソーム）といった投与方法のために、時々、ポリマトリクス含有製剤として調製されてもよい。リポソームの例については、米国特許No. 5,703,055 (Feigner, et al.) 及び、 Gregoriadis、Liposome Technology vols. I〜III巻 (第２版、1993)に記載されている。
【００９３】
注射又は、点滴のために好適な医薬剤形は、滅菌された水溶液若しくは分散液、又は滅菌された注射可能な若しくは点滴可能な溶液を即座に調製するために適合した活性成分を含む滅菌粉末、又は任意的にリポソームに被包された分散物を含むことができる。すべての場合において、究極の剤形は、製造時及び保存の条件において液状で安定していて、滅菌されているべきである。液体の担体又は媒体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、植物油、無毒なグリセリルエステル類、及びそれらの好適な組成物を含む溶媒又は、液性分散媒体でありうる。適切な流動性は、例えば、リポソームを形成させたり、分散させる際に、粒子のサイズを保持したり、又は界面活性剤を使うことによって維持することができる。微生物類の活動は、さまざまな抗菌薬及び抗真菌薬、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、及びチメロサール等によって押さえ込むことができる。多くの場合、糖質類、バッファー類、又は食塩といった等張性試薬を含んでいることが好ましい。注射可能な組成物の延長された吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンのような吸収を遅延させる試薬を組成物中で使用することにより可能になる。
【００９４】
滅菌注射液は、前記の活性化合物の必要とされる量を、上で列挙したさまざまな他の材料と一緒に、適切な溶媒の中で混合し、続いてフィルター滅菌することにより調製する。滅菌注射液を調製するための滅菌粉末を調製する場合に好んで用いられる方法は、真空乾燥法、及び、凍結乾燥法である。これらの方法によって、事前に滅菌濾過された溶液中に存在する活性成分と任意の望ましい成分を足し合わした粉末が産生される。
【００９５】
局所投与のために、本発明の化合物は液状の形態で適用されうる。化合物は、固体又は液体といった皮膚科学的に許容し得る担体と組み合わせて、組成物又は製剤としてしばしば投与される。化合物を皮膚に運ぶために使われる皮膚科学的に有用な組成物の例が知られている（例えば、Jacquet, et al. (米国特許No. 4,608,392)、Geria (米国特許No. 4,992,478)、Smith, et al. (米国特許No. 4,559,157)、及び、Wortzman (米国特許No. 4,820,508)を見られたし）。
【００９６】
化合物は、滑石、粘土、微晶質のセルロース、シリカ、アルミナ等の微細に砕かれた固形成分を含有する固体状担体を用いて、製剤化されてもよい。有用な液状の担体は、水、アルコール類又はグリコール類、水−アルコール／グリコール組成物を含み、任意的に無毒な界面活性剤の力を借りて、本発明の化合物を効果的なレベルで、それらの中に溶解又は分散させることができる。所定の用途への特性を最適化するために、香りや追加の抗菌剤といった補助剤を添加することもできる。前記のようにして得られた液性組成物は、薬剤を含浸させた絆創膏、及び他の包帯剤に使われている吸収性パッドを使っても投与でき、また、ポンプ形式、若しくはエアロゾル式のスプレーを用いて病巣部位に噴霧することもできる。使用者の皮膚に直接適用するために、塗布することが可能なペースト、ゲル、軟膏、及び、石鹸類等を作る際には、液性担体と共に、合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩、脂肪酸エステル、脂肪アルコール、修飾セルロース、又は、修飾を加えた鉱物由来物質といった濃化剤を利用することができる。
【００９７】
一般的に、液性組成物中における化合物の濃度は、しばしば約０．１重量％から約２５重量％の範囲にあり、時々、約０．５重量％から約１０重量％である。ゲル、又は粉末といった、半固体、又は固体の組成物における濃度は、約０．１重量％から約５重量％の範囲にあり、時々、約０．５重量％から約２．５重量％である。化合物の組成物は、製薬工業界で知られる伝統的な技法を用いて、投薬単位剤形に製剤される。通例として、そのような製薬技術とは、対象になった化合物を、液状形体、又は、微細に粉砕された固形物の形体、又は、その両方として、医薬品の担体（類）、及び／又は、賦形剤（類）に結合させること、そして、もし要求があれば該産物を成型するところまでを含んでいる。
【００９８】
表３は、本書に記述された化合物の調剤方法の例を示したものである。例えば、本書にある調剤方法を用いることで、１０ｍｇ／ｍＬから２０ｍｇ／ｍＬの薬用量を持つ溶液を製剤できる。表３で“Ｄ５Ｗ”と名付けたものは、５％のブドウ糖が入った脱イオン水である。それぞれの製剤における、それぞれの成分は、前記化合物の活性に影響を与えることなく変更することができる。一つの例として、前記の化合物は、ポリエチレングリコールとプロピレングリコールを含むリン酸バッファーのような緩衝液中で、製剤したものである。
表３
2008513485.tif 000089
【００９９】
前記化合物の組成物は、錠剤類、カプセル類、ゲルカプセル類、液状シロップ類、軟性ゲル類、座薬類、及び、浣腸液といった、任意の剤形に調剤することが可能である。また、前記組成物は、水性、又は、非-水性、又は、混合培地に分散させた状態に調剤することが可能である。水性懸濁液には、粘性を高める目的で、さらに、例えば、ナトリウム カルボキシメチルセルロース、ソルビトール、及び／又は、デキストランを含有していることがある。また、前記の懸濁液には、一つ、又は、それ以上の安定化剤が、含有されている場合がある。前記化合物、その活性塩、又は、誘導体について、治療において必要とされる薬量は、選択した特定の塩の種類だけでなく、投与経路、治療が行われた自然環境、年齢、患者の体調、そして、究極的には、かかり付けの医者や臨床家の慎重さによってもによってもはばらつく。
【０１００】
投与量
多くの場合、化合物の有効な投与量は、培養細胞又は培養組織を用いた系におけるインビトロでの活性、及び／又は動物の系を用いたインビボの活性を評価して決定する。例えば、当技術において、マウスや、他の動物で得られた効果的な投与量を、ヒトに外挿する方法が広く知られている。（例えば、米国特許No. 4,938,949参照）そのような実験系は、化合物のＬＤ５０（実験群の５０％を死に至らしめる薬量）及びＥＤ５０（実験群の５０％に効果が現れる薬量）の決定にも使うことができる。毒性と、治療効果との間の投与量の比率は、治療における指標であり、ＥＤ５０／ＬＤ５０という比であらわすことができる。多くの場合、前記の化合物の投与量は、ＥＤ５０がほとんど又はまったく毒性を示さない循環濃度の範囲内に存在している。前記の投与量は、この範囲内で、利用される剤形、又は利用される投与経路に依存して変化させることができる。本書に記述された方法において使用される任意の化合物のために、治療上の効果をもたらす投薬量は、まず始めに、培養細胞アッセイを行うことで推定することができる。１つの投与量は、インビトロアッセイで決定されるようなＩＣ５０（例えば、テスト化合物が、病気の症状を最高の半分にまで阻害することを到達した時の濃度）をカバーする循環血漿濃度に達するようにして調剤され、多くの場合、このような情報は、ヒトにおける有用な投与量をさらに厳密に決定するために用いられる。高速液体クロマトグラフィーを用いて、血漿中のレベルを測定することができる。
【０１０１】
対象についての効果的な投与量決定のもう一つの例は、該被験対象の血清中の「遊離」及び「結合」化合物の濃度を直接的に測定することである。そのようなアッセイでは、抗体ミミック、及び／又は分子刷り込み技法により作られた「バイオセンサー」を利用するかもしれない。前記化合物は、触媒作用を持つ試薬で、それら（単量体）が重合される前に、重合可能な単量体を空間的に組織化するための鋳型、又は、「刷り込み分子」として使用される。それに続く前記刷り込み分子の除去により、該化合物の反復された「陰画像」を含む重合体マトリクスが残り、生物学的なアッセイ条件下において、該分子を選択的に再結合させることができる（例えば、Ansell, et al, Current Opinion in Biotechnology (1996) 7:89-94 及び、Shea, Trends in Polymer Science (1994) 2:166-173を見られたし）。
【０１０２】
そのような「刷り込まれた」親和性マトリックスは、リガンド結合アッセイに鋭敏に反応し、それによって、前記の固定化されたモノクローナル抗体の構成成分は、適切に刷り込みマトリックスにより置換される。（例えば、Vlatakis, et al、Nature (1993) 361:645-647をみられたし）アイソトープ標識を使用することで、「遊離」している化合物の濃度が即座にモニター可能となり、そして、ＩＣ５０の算出に使用される。そのような「刷り込まれた」親和性マトリックスは、その光−放出特性が、化合物の局所的そして、選択的な結合によって測定可能な変化を起す蛍光基を含むように、デザインすることも出来る。これらの変化は、適切な光ファイバー装置を用いることで、リアル・タイムで即座にアッセイすることができる。これによって、被験対象に置ける投与量を、個々の化合物のＩＣ５０に基づいてすばやく最適化できる。そのような“バイオセンサー”の例は、Kriz, et al、Analytical Chemistry (1995) 67:2142-2144において、議論されている。
【０１０３】
代表的な投与量においては、対象、又はサンプルの重量１ｋｇに対して、ｍｇ単位、又はμｇ単位の前記化合物を含む。例えば、約１μｇ／Ｋｇ〜約５００ｍｇ／Ｋｇ、約１μｇ／Ｋｇ、約１００μｇ／Ｋｇ〜約５ｍｇ／Ｋｇ、又は約１μｇ／Ｋｇ〜約５０μｇ／Ｋｇである。発現の程度、又は調節されている活性に関して、小分子の適切な投与量は該小分子自身のもつ効力に依存していることが理解されている。本書に記載したポリペプチド、又は核酸といったものの発現、又は活性を制御する目的で、一つ又はそれ以上の数のこれら小分子を動物（例えば、ヒトに）投与した場合、医師、獣医、又は研究者は、例えば、最初は相対的に低い用量を処方するかもしれないが、その後で、適切な反応が得られるまで投与量を上げて行く。それに加えて、どんな任意の実験動物であっても、特定の投与量のレベルは、利用した特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、健康状態、性別、及び食餌状態、投与した時間、投与経路、排泄の割合、任意の薬剤の組み合わせ、並びに発現の程度、又は調節されている活性を含むさまざまな要因に依存しているということが理解されている。
【実施例】
【０１０４】
以下に示す例は、例証のために提示されるものであり、前記発明の範囲を制限するものではない。
【０１０５】
実施例１
2008513485.tif 000090
0 ℃で、塩化マグネシウム（6.74 g、70.8 mmol）、及び、マロン酸エチルカリウム（potassium ethyl malonate）（6.78 g、39.8 mmol）を溶かしこんだ、乾燥アセトニトリル（100 mL）溶液に、塩化２，４−ジクロロ−５−フルオロベンゾイルを、該溶液の内部温度を5 ℃以下に保ちながら、一滴ずつ添加した。前記の混合液を、さらに30分間攪拌して、そして、トリエチルアミン（6.1 mL、44.25 mmol）を一滴ずつ添加した、再び該温度を5 ℃以下に保ったまま、そして、該反応混合溶液を、一晩攪拌した。前記の混合液を、真空下で濃縮し、トルエン（250 mL）で希釈した、そして、1N 塩酸（100 mL）を添加し、そして、該混合液を30分間攪拌した、前記の層を分離して、そして、該有機層をもう一度1N 塩酸（100 mL）、そして、次に、ブラインで（200 mL）で洗浄し、そして、硫酸ナトリウムで完全に乾燥させた。前記の有機層を、濾過して、そして、真空下で濃縮し、そして、シリカゲル（１：１０  酢酸エチル／ヘキサン）で精製した、該ケトエステルは、静置しておくと凝固する油（5.02 g、81%）として得られた。
【０１０６】
2008513485.tif 000091
前記（上記構造式の）ケトエステル（5.0 g、18 mmol）のジグリム（50 mL）溶液に、水素化ナトリウム（1.52 g、39.6 mmol、60% in oil）を添加した２−クロロベンゾチアゾールを、10分間にわたって少しずつ添加した。前記の反応液を、160℃で24時間加熱し、そして、室温まで冷却した。前記の混合溶液は、注意深く、水（250 mL）を添加することによって、＜反応を＞停止させた、そして、その結果できた茶色の沈殿を、濾過で除去し、そして、水で洗浄した。前記の産物を、塩化メチレン（300 mL）に溶解し、ブラインで洗浄し、そして、セライトを通過させて、濾過した。前記の結果できた有機層を、硫酸ナトリウムで完全に乾燥し、濾過して、そして、真空下で濃縮した。前記の産物は、シリカゲル（ヘキサン中、7%酢酸エチル）で精製され、該産物の結晶化物（1.76g、26%）を固体として得た。
【０１０７】
実施例２
2008513485.tif 000092
前記（上記構造式の）クロロエステル（250 mg、0.66 mmol）のＮ−メチルピロリジノン（NMP、2 mL）溶液に、２−ピラジンエタンチオール（81 μL、0.66 mmol）、及び、炭酸カリウム（182 mg、1.32 mmol）を添加して、そして、該混合溶液を100℃で2時間、加熱した。前記の混合液を室温まで冷却して、水（50 mL）を添加して、そして、一晩攪拌し続けた。前記の粗製物質は、濾過によって回収され、そして、分離用TLC（塩化メチレン中、２％メタノール）で精製された、該純粋産物は、黄褐色のけば立った固体（122 mg、38%）として得られた。
【０１０８】
実施例３
2008513485.tif 000093
前記（上記構造式の）ケトエステル（2.0 g、7.2 mmol）のジグリム（20 mL）溶液に、水素化ナトリウム（0.63 g、15.8 mmol、60% in oil）を添加した２，６−ジクロロベンゾチアゾールを、10分間にわたって少しずつ添加した。前記の反応液を、160℃で24時間加熱し、そして、室温まで冷却した。前記の混合溶液は、注意深く、水（200 mL）を添加することによって、＜反応を＞停止させた、そして、その結果できた茶色の沈殿を、濾過で除去し、そして、水で洗浄した。前記の産物を、塩化メチレン（30 mL）に溶解し、ブラインで洗浄し、そして、セライトを通過させて、濾過した。前記の結果できた有機層を、硫酸ナトリウムで完全に乾燥し、濾過して、そして、真空下で濃縮した。前記の産物は、シリカゲル（ヘキサン中、5%酢酸エチル）で精製され、該産物の結晶化物（0.55 g、18.8%）を固体として得た。
【０１０９】
実施例４
2008513485.tif 000094
前記（上記構造式の）クロロエステル（250 mg、0.61 mmol）のＮ−メチルピロリジノン（NMP、2 mL）溶液に、２−ピラジンエタンチオール（75 μL、0.61 mmol）、及び、炭酸カリウム（170 mg、1.2 mmol）を添加して、そして、該混合溶液を100℃で2時間、加熱した。前記の混合液を室温まで冷却して、水（50 mL）を添加して、そして、一晩攪拌し続けた。前記の粗製物質は、濾過によって回収され、そして、分離用TLC（塩化メチレン中、２％メタノール）で精製された、該純粋産物は、黄褐色のけばだった固体（125 mg、40%）として得られた。
【０１１０】
実施例５
2008513485.tif 000095
前記（上記構造式の）ケトエステル（2.0 g、7.2 mmol）のジグリム（20 mL）溶液に、水素化ナトリウム（0.63 g、15.8 mmol、60% in oil）を添加した２−クロロ−６−メトキシベンゾチアゾール（1.73 g、8.63 mmol）を、10分間にわたって少しずつ添加した。前記の反応液を、160℃で24時間加熱し、そして、室温まで冷却した。前記の混合溶液は、注意深く、水（200 mL）を添加することによって、＜反応を＞停止させた、そして、その結果できた茶色の沈殿を、濾過で除去し、そして、水で洗浄した。
前記の産物を、塩化メチレン（30 mL）に溶解し、ブラインで洗浄し、そして、セライトを通過させて、濾過した。前記の結果できた有機層を、硫酸ナトリウムで完全に乾燥し、濾過して、そして、真空下で濃縮した。前記の産物は、シリカゲル（ヘキサン中、5%酢酸エチル）で精製され、該産物の結晶化物（0.23g、7.6%）を固体として得た。
【０１１１】
実施例６
2008513485.tif 000096
前記（上記構造式の）クロロエステル（220 mg、0.54 mmol）のＮ−メチルピロリジノン（NMP、2 mL）溶液に、２−ピラジンエタンチオール（66 μL、0.54 mmol）、及び、炭酸カリウム（150 mg、1.1 mmol）を添加して、そして、該混合溶液を100℃で2時間、加熱した。前記の混合液を室温まで冷却して、水（50 mL）を添加して、そして、一晩攪拌し続けた。前記の粗製物質は、濾過によって回収され、そして、分離用TLC（塩化メチレン中、２％メタノール）で精製された、該純粋産物は、黄褐色のけば立った固体（75 mg、28%）として得られた。
【０１１２】
実施例７
2008513485.tif 000097
前記（上記構造式の）クロロエステル（0.25 g、0.67 mmol）の氷酢酸（5 ml）懸濁液を、ギ酸アンモニウム（0.6 g、4.0 mmol）、そして、該混合液をアルゴン中で、2分間脱気した。次に、パラジウム付き活性炭（10% degussa型、0.6 g）を添加して、そして、該混合液を、60℃で1時間加熱した。追加のギ酸アンモニウム（0.1 g）、及び、触媒（0.1 g）を添加して、そして、加熱を一晩続けた。最後に、追加のギ酸アンモニウム、及び、触媒（各150 mgずつ）を添加して、そして、加熱を1.5時間続けた。前記の混合液を室温まで冷却して、セライトを通して濾過し、そして、前記の溶媒は、真空下で除去され、塩化メチレン（100 mL）に置換された。前記の有機物類は、まずは水（100 mL）、そして、ブライン（100 mL）で洗浄され、そして、硫酸ナトリウムで完全に乾燥させた。前記の溶媒は、真空下で除去され、前記ベンゾチアゾールを、黄褐色の固体（153 mg、67%）として得た。
【０１１３】
実施例８
2008513485.tif 000098
フルオロエステル（50 mg、0.15 mmol）のＮ−メチルピロリジノン（NMP、0.5 ml）溶液を、２−ピラジンエタンチオール（126 μL、1.0 mmol）に溶解した、及び、炭酸カリウム（40 mg、0.3 mmol）、そして、該混合溶液を、100℃で2時間加熱した。前記の混合液を室温まで冷却して、水（50 mL）を添加して、そして、一晩攪拌し続けた。前記の粗製物質は、濾過によって回収され、そして、分離用TLC（塩化メチレン中、２％メタノール）で精製された、該純粋産物は、黄褐色のけば立った固体（17 mg、25%）として得られた。
【０１１４】
実施例９
2008513485.tif 000099
化合物1（1.0 eq, 399 mg, 1.06 mmol）及び、１−イソプロピルピペラジン2（5.0 eq., 0.76 ml, 5.31 mmol）を、Ｎ−メチルピロリジノン（NMP、 5 ml）に溶解した。その結果できた混合溶液を、120℃で3日間攪拌した。LCモニタリングによって、２つの主要な産物である3及び、4が、等量できていることが明らかになった。前記の溶液を水の中に注ぎいれて、そして、その結果生じた沈殿を、濾過によって単離した。前記の2つの化合物を、ＳｉＯ２（塩化メチレン中、０．５〜７％メタノール濃度勾配）のフラッシュクロマトグラフィーにより分離し、3（135 mg, 27%収率）及び、4（135 mg, 26%＜収率＞）を得た。
【０１１５】
３：Ｒｆ＝０．４０（ＳｉＯ２、塩化メチレン中、５％メタノール）、ＬＣＭＳ（ＥＳ）：９５％純度、ｍ／ｚ  ４６８［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１１６】
４：Ｒｆ＝０．２６（ＳｉＯ２、塩化メチレン中、５％メタノール）、ＬＣＭＳ（ＥＳ）：９５％純度、ｍ／ｚ  ４８４［Ｍ］＋、４８６［Ｍ＋２］＋。
【０１１７】
実施例１０
この例は、2つの特定の化合物に関する活性のデータを供給します：
2008513485.tif 000100
４重鎖結合親和性Km 5.5 μM
腫瘍細胞平均生存時間（IC50）（アラマーブルー染色）
HeLa 2.8 μM
PC3 2.7 μM
HCT-116 1.1 μM
2008513485.tif 000101
４重鎖結合親和性Km 4.5 μM
腫瘍細胞平均生存時間（IC50）（アラマーブルー染色）
HeLa 2 .7 μM
PC3 0 .52 μM
HCT-116 0 .57 μM
【０１１８】
実施例１１
2008513485.tif 000102
窒素の入り口を装備した三つ首フラスコの中で、マロン酸エチルカリウム（1.5 eq、32.8 g、0.192 mol）及び、塩化マグネシウム（1.5 eq、18.4 g、0.193 mol）を、機械的攪拌の下、アセトニトリル（120 ml）に懸濁した。前記の懸濁液を、氷水浴槽を用いて冷却した。塩化２，４，５−トリフルオロベンゾイル（1.0 eq、25 g、0.128 mol）のアセトニトリル（60 ml）溶液を、一滴ずつ添加した。トリエチルアミン（2.0 eq, 36 ml, 0.258 mol）のアセトニトリル（50 ml）溶液を、添加して、氷−食塩の組成物を用いて外側から冷却することによって、前記混合溶液の内部温度が10℃以下になるようにして、30分間維持した。前記の操作の結果生じた、非常に厚いスラリーを、室温まで暖めた。前記のスラリーが、順当に攪拌できるように、追加のアセトニトリル（150 ml）を添加した。前記の反応液を、2日間攪拌し、そして、前記の揮発性物質類を真空下で除去した。10% 塩酸水溶液、及び、酢酸エチルを添加して、そして、該混合溶液を3時間攪拌した。前記の物質を、酢酸エチルで（3回）抽出した。前記の混合性抽出物類は、ブラインで洗浄して、そして、硫酸ナトリウムで完全に乾燥させた。前記の溶媒を、真空下で蒸発させた後、前記の物質を、10％水／エタノール混合液の中で再結晶化させ、化合物1を白い結晶性の物質（17.8 g, 56%収率）として得た。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：９５％純度、ｍ／ｚ  ２６９［Ｍ＋２３］＋。2つの互換性異性体の組成物。
【０１１９】
2008513485.tif 000103
化合物1（1.0 eq、3.27 g、13.29 mmol）を無水ＤＭＦに溶解した。前記の溶液を、氷で冷却し、K2CO3（3.0 eq、5.51 g、39.87 mmol）を添加した、そして、該溶液を、15分間攪拌した。前記の結果生じた白いスラリーに、すばやく二硫化炭素（1.5 eq、1.20 ml、19.86 mmol）を添加し、そして、該混合溶液を、0℃で5分間攪拌した。ヨウ化メチル（3.0 eq、2.5 ml、40.2 mmol）を、注射筒を通じて一滴ずつ添加し、そして、該反応液を、0℃で2時間攪拌した。氷冷した水を添加した後、前記の化合物を酢酸エチルで（3回）抽出した。前記の混合性抽出物類は、水で（1回）、そして、ブラインで（2回）洗浄して、硫酸ナトリウムで完全に乾燥させ、そして、前記の揮発性物質類は、真空下で除去した。ヘキサンと少量の酢酸エチル加えていると、前記の化合物は、結晶化を始めました。前記の粗製物質は、濾過によって単離され、そして、ヘキサンの中で再結晶化させ、白い結晶性の固体（3.27 g、70%収率）を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：９５％純度、ｍ／ｚ  ３７３［Ｍ＋２３］＋、３５１［Ｍ＋１］＋。
【０１２０】
2008513485.tif 000104
プロパン酸エチル３−オキソ−３−（２，３，４，５−テトラフルオロフェニル）（Ethyl3-oxo-3-(2,3,4,5-tetrafluorophenyl)propanoate）（1.0 eq、5.77 g、21.84 mmol）をＤＭＳＯ（55 ml）及び、水（12 ml）の混合液に溶解した。KOH（2.3 eq、2.82 g、50.26 mmol）を水（25 ml）に入れた水溶液を、氷浴を用いて、前記混合液の内部温度を15℃以下に保持しつつ、一滴ずつ添加した。15分間の攪拌の後、二硫化炭素（3.2 eq、4.2 ml、69.50 mmol）及び、ヨードメタン（3.8 eq、5.2 ml、83.35 mmol）の組成物を、すばやく添加して、そして、結果として出来た該混合液を、室温で一晩、攪拌した。水を添加し、前記の物質を、酢酸エチルで（2回）抽出した。前記の混合性抽出物類は、水で洗浄して、硫酸ナトリウムで完全に乾燥させ、そして、前記の溶媒は、真空下で除去した。前記の物質を、シリカゲル（ヘキサン中、５〜１５％酢酸エチル濃度勾配）のフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、黄色の油（1.69 g、21％収率）を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：９５％純度、ｍ／ｚ  ３２３［Ｍ＋１−ＥｔＯ］＋、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）δ１．１５（ｔ、Ｊ＝７．０，３Ｈ）、２．４０（ｂｒ  ｓ、６Ｈ）、４．１８（ｑ、Ｊ−７．２、２Ｈ）、７．５４−７．６０（ｍ、１Ｈ）ｐｐｍ。
【０１２１】
2008513485.tif 000105
化合物2（1.0 eq、993 mg、2.84 mmol）と、２−アミノチオフェノール（5.0 eq、1.52 ml、14.2 mmol）及び、ＮＥｔ３（4.0 eq、1.59 ml、11.0 mmol）を、無水トルエン（10 ml）の中で混合した。前記の混合液を、還流下で数時間攪拌した。真空下で、前記の溶媒を除去した後、前記物質を酢酸エチル／ヘキサン中の超音波処理で精製して、固体（724 mg、53%収率）を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：９５％純度、ｍ／ｚ  ４８５［Ｍ＋１］＋。
【０１２２】
2008513485.tif 000106
化合物4（1.0 eq、70 mg、0.144 mmol）を、ＤＢＵ（4.0 eq、65 μl、0.43 mmol）と共に、トルエン（1.5 ml）の中で混合した。前記の溶液を、還流の下、45分間攪拌した。前記の化合物を、シリカゲル（塩化メチレン中、１％メタノール）のフラッシュクロマトグラフィーで、精製した。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：９５％純度、ｍ／ｚ  ４６５［Ｍ＋１］＋。
【０１２３】
実施例１２
2008513485.tif 000107
化合物3（1.0 eq、347 mg、0.942 mmol）及び、２−アミノチオフェノール（1.0 eq、0.10 ml、0.934 mmol）を、トルエン（1 ml）の中で混合し、そして、130℃で14時間攪拌した。冷却後、一部の固体不純物類は、濾過で除去した。前記のトルエン溶液を、シリカゲルカラムに注ぎ入れた。トルエンは、ヘキサンで溶出することにより、最初に除去された。前記のカラムを、期待される前記化合物を供給するため、ヘキサン中、１０〜３０％酢酸エチル濃度勾配をかけた条件で溶出した。前記の揮発性物質類を蒸発させた後、前記の固体は、酢酸エチル／ヘキサンを用いた再結晶操作によってさらに精製を行った。化合物6を、灰色の固体（62 mg、18%収率）として単離した。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：９０％純度、ｍ／ｚ  ３７８［Ｍ＋１］＋。
【０１２４】
実施例１３
2008513485.tif 000108
化合物2（1.0 eq、3.15 g、8.99 mmol）及び、２−アミノチオフェノール（1.1 eq、1.06 ml、9.91 mmol）を、トルエン（150 ml）の中で混合した。窒素ガスを、泡立たせながら、前記の溶液に、10分間通じた。前述の反応液を、還流（油浴槽Ｔ＝140℃）において、30時間攪拌した。前記の揮発性物質類を、真空中で除去し、そして、塩化メチレンを添加した。固体の不純物は、濾過で除去した。前記の物質を、シリカゲル（ヘキサン中、１０〜５０％酢酸エチル濃度勾配）のフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物7がオフホワイト色の粉末（５７６ｍｇ、１８％収率）として得られた。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：９０％純度、ｍ／ｚ  ３６０［Ｍ＋１］＋。
【０１２５】
実施例１４
2008513485.tif 000109
化合物2（1.0 eq、2.52 g、7.20 mmol）を、トルエン（10ml）の中で、Ｎ−メチルベンゼン−１，２−ジアミン（1.2 eq、0.98 ml）及び、ＤＩＥＡ（1.2 eq、1.5 ml）と混合し、そして、該反応液を120℃で一日攪拌した。化合物8を、前記の反応液を冷ました後で、濾過し、単離した（679 mg、26%収率）。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：９５％純度、ｍ／ｚ  ３５８［Ｍ＋１］＋。
【０１２６】
実施例１５
2008513485.tif 000110
化合物７（1.0 eq、392 mg、1.09 mmol）及び、ラセミのｔｅｒｔ−ブチル３−（ピラジン−２−イル）ピロリジン−ｌ−カルボキシラート（1.6 eq、436 mg、1.74 mmol）を1 mlのNMP中に、懸濁した。前記の混合液を、マイクロ波により150℃で20分間、加熱した。水を添加し、そして、その結果生じた固体を濾過して単離した。フラッシュクロマトグラフィーによる精製により、固体として化合物9（265 mg、収率50%）が得られた。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：９５％純度、ｍ／ｚ  ４８９［Ｍ＋ｌ］＋。
【０１２７】
実施例１６
2008513485.tif 000111
化合物6（1.0 eq、66 mg、0.175 mmol）及び、ラセミのｔｅｒｔ−ブチル３−（ピラジン−２−イル）ピロリジン−ｌ−カルボキシレート（3.8 eq, 165 mg, 0.661 mmol）を0.5 mlのNMP中で、混合した。前記の混合液を、200℃で23時間、攪拌した。水を添加し、形成された前記の固体を、濾過によって除去した。シリカゲル（塩化メチレン中、１〜４％メタノール濃度勾配）で行ったフラッシュクロマトグラフィーによる精製により、化合物10が、茶色い固体（７０ｍｇ、７９％収率）として得られた。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：９０％純度、ｍ／ｚ  ５０７［Ｍ＋ｌ］＋。
【０１２８】
実施例１７
2008513485.tif 000112
化合物11は、化合物10に用いた手法に従って、調整した。前記の化合物は、シリカゲル（塩化メチレン中、1〜10％メタノール濃度勾配）で行ったフラッシュクロマトグラフィーによる精製により、固体（220ｍｇ、47％）として得られた。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：９５％純度、ｍ／ｚ  ４８６［Ｍ＋ｌ］＋。
【０１２９】
実施例１８
2008513485.tif 000113
化合物8（1.0 eq、202 mg、0.56 mmol）を、NMPの中で２−（ピラジン−２−イル）エタンチオール（1.05 eq, 76 μl）及び、K2CO3（1.2 eq、94 mg）と混合した。前記の混合液を、3時間、80℃で攪拌した。水を添加し、前記の固体を、濾過し、そして、化合物12を得るために乾燥した（２０２ｍｇ、８５％収率）。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：９５％純度、ｍ／ｚ  ４７７［Ｍ＋ｌ］＋。
【０１３０】
実施例１９
2008513485.tif 000114
化合物8 （313 mg）を、NMPの中で、Ｎ−イソプロピルピペラジン（1.5 eq、188 μl）と混合して、そして、該混合液を、90℃で数時間攪拌した。水を添加後、前記の化合物は、濾過で単離した。シリカゲル（メタノール／塩化メチレン）で行ったフラッシュクロマトグラフィーによる精製により、純粋な化合物13（222ｍｇ、54％収率）が得られた。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：９５％純度、ｍ／ｚ  ４６５［Ｍ＋ｌ］＋。
【０１３１】
実施例２０
2008513485.tif 000115
化合物9（1.0 eq、181 mg、0.370 mmol）及び、ラセミ体の２（ｌ−メチルピロリジン−２−イル）エタンアミン（4.0 eq、0.21 ml、1.449 mmol）を塩化メチレン（1.5 ml）の中で混合した。AlCl3（2.9eq、142 mg、1.06 mmol）を添加して、そして、前記の溶液を22時間攪拌した。真空中で塩化メチレンを除去した後、その結果生じたスラリーを、飽和酒石酸水溶液（ca. 1 ml）で処理して、そして、すべての固形物がなくなるまで攪拌した（該加水分解の完了まで、約1時間かかった）。水を添加し、そして、前記溶液のpHを、NaOHを添加することで、14に調整した。前記の物質を、塩化メチレンで（3回）抽出し、そして、該混合性の抽出物を水で（2回）洗浄した。硫酸ナトリウムで完全に乾燥させた後、該揮発性物質類は、真空中で除去した。前記の物質は、アルミナ（塩化メチレン中、０．１〜１％メタノール濃度勾配）で行ったフラッシュクロマトグラフィーにより、精製した。前記の塩化メチレン／メタノール溶液を、真空中で濃縮した。酢酸エチルの添加が、14を黄色固体（93 mg、44%収率）として沈殿させることを、誘発した。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：９５％純度、ｍ／ｚ  ５７１［Ｍ＋ｌ］＋。
【０１３２】
以下の化合物は、適切なアミンとキノロネチルエステルを用いて、同様の方法により調製した。
2008513485.tif 000116
2008513485.tif 000117
【０１３３】
実施例２１
2008513485.tif 000118
塩化メチレン（１．０ｍＬ）中の前記キノロンエステル（６０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）及び２−（２−アミノエチル）−１−メチルピロリジン（３０μＬ、０．１９ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化アルミニウム（２５ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を添加し、そして、その反応混合液を３０分間撹拌しておいた。前記の溶媒を減圧下で除去し、そして飽和Ｌ−酒石酸（１．０ｍＬ）を加え、その固体の全てが溶解するまで４５分間撹拌した。前記水溶液を、塩化メチレン（１．０ｍＬ）で洗浄し、１Ｎ水酸化ナトリウムで塩基化し、塩化メチレンで抽出した。そうして得られた抽出物をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、その溶媒を減圧下で除去した。得られた黄色の物質を分離用の薄層クロマトグラフィー（アルミナ、ＣＨ２Ｃｌ２中に２％メタノール）で精製すると、その生成物は黄色がかった固体（３０ｍｇ、４３％）として生じた。
【０１３４】
実施例２２
2008513485.tif 000119
塩化メチレン（１．０ｍＬ）中の前記キノロンエステル（６０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）及び２−（２−アミノエチル）−１−メチルピロリジン（２５μＬ，０．１７ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化アルミニウム（２３ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）を添加し、そして、その反応混合液を３０分間撹拌しておいた。前記の溶媒を減圧下で除去し、そして飽和Ｌ−酒石酸（１．０ｍＬ）を加え、その固体の全てが溶解するまで４５分間撹拌した。前記水溶液を、塩化メチレン（１．０ｍＬ）で洗浄し、１Ｎ水酸化ナトリウムで塩基化し、塩化メチレンで抽出した。そうして得られた抽出物をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、その溶媒を減圧下で除去した。得られた黄色の物質を分離用の薄層クロマトグラフィー（アルミナ、ＣＨ２Ｃｌ２中に２％メタノール）で精製すると、その生成物は黄色がかった固体（３０ｍｇ、４６％）として生じた。
【０１３５】
実施例２３
2008513485.tif 000120
塩化メチレン（１．０ｍＬ）中の前記キノロンエステル（７５ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）及び２−（２−アミノエチル）−１−メチルピロリジン（３２μＬ，０．２２ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化アルミニウム（２９ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）を添加し、そして、その反応混合液を３０分間撹拌しておいた。前記の溶媒を減圧下で除去し、そして飽和Ｌ−酒石酸（１．０ｍＬ）を加え、その固体の全てが溶解するまで４５分間撹拌した。前記水溶液を、塩化メチレン（１．０ｍＬ）で洗浄し、１Ｎ水酸化ナトリウムで塩基化し、塩化メチレンで抽出した。そうして得られた抽出物をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、その溶媒を減圧下で除去した。得られた黄色の物質を分離用の薄層クロマトグラフィー（アルミナ、ＣＨ２Ｃｌ２中に２％メタノール）で精製すると、その生成物は黄色がかった固体（３０ｍｇ、３４％）として生じた。
【０１３６】
実施例２４
2008513485.tif 000121
塩化メチレン（１．０ｍＬ）中の前記キノロンエステル（３４ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）及び１−（２−アミノエチル）ピロリジン（１５μＬ、０．１１ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化アルミニウム（１５ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を添加し、そして、その反応混合液を３０分間撹拌しておいた。前記の溶媒を減圧下で除去し、そして飽和Ｌ−酒石酸（１．０ｍＬ）を加え、その固体の全てが溶解するまで４５分間撹拌した。前記水溶液を、塩化メチレン（１．０ｍＬ）で洗浄し、１Ｎ水酸化ナトリウムで塩基化し、塩化メチレンで抽出した。そうして得られた抽出物をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、その溶媒を減圧下で除去した。得られた黄色の物質を分離用の薄層クロマトグラフィー（アルミナ、ＣＨ２Ｃｌ２中に２％メタノール）で精製すると、その生成物は黄色がかった固体（２８ｍｇ、７３％）として生じた。
【０１３７】
実施例２５
2008513485.tif 000122
塩化メチレン（１．０ｍＬ）中の前記キノロンエステル（１４６ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）及び２−（２−アミノエチル）−１−メチルピロリジン（１ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化アルミニウム（１ｍｍｏｌ）を添加し、そして、その反応混合液を３０分間撹拌しておいた。前記の溶媒を減圧下で除去し、そして飽和Ｌ−酒石酸（１．０ｍＬ）を加え、その固体の全てが溶解するまで４５分間撹拌した。前記水溶液を、塩化メチレン（１．０ｍＬ）で洗浄し、１Ｎ水酸化ナトリウムで塩基化し、塩化メチレンで抽出した。そうして得られた抽出物をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、その溶媒を減圧下で除去した。得られた黄色の物質を分離用の薄層クロマトグラフィー（アルミナ、ＣＨ２Ｃｌ２中に２％メタノール）で精製すると、その生成物は黄色がかった固体（１．７ｍｇ、５％）として生じた。
【０１３８】
実施例２６
2008513485.tif 000123
化合物３（１．０当量、１２６ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）及びアミン５（２．０当量、６８μＬ、０．５４ｍｍｏｌ）を、無水ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍｌ）に溶解させた。ＡｌＣｌ３（２．０当量、７２ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を、室温で３時間撹拌した。揮発性のもの（volatiles）を、真空下で除去した。生じたスラリーを、飽和酒石酸水溶液（１０ｍｌ）で処理し、全ての固形物がなくなるまで（加水分解の完了の約１時間）撹拌した。その溶液を、１Ｎ  ＮａＯＨにより中和し（ｐＨ＝１４に到達させて）、化合物を、ＣＨ２Ｃｌ２（４×）を用いて抽出した。有機相を、濃酒石酸ナトリウムカリウム水溶液、水（２×）を用いて洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４を通じて乾燥させた。ＣＨ２Ｃｌ２溶液を濃縮した。ＡｃＯＥｔの添加により、期待された化合物の結晶化を誘導した。濾過後、化合物６を、淡黄色の綿状固体（７６ｍｇ、収率５３％）として単離した。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ５３６［Ｍ＋Ｈ］＋；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）δ１．１２（ｄ，Ｊ＝６．６，６Ｈ）、１．８０（ｂｒｓ，４Ｈ）、２．６２（ｂｒｓ，４Ｈ）、２．７９（ｍ，７Ｈ）、３．３６（ｍ，４Ｈ）、３．６７（ｑ，Ｊ＝６．０，２Ｈ）、７．４５（ｔ，Ｊ＝７．２，１Ｈ）、７．５３（ｔｄ，Ｊ＝７．３，Ｊ＝１．３，１Ｈ）、７．８４（ｄｄ，Ｊ＝７．８，Ｊ＝１．２，１Ｈ）、７．８９（ｄ，Ｊ＝６．９，１Ｈ）、８．１６（ｄ，Ｊ＝１３．１，１Ｈ）、８．２３（ｄ，Ｊ＝８．５，１Ｈ）、１０．４６（ｂｒｔ，１Ｈ）ｐｐｍ。
【０１３９】
実施例２７
2008513485.tif 000124
化合物を、実施例２６において使用した手順に従って調製した。即ち、４（１０１ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）及び７から出発して、化合物８を、白色の綿状固体（３７ｍｇ、収率３１％）として得た。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ５６６［Ｍ］＋、５６８［Ｍ＋２］＋；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）δ１．１３（ｄ，Ｊ＝６．５，６Ｈ）、１．５７（水のシグナルと重なるｍ，２Ｈ）、１．７１（ｍ，１Ｈ）、１．８１（ｍ，１Ｈ）、２．０４−２．１８（ｍ，４Ｈ）、２．３４（ｓ，３Ｈ）、２．７８（ｍ，５Ｈ）、３．０６（ｂｒｔ，Ｊ＝８．６，１Ｈ）、３．２７（ｂｒｓ，４Ｈ）、３．５２−３．５９（ｍ，２Ｈ）、７．４７（ｔ，Ｊ＝７．３，１Ｈ）、７．５７（ｔｄ，Ｊ＝８．４，Ｊ＝１．１，１Ｈ）、７．８４（ｄ，Ｊ＝７．８，１Ｈ）、８．１９（ｓ，１Ｈ）、８．２７（ｄ，Ｊ＝８．４，１Ｈ）、８．５７（ｓ，１Ｈ）、１０．３８（ｂｒｔ，Ｊ＝５．６，１Ｈ）ｐｐｍ。
【０１４０】
実施例２８
実施例２８では、対応するエステルとアミンと、更に塩化アルミニウムとの反応から置換したベンズオキサジン類似体を調製する方法を記載する。
【０１４１】
2008513485.tif 000125
２，３，４，５−テトラフルオロ安息香酸（１００ｇ、５１０ｍｍｏｌ）を含む塩化メチレン（０．５Ｌ）の溶液に、塩化オキサリル（６８ｇ、５４０ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ（約（ca）３滴）を加え、得られた反応混合物を、生成したガスを逃しつつ室温で一晩撹拌しておいた。溶媒を、真空下で除去し、容器を、２時間高真空（約０．５ｍｍＨｇ）下におくと、酸塩化物が、粘性の油状物（１０５ｇ）として生じた。尚、この酸塩化物を、更に精製しないで、その後の反応において使用した。
【０１４２】
2008513485.tif 000126
マロン酸エチルカリウム（potassium ethyl malonate）（９７ｇ、５７０ｍｍｏｌ）及び塩化マグネシウム（５５ｇ、５７０ｍｍｏｌ）を含むアセトニトリルの懸濁液並びに前記懸濁液を、−０℃まで冷却した。この懸濁液に、粗２，３，４，５−塩化ベンゾイル（１０５ｇ，５２０ｍｍｏｌ）を５分間かけて加えた。トリエチルアミンを、反応温度を１０℃以下に保つのに十分な速度でゆっくりと加え、得られた混合物を、室温まで温めておき、一晩撹拌した。溶媒を、真空下で除去し、トルエン（３００ｍＬ）と交換し、１Ｎ  ＨＣｌ（５００ｍＬ）を加え、得られた混合物を、１時間撹拌しておいた。有機層を、分離し、１Ｎ  ＨＣｌ（１００ｍＬ）及びブライン（１００ｍＬ）を用いて洗浄し、硫酸ナトリウムを通じて乾燥させ、シリカゲルのパッド（５０×１００ｍｍ）を通じて濾過し、酢酸エチルを用いて溶出を行った。溶媒を、真空下で除去し、生じた油状物を、エタノール／水（９：１）に溶解させ、一晩結晶化させておいた。生じた結晶を、濾過により単離し、エタノール／水（８：２）を用いて洗浄して、ケトエステル（４３．７５ｇ、１６６ｍｍｏｌ）を、白色結晶性固体として得た。
【０１４３】
2008513485.tif 000127
２５０ｍＬ丸底フラスコに、前記テトラフルオロケトエステル（１０．０ｇ、３７．９ｍｍｏｌ）、オルトギ酸トリエチル（triethylorthoformate）（８．６ｍＬ、５６．８ｍｍｏｌ） 及び無水酢酸（７．１５ｍｌ、７５．８ｍｍｏｌ）を加え、得られた反応混合物を、１４５℃まで２時間加熱した。反応液を、室温まで冷却しておき、１時間高真空（約０．５ｍｍＨｇ）下においた。生じた油状物を、エタノール（１００ｍｌ）に溶解させ、２−アミノ−ナフトール（６．０２ｇ、３７．９ｍｍｏｌ）を室温で加えた。得られた溶液は、一時的に透明になったが、その後生成物が、析出し始めた。反応液を、２時間撹拌しておき、その後濾過し、エタノール（１００ｍＬ）を用いて洗浄して、エナミンを、黄色固体（１２．５ｇ、２８．９ｍｍｏｌ）として得た。
【０１４４】
2008513485.tif 000128
前記エナミン（１２．１３ｇ、２７．９５ｍｍｏｌ）を含む乾燥ＤＭＦ（５０ｍＬ）の溶液に、炭酸カリウム（４．２４ｇ、１．１当量）を加え、得られた混合物を、絶えず２時間撹拌しながら９０℃まで加熱した。その混合物を、撹拌しないで室温まで冷却しておき、更なる時間室温のままにしておいた。結晶性固体を、濾過により集め、水を用いて洗浄した。ＴＨＦからの再結晶により、ジフルオロエステルが、白色結晶性固体（９．３ｇ、２３．６ｍｍｏｌ）として生じた。
【０１４５】
2008513485.tif 000129
前記ジフルオロエステル（１．０ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を含むＮＭＰ（１０ｍＬ）の溶液に、Ｎ−Ｂｏｃ−３−（２−ピラジノ）ピロリジン（８７０ｍｇ、３．５ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を、３時間還流加熱した。その後反応混合物を、室温まで冷却しておき、生成物を、濾過により集めた。ＴＨＦからの結晶化により、ピラジンエステルが、黄色固体（９１０ｍｇ、１．７４ｍｍｏｌ）として生じた。
【０１４６】
2008513485.tif 000130
室温で前記ピラジンエステル（２５０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）及び２−（２−アミノエチル）−１−メチルピロリジン（８０ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を含む塩化メチレンの溶液に、塩化アルミニウム（８３ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を加え、得られた反応混合物を、２時間撹拌しておいた。溶媒を、真空下で除去し、飽和Ｌ−酒石酸を加え（５ｍＬ）、得られた混合物を、１時間撹拌しておいた。その後、塩化メチレン（１０ｍＬ）を加え、得られた混合物を、１Ｎ  ＮａＯＨを用いて塩基性化した。有機層を、分離し、ロッシェル塩（Rochelle's salt）の飽和溶液、ブラインを用いて洗浄し、硫酸ナトリウムを通じて乾燥させた。溶媒を真空下で除去し、生じた固体をＴＨＦに溶解させ、得られたものを濾過し、溶媒を再度除去した。粗固体を、酢酸エチル中で再結晶させると、アミドが、黄色固体（２２５ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ、純度９８．５％）として生じた。
【０１４７】
実施例２９
実施例２９において示されるように、対応するエステルからのアミドカップリングによっては、弱い反応が生じるか、又は如何なる反応も生じなかった。ここで、塩化亜鉛は、ルイス酸として使用した。
【０１４８】
2008513485.tif 000131
室温で前記エステル（１００ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）及び２−（２−アミノエチル）−１−メチルピロリジン（８０ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を含む塩化メチレンの溶液に、塩化亜鉛（８６ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を加え、得られた反応混合物を、一晩撹拌しておいた。ＬＣＭＳにより、如何なる反応も進行しなかったことが示され、反応を中止した。
【０１４９】
実施例３０
実施例３０では、対応するカルボン酸とアミンとの反応から置換したベンズオキサジン類似体を調製する方法を記載する。
【０１５０】
2008513485.tif 000132
前記ピラジノエステル（２．０ｇ、３．８ｍｍｏｌ）を、エタノール（１００ｍＬ）に溶解させ、濃ＨＣｌを加え（２０ｍＬ）、得られた混合物を、一晩還流した。その混合物を、室温まで冷却しておき、固体を、真空濾過により集め、エタノールを用いて洗浄して、ピラジノ酸（pyrazinoacid）を、淡黄褐色（light tan）粉体（１．６ｇ、３．２ｍｍｏｌ）として得た。
【０１５１】
2008513485.tif 000133
前記フルオロアミノ酸（１．６ｇ、３．２ｍｍｏｌ）及びＨＢＴＵ（２．０ｇ、５．３ｍｍｏｌ）を含むＮＭＰ（２０ｍＬ）の混合物に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｎ−エチルアミン（１．０ｍＬ、６ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を、室温でアルゴン雰囲気下１時間（溶液が透明になるまで）撹拌しておいた。（Ｓ）−２−（２−アミノエチル）−１−メチルピロリジン（Ｍｉｚｕｎｏ，Ａ．；Ｈａｍａｄａ，Ｙ．；Ｓｈｉｏｉｒｉ，Ｔ．，合成（Synthesis），１９８０，１２  １００７）（１．０ｍＬ、６．９ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を、３０分間撹拌しておいた。水（２００ｍＬ）を加え、生じた固体を、真空濾過により集め、水を用いて洗浄し、乾燥させて、ピラジンを、黄色固体として得た。その黄色固体を、シリカゲル（最初に１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用いて不純物を溶出・除去して、次いで５％ＮＨ４ＯＨ／１５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用いて溶出する）により精製した。合わせた画分を、エバポレートして、化合物を、黄色固体として得た。（１．２ｇ、２．０ｍｍｏｌ、純度８５％）。
【０１５２】
実施例３０
実施例３１では、ベンズオキサジン及びベンゾチアゾール化合物の調製において中間体として使用される、Ｂｏｃ保護ピロリジン（Boc-protected pyrrolidine）試薬の調製を記載する。
【０１５３】
2008513485.tif 000134
ベンジルアミン（９０ｇ、８４１ｍｍｏｌ）及びクロロメチルトリメチルシラン（３０ｇ、２４６ｍｍｏｌ）の混合物を、２００℃で２．５時間加熱した。一般に、トリメチルシリル基は、−ＳｉＲ１Ｒ２Ｒ３成分と置換されうる。ここで、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立してアルキル又は置換したアルキルである。ベンジル基も、他の適当な保護基と置換されうる。
【０１５４】
その混合物を、室温まで冷却しておき、撹拌しながら１Ｎ  水酸化ナトリウム（２５０ｍＬ）及びエーテル（２００ｍＬ）で処理した。水層についてエーテル（３×１００ｍＬ）を用いて抽出を行い、合わせた有機抽出物を、ブラインを用いて洗浄し、硫酸マグネシウムを通じて乾燥させ、シリカゲルのパッド（７０×５０ｍｍ）を通じて濾過し、エーテルを用いて溶出を行った。溶媒を、真空下で除去し、生じた油状物を、真空蒸留して（ｂｐ＝７０℃  約（ca）１ｍｍＨｇ）、アミンを、著しい量のベンジルアミンを含んだ無色の油状物（６０．８ｇ）として得た。その後、生じた油状物について、酢酸エチルを用いて溶出を行って、単一のｂｉｏｔａｇｅカラム（９０ｇ、シリカゲル、ＡＮＡＬＯＧＩＸ）によるクロマトグラフィーを行った。溶媒を真空下で除去して、純粋なアミンを、無色の油状物（４３．５５ｇ、２２５ｍｍｏｌ）として得た。その後、生じたアミンを、３７％ホルマリン（２５ｍＬ）に加え、得られた混合物を、室温で１０分間撹拌し、これに次いで、メタノール（２５ｍＬ）及び炭酸カリウム（２０ｇ）を加えた。生じた混合物を、一晩撹拌しておき、その後塩化メチレン（３×１００ｍＬ）を用いて抽出を行い、合わせた有機抽出物を、硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた。溶媒を、真空下で除去し、生じた油状物を、真空蒸留して（ｂｐ＝８０℃  約（ca）１ｍｍＨｇ）、アミンを、無色の液体として（３９．９ｇ、１６８ｍｍｏｌ）を得た。
【０１５５】
2008513485.tif 000135
ビニルピリジン（１０ｇ、９４．３ｍｍｏｌ）を含む塩化メチレン（２００ｍＬ）及びトリフルオロ酢酸（２ｍＬ）の溶液に、前記シリル化アミンエーテル（silylated amine ether）（２４．３３ｇ、１０２．７ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１００ｍＬ）に溶解させた溶液を４時間かけて滴下した。その後、容量を、１００ｍＬまで減じ、１Ｎ  ＨＣｌ（３×７５ｍＬ）を用いて抽出を行った。その後、水層を、ＮａＯＨを用いて塩基性化し、塩化メチレン（３×１００ｍＬ）を用いて抽出を行い、硫酸マグネシウムを通じて乾燥させ、シリカゲルのパッド（３０×１５０ｍｍ）を通じて濾過し、酢酸エチルを用いて溶出を行った。溶媒をエバポレートして、ベンジル化したピラジノピロリジン（２６．１９ｇ）を、茶色がかった透明な液体として得た。一般に、ピラジン複素環は、他の適当な複素環基と置換されてもよい。
【０１５６】
2008513485.tif 000136
前記ベンジルピロリジン（７．０ｇ、２９．３ｍｍｏｌ）及びジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（４４．７ｇ、２０５ｍｍｏｌ）を含むメタノール（３５ｍＬ）の溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（ｄｅｇｕｓｓａタイプ、湿式）を加え、容器を、振盪しつつ、水素（５０ＰＳＩ）を用いて加圧した。容器を３回ガス抜きして、圧力を調節した。５時間後、反応が終了した。その混合物を濾過し、溶媒を真空下で除去した。生じた物質についてシリカゲル（１：１  ヘキサン／酢酸エチル）によるクロマトグラフィーを行って、Ｂｏｃ保護ピロリジンを淡黄色油状物（２．３ｇ、９．２ｍｍｏｌ）として得た。
【０１５７】
2008513485.tif 000137
鏡像異性の割合を、ＴＰＣ（Ｎ−トリフルオロメチルアセチル−Ｌ−プロリルクロリド（N-trifluoromethylacetyl-L-prolyl chloride）、Ｒｅｇｉｓ＃４４０００１）を作成し、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｚｅｂｒｏｎキャピラリーカラム（ＺＢ−５０、５０％フェニル、５０％ジメチルポリシロキサン、３０ＭＸ０．２５ｍｍ、０．２５ｕＭ膜厚）によるＧＣＭＳ（ＨＰ  ６８９０Ｎ／５９７３  ＭＳＤ）を用いて測定することができる。クロマトグラフィー条件：１μＬ注入スプリット（injection split）５０：１。定流量（Constant Flow）Ｈｅ＝１．０ｍＬ／分。オーブン；１００℃、５分間、３００℃まで５℃／分、８分間保持）。化合物は３９．０８及び３９．３１分に出てくるが、分解能は極めて良好である。
【０１５８】
実施例３２
実施例３２では、アミドカップリングにおいて使用されるキラルなアミン試薬の調製を記載する。
【０１５９】
2008513485.tif 000138
前記ヒドロキシメチルピロリジン（５０ｇ、４３４ｍｍｏｌ）を含む塩化メチレン（１Ｌ）の溶液に、トリフェニルホスフィン（１４８ｇ、５６４ｍｍｏｌ）を加え、次いで、四臭化炭素（１８７ｇ、５６４ｍｍｏｌ）を室温で注意深く加えた。得られた反応混合物を、室温で１時間撹拌しておいた。水を加え、有機層を、ブラインを用いて洗浄し、硫酸ナトリウムを通じて乾燥させ、溶媒を、真空下で除去した。生じた油状物をシリカゲルクロマトグラフィー（１：１  ヘキサン／酢酸エチル）により精製すると、臭化物が、透明な油状物（３５ｇ、１９７ｍｍｏｌ）として生じた。
【０１６０】
2008513485.tif 000139
前記臭化物（２３．０ｇ、１２９ｍｍｏｌ）を含むアセトニトリル及び水  溶液（７５：１５、２００ｍＬ）の溶液に、シアン化カリウム（１２．６ｇ、１９４ｍｍｏｌ）及び１８−クラウン−６（３４０ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）を加え、得られた反応液を、室温で一晩撹拌しておいた。その後、容量を、真空下で５０ｍＬまで減じ、塩化メチレン（２×２００ｍＬ）を用いて２回抽出を行った。生じた抽出物を合わせ、ブラインを用いて洗浄し、硫酸ナトリウムを通じて乾燥させ、溶媒を真空下で注意深く除去して、シアン化物を、透明な油状物（１７ｇ）として得た。
【０１６１】
2008513485.tif 000140
シアン化物（１７ｇ、１３７ｍｍｏｌ）を含むメタノール（９０ｍＬ）の溶液に、ラネーニッケル（Raney Nickel）（２．０ｇ、水溶液）を加え、得られた混合物を、２４時間振盪しつつ、水素（６０ＰＳＩ）を用いて加圧した。その溶液を濾過し、溶媒を真空下で除去した。純粋なアミンを、蒸留（ＢＰ＝５０℃、約１０ｍｍＨｇ）により透明な油状物（７．５４ｇ、５８．９ｍｍｏｌ）として単離した。
【０１６２】
2008513485.tif 000141
鏡像異性の割合を、ＴＰＣ（Ｎ−トリフルオロメチルアセチル−Ｌ−プロリルクロリド（N-trifluoromethylacetyl-L-prolyl chloride）、Ｒｅｇｉｓ＃４４０００１）を作成し、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｚｅｂｒｏｎキャピラリーカラム（ＺＢ−５０、５０％フェニル、５０％ジメチルポリシロキサン、３０ＭＸ０．２５ｍｍ、０．２５ｕＭ膜厚）によるＧＣＭＳ（ＨＰ  ６８９０Ｎ／５９７３  ＭＳＤ）を用いて測定することができる。クロマトグラフィー条件：１μＬ注入スプリット（injection split）５０：１。定流量（Constant Flow）Ｈｅ＝１．０ｍＬ／分。オーブン；１００℃、５分間、３００℃まで５℃／分、８分間保持）。化合物は２８．５１及び２８．６８分に出てくるが、分解能は極めて良好である。
【０１６３】
前記詳細な説明及び付随する実施例は、単なる実例にすぎず、本発明の範囲についての制限としてとらえるべきではないことが理解される。開示した形態に対する各種変更及び修正は、その技術について熟知した者（当業者）にとって明白であろう。本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、形成、及び／又は使用方法に関する変更及び修正を制限なく含め、そのような変更及び修正が、本発明の目的及び範囲から離れることなくなされてもよい。本書において参照した米国特許及び公報は、参照により組み込まれる。
【０１６４】
2008513485.tif 000142
前記２，６−ジクロロニコチン酸（１．０当量、３１．２４ｇ、１６２．７ｍｍｏｌ）を含む塩化メチレン（５００ｍＬ）の溶液に、塩化オキサリル（１．２当量、２３．７ｇ、１８７．５ｍｍｏｌ）、次いで３滴のＤＭＦを加え、得られた混合物を、室温で一晩撹拌しておいた。その後、溶媒を真空下で除去して、粗酸塩化物を油状物として得た。セパレートフラスコ（separate flask）中で、マロン酸エチルカリウム（１．５当量、４１．５ｇ、２４４ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（５００ｍＬ）に溶解させ、得られた混合物を、５℃まで冷却した。その後、塩化マグネシウム（１．５当量、２３．４ｇ、２４５．８ｍｍｏｌ）を、温度を２５℃以下に保ちながら、５分間かけて加えた。その後、粗酸塩化物を、アセトニトリル（５０ｍＬ）に溶解させ、温度を５℃以下に保ちながら３０分間かけて滴下ロートにより加えた。その後、トリエチルアミン（２．０当量、４２．８ｍｌ、３２５ｍｍｏｌ）を、更に温度を１０℃以下に保っている間に、できるだけ速く加えた。添加が終了し次第、反応液を、絶えず撹拌しながら一晩室温まで温めておいた。溶媒を、真空下で除去し、酢酸エチルと交換した。１Ｎ  ＨＣｌを加え（５００ｍＬ）、得られた混合物を、更に３０分間撹拌した。有機層を分離し、ブラインを用いて洗浄し、硫酸ナトリウムを通じて乾燥させ、溶媒を真空下で除去して、ケトエステルを、橙色油状物（３５．０４ｇ）として得た。生成物を、１０％水／メタノールからの再結晶により精製すると、純粋なケトエステル１が白色結晶性固体（３１．２１ｇ、７４％）として生じた。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、２ピークについて溶出、ｍ／ｚ  ２１６、２６２。
【０１６５】
実施例３４
2008513485.tif 000143
ケトエステル１（１．０当量、１１．４５ｇ、４３．８７ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（６０ｍｌ）に溶解させ、得られた混合物を、氷浴を用いて０℃まで冷却した。その後、ヨウ化メチル（３．０当量、８．２ｍｌ、１３２．ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を、−５℃まで冷却した。その後、温度を５℃以下に保ちながら二硫化炭素（１．５当量、４．０ｍＬ、６５．８ｍｍｏｌ）、次いで炭酸カリウム（２．０当量、１２．１ｇ、８８ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を、２時間かけて撹拌しながら室温まで温めておき、酢酸エチル（５×１００ｍＬ）を用いて抽出を行い、硫酸ナトリウムを通じて乾燥を行った。溶媒を、真空下で除去し、生じた油状物をシリカゲルクロマトグラフィー（１０％酢酸エチル／ヘキサン）により精製すると、ビスチオエーテル２が黄色油状物（収率７０％）として生じた。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９０％、ｍ／ｚ  ３８８［Ｍ＋２２］＋、３２０［Ｍ＋１−ＯＥｔ］＋。
【０１６６】
実施例３５
2008513485.tif 000144
２，６−ジクロロ−５−フロロ−３−ピリジン−β−ケトプロピオン酸エチル（Ethyl 2,6-dichloro-5-fluoro-3-pyridine-β-keto propionate）（１．０当量、３１．７９ｇ、０．１１３ｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１８０ｍｌ）に溶解させた。得られた溶液を、氷−塩混合物を用いて冷却した。ヨードメタン（３．０当量、２１ｍｌ、０．８８７ｍｏｌ）及び二硫化炭素（１．５当量、１０．３ｍｌ、０．１７０ｍｏｌ）を加え、得られた混合物を、内部温度がＴ＝−２℃に達するまで撹拌した。Ｋ２ＣＯ３（２．０当量、３１．４ｇ、０．２２７ｍｏｌ）を、かなり素早く（２〜３分間かけて）加えて、内部温度がＴ＝１２℃に達するようにした。得られた混合物を、５時間氷浴中で撹拌した。水及びブラインを加えた後、化合物を、ＥｔＯＡｃ（３×）を用いて抽出した。合わせた抽出物を、ブライン（２×）を用いて洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４を通じて乾燥させ、揮発性のものを、真空下で除去した。シリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃのヘキサンにおける５から３０％  勾配）によって精製すると、化合物３が粘性の黄色油状物（２２．８６ｇ、収率５２％）が生じた。Ｒｆ＝０．１４（１０％ＥｔＯＡｃを含むヘキサン）；ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ３８４［Ｍ］＋、３３８［Ｍ−ＥｔＯＨ］＋、３４０［Ｍ＋２−ＥｔＯＨ］＋、３４２［Ｍ＋４−ＥｔＯＨ］＋；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）δ  １．１６（ｔ，Ｊ＝７．４，３Ｈ）、２．４３（ｓ，６Ｈ）、４．１８（ｑ，Ｊ＝７．４，２Ｈ）、７．８６（ｄｄ，Ｊ＝０．６，Ｊ＝７．４，１Ｈ）ｐｐｍ。
【０１６７】
実施例３６
2008513485.tif 000145
化合物３（１．０当量、１８．９３ｇ、４９．１８ｍｍｏｌ）を、トルエン（４００ｍｌ）に溶解させた。得られた溶液を、１０分間、窒素を通気することにより注意深く脱気した。２−アミノチオフェノール（０．９当量、４．７ｍｌ、４３．９２ｍｍｏｌ）を加えた後、得られた混合物を、反応液内部に窒素を絶えず通気しながら１３０〜１４０℃（油浴温度）で６時間撹拌した。ＤＩＥＡ（１．０当量、８．６ｍｌ、４９．３７ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を１４０℃で一晩撹拌した。冷却すると、化合物４が析出し始めた。固形物を濾過し、少量のトルエンを用いて洗浄した。得られた物質を、ＭｅＯＨに懸濁させ、数分間超音波処理した。濾過及び乾燥後、化合物４を黄褐色固体（９．１９ｇ、収率５６％）として単離した。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ３７７［Ｍ＋１］＋、３７９［Ｍ＋３］＋、３３１［Ｍ＋１−ＥｔＯＨ］＋、３３３［Ｍ＋３−ＥｔＯＨ］＋；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）δ  １．５０（ｔ，Ｊ＝７．０，３Ｈ）、４．５３（ｄ，Ｊ＝７．０，２Ｈ）、７．５２（ｔｄ，Ｊ＝０．９，Ｊ＝７．１，１Ｈ）、７．６３（ｔｄ，Ｊ＝１．４，Ｊ＝６．０，１Ｈ）、７．８４（ｄｄ，Ｊ＝１．２，Ｊ＝７．９，１Ｈ）、８．６２（ｄ，Ｊ＝７．４，１Ｈ）、９．４９（ｄ，Ｊ＝８．６，１Ｈ）ｐｐｍ。
【０１６８】
実施例３７
2008513485.tif 000146
バイアル中で、化合物３（１．０当量、２０２ｍｇ、０．５２６ｍｍｏｌ）及びＮ−メチル−ベンゼン−１，２−ジアミン（１．０当量、６０μｌ、０．５２８ｍｍｏｌ）を、無水トルエン（５ｍｌ）中１３０℃で１６時間撹拌した。揮発性のものを真空下で除去した後、粗混合物を、シリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィー（ＭｅＯＨのＣＨ２Ｃｌ２における０．５から３％  勾配）によって精製した。生じた油状物にＭｅＯＨを加えると、純粋な５が析出した。得られた物質を、濾過し、乾燥して、５を、黄色固体（２９ｍｇ、収率１５％）として得た。Ｒｆ＝０．２６（５％ＭｅＯＨを含むＣＨ２Ｃｌ２）；ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ３７４［Ｍ＋１］＋、３７６［Ｍ＋３］＋、３２８［Ｍ＋１−ＥｔＯＨ］＋、３３０［Ｍ＋３−ＥｔＯＨ］＋；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）δ  １．４７（ｔ，Ｊ＝７．０，３Ｈ）、３．７０（ｓ，３Ｈ）、４．５０（ｑ，Ｊ＝７．０，２Ｈ）、７．３７（ｄｄ，Ｊ＝８．１，Ｊ＝１．０，１Ｈ）、７．４４−７．５１（ｍ，２Ｈ）、８．５５（ｄ，Ｊ＝７．６，１Ｈ）、８．９４（ｄｄ，Ｊ＝１．１，Ｊ＝８．１，１Ｈ）ｐｐｍ。
【０１６９】
実施例３８
2008513485.tif 000147
バイアル中で、化合物３（１．０当量、２２１ｍｇ、０．５７５ｍｍｏｌ）及び２−アミノフェノール（１．１当量、７０ｍｇ、０．６４１ｍｍｏｌ）を、無水トルエン（５ｍｌ）中１３０℃で６時間撹拌した。得られた混合物を冷却した後、形成した褐色析出物を、濾過した。この物質を、ＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ、得られた溶液を、セライトのパッドを通じて濾過した。トルエン中での再結晶により、６（４８ｍｇ、収率２４％）がベージュの固体として生じた。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ３６１［Ｍ＋１］＋、３６３［Ｍ＋３］＋、３１５［Ｍ＋１−ＥｔＯＨ］＋、３１７［Ｍ＋３−ＥｔＯＨ］＋；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）δ  １．４６（ｔ，Ｊ＝７．０，３Ｈ）、４．５０（ｑ，Ｊ＝７．３，２Ｈ）、７．４８−７．５４（ｍ，２Ｈ）、７．６５（ｄｄ，Ｊ＝１．４，Ｊ＝７．９，１Ｈ）、８．５７（ｄ，Ｊ＝７．４，１Ｈ）、８．６８（ｄｄ，Ｊ＝１．４，Ｊ＝７．９，１Ｈ）ｐｐｍ。
【０１７０】
実施例３９
2008513485.tif 000148
バイアル中で、化合物３（１．０当量、２６６ｍｇ、０．６９２ｍｍｏｌ）及び３−アミノ−４−（メチルアミノ）ベンゾニトリル（１．０当量、１００ｍｇ、０．６８９ｍｍｏｌ）を、無水トルエン（５ｍｌ）中１３０℃で２日間撹拌した。溶媒のエバポレーション後、得られた粗混合物を、シリカゲルカラム（ＭｅＯＨのＣＨ２Ｃｌ２における０．５から３％  勾配）に通した。シリカゲル（１ｍｍ、２プレート、４％ＭｅＯＨを含むＣＨ２Ｃｌ２）による調製用ＴＬＣによって精製すると、化合物７が黄色固体（３２ｍｇ、収率１２％）として生じた。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ３９９［Ｍ＋１］＋、４０１［Ｍ＋３］＋、３５３［Ｍ＋１−ＥｔＯＨ］＋、３５５［Ｍ＋３−ＥｔＯＨ］＋；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）δ  １．４７（ｔ，Ｊ＝７．１，３Ｈ）、３．７２（ｓ，３Ｈ）、４．５１（ｑ，Ｊ＝７．３，２Ｈ）、７．４２（ｄ，Ｊ＝８．４，１Ｈ）、７．７９（ｄｄ，Ｊ＝１．５，Ｊ＝８．４，１Ｈ）、８．５５（ｄ，Ｊ＝７．３，１Ｈ）、９．２２（ｄ，Ｊ＝１．４，１Ｈ）ｐｐｍ。
【０１７１】
実施例４０
2008513485.tif 000149
バイアル中で、化合物３（１．０当量、２８８ｍｇ、０．７４９ｍｍｏｌ）及び２−アミノ−４−クロロベンゼンチオール（１．０当量、１２０ｍｇ、０．７５２ｍｍｏｌ）を、無水トルエン（５ｍｌ）中１３０℃で２日間撹拌した。反応の間に形成した固体を、濾過し、ＭｅＯＨ及びＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍｌ）の混合物に溶解させた。生じた濁った溶液を、セライトのパッドに通じて濾過した。揮発性のもののエバポレーション後、得られた物質を、シリカゲル（ＣＨ２Ｃｌ２、その後０．５％ＭｅＯＨを含むＣＨ２Ｃｌ２）によるフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。化合物８を、黄色固体（２０ｍｇ、収率６％）として単離した。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度＞８５％、ｍ／ｚ  ４１１［Ｍ］＋、４１３［Ｍ＋２］＋、４１５［Ｍ＋４］＋、３６５［Ｍ−ＥｔＯＨ］＋、３６７［Ｍ＋２−ＥｔＯＨ］＋、３６９［Ｍ＋４−ＥｔＯＨ］＋。
【０１７２】
実施例４１
2008513485.tif 000150
バイアル中で、化合物３（１．０当量、２５５ｍｇ、０．６６４ｍｍｏｌ）及びベンゼン−１，２−ジアミン（１．０当量、７２ｍｇ、０．６６６ｍｍｏｌ）を、無水トルエン（５ｍｌ）中１３０℃で５時間撹拌した。揮発性のものを、真空下で除去し、得られた物質を、ジグリム（２ｍｌ）に溶解させた。ＮａＨを含む油状物（１．０当量、２６ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）の６０％懸濁液を加え、得られた混合物を、１３０℃で３時間撹拌した。生じた析出物を、濾過し、水を用いて洗浄した。ＭｅＯＨ中のトリチュレーション及び濾過の後、化合物９を、褐色固体（９１ｍｇ、収率３８％）として単離した。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ３６０［Ｍ＋１］＋、３６２［Ｍ＋３］＋；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）δ  １．４４（ｔ，Ｊ＝７．１，３Ｈ）、４．４４（ｑ，Ｊ＝７．１，２Ｈ）、７．４０−７．４６（ｍ，２Ｈ）、７．４９（ｍ，１Ｈ）、８．５０（ｄ，Ｊ＝７．７，１Ｈ）、８．８１（ｄ，Ｊ＝６．８，１Ｈ）ｐｐｍ。
【０１７３】
実施例４２
2008513485.tif 000151
前記ビスチオエーテル２（１．０当量、１０．１４ｇ、２７．７ｍｍｏｌ）を含むトルエン（３００ｍＬ）の溶液に、２−アミノチオフェノール（１．１当量、３．８１ｇ、３０．５ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を、絶えず窒素を脱気しながら、一晩還流した。その後、その混合物を、室温まで冷却しておき、ジイソプロピルエチルアミン（１．５当量、７．０ｍＬ、４１．５５ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を、３時間還流加熱した。その混合物を、室温まで冷却しておき、生成物を濾過により集めて、環化エステル１０を、黄褐色固体（６．６ｇ、収率６６％）として得た。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ３５９［Ｍ＋１］＋。
【０１７４】
実施例４３
2008513485.tif 000152
前記ビスチオエーテル２（１．０当量、５．０ｇ、１３．６６ｍｍｏｌ）を含むトルエン（１５０ｍＬ）の溶液に、Ｎ−メチル−１，２−フェニレンジアミン（１．２当量、２．０ｇ、１６．４ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を、絶えず窒素を脱気しながら、一晩還流した。その後、その混合物を、室温まで冷却しておき、ジイソプロピルエチルアミン（１．５当量、３．５ｍＬ、２０．７５ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を、３時間還流加熱した。その混合物を、室温まで冷却しておき、メタノールを加えた。容量を、ロータリーエバポレーションにより約１００ｍｌまで減じ、２日間静置した。生成物を濾過により集め、エタノールから再結晶させると、環化エステル１１が、黄褐色固体（２．６ｇ、収率５３％）として生じた。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ３５６［Ｍ＋１］＋。
【０１７５】
実施例４４
2008513485.tif 000153
前記ビスチオエーテル２（１．０当量、１０．１４ｇ、２７．７ｍｍｏｌ）を含むトルエン（３００ｍＬ）の溶液に、１，２−フェニレンジアミン（１．１当量、３．３ｇ、３０．５ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を、絶えず窒素を脱気しながら、一晩還流した。その後、その混合物を、室温まで冷却しておき、ジイソプロピルエチルアミン（１．５当量、７．０ｍＬ、４１．５５ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を、３時間還流加熱した。その混合物を、室温まで冷却しておき、生成物を濾過により集めて、環化した酸１２ａを、黄褐色固体（３．５ｇ、１１．２ｍｍｏｌ、収率４０％）として得た。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ３１４［Ｍ＋１］＋。生じた濾液を、真空濃縮し、エーテル（１００ｍＬ）を用いてトリチュレートした。生成物を濾過により集めて、環化エステル１２を、黄褐色固体（３．５ｇ、１０．３ｍｍｏｌ、収率３７％）として得た。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ３４２［Ｍ＋１］＋。
【０１７６】
［実施例４５］
2008513485.tif 000154
化合物４（１．０当量、１．５７ｇ、４．１７ｍｍｏｌ）を、酢酸（１５ｍｌ）に懸濁させた。得られた懸濁液を、１０分間、窒素を通気することにより脱気した。ギ酸アンモニウム（１０当量、２．６３ｇ、４１．６ｍｍｏｌ）及びＰｄ／Ｃ（１０％湿度ｄｅｇｕｓｓａタイプ、２．５ｇ）を加え、得られた混合物を、６０℃で３時間激しく撹拌した。得られた混合物を、セライトのパッドを通じて濾過した。炭素を、ＣＨ２Ｃｌ２、ＭｅＯＨ及び酢酸の熱した混合物で数回処理して、期待された物質を完全に回収した。合わせた濾液を、蒸発させ、ＣＨ２Ｃｌ２を加えた。有機相を、水（２×）を用いて洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４を通じて乾燥させ、溶媒を、真空下で除去した。生じた固体を、ＥｔＯＡｃとヘキサンとの混合物中で超音波処理し、濾過し、乾燥させて、純粋な１３をオフホワイトの固体（１．１１ｇ、収率７８％）として得た。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ３４３［Ｍ＋１］＋。
【０１７７】
実施例４６
2008513485.tif 000155
化合物１４を、生成物１３について用いた手順に従って、より高い温度（８０℃）及びより長い時間を用いて調製した。転換を完了させるため、より大過剰量の試薬を、数回加えた。化合物を、オフホワイトの固体（４１ｍｇ、収率１５％）として単離した。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ３２５［Ｍ＋１］＋。
【０１７８】
実施例４７
2008513485.tif 000156
バイアル中で、化合物６（１．０当量、１３ｍｇ、０．０３６０ｍｍｏｌ）及びＮ−イソプロピルピペラジン（４．０当量、２１μｌ、０．１４７ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（０．１ｍｌ）中で９０℃で４．５時間撹拌した。水を添加した後、析出物を、濾過し、乾燥させた。生成物１５を、ＡｃＯＥｔ／ヘキサンを用いて析出により精製すると、ベージュの固体（７ｍｇ、収率４３％）が生じた。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度＞９０％、ｍ／ｚ  ４５３［Ｍ＋１］＋。
【０１７９】
下記類似体を、適当なアミン及びクロロ−アザベンゾフルオレノンを用いて、同様の方法により調製した。
2008513485.tif 000157
2008513485.tif 000158
【０１８０】
実施例４８
2008513485.tif 000159
バイアル中で、化合物４（１．０当量、１４ｍｇ、０．０３７２ｍｍｏｌ）及びラセミ体  ｔｅｒｔ−ブチル  ３−（ピラジン−２−イル）ピロリジン−１−カルボキレート（racemic tert-butyl 3-(pyrazin-2-yl)pyrrolidine-carboxylate）（４．０当量、５０ｍｇ、０．１６０ｍｍｏｌ）を、２００℃で１時間無水ＮＭＰ（０．２ｍｌ）中で撹拌した。水を加えた後、析出物を、濾過し、乾燥させた。この物質を、シリカゲルによる調製用ＴＬＣ（１ｍｍ  プレート、４％ＭｅＯＨを含むＣＨ２Ｃｌ２を用いて２回溶出を行う）により精製した。化合物２８を、褐色固体（９ｍｇ、収率５０％）として単離した。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９０％、ｍ／ｚ  ４９０［Ｍ＋１］＋。
【０１８１】
実施例４９
2008513485.tif 000160
バイアル中で、化合物５（１．０当量、２１ｍｇ、０．０５６２ｍｍｏｌ）及びラセミ体  ｔｅｒｔ−ブチル  ３−（ピラジン−２−イル）ピロリジン−１−カルボキレート（４．０当量、５６ｍｇ、０．２２５ｍｍｏｌ）を、２００℃で３時間無水ＮＭＰ（０．２ｍｌ）中で撹拌した。水を加えた後、析出物を、濾過し、乾燥させた。この物質を、シリカゲルによる調製用ＴＬＣ（１ｍｍ  プレート、５％ＭｅＯＨを含むＣＨ２Ｃｌ２を用いて２回溶出を行う）、及びＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサンを用いる析出により精製した。化合物２９を、ベージュの固体（１５ｍｇ、収率５５％）として単離した。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ４８７［Ｍ＋１］＋。
【０１８２】
実施例５０
2008513485.tif 000161
バイアル中で、化合物５（１．０当量、２１ｍｇ、０．０５６２ｍｍｏｌ）、２−（ピラジン−２−イル）エタンチオール（１．１当量、８μｌ、０．０６５２ｍｍｏｌ）及びＫ２ＣＯ３（１．２当量、９ｍｇ、０．０６５１ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ（０．２ｍｌ）中で混合した。得られた混合物を、９０℃で３時間撹拌した。水を加えた後、析出物を、濾過し、乾燥させた。この物質を、ＭｅＯＨ中でトリチュレートし（triturate）、濾過した。化合物３０を、黄色固体（１９ｍｇ、収率７１％）として単離した。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ４７８［Ｍ＋１］＋。
【０１８３】
下記類似体を、適当なクロロ−アザベンゾフルオレノンを用いて、同様の方法により調製した：
2008513485.tif 000162
【０１８４】
実施例５１
2008513485.tif 000163
化合物１３（１．０当量、２６６ｍｇ、０．７７７ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ（３ｍｌ）に懸濁させた。得られた混合物に、窒素を数分間通気した。２−（ピラジン−２−イル）エタンチオール（５．０当量、０．４８ｍｌ、３．９１ｍｍｏｌ）及びＫ２ＣＯ３（１０．０当量、１．０ｇ、７．２３ｍｍｏｌ）を加え、得られた反応混合物を、１００℃で１時間激しく撹拌した。水を加えて、全ての物質を溶解させた。ｐＨを、３Ｎ  ＨＣｌ水溶液を加えることによって１〜２に調整した。生じた橙色析出物を、濾過し、少量のＭｅＯＨに懸濁させ、二回目の濾過をした。粗化合物３４を、橙褐色（orange-brown）固体として単離し、如何なる精製も更に行わずに、次の工程のために用いた（１８８ｍｇ、収率６８％）。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度８０〜９０％、ｍ／ｚ  ３５７［Ｍ＋１］＋。
【０１８５】
実施例５２
2008513485.tif 000164
化合物３４（１．０当量、１８８ｍｇ、０．５２７ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（４ｍｌ）に懸濁させた。トリエチルアミン（２．２当量、０．１６ｍｌ、１．１４８ｍｍｏｌ）及び２−（ブロモメチル）ピリジニウムブロミド（１．２当量、１６０ｍｇ、０．６３２５ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を、室温で１５分間撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を加えた後、物質を、ＣＨ２Ｃｌ２（３×）により抽出した。合わせた抽出物を、Ｎａ２ＳＯ４を通じて乾燥させ、溶媒を、真空下で除去した。得られた化合物を、調製用ＨＰＬＣにより精製した。生じた溶液を濃縮し、そのｐＨを、ＮａＯＨ水溶液を加えることによって１０に調整した。化合物３５を、濾過し、ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン混合物中でトリチュレートし、濾過して、淡褐色固体（５９ｍｇ、収率２５％）を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ４４８［Ｍ＋１］＋。
【０１８６】
実施例５３
2008513485.tif 000165
丸底フラスコ中で、化合物４（１．０当量、１．２８ｇ、３．３９７ｍｍｏｌ）及び２−（ピロリジン−１−イル）エタンアミン（２．０当量、０．８６ｍｌ、６．７８６ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍｌ）と混合した。ＡｌＣｌ３（１．５当量、６８０ｍｇ、５．１０ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を、室温で１時間激しく撹拌した。ＣＨ２Ｃｌ２を真空下で除去した後、生じたスラリーを、飽和酒石酸水溶液（約（ca.）２０ｍｌ）で処理し、全ての固形物がなくなるまで（加水分解の完了の約１時間）撹拌した。水を加え、ｐＨを、ＮａＯＨを加えることによって１４に調整した。黄色析出物を、濾過し、水を用いて洗浄した。得られた固体を、多量のＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ混合物に溶解させ、濁った溶液を、セライトのパッドを通じて濾過した。揮発性のもの（volatiles）を、真空下で除去し、固形物を、熱したＭｅＯＨ中でトリチュレートした。濾過及び乾燥により、化合物３６（１．０９ｇ、収率７２％）を、黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ４４５［Ｍ＋１］＋；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ１．８４（ｍ，４Ｈ）、２．６５（ｍ，４Ｈ）、２．８０（ｔ，Ｊ＝７．２，２Ｈ）、３．６８（ｔ，Ｊ＝７．２，２Ｈ）、７．５２（ｔｄ，Ｊ＝１．２，Ｊ＝７．２，１Ｈ）、７．６２（ｔｄ，Ｊ＝１．２，Ｊ＝８．４，１Ｈ）、７．８１（ｄｄ，Ｊ＝０．８，Ｊ＝８．０，１Ｈ）、８．６２（ｄ，Ｊ＝７．２，１Ｈ）、９．４９（ｄ，Ｊ＝８．８，１Ｈ）  ｐｐｍ。
【０１８７】
下記化合物を、適当なアミン及びアザベンゾフルオレノン  エチル  エステルを用いて、同様の方法により調製した。いくつかの化合物については、代わりに、塩基性水溶液からＣＨ２Ｃｌ２を用いて抽出により単離した。いくつかの化合物については、アルミナによる調製用ＴＬＣ（１〜５％ＭｅＯＨを含むＣＨ２Ｃｌ２により溶出を行う）、調製用ＨＰＬＣ又はＥｔＯＡｃ若しくはＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン混合物中でのトリチュレーション（trituration）により精製した。
2008513485.tif 000166
2008513485.tif 000167
2008513485.tif 000168
2008513485.tif 000169
【０１８８】
実施例５４
2008513485.tif 000170
Ｂｏｃ基で保護された化合物６４は、生成物３６のために用いた方法に従って調製した。未精製のｂｏｃ−アミンを純粋のトリフルオロ酢酸（０．５ｍｌ）で４５分間処理した。酸を蒸発させた後、水を添加し、１ＮのＮａＯＨの添加によりｐＨを１４に調整した。ＣＨ２Ｃｌ２で４回抽出した後、抽出物を水で１回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。ラセミ体化合物６４を、アルミナ上の調製用ＴＬＣ（１．５ｍｍプレート、ＣＨ２Ｃｌ２中の４％メタノールで３回溶出）により精製し、黄色の固体（６ｍｇ、収率３７％）を取得した。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ５０９［Ｍ＋１］＋。
【０１８９】
実施例５５
2008513485.tif 000171
化合物６５は生成物６４のために用いた方法に従って調製した。化合物６５は、アルミナ上の調製用ＴＬＣ（１．５ｍｍプレート、ＣＨ２Ｃｌ２中の４％メタノールで２回溶出）と、ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサンによる沈殿（析出）により精製し、黄色の固体（２．７ｍｇ、収率１２％）を取得した。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度８５％以上、ｍ／ｚ５０６［Ｍ＋１］＋。
【０１９０】
実施例５６
2008513485.tif 000172
化合物６３（３００ｍｇ、０．５２３ｍｍｏｌ）を純粋のトリフルオロ酢酸（２ｍｌ）に懸濁した。混合物を数分間、約５０℃で攪拌し、揮発性成分を真空下に除去した。ＭｅＣＮ（５ｍｌ）を添加し、これをＥｔ２Ｏ（２００ｍｌ）で粉砕した。化合物６６は、調製用ＨＰＬＣで精製し、蒸発後、ＴＦＡの複塩として単離した（２１５ｍｇ、収率５９％）。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％以上、ｍ／ｚ４７４［Ｍ＋１］＋。
【０１９１】
実施例５７
2008513485.tif 000173
化合物５７（２０ｍｇ）は、ＮＭＰ（０．２ｍｌ）とラセミ体のピペリジン−３−イルメタノール（０．２ｍｌ）中に懸濁した。混合物を２００℃、１５分間、マイクロ波加熱した。調製用ＨＰＬＣで精製後、化合物６７の水／ＭｅＣＮ溶液を真空下に濃縮し、飽和ＮａＨＣＯ３でｐＨを９に調整し、当該化合物をＣＨ２Ｃｌ２で４回抽出した。得られた固体をＥｔＯＡｃ／ヘキサン中で粉末化し、黄褐色の固体としてラセミ体６７を取得した（１３ｍｇ、収率５４％）。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％以上、ｍ／ｚ５０６［Ｍ＋１］＋。
【０１９２】
以下の化合物は、適切なアミン及びフルオロアゾゼンゾフルオレノンを用いて同様の方法にて調製した。反応性の低いアミンを用いる場合は、２２０℃で２０分間反応した。
2008513485.tif 000174
2008513485.tif 000175
2008513485.tif 000176
2008513485.tif 000177
【０１９３】
下記化合物を、適当なアミン及びクロロ  アザベンゾフルオレノンを用いて、同様の方法により調製した。反応については、１００℃で５分間又は１５０℃で３分間、マイクロ波の加熱を用いて行った。
2008513485.tif 000178
【０１９４】
実施例５８
2008513485.tif 000179
クロロエステル（１．０ｇ、２．８１ｍｍｏｌ）及び１−（２−アミノエチル）ピロリジン（1-(2-aminoethyl)pyrrolidne）（０．５０ｇ、４．４ｍｍｏｌ）を含む塩化メチレン（２０ｍＬ）の溶液に、塩化アルミニウム（５８５ｍｇ、４．４ｍｍｏｌ）を加え、得られた反応液を、室温で４時間撹拌しておいた。その後反応液について、ロッシェル塩（Rochelle's salt）の飽和溶液を用いて反応を停止させ、この反応液を、１Ｎ  ＮａＯＨを用いて塩基性に保ち、更なる時間撹拌した。得られた混合物について、塩化メチレンを用いて抽出を行い、得られたものを、硫酸マグネシウムを通じて乾燥させ、溶媒を、真空下で除去した。生じた粗固体を、酢酸エチルからトリチュレート（triturate）して、クロロアミドを、黄褐色（tan）固体（０．５ｇ、１．１ｍｍｏｌ）として得た；ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ４３７［Ｍ＋１］＋。
【０１９５】
実施例５９
2008513485.tif 000180
クロロエステル（１．０ｇ、２．８１ｍｍｏｌ）を含むＮ−メチルピロリジノン（１０ｍＬ）の溶液に、Ｎ−アセチルピペラジン（５４０ｍｇ、４．２ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を、１１０℃で４時間加熱した。水を加え、粗生成物を、濾過により集めた。生じた固体を、塩化メチレンに溶解させ、硫酸ナトリウムを通じて乾燥させ、溶媒を、真空下で除去した。生じた粗固体を、酢酸エチルからトリチュレートして（triturate）、アミノステルを、黄褐色固体（０．７０ｇ、１．６２ｍｍｏｌ）として得た；ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ４３４［Ｍ＋１］＋。
【０１９６】
実施例６０
2008513485.tif 000181
クロロエステル（１．０ｇ、２．８１ｍｍｏｌ）を含むＮ−メチルピロリジノン（１０ｍＬ）の溶液に、Ｎ−アセチルピペラジン（５４０ｍｇ、４．２ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を、１１０℃で４時間加熱した。水を加え、粗生成物を、濾過により集めた。生じた固体を、塩化メチレンに溶解させ、硫酸ナトリウムを通じて乾燥させ、溶媒を、真空下で除去した。生じた粗固体を、酢酸エチルからトリチュレートして、アミノステルを、黄褐色固体（０．７５ｇ、１．６７ｍｍｏｌ）として得た；ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ４５１［Ｍ＋１］＋。
【０１９７】
実施例６１
2008513485.tif 000182
下記手順を用いて、類似体のライブラリを作成した。
【０１９８】
アミノエステル（２００ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）及び１−（２−アミノエチル）ピロリジン（1-(2-aminoethyl)pyrrolidne）（８０ｍｇ、１．５当量）を含む塩化メチレン（３ｍＬ）の溶液に、塩化アルミニウム（１００ｍｇ、１．５当量）を加え、得られた反応液を、室温で４時間撹拌しておいた。その後反応液について、ロッシェル塩の飽和溶液を用いて反応を停止させ、この反応液を、１Ｎ  ＮａＯＨを用いて塩基性に保ち、更なる時間撹拌した。得られた混合物について、塩化メチレンを用いて抽出を行い、得られたものを、硫酸マグネシウムを通じて乾燥させ、溶媒を、真空下で除去した。生じた粗固体を、質量選択的ＬＣＭＳ（mass selective LCMS）により精製すると、アミドが、白色固体（７１ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）として生じた；ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ５０２［Ｍ＋１］＋。
【０１９９】
実施例６２
2008513485.tif 000183
下記手順を用いて、類似体のライブラリを作成した。
【０２００】
アミノエステル（２００ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）及び１−（２−アミノエチル）ピロリジン（８０ｍｇ、１．５当量）を含む塩化メチレン（３ｍＬ）の溶液に、塩化アルミニウム（１００ｍｇ、１．５当量）を加え、得られた反応液を、室温で４時間撹拌しておいた。その後反応液について、ロッシェル塩の飽和溶液を用いて反応を停止させ、この反応液を、１Ｎ  ＮａＯＨを用いて塩基性に保ち、更なる時間撹拌した。得られた混合物について、塩化メチレンを用いて抽出を行い、得られたものを、硫酸マグネシウムを通じて乾燥させ、溶媒を、真空下で除去した。生じた粗固体を、質量選択的ＬＣＭＳにより精製すると、アミドが、白色固体（２００ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）として生じた；ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ５１９［Ｍ＋１］＋。
【０２０１】
実施例６３
2008513485.tif 000184
下記手順を用いて、類似体のライブラリを作成した。
【０２０２】
クロロアミド（３５０ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）を含むＮ−メチルピロリジノン（２ｍＬ）の溶液に、Ｎ−アセチルピペラジン（１６０ｍｇ、１．２４ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を、１１０℃で４時間加熱した。水を加え、粗生成物を、濾過により集めた。生じた固体を、塩化メチレンに溶解させ、硫酸ナトリウムを通じて乾燥させ、溶媒を、真空下で除去した。生じた粗固体を、酢酸エチルからトリチュレートして、アミドを、白色固体（２００ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）として得た；ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９８％、ｍ／ｚ  ５１６［Ｍ＋１］＋。
【０２０３】
実施例６４
2008513485.tif 000185
４−メトキシ−２−（メチルチオ）ピリミジン−５−カルボン酸。４−クロロ−２−（メチルチオ）ピリミジン−５−カルボン酸エチル（２４．４０ｇ、１０４．９ｍｍｏｌ）を含むＭｅＯＨ（１２５ｍＬ）の溶液に、室温で固体ナトリウムメトキシド（１１．４０ｇ、２１１．０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応混合物を、室温で５時間撹拌し、その後、ＮａＯＨ（１７．７０ｇ、３１５．５ｍｍｏｌ）を含むＨ２Ｏ（１００ｍＬ）で処理した。その後同じ温度で更に１時間撹拌を行った。反応混合物を、その体積の半分まで濃縮し、その後ＨＣｌ（６Ｎ）を用いてｐＨ＝４に酸性化させた。反応液について、ＥｔＯＡｃ（５×２００ｍＬ）を用いて抽出を行い、有機層を、ブライン（brine）（２００ｍＬ）を用いて洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４を通じて乾燥させ、濃縮して、望ましい生成物を、白色固体（１９．２８ｇ、９２％）として得た。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２０１（ＭＨ＋）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：８．７２（ｓ，１Ｈ）、３．９８（ｓ，３Ｈ）、２．５４（ｓ，３Ｈ）。
【０２０４】
実施例６５
2008513485.tif 000186
３−（４−メトキシ−２−（メチルチオ）ピリミジン−５−イル）−３−オキソプロパン酸エチル。４−メトキシ−２−（メチルチオ）ピリミジン−５−カルボン酸（１０．９２ｇ、５４．６ｍｍｏｌ）及び塩化オキサリル（１９．０ｍＬ、２１７．８ｍｍｏｌ）を含むトルエン（１００ｍＬ）の溶液を、１００℃で１時間加熱した。溶媒を、減圧下で除去し、粗酸塩化物を、精製しないで、次の工程で用いた。ＭｇＣｌ２（７．８０ｇ、８１．９ｍｍｏｌ）及びマロン酸エチルマグネシウム（ethyl magnesium malonate）（１４．１０ｇ、８２．６ｍｍｏｌ）を含むＴＨＦ（１００ｍＬ）の溶液に、０℃で前記酸塩化物を含むＴＨＦ（１００ｍＬ）、次いでＴＥＡ（１５．０ｍＬ、１０７．６ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応混合物を、０℃で３０分間、その後室温で２時間撹拌した。ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）及びＨ２Ｏ（１００ｍＬ）を加え、更に３０分間撹拌した。層を分離し、有機層を、ブライン（１００ｍＬ）を用いて洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４を通じて乾燥させ、濃縮した。粗製物を、フラッシュクロマトグラフィー（１５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製すると、望ましい化合物が、白色固体（７．７３ｇ、５２％）として生じた。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２７１（ＭＨ＋）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１２．６５（ｓ，１Ｈｘ２／３）、８．８５（ｓ，ｌＨｘｌ／３）、８．８４（ｓ，１Ｈｘ２／３）、６．０３（ｓ，１Ｈｘ２／３）、４．２６（ｑ，２Ｈｘ２／３）、４．１９（ｑ，２Ｈｘｌ／３）、４．１０（ｓ，３Ｈｘ２／３）、４．０９（ｓ，３Ｈｘｌ／３）、３．９２（ｓ，２Ｈｘｌ／３）、２．６０（ｓ，３Ｈｘｌ／３）、２．５９（ｓ，３Ｈｘ２／３）、１．３４（ｔ，３Ｈｘ２／３）、１．２６（３Ｈｘｌ／３）。
【０２０５】
実施例６６
2008513485.tif 000187
２−（４−メトキシ−２−（メチルチオ）ピリミジン−５−カルボニル）−３，３−ビス（メチルチオ）アクリル酸エチル。３−（４−メトキシ−２−（メチルチオ）ピリミジン−５−イル）−３−オキソプロパン酸エチルを含むＤＭＦ（８５ｍＬ）の溶液に、−５℃でヨウ化メチル（５．３ｍＬ、８５．１ｍｍｏｌ）、二硫化炭素（２．６ｍＬ、４３．０ｍｍｏｌ）を加えた。固体Ｋ２ＣＯ３を、内部温度を−３℃以下に保ちながら、ゆっくりと加えた。得られた反応混合物を、−５℃で１時間、その後室温で１時間撹拌した。それを、ＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）を用いて希釈し、Ｈ２Ｏ（２×２００ｍＬ）を用いて洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４を通じて乾燥させた。溶媒を、減圧下で除去し、粗製物を、フラッシュクロマトグラフィー（２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製すると、望ましい生成物が、黄色油状物（７．６０ｇ、７１％）として生じた。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３７５（ＭＨ＋）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：８．８２（ｓ，１Ｈ）、４．１６（ｑ，２Ｈ）、４．０３（ｓ，３Ｈ）、２．６１（ｓ，３Ｈ）、２．５１（ｂｒｓ，３Ｈ）、２．２８（ｂｒｓ，３Ｈ）、１．１５（ｔ，３Ｈ）。
【０２０６】
実施例６７
2008513485.tif 000188
２−メチルスルファニル−５−オキソ−５Ｈ−７−チア−１，３，１１ｂ−トリアザ−ベンゾ［ｃ］フルオレン−６−カルボン酸エチルエステル。２−（４−メトキシ−２−（メチルチオ）ピリミジン−５−カルボニル）−３，３−ビス（メチルチオ）アクリル酸エチル（４７５ｍｇ、１．２７ｍｍｏｌ）及び２−アミノベンゼンチオール（２００ｍｇ、１．６０ｍｍｏｌ）を含むトルエン（５ｍＬ）の溶液を、加熱乾固し、１４０℃で１時間、生のままで加熱し続けた。反応液に、トルエン（３０ｍＬ）及びＫ２ＣＯ３（３５０ｍｇ、２．５３ｍｍｏｌ）を加え、更に１時間加熱した。反応混合物を、室温まで冷却し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）及びＨ２Ｏ（５０ｍＬ）を、加えた。層を分離し、有機層を、ブライン（１００ｍＬ）を用いて洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４を通じて乾燥させ、濃縮した。粗固体を、Ｅｔ２Ｏ中でトリチュレートして、望ましい生成物を、黄色固体（２６０ｍｇ、５５％）として得た。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３７２（ＭＨ＋）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：９．３７（ｄ，１Ｈ）、９．３０（ｓ，１Ｈ）、８．０６（ｍ，１Ｈ）、７．６５（ｍ，１Ｈ）、７．５４（ｍ，１Ｈ）、４．３５（ｑ，２Ｈ）、２．７８（ｓ，３Ｈ）、１．３４（ｔ，３Ｈ）。
【０２０７】
実施例６８
2008513485.tif 000189
２−メチルスルファニル−５−オキソ−５Ｈ−７−チア−１，３，１１ｂ−トリアザ−ベンゾ［ｃ］フルオレン−６−カルボン酸（２−シクロペンチル−エチル）−アミド。２−メチルスルファニル−５−オキソ−５Ｈ−７−チア−１，３，１１ｂ−トリアザ−ベンゾ［ｃ］フルオレン−６−カルボン酸エチルエステル（２３０ｍｇ、０．６１９ｍｍｏｌ）及び２−（ピロリジン−１−イル）エタンアミン（０．２４ｍＬ、１．８５４ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（１５ｍＬ）の溶液に、室温で固体ＡｌＣｌ３（２５０ｍｇ、１．８７５ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応液を、室温で１時間撹拌し、ＤＣＭ（１００ｍＬ）、濃酒石酸ナトリウムカリウム（３０ｍＬ）、及びＮａＯＨ（６Ｎ、１０ｍＬ）を用いて希釈した。混合物を、１５分間撹拌し、層を、分離した。水層について、ＤＣＭ（５０ｍＬ）を用いて抽出を行い、合わせた有機層を、ブライン（５０ｍＬ）を用いて洗浄した。粗反応混合物を、Ｎａ２ＳＯ４を通じて乾燥させ、濃縮して、望ましい生成物を、黄色固体（２５０ｍｇ、９２％）として得た。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４０（ＭＨ＋）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１０．２６（ｂｒ，１Ｈ）、９．６１（ｓ，１Ｈ）、９．５５（ｍ，１Ｈ）、７．７７（ｍ，１Ｈ）、７．５７（ｍ，１Ｈ）、７．５０（ｍ，１Ｈ）、３．６７（ｑ，２Ｈ）、２．８１（ｓ，３Ｈ）、２．７７（ｔ，２Ｈ）、２．６３（ｍ，４Ｈ）、１．８２（ｍ，４Ｈ）。
【０２０８】
実施例６９
2008513485.tif 000190
２−（４−アセチル−ピペラジン−１−イル）−５−オキソ−５Ｈ−７−チア−１，３，１１ｂ−トリアザ−ベンゾ［ｃ］フルオレン−６−カルボン酸（２−ピロリジン−１−イル−エチル）−アミド。２−メチルスルファニル−５−オキソ−５Ｈ−７−チア−１，３，１１ｂ−トリアザ−ベンゾ［ｃ］フルオレン−６−カルボン酸（２−シクロペンチル−エチル）−アミド（２５ｍｇ、０．０５７ｍｍｏｌ）及び１−（ピペラジン−１−イル）エタノン（７５ｍｇ、０．５８５ｍｍｏｌ）を含むＮＭＰ（１．０ｍＬ）の溶液を、マイクロ波で２００℃２０分間加熱した。粗反応混合物を、逆相ＨＰＬＣにより精製した。ＭＳ（ｍ／ｚ）：５２０（ＭＨ＋）。
【０２０９】
実施例７０
2008513485.tif 000191
７−メチル−２−メチルスルファニル−５，８−ジオキソ−７，８−ジヒドロ−５Ｈ−１，３，７，１２ｂ−テトラアザ−ベンゾ［ｃ］フェナントレン−６−カルボン酸エチルエステル。２−（４−メトキシ−２−（メチルチオ）ピリミジン−５−カルボニル）−３，３−ビス（メチルチオ）アクリル酸エチル（７７５ｍｇ、２．０６９ｍｍｏｌ）及び２−アミノ−Ｎ−メチルベンズアミド（４７５ｍｇ、３．１６３ｍｍｏｌ）を含むトルエン（５ｍＬ）の溶液を、窒素流中、トルエンを蒸発させながら、加熱し、１４０℃で一晩、生のままで加熱し続けた。室温まで冷却し、ＤＣＭ（１０ｍＬ）から析出物を形成し、これを、濾過・除去した。母液の溶媒を、減圧下で除去し、Ｅｔ２Ｏ（１０ｍＬ）を用いて析出工程を繰り返した。メタノール中でのトリチュレーション（trituration）により、望ましい生成物を、黄色固体（３０ｍｇ、４％）として得た。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３９７（ＭＨ＋）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：９．３７（ｓ，１Ｈ）、８．３７（ｄ，１Ｈ）、８．２６（ｄｄ，１Ｈ）、７．７０（ｍ，１Ｈ）、７．４９（ｍ，１Ｈ）、４．４６（ｑ，２Ｈ）、３．６１（ｓ，３Ｈ）、２．６０（ｓ，３Ｈ）、１．４３（ｔ，３Ｈ）。
【０２１０】
実施例７１
2008513485.tif 000192
２−メチルスルファニル−５，８−ジオキソ−７，８−ジヒドロ−５Ｈ−１，３，７，１２ｂ−テトラアザ−ベンゾ［ｃ］フェナントレン−６−カルボン酸エチルエステル。２−（４−メトキシ−２−（メチルチオ）ピリミジン−５−カルボニル）−３，３−ビス（メチルチオ）アクリル酸エチル（２５０ｍｇ、０．６６８ｍｍｏｌ）及び２−アミノベンズアミド（１１８ｍｇ、０．８６７ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液を、窒素流中、ＤＣＭを蒸発させながら、加熱し、１４０℃で一晩、生のままで加熱し続けた。残滓を、室温まで冷却した後、ＤＭＦに溶解させ、ＮａＨ（６０ｍｇ、１．５００ｍｍｏｌ）で処理した。反応液を、室温で１時間撹拌し、ＤＣＭ（２０ｍＬ）及びＨ２Ｏ（２０ｍＬ）を用いて希釈した。層を分離し、ＤＣＭを、減圧下で除去した。粗製物を、Ｅｔ２Ｏ（１０ｍＬ）中でトリチュレートして、望ましい生成物を、黄色固体（５０ｍｇ、２０％）として得た。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３８３（ＭＨ＋）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１３．５８（ｂｒｓ，１Ｈ）、９．４３（ｓ，１Ｈ）、８．６０（ｄ，１Ｈ）、８．３３（ｄｄ，１Ｈ）、７．７９（ｍ，１Ｈ）、７．５９（ｍ，１Ｈ）、４．４８（ｑ，２Ｈ）、２．６２（ｓ，３Ｈ）、１．４６（ｔ，３Ｈ）。
【０２１１】
実施例７２
2008513485.tif 000193
前記物質を、わずかに変更した公知の手順（J. Med. Chem. 2003, 46, 1661-1669）に従って調製した。窒素雰囲気下、２−アミノベンジルアミン（２．０当量、２．４５ｇ、２０．０５ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（２５ｍｌ）に溶解させた。ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（１．０当量、２．１９ｇ、１０．０３ｍｍｏｌ）を含むＴＦＨ（２５ｍＬ）の溶液を、３０分間かけてシリンジポンプ（syringe pump）によってゆっくりと加えた。数分後、粘性の懸濁液（thick suspension）を十分に撹拌することができるように過剰のＴＨＦ（２５ｍｌ）を加えた。室温で一晩撹拌した後、このようにして形成した白色固体を、濾過・除去した。濾液を、真空濃縮し、シリカゲルカラムの上部に注ぎ、クロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃのヘキサンにおける１０から２０％  勾配）により精製した。生じた固体を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン中で再結晶させると、白色結晶性固体（１．９５ｇ、Ｂｏｃ２Ｏを基準に収率８７％）が生じた。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ２２４［Ｍ＋Ｈ］＋、２４５［Ｍ＋Ｎａ］＋；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ  １．４４（ｓ，９Ｈ）、４．２３（ｄ，Ｊ＝６．０，２Ｈ）、４．２（ｂｒｓ，２Ｈ）、４．８０（ｂｒｓ，１Ｈ）、６．６８（ｔ，Ｊ＝７．６，２Ｈ）、７．０２（ｄ，Ｊ＝６．８，１Ｈ）、７．１０（ｄｔ，Ｊ＝８．０，Ｊ＝１．６，１Ｈ）ｐｐｍ。
【０２１２】
実施例７３
2008513485.tif 000194
化合物１（１．２２ｇ、５．４９ｍｍｏｌ）及び２（２．０１ｇ、５．４９ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（１０ｍｌ）の混合物を、溶液への窒素の通気をしつづけながら、８０℃で５時間撹拌した。Ｋ２ＣＯ３（１．２当量、９１０ｍｇ、６．５８ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を、８０℃で４０分間撹拌した。水を加え、生じたゴム質の物質について、ＣＨ２Ｃｌ２（３×）を用いて抽出を行った。合わせた抽出物を、水（１×）を用いて洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４を通じて乾燥させ、揮発性のものを、真空下で除去して、粘性油状物（thick oil）（３．２ｇの溶媒含有物質、収率＞１００％）を得た。得られた物質は、純度８５％を超えるものであり、如何なる精製も更に行わずに、下記の工程のために用いた。キャラクタリゼーションのため、わずか一部を、調製用ＨＰＬＣにより精製した。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ５０４［Ｍ］＋、５０６［Ｍ＋２］＋；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ  １．３８（ｓ，９Ｈ）、１．４０（ｍ，３Ｈ）、２．３２（ｓ，３Ｈ）、３．９３（ｄｄ，Ｊ＝１５．２，Ｊ＝５．５，１Ｈ）、４．２４（ｄｄ，Ｊ＝１４．８，Ｊ＝４．２，１Ｈ）、４．４３（ｍ，２Ｈ）、４．８４（ｂｒｔ，１Ｈ）、７．１５（ｍ，１Ｈ）、７．２９（ｍ，１Ｈ）、７．４５（ｍ，１Ｈ）、７．５７（ｍ，２Ｈ）、８．６１（ｄ，Ｊ＝８．８，１Ｈ）ｐｐｍ。
【０２１３】
実施例７４
2008513485.tif 000195
化合物３（１．５ｇ、２．９８ｍｍｏｌ）を、５ｍｌのトリフルオロ酢酸に溶解させた。得られた混合物を、室温で２時間撹拌した。揮発性のものを、真空下で除去し、生じた粘性油状物を、真空下に保ちながら、ヒートガン（heat gun）を用いて加熱した。この操作を、環化による４の形成が完了するまで（ＬＣＭＳモニタリング）続けた。得られた化合物を、シリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃのヘキサンにおける３０から８０％  勾配）によって精製した。溶媒の濃縮により析出した固体を、濾過し、乾燥させて、化合物４を、白色微結晶性固体（４３４ｍｇ、収率４１％）を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ３５６［Ｍ＋Ｈ］＋、３７８［Ｍ＋Ｎａ］＋、３１０［Ｍ＋１−ＥｔＯＨ］＋；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ  １．４３（ｔ，Ｊ＝６．８，３Ｈ）、４．４０（ｑ，Ｊ＝７．２，２Ｈ）、４．４６（ｄ，Ｊ＝２．４，２Ｈ）、７．２４−７．４０（ｍ，４Ｈ）、７．６９（ｄ，Ｊ＝８．４，１Ｈ）、８．６２（ｄ，Ｊ＝８．０，１Ｈ）、１０．７４（ｂｒｓ，１Ｈ）ｐｐｍ。
【０２１４】
実施例７５
2008513485.tif 000196
化合物４（１．０当量、１９８ｍｇ、０．５５６ｍｍｏｌ）及びＫ２ＣＯ３（２．０当量、１５４ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１．５ｍｌ）に懸濁させた。ヨードメタン（１．４当量、０．０５ｍｌ、０．８０ｍｍｏｌ）を、加え、得られた混合物を、７０℃で４５分間撹拌した。水を加え、物質を、ＣＨ２Ｃｌ２（３×）を用いて抽出した。合わせた抽出物を、水を用いて洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４を通じて乾燥させ、揮発性のものを、真空下で除去した。シリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃのヘキサンにおける４０から８０％  勾配）によって精製した後、化合物５を、オフホワイトの固体（１８１ｍｇ、収率８８％）として単離した。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ３７０［Ｍ＋Ｈ］＋、３２４［Ｍ＋１−ＥｔＯＨ］＋；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ  １．４１（ｔ，Ｊ＝７．２，３Ｈ）、３．１７（ｓ，３Ｈ）、４．２９（ｓ，２Ｈ）、４．４１（ｑ，Ｊ＝７．２，２Ｈ）、７．２７（ｄ，Ｊ＝７．２，１Ｈ）、７．３３（ｔ，Ｊ＝７．６，１Ｈ）、７．３６（ｄ，Ｊ＝８．４，１Ｈ）、７．３９（ｔｄ，Ｊ＝７．２，Ｊ＝１．２，１Ｈ）、７．５７（ｄ，Ｊ＝８．４，１Ｈ）、８．６１（ｄ，Ｊ＝８．４，１Ｈ）ｐｐｍ。
【０２１５】
実施例７６
2008513485.tif 000197
化合物４（１．０当量、１０４ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦに懸濁させた。ＤＤＱ（１．１当量、７３ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を含むＴＨＦ（１ｍｌ）の溶液を、滴下し、生じた混合物を、７０℃で２４時間撹拌した。１Ｎ  ＮａＯＨの水溶液を加え、得られた溶液について、ＣＨ２Ｃｌ２（４×）を用いて抽出を行った。合わせた抽出物を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を用いて洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４を通じて乾燥させ、溶媒を、真空下で除去した。化合物を、調製用ＨＰＬＣ（ＭｅＣＮ／水）により精製した。ＭｅＣＮを蒸発させ、ＮａＨＣＯ３を加え、物質を、ＣＨ２Ｃｌ２（４×）を用いて抽出した。合わせた抽出物を、Ｎａ２ＳＯ４を通じて乾燥させ、溶媒を、真空下で除去して、６を、オフホワイトの固体（１８ｍｇ、収率１７％）として得た。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ３７２［Ｍ＋Ｈ］＋、３２６［Ｍ＋１−ＥｔＯＨ］＋；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ  １．４４（ｔ，Ｊ＝６．８，３Ｈ）、４．４２（ｑ，Ｊ＝７．２，２Ｈ）、６．０１（ｄ，Ｊ＝４．４，１Ｈ）、７．４−７．５５（ｍ，４Ｈ）、７．９８（ｄ，Ｊ＝８．８，１Ｈ）、８．６４（ｄ，Ｊ＝８．４，１Ｈ）、１１．５３（ｂｒｓ，１Ｈ）ｐｐｍ。
【０２１６】
実施例７７
2008513485.tif 000198
化合物６（８ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）を、ジオキサン（０．５ｍｌ）に懸濁させた。濃ＨＣｌ水溶液を１滴加え、生じた黄色溶液を、室温で撹拌した。２時間後、濃ＨＣｌを追加で１滴加え、溶液に、いくらかの空気を通気した。溶液を、室温で２４時間撹拌した。溶媒を、真空下で除去し、ＮＭＰを加え、化合物を、調製用ＨＰＬＣ（ＭｅＣＮ／水）により精製した。アセトニトリルを蒸発させ、生成物について、ＣＨ２Ｃｌ２（３×）を用いて抽出を行い、合わせた抽出物を、Ｎａ２ＳＯ４を通じて乾燥させた。溶媒を、除去して、７を、固体（５ｍｇ、収率６２％）として得た。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ３７０［Ｍ＋Ｈ］＋、３９２［Ｍ＋２３］＋、３２４［Ｍ＋１−ＥｔＯＨ］＋；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）δ  １．４６（ｔ，Ｊ＝７．２，３Ｈ）、４．４８（ｑ，Ｊ＝７．２，２Ｈ）、７．５２（ｄ，Ｊ＝８．０，１Ｈ）、７．５８（ｔ，Ｊ＝６．８，１Ｈ）、７．８１（ｄｔ，Ｊ＝６．８，Ｊ＝１．６，１Ｈ）、８．３３（ｄｄ，Ｊ＝７．６，Ｊ＝１．２，１Ｈ）、８．５６（ｄ，Ｊ＝８．８，１Ｈ）、８．７０（ｄ，Ｊ＝８．０，１Ｈ），１３．５８（ｂｒｓ，１Ｈ）ｐｐｍ。
【０２１７】
実施例７８
2008513485.tif 000199
化合物４（１．０当量、２１８ｍｇ、０．６１３ｍｍｏｌ）及びＫ２ＣＯ３（２．０当量、１６９ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１．５ｍｌ）に懸濁させた。ヨードメタン（１．２当量、０．０５９ｍｌ、０．７４ｍｍｏｌ）を、加え、得られた混合物を、７０℃で３５分間撹拌した。水を加え、物質を、ＣＨ２Ｃｌ２（４×）を用いて抽出した。合わせた抽出物を、Ｎａ２ＳＯ４を通じて乾燥させ、揮発性のものを、真空下で除去した。調製用ＨＰＬＣによって精製した後、生じたＭｅＣＮ／水  溶液のｐＨを、ＮａＨＣＯ３を加えることによって調整し、ＭｅＣＮを、蒸発させた。物質を、ＣＨ２Ｃｌ２を用いて抽出し、合わせた抽出物を、Ｎａ２ＳＯ４を通じて乾燥させた。ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサンを用いる析出により、８が、オフホワイトの固体（７７ｍｇ、収率３３％）として生じた。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ３８４［Ｍ＋Ｈ］＋、４０６［Ｍ＋Ｎａ］＋、３３８［Ｍ＋１−ＥｔＯＨ］＋。
【０２１８】
実施例７９
2008513485.tif 000200
化合物４（１．０当量、１１０ｍｇ、０．３０９ｍｍｏｌ）及びＮ−アセチルピペラジン（４．０当量、１５８ｍｇ、１．２３３ｍｍｏｌ）を、ＮＭＰ（０．３ｍｌ）と混合し、生じた溶液を、マイクロ波により１００℃で５分間加熱した。ＥｔＯＡｃとヘキサンとの混合物を加え、生じた固体を、濾過し、乾燥させた。化合物９を、オフホワイトの固体（１４５ｍｇ、収率１００％）として単離した。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ４４８［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０２１９】
実施例８０
2008513485.tif 000201
化合物９の調製のために使用した手順に従って、化合物１０を調製した。化合物１０を、オフホワイトの固体（１４７ｍｇ、収率７０％）として単離した。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ４６２［Ｍ＋Ｈ］＋、４１６［Ｍ＋Ｈ−ＥｔＯＨ］＋。
【０２２０】
実施例８１
2008513485.tif 000202
化合物９（１．０当量、１３１ｍｇ、０．２９３ｍｍｏｌ）及び１−（２−アミノエチル）ピロリジン（１．５当量、０．０５ｍｌ、０．３９４ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）と混合した。ＡｌＣｌ３（２．０当量、８０ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）を加え、生じた溶液を、室温で激しく撹拌した。３時間後、０．１ｍｌの１−（２−アミノエチル）ピロリジンを追加で加え、更に２ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２を加え、得られた反応液を、一晩撹拌した。ＣＨ２Ｃｌ２を真空下で除去した後、生じたスラリーを、飽和酒石酸水溶液で処理し、全ての固形物がなくなるまで（加水分解の完了の約１時間）撹拌した。水を加え、ｐＨを、ＮａＯＨを加えることによって１４に調整した。生成物について、ＣＨ２Ｃｌ２（４×）による抽出を行った。合わせた抽出物を、ブライン（１×）を用いて洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４を通じて乾燥させた。溶媒の除去後、粗製物を、ＮＭＰとトリフルオロ酢酸との混合物に溶解させ、調製用ＨＰＬＣ（ＭｅＣＮ、水）により精製した。ｐＨを、ＮａＯＨを用いて調整し、ＭｅＣＮを蒸発させた後、物質を、ＣＨ２Ｃｌ２を用いて抽出した。Ｎａ２ＳＯ４を通じて乾燥させ、揮発性のものを蒸発させた後、化合物１１を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサンにより析出させ、濾過し、乾燥させて、白色固体（６０ｍｇ、収率４０％）を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ５１６［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０２２１】
実施例８２
2008513485.tif 000203
化合物１１の調製のために使用した手順に従って、化合物１２を調製した。化合物１２を、オフホワイトの固体（２８ｍｇ、収率１７％）として単離した。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ５３０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０２２２】
実施例８３
2008513485.tif 000204
化合物８（１．０当量、７７ｍｇ、０．２０１ｍｍｏｌ）及びＮ−アセチルピペラジン（４．０当量、１０３ｍｇ、０．８０３ｍｍｏｌ）を、ＮＭＰ（０．５ｍｌ）と混合し、マイクロ波により１００℃で１０分間加熱した。水及びブラインを加え、ゴム質の固体を、濾過により単離した。この粗製物を、ＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ、溶液を、Ｎａ２ＳＯ４を通じて乾燥させ、揮発性のものを、真空下で除去した。その後、化合物１１の調製のために使用した手順に従って、粗エステルについて最終反応工程を実施した。化合物１３を、オフホワイトの固体（７ｍｇ、収率６％）として単離した。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９５％、ｍ／ｚ  ５４４［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０２２３】
実施例８４
2008513485.tif 000205
実施例８３において記載した化合物１３の調製のために使用した手順に従って、化合物１４を調製した。化合物１４を、オフホワイトの固体として単離した。ＬＣＭＳ（ＥＳ）：純度９１％、ｍ／ｚ  ５３０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０２２４】
実施例８５
2008513485.tif 000206
２−（４−クロロ−ベンゾチアゾール−２−イル）酢酸エチルを、Ａｂｂｏｔｔｏ、Ｂｒａｄａｍａｎｔｅら（J. Org. Chem. 2002, 16, 5753）の方法により調製した。４−クロロ−２−アミノチオフェノール（６．３６ｇ、４０ｍｍｏｌ）とシアン酢酸エチル（６．８ｇ、６０ｍｍｏｌ）との純粋な混合物（neat mixture）を、１２５℃で、ＴＬＣ分析によって出発原料がないとの判断から反応が終了したことが示された時間である２時間、加熱した。混合物を、ジエチルエーテル及びヘキサンを用いてトリチュレートして、第一バッチ（first batch）で７．９１ｇの黄色結晶を得、第二バッチ（second batch）で０．７５ｇの結晶を得、全部で８．６６ｇ（８５％）の結晶を得た。ＬＣＭＳ：２５６．２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０２２５】
2008513485.tif 000207
２，６−ジクロロピコリン酸（１．８０ｇ、９．５ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（１０ｍＬ）に懸濁させ、塩化オキサリル（１．５３ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を、氷浴中で冷却し、２滴のジメチルホルムアミドを加えた。初期の激しいガス発生（initial vigorous out gassing）の後、氷浴を取り去り、溶液を、室温で１８時間撹拌した。アリコート（aliquot）について、メタノールを用いて反応を停止させ、全ての酸が酸塩化物に転換されたことを示すＬＣＭＳによって分析した。溶液を、ロータリーエバポレーター（rotary evapolater）により濃縮して、酸塩化物を、淡褐色結晶性固体として得た。尚、この結晶性固体を、更に精製しないで、次の工程において使用した。ＬＣＭＳ：２０６．２（メチルエステル  Ｍ＋Ｈ）＋。
【０２２６】
2008513485.tif 000208
テトラヒドロフラン（２５ｍｌ）を、２−（４−クロロ−ベンゾチアゾール−２−イル）酢酸エチル（２．２ｇ、８．６ｍｍｏｌ）と塩化マグネシウム（１．１９ｇ、１２．９ｍｍｏｌ）と先の工程からの２，６−ジクロロピコリニルクロリド（2,6-dichloropicolinyl chloride）との混合物に加えた。生じた懸濁液を、氷浴中で冷却し、トリエチルアミン（２．４ｇ、１７．２ｍｍｏｌ）を、内部温度が、内部熱電対プローブ（internal thermocouple probe）を用いて測定したとき、１０℃を超えないような速度で、滴下した。一旦添加を終了し、氷浴を取り去り、混合物を、室温まで２時間かけて温めながら、撹拌しておいた。反応液を、ジメチルホルムアミド及び炭酸カルシウム（１．１９ｇ、８．６ｍｍｏｌ）を用いて希釈し、８０℃まで、ＬＣＭＳにより反応が終了したことが示された時間である１時間、温めた。反応液を、水を用いて希釈し、濾過した。固体を、ジクロロメタンとクロロホルムとの混合物に溶解させ、水を用いて洗浄し、有機相を、硫酸ナトリウムを通じて乾燥させた。ロータリーエバポレーターにより濃縮した後、生成物を、ジエチルエーテルを用いてトリチュレーションにより精製すると、２．５ｇ（７４％）のジクロロ−エステルがベージュの固体として生じた。ＬＣＭＳ：３９３．２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０２２７】
実施例８６
2008513485.tif 000209
２−（１−メチルピロリジン−２−イル）エチルアミン（２９５ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）を含むジクロロメタン（５ｍｌ）の溶液を、トリメチルアルミニウム（０．９９ｍｌ、ヘキサン中に２５％、２．３７ｍｍｏｌ）で処理した。この溶液を、ジクロロ−エステル  Ａ（６００ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ）及びジクロロメタン（１０ｍｌ）を含む溶液に、内部温度が１０℃を超えないような速度で加えた。溶液を、ＬＣＭＳにより反応が終了したと判断された時間である１８時間撹拌しておいた。反応液を、ロッシェル塩で処理し、得られたものについて、ジクロロメタンを用いて３回抽出を行った。有機抽出物を、硫酸ナトリウムを通じて乾燥させ、残滓を得た。この残滓を、ジクロロメタン及びジエチルエーテルを用いてトリチュレーションにより精製すると、４５０ｍｇ（６２％）のジクロロ−アミド  Ｂが、ベージュの固体として生じた。ＬＣＭＳ：４７５．５（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０２２８】
実施例８７
2008513485.tif 000210
ｂｏｃ−アミン（２５０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）の混合物を、５０℃で２時間、トリフルオロ酢酸（１ｍｌ）及びジクロロメタン（１ｍｌ）で処理することにより脱保護した。生じた残滓を、ロータリーエバポレーター、次いで高真空により濃縮した。この残滓に、ジクロロ−アミド  Ｂ（２００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルピロリジノン（０．８ｍｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（０．５ｍｌ）を加えた。混合物を、８０℃で、ＬＣＭＳにより反応が終了したことが示された時間である７２時間撹拌しておいた。混合物を、水（１０％トリフルオロ酢酸を含むもの）を用いて希釈し、調製用ＨＰＬＣにより精製すると、２８６ｍｇ（９７％）の化合物Ｃが、対応するトリフルオロ酢酸塩として生じた。ＬＣＭＳ：５８８．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０２２９】
実施例８８
この実施例では、静脈投与される以下の試験化合物の活性を評価する。
2008513485.tif 000211
【０２３０】
手法（methodology）
６週齢の雌ｎｕ／ｎｕマウスを、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ、ジャーマンタウン、ＮＹから購入した。これらの右脇腹に、５×１０６  ＨＣＴ１１６細胞をＳＱ注射した。腫瘍が研究にとって十分な大きさに達したとき、これらを、複数の群に無作為に分けた。
媒体：            ２４２．９ｍｍ３
試験化合物：      ２５１．０ｍｍ３
【０２３１】
動物については、側方尾静脈を通じて大量瞬時ＩＶ注射によって５日間連続して投与を行った。ノギス測定を、１、４、６日目に行った。図３は、２５ｍｇ／ｋｇ投与での試験化合物の活性を示すが、如何なる副作用も観察されなかった。
【０２３２】
実施例８９
この実施例では、静脈投与される以下の試験化合物の活性を評価する。
2008513485.tif 000212
【０２３３】
手法
６週齢の雌ｎｕ／ｎｕマウスを、Ｓｉｍｏｎｓｅｎ  Ｌａｂｓ、ギルロイ、ＣＡから購入した。これらの右脇腹に、５×１０６  ＨＣＴ１１６細胞をＳＱ注射した。腫瘍が研究にとって十分な大きさに達したとき、これらを、複数の群に無作為に分けた。
媒体：            １０１．９ｍｍ３
試験化合物：      １５２．８ｍｍ３
【０２３４】
動物については、側方尾静脈を通じて大量瞬時ＩＶ注射によって１４日間連続して投与を行った。ノギス測定を、１、３、５、７、１０、１２、１４、及び１８日目に行った。図４は、１２．５ｍｇ／ｋｇ投与での活性を示すが、如何なる副作用も観察されなかった。
【０２３５】
実施例９０
この実施例では、異なる投与レベルで静脈投与される実施例８９における試験化合物の活性を評価する。
【０２３６】
手法
６週齢の雌ｎｕ／ｎｕマウスを、Ｓｉｍｏｎｓｅｎ  Ｌａｂｓ、ギルロイ、ＣＡから購入した。これらの右脇腹に、５×１０６  ＨＣＴ１１６細胞をＳＱ注射した。腫瘍が研究にとって十分な大きさに達したとき、これらを、複数の群に無作為に分けた。
媒体：            １１４．６ｍｍ３
試験化合物：      １０６．１ｍｍ３
試験化合物：        ８４．１ｍｍ３
【０２３７】
動物については、側方尾静脈を通じて大量瞬時ＩＶ注射によって１４日間連続して投与を行った。ノギス測定を、１、４、６、８、１２、及び１５日目に行った。図５は、投与量依存性の活性（dose dependent activity）を示すが、如何なる副作用も観察されなかった。
【０２３８】
実施例９１
この実施例では、静脈投与される以下の試験化合物の活性を評価する。
2008513485.tif 000213
【０２３９】
手法
６週齢の雌ｎｕ／ｎｕマウスを、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ、ジャーマンタウン、ＮＹから購入した。これらの右脇腹に、５×１０６  ＨＣＴ１１６細胞をＳＱ注射した。腫瘍が研究にとって十分な大きさに達したとき、これらを、複数の群に無作為に分けた。
媒体：            ２４２．９ｍｍ３
試験化合物：      ２５２．１ｍｍ３
【０２４０】
動物については、側方尾静脈を通じて大量瞬時ＩＶ注射によって５日間連続して投与を行った。ノギス測定を、１、４、及び６日目に行った。図６は、２５ｍｇ／ｋｇ投与での試験化合物の活性を示すが、如何なる副作用も観察されなかった。
【０２４１】
実施例９２
この実施例では、静脈投与される以下の試験化合物の活性を評価する。
2008513485.tif 000214
【０２４２】
手法
６週齢の雌ｎｕ／ｎｕマウスを、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ、ジャーマンタウン、ＮＹから購入した。これらの右脇腹に、５×１０６  ＨＣＴ１１６細胞をＳＱ注射した。腫瘍が研究にとって十分な大きさに達したとき、これらを、複数の群に無作為に分けた。
媒体：            ２４２．９ｍｍ３
試験化合物：      ２３６．１ｍｍ３
【０２４３】
動物については、側方尾静脈を通じて大量瞬時ＩＶ注射によって５日間連続して投与を行った。ノギス測定を、１、４、及び６日目に行った。図７は、２５ｍｇ／ｋｇ投与での試験化合物の活性を示すが、如何なる副作用も観察されなかった。
【０２４４】
実施例９３
この実施例では、静脈投与される以下の試験化合物の活性を評価する。
2008513485.tif 000215
【０２４５】
手法
６週齢の雌ｎｕ／ｎｕマウスを、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ、ジャーマンタウン、ＮＹから購入した。これらの右脇腹に、５×１０６  ＨＣＴ１１６細胞をＳＱ注射した。腫瘍が研究にとって十分な大きさに達したとき、これらを、複数の群に無作為に分けた。
媒体：            ２４２．９ｍｍ３
試験化合物：      ２５４．７ｍｍ３
【０２４６】
動物については、側方尾静脈を通じて大量瞬時ＩＶ注射によって５日間連続して投与を行った。ノギス測定を、１、４、及び６日目に行った。図８は、２５ｍｇ／ｋｇ投与での試験化合物の活性を示すが、如何なる副作用も観察されなかった。
【０２４７】
実施例９４
この実施例では、静脈投与される以下の試験化合物の活性を評価する。
2008513485.tif 000216
【０２４８】
手法
６週齢の雌ｎｕ／ｎｕマウスを、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ、ジャーマンタウン、ＮＹから購入した。これらの右脇腹に、５×１０６  ＨＣＴ１１６細胞をＳＱ注射した。腫瘍が研究にとって十分な大きさに達したとき、これらを、複数の群に無作為に分けた。
媒体：            １１２．７ｍｍ３
試験化合物：      １１３．１ｍｍ３          ２５ｍｇ／ｋｇ
試験化合物：      １１０．１ｍｍ３          １２．５ｍｇ／ｋｇ
ＣＰＴ１１：      １０９．４ｍｍ３
【０２４９】
動物については、側方尾静脈を通じて大量瞬時ＩＶ注射によって９日間連続して投与を行った。ノギス測定を、１、３、５、７、及び９日目に行った。図９は、高投与量で限定的な活性があることを示し、中投与量（mid dose）で如何なる活性もないことを示すが、如何なる副作用も観察されなかった。
【０２５０】
実施例９５
この実施例では、静脈投与される以下の試験化合物の活性を評価する。
2008513485.tif 000217
【０２５１】
手法
６週齢の雌ｎｕ／ｎｕマウスを、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ、ジャーマンタウン、ＮＹから購入した。これらの右脇腹に、５×１０６  ＨＣＴ１１６細胞をＳＱ注射した。腫瘍が研究にとって十分な大きさに達したとき、これらを、複数の群に無作為に分けた。
媒体：            １１２．７ｍｍ３
試験化合物：      １０７．１ｍｍ３          ２５ｍｇ／ｋｇ
試験化合物：      １０８．９ｍｍ３          １２．５ｍｇ／ｋｇ
ＣＰＴ１１：      １０９．４ｍｍ３
【０２５２】
動物については、側方尾静脈を通じて大量瞬時ＩＶ注射によって７日間連続して投与を行った。ノギス測定を、１、３、５、及び７日目に行った。図１０は、投与量依存性が最小でありながら、優れた活性を示す。如何なる副作用も観察されなかった。
【０２５３】
実施例９６
細胞増殖及び／又は細胞毒性測定
本発明の化合物の抗増殖性効果を、細胞増殖及び／又は細胞毒性測定を用いて、以下に記載されるプロトコルに従って、テストしてもよい。
【０２５４】
細胞培養
ヒト頚部上皮細胞（Human cervical epithelial cells）（ＨｅＬａ細胞）は、アメリカ培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）（マナッサス、ＶＡ）から得られる。細胞は、２ｍＭ  グルタミン、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸、１ｍＭ  ピルビン酸Ｎａ、１．５ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３、５０ｍｇ／Ｌ  ゲンタマイシン、及び１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳＡ）を追加したＥａｇｌｅの最小必須培地（Eagle's Minimum Essential Medium）（ＭＥＭ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｕｔａｈ）中で、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃で増殖される。
【０２５５】
ＭＴＳアッセイ
抗癌剤の抗増殖性効果は、各種細胞の数を測定するための比色アッセイ（colorimetric assay）であるＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）によってテストされる。（例えば、Wang, L., et al., Methods Cell Sci (1996) 18: 249-255参照）。一般に、細胞（２，０００〜５，０００細胞／ウェル）は、０日目に、如何なる抗癌剤も含まない１００μｌの培地を含む９６ウェルの平板プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に播かれ、当該培地は、１日目に、各種濃度で抗癌剤を含むものと交換される。標準増殖条件下、３日のインキュベートの後（４日目）、単層は、ＰＢＳ中で１回洗浄され、培地は、９６ウェルプレートのぞれぞれにおいて、１００μｌのＰＢＳと交換される。２０：１の割合でＭＴＳとＰＭＳとを混合した後、２０μｌのＭＴＳ／ＰＭＳ溶液が、９６ウェルプレートのそれぞれに加えられ、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃で４時間インキュベートされる。吸光度を、ＦＬＵＯｓｔａｒＧａｌａｘｙ  ９６ウェルプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ドイツ）を用いて４９０ｎｍで読み取る。
【０２５６】
実施例９７
細胞測定におけるｍＲＮＡ値の測定
リアルタイム定量ＰＣＲ（real-time quantitative PCR）（ＱＰＣＲ）法を用いて、標的とするｃ−ｍｙｃ及び内因性参照ＧＡＰＤＨ遺伝子（endogenous reference GAPDH gene）コピーの変化を同一の管で検出してもよい。一般に、細胞（１５，０００細胞／ウェル）は、９６ウェルの平板プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に播かれ、標準増殖条件下で、一晩インキュベートされる。翌日、当該培地は、各種濃度で抗癌剤を含むものと交換され、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃で４時間インキュベートされる。全ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）が、ＲＮｅａｓｙ  ９６  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、ＣＡ）を用いて抽出される。ｔＲＮＡの濃度は、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ  ＲＮＡ定量試薬（RiboGreen RNA Quantitation Reagent）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ＯＲ）によって測定される。
【０２５７】
逆転写（ＲＴ）反応を、１×ＴａｑＭａｎ  ＲＴバッファ、２．５μＭランダム六量体、５．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ各デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、３０Ｕ  ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素（MultiScribe Reverse Transcriptase）、及び１０Ｕ  ＲＮａｓｅ阻害剤を含む２５μｌの反応液を含む各ウェルから５０ｎｇのｔＲＮＡを用いて行ってもよい。ＲＴ反応液は、２５℃で１０分間インキュベートされ、４８℃で３０分間逆転写され、９５℃で５分間不活性化され、４℃で静置される。全てのＲＴ試薬を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡから購入してもよい。
【０２５８】
リアルタイムＱＰＣＲ反応を、５μｌのｃＤＮＡ、１×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、１×ｃ−ｍｙｃ  Ｐｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄプライマー・プローブセット、並びに０．８×ＧＡＰＤＨ  Ｐｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄプライマー・プローブセットを含む５０μｌ反応液中で行ってもよい。Ｈｅｌａ細胞中のＧＡＰＤＨ遺伝子の相対量のため、ＧＡＰＤＨプライマー・プローブの濃度を、同一の管で両方の遺伝子について正確な閾値サイクル数（threshold cycle）（ＣＴ）を得るように、調整してもよい。当該閾値サイクル数（ＣＴ）は、増幅した標的の量が固定した閾値に達したときのサイクル数（fractional cycle number）を示す。そのようにすることで、ｃ−ｍｙｃの増幅に利用できる共通の反応物を限定することが可能になる前に、ＧＡＰＤＨ増幅が停止される。ΔＲｎ値は、標準化レポーターシグナル（normalized reporter signal）からベースラインを差し引いたものを表す。ΔＲｎは、単位複製配列コピー数（amplicon copy number）が増加するにつれて、反応がプラトーに達するまで、ＰＣＲ中、増加する。
【０２５９】
ｃ−ｍｙｃプローブは、６ＦＡＭＴＭ染料−ＭＧＢで標識され、ＧＡＰＤＨプローブは、ＶＩＣＴＭ染料−ＭＧＢで標識される。プレインキュベーションが、ＡｍｐＥｒａｓｅ  ＵＮＧ酵素を活性化するため５０℃で２分間、その後ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを活性化するため９５℃で１０分間行われる。ＤＮＡは、９５℃で１５秒及び６０℃で１分の４０サイクルで増幅される。ヒトｃ−ｍｙｃ及びＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡは、６−ＦＡＭ及びＶＩＣレポーター染料の両方を同時に検出するよう設定されたＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００シーケンスディテクションシステム（ABI Prism 7000 Sequence Detection System）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ）を用いてリアルタイムで増幅、検出及び定量化される
【０２６０】
データを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭシーケンスディテクションシステム（ABI PRISM Sequence Detection System）及びマイクロソフト  エクセル（Microsoft Excel）を用いて解析してもよい。相対的な定量化は、標準曲線と比較ＣＴ法（comparative CT method）とを同時に用いて行われ、両方の方法から同等の結果が得られる。増幅プロットがＣＴと交差するサイクルは、相対的なｍＲＮＡ値を正確に示すことが知られている（Heid, et al., Genome Res. (1996) 6: 986-994；Gibson, et al., Genome. Res. (1996) 6: 995-1001参照）。ＱＰＣＲ反応液は、各ｃＤＮＡサンプルに対して三通り用意され、三通りのＣＴ値の平均をとる。Ｐｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄプライマー・プローブセットを含む全ての試薬を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡから購入してもよい。
【０２６１】
実施例９８
インビトロでのキャラクタリゼーション
本発明の化合物のインビトロでのキャラクタリゼーションのため、ｉ）ストップアッセイ（stop assays）；ii）四本鎖／二本鎖競合アッセイ（quadruplex/duplex competition assay）；iii）クアドローマフットプリント（quadrome footprints）及び；iv）競合分子の非存在下での直接アッセイ（direct assay）等であるがこれらに限定されない各種方法を用いてもよい。
【０２６２】
ストップアッセイ（Stop Assays）
ストップアッセイは、標的とするＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造（G-quadruplex）と結合しこれを安定化する薬剤を検出するための高処理量の（high throughput）、初回通過選別法（first-pass screens）である。一般に、ＤＮＡテンプレートオリゴヌクレオチドが作成されるが、これは、薬剤スクリーニングが望ましい「標的とする（target）」四本鎖（quadruplex）のヌクレオチドシーケンスを含む。蛍光標識したプライマーＤＮＡは、その後テンプレートＤＮＡの３’末端にアニールされる。その後Ｔａｑポリメラーゼ等のＤＮＡポリメラーゼが導入されて、蛍光標識したプライマーから伸長することによりＤＮＡの相補鎖が合成される。Ｔａｑポリメラーゼの進行が妨害されていないときには、それによりテンプレートの完全長コピーが合成される。２重鎖ＤＮＡと結合するだけでなく４重鎖領域と選択的に結合しない試験薬剤の添加により、完全長産物の合成が減少すると同時に、各種長さのＤＮＡコピーが増加する。しかしながら、仮に前記試験薬剤が４重鎖と選択的に結合しこれを安定化する場合には、ポリメラーゼの進行は４重鎖についてのみ拘束し、特徴的な「停止産物（Stop Product）」が合成される。
【０２６３】
化合物は、最初に単一の濃度でスクリーニングされ、「成功かどうか（hits）」が投与量の範囲にわたって繰り返しアッセイされて（reassay）、ＩＣ５０値（即ち、１：１の阻害産物（arrest product）／完全長産物比を生ずるために必要である薬剤の濃度）が測定される。これらの産物は、キャピラリー電気泳動法により可視化される。
【０２６４】
４重鎖／２重鎖競合アッセイ（Quadruplex/Duplex Competitor Assay）
２重鎖ＤＮＡを基準として標的とする４重鎖シーケンスに対する化合物の選択性を、競合アッセイ（Competition Assay）（即ち、選択性選別法（selectivity screen））を用いて測定してもよい。この選択性選別法では、ストップアッセイがレポーターシステムとして用られて、外的付加したＤＮＡシーケンスがＤＮＡテンプレートに形成された標的とする４重鎖構造と薬剤の結合において競合する相対的な能力が測定される。例えば、競合物（competitors）は、テンプレートＤＮＡに存在する４重鎖シーケンスと同一であるｃ−ｍｙｃ４重鎖シーケンス；又は複合ゲノム２重鎖ＤＮＡ（complex genomic duplex DNA）に酷似するプラスミドＤＮＡである。各競合物が溶液中で薬剤をよく「吸収する（soak up）」程度は、停止産物の合成量の増加により示される。この方法では、薬剤の標的とする４重鎖及び２重鎖ＤＮＡの両方に対する相対的な結合親和力が、測定される。
【０２６５】
クアドローマフットプリント（Quadrome Footprints）
化合物はまた、異なる発癌遺伝子の範囲を制御する４重鎖制御因子を含む、生物学的な関連性のある他の天然４重鎖構造と結合する能力について評価されてもよい。結果として得られるデータを用いて、クアドローマフットプリント（Quadrome Footprint）が作成される。
【０２６６】
直接相互作用アッセイ（Direct Interaction Assay）
化合物はまた、４重鎖構造を形成することができる核酸と直接相互に作用する能力について評価されてもよい。ここで、前記核酸は、テロメア核酸ではない。当該アッセイは、同一の又は別々の容器中で行われてもよい。例えば、化合物を、各核酸と同一の容器中で接触させてもよい。これに代えて、化合物を、別々の容器でテストされる核酸のそれぞれと別々に接触させてもよい。本願において使用されるテロメア核酸は、染色体の末端で高度に反復した核酸（highly repetitive nucleic acid）の領域を表す。本願において使用されるように、直接相互作用は、競合核酸（competitor nucleic acid）の非存在下で、測定される。
【０２６７】
前記化合物と核酸との間の相互作用を、例えば、結合及び／又は４重鎖安定化を示しているＩＣ５０値を測定することによって、判定してもよい。相互作用の選択性を、例えば、測定したＩＣ５０値を比較することによって判定してもよい。例えば、前記化合物と前記核酸との間での強い相互作用を示すべく最低のＩＣ５０値が用いられてもよいが、相互作用が不十分であることを最高のＩＣ５０値が示してもよい；このようにして、相互作用の選択性が示される。反応産物が、キャピラリー電気泳動法よって特徴づけられてもよい。
【０２６８】
実施例９９
直接相互作用アッセイ（Direct Interaction assay）
一般に、５’−蛍光標識（5'-fluorescent-labeled）（ＦＡＭ）プライマー（Ｐ４５、１５ｎＭ）は、テンプレートＤＮＡ（１５ｎＭ）を含み、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．１ｍＭ  混合デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ’ｓ）を含むＴｒｉｓ−ＨＣＬバッファ（１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）と混合される。当該混合物を９５℃５分間で変性させ、室温まで冷却した後、３７℃で１５分間インキュベートする。室温まで冷却した後、１ｍＭ  ＫＣｌ２及び試験化合物（各種濃度）を加え、混合物を室温で１５分間インキュベートする。
【０２６９】
プライマーの伸長は、１３ｍＭ  ＫＣｌ及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／反応液、Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、７０℃で２０分間インキュベートすることによって行われる。反応は、１μｌの反応混合物を１０μｌ  混合Ｈｉ−Ｄｉホルムアミド（Hi-Di Formamide mixed）及び０．２５μｌ  ＬＩＺ１２０サイズスタンダード（LIZ120 size standard）に加えることによって停止される。当該方法は、初期段階に各種濃度の競合核酸を、プライマー及びテンプレートシーケンスと共に添加して繰り返される。Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造の結合リガンドが先に確立された濃度で加えられて、完全長産物に対して比１：１の停止産物が生成される。各核酸競合物（nucleic acid competitor）のＣＣ５０は、阻害産物の完全長産物に対する比を１：１から１：２に変えるために必要とされる競合物の濃度と定義される。このアッセイのために使用されうる４重鎖の核酸シーケンスを、表４に示す。
表４
2008513485.tif 000218
【０２７０】
実施例１００
チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ４５０）阻害アッセイ
本発明の化合物は、チトクロームＰ４５０アイソザイムに対する潜在的阻害活性（potential inhibitory activity）について評価されてもよい。一般に、５０ｍＭ  リン酸カリウム、ｐＨ７．４、２．６ｍＭ  ＮＡＤＰ＋、６．６ｍＭグルコース  ６−リン酸、０．８Ｕ／ｍＬのグルコース  ６−リン酸デヒドロゲナーゼ及び試験化合物の１：６段階希釈物を含む１００μＬの溶液を含む６つの反応管が、適当なポジティブコントロール阻害剤の１：６段階希釈物の６つの管と共に調製されるであろう。反応は、１００μＬの予め温めておいた酵素／基質溶液を反応管に加えることによって開始される。ゼロ時点のコントロールの反応液は、酵素を失活させるため１００μＬのコファクター溶液に５０μＬのアセトニトリルを加え、その後、１００μＬの酵素／基質溶液を加えることによって調製されるであろう。如何なる阻害剤も含まないコントロールの反応液もまた、調製されてもよい。３７℃での適当なインキュベーションの後、反応は、５０μＬのアセトニトリルの添加によって終結する。反応液は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いてプローブ基質の代謝形態について解析されるであろう。
【０２７１】
実施例１０１
腫瘍抑制における化合物の有効性の評価
ヒト癌腫の胸腺欠損ヌードマウスモデルにおける本発明の化合物の有効性を評価するための典型的な実験は、下記のようにデザインされてもよい。５〜６週齢で２０ｇを超える体重がある雄又は雌の動物（マウス、類似のもの（Sim））（ＮＣＲ、ｎｕ／ｎｕ）が用いられるであろう。動物は、意図的に飼育されるであろうし、研究の最初に実験的に未処置であろう。腫瘍は、注射した細胞又は腫瘍断片の継代の何れかから増殖するであろう。用いられるべき株細胞には、ａｌｉａ  Ｐａｃａ−２、ＨＰＡＣ、Ｈｓ７００Ｔ、Ｐａｎｃ１０．０５、Ｐａｎｃ０２．１３、ＰＬ４５、ＳＷ１９０、Ｈｓ７６６Ｔ、ＣＦＰＡＣ−１及びＰＡＮＣ−１が含まれるが、これらに限定されない。
【０２７２】
細胞移植
０．１ｍｌ培養液にＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、ベッドフォード、ＭＡ）の有り無しで懸濁させた１００万〜１０００万の細胞が、６０の動物の右尾に皮下接種されるであろう。動物につき１回の注射が行われるだけであろう。注射の７〜１４日以内に、腫瘍は、約１．０ｃｍ３の研究用の大きさまで発達するであろう。ごく一部の集団（＜１０／６０）の動物が、検討されるであろう。ドナー及び腫瘍は、連続移植のために使用されるように、１０〜２８日、１．５ｃｍ３の大きさまで増殖されるであろう。
【０２７３】
断片移植
ドナー動物は安楽死され、腫瘍が、無菌技術を用いて外科的に切除され、２ｍｍ３の大きさの断片に切り分けられるであろう。移植されるべき動物は、イソフルランを用いて軽く麻酔をかけられるであろう。移植されるべき部位は、７０％アルコール及びベタジン（betadine）を用いて清浄にされるであろう。ただ一つの断片は、その後外套針（trocar）を用いて皮下移植されるであろう。
【０２７４】
有効性の検討
５０〜６０の腫瘍を有している動物の群は、無作為に分けられるであろう。例えば、典型的な研究では、図５に記載したように、動物は、７の動物を含む３から８の群にそれぞれ無作為に分けられてもよい。
表５
2008513485.tif 000219
＊  媒体／希釈剤
＊＊  タキソール、ＣＰＴ１１及びゲムシタビン等であるが、これらに限定されない市販の抗癌化合物がポジティブコントロールとして使用されるであろう。
【０２７５】
投与手順
化合物は、ＩＰ、ＩＶ（側方尾静脈）又はＰＯを経由して、ＱＤ、ＱＯＤ、Ｑ３Ｄ又は毎週１回投与されるであろう。動物は、群全体にわたって同様に投与する時間を振り分ける規則正しい順序で投与されるであろう。大量瞬時ＩＰ及びＰＯ投与の間、動物は、手で拘束されるであろう。ＩＶ大量瞬時投与又は短期間のＩＶ注入（１分間）の間、動物は、機械的に拘束されるであろうが、鎮静剤を飲まされないであろう。各動物／投与のため、使い捨て滅菌シリンジが使用されるであろう。約１０〜１００ｍｇ／ｋｇ（例えば、約４０ｍｇ／ｋｇ）のゲムシタビン等の化学療法剤と組み合わせた試験化合物も、週に１回のＩＰ投与によって正常にテストされるであろう。
【０２７６】
実施例１０２
最大耐容量の評価
本発明の化合物の最大耐容量（maximum tolerated dose）（ＭＴＤ）を評価するための典型的な実験は、下記のようにデザインされてもよい。動物モデルの選択は、実施例１０１において記載したものと同様である。
【０２７７】
急性毒性研究
１回投与後にＭＴＤを決定するための典型的な研究では、６０の未処置の動物が、例えば、無作為に１０の動物（５の雄と５の雌）を含む群に分けられるであろうし、二つの投与経路を経由して一つの化合物を与えられるか、又はただ一つの投与経路を経由して二つの化合物を与えられるであろう。１回の５０ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ投与は、許容されることが示されており、これが予備的な低い投与量として使用される。経口の研究のための低い投与量は、投射耐容性（projected tolerability）に基づいており、必要に応じて、下方に調整されるであろう。投与レベル、投与容量及び投与溶液濃度の典型的なデザインを、表６に記載する。
表６
2008513485.tif 000220
【０２７８】
亜慢性の研究（SubChronic Studies）
度重なる投与の後に投与量−応答の関係を特徴づけるために典型的な研究では、２５の未処置の動物が、例えば、表７に記載したように、無作為に５の動物を含む群にそれぞれ分けられるであろう。それぞれ２週間の研究により、先の急性毒性研究において収集されたデータから誘導された最適な投与量で、ただ一つの投与経路を経由して一つの化合物のみがテストされるであろう。
表７
2008513485.tif 000221
【０２７９】
投与手順
化合物は、ＩＶ（側方尾静脈）又はＰＯを経由して、ＱＤ、ＱＯＤ、Ｑ３Ｄ又はＱ７Ｄ投与されるであろう。動物は、群全体にわたって同様に投与する時間を振り分ける規則正しい順序で投与されるであろう。ＰＯ投与の間、動物は、手で拘束されるであろう。ＩＶ大量瞬時投与又は短期間のＩＶ注入（１分間）の間、動物は、機械的に拘束されるであろうが、鎮静剤を飲まされないであろう。各動物／投与のため、使い捨て滅菌シリンジが使用されるであろう。
【０２８０】
実施例１０３
薬物動態学的特性の評価
本願における化合物の薬物動態学的特性を評価するための典型的な薬物動態学的研究では、下記のようにデザインされてもよい。雄の動物（マウス、Ｂａｌｂ／ｃマウス又はラット、ＳＤ系ラット）は、５から６週齢である。ラットモデルについては、２００ｇを超える体重があるラットが用いられるであろう。典型的な研究では、２０の動物が、例えば、表８に示したように、無作為に４つの群に分けられるであろう。一つの群は、未処理であり、ベースラインとして用いられるべく扱われるサンプルであろう。他の三つの群には、１回投与量の化合物が、静脈注射により投与されるであろう。
表８
2008513485.tif 000222
【０２８１】
投与手順
化合物は、ＩＶ（側方尾静脈）、ＩＰ又はＰＯを経由して投与されるであろう。動物は、群全体にわたって同様に投与する時間を振り分ける規則正しい順序で投与されるであろう。ＩＰ及びＰＯ投与の間、動物は、手で拘束されるであろう。ＩＶ大量瞬時投与又は短期間のＩＶ注入（１分間）の間、動物は、機械的に拘束されるであろうが、鎮静剤を飲まされないであろう。各動物／投与のため、使い捨て滅菌シリンジが使用されるであろう。
【０２８２】
約０．５ｍｌの血液が、最初の投与より前に、心臓穿刺によって未処置の動物から採取されるであろう。血液サンプル（０．５ｍｌ）は、心臓穿刺によって上記チャートに従う時点毎、群につき二匹の動物から定期的に採取されるであろう。全てのサンプルは、抗凝固剤としてヘパリンリチウムを含む管に入れられ、逆さにすることによって直ちに混合されるであろう。これらのサンプルは、遠心分離機にかけられ、液体窒素で血漿について急速冷凍され、−７０℃以上で貯蔵され、薬剤レベルについて分析されるであろう。
【０２８３】
実施例１０４
肝細胞におけるインビトロ代謝安定性（in vitro Metabolic Stability）の測定
インビトロインキュベーションにおいて肝細胞（ヒト、ラット、イヌ、サル）の存在下で新規化合物（new chemical entity）の安定性を測定する典型的なプロトコルは、下記のようにデザインされてもよい。テスト品は、３７℃で各種時間の間、肝細胞及び適当な培地と共にインキュベートされるであろう。反応混合物については、抽出が行われ、もとの化合物及び予測された代謝産物に対するＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析が行われるであろう。適用できる場合には、半減期が、テスト品の消費のため計算されるであろう。前記半減期値をテスト品について得られる半減期値と比較するため、代謝調節が行われるであろう。代謝調節物は、トルブタミド、デシプラミン及びナロキソンであってもよい。尚、これらは、それぞれ、低インビボクリアランス値、中程度のインビボクリアランス値及び高インビボクリアランス値に対応する薬物動態と定義されている。
【０２８４】
代謝安定性研究
一般に、試験化合物の溶液は、酵素活性の参考（reference）を与えることを意図した代謝調節物のカクテル溶液と共に調製されるであろう。反応は、これらの予め温められた溶液を、肝細胞懸濁液と、及び培地コントロール用液（media control solution）と組み合わせることによって開始されるであろう。コントロールゼロサンプル（control zero sample）は、開始直後にこれらの反応液から得られるであろう。その他のサンプルは、適当な時点に得られうる。各サンプルは、反応を停止させるべく直ちに終結溶液（terminating solution）（ＩＳを含む酸性化したＭｅＣＮ）に入れられるであろう。肝細胞ブランク懸濁液及び試験化合物標準溶液が調製されるであろう。
【０２８５】
試験化合物及び適当なブランクのサンプル並びに標準物質は、慣用のサンプル調製法に付され、タンデム型質量分析と連結したＨＰＬＣを用いて試験化合物のもとの形態及び／又は代謝産物形態について分析されてもよい。代謝調節物のサンプル及び標準物質は、本願に記載した分析法に付されてもよい。Ｋｒｅｂｓ  Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液（Krebs Henseleit buffer）が加えられる場合には、当該緩衝液は、ＢＳＡを０．２％ｗ／ｖの最終濃度まで加える前に、室温で５〜１０分間５％ＣＯ２を含む空気を通気されるであろう。終結溶液の容量及びサンプル調製の方法は、方法の進展中にテスト品について決定されるであろう。
【０２８６】
テスト品／培地溶液
テスト品の溶液は、０．２％ＢＳＡを含む、５％ＣＯ２を含む空気で平衡化したＫｒｅｂｓ  Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液に、適当量の貯蔵液（stock solution）を加えることによって調製されるであろう。最終濃度は、５μＭから２０μＭの間であろう。反応の開始時点での最終的なアッセイ濃度は、１μＭから１０μＭの間であろう。
【０２８７】
代謝調節物／培地溶液
トルブタミド、デシプラミン及びナロキソンの溶液は、０．２％ＢＳＡを含む、５％ＣＯ２を含む空気で平衡化したＫｒｅｂｓ  Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液に、適当量の各１０ｍＭ  貯蔵液を加えることによって調製されるであろう。最終濃度は、各代謝調節物について２０μＭであろう。最終的なアッセイ濃度は、反応の開始時点で１０μＭであろう。
【０２８８】
肝細胞懸濁溶液
肝細胞は、解凍され、メーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｔｅｃｈ社）指示に従って単離されるであろう。手順の最終工程の間、細胞の生存度が、トリパンブルー色素排除法（method of trypan blue exclusion）を用いて測定されるであろう。その後、肝細胞は、最終濃度が５０万生存細胞／ｍＬになるよう、０．２％ＢＳＡを含む、５％ＣＯ２を含む空気で平衡化したＫｒｅｂｓ  Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液を用いて再懸濁されるであろう。反応の開始時点での濃度は、２５万生存細胞／ｍＬであろう。
【０２８９】
テスト品のインキュベーションの開始
工程２．１．３において調製された等量のテスト品溶液は、ポリプロピレンシンチレーションバイアル（polypropylene scintillation vials）に分配されるであろう。バイアルは、９５％湿度及び５％ＣＯ２にした状態で、３７℃で５〜１０分間予め温められる。等量の、０．２％ＢＳＡを含む、５％ＣＯ２を含む空気で平衡化したＫｒｅｂｓ  Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液は二つのバイアルに加えられ、完全に混合されるであろう。反応の開始直後、タイマーを始動させ、１００μＬのサンプルを各バイアルから取り出し、適量の終結溶液を含む１．７−ｍＬ遠心管に入れる。これらのサンプルは、培地調節物（media controls）として非酵素分解及び血管との非特異的な結合を調べるのに役立つであろう。
【０２９０】
等量の、前記調製した肝細胞懸濁液は二つのバイアルに加えられ、完全に混合されるであろう。反応の開始直後、タイマーを始動させ、１００μＬのサンプルを各バイアルから取り出し、適量の終結溶液を含む１．７−ｍＬ遠心管に入れる。全てのバイアルは、３７℃、湿度９５％、及びＣＯ２５％に保たれたインキュベーターに入れられる。
【０２９１】
代謝調節物のインキュベーションの開始
等量の、前記調製した代謝調節物溶液は二つのポリプロピレンシンチレーションバイアルに分配されるであろう。バイアルは、９５％湿度及び５％ＣＯ２にした状態で、３７℃で５〜１０分間予め温められる。等量の、前記調製した肝細胞懸濁液は二つのバイアルに加えられ、完全に混合されるであろう。反応の開始直後、タイマーを始動させ、１００μＬのサンプルを各バイアルから取り出し、適当量の終結溶液を含む１．７−ｍＬ遠心管に入れる。全てのバイアルは、３７℃、湿度９５％、及びＣＯ２５％に保たれたインキュベーターに入れられる。
【０２９２】
サンプル収集
バイアルは、穏やかに振盪されるであろう。サンプル（１００μＬ）は下記の計画に従って取り出され、適量の終結溶液を含む１．７−ｍＬ遠心管に入れられるであろう：テスト品サンプルは、５、１０、１５、３０、６０、９０及び１２０分後に取り出される；代謝調節物サンプルは、３０、６０、９０及び１２０分後に取り出される。サンプルの取り出し直後、バイアルは、最後のサンプルが収集されるまでインキュベーターに戻される。
【０２９３】
ブランク調製
肝細胞懸濁液のサンプル（１００μＬ）は、等量の、０．２％ＢＳＡを含むＫｒｅｂｓ  Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液に加えられ、完全に混合されるであろう。この溶液の１００μＬサンプルは、取り出され、テスト品の反応液のために使用した同量の終結溶液を含む１．７−ｍＬ遠心管に入れられるであろう。インキュベーション培地（０．２％ＢＳＡを含むＫｒｅｂｓ  Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液）のサンプルは、テスト品の反応液のために使用した同量の終結溶液を含む１．７−ｍＬ遠心管に入れられるであろう。
【０２９４】
サンプル調製及び分析
全てのバイアルは、１６，０００ｇで３分間遠心分離機にかけられるであろう。上清は、ポリプロピレンオートサンプラーバイアルに入れられ、分析まで４℃で（＜１日）又は−７０℃（＞１日）で貯蔵されるであろう。テスト品溶液は、標準の手順に従ってＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ条件を用いて分析されるであろう。一つの例では、下記ＨＰＬＣ条件が用いられてもよい：カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｓｙｎｅｒｇｉ  Ｈｙｄｒｏ−ＲＰ、１００．０×２．０ｍｍ、５μｍ）；ガードカラム（guard column）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｃ１８、４．０×２．０ｍｍ、５μｍ）；流量（０．３ｍＬ／ｍｉｎ）；カラム温度４５℃；注入容量１０μＬ；及び周囲オートサンプラー温度（ambient autosampler temperature）。
【０２９５】
実施例１０５
ミクロソーム（microsomes）におけるインビトロ代謝安定性の測定
インビトロインキュベーションにおいて肝臓ミクロソーム（ヒト、ラット、イヌ、サル）の存在下で新規化合物（new chemical entity）の安定性を測定する典型的なプロトコルは、下記のようにデザインされてもよい。テスト品は、３７℃で各種時間の間、ミクロソーム及び適当な培地と共にインキュベートされるであろう。反応混合物については、抽出が行われ、もとの化合物及び予測された代謝産物に対するＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析が行われるであろう。適用できる場合には、半減期が、テスト品の消費について計算されるであろう。前記半減期値をテスト品について得られる半減期値と比較するため、代謝調節が行われるであろう。代謝調節物は、トルブタミド、デシプラミン及びテストステロンであり、これらの化合物は、それぞれ、低インビボクリアランス値、中程度のインビボクリアランス値及び高インビボクリアランス値に対応する薬物動態と定義されている。
【０２９６】
代謝安定性研究
一般に、５０ｍＭ  リン酸カリウム、ｐＨ７．４、２．６ｍＭ  ＮＡＤＰ＋、６．６ｍＭグルコース  ６−リン酸、０．８Ｕ／ｍＬのグルコース  ６−リン酸デヒドロゲナーゼ及び１、１０又は５０μＭの試験化合物を含む１００μＬの溶液を含む６つの予め温められた反応バイアルが調製される。低（トルブタミド）クリアランス化合物、中程度の（デシプラミン）クリアランス化合物及び高（テストステロン）クリアランス化合物を表す代謝調節物を含む同様の反応液が、同時にその酵素溶液と共に作成される。反応は、１００μＬの予め温められた酵素溶液を加えることによって開始され、反応液は、３７℃でインキュベートされる。ゼロ時点の反応液は、酵素溶液を加える前に、５０μＬのアセトニトリル（内部標準を含む）を試験化合物／コファクター溶液に加えることによって調製される。１５、３０、６０、９０及び１２０分後、反応管は、水浴から取り出され、反応は、内部標準を含む５０μＬのアセトニトリルを用いて終結される。反応液について抽出が行われ、サンプルは、ＭＳ／ＭＳ検出でＣ１８カラムを用いて試験化合物のもとの形態及びある代謝産物について分析される。各アッセイは、全く同一に行われる。
【０２９７】
コファクター／試験化合物溶液濃度
１０ｍＭ  ＮＣＥの貯蔵液は、１０％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）で調製されるであろう。全てのアッセイについて、テスト品の２、２０又は１００μＭ溶液は、５０ｍＭ  リン酸カリウム、ｐＨ７．４、２．６ｍＭ  ＮＡＤＰ＋、６．６ｍＭグルコース  ６−リン酸及び０．８Ｕ／ｍＬのグルコース  ６−リン酸デヒドロゲナーゼ（コファクター溶液）で調製されるであろう。
【０２９８】
コファクター／代謝調節物溶液濃度
代謝調節物（トルブタミド、デシプラミン、及びテストステロン）の貯蔵液を用いて、代謝調節物の６μＭ溶液が工程に記載したコファクター溶液で調製されるであろう。
【０２９９】
酵素溶液濃度
酵素溶液は、肝臓ミクロソームを、１ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで、５０ｍＭ  リン酸カリウム、ｐＨ７．４に加えることによって調製されるであろう。全てのミクロソームは、ＸｅｎｏＴｅｃｈ又はＩｎｖｉｔｒｏＴｅｃｈ社から購入した。
【０３００】
反応の開始
全ての反応管は、３７℃水浴中で約３〜５分間予め温められるであろう。ゼロ時点のコントロール反応液は、各複製について、酵素を失活させるため１５．９μＭ  ネブラリン（nebularine）（内部標準）を含む５０μＬのアセトニトリルを１００μＬのコファクター溶液に加え、その後ボルテックスで撹拌・混合することによって調製されるであろう。反応は、１００μＬの酵素溶液を管のそれぞれに加え、ボルテックスで撹拌・混合することによって開始されるであろう。ゼロ時点のコントロールを含む全ての管は、３７℃水浴中でインキュベートされるであろう。反応開始後の管における全ての成分の最終濃度は、５０ｍＭ  リン酸カリウム、ｐＨ７．４、１．３ｍＭ  ＮＡＤＰ＋、３．３ｍＭグルコース  ６−リン酸及び０．４Ｕ／ｍＬのグルコース  ６−リン酸デヒドロゲナーゼ、０．５ｍｇ／ｍＬ肝臓ミクロソーム及び１、１０又は５０μＭテスト品である。
【０３０１】
反応の終結及び抽出
３７℃で１５、３０、６０、９０及び１２０分後、反応は、１５．９μＭ  ネブラリン（内部標準）を含む１５０μＬのアセトニトリルの添加によって終結されるであろう。ゼロ時点のコントロールは、１２０分後に水浴から取り出される。全てのバイアルは、１６，０００ｇで３分間遠心分離機にかけられるであろう。上清は、ポリプロピレンオートサンプラーバイアルに入れられ、分析まで４℃で（＜１日）又は−７０℃（＞１日）で貯蔵されるであろう。
【０３０２】
テスト品溶液の分析
テスト品溶液は、実施例３９において記載した手順等、標準の手順に従ってＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ条件を用いて分析されるであろう。
【０３０３】
実施例１０６
細菌変異原性試験（Bacterial Mutagenicity Test）
この変異原性評価アッセイ（Mutagenicity Assessment assay）（エームスアッセイ（Ames Assay））によって、テスト品抽出物が、テスター生物（tester organisms）のゲノムにおける塩基置換（base change）若しくはフレームシフト変異（frameshift mutations）により引き起こされるサルモネラ菌Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍにおけるヒスチジン（histidine）（ｈｉｓ）復帰突然変異（reversion）（ｈｉｓ−からｈｉｓ＋）又は大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉにおけるトリプトファン（tryptophan）（ｔｒｐ）復帰突然変異（ｔｒｐ−からｔｒｐ＋）を誘発する可能性が評価されるであろう。一般に、平板混入アッセイ（plate incorporation assay）は、外因性哺乳類活性化系（exogenous mammalian activation system）（Ｓ９）の存在又は非存在下で、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ＴＡ９７ａ、ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１０２、及びＴＡ１５３５）の５つの菌株並びにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＷＰ２−ｕｖｒＡ−）の１つの菌株について行われるであろう。テスト品は、５％デキストロースに溶解されるであろう。その後、希釈系列が、テストする直前に生理食塩水で調製されるであろう。このアッセイについては、最終的な変異原性評価のためのおおよその投与量を決定するため、範囲設定研究（Range Finding Study）も行われるであろう。
【０３０４】
試験物質の調製
テスト品の貯蔵液は、下記のように２０．０ｍｇ／ｍＬに調製されるであろう：１．０ｇテスト品は、１分間１５．０ｍＬの０．１ＨＣｌに加えられるであろう。テスト品は、室温で１５分間撹拌されるであろう。次いで、３３．０ｍＬの脱イオン水が加えられ、３０分間撹拌させておくであろう。その後ｐＨは、３．５３に調整されるであろう。より低い投与量のものが、使用直前にこの貯蔵液から５％デキストロースで希釈することによって調製されるであろう。分解の如何なる変化をも最小限にするため、テスト品溶液は、調製後、投与処置直前まで氷上におかれるであろう。テスト品は、試験系に適合した溶媒を通じて、インビトロで投与されるであろう。
【０３０５】
試験菌株の遺伝子型キャラクタリゼーション
試験菌株のｗｏｒｋｉｎｇ  ｓｔｏｃｋは、遺伝子型マーカー及び許容できる自発性復帰突然変異率（acceptable spontaneous reversion rates）について確認されるであろう。全てのｗｏｒｋｉｎｇ  ｓｔｏｃｋは、ヒスチジン又はトリプトファン（Ｅ．ｃｏｌｉのみ）のための必要性を示すはずである。更に、下記のコンホメーション（conformations）が、各アッセイ、適当な場合：ｒｆａ壁変異（rfa wall mutation）によるクリスタルバイオレットに対する感受性、ｕｖｒＢ遺伝子（Ｅ．ｃｏｌｉにおいてｕｖｒＡ）の欠失による紫外線に対する感受性、ｐＫＭ１０１プラスミドの存在によるアンピシリンに対する抵抗性；及びｐＡＱ１プラスミドの存在によるテトラサイクリンに対する抵抗性について作成されるであろう。前記菌株についての自発性復帰突然変異率は、ネガティブコントロールを用いて測定されるであろう。
【０３０６】
水溶性であるテスト品は、等張生理食塩水（isotonic saline）又は他の適当な溶媒に溶解されるであろう。水溶性でないテスト品は、ジメチルスルホキシド（dimethylsulfoxide）（ＤＭＳＯ）又は他の適当な溶媒に溶解されるであろう。ＤＭＳＯが、テスト品との有害反応を起こすと予測される場合には、テスト品は、カルボキシメチルセルロースに懸濁されるであろう。溶解を助けるため、加熱、激しいボルテックスでの撹拌（vortexing）又は代替の溶媒が用いられてもよい。
【０３０７】
試験系
このアッセイは、Ａｍｅｓ（Ames et al., Mutation Research (1975) 31: 347-364）によって最初に記載され、Ｍａｒｏｎ及びＡｍｅｓ（Maron et al., Mutation Research (1983) 113: 173-215）によって改訂された平板混入法の手法に従って行われるであろう。このアッセイは、歴史的に、菌株にヒスチジン非依存性菌株を生じさせるヒスチジンの遺伝子についての突然変異を検出するため又は、付随して菌株にトリプトファン非依存性菌株を生じさせるトリプトファンの遺伝子についての突然変異を検出するために使用されている。更に、それによって、副作用と付随しているタイプの遺伝性のＤＮＡ突然変異を生ずる化学的突然変異の多種多様なクラスが検出されることが示されている。
【０３０８】
このアッセイにおいて使用されてもよいＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ菌株、ＴＡ９７ａ、ＴＡ９８、ＴＡ１００、及びＴＡ１０２は、Ｍａｒｏｎ及びＡｍｅｓ、ｓｕｐｒａ；Ｇｒｅｅｎら、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９７６）３８：３３−４２；及びＢｒｕｓｉｃｋら、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８０）７６：１６９−１９０に記載されている。Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ菌株ＴＡ１５３５及びＥ．ｃｏｌｉ菌株Ｗｐ２−ｕｖｒＡ−は、アメリカ培養細胞系統保存機関、マナッサス、ＶＡ（それぞれ、ＡＴＣＣ番号：２９６２９及び４９９７９）から得られうる。試験菌株の全てのｗｏｒｋｉｎｇ  ｓｔｏｃｋは、ヒスチジン又はトリプトファン（Ｅ．ｃｏｌｉのみ）のための必要性を示すはずである。
【０３０９】
実験法
テスター菌株（tester strains）のマスタープレート（master plate）は、凍結したｗｏｒｋｉｎｇ  ｓｔｏｃｋから調製されるであろう。そのアッセイにおいて使用される各細菌の菌株についてｗｏｒｋｉｎｇ  ｃｕｌｔｕｒｅを作成するため、単一のコロニーが、マスタープレートからＯｘｏｉｄのニュートリエントブロス（Oxoid nutrient broth）に移され、吸光度（６５０ｎｍでのもの）が０.６〜１．６に達するまで、３７±２℃で振盪されつつインキュベートされるであろう。この一晩の培養は、変異原性試験のため及び遺伝子型の確認のために使用されるであろう。遺伝子型試験（genotype test）は、前記プロトコルにおいて記載したように、行われるであろう。
【０３１０】
投与量範囲及び変異原性試験の両方のため、０．６％Ｄｉｆｃｏのアガーを含む０．５％ＮａＣｌからなるトップアガー（top agar）が融解されるであろう。その融解したトップアガーに、０．５ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン／０．５ｍＭ  ビオチン又は０．５ｍＭ  Ｌ−トリプトファンの溶液が、１００ｍＬアガーに対し１０ｍＬの割合で加えられるであろう。追加したアガーは、管につき２ｍＬ分注され、４５〜４７℃に保たれるであろう。処理用のトップアガーを調製するため、０．１ｍＬのテスト品又はコントロール、０．１ｍＬの菌液及び０．５ｍＬのリン酸緩衝食塩水（phosphate buffered saline）が、溶融したアガーに加えられるであろう。得られた混合物は、手短にボルテックスで撹拌され、室温の最小グルコースアガー（minimal glucose agar）プレート（Ｖｏｇｅｌ−Ｂｏｎｎｅｒ培地Ｅ中、１．５％Ｄｉｆｃｏのアガー、２％グルコースを含む）に流し込まれるであろう。代謝活性化は、ＰＢＳの存在下で、０．５ｍＬのＳ９ミックスを加えることによってもたらされるであろう。プレートは、固めておかれ、その後３７±２℃で４８〜７２時間インキュベートされるであろう。全てのプレートは、自動画像解析システム（automatic image analysis system）を用いてカウントされるであろう。ネガティブコントロール及びテスト品処理プレートは、細菌の菌叢の存在についてもテストされるであろう。
【０３１１】
外因性代謝活性化（Exogenous Metabolic Activation）
本アッセイにおいて使用されるインビトロ代謝活性化系は、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット肝臓酵素及びコファクタープールで構成される。酵素は、化学物質をより活性な形態に転換させることができる酵素の産生を誘導するようＡｒｏｃｈｌｏｒで処理したラットからの肝臓ミクロソーム（Ｓ９画分）の調製物に含まれるであろう。使用直前に、Ｓ９は、解凍され、ｐＨ７．４で２００ｍＭリン酸緩衝液中に５％  Ｓ９、５ｍＭグルコース  ６−リン酸、４ｍＭ  β−ニコチン−アデニンジヌクレオチドリン酸（β-nicotine-adenine dinucleotide phosphate）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び３３ｍＭ  ＫＣｌを含むようコファクタープールと混合されるであろう。
【０３１２】
投与レベル及び複製
テスト品は、適当な媒体（５％デキストロース）及び投与量範囲アッセイにおけるポジティブコントロールと共に５つの投与レベル（２０．０、１０．０、５．０、２．５、及び１．２５ｍｇ／ｍＬ）で三通りについてテストされるであろう。これは、２．０、１．０、０．５、０．２５、及び０．１２５ｍｇ／プレートと同等である。
【０３１３】
最終的なアッセイのため、三つの投与レベルが選択されるであろう（１０．０，１０．０、及び５．０ｍｇ／ｍＬ）。尚、これは、２．０、１．０、及び０．５ｍｇ／プレートと同等である。ネガティブ及びポジティブコントロールを含む全ての処理物は、代謝活性化の有り無しで試験菌株ＴＡ９７ａ、ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１０２、ＴＡ１５３５、及びＷＰ２−ｕｖｒＡ−に対して三通りプレートに蒔いて培養されるであろう。これらの投与量は、テスト品の毒性の範囲を誘導し、適用された投与量を最大にすることに基づいて選択されるであろう。
【０３１４】
コントロール物質
コントロール物質は、表９に記載したように、調製され、変異原性アッセイにおいて使用されてもよい。
表９
2008513485.tif 000223
【０３１５】
ネガティブ（媒体）コントロール
テスター菌株（tester strains）は、Ｓ９の有り無しで、対応する最大濃度（０．１ｍＬ）で未処理のデキストロース溶液と共に蒔かれて培養されるであろう。これらのプレートは、ネガティブコントロールとして役立ち、これによってバックグラウンド菌叢及び関連したコロニー形成に関する情報が得られる。
【０３１６】
投与量範囲アッセイ（Dose Range Assay）
初回量範囲アッセイ（initial dose range assay）は、２．０ｍｇ／プレートの最大濃度で開始する。テストされるべき４つのより低い投与量が、１：２希釈系列で希釈されるであろう。
【０３１７】
復帰突然変異アッセイ
各異なる細菌の菌株は、Ｓ９の有り無しで、それ自体平行するポジティブ及び媒体コントロールと異なる実験と考えられる。全てのプレートは、自動コロニーカウンターを用いてスコア化されるであろう。データのプリントアウトがなされた。ポジティブコントロールは、直接作用する変異原（direct-acting mutagen）及び代謝変換（metabolic transformation）を必要とする変異原からなるであろう。適当なポジティブコントロールを含む全ての菌株について、復帰突然変異率の２倍以上の増加が認められてもよい。各菌株のネガティブコントロール品の復帰突然変異率は、研究室の履歴データから予測される範囲内であるか又はこの範囲よりもわずかに下回るはずである。全ての菌株について誘導されたポジティブな結果は、ネガティブコントロール値を超えてプレート当たりの復帰突然変異コロニーの数が少なくとも２倍増加することによって示されるであろう。
【０３１８】
実施例１０７
ＣＨＯ細胞におけるインビトロ染色体異常試験
染色体異常試験は、物質の潜在遺伝毒性に関する当該物質のスクリーニングに使用可能なインビトロ試験の１つでもある。染色体異常は、発癌に関連をもった（関与した）突然変異である。従って、染色体異常試験は、潜在的変異原及び発癌物質の試験に適する（Galloway et al., Environ. Mut. (1985) 7:1-51; Galloway et al., Environ. Mut. (1987) 10:1-175）。この染色体異常試験とは、試験試料抽出物のチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）損傷誘発能を評価するものである。この試験は、外因性哺乳類賦活系（exogenous mammalian activation system）（Ｓ９）の存在下又は非存在下において３処置期（three treatment periods）に亘って実行される。陰性対照の調製物はすべて正常な量の自発異常を示すはずであるのに対し、陽性対照の培地は異常染色体の用量依存性の劇的な増加を示すはずである。
【０３１９】
試験物質が染色体異常誘発性であるか否か即ち該試験物質が染色体切断能を有するか否かを決定するための典型的試験の１つは、以下のように構成することができる。染色体の切断及び不適切な再結合によって、或る種の癌遺伝子（例えば、ｍｙｃ）が活性化されたり、或る種の癌抑制遺伝子（例えば、網膜芽細胞腫を抑制する遺伝子）が不活性化されたりし得るので、染色体異常誘発能は重要な指標の１つをなす。この試験では、哺乳類チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が、試験物質に接触させられ、紡錘体毒を用いて分裂中期で停止させられる。染色体の可視化は、処置したＣＨＯ細胞の低張性膨潤、固定及び染色の後、顕微鏡で（微視的に）実行する。染色体切断誘発能が認められる剤は、発癌物質である可能性が大きく、また、遺伝性染色体欠失誘発能も有する。
【０３２０】
ＣＨＯ−Ｋ１細胞株（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−６１）は、染色体数モード（モード数）が２０で個体数倍加時間が１０〜１４時間のプロリン栄養要求株である。この系は、多様な化学物質の染色体異常誘発活性に対し感受性を有することが示されている（Preston et al., Mutation Res. (1981) 87:143-188）。ＣＨＯ細胞は、１０％ウシ胎児血清、１％Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１００単位／ｍＬ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＭｃＣｏｙ５Ａ培地で増殖維持する。培養物は、キャップを緩めた状態で、５〜７％ＣＯ２を含む加湿インキュベータにおいて３７±２℃でインキュベートする。
【０３２１】
試験手順
原液は、５ｍｇ／ｍＬで調製する。低用量にする場合は、使用の直前にこの原液を５％ブドウ糖で希釈する。分解の可能性を最小限に抑えるために、試験試料溶液は、調製後投与処置直前まで氷冷保存する。細胞は、処置の一日前に、７５ｃｍ２組織培養フラスコ当り約１〜１．５×１０６細胞で１０ｍＬ新鮮培地に播種する。使用済み培地は、処置のために、新鮮成長培地で置換し、試験試料抽出物、陰性対照及び陽性対照を夫々各フラスコに加える。陽性対照は、溶媒毒性を最小にするために、０．１ｍＬの体積で投与する。試験試料希釈物と陰性対照は、１ｍＬの体積で投与する。新鮮培地を加えることにより、全処置体積を１０ｍＬにする。代謝賦活による試験の部分のために、Ｓ９賦活混合物を１．５％（ｖ／ｖ）の終濃度で無血清培地に加える。処置はすべて二つ組（duplicate）で実行する。試験試料抽出物、Ｓ９反応混合物（試験の代謝賦活部分のみ）及び成長培地の存在下、３７±２℃で細胞をインキュベートする。試験は、３つの処置期間、即ち、（最初の）３時間、（次の）Ｓ９賦活を伴う３時間、（最後の）２０時間、に分割する。
【０３２２】
処置期間経過後、すべてのフラスコについて、毒性の肉眼的発現、即ち細胞の形態変化又は有意な（著しい）細胞脱離を顕微鏡で評価する。フラスコはすべてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄する。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する規定成長培地を（これらの）新たに洗浄した細胞に加えた後、フラスコをインキュベータに戻し、更に１４．５〜１５．５時間インキュベートする。顕微鏡評価は、細胞回収（集菌）の直前に実行する。分裂期の細胞を蓄積するために、回収の２時間前に、すべてのフラスコにコルセミド１μｇを加える（終濃度０．１μｇ／ｍＬ）。
【０３２３】
二つ組の試験試料抽出物に対し、好適な溶媒及び陽性対照と共に、６つの用量レベル（培地中終濃度０．５、０．１６、０．０５、０．０１６、０．００５及び０．００１６ｍｌ／ｍＬ）で試験を行う。
【０３２４】
代謝賦活系
化合物のなかには前変異原性（promutagenic）状態でのみ存在するものがあるので、代謝賦活系の使用は、試験試料の評価のための重要な側面の１つである。即ち、そのような化合物は、外部の代謝源によって作用を及ぼされた後に初めて変異原性になる。インビトロ試験系は、Ｓ９のような外部系が加えられない限り化合物を代謝するこの能力を有さない。
【０３２５】
この試験に使用可能なインビトロ代謝賦活系は、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット肝酵素（複数）及びそれらの機能に必要なエネルギー産生系（ＮＡＤＰ及びイソクエン酸；コア反応混合物）を含み得る。これらの酵素は、化学物質を高活性型に変換する性質を有する酵素を誘導するためにＡｒｏｃｈｌｏｒ １２５４で処置されたラットからの肝ミクロソーム（Ｓ９フラクション）の調製物に含有される。Ｓ９は、モルトックス（ブーン市、ノースカロライナ州）から購入することができ、使用まで−７０℃未満で凍結保存される。このＳ９フラクションは、使用直前に解凍され、コア反応混合物に混合される。
【０３２６】
細胞の固定、染色及びスコアリング
分裂中期の細胞を有糸分裂シェイクオフによって収集し、７５ｍＭ ＫＣｌで膨潤し、メタノール：氷酢酸（３：１ｖ／ｖ）で固定する。細胞は、新鮮な固定液に再懸濁した後、ピペットでガラススライドに移し風乾する。スライドは、ブラインドコード（blind code）で標識する。各処置フラスコから夫々３つのスライドを調製する。スライドはギムザで染色し永久標本化する。スライドはすべて、高用量陽性対照を除き、ブラインドコードに基づいて読み取って評価を行い、異常頻度が十分であったことを最初に確認する。用量当り２００細胞（二つ組のフラスコの各々から１００）が、用量（レベル）の各々から判定される。１００細胞が、以下の定義に従って高用量陽性対照の各々から判定されるが、実際にそのようなものとして評価（記録）された。
染色分体型
ＴＧ（染色分体ギャップ）：“Ｔｉｄ Ｇａｐ”  １つの染色分体内の非染色質性（非染色）領域、その大きさは染色分体の幅と同じか小さい。これらは、すべてが真性切断とは限らないので、確認されても異常の（最終）総計には通常は含まれない。
ＩＧ（同位染色分体ギャップ）：“Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｇａｐ”  ギャップは２つの姉妹染色分体の同じ位置（座位）に存在する。これらは、すべてが真性切断とは限らないので、確認されても異常の（最終）総計には通常は含まれない。
ＴＢ（染色分体切断）：１つの染色分体中の非染色質性領域、染色分体の幅よりも大きい。関連する（結合ないし対合）断片は部分的又は完全に置換又は消失し得る。
ＩＤ（染色分体欠失）：染色分体の中央領域から“カット”される染色分体の長さに応じて、短縮された染色分体又は染色分体中のギャップの近くに存在する小断片又は環が生成する。
ＴＲ（トリラジアル）：２つの染色体間の交換、これにより、３腕構造が形成される。結合（関連する）無動原体断片を有し得る。
ＱＲ（クアドリラジアル）：トリラジアルと同様であるが、４腕構造が形成される。
ＣＲ（複合再配列（複合配列換））：３以上の染色体の交換、これは複数の切断及び交換の結果である。
ＴＩ（染色分体交換）：片方の腕又は両腕が関与する１つの染色体内部における交換。
染色体型
ＳＢ（染色体切断）：末端欠失。染色体は、転位される無動原体断片であって結合状態に維持又は細胞内の任意の位置に出現し得る無動原体断片を有する異常（欠失）染色体を形成する明確な切断（clear break）を有する。
ＤＭ（二重微小断片）：染色体中間部欠失。これらは、小さな二重「ドット」として出現するが、対合環でもあり得る。場合によっては、交換又は末端欠失から生じる無動原体断片と区別することができる。
Ｄ（二動原体）：２つの染色体間の交換、その結果、２つの動原体を有する染色体が形成される。これはしばしば無動原体断片と結合（対合）し、断片結合（対合）二動原体（ＤＦ）として分類される。
ＭＣ（多動原体染色体）：複数の染色体間の交換、その結果、３以上の動原体を有する染色体が形成される。
Ｒ（環）：動原体を含有する環を形成する染色体。これはしばしば無動原体断片と結合（対合）し、断片結合（対合）環（ＲＦ）として分類される。無動原体環もこのカテゴリーに含まれる。
Ａｂ（異常一動原体染色体）：これは、核型として異常な形態（モルフォロジー）を有する染色体であり、しばしば転座又は含動原体逆位のようなものの結果である。異常である場合に使用される分類は、例えば相互転座に帰せられることはできない。
Ｔ（転座）：２つの染色体間の物質の明白な移動、その結果、２つの異常染色体が形成される。同定可能な場合は“Ｔ”で評価され、“２Ａｂ”としては評価されない。
その他
ＳＤ（過酷障害細胞）：１０以上の任意のタイプの異常を有する細胞。重度障害細胞は、複数の異常のタイプを同定するために分析されるべきであるが、例えば三動原体と結合（対合）して発見される断片のような多重（倍数）断片のため、１０以上であってはならない。
ＰＵ（細粉化染色体）：非ラセン（コイル）化（despiralized）ないし断片化染色体。これは、単に、染色体凝縮の異なる段階（期）であってもよい。
Ｐ（＋細粉化細胞）：２以上の染色体が、全核の限度において、「細粉化」される。
ＰＰ（倍数体細胞）：一倍数の染色体の複数のコピーを含有する細胞。倍数体細胞は、正常骨髄又は細胞培養物において時折観察される。これらは、記録されるが、構造異常の（最終）総計には含まれない。
【０３２７】
対照物質
対照物質は、刊行された報告書に記載されているように、この試験において調製され使用される。使用可能な陽性対照としては、例えば、シクロホスファミド−高用量１５μｇ／ｍＬ；シクロホスファミド−低用量５μｇ／ｍＬ；マイトマイシンＣ−高用量１．０μｇ／ｍＬ；及びサイトマイシンＣ（citomycin C）−低用量０．２５μｇ／ｍＬがある。陰性（溶媒）対照のために、ＣＨＯ細胞は、Ｓ９賦活の存在下又は非存在下で５％デキストロース陰性対照によって処置される。これらの処置は、異常細胞のバックグラウンド数に関する情報を提供する。
【０３２８】
有効性評価試験及び統計解析
溶媒対照培養物の異常の総数（％ＣＡ）は、１〜１４％の範囲に含まれるべきである。高用量陽性対照は、統計解析によって決定されるような９５％信頼水準（ｐ＜０．０５）で異常の数に統計的に有意な増加を生成すべきである。陽性及び陰性対照群又は試験試料と陰性対照群との間の有意差を同定するために分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用してもよい。得られたｐ値が０．０５未満の場合、差は有意であると考えられる。
【０３２９】
実施例１０８
イヌにおける安全性及び耐性（許容度）決定
ビーグル犬に連続５日間に亘って一日一回種々の用量レベルで静脈内投与した化合物の安全性及び耐性（許容度）を決定するための典型的試験は、例えば、以下のように構成することができる。安全性パラメータは、観察評価、臨床病理学的評価及び顕微鏡組織病理学的評価によってモニターする。
【０３３０】
実験計画
表１０に、典型的試験の一例を示す。例えば、この試験は、３つの試験試料と１つの対照試料群を用いて実行される。対照試料は、投与前に試験試料を希釈するために使用される溶液（５％デキストロース水）であり、高用量と同じ体積で投与される。この試験のための試験試料用量（投与量）レベルは、凡そ１２、３．８及び１．２ｍｇ／ｋｇである。試験試料及び対照試料は、連続５日連続一日一回凡そ１時間に亘り、静脈（ＩＶ）点滴によって投与する。
【０３３１】
試験試料血液レベル分析のための血液サンプルは、以下のように採取する（即ち、ｐｋ／ｔｋサンプリング）。低用量群の３匹の雄イヌ及び３匹の雌イヌから夫々凡そ１．０ｍＬの血液を採取するが、まず、点滴（投与）の開始から凡そ２０分後及び４０分後に採取し、次いで、点滴（投与）の終了時（時間０）、及び点滴（投与）終了後５、１０、１５、及び３０分、１、２、４、８、１２、及び２４時間経過時に採取する。これらは、第１回及び第５回点滴（投与）に関して行う。更に、すべての試験動物に対し、及び剖検前に回復した試験動物に対し、第１回（投与）の前及び直後、及び第５回（投与）の前及び直後に、第２誘導の電極配置で凡そ５〜１０秒間ＥＣＧ記録する。試験動物は、最後の投与（点滴）後１〜１５日の内に試験を終了する。血液学的及び臨床化学的分析のための血液は、点滴開始前と、試験終了時の安楽死の前に採血する。安楽死後、剖検を実行するが、これには、顕微鏡評価のための主要器官の摘出も含まれる。
表１０
2008513485.tif 000224
【０３３２】
試験方法
典型的試験では、試験動物は、以下のように、各群に割り振られる：１つの性の最も体重の重いイヌを第１群に割り当て、その同じ性の次に重いイヌを第２群に割り当て、その次に重いイヌを第３群に割り当て、その次に重いイヌを第４群に割り当てる。次いで、同様に体重の重い順に第２群、第３群、第４群及び第１群に割り当て、更に、同様に体重の重い順に第３群、第４群、第１群及び第２群に割り当てる。そして、すべての試験動物が各群に完全に割り当てられるまで、この割り当てパターンを繰り返す。試験試料及び対照試料は、橈側皮静脈又は伏在静脈への静脈点滴として凡そ１時間に亘り各用量で投与する。
【０３３３】
試験動物の体重は、毎日投与前に測定し、更に、剖検前にも測定する。すべての試験動物に関し、投与直後及び投与後１時間経過時の薬理学的活性、行動の変化及び毒性の徴候を観察する。回復した試験動物についても、回復期間中、一日一回観察する。すべての試験動物に対し第１回及び第５回投与の前及び直後に、更に回復した試験動物に対しては剖検の前に、第２誘導の電極配置で凡そ５秒間ＥＣＧ記録する。これらの（心電図グラフの）記録は、ＱＲＳ群及びＴ波の周期及び振幅変化の解釈のためのデータの提供、及び（心電図グラフ）記録当り多数のセグメント（凡そ５〜１０）におけるＱＴ間隔の測定のために使用される。
【０３３４】
採血
ＰＫ／ＴＫ。試験試料血液レベル分析のための血液サンプルを採取する。低用量群の３匹の雄イヌ及び３匹の雌イヌから夫々凡そ１．０ｍＬの血液を採取するが、まず、点滴の開始から凡そ２０分後及び４０分後に採取し、次いで、点滴（投与）の終了時（時間０）、及び点滴（投与）終了後５、１０、１５、及び３０分、１、２、４、８、１２、及び２４時間経過時に採取する。これらは、第１回及び第５回点滴（投与）に関して行う。分析のために血漿（ヘパリンリチウム抗凝血剤）サンプルを調製する。
【０３３５】
臨床病理学。終夜絶食後及び第１回投与前に（ベースラインとしてすべての試験動物に対して行う）、次いで、各剖検前に、血液学及び臨床化学（的試験）のための血液サンプルを採取する。血液学的試験に関しては、ベースラインで採取した血液及び（絶食）剖検前に採取した血液は、赤血球数、ヘマトクリット、ＭＣＨ、白血球数、ディファレンシャルＷＣ、ＭＣＨＣ、ヘモグロビン、ＭＣＶ、血小板数、ＰＴ及びＡＰＴＴのために分析される。臨床化学的試験に関しては、ベースラインで採取した血液及び（絶食）剖検前に採取した血液は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＰ）、グロブリン＆Ａ／Ｇ比、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、ナトリウム、アルカリホスファターゼ、カリウム、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、クロライド、グルコース、カルシウム、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、総ビリルビン、 クレアチニン、無機リン、総タンパク、コレステロール、アルブミン、及びトリグリセリドのために検査される。
【０３３６】
剖検
血液サンプルを採取した後、一次（主）処置群及び回復群の試験動物は、各自の試験終了時に屠殺し、剖検する。主要器官を摘出し、計量し、顕微鏡評価のために保存する。剖検には、頭蓋腔、胸腔、腹腔及び骨盤腔、それらの内蔵、組織、器官、及び死体の検査が含まれる。
【０３３７】
統計的方法
臨床化学的及び血液学的値及び器官及び体の質量データの統計分析は、試験試料群と対照群との対比によって行う。データに使用される統計的方法は適宜選択する：パラメトリックデータは一元配置分散分析を用いて分析し、ノンパラメトリックデータはKurskai-Wallis検定によって分析する。対応のある（paired）ｔ検定は、各イヌのベースライン及び処置後の臨床化学的及び血液学的値を対比するためにも使用される。０．０５以下の確率（ｐ）値は、すべての統計検定に対し有意であると考えられる。
【０３３８】
実施例１０９
ラットにおける安全性及び耐性（許容度）試験
試験化合物の安全性及び耐性（許容度）を決定するための典型的試験、例えば連続５日間に亘ってラットに対し一日一回３種の用量レベルで静脈投与する試験は、以下のように構成することができる。安全パラメータは、観察評価、臨床病理学的評価、及び顕微鏡組織病理学的評価によってモニターする。選択される試験動物は、薬物動態学的／毒物動態学的評価のために血液サンプルの採取も受ける。
【０３３９】
試験方法
表１１は、典型的試験をまとめたものである。この試験は、３つの試験試料群と１つの対照試料群を用いて実行する。高（用量）試験試料群及び低（用量）試験試料群及び対照群は、夫々２８匹の試験動物から構成され、耐性（許容度）の評価のために使用される。中（用量）試験試料群は、６４匹の試験動物から構成され、そのうち２８匹の試験動物は、耐性（許容度）の評価のために使用され、残りの３６匹の試験動物は、この試験のＰＫ／ＴＫ部分における第１回及び第５回投与後の種々の時点における血中試験試料レベルを決定するために使用される。対照試料は、投与前に試験試料を希釈するために使用される溶液（５％デキストロース水；Ｄ５Ｗ）であり、高用量試験試料群と同じ体積で投与される。この試験のための試験試料用量（投与量）レベルは、２４、７．６及び２．４ｍｇ／ｋｇである。試験試料及び対照試料は、連続５日間に亘り夫々１分間、静脈内（ＩＶ）投与によって尾静脈に投与される。
【０３４０】
試験試料血液レベル分析のための血液サンプルは以下のように採取する。３匹の雄及び３匹の雌の麻酔ラットから夫々凡そ０．３〜０．５ｍＬの血液を、投与前の各サンプル時点、投与終了時（時間０）、投与終了後凡そ０．０８、０．２５、０．５、１、２、４、８、１２、及び２４時間経過時に採取する。これらは、第１回及び第５回投与に関して行う。耐性（許容度）の評価に使用される試験動物は、最後の投与後、（一次（処置）群に対し）１日目又は（回復群に対し）１５日目に試験終了する。耐性（許容度）試験動物の試験終了時、安楽死の前後に、血液学的及び臨床化学的試験のための採血する。剖検には、顕微鏡評価のための主要器官の摘出も含まれる。試験試料のレベルを決定するためだけにｐｋ／ｔｋ血液サンプリングに使用される試験動物は、最後の血液サンプルを採取した後安楽死させ、更なるサンプリングや観察はしない。
表１１
2008513485.tif 000225
【０３４１】
試験方法
試験試料及び対照試料は、各用量（投与量）で凡そ１分間静脈点滴で尾静脈に投与する。試験動物の体重は、毎日投与の前に及び剖検前に測定する。すべての試験動物に関し、投与直後及び投与後１時間経過時の薬理学的活性、行動の変化及び毒性の徴候を観察する。回復した試験動物についても、回復期間中、一日一回観察する。対照動物には、約６ｍＬ／ｋｇのＤ５Ｗを投与する。高用量、中用量及び低用量の試験試料（適用）動物は、夫々、約２４ｍｇ／ｋｇ、約７．６ｍｇ／ｋｇ、及び約２．４ｍｇ／ｋｇの用量（投与量）で投与する。
【０３４２】
採血
ＰＫ／ＴＫ。試験試料血液レベル分析のための血液サンプルを採取する。１８匹の雄及び１８匹の雌の中用量試験動物を利用して、３匹の雄及び３匹の雌の麻酔ラットから夫々約０．３〜０．５ｍＬの血液を、投与前の各サンプリング時点、投与終了時（時間０）、投与終了後凡そ０．０８、０．２５、０．５、１、２、４、８、１２、及び２４時間経過時に採取する。これらは、第１回及び第５回投与に関して行う。血液サンプリングは、試験動物の試験終了サンプルに対する眼窩静脈叢採血（retro-orbital bleeding）又は心臓穿刺採血（cardiac puncture bleeding）によって行う。分析のために、血漿（ヘパリンリチウム抗凝血剤）サンプルを調製する。化学（臨床）病理学、剖検、及び組織病理学のための一般的方法、並びに、上述したもののような、統計的方法が続いて行われる。
【０３４３】
実施例１１０
リン酸化及び総ｐ５３試験法
リン酸化及び総ｐ５３試験法は以下のように構成することができる。１日目に、２×１０６個／１０ｃｍシャーレ／１０ｍＬ培地で細胞を播種する。２日目に、以下のように細胞を処理する：対照＝０．０５％ＤＭＳＯ（５μｌＤＭＳＯストック／１０ｍｌ培地）；１μＭ試験化合物（１μｌストック（１０ｍＭ）／１０ｍｌ培地）；２μＭ試験化合物（２μｌストック（１０ｍＭ）／１０ｍｌ培地）；３μＭ試験化合物（３μｌストック（１０ｍＭ）／１０ｍｌ培地）；４μＭ試験化合物（４μｌストック（１０ｍＭ）／１０ｍｌ培地）及び５μＭ試験化合物（５μｌストック（１０ｍＭ）／１０ｍｌ培地）。
【０３４４】
３日目に、細胞を回収し、接着及び浮遊細胞を回収する。細胞は、ＰＢＳで２回洗浄し、カウントし、４×１０６個／サンプルで回収する。細胞ペレットは、次に使用するまで−８０℃で凍結する。３日目又は４日目に、細胞抽出用緩衝液（３ｍＬの細胞抽出用緩衝液、３００μｌのプロテアーゼ阻害剤及び１０μｌの０．３Ｍ ＰＭＳＦ）を用いて細胞を抽出する。各サンプルに緩衝液２００μｌを加えた溶液をボルテックスし、３０分間氷冷した後、１０分毎にボルテックスする。次いで、溶液を１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、管当り上清１００μｌを分注し、−８０℃で保存する。
【０３４５】
試験の準備（５日目）。抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ溶液は、８ウェルストリップ毎に、１００×濃縮溶液１０μｌをＨＲＰ希釈液１ｍｌで希釈することにより調製する。ウォッシュバッファ溶液は、×１溶液を作成するために蒸留水を用いて原バイアル（×２５）を希釈することによって調製する。ｐ５３標準溶液又はｐ５３総溶液の希釈は、表１２の典型的パラメータに応じて記載されているようにして調製することができる。完全な再構成を確実に達成するために、標準１は、穏やかに混合し、１０分間室温で静置してもよい。
表１２
2008513485.tif 000226
【０３４６】
試験法。使用前にすべての溶液を室温にし穏やかに混合する。採取して８ウェルストリップに添加する。標準希釈用緩衝液１００μｌを標準８ウェルに添加する（０ｎｇ／ｍｌ／ウェル又は０単位／ウェル）。クロモゲンブランクウェルには何も添加しない。標準又は希釈サンプル１００μｌを適当なマイクロタイターウェルに添加する。一般的に、サンプルは、少なくとも１：１０以上の割合で標準希釈用緩衝液で希釈すべきである。各サンプルは、プレートの側壁を軽く叩いて完全に混合する。プレート用カバーでプレートを覆い、室温で２時間インキュベートするか、４℃で終夜インキュベートする。常用（working）洗浄用緩衝液４００μｌでウェルを４回洗浄する。１５〜３０秒間浸漬させた後、液体を吸引する。洗浄後、吸水ティッシュペーパー上にプレートを裏返して置き、軽く叩いて乾燥させる。１００μｌの抗ｐ５３［ｐＳ１５］又は抗ｐ５３（トータル）（検出用抗体）をクロモゲンブランク以外の各ウェルに添加する。軽く叩いて混合する；プレートを覆い、室温で１時間インキュベートする。溶液をウェルから完全に吸引する。
【０３４７】
常用洗浄用緩衝液４００μｌでウェルを４回洗浄する。１５〜３０秒間浸漬させた後、液体を吸引する。洗浄後、吸水ティッシュペーパー上にプレートを裏返して置き、軽く叩いて乾燥させる。１００μｌの抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ常用溶液をクロモゲンブランク以外の各ウェルに添加する。プレートを覆い、室温で３０分間インキュベートする。常用洗浄用緩衝液４００μｌでウェルを４回洗浄する。１５〜３０秒間浸漬させた後、液体を吸引する。洗浄後、吸水ティッシュペーパー上にプレートを裏返して置き、軽く叩いて乾燥させる。１００μｌのＴＭＢ（安定化クロモゲン基質）を各ウェルに添加し、室温暗所で３０分間インキュベートする。色は青色に変化する。１００μｌ停止液（Stop soln）を添加する。プレートを軽く叩いて混合する。色は黄色に変化する。クロモゲンブランク（＝１００μｌＴＭＢ＋１００μｌ停止液）をブランクとして設定することにより、Ａ４５０ｎｍでプレートを測定する（読み取る）。吸光度は、試験終了後２時間以内に測定する（読み取る）。
【０３４８】
実施例１１１
カスパーゼ−３／７試験法
典型的なカスパーゼ−３／７試験法は以下のように構成することができる。１日目に、０．０１５×１０６ＨＣＴ−１１６細胞／５０μｌ／ウェルで播種する。ＣＯ２インキュベータで終夜３７℃でインキュベートする。２日目に、ウェルから培地２５μｌを除去する。ＨＣＴ−１１６細胞は、１、３及び５μＭの試験化合物で処理する。陽性対照群は、０．０１、０．１及び１μＭのスタウロスポリンで処理する。６個の陰性対照ウェルは、培地のみで処理した状態で維持する（２５μｌの希釈サンプルを適当なウェルに添加する）。ＣＯ２インキュベータで２４時間３７℃でインキュベートする。３日目に、１０μｌ試薬（基質）／１ｍｌ緩衝液でＡｐｏ−ＯＮＥホモジニアスカスパーゼ−３／７試験試薬（プロメガ）を調製する。希釈試薬５０μｌを添加する。室温で１時間インキュベートする。４８５／５２０で蛍光測定する。
【０３４９】
実施例１１２
アネキシンＶ−アレクサ４８８染色法
典型的なアネキシンＶ−アレクサ４８８染色法は以下のように構成することができる。１．５〜２．０×１０６ＨＣＴ−１１６細胞／１０ｃｍシャーレ／１０ｍｌ培地で播種する。ＣＯ２インキュベータで終夜又は最大２４時間３７℃でインキュベートする。翌日、細胞は、１、２、３、４及び５μＭの試験化合物で処理する。１又は２つの無処理プレート（培地のみ）を対照プレートとする。以下の対照を使用する：無処理サンプル（アレクサ又はヨウ化プロピジウムなし）、ヨウ化プロピジウム又はアレクサ４８８のみで処理した対照、及びアレクサ４８８とヨウ化プロピジウムの両方で処理した対照。細胞を回収する（接着及び浮遊細胞を回収する）。細胞を冷ＰＢＳで二回洗浄する。１×アネキシン結合用緩衝液に細胞を再懸濁する。
【０３５０】
細胞をカウントし、１×アネキシン結合用緩衝液で〜１×１０６個／０．１ｍｌに希釈し、試験当り１００μｌが使用できるよう十分な体積に調製する。アネキシンＶコンジュゲート５μｌを各細胞懸濁液１００μｌに添加する。ヨウ化プロピジウム溶液（ストック＝１ｍｇ／ｍｌ）４μｌを各細胞懸濁液１００μｌに添加する。サンプルを室温で１５分間インキュベートする。アネキシン結合用緩衝液４００μｌを添加し、穏やかに混合し、サンプルを氷冷保存する。染色した細胞は直ちにフローサイトメトリーで分析（測定）する。
【０３５１】
実施例１１３
ＤＮＡ細胞周期分析法
典型的なＤＮＡ細胞周期分析法は以下のように構成される。１．５〜２．０×１０６個／１０ｃｍシャーレで播種する（無処理細胞用の追加の１つのシャーレにも播種する）。３７℃加湿５％ＣＯ２インキュベータで細胞を２４時間インキュベートする。細胞を静止状態にするため細胞を低増殖期に同期するために、培地を除去し、無血清培地で一回リンスし、各シャーレに無血清培地１０ｍｌを添加する。３７℃加湿５％ＣＯ２インキュベータで細胞を２４時間インキュベートする。培地を除去し、処理剤（血清含有培地、１０ｍｌ）：１〜５μＭ試験化合物＋対照を添加する。３７℃加湿５％ＣＯ２インキュベータで細胞を２４時間インキュベートする。
【０３５２】
細胞をトリプシン処理／単離するために、処理剤を除去する。トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を３ｍｌ添加する。浮遊細胞を保持し、接着細胞と混合する。３７℃加湿５％ＣＯ２インキュベータで５分間インキュベートする。（ＦＢＳ含有）培地３ｍｌをウェルに添加し、遠心分離用チューブにピペットで入れる。１０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上清をデカントし、２〜３ｍｌのＰＢＳにペレットを再懸濁する。細胞をカウントし、細胞を一回洗浄して２×１０６個／チューブとし、ＰＢＳを２ｍｌ添加し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。ペレット状の細胞を０．３ｍｌ冷ＰＢＳに再懸濁する。
【０３５３】
細胞を固定するため、ボルテックスしながら、ＰＢＳ細胞懸濁液０．３ｍｌを含むチューブに０．７ｍｌの氷冷７０％エタノールを穏やかに滴下する。オンアイスで１時間（又は４℃で数日）静置する。１０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。冷ＰＢＳ（１〜２ｍｌ）で一回洗浄する。１０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。０．２５ｍｌ冷ＰＢＳに細胞ペレットを再懸濁し、５μｌの１０ｍｇ／ｍｌＲＮＡｓｅＡを添加する（終濃度０．２〜０．５ｍｇ／ｍｌ）。３７℃で１時間インキュベートする。１０μｌの１ｍｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム溶液を脱イオン水に添加し（終濃度１０μｌ／ｍｌ）、分析（測定）するまで暗所４℃で保存する。サイトメーターで４８８ｎｍで測定する（読み取る）ことによりＦＡＣＳを分析する。ヨウ化プロピジウムによる細胞の染色は、分析と同日に行ってもよい。
【０３５４】
上記詳細な説明及び実施例は、単なる説明のためのものと解すべきであり、本発明の範囲を限定するものと解すべきではない。開示した実施形態に対する変更・修正の多様な可能性は当業者には明らかである。そのような変更・修正は、化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、剤形及び／又は本発明の使用方法に関する変更・修正を限定なしに含むが、本発明の教示及び範囲を逸脱しない範囲においてなし得る。本書で引用した米国特許及び刊行物は、本書の一部を構成するものとする。
【図面の簡単な説明】
【０３５５】
【図１】ＨＣＴ−１１６結腸直腸癌異種移植モデルにおける本発明の化合物の例の活性
【図２】ＨＣＴ−１１６結腸直腸癌異種移植モデルにおける本発明の化合物の例の活性
【図３】ＨＣＴ−１１６結腸直腸癌異種移植モデルにおける本発明の化合物の例の活性
【図４】ＨＣＴ−１１６結腸直腸癌異種移植モデルにおける本発明の化合物の例の活性
【図５】ＨＣＴ−１１６結腸直腸癌異種移植モデルにおける本発明の化合物の例の活性
【図６】ＨＣＴ−１１６結腸直腸癌異種移植モデルにおける本発明の化合物の例の活性
【図７】ＨＣＴ−１１６結腸直腸癌異種移植モデルにおける本発明の化合物の例の活性
【図８】ＨＣＴ−１１６結腸直腸癌異種移植モデルにおける本発明の化合物の例の活性
【図９】ＨＣＴ−１１６結腸直腸癌異種移植モデルにおける本発明の化合物の例の活性
【図１０】ＨＣＴ−１１６結腸直腸癌異種移植モデルにおける本発明の化合物の例の活性
【図１】
2008513485.tif 000239
【図２】
2008513485.tif 000240
【図３】
2008513485.tif 000241
【図４】
2008513485.tif 000242
【図５】
2008513485.tif 000243
【図６】
2008513485.tif 000244
【図７】
2008513485.tif 000245
【図８】
2008513485.tif 000246
【図９】
2008513485.tif 000247
【図１０】
2008513485.tif 000248
【配列表】
2008513485000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年10月4日(2006.10.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）を有する化合物及びその医薬的に許容可能な塩、エステル及びプロドラッグ；
2008513485.tif 000249
ここに、Ｂ、Ｘ、Ａ又はＶは、Ｚ２、Ｚ３及びＺ４が夫々Ｎの場合は不存在、及びＺ２、Ｚ３及びＺ４がＣの場合は、独立してＨ、ハロ、アジド、Ｒ２、ＣＨ２Ｒ２、ＳＲ２、ＯＲ２又はＮＲ１Ｒ２；又は
ＡとＶ、ＡとＸ、又はＸとＢは、夫々任意的に（（サイクリック）環で）置換され及び／又は（サイクリック）環（cyclic ring）と融合していてもよい炭素環、複素環、アリール又はヘテロアリールを形成してもよい；
ＺはＯ、Ｓ、ＮＲ１、ＣＨ２又はＣ＝Ｏ；
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３及びＺ４は、任意の２つのＮが隣接していない場合、Ｃ又はＮ；
Ｗは、Ｎ及びＺと共に、任意的に置換される飽和又は不飽和環に融合される任意的に置換される５又は６員環を形成する；該飽和又は不飽和環は、ヘテロ原子を含んでいてもよく、かつ単環であるか又は炭素若しくは複素単環若しくは多重環と融合している；
ＵはＮＲ１Ｒ２、ＮＲ１−（ＣＲ１２）ｎ−ＮＲ３Ｒ４、又はＮ＝ＣＲ１Ｒ２であり、Ｎ＝ＣＲ１Ｒ２におけるＲ１及びＲ２は、Ｃと共に、環を形成してもよい、
ＵがＮＨ２の場合、Ｚ１〜Ｚ４の少なくとも１つはＮ；
各ＮＲ１Ｒ２におけるＲ１とＲ２は、Ｎと共に、任意的に置換される環を形成してもよい；
ＮＲ３Ｒ４におけるＲ３とＲ４は、Ｎと共に、任意的に置換される環を形成してもよい；
Ｒ１及びＲ３は、独立に、Ｈ又はＣ１−６アルキル；
各Ｒ２はＨ、又は夫々任意的にハロゲン、１又は２以上の非隣接へテロ原子、炭素環、複素環、アリール若しくはヘテロアリールで置換されるＣ１−１０アルキル若しくはＣ２−１０アルケニルであり、各環は任意的に置換される；又はＲ２は任意的に置換される炭素環、複素環、アリール又はヘテロアリール；
Ｒ４はＨ、又はＮ、Ｏ及びＳから選択される１又は２以上の非隣接へテロ原子を任意的に含み及び任意的に炭素環又は複素環で置換されるＣ１−１０アルキル又はＣ２−１０アルケニル；又はＲ３とＲ４は、Ｎと共に、任意的に置換される環を形成してもよい；
各Ｒ５は環Ｗ上の任意の位置の置換基；及びＨ、ＯＲ２、アミノ、アルコキシ、アミド、ハロゲン、シアノ又は無機置換基；又はＲ５はハロ、カルボニル、１又は２以上の非隣接へテロ原子によって夫々任意的に置換されるＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、−ＣＯＮＨＲ１；又は隣接する２つのＲ５は結合されて、任意的に置換される５又は６員の炭素環又は複素環を形成し、該炭素環又は複素環は任意的に置換される更なる炭素環又は複素環に融合されてもよい；及び
ｎは１〜６
である。
【請求項２】
Ｗは、Ｎ及びＺと共に、任意的に置換される５又は６員環を形成し、該５又は６員環は任意的に置換されるアリール又はヘテロアリールに融合され、該アリール又はヘテロアリールは以下の群から選択される：
2008513485.tif 000250
2008513485.tif 000251
ここに、各Ｑ、Ｑ１、Ｑ２及びＱ３は、独立に、ＣＨ又はＮ；
Ｙは、独立に、Ｏ、ＣＨ、Ｃ＝Ｏ又はＮＲ１；
ｎ及びＲ５は請求項１と同様；又は
Ｗは、Ｎ及びＺと共に、以下の群から選択される環を形成する：
2008513485.tif 000252
ここに、ＺはＯ、Ｓ、ＣＲ１、ＮＲ１又はＣ＝Ｏ；
各Ｚ５はＣＲ６、ＮＲ１又はＣ＝Ｏであり、ＺとＺ５は、隣接している場合、何れもＮＲ１ではない；
各Ｒ１はＨ、Ｃ１−６アルキル、ＣＯＲ２又はＳ（Ｏ）ＰＲ２であり、Ｐは、１又は２；
Ｒ６はＨ、又はヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、ハロ、アミノ又はアミドを含むがこれらに限定されない本技術分野で既知の置換基；及び
環Ｓ及び環Ｔは飽和又は不飽和の何れであってもよい
請求項１の化合物。
【請求項３】
Ｗは、Ｎ及びＺと共に、フェニルに融合される５又は６員環を形成する
請求項１の化合物。
【請求項４】
ＵはＮＲ１Ｒ２であり、Ｒ１はＨ、Ｒ２はヘテロ原子、Ｃ３−６シクロアルキル、アリール又は１又は２以上のＮ、Ｏ又はＳを含む５〜１４員複素環で任意的に置換されるＣ１−１０アルキルであり；又はＲ１及びＲ２は、Ｎと共に、任意的に置換されるピペリジン、ピロリジン、ピペラジン、モルフォリン、チオモルフォリン、イミダゾール、又はアミノジチアゾールを形成する
請求項１の化合物。
【請求項５】
Ｒ２はモルフォリン、チオモルフォリン、イミダゾール、アミノジチアダゾール、ピロリジン、ピペラジン、ピリジン又はピペリジンで置換されたＣ１−１０アルキルである
請求項４の化合物。
【請求項６】
ＵはＮＲ１−（ＣＲ１２）ｎ−ＮＲ３Ｒ４；ｎは１〜４；及びＮＲ３Ｒ４におけるＲ３及びＲ４は、（Ｎと）共に、任意的に置換されるピペリジン、ピロリジン、ピペラジン、モルフォリン、チオモルフォリン、イミダゾール、又はアミノジチアゾールを形成する
請求項１の化合物。
【請求項７】
ＵはＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ３Ｒ４であり、Ｒ３及びＲ４は、Ｎと共に、任意的に置換されるピロリジンを形成する
請求項１の化合物。
【請求項８】
Ｕは２−（Ｎ−メチルピロリジン−２−イル）エチルアミノ又は（２−ピロリジン−１−イル）エタンアミノである
請求項１の化合物。
【請求項９】
Ａ及びＸは、独立に、ハロ又はＳＲ２、ここに、Ｒ２は、ヘテロ原子、炭素環、複素環、アリール又はヘテロアリールによって任意的に置換されるＣ０−１０アルキル又はＣ２−１０アルケニルである
請求項１の化合物。
【請求項１０】
Ｒ２は、フェニル又はピラジンで置換されたＣ０−１０アルキルである
請求項９の化合物。
【請求項１１】
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３及びＺ４は、夫々、Ｃである
請求項１の化合物。
【請求項１２】
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３及びＺ４の何れか３つはＣであり、他の１つはＮである
請求項１の化合物。
【請求項１３】
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３及びＺ４の何れか２つはＣであり、他の２つは非隣接窒素である
請求項１の化合物。
【請求項１４】
Ｚ１及びＺ３はＣ、かつＺ２及びＺ４はＮ；又は
Ｚ１及びＺ３はＮ、かつＺ２及びＺ４はＣ；又は
Ｚ１及びＺ４はＮ、かつＺ２及びＺ３はＣである
請求項１１の化合物。
【請求項１５】
Ｚ１はＮである
請求項１の化合物。
【請求項１６】
前記化合物は、式（２Ａ）又は（２Ｂ）：
2008513485.tif 000253
ここに、Ａ、Ｂ、Ｖ、Ｘ、Ｕ、Ｚ、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４及びｎは上に同じ；
Ｚ５はＯ、ＮＲ１、ＣＲ６、又はＣ＝Ｏ；
Ｒ６はＨ、Ｃ１−６アルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、ハロ、アミノ又はアミド；及び
Ｚ及びＺ５は任意的に二重結合を形成してもよい
請求項１の化合物。
【請求項１７】
ＺはＮＲ１で、Ｒ１はＣ１−６アルキルである
請求項１の化合物。
【請求項１８】
Ｒ１はメチルである
請求項１７の化合物。
【請求項１９】
Ｂ、Ａ、Ｘ又はＶの少なくとも１つはハロであり、かつ対応する隣接Ｚ１−Ｚ４はＣである
請求項１の化合物。
【請求項２０】
ＶはＨである
請求項１の化合物。
【請求項２１】
請求項１の化合物と、医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項２２】
細胞増殖の減少及び／又は細胞増殖障害の寛解のための方法であって、
細胞増殖の減少及び／又は細胞増殖障害の寛解を必要とする系又は被検体に、請求項１の化合物の有効量又はその医薬組成物を、任意的に細胞増殖の減少及び／又は細胞増殖障害の寛解を惹起するための処置及び／又は化学療法剤と共に、投与すること
を含む方法。
【請求項２３】
前記細胞増殖障害は、腫瘍又は癌である
請求項２２の方法。
【請求項２４】
前記系は細胞又は組織であり、前記被検体は人間又は動物である
請求項２２の方法。
【請求項２５】
微生物価の減少及び／又は微生物感染の寛解のための方法であって、
微生物価の減少及び／又は微生物感染の寛解を必要とする系又は被検体に、請求項１の化合物の有効量又はその医薬組成物を、任意的に微生物価の減少及び／又は微生物感染の寛解を惹起するための抗菌剤と共に、接触させること
を含む方法。
【請求項２６】
前記系は細胞又は組織であり、前記被検体は人間又は動物である
請求項２５の方法。
【請求項２７】
前記微生物価及び／又は前記微生物感染は、ウイルス価、細菌価又は真菌価である
請求項２５の方法。
【請求項２８】
細胞死の誘導及び／又はアポトーシスの誘導をするための方法であって、
細胞死の誘導及び／又はアポトーシスの誘導を必要とする系又は被検体に、請求項１の化合物を含む組成物の有効量又はその医薬組成物を、任意的に細胞死の誘導及び／又はアポトーシスの誘導を惹起するための処置及び／又は化学療法剤と共に、投与すること
を含む方法。
【請求項２９】
前記系は細胞又は組織であり、前記被検体は人間又は動物である
請求項２８の方法。
【請求項３０】
前記化学療法剤はゲムシタビンである
請求項２８の方法。
【請求項３１】
前記処置は放射線処置又は外科的処置である
請求項２８の方法。
【請求項３２】
以下の式の化合物：
2008513485.tif 000254
2008513485.tif 000255
【請求項３３】
請求項３２の化合物と、医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項３４】
式（１）又は（１Ａ）の化合物の調製方法であって、
2008513485.tif 000256
式（３）又は（４）のエステルと、式ＮＨＲ１Ｒ２のアミンと、式ＭＬｎ、但しＬはハロゲン原子又は有機ラジカル、ｎは３〜５、及びＭは第３族元素の原子、第４族元素の原子、Ａｓ、Ｓｂ、Ｖ又はＦｅであるルイス酸を接触することを含む調製方法：
2008513485.tif 000257
ここに、Ａ、Ｖ、及びＸは、独立に、Ｈ、ハロ、アジド、Ｒ２、ＣＨ２Ｒ２、ＳＲ２、ＯＲ２又はＮＲ１Ｒ２；
又は
ＡとＸ又はＡとＶは、夫々任意的に（（サイクリック）環で）置換され及び／又は（サイクリック）環と融合していてもよい炭素環、複素環、アリール又はヘテロアリールを形成してもよい；
ここに、ＮＲ１Ｒ２におけるＲ１及びＲ２は任意的に置換される環を形成してもよい；
各ＺはＣＨ２、Ｏ、Ｓ、又はＮＲ１；
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ６、Ｚ７、及びＺ８は、独立に、Ｃ又はＮであり、任意の２つのＮは隣接していない；
Ｚ５はＣ又はＮであり、ＺがＯ、Ｓ又はＮＲ１の場合Ｚ５はＣ、かつ更に、Ｚ５がＮの場合Ｚ及びＺ６はＮでない；
各Ｒ１はＨ又はＣ１−６アルキル；
各Ｒ２はＨ、又はＮ、Ｏ及びＳから選択される１又は２以上の非隣接へテロ原子を任意的に含み及び炭素環又は複素環によって任意的に置換されるＣ１−１０アルキル又はＣ２−１０アルケニル；又はＲ２は任意的に置換される炭素環、複素環、アリール又はヘテロアリール；
各ＢはＨ又はハロ；
Ｗは、Ｎ及びＺと共に、任意的に置換されるアリール又はヘテロアリールに融合される任意的に置換される５又は６員環を形成し、該アリール又はヘテロアリールは、単環であるか又は単環若しくは多重環と融合されていてもよく、該環は任意的にヘテロ原子を含む；
Ｗ１は任意的に置換されるアリール又はヘテロアリールであり、該アリール又はヘテロアリールは単環であるか又は任意的にヘテロ原子を含む単環若しくは多重環と融合されてもよい；及び
各Ｒ５はＷ又はＷ１上の任意の位置の置換基；及びＨ、ＯＲ２、ＮＲ１Ｒ２、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニルであり、夫々任意的にハロ、Ｃ＝Ｏ又は１又は２以上のヘテロ原子で置換される；又はＲ５は無機置換基；又は隣接する２つのＲ５は結合されて、５又は６員の飽和又は不飽和炭素環又は複素環を形成し、任意的に更なる飽和又は不飽和炭素環又は複素環に融合される。
【請求項３５】
前記エステル、アミン、及びルイス酸は、室温で接触される
請求項３４の方法。
【請求項３６】
前記エステルとアミンを有機溶媒中で接触して溶液を生成し、及び該溶液とルイス酸を接触する
請求項３４の方法。
【請求項３７】
前記有機溶媒は、塩化メチレンである
請求項３６の方法。
【請求項３８】
前記エステルに対し過剰量のアミンが使用される
請求項３４の方法。
【請求項３９】
エステル対アミンの比は１：２；又は１：１．５；又は１：１．２５である
請求項３８の方法。
【請求項４０】
等モル量のルイス酸とアミンが使用される
請求項３４の方法。
【請求項４１】
式１又は式２の前記化合物を単離すること、及び任意的に式１又は式２の単離された化合物を生成すること、を更に含む
請求項３４の方法。
【請求項４２】
前記単離化合物は、カラムクロマトグラフィ又は再結晶又はカラムクロマトグラフィ及び再結晶によって精製される
請求項４１の方法。
【請求項４３】
前記単離化合物の純度は９０〜９９％、又は９０〜９５％である
請求項４２の方法。
【請求項４４】
前記エステルは、式ＮＨＲ１Ｒ２を有する前記アミンと接触される、
ここに、
Ｒ１は（ＣＲ３２）ｎ基；
Ｒ２はＮＲ３Ｒ４；
Ｒ３はＨ又はＣ１−６アルキル；
ｎは１〜６；及び
Ｒ４はＨ、又はＮ、Ｏ及びＳから選択される１又は２以上の非隣接へテロ原子を任意的に含み及び炭素環又は複素環によって任意的に置換されるＣ１−１０アルキル又はＣ２−１０アルケニル；及びＮＲ３Ｒ４におけるＲ３及びＲ４は任意的に置換される環を形成してもよい
請求項３２の方法。
【請求項４５】
前記ルイス酸は、ＢＬ３、Ａｌ３、Ｆｅ３、ＧａＬ３、ＳｂＬ５、ＩｎＬ３、ＺｒＬ４、ＳｎＬ４、ＴｉＬ４、ＴｉＬ３、ＡｓＬ３、又はＳｂＬ３であり、Ｌはハロ又はアルキルである
請求項３４の方法。
【請求項４６】
前記ルイス酸は、塩化アルミニウムである
請求項４５の方法。
【請求項４７】
以下の群から選択される化合物を調製するための請求項３４の方法：
2008513485.tif 000258
2008513485.tif 000259
2008513485.tif 000260
【国際調査報告】
2008513485.tif 000261
2008513485.tif 000262
2008513485.tif 000263
2008513485.tif 000264
2008513485.tif 000265
2008513485.tif 000266
2008513485.tif 000267
2008513485.tif 000268
2008513485.tif 000269