(57)【要約】  本発明は、消化管間質腫瘍の処置のための医薬組成物の製造における、遊離形または薬学的に許容される塩形態のミドスタウリンの使用、および温血動物、好ましくはヒトの処置法であって、該疾患または状態を有する動物に治療的有効用量のミドスタウリンを投与する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１】
2008511572.tif 000006
で示されるミドスタウリンまたはその薬学的に許容される塩の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、消化管間質腫瘍を有する患者の処置法。
【請求項２】
前記消化管間質腫瘍が、イマチニブ耐性消化管間質腫瘍である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ミドスタウリンを、１日当たり１００から３００ｍｇの用量で投与する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記用量が、１日当たり１５０から２５０ｍｇである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記用量が、１日当たり２００ｍｇである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ミドスタウリンを、イマチニブと同時、個別または連続使用すべきでないという条件で患者に投与する、請求項１から５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
消化管間質腫瘍の処置のための薬剤の製造を目的とした、ミドスタウリンの使用。
【請求項８】
前記消化管間質腫瘍が、イマチニブを用いる治療に耐性である、請求項８記載の使用。
【請求項９】
前記ミドスタウリンを、１日当たり１５０から２５０ｍｇの用量で投与する、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
投与すべき用量が、１日当たり２００ｍｇである、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
前記ミドスタウリンを経口投与する、請求項１記載の方法または請求項８記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物Ｉに耐性の消化管間質腫瘍(ＧＩＳＴ)、例えば消化管腫瘍の処置のための医薬組成物の製造における、遊離形または薬学的に許容される塩形態のミドスタウリンの使用、および温血動物、好ましくはヒトの処置法であって、上記の疾患または状態を有する動物に治療的有効用量のミドスタウリンを投与する方法に関する。
【０００２】
図面の説明
パネルＢ：ＫＩＴΔＷＫ５５７−５５８／Ｔ６７０Ｉ、ＰＤＧＦＲＡ Ｄ８４２ＶまたはΔＤＩＭ８４２−８４４変異を発現するＢａ／Ｆ３細胞の、イマチニブまたはＰＫＣ４１２に対する用量応答曲線。
【背景技術】
【０００３】
消化管間質腫瘍は、近年特徴付けられた、消化管に由来する間葉性新生物ファミリーであり、全ＧＩＳＴの６０〜７０％は胃に原発する。以前は、これらの腫瘍は、平滑筋腫、平滑筋芽腫または平滑筋肉腫として様々に分類されていた。しかしながら、現在、ＧＩＳＴは、その独特な分子病因および臨床的特徴に基づき、別の臨床病理学的集合を示すことが明らかである。
【０００４】
ＧＩＳＴは、約２０症例／百万の発症と概算され、相対的には稀であるが、消化管の最も一般的な間葉性新生物である。最近まで、唯一の利用可能な治療は外科的切除であった。慣用の細胞毒性化学療法および放射線療法の限られた有効性が、進行したＧＩＳＴを常に進行性かつ致死的状態とし、患者の平均生存期間は２０ヶ月（例えば、転移性ＧＩＳＴ）から１年以下（例えば、手術後再発）の間である。
【０００５】
大部分のＧＩＳＴにおいて最も可能性の高い原因となる発癌分子事象は、ＫＩＴまたは血小板由来増殖因子受容体Ａ（略して、ＰＤＧＦＲＡ）の活性化変異である。シグナル伝達経路が活性化されると、結果として細胞増殖および／または生存が促進される。イマチニブメシレートは、受容体型チロシンキナーゼであるＰＤＧＦＲ、ＫＩＴ、ＡＢＬおよびＡＲＧを特異的に阻害し、ＧＩＳＴを有する患者において高い応答率をもたらす。現在まで、イマチニブ治療は、この疾患の唯一の効果的、全身的処置である。その応答と腫瘍におけるＫＩＴ／ＰＤＧＦＲＡ変異の存在およびタイプを関連付ける臨床的および実験的観察によれば、ＫＩＴ エクソン１１変異を有するものが、処置に最も感受性である。キナーゼ触媒ドメインに影響を与えるＫＩＴ−Ｄ８１６ＶおよびＰＤＧＦＲＡ−Ｄ８４２Ｖ変異は、イマチニブの結合を妨げ、薬剤を一次的に無効にする。ＧＩＳＴ患者の多くは、薬剤に対する様々な程度の初期応答後、治療の間に耐性を生じる。慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）または慢性好酸球性白血病（ＣＥＬ）のような、イマチニブを用いて処置する他の悪性腫瘍の調査は、この阻害剤に対する耐性が、異なる分子機序によりもたらされ得ることを示す。イマチニブ耐性を有するＣＭＬ患者の多くは、新規変異体ＢＣＲ−ＡＢＬアレルを有するか、またはＢＣＲ−ＡＢＬ増幅により高レベルの融合タンパク質を発現する、白血病細胞のクローン増殖を有する。ＣＥＬにおけるイマチニブに対する耐性の発生は、ＦＩＰＬ１−ＰＤＧＦＲＡ融合タンパク質の触媒ドメイン内の第二の変異と関係し得る。イマチニブ耐性の疾患進行段階にあるＧＩＳＴ患者における予備試験は、ＫＩＴキナーゼドメインの後天的突然変異またはＫＩＴ遺伝子のゲノム増幅を有する腫瘍の大部分におけるＫＩＴ活性化が、一部の患者における病因として、機能的役割を果たし続けていることを示した。
【０００６】
イマチニブは、進行したＧＩＳＴを有する患者の価値のある処置として、現在明らかになっている特異的チロシンキナーゼを選択的に阻害する小分子である。ＧＩＳＴの処置のための単剤療法としてのイマチニブの使用は、ＰＣＴ公報ＷＯ０２／３４７２７（引用により本明細書中に包含される）に記載されている。しかしながら、イマチニブに対する一次的耐性が、患者集団に、例えば、一試験において患者の１３.７％に存在することが報告されている。加えて、多くの患者がイマチニブでの処置に耐性を獲得する。より一般的に、この耐性は、ある病巣においては部分的に進行をもたらすが、他の病巣では疾患の制御が続く。故に、これらの患者はイマチニブ処置を続けるが、さらなるまたは別の治療の必要性が明らかである。
【０００７】
イマチニブは、式Ｉ
【化１】
2008511572.tif 000002
の４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−[４−メチル−３−(４−ピリジン−３−イル)ピリミジン−２−イルアミノ)フェニル]−ベンズアミドである。
【０００８】
イマチニブの製造、とりわけ抗腫瘍剤としてのその使用は、１９９３年１０月６日公開の欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０５６４４０９の実施例２１、ならびに多くの他の国の対応出願および特許、例えばＵＳ特許第５，５２１，１８４号および日本特許第２７０６６８２号に記載されており、それらは全て引用により本明細書に包含される。
【発明の開示】
【０００９】
今回、驚くことに、プロテインキナーゼＣ阻害剤であるミドスタウリンは、消化管間質腫瘍の処置に、例えばイマチニブ耐性消化管間質腫瘍の処置に有用であることを示す治療特性を有することが発見された。
【００１０】
プロテインキナーゼＣ（以降、本明細書中、ＰＫＣとして略す。）は、細胞のシグナル伝達経路における重要な酵素の１種であり、それは、細胞増殖および分化の制御に重要な役割を果たしている。ＰＫＣは、セリン／スレオニンキナーゼのファミリーである。ＰＫＣの少なくとも１２種のイソ型が同定されており、それらは、それらの構造および基質要件に基づき、通常３群に分けられる。ＰＫＣは、ヒト乳房腫瘍生検サンプルにおいて、正常乳房組織と比較して上昇していることが判明しており、そして高いＰＫＣ発現は、ヒト星状細胞腫の悪性度の生物学的マーカーであると見なされている。ＰＫＣイソ型の１種、ＰＫＣθは、Ｔ細胞における生存シグナル伝達の正のレギュレーターである。興味深いことに、ＰＫＣθは、ＧＩＳＴにおいて構成的にリン酸化される。故に、ＰＫＣθを、ＧＩＳＴにおける治療的介入のための標的キナーゼの可能性があると見なし得る。特に、ＰＫＣ阻害剤はイマチニブ耐性ＧＩＳＴの処置に有利である。
【００１１】
従って、本発明は、ＧＩＳＴを有する患者、例えばイマチニブ耐性ＧＩＳＴを有する患者にミドスタウリンを投与することを含む、ＧＩＳＴの処置法に関する。
【００１２】
本発明のミドスタウリンは、式（ＩＩ）：
【化２】
2008511572.tif 000003
のＮ−［（９Ｓ，１０Ｒ，１１Ｒ，１３Ｒ）−２，３，１０，１１，１２，１３−ヘキサヒドロ−１０−メトキシ−９−メチル−１−オキソ−９，１３−エポキシ−１Ｈ，９Ｈ−ジインドロ［１，２，３−ｇｈ：３’，２’，１’−ｌｍ］ピロロ［３，４−ｊ］［１，７］ベンゾジアゾニン−１１−イル］−Ｎ−メチルベンズアミド、またはその塩（以降：“式ＩＩの化合物またはミドスタウリン”と称する。）である。
【００１３】
式ＩＩの化合物またはミドスタウリン［国際一般名］は、ＰＫＣ４１２としても公知である。
【００１４】
ミドスタウリンは、天然に存在するアルカロイドであるスタウロスポリンの誘導体であり、１９８８年１２月２１日公開の欧州特許第０２９６１１０号、ならびに１９９２年３月３日公開の米国特許第５０９３３３０号、および日本国特許第２７０８０４７号に具体的に記載されている。これらの文献に記載されたミドスタウリンは、引用により本明細書中に包含される。ミドスタウリンおよびその製造法は、多くの文献に具体的に記載されており、当業者によく知られている。
【００１５】
特許出願または科学文献が引用されるそれぞれの場合において、特に、ミドスタウリンに関して、最終製品、製剤および請求項の主題は、これらの文献を引用することにより本明細書中に包含される。
【００１６】
本明細書で用いる用語“イマチニブ耐性の”または“イマチニブ耐性”は、消化管間質腫瘍の処置における、イマチニブの治療的効果の欠失、減少または低下を意味する。
【００１７】
本発明は、ミドスタウリン（ＰＫＣ４１２としても公知）またはその薬学的に許容される塩の、消化管間質腫瘍（以降、本明細書中、ＧＩＳＴと略す。）、例えばイマチニブ耐性ＧＩＳＴの処置のための医薬の製造を目的とした使用、およびミドスタウリンまたはその薬学的に許容される塩の有効量を、そのような処置を必要とするＧＩＳＴのヒトを含む温血動物に投与することにより該動物を処置する方法に関する。
【００１８】
本発明は、ＧＩＳＴを有する、例えばイマチニブ耐性ＧＩＳＴを有する患者にミドスタウリンを投与することを含む、ＧＩＳＴ、例えばイマチニブ耐性ＧＩＳＴを処置する方法に関する。
【００１９】
上記の疾患および状態を処置するために用いるべきミドスタウリンの正確な投与量は、患者、処置すべき状態の性質および重症度、投与方法を含む様々な因子に依存する。一般的に、満足のいく結果は、ミドスタウリンを非経腸的に、例えば腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内または直腸内に、または経腸的に、例えば経口で、好ましくは静脈内に、または好ましくは経口で、０．１から１０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１から５ｍｇ／ｋｇ体重の１日投与量で静脈内に投与するとき、達成される。ヒト臨床試験において、２２５ｍｇ／日の全体用量は、最も可能性のある最大耐量（ＭＴＤ）であった。好ましい静脈内１日投与量は、０．１から１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、より大きな霊長類に関しては、２００−３００ｍｇの１日投与量である。典型的な静脈投与量は、３から５ｍｇ／ｋｇを、１週間に３回から５回である。
【００２０】
ミドスタウリンを、経口で約３００ｍｇ／日までの、例えば１００から３００ｍｇ／日の投与量で投与する。ミドスタウリンを、単回用量として投与するかまたは１日あたり２回もしくは３回用量、好ましくは２回用量に分ける。特に重要な用量は、２００−２２５ｍｇ／日、特に１００ｍｇ、１日２回(合計２００ｍｇ／日)である。投与量の上限は、副作用により設定され、処置される患者の臨床試験により決定できる。
【００２１】
本発明はまた、治療的有効量のミドスタウリンを、哺乳動物対象に対して１週間に７回から４回、またはある期間内に、１から６週間の期間に約１００％から約５０％を投与し、その後１から３週間に該薬剤を投与しないというサイクルを、１サイクルから数サイクル繰り返す方法に関する。
【００２２】
通常、初めに少量が投与され、投与量を、処置が決定される条件下で患者に最適な投与量まで徐々に増加する。投与量の上限は、副作用により設定され、処置される患者の臨床試験により決定できる。
【００２３】
ミドスタウリンは、１個以上の薬学的に許容される担体、および所望により１個以上の他の慣用の医薬アジュバントと共に組み合わせることができ、経腸的に、例えば錠剤、カプセルなどの形態で経口的に、または非経腸的に、例えば滅菌注射溶液または懸濁液の形態で腹腔内または静脈内に投与することができる。経腸的および非経腸的組成物を、常套法により製造することができる。
【００２４】
本発明の注入溶液は、好ましくは滅菌される。これは、例えば滅菌ろ過膜を通してろ過することにより、容易に達成することができる。液体形態の全ての組成物の滅菌形成、バイアルの滅菌充填および／または本発明の医薬組成物と適する希釈剤の滅菌条件下での組み合わせは、当業者によく知られている。
【００２５】
ミドスタウリンを、単位投与量形態の組成物および薬学的に許容される担体を含む組成物のような、上記疾患および状態を処置するために有効な一定量の活性物質を含む経腸的および非経腸的医薬組成物に製剤することができる。
【００２６】
有用な組成物の例は、欧州特許第０２９６１１０号、第０６５７１６４号、第０２９６１１０号、第０７３３３７２号、第０７１１５５６号、第０７１１５５７号に記載される。
【００２７】
好ましい組成物は、１９９５年６月１４日発行の欧州特許第０６５７１６４号に記載される。記載される医薬組成物は、飽和ポリアルキレングリコールグリセリド中ミドスタウリンの溶液または分散液を含み、ここで、グリコールグリセリドは、グリセロールと１個以上のＣ８−Ｃ１８飽和脂肪酸のポリエチレングリコールエステルの混合物である。
【００２８】
本発明は、ＧＩＳＴ、例えばイマチニブ耐性ＧＩＳＴを処置するための医薬の製造を目的とした、ミドスタウリン、またはその薬学的に許容される塩の使用（ただし、ミドスタウリンを、イマチニブと共に、連続してまたは別個に投与しない。）に関する。
【００２９】
本発明は、ＧＩＳＴ、例えばイマチニブ耐性ＧＩＳＴの処置のためのミドスタウリンまたはその薬学的に許容される塩の使用（ここで、イマチニブを、該ＧＩＳＴ、例えばイマチニブ耐性ＧＩＳＴの処置のために使用しない。）に関する。
【００３０】
本発明は、ミドスタウリンまたはその薬学的に許容される塩の使用（ここで、ミドスタウリンを、ＧＩＳＴ、例えばイマチニブ耐性ＧＩＳＴの処置のために抗腫瘍剤として使用する。）に関する。
【００３１】
本発明はさらに、ミドスタウリン、またはその塩を使用するための指示書を、ＧＩＳＴ、例えばイマチニブ耐性ＧＩＳＴの処置のために共に含む、パッケージングされたミドスタウリンに関する。
【００３２】
一局面において、本発明は、ＧＩＳＴを処置する方法であって、それを必要とする温血動物、特にヒトにＧＩＳＴに対して治療的有効量のミドスタウリンを投与することを含む方法を提供する。より特に、本発明は、有効量のミドスタウリン、またはその薬学的に許容される塩を患者に投与することを含む、ＧＩＳＴを有する患者を処置するための方法を提供する。より特に、本発明は、有効量のミドスタウリン、またはその薬学的に許容される塩を患者に、１日１００から３００ｍｇ、とりわけ１日１５０から２５０ｍｇ、最もとりわけ１日２００ｍｇの用量で経口用製剤として投与することを含む、ＧＩＳＴを有する患者を処置するための方法を提供する。
【実施例】
【００３３】
実施例１：ミドスタウリン製剤
組成物Ａ：
Ｇｅｌｕｃｉｒｅ ４４／１４（８２部）を、６０℃に加熱することにより融解する。粉末ミドスタウリン（１８部）を、融解物質に添加する。得られた混合物を均質化し、得られた分散物を、あるものは２５ｍｇのミドスタウリン投与量を含み、その他のものは７５ｍｇのミドスタウリン投与量を含むように、異なるサイズの硬ゼラチンカプセル中に挿入する。得られたカプセルは、経口投与に適する。
【００３４】
組成物Ｂ：
Ｇｅｌｕｃｉｒｅ ４４／１４（８６部）を、６０℃に加熱することにより融解する。粉末ミドスタウリン（１４部）を、融解物質に添加する。混合物を均質化し、得られた分散物を、あるものは２５ｍｇのミドスタウリン投与量を含み、その他のものは７５ｍｇのミドスタウリン投与量を含むように、異なるサイズの硬ゼラチンカプセル中に挿入する。得られたカプセルは、経口投与に適する。
【００３５】
Gattefosseにより市販されているＧｅｌｕｃｉｒｅ ４４／１４は、Ｃ８−Ｃ１８飽和脂肪酸とグリセロール、および約１５００の分子量を有するポリエチレングリコールのエステルの混合物であり、脂肪酸成分の組成の内訳は、カプリル酸を４−１０％重量、カプリン酸を３−９％重量、ラウリン酸を４０−５０％重量、ミリスチン酸を１４−２４％重量、パルミチン酸を４−１４％重量、およびステアリン酸を５−１５％重量である。
【００３６】
Ｇｅｌｕｃｉｒｅ製剤の好ましい例は、下記：
Ｇｅｌｕｃｉｒｅ （４４／１４）：４７ｇ
ミドスタウリン：３．０ｇ（６０ｍＬ ねじ切りフラスコ中に充填）
からなる。
【００３７】
組成物Ｃ：軟ゲルの例は、下記のマイクロエマルジョンを含み得る：
【表１】
2008511572.tif 000004
【００３８】
実施例２：
ＰＫＣ４１２は、慣用のＰＫＣ、ＦＬＴ３、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＫＩＴおよびＣＤＫ１−サイクリンＢ複合体のＡＴＰ結合部位に強く結合する。特に、ＰＫＣ４１２は、難治性ＣＥＬ患者においてＦＩＰＬ１−ＰＤＧＦＲＡのイマチニブ耐性Ｔ６７４Ｉ変異形態に対して十分な阻害活性を示すことが示された（例えば、Cools J., et al., Cancer Cell 2003；3：459−469を参照のこと。）。チロシンキナーゼの触媒部位は高度に保存されており、ＰＤＧＦＲＡのＴ６７４Ｉ変異は、それぞれ進行性ＢＣＲ−ＡＢＬ陽性ＣＭＬおよびＫＩＴ変異体ＧＩＳＴ患者における耐性変異である、ＡＢＬのＴ３１５Ｉ変異およびＫＩＴのＴ６７０Ｉ変異に対応する。イマチニブに反応しないＧＩＳＴの２６人の患者におけるイマチニブに対する耐性機序を調査し、再発性ＫＩＴ−Ｔ６７０Ｉまたは−Ｖ６５４Ａ、およびＰＤＧＦＲＡ−Ｄ８４２Ｖキナーゼドメイン変異によるこれらの患者のイマチニブに対する臨床的耐性を克服するためのＰＫＣ４１２の使用を検討する。
【００３９】
材料および方法
患者：Department of Oncology, University Hospital Leuvenにおいてイマチニブを用いて処置した２６人の患者からの進行性腫瘍を、評価した。平均年齢５３歳（３７歳から７７歳の範囲）の２０人の男性と６人の女性である。２６人の患者のうち２２人は、原発性腫瘍を手術により除去していた。化学療法および／または放射線療法を、イマチニブ処置前に、進行した疾患段階の１３人の患者に適用した。進行した腫瘍であるが、他の臨床状態は良好であった患者は、１日１０００ｍｇまで用量を増加することが可能であった。用量増加決定は、少なくとも４週間処置した患者からのデータに基づいて行った。病巣を、１月後、３月後、およびその後６月毎に再評価した。進行を、臨床検診およびＣＴ／ＰＥＴ画像に基づき、既報の基準に従い定義した（例えば、Van Oosterom AT et al., Lancet 2001；358：1421−1423を参照のこと。）。処置中の組織病理学的変化および分子的変化を、選択した同性の患者において一連の腫瘍生検法により評価する。
【００４０】
病理学：組織病理学的分析および免疫組織化学的分析を、パラフィン包埋組織にて行う。ＣＤ１１７に対するポリクローナル抗体（Ａ４５０２、１／２５０希釈、DAKO, Denmark）およびアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体を、抗原回復なしに用いる。
【００４１】
蛍光インサイチュウハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）：二色−間期ＦＩＳＨ分析を、イマチニブ処置前に得られた腫瘍生検標本（１８例）の４μｍのパラフィン包埋組織切片にて、またはイマチニブ耐性病変の新鮮な生検標本（全２６例）由来の少量の調製物にて行う。ＫＩＴ／４ｑ１２（ＲＰ１１−５６８Ａ２）またはＰＤＧＦＲＡ／４ｑ１２（ＲＰ１１−２４Ｏ１１）のジゴキシゲニンまたはビオチン標識ＢＡＣクローンを、既述の通り、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎまたはＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ標識した第４番染色体セントロメアプローブ（ＣＥＰ４、Vysis Inc., Downers Grove, IL, USA）をそれぞれ用いて共ハイブリダイズする（２１）。ＦＩＳＨデータを、冷却白黒電荷結合素子カメラ（Photometrics, Tuscon, AZ）を搭載したＬｅｉｃａ ＤＭＲＢ（Leica, Wetzlar, Germany）蛍光顕微鏡を、Ｑｕｉｐｓ ＳｍａｒｔＣａｐｔｕｒｅ(商標) ＦＩＳＨイメージングソフトウェア（Vysis, Bergisch−Gladbach, Germany）により実行して集める。１００個の間期核を評価し、そしてＫＩＴ／ＰＤＧＦＲＡのＣＥＰ４に対する比を、計算した。≧２の比を、特異的ＫＩＴ／ＰＤＧＦＲＡ増幅として定義する。
【００４２】
配列分析：ゲノムＤＮＡを、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲテンプレート精製キット（Roche, Mannheim, Germany）を用いて急速冷凍（snap−frozen）組織から抽出する。ＫＩＴのエクソン９、１１、１３、１４、１５および１７、ならびにＰＤＧＦＲＡのエクソン１２および１８を、既報のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する（例えば、Debiec−Rychter M et al., J Pathol 2004；202：430−438を参照のこと。）。そのＰＣＲ産物を、精製し（Microcon PCR, Millipore, MA, USA）、そしてＴｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ ＷＡＶＥ ＤＨＰＬＣシステムの高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ；Transgenomic, Inc., UK）により変異をスクリーニングした。異常な溶出プロフィールを示すサンプルを、再増幅し、配列決定した。
【００４３】
ウエスタンブロット：細胞溶解物の調製に十分な急速冷凍した腫瘍試料は、難治性ＧＩＳＴ１０人から入手可能であった。細胞溶解、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティングを、記載の通りに行った（２１）。膜（Amersham Pharmacia Biotechnology, UK）を、抗ホスホ−ＫＩＴ（Ｙ７０３）（Zymed, San Francisco, CA）抗体を１：５００希釈で一晩用いて免疫ブロットした。ＨＲＰ共役 抗ウサギＩｇＧを１：２５００希釈で用いて、増強した化学発光基質（Pierce）で可視化した。その後、膜を、全ＫＩＴタンパク質を認識する抗体（抗ＣＤ１１７、Ａ４５０２、DAKO, Glostrup, Denmark）を用いて全タンパク質レベルを決定するために、剥がして再ブロットした。
【００４４】
原発性耐性ＧＩＳＴ細胞応答分析：結晶化合物であるイマチニブメシレートおよびＰＫＣ４１２を、１００％ＤＭＳＯ（Sigma）中１０ｍＭで溶解し、アリコートを−８０℃で維持する。実験を、１０ｍＭ保存溶液の連続希釈液を用いて行う。対照は、溶媒（ＤＭＳＯ）希釈液を用いて行う。初代細胞を、コラゲナーゼでバラバラにした進行性腫瘍試料から入手し、１００ｍｍ細胞培養ディッシュ（Corning Inc., Corning, NY）中６０−７０％コンフルエンスで播き、１０％ウシ胎仔血清、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、および１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム添加ＤＭＥＭ中で３日間増殖させる。細胞を、イマチニブメシレート、ＰＫＣ４１２またはビヒクルのみのいずれかに９０分間暴露し、１０ｍｌの冷ＰＢＳで洗浄し、そして完全なプロテアーゼインヒビターカクテル錠（Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany）および０．２ｍＭ オルトバナジウム酸ナトリウム（Sigma, St. Louis, MO）を添加した、緩衝液［１％ ＮＰ４０、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ］中に溶解する。
【００４５】
コンストラクト：変異体ＰＤＧＦＲＡおよびＫＩＴ ｃＤＮＡを、進行性腫瘍から単離したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより入手する。そのｃＤＮＡを、レトロウイルスベクターｐＭＳＣＶ−ｐｕｒｏ（Clontech）中にクローン化する。
【００４６】
細胞培養：２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ中で増殖させる。Ｂａ／Ｆ３細胞を、１０％ＦＣＳおよびインターロイキン−３（１ｎｇ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０中で増殖させる。ウイルスの製造は既述の通りであり、例えば、Cools J, et al., N Engl J Med 2003；348：1201−1214を参照のこと。
【００４７】
異なるコンストラクトで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を、ピューロマイシン（２μｇ／ｍｌ）で選択する。因子非依存的増殖を試験するため、Ｂａ／Ｆ３細胞をＰＢＳで３回洗浄し、新しい培養をインターロイキン−３の不存在下で開始する。インターロイキン−３に非依存性となった細胞を、インターロイキン−３の不存在下で維持する。用量応答曲線について、Ｂａ／Ｆ３細胞を、２４ウェルプレート中、様々な濃度の阻害剤を用いて増殖させる。生存細胞の数を、開始時および２４時間後に、ＡｑｕｅｏｕｓＯｎｅ溶液（Promega）を用いて決定する。
【００４８】
結果：イマチニブを用いて処置した２６人の患者由来の進行性腫瘍を、評価する。診断から疾患の悪性が判明するまでの平均期間は、４８週（０から２６５週の範囲）であるが、診断からイマチニブ処置までの平均期間は、９１週（６から３０４週の範囲）である。１５人の患者（５７．６％）が部分寛解を達成し、１０人の患者（３８．４％）が、４８週（１６から２００週の範囲）のイベントフリー生存率の平均期間を有して、イマチニブ処置中の疾患の安定化を示した。
【００４９】
組織病理学：２５症例の原発性ＧＩＳＴは紡錘細胞腫瘍であることが示され、１症例は、混合形態を有していた。ＣＤ１１７抗原発現が、各原発性腫瘍において、および２６症例中２４症例（９２％）の進行性生検標本において証明される。２症例のイマチニブ耐性ＧＩＳＴは、その組織学的所見が紡錘型から類上皮型に転換し、かつその免疫表現型がＣＤ１１７陰性となる（データ表示せず）。
【００５０】
変異分析：Ｄ−ＨＰＬＣおよび直接配列決定の組み合わせは、２６症例中２５症例（９６．１％）のベースラインＧＩＳＴ生検におけるＫＩＴ変異を明らかにした（表１を参照のこと。）。１９の腫瘍が、エクソン１１の膜近傍変異を有し、６の腫瘍が、エクソン９変異を有していた。ＰＤＧＦＲＡ中に変異を有するか、またはＫＩＴ中に２個以上の変異を有する、前処置した腫瘍試料はなかった。１の腫瘍は、調べたエクソン中に、ＫＩＴまたはＰＤＧＦＲＡ配列変化を同定することができなかった。ＫＩＴキナーゼドメインの点変異は、イマチニブ処置前に腫瘍中に検出されないが、６個の異なる二次的ＫＩＴ変異が、治療の平均７７週（１６−１８８の範囲）後、進行時に１２／２６人（４８％）の患者において同定される。４人の患者はＶ６５４Ａを有しており、３人の患者はＴ６７０Ｉ置換を有していたが、残りの患者は、Ｄ７１６Ｎ、Ｄ８１６Ｇ、Ｄ８２０Ｙ、Ｄ８２０ＥまたはＮ８２２Ｋ変異を有していた。元々ＫＩＴ Ｇ５６５Ｒ変異を有する１人の患者は、この患者由来の原発性腫瘍において不検出のＰＤＧＦＲＡのＤ８４２Ｖ点変異を獲得していた。
【００５１】
ＦＩＳＨ分析：ＦＩＳＨ分析は、２６症例中２症例（７．７％）の進行性腫瘍におけるＫＩＴの増幅を明らかにする。２６人の患者由来の原発性非応答性腫瘍において、ＫＩＴ増幅は、ＰＤＧＦＲＡの刺激による増幅と関係がある（データ表示せず）。ＫＩＴまたはＰＤＧＦＲＡ変異は、処置前も疾患進行中もこの患者由来の腫瘍には見られない。１人の患者において、ＫＩＴ増幅（５倍まで）は、ＰＤＧＦＲＡの増加したコピー数と関係していない。この場合は、一次的ＫＩＴ変異を有するが、二次的変異は、進行中に同定されない。６個のイマチニブ耐性試料において、ＫＩＴ／ＰＤＧＦＲＡ／ＣＥＰ４座の欠失が間期ＦＩＳＨ分析により明らかにされる。３個の腫瘍において、このヘミ接合は、ベースライン腫瘍生検標本において既に観察されているが、３個の他の試料において、それは進行性病巣にのみ存在する。しかしながら、後者において、核毎のＫＩＴ／ＣＥＰ４シグナル数に著しい不均一性が見られる（０から４の範囲）。特に、１人の患者由来の進行性腫瘍生検標本の２３％の細胞は、ＫＩＴ／ＰＤＧＦＲＡ／ＣＥＰ４の両アレル欠失を示した。
【００５２】
耐性ＧＩＳＴにおけるＫＩＴ活性化：１０症例のイマチニブ耐性ＧＩＳＴにおけるＫＩＴ活性化を、ＫＩＴホスホチロシンＹ７０３および全ＫＩＴに対する抗体を用いるウエスタンブロッティングにより評価する。８個の試料は、ＫＩＴ発現および様々なレベルの構成的ＫＩＴ自己リン酸化を明示する。これら８個の腫瘍のうち４個は、二次的ＫＩＴ変異を有し、残り４個については、イマチニブ耐性腫瘍細胞におけるＫＩＴの再活性化の理由は不明である。２個の耐性転移性腫瘍は、ＫＩＴ発現を全体的に欠き、それは、免疫組織化学によりＣＤ１１７陽性の欠失、および１例にて観察されたＫＩＴ座の両アレルの欠失と一致する。
【００５３】
イマチニブおよびＰＫＣ４１２に対する耐性ＧＩＳＴのエクスビボ応答：ＫＩＴΔ５５７−５５８／Ｔ６７０ＩまたはＫＩＴ ＩｎｓＡＹ５０２−５０３／Ｖ６５４Ａ変異体イソ型を有する培養したイマチニブ耐性細胞におけるＫＩＴ Ｙ７０３残基の自己リン酸化に対するイマチニブおよびＰＫＣ４１２の効果を、ウエスタンブロットにより決定する。その結果を、ヘミ接合性ＫＩＴ Ｋ６４２Ｅ変異を有するＧＩＳＴ８８２細胞のものと比較する。観察を、抗ＫＩＴ抗体を用いて全ＫＩＴ発現について標準化する。ＫＩＴタンパク質は、耐性ＫＩＴΔ５５７−５５８／Ｔ６７０ＩおよびＫＩＴ Ｉｎｓ５０３ＡＹ／Ｖ６５４Ａ腫瘍、ならびにそれらのインビトロ培養細胞対応物の両方で発現され、顕著なレベルでリン酸化される。ＫＩＴの自己リン酸化は、どちらの初代細胞系もイマチニブ（５μＭまで）に暴露されることにより影響を受けない。対照的に、０．５μＭのＰＫＣ４１２は、変異体ＫＩＴΔ５５７−５５８／Ｔ６７０Ｉ細胞のＫＩＴ自己リン酸化を低減し、１μＭのＰＫＣ４１２は、全体的に阻害した。同様に、変異体ＫＩＴ Ｉｎｓ５０３ＡＹ／Ｖ６５４ＡのＫＩＴ自己リン酸化は、０．５μＭ濃度のＰＫＣ４１２で既に減少され、１０倍高濃度の薬剤で完全に阻害された。
【００５４】
インビトロでのＫＩＴおよびＰＤＧＦＲＡ変異に対するイマチニブおよびＰＫＣ４１２の影響：ＫＩＴΔ５５７−５５８／Ｔ６７０Ｉ、ＰＤＧＦＲＡ ΔＤＩＭ８４２−８４４およびＤ８４２Ｖの変異形態を、Ｂａ／Ｆ３マウス細胞中で発現させる。Ｂａ／Ｆ３細胞は、その増殖をＩＬ３に依存するが、ＦＩＰ１Ｌ１−ＰＤＧＦＲＡおよびＢＣＲ−ＡＢＬのような多くの活性化キナーゼの発現によりＩＬ３に非依存性となる。Ｂａ／Ｆ３細胞中に導入された変異体ＫＩＴおよびＰＤＧＦＲＡタンパク質も、因子非依存的増殖を供し、構成的にリン酸化され、これらが活性化キナーゼであることが確認される（データ表示せず）。用量応答曲線およびイマチニブを用いるＫＩＴΔ５５７−５５８／Ｔ６７０Ｉのリン酸化状態の分析は、１０μＭのイマチニブで完全に阻害されないリン酸化を有し、イマチニブに対する耐性を確認した（細胞のＩＣ５０〜５μＭ）。ＰＤＧＦＲＡ Ｄ８２４Ｖ変異体もイマチニブに対する耐性を示すが、その程度はより小さい（細胞のＩＣ５０〜１μＭ）。ＰＤＧＦＲＡΔＤＩＭ８４２−８４４変異体は、この実験において対照となる。〜２００ｎＭの最高細胞性ＩＣ５０値を有するＰＤＧＦＲＡ Ｄ８４２Ｖを有する３変異体は全て、１μＭより低い濃度でＰＫＣ４１２により阻害される（図１）。
【００５５】
予備的研究は、イマチニブ耐性の２つのカテゴリー：ＫＩＴ依存性またはＫＩＴ非依存性機序を記載した（１５）。結果を基に、本発明者らは、ＫＩＴの再活性化が、耐性機序に最も重要であるという結論を出した。ＫＩＴは、イマチニブ処置中のウエスタンブロットにより分析することができた１０症例中８症例の進行性腫瘍でリン酸化（活性化）されていることが判明した。これらの症例の５０％において、ＫＩＴの再活性化は、二次的耐性変異の結果であるが、その他の５０％の症例において再活性化の原因は不明である。これらの試料全体におけるＫＩＴの配列決定は、タンパク質をイマチニブ処置に非感受性にするＫＩＴの予期せぬ領域における新規の変異を同定するかもしれない。あるいは、細胞間薬剤輸送または除去に影響を与える因子は、受容体の阻害には不十分という結果であり、結果として疾患が進行するだろう。
【００５６】
本発明者らの研究の２６人の患者において、獲得された二次的ＫＩＴ変異は、イマチニブに対する耐性を説明する最もよく起こる事象である（症例の４８％）。６つの異なる二次的ＫＩＴ変異が、進行性腫瘍において同定される。全て、単一アミノ酸置換であり、かつ全て、ベースラインの、非処置腫瘍で同定される活性化ＫＩＴ変異に加えて存在する。本発明者らの知識によれば、単一症例に存在する２つの再発性ＫＩＴ変異、Ｖ６５４ＡおよびＴ６７０Ｉ、および他の３つ、Ｄ７１６Ｎ、Ｄ８２０ＥおよびＤ８１６Ｇは、原発性ＧＩＳＴでは未だ報告されてない。このことは、これらの変異と薬剤に対する耐性の発生が密接に関係することを支持する。Ｄ８２０ＹおよびＮ８２２Ｋ変異は、イマチニブ非処置ＧＩＳＴにおいて既報である。活性化ループ変異、例えば、Ｄ８１６Ｇ、Ｄ８２０Ｅ／Ｙ、Ｎ８２２Ｋは、イマチニブに対する耐性も直接与えるＫＩＴの活性化変異であることが多い。全身性肥満細胞症を有する患者および精上皮腫の一部の患者におけるＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ変異は、イマチニブに対する一次的耐性と関係がある。
【００５７】
一次的ＫＩＴ Ｇ５６５Ｒ変異を有する１つの腫瘍は、二次的ＰＤＧＦＲＡ Ｄ８４２Ｖ変異を介してイマチニブに対する耐性を獲得する。Ｄ８４２Ｖ変異は、ＧＩＳＴで最も一般的な活性化ＰＤＧＦＲＡ変異であり、イマチニブ耐性であることも証明されている。この変異は、イマチニブに対する減少した感受性を示す活性化変異である。イマチニブに対する耐性が、異なるキナーゼ、例えばＰＤＧＦＲＡの変異を介して起こり得るという観察は、これまでに記載されていない耐性の機序を同定する。一般的に、小分子の阻害剤に対して感受性の活性化キナーゼに依存する腫瘍の耐性は、この阻害剤に感受性でない異なるキナーゼの活性化変異により起こり得る。耐性のこの機序が、ＧＩＳＴおよび他の腫瘍および白血病でより頻繁に作動するかどうか、また本発明者らがＫＩＴの二次的ゲノム変化を同定することができない、本発明者らの症例における耐性の原因であるかどうかは、決定されていない。
【００５８】
この実験の２つの症例において、イマチニブ耐性は、ＫＩＴまたはＫＩＴ／ＰＤＧＦＲＡ遺伝子の増幅と関係する。後者において、重度の進行性腫瘍増殖を有する患者は、イマチニブに対する一次的耐性を示し、その結果、イマチニブ投与の開始から５週間で死亡した。この患者の疾患の悪性段階は１年以上続き、患者は、イマチニブでの処置前に高用量化学療法および放射線療法で前もって処置されたため、増幅は、イマチニブ投与前に腫瘍細胞に既に存在しており、薬剤の存在にてさらに選択された可能性が高かった。この発見は、ＫＩＴ増幅が、一次的耐性の原因であり得ることを示し、疾患進行と関係するクローン多様性の発展を増加し得る、ＧＩＳＴ患者において、薬剤に対する応答に影響を与える遺伝子変化の発生可能性を有する古典的化学療法剤の使用に警告する。
【００５９】
２個の進行性腫瘍は、耐性のＫＩＴ非依存性機序を示すＫＩＴ発現を完全に欠失する。間期ＦＩＳＨ分析は、これらの腫瘍の１つにおける標的とするＫＩＴ／ＰＤＧＦＲＡ遺伝子の両アレルの欠失を有し、さらに受容体依存を逃れる細胞の選択的増殖を明らかにした。ＫＩＴ／ＰＤＧＦＲＡヘミ接合へのシフトは、二次的ＫＩＴ変異の出現と関係する、イマチニブに対する耐性時の２個の腫瘍において観察される。ヘミ接合性／ホモ接合性が、イマチニブに対する再発性変異の非感受性を増加するかどうかは不明瞭であり、さらなる研究を必要とする。
【００６０】
進行時に腫瘍細胞に一般的に存在するＫＩＴ Ｖ６５４ＡおよびＴ６７０Ｉ変異のイマチニブ感受性を定義することを目的として、これらの変異を有する細胞におけるリガンド非依存性ＫＩＴリン酸化に対するイマチニブの阻害効果を、エクスビボ分析を用いて試験する。どちらの場合も、ＫＩＴ自己リン酸化は、インビボで達成され得るイマチニブのおよそ最大レベルである５μＭ程度の高濃度のイマチニブで阻害されない。ＰＫＣ４１２（別の、ＫＩＴおよびＰＤＧＦＲ阻害剤）は、薬剤の治療的使用を正当化する濃度で両方の変異体に対し阻害効果を生じた。イマチニブおよびＰＫＣ４１２に対するＫＩＴ Ｔ６７０Ｉ変異体の異なる感受性は、形質転換したＢａ／Ｆ３マウス細胞を用いてインビトロでさらに確認される。ＰＫＣ４１２に対する他のイマチニブ耐性変異の感受性をさらに調査するために、イマチニブ耐性ＰＤＧＦＲＡ Ｄ８４２Ｖ変異体で形質転換されたＢａ／Ｆ３細胞を試験する。ＰＫＣ４１２は、１μＭ濃度でＰＤＧＦＲＡ Ｄ８４２Ｖ変異体を効果的に阻害し、さらに異なるイマチニブ耐性変異体イソ型を有する腫瘍の阻害のために薬剤のインビトロ有効性を増強する。ＧＩＳＴ患者におけるイマチニブ耐性のＫＩＴ依存性および非依存性機序の存在が確認され、新規イマチニブ耐性ＫＩＴ変異体イソ型が明らかになる。それは、ＫＩＴ陽性腫瘍における二次的耐性の原因としてイマチニブ耐性ＰＤＧＦＲＡ変異の獲得を示し、薬剤に対する二次的耐性のみでなく、一次的耐性についても考えられる説明としてＫＩＴ増幅を示す。ＫＩＴ Ｔ６７０ＩおよびＶ６５４Ａ、ならびにＰＤＧＦＲＡ Ｄ６８４２Ｖ変異体のＰＫＣ４２１に対する感受性が、明らかとなる。個々のキナーゼドメイン変異が、選択的キナーゼ阻害剤に対して異なる感受性を示すならば、テーラー二次治療（tailor second-line therapy）を正確に耐性の機序に合わせることが重要である。
【００６１】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１、パネルＢは、ＫＩＴΔＷＫ５５７−５５８／Ｔ６７０Ｉ、ＰＤＧＦＲＡ Ｄ８４２ＶまたはΔＤＩＭ８４２−８４４変異体を発現するＢａ／Ｆ３細胞の、イマチニブまたはＰＫＣ４１２に対する用量応答曲線を示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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