(57)【要約】  本発明は、プロゲステロン受容体／リガンド複合体およびその製法ならびにソフトウェアシステムに関する。
2008510722.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロゲステロン受容体ポリペプチド；および
プロゲステロン受容体ポリペプチドのアゴニストまたはプロゲステロン受容体ポリペプチドのアンタゴニストである非ステロイド性リガンドを含む、結晶タンパク質−リガンド複合体。
【請求項２】
非ステロイド性リガンドがプロゲステロン受容体ポリペプチドのアゴニストである、請求項１記載の結晶タンパク質−リガンド複合体。
【請求項３】
非ステロイド性リガンドがプロゲステロン受容体ポリペプチドのアンタゴニストである、請求項１記載の結晶タンパク質−リガンド複合体。
【請求項４】
非ステロイド性リガンドが少なくとも２個の環を含む、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の結晶タンパク質−リガンド複合体。
【請求項５】
少なくとも２個の環が縮合される、請求項４記載の結晶タンパク質−リガンド複合体。
【請求項６】
縮合した環が少なくとも１個の環ヘテロ原子を含む、請求項５記載の結晶タンパク質−リガンド複合体。
【請求項７】
少なくとも１個の環ヘテロ原子がＮ、ＯおよびＳからなる群より選択される、請求項６記載の結晶タンパク質−リガンド複合体。
【請求項８】
非ステロイド性リガンドが、構造式：
【化１】
2008510722.tif 000088
［式中：Ａ、ＢおよびＣは環系を示し、ＢおよびＣは縮合した環であり、Ｌはリンカー部分である］
を有する、請求項１ないし７のいずれか一項記載の結晶タンパク質−リガンド複合体。
【請求項９】
非ステロイド性リガンドがベンゾオキサジン誘導体を含む、請求項１ないし８のいずれか一項記載の結晶タンパク質−リガンド複合体。
【請求項１０】
ベンゾオキサジン誘導体が２位にオキソまたはチオの置換基を含む、請求項９記載の結晶タンパク質−リガンド複合体。
【請求項１１】
ベンゾオキサジン誘導体が、ベンゾオキサジン環の４位にまたはその近接に少なくとも１個の疎水性置換基を有する、請求項９または１０の結晶タンパク質−リガンド複合体。
【請求項１２】
非ステロイド性リガンドがタナプロゲトである、請求項１記載の結晶タンパク質−リガンド複合体。
【請求項１３】
結晶タンパク質−リガンド複合体が空間群Ｐ２１を有する、請求項１ないし１２のいずれか一項記載の結晶タンパク質−リガンド複合体。
【請求項１４】
結晶タンパク質−リガンド複合体が、単位格子定数ａ＝５７．５Å、ｂ＝６４．５Å、ｃ＝７０．４Åおよびβ＝９５．８°を有する、請求項１ないし１３のいずれか一項記載の結晶タンパク質−リガンド複合体。
【請求項１５】
非ステロイド性リガンドがプロゲステロン受容体ポリペプチドに結合している、請求項１ないし１４のいずれか一の結晶タンパク質−リガンド複合体。
【請求項１６】
プロゲステロン受容体ポリペプチドがリガンド結合ドメインを含む、請求項１ないし１５のいずれか一項記載の結晶タンパク質−リガンド複合体。
【請求項１７】
非ステロイド性リガンドがリガンド結合ドメインに結合している、請求項１６記載の結晶タンパク質−リガンド複合体。
【請求項１８】
プロゲステロン受容体ポリペプチドが哺乳類由来である、請求項１ないし１７のいずれか一項記載の結晶タンパク質−リガンド複合体。
【請求項１９】
プロゲステロン受容体ポリペプチドが非哺乳類由来である、請求項１ないし１７のいずれか一項記載の結晶タンパク質−リガンド複合体。
【請求項２０】
プロゲステロン受容体ポリペプチドがヒト由来である、請求項１８記載の結晶タンパク質−リガンド複合体。
【請求項２１】
プロゲステロンポリペプチドが配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項２０記載の結晶タンパク質−リガンド複合体。
【請求項２２】
複合体が、少なくとも約３．５Åの分解能でＸ線を回折することができる、請求項１ないし２１のいずれか一項記載の結晶タンパク質−リガンド複合体。
【請求項２３】
複合体が、表２の構造座標±最大１．５Åであるアルファ炭素原子についての根平均自乗変位を含む、請求項１記載の結晶タンパク質−リガンド複合体。
【請求項２４】
非ステロイド性リガンドが、プロゲステロン受容体ポリペプチドの１以上のＧｌｎ７２５、Ｌｅｕ７９７、Ａｓｎ７１９およびＡｒｇ７６６と相互作用する、請求項１ないし２２のいずれか一項記載の結晶タンパク質−リガンド複合体。
【請求項２５】
請求項１ないし２４のいずれか一項記載の複合体を含む、組成物。
【請求項２６】
プロゲステロン受容体ポリペプチドのアゴニストまたはプロゲステロン受容体ポリペプチドのアンタゴニストである、非ステロイド性リガンドに結合したプロゲステロン受容体ポリペプチドの三次元モデルを用いて、プロゲステロン受容体ポリペプチドと相互作用する物質を設計することを含む、方法。
【請求項２７】
三次元モデルが、プロゲステロン受容体ポリペプチドのリガンド結合ドメインを含む、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
三次元モデルが、プロゲステロン受容体ポリペプチドの原子の構造座標を含む、請求項２６または２７記載の方法。
【請求項２９】
構造座標が実験的に決定された座標である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
原子がプロゲステロン受容体ポリペプチドの活性部位の原子を含む、請求項２８または２９記載の方法。
【請求項３１】
活性部位がリガンド結合ドメインである、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
構造座標が、表２に記載のもの±最大１．５Åであるアルファ炭素原子についての根平均自乗変位である、請求項２８記載の方法。
【請求項３３】
三次元モデルが非ステロイド性リガンドの構造座標を含む、請求項２８ないし３２のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
モデルの非ステロイド性リガンドを改変することをさらに含む、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
非ステロイド性リガンドの改変が、非ステロイド性リガンドの構造座標を変化させることを含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
非ステロイド性リガンドの改変が、非ステロイド性リガンドの化学構造を変化させることを含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
三次元モデルが、配列番号２のアミノ酸に記載のプロゲステロン受容体ポリペプチドのアミノ酸Ｇｌｎ７２５およびＡｒｇ７６６の原子からなる群より選択される原子の構造座標を含む、請求項２８ないし３６のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８】
三次元モデルが、配列番号２のアミノ酸に記載のアミノ酸Ｉｌｅ６９９、Ａｌａ７０１、Ｌｅｕ７１４、Ｌｅｕ７１５、Ｌｅｕ７１８、Ａｓｎ７１９、Ｌｅｕ７２１、Ｇｌｎ７２５、Ｔｒｐ７５５、Ｍｅｔ７５６、Ｍｅｔ７５９、Ｖａｌ７６０、Ｌｅｕ７６３、Ａｒｇ７６６、Ｓｅｒ７６７、Ｔｙｒ７７７、Ｐｈｅ７７８、Ａｌａ７７９、Ｌｅｕ７８２、Ｐｈｅ７９４、Ｌｅｕ７９７、Ｌｙｓ７９８、Ｍｅｔ８０１、Ｉｌｅ８０４、Ｌｅｕ８８７、Ｈｉｓ８８８、Ｔｙｒ８９０、Ｃｙｓ８９１、Ａｓｎ８９３、Ｔｈｒ８９４、Ｐｈｅ８９５、Ｓｅｒ８９８、Ｌｅｕ９０１、Ｖａｌ９０３、Ｐｈｅ９０５、Ｍｅｔ９０９、Ｉｌｅ９１３およびＬｅｕ９１７の原子からなる群より選択される原子の構造座標を含む、請求項２８ないし３７のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
プロゲステロン受容体ポリペプチドの原子と物質の原子の間の距離を計算することをさらに含む、請求項２６ないし３８のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
物質とプロゲステロン受容体ポリペプチドの間の予測相互作用と非ステロイド性リガンドとプロゲステロン受容体ポリペプチドの間の相互作用を比較することをさらに含む、請求項２６ないし３９のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
プロゲステロン受容体ポリペプチドを含む組成物を提供することをさらに含む、請求項２６ないし４０のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
プロゲステロン受容体ポリペプチドが結晶である、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
組成物が、プロゲステロン受容体ポリペプチドと相互作用する物質を含む、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
物質とプロゲステロン受容体ポリペプチドとの相互作用を実験的に決定することをさらに含む、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
物質とプロゲステロン受容体ポリペプチドとの相互作用と第二物質とプロゲステロン受容体ポリペプチドとの相互作用を比較することをさらに含む、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
請求項１ないし２４のいずれか一項に記載の複合体の三次元構造を用いて理論的薬剤設計を行うことにより物質を選択し：
物質とプロゲステロン受容体ポリペプチドを接触させ；および
プロゲステロン受容体ポリペプチドに結合する物質の能力を検出することを含む、方法。
【請求項４７】
物質がコンピュータモデリングを介して選択される、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
物質を合成することをさらに含む、請求項４６または４７記載の方法。
【請求項４９】
プロゲステロンポリペプチド受容体および物質を含む補充結晶複合体を得；
補充結晶複合体の三次元構造を決定し；
補充結晶複合体の三次元構造を用いて理論的薬剤設計を行うことにより第二物質を選択し；
第二物質とプロゲステロンポリペプチド受容体を接触させ；および
プロゲステロン受容体ポリペプチドに結合する物質の能力を検出することをさらに含む、請求項４６ないし４８のいずれか一項記載の方法。
【請求項５０】
第二物質がコンピュータモデリングを介して選択される、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
第二物質を合成することをさらに含む、請求項４９または５０記載の方法。
【請求項５２】
請求項１ないし２４のいずれか一項に記載の複合体の結晶を成長させるために、ポリペプチドと非ステロイド性リガンドを接触させることを含む、方法。
【請求項５３】
ハンギングドロップ蒸気拡散法の使用を含む、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
コンピュータシステムに：
プロゲステロン受容体ポリペプチドのアゴニストまたはプロゲステロン受容体ポリペプチドのアンタゴニストである、非ステロイド性リガンドに結合したプロゲステロン受容体ポリペプチドの構造に関する情報を受け取らせ；
候補物質に関する情報を受け取らせ；および
プロゲステロン受容体ポリペプチドの構造に関する情報および候補物質に関する情報に基づいて、候補物質とプロゲステロン受容体ポリペプチドの結合特性を決定させる命令を含む、ソフトウェアシステム。
【請求項５５】
非ステロイド性リガンドに結合したプロゲステロン受容体ポリペプチドの構造が結晶構造である、請求項５４記載のソフトウェアシステム。
【請求項５６】
結晶構造が、表２の構造座標±最大１．５Åであるアルファ炭素原子についての根平均自乗変位を含む、請求項５５記載のソフトウェアシステム。
【請求項５７】
コンピュータシステムに：
データベースから得た情報、候補物質に関する情報を適用させ；および
プロゲステロン受容体ポリペプチドの構造に関する情報および候補物質に関する情報に基づいて、プロゲステロン受容体ポリペプチドと結合しうるデータベースにおける候補物質を同定させる命令をさらに含む、請求項５４ないし５６のいずれか一項記載のソフトウェアシステム。
【請求項５８】
コンピュータシステムに、
候補物質とプロゲステロン受容体ポリペプチドの結合特性をモデル化させる命令をさらに含む、請求項５７記載のソフトウェアシステム。
【請求項５９】
１以上のプロセッサにより実行される場合、１以上のプロセッサに：
プロゲステロン受容体ポリペプチドのアゴニストまたはプロゲステロン受容体ポリペプチドのアンタゴニストである、非ステロイド性リガンドに結合したプロゲステロン受容体ポリペプチドの構造に関する情報を受け取らせ；
候補物質に関する情報を受け取らせ；および
プロゲステロン受容体ポリペプチドの構造に関する情報および候補物質に関する情報に基づいて、候補物質とプロゲステロン受容体ポリペプチドの結合特性を決定させる、複数の命令を格納するコンピュータ可読媒体に備わるコンピュータプログラム。
【請求項６０】
プロゲステロン受容体ポリペプチドのアゴニストまたはプロゲステロン受容体ポリペプチドのアンタゴニストである、非ステロイド性リガンドに結合したプロゲステロン受容体ポリペプチドの構造に関する情報を受け取らせ；および
プロゲステロン受容体ポリペプチドと候補物質の結合特性をモデリングすることを含む、ソフトウェアシステムにより実行される方法。
【請求項６１】
プロゲステロン受容体ポリペプチドの構造に関する情報および候補物質に関する情報に基づいて、プロゲステロン受容体ポリペプチドと結合しうる候補物質を同定するために、候補物質のデータベースから得た情報を適用することをさらに含む、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
１以上のプロセッサにより実行される場合、１以上のプロセッサに：
プロゲステロン受容体ポリペプチドのアゴニストまたはプロゲステロン受容体ポリペプチドのアンタゴニストである、非ステロイド性リガンドに結合したプロゲステロン受容体ポリペプチドの構造に関する情報を受け取らせ；および
プロゲステロン受容体ポリペプチドと候補物質の結合特性をモデル化させる、複数の命令を格納するコンピュータ可読媒体に備わるコンピュータプログラム。
【請求項６３】
１以上のプロセッサに：
データベースから得た情報、候補物質に関する情報を適用させ；および
プロゲステロン受容体ポリペプチドの構造に関する情報に基づいて、プロゲステロン受容体ポリペプチドと結合しうるデータベースにおける候補物質を同定させる、命令をさらに含む、請求項６２記載のコンピュータプログラム。
【請求項６４】
１以上のプロセッサに候補物質とプロゲステロン受容体ポリペプチドの結合特性をモデル化させる命令をさらに含む、請求項６３記載のコンピュータプログラム。
【請求項６５】
コンピュータシステムに：
プロゲステロン受容体ポリペプチドアゴニストまたはプロゲステロン受容体ポリペプチドアンタゴニストである、非ステロイド性リガンドに結合したプロゲステロン受容体ポリペプチドの構造に関する情報を受け取らせ；および
プロゲステロン受容体ポリペプチドと候補物質の結合特性をモデル化させる命令を含む、ソフトウェアシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００４年８月２０日出願の米国仮出願番号６０／６０３，２４２の優先権を主張し、全体を出典明示により本明細書の一部とする。
【０００２】
本発明は、プロゲステロン／リガンド複合体、その製法およびソフトウェアシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
プロゲステロンは、ステロイドホルモンであり、多数の生物学的工程を調節する。多数の生理学的効果は、プロゲステロン受容体（ＰＲｓ）を介する。プロゲステロンとプロゲステロン受容体の相互作用は、受容体の活性化をもたらしうる。これは、細胞質から核酸中に輸送されるプロゲステロン受容体をもたらしうる。核酸において、プロゲステロン受容体は、転写活性化因子として機能することができ、特定の遺伝子標的の発現を増加させることができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一般に、本発明は、非ステロイド性リガンドに結合したＰＲポリペプチドを含む、結晶タンパク質／リガンド複合体に関する。ＰＲポリペプチドは、ＰＲのリガンド結合ドメインを含み、非ステロイド性リガンドは、受容体のアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。本発明はまた、ＰＲポリペプチド／非ステロイド性リガンド複合体の三次元モデルの使用方法に関し、ＰＲポリペプチドと相互作用しうるアゴニストまたはアンタゴニストなどの物質を設計する。本発明はまた、関連ソフトウェア方法を特徴付ける。
【０００５】
一の態様において、本発明は、プロゲステロン受容体ポリペプチドおよび非ステロイド性リガンドを含む、結晶タンパク質−リガンド複合体を特徴付ける。非ステロイド性リガンドは、プロゲステロン受容体ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである。
【０００６】
別の態様において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含有するプロゲステロン受容体ポリペプチドおよび非ステロイド性リガンドを含む、結晶タンパク質−リガンド複合体を特徴付ける。結晶タンパク質−リガンド複合体は、少なくとも約３．５Åの分解能でＸ線を回折する。非ステロイドリガンドは、プロゲステロン受容体ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである。
【０００７】
別の態様として、本発明は、プロゲステロン受容体ポリペプチドおよび非ステロイド性リガンドを含有する結晶を含む組成物を特徴付ける。非ステロイド性リガンドは、プロゲステロン受容体ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである。
【０００８】
さらに別の態様として、本発明は、プロゲステロン受容体ポリペプチドと相互作用する物質を設計するための三次元モデルの使用を含む方法を特徴付ける。三次元モデルは、かかる受容体ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである非ステロイド性リガンドに結合したプロゲステロン受容体ペプチドを含む。
【０００９】
本発明の別の態様は、結晶複合体の三次元構造で理論的薬剤設計を行うことにより物質を選択することを含む方法を特徴付ける。複合体は、かかる受容体ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである、非ステロイド性リガンドに結合したプロゲステロン受容体ポリペプチドを含み、物質と受容体ペプチドを接触させ、かかるポリペプチドに結合する物質の能力を見出すことを含む。
【００１０】
別の態様において、本発明は、プロゲステロン受容体ポリペプチドおよびかかるポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである、非ステロイド性リガンドを含む結晶を大きくする方法を特徴付ける。方法は、受容体ポリペプチドを非ステロイド性リガンドと接触させることを含み、得られた結晶を、少なくとも３．５Åの分解能のＸ線で回折することができる。
【００１１】
本発明の別の態様は、候補物質とプロゲステロン受容体ポリペプチドの結合特性を決定させるソフトウェアシステムを特徴付ける。ソフトウェアは、プロゲステロン受容体ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである非ステロイド性リガンドに結合したプロゲステロン受容体ポリペプチドの構造に関する情報を受け取り、候補物質に関する情報を受け取るコンピュータシステムがもたらす命令を含む。結合特性の決定は、該受容体ポリペプチドの構造に関する情報および候補物質に関する情報に基づく。
【００１２】
本発明の別の態様は、候補物質とプロゲステロン受容体ポリペプチドの結合特性を決定させるコンピュータプログラムを特徴付ける。コンピュータプログラムは、複数の命令を含むコンピュータ可読媒体上に備わっている。１以上のプロセッサにより実行される場合、複数の命令をもたらし、１以上のプロセッサは、プロゲステロン受容体ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである非ステロイド性リガンドに結合したプロゲステロン受容体ポリペプチドの構造に関する情報を受け取り、候補物質に関する情報を受け取る。結合特性の決定は、該受容体の構造に関する情報および候補物質に関する情報に基づく。
【００１３】
別の態様において、本発明は、候補物質とプロゲステロン受容体ポリペプチドの結合特性をモデリングするための方法を特徴付ける。方法は、ソフトウェアシステムを含み、プロゲステロン受容体ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである非ステロイド性リガンドに結合したプロゲステロン受容体ポリペプチドの構造に関する情報を受容することにより結合特性をモデリングする。
【００１４】
さらに別の態様において、本発明は、候補物質とプロゲステロン受容体ポリペプチドの結合特性をモデリングするためのコンピュータプログラムを特徴付ける。コンピュータプログラムは、複数の命令を格納するコンピュータ可読媒体上に備わっている。命令が１以上のプロセッサにより実行される場合、プロセッサは、プロゲステロン受容体ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである非ステロイド性リガンドに結合したプロゲステロン受容体ポリペプチドの構造に関する情報を受け取り、プロセッサは、候補物質とかかる受容体ポリペプチドの結合特性をモデリングする。
【００１５】
別の態様において、本発明は、候補物質とプロゲステロン受容体ポリペプチドの結合特性をモデリングするためのソフトウェアを特徴付ける。ソフトウェアシステムは、コンピュータシステムに、プロゲステロン受容体ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである非ステロイド性リガンドに結合したプロゲステロン受容体ポリペプチドの構造に関する情報を受け取らせ、かかる受容体ポリペプチドと候補物質の結合特性をモデリングさせる命令を含む。
【００１６】
ポリペプチドの構造情報は、ポリペプチドがインビボでどのように機能するのかというより高い理解をもたらしうる。例えば、タンパク質の構造の知識は、タンパク質と他のタンパク質、エフェクター分子（例、ホルモン）、および核酸を含むそのリガンドの相互作用を促進する特性を示すことができる。プロゲステロン受容体の場合において、このような相互作用の理解は、リガンド（例、薬物）の設計または選択を促進することができ、インビボにおいてプロゲステロン受容体の活性の調節に有用であり、したがって、ヒトの治療に有用でありうる。構造に基づくモデリングは、ＰＲポリペプチドと相互作用しうるリガンドを同定する手段となり得、したがって、多大な費用および時間がかかりうるスクリーニング試験において必要な手段を除外しうる。構造情報はまた、ＰＲペプチドと相互作用する既知のリガンドの改変を導く手段となり得、より強力な結合またはより高い特異性などのより望ましい特性を有する代替のリガンドを創り出す。
【００１７】
特に記載がない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明に関する当業者により一般に理解される意味と同様である。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および物質は、本発明の実施または試験において使用されうるけれども、有用な方法および物質を、下記する。物質、方法および実施例は単なる説明であって、限定を意図するものではない。本発明の他の特徴および利点は、添付図面および明細書、および特許請求の範囲から明らかであろう。全ての文献、係属中の特許出願および特許公報、引用出願の内容
は、出典明示により本明細書の一部とする。争いの場合において、定義を含む本明細書が対照となるであろう。
【００１８】
（図面の簡単な説明）
図１Ａは、ヒトＰＲ−ＬＢＤに結合したタナプロゲトを示す電子密度図である。タナプロゲトのＡ、ＢおよびＣの環は、指定される。タナプロゲトのベンゾオキサジン部分は、環ＢおよびＣの形成である。
【００１９】
図１Ｂは、ヒトＰＲ−ＬＢＤに結合したタナプロゲトを示す電子密度図である。
【００２０】
図２Ａは、グアノシン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（下線以外の配列）と接合したヒトプロゲステロン受容体リガンド結合ドメイン（ヒトＰＲ−ＬＢＤ）（下線の配列）のアミノ酸配列を示す（配列番号１）。トロンビン開裂部位（ＬＶＰＲＧ（配列番号３）、太字）は、ＧＳＴとＰＲ−ＬＢＤの間の接合部で生じる。
【００２１】
図２Ｂは、ヒトＰＲ−ＬＢＤのアミノ酸配列を示す（配列番号２）。アミノ酸に、全長ヒトプロゲステロン受容体のアミノ酸配列にしたがって番号を付ける（図２Ｃ参照）。
【００２２】
図２Ｃは、ヒトプロゲステロン受容体全長配列である（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿０００９２６；配列番号４）。ヒトＰＲ−ＬＢＤのアミノ酸は、下線部分である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
非ステロイド性ホルモンのタナプロゲト（ｔａｎａｐｒｏｇｅｔ）（ＩＵＰＡＣ名：５−（４，４−ジメチル−２−チオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−３，１−ベンゾオキサジン−６−イル）−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２−カルボニトリル；タナプロゲトは米国一般名（ＵＳＡＮ）である）に結合したヒトプロゲステロン受容体リガンド結合ドメイン（ＰＲ−ＬＢＤ）の構造は、Ｘ線結晶学により決定され、本明細書に記載される。図１Ａおよび１Ｂは、ＰＲ−ＬＢＤ／タナプロゲト複合体の構造を示す電子密度図である。電子密度図は、タナプロゲトに結合したヒトＰＲ−ＬＢＤの三次構造が、天然リガンド、プロゲステロンに結合したヒトＰＲ−ＬＢＤの三次構造に非常に類似することを示す根拠を提供する。したがって、ヒトＰＲ−ＬＢＤ／タナプロゲト複合体の結晶構造（下記の表２参照）は、ＰＲ−ＬＢＤと相互作用しうる、例えば非ステロイド性リガンドなどの他のリガンドを設計または同定することに有用である。
【００２４】
図２Ａおよび２Ｂは、ヒトＰＲ−ＬＢＤのアミノ酸配列に関する情報を提供し、図２Ｃは、ＰＲの全長配列に関する情報を提供する。
【００２５】
タナプロゲトの化学構造を、下記に示す。
【化１】
2008510722.tif 000003
【００２６】
一般に、タナプロゲトに結合したヒトＰＲ−ＬＢＤ複合体を、要望どおりに調製することができる。いくつかの実施態様において、かかる複合体を、以下の通り調製することができる。ヒトＰＲ−ＬＢＤを、ＤＮＡプラスミドから発現する。発現を、誘導プロモーターなどのプロモーターにより促進することができる。ヒトＰＲ−ＬＢＤを、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ｍｙｃ、ＨＡ、ヘキサヒスチジン、またはＦＬＡＧタグなどの適当なタグとの融合タンパク質として発現することができる。タグは、細胞からヒトＰＲ−ＬＢＤの単離を容易にすることができる。融合タンパク質は、融合タンパク質中に設計されたプロテアーゼ部位で、例えば、ポリペプチドとタグの間の融合部位またはその近隣で開裂されうる。開裂および精製の後に、ヒトＰＲ−ＬＢＤは、タナプロゲトと接触されうる。例えば、ヒトＰＲ−ＬＢＤは、精製前に（例、ポリペプチドタグの開裂前に）タナプロゲトと合わせるか、またはヒトＰＲ−ＬＢＤは、精製後にタナプロゲトと合わせることができる。いくつかの実施態様において、タナプロゲトは、精製前および精製後に再度ヒトＰＲ−ＬＢＤと合わせることができる。
【００２７】
ヒトＰＲ−ＬＢＤおよびタナプロゲトを、ヒトＰＲ−ＬＢＤ／タナプロゲト複合体のスペクトルデータ、ヒトＰＲ−ＬＢＤ／タナプロゲト複合体のＮＭＲデータを収集し、またはヒトＰＲ−ＬＢＤ／タナプロゲト複合体の結晶を成長させるための溶液中で合わせうる。例えば、ヒトＰＲ−ＬＢＤ／タナプロゲト複合体は、塩（例、ナトリウム塩）、ポリマー（例、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、および／または有機溶媒の存在下で結晶化しうる。結晶は、例えば、シッティングまたはハンギングドロップ蒸気拡散法などの様々な方法で成長しうる。一般に、結晶化は、約４℃から約６０℃までの温度で（例、約４℃から約４５℃まで、例えば、約４℃、約１５℃、約１８℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３２℃、約３５℃、約３７℃で）行われ得る。
【００２８】
一般に、タナプロゲトに結合したヒトＰＲ−ＬＢＤの結晶は、約３．５Å以下の分解能（例、約３．２Å以下、約３．０Å以下、約２．５Å以下、約２．４Å以下、約２．３Å以下、約２．２Å以下、約２．１Å以下、約２．０Å以下、約１．９Å以下、約１．８Å以下、約１．７Å以下、約１．６Å以下、約１．５Å以下、約１．４Å以下）でＸ線を回折しうる。いくつかの実施態様において、タナプロゲトに結合したヒトＰＲ−ＬＢＤの結晶は、約１．６Åから約２．５Åまで（例、約１．８Åから約２．２Åまで）の分解能でＸ線を回折しうる。
【００２９】
いくつかの実施態様において、タナプロゲトに結合したヒトＰＲ−ＬＢＤの結晶は、単位格子パラメーターがａ＝５７．５２Å、ｂ＝６４．５０Å、ｃ＝７０．４１Åおよびｂ＝９５．７６°である、空間群Ｐ２１に属する。特定の実施態様において、タナプロゲトに結合したヒトＰＲ−ＬＢＤの結晶はさらに、非対称単位においてヒトＰＲ−ＬＢＤの２分子を含有しうる。結晶を記載する構造データを、例えば、Ｘ線回折により得ることができる。Ｘ線回折データを、様々な光源、Ｘ線の波長および検出器により収集することができる。いくつかの実施態様において、回転陽極およびシンクロトロン放射源（例、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ  （ＡＬＳ）、バークリー、カリフォルニア州；またはＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ  （ＡＰＳ）、アルゴンヌ、イリノイ州）を、Ｘ線の光源として使用しうる。特定の実施態様において、回折データの発生おけるＸ線は、約０．５Åから約１．６Åまで（例、約０．７Å、約０．９Å、約１．１Å、約１．３Å、約１．４Å、約１．５Å、または約１．６Å）の波長を有しうる。いくつかの実施態様において、面積検出器および／または電荷結合素子（ＣＣＤｓ）を、検出器として使用しうる。
【００３０】
タナプロゲトに結合したヒトＰＲ−ＬＢＤ複合体の結晶のＸ線回折データは、かかる複合体の原子の構造座標を得るために使用されうる。構造座標は、デカルト座標であり、かかる複合体の他の原子に関する三次元空間における原子の位置を記載する。例えば、表２に記載の構造座標は、タナプロゲトに結合したヒトＰＲ−ＬＢＤの結晶複合体の構造座標である。これらの構造座標は、相互に関するヒトＰＲ−ＬＢＤの原子の位置、タナプロゲトにおける原子に関するヒトＰＲ−ＬＢＤにおける原子の位置を記載する。複合体の構造座標は、数学的操作、例えば、反転または加法あるいは減法により調整されうる。そのようなものとして、構造座標は、相対座標である。例えば、タナプロゲトに結合したＰＲ−ＬＢＤにおける原子の位置を記載する構造座標は、特に、表２の実際のｘ、ｙおよびｚ座標により制限されない。
【００３１】
タナプロゲトに結合したヒトＰＲ−ＬＢＤの複合体の構造座標は、複合体の表示（例、二次元表示または三次元表示）、複合体の断片、ＰＲ−ＬＢＤまたはＰＲ−ＬＢＤの断片を導くために用いられ得る。そのような表示は、例えば、ポリペプチドの活性部位の可視化、同定および特徴付けを含む多数の応用に有用であり得る。特定の実施態様において、三次元表示は、表２±アミノ酸のアルファ炭素原子についての根平均自乗変位の約１．５Å以下（例、約１．０Å以下、約０．５Å以下）のヒトＰＲ−ＬＢＤの構造座標を含みうる。根平均自乗変位は、平均からの偏差の二乗の算術平均の平方根であり、構造座標からの偏差もしくは差異を表す一の方法である。アミノ酸の保存的置換（下記の記述参照）は、規定の根平均自乗変位内の構造座標を有する分子表示をもたらしうる。例えば、保存的アミノ酸置換により相互に異なるポリペプチドの二分子モデルは、約１．５Å未満（例、約１．０Å未満、約０．５Å未満）などの規定のｒｍｓ偏差内の骨格原子の座標を有しうる。ポリペプチドの骨格原子は、アルファ炭素（ＣαまたはＣＡ）原子、カルボニル炭素（Ｃ）原子、およびアミド窒素（Ｎ）原子を含む。
【００３２】
様々なソフトウェアプログラムは、一連の構造座標のグラフィック表示を可能とし、タナプロゲトに結合したヒトＰＲ−ＬＢＤの複合体またはその断片の表示を得る。一般に、そのような表示は、構造座標または特徴間の距離または角度などの構造座標に由来する情報を（相対的および／または絶対的に）正確に反映すべきである。いくつかの実施態様において、かかる表示は、立体的二次元図などの二次元図である。特定の実施態様において、かかる表示は、双方向性立体的二次元表示などの双方向性二次元表示である。双方向性二次元表示は、例えば、ポリペプチドの異なる側面を示すために回転しうるコンピュータ表示、ポリペプチドの断片、複合体および／または複合体の断片であり得る。いくつかの実施態様において、かかる表示は、三次元表示である。一例として、三次元モデルは、分子構造の物理的モデルであり得る（例、ｂａｌｌ−ａｎｄ−ｓｔｉｃｋモデル）。別の例として、三次元表示は、分子構造のグラフィック表示であり得る（例、コンピュータ表示上の図面または図形）。二次元表示が三次元情報を反映する場合、例えば、遠近法、陰影付けを用いて、または観察者から遠くにある特徴を観察者に近い特徴で遮ることを介する場合、二次元グラフィック表示（例、図面）は、三次元表示に対応しうる。いくつかの実施態様において、表示を、ワンランク上でモデル化しうる。一例として、三次元表示が、タナプロゲトに結合したヒトＰＲ−ＬＢＤの複合体などのポリペプチドを含む場合、かかるポリペプチドを、１以上の異なるレベルの構造、例えば、一次構造（アミノ酸配列）、二次構造（例、α−へリックスおよびβ−シート）、三次構造（全体的に折り畳まれた）および四次構造（オリゴマー状態）で表示しうる。表示は、細部の異なるレベルを含みうる。例えば、表示は、原子の位置を特定することなくタンパク質の二次構造の特徴の相対的位置を含みうる。より詳細な表示は、例えば、原子の位置を含みうる。
【００３３】
いくつかの実施態様において、表示は、タナプロゲトに結合したヒトＰＲ−ＬＢＤの複合体における原子の構造座標を加えた情報を含みうる。例えば、表示は、溶媒接触可能表面の形状、モデルの原子のファン・デル・ワールス半径および溶媒（例、水）のファン・デル・ワールス半径に関する情報を提供しうる。表示から得られることができる他の特徴は、例えば、静電電位、巨大分子構造中の空間またはポケットの位置および水素結合および塩橋の位置を含む。
【００３４】
ヒトＰＲ−ＬＢＤと相互作用する物質は、ヒトＰＲ−ＬＢＤの表示またはその断片、あるいはタナプロゲトに結合したヒトＰＲ−ＬＢＤの複合体またはその断片を用いることを含む方法により同定または設計されうる。典型的な表示の種類は、上記に記載の表示を含む。いくつかの実施態様において、表示は、類似ポリペプチド、ポリペプチド断片、複合体または複合体の断片でありうる。該表示と相互作用する候補物質は、該表示と候補物質のコンピュータ適合解析を実行することにより設計または同定されうる。一般に、物質は分子である。物質の例として、ポリペプチド、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡを含む）、ステロイドおよび非ステロイド性有機化合物が挙げられる。物質は、リガンドであり得、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用しうる。ポリペプチド（例、ＰＲポリペプチド）と相互作用する物質は、一時的または安定してポリペプチドと相互作用する。相互作用は、例えば、水素結合、静電気力、疎水性相互作用、ファン・デル・ワールス相互作用を含む本明細書に記載の力により介在されうる。
【００３５】
上記の記載として、Ｘ線結晶学は、タナプロゲトに結合したヒトＰＲ−ＬＢＤの複合体の構造座標を得るために用いられうる。しかしながら、そのような構造座標を、ＮＭＲ法を含む他の技法を用いて得ることができる。さらに構造情報を、スペクトル法（例、旋光分散（ＯＲＤ）、円偏光二色性（ＣＤ））、ホモロジーモデリングおよびコンピュータ方法（例、分子力学から得たデータを含みうるコンピュータ方法、力学実験から得たデータを含むコンピュータ方法）から得ることができる。
【００３６】
いくつかの実施態様において、Ｘ線の回折データは、タナプロゲトに結合したヒトＰＲ−ＬＢＤの複合体またはその断片の電子密度図を作成するために用いられ、電子密度図は、タナプロゲトに結合したヒトＰＲ−ＬＢＤまたはその断片の表示（例、二次元表示、三次元表示）を得るために用いられ得る。電子密度図の作成は、典型的には、Ｘ線散乱の位相に関する情報を用いることを含む。位相情報は、例えば、回折データまたは電子密度図の作成を完成するための補足的な回折実験のいずれかから引き出されうる。Ｘ線回折データから位相を算出するための方法は、例えば、多波長異常分散（ＭＡＤ）、多重同形置換（ＭＩＲ）、異常分散に用いる多重同形置換（ＭＩＲＡＳ）、異常分散を用いる単一同形置換（ＳＩＲＡＳ）、逆格子空間溶媒平坦化（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｓｐａｃｅ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｆｌａｔｔｅｎｉｎｇ）、分子置換またはその組み合わせを含む。これらの方法は、天然タンパク質に同形の構造的修飾を行うこと、例えば、重原子を含むか、または既存の重原子の散乱強度を変化させ、次いで、天然タンパク質および修飾した場合それぞれについて回折振幅を測定することにより、位相情報を生じる。さらなる重原子の位置またはその散乱強度における変化が知られているならば、次いで、一連の位相についての連立方程式（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ  ｅｑｕａｔｉｏｎ）を解くことにより、回折された各Ｘ線の位相を決定し得る。重原子部位の位置は、コンピュータプログラム、例えば、ＳＨＥＬＸＳ（Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ａｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍｉｅ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて同定され得、回折データを、コンピュータプログラム、例えば、ＭＯＳＦＬＭ、ＳＣＡＬＡ、ＳＯＬＯＭＯＮおよびＳＨＡＲＰを用いて処理し得る（「Ｔｈｅ  ＣＣＰ４  Ｓｕｉｔｅ：Ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ」，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｄ，５４：９０５−９２１，１９９７；ｄｅＬａ  Ｆｏｒｔｅｌｌｅ  ａｎｄ  Ｂｒｉｇｏｇｎｅ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２７６：４７２−４９４，１９９７）。位相が決定されると、ポリペプチドおよび複合体の電子密度図が作成され得る。
【００３７】
電子密度図は、ポリペプチドまたは複合体の表示あるいはポリペプチドまたは複合体の断片を得るために用いられ得、既知のポリペプチドまたは既知の複合体（例、リガンドに結合したポリペプチドを含む複合体）の三次元モデルを電子密度図に合わせた。この段階では、程度を示す比較モデルをもたらし、計算された電子密度図は、既知のポリペプチドまたは既知の複合体のモデルと異なる。続いて、比較モデルは、１以上のサイクル（例、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクル、１０サイクル）にわたって絞り込み、電子密度図とより良い適合を生じるＣＮＳ（Ｂｒｕｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５４：９０５−９２１，１９９８）などのソフトウェアプログラムは、モデルを絞り込むために用いられうる。比較モデルにおける適合の質は、例えば、ＲｗｏｒｋまたはＲｆｒｅｅ値により測定されうる。一般に、より小さなＲｗｏｒｋまたはＲｆｒｅｅ値は、より良い適合を示す。比較モデルにおけるミスアラインメントは、修正した比較モデルおよびより低いＲｗｏｒｋまたはＲｆｒｅｅ値を提供するために調整されうる。調整は、ヒトＰＲ−ＬＢＤ、タナプロゲト、既知のポリペプチドおよび／または既知の複合体に関する情報（例、配列情報）に基づきうる。一例として、リガンドに結合したポリペプチドの既知の複合体のモデルを用いる実施態様において、調整は、タナプロゲトを既知の複合体におけるリガンドで置換することを含みうる。別の例として、特定の実施態様において、調整は、ヒトＰＲ−ＬＢＤの対応する部位におけるアミノ酸で既知のポリペプチドにおけるアミノ酸を置換することを含みうる。修正した比較モデルの調整が電子密度図の最良適合を満たす場合、得られたモデルは、Ｘ線データから得たポリペプチドまたは複合体を記載するために決定される（例、ＰＲ−ＬＢＤ／タナプロゲト複合体）。そのような過程の方法は、例えば、ＣａｒｔｅｒおよびＳｗｅｅｔ，ｅｄｓ．，「Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ」ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２７７，Ｐａｒｔ  Ｂ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７、およびその引用文献、例えば、ＪｏｎｅｓおよびＫｊｅｌｄｇａａｒｄ，「Ｅｌｅｃｔｒｏｎ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｍａｐ  Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ」，ｐ．１７３、ならびにＫｌｅｙｗｅｇｔおよびＪｏｎｅｓ，「Ｍｏｄｅｌ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」，ｐ．２０８において開示されている。
【００３８】
いくつかの実施態様において、タナプロゲトに結合したヒトＰＲ−ＬＢＤの表示は、ヒトＰＲ−ＬＢＤに結合したプロゲステロンの以前決定した構造モデル（例、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．１ａ２８）をＸ線回折データから得たタナプロゲトに結合したヒトＰＲ−ＬＢＤの電子密度図で調整することにより選択されうる。モデリング過程において用いられ得る一の調整は、プロゲステロンをタナプロゲトで置換することを含みうる。
【００３９】
コンピュータなどの機械は、機械に連結されたディスプレー上に構造座標のグラフィック表示を作成しうるプログラムと共に、タナプロゲトに結合したヒトＰＲ−ＬＢＤの複合体の構造座標を用いてメモリー中にプログラミングされうる。別法または追加的に、ソフトウェアシステムは、構造座標を受け取り、格納するために設計および／または利用されうる。ソフトウェアシステムは、構造座標のグラフィック表示を作成することができる。ソフトウェアシステムはまた、ヒトＰＲ−ＬＢＤと同様の構造的特徴を有する化合物（例、ポリペプチド）を同定し、および／またはヒトＰＲ−ＬＢＤと相互作用する可能性がある候補物質（複数でも可）をレンダリングすることができる特性を有する１以上の候補物質を同定するために、外部データベースにアクセスすることができる。
【００４０】
構造データを有するメモリーを有する機械または該データを有するソフトウェアシステムは、ＰＲアゴニストおよび／またはＰＲアンタゴニストの理論的設計または選択に有用であり得る。例えば、そのような機械またはソフトウェアは、タナプロゲトに結合したヒトＰＲ−ＬＢＤの複合体に付随する物質の能力の評価に有用であり得、ＰＲ−ＬＢＤの構造または配列ホモロジーに関する化合物またはタンパク質のモデリングに有用であり得る。
【００４１】
機械は、タナプロゲトに結合したヒトＰＲ−ＬＢＤの複合体またはその断片の表示（例、二次元表示、三次元表示）をもたらしうる。ソフトウェアは、例えば、かかる情報を機械に作成させることができる。機械は、機械可読データでコードされたデータ格納マテリアルを含む機械可読データ格納媒体を含みうる。機械可読データは、タナプロゲトに結合したヒトＰＲ−ＬＢＤの複合体またはその断片の原子の構造座標を含みうる。機械可読格納媒体（例、データ格納マテリアル）は、例えば、慣用的なコンピュータのハードドライブ、フロッピーディスク、ＤＡＴテープ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤおよび他の磁気、光磁気、光媒体および機械（例、コンピュータ）との使用に適合させてもよい他の媒体を含む。機械はまた、機械可読データを処理するための命令の格納における作業メモリー、ならびに作業メモリーおよび好ましい三次元表示中に機械可読データ格納媒体に連結した中央演算処理装置（ＣＰＵ）を有しうる。ディスプレーは、三次元表示を使用者が見ることができるようにＣＰＵに連結しうる。したがって、データを用いるための命令がプログラミングされた機械（例、本明細書に記載した種類の１以上のプログラムを搭載したコンピュータ）を用いる場合、機械は、本明細書に記載のポリペプチド、ポリペプチド断片、複合体または複合体断片のグラフィック表示（例、二次元グラフィック表示、三次元グラフィック表示）を表示しうる。
【００４２】
ディスプレー（例、コンピュータディスプレー）は、タナプロゲトに結合したヒトＰＲ−ＬＢＤの複合体またはその断片を表示しうる。使用者は、表示を調べ、表示から得た情報を用いて、タナプロゲト以外の物質を含む複合体またはその断片のモデルを生成することができる。かかるモデルは、例えば、ヒトＰＲ−ＬＢＤ／タナプロゲト複合体の従来の表示を変換することにより生成させることができる。所望により、使用者は、タナプロゲトに結合したヒトＰＲ−ＬＢＤの表示上に物質の三次元モデルを重ね合わせうる。物質は、ヒトＰＲ−ＬＢＤのアゴニスト（例、候補アゴニスト）またはヒトＰＲ−ＬＢＤのアンタゴニスト（例、候補アンタゴニスト）であり得る。いくつかの実施態様において、物質は、既知化合物または化合物の断片であり得る。特定の実施態様において、物質は、これまで知られていない化合物、またはこれまで知られていない化合物の断片であり得る。
【００４３】
物質が、活性部位の形状を補完する形状を有することは、好ましいであろう。物質の原子とＰＲポリペプチドの原子間には好ましい距離、または距離の範囲があり得る。好ましい距離より長い距離は、物質と活性部位（例、ヒトＰＲ−ＬＢＤ）の間の弱い相互作用と関連しうる。好ましい距離より短い距離は、物質とポリペプチドの間の相互作用を弱めうる斥力と関連しうる。原子間距離が短すぎる場合、立体的衝突が起こり得る。２個の原子の位置が不当に相互に接近する場合、例えば、２個の原子がそれらのファン・デル・ワールス半径の合計未満の距離で離れている場合、立体的衝突が起こる。立体的衝突が存在する場合、使用者は、立体的衝突が取り除かれるまで、ＰＲポリペプチドに関する物質の位置を調整しうる（例、物質の剛体の並進または回転）。使用者は、物質または立体的衝突を取り除くために物質の近接のＰＲポリペプチドの構造を調整しうる。立体的衝突はまた、物質の構造を改変すること、例えば、芳香族環などの「巨大な基」をメチルまたはヒドロキシル基などのより小さな基に変換すること、またはリジッドな基を、立体的衝突を生じない立体構造を与えうるフレキシブルな基に変換することにより取り除かれうる。静電気力はまた、物質とリガンド結合ドメインの間の相互作用に影響しうる。例えば、静電的性質は、斥力に関連し、物質とＰＲポリペプチドの間の相互作用を弱めうる。静電反発力は、物質の電荷を変化させることにより、例えば、正に荷電した基を中性の基に変換することにより取り除かれうる。
【００４４】
タナプロゲトとヒトＰＲ−ＬＢＤの間の結合活性に影響を与える力は、ポリペプチド／物質モデルにおいて評価されうる。これらは、例えば、水素結合、静電気力、疎水性相互作用、ファン・デル・ワールス相互作用、双極子−双極子相互作用、π−スタッキング力およびカチオン−π相互作用を包含しうる。使用者は、視覚的にこれらの力を、例えば、水素結合に適当な距離および角度で配置した水素結合供与体／受容体対に留意することにより評価しうる。該評価に基づいて、使用者は、ＰＲポリペプチドと物質の間のより有利な相互作用を見出すためにモデルを改変しうる。該モデルを改変することは、該化学構造を改変することなく、例えば、アミノ酸の側鎖の構造または骨格のねじれ角を改変することによりポリペプチドの三次元構造を変換することを包含しうる。該モデルを改変することは、上記に記載の物質の位置または構造を改変することを包含しうる。該モデルを改変することはまた、例えば、基を置換すること、付加することまたは除去することにより物質の化学構造を改変することを包含しうる。例えば、ＰＲポリペプチド上の水素結合供与体が、物質上の水素結合供与体近接に位置する場合、使用者は、物質上の水素結合供与体を水素結合受容体に置換しうる。
【００４５】
物質とＰＲポリペプチドの相対的位置またはその構造は、ＰＲポリペプチドに対する特定の物質の最適化結合構造を見出すために調整されうる。最適化結合構造は、例えば、好ましい水素結合距離および角度、最大静電気引力、最大静電反発力、水性環境からの疎水性部分の隔離および立体的衝突の非存在により特徴付けられる。最適化構造は、ＰＲポリペプチド／物質複合体における一群の可能な構造の中で算出された最低エネルギーを有しうる。最適化された構造は、例えば、分子力学または分子動力学計算を通じて決定されうる。
【００４６】
タナプロゲトが異なった物質と置換または重ね合わされる、タナプロゲトに結合したヒトＰＲ−ＬＢＤの複合体の一連の表示が、作成されうる。スコアは、各表示において算出されうる。かかるスコアは、例えば、ヒトＰＲ−ＬＢＤと物質の間の相互作用の期待した活性を示しうる。スコアは、結合活性に影響を与える上記に記載の一つの因子を示しうる。該スコアは、一つ以上の因子を示す総スコアでありうる。異なる物質は、それらのスコアにしたがって順位を付けられうる。
【００４７】
物質の設計における工程は、機械により自動化方法にて実行されうる。例えば、ＰＲ−ＬＢＤの表示は、候補物質の表示と共に、機械にプログラミングされうる。かかる機械は、活性部位に対する各候補物質の最適化結合構造を見出し、スコアを計算し、一連の物質のうち、どの物質がヒトＰＲ−ＬＢＤと最も強力に相互作用する可能性があるかを決定しうる。
【００４８】
ソフトウェアシステムは、これらの工程を促進するために設計および／または実行されうる。かかる三次元モデルを作成するか、または必要な適合解析を実行するために用いられるソフトウェアシステム（例、コンピュータプログラム）は：Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのＭＣＳＳ、Ｌｕｄｉ、ＱＵＡＮＴＡ、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ、Ｃｅｒｉｕｓ２、ＣＨＡＲＭｍおよびＭｏｄｅｌｅｒ；ＴＲＩＰＯＳ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からのＳＹＢＹＬ，Ｕｎｉｔｙ，ＦｌｅＸＸおよびＬＥＡＰＦＲＯＧ；ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）；ＧＲＩＤ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）；ＤＯＣＫ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）；ならびにＦｌｏ＋およびＦｌｏ９９（Ｔｈｉｓｔｌｅｓｏｆｔ，Ｍｏｒｒｉｓ  Ｔｏｗｎｓｈｉｐ，ＮＪ）を含むが、これに限定されるわけではない。他の有用なプログラムは、Ｏｐｅｎｅｙｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓａｎｔａ  Ｆｅ，ＮＭ）からのＲＯＣＳ，ＺＡＰ，ＦＲＥＤ，ＶｉｄａおよびＳｚｙｂｋｉ；Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）からのＭａｅｓｔｒｏ，ＭａｃｒｏｍｏｄｅｌおよびＧｌｉｄｅ；ＭＯＥ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ），Ａｌｌｅｇｒｏｗ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｄｅ  Ｎｏｖｏ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ），ＣＮＳ（Ｂｒｕｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌ．Ｓｅｃｔ．Ｄ５４：９０５−９２１，１９９７）ならびにＧＯＬＤ（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４５：４３−５３，１９９５）を含む。構造座標はまた、ＭＯＬＳＣＲＩＰＴ，ＲＡＳＴＥＲ３ＤまたはＰＹＭＯＬ（Ｋｒａｕｌｉｓ，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２４：９４６−９５０，１９９１；ＢａｃｏｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈ．６：２１９−２２０，１９９８；ＤｅＬａｎｏ，Ｔｈｅ  ＰＹＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（２００２）ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）を用いてＰＫＣθの三次元構造を可視化するために用いられうる。
【００４９】
アゴニストまたはアンタゴニストのいずれかの物質は、例えば、適当なデータベースをスクリーニングすることにより選択され、適当なソフトウェアシステムと連動して非結合ヒトＰＲ−ＬＢＤの立体配置および電荷電位を解析することにより新たに設計され、および／またはプロゲステロン受容体または他のホルモン受容体の既知のアゴニストまたはアンタゴニストの特性を用いて設計されうる。かかる方法は、ヒトＰＲ−ＬＢＤのアゴニストまたはアンタゴニストを設計または選択するために用いられうる。ソフトウェアシステムは、データベース検索、および／または物質の選択および設計を促進するために設計および／または実行されうる。
【００５０】
物質が設計または同定された時点で、それを入手または合成してもよく、さらにヒトＰＲ−ＬＢＤ活性に対するその効果を評価してもよい。例えば、物質は、ヒトＰＲ−ＬＢＤと物質を接触させることおよびポリペプチド活性に対する物質の効果を測定することにより評価されうる。物質を評価するための方法は、インビトロまたはインビボで行われる活性アッセイを含みうる。活性アッセイは、例えば、細胞に基づいたアッセイであり得る。ヒトＰＲ−ＬＢＤに対する物質の活性によれば、物質は、ヒトＰＲ−ＬＢＤ活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用しうる。物質はまた、物質がプロゲステロンとポリペプチドの結合を阻害するかどうかを決定するためにプロゲステロン存在下にてポリペプチドと接触されうる。同定された物質に結合したヒトＰＲ−ＬＢＤを含有する結晶は、成長し得、かかる構造はＸ線結晶学により決定した。第二物質は、ヒトＰＲ−ＬＢＤと第一物質の相互作用に基づいて設計または同定されうる。
【００５１】
様々な分子分析および理論的薬剤設計の技法は、例えば、米国特許第５，８３４，２２８号、第５，９３９，５２８号および第５，８５６，１１６号ならびにＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１６８７９、公報ＷＯ９９／０９１４８においてさらに開示されている。
【００５２】
特定の実施態様を記載するが、他の実施態様も考えられる。
一例として、ヒトＰＲ−ＬＢＤおよびタナプロゲトを含む実施態様が記載されているが、本明細書の記載は、より一般に、ＰＲポリペプチドおよび非ステロイド性リガンドを対象とする。
【００５３】
ＰＲポリペプチドは、ＰＲポリペプチドのアイソフォームの全長アミノ酸配列を含有する、全長の成長したポリペプチドでありうる。アイソフォームは、一次構造が異なるタンパク質の様々な多型のいずれかである。例えば、ヒトプロゲステロン受容体は、少なくとも２個のアイソフォーム、Ｐｒ−Ｂ（全長ＰＲ）およびＰｒ−Ａ（Ｎ−末端切断ＰＲ）で存在する。２個のアイソフォームは、単一遺伝子から転写されるが、異なる転写開始部位を有する。したがって、アイソフォームは、Ｐｒ−Ｂがさらに１６４のＮ末端アミノ酸を含有することを除いて同一である。アイソフォームは、同一中心部のＤＮＡ結合ドメインを有し、転写活性機能−１（ＡＦ−１）ドメインのＮ末端、および核局在化シグナルおよびリガンド結合ドメイン（ＰＲ−ＬＢＤ）を含有するヒンジ領域のＣ末端の側面に位置する。第二転写活性機能ドメイン（ＡＦ−２）は、ＰＲ−ＬＢＤ中に位置する。
【００５４】
ＰＲポリペプチドは、リガンド結合ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、タンパク質相互作用ドメイン（例、活性化ドメイン）またはその組み合わせなどのＰＲの断片でありうる。
【００５５】
ＰＲポリペプチドは、活性部位を有しうる。一般に、活性部位は、リガンド結合部位またはリン酸化、グリコシル化、アルキル化、アシル化もしくは他の共有結合修飾の部位を含みうる。リガンド結合部位は、リガンドとの相互作用における活性に影響を及ぼしてもよい実際の結合部位と隣接または近接する付属結合部位を含みうる。ＰＲポリペプチドの活性部位は、配列番号２のアミノ酸を含有しうる。例えば、ＰＲポリペプチドの活性部位は、配列番号２に記載のＩｌｅ６９９、Ａｌａ７０１、Ｌｅｕ７１４、Ｌｅｕ７１５、Ｌｅｕ７１８、Ａｓｎ７１９、Ｌｅｕ７２１、Ｇｌｎ７２５、Ｔｒｐ７５５、Ｍｅｔ７５６、Ｍｅｔ７５９、Ｖａｌ７６０、Ｌｅｕ７６３、Ａｒｇ７６６、Ｓｅｒ７６７、Ｔｙｒ７７７、Ｐｈｅ７７８、Ａｌａ７７９、Ｌｅｕ７８２、Ｐｈｅ７９４、Ｌｅｕ７９７、Ｌｙｓ７９８、Ｍｅｔ８０１、Ｉｌｅ８０４、Ｌｅｕ８８７、Ｈｉｓ８８８、Ｔｙｒ８９０、Ｃｙｓ８９１、Ａｓｎ８９３、Ｔｈｒ８９４、Ｐｈｅ８９５、Ｓｅｒ８９８、Ｌｅｕ９０１、Ｖａｌ９０３、Ｐｈｅ９０５、Ｍｅｔ９０９、Ｉｌｅ９１３およびＬｅｕ９１７の１以上のアミノ酸を含有しうる。
【００５６】
ＰＲポリペプチドのアミノ酸の番号は、本明細書に記載のものと異なっていてもよく、ＰＲポリペプチドの配列は、同様の三次元構造をもたらす特定の保存的アミノ酸置換を含んでいてもよい。例えば、ＰＲ−ＬＢＤの番号は、図２Ｂに記載のものと異なっていてもよく、ＰＲ−ＬＢＤの配列は、保存的アミノ酸置換を含むが、表２の座標に記載され、図１Ａおよび１Ｂに示されるような同様の構造をもたらしてもよい。他のアイソフォームまたは類似体における類似アミノ酸および保存的置換は、関連アミノ酸配列の目視検査または商業的に入手可能なホモロジーソフトウェアプログラム（例、ＭＯＤＥＬＬＡＲ、ＭＳＩ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の使用により容易に同定される。
【００５７】
類似体は、保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドである。保存的置換は、１個のアミノ酸を、同様の極性、立体配置を有するか、または同じクラス（例、疎水性、酸性または塩基性）に属する別のものに置換することを含み得、ポリペプチド（例、ＰＲ−ＬＢＤ）と相互作用する物質の同定および設計ならびに分子置換分析および／またはホモロジーモデリングに関して、ＰＲポリペプチドの三次元構造に対して重要でない効果を有する置換を含む。
【００５８】
ＰＲポリペプチドは、非哺乳類または哺乳類に由来しうる。哺乳類のＰＲポリペプチドは、例えば、ヒト由来でありうる。典型的なヒト以外の哺乳類は、ヒト以外の霊長類（サルまたは類人猿など）、マウス、ラット、ヤギ、雌牛、雄牛、豚、馬、羊、イノシシ、ラッコ、猫および犬を含む。典型的な非哺乳類は、ニワトリ、七面鳥、エビ、アリゲータおよび魚を含む。
【００５９】
別の例として、実施態様はタナプロゲトがリガンドであると記載されているが、より一般的な他の非ステロイド性化合物もリガンドとして用いてもよい。例えば、結晶複合体の構造から得られたタナプロゲトに結合したヒトＰＲ−ＬＢＤの表示に基づいて、学説に制約されることなく：タナプロゲトのカルボニトリロ窒素は、ヒトＰＲ−ＬＢＤのＧｌｎ７２５およびＡｒｇ７６６の側鎖と水素結合を形成し；タナプロゲトのベンゾオキサジン窒素は、ヒトＰＲ−ＬＢＤのＡｓｎ７１９の側鎖の酸素と水素結合を形成し；疎水性相互作用は、ヒトＰＲ−ＬＢＤのＬｅｕ７９７とタナプロゲトの（４位中に対のメチル置換基を含有する）ベンゾオキサジン部の疎水性領域の間に生じ；および静電相互作用は、ヒトＰＲ−ＬＢＤのＴｈｒ８９４とタナプロゲトの硫黄の間に生じることが考えられる。
【００６０】
この情報に基づいて、学説に制約されることなく、ヒトＰＲ−ＬＢＤとの１以上の同様の相互作用を有しうる他の非ステロイド性化合物はまた、ヒトＰＲ−ＬＢＤにおけるリガンド（例、アゴニスト、アンタゴニスト）として作用してもよいと考えられる。そのような非ステロイド性化合物は、構造式：
【化２】
2008510722.tif 000004
［式中、Ａ，ＢおよびＣは環系を意味し、ＢおよびＣは縮合した環であり、Ｌはリンカー部分である］
を有していてもよい。
【００６１】
一般に、環Ａ、ＢおよびＣは、各々独立して、少なくとも４原子（例、５原子、６原子、７原子、８原子、９原子、１０原子、１１原子、１２原子、１３原子、１４原子）にて形成される。環Ａ、Ｂおよび／またはＣにおける１以上の原子（例、１原子、２原子、３原子、４原子、５原子）は、独立して、ヘテロ原子（例、Ｎ、Ｓ、Ｏ）であり得る。いくつかの実施態様において、環ＢおよびＣは、インドール、オキシインドール、チオインドール、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、ベンゾチアゾール、ベンズイミダゾール、ベンゾオキサジンまたはベンズチアジン（ｂｅｎｚｔｈｉａｚｉｎｅ）を形成する。一の実施態様において、環ＢおよびＣは、４位に少なくとも１個の疎水性置換基を有しうるベンゾオキサジン環を形成しうる。別の実施態様において、ベンゾオキサジン環は、４位の近隣、例えば、５位に少なくとも１個の疎水性置換基を有しうる。ベンゾオキサジン誘導体は、例えば、米国特許第６，５６２，８５７号に記載されており、これを出典明示により本明細書の一部とする。環Ａは、例えば、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾールまたはフェニルでありうる。いくつかの実施態様において、環Ａ、Ｂおよび／またはＣは、各々独立して、１以上（例、１、２、３、４）の置換基（例、例えば、水素結合、疎水性相互作用および／または静電相互作用などを介してヒトＰＲ−ＬＢＤとの好ましい相互作用を提供する１以上の置換基）を含有しうる。置換基の例として、ヒドロキシ基、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、オキシム基、チオール基、アミド基、オキソ基、アルキル基例、１−６個の炭素原子を有するアルキル基、アルケニル基、例、２−６個の炭素原子を有するアルケニル基、アルキニル基、例、２−６個の炭素原子を有するアルキニル基、アリール基、例、６−２０個の環炭素原子を有する芳香族炭素環式単環式または多環式環系、シクリル基、例、３−１４個の環原子を有する飽和されたまたは部分的に飽和された単環式または多環式炭素環式環系、ヘテロアリール基、例、５−１４個の環原子を有し１、２、３または４個の環原子がＮ、ＯまたはＳから選択される芳香族複素環単環式または多環式環系、ヘテロシクリル基、例、３−１４個の環原子を有し１、２、３または４個の環原子がＮ、ＯまたはＳから選択される飽和されたまたは部分的に飽和された単環式または多環式複素環系ならびにハロゲン（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）が挙げられる。いくつかの実施態様において、置換基自体は、ヒトＰＲ−ＬＢＤとの水素結合供与体または受容体であってもよいが、他の実施態様において、置換基は、水などの１以上の溶媒分子を介してヒトＰＲ−ＬＢＤの一部と水素結合を形成してもよい。
【００６２】
一般に、Ｌは直接の化学結合であり得、またはＬは、例えば、アルキル部、例、１−６個の炭素原子を有するアルキル部、アルケニル部、例、２−６個の炭素原子を有するアルケニル部、アルキニル部、例、２−６個の炭素原子を有するアルキニル部、エーテル部、チオエーテル部、アミド部、カルボニル部またはスルホニル部などの化学的基の形状を成しうる。いくつかの実施態様において、Ｌは、複数の基（例、アルキル部と結合したスルホニル部）の形状を成しうる。
【００６３】
実施態様は、非ステロイド性化合物が一緒になって縮合した環ＢおよびＣを含有すると記載されているけれども、いくつかの実施態様において、環ＢおよびＣは、化学的リンカーにより結合されうる。例えば、環Ｂは、環Ａと環Ｃが結合するリンカー部分で置換されうる。リンカーの例は、上記に記載されている。特定の実施態様において、環Ｂは存在しない。例えば、環Ｂは、環Ａと環Ｃが結合するリンカー部分と置換されうる。リンカー部分は、例えば、環ＡとヒトＰＲ−ＬＢＤの片側または両側のＧｌｕ７２５またはＡｒｇ７６６の間の好ましい相互作用を可能とする十分な長さでありうる。例えば、環Ｂは、分岐アルケンなどのアルケニルリンカーと置換され得、十分な長さ、構造的硬直性および好ましい体積を提供しうる（例、リンカー部分は分岐アルケニル部分を含有しうる）。
【００６４】
下記の実施例は本発明を説明するものであって、限定を意図するものではない。
【実施例】
【００６５】
ヒトプロゲステロンリガンド結合ドメイン（ＰＲ−ＬＢＤ）を、大腸菌ＢＬ２１（ストラタジーン）からアミノ末端グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として発現した。ＰＲ−ＬＢＤドメインコード配列を、ｔａｃ転写制御の下で、ｐＧＥＸプラスミド（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中にクローニングした。トロンビン開裂部位（ＬＶＰＲＧ、配列番号３）は、ＧＳＴとＰＲ−ＬＢＤ領域の境界に存在した（トロンビンはＲとＧの間で開裂する）。該融合タンパク質の配列を、図２Ａに示す。トロンビン開裂後のＰＲ−ＬＢＤポリペプチドの配列を、図２Ｂに示す。
【００６６】
細菌増殖およびタンパク質発現を、Ｂｉｏｓｔａｔ１０リットル発酵槽（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で行った。１００ｍｌの前処理培養物を、１０リットルの培地（発酵槽塩、グルコース、アンピシリン、微量金属および酵母エキス培地）に植菌するために用い、２５℃で一晩膨張させた。誘導１５分前に、容器温度を１５℃に下げ、１００％エタノール中５ｍｌの６６ｍＭプロゲステロン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加した。培養物を、イソプロピル−ベーター−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、Ｆｉｓｈｅｒ）を添加して５．４  ＯＤ６００の吸収単位の濃度で誘発し、最終濃度を１．０ｍＭとした。プロゲステロンを、発現中の誘導期間およびその後１５分毎に６６ｍＭを５ｍｌに小分けして再度添加した（全４時間、プロゲステロン最終濃度６６０μＭ）。誘導の４時間後、湿った細胞の重さとして１５８．７６ｇの収量で培養物を集菌した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで予測した場合、関連タンパク質は、全細胞タンパクの５−７％を示した。ＰＲ−ＬＢＤの単離の成功は、発現（適当なタンパク質の折り畳みを確実にすると考えられる）および精製中のＰＲリガンドの介在に強く依存する。例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｓｉｇｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：３９２−３９６，１９９８；Ｔａｎｅｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：５９９８−６００３，１９９８；およびＭａｔｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２６１６４−２６１７１，２０００参照。タナプロゲトを、精製中プロゲステロンと交換した。
【００６７】
２０ｇの凍結細胞を、０．３３ｍＭのプロテアーゼ阻害剤フッ化アミノエチルベンゼンスルホニル（ＡＥＢＳＦ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．３ｍＬのプロテアーゼ阻害剤カクテル（ｃｏｃｋｔａｉｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ｃａｔａｌｏｇ  ｎｕｍｂｅｒ  ８８４９）および５μＭプロゲステロン（プロゲステロンを、ジメチルスルホキシド中５０ｍＭストック溶液として保存）と、３００ｍＬのｐＨ７．３の５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）中で懸濁した。細胞を、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（Ｍｉｄｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）に通して破砕した。細胞残屑および凝集ＧＳＴ／ＰＲ−ＬＢＤを、約４０，０００ｇで２．５時間遠心分離により除去した。ＣＨＡＰＳ（Ｓｉｇｍａ）を１．５％に添加し、溶液を、０．４５ミクロンセルロース硝酸塩フィルターに通し、一晩保存した。
【００６８】
ＧＳＴ／ＰＲ−ＬＢＤ融合タンパク質の最初の精製を、アフィニティークロマトグラフィーにより行った。濾過した溶液を、約１ｍＬ／分の流速でＧＳＴｒａｐ  ＦＦ  グルタチオン−セファロースクロマトグラフィー培地（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の２個の５ｍＬカラムに（直列で）通した。樹脂を、５０ｍＬのｐＨ７．３の５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロールで、次いで、５０μＭタナプロゲトを含有する５０ｍＬの同様の溶液で洗浄した。ＧＳＴ／ＰＲ−ＬＢＤを、ｐＨ７．３の５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．１％オクチル−β−グルコシドおよび５０μＭタナプロゲト中１２ｍＭ還元グルタチオン（Ｓｉｇｍａ）で溶出した。５ｍＬのフラクションを収集した。ＧＳＴ／ＰＲ−ＬＢＤを含有するこれらのフラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定し、プールした。典型的なプールしたフラクションは、全容量３０−４０ｍＬを有した。トロンビンを、２５，０００  ＮＩＨ  単位／ｍＬに添加した。溶液を、特定のタンパク質分解のために一晩インキュベートした。
【００６９】
溶液を、４容量のｐＨ７．３の１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０％グリセロール、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％オクチル−β−グルコシドおよび５０μＭタナプロゲトで希釈した。溶液を、１ｍＬ／分の流速でＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＦＦスルホプロピル−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の１ｍＬカラムに通した。カラムを、５ｍＬのｐＨ７．３の１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．１％オクチル−β−グルコシドおよび１μＭタナプロゲトで洗浄した（タナプロゲトを、ジメチルスルホキジド中５０ｍＭストック溶液として保存した）。ＰＲ−ＬＢＤを、１５ｍＬの塩化ナトリウムの２０ｍＭから２２０ｍＭの勾配（他の成分は上記の通り）でカラムから溶出した。１ｍＬのフラクションを収集し、ＰＲ−ＬＢＤをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより特定し、１ないし２ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＲ／ＬＢＤを含有するこれらのフラクションを結晶化に直接用いた。
【００７０】
結晶化前に、ＰＲ−ＬＢＤ／タナプロゲト複合体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同種であると決定した。ＭＡＬＤＩ質量分析（〜２９，８００Ｄａ）により決定すると、タンパク質は予測した質量を有していた。タンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィー中に、一種類として作用した。保持容積を比較タンパク質と比較すると、ＰＲ−ＬＢＤ二量体と一致した。見出したプロゲステロンではなくＰＲ−ＬＢＤ／タナプロゲト複合体のこれらの調製のみを、結晶化に用いた。結合リガンドを、グアニジン−ＨＣｌの存在下、タンパク質変性にしたがって逆相クロマトグラフィーにより分析した。
【００７１】
結晶を、１８℃でハンギングドロップ蒸気拡散法により成長させた。２．０μＬのタンパク質ストック溶液（５ｍｇ／ｍＬタンパク質、ｐＨ７．３の１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０％グリセロール、５ｍＭ  ＤＴＴ、〜１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％オクチル−β−グルコシド、１μＭタナプロゲト）を含有したドロップを、１．０μＬウェル溶液（８％ＰＥＧ  ３３５０（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、３００ｍＭ  ＭｇＳＯ４、ｐＨ６．５の５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、１０％グリセロール）および０．５μＬの１，３−プロパンジオール（４０％ｖ／ｖ、Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と合わせ、１ｍＬウェル溶液に対して平衡化した。ダイヤモンド型結晶は２−６週で成長し、直径〜５０μｍを測定した。
【００７２】
多数の小結晶は、様々な硫酸塩と上記に記載の条件にて成長させた。核形成現象の数は、ドロップに１，３−プロパンジオール（４０％ｖ／ｖ）を添加すると減少され、より少なく、より大きい単結晶に成長させることを可能にした。結晶は、単位格子パラメーターａ＝５７．５２Å、ｂ＝６４．５０Å、ｃ＝７０．４１Åおよびβ＝９５．７６°の空間群Ｐ２１に属し、ならびに４４％の溶媒容量を含む非対称ユニットでＰＲ−ＬＢＤの２分子を含有していた。結晶を、２０％エチレングリコールおよび８０％ウェル溶液の抗凍結剤溶液を通して取り出し、液体窒素で急速に冷却した。回折データを、Ｒ軸４検出器（Ｒ−ａｘｉｓ  ４  ｄｅｔｅｃｔｏｒ）に記録した。強度を統一し、プログラムＤｅｎｚｏおよびＳｃａｌｅｐａｃｋ（ＯｔｗｉｎｏｗｓｋｉおよびＭｉｎｏｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７６：３０７−３２６、１９９７）を用いて測定した。
【００７３】
構造を、探索モデルとしてＰＲ−ＬＢＤ／プロゲステロン構造のタンパク質モデル（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＳｉｇｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：３９２−３９６、１９９８）を用いて分子置換により解いた。ＣＮＳ（Ｂｒｕｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５４：９０５−９２１、１９９８）および改良モデルを用いて改良の多数の反復性サイクルに付した後、タナプロゲトは置かれ、改良された。ＲｗｏｒｋおよびＲｆｒｅｅの最終値は、各々、１９．６２％および２３．７４％であった。表１は、データ収集パラメーターおよび結果を要約する。
【表１】
2008510722.tif 000005
【００７４】
改良モデルは、結晶の非対称ユニットにおいて２個のＰＲ−ＬＢＤ分子を含有し、各々１個のアゴニストと結合していた。タナプロゲトは、埋まった疎水性リガンド結合ポケットにフィットし、プロゲステロンとほぼ同一の領域を占有する。
【００７５】
核内受容体リガンド結合ドメインの本質的特性は、ＰＲ−ＬＢＤ中に保存された。１０個のへリックス（標準ステロイド受容体用語にしたがって、へリックス２は欠落しており、へリックス１０および１１は連続している）があり、へリックス３、５、７、１１および１２はリガンド結合ポケットに寄与した。結晶における２個のＰＲ−ＬＢＤ分子は、一のサブユニットのへリックス１１と他のへリックス１２の間の相互作用を中心とした二量体を形成した。
【００７６】
ＰＲ−ＬＢＤ／タナプロゲトの三次構造は、ＰＲ−ＬＢＤ／プロゲステロンの構造と非常に類似していた。タナプロゲトは、プロゲステロンと同様の結合ポケットを占有した。リガンド相により不偏でおよび１．２σに曲がったＰＲ−ＬＢＤに結合したタナプロゲトの３Ｆｏｂｓ−２Ｆｃａｌｃ実験マップの見解を示す、図１Ａおよび１Ｂ参照。ＰＲ−ＬＢＤ／タナプロゲト複合体およびＰＲ−ＬＢＤ／プロゲステロン複合体の構造の重ね合わせは、１−メチル−１Ｈ−ピロール−２−カルボニトリル環は、プロゲステロンのＡとＢの環の間に無作為に置かれ、１，４−ジヒドロ−３，１−ベンゾオキサジン−２−チオン部分（「ベンゾオキサジン」）は、プロゲステロンのメチル基が突き出す方向のプロゲステロンのＣおよびＤの環の真上に置かれることを示した。
【００７７】
タナプロゲトは、多くの点でＰＲ−ＬＢＤのリガンド結合ポケットとプロゲステロンの相互作用を再現した。ニトリル基は、プロゲステロンのＡ環の３−ケト置換基から約０．６Åに位置し、Ｇｌｎ７２５およびＡｒｇ７６６の側鎖と水素結合を形成した。同様に、プロゲステロンの３−ケト基は、Ｇｌｎ７２５およびＡｒｇ７６６の側鎖と相互作用し、水素結合ネットワークを維持し、Ａ環の３位の酸素原子とステロイドの特異性を提供する。ベンゾオキサジン部は、同様の疎水性相互作用を有するプロゲステロンの環ＣおよびＤと略同一の空間を占有した。ベンゾオキサジンの硫黄は、プロゲステロンのＣ１７のメチル−ケトン置換基よりも伸びているように考えられた。タナプロゲトは、ベンゾオキサジンの窒素とＡｓｎ７１９の側鎖の酸素の間に形成した水素結合におけるタンパク質とさらに好ましい相互作用を有していた。へリックス６とへリックス７の間のループは、アミノ酸７８８−７９４を含有し、ＰＲ−ＬＢＤ／プロゲステロン構造に関して転位された。しかしながら、一のタナプロゲトのベンゾオキサジンのメチル置換基からＰｈｅ７９４の側鎖までの領域におけるタナプロゲトとＰＲ−ＬＢＤの間の最も短い距離が５Åである場合、かかる転位は、直接、異なるリガンドによるものであるとは考えられなかった。タナプロゲトの硫黄原子が、ＰＲ−ＬＢＤのＴｈｒ８９４と弱い相互作用を形成してもよく、ベンゾオキサジン分子上の疎水性領域が、受容体ＬＢＤのＬｅｕ７９７と好ましい疎水性相互作用を形成することをかかる構造は示した。
【００７８】
多数の側鎖は他のもの（分子「Ｂ」）ではなく、非対称ユニットの１分子（分子「Ａ」）における実験的電子密度によりはっきりと定義した。これらの側鎖は：Ｍｅｔ９０８、Ｐｈｅ７９４、Ｔｒｐ７５５およびＬｅｕ７１４を含有する。Ｍｅｔ９０８は、分子「Ａ」において多少無秩序であり、１以上の回転異性体とともに電子密度で表された
【００７９】
【表２−１】
2008510722.tif 000006
【００８０】
【表２−２】
2008510722.tif 000007
【００８１】
【表２−３】
2008510722.tif 000008
【００８２】
【表２−４】
2008510722.tif 000009
【００８３】
【表２−５】
2008510722.tif 000010
【００８４】
【表２−６】
2008510722.tif 000011
【００８５】
【表２−７】
2008510722.tif 000012
【００８６】
【表２−８】
2008510722.tif 000013
【００８７】
【表２−９】
2008510722.tif 000014
【００８８】
【表２−１０】
2008510722.tif 000015
【００８９】
【表２−１１】
2008510722.tif 000016
【００９０】
【表２−１２】
2008510722.tif 000017
【００９１】
【表２−１３】
2008510722.tif 000018
【００９２】
【表２−１４】
2008510722.tif 000019
【００９３】
【表２−１５】
2008510722.tif 000020
【００９４】
【表２−１６】
2008510722.tif 000021
【００９５】
【表２−１７】
2008510722.tif 000022
【００９６】
【表２−１８】
2008510722.tif 000023
【００９７】
【表２−１９】
2008510722.tif 000024
【００９８】
【表２−２０】
2008510722.tif 000025
【００９９】
【表２−２１】
2008510722.tif 000026
【０１００】
【表２−２２】
2008510722.tif 000027
【０１０１】
【表２−２３】
2008510722.tif 000028
【０１０２】
【表２−２４】
2008510722.tif 000029
【０１０３】
【表２−２５】
2008510722.tif 000030
【０１０４】
【表２−２６】
2008510722.tif 000031
【０１０５】
【表２−２７】
2008510722.tif 000032
【０１０６】
【表２−２８】
2008510722.tif 000033
【０１０７】
【表２−２９】
2008510722.tif 000034
【０１０８】
【表２−３０】
2008510722.tif 000035
【０１０９】
【表２−３１】
2008510722.tif 000036
【０１１０】
【表２−３２】
2008510722.tif 000037
【０１１１】
【表２−３３】
2008510722.tif 000038
【０１１２】
【表２−３４】
2008510722.tif 000039
【０１１３】
【表２−３５】
2008510722.tif 000040
【０１１４】
【表２−３６】
2008510722.tif 000041
【０１１５】
【表２−３７】
2008510722.tif 000042
【０１１６】
【表２−３８】
2008510722.tif 000043
【０１１７】
【表２−３９】
2008510722.tif 000044
【０１１８】
【表２−４０】
2008510722.tif 000045
【０１１９】
【表２−４１】
2008510722.tif 000046
【０１２０】
【表２−４２】
2008510722.tif 000047
【０１２１】
【表２−４３】
2008510722.tif 000048
【０１２２】
【表２−４４】
2008510722.tif 000049
【０１２３】
【表２−４５】
2008510722.tif 000050
【０１２４】
【表２−４６】
2008510722.tif 000051
【０１２５】
【表２−４７】
2008510722.tif 000052
【０１２６】
【表２−４８】
2008510722.tif 000053
【０１２７】
【表２−４９】
2008510722.tif 000054
【０１２８】
【表２−５０】
2008510722.tif 000055
【０１２９】
【表２−５１】
2008510722.tif 000056
【０１３０】
【表２−５２】
2008510722.tif 000057
【０１３１】
【表２−５３】
2008510722.tif 000058
【０１３２】
【表２−５４】
2008510722.tif 000059
【０１３３】
【表２−５５】
2008510722.tif 000060
【０１３４】
【表２−５６】
2008510722.tif 000061
【０１３５】
【表２−５７】
2008510722.tif 000062
【０１３６】
【表２−５８】
2008510722.tif 000063
【０１３７】
【表２−５９】
2008510722.tif 000064
【０１３８】
【表２−６０】
2008510722.tif 000065
【０１３９】
【表２−６１】
2008510722.tif 000066
【０１４０】
【表２−６２】
2008510722.tif 000067
【０１４１】
【表２−６３】
2008510722.tif 000068
【０１４２】
【表２−６４】
2008510722.tif 000069
【０１４３】
【表２−６５】
2008510722.tif 000070
【０１４４】
【表２−６６】
2008510722.tif 000071
【０１４５】
【表２−６７】
2008510722.tif 000072
【０１４６】
【表２−６８】
2008510722.tif 000073
【０１４７】
【表２−６９】
2008510722.tif 000074
【０１４８】
【表２−７０】
2008510722.tif 000075
【０１４９】
【表２−７１】
2008510722.tif 000076
【０１５０】
【表２−７２】
2008510722.tif 000077
【０１５１】
【表２−７３】
2008510722.tif 000078
【０１５２】
【表２−７４】
2008510722.tif 000079
【０１５３】
【表２−７５】
2008510722.tif 000080
【０１５４】
【表２−７６】
2008510722.tif 000081
【０１５５】
【表２−７７】
2008510722.tif 000082
【０１５６】
【表２−７８】
2008510722.tif 000083
【０１５７】
【表２−７９】
2008510722.tif 000084
【０１５８】
【表２−８０】
2008510722.tif 000085
【０１５９】
【表２−８１】
2008510722.tif 000086
【０１６０】
【表２−８２】
2008510722.tif 000087
【０１６１】
（他の実施態様）
多数の本発明の実施態様が記載されているが、様々な改変を行ってもよいことが理解されるであろう。例えば、プロゲステロン受容体の構造に関しては、プロゲステロン受容体がタナプロゲト以外の非ステロイド性物質に結合している部位を決定することができる。したがって、他の実施態様も特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１Ａ】図１Ａは、ヒトＰＲ−ＬＢＤに結合したタナプロゲトを示す電子密度図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ヒトＰＲ−ＬＢＤに結合したタナプロゲトを示す電子密度図である。
【図２Ａ】図２Ａは、グアノシン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（下線以外の配列）と接合したヒトプロゲステロン受容体リガンド結合ドメイン（ヒトＰＲ−ＬＢＤ）（下線の配列）のアミノ酸配列を示す（配列番号１）。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ヒトＰＲ−ＬＢＤのアミノ酸配列を示す（配列番号２）。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ヒトプロゲステロン受容体全長配列である（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿０００９２６；配列番号４）。
【図１Ａ】
2008510722.tif 000089
【図１Ｂ】
2008510722.tif 000090
【図２Ａ】
2008510722.tif 000091
【図２Ｂ】
2008510722.tif 000092
【図２Ｃ】
2008510722.tif 000093
【手続補正書】
【提出日】平成19年4月23日(2007.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008510722000001.app
【国際調査報告】
2008510722.tif 000094
2008510722.tif 000095
2008510722.tif 000096
2008510722.tif 000097