(57)【要約】アンジオポエチン様４タンパク質のモジュレーター、ならびに疾患および病的状態の治療でのその使用方法を提供する。ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストと他の治療薬（例えば、抗癌薬）との組み合わせ、癌に感受性を示すかまたは癌と診断された哺乳動物、あるいは腫瘍成長が再発したかまたは癌細胞増殖が再発した哺乳動物の治療におけるその使用方法も提供する。また、ＡＮＧＰＴＬ４のインヒビターと血管形成のインヒビターとの組み合わせ、ならびに癌成長および／または血管形成に関与する障害を阻害するためのこのような組み合わせの使用方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍成長または癌細胞の増殖を遮断するかまたは減少させる方法であって、
ａ）有効量の抗癌薬を該腫瘍または該癌細胞に投与する工程と、
ｂ）有効量のアンジオポエチン様４タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ４）アンタゴニストを該腫瘍または該癌細胞に投与する工程と、
を包含し、
有効量の組み合わせによって該腫瘍成長または該癌細胞の増殖が遮断されるかまたは減少する、方法。
【請求項２】
前記抗癌薬が抗血管形成薬を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗血管形成薬がＶＥＧＦアンタゴニストである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＶＥＧＦアンタゴニストが抗ＶＥＧＦ抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記抗ＶＥＧＦ抗体がヒト化Ａ４．６．１である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストが抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体がＡＮＧＰＴＬ４（１８４〜４０６）に結合する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストが抗αＶβ５抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項４、請求項６、または請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストがＳｉＲＮＡ分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＳｉＲＮＡ分子がＡＮＧＰＴＬ４−ＳｉＲＮＡ分子である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＡＮＧＰＴＬ４−ＳｉＲＮＡ分子が、ＡＮＧＰＴＬ４をコードする核酸のＤＮＡ配列をターゲティングし、前記ＤＮＡ配列が、少なくともＧＴＧＧＣＣＡＡＧＣＣＴＧＣＣＣＧＡＡＧＡ（配列番号３）を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記腫瘍または前記癌細胞に第３の抗癌薬を投与する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第３の抗癌薬が化学療法薬である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第３の抗癌薬が別の血管形成インヒビターである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記投与工程（ａ）および（ｂ）を連続的に行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記投与工程（ａ）および（ｂ）を同時に行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記投与工程（ａ）および（ｂ）を連続的にも同時にも行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記投与工程を任意の順序で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記腫瘍または前記癌細胞が被験体中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記被験体がヒトである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記被験体が腫瘍成長または癌細胞の増殖を再発している、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
被験体における腫瘍成長または癌細胞の増殖を遮断するかまたは減少させる方法であって、
有効量の抗血管形成薬および有効量のアンジオポエチン様４タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ４）アンタゴニストを含む組み合わせ組成物を該被験体に投与する工程をさらに含み、有効量の組み合わせによって該腫瘍成長または該癌細胞の増殖が遮断されるかまたは減少する、方法。
【請求項２４】
さらなる薬剤を投与する工程をさらに含み、該さらなる薬剤が抗癌薬である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
被験体における腫瘍成長の再発または癌細胞増殖の再発を遮断するかまたは減少させる方法であって、
有効量のアンジオポエチン様４（ＡＮＧＰＴＬ４）アンタゴニストを被験体に投与する工程を含み、該被験体が抗癌薬での癌治療を受けていたかまたは同時に受けており、有効量の前記ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストの投与により、前記腫瘍成長の再発または癌細胞増殖の再発が遮断されるかまたは減少する、方法。
【請求項２６】
前記抗癌薬が１つまたは複数の化学療法薬である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗癌薬が抗血管形成薬を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗血管形成薬が抗ＶＥＧＦインヒビターを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗ＶＥＧＦインヒビターが抗ＶＥＧＦ抗体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗ＶＥＧＦ抗体がヒト化Ａ４．６．１である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストが抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストが抗αＶβ５抗体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項２９、請求項３１、または請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストがＳｉＲＮＡ分子を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＳｉＲＮＡ分子がＡＮＧＰＴＬ４−ＳｉＲＮＡ分子である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＡＮＧＰＴＬ４−ＳｉＲＮＡ分子が、ＡＮＧＰＴＬ４をコードする核酸のＤＮＡ配列をターゲティングし、前記ＤＮＡ配列が、少なくともＧＴＧＧＣＣＡＡＧＣＣＴＧＣＣＣＧＡＡＧＡ（配列番号３）を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
さらなる薬剤を投与する工程をさらに含み、該さらなる薬剤が抗癌薬である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３８】
腫瘍成長または癌細胞の増殖を遮断するかまたは減少させる方法であって、
有効量のアンジオポエチン様４（ＡＮＧＰＴＬ４）アンタゴニストを該腫瘍または該癌細胞に投与する工程を含み、該抗ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストがＡＮＧＰＴＬ４（１８４〜４０６）に結合する抗体であり、該有効量によって該腫瘍成長または該癌細胞の増殖が遮断されるかまたは減少する、方法。
【請求項３９】
ＡＮＧＰＴＬ４（１８４〜４０６）に結合する抗体およびＶＥＧＦアンタゴニストを含む組成物。
【請求項４０】
ＡＮＧＰＴＬ４−ＳｉＲＮＡ分子を含む組成物であって、該ＡＮＧＰＴＬ４−ＳｉＲＮＡ分子が、ＡＮＧＰＴＬ４をコードする核酸のＤＮＡ配列をターゲティングし、該ＤＮＡ配列が、少なくともＧＴＧＧＣＣＡＡＧＣＣＴＧＣＣＣＧＡＡＧＡ（配列番号３）を含む、組成物。
【請求項４１】
第１の量の抗血管形成薬、第２の量のアンジオポエチン様４（ＡＮＧＰＴＬ４）薬、および薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤、ならびに容器を含むキット。
【請求項４２】
第１の単位投薬形態の一定量の抗血管形成薬および薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または希釈剤；第２の単位投薬形態の一定量のアンジオポエチン様４（ＡＮＧＰＴＬ４）アンタゴニストおよび薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または希釈剤；ならびに容器を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、第１１９条（ｅ）項の下、２００４年７月２０日出願の米国特許仮出願番号６０／５８９，７８２号（その全体が本明細書中で参考として援用される）の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、ヒトの疾患および病的状態（癌など）の治療に関する。本発明は、アンジオポエチン様４タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ４）のインヒビター、ＡＮＧＰＴＬ４のインヒビターと他の治療薬との組み合わせ、ならびに疾患または病的状態の診断および治療のためのこのような組成物の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
癌は米国における主な死亡原因である。癌の治療のために種々の療法が使用されている。例えば、癌組織または死滅した組織を除去するために外科的方法が使用されている。充実性腫瘍の萎縮によって作用する放射線療法および急速に分化する細胞を死滅させる化学療法が癌治療として使用されている。
【０００４】
１９７１年に、Ｆｏｌｋｍａｎは、抗血管形成が有効な抗癌ストラテジーであり得ることを提唱した。非特許文献１。血管形成は、既存の血管および／または循環内皮幹細胞からの新規の血管系の発達である（例えば、非特許文献２を参照のこと）。血管形成は、１）プロテアーゼ放出後の局所細静脈（ｌｏｃａｌ  ｖｅｎｕｅ）の細胞外基質の分解、２）毛細管内皮細胞の増殖、および３）血管形成刺激への毛細管の移動からなる過程のカスケードである。非特許文献３。
【０００５】
新規の血管の成長は、胎児および生後発育（例えば、胚形成）、創傷治癒、および月経の正常な生理学的過程における必要条件である。例えば、非特許文献４を参照のこと。既存の毛細管からの新規の血管のこのような増殖は、さらに、種々の障害（腫瘍、増殖性網膜症、加齢黄斑変性、乾癬、炎症、糖尿病、および関節リウマチ（ＲＡ）が含まれるが、これらに限定されない）の病理学的発症における重要な役割を果たす。例えば、非特許文献５を参照のこと。
【０００６】
血管形成の顕著な生理学的および病理学的重要性を考慮して、この過程を調節することができる因子を解明するために非常に多くの研究が行われてきた。血管形成過程が血管形成促進性（ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）分子と抗血管形成分子との間のバランスによって調節され、このバランスが種々の疾患（詳細には、癌）で狂わされることが示唆されている。例えば、非特許文献６を参照のこと。
【０００７】
例えば、血管形成は、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ、血管透過性因子（ＶＰＦ）としても公知）および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）のような分泌因子に依存する。例えば、非特許文献７および非特許文献８を参照のこと。血管形成および脈管形成における血管形成因子であることに加えて、多面性成長因子としてのＶＥＧＦは、他の生理学的過程において複数の生物学的作用（内皮細胞の生存、血管透過性および血管拡張、単球走化性、ならびにカルシウム流入など）を示す。非特許文献７。さらに、研究によって、いくつかの非内皮細胞型（網膜色素上皮細胞、膵管細胞、およびシュワン細胞など）に対するＶＥＧＦの分裂促進効果が報告されている。例えば、非特許文献９；非特許文献１０；および非特許文献１１を参照のこと。
【０００８】
ＶＥＧＦは、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−ＤおよびＶＥＧＦ−Ｅが含まれる遺伝子ファミリーである。これらのリガンドは、内皮細胞上で発現したチロシンキナーゼ受容体に結合し、連結する。例えば、ＶＥＧＦチロシンキナーゼ受容体ファミリーには、Ｆｌｔ１（ＶＥＧＦ−Ｒ１）（リガンドＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、およびＰｌＧＦに結合する）、Ｆｌｋ１／ＫＤＲ（ＶＥＧＦ−Ｒ２）（ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅに結合する）、およびＦｌｔ４（ＶＥＧＦ−Ｒ３）（ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄに結合する）が含まれる。例えば、非特許文献１２；および非特許文献１３を参照のこと。
【０００９】
アンジオポエチンは、血管内皮の別の増殖因子群である。例えば、非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；および非特許文献１７を参照のこと。アンジオポエチンは、ＶＥＧＦと相補的且つ調和的な様式で作用するようであり、ＶＥＧＦは、血管成長において作用する一方で、アンジオポエチンは、血管系の再造形、成熟、および安定化の調整によって作用する可能性が最も高い。例えば、非特許文献１８を参照のこと。アンジオポエチン１、アンジオポエチン２、アンジオポエチン３、およびアンジオポエチン４は、内皮細胞上で見出される受容体であるチロシンキナーゼＴｉｅ２（Ｔｅｋとしても公知）受容体に結合する。例えば、非特許文献１９を参照のこと。Ｔｉｅ１オーファン受容体も存在する。
【００１０】
血管形成は、増殖因子に依存するだけでなく、細胞外基質内に存在するそのリガンドと結合する細胞接着分子（ＣＡＭ）（インテグリンが含まれる）にも影響を受ける。例えば、非特許文献２；および非特許文献２０を参照のこと。インテグリンは、細胞間隙および基底膜中に見出される細胞外基質タンパク質への細胞接着および移動を容易にする。細胞接着タンパク質のインテグリンファミリーは、少なくとも２２αβヘテロ二量体組み合わせ中で発現する少なくとも１８αおよび８βサブユニットから構成される。例えば、非特許文献２１；および非特許文献２２を参照のこと。これらのうちで、少なくとも６つ（αＶβ３、αＶβ５、α５β１、α２β１、αＶβ１、およびα１β１）の組み合わせが、血管形成に関与する（例えば、非特許文献２３；および非特許文献２４を参照のこと）。特異的接着受容体の種々の遺伝子の不活化または動物モデルへの遮断抗体の投与により、内皮細胞の血管形成応答に顕著な効果があった。例えば、非特許文献２５を参照のこと。
【００１１】
これらの分子は、癌療法の標的であった。例えば、病的状態における血管形成の主な調節因子としてＶＥＧＦが認識されることにより、ＶＥＧＦ活性を遮断する試みが数え切れないほど行われている。阻害抗ＶＥＧＦ受容体抗体、可溶性受容体構築物、アンチセンスストラテジー、ＶＥＧＦに対するＲＮＡアプタマー、および低分子量のＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）インヒビターは全て、ＶＥＧＦシグナル伝達の妨害における使用が提案されている。例えば、非特許文献２６を参照のこと。抗ＶＥＧＦ中和抗体は、ヌードマウスにおいて種々のヒト腫瘍細胞株の増殖を抑制し（非特許文献２７；非特許文献２８；非特許文献２９；および非特許文献３０）、虚血性網膜障害モデルにおいて眼内血管形成も阻害する（非特許文献３１）ことが示されている。実際、ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体であるベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は、転移性結腸直腸癌の一次療法として米国ＦＤＡで承認されている。例えば、非特許文献３２を参照のこと。
【００１２】
しかし、現在の癌治療方法は常に最適というわけではない。しばしば、単一治療型では病的状態を完全に抑制することができない。例えば、外科的手順は、しばしば、全ての癌成長を除去することができない。他の癌治療（化学療法など）は数え切れないほど副作用が生じ、そして／または治療が無効になる（例えば、癌が薬物または治療に耐性を示すため）。ＶＥＧＦもしくはＶＥＧＲ受容体またはＴｉｅ２受容体系の阻害では、時折、腫瘍成長が完全に抑制されなかった。例えば、非特許文献３３；非特許文献３２；非特許文献３４；非特許文献２７；非特許文献３５；非特許文献３６；非特許文献３７；非特許文献２８；非特許文献３８；非特許文献３９；非特許文献４０；非特許文献４１；非特許文献４２；非特許文献４３；および非特許文献４４を参照のこと。
【非特許文献１】Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２８５，１１８２−１１８６（１９７１）
【非特許文献２】Ｆｅｒｒａｒａ  ＆  Ａｌｉｔａｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５（１２）１３５９−１３６４（１９９９）
【非特許文献３】Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．１３：１８−３２（１９９２）
【非特許文献４】Ｆｏｌｋｍａｎ  ａｎｄ  Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：４４２−４４７（１９８７）
【非特許文献５】Ｆｅｒｒａｒａ，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇ．Ｈｏｒｍ．Ｒｅｓ．５５：１５−３５（２０００），ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ３５−６
【非特許文献６】Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  ａｎｄ  Ｊａｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：２４９−２５７（２０００）
【非特許文献７】Ｆｅｒｒａｒａ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．１８：４−２５（１９９７）
【非特許文献８】Ｆｅｒｒａｒａ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７７：５２７−５４３（１９９９）
【非特許文献９】Ｇｕｅｒｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６４：３８５−３９４（１９９５）
【非特許文献１０】Ｏｂｅｒｇ−Ｗｅｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２６：１２５−１３２（１９９７）
【非特許文献１１】Ｓｏｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：５７３１−５７４０（１９９９）
【非特許文献１２】Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９（６）：６６９−６７６（２００３）
【非特許文献１３】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＆  Ｓｔｒｉｎｇｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１１４（５）：８５３−６５（２００１）
【非特許文献１４】Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８７：１１６１−１１６９（１９９６）
【非特許文献１５】Ｓｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８７：１１７１−１１８０（１９９６）
【非特許文献１６】Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：５５−６０（１９９７）
【非特許文献１７】Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１９０４−１９０９（１９９９）
【非特許文献１８】Ｈｏｌａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：５３５６−５３６２（１９９９）
【非特許文献１９】Ｗａｒｄ  ＆  Ｄｕｍｏｎｔ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１３：１９−２７（２００２）
【非特許文献２０】Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，６（３）：３８９−３９５（２０００）
【非特許文献２１】Ｂｙｚｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，６（４）：８５１−８６０（２０００）
【非特許文献２２】Ｈｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２：９１−９９（２００２）
【非特許文献２３】Ｈｙｎｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｄｅｒ，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７８（１）：８３−８７（１９９７）
【非特許文献２４】Ｈｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｚ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．，３２（５）：５０１−５１０（１９９９）
【非特許文献２５】Ｅｌｉｃｉｅｒｉ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，４：７４１−７５０（１９９８）
【非特許文献２６】Ｓｉｅｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．１７：２４１−２４８（１９９８）
【非特許文献２７】Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：８４１−８４４（１９９３）
【非特許文献２８】Ｗａｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：１７８９−１７９７（１９９５）
【非特許文献２９】Ｂｏｒｇｓｔｒｏｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：４０３２−４０３９（１９９６）
【非特許文献３０】Ｍｅｌｎｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：９２１−９２４（１９９６）
【非特許文献３１】Ａｄａｍｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１１４：６６−７１（１９９６）
【非特許文献３２】Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，３：３９１−４００（２００４）
【非特許文献３３】Ｇｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６０：６２５３−６２５８（２０００）
【非特許文献３４】Ｍｉｌｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６７，５７６−５７９（１９９４）
【非特許文献３５】Ｍｉｌｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：１６１５−１６２０（１９９６）
【非特許文献３６】Ｇｏｌｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：８７９５−８８００（１９９８）
【非特許文献３７】Ａｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５５：５２９６−５３０１（１９９５）
【非特許文献３８】Ｆｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：９９−１０６（１９９９）
【非特許文献３９】Ｗｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：９７０−９７５（２０００）
【非特許文献４０】Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：２１７８−２１８９（２０００）
【非特許文献４１】Ｓｉｅｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：３１８５−３１９１（１９９９）
【非特許文献４２】Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：１５９−１６５（１９９９）
【非特許文献４３】Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：８８２９−８８３４（１９９８）
【非特許文献４４】Ｓｉｅｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９，３１８５−３１９１，（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、癌を制御するための新規且つより有効な治療薬が早急に必要である。以下の開示の概説から明らかなように、本発明は、これらおよび他の必要性について取り組んでいる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の要旨
本発明は、アンジオポエチン様４タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ４）のインヒビターならびに疾患および病的状態を治療する（例えば、腫瘍成長または癌細胞増殖を遮断するかまたは減少させるか、腫瘍成長の再発を遮断するかまたは減少させるなど）ためのこのようなインヒビターの使用方法に関する。本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４のインヒビターと抗癌薬との組み合わせおよび腫瘍成長を阻害するためのこのような組み合わせの使用方法を提供する。本発明はまた、ＡＮＧＰＴＬ４のインヒビターと血管形成のインヒビターとの組み合わせならびに癌成長および／または血管形成に関与する障害（例えば、新生物障害（例えば、腫瘍成長）および非新生物障害）を阻害するためのこのような組み合わせの使用方法を提供する。
【００１５】
ＡＮＧＰＴＬ４のモジュレーター（例えば、ＡＮＧＰＴＬ４のアンタゴニストまたはアゴニスト）を提供する。本発明のＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストは、ＡＮＧＰＴＬ４の活性を阻害または減少させる分子である。ＡＮＧＰＴＬ４インヒビターには、小分子量の物質、ポリヌクレオチド、アンチセンス分子、ＲＮＡアプタマー、ＡＮＧＰＴＬ４に対するリボザイムまたはその受容体ポリペプチド、ＡＮＧＰＴＬ４のポリペプチド、アンタゴニスト改変体、ＡＮＧＰＴＬ４活性を直接または間接的に阻害する単離タンパク質、組換えタンパク質、抗体、またはその複合体もしくは融合タンパク質が含まれ得る。特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ４のアンタゴニストには、ＡＮＧＰＴＬ４に結合する抗体が含まれる。本発明の特定の実施形態では、アンタゴニストＡＮＧＰＴＬ４抗体は、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質の特定の物質または領域（例えば、Ｎ末端、Ｎ末端コイルドコイル領域、Ｃ末端、Ｃ末端フィブリノーゲン様領域、またはヒトＡＮＧＰＴＬ４のＡＮＧＰＴＬ４（１〜１８３）、ＡＮＧＰＴＬ４（２３〜１８３）、ＡＮＧＰＴＬ４（１〜約１６２）、ＡＮＧＰＴＬ４（約１６２〜４０６）、ＡＮＧＰＴＬ４（２３〜４０６）、またはＡＮＧＰＴＬ４（１８４〜４０６）アミノ酸サブシーケンス、および／またはマウスＡＮＧＰＴＬ４のｍＡＮＧＰＴＬ４（１〜１８３）、ｍＡＮＧＰＴＬ４（２３〜１８３）、ｍＡＮＧＰＴＬ４（１〜約１６５）、ｍＡＮＧＰＴＬ４（２３〜約１６５）、ｍＡＮＧＰＴＬ４（２３〜４１０）、もしくはｍＡＮＧＰＴＬ４（１８４〜４１０）アミノ酸サブシーケンス）への結合によってＡＮＧＰＴＬ４の活性を阻害または減少させる抗体である。他のサブシーケンスには、例えば、ｈＡＮＧＰＴＬ４の４０〜１８３、６０〜１８３、８０〜１８３、１００〜１８３、１２０〜１８３、１４０〜１８３、４０〜４０６、６０〜４０６、８０〜４０６、１００〜４０６、１２０〜４０６、１４０〜４０６、および１６０〜４０６、ならびに、例えば、ｍＡＮＧＰＴＬ４の４０〜１８３、６０〜１８３、８０〜１８３、１００〜１８３、１２０〜１８３、１４０〜１８３、４０〜４１０、６０〜４１０、８０〜４１０、１００〜４１０、１２０〜４１０、１４０〜４１０、および１６０〜４１０も含まれるが、これらに限定されない。本発明の特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ４のアンタゴニストには、抗αＶβ５抗体（例えば、アンタゴニスト抗αＶβ５抗体）が含まれる。特定の実施形態では、本発明の抗体はヒト化抗体である。本発明の特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストは、ＳｉＲＮＡ分子である。一実施形態では、ＳｉＲＮＡ分子は、ＡＮＧＰＴＬ４−ＳｉＲＮＡ分子であり、この分子は、ＡＮＧＰＴＬ４をコードする核酸のＤＮＡ配列（例えば、ＧＴＧＧＣＣＡＡＧＣＣＴＧＣＣＣＧＡＡＧＡ）（配列番号３）をターゲティングする。
【００１６】
腫瘍成長または癌細胞の増殖を遮断するかまたは減少させる方法を提供する。特定の実施形態では、本方法は、有効量のアンジオポエチン様４（ＡＮＧＰＴＬ４）アンタゴニストを腫瘍または癌細胞に投与する工程を含む。別の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストは、アンタゴニスト抗αＶβ５抗体である。有効量で腫瘍成長または癌細胞の増殖が遮断または減少する。腫瘍細胞の移動の阻害方法も提供する。例えば、本方法は、有効量のＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストを腫瘍細胞に投与し、それにより、その移動が阻害される工程を含む。本発明の一実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストの投与により、転移が阻害される。
【００１７】
さらなる治療薬（例えば、１つまたは複数の抗癌薬、同一または異なる抗原に対する抗体、１つまたは複数の抗血管形成薬またはインヒビター、鎮痛薬など）を、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストと組み合わせ、そして／または同時に投与することができる。さらなる治療手順（例えば、外科的手順、照射など）を行うか、本発明の方法において、または本発明の組成物と共に腫瘍および／または癌細胞に施すこともできる。本発明はまた、組み合わせ組成物（例えば、抗癌薬（例えば、抗血管形成薬など）、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニスト、およびキャリア（例えば、薬学的に受容可能なキャリア）を含む組成物）を提供する。
【００１８】
抗癌薬には、例えば、当該分野で公知の抗癌薬および本明細書中に記載の抗癌薬が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、抗癌薬は、１つまたは複数の抗血管形成薬（例えば、ＶＥＧＦアンタゴニストまたはインヒビターなど）を含む。一実施形態では、ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ抗体またはその活性フラグメント（例えば、ヒト化Ａ４．６．１、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）など）を含む。特定の実施形態では、抗癌薬は、１つまたは複数の化学療法薬を含む。
【００１９】
腫瘍成長または癌細胞の増殖が遮断されるかまたは減少する組み合わせ方法を提供する。特定の実施形態では、本方法は、腫瘍または癌細胞に有効量の抗癌薬を投与する工程と、腫瘍または癌細胞に有効量のＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストを投与する工程とを含む。あるいはまたはさらに、有効量の抗癌薬（例えば、抗血管形成薬など）および有効量のＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストを含む組み合わせ組成物を投与することができる。有効量の組み合わせにより、腫瘍成長または癌細胞の増殖が遮断されるかまたは減少する。
【００２０】
腫瘍成長の再発または癌細胞増殖の再発を遮断するかまたは減少させる方法も提供する。本発明の特定の実施形態では、被験体は、少なくとも１つの抗癌薬での癌療法を受けていたか同時に受けており、被験体は、有効量のＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストを投与される。有効量のＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストの投与により、腫瘍成長の再発または癌細胞増殖の再発が遮断されるかまたは減少する。特定の実施形態では、被験体は、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストでの治療を受けていたか同時に受けており、被験体は、有効量の抗癌薬（例えば、抗血管形成薬）を投与され、有効量の抗癌薬の投与により、腫瘍成長の再発または癌細胞増殖の再発が遮断されるかまたは減少する。
【００２１】
典型的には、腫瘍および癌細胞は、被験体中に存在する。特定の実施形態では、被験体は、少なくとも１つの抗癌薬での癌療法を同時に受けているか、受ける予定である。典型的には、被験体は、哺乳動物（例えば、ヒト）である。特定の実施形態では、本発明の薬剤を、被験体に投与する。投与または手順工程を、任意の順序で行うことができる。一実施形態では、これらを連続的に行う。別の実施形態では、これらを同時に行う。あるいはまたはさらに、この工程を、連続的および同時の組み合わせとして任意の順序で行うことができる。
【００２２】
ＡＮＧＰＴＬ４モジュレーターのキットも提供する。特定の実施形態では、キットは、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニスト、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または希釈剤、および容器を含む。一実施形態では、キットは、第１の量の抗癌薬（例えば、抗血管形成薬など）、第２の量のＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニスト、ならびに薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または希釈剤、および容器を含む。別の実施形態では、キットは、第１の投薬形態の一定量の抗癌薬（例えば、抗血管形成薬など）、および薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または希釈剤、ならびに第２の投薬形態のＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニスト、および薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または希釈剤、ならびに容器を含む。その使用説明書も含めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
詳細な説明
定義
本発明を詳細に説明する前に、本発明は特定の組成物または生物系に制限されず、勿論、変化し得ると理解すべきである。本明細書中で使用した専門用語は特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明を制限することを意図しないことも理解すべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、明らかに別の内容を示さない限り、複数形が含まれる。したがって、例えば、「分子」には、任意選択的に、２つまたはそれを超えるこのような分子の組み合わせなどが含まれる。他で定義しない限り、全ての科学用語および技術用語は、関連分野で一般的に使用されているものと同一の意味を有すると理解される。本発明の目的のために、以下の用語を以下のように定義する。
【００２４】
用語「ＡＮＧＰＴＬ４」または「Ａｎｇｐｔｌ４」は、アンジオポエチン様４ポリペプチドまたはタンパク質、その天然に存在する対立遺伝子形態、分泌形態、およびプロセシング形態をいう。例えば、ヒト由来のＡＮＧＰＴＬ４は４０６アミノ酸タンパク質である一方で、マウスＡＮＧＰＴＬ４は４１０アミノ酸タンパク質である。用語「ＡＮＧＰＴＬ４」は、例えば、ポリペプチドのフラグメント（例えば、サブシーケンス、短縮形態など）（例えば、Ｎ末端フラグメント、コイルドコイルドメイン、Ｃ末端フラグメント、フィブリノーゲン様ドメイン、ヒトアンジオポエチン様４タンパク質のアミノ酸１〜１８３、２３〜１８３、１〜約１６２、２３〜約１６２、２３〜４０６、１８４〜４０６、約１６２〜４０６、または２３〜１８４およびマウスアンジオポエチン様４タンパク質のアミノ酸１〜１８３、２３〜１８３、１〜約１６５、２３〜約１６５、２３〜４１０、または１８４〜４１０が含まれる）をいうためにも使用される。他のフラグメントには、例えば、ｈＡＮＧＰＴＬ４の４０〜１８３、６０〜１８３、８０〜１８３、１００〜１８３、１２０〜１８３、１４０〜１８３、４０〜４０６、６０〜４０６、８０〜４０６、１００〜４０６、１２０〜４０６、１４０〜４０６、および１６０〜４０６ならびに、例えば、ｍＡＮＧＰＴＬ４の４０〜１８３、６０〜１８３、８０〜１８３、１００〜１８３、１２０〜１８３、１４０〜１８３、４０〜４１０、６０〜４１０、８０〜４１０、１００〜４１０、１２０〜４１０、１４０〜４１０、および１６０〜４１０が含まれるが、これらに限定されない。ＡＮＧＰＴＬ４の任意のこのような形態を、本出願中で識別して言及することができる（例えば、「ＡＮＧＰＴＬ４（２３〜４０６）」、「ＡＮＧＰＴＬ４（１８４〜４０６）」、「ＡＮＧＰＴＬ４（２３〜１８３）」、「ｍＡＮＧＰＴＬ４（２３〜４１０）」、「ｍＡＮＧＰＴＬ４（１８４〜４１０）」（ｍはマウス配列を示す）など）。未変性（ｎａｔｉｖｅ）ＡＮＧＰＴＬ４のフラグメントのアミノ酸の位置を、未変性ＡＮＧＰＴＬ４配列中に示すように番号をつけた。例えば、未変性ＡＮＧＰＴＬ４フラグメント中のアミノ酸２２位（Ｓｅｒ）はまた、未変性ヒトＡＮＧＰＴＬ４中の２２位（Ｓｅｒ）でもある（例えば、図２を参照のこと）。一般に、未変性ＡＮＧＰＴＬ４のフラグメントは、生物活性を有する。
【００２５】
用語「ＡＮＧＰＴＬ４モジュレーター」は、ＡＮＧＰＴＬ４もしくはその発現を活性化することができる分子（例えば、アゴニスト）またはＡＮＧＰＴＬ４の活性もしくはその発現を阻害することができる分子（例えば、アンタゴニスト（またはインヒビター））をいう。ＡＮＧＰＴＬ４アゴニストには、抗体および活性フラグメントが含まれる。ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストは、ＡＮＧＰＴＬ４活性（例えば、細胞増殖もしくは成長、移動、接着、または代謝産物（例えば、脂質）の調整、またはその発現（ＡＮＧＰＴＬ４受容体（例えば、αＶβ５）へのその結合が含まれる））を中和、遮断、阻害、排除、減少、または妨害することができる分子をいう。ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストには、例えば、抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体およびその抗原結合フラグメント、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合し、それにより、１つまたは複数の受容体への結合が順序付けられる受容体分子および誘導体、抗ＡＮＧＰＴＬ４受容体抗体、ならびにＡＮＧＰＴＬ４受容体アンタゴニスト（受容体の小分子インヒビターなど）が含まれる。他のＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストには、ＡＮＧＰＴＬ４のアンタゴニスト改変体、アンチセンス分子（例えば、ＡＮＧＰＴＬ４−ＳｉＲＮＡ）、ＲＮＡアプタマー、およびＡＮＧＰＴＬ４またはその受容体に対するリボザイムも含まれる。特定の実施形態では、アンタゴニストＡＮＧＰＴＬ４抗体は、ＡＮＧＰＴＬ４の特定の配列または領域（例えば、Ｎ末端フラグメント、コイルドコイルドメイン、Ｃ末端フラグメント、フィブリノーゲン様ドメイン、ヒトアンジオポエチン様４タンパク質のアミノ酸１〜１８３、２３〜１８３、１〜約１６２、２３〜約１６２、２３〜４０６、１８４〜４０６、または２３〜１８４およびマウスアンジオポエチン様４タンパク質のアミノ酸１〜１８３、２３〜１８３、１〜約１６５、２３〜約１６５、２３〜４１０、または１８４〜４１０）への結合によってＡＮＧＰＴＬ４活性を阻害または減少させる抗体である。他のフラグメントには、例えば、ｈＡＮＧＰＴＬ４の４０〜１８３、６０〜１８３、８０〜１８３、１００〜１８３、１２０〜１８３、１４０〜１８３、４０〜４０６、６０〜４０６、８０〜４０６、１００〜４０６、１２０〜４０６、１４０〜４０６、および１６０〜４０６ならびに、例えば、ｍＡＮＧＰＴＬ４の４０〜１８３、６０〜１８３、８０〜１８３、１００〜１８３、１２０〜１８３、１４０〜１８３、４０〜４１０、６０〜４１０、８０〜４１０、１００〜４１０、１２０〜４１０、１４０〜４１０、および１６０〜４１０が含まれるが、これらに限定されない。
【００２６】
用語「抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体」は、十分な親和性および特異性でＡＮＧＰＴＬ４に結合する抗体である。本発明の抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体を、ＡＮＧＰＴＬ４活性が関与する疾患または容態のターゲティングおよび妨害における治療薬として使用することができる。一般に、抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体は、通常、他のＡＮＧＰＴＬ４ホモログ（例えば、ＡＮＧＰＴＬ３）に結合しない。
【００２７】
用語「ＶＥＧＦ」および「ＶＥＧＦ−Ａ」を、１６５アミノ酸の血管内皮細胞増殖因子およびＬｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１３０６（１９８９），Ｈｏｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．，５：１８０６（１９９１）およびＲｏｂｉｎｓｏｎ  ＆  Ｓｔｒｉｎｇｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１４４（５）：８５３−８６５（２００１）に記載の関連する１２１、１４５、１８３、１８９、および２０６アミノ酸の血管内皮細胞増殖因子、その天然に存在する対立遺伝子形態、およびプロセシング形態をいうために交換可能に使用する。用語「ＶＥＧＦ」を、例えば、１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子のうちのアミノ酸８〜１０９または１〜１０９を含むポリペプチドのフラグメントをいうためにも使用する。ＶＥＧＦの任意のこのような形態を、本出願中で識別して言及することができる（例えば、「ＶＥＧＦ（８〜１０９）」、「ＶＥＧＦ（１〜１０９）」、または「ＶＥＧＦ１６５」）。未変性ＶＥＧＦの「フラグメント」のアミノ酸の位置を、未変性ＶＥＧＦ配列中に示すように番号をつける。例えば、未変性ＶＥＧＦフラグメント中のアミノ酸１７位（メチオニン）はまた、未変性ＶＥＧＦ中の１７位（メチオニン）でもある。未変性ＶＥＧＦのフラグメントは、未変性ＶＥＧＦに匹敵するＫＤＲおよび／またはＦｌｔ−１受容体に対する結合親和性を有し得る。
【００２８】
「抗ＶＥＧＦ抗体」は、十分な親和性および特異性でＶＥＧＦに結合する抗体である。本発明の抗ＶＥＧＦ抗体を、ＶＥＧＦ活性が関与する疾患または容態のターゲティングおよび妨害における治療薬として使用することができる。抗ＶＥＧＦ抗体は、通常、他のＶＥＧＦホモログ（ＶＥＧＦ−ＢまたはＶＥＧＦ−Ｃなど）に結合せず、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦ、またはｂＦＧＦなどの他の増殖因子にも結合しない。例えば、米国特許第６，５８２，９５９号、同第６，７０３，０２０号；ＷＯ  ９８／４５３３２；ＷＯ  ９６／３００４６；ＷＯ  ９４／１０２０２；欧州特許第０６６６８６８Ｂ１号；米国特許出願番号２００３０２０６８９９号、２００３０１９０３１７号、２００３０２０３４０９号、および２００５０１１２１２６号；Ｐｏｐｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８８：１４９−１６４（２００４）；ならびに代理人整理番号Ｐ２０７２Ｒ１を参照のこと。「ｒｈｕＭＡｂ  ＶＥＧＦ」または「Ａｖａｓｔｉｎ（商標）」としても公知の抗ＶＥＧＦ抗体「ベバシズマブ（ＢＶ）」は、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９（１９９７）にしたがって生成された組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である。これは、変異ヒトＩｇＧ１フレームワーク領域およびヒトＶＥＧＦのその受容体への結合を遮断するマウス抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ．４．６．１由来の抗原結合相補性決定領域を含む。ベバシズマブの約９３％のアミノ酸配列（ほとんどのフレームワーク領域を含む）は、ヒトＩｇＧ１に由来し、この配列の約７％はマウス抗体Ａ４．６．１に由来する。ベバシズマブの分子量は約１４９，０００ダルトンであり、グリコシル化されている。ベバシズマブおよび他のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体は、２００５年２月２６日発行の米国特許第６，８８４，８７９号にさらに記載されている。
【００２９】
「ＶＥＧＦアンタゴニスト」は、ＶＥＧＦ活性（例えば、１つまたは複数のＶＥＧＦ受容体へのその結合が含まれる））を中和、遮断、阻害、排除、減少、または妨害することができる分子をいう。ＶＥＧＦアンタゴニストには、抗ＶＥＧＦ抗体およびその抗原結合フラグメント、ＶＥＧＦに特異的に結合し、それにより、１つまたは複数の受容体への結合が順序付けられる受容体分子および誘導体、抗ＶＥＧＦ受容体抗体、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト（ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの小分子インヒビターなど）、ならびに融合タンパク質（例えば、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、ＶＥＧＦ１２１−ゲロニン（Ｐｅｒｅｇｉｎｅ））が含まれる。ＶＥＧＦアンタゴニストには、ＶＥＧＦのアンタゴニスト改変体、ＶＥＧＦに指向するアンチセンス分子、ＲＮＡアプタマー、およびＶＥＧＦに対するリボザイム、またはＶＥＧＦ受容体も含まれる。
【００３０】
ポリペプチドの「未変性配列」は、天然に由来するポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。したがって、ポリペプチドの未変性配列は、任意の哺乳動物由来の天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列を有する。このようなポリペプチドの未変性配列を、天然から単離し、あるいは組換え手段または合成手段によって産生することができる。用語ポリペプチドの「未変性配列」は、特に、天然に存在するポリペプチドの短縮形態または分泌形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に存在する改変体形態（例えば、選択的スプライシング形態）、および天然に存在するポリペプチドの対立遺伝子改変体を含む。
【００３１】
「ポリペプチド鎖」は、非共有結合性相互作用またはジスルフィド結合とは対照的に、ペプチド結合によってその各ドメインが他のドメインに連結したポリペプチドである。
【００３２】
ポリペプチド「改変体」は、少なくとも約８０％のアミノ酸配列が対応するポリペプチドの未変性配列と同一な生物活性ポリペプチドを意味する。このような改変体には、例えば、ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端の１つまたは複数のアミノ酸（天然に存在するアミノ酸および／または天然に存在しないアミノ酸）残基が負荷または欠失しているポリペプチドが含まれる。通常、改変体は、未変性のポリペプチド配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列が同一であるか、少なくとも約９０％のアミノ酸配列が同一であるか、少なくとも９５％またはそれを超えるアミノ酸配列が同一である。改変体には、未変性配列の（典型的には、生物活性）ポリペプチドフラグメント（例えば、サブシーケンス、短縮など）が含まれる。
【００３３】
「アミノ酸配列の同一率（％）」を、本明細書中で、同一配列の一部としていかなる保存的置換を考慮せず、必要に応じて、最大配列同一率を達成するための配列のアラインメントおよびギャップの導入後に選択した配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の比率と定義する。アミノ酸配列同一率の決定のためのアラインメントを、当業者の範囲内の種々の方法（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアの使用）で達成することができる。当業者は、アラインメント計測のための適切なパラメータ（比較配列の全長にわたって最大アラインメントを達成することが必要な任意のアルゴリズムが含まれる）を決定することができる。しかし、本明細書中の目的のために、以下に記載のように配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２の使用によってアミノ酸配列同一率の値を得る。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．が著作権を有し、エンドユーザ用付属文書と共にＵ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｏｆｆｉｃｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，２０５５９に提出されており、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７にて登録されており、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを通して公的に利用可能である。ＡＬＩＧＮ−２プログラムを、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム（例えば、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）  Ｖ４．０Ｄ）用にコンパイルすべきである。全ての配列比較パラメータを、ＡＬＩＧＮ−２プログラムで設定し、変更しない。
【００３４】
本明細書中の目的のために、所与のアミノ酸配列Ａの所与のアミノ酸配列Ｂとのアミノ酸配列同一率（所与のアミノ酸配列Ｂと一定のアミノ酸配列同一率を有するか含む所与のアミノ酸配列Ａと表現することもできる）を、以下のように計算した：
１００×分数Ｘ／Ｙ
（式中、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によって、このプログラムのＡおよびＢのアラインメントにおいて完全な一致とスコアリングされたアミノ酸残基数であり、Ｙは、Ｂ中の総アミノ酸残基数である）。アミノ酸配列Ａの長さはアミノ酸配列Ｂの長さと等しくなく、Ｂに対するＡのアミノ酸同一率はＡに対するＢのアミノ酸同一率と等しくないと認識される。
【００３５】
本明細書中で使用される、用語「ＡＮＧＰＴＬ４改変体」は、上記の改変体および／または未変性のＡＮＧＰＴＬ４配列中の１つまたは複数のアミノ酸変異を含むＡＮＧＰＴＬ４をいう。任意選択的に、１つまたは複数のアミノ酸変異には、アミノ酸置換が含まれる。本発明で使用されるＡＮＧＰＴＬ４およびその改変体を、当該分野で周知の種々の方法によって調製することができる。ＡＮＧＰＴＬ４のアミノ酸配列改変体を、ＡＮＧＰＴＬ４  ＤＮＡの変異によって調製することができる。このような改変体には、例えば、ＡＮＧＰＴＬ４のアミノ酸配列内の残基の欠失、挿入、または置換（例えば、ＡＴＣＣ寄託番号２０９２８４で寄託されているか図２に示す核酸によってコードされるヒトアミノ酸配列）が含まれる。欠失、挿入、および置換を任意に組み合わせて、所望の活性を有する最終構築物に到達することができる。改変体をコードするＤＮＡ中の変異を、読み取り枠外に配列を配置してはならず、好ましくは、変異により、二次ｍＲＮＡ構造を得ることができる相補領域が作製されない。欧州特許第７５，４４４Ａ号。
【００３６】
ＡＮＧＰＴＬ４変異体を、任意選択的に、未変性ＡＮＧＰＴＬ４をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的変異誘発またはファージディスプレイ技術、それによる改変体をコードするＤＮＡの産生、およびその後の組換え細胞培養物中でのＤＮＡの発現によって調製する。
【００３７】
アミノ酸配列改変の導入部位を予め決定する一方で、変異自体を予め決定する必要はない。例えば、所与の部位での変異能力を最適にするために、標的コドンまたは標的領域を無作為に変異誘発させ、発現されたＡＮＧＰＴＬ４改変体を所望の活性の最適な組み合わせについてスクリーニングすることができる。公知の配列を有するＤＮＡ中の予め決定した部位に置換変異を作製する技術（例えば、部位特異的変異誘発など）は周知である。本明細書中に記載のＡＮＧＰＴＬ４改変体を、ＰＣＴ公開ＷＯ  ００／６３３８０号などに記載のファージディスプレイ技術によって調製することができる。
【００３８】
このようなクローンを選択した後、変異タンパク質領域を除去し、タンパク質産生のための適切なベクター（一般に、適切な宿主の形質転換のために使用することができる発現ベクター型）に入れることができる。
【００３９】
アミノ酸配列の欠失は、一般に、約１〜３０残基、任意選択的に１〜１０残基、任意選択的に１〜５残基またはそれ未満の範囲であり、典型的には連続している。
【００４０】
アミノ酸配列挿入には、１残基から本質的に無制限の長さのポリペプチドまでのアミノ末端および／またはカルボキシ末端の融合および１つまたは複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。配列内挿入（すなわち、未変性のＡＮＧＰＴＬ４配列内の挿入）は、一般に、約１〜１０残基、任意選択的に１〜５残基、または任意選択的に１〜３残基の範囲であり得る。末端挿入の例には、組換え宿主からの分泌を容易にするためのＮ末端へのシグナル配列（宿主細胞と異種でも相同でもよい）の融合が含まれる。
【００４１】
さらなるＡＮＧＰＴＬ４改変体は、未変性のＡＮＧＰＴＬ４中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その位置に異なる残基が挿入されているＡＮＧＰＴＬ４改変体である。本発明の一実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ４改変体には、ＡＮＧＰＴＬ４の１６２位および／もしくは１６４位での置換またはｍＡＮＧＰＴＬ４の１６９位での置換が含まれる。このような置換を、表１に示す置換にしたがって行うことができる。ＡＮＧＰＴＬ４改変体はまた、本明細書中に記載の非天然アミノ酸でありうる。
【００４２】
アミノ酸を、以下のようにその側鎖の性質の類似性にしたがって分類することができる（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄ．，ｐｐ．７３−７５，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７５））。
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）非電荷極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）
あるいは、天然に存在する残基を、以下のように共通の側鎖の性質に基づいて分類することができる。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性疎水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
【００４３】
【表１】
2008507536.tif 000002
。
【００４４】
「天然に存在するアミノ酸残基」（すなわち、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸残基）を、以下からなる群から選択することができる：アラニン（Ａｌａ）；アルギニン（Ａｒｇ）；アスパラギン（Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ）；システイン（Ｃｙｓ）；グルタミン（Ｇｌｎ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ）；グリシン（Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉｌｅ）：ロイシン（Ｌｅｕ）；リジン（Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐｒｏ）；セリン（Ｓｅｒ）；スレオニン（Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｔｒｐ）；チロシン（Ｔｙｒ）；およびバリン（Ｖａｌ）。「天然に存在しないアミノ酸残基」は、ポリペプチド鎖中の隣接アミノ酸残基と共有結合することができる上記に列挙した天然に存在するアミノ酸残基以外の残基をいう。天然に存在しないアミノ酸残基の例には、例えば、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、および他のアミノ酸残基アナログ（Ｅｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１−３３６（１９９１）ならびに米国特許出願公開第２００３０１０８８８５号および同第２００３００８２５７５号に記載のアミノ酸残基など）が含まれる。簡単に述べれば、これらの手順は、サプレッサーｔＲＮＡを天然に存在しないアミノ酸残基で活性化し、その後にＲＮＡをインビトロまたはインビボで転写および翻訳する工程を含む。例えば、米国特許出願公開第２００３０１０８８８５号および同第２００３００８２５７５号；ならびにＮｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１８２（１９８９）；およびＥｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａを参照のこと。
【００４５】
「単離」ポリペプチドは、その自然環境の成分から同定、分離、および／または回収されたポリペプチドである。その自然環境の汚染成分は、ポリペプチドの診断または治療での使用を妨害する材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性溶質または非タンパク質性溶質が含まれ得る。特定の実施形態では、ポリペプチドを、（１）Ｌｏｗｒｙ法で決定したところ、９５重量％を超えるポリペプチドまたは９９重量％を超えるポリペプチドに精製するか、（２）スピンカップシークエネーターを用いて少なくとも１５残基のＮ末端アミノ酸配列または内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度に精製するか、（３）クーマシーブルーまたは銀染色を使用した還元条件下または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで精製する。単離ポリペプチドには、組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕのポリペプチドが含まれ、これは、ポリペプチドの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないからである。しかし、通常、単離ポリペプチドを、少なくとも１つの精製工程によって調製する。
【００４６】
用語「抗体」を最も広い意味で使用し、モノクローナル抗体（全長またはインタクトなモノクローナル抗体が含まれる）、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体（例えば、二重特異性抗体）、および、所望の生物活性を示す限り、抗体フラグメント（以下を参照のこと）が含まれる。
【００４７】
他で示さない限り、表現「多価抗体」を、本明細書を通して、３つまたはそれを超える抗原結合部位を含む抗体を示すために使用する。多価抗体を、典型的には、３つまたはそれを超える抗原結合部位を有するように操作し、一般に、ＩｇＭ抗体またはＩｇＡ抗体の未変性配列ではない。
【００４８】
「抗体フラグメント」は、一般に、インタクトな抗体の抗原結合部位を含み、それにより、抗原結合能力を保持するインタクトな抗体の一部のみを含む。本発明の定義に含まれる抗体フラグメントの例には、以下が含まれる：（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、およびＣＨ１ドメインを有するＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つまたは複数のシステイン残基を有するＦａｂフラグメントであるＦａｂ’フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦｄフラグメント；（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインならびにＣＨ１ドメインのＣ末端に１つまたは複数のシステイン残基を有するＦｄ’フラグメント；（ｖ）抗体の１つのアームにＶＬおよびＶＨドメインを有するＦｖフラグメント；（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６（１９８９））；（ｖｉｉ）単離ＣＤＲ領域；（ｖｉｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ領域でのジスルフィド結合によって連結した２つのＦａｂ’フラグメントを含む２価フラグメント）；（ｉｘ）一本鎖抗体分子（例えば、一本鎖Ｆｖ；ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８５：５８７９−５８８３（１９８８））；（ｘ）同一のポリペプチド鎖中に軽鎖可変領域（ＶＬ）に連結した重鎖可変領域（ＶＨ）を含む２つの抗原結合部位を有する「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」（例えば、欧州特許第４０４，０９７号；ＷＯ  ９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照のこと）；（ｘｉ）相補性軽鎖ポリペプチドと共に抗原結合領域対を形成するタンデムＦｄセグメント対（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む「線状抗体（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７  １０６２（１９９５）；および米国特許第５，６４１，８７０号）。
【００４９】
本明細書中で使用される、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体（すなわち、考えられる天然に存在する変異（少量であり得る）以外は集団を含む各抗体が同一である）をいう。モノクローナル抗体は特異性が高く、１つの抗原に対して指向する。さらに、典型的に異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の１つの決定基に対して指向する。修飾語「モノクローナル」は、任意の特定の方法による抗体の産生が必要であると解釈されない。例えば、本発明によって使用されるモノクローナル抗体を、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製することができるか、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によって作製することができる。「モノクローナル抗体」を、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）またはＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載の技術を使用したファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００５０】
本明細書中のモノクローナル抗体には、特に、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種に由来するか特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか相同である一方で、残りの鎖が別の種に由来するか別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか相同する「キメラ」抗体、所望の生物活性を示す限り、このような抗体のフラグメントが含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
【００５１】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの部分については、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基に置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基に置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体中で見出されない残基を含み得る。これらの修飾を、抗体の能力をさらに洗練させるために行う。一般に、ヒト化抗体は、実質的に全ての少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを含み、全てまたは実質的に全ての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、全てまたは実質的に全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列のＦＲに対応する。ヒト化抗体は、任意選択的に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域）の少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照のこと。
【００５２】
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生され、そして／または本明細書中に開示の任意のヒト抗体の作製技術を使用して作製された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、特に、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を排除する。ヒト抗体を、当該分野で公知の種々の技術を使用して産生することができる。一実施形態では、ヒト抗体を、ファージライブラリーがヒト抗体を発現する場合、ファージライブラリーから選択する（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０９−３１４（１９９６）：Ｓｈｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６１５７−６１６２（１９９８））；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））。ヒト抗体を、トランスジェニック動物（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活化されているマウス）へのヒト免疫グロブリン遺伝子座の移入によって作製することもできる。攻撃誘発の際、ヒト抗体産生が認められ、これはあらゆる点でヒトで認められる産生と酷似している（遺伝子の再編成、アセンブリ、および抗体レパートリーが含まれる）。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、ならびに以下の科学論文に記載さている：Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８２６（１９９６）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）に記載されている。あるいは、ヒト抗体を、標的抗原に対して指向する抗体を産生するヒトＢリンパ球（このようなＢリンパ球を、個体から回収するか、インビトロで免疫化することができる）の不死化によって調製することができる。例えば、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）；および米国特許第５，７５０，３７３号を参照のこと。
【００５３】
用語「可変」は、可変ドメインの一定の部分が抗体間の配列中で広範に異なるという事実をいい、それぞれの特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性において使用される。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布していない。可変性は、軽鎖および重鎖の可変ドメイン中の超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存されている部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。未変性の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、４つのＦＲを含み、これらは大部分がβシート立体配置を取り、３つの超可変領域によって連結されて、βシート構造（いくつかの場合、その一部）に連結しているループを形成する。各鎖中の超可変領域は、ＦＲと極めて接近して保持され、他の鎖由来の超可変領域と共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）を参照のこと）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、種々のエフェクター効果（抗体の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）への関与など）を示す。
【００５４】
本明細書中で使用される、用語「超可変領域」は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、および９５〜１０２（Ｈ３）（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）））および／または「超可変ループ」由来の残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、および９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３）（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）））を含む。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、本明細書中で定義された超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００５５】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、インタクトな抗体を異なる「クラス」に割り当てることができる。インタクトな抗体には５つの主なクラス（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）が存在し、これらのうちのいくつかを、「サブクラス」（イソ型）（例えば、ＩｇＧ１（非ＡおよびＡアロタイプが含まれる）、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２）にさらに分類することができる。異なる抗体クラスに対応する重鎖定常ドメインを、それぞれ、α、δ、ε、γおよびμと呼ぶ。異なる免疫グロブリンクラスのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。
【００５６】
任意の脊椎動物種由来の抗体の軽鎖を、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κ（６）およびλ（８）と呼ばれる２つの明確に異なる型の１つに割り当てることができる。
【００５７】
用語「Ｆｃ領域」を、インタクトな抗体のパパイン消化によって生成することができる免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用する。Ｆｃ領域は、未変性配列のＦｃ領域または改変Ｆｃ領域であり得る。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界が変化し得るにもかかわらず、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、一般に、約Ｃｙｓ２２６位または約Ｐｒｏ２３０位のアミノ酸残基からＦｃ領域のカルボキシル末端までのひと続き（ｓｔｒｅｔｃｈ）と定義する。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に、２つの定常ドメイン（ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）および任意選択的にＣＨ４ドメインを含む。
【００５８】
本明細書中の「Ｆｃ領域鎖」は、Ｆｃ領域の２つのポリペプチド鎖のうちの１つを意味する。
【００５９】
ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」（「Ｃｇ２」ドメインとも呼ばれる）は、通常、約２３１位のアミノ酸残基から約３４０位のアミノ酸残基までにわたる。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対合しないという点で固有である。むしろ、２つのＮ結合分岐炭水化物鎖が、インタクトな未変性ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に入っている。炭水化物がドメイン−ドメイン対合の代わりとなってＣＨ２ドメインの安定化に役立つと推測されている。Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１−２０６（１９８５）。本明細書中のＣＨ２ドメインは、未変性配列のＣＨ２ドメインまたは変性ＣＨ２ドメインであり得る。
【００６０】
「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域中のＣ末端からＣＨ２ドメインまで（すなわち、ＩｇＧの約３４１位のアミノ酸残基から約４４７位のアミノ酸残基まで）のひと続きの残基を含む。本明細書中のＣＨ３領域は、未変性配列のＣＨ３ドメインまたは変性ＣＨ３ドメイン（例えば、一方の鎖中に移入された「突出部（ｐｒｏｔｒｏｂｅｒａｎｃｅ）」および他方の鎖中に対応する移入された「溝（ｃａｖｉｔｙ）」を有するＣＨ３ドメイン）であり得る（米国特許第５，８２１，３３３号（特に本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。このような変異ＣＨ３ドメインを使用して、本明細書中に記載の多重特異性（例えば、二重特異性）抗体を作製することができる。
【００６１】
「ヒンジ領域」は、一般に、ヒトＩｇＧ１の約Ｇｌｕ２１６または約Ｃｙｓ２２６から約Ｐｒｏ２３０までのひと続きと定義される（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１−２０６（１９８５））。他のＩｇＧイソ型のヒンジ領域を、第１および最後のシステイン残基を配置して同一の位置に重鎖内Ｓ−Ｓ結合を形成することによってＩｇＧ１配列と整列させることができる。本明細書中のヒンジ領域は、未変性配列のヒンジ領域または変異ヒンジ領域であり得る。変異ヒンジ領域の２つのポリペプチド鎖は、一般に、ポリペプチド鎖あたり少なくとも１つのシステイン残基を保持し、その結果、変異ヒンジ領域の２つのポリペプチド鎖は２つの鎖の間にジスルフィド結合を形成することができる。本明細書中の好ましいヒンジ領域は、未変性配列のヒトヒンジ領域（例えば、未変性配列のヒトＩｇＧ１ヒンジ領域）である。
【００６２】
「機能的Ｆｃ領域」は、未変性配列のＦｃ領域の少なくとも１つの「エフェクター機能」を有する。例示的「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などが含まれる。このようなエフェクター機能は、一般に、結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わされるべきＦｃ領域が必要であり、このような抗体エフェクター機能の評価のために当該分野で公知の種々のアッセイを使用して評価することができる。
【００６３】
「未変性配列のＦｃ領域」は、天然で見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。
【００６４】
「改変Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって未変性配列のＦｃ領域と異なるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、改変Ｆｃ領域は、未変性配列のＦｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸が置換されている（例えば、未変性配列のＦｃ領域中または親ポリペプチドのＦｃ領域中に約１個〜約１０個のアミノ酸の置換、好ましくは、約１個〜約５個のアミノ酸置換を有する）。本明細書中の改変Ｆｃ領域は、典型的に、例えば、未変性配列のＦｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の配列が同一であるか、少なくとも約９０％の配列が同一であるか、少なくとも約９５％またはそれを超える配列が同一である。
【００６５】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」および「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が標的細胞上の結合抗体を認識し、その後に標的細胞を溶解させる細胞媒介性反応をいう。ＡＤＣＣの媒介のための主な細胞（ＮＫ細胞）はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対して、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）の４６４頁の表３にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、インビトロＡＤＣＣアッセイ（米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載のアッセイなど）を行うことができる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいはまたはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性を、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）に開示の動物モデルなどの動物モデルにおいてインビボで評価することができる。
【００６６】
「ヒトエフェクター細胞」は、１つまたは複数のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を発揮する白血球である。典型的には、細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を発揮する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、および好中球が含まれ、一般に、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞を、天然供給源（例えば、本明細書中に記載の血液またはＰＢＭＣ）から単離することができる。
【００６７】
用語「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」を、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明するために使用する。好ましいＦｃＲは、未変性配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合する（γ受容体）ＦｃＲであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体（これらの受容体の対立遺伝子改変体および選択的スプライシング形態が含まれる）が含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、主にその細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有するＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が含まれる。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＩＢは、その細胞質ドメイン中に、免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（Ｄａeｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）に概説）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）；およびｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）に概説されている。他のＦｃＲ（将来的に同定されるＦｃＲが含まれる）は、本明細書中の用語「ＦｃＲ」に含まれる。この用語には、母方のＩｇＧの胎児への輸送を担う新生児受容体（ｎｅｏｎａｔａｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＦｃＲｎ）も含まれる（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）；およびＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））。
【００６８】
「補体依存性細胞傷害性」および「ＣＤＣ」は、補体存在下での標的の溶解をいう。補体活性化経路は、同族抗原と複合体化した分子（例えば、抗体）への補体系（Ｃ１ｑ）の第１の成分の結合によって開始される。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイ（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６））を行うことができる。
【００６９】
「親和性成熟」抗体は、１つまたは複数のそのＣＤＲ中に１つまたは複数の変化を有し、これらの変化を持たない親抗体と比較して抗原に対する抗体の親和性が改良された抗体である。好ましい親和性成熟抗体は、ナノモルまたはさらにピコモルの標的抗原に対して親和性を有する。親和性成熟抗体を、当該分野で公知の手順によって産生する。Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）は、ＶＨおよびＶＬドメインのシャフリングによる親和性成熟を記載している。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基の無作為な変異誘発は、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−９（１９９５）；およびＨａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６（１９９２）に記載されている。
【００７０】
本明細書中の「可動性リンカー」は、ペプチド結合によって連結された２つまたはそれを超えるアミノ酸残基を含むペプチドをいい、これによって連結された２つのポリペプチド（２つのＦｄ領域など）の回転自由度が増加する。このような回転自由度により、可動性リンカーによって連結された２つまたはそれを超える抗原結合部位をより効率的に各標的抗原に近づけることが可能である。適切な可動性リンカーペプチド配列の例には、ｇｌｙ−ｓｅｒ、ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｓｅｒ、ａｌａ−ｓｅｒ、およびｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒが含まれる。
【００７１】
「二量体化ドメイン」は、少なくとも２つのアミノ酸残基（一般に、システイン残基）または少なくとも２つのペプチドまたはポリペプチド（同一または異なるアミノ酸配列を有する）の会合によって形成される。ペプチドまたはポリペプチドは、共有結合および／または非共有結合によって互いに相互作用し得る。二量体化ドメインの例には、Ｆｃ領域；ヒンジ領域；ＣＨ３領域；ＣＨ４領域；ＣＨ１−ＣＬ対；米国特許第５，８２１，３３３号（特に本明細書中で参考として援用される）の記載のように操作された「ノブ（ｋｎｏｂ）」および／または「突出部（ｐｒｏｔｒｕｂｅｒａｎｃｅ）」との「接合部分」；ロイシンジッパー（例えば、ｊｕｎ／ｆｏｓロイシンジッパー、Ｋｏｓｔｅｌｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと；または酵母ＧＣＮ４ロイシンジッパー）；イソロイシンジッパー；受容体二量体対（例えば、インターロイキン８受容体（ＩＬ−８Ｒ）；およびインテグリンヘテロ二量体（ＬＦＡ−１およびＧＰＩＩＩｂ／ＩＩＩａなど）またはその二量体形成領域；二量体リガンドポリペプチド（例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＤＧＦメンバー、および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（Ａｒａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（４５）：２７８３３−２７８３９（１９９４）およびＲａｄｚｉｅｊｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２（４８）：１３５０（１９９３）を参照のこと）またはその二量体形成領域；ジスルフィド結合を形成することができるシステイン残基対；ペプチドとポリペプチドとの間にジスルフィド結合を形成することができるように少なくとも１つのシステイン残基（例えば、約１個、２個、または３個〜約１０個のシステイン残基）（以後、「合成ヒンジ」）をそれぞれ含むペプチド対またはポリペプチド対；ならびに抗体可変領域が含まれる。本明細書中で最も好ましい二量体化ドメインは、Ｆｃ領域またはヒンジ領域である。
【００７２】
抗体の「機能的抗原結合部位」は、標的抗原に結合することができる抗原結合部位である。抗原結合部位の抗原結合親和性は、抗原結合部位が由来する親抗体と必ずしも同等の強さではないが、抗原への抗体の結合を評価するための公知の種々の方法のいずれか１つを使用して抗原結合能力を測定可能でなければならない。さらに、本明細書中の多価抗体の各抗原結合部位の抗原結合親和性は、量的に同一である必要はない。本明細書中の多量体抗体について、機能的抗原結合部位数を、超遠心分離分析を使用して評価することができる。この分析方法にしたがって、異なる比率で標的抗原と多量体抗体とを組み合わせ、複合体の平均分子量を計算し、異なる機能的結合部位数を計算する。これらの理論値を得られた実際の実験値と比較し、機能的結合部位数を評価する。
【００７３】
指定された抗体の「生物学的特徴」を有する抗体は、同一の抗原に結合する他の抗体が区別される１つまたは複数の生物学的特徴を有する抗体である。
【００７４】
目的の抗体によって結合された抗原上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）などに記載の日常的な交差遮断（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）アッセイを行うことができる。
【００７５】
１つまたは複数のさらなる治療薬「と組み合わせた」投与には、同時（併用）投与および／または任意の順序での連続的投与が含まれる。
【００７６】
治療される「哺乳動物」は、哺乳動物として分類される任意の動物（ヒト、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌ）および家畜（ｆａｒｍ  ａｎｉｍａｌ）、ならびに動物園の動物、競技動物（ｓｐｏｒｔｓ）、またはペット用動物が含まれる）（イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタなど）をいう。典型的には、哺乳動物はヒトである。
【００７７】
「障害」は、本発明の分子を使用した治療から恩恵を受けるであろう任意の容態である。これには、慢性および急性の障害または疾患（哺乳動物が問題の障害にかかりやすい病的状態が含まれる）が含まれる。本明細書中の治療すべき障害の制限されない例には、任意の形態の腫瘍、良性および悪性腫瘍;血管新生化腫瘍;肥大;白血病およびリンパ性悪性疾患;ニューロン、神経膠細胞、星状細胞、視床下部、および他の腺、マクロファージ、上皮、間質、および胞胚腔の障害;ならびに不適当な、異常な、過剰のおよび／または病理学的な血管新生および／または血管透過性を生じる炎症性障害、血管形成障害、および免疫障害、血管障害が含まれる。
【００７８】
用語「有効量」または「治療有効量」は、哺乳動物の疾患または障害を治療するのに有効な薬物の量をいう。癌の場合、有効量の薬物により、癌細胞数を減少させることができ、腫瘍サイズを減少させることができ、周辺器官への癌細胞浸潤を阻害する（すなわち、ある程度遅延させ、典型的には停止させる）ことができ、腫瘍の転移を阻害（すなわち、ある程度遅延させ、典型的には停止させる）することができ、腫瘍成長をある程度阻害することができ、そして／または障害に関連する１つまたは複数の症状をある程度緩和することができる。薬物によって既存の癌細胞の増殖を防止し、そして／または死滅させることができる程度まで、静菌性および／または細胞傷害性を示し得る。癌療法のために、インビボでの有効性を、例えば、生存期間、疾患進行時間（ＴＴＰ）、反応速度（ＲＲ）、応答の持続時間、および／または生活の質の評価によって測定することができる。
【００７９】
「治療」は、処置上の治療および予防的または防止的手段をいう。治療が必要な者には、既に障害を罹患している者および障害を予防すべき者が含まれる。
【００８０】
本明細書中のＡＮＧＰＴＬ４分子に関する用語「生物活性」および「生物学的に活性な」は、特異的に結合して細胞応答（例えば、増殖、接着、移動、脂質調整など）を調節する分子の能力をいう。細胞応答には、ＡＮＧＰＴＬ４受容体（例えば、αＶβ５インテグリン受容体）によって媒介される細胞応答（接着、移動、および／または増殖が含まれるが、これらに限定されない）も含まれる。この文脈では、用語「調整する」には、促進および阻害の両方が含まれる。本発明の分子には、ＡＮＧＰＴＬ４受容体（例えば、αＶβ５インテグリン受容体）のアゴニストおよびアンタゴニストも含まれる。
【００８１】
本明細書中で使用される、「肥大」を、腫瘍形成に関与しない天然の成長と無関係な器官または構造の質量の増大と定義する。器官または組織の肥大は、各細胞の質量の増大（真性肥大）、組織を作製する細胞数の増加（過形成）、またはその両方のいずれかに起因する。
【００８２】
用語「癌」および「癌性」は、典型的には、無秩序の細胞増殖によって特徴づけられる哺乳動物の生理学的容態をいうか説明する。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ性悪性疾患が含まれるが、これらに限定されない。このような癌のより詳細な例には、腎臓癌もしくは腎癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、直腸結腸癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌が含まれる）、扁平上皮癌（例えば、上皮扁平上皮癌）、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）または胃の癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）（消化器癌が含まれる）、膵癌、頭頸部癌、グリア芽細胞腫、網膜芽細胞腫、星細胞腫、テコーマ、男性化腫瘍、肝細胞腫、血液悪性腫瘍（非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫、および急性血液悪性腫瘍が含まれる）、子宮内膜癌もしくは子宮癌、子宮内膜症、線維肉腫、絨毛癌、唾液腺癌、外陰癌、甲状腺癌、食道癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、上咽頭癌、鼻咽頭癌、咽頭癌、カポジ肉腫、黒色腫、皮膚癌、シュワン腫、乏突起細胞腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、尿路癌、甲状腺癌、ウィルムス腫瘍、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中等度の悪性度の濾胞性ＮＨＬ；中等度の悪性度のびまん性ＮＨＬ；高悪性度の免疫芽細胞ＮＨＬ；高悪性度のリンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度の小さな非切れ込み細胞ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；およびワンデンシュトレームマクログロブリン血症が含まれる）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；および移植後リンパ球増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症（ｐｈａｋｏｍａｔｏｓｅｓ）に関連する異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍に関連する浮腫など）、およびメージ症候群が含まれる。
【００８３】
用語「抗新生物組成物」は、少なくとも１つの活性な治療薬（例えば、「抗癌薬」）を含む癌治療で有用な組成物をいう。治療薬（抗癌薬）の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：例えば、化学療法薬、増殖抑制薬、細胞傷害薬、放射線治療で使用される薬剤、抗血管形成薬、アポトーシス薬、抗チューブリン薬、毒素、癌を治療するための他の薬剤（例えば、抗−ＶＥＧＦ中和抗体）、ＶＥＧＦアンタゴニスト、抗ＨＥＲ−２、抗ＣＤ２０、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）アンタゴニスト（例えば、チロシンキナーゼインヒビター）、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲインヒビター、エルロチニブ、ＣＯＸ−２インヒビター（例えば、セレコキシブ）、インターフェロン、サイトカイン、１つまたは複数のＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４に結合するアンタゴニスト（例えば、中和抗体）、またはＶＥＧＦ受容体、血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ）および／または幹細胞因子（ＳＣＦ）の受容体チロシンキナーゼのインヒビター（例えば、イマチニブメシレート（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）Ｎｏｖａｒｔｉｓ））、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２、および他の生物活性薬および有機化学薬など。その組み合わせも本発明に含まれる。
【００８４】
本明細書中で使用される、用語「細胞傷害薬」は、細胞機能を阻害または防止し、そして／または細胞破壊を起こす物質をいう。この用語は、放射性同位体（２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、およびＬｕの放射性同位体）、化学療法薬、小分子毒素または細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素（そのフラグメントおよび／または改変体が含まれる）などの毒素が含まれることが意図される。
【００８５】
本明細書中で使用される場合、「増殖抑制薬」は、細胞増殖をインビトロおよび／またはインビボで阻害する化合物または組成物をいう。したがって、成長抑制薬は、Ｓ期の細胞の比率を有意に減少させるものであり得る。成長抑制薬の例には、細胞周期（Ｓ期以外）の進行を遮断する薬剤（Ｇ１の停止およびＭ期の停止を誘導する薬剤など）が含まれる。古典的なＭ期遮断薬には、ビンカ（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、ＴＡＸＯＬ（登録商標）、およびトポＩＩ阻害薬（ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンなど）が含まれる。Ｇ１期を停止させる薬剤（例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、およびａｒａ−ＣなどのＤＮＡアルキル化剤）は、Ｓ期の停止にも波及する。さらなる情報を、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ａｎｄ  Ｉｓｒａｅｌ，ｅｄｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １，ｅｎｔｉｔｌｅｄ  “Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，ａｎｄ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ”  ｂｙ  Ｍｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９５）（特に、ｐ．１３）に見出すことができる。
【００８６】
「化学療法薬」は、癌治療に有用な化合物である。化学療法薬の例には、アルキル化剤（チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミドなど）；アルキルスルホン酸塩（ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなど）；アジリジン（ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、およびウレドパなど）；エチレンイミンおよびメチラメルアミン（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチロールメラミンが含まれる）；アセトゲニン（特に  ブラタシンおよびブラタシノン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎｏｎｅ））；δ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；β−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成アナログトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標）が含まれる）、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトセシン、スコポレクチン（ｓｃｏｐｏｌｅｃｔｉｎ）、および９−アミノカンプトテシンが含まれる）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、およびビセレシン合成アナログが含まれる）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；テニポシド；クリプトフィシン（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｉｎ）（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ズオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）（合成アナログＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１が含まれる）；エレウセロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチイン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード（クロランブシル、クロラムブシル、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロホスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタードなど）；ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）（カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロリムスチン、ニムスチン、およびラニムスチンなど）；抗生物質（エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン（特に、カリケアマイシンγ１ＩおよびカリケアマイシンωＩ１）（例えば、Ａｇｎｅｗ、Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）を参照のこと）など）；ダイネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）（ダイネミシンＡが含まれる）；エスペラミシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）；ならびにネオカルチノスタチン発色団および関連色素タンパク質であるエンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉ���ｉｎ）、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシンリポソーム注射（ＤＯＸＩＬ（登録商標））、およびデオキシドキソルビシンが含まれる）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（マイトマイシンＣなど）、ミコフェノール酸、ノガルマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）；代謝拮抗物質（メトトレキセート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、テガフール（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポシロン、および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）など）；葉酸アナログ（デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキセート、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキセートなど）；プリンアナログ（フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニンなど）；ピリミジンアナログ（アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなど）；アンドロゲン（カルウステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなど）；抗アドレナル（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）（アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなど）；葉酸補給薬（フォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）など）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルフォルニシン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）；エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）（マイタンシンおよびアンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ）など）；ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）；ミトキサントロン；モピダンモル（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメト（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントリン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；２−エチルヒドラジン；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）ポリサッカリド複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２''−トリクロロトリエチルアミン；トリコテシン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ  Ａ）、ロリジンＡおよびアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン（ｍａｎｎｏｍｕｓｔｉｎｅ）；ミトブロニトール；ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タイソイド（例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子処方物（ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭ）、およびドキセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）））；クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金アナログ（シスプラチンおよびカルボプラチンなど）；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボビン（ｌｅｕｃｏｖｏｖｉｎ）；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン；エダトレキセート（ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼインヒビターであるＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｌｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）（ＤＭＦＯ）；レチノイド（レチノイン酸など）；上記のいずれかの薬学的に受容可能な塩、酸、または誘導体；ならびに上記の２つまたはそれを超える組み合わせ（ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの併用療法の略語）など）およびＦＯＬＦＯＸ（５−ＦＵおよびロイコボビンと組み合わせたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮＴＭ）を使用した治療計画の略語）が含まれる。
【００８７】
癌の成長を促進することができるホルモンの作用を調節、減少、遮断、または阻害するように作用する抗ホルモン薬（しばしば、全身（ｓｙｓｔｅｍｉｃ）または全身（ｗｈｏｌｅ−ｂｏｄｙ）治療の形態である）もこの定義に含まれる。これら自体がホルモンであり得る。例には、抗女性ホルモン薬および選択的エストロゲン受容体調節物質（ＳＥＲＭ）（例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンが含まれる）、ラロキシフェン（ＥＶＩＳＴＡ（登録商標））、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）、およびトレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））が含まれる）；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体下方調節因子（ＥＲＤ）；卵巣を抑制するか遮断するように機能する薬剤（例えば、黄体形成（ｌｅｕｔｉｎｉｚｉｎｇ）ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト（酢酸ロイプロリド（ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）およびＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）など）、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン、およびトリプテレリン（ｔｒｉｐｔｅｒｅｌｉｎ））；他の抗アンドロゲン（フルタミド、ニルタミド、およびビカルタミドなど）；ならびに副腎中でのエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼインヒビター（例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール（ＭＥＧＡＳＥ（登録商標））、エキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））、ホルメスタチン（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ボロゾール（ｖｏｒｏｚｏｌｅ）（ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））、およびアナストロゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））など）が含まれる。さらに、化学療法薬のこのような定義には、ビスフォスフォネート（クロドロネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）またはＯＳＴＡＣ（登録商標）など）、エチドロン酸（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標））、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロン酸塩（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））、アレンドロネート（ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標））、パミドロン酸（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、チルドロン酸（ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））、またはリセドロン酸（ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））など）；ならびにトロキサシタビン（ｔｒｏｘａｃｉｔａｂｉｎｅ）（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；アンチセンスオリゴヌクレオチド（特に、異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路において遺伝子発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、および上皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）など）；ワクチン（ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチンおよび遺伝子治療ワクチン（例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチンなど）；トポイソメラーゼ１インヒビター（例えば、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標））；ｒｍＲＨ（例えば、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標））；ラパチニブジトシレート（Ｅｒｂ���−２およびＧＷ５７２０１６としても公知のＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子インヒビター）；ＣＯＸ−２インヒビター（セレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）など）；４−（５−（４−メチルフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ベンゼンスルホンアミド；ならびに上記のいずれかの薬学的に受容可能な塩、酸、または誘導体が含まれる。
【００８８】
用語「サイトカイン」は、一方の細胞集団によって放出され、細胞内メディエーターとして他方の細胞に対して作用するタンパク質の一般名である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインのうちで、成長ホルモン（ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンなど）；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインシュリン；リラキシン；プロレラキシン（ｐｒｏｒｅｌａｘｉｎ）；糖タンパク質ホルモン（濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）など）；肝臓成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子αおよびβ；ミューラー管阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（例えば、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ）；胎盤由来成長因子（ＰｌＧＦ）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ（例えば、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＣ、ＰＤＧＦＤ））；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；神経成長因子（ＮＧＦ−αなど）；血小板成長因子；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）（ＴＧＦαおよびＴＧＦβなど）；インスリン様成長因子ＩおよびＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン（インターフェロンα、β、およびγなど）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）など）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）（ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−３０など）；セクレトグロビン／ウテログロビン（ｓｅｃｒｅｔｏｇｌｏｂｉｎ／ｕｔｅｒｏｇｌｏｂｉｎ）；オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）；腫瘍壊死因子（ＴＮＦαまたはＴＮＦ−βなど）；ならびに他のポリペプチド因子（ＬＩＦおよびキットリガンド（ＫＬ）が含まれる）が含まれる。本明細書中で使用される、用語「サイトカイン」には、天然供給源または組換え細胞培養物由来のタンパク質および未変性配列のサイトカインの生物活性等価物が含まれる。
【００８９】
本明細書中で使用される、用語「プロドラッグ」は、親薬物と比較して腫瘍細胞に対する細胞傷害性が低く、酵素的に活性化するかより活性な親形態に変換することができる薬学的に活性な物質の前駆体または誘導体形態をいう。例えば、Ｗｉｌｍａｎ，“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ”  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，１４，ｐｐ．３７５−３８２，６１５ｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｂｅｌｆａｓｔ（１９８６）およびＳｔｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄ．），ｐｐ．２４７−２６７，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）を参照のこと。本発明のプロドラッグには、より活性な細胞傷害性遊離薬に変換することができるリン酸塩含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、硫酸塩含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、βラクタム含有プロドラッグ、任意選択的に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは任意選択的に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンプロドラッグおよび他の５−フルオロウリジンプロドラッグが含まれるが、これらに限定されない。本発明で使用するためにプロドラッグ形態に誘導体化することができる細胞傷害薬の例には、上記の化学療法薬が含まれるが、これらに限定されない。
【００９０】
「血管形成因子または血管形成薬」は、血管の発達を刺激する（例えば、血管形成、内皮細胞増殖、血管の安定性、および／または脈管形成などを促進する）成長因子である。例えば、血管形成因子には、例えば、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦファミリーのメンバー、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦファミリー、線維芽細胞成長因子ファミリー（ＦＧＦ）、ＴＩＥリガンド（アンジオポエチン）、エフリン、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４などが含まれるが、これらに限定されない。創傷治癒を促進する因子（成長ホルモン、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、ＶＩＧＦ、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、ＣＴＧＦおよびそのファミリーのメンバー、ならびにＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）も含まれるであろう。例えば、Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ  ａｎｄ  Ｄ’Ａｍｏｒｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，５３：２１７−３９（１９９１）；Ｓｔｒｅｉｔ  ａｎｄ  Ｄｅｔｍａｒ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：３１７２−３１７９（２００３）；Ｆｅｒｒａｒａ  ＆  Ａｌｉｔａｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５（１２）：１３５９−１３６４（１９９９）；Ｔｏｎｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：６５４９−６５５６（２００３）（例えば、血管形成因子を列挙した表１）；およびＳａｔｏ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，８：２００−２０６（２００３）を参照のこと。
【００９１】
「抗血管形成薬」または「血管形成インヒビター」は、血管形成、脈管形成、または望ましくない血管透過性を直接または間接的に阻害する低分子量の物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、単離タンパク質、組換えタンパク質、抗体、またはその複合体もしくは融合タンパク質をいう。例えば、抗血管形成薬は、上記で定義した血管形成薬に対する抗体または他のアンタゴニス（例えば、ＶＥＧＦに対する抗体、ＶＥＧＦ受容体に対する抗体、ＶＥＧＦ受容体シグナル伝達を遮断する小分子（例えば、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２８４、ＳＵ６６６８））である。抗血管形成薬には、未変性の血管形成インヒビター（例えば、アンジオスタチン、エンドスタチンなど）も含まれる。例えば、Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ  ａｎｄ  Ｄ’Ａｍｏｒｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，５３：２１７−３９（１９９１）；Ｓｔｒｅｉｔ  ａｎｄ  Ｄｅｔｍａｒ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：３１７２−３１７９（２００３）（例えば、悪性黒色腫の抗血管形成薬療法を列挙した表３）；Ｆｅｒｒａｒａ  ＆  Ａｌｉｔａｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５（１２）：１３５９−１３６４（１９９９）；Ｔｏｎｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：６５４９−６５５６（２００３）（例えば、抗血管形成因子を列挙した表２）；およびＳａｔｏ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，８：２００−２０６（２００３）（例えば、表１は、臨床試験で使用した抗血管形成薬を列挙している）を参照のこと。
【００９２】
用語「標識」は、本明細書中で使用される場合、ポリペプチドと直接または間接的に抱合する検出可能な化合物または組成物をいう。標識自体が検出可能であり得るか（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物または組成物の化学的変化を触媒することができる。
【００９３】
「単離」核酸分子は、通常はポリペプチド核酸の天然供給源中で会合した少なくとも１つの汚染核酸分子から同定および分離された核酸分子である。単離核酸分子は、自然界で見出される形態または配置とは異なる。したがって、単離核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子と区別される。しかし、単離核酸分子には、通常はポリペプチドを発現する細胞中に含まれ、例えば、天然の細胞と異なる染色体位置に存在する核酸分子が含まれる。
【００９４】
表現「調節配列」は、特定の宿主生物中の作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物に適切な調節配列には、例えば、プロモーター、任意選択的に、オペレーター配列、およびリボゾーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが公知である。
【００９５】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係におかれた場合、「作動可能に連結されて」いる。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現された場合、ポリペプチドのＤＮＡと作動可能に連結されているか、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合、コード配列と作動可能に連結されているか、リボゾーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置されている場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結された」は、連結されるＤＮＡ配列が連続していること、分泌リーダーの場合には、連続し且つ読み枠内に存在することを意味する。しかし、エンハンサーは、必ずしも連続している必要はない。従来の制限部位でのライゲーションによって連結される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを、従来の慣習にしたがって使用する。
【００９６】
本明細書中で使用される、表現「細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」を交換可能に使用し、全てのこのような表示には子孫が含まれる。したがって、用語「形質転換体」および「形質転換細胞」には、初代対象細胞および継代数と無関係のこれに由来する培養物が含まれる。全子孫は、意図的および不注意な変異によってＤＮＡの内容が正確に同一でないかもしれないことも理解される。スクリーニングした最初に形質転換した細胞と同一の機能または生物活性を有する変異子孫が含まれる。異なる表示が意図される場合、文脈から明らかである。
【００９７】
ＡＮＧＰＴＬ４
アンジオポエチン様４タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ４）は、分泌タンパク質であり、アンジオポエチンファミリーのメンバーである。これは、肝臓フィブリノーゲン／アンジオポエチン関連タンパク質（ＨＦＡＲＰ）（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４６：６０３−６１０（２０００））、ＰＧＡＲ（ＰＰＡＲγアンジオポエチン関連タンパク質）（Ｙｏｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２０：５３４３−５３４９（２０００））、絶食誘発性脂肪因子（ＦＩＡＦ）（Ｋｅｒｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：２８４８８−２８４９３（２０００））；アンジオポエチン関連タンパク質（ＡＲＰ−４）；ＮＬ２（米国特許第６，３４８，３５０号；同第６，３７２，４９１号；および同第６，４５５，４９６を参照のこと）；およびＡｎｇ６としても公知である。
【００９８】
ヒト由来のＡＮＧＰＴＬ４は４０６アミノ酸タンパク質である一方で（例えば、米国特許第６，３４８，３５０号、同第６，３７２，４９１号、および同第６，４５５，４９６号）、マウスＡＮＧＰＴＬ４は４１０アミノ酸タンパク質である（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４６：６０３−６１０（２０００））。マウスおよびヒトは、アミノ酸レベルで約７５％同一である。Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４６：６０３−６１０（２０００）。ＡＮＧＰＴＬ４は、シグナルペプチド、３つの潜在的なＮ−グリコシル化部位、および分子内ジスルフィド結合に関与し得る４つのシステインを有する。例えば、図３のパネルＡに示すように、ＡＮＧＰＴＬ４はより高次の分子構造を形成する。例えば、Ｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（３）：２０３８−２０４５（２００４）；Ｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４５：２０７１−２０７９（２００４）；およびＭａｎｄａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（３３）：３４４１１−３４４２０（２００４）も参照のこと。ＡＮＧＰＴＬ４を、タンパク質分解的にプロセシングすることもできる。例えば、Ｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（３）：２０３８−２０４５（２００４）；およびＭａｎｄａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（３３）：３４４１１−３４４２０（２００４）も参照のこと。本明細書中に記載するように、ＡＮＧＰＴＬ４のＲ１６２ＧおよびＲ１６４Ｅ置換により、ＳＤＳゲル上で野生型（または未変性）タンパク質よりも高い分子量に泳動する変異ＡＮＧＰＴＬ４が得られる（図３、パネルＢを参照のこと）。
【００９９】
アンジオポエチンファミリーの保存領域には、コイルドコイルドメインおよびＣ末端フィブリノーゲン（ＦＢＮ）様ドメインが含まれる。例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４６：６０３−６１０（２０００）を参照のこと。Ｃ末端フィブリノーゲン様ドメインを放出する調節された方法で、ＡＮＧＰＴＬ４がタンパク質分解的にプロセシングされることが示唆される。例えば、Ｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（３）：２０３８−２０４５（２００４）を参照のこと。アンジオポエチンファミリーの他のメンバーには、Ｔｉｅ２受容体に結合するアンジオポエチン１、アンジオポエチン２、およびアンジオポエチン３／アンジオポエチン４が含まれる。例えば、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８７，１１６１−１１６９（１９９６）；Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７，５５−６０（１９９７）；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６，１９０４−１９０９（１９９９）；ならびに米国特許第５，５２１，０７３号；同第５，６５０，４９０号；および同第５，８１４，４６４号を参照のこと。アンジオポエチン１および４は、Ｔｉｅ２受容体のアゴニストであるようである一方で、アンジオポエチン２および３は、Ｔｉｅ２受容体のアンタゴニスト（場合により、アゴニスト）であるようである。例えば、Ｆｏｌｋｍａｎ  ＆  Ｄ’Ａｍｏｒｅ，Ｃｅｌｌ，８７：１１５３−１１５５（１９９６）；Ｓｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８７：１１７１−１１８０（１９９６）；Ｍａｓｉｏｎｐｉｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：５５−６０（１９９７）；およびＷａｒｄ  ＆  Ｄｕｍｏｎｔ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１３：１９−２７（２００２）を参照のこと。
【０１００】
別のファミリーメンバー、アンジオポエチン様３タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ３）は、インテグリンαＶβ５に結合する血管形成因子である。例えば、２００３年１１月２０日に公開された米国特許出願２００３０２１５４５１号およびＣａｍｅｎｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７（１９）：１７２８１−１７２９０（２００２）を参照のこと。ＡＮＧＰＴＬ３は、受容体Ｔｉｅ２に結合しないようである。Ｃａｍｅｎｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（１９）：１７２８１−１７２９０（２００２）。ＡＮＧＰＴＬ３はまた、血漿脂質レベルの調節因子である。例えば、Ｋｏｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３０：１５１−１５７（２００２）を参照のこと。
【０１０１】
ＡＮＧＰＴＬ４は、インテグリンαＶβ５に結合する。例えば、図１１、１２、および１３を参照のこと。インテグリンαＶβ５は、細胞外基質タンパク質（ビトロネクチンおよびＤｅｌ−１が含まれる）の受容体である（例えば、Ｓｔｕｐａｃｋ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１５：３７２９−３７３８（２００２）を参照のこと）。αｖインテグリンは、腫瘍の進行および転移に関与している。例えば、Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｊ  Ｆ  ａｎｄ  Ｈａｒｔ，Ｉ  Ｒ  Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．７（３）：１２９−３８（１９９６）を参照のこと。さらに、血管形成におけるαｖインテグリンの役割も示されている。例えば、Ｅｌｉｃｅｉｒｉ，Ｂ  Ｐ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ，Ｄ  Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：７４１−７５０（１９９８）を参照のこと。例えば、αＶβ５のモノクローナル抗体は、ウサギ角膜モデルおよびニワトリ絨毛尿膜モデルにおいてＶＥＧＦ誘導性血管形成を阻害することが示されている。例えば、Ｍ．Ｃ．Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：１５００−１５０２（１９９５）を参照のこと。αＶβ３およびαＶβ５のアンタゴニストは、成長因子および腫瘍誘導性血管形成を阻害することも示されている。例えば、Ｅｌｉｃｅｉｒｉ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１３：５６３−５６８（２００１）を参照のこと。
【０１０２】
本発明は、アンジオポエチン様４タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ４）のモジュレーター（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）の組成物およびこれらのモジュレーターの他の治療薬との組み合わせを提供する。例えば、ＡＮＧＰＴＬ４のアンタゴニストの抗癌薬との組み合わせおよび腫瘍成長または癌細胞増殖の遮断または減少におけるその使用方法を提供する。本発明はまた、ＡＮＧＰＴＬ４のアンタゴニストおよび／または他の抗癌薬を使用した腫瘍成長の再発または癌細胞増殖の再発を遮断するかまたは減少させる方法を提供する。ＡＮＧＰＴＬ４のアンタゴニストの組成物、抗血管形成薬の組み合わせ、および新生物障害または非新生物障害の新血管形成の遮断または減少におけるその使用方法も提供する。
【０１０３】
ＡＮＧＰＴＬ４モジュレーターおよびその使用
ＡＮＧＰＴＬ４のモジュレーターは、ＡＮＧＰＴＬ４活性を調整する分子（例えば、アゴニストおよびアンタゴニスト）である。用語「アゴニスト」を、未変性のＡＮＧＰＴＬ４受容体（例えば、αＶβ５インテグリン）を介してシグナルを伝達する能力を有する場合、ＡＮＧＰＴＬ４のペプチドアナログおよび非ペプチドアナログならびにこのようなＡＮＧＰＴＬ４分子に特異的に結合する抗体をいうために使用する。ＡＮＧＰＴＬ４受容体（例えば、αＶβ５）の生物学的役割の文脈で、用語「アゴニスト」を定義する。特定の実施形態では、アゴニストは、上記に定義するように、未変性のＡＮＧＰＴＬ４の生物活性（細胞の増殖、移動、および／もしくは接着、ならびに／または脂質ホメオスタシス（ｈｏｍｅｓｔａｓｉｓ）の調整など）を有する。
【０１０４】
用語「アンタゴニスト」を、ＡＮＧＰＴＬ４またはその受容体（例えば、αＶβ５）に結合する能力と無関係に、ＡＮＧＰＴＬ４の生物活性を阻害する能力を有する分子をいうために使用する。したがって、ＡＮＧＰＴＬ４またはその受容体に結合する能力を有するアンタゴニストには、抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体および抗αＶβ５抗体が含まれる。アンタゴニストＡＮＧＰＴＬ４を、例えば、ＡＮＧＰＴＬ４活性（ＡＮＧＰＴＬ４の接着、移動、増殖、および／または脂質ホメオスタシス活性の調整）の阻害によって評価することができる。αＶβ５インテグリン受容体活性に関して、αＶβ５インテグリン受容体のモジュレーターを、当該分野で公知の方法によって決定することができる。例えば、Ｊ．Ｗ．Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２２６７−１２２７１（１９９０）に記載の方法を使用することができる。
【０１０５】
治療上の使用
ＡＮＧＰＴＬ４は、癌標的に関与する。ＡＮＧＰＴＬ４は、いくつかの腫瘍細胞で発現される場合、インビトロおよびインビボでの腫瘍細胞増殖を引き起こす（例えば、図４、図５、図７、ならびに図８のパネルＡおよびパネルＢを参照のこと）。ＡＮＧＰＴＬ４が抗血管形成因子（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）で治療された腫瘍で発現した場合、腫瘍は成長能力を維持することができる（例えば、図８のパネルＣを参照のこと）。ＡＮＧＰＴＬ４はまた、腫瘍細胞を移動させる（例えば、図９を参照のこと）。これは、腎癌で上方制御されることも示されている。例えば、代理人整理番号Ｐ５０３２Ｒ１；ＷＯ  ０２／０７９４１；およびＬｅ  Ｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１６２（５）：１５２１−１５２８（２００３）を参照のこと。さらに、ＡＮＧＰＴＬ４は血管形成促進因子（ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）であり（例えば、Ｓ．Ｌｅ  Ｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１６２（５）：１５２１−１５２８（２００３）を参照のこと）、癌療法の標的である。ＶＥＧＦのように（Ｓｈｗｅｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ９２：７６８−７７２（１９９５）、ＡＮＧＰＴＬ４発現は、低酸素状態に応答して増加する。例えば、Ｌｅ  Ｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１６２（５）：１５２１−１５２８（２００３）を参照のこと。
【０１０６】
ＡＮＧＰＴＬ４は、種々の条件下で、腫瘍細胞（例えば、Ａ６７３細胞）に結合する（例えば、図６のパネルＡおよびＢ）。例えば、図４のパネルＡおよびパネルＢに示すように、ＡＮＧＰＴＬ４は、細胞がＡＮＧＰＴＬ４を発現する発現構築物で形質導入された場合にインビトロでいくつかの腫瘍細胞増殖を刺激する。図４のパネルＣはまた、ＡＮＧＰＴＬ４で形質導入したＣＯＳ７細胞由来の馴化培地の添加によってＡ６７３細胞の増殖が誘導されることを示す。図７のパネルＡおよびＢも参照のこと。ＡＮＧＰＴＬ４は、ＡＮＧＰＴＬ４が培養皿上にコーティングされた場合にＡ６７３細胞の増殖が誘導されるが（図５を参照のこと）、腎臓上皮細胞、腎臓メサンギウム細胞、またはＨＵＶＥＣの細胞増殖は誘導しない。ＡＮＧＰＴＬ４はまた、腫瘍細胞の細胞移動を誘導する。例えば、図９を参照のこと。
【０１０７】
ＡＮＧＰＴＬ４は、主に、脂肪組織、胎盤、肝臓、および腎臓で発現し、ｏｂ／ｏｂ（レプチンノックアウト）マウスおよびｄｂ／ｄｂ（レプチン受容体ノックアウト）マウスでも上方制御される。例えば、Ｙｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：５３４３−５３４９（２０００）；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３４６：６０３−６１０（２０００）；Ｋｅｒｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：２８４８８−２８４９３（２０００）；およびＬｅ  Ｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １６２（５）：１５２１−１５２８（２００３）を参照のこと。ＡＮＧＰＴＬ４はまた、脂質モジュレーターおよびリポタンパク質リパーゼのインヒビターであると報告されている。例えば、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １０２（５）：１７６７−１７７２（２００５）；Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４３：１７７０−１７７２（２００２）；およびＷｉｅｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １８０：Ｒ１−Ｒ６（２００４）を参照のこと。ＡＮＧＰＴＬ４発現はまた、脂肪組織中のＰＰＡＲγおよびαによって誘導され、飢餓によって誘導される。これは、脂肪前駆細胞および肝細胞の増殖ならびに／または脂肪前駆細胞の移動も調整し、それに伴って血清中のトリグリセリドレベルおよびコレステロールレベルが調整される。米国特許仮出願番号６０／５８９，８７５号および同時に提出された代理人整理番号Ｐ２１５６Ｒ１（全ての目的のために参考として援用される）を参照のこと。研究者は、血管形成と脂質生成との間の関係を報告している。例えば、Ｓｉｅｒｒａ−Ｈｏｎｉｇｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｅｐｔｉｎ  ａｓ  ａｎ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１６８３−１６８６；（１９９８）；Ｒｕｐｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍａｓｓ  ｃａｎ  ｂｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ”  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９（１６）：１０７３０−１０７３５（２００２）；およびＦｕｋｕｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐａｒａｃｒｉｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ．”  Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９３：ｅ８８−ｅ９７（２００３）を参照のこと。
【０１０８】
本発明によれば、ＡＮＧＰＴＬ４モジュレーターおよび／またはＡＮＧＰＴＬ４モジレーターと他の治療薬との組み合わせを使用して、種々の新生物または非新生物容態を治療することができることが意図される。一実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ４モジュレーター（例えば、ＡＮＧＰＴＬ４のアンタゴニスト）を、癌細胞または腫瘍成長の阻害で使用する。例えば、図１０のパネルＡおよびＢに示すように、抗ＡＮＧＰＴＬ４ポリクローナル抗体は、用量依存性様式で腫瘍細胞増殖を阻害した。ＡＮＧＰＴＬ４により、腫瘍細胞を移動させることができる（例えば、図９を参照のこと）。本発明によれば、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストを使用して腫瘍の転移を阻害することもできることが意図される。ＡＮＧＰＴＬ４はまた、脂肪前駆細胞の移動を誘導する。米国特許仮出願番号６０／５８９，８７５号および同時に提出された代理人整理番号Ｐ２１５６Ｒ１を参照のこと。特定の実施形態では、１つまたは複数の抗癌薬をＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストと共に投与して、癌細胞または腫瘍成長を阻害することができる。本明細書中の「併用療法」の項を参照のこと。
【０１０９】
治療すべき新生物障害の例には、用語「癌」および「癌性」が付いた本明細書中に記載の新生物障害が含まれるが、これらに限定されない。本発明のアンタゴニストでの治療が可能な非新生物容態には、例えば、望ましくないか異常な肥大、関節炎、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬性プラーク、サルコイドーシス、粥状動脈硬化、動脈硬化プラーク、心筋梗塞由来の浮腫、糖尿病性網膜症および他の増殖性網膜症（未熟児網膜症が含まれる）、水晶体後線維増殖症、血管新生緑内障、加齢黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、角膜新血管形成、角膜移植片新血管形成、角膜移植片拒絶、網膜／脈絡膜新血管形成、隅角の新血管形成（ルベオーシス）、眼新生血管疾患、血管再狭窄、動静脈奇形（ＡＶＭ）、髄膜腫、血管腫、血管線維腫、甲状腺過形成（グレーブス病が含まれる）、角膜および他の組織の移植、慢性炎症、肺炎、急性肺損傷／ＡＲＤＳ、敗血症、原発性肺高血圧症、悪性肺浸出、脳浮腫（例えば、急性脳卒中／閉鎖性頭部外傷／外傷に関連する）、滑膜炎、ＲＡにおけるパンヌス形成、骨化性筋炎、肥大性骨形成、骨関節炎（ＯＡ）、難治性腹水、多嚢胞性卵巣疾患、子宮内膜症、細胞外液疾患（３ｒｄ  ｓｐａｃｉｎｇ  ｏｆ  ｆｌｕｉｄ  ｄｉｓｅａｓｅ）（膵炎、区画症候群、熱傷、腸疾患）、子宮筋腫、早産、慢性炎症（ＩＢＤ（クローン病および潰瘍性大腸炎）など）、腎臓の同種移植片拒絶、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、望ましくないか異常な組織塊の成長（非癌性）、肥満、脂肪組織塊の成長、血友病性関節、肥厚性瘢痕、発毛の抑制、オスラー−ウェーバー症候群、化膿性肉芽腫水晶体後線維増殖症、強皮症、トラコーマ、血管接着、滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心膜滲出液（心膜炎に関連する）、および胸膜滲出液が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１０】
ＡＮＧＰＴＬ４のモジュレーター（例えば、ＡＮＧＰＴＬ４のアゴニストまたはアクチベーター）を、病理学的障害の治療のために使用することができる。ＡＮＧＰＴＬ４のモジュレーター（例えば、ＡＮＧＰＴＬ４のアゴニスト）を、血管形成もしくは新血管形成および／または肥大の傾向のある病理学的障害（例えば、血管性外傷、創傷、断裂、切開、熱傷、潰瘍(例えば、糖尿病性潰瘍、褥瘡、血友病性潰瘍、静脈瘤性潰瘍)、組織増殖、重量増加、末梢動脈疾患、分娩誘導、発毛、表皮水疱症、網膜萎縮症、骨折、骨と脊髄の融合、半月板裂傷などが含まれるが、これらに限定されない）の治療で使用することができる。米国特許仮出願番号６０／５８９，８７５号および同時に提出された代理人整理番号Ｐ２１５６Ｒ１も参照のこと。
【０１１１】
併用療法
上に示すように、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストを別の治療薬と共に投与する併用療法を提供する。例えば、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストを、抗癌治療薬または抗新血管形成治療薬と組み合わせて使用して、種々の新生物容態または非新生物容態を治療する。一実施形態では、新生物容態または非新生物容態を、異常または望ましくない血管形成に関連する病理学的障害を特徴とする。ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストを、同一組成物中または個別の組成物としてこれらの目的に有効な別の薬剤と連続的または組み合わせて投与することができる。あるいはまたはさらに、ＡＮＧＰＴＬ４の複数のインヒビターを投与することができる。
【０１１２】
本発明のアンタゴニストおよび／または薬剤を、同一または異なる投与経路を使用して、同時に（例えば、１つの組成物として）または２つまたはそれを超える個別の組成物として投与することができる。あるいはまたはさらに、任意の順序で連続的に投与することができる。特定の実施形態では、２つまたはそれを超える組成物の投与の間隔は、分から日、週から月までの範囲であり得る。例えば、抗癌薬を、最初に投与し、その後にＡＮＧＰＴＬ４インヒビターを投与することができる。しかし、同時投与またはＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストの最初の投与も意図される。
【０１１３】
ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストと組み合わせて投与される治療薬の有効量は、医師または獣医の判断による。治療すべき容態が最大に管理されるように投与および投薬量の調整を行う。用量は、さらに、使用される治療薬の型および治療される特定の患者などの要因に依存する。抗癌薬の適切な投薬量は、現在使用されている量であり、抗癌薬とＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストとの組み合わせ作用（相乗効果）によって軽減することができる。特定の実施形態では、インヒビターの組み合わせにより、１つのインヒビターの有効性が強化される。用語「強化する」は、その一般的または承認された用量での治療薬の有効性の改善をいう。本明細書中の「薬学的組成物」も参照のこと。
【０１１４】
典型的には、腫瘍成長または癌細胞の増殖などの病理学的障害を遮断するかまたは減少させるためのＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストおよび抗癌薬は、同一または類似の疾患に適切である。一実施形態では、抗癌薬は、抗血管形成薬である。
【０１１５】
癌に関連する抗血管形成療法は、腫瘍成長を支持するための栄養素の供給に必要な腫瘍血管の発達を阻害することを目的とする癌治療ストラテジーである。血管形成が原発性腫瘍成長および転移の両方に関与するので、本発明によって提供された抗血管形成治療は、原発部位の腫瘍の新生物成長を阻害し、続発性部位への腫瘍の転移を防止することができ、それにより、他の治療薬によって腫瘍を攻撃可能である。
【０１１６】
多数の抗血管形成薬が同定されており、これらは当該分野で公知であり、本明細書中（例えば、定義に列挙）および、例えば、Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  ａｎｄ  Ｊａｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：２４９−２５７（２０００）；Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，３：３９１−４００（２００４）；およびＳａｔｏ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，８：２００−２０６（２００３）に列挙した抗血管形成薬が含まれる。米国特許出願番号ＵＳ２００３００５５００６号も参照のこと。一実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストを、抗ＶＥＧＦ中和抗体（またはフラグメント）および／または他のＶＥＧＦアンタゴニストもしくはＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト（例えば、可溶性ＶＥＧＦ受容体（例えば、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ニューロピリン（例えば、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２））フラグメント、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲを遮断することができるアプタマー、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の低分子量インヒビター、ＶＥＧＦのアンチセンスストラテジー、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体に対するリボザイム、ＶＥＧＦのアンタゴニスト改変体；およびこれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない）と組み合わせて使用する。あるいはまたはさらに、２つまたはそれを超える血管形成インヒビターを患者に同時投与することができる。特定の実施形態では、１つまたは複数のさらなる治療薬（例えば、抗癌薬）を、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストおよび抗血管形成薬と組み合わせて投与することができる。
【０１１７】
本発明の特定の態様では、本発明のアンタゴニストとの腫瘍併用療法に有用な他の治療薬には、他の癌療法（例えば、手術、放射線治療（例えば、照射または放射性物質の投与が含まれる）、化学療法、本明細書中に列挙され、且つ当該分野で公知の抗癌薬での治療、またはこれらの組み合わせ）が含まれる。あるいはまたはさらに、本明細書中に記載の同一または２つまたはそれを超える異なる抗原に結合する２つまたはそれを超える抗体を、患者に同時投与することができる。時折、１つまたは複数のサイトカインを患者に投与することも有益であり得る。
【０１１８】
化学療法薬
特定の態様では、本発明は、有効量のＡＮＧＰＴＬ４のアンタゴニストおよび／または血管形成インヒビターおよび１つまたは複数の化学療法薬を癌に感受性を示すか癌と診断された患者に投与することによる、腫瘍成長または癌細胞の増殖を遮断するかまたは減少させる方法を提供する。種々の化学療法薬を、本発明の併用治療方法で使用することができる。意図される化学療法薬の例示的且つ非限定的なリストを、本明細書中の「定義」に示す。
【０１１９】
当業者に理解されているように、治療薬の適切な用量は、およそ、一般に、化学療法薬を単独または他の化学療法薬と組み合わせて投与する臨床療法で既に使用されている用量である。治療される容態によって投薬量が変化する可能性が高い。治療を行う医師は、各被験体に適切な用量を決定することができる。
【０１２０】
腫瘍成長の再発
本発明はまた、腫瘍成長の再発または癌細胞増殖の再発を阻害または防止する方法および組成物を提供する。例えば、図８のパネルＣは、腫瘍がＡＮＧＰＴＬ４も発現する場合に抗ＶＥＧＦ抗体（ＡＶＡＳＴＩＮ）で治療される腫瘍が治療を回避する能力（例えば、１つの再発型）を概略的に示す。
【０１２１】
腫瘍成長の再発または癌細胞増殖の再発を使用して、１つまたは複数の現在利用可能な療法（例えば、癌療法（化学療法、放射線療法、手術、ホルモン療法、および／または生物学的療法／免疫療法、特に、特定の癌のための標準的な治療計画など））を受けたか治療された患者が臨床的に適切に治療されないか、患者がもはや治療からいかなる有益な効果も得られず、これらの患者がさらなる有効な療法を必要とする容態を説明する。本明細書中で使用される場合、この句は、「非応答／難治性」患者（例えば、依然として療法に応答する患者、副作用を生じる患者、耐性を示す患者、療法に応答しない患者、療法に満足に応答しない患者などを説明する）の容態もいうことができる。種々の実施形態では、癌は、癌細胞数が有意に減少しないか増加し、腫瘍サイズが有意に減少しないか増加し、あるいは、癌細胞のサイズまたは数がさらに減少しない腫瘍成長の再発または癌細胞増殖の再発である。癌細胞が腫瘍成長の再発または癌細胞増殖の再発であるかどうかを、このような状況にて当該分野で承認されている「再発」、「難治性」、または「非応答性」手段を使用した当該分野で公知の任意の癌細胞に対する治療有効性のアッセイ方法によってインビボまたはインビトロで決定することができる。
【０１２２】
本発明は、被験体の腫瘍成長の再発または癌細胞増殖の再発を遮断するかまたは減少させるための１つまたは複数の本発明のＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストの投与による、被験体の腫瘍成長の再発または癌細胞増殖の再発を遮断するかまたは減少させる方法を提供する。特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストを、癌療法の後に投与することができる。特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ４を、癌療法と同時に投与する。あるいはまたはさらに、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニスト療法を別の癌療法と交互に実施し、これを任意の順序で実施することができる。本発明はまた、癌を罹患しやすい患者の癌の発症または再発を防止するための１つまたは複数のＡＮＧＰＴＬ４阻害抗体の投与方法を含む。一般に、被験体は、癌療法を受けていたか同時に受ける。一実施形態では、癌療法は、抗血管形成薬での治療である。抗血管形成薬には、当該分野で公知の抗血管形成薬および本明細書中の定義で見出される抗血管形成薬が含まれる。一実施形態では、抗血管形成薬は、抗ＶＥＧＦ中和抗体またはフラグメント（例えば、ヒト化Ａ４．６．１、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、Ｙ０３１７、Ｍ４、Ｇ６、Ｂ２０、２Ｃ３など）である。例えば、米国特許第６，５８２，９５９号、同第６，８８４，８７９号、同第６，７０３，０２０号；ＷＯ  ９８／４５３３２；ＷＯ  ９６／３００４６；ＷＯ  ９４／１０２０２；欧州特許第０６６６８６８Ｂ１号；米国特許出願番号２００３０２０６８９９号、同第２００３０１９０３１７号、同第２００３０２０３４０９号、および同第２００５０１１２１２６号；Ｐｏｐｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８８：１４９−１６４（２００４）；および代理人整理番号ＰＲ２０７２−４を参照のこと。腫瘍成長の再発または癌細胞増殖の再発を遮断するかまたは減少させるために、さらなる薬剤を、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストと組み合わせて投与することができる。例えば、本明細書中の「併用療法」の項を参照のこと。
【０１２３】
一実施形態では、本発明のＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストまたはＡＮＧＰＴＬ４発現を減少させる他の治療薬を投与して、一定の生物薬、ホルモン薬、放射線、および化学療法薬に対する癌細胞の耐性または感受性の減少を逆転させ、それにより、１つまたは複数のこれらの薬剤に対して癌細胞が再感作され、その後に癌を治療または管理する（転移の防止が含まれる）ために投与する（または投与し続ける）ことができる。
【０１２４】
抗体
本発明の抗体には、抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体および抗ＡＮＧＰＴＬ４フラグメント抗体、抗血管形成薬または血管形成インヒビターである抗体、抗癌薬である抗体、ＡＮＧＰＴＬ４受容体に対する抗体（例えば、抗αＶβ５抗体）、または本明細書中に記載の他の抗体が含まれる。例示的な抗体には、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、フラグメント抗体、多重特異性抗体、ヘテロ抱合抗体、多価抗体、エフェクター機能抗体などが含まれる。
【０１２５】
ポリクローナル抗体
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体を含み得る。ポリクローナル抗体の調製方法は、当業者に公知である。例えば、本発明の抗体に対するポリクローナル抗体を、関連抗原およびアジュバントの１回または複数回の皮下（ｓｃ）注射または腹腔内（ｉｐ）注射によって動物内に惹起する。二官能性剤または誘導体化剤（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介して抱合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である））を使用して、免疫化すべき種で免疫原性を示すタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビター）に関連抗原を抱合するのに有用であり得る。
【０１２６】
例えば、１００μｇまたは５μｇのタンパク質または複合体（それぞれウサギまたはマウス用）を３体積のフロイント完全アジュバントと組み合わせ、溶液を複数の部位に皮内注射することによって本発明の分子、免疫原性複合体、または誘導体に対して動物を免疫化する。１ヶ月後、動物を、元の量の１／５〜１／１０のペプチドまたは複合体を含むフロイント完全アジュバントの複数の部位への皮下注射によって動物を追加免疫する。７〜１４日後、動物を採血し、抗体力価について血清をアッセイする。力価がプラトーに達するまで動物を追加免疫する。典型的には、動物を同一抗原の複合体で追加免疫するが、異なるタンパク質に抱合し、そして／または異なる架橋試薬を使用している。複合体を、タンパク質融合物として組換え細胞培養物中で作製することもできる。また、ミョウバンなどの凝集剤を適切に使用して、免疫応答を増強する。
【０１２７】
モノクローナル抗体
本明細書中に記載の抗原に対するモノクローナル抗体を、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に最初に記載されたハイブリドーマ法を使用して作製することができるか、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製することができる。
【０１２８】
ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物（ハムスターまたはマカクザルなど）を上記のように免疫化して、免疫化のために使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか産生することができるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することができる。次いで、リンパ球を、適切な融合剤（ポリエチレングリコールなど）を使用して骨髄腫細胞と融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【０１２９】
このようにして調製したハイブリドーマ細胞を、典型的には、非融合親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つまたは複数の物質を含む適切な培養培地中に播種して成長させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）（これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻害する）を含む。
【０１３０】
典型的な骨髄腫細胞は、効率よく融合し、選択された抗体産生細胞によって抗体の安定な高レベル産生を支持し、ＨＡＴ培地などの培地に感受性を示す骨髄腫細胞である。これらのうち、好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫株（Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡから利用可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍由来の株）およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ＵＳＡから利用可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞など）である。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロミエローマ（ｈｅｔｅｒｏｍｙｅｌｏｍａ）細胞株も記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【０１３１】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地を、例えば、ＡＮＧＰＴＬ４、αＶβ５、または血管形成分子に指向するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ（放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など）によって決定することができる。このような技術およびアッセイは、当該分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性を、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって決定することができる。
【０１３２】
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを、限界希釈手順によってサブクローン化し、標準的な方法（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））によって増殖させることができる。この目的に適切な培養培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭ培地またはＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞を、動物内で腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
【０１３３】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体を、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ハイドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィなど）によって、培養培地、腹水、または血清から適切に分離する。
【０１３４】
組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号に記載の方法など）によってモノクローナル抗体を作製することもできる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、従来の手順（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブの使用による）を使用して、容易に単離および配列決定する。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの供給源として役立つ。一旦単離されると、ＤＮＡを発現ベクターに入れ、次いで、別の方法で免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞（大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞など）にトランスフェクトして組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体を合成することができる。抗体の組換え産生を、以下により詳細に記載する。
【０１３５】
別の実施形態では、抗体または抗体フラグメントを、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載の技術を使用して生成した抗体ファージライブラリーから単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）はそれぞれ、ファージライブラリーを使用したマウス抗体およびヒト抗体の単離を記載している。その後の精製は、鎖シャフリング（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２））ならびに非常に巨大なファージライブラリーの構築のためのストラテジーとしての組み合わせ感染およびインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３））による高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生を記載している。したがって、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の実行可能な代替法である。
【０１３６】
ＤＮＡを、例えば、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列相同なマウス配列への置換（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４））または免疫グロブリンコード配列への非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部もしくは一部の共有結合によって修飾することができる。
【０１３７】
典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドに、抗体の定常領域を置換するか、抗体の１つの抗原組み合わせ部位の可変ドメインを置換して、一方の抗原に対する特異性を有する１つの抗原組み合わせ部位および異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原組み合わせ部位を含む２価のキメラ抗体を作製する。
【０１３８】
ヒト化抗体およびヒト抗体
本発明の抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体を含み得る。ヒト化抗体は、これに移入された非ヒト供給源由来の１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。しばしば、これらの非ヒトアミノ酸残基を、「導入（ｉｍｐｏｒｔ）」残基といい、典型的には、「導入」可変領域から取り出される。本質的にＷｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  ｃｏ−ｗｏｒｋｅｒｓ（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））の方法にしたがって、げっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列へのヒト抗体の対応する配列の置換によってヒト化することができる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、実質的にインタクト未満のヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応する配列に置換されたキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくいくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体中の類似の部位由来の残基に置換されているヒト抗体である。
【０１３９】
ヒト化抗体の作製において使用すべきヒト可変ドメイン（軽鎖および重鎖の両方）の選択は、抗原性の減少のために非常に重要である。いわゆる「最良適合（ｂｅｓｔ−ｆｉｔ）」法にしたがって、げっ歯類抗体の可変ドメイン配列を、公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。次いで、げっ歯類の配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク（ＦＲ）として許容する（Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７））。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定の下位集団の全ヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを使用する。いくつかの異なるヒト化抗体に同一のフレームワークを使用することができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３））。
【０１４０】
抗原に対する高い親和性および他の好ましい生物学的性質を保持しながら抗体をヒト化することがさらに重要である。この目的を達成するために、典型的な方法にしたがって、ヒト化抗体を、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用した親配列および種々の概念ヒト化産物の分析過程によって調製する。三次元免疫グロブリンモデルが一般的に利用可能であり、当業者に良く知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元高次構造を例示および表示するコンピュータプログラムは利用可能である。これらのディスプレイの検討により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性の高い役割が分析される（すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基が分析される）。この方法では、所望の抗体特性（標的抗原に対する親和性の増加など）が達成されるように、ＦＲ残基を、レシピエントから選択して組み合わせ、配列に導入する。一般に、ＣＤＲ残基は、直接且つほとんど実質的に抗原結合への影響に関与する。
【０１４１】
あるいは、免疫化の際に、内因性免疫グロブリン非産生条件下でヒト抗体の全レパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を産生することが現在可能である。例えば、キメラマウスおよび生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失によって内因性抗体産生が完全に阻害されることが記載されている。このような生殖系列変異マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの導入により、抗原攻撃誘発の際にヒト抗体が産生される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；およびＤｕｃｈｏｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：２５８（１９９２）を参照のこと。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーに由来し得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）；Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １４：３０９（１９９６））。
【０１４２】
ヒト抗体を、当該分野で公知の種々の技術（ファージディスプレイライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））が含まれる）を使用して産生することもできる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、繊維状バクテリオファージの大または小コートタンパク質（Ｍ１３またはｆｄ）のいずれかにインフレームでクローン化し、ファージ粒子表面上に機能的抗体フラグメントとしてディスプレイする。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能的性質に基づいた選択により、これらの性質を示す抗体をコードする遺伝子も選択される。したがって、ファージはＢ細胞のいくつかの性質を模倣する。種々の形式でファージディスプレイを行うことができる（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ  Ｓ．ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄ  Ｊ．，Ｃｕｒ  Ｏｐｉｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ３：５６４−５７１（１９９３）に概説されている）。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージディスプレイに使用することができる。例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）では、免疫化マウスの脾臓由来のＶ遺伝子の小さな無作為の組み合わせライブラリーから種々の多数の抗オキサゾロン抗体が単離された。非免疫化ヒトドナー由来のＶ遺伝子のレパートリーを構築し、種々の多数の抗原（自己抗原が含まれる）に対する抗体を、例えば、本質的にＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）またはＧｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）に記載の技術にしたがって単離することができる。米国特許第５，５６５，３３２号および同第５，５７３，９０５号も参照のこと。Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．ａｎｄ  Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の技術もヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）およびＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１））。ヒト抗体を、インビトロ活性化Ｂ細胞によって生成することもできる（米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号を参照のこと）。
【０１４３】
抗体フラグメント
抗体フラグメントも本発明に含まれる。抗体フラグメント産生のための種々の技術が開発されている。伝統的には、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解性消化に由来していた（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）およびＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５））を参照のこと）。しかし、現在、これらのフラグメントを、組換え宿主細胞によって直接産生することができる。例えば、抗体フラグメントを、上記で考察の抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを、大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングしてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。別のアプローチにしたがって、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体フラグメントの他の産生技術は、当業者に明らかである。他の実施形態では、最適な抗体は、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ  ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号および米国特許第５，５８７，４５８号を参照のこと。ＦｖおよびｓＦｖは、定常領域を欠くインタクトな組み合わせ部位を有する唯一の種である。したがって、これらは、インビボでの非特異的結合の減少に適切である。ｓＦｖ融合タンパク質を構築して、ｓＦｖのアミノ末端およびカルボキシ末端のいずれかにエフェクタータンパク質の融合物を得ることができる。Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｅｄ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，ｓｕｐｒａを参照のこと。抗体フラグメントは、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載の「線状抗体」でもあり得る。このような線状抗体フラグメントは、単一特異性または二重特異性であり得る。
【０１４４】
多重特異性抗体（例えば、二重特異性）
本発明の抗体には、例えば、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する多重特異性抗体も含まれる。このような分子は、通常、２つの抗原のみに結合する一方で（すなわち、二重特異性抗体、ＢｓＡｂ）、本明細書中で使用される場合、三重特異性抗体などのさらなる特異性を有する抗体がこの表現に含まれる。ＢｓＡｂの例には、腫瘍細胞抗原に指向する１つのアームおよび細胞傷害性誘発分子に指向する他のアームを有するＢｓＡｂ（抗ＦｃγＲＩ／抗ＣＤ１５、抗ｐ１８５ＨＥＲ２／ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、抗ＣＤ３／抗悪性Ｂ細胞（１Ｄ１０）、抗ＣＤ３／抗ｐ１８５ＨＥＲ２、抗ＣＤ３／抗ｐ９７、抗ＣＤ３／抗腎細胞癌、抗ＣＤ３／抗ＯＶＣＡＲ−３、抗ＣＤ３／Ｌ−Ｄ１（抗結腸癌）、抗ＣＤ３／抗メラニン細胞刺激ホルモンアナログ、抗ＥＧＦ受容体／抗ＣＤ３、抗ＣＤ３／抗ＣＡＭＡ１、抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３／ＭｏＶ１８、抗神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）／抗ＣＤ３、抗葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）／抗ＣＤ３、抗膵臓癌（ｐａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）関連抗原（ＡＭＯＣ−３１）／抗ＣＤ３など）；腫瘍抗原に特異的に結合する１つのアームおよび毒素に結合する１つのアームを有するＢｓＡｂ（抗サポリン／抗Ｉｄ−１、抗ＣＤ２２／抗サポリン、抗ＣＤ７／抗サポリン、抗ＣＤ３８／抗サポリン、抗ＣＥＡ／抗リシンＡ鎖、抗インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）／抗ハイブリドーマイディオタイプ、抗ＣＥＡ／抗ビンカアルカロイドなど）；変換酵素活性化プロドラッグのＢｓＡｂ（抗ＣＤ３０／抗アルカリホスファターゼ（リン酸マイトマイシンプロドラッグのマイトマイシンアルコールへの変換を触媒する）など）；繊維素溶解薬として使用することができるＢｓＡｂ（抗フィブリン／抗組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、抗フィブリン／抗ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベーター（ｕＰＡ）など）；免疫複合体を細胞表面受容体にターゲティングするためのＢｓＡｂ（抗低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）／抗Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、またはＦｃγＲＩＩＩ）など）；感染症の治療で使用されるＢｓＡｂ（抗ＣＤ３／抗単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、抗Ｔ細胞受容体：ＣＤ３複合体／抗インフルエンザ、抗ＦｃγＲ／抗ＨＩＶなど）；インビトロまたはインビボでの腫瘍検出のためのＢｓＡｂ（抗ＣＥＡ／抗ＥＯＴＵＢＥ、抗ＣＥＡ／抗ＤＰＴＡ、抗ｐ１８５ＨＥＲ２／抗ハプテンなど）；ワクチンアジュバンとしてのＢｓＡｂ；ならびに診断ツールとしてのＢｓＡｂ（抗ウサギＩｇＧ／抗フェリチン、抗西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／抗ホルモン、抗ソマトスタチン／抗物質Ｐ、抗ＨＲＰ／抗ＦＩＴＣ、抗ＣＥＡ／抗β−ガラクトシダーゼなど）が含まれる。三重特異性抗体の例には、抗ＣＤ３／抗ＣＤ４／抗ＣＤ３７、抗ＣＤ３／抗ＣＤ５／抗ＣＤ３７、および抗ＣＤ３／抗ＣＤ８／抗ＣＤ３７が含まれる。全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として二重特異性抗体を調製することができる。
【０１４５】
二重特異性抗体の作製方法は当該分野で公知である。全長二重特異性抗体の伝統的な産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（この２つの鎖は異なる特異性を有する）の同時発現に基づく（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖の無作為な分類のために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０種の異なる抗体分子の混合物を産生する可能性があり、そのうちの１つのみが正確な二重特異性構造を有する。通常はアフィニティクロマトグラフィ工程によって行われる正確な分子の精製はむしろ煩雑であり、収率が低い。類似の手順が、ＷＯ  ９３／０８８２９およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。
【０１４６】
異なるアプローチにしたがって、所望の結合特異性（抗体−抗原組み合わせ部位）を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合する。ヒンジ領域の少なくとも一部、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含む免疫グロブリンの重鎖定常ドメインと融合することが好ましい。少なくとも１つの融合物中に存在する軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリンの重鎖融合物および、所望ならば、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを、個別の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生物に同時トランスフェクトする。構築に使用された比率が等しくない３つのポリペプチド鎖によって最適な収率が得られる実施形態では、これにより、３つのポリペプチドフラグメントの相互の比率の調整が非常に柔軟に行える。しかし、等しい比率の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現によって収率が高くなるか、比率が特に重要でない場合、２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０１４７】
このアプローチの一実施形態では、二重特異性抗体は、一方のアーム中の第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖および他方のアーム中のハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性が得られる）から構成される。たった半分の二重特異性分子中の免疫グロブリン軽鎖によって容易な分離方法が得られるので、この非対称構造によって望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせからの所望の二重特異性化合物の分離が容易になることが見出された。このアプローチは、ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体の生成についてのさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
【０１４８】
ＷＯ  ０９６／２７０１１に記載の別のアプローチにしたがって、抗体分子対間の接合部分を、ヘテロ二量体の比率を最大にするように操作し、組換え細胞培養物から回収することができる。好ましい接合部分は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の接合部分由来の１つまたは複数の小アミノ酸鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）に置換する。巨大側鎖と同一または類似のサイズの代償的「空洞」を、巨大アミノ酸側鎖のより小さな側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）への置換によって第２の抗体分子の接合部分に作製する。これにより、ホモ二量体などの他の望ましくない最終産物を超えたヘテロ二量体収率を増加させる機構が得られる。
【０１４９】
抗体フラグメントから二重特異性抗体を生成する技術も文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体をタンパク質分解によって切断してＦ（ａｂ’）２フラグメントを生成する手順を記載している。隣接ジチオールを安定化して分子間ジスルフィド結合を防止するためのジチオール錯化剤である砒酸ナトリウムの存在下で、これらのフラグメントは減少する。次いで、Ｆａｂ’フラグメントを、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次いで、メルカプトエチルアミンでの還元によってＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つをＦａｂ’−チオールに変換し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成させる。産生された二重特異性抗体を、抗体の選択的固定化のための薬剤として使用することができる。
【０１５０】
最近の進歩によって大腸菌からＦａｂ’−ＳＨフラグメントを直接回収することが容易になり、これを化学的にカップリングして二重特異性抗体を形成することができる。Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生を記載している。各Ｆａｂ’フラグメントを大腸菌から個別に分離し、インビトロでの有向（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）化学的カップリングに供して二重特異性抗体を形成した。このようにして形成された二重特異性抗体は、ＶＥＧＦ受容体および正常なヒトＴ細胞を過剰発現する細胞に結合し、ヒト乳癌標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘発することができた。
【０１５１】
二重特異性抗体フラグメントの作製および組換え細胞培養物からの直接的単離のための種々の技術も記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して産生されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結した。ヒンジ領域の抗体ホモ二量体を還元して単量体を形成させ、次いで、再度酸化させて抗体ヘテロ二量体を形成させた。抗体ホモ二量体産生にもこの方法を利用することができる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）に記載の「ダイアボディ」テクノロジーにより、二重特異性抗体フラグメントの別の作製機構が得られる。フラグメントは、リンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、このリンカーは、短すぎて同一鎖上の２つのドメインを対合させることが不可能である。したがって、１つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的ＶＬおよびＶＨドメインとの対合を強いられ、それにより、２つの抗原結合部位が形成される。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用による二重特異性抗体フラグメントの別の作製ストラテジーも報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。
【０１５２】
２価を超える抗体が意図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０１５３】
ヘテロ複合体抗体
二重特異性抗体には、架橋または「ヘテロ複合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」抗体が含まれ、本発明の抗体である。例えば、ヘテロ複合体中の抗体の一方をアビジンにカップリングし、他方をビオチンにカップリングすることができる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞の望ましくない細胞へのターゲティング（米国特許第４，６７６，９８０号）およびＨＩＶ感染症の治療（ＷＯ  ９１／００３６０、ＷＯ  ９２／２００３７３、欧州特許第０３０８９号）が提案されている。ヘテロ複合体抗体を、任意の従来の架橋法を使用して作製することができる。適切な架橋剤は当該分野で周知であり、多数の架橋技術と共に米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
【０１５４】
多価抗体
本発明の抗体には、多価抗体が含まれる。多価抗体を、抗体が結合する抗原を発現する細胞によって２価抗体よりも迅速に内在化（および／または異化）することができる。本発明の抗体は、３つまたはそれを超える抗原結合部位を有し、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現によって容易に産生することができる（ＩｇＭクラス以外の）多価抗体（例えば、４価抗体）であり得る。多価抗体は、二量体化ドメインおよび３つまたはそれを超える抗原結合部位を含み得る。好ましい二量体化ドメインは、Ｆｃ領域またはヒンジ領域を含む（またはこれらからなる）。このシナリオでは、抗体は、Ｆｃ領域およびＦｃ領域のアミノ末端側に３つまたはそれを超える抗原結合部位を含む。本明細書中の好ましい多価抗体は、３〜約８個の抗原結合部位を含むが（またはこれらからなる）、４つが好ましい。多価抗体は、少なくとも１つのポリペプチド鎖（および好ましくは２つのポリペプチド鎖）を含み、ポリペプチド鎖は２つまたはそれを超える可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃ（式中、ＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域の１つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１およびＸ２はアミノ酸またはポリペプチドを示し、ｎは０または１である）を含み得る。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＨ−ＣＨ１−可動性リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖またはＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖を含み得る。本明細書中の多価抗体は、好ましくは、少なくとも２つ（好ましくは４つ）の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに含む。本明細書中の多価抗体は、例えば、約２〜約８個の軽鎖可変ドメインポリペプチドを含み得る。本明細書中で意図される軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、任意選択的に、ＣＬドメインをさらに含む。
【０１５５】
エフェクター機能の操作
例えば、癌治療における抗体の有効性を増強するために、エフェクター機能に関して本発明の抗体を修飾することが望ましいかもしれない。例えば、システイン残基をＦｃ領域に移入し、それにより、この領域中の鎖間ジスルフィド結合を形成することができる。このようにして生成されたホモ二量体抗体は、内在化能力が改良され、そして／または補体媒介性細胞死滅および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増加させることができる。Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照のこと。抗腫瘍活性が増強されたホモ二量体を、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載のように、ヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製することもできる。あるいは、二重Ｆｃ領域を有し、それにより、補体溶解およびＡＤＣＣ能力を増強することができるように抗体を操作することができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９−２３０（１９８９）を参照のこと。抗体の血清半減期を増加させるために、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載されているように、抗体（特に、抗体フラグメント）にサルベージ（ｓａｌｖａｇｅ）受容体結合エピトープを組み込むことができる。本明細書中で使用される、用語「サルベージ受容体結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期の増加を担うＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープをいう。
【０１５６】
免疫複合体
本発明はまた、治療薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、または動物を起源とする酵素活性毒素またはそのフラグメント）、または放射性同位体（すなわち、放射性複合体（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ））などの細胞傷害薬に抱合した本明細書中に記載の抗体を含む免疫複合体に関する。放射性複合体抗体の産生のために、種々の放射性核種を利用可能である。例には、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５７】
このような免疫複合体の生成に有用な化学療法薬を上に記載している。例えば、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｉｃｉｎ）、ビンクリスチン、５−フルオロウラシル、米国特許第５，０５３，３９４号、同第５，７７０，７１０号に記載の集合的にＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、エスペラミシン（米国特許第５，８７７，２９６号）など（本明細書中の化学療法薬の定義も参照のこと）を、抗ＡＮＧＰＴＬ４、抗αＶβ５、抗血管形成抗体、またはそのフラグメントに抱合することができる。
【０１５８】
腫瘍の選択的破壊のために、抗体は、高放射性原子を含み得る。種々の放射性同位体を、放射性抱合された抗ＡＮＧＰＴＬ４または抗血管形成抗体またはそのフラグメントの産生に利用可能である。例には、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、２１２Ｐｂ、１１１Ｉｎ、およびＬｕの放射性同位体などが含まれるが、これらに限定されない。複合体を診断のために使用する場合、複合体は、シンチグラフィ研究のための放射性原子（例えば、９９ｍｔｃまたは１２３Ｉ）または核磁気共鳴（ＮＭＲ）映像法（磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）としても公知）のためのスピン標識（ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン、または鉄など）を含み得る。
【０１５９】
放射性標識または他の標識を、公知の方法で複合体中に組み込むことができる。例えば、ペプチドを生合成するか、適切なアミノ酸前駆体（例えば、水素の代わりにフッ素−１９を含む）を使用したアミノ酸の化学合成によって合成することができる。９９ｍｔｃまたは１２３Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、および１１１Ｉｎなどの標識を、ペプチド中のシステイン残基を介して結合させることができる。イットリウム−９９を、リジン残基を介して結合させることができる。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９  ５７）を使用して、ヨウ素−１２３を組み込むことができる。例えば、他の方法を詳述したＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）を参照のこと。
【０１６０】
使用することができる酵素活性毒素およびそのフラグメントには、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンシン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリインヒビター、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、ネオマイシン、およびトリコテセンが含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開のＷＯ  ９３／２１２３２を参照のこと。
【０１６１】
抗体と細胞傷害薬との複合体を、種々の二官能性タンパク質カップリング剤（Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（塩酸ジメチルアジポイミデードなど）、活性エステル（ジスクリニミジルスベレートなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トリエン２，６−ジイソシアネートなど）、およびビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）など）を使用して作製する。例えば、リシン免疫毒素を、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載のように調製することができる。炭素−１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドの抱合のための例示的キレート剤である。ＷＯ  ９４／１１０２６を参照のこと。リンカーは、細胞中の細胞傷害薬の放出を容易にする「切断リンカー」であり得る。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用することができる。
【０１６２】
あるいは、抗ＡＮＧＰＴＬ４、抗αＶβ５、または抗血管形成抗体および細胞傷害薬を含む融合タンパク質を、例えば、組換え技術またはペプチド合成によって作製することができる。ＤＮＡの長さは、互いに隣接するか複合体の所望の性質を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域によって分離されている２つの複合体部分をコードする各領域を含み得る。
【０１６３】
特定の実施形態では、腫瘍プレターゲティングで使用するために、抗体を、「受容体」（ストレプトアビジンなど）に抱合し、抗体−受容体複合体を患者に投与し、その後に清澄化薬（ｃｌｅａｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を使用して循環から非結合複合体を除去し、細胞傷害薬（例えば、放射性核種）に抱合した「リガンド」（例えば、アビジン）を投与する。特定の実施形態では、抗体と核溶解（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ（デオキシリボヌクレアーゼ（Ｄｎアーゼなど）））との間に免疫複合体を形成する。
【０１６４】
マイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）およびマイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）
本発明は、１つまたは複数のマイタンシノイド分子に抱合した本発明の抗体を提供する。マイタンシノイドは、チューブリン重合の阻害によって作用する有糸分裂（ｍｉｔｏｔｏｔｉｃ）インヒビターである。マイタンシンは、東アフリカの低木マイテナス・セラタ（Ｍａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａ）から最初に単離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。その後、一定の微生物がマイタンシノイド（マイタンシノール（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｌ）およびＣ−３マイタンシノールエステルなど）も産生することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成マイタンシノールならびにその誘導体およびアナログは、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号；同第４，２４８，８７０号；同第４，２５６，７４６号；同第４，２６０，６０８号；同第４，２６５，８１４号；同第４，２９４，７５７号；同第４，３０７，０１６号；同第４，３０８，２６８号；同第４，３０８，２６９号；同第４，３０９，４２８号；同第４，３１３，９４６号；同第４，３１５，９２９号；同第４，３１７，８２１号；同第４，３２２，３４８号；同第４，３３１，５９８号；同第４，３６１，６５０号；同第４，３６４，８６６号；同第４，４２４，２１９号；同第４，４５０，２５４号；同第４，３６２，６６３号；および同第４，３７１，５３３号に開示されている。
【０１６５】
抗ＡＮＧＰＴＬ４、抗αＶβ５、または抗血管形成抗体を、抗体またはマイタンシノイド分子の生物活性を有意に減少させることなくマイタンシノイド分子に抱合する。１抗体分子あたり平均３〜４個のマイタンシノイド分子が抱合し、抗体の機能または溶解性に負の影響を与えることなく標的細胞の細胞傷害性の増強に有効性を示しているが、１分子の毒素／抗体でさえも裸の抗体を使用するよりも細胞傷害性を増強すると予想される。マイタンシノイドは当該分野で周知であり、公知の技術によって合成するか、天然供給源から単離することができる。適切なマイタンシノイドは、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号および他の特許ならびに上記に言及したおよび非特許刊行物に開示されている。一実施形態では、マイタンシノイドは、マイタンシノールおよびマイタンシノール分子の芳香環または他の位置が修飾されたマイタンシノールアナログ（種々のマイタンシノールエステルなど）である。
【０１６６】
抗体−マイタンシノイド複合体を作製するための当該分野で公知の結合基が多数存在し、米国特許第５，２０８，０２０号または欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号、およびＣｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）に開示の結合基が含まれる。結合基には、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、感光基、ペプチダーゼ不安定性基、またはエステラーゼ不安定性基が含まれ、上記で定義された特許に開示のように、ジスルフィド基およびチオエーテル基が好ましい。
【０１６７】
抗体とマイタンシノイドとの複合体を、種々の二官能性タンパク質カップリング剤（Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミオンチオラン（ＩＴ）など）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジポイミデート塩酸塩など）、活性エステル（スベリン酸ジスクシニミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス−（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）、およびビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）を使用して作製することができる。典型的なカップリング剤には、ジスルフィド結合を得るためのＮ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート−（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３：７２３−７３７［１９７８］）およびＮ−スクシニミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）が含まれる。
【０１６８】
結合型に依存して、マイタンシノイド分子の種々の位置にリンカーを結合することができる。例えば、従来のカップリング技術を使用した水酸基との反応によってエステル結合を形成することができる。水酸基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチル基で修飾されたＣ−１４位、水酸基で修飾されたＣ−１５位、および水酸基を有するＣ−２０位で反応が起こり得る。マイタンシノールまたはマイタンシノールアナログのＣ−３位にリンカーを形成する。
【０１６９】
カリケアマイシン
別の目的の免疫複合体は、１つまたは複数のカリケアマイシン分子と抱合した本発明の抗体を含む。抗生物質のカリケアマイシンファミリーは、ピコモル以下の濃度で二本鎖ＤＮＡを破壊することができる。カリケアマイシンファミリーの複合体の調製については、米国特許第５，７１２，３７４号、同第５，７１４，５８６号、同第５，７３９，１１６号、同第５，７６７，２８５号、同第５，７７０，７０１号、同第５，７７０，７１０号、同第５，７７３，００１号、同第５，８７７，２９６号（全てＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を参照のこと。使用することができるカリケアマイシンの構造アナログには、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ、およびθＩ１（Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：３３３６−３３４２（１９９３），Ｌｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２９２５−２９２８（１９９８）および上記のＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄの米国特許）が含まれるが、これらに限定されない。抗体を抱合することができる別の抗腫瘍薬は、葉酸拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシンおよびＱＦＡは共に細胞内作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。したがって、抗体媒介性内在化によるこれらの薬剤の細胞取り込みにより、その細胞傷害作用が非常に増強される。
【０１７０】
他の抗体修飾
他の抗体修飾が本明細書中で意図される。例えば、抗体を、種々の非タンパク質性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマー）のうちの１つと結合することができる。抗体を、例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョン中に捕捉することができる。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．，Ｅｄ．，（１９８０）に開示されている。
【０１７１】
リポソームおよびナノ粒子
本発明のポリペプチドを、リポソーム中に処方することができる。例えば、本発明の抗体を、免疫リポソームとして処方することができる。抗体を含むリポソームを、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；および米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号などに記載の当該分野で公知の方法によって調製する。循環時間が造抗されたリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。一般に、リポソームの処方および使用は、当業者に公知である。
【０１７２】
特に有用なリポソームを、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む液体組成物を使用した逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームを所定の孔サイズのフィルターから押し出して所望の直径のリポソームを得る。Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載のように、ジスルフィド鎖間反応を介して、本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントをリポソームに抱合することができる。化学療法薬（ドキソルビシンなど）を、任意選択的にリポソーム内に含める。Ｇａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８１（１９）１４８４（１９８９）を参照のこと。
【０１７３】
他の用途
本発明の抗体には種々の用途がある。例えば、抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体を、ＡＮＧＰＴＬ４の診断アッセイ（例えば、癌検出（例えば、腎癌検出）のための特定の細胞、組織、または血清におけるその発現の検出など）で使用することができる。一実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ４抗体を、本明細書中に提供した方法を使用した治療のための患者集団（例えば、ＡＮＧＰＴＬ４を発現する患者、ＡＮＧＰＴＬ４が上昇した患者、ＡＮＧＰＴＬ４レベルに感受性を示す癌患者）の選択のために使用する。当該分野で公知の種々の診断アッセイ技術（競合結合アッセイ、直接または間接的サンドイッチアッセイ、および均一相または不均一相において行った免疫沈降アッセイなど）を使用することができる（Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８７）ｐｐ．１４７−１５８）。診断アッセイで使用する抗体を、検出可能な部分で標識することができる。検出可能な部分は、直接または間接的に検出可能なシグナルを生じることができるはずである。例えば、検出可能な部分は、放射性同位体（３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉなど）、蛍光化合物、化学発光化合物（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、またはルシフェリンなど）、または酵素（アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、または西洋ワサビペルオキシダーゼなど）であり得る。当該分野で公知の検出可能部分に抗体を抱合する任意の方法（Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，４０：２１９（１９８１）；およびＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，３０：４０７（１９８２）に記載の方法が含まれる）を使用することができる。
【０１７４】
抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体はまた、組換え細胞培養物または天然供給源からのＡＮＧＰＴＬ４またはＡＮＧＰＴＬ４フラグメントのアフィニティ生成に有用である。この過程では、当該分野で周知の方法を使用して、ＡＮＧＰＴＬ４に対する抗体を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂または濾紙のような適切な支持体に固定する。次いで、固定された抗体を、精製すべきＡＮＧＰＴＬ４を含むサンプルと接触させ、その後、支持体を適切な溶媒で洗浄し、サンプル中のＡＮＧＰＴＬ４以外の固定化抗体に結合した実質的に全ての材料を除去する。最後に、支持体を別の適切な溶媒で洗浄し、抗体からＡＮＧＰＴＬ４を放出させる。
【０１７５】
本発明のポリペプチドに対する共有結合修飾
本発明のポリペプチド（例えば、ポリペプチドアンタゴニストフラグメント、融合分子（例えば、免疫融合分子）、本発明の抗体）の共有結合修飾は、本発明の範囲内に含まれる。適切な場合、ポリペプチドの化学合成または酵素切断もしくは化学的切断によってこれを行うことができる。ターゲティングされたポリペプチドのアミノ酸残基と選択された側鎖、Ｎ末端残基、もしくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤との反応または修飾アミノ酸もしくは非天然アミノ酸の成長中のポリペプチド鎖への組み込みによって、他のポリペプチドの共有結合修飾型を分子に移入する（例えば、Ｅｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１−３３６（１９９１）；Ｎｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１８２（１９８９）；ならびに米国特許出願公開番号２００３０１０８８８５号および同第２００３００８２５７５号）。
【０１７６】
システイニル残基を、α−ハロアセテート（および対応するアミン）（クロロ酢酸またはクロロアセトアミドなど）と反応させてカルボキシメチル誘導体またはカルボキシアミドメチル誘導体を得ることが最も一般的である。システイニル残基は、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルリン酸、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によっても誘導される。
【０１７７】
ｐＨ５．５〜７．０でのジエチルピロカーボネート（この薬剤はヒスチジル側鎖に非確定特異的であるため）との反応によってヒスチジル残基を誘導体化する。パラ−ブロモフェナシルブロミドも有用である。反応を、典型的には、ｐＨ６．０にて０．１Ｍカルコジル酸ナトリウム中で行う。
【０１７８】
リジニル残基およびアミノ末端残基を、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの薬剤での誘導体化は、リジニル残基の電荷を逆にする効果がある。α−アミノ含有残基を誘導体化するのに適切な他の薬剤には、イミドエステル（メチルピコリニミデート、など）、ピリドキサルリン酸、ピリドキサル、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン、およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。
【０１７９】
１つまたはいくつかの従来の試薬、特に、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンと反応によってアルギニル残基を修飾する。アルギニン残基の誘導体化には、グアニジン官能基のｐＫａが高いので、アルカリ条件下で反応を行うことが必要である。さらに、これらの試薬は、リジン基およびアルギニンε−アミノ基と反応することができる。
【０１８０】
チロシル残基の特異的修飾を行うことができ、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によるチロシル残基へのスペクトル標識の移入が特に興味深い。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾール（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）およびテトラニトロメタンを使用して、Ｏ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体をそれぞれ形成する。１２５Ｉまたは１３１Ｉを使用してチロシル残基をヨード化して、放射免疫アッセイで使用される標識タンパク質を調製する。
【０１８１】
カルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’（式中、ＲおよびＲ’は異なるアルキル基である））（１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルフェニル）カルボジイミドなど）との反応によって、カルボキシル側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）を選択的に修飾する。さらに、アンモニウムイオンとの反応によって、アスパルチル残基およびグルタミル残基を、アスパラギニル残基およびグルタミニル残基に変換する。
【０１８２】
グルタミニル残基およびアスパラギニル残基を、しばしば、対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基にそれぞれ脱アミド化する。これらの残基を、中性または塩基性条件下で脱アミド化する。これらの残基の脱アミド化形態は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１８３】
他の修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル残基またはトレオニル残基の水酸基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のαアミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３））、Ｎ−末端アミンのアセチル化、および任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
【０１８４】
別の共有結合修飾型は、本発明のポリペプチドへのグリコシドの化学的または酵素的カップリングを含む。これらの手順は、ＮまたはＯ結合グリコシル化のためのグリコシル化能力を有する宿主細胞中でのポリペプチド産生を必要としないという点で有利である。使用したカップリング様式に依存して、糖を、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基（システインの遊離スルフヒドリル基など）、（ｄ）遊離ヒドロキシル基（セリン、スレオニン、またはヒドロキシプロリンの遊離ヒドロキシル基など）、（ｅ）芳香族残基（フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンの芳香族残基など）または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合することができる。これらの方法は、１９８７年９月１１日公開のＷＯ  ８７／０５３３０およびＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）に記載されている。
【０１８５】
本発明のポリペプチド上に存在する任意の炭水化物部分を、化学的または酵素的に除去することができる。化学的脱グリコシル化には、化合物トリフルオロメタンスルホン酸またはその等価な化合物へのポリペプチドの曝露が必要である。この処理により、結合している糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外の全てまたはほとんどの糖が切断される一方で、ポリペプチドはインタクトなままである。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２（１９８７）およびＥｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１（１９８１）に記載されている。例えば、抗体上の炭水化物部分の酵素的切断を、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０（１９８７）に記載の種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用によって行うことができる。
【０１８６】
本発明のポリペプチドの別の共有結合修飾型は、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号、または同第４，１７９，３３７号に記載の様式での種々の非タンパク質性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン）のうちの１つへのポリペプチドの結合を含む。
【０１８７】
ベクター、宿主細胞、および組換え法
本発明のポリペプチドを、容易に入手可能な技術および材料を使用した組換えによって産生することができる。
【０１８８】
本発明のポリペプチド（例えば、ＡＮＧＰＴＬ４または抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体、抗αＶβ５抗体または抗血管形成抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体））の組換え産生のために、ポリペプチドをコードする核酸を単離し、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のための複製ベクターに挿入する。従来の手順を使用して、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを容易に単離し、配列決定する。例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブの使用などによって、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡを単離し、配列決定する。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分には、一般に、１つまたは複数の以下が含まれるが、これらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列。
【０１８９】
シグナル配列成分
本発明のポリペプチドを、組換えによって直接産生することができるだけでなく、異種ポリペプチド（典型的には、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有するシグナル配列または他の配列である）との融合ポリペプチドとして産生することもできる。選択された異種シグナル配列は、典型的には、宿主細胞によって認識およびプロセシングされた（すなわち、シグナルペプチドによって切断された）配列である。未変性のポリペプチドシグナル配列を認識およびプロセシングしない原核宿主細胞については、シグナル配列を、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列に置換する。酵母分泌のために、未変性シグナル配列を、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（サッカロミセス属およびクリベロミセス属のα因子リーダーが含まれる）、酸ホスファターゼリーダー、カンジタ・アルビカンスのグルコアミラーゼリーダー、またはＷＯ  ９０／１３６４６に記載のシグナルに置換することができる。哺乳動物細胞発現では、哺乳動物シグナル配列およびウイルス分泌リーダー（例えば、単純ヘルペスｇＤシグナル）が利用可能である。
【０１９０】
このような前駆領域のＤＮＡを、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡに読み枠内でライゲーションする。
【０１９１】
複製起点成分
発現ベクターおよびクローニングベクターは共に、１つまたは複数の選択された宿主細胞中でベクターが複製することができる核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターでは、この配列は、宿主染色体ＤＮＡと無関係にベクターが複製することができる配列であり、複製起点または自己複製配列が含まれる。このような配列は、種々の細菌、酵母、およびウイルスで周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適切であり、２μプラスミドの複製起点は酵母に適切であり、種々のウイルスの複製起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターに必要ない（初期プロモーターを含むので、典型的にはＳＶ４０の複製起点のみを使用することができる）。
【０１９２】
選択遺伝子成分
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含み得る。典型的な選択遺伝子は、抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリン）に対する耐性を付与するか、（ｂ）栄養要求性欠損を補足するか、（ｃ）天然培地から利用できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする（例えば、バチルス属のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。
【０１９３】
選択スキームの１つの例は、宿主細胞の成長を停止させる薬物を使用する。異種遺伝子で首尾よく形質転換された細胞は、薬物耐性が付与されたタンパク質を産生し、それにより、選択レジメ（ｒｅｇｉｍｅｎ）で生存する。このような優性選択（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）の例は、薬物ネオマイシン、ミコフェノール酸、およびハイグロマイシンを使用する。
【０１９４】
哺乳動物細胞に適切な選択マーカーの別の例は、細胞が抗体核酸を取り込む能力を同定することができる選択マーカー（ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−ＩおよびＩＩ（典型的には、霊長類メタロチオネイン遺伝子）、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなど）である。
【０１９５】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞を、メトトレキセート（Ｍｔｘ）（ＤＨＦＲの競合的アンタゴニスト）を含む培養培地中の全ての形質転換体の培養によって最初に同定する。野生型ＤＨＦＲを使用する場合の適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。
【０１９６】
あるいは、本発明のポリペプチド（野生型ＤＨＦＲタンパク質）をコードするＤＮＡ配列およびアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）などの別の選択マーカーで形質転換または同時形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）を、アミノグリコシド抗生物質（例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８）などの選択マーカーのための選択剤を含む培地での細胞増殖によって選択することができる。米国特許第４，９６５，１９９号を参照のこと。
【０１９７】
酵母での使用に適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹｒｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９））。ｔｒｐ１遺伝子により、トリプトファン中で成長能力を欠く酵母変異株（例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１）の選択マーカーが得られる。Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７）。次いで、酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐ１損傷の存在により、トリプトファンの非存在下での成長による形質転換の検出に有効な環境が得られる。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ２０，６２２または３８，６２６）にＬｅｕ２遺伝子を有する公知のプラスミドを補足する。
【０１９８】
さらに、１．６μｍ環状プラスミドｐＫＤ１由来のベクターを、クリベロミセス属酵母の形質転換に使用することができる。あるいは、Ｋ．ラクチスについての組換えウシキモシンの大量生産のための発現系が報告されている。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０）。クリベロミセス属の産業株（ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｓｔｒａｉｎ）による成熟組換えヒト血清アルブミン分泌のための安定な多コピー発現ベクターも開示されている。Ｆｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８−９７５（１９９１）。
【０１９９】
プロモーター成分
発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、本発明のポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。原核生物宿主と共に使用するのに適切なプロモーターには、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ならびにｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが含まれる。しかし、他の公知の細菌プロモーターも適切である。細菌系で使用されるプロモーターは、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されたシャイン−ダルカルノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含む。
【０２００】
真核生物のためのプロモーター配列が公知である。事実上全ての真核生物遺伝子は、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多数の遺伝子の転写開始から７０〜８０塩基上流に見出される別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域（Ｎは任意のヌクレオチドであってよい）である。ほとんどの真核生物遺伝子の３’末端は、ＡＡＴＡＡＡ配列であり、この配列は、コード配列の３’末端にポリＡテールを付加するためのシグナルであり得る。これらの全配列を、真核生物発現ベクターに適切に挿入する。
【０２０１】
酵母宿主と共に使用される適切なプロモーター配列の例には、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素（エノラーゼなど）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのプロモーターが含まれる。
【０２０２】
成長条件によって調節される転写のさらなる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトース利用を担う酵素のプロモーター領域である。酵母発現で使用される適切なベクターおよびプロモーターは、欧州特許第７３，６５７号にさらに記載されている。酵母プロモーターと共に酵母エンハンサーを使用することも有利である。
【０２０３】
哺乳動物宿主細胞中のベクターからの本発明のポリペプチドの転写を、例えば、ポリオーマウイルス、伝染性上皮腫ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、典型的には、サルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得たプロモーター、異種哺乳動物プロモーター（例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター）、熱ショックプロモーター（プロモーターが宿主細胞系と適合する場合）によって調節する。
【０２０４】
ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーターを、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含むＳＶ４０制限フラグメントとして得ることが都合が良い。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターを、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限フラグメントとして得ることが都合がよい。ベクターとしてウシ乳頭腫ウイルスを使用した哺乳動物宿主中のＤＮＡ発現系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の改変は、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現については、Ｒｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：５９８−６０１（１９８２）も参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復を、プロモーターとして使用することができる。
【０２０５】
エンハンサーエレメント成分
高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を、しばしば、ベクターへのエンハンサー配列の挿入によって増加させる。現在、哺乳動物遺伝子由来の多数のエンハンサー配列が公知である（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリン）。典型的には、真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例には、複製起点の後期側（ｂｐ１００〜２７０）のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化エレメントの増強については、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７−１８（１９８２）も参照のこと。エンハンサーを、ベクター中のポリペプチドコード配列の５’位または３’位にスプライシングすることができるが、典型的には、プロモーターから５’位に配置する。
【０２０６】
転写終結成分
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物由来の有核細胞）で使用される発現ベクターは、転写終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの一般に５’、時折３’の非翻訳領域から利用可能である。これらの領域は、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化部位として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ  ９４／１１０２６およびこれに開示されている発現ベクターを参照のこと。
【０２０７】
宿主細胞の選択および形質転換
本明細書中のベクターにおける本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡをクローニングまたは発現する適切な宿主細胞は、上記の原核細胞、酵母細胞、または高等真核細胞である。この目的に適切な原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物などの真正細菌（例えば、腸内細菌科（大腸菌属（例えば、大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ（例えば、ネズミチフス菌）、セラチア（例えば、セラチア・マルセスカンス）、および赤痢菌など）、ならびに桿菌（枯草菌、バチルス・リケニホルミス（例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ  ２６６，７１０に開示のバチルス・リケニホルミス４１Ｐ）など）、シュードモナス（緑膿菌など）および放線菌類）が含まれる。典型的には、大腸菌クローニング宿主は、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）であるにもかかわらず、大腸菌Ｂ株、大腸菌Ｘ１７７６株（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）、および大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）などの他の株も適切である。これらの例は、制限ではなく、むしろ例示である。
【０２０８】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物は、本発明のポリペプチドをコードするベクターの適切なクローニング宿主または発現宿主である。出芽酵母（すなわち、一般的なパン酵母）は、下等真核生物宿主微生物で最も一般的に使用されている。しかし、多数の他の属、種、および株（分裂酵母；クリベロミセス宿主（例えば、クリベロミセス・ラクチス、Ｋ．フラジリス（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ブルガリクス（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、Ｋ．ウィケラミイ（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、Ｋ．ワルチイ（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（ＡＴＣＣ  ３６，９０６）、Ｋ  ．サーモトレランス、およびＫ．マルキサヌスなど）；ヤロウィア属（欧州特許第４０２，２２６号）；ピキア・パストリス（欧州特許第１８３，０７０号）；カンジダ；トリコデルマ・レエシア（欧州特許第２４４，２３４号）；アカパンカビ；シュワニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）（シュワニオマイセス・オシデンタリスなど）；および糸状菌類（例えば、パンカビ、アオカビ類、トリポクラジウム、およびアスペルギルス宿主（Ａ．ニジュランスおよびクロカビなど）など）を本明細書中で一般に利用可能であり、且つ有用である。
【０２０９】
本発明のグリコシル化ポリペプチドの発現のための適切な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞および昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株ならびに改変体および対応する許容状態の昆虫宿主細胞（ヨウトガ(毛虫)、ネッタイシマカ(蚊)、ヒトスジシマカ(蚊)、キイロショウジョウバエ(ショウジョウバエ)、およびカイコなど）が同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株が公的に利用可能であり（例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ−１改変体およびカイコＮＰＶのＢｍ−５株）、このようなウイルスを、特にヨウトガ細胞のトランスフェクションのための本発明のウイルスとして使用することができる。ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、およびタバコの植物細胞培養物を、宿主として使用することもできる。
【０２１０】
しかし、脊椎動物細胞に最も高い関心が寄せられており、培養（組織培養）での脊椎動物細胞の増殖は日常的手段となりつつある。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３細胞または懸濁培養での増殖についてサブクローン化された２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞腫株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０２１１】
宿主細胞を、本発明で産生するポリペプチドのための上記発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切なように改変した従来の栄養培地中で培養する。
【０２１２】
宿主細胞の培養
本発明のポリペプチドを産生するのに使用される宿主細胞を、種々の培地中で培養することができる。Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最少必須培地（（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）Ｓｉｇｍａ）などの市販されている培地が宿主細胞の培養に適切である。さらに、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９），Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；または同第５，１２２，４６９号；ＷＯ  ９０／０３４３０；ＷＯ  ８７／００１９５；または米国特許再発行３０，９８５号に記載の任意の培地を、宿主細胞の培養培地として使用することができる。これらの培地のいずれかに、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン（商標）薬など）、微量元素（通常、μモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物と定義する）、およびグルコースまたは等価なエネルギー源を補足することができる。任意の他の必要な栄養補助剤を、当業者に公知の適切な濃度で含めることもできる。培養条件（温度およびｐＨなど）は、発現のために選択した宿主細胞で以前に使用した条件であり、当業者に明らかである。
【０２１３】
ポリペプチドの精製
組換え技術を使用する場合、本発明のポリペプチド（例えば、ＡＮＧＰＴＬ４）、本発明の抗体（例えば、抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体、抗αＶβ５抗体、または抗血管形成分子抗体）を、細胞内に産生するか、細胞膜周辺腔中に産生するか、培地に直接分泌させることができる。本発明のポリペプチドを、培養培地または宿主細胞溶解物から回収することができる。膜に結合している場合、適切な界面活性剤溶液（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００）を使用するか、酵素切断によって膜から放出させることができる。本発明のポリペプチド発現で使用される細胞を、種々の物理的手段または化学的手段（凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤など）によって破壊することができる。
【０２１４】
組換え細胞のタンパク質またはポリペプチドから本発明のポリペプチドを精製することが望ましいかもしれない。以下の手順は適切な精製手順の例である：イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカでのクロマトグラフィ；陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラム、ＤＥＡＥなど）によるヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィでのクロマトグラフィ；等電点電気泳動；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を使用したゲル濾過；ＩｇＧなどの夾雑物を除去するためのプロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム；および本発明のポリペプチドのエピトープタグ化形態に結合させるための金属キレートカラム。種々のタンパク質精製方法を使用することができ、このような方法は当該分野で公知であり、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８２（１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）に記載されている。選択される精製工程は、例えば、使用される産生過程および産生された本発明の特定のポリペプチドの性質に依存する。
【０２１５】
例えば、細胞から調製された抗体組成物を、例えば、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティクロマトグラフィを使用して精製することができ、アフィニティクロマトグラフィが典型的な精製技術である。アフィニティリガンドとしてのプロテインＡが適切性であるかどうかは、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡを使用して、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づいて抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。全マウスアイソタイプおよびヒトγ３にはプロテインＧが推奨される（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。アフィニティリガンドが結合したマトリクスはほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリクスを利用可能である。細孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）またはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリクスにより、アガロースよりも流速が速くなり、処理時間が短くなる。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）が精製に有用である。回収される抗体に依存して、他のタンパク質精製技術（例えば、上記の技術）の利用可能である。大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌された抗体の単離手順を記載しているＣａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）も参照のこと。
【０２１６】
薬学的組成物
保存のための凍結乾燥処方物または水溶液の形態の本発明のポリペプチド、本発明の分子、およびその組み合わせの治療処方物ならびに本発明にしたがって使用される本明細書中に記載の治療処方物を、所望の精製度のポリペプチドと任意選択的な薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．［１９８０］）との混合によって調製する。受容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに無毒であり、緩衝液（リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、および他の有機酸の緩衝液など）；抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオニンが含まれる）；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；アルキルパラベン（メチルパラベンまたはプロピルパラベンなど）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど）；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなど）；モノサッカリド、ジサッカリド、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンが含まれる）；キレート剤（ＥＤＴＡなど）；糖（スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールなど）；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；および／または非イオン性界面活性剤（ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）が含まれる。
【０２１７】
また、有効成分を、例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョン中に捕捉することができる。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．，Ｅｄ．，（１９８０）に開示されている。
【０２１８】
インビボ投与で使用すべき処方物は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜での濾過によって容易に行われる。
【０２１９】
徐放性調製物を調製することができる。徐放性調製物の適切な例には、本発明のポリペプチドを含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが含まれ、マトリクスが造形品（例えば、フィルム）またはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチルＬ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射用ミクロスフェア）など）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーが１００日間超にわたって分子を放出することができる一方で、一定のヒドロゲルはより短い期間タンパク質を放出する。カプセル化抗体が体内に長期間保持される場合、抗体は３７ＥＣで水分に曝露された結果として変性または凝集し、それにより、生物活性を喪失し、免疫原性が変化する可能性がある。関連する機構に依存した安定化のための合理的ストラテジーを考案することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換による分子内Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見された場合、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、含水率の調節、適切な添加物の使用、および特定のポリマーマトリクス組成物の開発によって安定化することができる。多価電解質被膜を有するカプセルを記載している米国特許第６，６９９，５０１号も参照のこと。
【０２２０】
遺伝子療法によって本発明の薬剤（ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ４アゴニスト、またはＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニスト）を被験体に移入することができることがさらに意図される。遺伝子療法は、被験体への核酸の投与によって行われる療法をいう。遺伝子療法の適用では、遺伝子を細胞に移入し、例えば、欠失遺伝子の置換のための治療有効遺伝子産物のインビボ合成を行う。「遺伝子療法」には、１回の治療で持続的効果が得られる従来の遺伝子療法および治療有効ＤＮＡまたはｍＲＮＡの１回または反復投与を含む遺伝子療法薬の投与が含まれる。アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡを、インビボでの一定の遺伝子の発現の遮断のための治療薬として使用することができる。例えば、本明細書中に記載のＡｄ−ＡＮＧＰＴＬ４−ＳｉＲＮＡを参照のこと。短鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドをこれらがインヒビターとして作用する細胞に導入することができるが、細胞膜による取り込みの制限によって細胞内濃度が低くなることが既に示されている。（Ｚａｍｅｃｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：４１４３−４１４６（１９８６））。例えば、負電荷のホスホジエステル基の非荷電性基への置換によって、オリゴヌクレオチドを修飾して、その取り込みを増強することができる。遺伝子療法の方法の一般的概説については、例えば、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５（１９９３）；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；Ｍｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；およびＭａｙ  ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。使用することができる組換えＤＮＡテクノロジー分野で一般的に公知の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ（１９９０）Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹに記載されている。
【０２２１】
生存細胞への核酸の移入に利用可能な種々の技術が存在する。核酸が、培養細胞にインビトロで導入されるのか、意図する宿主の細胞にインビボで導入されるのかどうかによって技術は変化する。インビトロでの哺乳動物細胞への核酸の導入に適切な技術には、リポソーム、エレクトロポレーション、微量注入、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法の使用が含まれる。現在好ましいインビボ遺伝子導入技術には、ウイルス（典型的には、レトロウイルス）ベクターでのトランスフェクションおよびコートタンパク質−リポソーム媒介トランスフェクションが含まれる（Ｄｚａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１，２０５−２１０（１９９３））。例えば、インビボ核酸導入技術には、ウイルスベクター（アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、またはアデノ随伴ウイルスなど）でのトランスフェクションおよび脂質ベースの系（脂質媒介性遺伝子導入に有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、およびＤＣ−Ｃｈｏｌである）が含まれる。遺伝子療法でのウイルスベクターの使用例を、Ｃｌｏｗｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１（１９９４）；Ｋｉｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８３：１４６７−１４７３（１９９４）；Ｓａｌｍｏｎｓ  ａｎｄ  Ｇｕｎｚｂｅｒｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：１２９−１４１（１９９３）；Ｇｒｏｓｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．３：１１０−１１４（１９９３）；Ｂｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：３−１０（１９９４）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４（１９９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５（１９９２）；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４（１９９３）；およびＷａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９−３００（１９９３）に見出すことができる。
【０２２２】
いくつかの状況では、標的細胞をターゲティングする薬剤（細胞表面膜タンパク質または標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上の受容体のリガンドなど）を核酸供給源に提供することが望ましい。リポソームを使用する場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質を、例えば、特定の細胞型に向かうキャプシドタンパク質またはそのフラグメント、循環時に内在化を受けるタンパク質の抗体、細胞内局在化をターゲティングして細胞内半減期を増強するタンパク質のターゲティングおよび／または取り込みの促進のために使用することができる。受容体媒介性エンドサイトーシス技術は、例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４４２９−４４３２（１９８７）；およびＷａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，３４１０−３４１４（１９９０）に記載されている。遺伝子の作製および遺伝子治療プロトコールの概説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６，８０８−８１３（１９９２）を参照のこと。
【０２２３】
投薬量および投与
公知の方法（ボーラスとしての静脈内投与、長期間にわたる連続的注入、筋肉内投与、腹腔内投与、脳脊髄内（ｉｎｔｒａｃｅｒｏｂｒｏｓｐｉｎａｌ）投与、皮下投与、関節内投与、髄液嚢内投与、鞘内、経口投与、局所投与、または吸入経路、および／または皮下投与など）にしたがって、本発明の分子を、ヒト患者に投与する。
【０２２４】
特定の実施形態では、本発明の治療は、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストと１つまたは複数の抗癌薬（例えば、抗血管形成薬）との組み合わせ投与を含む。一実施形態では、さらなる抗癌薬（例えば、１つまたは複数の異なる抗血管形成薬、１つまたは複数の化学療法薬など）が存在する。本発明はまた、複数のインヒビター（例えば、同一抗原に対する複数の抗体または異なる癌活性分子に対する複数の抗体）の投与を意図する。一実施形態では、異なる化学療法薬のカクテルを、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストおよび／または１つまたは複数の抗血管形成薬と共に投与する。組み合わせ投与には、個別の処方物または単一の薬学的処方物を使用した同時投与および／またはいずれかの順序での連続投与が含まれる。例えば、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストは、抗癌薬の前、後、交互に投与することができるか、同時に投与することができる。一実施形態では、両方の（または全ての）活性成分（ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）がその生物活性を同時に発揮する期間が存在する。
【０２２５】
疾患の防止または治療のために、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストの適切な投薬量は、上記定義の治療すべき疾患の型、疾患の重篤度および経過、防止または治療目的でインヒビターを投与しているかどうか、以前の治療、患者の病歴およびインヒビターに対する応答性、ならびに主治医の判断に依存する。インヒビターを、１回または治療を通して患者に適切に投与する。併用療法の投与計画では、本発明の組成物を、治療有効量または治療的に相乗効果のある量で投与する。本明細書中で使用される、「治療有効量」は、本発明の組成物の投与および／またはＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストおよび１つまたは複数の治療薬の同時投与によってターゲティングされる疾患または容態が軽減または阻害される量である。薬剤の組み合わせの投与効果は付加的であり得る。一実施形態では、投与の結果は、相乗効果である。治療的に相乗効果のある量は、特定の疾患に関連する容態または症状を相乗的または有意に軽減または排除するのに必要なＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストおよび１つまたは複数の他の治療薬（例えば、血管形成インヒビター）の量である。
【０２２６】
疾患の型および重篤度に依存して、約１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）のＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストまたは血管形成インヒビターは、例えば、１つまたは複数の個別の投与または連続注入による患者の投与のための第１の候補投薬量である。典型的な１日量は、上記要因に依存して、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲であり得る。数日間またはそれを超える繰り返し投与のために、容態に依存して、疾患の症状が望ましく抑制されるまで治療を継続する。しかし、他の投薬計画が有用であり得る。典型的には、臨床医は、本発明の分子を、必要な生物学的効果が得られる投薬量に到達するまで投与する。本発明の治療過程を、従来の技術およびアッセイによって容易にモニタリングする。
【０２２７】
例えば、血管形成インヒビター（例えば、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）などの抗ＶＥＧＦ抗体）の調製および投与計画を、製造者の説明者にしたがって使用するか、当業者によって経験的に決定することができる。別の例では、このような化学療法薬の調製および投与計画を、製造者の説明者にしたがって使用するか、当業者によって経験的に決定することができる。化学療法薬の調製および投与計画は、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｅｄ．，Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９２）にも記載されている。
【０２２８】
治療有効性
本発明の治療有効性を、新生物障害または非新生物障害の評価で一般的に使用されている種々の終点によって測定することができる。例えば、癌治療を、例えば、腫瘍の緩解、腫瘍重量、またはサイズの縮小、無増悪期間、生存期間、無増悪生存率、全奏功率、奏功期間、および生活の質によって評価することができる。本明細書中に記載の抗血管形成薬が腫瘍血管系をターゲティングし、必ずしも新生物細胞自体ではないので、抗血管形成薬は固有の抗癌薬クラスを示し、それにより、薬物に対する臨床反応を固有に測定および定義する必要があり得る。例えば、二次元分析における５０％を超える腫瘍の縮小は、応答を宣言するための標準的なカットオフである。しかし、本発明のインヒビターは、原発性腫瘍を縮小させることなく転移の拡大を阻害することができるか、単純に腫瘍静止効果（ｔｕｍｏｕｒｉｓｔａｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）を発揮することができる。したがって、治療法の有効性を決定するアプローチ（例えば、血管形成の血漿マーカーまたは尿マーカーの測定および放射線画像化による応答の測定が含まれる）を使用することができる。
【０２２９】
一実施形態では、本発明を、非新生物障害または新生物障害（例えば、癌）に感受性を示すか診断されたヒト患者の生存期間を増加させるために使用することができる。生存期間を、最初の薬物の投与から死亡までの時間と定義する。１つの態様では、本発明のＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストを、１つまたは複数の抗癌薬と組み合わせてヒト患者に投与し、それにより、１つの治療型のみと比較して患者の生存期間が有効に増加する（例えば、１つの治療型と比較して、約５％の増加、約１０％の増加、約２０％の増加、約３０％の増加、約４０％の増加、あるいは約５０％またはそれを超える増加）。
【０２３０】
別の実施形態では、本発明は、非新生物障害または新生物障害（例えば、癌）に感受性を示すか診断されたヒト患者の無増悪生存率を増加させる方法を提供する。疾患の進行期間を、薬物の投与から疾患が進行するまでの時間と定義する。一実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストおよび１つまたは複数の抗癌薬の本発明の併用療法により、抗癌薬のみと比較して、少なくとも約２ヶ月、少なくとも約４ヶ月、少なくとも約６ヶ月、少なくとも約８ヶ月、１年またはそれを超えて無増悪生存率が有意に増加する。
【０２３１】
さらに別の実施形態では、本発明の治療により、種々の治療法で治療した癌に感受性を示すか癌と診断されたヒト患者群で応答率が有意に増加する。応答率を、治療に応答した治療患者の比率と定義する。本発明の一実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストおよび１つまたは複数の抗癌薬を使用した本発明の併用療法により、単一の癌療法（例えば化学療法のみ）での治療群と比較して、この治療患者群の応答率が有意に増加し、この増加のカイ２乗ｐ値は、例えば、０．０１０未満、０．００５未満、または０．００１未満である。
【０２３２】
１つの態様では、本発明は、癌に感受性を示すか癌と診断されたヒト患者またはヒト患者群の応答期間を増加させる方法を提供する。応答期間を、最初の応答から疾患の進行までの時間と定義する。本発明の特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストおよび１つまたは複数の抗癌薬を使用した本発明の併用療法により、例えば、応答期間を、例えば、少なくとも２ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも６ヶ月統計的に有意に増加させることができる。
【０２３３】
製品
本発明の別の実施形態では、上記の障害の治療に有用な材料を含む製品を提供する。製品は、容器、ラベル、および添付文書を含む。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどが含まれる。容器を、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成することができる。容器は、容態治療に有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針で突き刺すことができるストッパーを有する静脈注射用溶液バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性成分は、ＡＮＧＰＴＬ４モジュレーターである。容器上または容器に封入したラベルは、最適な容態の治療のために組成物を使用することを示す。製品は、さらに、薬学的に受容可能な緩衝液（リン酸緩衝化生理食塩水など）、リンゲル液、およびデキストロース溶液を含む第２の容器を含み得る。製品は、さらに、商業的および使用者の観点から望ましい他の材料（さらなる活性成分、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、ニードル、およびシリンジが含まれる）を含む。
【０２３４】
材料の寄託
以下の材料を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ．２０１１０−２２０９，ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に寄託した。
【０２３５】
【表２】
2008507536.tif 000003
特許手続き上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（ブダペスト条約）の下に寄託を行った。これにより、寄託日から３０年間寄託物が生きたまま確実に維持される。寄託物を、ブダペスト条約の条項に従い、且つＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．とＡＴＣＣとの間の合意を条件としてＡＴＣＣから利用可能であり、適切な米国特許の発行時または任意の米国または外国特許出願の公開時にいずれが最初であっても寄託物の培養物の子孫の公的な恒久的且つ無制限の利用が保証され、合衆国法典第３５巻第１２２条およびこれに準拠する米国特許商標局の規則（連邦規則集第３７巻第１．１４条（８８６  ＯＧ  ６３８を特に参照する）が含まれる）に従って米国特許商標局長によって権利を与えると決定された者の子孫の利用が保証される。
【０２３６】
出願の譲受人は、寄託した材料の培養物が適切な条件下での培養時に死滅、紛失、または破壊された場合、通知の際に材料を別の寄託物と迅速に取り替えることに同意している。特許法にしたがって任意の政府当局で付与された権利に違反して、寄託材料の利用が発明の実施を許可すると解釈されない。
【実施例】
【０２３７】
本明細書中に記載の寄託物、実施例、および実施形態は例示のみを目的とし、これらを考慮して種々の修正形態または変更形態が当業者に示唆され、これらが本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれると理解される。実施例で言及した市販の試薬を、他で示さない限り、製造者の説明書に従って使用した。
【０２３８】
実施例１：ＡＮＧＰＴＬ４は、腫瘍細胞の増殖および細胞移動を刺激する
アデノウイルスベクターの生成および形質導入。アデノウイルス構築物を、本質的に製造者が説明するように、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）のＡｄ−ｅａｓｙベクター構築キットのポリリンカー部位へのＮｏｔ１−Ｎｏｔ１  ｃＤＮＡインサートのクローン化によって構築した。例えば、Ｈｅｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０４（１）：１４９−１５８（２００４）を参照のこと。
【０２３９】
ｈＡｎｇｐｔｌ４（２３−４０６）（ＰＵＲ９３８４）、ｍＡｎｇｐｔｌ４（１８４−４１０）−ＩｇＧ（ＰＵＲ９３８８）、およびｍＡｎｇｐｔｌ４（２３−４１０）（ＰＵＲ９４５２）シングルフラッグタグ化タンパク質の生成。採取した細胞培養液を、抗ｆｌａｇ  Ｍ２樹脂（Ｓｉｇｍａ#Ａ−２２２０）に一晩通過させた。カラムを、ＰＢＳでベースラインまで洗浄し、５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）で溶離した。この体積を、Ａｍｉｃｏｎ−１５  １０，０００ＭＷＣＯ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃ＵＦＣ９０１０２４）で濃縮した。最終工程は、１ｍＭ  ＨＣｌ／ＳｕｐｅｒＱ水への透析および０．２μｍの濾過であった。４〜２０％のトリス／グリシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃ＥＣ６０２８ｂｏｘ）ＳＤＳｐａｇｅゲル＋／−１０ｍＭ  ＤＴＴを使用して、純度を決定した。正確なタンパク質を、質量分析またはエドマンＮ末端配列決定によって同定した。
【０２４０】
ｈＡｎｇｐｔｌ４（１８４−４０６）−ＩｇＧ（ＰＵＲ  ９４４１）Ｎ末端フラッグタグおよびその後の連続したＮ末端ｈｕＦｃタグの生成。採取した細胞培養液を、ＰｒｏＳｅｐ  Ａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  #１１３１１１８３５）に一晩通過させた。次いで、カラムを、ＰＢＳでベースラインまで洗浄した。次いで、４カラム体積の０．５Ｍ  ＴＭＡＣ／ＰＢＳ（ｐＨ７．５）洗浄工程を行い、その後、ベースラインまでＰＢＳ洗浄を行った。溶離工程は、５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）バンプ（ｂｕｍｐ）であった。この体積を、Ａｍｉｃｏｎ−１５  １０，０００ＭＷＣＯ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃ＵＦＣ９０１０２４）で濃縮した。最終工程は、１ｍＭ  ＨＣｌ／ＳｕｐｅｒＱ水への透析および０．２μｍの濾過であった。４〜２０％のトリス／グリシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃ＥＣ６０２８ｂｏｘ）ＳＤＳｐａｇｅゲル＋／−１０ｍＭ  ＤＴＴを使用して、純度を決定する。正確なタンパク質を、質量分析またはエドマンＮ末端配列決定によって同定した。当該分野で公知の標準的技術を使用して、組換えタンパク質を作製することもできる。
【０２４１】
Ａｄ−ＡＮＧＰＴＬ４−ＳｉＲＮＡの生成。４つの潜在的なＡＮＧＰＴＬ４−ＳｉＲＮＡ分子（Ｑｉａｇｅｎ）を、全長ｈＡＮＧＰＴＬ４配列に基づいて生成した。１つのＡＮＧＰＴＬ４−ＳｉＲＮＡを、ＳｉＲＮＡがｈＡＮＧＰＴＬ４発現を阻害する能力に基づいて選択した。これは、以下のＡＮＧＰＴＬ４のＤＮＡ標的配列ＧＴＧＧＣＣＡＡＧＣＣＴＧＣＣＣＧＡＡＧＡ（配列番号３）をターゲティングした（例えば、ｒ（ＧＧＣＣＡＡＧＣＣＵＧＣＣＣＧＡＡＧＡＵＵ）（配列番号４）および／またはｒ（ＵＣＵＵＣＧＧＧＣＡＧＧＣＵＵＧＧＣＣＡＣ）（配列番号５））。ＳｉＲＮＡを、ＲＮＡプロモーター（例えば、Ｈ１プロモーター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ））を含むＣＭＶｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｈ１．１導入ベクターにクローン化した。次いで、ＳｉＲＮＡ発現カセットをクローン化して、アデノウイルスＡｄｈＡＮＧＰＴＬ４−ＳｉＲＮＡ構築物を生成した。例えば、アデノウイルス構築物を、本質的に製造者が説明するように、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）のＡｄ−ｅａｓｙベクター構築キットのポリリンカー部位へのＮｏｔ１−Ｎｏｔ１  ｃＤＮＡインサートのクローン化によって構築した。例えば、Ｈｅｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０４（１）：１４９−１５８（２００４）を参照のこと。
【０２４２】
ＡＮＧＰＴＬ４の発現を、抗ＦＬＡＧ抗体を使用したウェスタンブロッティング分析によって検証した。製造者の説明書にしたがって、１つの強く発現するクローンを選択し、力価を増幅した。ウイルス調製物を、ＣｓＣｌ遠心分離によって精製し、ＰＣＲによって復帰変異体について試験した。製造者の説明書にしたがって、ウイルス力価を、９６ウェル細胞溶解実験によって決定した。これらのベクターを、提供されたｐＳｈｕｔｔｌｅＣＭＶ−ｌａｃＺと共に、Ｅ１およびＥ３領域が欠失したＡｄ５ゲノムを含むＡｄＥａｓｙベクターを含むＢＪ５１８３エレクトロコンピテント細菌中で組み換えた。初代ウイルスストックを、宿主ＨＥＫ２９３細胞への組換えＡｄＥａｓｙプラスミドの一過性トランスフェクションによって調製した。アデノウイルスストックを、ＨＥＫ２９３細胞中でさらに増幅し、製造者が記載のように、ＣｓＣｌ勾配精製法を使用して精製した。アデノウイルス作用力価（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｔｉｔｅｒ）を、Ｅｌｉｓａアッセイによって得た。
【０２４３】
ｍＡＮＧＰＴＬ４の生成。２９３細胞を、全長ｍＡＮＧＰＴＬ４（１〜４１０）をコードする核酸を含む構築物で一過性にトランスフェクトした。ｍＡＮＧＰＴＬ４を上清から精製し、実験に使用した。
【０２４４】
インビトロでの腫瘍細胞増殖。ＡＮＧＰＴＬ４は、インビトロで、ヒトＡ６７３横紋筋肉腫腫瘍細胞（ＨＴＢ  １５９８）の増殖を刺激した。図４のパネルＡを参照のこと。以前に記載のように、Ａｄ−Ａｎｇｐｔｌ４、Ａｄ−ＬａｃＺ、Ａｄ−Ａｎｇｐｔｌ１３のアデノウイルス構築物を生成した（Ｈｅｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０４（１）：１４９−１５８（２００４））。Ａ６７３細胞を、感染多重度（ＭＯＩ）１００にて、アデノウイルス−ＡＮＧＰＴＬ４構築物（Ａｄ−Ａｎｇｐｔｌ４）、コントロールとしてのアデノウイルス−ＬａｃＺ構築物（Ａｄ−ＬａｃＺ）、またはアデノウイルス−ＡＮＧＰＴＬ３構築物（Ａｄ−Ａｎｇｐｔｌ３）を含むいずれかの構築物で形質導入した。５％ＦＣＳ高グルコースＤＭＥＭ中でのＡ６７３細胞の３日間の増殖後、細胞を計数した。図４のパネルＡに示すように、Ａｄ−Ａｎｇｐｔｌ４は腫瘍細胞増殖を刺激した。Ａｄ−ＬａｃＺコントロールと比較して、Ａｄ−Ａｎｇｐｔｌ４で処置した細胞において、約２倍を超える細胞数の増加が認められた。Ａｄ−Ａｎｇｐｔｌ４はまた、コントロールと比較して、ＭＣＦ７細胞（ヒト乳腺腫）の増殖を約３倍、ＴＫ１０細胞（腎細胞癌株）の増殖を約２倍、Ａ５４９細胞（ヒト肺癌）の増殖を約１．５倍に刺激した。Ａｄ−Ａｎｇｐｔｌ４はまた、Ｕ８７ＭＧ細胞の増殖を刺激した。細胞（Ａ６７３、Ｕ８７ＭＧ、４Ｔ−１、またはＣａｋｉ）を、感染多重度（ＭＯＩ）５００にて、アデノウイルス−ＡＮＧＰＴＬ４構築物（Ａｄ−Ａｎｇｐｔｌ４（２））、コントロールとしてのアデノウイルス−ＬａｃＺ構築物（Ａｄ−ＬａｃＺ（１））、またはアデノウイルスＡＮＧＰＴＬ４−ＳｉＲＮＡ構築物（３）を含むいずれかの構築物で形質導入した図４のパネルＢを参照のこと。５％ＦＣＳ高グルコースＤＭＥＭ中での細胞の２〜３日間の増殖後、細胞を計数した。
【０２４５】
ＡＮＧＰＴＬ４で形質導入したＣＯＳ細胞由来の馴化培地もＡ６７３細胞の増殖を誘導した。図４のパネルＣを参照のこと。アデノウイルス構築物（Ａｄ−Ａｎｇｐｔｌ４（２）、Ａｄ−ＬａｃＺ（１）、またはＡｄ−Ａｎｇｐｔｌ３（３））で形質導入した肝細胞（Ｈｅｐａ）（Ａ）、ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）細胞（Ｂ）、またはＣＯＳ７（Ｃ）由来の馴化培地を、Ａ６７３細胞に添加した。５％ＦＣＳ高グルコースＤＭＥＭ中でのＡ６７３細胞の４日間の増殖後、細胞を計数した。図４のパネルＣに示すように、ＣＯＳ細胞＋Ａｄ−Ａｎｇｐｔｌ４由来の上清は、コントロールおよび使用した他の細胞型（肝細胞およびＨＭＶＥＣ細胞）由来の上清と比較して、腫瘍細胞増殖を刺激した。
【０２４６】
培養皿にコーティングした場合のＡｎｇｐｔｌ４活性。Ａｎｇｐｔｌ４によるＡ６７３細胞の増殖も、培養皿へのタンパク質のコーティングによって試験した。プレートを、種々の濃度で（例えば、コーティングなし、０．３μｇ／ｍｌ、３．０μｇ／ｍｌ、または３０μｇ／ｍｌ）、マウスＡｎｇｐｔｌ４、ＬＺ−ｈＡＮｇｐｔｌ４、フィブロネクチン、ＮＬ４（コントロールタンパク質）、ＩｇＧ−ｈＡｎｇｐｔｌ４（１８４〜４０６）、ｍＡｎｇｐｔｌ３、ｈＡｎｇｐｔｌ３、ｍＡｎｇｐｔｌ４（２３〜４１０）、Ｌｚ−ｈＡｎｇｐｔｌ４（１８４〜４０６）、Ｆｃ−ｈＡｎｇｐｔｌ４（１８４〜４０６）、またはＢＳＡでコーティングした。９６ウェル平底プレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、４℃で一晩コーティングした。ヒトＡ６７３腫瘍細胞を採取し、５％ＦＣＳを含むＨＧ−ＤＭＥＭ培地中で１０５細胞／ｍｌに希釈した。２００μｌの細胞懸濁液（１０４細胞／ウェル）を、コーティングしたウェルに添加し、プレートを、３７℃で選択された期間インキュベートした。非接着細胞をＰＢＳ洗浄によって除去し、クリスタルバイオレットまたはＬａｎｄｅｇｒｅｎのＰＮＡＳ法を使用して細胞付着を測定した。Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕ．（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６７：３７９−３８８を参照のこと。結果を、３連のウェルの平均ＯＤ５５０値またはＯＤ４０５値で示す。
【０２４７】
同様に、ヒト臍帯またはヒト腎臓（Ｃａｍｂｒｅｘ）のいずれかから単離したヒト初代臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の上皮細胞（ｅｐｉ）およびメサンギウム細胞（ｍｅｓａ）を採取し、同一条件の使用によって試験した。増殖アッセイのために、製造者（Ｃａｍｂｒｅｘ）によって各細胞型のために供給された培地を使用した。ＡＮＧＰＴＬ４は、腎臓上皮細胞、腎臓メサンギウム細胞、またはヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖を誘導しないようであるが、Ａ６７３の増殖を誘導しなかった（図５）。
【０２４８】
Ａ６７３細胞へのＡＮＧＰＴＬ４結合のＦＡＣＳ分析。ヒトＡ６７３細胞へのＡＮＧＰＴＬ４の結合を、ＦＡＣＳ分析によって試験した。Ａ６７３細胞を、１０ｃｍ培養皿に５００，０００〜１×１０６細胞／サンプルウェルでプレートした。ＦＡＣＳの前日に、細胞を分割した。細胞を、ＰＢＳで１回洗浄し、１０ｍｌの２０ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳを添加し、１０〜２０分間インキュベートした。２０分後、プレートから細胞を擦り取った。１０ｍｌの５％ＦＣＳを含むＰＢＳを添加し、細胞を、５０ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎチューブに移した。細胞を、１．８Ｋｒｐｍにて４℃で５分間スピンした。上清を除去し、細胞を、１ｍｌの５％ＦＣＳを含むＰＢＳに再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液を、１μｇのタンパク質を含む５ｍｌ  ＦＡＣＳチューブに分布させ、氷上で３０分以上インキュベートした。以下のタンパク質を使用した：ｍＡｎｇｐｔｌ４（２３〜４１０）、ＰＵＲ  ９４５２、０．４２８ｍｇ／ｍｌ（２μｌ／サンプル）；ｈＡｎｇｐｔｌ４（２３〜４０６）、ＰＵＲ  ９３８４、＋／−９０μｇ／ｍｌ（１０μｌ／サンプル）；ｈＡｎｇｐｔｌ４（１８４〜４０６）−ＩｇＧ、ＰＵＲ  ９４４１、１．５ｍｇ／ｍｌ（１μｌ／サンプル）；およびコントロールＦＬＡＧ−ＢＡＰ（Ｓｉｇｍａ）０．１ｍｇ／ｍｌ（２μｌ／サンプル）。インキュベーション後、チューブを、氷上５ｍｌの５％ＦＣＳを含むＰＢＳで満たした。細胞を、２Ｋｒｐｍで５分間スピンした。上清を除去した。抗ＦＬＡＧ−ＦＩＴＣ抗体（Ｓｉｇｍａ）を添加し（２μｌの抗体（１００μｇ／ｍｌストック））、氷上で５分以上インキュベートした。最終抗体濃度は、１μｇ／ｍｌであった。５ｍｌの５％ＦＣＳを含むＰＢＳを添加し、細胞を１．８Ｋｒｐｍにて４℃で５分間スピンした。上清を除去し、細胞を、氷上で５％ＦＣＳを含む０．２５ｍｌ  ＰＢＳ中に再懸濁した。受容体内在化を防止するための０．０５％アジ化ナトリウムも存在させることができる。サンプルあたり１μｌの５０倍希釈したヨウ化プロピジウム（ＰＩ）のストックを添加することができる。次いで、細胞を、ＦＡＣＳに供した。種々の条件下で（図６のパネルＢ）（酸素正常状態、低酸素状態（０％Ｏ２で２４時間）、またはＰＭＡ（２００ｎＭで２４時間））種々のＡＮＧＰＴＬ４形態（ヒトおよびマウスＡＮＧＰＴＬ４）がＡ６７３細胞（図６のパネルＡ）に結合した。低酸素状態試験のために、細胞を、５％ＣＯ２にて３７℃で２４時間インキュベートし、９５％Ｎ２で２４時間インキュベートした。あるいは、細胞を、３７℃のインキュベーター中にて２００ｎＭホルボールエステル（ＰＭＡ）の存在下、５％ＣＯ２、および酸素正常状態で活性化した。
【０２４９】
ＡＮＧＰＴＬ４を発現する細胞由来の馴化培地。Ａｎｇｐｔｌ４を発現する細胞由来の馴化培地を使用するか組換えＡｎｇｐｔｌ４を添加した場合のＡ６７３細胞の増殖を試験した。アデノウイルス構築物（Ａｄ−Ａｎｇｐｔｌ４（２）、Ａｄ−ＬａｃＺ（１）、またはＡｄ−ＬａｃＺ＋ｒｍＡｎｇｐｔｌ４（２３〜４１０）（３）（５μｇ／ｍｌ））で形質導入したＣＯＳ７由来の５００μｌの馴化培地（上清）を、Ａ６７３細胞に添加した。５％ＦＣＳ高グルコースＤＭＥＭを含む培地中で７日間細胞を増殖させた後（図７のパネルＡ）、細胞を計数した。５％ＦＣＳを含む培地への組換えＡｎｇｐｔｌ４の添加および４日間の細胞の増殖によってもＡ６７３増殖を試験した。添加せず（１）、緩衝液コントロール（２）、ｍＡｎｇｐｔｌ４（２３〜４１０）（２．５μｇ／ｍｌ）（３）、ｈＡｎｇｐｔｌ４（２３〜４０６）（２．５μｇ／ｍｌ）（４）、ｈＩｇＧ−ｈＡｎｇｐｔｌ４（１８４〜４０６）（２．５μｇ／ｍｌ）（５）、またはｈＩｇＧ−ｍＡｎｇｐｔｌ４（１８４〜４１０）（２．５μｇ／ｍｌ）（６）のいずれかを、示した濃度で培地に添加した。５％ＦＣＳ高グルコースＤＭＥＭを含む培地中で４日間細胞を増殖させた後（図７のパネルＢ）、細胞を計数した。培地に添加したＡＮＧＰＴＬ４または組換えタンパク質を発現する細胞由来の馴化培地によるＡ６７３細胞の増殖は、細胞密度に依存し得る。図７のパネルＡ（示した条件下で７日間増殖させた場合の細胞増殖）およびパネルＢ（示した条件下で４日間増殖させた場合の細胞増殖）を参照のこと。
【０２５０】
Ａｎｇｐｔｌ４は細胞移動を誘導する。本発明者らは、Ａｎｇｐｔｌ４がマウス４Ｔ−１腫瘍細胞の細胞移動を誘導する能力を試験した。細胞運動性を、孔サイズ３μｍのＨＴＳマルチウェル組織培養インサート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＮＪ）を使用して、記載のように測定した（例えば、Ｃａｍｅｎｉｓｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７（１９）：１７２８１−１７２９０（２００２）を参照のこと）。ｈＡＮＧＰＴＬ４（１〜４０６）を、５０／５０／０．１％ＢＳＡで５、１、および０．２μｇ／ｍｌに希釈した。正のコントロールとして、膜を、培地または０．１μｇ／ｍｌの組換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）とインキュベートした。５０／５０／０．１％ＢＳＡを、負のコントロールとして使用した。マウス４Ｔ１腫瘍を、ＰＢＳで３回洗浄し、採取し、約１０５細胞／ｍｌを含む５０／５０／０．１％ＢＳＡ中に再懸濁した。ｍＡＮＧＰＴＬ４をＮＬ２と示す以下の細胞調製物を試験した。
【０２５１】
【表３】
2008507536.tif 000004
調製物を下の室に添加し、調製物を３７℃で１９時間インキュベートした。
【０２５２】
細胞懸濁液（２５０μｌ）を下の室に添加し、細胞を、３７℃で一晩５％ＣＯ２加湿インキュベーター中に移動させた。インキュベーション後、上および下の室から培地を吸引し、より下の膜表面に移動した細胞を、メタノールで固定し（４００μｌのＭｅＯＨにて４℃で３０分間固定し、ＭｅＯＨを除去し、４０分間風乾する）、ヨウ化ＹＯ−ＰＲＯ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ＯＲ）（４００μｌのヨウ化ＹＯ−ＰＲＯ−１（１０μｍ）（１ｍＭストックの１００倍希釈物））で染色した。移動の結果を、Ｏｐｅｎｌａｂソフトウェア（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ，ＭＡ）を使用した２０倍での顕微鏡視野あたりの平均細胞数として定量する。
【０２５３】
別の実験では、Ａｎｇｐｔｌ４は、４Ｔ−１腫瘍細胞の移動に伴ってＡ６７３細胞の移動を誘導することが見出された。ｍＡＮＧＰＴＬ４を、５０／５０／０．１％ＢＳＡで６、１．５、および０．３７５μｇ／ｍｌに希釈した。正のコントロールとして、膜を、培地または０．１μｇ／ｍｌの組換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）とインキュベートした。５０／５０／０．１％ＢＳＡを、負のコントロールとして使用した。４Ｔ−１およびＡ６７３細胞を採取し、５０／５０／０．１％ＢＳＡに再懸濁した（２×１０５細胞／ｍｌ）。ｍＡＮＧＰＴＬ４をＮＬ２と示す以下の細胞調製物を試験した。
【０２５４】
【表４】
2008507536.tif 000005
調製物を７５０μｌの下の室に添加し、調製物を３７℃で１９時間インキュベートした。
【０２５５】
細胞懸濁液（２５０μｌ）（５×１０４）を下の室に添加し、細胞を、３７℃で７時間５％ＣＯ２加湿インキュベーター中に移動させた。インキュベーション後、上および下の室から培地を吸引し、より下の膜表面に移動した細胞を、メタノールで固定し（４００μｌのＭｅＯＨにて４℃で３０分間固定し、ＭｅＯＨを除去し、４０分間風乾する）、ヨウ化ＹＯ−ＰＲＯ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ＯＲ）（４００μｌのヨウ化ＹＯ−ＰＲＯ−１（１０μｍ）（１ｍＭストックの１００倍希釈物））で染色した。移動の結果を、Ｏｐｅｎｌａｂソフトウェア（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ，ＭＡ）を使用した２０倍での顕微鏡視野あたりの平均細胞数として定量する。（１）血清を添加せず、（２）１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加し、（３）ＰＤＧＦ−ＢＢを添加し、（４）ＡＮＧＰＴＬ４を添加した図９を参照のこと。ＡＮＧＰＴＬ４および１０％ＦＣＳの両方を使用して、Ａ６７３細胞および４Ｔ−１細胞が移動した。したがって、Ａｎｇｐｔｌ４に対するアンタゴニストを使用して、例えば、１つの理論に拘束されないが、腫瘍細胞の移動の防止によって転移を阻害することができる。
【０２５６】
ＡＮＧＰＴＬ４はインビボで腫瘍サイズを増加させる。ヒトＡ６７３横紋筋肉腫細胞（ＨＴＢ  １５９８）を、以前に記載のように培養した（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：８４１−８４４（１９９３）；およびＧｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６０：６２５３−６２５８（２０００））。５×１０６個のＡ６７３細胞を含む０．１ｍｌのＭａｔｒｉｇｅｌを、ベージュヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）の背側の側腹部に皮下注射して異種移植片を確立させた。アデノウイルス構築物を、７日毎に（１、７、および１４日目に）１×１０８プラーク形成単位（ＰＦＵ）で腫瘍内に（ＩＴ）注射した。２８ゲージの針および０．５ｍｌのツベルクリンシリンジを使用して、腫瘍塊の側面および底面に直接注射した。アデノウイルス構築物は、アデノウイルス−ＡＮＧＰＴＬ４構築物（Ａｄ−Ａｎｇｐｔｌ４）、コントロールとしてのアデノウイルス−ＬａｃＺ構築物（Ａｄ−ＬａｃＺ）、またはアデノウイルス−ＡＮＧＰＴＬ３構築物（Ａｄ−Ａｎｇｐｔｌ３）であった。腫瘍移植から種々の日数で腫瘍サイズを決定した。２日毎に腫瘍サイズを測定し、楕円体積の式（π／６×Ｌ×Ｗ×Ｈ（式中、Ｌ＝長さ、Ｗ＝幅、Ｈ＝高さ）；Ｔｏｍａｙｋｏ  ＆  Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２４：１４８−１５４（１９８９））を使用して腫瘍体積を計算した。図８に示すように、腫瘍サイズ（パネルＡ）および重量（パネルＢ）は、Ａｄ−ＬａｃＺまたはＡｄ−Ａｎｇｐｔｌ３構築物と比較して、Ａ６７３細胞およびアデノウイルス−ＡＮＧＰＴＬ４構築物（Ａｄ−Ａｎｇｐｔｌ４）を注射したマウスで統計的に増加した（Ｐ＜０．０００１）。
【０２５７】
実施例２：ＡＮＧＰＴＬ４で処置した腫瘍の抗ＶＥＧＦ治療から回避する傾向
ＡＮＧＰＴＬ４は、抗血管形成薬（例えば、抗ＶＥＧＦ）（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）など）で処置した腫瘍における腫瘍細胞増殖を刺激した。図８のパネルＣを参照のこと。ヒトＡ６７３横紋筋肉腫細胞（ＨＴＢ  １５９８）を、以前に記載のように培養した（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：８４１−８４４（１９９３）；およびＧｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６０：６２５３−６２５８（２０００））。５×１０６個のＡ６７３細胞を含む０．１ｍｌのＭａｔｒｉｇｅｌを、ベージュヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）の背側の側腹部に皮下注射して異種移植片を確立させた。アデノウイルス構築物を、７日毎に（１、７、１４、２１、２８日目に）１×１０８プラーク形成単位（ＰＦＵ）で腫瘍内に（ＩＴ）注射した。アデノウイルス構築物は、アデノウイルス−ＡＮＧＰＴＬ４構築物（Ａｄ−Ａｎｇｐｔｌ４）、コントロールとしてのアデノウイルス−ＬａｃＺ構築物（Ａｄ−ＬａｃＺ）、またはアデノウイルス−ＡＮＧＰＴＬ３構築物（Ａｄ−Ａｎｇｐｔｌ３）であった。マウスにＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を、５ｍｇ／ｋｇの用量で１週間に２回腹腔内を処置した。２８ゲージの針および０．５ｍｌのツベルクリンシリンジを使用して、腫瘍塊の側面および底面に直接注射した。２日毎に腫瘍サイズを測定し、楕円体積の式（π／６×Ｌ×Ｗ×Ｈ（式中、Ｌ＝長さ、Ｗ＝幅、Ｈ＝高さ）；Ｔｏｍａｙｋｏ  ＆  Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２４：１４８−１５４（１９８９））を使用して腫瘍体積を計算した。図８のパネルＣに示すように、腫瘍サイズは、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）治療と組み合わせたＡｄ−ＬａｃＺまたはＡｄ−Ａｎｇｐｔｌ３構築物を含む細胞を注射したマウスと比較して、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）で処置したにもかかわらず、Ａ６７３細胞およびアデノウイルス−ＡＮＧＰＴＬ４構築物（Ａｄ−Ａｎｇｐｔｌ４）を注射したマウスで増加した。
【０２５８】
実施例３：ＡＮＧＰＴＬ４に結合する抗体は、腫瘍細胞増殖を阻害する
抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体がＡＮＧＰＴＬ４の生物活性（例えば、腫瘍細胞の増殖）を阻害する能力を試験した。１×１０４腫瘍細胞（例えば、ＨｅＬａ−Ｓ３、Ｃａｋｉ、Ｕ８７ＭＧ、２９３、Ａ６７３、ＨＭ７、およびＣａｌｕ６）／ウェルを、１０％ＦＣＳを含む培地中の１２ウェルプレートにプレートした。細胞を、５％ＣＯ２加湿インキュベーター中にて３７℃で一晩インキュベートした。培地を、５％ＦＣＳと交換し（１０％ＦＣＳを含むＣａｌｕ６細胞以外）、１、２．５、５、または１０μｇ／ｍｌの抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体または抗Ｄｓｃｒをウェルに添加するか、抗体を添加しなかった。プレートを、３７℃の５％ＣＯ２加湿インキュベーター中に入れた。抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体の添加から２または３日後に細胞を計数した。抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体は、ＨｅＬａ−Ｓ３、Ｃａｋｉ  Ｕ８７ＭＧ、２９３、Ａ６７３、およびＣａｌｕ  ６の細胞成長を阻害したが、ＨＭ７細胞は阻害されなかった。図１０のパネルＡおよびＢを参照のと。
【０２５９】
実施例４：ＡＮＧＰＴＬ４に結合する抗体の調製
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の産生技術は、当該分野で公知であり、本明細書中に記載されている。使用することができる抗原（または免疫原）には、本発明の精製タンパク質、タンパク質フラグメント、このようなタンパク質を含む融合タンパク質、ならびに細胞表面上に組換えタンパク質および／またはタンパク質フラグメントを発現する細胞が含まれる。当業者は、過度に実験することなく、抗原を選択することができる。
【０２６０】
Ｂａｌｂ／ｃなどのマウスを、フロイント完全アジュバント中に乳化した抗原で免疫化し、約１〜１００マイクログラムの量で皮下または腹腔内に注射した。あるいは、抗原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）中に乳化し、動物の後足の足蹠に注射した。次いで、免疫化マウスを、１０〜１２日後に、選択したアジュバント中で乳化したさらなる抗原で追加免疫する。その後、数週間、マウスを、さらなる免疫化注射で追加免疫することもできる。抗体を検出するためのＥＬＩＳＡアッセイ試験のための血清サンプルを、眼窩後出血によってマウスから定期的に得ることができる。
【０２６１】
適切な抗体力価を検出した後、抗体に対して「陽性の」動物に、所与のリガンドの最終静脈内注射を用いて注射することができる。３〜４日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を採取する。次いで、脾臓細胞を、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ  １５９７から利用可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１などの選択されたマウス骨髄腫細胞株に融合する（３５％ポリエチレングリコールを使用する）。融合物はハイブリドーマ細胞を生成し、その後に、非融合細胞、骨髄腫細胞、および脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するためのＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートにプレートすることができる。
【０２６２】
ハイブリドーマ細胞を、抗原に対する反応性についてＥＬＩＳＡでスクリーニングする。ＡＮＧＰＴＬ４に対して所望のモノクローナル抗体を分泌する「陽性」ハイブリドーマ細胞の決定は、当業者の範囲内である。
【０２６３】
陽性ハイブリドーマを同系Ｂａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射して、抗ＡＮＧＰＴＬ４モノクローナル抗体を含む腹水を産生することができる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコまたはローラーボトル中で増殖させることができる。腹水中に産生されたモノクローナル抗体を、硫酸アンモニウム沈殿、その後のゲル排除クロマトグラフィによって精製することができる。あるいは、プロテインＡまたはプロテインＧへの抗体の結合に基づいたアフィニティクロマトグラフィを使用することができる。
【０２６４】
例えば、ウサギポリクローナル抗体を、１、４０、および７０日目に大腸菌で生成された５００μｇの組換えヒトＡＮＧＰＴＬ４タンパク質（２３〜４０６）でのウサギの免疫化によって生成した。免疫化から８０日後および１２０日後に血清を採取し、プロテインＡ  ｓｅｐｈａｄｅｘカラムによって抗体を精製した。
【０２６５】
実施例５：遮断抗体または中和抗体
本明細書中に記載の抗体を、当該分野で公知の種々の技術（例えば、ＥＬＩＳＡ）によって同定することができる。例えば、プレートを、目的のポリペプチド（例えば、ＡＮＧＰＴＬ４またはそのフラグメント）でコーティングし、このポリペプチド（例えば、ＡＮＧＰＴＬ４）に対して生成された抗体とインキュベートした（例えば、米国特許第６，３４８，３５０号、同第６，３７２，４９１号、および同第６，４５５，４９６号の説明を参照のこと）。結合した抗体を、種々の方法によって検出することができる。
【０２６６】
アンタゴニスト（例えば、遮断または中和）抗体を、競合アッセイおよび／または活性アッセイによって同定することができる。例えば、ＡＮＧＰＴＬ４の発現は、腫瘍細胞の増殖、移動、接着、またはαＶβ５への結合を刺激する。ＡＮＧＰＴＬ４に対する遮断抗体または中和抗体の決定を、抗体が腫瘍細胞の増殖（例えば、図１０のパネルＡおよびＢを参照のこと）、移動、接着（例えば、図１２を参照のこと）、またはαＶβ５への結合（ＵＳＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ，３７Ｋ，Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）（例えば、図１３のパネルＢおよびＣを参照のこと）を遮断する能力によって示すことができる。例えば、Ａ６７３横紋筋肉腫細胞をプレートし、抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体、コントロール抗体、またはＰＢＳと共にＡｄ−ｈＡｎｇｐｔｌ４で形質導入されたＣＯＳ７細胞由来の上清とインキュベートした。７日後細胞を、トリプシン処理し、計数することができる。細胞数を減少させる抗体を、遮断抗体または中和抗体と定義する。ＡＮＧＰＴＬ４はまた、腫瘍細胞の細胞移動を誘導し、血管形成促進因子であることが示されていた。例えば、Ｌｅ  Ｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１６４（５）：１５２１−１５２８（２００３）を参照のこと。したがって、ＡＮＧＰＴＬ４に対する中和抗体を、腫瘍細胞移動アッセイおよび／または血管形成アッセイ（例えば、ＣＡＭアッセイ）においてＡＮＧＰＴＬ４と組み合わせて抗体を使用することによって同定することができる。
【０２６７】
腫瘍成長の遮断もしくは減少または癌細胞増殖の遮断または減少で使用することができるＡＮＧＰＴＬ４に対する遮断抗体および中和抗体を、上記の培養および／またはベージュ／ヌードマウス研究における腫瘍細胞の使用によって同定することができる。例えば、ヌードマウスに腫瘍細胞を注射することができる。腫瘍細胞が確立された種々の期間に、マウスに、種々の用量の遮断または中和ＡＮＧＰＴＬ４抗体、抗体コントロール、またはＰＢＳを１週間に１回または２回腹腔内に注射することができる。腫瘍サイズを毎週測定することができ、研究終了時に、腫瘍を切り出して秤量することができる。マウス内の腫瘍成長を遮断するかまたは減少させる遮断または中和ＡＮＧＰＴＬ４抗体を同定する。
【０２６８】
腫瘍成長を遮断するかまたは減少させるか、癌細胞増殖を遮断するかまたは減少させるＡＮＧＰＴＬ４抗体と抗血管形成薬との組み合わせを、上記の培養および／またはベージュ／ヌードマウス研究における腫瘍細胞の使用によって同定することができる。上記のように、ヌードマウスに腫瘍細胞を注射することができる。腫瘍細胞が確立された種々の期間に、マウスに、種々の用量のＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストと抗癌薬（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体などの抗血管形成薬）との組み合わせ、またはＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニスト、抗癌薬、抗体コントロール、もしくはＰＢＳを１週間に１回または２回腹腔内に注射することができる。腫瘍サイズを毎週測定することができ、研究終了時に、腫瘍を切り出して秤量することができる。コントロールまたは単剤のみと比較して、マウス内の腫瘍成長を遮断するかまたは減少させるか、腫瘍成長の遮断または減少を増強するＡＮＧＰＴＬ４抗体と抗癌薬との併用療法を同定する。
【０２６９】
実施例６：ＡＮＧＰＴＬ４改変体
製造者のプロトコールにしたがって標準的な変異誘発キット（例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬ部位特異的変異誘発キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））を使用して、変異ＡＮＧＰＴＬ４を作製した。２つのアミノ酸配列ヒトＡＮＧＰＴＬ４配列中の２つのアミノ酸を置換した（例えば、図２を参照のこと）。１６２位および１６４位を置換し（Ｒ１６２ＧおよびＲ１６４Ｅ）、ＲＫＲがＧＫＥに変化した。ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質（Ｌ２８０プラスミド、ａａ１〜４０６）または変異ＡＮＧＰＴＬ４を、一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の上清から単離した。精製するために、上清をニッケルカラムにロードした。抗ＦＬＡＧ−ＨＲＰ抗体を使用したウェスタンブロットによってタンパク質を検出した。図３のパネルＢを参照のこと。置換して変異ＡＮＧＰＴＬ４を未変性または野生型ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質と比較した場合、変異ＡＮＧＰＴＬ４は、ウェスタンブロッティングによって未変性のＡＮＧＰＴＬ４よりも分子量が高いことが見出された。未変性タンパク質の１６２位および１６４位でのＲＫＲからＧＫＥへの置換により、ＡＮＧＰＴＬ４のタンパク質分解が防止された。
【０２７０】
実施例７：ＡＮＧＰＴＬ４はαＶβ５インテグリンに結合する
アンジオポエチンは、そのフィブリノーゲン（ＦＢＮ）様ドメインを介した内皮細胞特異性チロシンキナーゼ受容体Ｔｉｅ２への結合によって血管形成を調節する分泌性因子である。分泌性リガンドファミリー中に存在するコイルドコイルドメインは、リガンドオリゴマー形成に必要であることが見出された（例えば、Ｐｒｏｃｏｐｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：３０１９６−２０１（１９９９）を参照のこと）。
【０２７１】
アンジオポエチンと同様に、ＡＮＧＰＴＬ３およびＡＮＧＰＴＬ４は分泌性糖タンパク質であり、それぞれ、Ｎ末端シグナルペプチド、その後のコイルドコイルドメイン、およびＣ末端ＦＢＮ様ドメインからなる。ＡＮＧＰＴＬ３はＦＢＮ様ドメインを介してαＶβ３に結合すると確定した。本発明者らは、ＡＮＧＰＴＬ４はαＶβ５に結合すると確定した。αＶβ５インテグリンで安定にトランスフェクトされた２９３〜１９５３細胞株を、ＡＮＧＰＴＬ４コーティングプレートへの結合能力または接着能力について試験した。細胞を採取し、ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、および１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む無血清培地にて１０５細胞／ｍｌに希釈した。細胞を、抗インテグリンαＶβ５抗体（ＭＡＢ１９６１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ））またはペプチドを含めるか含めずに３７℃で１５分間プレインキュベートした。組換えｍＡＮＧＰＴＬ４、ＢＳＡ、またはビトロネクチン（１μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、または３０μｇ／ｍｌ）を、Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ９６ウェル平底マイクロタイタープレート上に４℃で一晩コーティングし、２００μｌの３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）にて３７℃で１．５時間ブロッキングした。細胞懸濁液（５×１０４細胞／１００μｌ／ウェル（５×１０５／ｍｌ））を、コーティングしたウェルに添加し、プレートを３７℃で５．５時間インキュベートした。非接着細胞を、ＰＢＳ洗浄によって除去し、細胞付着を、２００μｌのＣｙＱｕａｎｔ  ＧＤ  Ｄｙｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））（１：４００）／細胞溶解緩衝液の添加によって測定し、２〜５分間インキュベートした。４８０ｎｍの励起および５２０ｎｍの放射極大を使用してサンプルの蛍光を測定した。ＬａｎｄｅｇｒｅｎのＰＮＡＧ法を使用することもできる（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６７：３７９−３８８（１９８４）を参照のこと）。αＶβ５を発現する細胞は、ＢＳＡ（負のコントロール）と比較して、ＡＮＧＰＴＬ４およびビトロネクチン（ＵＳＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）（正のコントロール）への接着を示した。図１１を参照のこと。
【０２７２】
αＶβ５インテグリンがＡＮＧＰＴＬ４細胞接着を媒介するのに十分であるかどうかを決定するために、遮断抗体を、細胞接着アッセイにおけるその接着阻害能力について試験した。機能的遮断抗体（抗αＶβ５抗体（ＭＡＢ１９６１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ））または抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体）を、２９３〜１９５３細胞に添加し、その後にタンパク質コーティングしたウェル（ＢＳＡ（１）、ビトロネクチン（２）、またはＡＮＧＰＴＬ４（３））とインキュベートした。図１２を参照のこと。抗αＶβ５および抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体により、ＡＮＧＰＴＬ４の細胞接着活性が破壊された。
【０２７３】
さらなる実験を行ってＡＮＧＰＴＬ４がαＶβ５に結合することを確認した。ＥＬＩＳＡ実験を行ってｍＡＮＧＰＴＬ４、ＩｇＧ−ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｎ末端（１〜１８３）、および／またはＩｇＧ−ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端（１８４〜４０６）がαＶβ５（ＵＳＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ，３７Ｋ，Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）コーティングプレートに結合するかどうかを検出した。１００μｌ／ウェルのコーティング緩衝液を含むインテグリンαＶβ５希釈剤（１μｇ／ｍｌコーティング緩衝液（５０ｍＭ炭酸塩／重炭酸塩、ｐＨ９．６））を、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄し、１００μｌ／ウェルの遮断緩衝液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．５％ＢＳＡ）を、穏やかに震盪しながら室温で１時間添加した。種々の量（０、０．０７０μｇ、０．２２μｇ、０．６６μｇ、２μｇ、または６μｇ）のサンプル、ｍＡＮＧＰＴＬ４、ＩｇＧ−ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｎ末端（１〜１８３）、および／またはＩｇＧ−ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端（１８４〜４０６）を、サンプル緩衝液（０．５％ＢＳＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５０μＭ  ＣａＣｌ２、５０μＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中で調製し、３０分間インキュベートした。サンプルをプレートに添加し（１００μｌ／ウェル、上記でインキュベートした量）、穏やかに震盪しながら室温で２時間インキュベートした。プレートを緩衝液で洗浄し、１００μｌ／ウェル抗Ｆｌａｇ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（１００ｎｇ／ｍｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ，#１０９−０３６−０９８）を含むアッセイ緩衝液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を添加し、穏やかに震盪しながら室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄した。１００μｌ／ウェルのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｍｏｓｓ，Ｉｎｃ．）を添加し、室温で良好に発色するまでプレート中でインキュベートした。１００μｌ／ウェルの停止液（１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４）を添加して、反応を停止させた。プレートを、６３０ｎｍで読み取った。ｍＡＮＧＰＴＬ４、ＩｇＧ−ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｎ末端、およびＩｇＧ−ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端はαＶβ５コーティングプレートに結合したが、ＩｇＧ−ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端がプレートにわずかにより結合した。図１３のパネルＡを参照のこと。
【０２７４】
抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体は、αＶβ５コーティングプレートへのＡＮＧＰＴＬ４の結合を阻害する。ＥＬＩＳＡ実験を行った。１００μｌ／ウェルのコーティング緩衝液を含むインテグリンαＶβ５希釈剤（１μｇ／ｍｌコーティング緩衝液（５０ｍＭ炭酸塩／重炭酸塩、ｐＨ９．６））を、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄し、１００μｌ／ウェルの遮断緩衝液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．５％ＢＳＡ）を、穏やかに震盪しながら室温で１時間添加した。０．６μｇ〜６．０μｇのサンプル、ｍＡＮＧＰＴＬ４、ＩｇＧ−ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｎ末端（１〜１８３）、および／またはＩｇＧ−ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端（１８４〜４０６）を、サンプル緩衝液（０．５％ＢＳＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５０μＭ  ＣａＣｌ２、５０μＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中で抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体（１．５μｇ）または抗Ｄｓｃｒ（１．５μｇ）と３０分間インキュベートした。インキュベーション後、１００μｌ／ウェルのサンプル＋／−抗体をプレートと穏やかに震盪しながら室温で２時間インキュベートした。プレートを緩衝液で洗浄し、１００μｌ／ウェル抗Ｆｌａｇ−ＨＲＰ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含むアッセイ緩衝液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を添加し、穏やかに震盪しながら室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１００μｌ／ウェルのＴＭＢを添加し、室温で良好に発色するまでプレート中でインキュベートした。１００μｌ／ウェルの停止液（１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４）を添加して、反応を停止させた。プレートを、６３０ｎｍで読み取った。抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体は、抗Ｄｓｃｒ抗体、５Ｇ７モノクローナル抗体、または培地と比較して、αＶβ５コーティングプレートに結合するｍＡＮＧＰＴＬ４、ＩｇＧ−ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｎ末端、およびＩｇＧ−ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端の量を減少させた。図１３のパネルＢを参照のこと。
【０２７５】
別の実験では、ＡＮＧＰＴＬ４およびインテグリンαＶβ５の結合を、ＥＬＩＳＡによって示した。この実験では、８０μｌ／ウェルのｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端、ビトロネクチン、またはＢＳＡ（５μｇ／ｍｌ）を、コーティング緩衝液（５０ｍＭ炭酸塩／重炭酸塩、ｐＨ９．６））中のプレートに添加し、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄し（洗浄緩衝液：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）、１００μｌ／ウェルのいずれかの培地を有する遮断緩衝液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．５％ＢＳＡ）、抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体（１５μｇ／１００μｌ）、または抗Ｄｓｃｒ抗体（１５μｇ／１００μｇ）を添加し、穏やかに震盪しながら室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、αＶβ５１００μｌ（３〜９μｇ／ｍｌ）を添加し、穏やかに震盪しながら室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１μｇ／ｍｌ（１０００倍）の抗αＶβ５抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）（５μｇ／１００μｌ）を、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中に添加し、穏やかに震盪しながら室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを洗浄し、１００μｌ／ウェルの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抗マウス（５０００倍）をアッセイ緩衝液に添加した。プレートを洗浄し、１００μｌ／ウェルのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加し、室温で良好に発色するまでプレート中でインキュベートした。１００μｌ／ウェルの１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４で反応を停止させ、プレートを、６３０ｎｍで読み取った。αＶβ５はＡＮＧＰＴＬ４（レーン１）およびビトロネクチン（レーン４）コーティングプレートに結合する。結合は、抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体（レーン２）で遮断されるが、コントロール抗体である抗Ｄｓｃｒを使用する場合（レーン３）またはコントロールタンパク質をプレート上にコーティングする場合（レーン５）、遮断されない。図１３のパネルＣを参照のこと。
【０２７６】
したがって、これらの所見は、組換えＡＮＧＰＴＬ４がαＶβ５インテグリンに特異的に結合することを証明する。
【０２７７】
明細書は、当業者が本発明を実施可能にするのに十分であると見なされる。本明細書中に記載の実施例および実施形態は例示のみを目的とすると理解される。寄託物が本発明の特定の態様の一例であることが意図され、機能的に等価な任意の構築物が本発明の範囲内に含まれるので、本発明は、寄託した構築物によってその範囲が制限されない。本明細書中の材料の寄託は、明細書が本発明の任意の態様（最良の形態が含まれる）を実施するのに不適切であることを認めず、示される特定の例に特許請求の範囲が制限されるとも解釈されない。実際、本明細書中に示し、且つ説明した事項に加えて、上記説明から本発明の種々の修正形態が当業者に明らかであり、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれる。本明細書中に引用された全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的のためにその全体が本明細書中で参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０２７８】
【図１Ａ】図１は、ヒトＡＮＧＰＴＬ４の核酸配列（配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１））を示す。
【図１Ｂ】図１は、ヒトＡＮＧＰＴＬ４の核酸配列（配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１））を示す。
【図２Ａ】図２は、ヒトＡＮＧＰＴＬ４のアミノ酸配列（配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．）２）を示す。
【図２Ｂ】図２は、ヒトＡＮＧＰＴＬ４のアミノ酸配列（配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．）２）を示す。
【図３Ａ】図３のパネルＡは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の存在下（１０ｍＭ）または非存在下でＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（４〜２０％）にて分離した精製組換えマウスＡＮＧＰＴＬ４（２３〜４１０）を示す。図３のパネルＢは、ＳＤＳゲルにて分離し、ウェスタンブロッティングによって検出された野生型（レーン１）および変異ｈＡＮＧＰＴＬ４（レーン２）を示し、変異ｈＡＮＧＰＴＬ４は、Ｒ１６２ＧおよびＲ１６４Ｅ置換を有する。
【図３Ｂ】図３のパネルＡは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の存在下（１０ｍＭ）または非存在下でＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（４〜２０％）にて分離した精製組換えマウスＡＮＧＰＴＬ４（２３〜４１０）を示す。図３のパネルＢは、ＳＤＳゲルにて分離し、ウェスタンブロッティングによって検出された野生型（レーン１）および変異ｈＡＮＧＰＴＬ４（レーン２）を示し、変異ｈＡＮＧＰＴＬ４は、Ｒ１６２ＧおよびＲ１６４Ｅ置換を有する。
【図４Ａ】図４のパネルＡ、Ｂ、およびＣは、ＡＮＧＰＴＬ４発現構築物での腫瘍細胞の形質導入およびＡＮＧＰＴＬ４発現構築物で形質導入されたＣＯＳ細胞（Ｃ）由来の馴化培地（２）によって、ＡＮＧＰＴＬ４がＡ６７３腫瘍細胞（パネルＡおよびＢ）およびＵ８７ＭＧ腫瘍細胞（パネルＢ）の増殖を刺激することを概略的に示す（パネルＣ）。パネルＢでは、腫瘍細胞を、（１）ＡｄＬａｃＺ発現構築物コントロール、（２）Ａｄ−ＡＮＧＰＴＬ４発現構築物、または（３）Ａｄ−ＳｉＲＮＡ  ＡＮＧＰＴＬ４構築物のいずれかで形質導入する。パネルＣでは、Ａ６７３腫瘍細胞を、（１）ＬａｃＺ発現構築物、（２）ＡＮＧＰＴＬ４発現構築物、または（３）ＡＮＧＰＴＬ３発現構築物のいずれかで形質導入されたＨｅｐａ（Ａ）、ＨＭＶＥＣ（Ｂ）、またはＣＯＳ細胞（Ｃ）由来の馴化培地によって増殖させる。
【図４Ｂ】図４のパネルＡ、Ｂ、およびＣは、ＡＮＧＰＴＬ４発現構築物での腫瘍細胞の形質導入およびＡＮＧＰＴＬ４発現構築物で形質導入されたＣＯＳ細胞（Ｃ）由来の馴化培地（２）によって、ＡＮＧＰＴＬ４がＡ６７３腫瘍細胞（パネルＡおよびＢ）およびＵ８７ＭＧ腫瘍細胞（パネルＢ）の増殖を刺激することを概略的に示す（パネルＣ）。パネルＢでは、腫瘍細胞を、（１）ＡｄＬａｃＺ発現構築物コントロール、（２）Ａｄ−ＡＮＧＰＴＬ４発現構築物、または（３）Ａｄ−ＳｉＲＮＡ  ＡＮＧＰＴＬ４構築物のいずれかで形質導入する。パネルＣでは、Ａ６７３腫瘍細胞を、（１）ＬａｃＺ発現構築物、（２）ＡＮＧＰＴＬ４発現構築物、または（３）ＡＮＧＰＴＬ３発現構築物のいずれかで形質導入されたＨｅｐａ（Ａ）、ＨＭＶＥＣ（Ｂ）、またはＣＯＳ細胞（Ｃ）由来の馴化培地によって増殖させる。
【図４Ｃ】図４のパネルＡ、Ｂ、およびＣは、ＡＮＧＰＴＬ４発現構築物での腫瘍細胞の形質導入およびＡＮＧＰＴＬ４発現構築物で形質導入されたＣＯＳ細胞（Ｃ）由来の馴化培地（２）によって、ＡＮＧＰＴＬ４がＡ６７３腫瘍細胞（パネルＡおよびＢ）およびＵ８７ＭＧ腫瘍細胞（パネルＢ）の増殖を刺激することを概略的に示す（パネルＣ）。パネルＢでは、腫瘍細胞を、（１）ＡｄＬａｃＺ発現構築物コントロール、（２）Ａｄ−ＡＮＧＰＴＬ４発現構築物、または（３）Ａｄ−ＳｉＲＮＡ  ＡＮＧＰＴＬ４構築物のいずれかで形質導入する。パネルＣでは、Ａ６７３腫瘍細胞を、（１）ＬａｃＺ発現構築物、（２）ＡＮＧＰＴＬ４発現構築物、または（３）ＡＮＧＰＴＬ３発現構築物のいずれかで形質導入されたＨｅｐａ（Ａ）、ＨＭＶＥＣ（Ｂ）、またはＣＯＳ細胞（Ｃ）由来の馴化培地によって増殖させる。
【図５】図５は、培養皿をコーティングした場合にｍＡＮＧＰＴＬ４がＡ６７３増殖を刺激することを概略的に示す。
【図６Ａ】図６のパネルＡおよびＢは、Ａ６７３腫瘍細胞に結合するＡＮＧＰＴＬ４の種々の形態（パネルＡ）および種々の条件下でのＡＮＧＰＴＬ４の種々の形態（パネルＢ）を概略的に示す。
【図６Ｂ】図６のパネルＡおよびＢは、Ａ６７３腫瘍細胞に結合するＡＮＧＰＴＬ４の種々の形態（パネルＡ）および種々の条件下でのＡＮＧＰＴＬ４の種々の形態（パネルＢ）を概略的に示す。
【図７Ａ】図７のパネルＡおよびＢは、７日間（パネルＡ）または４日間（パネルＢ）成長させた場合のＡＮＧＰＴＬ４含有培地でのＡ６７３増殖を概略的に示す。パネルＡでは、（１）はＡｄＬａｃＺ発現構築物コントロールであり、（２）はＡｄ−ｈＡＮＧＰＴＬ４発現構築物であり、（３）はＡｄＬａｃＺ発現構築物およびｒｍＡＮＧＰＴＬ４である。パネルＢでは、（１）はなにも添加せず、（２）は緩衝液コントロールであり、（３）はｍＡＮＧＰＴＬ４（２．５μｇ／ｍｌ）であり、（４）はｈＡＮＧＰＴＬ４（２．５μｇ／ｍｌ）であり、（５）はｈＩｇＧ−ｈＡＮＧＰＴＬ４（２．５μｇ／ｍｌ）であり、（６）はｈＩｇＧ−ｍＡＮＧＰＴＬ４（２．５μｇ／ｍｌ）である。
【図７Ｂ】図７のパネルＡおよびＢは、７日間（パネルＡ）または４日間（パネルＢ）成長させた場合のＡＮＧＰＴＬ４含有培地でのＡ６７３増殖を概略的に示す。パネルＡでは、（１）はＡｄＬａｃＺ発現構築物コントロールであり、（２）はＡｄ−ｈＡＮＧＰＴＬ４発現構築物であり、（３）はＡｄＬａｃＺ発現構築物およびｒｍＡＮＧＰＴＬ４である。パネルＢでは、（１）はなにも添加せず、（２）は緩衝液コントロールであり、（３）はｍＡＮＧＰＴＬ４（２．５μｇ／ｍｌ）であり、（４）はｈＡＮＧＰＴＬ４（２．５μｇ／ｍｌ）であり、（５）はｈＩｇＧ−ｈＡＮＧＰＴＬ４（２．５μｇ／ｍｌ）であり、（６）はｈＩｇＧ−ｍＡＮＧＰＴＬ４（２．５μｇ／ｍｌ）である。
【図８Ａ】図８のパネルＡ、Ｂ、およびＣは、ＡＮＧＰＴＬ４がインビボでの腫瘍成長を促進し（パネルＡおよびパネルＢ）、アデノウイルス−Ａｎｇｐｔｌ４構築物の腫瘍内投与を行った腫瘍で、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体（ＡＶＳＴＩＮ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ））を使用した抗腫瘍治療を回避する傾向がある（パネルＣ）ことを概略的に示す。パネルＡおよびＣは、腫瘍サイズ（ｃｍ３）対腫瘍移植後の日数を示す。パネルＢは、移植２０日後の異種移植されたＡ６７３腫瘍の重量を示す。
【図８Ｂ】図８のパネルＡ、Ｂ、およびＣは、ＡＮＧＰＴＬ４がインビボでの腫瘍成長を促進し（パネルＡおよびパネルＢ）、アデノウイルス−Ａｎｇｐｔｌ４構築物の腫瘍内投与を行った腫瘍で、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体（ＡＶＳＴＩＮ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ））を使用した抗腫瘍治療を回避する傾向がある（パネルＣ）ことを概略的に示す。パネルＡおよびＣは、腫瘍サイズ（ｃｍ３）対腫瘍移植後の日数を示す。パネルＢは、移植２０日後の異種移植されたＡ６７３腫瘍の重量を示す。
【図８Ｃ】図８のパネルＡ、Ｂ、およびＣは、ＡＮＧＰＴＬ４がインビボでの腫瘍成長を促進し（パネルＡおよびパネルＢ）、アデノウイルス−Ａｎｇｐｔｌ４構築物の腫瘍内投与を行った腫瘍で、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体（ＡＶＳＴＩＮ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ））を使用した抗腫瘍治療を回避する傾向がある（パネルＣ）ことを概略的に示す。パネルＡおよびＣは、腫瘍サイズ（ｃｍ３）対腫瘍移植後の日数を示す。パネルＢは、移植２０日後の異種移植されたＡ６７３腫瘍の重量を示す。
【図９】図９は、ＡＮＧＰＴＬ４が腫瘍細胞（Ａ６７３および４Ｔ−１）の細胞移動を誘導することを示し、（１）は血清を添加せず、（２）は１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加し、（３）はＰＤＧＦ−ＢＢを添加し、（４）はＡＮＧＰＴＬ４を添加している。
【図１０Ａ】図１０のパネルＡおよびＢは、抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体が腫瘍成長を阻害することを示す（例えば、パネルＡ（ＨｅＬａ−Ｓ３細胞およびＣａｋｉ細胞）およびパネルＢ（Ｕ８７ＭＧ細胞、２９３細胞、およびＡ６７３細胞））。（１）は抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体であり、（２）は抗ダウン症候群重要領域１タンパク質（Ｄｓｃｒ）抗体コントロールであり、（３）はなにも添加せず、棒グラフの下の数値は、抗体濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。
【図１０Ｂ】図１０のパネルＡおよびＢは、抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体が腫瘍成長を阻害することを示す（例えば、パネルＡ（ＨｅＬａ−Ｓ３細胞およびＣａｋｉ細胞）およびパネルＢ（Ｕ８７ＭＧ細胞、２９３細胞、およびＡ６７３細胞））。（１）は抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体であり、（２）は抗ダウン症候群重要領域１タンパク質（Ｄｓｃｒ）抗体コントロールであり、（３）はなにも添加せず、棒グラフの下の数値は、抗体濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。
【図１１】図１１は、下に示した濃度（μｇ／ｍｌ）のＡＮＧＰＴＬ４またはビトロネクチンでコーティングしたプレートへの２９３〜１９５３（αＶβ５）細胞の接着を示す。コントロールとしてＢＳＡを使用する。
【図１２】図１２は抗αＶβ５および抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体がＡＮＧＰＴＬ４細胞接着活性を無効にすることを示す。（１）はＢＳＡであり、（２）はビトロネクチンであり、（３）はＡＮＧＰＴＬ４である。
【図１３Ａ】図１３のパネルＡ、Ｂ、およびＣは、インテグリンαＶβ５へのＡＮＧＰＴＬ４の結合を示す。パネルＡは、αＶβ５コーティングしたプレートへの表示の量を使用したタンパク質（ｍＡＮＧＰＴＬ４、ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｎ末端、またはｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端）の結合を示す。パネルＢは、抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体を含むαＶβ５コーティングしたプレートへのタンパク質（ｍＡＮＧＰＴＬ４、ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｎ末端、またはｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端）の結合阻害を示す。パネルＣは、ＡＮＧＰＴＬ４およびαＶβ５の結合を示す。（１）はプレート上にコーティングされたｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端であり、（２）はプレート上にコーティングし、抗ｈＡＮＧＰＴＬ４と共にインキュベートしたｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端であり、（３）はプレート上にコーティングし、抗Ｄｓｃｒと共にインキュベートしたｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端であり、（４）はプレート上にコーティングしたビトロネクチンであり、（５）はαＶβ５の添加前にプレート上にコーティングしたＢＳＡである。
【図１３Ｂ】図１３のパネルＡ、Ｂ、およびＣは、インテグリンαＶβ５へのＡＮＧＰＴＬ４の結合を示す。パネルＡは、αＶβ５コーティングしたプレートへの表示の量を使用したタンパク質（ｍＡＮＧＰＴＬ４、ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｎ末端、またはｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端）の結合を示す。パネルＢは、抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体を含むαＶβ５コーティングしたプレートへのタンパク質（ｍＡＮＧＰＴＬ４、ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｎ末端、またはｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端）の結合阻害を示す。パネルＣは、ＡＮＧＰＴＬ４およびαＶβ５の結合を示す。（１）はプレート上にコーティングされたｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端であり、（２）はプレート上にコーティングし、抗ｈＡＮＧＰＴＬ４と共にインキュベートしたｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端であり、（３）はプレート上にコーティングし、抗Ｄｓｃｒと共にインキュベートしたｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端であり、（４）はプレート上にコーティングしたビトロネクチンであり、（５）はαＶβ５の添加前にプレート上にコーティングしたＢＳＡである。
【図１３Ｃ】図１３のパネルＡ、Ｂ、およびＣは、インテグリンαＶβ５へのＡＮＧＰＴＬ４の結合を示す。パネルＡは、αＶβ５コーティングしたプレートへの表示の量を使用したタンパク質（ｍＡＮＧＰＴＬ４、ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｎ末端、またはｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端）の結合を示す。パネルＢは、抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体を含むαＶβ５コーティングしたプレートへのタンパク質（ｍＡＮＧＰＴＬ４、ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｎ末端、またはｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端）の結合阻害を示す。パネルＣは、ＡＮＧＰＴＬ４およびαＶβ５の結合を示す。（１）はプレート上にコーティングされたｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端であり、（２）はプレート上にコーティングし、抗ｈＡＮＧＰＴＬ４と共にインキュベートしたｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端であり、（３）はプレート上にコーティングし、抗Ｄｓｃｒと共にインキュベートしたｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端であり、（４）はプレート上にコーティングしたビトロネクチンであり、（５）はαＶβ５の添加前にプレート上にコーティングしたＢＳＡである。
【図１Ａ】
2008507536.tif 000006
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
2008507536.tif 000008
【図２Ｂ】
2008507536.tif 000009
【図３Ａ】
2008507536.tif 000010
【図３Ｂ】
2008507536.tif 000011
【図４Ａ】
2008507536.tif 000012
【図４Ｂ】
2008507536.tif 000013
【図４Ｃ】
2008507536.tif 000014
【図５】
2008507536.tif 000015
【図６Ａ】
2008507536.tif 000016
【図６Ｂ】
2008507536.tif 000017
【図７Ａ】
2008507536.tif 000018
【図７Ｂ】
2008507536.tif 000019
【図８Ａ】
2008507536.tif 000020
【図８Ｂ】
2008507536.tif 000021
【図８Ｃ】
2008507536.tif 000022
【図９】
2008507536.tif 000023
【図１０Ａ】
2008507536.tif 000024
【図１０Ｂ】
2008507536.tif 000025
【図１１】
2008507536.tif 000026
【図１２】
2008507536.tif 000027
【図１３Ａ】
2008507536.tif 000028
【図１３Ｂ】
2008507536.tif 000029
【図１３Ｃ】
2008507536.tif 000030
【配列表】
2008507536000001.app
【国際調査報告】
2008507536.tif 000031
2008507536.tif 000032
2008507536.tif 000033
2008507536.tif 000034
2008507536.tif 000035