(57)【要約】  一つの細胞系アッセイシステムで使用できる、ミクロソームプロスタグランジンＥ２合成酵素阻害剤の有効性、特異性および毒性の測定方法が提供される。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
外部刺激により誘導されるPGE2の増加したレベルに応答する哺乳類細胞でのmPGESを特異的に阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
ｉ）該化合物と哺乳類細胞を接触させる工程；
ii）該哺乳類細胞を外部刺激で刺激する工程；
iii）該哺乳類細胞中のPGE2および６−ケトPGF1αのレベルを測定する工程；および
iv）該哺乳類細胞中のPGE2および６−ケトPGF1αのレベルと、化合物を添加しない哺乳類細胞中のPGE2および６−ケトPGF1αのレベル、ならびに化合物も外部刺激も加えないさらに他の哺乳類細胞と比較する工程であって；ここで活性は外部刺激に晒された細胞中の化合物が有る条件下と無い条件下でのPGE2レベルの比として測定され、ここで特異性および細胞毒性は外部刺激に晒された細胞中の化合物の存在下および不在下での６−ケトPGF1αレベルの比として測定される工程；
を含む上記方法。
【請求項２】
外部刺激が１またはそれ以上の炎症誘発性サイトカイン、成長因子および腫瘍プロモーターから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サイトカインがTNFαおよびIL1βである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
哺乳類細胞がA549、HEK293、COSおよびJ774から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
哺乳類細胞がA549である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
PGE2および６−ケトPGF1αのレベルがHPLC、ELISA、GM-MS、EIA、RIA、FPおよびSPAを用いて測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
外部刺激により誘導されるPGE2の増加したレベルに応答する哺乳類細胞でのmPGESを特異的に阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
ｉ）該化合物と哺乳類細胞を該化合物の２またはそれ以上の異なった濃度で接触させる工程；
ii）該哺乳類細胞を外部刺激で刺激する工程；
iii）該哺乳類細胞中のPGE2および６−ケトPGF1αのレベルを測定する工程；および
iv）該哺乳類細胞中のPGE2および６−ケトPGF1αのレベルと、化合物を添加しない哺乳類細胞中のPGE2および６−ケトPGF1αのレベルと比較し、そして対照値の百分率、および、続いて２またはそれ以上の濃度の点を基にしたIC50を計算し、ならびに化合物も外部刺激も加えないさらに他の哺乳類細胞と比較する工程であり；ここで活性は外部刺激に晒された該哺乳類細胞中の化合物が有る条件下と無い条件下でのPGE2のIC50として測定され、ここで特異性および細胞毒性は外部刺激に晒された細胞中の化合物が有る条件下と無い条件下での６−ケトPGF1αのIC50として測定される工程；
を含む上記方法。
【請求項８】
外部刺激が１またはそれ以上の炎症誘発性サイトカイン、成長因子および腫瘍プロモーターから選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
サイトカインがTNFαおよびIL1βである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳類細胞がA549、HEK293、COSおよびJ774から成る群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳類細胞がA549である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
PGE2および６−ケトPGF1αのレベルがHPLC、ELISA、GM-MS、EIA、RIA、FPおよびSPAを用いて測定される、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物および薬剤がミクロソームプロスタグランジンＥ２合成酵素（mPGES）の活性を減少させまたは阻害する活性を測定するための新規で有用な方法に関する。特に、本発明は、mPGES阻害剤の効力、特異性および毒性を測定するためのアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
プロスタグランジン類はエイコニソイド（eiconisoids）の一つのクラスであり、疼痛、発熱および炎症において重要な働きを担っている。それらはアラキドン酸から合成され、アラキドン酸鎖の部分を形成する炭素原子の５員環を有している。プロスタグランジン類は局所的、すなわちそれらの合成部位に近接して作用する。プロスタグランジンＥ２は特に発熱、疼痛および炎症を引き起こすことに関連している（Funk, C. Science, 294:1871-1875 (2001)）。
【０００３】
PGE2は、炎症誘発性（pro-inflammatory）および痛覚過敏誘導性の脂質メディエーターであることが示されている。PGE2の合成は二つのクラスの酵素により触媒されている。第一のクラスの酵素、シクロオキシゲナーゼは、膜リン脂質から放出されるアラキドン酸前駆体を用いてプロスタグランジンＨ２（PGH2）を産生する。シクロオキシゲナーゼの例にはCOX-1およびCOX-2が含まれる。第二のクラスの酵素、PGE2合成酵素は、PGH2前駆体を用いてPGE2を産生する。PGE2合成酵素の例には、細胞質ゾルPGE2合成酵素（cPGES）およびミクロソームPGE2合成酵素（mPGES）が含まれる（Murakami, M等, Progress in Lipid Research 43: 3-35, (2004)）。
【０００４】
PGE２は二つの異なった経路により産生されることがわかっている。最初の経路は基礎レベルのPGE2を産生する。構成的に産生されたPGESは、広汎な種類の哺乳類細胞において基底条件（basal conditions）下で、細胞質ゾル中で発現している（cPGES）。基底条件下で、COX-1はアラキドン酸からのPGH2の産生を促進し、これは次には、cPGESによる活性化によって、基底レベルのPGE2を産生する。第二の経路は、サイトカインのような外部の刺激により誘導された後にPGE2を産生し、それは細胞のミクロソーム区画に局在化しており；そのためにmPGESと名づけられる。サイトカインのような炎症促進性刺激による刺激によって、COX-2はアラキドン酸と反応しPGH2を産生し、これが次にはPGH2からPGE2を産生するmPGESを誘導する。（図１を参照する）。これが炎症および痛覚過敏に関連する第二の「誘導可能な」経路であり、他方、最初の「構成的」経路はほとんどまたは全く関与していないことが示されている。（Murakami, M等, J. Biol. Chem. 275: 32783-32792, (2000) および Tanioka等, J. Biol. Chem. 275: 32775-32782 (2000)）。mPGESの阻害剤は炎症および疼痛を治療するために使用できる可能性のあることが知られている。
【０００５】
mPGES阻害剤は非特異性および毒性のような望ましくない性質を有するかもしれない。例えば、mPGESに加えて、血管拡張を引き起こしそして血小板凝集を阻害するプロスタグランジンであるPGI2の産生を触媒するプロスタグランジンＩ２合成酵素（PGIS）のような他のプロスタグランジン合成酵素が存在している。非特異的なPGES阻害剤はそれらの他のプロスタグランジン合成酵素を阻害し、望ましくない副作用をもたらす可能性がある。またmPGES阻害剤はPGE2の基底産生レベルも阻害するかも知れない。
【０００６】
PGE2は発熱、疼痛および炎症において重要な役割を果たすために、それらの産生を阻害できる化合物のアッセイを確立するための努力が為されてきた。特に、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、酵素免疫吸着測定法（ELISA）、また酵素免疫測定法（EIA）、または放射免疫測定法（RIA）が、化合物または薬剤のPGE2の産生を減少させるかまたは阻害する能力を測定するためのPGE2の産生を定量化するために用いられてきた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これまでは、有効性、特異性および毒性の評価については異なった実験に分かれて行われていた。さらに、多くの場合に細胞中の実際の複雑な条件を模倣することのできない生化学的アッセイにおいて、特異性はより実現可能なものであった。そして同じ実験試料からmPGES阻害剤の有効性、特異性および毒性を測定する細胞系アッセイ（cell based assay）を設計することが望ましい。そうした設計は通常、二次的なスクリーニングを必要とする段階を短縮し、そしてよりインビボでの細胞条件に密接に関連した情報を提供するだろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、mPGES阻害剤の有効性、特異性および細胞毒性を同時に評価する単細胞系アッセイを確立するものである。mPGES阻害剤は、炎症および疼痛に対する有力な治療手段である。このアッセイデザインはPGE2産生が外部刺激により誘導されることが明らかな全ての哺乳類細胞系での使用に適している。本発明において、哺乳類細胞は、１またはそれ以上のサイトカイン、例えばTNFαおよびIL-1βで処理される。PGE2はそのように高レベルで産生されるので試験用の阻害性化合物と細胞とをインキュベートすることによって、そしてPGE2の現象を上清中で測定することによってこの試験用の阻害化合物を評価しうる。試験化合物の有効性を測定することに加えて、本発明は同じ細胞系アッセイシステムにおいて特異性および細胞毒性の測定も提供する。これはプロスタノイド６−ケトPGF1αの第二の読み取りを評価すること、および基底PGE2産生に対する試験化合物の効果を評価することによりデザインされた。
【０００９】
本発明の上記の局面および他の局面、様相、および利点については、以下の詳細な説明と添付されている図面と合わせることによって、より良く理解されるだろう。
【００１０】
図１はアラキドン酸代謝経路を図示する。略語は以下のとおり：アラキドン酸（AA）、プロスタグランジンＥ２（PGE2）、プロスタグランジンＨ２（PGH2）、プロスタグランジンＩ2（PGI2）、６−ケトプロスタグランジンＦ1α（PGF1α）、プロスタグランジンＩ2合成酵素（PGIS）、細胞質PGE2合成酵素（cPGES）、ミクロソームPGE2合成酵素（mPGES）。
【００１１】
図２は、mPGE2細胞系アッセイで、化合物の単一の濃度（１点）および複数の濃度（この例では８点）の両方を用いる代表的なスクリーニングシステムを示す。試験化合物はハイスループットスクリーニングを用いて迅速にスクリーニングし、続いて試験化合物の複数の濃度を用いてのポジテイブなヒットによりIC50測定を行う。
【００１２】
本発明はミクロソームPGE2合成酵素（mPGES）の阻害剤のスクリーニングのための細胞系アッセイに関する。このアッセイは生細胞中での試験化合物PGES阻害剤の有効性、特異性および毒性を評価する。本発明は、疼痛、発熱、アルツハイマー病、ならびに、例えば、それには限定されないが、喘息、アレルギー性鼻炎、関節炎、腸炎症性疾患および多発性硬化症を含む多くの炎症性疾患を治療するために経口薬剤として使用できる阻害剤化合物の同定を可能にする。
【００１３】
本発明は一般に単細胞系アッセイに関連し、これは試験するmPGES阻害剤について、全てを同じ細胞系アッセイで、有効性、特異性および細胞毒性を測定するために用いられる。測定は迅速に行うことができ、そして大量の異なった阻害性化合物を同時に試験するために規模を大きくすることができる。
【００１４】
使用する阻害剤化合物に関して特別な制限はない。例には、小分子量の化学分子、合成低分子化合物のライブラリー、精製タンパク質、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成ペプチドライブラリー、細胞抽出物および培養上清が挙げられる。
【００１５】
どのような哺乳類細胞株でも、哺乳類細胞株が１またはそれ以上のサイトカインによりmPGESを発現するように誘導できる限り、本発明で使用することができる。サイトカイン刺激でのPGE2の誘導が大きくなるほど、試験化合物の有効性、特異性および細胞毒性を測定するために利用できるスクリーニングの枠が大きくなる。好ましい細胞株は、市販されている非小細胞肺癌のヒト上皮細胞株のA549である。しかし、他の哺乳類細胞株、例えばHEK293のようなヒト細胞株、COS細胞のようなサル細胞株およびJ774のようなマウス細胞株も容易にA549と置き換えることができる。
【００１６】
サイトカインの刺激によるPGE2産生の高いレベルを示す細胞株は、次に１またはそれ以上の外部刺激分子により刺激した後、試験化合物と細胞をインキュベートして化合物の有効性を測定するために使用される。外部刺激は、炎症促進性サイトカイン、成長因子およびプロモーターから選択される。
【００１７】
PGE2の濃度は、１またはそれ以上のサイトカイン、成長因子およびプロモーター等で刺激される前後に、PGE2に特異的な酵素免疫アッセイを用いて、容易に測定できる。阻害剤化合物の有効性は、それを添加した後の上清中のPGE2レベルの減少により測定される。本発明では、選択された細胞型と混合した場合に誘導可能なPGE2経路を刺激できることが証明されたどのような刺激性化合物でも、単独または組み合わせて用いることができる。好ましい実施態様では、サイトカイン、成長因子および腫瘍プロモーターが、単独または共に、選択された細胞でPGE2産生を刺激してPGE2レベルを基礎レベルの１００から４００倍の間まで誘導するために使用できる。より好ましい実施態様では、A549細胞がTNFαおよびIL-1βで刺激され、PGE2産生のためのCOX-2およびmPGES共役経路を誘導する（図１を参照）。
【００１８】
有効性に加えて、本発明は同じ細胞系アッセイシステムにおいて試験化合物の特異性および細胞毒性の評価を組み入れる。これはプロスタノイド６−ケトPGF1αの第二の読み取りを評価すること、ならびにCOX-1およびcPGES共役経路により媒介される基礎PGE2産生に対する試験化合物の効果を評価することによりデザインされた（図１を参照）。
【００１９】
基底阻害では、cPGESにより媒介されるPGE2の基礎レベルの産生への化合物の作用を測定する。基底レベルの阻害は、非誘導細胞において阻害剤化合物が有るか無い条件下でのPGE2濃度の測定から決定される。
【００２０】
特異的阻害は、化合物の望ましい作用：すなわち、誘導細胞におけるmPGESにより媒介されたPGE2の産生を測定する。特異的阻害は、誘導細胞において阻害剤化合物が有るか無い条件下でのPGE2濃度の測定から決定される。したがって、基底および特異的阻害測定は、試験化合物の細胞毒性および特異性の指標である。
【００２１】
好ましい実施態様において、TNFαおよびIL-1βで誘導されたA549細胞では、PGE2産生が相乗的に４００倍も増加し、従来考えられていたところより正確な阻害レベルの測定（有効性、特異性および毒性の意味で）を可能にする。
【００２２】
非特異的な阻害は、試験化合物がもつかもしれない他の作用、例えばmPGES以外の酵素の阻害を測定する。非特異的な阻害は、mPGESのような同じ基質から、PGI2の産生および最終的に６−ケトPGF1α（または他のプロスタグランジン類）の産生を触媒するPGI2経路または他のプロスタグランジン経路に対するこの化合物の作用を測定することにより決定される。好ましい実施態様では、６−ケトPGF1αの濃度は、化合物が有るか無い条件下での誘導後の細胞上清中で測定される。化合物がPGE2と同時に６−ケトPGF1αの産生を阻害することが示された場合は、この化合物はmPGESのみに作用するのではなく、PGH2のようなそれらの共通の前駆体の産生を担っているある上流の要素にも作用していると推定することができる。
【００２３】
阻害レベルは、阻害剤化合物が有るか無い条件下で測定されるだけではなく、その種々の濃度においても決定される。種々の阻害剤化合物の濃度で測定することにより、ある特性、例えばそのIC50を算出することが可能になる。IC50は化合物が５０％阻害を生じさせる濃度として定義される。（図２を参照、ここでは化合物の８つの濃度（「８点」）が調製されている）。
【００２４】
また、本発明のアッセイは、化合物の一つだけの濃度を用いてPGE2産生への化合物の阻害を評価する１点アッセイとして行うこともできる。１点スクリーニングおよびIC50アッセイの両方ともハイスループットスクリーニングに適用可能である。（図２を参照）。ハイスループットスクリーニングシステムは市販のものを利用できる（例えば、Zymark Corp., Hopkington, Mass.; Air Technical Industries, Mentor, Ohio; Beckman InstrμMents, Inc. Fullerton, Calif.; Precision Systems, Inc., Natick, Mass.,等、を参照）。これらのシステムは典型的には、全ての操作が自動化されており、その操作には全ての試料および試薬のピペッテング、液体の調合、時間を定めたインキュベーション、および最後のアッセイに適した検出器での試料の読み取りを含んでいる。これらの構成可能なシステムは、ハイスループットおよび速やかな開始、ならびに高度の柔軟性およびカスタム化を提供する。そうしたシステムの製造者は、各種のハイスループットアッセイのための詳細なプロトコールを提供している。PGE2および６−ケトPGF1αの濃度の測定方法は当該分野で周知である。例には、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、ガスクロマトグラフィー質量分析（GC-MS）、酵素免疫アッセイ（EIA）としても知られている酵素免疫測定吸着法（ELISA）、放射免疫アッセイ（RIA）、蛍光偏光法（FP）、およびシンチレーション近接アッセイ（SPA）が含まれる。
【００２５】
本発明は、本願で記載された特定の実施態様の範囲に限定されない。実際、当業者には、前述の記載および添付の図から、本願で記載されたものの他の各種の発明の修正は自明であろう。そうした修正も添付の請求の範囲内に包含されることが意図されている。
【００２６】
全ての本願で引用された参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
〔実施例〕
実施例１
サイトカインによる細胞の処理ならびに試験および対照化合物とのインキュベーションこの実施例において、A549細胞が９６ウエル平底ポリスチレンプレートに１ウエル当たり104細胞の密度で蒔かれた。次にこのプレートを37℃で終夜インキュベートした。
【００２７】
翌日、COX-2阻害剤のNS398（ケイマン・ケミカルから購入）を解凍し、使用直前に１mMの濃度で良く混合した。TNF−αおよびIL1−β（Ｒ＆Ｄシステムス）のアリコットを使用するまで氷上に保持した。試験化合物を解凍し、そして500rpmの卓上ミキサー上に置いた。
【００２８】
無菌のクラスターチューブの一組を以下の割付に従って並べた：
【００２９】
【表１】
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【００３０】
Ａ、ＢおよびＣは、下記のような３つの異なったDMSO濃度でのTNF-αおよびIL1-βのサイトカインを含有する媒体（試薬Ａ、ＢおよびＣ）を意味する。
【００３１】
試薬Ａは、DMSOなしで５ng／mlのTNF-αおよび５ng／mlのIL1-βの濃度の培養細胞培地を含んでいた。試薬Ｂは、試薬ＡにDMSOの濃度を0.2％となるようにDMSOを加えて作成した。試薬Ｃは、試薬ＡにDMSOの濃度を0.3％となるようにDMSOを加えて作成した。サイトカインを含まない培養培地をネガテイブ対照チューブに加えた。試薬Ａを200μlずつ全てのチューブに加えた。試薬Ａを315μlずつクラスターチューブの第１列に加えた。試薬Ｂの315μlをクラスターチューブの第２列に加えた。試薬Ｃの500μlをNS398対照クラスターチューブの第１行に加えた。試薬Ｃの450μlをクラスターチューブの第２〜４行に加えた。試薬Ｃの１mlをポジテイブ対照チューブに加えた（上記の表を参照）。
【００３２】
試験化合物の保存溶液を調製するために、10mMの保存溶液から試験化合物の２μlを対応するチューブに加え（最終１：100希釈）、うず巻攪拌（vortex）した。試験化合物の希釈は以下のように行った：保存溶液から135μlを取って30μM チューブに加え、次に保存溶液から45μlを取り10μM チューブに加えた。化合物の30、10、３、１、0.3、0.1、0.03、0.01、および0.003μMの濃度を作成するために連続的な希釈を行う。
【００３３】
対照NS398の保存溶液を調製するために、１mMのNS398の２μlを対応するチューブに加え（最終１：100希釈）、うず巻攪拌した。NS398の希釈は以下のように行った：保存溶液から15μlを取ってNS398の300nM チューブに加え、次に保存溶液から５μlを取りNS398の100nM チューブに加えた。NS398の300、100、30、10、３、１、0.3、および0.1nMの濃度を作成するために連続的な希釈を行う。
【００３４】
全ての希釈が完了した後、インキュベートされた細胞を以下のように処置した。細胞から培地を取り除きそして直ぐに希釈した化合物および対照で置き換えた。９６ウエルプレートを次に37℃で16時間インキュベートした。このプレートを５分間1000rpmで遠心した。各ウエルから上清を80μlずつ回収し、以下の実施例で記載したように、酵素免疫アッセイ（EIA）またはシンチレーション近接アッセイ（SPA）のいずれかの試験に用いた。上清は４℃で２時間まで、または−80℃では３ヶ月まで保存された。
【００３５】
代替法の短時間アッセイについては、A549細胞を最初にTNF-αおよびIL1-βで処理し、そして細胞をサイトカインと共に37℃で16時間インキュベートした。培養培地を0.1％BSAを添加したHBSS緩衝液で置換し、そして連続希釈した化合物を加えて30分間プレインキュベーションした。続いて、10μMのアラキドン酸を加えて、細胞上清を30分後に回収した。
【００３６】
実施例２
プロスタグランジンのレベルの定量化：酵素免疫アッセイ
この実施例では、PGE2および６−ケトPGF1αの濃度を測定するためのEIAが商業的に利用できる。例えば、PGE2および６−ケトPGF1αのEIAキットがアッセイ・デザイン（Assay Designs）から入手可能である。このPGE2 EIAは、PGE2に特異的なマウスモノクローナル抗体を使用している。溶液中の遊離のPGE2が既知量のPGE2トレーサと競合して、限定された量の抗PGE2抗体に結合する。PGE2トレーサはPGE2とアセチルコリンエステラーゼとの共役体である。抗PGE2抗体は次にヤギ抗マウスIg抗体を用いて固定される。固定化抗体が次に、アセチルコリンエステラーゼの基質を含むエルマン試薬（Ellman's Reagent）で発色する。この反応により産生した生成物は黄色であり、412nmでの強い吸収を有する。高濃度のPGE2が存在する場合は、PGE2はトレーサとの競合に勝って、得られた試料は412 nmで弱い吸収を有するだろう。反対に、低濃度のPGE2が存在する場合は、トレーサはPGE2との競合に勝って、得られた試料は412nmで強い吸収を有するだろう。このアッセイを行って、412nmでの吸収を既知濃度のPGE2の吸収標準と比較した。
【００３７】
同様なアッセイを、６−ケトPGF1αについても適切なモノクローナル抗体およびトレーサで置き換えて実施できる。このアッセイは、例えばZymark SciClone Deckを用いて当業者により容易に自動化フォーマットに転換できる。
【００３８】
試験化合物の８濃度で処置した細胞中のプロスタグランジンのレベルを測定した後、プロスタグランジンのレベルに対する対数スケールでの化合物濃度を半対数プロットすることで、化合物のIC50が算出された。このアッセイはまた、化合物の一つの濃度のみをもちいたPGE2産生への化合物の阻害を評価する一点アッセイとしても行うことができる。
【００３９】
実施例３
プロスタグランジンのレベルの定量化：シンチレーション近接アッセイ
この方法では、細胞分散液中でのPGE2濃度が、シンチレーション近接アッセイ（「SPA」）を用いて測定された。例えば米国特許4,568,649に記載されたように、このSPAは試験試料中の放射標識された化合物の濃度を測定する。
【００４０】
抗体とビーズの終夜混合物を、抗PGE2抗体（ケイマン・ケミカル）をアッセイ緩衝液中に１：6.67希釈で希釈して調製された。用いたアッセイ緩衝液は0.05％ツイーン20を含むTBSであった。SPAプロテインＡビーズを次に等量、混合液に加えた。この混合液を４℃で終夜混合した。
【００４１】
非放射性（「コールド」）PGE2標準を0.5％FBS媒体で希釈した。測定すべき上清の試料も同様に希釈した。
【００４２】
トレーサは、3-H PGE2が総体積500μl中に50mCiの総放射能を有するように調製され、そして５μl中の参照平均は4.74×105cpmであった。
【００４３】
アッセイは、アッセイ緩衝液の20μl を各ウエルに、コールド標準または試料の20μlを適切なウエルに、トレーサの25μlをブランク対照ウエル以外の全てのウエルに、抗体／ビーズ混合液の130μlを非特異的結合（NSB）ウエル以外の全てのウエルに、および抗体を含まない適切に希釈されたビーズの130μlをNSBウエルに加えた。このプレートを室温で２時間振とうさせた。放射能の読み取りはWallac 1450 Microbeta Triluxを用いて行った。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】アラキドン酸代謝経路を図示する。
【図２】mPGE2細胞系アッセイで、化合物の単一の濃度（１点）および複数の濃度（この例では８点）の両方を用いる代表的なスクリーニングシステムを示す。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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