(57)【要約】  本発明は膜チャンネルと相互作用する分子を検出するためのアッセイ系を提供し、このアッセイ系は１種以上の膜チャンネルを含む細胞膜；シンチラントおよび細胞膜と会合するカップリング剤を含んでなる支持体；膜チャンネルと結合するために選択された、シンチラント活性化標識を含んでなるリガンドを含む。本発明に従い、支持体と細胞膜との会合、およびリガンドと膜チャンネルとの結合は、支持体のシンチラントから発光を生じ、そして膜チャンネルと存在する試験分子の存在下で、支持体のシンチラントからの発光が変化する。細胞膜チャンネルと相互作用する分子を同定する方法も記載する。
2008507275.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞膜チャンネルと相互作用する分子を検出するアッセイ系であって：
ａ．膜チャンネルを含んでなる細胞膜；
ｂ．シンチラントおよび細胞膜と会合するカップリング剤を含んでなる支持体；および
ｃ．膜チャンネルと結合すべく選択されたリガンドであって、シンチラント活性化標識を含むリガンド、
を含んでなり、かつ、支持体と細胞膜との会合、およびリガンドと膜チャンネルとの結合が、支持体のシンチラントから発光を生じ、そして膜チャンネルと相互作用する試験分子の存在下で、支持体のシンチラントからの発光が変化する、上記アッセイ系。
【請求項２】
細胞膜が天然の膜チャンネルを発現する細胞から得られる、請求項１に記載のアッセイ系。
【請求項３】
細胞膜が外因性ＤＮＡから膜チャンネルを発現する組換え細胞から単離される、請求項１に記載のアッセイ系。
【請求項４】
細胞膜が人工膜である請求項１に記載のアッセイ系。
【請求項５】
膜チャンネルがイオンチャンネルである請求項１に記載のアッセイ系。
【請求項６】
イオンチャンネルがナトリウムチャンネル、カリウムチャンネル、クロライドチャンネル、カルシウムチャンネルおよびリガンド依存性イオンチャンネルからなる群から選択される、請求項５に記載のアッセイ系。
【請求項７】
イオンチャンネルがカルシウムチャンネルである請求項６に記載のアッセイ系。
【請求項８】
膜チャンネルがリガンド依存性チャンネルである請求項１に記載のアッセイ系。
【請求項９】
支持体がビーズを含んでなる請求項１に記載のアッセイ系。
【請求項１０】
支持体がジフェニルオキサゾールを含んでなる請求項１に記載のアッセイ系。
【請求項１１】
支持体がポリ（ビニルトルエン）を含んでなる請求項１に記載のアッセイ系。
【請求項１２】
支持体がケイ酸イットリウムを含んでなる請求項１に記載のアッセイ系。
【請求項１３】
カップリング剤が細胞膜と非特異的様式で会合する請求項１に記載のアッセイ系。
【請求項１４】
カップリング剤が細胞膜と会合するために細胞膜の負電荷に依存する請求項１３に記載のアッセイ系。
【請求項１５】
カップリング剤がコムギ胚芽アグルチニンＡ型およびコムギ胚芽アグルチニンＢ型からなる群から選択される請求項１３に記載のアッセイ系。
【請求項１６】
カップリング剤が細胞膜と特異的結合相互作用で会合する請求項１に記載のアッセイ系。
【請求項１７】
カップリング剤が細胞膜上に発現する１種以上のタンパク質に対して向けられた抗体である請求項１６に記載のアッセイ系。
【請求項１８】
リガンドが抗体または抗体フラグメント、ペプチドおよび低分子から選択される請求項１に記載のアッセイ系。
【請求項１９】
リガンドがＧＶＩＡ、ＭＶＩＩＡ、ＭＶＩＩＣから選択される請求項１８に記載のアッセイ系。
【請求項２０】
シンチラント活性化標識が放射性同位体である請求項１に記載のアッセイ系。
【請求項２１】
分子がイオンチャンネルモジュレーターである請求項１に記載のアッセイ系。
【請求項２２】
膜チャンネルと相互作用する試験分子の存在下で支持体のシンチラントからの発光が減少する請求項１に記載のアッセイ系。
【請求項２３】
膜チャンネルと相互作用する分子を同定する方法であって；
ａ．１種以上の膜チャンネルを含んでなる細胞膜を準備し；
ｂ．細胞膜を、シンチラントおよびカップリング剤を含んでなる支持体と、カップリング剤が細胞膜に会合できる条件下でインキュベーションし；
ｃ．細胞膜を、シンチラント活性化標識剤を含んでなるリガンドと、リガンドが膜チャンネルに結合できる条件下でインキュベーションし；
ｄ．細胞膜を、膜チャンネルと相互作用すると思われる試験分子とインキュベーションし；
ｅ．試験分子が存在する時、および試験分子が不存在である時の支持体のシンチラントからの発光を測定し；そして
ｆ．試験分子が存在する時の支持体のシンチラントからの発光を、試験分子が不存在である時の支持体のシンチラントからの発光と比較する、
工程を含んでなる上記方法。
【請求項２４】
工程（ｂ）が工程（ｃ）または（ｄ）より前に行われる請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ｃ）および工程（ｄ）が工程（ｂ）より前に行われる請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
シンチラントからの発光を測定する工程が、光エネルギーの発光を測定することを含んでなる請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は細胞膜チャンネルと相互作用する分子を検出するアッセイ系および方法に関する。より詳細には本発明はイオンチャンネルのモジュレーターを検出するためのシンチレーションプロキシミティアッセイ（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ：ＳＰＡ）系および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
細胞膜は、栄養、老廃物、イオンおよび低分子のような分子が通過する多数のチャンネルを含む。イオンチャンネルは、すべての細胞の膜に見いだされる膜チャンネルの１例である。典型的なイオンチャンネルは膜貫通タンパク質または膜の脂質二重層を通るイオンの通過を選択的に可能とするタンパク質の群からなる。チャンネルを通過する主要なイオンにちなんで、イオンチャンネルの例にはナトリウム（Ｎａ＋）チャンネル、カリウム（Ｋ＋）チャンネル、クロライド（Ｃｌ−）チャンネルおよびカルシウム（Ｃａ２＋）チャンネルがある。イオンチャンネルは、カリウムリークチャンネルに見いだされるように永久的に開いていることができる。イオンチャンネルは電位依存性（ｖｏｌｔａｇｅ  ｇａｔｅｄ）チャンネルであることもでき、そして１例はナトリウムチャンネルである。あるいはイオンチャンネルはリガンド依存性（ｌｉｇａｎｄ  ｇａｔｅｄ）であることもできる。リガンド依存性チャンネルは、神経伝達物質のようにイオンに対する透過性が特異的リガンドの結合に対して感受性であるイオンチャンネルである。神経伝達物質の例には限定するわけではないが、アセチルコリン、グルタメート、グリシンまたはγ−アミノ酪酸を含む。また膜チャンネルの範疇には、イオン伝導性ではなく、むしろ他の分子の細胞への、かつ／または細胞からの通過を可能とする膜チャンネルを含む。
【０００３】
イオンチャンネルの構造はチャンネルファミリー間で異なる。各チャンネルは、特定の細胞型で、または器官の発生および成長の特定の期間に選択的に発現され得る、異なる遺伝子によりコードされる種々のタンパク質サブユニットを含む。
【０００４】
イオンチャンネルは神経および筋肉細胞の電気的活性の形成、ならびに神経伝達物質およびホルモンの分泌の制御に重要な役割を果たす。筋肉の収縮、膵臓からのインスリンの放出および神経系における神経伝達物質の放出のような脊椎動物の種々の生理学的プロセスに対するイオンチャンネルの関連性から、イオンチャンネルの研究は製薬産業に対して重要性が増してきた。
【０００５】
特にカルシウムチャンネルは、細胞への、および細胞からのＣａ２＋通過を特異的に媒介する偏在するイオンチャンネルであるので、さらなる調査に重要な標的となる。電位依存性Ｃａ２＋チャンネルを通って細胞に入るＣａ２＋は電気シグナリングの第２メッセンジャーとして役立ち、収縮、分泌、シナプス伝達のような出来事、および遺伝子発現を開始する。カルシウムチャンネルは、活性化および不活性化の動力学、イオン特異性および薬剤またはトキシンに対する感受性のような因子に基づき、Ｌ型（長期持続に）、Ｔ型（一過性に）、Ｎ型（Ｌ型でもＴ型でもなく、ニューロンに）、Ｐ型（プルキンエ細胞に）、Ｑ型、およびＲ型（耐性に）分類される。低電位活性化（ＬＶＡ）チャンネルであるＴ型チャンネルを除き、Ｌ−、Ｎ−、Ｐ−、Ｑ−およびＲ型は高電位活性化（ＨＶＡ）である。換言すると、ＨＶＡチャンネルは通常、−４０ｍＶより高い活性化閾値を現す。Ｌ型およびＴ型Ｃａ２＋電流は、広い範囲の細胞型で記録されるが、Ｎ−、Ｐ−、Ｑ−および
Ｒ型電流はニューロンで最も顕著である。
【０００６】
イオンチャンネルに特異的な調節効果（ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔ）を有する新規薬剤を同定するアッセイの設計は、イオンチャンネルが多くのタンパク質サブユニットで作られ、そしてイオンチャンネルの機能はチャンネルが膜の脂質二重層内である時にのみ評価できるという事実により妨げられる。特にカルシウムチャンネルのモジュレーションのための化合物同定アッセイは：１）低密度での天然チャンネルの発現；２）従来の電位−クランプ法による挟むことの難しさ（実験の候補となる多くのイオンチャンネルは挟むことが難しい細胞を占め、そしてこれらの細胞の例にはそれらの複雑なインフォールディングにより樹状突起、神経終末および筋肉細胞を含む）；および３）イオンチャンネルの小電流はこれらの多くの他のチャンネルにより遮蔽される傾向がある、といった要因により複雑になる。
【０００７】
イオンチャンネルモジュレーターを同定するための既存の技術は、処理量、生理学的関連性、感度および頑丈さとの間の妥協点にある。イオンチャンネル機能を研究するための広く許容されているアッセイは、パッチ−クランプ技術である（非特許文献１）。幾つかの会社がパッチ−クランプ法を自動化しようとしているが、実験設定の現在の複雑さおよび再現性では、現時点で自動化は高処理スクリーニング（ＨＴＳ）の応用には適さない。電位感受性色素または放射性同位体を使用した光学的記録が、カルシウムチャンネルを含む電位依存性イオンチャンネルの実験に一般的となった。そのような方法は、より容易に自動化され、そして薬剤スクリーニングの応用にさらに高い処理量を与え（現在、１日あたり最高１００，０００個の化合物）、そしてイオンチャンネル活性のより感受性のある測定を提供することができる（非特許文献２）。しかしこれらのアッセイはしばしば調査下でチャンネルを活性化するために薬理学的な仲介を必要とし、偽陽性の結果を生じる恐れを導く（非特許文献３）。
【０００８】
ＨＴＳに適合できる別のアッセイ技術は、競合的結合アッセイである。多くは真空濾過法を使用して、放射標識化特異的リガンドのイオンチャンネルへの結合を定量する。チャンネルに結合したリガンドはフィルターに残り、そして非結合の遊離リガンドは洗浄バッファーで洗い出される。この手順は比較的長時間かかり、しかも大容量の洗浄バッファーを必要とするので繁雑となり得る。さらに分離手順には洗浄バッファーを用いて繰り返し洗浄することが含まれ、これにより大容量の放射性液体廃棄物が生じ、これは廃棄するために費用がかかるだけでなく、実験を行う人の健康にも潜在的に有害となる恐れがある。
【参考文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｎｅｈｅｒ，Ｎｅｕｒｏｎ，８：６０５−６１２，１９９２
【非特許文献２】Ｘｕ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，６：１２７８−１２８８７，２００１
【非特許文献３】Ｄｅｎｙｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，３：３２３−３３２，１９９８
【発明の開示】
【００１０】
発明の要約
本発明は、細胞膜チャンネルと相互作用する分子を検出するアッセイ系および方法を提供する。より詳細には本発明はイオンチャンネルのモジュレーターを検出するためのシンチレーションプロキシミティアッセイ系および方法に関する。好適な態様では、本発明のアッセイ系および方法は、高処理量、必要な資源および試薬という意味における経費の低減、および廃棄物の低減のような利点を提供することができる。好適な態様では、本発明は１回の反応混合物中で行うことができる均一アッセイを提供する。さらに本発明は好ましくは偽陽性の結果および／またはバックグラウンドを減らし、これにより信頼性があり
、しかも再現性のあるアッセイ結果を生じる系を提供する。
【００１１】
１つの観点では、本発明は細胞膜チャンネルと相互作用する分子を検出するアッセイ系を提供し、このアッセイ系は：
ａ．１種以上の膜チャンネルを含む細胞膜；
ｂ．シンチラントおよび細胞膜と会合（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）するカップリング剤を含んでなる支持体（ｓｕｐｐｏｒｔ  ｂｏｄｙ）；
ｃ．膜チャンネルと結合すべく選択されたリガンドであり、シンチラント活性化標識を含んでなるリガンド、
を含んでなり、ここで支持体と細胞膜との会合、およびリガンドと膜チャンネルとの結合は、支持体のシンチラントから発光を生じ、そして膜チャンネルと相互作用する試験分子の存在下で、支持体のシンチラントからの発光が変化する。
【００１２】
別の観点では、本発明は細胞膜チャンネルと相互作用する分子を同定する方法を提供し、この方法は；
ａ．１種以上の膜チャンネルを含む細胞膜を準備し；
ｂ．細胞膜を、シンチラントおよびカップリング剤を含んでなる支持体と、カップリング剤が細胞膜に会合できる条件下でインキュベーションし；
ｃ．細胞膜を、シンチラント活性化標識剤を含んでなるリガンドと、リガンドが膜チャンネルに結合できる条件下でインキュベーションし；
ｄ．細胞膜を、膜チャンネルと相互作用すると思われる試験分子とインキュベーションし；
ｅ．試験分子が存在する時、および試験分子が不存在である時の支持体のシンチラントからの発光を測定し；そして
ｆ．試験分子が存在する時の支持体のシンチラントからの発光を、試験分子が不存在である時の支持体のシンチラントからの発光と比較する、
工程を含んでなる。
【００１３】
発明の詳細な説明
本明細書に引用するすべての刊行物は、参照により本明細書に編入する。他に定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術および科学用語は、本発明が関係する当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。
【００１４】
本明細書で使用する用語「含んでなる」、「含有する」、「有する」および「含む」は、限定を設けない、非限定的意味で使用する。
【００１５】
本明細書に記載するように、「試験化合物」とは細胞膜チャンネルと相互作用すると思われる分子、すなわち本明細書に記載するアッセイ系および方法にかけられる分子を意味する。「試験分子」、「試験化合物」および「膜チャンネルと相互作用すると思われる分子」は、本明細書では互換的に使用する。
【００１６】
本アッセイ系および方法は、本教示を再考すると分かるように、リガンドに結合するための膜チャンネルの能力に影響を及ぼす任意の様式で、膜チャンネルと相互作用する試験分子を検出するために使用することができる。
【００１７】
本明細書で使用するイオンチャンネル「モジュレーター」には、イオンチャンネルの活性に影響を及ぼすようにイオンチャンネルと相互作用する分子を含む。モジュレーターの具体例には、チャンネル活性を低下し、遮断し、防止し、活性化を遅らせ、不活性にし、脱感作し、またはダウンレギュレーションするか、あるいは例えばチャンネルインヒビターもしくはブロッカーのようにイオンチャンネルの脱活性化の速度を上げるか、または強
化する分子を含む。モジュレーターの他の具体例には、チャンネル活性を上げ、開き、活性化し、促進し、活性化を強化し、感作し、またはアップレギュレートするか、あるいは例えばチャンネルアクチベーターもしくはオープナーのようなチャンネルの不活性化を遅らせるか、または速度を落とす（ｓｌｏｗ）分子を含む。
【００１８】
イオンチャンネル「モジュレーター」と目的の膜チャンネルとの相互作用は、直接的または間接的であることができる。直接的相互作用の例には、分子の膜チャンネルのリガンド結合部位への結合を含む。間接的相互作用には、膜チャンネルがリガンドに結合する能力に影響を及ぼすように、膜チャンネルの任意の他の部位との相互作用を含む。そのような間接的相互作用には、例えばインヒビターまたはアクチベーターとして機能する分子を含む。
【００１９】
本明細書で記載する「支持体」は、シンチラントおよびカップリング剤を含んでなる物理的粒子である。支持体はシンチラントがエネルギーを受け、そして放出することができ、そしてカップリング剤が細胞膜と会合できるように、シンチラントおよびカップリング剤を包含する任意の適切な形状で提供され得る。支持体の例は、例えばファルマシア  アマシャム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ａｍｅｒｓｈａｍ）から販売されているシンチレーションプロキシミティアッセイビーズ（ＳＰＡビーズ）である。ラテックス粒子または他の構造物のような他の形式の支持体を企図する。
【００２０】
場合により支持体はさらに、１，４−ビス（５−フェニル−２−オキサゾリル）ベンゼン；９，１０−ジフェニルアントラセン；１，４−ビス（２−メチルスチリル）−ベンゼン等のような波長シフター（ｓｈｉｆｔｅｒ）を含むことができる。波長シフターが存在する場合、その機能はシンチラントが発する光を吸収し、そしてシンチレーションカウンターで使用する光感受性検出器により一層合う、より長い波長の光を再放出することである。
【００２１】
支持体の「シンチラント」は、放射線に対して感受性であり、そして放射線への暴露でシンチレートする（例えば光エネルギーを発する）作用物質である。シンチラントは物理的または化学的に支持体に包含され得る。放射標識反応物による励起で、励起したシンチラントは十分なエネルギーを放出し、これがシンチレーションカウンターまたは光電子倍増管を使用するような他の検出デバイスにより検出され得る。シンチラントの例には限定するわけではないがセリウム負荷（ｌｏａｄｅｄ）ガラス、ケイ酸イットリウム、ランタニド金属化合物のような希土類金属に基づく物質、またはポリ（ビニルトルエン）のようなシンチラントポリマーを含む。
【００２２】
またシンチラントの例には、放射標識反応物に極めて近傍に運ばれた時、励起で光エネルギーを放つ蛍光物質も含む。本発明に有用な蛍光物質には、シンチレーションカウンティングの分野で周知な任意の有機フルオロを含む。一般に適切な蛍光物質は、例えば有機シンチレーション検出（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ），Ｅ．Ｓｃｈｒａｍ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌｏｍｂａｅｒｔ，エルセビア出版社（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．），１９６３中で「有機フルオロ」および「有機シンチレーター」として記載されているものから選択することができる。蛍光物質の例には、２，５−ジフェニルオキサゾール（ＰＰＯ）；２−（４−ｔ−ブチルフェニル）−５−（４−ビフェニリル）−１−３，４−オキサジアゾールおよび２，５−ジフェニルオキサゾールのようなオキサゾールおよび１，３，４−オキサジアゾールの誘導体；アントラセン；９，１０−ジフェニルアントラセン；ｐ−ターフェニル、ｐ−クウォーターフェニルおよびそれらの誘導体；２−（４−ビフェニリル）−５−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−フェニル）−１，３−４−オキサジアゾール（ブチルＰＢＤ）；ＰＢＤ；２−（１−ナフチル）−５−フェニルオキサゾール（α−ＮＰＯ）；等を含む。ベータ線（１４Ｃ、３
５Ｓ、３３Ｐおよび１２５Ｉから発生するような）の状態の放射性エネルギーを用いて使用することができる好適なシンチラントの例は、ジフェニルオキサゾール（ＰＰＯ）である。
【００２３】
多数の物質を使用して支持体のシンチラント用の結合剤、マトリックスまたは他の支持体を提供することができる。適切な結合剤物質の例には、ポリアクリルアミド、アクリルアミド、アガロース、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ等がある。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂビーズのようなビーズは市販されている（ファルマシア  ファイン  ケミカル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ウプサラ、スウェーデンから）。
【００２４】
シンチラントが支持体に包含される方法は、例えば支持体を形成するために使用する材料、シンチラント、支持体中のシンチラントの所望する負荷密度等のような因子に依存する。１つの包含法では、例えばシンチラントを支持体を形成する材料に吸着させる。この特定の態様に従い、溶媒はシンチラントが可溶性となるように選択され得る。好ましくはシンチラントは水に不溶性であり、そしてこれらの態様では、溶媒は水と混和性になるように選択される。支持体を形成する材料は、材料を脱水するために溶媒中でインキュベーションされる。その後、材料はシンチラントを含有する溶媒中で、シンチラントが材料に吸着するような条件下でインキュベーションされ、これによりシンチラントを含有する支持体を形成する。過剰な溶媒は捨てることができ、シンチラントを水または緩衝化塩溶液を加えることにより沈殿させ、これによりシンチラントを支持体材料内に閉じ込める。シンチラントをビーズのような支持体に組み込むための適切な方法は、米国特許第４，５６８，６４９号明細書および欧州特許第１５４，７３４号明細書に記載されている。
【００２５】
支持体の「カップリング剤」は、例えば細胞膜への結合により細胞膜と会合する分子である。そのような会合は非特異的または特異的のいずれかであることができる。例えば会合は非特異的であり、会合はその負電荷のような細胞膜の一般的特性に依存する。非特異的会合の１例では、ポリ−Ｌ−リシンが負に荷電した細胞膜に結合することができる。特異的結合については、会合は例えば細胞膜内または表面上に位置する特異的タンパク質の存在に依存し得る。例えばコムギ胚芽アグルチニンは、膜表面上にオリゴ糖を含有するＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンに結合し；ストレプトアビジンはビオチン化タンパク質、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドに結合し；黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡは抗体−抗原複合体に結合するために使用することができ；そして細胞膜上の特異的部位に結合する抗体を選択することができる。カップリング剤の例には、ポリ−Ｌ−リシン、コムギ胚芽アグルチニン、ストレプトアビジン、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡ、抗体等を含む。
【００２６】
本明細書ではカップリング剤が細胞膜に結合する能力について言及するが、本発明はカップリング剤と細胞膜自体との間の結合相互作用を必要としない。対照的に、本アッセイを行うことができるような、カップリング剤と細胞膜の表面で支持体を保持する細胞膜との間の任意の会合が本発明での使用に適している。好適な態様では、細胞膜に対するカップリング剤の結合親和性は、約５０ｎＭから１ｐＭの範囲である。
【００２７】
カップリング剤は、支持体を形成するために使用する材料、シンチラント、選択した特定のカップリング剤、カップリング剤の所望する負荷密度等のような因子に依存して、適切な方法を使用して支持体と会合させることができる。幾つかの態様では、カップリング剤は例えば臭化シアン、カルボジイミド、タンニン酸、グルタルアルデヒド、またはポリエチレングリコールのような連結剤を使用して支持体に包含される。連結剤は所望するカップリング剤と共有結合するために支持体に包含され得る。カップリング剤の包含後、ブロッキング剤（例えばグリシンのような）を使用して、所望によりビーズ上に残る活性部
位をブロックし、これにより細胞膜がカップリング剤ではなく支持体へ直接結合することを減らす。
【００２８】
カップリング剤は支持体の材料に包含され得る。そのような包含は物理的（例えば封入）または化学的（例えば化学的結合）であることができる。あるいはカップリング剤は支持体の表面上に被覆されることができる。カップリング剤が支持体に包含される様式は、カップリング剤が本アッセイに従い細胞膜との会合に利用できる限り重要ではない。
【００２９】
１つの具体的例示態様では、臭化シアンで活性化されたＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂビーズおよび黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡまたは細胞膜タンパク質に特異的な抗体の状態のカップリング剤が、支持体をプロテインＡまたは抗体および適切なバッファーを含有する溶液中に置くことにより支持体に包含され得る。その後、過剰なプロテインＡ（または抗体）を洗い出し、そしてプロテインＡ（または抗体）が結合していない支持体上に残る活性部位を、グリシンのような適切なブロッキング剤を用いてブロックする。
【００３０】
本明細書で使用する「シンチラント活性化標識」は、シンチラントを励起することができる反応物質であり、そして膜チャンネル用のリガンドと会合する。シンチラント活性化標識は、支持体に含まれるシンチラントの種類に依存して選択される。例えばシンチラント活性化標識は、放射性同位体を含んでなることができる。好適な放射性同位体は、ほとんどの部分で、膜チャンネルに結合する標識化リガンド上の放射性同位体のみが、支持体上に結合した支持体のシンチラントを実際に活性化するように、水中では限定された範囲の放射線のみを有するように選択される。適切な放射性同位体の例には、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、５９Ｆｅ、３３Ｐ、３５Ｓ、３８Ｓｒ等を含む。選択されるシンチラントがＰＰＯである好適な態様では、ベータ線またはガンマ線からのオージェ電子のいずれかを発生する同位体を使用することができる。
【００３１】
シンチラント活性化標識は、リガンドが膜チャンネルに結合する能力（例えば特異性）に実質的に影響を及ぼさない適切な方法を使用してリガンドに包含される。標識化に使用する方法は、使用するシンチラント活性化標識の種類により変動するだろう。例えば放射性同位体での標識は、リガンドの原子の１つを対応する放射性同位体に置き換えることにより達成することができる。この特定の態様に従い、例えば１種以上の水素原子をトリチウム（３Ｈ）に置き換えることができ、１種以上の炭素原子を炭素−１４（１４Ｃ）に置き換えることができ、または１種以上のストロンチウム原子をストロンチウム−３８（３８Ｓｒ）に置き換えることができる。別の態様では、リガンド中の原子を置き換えることに対して、同位体をリガンドに加えることができる。一般に使用されているそのような放射性同位体の例には、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）および鉄−５９（５９Ｆｅ）がある。生物学的有機体またはそれら有機体の一部がタンパク質を合成することができる状況では、標識化は有機体をメチオニン−３５（３５Ｓ）のような適切な放射標識化前駆体と培養して、有機体が同位体を産物に取り込むようにすることにより行うことができる。
【００３２】
本発明は膜チャンネルと相互作用する分子を検出する系および方法を対象とする。好適な態様では、本発明はイオンチャンネルと相互作用する分子を検出する系および方法を対象とする。具体的説明の目的で、本発明はイオンチャンネルモジュレーターについて記載する。しかし本発明のアッセイ系および方法を、本明細書の教示を使用して任意の種類の膜チャンネルと相互作用する多くの異なる型の分子を同定するために使用できることは本開示を再考することで容易に明らかとなるだろう。
【００３３】
本発明のアッセイ系および方法は、細胞膜チャンネルと相互作用する分子を検出するために使用される。好適な態様では、本発明のアッセイ系および方法は、イオンチャンネル
のモジュレーターを同定するために使用される。
【００３４】
本発明は膜チャンネルと相互作用する分子を同定する方法を提供し、この方法は：
（ａ）１種以上の膜チャンネルを含む細胞膜を準備し；（ｂ）細胞膜を、シンチラントおよびカップリング剤を含んでなる支持体と、カップリング剤が細胞膜に会合できる条件下でインキュベーションし；（ｃ）細胞膜を、シンチラント活性化標識剤を含んでなるリガンドと、リガンドが膜チャンネルに結合できる条件下でインキュベーションし；（ｄ）細胞膜を、膜チャンネルと相互作用すると思われる試験分子とインキュベーションし；（ｅ）試験分子が存在する時、および試験分子が不存在である時に支持体のシンチラントからの発光を測定し；そして（ｆ）試験分子が存在する時の支持体のシンチラントからの発光を、試験分子が不存在である時の支持体のシンチラントからの発光と比較する工程を含んでなる。工程（ｆ）で集めた情報は、目的の膜チャンネルと相互作用する分子を評価するために使用する。好適な態様では、本発明を使用して膜チャンネルのモジュレーターを検出する。
【００３５】
一般的に１つの観点では、本発明は２つの部分、支持体および好ましくは細胞膜で相互作用するリガンドを利用して、試験化合物と膜チャンネルとの相互作用の指標となる情報を出力する。支持体は、支持体に包含され、そしてシンチラントを含んでなるカップリング剤を利用して細胞膜と会合する。リガンドは細胞膜の膜チャンネルに特異的に結合し、そしてシンチラント活性化標識を含んでなる。このアッセイは（支持体の）シンチラントおよび（リガンドの）シンチラント活性化標識との間の空間的分離を利用して、モジュレーターが目的の膜チャンネルと相互作用するかどうかを決定するために設計されている。
【００３６】
１つの具体的説明の態様では、リガンドのシンチラント活性化標識は放射性同位体、例えば１２５Ｉである。１２５Ｉ標識化リガンドは膜チャンネルに結合し、そして支持体は細胞膜に会合する。１２５Ｉがλ１の波長の放射線を発する場合、この放射線は支持体に受け取られ、そして次いで支持体のシンチラントは検出できるλ２の波長の蛍光放射線を発する。水中の１２５Ｉ線の平均範囲は比較的短いので、反応物が懸濁している任意の水性媒質を発光の効果的吸収体として役立てることができる。その結果、非結合１２５Ｉは検出可能なシグナルの出力に貢献せず；むしろ非結合１２５Ｉからの発光は、水性媒質に吸収される。出力シグナルの検出は、１２５Ｉ試験に関して通った（ｇａｔｅｄ）エネルギーの標準的な液体シンチレーションカウンティングシステムを用いて容易に行われる。
【００３７】
一般に、シンチラント活性化標識により発せられるエネルギーが水中で限定された移動範囲を有する場合、非結合リガンドは典型的にはシンチラントから遠すぎてシンチラントを励起することができない。その結果、アッセイシグナルを測定する前に膜複合体を洗浄する必要はないか、またはシンチラント活性化標識を含有する非結合リガンドを除去する必要はない。このように本アッセイ系および方法は、アッセイの結果を読み取る前のさらなる洗浄および／または分離工程を回避する均一系を提供する。
【００３８】
好ましくは支持体は本明細書に記載するプロキシミティアッセイに適する寸法で提供される。例えば好適な態様における支持体の典型的な直径は、支持体および標識化リガンドの両方が細胞膜および膜チャンネルとそれぞれ会合した時に、シンチラント活性化標識から発せられるエネルギーが支持体のシンチラントに達し、そしてシンチラントがエネルギーを放出するように、支持体に含有されるシンチラントが標識化リガンドに対して十分に近接した物理的関係となるように至適化される。典型的には支持体の直径は、シンチラントの活性化範囲未満である。例えばポリ（ビニルトルエン）（ＰＶＴ）ビーズの典型的直径は約５μｍであり、一方、ケイ酸イットリウム（ＹＳｉ）ビーズの典型的な直径は約２．５μｍである。
【００３９】
好適な態様では、支持体はアッセイ反応溶液の約０．７５〜５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で提供される。好ましくは支持体は室温（２０〜２５℃）から約３７℃の範囲の温度で、約４〜約８の範囲のｐＨ条件で細胞膜とインキュベーションされる。
【００４０】
本発明は、目的の膜チャンネルと相互作用する分子（１つもしくは複数）を検出するための競合結合アッセイを提供する。上で検討したように、標識リガンドは目的の膜チャンネルと結合する。分子（１つもしくは複数）および標識化リガンドの両方がアッセイ混合物中に存在し、そして試験分子（１つもしくは複数）が目的の膜チャンネルと相互作用する場合、ゆえに２つの部分は膜チャンネルの結合に関して競合する。一般に分子が膜チャンネルと相互作用する場合（例えばリガンドに結合するか、またはそうではなくリガンドの結合に影響を及ぼす）、結果として標識化リガンドは溶液中に残る。水溶液中のシンチラント活性化標識の短い長さの発光により、溶液中の標識からの発光は溶液中で終わり、検出される出力シグナルを生じない。
【００４１】
換言すると、支持体に対するリガンドの近接がアッセイに従い測定され；リガンドおよび支持体が活性化範囲内にある場合、リガンドは支持体のシンチラントに検出可能なエネルギーの放出を誘導する。活性化範囲は、反応溶液中のシンチラント活性化標識からの発光範囲に等しい支持体からの距離である。アッセイは複合体を形成するための２つの出来事の発生の測定に基づく：リガンド／膜チャンネル−支持体／細胞膜複合体を形成する（１）標識化リガンドの膜チャンネルへの結合、および（２）支持体の細胞膜への会合。この測定を利用して、相互作用により標識化リガンドを活性化範囲の外側の位置に競合的に置き換える分子（１つもしくは複数）を検出することができる。分子（１つもしくは複数）が膜チャンネルと相互作用（例えば結合）する場合、置き換えられた標識化リガンドは膜チャンネルに結合できず、したがって溶液中および活性化範囲の外側に残る。標識化リガンドからの発光は水性反応溶液により吸収される。支持体のシンチラントからの出力シグナルは対応して減少する。一方、分子（１つもしくは複数）が膜チャンネルと相互作用しない場合、より多くのリガンドが膜チャンネルに結合し、そしてすなわち活性化範囲内に位置している。支持体のシンチラントからの出力シグナルは対応して上昇する。好ましくは標識化リガンド／膜チャンネル−支持体／細胞膜複合体が形成する程度は、検出器に到達するλ２バンドの強度により推定（または標準曲線を用いた比較により測定）することができる。
【００４２】
本発明の態様では、反応媒質は水性であり、ｐＨは約３〜約９の範囲であり、そして媒質の温度はアッセイ中、約２５℃〜約３７℃の範囲内である。
【００４３】
本発明に従い、細胞膜はシンチラントおよびカップリング剤を含んでなる支持体と、カップリング剤が細胞膜に会合できる条件下でインキュベーションされる。細胞膜は１種以上の膜チャンネルを含む。本発明に従い、細胞膜は全細胞、細胞膜の一部および／または膜小胞を含んでなることができる。細胞膜は、ヒト、ラット等を含む任意の適切な型の動物細胞から得ることができる。全細胞は全組織の機械的または酵素的破壊を含む細胞調製について当該技術分野で知られている方法を使用して、または細胞培養により単離または処理することができる。幾つかの態様では、例えば細胞膜の調製手順が細胞受容体を破壊または不活性化する恐れがある場合、細胞膜の供給源として全細胞を利用することが好ましい可能性がある。
【００４４】
幾つかの好適な態様では、膜を制御された条件下で破壊することができ、細胞膜の部分および／または膜小胞を生じる。幾つかの態様ではアッセイ中、細胞溶解および／または剪断には関心がそれほどないことから、細胞膜の部分および／または小胞は本発明のアッセイおよび方法に、より容易な形式を提供する。細胞膜は組織および／または培養した細胞に由来することができる。細胞膜を破壊し、そしてそれらを安定化するような方法は、
当該技術分野で知られている。組織を処理して細胞膜を得る方法も当該技術分野では知られている。
【００４５】
細胞膜内に含まれる膜チャンネルは、細胞により内因的に発現される天然の膜チャンネルであるか、あるいは細胞に導入される外因性のＤＮＡから組換え的に発現される膜チャンネルであることができる。細胞膜の単離は当該技術分野で知られており、そして膜チャンネル（例えばイオンチャンネル）用の組換え宿主細胞を構築する方法も当該技術分野では知られている。
【００４６】
別の態様では、膜チャンネルは人工膜に包含され得る（Ｃｏｒｎｅｌｌ，ＢＡ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８７，５８０−５８３）。例えばそのような人工膜には、イオンチャンネルを含有する脂質膜に係留され、そしてリザーバーを形成する電極を含むことができる。
【００４７】
本発明のアッセイ系および方法は、種々の膜チャンネルと関連して利用することができる。そのような膜チャンネルにはイオンチャンネル、リガンド依存性チャンネル等を含む。本記載は１つの特定のクラスのチャンネル、例えばイオンチャンネルに関して本発明を説明するが、本明細書の教示は細胞膜に存在する種々の膜チャンネルに応用できることは容易に明白である。
【００４８】
本発明の好適な態様では、０．５μｇ以上の細胞膜が各２００μｌのアッセイ反応溶液中に存在する。好ましくは細胞膜は２００μｌのアッセイ反応溶液中、約０．５〜約２０μｇの量で存在する。別の観点では、細胞膜は好ましくは約２．５ｍｇ／ｍｌ以上、好ましくはアッセイ反応溶液の約２．５〜約１００ｍｇ／ｍｌの範囲で存在する。
【００４９】
細胞膜に含まれる膜チャンネルの量は、細胞膜の起源に依存して変動する。例えば自然に存在する細胞膜では、細胞膜調製物内のチャンネルの濃度は種により変動し得る（例えばヒト対ラットの膜）。膜の起源は、所望する膜チャンネル濃度を達成するためにアッセイに含まれる細胞膜の量を測定する場合に考慮することができる。
【００５０】
本発明に従い、細胞膜はシンチラント活性化標識を含んでなるリガンドと、リガンドが膜チャンネルに結合できる条件下でインキュベーションされる。
【００５１】
本明細書で検討するために、シンチラント活性化標識を含むリガンドは、「標識化リガンド」とも呼ぶ。このリガンドは目的の膜チャンネルに結合するように選択され、そして幾つかの特定の態様では、リガンドは膜チャンネルを介する伝導性を遮断することもできる。本発明のリガンドは、シンチラントと近接する場合にシンチラントを励起することができるシンチラント活性化標識を除いて、非標識化リガンドと実質的に生物学的および化学的に同一である。前記文章の内容において、「実質的に生物学的および化学的に同一である」とは、シンチラント活性化標識を含有するリガンドが、非標識リガンド（すなわちリガンドはシンチラント活性化標識を欠く）と実質的に類似する様式で目的の膜チャンネルと相互作用するように形成されていることを意味する。換言すると、シンチラント活性化標識の取り込みはリガンドの構造または機能を有意に妨害せず、そして特にリガンドと目的の膜チャンネルとの相互作用を有意に妨害しない。
【００５２】
本発明による適切なリガンドの例には、抗体、ペプチドまたは低分子を含む。適切な抗体の例には目的の膜チャンネルに特異的に結合する任意の抗体を含む。本発明に従い、抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであることができ、そして完全長のタンパク質またはフラグメント（例えばＦｃまたはＦ（ａｂ）’）を含んでなることができる。
【００５３】
膜チャンネルに結合する多くのペプチドが同定され、そして任意のそれらを本発明に従い利用することができる。例えば、カルシウムチャンネルのリガンドペプチドには限定するわけではないがクモおよびイモ貝（ｃｏｎｅ  ｓｎａｉｌ）ペプチドトキシンを含む（例えばＭｉｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ，（１９９２）Ｎｅｕｒｏｎ  ９：８５−９５；Ｒａｎｄａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：２９９５−３０１２）を参照にされたい）。ナトリウムチャンネルについて、よく調査された特異的ブロッカーには、限定するわけではないが、サソリの毒中のペプチドトキシンおよび空腸動物の触手の刺胞、熱帯地方のカエルにより分泌されるアルカロイドトキシン、および多くの種類の植物の葉から得られる他の脂質溶解性の殺虫物質を含む（Ｈｉｌｌｅ、励起性膜のイオンチャンネル（Ｉｏｎｉｃ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｏｆ  ｅｘｃｉｔａｂｌｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）、第２版、シナウアーアソシエイツ社（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、サンダーランド、マサチューセッツ州を参照にされたい）。カリウムチャンネルについて、適切なリガンドペプチドの例には、限定するわけではないが、以下の表に列挙するようなトキシンを含む。適切なリガンドおよびそれらの対応するイオンチャンネルの例を、以下の表Ｉにまとめる。リガンドが自然に存在する場合、リガンドの起源も示す。
【００５４】
【表１】
2008507275.tif 000003
【００５５】
特にコヌス  ジオグラファス（Ｃｏｎｕｓ  ｇｅｏｇｒａｐｈｕｓ）から最初に単離されたＧＶＩＡは、Ｎ型カルシウムチャンネルの有力かつ選択的ブロッカーである２７アミノ酸ペプチドである（Ｗｈｏｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９６，２３（１）：１６−２１）。ＭＶＩＩＡ（ジンコンチド（ｚｉｎｃｏｎｔｉｄｅ）またはＳＮＸ−１１１としても知られている）は、コヌス
マグナス（Ｃｏｎｕｓ  ｍａｇｎｕｓ）の毒液から最初に単離され、そして有力なＮ型カルシウムチャンネルブロッカーである２５アミノ酸ペプチドである（Ｏｌｉｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６：２０８６−２０９０）。コヌス  マグナス（Ｃｏｎｕｓ  ｍａｇｎｕｓ）の毒液から単離されたＭＶＩＩＣは２６残基のペプチドであり、そしてＮ型カルシウムチャンネルの弱いブロッカーであり、そしてＰ／Ｑ型カルシウムチャンネルの有力なインヒビターである（Ｈｉｌｌｙａｒｄ  ｅｔ
ａｌ．，（１９９２）Ｎｅｕｒｏｎ  ９：６９−７７；Ｗｈｅｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：１０７−１１１；Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｆｅｂｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４６６：１２５−１２９）。ω−アガトキシンＩＶＡはクモ（Ａｇｅｌｅｎｏｐｓｉｓ  ａｐｅｒｔａ）から単離され、４８アミノ酸ペプチドであり、そしてＰ／Ｑ型カルシウムチャンネルに結合することが示された（Ｍｉｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ，（１９９２）Ｎｅｕｒｏｎ  ９：８５−９５）。
【００５６】
さらなる態様では、リガンドは目的の膜チャンネルに結合する低分子を含んでなる。適切な低分子の例にはアンタゴニスト薬剤（カルシウムチャンネル）；ならびにテトラエチルアンオニウムイオン、およびニフェジピンおよびキニジンのような抗不整脈剤（カリウムチャンネル）；ジスルホン酸スチルベン、アリールアミノベンゾエートおよびスルホニルウレア化合物のような有機分子（クロライドチャンネル）がある。さらに結晶アルカロイドカプサイシンを使用することができる。
【００５７】
リガンド依存性チャンネルについて、アセリルコリン、グルタメート、グリシンまたはγ−アミノ酪酸のような内因性の特異的リガンドを、本発明の幾つかの態様に従い使用することができる。
【００５８】
目的の膜チャンネルに対するリガンドの親和性は、アッセイの感受性に影響を及ぼすことができる。例えば高親和性リガンドは弱く結合した分子の検出を可能とはしないかもしれないが、一方、低親和性リガンドは非特異的結合の検出の上昇を導くことができる。このように好適な態様では、リガンドの親和性はアッセイから得られるＥＣ５０値がパッチ−クランピングのような従来の方法から得られる値と合理的相関を有するように、所望する範囲内となるように選択される。例えば膜チャンネルに関するリガンドの親和性は好ましくは、約１ｐＭ〜約５０ｎＭの範囲、より好ましくは約５ｐＭ〜約５０ｐＭの範囲になるように選択される。
【００５９】
好適な態様では、リガンドは約１０ｐＭ〜約５０ｐＭ、好ましくは約１２ｐＭ〜約２０ｐＭの範囲、最も好ましくは約１５ｐＭの量で存在する
多くのリガンドは種々の市販されている供給源から放射性標識形態で容易に入手可能である。
【００６０】
好適な態様では、試薬および反応条件の選択は、標識したリガンドの非特異的結合を減らすように制御される。このような態様に従い、そのような所望しない非特異的結合には標識化リガンドの、目的とする膜チャンネル以外の任意の部位への結合を含む。例えばそのような非特異的結合には、膜に位置する膜脂質および他のタンパク質が関与し得る。他の場合では、そのような非特異的結合には支持体またはアッセイ容器自体への標識化リガンドの直接的結合が関与し得る。非特異的結合は非飽和性であるが、サンプル中に存在す
るリガンドの全濃度に対しておよそ直線的関係である。これが生じる場合、非特異的結合はバックグラウンドのカウントを上げ、そしてその結果、アッセイで測定される特異的シグナルを下げる。
【００６１】
一般に、観察される全リガンド結合はリガンドの対応する受容体（この場合は膜チャンネル）への飽和可能な（誇大な：ｈｙｐｅｒｂｏｌｉｃ）特異的結合、およびリガンドの種々雑多な部位（すなわち目的の膜チャンネル以外の部位）への非飽和性（直線的）結合の和である。この関係は以下のように表現することができる：
（全結合）＝（膜チャンネルへの特異的結合）＋（他の部位への非特異的結合）。特異的結合成分は、典型的には過剰な非標識化リガンドの存在下で結合実験を行うことにより間接的に得られる。非標識化リガンドは膜チャンネルの結合について標識化リガンドと競合する。過剰な非標識化リガンドにより、特異的結合部位（膜チャンネル結合部位）は実験用リガンドに利用されることができず、したがってその結合は非特異的部位に限定される。
【００６２】
非特異的結合は、互いの成分の適合性かつ／またはアッセイ様式に基づき、アッセイに適切な成分を選択することにより低減することができる。１つの好適な態様では、例えばω−コノトキシンをリガンドとして使用する場合、好適な支持体はコムギ胚芽アグルチニンで被覆したＰＶＴビーズである。好適な態様では、非特異的結合が最適なシグナル対ノイズ比を提供するレベルに維持される。
【００６３】
さらに、バッファーのｐＨ、特異的イオンまたは有機分子の存在、および／またはインキュベーション時間のようなアッセイ条件を至適化して、非特異的結合を下げることができる。さらなる態様では、バッファー系に添加剤を加えて非特異的結合を下げることができる。典型的なＮＳＢ低下剤には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、塩および界面活性剤がある。さらに非結合表面（ＮＢＳ）を用いたもののような材料から作られたマイクロタイタープレートのようなアッセイ容器は、リガンドのアッセイ容器への非特異的結合を下げることができる。
【００６４】
本発明に従い、細胞膜は膜チャンネルと相互作用すると思われる試験分子とインキュベーションされる。本発明に従い、支持体は細胞膜と会合し、そしてシンチラント活性化標識を含有するリガンドは目的の膜チャンネルに結合する。これが起こった場合、支持体に含まれるシンチラントが刺激されてエネルギーを放出する。試験分子が存在する場合、次いでシンチラントからの発光を、試験分子が不存在である場合のシンチラントからの発光と比較する。試験分子が存在する場合の発光の変化（例えば減少）は、試験分子と目的の膜チャンネルとの相互作用の指標である。
【００６５】
これからさらに詳細に説明するように、アッセイのインキュベーション工程の特定の順序は、所望により修飾することができる。例えば幾つかの態様では、細胞膜、シンチラントおよびカップリング剤を含んでなる支持体、シンチラント活性化標識を含んでなるリガンド、および膜チャンネルと相互作用すると思われる試験分子が、別個の順次添加物としてアッセイに加えられる。換言すると、この態様では工程（ａ）から（ｄ）がアッセイにおいて別個の順次工程として行われる。好ましくはこの態様はいかなる分離または洗浄工程も必要とせず、そしてすべての試薬はアッセイ媒質に順次に直接加えられる。これらの特定の態様は、単純化されたアッセイ形式および手順といった利点を提供することができる。さらにアッセイに先立つプレインキュベーション期間は必要なく、そしてこのような試薬はアッセイ当日に再構成または解凍することができる。幾つかの態様では、マトリックス実験は膜を変動させ、そして支持体濃度を変動させて設定できるので、この特定の形式により支持体に対する膜の比率の容易な至適化が可能になる。好ましくはわずかに過剰な支持体を利用してアッセイに存在するすべての細胞膜の完全な捕捉を確実にする。当業
者は本明細書に記載するアッセイで使用される支持体の最適濃度を測定するために、既知の方法を利用することができる。特定の添加順序が本発明に重要であるとは考えない。
【００６６】
幾つかの態様では、細胞膜は支持体と、細胞膜および支持体が膜−支持体複合体を形成できる条件下でプレインキュベーションされた後、アッセイのさらなる試薬が加えられる。この態様に従い、細胞膜および支持体は、細胞膜または標識化リガンドがアッセイに加えられる前にプレインキュベーションされる。一般にこれを行うための１つの代表的方法として、細胞膜および支持体は所望の温度で（典型的には２〜８℃）プレインキュベーション期間にゆるやかに撹拌される（典型的には１〜４時間）。この特定の態様は、支持体および膜が単一試薬として加えられるので、アッセイに対してなされる添加の数を減らすような利点を提供することができる。幾つかの態様では、この態様は同じ調製物がアッセイの各反応溶液に使用されるので、アッセイ条件に均一性を提供することができる。
【００６７】
あるいは幾つかの態様では、細胞膜がシンチラント活性化標識で標識されたリガンドと、細胞膜およびリガンドが膜−リガンド複合体を形成できる条件下でプレインキュベーションされ、その後にアッセイのさらなる試薬が加えられる。この態様に従い、加えられる支持体の量は、アッセイ反応混合物中のすべての細胞膜と会合するために十分である。さらなる容量が導入されると、結合  対  遊離リガンドの平衡をシフトさせるので、測定を行う前の反応には再平衡化するために十分な時間が与えられるべきである。幾つかの態様では、このアッセイ形式のインキュベーション時間は、試薬が順次様式で加えられる場合よりも短くすることができる。
【００６８】
好ましくは本発明の方法を行うために本明細書に記載するすべての態様において、支持体に対する細胞膜の比率は、アッセイに存在するすべてまたは実質的にすべての細胞膜が支持体に会合（例えば結合）するように至適化される。非カップリング膜（支持体に会合していない膜）に結合した標識化リガンドは、標識化リガンドが支持体のシンチラントから離れすぎていてシンチラントからの発光に影響を及ぼすことができないので、アッセイシグナルに貢献しない。試薬の添加が順次であるか、またはリガンドが細胞膜とプレインキュベーションされる態様では、支持体によるすべての細胞膜の捕捉を確実とするために、わずかに過剰な支持体を含むことが好ましい。
【００６９】
本発明の典型的な性能において、リガンドが膜チャンネルに結合し、そして支持体が細胞膜と会合した時に、シグナルはアッセイが平衡になるまで上昇し続ける。あるいは測定をアッセイ中の特定の時点、ｔで取ることができる。生成した出力は、光電子倍増管を利用する適切な検出器により検出される。市販されている任意のシンチレーションカウンターを検出器として使用することができる。
【００７０】
本明細書で使用するように、本発明は膜チャンネルと相互作用する分子を同定する方法を提供する。すなわち膜チャンネルと相互作用すると思われる分子がアッセイサンプル中に存在する場合、分子はシンチラント活性化標識を含有するリガンドと、目的の膜チャンネルの結合について競合する。その結果、分子が膜チャンネルに結合すると、これが標識化リガンドと置き換わり、これによりシンチラント活性化標識を含有するリガンドはシンチラントの近接から除去されるので、シンチラントから発する光エネルギーが減少する。分子がさらに競合的ならば、アッセイの出力に測定し得る変化が観察される。
【００７１】
本発明の好適な態様はこのように、目的の膜チャンネルと相互作用すると思われる分子の高処理量スクリーニングを可能にする系のような多数の利点を提供することができる。さらに本発明の好適な態様に従い、アッセイを完了するために要する時間は、調査中の系のリガンド−膜チャンネル反応速度にのみ限定される。本発明に従い、細胞膜に結合するシンチラント活性化標識を含有するリガンドのみが支持体のシンチラントに対して十分に
近接しているので、標識化リガンドにより発せられる放射エネルギーはシンチラントに衝撃を与えることができる。その結果、支持体を洗浄するか、または反応混合物から非結合標識化リガンドを除去するための他の試みは必要なく；代わりに発光エネルギーのレベルはアッセイ混合物中に存在するすべての成分を用いて測定することができる。
【００７２】
以下の実施例は、本発明の種々の観点を具体的に説明する。
【実施例】
【００７３】
試薬および方法
結合バッファー：５０ｍＭ  ｈｅｐｅｓ−Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４および０．０５％ウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）
ＰＶＴ−ＷＧＡビーズ：ポリ（ビニルトルエン）−コムギ胚芽アグルチニン  ＳＰＡ
ビーズ（ニュージャージー州、ピスカタウェイのアマシャムから
Ｃａｔ．Ｎｏ．ＲＰＮＱ０００１で市販されている）。
Ｙｓｉ−ＷＧＡビーズ：ケイ酸イットリウム−コムギ胚芽アグルチニン  ＳＰＡビーズ  
（ニュージャージー州、ピスカタウェイのアマシャムからＣａｔ．
Ｎｏ．ＲＰＮＱ００１１で市販されている）。
Ｙｓｉ−ＰＬビーズ：ケイ酸イットリウム−コムギ胚芽アグルチニン  ＳＰＡビーズ    
（ニュージャージー州、ピスカタウェイのアマシャムからＣａｔ．  
Ｎｏ．ＲＰＮＱ００１０で市販されている）。
［１２５Ｉ］ＧＶＩＡ：マサチューセッツ州、ボストンのパーキンエルマー  ライフサイ
エンス（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）
、Ｃａｔ．Ｎｏ：ＮＥＸ２３９
［１２５Ｉ］ＭＶＩＩＣ：マサチューセッツ州、ボストンのパーキンエルマー  ライフサ
イエンス、Ｃａｔ．Ｎｏ：ＮＥＸ３２３
［１２５Ｉ］ＭＶＩＩＡ：マサチューセッツ州、ボストンのパーキンエルマー  ライフサ
イエンス、Ｃａｔ．Ｎｏ：ＮＥＸ３１６
特に示さない限り、ＳＰＡビーズは以下の実施例に５ｍｇ／ｍｌの濃度で使用した。
【００７４】
細胞膜の調製：
細胞膜はブロモデオキシウリジンにより分化させたヒト神経芽細胞（ＩＭＲ３２）から、またはオス成体のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの脳組織から、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  １：９５５−９６５に記載されている手順に従い調製した。簡単に説明すると細胞または組織を氷冷した２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）、２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび３２０ｍＭシュクロース中で均一化した。均一化後、懸濁液を最初に１００ｘｇで１０分間遠心した。生じた上清を集め、次いで４０，０００ｘｇで２０分間遠心した。膜ペレットを集め、結合バッファーに再懸濁し、そして−７０℃で保存した。膜調製物中のタンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ（バイオ−ラッド：Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準として用いて測定した。細胞膜は２〜５ｍｇ／ｍｌの量で存在した。典型的にはカルシウムチャンネルは約２００ｆｍｏｌ／ｍｇのラット脳膜タンパク質の量で存在する。
【００７５】
実施例１：リガンドのカルシウムチャンネルへの特異的結合
この実施例は、リガンドのラットの脳組織から単離した細胞膜内に含まれるカルシウムチャンネルへの特異的結合を測定するための方法を具体的に説明する。
【００７６】
アッセイは９６−ウェルのマイクロタイタープレート中で室温（２０℃〜２５℃）で行った。各ウェルで、上に示したようにラット脳組織から単離した２．５μｇの細胞膜（タンパク質濃度で測定した）、１ｍｇのＰＶＴ−ＷＧＡビーズおよび結合バッファーを全反
応溶液が２００μｌの容量となる量で室温にて１時間、ｐＨ７．４でインキュベーションした。このプレインキュベーション工程は細胞膜／ビーズ複合体の形成を可能とした。
【００７７】
インキュベーション後、１５ｐＭの以下の標識化リガンドの１つを各ウェルに加えた：［１２５Ｉ］ＧＶＩＡまたは［１２５Ｉ］ＭＶＩＩＣ。生じた反応混合物を室温でｐＨ７．４にて６０分間インキュベーションした。
【００７８】
非特異的結合については、１００ｎＭの非標識ＧＶＩＡコノトキシンを、［１２５Ｉ］ＧＶＩＡを加える前に各ウェルに加え、そして反応混合物を１時間、室温でｐＨ７．４にてインキュベーションして、平衡に達するようにした。すべての利用可能なカルシウムチャンネル特異的結合部位が標識化ＧＶＩＡの添加前に非標識化リガンドにより結合されように、非標識化ＧＶＩＡコノトキシンは過剰に存在した。
【００７９】
マイクロタイタープレートから発する光エネルギーは、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ（商標）シンチレーションカウンターを使用して測定した。光エネルギーの上昇は膜ビーズ複合体の形成に対応した。
【００８０】
ＧＶＩＡの結合に関する結果は図１に示す。［１２５Ｉ］ＧＶＩＡとのインキュベーションは、種々の期間（０〜２０時間）上記のように行い、そして図１のＸ軸上に表す。［１２５Ｉ］ＧＶＩＡ結合はｃｐｍでＹ軸上に表す。リガンドの全結合は曲線Ａ（黒色四角）で示し、一方、非特異的結合は曲線Ｂ（白抜き四角）で示す。ＧＶＩＡのカルシウムチャンネルへの特異的結合は、全結合（曲線Ａ）と非特異的結合（曲線Ｂ）との間の差異を測定することにより得られる。
【００８１】
ウェル毎の変動を測定するために、全部で４８の結合サンプルおよび４８の非特異的結合サンプルを９６ウェルプレート中で試験した。アッセイ手順は上記の実施例１の概説に従った。結果を図７に示し、これは全結合およびＮＳＢサンプルに関するｃｐｍでの（Ｙ軸）［１２５Ｉ］ＧＶＩＡ結合を具体的に説明する。サンプル数はＸ軸に示す。全結合は図中の四角で示され、そして非特異的結合は三角で示される。示すように、全結合は１分あたり１６４１．３カウント（ｃｐｍ）を測定し、非特異的結合（ＮＳＢ）は２６４ｃｐｍを測定した。このようにＧＶＩＡの特異的結合（全結合−ＮＳＢ）は１３７７ｃｐｍとなると測定された。全結合  対  非特異的結合の算出された比率は約６であった。Ｚ−因子（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，４：６７−７３）は約０．７５であり、このアッセイの再現性が高処理量スクリーニングの実施に十分であることを示唆する。
【００８２】
実施例２：標識化リガンドの細胞膜への結合に及ぼす効果
支持体の濃度、細胞膜濃度およびリガンド濃度が標識化リガンドの細胞膜への結合に及ぼす効果を測定した。
【００８３】
支持体濃度
設定濃度の標識化リガンドおよび細胞膜の存在下で、支持体の濃度の変動させる効果を調査した。濃度を変えた（０．７５〜５ｍｇ／ｍｌ）ＳＰＡビーズを有するウェルをマイクロタイタープレート中に調製した。各ウェルにラット脳組織から単離した２．５μｇの細胞膜、および結合バッファーを全反応溶液の容量が２００μｌになる量で合わせた。反応混合物を１時間、室温、ｐＨ７．４でインキュベーションした。
【００８４】
対照として１００ｎＭの非標識ＧＶＩＡを各ウェルに加え、そして反応混合物を１時間、室温、ｐＨ７．４でインキュベーションした。すべての利用可能なカルシウムチャンネル特異的結合部位が非標識リガンドにより結合されるように、非標識ＧＶＩＡは過剰に存
在した。
【００８５】
次いで１５ｐＭの［１２５Ｉ］ＧＶＩＡを各ウェルに加え、そして反応混合物を１時間、室温、ｐＨ７．４でインキュベーションして平衡に達するようにした。
【００８６】
マイクロタイタープレートから発する光エネルギーは、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ（商標）シンチレーションカウンターを使用して測定した。結果を図２に示す。ＳＰＡビーズの濃度（ｍｇ／ウェル）はＸ軸で具体的に説明し、そして［１２５Ｉ］ＧＶＩＡ結合の濃度はｃｐｍでＹ軸にて具体的に説明する。光エネルギーの上昇は、ビーズ−膜複合体の形成に対応した。図２に具体的に示すように、［１２５Ｉ］ＧＶＩＡの細胞膜への結合は、存在するＰＶＴ−ＷＧＡビーズの濃度に依存した。標識化ＧＶＩＡの全結合は曲線Ａで表し（暗い丸）、一方、標識化ＧＶＩＡの非特異的結合は曲線Ｂで示す（白抜き丸）。
【００８７】
細胞膜濃度
設定濃度の標識化リガンドおよび支持体の存在下で、細胞膜濃度を変動させる効果を調査した。ラット脳組織から得た濃度を変えた細胞膜（３．１２５〜２５ｍｇ／ｍｌ）をマイクロタイタープレート中のウェルに入れた。各ウェルに１ｍｇＰＶＴ−ＷＧＡビーズおよび結合バッファーを全反応溶液の容量が２００μｌになる量で加えた。反応混合物を１時間、室温、ｐＨ７．４でインキュベーションした。
【００８８】
インキュベーション後、１００ｎＭの非標識化ＧＶＩＡを各ウェルに加え、そして反応混合物を室温でｐＨ７．４にて１時間インキュベーションした。すべての利用可能なカルシウムチャンネル特異的結合部位が非標識リガンドにより結合されるように、非標識化ＧＶＩＡは過剰に存在した。
【００８９】
次いで１５ｐＭの［１２５Ｉ］ＧＶＩＡを各ウェルに加え、そして反応混合物を１時間、室温、ｐＨ７．４でインキュベーションして平衡に達するようにした。
【００９０】
マイクロタイタープレートから発する光エネルギーは、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ（商標）シンチレーションカウンターを使用して測定した。結果を図３に示す。脳の膜の濃度はＸ軸で具体的に説明し（μｇ／ウェル）、そして［１２５Ｉ］ＧＶＩＡ結合はＹ軸にて具体的に説明する（ｃｐｍ）。光エネルギーの上昇は、ビーズ−膜複合体の形成に対応した。図３に具体的に示すように、ビーズ−膜複合体の形成は、アッセイ混合物中に存在する細胞膜の濃度に依存した。標識化ＧＶＩＡの全結合は曲線Ａで表し（暗い丸）、一方、標識化ＧＶＩＡの非特異的結合は曲線Ｂで示す（白抜き丸）。
【００９１】
リガンド濃度
設定濃度の支持体および細胞膜の存在下で、リガンド濃度を変動させる効果を調査した。１ｍｇＰＶＴ−ＷＧＡビーズ、ラット脳から単離した２．５μｇの細胞膜および結合バッファーを２００μｌの全反応溶液容量となるように９６ウェル−マイクロタイタープレートのウェルに入れた。反応混合物を１時間、室温、ｐＨ７．４でインキュベーションした。
【００９２】
インキュベーション後、１００ｎＭの非標識化ＧＶＩＡを各ウェルに加え、そして反応混合物を室温でｐＨ７．４にて１時間インキュベーションした。すべての利用可能なカルシウムチャンネル特異的結合部位が非標識化リガンドにより結合されるように、非標識ＧＶＩＡは過剰に存在した。
【００９３】
次いで濃度を変えた［１２５Ｉ］ＧＶＩＡ（１〜１００ｐＭ）を各ウェルに加え、そし
て反応混合物を１時間、室温、ｐＨ７．４でインキュベーションして平衡に達するようにした。
【００９４】
マイクロタイタープレートから発する光エネルギーは、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ（商標）シンチレーションカウンターを使用して測定した。結果を図４に示す。［１２５Ｉ］ＧＶＩＡの濃度はｐＭでＸ軸で具体的に説明し、そして［１２５Ｉ］ＧＶＩＡ結合はＹ軸にてｃｐｍで具体的に説明する。光エネルギーの上昇は、ビーズ−膜複合体の形成に対応した。図４は標識化リガンドの細胞膜への結合に及ぼす［１２５Ｉ］ＧＶＩＡ濃度の効果を具体的に説明する。バックグラウンド（曲線Ｂ、三角）は、細胞膜の不存在下で測定した。リガンドの全結合は曲線Ａで表し（暗色四角）、一方、非特異的結合は曲線Ｃで示す（白抜き四角）。
【００９５】
図５は細胞膜への［１２５Ｉ］ＧＶＩＡの結合が高濃度のリガンドで飽和できることを具体的に説明する。ｐＭでの［１２５Ｉ］ＧＶＩＡの濃度はＸ軸で具体的に説明し、そしてｃｐｍでの［１２５Ｉ］ＧＶＩＡ結合をＹ軸で具体的に説明する。図５で具体的に説明するデータは、図４に表すデータの再プロットである。コンピューターで書いた曲線は、データにベストフィットすることを示す。最大の半分の結合（ＥＣ５０）は約１２ｐＭの濃度で到達し、一方、最大結合（Ｂｍａｘ）は約２５ｐＭの濃度で達した。［１２５Ｉ］ＧＶＩＡに関する飽和データは、結合が１部位モデルを使用して最高に合うことを示し、１３ｐＭの解離定数（Ｋｄ）値および２２５ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質のＢｍａｘ値であった。
【００９６】
実施例３：カルシウムチャンネルの競合的結合
他のカルシウムチャンネルリガンドが、ラット脳から単離した細胞膜への結合について［１２５Ｉ］ＧＶＩＡと競合する能力を以下のように実験した。
【００９７】
９６ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに、以下を加えた：１ｍｇのＷＧＡ−ＰＶＴビーズ、ラット脳組織から単離した２．５μｇのラット細胞膜、および全反応溶液の容量が２００μｌとなる量の結合バッファー。反応混合物を１時間、室温、ｐＨ７．４でインキュベーションした。
【００９８】
インキュベーション後、１５ｐＭの［１２５Ｉ］ＧＶＩＡを各ウェルに加え、そして反応混合物を室温でｐＨ７．４にて１時間インキュベーションした。
【００９９】
種々のリガンドが細胞膜への結合について競合する能力は、以下のリガンドの１つを上記のように調製した反応混合物に加えることにより実験した：ＧＶＩＡ、ＭＶＩＩＡ、ＭＶＩＩＣおよびω−アガトキシン。各リガンドを０１．ｐＭ〜０．１μＭの濃度で加えた。反応混合物を室温でｐＨ７．４にて１時間インキュベーションして平衡に達するようにした。
【０１００】
マイクロタイタープレートから発する光エネルギーは、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ（商標）シンチレーションカウンターを使用して測定した。結果を図６に示し、これは実験した各リガンドに関する結合曲線を具体的に説明する。阻害曲線は単一部位結合モデルにベストフィットした。リガンドの濃度はＸ軸で示し（ｌｏｇＭ）、そして［１２５Ｉ］ＧＶＩＡ結合はＹ軸に示す（ｃｐｍ）。ＧＶＩＡの結合は曲線Ａ（四角）で示し、ＭＶＩＩＡは曲線Ｂ（丸）で示し、ＭＶＩＩＣは曲線Ｃ（暗色三角）で示し、ω−アガトキシンは曲線Ｄ（白抜き三角）で示す。細胞膜に対する［１２５Ｉ］ＧＶＩＡ結合の置換は、以下の順序で観察された：ＧＶＩＡ＞ＭＶＩＩＡ＞ＭＶＩＩＣ＞＞ω−アガトキシン。換言すると、ＧＶＩＡはアッセイしたリガンドで最高の相対的結合親和性を表し、一方、ω−アガトキシンは最低の相対的結合親和性を表した。ＧＶＩＡ、ＭＶＩＩＡおよびＭ
ＶＩＩＣ結合データは、１部位モデルにベストフィットした。この結果は［１２５Ｉ］ＧＶＩＡがラット脳から単離した細胞膜中のＮ型カルシウムチャンネルに特異的に結合することを示す。
【０１０１】
各リガンドに関する親和性定数（ｋｉ）を計算し、そして結果の以下の表２に示す。データはアッセイ法がカルシウムチャンネルとの競合的結合を実験するための確実な系を提供することを証明する。
【０１０２】
【表２】
2008507275.tif 000004
【０１０３】
実施例４：細胞膜へのリガンドの結合
２種のリガンドのラット脳から単離した細胞膜への結合を以下のように実験した。
【０１０４】
アッセイは室温でマイクロタイタープレート中にて行った。［１２５Ｉ］ＭＶＩＩＡ結合を検出するために計画した第１組の反応では、ラット脳組織から上記のように単離された２．５μｇの細胞膜、１ｍｇのＰＶＴ−ＷＧＡビーズ、および全反応溶液の容量を２００μｌとする量の結合バッファーが各ウェルに加えられ、そして室温でｐＨ７．４にて１時間インキュベーションされた。［１２５Ｉ］ＭＶＩＩＣ結合を検出するために計画した第２組の反応では、ラット脳組織から上記のように単離された５μｇの細胞膜、１ｍｇのＰＶＴ−ＷＧＡビーズ、および全反応溶液の容量を２００μｌとする結合バッファーが各ウェルに加えられ、そして室温でｐＨ７．４にて１時間インキュベーションされた。このプレインキュベーション工程で細胞膜／ビーズ複合体を形成させた。
【０１０５】
上記インキュベーション後、１５ｐＭの［１２５Ｉ］ＭＶＩＩＡを第１組の反応に加え、そして１５ｐＭの［１２５Ｉ］ＭＶＩＩＣを第２組の反応に加えた。反応混合物を室温でｐＨ７．４にて１時間インキュベーションして平衡に到達させた。
【０１０６】
非特異的結合は、実施例１の手順を使用して、反応混合物に適するように１００ｎＭの非標識ＭＶＩＩＡ（第１組の反応）またはＭＶＩＩＣ（第２組の反応）の存在下で試験した。
【０１０７】
マイクロタイタープレートから発する光エネルギーは、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ（商標）シンチレーションカウンターを使用して測定した。結果を図８に示す。各リガンドに関する全結合を棒Ａで示し、一方、各リガンドに関する非特異的結合を棒Ｂで示す。［１２５Ｉ］コノトキシン結合（第１組の反応にはＭＶＩＩＡ、第２組の反応にはＭＶＩＩＣ）をＹ軸上でｃｐｍにて示す。
【０１０８】
実施例５：リガンドのＩＭＲ３２細胞への結合
標識化リガンドのＩＭＲ３２細胞への結合を、以下のように実験した。アッセイは室温でマイクロタイタープレート中にて行った。各ウェルに、上記のようなＩＭＲ３２細胞から単離した１０μｇの細胞膜、１ｍｇのＰＶＴ−ＷＧＡビーズおよび全反応溶液の容量を２００μｌとする量の結合バッファーが各ウェルに加えられ、そして室温でｐＨ７．４にて１時間インキュベーションされた。このプレインキュベーション工程は細胞膜／ビーズ複合体を形成させた。
【０１０９】
インキュベーション後、１５ｐＭの［１２５Ｉ］ＧＶＩＡ（第１組の反応）または［１２５Ｉ］ＭＶＩＩＡ（第２組の反応）を反応混合物に加えた。反応混合物を室温でｐＨ７．４にて１時間インキュベーションして平衡に到達させた。
【０１１０】
非特異的結合は、実施例１の手順を使用して、反応混合物に適するように１００ｎＭの非標識ＧＶＩＡ（第１組の反応）またはＭＶＩＩＡ（第２組の反応）の存在下で試験した。
【０１１１】
マイクロタイタープレートから発する光エネルギーは、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ（商標）シンチレーションカウンターを使用して測定した。結果を図９に示す。各リガンドに関する全結合を棒Ａで示し、一方、各リガンドに関する非特異的結合を棒Ｂで示す。［１２５Ｉ］コノトキシン結合（第１組の反応にはＧＶＩＡ、第２組の反応にはＭＶＩＩＡ）をＹ軸上でｃｐｍにて示す。
【０１１２】
実施例６：変動するカップリング剤を含有するビーズの結合
変動するカップリング剤を含有する支持体が細胞膜と会合し、そしてリガンド−結合アッセイで機能する能力を以下のように実験した。
【０１１３】
アッセイは室温でマイクロタイタープレート中にて行った。各ウェルに、ラット脳組織から単離した２．５μｇの細胞膜、１ｍｇのＹｓｉ−ＷＧＡビーズまたはＹｓｉ−ＰＬビーズ、および全反応溶液の容量を２００μｌとする量の結合バッファーが各ウェルに加えられ、そして室温でｐＨ７．４にて１時間インキュベーションされた。このプレインキュベーション工程は細胞膜／ビーズ複合体を形成させた。
【０１１４】
インキュベーション後、１５ｐＭの［１２５Ｉ］ＭＶＩＩＡを反応混合物に加えた。反応混合物を室温でｐＨ７．４にて１時間インキュベーションして平衡に到達させた。
【０１１５】
非特異的結合は、実施例１の手順を使用して１００ｎＭの非標識ＭＶＩＩＡの存在下で試験した。
【０１１６】
マイクロタイタープレートから発する光エネルギーは、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ（商標）シンチレーションカウンターを使用して測定した。結果を図１０に示す。全結合を棒Ａで示し、一方、非特異的結合を棒Ｂで示す。［１２５Ｉ］ＭＶＩＩＡをＹ軸上でｃｐｍにて示す。非特異的結合はＰＶＴ−ＷＧＡビーズを使用したアッセイよりも高いことが観察された。
【０１１７】
本発明の他の態様は、本明細書の考察またはここに開示する本発明の実施から当業者には明白であろう。本明細書に記載する原理および態様に対する種々の省略、修飾および変更は、特許請求の範囲に示される本発明の真の範囲および精神から逸脱せずに当業者によりなされることができる。本明細書で引用するすべての特許、特許明細書および刊行物は、個々に編入されるように参考により本明細書に編入する。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
本明細書に編入され、そしてその一部を構成する添付図面は本発明の幾つかの観点を具体的に説明し、そして好適な態様の説明と一緒に本発明の原理を説明するために役立つ。図面の簡単な説明は以下の通りである：
【図１】ラット脳から単離された細胞膜中のイオンチャンネルに対する［１２５Ｉ］ＧＶＩＡの結合に及ぼす時間でのインキュベーション時間（Ｘ軸）の効果を、分あたりのカウント（ｃｐｍ）（Ｙ軸）で具体的に説明するグラフである。白抜き四角；非特異的結合（ＮＳＢ）；黒色四角：全結合。
【図２】ラット脳から単離された細胞膜中のイオンチャンネルに対する［１２５Ｉ］ＧＶＩＡの結合に及ぼすビーズ濃度（ｍｇ／ウェル（Ｘ軸））の効果をｃｐｍで（Ｙ軸）で具体的に説明するグラフである。白抜き丸；非特異的結合（ＮＳＢ）；黒色丸：全結合。
【図３】ラット脳から単離された細胞膜中のイオンチャンネルに対する［１２５Ｉ］ＧＶＩＡの結合に及ぼす細胞膜濃度（μｇ／ウェル（Ｘ軸））の効果をｃｐｍで（Ｙ軸）で具体的に説明するグラフである。白抜き丸；非特異的結合（ＮＳＢ）；黒色丸：全結合。
【図４】ラット脳から単離された細胞膜中のイオンチャンネルに対する［１２５Ｉ］ＧＶＩＡの結合に及ぼすピコモルのリガンド濃度（ｐＭ（Ｘ軸））の効果をｃｐｍで（Ｙ軸）で具体的に説明するグラフである。白抜き四角；非特異的結合（ＮＳＢ）；黒色四角：全結合；暗色三角、バックグラウンド（ＢＫＧ）。
【図５】ラット脳から単離された細胞膜中のイオンチャンネルに対する［１２５Ｉ］ＧＶＩＡの結合に及ぼすリガンド濃度（ｐＭ（Ｘ軸））の効果をｃｐｍで（Ｙ軸）で具体的に説明するグラフである。この図面のデータは図４のデータの再プロットである。
【図６】ラット脳から単離された細胞膜中のイオンチャンネルに対する［１２５Ｉ］ＧＶＩＡの結合に及ぼす競合的リガンドの存在の効果を具体的に説明するグラフである。競合的リガンドの濃度の対数をＸ軸上に表し、そして［１２５Ｉ］ＧＶＩＡの結合をｃｐｍでＹ軸上に表す。四角：ＣＴＸ−ＧＶＩＡ；丸：ＣＴＸ−ＭＶＩＩＡ；暗色三角：ＣＴＸ−ＭＶＩＩＣ；白抜き三角、ω−アガトキシン。
【図７】Ｚ因子の算出について、ラット脳から単離された細胞膜中の膜チャンネルに対する全［１２５Ｉ］ＧＶＩＡ結合（四角で表す）および細胞膜に対する非特異的結合（三角で表す）を具体的に説明するグラフである。サンプル番号はＸ軸上に表し、そして［１２５Ｉ］ＧＶＩＡ結合はｃｐｍでＹ軸上に表す。
【図８】本発明の１つの態様を使用して、ラット脳から単離された細胞膜中の膜チャンネルに対する［１２５Ｉ］ＭＶＩＩＡまたは［１２５Ｉ］ＭＶＩＩＣの結合を具体的に説明するグラフである。全結合は灰色棒として表し、そして非特異的結合は白色棒として表す。
【図９】本発明の１つの態様を使用して、ＩＭＲ３２細胞から単離された細胞膜中の膜チャンネルに対する［１２５Ｉ］ＧＶＩＡまたは［１２５Ｉ］ＭＶＩＩＡの結合を具体的に説明するグラフである。全結合は灰色棒として表し、そして非特異的結合は白色棒として表す。
【図１０】コムギ胚芽アグルチニン（ＷＧＡ−Ｙｓｉ）またはポリリシン（ＰＬ−Ｙｓｉ）で被覆したケイ酸イットリウムビーズに前以てカップリングさせた細胞膜中の膜チャンネルに対する［１２５Ｉ］ＭＶＩＩＡの結合を具体的に説明するグラフである。全結合は灰色棒として表し、そして非特異的結合は白色棒として表す。
【図１】
2008507275.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2008507275.tif 000013
【図１０】
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【国際調査報告】
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