(57)【要約】活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）、プロドラッグおよび／またはＡＰＣの変異体をしようして、プラスミノゲン活性化因子の不都合な作用、例えば、神経細胞および内皮細胞のアポトーシスおよび細胞死、脳出血もしくは脳内出血ならびに／または被験体の脳内での組織損傷を阻害することができる。この阻害は、死受容体信号伝達の外因経路を介して作用すると考えられる。本発明は、プラスミノゲン活性化因子を使用した処置法（例えば繊維素溶解）の改善を提供する。不都合な作用を低減することによって、プラスミノゲン活性化因子による繊維素溶解治療法への道が広がる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の脳内でプラスミノゲン活性化因子の有害な作用を阻害する方法であって、
（ａ）プラスミノゲン活性化因子によって被験体を処置し、
（ｂ）有効量の活性化プロテインＣまたはその少なくとも１つの機能変異体を含む医薬品組成物を、前記被験体に投与し、前記プラスミノゲン活性化因子の有害な作用を阻害する、方法。
【請求項２】
前記プラスミノゲン活性化因子を、卒中の処置を行うために前記被験体に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プラスミノゲン活性化因子を、前記卒中の３時間以内に前記被験体に投与する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記プラスミノゲン活性化因子を、前記被験体の体重１ｋｇ当たり少なくとも０．９ミリグラムの量で前記被験体に投与する、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。 
【請求項５】
前記医薬品組成物を、前記プラスミノゲン活性化因子による前記処置の２４時間以内に前記被験体に投与する、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記活性化プロテインＣの前記有効量が、前記被験体の体重１ｋｇ当たり０．００５〜２ミリグラムであるか、または前記プロドラッグもしくは前記機能異性体の等量である、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも脳出血、虚血性卒中から出血性卒中への転向、組織損傷またはこれらの組合せを減少させる、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
脳の少なくともアポトーシスまたは細胞死が減少する、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記医薬品組成物を、脳への運搬に適応させる、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。 
【請求項１０】
前記医薬品組成物を、前記プラスミノゲン活性化因子による前記処置の前に投与する、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記医薬品組成物を、前記プラスミノゲン活性化因子による前記処置の少なくとも３０分前に投与する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記医薬品組成物を、前記プラスミノゲン活性化因子による前記処置の後に投与する、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記医薬品組成物を、前記プラスミノゲン活性化因子による前記処置の少なくとも３０分後に投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記医薬品組成物を、前記プラスミノゲン活性化因子による前記処置とほぼ同時に投与する、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記活性化プロテインＣ、少なくとも１つのプロドラッグ、または少なくとも１つのその異性体が、ヒトから誘導されている、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記被験体がヒトである、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
活性化プロテインＣ、少なくとも１つのプロドラッグ、または少なくとも１つのその 機能変異体の、プラスミノゲン活性化因子による被験体の処置によって得られる有害な作用を低減させる医薬品組成物の製造のための使用。
【請求項１８】
薬剤をスクリーニングするプロセスであって、
（ａ）活性化プロテインＣおよび／またはプロテインＣの変異体である候補の薬剤のライブラリを準備し、
（ｂ）プラスミノゲン活性化因子によって被験体または細胞を処置し、
（ｃ）前記プラスミノゲン活性化因子による有害な作用を低減させる性能によって、前記ライブラリから少なくとも１つの薬剤を選択する、プロセス。
【請求項１９】
薬剤をスクリーニングするプロセスであって、
（ａ）活性化プロテインＣおよび／またはプロテインＣの変異体である候補の薬剤のライブラリを準備し、
（ｂ）プラスミノゲン活性化因子によって被験体または細胞を処置し、
（ｃ）前記被験体または細胞内でのカスパーゼ−８信号伝達および／またはマトリクスメタロプロテイナーゼ−９の発現を阻害する性能によって、前記ライブラリから少なくとも１つの薬剤を選択する、プロセス。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載のプロセスによって製造される薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００４年７月２３日付けの米国特許仮出願第60/590,339号明細書の利益を主張するものである。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、米国保険福祉省からの助成金（国立衛生研究所からの助成金、NIH grant HL63290）の援助を受けており、米国政府は本発明の権利を有する。
【０００３】
本発明は、脳内のプラスミノゲン活性化因子の不都合な作用を抑制する、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）、プロドラッグおよび／またはＡＰＣの変異体の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
卒中の大部分は、実際には虚血性および血栓性である。組織型プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）による血栓溶解療法は、現在のところＦＤＡに認可されている急性虚血性脳卒中の唯一の処置法であるが１，２、ｔＰＡには神経細胞を損傷し３，７、症候性脳内出血を増加させる８作用があるので問題である。ｔＰＡの効果を改善し、その不都合な作用を抑制することへの緊急の要求があるにも関わらず９、そのような不都合な作用を脳内で起こすｔＰＡの機構は十分に分かっていない。ｔＰＡ自体が神経細胞に直接毒性を及ぼすのか４、またはその毒性がプラスミン生成に対する二次的なものであるのか６は知られていない。ｔＰＡの血液脳関門（ＢＢＢ）に対する不都合な作用には、密着結合を開くこと１０およびマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の活性化１１が含まれ、これらの作用は出血の形成において重要である１２〜１４。ｔＰＡが、in vivoでＢＢＢを形成する虚血脳内皮の細胞に直接毒性を及ぼすかどうかも知られていない。
【０００５】
活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）は、浸透性の抗凝血作用および抗炎症作用を有するセリンプロテアーゼであり、顕著で直接的な細胞の抗アポトーシス作用を有する１５，１６。プロテインＣが虚血性脳損傷と関連していることは、臨床的および生化学的に証明されている１５，１６。ＡＰＣは、動物モデルでは敗血症１６、またヒトでは重症の敗血症において１７臓器の損傷を低減し、胎盤形成におけるアポトーシスを抑制し１８、一過性虚血の際に脳を保護する１９，２０。ＡＰＣは、内皮の遺伝子発現プロファイルを変え２１，２２、抗アポトーシスＢｃｌ−２ホモログＡ１およびアポトーシスプロテイン−１の阻害因子を上方制御する２１，２２。また、ＡＰＣは、虚血脳内皮細胞（ＢＥＣ）でのｐ５３依存性アポトーシス２０、スタウロスポリン介在神経細胞アポトーシスにおけるカスパーゼ−８の作用２３、およびＮ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）介在アポトーシスでのアポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）のカスパーゼ−３依存核転座２３をブロックする。よって、ＡＰＣは、卒中および他の神経変性疾患に関し直接的な神経細胞保護作用を有し得る。しかし、ＡＰＣが、血栓溶解時にも保護作用を有するかは、知られていなかった。
【０００６】
ここで、ｔＰＡが、虚血性のヒトのＢＥＣおよび神経興奮毒性障害のＮＭＤＡモデルにおいて、通常、ｔＰＡがなくとも脳細胞に障害を生ぜしめるカスパーゼ−９のミトコンドリア依存性の活性化ではなく、カスパーゼ−８を活性化することによりアポトーシスが誘導されることを実証した２０，２３。ＡＰＣは、ＮＭＤＡで処置された虚血ＢＥＣおよび神経細胞におけるｔＰＡ誘導アポトーシスを、それぞれカスパーゼ−３の上流およびＡＩＦ核転座の上流においてカスパーゼ−８の作用を阻害することによって、ブロックした。ＡＰＣは、ｔＰＡ処理後の神経毒性および出血に先立つＢＢＢの早期の破壊に関わる、ＢＥＣにおけるＭＭＰ−９のｔＰＡ／低酸素症介在作用をブロックした。卒中のマウスモデルでは、ＡＰＣは、in vitroで低酸素神経細胞およびＢＥＣでのｔＰＡ介在アポトーシスへの、実質的な抗アポトーシス作用に一致した体内のｔＰＡ誘導の脳障害および出血を制限する。よって、ＡＰＣは、in vitroおよびin vivoでの脳細胞におけるｔＰＡの直接的な毒性、ならびにＢＢＢのｔＰＡ介在破壊を低減しており、ＡＰＣが、虚血症に対する補助療法のための理想的な神経細胞保護物質候補であることを示唆している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）、プロドラッグおよびその変異体を、被験体の脳内での神経毒性および／または出血を阻害する効果的な量で使用することであり、この場合、このような不都合な作用は、プラスミノゲン活性化因子（例えばｔＰＡ）に起因するものである。これにより、治療用および予防用の（例えば、神経細胞および血管系のアポトーシスおよび細胞死を低減または防止する）新規の改善された医薬品組成物への長年にわたる切実な要求に対する解決策が提供される。また、アポトーシスもしくは細胞死を阻害し、細胞生存を促進するための治療的および予防的方法も提供される。プロテインＣの変異体（つまり、プロドラッグ）、活性化プロテインＣの変異体、配合の方策および処置のプロトコルを、カスパーゼ−８信号伝達経路またはマトリックスメタロプロテイナーゼ−９への作用のために選択できる。上記の生成物を使用するプロセスおよびそれを製造するプロセスについて説明する。本発明のさらなる目的および利点についても以下に説明する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、プラスミノゲン活性化因子による対象物の、少なくとも改善された療法（例えば、組織型プラスミノゲン活性化因子による繊維素溶解）であって、プラスミノゲン活性化因子により誘導された神経毒性および血管毒性の少なくとも一部が、有効量の活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）によって阻害されるものに関する。繊維素溶解療法は、虚血および卒中に関連している。有効量のＡＰＣまたはその機能的な等量を、このようなプラスミノゲン活性化因子療法とほぼ同時に（またはその療法の前もしくは後２４時間以内に）被験体に投与し、これにより、脳内で、少なくとも、神経毒性もしくは血管毒性、ストレスを受けた細胞のアポトーシス、出血、組織損傷またはこれらの組み合わせを低減させることができる。例えば、ＡＰＣまたはこれと機能的に同等のものは、脳内細胞（例えば、神経細胞および内皮細胞）内のカスパーゼ−８信号伝達経路またはマトリックスメタロプロテイナーゼ−９を介して作用することによって、プラスミノゲン活性化因子介在毒性が低減され防止され得る。信号伝達には、経路でのカスパーゼ−８の上流では内皮プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）および／またはプロテアーゼ活性化受容体１（ＰＡＲ１）、経路でのカスパーゼ−８の下流ではカスパーゼ−３および／またはアポトーシス誘導因子が必要となり得る。よって、阻害は、死受容体信号伝達の外因経路を介して作用すると考えられる。
【０００９】
したがって、本発明は、活性化プロテインＣまたはこれと機能的に同等なものを使用して、プラスミノゲン活性化因子の有害な作用を阻害する（例えば、このような有害な作用の数もしくは重大度を減らす、またはその発生もしくは悪化を防ぐ）。有害な作用を低減することによって、プラスミノゲン活性化因子による療法へに対しての治療法の道を広げることができる（例えば、症状の発現後３時間以上経過して処置を開始すること）。これに従って、医薬品組成物を製造し評価することができる。
【００１０】
本発明のさらなる態様は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲、ならびにこれらの一般化によって当業者に明らかとなるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、プラスミノゲン活性化因子の有害な作用を阻害する（例えば、このような有害な作用の数もしくは重大度を減らす、またはその発生もしくは悪化を防ぐ）ことにおいて有用である。公知のプラスミノゲン活性化因子は、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼを含む。本発明により、アポトーシスおよび／または細胞死を減少させる（もしくは少なくとも抑制する）ことができる。同様に、出血および組織損傷も減少させるもしくは少なくとも抑制することができる。特に、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）受容体の過度な刺激によって起こる神経毒性は、神経変性疾患の作用に類する神経細胞の損傷および死の有用なモデルである。細胞保護作用は、様々な細胞種、器官もしくは組織、または生体全体のレベルで判定することができる。
【００１２】
本発明は、被験体の脳内でのプラスミノゲン活性化因子の望ましくない作用を阻害する方法を提供する。アルテプラーゼの典型的なプロトコルは、被験体の体重１ｋｇに対し約０．９ｍｇ（最大約９０ｍｇ）の静脈投与であって、約１分間で投与量の約１０％（つまり、ボーラスもしくは急速投与）、約１時間で投与量の約９０％（つまり、インフュージョンもしくは持続投与）を投与するものである。虚血性卒中の治療は、症状の発現から３時間以内に開始するのが好ましく（Adamsら、Stroke 34: 1056-1083, 2003を参照）、症状の発現から９０分以内に開始するのがより好ましい。しかし、本発明は、虚血性卒中の症状が発現して３時間以上後に（例えば、症状が発現して約６時間後に）プラスミノゲン活性化因子による治療を開始することを含む。例えば、別態様によるレテプラーゼのプロトコルは、約８ｍｇ〜約１２ｍｇの分割投与での約６時間にわたる、被験体の体重１ｋｇに対し約０．６ｍｇの経動脈投与である。
【００１３】
改善は、有効量のＡＰＣまたはこれと機能的に同等のものを被験体に投与し、これにより、プラスミノゲン活性化因子の１つ以上の望ましくない作用（例えば、アポトーシスおよび脳内の別の細胞毒性プロセス）を阻害することを含む。例えば、ＡＰＣまたはこれと機能的に同等のものを、治療の開始とほぼ同時に、プラスミノゲン活性化因子による治療後に（例えば、治療の開始から少なくとも３０分、１時間、９０分、２時間、３時間、６時間、１２時間もしくは２４時間後）、またはプラスミノゲン活性化因子による治療前（例えば、治療の開始の少なくとも３０分、１時間、９０分、２時間、３時間もしくは６時間前）に投与することができる。神経損傷（例えば、脳の神経細胞および内皮細胞の損傷）を、少なくとも減少させるもしくは制限することができ、これにより、症状、例えば、プラスミノゲン活性化因子により誘導された脳内出血および脳内組織損傷、プラスミノゲン活性化因子により誘導された神経毒性および血管毒性、虚血性卒中および続いてのプラスミノゲン活性化因子による治療によりストレスを受けた脳内のアポトーシスおよび細胞死、ならびにこれらの組合せを改善することができる。効率は、ＡＰＣまたはこれと機能的に同等のものを投与してまたは投与しないで、被験体の神経学的状態および卒中後の神経学的臨床スコア（例えば、ＮＩＨ評価法）（BartlettまたはRankin評価法）の改善、プラスミノゲン活性化因子により誘導された脳内出血（つまり、大脳内出血）または組織損傷（例えば、ＣＴまたはＭＲＩ画像法を利用して検出された腫脹および梗塞）の減少、プラスミノゲン活性化因子による治療と関連する虚血性卒中から出血性卒中への転向（例えば、ＣＴまたはＭＲＩ、動物モデルでのヘモグロビンの定量、または単なる血液の観察を利用して出血を撮像することによって脳内で検出されるもの）の減少、またはこれらの組合せによって評価することができる。
【００１４】
本発明の一態様は、活性化プロテインＣの作用、例えば、アポトーシスもしくは細胞死の阻害剤、細胞生存因子および細胞保護剤としての作用を含む。細胞は、被験体の脳血管（例えば、内皮細胞、繊維芽細胞、周皮細胞、平滑筋細胞、ベール細胞）、特に脳血管の内皮細胞から得ることができる。別態様では、細胞は、神経細胞、星状細胞、小グリア細胞、または乏突起膠細胞であってよく、これらの細胞の前駆体もしくは前駆細胞、または被験体の中枢神経系もしくは末梢神経系から分化した細胞の別種であってよい。特に、「神経細胞」には、各々異なる特性を有する数百もの様々な種類の神経細胞が含まれる。各種の神経細胞は、神経伝達物質および神経栄養因子の様々な組合せを作りだし、またそれに応答する。神経細胞は、典型的には成人の脳では分裂せず、通常は体外で長時間生存することもない。本発明の方法は、脳および脊髄の実質的に任意の領域からの神経細胞の死もしくは老化からの保護を提供するものである。神経細胞には、海馬、小脳、脊髄、大脳皮質（例えば、運動皮質または体性感覚皮質）、線条体、前脳基底部（例えば、コリン作動性神経細胞）、腹側中脳（例えば、黒質の細胞）、および青斑（例えば、中枢神経系の神経アドレナリン細胞）を含む、胚、胎児もしくは成人の神経組織内のものが含まれる。
【００１５】
生死に関わる局所的および離れた組織損傷は、このような組織から所定時間の酸素化が奪われ（虚血）、通常の循環が回復する（再かん流）ことによって、卒中の際に起こる。細胞死および組織損傷によって、臓器不全もしくは臓器の機能低下が起こりうる。本発明の組成物および方法は、上記のような障害の治療または防止に有用である。
【００１６】
プロテインＣは、元来、抗凝血作用および繊維素溶解促進性作用によって特定されていた。チモーゲン（酵素原）の形態での作用に関し、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）は、Factor VaおよびVIIIaを不活性化するセリンプロテアーゼである。ヒトのプロテインＣは、４６１のアミノ酸の単一ポリペプチドとして肝臓内で作られる。次に、この前駆体分子を、ポスト翻訳の段階で、（ｉ）４２アミノ酸シグナル配列の分裂、（ｉｉ）二鎖の形態を生成するための、１５５位でのリジン残基および１５６位でのアルギニン残基の単一鎖チモーゲンからのタンパク質分解除去（つまり、２６２アミノ酸残基の、セリンプロテアーゼ含有の重鎖にジスルフィド結合した１５５アミノ酸残基の軽鎖）、（ｉｉｉ）γ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）をもたらす軽鎖の第１の４２アミノ酸においてクラスタ形成しているグルタミン酸残基のカルボキシル化、および（ｉｖ）４箇所（軽鎖での１箇所および重鎖での３箇所）でのグリコシル化によって改質する。重鎖は、Asp257、His211およびSer360の三組のセリンプロテアーゼを含む。
【００１７】
他の大抵の細胞外プロテアーゼのチモーゲンおよび凝固因子と同様に、プロテインＣは、チモーゲンおよび酵素の制御を可能にする挿入およびＮ末端延長を有する、キモトリプシン類のコア構造を有している。上皮成長因子（ＥＧＦ）類似のアミノ酸配列を有する２つのドメインが重要である。ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ブタ、ウマおよびウシ由来のプロテインＣ、ならびにヒトプロテインＣの突然変異体および多型体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の少なくとも一部が知られている（GenBankアクセス番号P04070を参照）。様々な生物学的作用をもたらす複数のヒトプロテインＣの変異体が知られている。
【００１８】
「プロテインＣ」は、天然の遺伝子およびその類に属するプロテイン、ならびにその変異体（例えば、天然におよび人工的に設計したものとして見出されている突然変異体および多型体）を指す。遺伝子およびタンパク質の科学的構造は、天然もしくは非天然の共有結合によって結合した天然もしくは非天然のヌクレオチドのポリマー（つまり、ポリヌクレオチド）、または天然もしくは非天然の共有結合によって結合した天然もしくは非天然アミノ酸のポリマー（ポリペプチド）であってよい。天然および非天然ヌクレオチドおよびアミノ酸の非限定的リストであるWIPO Standard ST. 25 (1998)の表１〜４を参照されたい。プロテインＣ遺伝子およびプロテインは、ヒトホモログＰＲＯＣと比較することによって、核酸結合（例えば、オリゴヌクレオチドに対してはＮａＣｌ４００ｍＭ、ＰＩＰＥＳｐＨ６．４  ４０ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ、５０℃もしくは７０℃の条件下で、５０塩基以上の長さのポリヌクレオチドに対してはＮａＨＰＯ４ｐＨ７．２  ５００ｍＭ、ＳＤＳ７％、ＢＳＡ１％、ＥＤＴＡ１ｍＭ、４５℃もしくは６５℃の条件下でのストリンジェントなハイブリダイゼーション、ならびに適切な洗浄）、またはタンパク質結合（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．４  ５０ｍＭ、ＮａＣｌ５０ｍＭ、ＴＷＥＥＮ２０界面活性剤０．０５％、ＢＳＡ１％、室温というストリンジェントな結合条件下での特異的イムノアッセイ、ならびに適切な洗浄）、あるいはコンピュータアルゴリズム（Doolittle, Of URFS and ORFS, 1986、Gribskov & Devereux, Sequence Analysis Primer, 1991、およびこれらの文献において引用された文献）の使用によって、この類に属するものとして認識することができる。
【００１９】
「突然変異」とは、天然プロテインＣと比較して、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列の１つ以上の変化を指し、より作用の強いもしくはより作用の弱い少なくとも１つの機能、変化したもしくは欠けている存在する機能、天然には存在していない新規の機能、またはこれらの組合せを有する。一方、「多型」も、天然プロテインＣと比較してその配列が異なるものを指すが、その変化が機能的な結果を有している必要は必ずしもない。突然変異および多型は、遺伝子工学技術または化学合成によって作ることができるが、非天然ヌクレオチド、アミノ酸および結合に対しては後者が好ましい。リーディングフレームで結合されるドメインの融合は、配列における多様性を生成するもしくは機能ドメインを混合および適合する別の手法である。例えば、ホモログプロテインＣおよびプロテインＳは共に使用して最良の作用を及ぼし（例えばヒト）、これは、それらの配列が、酵素とその補助因子との相互作用が最適化されるように共進化していてよいことを示す。エキソンシャッフリングもしくは遺伝子シャッフリング技術を、選択されたバックグラウンド（例えば、異なる生物学的作用を有する分離可能なドメイン、種の決定要因を配置したヒト／マウスのハイブリッド配列）において望ましい表現型を選択するために使用することができる。
【００２０】
配列の対間での同一性のパーセンテージは、BESTFITコンピュータプログラム（Smith & Waterman. J. MoI. Biol. 147:195-197, 1981、Pearson, Genomics 11 :635-650, 1991）で実施されるアルゴリズムによって計算することができる。配列分散を計算する別のアルゴリズムは、高速データベース検索に適合され、BLASTコンピュータプログラムで実施される（Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25:3389-3402, 1997）。ヒトの配列と比較して、プロテインＣポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、アミノ酸レベルで単に約６０％同一、７０％以上同一、８０％以上同一、９０％以上同一、９５％以上同一、９７％以上同一、もしくは９９％以上同一であってよい。
【００２１】
比較の際には、同類アミノ酸置換（例えば、Glu/Asp、Val/lle、Ser/Thr、Arg/Lys、Gln/Asn）も考慮することができ、それというのは、アミノ酸残基のこれらの対の化学的類似性は、多くの場合に機能的な同等性をもたらすことが期待されるからである。ポリペプチドの生物学的機能が変換されることが期待されるアミノ酸置換により、置換されたアミノ酸残基の化学的特質、例えば疎水性、親水性、側鎖帯電または大きさが変換され得る。ヒトの配列と比較して、プロテインＣポリペプチドは、単に焼く８０％以上類似、９０％以上類似、９５％以上類似、９７％以上類似、もしくは約１００％類似であってよい。機能的な同等性もしくは生物学的機能の同類性は、構造決定のための方法およびバイオアッセイにより評価することができる。使用されるコドンは、ホストのコドン選択を作用することによって、変異体ホストでの翻訳にも適合させることができる。これにより、ポリペプチドの化学構造を実質的に変化させることなしに、変異体ホストの翻訳機構が提供される。
【００２２】
プロテインＣおよびその変異体（つまり、欠失、ドメインシャッフリングもしくは複製、挿入、置換またはこれらの組合せ）は、構造機能的な関係を決定するために使用することができる（例えば、アラニンスキャニング、同類もしくは非同類アミノ酸置換）。例えば、プロテインＣの折畳みおよびプロセス、分泌、受容体結合、ＥＰＣＲおよび／またはＰＡＲ−１を介しての信号伝達、カスパーゼ−８信号伝達の阻害、ここに記載の任意の他の生物学的作用、またはこれらの組合せは、アミノ酸配列の変化に関する。Wells （Bio/Technology 13:647-651 , 1995）および米国特許第5,534,617号明細書を参照されたい。プロテインＣを使用した定方向もしくはランダム突然変異または遺伝子シャッフリングによって方向付けされた進化は、選択基準に基づき新規のかつ改善された機能を得るために使用することができる。突然変異体および多型変異体のポリペプチドは、適切な突然変異および多型変異ポリヌクレオチドによってコードされている。プロテインＣの構造活性相関は、ホスト細胞内にトランスフェクトされた発現構成体によって生成された変異体ポリペプチドを使用して、発現内因性プロテインＣによりまたはそれなしで研究することができる（つまりSAR研究）。よって、プロテインＣの個別のドメインの突然変異は、プロテインの機能の低下作用と、または増大作用とさえも関連し得る。
【００２３】
Galeら（J. Biol. Chem. 277:28836-28840, 2002）は、ＡＰＣの表面ループの突然変異が、抗凝固作用に影響を及ぼすことを示した。ＡＰＣ突然変異体であるKKK191/193AAA（ループ３７）、RR229/230AA（カルシウムループ）、RR306/ 312AA（自己消化ループ）、RKRR306/314AAAA（自己消化ループ）はそれぞれ、天然ＡＰＣの約１０％、５％、１７％および２％未満の抗凝固作用を有する。さらに最近の研究によれば、これらのより低い抗凝固作用を有するＡＰＣ突然変異体（KKK191/193AAA、RR229/230AA、RR306/312AAおよびRKRR306/312AAAA）は、アポトーシスのスタウロスポリンモデルにおいてＡＰＣの抗アポトーシス作用を保持している。
【００２４】
プロテインＣチモーゲン、活性化プロテインＣの前駆体は、プロテイナーゼにより、体内で容易に活性化プロテインＣに変換される。プロテインＣは、活性化プロテインＣのプロドラッグの形態と見なすことができる。よって、活性化プロテインＣの使用は、表現上、プロテインＣおよびその変異体を含むことが意図されている。プロテインＣを使用した治療は、当業者に知られているよりも適宜多い投与量が必要とされると考えられる（以下参照）。
【００２５】
組み換え型のプロテインＣは、選択された化学構造により生成することができる（例えば、天然の構造、突然変異体のもしくは多型体）。例としては、遺伝子コード化ヒトプロテインＣは、米国特許第4,775,624号明細書に記載されており、米国特許第4,981,952号明細書に記載のように組み換えヒトプロテインＣを生成するのに使用することができる。ヒトプロテインＣは、米国特許第6,037,322号に記載のように組織培養で組み換えにより生成し、活性化することができる。天然ヒトプロテインＣは、米国特許第5,084,274号明細書に記載のように、血漿から精製し、活性化して、アッセイを行うことができる。プロテインＣの対照として、これらの特許文書に記載のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を使用することができる。
【００２６】
被験体において出血を低減させる投与量、投与プロトコルおよびプロテインＣの変異体は、被験体に対して内因性の活性化プロテインＣよりも好ましい。天然プロテインＣのアミノ酸配列の突然変異は、カスパーゼ−８信号伝達を阻害する（つまり、低減させるまたは防止する）能力を他の生物学的作用（例えば、抗凝固作用）から分離することができる。これにより、活性化プロテインＣの阻害作用は維持されるかまたは増大するが、その一方で、その投与の際の不都合な作用（例えば、脳内および他の臓器内での出血）を低減させることができる。
【００２７】
配合物およびその投与
活性化プロテインＣ、プロドラッグまたはその変異体は、ここに開示の１つ以上の有用性を有する医薬品組成物を配合するために使用することができる。これは、in vitroで培養地の細胞に投与してもよいし、in vivoで体内の細胞に投与してもよいし、ex vivoで、被験体の外部の細胞に投与し、その後、同じ被験体もしくは別の被験体の体に戻してもよい。細胞は、被験体から取り出したものでも、被験体に移植したものでも、被験体に存在しているものでもよい（例えば、in vitroで内皮細胞の遺伝子組み換えをし、その細胞を脳内皮に戻してもよい）。候補薬剤をin vitroまたはin vivoでスクリーニングして、所望の特性を有するものを選択することもできる。細胞は、内皮（例えば、内皮細胞、繊維芽細胞、周皮細胞、平滑筋細胞、ベール細胞）、特に脳血管の内皮細胞から得ることができる。細胞は、神経細胞、グリア細胞、前駆体、前駆細胞もしくはこれらの幹細胞、または中枢神経系もしくは末梢神経系から分化した別の細胞であってもよい。
【００２８】
薬学的に対し許容可能な担体（つまり、被験体に許容され、かつ投与時に許容不能なレベルの吐き気、めまい、胃の不調等を引き起こさない媒体または粒子キャリア）を含む組成物が、そこに溶解または分散された活性の材料と共に使用される。この組成物は、被験体に投与した場合に免疫原性でないことが好ましい。組成物を被験体の脳に運ぶために有用な構成要素をさらに有する装置ならびにそのような成分をさらに含む組成物は、当分野で知られている。このような担体および他の成分を本発明の組成物に添加することは、十分に当業者のレベル内で行われることである。例えば、浸透性の材料によって局所領域でその含有物を放出させてもよいし、チューブによってリザーバの内容物を脳の離れた箇所へ導いてもよい。
【００２９】
医薬品組成物は、中枢神経系への直接的な適用に適合しているかまたは腸を介してもしくは血の循環による経路で利用するのに適した配合物として投与することができる。別態様では、医薬品組成物は、培養媒体に添加することができる。活性の原料に加え、このような組成物は、薬学的に許容可能な担体ならびに投与を簡単にしかつ／または取込みを増大させることが知られている他の組成物を含む。この組成物は、一度に投与することもできるし、それぞれ別の時間に複数回で投与することもできる。組成物の単位投与量は、神経細胞防護作用、細胞防護作用を提供し、アポトーシスもしくは細胞死を阻害しかつ／または細胞の生存を促進する活性材料の所定量である。
【００３０】
医薬品組成物は、公知の経路で投与することができる。例えば、組成物は、粘膜、肺、局所的な経路、または局在もしくは全身経路（例えば、経腸または非経口）により投与することができる。特に、中枢神経系での有効量の活性化プロテインＣ、プロドラッグ、もしくは機能的変異体を得ることが望ましいであろう。それには、脳への蓄積注射または脳内の外科的移植が必要となり得る。「非経口の」とは、限定されることなく、皮下、硬膜下（intraepidural）、筋内、静脈内、髄腔内および他の注射もしくは輸液技術が含まれる。動脈内（例えば、頸動脈、中大脳動脈）もしくは静脈内経路によるボーラスおよびインフュージョン注射が好ましい。
【００３１】
投与の量および時期、配合および投与経路の適切な選択は、被験体の好ましい応答を得ること（つまり効能）と、被験体に対する過度の毒性もしくは他の害を回避すること（つまり安全性）とを最終目標にして行うことができる。よって、「有効な」とは、所望の硬化を得るための条件の経路操作を含む上記のような選択を指す（例えば、神経毒性および／または脳出血）。したがって、「有効量」とは、所望の効果が得られる、活性化プロテインＣ、プロドラッグ（例えばプロテインＣ）または機能変異体の全量を指す。活性は、被験体に投与されたＡＰＣの量を参照することにより決めることができ（例えば、０．００５ｍｇ／ｋｇ未満、０．０１ｍｇ／ｋｇ未満、０．０５ｍｇ／ｋｇ未満、０．１ｍｇ／ｋｇ未満、０．５ｍｇ／ｋｇ未満、１ｍｇ／ｋｇ未満、２ｍｇ／ｋｇ未満）、同様に、プロドラッグまたは機能変異体の「有効量」は、基準量の活性化プロテインＣと同じもしくは同様の所望の効果を得ることによって決定することができる。
【００３２】
被験体に一度のみの投与を行う配合物のボーラスは、便利な投与スケジュールであるが、脳内での活性成分の有効濃度を得るためにはより頻繁な投与を必要とすることがある（例えば、症状の発現から３時間以内の０．１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの全量での３回分割注射）。急性期治療では、持続注入（例えば、症状の発現から３時間以内）またはより遅い注入（例えば、症状の発症から２４時間以内）を利用することができる。医薬品組成物中の活性成分の量は、被験体において活性成分またはその代謝産物の一時的なもしくは持続的な濃度が達成され、これにより、所望の生理的応答が得られるように変化させることができる。しかし、所望の生理的応答を達成するのに必要な量よりも低いレベルで投与を開始し、所望の効果が得られるまで徐々に投入量を増加させていくことも当分野の範囲にある。
【００３３】
投与される活性成分の量は、例えば、組成物の生物活性および生体利用性もしくはバイオアベイラビリティ（例えば、体内での半減期、安定性および代謝）、組成物の化学的特性（例えば、分子量、疎水性および溶解性）、投与の経路およびスケジュール等の因子に依存する。いかなる特定の被験体に対しても達成されるべき特定の投与レベルが、年齢、健康、病歴、体重、１つ以上の他の薬との組合せ、および疾病の重篤さを含む様々な因子に依存していてよいことを理解されたい。ヒト血液中でのＡＰＣの典型的な基準レベルは、約２．２ｎｇ／ｍｌである。有効量は、ＡＰＣ、プロドラッグまたは機能変異体の活性を増大させるのに十分なものであり、活性化プロテインＣの約１ｎｇ／ｍｌ以上、約５１ｎｇ／ｍｌ以上もしくは約５０ｎｇ／ｍｌ以上であって、約０．２ｍｇ／ｍｌ未満、約０．５ｍｇ／ｍｌ未満もしくは約１ｍｇ／ｍｌ未満、またはこの範囲の中間（例えば、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ）という血中濃度の上昇に等しいものであってよい。
【００３４】
同類の系（例えば、患者に投与されるヒトの天然もしくは組み換えＡＰＣ）においては、ＡＰＣの１回以上のボーラス注射（例えば、１分間での投与が０．００５ｍｇ／ｋｇ以下、０．０１ｍｇ／ｋｇ以下、０．０５ｍｇ／ｋｇ以下、０．１ｍｇ／ｋｇ以下、２ｍｇ／ｋｇ以下）が、脳循環で著しい抗血栓作用を生じることなくプラスミノゲン活性化因子の不都合な作用を阻害するのに十分であろう。０．００５ｍｇ／ｋｇ未満、０．０１ｍｇ／ｋｇ未満、０．０５ｍｇ／ｋｇ未満、０．１ｍｇ／ｋｇ未満、０．５ｍｇ／ｋｇ未満、１ｍｇ／ｋｇ未満、２ｍｇ／ｋｇ未満の投与量でのＡＰＣのインフュージョンも利用することができる。ここで例示する量は、７０ｋｇの成人に対して計算されたものであり、この量は、５０〜９０ｋｇのヒトに対して処置するのに十分である。
【００３５】
有効量または当量には、１つ以上の所望の効果を得てかつ／または１つ以上の不都合な作用を回避するための指示による「単位投与量」も含んでいてよい。上述の配合、投与の経路および投与スケジュールは、単に使用可能な技術を例示したものに過ぎない。
【００３６】
「処置」という用語は、特に、プラスミノゲン活性化因子による処置の１つ以上の不都合な作用を低下させるまたは軽減することを指す。例えば、組織型プラスミノゲン活性化因子による卒中の処置のような標準的な治療法を、ＡＰＣ、プロドラッグまたはその機能変異体がある場合およびない場合で比較することができる。これには、罹患した被験体の治療または危険を伴う被験体に対する予防法が含まれる。処置が必要な被験体について、症状の改善、悪化、退行または進行を、客観的または主観的な測定によって判定することができる。処置が必要な被験体は、虚血または血栓症の危険を有しているかまたは既に虚血または血栓症を発症しており、よって、処置は、卒中の診断前および／または後に始めることができる。患者において、処置が効果的なことを表すものは、改善された神経学的な成績、運動もしくは感覚機能、認知機能、精神運動性機能、運動性神経機能、高次の統合知的機能、記憶、視覚、聴覚等であり、非侵襲性の画像解析（例えば、ＭＲＩまたは脳血流画像形成）によって証明されるような低減された脳の損傷および障害であり、またはこれらの組合せであってよい。この作用は、脳組織の神経病理学的分析によって確証することができる。最終的には、脳内皮細胞の機能の安定化およびその細胞死の防止によって、脳血流（ＣＢＦ）の改善およびＣＢＦの調整機能の正常化がもたらされる。前臨床研究では、神経的または行動的な発見事項、アポトーシスまたはそのマーカー（例えば、ＤＮＡの断片化またはＤＮＡ量の減少）の低減、細胞生存の増加、細胞死の減少、またはこれらの組合せは、動物モデルで実証可能である。これらの利点は、ヒトまたは動物の被験対象において系の抗凝固をほとんど生じずまたは著しく生じずに得ることができる。細胞レベルでは、カスパーゼ−８の信号伝達の減少を観察することができる。増加または減少（上昇または低下）は、活性化プロテインＣ、プロドラッグまたはこれらと機能的に同等のものの投与をプラセボと比較することによって判定することができる（プラスミノゲン活性化因子による線溶処置の不都合な作用を含む）。
【００３７】
本発明は、処置および薬剤の別の現存の態様（例えば、プロテインＳ、繊維素溶解剤および抗血栓剤、ステロイド性もしくは非ステロイド性の抗炎症剤）も含み得る。よって、処置の組合せも実施され得る。
【実施例】
【００３８】
組織型プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）の血管内血栓溶解作用は、虚血性卒中の処置のためには有利であるが、その神経毒性および出血を引き起こす可能性が問題である。ここに我々は、ｔＰＡが、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテートに暴露した虚血性ヒト脳内皮およびマウス皮質神経細胞において、通常ｔＰＡの非存在下ではあまり重要な役割を果たさないかまたは上記脳細胞のアポトーシスには関係しないカスパーゼ−８の活性化によって、ストレス誘導性アポトーシスを増強することを報告する。ＡＰＣは、in vitroおよびin vivoでのｔＰＡ誘導性神経毒性をブロックし、マウス卒中モデルにおいてｔＰＡ介在脳障害および脳出血を減少させる。我々が得た結果によれば、ＡＰＣは、脳内皮におけるマトリクスメタロプロテイナーゼ９のｔＰＡ誘導活性化をブロックし、血液脳関門の完全性の維持を助成する。このようなin vitroおよびin vivoでの結果は、脳内細胞へのｔＰＡの直接的な毒性作用を中和することによって、虚血性卒中のｔＰＡ処置の有効性を実質的に増大させるためにＡＰＣを添加できることを示唆している。
【００３９】
試薬
ヒト組み換えｔＰＡ（アルテプラーゼ、Genentech, San Francisco, CA）を使用した。in vitroでのいくつかの研究では、Sigma（St. Louis, MO）のヒト組み換えｔＰＡも使用した。 ヒト血漿誘導ＡＰＣおよびマウス組み換えＡＰＣを、文献１９、３２に記載のように準備した。ＮＭＤＡはSigmaより入手した。免疫ブロッティングのために、多クローン性のヒトＡＩＦに対する抗体（１：１０００、１ｍｇ／ｍｌ、Chemicon, Temecula, CA）、ヒトｐ５３に対する抗体（１：１０００、０．５ｍｇ／ｍｌ、Cell Signaling, Beverly, MA）、ヒトＮＭＤＡξ１に対する抗体（ＮＲ１、１：１０００、０．２ｍｇ／ｍｌ、Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）、ヒトβ−アクチンに対する抗体（１：２５００、０．２ｍｇ／ｍｌ、Santa Cruz Biotechnology）、または単クローン性のヒトＢｃｌ−２に対する抗体（１：１００、０．２ｍｇ／ｍｌ、Santa Cruz Biotechnology）を使用し、これらは全て対応するマウス抗原と交差反応する。多クローン性のマウスＮＲ２Ａに対する抗原（１：５００、１ｍｇ／ｍｌ、Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY）またはマウスＢａｘに対する抗原（１：１００、０．２ｍｇ／ｍｌ、Chemicon）も使用した。阻害性ペプチドＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ（カスパーゼ−３、Sigma）ｚ−ｌＥＴＤ−ｆｍｋ（カスパーゼ−８、Sigma）およびｚ−ＬＥＨＤ−ｆｍｋ（カスパーゼ−９、 Calbiochem, San Diego, CA）を、その基質の特異性に基づいて選択した２３、２５、２６。
【００４０】
ヒトＢＥＣのｔＰＡ／低酸素条件
第１のヒトＢＥＣを、神経に異常のない外傷のあった若者から迅速な死体解剖により分離し、前述のように培養した２０。細胞を、血清不含のダルベッコ変法イーグル培地で維持し、１〜１６時間ｔＰＡ（２０μｇ／ｍｌ）に、常酸素条件（２０％酸素、５ｍＭグルコース）に、低酸素条件（＜２％酸素、グルコースなし）に、またはｔＰＡ＋低酸素条件に曝した。低酸素条件は、嫌気性チャンバを使用して導入した（Forma Scientific, Holbrook, New York）２０。Ｏ２のレベルは、O2 Fyrite（Forma Scientific）により監視した。ｚ−ＩＥＴＤ−ｆｍｋ（１０μＭ）またはｚ−ＬＥＨＤ−ｆｍｋ（１５μＭ）を、ｔＰＡ／低酸素処置の２時間前に付着させた。ヒトＡＰＣ（１０〜６００ｎＭ）を、ｔＰＡ／低酸素処置の時点で添加した。カスパーゼ−３、カスパーゼ−８またはカスパーゼ−９の活性を、４００ｎＭ ＡＰＣの存在下で判定した。
【００４１】
神経細胞内でのｔＰＡ／ＮＭＤＡ誘導アポトーシス
第１の神経細胞培養物は、上述のように２３胎児Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスより準備した。培養物を、血清不含のＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ媒体＋Ｂ２７サプルメント（Gibco BRL, Rockville, MD）に、加湿５％ＣＯ２インキュベータ内で３７℃で１４日間で維持し、その後、ｔＰＡ（２０μｇ／ｍｌ）のみ、ＮＭＤＡ（２５ｍＭ）／５μＭグリシンまたはｔＰＡ＋ＮＭＤＡで３〜２４時間処置した。Ａｃ−ＤＥＶＯ−ＣＨＯ（５０μＭ）、ｚ−ＩＥＴＤ−ｆｍｋ（２０μＭ）またはｚ−ＬＥＨＤ−ｆｍｋ（５μＭ）を、ｔＰＡ／ＮＭＤＡ処置の３時間前に付着させた。マウス組み換えＡＰＣ（２０ｎＭ）を、ｔＰＡ／ＮＭＤＡ処置の３０分前に添加した。
【００４２】
細胞障害およびアポトーシスの検出
ＢＥＣの細胞障害は、ＬＤＨの放出によって検出した（ＬＤＨアッセイ、Sigma）。ヘキスト染料（ヘキスト３３，３４２、Sigma）およびin situのterminal deoxynucleotidyl transferase-mediated digoxigenin-dUTP nick-end標識（ＴＵＮＥＬ）（Phoenix Flow Systems, San Diego, CA）アッセイを、アセトン固定したＢＥＣまたはｐ−ホルムアルデヒド固定した神経細胞で実施した。Nikon TE2000-U顕微鏡を使用して画像を視覚化した。
【００４３】
カスパーゼ−３、−８および−９の活性
ＢＥＣまたは皮質神経細胞の溶解物を、カスパーゼ−３（ＤＥＶＤ−ｐＮＡ）、カスパーゼ−８（ＩＥＴＤ−ｐＮＡ）（ApoAlertカスパーゼアッセイキット、Clontech, Palo Alto, CA）、またはカスパーゼ−９（Ａｃ−ＬＥＨＤ−ｐＮＡ、Chemicon; Temecula, CA）と共に３７℃でインキュベートした。基質の加水分解を、マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍでの吸収の変化として判定した。酵素活性を、プロテイン１ｍｇ当たりの任意の単位で表した。
【００４４】
ウェスタンブロット分析
細胞抽出物全体、核プロテインまたは細胞膜フラクションを、前述のように準備した２３。核プロテインの相対存在量を、β−アクチンを内部標準として走査式濃度測定により判定した。マルチプルウェスタンブロット（ｎ＝３〜５）からのデータを、統計的な分析のために平均化した。
【００４５】
ＭＭＰゼラチンザイモグラフィ
ヒトＡＰＣ（５０〜１，０００ｎＭ）の非存在下または存在下でｔＰＡ（２０μｇ／ｍｌ）または低酸素条件に４時間暴露したＢＥＣからの馴らし培地を、前述のように１１ゼラチンザイモグラフィによって分析した。ＭＭＰ−２の活性は顕著には変化しなかった。ＭＭＰ−９の活性は、常酸素条件の対照と比較して数倍増加して定量された。
【００４６】
in vivo卒中モデル
プロトコルは、国立衛生研究所のガイドラインを利用してロチェスター大学の動物実験委員会（Animal Care Committee）によって承認された。ビヒクル、ｔＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ、１０％ボーラス／９０％インフュージョン）、またはｔＰＡ＋マウス組み換えＡＰＣ（０．０２〜１ｍｇ／ｋｇ、５０％ボーラス／５０％インフュージョン）を、大腿静脈から別個の静脈ラインおよび前述のマウス卒中モデル１９、２０をＭＣＡ閉塞４５分間／再かん流２４時間に変更したものを使用して投与した。ｔＰＡを、ＭＣＡ閉塞の最後の１０分間および再かん流に入って２０分間、注入した。ＡＰＣを、ｔＰＡと同時に、ｔＰＡ注入後にまたはｔＰＡ注入前に注入した。ここで使用されているｔＰＡの投与量は、齧歯類でよく使用されているものであり、ヒトの治療上の投与量に等しいと考えられている１２、１３、４４、５０。ＣＢＦは、レーザドップラー流量計（Transonic Systems）によって監視した１９。動脈血液ガスを測定した１９。神経学的試験を２４時間で実施し、スコア付けを、神経学的欠損がない（０）、左前足を完全に伸ばすことができない（１）、左前足に曲がり（２）、左前足に旋回（３）、自然に歩くことができない（４）、または卒中に関連した死（５）、のように行った。神経病理学的分析を２４時間で行った。非固定の視交叉の高さでの１ｍｍ冠状脳切片を、２％トリフェニルテトラゾリウムクロライドのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中でインキュベートした。脳障害、梗塞および浮腫の体積を、前述のように１９、２０判定した。フィブリン沈着を、抗フィブリンＩＩ抗体（１：５００、ＮＹＢ−Ｔ２Ｇ１、Accurate Chemical Scientific Corp.）によるウェスタンブロッティングにより定量し１９、２０、３０、白血球をＣＤ１１ｂ抗体（１：２５０、DAKO Corp.）で染色した１９、２０。ヘモグロビンを、Drabkin試薬（Sigma）を使用して分光学的アッセイにより前述のように判定した１９。
【００４７】
ｔＰＡヨウ素化
ｔＰＡ（５０μｇ）を、IodoBeads（Pierce Chemical, Rockford, IL）および０．５ｍＣｉＮａ１２５Ｉ（Amersham Biosciences, UK）を使用して放射性ヨウ素化を行った。遊離１２５Ｉを限外ろ過によって除去した。
【００４８】
統計学的分析
データは、平均値±標準誤差として表した。ＡＮＯＶＡ（分散分析法）を使用して、統計的な有意差を判定した。非パラメータ的データ（神経学的成績スコア）は、クラスカル・ウォリス試験によって比較した。ｐ＜０．０５を統計的に有意であると考えた。
【００４９】
実施例１：虚血ヒトＢＥＣでのｔＰＡ介在アポトーシスおよびＡＰＣによる防護
ｔＰＡおよび低酸素／無糖血への同時の暴露は、低酸素／無糖血のみの暴露と比較してＢＥＣ障害を実質的に加速化させた。ｔＰＡへの暴露後２時間および４時間の時点で、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の虚血ＢＥＣから媒体中への放出量は、ｔＰＡの非存在下でのバックグラウンド値および５７％からそれぞれ５０％および９５％へと増大した（図１Ａ）。しかし、ｔＰＡのみでは、常酸素条件のＢＥＣからのＬＤＨ放出には影響がなかった。４時間経過後、ｔＰＡは、ＴＵＮＥＬ陽性低酸素ＢＥＣの数を、低酸素条件のみで見られた６０％から１００％へと増大させた。ｔＰＡのアポトーシス増強作用は、ヒト血漿誘導ＡＰＣによって完全にブロックされた。ＡＰＣは、投与量に依存して、ＬＤＨ放出量およびＴＵＮＥＬ陽性のｔＰＡ処置された低酸素ＢＥＣの数を、ほぼバックグラウンドのレベルにまで低下させる（図１Ｂ）。
【００５０】
低酸素ＢＥＣのｔＰＡへの暴露によって、カスパーゼ−９の活性は、低酸素条件のみの場合に対して顕著には増大しない（図１Ｃ）。これに対して、ｔＰＡにより、虚血ＢＥＣでのカスパーゼ−８の活性の初期のかつシャープな増大が導入され、その活性は１６時間にわたり低酸素条件のみのものと比較して高いままである。これらのデータは、ｔＰＡが、ミトコンドリアを介在させたアポトーシス経路よりもミトコンドリアとは無関係のアポトーシス経路に大きな作用を及ぼすことを示唆している。ｔＰＡの存在下では、低酸素条件のみのものと比較してカスパーゼ−３の活性に関して、４時間で有意な２．８倍の増大があり（ｐ＜０．００１）、１６時間以内で＞３．０倍の増大があった（図１Ｅ）。ＡＰＣは、低酸素ＢＥＣについて、ｔＰＡにより誘導されたカスパーゼ−８（図１Ｄ）およびカスパーゼ−３の活性の増大も完全に封じた（図１Ｅ）。ＡＰＣは、低酸素によってもカスパーゼ−９の活性を阻害し（図１Ｃ）、これは、虚血ＢＥＣにおいてＡＰＣがミトコンドリアに依存したアポトーシスをブロックするという我々の以前の報告と一致している２０。
【００５１】
虚血ＢＥＣにおけるｔＰＡ誘導アポトーシスに必要なカスパーゼを同定するために、カスパーゼ−８阻害剤およびカスパーゼ−９阻害剤のカスパーゼ−３の活性に対する作用も研究した。ｔＰＡの非存在下で、カスパーゼ−９阻害剤であるｚ−ＬＥＨＤ−ｆｍｋは、低酸素ＢＥＣにおけるカスパーゼ−３の活性について８５％を超える阻害をもたらし、カスパーゼ−８阻害剤であるｚ−ＩＥＴＤ−ｆｍｋは、カスパーゼ−３の活性について穏やかな（１５％未満の）阻害をもたらす（図１Ｆ）。このことは、一般的な低酸素でのアポトーシス経路が、カスパーゼ−９の活性によって駆動されることを示唆し、このことは、低酸素ＢＥＣのミトコンドリア依存のアポトーシスについての報告と一致している。一方、ｚ−ＬＥＤＨ−ｆｍｋは、ｔＰＡの存在下ではカスパーゼ−３の活性をわずかしか阻害しないが、ｚ−ＩＥＤＨ−ｆｍｋは、カスパーゼ−３の活性を完全に（９５％を超えて）阻害する（図１Ｆ）。これらの結果は、ｔＰＡが、驚くべきことに、虚血ＢＥＣでのアポトーシスのための明確な駆動力が、内因性のカスパーゼ−９依存の経路から、カスパーゼ−８、つまり死受容体（外因性）経路の上流伝達物質の活性を必要とする１つ以上の機構へとシフトすることを示唆している。
【００５２】
実施例２：ＮＭＤＡモデルでのｔＰＡ誘導神経細胞アポトーシスおよびＡＰＣによる防護
ｔＰＡは、ＮＭＤＡに暴露した２４時間後のアポトーシスに関連する神経細胞の数を倍増させ、このことは、以前の報告と一致する４。ＮＭＤＡのみと比較して、組み合わせたｔＰＡ／ＮＭＤＡ処置は、カスパーゼ−９の活性を変化させないが（図２Ａ）、神経細胞におけるカスパーゼ−８の堅調な活性をもたらし（図２Ｂ）、このことは、通常は、ＮＭＤＡ介在アポトーシスで起こらない２３、２６。また、ｔＰＡは、ＮＭＤＡのみの条件のものと比較してカスパーゼ−３の活性を増大させる（図２Ｃ）。ＮＭＤＡモデルにおけるカスパーゼ−３の活性は、通常、増大させたＢａｘ／Ｂｃｌ−２比によって、ｐ５３に依存し、またミトコンドリアを介在させるものである２３、２７〜２９。ＮＭＤＡ処置された神経細胞でのカスパーゼ−９の活性も見出したが（図２Ａ）、ｔＰＡは、ＮＭＤＡを介在させた場合のｐ５３およびＢａｘ発現の増大（図２Ｄ〜２Ｅ）、Ｂｃｌ−２発現の減少（図２Ｄ〜２Ｅ）またはカスパーゼ−９の活性の増大（図２Ａ）には影響を及ぼさなかった。よって、ｔＰＡは、公知のＮＭＤＡを介在させたミトコンドリアに依存したプロアポトーシスの作用を増強させることはない。ｔＰＡはそれのみでは、神経細胞またはカスパーゼ−８、９または３の活性に影響を及ぼさなかった。
【００５３】
図３Ａに、マウス組み換えＡＰＣが、ＮＭＤＡモデルにおいてｔＰＡ誘導アポトーシスをブロックし、ｔＰＡ／ＮＭＤＡ処置された神経細胞におけるアポトーシス細胞の数を８０％を超えて減少させていることが示されている。ＡＰＣおよびカスパーゼ−８阻害剤であるｚ−ＩＥＴＤ−ｆｍｋは、各々が、ｔＰＡにより誘導されたカスパーゼ−８の活性の増加を封じ、一方、カスパーゼ−９阻害剤は作用がなかった（図３Ｂ）。ＡＰＣは、ｔＰＡ／ＮＭＤＡに暴露した細胞のカスパーゼ−３活性を、顕著に約８０％（ｐ＜０．０５）減少させる。特定のカスパーゼ−３阻害剤であるＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯおよびカスパーゼ−８阻害剤は、ｔＰＡ／ＮＭＤＡ処置された細胞のカスパーゼ−３の活性を９０％を超えてブロックするが、カスパーゼ−９阻害剤はその作用はない（図３Ｃ）。一方、カスパーゼ−９阻害剤は、ＮＭＤＡのみで処置された細胞でのカスパーゼ−３の活性を顕著に（８０％を超えて）減少させる（図３Ｃ）。この結果は、ｔＰＡが、ＮＭＤＡ介在の神経細胞アポトーシスの際のアポトーシスの機構が、活性化したカスパーゼ−８からの臨界的な寄与を有する経路へとシフトすることを示唆している。
【００５４】
ｔＰＡは、カスパーゼ−８依存の機構を介して、ＮＭＤＡの存在下で、ＡＩＦの核転座を５０％を超えて（ｐ＜０．０５）顕著に増大させた。すなわち、カスパーゼ−８またはカスパーゼ−３に特異的な阻害剤が、ｔＰＡの存在下でＡＩＦ核転座をブロックし、カスパーゼ−９阻害剤の作用がずっと小さかった。カスパーゼ−８活性の阻害（図３Ｂ）と一致して、ＡＰＣは、ＮＭＤＡ／ｔＰＡ障害時、ＡＩＦのミトコンドリア転移から核転移をブロックする。ｔＰＡのＮＭＤＡ受容体に対するタンパク質分解作用をアッセイした時、ｔＰＡは、ＮＭＤＡ受容体のＮＲ１およびＮＲ２Ａサブユニットのどちらも分割させることはなく、これは、以前の報告４とは対照的であるが、より最近の報告６とは一致している。
【００５５】
実施例３：マウス卒中モデルにおけるｔＰＡ神経毒性およびＡＰＣ防護
ＡＰＣがｔＰＡの神経毒性をin vivoで減少できるかを研究するために、シリコーンで処理されていないフィラメントを使用し３０、二次的な脳血栓による頑固な脳損傷を引き起こす３１中大脳動脈（ＭＣＡ）閉塞モデルを変更した。２４時間の再かん流後に穏やかな脳損傷しか起こらないように、ＭＣＡ閉塞を４５分に短縮した（図４Ａ〜４Ｄ）。ｔＰＡ注入は、対照と比較して、脳障害の体積をほぼ２倍にし、閉塞の体積を７５％（図４Ｂ）、浮腫を１５５％（図５Ｃ）有意に増大させ、その結果、運動神経学的スコアを２．３から３．５に悪化させた（図４Ｄ）。
【００５６】
ｔＰＡと同時に注入されたマウス組み換えＡＰＣ２０、３２は、ｔＰＡ誘導脳障害に対して投与量依存の神経防護作用を示した。研究されたうちの最も高い投与量（１ｍｇ／ｋｇ）では、ＡＰＣは、全脳障害、梗塞および浮腫の体積をそれぞれ約５倍、６．５倍および３．５倍減少させ、これらの値は、ビヒクルのみで処置された動物中の対照値を有意に（ｐ＜０．０５〜０．０１）下回っており（図４Ａ〜４Ｄ）、神経学的運動スコアを３．５から０．６に低めた（図４Ｄ）。ＡＰＣの最低投与量では効果がなかったが、０．０４ｍｇ／ｋｇの中間投与量では、ｔＰＡのみの場合と比較して、脳障害、浮腫および神経学的スコアに対して有意に（ｐ＜０．０５）有利な作用を示した。繊維素溶解処置後のＡＰＣの注入（１ｍｇ／ｋｇ）によっても、ｔＰＡの不都合な作用が同様に顕著に阻害され、神経防護、脳障害体積の４．９倍の低減、および運動神経学的スコアの３．５から０．７への改善が見られた。同様に、繊維素溶解処置の前のＡＰＣの注入（１ｍｇ／ｋｇ体重）は、神経保護作用があり、ｔＰＡ処置と同時のまたはｔＰＡ処置後のＡＰＣの注入と比較可能なレベルで、ｔＰＡと関連した脳障害を減少させる。
【００５７】
血栓溶解作用と一致して、ｔＰＡによる処置は、ビヒクルのみで処置された対照と比較して、虚血後脳血流（ＣＢＦ）を３５％有意に改善し（図５Ａ〜５Ｂ）、虚血脳フィブリン沈着をバックグラウンドレベルにまで減少させた（図５Ｃ）。しかし、増加した脳障害と一致して、ｔＰＡは、白血球の脳蓄積を約６５％増加させた（図５Ｄ、好中球に対して特異的なジクロロアセテートエステラーゼ染色によって確定した）。予想通り、ＡＰＣは、ｔＰＡと同様に虚血後ＣＢＦを増大させたが、異なる投与量のＡＰＣのｔＰＡへの添加によって、さらなるＣＢＦの改善は得られず、対照基準値の約７０〜７５％に維持された（図５Ａ〜５Ｂ）。ＡＰＣは、単独でもｔＰＡが存在しても、フィブリンレベルをバックグラウンド値にまで低下させ（図５Ｃ）、ｔＰＡにより誘導された虚血脳中での好中球の蓄積をなくすことができ（図５Ｄ）、この結果は、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の下方制御によって引き起こされるＢＢＢを通る白血球移動の封鎖に冠する報告と一致する１９。
【００５８】
実施例４：ＡＰＣによりブロックされるｔＰＡ誘導脳出血およびＭＭＰ−９活性
ＭＣＡ卒中モデルでは、ｔＰＡは、研究された全てのマウス（６／６）において実質的な出血を誘導した（図６Ａ〜６Ｂ）。このことは、ｔＰＡで処置された動物の虚血半球においてヘモグロビンのレベルが３．０倍を超えて増大したことに反映されており（図６Ａ）、これと対照的に、ビヒクルのみで処置された対照の虚血脳組織においては出血はなく、ヘモグロビンレベルもほとんど検出できないものであった（図６Ａ）。ＡＰＣのみ（０．２ｍｇ／ｋｇ）で処置されたものは、虚血脳組織における細胞間出血またはヘモグロビンレベルへ何ら作用せず１５、１６、１９、２０、これは前述の報告の通りであった。より高い投与量では、ＡＰＣ（１ｍｇ／ｋｇ）ｈ，ｔＰＡ誘導出血の体積を減少させ、これは、脳毛細血管の残りのヘモグロビンに対して補正した虚血半球でのヘモグロビンレベルの、ｔＰＡ処置のみの場合と比較して有意に４８％減少（ｐ＜０．０１）していたことに現れていた（図６Ａ）。
【００５９】
ＭＭＰの活性がｔＰＡ誘導出血の増大に関係しているので１２〜１４、ヒトＡＰＣの非存在下または存在下でのヒトＢＥＣでの低酸素およびｔＰＡのＭＭＰ−９酵素活性への作用を研究した。低酸素条件は、ＭＭＰ−９の活性を穏やかに増大させ（図６Ｂ）、さらにこの活性はｔＰＡによって約２倍に増強された（図６Ｂ〜６Ｃ）。ＡＰＣは、低酸素ＢＥＣでのＭＭＰ−９活性のｔＰＡ誘導による増加に対抗して、投与量に依存して作用した（図６Ｃ）。ＡＰＣの作用が、ｔＰＡのタンパク質分解によるものでないことは、ＡＰＣの存在下でin vitroでの１２５Ｉ−ｔＰＡの安定性を示したウェスタンブロット分析によって確証された（図６Ｄ）。
【００６０】
ｔＰＡの血管内血栓溶解作用が卒中治療のために有益であると考えられている一方、 その脳における血管内での作用、つまり、神経毒性および脳出血は、治療法の賢明な方策によって最小限にしなければならない９、３３。ｔＰＡによる治療は、効能を及ぼすことのできる時間が３時間という短い時間であること３４、大きな凝血塊が溶解するという時折の不都合、事例の約３分の１に起こる動脈の際閉塞３５、再かん流しても残り得る脳細胞への障害によって制限されてしまう。ｔＰＡが、過剰のカルシウム流束と関連したＮＭＤＡ受容体のＮＲ１サブユニットの分裂による神経細胞への直接的な神経毒性作用をもたらすことが教示されおり４、これにより、存在する下流のＮＭＤＡ介在アポトーシスカスケードが潜在的に増強され得る３６。一方で、ｔＰＡ介在神経障害が、ｔＰＡのプラスミン生成に対して二次的となり得ることも教示されており６、これにより、ラミニンのような細胞外マトリクスプロテインが分解されることによって神経細胞の死が促され得る３７〜３９。しかし、プラスミノゲンとは無関係のｔＰＡ誘導毒性が、ニューロセプリンに関する研究で実証され、天然ｔＰＡ阻害剤は、in vivoでのｔＰＡ誘導神経毒性および発作拡散を抑制できる４０。ここで、ｔＰＡが、ＮＭＤＡに暴露された虚血脳内皮および神経細胞に対して直接的な毒性を有することを示し、このようなストレスを受けた脳細胞内でのｔＰＡが、アポトーシスのための駆動力を、カスパーゼ−９および内因性経路からカスパーゼ−３の上流のカスパーゼ−８の強い必要性へとシフトすることを実証する。カスパーゼ−８依存アポトーシス経路は、虚血ＢＥＣのアポトーシスにおいては通常は主たる役割を果たしておらず、増大したｐ５３およびＢａｘおよび減少したＢｃｌ−２発現が優勢となり２０、４１、４２、その結果、カスパーゼ−９の活性化を招く。カスパーゼ−８は、通常、ＮＭＤＡ介在皮質神経細胞アポトーシスに関連しない２３、２６。ＮＭＤＡ処置された神経細胞においてｔＰＡにより誘導されるカスパーゼ−８の活性により、ＡＩＦ核転座が起こり、これは、ｐ５３およびカスパーゼ−９とは無関係であると考えられる。潜在的な機構は、「アポトーシスしきい値」のｔＰＡに依存する変化および／または内因性経路と外因性経路とのクロストークの変更を含み得る。
【００６１】
神経細胞アポトーシスのスタウロスポリン誘導経路のカスパーゼ−８の活性を阻害するＡＰＣ２３、およびカスパーゼ−８阻害剤であるｚ−ＬＥＴＤ−ｆｍｋは、虚血ＢＥＣおよびＮＭＤＡ処置された神経細胞の両方においてｔＰＡ誘導アポトーシスをなくすが、カスパーゼ−９阻害剤であるｚ−ＬＥＤＨ−ｆｍｋにはその作用はない。ＢＥＣに関する以前の報告と一致して２０、２２、４３、有益なＡＰＣは、ＢＥＣならびに神経細胞のＰＡＲ１およびＰＡＲ３において、必要とされる内皮プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）ならびにプロテアーゼ活性受容体−１（ＰＡＲ１）に作用する。
【００６２】
in vivoでは、ｔＰＡの有益なおよび有害な作用は、卒中モデルの種類３１およびＭＣＡ閉塞後の投与の時間に臨界的に依存する。これまでの研究によれば、ｔＰＡは、脳塞栓症後の神経学的な損傷を減少させ４５、４６、虚血障害を悪化させるものではないが４７、実質的な微小血管の二次的な血栓症卒中モデルにおけるｔＰＡ遺伝子の欠失は、虚血損傷部の体積を増大させる３０。一方、脳血栓が最小限に抑えられたＭＣＡモデルでは３１、内因性ｔＰＡは、直接的な神経毒性を有する。我々は、穏やかな脳障害および二次的な血栓を持ったマウスでの変更した卒中モデルを利用して、虚血後の血液再かん流が実質的に改善され、ｔＰＡ血栓溶解作用によって引き起こされるフィブリン沈着が低減したとしても、ｔＰＡが神経学的結果および神経病理学的結果の両方を悪化させることを示す。脳細胞にin vitroで作用したように、ｔＰＡの神経毒性の作用を中和させるようにin vivo作用させるＡＰＣ注入により、ｔＰＡの誘導による梗塞および浮腫の体積、運動神経学的スコアならびに白血球の浸潤の増大は、顕著に（有意に）減少する。
【００６３】
ＡＰＣは抗凝血剤であるが、ＡＰＣは、敗血症もしくは卒中の動物モデルで出血を起こさない１５、１６。さらに、ここでは、ＡＰＣが、マウス卒中モデルで、ｔＰＡ誘導出血を顕著に弱めることを示す。最近の研究によれば、ｔＰＡは、直接的に細胞間信号伝達を介して１０および／または間接的にＢＥＣにおけるＭＭＰ−９の活性およびひいては血管基底膜の分解を増大させることによって１１低密度のリポタンパク質受容体関連プロテイン−１を介して作用し、ＢＢＢを開放し得る。ＭＭＰ−９は、反応性の酸素種によってＢＢＢの早期の破壊も引き起こし４８、脳血管疾患４９およびｔＰＡ誘導出血におけるＭＭＰ−９を含むＭＭＰの関与も実証されている。ここで、低酸素条件が、ＭＭＰ−９の活性を穏やかに増大させ、ｔＰＡが、低酸素ＢＥＣにおけるこの活性を実質的に増大させ、一方で、ＡＰＣが、投与量に依存する形式で、ｔＰＡ／低酸素誘導ＭＭＰ−９活性をブロックすることを示す。ＡＰＣのこのＢＢＢ安定化効果は、ＥＰＣＲおよびＰＡＲ１を必要とした。よって、ＡＰＣは、少なくとも２つの異なる相補的な機構、つまり（ｉ）in vivoでＢＢＢの破裂を促進するような脳内皮細胞のｔＰＡ介在アポトーシスを防ぐこと、（ｉｉ）タンパク質溶解により血管の完全性を損なうＭＭＰ−９の活性を阻害することによって、ｔＰＡ関連出血を制限することが可能である。
【００６４】
要約すると、我々は、ＮＭＤＡによりストレスをかけられた虚血ＢＥＣおよび神経細胞において、ｔＰＡが、カスパーゼ−８依存性アポトーシスを導入することを見出した。in vitroおよびin vivoの脳細胞への全てのｔＰＡ誘導毒性作用は、様々なな障害モデルにおいてＡＰＣによりブロックすることができ、そのモデルには、ｔＰＡにより誘導された（ｉ）脳内皮および神経細胞でのアポトーシス、（ｉｉ）ＢＢＢの破壊、（ｉｉｉ）ｔＰＡ誘導ＭＭＰ−９の活性、および（ｉｖ）マウスの局所的虚血モデルでのｔＰＡ神経毒性が含まれる。ｔＰＡが閉塞されていた血管を再開放して凝血塊を溶解しかつＡＰＣがｔＰＡの直接的な血管および神経細胞毒性を阻害するｔＰＡ／ＡＰＣの組合せ療法が、虚血性卒中の治療法として極めて有望なものとなり得るという我々の考えは、データにより裏付けされる。
【００６５】
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ここで引用した特許、特許出願、書籍および他の刊行物は、参照によりその内容全体が本発明に組み込まれる。
【００６６】
特許請求の範囲が意図するものおよびそれと法律的に同等の範囲内で行う全ての変更および置換えは、本発明の枠内に包含される。上記の説明によって、本発明が、本発明の精神またはその本質的な特性から逸脱することがなければ別の特定の形態で実施可能であることは、当業者に明らかである。例えば、活性化プロテインＣの変異体は、公知のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列において同族体、突然変異体および多型体として知られている。
【００６７】
「含む（comprising）」という移行句（transition）は、そのクレーム内に別の要素を包含するものであるが、本発明は、この「含む（comprising）」の語に代えて、移行句「本質的に〜なる（consisting essentially of）」（すなわち、別の要素が、本発明の操作に物質的に影響を及ぼさないのであればクレーム内に含まれる）および移行句「〜なる（consisting）」（すなわち、本発明と通常関連する不純物または重要でない作用を別として、クレームに列記された要素のみが許容される）を用いたクレームによっても記述されている。これらの３つの移行句のいずれも、本発明の特許請求をするために使用することができる。
【００６８】
さらに、クレーム中に明確に記載されていなければ、あるクレームの制限と別のクレームの制限との特定の関係は意図されていない（例えば、製品のクレーム中の成分の構成または方法のクレームのステップの順序は、明確な記載がなければ、クレームの制限とはならない）。ここに開示の個々の要素の全ての可能な組合せおよび順列は、本発明の態様であると考える。同様に、本発明の記載の一般化も、本発明の一部であると考える。
【００６９】
本明細書に記載の要素は、クレーム内で明確な記載がなければ、本発明を制限するものであると解釈されないことを理解されたい。よって、本発明に対する法律的な保護の範囲は、明細書よりむしろ特許請求の範囲の記載によって示されているので、記載された態様は、単に例示的なものであって限定的なものではないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１Ａ】図１全体として、ヒトＡＰＣによるヒトＢＥＣにおけるｔＰＡ誘導アポトーシスおよび細胞保護作用を示す。mean±s.e.m.（平均値±標準誤差）で示し、ｎ＝３〜６である。図１Ａに、ｔＰＡの非存在下（グラフ中の黒丸ドット、黒逆三角ドット）または存在下（白抜き丸ドット、白抜き逆三角ドット）での低酸素ＢＥＣおよび常酸素ＢＥＣからのＬＤＨ放出量を示す。
【図１Ｂ】低酸素ＢＥＣにおけるＡＰＣ（黒丸ドット）およびビヒクル（白抜き丸ドット）のｔＰＡ誘導アポトーシスへの作用を示す。
【図１Ｃ】ビヒクル（黒丸ドット、黒逆三角ドット）、ｔＰＡ（白抜き丸ドット、白抜き逆三角ドット）およびｔＰＡ＋ＡＰＣ（黒四角ドット）で処理した低酸素細胞および常酸素細胞におけるカスパーゼ−９の作用を示す。
【図１Ｄ】ビヒクル（黒丸ドット、黒逆三角ドット）、ｔＰＡ（白抜き丸ドット、白抜き逆三角ドット）およびｔＰＡ＋ＡＰＣ（黒四角ドット）で処理した低酸素細胞および常酸素細胞におけるカスパーゼ−８の作用を示す。
【図１Ｅ】ビヒクル（黒丸ドット、黒逆三角ドット）、ｔＰＡ（白抜き丸ドット、白抜き逆三角ドット）およびｔＰＡ＋ＡＰＣ（黒四角ドット）で処理した低酸素細胞および常酸素細胞におけるカスパーゼ−３の作用を示す。
【図１Ｆ】低酸素ＢＥＣ＋ｔＰＡにおけるカスパーゼ−９もしくはカスパーゼ−８阻害剤のカスパーゼ−３への作用を示す。
【図２Ａ】図２全体に、ｔＰＡが、カスパーゼ−８によるマウスの皮質神経細胞におけるＮＭＤＡ介在アポトーシスを強化することを示している。mean±s.e.m.（平均値±標準誤差）で示し、ｎ＝３〜５である。図２Ａに、ＮＭＤＡまたはＮＭＤＡ＋ｔＰＡに暴露された培養皮質神経細胞におけるカスパーゼ−９の活性を示す。
【図２Ｂ】ＮＭＤＡまたはＮＭＤＡ＋ｔＰＡに暴露された培養皮質神経細胞におけるカスパーゼ−８の活性を示す。
【図２Ｃ】ＮＭＤＡまたはＮＭＤＡ＋ｔＰＡに暴露された培養皮質神経細胞におけるカスパーゼ−３の活性を示す。
【図２Ｄ】ＮＭＤＡ処理された細胞＋ｔＰＡにおける核プロテイン抽出物中のｐ５３（上段）または全細胞抽出物中のＢｃｌ−２およびＢａｘ（下段）に対するウェスタンブロット分析を示す。
【図２Ｅ】図２Ｄに示すバンドの走査式濃度測定による定量結果を示す。
【図３Ａ】図３全体に、マウスＡＰＣまたはカスパーゼ−８阻害剤が、ｔＰＡ誘導ＮＭＤＡ介在皮質アポトーシスをブロックすることを示している。mean±s.e.m.（平均値±標準誤差）で示し、ｎ＝３〜５である。図３Ａに、ＡＰＣの非存在下または存在下でのＮＭＤＡ／ｔＰＡ介在アポトーシスを示す。
【図３Ｂ】ｔＰＡ＋ＮＭＤＡで処理された細胞における、ＡＰＣおよびカスパーゼ−８阻害剤、カスパーゼ−９阻害剤またはカスパーゼ−３阻害剤の存在下でのカスパーゼ−８の活性を示す。
【図３Ｃ】ｔＰＡ＋ＮＭＤＡで処理された細胞における、ＡＰＣおよびカスパーゼ−８阻害剤、カスパーゼ−９阻害剤またはカスパーゼ−３阻害剤の存在下でのカスパーゼ−３の活性を示す。
【図３Ｄ】ＮＭＤＡ／ｔＰＡ処理された細胞からの核抽出物における、ＡＰＣおよびカスパーゼ−８阻害剤、カスパーゼ−９阻害剤またはカスパーゼ−３阻害剤の存在下でのＡＩＦのウェスタンブロット分析を示す。
【図３Ｅ】ｔＰＡによる処理から２４時間後の膜フラクションにおけるＮＲ１サブユニットおよびＮＲ２Ａサブユニットのウェスタンブロット分析を示す。
【図４Ａ】図４全体に、ＡＰＣが、マウスにおいて脳虚血時にｔＰＡ誘導障害を防ぐことを示している。ｔＰＡおよびＡＰＣは、３０分間、大脳動脈閉塞の最後の１０分間および再かん流期に入って２０分間にわたり静脈内注入した。mean±s.e.m.（平均値±標準誤差）で示し、一群につきｎ＝６である。図４Ａに、ヒトｔＰＡの存在下または非存在下でのならびに異なる投与量（ｍｇ／ｋｇ）のマウス組み替えＡＰＣを使用した場合の障害を体積で示す。
【図４Ｂ】ヒトｔＰＡの存在下または非存在下でのならびに異なる投与量（ｍｇ／ｋｇ）のマウス組み替えＡＰＣを使用した場合の梗塞を体積で示す。
【図４Ｃ】ヒトｔＰＡの存在下または非存在下でのならびに異なる投与量（ｍｇ／ｋｇ）のマウス組み替えＡＰＣを使用した場合の浮腫を体積で示す。
【図４Ｄ】ヒトｔＰＡの存在下または非存在下でのならびに異なる投与量（ｍｇ／ｋｇ）のマウス組み替えＡＰＣを使用した場合の運動神経学的スコアを体積で示す。
【図５Ａ】図５全体に、ｔＰＡおよびＡＰＣが、マウスにおいて脳虚血時に神経血管系へ作用することを示している。mean±s.e.m.（平均値±標準誤差）で示し、一群につきｎ＝６である。図５Ａに、ビヒクル（黒丸ドット）、ｔＰＡ（黒逆三角ドット）またはｔＰＡ＋マウス組み換えＡＰＣ（白抜き丸ドット）（ｍｇ／ｋｇ）の存在下での中大脳動脈の閉塞および再かん流時の脳血流（ＣＢＦ）を示す。
【図５Ｂ】ｔＰＡまたはｔＰＡ＋ＡＰＣ処置された虚血後のＣＢＦを示す。
【図５Ｃ】ｔＰＡ＋ＡＰＣ処置された虚血脳組織におけるフィブリン沈着を示す。
【図５Ｄ】ｔＰＡ＋ＡＰＣ処置された虚血脳組織におけるＣＤ１１ｂ陽性白血球を示す。
【図６Ａ】図６全体に、ｔＰＡ誘導出血およびＢＥＣのＭＭＰ−９活性が、ＡＰＣにより制御されることを示している。図５Ａに、ｔＰＡ＋ＡＰＣの存在下または非存在下での虚血半球におけるヘモグロビン量を示す。（出血量は図示しない。）mean±s.e.m.（平均値±標準誤差）で示し、一群につきｎ＝６であり、ＡＰＣにはマウス組み換えＡＰＣを使用した（ｍｇ／ｋｇ）。
【図６Ｂ】ｔＰＡ＋ＡＰＣで処置された常酸素または低酸素ＢＥＣにおけるＭＭＰ−９酵素電気泳動法の結果を示す。
【図６Ｃ】ｔＰＡに暴露させた低酸素ＢＥＣでの、ＡＰＣのプロＭＭＰ−９／ＭＭＰ−９活性への投与量に依存した作用を示す。＊ｐ＜０．０１、ｔＰＡ／低酸素 対 低酸素、＊＊ｐ＜０．００１、ＡＰＣ＋ｔＰＡ／低酸素 対 ｔＰＡ／低酸素である。
【図６Ｄ】ＡＰＣの非存在下または存在下での１２５Ｉ−ｔＰＡのウェスタンブロット分析を示す。mean±s.e.m.（平均値±標準誤差）で示し、一点につきｎ＝３〜５である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【国際調査報告】
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