(57)【要約】  参照生物と比較してより成長が早い及び/又は収量が増加した非ヒト生物の作製方法であって、該生物又はその一以上の部分で配列番号2、107、125、129又は137の活性を参照生物に比較して増加させることを含む、上記方法。
2008507960.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
参照生物に比較して成長が早くかつ/又は収量が増加した非ヒト生物を作製する方法であって、該生物又はその1以上の部分において、配列番号2、107、125、129又は137の活性を参照生物に比較して増加させることを含む、上記方法。
【請求項２】
成長及び収量を増加させるタンパク質が、20以下のアミノ酸位置がXで置換され得る及び/又は20以下のアミノ酸がその配列中に挿入される配列番号2、107、125、129又は137に示される配列を含むか、あるいは、10以下のアミノ酸位置がXで置換され得る及び/又は10以下のアミノ酸がその配列中に挿入される配列番号4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、99、101、103、105又は配列番号109、111、113、115、117、119、121、133又は135に示される配列を含むポリペプチドによりコードされる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドの活性を、以下よりなる群から選択される核酸分子を含む核酸分子によってコードされる前記生物中の少なくとも1つのポリペプチド又はその一部分の活性を増加することによって、増加する、請求項1に記載の方法。
(aa)成長又は収量を増加させるポリペプチドをコードするか、又は少なくとも配列番号2、107、125、129又は137で表されるポリペプチドの成熟形態をコードする、核酸分子；
(bb)少なくとも配列番号1、106、124、128又は136に記載のコード配列の成熟ポリヌクレオチドを含む核酸分子；
(cc)その配列が、(aa)又は(bb)に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチド配列から、遺伝子コードの縮重によって誘導できる核酸分子；
(dd)その配列が(aa)〜(cc)に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも20％同一であるポリペプチドをコードする核酸分子；
(ee)(aa)〜(dd)に記載の核酸分子によってコードされる配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドから、(aa)〜(dd)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列の1以上のアミノ酸の置換、欠失及び/又は付加によって誘導されるポリペプチドをコードする核酸分子；
(ff)(aa)〜(ee)に記載の核酸分子のいずれかによってコードされる、配列番号2、107、125、129、137のポリペプチドの断片又はエピトープをコードする核酸分子；
(gg)配列番号96及び97、122及び123、126及び127、130及び131、138及び139、あるいはその組合せのプライマーを用いたcDNAバンク又はゲノムバンクの増幅によって取得される核酸分子配列を含むポリヌクレオチドを含む核酸分子；
(hh)(aa)〜(gg)に記載の核酸分子のいずれかによってコードされるポリペプチドに対するモノクローナル抗体を用いて単離される、配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドをコードする核酸分子；
(ii)(aa)〜(hh)に記載の配列のいずれかを含むプローブ、あるいは(aa)〜(hh)で特徴付けられる核酸の、少なくとも15nt、好ましくは20nt、30nt、50nt、100nt、200nt又は500ntの断片を用いて、ストリンジェントな条件下で適当なライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつ配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドをコードする、核酸分子；並びに
(jj)図1及び/又は図2に記載されかつ参照生物に比較した成長の早さ及び/又は収量の増加に寄与するコンセンサス配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
あるいはそれらの相補配列を含む核酸分子。
【請求項４】
活性を、
(a)配列番号2、107、125、129又は137のタンパク質の発現を増加させる；
(b)配列番号2、107、125、129若しくは137のRNA、又は配列番号2、107、125、129若しくは137のタンパク質の安定性を増加させる；
(c)配列番号2、107、125、129又は137のタンパク質の比活性を増加させる；
(d)配列番号2、107、125、129又は137の内因的遺伝子機能の発現を増加できる同種又は人工転写因子を発現させる；あるいは
(e)配列番号2、107、125、129若しくは137の活性、又は食物若しくは培地への配列番号1、106、124、128若しくは136の発現、を増加又は誘導する外因的因子を添加する、
ことによって増加する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
前記生物が微生物、又は好ましくは植物である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドの活性を、以下よりなる群から選択される核酸分子によってコードされる、配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、前記生物、好ましくは植物、又はその1以上の部分に導入することによって増加する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
(a)配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドをコードする核酸分子；
(b)少なくとも配列番号1、106、124、128又は136に記載のコード配列の成熟ポリヌクレオチドを含む核酸分子；
(c)その配列が、(a)又は(b)に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチド配列から、遺伝子コードの縮重によって誘導できる核酸分子；
(d)その配列が(a)〜(c)に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも20％同一であるポリペプチドをコードする核酸分子；
(e)(a)〜(d)に記載の核酸分子によってコードされる配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドから、(a)〜(d)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列の1以上のアミノ酸の置換、欠失及び/又は付加によって誘導されるポリペプチドをコードする核酸分子；
(f)(a)〜(e)に記載の核酸分子のいずれかによってコードされる、配列番号2、107、125、129、137のポリペプチドの断片又はエピトープをコードする核酸分子；
(g)配列番号96及び97、122及び123、126及び127、130及び131、並びに/又は138及び139、あるいはその組合せのプライマーを用いたcDNAバンク又はゲノムバンクの増幅によって取得される核酸分子の配列を含むポリヌクレオチドを含む核酸分子；
(h)(a)〜(g)に記載の核酸分子のいずれかによってコードされるポリペプチドに対するモノクローナル抗体を用いて単離される、配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドをコードする核酸分子；
(i)(a)〜(h)に記載の配列のいずれかを含むプローブ、あるいは(a)〜(h)で特徴付けられる核酸の、少なくとも15nt、好ましくは20nt、30nt、50nt、100nt、200nt又は500ntの断片を用いて、ストリンジェントな条件下で適当なライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつ配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドをコードする、核酸分子；並びに
(j)20以下のアミノ酸位置がXで置換され得る及び/又は20以下のアミノ酸がその配列中に挿入される配列番号2、107、125、129又は137に示される配列を含むか、あるいは10以下のアミノ酸位置がXで置換され得る及び/又は10以下のアミノ酸がその配列に挿入されるか若しくはその配列から欠失した配列番号4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、99、101、103、105又は配列番号109、111、113、115、117、119、121、133若しくは135で示される配列を含む、成長又は収量を増加させるポリペプチドをコードする、核酸分子；
あるいはそれらの相補配列を含む核酸分子。
【請求項７】
内因的な配列番号2、107、125、129若しくは137のポリペプチド又は活性をコードするポリヌクレオチドが、配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドの発現の増加を生じる調節配列と機能的に連結している、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
収量又はバイオマスを増加させる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
以下よりなる群から選択される核酸分子を含む、成長又は収量を増加させるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
(a)配列番号2、107、125、129若しくは137で表されるポリペプチドの成熟形態を少なくともコードする、又は配列番号1、106、124、128若しくは136で表されるポリヌクレオチドの成熟形態を少なくとも含む、核酸分子；
(b)その配列が(a)に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチド配列から、遺伝子コードの縮重によって誘導できる核酸分子；
(c)その配列が配列番号1、106、124、128若しくは136で表される配列又は配列番号1、106、124、128若しくは136で表される配列を含む配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも30％同一である配列番号2、107、125、129若しくは137のポリペプチドをコードする、核酸分子；
(d)核酸分子(a)〜(c)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列の1以上のアミノ酸の置換、欠失及び/又は付加によって、(a)〜(c)に記載のポリヌクレオチドによってコードされる配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドから誘導されるポリペプチドをコードする核酸分子； 
(e)(a)〜(d)に記載の核酸分子のいずれかによってコードされる配列番号2、107、125、129若しくは137のポリペプチドの断片又はエピトープをコードする核酸分子；
(f)配列番号96及び97、122及び123、126及び127、130及び131若しくは138及び139又はその組合せのプライマーを用いたcDNAバンク又はゲノムバンクの増幅により取得される核酸分子配列を含むポリヌクレオチドを含む核酸分子；
(g)(a)〜(f)に記載の核酸分子のいずれかによってコードされるポリペプチドに対するモノクローナル抗体を用いて単離された、配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドをコードする核酸分子；
(h)(a)〜(g)に記載の配列のいずれかを含むプローブを用いて、ストリンジェントな条件下で適当なライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつ配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドをコードする、核酸分子；
(i)20以下のアミノ酸位置がXで置換され得る及び/又は20以下のアミノ酸がその配列中に挿入される配列番号2、107、125、129若しくは137に示される配列、あるいは10以下のアミノ酸位置がXで置換され得る及び/又は10以下のアミノ酸がその配列中に挿入される配列番号4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、99、101、103、105又は配列番号109、111、113、115、117、119、121、133若しくは135に示される配列、を含む成長又は収量を増加させるポリペプチドをコードする核酸分子；
あるいはそれらの相補鎖であって、(a)〜(h)に記載の前記ポリヌクレオチド又は前記核酸分子は、配列番号2、107、125、129若しくは137で表される配列又はその相補配列を含まない、上記相補鎖。
【請求項１０】
DNA又はRNAである請求項9に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項9又は10に記載のポリヌクレオチドをベクターに挿入することを含む、ベクターの作製方法。
【請求項１２】
請求項9若しくは10に記載のポリヌクレオチドを含むか、又は請求項11に記載されるように作製されたベクター。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドが原核又は真核宿主中での発現を可能にする調節配列と機能的に連結されている、請求項12に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項12若しくは13に記載のベクター又は請求項9若しくは10に記載のポリヌクレオチドで安定的に又は一過的に形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１５】
細菌細胞又は真核細胞、好ましくは単細胞微生物又は植物細胞である、請求項14に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
請求項9又は10に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含むか、あるいは20以下のアミノ酸位置がXで置換され得る及び/若しくは20以下のアミノ酸がその配列中に挿入される配列番号2、107、125、129若しくは137に示される配列、又は10以下のアミノ酸位置がXで置換され得る及び/若しくは10以下のアミノ酸がその配列中に挿入される若しくはその配列から欠失する配列番号4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、99、101、103、105又は配列番号109、111、113、115、117、119、121、133若しくは135に示される配列を含む、成長又は収量を増加させるポリペプチドを含む、ポリペプチド。
【請求項１７】
請求項16に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１８】
請求項9又は10に記載のポリヌクレオチドの相補配列を含む、アンチセンス核酸。
【請求項１９】
トランスジェニック植物、植物細胞、植物組織、有用動物細胞、有用動物又はトランスジェニック微生物を作製する方法であって、そのゲノム中に請求項9若しくは10に記載のポリヌクレオチド又は請求項12若しくは13に記載のベクターを導入することを含む、上記方法。
【請求項２０】
請求項9若しくは10に記載のポリヌクレオチド又は請求項12若しくは13に記載のベクターを含む、非ヒト生物、特に動物細胞、植物細胞又は微生物。
【請求項２１】
請求項20に記載の植物細胞を含む、配列番号2、107、125、129若しくは137の活性又はタンパク質量が増加した非ヒト動物、特に植物組織又は植物。
【請求項２２】
配列番号2、107、125、129若しくは137のタンパク質又は活性の量が増加したトランスジェニック微生物。
【請求項２３】
請求項20に記載の有用動物細胞を含む、配列番号2、107、125、129又は137のタンパク質又は活性量が増加した、非ヒト生物、特に有用動物又は動物器官。
【請求項２４】
請求項9若しくは10に記載のポリヌクレオチド又は請求項20に記載の植物細胞を含む、請求項21に記載の植物の種子、塊茎又は繁殖材料(propagation material)。
【請求項２５】
請求項16に記載のポリペプチド、請求項20に記載の細胞、又は請求項9若しくは10に記載のポリヌクレオチドを含む、請求項22に記載の微生物のバイオマス。
【請求項２６】
配列番号1、106、124、128又は136の核酸配列のいずれかを(過剰)発現する植物細胞、植物細胞の細胞小器官、植物組織、植物又はその一部分であって、乾燥重量が、最も早い寄託日が2005年の6月2日以前であるドイツ国植物遺伝学・作物研究所(IPK)(Corrensstrasse 3, D-06466 Gatersleben, Germany)に寄託されている品種と比較して、1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、又は50％以上増加しており、その際、植物細胞、植物細胞の細胞小器官、植物組織、植物又はその一部分の乾燥重量が、植物細胞、植物細胞の細胞小器官、植物組織、植物又はその一部分の、植物細胞、植物細胞の細胞小器官、植物組織、植物又は一部分に含まれる水分量を差し引いた有機材料の重量を意味する、上記植物細胞、植物細胞の細胞小器官、植物組織、植物又はその一部分。
【請求項２７】
配列番号1、106、124、128又は136の核酸配列のいずれかを(過剰)発現する植物細胞、植物細胞の細胞小器官、植物組織、植物又はその一部分であって、乾燥重量が以下よりなる群から選択される品種の乾燥重量と比較して1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、又は50％以上増加しており、その際、乾燥重量が植物細胞、植物細胞の細胞小器官、植物組織、植物又はその一部分の、植物細胞、植物細胞の細胞小器官、植物組織、植物又はその一部分に含まれる水分量を差し引いた有機材料の重量を指す、上記植物細胞、植物細胞の細胞小器官、植物組織、植物又はその一部分。
(a)G.ヒルスツム（G. hirsutum）IPK登録番号GOS 6 (D 120)、GOS 7 (ST 446)、GOS 10 (D 1635)、GOS 17 (D 4302)若しくはGOS 21 (D 5553)、G.アレイシアナム(G. areysianum)Deflers、G.インカヌム(G. incanum)(Schwartz) Hillc.、G.ライモンディ(G. raimondii)Ulbr.、G.ストックシイ(G. stocksii)Masters、G.チュルベリ(G. thurberi Tod.)、G.トメントスム(G. tomentosum)Nutt.、G.トリフィルム(G. triphyllum)Hochr.、ゴシッピウム・アルボレウム(Gossypium arboreum)IPK登録番号GOS 13 (D 1634)、GOS 16 (D 4240)、GOS 18 (D 4505)、GOS 19 (D 4506)、GOS 20 (D 4750)、若しくはGOS 12 (D 1329)、ゴシッピウム・バルバデンセ(Gossypium barbadense)、又はゴシッピウム・ヘルバセウム(Gossypium herbaceum);
(b)ブラッシカ・ナプス(Brassica napus)のMika品種、ブラッシカ・ナプスのDigger品種、ブラッシカ・ナプスのArtus品種、ブラッシカ・ナプスのTerra品種、ブラッシカ・ナプスのSmart品種, ブラッシカ・ナプスのOlivine品種、ブラッシカ・ナプスのLibretto品種、ブラッシカ・ナプスのWotan品種、ブラッシカ・ナプスのPanther品種、ブラッシカ・ナプスのExpress品種、ブラッシカ・ナプスのOase品種、ブラッシカ・ナプスのElan品種、ブラッシカ・ナプスのAbility品種、ブラッシカ・ナプスのMohican品種;
(c)リヌム・ウシタティッシムム(Linum usitatissimum)のLibrina品種、リヌム・ウシタティッシムムのFlanders品種、リヌム・ウシタティッシムムのScorpion品種、リヌム・ウシタティッシムムのLivia品種、リヌム・ウシタティッシムムのLola品種、リヌム・ウシタティッシムムのTaurus品種、リヌム・ウシタティッシムムのGolda品種、リヌム・ウシタティッシムムのLirima品種;
(d) ジー・メイス(Zea mays)のArticat品種、ジー・メイスのNK Dilitop品種、ジー・メイスのTotal品種、ジー・メイスのOldham品種、ジー・メイスのAdenzo品種、ジー・メイスのNK Lugan品種、ジー・メイスのLiberal品種、ジー・メイスのPeso品種;
(e)グリシン・マックス(Glycine max)のOligata品種、グリシン・マックスのLotus品種、グリシン・マックスのPrimus品種、グリシン・マックスのAlma Ata品種、グリシン・マックスのOAC Vision品種、グリシン・マックスのJutro品種;
(f)ヘリアンサス・アヌウス(Helianthus annus)のHelena品種、ヘリアンサス・アヌウスのFlavia品種、ヘリアンサス・アヌウスのRigasol品種、ヘリアンサス・アヌウスのFlores品種、ヘリアンサス・アヌウスのJazzy品種、ヘリアンサス・アヌウスのPegaso品種、ヘリアンサス・アヌウスのHeliaroc品種、ヘリアンサス・アヌウス のSalut RM品種;
(g)カメリナ・サティバ(Camelina sativa)のDolly品種、カメリナ・サティバのSonny品種、カメリナ・サティバのLigena品種、カメリナ・サティバのCalinka品種;
(h)シナピス・アルバ(Sinapis alba)のMartigena品種、シナピス・アルバのSilenda品種、シナピス・アルバのSirola品種、シナピス・アルバのSito品種、シナピス・アルバのSemper品種、シナピス・アルバのSeco品種;
(i)カーサムス・チンクトリウス(Carthamus tinctorius)のSabina品種、カーサムス・チンクトリウスのHUS-305品種、カーサムス・チンクトリウスのlandrace品種、カーサムス・チンクトリウスのThori-78品種、カーサムス・チンクトリウスのCR-34品種、カーサムス・チンクトリウスのCR-81品種;
(j)ブラッシカ・ユンセア(Brassica juncea)のVittasso品種、ブラッシカ・ユンセアのMuscon M-973品種、ブラッシカ・ユンセアのRAPD品種、ブラッシカ・ユンセアのCo.J.86品種、ブラッシカ・ユンセアのIAC 1-2品種、ブラッシカ・ユンセアのPacific Gold品種;
(k)ココス・ヌシフェラL(Cocos nucifera L.)のMaypan品種、Ceylon Tall品種、Indian Tall品種、Jamaica Tall品種、Malayan Tall品種、Java Tall品種、Laguna品種、KingCRIC 60品種、CRIC 65品種、CRISL 98品種、Moorock tall品種、Plus palm tall品種、San Ramon品種、Typica品種、Nana品種又はAurantiaca品種;
(l)トリティカム・エスチバムL（Triticum aestivum L.）のAltos品種（Bundessortenamtファイル番号2646）、トリティカム・エスチバム L.のBussard品種（Bundessortenamtファイル番号1641）、又はトリティカム・エスチバム L.のCentrum品種（Bundessortenamtファイル番号2710）;
(m)ベータ・ブルガリス(Beta vulgaris)のDieck 13品種（CPVOファイル番号19991828）、ベータ・ブルガリスのFD 007品種（CPCOファイル番号20000506）又はベータ・ブルガリスのHI 0169品種(CPVOファイル番号20010315);
(n)ホルデウム・ブルガレ(Hordeum vulgare)のDorothea品種(CPVOファイル番号20031457)、ホルデウム・ブルガレのColibri品種(CPVOファイル番号20040122)、ホルデウム・ブルガレのBrazil品種(CPVOファイル番号20010274)又はホルデウム・ブルガレのChristina品種(CPVOファイル番号20030277);
(o)セカレ・セレアレ(Secale cereale)のEsprit品種(CPVOファイル番号19950246)、セカレ・セレアレのResonanz品種(CPVOファイル番号20040651)又はセカレ・セレアレのUrsus品種(CPVOファイル番号19970714);
(p)オリザ・サティバ(Oryza sativa)のGemini品種(CPVOファイル番号20010284)、オリザ・サティバのTanaro品種(CPVOファイル番号20020177)又はオリザ・サティバのZeus品種(CPVOファイル番号19980388);
(q)ソラヌム・チュベロスムL（Solanum tuberosum L.）のLinda品種、Nicola品種、Solara品種、Agria品種、Sieglinde品種又はRusset Burbank品種;
(r)アラチス・ヒポガエア(Arachis hypogaea)の亜種ファスティジアタ(fastigiata)のValencia栽培品種;
(s)アラチス・ヒポガエア(Arachis hypogaea)の亜種ヒポガエア(hypogaea)の栽培品種Virginiaの「Holland Jumbo」品種、「Virginia A23-7」品種、又は「Florida 416」品種;
(t)アラチス・ヒポガエア(Arachis hypogaea)の亜種ヒルスタ(hirsuta)の栽培品種Peruvian runnerの「Southeastern Runner 56-15」品種、「Dixie Runner」品種、又は「Early Runner」品種;
(u)アラチス・ヒポガエア(Arachis hypogaea)の亜種ブルガリス(vulgaris)の栽培品種Spanishの「Dixie Spanish」品種、「Improved Spanish 2B」品種又は「GFA Spanish」品種。
【請求項２８】
配列番号2、107、125、129又は137の活性が増加した細胞、組織又は非ヒト生物を準備すること、及び該細胞、組織又は生物を、該細胞、組織又は生物中での所望の精製化学物質の産生を可能にする条件下で培養することを含む、精製化学物質の製造方法。
【請求項２９】
出発生物と比較して非ヒト生物の収量を増加する及び/又は成長を増加するための、請求項8又は9に記載の配列番号2、107、125、129若しくは137のポリペプチド、又は請求項16に記載のポリペプチドの使用。
【請求項３０】
参照生物と比較して請求項16に記載のポリペプチドの活性が増加しており、かつ参照生物と比較して非生物的又は生物的ストレスに対する耐性が増加した非ヒト生物。
【請求項３１】
以下のステップを含む、成長及び/又は収量の増加に寄与する遺伝子産物の同定方法。
(a)発現後に成長及び/又は収量の増加に寄与する遺伝子産物をコードする候補遺伝子を含み得るサンプルの核酸分子を、請求項9に記載の核酸分子と接触させること；
(b)緩いストリンジェント条件下で請求項9に記載の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子を同定すること；
(c)成長及び/又は収量の増加を測定するのに適当な宿主細胞に候補核酸分子を導入すること；
(d)同定した核酸分子を宿主細胞内で発現させること；
(e)成長及び/又は収量の増加を宿主細胞中でアッセイし；かつその発現が発現後に野生型と比較して宿主細胞における成育及び/又は収量の増加に寄与する、核酸分子及びその遺伝子産物を同定すること。
【請求項３２】
以下のステップを含む、成長及び/又は収量の増加に寄与する遺伝子産物の同定方法。
(a)発現後に生物又はその一部分に対する成長及び/又は収量の増加に寄与する遺伝子産物をコードする候補遺伝子を含み得る、かつ請求項9に記載の核酸分子と少なくとも30％同一である、生物の核酸分子をデータバンク中で同定すること；
(b)成長及び/又は収量の増加をモニタリングするのに適当な宿主細胞中に候補核酸分子を導入すること；
(c)同定した核酸分子を宿主細胞内で発現させること；
(d)宿主生物内で成長及び/又は収量レベルの増加をアッセイすること；並びに
(e)その発現が発現後に野生型と比較して宿主生物における成長及び/又は収量の増加に寄与する、核酸分子及びその遺伝子産物を同定すること。
【請求項３３】
成長及び/又は収量の増加に寄与する核酸分子を同定するための、請求項9に記載の核酸分子の使用。
【請求項３４】
マッピング及び育種プロセスにおいて、より成長が早い及び/又は収量が増加した植物品種を同定するための、請求項9に記載の核酸分子の使用。
【請求項３５】
植物中での配列番号2、107、125、129又は137の活性を阻害する除草剤に対して耐性である除草剤耐性植物の作製のための、請求項9に記載の核酸分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、参照生物と比較して、より成長が早いかつ/又はより収量が高い非ヒト生物の作製方法に関し、該方法は、該非ヒト生物又はその1以上の部分で、例えば、配列番号1、106、124、128若しくは136のRNA及び/又は配列番号2、107、125、129若しくは137のポリペプチドの量の増加に基づいて、有利には配列番号1、106、124、128又は136の発現の増加に基づいて、配列番号2、107、125、129又は137の活性を該参照生物と比較して増加させることを含む。別の実施形態では、本発明はより早く成長する又はより高い収量を生じる植物、微生物又は有用動物を作製する方法であって、該生物中で配列番号2、107、125、129又は137の活性を増加させることを含む前記方法、配列番号2、107、125、129又は137の活性が増加した植物、微生物及び有用動物、その産出物並びにバイオマスに関する。さらに、本発明はまた、配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、これにより形質転換された細胞、植物、微生物及び有用動物、並びに本発明の前記実施形態を使用することによる精製化学物質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有用植物が最初に栽培されて以降、非生物的及び生物的ストレスに対する耐性を改善することに加えて、新しい植物品種を成長させる際に、作物の収量を増加させることが最も重要な目標となってきた。いくつか例を挙げると、耕起栽培(tilling)、施肥、灌漑、栽培、作物保護剤等の多様な手段が収量の改善に使用される。したがって、例えば結実を増加させることによる、作物の増加における栽培の成功と、例えば悪天候（すなわち過乾燥、過湿、過温又は過冷であるかどうか）による、あるいは害虫（例えば、昆虫、真菌又は細菌等）の横行に起因する、作物の欠失の低減における栽培の成功とが、互いに補足し合う。急速に増加する世界人口に照らして、経済的に耕作可能な面積を拡張することなく収量を実質的に増加させることは、十分な食物を提供すると同時に、他の既存の自然空間を保護するために絶対に必要である。
【０００３】
収量が改善した新規品種を開発するための伝統的な遺伝学及び栽培方法は、遺伝学的方法によって一層補われる。したがって、特定の性質(非生物学的若しくは生物学的ストレスに対する耐性又は成長速度の制御等)の原因となる遺伝子が同定されてきた。目的の遺伝子又はその遺伝子産物が、望まれる有用植物で、例えば突然変異、かかる遺伝子又はその産物の(過剰)発現又は低減/阻害によって適切に調節されて、所望の収量の増加又はストレスに対する高い耐性を獲得し得る。
【０００４】
これは微生物又は有用動物にも同様に適用され、その育種(breeding)は同様に、生物学的又は非生物学的ストレスに対する高耐性に加えて、特定のバイオマス又は特定の重量をより迅速に獲得することに主にかつ特に関係している。
【０００５】
改善した又はより急速な植物の成長を調節する戦略の一例は、植物の光合成能力を増加させることである(US 6,239,332及びDE 19940270)。しかし、この取り組みはかかる植物の光合成効率が成長制限である場合のみを見込んでいる。別の取り組みは、細胞周期制御に影響を与えることによって植物の成長の調節をモジュレートすることである(WO 01/31041, CA 2263067, WO 00/56905, WO 00/37645)。しかし、植物構造の変化は、植物の成長の制御における所望でない副作用による大規模な干渉であり得る(WO 01/31041; CA 2263067)。他の取り組みは、例えばWO 02/079403又はUS 2003/013228で特許請求されているように、推定の転写調節因子に関係し得る。かかる転写調節因子はしばしば遺伝子ファミリー中に出現し、その際、そのファミリーメンバーはかなりのクロストーク及び/又は拮抗的制御を示し得る。加えて、転写因子の機能は、標的生物中のその認識配列の明確な存在に依存している。この事実は、モデル種からの結果の標的生物への転用を複雑にするかもしれない。見込みのある取り組みがわずかであるにも関わらず、依然として成長が早いかつ収量が高い生物（特に植物及び微生物）を作製する方法を提供する、及びかかる生物(特に植物及び微生物)を供給する、大きなニーズが存在する。
【発明の開示】
【０００６】
本発明の一つの目的は、生物(特に植物)の収量及び成長を増加させるための、この種の方法を提供することである。
【０００７】
本発明者らは、この目的が本明細書に記載される本発明の方法及び特許請求の範囲で特徴付けられる実施形態によって達成されることを見出した。
【０００８】
したがって、本発明は、成長速度が増加した、すなわち参照生物と比較して、より成長が早い及び/又はより収量が高い非ヒト生物を作製する方法であって、該非ヒト生物又はその1以上の部分において、参照生物と比較して配列番号2、107、125、129又は137の活性を、例えば配列番号1、106、124、128若しくは136のRNA及び/又は配列番号2、107、125、129若しくは137のポリペプチドの量を増加させることを基礎として、増加させることを含む、上記方法に関する。
【０００９】
シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)における配列番号1、106、124、128又は136の発現の増加が、植物の成長の促進並びに最終重量の増加及び種子量の増加に導くことが見出されている。
【００１０】
配列番号2は、機能が未確認のタンパク質として記載されており、ピリドキシン代謝に関与し得ること、及びその発現が定常期の間に誘導されることが記載されている。出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来(YMR095Cに関してGenBank登録番号PIR|S55081)。したがって、ORFのアノテーションにおいてはっきりとした機能は言及されていない。しかし、標準的な条件下でのYMR095C(配列番号2)配列のBlastp比較により、配列番号4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、99、101、103、105、133及び135との有意な相同性が明らかになった。
【００１１】
進化的に遠縁である酵母(Saccharomyces cerevieiae)の配列番号1の発現により、シロイヌナズナの成長が増加したという所見が特に驚きであった。また、配列番号1が機能的に保存された遺伝子であること、及び配列番号2又は特定のホモログである4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、99、101、103、105、133若しくは135の活性の増加も、配列番号2に関して及びシロイヌナズナにおいて本発明に従って観察されているのと同様に、生物のより早い成長及び収量の増加をもたらすことを推定し得る。したがって、おそらくは、ある生物における他の遠縁の配列番号1のホモログのトランスジェニック発現により、より早い成長及び高い収量が観察されるだろう。
【００１２】
配列番号107は出芽酵母由来の液胞形態形成タンパク質VAM7(YGL212Wに関してGenBank登録番号PIR|S31263)として記載されている。ORFのアノテーションにおいて別の機能は言及されていない。しかし、標準的な条件下でのYGL212W配列のBlastp比較により、配列番号109、111、113、115、117、119及び121との有意な相同性が明らかになった。
【００１３】
進化的に遠縁である酵母(Saccharomyces cerevisiae)の配列番号106の発現がシロイヌナズナの成長を増加するという所見が特に驚きであった。また、配列番号106が機能的に保存された遺伝子であること、及び配列番号107又は特定のホモログである配列番号109、111、113、115、117、119若しくは121の活性の増加も、本発明に従ってシロイヌナズナにおいて配列番号106に関して観察されているのと同様に、生物のより早い成長又は収量の増加をもたらすことを推定し得る。したがって、おそらくは、ある生物における他の遠縁の配列番号106のホモログのトランスジェニック発現により、より早い成長及び高い収量が観察されるだろう。
【００１４】
配列番号125は、仮定のタンパク質として早期に記載されており、現在では定常期におけるより高温での生存に必要なタンパク質としてアノテートされている。出芽酵母由来(GenBank登録番号SWISSPROT|YMZ7_YEASTYMR107w)。ORFのアノテーションにおいてはっきりとした機能は言及されていない。
【００１５】
進化的に遠縁である酵母(Saccharomyces cerevisiae)の配列番号124の発現が、シロイヌナズナの成長を増加させるという所見が特に驚きであった。また、配列番号124が機能的に保存された遺伝子であること、及び配列番号125又は特定のホモログの活性の増加も、本発明に従ってシロイヌナズナにおいて配列番号125に関して観察されているのと同様に、生物でのより早い成長又は収量の増加をもたらすことを推定し得る。したがって、おそらくは、ある生物における配列番号124のホモログのトランスジェニック発現によっても、より早い成長及び高い収量が観察されるだろう。
【００１６】
配列番号129は出芽酵母由来の仮定のタンパク質として記載されている(YDL057Wに関してGenBank登録番号SPTREMBL|Q07379)。
【００１７】
進化的に遠縁である酵母(Saccharomyces cerevisiae)の配列番号128の発現が、シロイヌナズナの成長を増加するという所見が特に驚きであった。配列番号128が機能的に保存された遺伝子であること、及び配列番号129又は特定のホモログの活性の増加も、本発明に従ってシロイヌナズナにおいて配列番号128に関して観察されているのと同様に、ある生物中でのより早い成長又は収量の増加をもたらすことを推定し得る。おそらくは、ある生物における配列番号128のホモログのトランスジェニック発現によっても、より早い成長及び高い収量が観察されるだろう。
【００１８】
配列番号137は、マウスキネシン関連タンパク質KIF3に類似した、出芽酵母由来の未知のタンパク質と記載されている(YGL217Cに関してGenBank登録: NP_011298.1)。
【００１９】
進化的に遠縁である酵母(Saccharomyces cerevisiae)の配列番号136の発現がシロイヌナズナの成長を増加させるという所見が特に驚きであった。配列番号136が機能的に保存された遺伝子であること、及び配列番号136又は特定のホモログの活性の増加も、本発明に従ってシロイヌナズナにおいて配列番号136に関して観察されているのと同様に、ある生物中でのより早い成長又は収量の増加をもたらすことを推定し得る。おそらくはある生物における配列番号136のホモログのトランスジェニック発現によっても、より早い成長及び高い収量が観察されるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
好適な実施形態では、本発明は成長速度が増加した、すなわちより成長が早いかつ/又は収量が増加した生物、細胞、組織、例えば動物、微生物又は植物を作製する方法であって、該生物又はその1以上の部分で、配列番号2、107、125、129又は137の活性を、配列番号1、106、124、128若しくは136のRNA及び/又は配列番号2、107、125、129若しくは137のポリペプチドの量を増加させることに基づいて増加することを含む、上記方法に関する。
【００２１】
本明細書中、「生物」は、ヒトではない任意の生物を指す。したがって、この用語は原核細胞及び真核細胞、微生物、高等及び下等植物(コケ類及び藻類を含む)、並びに非ヒト動物又は細胞を指す。一実施形態では、生物は単細胞又は多細胞である。
【００２２】
本明細書中、「成長の増加」、「より早い成長」又は「成長速度の増加」は、重量、例えば新鮮重量、又は時間単位当たりのバイオマスの増加が、参照、特に本発明の非ヒト生物を作製する出発生物のものより大きいことを意味する。より早い成長がより高い前記非ヒト生物の最終重量を生じることが好ましい。したがって例えば、より早い成長により、特定の発育段階により早期に達すること、及び特定の発育段階において成長を引き伸ばすことが可能になる。
【００２３】
「野生型」、「対照」又は「参照」という用語は交換可能であり、かつ細胞又は生物の一部分(細胞小器官若しくは組織)、又は生物、特に微生物若しくは植物であり得、本明細書に記載の本発明の方法に従って改変又は処理されていないものである。したがって、野生型、対照又は参照として使用される細胞又は生物の一部分(細胞小器官もしくは組織)あるいは生物、特に微生物又は植物は、細胞、生物又はその一部分と可能な限り一致し、かつ本発明の方法の結果以外のあらゆる性質が可能な限り本発明の対象と同一である。したがって、野生型、対照又は参照は同一又は可能な限り同一として扱われ、試験した性質の質にさらに影響することがない条件又は性質のみが異なり得ることをいう。
【００２４】
あらゆる比較を類似した条件下で実施することが好ましい。「類似した条件」という用語は、例えば培養若しくは生育条件、アッセイ条件(バッファー組成、温度、基質、病原体種、濃度等)等の全ての条件が、比較されるべき実験間で同一に維持されることをいう。
【００２５】
「参照」、「対照」又は「野生型」が、本明細書に記載の本発明の方法に従って改変又は処理されておらず、かつ本発明の対象と他のあらゆる性質において可能な限り類似である、被験体、例えば細胞小器官、細胞、組織、生物、特に植物又は微生物であることが好ましい。参照、対照又は野生型は、そのゲノム、トランスクリプトーム、プロテオーム又はメタボロームが本発明の対象と可能な限り類似である。好ましくは、「参照-」、「対照-」又は「野生型-」-細胞小器官、-細胞、-組織又は-器官という用語は、特に植物又は微生物は、本発明の、細胞小器官、細胞、組織又は生物、特に微生物又は植物又はその一部分とほとんど、好ましくは95％、より好ましくは98％、より一層好ましくは99.00％、特に99.10％、99.30％、99.50％、99.70％、99.90％、99.99％、99.999％以上、遺伝子的に同一な細胞小器官、細胞、組織又は生物、特に植物又は微生物に関する。最も好ましくは、「参照」、「対照」又は「野生型」は、核酸分子又はそれらによってコードされる遺伝子産物が本発明の方法によって変更されている以外は、本発明の方法に従って使用される生物、細胞、細胞小器官と遺伝子的に同一である対象、例えば細胞小器官、細胞、組織、生物であることが好ましい。
【００２６】
参照、対照又は野生型が本発明の対象と、例えば、本発明のポリペプチドの細胞活性においてのみ異なり、これが該活性及びその生化学的又は遺伝子的原因を有するタンパク質の発現レベル又は活性による、本発明の核酸分子レベルの増加又は本発明のポリペプチドの比活性の増加の結果であることが好ましい。
【００２７】
本発明の方法の対象ではないことによってのみ本発明の対象と異なる対照、参照又は野生型が提供できない場合は、対照、参照又は野生型は、収量若しくは成長又は本明細書に記載される本発明の核酸分子の発現の増加に寄与する活性のモジュレーションの原因が、元に切り替えられるか又はオフにされている生物であってもよく、これは例えば原因遺伝子産物の発現をノックアウトすることによって、例えばアンチセンス阻害によって、アクチベーター又はアゴニストの不活性化によって、阻害剤又はアンタゴニストの活性化によって、阻害抗体の添加を介した阻害、活性化合物(例えばホルモンなど)を添加すること、ドミナントネガティブ突然変異体を導入すること等による。遺伝子の産生は、酵素活性の阻害若しくは不安定化または補因子等への結合能力の阻害に導く、不活性化点突然変異を導入することによってノックアウトすることができる。
【００２８】
したがって、好適な参照対象は、本発明の方法の出発対象である。参照及び本発明の対象は、例えば総RNA、DNA若しくはタンパク質の量、又は参照遺伝子の活性又は発現(ユビキチン等のハウスキーピング遺伝子も同様)への標準化及び正常化後に比較されることが好ましい。
【００２９】
本発明のポリペプチドの改変を介して直接的に又は間接的に収量に影響を与える一連の機構が存在する。例えば、本発明のポリペプチドの分子数若しくは比活性又は本発明の核酸分子を増加し得る。望まれるバイオマスの増加は、例えば本発明のタンパク質コード遺伝子のコピー数を増加することによって達成することができる。しかし、生物中に天然に存在する遺伝子の発現を、例えば遺伝子の調節を改変することによって、又はmRNA若しくは本発明の核酸分子によってコードされる遺伝子産物の安定性を増加させることによって増加することも可能である。
【００３０】
したがって、好適な参照対象は、本発明の方法の出発対象である。参照及び本発明の対象が、総RNA、DNA若しくはタンパク質の量、又は参照遺伝子の活性若しくは発現(ハウスキーピング遺伝子又は実施例に示される遺伝子も同様)への正常化後に比較されることが好ましい。
【００３１】
本発明の増加、減少又はモジュレーションは、例えば安定な発現に起因して構成的であり得るし、例えば一過的形質転換又はモジュレーター(アゴニスト若しくはアンタゴニスト)の一時的な添加に起因して一過的であり得るし、例えば本発明の配列を有する誘導可能な構築物で形質転換し、誘導因子を添加した後に誘導的であり得る。
【００３２】
細胞、組織、生物(例えば植物又は微生物)の活性の「増加」又は「減少」という用語は、その区画中の全体的な活性が、例えば遺伝子産物の発現の増加又は減少、アゴニスト又はアンタゴニストの添加又は低減、酵素の阻害又は活性化、あるいは遺伝子産物の比活性のモジュレーションの結果（例えば突然変異の結果）として増加又は減少することを意味する。本発明の酵素の触媒中心における突然変異により、酵素の回転率をモジュレートすることができ、例えば必須アミノ酸のノックアウトは該酵素の活性の低減又は完全なノックアウトをもたらすことができる。本発明の酵素の比活性は、回転率が増加するか又は補因子の結合が改善されるように増加させることができる。コードmRNA又はタンパク質の安定性を改善することによっても、遺伝子産物の活性を増加することができる。この活性の刺激も、「活性の増加」という用語の範囲内である。本発明のタンパク質又は本発明のポリヌクレオチド若しくは発現カセットによってコードされるタンパク質の比活性は、実施例に記載されるように試験することができる。特に、前記タンパク質の細胞(例えば、植物細胞又は微生物)中での発現、及び対照と比較した新鮮重量、乾燥重量、種子数及び/又は種子重量の増加の検出は簡単な試験である。
【００３３】
したがって、「増加」又は「減少」という用語は、本発明のタンパク質、mRNA又はDNAの比活性並びに化合物の量を増加又は減少できることを意味する。
【００３４】
「増加」という用語はまた、化合物又は活性が細胞にde novoで導入されること、あるいは化合物又は活性が検出可能でないことも指す。したがって、以下において、「増加」という用語は「生じる」又は「刺激する」という用語をも含む。
【００３５】
一般的に、生物、特に植物細胞、植物、若しくは植物組織又はその一部分における遺伝子産物の活性は、特定のコードmRNA又はこれに対応するタンパク質の量を該生物又はその一部分において増加させることによって増加できる。「タンパク質又はmRNAの量」は、本発明のポリペプチド又はmRNA分子の、生物、組織、細胞又は細胞区画中での分子数を意味するものとして理解される。本発明のタンパク質の量の「増加」は、生物、組織、細胞若しくは細胞区画又はその一部における前記タンパク質の分子数の、野生型、対照又は参照に比較した量的増加(例えば本明細書下記に記載される方法の一つによる)を意味する。
【００３６】
分子数の増加が、少なくとも1％、好ましくは10％以上、より好ましくは30％以上、特に好ましくは50％、100％以上、非常に好ましくは500％、最も好ましくは1000％以上になることが好ましい。しかし、de novo発現も本発明の対象とみなされる。
【００３７】
改変、すなわち増加又は減少は、内因的又は外因的因子によって生じ得る。例えば、生物又はその一部分における活性の増加は、遺伝子産物若しくは前駆体又はアクチベーター若しくはアゴニストを培地又は栄養物に添加することによって生じ得るし、あるいは前記対象を生物に一過的に又は安定的に導入することによって生じ得る。
【００３８】
したがって、一実施形態では、本発明の方法は以下の1以上のステップを含む：
a)本発明のタンパク質を安定化すること；
b)本発明のタンパク質コードmRNAを安定化すること；
c)本発明のタンパク質の比活性を増加させること；
d)本発明のタンパク質発現のための同種又は人工転写因子を発現させるか、あるいはその発現を増加させること；
e)外因的誘導因子を介して本発明のタンパク質の活性を刺激すること；
f)本発明のトランスジェニックタンパク質コード遺伝子を発現させること；及び/又は
g)本発明のタンパク質コード遺伝子のコピー数を増加させること；
h)例えば、部位特異的突然変異誘発又は他の技術を介した遺伝子の内因的制御の操作により、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を増加させること。
【００３９】
一般的に、細胞又は生物の区画中のmRNA又はポリペプチドの量は、その容積中のコードタンパク質又は酵素の活性と相関する。この相関は常に線状というわけではなく、容積中の活性は分子の安定性又は活性化若しくは阻害性補因子の存在に左右される。さらに、酵素の産物及び遊離体の阻害は周知である。しかし、一実施形態では、本発明のポリペプチドの活性はコード遺伝子、特に本発明のポリヌクレオチドの配列を含む核酸分子の発現の増加を介して増加され、これは本発明のポリペプチドの量の恒常的な増加をもたらす。
【００４０】
一実施形態では、新鮮重量、乾燥重量、種子重量及び/又は種子量の増加は、本発明のタンパク質の内因的レベルを増加することによって増加される。本発明のタンパク質の内因的レベルは、例えばポリペプチドの転写又は翻訳調節を改変することによって増加することができる。調節配列は、内因的タンパク質のコード領域に作動可能に連結して、その転写及び翻訳、又はコードmRNA若しくは発現タンパク質の安定性若しくは減衰を制御する。発現を改変及び制御するために、プロモーター、UTR、スプライシング部位、プロセシングシグナル、ポリアデニル化部位、ターミネーター、エンハンサー、転写後又は翻訳後修飾部位を変更又は補正することができる。例えば、内因的タンパク質の発現レベルは、内因的プロモーターを強力なトランスジェニックプロモーターで置換することによって、又は内因的3'UTRをコード領域を補正することなく更なる安定性を与える3'UTRで置換することによってモジュレートすることができる。さらに、転写調節は、実施例に記載されるような人工転写因子の導入によってモジュレートすることができる。代替的なプロモーター、ターミネーター及びUTRは下に記載される。
【００４１】
配列番号2のホモログに関する1つの有利な実施形態では、本発明の方法において、以下のコンセンサス配列を含むか又はこの配列からなるポリペプチドの活性が、大文字で示された20以下、好ましくは15又は10、好ましくは9、8、7又は6、より好ましくは5又は4、より一層好ましくは3、より一層好ましくは2、より一層好ましくは1、最も好ましくは0のアミノ酸位置をxで置換され得ることによって増加される：
2008507960.tif 000003
【００４２】
一実施形態では、大文字で示された5以下、好ましくは4、より一層好ましくは3又は2、最も好ましくは1又は0のアミノ酸位置がxで置換される。
【００４３】
一実施形態では、20以下、好ましくは15又は10、好ましくは9、8、7又は6、より好ましくは5又は4、より一層好ましくは3、より一層好ましくは2、より一層好ましくは1、最も好ましくは0のアミノ酸がコンセンサス配列中に挿入される。
【００４４】
一実施形態では、xで表された20以下、好ましくは15又は10、好ましくは9、8、7又は6、より好ましくは5又は4、より一層好ましくは3、より一層好ましくは2、より一層好ましくは1、最も好ましくは0のアミノ酸が、コンセンサス配列から欠失される。
【００４５】
コンセンサス配列は、図1に示されるように、超好熱性古細菌（Aeropyrum pernix）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）(Mouse-ear cress)、好熱性硫黄細菌（Archaeoglobus fulgidus）、糸状嚢菌（Ashbya gossypii）(Yeast)(Eremothecium gossypii)、セレウス菌（Bacillus cereus）ATCC 10987、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)、バチルス・ハロデュランス（Bacillus halodurans）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ブラッシカ・ナプス（Brassica napus）、サーコスポラ・ニコチアナエ（Cercospora nicotianae）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）(Brevibacterium flavum)、デイノコッカス・ラジオデュランス（Deinococcus radiodurans）、エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）(Aspergillus nidulans)、グリシン・マックス(glycine max)、ヘモフィルス・デュクレイイ(Haemophilus ducreyi)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、ハロバクテリウム・エスピー(Halobacterium sp.)NRC-1、ホーデウム・ブルガレ(Hordeum vulgare)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、メタノバクテリウム・サーモオートロフィカム(Methanobacterium thermoautotrophicum)、メタノコッカス・マリパルデス(Methanococcus maripaludis)、メタノピラス・カンドレリ(Methanopyrus kandleri)、メタノサルシナ・アセチボランス(Methanosarcina acetivorans)、メタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)(Methanosarcina frisia)、マイコバクテリウム・チュバクロシス(Mycobacterium tuberculosis)、ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)、オリザ・サティバ(Oryza sativa)(ジャポニカ栽培品種群)、パラクラミディア・エスピー(Parachlamydia sp.)UWE25、パステウレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ピロバクルム・アエロフィルム(Pyrobaculum aerophilum)、ピロコッカス・アビッシ(Pyrococcus abyssi)、ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)、ピロコッカス・ホリコシイ(Pyrococcus horikoshii)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、スタフィロコッカス・エピデーミディス(Staphylococcus epidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトミセス・アベルミチリス(Streptomyces avermitilis)、スベリテス・ドムンキュラ(Suberites domuncula)(Sponge)、スルフォロバス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)、スルフォロバス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii)、サーモプラズマ・アシドフィルム(Thermoplasma acidophilum)、サーモプラズマ・ボルカニウム(Thermoplasma volcanium)、サーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)、サームス・サーモフィルス(Thermus thermophilus)HB27、トロフェリマ・ホイッペレイ(Tropheryma whipplei)(TW08/27株)(ホイップル病のバチルス)、ジー・メイス(Zea mays)、の配列の多重アライメントから誘導した。Xは所与のアミノ酸のいずれかを示す。これらのアミノ酸は、整列させたタンパク質配列の少なくとも80％で保存されたコンセンサス(80％コンセンサス)で特定される。
【００４６】
配列番号2のホモログに関連した1つの有利な実施形態では、本発明の方法において、ポリペプチドの活性が、植物のホモログ配列のアライメントに基づく以下のコンセンサス配列を含むかまたはこの配列からなるポリペプチドの活性が、大文字で示された20以下、好ましくは15又は10以下、好ましくは7、好ましくは4又は3、より好ましくは2、より一層好ましくは1、最も好ましくは0のアミノ酸位置をxで置換されることによって増加される：
2008507960.tif 000004
【００４７】
コンセンサス配列は、図2に示されるように、シロイヌナズナ、ナタネ(Canola)、ダイズ、オオムギ、イネ、トウモロコシの植物配列の多重アライメントから誘導した。Xは所与のアミノ酸のいずれかを示す。この場合、整列された植物のタンパク質配列の約100％で保存されているアミノ酸(100％コンセンサス)が特定される。
【００４８】
したがって、一実施形態では、本発明の方法において、前記コアコンセンサス配列の1つ又は両方を含むポリペプチドの活性が、大文字で示された10以下、好ましくは7、好ましくは4又は3、より好ましくは2、より一層好ましくは1、最も好ましくは0のアミノ酸位置がxで置換され得ることによって増加される。好ましくは、大文字で示された1以下のアミノ酸位置がxで置換される。
【００４９】
全ての生物の配列番号2のホモログのコアコンセンサス配列は、以下のコンセンサス配列の必須部分を表す：
(P/S)GGE(S/T)T
又は
(G/A)(T/S)CAGX(I/V)
又は
(V/A/I/C)XRNX(F/Y)GXQXXS(F/S)
又は
FIR(A/S/G)P
又は
FHPE(L/M/E)
【００５０】
したがって、一実施形態では、本発明の方法において、前記コアコンセンサス配列の1以上を含有するポリペプチドの活性が増加される。
【００５１】
植物の配列番号2のホモログのコアコンセンサス配列は、以下のコンセンサス配列の必須部分を表す：
VGVLALQGSXNEHXXALRRXGXXGXEXRKXXQLXXXXSLIIPGGEXTTMAKLAXYXNLFPALREFVXXGXPVWGTCAGLIFLA
又は
GGQXLXGGLDCTVHRNFFGSQXQSFE
又は
EGGXXTXRGXFIRAPA
又は
VIVAVXQXNXLATAFHPELTXDXRWH
【００５２】
したがって、一実施形態では、本発明の方法において、植物ホモログの前記コアコンセンサス配列の1以上を含むポリペプチドの活性が増加される。
【００５３】
配列番号107のホモログに関する別の有利な実施形態では、本発明の方法において、以下のコンセンサス配列を含むか又はこの配列からなるポリペプチドの活性が増加される：
(L/S)XXXXXXXXXXXXXXXXXXX(E/Q)XXX(K/R)
又は
(Q/Y)XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX(E/A)XXX(Q/A)
【００５４】
したがって、一実施形態では、本発明の方法において、前記コンセンサス配列の1つ又は両方を含むポリペプチドの活性が増加される。
【００５５】
多重アライメントは、Software GenoMax Version 3.4、InforMaxTM, InvitrogenTMライフサイエンスソフトウェア、U.S. Main Office、7305 Executive Way、Frederick、MD 21704,USAを以下の設定で使用して実施した：
ギャップオープニングペナルティ：10,0；ギャップ伸長ペナルティ:0,05;ギャップ分離ペナルティ範囲:8;アライメント遅延に関する同一性％:40;残基置換行列:blosum;親水性残基: G P S N D Q E K R；転移の重み付け:0,5;コンセンサス計算オプション:コンセンサスに関する残基分数(Residue fraction):0,5。
【００５６】
「コンセンサス配列」という用語により、記載される全ての変形物(variation)中の上記コンセンサス配列、コア配列、植物コンセンサス配列、植物コアコンセンサス配列が理解される。
【００５７】
したがって、一実施形態では、本発明の方法において、大文字で示される10以下、好ましくは7、好ましくは4又は3、より好ましくは2、より一層好ましくは1、最も好ましくは0のアミノ酸位置がxで置換され得ることにより、前記コアコンセンサス配列の1つ又は両方を含むポリペプチドの活性が増加される。大文字で示される1以下のアミノ酸位置がxで置換されることが好ましい。
【００５８】
参照生物は、好ましくは本発明の方法を実施する前の出発生物(野生型)又は対照生物を指す。
【００５９】
生物が植物でありかつ起源の系統が参照として決定できない場合は、出願時にヨーロッパ又はドイツ植物品種局で承認されており、かつ調査すべき植物と最大の遺伝子相同性を有する品種を、配列番号2、107、125、129又は137の活性の増加を測定するための参照として考えることができる。したがって、出願時に既に承認されている植物品種は、その後、参照細胞小器官、参照細胞、参照組織又は参照器官についても同様に、適切な参照又は供与源である。遺伝子相同性は、当業者に周知の方法を介して、例えばRoldan-Ruiz, Theor. Appl. Genet., 2001, 1138-1150に記載されるような、例えばフィンガープリント分析を介して、決定し得る。したがって、配列番号2、107、125、129又は137の活性が増加した、及び可能であれば、本明細書に記載されるような遺伝子的に同定された植物と比較して収量が増加した又はより成長の早い植物又は品種は、本発明の植物としてみなすことができる。適切な場合には、特定の配列番号2、107、125、129又は137の活性は、本明細書に記載されるように、配列番号1、106、124、128若しくは136のmRNA又は配列番号2、107、125、129又は137のタンパク質の量で置き換えることができる。動物及び微生物の遺伝的関係を決定するための類似した方法は、当業者、特に系統学者(sytematist)に十分に知られている。
【００６０】
適切な場合には、生物及び、特に実施例で言及される生物種が参照生物として役立つ。特に、そこで言及される植物種は、稀なケース、すなわち上述される参照を提供し得ない場合に、特定の植物種に対する参照生物として役立つ。
【００６１】
本発明の方法を実施するために使用される起源の系統が、好適な参照である。
【００６２】
生物種の様々な種又は品種は、異なる量又は活性の配列番号2、107、125、129又は137を有し得る。細胞区画、細胞小器官、細胞、組織、器官又は完全植物における配列番号2、107、125、129又は137の量又は活性が、異なる種又は品種間で異なることを見出すことができる。しかし、本発明に基づく観察によれば、各出発種若しくは各出発品種又は上述した参照に比較した、特に生物の、好ましくは植物の全抽出物の増加が、より早い成長及び/又はより高い収量をもたらす。しかし、特定の器官における、例えば過剰発現に起因する、活性の増加でさえ、所望の効果、すなわちより早い成長及びより高い収量の原因となり得ることも予想される。
【００６３】
以下において、「増加する」という用語は、性質を生じること及び刺激することを含む。
【００６４】
「量の増加」、「発現の増加」、「活性の増加」又は「質量の増加」を測定するために、この性質が参照又は出発生物のものと比較されるが、規定の値に標準化される。例えば、トランスジェニック非ヒト生物及び参照(野生型)の発現が比較され、例えば総RNA、総DNA若しくはタンパク質、又は特定の遺伝子(例えばハウスキーピング遺伝子)(若しくは遺伝子産物)のmRNAの活性若しくは量に標準化される。質量又は収量の増加も同様に、改変生物及び出発生物の比較を含むが、個別の植物又はヘクタール当たりの収量への標準化等を伴う。
【００６５】
配列番号2、107、125、129又は137の活性が、参照生物のものよりも少なくとも5％、より好ましくは10％、より一層好ましくは20％、30％、50％又は100％高いことが好ましい。最も好ましくは、活性は参照生物におけるものよりも200％、500％又は1000％以上高い。
【００６６】
より高い配列番号2、107、125、129又は137の活性により、特に配列番号2、107、125、129又は137の活性の5％〜1000％の増加により、好ましくは10％〜100％の増加により、成長が5％、好ましくは10％、20％又は30％早いことが好ましい。より好ましくは、成長は参照生物と比較して50％、100％、200％又は500％以上早い。配列番号2、107、125、129又は137の活性が10％、20％、30％又は50％〜100％増加すること、及び10％、20％、30％又は50％成長が早いことも好ましい。
【００６７】
より高い配列番号2、107、125、129又は137の活性により、特に配列番号2、107、125、129又は137の活性の5％〜1000％の増加により、好ましくは10％〜1005の増加により、収量が5％、好ましくは10％、20％又は30％高いことが好ましい。より好ましくは、収量は参照生物と比較して、50％、100％、200％又は500％以上高い。配列番号2、107、125、129又は137の活性が10％、20％、30％又は50％〜100％増加すること、及び10％、20％、30％又は50％成長が早いことも好ましい。
【００６８】
植物における「成長の促進」、「より早い成長」又は「成長速度の増加」は、より早い「植物の成長」、すなわち栄養期における新鮮重量の増加が、参照植物、特に本発明の植物が作製される出発植物のものよりも大きいことを指す。前記植物の最終重量も参照植物のものよりも高いことが好ましい。
【００６９】
微生物又は細胞に関して、より早い成長はより高いバイオマスの産生を指す。
【００７０】
「最終重量」は、典型的に特定の段階の終わりに達する重量又は産生された生物のバイオマスを指す。植物に関して、「最終重量の増加」が、成長段階の終わりに達する、参照生物の新鮮重量に比較したより高い新鮮重量を指すことが好ましい。より具体的には、より高い最終重量は、下記で論じられるように、より高い収量に起因し得る。微生物又は細胞に関して、「最終重量の増加」は、対数増殖期における該微生物又は細胞によって産生されるバイオマスの量を指す。
【００７１】
「収量」という用語は、本発明によれば、更なる処理に適切なバイオマス又は生体材料が増加することを指す。「更なる処理」という用語は、生産加工及び摂食のための即時的な使用の両者を指す。この方法が植物に関する場合、これは全ての物理形態（種子、葉、繊維、根、茎、胚、カルス、収穫材料、木質部、あるいは実際の植物に由来する及び/又は本発明の植物を作製するために使用し得る植物組織、生殖組織並びに細胞培養物）の植物細胞及び組織、器官並びに植物の一部分を含む。植物の任意の部分又は器官（葉、茎、シュート、花、根、塊茎、果実、樹皮若しくは葉又はその一部分等）あるいは完全植物が好ましい。種子は種子の任意の部分(種皮、表皮細胞及び種子細胞又は胚芽組織)を含む。農産物又は収穫産物が、特に果実、種子、塊茎、根、樹皮若しくは葉又はその一部分が特に好ましい。
【００７２】
したがって、配列番号2、107、125、129又は137の発現が増加したシロイヌナズナ(Arabidopsis)植物は、参照植物よりも有意に早く規定の重量に達するだけでなく、最大の新鮮重量、乾燥重量、種子重量及び/又は高収量に到達する。
【００７３】
このように、例えば、配列番号2、107、125、129又は137の発現が増加したシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)の新鮮重量は、同一の条件下の同じ実験において成長させた野生型と比較して、スクリーニング実験(実験1.1又は1.2)においては15％〜53％増加し、確認実験(確認ループ1又は2)においては野生型植物と比較して26％〜56％増加した。詳細は表1から取得できる。
【００７４】
この方法が有用動物に関する場合、「収量」は、更なる処理に適切な有用動物のバイオマス又は生体材料、特に肉、脂肪、骨、器官、皮膚、毛皮、卵又はミルク、の量を指す。
【００７５】
本発明の方法が微生物に関する場合、「収量」という用語は、該微生物によって産生されるバイオマス（例えば発酵ブロス）及び細胞自体の両方を指す。前記微生物が更なる処理又は直接的な使用に適当な特定の産物（例えば下記に記載される精製化学物質）を産生する場合、本発明の方法が微生物当たりの又は単位時間当たりの該産物の産生を増加することが好ましい。「量を増加する」、「発現を増加する」、「活性を増加する」又は「質量を増加する」は、いずれの場合も同一の成長条件を考慮した野生型又は参照と比較して、特定の性質を増加することを指す。野生型又は参照は、本発明の方法に供されていないが、可能な限り同一の条件下でインキュベートされかつその後本明細書で記載する特徴に関して本発明に従って作製された産物と比較される、細胞区画、細胞小器官、細胞、組織、器官又は非ヒト生物、好ましくは植物であり得る。
【００７６】
「増加」は、配列番号2、107、125、129若しくは137の活性(配列番号2、107、125、129又は137の産物の量及びその相対活性)の増加又は配列番号2、107、125、129若しくは137の量(区画、細胞小器官、細胞、組織、器官及び/若しくは非ヒト生物当たりの量)の増加をそこで測定することが可能となるように改変、変更及び/又は操作されている参照として、細胞区画、細胞小器官、細胞、組織、器官又は非ヒト生物、好ましくは植物を指してもよい。
【００７７】
この増加はまた、内因的又は外因的因子によって、例えば配列番号2、107、125、129若しくは137又はその前駆体若しくはアクチベーターを栄養物質又は飼料に添加することによって影響を与えることができる。この増加はまた、配列番号2、107、125、129若しくは137又は前駆体若しくはアクチベーターをコードする遺伝子の内因的又はトランスジェニック発現を増加することによって、あるいは上述した要素の安定性を増加することによっても実施し得る。因子の表現型作用、特にその配列番号2、107、125、129又は137の活性は、例えば、実施例に記載されるように、シロイヌナズナにおける構成的発現によって測定し得る。本明細書中、配列番号2、107、125、129又は137の活性は下記に記載される活性である。
【００７８】
細胞中での配列番号2、107、125、129又は137の活性の増加が好ましく、1以上の組織又は1以上の器官において増加した活性がより好ましい。通常は、非ヒト生物における増加は1以上の組織又は1以上の器官における増加を伴い、これはタンパク質が分泌されない限り、しばしば順次的に細胞における増加を伴う。例えば下記に列挙される細胞区画の1つにおけるより高い活性により、細胞中でのより高い配列番号2、107、125、129又は137の活性を引き起こすことができる。
【００７９】
「量を増加する」、「発現を増加する」、「活性を増加する」又は「質量を増加する」は、いずれの場合も構成的な又は誘導的な、安定的な又は一過的な様式で増加することを指す。例えば、増加はまた、細胞又は組織において、参照に比較して、特定の時間でのみ増加してもよく、例えば特定の発生段階でのみ、又は細胞周期の特定の段階でのみ増加してもよい。「増加」という用語はまた、異なる量に起因する増加を指し、これは異なる誘導試薬(例えばホルモン又は生物若しくは非生物シグナル等)に対する反応によって生じ得る。しかし、この活性は、阻害又は活性化様式のいずれかで作用する外因性又は内因性モジュレーターと相互作用する配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドによっても増加し得る。
【００８０】
本明細書中、ポリペプチドの「配列番号2、107、125、129又は137の活性」は、好ましくは該ポリペプチド、又は配列番号4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、99、101、103、105、109、111、113、115、117、119、121、133及び135で記載される相同ポリペプチドの発現又は活性の増加が、より高い新鮮重量、乾燥重量、種子重量及び/又は収量をもたらすこと、特に好ましくはこれが前記複数の特徴をもたらすこと、より一層好ましくは前記特徴の全てをもたらすことを指す。ここで、最も好ましくは、ポリペプチドの「配列番号2、107、125、129又は137の活性」は、該ポリペプチドが上で規定されるポリペプチドコンセンサス又はコンセンサスコア配列を含むか、又は以下：
(a)配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドをコードするか、又は配列番号2、107、125、129又は137で表されるポリペプチドの少なくとも成熟形態をコードする、核酸分子；
(b)好ましくは少なくとも成熟形態の、配列番号1、106、124、128又は136に記載のコード配列のポリヌクレオチドを含む、核酸分子；
(c)その配列が、(a)又は(b)に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチド配列から、遺伝子コードの縮重によって誘導できる核酸分子；
(d)その配列が(a)〜(c)に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも20％、好ましくは35％、より好ましくは45％、より一層好ましくは60％、より一層好ましくは70％、80％、90％、95％、97％、98％及び99％同一である配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドをコードする核酸分子；
(e)(a)〜(d)に記載の核酸分子によってコードされる配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドから、(a)〜(d)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列の1以上のアミノ酸の置換、欠失及び/又は付加によって誘導される、配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドをコードする核酸分子；
(f)(a)〜(e)に記載の核酸分子のいずれかによってコードされる、配列番号2、107、125、129もしくは137のポリペプチドの断片、エピトープ又はコンセンサスモチーフをコードする核酸分子；
(g)好ましくは配列番号96及び97、122及び123、126及び127、並びに/若しくは130及び131、又はそれらの組合せのプライマーを用いた、微生物又は植物cDNAバンクの増幅、あるいは好ましくは配列番号96及び97、122及び123、126及び127、130及び131、並びに/又は138及び139のプライマーを用いた微生物又は植物ゲノムバンクの増幅、によって取得される核酸分子の配列を含むポリヌクレオチドを含む核酸分子；
(h)(a)〜(g)に記載の核酸分子のいずれかによってコードされるポリペプチドに対するモノクローナル抗体を用いて単離される、配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドをコードする核酸分子；
(i)(a)〜(h)に記載の配列のいずれかを含むプローブ、あるいは(a)〜(h)で示される核酸の、少なくとも15nt、好ましくは20nt、30nt、50nt、100nt、200nt又は500ntの断片を用いて、ストリンジェントな条件下で適当なライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつ配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドをコードする、核酸分子；並びに
(j)20以下、好ましくは15又は10のアミノ酸位置がXで置換され得る及び/又は20以下、好ましくは15又は10のアミノ酸がその配列中に挿入されるか又はその配列から欠失される配列番号2、107、125、129又は137に示された配列を含むか、あるいは10以下、好ましくは7のアミノ酸位置がXで置換され得る及び/又は10以下、好ましくは7のアミノ酸がその配列に挿入されるか若しくはその配列から欠失された配列番号2、107、125又は129に示された配列を含む、成長又は収量を増加させるポリペプチドをコードする核酸分子；
よりなる群から選択される核酸分子を含む核酸分子によってコードされ、かつ非ヒト生物における参照生物、好ましくは植物、に比較したその活性の増加が、上述されるように参照生物に比較してより早い成長及び/又は収量の増加をもたらすことを指す。ポリヌクレオチドが植物起源であるか、又は原核若しくは真核微生物、例えばサッカロミセス・エスピー(Saccharomyces sp.)から生じることが好ましい。植物又は微生物が、下記に記載されるように、より成長が早い若しくは激しい及び/又は収量が高いことが好ましい。
【００８１】
細胞区画、細胞小器官、細胞、組織、器官又は非ヒト生物、好ましくは植物において「配列番号2、107、125、129又は137の活性を増加すること」は、好ましくは、「配列番号2、107、125、129又は137の絶対活性を増加すること」、すなわち、これが細胞区画、細胞小器官、細胞、組織、器官又は非ヒト生物中の、より多くのタンパク質又はより多くの活性タンパク質に起因するかどうかとは無関係であることを指す。
【００８２】
比活性は、例えばポリペプチドを、例えば高い回転率又はより改善した補因子の結合が生じるように突然変異させることによって、増加することができる。ポリペプチドの安定性を増加することにより、例えば、ユニット当たりの活性、例えば体積当たりの又は細胞当たりの活性が増加する。すなわち、該ポリペプチドの分解に起因する、継時的な活性の損失が阻止される。配列番号2、107、125、129又は137の比活性を測定するためのin-vitroアッセイは依然として当業者に公知ではない。
【００８３】
ポリペプチドの比活性は、下記の実施例に記載されるように測定することができる。例えば、モデル生物中で可能な配列番号1、106、124、128又は136を発現させ、成長曲線を同一条件の参照のものと比較することができる。成長の増加は既に細胞レベルで検出できるが、これは全成長期間中の観察を要するかもしれない。ここでは、このために植物発現及びアッセイ系を用いることが好適であり得る。このようにして、驚くべきことに、植物中での酵母タンパク質である配列番号2、107、125、129又は137の構成的発現も、より早い成長をもたらすことを見出した。
【００８４】
「増加する」という用語は、物質又は活性(ここでは配列番号2、107、125、129若しくは137のRNA、配列番号2、107、125、129若しくは137のDNA、又は配列番号2、107、125、129若しくは137のタンパク質、あるいは配列番号2、107、125、129若しくは137の活性)を、例えば配列番号2、107、125、129又は137欠陥非ヒト生物中での配列番号1、106、124、128又は136の核酸のトランスジェニック発現によって、特定の環境に初めて導入されるか又は既に検出可能でない前記環境に導入すること、並びに特定の環境における物質の活性又は量を、例えば配列番号2、107、125、129又は137発現生物中での配列番号1、106、124、128又は136遺伝子の同時トランスジェニック発現によって、又は環境からの配列番号2、107、125、129又は137の取り込みによって、本来の状態と比較して増加させることの両者を指す。したがって、「増加する」という用語はde-novo発現も含む。
【００８５】
植物細胞、植物細胞小器官、植物組織、植物又はその一部分の「乾燥重量」は、植物細胞、植物細胞小器官、植物組織、植物又はその一部分の有機物の、該植物細胞、植物細胞小器官、植物組織、植物又はその一部分に含まれる水分量を差し引いた重量を指す。
【００８６】
本発明の一実施形態では、核酸配列である配列番号1、106、124、128若しくは136又はそのホモログのいずれかを(過剰)発現する、植物細胞、植物細胞小器官、植物組織、植物又はその一部分の乾燥重量は、最も早い寄託日が2005年の6月2日以前であるドイツ国植物遺伝学・作物研究所(IPK)(Corrensstrasse 3, D-06466 Gatersleben, Germany)に寄託されている品種に比較して、1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％又は50％以上増加される。
【００８７】
本発明の別の実施形態では、核酸配列である配列番号1、106、124、128若しくは136又はその相同配列のいずれかを(過剰)発現する、植物細胞、植物細胞小器官、植物組織、植物又はその一部分の乾燥重量は、以下よりなる群から選択される品種の乾燥重量に比較して、1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％又は50％以上増加される：
(a)G.ヒルスツム(G. hirsutum)IPK登録番号GOS 6 (D 120)、GOS 7 (ST 446)、GOS 10 (D 1635)、GOS 17 (D 4302)若しくはGOS 21 (D 5553)、G.アレイシアナム(G. areysianum)Deflers、G.インカヌム(G. incanum)(Schwartz) Hillc.、G.ライモンディ(G. raimondii)Ulbr.、G.ストックシイ(G. stocksii)Masters、G.チュルベリ(G. thurberi)Tod.、G.トメントスム(G. tomentosum)Nutt.、G.トリフィルム(G. triphyllum)Hochr.、ゴシッピウム・アルボレウム(Gossypium arboreum)IPK登録番号GOS 13 (D 1634)、GOS 16 (D 4240)、GOS 18 (D 4505)、GOS 19 (D 4506)、GOS 20 (D 4750)、若しくはGOS 12 (D 1329)、ゴシッピウム・バルバデンセ(Gossypium barbadense)、又はゴシッピウム・ヘルバセウム(Gossypium herbaceum);
(b)ブラッシカ・ナプス(Brassica napus)のMika品種、ブラッシカ・ナプスのDigger品種、ブラッシカ・ナプスのArtus品種、ブラッシカ・ナプスのTerra品種、ブラッシカ・ナプスのSmart品種、ブラッシカ・ナプスのOlivine品種、ブラッシカ・ナプス Libretto品種、ブラッシカ・ナプスのWotan品種、ブラッシカ・ナプスのPanther品種、ブラッシカ・ナプスのExpress品種、ブラッシカ・ナプスのOase品種、ブラッシカ・ナプスのElan品種、ブラッシカ・ナプスのAbility品種、ブラッシカ・ナプスのMohican品種;
(c)リヌム・ウシタティッシムム(Linum usitatissimum)のLibrina品種、リヌム・ウシタティッシムムのFlanders品種、リヌム・ウシタティッシムムのScorpion品種、リヌム・ウシタティッシムムのLivia品種、リヌム・ウシタティッシムムのLola品種、リヌム・ウシタティッシムムのTaurus品種、リヌム・ウシタティッシムムのGolda品種、リヌム・ウシタティッシムムのLirima品種、
(d)ジー・メイス(Zea mays)のArticat品種、ジー・メイスのNK Dilitop品種、ジー・メイスのTotal品種、ジー・メイスのOldham品種、ジー・メイスのAdenzo品種、ジー・メイスのNK Lugan品種、ジー・メイスのLiberal品種、ジー・メイスのPeso品種;
(e)グリシン・マックス(Glycine max)のOligata品種、グリシン・マックスのLotus品種、グリシン・マックスのPrimus品種、グリシン・マックスのAlma Ata品種、グリシン・マックスのOAC Vision品種、グリシン・マックスのJutro品種;
(f)ヘリアンサス・アヌウス(Helianthus annus)のHelena品種、ヘリアンサス・アヌウスのFlavia品種、ヘリアンサス・アヌウスのRigasol品種、ヘリアンサス・アヌウスのFlores品種、ヘリアンサス・アヌウスのJazzy品種、ヘリアンサス・アヌウスのPegaso品種、ヘリアンサス・アヌウスのHeliaroc品種、ヘリアンサス・アヌウス のSalut RM品種;
(g)カメリナ・サティバ(Camelina sativa)のDolly品種、カメリナ・サティバのSonny品種、カメリナ・サティバのLigena品種、カメリナ・サティバのCalinka品種;
(h)シナピス・アルバ(Sinapis alba)のMartigena品種、シナピス・アルバのSilenda品種、シナピス・アルバのSirola品種、シナピス・アルバのSito品種、シナピス・アルバのSemper品種、シナピス・アルバのSeco品種;
(i)カーサムス・チンクトリウス(Carthamus tinctorius)のSabina品種、カーサムス・チンクトリウスのHUS-305品種、カーサムス・チンクトリウスのlandrace品種、カーサムス・チンクトリウスのThori-78品種、カーサムス・チンクトリウスのCR-34品種、カーサムス・チンクトリウスのCR-81品種;
(j)ブラッシカ・ユンセア(Brassica juncea)のVittasso品種、ブラッシカ・ユンセアのMuscon M-973品種、ブラッシカ・ユンセアのRAPD品種、ブラッシカ・ユンセアのCo.J.86品種、ブラッシカ・ユンセアのIAC 1-2品種、ブラッシカ・ユンセアのPacific Gold品種;
(k)ココス・ヌシフェラL（Cocos nucifera L.）のMaypan品種、Ceylon Tall品種、Indian Tall品種、Jamaica Tall品種、Malayan Tall品種、Java Tall品種、Laguna品種、KingCRIC 60品種、CRIC 65品種、CRISL 98品種、Moorock tall品種、Plus palm tall品種、San Ramon品種、Typica品種、Nana品種又はAurantiaca品種;
(l)トリティカム・エスチバムL(Triticum aestivum L.)のAltos品種（Bundessortenamtファイル番号2646）、トリティカム・エスチバム L.のBussard品種（Bundessortenamtファイル番号1641）、又はトリティカム・エスチバム L.のCentrum品種（Bundessortenamtファイル番号2710）;
(m)ベータ・ブルガリス(Beta vulgaris)のDieck 13品種（CPVOファイル番号19991828）、ベータ・ブルガリスのFD 007品種（CPCOファイル番号20000506）又はベータ・ブルガリスのHI 0169品種(CPVOファイル番号20010315);
(n)ホルデウム・ブルガレ(Hordeum vulgare)のDorothea品種(CPVOファイル番号20031457)、ホルデウム・ブルガレのColibri品種(CPVOファイル番号20040122)、ホルデウム・ブルガレのBrazil品種(CPVOファイル番号20010274)又はホルデウム・ブルガレのChristina品種(CPVOファイル番号20030277);
(o)セカレ・セレアレ(Secale cereale)のEsprit品種(CPVOファイル番号19950246)、セカレ・セレアレのResonanz品種(CPVOファイル番号20040651)又はセカレ・セレアレのUrsus品種(CPVOファイル番号19970714);
(p)オリザ・サティバ(Oryza sativa)のGemini品種(CPVOファイル番号20010284)、オリザ・サティバのTanaro品種(CPVOファイル番号20020177)又はオリザ・サティバのZeus品種(CPVOファイル番号19980388);
(q)ソラヌム・チュベロスムL(Solanum tuberosum L.)のLinda品種、Nicola品種、Solara品種、Agria品種、Sieglinde品種又はRusset Burbank品種;
(r)アラチス・ヒポガエア(Arachis hypogaea)の亜種ファスティジアタ(fastigiata)のValencia栽培品種;
(s)アラチス・ヒポガエア(Arachis hypogaea)の亜種ヒポガエア(hypogaea)の栽培品種Virginiaの「Holland Jumbo」品種、「Virginia A23-7」品種、又は「Florida 416」品種;
(t)アラチス・ヒポガエア(Arachis hypogaea)の亜種ヒルスタ(hirsuta)の栽培品種Peruvian runnerの「Southeastern Runner 56-15」品種、「Dixie Runner」品種、又は「Early Runner」品種;
(u)アラチス・ヒポガエア(Arachis hypogaea)の亜種ブルガリス(vulgaris)の栽培品種Spanishの「Dixie Spanish」品種、「Improved Spanish 2B」品種又は「GFA Spanish」品種。
【００８８】
当業者の知識によれば、細胞、区画などにおけるRNA又はポリペプチドの量は、ある容積中のタンパク質の活性に規則正しく相関する。この相関は常に線状というわけではなく、例えばこの活性も分子の安定性又は活性化若しくは阻害性補因子の存在に左右される。同様に、産物及び反応物の阻害も知られる。本願の基礎となる発明は、配列番号2、107、125、129又は137のRNAの量と、生体物質（特に新鮮重量、葉及び収量の数）の増加との依存関係を示している。通常は、遺伝子の発現の増加は、本明細書の実施例でも示されるように、前記遺伝子のmRNA及びコードされるポリペプチドの量の増加をもたらす。したがって、配列番号2、107、125、129又は137の量が細胞小器官、細胞、組織、器官又は植物中で増加されるときに、その中での活性の増加が期待できる。配列番号2、107、125、129又は137の量が異なる手法で増加される時も、同様のことを期待し得る。
【００８９】
一実施形態では、このように、非ヒト生物又は記載した部分（例えば器官、細胞、組織又は細胞小器官）における配列番号2、107、125、129又は137のmRNA又は配列番号2、107、125、129又は137のタンパク質の量が増加される。この量は、例えば、非ヒト生物の細胞におけるde-novo発現又は発現の増強によって、安定性の増強、分解の低減又は外部からの取り込み(の増強)によって、増加することもできる。
【００９０】
一実施形態では、本発明の方法は、より成長の早い及び/又はより高収量の植物に関する。したがって、好適な実施形態では、本発明の方法は、上述した核酸分子(a)〜(i)のいずれかを含むポリヌクレオチドによってコードされる配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドの活性を植物中で増加させることを含む。より好ましくは、ポリヌクレオチドは上述の核酸分子(a)〜(c)のいずれかを含む。配列番号1、106、124、128又は136で表される配列のいずれかを含むか、あるいは配列番号2、107、125、129又は137で表されるポリヌクレオチドをコードする核酸又はそのホモログを含む、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの活性を増加させることがより一層好ましい。
【００９１】
好適なホモログは下記に記載される。したがって、配列番号1、106、124、128又は136によりコードされるかあるいは配列番号2、107、125、129又は137で表されるポリペプチドと、アミノ酸レベルで少なくとも20％、好ましくは40％、より好ましくは50％、より一層好ましくは60％、より一層好ましくは70％、より一層好ましくは80％、より一層好ましくは90％、そして最も好ましくは95％、96％、97％、98％又は99％同一であるホモログが、配列番号1、106、124、128又は136によってコードされるアミノ酸配列あるいは配列番号2、107、125、129又は137で表されるアミノ酸配列のホモログと共に、特に好適である。本発明が植物、あるいは植物において成長又は収量を増加させる方法に関する場合、植物における配列番号2、107、125、129又は137の活性は、参照生物に比較して、5％以上、より好ましくは10％、より一層好ましくは20％、30％、50％又は100％増加される。最も好ましくは、活性は、参照生物に比較して、200％、500％又は1000％以上増加される。
【００９２】
より高い配列番号2、107、125、129又は137の活性により、特に配列番号2、107、125、129又は137の活性の5％〜1000％の増加により、好ましくは10％〜100％の増加により、植物の成長が5％、好ましくは10％、20％又は30％早いことが好ましい。成長が、参照生物に比較して、50％、100％、200％又は500％以上早いことがより好ましい。配列番号2、107、125、129又は137の活性が10％、20％、30％又は50％〜1000％増加すること、及び成長が10％、20％、30％又は50％〜200％早いことも好ましい。
【００９３】
より高い配列番号2、107、125、129又は137の活性により、特に配列番号2、107、125、129又は137の活性の5％〜1000％の増加により、好ましくは10％〜100％の増加により、植物の収量が5％、好ましくは10％、20％又は30％高いことが好ましい。収量が参照生物に比較して50％、100％、200％又は500％以上高いことがより好ましい。配列番号2、107、125、129又は137の活性が10％、20％、30％又は50％〜100％増加すること、及び収量が10％、20％、30％又は50％高いことも好ましい。
【００９４】
別の実施形態では、本発明の方法は、微生物におけるより早い成長及び/又はより高い収量又はより高いバイオマスに関する。驚くべきことに、酵母(Saccharomyces cerevisiae)の配列番号1、106、124、128又は136の発現は、シロイヌナズナでより早い成長をもたらし、かつより高い収量をもたらし得る。配列番号2、107、125、129又は137のより高い保存性により、微生物又は動物における配列番号2、107、125、129又は137の活性の増加も同様に、より早い成長、すなわち、より高い分裂速度、より高い成長速度又はより大きな細胞をもたらすことが期待できる。したがって、好適な実施形態では、本発明の方法は、上述した核酸(a)〜(i)のいずれかを含むポリヌクレオチドによりコードされる配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドの活性を、微生物、動物又は細胞中で増加させることを含む。より好ましくは、ポリヌクレオチドは、上述した核酸(a)〜(c)のいずれか又はそのホモログのいずれかを含む。好適なホモログは下に記載される。例えば、配列番号2、107、125、129又は137に記載のポリペプチドとアミノ酸レベルで少なくとも30％、好ましくは40％、より好ましくは50％、より一層好ましくは60％、より一層好ましくは70％、より一層好ましくは80％、より一層好ましくは90％、そして最も好ましくは95％、96％、97％、98％又は99％同一であるホモログが特に好ましい。
【００９５】
一実施形態では、核酸分子は、配列番号1、106、124、128又は136に示される配列を含む配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドをコードし、その際、20以下、好ましくは15又は10のアミノ酸位置がXで置換され得る及び/又は20以下、好ましくは15又は10のアミノ酸がその配列に挿入されるか、10以下の、好ましくは7のアミノ酸位置がXで置換され得る及び/又は10以下、好ましくは7のアミノ酸がその配列に挿入されるか若しくはその配列から欠失される。
【００９６】
一実施形態では、核酸分子は、上で規定される及び図1に示される異なる生物由来のコンセンサス又はコンセンサスコア配列を含むポリペプチドを含むか又は該ポリペプチドからなる配列番号2のポリペプチドをコードし、その際、図1において大文字で示された20以下、好ましくは15又は10、好ましくは9、8、7又は6、より好ましくは5又は4、より一層好ましくは3、より一層好ましくは2、より一層好ましくは1、最も好ましくは0のアミノ酸位置はXで置換され得る、及び/又は図1において大文字で示された5以下、好ましくは4、より一層好ましくは3又は2、最も好ましくは1以下のアミノ酸位置はXで置換され得る、及び/又は20以下、好ましくは15又は10、好ましくは9、8、7又は6、より好ましくは5又は4、より一層好ましくは3、より一層好ましくは2、より一層好ましくは1、最も好ましくは0のアミノ酸がコンセンサス配列に挿入されるか又はコンセンサス配列から欠失される。
【００９７】
別の実施形態では、核酸分子は、上で規定した(例えば図2に示される)異なる植物種由来のコンセンサス配列を含むポリペプチドを含むか又は該ポリペプチドからなる配列番号2のポリペプチドをコードし、その際、図2において大文字で示された20以下、好ましくは15又は10、好ましくは9、8、7又は6、より好ましくは5又は4、より一層好ましくは3、より一層好ましくは2、より一層好ましくは1、最も好ましくは0のアミノ酸位置がXで置換され得る、及び/又は図2において大文字で示される5以下、好ましくは4、より一層好ましくは3又は2、最も好ましくは1以下のアミノ酸位置がXで置換される、及び/又は20以下、好ましくは15又は10、好ましくは9、8、7又は6、より好ましくは5又は4、より一層好ましくは3、より一層好ましくは2、より一層好ましくは1、最も好ましくは0のアミノ酸がコンセンサス配列に挿入されるか又はコンセンサス配列から欠失される。
【００９８】
本発明が微生物、又は微生物の成長若しくは収量を増加する方法に関する場合、配列番号2、107、125、129又は137の活性が、参照生物のものよりも少なくとも5％、より好ましくは10％、より一層好ましくは20％、30％、50％又は100％高いことが好ましい。最も好ましくは、活性が参照生物よりも200％、500％、又は1000％以上高い。
【００９９】
より高い配列番号2、107、125、129又は137の活性により、特に配列番号2、107、125、129又は137の活性における5％〜1000％の増加により、好ましくは10％〜100％の増加により、微生物の成長が5％、好ましくは10％、20％又は30％早いことが好ましい。成長が、参照生物に比較して、50％、100％、200％又は500％以上早いことがより好ましい。配列番号2、107、125、129又は137の活性が10％、20％、30％又は50％〜100％増加すること、及び成長が10％、20％、30％又は50％早いことも好ましい。
【０１００】
より高い配列番号2、107、125、129又は137の活性により、特に配列番号2、107、125、129又は137の活性における5％〜1000％の増加により、好ましくは10％〜100％の増加により、微生物の収量、特にバイオマスが5％、好ましくは10％、20％又は30％高いことが好ましい。収量が参照生物に比較して50％、100％、200％又は500％以上高いことがより好ましい。配列番号2、107、125、129又は137の活性が10％、20％、30％又は50％〜100％増加すること、及び収量が10％、20％、30％又は50％高いことも好ましい。
【０１０１】
別の実施形態では、本発明の方法は有用動物のより早い成長及び/又はより高い収量に関する。したがって、好適な実施形態では、本発明の方法は、上記核酸のいずれかを含むポリヌクレオチドによってコードされる配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドの活性を有用動物において増加させることを含む。より好ましくは、ポリヌクレオチドは上記核酸(a)〜(c)のいずれかを含む。
【０１０２】
本発明が有用動物、又は参照動物に比較して有用動物の成長又は収量を増加する方法に関する場合、配列番号2、107、125、129又は137の活性が、参照生物のものよりも少なくとも5％、より好ましくは10％、より好ましくは20％、30％、50％又は100％高いことが好ましい。最も好ましくは、活性は参照生物中よりも200％、500％又は1000％以上高い。
【０１０３】
より高い配列番号2、107、125、129又は137の活性により、特に配列番号2、107、125、129又は137の活性における5％〜1000％の増加により、好ましくは10％〜100％の増加により、有用動物の成長は、比較により5％、好ましくは10％、20％又は30％早いことが好ましい。成長が、参照生物に比較して50％、100％、200％又は500％以上早いことがより好ましい。配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドの活性が10％、20％、30％又は50％〜100％増加すること、及び成長が10％、20％、30％又は50％早いことも好ましい。
【０１０４】
本発明の方法に使用される核酸配列である配列番号124、128又は136は、その活性が依然として正確には知られていないポリペプチドをコードする核酸配列である。
【０１０５】
しかし、ビタミンB6の生合成に関与するタンパク質に対する配列番号2の相同性により、これがビタミンB6の代謝に直接的又は間接的に関わる対応のタンパク質であることを仮定し得る。したがって、細胞、細胞小器官、区画、組織、器官又は非ヒト生物、特に植物における配列番号2のタンパク質の活性の増加は、ビタミンB6生合成活性を測定することによって測定可能であろう。
【０１０６】
しかし、液胞形態形成タンパク質VAM 7に関与するタンパク質に対する配列番号107の相同性により、これが液胞膜生理機能に直接的又は間接的に関与する対応のタンパク質であることを仮定し得る。したがって、細胞、細胞小器官、区画、組織、器官又は非ヒト生物、特に植物における配列番号107のタンパク質の活性の増加は、液胞膜におけるこのタンパク質の存在を測定することによって測定可能であろう。
【０１０７】
これとは別に、配列番号2、107、125、129又は137の活性は、配列番号2、107、125、129若しくは137のRNAの量又は配列番号2、107、125、129又は137のタンパク質の量を測定することにより間接的に測定し得る。したがって、本明細書に記載の本発明のポリヌクレオチドの定量的ノーザンブロット又は定量的PCRにより、例えば細胞中の又は全抽出物中のmRNAの量を測定でき、またウエスタンブロットを用いて、例えば細胞又は全抽出物中のタンパク質量を参照中のものと比較することができる。この種の方法は当業者に公知であり、例えば、Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989若しくはCurrent Protocols, 1989及び改訂版, John Wiley & Sons, N. Y.、又は下記に引用される他の情報源で詳細に記載されている。
【０１０８】
本発明の方法における作製に適当な非ヒト生物(宿主生物)は、原則的にはより成長が早い有用な任意の非ヒト生物であり、望ましくは例えば、微生物(酵母等)、真菌又は細菌、単子葉又は双子葉植物、コケ類、藻類、及び下に列挙されるような有用動物である。非ヒト生物、宿主生物又は有用動物という用語は、ヒト起源の生体構成物質、例えばヒト細胞株をさらに含むが、ヒト生物は含まない。
【０１０９】
本明細書で使用される「植物」という用語は、高等植物、下等植物、コケ類又は藻類を含み得るが、本発明の方法の好ましい実施形態では、「植物」という用語は高等植物を指す。
【０１１０】
本発明の方法が下に列挙されるような有用植物に属する植物を使用することが有利である。飼料又は動物性食品の製造とは別に、本発明に従って作製される植物は特に精製化学物質の製造にも使用し得る。
【０１１１】
一実施形態では、本発明の方法は、配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドの活性を、前記生物又はその1以上の部分において、少なくとも1つのポリペプチドの活性を増加させることによって増加させることを含み、該ポリペプチドは以下よりなる群から選択される核酸分子を含む核酸分子によってコードされる：
(aa)配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチド、又は好ましくは少なくとも配列番号2、107、125、129又は137で表されるポリペプチドの成熟形態、をコードする核酸分子；
(bb)配列番号1、106、124、128又は136に記載のコード配列の、好ましくは少なくとも成熟ポリヌクレオチドを含む核酸分子；
(cc)その配列が、(aa)又は(bb)に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチド配列から、遺伝子コードの縮重によって誘導できる核酸分子；
(dd)その配列が(aa)〜(cc)に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも20％、好ましくは35％、より好ましくは45％、より一層好ましくは60％、より一層好ましくは70％、80％、90％、95％、97％、98％及び99％同一であるポリペプチドをコードする核酸分子；
(ee)(aa)〜(dd)、好ましくは(aa)〜(cc)に記載の核酸分子によってコードされる配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドから、(aa)〜(dd)、好ましくは(aa)〜(cc)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列の1以上のアミノ酸の置換、欠失及び/又は付加によって誘導されるポリペプチドをコードする核酸分子；
(ff)(aa)〜(ee)、好ましくは(aa)〜(cc)に記載の核酸分子のいずれかによってコードされる、配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドの断片又はエピトープをコードする核酸分子；
(gg)好ましくは配列番号96及び97、122及び123、126及び127、130及び131、並びに/若しくは138及び139又はその組合せのプライマーを用いた微生物又は植物cDNAバンクの増幅、あるいは好ましくは配列番号96及び97、122及び123、126及び127、130及び131並びに/又は138及び139のプライマーを用いた微生物又は植物ゲノムバンクの増幅、によって取得される核酸分子配列を含むポリヌクレオチドを含む核酸分子；
(hh)(aa)〜(gg)、好ましくは(aa)〜(cc)に記載の核酸分子のいずれかによってコードされるポリペプチドに対するモノクローナル抗体を用いて単離される、配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドをコードする核酸分子；
(ii)(aa)〜(hh)、好ましくは(aa)〜(cc)に記載の配列のいずれかを含むプローブ、あるいは(aa)〜(hh)、好ましくは(aa)〜(cc)で特徴付けられる核酸の、少なくとも15nt、好ましくは20nt、30nt、50nt、100nt、200nt又は500ntの断片を用いて、ストリンジェントな条件下で適当なライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつ配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドをコードする、核酸分子；並びに
(jj)配列番号1、106、125又は128に示される配列を含む配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドをコードする核酸分子であって、示された20以下、好ましくは15若しくは10のアミノ酸位置がXで置換され得る及び/又は20以下、好ましくは15若しくは10のアミノ酸が示された配列中に挿入されるか、あるいは示された10以下、好ましくは7のアミノ酸位置がXで置換され得る及び/又は10以下、好ましくは7のアミノ酸が示された配列中に挿入されるか又は該配列から欠失される、上記核酸分子；
あるいはそれらの相補配列を含む核酸分子。
【０１１２】
一実施形態では、配列番号2、107、125、129又は137のタンパク質の活性を以下によって増加させる：
(a)配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドの発現を増加させること；
(b)配列番号2、107、125、129若しくは137のRNA、又は配列番号2、107、125、129若しくは137のタンパク質、好ましくは(a)に記載のポリペプチド又はポリヌクレオチド、の安定性を増加させること；
(c)配列番号2、107、125、129又は137のタンパク質、好ましくは(a)に記載されるか又は(a)に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの比活性を増加させること；
(d)好ましくは(a)に記載されるポリヌクレオチドの配列を含む、配列番号2、107、125、129又は137の内因的遺伝子機能の発現を増加できる天然又は人工転写因子を発現させること；あるいは
(e)配列番号2、107、125、129又は137の活性、又は食物若しくは培地への配列番号2、107、125、129若しくは137の発現、好ましくは(a)に記載されるポリヌクレオチドの活性又は発現を増加又は誘導する外因的因子を添加すること。
【０１１３】
一実施形態では、本発明の方法は、生物に、好ましくは植物に又はその1以上の部分にポリヌクレオチドを導入することによって、配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドの活性を増加させることを含み、該ポリヌクレオチドは以下よりなる群から選択される核酸分子を含む核酸分子によってコードされる配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドをコードする：
(a)配列番号2、107、125、129若しくは137のポリペプチドをコードするか、又は配列番号2、107、125、129若しくは137で表される、好ましくは少なくとも成熟形態のポリペプチドをコードする、核酸分子；
(b)配列番号1、106、124、128若しくは136に記載のコード配列の、好ましくは少なくとも成熟ポリヌクレオチドを含む核酸分子；
(c)その配列が、(a)又は(b)に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチド配列から、遺伝子コードの縮重によって誘導できる核酸分子；
(d)その配列が(a)〜(c)に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも20％、好ましくは35％、より好ましくは45％、より一層好ましくは60％、より一層好ましくは70％、80％、90％、95％、97％、98％及び99％同一であるポリペプチドをコードする核酸分子；
(e)(a)〜(d)、好ましくは(a)〜(c)に記載の核酸分子によってコードされる配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドから、(a)〜(d)、好ましくは(a)〜(c)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列の1以上のアミノ酸の置換、欠失及び/又は付加によって誘導されるポリペプチドをコードする核酸分子；
(f)(a)〜(e)、好ましくは(a)〜(c)に記載の核酸分子のいずれかによってコードされる、配列番号2、107、125、129、137のポリペプチドの断片又はエピトープをコードする核酸分子；
(g)好ましくは配列番号96及び97、122及び123、126及び127、若しくは130及び131、又はそれらの組合せのプライマーを用いた微生物又は植物cDNAバンクの増幅、あるいは好ましくは配列番号96及び97、122及び123、126及び127、130及び131並びに/又は138及び139のプライマーを用いた微生物又は植物ゲノムバンクの増幅、によって取得される核酸分子配列を含むポリヌクレオチドを含む核酸分子；
(h)(a)〜(g)、好ましくは(a)〜(c)に記載の核酸分子のいずれかによってコードされるポリペプチドに対するモノクローナル抗体を用いて単離される、配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドをコードする核酸分子；
(i)(a)〜(h)、好ましくは(a)〜(c)に記載の配列のいずれかを含むプローブ、あるいは(a)〜(h)、好ましくは(a)〜(c)で特徴付けられる核酸の、少なくとも15nt、好ましくは20nt、30nt、50nt、100nt、200nt又は500ntの断片を用いて、ストリンジェントな条件下で適当なライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつ配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドをコードする、核酸分子；並びに
(j)配列番号1、106、124、128又は136で示される配列を含む配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドをコードする核酸分子であって、示された20以下、好ましくは15若しくは10のアミノ酸位置がXで置換され得る及び/又は20以下、好ましくは15若しくは10のアミノ酸が示された配列中に挿入されるか、あるいは示された10以下、好ましくは7のアミノ酸位置がXで置換され得る及び/又は10以下、好ましくは7のアミノ酸が示された配列中に挿入されるか又は該配列から欠失される、上記核酸分子；
あるいはその相補配列を含む核酸分子。
【０１１４】
生物は微生物であることが好ましく、又はより好ましくは植物である。
【０１１５】
「コード」配列又は「コードする」という用語は、本発明に従い、暗号配列及びそれらに対する相補配列又は参照の両者を指し、すなわちDNA及びRNA配列の両者がコードとしてみなされる。例えば、構造遺伝子は転写を介してmRNAを、翻訳を介してタンパク質をコードし、コードmRNAはタンパク質に翻訳される。いずれの分子もコードポリペプチドの配列をもたらす情報を含む、すなわちこれらは後者をコードする。RNA及びポリペプチドの転写後及び翻訳後修飾は当業者に十分に知られており、これらも同様に含まれる。
【０１１６】
本発明に従い、「生物又はその1以上の部分」は生物又は非ヒト生物の細胞、細胞区画、細胞小器官、組織又は器官を指す。
【０１１７】
本発明に従い、「植物又はその一以上の部分」は細胞、細胞区画、細胞小器官、組織、器官又は植物を指す。
【０１１８】
「核酸」、「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」並びに「ポリペプチド」及び「タンパク質」についても本明細書で同義的に使用される。
【０１１９】
本発明の方法において、「核酸」又は「ポリヌクレオチド」はDNA又はRNA配列を指し、これらは一本鎖又は二本鎖であってもよいし、又は場合によりDNA又はRNA中に導入できる合成、非天然又は修飾ヌクレオチド塩基を有してもよい。
【０１２０】
したがって、本発明はさらにポリヌクレオチドに関し、これは以下よりなる群から選択される核酸分子を含む：
(a)配列番号2、107、125、129若しくは137で表される、好ましくは少なくとも成熟形態の、ポリペプチドをコードする、又は配列番号1、106、124、128若しくは136で表される、少なくとも成熟形態の、ポリヌクレオチドを含む、核酸分子；
(b)その配列が(a)に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチド配列から、遺伝子コードの縮重によって誘導できる核酸分子；
(c)その配列が配列番号1、106、124、128若しくは136で表される配列又は配列番号1、106、124、128若しくは136で表される配列を含む配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも30％、好ましくは35％、より好ましくは45％、より一層好ましくは60％、より一層好ましくは70％、80％、90％、95％、97％、98％及び99％同一である配列番号2、107、125、129若しくは137のポリペプチドをコードする、核酸分子；
(d)核酸分子(a)〜(c)によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列の1以上のアミノ酸の置換、欠失及び/又は付加によって、(a)〜(c)に記載のポリヌクレオチドによってコードされる配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドから誘導されるポリペプチドをコードする核酸分子であって、配列番号2、107、125、129又は137をコードする、前記核酸分子； 
(e)(a)〜(d)、好ましくは(a)〜(c)に記載の核酸分子のいずれかによってコードされる配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドの断片又はエピトープをコードし、かつ配列番号2、107、125、129又は137の活性を有するタンパク質をコードする核酸分子；
(f)配列番号96及び97、122及び123、126及び127、及び/若しくは130及び131又はそれらの組合せのプライマーを用いた植物cDNAバンクの増幅、あるいは好ましくは配列番号96及び97、122及び123、126及び127、130及び131並びに/又は138及び139のプライマーを用いた微生物又は植物ゲノムバンクの増幅、により取得される核酸分子配列を含むポリヌクレオチドを含む核酸分子；
(g)(a)〜(f)、好ましくは(a)〜(c)に記載の核酸分子のいずれかによってコードされるポリペプチドに対するモノクローナル抗体を用いて単離された、配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドをコードし、かつ配列番号2、107、125又は129の活性を有するタンパク質をコードする核酸分子；
(h)(a)〜(g)に記載の配列のいずれかを含むプローブ、あるいは(a)〜(g)、好ましくは(a)〜(c)で特徴付けられる核酸の少なくとも15nt、好ましくは20nt、30nt、50nt、100nt、200nt又は500ntの断片を用いて、ストリンジェントな条件下で適当なライブラリーをスクリーニングすることによって取得可能であり、かつ配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドをコードする、核酸分子；
(i)配列番号1、106、124又は128に示される配列を含む配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドをコードする核酸分子であって、示された20以下、好ましくは15若しくは10のアミノ酸位置がXで置換され得る及び/又は20以下、好ましくは15若しくは10のアミノ酸が示された配列に挿入される、又は示された10以下、好ましくは7のアミノ酸位置がXで置換され得る及び/又は10以下、好ましくは7のアミノ酸が示された配列中に挿入されるか又は該配列から欠失される、上記核酸分子；
あるいはそれらの相補鎖であって、(a)〜(i)に記載の前記ポリヌクレオチド又は前記核酸分子が、配列番号1、106、124、128若しくは136で表される配列を含まない、上記相補鎖。
【０１２１】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に示される既に公開されたポリヌクレオチド、例えば配列番号1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94又は108、110、112、114、116、118、120又は106、124又は128又は136のポリヌクレオチドと少なくとも1ヌクレオチド異なる。好ましくは、コードされるポリペプチドは、既に公開されたポリペプチド、例えば配列番号2、4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95又は107、109、111、113、115、117、119、121又は125又は129、137と少なくとも1つのアミノ酸が異なる。
【０１２２】
配列番号1及び2は、例えばYMR095cタンパク質に関してAccession PIR|S55081で開示され、YMR095C核酸配列に関してAccession GENESEQ_DNA|AAA14857で開示されるように、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）のYMR095C遺伝子座に関するポリペプチド（配列番号2）及び核酸配列（配列番号１）を記載する。
【０１２３】
配列番号106及び107は、例えばYGL212Wタンパク質に関してAccessions PIR|S31263で開示され、YGL212w核酸配列に関してZ72734で開示されるように、出芽酵母のYGL212w遺伝子座のポリペプチド（配列番号107）及び核酸配列（配列番号106）を記載する。
【０１２４】
配列番号124及び125は、例えばYMR107wタンパク質に関してAccessions SWISSPROT|YMZ7_YEASTで開示され、YMR107W核酸配列に関してplant|AY558405で開示されるように、出芽酵母のYMR107w遺伝子座に関するポリペプチド（配列番号125）及び核酸配列（配列番号124）を記載する。
【０１２５】
配列番号128及び129は、YDL057Wタンパク質に関してAccessions SPTREMBL|Q07379で開示され、YDL057w核酸配列に関してplant|Z74105で開示されるように、出芽酵母のYDL057w遺伝子座に関するポリペプチド（配列番号129）及び核酸配列（配列番号128）を記載する。
【０１２６】
配列番号136及び137は、YGL217Cタンパク質に関してAccessions NP_011298.1で開示され、YGL217C核酸配列に関してAY693253で開示されるように、出芽酵母のYGL217C遺伝子座に関するポリペプチド（配列番号137）及び核酸配列（配列番号136）を記載する。
【０１２７】
一実施形態では、本発明はさらに、例えば植物由来のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号52、78、90、98、100、102、104、108、118、132又は134のいずれか1つを含むポリペプチドをコードする核酸分子、又は以下よりなる群から選択される核酸分子を含む、上記ポリヌクレオチドに関する：
(a)配列番号53、79、91、99、101、103、105、109、119、133又は135で示される、好ましくは少なくとも成熟形態の、ポリペプチドをコードする、又は配列番号52、78、90、98、100、102、104、108、118、132又は134で表される、好ましくは少なくとも成熟形態の、ポリヌクレオチドを含む、核酸分子；
(b)その配列が(a)に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチド配列から、遺伝子コードの縮重によって誘導できる核酸分子；
(c)その配列が、配列番号52、78、90、98、100、102、104、108、118、132又は134で表される配列あるいは配列番号52、78、90、98、100、102、104、108、118、132又は134で表される配列を含む配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも55％、好ましくは60％、より好ましくは70％、より一層好ましくは80％、より一層好ましくは90％、最も好ましくは95％、96％、97％、98％又は99％同一であるポリペプチドをコードするか、核酸分子；
(d)その配列が、配列番号53、79、91、99、101、103、105、109、119、133又は135で表される配列あるいは配列番号53、79、91、99、101、103、105、109、119、133又は135で表される配列を含む配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも90％、好ましくは95％、96％、97％、98％又は99％同一であるポリペプチドをコードする、核酸分子；
(e)その配列が、配列番号53、79、91、99、101、103、105、109、119、133又は135で表される配列あるいは配列番号53、79、91、99、101、103、105、109、119、133又は135で表される配列を含む配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも65％、より好ましくは70％、より一層好ましくは80％、より一層好ましくは90％、最も好ましくは95％、96％、97％、98％又は99％同一であるポリペプチドをコードする、核酸分子；
(f)その配列が、配列番号53、79、91、99、101、103、105、109、119、133又は135で表される配列あるいは配列番号53、79、91、99、101、103、105、109、119、133又は135で表される配列を含む配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも55％、より好ましくは70％、より一層好ましくは80％、より一層好ましくは90％、最も好ましくは95％、96％、97％、98％又は99％同一であるポリペプチドをコードする、核酸分子；
(g)その配列が、配列番号53、79、91、99、101、103、105、109、119、133又は135で表される配列あるいは配列番号53、79、91、99、101、103、105、109、119、133又は135で表される配列を含む配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも35％、より好ましくは50％、60％又は70％、より一層好ましくは80％、より一層好ましくは90％、最も好ましくは95％、96％、97％、98％又は99％同一であるポリペプチドをコードする、核酸分子；
(h)その配列が、配列番号53、79、91、99、101、103、105、109、119、133又は135で表される配列あるいは配列番号53、79、91、99、101、103、105、109、119、133又は135で表される配列を含む配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも55％、好ましくは60％、より好ましくは70％、より一層好ましくは80％、より一層好ましくは90％、最も好ましくは95％、96％、97％、98％又は99％同一であるポリペプチドをコードする、核酸分子；
(i)その配列が、配列番号53、79、91、99、101、103、105、109、119、133又は135で表される配列あるいは配列番号53、79、91、99、101、103、105、109、119、133又は135で表される配列を含む配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも90％、好ましくは95％、96％、97％、98％又は99％同一であるポリペプチドをコードする、核酸分子；
(j)(a)〜(i)の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列の1以上のアミノ酸の置換、欠失及び/又は付加によって、(a)〜(i)に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドから誘導されるポリペプチドをコードする、核酸分子；
(k)(a)〜(j)に記載の核酸分子のいずれかによってコードされるポリペプチドの断片又はエピトープをコードする、核酸分子；
(l)配列番号96及び97、122及び123、126及び127、130及び131並びに/若しくは138及び139、又はそれらの組合せのプライマーによる微生物又は植物cDNAライブラリー、あるいは好ましくは微生物又は植物ゲノムライブラリー、の増幅によって取得される核酸分子配列を含むポリヌクレオチドを含む、核酸分子；
(m)(a)〜(l)に記載の核酸分子のいずれかによってコードされるポリペプチドに対するモノクローナル抗体を用いて単離された、配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドをコードする核酸分子；
(n)(a)〜(m)に記載の配列のいずれかを含むプローブ、あるいは(a)〜(m)で特徴付けられる核酸の少なくとも15nt、好ましくは20nt、30nt、50nt、100nt、200nt又は500ntの断片を用いて、ストリンジェントな条件下で適当なライブラリーをスクリーニングすることによって取得でき、かつポリペプチドをコードする、核酸分子；
(o)配列番号2、107、125、129又は137で示される配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子であって、示された20以下、好ましくは15若しくは10のアミノ酸位置がXで置換され得る及び/又は20以下、好ましくは15若しくは10のアミノ酸が示された配列若しくは配列番号2、107、125、129又は137中に挿入されるか又は該配列から欠失される、あるいは示された10以下、好ましくは7のアミノ酸位置がXで置換され得る及び/又は10以下、好ましくは7のアミノ酸が示された配列中に挿入されるか又は該配列から欠失される、上記核酸分子；
あるいはそれらの相補鎖であって、好ましくは(a)〜(o)に記載の前記ポリヌクレオチド又は前記核酸分子が配列番号1、106、124、128若しくは136に記載の配列又はそれらと相補的な配列を含まない、上記相補鎖。
【０１２８】
原則的に、配列番号2、107、125、129又は137の活性を有するポリペプチドをコードする任意の核酸を本発明の方法で使用し得る。バイオマスがより高い又は収量がより高い植物を作製する場合には、かかる核酸が植物（藻類、コケ類又は高等植物）由来であることが有利である。
【０１２９】
本発明の方法において、核酸配列は以下の配列よりなる群から選択されることが有利である：配列番号52、78、90、98、100、102、104、108、118、132、134の配列又は依然として配列番号2、107、125、129若しくは137の生物学的活性を有するポリペプチドをコードする上述されるこれらの誘導体若しくはホモログ。これらの配列は、発現構築物中に個々に又は組合せてクローニングされる（他の遺伝子共にクローニングすることを含む）。
【０１３０】
配列番号2、107、125、129又は137の活性を有するポリペプチドをコードする特定の供与生物の核酸配列は、一般的には通常入手可能である。ここでは一般的な遺伝子データベース、例えばEMBLデータベース(Stoesser G.ら, Nucleic Acids Res. 2001, Vol. 29, 17-21)、GenBankデータベース(Benson D.A.ら, Nucleic Acids Res. 2000, Vol. 28, 15-18)、又はPIRデータベース(Barker W. C.ら, Nucleic Acids Res. 1999, Vol. 27, 39-43)を特に記載する必要がある。さらに、生物特異的遺伝子データベース、例えば有利には、酵母に関するSGDデータベース(Cherry J. M.ら, Nucleic Acids Res. 1998, Vol. 26, 73-80)若しくはMIPSデータベース(Mewes H.W.ら, Nucleic Acids Res. 1999, Vol. 27, 44-48)、大腸菌に関するGenProtECデータベース(http://web.bham.ac.uk/bcm4ght6/res.html)、又はシロイヌナズナに関するTAIRデータベース(Huala, E.ら, Nucleic Acids Res. 2001 Vol. 29(1), 102-5)若しくはMIPSデータベース等を使用することができる。
【０１３１】
本発明の方法に使用される配列番号2、107、125、129又は137と使用される非ヒト生物とが同一起源に由来するか又は可能な限り遺伝的に近縁の起源に由来（例えば同一の又は非常に密接に関係するタイプ若しくは種に由来）することが有利である。しかし、合成の配列番号2、107、125、129又は137も非ヒト生物において使用し得る。
【０１３２】
別の実施形態では、非ヒト生物由来のものでない本発明のタンパク質をコードする遺伝子を使用することが有利であり得、その際、その由来する生物中に遺伝子が過剰発現される際にしばしば生じる同時抑制（cosuppression）の問題を回避するように本発明を実施するべきである。
【０１３３】
「遺伝子」という用語は、本発明に従い、暗号遺伝子断片及び調節要素を含む核酸配列を指す。「暗号遺伝子断片」は、本発明に従い、連続的核酸配列（「オープンリーディングフレーム」、略記ORF）を指す。かかるORFは、適当なスプライス部位を介してORF中に存在するエクソンに結合する1以上のイントロンを含まなくてもよい。ORF及びその調節要素は、例えば酵素、輸送体、イオンチャネル等に翻訳される構造遺伝子、又は例えば調節遺伝子（Rho若しくはSigmaタンパク質等）等の非構造遺伝子をコードする。しかし、タンパク質に翻訳されない遺伝子をさらにコードしてもよい。非ヒト生物の発現では、暗号遺伝子断片は、例えばプロモーター、ターミネーター、UTR等の特定の調節要素と共に発現される。調節要素は同種又は異種起源であり得る。遺伝子、暗号遺伝子断片（ORF）、調節配列は、本明細書の下記で、核酸及びポリヌクレオチドという用語によって包含される。
【０１３４】
「発現」という用語は、暗号遺伝子断片又は遺伝子の転写及び/又は翻訳を指す。生じる産物は、通常はmRNA又はタンパク質である。しかし、発現した産物は、例えば調節RNA又はリボザイム等のRNAも含む。発現は全身的又は局所的（例えば特定の細胞型、組織又は器官に制限される）であり得る。発現は、転写の範囲に、特にrRNA、tRNA及びmRNAの転写からRNAの輸送及び転写産物のプロセシングに関連するプロセスを含む。タンパク質生合成の範囲に、特にリボソーム生合成、翻訳、翻訳制御及びアミノアシル-tRNAシンセターゼが含まれる。タンパク質のプロセシング範囲に含まれる機能は、特に折りたたみ及び安定化、標的化、分類(sorting)、転移、タンパク質修飾、タンパク質複合体のアセンブリ、及びタンパク質のタンパク質分解に関する。
【０１３５】
暗号遺伝子断片（ORF）及びその調節要素の発現産物は、その機能によって特徴付けることができる。その機能の例は、以下の範囲のものである：代謝、エネルギー、転写、タンパク質合成、タンパク質プロセシング、細胞輸送及び輸送機構、細胞間情報伝達（cellular communication）及び情報伝達、細胞レスキュー、細胞防御及び細胞毒性、細胞環境の調節及び細胞のその環境との相互作用、細胞運命、可搬型要素、ウイルスタンパク質及びプラスミドタンパク質、細胞構成の制御、細胞内位置、タンパク質活性の調節、結合機能を有するタンパク質又は補因子要件、並びに輸送の促進。同一の機能を有する遺伝子は、共に「機能的遺伝子ファミリー」にクループ分けされる。本発明に従い、配列番号1、106、124、128又は136の発現により成長速度の増加が生じる。
【０１３６】
ポリヌクレオチドは通常、発現のために、コード遺伝子領域の3'及び5'末端に非翻訳配列、例えば、コード領域の5'末端上流の500〜100ヌクレオチドの配列、及び/又は、例えばコード領域の3'末端下流の200〜20ヌクレオチドの配列を含む。「単離された」核酸分子は、核酸の天然源に存在する他の核酸分子から除かれる。「単離された」核酸は、該核酸の起源となる生物のゲノムDNA中の核酸に本来隣接する配列（例えば、該核酸の5'及び3'末端に位置する配列）を有しないことが好ましい。様々な実施形態では、配列番号1、106、124、128又は136の単離された核酸分子は、例えば、該核酸分子の起源となる細胞のゲノムDNA中の核酸分子に本来隣接する、5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5、0.1kb又は0kbのヌクレオチド配列を含んでもよい。
【０１３７】
本発明の方法で使用される核酸分子、例えば本発明の方法で使用される核酸分子又はその一部分のヌクレオチド配列を有する核酸分子は、標準的な分子生物学的技術及び本明細書で提供される配列情報を用いて単離し得る。例えば、比較アルゴリズムを用いて、相同配列又は保存された相同配列領域をDNA又はアミノ酸レベルで同定することも可能である。これらの配列領域は、例えばSambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されるような、標準的なハイブリダイゼーション技術により、ハイブリダイゼーションプローブとして使用して、本発明に有用な更なる核酸配列を単離することもできる。さらに、配列番号1、106、124、128若しくは136又は配列番号3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、98、100、102若しくは104又は108、110、112、114、116、118、120、132若しくは134の完全な配列を含む核酸分子、又は本発明の方法に使用される他の核酸分子、あるいはそれらの一部分は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって単離でき、公知の方法に従って作製できる。適当なヌクレオチドプライマーと、鋳型として逆転写酵素により調製したcDNA又はゲノムDNAとを用いる標準的なPCR増幅によって、本発明の核酸を増幅することが可能である。このように増幅した核酸は適当なベクターにクローニングすることができ、DNA配列分析によって特徴付けられる。
【０１３８】
本発明の方法で使用される核酸分子のホモログの例は、配列番号3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、98、100、102若しくは104又は108、110、112、114、116、118、120、132若しくは134で表されるヌクレオチド配列のいずれかと、少なくとも30％、好ましくは40％、より好ましくは50％、60％、70％、80％又は90％、そしてより一層好ましくは95％、96％、97％、98％、99％以上同一である対立遺伝子変異体である。対立遺伝子変異体は特に、配列番号3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、98、100、102若しくは104又は108、110、112、114、116、118、120、132若しくは134で表される配列におけるヌクレオチドの欠失、挿入又は置換によって取得できるが、これらにより合成されるタンパク質の配列番号2、107、125、129又は137の活性を保持又は増加する目的を有する、機能的変異体を含む。配列番号2、107、125、129又は137の生物学的又は酵素活性を依然として保持するタンパク質は、さらに、その活性が配列番号4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、99、101、103若しくは105又は109、111、113、115、117、119、121、133若しくは135によってコードされるタンパク質と比較して実質的に低減されないタンパク質、すなわち本来の生物学的活性の5％、好ましくは20％、特に好ましくは30％、さらに好ましくは40％以上有するタンパク質を含む。
【０１３９】
しかし、相同な活性が特定の非ヒト生物中での配列番号1、106、124、128又は136の異種発現と比較して増加することが好ましい。
【０１４０】
本発明の方法に使用される配列番号1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、98、100、102若しくは104又は108、110、112、114、116、118、120若しくは106、124若しくは128又は132、134若しくは136の核酸分子のホモログは、例えば、原核生物若しくは真核生物の、すなわち例えば細菌、動物、真菌及び植物のホモログ、先端切断型配列、コード及び非コードDNA配列の一本鎖DNA又はRNAを指す。
【０１４１】
本発明の方法に使用される配列番号1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、98、100、102若しくは104又は108、110、112、114、116、118、120若しくは106、124若しくは128又は132、134若しくは136の核酸分子のホモログは、誘導体、例えばコード配列又は調節配列（例えばプロモーター、UTR、エンハンサー、スプライスシグナル、プロセシングシグナル、ポリアデニル化シグナル等）の変異体等も含む。示されたヌクレオチド配列の誘導体は、1以上のヌクレオチド置換によって、挿入及び/又は欠失によって、機能性又は活性を破壊することなく改変し得る。さらに、誘導体の活性は、その配列の改変によって増加するか又は、該誘導体をより活性な要素（異種の生物由来のものでも）で完全に置換することが可能である。
【０１４２】
2つのアミノ酸配列（例えば、配列番号2、4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、99、101、103若しくは105又は107若しくは109、111、113、115、117、119、121若しくは125、又は129、133、135若しくは137の配列のいずれか）、あるいは2つの核酸配列（例えば配列番号1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、98、100、102若しくは104又は108、110、112、114、116、118若しくは120又は106、124若しくは128又は132、134若しくは136のいずれか）の相同性（＝同一性）％を測定するために、配列を、例えば、該配列を整列させることにより、又は両配列をコンピュータープログラムを用いて分析することによって、互いに比較する。1つのタンパク質又は1つの核酸の配列中にギャップを導入して、他のタンパク質又は他の核酸との最適なアライメントを作成し得る。次いで、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。1つの配列中の位置が、他の配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基又は同一のヌクレオチドで占められている場合は、これらの分子はこの位置で同一である（すなわち、本明細書で使用されるアミノ酸又は核酸「相同性」は、アミノ酸又は核酸「同一性」に等しい）。2つの配列間の相同性％は、配列が共有する同一位置数の関数（すなわち、相同性％＝同一位置数/位置の総数×100）である。したがって、相同性及び同一性という用語は本明細書で同義的に使用される。
【０１４３】
2つのタンパク質又は核酸配列間の「同一性」は、完全長にわたる同一性を指し、特に実施例に記載されるように実施した同一性を指す。
【０１４４】
NCBI標準設定、すなわち以下のパラメーターをアミノ酸配列のblastp比較に用いた：「組成に基づく統計値」及び「低コンプレキシティーフィルター」、「Expect」:10、「Word Size」:3、「Matrix」:Blosum62及び「Gap cost」：Existence : 11 Extension 1。
【０１４５】
配列番号2及び107のアミノ酸配列に対する様々なアミノ酸配列の同一性を、一例として、図3中の配列番号2及び図4中の配列番号107について下記に示す。
【０１４６】
しかし、2以上のアミノ酸又は2以上のヌクレオチド配列の相同性（同一性）％の決定のために、様々な他のコンピューターソフトウェアプログラムが開発されている。2以上の配列の相同性は、例えばfastaソフトウェア（現在はfasta 3バージョンで使用されている）を用いて算出することができる（W. R. Pearson及びD. J. Lipman (1988), Improved Tools for Biological Sequence Comparison. PNAS 85:2444-2448; W. R. Pearson (1990) Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA, Methods in Enzymology 183:63-98; W. R. Pearson及びD. J. Lipman (1988) Improved Tools for Biological Sequence Comparison.PNAS 85:2444- 2448; W. R. Pearson (1990); Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA Methods in Enzymology 183:63-98）。異なる配列の相同性を算出するための他の有用なプログラムは、Biomax pedantソフトウェア(Biomax, Munich, Federal Republic of Germany)に含まれる標準的なblastプログラムである。あいにく、Blastは対象及びクエリの完全な配列を常に含むわけではないため、しばしば次善最適な結果をもたらす。それでもなお、このプログラムは非常に効率的であるため、膨大な数の配列の比較に使用することができる。かかる配列の比較のために典型的に以下の設定を使用する:
-p  プログラム名[String];-d  データベース[String];デフォルト=nr;-i  クエリファイル[File In];デフォルト=stdin;-e  期待値(E)[Real];デフォルト=10.0;-m  アライメント表示オプション:0=ペアワイズ;1=同一性を示すクエリ-アンカー;2 =クエリ-アンカー同一性なし;3 =同一性を示す均一なクエリ-アンカー; 4=均一なクエリ-アンカー、同一性なし;5 =クエリ-アンカー同一性及び平滑末端なし;6=均一なクエリ-アンカー、同一性及び平滑末端なし;7=XML Blast出力;8=表（tubular）;9  注釈付きの表[Integer];デフォルト=0;-o  BLASTレポート出力ファイル[File Out]  任意;デフォルト=stdout;-F  フィルタークエリ配列(blastnで用いるDUST、その他で用いるSEG)[String];デフォルト=T;-G  ギャップを開始するためのコスト(0はデフォルトの動作を起動する)[Integer];デフォルト=0;-E  ギャップを伸長するためのコスト(0はデフォルトの動作を起動する)[Integer];デフォルト=0;-X  ギャップアライメントに関するX減少値(ビット)(0はデフォルトの動作を起動する);blastn 30、megablast 20、tblastx 0、その他全て15[Integer];デフォルト=0;-I  deflinesにおけるGI’sを示す[T/F];デフォルト=F;-q  ヌクレオチド不一致に対するペナルティ(blastnのみ)[Integer];デフォルト=-3;-r  ヌクレオチド一致に対する報酬(blastnのみ)[Integer];デフォルト=1;-v  (V)に関する一行記載を示すデータベース配列数[Integer];デフォルト=500;-b  (B)に関するアライメントを示すデータベース配列数[Integer]; デフォルト= 250; -f  ヒットを伸長するための閾値、0の場合はデフォルト;blastp 11、blastn 0、blastx 12、tblastn 13;tblastx 13、megablast 0[Integer];デフォルト=0;-g  ギャップアライメントを実行する(tblastxで利用可能でない)[T/F];デフォルト=T;-Q  使用するクエリ遺伝子コード[Integer];デフォルト=1; -D  DB遺伝子コード(tblast[nx]用のみ)[Integer];デフォルト=1; -a  使用するプロセッサー数[Integer];デフォルト=1;-O  SeqAlignファイル[File Out]  任意;-J  クエリdefline[T/F]を真とする;デフォルト= F;-M  行列[String];デフォルト=BLOSUM62; -W  ワードワイズ、0の場合はデフォルト(blastn 11、megablast 28、その他全て3)[Integer];デフォルト= 0; -z  データベースの効果的長さ(実サイズに関して0を使用する)[Real];デフォルト=0;-K  維持する領域からの最大ヒット数(100の値を使用することが推奨される場合は、デフォルトで解除)[Integer];デフォルト=0;-P  複数ヒットに関して0、シングルヒットに関して1[Integer];デフォルト=0;-Y  検索空間の効果的長さ(実サイズに関して0を使用する)[Real];デフォルト=0;-S  データベースに対して検索するクエリ鎖(blast[nx]及びtblastx用);3は両方、1はトップ、2はボトム[Integer];デフォルト=3;-T  HTML出力を作成する[T/F];デフォルト= F; -l  GI’sのリストに対するデータベースの制限検索[String]  任意; -U  FASTA配列の小文字フィルタリングを使用する[T/F]  任意; デフォルト=F;-y  ギャップのない伸長に対するX減少値(ビット)(0.0はデフォルトの動作を起動する);blastn 20、megablast 10、その他全て7[Real];デフォルト=0.0;-Z  最終ギャップアライメントに対するX減少値(ビット)(0.0はデフォルトの動作を起動する);blastn/megablast 50、tblastx 0、その他全て25[Integer];デフォルト=0;-R  PSI-TBLASTNチェックポイントファイル[File In]  任意; -n  MegaBlast検索[T/F];デフォルト=F; -L  クエリ配列上の位置[String]  任意;-A  複数ヒットウインドウのサイズ、0の場合はデフォルト(blastn/megablast 0、その他全て40[Integer];デフォルト=0;-w  フレームシフトペナルティ(blastxに関してはOOFアルゴリズム)[Integer];デフォルト=0;-t  tblastnで許容されるHSPsを関連付けるためのイントロンの最大の長さ(0は関連付けを不能にする)[Integer];デフォルト=0。
【０１４７】
良質の結果は、Needleman及びWunsch又はSmith及びWatermanのアルゴリズムを用いることによって得られる。したがって、前記アルゴリズムを基礎とするプログラムが好ましい。配列の比較をプログラムPileUp(J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higginsら, CABIOS, 5 1989: 151-153)又は好ましくはプログラムGap及びBestFit（これらはそれぞれNeedleman及びWunsch(J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970))並びにSmith及びWaterman(Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981))のアルゴリズムを基礎とする）を用いて行い得ることが有利である。いずれのプログラムもGCGソフトウェアパッケージ（Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991); Altschulら(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 et SEQ）の一部である。したがって配列相同性の割合を決定するための計算をプログラムGapを用いて配列の全体領域にわたって行うことが好ましい。核酸配列の比較のために以下の標準的な調整（adjustment）を使用し得る：ギャップウェイト: 50、長さ重み付け:3、平均一致:10.000、平均不一致: 0.000。
【０１４８】
本発明の方法に有利な核酸分子は、本明細書に開示される核酸に対するその相同性に基づいて単離し、及び本発明の方法において、標準的なハイブリダイゼーション技術に従い、ハイブリダイゼーションプローブとしてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で該配列又はその一部分を用いることによって使用できる。これらは例えば、参照により本明細書に明示的に組み入れるUS 2002/0023281にも記載される。ここで、例えば少なくとも10、好ましくは少なくとも15ヌクレオチドの長さであり、かつ配列番号1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、98、100、102若しくは104又は108、110、112、114、116、118若しくは120又は106、124若しくは128又は132、134若しくは136の核酸配列を含む核酸分子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、単離された核酸分子を使用することが可能である。本明細書で使用される「好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、互いに少なくとも20％同一であるヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズするハイブリダイゼーション及び洗浄条件を記述することを意図する。本明細書で使用される「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、互いに30％、好ましくは50％以上同一であるヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズするハイブリダイゼーション及び洗浄条件を記述すること意図する。互いに60％、より好ましくは75％、そしてより一層好ましくは少なくとも約85％以上同一である配列が、互いのハイブリダイゼーションを通常維持するような条件であることが好ましい。これらのストリンジェントな条件は当業者に知られ、かつCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6., 又はSambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989で見出すことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、6ｘ塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中、約45℃でのハイブリダイゼーションに続く、0.2ｘSSC、0.1％ SDS中、50〜65℃での1回以上の洗浄ステップである。これらのハイブリダイゼーション条件が、核酸のタイプ、特にAT又はGC含量、又は、洗浄の温度、継続時間に対する有機溶媒の存在、並びにハイブリダイゼーション溶液及び洗浄溶液の塩濃度に応じて異なることが当業者に知られている。「標準的なハイブリダイゼーション条件」下で、例えば、温度は、核酸のタイプに応じて、0.1〜5ｘSSCの濃度の水性バッファー（pH 7.2）中、42℃〜58℃で異なる。有機溶媒（例えば50％ホルムアミド）が上述のバッファー中に存在する場合、標準的な条件下での温度は約42℃である。DNA:DNAハイブリッドのためのハイブリダイゼーション条件は、例えば0.1ｘSSC及び20℃〜45℃、好ましくは30℃〜45℃である。DNA:RNAハイブリッドのためのハイブリダイゼーション条件は、例えば0.1ｘSSC及び30℃〜55℃、好ましくは45℃〜55℃であることが好ましい。上述のハイブリダイゼーション温度は、例えば約100bp(＝塩基対)の長さでかつ50％のG＋C含量を有する核酸について、ホルムアミドの不在下で決定する。当業者は、必要なハイブリダイゼーション条件を上述したもの又は以下の教本等の教本に基づいてどのように決定するかを知っている：Sambrook,「Molecular Cloning」, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989；Hames及びHiggins (編集) 1985, 「Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach」、IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (編集) 1991, 「Essential Molecular Biology: A Practical Approach」、IRL Press at Oxford University Press, Oxford又は「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley & Sons, N. Y. (1989)。
【０１４９】
DNAハイブリダイゼーション（サザンブロットアッセイ）及び洗浄ステップのための条件の幾つかの例を本明細書下記に示す：
(1)ハイブリダイゼーション条件を、例えば以下の条件から選択することができる：
a)4X SSC、65℃、
b)6X SSC、45℃、
c)6X SSC、100mg/mlの変性断片化魚類精子DNA、68℃、
d)6X SSC、0.5％ SDS、100mg/ml変性サーモン精子DNA、68℃、
e)6X SSC、0.5％ SDS、100mg/ml変性断片化サーモン精子DNA、50％ホルムアミド、42℃、
f)50％ホルムアミド、4X SSC、42℃、
g)50％(vol/vol)ホルムアミド、0.1％ウシ血清アルブミン、0.1％Ficoll、0.1％ポリビニルピロリドン、50mM リン酸ナトリウムバッファー(pH 6.5)、750mM NaCl、75mMクエン酸ナトリウム、42℃、
h)2X又は4X SSC、50℃(低ストリンジェント条件)、又は
i)30〜40％ ホルムアミド、2X又は4X SSC、42℃(低ストリンジェント条件)。
【０１５０】
(2)洗浄ステップは、例えば以下の条件から選択することができる:
a)0.015M NaCl/0.0015M クエン酸ナトリウム/0.1％ SDS、50℃
b)0.1X SSC、65℃、
c)0.1X SSC、0.5％ SDS、68℃、
d)0.1X SSC、0.5％ SDS、50％ホルムアミド、42℃、
e)0.2X SSC、0.1％ SDS、42℃、
f)2X SSC、65℃(低ストリンジェント条件)。
【０１５１】
さらに、配列番号2、107、125、129若しくは137又は様々な生物由来のタンパク質、すなわちその後順次的に縮重プライマーを誘導し得る保存領域、と相同なタンパク質配列を比較することによって同定可能である。これらの縮重プライマーは、その後、他の生物由来の新規相同遺伝子の断片の増幅のために、PCRによってさらに使用し得る。次いで、これらの断片は完全な遺伝子配列を単離するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用し得る。あるいは、欠落した5'及び3'配列は、RACE-PCRを用いて単離し得る。この関連で、特に、US 2002/0023281、分子生物学的方法における上記文献、特にSambrook, 「Molecular Cloning」及び「Current Protocols in Molecular Biology」, John Wiley & Sons中の開示を参照されたい。
【０１５２】
本発明の方法に使用される、特に配列番号4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、99、101、103若しくは105又は109、111、113、115、117、119、121、133若しくは135又は2、107、125、129若しくは137のタンパク質配列と相同なタンパク質をコードする単離された核酸分子は、例えば1以上のアミノ酸置換、付加又は欠失がコードタンパク質中に導入されるように配列番号1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、98、100、102若しくは104又は108、110、112、114、116、118若しくは120、又は106、124若しくは128又は132、134若しくは136のヌクレオチド配列中に1以上のヌクレオチド置換、付加又は欠失を導入することによって作製し得る。突然変異は、標準的な技術（部位特異的突然変異誘発及びPCR仲介突然変異誘発等）を用いて本発明の方法で使用される核酸分子の配列のいずれかに導入し得る。予測される非必須アミノ酸残基の1以上に保存的アミノ酸置換を作製することが好ましい。「保存的アミノ酸置換」において、アミノ酸残基は同種の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される。同種の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を持つアミノ酸を含む。したがって、予測される非必須アミノ酸残基は、同一の側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換されることが好ましい。置換アミノ酸が本来のアミノ酸のものと類似の性質を有する「保存的」置換、例えばGluについてAsp、GlnについてAsn、ValについてIle、LeuについてIle、SerについてThr、の置換を実施することが好ましい。
【０１５３】
あるいは別の実施形態では、突然変異は、例えば飽和突然変異誘発によって、コード配列の全て又は一部分の全域で無作為に導入してもよく、生じた突然変異体を本明細書に記載される活性についてスクリーニングして、例えば成長速度が増加した植物、好ましくはより成長が早い及び/又は収量が高い植物をもたらす突然変異体を同定し得る。突然変異誘発後、コードタンパク質は組換え発現することができ、該タンパク質の活性は例えば本明細書に記載のアッセイを用いて測定し得る。
【０１５４】
本発明の方法で使用される核酸分子はタンパク質又はその一部分をコードする。前記タンパク質又はその個々のタンパク質若しくは一部分は、上で示される1つのコンセンサス配列又はコアコンセンサス配列、例えば図1若しくは2に示されるアミノ酸配列であって、図1又は2において大文字で示された20以下、好ましくは15若しくは10、好ましくは9、8、7若しくは6、より好ましくは5若しくは4、より一層好ましくは3、より一層好ましくは2、より一層好ましくは1、最も好ましくは0のアミノ酸位置がｘで置換できる、及び/又は図1若しくは2において大文字で示された5以下、好ましくは4、より一層好ましくは3若しくは2、最も好ましくは1以下のアミノ酸位置がｘで置換される、及び/又は20以下、好ましくは15若しくは10、好ましくは9、8、7若しくは6、より好ましくは5若しくは4、より一層好ましくは3、より一層好ましくは2、より一層好ましくは1、最も好ましくは0のアミノ酸がコンセンサス配列に挿入されるか又は該配列から欠失される、あるいは該タンパク質又はその一部分が配列番号2又は107の活性を維持するように、配列番号2、4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、99、101、103若しくは105又は107、109、111、113、115、117、119、121、133若しくは135又は137のアミノ酸配列と十分に相同である、アミノ酸配列を含むことが好ましい。
【０１５５】
この核酸分子にコードされるタンパク質又はその一部が、とりわけより成長速度が高い又はより成長が早い標的生物、好ましくは標的植物をもたらすその本質的な生物学的活性を有することにより、より高いバイオマスの産生及び収量の増加をもたらすことが好ましい。タンパク質の保存領域は、タンパク質又はタンパク質ファミリーの様々なメンバーの、様々なホモログ又は誘導体の配列比較によって決定し得る。さらに、その配列及び他の性質により、タンパク質の構造を予測するコンピュータープログラムが当業者に知られる。抗体結合調査及びプロテアーゼ消化に対するタンパク質ドメインの感受性又は超感受性の調査は、同様にポリペプチドの構造又は特定の環境、例えば細胞中でのその位置を調査するのに使用し得る。さらに、タンパク質を特徴付けるためのこの種の別の方法が当業者に知られ、本明細書に記載の文献、例えばUS 2002/0023281にも開示されている。
【０１５６】
使用されるタンパク質の一部分又はドメインは、本明細書に記載される配列間で、例えば植物配列、又は動物配列間で、好ましくは全ての配列間で高度に保存されることが好ましい。
【０１５７】
核酸分子によってコードされるタンパク質が、配列番号4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、99、101、103若しくは105又は109、111、113、115、117、119、121、133若しくは135のアミノ酸配列と少なくとも20％、好ましくは40％、より好ましくは50％、60％、70％、80％又は90％、最も好ましくは95％、96％、97％、98％、99％以上相同であることが有利である。上記タンパク質が、配列番号4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、99、101、103若しくは105又は109、111、113、115、117、119、121、133若しくは135の全アミノ酸配列と本質的に一部相同であり、かつ好ましくは配列番号4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、99、101、103若しくは105又は109、111、113、115、117、119、121、133若しくは135で表されたオープンリーディングフレームから誘導される全長タンパク質であることが好ましい。しかし、上述されるコアコンセンサス配列又はコンセンサス配列（例えば図1及び2に示される）が維持されることが好ましい。
【０１５８】
使用されるタンパク質又はポリペプチドの「本質的な生物学的活性」は、上で論じられるように、該タンパク質又はポリペプチドが配列番号2、107、125、129又は137の生物学的活性を保持することを指す。「配列番号2、107、125、129又は137の生物学的活性」は、非ヒト生物におけるこのポリペプチドの発現が、該ポリペプチドを発現しないか又はより少ない程度で発現する非ヒト生物に比較して5％以上で成長の促進又は収量の増加をもたらすことを指す。10％、より一層好ましくは20％まで、最も好ましくは50％、100％若しくは200％又はそれ以上まで促進されることがより好ましい。調査し得る配列番号2、107、125、129又は137と相同な配列の生物学的活性を測定するための試験系は、シロイヌナズナでの発現の表現型、又は適切な場合には、さらに相同核酸が誘導される生物中での（過剰）発現である。
【０１５９】
配列番号2、107、125、129又は137及びそのホモログの細胞活性又は機能は、上述されるように依然として知られておらず、その結果、in vitroアッセイ系も同様に依然として利用可能ではない。しかし、おそらく当業者は配列番号2、107、125、129又は137のタンパク質又はポリペプチドの比活性を、該タンパク質又はポリペプチドを細胞中で、好ましくは不完全細胞中で(過剰)発現させること、及びこれを不完全細胞の表現型と比較することによって測定可能であろう。
【０１６０】
本発明で有利に使用し得るタンパク質は、藻類若しくはコケ類等の植物生物、又は特に高等植物由来のものである。
【０１６１】
したがって、本発明の方法の一実施形態では、ポリヌクレオチドを非ヒト生物、特に植物、有用動物若しくは微生物、又はその1以上の部分に導入することを含み、その際、該ポリヌクレオチドは配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドをコードする。ポリヌクレオチドが本明細書で特徴付けられるポリヌクレオチド、特に配列番号4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、99、101、103若しくは105又は109、111、113、115、117、119、121、133若しくは135又は2、106、124、128若しくは137の配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むこと、本明細書で特徴付けられる核酸分子、特に配列番号1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、98、100、102若しくは104若しくは108、110、112、114、116、118若しくは120若しくは106、124若しくは128若しくは132、134若しくは136によってコードされるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むこと、あるいはより成長が早い、より収量が高い及び/又はよりストレスに対する耐性が高いトランスジェニック植物が得られるようにこれらの配列のいずれかを含むことが好ましい。本明細書で記載された植物配列又はその植物ホモログのいずれかを発現する植物、本明細書で記載された動物配列又はその動物ホモログを発現する動物、及び本明細書で記載された微生物配列又はその微生物ホモログを発現する微生物が好ましい。しかし、上記の通り、配列番号1、106、124、128又は136の酵母核酸も、植物において配列番号2、107、125、129又は137の活性を示す。
【０１６２】
一実施形態では、本発明は、好ましくは上述の活性に寄与する、本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチドに関する。
【０１６３】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドの製造方法であって、該ポリペプチドが本発明の宿主細胞中で、好ましくはトランスジェニック微生物又はトランスジェニック植物細胞中で発現される、上記方法に関する。
【０１６４】
一実施形態では、ポリペプチドの製造方法で使用される核酸分子は、宿主細胞として真核生物を用いて、微生物から誘導される。一実施形態では、ポリペプチドは原核生物又は菌類若しくは藻類、あるいは他の微生物（植物ではない）から誘導される核酸分子により、植物細胞又は植物中で産生される。
【０１６５】
当業者は、異なる生物で発現されるタンパク質及びDNAが、多くの観点及び性質、例えばメチル化、分解及び翻訳後修飾（例えばグルコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、ADPリボシル化、ファルネシル化、カルボキシル化、硫酸化、ユビキチン化等）において異なるが、同一のコード配列を有することを知っている。したがって、対応するタンパク質の細胞発現の制御が、内因的タンパク質又は他の真核生物のタンパク質の活性及び発現を制御する制御機構において異なることが好ましい。
【０１６６】
本発明のポリペプチドは、組換えDNA技術によって製造されることが好ましい。例えば、タンパク質をコードする核酸分子をベクターにクローニングし（上述されるように）、ベクターを宿主細胞に導入し（上述されるように）、そして該ポリペプチドを宿主細胞内で発現させる。次いで、該ポリペプチドは、標準的なタンパク質精製技術を用いて、適当な精製スキームにより細胞から単離することができる。組換え発現の代わりに、本発明のポリペプチド又はペプチドは、標準的なペプチド合成技術を用いて化学的に合成することができる。さらに、天然のポリペプチドは、例えば記載される本発明の抗体を用いて細胞（例えば内皮細胞）から単離することができ、該抗体は本発明のポリペプチド又はその断片、すなわち本発明のポリペプチドを利用する標準的な技術によって製造することができる。
【０１６７】
一実施形態では、本発明は、配列番号2に示されるポリペプチド配列又はそのホモログの50％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％又は99,5％以上を含むか又はこれらよりなるポリペプチドに関し、好ましくは配列番号2に示される配列から構成されない。
【０１６８】
一実施形態では、本発明のタンパク質は配列番号2に示される配列を含まない。
【０１６９】
一実施形態では、本発明は、液胞形態形成タンパク質VAM7に関する。一実施形態では、本発明は配列番号107又はそのホモログの50％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％又は99.5％以上を含むか又はこれらよりなるポリペプチドに関し、好ましくは配列番号107に示される配列から構成されない。
【０１７０】
一実施形態では、本発明のタンパク質は配列番号107に示される配列を含まない。
【０１７１】
一実施形態では、本発明は、配列番号125又はそのホモログの50％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％又は99.5％以上を含むか又はこれらよりなるポリペプチドに関し、好ましくは配列番号125に示される配列から構成されない。
【０１７２】
一実施形態では、本発明のタンパク質は配列番号125に示される配列を含まない。
【０１７３】
一実施形態では、本発明は配列番号129又はそのホモログの50％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％又は99.5％以上を含むか又はこれらよりなるポリペプチドに関し、好ましくは配列番号129に示される配列から構成されない。
【０１７４】
一実施形態では、本発明のタンパク質は配列番号129に示される配列を含まない。
【０１７５】
一実施形態では、本発明は、配列番号137又はそのホモログの50％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％又は99.5％以上を含むか又はこれらよりなるポリペプチドに関し、好ましくは配列番号137に示される配列から構成されない。
【０１７６】
一実施形態では、本発明のタンパク質は配列番号137に示される配列を含まない。
【０１７７】
一実施形態では、本発明は、本発明の核酸分子によってコードされ、又は本発明の方法によって取得可能なアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。上記ポリペプチドは、好ましくは上述の活性に寄与し、特に該ポリペプチドは本明細書に記載されるように、例えば該ポリペプチドの発現又は比活性を増加させることによって細胞活性を増加させた後に、細胞若しくは生物又はその一部分における収量又は成長の増加に寄与する。一実施形態では、上記ポリペプチドは配列番号2、4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、107、109、111、113、115、117、119、121、125又は129で表される配列にわたって1以上のアミノ酸で区別する。別の実施形態では、本発明の上記ポリペプチドは、配列番号2、4、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、107、109、111、113、115、117、119、121、125又は129に示される配列から構成されない。一実施形態では、上記ポリペプチドは配列番号1、3、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、又は108、110、112、114、116、118若しくは120、又は106、124若しくは128に示される核酸分子によってコードされる配列から構成されない。一実施形態では、本発明のポリペプチドは非植物細胞、特に微生物を起源とし、植物細胞で発現した。この出願で使用される「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は交換可能である。「ポリペプチド」はアミノ酸のポリマー（アミノ酸配列）を指し、特定の長さの分子に関するものではない。したがって、ペプチド及びオリゴペプチドはポリペプチドの定義に含まれる。この用語はさらに、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等に関するか又はこれらを含む。例えばアミノ酸の1以上の類似体（例えば非天然アミノ酸等を含む）を含むポリペプチド、置換結合を含むポリペプチド、並びに当該技術分野で公知の他の修飾（天然および非天然の両方）がこの定義に含まれる。
【０１７８】
ポリペプチドは単離されることが好ましい。「単離」又は「精製」タンパク質若しくはポリヌクレオチド又はその生物学的に活性な部分は、組換えDNA技術で製造される際に細胞物質を実質的に含まないか、又は化学的に合成される際に化学的前駆物質若しくは他の化学物質を実質的に含まない。
【０１７９】
「細胞物質を実質的に含まない」という言葉は、本発明のポリペプチドの調製物であって、タンパク質が天然に又は組換え的に産生される細胞中の細胞成分から分離されている、上記調製物を含む。一実施形態では、「細胞物質を実質的に含まない」という言葉は、「汚染タンパク質」を約30％（乾燥重量）未満で、より好ましくは「汚染タンパク質」を約20％未満で、より一層好ましくは「汚染タンパク質」を約10％未満で、そして最も好ましくは「汚染タンパク質」を約5％未満で有する調製物を含む。「汚染タンパク質」という用語は、本発明のポリペプチドではないポリペプチドを指す。本発明のポリペプチド又はその生物学的に活性な部分が組換え的に産生されるとき、培養培地を実質的に含まない、すなわち、培養培地が、タンパク質調製物の量の約20％未満、より好ましくは約10％未満、そして最も好ましくは約5％未満を表すことも好ましい。「化学的前駆物質又は他の化学物質を実質的に含まない」という言葉は、本発明のポリペプチドがタンパク質の合成に関与する化学的前駆物質又は他の化学物質から分離されている調製物を含む。
【０１８０】
本発明のポリペプチドは本発明の方法に関与することができる。
【０１８１】
さらに、該ポリペプチドは本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列にハイブリダイズする、好ましくは上述されるようにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有することができる。したがって、ポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列及び本明細書に示されるアミノ酸配列の1つと少なくとも約35％、50％又は60％、好ましくは少なくとも約70％、より好ましくは少なくとも約80％、90％、95％、そしてより一層好ましくは少なくとも約96％、97％、98％、99％又はそれ以上相同なヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有する。本発明の好適なポリペプチドが、本発明による活性及び本明細書に記載される活性の少なくとも1つを備えることが好ましい。本発明の好適なポリペプチドは、ハイブリダイズする、好ましくは上記のようにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。
【０１８２】
本発明はさらにキメラ又は融合タンパク質を提供する。
【０１８３】
本明細書で使用される「キメラタンパク質」又は「融合タンパク質」は、上述の活性に寄与しないポリペプチドと機能的に連結されたポリペプチドを含む。
【０１８４】
融合タンパク質において、「機能的に連結された」という用語は、本発明のポリペプチドと発明に係るものではないポリペプチドとが、両配列が使用される配列に向けられた計画的機能を果たすように、互いに融合されることを示すものとする。発明に係るものではないポリペプチドは、本発明のポリペプチドのN末端又はC末端で融合することができる。例えば、一実施形態では、融合タンパク質は、本発明のポリペプチドの配列がGST配列のC末端と融合されたGST-LMRP融合タンパク質である。係る融合タンパク質は本発明の組換えポリペプチドの精製を容易にすることができる。
【０１８５】
別の実施形態では、融合タンパク質はそのN末端に異種シグナル配列を含む本発明のポリペプチドである。特定の宿主細胞（例えば哺乳類宿主細胞）では、発現及び/又は分泌は異種シグナル配列の使用を通じて増加することができる。標的化配列は、遺伝子産物の特定の細胞区画、例えば液胞、核、全てのタイプの色素体（アミロプラスト、クロロプラスト、有色体等）、細胞外空間、ミトコンドリア、小胞体、エライオプラスト（elaioplasts）、ぺルオキシゾーム、グリコゾーム、及び細胞又は細胞外の他の区画、への標的化を必要とする（概要についてはKermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285-423及びそこで引用される参照を参照されたい）。この関連で言及すべき配列は、特にそれ自体公知のシグナルペプチド又は輸送ペプチドコード配列である。例えば、色素体輸送ペプチドコード配列は、発現産物の植物細胞の色素体への標的化を可能にする。標的化配列は真核生物及びより低い程度で原核生物についても知られ、本発明の核酸分子と機能的に都合よく連結して、上記区画の1つ又は細胞外での発現を行うことができる。
【０１８６】
本発明のキメラ又は融合タンパク質を標準的な組換えDNA技術によって作製することが好ましい。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするDNA断片を、従来の技術に従って、例えば連結のために平滑末端又はスタガ型（stagger-ended）末端、適当な末端を生じさせるための制限酵素消化、必要に応じて付着末端の充填(filling-in)、所望でない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、及び酵素連結、を用いることによってインフレームで共に連結する。融合遺伝子は、自動化DNA合成器を含む従来の技術によって合成することができる。あるいは、遺伝子断片のPCR増幅はアンカープライマーを用いて実施することができ、該プライマーは2つの連続した遺伝子断片間に相補的な突出部を生じさせ、その後アニールして再増幅することによりキメラ遺伝子配列を生じさせることができる（例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, 編集. Ausubelら. John Wiley & Sons: 1992参照）。さらに、予め融合部分（例えばGSTポリペプチド）をコードする多くの発現ベクターが市販されている。本発明のポリヌクレオチドは、融合部分がインフレームでコードタンパク質と連結するように、そのような発現ベクター中にクローニングすることができる。
【０１８７】
さらに、本発明のタンパク質の構造モチーフの折りたたみシミュレーション及びコンピューター再設計を、適当なコンピュータープログラムを用いて実行することができる（Olszewski, Proteins 25 (1996), 286-299; Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 11(1995),675-679）。タンパク質折りたたみのコンピューターモデリングは、詳細なペプチド及びタンパク質モデルの立体構造及びエネルギー分析に使用することができる（Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995), 995-1012; Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376 (1995), 37-45）。適当なプログラムを、本発明のポリペプチドと、その基質又は結合因子もしくは他の相互作用タンパク質との相互作用部位の、相補的ペプチド配列のコンピューター補助検索（computer assistant search）による同定に使用することができる(Fassina, Immunomethods (1994), 114-120)。タンパク質及びペプチドを設計するための別の適当なコンピューターシステムは先行技術、例えばBerry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033-1036; Wodak, Ann. N. Y. Acad. Sci. 501 (1987), 1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987-5991に記載されている。上記のコンピューター分析から取得した結果は、例えば本発明のタンパク質のペプチドミミック又はその断片の調製に使用することができる。タンパク質の天然のアミノ酸配列のこのような擬ペプチド類似体は、元のタンパク質を非常に効果的に模倣し得る（Benkirane, J. Biol. Chem. 271 (1996), 33218-33224）。例えば、容易に入手可能なアキラルQアミノ酸残基の本発明のタンパク質又はその断片への組込みは、脂肪族鎖のポリメチレンユニットによるアミド結合の置換をもたらし、その結果、ペプチドミミックを構成する便利な戦略を提供する（Banerjee, Biopolymers 39 (1996), 769-777）。
【０１８８】
他のシステムにおける小ペプチドホルモンの超活性なペプチドミミック類似体が先行技術で記載されている（Zhang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 224(1996), 327-331）。本発明のタンパク質の適当なペプチドミミックも、連続的なアミドアルキル化を介したペプチドミミック組合せライブラリーの合成、及び生じた化合物の、例えばその結合及び免疫学的性質の試験によって同定することができる。ペプチドミミック組合せライブラリーの作製方法及び使用方法は先行技術、例えばOstresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220-234及びDorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709-715に記載されている。
【０１８９】
さらに、本発明のタンパク質の三次元及び/又は結晶構造を、本発明のタンパク質の生物学的活性のペプチドミミック阻害剤の設計に使用することができる（Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933-12944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558）。
【０１９０】
さらに、本発明のタンパク質の三次元及び/又は結晶構造並びに本発明のポリペプチドとその基質又は結合因子との相互作用部位の同定を、結合又は回転活性がモジュレートされた突然変異体の設計に使用することができる。例えば、本発明のポリペプチドの活性中心をモデル化することができ、触媒反応に関与するアミノ酸残基を、基質の結合を増加又は低減してポリペプチドを不活性化するためにモジュレートすることができる。活性中心及び触媒反応に関与するアミノ酸の同定は、活性が増加した突然変異体のスクリーニングを容易にする。特に、コンセンサス配列中の保存的アミノ酸に関する情報は活性をモジュレートするのに役立ち得る。
【０１９１】
しかし、適切な場合には、当業者の知識に従って、液胞形態形成タンパク質VAM7をコードする遠縁の非ヒト生物のポリヌクレオチドを発現させることにより、本発明の特に強力な効果、すなわち成長及び/又は収量の特に大きな増加をもたらし得る。というのも、このコードポリペプチドはおそらく内因的な調節の影響を受けにくいからである。
【０１９２】
「トランスジェニック」又は「組換え」とは、本発明に従って、例えば核酸配列、発現カセット（＝遺伝子構築物）又は本発明の核酸配列を含むベクター、あるいは本発明の核酸分子配列、発現カセット又はベクターで形質転換された非ヒト生物に関して、遺伝子法によって作製された全ての構造物であって、
a)本発明の方法で使用される核酸配列、又は
b)本発明の方法で使用される核酸配列と機能的に連結された遺伝子制御又は調節配列（例えばプロモーター）あるいは
c)(a)及び(b)
がその天然の遺伝子環境で存在しないか、あるいは遺伝子法によって改変されており、該改変がおそらくは、一例として1以上のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、転移又は挿入によるものである、上記構築物を指す。天然の遺伝子環境とは、供給源生物における天然のゲノム若しくは染色体座、又はゲノムライブラリー中でのその存在を指す。ゲノムライブラリーの場合、核酸配列の天然の遺伝子環境が依然として少なくとも部分的に維持されることが好ましい。この環境はこの核酸配列に少なくとも片側で隣接し、その配列は0bp以上、好ましくは50bp、より好ましくは100〜500bp、特に好ましくは1000bp以上の長さであるが、5000bp以上の配列も記載されている。天然の発現カセット、例えば液胞形態形成タンパク質VAM7核酸配列の天然プロモーターの天然の組合せは、非天然の合成（「人工」）法（例えば突然変異誘発）によって改変される際に、トランスジェニック発現カセットとなる。これに対応する方法は、例えばUS 5,565,350又はWO 00/15815に記載されている。
【０１９３】
天然の及び人工の発現カセットの調節機能は、該発現カセットを調節する因子を変更することによって間接的に又はトランスで改変し得る。これは特に調節に影響を与える同種の、異種の及び人工の転写因子を含む。
【０１９４】
先行技術及び本明細書でも詳細に記載されるクローニングベクターを形質転換に使用し得る。植物の形質転換に適切なベクター及び方法は、例えばPlant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), 6/7章, pp. 71-119 (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, 編集者: Kung及びR. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenesら, Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, 編集者: Kung及びR. Wu, Academic Press (1993), 128-143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225で公開又は引用されている。
【０１９５】
微生物及び高等真核生物の形質転換は、非常に多くの教本、例えばSambrook, Molecular Cloning, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory and in 「Current Protocols in Molecular Biology」, John Wiley & Sons, N.Y. (1989)に記載されている。
【０１９６】
同種又は異種核酸を発現させることが可能である、すなわち受容及び供与生物は同一種、適切な場合には同一品種に属し、又は異なる種、適切な場合には品種に属する。しかし、トランスジェニックは、本発明の核酸が生物のゲノムのその天然の位置に位置するが、配列が天然の配列及び/又は天然の配列の調節配列と比較して改変されていることも指す。トランスジェニックが、ゲノム中の非天然部位での本発明の核酸の発現、すなわち該核酸の同種、又は好ましくは異種発現が生じることを指すことが好ましい。
【０１９７】
「調節配列」という用語はまた、多くの宿主細胞種においてヌクレオチド配列の構成的発現を制御する配列、及び特定の条件下で特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の直接的な発現を制御する配列を含む。当業者は、発現ベクターの設計が形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現の程度等の要素に左右され得ることを理解している。転写は、例えば強力な転写シグナル（プロモーター及び/又はエンハンサー若しくはmRNA安定化剤）を用いることによって、例えば特定の5'及び/又は3'UTRによって増加され得る。したがって、例えばより高い転写速度又はより安定なmRNAへ導くシグナルは、内因的シグナルと置換し得る。しかし、これに加えて、例えばリボソーム結合又はmRNA安定性を改善することによって翻訳を増強することも可能である。
【０１９８】
原則的に、微生物、植物又は動物等の生物において遺伝子の転写を刺激できるプロモーターを使用し得る。上記生物で機能的である好適なプロモーターは周知である。これらは構成的プロモーター又は誘導性プロモーターであり得る。適当なプロモーターは、多細胞真核生物において発生及び/又は組織特異的発現を可能にすることができ、したがって、植物において葉、根、花、種子、孔辺細胞又は果実特異的プロモーターを都合よく使用することが可能である。別の調節配列は上記及び下記に記載される。
【０１９９】
本発明に従って使用される「トランスジェニック」という用語はまた、トランスジェニック非ヒト生物、例えば植物の子孫、例えばT1、T2、T3及びそれに続くの植物世代、又はBC1、BC2、BC3及びそれに続く植物世代を指す。したがって、本発明のトランスジェニック植物を生育し、自家交配又は他の個体と交配して本発明の更なるトランスジェニック植物を取得してもよい。トランスジェニック植物細胞の栄養繁殖によってトランスジェニック植物を取得することも可能である。
【０２００】
好適な実施形態では、より早い成長及び/又はより高い収量は、内因性液胞形態形成タンパク質VAM7の発現を増加することによって達成する。
【０２０１】
したがって、本発明の方法において、内因性液胞形態形成タンパク質VAM7をコードするポリヌクレオチドを、該液胞形態形成タンパク質VAM7のポリペプチドの量の増加に導く調節配列と機能的に連結することによって、液胞形態形成タンパク質VAM7の量を増加することが可能である。
【０２０２】
遺伝子の発現量は、転写又は翻訳レベルで、あるいは遺伝子産物の安定性及び分解の関連で調節される。
【０２０３】
調節配列は、通常は、特定の核酸又は特定の暗号遺伝子断片に対して上流(5')、その内部及び/又は下流(3')に配置される。これらは特に転写及び/又は翻訳、及び暗号遺伝子断片の転写産物の安定性も、適切な場合には細胞に本来備わる別の機能的系（細胞のタンパク質生合成機構）と協働して制御する。したがって、当業者の知識に従って、プロモーター、UTR、スプライス部位、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、エンハンサー、プロセシングシグナル、転写後及び/又は翻訳後修飾等に影響を与えることにより、内因的タンパク質の発現を該タンパク質自体の配列に影響を与えることなく増加することが可能である。したがって、液胞形態形成タンパク質VAM7の量は、コード配列に隣接する液胞形態形成タンパク質VAM7の領域を操作する際にも、本発明に従って増加し得る。したがって、例えばより高い又はより特異的な発現を仲介する外因的プロモーターで、液胞形態形成タンパク質VAM7の内因的プロモーターを置換することにより、タンパ質のより高い発現をもたらすことができる。例えば、内因性5'UTR又は3'UTRを置換することによって、タンパク質の内在性配列に影響を与えることなく、mRNA産物の安定性を増加することも可能である。生物においてタンパク質の発現を増加するこの種の他の方法が当業者に知られている。したがって、例えば液胞形態形成タンパク質VAM7の安定性を、タンパク質中の分解制御要素を欠失させて、量を増加させる結果として細胞中の活性を増加することにより、増加させることも可能である。より多くの量、又は適切な場合にはより高い活性を可能にするもので置換された別の機能的又は調節配列が本明細書で記載される。
【０２０４】
さらに、転写調節は、下記及び実施例で記載されるように、人工転写因子を導入することによって特異的に改変し得る。
【０２０５】
調節配列は、例えばGoeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990),又はGruber; Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Florida, eds.: Glick及びThompson,7章, 89-108（その中の参照を含む）に開示されている。
【０２０６】
液胞形態形成タンパク質VAM7の発現又は活性に対する阻害的又は活性化的影響（アロステリック効果）し、かつその後スイッチオフ又は増強される正及び負の調節因子を同定することも可能である。かかる機構は複数の代謝経路で当業者に十分に知られている。
【０２０７】
本発明の方法の一実施形態では、液胞形態形成タンパク質VAM7タンパク質は、非ヒト生物又はその1以上の部分における転写を増加させる転写因子の量の増加によって増加される。
【０２０８】
一般的に、例えばプロモーター分析によって、配列番号1、106、124、128又は136の内因的遺伝子の転写調節に関与する内因的転写因子を同定することが可能である。正の調節因子の活性の増加又は負の調節因子の活性の低減により、配列番号1、106、124、128又は136の内因的遺伝子の転写を増加し得る。
【０２０９】
さらに、人工転写因子により遺伝子の発現を改変する方法が当業者に知られる。
【０２１０】
したがって、例えば遺伝子の発現、特に配列番号2、107、125、129又は137を発現する遺伝子における改変は、特定の特異的DNA結合因子（例えばジンクフィンガー転写因子等）を改変すること又は合成することによって達成し得る。これらの因子は、内因性標的遺伝子の特定のゲノム領域、好ましくは調節配列に結合し、該遺伝子の活性化又は抑制を生じ得る。かかる方法の使用は、内因的遺伝子の発現を、該遺伝子の配列の組換え操作を回避しながら活性化又は低減することが可能にする。これに対応する方法は、例えばDreier B [(2001) J. Biol. Chem. 276(31): 29466-78及び(2000) J. Mol. Biol. 303(4): 489-502], Beerli RR (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(25): 14628-14633; (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4): 1495-1500及び(2000) J. Biol. Chem. 275(42): 32617-32627), Segal DJ及びBarbas CF (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4(1): 34-39, Kang JS及びKim JS (2000) J. Biol. Chem. 275(12): 8742-8748, Kim JS, (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(8): 3616-3620, Klug A (1999) J. Mol. Biol. 293(2): 215-218, Tsai SY, (1998) Adv. Drug Deliv. Rev. 30(1-3): 23-31], Mapp AK (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(8): 3930-3935, Sharrocks AD (1997) Int. J. Biochem. Cell Biol. 29(12): 1371-1387並びにZhang L (2000) J. Biol. Chem. 275(43): 33850-33860に記載されている。
【０２１１】
植物における遺伝子発現を改変する方法を適用する例は、例えばWO 01/52620, Ordiz MI, (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(20):13290-13295)又はGuan (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(20): 13296-13301及び下記に記載の実施例に記載されている。
【０２１２】
一実施形態では、本発明の方法は本発明の方法に使用されかつ本明細書で植物において特徴付けられたポリヌクレオチドの遺伝子コピー数を増加させることを含む。
【０２１３】
本明細書に記載される方法が、配列番号2、107、125、129又は137の活性が増加された植物の、葉の数及び大きさ、果実の数及び/又は果実の大きさを増加し、果実が植物の収穫された任意の産物（例えば、種子、塊茎、葉、花、樹皮、果実及び根等）を指すことが好ましい。
【０２１４】
本発明の方法で作製された植物が5％、より好ましくは10％、より一層好ましくは15％、20％又は30％超増加した新鮮重量を有することが好ましい。収量が50％以上、例えば75％、100％又は200％以上増加することがより一層好ましい。
【０２１５】
本発明の方法で作製された植物の収量が、少なくとも5％、より好ましくは10％超、より一層好ましくは15％、20％又は30％超増加することが好ましい。収量が50％超、例えば75％、100％又は200％以上増加することがより一層好ましい。
【０２１６】
別の実施形態では、本発明の方法で作製された植物は非生物的又は生物的ストレスにより耐性である。
【０２１７】
好適な実施形態では、本発明はさらに、精製化学物質を製造する方法に関する。この方法は、配列番号2、107、125、129又は137の活性が増加した細胞、組織又は生物を準備すること、該細胞、該組織又は該生物を、該細胞、該組織又は該生物中での所望の精製化学物質の製造を可能にする条件下で培養することを含む。この方法において本発明の植物、本発明の微生物又は本発明の有用動物を提供することが好ましい。
【０２１８】
上述されるように、非ヒト生物、特に植物における配列番号2、107、125、129又は137の活性の増加は、収量の増加及びより早い成長をもたらす。しかし、既に多くの生物が精製化学物質の製造に使用されている。精製化学物質の製造は現在では、その化学合成が多くの処理段階及び精製ステップを含む複雑な分子でさえ、安価でかつ特異的に産生する微生物なくしては考えられない。したがって、ビタミン及びアミノ酸等の精製化学物質は、例えば成長因子、抗体等の複雑な製薬上活性な化合物と同様の手法において、大規模に産業上製造され、精製化学物質という用語は本明細書下記の活性化合物をさらに含む。植物も既に、例えばポリマー（例えばポリヒドロキシアルカノイド、ビタミン、アミノ酸、糖、脂肪酸、特にポリ不飽和脂肪酸等）等の様々な精製化学物質を製造するために同様に使用されている。有用動物でさえ既に、精製化学物質の製造に使用されている。したがって、抗体及び他の製薬上活性な化合物の、ヤギ又はウシのミルク中での製造も既に記載されている。
【０２１９】
したがって、特に好適な実施形態では、本発明の方法は、非ヒト生物、好ましくは植物又は微生物における配列番号2、107、125、129又は137の活性を増加させ、かつ1以上の精製化学物質の製造量及び/又は製造効率が増加されるように1以上の代謝経路をモジュレートする方法に関する。
【０２２０】
製造又は生産性という用語は当業者に知られ、所望の産物（例えば、脂肪酸、カロテノイド、(ポリ)サッカリド、ビタミン、イソプレノイド、脂質、脂肪酸(エステル)、及び/又はポリヒドロキシアルカノイド等のポリマー、並びに/又はその代謝産物又は本明細書に記載される他の所望の精製化学物質）の濃度を特定の時間及び特定の量の範囲（例えばキログラム/時間/リットル）で増加させることを含む。
【０２２１】
「精製化学物質」という用語は当該技術分野で知られ、非ヒト生物によって製造されかつ様々な産業部門、例えばこれに限定されるものではないが、製薬産業、農業産業及び化粧品産業等で使用される分子を含む。これらの化合物は、酒石酸、イタコン酸及びジアミノピメリン酸等の有機酸、ポリマー又は高分子、例えばポリペプチド（例えば酵素、抗体、成長因子若しくはその断片）、核酸（ポリ核酸、タンパク質生成及びタンパク質非生成アミノ酸の両者、プリン及びピリミジン塩基、ヌクレオシド並びにヌクレオチド（例えばKuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, pp. 561-612、Biotechnology vol. 6, Rehmら, eds VCH: Weinheim及びその中の参照に記載される））、脂質、飽和及び不飽和脂肪酸（例えばアラキドン酸）、ジオール（例えばプロパンジオール及びブタンジオール）、炭水化物（例えば、ペントース、ヘキソース、ヒアルロン酸及びトレハロース）、芳香族化合物（例えば、芳香族アミン、バニリン及びインジゴ）、イソプレノイド、プロスタグランジン（prostagladins）、トリアシルグリセロール、コレステロール、ポリヒドロキシアルカノイド、ビタミン及び補因子(Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A27, 「Vitamins」, pp. 443-613 (1996) VCH: Weinheim及びその中の参照;並びにOng, A.S., Niki, E.及びPacker, L. (1995) 「Nutrition, Lipids, Health and Disease」 Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research-Asia, held on Sept. 1-3, 1994、Penang, Malaysia, AOCS Press (1995)に記載される)、酵素並びにGutcho(1983)（Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086）及びその中に示された参照に記載される他の全ての化学物質を含む。したがって、本明細書で使用される「精製化学物質」という用語は、生物中で産生され得る医薬化合物、例えば抗体、成長因子等又はその断片も含む。
【０２２２】
「アミノ酸」という用語は当該技術分野で公知である。アミノ酸は、全てのタンパク質の基礎構造単位を含み、したがって正常な細胞機能に不可欠である。タンパク質生成アミノ酸（20タイプが存在する）は、これらがペプチド結合により共に結合したタンパク質の構造単位としての役割を果たすが、非タンパク質生成アミノ酸（数百のものが知られる）は通常タンパク質を生じない（Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, pp. 57-97 VCH: Weinheim (1985)参照）。アミノ酸はD又はL配置で存在することができるが、Lアミノ酸は通常天然のタンパク質中で見られる唯一の型である。20種のタンパク質生成アミノ酸のそれぞれの生合成及び分解経路は、原核及び真核細胞で十分に特徴付けられている（例えばStryer, L. Biochemistry, 第3版, pp. 578-590 (1988)参照）。タンパク質生合成におけるそれらの機能とは別に、これらのアミノ酸は、その多くがヒト食品、飼料、化学製品、化粧品農業及び医療産業において様々な用途を有する興味深い化学物質であり、係る用途を有することが見出されている。リシンはヒト栄養のみならず、単胃動物（家禽及びブタ等）にとっても重要なアミノ酸である。グルタメートは食品産業等において香味用添加物（グルタミン酸一ナトリウム、MSG）として、アスパルテート、フェニルアラニン、グリシン及びシステインと同様に最も頻繁に使用される。グリシン、L-メチオニン及びトリプトファンは全て製薬産業で使用される。グルタミン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、アルギニン、プロリン、セリン及びアラニンは製薬産業及び化粧品産業で使用される。トレオニン、トリプトファン及びD-/L-メチオニンは、飼料添加物に広範に使用される（Rehmら(編集) Biotechnology 6巻, 14a章, VCH: Weinheim中、Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids-technical production and use, pp. 466-502）。これらのアミノ酸が、合成アミノ酸及びタンパク質（N-アセチルシステイン、S-カルボキシメチル-L-システイン、(S)-5-ヒドロキシトリプトファン及びUllmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, pp. 57-97, VCH, Weinheim, 1985に記載される他の物質等）を合成する前駆物質としてさらに適当であることが分かっている。
【０２２３】
「ビタミン」という用語は、当該技術分野で知られており、生物の正常な機能に必要な栄養物質を含むが、その生物自身は合成できない。ビタミンの群は補因子及び栄養補助化合物を含み得る。
【０２２４】
「補因子」という用語は、正常な酵素活性の出現に必要な非タンパク性化合物を含む。これらの化合物は有機的又は無機的であってよく、本発明の補因子分子が有機的であることが好ましい。
【０２２５】
「栄養補助食品」という用語は、植物及び動物、特にヒトの健康を促進する食品添加物を含む。そのような分子の例はビタミン、抗酸化剤及び同様に特定の脂質（例えばポリ不飽和脂肪酸）である。
【０２２６】
したがって、ビタミン、補因子及び栄養補助食品は、高等動物が合成できず、その結果これらを摂取する必要があるが、他の生物（細菌等）によって容易に合成される分子の一群を含む。これらの分子は、多くの代謝経路において電子伝達体又は中間生成物として役立つ、生物活性分子自体又は生物活性分子の前駆物質のいずれかである。これらの栄養的価値に加えて、これらの化合物はさらに着色剤、抗酸化剤及び触媒又は他の加工助剤としての実質的な産業価値を有する。これらの化合物の構造、活性及び産業用との概要については、例えばUllmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 「Vitamins」, vol. A27, pp. 443-613, VCH: Weinheim, 1996を参照されたい。ポリ不飽和脂肪酸は特にSimopoulos 1999, Am. J. Clin. Nutr., 70 (3 Suppl):560-569, Takahataら, Biosc. Biotechnol. Biochem, 1998, 62 (11):2079-2085, Willich及びWinther, 1995, Deutsche Medizinische   Wochenschrift, 120 (7):229 ff並びにその中の参照に記載されている。
【０２２７】
「プリン」又は「ピリミジン」という用語は、核酸、補酵素及びヌクレオチドの一部を形成する窒素含有塩基を含む。「ヌクレオチド」という用語は、核酸分子の基礎構造単位を含み、これは窒素含有塩基、五炭糖（糖は、RNAの場合はリボース、DNAの場合はD-デオキシリボースである）及びリン酸を含む。「ヌクレオシド」という用語は、ヌクレオチドの前駆物質としての役割を果たすが、ヌクレオチドとは対照的にリン酸体を有しない分子を含む。これらの分子の生合成又はこれらの流動化を阻害して核酸分子を生じさせることによってRNA及びDNA合成を阻害することが可能である（癌細胞におけるこの活性の阻害の標的化は、腫瘍細胞の分裂及び複製能の阻害を可能にする）。さらに、核酸分子を生じないがエネルギー貯蔵（すなわちAMP）として又は補酵素（すなわちFAD及びNAD）としての役割を果たすヌクレオチドが存在する。しかし、プリン及びピリミジン塩基、ヌクレオシド及びヌクレオチドも、様々な精製化学物質の生合成における中間産物（例えば、チアミン、S-アデノシルメチオニン、フォレート又はリボフラビン）としての、細胞（例えばATP又はGTP）及び化学物質自体（これらは通常、調味料（例えばIMP若しくはGMP）として又は多くの医療用途に使用される）のエネルギー担体としての、他の可能な用途を有する（例えばKuninaka, A., (1996) 「Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology」 vol. 6, Rehmら,編集. VCH: Weinheim, pp. 561-612参照）。プリン、ピリミジン、ヌクレオシド又はヌクレオチド代謝に関与する酵素はさらに、作物保護のためにそれに対する化学物質が開発されつつある標的（殺菌剤、除草剤及び殺虫剤を含む）としてますます役立っている。
【０２２８】
細胞は「精製化学物質」という用語にも含まれる異なる炭素供給源、例えばグルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース若しくはラフィノース、デンプン又はセルロース等の糖、アルコール(例えばメタノール又はエタノール)、アルカン、脂肪酸、特にポリ不飽和脂肪酸並びに酢酸又は乳酸等の有機酸を含む。糖は複数の機構により細胞膜を介して細胞中に輸送され得る。培養中に迅速に成長しかつ分裂する細胞の能力は、該細胞がエネルギーに富む分子（グルコース及び他の糖など）を吸収しかつ利用する能力の程度にかなり左右される。トレハロースはα,α-1,1-結合によって共に連結された2つのグルコース分子からなる。これは通常、食品産業において甘味剤として、乾燥又は冷凍食品用の添加物として、及び飲料に使用される。しかし、これは製薬産業、化粧品産業及びバイオテクノロジー産業においても使用される（例えばNishimotoら, (1998) US特許第5 759 610号; Singer, M.A.及びLindquist, S. Trends Biotech. 16 (1998) 460-467; Paiva, C.L.A.及びPanek, A.D. Biotech Ann. Rev. 2 (1996) 293-314;並びにShiosaka, M. J. Japan 172 (1997) 97-102参照）。トレハロースは多くの微生物の酵素によって使用され、周囲培地へ自然放出され、当該技術分野で公知の方法によって該培地から単離できる。
【０２２９】
生物における該分子の生合成は、例えばUllmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, VCH: Weinheim, 1996,例えば「Vitamins」の章, vol. A27, pp. 443-613, Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Ong, A.S., Niki, E.及びPacker, L. (1995) 「Nutrition, Lipids, Health and Disease」 Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for free Radical Research-Asia, held on Sept. 1-3, 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press, Champaign, IL X, 374 Sで包括的に特徴付けられている。
【０２３０】
したがって、本発明の一実施形態は植物の油産生を増加させる方法に関する。
【０２３１】
植物は、例えば脂肪酸の製造に有利に使用し得る。例えば、高等植物の種子中の貯蔵脂質は、主に16〜18個の炭素を有する脂肪酸から合成される。該脂肪酸は様々な植物種の種子油中にある。シロイヌナズナにおける配列番号2、107、125、129又は137の増加により、種子産生が約30％増加されることが既に示されている。植物における該油の産生は、例えば本明細書で特徴付けられたポリヌクレオチドを発現させることによって増加し得る。次いで、植物油は例えば様々な産物（例えばプラスチック、薬剤等）の燃料又は材料として使用し得る。ポリ不飽和脂肪酸は栄養及び給餌に特に有利に使用し得る。
【０２３２】
一実施形態では、本発明の上記方法は、非ヒト生物を、1以上の別のポリヌクレオチドであって、その遺伝子産物が上記代謝経路の1つの一部であるか又はその遺伝子産物がこれらの代謝経路の1つの制御に関与することで非ヒト生物が所望の精製化学物質を産生するか又は所望の精製化学物質の産生が増加される、上記ポリヌクレオチドで形質転換することによって精製化学物質を製造することを含む。本発明に使用される遺伝子を、配列番号2、107、125、129又は137の活性の増加と同時に発現させることにより、上記精製化学物質の製造の増加を首尾よく増加させることが有利である。上記精製化学物質の製造に役立つ遺伝子は当業者に公知であり、多くの異なる手法で文献中に記載されている。
【０２３３】
上記精製化学物質、例えば脂肪酸、カロテノイド、ポリサッカリド、ビタミン、イソプレノイド、脂質、脂肪酸エステル又はポリヒドロキシアルカノイド及び上記代謝産物の、植物中での生合成は、しばしば特定の細胞小器官の特別な代謝経路で起こる。したがって、その遺伝子産物がそれらの生合成経路の1つの役割を果たしかつその結果この特別な細胞小器官に位置するポリヌクレオチドは、対応するシグナルペプチドをコードする配列を含む。
【０２３４】
別のポリヌクレオチドを、宿主細胞、好ましくは植物細胞に、本明細書に記載される遺伝子構築物、発現カセット、ベクター等と共に導入してもよい。この種の発現カセット、遺伝子構築物、ベクター等は、複数の個別の発現カセット、遺伝子構築物、ベクター等の同時形質転換により、又は好ましくは、複数の遺伝子、ORF又は発現カセットを1つの構築物中で組合せることによって導入することもできる。いずれの場合も複数の形質転換用発現カセットを含む複数のベクターを用い、かつこれらを宿主細胞に導入することも可能である。
【０２３５】
したがって、本発明の方法について上述される遺伝子構築物、発現カセット、ベクター等は、本発明に従い、配列番号1、106、124、128又は136の発現の増加に加えて、別の遺伝子の増加又は低減も仲介し得る。
【０２３６】
したがって、宿主生物に導入して、そこでその活性に起因して生合成経路の1以上の遺伝子の調節を介在する調節遺伝子（誘導因子、リプレッサー又は酵素の遺伝子等）を発現させることが有利である。これらの遺伝子は、異種又は同種起源であり得る。さらに、精製化学物質を産生させるための生合成遺伝子を、該精製化学物質の産生が高められた成長に起因して部分的に効果的であるように、追加的に導入することが可能である。
【０２３７】
このために、上記核酸は、これらが本発明の発現カセットに例えば他のポリペプチドをコードする核酸分子との組合せにおいてクローニングした後に、植物の形質転換のために、例えばアグロバクテリウムを用いて使用することができる。「他のポリペプチド」又は「調節因子」をコードする遺伝子は、所望の非ヒト生物に、独立の形質転換で導入してもよい。これは、上記非ヒト生物において配列番号2、107、125、129又は137の活性が増加される前又は後に行い得る。第2の発現構築物又はベクターによる同時形質転換及びその後の適当なマーカーの選択も可能である。
【０２３８】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される1以上の核酸分子又はポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物、発現カセット又はベクターに関する。カセット、構築物又はベクターは本発明の方法における使用に適当であり、かつ例えば、好ましくは植物中での遺伝子発現を仲介又は増加するための1以上の調節シグナルと機能的に連結された、上記配列番号2、107、125、129又は137の活性をコードするポリヌクレオチドを含むことが好ましい。
【０２３９】
有利には遺伝子発現を増加するための、1以上の調節シグナル又は調節配列と機能的に連結された前記ホモログ、誘導体又は類似体が含まれる。
【０２４０】
調節配列は遺伝子の発現の標的化及びコードタンパク質の合成を可能にすることを意図する。「調節配列」という用語は、上で定義されており、例えば記載されたターミネーター、プロセシングシグナル、転写後、翻訳後修飾、プロモーター、エンハンサー、UTR、スプライス部位、ポリアデニル化シグナル及び当業者に公知かつ本明細書に記載の他の発現制御要素を含む。
【０２４１】
宿主生物に応じて、例えばこれは、遺伝子が誘導後にのみ発現及び/又は過剰発現されること、あるいは直ちに発現及び/又は過剰発現されることを意味し得る。これらの調節配列の例は、誘導因子又はリプレッサーが結合し、その結果核酸の発現を調節する配列である。これらの新たな調節配列に加えて、又はこれらの配列の代わりに、該配列の自然調節も依然として現実の構造遺伝子の上流に存在してもよく、適切な場合には自然調節がオフにされかつ遺伝子の発現が増加されるように遺伝子的に改変してもよい。しかし、発現カセット（＝発現構築物＝遺伝子構築物）もより単純な構造を有する、すなわち追加の調節シグナルが核酸配列又はその誘導体の上流に挿入されず、かつその調節を伴う天然のプロモーターが欠失されていなくてもよい。その代りに、天然の調節配列は、調節がもはや起こらない及び/又は遺伝子発現が増加されるように突然変異される。これらの改変プロモーターも、天然の遺伝子の上流に沿う部分配列（＝本発明の核酸配列の一部を含むプロモーター）の形態で挿入して、活性を増加してもよい。さらに、遺伝子構築物が、核酸配列の発現の増加を可能にするプロモーターに機能的に連結された1以上の「エンハンサー」配列も含むことが有利である。別の調節要素又はターミネーター等の追加的な有利な配列を、さらにDNA配列の3'末端に挿入してもよい。好ましくは配列番号2、107、125、129又は137の活性をコードする、本発明の核酸配列は、発現カセット（＝遺伝子構築物）中に1以上のコピーで存在してもよい。遺伝子の1以上のコピーが発現カセット中に存在してもよい。この遺伝子構築物又は遺伝子構築物は、宿主生物中で一緒に発現されてもよい。この遺伝子構築物又は遺伝子構築物を1以上のベクターに挿入して、細胞中で遊離形態で存在させること又はゲノム中に挿入することが可能である。植物の場合、色素体ゲノム又は細胞ゲノムへの組込みが起こっていてもよい。先行技術及び本明細書で包括的に記載されているように、クローニングベクターを形質転換に使用し得る。
【０２４２】
この方法で使用される核酸配列を、非ヒト生物、好ましくは植物中での核酸の発現を可能にする発現カセットへ導入することが好ましい。
【０２４３】
発現カセットは、原則的には植物への導入のために、又はベクターへの導入のために直接的に使用し得る。
【０２４４】
別の実施形態では、本発明はさらに、本発明の上記ポリヌクレオチドの相補配列及びアンチセンスポリ核酸に関する。アンチセンス核酸分子は、例えば、タンパク質をコードする「センス」核酸分子に相補的である、例えば二本鎖cDNA分子のコード鎖に相補的又はmRNA配列に相補的である、ヌクレオチド配列を含む。アンチセンス分子という用語は、さらにRNA干渉分子、具体的には相補配列間にスペーサー又はリンカー配列を含む又は含まないRNAiヘアピン分子をも包含するものとする。
【０２４５】
したがって、アンチセンス核酸分子は、センス核酸分子と水素結合を形成することが可能である。アンチセンス核酸分子は、本明細書で表されるコード鎖のいずれか又はその一部分のみと相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば5、10、15、20、25、30、35、40、45又は50ヌクレオチドの長さであり得る。アンチセンス核酸分子は当業者に公知の方法による化学合成及び酵素連結によって作製し得る。アンチセンス核酸分子は天然のヌクレオチド、あるいは該分子の生物学的安定性を増加させるために又はアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される二本鎖の物理的安定性を増強するために様々な手法で改変されたオリゴヌクレオチド（例えばホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換型ヌクレオチドを使用することが可能である）を用いて化学的に合成することができる。あるいは、ポリヌクレオチドがアンチセンス配向でクローニングされている発現ベクターを用いてアンチセンス核酸分子を生物学的に作製することが可能である。アンチセンス核酸分子はさらに「α-アノマー」核酸分子であり得る。「α-アノマー」核酸分子は相補的RNAとの特定の二本鎖ハイブリッドであって、通常のβユニットとは対照的に、鎖が互いに平行にはしる、上記ハイブリッドを生じる。アンチセンス核酸分子は、2-0-メチルリボヌクレオチド又はキメラRNA-DNA類似体を含んでもよい。アンチセンス核酸分子はさらにリボザイムであってもよい。リボザイムはリボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNA分子であり、相補的領域を有する一本鎖核酸（例えばmRNA等）に切断可能である。
【０２４６】
別の好適な実施形態では、本発明は本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、及び該ポリペプチドに対するポリクローナル又はモノクローナル抗体、好ましくはモノクローナル抗体に関する。
【０２４７】
「抗体」は、例えばポリクローナル、モノクローナル、ヒト若しくはヒト化又は組換え抗体又はそのフラグメント、一本鎖抗体又は合成抗体を指す。本発明の抗体又はそのフラグメントは、原則的には全ての免疫グロブリンのクラス（IgM、IgG、IgD、IgE、IgA）又はそのサブクラス（IgGサブクラス）、あるいはその混合物を指す。IgG及びそのサブクラス、例えばIgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3及びIgGMが好ましい。IgGサブクラスIgG1及びIgG2が特に好ましい。記載し得るフラグメントは、抗原と相補的な1つ又は2つの結合部位を有する任意の先端切断型又は改変型抗体フラグメント、例えば抗体に相当しかつ軽鎖及び重鎖から構成される結合部位を有する抗体部分（Fv, Fab若しくはF(ab')2フラグメント又は一本鎖フラグメント）である。Fv、Fab又はF(ab')2等の先端切断型二本鎖フラグメントが好ましい。これらのフラグメントは、例えばパパイン若しくはペプシン等の酵素を用いて抗体のFc部分を切断することによって酵素的に、化学酸化により、又は抗体遺伝子の遺伝子操作により取得し得る。遺伝子的に操作した非先端切断型フラグメントを使用することも有利である。抗体又はフラグメントは単独で又は混合物で使用し得る。抗体は融合タンパク質の一部であってもよい。
【０２４８】
別の実施形態では、本発明はベクターを作製する方法であって、本発明のポリヌクレオチド又は発現カセットをベクターに挿入することを含む上記方法、及び本発明のポリヌクレオチド又は本発明に従って作製したポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【０２４９】
好適な実施形態では、ポリヌクレオチドは原核又は真核宿主内での発現を可能にする調節配列と機能的に連結される。
【０２５０】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが結合する別の核酸へ輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターの1つのタイプの一例は「プラスミド」、すなわち環状二本鎖DNAループである。その他のタイプのベクターはウイルスベクターであり、これはウイルスゲノムへ追加のDNA断片を連結することが可能である。例えば複製起点を有するベクター等の特定のベクターは、これらが導入される宿主細胞中で独立に複製し得る。他の好適なベクターが、それらが導入される宿主細胞のゲノム中に組み込まれることにより、宿主ゲノムと一緒に複製されることが有利である。さらに、特定のベクターはこれらが機能的に連結される遺伝子の発現を制御できる。これらのベクターは本明細書中「発現ベクター」と称する。上述されるように、これらは自己複製し得るか又は宿主ゲノムに組み込まれ得る。DNA組換え技術に適当な発現ベクターは、通常はプラスミドの形態である。「プラスミド」及び「ベクター」は本明細書の記載中、同義的に使用し得る。したがって、本発明はさらに、ファージ、ウイルス、例えばSV40、CMV若しくはTMV、トランスポゾン、IS要素、ファスミド、ファージミド、コスミド、線状又は環状DNA及び当業者に知られる他の発現ベクターを含む。
【０２５１】
この方法で有利に使用される組換え発現ベクターは、本発明の核酸又は本発明の遺伝子構築物を、宿主細胞中で使用される核酸の発現に適当な形態で含み、これは組換え発現ベクターが、発現に使用されるべき宿主細胞に基づいて選択されかつ発現されるべき核酸配列と機能的に連結する1以上の調節配列を含む。
【０２５２】
組換え発現ベクターにおいて、「機能的に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、調節配列と、該ヌクレオチド配列の発現が可能でありかつこれらが互いに結合されることで両配列が配列に向けられた予測の機能を果たすように結合されることを指す（例えばin vitro転写/翻訳系で、又はベクターが上記宿主細胞に導入される際には宿主細胞で）。
【０２５３】
使用される組換え発現ベクターは、特に原核及び/又は真核細胞、好ましくは植物での発現のために設計してもよい。例えば、配列番号1、106、124、128又は136をコードする遺伝子は、例えばバキュロウイルス発現ベクターを用いることによって、細菌細胞、昆虫細胞中で、酵母細胞及び他の菌類細胞中で（例えばRomanos, (1992), Yeast 8:423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J., (1991), J.W. Bennet & L.L. Lasure, 編集, pp. 396-428: Academic Press: San Diego;及びvan den Hondel, C.A.M.J.J., (1991) : Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F, ed., pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge従って）、例えばFalciatore, 1999, Marine Biotechnology.1, 3:239-251に従って藻類中で、WO 98/01572に記載された形質転換法に従ってベクターを用いて、繊毛虫（例えばホロトリキア(Holotrichia)、ペリトリキア(Peritrichia)、スピロトリキア（Spirotrichia）、スクトリア（Suctoria）、テトラハイマナ(Tetrahymena)、パラメシウム(Paramecium)、コルピジウム(Colpidium)、グラウコマ(Glaucoma)、プラティオフリア(Platyophrya)、ポトマカス(Potomacus)、デサチュラーゼウドコニェバス（Desaturaseudocohnilembus）、ユープロテス(Euplotes)、エンゲルマニエラ(Engelmaniella)、スチロニキア(Stylonychia)）又はスチロニキア・レムナエ(Stylonychia lemnae)において、及び好ましくは多細胞植物の細胞において（Schmidt, R., (1988) Plant Cell Rep.: 583-586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, 6/7章, pp. 71-119 (1993); F.F. White, B. Jenes, Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, eds.: Kung及びR. Wu, Academic Press (1993), 128-43; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225、及び本明細書で記載される文献中の参照を参照）発現させることができる。好適な宿主細胞は、またGoeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)において考察されている。あるいは、組換え発現ベクターは例えばT7-プロモーター調節配列及びT7ポリメラーゼを用いてin vitroで転写及び翻訳し得る。
【０２５４】
植物発現カセット又はこれに対応するベクターが、植物細胞中での遺伝子発現を制御可能であり、かつ各配列が機能するようにORFに機能的に連結された調節配列を含むことが好ましい。
【０２５５】
発現カセットが適切な時点でかつ細胞又は組織特異的な様式で遺伝子発現を実行する適当なプロモーターと連結されることが好ましい。したがって、新規方法に有利な調節配列は、植物プロモーターCaMV/35S（Franck, Cell 21 (1980) 285-294, US 5,352,605）、PRP1（Ward, Plant. Mol. Biol. 22 (1993)）、SSU、PGEL1、OCS（Leisner, (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:2553）、lib4、usp、mas（Comai (1990) Plant Mol Biol 15:373）、STLS1、ScBV（Schenk(1999) Plant Mol Biol 39:1221）、B33、SAD1及びSAD2(アマプロモーター（Jain, (1999) Crop Science, 39:1696)及びnos(Shaw (1984) Nucleic Acids Res. 12:7831)に存在する。シロイヌナズナの様々なユビキチンプロモーター(Callis (1990) J Biol Chem 265:12486; Holtorf (1995) Plant Mol Biol 29:637)、ピーナツ、トウモロコシ（(Ubi1及びUbi2)、US 5,510,474; US 6,020,190及びUS 6,054,574）又はパセリ[Kawalleck (1993) Plant Molecular Biology, 21:673]あるいはファゼオリンプロモーターを有利に使用し得る。この関連でEP-A-0 388 186 (ベンジルスルフォンアミド誘導性)、Gatz, (1992) Plant J. 2:397(テトラサイクリン誘導性)、EP-A-0 335 528(アブシジン酸誘導性)又はWO 93/21334(エタノール又はシクロヘキサノール誘導性)に記載されるプロモーター等の誘導性プロモーターも同様に有利である。さらに適当な植物プロモーターは、細胞質FBPアーゼのプロモーター又はジャガイモST-LSIプロモーター(Stockhaus, 1989, EMBO J. 8, 2445)、ダイズホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼプロモーター(GenBank登録番号U87999)又はEP-A-0 249 676に記載の節(node)特異的プロモーターである。特定の組織での発現を可能にする又は特定の組織で優先的な発現を示すプロモーターも適当であり得る。また、種子特異的プロモーター(USPプロモーター等)も有利であるが、LeB4、DC3、SAD1、ファゼオリン又はナピンプロモーター等の他のプロモーターも有利である。DE-A 19644478に記載されるような葉特異的プロモーター又は光制御化プロモーター（例えばpetEプロモーター等）も植物における遺伝子の発現に利用可能である。さらに有利なプロモーターは、単子葉又は双子葉植物に使用できる、並びにUS 5,608,152 (アブラナ種子油のナピンプロモーター)、WO 98/45461(シロイヌナズナのオレオシンプロモーター)、US 5,504,200(インゲンマメ(Phaseolus vulgaris)のファゼオリンプロモーター)、WO 91/13980 (アブラナのBce4プロモーター)及びvon Baeumlein, 1992, Plant J., 2:233 (マメ科植物のLeB4プロモーター)に記載される種子特異的プロモーターであり、これらのプロモーターは双子葉植物に適当である。単子葉植物に適当なプロモーターの例は以下である：オオムギlpt-2-又はlpt-1プロモーター(WO 95/15389及びWO 95/23230)、オオムギホルデインプロモーター、トウモロコシユビキチンプロモーター及びWO 99/16890に記載の他の適当なプロモーター。
【０２５６】
可能な限り多くの組織で、特に葉においても異種配列を強く発現させるために、上述の様々なプロモーターに加えて、植物のアクチン又はユビキチン遺伝子のプロモーター（例えばイネアクチン1プロモーター等）を使用することが好ましい。植物の構成的プロモーターのその他の例はサトウキビV-ATPアーゼプロモーター（WO 01/14572）である。
【０２５７】
原則的には、新規方法のための制御配列を含む天然の全てのプロモーター（上述されるもの等）を使用することが可能である。追加的に又は単独で合成プロモーターを使用することも、特にこれらが構成的発現を仲介する場合には、同様に可能かつ有利である。構成的合成プロモーターの例はスーパープロモーター（WO 95/14098）及びGボックスから誘導されるプロモーター（WO 94/12015）である。
【０２５８】
植物遺伝子は、化学的に誘導可能なプロモーターを介して発現させることもできる（Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108の総説を参照）。化学的に誘導可能なプロモーターは、時間特異的様式で遺伝子を発現させることが望ましい場合に特に適当である。係るプロモーターの例は、サリチル酸誘導性プロモーター(WO 95/19443）、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Gatzら(1992) Plant J. 2, 397-404）、エタノール誘導性プロモーター及びEP-A 0 388 186、EP-A 0 335 528、WO 97/06268である。裸子植物又は被子植物での特異的発現も原則的に可能である。
【０２５９】
生物的又は非生物的ストレス条件に応答するプロモーターも適当なプロモーターであり、例えば植物では、病原体誘導型PRP1遺伝子プロモーター(Ward, Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361)、熱誘導性トマトhsp80プロモーター(US 5,187,267)、低温誘導性ジャガイモα-アミラーゼプロモーター(WO 96/12814)又は創傷誘導性pinIIプロモーター(EP-A-0 375 091)である。
【０２６０】
好適なポリアデニル化シグナルは当業者に十分に知られており、例えば植物に関して、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）t-DNAから誘導されるもの、例えばTiプラスミドpTiACH5 (Gielen, EMBO J. 3 (1984) 835)のオクトピンシンターゼ（ocs遺伝子）として知られる遺伝子3、nos遺伝子又はその機能的同等物等がある。植物中で機能的に活性な他の既知のターミネーターも適当である。
【０２６１】
有利な別の調節配列は、場合により発現産物の輸送及び/又は位置を制御する（標的化）配列も含む。この関連で、特にそれ自体公知のシグナルペプチド又は輸送ペプチドをコードする配列に言及すべきである。例えば、色素体輸送ペプチドコード配列を用いて発現産物を植物細胞の色素体に導くことが可能である。したがって、特に遺伝子産物を適当な細胞区画、例えば液胞、核、あらゆる種類の色素体（アミロプラスト、クロロプラスト、有色体等）、細胞外空間、ミトコンドリア、小胞体、油体、ペルオキシソーム及び植物細胞の他の区画、に導くために必要な標的化配列を、植物発現カセット中で機能連関のために使用することが好ましい（Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285中の総説及びその中の参照を参照）。このように、特にペルオキシソーム標的化シグナルが、例えばOlsen LJ, Plant Mol Biol 1998, 38:163-189に記載されている。
【０２６２】
本発明に従い、遺伝子構築物、ベクター、発現カセット等は、例えばポリリンカー中でプロモーターの後に発現されるべき核酸の挿入のための適当な切断部位が位置し、次いで適当な場合にはポリリンカー又はインサートの下流に、ターミネーターが位置するように、構成されることが有利である。この配列は、複数の遺伝子が一つの構築物中で組み合わされかつこの手法で発現用のトランスジェニック植物に導入することができるように、複数回、例えば3回、4回又は5回反復させてもよい。各核酸配列がその固有のプロモーター、及び適切な場合にはその固有のターミネーターを有することが有利である。ポリシストロニックRNAをプロセシングすることが可能な微生物の場合には、プロモーターの下流に、適切な場合にはターミネーターの上流に、複数の核酸配列を挿入することも可能である。発現カセット中で異なるプロモーターを使用することが可能であることが有利である。異なるターミネーター配列は各遺伝子に都合よく使用し得る。
【０２６３】
植物発現カセットが、翻訳エンハンサー等の別の機能的に結合された配列、例えばタンパク質/RNA比を増加するタバコモザイクウイルスの5'非翻訳リーダー配列(Gallie, 1987, Nucl. Acids Research 15:8693)を含む過励配列（overdrive sequence）を含むことが好ましい。
【０２６４】
導入されるべきベクター、カセット、核酸分子等は、従来の形質転換又はトランスフェクション技術を介して原核又は真核細胞に導入することができる。
【０２６５】
本明細書で使用される「形質転換」及び「トランスフェクション」、コンジュゲーション及び形質導入という用語は、外来核酸（例えばDNA）を宿主細胞に導入するための先行技術で知られる複数の方法を含むものとし、これにはリン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈殿、DEAE-デキストラン仲介トランスフェクション、リポフェクション、自然反応能（natural competence）、化学物質仲介伝達、エレクトロポレーション又は粒子衝突が含まれる。宿主細胞（植物細胞を含む）を形質転換又はトランスフェクトするのに適当な方法は、Sambrookら(Molecular Cloning: A Laboratory Manual.,第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)及びMethods in Molecular Biology, 1995, vol. 44, Agrobacterium protocols, eds: Gartland及びDavey, Humana Press, Totowa, New Jersey等の他の実験マニュアル中で見出すことができる。
【０２６６】
このように、本発明の方法に使用される核酸、遺伝子構築物、発現カセット、ベクター等を、植物細胞又は植物への導入後に、色素体ゲノム又は好ましくは宿主細胞の核ゲノムのいずれかに導入することが可能である。ゲノムへの組込みはランダムであってもよいし、導入されたコピーが天然の遺伝子を置換することにより、細胞による所望の化合物の産生をモジュレートするように組換えを介して、又は該遺伝子が遺伝子の発現を保証する少なくとも1つの配列及び機能的な転写遺伝子のポリアデニル化を保証する少なくとも1つの配列を含む機能的発現ユニットと機能的に連結するように遺伝子をin transで用いることによって、実施し得る。適当な場合には、核酸は遺伝子の多数同時発現（multiparallel expression）のための多重発現カセット又は構築物を介して植物に伝達される。別の実施形態では、核酸配列は更なる別種の核酸配列なく植物に導入される。
【０２６７】
上述されるように、外来遺伝子の植物のゲノムへの伝達は、形質転換と称される。この場合、形質転換及び植物組織又は植物細胞からの植物の再生のために記載される方法が、一過的な又は安定な形質転換のために利用される。適当な方法は、ポリエチレングリコール誘導型DNA摂取、遺伝子銃を用いた遺伝子銃法（「粒子衝突」法）、エレクトロポレーション、DNA含有溶液中での乾燥胚のインキュベーション、マイクロインジェクション及びアグロバクテリウム仲介遺伝子伝達によるプロトプラスト形質転換である。上記方法は、例えばB. Jenes, Techniques for Gene Transfer: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, S.D. Kung及びR. Wu編集, Academic Press (1993) 128-143並びにPotrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225)に記載される。
【０２６８】
発現されるべき構築物を、例えば本明細書に記載されるように、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を形質転換するのに適当なベクター、例えばpBin19 (Bevan, Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711)中にクローニングすることが好ましい。その後、係るベクターで形質転換されたアグロバクテリアは、植物、特に作物（例えばタバコ植物等）を公知の様式で、例えば創傷した葉又は葉の破片をアグロバクテリアの溶液に浸した後、該葉又は葉の破片を適当な培地中で培養することによって形質転換するために使用し得る。アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）による植物の形質転換は、例えばHofgen, Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877に記載されるか、又は特にF.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants;Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, S.D. Kung及びR. Wu編, Academic Press, 1993, pp. 15-38に開示されている。
【０２６９】
この方法で使用される核酸、遺伝子構築物、発現カセット、ベクター等を検査し、適切な場合には、その後植物の形質転換に使用する。このために、最初に中間宿主から構築物、プラスミド、ベクター等を取得することが必要であり得る。例えば、構築物は細菌宿主から、従来のプラスミド単離法に従ってプラスミドとして単離することができる。植物を形質転換する非常に多くの方法が知られている。異種DNAの植物のゲノムへの安定な組込みが本発明に従って有利であるため、特にT-DNA仲介形質転換が好都合であることが証明されており、これはそれ自体公知の様式で実施し得る。例えば、上で述べられたように作製したプラスミド構築物は、エレクトロポレーション又は熱ショックによってコンピテントアグロバクテリウムに形質転換し得る。原則的に、一方で同時に組み込まれたベクターの形成とバイナリーベクターによる形質転換は区別されるべきである。最初の選択肢において、暗号遺伝子断片を含むベクター構築物は任意のT-DNA配列を含まず、むしろ、ベクター構築物のT-DNAによる相同性組換えによって、アグロバクテリア中で同時に組み込まれたベクターが生じる。T-DNAはアグロバクテリウム中でTi又はRiプラスミドの形態で存在し、その際、癌遺伝子が外因性DNAで都合よく置換されている。バイナリーベクターを使用する際、これらは細菌コンジュゲーション又はアグロバクテリアへの直接的な伝達によって伝達し得る。係るアグロバクテリアは予めvir遺伝子（しばしばヘルパーTi(Ri)プラスミドと称される）を保有するベクターを含むことが好都合である。1以上のマーカーを用いてもよく、これに基づいて形質転換したアグロバクテリア及び形質転換した植物細胞の選別が可能であることが好都合である。非常に多数のマーカーが当業者に知られている。
【０２７０】
核酸の安定的な又は一過的な組み込みについて、使用される発現ベクター及び使用されるトランスフェクション技術に応じて、ごく少数の細胞のみが外来DNAを摂取し、必要に応じてこれをそのゲノム中に組み込むことが知られている。これらの組込み体（integrant）の同定及び選別のために、通常は選択可能なマーカー（例えば抗生物質耐性）をコードする遺伝子を目的の遺伝子と共に宿主細胞内に導入する。
【０２７１】
マーカー遺伝子を本発明の核酸分子の宿主生物、特に植物への導入の成功について選別するために使用することが有利である。これらのマーカー遺伝子は、本発明の核酸の導入の成功を、多くの異なる原理によって、例えば蛍光、発光を利用した又はヒトに可視である光の波長領域での視覚的認定により、除草剤又は抗生物質耐性を介して、「栄養」(栄養要求性)マーカー又は抗栄養マーカーを介して、植物ホルモンを介した酵素アッセイによって、同定することを可能にする。ここで記載し得る上記マーカーの例は、GFP(＝緑色蛍光タンパク質)、ルシフェリン/ルシフェラーゼ系；β-ガラクトシダーゼとその着色基質（例えばX-Gal）；例えばイミダゾリノン、グリホサート、ホスホスリシン（phosphothricin）又はスルホニル尿素に対する、除草剤耐性；少し例を挙げると、例えばブレオマイシン、ハイグロマイシン、ストレプトマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、アンピシリン、ゲンタマイシン、ゲネチシン(G418)、スペクチノマイシン又はブラストサイジンに対する、抗生物質耐性；マンノース又はキシロースの利用等の栄養マーカー、あるいは2-デオキシグルコース耐性等の抗栄養マーカーである。このリストは可能なマーカーのごく一部を表す。この種のマーカーは当業者に周知である。
【０２７２】
生物及び選別方法に応じて異なるマーカーが好ましい。好ましい選択可能なマーカーは、植物では、グリホスフェート又はグルフォシネート等の除草剤に対する耐性を付与するものが含まれる。別の適当なマーカーは、例えば糖又はアミノ酸の生合成経路に関与する遺伝子（β-ガラクトシダーゼ、ura3又はilv2等）をコードするマーカーである。ルシフェラーゼ、gfp等のマーカーコード遺伝子又は他の蛍光遺伝子も同様に適当である。これらのマーカーは、上記遺伝子が例えばこれらが従来の方法によって欠失されていることにより機能的ではない突然変異体で使用することが可能である。さらにマーカーは、配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドをコードする核酸分子、又は本明細書に記載の本発明の別の核酸分子と同じベクター上で宿主細胞に導入してもよいし、あるいはこれらは別のベクター上で導入してもよい。
【０２７３】
マーカー遺伝子、特に抗生物質及び除草剤耐性遺伝子は、核酸の導入が成功した後、通常はトランスジェニック宿主細胞中で必要でないか又は望ましくないため、これらのマーカー遺伝子を削除することを可能にする技術を、核酸を導入するために本発明の方法で使用することが有利である。係る方法の1つは、「同時形質転換」である。同時形質転換は、一方が本発明の核酸を有し、他方がマーカー遺伝子を有する、2つの形質転換用ベクターを同時に使用することを含む。植物の場合、大部分の形質転換体は両ベクターを獲得するか又は含む（最大40％又はそれ以上の形質転換体）。その後、形質転換した植物から交配によってマーカー遺伝子を取り除くことが可能である。別の方法は、形質転換のために、所望の核酸と共にトランスポゾンに組み込まれたマーカー遺伝子を使用する（Ac/Ds技術）。一部の場合（約10％）では、形質転換が成功した後、トランスポゾンが宿主細胞のゲノムから飛び出て、消失する。別の多くの場合では、トランスポゾンは他の部位へ移入する。これらの場合、マーカー遺伝子を再び異型交配することが必要である。かかる事象を検出することを可能にするか又は容易にする微生物学的技術が開発されている。別の有利な方法は、異種交配を省略可能にする利点を有する「組換え系」を使用する。この種も最も知られた系は「Cre/lox」系である。Cre1はloxP配列間に位置する配列を欠失させるレコンビナーゼである。マーカー遺伝子がloxP配列間に組み込まれる場合、形質転換が成功した後にCre1レコンビナーゼを用いて欠失される。別のレコンビナーゼ系は、HIN/HIX、FLP/FRT及びREP/STB系(Tribbleら, J.Biol. Chem., 275, 2000: 22255-22267; Velmuruganら, J. Cell Biol., 149, 2000: 553-566)である。本発明の核酸配列の植物ゲノムへの組込みの標的化も原則的には可能であるが、非常に多くの作業を伴うためこれまであまり好ましくない。もちろんこれらの方法は、酵母、真菌又は細菌等の微生物にも適用可能である。
【０２７４】
本発明の発現ベクターで形質転換したアグロバクテリアも同様に、試験植物（シロイヌナズナ等）、あるいは作物、例えば穀類、トウモロコシ、オートムギ、ライムギ、オオムギ、コムギ、ダイズ、イネ、ワタ、砂糖大根、カノラ、ヒマワリ、アマ、大麻、ジャガイモ、タバコ、トマト、ニンジン、パプリカ、ナタネ、タピオカ、カッサバ、クズウコン、マンジュギク、アルファルファ、レタス及び多様な樹木、ナッツ及びブドウ種、油含有作物、例えばダイズ、ピーナッツ、ヒマシ油植物、ヒマワリ、トウモロコシ、綿、アマ、ナタネ、ココナッツ、アブラヤシ、ベニバナ(Carthamus tinctorius)又はカカオ豆あるいは下記に記載の他の植物を、例えば創傷した葉又は葉の破片をアグロバクテリアの溶液に浸した後に該葉又は葉の破片を適当な培地中で培養することによって形質転換するために、公知の方法で使用し得る。
【０２７５】
遺伝子的に改変した植物細胞は当業者に公知の方法のいずれかによって再生し得る。適当な方法はS.D. Kung及びR. Wu, Potrykus又はHofgen及びWillmitzerによる上記刊行物中で見出すことができる。
【０２７６】
所望であれば、プラスミド構築物を、アグロバクテリアへの形質転換前に、PCR又はサザンブロット分析を用いて、同一性及び/又は完全性について再度検査してもよい。通常は、プラスミド構築物中に調節配列が結合した暗号遺伝子断片の片側又は両側に、T-DNAに隣接していることが望ましい。これは、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）又はアグロバクテリウム・リゾジェネス（Agrobacterium rhizogenes）種の細菌が形質転換に使用される際に特に有用である。形質転換したアグロバクテリアはそれ自体公知の様式で培養することができ、その結果、従来の植物形質転換が利用可能である。形質転換されるべき植物又は植物の一部分を生育し、従来の様式で準備する。アグロバクテリアは異なる手法で植物又は植物の部分に作用し得る。したがって、例えば形態形成植物細胞又は組織の培養物を使用することが可能である。T-DNA伝達に従い、細菌は通常は抗生物質によって排除され、植物組織の再生が誘導される。このために、特に適当な植物ホルモンを使用して、初期カルスの形成後にシュートの形成を促進する。本発明によれば、インプランタ形質転換を実施することが好ましい。このために、植物の種子を、例えばアグロバクテリアに曝露するか又は植物分裂組織をアグロバクテリアで接種することが可能である。本発明によれば、完全植物又は少なくとも花原基を、形質転換したアグロバクテリアの懸濁液に曝露することが特に有利であることが証明されている。その後、前者は、処理した植物の種子が取得されるまでさらに生育される（Clough and Bent, Plant J. (1998) 16, 735）。形質転換植物を選別するために、形質転換体から取得した植物材料は通常、形質転換植物を非形質転換植物と区別できる選択的条件に供される。例えば、上述される様式で取得した種子を新たに播種し、生育後に適当なスプレー選別に供することができる。その他の可能性は、形質転換した種子のみが植物に生育できるように、必要に応じて滅菌後に、寒天平板上で適当な選択剤を用いて種子を生育することである。
【０２７７】
本発明はさらに、本発明のベクター又は本発明のポリヌクレオチドで安定的に又は一過的に形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞に関する。したがって、本発明はさらに、一実施形態では、その配列番号2、107、125、129又は137の活性が、例えば本明細書で特徴付けられるポリ核酸の（過剰）発現に起因して増加される、微生物に関する。
【０２７８】
一実施形態では、宿主細胞又は微生物は、細菌細胞又は真核細胞、特に単細胞微生物又は植物細胞である。
【０２７９】
別の実施形態では、本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターを含む動物細胞又は植物細胞に関する。好適な実施形態では、本発明は特に、配列番号2、107、125、129又は137の量が増加した及び/又は本発明の植物細胞を含む、植物組織又は植物に関する。一実施形態では、本発明はさらに、配列番号2、107、125、129又は137の活性が増加した、又は配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドの量が増加した植物区画、植物細胞小器官、植物細胞、植物組織又は植物に関する。
【０２８０】
原則的に本発明の核酸、本発明の遺伝子産物又は本発明のベクターを摂取するのに適当な宿主細胞は、任意の原核又は真核生物の細胞である。本発明の核酸、発現カセット又はベクターに適当な生物又は宿主生物は、原則的により早い成長及びより高い収量が望まれる任意の生物、好ましくは上記のように、作物である。
【０２８１】
したがって、本発明の別の態様は、本発明の少なくとも1つの核酸配列、発現カセット又はベクターで形質転換されたトランスジェニック生物、及び細胞、細胞培養物、組織、係る生物由来の一部分又は繁殖材料（propagation material）に関する。
【０２８２】
「宿主生物」、「宿主細胞」、「組換え(宿主)生物」、「組換え(宿主)細胞」、「トランスジェニック(宿主)生物」及び「トランスジェニック(宿主)細胞」は本明細書で交換可能に使用される。もちろんこれらの用語は特定の宿主生物又は特定の標的細胞だけでなく、該生物又は細胞の子孫又は可能な子孫にも関する。突然変異又は環境効果により、後世代に特定の改変を生じさせ得るため、これらの子孫は親細胞と同一である必要はないが、依然として本明細書に記載される用語の範囲内に含まれる。
【０２８３】
ここで言及すべき例は、真菌(例えばモルティエレラ(Mortierella)、サプロレグニア(Saprolegnia)又はピシウム(Pythium)属)等の微生物、細菌(例えばエシェリキア(Escherichia)属等)、酵母（例えばサッカロミセス(Saccharomyces)属等）、シアノバクテリア、繊毛虫、藻類又は原生生物（例えばクリプテコジニウム(Crypthecodinium)等の渦べん毛虫等）である。
【０２８４】
微生物の成長速度の増加は、価値のある産物の合成、例えば精製化学物質を製造する本発明の方法と組合せることが特に有利である。したがって、有利な実施形態は、例えば（本来的に）比較的大量のビタミン、糖、ポリマー、油等を合成する微生物である。ここで記載し得る例は、真菌（例えばモルティエレラ・アルピナ(Mortierella alpina)、ピシウム・インシドオスム(Pythium insidiosum)等）、酵母(例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)及びサッカロミセス属の微生物等）、シアノバクテリア、繊毛虫、藻類又は原生生物（例えばクリプテコジニウム(Crypthecodinium)等の渦べん毛虫等）である。
【０２８５】
利用可能な宿主細胞はさらにGoeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。有用な発現株、例えば比較的低いプロテアーゼ活性を有するものは、Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128に記載されている。
【０２８６】
タンパク質は通常、融合又は非融合タンパク質の発現を制御する構成的又は誘導性プロモーターを含むベクターを用いることによって、原核生物中で発現される。典型的な融合発現ベクターは、特にpGEX(Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B.及びJohnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40)、pMAL(New England Biolabs, Beverly, MA)及びpRIT5(Pharmacia, Piscataway, NJ)である。適当な誘導可能な非融合大腸菌発現ベクターの例は、特にpTrc (Amannら(1988) Gene 69:301-315)及びpET 11d(Studier, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60)である。
【０２８７】
原核生物に適当な他のベクターは当業者に公知であり、例えば大腸菌(E. coli)ではpLG338、pACYC184、pBRシリーズ(pBR322等)、pUCシリーズ(pUC18又はpUC19)等、M113mpシリーズ、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11又はpBdCI、ストレプトミセス(Streptomyces)ではpIJ101、pIJ364、pIJ702又はpIJ361、バチルス(Bacillus)ではpUB110、pC194又はpBD214、コリネバクテリウム(Corynebacterium)ではpSA77又はpAJ667である。
【０２８８】
しかし、真核生物発現系が好ましい。別の実施形態では、発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母(S. cerevisiae)での発現用のベクターの例は、pYeDesaturasec1 (Baldari (1987) Embo J. 6:229)、pMFa(Kurjan (1982) Cell 30:933)、pJRY88 (Schultz (1987) Gene 54:113)、2ミクロン、pAG-1、YEp6、YEp13、pEMBLYe23及びpYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA)を含む。他の真菌（糸状菌等）での使用に適当なベクターを構成するためのベクター及び方法は、van den Hondel, C.A.M.J.J. (1991): Applied Molecular Genetics of fungi, J.F. Peberdy,編集, pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge;又は: J.W. Bennet,編集, p. 396: Academic Press: San Diegoに詳細に記載されるものを含む。真菌におけるベクターの例はpALS1、pIL2又はpBB116であり、植物ではpLGV23、pGHlac＋、pBIN19、pAK2004又はpDH51である。
【０２８９】
あるいは、価値のある産物、例えば記載の精製化学物質は、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞中で発現させることができる。培養した昆虫細胞（例えばSf9細胞）中でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターは、pAcシリーズ(Smith (1983) Mol. Cell Biol.. 3:2156)及びpVLシリーズ(Lucklow (1989) Virology 170:31)を含む。
【０２９０】
上述したベクターは、可能な適当なベクターにわたってわずかな概要のみを提供する。別のプラスミドは当業者に知られており、例えばCloning Vectors (編集者Pouwels, P.H.ら, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018)に記載されている。原核及び真核細胞に適当な別の発現系については、Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 or Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989)の16及び17章を参照されたい。
【０２９１】
微生物が本発明の方法に適当な上記核酸分子を含むポリヌクレオチドで一過的に又は安定的に形質転換されていることが好ましい。
【０２９２】
本発明の別の有利な実施形態では、配列番号2、107、125、129又は137のより高い活性を有し、その結果より高い増殖速度を有するように、例えば価値のある産物又は精製化学物質を、単細胞植物細胞（藻類等）で（Falciatore, 1999, Marine Biotechnology 1 (3): 239及びその中の参照を参照）、及び高等植物の植物細胞で（例えば作物等の種子植物）で発現させることも可能である。植物発現ベクターの例は、上で詳細に記載されるもの、又はBecker, (1992), Plant Mol. Biol. 20:1195及びBevan, (1984), Nucl. Acids Res. 12:8711; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants: Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, 編集者: Kung及びR. Wu, Academic Press, 1993, p.15のものを含む。アグロバクテリウムのバイナリーベクターの比較的最近の概要はHellens, 2000, Trends in Plant Science, Vol. 5, 446で見出すことができる。
【０２９３】
有利に使用される宿主生物は細菌、真菌、酵母又は植物、好ましくは作物又はその一部分である。真菌、酵母又は植物、特に好ましくは植物を使用することが好ましく、特に穀類及びイネ科の植物等の農業的に有用な植物、例えばトリティカム・エスピーピー(Triticum spp.)、ジー・メイス(Zea mais)、ホルデウム・ブルガレ(Hordeum vulgare)、オートムギ、セカレ・セレアレ(Secale cereale)、オリザ・サティバ(Oryza sativa)、ペニセツム・グラウキュム(Pennisetum glaucum)、ソルガム・ビコロル(Sorghum bicolor)、ライコムギ、アグロティス・エスピーピー(Agrostis spp.)、センクルス・シリアリス(Cenchrus ciliaris)、ダクチリス・グロメラタ(Dactylis glomerata)、フェスツカ・アルンディナセア(Festuca arundinacea)、ロリウム・エスピーピー(Lolium spp.)、メディカゴ・エスピーピー(Medicago spp.)、アルファルファ及びサッカルム・エスピーピー(Saccharum spp.)、マメ科植物及び油種子作物、例えばブラッシカ・ユンセア(Brassica juncea)、ブラッシカ・ナプス(Brassica napus)、ブラッシカ・ニグラ(Brassica nigra)、シナペス・アルバ(Sinapes alba)、グリシン・マックス(Glycine max)、アラチス・ヒポガエア(Arachis hypogaea)、カノラ、ヒマシ油植物、ココナッツ、アブラヤシ、ココア豆、ナツメヤシ、ゴシッピウム・ヒルスツム(Gossypium hirsutum)、シセル・アリエティヌム(Cicer arietinum)、ヘリアンタス・アヌウス(Helianthus annuus)、レンス・クリナリス(Lens culinaris)、リヌム・ウシタティッシムム(Linum usitatissimum)、シナピス・アルバ(Sinapis alba)、トリフォリウム・レペンス(Trifolium repens)、カーサムス・チンクトリウス(Carthamus tinctorius)及びビシア・ナルボネンシス(Vicia narbonensis)、大麻、野菜、レタス及び果実、例えばバナナ、ブドウ、トマト(Lycopersicon esculentum)、アスパラガス、キャベツ、スイカ、キーウィ、ソラヌム・チュベロスム(Solanum tuberosum)、ソラヌム・リパーシキュム(Solanum lypersicum)、ニンジン、パプリカ、タピオカ、カッサバ、ベータ・ブルガリス(Beta vulgaris)、カッサバ及びキコリ、クズウコン、ナッツ及びブドウ種、樹木、例えばコフィア(Coffea)種、シトラス・エスピーピー(Citrus spp.)、ユーカリプツス・エスピーピー(Eucalyptus spp.)、ピセア・エスピーピー(Picea spp.)、ピーヌス・エスピーピー(Pinus spp.)及びポプルス・エスピーピー(Populus spp.)、タバコ、医薬植物並びに樹木及び花、例えばタゲテス(Tagetes)を記載し得る。
【０２９４】
植物が供与生物として選択される場合、該植物は原則的には受容植物と何らかの系統的関係を有し得る。したがって、供与植物及び受容植物は、同一の科、属、種、品種又は系統に属することができ、これにより組み込まれるべき核酸と受容植物のゲノムの対応部分との相同性の増加をもたらす。
【０２９５】
本発明の特定の実施形態によれば、供与生物は真菌、好ましくはサッカロミセス(Saccharomycetaceae)科、特にサッカロミセス(Saccharomyces)属、特に好ましくはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。
【０２９６】
好適な受容植物は、適切に形質転換できる特定の植物である。これには単子葉及び双子葉植物が含まれる。特に、穀類及びイネ科等の農業上有用な植物、例えばトリティカム・エスピーピー(Triticum spp.)、ジー・メイス(Zea mais)、ホルデウム・ブルガレ(Hordeum vulgare)、オートムギ、セカレ・セレアレ(Secale cereale)、オリザ・サティバ(Oryza sativa)、ペニセツム・グラウキュム(Pennisetum glaucum)、ソルガム・ビコロル(Sorghum bicolor)、ライコムギ、アグロティス・エスピーピー(Agrostis spp.)、センクルス・シリアリス(Cenchrus ciliaris)、ダクチリス・グロメラタ(Dactylis glomerata)、フェスツカ・アルンディナセア(Festuca arundinacea)、ロリウム・エスピーピー(Lolium spp.)、メディカゴ・エスピーピー(Medicago spp.)及びサッカルム・エスピーピー(Saccharum spp.)、マメ科植物及び油種子作物、例えばブラッシカ・ユンセア(Brassica juncea)、ブラッシカ・ナプス(Brassica napus)、グリシン・マックス(Glycine max)、アラチス・ヒポガエア(Arachis hypogaea)、ゴシッピウム・ヒルスツム(Gossypium hirsutum)、シセル・アリエティヌム(Cicer arietinum)、ヘリアンタス・アヌウス(Helianthus annuus)、レンス・クリナリス(Lens culinaris)、リヌム・ウシタティッシムム(Linum usitatissimum)、シナピス・アルバ(Sinapis alba)、トリフォリウム・レペンス(Trifolium repens)及びビシア・ナルボネンシス(Vicia narbonensis)、野菜及び果実、例えばバナナ、ブドウ、トマト(Lycopersicon esculentum)、アスパラガス、キャベツ、スイカ、キーウィ、ソラヌム・チュベロスム(Solanum tuberosum)、ベータ・ブルガリス(Beta vulgaris)、カッサバ及びキコリ、樹木、例えばコフィア(Coffea)種、シトラス・エスピーピー(Citrus spp.)、ユーカリプツス・エスピーピー(Eucalyptus spp.)、ピセア・エスピーピー(Picea spp.)、ピーヌス・エスピーピー(Pinus spp.)及びポプルス・エスピーピー(Populus spp.)、医薬植物並びに樹木、及び花、に言及すべきである。特定の実施形態によれば、本発明はアラビドプシス（Arabidopsis）属、例えばシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)及びオリザ属の、トランスジェニック植物に関する。
【０２９７】
形質転換後、植物は最初に上述のように再生され、その後従来の通り栽培及び生育する。
【０２９８】
本発明の植物区画、植物細胞小器官、植物細胞、植物組織又は植物は、本発明の方法に従って作製されるか、又は本明細書に記載の遺伝子構築物若しくは記載のベクターを含むことが好ましい。
【０２９９】
一実施形態では、本発明は本発明の植物又は本発明の有用動物の収量又は繁殖材料、あるいは微生物のバイオマス、すなわち本発明の方法に従って産生した非ヒト生物の生体材料に関する。
【０３００】
本発明はさらに、本発明のトランスジェニック植物集団から誘導可能なトランスジェニック植物材料に関する。前記材料は、実際のトランスジェニック植物から誘導された及び/又はトランスジェニック植物を作製するために使用し得る、植物細胞及び特定の組織、器官及び植物の一部分をその任意の表現形態、例えば種子、葉、やく、繊維、根、根毛、茎、胚芽、カルス、子葉、葉柄、収穫材料、植物組織、再生組織及び細胞培養物で含む。
【０３０１】
葉、茎、シュート、花、根、塊茎、果実、樹皮、木質部、種子等の任意の植物部分又は植物器官、あるいは完全植物が好ましい。この関連で、種子は種皮、表皮及び種子細胞、胚乳組織又は胚組織等の種子部分の全てを含む。収穫産物、特に果実、種子、塊茎、果実、根、樹皮若しくは葉又はその一部分が特に好ましい。
【０３０２】
本発明の方法では、トランスジェニック植物は植物細胞、植物組織又は植物器官をも指し、農業的産物としてみなされる。
【０３０３】
この方法で産生された、特に本発明の方法によって改変されている植物の生体材料は直接販売してもよい。
【０３０４】
一実施形態では、本発明はまた、本発明の方法に従って製造した植物の繁殖材料に関する。繁殖材料は、例えば他の（例えば食物としての）機能を有し得る場合でさえ、植物を播種しかつ生育させるために役立ち得る任意の材料を指す。
【０３０５】
「生育」は、例えばトランスジェニック植物細胞、植物組織又は植物器官を栄養培地で培養すること、又は全植物を基質上又は基質中で、例えば水耕で又は畑で栽培することも指す。
【０３０６】
本発明はさらに、本発明の方法に使用されかつ本明細書で特徴付けられるポリヌクレオチド、遺伝子構築物、ベクター、植物細胞、植物、植物組織又は植物材料の、収量が増加した植物を作製するための使用に関する。
【０３０７】
また適当な宿主細胞は、原則的に、上述のトランスジェニック生物に加えて、好ましくは配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチドをコードする核酸分子、又は本発明の方法に適当であるとして本明細書で特徴付けられた核酸分子を含むポリヌクレオチドで一過的に又は安定的に形質転換されている、有用なトランスジェニック非ヒト動物、例えばブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ガチョウ、カモ、七面鳥、ウマ、ロバ等である。
【０３０８】
別の好適な実施形態では、本発明は特に、配列番号2、107、125、129又は137の量が増加した及び/又は本発明の有用動物細胞を含む、有用動物又は動物器官に関する。
【０３０９】
有用動物は、配列番号2、107、125、129又は137の量の増加、特に発現又は活性の増加を含み、その結果、成長速度の増加、すなわちより早い成長及び、上に列挙した農業的産物の重量の増加又は生産の増加、を含む。
【０３１０】
有用動物がウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ又はヤギであることが好ましい。
【０３１１】
一実施形態では、本発明は配列番号2、107、125、129又は137のポリペプチド、あるいは本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドの、出発生物に比較して非ヒト生物の収量を増加する及び/又は成長を増加するための使用に関する。
【０３１２】
本発明の別の実施形態は、前記方法により取得した産物、例えば生体材料、特に上述した植物材料の、食品、飼料製品、栄養物質、化粧品又は医薬中での使用である。本発明の方法によって取得した植物又は植物の部分から、精製化学物質等の市販の物質を単離することも可能である。
【０３１３】
限定するものとみなすべきではない下記の実施例及び図面により本発明をさらに説明する。
【０３１４】
別の実施形態では、本発明は、本発明の発現構築物、本発明のベクター又は本発明のポリヌクレオチドの、微生物又はその一部部への導入を含む、微生物の作製方法に関する。
【０３１５】
別の実施形態では、本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド、本発明の発現構築物又は本発明のベクターを含むトランスジェニック微生物に関する。適当な微生物は本明細書に既に記載されており、特に精製化学物質の産生に適当な上記株が好ましい。
【０３１６】
この方法で取得される精製化学物質は、価値のある別の産物の合成のための出発材料として適当である。例えば、これらは医薬、食糧、飼料又は化粧品の製造のためにそれぞれを組合せて、又は単独で使用することができる。したがって、本発明は本発明の方法のステップを含む医薬、食糧、飼料又は栄養物質の製造方法であって、該ステップが精製化学物質、特に製造されたアミノ酸組成物（例えば所望である場合に製造されたメチオニン）の単離、及び該産物の製薬上許容し得る担体との製剤化又は該産物の農業用途に許容し得る形態での製剤化を含む、上記方法に関する。本発明の別の実施形態は、この方法で製造した精製化学物質又はトランスジェニック生物の、飼料、食糧、薬剤、栄養補助食品、化粧品又は医薬における使用である。
【０３１７】
本発明の方法では、真菌（クラビセプス(Claviceps)属又はアスペルギウス(Aspergillus)属等）、グラム陽性細菌(バチルス(Bacillus)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、ミクロコッカス(Micrococcus)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、ノカルディア(Nocardia)属、カセオバクター(Caseobacter)属又はアルスロバクター(Arthrobacter)属等)、グラム陰性細菌(エシェリキア(Escherichia)属、フラボバクテリウム(Flavobacterium)属又はサルモネラ(Salmonella)属等)又は酵母（ロドトルラ(Rhodotorula)属、ハンセヌラ(Hansenula)属又はカンジダ(Candida)属等）等のトランスジェニック微生物を使用することが有利である。特に有利な生物は、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、エシェリキア属、バチルス属、ロドトルラ属、ハンセヌラ属、カンジダ属、クラビセプス属又はフラボバクテリウム属よりなる群から選択される。本発明の方法において、ハンセヌラ・アノマラ(Hansenula anomala)、カンジダ・ユーティリス(Candida utilis)、クラビセプス・プルプレア(Claviceps purpurea)、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)、バチルス・エスピー(Bacillus sp.)、ブレビバクテリウム・アルビダン(Brevibacterium albidum)、ブレビバクテリウム・アルバム(Brevibacterium album)、ブレビバクテリウム・セリヌム(Brevibacterium cerinum)、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)、ブレビバクテリウム・グルタミゲネス(Brevibacterium glutamigenes)、ブレビバクテリウム・イオジヌム(Brevibacterium iodinum)、ブレビバクテリウム・ケトグルタミカム(Brevibacterium ketoglutamicum)、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンツム(Brevibacterium lactofermentum)、ブレビバクテリウム・リネンス(Brevibacterium linens)、ブレビバクテリウム・ロセウム(Brevibacterium roseum)、ブレビバクテリウム・サッカロリチカム(Brevibacterium saccharolyticum)、ブレビバクテリウム・エスピー(Brevibacterium sp.)、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム(Corynebacterium acetoacidophilum)、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム(Corynebacterium acetoglutamicum)、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)(＝ミクロコッカス・グルタミカム(Micrococcus glutamicum))、コリネバクテリウム・メラッセコラ(Corynebacterium melassecola)、コリネバクテリウム・エスピー(Corynebacterium sp.)又はエシェリキア・コリ(Escherichia coli)、特にエシェリキア・コリ(Escherichia coli)K12並びにその記載される株よりなる属及び種よりなる群から選択された微生物を使用することがより一層有利である。
【０３１８】
本発明の方法は、宿主生物が微生物である場合に、0℃〜95℃、好ましくは10℃〜85℃、特に好ましくは15℃〜75℃、より一層好ましくは15℃〜45℃の温度で実施することが有利である。pHはその間、pH4〜12、好ましくはpH6〜9、特に好ましくはpH7〜8に維持されることが好ましい。本発明の方法は、バッチワイズ、セミバッチワイズ又は連続的に操作することができる。既知の培養法の概要は、Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))による教本又はStorhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))による教本中で見出される。使用されるべき培養培地は、適当な様式で各株の必要条件に適合する必要がある。様々な微生物のための培養培地の記載は米国微生物学会（Washington D. C., USA, 1981）のハンドブック「Manual of Methods for General Bacteriology」にある。本発明に使用できるこれらの培地は、上述されるように、通常は1以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン及び/又は微量元素を含む。好適な炭素源は、単糖、二糖又は多糖等の糖である。非常に良好な炭素源の例は、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプン又はセルロースである。糖は、糖蜜又は他の精糖の副産物などの複合化合物を介して培地に添加することもできる。様々な炭素源の混合物を添加することも有利であり得る。他の可能な炭素源は油及び脂肪（例えば大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油及び/又はココナッツ脂等）、脂肪酸(例えばパルミチン酸、ステアリン酸及び/又はリノレン酸等)、アルコール並びに/あるいはポリアルコール(例えばグリセロール、メタノール及び/又はエタノール)並びに/あるいは有機酸(例えば酢酸及び/又は乳酸等)である。窒素源は通常は、有機又は無機窒素化合物又はこれらの化合物を含む物質である。窒素源の例は、液体中の又は気体形態のアンモニア又はアンモニア塩（硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム又は硝酸アンモニウム等）、ニトレート、尿素、アミノ酸又は複合窒素源（コーンスティープリカー、ダイズミール、ダイズタンパク質、酵母エキス、肉エキス等）を含む。窒素源は単独で又は混合物として使用し得る。培地中に存在し得る無機塩化合物は、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅及び鉄の塩化物塩、リン塩又は硫酸塩を含む。硫黄含有精製化学物質、特にアミノ酸(例えばメチオニン)を製造するために、硫黄源として無機硫黄含有化合物（例えばスルフェート、スルファイト、ジチオナイト、テトラチオネート、チオスルフェート、スルフィド等）あるいは有機硫黄化合物（メルカプタン及びチオール等）を使用することが可能である。リン源としてリン酸、リン酸二水素カリウム又はリン酸水素二カリウムあるいはその対応するナトリウム含有塩を使用することが可能である。溶液中の金属イオンを維持するためにキレート剤を培地に添加することができる。特に適当なキレート剤は、ジヒドロキシフェノール（カテコール又はプロトカテキュエート(protocatechuate)等）、又は有機酸(クエン酸等)が含まれる。微生物を培養するために本発明に従って使用される発酵培地は、通常は他の成長因子（ビタミン又は成長促進物質）をさらに含み、これには例えばビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテネート及びピリドキシンが含まれる。成長因子及び塩はしばしば複合培地成分（酵母エキス、糖蜜、コーンスティープリカー等）に由来する。適当な前駆物質をさらに培養培地に添加することができる。培地化合物の正確な組成は特定の実験に大きく左右され、各特定の場合について個々に選択される。培地の最適化についての情報はテキストブック「Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach」(編集者P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)から得ることができる。Standard 1(Merck)又はBHI(Brain heart infusion, DIFCO)等の増殖培地も商業的供給業者から購入することができる。全ての培地成分は、加熱（1.5バール及び121℃で20分）又は濾過滅菌（sterilizing filtration）のいずれかによって滅菌する。この成分は共に、又は必要に応じて別々に滅菌することができる。全ての培地成分は、培養の開始時に存在することができ、あるいは場合により連続的に又はバッチワイズで添加することができる。培養の温度は通常は15℃〜45℃、好ましくは25℃〜40℃であり、実験の間一定に維持することも、変更することもできる。培地のpHは5〜8.5の範囲、好ましくは約7とするべきである。培養のためのpHは培養の間、塩基性化合物（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、又はアンモニア水等）又は酸性化合物(リン酸又は硫酸等)を添加することによって制御することができる。発泡は、消泡剤(例えばポリグリコール脂肪酸エステル等)を使用することによって制御できる。プラスミドの安定性は、選択的効果を有する適当な物質（例えば抗生物質）を培地に添加することによって維持することができる。好気条件は、酸素又は酸素含有ガス混合物（例えば環境空気）を培養物に導入することによって維持される。培養の温度は通常は20℃〜45℃、好ましくは25℃〜40℃の範囲である。培養は所望の産物の形成が最大になるまで継続される。この目的は通常は10時間〜160時間で達成される。このようにして取得した、特定の精製化学物質を含む発酵ブロスは、通常は7.5〜25重量％の乾燥物質含量を有する。少なくとも最後に、特に発酵時間の少なくとも30％で、糖を制限する発酵がさらに有利である。これは、発酵培地中の利用可能な糖の濃度が、この時間の間、0〜3g/lに維持されるか、又はこれ以下に低減されることを意味する。その後、発酵ブロスはさらに処理される。必要に応じて、分離法（例えば遠心分離、濾過、デカンテーション又はこれらの方法の組合せ等）によって、バイオマスを発酵ブロスから完全に又は部分的に除去すること、又はその中に完全に残すことができる。その後、発酵ブロスは公知の方法（例えば回転式蒸発器、薄膜蒸発器、流下液膜式蒸発器（falling film evaporator）を使用するもの等）によって、逆浸透によって、又はナノ濾過によって、濃く又は濃縮することができる。この濃縮した発酵ブロスはその後、凍結乾燥、スプレー乾燥、スプレー式造粒処理又は他の方法によって仕上げ処理することができる。
【０３１９】
しかし、製造した精製化学物質をさらに精製することも可能である。このために、産物含有組成物を適当な樹脂上によるクロマトグラフィーに供し、この場合、所望の産物又は不純物はクロマトグラフィー樹脂上に完全に又は部分的に保持される。これらのクロマトグラフィーステップは、必要に応じて、同一の又は異なるクロマトグラフィー樹脂を用いて繰り返すことができる。当業者は適当なクロマトグラフィー樹脂及びその最も効率的な使用に精通している。精製した産物は、濾過又は超音波によって濃縮し、かつ産物の安定性が最大になる温度で保存することができる。
【０３２０】
単離した化合物の同一性及び純度は、先行技術によって測定することができる。これには高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)、分光法、質量分析(MS)、染色法、薄層クロマトグラフィー、NIRS、酵素アッセイ又は微生物学的アッセイが含まれる。これらの分析方法はPatekら(1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhovaら(1996) Biotekhnologiya 11 27-32;及びSchmidtら(1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Vol. A27, VCH: Weinheim, pp. 89-90, pp. 521-540, pp. 540-547, pp. 559-566, 575-581及びpp. 581-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley及びSons; Fallon, A.ら(1987) Applications of HPLC in Biochemistry :Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 17に要約されている。
【０３２１】
さらに別の態様では、本発明はさらに、本発明の核酸分子を発現するトランスジェニック植物細胞又は本発明のポリペプチドの増加した細胞活性（例えば所望のタンパク質の発現レベルの増加又はより高い活性）を示す細胞を含む本発明のトランスジェニック植物の、収穫可能部分及び繁殖材料に関する。
【０３２２】
収穫可能部分は、原則的に植物の有用な部分のいずれか、例えば、花、花粉、実生、塊茎、葉、茎、果実、種子、根等であり得る。繁殖材料は、例えば種子、果実、挿し穂(cutting)、実生、塊茎、根茎等が含まれる。
【０３２３】
本発明はさらに、本発明のトランスジェニック生物、及びこれらに由来する細胞、細胞培養物、その一部分（例えば、トランスジェニック植物生物の場合には、上記のように根、葉等）、及びトランスジェニック繁殖材料（上述されるように種子又は果実等）の、食糧又は飼料、医薬あるいは精製化学物質の製造のための使用に関する。
【０３２４】
したがって、別の実施形態では、本発明はポリヌクレオチド、生物(例えば微生物、植物、植物細胞又は植物組織)、ベクター、又は本発明のポリペプチドの、脂肪酸、カロテノイド、イソプレノイド、ビタミン、脂質、ろうエステル、多糖及び/又はポリヒドロキシアルカノアート、並びに/あるいはその代謝産物、特にステロイドホルモン、コレステロール、プロスタグランジン、トリアシルグリセロール、胆汁酸並びに/あるいは細胞、組織及び/又は植物を産生するケトン体を製造するための使用に関する。脂肪酸、カロテノイド、イソプレノイド、ビタミン、ろうエステル、脂質、多糖及び/又はポリヒドロキシアルカノアート、並びに/あるいはその代謝産物、特にステロイドホルモン、コレステロール、トリアシルグリセロール、プロスタグランジン、胆汁酸及び/又はケトン体、あるいは係る改変タンパク質に組み込まれる上で規定した別の精製化学物質、の収量、産生及び/又は産生効率に影響し得る多くの機構が存在する。植物の場合、多くの産物（例えば脂肪酸、カロテノイド、イソプレノイド、ビタミン、脂質、多糖、ろうエステル及び/又はポリヒドロキシアルカノアート、並びに/あるいはその代謝産物、特にプロスタグランジン、ステロイドホルモン、コレステロール、トリアシルグリセロール、胆汁酸及び/又はケトン体）の基礎であるアセチル-CoAの細胞中での発現を増加することによって、上記化合物の産生量を増加し、それによって収穫及び精製のかなりの容易化、又は植物の場合はより効果的な分割(partitioning)が可能であり得る。さらに、適当な生合成経路に、前記代謝産物の1以上、補因子、前駆体分子及び中間体化合物の量の増加が必要かもしれない。したがって、栄養物質（炭素源(すなわち糖)、窒素源（すなわちアミノ酸、アンモニウム塩）、ホスフェート及び硫黄）の移入に関与する輸送タンパク質の数及び/又は活性を増加することにより、生合成プロセスにおける任意の栄養物質供給の制限の排除に起因して、アセチルCoA及びその代謝産物の産生を上記のように改善することが可能であり得る。特に、前記化合物(例えば脂肪酸、カロテノイド、イソプレノイド、ビタミン、ろうエステル、脂質、多糖、及び/又はポリヒドロキシアルカノアート、並びに/あるいはその代謝産物、特にステロイドホルモン、コレステロール、プロスタグランジン、トリアシルグリセロール、胆汁酸及び/又はケトン体分子等)の収量、産生、及び/又は産生効率を植物において増加することが可能であり得る。
【０３２５】
医薬又は精製化学物質の宿主生物中での組換え製造方法であって、宿主生物を、所望の精製化学物質をコードするか又は所望の精製化学物質の生合成を触媒する1以上の構造遺伝子を含む上記発現構築物の1つで形質転換し、形質転換した宿主生物を培養し、そして所望の精製化学物質を培養培地から単離する、上記方法がさらに好ましい。この方法は、酵素、ビタミン、アミノ酸、糖、脂肪酸等の精製化学物質、並びに天然の及び合成の香料、香気物質及び着色剤、あるいはこれらを含む組成物に広く適用することができる。アミノ酸、トコフェロール、トコトリエノール及びカロテノイド又は該化合物を含む組成物の更なる製造が特に好ましい。形質転換した宿主生物を培養し、産物を宿主生物又は培養培地から当業者に公知の方法で回収するか、あるいは生物自体を食物又は栄養補助食品として提供する。例えば抗体又はワクチン等の医薬の製造は、Hood EE, Jilka JM. Curr Opin Biotechnol. 1999 Aug; 10(4):382-6; Ma JK, Vine ND. Curr Top Microbiol Immunol. 1999; 236:275-92に記載されている。
【０３２６】
一実施形態では、本発明は、以下のステップを含む、生物の成長又は収量の増加に寄与する遺伝子産物の同定方法に関する：
a)発現後に上記のように収量又は成長に寄与する遺伝子産物をコードする候補遺伝子を含み得る、サンプル、例えば細胞、組織、植物又は微生物あるいは核酸ライブラリーを、本発明のポリヌクレオチドと接触させる、例えばハイブリダイズさせること；
b)緩いストリンジェント条件下で本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸分子を同定すること、場合により全長cDNAクローン又は完全なゲノムクローンを単離すること；
c)候補核酸分子を宿主細胞、好ましくは植物細胞又は微生物に導入すること；
d)同定した核酸分子を宿主細胞内で発現させること；
e)トランスジェニック生物を誘導し、かつ宿主生物の成長速度又は収量をアッセイすること；並びに
f)核酸分子及びその発現が発現後に野生型に比較して増加に寄与する遺伝子産物を同定すること。
【０３２７】
緩いハイブリダイゼーション条件は以下の通りである：標準的なハイブリダイゼーション手順後に、洗浄ステップを低〜中ストリンジェント条件（通常は例えば60℃〜68℃、0.1xSSC及び0.1％SDSのストリンジェント洗浄条件に比較して、40℃〜55℃の洗浄条件、並びに0.1％SDSを含む2xSSC〜0.2xSSCの塩条件）で実施することができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に関する別の例は、上に列挙した参照中で見出すことができる。通常は洗浄ステップはストリンジェンシー及び長さを増加しながら、ノイズ比に対する有用なシグナルが検出されるまで繰り返し、これは多くの要素、標的については例えばその純度、GC含量、大きさ等、プローブについては例えばその長さ、RNA又はDNAプローブ、塩条件、洗浄又はハイブリダイゼーション温度、洗浄又はハイブリダイゼーション時間等に左右される。
【０３２８】
別の実施形態では、本発明は、以下のステップを含む、生物中の収量又は成長の増加に寄与する遺伝子産物の同定方法に関する：
a)発現後に成長速度及び/又は収量の増加に寄与する遺伝子産物をコードする候補遺伝子を含み得るかつ、本発明の核酸分子と少なくとも20％、好ましくは25％、より好ましくは30％、より一層好ましくは35％、40％又は50％、より一層好ましくは60％、70％又は80％、最も好ましくは90％又は95％以上相同である、生物の核酸分子を、データバンク中の相同性検索を介して同定すること；
b)候補核酸分子を、食餌又は食糧あるいは精製化学物質の産生に適当な宿主細胞、好ましくは植物細胞又は微生物に導入すること；
c)同定した核酸分子を宿主細胞中で発現させること；
d)生物を誘導し、かつ生物の収量又は成長をアッセイすること；
e)並びにその発現が発現後に野生型に比較して宿主細胞の収量又は成長の増加に寄与する核酸分子およびその遺伝子産物を同定すること。
【０３２９】
次いで、同定した核酸分子は本発明のポリヌクレオチドと同様に使用することができる。 
さらに、一実施形態では、本発明は、植物の成長又は産出を刺激する化合物の同定方法であって、
a)本発明のポリペプチド又はそのmRNAを発現する細胞を、細胞培養条件下で候補化合物と接触させること；
b)該ポリペプチド又は該mRNAの発現の増加をアッセイすること；
c)発現レベルを該候補化合物の不在下でなされた標準的な反応と比較すること、
を含み、その際、標準を超える発現の増加が、該化合物が収量又は成長を刺激していることを示す、上記方法に関する。
【０３３０】
さらに、一実施形態では、本発明は本発明のポリペプチドの活性のアゴニストをスクリーニングする方法であって；
a)本発明のポリペプチドを発現する細胞、組織、植物又は微生物を、候補化合物又は複数の化合物を含むサンプルと、本発明のポリペプチドの発現が許容される条件下で接触させること；
b)細胞、組織、植物又は微生物中で、あるいは細胞、組織、植物又は微生物が培養される又は維持される培地中で、成長、収量又はポリペプチドの発現レベルをアッセイすること；並びに
c)測定した成長又は収量あるいはポリペプチド発現レベルを、該候補化合物又は該複数の化合物を含むサンプルの不在下で測定した標準的な成長、収量又はポリペプチド発現レベルと比較することによって、アゴニスト又はアンタゴニストを同定すること
を含み、その際、標準を超える増加レベルが該化合物又は該複数の化合物を含むサンプルがアゴニストであることを示し、標準を超える減少レベルが該化合物又は該複数の化合物を含むサンプルがアンタゴニストであることを示す、上記方法に関する。
【０３３１】
さらに、一実施形態では、本発明は、以下のステップを含む、植物又は微生物の生育及び/又は収率生産の増加に寄与する化合物の同定方法に関する：
a)細胞、組織又は微生物、あるいは本発明のポリペプチドを発現する植物又は該ポリペプチドをコードする核酸分子と、読み出し系とを培養するか又は維持すること、その際、該読み出し系は、化合物又は複数の化合物を含むサンプルの存在下でポリペプチドと該読み出し系とが相互作用する適当な条件下でポリペプチドと相互作用可能であり、かつ該読み出し系と本発明のポリペプチドの発現が可能な条件下での化合物のポリペプチドとの結合に応答して検出可能なシグナルを生じることが可能である；並びに
b)化合物が有効なアゴニストであるかどうかを、該読み出し系により生じるシグナルの存在若しくは不在又は増加を検出することによって同定すること。
【０３３２】
上記化合物は化学的に合成しても、微生物的に製造してもよく、及び/又は例えばサンプル中に、例えば植物、動物又は微生物(例えば病原体)由来の細胞抽出物中に含ませてもよい。さらに、上記化合物は当該技術分野で公知であってもよいが、今まで本発明のポリペプチドを抑制又は活性化できることが知られていないものである。反応混合物は無細胞抽出物であってもよいし、細胞又は組織培養物を含んでもよい。本発明の方法の適当な設定は当業者に公知であり、例えばAlbertsら, Molecular Biology of the Cell,第3版(1994),特に17章に一般的に記載されている。化合物は、例えば反応混合物、培養培地に添加してもよいし、細胞に注入しても植物に噴霧してもよい。
【０３３３】
化合物を含有するサンプルが本発明の方法で同定される場合、活性化又は増加可能な化合物を含むものとして同定された元のサンプルから化合物を単離することが可能であり、あるいは例えばサンプルが複数の異なる化合物から構成される場合は、サンプル当たりの異なる物質数を低減するために元のサンプルをさらに細分化し、元のサンプルの細分化を伴う方法を繰り返すことができる。サンプルの複雑性に応じて、上述のステップを数回、好ましくは本発明の方法に従って同定したサンプルが限定数の又はわずかに1つの物質を含むまで実施することができる。前記サンプルが類似の化学的及び/又は物理的性質の物質を含むことが好ましく、該物質が同一であることが最も好ましい。上記方法に従って同定される化合物又はその誘導体は、植物育種又は植物細胞及び組織培養の用途に適当な形態でさらに製剤化される。
【０３３４】
本発明の方法に従って試験しかつ同定できる化合物は発現ライブラリー、例えばcDNA発現ライブラリー、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、小型有機化合物、ホルモン、ペプチドミミック、PNA等であり得る（Milner, Nature Medicine 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell 79 (1994), 193-198及び上で引用された参照）。前記化合物はまた、既知の阻害剤又は活性化剤の機能的誘導体又は類似体であり得る。化学的誘導体及び類似体の製造方法は当業者に周知であり、例えばBeilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer edition New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N.Y. 10010 U.S.A.及びOrganic Synthesis, Wiley, New York, USAに記載されている。さらに、前記誘導体及び類似体は当該技術分野で公知の方法に従ってその効果について試験することができる。さらに、ペプチドミミック及び/又は適当な誘導体及び類似体の設計を手助けするコンピューターを、例えば上に記載される方法に従って使用することができる。本発明の方法で使用し得る細胞又は組織が、本明細書の下記の実施形態で記載される本発明の宿主細胞、植物細胞又は植物組織であることが好ましい。
【０３３５】
したがって、別の実施形態では、本発明は本発明のアゴニストを同定する方法に従って取得又は同定した、本発明のポリペプチドのアゴニストである化合物に関する。
【０３３６】
したがって、一実施形態では、本発明はさらに、本発明の化合物を同定するための方法によって同定した化合物に関する。
【０３３７】
上記化合物は、例えば本発明のポリペプチドのホモログである。本発明のポリペプチドのホモログは、突然変異誘発、例えば本発明のポリペプチドの不連続な点突然変異又は先端切断によって作製することができる。本明細書で使用される「ホモログ」という用語は、変異体形態のタンパク質であって、本発明のポリペプチドの活性のアゴニストとして作用する上記タンパク質を指す。前記タンパク質のアゴニストは実質的に、本発明のポリペプチドの同一の生物学的活性又は生物学的活性のサブセットを保持することができる。特に、前記アゴニストは、生物又はその一部分での本発明のポリペプチドの発現レベル及び/又は該アゴニストの発現の増加に寄与し、これは成長及び/又は収量の増加に寄与する。
【０３３８】
一実施形態では、本発明は本発明の化合物又はアゴニストを特異的に認識する抗体に関する。
【０３３９】
本発明はさらに、本発明の上記ポリヌクレオチド、核酸分子、ベクター、タンパク質、抗体又は化合物、及び場合により検出のための適当な手段を含む診断用組成物に関する。
【０３４０】
本発明の診断用組成物は、細胞からのmRNAの単離に適当であり、そのように取得したmRNAを上述した核酸プローブを含むプローブとハイブリダイズする条件下で接触させ、該プローブとハイブリダイズしたmRNAの存在を検出することにより、細胞中のタンパク質の発現を検出する。本発明のタンパク質の存在を検出するための別の方法は、当該技術分野で公知の免疫技術、例えば酵素結合免疫吸着アッセイを含む。
【０３４１】
さらに、本発明の核酸分子を、関連性マッピング又は植物育種(特にマーカー補助育種)における分子マーカー又はプライマーとして使用することが有用である。好適な実施形態では、本発明の核酸分子は植物の成長又は収量に直接的に又は間接的に関連する形質に関する関連性マッピング又は植物育種（特にマーカー補助育種）に使用することができる。例えば本発明の核酸は、成長及び収量に関する量的形質遺伝子座と共局在化し得る。この場合、本発明の核酸の異なる変異体と成長又は収量における差異との共偏析により、本発明の核酸の有利な又は不利な変異体の存在又は不在について交雑した子孫を試験することによって、これらの形質に関する育種を進歩させることができる。検出のための適当な手段は当業者に周知であり、例えばハイブリダイゼーションアッセイ用のバッファー及び溶液、例えば上記の溶液及びバッファー、そしてさらに例えばSambrookらに記載されるサザンブロット、ウエスタンブロット、ノーザンブロット等の手段が知られる。
【０３４２】
別の実施形態では、本発明は、核酸分子、ベクター、宿主細胞、ポリペプチド、アンチセンス核酸、抗体、植物細胞、植物又は植物組織、収穫可能部分、繁殖材料及び/又は本発明の方法に従って同定した化合物又はアゴニストを含むキットに関する。
【０３４３】
本発明のキットの化合物は、場合によりバッファーと共に又はバッファー及び/又は溶液中で、バイアル等の容器にパッケージングし得る。適切な場合には、前記成分の1以上を1つの同一の容器中にパッケージングし得る。これに加えて又はこれとは選択的に、前記成分の1以上を固体担体（例えばニトロセルロースフィルター、ガラス平板、チップ又はナイロンメンブレン）又はマイクロタイタープレートのウェルに吸着させてもよい。キットは本明細書に記載の方法及び実施形態のいずれか、例えば宿主細胞、トランスジェニック植物、医薬組成物の製造、相同配列の検出、アンタゴニスト又はアゴニストの、食品、食餌又はその栄養補助食品、植物の処理用の栄養補助食品としての同定に使用することができる。
【０３４４】
さらにキットは、任意の前記実施形態のためのキットを使用するための、特に生物は又はその一部分を作製するために使用するため使用説明書を含むことができる。
【０３４５】
一実施形態では、キットは上記タンパク質の1以上をコードする核酸分子、及び/又は抗体、ベクター、宿主細胞、アンチセンス核酸、植物細胞若しくは植物組織又は植物をさらに含む。
【０３４６】
別の実施形態では、本発明は農業用組成物の製造方法に関し、該方法は、本発明の核酸分子、ベクター若しくはポリペプチドを準備し、又は前記化合物、アゴニスト若しくはアンタゴニストの同定のための本発明の方法のステップを含み；そして本発明の核酸分子、ベクター若しくはポリペプチド、あるいは本発明の方法若しくはプロセスに従って又は本発明の対象を用いて同定したアゴニスト若しくは化合物を、植物の農業用組成物として適用可能な形態で製剤化する。
【０３４７】
別の実施形態では、本発明は植物の成長又は収量の増加に寄与する農業用組成物の製造方法に関し、該方法は本発明の方法のステップを含み、同定した化合物を農業用組成物として許容し得る形態で製剤化する。
【０３４８】
「農業用組成物として許容し得る」により、そのような組成物が殺菌剤、植物栄養物質、除草剤等の含量を規制する法律に合致していると理解される。係る組成物が保護植物及びこれらを摂取した動物(ヒトを含む)にいかなる害もないことが好ましい。
【０３４９】
本発明はまた、更なる使用及び方法に関連する様々な実施形態に関する。本明細書に記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質ホモログ、融合タンパク質、プライマー、ベクター、宿主細胞は、以下の方法の1以上で使用することができる：上述したアミノ酸製造の促進に有用な植物及びこれに関連する生物の同定；ゲノムのマッピング；目的の配列の同定及び局在化；進化的研究；機能に必要な領域の決定；活性のモジュレーション。
【０３５０】
アゴニストの同定と類似した手法により同定される本発明のポリペプチドの阻害剤が、除草剤として使用できることが有利である。本発明のポリペプチドの阻害剤は植物の成長を低減することができる。例えば、阻害剤の畑への適用により、本発明のポリペプチドを過剰発現する有用な植物が生存できるという条件で、所望でない植物の成長を阻害する。
【０３５１】
したがって、本発明のポリヌクレオチドは様々な用途を有する。第1に、これらは生物又はその近縁種を同定するのに使用し得る。さらに、これらは微生物又は植物の混合集団中でその種又は関連種の存在を同定するのに使用し得る。植物の固有の又は混合した集団の培養物の抽出したゲノムDNAを、これに固有である本発明の遺伝子の領域に及ぶプローブを用いてストリンジェントな条件下でプロービングすることにより、固有の生物が混合集団に存在するか否かを確認することができる。
【０３５２】
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、これらの核酸分子が関連生物におけるゲノムマップを構成するためのマーカーとして役立ち得るように、関連種の配列と十分に相同であり得る。
【０３５３】
本発明のポリヌクレオチドはまた、進化的及びタンパク質構造的研究に有用である。配列を他の生物由来の類似の酵素をコードする配列と比較することにより、生物の進化的同系性を評価することができる。同様に、そのような比較により、保存されている及び保存されていない配列の領域を評価することが可能であり、これは酵素の機能性に不可欠なタンパク質の領域を決定する手助けとなり得る。このタイプの決定は、タンパク質操作の研究に価値があり、タンパク質が突然変異誘発の観点で機能を喪失することなく許容され得ることの指標を与え得る。
【０３５４】
さらに、本発明のポリヌクレオチド、本発明のポリペプチド、本発明の核酸構築物、本発明の生物、宿主細胞、微生物、植物、植物組織、植物細胞又はその一部分、本発明のベクター、本発明の方法により同定されるアンタゴニスト又はアゴニスト、本発明の抗体、本発明のアンチセンス分子あるいは本発明の方法で同定される核酸分子は、農業用組成物の製造に使用することができる。
【０３５５】
さらに、本発明のポリヌクレオチド、本発明のポリペプチド、本発明の核酸構築物、本発明の生物、宿主細胞、微生物、植物、植物組織、植物細胞又はその一部分、本発明のベクター、本発明の方法により同定されるアゴニスト又はアンタゴニスト、本発明の抗体、本発明のアンチセンス又はRNAi分子あるいは本発明の方法により同定される核酸分子は、同定された前記化合物が生物又はその一部分に（すなわちその食品の一部として、又は成長又は培養培地に）適用される場合に、生物又はその一部分における収量又は成長のモジュレーションに寄与することが可能な化合物の同定及び製造に使用することができ、好ましくは生物又はその一部分における成長及び産出レベル又は速度の増加に寄与する化合物を同定及び製造するために使用することができる。
【０３５６】
これらの及び他の実施形態が本発明の記載及び実施例に開示されかつ包含される。本発明に従って使用されるべき方法、使用及び化合物のいずれかに関する更なる文献は、例えば電子デバイスを用いて、公開ライブラリーから検索することができる。例えば公開データベース「Medline」を利用してもよく、これは例えばhftp://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.htmlによりインターネット上で利用可能である。hftp://www.ncbi.nlm.nih.gov/、hftp://www.infobiogen,fr/、hftp://www.fmi.ch/biology/research-tools.html、hftp://www.tigr.org/等の別のデータベース及びアドレスが当業者に知られており、例えばhftp://www.lycos.comを使用して取得することもできる。バイオテクノロジーにおける特許情報の概要、並びに各検索及びカレント・アウェアネス（current awareness）に有用な特許情報の関連ソースの調査はBerks, TIBTECH 12 (1994), 352-364で提供されている。
【０３５７】
本件特許出願中で引用された全ての参考文献、特許出願、特許及び公開特許出願の内容は、参照により本明細書に組み入れる。
【実施例】
【０３５８】
実施例1:
酵母ORF YMR095C、YGL212W、YMR107W、YDL057W及びYGL217Cの増幅及びクローニング
特に記載しない限り、Sambrookら, Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressによる標準的な方法を使用する。ORF YMR095C、YGL212W、YMR107W、YDL057及びYGL217CのPCR増幅は、Pfu Turbo DNAポリメラーゼ(Stratagene)のプロトコールに従って実施した。組成は以下の通りであった：1x PCRバッファー(20 mM Tris-HCl (pH 8.8)、2mM MgSO4、10mM KCl、10mM (NH4)2SO4、0.1% Triton X-100、0.1 mg/ml BSA)、0.2 mM d-thio-dNTP及びdNTP (1:125)、100ngのサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)(S288C株; Research Genetics, Inc.,現在はInvitrogen)のゲノムDNA、50 pmolの正方向プライマー、50 pmolの逆方向プライマー、2.5 uのPfu Turbo DNAポリメラーゼ。増幅サイクルは以下の通りであった：
95℃3分の1サイクル、その後各場合につき95℃1分、50℃45秒及び72℃210秒の36サイクル、その後72℃8分の1サイクル、その後4℃。
【０３５９】
以下のプライマー配列は、配列番号1、106、124、128及び136に従って、サッカロミセス・セレビシエの遺伝子の増幅のために選択した：
YMR095C用の正方向プライマー(配列番号96):
5'-atgcacaaaa cccacagtac aatgt-3'
YMR095C用の逆方向プライマー(配列番号97):
5'-ttaattagaa acaaactgtc tgataaac-3'
YGL212W用の正方向プライマー(配列番号122):
5'-atggcagcta attctgtagg gaaaa-3'
YGL212W用の逆方向プライマー(配列番号123):
5'-tcaagcactg ttgttaaaat gtctag-3'
YMR107W用の正方向プライマー(配列番号126):
5'-atgggtagtt tttgggacgc attc-3'
YMR107W用の逆方向プライマー(配列番号127):
5'-ttatctattt actttattgt cgggttc-3'
YDL057W用の正方向プライマー(配列番号130):
5'-atggaaaaaa aacatgtcac tgtgc-3'
YDL057W用の逆方向プライマー(配列番号131):
5'-ctatgtatct tgcaggtatt ccata-3'
YGL217C用の正方向プライマー(配列番号138):
5'-ATGAGCATTCTATCATCCACACAAT-3'
YGL217C用の逆方向プライマー(配列番号139):
5'-TTAACTACTTGAGTTTTCTTTCCAGC-3'
【０３６０】
その後、アンプリコンをQIAquickカラムを介して標準的なプロトコールに従って精製した(Qiagen)。
【０３６１】
ベクターDNA(30ng)の制限処理はEcoRI及びSmaIを標準的なプロトコールに従って用いて実施し、EcoRI切断部位を標準的なプロトコール(MBI-Fermentas)に従って充填し、高塩濃度バッファーを添加することによって反応を停止した。切断したベクター断片はNucleobondカラムを介して標準的なプロトコール(Machery-Nagel)に従って精製した。選択カセット（プロモーター、選択マーカー（例えばbar遺伝子又はAHAS遺伝子）、ターミネーター）及び構成的プロモーター（スーパープロモーター(ocs3mas)等）（Niら, The Plant Journal 1995, 7, 661-676）を含む発現カセット、クローニングカセット及びターミネーター配列をT-DNA境界配列間に含むバイナリーベクターを使用した。クローニングカセット中以外に、バイナリーベクターはEcoRI及びSmaI切断部位を有しなかった。使用し得るバイナリーベクターは当業者に知られており、バイナリーベクター及びその使用の概要はHellens, R., Mullineaux, P.及びKlee H., (2000) 「A guide to Agrobacterium binary vectors」, Trends in Plant Science, Vol. 5 NO 10, 446-451中に見出すことができる。使用するベクターに応じて、他の制限酵素を用いてクローニングを実施することも有利であり得る。対応する有利な切断部位は、PCR増幅用の対応プライマーを用いることによってORFに連結し得る。
【０３６２】
作製した約30ngのベクター及び調製した既定量のアンプリコンを混合し、リガーゼを添加して連結した。連結したベクターを、コンピテント大腸菌細胞(DH5α株)を添加し、1℃で20分間インキュベートした後、42℃で90秒の熱ショックを行い、4℃まで冷却することにより、同一の反応容器中で形質転換した。その後、完全培地(SOC)を添加し、37℃で45分間インキュベートした。次いで、この混合物全体を、抗生物質(使用するバイナリーベクターに応じて選択する)を含む寒天平板にプレートアウトし、37℃で一晩インキュベートした。
【０３６３】
クローニングの成功は、制限酵素部位の上流及び下流に結合するプライマーを用いることで挿入物の増幅を可能にすることによって確認した。増幅はTaq DNAポリメラーゼプロトコール(Gibco-BRL)に従って実施した。組成は以下の通りであった：1x PCRバッファー（20mM Tris-HCL (pH 8.4)、1.5mM MgCl2、50mM KCl、0.2mM dNTP、5pmolの正方向プライマー、5pmolの逆方向プライマー、0.625uのTaq DNAポリメラーゼ）。
【０３６４】
増幅サイクルは以下の通りであった：94℃で5分の1サイクル、その後各場合につき94℃で15秒、66℃で15秒及び72℃で5分の35サイクル、その後72℃で10分の1サイクル、その後4℃。
【０３６５】
数個のコロニーを、制限消化及び配列決定によってさらに確認し、予想されたサイズのPCR産物が正しい配向で同定されている1個のコロニーのみをさらに使用した。
【０３６６】
この陽性コロニーの1アリコートを完全培地(LB)で充填した反応容器に移し、37℃で一晩インキュベートした。LB培地は、使用したバイナリーベクター及びこれに含まれる耐性遺伝子に従って選択したクローンの選別のための抗生物質を含んだ。プラスミドの製造はQiaprep標準プロトコール(Qiagen)のガイドラインに従って実施した。
【０３６７】
実施例2:
一般的な植物形質転換
アグロバクテリウムによるトランスフェクションを介した植物の形質転換及び植物の再生は、例えば本明細書又はGelvin, Stanton B.; Schilperoort, Robert A, 「Plant Molecular Biology Manual」,第2版. - Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. - in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R.; Thompson, John E., 「Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology」, Boca Raton : CRC Press, 1993. - 360 S., ISBN 0-8493-5164-2に記載される、標準的な方法に従って実施し得る。
【０３６８】
アブラナは、例えばMoloneyら, Plant cell Report 8 (1989), 238-242; De Blockら, Plant Physiol. 91 (1989, 694-701)による、子葉形質転換によって形質転換し得る。
【０３６９】
ダイズは、例えばEP 0424 047、US 5,322,783又はEP 0397 687、US 5,376,543、US 5,169,770に記載の方法に従って形質転換し得る。
【０３７０】
あるいは、DNA摂取を行ってもよいし、植物はアグロバクテリウム仲介植物形質転換というよりもむしろ、粒子衝突、ポリエチレングリコール仲介又は「炭化ケイ素繊維」技術を介して形質転換することもできる（例えばFreeling and Walbot 「The maize handbook」 (1993) ISBN 3-540-97826-7, Springer Verlag New York参照）。
【０３７１】
実施例3: ORF YMR095C、YGL212W、YMR107W、YDL057W及びYGL217Cを過剰発現する植物の作製
各プラスミド構築物は、pMP90プラスミドを含むアグロバクテリアpGV3101株にエレクトロポレーションによって形質転換し、コロニーを選択マーカーであるカナマイシン、ゲンタマイシン及びリファンピシンを含むTB培地（QBiogen, Germany）にプレートアウトし、28℃で2日間インキュベートした。抗生物質又は選択物質は、使用するプラスミド及び対応のアグロバクテリア株に従って選択される。バイナリープラスミド及びアグロバクテリア株の概要は、Hellens, R., Mullineaux, P.及びKlee H., (2000) 「A guide to Agrobacterium binary vectors」, Trends in Plant Science, Vol 5 NO 10, 446-451中で見出すことができる。
【０３７２】
コロニーを爪楊枝を用いて寒天平板から拾い上げ、上記の抗生物質を含む3mlのTB培地に取り入れた。
【０３７３】
前培養物は28℃、120rpmで48時間、振とうインキュベーター中で増殖させた。適当な抗生物質を含む400mlのLB培地を主培養に用いた。前培養物を主培養物に移し、28℃、120rpmで18時間増殖させた。4000rpmでの遠心分離後、ペレットを浸透培地（infiltration medium）(10％スクロースを含むM&S培地)中で再懸濁した。シャーレ（Wiesauplast, Kunststofftechnik, GermanyのPiki Saat 80（緑色、網状の底面を備える、30x20x4.5cm））をGS90基材（標準的な土壌, Werkverband E.V., Germany）で半分充填した。このシャーレを0.05％ Previcur溶液(Previcur N, Aventis CropScience)で一晩給水した。シロイヌナズナの形質転換はBechtold N.及びPelletier G. (1998) In planta Agrobacterium-mediated transformation of adult Arabidopsis thaliana plants by vacuum infiltration. Methods in Molecular Biology. 82:259-66並びにClough及びBent Clough, JC及びBent, AF. 1998 Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana, Plant J. 16:735-743に従って実施した。
【０３７４】
シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)C24種子（Nottingham Arabidopsis Stock Centre, UK; NASC Stock N906）をシャーレにわたって蒔いた（シャーレ当たり約1000個の種子）。シャーレをフードで多い、層化設備に置いた(8h 110μE、5℃; 16℃ 暗所6℃)。5日後、シャーレを短日性ファイトトロンに置き（8h 130μE、22℃; 16H 暗所 20℃）、そこでこれらを最初の真の葉が生じるまで10日間維持した。実生を同じ基材を含むポット（Tekuポット, 10 cm φ, LCシリーズ、Poppelmann GmbH&Co, Germanyにより製造）に移した。9個体の植物を各ポットに刺し移した(prick out)。次いで、植物の生育を続けるためにポットを短日性ファイトトロンに戻した。10日後、植物を温室保管棚に移し（16h 340μE 22℃及び8h 暗所 20℃）、そこでさらに10日間生育させた。
【０３７５】
ちょうど開花し始めた7週齢のシロイヌナズナ植物を、予め10μlのSilwett L77 (Crompton S.A., Osi Specialties, Switzerland)で処理されている上記アグロバクテリア懸濁液中に10秒間浸した。この方法はBechtold N.及びPelletier G. (1998)に記載されている。次いで、植物を湿室に18時間置き、その後植物の生育を続けるために温室にポットを戻した。種子が収穫されるまで植物をさらに10週間そこに維持した。
【０３７６】
形質転換植物を選択するために使用する耐性マーカーに応じて、収穫した種子を温室に蒔き、スプレー選別に供するか、あるいは滅菌後、適当な選択物質と共に寒天平板上で培養した。BASTA(登録商標)耐性の場合、小植物を2〜3日の間隔で4回、0.02％BASTA(登録商標)でスプレーした。約10〜14日後、形質転換した耐性植物は、死滅した野生型の実生と明らかに異なり、6cmポットに刺し移すことができた。形質転換した植物は種子を備えることができた。トランスジェニックシロイヌナズナ植物の種子は、冷凍器で保存した(-20℃)。
【０３７７】
実施例4
新鮮重量を測定することによる、配列番号1、106、124、128又は136を過剰発現する系統の分析
配列番号1、106、124、128又は136のRNAを過剰発現する系統を選別した。このために、総RNAを、配列番号1、106、124又は128についての3週齢のトランスジェニックシロイヌナズナ植物から抽出した。ハイブリダイゼーションのために、20μgのRNAを電気泳動的に細分化し、Hybond Nメンブレン(Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Germany)に製品説明書に従ってブロットし、YMR095C、YGL212W、YMR107W、YDL057又はYGL217C-特異的プローブとハイブリダイズさせた。Rothi-Hybri-Quickバッファー(Roth, Karlsruhe, Germany)をハイブリダイゼーションのために使用し、プローブをRediprime II DNA Labeling System (Amersham Biosciences Europe GmbH Freiburg, Germany)を製品説明書に従って用いて標識した。これらのプローブに対するDNA断片は、シロイヌナズナのゲノムDNA及び以下のプライマーによる標準的なPCRによって作製した：
それぞれ5'-atgcacaaaa cccacagtac aatgt-3'(配列番号96)
及び
5'-ttaattagaa acaaactgtc tgataaac-3'(配列番号97)、
5'-atggcagcta attctgtagg gaaaa-3'(配列番号122)
及び
5'-tcaagcactg ttgttaaaat gtctag-3'(配列番号123)、
5'-atgggtagtt tttgggacgc attc-3'(配列番号126)
及び
5'-ttatctattt actttattgt cgggttc-3'(配列番号127)、
5'-atggaaaaaa aacatgtcac tgtgc-3'(配列番号130)
及び
5'-ctatgtatct tgcaggtatt ccata-3'(配列番号131)又は
5'-ATGAGCATTCTATCATCCACACAAT-3'(配列番号138)
及び
5'-TTAACTACTTGAGTTTTCTTTCCAGC-3'(配列番号139)。
【０３７８】
分析のために、植物をファイトトロン(Swalof Weibull(Sweden))中、以下の条件下で栽培した。層化後、試験植物を16時間明所/8時間暗所の周期、20℃、60％の湿度及び400ppmのCO2濃度で22〜23日間栽培した。使用した光源は、太陽と似た色のスペクトルの光を220μE/m2/s-1の光強度で生じる、Powerstar HQI-T 250 W/D昼光電球(Osram)であった。
【０３７９】
播種後24日目（これは発芽後約17日目に相当する）に、いずれの場合も、野生型(WT)並びにYMR095C、YGL212W、YMR107W、YDL057W及びYGL217C-過剰発現系統(それぞれ3318、5194、3325、4803及び9001系統)の約40個体の各植物を調査した。その後即座にトランスジェニック系統及び野生型(WT)シロイヌナズナ植物の地上部の新鮮重量を精密天秤を用いて測定した。野生型植物と最高重量のトランスジェニック系統に関する結果の差異を、各系統についてのT検定によって、有意性について試験した。
【０３８０】
その結果は表1に記載される。
【表１】
2008507960.tif 000005
【０３８１】
実施例5
タバコ及びカノラにおける配列番号1、106、124、128又は136の過剰発現
カノラ(Brassica napus)の形質転換について、5〜6日齢の実生の子葉柄(cotyledonary petiole)及びはい軸を、組織培養のための外植片として使用し、特にBabicら(1998, Plant Cell Rep 17: 183-188)に記載されるように形質転換した。市販のWestar品種は、形質転換のための標準品種であるが、他の品種も使用し得る。配列番号2、107、125、129又は137の活性をコードする配列を、選択カセットを含むバイナリーベクターの発現カセット中に、標準的な分子法に従ってクローニングした。例示的なクローニングは、実施例の他の箇所に記載されており、かつ当業者に公知である。
【０３８２】
アグロバクテリア株であるアグロバクテリウム・チュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404株(バイナリーベクターで形質転換されたものを含む)を形質転換に使用する。多数の植物形質転換用のバイナリーベクターが既に記載されている（特にAn, G. in Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology vol. 44, pp. 47-62, Gartland KMA及びDavey MR編集. Humana Press, Totowa, New Jersey）。多くのバイナリーベクターは、Bevan (Nucleic Acid Research. 1984. 12:8711-8721)に記載され、アグロバクテリウム・チュメファシエンスTiプラスミドの左側及び右側境界に隣接する植物用の発現カセットを含む、バイナリーベクターpBIN19から誘導する。植物発現カセットは少なくとも2つの成分、すなわち選択マーカー遺伝子及び植物細胞におけるcDNA又はゲノムDNAの転写を所望の様式で調節することができる適当なプロモーターを含む。抗生物質耐性又は除草剤耐性遺伝子等の複数の選択マーカー遺伝子(例えば突然変異型除草剤耐性AHAS酵素をコードする突然変異型シロイヌナズナ遺伝子（US 5,767,366及びUS 6,225,105）等)を、使用し得る。同様に、配列番号2、107、125、129又は137の活性を持つ遺伝子を発現するための異なるプロモーターを使用することも可能である。例えば、34Sプロモーター(GenBank登録番号: M59930及びX16673)に仲介される構成的発現あるいは種子特異的発現が所望であり得る。
【０３８３】
カノラ種子を70％エタノール中で2分間、その後一滴のTween-20を含む30％クロロクス(chlorox)中で殺菌した後、滅菌水中で3回洗浄する。
【０３８４】
種子は、発芽のために、ホルモンを含まず、1％スクロース、0.7％phytagarを含む半濃縮MS培地上、23℃、16/8h day/nightの周期で5日間、in vitroでインキュベートする。子葉柄外植片を子葉と共に実生から分離し、切断した部位を細菌懸濁液中に浸すことによって、アグロバクテリアで接種した。次いで、外植片を3mg/lのBAP、3％スクロース及び0.7％phytagarを含むMSBAP-3培地上、23℃、16時間の光で2日間インキュベートした。アグロバクテリアとの共生培養の2日後、外植片を3mg/lのBAP、セフォタキシム、カルベニシリン又はチメンチン(300mg/l)を含むMSBSAP-3培地に7日間移し、その後、セフォタキシム、カルベニシリン又はチメンチン及び選択物質を含むMSBAP-3培地にシュートが再生されるまで移す。シュートが5〜10mmの長さのとき、これらを切り取り、「シュート伸長培地」（0.5 mg/l BAPを含むMSBAP-0.5）に移す。次いで、約2cmの長さのシュートは根の誘導のために根培地(MS0)に移す。
【０３８５】
一次トランスジェニック植物の材料は、T-DNAのゲノム中への組込みを確認するためにPCRによって調査する。次いで、肯定的な結果をサザンブロット分析により確認する。
【０３８６】
その後、確認したトランスジェニック植物をより早い成長及びより高い収量について試験する。
【０３８７】
タバコ植物の滅菌培養
無菌条件下で栽培したタバコ植物は、約1〜2cmの長さの茎片を、いずれの場合もinternodiumと共に滅菌培地に置くことによってin vitroで増殖する（2％スクロース及び0.7％寒天を含むMurashige and Skoog培地）(Murashige, T.及びSkoog, F. (1962) Physiol. Plant. 15:473-497)。植物は23℃、200μE及び16h/8h 明所/暗所周期で生育する。
【０３８８】
生育の約5〜6週後、前記植物の葉を滅菌条件下で約1cm2片に切る。
【０３８９】
細菌の培養
配列番号2、107、125、129又は137の活性を発現させるための構築物で形質転換されるアグロバクテリアコロニーを、滅菌のプラスチックチップを用いて寒天平板から取り上げ、その後、関連の抗生物質を含む約20mlのYEB液体培地（Sambrookら, Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press）に移す。前記YEB培地の量は、形質転換体数の関数として選択する。通常は、20mlの細菌培養物は約80個体のトランスジェニックタバコ植物を生じるのに十分である。細菌培養物は撹拌器上、200rpm、28℃で1日増殖させる。次の日に、細菌培養物を4000rpmでの遠心分離によって取り出し、Murashige and Skoog液体培地中に取り上げる。
【０３９０】
形質転換
葉片を細菌懸濁液に簡単に浸し、Murashige and Skoog培地(2％スクロース及び0.7％寒天)上、暗下で2日間培養する。外植片を、Rocha-Sosa (Rocha-Sosa, M., Sonnewald, U., Frommer, W., Stratmann, M., Schell, J.及びWillmitzer, L. 1998, EMBO J. 8: 23-29)に記載されるように、抗生物質及び対応のホルモンを含むMS培地に移す。
【０３９１】
次いで、トランスジェニック系統は、配列番号2、107、125、129又は137トランス遺伝子の発現について、ノーザンブロット分析によって分析することができる。その後、野生型に比較して選択した系統の種子の新鮮重量及び収量の増加を判定することが可能である。
【０３９２】
実施例6
配列番号2、107、125、129又は137の内因性ホモログに近接して結合し、かつその転写を活性化する合成転写因子の設計及び発現
配列番号1、106、124、128若しくは136の内因性ORF、又は他の植物種における相同なORFは、合成の特異的活性化因子を導入することによって活性化し得る。このために、配列番号1、106、124、128若しくは136のORF又は他の植物におけるそのホモログの調節領域中の特定の領域に結合する、キメラジンクフィンガータンパク質の遺伝子を構築する。人工ジンクフィンガータンパク質は、特異的DNA結合ドメイン及び活性化ドメイン（例えば単純ヘルペスウイルスのVP16ドメイン等）を含む。次いで、このキメラ活性化因子の植物における発現により、標的遺伝子、ここでは例えば配列番号118（YGL212wのシロイヌナズナホモログ）又は配列番号102（配列番号1(YMR095C)のトウモロコシホモログ）、あるいは他の植物種における配列番号1、106、124、128又は136の他のホモログ、の特異的発現を生じる。実験の詳細は、WO 01/52620又はOrdiz MI(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, Vol. 99, Issue 20, 13290)あるいはGuan(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, Vol. 99, Issue 20, 13296)に記載されるように実施し得る。
【０３９３】
実施例7
強力なプロモーターが植物中の配列番号1、106、124、128又は136のホモログの上流に組み込まれることより発現を活性化する系統の同定
所望のORFの強力な異所発現のために、強力なプロモーターを該ORFの上流に組み込むことがさらに可能である。このために、両方向masプロモーター（Velten, 1984, EMBO J, 3, 2723）をT-DNAの左側境界に含むベクターを組み込むトランスジェニックシロイヌナズナ植物の集団を作製した。前記プロモーターは、その2'プロモーターを介して、T-DNAからの左側境界を介したその隣接するゲノムDNAへの転写を可能にした。次いで、ゲノムDNAを個々の植物から単離し、具体的な計画に従ってプールした。特定の遺伝子座でのT-DNA組込みを逆スクリーニングする方法は、Krysanら(Krysan, 1999, The Plant Cell, Vol 11, 2283)及びその中の参照に詳細に記載されている。T-DNAが配列番号1、106、124、128又は136のORFの植物ホモログの上流に組み込まれている系統を同定した。野生型と比較した配列番号1、106、124又は128の植物ホモログの発現の増強は、ノーザンブロット分析によって検出した。
【０３９４】
実施例8
他の植物種における相同遺伝子の同定
他の植物の相同配列は、特別なデータベース検索ツール、特にBLASTアルゴリズム(Basic Local Alignment Search Tool, Altschul, 1990, J. Mol. Biol., 215, 403及びAltschul, 1997, Nucl. Acid Res., 25, 3389)等により同定した。blastn及びblastp比較は、BLOSUM-62スコアリング行列（Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10915）を用いて標準的な様式で実施した。NCBI GenBankデータベース、並びに3種のブラッシカ・ナプス(Brassica napus)cv.の発現配列タグ（EST）のライブラリー「AC Excel」、「Quantum」及び「Cresor」(カノラ)、及びオリザ・サティバ(Oryza sativa)cv.日本晴れ(Japonica rice)を調査した。検索により、配列番号2、107、125、129及び137と相同な、様々な生物由来のアミノ酸配列及びそれらの各核酸配列を同定した。
【０３９５】
実施例9
植物の操作
実施例9a
ライグラス植物の操作
様々な異なるライグラス品種の種子は、形質転換のための外植片の供給源として使用でき、これにはSvalof Weibull種子会社から取得可能な市販のGunne品種又はAffinity品種が含まれる。種子は1％ Tween-20で1分間、100％漂白剤で60分間、連続的に表面を殺菌し、それぞれ脱イオン化しかつ蒸留したH2Oで5分間の洗浄を3回行い、その後、湿った滅菌ろ紙上で3〜4日間、暗下で発芽させる。実生はさらに1％ Tween-20で1分間、75％漂白剤で5分間さらに滅菌し、ddH2Oで5分間の洗浄を3回行う。
【０３９６】
表面を滅菌した種子をMurashige and Skoog基礎塩及びビタミン、20g/l スクロース、150mg/l アスパラギン、500mg/l カゼイン加水分解物、3g/l Phytagel、10mg/l BAP及び5mg/l ジカンバを含む、カルス誘導培地上に置く。プレートを、種子の発芽及び胚形成カルスの誘導のために、25℃の暗所で4週間インキュベートする。
【０３９７】
カルス誘導培地上で4週間後、実生のシュート及び根を切り取り、カルスを新鮮な培地に移し、さらに4週間培養を維持し、その後MSO培地(明所)に2週間移す。カルス(11〜17週齢)の数破片は、10メッシュふるいを通じて損傷させて、カルス誘導培地上に置くか、あるいは250mlフラスコ中の100mlのライグラスカルス誘導液体培地（寒天を含むカルス誘導用のものと同一の培地）中で培養する。フラスコは箔で包み、175rpm、暗下、23℃で1週間振とうする。40メッシュふるいで液体培養物をふるいにかけることで、細胞を収集する。ふるいに収集された画分を固体ライグラスカルス誘導培地上に塗布し、暗下、25℃で1週間培養する。次いで、カルスを1％スクロースを含むMS培地に移し、2週間培養する。
【０３９８】
形質転換は、アグロバクテリウム又は粒子衝突法のいずれかで行うことができる。構成的植物プロモーター及び遺伝子のcDNAをpUCベクター中に含む発現ベクターを作製する。プラスミドDNAは、Qiagenキットを製品説明書に従って用いて、大腸菌細胞から調製する。約2gの胚芽形成カルスをペトリ皿中の滅菌ろ紙の中央に広げる。10g/lスクロースを含む液体MSOのアリコートをろ紙に添加する。金粒子（1.0μmのサイズ）をSanfordら, 1993の方法に従ってプラスミドDNAでコーティングし、以下のパラメーターを用いて胚形成カルスに送達する：1ショット当たり500μgの粒子及び2μgのDNA、1300psi及び8.5cmの標的距離（阻止平板(stopping plate)からカルスの平板）並びにカルスの平板当たり1ショット。
【０３９９】
衝突後、カルスを新鮮なカルス発生培地に戻し、暗下、室温で1週間維持する。次いで、カルスを明下、25℃で増殖条件に移し、適当な選択剤（例えば250nM アーセナル、5mg/l PPT又は50 mg/L カナマイシン）による胚芽分化を開始させる。選択剤に耐性であるシュートが出現し、発根したものだけを土壌へ移す。
【０４００】
一次トランスジェニック植物(T0)のサンプルは、PCRによって分析してT-DNAの存在を確認する。これらの結果は、DNAを1％アガロースゲル上に電気泳動し、正に帯電したナイロン膜(Roche Diagnostics)に移すサザンハイブリダイゼーションによって確認する。PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics)を製造業者により推奨されるように使用して、PCRによってジゴキシゲニン標識プローブを作製する。
【０４０１】
トランスジェニックT0ライグラス植物は分蘖枝を切除することにより無性的（vegetatively）に増殖する。移植した分蘖枝は温室中で2ヶ月間、十分に定着するまで維持する。シュートを落葉させ、2週間生育させる。
【０４０２】
実施例9b
ダイズ植物の操作
ダイズはTexas A&M特許US 5,164,310に記載の方法の以下の改変に従って形質転換することができる。様々な市販のダイズ品種がこの方法による形質転換に影響を受ける。栽培品種Jack（Illinois Seed Foundationから入手可能）が共通して形質転換に使用される。種子は70％(v/v)エタノール中に6分間、そして0.1％(v/v)Tweenを補充した市販の25％漂白剤(NaOCl)中に20分間浸すことによって滅菌した後、滅菌二回蒸留水で4回洗浄する。幼根、胚軸及び1つの子葉を各実生から除去し、7日齢実生を増殖する。その後、1つの子葉を含む上胚軸をペトリ皿中の新鮮な発芽培地に移し、16時間の光周期下（約100μE-m-2s-1）、25℃で3週間培養する。葉腋の節(axillary node)(約4mmの長さ)を3〜4週齢の植物から切り取る。葉腋の節を切除し、アグロバクテリウムLBA4404培養物中にインキュベートする。
【０４０３】
多くの異なるバイナリーベクター系が植物形質転換用に記載されている(例えばAn, G. Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology vol 44, pp 47-62, Gartland KMA及びMR Davey編集. Humana Press, Totowa, New Jersey)。多くはBevan (Nucleic Acid Research. 1984. 12:8711-8721)により記載されるベクターpBIN19を基礎とし、該ベクターはアグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のTiプラスミド由来の左側及び右側境界配列が隣接する植物遺伝子発現カセットを含む。植物遺伝子発現カセットは、少なくとも2つの遺伝子、すなわち選択マーカー遺伝子及び形質遺伝子のcDNA又はゲノムDNAの転写を調節する植物プロモーターからなる。様々な選択マーカー遺伝子を上記のように使用することができ、これには突然変異型アセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)酵素（米国特許第5,767,366号及び同第6,225,105号）をコードするシロイヌナズナ遺伝子が含まれる。同様に、形質遺伝子を調節するために様々なプロモーターを使用して、上記のように遺伝子転写の構成的、発生的、組織又は環境的制御を提供することができる。この実施例では、34Sプロモーター(GenBank登録番号M59930及びX16673)を使用して形質遺伝子の構成的発現を提供する。
【０４０４】
共生培養処理後、外植片を洗浄し、500mg/Lのチメンチンを補充した選択培地に移す。シュートを切除し、シュート伸長培地上に置く。1cmより長いシュートを土壌へ移す前に2〜4週間発根培地に置く。
【０４０５】
一次トランスジェニック植物(T0)をPCRによって分析して、T-DNAの存在を確認する。これらの結果は、DNAを1％アガロースゲル上に電気泳動し、正に帯電したナイロン膜(Roche Diagnostics)に移すサザンハイブリダイゼーションによって確認する。PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics)を製造業者により推奨されるように使用して、PCRによってジゴキシゲニン標識プローブを作製する。
【０４０６】
実施例9c
トウモロコシ植物の操作
トウモロコシ（Zea Mays L.）の形質転換は、Ishidaら(1996. Nature Biotech 14745-50)によって記載される方法の改変型により実施する。形質転換はトウモロコシ植物では遺伝子型依存的であり、特定の遺伝子型のみが形質転換及び再生に影響を受ける。近交系A188（University of Minnesota）又は親としてのA188との交配種は、形質転換のための供与材料の良好な供給源であるが（Frommら 1990 Biotech 8:833-839）、他の遺伝子型も同様に効率よく使用することができる。受粉後（DAP）約11日で、穂先をトウモロコシ植物から収穫する（その際未成熟の胚芽の長さは約1〜1.2mmである）。未成熟の胚芽を「スーパーバイナリー」ベクターを保有するアグロバクテリウム・チュメファシエンスと共に共生培養し、トランスジェニック植物を器官形成を通じて再生する。Japan Tobaccoのスーパーバイナリーベクター系はWO特許WO94/00977及びWO95/06722に記載されている。ベクターは記載されるように構築することができる。様々な選択マーカー遺伝子を使用することができ、これには突然変異型アセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)酵素をコードするトウモロコシ遺伝子(US 6,025,541)が含まれる。同様に、様々なプロモーターを形質遺伝子を調節するために使用して、遺伝子転写の構成的、発生的、組織又は環境的制御を提供することができる。この実施例では、34Sプロモーター(GenBank登録番号M59930及びX16673)を使用して形質遺伝子の構成的発現を提供する。
【０４０７】
切除した胚芽をカルス誘導培地上で、その後選択剤としてイミダゾリノンを含有するトウモロコシ再生培地上で生育させる。ペトリ平板を明下、25℃で2〜3週間、又はシュートが発生するまでインキュベートする。緑色のシュートを各胚芽からトウモロコシ発根培地に移し、25℃で2〜3週間、根が発生するまでインキュベートする。発根したシュートを温室中の土壌に移す。T1種子はイミダゾリノン除草剤に耐性を示し、かつトランス遺伝子に関してPCR陽性である植物から産生させる。
【０４０８】
T-DNAの単一遺伝子座挿入物のT1世代は、トランス遺伝子に関して3:1の比で分離することができる。トランス遺伝子の1つ又は2つのコピーを含む子孫は、イミダゾリノン除草剤耐性である。ホモ接合のT2植物は、T1植物と類似の表現型を示すことができる。ホモ接合のトランスジェニック植物と非トランスジェニック植物との交雑植物(F1子孫)も、増加した類似の表現型を示すことができる。
【０４０９】
実施例9d
コムギ植物の操作
コムギの形質転換は、Ishidaら(1996 Nature Biotech. 14745-50)に記載される方法により実施する。栽培品種Bobwhite（CYMMIT, Mexicoから入手可能）が共通して形質転換に使用される。未成熟の胚芽は、「スーパーバイナリー」ベクターを保有するアグロバクテリウム・チュメファシエンスと共に共生培養し、トランスジェニック植物を器官形成を通じて回収する。Japan Tobaccoのスーパーバイナリーベクター系はWO特許WO94/00977及びWO95/06722に記載されている。ベクターは記載されるように構築した。様々な選択マーカー遺伝子を使用することができ、これには突然変異型アセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)酵素をコードするトウモロコシ遺伝子(US 6,025,541)が含まれる。同様に、様々なプロモーターを形質遺伝子を調節するために使用して、遺伝子転写の構成的、発生的、組織又は環境的制御を提供することができる。この実施例では、34Sプロモーター(GenBank登録番号M59930及びX16673)を使用して形質遺伝子の構成的発現を提供する。
【０４１０】
アグロバクテリウムとのインキュベーション後、胚芽をカルス誘導培地上で、その後選択剤としてイミダゾリノンを含む再生培地上で生育させる。ペトリ平板を明下、25℃で2〜3週間、又はシュートが発生するまでインキュベートする。緑色のシュートを各胚芽から発根培地に移し、25℃で2〜3週間、根が発生するまでインキュベートする。発根したシュートを温室中の土壌に移す。T1種子はイミダゾリノン除草剤に耐性を示しかつトランス遺伝子に関してPCR陽性である植物から産生させる。
【０４１１】
T-DNAの単一遺伝子座挿入物のT1世代は、トランス遺伝子に関して3:1の比で分離することができる。トランス遺伝子の1つ又は2つのコピーを含む子孫は、イミダゾリノン除草剤耐性である。ホモ接合のT2植物は類似の表現型を示した。
【０４１２】
実施例9e
アブラナ/カノラ植物の操作
5〜6日齢の稚苗の子葉柄及びはい軸を組織培養のための外植片として使用し、Babicら(1998, Plant Cell Rep 17: 183-188)に従って形質転換する。市販の栽培品種Westar(Agriculture Canada)が形質転換に使用される標準的な品種であるが、他の品種を使用することができる。
【０４１３】
バイナリーベクターを含むアグロバクテリウム・チュメファシエンスLBA4404をカノラの形質転換に使用する。多くの異なるバイナリーベクター系が植物形質転換のために記載されている（例えばAn, G. Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology vol 44, pp 47-62, Gartland KMA及びMR Davey編集. Humana Press, Totowa, New Jersey）。多くはアグロバクテリウム・チュメファシエンスのTiプラスミド由来の左側及び右側境界配列に隣接した植物遺伝子発現カセットを含む、Bevan(Nucleic Acid Research. 1984. 12:8711-8721)によって記載されたベクターpBIN19を基礎とする。植物遺伝子発現カセットは少なくとも2つの遺伝子、すなわち選択マーカー遺伝子及び形質遺伝子のcDNA及びゲノムDNAの転写を制御する植物プロモーターからなる。様々な選択マーカー遺伝子を使用することができ、これには突然変異型アセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)酵素（US 5,767,366及びUS 6,225,105）をコードするシロイヌナズナ遺伝子が含まれる。同様に、様々なプロモーターを形質遺伝子を調節するために使用して、遺伝子転写の構成的、発生的、組織又は環境的調節を提供することができる。この実施例では、34Sプロモーター（GenBank登録番号M59930及びX16673）を使用して形質遺伝子の構成的発現を提供することができる。
【０４１４】
カノラ種子の表面を70％エタノール中で2分間、次いで一滴のTween-20を含む30％クロロクス中で滅菌した後、滅菌蒸留水で3回洗浄する。次いで、ホルモン、1％スクロース、0.7％ Phytagarを含まない半強化(half strength)MS培地上、23℃、16hr明下で5日間in vitroで発芽させる。子葉が付着した子葉柄外植片をin vitro実生から切除し、柄外植片の切断末端を細菌懸濁液中に浸すことにより、アグロバクテリウムで接種する。次いで、外植片は3mg/l BAP、3％スクロース、0.7％ Phytagarを含むMSBAP-3培地上、23℃、16hr明下で2日間培養する。アグロバクテリウムとの共生培養の2日後、柄外植片を3mg/l BAP、セフォタキシム、カルベニシリン又はチメンチン(300mg/l)を含むMSBAP-3培地に7日間移し、その後、セフォタキシム、カルベニシリン又はチメンチン及び選択剤を含むMSBAP-3培地上でシュートが再生されるまで培養する。シュートが5〜10mmの長さのとき、これらを切断し、シュート伸長培地（0.5mg/l BAPを含むMSBAP-0.5）に移す。約2cmの長さのシュートは根の誘導のために発根培地(MSO)に移す。
【０４１５】
一次トランスジェニック植物（T0）のサンプルをPCRによって分析して、T-DNAの存在を確認する。これらの結果は、DNAを1％アガロースゲル上に電気泳動し、正に帯電したナイロン膜（Roche Diagnostics）に移すサザンハイブリダイゼーションによって確認する。PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics)を製造業者によって推奨されるように使用して、PCRによってジゴキシゲニン標識プローブを作製する。
【０４１６】
実施例9f
アルファルファ植物の操作
アルファルファ（メディカゴ・サティバ（Medicago sativa））の再生クローンを、McKersieら, 1999 Plant Physiol 119: 839-847の方法を用いて形質転換する。アルファルファの再生及び形質転換は遺伝子型依存的であり、したがって植物の再生が必要である。再生植物を取得する方法が記載されている。例えばこれらは栽培品種Rangelander (Agriculture Canada)又はBrown DCW及びA Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111-112)に記載される他の任意の市販のアルファルファ品種から選択することができる。あるいは、RA3品種（University of Wisconsin）が、組織培養における使用のために選択されている（Walkerら, 1978 Am J Bot 65:654-659）。
【０４１７】
柄外植片を、バイナリーベクターを含むアグロバクテリウム・チュメファシエンスC58C1 pMP90 (McKersieら, 1999 Plant Physiol 119: 839-847)又はLBA4404の一晩培養物と共に共生培養する。多くの異なるバイナリーベクター系が植物の形質転換のために記載されている（例えば、An, G. Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology vol 44, pp 47-62, Gartland KMA及びMR Davey編集. Humana Press, Totowa, New Jersey）。多くはアグロバクテリウム・チュメファシエンスのTiプラスミド由来の左側及び右側境界配列に隣接する植物遺伝子発現カセットを含む、Bevan(Nucleic Acid Research. 1984. 12:8711-8721)により記載されたベクターpBIN19を基礎とする。植物遺伝子発現カセットは、少なくとも2つの遺伝子、すなわち選択マーカー遺伝子及び形質遺伝子のcDNA又はゲノムDNAの転写を調節する植物プロモーターからなる。様々な選択マーカー遺伝子を使用することができ、これには突然変異型アセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)酵素をコードするシロイヌナズナ遺伝子（US 5,767,366及びUS 6,225,105）が含まれる。同様に、様々なプロモーターを使用して、遺伝子転写の構成的、発生的、組織又は環境的調節を提供する形質遺伝子を調節することができる。この実施例では、34Sプロモーター（GenBank登録番号M59930及びX16673）を使用して、形質遺伝子の構成的発現を提供することができる。
【０４１８】
外植片を、暗下、288mg/Lプロリン、53mg/L チオプロリン、4.35g/L K2SO4及び100μm アセトシリンジノン(acetosyringinone)を含むSH誘導培地上で3日間共生培養する。外植片を半強化Murashige-Skoog培地（Murashige及びSkoog, 1962）で洗浄し、アセトシリンジノンを含まないが適当な選択剤と適当な抗生物質を含む同一のSH誘導培地に塗布して、アグロバクテリウムの増殖を阻害する。数週間後、不定胚を成長調節剤、抗生物質を含まず、50g/Lのスクロースを含む、BOi2Y発生培地に移す。その後、不定胚を半強化Murashige-Skoog培地上で発芽させる。発根した実生をポットに移し、温室で生育させる。
【０４１９】
T0トランスジェニック植物は、結節の切断によって増殖し、Turface生育培地中で発根する。植物を落葉させ、約10cmの高さまで生育させる（落葉後約2週間）。
【０４２０】
同等物
当業者は、本発明の特定の実施形態の非常に多くの同等物を理解する、あるいは単純な慣用法を用いることによってこれを同定することができる。これらの同等物も特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０４２１】
【図１−１】図1-1は、YMR095cと様々な生物由来のホモログとのアライメントを示す。
【図１−２】図1-2は、図1-1の続きである。
【図２】図2は、様々な植物種由来のYML095cホモログのアライメントを示す。
【図３−１】図3-1は、YMR095Cのホモログを示す。
【図３−２】図3-2は、図3-1の続きである。
【図４】図4は、YGL212Wのホモログを示す。
【図１−１】
2008507960.tif 000006
【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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