(57)【要約】【課題】歯原基を使用した顎骨の増強を提供する。【解決手段】本発明は、歯原基を哺乳動物の顎に挿入し、歯の形成が引き続き起こるとき、新しい歯のまわりの新しい歯槽骨が形成すると言う発見に基づいている。本発明は、顎における選定個所（例えば、臼歯領域における４箇所）における歯原基の移植による新しい歯の形成を刺激し、その結果、義歯の保持を容易にすることができる骨隆起部の形成が生じると言う概念に基づいている。次いで、歯を患者の顎から取出して新しい歯槽骨を残すことができる。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯原基を患者の口腔内の空間に移植し、そして歯原基を歯へ成長させることを備えている顎の増強方法。
【請求項２】
ｉ）歯原基を患者の口腔内の空間に移植し、そして歯原基を歯へ成長させ、
ｉｉ）義歯の保持を容易にするために歯を取り出して患者の顎に骨隆起部を残すことを備えている、必要の際に患者の義歯の保持を容易にするために歯槽骨を再生するための方法である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｉｉｉ）骨隆起部により少なくとも部分的に適所に保持されるべきである患者のための義歯を作成することを更に備えている請求項２に記載の方法。
【請求項４】
顎増強用の薬剤の製造における幹細胞の用途。
【請求項５】
顎増強用の薬剤の製造における歯原基の用途。
【請求項６】
義歯の保持を容易にする骨隆起部を生じる目的で顎の増強を行う請求項４または５に記載の用途。
【請求項７】
歯の損失の治療のための調合薬の製造における歯原基の用途であって、前記治療は、
ｉ）歯原基を患者の口腔における空間に移植し、この歯原基を歯へ成長させることと；
ｉｉ）義歯の保持を容易にするために歯を取り出し、それにより骨隆起部を患者の顎に残すことと、
を備えている歯原基の用途。
【請求項８】
前記治療は、
ｉｉｉ）少なくとも部分的に骨隆起部により適所に保持されるべきである患者のための義歯を作成すること、
を更に備えている請求項７に記載の用途。
【請求項９】
患者により、少なくとも部分的に、請求項１または２に記載の方法により生じられた１つまたはそれ以上の骨隆起部により保持されるべきである義歯を作成する方法であって、患者の顎の少なくとも一部のモデルを作成し、このモデルを使用して義歯を生じることを備えている、義歯を作成する方法。
【請求項１０】
請求項９の方法により作成された義歯。
【請求項１１】
歯原基は、患者から幹細胞を誘発して器官形成して歯前駆細胞を形成し、次いで歯原基を形成することにより生じられる、請求項１、２、３または９に記載の方法、または請求項５または請求項７に記載の用途。
【請求項１２】
前記幹細胞は治療されている患者からのものである、請求項４に記載の用途。
【請求項１３】
歯原基を顎において少なくとも９０日間成長され、それにより前記歯を形成する、請求項１、２、３、９または１１に記載の方法。
【請求項１４】
歯原基を顎における少なくとも２個所に移植し、それにより患者の顎における少なくとも２つの骨隆起部の形成を行う、請求項１、２、３、９または１１に記載の方法。
【請求項１５】
歯原基を患者の上顎における少なくとも２箇所および患者の下顎における少なくとも２箇所に移植する、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は歯槽骨の製造および顎の増強に関する。ここに述べられる文献すべてはそれらの全体がここに組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
多くの人は歯の損失を経験し、そして義歯を必要としている。運悪く、多くの患者は、歯の損失がその後の歯槽骨(歯支持骨隆起部)の損失が伴われるため、義歯を適所に保持する際に大きな難点を受ける。義歯床を位置決めすべきであるいずれかの隆起部が欠けると、義歯の保持に問題を生じる。現在の骨移植手順は、肋骨または臀部からの骨代用物または移植片の外科的挿入を伴う。これらの手順は歯を失った（通常、高齢の）患者のうちの大多数にとって適切でない重要な外科手順である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は重要な外科手術を必要としない義歯の保持を容易にするための方法および構成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、顎の増強、詳細には、義歯の保持を容易にする目的で顎の増強に関する。歯原基が哺乳動物の顎に挿入され、歯の形成が引き続き生じると、新しい歯のまわりの新しい歯槽骨が形成することがわかった。本発明は、顎における選定個所（例えば、臼歯領域における４箇所）における歯原基の移植による新しい歯の形成を刺激し、その結果、義歯の保持を容易にすることができる骨隆起部の形成が生じると言う概念に基づいている。次いで、歯を患者の顎から取出して新しい歯槽骨を残すことができる。
本発明は、歯のまわりに形成された骨の（「火山状」）隆起部が、侵襲的外科成形を必要とする現在の外科移植方法により形成された骨よりも、はるかに製造容易であり、義歯の固定により適していると言う利点を有している。
更に、本発明は、新しい歯の形状、サイズおよび配向の管理が重要でないので、新しい歯槽骨の形成が歯の取替えより達成し易いと言う利点を有している。
【０００５】
本発明の第１面は、顎の増強方法を提供し、この方法は、歯原基を患者の口腔内の空間に移植し、そして歯原基を歯へ成長させることを備えている。
好ましくは、顎の増強は義歯の保持を容易にすることができる１つまたはそれ以上の骨隆起部を作成する目的である。変更例として、顎の増強は歯の交換の目的または歯周病の治療のためでもよい。従って、本発明の第１面の好適な実施形態では、
ｉ）歯原基を患者の口腔内の空間に移植し、そして歯原基を歯へ成長させ、
ｉｉ）義歯の保持を容易にするために歯を取り出して患者の顎に骨隆起部を残すことを備えている、
義歯の保持を容易にするために歯槽骨を再生するための方法が提供される。
好ましくは、この方法は、下記の更なる工程、
ｉｉｉ）骨隆起部により少なくとも部分的に適所に保持されるべきである患者のための義歯を作成する、
工程を備えている。
好ましくは、本発明の工程ｉ）に使用される歯胚は、患者からの幹細胞（例えば、歯／歯細胞を残して患者からの神経幹細胞、胚幹細胞、骨髄細胞幹細胞、または幹細胞（これらは例えば歯髄に存在されるものでもよく、および剥離乳歯からのものでもよい））を誘発して歯牙形成を受けて歯前駆細胞および歯原基を形成することにより生じられる。
【０００６】
本発明の第２面は顎増強のための薬剤の製造における幹細胞の用途を提供する。
本発明の第３面は顎増強のための薬剤の製造における歯原基の用途を提供する。
本発明の第２面および第３面では、義歯保持を容易にする骨隆起部を生じる目的で顎の増強を行うことが好ましい。
好ましくは、本発明の方法および用途に使用される歯原基は治療されている患者からの細胞から製造される。これにより、移植拒絶の問題を回避する。かくして、好適な実施形態では、使用される歯原基は治療を受けている患者からの幹細胞を使用して製造される。
【０００７】
本発明の第４面は、患者により、少なくとも部分的に、本発明の第１面の方法により生じられる１つまたはそれ以上の骨隆起部により保持されるべきである義歯を作成する方法を提供し、この方法は、本発明の第１面の方法により顎増強を受ける患者の顎の少なくとも一部のモデル(例えば、印象)を作成し、このモデルを使用して義歯を生じることを備えている。
本発明の第５面は本発明の第４面の方法により作成された義歯を提供する。
好ましくは、患者は人間の患者である。好ましくは、患者は大人（１８歳より高齢）であり、より好ましくは、患者は中年（例えば、４５歳より高齢）であるか、或は熟年（例えば、６５歳より高齢）患者である。
【０００８】
歯原基の製造
歯の成長は間充組織および上皮系統からの細胞の組合せを必要とする。哺乳動物の歯の成長は器官形成中における上皮／間充組織の相互作用の研究のためのモデル系として認識された。歯は、細胞の２種類、すなわち、口上皮細胞と神経堤誘導間充組織細胞との間の一連の相補的相互作用から哺乳動物の胚形成において早期に（マウスでは１１日、人間では６週）成長し始める。
歯の成長のための誘導信号は上皮から出力し、そこで、応答する間充組織細胞が歯牙形成状態になるようにプログラミングされる（２）。
【０００９】
次いで、歯牙形成間充組織細胞は更なる歯の成長のための指令信号を生じる（３）。結局、上皮細胞はエナメル質形成のために応答可能であるエナメル芽細胞を生じ、間充組織細胞は義歯およびセメント芽細胞を生じる象牙芽細胞を形成する。
これらの異なる指令信号の本質は、遺伝子発現研究および移植実験により明らかにされた。ＦＧＦ８、ＢＭＰ４およびＳＨＨが口上皮からの早期指令信号として設定される（３）。ＢＭＰ、ＦＧＦおよびアクチビンは間充組織からの早期信号のうちのものである（３、４）。
【００１０】
歯原基の製造に対する従来の解決策は、生体外組織組み換えを有していた。この解決策では、２つの異なる組織の種類を動物の胚から別個に切断し、これらの組織を実験室で組み換える。次いで、一方の組織からの信号が他方の組織における歯原基の形成を誘発し得る。これは多くの外科技能を伴った非常に訓練されたワーカーにより実施される手間のかかる方法である。
別の解決策では、ヤング等は、早期の歯の芽から解離された細胞が、マトリックスにおいて培養され大人の動物に移植されると、上皮および間充組織歯幹細胞の両方の存在を示す歯を形成することを示した（ヤング、Ｃ.Ｓ.、テラダ、Ｓ.、バキャンチ、Ｊ.Ｐ.、ホンダ、Ｍ.、バートレット、Ｊ.Ｄ.、イェリック、Ｐ.Ｃ.（２２０２）、生物分解可能なポリマー骨格における複雑な歯構造体の組織工学処理、Ｊ.Ｄｅｎｔ.Ｒｅｓ.８１、６９５-７００）。
【００１１】
人間の治療目的で、主な欠点は、移植拒絶の潜在的な問題であり、かくしてホスト（受容体）の免疫抑制または回避拒絶および細胞の得難さに対する移植細胞の遺伝子操作を必要とする。従って、各患者から排他的に得られる細胞の使用により、このような拒絶問題を回避する。
シャーぺ（特許第ＷＯ０１／６０９８１号）は、培養された胚幹細胞が上皮および間充組織系統を生じることができ、胚幹細胞から歯胚の製造を可能にすることを示した。しかしながら、胚幹細胞の使用は細胞の集団の浄化および増殖を必要とする。これは、複雑で非常に熟練された分離および操作技術を伴う。胚幹細胞の使用と関連された他の問題は、胚幹細胞を得ることができる制限された利用可能性および容易性である。
大人（すなわち、非胚）の骨髄細胞が(ａ)造血細胞および（ｂ）間質（間充組織）細胞を生じる幹細胞および多能性細胞の集団を含有することが知られている。しかしながら、骨髄における造血細胞は非造血組織を生じない（ワガー等）。間充組織幹細胞は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、腱、造血支持間質およびメサンギウム組織を含めて、均一な識別された細胞種類の組織を生じるが、成長が１つより多い細胞系列からの貢献を必要とする歯のような、複合細胞系列の器官、および特定の相補的な組織相互作用を必要とする器官を形成することが可能であると知られていない。
【００１２】
英国特許第ＰＣＴ／ＧＢ２００４／０００６３５号は、歯原基を製造するために骨髄細胞を使用し得ると言う驚くべき発見を実証している。骨髄細胞の使用は、細胞の集団の浄化および増殖の必要性を回避する。骨髄細胞を任意の個人から得ることができるので、治療上の歯の形成におけるかかる細胞の使用は、(ａ)移植拒絶問題の回避および（ｂ）胚幹細胞と比較して多能性の細胞成分の広範囲の利用可能性をもたらす。
１つの実施形態では、骨髄細胞は特定の細胞の種類についての浄化を受けなかった。「特定の細胞の種類についての浄化」とは、未浄化の細胞集団に存在する１つまたはそれ以上の他の細胞の種類の除去により存在する骨髄細胞の特定の種類の割合を増す任意の方法を指している。
好ましくは、未浄化の骨髄細胞は存在する特定の細胞種類の割合を増すために増殖を受けなかった。変更例として、未浄化の骨髄細胞は存在する特定の細胞種類の割合を増すために増殖を受けた。
【００１３】
他の実施形態では、未浄化の骨髄細胞は、例えば存在する骨髄幹の割合を増すために、特定の細胞種類についての浄化を受けた。浄化された細胞集団を得るための技術が当業者に周知であろう。
好ましくは、浄化された骨髄細胞は（浄化の前または後に、好ましくは浄化の後に）増殖を受けた。このようにして、増大数の存在する特定の細胞種類をえることができる。
口上皮誘導信号の存在下で骨髄細胞を培養することにより歯前駆細胞を製造し得る。適切には、少なくとも１００、５００、１０００、２５００、５０００、７５００、１００００または１５０００個の骨髄細胞が口上皮誘導信号の存在下で培養される。
【００１４】
骨髄細胞は、好ましくは、一人の個人から得られる。変更例として、骨髄細胞は多数の個人から得られ、貯留されてもよい。
骨髄細胞は多くの方法で誘導／相互作用のために調製されてもよい。例えば、骨髄細胞は小さい集合体を形成するようにペレット化されてもよい。これは骨髄細胞をフィルター上にペレット化することにより達成されてもよい。このようなフィルターは予備ゼラチン化されたミリポアフィルタのような任意の適切な基質を備えてもよい。便宜上、フィルターは、例えばファーグソン等（１９９８）に述べられているような金属格子により支持されてもよい。骨髄細胞はゲルまたは他の適当な半固形の支持体に形成された小さい穴の中へペレット化されてもよい。ゲルはコラーゲンゲルであってもよい。ゲルはコラボレートバイオメディアルプロダクト社のマトリゲルまたは同様な基質であってもよい。
選択自由として、上皮を骨髄細胞に被せて穴を覆い、次いでこの穴をゲルの薄層で覆って培養してもよい。
このように使用されるゲルは、それら自身、膜および／または金属格子により支持されてもよい。
【００１５】
骨髄細胞を口上皮誘導信号と接触させる。好ましくは、骨髄細胞を、ＦＧＦ８、ＢＭＰ４、ＳＨＨおよびＷＮＴＳのうちの１つ、２つ、３つまたはすべての任意の組合せと接触させる。後述のように、口上皮誘導信号は、幾つかが胚口上皮細胞の存在を必要としない様々な手段により得られ得る。
上皮マーカーの例としては、Ｐｉｔｘ２、ｐ２１、Ｗｎｔ７ｂなどがある、これらのマーカーは任意の適当な手段、例えば、ウエスターンブロッティング、免疫蛍光、放射性原位置交配または他の適当な手段により検出され得る。
歯胚芽上皮に発現されると知られている遺伝子としては、Ｂｍｐ-４、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、ＣＤ４４、ＦＧＦ８、Ｐｉｔｘ２およびＯｔｌｘ-２遺伝子がある。
自生型胚では、Ｂｍｐ-４が初めに歯上皮に発現されるが、発現はＥ１３.５からの歯芽のまわりの間充組織へ転じる（アベルグ等、１９９７）。Ｅ１３.５間充組織Ｂｍｐ-４では、発現はこの段階で発達的に最も進んでいる下側門歯にのみ見られるが、発現は上側門歯および臼歯の上皮において存続する（ファーグソン等、１９９８）。
【００１６】
Ｓｈｈは、早期歯胚芽の上皮肥大において発現され、そして間充組織における遺伝子発現を含めて、この早期段階における上皮から下層の間充組織へ移る信号の重要な成分であると思われる（ビットグッドおよびマクホン、１９９５；テスレッフおよびシャーぺ、１９９７）。後段階では、Ｓｈｈは下方調整されるが、転写体が、エナメル質結節を構成する上皮細胞に再現し、歯の成長の後芽段階では、過渡信号伝達中心が生じる（ファーグソン等、１９９８；ファートカリ等、１９９６）。
ＳＤ４４およびＯｔｌｘ-２は口上皮にＳｈｈよりも広く発現される（ファーグソン等、１９９８；ムッチーリ等、１９９７）。ＣＤ４４はヒアルロン酸受容体を符号化し、Ｏｔｌｘ-２は、突然変異されると、歯が存在しないリーガー症候群として知られている病気を引き起こす人間の遺伝子のネズミ相同体である（セミナ等、１９９６）。
【００１７】
ホリスタチンは、アクチビンの活性を抑制するものと示されたアクチビン結合蛋白質である（マイケル等、１９９３；デウィンター等、１９９６）。ホリスタチンの発現パターンは原位置交配分析により検査されてもよい（ファーグソン等、１９９８）。
ホリスタチンの発現はＥｌ１.５からのアクチビン発現細胞にすぐ隣接した歯胚芽上皮細胞に見られる。後段階では、ホリスタチン転写体は上皮芽の最も外側の層を形成する柱状細胞に制限され、上皮細胞の中心コアはホリスタチン陰性である（ファーグソン等、１９９８）。従って、ホリスタチンは歯間充組織におけるアクチビンに隣接してアクチビンと相補的なパターンで歯上皮に発現される。
歯前駆細胞は、その幾つかの分子マーカー特性を発言するものである。例えば、細胞が１つまたはそれ以上の歯間充組織細胞マーカーを発現したなら、この細胞は歯前駆細胞であると考えられる。このようなマーカーの例としては、Ｂａｒｃｌ１.Ｄｌｘ２、Ｄｌｘ５、Ｍｓｘ１、Ｐａｘ９、アクチビンβＡ、Ｌｈｘ６、Ｌｈｘ７などがある。これらのマーカーは任意の適当な手段、例えば、ウエスターンブロッティング、免疫蛍光、放射性原位置交配または他の適当な手段により検出され得る。
【００１８】
芽段階の自生型歯では、Ｂａｒｘ-１遺伝子の発現は、主に下顎および上顎の臼歯領域に見られ、そして歯間充組織に制限されるのではなく、神経堤誘導間充組織細胞の広い範囲に存在する（ファーグソン等、１９９８；ティッシエル-セタ等、１９９５）。
Ｍｓｘ-１、Ｌｅｆ-１およびＢｍｐ-４は上皮信号伝達に応答して歯間充組織（すなわち誘導性の門歯および臼歯上皮歯芽と関連された凝縮性間充組織細胞）に発現される（ファーグソン等、１９９８；マッケンジー等、１９９１；クラトチウィル等、１９９６；バイニオ等、１９９３）。
Ｄｌｘ-２の発現は、主に上皮芽をじかに取囲んでいる間充組織細胞に見られるが、芽の口腔側の歯上皮にも存在する（ファーグソン等、１９９８；トーマス等、１９９５；クイ等、１９９７）。
Ｐａｘ-９、Ｌｈｘ６およびＬｈｘ７は、芽の形成の前の早期歯間充組織に発現され、次いで、芽段階における凝縮性間充組織に発現される（ファーグソン等、１９９８；ニューベーサー等、１９９７）。
【００１９】
Ｏｌｉ-３はＥ１０.５からの間充組織に発現される。芽およびキャップ段階において、Ｇｌｉ-３の発現はＰａｒ-９の発現よりわずかに局部化され、そして歯乳頭および歯小胞に集中される（ファーグソン等、１９９８；ハードキャッスルおよびシャーぺ、１９９８）。
シンデカン-１、すなわち、細胞表面へパリンスルフェートプロテオグリカンは歯間充組織に過渡的に発現され、そして誘導性の歯上皮の下で歯間充組織細胞の凝縮を調整するものと思われる（ファーグソン等、１９９８；テスレッフェ等、１９９６）。
Ｔｇｆβ-１は、歯間充組織に見られ、また門歯の上皮に弱く見られ、そしてキャップ段階で歯上皮に出現するだけである（ファーグソン等、１９９８；ファートカリ等、１９９１）。
Ｔｇｆβ-３の発現は顔の間充組織に広がっているが、その発現は門歯および臼歯の上皮芽にじかに隣接して凝縮性間充組織細胞から実質的に不存在であると思われる（ファーグソン等、１９９８；チャイ等、１９９４）。
【００２０】
口上皮誘導信号による培養は歯前駆細胞を生じるのに十分な時間に及ぶ。好ましくは、この時間は少なくとも１２時間である。この時間は１２時間と８２時間との間、好ましくは１２時間と７２時間との間である。好ましくは、この時間は１２時間と２４時間との間、１２時間と３６時間との間または１２時間と４８時間との間である。
特許第ＷＯ０１／６０９８１号に論述されているように、口上皮誘導信号は、ｉ）胚口上皮細胞の使用、ｉｉ）胚口上皮細胞ではないが、口上皮誘導信号を発現し、それにより胚口上皮細胞の信号伝達特性を模倣する細胞の使用、およびｉｉｉ）浄化された蛋白質の使用を含めて、種々の方法で与えられ得る。
【００２１】
１つの実施形態では、骨髄細胞を１つまたはそれ以上の胚口上皮細胞の存在下で培養して歯前駆細胞を生じる。好ましくは、骨髄細胞を胚口上皮の存在下で培養する。
特許第ＷＯ０１／６０９８１号で確立されているように、口上皮誘導信号を与える際の胚口上皮細胞の役割は、とりわけ、胚口上皮の信号伝達特性を模倣する誘導歯牙形成細胞を使用することにより交換されてもよい。特許第ＷＯ０１／６０９８１号は、胚口上皮の特性を有るように工学処理され、それにより工学処理された上皮による胚口上皮の交換を許容し得る培養された細胞から歯牙形成上皮細胞を生じ得ることを開示している。歯前駆体製造における胚口上皮細胞の役割を交換し得る細胞の例が特許第ＷＯ０１／６０９８１号に示されており、これらの例としては、不滅化細胞系列（例えば、歯上皮細胞の不滅化系列から得られる上皮細胞、およびＥＳ細胞誘導（すなわち、培養細胞誘導）上皮細胞がある。
【００２２】
従って、別の実施形態では、歯前駆細胞を生じるために胚口上皮細胞の信号伝達特性を模倣する１つまたはそれ以上の誘導歯牙形成細胞の存在下で骨髄細胞を培養してもよい。
誘導歯牙形成細胞を非口上皮細胞（例えば、歯上皮細胞の不滅化系列から得られる上皮細胞）から生じてもよい。好ましくは、歯牙形成細胞を不滅化細胞系列または幹細胞（例えば、ＥＳ細胞）から生じる。
誘導歯牙形成細胞は、好ましくは、ＦＧＦ８、ＢＭＰ４、ＳＨＨ、Ｐｉｔｘ２およびＩｓｌｅｔ１のうちの１つ、２つ、３つ、４つまたはすべてを発現する。
【００２３】
特許第ＷＯ０１／６０９８１号に論述されているように、早期口上皮の信号伝達特性が良好に設定されるかどうかを定めるために、分子マーカーを分析してもよい。例えば、どの細胞が口上皮細胞に取って代わることができるかを定めるために、ＦＧＦ８、ＢＭＰ４、ＳＨＨおよびＰｉｔｘ２（口上皮の最も早期のマーカー）の発現を分析してもよい。細胞系列の歯牙形成誘発能力を試験する方法もまた特許第ＷＯ０１／６０９８１号に開示されている。
特許第ＷＯ０１／６０９８１号に論述されているように、上皮細胞が歯牙形成を適切に誘発しないなら、誘導信号伝達分子（ＦＧＦ８、ＢＭＰ４、ＳＨＨなど）の発現をコラーゲン外植片の培養において分析してもよく、いずれの信号も、ビード上の浄化蛋白質により、或は遺伝子発現構成体により交換される。
【００２４】
変更例として、特許第ＷＯ０１／６０９８１号に述べられているようなビード供給装置の使用によるような、浄化蛋白質を使用して、骨髄細胞に歯牙形成を誘発するのに必要な分泌された信号の組合せを生じてもよい。
従って、他の実施形態では、口上皮誘導信号を与えて歯前駆細胞を生じるために、骨髄細胞を蛋白質含有ビードまたは蛋白質被覆ビードの存在下で培養してもよい。当業者は蛋白質の適当な濃度を容易に工夫することができるであろう。
歯前駆細胞が発生されたら、歯前駆細胞に歯牙形成誘導能力が存在し、未感作上皮細胞は歯前駆細胞からの信号に応答し、そして歯原基および歯の成長を許容する。培養に使用される成長培地が歯牙形成上皮の生成のために必要とされる因子を含有していない場合、培地は必要な因子が補給されてもよい。
【００２５】
語「歯原基」は当業界で周知であり、完全に形成された歯へ成長することができる構造体を指している。
１つまたはそれ以上の上皮細胞に存在下での歯前駆細胞の培養は歯原基を生じるのに十分な時間がかかる。好ましくは、この時間は少なくとも１２時間である。好ましくは、歯前駆細胞は口上皮の存在下で培養される。
好ましくは、１つまたはそれ以上の上皮細胞は、口上皮細胞；胚上皮細胞、口胚上皮細胞であるか、或は幹細胞(胚幹（ＥＳ）細胞または大人の幹細胞)または不滅化された細胞系列から得られる上皮細胞である。
【００２６】
特許第ＷＯ２００１／ＧＢ００６５１号（ＷＯ０１／６０９８１号）、特許ＰＣＴ／ＧＢ２００４／０００６３５号（これらの両方は出典を明示することにより本願明細書の開示の一部とされる）およびオーザマ等（２００４）ＪＤｅｎｔＲｅｓ.２００４年７月；８３（７）；５１８-２２に記載の技術が本発明に使用される歯原基の発生のために好ましいが、本発明は歯原基を発生させるいずれの特定の方法にも制限されない。従って、特許第ＷＯ２００１／ＧＢ００６５１号（ＷＯ０１／６０９８１号）および特許ＰＣＴ／ＧＢ２００４／０００６３５号に記載にもの以外の方法が本発明に使用されてもよい。
【００２７】
歯原其の移植
歯原基を口腔における空間に移植し、そして歯原基を歯へ成長させることによって患者の顎に歯を発生させるために、歯原基を使用することができる。
移植は、上顎または下顎の軟組織に小さい切口を形成し、そして外植片をこの切口に設置して外科接着剤（例えば、べトボンド、３Ｍ）で固定することによって達成されてもよい。
【００２８】
歯および歯槽骨の成長
歯の交換の目的で歯を作成する場合、原位置で成長する歯が正しい形状および大きさのものであることが望ましい。歯の形状を定める多数の遺伝子が知られており、これらの遺伝子の操作により、歯の形状を変えることが可能である（１、４、７、８）。同様に、信号伝達事象の調整により、歯の大きさの変更が生じることが実験的に示されている。例えば、Ｗｎｔ信号伝達の抑制により、小さい歯の成長が生じる（９）。これらの観察結果を本発明の方法に有利に用いることができた。
顎の増強が義歯の保持を容易にする目的である場合、一旦移植された歯原基を歯へ成長させ、次いで、この歯を取出して患者の義歯を適所に把持するために使用され得る骨隆起部を残す。歯を取出そうとする場合、新しい歯の形状、大きさおよび配向の管理は明らかに特に重要のものではない。
【００２９】
十分な歯槽骨の形成が一般に焼く９０日後に起こる。従って、歯原基の移植から約８０または９０日後、より好ましくは移植から少なくとも１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０または１７０日後に歯の取出しが起こることが好ましい。
好ましくは、新しい歯の形成は顎における１つより多い個所で刺激され、好ましくは、新しい歯の形成は顎の各側で少なくとも１箇所で刺激される。好ましくは、歯の形成は顎における（上顎または下顎または両方における）少なくとも２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの部位で刺激される。
新しい歯の形成は患者の要求に応じて上顎および／または下顎において刺激されてもよい。
【００３０】
好ましくは、歯の形成は臼歯領域において刺激される。従って、１つの好適な実施形態では、歯の形成は顎の臼歯領域における少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの部位で刺激される。
１つより多い歯原基を移植する場合、歯原基を同時に移植してもよく、或は治療を見張る医療実施者による次々の治療中に別々の時に移植してもよい。１つの実施形態では、１つまたはそれ以上の歯原基を１つの治療において顎の一方の側に挿入し、次いで、次の治療中、１つまたはそれ以上の歯原基を顎の他方の側に挿入する。
【００３１】
歯の取出し
歯原基を義歯の保持の目的で移植した場合、新しい歯自身は余分であり、取出される。好ましくは、新しい歯は萌出時に或は萌出時ごろに取出される。
【００３２】
義歯の製造
義歯の製造のための種々の技術が当業界で知られており、これらの技術は当業者にはおなじみであろう。例えば、Ａ.Ｏ.ラーンによる「完全義歯のテキストブック」、２００２、Ｂ.Ｃ.デッカー社発行、ＩＳＢＮ  １５５０９１９８０を参照されたい。
【実施例】
【００３３】
本発明を例により以下に説明する。
【００３４】
材料および方法
非歯細胞の培養
１０3Ｕ／ｍｌのフィーダー非依存性マウス胚幹細胞（Ｅ１４.２）を白血病抑制因子、水牛ラット肝臓細胞‐条件培地、２００ｍＭのＬ-グルタミン、非必須アミノ酸、２-メルカプトエタノールを含有するＤ-ＭＥＭで培養した。毎日、培地を装填し、２-３日ごとにＥＳ細胞を通過させた。細胞の重複フラスコを使用してマウスの遺伝子ノックアウトを生じ、その結果、全細胞系列伝達を伴ったマウスの２系列が生じた（未公表）。
神経幹細胞を下頸部領域までの上肢の高さにおけるＥ１４胚脊髄から隔離した。むき出しの脊髄以外なのも現さないように脊髄自身をいずれの他の組織および膜から自由に注意深く解離した。次いで、トリプシンおよび火炎の幅狭いピペットを使用して脊髄を単一細胞に解離し、Ｎ２神経補給剤および２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ-２を含有する無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）において１０∝ｇ／ｍｌのポリオルニチンおよび１０∝ｇ／ｍｌのラミニンにＴ-７５あたり２００，０００で平板培養した。採取前に、細胞を７日間培養した（ミンガー等、１９９６年）。これらの細胞は神経幹細胞マーカーネスチン発現について９９％陽性である検証し、異なるニューロン細胞の種類への分化させるこれらの細胞の能力を生体外で分析し、そして３つの主ニューロン細胞の種類のすべて、すなわち、ニューロン、オリゴデンドロサイトおよび星形膠細胞を形成した（補給物質参照）。
【００３５】
６-９週歳の雌の野生型マウス（ＣＤ−１）の頸骨および大腿骨から骨の骨髄細胞を採取した。５匹のマウスを頸部転位により殺し、頸骨および大腿骨を無菌的に取出し、付随組織から離して解離した。骨の両端部を切断し、無菌の２１ゲージのニードルを使用して骨の端部のところでゆっくり注入された培養培地で骨の空洞を洗浄した。次いで、骨の骨髄間質細胞を２０％の熱不活性化された胎児ウシの血清（ＦＢＳ；ＧｉｂｃｏＢＲＬ）および１００μＭのＬ-アスコルビン酸２フォスフェート（シグマ）を含有する〈-最小必須培地（シグマ）に懸濁した、そして７５ｃｍ2の組織フラスコに１０日間保持した。３日後、次いで２日ごとに培地を交換した。
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２およびＮＩＨ３Ｔ３細胞を１０％のＦＢＳを含有するダルベッコの変性イーグル培地（Ｄ-ＭＥＭ）で培養した。すべての溶液はペニシリンおよびストレプトマイシンを２０１Ｕ／ｍｌで含有していた。
【００３６】
組織の組み換え
外間充識細胞による胚口上皮のいずれの可能な汚染をも検出するために、組み換えにおける上皮の源として緑色蛍光蛋白質を発現する遺伝子導入マウス（ＧＦＰマウス）を使用した（アジャントキス等、１９９８；ザンブロウィクス等、１９９７）。原位置交配に引き続き、ＧＥＰの発現の結果、組み換えにおける非歯細胞がいずれの外間充識細胞で汚染されていないことを示した。腎被膜に形成された歯の諸部分におけるＧＦＰ発現のための原位置交配の結果、いずれの間充組織誘導細胞における発現が無かったが、ＧＦＰマウスから生じられた歯からの諸部分はすべての間充組織誘導細胞における発現を示した（図示せず）。
【００３７】
ＧＦＰマウスからの胚（Ｅ１０）の下頸原基をグルタマックス-１を含有するＤ-ＭＥＭで解離した。３７℃で１０-１５分間、カルシウムおよびマグネシウムを含有しないＰＢＳ中に２Ｕ／ｍｌで形成されたディスペース（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）の溶液における培養後に、上皮を隔離した。培養後、組織を１０％のＦＢＳを含有するＤ-ＭＥＭで洗浄し、タングステンニードルを使用して上皮を機械的に分離した。ＥＤＴＡ‐トリプシン（２ｇ／ｌのＥＤＴＡおよび５ｇ／ｌのトリプシン）への短時間の露出により、５-６ｘ１０6個の細胞よりなる培養された細胞集団を採取した。数回の洗浄後、これらの細胞を遠心分離してペレットを形成し、次いで、このペレットを、サクセンにより変更されたようなトロウェル技術（１９５９）に従って金属格子により支持された透明な核孔膜フィルタ（０.１ｍ口径；コスター）に設置した。次いで、上皮の３つまたは４つの断片を細胞ペレットに設置し、組み換え外植片を３７℃で１ないし３日間、培養した。
培養期間後、外植片を固定し、原位置交配のために処理するか、或は腎被膜の下に移植した。外食片をホスト腎臓で１０日間培養して歯の全成長を行った。次いで、その結果得られた組織を固定し、そして０.５ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７.６）を使用して脱石灰化した。
【００３８】
原位置交配
原位置交配のために、外植片を埋め込み、そして７μｍで連続的に分断した。断片を５ないし１０個のスライド上に分割した。先のリポート（アンガーラーおよびアンガーラー、１９６６年；タッカー等、１９９８年）に従って、35Ｓ-ＵＴＰ放射性標識化リボプローブを使用した放射性の原位置交配を行った。マウスのｐａｘ９ｃＤＮＡクローンはルディボーリングから寄贈品であった。
ＰＴＳに対するプロジェクトアンドパーソナルライセンスにより保護されたホームオフィスガイドラインに従って動物を含むすべての実験を行った。
【００３９】
結果
日歯細胞の３つの異なる源を、これらの外植片組み換えにおける胚口上皮に対するそれらの歯牙形成応答について分析した。かくして適切な信号を仮定して、歯細胞を形成することができるものと期待される多能性幹細胞集団として胚幹（ＥＳ）細胞を純粋な使用した。歯細胞を形成することができるものと知られていない純粋な多分化性幹細胞集団として神経幹細胞を使用した。大人の不均一細胞集団の歯形成可能性を分析するために、骨髄誘導（ＢＭＤ）細胞を使用した。ＥＳ細胞は、生殖細胞系列キメラを発生させるために首尾よく使用された細胞の同じ通路から誘導されたものであった。神経幹細胞はネスチン発現について９９％陽性であると検証した集団（データ図示せず）から誘導されたものであった。ＢＭＤ細胞は、線維芽細胞と、骨芽細胞および含脂肪細胞の前駆細胞と、０.０１％までの幹細胞とよりなるものと示された混合集団であった(ペレイラ等、１９９８年；ピテンガー等、１９９９年)。細胞を凝集してＥ１０口上皮で覆われた１つの固形塊とし、３日間、生体外で培養し、そして歯成長の分子マーカーの発現について分析した。胚幹細胞、胚神経幹細胞および大人のＢＭＤ細胞はすべて、１つの細胞種類あたり計５つの組み換えにおいてＭｓｘ１、Ｌｈｘ７およびＰａｘ９発現の誘発により同じように応答した(図１、２Ａ-Ｈ)。これらの遺伝子の各々は歯間充組織の発現組合せは歯牙形成間充識細胞にとって独特である（マッケンジー等、１９９２年；グリオリオウ等、１９９８年；ピーター等、１９９８年）。また、ＮＩＨ３Ｔ３およびネズミ間充細胞（Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２）のような任意の多分化性幹細胞様の特性を有していないと知られている培養された非歯細胞集団で組み替えを行ったが、これらの場合、マーカー遺伝子のいずれかの発現が観察されなく、その一方、非歯牙形成遺伝子の発現が確かめられた。（図２Ｉ−Ｌ；データ図示せず）。
【００４０】
これらの制御培養における歯発生の不開始の結果、外間充組織細胞による口上皮の汚染が無かった。これは、また、組み換えにおける非歯間充組織細胞に発現が検出されなかった（図２Ｅ）緑色傾向蛋白質（ＧＦＰ）‐マウスからの遺伝子的に異なった口上皮を使用して確認された。かくして、培養された非歯「間充組織」細胞集団の歯牙形成応答は、組織起源または成長年齢に関連されないもの以外、幹細胞特性であるように思われる。マウスの上皮歯原基が大人のマウスに移植された場合に歯に成長することができるかどうかを判断するために、Ｅ１４．５モルの歯原基を大人のマウスの上顎の正中離開の軟組織に外科的に移植した。移植された外植片を組織構造のための固定および脱石灰化の前に２６日間放置した。図３Ａないし図３Ｄは上顎門歯（Ａ）および臼歯（ＢないしＤ）の正常な組織構造を示している。図３Ｅは移植部位に形成された識別可能な異所性歯牙をはっきり示している門歯（Ａ）と臼歯（ＢないしＤ）との間の部分である。異所性歯牙は第１臼歯と同様な大きさのものであり、象牙質およびエナメル質では組織学的に正常である。歯は組織化された軟連結組織により異所性骨に連結されていた（図３Ｆ)。
【００４１】
考察
ここに示されるデータは、浄化された幹細胞集団および大人の細胞の混合集団を含めて異なる起源の非歯細胞において歯牙形成方法を開始したことを示している。骨および軟組織は、完全に、浄化された幹細胞よりなる非歯細胞集団から、或はＢＭＤ細胞のような不均一集団から形成されることができる。ＢＭＤは、大人のマウスにおける骨の骨髄移植後にニューロンを形成することができる幹細胞の有利な非純粋の源であることが最近示された。この大人の不均一細胞集団が組織工学処理原基に骨および歯を形成することができることは、幹細胞の純粋な集団が必要でなく、かくして、人間におけるこれらの手順の更なる開発のための重要な意味あいを有するかも知れないことを暗示するので、意義深い。胚口上皮は簡単な２細胞の厚い外胚葉であり、これは他の源からの上皮細胞と交換されることができるものと考えられることができる。歯牙形成を開始すべく適切な信号を発現するようにこの上皮を工学処理すれば、培養された細胞から完全な歯原基を生じることができる。また、歯髄における幹細胞および剥離された乳歯からの幹細胞を確認することにより、新しい歯原基を発生させるために患者自身の歯細胞を使用する可能性を高める（グロンソス等、２０００年；ミウラ等、２００３年）。歯原基のような器官原基を組織処理することができることにより、再生医術手順の主構成要素を構成する（チャイおよびスラフキン２００３年）しかしながら、このような器官原基は大人の身体における適切な部位にその場で完全な器官へ成長することが可能でなければならない。目の腎被膜および前房は、免疫低下され、そして移植された組織への適切な血液供給を行うことができるので、異所性器官および組織の成長を支持するために規定どうりに使用された２つの大人の部位である。ここで示しておくことは、大人の顎への胚歯原基の転位の結果、完全な歯の成長が生じ、胚原基がその大人の状況に成長することができ、且つ歯槽骨の再生を生じることができることを示していることである。
【００４２】
本発明の前記方法および装置の種々の変更例および変形例は、本発明の範囲および精神を逸脱することなしに、当業者には明らかであろう。本発明を特定の好適な実施形態に関連して説明したが、本発明が、請求しているように、このような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないことは理解されるべきである。実際、生物化学および生物技術または関連分野における当業者にとって明らかである本発明を実施するための前記形態の種々の変更例が請求項の範囲内であるものと意図される。
【００４３】
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【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】ＥＳ細胞の集団と胚口上皮との間の異型組み換えの部分を示している。図１Ａおよび１Ｄは組み換え外植片における上皮芽の形成を示す光照射野顕微鏡写真であり、図１Ｂおよび図１ＣはＬｈｘ７（Ｂ）およびＭｓｘ１（Ｃ）のための放射性原位置交配を示す（Ａ）に隣接した部分を示している。図１ＥはＰａｘ９（Ｅ）のための放射性原位置交配を示す（Ｄ）に隣接した部分を示している。歯胚芽上皮が略示されている。スケールバー：１００μｍ。
【図２】神経幹細胞集団と胚口上皮との間（Ａ-Ｄ）、骨髄誘導細胞と胚口上皮との間（Ｅ-Ｈ）およびＮＩＨ３Ｔ３細胞集団と胚口上皮との間（Ｉ-Ｌ）の異型組み換えの部分を示している。図２Ａは組み換え外植片における上皮の局部化を示す光照射野顕微鏡写真である。図２Ｂないし図２ＤはＬｈｘ７（Ｂ）、Ｍｓｘ１（Ｃ）およびＰａｘ９（Ｄ）のための放射性原位置交配を示す（Ａ）に隣接した部分を示している。図２Ｅないし図２Ｈは骨髄誘導細胞と胚口上皮との間の組み換えの隣接部分を示している。図２Ｅは組み換えにおける胚口上皮におけるＧＦＰ発現の例を示している。図２Ｆないし図２Ｈは胚口上皮隣接した骨髄誘導細胞におけるＬｈｘ７（Ｆ）、Ｍｓｘ１（Ｇ）およびＰａｘ９（Ｈ）の夏原を示している。図２Ｉは組み換え外植片における上皮の局部化を示す光照射野顕微鏡写真である。図２Ｊないし図２ＬはＬｈｘ７（Ｊ）、Ｍｓｘ１（Ｋ）およびＰａｘ９（Ｌ）の無発現を示す（Ｉ）に隣接した部分を示している。歯胚芽上皮が略示されている。スケールバー：１００μｍ。
【図３】Ｅ１４.５臼歯外植片の移植から２６日後の大人のマウスにおける上顎の歯を示している。Ｅ１４.５Ｃ５６／Ｂ６マウスから切断された周囲の組織による臼歯原基を２４時間、生体外で培養した。マウスの歯列は、口の各４分の１における無歯領域（正中離間）による３つの臼歯から分離された１つの門歯を備えている。大人（２０週以上）のオスのマウスの正中離間における上顎の軟組織に小さい切口を形成した。外植片（ほぼ２ｍｍ）をこの切口に設置し、外科接着剤（べトボンド、３Ｍ）で固定した。動物に軟食を供給しながら移植された外植片を２６日間放置した。固定および脱石灰後、ワックス連続前額断を切断し、そして染色した（Ｈ＆Ｅ）。Ａ：門歯；Ｂ：第１臼歯；Ｃ：第２臼歯；Ｄ：第３臼歯；Ｅ：正中離間領域（ＡとＢとの間）における異所性歯牙。矢印は異所性骨を示している。Ｆ：歯周靭帯状組織を示すＥにおける囲み領域の高い拡大。ｄ＝象牙質；ｐｄ＝予備象牙質。スケールバー：１.２ｍｍ（Ａ-Ｄ）；１.０ｍｍ（Ｅ）；５０μｍ（Ｆ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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