(57)【要約】成熟ＴＧＦ−β２および成熟ＴＧＦ−β３以上に成熟ＴＧＦ−β１に対して特異的な抗体を提供する。抗体は、重鎖のＣＤＲ３であるＧＹＲＸ１Ｘ２Ｘ３Ｙ（Ｘ１はＷまたはＡ、Ｘ２はＦまたはＬ、Ｘ３はＡ、ＥまたはＹ）によって特徴付けられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
成熟ＴＧＦベータ２及び成熟ＴＧＦベータ３以上に成熟ＴＧＦベータ１に特異的に結合する単離された結合性組成物であって、ＧＹＲＸ１Ｘ２Ｘ３Ｙ（配列番号４）を含む結合部位を有する第１の部分を含み、Ｘ１が、Ｗ又はＡであり、Ｘ２が、Ｆ又はＬであり、Ｘ３が、Ａ、Ｅ、又はＹである結合性組成物。
【請求項２】
前記第１の部分が、
ｉ．ＧＹＸ１ＦＸ２ＤＹＮＸ３Ｘ４（配列番号２）であり、Ｘ１が、Ｔ又はＤであり、Ｘ２が、Ｔ、Ｅ又はＦであり、Ｘ３が、Ｍ、Ｉ、Ｌ又はＶであり、Ｘ４が、Ｈ、Ｖ又はＡである配列、又は、
ｉｉ．Ｘ１Ｘ２ＹＰＹＤＧＸ３ＴＧＸ４ＮＸ５ＫＸ６ＫＳ（配列番号３）であり、Ｘ１が、Ｙ、Ｑ又はＳであり、Ｘ２が、Ｉ又はＶであり、Ｘ３が、Ｄ又はＥであり、Ｘ４が、Ｙ、Ｔ、Ｈ又はＬであり、Ｘ5が、Ｑ、Ｋ、Ｐ又はＳであり、Ｘ６が、Ｆ又はＹである配列
のうち少なくとも１つをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｘ１ＱＷＤＸ２Ｘ３Ｘ４ＰＡ（配列番号７）の結合部位を含む第２の部分をさらに含み、Ｘ１が、Ｑ又はＳであり、Ｘ２が、Ｌ、Ｄ又はＰであり、Ｘ３が、Ｎ又はＲであり、Ｘ４が、Ｐ、Ｆ、Ｙ又はＲである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記第２の部分が、
ｉ．Ｘ１ＡＸ２Ｘ３Ｘ４ＶＸ５ＹＭＨ（配列番号５）であり、Ｘ1は、Ｒ、Ｙ、Ｅ又はＱであり、Ｘ２が、Ｓ又はＴであり、Ｘ３が、Ｓ、Ｖ又はＡであり、Ｘ４が、Ｓ又はＬであり、Ｘ5 が、Ｓ、Ｐ、Ｌ又はＹである配列、又は、
ｉｉ．ＡＴＳＮＸ１ＡＸ２（配列番号６）であり、Ｘ１が、Ｌ、Ｎ又はＰであり、Ｘ２が、Ｓ、Ｋ、Ｙ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｅ、Ｑ、Ｒ又はＨである配列
のうち少なくとも１つをさらに含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
ａ）前記第１の部分が、
ｉ）成熟ヒトＴＧＦベータ１に対して免疫反応性である、
ｉｉ）成熟霊長類ＴＧＦベータ１に対して免疫反応性である、
ｉｉｉ）精製された或いは組換え産生されたヒトＴＧＦベータ１タンパク質又はその断片に対して作られる、
ｉｖ）モノクローナル抗体、抗体のＦａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）２又は可変ドメインの一部である、
ｖ）少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの保存的置換を有する、
ｖｉ）ヒト、又はヒト化抗体フレームワーク内に埋め込まれる、又は
ｖｉｉ）抗体の重鎖、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又はＦ（ａｂ）２の可変領域の一部を含む、請求項１に記載の組換え結合性組成物。
【請求項６】
ａ）以下を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）：
Ｉ．ＧＹＸ１ＦＸ２ＤＹＮＸ３Ｘ４［配列番号２］（Ｘ１が、ＴかＤであり、Ｘ２が、Ｔ、Ｅ又はＦであり、Ｘ３が、Ｍ、Ｉ、Ｌ又はＶであり、Ｘ４が、Ｈ、Ｖ、又はＡである）を含む配列から選択されるＣＤＲ１；
ＩＩ．Ｘ１Ｘ２ＹＰＹＤＧＸ３ＴＧＸ４ＮＸ５ＫＸ６ＫＳ［配列番号３］（Ｘ１が、Ｙ、Ｑ又はＳであり、Ｘ２が、Ｉ又はＶであり、Ｘ３が、Ｄ又はＥであり、Ｘ４が、Ｙ、Ｔ、Ｈ又はＬであり、Ｘ５が、Ｑ、Ｋ、Ｐ又はＳであり、Ｘ６はＦかＹである）を含む配列から選択されるＣＤＲ２；および
ＩＩＩ．ＧＹＲＸ１Ｘ２Ｘ３Ｙ［配列番号４］（Ｘ１が、ＷかＡであり、Ｘ２が、ＦかＬであり、Ｘ３が、Ａ又はＥである）を含む配列から選択されるＣＤＲ３；並びに
ｂ）以下を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）：
Ｉ．Ｘ１ＡＸ２Ｘ３Ｘ４ＶＸ５ＹＭＨ［配列番号５］（Ｘ１が、Ｒ、Ｙ、Ｅ又はＱであり、Ｘ２が、ＳかＴであり、Ｘ３が、Ｓ、Ｖ又はＡであり、Ｘ４が、Ｓ又はＬであり、Ｘ５が、Ｓ、Ｐ、Ｌ又はＹである）を含む配列から選択されるＣＤＲ１；
ＩＩ．ＡＴＳＮＸ１ＡＸ２［配列番号６］（Ｘ１が、Ｌ、Ｎ又はＰであり、Ｘ２が、Ｓ、Ｋ、Ｙ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｅ、Ｑ、Ｒ又はＨである）を含む配列から選択されるＣＤＲ２；および
ＩＩＩ．Ｘ１ＱＷＤＸ２Ｘ３Ｘ４ＰＡ［配列番号７］（Ｘ１が、Ｑ又はＳであり、Ｘ２が、Ｌ、Ｄ又はＰであり、Ｘ３が、ＮかＲであり、Ｘ４が、Ｐ、Ｆ、Ｙ又はＲである）を含む配列から選択されるＣＤＲ３
を含んでなるモノクローナル抗体である請求項５の結合性組成物。
【請求項７】
ａ）前記ＨＣＶＲが、
Ｉ．配列番号８を含むＦＲ１フレームワーク、
ＩＩ．配列番号９を含むＦＲ２フレームワーク、
ＩＩＩ．配列番号１０を含むＦＲ３フレームワーク、
ＩＶ．配列番号１１を含むＦＲ４フレームワーク
を有し、
ｂ）前記ＬＣＶＲが、
Ｉ．配列番号１２を含むＦＲ１フレームワーク、
ＩＩ．配列番号１３〜３６から選択される配列を含むＦＲ２フレームワーク、
ＩＩＩ．配列番号３７を含むＦＲ３フレームワーク、及び、
ＩＶ．配列番号３８を含むＦＲ４フレームワーク
を有する請求項６のモノクローナル抗体。
【請求項８】
ａ）ヒト定常領域又はヒト化定常領域をさらに含み、
ｂ）Ｉ．配列番号４０を含む重鎖配列、およびＩＩ．配列番号４１を含む軽鎖配列以下を含んでなるＩｇＧ４定常領域をさらに含み、
ｃ）Ｆａｂ断片であり、
ｄ）Ｆｖ断片であり、
ｅ）ｓｃＦｖ断片であり、
ｆ）Ｆ（ａｂ）２断片であり、
ｇ）ヒト定常領域に融合され、
ｈ）検出可能に標識され、
ｉ）凍結乾燥され、
ｊ）単離核酸分子内でコードされ、
ｋ）発現ベクターにおいて作動可能に連結された単離された核酸分子においてコードされ、
ｌ）宿主細胞に組み込まれた発現ベクターにおいて作動可能に連結された単離された核酸分子においてコードされ、
ｍ）キメラ抗体であり、
ｎ）他の化学部分に接合され、
ｏ）滅菌され、または
ｐ）医薬組成物である、
請求項７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
ａ）配列番号４２〜８６から選択される配列を有するＬＣＶＲと、ｂ）配列番号８７〜１２５から選択される配列を有するＨＣＶＲとを含む請求項８のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
ａ）ヒト化され、
ｂ）１つ又は複数のヒト定常領域に融合され、
ｃ）Ｆａｂ断片であり、
ｄ）Ｆｖ断片であり、
ｅ）ｓｃＦｖ断片であり、
ｆ）Ｆ（ａｂ）２断片であり、
ｇ）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＤから選択される定常領域を含み、
ｈ）検出可能に標識され、
ｉ）凍結乾燥され、
ｊ）キメラ抗体であり、
ｋ）以下の状態
１．腎臓病、
２．慢性腎疾患、
３．末期腎不全、
４．線維症、線維障害若しくは線維形成状態、又は、
５．腎線維症
の治療のために霊長類に投与するための薬物の製造において使用され、
ｌ）１つ又は複数の他の化学部分に接合され、
ｍ）滅菌され、或いは、
ｎ）医薬組成物を含む、
請求項９のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
以下のもの
１．配列番号４２を含むＬＣＶＲ及び配列番号８７、８８、８９、９０、９１、９２を含むＨＣＶＲ、
２．配列番号４３を含むＬＣＶＲ及び配列番号９０、９５を含むＨＣＶＲ、
３．配列番号４４を含むＬＣＶＲ及び配列番号９３又は９４を含むＨＣＶＲ
４．配列番号４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３、５４、又は５５を含むＬＣＶＲ及び配列番号９６を含むＨＣＶＲ、
５．配列番号５１を含むＬＣＶＲ及び配列番号９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４を含むＨＣＶＲ
を含む請求項１０に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１２】
以下のＬＣＶＲ及びＨＣＶＲ：
１．配列番号５６を含むＬＣＶＲ及び配列番号１０５、１０６、１０７、１０９、１１０を含むＨＣＶＲ、
２．配列番号５７を含むＬＣＶＲ及び配列番号１０７を含むＨＣＶＲ、
３．配列番号５８を含むＬＣＶＲ及び配列番号１０６を含むＨＣＶＲ、
４．配列番号６０を含むＬＣＶＲ及び配列番号１０８を含むＨＣＶＲ、
５．配列番号６１を含むＬＣＶＲ及び配列番号１１０、１１１を含むＨＣＶＲ、
６．配列番号６２、６３、６４、６６、６７、６８、６９を含むＬＣＶＲ及び配列番号１１２を含むＨＣＶＲ、
７．配列番号６９を含むＬＣＶＲ及び配列番号１１２、１１３、１１４、１１５を含むＨＣＶＲ、又は、
８．配列番号７０、７１、７２を含むＬＣＶＲ、及び配列番号１１６からなるＨＣＶＲ
を含む請求項８に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１３】
以下のＬＣＶＲ及びＨＣＶＲ：
１．配列番号７２、７３を含むＬＣＶＲ及び配列番号１１７を含むＨＣＶＲ、
２．配列番号７４を含むＬＣＶＲ及び配列番号１１８、１１９を含むＨＣＶＲ、
３．配列番号７３を含むＬＣＶＲ及び配列番号１１９を含むＨＣＶＲ、
４．配列番号７５を含むＬＣＶＲ及び配列番号９６、１１７を含むＨＣＶＲ、
５．配列番号７６を含むＬＣＶＲ及び配列番号１１７を含むＨＣＶＲ、
６．配列番号７７、７８、７９を含むＬＣＶＲ、及び配列番号９６を含むＨＣＶＲ、
７．配列番号８０を含むＬＣＶＲ及び配列番号１２０、１２１、１２２を含むＨＣＶＲ、
８．配列番号８１を含むＬＣＶＲ及び配列番号１１７、１２０、１２１、１２２、１２３を含むＨＣＶＲ、
９．配列番号８２、８４を含むＬＣＶＲ及び配列番号１１７を含むＨＣＶＲ、
１０．配列番号８３を含むＬＣＶＲ及び配列番号１１７、１２４を含むＨＣＶＲ、
１１．配列番号８４を含むＬＣＶＲ及び配列番号１１７を含むＨＣＶＲ、
１２．配列番号８５を含むＬＣＶＲ及び配列番号９１を含むＨＣＶＲ、
１３．配列番号８６を含むＬＣＶＲ及び配列番号１１７、１２５を含むＨＣＶＲ、又は
１４．配列番号８２を含むＬＣＶＲ及び配列番号８９を含むＨＣＶＲ
を含む請求項８に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１４】
請求項６に記載の結合性組成物を使用する方法であって、該結合性組成物を、抗原を含む生体試料に接触させ、これによりＴＧＦベータ１結合性組成物−抗原複合体を生成することを含む方法。
【請求項１５】
前記生体試料がヒト由来のものであり、前記結合性組成物がモノクローナル抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項６に記載の前記結合性組成物、および
ａ）前記結合性組成物の前記検出のための使用の教材、又は
ｂ）前記結合性組成物の分離に使用できる区画
を含む、検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＧＦベータ１タンパク質に関連する組成物に関連する。本発明は、特に、精製された結合性の組成物と、細胞増殖性疾患、自己免疫疾患並びに炎症性疾患、心血管疾患、線維性疾患の診断、治療並びに予防、核酸の発現及びかかるタンパク質のアミノ酸配列に対する外因性化合物の効果の評価において役立つ試薬を提供する。
【背景技術】
【０００２】
分泌ポリペプチド因子（ＴＧＦ−ベータ１）のトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−ベータ）スーパーファミリーの最初のメンバーは、約２０年前に発見された。以後、このファミリーは大きく拡大し、現在３０種類以上の脊椎動物のメンバー、及び虫やハエなどの無脊椎動物における、１０種類以上の構造的、機能的に関連するタンパク質が含まれる（たとえば、Ａｔｔｉｓａｎｏ＆Ｌｅｅ−Ｈｏｅｆｌｉｃｈ（２００１  Ｇｅｎ．Ｂｉｏｌ．２、ｒｅｖｉｅｗ  ３０１０１）、Ｍｏｕｓｔａｋａｓら（２００１  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１４：４３５９；  Ｗｒａｎａ，  ２０００  Ｃｅｌｌ  １００：１８９）参照）。ＴＧＦベータファミリーのメンバーは、細胞のさまざまな機能を制御し、その活性は、発達及びホメオスタシスに関連するさまざまな働きを調節するうえで極めて重要である。保存されたＴＧＦ−ベータシグナリング経路が、脊椎動物、虫及びハエの中に存在することが、実験により明らかになった。
【０００３】
このファミリーのメンバーであるＴＧＦベータ１は、種々の細胞過程（たとえば細胞増殖及び分化、移染、分化、アポトーシス、胚発生、細胞間マトリックス形成、骨成長、創傷治癒、造血、免疫及び炎症反応に関係している（たとえば、Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＳｐｏｒｎ  （１９９０  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、ｐｐ．４１９−７２、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）、Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｍａｓｓａｇｕｅ，  Ｊ．（１９９８  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６７：７５３）参照）。
【０００４】
さらに、症状発現前後のデータにより、ＴＧＦ−ベータ１が間質性線維症の基質タンパク質堆積の主な一因であり、多くの付随する線維性疾患（全慢性腎疾患に共通して見られる腎性線維症を含む）の惹起及び進行に関連していることが明らかになっている。腎性線維症の拡大は、慢性腎不全（末期腎不全）の進行に明確な相関関係があり、死、あるいは継続的透析や腎移植術が必要性となる場合がある。
【０００５】
ＴＧＦベータは、腎臓の大多数の細胞に影響する複雑かつ多様なイベントを通じて、慢性腎不全と関連付けられる（Ｂｏｔｔｉｎｇｅｒ、２００２、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１３：２６００）。これらのイベントは、ネフロンの機能損失をもたらす尿細管間質性線維症及び糸球体硬化症をもたらし、これらが慢性腎不全につながる。３つのＴＧＦ−ベータアイソフォームのうち、ＴＧＦ−ベータ１は慢性腎不全の進行を特異的に媒介する要素であると考えられる。これは、ＴＧＦ−ベータ１が最も特異的に発現するアイソフォームであるというだけでなく、ＴＧＦ−ベータ１の発現の増加が、ＴＧＦ−ベータ２とＴＧＦ−ベータ３両方の効果を媒介していると考えられるためである（Ｙｕ、２００３、Ｋｉｄ．Ｉｎｔ．６４、８４４）。従って、慢性腎疾患のような疾患の有害作用を予防するためには、ＴＧＦベータ１の発現を調整する必要がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、新規なＴＧＦベータ１結合性組成物の発見は、線維性疾患（たとえば慢性腎疾患）の診断、予防、治療に役立つ組成物を提供することで、当該技術における必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一部は、成熟ＴＧＦ−ベータ２及び／又は成熟ＴＧＦベータ３ではなく成熟ＴＧＦベータ１に特異的及び／又は選択的に結合し、成熟ＴＧＦベータ１を中和する特性を有する結合性組成物の発見に基づく。
【０００８】
これらの結合性組成物は、ａ）ＧＹＲＸ１Ｘ２Ｘ３Ｙ［配列番号４］であって、Ｘ１が、ＷかＡであり、Ｘ２は、ＦかＬである。及び、Ｘ３もＡ、Ｅ又はＹである配列と、ｂ）ＧＹＸ１ＦＸ２ＤＹＮＸ３Ｘ４［配列番号２］であって、Ｘ１が、ＴかＤであり、Ｘ２は、Ｔ、Ｅ、Ｆのいずれかであり、Ｘ３は、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖのいずれかであり、Ｘ４は、Ｈ、Ｖ、Ａのいずれかである配列と、ｃ）Ｘ１Ｘ２ＹＰＹＤＧＸ３ＴＧＸ４ＮＸ５ＫＸ６ＫＳ［配列番号３］であって、Ｘ１が、Ｙ、Ｑ、Ｓのいずれかであり、Ｘ２が、Ｉ又はＶであり、Ｘ３が、Ｄ又はＥであり、Ｘ４が、Ｙ、Ｔ、Ｈ、Ｌのいずれかであり、Ｘ５が、Ｑ、Ｋ、Ｐ、Ｓのいずれかであり、Ｘ６が、Ｆ又はＹである配列のうち少なくとも１つを含む第１の部分、及び／又は、ｂ）Ｘ１ＱＷＤＸ２Ｘ３Ｘ４ＰＡ［配列番号７］であって、Ｘ１が、Ｑ又はＳであり、Ｘ２が、Ｌ、Ｄ、Ｐのいずれかであり、Ｘ３が、Ｎ又はＲであり、Ｘ４が、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｒのいずれかである配列と、Ｘ１ＡＸ２Ｘ３Ｘ４ＶＸ５ＹＭＨ［配列番号５］であって、Ｘ１が、Ｒ、Ｙ、Ｅ、Ｑのいずれかであり、Ｘ２が、Ｓ又はＴであり、Ｘ３が、Ｓ、Ｖ、Ａのいずれかであり、Ｘ４が、Ｓ又はＬであり、Ｘ５が、Ｓ、Ｐ、Ｌ、Ｙのいずれかである配列と、ＡＴＳＮＸ１ＡＸ２［配列番号６］であって、Ｘ１が、Ｌ、Ｎ、Ｐのいずれかであり、Ｘ２が、Ｓ、Ｋ、Ｙ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｅ、Ｑ、Ｒ、Ｈのいずれかである配列のうち少なくとも１つを含む第２の部分を含む。前記結合性組成物は、ａ）少なくとも２つの上記配列を含む上記第１の部分と、ｂ）３つの上記配列を含む上記第１の部分と、ｃ）少なくとも２つの上記配列を含む上記第２の部分と、ｄ）３つの上記配列を含む上記第２の部分と、ｅ）少なくとも２つの上記配列を含む上記第１の部分と、３つの上記配列を含む前記第２の部分と、ｆ）少なくとも２つの上記配列を含む上記第２の部分並びに３つの上記配列を含む上記第１の部分、ｇ）３つの上記配列を含む上記第１の部分並びに３つの上記配列を含む上記第２の部分とを含むことができ、前記結合性組成物の結合部位が、ヒトのＴＧＦベータ−１のポリペプチドに対して特に免疫反応性であるか、ネズミのＴＧＦベータ−１のポリペプチドに対して特に免疫反応性であるか、精製又は組換え産生されたヒトのＴＧＦベータ−１タンパク質又はその断片に対して作られたものであるか、モノクローナル抗体、抗体のＦａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）２、又は可変ドメイン内にあるか、少なくとも１、２、又は３個の保存的置換を有するか、或いは、ヒト又はヒト化抗体のフレームワーク内にあり、前記上記結合性組成物が、抗体分子、モノクローナル抗体分子、二重抗体分子、三重抗体分子、四重抗体分子、ミニ抗体分子、モノクローナル抗血清、検出可能標識を持つか、凍結乾燥されているか、無菌であるか、或いは、バッファ組成物中にあり、前記結合性組成物が、改良された特性を有するモノクローナル抗体である、結合性組成物である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
Ｉ．全般
本発明は、本願明細書で特定される組成物、方法、技術に限定されるものではなく、この組成物、方法、技術は、当然ながら変更可能であることを理解されたい。本願明細書において用いられる用語は、特定の態様を説明する目的にのみ使用され、本発明の範囲を限定することを目的とするものではないことも理解されたい。本発明の範囲は、本願の請求の範囲によってのみ限定される。
【００１０】
請求の範囲を含む本願明細書において使用される単数形の単語は、特に明示がない限り、その複数形も包含するものである。つまり、たとえば「生体」という表現は、１又は複数の異なる生体を包含し、「細胞」という表現は１又は複数の同様の細胞を包含し、「方法」という表現は、当業者に周知である同様のステップ及び方法を包含するものである。
【００１１】
特に明記しない限り、本願明細書において用いられるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって理解されるものと同じ意味を有する。本願明細書において記載されている方法及び物質は、同様又は同等のものによって置換することが可能であるが、以下に、適切な方法及び物質を説明する。本願明細書において言及するすべての出版物、特許出願、特許、その他の引用は、本願出願の出願日前に開示された技術を参照する目的にのみ使用されるものである。本願明細書のいかなる記述において、従来の発明による開示に先立つものとして権利化できないことを承諾するとして解釈されるべきではない。本願明細書に記載のすべての出版物、特許出願、特許、その他の引用は、文脈によって明らかなように、教示目的のため、参照によりその全体が本願に援用されるものとする。これには、図、図面、画像、グラフ、ハイパーリンク、その他ブラウザ実施可能コードが含まれる。
【００１２】
ＩＩ．定義
「結合性組成物」とは、少なくとも１つの他の分子的実体又は結合パートナーに対する選択性及び／又は特異性の結合能を有する分子的実体である。通常、結合は、共有又は非共有の天然的、かつ生理的に妥当な相互作用において存在し、多タンパク質複合体のメンバー（限定されるものではないが、担体化合物、二量体化パートナー又は多量体化パートナーを含む）を含有することができる。結合性組成物は、天然に生成する（たとえば、分離、及び／又は精製）ことも、一部又は全体を合成的に産生することもできる。通常、結合性の組成物は、結合パートナー上の領域又は部位の特定の空間構成及び／又は極性組織に対して、特異的に及び／又は選択的に「適合する」、「結合する」、若しくは「相補性である」要素を少なくとも１つ有する。非限定的な例としては、表面範囲、形状（たとえばキャビティ、中裂、間隙又は突起）、分子配置、空間構成などである。つまり、たとえば結合性組成物が潜在的な結合パートナーに十分近づいた際に、結合性組成物及びパートナーは、互いに特異的に及び／又は選択的に結合する。結合パートナーと対をなす結合性組成物の非限定的な例としては、抗原抗体及びハプテン結合部位などがある。結合性の組成物が含有する抗体の非限定的な例としては、抗体、二重抗体、三重抗体、四重抗体、ミニ抗体、Ｆａｂ断片（たとえば、二量体又は三量体のＦａｂ）、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆ（ａｂ）２断片などがあげられる（本発明により包含される抗体結合組成物の非限定的な例については、Ｈｕｄｓｏｎ  ＆  Ｓｏｕｒｉａｕ  ２００３  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９：１２９−３４を参照）。モノクローナル抗体結合組成物は、実質的に均一な抗体（すなわち、集合を含む個々の抗体が実質的に同一である（たとえば、単一の細胞型のクローンに由来するなど））の集合に由来するという点で、単クローン性である。しかし、これは、その由来を特定の起源に限定するものではない。このような抗体は、通常は抗体（たとえばＣＨＯ、ＮＳＯ又はＣＯＳ細胞）を産生しない細胞において、容易に産生できる。さらに、このような抗体は、その他の種類の細胞（特に哺乳類や植物の細胞）を遺伝子操作し、抗体産生物を形成するポリペプチド軽鎖及び重鎖を発現させて構築させることにより、これらの細胞でも産生することができる。さらに、このような鎖は、化学合成可能であるが、これらの鎖は特定の抗原決定基群に対して特異性を持つことから、本願明細書で用いられる意味でのモノクローナル抗体を構成する。したがって、本願明細書において用いられるモノクローナル抗体という用語は、前記抗体の産生のために使用される単なるメカニズムではなく、むしろ抗体分子の特異性及び純度を指すために用いられる。
【００１３】
結合部位とは、他の分子的実体との間に特異的及び／又は選択的な結合を構成する分子的実体における、特定の領域、範囲、又は構成である。結合部位の非限定的な例としては、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、隣接のアミノ酸配列があげられる。実施形態において、本発明の結合部位には、Table １に示される式を有する配列が含まれる。別の非限定的な態様において、結合部位には、Table １の配列の組み合わせが含まれる。別の非限定的な例としては、三次元構成によって、或いは、Ｆａｂ断片の８重らせん状のβバレルの末端にある重鎖軽鎖可変領域の６つのＣＤＲ環を含むアミノ酸配列の空間構成により形成される結合部位があげられる（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ  １９８７  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−１７参照）。本発明で開示されるＣＤＲは、たとえばＣＤＲ移植において行われるように、フレームワーク又は分子構造に組み込み／埋め込まれうる。一態様において、本発明のＣＤＲを担持する構造は通常、抗体の重鎖又は軽鎖配列、又はその実質部分の構造である。上記ＣＤＲは、再配列された免疫グロブリン遺伝子によってコードされた天然由来のＶＨ抗体及びＶＬ抗体の可変ドメインＣＤＲに対応する位置に配置される。イムノグロブリンの可変ドメインの構造及び位置は、以下を参照して判定することができる（Ｋａｂａｔら、１９８７  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．４ｔｈ  Ｅｄ．ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、及び、現在インターネット（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｍｕｎｏ．ｂ−ｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ）上でその最新版が利用可能である）。ＣＤＲは、通常、Ｋａｂａｔにより定義されたとおりであるが、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−１７）及び／又はＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−４５）による定義も知られている。当業者は、通常の方法によって、ＣＤＲが埋め込まれる可変部アミノ酸配列からそのＣＤＲが含まれる残基を決定することができる。さらに、ＣｈｏｔｈｉａならびにＫａｂａｔにより定義されたループのＣＤＲを移植した残基では、ＶＨ  ＣＤＲ１を移植することができる。
【００１４】
一態様において、組換えＤＮＡ技術を用いて、本発明のＣＤＲ配列を、ＣＤＲ部位を欠く可変ドメインのレパートリに導入することができる。たとえば、Ｍａｒｋｓら（１９９２  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−８３）は、抗体の可変ドメインのレパートリの生成方法を述べている。ここでは、ＣＤＲ３を欠くＶＨ可変ドメインのレパートリを生成するために、可変ドメイン域の５´末端、又はそれに隣接して導かれるコンセンサスプライマが、ヒトのＶＨ遺伝子の第３のフレームワーク領域に対するコンセンサスプライマとあわせて使われる。Ｍａｒｋｓらはさらに、このレパートリを特定の抗体（たとえば、本願明細書において記載される抗体）のＣＤＲ３に結合する方法についても記述している。類似の技術を使用して、本発明のＣＤＲ３配列を、ＣＤＲ３を欠くＶＨ領域又はＶＬ領域のレパートリと混合し、混合された完全なＶＨ領域又はＶＬ領域を同種のＶＬ領域又はＶＨ領域と結合させることで、本発明の、特定の結合性組成物のメンバーを形成することができる。あるいは、類似の方法により、ＣＤＲ３配列を本発明の他のＣＤＲと結合することもできる。次いで、適切な特定の結合性メンバーを選択できるように、上記レパートリをＷ０９２／０１０４７のファージ提示システムのような適切な宿主系で表示することができる。
【００１５】
結合性組成物：ＴＧＦベータ１複合体
本願明細書で用いられる「結合性組成物：ＴＧＦベータ１複合体」は、ＴＧＦベータ１タンパク質に結合性組成物を特異的及び／又は選択的に結合することにより形成される結合性組成物とＴＧＦベータ１タンパク質の複合体を指すものである。好ましい一態様において、本願明細書を通じて言及するＴＧＦベータ１は、成熟霊長類ＴＧＦベータ１タンパク質である。より好ましい一態様では、本願明細書全体を通じて言及するＴＧＦベータ１は、成熟ヒトのＴＧＦベータ１タンパク質（ＮＣＢＩアクセス番号Ｐ０１１３７（ヒトのトランスフォーミング成長因子ベータ１前駆体（ＴＧＦベータ１）及びその成熟部分のアミノ酸配列についての記述がある）参照）である。各例において、本願全体を通じて言及するＴＧＦベータ１は、生物学的に能動的な状態の成熟ＴＧＦベータ１である［（ＴＧＦベータ１は、非活性の「潜在型」複合体として細胞から放出される。これは、２つのプロセグメントを有する非共有の複合体内にあるＴＧＦベータ１ホモ二量体を含み、このホモ二量体には、ＴＧＦ潜在型ベータ１結合タンパク質のうちの１つがしばしば連結される（たとえば、Ａｎｎｅｓら、２００３  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１６：２１７−２４、Ｍｉｙａｚｏｎｏら、１９９３  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ８：１１−２２、Ｍｕｎｇｅｒら、１９９７  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５１：１３７６−８２、Ｏｋｌｕ  ＆  Ｈｅｓｋｅｔｈ  ２０００  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５２：６０１−１０参照）。この潜在型ＴＧＦベータ１複合体は、偶発的活性化に対する重要な予防手段であり、また、潜在型のＴＧＦベータ１の対象を、この複合体が単離細胞間マトリックスへと固定化して標的にすることが可能である（Ｔａｉｐａｌｅら、１９９８  Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７５：８７−１３４）。上記細胞間マトリックスは、このように、ＴＧＦ−ベータ１が新規な細胞合成を必要とすることなく、直ちに活性化できるようにするためのリゼルバとして機能する。潜在型複合体としてのＴＧＦベータ１の分泌には、調節された活性化プロセスの存在が必要である。この活性化プロセスは、おそらく、優先的にＴＧＦベータ１プロセグメントを分解し、安定性が高く、成熟活性型ＴＧＦ−ベータ１二量体の二量体形を放出するプロテアーゼの活性により媒介される）］。
【００１６】
結合性組成物の特異的結合とは、結合性組成物が、概して未変性の活性コンフォーメーションにおいてＴＧＦベータ１の領域を認識する結合部位を有することを意味する。たとえば、ＴＧＦベータ１に対して作られ、ＴＧＦベータ１のエピトープを認識する抗体は、特異的結合により、結合性組成物ＴＧＦベータ１複合体を生成することができる。一般に、結合性組成物ＴＧＦベータ１タンパク質複合体の生成は、たとえば他のタンパク質や生物製剤と混合することにより、生体試料内のＴＧＦベータ１の計測を可能にする。本発明の結合性組成物のエピトープは、本願明細書において開示する技術又は従来技術（たとえば、Ｇ．Ｔｒｉｂｂｉｃｋ、２００２  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６７：２７−３５、Ｗｏｏｄｓ及びＨａｍｕｒｏ、２００１  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３７：８９−９８参照）、及び／又は本願明細書において開示する競合性結合を用いることで測定できる。好ましい一態様において、本発明の結合性組成物のエピトープは、配列番号１のアミノ酸残基ＹＹＶＧＲＫ［配列番号１３６］を含む。別の態様では、本発明の結合性組成物のエピトープは、配列番号１のアミノ酸残基ＹＹＶＧＲＫ［配列番号１３６］及び配列番号１のＹＳＫＶを含む。さらに別の態様において、本発明の結合性組成物のエピトープは、配列番号１のＹＹＶＧＲＫ［配列番号１３６］から、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの（隣接又は非隣接の）残基を含み、及び／又は、配列番号１のＹＳＫＶから、少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの（隣接又は非隣接の）残基を含む（この態様は、上記のすべての組み合わせを包含する。たとえば、これらに限らないが、ＹＹＶＧＲＫ［配列番号１３６］と配列番号１のＫＶ、又はＹＶＧＲＫ［配列番号１３７］と配列番号１のＹ及びＫＶ（コンピュータアルゴリズムと順列組み合わせの周知の数式を用いれば、すべての組み合わせを簡単に求めることができる））。更に好ましい一態様において、本発明のエピトープは、たとえば、本発明の結合性組成物が、同一抗原を対象とする結合性組成物（たとえばＴＧＦベータ１）に競合することで後続の結合性複合体の生成を阻害する能力によって、機能的に定義される（このような競合性結合を本願明細書において開示する）。
【００１７】
本願明細書において使用される「特異的結合」の用語は、特異的な一対の結合における１つの構成要素が、その特異的な結合パートナー以外の分子と有意に結合しない状況を指す。上記用語はまた、たとえば抗原−結合ドメインは特定の多くの抗原によって担持されるエピトープに特異的である場合にも適用でき、その場合、その抗原−結合ドメインを有している特異的な結合メンバーはエピトープを担持している様々な抗原に結合することが可能である。つまり、成熟ＴＧＦベータ１に特異的な結合性組成物は、「その特異的な結合パートナー以外の分子には、有意な結合を示さない」。
【００１８】
結合性の組成物に関して「特異的に結合する」又は「特異的に免疫反応性である」という表現は、タンパク質及び他の生物学的要素の不均一な集合の存在下で結合性組成物の存在を決定する結合反応を指す。したがって、特定のイムノアッセイ状態の下で、特定の結合性組成物は、特異的なタンパク質に結合し、試料内に存在する他のタンパク質には有意に結合しない。このような状態下での結合性組成物に対する特異性結合には、特定のタンパク質に対する特異性によって選択された結合性組成物が必要となる場合がある。たとえば、結合性組成物（たとえば抗体）は、［配列番号１］で表される成熟アミノ酸配列単量体を有するＴＧＦベータ１のヒト活性化二量体の形態に対して作られ、次いで、そのＴＧＦベータ１タンパク質に対して特異的に免疫反応性であり、他のタンパク質に対しては免疫反応性でない抗体を得るために選択することができる。このような結合性組成物は、ヒトのＴＧＦベータ１タンパク質に極めて相同的であるタンパク質（たとえば、別のヒトのＴＧＦベータアイソフォーム（ヒトのＴＧＦベータ２又はヒトのＴＧＦベータ３など））を区別することができる。好ましい一態様において、成熟ＴＧＦベータ１に対する本発明の結合性組成物の特異性は、成熟ＴＧＦベータ２及び／又は成熟ＴＧＦベータ３に対する特異性の１．５倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、７．０倍、７．５倍、８．０倍、８．５倍、９．０倍、９．５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、１００倍、１２５倍、１５０倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、１５００倍、２０００倍、２５００倍、３０００倍、３５００倍、４０００倍、４５００倍、５０００倍、５５００倍、６０００倍、６５００倍、７０００倍、７５００倍、８０００倍、８５００倍、９０００倍、９５００倍、又は１０，０００倍に等しいかそれ以上である。別の好ましい一態様として、本発明の組成物の特異性は、ヒトのＴＧＦベータ２に対して、上記リストのいずれかの特定の特異値を持ち、ヒトのＴＧＦベータ３に対しては異なる特異値を持つ。たとえば、成熟ＴＧＦベータ１に対する特異性は、成熟ＴＧＦベータ２に対する特異値の１００倍に等しいかそれ以上であり、成熟ＴＧＦベータ３に対する特異値の９００倍に等しいかそれ以上になる。また、すべての値の組み合わせが包含される。
【００１９】
本発明の結合性組成物は、好ましくはＴＧＦベータ１を中和し、ＴＧＦベータ１に対する解離定数（Ｋｄ）は、好ましくは、約１００ｐＭ、９５ｐＭ、９０ｐＭ、８５ｐＭ、８０ｐＭ、７５ｐＭ、７０ｐＭ、６５ｐＭ、６０ｐＭ、５５ｐＭ、５０ｐＭ、４５ｐＭ、４０ｐＭ、３５ｐＭ、３０ｐＭ、２５ｐＭ、２０ｐＭ、１５ｐＭ、１４ｐＭ、１３ｐＭ、１２ｐＭ、１１ｐＭ、１０ｐＭ、又はこれ以下である。より好ましくは、約１０ｐＭ、９．９ｐＭ、９．８ｐＭ、９．７ｐＭ、９．６ｐＭ、９．５ｐＭ、９．４ｐＭ、９．３ｐＭ、９．２ｐＭ、９．１ｐＭ、９．０ｐＭ、８．９ｐＭ、８．８ｐＭ、８．７ｐＭ、８．６ｐＭ、８．５ｐＭ、８．４ｐＭ、８．３ｐＭ、８．２ｐＭ、８．１ｐＭ、８．０ｐＭ、７．９ｐＭ、７．８ｐＭ、７．７ｐＭ、７．６ｐＭ、７．５ｐＭ、７．４ｐＭ、７．３ｐＭ、７．２ｐＭ、７．１ｐＭ、７．０ｐＭ、６．９ｐＭ、６．８ｐＭ、６．７ｐＭ、６．６ｐＭ、６．５ｐＭ、６．４ｐＭ、６．３ｐＭ、６．２ｐＭ、６．１ｐＭ、６．０ｐＭ、５．９ｐＭ、５．８ｐＭ、５．７ｐＭ、５．６ｐＭ、５．５ｐＭ、５．４ｐＭ、５．３ｐＭ、５．２ｐＭ、５．１ｐＭ、５．０ｐＭ又はそれ未満である。さらに好ましくは、約５．０ｐＭ、４．９ｐＭ、４．８ｐＭ、４．７ｐＭ、４．６ｐＭ、４．５ｐＭ、４．４ｐＭ、４．３ｐＭ、４．２ｐＭ、４．１ｐＭ、４．０ｐＭ、３．９ｐＭ、３．８ｐＭ、３．７ｐＭ、３．６ｐＭ、３．５ｐＭ、３．４ｐＭ、３．３ｐＭ、３．２ｐＭ、３．１ｐＭ、３．０ｐＭ、２．９ｐＭ、２．８ｐＭ、２．７ｐＭ、２．６ｐＭ、２．５ｐＭ、２．４ｐＭ、２．３ｐＭ、２．２ｐＭ、２．１ｐＭ、２．０ｐＭ、１．９ｐＭ、１．８ｐＭ、１．７ｐＭ、１．６ｐＭ、１．５ｐＭ、１．４ｐＭ、１．３ｐＭ、１．２ｐＭ、１．１ｐＭ、１．０ｐＭ又はそれ未満である。さらに好ましくは、９．９ｐＭ、９．８ｐＭ、９．７ｐＭ、９．６ｐＭ、９．５ｐＭ、９．４ｐＭ、９．３ｐＭ、９．２ｐＭ、９．１ｐＭ、９．０ｐＭ、８．９ｐＭ、８．８ｐＭ、８．７ｐＭ、８．６ｐＭ、８．５ｐＭ、８．４ｐＭ、８．３ｐＭ、８．２ｐＭ、８．１ｐＭ、８．０ｐＭ、７．９ｐＭ、７．８ｐＭ、７．７ｐＭ、７．６ｐＭ、７．５ｐＭ、７．４ｐＭ、７．３ｐＭ、７．２ｐＭ、７．１ｐＭ、７．０ｐＭ、６．９ｐＭ、６．８ｐＭ、６．７ｐＭ、６．６ｐＭ、６．５ｐＭ、６．４ｐＭ、６．３ｐＭ、６．２ｐＭ、６．１ｐＭ、６．０ｐＭ、５．９ｐＭ、５．８ｐＭ、５．７ｐＭ、５．６ｐＭ、５．５ｐＭ、５．４ｐＭ、５．３ｐＭ、５．２ｐＭ、５．１ｐＭ、５．０ｐＭ、５．０ｎＭ、４．９ｐＭ、４．８ｐＭ、４．７ｐＭ、４．６ｐＭ、４．５ｐＭ、４．４ｐＭ、４．３ｐＭ、４．２ｐＭ、４．１ｐＭ、４．０ｐＭ、３．９ｐＭ、３．８ｐＭ、３．７ｐＭ、３．６ｐＭ、３．５ｐＭ、３．４ｐＭ、３．３ｐＭ、３．２ｐＭ、３．１ｐＭ、３．０ｐＭ、２．９ｐＭ、２．８ｐＭ、２．７ｐＭ、２．６ｐＭ、２．５ｐＭ、２．４ｐＭ、２．３ｐＭ、２．２ｐＭ、２．１ｐＭ、２．０ｐＭ、１．９ｐＭ、１．８ｐＭ、１．７ｐＭ、１．６ｐＭ、１．５ｐＭ、１．４ｐＭ、１．３ｐＭ、１．２ｐＭ、１．１ｐＭ、１．０ｐＭ、０．９ｐＭ、０．８ｐＭ、０．７ｐＭ、０．６ｐＭ、０．５ｐＭ、０．４ｐＭ、０．３ｐＭ、０．２ｐＭ、０．１ｐＭ、又は０．０１ｐＭである。結合性組成物の解離定数（Ｋｄ）は、任意の方法によって求めることができる。たとえば、Ｋａｒｌｓｓｏｎら、１９９１  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４５、２９９−３４０の方法を適応させたＢＩＡＣｏｒｅ（登録商標）などである。その他の記述については、Ｊｏｎｓｓｏｎら、１９９３  Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６、Ｊｏｎｓｓｏｎら、１９９１  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：６２０−７、Ｊｏｈｎｓｓｏｎら、１９９５  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−３１、Ｊｏｈｎｓｓｏｎら、１９９１  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８−７７を参照。
【００２０】
本願明細書で用いられる用語「ｋｏｎ」は、Ｍ−１ｓｅｃ−１を単位として求められる、正反応又は複合体生成反応の結合又はオン反応速度定数、又は特定の反応速度を示す。本願明細書で用いられる用語「ｋｏｆｆ」は、１／秒を単位として求められる、抗体抗原複合体からの抗体の解離に関する解離又はオフ反応速度定数、又は特定の反応速度を示す。本願明細書で用いられる用語「Ｋｄ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を示す。Ｋｄは、次の式により求められる。
ｋｏｆｆ／ｋｏｎ＝Ｋｄ
結合性組成物の親和性は、高いｋｏｎ値よりも低いｋｏｆｆ値と相関する場合があるが、態様では、理論の制約を受けることなく、改善したｋｏｆｆ値及びｋｏｎ値の両方を包含する。より好ましい一態様では、本発明の結合性組成物は高力価抗体又はその断片であり、通常、低いｋｏｆｆ値を呈する。さらに好ましい一態様では、本発明のＦａｂの態様のｋｏｎ値は、相当するＦａｂ（たとえばＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１８９２１、ＵＳ６０／４８５，８２０に記載されているｍＡｂ２４７１など）に比べ、少なくとも、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、又は２．４倍の改善したｋｏｎ値を呈する。他の態様では、本発明の組成は、相当する結合性組成物（たとえば、Ｆａｂ又はｍＡｂ）に比べて、少なくとも、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１３０、１５０、１９５、２００、２２５、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、又は３００倍に改善したｋｏｆｆ値を呈する。
【００２１】
好ましくは、抗体結合組成物はＴＧＦベータ２及び／又はＴＧＦベータ３と比較して、特異的に及び／又は選択的にＴＧＦベータ１に結合する。より好ましくは、抗体結合組成物はヒトのＴＧＦベータ２及び／又はヒトのＴＧＦベータ３と比較して、特異的に及び／又は選択的にヒトのＴＧＦベータ１に結合する。好ましくは、このような抗体は、ＴＧＦベータ２及び／又はＴＧＦベータ３に対して２０％未満の交差反応性を有し（解離定数の比率により測定）、より好ましくは、約１５％未満の交差反応性を有し、さらに好ましくは、約１０％未満の交差反応性を有する。さらにより好ましくは、９、８、７、６、５、４、３、２又は１％未満の交差反応性を有する。
【００２２】
さらに、抗体結合組成物は、好ましくはＴＧＦベータ１の潜在型形態ではなく活性化形態を認識し、より好ましくはヒトＴＧＦベータ１の潜在型形態ではなく活性化形態を認識する。
【００２３】
中和
結合性組成物に関する「中和する」又は「拮抗する」という用語は、結合性組成物の、他の分子的実体に対する特異的及び／又は選択的結合が、上記結合性組成物に結合した上記分子的実体の生物学的エフェクターの機能の抑止又は阻害をもたらすことを指す。ＴＧＦベータ１に関する「中和する」又は「拮抗する」という用語は、結合性組成物のＴＧＦベータ１に対する結合又は相互作用が、ＴＧＦベータ１によって誘発された生物学的活性度の阻害をもたらす状況を指す。ＴＧＦベータ１の生物学的活性度の阻害は、１又は複数のｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴＧＦベータ１の生物学的活性度の指標を測定することによって評価できる。非限定的な例として、受容体−結合の阻害、線維形成の阻害、化学向性の阻害、又はＴＧＦベータ１の結合アッセイにおけるシグナル変換の阻害などがある（中和試験法の非限定的な例は、欧州特許第０  ９４５  ４６４号明細書を参照）。非限定的な一態様において、ＴＧＦベータ１活性を中和又は拮抗する結合性組成物の能力は、本願明細書の実施例において説明されるとおり、上記アッセイによって評価される。
【００２４】
抗体の態様などのような結合性組成物の中和活性は、従来技術により認められた方法によって検査できる。非限定的な一態様において、Ｒａｎｄａｌｌら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １６４，  ６１−６７のアッセイを適用／変更し、検査を実施している。このアッセイはＴＧＦベータ１及びＴＧＦベータ２の、インターロイキン５（ＩＬ−５）に誘発された赤白血病細胞系ＴＦ１の増殖を阻害する能力、また、ＴＧＦベータに特異的な結合性組成物によりＴＧＦベータ阻害を逆転させる能力に基づくものである。上記アッセイでは、５００ｆｇ／ｍｌ未満のＴＧＦベータ１及び５−１０ｐｇ／ｍｌのＴＧＦベータ２に、急速に繁殖できる感受性があったことが報告された。上記アッセイでは、他の抑制分子（たとえばインターフェロンベータ、インターフェロンガンマ及びＴＮＦアルファ）に対しては、感受性が１００−１０００倍少ないことも報告された。上記アッセイでは、これらの分子の、容易に入手可能なすべての組み換え可能な分子種や、ヒト及びウシの血小板から産生した天然タンパク質を認識する目的、又は、血清サンプル内のＴＧＦベータを検出する目的で、ＴＧＦ−ベータ１又はＴＧＦ−ベータ２に対して特異的な中和抗体を含有させることによってＴＧＦ−ベータ１又はＴＧＦ−ベータ２に対して特異的に反応させることができると報告された。
【００２５】
本願明細書において報告される、又は公知の技術であるその他のアッセイも包含される。たとえば、ラットの抗Ｔｈｙ１．１モデルは、メサンギウム細胞の表面にあるＴｈｙ抗原を標的にした抗体の注入によってメサンギウム融解を誘発し、それに続いて起こるメサンギウム細胞の代償的増殖のフェーズが、尿タンパク質（蛋白尿）の濃度上昇をもたらすといったメサンギウム増殖性糸球体腎炎の安定したモデルである（たとえば、Ｍｏｒｉｔａら、１９９８  Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ  ３１：５５９−７３、Ｂａｇｃｈｕｓら、１９８６  Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．５５：６８０−７、Ｙａｍａｍｏｔｏ及びＷｉｌｓｏｎ  、１９８７  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．３２：５１４−２５参照）。抗Ｔｈｙ１．１腎炎モデルは、多くの点で、ヒトのＩｇＡ腎炎又はヘーノホ−シェーンライン紫斑病に類似しており（Ｏ’Ｄｏｎｏｇｈｕｅら、１９９１  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８８：１５２２−３０）、試験組成物の投与量に関連する尿タンパクの減少量を測定することによって、腎臓病の潜在的治療法を検査するために用いられてきた（たとえば、Ｂｕｒｇら、１９９７  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ７６：５０５−１６、Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９５  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ４７：６２−９参照）。好ましい一態様において、本発明の結合性組成物は、このようなモデルにおいて、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、又はそれ以上の尿タンパク質を減少させる。また、同様のモデルにおいて、尿タンパク質の減少率が上記の２つの値の間の範囲にあり、その範囲が、上限及び下限の数値のいずれか又は両方を含むあるいは含まない（たとえば、１２％を超え４２％以下である）態様が、さらに包含される。
【００２６】
加えて、ＴＧＦベータが腎臓における生物学的作用を慢性的に阻害することで、糖尿病による腎不全を効果的に予防することを立証するＳｈａｒｍａのｄｂ／ｄｂ糖尿病マウスモデルアッセイ（２０００  ＰＮＡＳ  ９７：８０１５−２０参照）を採用することもできる。又は、糖尿病性腎障害の回復又は防止に関する結合性組成物の能力を検査するＳｈａｒｍａのＳＴＺ糖尿病マウスモデルを採用することもできる。（１９９６  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４５、５２２−３０）。さらに、Ｕｅｂｅｒｈａｍら、２００３  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３７（５）：１０６７−７８では、肝線維症の二重トランスジェニックマウスモデルのテトラサイクリンにより調節された遺伝子発現システムについての記載がある。ここでは、ＴＧＦ−ベータ１の発現を、飲料水に塩酸ドキシサイクリンを追加又は除去することによってＴＧＦ−ベータの発現を調節することにより、ＴＧＦ−ベータの発現を自由にオン／オフ切り替えできるようにする。このような動物の肝臓においてＴＧＦ−ベータ１の発現が増加すると、線維性疾患の状態となる。これは、肝重が５９％減少した後であっても、ＴＧＦベータ１の発現をオフにすることによって改善可能である。このモデルを使用することで、ＴＧＦベータ１の発現を切替える塩酸ドキシサイクリンの効果と、本発明の結合性組成物を比較することによって、本発明の結合性組成物がＴＧＦベータ１の生物学的機能を阻害する効果を評価することができる。出願人は、ＨＴ−２細胞増殖アッセイ（本願明細書において開示される）を使用した特定の一態様において、ＩＣ５０の値が、同一又は同様のアッセイ条件下で同様の結合性組成物（たとえば、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１８９２１、ＵＳ  ６０／４８５，８２０に記載されているｍＡｂ２４７１）を使用して得られたＩＣ５０値と比較して、少なくとも、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１０５倍、１２５倍、１５０倍、１７５倍、２００倍、２２５倍、２５０倍、２７５倍、３００倍、３２５倍、３５０倍、３７５倍、４００倍、４２５倍、４５０倍又はそれ以上に改善している結合性組成物の態様を、好ましくは包含する。また、ＩＣ５０の値の改善率（上記記載）が上記の２つの値の間の範囲にあり、その範囲が、上限及び下限の数値のいずれか又は両方を含むあるいは含まない（たとえば、ＩＣ５０の値が、ｍＡｂ２４７１と比較して８０〜１００倍改善する）態様が、さらに包含される。
【００２７】
抗体
本発明の抗体結合組成物には、たとえば、これらに限定されるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ発現ライブラリによって産生される断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（たとえば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）及び上記のいずれかのエピトープ結合性断片が含まれる。
【００２８】
本願明細書で用いられる用語「抗体」は、イムノグロブリン組成物と、イムノグロブリン組成物（たとえば特異的に及び／又は選択的に抗原に結合する結合部位を含有する結合性組成物分子）の免疫学的に活性な部分とを指す。本発明のイムノグロブリン組成物は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（たとえばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスに属するものでもよい。好ましくは、抗体は、本発明のヒト抗原結合性の抗体断片、たとえば、これらに限定されるものではないが、Ｆａｂ抗体、Ｆａｂ’抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体、Ｆｃ抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）単鎖抗体、ジスルフィド結合されたＦｖｓ（ｓｄＦｖ）及びＶＬ領域又はＶＨ領域からなる断片である。単鎖抗体を含む抗原結合性の抗体断片は、可変領域を、単独で、或いは、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３領域又はこれらの組み合わせの全体又は一部と共に含むことができる。また、本発明には、たとえば、これらに限定されるものではないが、ヒンジ領域を有する可変領域の任意の組み合わせ（たとえば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３領域又はそれらの組み合わせ）を含むことができる抗原結合性断片が包含される。本発明の抗体は、鳥類及び哺乳類を含む、任意の動物起源のものであってもよい。好ましくは、抗体は、ヒト、霊長類ネズミ科の動物（たとえばマウス、ラット）、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ又はニワトリのものである。
【００２９】
本願明細書で使用される「ヒト抗体」という用語には、たとえば、これらに限定されるものではないが、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体（たとえば、これらに限定されるものではないが、ヒト免疫グロブリンライブラリ（たとえばヒトの生殖細胞系ライブラリ）から分離された抗体、又は、本願明細書で開示されるとおり、又は米国特許第５９３９５９８号明細書において教示されるとおり、１つ又は複数のヒト免疫グロブリンを導入した、内因性のイムノグロブリンを発現しない動物から分離された抗体が含まれる）が包含される。
【００３０】
結合性組成物は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、又はさらに多特異性であってよい。多特異的な抗体は、標的タンパク質、ポリペプチド（又はその断片）の異なるエピトープに対し特異的であってよい。或いは、ＴＧＦベータ１と非相同のエピトープ（たとえば非相同のＴＧＦベータアイソフォーム又は担体物質）の両方に対して特異的であってよい（たとえば、国際公開第２０９３／１７７１５号パンフレット、国際公開第９２／０８８０２号パンフレット、国際公開第９１／００３６０号パンフレット、国際公開第９２／０５７９３号パンフレット、Ｔｕｔｔら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９、米国特許第４４７４８９３号明細書、４７１４６８１号明細書、４９２５６４８号明細書、５５７３９２０号明細書、５６０１８１９号明細書、又はＫｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３参照）。
【００３１】
結合性組成物は、その結合性組成物が特異的に認識及び／又は特異的に結合するＴＧＦベータ１タンパク質（又はその断片）のエピトープ又は部分によって表現若しくは特定することができる。エピトープ又はポリペプチド部分は、本願明細書において記載されるように特定することができる。たとえば、Ｎ末端及びＣ末端の位置によって、隣接するアミノ酸残基の大きさによって、或いは、本願明細書に添付の表及び／又は図若しくは本願明細書において記載されるように特定することができる。加えて、或るエピトープ、ポリペプチド、タンパク質、又はポリペプチド又はタンパク質の断片、に特異的に結合する抗体を本発明から具体的に除外してもよい。たとえば、出願人は、或るエピトープ、ポリペプチド、タンパク質、又はポリペプチド又はタンパク質の断片に特異的に結合する任意の抗体を除外する権利を保有する。したがって、本発明は、或るポリペプチド又はタンパク質（又はその断片）に特異的に結合する第１の（又は他の）抗体を包含できると同時に、たとえば別のエピトープに結合することにより、同一ポリペプチド又はタンパク質（又はその断片）に選択的に結合する第２の（又は他の）抗体を排除できる。好ましい一態様において、出願人は、ＴＧＦベータ２上及び／又はＴＧＦベータ３上のＴＧＦベータ１アイソフォームに特異的に及び／又は選択的に結合する少なくとも１つの結合部位を含むＴＧＦベータ１を中和する結合性組成物を排除する。この結合性組成物には、少なくとも以下のものが含まれる。ＱＱＷＮＧＮＰＰＡ［配列番号１２６］の４つの隣接するアミノ酸、ＱＱＷＤＳＮＰＰＡ［配列番号１２７］の少なくとも６つの隣接するアミノ酸、ＹＩＹＰＹＮＧＤＴＧＹＮＱＫＦＫＳ［配列番号１２８］の少なくとも５つの隣接するアミノ酸（少なくとも５つの隣接するアミノ酸のうちの１つはＤである）、又は、ＧＹＴＦＴＤＹＴＭＨ［配列番号１２９］の少なくとも５つの隣接するアミノ酸。
【００３２】
本発明の抗体は、その交差反応性によって記述若しくは特定することができる。標的タンパク質又はポリペプチド（又はその断片）の他の任意の誘導体、オルソログ、パラログ又はホモローグにも結合しない抗体が、包含される。
【００３３】
さらに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション状態（本願明細書において記載される）の下で、安定してハイブリダイズするポリヌクレオチドによってエンコードされたポリペプチドをヒトのＴＧＦベータ１ポリヌクレオチド配列に選択的に結合する抗体が、本発明に包含される。
【００３４】
結合性組成物は、タンパク質又はポリペプチド（又はその断片）又はエピトープに対する結合能によって特徴付け又は特定することもできる。他の態様では、抗体又は抗体結合断片などの結合性組成物の好適な結合能には、以下の数値よりも小さい（或いは、以下の２数値間の範囲にあり、その範囲が、上限及び下限の数値のいずれか又は両方を含むあるいは含まない）解離定数（Ｋｄ）を呈する結合能（本願明細書において記載されるアッセイにおける）が包含される。５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、４．９×１０−１２Ｍ、４．８×１０−１２Ｍ、４．７×１０−１２Ｍ、４．６×１０−１２Ｍ、４．５×１０−１２Ｍ、４．４×１０−１２Ｍ、４．３×１０−１２Ｍ、４．２×１０−１２Ｍ、４．１×１０−１２Ｍ、４．０×１０−１２Ｍ、３．９×１０−１２Ｍ、３．８×１０−１２Ｍ、３．７×１０−１２Ｍ、３．６×１０−１２Ｍ、３．５×１０−１２Ｍ、３．４×１０−１２Ｍ、３．３×１０−１２Ｍ、３．２Ｘ  １０−１２Ｍ、３．１×１０−１２Ｍ、３．０×１０−１２Ｍ、２．９×１０−１２Ｍ、２．８×１０−１２Ｍ、２．７×１０−１２Ｍ、２．６×１０−１２Ｍ、２．５×１０−１２Ｍ、２．４×１０−１２Ｍ、２．３×１０−１２Ｍ、２．２×１０−１２Ｍ、２．１×１０−１２Ｍ、２．０×１０−１２Ｍ、１．９×１０−１２Ｍ、１．８×１０−１２Ｍ、１．７×１０−１２Ｍ、１．６×１０−１２Ｍ、１．５×１０−１２Ｍ、１．４×１０−１２Ｍ、１．３×１０−１２Ｍ、１．２×１０−１２Ｍ、１．１×１０−１２Ｍ、１．０×１０−１２Ｍ、０．９×１０−１２Ｍ、０．８×１０−１２Ｍ、０．７×１０−１２Ｍ、０．６×１０−１２Ｍ、０．５×１０−１２Ｍ、０．４×１０−１２Ｍ、０．３×１０−１２Ｍ、０．２×１０−１２Ｍ、０．１×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ又は１０−１５Ｍ。
【００３５】
本発明にはまた、競合的結合を測定する公知の技術（たとえば、本願明細書において記載又は参照されるイムノアッセイ）によって測定されるＴＧＦベータ１のエピトープに対する結合性組成物の結合を、競合的に阻害する抗体が含まれる。他の好ましい態様では、上記抗体はエピトープへの結合を少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％又は９１％、少なくとも９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、又は少なくとも５０％（又は上記の２数値間の範囲にあり、その範囲が、上限及び下限の数値のいずれか又は両方を含むあるいは含まない）、競争的に阻害する。
【００３６】
本発明の抗体は、ＴＧＦベータ１（又はその断片）のアンタゴニストとして作用しうる。たとえば、抗体又は本発明の結合性組成物は、たとえば同種の受容体／リガンドを有するＴＧＦベータ１の相互作用を、部分的に又は完全に中断させることができる。好ましくは、本発明の抗体は、ＴＧＦベータ１の抗原エピトープ又はその一部分に結合する。
【００３７】
同様に、本発明には、リガンドに結合して、そのリガンドが受容体と結合するのを（たとえば立体障害により）妨げる抗体が包含される。同様に、受容体結合を阻害することなく受容体の活性化を阻害するリガンド結合性抗体も包含される。
【００３８】
本発明の抗体は、たとえば、これらに限定されるものではないが、たとえばｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏでの診断法及び治療法に利用するＴＧＦベータ１（又はその断片）を、精製、検出、又は標的にするために用いることができる。たとえば、抗体は、生体試料中の本発明のＴＧＦベータ１（又はその断片）の質的及び／又は量的な濃度を測定するイムノアッセイに使用できる（たとえば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、“Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９）参照）。
【００３９】
結合性組成物は、単独、或いは、他の組成物と組み合わせて用いることができる。さらに、抗体のような結合性組成物は、組換えにより、Ｎ末端又はＣ末端において異種ポリペプチドに融合させることができる。また、ポリペプチド又はその他の組成物に、化学的に接合（共有接合及び非共有接合）することができる。たとえば、本発明の抗体は、検出アッセイの標識として有効な分子及びエフェクター分子（たとえば異種ポリペプチド、薬物、放射性核種又は毒素）に対し、組換えによって融合又は接合することができる（たとえば、国際公開第９２／０８４９５号パンフレット、国際公開第９１／１４４３８号パンフレット、国際公開第８９／１２６２４号パンフレット、米国特許第５３１４９９５号明細書、及び欧州特許第３９６３８７号明細書参照）。
【００４０】
結合性組成物には、共有結合が抗体が抗イディオタイプ応答の生成を妨げることが無いような方法で、たとえば、任意の種類の分子をたとえば抗体に共有結合することにより改質された誘導体が含まれる。たとえば、抗体誘導体には、これらに限定されるものではないが、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸エステル化、アミド化、周知の保護／ブロッキンググループによる誘導体化、タンパク分解性切断、細胞のリガンド又は他のタンパク質に対する結合、などによって改質された抗体が包含される。様々な化学修飾のうちのいずれか、たとえば、これらに限定されるものではないが、特定の化学開裂、アセチル化、製剤、ツニカマイシンの代謝合成などを、周知の技術によって実施することができる。加えて、誘導体には、１つ又は複数の非古典的アミノ酸が含有されうる。結合性組成物は、任意の適切な公知技術によって生成されてもよい。たとえば、モノクローナル抗体は、たとえば以下のような公知技術によって生成できる。Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８）、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、“Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９）、Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ及びＤｕｅｂｅｌ、１９９９、“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、Ｈ．Ｚｏｌａ、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”（Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｒｅｓｓ）、及びＪａｍｅｓ  Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）
【００４１】
本願明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」は限定されるものではないが、特定の技術（たとえば、ハイブリドーマ技術）によって産生される抗体である。ハイブリドーマ技術を使用した特定の抗体の作製及びスクリーニングは、慣習的技術及び従来技術において周知である。「モノクローナル抗体」とは、たとえば単一のクローン（たとえば、あらゆる真核生物、原核生物又はファージクローン）に由来する抗体を指し、それが産生される方法のことではない。
【００４２】
特異性のエピトープを認識する抗体断片は、周知の技術によって生成することができる。たとえば、本発明のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、パパイン（Ｆａｂ断片を産生する場合）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を産生する場合）などの酵素を用いて、免疫グロブリン分子のタンパク分解性切断によって産生することができる。Ｆ（ａｂ’）２断片には、可変領域、軽鎖定常領域及び軽鎖のＣＨ１領域が含まれる。たとえば、結合性組成物は、ファージ粒子をエンコードするポリヌクレオチド配列を担持しているファージ粒子の表面に機能性抗体ドメインを表示する当該技術において公知のさまざまなファージディスプレイ法を使用して生成することもできる。
【００４３】
特定の一態様では、ファージディスプレイ法を、レパートリ又はコンビナトリアル抗体ライブラリ（たとえば、ヒト又はネズミ）が発現する抗原結合ドメインを表示するために用いる。対象となる抗原に結合する抗原結合ドメインを表示するファージは、たとえば、標識抗原又は、固体表面又はビーズに結合又は捕獲された抗原を使用することにより、抗原によって選択又は同定することができる。ファージ選択の後、ファージから抗体コード領域を分離し、これを使用してヒト抗体を含む完全抗体、又は、その他任意の抗原結合性断片を生成し、及び、この抗体コード領域を、たとえば哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌及び細菌を含む、任意の望ましい宿主内に発現する。
【００４４】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片を組換えにより産生する技術は、周知の方法（たとえば、国際公開第９２／１２２３２４号パンフレット、Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９９２  １２（６）：８６４−９、Ｓａｗａｉら、１９９５  ＡＪＲＩ  ３４：２６−３４、及びＢｅｔｔｅｒら、１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−３）を利用して採用することもできる。単鎖のＦｖｓ及び抗体の産生例は、たとえば、米国特許第４９４６７７８号明細書、５２５８４９８号明細書、Ｈｕｓｔｏｎら、１９９１  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８、Ｓｈｕら、１９９３  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：７９９５−９、Ｓｋｅｒｒａら、１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：  １０３８−４０などがある。ヒト抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの使用、及び、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの検出アッセイを含む一部の用途においては、周知の技術によって産生されたヒト化抗体又はヒト抗体を使用することが好ましい場合もある。
【００４５】
本願明細書において言及されるヒト化抗体は、本願明細書において記述されるとおり、ヒト宿主系へのｉｎ  ｖｉｖｏ導入（たとえば、非経口投与後）において有害な免疫原性反応を引き起こす可能性が低く、フレームワーク領域内に埋め込まれる１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を持つ、所定の抗原に結合する結合性組成物である。しばしば、ＣＤＲドナー領域は、抗原結合を改善、及び／又は免疫原性を減少させるために、ヒトのフレームワーク領域内で適切に埋め込まれる。有用なフレームワーク領域は、周知の方法を使用して同定できる。たとえば、（１）ＣＤＲ及びフレームワーク残基の相互作用をモデル化して、抗原結合において重要なフレームワーク残基を同定する、（２）配列比較により、特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定する（米国特許第５５８５０８９号明細書、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８））、（３）実験的に同定する。
【００４６】
本発明の特定のモノクローナル抗体結合組成物の態様における重鎖及び軽鎖可変相補性決定領域（ＣＤＲ）を、Table １ａ、Table １ｂに示す。ＣＤＲ領域は、標準アミノ酸の１文字コード及び標準ＣＤＲ番号を使用して表される（すなわち、ＣＤＲの値が大きいほうが、典型的なＩｇＧの重鎖又は軽鎖構造の不変領域に近いことになる。たとえば、ＶＨ  ＣＤＲ３は、ＶＨ  ＣＤＲ１よりもＣＨ１ドメインに近い）。
【００４７】
特定のＣＤＲの態様は、ＣＤＲの種類を記述するためにアミノ酸式を使用して一般的に表記する（ここにおいても、標準アミノ酸の１文字コードを使用し、代用可能なアミノ酸残基を「Ｘ」で表す。特定のＣＤＲ内における残基の配置は下付き数字によって表す。この下付き数字の値は、最小がＣＤＲ内で最もアミノ末端寄り、最大が最もカルボキシ末端寄りの残基を表す（たとえば、ＶＨＣＤＲ２のＸ１はＣＤＲの最もアミノ末端寄りの残基であり、Ｘ６は最もカルボキシ末端寄りの置換可能な残基である））。従来技術における当業者は、これらの一般的な式によって、本発明に包含される多様な重鎖ドメイン又は軽鎖ドメイン（ＶＬ又はＶＨ）内のすべての所定位置におけるＣＤＲの態様を確認できる。考えうるアミノ酸配列の特定のインスタンス化は、アミノ酸コードを使用している特定のＣＤＲ式において、特定の残基Ｘそれぞれに置換可能なすべてのアミノ酸を生成することによってすべて確認可能である。本願明細書は、すべてのこのような態様を包含する。
【００４８】
更に、考えうるＣＤＲの組み合わせにおける、考えうるすべてのＶＬ又はＶＨの態様も、本発明において包含される（たとえば、開示されている情報から、考えうるＶＨＣＤＲ１は７２個、考えうるＶＨＣＤＲ２は３８４個、考えうるＶＨＣＤＲ３は１２個あることが直ちに算出可能である。ここから、本発明の結合性組成物の特定の可変重鎖抗体の態様においては合計７２×３８４×１２通りの考えうるＶＨのＣＤＲを組み合わせることができる。本願明細書は、すべてのこのような組み合わせを包含する。同様の論理が、すべてのＶＬ  ＣＤＲ及び軽鎖可変ドメインＶＬに包含されるすべての考えうる組み合わせにもあてはまる。たとえば、考えうるＶＬＣＤＲ１は１９２あり、考えうるＶＬＣＤＲ２は１２個あり、考えうるＶＬＣＤＲ３は４８個ある。ここから、本発明の結合性組成物の特定の可変軽鎖抗体の態様においては合計１９２ｘ１２ｘ４８通りのＶＬＣＤＲを組み合わせることができる）。同様に、特定の結合性組成物の態様における、ＶＨとＶＬの考えうるすべての組み合わせも本発明に包含される。
Table １ａ  結合性組成物のＣＤＲ重鎖の式
【表１】
2008538564.tif 000002
●＊ＶＨＣＤＲ１について、Ｘ１は、ＴかＤであり、Ｘ２は、Ｔ、Ｅ、Ｆのいずれかであり、Ｘ３は、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖのいずれかであり、Ｘ４は、Ｈ、Ｖ、Ａのいずれかである。
●＊＊ＶＨＣＤＲ２について、Ｘ１は、Ｙ、Ｑ、Ｓのいずれかであり、Ｘ２は、Ｉ又はＶであり、Ｘ３は、Ｄ又はＥであり、Ｘ４はＹ、Ｔ、Ｈ、Ｌのいずれかであり、Ｘ５は、Ｑ、Ｋ、Ｐ、Ｓのいずれかであり、Ｘ６は、Ｆ又はＹである。
●＊＊＊ＶＨＣＤＲ３について、Ｘ１は、ＷかＡであり、Ｘ２は、Ｆ又はＬであり、Ｘ３もＡ、Ｅ又はＹである。
Table １ｂ  結合性組成物のＣＤＲ軽鎖の式
【表２】
2008538564.tif 000003
●＊ＶＬＣＤＲ１について、Ｘ１は、Ｒ、Ｙ、Ｅ、Ｑのいずれかであり、Ｘ２は、Ｓ又はＴであり、Ｘ３は、Ｓ、Ｖ、Ａのいずれかであり、Ｘ４は、Ｓ又はＬであり、Ｘ５は、Ｓ、Ｐ、Ｌ、Ｙのいずれかである。
●＊＊ＶＬＣＤＲ２について、Ｘ１は、Ｌ、Ｎ、Ｐのいずれかであり、Ｘ２は、Ｓ、Ｋ、Ｙ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｅ、Ｑ、Ｒ、Ｈのいずれかである。
●＊＊＊ＶＬＣＤＲ３について、Ｘ１は、Ｑ又はＳであり、Ｘ２はＬ、Ｄ、Ｐのいずれかであり、Ｘ３は、Ｎ又はＲであり、Ｘ４は、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｒのいずれかである。
【００４９】
更に、本願明細書に包含されるＣＤＲ（得られた結合性組成物が、成熟ＴＧＦベータ２又は成熟ＴＧＦベータ３ではなく、成熟ＴＧＦベータ１に、特異的及び／又は選択的に結合することを可能にするために、かつ、成熟ＴＧＦベータ１を中和するために、ヒトの抗体フレームワーク領域内に埋め込む（適当な配向性において）又は担持された）を使用する抗体結合組成物が、本発明に包含される。周知の技術を使用して、適当なフレームワーク内に特定のＣＤＲを埋め込み、或いは、配置することができる。本発明で使用される可変ドメインは、任意の生殖細胞系又は再配列されたヒトの可変ドメインに由来するものでもよく、或いは、周知のヒトの可変ドメインのコンセンサス配列に基づく合成的な可変ドメインでもよい。
【００５０】
好適な可変ドメインフレームワークは、抗ＴＧＦベータ１抗体結合組成物の態様の生物的性質（すなわち、成熟ＴＧＦベータ２及び／又はＴＧＦベータ３ではなく成熟ＴＧＦベータ１に、特異的に及び／又は選択的に結合し、成熟ＴＧＦベータ１を中和する機能）に大きく影響を及ぼさないものである。より好ましくは、ヒト被験者に（たとえば、非経口的に）投与した際に、有意な免疫反応を誘発しないフレームワークである。好適なフレームワーク配列は、天然に存在するヒト抗体、又は複数のヒト抗体のコンセンサス配列であってよい。本発明の抗体の態様の重鎖可変領域のフレームワーク配列の非限定的な例には、ＶＨ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ＤＰ−５（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９９２  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−９８）及び、Ｊ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ＪＨ４、ＪＨ１、又はＪＨ５（Ｒａｖｅｔｃｈら、１９８１  Ｃｅｌｌ  ２７：５８３−９１）が含まれる。ＶｋセグメントＬ１（Ｃｏｘら、１９９４  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−３６）及びＪ  ｓｅｇｍｅｎｔ  Ｊｋ４（Ｈｉｅｔｅｒら、１９８２  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  １０：１５１６−２２）は、軽鎖可変領域のフレームワーク配列の非限定的な例である。好ましい一態様において、ＨＣＶＲ  ＦＲ１フレームワークはＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳ［配列番号８］を含み、ＨＣＶＲ  ＦＲ２フレームワークはＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧ［配列番号９］を含み、ＨＣＶＲ  ＦＲ３フレームワークはＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲ［配列番号１０］を含み、ＨＣＶＲ  ＦＲ４フレームワークはＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ［配列番号１１］を含む。他の好ましい一態様として、ＬＣＶＲ  ＦＲ１フレームワークはＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ［配列番号１２］を含み、ＬＣＶＲ  ＦＲ２フレームワークは［配列番号１３−３６］から選択される配列を含み、ＬＣＶＲ  ＦＲ３フレームワークはＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ［配列番号３７］を含み、ＬＣＶＲ  ＦＲ４フレームワークはＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ［配列番号３８］を含む。より好ましい一態様において、このようなフレームワーク領域には、変更、欠失、付加、置換、又はそれらの組み合わせすべてが含まれうる。さらに、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個のアミノ酸が、任意の組み合わせで置換、欠失、又は付加されたフレームワークも好ましい。
【００５１】
一態様において、本発明の抗体結合組成物ＣＤＲを埋め込むのに用いられる好適な重鎖定常領域には、たとえば、ＩｇＧ定常領域が含まれる。より好ましい一態様では、ＩｇＧ定常領域は、以下に示すようにＩｇＧ１定常領域又はＩｇＧ４定常領域である。
ＩｇＧ１［配列番号３９］：
ＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ又は、
ＩｇＧ４［配列番号４０］
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
【００５２】
本発明の好適な軽鎖定常領域配列は、以下に示されるカッパ鎖定常領域である。ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ［配列番号４１］
【００５３】
他の好ましい態様（抗体）において、結合性組成物はＩｇＧ１重鎖定常領域又はＩｇＧ４重鎖定常領域、及びカッパ軽鎖定常領域を含む。
【００５４】
本願明細書において開示されている情報から、従来技術における当業者は、Ｎｏ．４６Ｐ−Ｌ１−６のような、以下を含む軽鎖と重鎖を有する本発明の１ｍＡｂ態様を作成できる。
軽鎖：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＥＡＳＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＰＬＩＹＡＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＷＤＬＮＰＰＡＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ［配列番号１３０］ＬＣＶＲ  ＦＲ１フレームワーク＝ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ［配列番号１２］ＶＬ  ＣＤＲ１＝式Ｘ１ＡＸ２Ｘ３Ｘ４ＶＸ５ＹＭＨ［配列番号５］（Ｘ１はＲ、Ｙ、Ｅ又はＱであり、Ｘ２はＳ又はＴであり、Ｘ３はＳ、Ｖ、又はＡであり、Ｘ４はＳ又はＬであり、Ｘ５はＳ、Ｐ、Ｌ又はＹである）のＥＡＳＳＳＶＳＹＭＨ［配列番号１３８］ＬＣＶＲ  ＦＲ２フレームワーク＝ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＰＬＩＹ［配列番号１３］ＶＬ  ＣＤＲ２＝式ＡＴＳＮＸ１ＡＸ２［配列番号６］（Ｘ１はＬ、Ｎ又はＰであり、Ｘ２は、Ｓ、Ｋ、Ｙ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｅ、Ｑ、Ｒ又はＨである）のＡＴＳＮＬＡＳ［配列番号１３９］ＬＣＶＲ  ＦＲ３フレームワーク＝ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ［配列番号３７］ＶＬ  ＣＤＲ３＝式Ｘ１ＱＷＤＸ２Ｘ３Ｘ４ＰＡ［配列番号７］（ここでＸ１は、Ｑ又はＳであり、Ｘ２はＬ、Ｄ、Ｐのいずれかであり、Ｘ３は、Ｎ又はＲであり、Ｘ４は、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｒのいずれかである）のＱＱＷＤＬＮＰＰＡ［配列番号１４０］ＬＣＶＲ  ＦＲ４フレームワーク＝ＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ［配列番号３８］軽鎖定常領域＝ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ［配列番号４１］
重鎖：ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＮＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＹＰＹＤＧＤＴＧＹＮＱＫＦＫＳＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＲＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ［配列番号１３１］ＨＣＶＲ  ＦＲ１フレームワーク＝ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳ［配列番号８］ＶＨ  ＣＤＲ１＝式ＧＹＸ１ＦＸ２ＤＹＮＸ３Ｘ４  ＧＹＴＦＴＤＹＮＭＨ［配列番号２］（Ｘ１はＴ又はＤであり、Ｘ２はＴ、Ｅ、又はＦであり、Ｘ３はＭ、Ｉ、Ｌ、又はＶであり、Ｘ４はＨ、Ｖ、又はＡである）のＧＹＴＦＴＤＹＮＭＨ［配列番号１４１］ＨＣＶＲ  ＦＲ２フレームワーク＝ＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧ  ＧＹＴＦＴＤＹＮＭＨ［配列番号９］ＶＨ  ＣＤＲ２＝式Ｘ１Ｘ２ＹＰＹＤＧＸ３ＴＧＸ４ＮＸ５ＫＸ６ＫＳ［配列番号３］（Ｘ１は、Ｙ、Ｑ、Ｓのいずれかであり、Ｘ２は、Ｉ又はＶであり、Ｘ３は、Ｄ又はＥであり、Ｘ４はＹ、Ｔ、Ｈ、Ｌのいずれかであり、Ｘ５は、Ｑ、Ｋ、Ｐ、Ｓのいずれかであり、Ｘ６は、Ｆ又はＹである）のＹＩＹＰＹＤＧＤＴＧＹＮＱＫＦＫＳ  ＧＹＴＦＴＤＹＮＭＨ［配列番号１４２］ＨＣＶＲ  ＦＲ３フレームワーク＝ＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲ  ＹＩＹＰＹＤＧＤＴＧＹＮＱＫＦＫＳ  ＧＹＴＦＴＤＹＮＭＨ［配列番号１０］ＶＨ  ＣＤＲ３＝式ＧＹＲＸ１Ｘ２Ｘ３Ｙ［配列番号４］（Ｘ１はＷかＡであり、Ｘ２はＦかＬであり、Ｘ３はＡ、Ｅ又はＹである）のＧＹＲＷＦＡＹ［配列番号１４３］ＨＣＶＲ  ＦＲ４フレームワーク＝ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ［配列番号１１］重鎖定常領域＝ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ［配列番号４０］である。
【００５５】
抗体をコードするポリヌクレオチド
本発明はさらに、結合性組成物（又はその断片）をエンコードするポリヌクレオチド配列又は本発明のポリペプチド配列を含む核酸分子を包含する。上記ポリヌクレオチドを得ることができ、及び、周知の方法（たとえば、（抗体又はその断片の）によってポリペプチド配列が明らかである場合、ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドは、任意のコンピュータアルゴリズムで遺伝子コードの縮重を用いることで容易に判定できる）によって判定したポリヌクレオチドのヌクレオチド配列と、得られた配列情報を用いることにより、たとえば化学合成されたオリゴヌクレオチドを構築することができる（たとえば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒら、（１９９４）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２４２に記載）。このステップは、簡潔に説明するならば、ポリペプチド配列をエンコードする配列部分を含む重複するオリゴヌクレオチドを合成し、これらのオリゴヌクレオチドをアニーリング及びライゲーションし、次いで、ＰＣＲ法を使用して、ライゲーションしたオリゴヌクレオチドを増幅する。
【００５６】
あるいは、本発明のポリペプチド配列をエンコードするポリヌクレオチドは、任意の適切な発生種から生成された核酸からでも生成できる。特定の抗体をエンコードする核酸分子を含むクローンが利用できない場合においても、上記抗体の分子の配列が明らかになっていれば、イムノグロブリンをエンコードする核酸は、化学合成、又は適切なソースから得ることができる。たとえば、ソースは、対象の抗体を発現する任意の組織又は細胞（たとえば、対象となるポリヌクレオチド配列の３’及び５’端にハイブリダイズ可能な合成プライマを使用したＰＣＲ増幅により、本発明の抗体を発現するよう選択されたハイブリドーマ細胞）から分離された、抗体ｃＤＮＡライブラリ又はポリＡ＋ＲＮＡから生成されたｃＤＮＡライブラリであってよい。又は、同定したい特定の遺伝子配列（たとえば、上記抗体をエンコードするｃＤＮＡライブラリからのｃＤＮＡクローン）に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用したクローニングにより、上記抗体の核酸分子を生成できる。
【００５７】
増幅された核酸は、任意の技術周知の方法を使用して、複製可能なクローニングベクターにクローン化することが可能である。抗体のヌクレオチド及び対応するアミノ酸配列が決定されれば、任意の周知の方法（たとえば、組換えＤＮＡ技術、部位指定変異、ＰＣＲなど）を用いて、抗体のヌクレオチド配列を操作し、異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成してアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を実施することができる（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、及びＡｕｓｕｂｅｌら編、ｃｕｒ．ｅｄ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ参照）。
【００５８】
特定の一態様において、重鎖及び／又は軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を周知の方法で検査することにより、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を同定可能である。たとえば、他の重鎖及び軽鎖可変領域の周知のアミノ酸配列と比較することにより、配列の超可変性領域を決定できる。慣習的な組換えＤＮＡ技術を使用して、本願明細書において記載されている１つ又は複数のＣＤＲを、適切なフレームワーク領域内に挿入することができる。たとえば、免疫原性を減少させるためにヒトフレームワーク内に挿入することが可能である。フレームワーク領域は、天然由来であっても、又はコンセンサスフレームワーク領域（又は本願明細書において教示されるとおり）であってもよく、好ましくは、ヒトのフレームワーク領域である（ヒトのフレームワーク領域の一覧は、たとえばＣｈｏｔｈｉａら、１９９８  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−７９を参照）。一般的に、抗原結合部位の整合性に影響を与える可能性が高いヒトのフレームワーク内の残基を同定するには、ドナー及び選択されたヒトのアクセプター配列の両方を、抗体レパートリに由来するいくつかの配列テンプレートに整列配置すればよい。「Ｉｎｖａｒｉａｎｔ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ」（Ｋａｂａｔら、１９９１）及び「ｋｅｙ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ」（Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９）は同定されており、ドナー抗原結合ループＬ１−Ｌ３、Ｈ１及びＨ２（順に）の標準クラスへの配列は、配列テンプレートに対して配列をスクリーニングすることによって決定される（Ｍａｒｔｉｎ及びＴｈｏｒｎｔｏｎ、１９９６  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：８００−１５、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／）。さらに、ＶＨ／ＶＬインタフェースにおける残基（Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８５）及びコア部位に構造的に保存されることが公知である残基（Ｃｈｏｔｈｉａら、１９９８）が、対応するドナー及びアクセプター残基と比較される。これらの部位にある一致しないドナー及びアクセプターフレームワーク残基は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋの周知の構造を有する他の抗体の情報に基づき解析される（Ｂｅｒｍａｎら、２０００  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８（１）：２３５−４２）。異質なＶ領域のヒト化において、テンプレートとして使用するヒトフレームワークの選択が、次ぎにどの残基をヒト化するかという判断を決定する。相同的なテンプレートは、周知の結晶構造を有する抗体から、生殖細胞系、非生殖細胞系、又は利用可能なデータベースに由来するコンセンサス配列から選択することができる。（これについての議論は、たとえばＲｏｕｔｌｅｄｇｅら（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅら、１９９３  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍａｎ（Ｃｌａｒｋ，  Ｍ．，  ｅｄ）ｐｐ．１４−４４、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｔｉｔｌｅｓ、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ、ＵＫ、及びＢ．Ｌｏ、２００４  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）を参照。抗体をヒト化する他の方法は、ドナ��ＣＤＲを受け入れるフレームワークとして、最も近いヒトの生殖細胞系配列（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９９２）を選択することである。この生殖細胞系アプローチは、最適な方法と同じ原理に基づいているが、データベースにおいて生殖細胞系配列だけを検索する（たとえば、Ｖ  ＢＡＳＥ参照。これは、公開されている１０００を超える配列から収集（ＧｅｎｂａｎｋやＥＭＢＬデータライブラリの最近の発表もこれに含まれる）されたすべてのヒト生殖細胞系可変領域配列の包括的なディレクトリである。Ｖ  ＢＡＳＥデータベースは、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（英国、ケンブリッジ）において、ヒト抗体遺伝子のシークエンシング及びマッピングの研究の延長として、或いは、解析用のユーザーフレンドリーなツールを提供することを目的として、数年かけて開発された）。ヒトの生殖細胞系配列は潜在的な免疫原性な体細胞超変異を示さないため、生殖細胞系フレームワークを用いる方法は極めて有用である。コンセンサスヒト生殖細胞系の方法を用いて、ＣＤＲをヒトフレームワークに移植又は埋め込むこともできる。フレームワークとして、ヒトの部分群のうちの１つを使用する（たとえば、Ｐｒｅｓｔａら、１９９３  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５１：２６２３−３２、Ｃｏｕｔｏら、１９９４  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１３：２１５−９、Ｃｏｕｔｏら、１９９５  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（Ｓｕｐｐｌ．）、５５、５９７３ｓ−７ｓ、Ｗｅｒｔｈｅｒら、１９９６  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５７：４９８６−９５、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、１９９８  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｎｇ  １１：３２１−８参照）。
【００５９】
好ましくは、フレームワーク配列とＣＤＲの組み合わせにより生成されたポリヌクレオチドは、特異的及び／又は選択的にＴＧＦベータ１（又はそのエピトープ）に結合する抗体（又はその断片）をエンコードする。好ましくは、本願明細書において述べられるように、その抗原に対する抗体の結合を改善するため、１又は複数のアミノ酸置換がフレームワーク領域内で作られる。
【００６０】
加えて、このような方法を用いて、１又は複数の可変領域で、鎖内ジスルフィド結合に関与するシステイン残基のアミノ酸置換又は欠失させ、１又は複数の鎖内ジスルフィド結合が欠失している抗体分子を生成することができる。ポリヌクレオチドに対する他の改変も、本発明及び、分子生物学者などの当業者の技術の範囲内に包含される。
【００６１】
あるいは、周知の技術を応用し、単鎖抗体を作製することができる（たとえば、米国特許第４９４６７７８号明細書、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２の（１９８８）、Ｈｕｓｔｏｎら、ＰＮＡＳ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）、Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５４（１９８９）を参照）。単鎖抗体はアンモ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖及び軽鎖断片を連結することによって形成される。その結果、単鎖ポリペプチドとなる。大腸菌の機能的Ｆｖ断片の構築技術を用いることもできる（Ｓｋｅｒｒａら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８−１０４１）。
【００６２】
ポリペプチド断片
本発明には、結合性組成物の断片も包含される。「ポリペプチド断片又はセグメント」という表現には、本願明細書において記載される配列の一部又は配列番号のポリペプチド配列の一部であるアミノ酸配列が包含される。タンパク質及び／又はポリペプチド断片又はセグメントは、「独立して存在」していてもよく、又は、大きいポリペプチド又はタンパク質（その断片又はセグメントが、部分又は領域を形成するものであり、たとえば、配列番号（本願明細書では、融合タンパク質内に接続されている）の単一の連続した領域）の一部を含んでいてもよい。
【００６３】
好ましくは、ポリペプチドセグメントの長さは、少なくとも約７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、又は１５０の隣接するアミノ酸の長さである。この文脈では、「約」とは、たとえば、本願明細書で具体的に記載されている範囲又は値を含むほか、さらに、上記に列挙された値が、断片の両端若しくは片方の端においてアミノ酸残基の数といくつか異なる値（たとえば、アミノ酸残基の数±５、±４、±３、±２、±１）を包含する。このようなポリペプチド断片をエンコードするポリヌクレオチドが、本発明によって包含される。
【００６４】
さらに、本発明は、複数の上記アミノ酸セグメント又は断片（たとえば、オーバーラップしていない特定の長さのセグメント）を含むタンパク質又はポリペプチドを包含する。通常、「複数」とは、少なくとも２、より一般的には、少なくとも３、好ましくは、少なくとも４、５、６、７、８、９又はそれ以上である。１つのセグメントの長さの下限値は指定されており、任意の特定の複数のセグメントについても、さまざまな大きさにおける最大長が包含される。たとえば、複数の３つのセグメントには、全長が隣接アミノ酸７である１つのセグメントと、長さがそれぞれ１２である２つのオーバーラップしていないセグメントを含まむことができる。
【００６５】
また好ましくは、構造的ドメイン又は機能的ドメインを特徴とするポリペプチド断片又はセグメント（及びそれに対応するポリヌクレオチド断片）である。たとえば、相補性決定領域（ＣＤＲ、たとえばＶＬ又はＶＨ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、又はＣＤＲ３）、可変領域（たとえば、重鎖又は軽鎖可変領域、ＶＬ又はＶＨの可変領域）、フレームワーク領域（ＦＨ１、２、３、又は４）、Ｄ又はＪ領域、定常領域（たとえば、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３）、ヒンジ領域、Ｆｃガンマ受容体−結合領域、αヘリックス及びαヘリックス形成領域、ベータシート及びベータシート形成領域、ターン及びターン形成領域、コイル及びコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可撓性領域、ループ領域、ヘアピンドメイン、βαβモチーフ、へリックス束、α／βバレル、アップダウンβバレル、ゼリーロール又はスイスロールモチーフ、膜貫通ドメイン、表面形成領域、基質結合性領域、膜貫通領域、リンカー、免疫原性領域、エピトープ領域、高抗原インデックス領域などである。さらに、これらの領域をエンコードするポリヌクレオチドも包含される。
【００６６】
他の好ましいポリペプチド断片は、生物活性な断片である。生物活性な断片は、結合性組成物ポリペプチド（又はその断片）（たとえばＦａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又はＦ（ａｂ）２）の活性に類似であるが必ずしも同一でない活性を呈するものである。本発明は、これらのポリペプチド断片をエンコードするポリヌクレオチドを包含する。
【００６７】
好ましくは、ポリヌクレオチド断片は、機能活性を呈するポリペプチドをエンコードする。「機能活性」という用語は、１又は複数の周知の機能活性を達成することができるポリペプチドセグメントを包含する。このような機能活性には、たとえば、これらに限定されるものではないが、生物学的活性、抗原性［本発明のポリペプチドに対する抗体結合組成物と結合する（又はポリペプチドと結合を競合する）能力］、免疫原性（本発明のポリペプチドと結合する抗体を生成する能力）、本発明のポリペプチドを有する多量体を形成する能力、及び本願明細書において記載されているポリペプチドの受容体又はリガンドと結合する能力が包含される。
【００６８】
ポリペプチド（その断片、変異体、誘導体及び類縁体を含む）の機能活性は、さまざまな方法によって分析することができる。たとえば、本発明のポリペプチドの抗体と結合するため、本発明の全長ポリペプチドに結合又は競合する能力を分析する場合、公知技術のさまざまなイムノアッセイを用いることができる。たとえば、これらに限定されるものではないが、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）、サンドイッチイムノアッセイ、免疫放射定量分析法、ゲル内拡散沈降素反応、免疫拡散法、ｉｎ  ｓｉｔｕのイムノアッセイ（たとえば、コロイド金、酵素又はラジオアイソトープ標識を使用）、ウエスタンブロット法、沈降反応、アグルチネーション試験法（たとえばゲルアグルチネーション法、赤血球凝集反応、補体結合法、免疫蛍光検査、プロテインＡアッセイ、及び免疫電気泳動法など）などの技術を使用する競合性及び非競合性のアッセイシステムがこれに含まれる。
【００６９】
別の一態様では、抗体の結合は、一次抗体の標識を検出することによって達成される。別の一態様では、二次抗体又は試薬による一次抗体への結合を検出することによって、一次抗体が検出される。さらに別の一態様では、二次抗体が標識化される。イムノアッセイにおいて結合を検出する方法としては、数多くの手段が当該技術において周知であり、本発明の範囲内である。
【００７０】
別の一態様では、リガンドを同定し、或いは、本発明のポリペプチド断片、変異体、又は誘導体の多重結合する能力を評価し、結合を分析することができる。たとえば、還元及び非還元ゲルクロマトグラフィー、タンパク質親和性−クロマトグラフィー、及び親和性ブロッティング（一般的にはＰｈｉｚｉｃｋｙら（１９９５）、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｒｅｖ．５９：９４−１２３を参照）を用いて分析する。別の一態様では、基質（細胞情報伝達）に対するポリペプチド結合の生理学的な関連要因は、一般的技術によって分析できる。加えて、本願明細書において記載（本願の「実施例」セクション参照）の分析法、或いは、従来技術において周知の分析法は、結合性組成物（その断片、変異体、誘導体、及び類縁体）のＴＧＦベータ１に関連する生物活性（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ）を調整するための性能を測定するために日常的に適用できる。
抗体産生方法
【００７１】
抗体結合組成物は、任意の公知技術の方法を使っても産生できる。すなわち、化学合成、又は、好ましくは、組換え発現技術である。
【００７２】
結合性組成物若しくはその断片、誘導体又は類縁体（たとえば本発明の抗体の重鎖又は軽鎖、若しくは本発明の単鎖抗体）の組換え発現には、抗体をエンコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターの作成が必要である。本発明の抗体分子若しくは抗体の重鎖又は軽鎖をエンコードするポリヌクレオチド配列又はその一部分（好ましくは、重鎖又は軽鎖可変ドメインを含む）を得れば、抗体分子を産生するベクターを周知の組換えＤＮＡ技術によって産生できる。
【００７３】
結合性組成物のコード配列及び適切な転写並びに翻訳の制御シグナルを含む発現ベクターは、公知技術の方法を使って作成できる。これらの方法には、たとえば、これらに限定されるものではないが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝的組換えが包含される。つまり本発明は、本発明の抗体（又はその断片）若しくはその重鎖又は軽鎖若しくは重鎖又は軽鎖可変領域若しくはプロモーターと操作可能に連結されたＣＤＲをエンコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを包含する。このようなベクターには、たとえば、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列（国際公開第８６／０５８０７号パンフレット、国際公開第８９／０１０３６号パンフレット、又は米国特許第５１２２４６４号明細書）が含まれ、上記抗体の可変ドメインをこのようなベクターにクローンすることにより、重鎖又は軽鎖全体若しくはその一部を発現させることができる。
【００７４】
一般的に、従来の技術によって発現ベクターを宿主細胞へ転送し、次いでトランスフェクション細胞を培養して抗体又はその一部を産生する。つまり、本発明には、たとえば、本発明の抗体をエンコードしているポリヌクレオチドを含む宿主細胞、又はその重鎖又は軽鎖若しくは非相同のプロモーターに操作可能に連結された単鎖抗体が含まれる。二重鎖抗体の発現のための好ましい一態様において、本願明細書において詳述されるか又は従来技術において公知であるとおり、重鎖及び軽鎖の両方をエンコードしているベクターは、免疫グロブリン分子全体を発現するために、宿主細胞において共発現することができる。
【００７５】
本発明の抗体分子は、さまざまな宿主発現ベクター系を使用して発現することができる。このような宿主発現系は、対象となる任意のコード配列も生成及び次いで精製することのできる媒介物を表す。しかしながら、宿主発現系細胞は、適切なヌクレオチドコード配列によってトランスフォーム又はトランスフェクトされた際に、その位置で本発明の抗体分子を発現することもできる。これらの細胞には、たとえば、限定されるものではないが、以下のものが含まれる。微生物（たとえば抗体コード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベクターによってトランスフォームされた細菌（たとえば大腸菌、枯草菌））、抗体コード配列を含む組換え酵母菌発現ベクターによってトランスフォームされた酵母菌（たとえばサッカロミセス、ピキア）、抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（たとえばかん状ウイルス）に感染した昆虫細胞系、組換えウイルス発現ベクター（たとえば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））に感染した、又は抗体コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（たとえばＴｉプラスミド）によってトランスフォームされた植物細胞システム、又は、哺乳類細胞のゲノムを由来とするプロモーター（たとえばメタロチオネインプロモーター）又は哺乳類のウイルスを由来とするプロモーター（たとえば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構造物を宿している哺乳類細胞系。
【００７６】
組換え抗体分子の発現には、好ましくは、大腸菌のような細菌細胞、及び、より好ましくは、真核細胞が使われる。たとえば、ヒト−サイトメガロウイルスからの主要な中間初期遺伝子プロモーター要素のようなベクターと組み合わせたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞は、抗体の有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら（１９８６）Ｇｅｎｅ  ４５：１０１、Ｃｏｃｋｅｔｔら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２）。
【００７７】
細菌系では、発現された抗体分子の用途に合わせ、数多くの発現ベクターを適切に選択できる。たとえば、多量のタンパク質を産生する際（たとえば、抗体分子の医薬組成物を産生するなど）、高濃度の融合タンパク質産生物の発現（直ちに精製可能）を導くベクターが好ましい場合もある。このようなベクターには、たとえば、これらに限定されるものではないが、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１（１９８３））（融合タンパク質を産生するよう、抗体コード配列が、ラックＺコード領域と同一枠で個別にベクターに結紮される）、ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ及びＩｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３  １０１−３で１０９（１９８５）、Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ及びＳｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））などが含まれる。ｐＧＥＸベクターは、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を有する融合タンパク質として異質なポリペプチドを表すために用いることもできる。
【００７８】
一般に、そのような融合タンパク質は溶解性で、吸着、及び基質グルタチオンアガロースビーズとの結合、次いで遊離グルタチオンの存在下での溶離によって、溶解された細胞から容易に精製できる。ｐＧＥＸベクターは、クローン化ターゲット遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出されるよう、たとえば、トロンビン、又はＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含有するように設計されている。異質な遺伝子を表すベクターとして使用される昆虫システムの１つが、オートグラファ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）系である。ＡｃＮＰＶウイルスは、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の細胞において成長する。抗体コード配列は、ウイルスの非必須な部位（たとえばポリヘドリン遺伝子）に個々にクローン化でき、ＡｃＮＰＶプロモーター（たとえばポリヘドリンプロモーター）の制御下におくことができる。
【００７９】
哺乳動物宿主細胞において、多くのウイルス由来の発現系を利用することができる。アデノウイルスが発現ベクターとして使われるケースにおいて、対象となる抗体コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳調節複合体（たとえば後期プロモーター及びトリパータイトリーダー配列）にライゲーションすることができる。このキメラ遺伝子は、続いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでの組み換えを用いて、アデノウイルスゲノムに挿入できる。ウイルスのゲノム（たとえば領域Ｅ１又はＥ３）を必須でない部位へ挿入することにより、感染した宿主内で生存可能であり、抗体分子を発現することができる組換えウイルスが得られる。挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳のためには、特定の開始シグナルが必要となる場合がある。これらのシグナルには、たとえば、ＡＴＧ開始コドン及び隣接する配列などが含まれる。さらに、挿入部分全体が適切に翻訳されるためには、開始コドンが、望ましいコード配列の読み取りフレームと一致する必要がある。これらの外因性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、種々の起源（天然及び合成）に由来するものであってよい。
【００８０】
発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素や転写ターミネーターなどを含めることにより改善できる（たとえば、Ｂｉｔｔｎｅｒら、１９８７  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５  １−４）。加えて、特定の所望の方法により、挿入配列の発現を調整する、或いは、遺伝子産生物を改質修正及び加工する宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産生物のこのような改質（たとえばグリコシル化）及び処理（たとえば分解）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。
【００８１】
様々な宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後のプロセシング及び改質のための特性及び特定の機構を有する。発現する異質なタンパクの改質及び処理を確実に正しく実施するために、適当な細胞系又は宿主系を選択することができる。この目的のため、転写一次産物、グリコシル化、及びリン酸エステル化を適切に処理する細胞機構を有する真核の宿主細胞を用いることができる。このような哺乳類宿主細胞には、たとえば、これらに限定されるものではないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、及び、特に、たとえば乳がん細胞系（たとえばＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０及びＴ４７Ｄ）、及び通常の乳房腺細胞系（たとえばＣＲＬ７０３０及びＨｓ５７８Ｂｓｔ）が含まれる。
【００８２】
本発明は、融合タンパク質を生成するために、ポリペプチド（又はその一部、好ましくは、上記ポリペプチドの隣接アミノ酸を少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００個含む）に組み換えによって融合又は化学的に接合された（共有接合及び非共有接合の両方を含む）抗体を包含する。融合とは、必ずしも直接的である必要はなく、リンカー配列を介して発生することができる。
【００８３】
ポリペプチドに融合又は接合された抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏイムノアッセイにおいて、及び、公知技術の方法（たとえば、Ｈａｒｂｏｒ  ｓｕｐｒａ、国際公開第９３１２  １２３２号パンフレット、欧州特許第４３９０９５号明細書、Ｎａｒａｍｕｒａら、（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９  １−９、米国特許第５４７４９８１号明細書、Ｇｉｌｌｉｅｓら、１９９２  ＰＮＡＳ  ８９：１４２８−３２、Ｆｅｌｌら、１９９１  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−５２参照）を使用する精製法において用いることもできる。
【００８４】
本発明は更に、可変部以外の抗体領域に融合又は接合されたポリペプチド（又はその断片）を含む組成物を含む。たとえば、本発明のポリペプチド（又はその断片）は、抗体定常領域（Ｄ又はＪ領域）又はＦｃ領域若しくはその一部に融合又は接合できる。本発明のポリペプチド（又はその断片）に融合された抗体部は、定常領域、ヒンジ領域、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域、及び／又はＣＨ３領域、又はこれらの領域の任意の組み合わせ、又はその一部も含むことができる。ポリペプチド（又はその断片）は、多量体を生成するために、本願明細書において記載される抗体部に融合又は接合できる。たとえば、本発明のポリペプチド（又はその断片）に融合されるＦｃ部は、Ｆｃ部同士の間にジスルフィド結合が起きることにより二量体を形成しうる。より高い多量体形が、ＩｇＡ及びＩｇＭ部分にポリペプチドを融合することによって作製できる。抗体部に本発明のポリペプチド（又はその断片）を融合又は接合する方法は、公知である（たとえば、米国特許第５３３６６０３号明細書、５６２２９２９号明細書、５３５９０４６号明細書、５３４９０５３号明細書、５４４７８５１号明細書、５１１２９４６号明細書、欧州特許第３０７４３４明細書、欧州特許第３６７１６６明細書、国際公開第９６／０４３８８号パンフレット、国際公開第９１０６５７０号パンフレット、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：１０５３５−１０５３９、Ｚｈｅｎｇら、（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００、及び、Ｖｉｅら、（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：１１３３７−１１３４１参照）。
【００８５】
本願明細書において述べられるように、ポリペプチド（ポリペプチド断片）は、本願明細書において記載されている、又は従来技術において公知である抗体部に融合又は接合して、ｉｎ  ｖｉｖｏの半減期を延長させることができる。更に、ポリペプチド（ポリペプチド断片）は、抗体部に融合又は接合することにより、精製を促進することができる。一実施例において、ヒトのＣＤ４−ポリペプチドの最初の２つの領域、及び哺乳類の免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖定常領域のさまざまな領域を含むキメラタンパク質が使用されている。（たとえば、欧州特許第３９４，８２７号明細書、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３  １：８４−８６参照）
【００８６】
多くの場合、融合タンパク質のＦｃ部分は治療及び診断において有益であり、すなわち、たとえば、薬物動態学的特性の改良（欧州特許公開第２３２，２６２号参照）をもたらすことが考えられる。あるいは、融合タンパク質が発現、欠失、精製した後でＦｃ部分を欠失させることが好ましい。たとえば、融合タンパク質を免疫化のための抗原として使用する場合、Ｆｃ部分が治療及び診断の妨げとなることが考えられる。創薬において、たとえば、ｈＩＬ−５の拮抗剤を同定するための高スループットのスクリーニング法を目的として、ヒトのタンパク（たとえばｈＩＬ−５）がＦｃ部分に融合された（たとえば、Ｂｅｎｎｅｔｔら（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ８：５２−５８、Ｊｏｈａｎｓｏｎら、（１９９５）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１参照）。
【００８７】
さらに、精製を促進するために、結合性組成物（又はその断片）を標識配列（たとえばペプチド）に融合させることができる。好ましい態様では、標識アミノ酸配列の１つは、ヘキサヒスチジンペプチド（たとえばｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ社製、カリフォルニア州チャットワース）に設けられたタグ）である。標識アミノ酸配列の多くは市販されている。ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質（Ｇｅｎｔｚら（１９８９）ＰＮＡＳ  ８６：８２１−８２４）の簡便な精製を可能にする。精製に役立つ他のペプチドタグには、たとえば、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来したエピトープに対応するＨＡタグ（Ｗｉｌｓｏｎら、（１９８４）Ｃｅｌｌ  ３７：７６７）及び「フラグ」タグが含まれる。
【００８８】
本発明はさらに、診断又は治療用の薬剤に接合された本発明の抗体又は断片を包含する。上記抗体は、所与の治療計画の有効性を判定するために、たとえば、臨床的な検査手順の一部として腫瘍の発現又は進行をモニタするなどの目的で診断において使用できる。検出は、検出可能な物質に抗体をカップリングさせることにより容易になる。検出可能な物質の例には、たとえば、さまざまな酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、さまざまな陽電子放出断層撮影を用いた陽電子放出金属、及び非放射性の定磁性金属イオンが含まれる。検出可能な実体は、確立した技術（本発明による診断使用のために抗体に接合することができる金属イオンについて、米国特許第４７４１９００号明細書参照）を用いて、抗体（又はその断片）に直接、又は中間体（たとえば、当該技術で周知のリンカー）を介して間接的に、連関又は接合されることができる。好適な酵素の例には、たとえば、これらに限定されるものではないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β‐ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼが含まれる。好適な補欠分子団複合体の例には、たとえば、これらに限定されるものではないが、ストレプトアビジン／ビオチン、及びアビジン／ビオチンが含まれる。好適な蛍光物質の例には、たとえば、これらに限定されるものではないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレッセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリトリンが含まれる。発光物質の例には、たとえば、これらに限定されるものではないが、ルミノールが含まれる。生物発光物質の例には、たとえば、これらに限定されるものではないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びアエクオリンが含まれる。好適な放射性物質の例には、たとえば、Ｉ１２5、I１３１、Ｉ１１１又はＴｃ９９が含まれる。
【００８９】
本発明の結合性組成物は固体の支持体に付着させることもでき、これは特に、標的抗原のイムノアッセイ又は精製に有用である。このような担体には、たとえば、これらに限定されるものではないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリプロピレンが含まれる。抗体に治療用部分を接合するための技術は、公知である。たとえば、Ａｍｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら編、ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．１９８５）、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ  Ｅｄ．）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編、ｐｐ．６２３−５３  （Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．１９８７）、Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ‘８４：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｐｉｎｃｈｅｒａら編、ｐｐ．４７５−５０６  （１９８５）、「Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｒｅｓｕｌｔｓ，  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｆ  ＴＨＥ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら編、ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）、及びＴｈｏｒｐｅら、「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：  １１９−５８（１９８２）を参照。
【００９０】
Ｂ．イムノアッセイ
ＴＧＦベータ１のような特定のタンパク質は、さまざまなイムノアッセイ法、たとえば、これらに限定されるものではないが、ウエスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）、サンドイッチイムノアッセイ、免疫沈降法、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散法、アグルチネーション法、補体結合法、免疫放射定量測定法、蛍光免疫法及びプロテインＡイムノアッセイなどの技術を使用する、競合性及び非競合性のアッセイシステムによって測定することができる。一般的な免疫学的手法やイムノアッセイ法についての議論は、Ｓｔｉｔｅｓ及びＴｅｒｒ編、（１９９１）Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（７ｔｈ  ｅｄ．）を参照。さらに、本発明のイムノアッセイは、数多くの構成において実施することができる。これらの構成については、Ｍａｇｇｉｏ編、（１９８０）Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ、Ｇｏｓｌｉｎｇ  Ｊ  Ｐ  ２０００  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ  Ｐｒｅｓｓ、Ｄｉａｍａｎｄｉｓ及びＣｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｕｓ、１９９６  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、Ｔｉｊａｎ  （１９８５）、「Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ」Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｗｉｌｄ，  Ｄ編、２００１  Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｕｂ  Ｇｒｏｕｐ、Ｊａｍｅｓ  Ｔ．Ｗｕ、２０００  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ａｓｓａｙ  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ，  Ｔｒｏｕｂｌｅｓｈｏｏｔｉｎｇ，  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ａｍｅｒ  Ａｓｓｎ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｂｒｏｕｓｓｅａｕ及びＢｅａｕｄｅｔ編、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ、及びＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ｓｕｐｒａで詳細にわたり論じられている。また、Ｃｈａｎ編（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｒｌａｎｄｏ、ＦＬ、Ｐｒｉｃｅ及びＮｅｗｍａｎ編（１９９１）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、及びＮｇｏ編（１９８８）Ｎｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ。
【００９１】
測定のためのイムノアッセイは、さまざまな技術周知の方法によって実施できる。簡単に言えば、タンパク質を測定するイムノアッセイは、競合性又は非競合性、いずれの結合アッセイであってもよい。競合的結合アッセイにおいて、分析される試料は、固体表面に結合された補足剤上の特定の結合部位に対して標識化された検体と競合する。好ましくは、上記補足剤は、本願明細書において記載されているＴＧＦベータ１タンパク質に特異的に反応する抗体である。補足剤に結合された標識検体の濃度は、試料中に存在する遊離検体の量に反比例する。
【００９２】
競合的結合イムノアッセイにおいて、試料中に存在する標的タンパク質は、特定の結合性組成物（たとえば、標的タンパク質に対して特異的及び／又は選択的に反応する結合性組成物（抗体など））に対する標識タンパク質と競合する。結合性組成物は、結合標識タンパク質を非結合標識タンパク質から分離できるようにするために、固体表面に結合できる。あるいは、競合的結合アッセイは、非結合標識タンパク質から結合標識タンパク質を分離するために、液相内で実施することも、また、公知技術のさまざまな手法を用いて実施することもできる。分離後、結合標識タンパク質の量を測定する。試料内に存在するタンパク質の量は、標識化されたタンパク質結合の量に反比例する。
【００９３】
あるいは、分離のステップによって不要なホモジニアスイムノアッセイを実施することもできる。これらのイムノアッセイにおいて、タンパク質が、そのタンパク質に特異的な結合性組成物に結合することにより、上記タンパク質上の標識が変化する。標識タンパク質におけるこの変化は、標識によって放射されるシグナルの減少又は増加をもたらす。これにより、イムノアッセイ終了時に標識を測定することで、タンパク質の検出又は定量化が可能になる。
【００９４】
また、競合アッセイも特に有用である。ここでは、細胞が、標識化された結合パートナー又は上記タンパク質に対する周知の結合能を持つ抗体（たとえば１２５Ｉ−抗体）、及び結合性組成物に対する結合能が測定される試験サンプルによって接触及びインキュベーションされる。次いで、タンパク質結合の程度を評価するため、結合され、ラベルフリーの結合性組成物を分離する。結合される検査化合物の量は、周知のソースに結合している標識結合パートナーの量に反比例する。数多くある技術のいずれかを用いて、タンパク質結合の程度を評価するために、結合を遊離タンパク質から分離することができる。概してこの分離ステップには、細胞膜を、たとえばフィルタへ接着後に洗浄、プラスチックへ接着後に洗浄、或いは、遠心分離するなどの手順を含むことができる。ＴＧＦベータタンパク質が媒介する機能（たとえば、第二メッセンジャーの標識（たとえば細胞増殖）、リン酸イノシトールプールの変化、ルシフェラーゼタイプのアッセイを使用した転写など）に対する薬物の効果をスクリーニングするために、生菌を使用することもできる。一部の検出法では、分離ステップを排除できる（たとえば、接近感応性検出システム）。
【００９５】
タンパク質の質的又は量的解析は、さまざまな非競合性イムノアッセイ法で測定できる。たとえば、２サイト固相サンドイッチイムノアッセイを用いることができる。このようなアッセイにおいては、タンパク質（たとえば抗体）用の結合性組成物が、担体に付着される。異なる部位でタンパク質に結合する２番目のタンパク質結合性組成物（こちらも抗体であってよい）が、標識化される。タンパク質上の両方の部位に結合が成立した後、結合されていない標識結合性組成物を取り除き、固相に結合された標識結合性組成物の量を測定する。結合した標識結合性組成物の量は、試料内のタンパク質の量に正比例する。
【００９６】
以上に記載したイムノアッセイのフォーマットでは、標識アッセイ要素を使用する。標識は、公知技術の方法により、アッセイの所望の要素に、直接的又は間接的にカップリングすることができる。様々な標識及び方法を用いることができる。従来は、放射性の標識が配合された３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ又は３２Ｐが使われた。非放射性の標識にはタンパク質が含まれ、このタンパク質が、標識タンパク質に対する特異性結合ペアのメンバーとしての役割を果たすことのできる標識化された抗体、蛍光物質、化学発光材料、酵素、及び抗体に結合する。標識は、感応性の要件、化合物に対する接合の容易さ、安定性の要件、及び利用可能な器具によって選択される。使用可能なさまざまな標識化、又はシグナル生成システムについての議論は、特許第４３９１９０４号明細書を参照。
【００９７】
特定のタンパク質に反応する抗体結合組成物は、種々のイムノアッセイ法で測定することもできる。イムノアッセイ技術によって抗体を測定する際に適用できる免疫学的手順又はイムノアッセイの手順についての議論は、Ｓｔｉｔｅｓ及びＴｅｒｒ編、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（７ｔｈ  ｅｄ．）ｓｕｐｒａ、Ｍａｇｇｉｏ  編、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ｓｕｐｒａ、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ｓｕｐｒａを参照。
【００９８】
簡単に言えば、標的タンパク質に反応する抗血清を測定するイムノアッセイは、競合性又は非競合性、いずれの結合アッセイであってもよい。競合的結合アッセイにおいて、サンプル検体は、固体表面に結合された補足剤上の特定の結合部位への結合を、標識化された検体と競合する。好ましくは、捕捉剤は、精製組換えタンパク質である。他のタンパク源（たとえば、単離した、或いは、部分的に精製した自然由来のタンパク質）を用いることもできる。非競合性アッセイには、サンドイッチ法が含まれる。サンドイッチ法では、サンプル検体は２つの検体特異性結合性試薬の間に結合される。結合性組成物の１つは、捕捉剤として使われ、固体表面に結合する。第２の結合性組成物は、標識化され、結果として生じる複合体を視覚的手段又は計測手段によって測定又は検出するために用いられる。捕捉剤と標識結合性組成物は、様々な組み合わせで用いることができる。タンパク質の測定には、様々なイムノアッセイフォーマット、分離手法、及び標識を上記のものと同様に用いることができる。
【００９９】
たとえば、対象となる抗体の、特定の抗原を免疫沈降する性能は、ウエスタンブロット解析によって評価することができる。パラメータを変更して、抗体の抗原への結合を改善させたり、バックグラウンドを減少させたりすることが可能であることは、当業者には周知である（たとえば、セファロースビーズを用いて細胞可溶化物をあらかじめ除去する）。免疫沈降プロトコールに関する詳細な議論は、たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋにおいて参照できる。
【０１００】
ＥＬＩＳＡアッセイには、抗原を準備し、９６穴マイクロタイタープレートのウェルに抗原を塗布し、ウェルに酵素基質（たとえば西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリ性ホスファターゼ）などの検出可能な化合物に接合した対象となる抗体を添加し、一定期間インキュベーションし、抗原の存在を検出するというステップが含まれる。ＥＬＩＳＡにおいて、対象となる抗体を必ずしも検出可能な化合物に接合する必要はなく、その代わりに、上記抗体を認識する第二抗体を検出可能な化合物に接合し、ウェルに添加してもよい。更に、ウェルに抗原を塗布する代わりに、抗体をウェルに塗布することもできる。この場合、検出可能な化合物に接合された第二抗体は、コーティングされたウェルに対象となる抗原を添加した後に、添加することができる。当業者は、過度の実験を実施することなく、たとえば、シグナルを増加させるにはどのパラメータを調整すべきか、或いは、他のどの種類のＥＬＩＳＡを利用すべきかなどを判断できる（たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。
【０１０１】
抗体の抗原に対する結合能、及び、抗体抗原相互作用のオンレート及びオフレートは、競合的結合アッセイを使用することで測定できる。非限定例の１つは、ラジオイムノアッセイである。ラジオイムノアッセイでは、増加する非標識抗原の存在化において、標識抗原（たとえば３Ｈ又は１２５Ｉを用いる）を対象となる抗体と共にインキュベーションし、標識抗体に結合された抗体の量を検出するというステップが含まれる。対象となる抗体の、特定の抗原に対する親和性、及び、結合のオフレートは、たとえば、スキャッチャードプロット解析によって、データから測定することができる。第二抗体との競合は、たとえば、ラジオイムノアッセイを使用して測定することもできる。この場合、抗原は、標識化合物（たとえば３Ｈ又は１２５Ｉ）に接合された対象となる抗体と共に、増加する非標識第二抗体の存在下においてインキュベーションされる。
【０１０２】
物理的な変異体
本発明はまた、本願明細書に記載されるアミノ酸配列とアミノ酸配列の実質的な類似性及び／又は同一性を有するポリペプチド配列を包含する。アミノ酸の配列類似性又は配列同一性は、残基を同一となるように最適化することによって決定される。このことは、保存的置換を同一であるとみなすときに変化する。保存的置換は、一般的にグリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；及び、フェニルアラニン、チロシン基内の置換を含む。Ｎｅｅｄｌｅｈａｍら（１９７０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３；Ｓａｎｋｏｆｆら（１９８３年）Ｔｉｍｅ  Ｗａｒｐｓ、Ｓｔｒｉｎｇ  Ｅｄｉｔｓ、ａｎｄ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ｃｈａｐｔｅｒ  Ｏｎｅ、Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ、Ｒｅａｄｉｎｇ、ＭＡ；及び、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡからのソフトウェアパッケージ；及び、ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩも参照のこと。
【０１０３】
本発明は、限定されるものではないが、本願のある具体的な配列識別子によってコードされるポリペプチドに機能的に関連するポリペプチド配列を包含する。機能的に関連するポリペプチドは、結合性組成物（たとえば、ＴＧＦベータ１には選択的及び／又は特異的に結合するが、ＴＧＦベータ２及び／又は３には結合しない能力）と機能特性を共有する任意のポリペプチドを含む。かかる機能的に関連するポリペプチドは、限定されるものではないが、本願明細書に記載される配列によってコードされるアミノ酸配列内のアミノ酸残基の追加又は置換、特にサイレント変化となることによって機能的に等価なポリペプチドを産生するものを含む。アミノ酸置換は、関係する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性の性質における類似性に基づいて行なうことができる。
【０１０４】
たとえば、無極の（疎水）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンを含有し、極性が中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンを含有し、正に荷電する（塩基の）アミノ酸は、アルギニン、リジン、及びヒスチジンを含有し、負に荷電する（酸性の）アミノ酸は、アスパラギン酸、及びグルタミン酸を含有する。
【０１０５】
さらにまた、非古典的なアミノ酸又は化学アミノ酸誘導体は、ポリペプチド配列に置換又は追加される場合がある。非古典的なアミノ酸は、限定されるものではないが、たとえば、一般のアミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅＡｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｄ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロアミノ酸、ｂ−メチルアミノ酸のようなデザイナーアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸、及び一般のアミノ酸誘導体を含む。さらにまた、アミノ酸は、右旋性（Ｄ）又は左旋性（Ｌ）のいずれかであってよい。
【０１０６】
取り扱いが容易となるペプチド部分の追加は、周知の常套的な技術である。さらに、結合性組成物（その任意の断片及び特にエピトープを含む）は、イムノグロブリン（たとえば、そのＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭの部分（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）並びに全体のドメイン及びその部分の両方を含むそれらの任意の組み合わせ）の、不変ドメインの部分と組み合わせることができ、キメラポリペプチドが得られる。かかる融合タンパク質は、精製を促進することがあり、タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏの半減期を増加させることに有用であることが多い。たとえば、このことは、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメイン、及び哺乳類の免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖の定常領域のさまざまなドメインを含むキメラタンパク質について証明されている（欧州特許第３９４，８２７号明細書；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：８４−６）。ジスルフィドに結合された二量体の構造（ＩｇＧドメインに起因する）を有する融合タンパク質は、他の分子に結合して中和する際に、単遺伝子性の分泌されたタンパク質又は唯一のタンパク質断片よりも効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、１９９５年、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５、２７０：３９５８−６４）。免疫系に対する上皮性関門全体の抗原が増大した送達は、ＦｃγＲ結合しているパートナー（たとえばＩｇＧ又はＦｃ断片）に共役される抗原（たとえばインシュリン）について証明されている（たとえば国際公開第９６／２２０２４号パンフレット及び国際公開第９９／１０４８１３号パンフレットを参照のこと）。
【０１０７】
加えて、融合タンパク質は、ヒトタンパク質（又はその一部）と共に、免疫グロブリン分子の定常領域のさまざまな部分を含み得る。多くの場合に、融合タンパク質におけるＦｃ部分は、治療及び診断において有益であり、したがって、たとえば改良された薬物動態学的な特性を得ることができる。あるいは、融合タンパク質が発現、検出、及び精製された後に、Ｆｃパートを欠失させることが所望される場合がある。たとえば、融合タンパク質が免疫化のための免疫原として使用される場合には、Ｆｃ部分は、治療及び／又は診断を妨げることができる。たとえば薬物発見において、ヒトタンパクは、拮抗剤を確認する高いスループットスクリーニングアッセイのために、Ｆｃ部分と融合されている。
【０１０８】
さらにまた、新規な構造体は、他のタンパクから類似の機能的ドメインを組み合わせることによって作製できる。たとえば、タンパク結合又は他のセグメントは、異なる新たな融合ポリペプチド又は断片の間で「交換」できる。したがって、特異性の新しい組み合わせを呈する新しいキメラポリペプチドは、タンパク結合特異性及び他の機能的ドメインの機能的結合から生じる。加えて、融合構造は、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エクソンシャフリング、及び／又はコドンシャフリングの技術によって生成できる。
【０１０９】
「実質的に純粋である」というのは、自然環境から取り出され、他の汚染するタンパク質、核酸、及び他の生物学的製剤から分離及び／又は切り離された、核酸、タンパク質、又はポリペプチドを指す。純度又は「アイソレーション」は、標準的な方法によって検定することができ、通常は少なくとも約５０％純粋であり、より通常には少なくとも約６０％純粋であり、一般的には少なくとも約７０％純粋であり、さらに一般的には少なくとも約８０％純粋であり、しばしば少なくとも約８５％純粋であり、よりしばしば少なくとも約９０％純粋であり、より好ましくは少なくとも約９８％純粋であり、最も好ましい態様において少なくとも約９９％純粋である。同様の概念は、たとえば結合性組成物（たとえば本発明の抗体など）にあてはまる。たとえば、組換え細胞のタンパク質又はポリペプチドからポリペプチドを精製することが望ましい場合がある。
【０１１０】
タンパク質又はポリペプチドの「溶解性」は、スベドベリ単位において測定される遠心沈降によって反映される。スベドベリ単位は、特定の条件下での分子の沈降速度の測定である。沈降速度の決定は、古典的には分析用超遠心機において実施されたが、現在では一般的に標準的な超遠心機において実施される（Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ、１９８２年、Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第２版）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；及び、Ｃａｎｔｏｒ及びＳｃｈｉｍｍｅｌ（１９８０年）Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙパート１〜３、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡを参照のこと）。粗分析定量として、溶解性のポリペプチドを含むと推定されるサンプルは、約１０分間にわたり約５０Ｋのｒｐｍで標準的な原寸の超遠心機で回転させ、溶解性の分子を上澄みの中に残す。溶解性の粒子又はポリペプチドは、一般的には約３０Ｓ未満であり、より一般的には約１５Ｓ未満であり、通常は約１０Ｓ未満であり、より通常は約６Ｓ未満であり、特定の態様において、好ましくは約４Ｓ未満であり、より好ましくは約３Ｓ未満である。ポリペプチド又は断片の溶解性は、環境及びポリペプチドに依存する。多くのパラメータは、ポリペプチドの、温度、電解液環境、大きさ及び分子の特性、及び溶剤の性質を含む、ポリペプチド溶解性に影響を及ぼす。一般的に、ポリペプチドが使用される温度は、約４℃〜約６５℃の範囲にわたる。通常、使用における温度は、約１８℃よりも高く、より通常は約２２℃よりも高い。診断目的のため、温度は、通常はほぼ室温以上であるが、アッセイの構成成分の変性融点よりも低い。治療目的のために、温度は通常は体温であり、ヒトについては一般的に約３７℃であるが、特定の状況下で、温度は、ｉｎ  ｓｉｔｕ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで上下する場合がある。ポリペプチドの大きさ及び構造は、一般的には実質的に安定状態にある必要があり、通常は変性状態である必要はない。ポリペプチドは、たとえば溶解性を与えるために四次構造の他のポリペプチドと会合するか、又は天然の脂質二重層相互作用に近い方法で脂質又は洗浄剤と会合することができる。
【０１１１】
溶剤は、通常は生物活性の保存のために使用し、生物学的に適合性のある緩衝液であって、通常は生理学的な溶剤に近い。通常、溶剤のｐＨは、一般的にほぼ５〜１０、好ましくは約７．５、中性である。一部の場合において、タンパク質の構造的又は生理学的な特性の有意な破壊を回避するために、一般的に穏やかな非変性の洗浄剤（たとえばＣＨＳ（コレステリルヘミスクシナート）又はＣＨＡＰＳ（３−［３−胆汁アミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸））、又は十分に低い濃度の洗浄剤が添加される。好ましい態様において、本発明の結合性組成物（ｐＨ５．０〜６．０及び１５０ｍＭのＮａＣｌ）の溶解性は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０ｍｇ／ｍＬよりも大きく、より好ましい態様において、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０ｍｇ／ｍＬよりも大きく、さらにより好ましい態様において、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、又は６０ｍｇ／ｍＬよりも大きく、よりいっそう好ましい態様において、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、又は１５０ｍｇ／ｍＬよりも大きい（又は、そのような任意の２つの値の間の範囲にあり、上限及び下限の数値のいずれか又は両方を含んでもよく、含まなくてもよい）。
【０１１２】
変異体
本発明は、たとえば本発明のポリペプチド配列（又はその断片）と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、又は代替的にそのようなアミノ酸配列からなるポリペプチドを示す。特定の配列が結合性組成物の配列に対して同一性を示すかどうかを決定することは、当該技術分野において周知の方法を使用して達成できる。
【０１１３】
一般的に、そのような配列の比較において、ある配列は参照配列として作用し、それに対してテスト配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用するときに、テスト配列及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて、得られた座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次に、配列比較アルゴリズムは、特定のプログラムのパラメータに基づいて、参照配列と関連してテスト配列についてのパーセンテージ配列同一性を算出する。
【０１１４】
比較用の配列の最適整列は、たとえば、以下によって実施することができる。Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１年）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局在性ホモロジアルゴリズム；Ｎｅｅｄｌｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（１９７０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３のホモロジ整列化アルゴリズム；Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（１９８８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ´ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４の類似性検索の方法；これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実施（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）；ＤＮＡＳＴＡＲ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）によって生産されるＬＡＳＥＲＧＥＮＥ生命情報科学コンピューティングセット；Ｎｏｔｒｅｄａｍｅらによって開発された複数の配列整列法（たとえば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００４年：３２（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｗ３７−４０；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００３年７月１日；３１（１３）：３５０３−６；又はＰｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００２年１月；３（１）：１３１−４における、３Ｄｃｏｆｆｅｅ又はＴｃｏｆｆｅｅ）；又は外観検査（一般的に上記のＡｕｓｕｂｅｌらを参照のこと）。最適な整列を測定することによってヌクレオチド又はアミノ酸配列を比較する他の方法は、周知である（たとえば、Ｐｅｒｕｓｋｉ及びＰｅｒｕｓｋｉ、Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｕｍｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２３−１５１頁におけるＷｕら（ｅｄｓ．）の「Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｕｐｅｒｈｉｇｈｗａｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｄａｔａｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．１９９７年）；又はＢｉｓｈｏｐ（ｅｄ．）のＧｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，第２版（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９８年）を参照のこと）。
【０１１５】
他のアミノ酸配列に対して、たとえば少なくとも約９５％の「配列同一性」を呈するか又は有するポリペプチドは、たとえば、試験用アミノ酸配列の各１００のアミノ酸鎖につき、最高５つのアミノ酸変異を含有することができる。換言すれば、第２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一性である第１のアミノ酸配列は、たとえば、アミノ酸残基の挿入、欠失、又は置換によって、第２の配列とは異なるアミノ酸残基の総数の最高５％を含有することができる。ポリペプチド配列のアミノ残基の変質は、たとえば、アミノ又はカルボキシ末端位置において、或いは、これらの末端位置の間のどこでも発生することが可能である。これらの末端位置は、配列における残基の間に個々に、或いは、配列内の１又は複数の隣接するアミノ残基セクション、部分又は断片のいずれかに点在する。実際問題として、たとえば、本願明細書中の表に示すように、任意の特定のポリペプチド配列が他の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の類似性を呈するか否かは、当該技術分野において周知の方法を使用して判定できる。
【０１１６】
本発明によって包含される変異体は、コード領域、非コード領域、又は両方における変質を含み得る。さらに、任意の組み合わせにおいて１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸が置換、欠失、又は追加される変異体もまた好ましい。非自然に生じる変異体は、突然変異誘発技術によって、又はタンパク質工学及び組換えＤＮＡ技術の周知の方法を使用する直接的な合成によって産生できる。かかる変異体は、結合性組成物ポリペプチド（又はその断片）の特性を改良するか又は変質するように生成できる。たとえば、１又は複数のアミノ酸は、生物学的機能を実質的に損失することなく、本発明の分泌されたポリペプチド（又はその断片）のＮ末端又はＣ末端から欠失させることができる。たとえば、Ｒｏｎら（１９９３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４−８）は、３、８、又は２７のアミノ末端アミノ酸残基を欠失させた後でさえ、ヘパリン結合活性を有する変異体ＫＧＦタンパクを報告している。たとえば、分泌された形態の大部分に満たない残基が、Ｎ末端又はＣ末端から取り除かれるときに、抗原性及び／又は免疫原性が保持できる（たとえば、ポリペプチドの成熟形態を認識する抗体を誘導及び／又は結合する遺伝子欠失変異体の能力）。タンパク質のＮ末端又はＣ末端の残基が欠失したポリペプチドがかかる活性を保持するかどうかは、本願明細書に記載される日常的な方法又は当該技術分野において公知の日常的な方法で、容易に決定される。したがって、本発明はまた、たとえば生物活性（たとえば免疫原性又は抗原性など）を示すポリペプチド変異体を包含する。かかる変異体は、たとえば、当該技術において周知である一般的に規定させる活性に対してほとんど影響を及ぼさないように選択される欠失、挿入、逆位、反復及び置換を含む。たとえば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作ることに関する教示は、たとえばＢｏｗｉｅら（（１９９０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０）から得られる。
【０１１７】
たとえば、保存的アミノ酸置換を使用することの他に、本発明の他の変異体は、限定されるものではないが、たとえば以下のいずれかを含む。（ｉ）１以上の非保存的アミノ酸残基による置換（置換アミノ酸残基は遺伝子コードによってコードされるものであってもなくてもよい）（ｉｉ）置換基を有する１以上のアミノ酸残基による置換（ｉｉｉ）他の化合物（たとえばポリペプチド（たとえばポリエチレングリコール）の安定性及び／又は溶解性を増加させる化合物）による成熟ポリペプチドの融合（ｉｖ）付加アミノ酸（たとえばＩｇＧ  Ｆｃ融合領域ペプチド、若しくはリーダー配列又は分泌配列、若しくは精製を容易にする配列）によるポリペプチドの融合。そのような変異体はすべて本願明細書における出願人の教示が前提とする分子生物学の当業者の範囲内である（たとえば他とは異なるユニークなポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を特定すること）。
【０１１８】
たとえば、他の荷電アミノ酸又は中性アミノ酸による荷電アミノ酸のアミノ酸置換を含むポリペチド変異体は、改良された特性（たとえばより少ない凝集など）を有するポリペチドを産生できる。医薬組成物の凝集は、凝集物の免疫原の活性に起因して、活性を減少させ、クリアランスを増加させる（Ｐｉｎｃｋａｒｄら（１９６７年）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３ｌ−３４０；Ｒｏｂｂｉｎｓら（１９８７年）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３６：８３８−８４５；Ｃｌｅｌａｎｄら（１９９３年）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １０：３０７−３７７）。好ましい態様において、適切なｐＨ／緩衝液系において製剤化される本発明の結合性組成物（本願明細書に記載されているか、或いは、周知の技術である）は、約１〜１０℃、より好ましくは２〜８℃、さらにより好ましくは３〜７℃、及びさらにより好ましくは５〜６℃の範囲の温度条件の下で、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、又は９ヶ月にわたるインキュベーション後でも有意な凝集を示さない。
【０１１９】
本発明のさらなる態様は、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むが、５０以下のアミノ酸置換、さらにより好ましくは４０以下のアミノ酸置換、さらにまたより好ましくは３０以下のアミノ酸置換、さらによりいっそう好ましくは２０以下のアミノ酸置換、又は１５以下のアミノ酸置換を含む本発明のアミノ酸配列を含む組成物を包含する。もちろん、好適である順番において、ペプチド又はポリペプチドは、本発明のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有することが極めて好ましく、アミノ酸配列は、少なくとも１個の、しかし１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸置換を含む。特定の態様において、本発明のポリペプチド配列又はその断片における、追加、置換、及び／又は欠失の数は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、１０〜５０、又は５０〜１５０であり、保存的アミノ酸置換は非保存的な置換よりも好ましい。
【０１２０】
治療用途
本発明はまた、有用な治療的価値を備えた試薬を提供する。本発明の治療学的な結合性組成物は、たとえば、限定されるものではないが、本発明の抗体結合組成物（本願明細書に記載される断片、類縁体、及びその誘導体を含む）、及びそれらをコードする核酸分子（本願明細書に記載される断片、類縁体並びにその誘導体、及び抗イディオタイプの抗体を含む）を含む。そのような抗体は、異所性の発現及び／又はＴＧＦベータ１（又はその断片）の活性に関連する疾患、障害、又は状態を、調整、治療、阻害、回復、又は防止するために使用することができる。それらは、たとえば、限定されるものではないが、本願明細書に記載される疾患、障害、症候群、又は状態のうちの任意の１又は複数を含む。異所性の発現及び／又はＴＧＦベータ１の活性に関連する疾患、障害、又は状態の治療、回復及び／又は防止は、たとえば、限定されるものではないが、それらの疾患、障害又は状態に関連する症状を回復させることを含む。
【０１２１】
たとえば、ＴＧＦベータ１による異常性の発現又は異常性のシグナリングに関連する疾患又は障害は、ＴＧＦベータ１（たとえば本発明の結合性組成物）の拮抗剤の対象となる。本発明は、動物、好ましくは哺乳類、最も好ましくは霊長類（たとえばヒト）に結合性組成物を投与することを含む、結合性組成物に基づいた治療法を包含することによって、本願明細書に記載して開示した疾患、障害、又は症状のうちの１又は複数を、調整、治療、阻害、達成、又は回復させる。たとえば、理論によって固められてはいないが、ヒトＴＧＦベータに特異的な抗体は、ＴＧＦ受容体（ＴＧＦＲ）が完全に発現される疾患治療用の動物モデルに効果的であることが示されている。ＴＧＦベータに対する抗血清は、糸球体腎炎（Ｂｏｒｄｅｒら、１９９０年、Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：３７１−４）及び肺線維症（Ｇｉｒｉら、１９９３年、Ｔｈｏｒａｘ  ４８：９５９−６６）の治療に効果的であることが示されている。従って、改良された特性を有する本発明の新規な結合性組成物は、症状、状態、又は疾患（たとえばＴＧＦベータ１に関連する線維症及びその症状など）の回復にも効果的である。
【０１２２】
本発明の、組み換え型結合性組成物及び／又は単離された結合性組成物（たとえば抗体など）は、精製して治療の被験者に投与することができる。これらの試薬は、生理的に無害な安定剤及び賦形剤とともに、たとえば従来の薬理学的に許容できる担体又は希釈液（たとえば免疫原のアジュバント）において、付加的な活性又は不活性の成分とともに使用するために組み合わせることができる。これらの組み合わせは、投与バイアルにおける凍結乾燥、或いは、安定化水性製剤における貯蔵によって細菌濾過して剤形の中に入れることができる。本発明はまた、抗体又はその結合性の断片の使用を企図し、補体結合でない形態を含む。
【０１２３】
本発明の範囲内に含まれる別の治療アプローチは、任意の従来の投与技術（たとえば、限定されるものではないが、局所注入、吸入、又は全身投与）による、試薬、製剤、又は組成物の、被験者への直接投与を含む。本発明はまた、たとえば、治療のために、本発明の組成物の１以上の成分が入った容器と、例えば（典型的には医薬品又は生物学的産生物の製造、使用、又は販売を規制する政府機関によって指定される形での）処分についての説明書を含んでなる製薬パック又はキットを提供する。投与の方法は、静脈内、腹腔内、又は筋肉内の投与、経皮的な拡散、及びその他を含む。薬理学的に許容できる担体としては、例えばＭｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ、ＮＪ）に記載されている水、生理的食塩水、緩衝液、及び他の化合物が挙げられる。
【０１２４】
本願明細書に包含される進行する他の異常な状態は、ノーザンブロット解析によってＴＧＦベータ１メッセンジャーＲＮＡを所有することが示される細胞型において知られている（たとえば、Ｂｅｒｋｏｗ（ｅｄ．）Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．；Ｔｈｏｒｎら、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｙ．；及びＲｉｃｈ（ｅｄ．）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｍｏｓｂｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ（ｃｕｒ．ｅｄ．）及び下記を参照）。（たとえば、ニューロン、免疫性、又は造血系の）発達又は機能の異常は、本願明細書において提供される組成物を使用する予防又は治療の影響を受けやすい医学的な異常及び状態を顕著に生じる。
【０１２５】
本発明の範囲に含まれる別の治療アプローチは、任意の従来の投与技術（たとえば、限定されるものではないが、局所注入、吸引、又は全身投与）による、試薬、製剤又は組成物の、被験者への直接投与を含む。包含される試薬、製剤、又は組成物は、本願明細書に記載されているか、或いは、当該技術分野において公知の任意の方法によって標的にできる。疾患、障害、状態、症候群、その他を調整する、試薬、製剤、又は組成物の実際の投与量は、生体の大きさ及び健康を含む多くの要因に依存する。しかしながら、当業者は、臨床的な投与量を決定する方法及び技術を記載する以下の教示を使用できる（たとえば、Ｓｐｉｌｋｅｒ（１９８４年）Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｂｏｏｋｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．７−１３，５４−６０；Ｓｐｉｌｋｅｒ（１９９１年）Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．９３−１０１；Ｃｒａｉｇ及びＳｔｉｔｚｅｌ（ｅｄｓ．１９８６年）Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，第２版、Ｌｉｔｔｌｅ，Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ｐｐ．１２７−３３；Ｓｐｅｉｇｈｔ（ｅｄ．１９８７年）Ａｖｅｒｙ’ｓ  Ｄｒｕｇ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第３版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ及びＷｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ｐｐ．５０−５６；Ｔａｌｌａｒｉｄａら（１９８８年）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ｐｐ．１８−２０；及び米国特許第４，６５７，７６０号明細書；米国特許第５，２０６，３４４号明細書；又は米国特許第５，２２５，２１２号明細書）。一般的に、終末濃度を含むおよそ０．５ｆｇ／ｍｌ及び５００ｕｇ／ｍｌの間の（両方を含む）範囲において、任意の薬理学的に許容できる担体で、成人に１日あたりに投与されるものである。さらにまた、動物実験は、ヒトの治療上有効量を決定するために、信頼性の高い指標を提供する。有効量の種間のスケーリングは、当該技術分野において周知の以下の原理に従って実施できる（たとえば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ及びＣｈａｐｐｅｌｌ（１９８９年）のＴｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔにおける「Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ  Ｓｃａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ」；Ｙａｃｏｂｉら（ｅｄｓ．）Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照のこと）。
【０１２６】
有効量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又は動物モデルの試験系に由来する用量反応曲線を用いて外挿することもできる。たとえば、抗体について、投与量は一般的に、レシピエントの体重の０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。好ましくは、投与量は、レシピエントの体重の０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは、レシピエントの体重の１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。一般的に、ヒト特異的抗体は、異種特異的抗体よりも長い半減期を有する（たとえば、ヒト抗体は、おそらく異質な組成物に対して宿主の免疫反応起因し、マウスなどの別の生物種由来の抗体よりもヒト宿主内で長く持続する）。したがって、抗体がヒト被験者に与えられる場合には、ヒト抗体のより投与量が少なく、投与回数が少なくなることが多い。さらにまた、本発明の抗体の投与の投与量及び頻度は、一時変異（たとえば脂質化）を使用して摂取及び組織透過性（たとえば、脳に）を増やすることによって減少させてもよい。
【０１２７】
本発明はまた、たとえば、治療のために、本発明の組成物の１以上の成分が入った容器と、例えば（典型的には医薬品又は生物学的産生物の製造、使用、又は販売を規制する政府機関によって指定される形での）処分についての説明書を含んでなる製薬パック又はキットを提供する。
【０１２８】
有効な治療のために必要な試薬の量は、多くの異なる因子に依存し、因子は、投与の手段、標的部位、患者の生理学的な状態及び投与される他の薬物を含む。したがって、治療投与量は、安全性及び有効性を最適化するように滴定する必要がある。一般的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用する投与量は、これらの試薬のｉｎ  ｓｉｔｕの投与において有用な量の有用な指標を提供することができる。特定の障害の治療上有効量の動物試験は、ヒトの投与量をさらに予測する指標を提供する。さまざまな考察は、たとえば、Ｇｉｌｍａｎら（ｅｄｓ．）（１９９０年）におけるＧｏｏｄｍａｎ及びＧｉｌｍａｎのＴｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（第８版）Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；及び（１９９０年）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１７版）Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに記載されている。投与の方法は、経口的、静脈内、腹腔内、又は筋肉内の投与、経皮的な拡散、及びその他のために、上記及び下記に述べられている。薬理学的に許容できる担体は、たとえばＭｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ）に記載されている水、生理的食塩水、緩衝液及び他の化合物を含む。投与量は、適切な担体について、通常、１ｍＭ未満の濃度、一般的に約１０μＭ未満の濃度、通常は約１００ｎＭ未満、好ましくは約１０ｐＭ未満（ピコモル）、及び最も好ましくは約１ｆＭ（フェムトモル）未満の量であると予想される。緩効性の製剤又は緩効性の装置は、継続投与のために利用されることが多い。
【０１２９】
結合性組成物は、治療されるべき宿主に直接的に投与でき、或いは化合物の大きさに応じて担体タンパク質（たとえばそれらを投与する前のオボアルブミン又は血清アルブミン）に接合することが望ましい場合がある。治療用製剤は、任意の従来の投与量製剤で投与できる。活性成分が単独で投与されることは可能であるが、医薬製剤として提示することが好ましい。一般的に、製剤は、１又は複数の許容できる担体と共に、本願明細書で定義されるように、少なくとも１つの活性成分を含む。各担体は、他の成分と適合性があり、かつ、患者に有害でないという意味において、薬理学的及び生理的に許容可能であるべきである。製剤は、経口、直腸、経鼻、又は非経口（皮下、筋肉内、静脈内、及び皮内を含む）の投与に適した製剤を含む。製剤は、単位投与形態において都合よく提示でき、薬学の技術分野において周知の任意の方法によって調合できる。たとえば、Ｇｉｌｍａｎら（ｅｄｓ．）（１９９０年）Ｇｏｏｄｍａｎ及びＧｉｌｍａｎの以下を参照されたい。Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（第８版）Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；及び（１９９０年）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１７版）Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ；Ａｖｉｓら（ｅｄｓ．）（１９９３年）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（ｅｄｓ．）（１９９０年）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；及びＬｉｅｂｅｒｍａｎら（ｅｄｓ．）（１９９０年）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ。本発明の治療は、他の治療薬（たとえばアンジオテンシン変換酵素阻害剤）と混合して、或いは、それと組み合わせて使用できる。
【０１３０】
本発明はまた、医薬組成物を提供する。そのような組成物は、たとえば、薬理学的に許容できる担体において、本発明の組成の治療上有効量を含む。本願明細書において使用されているように、「薬理学的に許容できる担体」という用語は、アメリカ合衆国の連邦規制機関又は米国州政府の規制／管理機関によって承認される担体、又は米国薬局方又は他の薬局方において列挙された担体を意味し、一般的に、動物（たとえば哺乳類）、より具体的には霊長類（たとえばヒト霊長類）における使用について、当業者によって認識される。
【０１３１】
本願明細書において使用される「担体」という用語は、本発明の組成物とともに投与される、希釈液、アジュバント、賦形剤又は媒介物に関する。薬剤担体は、一般的に無菌の液体（たとえば水又は油）（たとえば落花生油、ダイズ油、鉱油、胡麻油などの、石油、動物、野菜、又は合成的に由来する液体を含む）であり得る。一般的に、滅菌水は、医薬組成物が静脈内に投与される際の好ましい担体である。特に注射剤溶液のために、食塩溶液及び水性デキストロース及びグリセリン溶液もまた、液体担体として使用することができる。
【０１３２】
適切な医薬賦形剤は、たとえば、限定されるものではないが、デンプン、グルコース、乳糖、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。本発明の組成物は、必要に応じて、軽微な量の湿潤剤又は乳化剤、若しくはｐＨ緩衝剤を含有できる。
【０１３３】
本発明の組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、パウダー、持効性製剤の形態とすることができ、或いは、（従来の結合剤、及び／又はたとえばトリグリセリドのような担体による）坐剤として処方することができる。適切な薬剤担体の付加的な例は、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載されている。かかる製剤は、被験者に適切な投与を提供するために、適切な量の担体と共に、好ましくは精製された形で、治療上有効量の本発明の組成物を含む。伝統的に、製剤は投与の様式に適するようにする。
【０１３４】
好ましい態様において、組成物は、たとえばヒトへの静脈内投与のために適応された医薬組成物として、常套的な手順に従って処方される。一般的に、静脈内投与用の組成物は、無菌の等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合には、組成物は、たとえば、可溶化剤及び局所麻酔薬（たとえば注射部位における快適さを促進するリドカイン）を含むこともある。一般的に、成分は、たとえば、密閉封入された容器（たとえば活性薬剤の量を示すアンプル又は小さい袋）の中の乾燥した凍結乾燥粉末又は水分を含有しない濃縮物として、単独で、或いは、単位投与形態で混合して供給される。組成物が注入液によって投与される場合には、無菌の製薬等級水又は生理食塩水が入っている注入ボトルを使用して調剤することができる。組成物が注射剤によって投与される場合には、成分を投与前に混合するために、注射用滅菌水又は生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【０１３５】
本発明の組成物は、中性又は塩の形態として処方できる。薬理学的に許容できる塩類は、たとえば、限定されるものではないが、アニオン性塩類（塩化水素酸、リン酸、酢酸、蓚酸、酒石酸酸、その他に由来するものなど）、及びカチオンの塩類（たとえば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなど）を含む。
【０１３６】
線維症、その障害又は症状
たとえば抗体などの結合性組成物は、線維症に関連する状態の治療に役立つ。細胞間マトリックス（ＥＣＭ）の構成成分の蓄積又は多種多様な細胞、組織、及び器官のＥＣＭ構成成分を有する正常な細胞形質成分の置換は、疾患をもたらす線維症となる場合がある。進行性線維症は致命的となる場合があり、多器官（たとえば腎臓）の末端器官不全に至る。症状発現前のデータ及び臨床的データの両方は、ＴＧＦ−ベータ１が、間質性線維症の基質タンパク質沈着の大きな一因であって、多くの付随する線維症及びその状態の惹起及び進行に関係していることを示す。疾患状態は、腎性線維症を含み、腎性線維症は、あらゆる種類の慢性腎疾患（ＣＲＤ）に共通である。腎性線維症の範囲は、慢性腎不全（連続強化（ＣＲＦ）、別名末期腎臟疾患（ＥＳＲＤ））の進行と明らかに相関する。慢性腎不全は、慢性的な透析又は腎移植術、及び死亡に至る場合がある。ＴＧＦ−ベータ１は、サイトカインであり、実験に基づいて、及びヒト研究及び動物研究との関連によって、そのような線維性のプロセスと最も一貫して関連性がある。
【０１３７】
ＴＧＦ−ベータ１のＥＣＭへの著しい効果は、合成の刺激及び細胞外基質成分の劣化の阻害における役割を含んでおり、数多くの検討課題になっている（たとえば、Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ  Ｉｓｓｕｅｓ  ｉｎ  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  ｖ．２３におけるＲｏｃｃｏ＆Ｚｉｙａｄｅｈ、１９９１年、「Ｈｏｒｍｏｎｅｓ，ａｕｔｏｃｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｋｉｄｎｅｙ」Ｅｄ．Ｊａｙ  Ｓｔｅｉｎ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ｐｐ．３９１−４１０；Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９８８年、Ｒｅｃ．Ｐｒｏｇ．Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｓ．４４：１５７−９７を参照のこと）。ＴＧＦ−ベータ１は、複数かつ協力的な方法で、ＥＣＭの蓄積を誘導することができる。たとえば、ＴＧＦ−ベータ１は、タイプＩコラーゲン、タイプＩＶコラーゲン、フィブロネクチン、及びラミニンを含む主なＥＣＭ構成成分のメッセンジャーＲＮＡ発現及びタンパク質生成を刺激する（Ｓｈａｒｍａ＆Ｚｉｙａｄｅｈ、１９９７年、Ｓｅｍｉｎ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １７：８０−９２）。同時に、ＴＧＦ−ベータ１は、基質を温浸するプロテアーゼ（たとえばプラスミノーゲンアクチベータ、コラゲナーゼ、エラスターゼ、及びストロメライシンなど）の生成を阻害することによって、かつ、それらのプロテアーゼの阻害剤（たとえばメタロプロテイナーゼ及びプラスミノーゲン物質阻害剤１の組織阻害剤など）を活性化することによって、ＥＣＭの劣化を妨げる（Ｓｈａｒｍａ＆Ｚｉｙａｄｅｈ、１９９５年、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ５１：Ｓ３４−６）。ＴＧＦ−ベータ１はまた、ＥＣＭのためのインテグリン及び細胞表面受容体を上方制御することによって特異性のＥＣＭタンパクと相互作用するように細胞の能力を高める（Ｈｅｉｎｏら、１９８９年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４：３８０−８）。加えて、ＴＧＦ−ベータ１は、ＥＣＭ細胞（たとえば線維芽細胞及び食細胞）を引きつける強力な走化性特性を有する（Ｒｅｉｂｍａｎら、１９９１年、ＰＮＡＳ  ８８：６８０５−９）。さらに、ＴＧＦ−ベータ１は、それ自体の発現を誘導する特有の能力を有し、異所性の線維性プロセスを潜在的に増幅する（Ｋｉｍら、１９９０年、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０：１４９２−７）。
【０１３８】
ＴＧＦ−ベータ１は、以下の疾患、症候群及び／又は症状に関係する。
＊  腎疾患−たとえば、慢性腎疾患（ＣＲＤ）；慢性腎不全（連続強化）；末期腎臟疾患（ＥＳＲＤ）；糸球体腎炎（ＧＮ）であって、たとえば糸球体間質の増殖ＧＮ、メサンギウム細管糸球ＧＮ、膜状ＧＮ、単状糸球体及び分節性糸球体ＧＮ、免疫性ＧＮ、及び半月状ＧＮを含むもの；糸球体硬化症；腎硬化症、膜性腎症、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）腎症；腎性間質性線維症；単状分節性腎糸球体硬化症、サイクロスポリン移植患者の腎性線維症；慢性腎性移植拒絶；ＨＩＶ関連腎症；腎性細胞肥大；慢性腎症を伴う尿細管間質性線維症であって、尿路内腔の閉塞又は鎮痛薬関連腎症に起因するもの、又は急性腎不全（たとえば腎虚血に起因する急性腎不全）の発症に続くものを含む（Ｓｐｕｒｇｅｏｎら、Ａｍ．Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８８：Ｆ５６８−Ｆ５７７，２００５年）；血栓性細小血管症腎性の血栓性細小血管症であって、たとえば腎糸球体内皮の細胞損傷、又は他の微小血管内皮の細胞損傷（たとえば子癇前症、エンドトキシン血症、及び放射線被曝に関連するもの）に関連するもの；腎性脈管炎；単状糸球体壊死性腎炎；糖尿病性腎障害（ＴＧＦベータ１は、腎の大多数の細胞に影響する複雑かつ多様なイベントに関連する）（Ｂｏｔｔｉｎｇｅｒ、２００２、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１３、２６００年）。これらのイベントによって、最終的に、尿細管間質性線維症及び糸球体硬化症の両方を発症し、ネフロン機能損失、及び最終的に慢性腎不全につながる。３つのＴＧＦ−ベータアイソフォームのうち、ＴＧＦ−ベータ１は、最も優性に発現したアイソフォームであるという理由のみならず、ＴＧＦ−ベータ２及びＴＧＦ−ベータ３の両方がＴＧＦ−ベータ１発現の上方制御によってそれらの効果を媒介すると思われるという理由から、慢性腎疾患の進行を媒介する際に優性であることを示す（Ｙｕ、２００３年、Ｋｉｄ．Ｉｎｔ．６４：８４４）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方の研究は、１型又は２型の真正糖尿病に伴う合併症を含む糖尿病性腎疾患（たとえば糸球体硬化症及び尿細管間質性線維症など）の病因において、ＴＧＦ−ベータ１に関係があるとされる（Ｚｉｙａｄｅｈ、１９９８年、Ｃｕｒ．Ｐｒａｃｔ．Ｍｅｄ．１：８７−９）。ＴＧＦベータに対する抗血清は、以下の治療に効果的である。糸球体腎炎（Ｂｏｒｄｅｒら、１９９０年、Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：３７１−４）；線維性腎疾患（ＴＧＦ−ベータ１は、腎性の細胞性の肥大、すなわちサイクリンに依存するキナーゼ阻害剤（たとえばｐ２７Ｋｉｐ１及びｐ２１Ｃｉｐ１）を誘導することによって、細胞周期の通常の調節を妨げることによる糖尿病性腎障害の別の特性を媒介する）（Ｗｏｌｆ及びＺｉｙａｄｅｈ、１９９９年、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ５６：３９３−４０５）。これらの阻害剤もまた、高グルコース及び糖尿病の状態によって増加する（Ｗｏｌｆら、２００１年、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ；１５８：１０９１−１１００；Ｗｏｌｆら、１９９９年、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４２：１４２５−３２；Ｗｏｌｆら、１９９７年、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７３：Ｆ３４８−５６）。それらは、サイクリンに依存するキナーゼ（主にサイクリンに依存するキナー���２／サイクリンＥキナーゼ）の活性を抑止する（Ｌｉｕ及びＰｒｅｓｉｇ、１９９９年、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７７：Ｆ１８６−９４）ことによって、網膜芽細胞腫タンパク質のリン酸エステル化を阻害して、Ｇ１期後期に細胞を停止する。細胞は、ＤＮＡ複製のないタンパク質合成の期間に入って肥大する。したがって、ＴＧＦ−ベータ１は、糖尿病性腎障害、実験の糖尿病性腎障害、及び高血圧性腎硬化症の病態生理学的特徴につながる細胞レベルにおいて、変化を引き起こす。糸球体の構造及び濾過性は、主にメサンギウム及び腎糸球体膜の細胞間マトリックス組成物によって決定されるので、ＴＧＦ−ベータ１が腎臓に著しい影響を及ぼすことは驚くべきでない。ＴＧＦ−ベータ１は、糖尿病性腎疾患の病理的な変化を媒介する（Ｚｉｙａｄｅｈ、１９９８年、Ｃｕｒ  Ｐｒａｃ  Ｍｅｄ  １：８７−８９）。増殖性糸球体腎炎（Ｂｏｒｄｅｒら、１９９０年、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．３７：６８９−６９５）及び糖尿病性腎障害（Ｍａｕｅｒら（１９８４年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７４：１１４３−１１５５）における糸球体間質の基質の蓄積は、疾患の明確かつ優性な病理学的特徴である。ＴＧＦ−ベータ１の濃度は、ヒトの糖尿病性糸球体硬化症（後生的なニューロパチ）において上昇する（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１８１４−１８１８）。ＴＧＦ−ベータ１はまた、多くの動物モデルにおける腎性線維症の起源の重要な媒介物であることが見い出されている（Ｐｈａｎら、１９９０年、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．３７：４２６；Ｏｋｕｄａら、１９９０年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８６：４５３）。ラットにおける実験的に誘導される腎炎の抑止は、ＴＧＦ−ベータに対する抗血清を使用することによって（Ｂｏｒｄｅら、１９９０年、Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：３７１）、かつ、ＴＧＦ−ベータ１に結合し得る細胞外の基質タンパク質（デコリン）によって証明されている（Ｂｏｒｄｅｒら、１９９２年、Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：３６１−３６３；たとえば、Ｂｏｒｄｅ及びＮｏｂｌｅ、１９９４年、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３１：１２８６−９２；Ｂｏｒｄｅｒら、１９８９年、Ｓｅｍｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．９：３０７−１７；Ｈａｎら、２０００年、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７８：Ｆ６２８−３４；及びＺｉｙａｄｅｈら、２０００年、ＰＮＡＳ  ９７：８０１５−２０も参照のこと）。したがって、本発明の結合性組成物は、上記の通りに、疾患、障害、症候群、及び／又は状態の治療、回復、変調、診断、及び／又は阻害において有用である。
【０１３９】
＊肝臓疾患−たとえば、肝硬変、肝線維症。肝線維症は、肝細胞性のネクローシス又は損傷に対する一般によくある応答であり、それは多種多様な要因（たとえば肝臓のホメオスタシスを妨げる任意のプロセス（特に炎症、毒性の損傷、又は変質した肝血流））及び肝臓の感染症（ウイルス性、細菌性、真菌性、及び寄生性）によって誘発される場合がある。先天性代謝異常に起因する多数の貯蔵障害は、線維症に関連することが多く、以下を含む。脂質異常（ゴーシェ病）；糖原病（特にタイプＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩ、ＩＸ、及びＸ）；１−抗トリプシン欠損症；鉄過剰負荷症候群（ヘモクロマトーシス）及び銅蓄積症（ウィルソン氏病）に見られるような外因性の物質の貯蔵；毒性の代謝産物の蓄積（チロシン血症、果糖血症、及びガラクトース血症におけるような）；及びペルオキシソーム障害（ゼルウィガー症候群）。多数の化学物質及び薬物によって、線維症、特にアルコール、メトトレキサート、イソニアジド、オキシフェノールイサチン、メチルドパ、クロルプロマジン、トルブタミド、及びアミオダロンが生じる。肝臓の循環障害（たとえば慢性心不全、肝静脈血栓症、静脈閉塞の疾患、門静脈血栓症）及び胆汁の流れに対する慢性閉塞は、線維症に至る場合がある。最後に、先天性肝線維症は、常染色体劣性奇形である。
【０１４０】
世界中の大多数の人々は、慢性ウイルス性肝炎、あるいはアルコール又は肥満症のいずれかに関連する脂肪肝炎を有する。しかし、他の線維症を誘発する傷害は、たとえば、寄生虫症（たとえば住血吸虫症）、肝細胞又は胆管上皮における自己免疫の発病、新生児の肝疾患、ウィルソンのヘモクロマトーシス及び種々の蓄積症を含む代謝異常、慢性炎症状態（たとえばサルコイドーシス）、薬物毒性（たとえばメトトレキセート又はビタミンＡ過剰症）、及び維管束障害（先天性又は後天性のいずれか）を含む。
【０１４１】
肝星細胞（ＨＳＣ）は、肝線維症におけるＥＣＭの重要な細胞性の源である（Ｌｉ及びＦｒｉｅｄｍａｎ、１９９９年、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１４：６１８−３３）。ＨＳＣは、類洞周囲のディッセ腔にあり、それは肝細胞を類洞内皮から分離する。記載されているように、肝傷害は、通常は停止しているＨＳＣを活性化し、次にＨＳＣの増殖及び活性化につながる。活性化したＨＳＣは、収縮性の筋線維芽細胞（ＭＦＢ）に対する次の表現形の分化転換を受け、これは、平滑筋アクチン、及び肝線維症に見られるＥＣＭ分子の過剰を表す。ＨＳＣのＭＦＢへの分化転換は、ストレス及び損傷に対する肝臓の線維性の反応の重要な調節因子として、完全にその役割におけるＴＧＦ−β１の発現に起因する（Ｇｒｅｓｓｎｅｒら、２００２年、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．７：ｄ７９３−８０７）。ＴＧＦ−β１は、肝線維症のエフェクター細胞の線維形成で最も強力な周知の誘導物質である（Ｓｃｈｕｐｐａｎら、２００３年、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．１０  Ｓｕｐｌ  １：Ｓ５９−６７）。したがって、活性ＴＧＦ−β１の組織及び血清中の濃度は、肝線維症において上昇し、トランスジェニックマウスにおけるＴＧＦ−β１の過剰発現及び外因性ＴＧＦ−β１を適用することによって、器官線維症を誘発することが示されている（Ｋａｎｚｌｅｒら、１９９９年、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７６：Ｇ１０５９−６８；Ｓａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９５年、ＰＮＡＳ  ２５７２−７６）。さらに、実験に基づく線維症は、抗−ＴＧＦ−β１処理によって（たとえば中和抗体又は溶解性のＴＧＦ受容体を用いて）阻害される場合がある（Ｇｅｏｒｇｅら、１９９９年、ＰＮＡＳ  １２７１９−２４；Ｑｉら、１９９９年、ＰＮＡＳ  ２３４５−４９）。活性化したＨＳＣ／ＭＦＢの観察されたＴＧＦ−β１発現、ＥＣＭ発現を上方制御するＴＧＦ−β１の効力、及びＨＳＣ上のＴＧＦ受容体の発現は、広く認められるモデルに至り、そのモデルにおいて、ＴＧＦ−β１による活性化したＨＳＣ／ＭＦＢの持続的な自己刺激／パラクリン刺激は、器官線維症を促進する際の重要な線維形成の応答である。したがって、ＴＧＦ−β１の低減は、肝線維形成を低減することが予測される（Ｗｕ及びＺｅｒｎ、２０００年、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．３５：６６５−７２）。
【０１４２】
＊肺疾患  −  たとえば：肺線維症（Ｇｉｒｉら、Ｔｈｏｒａｘ  ４８、９５９−９６６、１９９３）；特発性肺線維症；成人呼吸窮迫症候群；特発性器質化肺炎、閉塞性細気管支炎（ＢＯ）、閉塞性細気管支炎（移植に関連する）；薬物性肺疾患；放射線性肺疾患；喘息及び気腫における気道周辺の限局性線維症；過敏性肺臓炎；特発性器質化肺炎（ＣＯＰ）；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；急性間質性肺炎（ＡＩＰ）；石綿肺；自己免疫不全（たとえば全身性エリテマートーデス及び強皮症）、化学接触、又はアレルギーに関連する間質性肺線維症；喘息；新生児の慢性肺疾患（ＣＬＤ）（ＴＧＦ−β１の無調節発現は、喘息、肺線維症、及び新生児の慢性肺疾患（ＣＬＤ）を含む多くの慢性肺疾患の異常気道増殖の病因において、重要な役割を果たす）（Ｈｏｌｇａｔｅら、２００１年、Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２４  １−３：２５３−８；Ｋｈａｌｉｌら、２００１年、Ｔｈｏｒａｘ  ５６  １２：９０７−１５；Ｌｅｃａｒｔら、２０００年、Ｂｉｏｌ  Ｎｅｏｎａｔｅ  ７７  ４：２１７−２３；Ｐｕｌｌｅｙｎら、２００１年、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  １０９  ６：６２３−７；Ｓａｇａｒａら、２００２年、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１０  ２：２４９−５４；Ｓｈｅｐｐａｒｄ、２００１年、Ｃｈｅｓｔ  １２０  １  Ｓｕｐｐｌ：４９Ｓ−５３Ｓ；Ｓｔｒｉｅｔｅｒ、２００１年、Ｃｈｅｓｔ  １２０  １  Ｓｕｐｐ：７７Ｓ−８５Ｓ；Ｔｏｔｉら、１９９７年、Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｐｕｌｍｏｎｏｌ  ２４  １：２２−８）。マウスの歯槽の表面に沿った活性ＴＧＦ−β１の過剰発現によって、活発な線維性の応答が誘発され、抗体又はデコイによるＴＧＦ−β１の阻害によって、ブレオマイシンによって誘発される線維症が阻止される（Ｋｅｌｌｙら、２００３年、Ｃｕｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．９：３９４９）。さらに、肺メッセンジャーＲＮＡ全体のマイクロアレイ解析は、周知のＴＧＦ−β１誘導性の遺伝子の大部分が、実験的に誘発された繊維症において上方制御されることを示す（Ｋａｍｉｎｓｋｉら、２０００年、ＰＮＡＳ  ９７：１７７８−８３）。
【０１４３】
＊心臓血管疾患−アテローム性動脈硬化症；（ＴＧＦ−βはアテローム性動脈硬化症に関連する（たとえばＴ．Ａ．ＭｃＣａｆｆｒｅｙ：２０００年「ＴＧＦ−βｓ  ａｎｄ  ＴＧＦ−βＲｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ」Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １１：１０３−１１４を参照のこと。））；肥大心成長（Ｓｃｈｕｌｔｚら、２００２年、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１０９（６）：７８７−９６；Ｂｒａｎｄ及びＳｃｈｎｅｉｄｅｒ、１９９５年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２７：５１８）；全身性進行性硬化症（加齢による脈管構造内のＴＧＦ−β１濃度の増加に匹敵して、フィブロネクチン濃度が著しい増加する（Ｌｉら、１９９９年）。これらの変化によって、弾性のある血管から線維性の／硬直した血管に変化することが確実である。）；機械的に誘発された微小血管の線維症；サルコイドーシス；心室の線維症；放射線障害性虚血性心疾患［ホジキン病及び乳癌のために放射線治療した患者について、虚血性心疾患に起因する死亡率が著しく高いことが報告されている。特定のサイトカイン及び成長因子（たとえばＴＧＦ−β１）は、放射線障害性の内皮増殖、線維芽細胞増殖、コラーゲン沈着、及び線維症を刺激することがあり、アテローム性動脈硬化症の進展病巣に至る。］；動脈損傷（Ｗｏｌｆら、１９９４年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３、１１７２−８）；慢性静脈機能不全（ＣＶＩ）；経皮経管冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）又はステント術後の再狭窄病変；ヘルマンスキー‐パドラック症候群；多発性筋炎；強皮症；皮膚筋炎；エオジン好性筋膜炎；限局性強皮症、又はレイノー症候群の発生に関連する限局性強皮症；非梗塞性心筋の壁内冠状動脈脈管構造の血管周囲の線維症；損傷によって誘発された過形成症（たとえば再狭窄）；コラーゲン血管疾患を有するアテローム性動脈硬化症線維症（ＴＧＦ−β１は、バルーン血管形成術の後、平滑筋細胞の増殖及び動脈の細胞間マトリックスの堆積に起因する動脈壁の進行性肥厚の因子であり得る。再狭窄した動脈の直径は、肥厚によって９０％低減することがあり、直径の低減のほとんどは、平滑筋細胞体よりもむしろ細胞間マトリックスに起因するので、広範囲の細胞間マトリックス沈着を単に低減することによって、これらの血管を５０％まで広げることが可能である。ＴＧＦ−β１遺伝子によってｉｎ  ｖｉｖｏにトランスフェクトされる無傷のブタ動脈において、ＴＧＦ−β１遺伝子発現は、細胞間マトリックス合成及び過形成症の両方を伴った（Ｎａｂｅｌら、１９９３年、ＰＮＡＳ  ９０：１０７５９−６３）。）；ヒスチオサイトーシスＸ（好酸性肉芽腫）。
【０１４４】
＊軟組織線維症−（Ｂｏｒｄｅｒ及びＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９２年、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖ  ９０：１−７；Ｂｏｒｄｅｒ及びＮｏｂｌｅ、１９９４年、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３１：１２８６−９１）；勃起障害（Ｍｏｒｅｌａｎｄ，Ｒ．、１９９８年、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｉｍｐｏｔ  Ｒｅｓ  １０：１１３−２０）；リウマチ様関節炎（（Ｗａｈｌら、１９９３年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １７７，２２５−３０）。
【０１４５】
＊損傷治癒−経皮の瘢痕化；熱傷；肥厚性の瘢痕化；ケロイド形成；結膜の瘢痕化（Ｃｏｒｄｅｉｒｏ  ＭＦ、２００３年、Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ（Ｌｏｎｄ）．１０４（２）：１８１−７）（様々な濃度のＴＧＦ−β１による胎児損傷の治療は、損傷の著しい瘢痕化をもたらし、皮膚の瘢痕化におけるＴＧＦ−β１の直接的な関与を示した（Ｓｕｌｌｉｖａｎら、１９９５年、Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｓｕｒｇ  ３０：１９８−２０３）。ラットにおける治癒する損傷周囲に注入されるＴＧＦ−β１抗体を中和することは、損傷治癒率又は損傷の抗張力を妨げることなく、瘢痕を阻害することが示された。同時に、脈管形成が低減し、損傷におけるマクロファージ及び単核細胞の数が低減し、瘢痕組織における無秩序なコラーゲン繊維沈着の量が低減した（Ｓｈａｈら、１９９２年、Ｌａｎｃｅｔ  ３３９：２１３−４；Ｓｈａｈら、１９９４年、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０７：１１３７−５７；Ｓｈａｈら、１９９５年、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１０８：９８５−１００２）。瘢痕性の応答は、アンチセンスＴＧＦ−β１によって局所的に治療されるマウス損傷において減少する（Ｃｈｏｉら、１９９６年、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７４：１４４−５０）。合成ＴＧＦ−β１拮抗剤の局所塗布によって、ウサギ皮膚切除術と同様に、ブタの熱傷及び切除の損傷における瘢痕を低減した（Ｈｕａｎｇら、２００２年、ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １６：１２６９−７０；Ｗｅｒｎｅｒ及びＧｒｏｓｅ、２００３年、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ８３（３）：８３５−７０）。）
【０１４６】
＊炎症疾患−炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（たとえばクローン病（ＣＤ）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）など）（腸管炎症は、炎症サイトカイン、特にＩＦＮ−γ及びＴＧＦ−β１活性の間平衡性に依存している（Ｓｔｒｏｂｅｒら、１９９７年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １８：６１−４；Ｎｅｕｒａｔｈら、１９９６年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３，２６０５−１６；Ｌｕｄｖｉｋｓｓｏｎら、１９９７年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９；Ｂｏｉｒｉｖａｎｔら、１９９８年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８，１９２９−３９；Ｐｏｗｒｉｅら、１９９６年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３，２６６９−７４）。腸における免疫学的に媒介された組織損傷は、炎症誘発性のサイトカインの産生を増大させ、種々の異なる細胞型の転写因子ＮＦκ−Ｂを活性化する。）；リウマチ様関節炎（ＲＡ）；滑液の過形成症（ＴＧＦ−β１は、ヒトのリウマチ様関節炎滑液において上昇する（Ｌｏｔｚら、１９９０年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：４１８９−９４）。過剰量のＴＧＦ−β１は、骨棘と呼ばれる痛みを伴う骨の成長（ｖａｎ  Ｂｅｕｎｉｎｇｅｎら、１９９４年、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７１：２７９−９０）、滑液の過形成症、及びＲＡにおける炎症を形成する（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９９１年、ＰＮＡＳ  ８８：７１８０−４）。マウスの関節炎モデルにおける内因性ＴＧＦ−β１の阻害によって、骨棘形成が防止でき、軟骨修復を損ない、これらの病理的なイベントにおけるその役割を示唆する（Ｓｃｈａｒｓｔｕｈｌら、２００２年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５０７−１４）。）
【０１４７】
＊細胞増殖性疾患−数多くのデータによって、ＴＧＦ−β１が形質転換能を有するのみならず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、悪性進行、浸潤、及び転移を誘発することを証明する（Ｄｅｒｙｎｃｋら、２００１年、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ  ２９：１１７−２９；Ｃｕｉら、１９９６年、Ｃｅｌｌ  ８６：５３１−４２）。高増殖性状態、疾患、障害、症候群、及び／又は症状の例は、たとえば、限定されるものではないが、結腸、腹部、骨、乳房、消化器系、肝、膵、腹膜、内分泌系（たとえば副腎、上皮小体、脳下垂体、精巣、子房、胸腺、又は甲状腺）、眼、頭部、頚部、神経系（中枢神経系又は末梢神経系）、リンパ系、骨盤、皮膚、脾臓、胸部、及び泌尿生殖器系の新生物を含む。同様に、他の高増殖性の状態は、たとえば、限定されるものではないが、グロブリン過剰血症、リンパ球増殖の状態、パラプロテイン血症、紫斑病、サルコイドーシス、過誤腫、セザリー症候群、Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｎマクログロブリン血症、ゴーシェ病症候群、組織球増殖症、及び他の高増殖性の状態を含む。
【０１４８】
ＴＧＦ−β１の腫瘍サプレッサ活性にもかかわらず、腫瘍細胞は、成長因子がさらに生成することが多く（Ｄｅｒｙｎｃｋら、１９８７年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：７０７−１２；Ｄｉｃｋｓｏｎら、１９８７年、ＰＮＡＳ  ８４：８３７−４１）、腫瘍細胞浸潤への影響及び腫瘍微小環境の変化を通して、その発癌促進性の役割を文献によって証明されている。ＴＧＦ−β１が、腫瘍サプレッサ、及び腫瘍の発達、浸潤及び転移の有意な刺激要因の両方として作用できることは、現在では明らかである。腫瘍形成の初期段階（腫瘍がまだ良性であるときなど）において、ＴＧＦ−βは、腫瘍成長を抑止するように癌細胞に直接的に作用する。しかしながら、腫瘍が進行するにつれて、遺伝学的及び／又は生物化学的な変化によって、ＴＧＦ−β１は、癌細胞自体及び腫瘍の非悪性の間質性細胞型の両方におけるその多形質発現活性によって、腫瘍発達を刺激する場合がある。ヒト腫瘍の大半が機能性ＴＧＦ−βシグナル伝達経路を維持するにつれて、ＴＧＦ−β１による浸潤及び転移の刺激作用は、その腫瘍抑制的な役割よりも大きな臨床的結果になる可能性がある（Ａｋｈｕｒｓｔ及びＤｅｒｙｎｃｋ、２００１年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：Ｓ４４−５１）。
【０１４９】
細胞増殖性疾患における過剰量のＴＧＦ−β１産生が予後不良を伴うという証拠がかなりある（Ｔｓｕｓｈｉｍａら、１９９６年、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１０：３７５−８２；Ａｄｌｅｒら、１９９９年、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１６１：１８２−７）。腫瘍によって産生するＴＧＦ−β１が有害である可能性がある癌が数種類ある。ＭＡＴＬｙＬｕラットの前立腺癌細胞（Ｓｔｅｉｎｅｒ及びＢａｒｒａｃｋ、１９９２年、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ６：１５−２５）及びＭＣＦ−７ヒト乳がん細胞（Ａｒｔｅａｇａら、１９９３年、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒ．４：１９３−２０１）は、マウスＴＧＦ−β１を発現するベクターによるトランスフェクションの後、発癌性及び転移性になった。ＴＧＦ−β１は、ヒトの前立腺癌及び進行性胃癌において、脈管形成、転移、及び予後不良を伴う（Ｗｉｋｓｔｒｏｍら（１９９８）Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ３７：１９−２９；Ｓａｉｔｏ，Ｈ．ら（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  ８６：１４５５−６２）。乳癌において、予後不良は、ＴＧＦ−β１が増大し（Ｄｉｃｋｓｏｎら、１９８７年、ＰＮＡＳ  ８４：８３７−４１；Ｋａｓｉｄら、１９８７年；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：５７３３−８；Ｄａｌｙら、１９９０年、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．４３：１９９−２１１；Ｂａｒｒｅｔｔ−Ｌｅｅら、１９９０年、Ｂｒ．Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ６１：６１２−７；Ｋｉｎｇら、１９８９年、Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４：１３３−８；Ｗｅｌｃｈら、１９９０年、ＰＮＡＳ  ８７：７６７８−８２；Ｗａｌｋｅｒら、１９９２年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２３８：６４１−４）、タモキシフェン治療によるＴＧＦ−β１の誘発（Ｂｕｔｔａら、１９９２年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：４２６１−４）によって、乳癌のタモキシフェン治療の失敗となる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９１年、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６３：６０９−１４）。抗−ＴＧＦ−β１抗体は、無胸腺症のマウスにおけるＭＤＡ−２３１ヒト乳癌細胞の成長を阻害する（Ａｒｔｅａｇａら、１９９３年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：２５６９−７６）。これは、脾臓ナチュラルキラー細胞活性の増加と相関する治療である。潜在性のＴＧＦ−β１によってトランスフェクトされるＣＨＯ細胞もまた、ヌードマウスにおいて、低減したＮＫ活性及び増加した腫瘍成長を示す（Ｗａｌｌｉｃｋら、１９９０年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１７７７−８４）。したがって、乳房腫瘍によって分泌されるＴＧＦ−β１は、内分泌免疫抑制を引き起こす可能性がある。ＴＧＦ−β１の高い血漿濃度は、進行性乳癌患者の予後不良を示す（Ａｎｓｃｈｅｒら、１９９３年、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２８：１５９２−８）。高用量化学療法及び自家骨髄移植の前にＴＧＦ−β１の循環が高い患者は、肝臓の静脈閉塞の疾患リスクが高く（５０％までの死亡率を有する全患者の１５〜５０％）、特発性間質性肺臓炎のリスクが高い（全患者の４０〜６０％）。これらの所見の意味は、ＴＧＦ−β１の高い血漿中の濃度によってリスクのある患者を確認できるということであり、ＴＧＦ−β１を低減すれば乳癌患者におけるこれらの治療の罹患率及び死亡率を減少することができるということである。
【０１５０】
多くの悪性細胞がＴＧＦ−β１を分泌するということは、ＴＧＦ−β１産生によって、宿主免疫監視機構から腫瘍細胞が逃れるメカニズムを得ることができることを示唆する。癌を有する宿主においてＴＧＦ−β１シグナル伝達が妨害された白血球の亜集団の確立は、癌の免疫療法のための可能性のある手段を提供する。Ｔ細胞においてＴＧＦ−βシグナル伝達が妨害された移植遺伝子の動物モデルは、致命的なＴＧＦ−β１過剰発現リンパ腫腫瘍（ＥＬ４）を普通に根絶することができる（Ｇｏｒｅｌｉｋ及びＦｌａｖｅｌｌ、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７（１０）：１１１８−２２）。腫瘍細胞においてＴＧＦ−β１分泌の下方制御によって、宿主における免疫原性を回復できる一方で、ＴＧＦ−β１に対するＴ細胞無感受性は、分化の促進と自己免疫をもたらし、その要素は、寛容化した宿主において自己抗原を発現する腫瘍と闘うのに必要となり得る。ＴＧＦ−β１の免疫抑制効果もまた、ＣＤ４／ＣＤ８  Ｔ細胞計数に基づく予測よりも低い免疫反応を有するＨＩＶ患者の集団において関係している（Ｇａｒｂａら、２００２年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６８：２２４７−５４）。ＴＧＦ−β１中和抗体は、培養組織における効果を逆転させることができた。このことは、他のＴＧＦ−β１抗体阻害剤が、ＨＩＶ患者のこの亜集団に存在する免疫抑制を逆転させる効用を有する可能性があることを示す。
【０１５１】
ＴＧＦ−β１の２つの腫瘍抑止／腫瘍促進の役割は、ケラチノサイトにおいて発現するＴＧＦ−β１にわたるトランスジェニック系において明らかに解明される。トランスジェニックが良性の皮膚病巣の形成に対して耐性である際に、トランスジェニックにおける転移性への転換率は劇的に増加した（Ｃｕｉら、１９９６年、Ｃｅｌｌ  ８６（４）：５３１−４２）。原発腫瘍の悪性細胞によるＴＧＦ−β１の産生は、腫瘍発達の進行段階と共に増加する。主要な上皮癌の多くにおける研究は、ヒト癌によるＴＧＦ−β１のさらなる産生が、腫瘍発達中に比較的遅いイベントとして発生することを示唆する。さらに、腫瘍関連のＴＧＦ−β１は、腫瘍細胞に選択有利性を提供して、腫瘍発達を促進する。細胞／細胞及び細胞／ストローマの相互作用に対するＴＧＦ−β１は、浸潤及び転移に大きな影響を与える。たとえば悪性の脳腫瘍又は乳房腫瘍の患者に見られるように、腫瘍関連のＴＧＦ−β１は、活性化リンパ球のクローン増殖の強力な阻害剤であるので、腫瘍細胞による免疫学的監視から逃れることができる（Ａｒｔｅａｇａら、１９９３年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：２５６９−７６）。ＴＧＦ−β１は、アンジオスタチンの産生を阻害する。放射線療法及び化学療法などの癌治療法は、腫瘍における活性化ＴＧＦ−β１の産生を誘発するこによって、ＴＧＦ−β１の増殖阻害性効果に対して耐性のある悪性細胞の成長を選択する。したがって、これらの抗癌治療法は、リスクを増加させ、悪性腫瘍の発育を促進する。ＴＧＦ−β１によって媒介される細胞情報伝達を防止する要因は、かかる状況における極めて有効な治療戦略であるとされる。ＴＧＦ−β１に対する腫瘍細胞の抵抗によって、放射線療法及び化学療法の細胞毒性効果の多くを無効にし、ストローマにおけるＴＧＦ−β１の治療依存の活性化によって、微環境が腫瘍発達を引き起こす場合があり、線維症に至る組織損傷に寄与するので、有害となる場合がある。前立腺癌細胞は、高度のＴＧＦ−β１を発現し、脈管形成を刺激することによって、かつ、腫瘍細胞に対する免疫反応を阻害することによって、前立腺癌の成長及び転移を高めるものと思われる。前立腺癌細胞は、しばしばＴＧＦベータ受容体を欠損しており、ＴＧＦ−β１の抗増殖性及びプロアポトーシスの効果に対する耐性が得られる。したがって、ＴＧＦ−β１の高い発現及びＴＧＦベータ受容体発現の欠損は、ヒト前立腺癌患者における特に悪い予後に関連している（Ｗｉｋｓｔｒｏｍら、２０００年、Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｕｒｏｌ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．３４（２）：８５−９４）。肝細胞癌（ＨＣＣ）において、肝病巣及び結節におけるＴＧＦ−β１受容体発現の同時欠損のＴＧＦ−β１発現の誘発は、変質した肝細胞をＴＧＦ−β１誘発のアポトーシスから逃避させることによって、肝臓癌発生中に変質した肝細胞に成長効果を与える（Ｌｉｍ、２００３年、Ｍｅｃｈ  Ａｇｅｉｎｇ  Ｄｅｖ．１２４（５）：６９７−７０８）。頭頸部扁平上皮癌において、早期のＴＧＦ−β１過剰発現は、発癌促進性微小環境を提供する（Ｌｕら、２００４年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４（１３）：４４０５−１０）；結合性組成物は、直接的又は間接的な相互作用を介して、高増殖性疾患、状態、障害、又���症候群（たとえば新生物など）を調整、回復、治療、防止、及び／又は診断するために使用することができる。たとえば、高増殖性状態を調整する細胞増殖の阻害を防止することによって、或いは、免疫反応を増加させることによって（たとえば高増殖性状態に関係するタンパク質の抗原性を増加させることによって）、或いは、特異性の細胞型（たとえばＴ細胞）の増殖、分化、或いは、動員を引き起こすことによって、たとえば、ＴＧＦベータ１は、Ｔリンパ球、リンフォカイン活性化キラー細胞、ＮＫ細胞、好中球、マクロファージ、及びＢ細胞の、増殖及び機能分化を阻害する（Ｌｅｔｔｅｒｉｏ及びＲｏｂｅｒｔｓ、１９９８年、「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｂｙ  ＴＧＦ  Ｂｅｔａ」Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６：１３７−６１）。本発明の組成物を使用することによる望ましい効果は、たとえば、既存の免疫反応を強化することによって、或いは、新しい免疫反応を開始することによって達成できる。あるいは、望ましい結果は、たとえば、既存の免疫反応を減少させるか又は遮断することによって、或いは、新しい免疫反応の開始を防止することによって影響される場合がある。異常増殖細胞への局所投与は、たとえば、限定されるものではないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、細胞のマイクロインジェクション、又は媒介物（たとえばリポソーム、リポフェクチン、又は裸（ｎａｋｅｄ）ポリヌクレオチド）を含む、本願明細書に記載された当該技術分野において周知の任意の方法又は技術によって達成され得る。「細胞増殖の状態」は、任意のヒト又は動物の、疾患、症候群、障害、症状、又は状態を意味し、任意の細胞、組織、任意の部位、あるいは、器官、組織、又は身体部分の任意の組み合わせに影響を及ぼし、良性又は悪性の細胞、細胞のグループ、又は組織の単数又は複数の局在性の異常増殖を特徴とする。
【０１５２】
＊ニューロン疾患−神経の瘢痕化（Ｌｏｇａｎら、１９９４年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６：３５５−６３）；脳血管異常；アルツハイマー病（Ｍａｓｌｉａｈら、２００１年、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ３９：３９３−４００）（中前頭回（ｍｉｄｆｒｏｎｔａｌ  ｇｙｒｕｓ）におけるＴＧＦ−β１メッセンジャーＲＮＡ濃度は、明らかに脳部位の脳血管性のアミロイド堆積の相対量と相関する。そのことは、ヒトの脳血管異常におけるＴＧＦ−β１の考えられる役割を示唆する。神経膠星状細胞においてＴＧＦ−β１を過剰発現しているトランスジェニックマウスは、血管周囲の星状細胞増加、微小血管の基底膜肥厚、及び実質性退化がない場合におけるチオフラビンＳ陽性アミロイドの蓄積を含む、アルツハイマー病（ＡＤ）状の脳血管異常を発症する。脳内のＴＧＦ−β１の慢性過剰産生は、アミロイド脈管障害を伴うＡＤ患者における障害を連想させる構造的障害及び機能的障害となる（Ｂｕｃｋｗａｌｔｅｒら、２００２年、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．９７７：８７−９５））；  増殖性網膜症（Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら、２００２年、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２５：２３２０−７）；ＴＧＦ−β１過剰産生に関連する繊維増殖性の状態に関連する他の眼疾患は、増殖性硝子体網膜症を伴う網膜再付着外科手術を含む；人工水晶体体内移植による白内障摘出；及びポスト緑内障排液外科手術。
【０１５３】
＊造血性の状態／状態−脈管形成の内因性刺激要因と阻害剤との間の自然に生じる平衡性は、抑制効果が一般的に主である（たとえばＲａｓｔｉｎｅｊａｄら、Ｃｅｌｌ  ５６３４５−３５５（１９８９年）を参照のこと）。通常の生理学的条件（たとえば損傷治癒、器官再生、胚発生、及び女性の生殖作用）の下で血管新生が発生するときに、脈管形成は、厳密に調節され、空間的かつ時間的に範囲を定められる。たとえば固形腫瘍形成などの病的な脈管形成において、これらの制御調節は失敗し、無秩序な脈管形成が、多くの腫瘍性疾患及び非腫瘍性疾患の進行を継続することによって発症する場合がある。多くの重病疾患は、異常な血管新生を特徴とする（たとえば、固形腫瘍の成長及び転移、関節炎、一部の眼疾患及び乾癬を含む）；たとえば、Ｍｏｓｅｓら、１９９１年、Ｂｉｏｔｅｃｈ．９６３０−６３４；Ｆｏｌｋｍａｎら、１９９５年、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３３：１７５７−６３；Ａｕｅｒｂａｃｈら、１９８５年、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２９：４０１−１１；Ｆｏｌｋｍａｎ，「Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」Ｅｄｓ．Ｋｌｅｉｎ及びＷｅｉｎｈｏｕｓｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１７５−２０３（１９８５年）；Ｐａｔｚ，１９８２年、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．９４：７１５−４３；及びＦｏｌｋｍａｎら、１９８３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２１：７１９−２５による考察を参照のこと。血管は、栄養素及び酸素を腫瘍細胞に送達し、それらが血液系に血管内遊出（ｉｎｔｒａｖａｓａｔｅ）させて転移に至るため、腫瘍脈管形成は、腫瘍の成長及び浸潤にとって重大である。ＴＧＦ−ベータ１は、いくつかのアッセイにおける脈管形成の強力な誘導物質として作用し（Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９８６年、ＰＮＡＳ  ８３：４１６７−７１；Ｍａｄｒｉら、１９８８年、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０６：１３７５−８４；Ｙａｎｇ及びＭｏｓｅｓ、１９９０年、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１１：７３１−７４；Ｇａｊｄｕｓｅｋら、１９９３年、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５７：１３３−４４；Ｃｈｏｉ及びＢａｌｌｅｒｍａｎｎ、１９９５年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２１１４４−５０）、ＴＧＦシグナル伝達構成成分に欠陥があるマウスモデルによって、正常な血管発達におけるＴＧＦ−１の重要性を示される。さらに、ＴＧＦβ１及びその受容体ＡＬＫ−５及びＡＬＫ−１は、脈管形成の血管成熟段階に含まれる（たとえばＢｕｌｌ  Ａｃａｄ  Ｎａｔｌ  Ｍｅｄ．２０００年；１８４（３）：５３７−４４を参照のこと）。多くの疾患状態において、脈管形成は疾患状態に寄与し、たとえば、固形腫瘍形成が脈管形成に依存することを示唆する有意なデータが蓄積されている（たとえばＦｏｌｋｍａｎ及びＫｌａｇｓｂｒｕｎ、１９８７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：４４２−７を参照のこと）。本発明の別の態様において、結合性組成物の投与は、血管新生又は造血性細胞増殖に関連する疾患、障害、症候群及び／又は状態の治療、回復、変調、診断及び／又は阻害を提供する。結合性組成物を使用して所望の方法で効果が得られる悪性状態及び転移性状態は、たとえば、本願明細書に記載されているように、或いは、当該技術分野において公知であるように、限定されるものではないが、悪性腫瘍、固形腫瘍及び癌を含む（かかる障害、症候群などの考察については、たとえばＦｉｓｈｍａｎら、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｄ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ２００２年を参照のこと）。たとえば、本発明の組成物を使用して効果が得られる癌は、たとえば、限定されるものではないが、前立腺、肺、乳房、卵巣、胃、膵臓、喉頭、食道、精巣、肝臓、耳下腺、胆管、結腸、直腸、頸部、子宮、子宮内膜、腎臓、膀胱、及び甲状腺癌を含む固形腫瘍；原発腫瘍及び転移；メラノーマ；神経グリア芽細胞腫；カポジ肉腫；平滑筋肉腫；肺非小細胞癌；結直腸癌；新構成悪性腫瘍；及び血液由来の腫瘍（たとえば白血病）を含む。
【０１５４】
＊感染症−敗血症；（マウスのレーシュマニア感染症の過程は、ＴＧＦ−β１によって大幅に変質される。遺伝的に耐性のあるマウスは、ＴＧＦ−β１の投与に応じて、レーシュマニア感染症にかかりやすくなった。ＴＧＦ−β１は疾患を悪化させたが、ＴＧＦ−β１抗体は疾患進行を停止させた（Ｂａｒｒａｌ−Ｎｅｔｔｏら、１９９２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：５４５−７））。
【０１５５】
＊脱毛−脱毛症；脱毛（中和抗−ＴＧＦ−β１抗体は、用量依存的方法でアンドロゲン誘発のケラチノサイトの成長阻害を逆転させた。このことは、脱毛している真皮乳頭細胞に由来するアンドロゲン誘発性ＴＧＦ−β１が、雄性発生の脱毛症における発毛抑制を媒介することによって、ヒトの禿頭症において役割を果たしえることを示唆する）（Ｉｎｕｉら、２００２年、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１６（１４）：１９６７−９）；したがって、本発明は、脈管形成関連の疾患及び／又は障害を回復、調整、治療、防止、及び／又は診断する方法を提供し、該方法は、その必要のある被験者に対して有益に効果的な量の結合性組成物を与えることを含む。
【０１５６】
本発明の幅広い範囲は、以下の実施例を参照して最も良く理解され、実施例は本発明を特定の態様に制限することを目的としない。
【実施例】
【０１５７】
一般的手法
本願明細書に記載されている標準分析法の多くは、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；及びその関連するウェブサイト：（ｗｗｗ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．ｃｏｍ）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｂｒｏｏｋｌｙｎ，ＮＹ；又はＡｕｓｕｂｅｌら（１９８７  ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，（ＮＹ）；Ｂａｒｔｌｅｔｔ  ＆  Ｓｔｉｒｌｉｎｇ（２００３）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２２６  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，（ＮＪ）に記載又は参照されている。タンパク質精製方法としては、硫安沈殿法、カラムクロマトグラフィー、電気泳動法、遠心沈殿法、結晶法、その他の方法が挙げられる（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ（１９９０）“Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第１８２巻及びこのシリーズの他の巻：Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５  ａｎｄ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ（ｅｄ．）（１９９３）Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；及びｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ’ｓ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  ｏｎ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ｅ．ｇ．，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，若しくはＢｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ参照）。組換え技術の組み合わせによって、適切なセグメント（エピトープ標識）へ融合できる。たとえば、着脱可能なプロテアーゼ配列で、ＦＬＡＧ配列又は等価物を融合できる。Ｈｏｃｈｕｌｉ（１９８９）Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ  １２：６９−７０；Ｈｏｃｈｕｌｉ（１９９０）“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｍｅｔａｌ  Ｃｈｅｌａｔｅ  Ａｂｓｏｒｂｅｎｔ”Ｓｅｔｌｏｗ（編集）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２：８７−９８，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；並びにＣｒｏｗｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ：Ｔｈｅ  Ｈｉｇｈ  Ｌｅｖｅｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＱＵＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ参照。
【０１５８】
標準的な免疫学的技術は、たとえば、Ｈｅｒｔｚｅｎｂｅｒｇら（編集）第５版  １９９６，Ｗｅｉｒ’ｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  第１から４巻，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｂｉｅｒｅｒら編集（２００４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ、ＮＹ；及びＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第７０，７３，７４，８４，９２，９３，１０８，１１６，１２１，１３２，１５０，１６２及び１６３巻，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＵＳＡに記載されている。
【０１５９】
実施例１
ＣＤＲ及びヒトフレームワークを用いたＦａｂの構造及びスクリーニング
単一の突然変異体の抗体可変部ＣＤＲライブラリの特徴づけ及び合成するために標準方法を用いる（Ｗｕら，１９９８，ＰＮＡＳ９５：６０３７−４２参照）。ライブラリを、抗体軽鎖を含むバクテリオファージＭ１３発現ベクター及び本発明のＣＤＲ配列と共に本願明細書に記載されているヒト定常領域並びに可変部基質配列からなる重鎖遺伝子を構築する。場合によっては、標的ＣＤＲを、ヌクレオチドをアニーリングする前に、最初に除去する。オリゴヌクレオチド合成のために、コドンベースの突然変異誘発によって、本発明のＣＤＲ配列を得る。
【０１６０】
ライブラリを、最初にカプチュールリフトで選別し、最も親和性の高い変異体を識別する。カプチュールリフトによる手順（Ｗａｔｋｉｎｓ，２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：１８７−９３）は公知の技術であり、国際公開／０１６４７５１号パンフレット及び米国特許出願公開第２００２／００９８１８９号明細書に記載されている。次いで、本願明細書に記載されているように、所望のクローンを、ＥＬＩＳＡ及び細胞増殖能アッセイで固定された抗原に滴定して更に特徴づける。かかる選別の後、解離定数（Ｋｄ）、結合速度（Ｋｏｎ）及び解離速度（Ｋｏｆｆ）を、対象クローンに対して測定する。
【０１６１】
合成ＣＤＲのライブラリを、本願明細書に記載の方法又は公知の方法で欠失テンプレートに挿入して、本発明の包理ドナーＣＤＲを含む潜在的な抗体結合組成物を決定する。標準的突然変異誘発技術（Ｋｕｎｋｅｌ，１９８５，ＰＮＡＳ８２：４８８−９２）を、突然変異誘発性のオリゴヌクレオチドのプールを用いて特定のＣＤＲの置換に用いる。一般的に、フレームワーク中のＣＤＲの配置を、ＣＤＲＨ１は例外として、Ｋａｂａｔによって定義されたシステムを用いて実施する。それはＫａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａ定義の要旨である。突然変異誘発性のオリゴヌクレオチドを、対応するＣＤＲが欠失しているウリジニル化したファージテンプレートにアニーリングする。
【０１６２】
反応物を８５℃で５分間インキュベートし、次いで４５分間以上かけて２０℃まで放冷して、アニーリングを実施する。アニーリングしたサンプルを氷上に置き、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４ＤＮＡリガーゼを添加して、二本鎖ＤＮＡを生成し、反応物を４℃で５分間、次いで３７℃で９０分間インキュベートする。反応物は、抽出したフェノール、沈殿したエタノールであり、得られたＤＮＡをＤＨ１０Ｂ細胞へと電気穿孔する。ＸＬＯＬＲ細胞を反応物に添加して、ライブラリが培養される前にファージ増幅を可能にする。ファージストックを、プレートに８ｍｌの増殖培地を添加して調製し、４℃で最低４時間インキュベートする。ファージ含有培地を収集し、遠心沈殿法で浄化し、アジ化ナトリウム（０．０２％）を防腐剤として添加する。
【０１６３】
ライブラリの最初の選別を、Ｗａｔｋｉｎｓら，１９９８，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ２５６：１６９−７７，及びＷａｔｋｉｎｓ，２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７８：１８７−９３に記載されているように、プラークリフトで実施する。固定された抗ヒトκ抗体に結合する個々のプラークから発現したＦａｂを含むフィルタを、ビオチン化ＴＧＦベータ−１（バイオ−ＴＧＦベータ−１）、ニュートラアビジン−アルカリホスファターゼ（ＮＡ−ＡＰ）で、合間に簡単に洗浄しながら順次インキュベートする。関連するクローンを順番に配列し、ＥＬＩＳＡで更に特徴づける。通常ＥＬＩＳＡには、０．４ｕｇ／ｍｌのＴＧＦベータ−１、ＴＧＦ−ベータ−２又はＴＧＦ−ベータ３を、終夜４℃で塗布したＣｏｓｔａｒ３３６６のミクロタイタープレートを使用した。プレートを、各ウェルに１００ｕＬのブロッキング溶液（洗浄バッファ中の１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）を添加する前に、続けて２度洗浄する。Ｆａｂの希釈溶液を、被覆ウェル中で２２℃で１．５時間インキュベートする。洗浄後、抗ヒトκ−アルカリ性ホスファターゼ接合体を添加して、２２℃で１時間ンキュベートする。発色基質を、十分な洗浄後に添加し、Ａ５６０の吸光度で測定して、陽性クローンを同定する。
【０１６４】
ＥＬＩＳＡによるＦａｂの分析
非限定的な一実施例では、ＥＬＩＳＡに、０．４ｕｇ／ｍｌのＴＧＦベータ−１、ＴＧＦ−ベータ−２又はＴＧＦ−ベータ−３（ＴＧＦ−ベータ−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ＃２４０−Ｂ／ＣＦ，２３９ｕｇ／ｍｌ），ＴＧＦ−ベータ−２（ＲＤＩ，Ｃａｔ＃ＲＤＩ−１０３５，５０ｕｇ／ｍｌ）及びＴＧＦ−ベータ−３（ＲＤＩ，Ｃａｔ＃ＲＤＩ−１０３６／ＣＦ，５０ｕｇ／ｍｌ）を、コーティング緩衝液中で０．４ｕｇ／ｍＬに希釈した）を、終夜４℃で塗装したＣｏｓｔａｒ３３６６のミクロタイタープレートを使用する。プレートを、各ウェルに１００ｕＬのブロッキング溶液（洗浄バッファ中の１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）を添加する前に、続けて（２度）洗浄する。本発明のＦａｂの希釈溶液を、被覆ウェル中で（２２℃で１．５時間）インキュベートする。洗浄後、抗ヒトκ−アルカリホスファターゼ接合体を添加して、（２２℃で１時間）インキュベートする。発色基質を、十分に洗浄後に添加し、吸光度をＡ５６０で測定する。
【０１６５】
別の実施例では、本発明の結合性組成物を、競合ＥＬＩＳＡアッセイで検査する。一般的に、溶液相アッセイは、はじめに、結合組成物（たとえば抗体）に対する結合に関して抗原と競合し得る化合物を液相中で抗体と混合し、次いで、抗原に対する抗体の結合の程度を測定する。
【０１６６】
物質：
炭酸塩コーティング緩衝液は、５０ｍＭのｐＨ  ９．６の炭酸ナトリウムからなる。抗原は、コーティング緩衝液中で０．４ｕｇ／ｍＬに希釈されたＴＧＦ−ベータ１（Ｒ＆Ｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ＃２４０−Ｂ／ＣＦ，２３９ｕｇ／ｍｌ）、ＴＧＦ−ベータ２（ＲＤＩ，Ｃａｔ＃ＲＤＩ−１０３５，５０ｕｇ／ｍｌ）及びＴＧＦ−ベータ３（ＲＤＩ，Ｃａｔ＃ＲＤＩ−１０３６／ＣＦ，５０ｕｇ／ｍｌ）である。洗浄バッファは、０．０２ＭのｐＨ  ７．４のトリス、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０及び洗浄バッファ中に溶解した１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（ＳｉｇｍａＡ−４５０３）のブロッキング溶液からなる。陽性対照として使用するタンパク質は、マウス−抗ヒトのＴＧＦ−ベータ１、２又は３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｃａｔ＃１Ｄ１１）、マウス−抗ヒトのＴＧＦ−ベータ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｃａｔ＃ＢＡＦ３０２）及びマウス−抗ヒトのＴＧＦ−ベータ３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｃａｔ＃ＢＡＦ２４３）であり、ブロックバッファ中で１ｕｇ／ｍｌに希釈されている。使用する検出抗体複合体は、ブロッキング溶液中で使用濃度が１：２０００の抗マウスκ  −  ペルオキシダーゼ接合体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ｃａｔ＃１０５０−０５）  である。呈色反応に用いた基質は、Ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）錠剤（Ｓｉｇｍａ  ｃａｔ＃Ｐ−６９１２）であり、基質バッファ（０．１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ５．０以下の０．０５Ｍのクエン酸を有する）中に溶解される。各プレート展開前に、ＯＰＤ基質希釈標準溶液（すなわち１枚の１９６−ウェルプレートの容積）を、１２．５ｍＬの基質バッファ中に１×５ｍｇのＯＰＤ錠剤を溶解し、次いで５ｕｌの３０％のＨ２Ｏ２を添加することにより、新たに調製する。
【０１６７】
プロトコール：
単一の９６ウェルプレートを、抗原（０．４ｕｇ／ｍｌのＴＧＦ−ベータ１、２又は３であり、各ウェルごとに５０ｕＬずつ分配されている）でコーティングし、次いで、貯蔵（４℃で１６−２０時間）の前に接着テープで封止する。プレートを、各ウェルに１００ｕＬのブロッキング溶液（洗浄バッファ中の１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）を添加する前に、（前記）洗浄バッファで続けて（２度）回洗浄する。インキュベーション（２２℃でほぼ１時間）後、プレートを洗浄バッファで（２度）回洗浄する。次いで、１００ｕＬのサンプル（バッファで希釈される）又は実験対照（ＰＢＳで希釈される）のいずれかを各ウェルに添加して、（２２℃で１．５時間）インキュベートする。インキュベーション後、プレートを、各ウェルごとに１００ｕＬの抗マウスκ−ペルオキシダーゼ接合体（ブロッキング溶液中で１：２０００に希釈される）又はＳＡ−ＨＲＰ（ブロッキング溶液中で１：１０、０００に希釈される）のいずれかを添加する前に、洗浄バッファで（６度）洗浄する。試験サンプルを、各ウェルに１００ｕＬのＯＰＤ基質を添加する前に、インキュベーション（２２℃で１時間）する。発色現像（ほぼ１０分）の後、９６穴プレートを、４９０ｎｍの吸光度で測定する。
【０１６８】
このような条件下での成果は、４９０ｎｍのＴＧＦ−ベータ１で１．６ユニットより大きい吸光度を生じるが、ＴＧＦ−ベータ２及びＴＧＦ−ベータ３では有意に低い値を示し、ＴＧＦ−ベータ１に対して特異的及び／又は選択的な結合を示すＦａｂの態様である。
【０１６９】
細胞ベースのアッセイでのｍＡｂｓの分析
ＴＧＦベータ生理活性を中和し、特定のＴＧＦベータアイソフォームを中和する本発明の結合組成物の性能を試験するため、Ｔｓａｎｇら（１９９５  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ７：３８９−９７）のＨＴ−２細胞増殖アッセイを適応させることができる。ＨＴ−２細胞増殖アッセイを利用して、Ｆａｂ及びｍＡｂ組成物のインビトロ効力を判定する。簡潔には、ＨＴ−２細胞は、ＩＬ−４の存在下で増殖するが、ＴＧＦ−ベータの存在下でアポトーシスを受ける。ＴＧＦ−ベータ誘発性の細胞死を、ＴＧＦ−ベータ１を中和するＦａｂ又はｍＡｂの添加により防止する。
【０１７０】
ヒト細胞系ＨＴ−２は、ＩＬ−４に応答して増殖するが、ＩＬ−４により誘発された増殖は、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２又はＴＧＦ−ベータ３により阻害される。従って、ＴＧＦ−ベータ１に対して特異的及び／又は選択的な結合組成物は、それがＩＬ−４により誘発されたＨＴ−２細胞に対してＴＧＦ−ベータ１が有する通常の抑制効果を防止するならば、中和をしている。従って、十分なＴＧＦ−ベータ１の特異結合組成物をＴＧＦ−ベータ１を含むＨＴ−２細胞の混合液に添加する場合、ＩＬ−４により誘発される細胞増殖は制約を受けることなく進行するはずである。従って、本発明の結合組成物の用量応答中和能力を、特定のＴＧＦアイソフォーム及びＩＬ−４増殖シグナルの存在下で、ＨＴ−２アッセイを使用して評価する。細胞増殖の程度を、市販の比色細胞増殖測定（たとえば、ＰｒｏｍｅｇａのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）を用いて評価する。
【０１７１】
ＨＴ−２細胞を、それぞれ１００Ｕ／ｍｌ及び１００ｕｇ／ｍｌの１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、５０ｕＭのβ−メルカプトエタノール及び１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加したＲＰＭＩ１６４０中で維持する。細胞を、Ｊｏｕａｎ  ＣＲ４２２遠心分離機で１０００回転数／分で遠心分離して、ＰＢＳ中で再懸濁する。ＰＢＳで２度洗浄した後、それぞれ１００Ｕ／ｍｌ及び１００ｕｇ／ｍｌの２％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、５０ｕＭβの−メルカプトエタノールを添加した遊離フェノールレッドＲＰＭＩ１６４０からなるアッセイ媒体中で細胞を最終的に再懸濁し０．１５ｘ１０６細胞／ｍｌとする。アッセイ媒体中の５０ｕｌの細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに添加する。細胞バイオアッセイに被検ｍＡｂｓを添加する前に、種々の濃度のｍＡｂを、３００ｐｇ／ｍｌのＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２又はＴＧＦ−ベータ３（アッセイ媒体中）とプレインキュベートする。３０分のインキュベーション後、５０ｕｌのＴＧＦ−ベータ／Ｆａｂ混合液を細胞に添加し、次いで直ちに４５ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ−４（終濃度１５ｎｇ／ｍｌ）を含む５０ｕｌのアッセイ媒体を添加する。２０〜４８時間のインキュベーション後、３５ｕｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６水溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ）を添加する。更に２〜３時間のインキュベーション（加湿状態で３７℃、５％の二酸化炭素雰囲気の下）の後、アッセイを、ＥＬＩＳＡプレート読み取り装置上で、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）比色アッセイを用いて４９０ｎＭで分析することにより数量化する（生成したホルマザン生成物の量（４９０ｎｍの吸光度により測定される）は、培養物中の生細胞の数と正比例している）。モデルデータを、下記のTable ２に示す。
Table ２  ＨＴ−２インビトロ細胞バイオアッセイ：
【表３】
2008538564.tif 000004
ＨＴ−２細胞増殖アッセイを用いて、本発明のＦａｂ及びｍＡｂ結合組成物のインビトロ効力を判定する。ＨＴ−２細胞は、ＩＬ−４の存在下で増殖するが、ＴＧＦ−ベータの存在下でアポトーシスを受ける。ＴＧＦ−ベータ誘発性の細胞死を、ＴＧＦ−ベータ中和組成物（たとえば本発明のＦａｂ又はｍＡｂ）の添加により防止する。マウスＩｇＧ１  ＦＡｂ＃２４７１と比較して、本発明の結合組成物は、ＴＧＦ−ベータ誘発性細胞死の防止における中和効力の少なくとも１００倍以上の改善を示した。ｍＡｂ組成物のＩＣ５０は、約０．１〜１．０ｎｇ／ｍｌ（ｍＡｂ２４７１のＩＣ５０は、約０．１μｇ／ｍｌである）の範囲である。
【０１７２】
Ｆａｂの反応速度定数の測定
ＫｉｎＥｘＡ３０００計測器（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔ．Ｉｎｃ．）を用いて、結合速度定数を測定する。簡潔に言えば、抗原をａｌｚａｃｔｏｎｅビーズと共有結合させ、ビーズに対する本発明の遊離Ｆａｂ結合組成物の結合を計測器で検出する。Ｋｄを測定するため、２０ｐＭのＦａｂ（ｍＡｂに対して２００ｐＭ）を連続希釈された抗原（０−２５０ｎＭ）と共に含む各試験管を、１％ＢＳＡ、０．０２％のアジド及び０．０１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ中で２５℃にて１〜６日間インキュベートする。インキュベーション後、各平衡サンプル中の遊離Ｆａｂを、取扱説明書に従いＫｉｎＥｘＡ３０００で測定する。Ｋｄ値を、ＫｉｎＥｘＡ３０００ソフトウェアを用いて求める。
【０１７３】
ｋｏｎを測定するため、２ｎＭのＦａｂをそれぞれ、取扱説明書に従った注入法を用いて０〜２４０ｎＭの抗原と混合し、結合しなかったＦａｂを検出する。結果データを用い、ＫｉｎＥｘＡ３０００ソフトウェアによりｋｏｎを算出する。ｋｏｆｆは、式Ｋｄ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎを用いて算出する。
【０１７４】
Ｍａｂに対する反応速度定数の測定
反応速度定数の測定の別の方法は公知である。たとえば、ヒトのＴＧＦ−ベータ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ＃２４０−Ｂ／ＣＦ）、ＴＧＦ−ベータ２（ＲＤＩ，Ｃａｔ＃ＲＤＩ−１０３５）及びＴＧＦ−ベータ３（ＲＤＩ，Ｃａｔ＃ＲＤＩ−１０３６／ＣＦ）に対する結合組成物の親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００計測器を使用して測定する。ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）は、表面プラズモン共鳴の光学特性を利用して、デキストランバイオセンサマトリクスの中で相互作用する分子のタンパク質濃度の変化を検出する。特に明記しない限り、すべての試薬及び物質はＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）ＡＢ（Ｕｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から購入する。すべての測定は室温で行う。サンプルを、ＨＢＳ−ＥＰバッファ（１５０ｍＭの塩化ナトリウム、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％（ｗ／ｖ）の界面活性剤Ｐ−２０及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））中に溶解する。組換えプロテインＡを、ＣＭ４センサチップの全４つのフローセルに、アミン結合キットを用いて、４００−４５０の応答単位（ＲＵ）レベルで固定する。
【０１７５】
結合を、複数の分析サイクルを用いて測定する。各サイクルは、５０μＬ／分の流速で実施し、次の工程からなる：１２μＬの抗体結合組成物０．５μｇ／ｍＬを注入、２５０μＬのＴＧＦ−ベータ１を注入（５ｎＭにて開始、０．１３ｎＭまで各サイクルにつき二倍階段希釈、各濃度につき注入は２回）、次いで、短時間（５分）または長時間（１２０分）おいて解離させ、５０μＬの１０ｍＭグリシンヒドロクロリド（ｐＨ１．５）を２度注入し再生成させる。各サイクルの会合速度と解離速度を、単純な会合モデルを用いているＣｌａｍｐＸＰ（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｕｔａｈ）を用いて、バイオセンサデータを適合し、ｋｏｎ及びｋｏｆｆ速度定数を抽出して求める。平衡結合定数Ｋｄを、関係式Ｋｄ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎを用いて算出する。本発明組成物のモデルデータを、以下のTable ３に示す。
【表４】
2008538564.tif 000005
Table ３本発明のＦａｂ及びｍＡｂｓの結合親和性及び反応速度測定
平衡結合パラメータ（Ｋｄ）及び動的結合パラメータ（ｋｏｎ）を、Ｋｉｎｅｘａ（ｋｏｆｆは、Ｋｄ及びｋｏｎから算出される）を用いて求める。ｍＡｂｓの平衡状態及び及び動力学的結合特性を、バイアコアを用いて求める。平衡結合定数Ｋｄを、求めたｋｏｎ及びｋｏｆｆから算出する。マウスＩｇＧ１Ｆａｂ＃２４７１と比較する。極めて緩慢な解離のため、２１Ｄ１及びＤＭ７のｋｏｆｆは、検出可能な上限値であり、したがって更に緩慢である傾向があり、算出したＫｄ値もまた上限値となる。値は、繰り返し測定した値（ｎ＝３〜４）の平均である。
【０１７６】
Ｍａｂ特異性の測定
ＢＩＡｃｏｒｅ法を用いて、本発明のｍＡｂ組成物が他の実体、特にＴＧＦ−ベータ１又はＴＧＦ−ベータ３の潜在的な形に結合する能力を測定する。すべての測定を室温で実施する。サンプルを、ＨＢＳ−ＥＰバッファ（１５０ｍＭの塩化ナトリウム、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％（ｗ／ｖ）の界面活性剤Ｐ−２０及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））中に溶解する。組換えプロテインＡを、ＣＭ４センサチップの全４つのフローセルに、アミン結合キット用いて、４００−４５０の応答単位（ＲＵ）のレベルで固定する。
【０１７７】
結合を、複数の分析サイクルを用いて評価する。各サイクルを１００μＬ／分の流速で実施し、次の工程からなる：１μｇ／ｍＬの抗体結合組成物１５μＬを注入、２５０μＬの５ｎＭ  ＴＧＦ−ベータ１、５ｎＭ潜在性のＴＧＦ−ベータ１又は５ｎＭのＴＧＦ−ベータ３のいずれかを注入、次いで、短時間（５分）おき、５０μＬの１０ｍＭのグリシンヒドロクロリド（ｐＨ１．５）の２度の注入により再生成させる。最初にＭａｂ、次いでリガンドを捕捉したシグナル量を計測器制御ソフトウェアを用いて求める。シグナルが、捕捉されたタンパク質の質量と比例しているので、捕捉されたリガンドの化学量論は容易に計算可能である（Table ４）。
【表５】
2008538564.tif 000006
Table ４  ＴＧＦ−ベータ１、潜在性のＴＧＦ−ベータ１及びＴＧＦベータ３のＭａｂｓ（５ｎＭリガンドで試験）との結合
【０１７８】
ＴＧＦ−ベータ１の特異性
ＴＧＦ−β３に対する結合組成物ｍＡｂｓの親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ方法を用いて求める。すべての測定を室温で実施する。サンプルを、ＨＢＳ−ＥＰバッファ（１５０ｍＭの塩化ナトリウム、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％（ｗ／ｖ）の界面活性剤Ｐ−２０及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））中に溶解する。組換えプロテインＡを、ＣＭ４センサチップの４つのフローセルに、アミン結合キットを用いて、４００−４５０の応答単位（ＲＵ）のレベルで固定する。結合を、複数の分析サイクルで評価する。各サイクルは、１００μＬ／分の流速で実施され、次の工程からなる：０．５μｇ／ｍＬの１５μＬの抗体結合組成物を注入、２５０μＬのＴＧＦ−β３（５ｎＭにて開始、０．１３ｎＭまで各サイクルにつき二倍階段希釈、各濃度につき注入は２回）を注入し、次いで、解離のため短時間（５分）おき、５０μＬの１０ｍＭのグリシンヒドロクロリド（ｐＨ１．５）を２度注入し再生させる。
【０１７９】
ＴＧＦ−β３注入の最後の１０秒間で平均シグナルを測定して種々のＴＧＦ−β３の濃度で達した平衡シグナルに基づき、全てのＴＧＦ−β３濃度で得られたシグナルを  ＳＣＲＵＢＢＥＲ（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｕｔａｈ）にて単純な結合均衡モデルに適合させて親和性を判定する。本発明の試験したヒトｍａｂのＫｄ及び特異性（記載のＴＧＦ−β３結合のＫｄをＴＧＦ−β１結合のＫｄで割ることにより求めた）のモデルデータを、以下のTable ５に示す。
【表６】
2008538564.tif 000007
Table ５  ＴＧＦ−β３の結合に対するｍＡｂｓを検査した結合組成物の親和性及び比特異性
示されている誤差は複数回の繰り返し測定（ｎ＝３）による標準偏差を表す。
【０１８０】
実施例２：肝線維症胆管結紮Ｉｎ  Ｖｉｖｏモデル
Ａｒｉａｓら（ＢＭＣ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ３（２９），２００３）による報告と類似の方法で、胆管結紮モデルを用いて、抗ＴＧＦ−β１療法のＩｎ  Ｖｉｖｏ有効性を測定する。簡潔には、オスのＳＤラット（２５０−３００ｇ）を、イソフルラン（２−３％）吸入で、作用するまで麻酔する。腹部を剃毛し、ベタジン及び７０％のエチルアルコールで洗浄する。無菌条件の下、正中切開（〜４ｃｍ）し、総胆管を分離し、ほぼ１ｃｍ離して６−０の外科用絹糸で２箇所で結紮し、次いで、結紮箇所の間を横切開する。腹壁を４−０の絹糸縫合で閉じて、皮膚をホチキスで留める。抗ＴＧＦ−β１組成物の投与及びアイソタイプマウス制御ｍＡｂ（ＩｇＧ）を、手術の日に開始し、次いで７日ごとに実施する。術後４から１２日で、ラットを安楽死させ、血清肝酵素、全血球数算定及び肝組織像（トリクローム及びＨ＆Ｅ染色）を実施し、治療の効果を判定する。
【０１８１】
実施例３：肺線維症Ｉｎ  Ｖｉｖｏモデル
肺線維症の抗ＴＧＦベータ組成物のＩｎ  Ｖｉｖｏ有効性を判定するために多くのモデルが利用できる。たとえば、ブレオマイシンモデルを、Ｐｉｔｔｅｔら（ＪＣＩ  １０７，１５３７−１５４４，（２００１））により報告された方法に適用し、抗ＴＧＦベータ方法における改善を評価する。別のモデルは、呼吸器レオウィルス１／Ｌモデル（Ｂｅｌｌｕｍら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ，１５０，２２４３；又はＬｏｎｄｏｎら，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０３，２８４；及びＬｏｎｄｏｎら，Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ，７２，２４−３６参照）である。簡潔には、マウスを用いて、１日目に、レオウイルス１／Ｌ、ｉ．ｎ．１ｘ１０７ｐｆｕ（合計３０ｕｌ）を、鼻孔から投与し、３日目、７日目、１２日目に、本発明の抗ＴＧＦベータ結合組成物の濃度を変化させて投与するか、若しくは本願明細書に記載の方法又は公知の技術で、アイソタイプコントロールｍＡｂを投与する。動物を、呼吸困難、体重損失及び死亡率の徴候の治療期間の間観察する。治療の開始から１４日後、動物を安楽死させ、組織病理学検査（Ｈ／Ｅ）用に肺サンプルを調製し、（繊維増多の測定にヒドロキシプロリン含有量を分析して）肺疾患の発現及び／又は進行を判定する。
【０１８２】
実施例４：抗Ｔｈｙ１．１糸球体腎炎Ｉｎ  Ｖｉｖｏモデル
ラット抗Ｔｈｙ１．１モデルは、メサンギウム増殖性糸球体腎炎（Ｍｏｒｉｔａら，１９９８  Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ  ３１：５５９−７３；Ｂａｇｃｈｕｓら，１９８６  Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．５５：６８０−７及びＹａｍａｍｏｔｏ＆Ｗｉｌｓｏｎ  １９８７  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．３２：５１４−２５参照）の確立されたモデルであり、糸球体間質細胞の表面にあるＴｈｙ抗原に対する抗体の注入は、メサンギウム融解を誘発し、次いで、糸球体間質細胞を過剰代償増殖させ、尿タンパク質（蛋白尿）を上昇させる。抗Ｔｈｙ１．１腎炎モデルは、多くの面でヒトＩｇＡ腎炎又はヘノッホ−シェーンライン紫斑病（Ｏ´Ｄｏｎｏｇｈｕｅら，１９９１  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８８：１５２２−３０）と類似しており、試験組成の能力を判定して、蛋白尿（Ｂｕｒｇら，１９９７  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ７６：５０５−１６；Ｊｏｈｎｓｏｎら，１９９５  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ４７：６２−９参照）の用量関連減少を生じさせることにより、腎臓病の潜在的治療法の検査に用いる。
【０１８３】
そのようなモデルにおいて本発明の結合組成物を試験するために、それぞれ印をつけたオスＳＤラット（２００−２６０グラム、ほぼ生後９週間目）を、標準食餌で餌と水を自由に摂取させて５日間前処理し、環境に順化させた。尿前タンパク定量は、処理の５日前に実施する。眼窩後で出血させる前にラットの尾にマーカーで着色すると共に耳にタグを付けて個体識別し、１日目に体重によって５群に無作為に分ける。
【０１８４】
試験は投与群が分からないようにして行い、検査終了時に非盲検とする。対照群には、１．２５ｍｇの抗Ｔｈｙ１．１ｍＡｂ又はＰＢＳを、０日目に陰茎の静脈から投与する。結合組成物を、標準的な条件でまたは本願明細書に記載されている方法で、調製及び精製する。コントロールマウスＩｇＧ１ｍＡｂ（１１５１３）は、ＰＢＳ  ｐＨ７．２で再懸濁されたプロテインＡ精製物質であり、Ｈａｒｌａｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ  ４６２２９−０１７６から購入する。
【０１８５】
マウス抗Ｔｈｙ１．１は、マウスハイブリドーマの２×１０Ｌの培養組織中に産生させる。培養上清を混合し、１８倍に濃縮した後精製する。約７６４ｍＬｓの得られた濃縮上澄を、１．５Ｍのグリシン／３．０ＭのＮａＣｌ  ｐＨ  ８．９と混合し、１．５Ｍのグリシン／３．０ＭのＮａＣｌ  ｐＨ  ８．９で予め平衡化した未使用の１３７ｍｌのプロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに入れる。次いで、プロテインＡカラムを、１．５Ｍのグリシン／３．０ＭのＮａＣｌ  ｐＨ  ８．９で洗浄する。カラムを、１００ｍＭのクエン酸  ｐＨ  ３．０で溶離する。ＩｇＧと一致する溶離液の選択された留分をプールし、ｐＨ  ７．４に１ＭのＮａＯＨで調整し、ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４塩化ナトリウム）中の３１８ｍｌのファルマシアＳｕｐｅｒｄｅｘ２００に適用する。ＩｇＧと大きさが一致するピークをプールし、等分して、−２０℃で保管する。
【０１８６】
抗Ｔｈｙ１．１ｍＡｂ投与の１時間後、動物に、アイソタイプ又は本発明の抗ＴＧＦ−ベータ１抗体組成物を皮下投与する。抗体を７日目に再び投与し、動物を以下の４種類の治療グループで検査する。
１）擬似的処置；ＰＢＳ注入
２）抗ｔｈｙ１．１、アイソタイプコントロール抗体約１２．５ｍｇ／ｋｇ又は２．５ｍｇ／ｄｏｓｅ
３）抗ｔｈｙ１．１、ＤＭ４抗体約５ｍｇ／ｋｇ又は１ｍｇ／ｄｏｓｅ
４）抗ｔｈｙ１．１、ＤＭ７抗体約１２．５ｍｇ／ｋｇ又は２．５ｍｇ／ｄｏｓｅ
５）抗ｔｈｙ１．１、Ｃ２７抗体約１２．５ｍｇ／ｋｇ又は２．５ｍｇ／ｄｏｓｅ
【０１８７】
ラットを、５日目と１３日目に２４時間代謝ケージに置く。１４日目に、ラットをＣＯ２で屠殺し、心臓穴から出血した血液を採取して分析する。左腎は、ＰＢＳ中の４％のパラホルムアルデヒドで固定し、後の組織分析のために７０％のエタノール中で保管する。ラットが瀕死となる場合は、屠殺し（ＣＯ２）、尿タンパク質及び血中尿素窒素濃度について処理をする。尿タンパク質及び血中尿素窒素（ＢＵＮ）濃度を、ＨＩＴＡＣＨＩ９１１自動分析器にてＢｉｏｒａｄのコントロールを用い取扱説明書に従い分析する。
【０１８８】
下記Table ６のモデルデータは、本発明の結合組成物がＩｎ  Ｖｉｖｏで腎障害を軽減し、抗Ｔｈｙ１．１ｍＡｂ誘発性腎障害に関連する尿タンパクの増大を軽減させる有意の能力を有することを示す。
【表７】
2008538564.tif 000008
Table ６
ラットに、２．５ｍｇ／ｋｇのα−Ｔｈｙ１．１ｍＡｂを注入し、次いで、３０分後に２１Ｄ１及びＤＭ４研究の１ｍｇのＨｅｒｃｅｐｔｉｎを注入する。抗ＴＧＦ−ベータ１及びコントロールｍＡｂの２度目の投与を、７日目に行い、動物を１４日目に安楽死させる。２１Ｄ１及びＤＭ４ｍＡｂ結合組成物は、用量依存的方法で尿タンパク質濃度（蛋白尿）を減少させる。
【０１８９】
実施例５
ＴＧＦ−β１結合組成物のエピトープマッピング
Ｈ／Ｄｅｘ及び化学的標識の組み合わせを用いて、本発明のＴＧＦ−β１結合組成物（たとえば抗体）のエピトープマッピングを行う。Ｈ／Ｄ交換及び化学修飾は、アミノ酸残基の溶剤接触性次第であり、結合組成物の形成の後に溶剤接触性は変化する。ＴＧＦ  Ｂｅｔａ１複合体を用いて、抗体結合に関与する残基を同定する。Ｈ／Ｄ交換又は化学修飾の後に、前に結合した抗原のペプチドを切断断片にタンパク分解して、断片の間の分子量比較（ＬＣ／ＭＳを用いる）を可能とし、結合複合体形成の後、どのアミノ酸残基がＨ／Ｄ交換又は化学修飾からブロックされるか判定する。
【０１９０】
タンパク質表面化学標識
４ｍＭのＨＣｌ溶液中の１ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１の１５μｇアリコートをプラスチックバイアルに移し、そこへ１８０μｇのコントロール又は本発明のＴＧＦ−β１抗体組成物を添加する（モル比：ＴＧＦ−β１／抗体＝１／２）。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を各バイアルへ１５０μＬの最終容積まで添加し、溶液を、（結合複合体の形成を可能とするために）タンパク質表層標識の前に少なくとも１０分間常温でインキュベートする。化学標識は、５ｍｇ／ｍＬの酢酸ヒドロキシルスクシンイミドエステル（ＡＨＳＥ）溶液の７．５μＬを各複合バイアルに添加し、次いで、混合液を常温度でインキュベート（モル比：ＡＨＳＥ／抗体＝２００／１）する。種々の時間（例えば１０、２０及び６０分）に、５０μＬの混合液溶液を、０．１Ｍのトリスバッファ（ｐＨ  ８．０）中の１ｍｇ／ｍＬのＫ５０μＬと混合してクエンチする。溶液を、（本願明細書に記載されているように）ＬＣ／ＭＳで、直接分析する。各サンプルの残りの溶液を、３〜５μＬの５０ｍｇ／ｍＬのＤＴＴ溶液で、３７℃（１０〜１５分）にて処理して、成熟ＴＧＦ−β１のジスルフィド結合を還元する。
【０１９１】
次いで、還元タンパク質溶液を、３μＬの０．１ｍｇ／ｍＬのキモトリプシン溶液で、３７℃で２〜３時間処理し、１μＬの０．２５ｍｇ／ｍＬのＧｌｕ−Ｃ溶液で、更に３７℃で２〜３時間処理する。この反応物を、０．５μＬの氷酢酸を添加してクエンチし、次いで、Ｗａｔｅｒｓ  ２７９５  ＨＰＬＣ及びＭｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＴＣ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｍａｓｓ分光計を用いて、ＬＣ／ＭＳで分析する。ＨＰＬＣは、常温で、２．１×５０ｍｍ、Ｚｏｒｂａｘ（ＳＢ  Ｃ１８）を用い、タンパク質及びペプチドを、アセトニトリル法勾配で０．１５％のギ酸に溶離し、１４分間の実施時間を完全なタンパク質の溶離に用い、７５分間の実施時間をタンパク分解性消化物の溶離に用いる。
【０１９２】
ＴＧＦ−β１表面若しくはエピトープの内部又は構造的に近くのリシン（Ｋ）残基について、Ｋアミノ基のアセチル化は、試験組成物がＴＧＦ−β１を結合した後、（部分的に、又は完全に）ブロックする。複合型（ＴＧＦ−β１＋ＴＧＦ−β１と結合する抗体）および非複合型（ＴＧＦ−β１＋ＴＧＦ−β１と結合しないコントロール抗体）サンプルからのペプチドの間でアセチル化の程度を比較することで、結合複合体の形成によりアセチル化からブロックされたアミノ酸残基を特定できる。そのようなＬＣ／ＭＳ分析のもとで得られたアセチル化データの１つのモデルを、下記Table ７に示す。
Table ７
エピトープマッピングに関してＬＣ／ＭＳにより得られた、モルペプチドにつきアセチル化されたアミノ基のモル
【表８】
2008538564.tif 000009
＊及び＃は、ＤＭ４抗体の異なる２種のロットを別々に特徴づけられることを示す。
【０１９３】
そのようなモデルデータから、ＴＧＦ−β１：抗体複合体と対照との間の違いが、特に短時間（たとえば、１０分間）のアセチル化で示されるように、いくつかのＴＧＦ−β１ペプチド断片について認められる。残基３１−３９、３３−４３、５３−６２及び９１−１１２を含む断片は、そのような識別可能な違いを示している。断片３１−３９と３３−４３はいずれもＫ３７残基を含む。Ｋ２６及びＫ３１を含む断片２２−３２は、対照との有意な違いを示さないことから、断片３１−３９のアセチル化の違いが、抗原：抗体複合体の形成の後のアセチル化からＫ３７をブロックすることに寄与している。
【０１９４】
断片５３−６２及び９１−１１２は、試験した範囲において、並びに、試験した各抗体について持続的な違いを示している。断片５３−６２は、アセチル化（６０分）の上限範囲の減少の違いを示すが、ＡＨＳＥ／抗体低比率の条件下、そのような違いは全範囲にわたり不変のままである。理論に束縛されないが、そのようなデータの１つの解釈は、Ｋ６０が抗原：抗体結合に直接関与していないが、結合複合体に対するその近さは、ＡＨＳＥがＫ６０残基へ接近するのをブロックするのに十分なほど接近し、従って、アセチル化をブロックしているというものである。あるいは、Ｋ６０は、試験した抗体で定義されるエピトープを含むことができる。
【０１９５】
断片９１−１１２は、試験した範囲にわたってアセチル化の違いを示し、このことは、この断片の３個のリジン残基（Ｋ９５、Ｋ９７又はＫ１１０）の少なくとも１個が、結合組成物：ＴＧＦ  Ｂｅｔａ１複合体に関与することを示唆する。関与するリジン残基を特定するために、キモトリプシン消化物を、Ｇｌｕ−Ｃを生じる２個の断片９１−９９及び１００−１１２で更に処理する。後者（断片１００−１１２）はＫ１１０を含むが、有意なアセチル化の違いを示さず、溶剤又は化学修飾に接触できないことを示唆する。
【０１９６】
Ｋ９５及びＫ９７を含む前者（断片９１−９９）を、ＡＨＳＥで処理した非複合型ＴＧＦ−β１及びＭＳ／ＭＳ分析を用いてさらに試験し、１カ所がアセチル化された種の溶離時間を判定し、Ｋ９５又はＫ９７アセチル化の程度を数量化する（そのような条件下でのモデルデータを下記Table ８に示す）。そのようなデータは、Ｋ９７のアセチル化が複合体形成の有無にかかわらず不変であることを示すが、本発明の抗体組成物の存在はＫ９５のアセチル化に有意に影響を及ぼし、Ｋ９５が結合複合体形成に直接関与していることを示している。
Table ８
Ｋ９５及びＫ９７のアセチル化
【表９】
2008538564.tif 000010
＊及び＃は、ＤＭ４抗体の異なる２種のロットが特徴づけられることを示す。
【０１９７】
Ｈ／Ｄ交換
エピトープマッピングにおいて、重水素／水素（Ｈ／Ｄ）交換の技術は、タンパク質表層標識／ＭＳと類似するが、Ｈ／Ｄ交換は残基に特異的でないことから、任意のアミノ酸残基の変化を検出できる。結合組成物：ＴＧＦ  Ｂｅｔａ１複合体を、非複合型の成熟ＴＧＦ−β１タンパク質と比較すると、複合型タンパク質の分子量は、非複合型ＴＧＦ−β１より約２０Ｄａ（又は１００％Ｄ２Ｏでは３０Ｄａ）軽く、複合型と非複合型ＴＧＦ−β１との間のＤ２Ｏの重量の差を算出することによって、成熟ＴＧＦ−β１二量体中の約３０アミノ酸残基が本発明の結合複合体の形成に関与し得ることを示すことができる。
【０１９８】
抗体溶液の１２０μｇアリコート（約１４０又は２８０μＬ）を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（３０ｋＤ）限外濾過タンパク質濃縮器（ミリポア）を用いた連続濃縮及び希釈によりＰＢＳにバッファ交換する。ＰＢＳで２回連続濃縮及び希釈した後、抗体溶液を濃縮し、留去し、ＰＢＳで最終容積７０μＬに調整する。次いで、４ｍＭのＨＣｌ溶液中の１０μＬの１ｍｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１及び２μＬの１Ｍのトリスバッファ（ｐＨ  ８．０）を、各抗体バイアルに添加して、ＴＧＦ−β１（抗体複合体）を形成する。ＴＧＦ−β１コントロール試料を、７０μＬの１ｘＰＢＳ、４ｍＭのＨＣｌ溶液中の２０μＬのＴＧＦ−β１、２μＬの１Ｍのトリスバッファ（ｐＨ  ８．０）を混合して調製する。次いで、９μＬのＴＧＦ−β１又はＴＧＦ−β１抗体複合体を、ミクロプラスチックバイアルへ移し、次いで、２１μＬの１００％のＤ２Ｏを添加して、７０％のＤ２Ｏ溶液を生成する。溶液を、常温にて１０分間温め、次いで、０℃で１分間インキュベートする。
【０１９９】
インキュベーション後、Ｈ／Ｄ交換をクエンチし、１５μＬの１％のギ酸溶液（０℃）及び４μＬの２ｍｇ／ｍＬのペプシン溶液（０℃）を加えてタンパク質を消化し、次いで、０℃で５分間インキュベートする。消化物を、手動で直ちにカラム上に注入し、ＬＣ／ＭＳ分析（管及びＨＰＬＣカラムは、氷水浴に浸漬させることを除いて、上記の通りである）する。
【０２００】
ジスルフィド結合形成により、成熟ＴＧＦ−β１は低ｐＨ（〜２．５）及び低温（０℃）でペプシン消化されない。その結果、ほとんどペプチド切断が生じず、大部分のＴＧＦ−β１は、長い消化時間と高酵素：タンパク質濃度にもかかわらず無傷である。特定可能なＴＧＦ−β１タンパク分解性断片は、典型的にはタンパク質のＣ末端および中間域（たとえば断片５８−６４又は６１−６４）で発生する。そのような断片を用いたＤ／Ｈ交換の後の質量（δ質量）変化についてのモデルデータを、以下のTable ９に示す。断片６１−６４のδ質量がほぼ０である一方、断片５８−６４のδ質量は約１Ｄａであり、このことは、重水素交換から保護された領域（本発明の結合組成物との複合体形成の後）がアミノ酸残基５８−６１を含んでなることを示唆している。
Table ９
ＴＧＦ−ベータ１の特定された消化ペプチドのＤ／Ｈ交換後のδ質量
【表１０】
2008538564.tif 000011
【表１１】
2008538564.tif 000012
【０２０１】
本発明の結合組成物のエピトープをさらに定義するために、伝統的な突然変異誘発技術を用いて、本発明の組成物と結合複合体を形成する際に必須のＴＧＦ  Ｂｅｔａ１残基を特定する。ＴＧＦ−ベータ３／ＴＧＦ−ベータＲＩＩ複合体の結晶構造（２００２  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．３：２０３−８）をモデルとして用い、有意なＴＧＦ−ベータ１のタンパク質突然変異誘発部位（Ｒ２５Ｋ、Ｋ２６Ｒ、Ｖ３３Ｉ、Ｐ８７Ｔ、Ｖ８９Ｌ及びＫ９５Ｔ（上記））を特定する。
【０２０２】
ＴＧＦ  Ｂｅｔａ１突然変異タンパク質を結合する能力を、ＴＧＦ  Ｂｅｔａアイソフォームに特異的な結合組成物、及びＴＧＦ  Ｂｅｔａ１のその同族受容体（ＴＧＦ−ベータＲＩＩ）への結合を阻止する市販のｍＡｂｓ（１Ｄ１１及び２４０；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて試験する。試験は、レーザーで誘発された脱着／電離飛行時間型質量分析装置分析法で実施する。試験ｍＡｂｓ（たとえば、ＴＧＦ  Ｂｅｔａ１に特異的に結合するｍＡｂ３８２１及び２４７１（ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１８９２１；ＵＳ６０／４８５，８２０号に開示）及び対照（たとえば、３種のＴＧＦ  Ｂｅｔａアイソフォーム全てと結合するｍＡｂ１Ｄ１１）を、混合（ＴＧＦ  Ｂｅｔａ１タンパク質（突然変異体又は野生型）と複合体を形成する機会を与える）し、検出チップに固定し、レーザー処理し、次いで、製造元の条件下（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、標準化されたソフトウェアを使用して分析する。
【０２０３】
モデル結果は、ＴＧＦ  Ｂｅｔａ１／ＴＧＦ−ベータＲＩＩの結合面でアミノ酸残基のサブセットが、他のＴＧＦ−ベータアイソフォーム（ＴＧＦ  Ｂｅｔａ２及びＴＧＦ  Ｂｅｔａ３）と明かに異なることを示している。試験したｍＡｂ＃２４７１（ＴＧＦ  Ｂｅｔａ１に対して特異的な結合親和性を有する）は、ＴＧＦ  Ｂｅｔａ１突然変異体と比較して５倍も野生型ＴＧＦ−ベータ１と結合し、一方、ｍＡｂｓ３８２１及び１Ｄ１１のＴＧＦ−ベータ１突然変異体との結合は、野生型ＴＧＦ  Ｂｅｔａ１と比較して、２．５倍低かった。
【０２０４】
配列表
配列番号１は、霊長類成熟ＴＧＦベータ１アミノ酸配列である。
配列番号２は、霊長類ＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列である。
配列番号３は、霊長類ＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列である。
配列番号４は、霊長類ＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列である。
配列番号５は、霊長類ＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列である。
配列番号６は、霊長類ＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列である。
配列番号７は、霊長類ＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列である。
配列番号８は、霊長類ＨＣＶＲ  ＦＲ１フレームワークアミノ酸配列である。
配列番号９は、霊長類ＨＣＶＲ  ＦＲ２フレームワークアミノ酸配列である。
配列番号１０は、霊長類ＨＣＶＲ  ＦＲ３フレームワークアミノ酸配列である。
配列番号１１は、霊長類ＨＣＶＲ  ＦＲ４フレームワークアミノ酸配列である。
配列番号１２は、霊長類ＬＣＶＲ  ＦＲ１フレームワークアミノ酸配列である。
配列番号１３〜３６は、霊長類ＬＣＶＲ  ＦＲ２フレームワークアミノ酸配列である。
配列番号３７は、霊長類ＬＣＶＲ  ＦＲ３フレームワークアミノ酸配列である。
配列番号３８は、霊長類ＬＣＶＲ  ＦＲ４フレームワークアミノ酸配列である。
配列番号３９は、霊長類ＩｇＧ１重鎖定常領域アミノ酸配列である。
配列番号４０は、霊長類ＩｇＧ４重鎖定常領域アミノ酸配列である。
配列番号４１は、霊長類ＩｇＧ４軽鎖定常領域アミノ酸配列である。
配列番号４２〜８６は、霊長類軽鎖可変領域アミノ酸配列である。
配列番号８７〜１２５は、霊長類ＨＣＶＲ重鎖アミノ酸配列である。
【配列表】
2008538564000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成20年3月18日(2008.3.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008538564000001.app
【国際調査報告】
2008538564.tif 000085
2008538564.tif 000086
2008538564.tif 000087