(57)【要約】本発明は、生体発光を用いる、酵素活性を検出する方法及びキットに関する。特に、ルシフェラーゼリポーター酵素活性のような、ルシフェラーゼ活性の敏感かつ簡便な検出のための、増加された光産生を有する新規分析系に関する。光シグナルの産生を許すためのルシフェリン及びＡＴＰの存在において、サンプルをインキュベートすることであって、該光シグナルはリン酸イオン及びアンモニウムイオンを含む反応混合物中でインキュベーションを実施することにより増されるインキュベートすること、及び光シグナルを測定することを含む、サンプル中のルシフェラーゼ活性を検出する方法が与えられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のルシフェラーゼ活性を検出する方法において、ルシフェリン及びＡＴＰ並びに光シグナルの産生を許す二価カチオンの存在下においてサンプルをインキュベートすること、ここで該光シグナルの全体の光産出がアンモニウムイオン及び少なくとも20mMのリン酸イオンを含む反応混合物中でインキュベーションを実施することにより増される、及び光シグナルを測定することを含む。
【請求項２】
該リン酸イオン濃度が60mM超である、請求項１に従う方法。
【請求項３】
リン酸イオンが、Ｈ３ＰＯ４、Ｈ２ＰＯ４−若しくはＨＰＯ４２−、ＰＯ４３−又はそれらの組み合わせにより与えられる、請求項１又は２に従う方法。
【請求項４】
該アンモニウムイオンがアンモニウム塩、アミン若しくは両性イオン化合物、又はそれらの組み合わせにより与えられる、請求項１〜３のいずれか１項に従う方法。
【請求項５】
該アンモニウムイオンが、アミンに基づくバッファー、好ましくはトリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）又はビス−トリス（ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタン）により与えられる、請求項１〜４のいずれか１項に従う方法。
【請求項６】
該アミンが、１級又は２級アミン、好ましくはモノエタノールアミン、ジエタノールアミン、モノエチルアミン及びジエチルアミンの群から選ばれるアミンである、請求項４又は５に従う方法。
【請求項７】
アンモニウムイオン濃度が少なくとも20mM、好ましくは少なくとも60mM、より好ましくは100mM超である、請求項１〜６のいずれか１項に従う方法。
【請求項８】
反応混合物ｐＨが５乃至９の範囲にある、請求項１〜７のいずれか１項に従う方法。
【請求項９】
該インキュベーションが、ＤＴＴ、グルタチオン又はＣｏＡのような、外因的に加えられた又は補充のチオール含有性化合物の不在下に実施され、好ましくは該インキュベーションがＤＴＴの不在下に実施される、請求項１〜８のいずれか１項に従う方法。
【請求項１０】
該反応混合物が更に還元剤を含む、請求項１〜９のいずれか１項に従う方法。
【請求項１１】
該還元剤が、非チオール化合物、好ましくはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、チオ硫酸塩、亜硫酸塩及び亜ジチオン酸塩から成る群から選ばれる化合物である、請求項１０に従う方法。
【請求項１２】
リン酸イオン及びアンモニウムイオンを含む、ルシフェラーゼ活性検出のための分析試薬。
【請求項１３】
請求項１２に従う分析試薬及び基質混合物を含む、ルシフェラーゼ活性を検出するためのキット。
【請求項１４】
該基質混合物が真空凍結乾燥された状態にある、請求項１３に従うキット。
【請求項１５】
更に細胞溶解剤を含む、請求項１３又は１４に従うキット。
【請求項１６】
該細胞溶解剤が該分析試薬中に存在する、請求項１５に従うキット。
【請求項１７】
更にルシフェラーゼ標準を含む、請求項１３〜１６のいずれか１項に従うキット。
【請求項１８】
ルシフェラーゼ検出系においてルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の全体の光産出を増すために、リン酸イオン及びアンモニウムイオンの組み合わせを使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体発光を用いる、酵素活性を検出する方法及びキットに関する。特に、ルシフェラーゼ活性の敏感かつ簡便な検出のための、増加された光産生を有する新規分析系に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体発光は自然的に発生する現象であり、多くの応用のために利用されており、特に分子生物学において、それに関係付けられた酵素が遺伝子のリポーターとして用いられる。生体発光は、遺伝子のマーカーとしての使用にとってほぼ理想的である。概して、哺乳類細胞には内因性の発光性活性がないが、実験的に導入された生体発光はほぼ瞬間的で、感度良く、かつ定量的である。数多くの種が生体発光を示すが、比較的少数だけが特徴付けられそしてクローン化されている。これらのうちの、ホタル（フォチヌス  ピラリス）ルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ及びエクオリンだけが多くの実用性を有する。ホタルルシフェラーゼが生態発光を産生するメカニズムにおける分子成分の研究は、酵素の基質がホタルルシフェリン、ポリへテロシクロ有機酸、D-(-)-2-(6'-ヒドロキシ-2'-ベンゾチアゾリル)-Δ2-チアゾリン-4-カルボン酸（以下、本明細書にて「ルシフェリン」と言う）であることを示す。
【０００３】
ホタルルシフェラーゼは、２段階のプロセスでのルシフェリンの酸化を触媒し、５６０ｎｍの光を生じる、単量体の６１ｋＤ酵素である。第一段階は、マグネシウムの存在下でのＡＴＰのα−ホスフェートによるアシル化により、ルシフェリンのカルボキシレート基の活性化に関わり、無機ピロホスフェート（ＰＰi）の脱離によるルシフェリルアデニレートの産生をする。第二段階では、ルシフェリルアデニレートが分子酸素により酸化され、ＡＭＰ、二酸化炭素及びオキシルシフェリンを生じる。オキシルシフェリンは電子的に励起された状態で産生される。基底状態へ遷移すると、オキシルシフェリンは光を放つ。
【０００４】
以下本明細書中にて「ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応」と云われる反応の反応スキームは以下のとおりである。
【０００５】
2008545378.tif 000002
【０００６】
ルシフェラーゼは、リポーター酵素のためにそれを理想的にする多くの特徴を有する。その活性は、何らの翻訳後修飾に依存せず、このことは定量の為にそれを直接に利用可能とする。さらに、発光はとても明るく、多くの他の生体及び化学的発光反応と比較してとても高い量子効率を有する。
【０００７】
光の放出は、ＡＴＰ、Ｍｇ２＋（又はＭｎ２＋のような他の二価カチオン）及びルシフェリンを含む反応混合物であって、全ての成分が飽和濃度に近く又は飽和濃度にある反応混合物中へのルシフェラーゼの添加により開始され、光強度の迅速な増加、及びその後の、数時間継続しうる低水準の維持された光強度への、最初の数秒での迅速な減少を観察する。反応速度におけるこの迅速な減少は生産物阻害によるものであると考えられてきた。ホタルルシフェラーゼを用いる、これら慣用の”閃光”型分析は、光の閃光を結果し、この閃光は酵素への基質の付加により迅速に減衰する。特に、自動化された（例えば機械的な）分析手段ではこれは、もし存在するならば検出されうるシグナルの時間窓をそれは劇的に減少させるので、これは主要な問題である。ルシフェラーゼ分析における光シグナルの持続時間を延ばす為の手段が切に求められてきた。
【０００８】
ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の速度論の問題及び関連する、閃光の間に放出される光を正確に測定することの困難を解決する為の、いくらかの評判を得た手法は酵素の種々の阻害剤を用いることであり、これは閃光が生じることを防ぎ、又は光の産生を延長すると報告された。そのような剤の一つはヒ酸塩である。ヒ酸塩は閃光の頂点を低め、かつ光の放出期間を延ばす傾向がある。光シグナルの強度の減少はかなり望ましくなく、特に、マイクロタイタープレート又はストリップ（strip）を読み取ることができる装置が用いられる場合にはそうである。さらに、ヒ酸塩の使用は環境的な観点から望ましくない。
【０００９】
米国特許第４，２４６，３４０号明細書は同様に、Ｄ−ルシフェリンの類似体のような阻害剤の使用に基づく、ルシフェリン−ルシフェラーゼ分析における光シグナルを延ばす方法を提案する。これは光シグナルを数秒から数分へ延ばす。
【００１０】
補因子補酵素Ａ（ＣｏＡ）は、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応における光放出のパターンに影響すると報告されている。Airthら（Biochimica  et  Biophysica  Acta,  Vol.  27(1958)pp.  519-532）は、ＣｏＡがホタルルシフェリン−ホタルルシフェラーゼ反応混合物に添加された場合、光強度の初期頂点に対する影響は無いが、添加された全ＣｏＡに比例する時間、より高い水準で発光が継続しうることを報告する。Airthらは、放出された全体の光は、ＣｏＡの不在下よりも存在下のほうがより多いことを示した。米国特許第５，２８３，１７９号明細書も、より多い酵素代謝産物、そしてそれによるより大きな発光強度を生じる為の、分析試薬中への補酵素Ａ（ＣｏＡ）の添加を開示する。これは、少なくとも６０秒間維持される、増加された光産出を結果した。
【００１１】
他のスルフヒドリル化合物が酵素の調製及び保管の間のルシフェラーゼの安定性に貢献することが報告されている。米国特許第４，８３３，０７５号明細書は、古いフォチヌス  ピラリスルシフェラーゼ溶液中で、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）が５０％の水準でルシフェラーゼ活性を維持しうることを開示し、上記古い溶液は、ＤＴＴなしでは新鮮に調製されたルシフェラーゼ溶液と比べて僅か１０％の残存酵素活性を有する。米国特許第４，６１４，７１２号明細書は、バクテリアのルシフェラーゼがジスルフィド形成により不活性化された場合、酵素活性がＤＴＴ、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）又は他の還元剤の添加により回復されうることを記載する。
【００１２】
米国特許第５，６１８，６８２号明細書は、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の検出可能な光子の放出の持続時間を増加する組成物及び方法を記載する。この目的で、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、ＡＴＰ及びルシフェラーゼ触媒活性に必要とされる補因子を含む反応混合物が、アデノシン一リン酸、ラジカル捕捉剤（ＤＴＴ）及びキレート剤（ＥＤＴＡ）を含む組成物と混合される。
【００１３】
米国特許第５，６５０，２８９号明細書は、反応混合物中におけるＣｏＡ及びＤＴＴの組合せ使用がルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の速度論に正に影響することを報告する。光シグナルの半減期、すなわち当初の光シグナルの50％が観察される期間は、300〜500秒であると評価された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ホタルルシフェラーゼリポーター酵素の敏感な検出の為の、改善された光産出及び延長された明るい光放出を有する代替的なルシフェラーゼ検出分析系を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
驚くべきことに、この目的が、リン酸アニオン及びアンモニウムカチオンの存在下においてルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を実施することにより達成されることが発見された。それ故に、本発明は、サンプル中のルシフェラーゼ活性を検出する方法において、サンプル、又はその一部を、ルシフェリン及びＡＴＰ並びに光シグナルの産生を許す為に必要とされる何らかの補因子（例えばＭｇ２＋又はＭｎ２＋）の存在下においてインキュベートすること、ここで該インキュベーションが該光シグナルを増す為にリン酸イオン及びアンモニウムイオンを含む反応混合物中で実施される、及び光シグナルを測定することを含む方法に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本明細書中で示されるように、反応混合物中のアンモニウム及びリン酸の組合わされた存在は、比較的長い時間安定である強い光シグナルを生じる。30分から８時間までに及ぶ光シグナルの半減期が達成されうる。
【００１７】
本発明の利点は、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応における光産生の速度論及び産生される全体の光の改善を与え、その改善がルシフェラーゼについての分析を簡単かつ敏感にすることである。例えば、本発明の方法又は試験キットにより、慣用のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の迅速な閃光において放出される光を測定する為の、迅速なサンプル注入のような特別な手順、又は精巧な照度計のような特別な機器を、分析は必要としない。確かに、本発明の方法及び、組成物又はキットを用いることで、シンチレーションカウンターのような、他の種類の計測の為に多くの実験室ですでに利用可能である装置が、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応において産生された光の測定を必要とする分析において採用されうる。これは、光産生を測定する為に、照度計を有さないがシンチレーションカウンター又は他の装置を有する実験室における上記分析の使用を容易にすることにより、科学及び技術におけるそのような分析の適用を、有意に拡張する。
【００１８】
本発明の方法又は試験キットの他の利点は、維持される高いシグナルにより、多数のサンプルが、マイクロプレート中で調製され、そしてルシフェラーゼ活性について分析されうることである。これは、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）の応用における、サンプルのバッチ式及び連続的処理の両方において特に役立つ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明に従い、反応混合物は、比較的高い濃度のリン酸イオン及びアンモニウムイオンの両方を含む。一般的に云うと、リン酸根濃度が高いほど、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の全体の光産出が高いことが観察される。全体の光産出又は全体の発光は、時間の関数としての、検出可能な光の単位を表す曲線下の面積を云う。それは、頂点強度（すなわち、酵素及び基質を一緒にすると生じる最初の光バースト）、及び頂点強度が達成された後の、強度が減少する速度により決定される。
【００２０】
反応混合物中の全リン酸根濃度は好ましくは、少なくとも10mM、好ましくは少なくとも25mM、より好ましくは少なくとも60mM、最も好ましくは少なくとも100mMである。例えば、125mM、150mM、200mM、500mM又は１Mのリン酸濃度が用いられうる。以下の実施例に例示されるように、1.4Mリン酸根までのリン酸根濃度が試験され、初期光シグナル及び光シグナルの持続時間の点において良い結果を生じた。本明細書中で用いられる語「リン酸根」は、１のリン原子及び４の酸素原子からなる多原子のイオン又は基を云う。イオンの形態では、−３の形式電荷を帯び、そしてＰＯ４３−により示される。生化学的な環境では、溶液中の遊離リン酸イオンは無機リン酸根と呼ばれる。無機リン酸根は一般的にはＰｉにより示される。リン酸根の適当な源は、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）及び、ＰＯ４３−、ＨＰＯ４２−及びＨ２ＰＯ４−のアルカリ塩又はアルカリ土類塩のようなそれらの塩を含む。
【００２１】
本明細書で用いられる語「アンモニウムイオン」は、一般式ＮＲ４＋のカチオンを云い、ここでＲは本質的に任意の基でよい。好ましいＲ基は、任意的に例えばヒドロキシルで置換された、線状又は枝分かれした炭化水素のような脂肪族基、及び水素を包含する。窒素原子を配位する４つのＲ基は、同じ又は異なってよい。アンモニウムイオンは、水溶液中でＮＲ４＋イオンを与えることができる任意の化合物により、反応混合物に供給されてよい。一つの実施態様では、アンモニウムイオンは、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４及び（ＮＨ４）２ＨＰＯ４のような、１以上のアンモニウム（ＮＨ４＋）塩により与えられる。ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４及び（ＮＨ４）２ＨＰＯ４は、これら塩がアンモニウムカチオンだけでなくリン酸アニオンの両方を与えるので、とても適当である。更なる実施態様では、アンモニウムイオンはプロトン化されたアミンにより与えられうる。アミンは、アンモニア（ＮＨ３）の有機的誘導体である。１、２又は３のアルキル基はアンモニアの水素を置換して、１級、２級又は３級アミンを夫々与えうる。アンモニアのように、アンモニア誘導体であるアミン、は弱塩基である。これは、アミンの水溶液は、もしアミンを水を混合するならばアルカリ性になり、窒素原子上の孤立電子対が水からプロトンを奪って、アンモニウムイオン及び水酸化イオンを産生することを意味する。
【００２２】
本発明に従い１Mのエタノールアミンの最終濃度は、水性反応混合物に１Mのアンモニウムイオンを備えるとみなされる。このように、反応混合物中のアンモニウムイオンの濃度は、反応混合物中のアンモニウムイオンの化合物（バッファー、塩等）源の濃度と同一であるとみなされる。
【００２３】
標準的な脂肪族アミンは、３〜４の範囲のｐＫｂを有する、ほぼ同じ塩基強度を有し、そしてアンモニアよりやや強い塩基である。アンモニアと比較しての塩基性の増加は、アンモニウムイオンＮＨ４＋と比較しての例えばＲＣＨ２ＮＨ３＋ような、アルキルアンモニウムイオンのより大きな安定性に起因しうる。このより大きな安定性は、アルキル基の電子供与的な効果及び結果として生じる、アルキルアンモニウムイオンにおける、窒素原子から炭素原子上へ正電荷の部分的な非局在化から生じる。芳香族アミンは、ほぼ９〜１３のｐＫｂを有するはるかにより弱い塩基である。これは、芳香族のπ系への孤立電子対の共鳴非局在化により説明されうる。
【００２４】
上記から明らかなように、本発明は、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応混合物中のリン酸イオン及びアンモニウムイオンの組合わされた存在が、ルシフェラーゼ検出系の全体の発光を増すことを開示する。全体の光産出に対するこの有益な効果は、ルシフェラーゼ検出系のようにやはりルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を採用するＡＴＰ検出の為の系においては観察されないことが注目されるべきである（例えば本明細書の以下の実施例４を参照）。ＡＴＰ分析では、大量のトリスリン酸のイオンと組み合わせた、大量のルシフェラーゼ（分析試薬として）及び低量のＡＴＰ（サンプル中に存在する）が、分析混合物中にトリスリン酸がない又はより低量である場合よりも、より低い全体の発光を生じる。対照的に、トリスリン酸のイオン濃度の量の増加は、大量のＡＴＰ（分析試薬である）及び低量のルシフェラーゼ（サンプルに由来する）を含むルシフェラーゼ検出分析混合物中の発光反応の光産出を増す。ホタルルシフェラーゼの酵素の特徴は、ＡＴＰ−及びルシフェラーゼの検出夫々の為に調整された分析間で異なることが報告されている。例として、"A  Practical  Guide  to  Industrial  Uses  of  ATP-Luminescence  in  Rapid  Microbiology"（Cara  Technology  Limited,  Lingfieldにより１９９７年に発行された）におけるYeらを参照されたい。本発明において開示される、アンモニウムイオンおよびリン酸イオンの組み合わせの、ルシフェラーゼ検出系及びＡＴＰ検出系に対しての顕著な影響は、異なる酵素の特徴に関係している可能性が非常に高い。一つの実施態様では、本発明の方法は、サンプル中のルシフェラーゼ活性を検出することであって、その検出は、ルシフェリン及び（ルシフェラーゼに比べて）過剰のＡＴＰ並びに光シグナルの産生を許す二価カチオンの存在下においてサンプルをインキュベートすること、ここで該光シグナルの全体の光産出は、アンモニウムイオン及び少なくとも20mMのリン酸イオン及びアンモニウムイオンを含む反応混合物中でインキュベーションを実施することにより増加される、及び光シグナルを測定することを含む。好ましくは、ルシフェリン／ルシフェラーゼ分析混合物中のＡＴＰの濃度は、少なくとも0.05mM、好ましくは少なくとも0.1mMであり、例えば0.5〜５ｍＭ  ＡＴＰの範囲である。
【００２５】
本発明の方法において、用いられるアミンは好ましくは反応混合物のｐＨでプロトン化され、該ｐＨは典型的にはｐＨ５乃至９の範囲である。これは、アミンのｐＫｂが好ましくは、反応混合物の所望のｐＨ未満であることを意味する。下の表１は、いくつかのアミンのいくつかの例及びそれらのｐＫｂ値を一覧にする。エチルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン及びジエタノールアミンのような、１級及び２級のアルキルアミン又はアルカノールアミンは、本発明の方法において特に有用であるように見える。しかしながら、トリエチルアミンのような或る種の３級アミンも用いられうる。
【００２６】
2008545378.tif 000003
【００２７】
アミンに基づくバッファーは、本発明を実施することにおいて特に有用である。アミンに基づくバッファーの例は、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン及びビス−トリス（ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノ]−トリス（ヒドロキシメチル）メタン）を含む。さらに、ヘテロ環状アミンが用いられうる。ヘテロ環状アミンにおいて、５又は６の原子の環が１以上の窒素原子を含む。例はイミダゾールである。さらに、両性イオン化合物が、ルシフェラーゼ反応混合物にアンモニウムイオンを備える為に用いられうる。定義により、両性イオン（zwitterion）（ドイツ語の「zwei」に由来し、「２」を意味する）は、同一分子中に正及び負に荷電したイオンの両方を含むイオンである。両性イオンは、酸性及び塩基性の基の両方を含有する化合物により形成されうる。アミノ酸は両性イオン化合物の典型的な例である。カルボキシル及びアミノの両方の官能基がアミノ酸中に存在することにより、これら二つの官能基は同一の方法で互いに反応する傾向にあり、カルボキシレートアニオン及びアンモニウムカチオンの両方の官能基を有する、「分子内塩」を生じる。平衡は塩とは離れたところにあり、その故にアミノ酸の優勢な構造は両性イオン構造である。例えば、グリシンは塩基性アミノ基（ＮＨ２）及び酸性カルボキシル基（ＣＯＯＨ）の両方を含み、これらが水溶液中で両方ともイオン化される場合、酸基はプロトンをアミノ基へと失い、分子は一端で正に荷電し、かつ他端で負に荷電する。実質的に酸性の溶液では、両性イオンのカルボン酸官能基はプロトン化され、従ってアンモニウムイオン官能基を有するカチオン的構造を形成する。これは、両性イオンの（及びまた、アミノ基をプロトン化することによる、中性で非荷電のアミノ酸の形態の）共役酸である。本発明に従い、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応混合物のｐＨより上の、アミノ基の共役酸のｐＫａを有する両性イオン化合物が好ましく、なぜならこれが、アミン部分がプロトン化されることを保証するからである。
【００２８】
有用な両性イオン化合物の他の種類は、両性イオンバッファーにより表される。表２は、本発明において用いられうる、いくつかの典型的なよく知られた両性イオンバッファーを一覧にする。しかしながら、本発明は以下に一覧にされ、これら両性イオンバッファーの使用に限られない。本発明の方法において、反応混合物ｐＨは典型的には５乃至９、好ましくは６．５乃至８．２の間に及ぶ。
【００２９】
2008545378.tif 000004
2008545378.tif 000005
【００３０】
上から明らかなように、リン酸根源及びアンモニウム源の、多くの組み合わせが、本発明のルシフェラーゼ反応混合物中で用いられうる。所与のイオンの為の１より多い源が用いられてもよい。リン酸根／アンモニウム源の或る組み合わせが特に有用であることが発見された。リン酸により中和される、トリス又はビス−トリスのような、アミンに基づくイオン的バッファーの組み合わせは、本発明における使用にとって特に関心がある。
【００３１】
本発明のルシフェラーゼ反応混合物中のアンモニウムイオンの濃度は様々であってよい。少なくとも20mM、より良くは60mM超のアンモニウムイオンの濃度が好まれる。非常に良い光産出は、100mM超のアンモニウムイオン、さらにより良くは200mM超のアンモニウムイオン、例えば、250mM  トリス若しくはエタノールアミン又は500mMアンモニウム（ＮＨ４＋）の濃度で観察されうる。
【００３２】
本発明に従い、反応混合物中のリン酸イオン及びアンモニウムイオンの濃度は同じであってよく、あるいはそれらは異なってよい。一つの実施態様では、アンモニウムイオンの濃度はリン酸イオンの濃度よりも高い。他の実施態様では、アンモニウムイオンの濃度はリン酸イオンの濃度よりも低い。特定の実施態様では、アンモニウムイオンは過剰のリン酸イオン中に存在し、例えば、アンモニウムイオンの、少なくとも1.1倍過剰、好ましくは少なくとも1.4倍過剰、例えば1.5、1.7、1.8倍、又は２倍でさえ過剰である。以下に例示されるように、過剰（例えば２倍）のリン酸（リン酸イオンの源として）中の、アンモニウムイオンの源としてのトリスを用いて、特に、少なくとも60mMのリン酸根濃度及び／又は少なくとも120mMのアンモニウムイオン濃度で、非常に良い結果が得られうる（表３参照）。ルシフェラーゼ反応の全体の光産出に対する、エタノールアミン（表４）又はアンモニウム（表５）及びリン酸根の濃度を増加させることの影響を示す表４及び５を参照されたい。ここでも、アンモニウムイオンは過剰のリン酸イオン中に存在する。これは、アンモニウムイオン（Ｔｒｉｓ、エタノールアミン、リン酸アンモニウム）を含有する溶液をリン酸でｐＨ7.0に中和することの結果である。もちろん、水性反応混合物の最終ｐＨがもっぱらアンモニウムイオン及びリン酸イオンにより調節されることは必要条件ではない。例えば、本発明は、ＮａＯＨ、ＫＯＨ及び同様物のような、アンモニウムイオンの源でないアルカリ剤により中和される、過剰のアンモニウムイオン中にリン酸イオンを含む反応混合物も包含する。同様の様式で、リン酸イオンを与えるもの以外の酸性剤が所望の値にｐＨを合わせる為に用いられうる。
【００３３】
一つの実施態様では、トリスバッファー及びリン酸の組み合わせが用いられる。例えば、63mM  Ｈ３ＰＯ４により中和された125mM  トリスを含む２倍検出バッファーが、反応混合物に十分なリン酸イオン及びアンモニウムイオンを与えて、光シグナルの強さ及び速度論に正に影響する。トリス及び／又はリン酸根の濃度を増加させることは、さらにこの影響を増す（図１も参照のこと）。非常に満足な結果が、少なくとも125mMリン酸根が加えられた、少なくとも250mM  トリスを含む反応混合物において得られた。
【００３４】
他の有用な組み合わせは、モノ−及びジ−アルカノールアミン及びリン酸を含む。一つの局面では、ルシフェラーゼ反応混合物は、リン酸によりほぼｐＨ＝7.0に中和されたエタノールアミンを含む（図２を参照されたい）。反応混合物は好ましくは、ルシフェラーゼの為の安定化剤をも含む。安定化剤の適当な例は、哺乳類血清アルブミン、ラクトアルブミン及びオボアルブミンである。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の使用が好ましい。安定化剤の量は典型的には、反応混合物の全重量に基づき計算して、１重量％未満だろう。更に、反応混合物は好ましくは、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（ＥＧＴＡ）又はシクロヘキサン−１，２−ジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）のような封鎖剤を含む。封鎖剤は一般的には0.1から25mMの量で存在する。
【００３５】
当業者に既知のルシフェラーゼ活性を検出する方法は典型的には、ＤＴＴ及び／又はＣｏＡのようなチオールを含有する化合物を含む（例として米国特許第５，６５０，２８９号明細書を参照されたい）。報告されるところによれば、チオールはルシフェラーゼの安定性に寄与しかつ光産生の速度論を改善するが、それらはいくつかの欠点を有する。チオールを含有する処方は刺激臭を有する。更に、チオールは溶液中で自己酸化を受けそして、その結果として長時間安定ではない。本発明者らは意外なことに、もしアンモニウムイオン及びリン酸イオンが両方とも存在するならば、ルシフェラーゼ反応混合物中のチオール化合物はもはや必要ないことを観察した。チオールは不在だがアンモニウムイオン（例えばトリスバッファーにより与えられる）及びリン酸イオンが存在する場合の全体の光産生は、チオールの存在下における光産生と同様又は優るさえすることが見出された。これによって、本発明は、サンプル中のルシフェラーゼ活性を検出する方法を与え、その方法は、ルシフェリン、ＡＴＰ及び光シグナルの産生を許す二価カチオン（例えばＭｇ２＋又はＭｎ２＋）の存在下においてサンプルをインキュベートすること、ここで該インキュベートがチオールを含有する化合物の相対的な不在下においてリン酸イオン及びアンモニアイオンを含む反応混合物中で実施される、及び光シグナルを測定することを含む。表現「チオールを含有する化合物の相対的な不在」は、ＤＴＴ、グルタチオン及び／又はＣｏＡのような、外因性又は補充のチオール化合物が反応混合物に添加されないことを示す為に意味される。一つの実施態様では、本発明の反応混合物及び分析試薬は、チオール化合物を有さない又は実質的に有さない。しかしながら、ルシフェラーゼ活性について分析されるべきサンプルが、微量のチオール化合物、例えば細胞由来の又は反応混合物への別の溶解溶液からのチオールを含むことが起こりうる。好ましい実施態様では、本発明は、サンプル中のルシフェラーゼ活性を検出する方法を提供し、その方法はサンプルをルシフェリン及びＡＴＰ並びに光シグナルの産生を許す二価カチオンの存在下においてインキュベートすること、ここで該光シグナルの全体の光産出は、アンモニウムイオン及びリン酸イオンを含むが外因性又は補充のチオール化合物を含まない（すなわち非細胞由来のチオール化合物を含まない）反応混合物中でインキュベーションを実施すること、及び光シグナルを測定することにより増される、及び光シグナルを測定することを含む。好ましくは、反応混合物は少なくとも20mM、より好ましくは100、150、200、250、350、400、500mMのような60mM超、又はさらに１若しくは1.5Mさえのリン酸イオンを、任意的に少なくとも60mM又は好ましくは少なくとも100mM超のアンモニウムイオンとの組み合わせで含む。
【００３６】
本発明の教示はチオール化合物の含有を不必要とするが、本発明はチオール化合物なしの分析条件に限られないことが注目されるべきである。ＤＴＴ、グルタチオン及び／又はＣｏＡ、あるいは何らか他の一般に用いられる当業者に既知の分析成分が、反応混合物中に存在してよい。しかしながら、匂いのない非チオール還元剤の使用が好まれる。例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸（ＴＣＥＰ）のような、水溶性の有機ホスフィンを含有する化合物が、本発明の方法において用いられうる（国際公開第０３／０４４２２３号パンフレットを参照されたい）。本発明者らは、チオ硫酸塩、亜硫酸塩及び亜ジチオン酸塩のような、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応混合物中に使用する為に適当であるとして、他の適当な還元剤も同定した（実施例３及び実施例４を参照されたい）。還元剤は典型的には0.1から10mMの量で存在する。
【００３７】
上述された物質以外に、反応混合物は、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応混合物中で用いられる、全ての通常の物質を含みうる。
【００３８】
本発明の方法は、サンプル中のルシフェラーゼ活性の敏感かつ簡便な検出を許す。サンプルはルシフェラーゼ活性を含む（と疑われる）細胞を含みうる。サンプルは、細胞、例えばルシフェラーゼをコードする核酸が供えられた細胞の懸濁物、抽出物又は溶解物であってよい。甲虫の発光器官から直接的に単離された結晶性のルシフェラーゼの入手可能性以上に、いくつかの甲虫の種のルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡ（とりわけ、Ｐ．ピラリス（ホタル）のルシフェラーゼ、Ｐ．ピラジオフタラマス（コメツキムシ）の４つのルシフェラーゼアイソザイム、Ｌ．クルシアタ（ホタル）のルシフェラーゼ及びＬ．ラテラリスのルシフェラーゼ）（de  Wet  et  al.,  Molec.  Cell.  Biol.  7,  725-737(1987);Masuda  et  at.,  Gene  77,  265-270(1989);Wood  et  al.,  Science  244,  700-702(1989);欧州特許出願公開第0  353  464号明細書）が入手可能である。更に、ルシフェラーゼを作る、何らか他の甲虫種のルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡが、当業者により、既知の技術を用いて容易に入手可能である（de  Wet  et  al.  Meth.  Enzymol.  133,  3-14(1986);Wood  et  al.,  Science  244,  700-702(1989)）。また、変異ルシフェラーゼ、例えば、増加されたｐＨ安定性又は増加された熱安定性を有する天然に生じないルシフェラーゼのような、その特性を改善する為に遺伝子的に操作されたルシフェラーゼの活性の検出も包含される。他の有用な変異体は、製造された発光において色の変化を引き起こす修正を含むルシフェラーゼである。これらは、例えば米国特許第６，３８７，６７５号明細書に記載される。
【００３９】
ホタルルシフェラーゼは、遺伝子調節の研究におけるリポーターとして、様々な発現ベクターから及び種々の生物において信頼性良く発現され得る。ルシフェラーゼリポーター分析系は、現在では、遺伝子発現を測定する為の最も非毒性、迅速及び敏感な方法の一つである。分析は、遺伝子中のＤＮＡ調節要素に起因する転写、それら要素内の変異ならびに細胞外及び細胞内のシグナルへの応答に関係するルシフェラーゼ活性の検出に基づく。
【００４０】
好ましい実施態様では、本発明の方法は、リポーター酵素として用いられるルシフェラーゼの活性を定量する為に適用される。ルシフェラーゼリポーター遺伝子系の使用の為の基本的な工程は以下のとおりである：１）適切なルシフェラーゼリポーターベクターの構築；２）ルシフェラーゼ発現を許す細胞内へのプラスミドＤＮＡの形質移入；３）任意的に細胞抽出物の調製、及び４）光シグナルにより証されるルシフェラーゼ活性の測定。本発明に従い、後者の測定は、全体の光産出を増加させる為の、リン酸根及びアンモニウムの両方の存在下において実施される。
【００４１】
全ての反応と同様に、温度はルシフェラーゼ活性の速度に影響する。最適なルシフェラーゼ分析の為に許容される範囲は、20〜25℃の間である。周囲の室温はこの範囲内にあり、分析の実施にとって簡便である。それ故に、サンプル及び全てのバッファーは好ましくは、一貫したかつ再現可能な結果を得る為に、室温に平衡することが許容される。３０℃を超える温度では、光放出は赤に移り、酵素が早く分解する。
【００４２】
検出されるべきルシフェラーゼの量に比較して過剰なＡＴＰ、ルシフェリン及びＭｇ２＋の条件下において、初期頂点の高さ及び反応からの積分された全光放出量は、機能的なルシフェラーゼ酵素の量と比例する。しかしながら、最適な光産生は、Ｋｍ値を超える、かなり狭い基質濃度範囲においてのみ発生する。より低いＡＴＰ濃度では、光放出頂点の高さが達せられ、そして長期間にわたりその水準のままであるが、より高いＡＴＰ濃度では初期光バーストが増加されるが、衰退の速度はそうでない。ルシフェラーゼ溶解物には二つのＡＴＰの源が存在する：サンプルに加えられた既知の量、及びルシフェラーゼサンプル中に共に抽出された内因性細胞性ＡＴＰの未知かつ種々の量である。絶対的な最終濃度は幾分不確かである。大抵の分析条件の為に、分析反応混合物中の0.5〜2.5mM  ＡＴＰが最適だろう。
【００４３】
系の他の反応補因子及び基質の成分、主としてＭｇ２＋（又はＭｎ２＋）及びルシフェリンはまた、最適な濃度を有する。それらは、ＡＴＰよりも、これら値の広い範囲を有する傾向にある。マグネシウムイオンは好ましくは少なくとも0.5mMの量で存在する。通常は、反応混合物中のＭｇ２＋の濃度は50mMを超えない。多く条件について、0.5〜1.0mMの最終ルシフェリン濃度及び１〜５mMのＭｇ２＋濃度が、ほぼ最適である。細胞抽出物中のＭｇ２＋の比較的低い濃度は概して反応速度を変える為に不十分であり、かつホタルルシフェリンは他の生物中に見られる天然の成分ではない。もし細胞溶解物が調製されるならば、細胞に対してＭｇ２＋及びＣａ２＋がない洗浄バッファーの使用が推奨される。ルシフェリンは好ましくは、0.01乃至３ｍＭの間、より好ましくは0.05乃至1.0ｍＭの間の量で存在する。
【００４４】
相対的な実験的ルシフェラーゼ活性が絶対値に関係付けられるべきときは、精製されたルシフェラーゼ標準曲線が利用されうる。通常は、活性の測定される水準はＲＬＵ、すなわち相対発光単位で述べられる故に、絶対値は決定されない。異なる装置により測定されるときは、機器の設計及び較正における差異の故に、ＲＬＵ値は同一サンプルについて極めて有意に変化しうる。特定の活性が保証されたルシフェラーゼ標準は、製造者の仕様書に従い再構成される場合、既知のルシフェラーゼ量から得られるシグナルを結果するだろう。これら既知の特定の活性参照値は、所与の機器に対して、任意のＲＬＵサンプル測定を正規化する為に用いられうる。更に、発現されたルシフェラーゼの特定の活性は精製されたルシフェラーゼと異なりうる故に、精製されたルシフェラーゼ標準は、形質転換された細胞により生産されたルシフェラーゼの正確な量を必ずしも表さない。なぜならば、発現されたルシフェラーゼの特定の活性は、精製されたルシフェラーゼと違いうるからである。
【００４５】
本発明の方法における、（異種）発現されたルシフェラーゼ活性の測定の為に、ルシフェラーゼを含有すると疑われる細胞の懸濁物が、溶解剤を含む反応バッファーに、単純で添加されうる。従って、別の溶解工程は必要とされない。細胞が溶解すると、ルシフェラーゼは反応バッファーの他の成分（基質、補因子、アンモニウムイオン及びリン酸イオンなど）に接近可能となり、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応が起こりうる。典型的な溶解剤は、Tergitol（商標）NP-9、Triton（商標）X-100、Thesis（商標）及びTween（商標）20のような非イオン性界面活性剤である。
【００４６】
他の実施態様では、サンプルは細胞溶解物又は細胞抽出物を含み、すなわちルシフェラーゼは、ルシフェラーゼを発現する細胞から最初に抽出される。ルシフェラーゼの抽出の為の２つの主要な手法があり、機械的又は化学的な方法のいずれかによる。両方の方法ともに有利点及び不利点を有し、用いられる方法の評価は、効率的なルシフェラーゼ抽出及び最適な分析感度にとって重要である。
細胞溶解物は、認識しうる無傷の細胞構造にもはや編成されない細胞成分を含む。細胞溶解物は可溶性又は不溶性の成分を有し得、そのいずれかが除去された後、溶解物が用いられる。超音波処理、ダウンス（dounce）、すり鉢とすりこぎ、凍結解凍の繰返し、若しくは細胞の物理的な一体性を破壊する何らか他の装置若しくは処理を用いた機械的な破壊、又は両性イオン界面活性剤及び非イオン界面活性剤若しくはカチオン的界面活性剤のような界面活性剤による化学的溶解を含む何らかの手段により、溶解物は調製されうる。細胞破砕に最も一般的に用いられる機械的な溶解方法は超音波処理である。サンプルに結合される大量のエネルギーの故に、加熱が生じうる。ルシフェラーゼは熱不安定であり、それ故に、超音波処理方法は、短い超音波処理の繰返しを用いることにより、これを考慮すべきである。５〜１０秒の５回の超音波破砕と共にサンプルの冷却が、最小限のルシフェラーゼの不活性化を有する溶解の為に、通常、十分である。複数の繰返しの凍結解凍溶解も、ルシフェラーゼ分析に幅広く利用される。この機械的な溶解方法の不利点は、ルシフェラーゼが、遠心後に、細胞の砕片沈殿物に結合したままである傾向にあることである。利点は、細胞破砕化学品からの干渉がないことである。
【００４７】
真核細胞の溶解の、有意な改善及び簡便性は、化学的溶解により達せられうる。１％Triton（商標）X-100のような非イオン性界面活性剤を使用することは、細胞成分からのルシフェラーゼの可溶性を大いに増す。界面活性剤による、より良い回収及びルシフェラーゼ活性の刺激の故に、単純凍結解凍の溶解より２５倍多い光放出が可能である。他のカチオン性又は両性イオン界面活性剤は真核細胞の溶解にとって有用であり得、かつ同様にルシフェラーゼ活性を刺激する傾向にある得る。しかしながら、アニオン性界面活性剤は概してルシフェラーゼ活性を阻害する。適当な緩衝系も、酵素活性の最適化において必要とされる。トリスリン酸、トリシン又はリン酸塩バッファー、ｐＨ7.5〜8.0、を有する溶解試薬が最大のルシフェラーゼ安定性にとって好まれる。ＤＴＴの添加は酵素機能を保つことを助け得、ＥＤＴＡ又はＥＧＴＡのようなキレート剤が、例えばルシフェラーゼに不都合に影響しうるプロテアーゼの活性を抑制する為に、例えばＭｇ２＋及びＣａ２＋イオンのキレート化及びルシフェラーゼ活性を阻害しうる重金属イオンのキレート化の為に好ましくは含まれる。微生物生理の性質の故に、微生物の溶解の為の界面活性剤単独の含有は不十分であることがわかる。微生物の細胞壁の更なる破壊は一般的に、好結果となる為に酵素的及び／又は機械的溶解工程を必要とする。１％Triton  X-100及び１ｍｇ／ｍｌ  リゾチームの組み合わせは、ルシフェラーゼの活性又は安定性に影響することなく、溶解に用いられうる。細胞破砕物に結合した、過度でない量のルシフェラーゼが抽出できないままである。可能な代替法は、遠心が無く、明澄化されていない微生物溶解物の使用であり、これは感度を増加させるが、抽出物中の酵素の均一でない配分の故に再現性を低める。
【００４８】
本発明の他の面は、リン酸イオン及びアンモニウムイオンを含む、ルシフェラーゼ活性の検出の為の分析試薬に関する。該分析試薬は、反応混合物中へ希釈されると、リン酸イオン及びアンモニウムイオンの所望の最終濃度を与える、高濃度な形態でありうる。好ましい（高濃度の）分析試薬は、少なくとも40mMリン酸イオン、より好ましくは少なくとも100mMリン酸イオン、最も好ましくは少なくとも250mMリン酸イオン、及び／又は少なくとも20mMアンモニウムイオン、好ましくは少なくとも100mM、最も好ましくは少なくとも250mMアンモニウムイオンを含む。特定の面において、分析試薬中のアンモニウムイオンは、リン酸イオンより多く、例えば１．１倍過剰、又は１．５〜２．０倍過剰あるいはさらにより高く過剰で存在する。好ましい分析試薬は、リン酸により中性のｐＨに中和された、トリス、エタノールアミン及び／又はリン酸アンモニウム（ＮＨ４）２ＨＰＯ４を含むものである。しかしながら、アンモニウム及びリン酸根源の他の組み合わせが同様に用いられうる。典型的な分析試薬は、以下の実施例に記載されるものである。
【００４９】
分析試薬は、液体の形態（例えば水溶液）又は再構成するとリン酸イオン及びアンモニウムイオンを与える固体の形態であってよい。好ましい分析試薬は、アンモニウムイオンの源として、アンモニウム塩、アミン、両性イオン化合物及びそれらの組み合わせから成る群から選ばれる化合物を含む。他方の好ましい分析試薬は、リン酸根の源として、リン酸又はその塩を含む。分析試薬は、安定化剤、キレート剤、還元剤及び／又は細胞溶解剤のような、他の有用な物質を含んでもよい。一つの実施態様では、本発明は、ルシフェラーゼを除く、ルシフェリンールシフェラーゼ反応が起こる為に必要な全ての成分を含む分析試薬を提供する。この「１以外の全部」のタイプの分析試薬は、光シグナルを得る為に、ルシフェラーゼの源、例えばルシフェラーゼを発現する細胞の懸濁物と、単純に接触されうる。「１以外の全部」分析試薬の例は、トリスリン酸バッファーｐＨ７、Ｄ−ルシフェリン、ＡＴＰ、Ｍｇ２＋、ＥＤＴＡ、Ｃａ２＋、チオ硫酸塩及び細胞を溶解する為の非イオン界面活性剤を含む。アンモニウムイオン及びリン酸イオンが存在する限りにおいて、当業者は本分析試薬の多くの変形を調製できるであろう。
【００５０】
好ましい実施態様では、分析試薬はＤＴＴを含まず、なぜならルシフェリンがＤＴＴの不在下でより安定であることが発見されたからである。ＤＴＴの不在下のルシフェリンの安定性は、十分長い保存期間を有する、「１以外の全部」の分析試薬を調製することを許す。
【００５１】
ルシフェラーゼ活性分析、例えば遺伝子リポーター分析、において使用するキットも提供され、該キットは本明細書において与えられるようなルシフェラーゼ活性分析を実施する為に必要とされる成分を含む。そのようなキット成分は、ルシフェラーゼ基質（ルシフェリン）、補基質（ＡＴＰ）、Ｍｇ２＋又はＭｎ２＋のような補因子、チオ硫酸ナトリウムのような還元剤及びリン酸イオン及びアンモニウムイオンの源を含む。
【００５２】
好ましくは、キットは上述された分析試薬を含む。他の有用なキット成分は、溶解バッファー、好ましくは非イオン性界面活性剤を含む。好ましくは、キット成分は、最少数の別々の容器にまとめられる。成分の予備混合は、キットのユーザーにより実施される操作工程の数を減らす。一つの実施態様では、ルシフェリン、ＡＴＰ及び還元剤を含む基質混合物を有する第１の容器、及び少なくともリン酸イオン及びアンモニウムイオン並びに二価カチオンを含むバッファー溶液を有する第２の容器を含むルシフェラーゼ検出キットを、本発明は提供する。さらに、バッファー溶液は、安定化剤、キレート剤及び／又は細胞溶解剤のような、追加の有用な物質を含みうる。もちろん、基質混合物及びバッファー溶液のいずれか又は両方が、追加的な（バッファー）塩、キレート剤、細胞溶解剤、二価カチオン（Ｍｇ２＋；Ｍｎ２＋）、安定化剤及び同様物のような、他の有用な成分を含んでよい。好ましい実施態様では、キットは、バッファー溶液により再構成されて、すぐに使用できる検出バッファーを生じる、真空凍結乾燥された基質混合物を含む。新たに調製された検出バッファーは、その後、ルシフェラーゼ活性について分析されるべきサンプルに加えられうる。上述のリン酸イオン及びアンモニウムイオンの源のいずれかが、バッファー溶液中で用いられうる。特定の面において、本発明はキットを提供し、ここでバッファー溶液中のアンモニウムイオンはトリス又は（ジ）エタノールアミンにより与えられる。該バッファー溶液は好ましくはＨ３ＰＯ４により中和される。
【００５３】
本発明のキットは細胞溶解溶液も含む。キットは更に、陽性対照として又はルシフェラーゼ標準曲線を用意する為に用いられうる（精製された）ルシフェラーゼ酵素を含みうる。
【００５４】
特定の面において、本発明のキットは、凍結乾燥された基質混合物及び、すぐに使えるルシフェラーゼ検出試薬を得るために該凍結乾燥された基質混合物に添加されるべきバッファー溶液を含む。凍結乾燥された基質混合物はＡＴＰ、ルシフェリン及びチオ硫酸塩を含む。基質混合物は更に、光シグナルの半減期を更に増すＡＭＰのような、当技術分野で既知の、他の有用な成分を含む。バッファー溶液は、アンモニウム、リン酸根、界面活性剤（細胞溶解剤）、Ｍｇ２＋、ＥＤＴＡ、Ｃａ２＋及び（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む。
【００５５】
本発明は以下の実施例により説明される。
【００５６】
図面
【００５７】
図１：アンモニウムイオン（トリス）及びリン酸イオンの様々な濃度でのルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の光放出の時間経過。
【００５８】
図２：、エタノールアミン及びリン酸根（パネルＡ）又はアンモニウム及びリン酸根（パネルＢ）の、様々な濃度でのルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の光放出の時間経過。
【００５９】
図３：トリス（0.5M）、リン酸根（0.25M）及び種々の還元剤を含む、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の光放出の時間経過。
【００６０】
図４：（パネルＡ）小量のＡＴＰ（５nM）及びより大量のルシフェラーゼ（５mg/l≒8.3×10-8  M）を有するＡＴＰ検出系における、又は（パネルＢ）小量のルシフェラーゼ（5.0×10-5  mg/l≒8.3×10-13M）及び過剰（1.5mM）のＡＴＰを有するルシフェラーゼ検出系における、発光反応の反応速度論についての反応混合物中の様々なトリスリン酸濃度の影響。
【００６１】
図５：図４Ａ及び４Ｂの、ＡＴＰ及びルシフェラーゼ分析系の夫々の発光反応の全光産出。様々なトリスリン酸イオン濃度による、夫々の反応速度論曲線の積分が、１乃至420分の間で決定された。生じた全発光は、リン酸イオン濃度の関数として、メガカウント（１０６カウント）で表現される。
【００６２】
図６：図４Ａ及び４Ｂの、ＡＴＰ及びルシフェラーゼ分析系の発光反応の（10分のインキュベーション後に算出された）半減期に対するリン酸根濃度の影響。半減期は、発光が、初期値の半分に減衰する為に必要とされた時間である。
【００６３】
実施例
【００６４】
実施例１：様々な濃度のアンモニウムイオン及びリン酸イオンの影響
【００６５】
本実施例は、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の成績に対する、様々な濃度のトリス及びリン酸根の影響を示す。
【００６６】
4.0Mのトリス（アンモニウムイオンの源）の原液が、7.0のｐＨが達せられるまで、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）により中和された。この原バッファー溶液は、2.0Mのリン酸根を含んだ。原液は、それぞれ2.2、1.1、0.55、0.275、0.138、0.069、0.034及び0.017Mトリスを含む、一連の分析試薬を作成する為に用いられた。これら分析試薬中のリン酸根濃度は、それぞれ1.1、0.55、0.275、0.138、0.069、0.034、0.017及び0.085Mリン酸根であった。
【００６７】
それぞれの試薬は、そのｐＨが7.0であることが確認され、もし必要であれば、少量のＨ３ＰＯ４（数μｌの２Ｍ  Ｈ３ＰＯ４溶液）により調整された。この様式で添加されたリン酸アニオンは、上で報告されたリン酸根濃度に有意な影響を有さなかった。それぞれの分析試薬は、250μlの新たに調製された原液（30mM  ＡＴＰ、３mM  Ｄ−ルシフェリン、１Ｍ  ＮａＯＨによりｐＨ＝7.0に調整された100mMチオ硫酸塩）の添加により、Ｄ−ルシフェリン、ＡＴＰ及びチオ硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）が補われ、2250μlの分析試薬となった。
【００６８】
ルシフェラーゼは、0.05g/mlトレハロース及び0.016g/ml  ＢＳＡを含有する、Ｍｇ及びＣａを有するDulbeccoのＰＢＳ（D'PBS++）中で真空凍結乾燥された。ルシフェラーゼサンプルは、真空凍結乾燥されたルシフェラーゼを200μlの水の中で再構成することにより調製された。生じた溶液は、その後、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、0.4％Ｔｈｅｓｉｔ（非イオン界面活性剤）及び0.1％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する１５ｍＬのＰＢＳ（8.1mM  ＮａＨ２ＰＯ４、1.5mM  ＫＨ２ＰＯ４、2.7mM  ＫＣｌ及び137mM  ＮａＣｌ）に、再構成されたルシフェラーゼ150μlを添加することにより、１００倍希釈された。これは、27ng/mlのルシフェラーゼを含有する「ルシフェラーゼサンプル」溶液を生じた。
【００６９】
夫々のトリスリン酸濃度についてのルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の発光速度論の測定の為に、夫々の分析試薬（Ｄ−ルシフェリン、ＡＴＰ及びチオ硫酸を有するトリスリン酸希釈）の100μｌが、白い９６ウェルマイクロプレートのウェルに添加され、その後、100μｌのサンプル溶液が添加された。マイクロプレートは、マイクロプレート振とう器上で1100rpmで10秒間振とうされ、その後すぐにＴｏｐＣｏｕｎｔ（商標）−NXT  マイクロプレートシンチレーションアンドルミネセンスカウンター中に配置された。生じた発光の光シグナルは、マイクロプレートをカウンター中に装填後すぐに測定された。測定は、５及び１０分後に繰り返された。この後、シグナルは１５分間隔で、４２０分の全時間まで繰返し測定された。連続する測定の間、マイクロプレートは、２２℃でカウンター中に一定に保持された。放出された光は、ウェル当たり３秒の計測時間の、カウント毎秒（cps）として定量された。
【００７０】
種々の反応混合物中の最終トリス濃度は、1.0、0.5、0.25、0.125、0.063、0.031、0.016及び0.008Mであった。リン酸根濃度は夫々、0.5、0.25、0.125、0.063、0.031、0.016、0.008及び0.004Mリン酸イオンであった。反応混合物中の、最終のMg２＋、D-ルシフェリン、ATP、チオ硫酸塩及びルシフェラーゼの濃度は夫々、2.5mM、150μM、1.5mM、5mM及び14pg/μlであった。
【００７１】
図１は、光シグナルの初期高さ及び減衰に対する、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応混合物中におけるトリスリン酸濃度を増加させることの影響を示す。夫々の反応混合物の全光産出（１０９カウントとして表現される）を比較する為に、曲線下の面積が、０乃至４２０分の間の曲線の方程式を積分することにより計算された。これらの曲線の方程式は、Microsoft  Exel(商標）ソフトウェアのオプション「trend  line  with  equation」を用いて得られた。これら光産出の計算の結果は、表３にまとめられている。
【００７２】
図１及び表３は、ルシフェラーゼ検出反応混合物中のアンモニウムイオン及びリン酸イオンを増加させることが、0.5M  トリス／0.25M  リン酸根の最終濃度までは、初期光シグナルならびに全光産出の両方の増加を結果することを示す。これら濃度を超えると、初期光シグナル及び、より小さい程度で全光産出が、0.5M  トリス／0.25M  リン酸根を用いて得られた値に比べて減少し、これらの濃度は最適な濃度を超えていることを示す。表３から明らかなように、最適濃度を超えたアンモニウムイオン及びリン酸イオンの使用は、低い又はかなり低いアンモニウム／リン酸根濃度と比べた場合、改善された光産出をなおも結果する。それ故に、本発明の方法は準最適又は最適なイオン濃度の使用に限定されない。
【００７３】
2008545378.tif 000006
【００７４】
実施例２：アンモニウムイオンの様々な源の影響
【００７５】
この実施例は、エタノールアミン又はリン酸アンモニウムが、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応にアンモニウムイオンを提供する為に用いられる場合の、光産出についての有利な影響を示す。
【００７６】
4.0Mエタノールアミン（Ｈ２ＮＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）及び3.0Mリン酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＨＰＯ４）の原液が、ｐＨ７．０が達せられるまで、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）により中和された。希釈は、実施例１に記載されたのと同じ様式で作成された。さらに、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応において、分析混合物を作成する為及びこれを光産出について試験する為に用いられる全ての方法及び他の化学物質は、標準化され、すなわち実施例１におけるものと同じであった。分析における最終エタノールアミン濃度は、1.0、0.5、0.25、0.125、0.063、0.031、0.016及び0.008Mであり、そしてリン酸根は夫々、0.5、0.25、0.125、0.063、0.031、0.016、0.008及び0.004Mであった。本発明に従い、最終濃度１Ｍのエタノールアミンが、水性で中性の反応混合物に１Mのアンモニウムイオンを備えると推定される。このように、反応混合物中のアンモニウムイオンの濃度は、アンモニウムイオンの源のそれと同じであるとみなされる。
【００７７】
（ＮＨ４）２ＨＰＯ４の場合、アンモニウム塩は、アンモニウムイオン及びリン酸イオンの両方を与える。試験された希釈において、最終混合物中のアンモニウム（ＮＨ４＋）濃度は、2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.063、0.031及び0.016Mであり、これら希釈は夫々、1.4、0.70、0.35、0.17、0.085、0.043、0.021及び0.011Mリン酸根を最終反応混合物中に含む。夫々の試験されたアンモニウム−リン酸根希釈は、少量の28mM  ＭＯＰＳ（3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸）も含む。
【００７８】
図２は、様々な量のエタノールアミン−リン酸根（パネルＡ）又はアンモニウム−リン酸（パネルＢ）を含む、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応混合物における光シグナルの測定の結果を示す。曲線下の表面積計算を通じた反応速度論の定量は、表４（エタノールアミン−リン酸根希釈）及び表５（アンモニウム−リン酸根希釈）に示される。
【００７９】
トリスリン酸と同様に、エタノールアミン−リン酸根濃度の増加は、より良い光産出を生じるが、0.25M  リン酸根を有するエタノールアミン0.5Mまでだけである。0.5Mリン酸根を有する1.0M  エタノールアミンで、反応は、0.25M  リン酸根を有する0.5M  エタノールアミンの反応混合物と比べて、減少された光産出を生じる。明らかに、これらの濃度は、最適を超えているが、それでもなお有用である。500mMアンモニウム及び350mMのリン酸根まで、アンモニウム−リン酸根の組み合わせを増加させることも、増加された光産出を引き起こす。より高い濃度では、光産出は減少する。
【００８０】
2008545378.tif 000007
【００８１】
2008545378.tif 000008
【００８２】
実施例３：種々の種類の還元剤の影響
【００８３】
この実施例は、ルシフェラーゼの反応性スルフヒドリル基を酸化から保護する為に用いられる種々の種類の還元剤の影響を示す。これは、酵素の維持される活性にとって重要でありうる。（DeLuca  et  al.  Biochemistry  3:935(1964);  and  Lee  et  al.,  Biochemistry  8:130-136(1969))。種々の保護剤が、アンモニウムイオン及びリン酸イオン（0.5M  トリス及び0.25M  リン酸根）を含むルシフェリン−ルシフェラーゼ反応において、還元剤を含まない対照サンプルに対して比較された。
【００８４】
100mMの以下の還元剤を含む原液が調製された：亜ジチオン酸ナトリウム（Na2S2O4）、ジチオスレイトール（DTT）、トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）、チオ硫酸ナトリウム（Na2S2O3）及び亜硫酸ナトリウム（Na2SO3）。TCEP原液は、塩酸塩（TCEP・HCL）を溶解することにより調製された。
【００８５】
3.5M  トリス／1.8M  リン酸根原液が、1.2M  トリス／0.62M  リン酸根（又は1.11M／0.56M  Na2S2O4）の濃度に希釈された。夫々の還元剤について、検出バッファーが、100μlの夫々の還元剤の原液（Na2S2O4について10μl）を800μlトリスリン酸バッファー溶液（Na2S2O4について890μl）中に希釈することにより作成された。検出バッファーは、30mM  ＡＴＰ、3mM  D-ルシフェリンを有する、pH7.0の新たに作成された溶液100μlを添加することにより完成された。ルシフェラーゼサンプル及び光シグナル測定は上記のように実施された。反応混合物中の還元剤の最終濃度は、DTT、TCEP、Na2S2O3及びNa2SO3について５mM、並びにNa2S2O4について0.5mMであった。
【００８６】
光シグナルの時間経過（図３）及び夫々の反応の結果として生じた光産出（表６）は、ルシフェラーゼを酸化から保護する為の、反応混合物中の還元剤の存在が、光産出における大きな増加を生じることを示す。更に、その結果は、ルシフェリン−ルシフェラーゼ分析における、非チオール還元剤としての亜ジチオン酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩及びTCEPの適合性を示す。
【００８７】
2008545378.tif 000009
【００８８】
実施例４：ルシフェラーゼ検出分析に対してのＡＴＰ検出分析における、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に対する様々なアンモニウムイオン／リン酸イオン濃度の差別的な影響。
【００８９】
本実施例は、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応混合物中のアンモニウムイオン及びリン酸イオンの量の増加が、ＡＴＰ検出系に対して、ルシフェラーゼ検出系に対してとは異なる影響を有することを示す。
【００９０】
本実験の為に、１６の異なる試薬混合物が調製された；（ＡＴＰ分析の為の）８混合物は大量のルシフェラーゼ、少量のＡＴＰ及び増加するトリスリン酸濃度を含み、そして（ルシフェラーゼ分析の為の）８混合物は大量のＡＴＰ、少量のルシフェラーゼ及び増加する量のトリスリン酸を含んだ。最終反応混合物の夫々の成分の濃度は表７に示されている。試薬間の少しの濃度差によりもたらされうる変化を減ずる為に、全ての試薬は、可能であれば、同一原液から作成された。
【００９１】
「ルシフェラーゼサンプル」は、真空凍結乾燥されたルシフェラーゼ対照サンプル（PerkinElmer  Inc.）を水中で再構成すること及びこれをCa/Mgを有するDulbeccoのPBS（D'PBS++）中に希釈して1.0×10-7  g/lのルシフェラーゼ溶液とすることにより調製された。
【００９２】
「ＡＴＰサンプル」は再構成された真空凍結乾燥されたＡＴＰ標準（PerkinElmer  Inc.）をD'PBS++中に希釈して、1.0×10-8mM  ＡＴＰ溶液を得ることにより調製された。
【００９３】
ＡＴＰについて分析する場合のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の発光速度論を測定する為に、ルシフェラーゼを有する100μlの夫々のトリスリン酸濃度の試薬が、９６ウェルCulturPlate（商標）（PerkinElmer  Inc.）中にピペットされ、100μlの「ＡＴＰサンプル」が添加された。同様に、同じマイクロプレート中で、ルシフェラーゼについて分析する場合の反応速度論が、ＡＴＰを有する100μlの夫々のトリスリン酸濃度試薬をピペットすること及び100μlの「ルシフェラーゼサンプル」を添加することにより測定された。
【００９４】
マイクロプレートはマイクロプレート振とう器上で１０秒間振とうされ、TopSeal-A（商標）（PerkinElmer  Inc.）により封された。その後、プレートは、放出された光を測定する為に、すぐにTopCount（商標）-NTX中に配置された。発光の光シグナルはすぐに測定され、これは試薬とサンプルの混合後約１分、並びに５及び１０分後を意味する。この後、シグナルは１５分間隔で、全時間４２０分まで繰返し測定された。連続する測定の間、マイクロプレートは２２℃で計測器中に一定に保持された。放出された光は、ウェル当たり３秒の測定時間で、カウント毎秒（cps）として定量された。
【００９５】
図４Ａは、ＡＴＰ検出の設定における反応速度論についての、増加するトリスリン酸濃度の影響を表し、図４Ｂは、ルシフェラーゼ検出についての影響を示す。
【００９６】
ＡＴＰ検出系及びルシフェラーゼ検出系の間の差を更に示す為に、夫々の曲線の全発光、すなわち１から４２０分の間の106カウントで表現されたその曲線下の積分が計算されそしてリン酸根濃度の関数として図５にプロットされた。
【００９７】
図６は、ＡＴＰ分析及びルシフェラーゼ分析についての、リン酸根濃度及び発光の半減期、すなわち発光がその初期値の半分に減衰する為に必要とされる時間（分単位）、の間の関係を示す。初期発光は１０分のインキュベーション後に評価された。
【００９８】
ＡＴＰ検出分析及びルシフェラーゼ検出分析は、反応混合物中の増加するアンモニウムイオン／リン酸イオンに関して、明らかに異なった成績を与えた。ルシフェラーゼ−ＡＴＰ比率が酵素の方にシフトされるＡＴＰ分析では、より高いトリスリン酸イオン濃度が全発光を阻害する。一方、ルシフェラーゼ−ＡＴＰ比率がＡＴＰの方にシフトされるルシフェラーゼ分析では、100mMまでのトリスリン酸の存在が、全発光を増加する。
【００９９】
表７：ＡＴＰ検出分析又はルシフェラーゼ検出分析の為の、ウェル当たり200μl反応混合物中の夫々の成分の濃度
2008545378.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】様々な濃度のアンモニウムイオン（トリス）及びリン酸イオンにおけるルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の光放出の時間経過を表すグラフである。
【図２】様々な濃度のエタノールアミン及びリン酸根（パネルＡ）又はアンモニウム及びリン酸（パネルＢ）におけるルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の光放出の時間経過を表すグラフである。
【図３】トリス（０．５Ｍ）、リン酸（０．２５Ｍ）及び様々な還元剤を含む、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の光放出の時間経過を表すグラフである。
【図４Ａ】少量のＡＴＰ（５ｎＭ）及びより多い量のルシフェラーゼ（５ｍｇ／ｌ≒８．３×１０−８Ｍ）を伴うＡＴＰ検出系における、発光反応の反応速度論に対する反応混合物中の様々なトリスリン酸濃度の影響を表すグラフである。
【図４Ｂ】少量のルシフェラーゼ（５．０×１０−５ｍｇ／ｌ≒８．３×１０−１３Ｍ）及び過剰（１．５ｍＭ）のＡＴＰを伴うルシフェラーゼ検出系における、発光反応の反応速度論に対する反応混合物中の様々なトリスリン酸濃度の影響を表すグラフである。
【図５】図４Ａ及び４ＢのＡＴＰ及びルシフェラーゼ分析系の夫々の発光反応の全光産出を表すグラフである。
【図６】図４Ａ及び４ＢのＡＴＰ及びルシフェラーゼの発光反応の半減期に対するリン酸根濃度の影響を表すグラフである。
【図１】
2008545378.tif 000011
【図２】
2008545378.tif 000012
【図３】
2008545378.tif 000013
【図４】
2008545378.tif 000014
【図５】
2008545378.tif 000015
【図６】
2008545378.tif 000016
【国際調査報告】
2008545378.tif 000017
2008545378.tif 000018