(57)【要約】  複合体サンプル中の病原性大腸菌を特異的に検出し、識別するためのオリゴヌクレオチド配列および方法。複合体サンプルは、食物サンプル、水サンプル、または選択的に濃厚化された食物マトリックスであることができる。検出方法は、正の内部対照があるＰＣＲ増幅、または正の内部対照がないＰＣＲ増幅、および適切なプライマー対を利用してもよい。本方法を実施するための試薬はキットとして、および／または錠剤形態で提供できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）配列番号２および３、
（ｉｉ）配列番号５および６、
（ｉｉｉ）配列番号８および９、
（ｉｖ）配列番号１０および１１、
（ｖ）配列番号１３および１４、および
（ｖｉ）配列番号１６および１７
よりなる群から選択されるプライマー対を使用してサンプルのＰＣＲ増幅を実施し、ＰＣＲ増幅結果を生じさせるステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）のＰＣＲ増幅結果を調べてプライマー対の増幅生成物を検出し、それによって、プライマー対の増幅生成物の陽性検出がサンプル中の病原性大腸菌の存在を示すステップと
を含んでなる、サンプル中の病原性大腸菌の存在の検出方法。
【請求項２】
プライマー対が（ａ）（ｉｉ）、（ａ）（ｉｉｉ）、および（ａ）（ｉｖ）よりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プライマー対が（ａ）（ｉｉ）を含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
プライマー対が（ａ）（ｉｉｉ）を含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
プライマー対が（ａ）（ｉｖ）を含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）（ｉ）配列番号２および３、
（ｉｉ）配列番号５および６、
（ｉｉｉ）配列番号８および９、
（ｉｖ）配列番号１０および１１、
（ｖ）配列番号１３および１４、および
（ｖｉ）配列番号１６および１７
よりなる群から選択される２つの異なるプライマー対を使用してサンプルのＰＣＲ増幅を実施し、ＰＣＲ増幅結果を生じさせるステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）のＰＣＲ増幅結果を調べて２つの異なるプライマー対双方の増幅生成物を検出し、それによって、２つの異なるプライマー対双方の増幅生成物の陽性検出がサンプル中の病原性大腸菌の存在を示すステップと
を含んでなる、サンプル中の病原性大腸菌の存在の検出方法。
【請求項７】
２個のプライマー対が（ａ）（ｉｉ）および（ａ）（ｉｖ）を含んでなる請求項６に記載の方法。
【請求項８】
２個のプライマー対が（ａ）（ｉｉ）および（ａ）（ｉｉｉ）を含んでなる請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｂ）において、融解曲線分析を使用して増幅生成物を検出する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
該ステップ（ａ）に先だって、ＰＣＲ増幅のためのサンプルを調製するステップをさらに含んでなる請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
該調製するステップが、（１）細菌濃厚化、（２）サンプルからの細菌細胞の分離、（３）細胞溶解、および（４）全ＤＮＡ抽出の少なくとも１つのプロセスを含んでなる請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
サンプルが食物サンプルまたは水サンプルを含んでなる請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
サンプルが選択的に濃厚化された食物マトリックスを含んでなる請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、または配列番号１７を含んでなる、病原性大腸菌の検出のための単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１５】
（ａ）（ｉ）配列番号２および３、
（ｉｉ）配列番号５および６、
（ｉｉｉ）配列番号８および９、
（ｉｖ）配列番号１０および１１、
（ｖ）配列番号１３および１４、および
（ｖｉ）配列番号１６および１７
よりなる群から選択される少なくとも１つのプライマー対、ならびに
（ｂ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
を含んでなる、病原性大腸菌の検出のためのキット。
【請求項１６】
構成要素（ａ）が（ａ）（ｉｉ）および（ａ）（ｉｖ）の双方を含んでなる請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
構成要素（ａ）が（ａ）（ｉｉ）および（ａ）（ｉｉｉ）の双方を含んでなる請求項１５に記載のキット。
【請求項１８】
（ａ）（ｉ）配列番号２および３、
（ｉｉ）配列番号５および６、
（ｉｉｉ）配列番号８および９、
（ｉｖ）配列番号１０および１１、
（ｖ）配列番号１３および１４、および、
（ｖｉ）配列番号１６および１７
よりなる群から選択される少なくとも１つのプライマー対、ならびに
（ｂ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
を含んでなる、ＰＣＲの実施において使用するための複製組成物。
【請求項１９】
構成要素（ａ）が（ａ）（ｉｉ）および（ａ）（ｉｖ）の双方を含んでなる請求項１８に記載の複製組成物。
【請求項２０】
構成要素（ａ）が（ａ）（ｉｉ）および（ａ）（ｉｉｉ）の双方を含んでなる請求項１８に記載の複製組成物。
【請求項２１】
請求項１８、１９または２０に記載の複製組成物を含んでなる錠剤。
【請求項２２】
サンプル中の病原性大腸菌の検出のための請求項２１に記載の錠剤を含んでなるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、核酸配列の存在に基づく大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細菌の検出および識別のための迅速な方法、特に検出のためのＰＣＲベースの方法、そのために有用なオリゴヌクレオチド分子および試薬およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）はグラム陰性桿菌である。ほとんどの大腸菌株は無害でヒトおよびその他の動物の正常な腸内細菌叢としてみられるが、いくつかの株は病原性であり、時として致命的疾患を引き起こすことができる。異なる病原性大腸菌株は、それらの疫学、臨床経過、および疾患の突発的大発生を引き起こす潜在性が異なる。疾患移行は概して糞便／経口経路を通じる。
【０００３】
病原性はＯおよびＨ抗原によって定義されるように、いくつかの血清型と関係している。異なる病原性血清型は異なる臨床疾患経過と関連し、公衆衛生の観点からそれらを異なるレベルの懸念に関連づけている。いくつかの疾患の突発的大発生は、病原性大腸菌の食物および水媒介起源と突き止められている。
【０００４】
１つの血清型、特に大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７血清型は、いくつかの食物および水媒介突発的大発生と関連しており、ＵＳＤＡによって牛挽肉中の混和物として許容度ゼロの基準で規制される。
【０００５】
大腸菌は遍在性でほとんどの血清型は非病原性であるので、病原性血清型を検出し、臨床および公衆衛生に異なるかかわりあいがある病原性血清型を識別する能力は、有用である。
【０００６】
したがって病原性大腸菌の迅速な検出のための試験を有して、より大きな公衆衛生および規制懸念があるものを識別することが望ましい。
【発明の開示】
【０００７】
発明の要旨
【０００８】
本発明は、以下を含む。
（ａ）（ｉ）配列番号２および３、（ｉｉ）配列番号５および６、（ｉｉｉ）配列番号８および９、（ｉｖ）配列番号１０および１１、（ｖ）配列番号１３および１４、および（ｖｉ）配列番号１６および１７よりなる群から選択されるプライマー対を使用してサンプルのＰＣＲ増幅を実施し、ＰＣＲ増幅結果を生じさせるステップと、（ｂ）ステップ（ａ）のＰＣＲ増幅結果を調べてプライマー対の増幅生成物を検出し、それによって、プライマー対の増幅生成物の陽性検出がサンプル中の病原性大腸菌の存在を示すステップを含んでなる、サンプル中の病原性大腸菌の存在の検出方法。好ましくは、プライマー対は、（ａ）（ｉｉ）、（ａ）（ｉｉｉ）、および（ａ）（ｉｖ）よりなる群から選択される。
【０００９】
（ａ）（ｉ）配列番号２および３、（ｉｉ）配列番号５および６、（ｉｉｉ）配列番号８および９、（ｉｖ）配列番号１０および１１、（ｖ）配列番号１３および１４，および（ｖｉ）配列番号１６および１７よりなる群から選択される２個の異なるプライマー対を使用してサンプルのＰＣＲ増幅を実施して、ＰＣＲ増幅結果を生成するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）のＰＣＲ増幅結果を調べて２個の異なるプライマー対双方の増幅生成物を検出し、それによって、２個の異なるプライマー対双方の増幅生成物の陽性検出がサンプル中の病原性大腸菌の存在を示すステップを含んでなる、サンプル中の病原性大腸菌の存在の検出方法。２個の異なるプライマー対は、好ましくは（ａ）（ｉｉ）および（ａ）（ｉｉｉ）、さらにより好ましくは（ａ）（ｉｉ）および（ａ）（ｉｖ）を含んでなる。
【００１０】
ステップ（ｂ）において、融解曲線分析を使用して増幅生成物を検出する、上のいずれかの方法。
【００１１】
前記ステップ（ａ）に先だって、ＰＣＲ増幅のためのサンプルを調製するステップをさらに含んでなる、上のいずれかの方法。好ましくは調製するステップは、（１）細菌濃厚化、（２）サンプルからの細菌細胞の分離、（３）細胞溶解、および（４）全ＤＮＡ抽出のプロセスの少なくとも１つを含んでなる。
【００１２】
サンプルが食物サンプル、水サンプル、または選択的に濃厚化された食物マトリックスを含んでなる、上のいずれかの方法。
【００１３】
配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、または配列番号１７を含んでなる、病原性大腸菌の検出のための単離されたポリヌクレオチド。
【００１４】
（ａ）（ｉ）配列番号２および３、（ｉｉ）配列番号５および６、（ｉｉｉ）配列番号８および９、（ｉｖ）配列番号１０および１１、（ｖ）配列番号１３および１４、および（ｖｉ）配列番号１６および１７よりなる群から選択される少なくとも１つのプライマー対、ならびに（ｂ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含んでなる、病原性大腸菌の検出のためのキット。キットは、好ましくは（ａ）（ｉｉ）および（ａ）（ｉｉｉ）の双方、さらにより好ましくは（ａ）（ｉｉ）および（ａ）（ｉｖ）の双方を含んでなる。
【００１５】
（ｉ）配列番号２および３、（ｉｉ）配列番号５および６、（ｉｉｉ）配列番号８および９、（ｉｖ）配列番号１０および１１、（ｖ）配列番号１３および１４、および（ｖｉ）配列番号１６および１７よりなる群から選択される少なくとも１つのプライマー対、ならびに（ｂ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含んでなる、ＰＣＲの実施で使用するための複製組成物。複製組成物は、好ましくは（ａ）（ｉｉ）および（ａ）（ｉｉｉ）の双方、さらにより好ましくは、（ａ）（ｉｉ）および（ａ）（ｉｖ）の双方を含んでなる。
【００１６】
上の複製組成物のいずれかを含んでなる錠剤、およびサンプル中の病原性大腸菌の検出のための錠剤を含んでなるキット。
【００１７】
配列の要旨
配列番号１は、その検出が血清型Ｏ１５７：Ｈ７、Ｏ１５７：ＨＮＭ、Ｏ５５：Ｈ７、Ｏ２６：Ｈ１１、またはＯ１４５：ＨＮＭの病原性大腸菌の存在を特異的に示す、病原性大腸菌のヌクレオチド配列である。配列番号１は、プライマー配列番号２および配列番号３によって境界され、それを含有し、それによって増幅される。
【００１８】
配列番号２は、細菌ＤＮＡと配列番号３とのポリメラーゼ連鎖反応において、血清型Ｏ１５７：Ｈ７、Ｏ１５７：ＨＮＭ、Ｏ５５：Ｈ７、Ｏ２６：Ｈ１１、またはＯ１４５：ＨＮＭの病原性大腸菌のＤＮＡを特異的に増幅する、病原性大腸菌のゲノム領域に対する５’プライマーのヌクレオチド配列である。
【００１９】
配列番号３は、細菌ＤＮＡと配列番号２とのポリメラーゼ連鎖反応において、血清型Ｏ１５７：Ｈ７、Ｏ１５７：ＨＮＭ、Ｏ５５：Ｈ７、Ｏ２６：Ｈ１１、またはＯ１４５：ＨＮＭの病原性大腸菌のＤＮＡを特異的に増幅する、病原性大腸菌のゲノム領域に対する３’プライマーのヌクレオチド配列である。
【００２０】
配列番号４は、その検出が血清型Ｏ１５７：Ｈ７、Ｏ１５７：ＨＮＭ、Ｏ５５：Ｈ７、Ｏ２６：Ｈ１１、Ｏ２６：ＨＮＭ、Ｏ１４５：ＨＮＭ、または０１１１：ＨＮＭの病原性大腸菌の存在を特異的に示す、病原性大腸菌のヌクレオチド配列である。配列番号４は、プライマー配列番号５および配列番号６によって境界され、それを含有し、その使用によって増幅される。
【００２１】
配列番号５は、細菌ＤＮＡと配列番号６とのポリメラーゼ連鎖反応において、血清型Ｏ１５７：Ｈ７、Ｏ１５７：ＨＮＭ．Ｏ５５：Ｈ７、Ｏ２６：Ｈ１１、Ｏ２６：ＨＮＭ、Ｏ１４５：ＨＮＭ、または０１１１：ＨＮＭの病原性大腸菌のＤＮＡを特異的に増幅する、病原性大腸菌のゲノム領域に対する５’プライマーのヌクレオチド配列である。
【００２２】
配列番号６は、細菌ＤＮＡと配列番号５とのポリメラーゼ連鎖反応において、血清型Ｏ１５７：Ｈ７、Ｏ１５７：ＨＮＭ．Ｏ５５：Ｈ７、Ｏ２６：Ｈ１１、Ｏ２６：ＨＮＭ、Ｏ１４５：ＨＮＭ、または０１１１：ＨＮＭの病原性大腸菌のＤＮＡを特異的に増幅する、病原性大腸菌のゲノム領域に対する３’プライマーのヌクレオチド配列である。
【００２３】
配列番号７は、その検出が血清型Ｏ１５７：Ｈ７、Ｏ１５７：ＨＮＭまたはＯ５５：Ｈ７の病原性大腸菌の存在を特異的に示す、病原性大腸菌のヌクレオチド配列である。配列番号７はプライマー配列番号８および配列番号９によって境界され、それを含有し、その使用によって増幅される。配列番号５もまた、それぞれ配列番号８および配列番号９の修正である、配列番号１０および配列番号１１で表されるプライマーの使用によって増幅される。
【００２４】
配列番号８は、細菌ＤＮＡと配列番号９とのポリメラーゼ連鎖反応において、血清型Ｏ１５７：Ｈ７、Ｏ１５７：ＨＮＭまたはＯ５５：Ｈ７の病原性大腸菌のＤＮＡを特異的に増幅する、病原性大腸菌のゲノム領域に対する５’プライマーのヌクレオチド配列である。
【００２５】
配列番号９は、細菌ＤＮＡと配列番号８とのポリメラーゼ連鎖反応において、血清型Ｏ１５７：Ｈ７、Ｏ１５７：ＨＮＭまたはＯ５５：Ｈ７の病原性大腸菌のＤＮＡを特異的に増幅する、病原性大腸菌のゲノム領域の３’プライマーのヌクレオチド配列である。
【００２６】
配列番号１０は、配列番号８の修正である。配列番号１０は、ＧＣ  ｒｉｃｈ  ｃｌａｍｐがそれに付加された、配列番号８の全配列を含む。このｃｌａｍｐの付加は標的特異性を変更しないが、増幅生成物の融解温度を変更する。配列番号１０は、細菌ＤＮＡと配列番号１１とのポリメラーゼ連鎖反応において、血清型Ｏ１５７：Ｈ７、Ｏ１５７：ＨＮＭまたはＯ５５：Ｈ７の病原性大腸菌のＤＮＡを特異的に増幅する、病原性大腸菌のゲノム領域に対する５’プライマーのヌクレオチド配列である。
【００２７】
配列番号１１は、配列番号９の修正である。配列番号１１は、ＧＣ  ｒｉｃｈ  ｃｌａｍｐがそれに付加された、配列番号９の全配列を含む。このｃｌａｍｐの付加は標的特異性を変更しないが、増幅生成物の融解温度を変更する。配列番号１１は、細菌ＤＮＡと配列番号１０とのポリメラーゼ連鎖反応において、血清型Ｏ１５７：Ｈ７、Ｏ１５７：ＨＮＭまたはＯ５５：Ｈ７の病原性大腸菌のＤＮＡを特異的に増幅する、病原性大腸菌のゲノム領域に対する３’プライマーのヌクレオチド配列である。
【００２８】
配列番号１２は、その検出が血清型Ｏ１５７：Ｈ７を含む病原性大腸菌の存在を特異的に示す病原性大腸菌のヌクレオチド配列である。配列番号１２は、プライマー配列番号１３および配列番号１４によって境界され、それを含有し、それによって増幅される。
【００２９】
配列番号１３は、細菌ＤＮＡと配列番号１４とのポリメラーゼ連鎖反応において、血清型Ｏ１５７：Ｈ７を含む病原性大腸菌のＤＮＡを特異的に増幅する、病原性大腸菌のゲノム領域に対する５’プライマーのヌクレオチド配列である。
【００３０】
配列番号１４は、細菌ＤＮＡと配列番号１３とのポリメラーゼ連鎖反応において、血清型Ｏ１５７：Ｈ７を含む病原性大腸菌のＤＮＡを特異的に増幅する、病原性大腸菌のゲノム領域に対する３’プライマーのヌクレオチド配列である。
【００３１】
配列番号１５は、その検出が血清型Ｏ１５７：Ｈ７を含む病原性大腸菌の存在を特異的に示す病原性大腸菌のヌクレオチド配列である。配列番号１５は、プライマー配列番号１６および配列番号１７によって境界され、それを含有し、それによって増幅される。
【００３２】
配列番号１６は、細菌ＤＮＡと配列番号１７とのポリメラーゼ連鎖反応において、血清型Ｏ１５７：Ｈ７を含む病原性大腸菌のＤＮＡを特異的に増幅する、病原性大腸菌のゲノム領域に対する５’プライマーのヌクレオチド配列である。
【００３３】
配列番号１７は、細菌ＤＮＡと配列番号１６とのポリメラーゼ連鎖反応において、血清型Ｏ１５７：Ｈ７を含む病原性大腸菌のＤＮＡを特異的に増幅する、病原性大腸菌のゲノム領域に対する３’プライマーのヌクレオチド配列である。
【００３４】
配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．§８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。
【００３５】
好適態様の詳細な記述
本願明細書に記載される各参考文献の開示は、参照によってその全体を援用する。
【００３６】
定義
本願明細書では、いくつかの用語および略語を使用する。以下の定義が提供される。
【００３７】
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略される。
【００３８】
「単離された」と言う用語は、自然発生的環境において材料に常態で付随する、あるいはそれと相互作用する構成要素から実質的に遊離し、さもなくば除去された、核酸分子および／またはタンパクなどの物質を指す。単離ポリヌクレオチドは、その中でそれらが自然に生じる宿主細胞から精製されても良い。当業者に既知の従来の核酸精製法を使用して、単離ポリヌクレオチドを得ても良い。この用語は、リコンビナントポリヌクレオチドおよび化学的に合成されたポリヌクレオチドも包含する。
【００３９】
「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、および「核酸断片」と言う用語は、ここでは同義的に使用される。これらの用語はヌクレオチド配列などを包含する。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二重鎖で、任意に合成、非天然または変性ヌクレオチド塩基を含有するＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであっても良い。ＤＮＡポリマーの形態のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡの１本またはそれ以上のストランド、またはそれらの混合物を含んでなっても良い。
【００４０】
「増幅生成物」という用語は、プライマー−誘導増幅反応中に生成された核酸断片を指す。プライマー−誘導増幅の典型的な方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）またはストランド置換増幅（ＳＤＡ）が挙げられる。ＰＣＲ法が選択される場合、複製組成物は、例えばヌクレオチド三リン酸、適切な配列がある２個（以上）のプライマー、熱安定性ポリメラーゼ、緩衝液、溶質、およびタンパク質などの核酸複製のための構成要素を含んでなってもよい。これらの試薬および核酸増幅におけるそれらの使用手順を述べた詳細は、１９８７年にマリス（Ｍｕｌｌｉｓ）らに付与された米国特許第４，６８３，２０２号明細書、および１９８６年にマリス（Ｍｕｌｌｉｓ）らに付与された米国特許第４，６８３，１９５号明細書で提供される。ＬＣＲ法が選択される場合、核酸複製組成物は、例えば熱安定性リガーゼ（例えばＴ．アクアテイカス（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）リガーゼ）、２組の隣接するオリゴヌクレオチド（各セットの１つのメンバーが各標的ストランドに相補的である）、トリス−ＨＣｌ緩衝液、ＫＣｌ、ＥＤＴＡ、ＮＡＤ、ジチオトレイトール、およびサケ精子ＤＮＡを含んでなってもよい。例えば、タボール（Ｔａｂｏｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８２：１０７４〜１０７８頁（１９８５年）を参照されたい。
【００４１】
「プライマー」という用語は、相補的ストランドの合成がポリメラーゼによって触媒される条件下におかれると、相補的ストランドに沿った、核酸合成または複製の開始点として作用できる（合成または天然）オリゴヌクレオチドを指す。
【００４２】
「プローブ」という用語は、目的のポリヌクレオチドに相補的（必ずしも完全に相補的でなくてもよいが）で、目的のポリヌクレオチドの少なくとも１つのストランドとのハイブリダイズによって二本鎖構造を形成する（合成または天然）オリゴヌクレオチドを指す。
【００４３】
「複製阻害物質部分」という用語は、核酸ストランド複製のための連鎖延長の相互反応をブロックする、オリゴヌクレオチドの３’末端水酸基に付着するあらゆる原子、分子または化学基を指す。例としては３’−デオキシヌクレオチド（例えばコルジセピン）、ジデオキシヌクレオチド、ホスフェート、リガンド（例えばビオチンおよびジニトロフェノール）、リポーター分子（例えばフルオレセインおよびローダミン）、炭素鎖（例えばプロパノール）、不適正ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、またはペプチド核酸単位が挙げられるが、これに限定されるものではない。「非参加の」という用語は、核酸分子増幅のための反応におけるプローブまたはプライマーの参加の欠如を指す。具体的には非参加のプローブまたはプライマーは、基材としての機能を果たさない、またはＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによって延長されないものである。「非参加プローブ」は、本質的にポリメラーゼによって連鎖延長されることができない。それは複製阻害物質部分を有しても有さなくてもよい。
【００４４】
核酸分子は、適切な温度および溶液イオン強度条件下で、核酸分子の一本鎖形態がその他の核酸分子とアニールできる場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの別の核酸分子と「ハイブリッド形成可能」である。ハイブリッド形成および洗浄条件については良く知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．著「分子クローンニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）の特に第１１章およびその表１１．１で例示される（参照によってその全体を本願明細書に援用する）。温度およびイオン強度条件が、ハイブリッド形成の「ストリンジェンシー」を定める。相同的な核酸の予備スクリーニングでは、例えば５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％ミルク、およびホルムアミドなし、または３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳなどの５５°のＴｍに相当する低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が使用できる。中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、例えば５×または６×ＳＳＣを伴う４０％ホルムアミドなどのより高いＴｍに相当する。ハイブリダイズのストリンジェンシー次第で塩基間のミスマッチは可能であるが、ハイブリダイズは、２つの核酸が相補的配列を含有することを要求する。核酸がハイブリダイズする適切なストリンジェンシーは、当該技術分野で良く知られた変数である核酸の長さおよび相補性の程度に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高い程、これらの配列を有する核酸ハイブリッドのＴｍ値は大きくなる。核酸ハイブリダイズの相対安定性（より高いＴｍに対応する）は、次の順で低下する。ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００ヌクレオチドを超えるハイブリッドでは、Ｔｍを計算する式が導かれている（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、前述９．５０〜９．５１参照）。より短かい核酸、すなわちオリゴヌクレオチドによるハイブリダイズのためにはミスマッチの配置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ））ら、前述１１．７〜１１．８参照）。好ましい一実施態様では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくともヌクレオチド約１０個である。より好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸の最小の長さは少なくともヌクレオチド約１５個、より好ましくは少なくともヌクレオチド約２０個、最も好ましくは長さが少なくともヌクレオチド３０個である。さらに当業者は、温度および洗浄液の塩濃度が、プローブの長さなどの要因次第で必要に応じて調節できることを認識する。
【００４５】
「遺伝子」とは、コード配列に先行する制御配列（５’非コード配列）およびその後ろの制御配列（３’非コード配列）を含めた特異性タンパク質を発現する核酸断片を指す。
【００４６】
本明細書で用いられる「発現」という用語は、発明の核酸断片から誘導されるセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指しても良い。
【００４７】
ここで使用される標準リコンビナントＤＮＡおよび分子クローンニング技術は当該技術分野で良く知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．著「分子クローンニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）（以下「マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）」）、およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ），Ｆ．Ｍ．ら著「現代分子生物学プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版（１９８７）で述べられている。
【００４８】
プライマー／オリゴヌクレオチド
本発明のオリゴヌクレオチドは、病原性大腸菌の検出および同定のために開発された。
【００４９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜１７で記述される。
【００５０】
下の表Ｉに示すように、本発明の特定のオリゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅のためのプライマーとして使用してもよい。
【００５１】
【表１】
2008504031.tif 000002
【００５２】
プライマーセットＰＳ１（配列番号２および配列番号３）、ＰＳ２（配列番号５および配列番号６）、ＰＳ３（配列番号８および配列番号９）、ＰＳ５（配列番号１３および配列番号１４）、およびＰＳ６（配列番号１６および配列番号１７）は、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７ゲノムの領域の配列分析に基づいてデザインされた。プライマーセットＰＳ４（配列番号１０および配列番号１１）は、プライマー特異性を変更することなくＰＣＲ生成物の融点を上昇させるように生成されたＰＳ３中のプライマーの修正である。ＮＣＢＩデータベースのＢｌａｓｔ検索からは、既知の機能を有する遺伝子との顕著な配列相同性は明らかにされなかった。プライマーデザインは、いかなるソフトウェアプログラムによっても補助されなかった。
【００５３】
これらのオリゴヌクレオチドプライマーはまた、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（１９８９年にベックマン（Ｂａｃｋｍａｎ）らに付与されたＥＰ  ０  ３２０  ３０８号明細書、キャリノ（Ｃａｒｒｉｎｏ）ら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３：３〜２０頁、１９９５年）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）（キャリノ（Ｃａｒｒｉｎｏ）ら、１９９５年、前出）、および自立配列複製（３ＳＲ）および「Ｑレプリカーゼ増幅」（ペッファー（Ｐｆｅｆｆｅｒ）ら、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１９：３７５〜４０７頁、１９９５年）などのその他の核酸増幅法でも有用であるかもしれない。
【００５４】
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、ハイブリダイズプローブとして使用してもよい。ＤＮＡプローブを使用したハイブリダイズは、食物、臨床、および環境サンプル中の病原体の検出のために使用されることが多く、方法は概して当業者に知られている。プローブハイブリダイズの感度および特異性の程度は、前述の増幅技術で得られるよりも低いことが概して認識される。
【００５５】
アッセイ方法
病原性大腸菌の検出のために、配列番号１〜１７を多様な形態で使用してもよい。最も好ましいのは、プライマー−誘導増幅法および核酸ハイブリダイズ法である。
【００５６】
これらの方法を使用して、例えば汚染が疑われる動物、環境または食物源からのサンプル中の病原性大腸菌を検出してもよい。
【００５７】
本発明の核酸配列およびオリゴヌクレオチドを使用した、増幅ベースおよびハイブリダイズベースの双方の方法もまた使用して、複合体マトリックスまたは精製された培養物中の大腸菌の同定を確認してもよい。本発明の好ましい実施態様は、（１）複合体サンプル混合物を非選択的成長培地中で培養して標的細菌を蘇生するステップと、（２）全標的細菌ＤＮＡを放出するステップと、（３）全ＤＮＡを本発明のプライマー対と共に増幅プロトコルの対象にするステップを含んでなる。
【００５８】
プライマー−誘導増幅アッセイ方法
好ましい一実施態様では、病原性大腸菌の検出のためのプライマー−誘導核酸増幅で使用するためのプライマーとして、プライマー対ＰＳ１−ＰＳ６を使用してもよい。
【００５９】
熱循環方法（例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、およびＬＣＲ）、ならびに恒温方法およびストランド置換増幅（ＳＤＡ）をはじめとする、多様なプライマー−誘導核酸増幅法が当該技術分野で知られている。
【００６０】
好ましい方法はＰＣＲである。
【００６１】
サンプル調製
本発明に従ったオリゴヌクレオチドおよび方法は、いかなるサンプル調製の必要もなしに、あらゆる適切な臨床または環境サンプルと共に直接使用してもよい。より高い感度を達成するために、そして時間が制限要因でない状況において、サンプルを前処理し増幅前濃厚化が実施されることが好ましい。
【００６２】
食物−媒介病原菌の検出のための最小工業基準は、「細菌学的分析マニュアル（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ）」第８版、改訂版Ａの第１章、アンドリュー（Ａｎｄｒｅｗｓ）ら著「食物サンプルおよびサンプルホモジネートの調製（Ｆｏｏｄ  Ｓａｍｐｌｅ  ａｎｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ）」、公認分析化学者協会、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＶＡ、１９８４年で述べられるように、２５ｇの食物マトリックス中に１個の病原体細胞の存在を確実に検出する方法である。この厳しい基準を満たすため、生化学的、免疫学的または核酸ハイブリダイズ手段による検出を容易にするために、濃厚化の方法および培地が開発されており、標的病原体細胞の生育を増強する。典型的な濃厚化手順は、標的細菌の生育および健康を増強し、また存在するあらゆる背景または非標的微生物の生育を阻害する培地を用いる。例えば米国農務省（ＵＳＤＡ）は、病原性大腸菌について試験する牛挽肉サンプルの濃厚化のプロトコルを示している。米国食品医薬品局細菌分析マニュアル（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ）。
【００６３】
多様な病原菌のために選択的培地が開発されており、当業者は濃厚化する特定の生物体に適した培地を選択することを知っている。非選択的培地の一般的考察および処方については、公認分析化学者協会（Ｓｕｉｔｅ  ４００，２２００  Ｗｉｌｓｏｎ  Ｂｌｖｄ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＶＡ  ２２２０１〜３３０１）が出版、頒布するＦＤＡ細菌分析マニュアル（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ）（１９９８年）で述べられる。
【００６４】
選択的生育後、さらなる分析のために複合体混合物のサンプルを取り出す。サンプリング手順は、当業者によく知られている多様な手段によって達成してもよい。好ましい実施態様では、５μＬの濃厚化培養物を取り出して、プロテアーゼを含有する２００μＬの溶解溶液に入れる。デラウェア州ウィルミントンのクオリコン（Ｑｕａｌｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ．））からのバックス（ＢＡＸ）（登録商標）システム使用ガイドで述べられるように、溶解溶液を３７℃に２０分間加熱し、９５℃で１０分のプロテアーゼ不活性化がそれに続く。
【００６５】
ＰＣＲアッセイ方法
サンプル中の病原性大腸菌の存在を検出する好ましい方法は、（ａ）ＰＳ１、ＰＳ２、ＰＳ３、ＰＳ４、ＰＳ５、およびＰＳ６よりなる群から選択されるサンプルプライマー対を使用してＰＣＲ増幅を実施し、ＰＣＲ増幅結果を生じさせるステップと、（ｂ）ステップ（ａ）のＰＣＲ増幅結果を調べてプライマー対の増幅生成物を検出し、それによって、プライマー対の増幅生成物の陽性検出がサンプル中の病原性大腸菌の存在を示すステップを含んでなる。
【００６６】
より好ましくは、上記方法で、プライマー対はＰＳ２、ＰＳ３、およびＰＳ４よりなる群から選択される。
【００６７】
サンプル中の病原性大腸菌の存在を検出する別の好ましい方法は、（ａ）ＰＳ１、ＰＳ２、ＰＳ３、ＰＳ４、ＰＳ５、およびＰＳ６よりなる群から選択される２個の異なるプライマー対を使用してサンプルのＰＣＲ増幅を実施し、ＰＣＲ増幅結果を生じさせるステップと、（ｂ）ステップ（ａ）のＰＣＲ増幅結果を調べて２個の異なるプライマー対双方の増幅生成物を検出し、それによって、２個の異なるプライマー対双方の増幅生成物の陽性検出がサンプル中の病原性大腸菌の存在を示すステップを含んでなる。
【００６８】
上記方法で、２個のプライマー対は好ましくはＰＳ２およびＰＳ３、より好ましくはＰＳ２およびＰＳ４を含んでなる。
【００６９】
別の好ましい実施態様では、ＰＣＲ増幅を実施するのに先だって、サンプルを調製するステップを実施してもよい。調製するステップは、（１）細菌濃厚化、（２）サンプルからの細菌細胞の分離、（３）細胞溶解、および（４）全ＤＮＡ抽出のプロセスの少なくとも１つを含んでなってもよい。
【００７０】
増幅条件
当業者は、本発明のオリゴヌクレオチドを使用して、標的病原性大腸菌細菌を成功裏に検出するのに、あらゆる概して許容可能なＰＣＲ条件を使用してもよいこと、そして試験されるサンプルおよびその他の試験室条件次第で、最適感度および特異性を達成するために、ＰＣＲ条件の日常的最適化が必要かもしれないことを理解するであろう。最適には、彼らは、その他の非標的種にはＰＣＲ生成物を与えない一方で、全ての意図される特異的標的からＰＣＲ増幅生成物を得る。
【００７１】
好ましい実施態様では、以下の試薬およびサイクル条件を使用してもよい。（デラウェア州ウィルミントンのクオリコン（Ｑｕａｌｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ．）製）１個のバックス（ＢＡＸ）（登録商標）試薬錠剤、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド、（オレゴン州ユージーンのモレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）からの）ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン（Ｇｒｅｅｎ）、および緩衝液構成要素を含有する該錠剤、および５μＬのプライマー混合物を含有するＰＣＲチューブに、４５μＬの溶解産物を添加して、各プライマーについてＰＣＲ中０．１５０μモルの最終濃度を達成する。好ましいＰＣＲサイクル条件は次のとおり。９４℃で２分の初期ＤＮＡ変性後、９４℃で１５秒間を３８サイクル、および７０℃で３分間のアニーリング／延長。
【００７２】
検出／検査／分析
プライマー−誘導増幅生成物は、様々な方法を使用して分析できる。
【００７３】
均質検出とは、増幅生成物検出の好ましい方法を指し、テンプレートまたはプライマーからの増幅生成物分離（ゲル電気泳動法などによる）が必要でない。均質検出は典型的に、蛍光性染料存在下で反応混合物の蛍光レベルを測定して達成される。
【００７４】
好ましい実施態様では、特にクオリコン（Ｑｕａｌｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．）からのバックス（ＢＡＸ）（登録商標）システムハードウェアおよび試薬錠剤を用いたＤＮＡ融解曲線分析が使用されて、均質検出が行われる。システムの詳細は、それぞれその内容全体を参照により本願明細書に援用した、米国特許第６，３１２，９３０号明細書およびＰＣＴ公報国際公開第９７／１１１９７号パンフレットおよび国際公開第００／６６７７７号パンフレットにある。
【００７５】
融解曲線分析は、各増幅サイクル中に選択される時点で、標的増幅生成物（「標的単位複製配列」）の蛍光をモニタリングすることで、二本鎖核酸分子（「ｄｓＤＮＡ」または「標的」）を検出および定量する。
【００７６】
当業者にはよく知られているように、温度がその融解温度よりも高いと、ｄｓＤＮＡの二本鎖は分離または融解する。ｄｓＤＮＡ分子の融解はプロセスであり、特定の溶液条件下では、融解は１つの温度で開始し（以下ＴＭＳと称する）、別の温度で完了する（以下、ＴＭＥと称する）。見慣れた項Ｔｍは融解が５０％完了する温度を指す。
【００７７】
典型的なＰＣＲサイクルは、標的ｄｓＤＮＡが融解する変性相、温度がプライマーが一本鎖になった標的プライマーに結合するのに最適であるアニーリング相、および温度がＤＮＡポリメラーゼが機能するのに最適である鎖伸長相（温度ＴＥ）を伴う。
【００７８】
本発明に従って、ＴＭＳはＴＥよりも高くあるべきで、ＴＭＥはＤＮＡポリメラーゼが熱不活性化される温度よりも低くあるべきである（かなりより低くなることが多い）。融解特性はデオキシヌクレオチド組成物などの特定のｄｓＤＮＡ分子の固有特性、およびｄｓＤＮＡの長さによってもたらされる。
【００７９】
挿入染料は二本鎖ＤＮＡに結合する。染料／ｄｓＤＮＡ複合体は、染料に依存する適切な励起波長の光に曝露すると蛍光を発し、蛍光の強さはｄｓＤＮＡ濃度に比例してもよい。ＤＮＡ挿入染料の使用を活用して、ｄｓＤＮＡを検出および定量化する方法は当該技術分野で知られている。これらの目的で多くの染料が当該技術分野で知られており、使用されている。本方法もまた、このような関係を活用する。
【００８０】
このような染料の例としては、挿入染料が挙げられる。このような染料の例としては、ＳＹＢＲグリーン（Ｇｒｅｅｎ）−Ｉ（登録商標）、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、トト（ＴＯＴＯ）（登録商標）−１｛キノリニウム，１−１’−［１，３−プロパンジイルビス［（ジメチルイミニオ）−３，１−プロパンジイル］］ビス［４−［（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）メチル］］−，四ヨウ化物｝、およびヨプロ（ＹｏＰｒｏ）（登録商標）｛キノリニウム、４−［（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾオキサゾリリデン）メチル］−１−［３−（トリメチルアンモニオ）プロピル］−，二ヨウ化物｝が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明で最も好ましいのは、オレゴン州ユージーンのモレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）によって製造されるＳＹＢＲグリーン（Ｇｒｅｅｎ）−Ｉ（登録商標）などの非対称性シアン化物染料である。
【００８１】
融解曲線分析は、温度を上昇させながら蛍光変化をモニタリングして達成される。温度が標的単位複製配列に特異的なＴＭＳに達すると、ｄｓＤＮＡは変性し始める。ｄｓＤＮＡが変性すると、挿入染料はＤＮＡから分離して蛍光が低下する。蛍光の対数の変化の負数を温度変化で除して、温度に対してプロットした数学的分析は、融解曲線として知られているグラフピークをもたらす（一般的融解曲線分析を例示する図６を参照されたい）。
【００８２】
図１に示されるデータ形質転換プロセスは、以下を伴う。
１．データを補間して等間隔のデータ点を得る
２．蛍光（Ｆ）の対数を取る
３．ｌｏｇＦを補整する
４．−ｄ（ｌｏｇＦ）／ｄＴを計算する
５．（標的生物次第で）データを１度間隔で離れた１１〜１３個のデータ点に減少させる。
【００８３】
本均質検出方法を使用して、標的ｄｓＤＮＡを検出および定量化でき、それから標的生物体の存在およびレベルを判定できる。この方法は非常に特異的で高感度である。検出可能な最少数の標的ｄｓＤＮＡは、典型的な反応条件および容量下で１〜１０である。
【００８４】
均質検出を用いて、本発明のプライマー対を使用し、「リアルタイム」プライマー−誘導核酸増幅（例えば「リアルタイム」ＰＣＲおよび「リアルタイム」ＲＴ−ＰＣＲ）を行ってもよい。好ましい「リアルタイム」法については、その各内容全体を本願明細書に援用した、米国特許第６，１７１，７８５号明細書および米国特許第５，９９４，０５６号明細書に記載されている。
【００８５】
別の検出方法は、その内容全体を参照により本願明細書に援用した、米国特許第５，８０４，３７５号明細書、米国特許第５，５３８，８４８号明細書、米国特許第５，４８７，９７２号明細書、および米国特許第５，２１０，０１５号明細書に記載される５’ヌクレアーゼ検出法である。
【００８６】
標準非変性ゲル電気泳動法（例えばアクリルアミドまたはアガロース）、変性勾配ゲル電気泳動法、および温度勾配ゲル電気泳動法をはじめとする、多様なその他のＰＣＲ検出方法が当該技術分野で知られている。標準非変性ゲル電気泳動法はＰＣＲ検出の単純で迅速な方法であるが、あらゆる用途に対しては適切でないかもしれない。
【００８７】
変性勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）は、小型ＤＮＡ断片（２００〜７００ｂｐ）の変性動態の違いを検出する分離方法である。分離の原理は、断片の長さおよびヌクレオチド配列の双方に基づく。同一長さの断片では、１個の塩基対程度の小さな違いが検出できる。これは、ＤＮＡ断片がサイズによってのみ分離される非変性ゲル電気泳動法とは、対照的である。非変性ゲル電気泳動法のこの限界は、ＤＮＡ分子間の電荷密度の違いが中性に近く、それらの分離にほとんど役立たないために帰結する。ＤＮＡ断片のサイズが増大すると、ゲルを通過するその速度は低下する。
【００８８】
ＤＧＧＥは主として、それらの変性プロフィールおよび配列に基づいて、同一サイズのＤＮＡ断片を分離するのに使用される。ＤＧＧＥを使用して、熱または化学変性剤が適用されると、二本鎖のＤＮＡ分子は分離または融解する。ＤＮＡ二本鎖の変性は、１）相補的塩基対間に形成された水素結合（ＧＣに富む領域はＡＴに富む領域よりも高い変性条件で融解するので）、および２）同一ストランドまたは「スタッキング」の隣接塩基間の親和性の２つの要因によって影響される。したがってＤＮＡ分子は、それらのヌクレオチド配列によって定まる個々の特徴的な変性条件がある、いくつかの融解ドメインを有してもよい。ＤＧＧＥは、特異的変性ドメイン内のただ１個のヌクレオチド以外は、同一の長さおよびＤＮＡ配列を有するその他の点では同一のＤＮＡ分子が、異なる温度またはＴｍで変性するという事実を有効に使う。したがって増大する化学変性剤の勾配を通じて二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ断片を電気泳動すると、それは変性し始め、立体配座および移動性変化の双方を被る。分子の一本鎖部分の枝分かれ構造は、ゲルマトリックス内で絡まるので、ｄｓＤＮＡ断片は、変性一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ断片よりも早く移動する。変性環境が増大すると、ＤＮＡストランドの特定の低変性ドメインが分離する変性剤濃度において、ｄｓＤＮＡ断片は完全に分離し、ゲルを通過する分子の移動性が遅延する。実際には一定温度（約６０℃）で電気泳動法が行われ、１００％のＤＮＡ分子に変性をもたらす濃度（すなわち４０％ホルムアミドおよび７Ｍ尿素）で化学変性剤が使用される。この可変変性勾配は、０％変性剤から１００％までの変性剤に各ＤＧＧＥゲルの組成が徐々に変化するように、勾配マーカーを使用して作り出される。もちろん、より低い範囲の変性剤を含有する勾配（例えば３５％〜６０％）もまた、ＤＮＡの増大する分離のために注入できる。
【００８９】
ＤＧＧＥで使用される原理はまた、化学変性剤勾配の代わりに温度勾配を使用する第２の方法にも応用できる。この方法は、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）として知られている。この方法は温度勾配を利用して、ｄｓＤＮＡからｓｓＤＮＡへの立体配座変化を誘導して、サイズが等しく配列が異なる断片を分離する。ＤＧＧＥの場合と同じく、異なるヌクレオチド配列のＤＮＡ断片は、ゲルの異なる位置で不動性になる。プライマーデザインのバリエーションを都合良く利用して、ＰＣＲ生成物の特性決定および同定のためのＤＧＧＥの有用性を増大できる。プライマーデザインのバリエーションを使用したこれらの方法および原理については、「ＰＣＲ技術原理および応用（ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」ヘンリーＡ．エルリッヒ（Ｈｅｎｒｙ  Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ）編、Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ，７１〜８８頁（１９８８年）で述べられる。
【００９０】
計測手段
好ましい実施態様に従って、デラウェア州ウィルミントンのクオリコン（Ｑｕａｌｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ．））からのバックス（ＢＡＸ）（登録商標）システムおよび融解曲線分析を使用した。
【００９１】
試薬およびキット
あらゆる形態のあらゆる適切な核酸複製組成物（「複製組成物」）を使用できる。
【００９２】
ＰＣＲ増幅のための典型的な複製組成物は、例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、標的特異的プライマー、および適切なポリメラーゼを含んでなってもよい。
【００９３】
複製組成物が液体形態である場合、当該技術分野で知られている適切な緩衝液を使用してもよい（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．ら著「分子クローンニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）。
【００９４】
代案としては、複製組成物が錠剤形態中に含有される場合、安定剤および結合剤などの典型的な錠剤化試薬が含まれてもよい。好ましい錠剤化技術については、それぞれその内容全体を本願明細書に援用した米国特許第４，７６２，８５７号明細書および米国特許第４，６７８，８１２号明細書で記載される。
【００９５】
本発明の好ましい複製組成物は、（ａ）ＰＳ１、ＰＳ２、ＰＳ３、ＰＳ４、ＰＳ５、およびＰＳ６よりなる群から選択される少なくとも１つのプライマー対、および（ｂ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含んでなる。複製組成物はより好ましくはプライマー対ＰＳ２およびＰＳ３の双方、さらにより好ましくはプライマー対ＰＳ２およびＰＳ４の双方を含んでなる。
【００９６】
本発明の好ましいキットは、（ａ）ＰＳ１、ＰＳ２、ＰＳ３、ＰＳ４、ＰＳ５、およびＰＳ６よりなる群から選択される少なくとも１つのプライマー対、および（ｂ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含んでなる。好ましいキットは、より好ましくはプライマー対ＰＳ２およびＰＳ３の双方、さらにより好ましくはプライマー対ＰＳ２およびＰＳ４の双方を含んでなる。
【００９７】
本発明の好ましい錠剤は、（ａ）ＰＳ１、ＰＳ２、ＰＳ３、ＰＳ４、ＰＳ５、およびＰＳ６よりなる群から選択される少なくとも１つのプライマー対、および（ｂ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含んでなる。好ましい錠剤は、より好ましくはプライマー対ＰＳ２およびＰＳ３の双方、さらにより好ましくは、プライマー対ＰＳ２およびＰＳ４の双方を含んでなる。さらにより好ましくは、本発明のキットは、前述の好ましい錠剤を含んでなる。
【００９８】
別の好ましい実施態様では、複製組成物は陽性内部対照を含有する。ＰＣＲ反応内に含有される陽性内部対照の利点については、その各内容全体を本願明細書に援用した米国特許第６，３１２，９３０号明細書およびＰＣＴ出願国際公開第９７／１１１９７号パンフレットで以前述べられており、以下が含まれる。（ｉ）対照を単一プライマーを使用して増幅してもよい、（ｉｉ）対照増幅生成物の量はサンプル中に含有されるあらゆる標的ＤＮＡまたはＲＮＡから独立している、（ｉｉｉ）対照ＤＮＡは手動および自動試験手順の双方において、使用の容易さおよび高度な再現性のために、その他の増幅試薬と共に錠剤にできる、（ｉｖ）対照は均質な検出と共に、すなわち反応物質からの生成ＤＮＡの分離なしに使用できる。（ｖ）内部対照は、反応中のその他の可能な増幅生成物とははっきりと識別される融解プロフィールを有する。
【００９９】
対照ＤＮＡは、プライマー−誘導増幅反応において増幅を可能にする適切なサイズおよび塩基組成である。対照ＤＮＡ配列は、大腸菌ゲノムまたは別の供給源から得てもよいが、標的増幅生成物の増幅を可能にする同一条件下で、再現性よく増幅されなくてはならない。
【０１００】
対照反応は、増幅反応を確認するのに有用である。対照ＤＮＡの増幅は試験サンプルと同一の反応チューブ内で起きるので、サンプルが標的陰性である、すなわち標的増幅生成物が生成されない場合に、増幅反応の成功を示す。増幅反応の顕著な確認を達成するために、対照ＤＮＡの適切数のコピーを各増幅反応に含めなくてはならない。
【０１０１】
場合によっては、追加的な陰性対照複製組成物を含めることが有用かもしれない。陰性対照複製組成物は、複製組成物と同一の試薬を含有するがポリメラーゼがない。このような対照の主要な機能は、方法が蛍光性検出手段を用いる場合に、均質な形態での偽性の背景蛍光をモニターすることである。
【０１０２】
複製組成物は、それらが標的ＤＮＡまたは対照ＤＮＡを増幅するのに使用されるためにデザインされているかどうかによって、変性されてもよい。標的ＤＮＡ（試験複製組成物）を増幅する複製組成物は、（ｉ）ポリメラーゼ（概して熱安定性）、（ｉｉ）標的ＤＮＡにハイブリダイズできるプライマー対、および（ｉｉｉ）増幅反応が進行するのに必要な緩衝液を含んでもよい。対照ＤＮＡ（陽性対照または陽性複製組成物）を増幅する複製組成物は、（ｉ）ポリメラーゼ（概して熱安定性）、（ｉｉ）対照ＤＮＡ、（ｉｉｉ）対照ＤＮＡにハイブリダイズできる少なくとも１つのプライマー、および（ｉｖ）増幅反応が進行するのに必要な緩衝液を含んでもよい。
【０１０３】
核酸ハイブリダイズ法
核酸ハイブリダイズ法で特に有用なプローブは、配列番号１〜１７のいずれか、またはそれから誘導される配列である。
【０１０４】
核酸ハイブリダイズ試験の基本的構成要素は、プローブ、病原性大腸菌を含有することが疑われるサンプル、および特異的ハイブリダイズ法を含む。プローブは、検出する核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは検出する核酸配列に「ハイブリダイズ可能」である。典型的に、プローブ長はわずか５塩基から大腸菌診断用配列の完全長まで変動でき、行われる特異的試験に依存する。プローブ分子の一部のみが、検出する核酸配列に相補的であればよい。さらにプローブと標的配列間の相補性は、完全でなくてもよい。ハイブリダイズは不完全に相補的な分子間で起き、その結果、ハイブリダイズ領域内の塩基の特定の画分は、適切な相補的塩基と対にならない。プローブはＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかから構成されてもよい。核酸プローブの形態は、単に１つの極性の標識一本鎖分子、または双方の極性が存在する標識一本鎖分子であってもよい。プローブの形態は、その長さのように、行われるハイブリダイズ試験のタイプによって定まる。
【０１０５】
サンプルは病原性大腸菌を含有しても、しなくてもよい。サンプルは多様な形態を取ってもよいが、概して汚染が疑われる動物、環境または食物源から抽出される。
【０１０６】
ＤＮＡは直接検出されてもよいが、最も好ましくは、あらゆるプローブおよび標的分子のハイブリダイズが起きる前に、サンプル核酸がプローブと接触できるようにされなくてはならない。したがって生物体のＤＮＡは細胞を含んではならず、ハイブリダイズが起きる前に適切な条件下に置かれる。溶液内ハイブリダイズ法は、サンプルＤＮＡとプローブのハイブリダイズを得られるようにするために、ＤＮＡの精製を必要とする。これはサンプル中の標的配列検出のための溶液内法の使用が、サンプルの核酸を最初に精製してタンパク質、脂質、およびその他の細胞構成要素を除去し、次にハイブリダイゼーション条件下でプローブと接触させなくてはならないことを意味する。サンプル核酸の精製方法は当該技術分野で一般的であり、よく知られている（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）前出）。
【０１０７】
同様に、ハイブリダイズ法は良好に規定されている。典型的にプローブおよびサンプルは、核酸がハイブリダイズできるようにする条件下で混合されなくてはならない。これは適切な濃度および温度条件下において、無機または有機塩存在下でプローブとサンプルを接触させることを伴う。プローブとサンプル核酸は、プローブとサンプル核酸の間にあらゆる可能なハイブリダイズが起きるように、十分長い時間接触させなくてはならない。混合物中のプローブまたは標的の濃度によって、ハイブリダイズが起きるのに必要な時間が定まる。プローブまたは標的濃度が高いほど、必要なハイブリダイズインキュベーション時間は短くなる。
【０１０８】
好ましい一実施態様では、核酸を抽出する必要なしに、ハイブリダイズアッセイを細胞溶解産物に直接行ってもよい。これはサンプル取り扱いプロセスからいくつかのステップを排除し、アッセイを加速する。粗製細胞溶解産物においてこのようなアッセイを実施するために、典型的に、上述のように調製された細胞溶解産物にカオトロピック剤が添加される。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性を阻害することで核酸を安定化する。さらにカオトロピック剤は、室温において、短いオリゴヌクレオチドプローブのＤＮＡへの高感度およびストリンジェントなハイブリダイズを可能にする。（ヴァンネス（Ｖａｎ  Ｎｅｓｓ）およびチェン（Ｃｈｅｎ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：５１４３〜５１５１（１９９１年））。適切なカオトロピック剤としては、塩化グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウム、およびトリフルオロ酢酸セシウムなどが挙げられる。典型的に、カオトロピック剤は約３Ｍの最終濃度で存在する。所望ならば、ホルムアミドをハイブリダイズ混合物に典型的に３０〜５０％（ｖ／ｖ）で添加できる。
【０１０９】
代案としては、プローブハイブリダイズに先だって、サンプル核酸を精製できる。例えばフェノール−クロロホルム抽出、ワシントン州ボセルのマイクロプローブ社（ＭｉｃｒｏＰｒｏｖｅ  Ｃｏｒｐ．（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ））からのイソクイック（ＩｓｏＱｕｉｃｋ）抽出、およびその他の多様な方法が、当業者に知られている。ハイブリダイズ前精製は、標準フィルターハイブリダイズアッセイのために特に有用である。さらに精製は、自立配列複製などの生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）ＲＮＡ増幅法（例えばフェイ（Ｆａｈｙ）ら著「ＰＣＲ方法および応用（ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９９１）、２５〜３３頁を参照されたい）または逆転写酵素ＰＣＲ（カワサキ（Ｋａｗａｓａｋｉ）著「ＰＣＲプロトコル：方法および応用ガイド（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」Ｍ．Ａ．イニス（Ｉｎｎｉｓ）ら編、（１９９０年）、２１〜２７頁）を組み込むことにより、アッセイ感度を増大させる手段を容易にする。
【０１１０】
ＤＮＡが放出されると、それは多様な方法のいずれかによって検出できる。しかし最も有用な実施態様は、速度、便宜、感度、および特異性の少なくともいくつかの特性を有する。
【０１１１】
様々なハイブリダイズ溶液を用いることができる。典型的に、これらは約２０〜６０％容量、好ましくは３０％の極性有機溶剤を含んでなる。一般的なハイブリダイズ溶液は、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミドと、約０．１５〜１Ｍの塩化ナトリウムと、クエン酸ナトリウム、トリスＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲約６〜９）などの約０．０５〜０．１Ｍの緩衝液と、ドデシル硫酸ナトリウムなどの約０．０５〜０．２％の洗剤と、または０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡと、ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．）からのＦＩＣＯＬＬ（約３００〜５００キロダルトン）と、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋｄ）と、血清アルブミンを用いる。典型的なハイブリダイズ溶液には、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの未標識のキャリア核酸、断片核ＤＮＡ（例えば仔ウシ胸腺またはサケ精子ＤＮＡ、または酵母ＲＮＡ）、および場合により約０．５〜２％ｗｔ／ｖｏｌのグリシンも含まれる。多様な極性水溶性または膨潤性作用薬（例えばポリエチレングリコール）、アニオン性ポリマー（例えばポリアクリレートまたはポリメチルアクリレート）、およびアニオン性糖質ポリマー（例えば硫酸デキストラン）をはじめとする体積排除剤などのその他の添加剤もまた含まれてもよい。
【０１１２】
核酸ハイブリダイズは、多様なアッセイ様式に適合できる。最も適切な１つは、サンドイッチアッセイ様式である。サンドイッチアッセイは、特に非変性条件下でハイブリダイズに適合できる。サンドイッチ−タイプアッセイの主要構成要素は固体担体である。固体担体は、未標識でＤＮＡ配列の一部と相補的な固定化核酸プローブを吸着しており、またはそれと共有結合的に共役している。
【０１１３】
サンドイッチアッセイは、アッセイキット内に包含されてもよい、このキットは、汚染が疑われるサンプル収集のための第１の構成要素、およびサンプルの分配および溶解のための緩衝液を含む。第２の構成要素は、標的およびプローブポリヌクレオチドのハイブリダイズのため、ならびに洗浄による望ましくないおよび非二本鎖形態除去のための乾燥または液体いずれかの形態の培地を含む。第３の構成要素は、その上に、大腸菌ゲノムの一部と相補的な未標識の核酸プローブ（群）が固定される（または抱合される）固体担体（ディップスティック）を含む。第４の構成要素は、第３の構成要素の固定化未標識核酸プローブがハイブリダイズするのと同一のＤＮＡストランドの第２の異なる領域と相補的な標識プローブを含有する。
【０１１４】
別の好ましい実施態様では、均質または不均一いずれかのアッセイ様式において、３’ブロック化検出プローブとして、配列番号１〜１７またはそれらの誘導体を使用してもよい。例えばこれらの配列から発生したプローブは、３’ブロックされまたは非参加であってもよく、核酸増幅反応によって延長されずまたはそれに参加しない。さらにプローブには、プローブ／分析物ハイブリッドの固定化付着点として、または検出可能シグナルを生じるリポーターとして作用する反応性リガンドの役割を果たすことができる標識が組み込まれる。したがって大腸菌汚染が疑われるサンプルから単離されたゲノムまたはｃＤＮＡは、過剰な３’ブロック化検出プローブの存在下で標準プライマー−誘導増幅プロトコルによって増幅され、増幅生成物が生成する。プローブは３’ブロックされているので、標的の増幅に参加しないまたはそれを妨げない。最終増幅サイクル後、検出プローブは増幅されたＤＮＡの適切な部分にアニールし、次にアニールした複合体は反応性リガンドを通じて担体上に捕捉される。
【０１１５】
場合によっては、複製組成物中の標識プローブと共に、標識ｄＮＴＰをリガンドに組み込んで、担体上におけるＰＣＲ反応生成物の固定化、次に標識プローブ試薬の手段による固定化生成物の検出を容易にすることが望ましい。例えばビオチン、ジゴキシゲニンまたはジゴキシン標識ｄＮＴＰをＰＣＲ反応組成物に添加できる。次にＰＣＲ生成物に組み込まれたビオチンまたはジゴキシンは、それぞれストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）、アンチジキソギン、アンチジゴキシゲニン抗体担体上に固定化できる。次にプローブ標識の存在によって、固定化ＰＣＲ生成物を検出できる。
【０１１６】
本発明のプローブは、いくつかの代案の形態でデザインされてもよい。プローブの３’末端は、複製阻害する部分の付着によって、プライマー延長反応への参加からブロックされる。典型的な複製阻害物質部分としては、ジデオキシヌクレオチド、３−デオキシヌクレオチド、不適正ヌクレオシドまたはヌクレオチド配列、３’ホスフェート基、および化学物質が挙げられるが、これに限定されるものではない。コルジセピン（３’デオキシアデノシン）が好ましい。
【０１１７】
複製阻害物質は、標準シアノエチルホスホラミダイト化学反応を使用して、化学合成中に、非参加プローブの３’末端ヌクレオチドの３’ヒドロキシ基に共有結合的に付着する。このプロセスは、その中で３’末端が不溶性の担体（調節孔ガラスまたは「ＣＰＧ」）に共有結合的に付着しながら、新しく合成された鎖が５’末端で成長する、固相合成化学反応を使用する。３−デオキシリボヌクレオチドが好ましい複製阻害物質である。コルジセピン（３−デオキシアデノシン）が最も好ましい。コルジセピンはプローブの３’末端に付着するので、合成は、ＣＰＧに共有結合的に付着するコルジセピン、５−ジメトキシトリチル−Ｎ−ベンゾイル−３−デオキシアデノシン（コルジセピン）、バージニア州スターリングのグレン・リサーチ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ））からの２−サクシノイル−長鎖アルキルアミノ−ＣＰＧから開始する。ジメトキシトリチル基は除去され、連鎖合成惹起は、固相コルジセピンの脱保護された５’水酸基で開始する。合成完了後、オリゴヌクレオチドプローブが固体担体から切断され、３’−末端付着コルジセピン上に遊離２’水酸基が残る。その他の試薬もまた、合成中に、非参加プローブの３’末端に付着して、複製阻害物質の役割を果たすことができる。これらとしては、その他の３−デオキシリボヌクレオチド、ビオチン、ジニトロフェノール、フルオレセイン、およびジゴキシゲニンが挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの各試薬はまた、カリフォルニア州パロ・アルトのグレン・リサーチ；クロンテック・ラボラトリーズ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ））からのＣＰＧ担体上で誘導体化される。
【実施例】
【０１１８】
以下の実施例で本発明をさらに明確にする。これらの実施例は本発明の好ましい実施態様を示しながら、あくまでも例示の目的で提供されるものとする。
【０１１９】
実施例で使用した一般方法および材料
細菌培養の維持および生育に適した材料および方法は、当該技術分野で良く知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術は、以下で述べられる。「一般微生物学方法マニュアル（Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、フィリップ・ゲアハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレー（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスティロウ（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリーグ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）、およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、米国微生物学会、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４年）、またはトーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）著「バイオテクノロジー：工業微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）第２版（１９８９年）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９年）、または「細菌学的分析マニュアル（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ）」第６版、公認分析化学者協会、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＶＡ（１９８４年）。
【０１２０】
病原性大腸菌株および比較非標的菌株を生育させるのに使用した培地は、ＢＢＬ（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））から得られたブレインハートインフュージョンブロス（ＢＨＩ）であった。病原性大腸菌株サンプルはＢＨＩブロス中で一晩生育させ、０．１％ペプトン水中でおよそ１０６ｃｆｕ／ｍｌに希釈した培養物から得られた。比較非標的菌株のサンプルをＢＨＩ中でおよそ１０９ｃｆｕ／ｍｌに濃厚化した。
【０１２１】
プライマー（配列番号２、３、５、６、８、９、１０、１１）は、テキサス州ウッドランドのシグマ・ジェノシス（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ））によって調製された。
【０１２２】
ＰＣＲで使用した試薬は、デラウェア州ウィルミントンのデュポン・クオリコン（ＤｕＰｏｎｔ  Ｑｕａｌｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ．））からのバックス（ＢＡＸ）（登録商標）システム試薬錠剤キットからのものであり、オレゴン州ユージーンのモレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）からのＳＹＢＲ（登録商標）グリーン（Ｇｒｅｅｎ）、カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ））からのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、インディアナ州インディアナポリスのロシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ））からのデオキシヌクレオチド、およびニュージャージー州のＥＭサイエンス（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ））からの緩衝液を含む。
【０１２３】
全てのＰＣＲ反応は、デラウェア州ウィルミントンのデュポン・クオリコン（ＤｕＰｏｎｔ  Ｑｕａｌｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ．））からの標準バックス（ＢＡＸ）（登録商標）システムを使用して実施した。
【０１２４】
略語の意味は、次のとおり。「ｈ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味する。
【０１２５】
実施例１〜３
病原性大腸菌特異的ＤＮＡ断片の増幅
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７ゲノムの領域の配列分析に基づいて、３個のプライマーセット（ＰＳ１、ＰＳ２、ＰＳ３）をデザインした。１個のプライマーセット（ＰＳ４）は、特異性は変更しないが、増幅生成物の融解温度が変更するＰＳ３の修正であった。ＮＣＢＩデータベースのＢｌａｓｔ検索からは、既知の機能を有する遺伝子との顕著な配列相同性は明らかにされなかった。プライマーデザインは、いかなるソフトウェアプログラムによっても補助されなかった。
【０１２６】
上述のプライマーセットについて以下のサイクリング条件で試験した。９４℃で２分の初期ＤＮＡ変性後、９４℃で１５秒間を３８サイクル、および７０℃で３分間のアニーリング／延長。
【０１２７】
病原性および非病原性血清型の複数の大腸菌株を試験した。
【０１２８】
配列番号１の存在の判定は、上述のようにプライマーセット１（ＰＳ１）およびＤＮＡ融解曲線分析で達成される陽性ＰＣＲである。プライマーセット１（ＰＳ１）の陽性反応は、およそ８３℃における融解曲線ピークの外観をもたらす。図２は、プライマーセット１（ＰＳ１）で増幅された標的増幅生成物（配列番号１）に対して陽性の病原性大腸菌の代表的な融解曲線分析を示す。
【０１２９】
配列番号４の存在の判定は、上述のようにプライマーセット２（ＰＳ２）およびＤＮＡ融解曲線分析で達成される陽性ＰＣＲである。プライマーセット２（ＰＳ２）の陽性反応は、およそ８８℃における融解曲線ピークの外観をもたらす。図３は、プライマーセット２（ＰＳ２）で増幅された標的増幅生成物（配列番号４）に対して陽性の病原性大腸菌の代表的な融解曲線分析を示す。
【０１３０】
配列番号７の存在の判定は、上述のようにプライマーセット３（ＰＳ３）およびＤＮＡ融解曲線分析で達成される陽性ＰＣＲである。プライマーセット３（ＰＳ３）の陽性反応は、およそ８０℃における融解曲線ピークの外観をもたらす。図４は、プライマーセット３（ＰＳ３）で増幅された標的増幅生成物（配列番号７）に対して陽性の病原性大腸菌の代表的な融解曲線分析を示す。
【０１３１】
配列番号７の存在の判定は、上述のように、プライマーセット４（ＰＳ４）およびＤＮＡ融解曲線分析で達成される陽性ＰＣＲである。プライマーセット４（ＰＳ４）に対する陽性反応は、ＣＣ  ｃｌａｍｐ（上で説明したようにプライマーセットＰＳ４はＧＣ  ｃｌａｍｐのあるプライマーセットＰＳ３である）のために、およそ８３℃における融解曲線ピークの外観をもたらす。図５は、プライマーセット４（ＰＳ４）で増幅された病原性大腸菌陽性の代表的な融解曲線分析を示す。
【０１３２】
完全な結果を表ＩＩ（ＰＳ１、実施例１）、表ＩＩＩ（ＰＳ２、実施例２）、および表ＩＶ（ＰＳ３またはＰＳ４、実施例３）に記載する。
【０１３３】
【表２】
2008504031.tif 000003
【０１３４】
【表３】
2008504031.tif 000004
【０１３５】
【表４】
2008504031.tif 000005
【０１３６】
実施例４
同一ＰＣＲ反応における複数プライマーセットおよび内部対照の使用
図５は、陽性内部対照を添加したサンプルを示す。陽性内部対照はおよそ７７〜７８℃で融解し、用いた２個のプライマーセット、すなわちおよそ８３℃で融点曲線ピークを生じるプライマーセット４（ＰＳ４）（配列番号７検出のためのプライマーセット３（ＰＳ３）の代わり）、およびおよそ８８℃で融点曲線ピークを生じる配列番号４検出のためのプライマーセット１（ＰＳ２）の双方の病原性大腸菌単位複製配列とは、明らかに区別できる。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】融解曲線分析のプロセスを示す。標的ＤＮＡの蛍光変化は、融解中に捉えられる。蛍光の対数の変化の負数を温度変化で除して、温度に対してプロットした数学的分析は、融解曲線として知られているグラフピークをもたらす。
【図２】プライマーセット１（ＰＳ１）で増幅された病原性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７陽性サンプルの代表的な融解曲線分析を示す。増幅標的（配列番号１）の融解曲線は、およそ８３℃である。
【図３】プライマーセット２（ＰＳ２）で増幅された病原性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７陽性サンプルの代表的な融解曲線分析を示す。増幅標的（配列番号４）の融解曲線は、およそ８８℃である。
【図４】プライマーセット３（ＰＳ３）で増幅された病原性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７陽性サンプルの代表的な融解曲線分析を示す。増幅標的（配列番号７）の融解曲線は、およそ８０℃である。
【図５】陽性内部対照、およびプライマーセット２（ＰＳ２）およびプライマーセット４（ＰＳ４）で増幅された大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７ＤＮＡの包含を示す。プライマーセット２（ＰＳ２）からの増幅標的（配列番号４）は、およそ８８℃の融解曲線を発生させる。５’末端にＧＣ  ｒｉｃｈ付加を有するプライマーセット４（ＰＳ４）は、増幅標的の融解曲線（ＧＣ  ｃｌａｍｐからのＧＣがある配列番号７）を配列番号７（およそ８０℃）に対して、より高温（およそ８３℃）にシフトするので、それを陽性内部対照融解曲線（およそ８１℃）からより容易に識別することができる。
【図１】
2008504031.tif 000006
【図２】
2008504031.tif 000007
【図３】
2008504031.tif 000008
【図４】
2008504031.tif 000009
【図５】
2008504031.tif 000010
【配列表】
2008504031000001.xml
【国際調査報告】
2008504031.tif 000015
2008504031.tif 000016
2008504031.tif 000017