(57)【要約】1つの局面において、本発明は、粗血漿、血清、血漿由来冷却上清、分画ヒト血漿、血漿由来冷却沈澱、および組み換えブロスからなる群より選択される、タンパク質を含む溶液からタンパク質を単離するためのプロセスに関する。本プロセスは、式M-S-L（式中、Mはマトリックス骨格、Sは任意でのスペーサーアーム、Lはメルカプトニコチン酸であるリガンドである）を有する固体分離媒体を提供する工程と、タンパク質の少なくとも1つが該固体分離媒体に可逆的に結合されるように、タンパク質を含む溶液に固体分離媒体を接触させる工程とを含む。次に少なくとも1つの溶出工程を実施し、固体分離媒体から少なくとも1つのタンパク質画分を選択的に溶出する。別の局面において、本発明は、第VIII因子および/または第IX因子を単離するためのプロセスに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
粗血漿、血清、血漿由来冷却上清、分画ヒト血漿、血漿由来冷却沈澱、および組換え型ブロスからなる群より選択される、タンパク質を含む溶液からタンパク質を単離するためのプロセスであって、以下の工程を含むプロセス：
(i) 下記式を有する固体分離媒体を提供する工程：
M-S-L
式中、Mはマトリックス骨格、Sは任意でのスペーサーアーム、Lはメルカプトニコチン酸であるリガンドである；
(ii) 該タンパク質の少なくとも1つが該固体分離媒体に可逆的に結合されるように、該固体分離媒体を該溶液と接触させる工程；
(iii) 固体分離媒体から少なくとも1つのタンパク質画分を選択的に溶出するために、少なくとも1つの溶出工程を実施する工程。
【請求項２】
溶液が粗血漿である、請求項1記載のプロセス。
【請求項３】
Mが高密度樹脂である、請求項1または請求項2記載のプロセス。
【請求項４】
Lが2-メルカプトニコチン酸である、請求項1〜3のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項５】
Sがエポキシ基を含む化合物である、請求項1〜4のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項６】
少なくとも1つのタンパク質画分が、以下からなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載のプロセス：IgG、IgA、IgM、IgD、またはIgEといった免疫グロブリン、トランスフェリン、フィブリノーゲンまたはその誘導体、抗トロンビン、例えば抗トロンビンIIIといった血漿プロテアーゼ阻害剤、血液凝固促進タンパク質、血液抗凝固タンパク質、サイトカイン、成長因子、アルブミンまたはその誘導体、血栓溶解剤、抗血管新生タンパク質、インスリンまたはその誘導体、α-1-抗トリプシンといったα-1-プロテイナーゼ阻害剤またはその誘導体、α-2-抗プラスミンまたはその誘導体、C-1エステラーゼ阻害剤、アポリポタンパク質、HDL、フィブロネクチンまたはその誘導体、β-2-糖タンパク質I、プラスミノーゲン、プラスミン、プラスミノーゲン活性化因子、プラスミノーゲン阻害剤、ウロキナーゼまたはその誘導体、ストレプトキナーゼまたはその誘導体、インター（inter）-α-トリプシン阻害剤、α-2-マクログロブリン、アミロイドタンパク質、オロソムコイド、フェリチン、プレアルブミン、GC-グロブリン、ヘモペキシン、およびC3補体。
【請求項７】
少なくとも1つのタンパク質画分が、免疫グロブリン、トランスフェリン、フィブリノーゲンまたはその誘導体、α-1-プロテイナーゼ阻害剤、およびアルブミン、またはその誘導体からなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質を含む、請求項6記載のプロセス。
【請求項８】
タンパク質を含む溶液が約3.0〜約6.0のpHを有する、請求項1〜7のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項９】
タンパク質を含む溶液が約4.5〜約6.0のpHを有する、請求項8記載のプロセス。
【請求項１０】
第1のタンパク質画分を溶出するため、第1の溶出工程が、約4〜約8のpH、および約0.00005 S/cm〜約0.1 S/cmのイオン強度を有する溶液で固体分離媒体を溶出する工程を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項１１】
第1のタンパク質画分が、α-1プロテイナーゼ阻害剤、アルブミン、オロソムコイド、およびプレアルブミンからなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質を含む、請求項10記載のプロセス。
【請求項１２】
第2のタンパク質画分を溶出するため、第2の溶出工程が、約5〜約7のpH、および約0.0001 S/cm〜約0.1 S/cmのイオン強度を有する溶液で固体分離媒体を溶出する工程を含む、請求項10または請求項11記載のプロセス。
【請求項１３】
溶液が、芳香族、非芳香族、または複素環式芳香族の疎水性化合物をさらに含む、請求項12記載のプロセス。
【請求項１４】
非芳香族の疎水性化合物が、アルキルカルボン酸の塩、スルホン酸の塩、または負に荷電した界面活性剤である、請求項13記載のプロセス。
【請求項１５】
第2のタンパク質画分が、アルブミンおよび免疫グロブリンからなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質を含む、請求項12〜14のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項１６】
第3のタンパク質画分を溶出するため、第3の溶出工程が、約5〜約9のpH、および約0.001 S/cm〜約4 S/cmのイオン強度を有する溶液で固体分離媒体を溶出する工程を含む、請求項12〜15のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項１７】
第3のタンパク質画分が、免疫グロブリン、トランスフェリン、およびフィブリノーゲンからなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質を含む、請求項16記載のプロセス。
【請求項１８】
第4のタンパク質画分を溶出するため、第4の溶出工程が、約5〜約9のpH、および約0.01 S/cm〜約2 S/cmのイオン強度を有する溶液で固体分離媒体を溶出する工程を含む、請求項16または請求項17記載のプロセス。
【請求項１９】
溶液が無機酸の塩をさらに含む、請求項18記載のプロセス。
【請求項２０】
第4のタンパク質画分が、トランスフェリン、免疫グロブリン、フィブリノーゲン、およびα-2-マクログロブリンからなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質を含む、請求項18または請求項19記載のプロセス。
【請求項２１】
拡張ベッド吸着カラムにおいて拡張ベッドモードで行われる、請求項1〜20のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項２２】
充填ベッドカラムにおいて充填ベッドモードで行われる、請求項1〜20のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項２３】
粗血漿、血清、血漿由来冷却上清、分画ヒト血漿、血漿由来冷却沈澱、および組換え型ブロスからなる群より選択される、第VIII因子および/または第IX因子を含む溶液から第VIII因子および/または第IX因子を単離するためのプロセスであって、以下の工程を含むプロセス：
(i) 下記式を有する固体分離媒体を提供する工程：
M-S-L
式中、Mはマトリックス骨格、Sは任意でのスペーサーアーム、Lはキシリレンジアミンであるリガンドである；
(ii) 少なくとも第VIII因子および/または第IX因子が該固体分離媒体に可逆的に結合されるように、該固体分離媒体を該溶液と接触させる工程；
(iii) 固体分離媒体から非結合タンパク質を溶出するために、第1の溶出工程を実施する工程；
(iv) 固体分離媒体から第VIII因子および/または第IX因子を溶出するために、第2の溶出工程を実施する工程。
【請求項２４】
第VIII因子および第IX因子を含む溶液が粗血漿である、請求項23記載のプロセス。
【請求項２５】
Mが高密度樹脂である、請求項23または請求項24のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項２６】
Sがエポキシ基を含む化合物である、請求項23〜25のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項２７】
第1のタンパク質画分を溶出するため、第1の溶出工程が、約5.5〜約6.5のpH、および約0.001 S/cm〜約0.02 S/cmのイオン強度を有する溶液で固体分離媒体を溶出する工程を含む、請求項23〜26のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項２８】
第2のタンパク質画分を溶出するため、第2の溶出工程が、約7〜約9のpH、および約0.03 S/cm〜約0.2 S/cmのイオン強度を有する溶液で固体分離媒体を溶出する工程を含む、請求項27記載のプロセス。
【請求項２９】
溶液が無機酸の塩をさらに含む、請求項27または請求項28記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生物学的原料からタンパク質を単離するためのプロセスに関する。より詳しくは、本発明は、血液からタンパク質を単離するためのプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
血漿は自然界で最も価値の高い原材料の1つであり、血漿から精製されたタンパク質は世界中の何百万という個体の生命と幸福に必須である。これらタンパク質の大多数はCohn冷エタノール分画によって生成される。このプロセスは、1940年代初期にHarvard UniversityのDr Edwin Cohnによって開発された。Cohnは、血漿中のタンパク質をそれらの沈澱特性に基づいて様々な条件（pH、イオン強度、タンパク質濃度、温度、およびエタノール濃度）下で分離することが可能であることを見出した。これらのパラメーターを変更することにより、様々なタンパク質が工程毎に沈澱してくる。Cohn技術は血漿産業において何十年にもわたって用いられているが、このプロセスには純度と効率の点でいくつか限界がある。このプロセスは質の良い産物を生成できる一方で、手順の柔軟性と生成される産物の純度に限界がある。この方法論をまだ用いている最も一般的な商業的に生成されているタンパク質としては、アルブミン、免疫グロブリン、抗トロンビンIII、トロンビン、およびフィブリノーゲンが挙げられる。
【０００３】
血漿製品製造における1種の技術的進歩は、静止固体表面（固相）を含む封入カラムに液体（移動相）が浸透していくにつれて静止相上へタンパク質分子が選択的に吸着されることに基づいて血漿中のタンパク質を分離する、クロマトグラフィーの使用を組み入れている。吸着または相互作用の効率に依存して種々のタンパク質の動きが様々な度合いで遅滞し、カラム下部からそれらを分離・採集することが可能となる。
【０００４】
クロマトグラフィーは本質的に、タンパク質を高濃度のエタノールに長時間曝露する伝統的なCohn冷エタノールプロセスよりも穏やかなタンパク質分離手段である。高濃度のエタノールに長時間曝露すると、タンパク質が変性して望ましくない凝集物を生成し、これら産物を与えられた患者に有害な治療結果をもたらしうる。対照的に、クロマトグラフィー分画は、タンパク質の元来の構造に影響することなく不純物を効率的に取り除く。大規模な沈澱作業を繰り返すCohn冷エタノール分画と比べて、クロマトグラフィーはより直接的な分離方法であり、血漿リットル当たり生成されるタンパク質量を増加させることができる。
【０００５】
現在までに受け入れられているクロマトグラフィー法はまだ、必要な純度レベルを保持または増強しつつ収量を最適化するという点で課題を提供する。既存の方法よりも優れた純度および収量で血漿成分を選択的に溶出する、効率的で費用効果の高いクロマトグラフィー技法の必要性が残されている。
【０００６】
1960年代初期、血漿を低温でインキュベートすると沈澱形成が見られることが認められた。この沈澱は、第VIII因子、フォンウィルブラント（Von Willebrands）因子、および数々の他の血漿タンパク質を含むことが確かめられた。当初、この冷却沈澱（cryoprecipitate）は血友病A患者を処置するために用いられたが、製品に対する患者の耐性を改善する必要性に伴い、より精製された形態の第VIII因子が利用可能となった。冷却沈澱プロセスは、今日の産業に用いられる第VIII因子産生の第1の基礎であり続けている。残念なことに、このプロセスはそれほど効率的でなく、冷却沈澱ではなく血漿を直接用いることによって第VIII因子の回収率を改善するよう種々の試みがなされているが、これらの試みのうち商業的に成功しているものはほとんどない。
【０００７】
第IX因子は血友病B患者の処置に用いられ、十分に確立されているCohn血漿分画プロセスの副画分である上清Iから単離される。上清I中の第IX因子は通常、本質的に全て現行の製造プロセスで、Heparin Sepharoseを用いるアフィニティークロマトグラフィー工程によってさらに精製されるが、全体のプロセスがCohn分画に基づいているため、製造効率における大きな限界が残されたままである。
【０００８】
やはりこのケースでも、第VIII因子および/または第IX因子を含む混合物から第VIII因子および/または第IX因子を単離するための、より効率的なプロセスの必要性がある。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
第1の局面によると、本発明は、粗血漿、血清、血漿由来冷却上清（cryosupernatant）、分画ヒト血漿、血漿由来冷却沈澱、および組み換えブロスからなる群より選択される、タンパク質を含む溶液からタンパク質を単離するためのプロセスであって、以下の工程を含むプロセスを提供する：
(i) 下記式を有する固体分離媒体を提供する工程：
M-S-L
式中、Mはマトリックス骨格、Sは任意でのスペーサーアーム（spacer arm）、Lはメルカプトニコチン酸であるリガンドである；
(ii) 該タンパク質の少なくとも1つが該固体分離媒体に可逆的に結合されるように、該固体分離媒体を該溶液と接触させる工程；
(iii) 固体分離媒体から少なくとも1つのタンパク質画分を選択的に溶出するために、少なくとも1つの溶出工程を実施する工程。
【００１０】
以下の特徴が本発明の第1の局面に関する。
【００１１】
1つの態様において、タンパク質は哺乳動物またはヒト起源である。
【００１２】
スペーサーアームSは、エポキシ基を含む化合物（例えば、ブタンジオールジグリシジルエーテル（butane dioldiglycidylether）もしくはエピクロロヒドリン）、またはリガンドの共有結合（covalent attachment）について当技術分野で公知の他の適したカップリング試薬に由来しうる。
【００１３】
マトリックス骨格Mは、固体分離媒体がリガンドで官能化された樹脂であるような樹脂でありうる。さらに樹脂は、リガンドが付着していてもよい任意の樹脂でありうる。そしてさらに樹脂は、例えば流動ベッド吸着および拡張ベッド吸着（expanded bed adsorption）などの非充填ベッド吸着に適した高密度樹脂、例えば、6%または4%アガロースに基づく高度に架橋されたビーズ状アガロース誘導体、アガロース-タングステンカーバイド集成体（conglomerate）、アガロースステンレススチール集成体、アガロース-石英集成体、多孔性セラミックビーズ、多孔性ジルコニアビーズ、制御孔ガラスから作られたビーズ、および孔内に有機ポリマーを含む多孔性無機材料の複合ビーズでありうる。
【００１４】
1つの態様において、リガンドは2-メルカプトニコチン酸でありうる。
【００１５】
リガンドに対するタンパク質の結合は可逆的なので、タンパク質は以下に述べる適切な溶出条件下で固体分離媒体から単離されうる。
【００１６】
固体分離媒体は、約10ミクロン〜約150ミクロンの範囲の平均粒子サイズと約1.5 g/ml〜15 g/mlの範囲のビーズ密度とを、あるいは約10ミクロン〜120ミクロンの範囲の平均粒子サイズと約2.0 g/ml〜15 g/mlの範囲のビーズ密度とを、あるいは約15ミクロン〜100ミクロンの範囲の平均粒子サイズと約2.3 g/ml〜15 g/mlの範囲のビーズ密度とを、あるいは約15ミクロン〜80ミクロンの範囲の平均粒子サイズと約3 g/ml〜15 g/mlの範囲のビーズ密度とを有する高密度樹脂を含みうる。
【００１７】
第1の局面のプロセスによって単離されるタンパク質は、以下のものからなる群より選択されうる：免疫グロブリン、例えば、IgG、IgA、IgM、IgD、またはIgE、トランスフェリン（Tf）、フィブリノーゲンまたはその誘導体、抗トロンビン、例えば抗トロンビンIIIなどの血漿プロテアーゼ阻害剤、血液凝固促進タンパク質、血液抗凝固タンパク質、サイトカイン、成長因子、アルブミンまたはその誘導体、血栓溶解剤、抗血管新生タンパク質、インスリンまたはその誘導体、α-1-抗トリプシンなどのα-1-プロテイナーゼ阻害剤またはその誘導体、α-2-抗プラスミンまたはその誘導体、C-1エステラーゼ阻害剤、アポリポタンパク質、HDL、フィブロネクチンまたはその誘導体、β-2-糖タンパク質I、プラスミノーゲン、プラスミン、プラスミノーゲン活性化因子、プラスミノーゲン阻害剤、ウロキナーゼまたはその誘導体、ストレプトキナーゼまたはその誘導体、インター（inter）-α-トリプシン阻害剤、α-2-マクログロブリン、アミロイドタンパク質、オロソムコイド、フェリチン、プレアルブミン、GC-グロブリン、ヘモペキシン、およびC3補体。
【００１８】
タンパク質画分は1つのタンパク質を含みうる。あるいは、タンパク質画分は複数のタンパク質を含みうる。
【００１９】
本プロセスは、1〜50、1〜30、1〜20、1〜10、1〜5つの溶出工程、1〜3、または1つの溶出工程を含みうる。
【００２０】
1つの態様において、各溶離剤は約4.0〜約9.0の範囲のpHを有しうる。あるいは、各溶離剤は約4.0〜8.5の範囲のpHを有しうる。あるいは、各溶離剤は約4.0〜約8.0の範囲のpHを有しうる。さらに、各溶離剤は約5.0〜約8.0の範囲のpHを有しうる。さらに、各溶離剤は約4.5〜8.0の範囲のpHを有しうる。そしてさらに、各溶離剤は約5.5〜約8.0の範囲のpHを有しうる。そしてまたさらに、各溶離剤は約6.0〜8.0の範囲のpHを有しうる。
【００２１】
各溶離剤は約0.00005シーメンス/センチメートル（S/cm）〜約10.0 S/cmの範囲のイオン強度を有しうる。あるいは、各溶離剤は約0.0005 S/cm〜10.0 S/cmの範囲のイオン強度を有しうる。あるいは、各溶離剤は約0.0001 S/cm〜約6.0 S/cmの範囲のイオン強度を有しうる。さらに、各溶離剤は約0.001 S/cm〜約5.5 S/cmの範囲のイオン強度を有しうる。そしてさらに、各溶離剤は約0.001 S/cm〜約5.0 S/cmの範囲のイオン強度を有しうる。そしてさらに、各溶離剤は約0.005 S/cm〜約5.0 S/cmの範囲のイオン強度を有しうる。そしてまたさらに、溶離剤は約0.01 S/cm〜約4.0 S/cmの範囲のイオン強度を有しうる。
【００２２】
各溶離剤は、上記に特定した範囲内のpHおよびイオン強度の値の任意の組み合わせを有しうる。
【００２３】
第1、第2、または第3の溶離剤は、約4.0〜約9.0のpHと約0.00005 S/cm〜約10.0 S/cmのイオン強度とを有しうる。第1の溶離剤は、約4.0〜約8.0のpHと約0.00005 S/cm〜約0.1 S/cmのイオン強度とを有しうる。さらに、第1の溶離剤は、約4.5〜約6.5のpHと約0.00005 S/cm〜約0.075 S/cmのイオン強度とを有しうる。さらに、第1の溶離剤は、約5.0〜約6.0のpHと約0.001 S/cm〜約0.05 S/cmのイオン強度とを有しうる。
【００２４】
第2の溶離剤は、約5.0〜約7.0のpHと約0.0001 S/cm〜約0.1 S/cmのイオン強度とを有しうる。あるいは、第2の溶離剤は、約5.5〜約6.5のpHと約0.0001 S/cm〜約0.075 S/cmのイオン強度とを有しうる。さらに、第2の溶離剤は、約5.5〜約6.5のpHと約0.001 S/cm〜約0.05 S/cmのイオン強度とを有しうる。
【００２５】
第3の溶離剤は、約5.0〜約9.0のpHと約0.0001 S/cm〜約4.0 S/cmのイオン強度とを有しうる。あるいは、第3の溶離剤は、約6.0〜約8.0のpHと0.01 S/cm〜約3.0 S/cmのイオン強度とを有しうる。さらに、第3の溶離剤は、約6.0〜約8.0のpHと約0.05 S/cm〜約2.0 S/cmのイオン強度とを有しうる。
【００２６】
第1の溶離剤は、タンパク質の生物学的機能の喪失を起こさない溶離剤、例えば、鉱質除去水、または強無機酸の1もしくは複数の無機塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、および硫酸アンモニウムなどの、塩酸、硫酸、および硝酸の塩の水溶液でありうる。あるいは、第1の溶離剤は、タンパク質の生物学的機能の喪失を起こさない無機および/または有機酸の塩を含む水性緩衝溶液、例えば、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、リン酸塩、またはホウ酸塩を含む緩衝剤でありうる。
【００２７】
第2の溶離剤は、タンパク質の生物学的機能の喪失を起こさない無機および/または有機酸の塩を含む水性緩衝溶液、例えば、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、リン酸塩、またはホウ酸塩を含む緩衝剤でありうる。1つの態様において、第2の溶離剤は、中〜長鎖のアルキル-カルボン酸およびアルキル-スルホン酸の塩などの、非芳香族、芳香族、または複素芳香族疎水性部位を有する負に荷電した分子、ならびにドデシル硫酸ナトリウムおよびデオキシコール酸ナトリウムなどの負に荷電した界面活性剤を含む。例えば、第2の溶離剤は、カプロン酸、ヘプタン酸、カプリル酸、ペルラゴン酸（perlagonic acid）およびカプリン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、およびペンタデカン酸からなる群より選択される1または複数の酸の塩、ならびにその不飽和およびアルキル置換誘導体を含みうる。あるいは、第2の溶離剤は、ヘキサンスルホン酸、オクタンスルホン酸、デカンスルホン酸、ドデカンスルホン酸、ヘキサン硫酸、オクタン硫酸、デカン硫酸、およびドデカン硫酸からなる群より選択される1または複数の酸の塩を含みうる。
【００２８】
第3の溶離剤は、タンパク質の生物学的機能の喪失を起こさない無機および/または有機酸の塩を含む水性緩衝溶液、例えば、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、リン酸塩、またはホウ酸塩を含む緩衝剤でありうる。あるいは、第3の溶離剤は、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウムなどの、比較的高いライオトロフォビシティー（lyotrophobicity）の無機または有機塩を含みうる。
【００２９】
第1の局面のプロセスは、第4のタンパク質画分を選択的に溶出するために、第4の溶離剤で固体分離媒体を溶出する工程を含みうる。第4の溶離剤は、約5.0〜約9.0のpHと約0.01 S/cm〜約2 S/cmのイオン強度とを有しうる。あるいは、第4の溶離剤は、約6.0〜約8.0のpHと約0.01 S/cm〜約1.0 S/cmのイオン強度とを有しうる。さらに、第4の溶離剤は、約6.0〜約8.0のpHと約0.05 S/cm〜約1.0 S/cmのイオン強度とを有しうる。第4の溶離剤は、単離するタンパク質と適合性である無機および/または有機酸の塩を含む水性緩衝溶液、例えば、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、リン酸塩、またはホウ酸塩を含む緩衝剤でありうる。
【００３０】
第4の溶離剤はまた、タンパク質の生物学的機能の喪失を起こさない無機酸、特に強無機酸の1または複数の無機塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウムなどの、塩酸、硫酸、および硝酸の塩の水溶液を含みうる。
【００３１】
第1のタンパク質画分は、アルブミン、オロソムコイド、プレアルブミン、α-1-プロテイナーゼ阻害剤（α-1-PI）、トランスフェリン、およびフィブリノーゲンからなる群より選択される、1または複数のタンパク質を含みうる。
【００３２】
第2のタンパク質画分は、抗トロンビン、例えば抗トロンビンIII、アルブミン、免疫グロブリン、トランスフェリン、およびフィブリノーゲンからなる群より選択される、1または複数のタンパク質を含みうる。
【００３３】
第3のタンパク質画分は、免疫グロブリン、例えば、IgA、IgD、IgE、IgG、および/またはIgM、トランスフェリン、ならびにフィブリノーゲンからなる群より選択される、1または複数のタンパク質を含みうる。
【００３４】
第4のタンパク質画分は、トランスフェリン、α-2-マクログロブリン、IgMなどの免疫グロブリン、およびフィブリノーゲンからなる群より選択される、1または複数のタンパク質を含みうる。
【００３５】
第2の局面によると、本発明は、粗血漿、血清、血漿由来冷却上清、分画ヒト血漿、血漿由来冷却沈澱、および組み換えブロスからなる群より選択される、第VIII因子および/または第IX因子を含む溶液から、第VIII因子および/または第IX因子を単離するためのプロセスであって、以下の工程を含むプロセスを提供する：
(i) 下記式を有する固体分離媒体を提供する工程：
M-S-L
式中、Mはマトリックス骨格、Sは任意でのスペーサーアーム、Lはキシリレンジアミンであるリガンドである；
(ii) 少なくとも第VIII因子および/または第IX因子が該固体分離媒体に可逆的に結合されるように、該固体分離媒体を該溶液と接触させる工程；
(iii) 固体分離媒体から非結合タンパク質を溶出するために、第1の溶出工程を実施する工程；
(iv) 固体分離媒体から第VIII因子および/または第IX因子を溶出するために、第2の溶出工程を実施する工程。
【００３６】
Mは、非充填ベッド吸着、例えば流動ベッド吸着および拡張ベッド吸着に適した高密度樹脂、例えば、6%または4%アガロースに基づく高度に架橋されたビーズ状アガロース誘導体、アガロース-タングステンカーバイド集成体、アガロースステンレススチール集成体、アガロース-石英集成体、多孔性セラミックビーズ、多孔性ジルコニアビーズ、制御孔ガラスから作られたビーズ、および孔内に有機ポリマーを含む多孔性無機材料の複合ビーズでありうる。
【００３７】
高密度樹脂は、約10ミクロン〜約300ミクロンまたは約15ミクロン〜150ミクロンの範囲の平均粒子サイズと、約1.1 g/ml〜15 g/mlまたは約1.5 g/ml〜15 g/mlの範囲のビーズ密度とを、あるいは約10ミクロン〜120ミクロンの範囲の平均粒子サイズと約2.0 g/ml〜15 g/mlのビーズ密度とを、あるいは約15ミクロン〜100ミクロンの範囲の平均粒子サイズと約2.3 g/ml〜15 g/mlの範囲のビーズ密度とを、あるいは約15ミクロン〜80ミクロンの範囲の平均粒子サイズと約3 g/ml〜15 g/mlの範囲のビーズ密度とを有しうる。
【００３８】
スペーサーアームSは、エポキシ基を含む化合物（例えば、ブタンジオールジグリシジルエーテルもしくはエピクロロヒドリン）、またはリガンドの共有結合について当技術分野で公知の他の適したカップリング試薬に由来しうる。
【００３９】
1つの態様において、Lはm-キシリレンジアミンでありうる。あるいはLはp-キシリレンジアミンでありうる。Lはまたo-キシリレンジアミンであってもよい。
【００４０】
非結合タンパク質は、限定はされないが、以下のものからなる群より選択されうる：IgG、IgA、IgM、IgD、またはIgE、トランスフェリン（Tf）、フィブリノーゲンまたはその誘導体、抗トロンビン、例えば抗トロンビンIIIなどの血漿プロテアーゼ阻害剤、血液凝固促進タンパク質、血液抗凝固タンパク質、サイトカイン、成長因子、アルブミンまたはその誘導体、血栓溶解剤、抗血管新生タンパク質、インスリンまたはその誘導体、α-1-抗トリプシンなどのα-1-プロテイナーゼ阻害剤またはその誘導体、α-2-抗プラスミンまたはその誘導体、C-1エステラーゼ阻害剤、アポリポタンパク質、HDL、フィブロネクチンまたはその誘導体、β-2-糖タンパク質I、プラスミノーゲン、プラスミン、プラスミノーゲン活性化因子、プラスミノーゲン阻害剤、ウロキナーゼまたはその誘導体、ストレプトキナーゼまたはその誘導体、インター-α-トリプシン阻害剤、α-2-マクログロブリン、アミロイドタンパク質、オロソムコイド、フェリチン、プレアルブミン、GC-グロブリン、ヘモペキシン、およびC3補体。
【００４１】
溶出工程で用いる溶離剤は約5.0〜約9.0の範囲のpHを有しうる。溶離剤は約0.0001 S/cm〜約10.0 S/cmの範囲の伝導率を有しうる。溶離剤は約6.0〜約9.0の範囲のpHと約0.03 S/cm〜約0.2 S/cmの伝導率とを有しうる。
【００４２】
溶離剤はほぼ同じpHを有しうるが、イオン強度において異なりうる。例えば、各溶離剤は様々な緩衝系を含み得、ならびに/またはさらに別の塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウムなどの、塩酸、硫酸、および硝酸の塩を含みうる。
【００４３】
各溶離剤は、上記に特定した範囲内のpHおよびイオン強度の値の任意の組み合わせを有しうる。溶離剤は、第VIII因子および/または第IX因子の生物学的機能の喪失を起こさない無機または有機酸の塩を含む水性緩衝溶液、例えば、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、ホウ酸塩、またはリン酸塩を含む緩衝剤を含みうる。溶離剤はまた、タンパク質の生物学的機能の喪失を起こさない強無機酸の1または複数の無機塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウムなどの、塩酸、硫酸、および硝酸の塩の水溶液を含みうる。
【００４４】
第1および第2の溶離剤は、約6.0〜約8.0のpHと約0.0001 S/cm〜約1.0 S/cmのイオン強度とを有しうる。あるいは、第1の溶離剤は、約5.5〜約6.0のpHと約0.0001 S/cm〜約0.01 S/cmのイオン強度とを有しうる。
【００４５】
さらに、第1の溶離剤は、約5.5〜約6.0のpHと約0.0001 S/cm〜約0.05 S/cmのイオン強度とを有しうる。さらに、第1の溶離剤は、約6.0〜約6.5のpHと約0.001 S/cm〜約0.1 S/cmのイオン強度とを有しうる。
【００４６】
第2の溶離剤は、約6.0〜約8.0のpHと約0.0001 S/cm〜約0.1 S/cmのイオン強度とを有しうる。あるいは第2の溶離剤は、約6.0〜約8.0のpHと約0.0001 S/cm〜約0.5 S/cmのイオン強度とを有しうる。さらに、第2の溶離剤は、約7.0〜約9.0のpHと約0.001 S/cm〜約1 S/cmのイオン強度とを有しうる。
【００４７】
以上の段落に述べたように溶離剤のpHおよび伝導率を制御することにより、本プロセスを用いて第VIII因子および第IX因子ならびに他の物質を含む溶液から第VIII因子および第IX因子を混合物として単離することが可能である。あるいは、溶液が第VIII因子のみを含む場合（例えば、溶液が血漿由来冷却沈澱、または第VIII因子のみが発現されている組み換えブロスである場合）、上の段落に述べたように溶離剤のpHおよび伝導率を制御することにより、本プロセスを用いて第VIII因子のみを単離することが可能である。溶液が第IX因子のみを含む場合（例えば、溶液が血漿由来冷却上清、または第IX因子のみが発現されている組み換えブロスである場合）、上の段落に述べたように溶離剤のpHおよび伝導率を制御することにより、本プロセスを用いて第IX因子のみを単離することが可能である。
【００４８】
定義
以下は、本発明の説明を理解するために役立つ可能性があるいくつかの定義である。
【００４９】
本明細書の文脈において、「含む」（comprising）という用語は、「主に含むが、必ずしもそれのみを含むわけではない」ことを意味する。さらに、「含む（comprise）」および「含む（comprises）のような」、「含む」という単語の変化形は、対応して変化した意味を有する。
【００５０】
本発明の文脈において、「溶出段階」、「溶出」または「溶出する」という用語は、互換的に用いられる可能性があり、固体分離媒体に結合して、または結合せずに、その後固体分離媒体から放出される可能性がある一つまたは複数のタンパク質を含むタンパク質分画を得る段階を指すと意図される。
【００５１】
本明細書の文脈において、「洗浄段階」という用語は、固体分離媒体から如何なるタンパク質も実質的に放出しない、固体分離媒体に液体を流す段階を指すと意図される。
【００５２】
本明細書の文脈において、「平衡段階」という用語は、流出した溶液の対イオン濃度、伝導率、およびpHが流入する溶液とほぼ同じであるように、十分な溶液を固体分離媒体の中に通過させる段階を指すと意図される。
【００５３】
本明細書の文脈において、「組換え型ブロス（broth）」という用語は、遺伝子操作された細胞によってインビトロで発現されている可溶性タンパク質を指す。組換え型ブロスにおける、これらの操作された細胞によって発現される可能性があるタンパク質には；凝固経路のタンパク質、例えば第VII因子、第VIII因子、第IX因子、または第XIII因子、免疫グロブリン、例えばIgG、IgA、IgM、IgD、またはIgE、トランスフェリン（Tf）、フィブリノーゲンまたはその誘導体、抗トロンビン、例えば抗トロンビンIII、α1-プロテイナーゼ阻害剤のような血漿プロテアーゼ阻害剤、血中凝固促進タンパク質、血中抗凝固タンパク質、サイトカイン、増殖因子、アルブミンまたはその誘導体、血栓溶解剤、抗血管新生タンパク質、インスリンまたはその誘導体、α-1抗トリプシン、α-2-抗トリプシンまたはその誘導体のようなα-1プロテイナーゼ阻害剤またはその誘導体、C-1エステラーゼ阻害剤、アポリポタンパク質、HDL、フィブロネクチンまたはその誘導体、β-2糖タンパク質I、プラスミノーゲン、プラスミン、プラスミノーゲン活性化因子、プラスミノーゲン阻害剤、ウロキナーゼまたはその誘導体、ストレプトキナーゼまたはその誘導体、インター（inter）-α-トリプシン阻害剤、α-2マクログロブリン、アミロイドタンパク質、オロソムコイド、フェリチン、プレアルブミン、GC-グロブリン、ヘモペキシン、およびC3補体が含まれてもよい。
【００５４】
本明細書の文脈において、「血漿」という用語は、血液の液体部分を指し、90％より多い水を含む複雑な溶液である。血漿の主要な溶質は、不均一な群のタンパク質である。他の血漿構成成分には、脂肪物質（脂質）、無機電解質、グルコース、アミノ酸、ビタミン、ホルモン、および代謝老廃物が含まれる。
【００５５】
本明細書の文脈において、「血清」という用語は、凝固の過程においてフィブリノーゲンが除去されている血漿を指す。
【００５６】
本明細書の文脈において、「冷却上清」および「冷却沈殿」という用語は、以下に従って理解されるべきである：冷却上清は、冷却沈殿の除去後の血漿から生成された溶液である。冷却沈殿は、1℃〜10℃の温度に血漿を曝露することによって血漿から沈殿したタンパク質で構成される。
【００５７】
本明細書の文脈において、「分画ヒト血漿」という用語は、分離プロセス、例えば、沈殿、濾過、クロマトグラフィー等に供された血漿に由来する血漿の任意の成分または成分の混合物を指すと理解すべきである。
【００５８】
本明細書の文脈において、「通過液（run-through）」という用語は、第一の溶出段階から得られた溶出液（eluate）と混合されている、血漿溶液をカラムにローディングした場合に得られた溶出液を含む本発明の第二の局面から得られたタンパク質分画を指すと理解すべきである。
【００５９】
発明の詳細な説明
タンパク質の単離
本発明の第一の局面は、生体溶液からタンパク質を単離するためのプロセスに関する。より詳しく述べると、本発明は、ヒト血漿、ヒト血漿に由来する冷却上清、分画ヒト血漿、ヒト血漿に由来する冷却沈殿、血清、または組換え型ブロスからヒトタンパク質を単離するためのプロセスに関する。
【００６０】
タンパク質を含む溶液は、もう一つの適した液体によって希釈してから、固体分離媒体に接触させてもよい。例えば、血漿は、脱塩水によって、または単離されるタンパク質と適合性である強い無機酸の一つもしくは複数の無機塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウムのような、塩酸塩、硫酸塩、および硝酸塩の水溶液によって希釈してもよい。
【００６１】
タンパク質を含む溶液は、もう一つの適した液体によって約1000：1〜約1：1000の比で希釈してもよい。例えば、希釈比は、約1000：1、約750：1、約500：1、約250：1、約100：1、約50：1、約25：1、約10：1、約7.5：1、約5：1、約3：1、約2.5：1、約2：1、約1：1、約1：2、約1：2.5、約1：3、約1：5、約1：7.5、約1：10、約1：25、約1：50、約1：100、約1：250、約1：500、約1：750、または約1：1000であってもよい。
【００６２】
タンパク質を含む溶液のpHは、固体分離媒体に液体を接触させる前に調節してもよい。または、pHは、タンパク質を含む溶液を固体分離媒体に接触させた後に調節してもよい。pHは上昇させてもよく、またはpHは低下させてもよい。または、pHは不変であってもよい。pHは、約3.0〜約6.0の範囲のpHに調節してもよく、またはpHは約4.5〜約6.0の範囲のpHに調節してもよい。
【００６３】
例えば、pHは、約3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0に調節してもよい。pHは、適した酸、例えば塩酸、硫酸、リン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸等を用いて調節してもよい。
【００６４】
pHは、適した塩基、例えば炭酸塩、重炭酸塩、アンモニア、水酸化物等を用いて調節してもよい。pHは、適した緩衝系によって調節してもよい。緩衝系は当業者に周知であり、これには、例えばクエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、ギ酸塩、コハク酸塩、MES、ADA、ビストリスプロパン、PIPES、ACES、イミダゾール、MOPS、TES、HEPES、HEPPS、TRICINE、グリシンアミド塩酸塩、TRIS、BICINE、グリシルグリシン、ホウ酸、CHES、CAPSが含まれる。多くの緩衝系が市販されており、例えば、Sigma Chemical Companyから得てもよい。当業者は、所望のpHに関して適した緩衝系を同定することができるであろう。
【００６５】
溶離剤（eluant）は、pHが異なってもよい。溶出段階は、pHが増加する、またはpHが減少する溶離剤によって固体分離媒体を処置する段階を含んでもよい。
【００６６】
溶離剤は、ほぼ同じpHを有してもよいが、イオン強度が異なってもよい。例えば、それぞれの溶離剤は、異なる緩衝系を含んでもよく、および／または任意でさらなる塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウムのような、塩酸塩、硫酸塩および硝酸塩を含む。
【００６７】
溶出したタンパク質のそれぞれの収量は、開始材料に存在するタンパク質の量と比較して、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％であってもよい。
【００６８】
溶出段階は、0℃〜40℃の温度範囲で行ってもよい。例えば、温度は、約5℃、約10℃、約15℃、約20℃、約25℃、約30℃、約35℃、または約40℃であってもよい。
【００６９】
第一の局面のプロセスには、任意で1回または複数の洗浄段階が含まれてもよい。洗浄段階は、第一の局面のプロセスの任意の段階で、例えば、タンパク質を含む溶液に固体分離媒体を接触させる前に、タンパク質を含む溶液に固体分離媒体を接触させた後に、または各溶出段階のあいだに行ってもよい。洗浄段階は、それによって、タンパク質の生物機能の喪失が起こらない任意の溶液、例えば水、生理食塩液、または緩衝液、例えばクエン酸緩衝液を用いて行ってもよい。
【００７０】
洗浄段階は、第二の溶離剤によって固体分離媒体を溶出した後に行ってもよい。洗浄緩衝液は、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウムのような、ライオトロフォビシティー（lyotrophobicity）が比較的高い無機または有機塩を含んでもよい。洗浄緩衝液のイオン強度は、少なくとも0.001 S/cm、または少なくとも0.01 S/cm、または少なくとも0.1 S/cm、またはさらに少なくとも1.0 S/cmであってもよい。
【００７１】
第一の局面のプロセスにはさらに、一つまたは複数の平衡段階が含まれてもよい。平衡段階は、タンパク質を含む溶液に固体分離媒体を接触させる前に行ってもよい。平衡段階は、固体分離媒体のpHおよびイオン強度を調節するために、固体分離媒体を水または適した緩衝液によって処置する段階を含んでもよい。平衡段階のために用いられる溶液は、脱塩水であってもよく、または単離されるタンパク質と適合性である強い無機酸の一つもしくは複数の無機塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウムのような、塩酸塩、硫酸塩、および硝酸塩の水溶液であってもよい。または、平衡緩衝液は、単離されるタンパク質と適合性である無機および／または有機酸の塩を含む水性緩衝液、例えばクエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、リン酸塩、またはホウ酸塩を含む緩衝液であってもよい。
【００７２】
平衡段階は、約10℃〜約40℃の温度範囲で行ってもよい。例えば、温度は約10℃、約15℃、約20℃、約25℃、約30℃、または約40℃であってもよい。
【００７３】
タンパク質を含む溶液のpHは、タンパク質を含む溶液に固体分離媒体を接触させる前に、固体分離媒体を平衡にするために用いられる緩衝液のpHと同じであってもよい。タンパク質を含む溶液のpHは、タンパク質を含む溶液に固体分離媒体を接触させる前に、固体分離媒体を平衡にするために用いられる緩衝液のpHと異なってもよい。
【００７４】
第一の局面のプロセスには、一つまたは複数の再生段階がさらに含まれてもよい。再生段階は、固体分離媒体から残留材料を除去することができる適した試薬によって、固体分離媒体を処置する段階を含む。再生段階は、第一の溶出段階が行われた後の如何なる時期に行ってもよい。適した再生試薬には、塩基、例えば水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムのような水酸化物溶液、過酸または過酸化水素の溶液、次亜塩素酸塩溶液のような活性塩素を含む溶液、塩酸グアニジニウムのような変性剤、有機溶媒、例えばエタノールが含まれてもよい。
【００７５】
第一の局面のプロセスに従って、固体分離媒体は、適したクロマトグラフィーカラム装置にローディングしてもよい。プロセスは、充填（packed）ベッドモードで充填ベッドカラムにおいて行ってもよい。または、プロセスは、拡張（expanded）ベッドモードで拡張ベッド吸収（EBA）カラムにおいて行ってもよい。第一の局面の文脈において、実質的に全てのヒト血漿タンパク質を、一つのカラムにおける固体分離媒体に吸着させることができる。次に、本明細書に記述の連続溶出段階を用いて、特異的タンパク質が濃縮されたタンパク質分画を選択的に溶出することができる。
【００７６】
EBAカラムは当技術分野において周知であり、液体を拡張ベッドカラムに導入する方法を含む、適したカラム装置およびセットアップは、GE Healthcare、Swedenから市販されている、またはその全内容が相互参照により本明細書に組み入れられる、国際公開公報第99/65586号、国際公開公報第01/85329号、および国際公開公報第92/00799号に記述されている。
【００７７】
第一の局面の一つの態様は、EBAカラムを選択する段階、および固体分離媒体の適当量をカラムに入れる段階を含む。用いる固体分離媒体の量は、適用されるタンパク質を含む溶液の量、およびタンパク質溶液におけるタンパク質濃度に依存するであろう。タンパク質溶液がヒト血漿または冷却沈殿血漿である場合、典型的に血漿0.5〜1.5 Lあたり固体分離媒体1.0 Lを用いる。タンパク質溶液が組換え型発酵ブロスである場合、発酵ブロス1 Lおよび発酵ブロス1000 Lまでに対して固体分離媒体1 Lを用いてもよい。固体分離媒体が流動化されるまでカラムの底からフロースルーを確立する。適したカラムの線流速には、0.5〜20 cm/分、または約5 cm/分〜15 cm/分の範囲の流速が含まれる。次に、適当な溶液（例えば水、電解質水溶液、または緩衝液）を用いて固体分離媒体を平衡にした後、血漿、血清、冷却上清、可溶化冷却沈殿または組換え型ブロスのような溶液をカラムの底に導入してもよい。溶液を固体分離媒体にローディングした後、任意でさらなる洗浄段階を行ってもよい。次に、特異的タンパク質が濃縮されたタンパク質分画を選択的に溶出するために、溶出段階を行ってもよい。
【００７８】
各溶出段階は、一つまたは複数のタンパク質を含むタンパク質分画を選択的に溶出するために適した条件で行われる。例えば、それぞれの溶出段階において用いられる溶離剤のpHおよび／またはイオン強度を変化させることによって、異なるタンパク質を溶出してもよい。溶離剤は、適当な緩衝液を用いて適したpHおよびイオン強度に調節してもよい。イオン強度はまた、塩を用いて調節してもよい。連続的溶出段階は、固体分離媒体を、pHが増加する溶離剤によって処置する段階を含んでもよい。または、連続的溶出段階は、pHが減少する溶離剤によって固体分離媒体を処置する段階を含んでもよい。
【００７９】
第一の局面に従うもう一つの態様は、2-メルカプトニコチン酸によって官能化されたアガロース-タングステンカーバイド集塊ビーズを含むEBAカラムを確立する段階を含む。アガロース-タングステンカーバイドビーズは、40〜120ミクロンのサイズ分布を有し、平均直径70ミクロンを有する。ビーズの密度は2.9 g/mlである。平衡段階は、pH約4.5のクエン酸緩衝液を用いて行われ、直後にpH約5.0のクエン酸緩衝液によるさらなる平衡段階を行う。次に、2倍量の水で希釈して、HClによってpHを5.0に調節したヒト血漿を、固体分離媒体1 Lあたり希釈血漿1.5 Lの割合でカラムに適用した。カラムを以下の緩衝液によって溶出した：
溶出1．10 mMクエン酸ナトリウム、pH 5.0
溶出2．5 g/Lカプリル酸ナトリウムおよびHCl、pH 6.0
溶出3．1 Mクエン酸ナトリウム、pH 8.0
溶出4．20 mMクエン酸ナトリウムおよび0.1 M塩化ナトリウム、pH 8.0
次に、固体分離媒体を1 M NaOHによって再生した。
全ての操作の流速は7.5 cm/分であり、用いた各溶液の量を以下の表2に示す。
【００８０】
用いた溶離剤の容積は典型的に、多くの相互関連する要因に依存するであろう、例えば：
（i）試料の適用、洗浄、溶出、再生、および平衡の際に用いる流速；
（ii）溶出した産物分画の数；
（iii）溶離剤の選択は個々の分画の収率および純度に影響を及ぼすことから、各段階において用いられた溶離剤の選択；
（iv）得られた産物の収率および純度に同様に影響を及ぼす個々の分画のあいだの最適なギャップ；
（v）一般的に、消費される洗浄および溶出容積は、固体分離媒体のベッドの高さが減少すると減少することから、固体分離媒体のベッドの高さ。
【００８１】
表2は、上記の態様における各段階の溶液の最適容積を示す。
【００８２】
図3を参照して、タンパク質α-1プロテイナーゼ阻害剤、アルブミン、IgGおよびフィブリノーゲンが効率的に単離されうることが、上記の態様から認められうる。
【００８３】
【表２】
2008511546.tif 000002
* CVはカラム容積である。
【００８４】
下記の表3は、SRIによって決定した場合の、適用した未希釈血漿と比較したタンパク質の収量を示す。
【００８５】
【表３】
2008511546.tif 000003
【００８６】
溶離剤分画1〜4における個々のタンパク質の相対的収量を決定するために、一元放射免疫拡散（SRI）を行った。図4は、アルブミン、IgG、α-1プロテイナーゼ阻害剤、およびフィブリノーゲンに関するSRI分析を示す。
【００８７】
上記のプロセスは、潤滑で再現性よく、単純な方法で行われることが見いだされた。最終的な溶出液は全て、如何なるタンパク質の有意な変性／沈殿の徴候もなく、透明な液体であることが見いだされた。SDS-PAGEおよび上記のSRIによるカラム後の検査は、溶出した産物の切断、凝集、または免疫反応性の変化の徴候を示さなかった。
【００８８】
当業者は、第一の局面、および実際に第二の局面のプロセスが、カラムに存在する液体の紫外線吸収によって測定することによってモニターされる可能性があることを承知しているであろう。タンパク質および他のUV吸収材料の存在は、本発明のプロセスの際に検出および定量することができ、異なるタンパク質分画の正確な収集を行うことができる。同様に、pH、伝導率、および屈折率の連続的なモニタリングは、本発明のプロセスを記録および制御するために有用となる可能性がある。
【００８９】
第VIII因子および第IX因子の単離
第VIII因子および／または第IX因子を含む溶液は典型的に、固体分離媒体に直接接触させてもよい未希釈血漿である。または、未希釈血漿はもう一つの適した液体によって希釈した後、固体分離媒体に接触させてもよい。例えば、血漿は、脱塩水によって、または第VIII因子および／または第IX因子と適合性である強い無機酸の一つもしくは複数の無機塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウムのような、塩酸塩、硫酸塩、および硝酸塩の水溶液によって希釈してもよい。
【００９０】
第VIII因子および／または第IX因子を含む溶液は、もう一つの適した液体によって約1000：1〜約1：1000の割合で希釈してもよい。例えば、希釈比は、約1000：1、約750：1、約500：1、約250：1、約100：1、約50：1、約25：1、約10：1、約7.5：1、約5：1、約3：1、約2.5：1、約2：1、約1：1、約1：2、約1：2.5、約1：3、約1：5、約1：7.5、約1：10、約1：25、約1：50、約1：100、約1：250、約1：500、約1：750、または約1：1000であってもよい。
【００９１】
第VIII因子および／または第IX因子を含む溶液のpHは、固体分離媒体に接触させる前に調節してもよい。または、pHは、第VIII因子および／または第IX因子を含む溶液を固体分離媒体に接触させた後に調節してもよい。pHは上昇させてもよく、またはpHは低下させてもよい。または、pHは不変であってもよい。pHは、約5.0〜約9.0の範囲のpHに調節してもよい。例えば、pHは約5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、または9.0に調節してもよい。pHは、適した酸、例えば塩酸、硫酸、リン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸等を用いて調節してもよい。
【００９２】
pHは、適した塩基、例えば炭酸塩、重炭酸塩、アンモニア、水酸化物等を用いて調節してもよい。pHは、適した緩衝系によって調節してもよい。緩衝系は当業者に周知であり、これには、例えばクエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、ギ酸塩、コハク酸塩、MES、ADA、ビストリスプロパン、PIPES、ACES、イミダゾール、MOPS、TES、HEPES、HEPPS、TRICINE、グリシンアミド塩酸塩、TRIS、BICINE、グリシルグリシン、ホウ酸、CHES、CAPSが含まれる。多くの緩衝系が市販されており、例えば、Sigma Chemical Companyから得てもよい。当業者は、所望のpHに関して適した緩衝系を同定することができるであろう。
【００９３】
プロセスには、任意で一つまたは複数の洗浄段階が含まれてもよい。洗浄段階は、第VIII因子および／または第IX因子を含む溶液に固体分離媒体を接触させる前に行ってもよく、または第VIII因子および／または第IX因子を含む溶液に固体分離媒体を接触させた後に行ってもよい。洗浄段階は、第VIII因子および／または第IX因子の生物機能の喪失が起こらない任意の溶液、例えば水、生理食塩液、または緩衝液、例えばクエン酸緩衝液を用いて行ってもよい。
【００９４】
または、洗浄緩衝液は、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウムのような、ライオトロフォビシティーが比較的高い無機または有機塩を含んでもよい。洗浄緩衝液は約5.0〜約9.0のpH範囲を有してもよい。洗浄緩衝液のpHは、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、または9.0であってもよい。洗浄緩衝液は、約0.1 mS/cm〜約100 mS/cmの範囲の伝導率を有してもよい。または、洗浄緩衝液は約0.1 mS/cm〜約40 mS/cmの範囲の伝導率を有してもよい。
【００９５】
洗浄緩衝液はまた、タンパク質の生物機能の喪失が起こらない強い無機酸の一つまたは複数の無機塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウムのような、塩酸塩、硫酸塩、および硝酸塩の水溶液を含んでもよい。
【００９６】
プロセスにはさらに、一つまたは複数の平衡段階が含まれてもよい。第VIII因子および／または第IX因子を含む溶液に固体分離媒体を接触させる前に、平衡段階を行ってもよい。平衡段階は、固体分離媒体のpHおよびイオン強度を調節するために、水または適した緩衝液によって固体分離媒体を処置する段階を含んでもよい。平衡段階のために用いられる溶液は、脱塩水であってもよく、または第VIII因子および／または第IX因子と適合性である強い無機酸の一つもしくは複数の無機塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウムのような、塩酸塩、硫酸塩、および硝酸塩の水溶液であってもよい。または、平衡緩衝液は、第VIII因子および／または第IX因子と適合性である無機および／または有機酸の塩を含む水性緩衝液、例えばクエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、リン酸塩、またはホウ酸塩を含む緩衝液であってもよい。
【００９７】
平衡段階は、約2℃〜約28℃の温度範囲で行ってもよい。例えば、温度は約2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、または28℃であってもよい。
【００９８】
第VIII因子および／または第IX因子を含む溶液のpHは、第VIII因子および／または第IX因子を含む溶液に固体分離媒体を接触させる前に固体分離媒体を平衡にするために用いられる緩衝液のpHと同じであってもよい。第VIII因子および／または第IX因子を含む溶液のpHは、第VIII因子および／または第IX因子を含む溶液に固体分離媒体を接触させる前に固体分離媒体を平衡にするために用いられる緩衝液のpHと異なってもよい。
【００９９】
プロセスには、一つまたは複数の再生段階がさらに含まれてもよい。再生段階は、固体分離媒体から残留材料を除去することができる適した試薬によって固体分離媒体を処置する段階を含む。再生段階は、第VIII因子および第IX因子を溶出するために溶離剤によって固体分離媒体を溶出した後に行ってもよい。適した再生試薬には、塩基、例えば水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムのような水酸化物溶液、過酸または過酸化水素の溶液、次亜塩素酸塩溶液のような活性塩素を含む溶液、塩酸グアニジニウムのような変性剤、有機溶媒、例えばエタノールが含まれてもよい。
【０１００】
プロセスは、充填ベッドモードで充填ベッドカラムにおいて行ってもよい。またはプロセスは、拡張ベッドモードでEBAカラムにおいて行ってもよい。
【０１０１】
一つの態様において、先に記述したように、プロセスを用いて、他の物質と共に第VIII因子および第IX因子を含む溶液からの混合物として第VIII因子および第IX因子を単離してもよい。この態様において、EBAカラムを選択して、その中に適当な量の固体分離媒体を入れる。用いる固体分離媒体の量は、適用される第VIII因子および第IX因子を含む溶液の量、ならびに溶液中の第VIII因子および第IX因子の濃度に依存するであろう。タンパク質溶液がヒト血漿または冷却沈殿血漿である場合、典型的に血漿5〜30 Lあたり固体分離媒体1.0 Lを用いる。タンパク質溶液が組換え型発酵ブロスである場合、発酵ブロス1 Lおよび発酵ブロス1000 Lまでに対して固体分離媒体1 Lを用いてもよい。固体分離媒体が流動化されるまでカラムの底からフロースルーを確立する。適したカラムの線流速には、0.5 cm/分〜40 cm/分、または約3 cm/分〜15 cm/分の範囲の流速が含まれる。次に、適当な溶液（例えば水、電解質水溶液、または緩衝液）を用いて平衡段階を行った後、第VIII因子および第IX因子を含む溶液、例えば粗血漿をカラムの底に導入してもよく、それによって第VIII因子および第IX因子を含む溶液を固体分離媒体に接触させる。次に、カラムから未結合のタンパク質を溶出するために、第一の溶出段階を行ってもよい。第一の溶出段階の後、任意で洗浄段階を行ってもよい。次に、第VIII因子および第IX因子を固体分離媒体から溶出するために、第二の溶出段階を行ってもよい。
【０１０２】
本発明の第一および第二の局面は、第一段階が、第VIII因子、またはフォンウィルブラント（von Willebrand）因子とのその複合体、および／または第IX因子を、英文明細書の4頁に記載した任意のタンパク質を含む溶液から濃縮係数少なくとも10で単離するために本発明の第二の局面を用いることを含み、第二段階が、第二の局面の第一段階から得られた未結合タンパク質を、α-1プロテイナーゼ阻害剤、アルブミン、IgG、抗トロンビンIII、およびフィブリノーゲンのようなタンパク質を含む分画へと全て高い収率で分離するために本発明の第一の局面を用いることを含む、二段階プロセスにおいて連続的に用いることができる。
【０１０３】
第二の局面のプロセスは、他のタンパク質単離プロセスと連続して用いてもよい。例えば、第二の局面のプロセスは、通過液（run-through）から得られた分画に存在する残りのタンパク質を原料として用いて、血漿溶液から第VIII因子および／または第IX因子を単離するために用いてもよく、そこからタンパク質、例えばアルブミン、フィブリノーゲン、免疫グロブリン、α-1プロテイナーゼ阻害剤を、様々な他の分画プロセス、例えば沈殿、濾過、イオン交換クロマトグラフィー等を用いて単離してもよい。
【０１０４】
本発明の局面の第一および第二の局面の単離されたタンパク質を、適当な製剤、例えば、粉末、溶液、液体等に組み入れてもよい。いくつかの製品製剤の例を表4に提供する。
【０１０５】
【表４】
2008511546.tif 000004
【０１０６】
単離されたタンパク質分画のさらなる精製も同様に、必要に応じて、または適当であれば本発明のプロセスにおいて用いてもよい。
【０１０７】
そのような一つの方法は、陰イオン交換または疎水性相互作用クロマトグラフィー段階を連続的に含めることを含んでもよい。これらのような方法は、本発明のプロセスから得られたタンパク質分画を濃縮およびさらに精製するように機能する。連続クロマトグラフィー段階または複数の段階にとって最適な静止媒体および溶出条件を選択することによって、本発明のプロセスによって得られたタンパク質を全て、カラムに結合させることができる。次に、結合したタンパク質を、それによってタンパク質の有意な濃縮およびおそらくさらなる精製が得られる異なる組の化学条件下で、二次カラムから選択的に溶出させることができる。アフィニティクロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー、およびゲル濾過のような他のクロマトグラフィー技術も同様に個々にまたは組み合わせて用いてもよい。
【０１０８】
図1は、本発明のプロセス後に実現可能に用いられる可能性があるさらなる精製段階のいくつかを示す。
【０１０９】
本発明のプロセスは、任意でウイルス不活化段階を含んでもよい。例えば、ウイルス不活化／消失段階を、本発明のプロセスを通して単離されている各産物に関して表5に図示する。
【０１１０】
【表５】
2008511546.tif 000005
【０１１１】
本発明は、以下の実施例に関して説明するために限ってより詳細に記述されるであろう。実施例は、本発明を説明するために供給されると意図され、明細書全体の説明の開示の一般性を制限すると解釈すべきではない。
【０１１２】
実施例
実施例1  −  α-1-プロテイナーゼ阻害剤、抗トロンビンIII、フィブリノーゲン、免疫グロブリンおよびアルブミン
段階1. 固体分離媒体：2-メルカプトニコチン酸で官能性を持たせたアガロース-タングステンカーバイドビーズ。アガロース-タングステンカーバイドビーズは、70ミクロンの平均直径をもつ40〜120ミクロンの間のサイズ分布をもつ。ビーズの密度は、2.9g/mlであった(Fast Line UFC NNSDWカタログ番号：CS48, UpFront Chromatography A/S, Copenhagen, Denmark)。ビーズはEBAカラム(FastLine 100, UpFront Chromatography A/S, Copenhagen, Denmark)(10cm直径；50cm固定ベッド高さ；固定ベッド容量＝3.926L)に入れられる。平衡は、25℃の温度においてpH4.5での40mMクエン酸ナトリウムの2.5カラム容量(9.8L)、続いて、7.5cm/minの直線的流速における40 mMクエン酸ナトリウムおよびpH5.0のさらなる2.5カラム容量(9.8L)で行われる。
【０１１３】
段階2. このカラム上へ、4Lの水で1:2の比で希釈されている解凍されたヒト血漿の2Lを含む希釈血漿溶液の6Lが負荷された。希釈血漿溶液のpHは、カラムへの添加の前に1M HClでpH5.0に調整され、負荷比は、樹脂の1リットルあたり希釈血漿溶液の1.5リットルであった。
【０１１４】
段階3. 希釈血漿溶液の負荷後、カラムは、10mMクエン酸ナトリウム、pH5.0を含む緩衝液の4.2カラム容量(16.49L)を含む溶出緩衝液1で溶出された。これは、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するα-1-プロテイナーゼ阻害剤の95%より多くを含む、結合していないタンパク質、脂質、および他の物質の取り出しを生じた。
【０１１５】
段階4. 段階3後、カラムは、5g/Lカプリル酸ナトリウム/HCl、pH6.0を含む溶出緩衝液2の2.9カラム容量(11.39L)で溶出された。段階4は、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するアルブミン量の95%より高い収率でのカラムからのアルブミンの溶出を生じた。この段階はまた、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在する抗トロンビンIIIの60%の溶出を生じた。
【０１１６】
段階5. 上の段階4に記載されているようにカラムの溶出後、カラムは、1Mクエン酸ナトリウム、pH8.0を含む溶出緩衝液3の4.4カラム容量(17.27L)で溶出された。この段階は、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在する免疫グロブリンの95%より多くの溶出を生じた。
【０１１７】
段階6. 上の段階5に記載されているようにカラムの溶出後、カラムは、pH8.0での0.1M塩化ナトリウムを含む20mMクエン酸ナトリウムの2.1カラム容量(8.24L)を含む溶出緩衝液4で溶出された。この段階は、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するフィブリノーゲンの95%より多くの溶出を生じた。
【０１１８】
段階7. 段階6に記載されているようにカラムの溶出後、カラムは、1M水酸化ナトリウムの1カラム容量(3.926L)で再生され、40mMクエン酸ナトリウム、pH4.5の2.5カラム容量(9.8L)、続いて40mMクエン酸ナトリウムおよびpH5.0のさらなる2.5カラム容量(9.8L)で再平衡化された。
【０１１９】
実施例2  −  追加の洗浄段階が含まれるα-1-プロテイナーゼ阻害剤、アルブミン、免疫グロブリンおよびフィブリノーゲンの単離
この実施例に用いられる固体分離媒体は、実施例1で用いられたのと同じである。
【０１２０】
段階1. EBAカラム(FastLine 20, UpFront Chromatography A/S, Copenhagen, Denmark)(2cm直径；25cmベッド高さ；固定ベッド容量＝78.5mL)は、5.0cm/minの直線的流速における40 mMクエン酸ナトリウム、pH4.5の2.5カラム容量(196.3mL)で21℃の温度において平衡化された。
【０１２１】
段階2. このカラム上へ、78.5mLの水で1:2の比で希釈されている解凍されたヒト血漿の39.3mLを含む希釈血漿溶液の117.8mLが負荷された。希釈血漿溶液のpHは、カラムへの添加の前に1M HClでpH5.0に調整され、負荷比は、樹脂の1リットルあたり血漿溶液の1.5リットルであった。
【０１２２】
段階3. 希釈血漿溶液の負荷後、カラムは、10mMクエン酸ナトリウム、pH5.0を含む溶出緩衝液1の3.3カラム容量(259.2mL)で溶出された。これは、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するα-1-プロテイナーゼ阻害剤を含む、結合していないタンパク質、脂質、および他の物質の取り出しを生じた。
【０１２３】
段階4. 上の段階3後、カラムは、5g/Lカプリル酸ナトリウム/HCl、pH6.0を含む溶出緩衝液2の2.6カラム容量(204.2mL)で溶出された。段階4は、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するアルブミンの溶出を生じた。
【０１２４】
段階4a. 上の段階4に記載されているようにカラムの溶出後、カラムは、1Mクエン酸ナトリウム、pH8.0の1.0カラム容量(78.5mL)で洗浄された。
【０１２５】
段階5. 上の段階4aに記載されているようにカラムの洗浄後、カラムは、0.3Mクエン酸ナトリウム、pH8.0を含む溶出緩衝液3の4.9カラム容量(384.8mL)で溶出された。この段階は、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在する免疫グロブリンの溶出を生じた。
【０１２６】
段階6. 上の段階5に記載されているようにカラムの溶出後、カラムは、pH8.0での0.1M塩化ナトリウムを含む20mMクエン酸ナトリウムの2.6カラム容量(204.2mL)を含む溶出緩衝液4で溶出された。この段階は、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するフィブリノーゲンの溶出を生じた。
【０１２７】
段階7. 段階6に記載されているようにカラムの溶出後、カラムは、1M水酸化ナトリウムの1カラム容量(78.5mL)で再生され、40mMクエン酸ナトリウム、pH4.5の2.0カラム容量(157mL)で再平衡化された。
【０１２８】
実施例3  −  α-1-プロテイナーゼ阻害剤、アルブミン、トランスフェリン、免疫グロブリンおよびフィブリノーゲンの単離
この実施例に用いられる固体分離媒体は、実施例1で用いられたのと同じである。
【０１２９】
段階1. EBAカラム(FastLine 20, UpFront Chromatography A/S, Copenhagen, Denmark)(2cm直径；25cmベッド高さ；固定ベッド容量＝78.5mL)は、15.0cm/minの直線的流速における40 mMクエン酸ナトリウム、pH5.0の2.5カラム容量(196.3mL)で21℃の温度において平衡化された。
【０１３０】
段階2. このカラム上へ、78.5mLの水で1:2の比で希釈されている解凍されたヒト血漿の39.3mLを含む希釈血漿溶液の117.8mLが負荷された。希釈血漿溶液のpHは、カラムへの添加の前に1M HClでpH5.0に調整され、負荷比は、樹脂の1リットルあたり血漿溶液の1.5リットルであった。
【０１３１】
段階3. 希釈血漿溶液の負荷後、カラムは、脱塩水の9.4カラム容量(738.3mL)を含む溶出緩衝液1で溶出された。これは、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するα-1-プロテイナーゼ阻害剤の100%、アルブミンの10%、トランスフェリンの5%およびフィブリノーゲンの10%を含む、結合していないタンパク質、脂質、ならびに他の物質の取り出しを生じた。
【０１３２】
段階4. 段階3後、カラムは、5g/Lカプリル酸ナトリウム/HCl、pH6.0を含む溶出緩衝液2の8.9カラム容量(699mL)で溶出された。段階4は、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するアルブミン量の90%の収率でのカラムからのアルブミンの溶出を生じた。この段階はまた、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在する免疫グロブリンの5%の溶出を生じる。
【０１３３】
段階5. 上の段階4に記載されているようにカラムの溶出後、カラムは、0.3Mクエン酸ナトリウム、pH8.0を含む溶出緩衝液3の9.0カラム容量(706.8mL)で溶出された。この段階は、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在する免疫グロブリンの85%より多くの溶出を生じた。この段階はまた、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するトランスフェリンの95%およびフィブリノーゲンの30%の溶出を生じる。
【０１３４】
段階6. 上の段階5に記載されているようにカラムの溶出後、カラムは、pH8.0での0.1M塩化ナトリウムを含む20mMクエン酸ナトリウムの5.0カラム容量(392.7mL)を含む溶出緩衝液4で溶出された。この段階は、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するフィブリノーゲンの60%および免疫グロブリンの10%の溶出を生じた。
【０１３５】
段階7. 段階6に記載されているようにカラムの溶出後、カラムは、1M水酸化ナトリウムの1カラム容量(78.5mL)で再生され、40mMクエン酸ナトリウム、pH5.0の2.0カラム容量(157mL)で再平衡化された。
【０１３６】
実施例4  −  α-1-プロテイナーゼ阻害剤、免疫グロブリン、トランスフェリンおよびフィブリノーゲンの単離
この実施例に用いられる固体分離媒体は、実施例1で用いられたのと同じである。
【０１３７】
段階1. EBAカラム(FastLine 20, UpFront Chromatography A/S, Copenhagen, Denmark)(2cm直径；25cmベッド高さ；固定ベッド容量＝78.5mL)は、5.0cm/minの直線的流速における40 mMクエン酸ナトリウム、pH5.0の2.5カラム容量(196.3mL)で21℃の温度において平衡化された。
【０１３８】
段階2. このカラム上へ、78.5mLの水で1:2の比で希釈されている解凍されたヒト血漿の39.3mLを含む希釈血漿溶液の117.8mLが負荷された。希釈血漿溶液のpHは、カラムへの添加の前に1M HClでpH5.0に調整され、負荷比は、樹脂の1リットルあたり血漿溶液の1.5リットルであった。
【０１３９】
段階3. 希釈血漿溶液の負荷後、カラムは、脱塩水の6.8カラム容量(533.8mL)を含む溶出緩衝液1で溶出された。これは、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するα-1-プロテイナーゼ阻害剤の100%、アルブミンの10%、トランスフェリンの5%およびフィブリノーゲンの10%を含む、結合していないタンパク質、脂質、ならびに他の物質の取り出しを生じた。
【０１４０】
段階4. 上の段階3に記載されているようにカラムの洗浄後、カラムは、5g/Lカプリル酸ナトリウム/HCl、pH6.0を含む溶出緩衝液2の5.5カラム容量(431.75mL)で溶出された。段階4は、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するアルブミン量の90%の収率でのカラムからのアルブミンの溶出を生じた。この段階はまた、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在する免疫グロブリンの5%の溶出を生じる。
【０１４１】
段階5. 上の段階4後、カラムは、0.3Mクエン酸ナトリウム、pH8.0を含む溶出緩衝液3の5.0カラム容量(392.5mL)で溶出された。この段階は、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在する免疫グロブリンの85%より多くの溶出を生じた。この段階はまた、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するトランスフェリンの95%およびフィブリノーゲンの30%の溶出を生じる。
【０１４２】
段階6. 上の段階5に記載されているようにカラムの溶出後、カラムは、pH8.0での0.1M塩化ナトリウムを含む20mMクエン酸ナトリウムの3.1カラム容量(243.35mL)を含む溶出緩衝液4で溶出された。この段階は、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するフィブリノーゲンの60%および免疫グロブリンの10%の溶出を生じた。
【０１４３】
段階7. 段階6に記載されているようにカラムの溶出後、カラムは、1M水酸化ナトリウムの1カラム容量(78.5mL)で再生され、40mMクエン酸ナトリウム、pH5.0の2.0カラム容量(157mL)で再平衡化された。
【０１４４】
実施例5  −  α-1-プロテイナーゼ阻害剤、アルブミン、免疫グロブリン、フィブリノーゲンおよびトランスフェリンの単離
この実施例に用いられる固体分離媒体は、実施例1で用いられたのと同じである。
【０１４５】
段階1. EBAカラム(FastLine 20, UpFront Chromatography A/S, Copenhagen, Denmark)(2cm直径；25cmベッド高さ；固定ベッド容量＝78.5mL)は、10.0cm/minの直線的流速における40 mMクエン酸ナトリウム、pH5.0の2.5カラム容量(196.3mL)で21℃の温度において平衡化された。
【０１４６】
段階2. このカラム上へ、78.5mLの水で1:2の比で希釈されている解凍されたヒト血漿の39.3mLを含む希釈血漿溶液の117.8mLが負荷された。希釈血漿溶液のpHは、カラムへの添加の前に1M HClでpH5.0に調整され、負荷比は、樹脂の1リットルあたり血漿溶液の1.5リットルであった。
【０１４７】
段階3. 希釈血漿溶液の負荷後、カラムは、脱塩水の9.5カラム容量(745.75mL)を含む溶出緩衝液1で溶出された。これは、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するα-1-プロテイナーゼ阻害剤の100%、アルブミンの10%、トランスフェリンの5%およびフィブリノーゲンの10%を含む、結合していないタンパク質、脂質、ならびに他の物質の取り出しを生じた。
【０１４８】
段階4. 上の段階3後、カラムは、5g/Lカプリル酸ナトリウム/HCl、pH6.0を含む溶出緩衝液2の7.1カラム容量(557.35mL)で溶出された。段階4は、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するアルブミン量の90%の収率でのカラムからのアルブミンの溶出を生じた。この段階はまた、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在する免疫グロブリンの5%の溶出を生じる。
【０１４９】
段階5. 上の段階4後、カラムは、0.3Mクエン酸ナトリウム、pH8.0を含む溶出緩衝液3の5.9カラム容量(463.15mL)で溶出された。この段階は、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在する免疫グロブリンの85%より多くの溶出を生じた。この段階はまた、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するトランスフェリンの95%およびフィブリノーゲンの30%の溶出を生じる。
【０１５０】
段階6. 上の段階5に記載されているようにカラムの溶出後、カラムは、pH8.0での0.1M塩化ナトリウムを含む20mMクエン酸ナトリウムの3.1カラム容量(243.35mL)を含む溶出緩衝液4で溶出された。この段階は、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するフィブリノーゲンの60%および免疫グロブリンの10%の溶出を生じた。
【０１５１】
段階7. 段階6に記載されているようにカラムの溶出後、カラムは、1M水酸化ナトリウムの1カラム容量(78.5mL)で再生され、40mMクエン酸ナトリウム、pH5.0の2.0カラム容量(157mL)で再平衡化された。
【０１５２】
実施例6  −  α-1-プロテイナーゼ阻害剤、アルブミン、免疫グロブリン、トランスフェリンおよびフィブリノーゲンの単離
この実施例に用いられる固体分離媒体は、実施例1で用いられたのと同じである。
【０１５３】
段階1. EBAカラム(FastLine 20, UpFront Chromatography A/S, Copenhagen, Denmark)(2cm直径；25cmベッド高さ；固定ベッド容量＝78.5mL)は、20.0cm/minの直線的流速における40 mMクエン酸ナトリウム、pH5.0の2.5カラム容量(196.3mL)で21℃の温度において平衡化された。
【０１５４】
段階2. このカラム上へ、78.5mLの水で1:2の比で希釈されている解凍されたヒト血漿の39.3mLを含む希釈血漿溶液の117.8mLが負荷された。希釈血漿溶液のpHは、カラムへの添加の前に1M HClでpH5.0に調整され、負荷比は、樹脂の1リットルあたり血漿溶液の1.5リットルであった。
【０１５５】
段階3. 希釈血漿溶液の負荷後、カラムは、脱塩水の12.6カラム容量(989.1mL)を含む溶出緩衝液1で溶出された。これは、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するα-1-プロテイナーゼ阻害剤の100%を含む、結合していないタンパク質、脂質、ならびに他の物質の取り出しを生じた。20cm/minの流速におけるこの段階において、有効量のアルブミンもまた溶出されていることは注目される。
【０１５６】
段階4. 上の段階3後、カラムは、5g/Lカプリル酸ナトリウム/HCl、pH6.0を含む溶出緩衝液2の10.6カラム容量(832.1mL)で溶出された。段階4は、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するアルブミン量の90%の収率でのカラムからのアルブミンの溶出を生じた。この段階はまた、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在する免疫グロブリンの5%の溶出を生じる。
【０１５７】
段階5. 上の段階4後、カラムは、0.3Mクエン酸ナトリウム、pH8.0を含む溶出緩衝液3の6.9カラム容量(541.65mL)で溶出された。この段階は、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在する免疫グロブリンの85%より多くの溶出を生じた。この段階はまた、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するトランスフェリンの95%およびフィブリノーゲンの30%の溶出を生じる。
【０１５８】
段階6. 上の段階5に記載されているようにカラムの溶出後、カラムは、pH8.0での0.1M塩化ナトリウムを含む20mMクエン酸ナトリウムの6.8カラム容量(533.8mL)を含む溶出緩衝液4で溶出された。この段階は、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するフィブリノーゲンの60%および免疫グロブリンの10%の溶出を生じた。
【０１５９】
段階7. 段階6に記載されているようにカラムの溶出後、カラムは、1M水酸化ナトリウムの1カラム容量(78.5mL)で再生され、40mMクエン酸ナトリウム、pH5.0の2.0カラム容量(157mL)で再平衡化された。
【０１６０】
実施例7  −  α-1-プロテイナーゼ阻害剤、アルブミンおよびIgGの単離
この実施例に用いられる固体分離媒体は、実施例1で用いられたのと同じである。
【０１６１】
段階1. EBAカラム(FastLine 20, UpFront Chromatography A/S, Copenhagen, Denmark)(2cm直径；25cmベッド高さ；固定ベッド容量＝78.5mL)は、5.0cm/minの直線的流速における40 mMクエン酸ナトリウム、pH4.5の2.5カラム容量(196.3mL)で21℃の温度において平衡化された。
【０１６２】
段階2. このカラム上へ、78.5mLの水で1:2の比で希釈されている解凍されたヒト血漿の39.3mLを含む希釈血漿溶液の117.8mLが負荷された。希釈血漿溶液のpHは、カラムへの添加の前に1M HClでpH5.0に調整され、負荷比は、樹脂の1リットルあたり血漿溶液の1.5リットルであった。
【０１６３】
段階3. 希釈血漿溶液の負荷後、カラムは、10mMクエン酸ナトリウム、pH5.0を含む溶出緩衝液1の3.3カラム容量(259.2mL)で溶出された。これは、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するα-1-プロテイナーゼ阻害剤を含む、結合していないタンパク質、脂質、ならびに他の物質の取り出しを生じた。
【０１６４】
段階4. 上の段階3に記載されているようにカラムの洗浄後、カラムは、5g/Lカプリル酸ナトリウム/HCl、pH6.0を含む溶出緩衝液2の2.7カラム容量(211.95mL)で溶出された。段階4は、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するアルブミンの溶出を生じた。
【０１６５】
段階5. 削除。
【０１６６】
段階6. 上の段階4に記載されているようにカラムの溶出後、カラムは、pH8.0での0.1M塩化ナトリウムを含む20mMクエン酸ナトリウムの3.8カラム容量(298.3mL)を含む溶出緩衝液4で溶出された。この段階は、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するIgGの溶出を生じた。
【０１６７】
段階7. 段階6に記載されているようにカラムの溶出後、カラムは、1M水酸化ナトリウムの1カラム容量(78.5mL)で再生され、40mMクエン酸ナトリウム、pH4.5の2.0カラム容量(157mL)で再平衡化された。
【０１６８】
実施例8  −  追加の洗浄段階が含まれるα-1-プロテイナーゼ阻害剤、アルブミン、免疫グロブリンおよびフィブリノーゲンの単離
この実施例に用いられる固体分離媒体は、実施例1で用いられたのと同じである。
【０１６９】
段階1. EBAカラム(FastLine 20, UpFront Chromatography A/S, Copenhagen, Denmark)(2cm直径；25cmベッド高さ；固定ベッド容量＝78.5mL)は、5.0cm/minの直線的流速における40 mMクエン酸ナトリウム、pH4.5の2.5カラム容量(392.5mL)で21℃の温度において平衡化された。
【０１７０】
段階2. このカラム上へ、78.5mLの水で1:2の比で希釈されている解凍されたヒト血漿の39.3mLを含む希釈血漿溶液の117.8mLが負荷された。希釈血漿溶液のpHは、カラムへの添加の前に1M HClでpH5.0に調整され、負荷比は、樹脂の1リットルあたり血漿溶液の1.5リットルであった。
【０１７１】
段階3. 希釈血漿溶液の負荷後、カラムは、10mMクエン酸ナトリウム、pH5.0を含む溶出緩衝液1の2.9カラム容量(455.3mL)で溶出された。これは、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するα-1-プロテイナーゼ阻害剤を含む、結合していないタンパク質、脂質、および他の物質の取り出しを生じた。
【０１７２】
段階4. 上の段階3後、カラムは、5g/Lカプリル酸ナトリウム/HCl、pH6.0を含む溶出緩衝液2の2.8カラム容量(439.6mL)で溶出された。段階4は、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するアルブミンの溶出を生じた。
【０１７３】
段階4a. 上の段階4に記載されているようにカラムの溶出後、カラムは、1Mクエン酸ナトリウム、pH8.0の1.0カラム容量(157mL)で洗浄された。
【０１７４】
段階5. 上の段階4aに記載されているようにカラムの洗浄後、カラムは、0.3Mクエン酸ナトリウム、pH8.0を含む溶出緩衝液3の4.5カラム容量(706.5mL)で溶出された。この段階は、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在する免疫グロブリンの溶出を生じた。
【０１７５】
段階6. 上の段階5に記載されているようにカラムの溶出後、カラムは、pH8.0での0.1M塩化ナトリウムを含む20mMクエン酸ナトリウムの1.9カラム容量(298.3mL)を含む溶出緩衝液4で溶出された。この段階は、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するフィブリノーゲンの溶出を生じた。
【０１７６】
段階7. 段階6に記載されているようにカラムの溶出後、カラムは、1M水酸化ナトリウムの1カラム容量(157mL)で再生され、40mMクエン酸ナトリウム、pH4.5の1.9カラム容量(298.3mL)で再平衡化された。
【０１７７】
実施例9  −  追加の洗浄段階が含まれるα-1-プロテイナーゼ阻害剤、アルブミン、免疫グロブリンおよびフィブリノーゲンの単離
この実施例に用いられる固体分離媒体は、実施例1で用いられたのと同じである。
【０１７８】
段階1. EBAカラム(FastLine 20, UpFront Chromatography A/S, Copenhagen, Denmark)(2cm直径；25cmベッド高さ；固定ベッド容量＝78.5mL)は、10.0cm/minの直線的流速における40 mMクエン酸ナトリウム、pH4.5の2.5カラム容量(392.5mL)で21℃の温度において平衡化された。
【０１７９】
段階2. このカラム上へ、78.5mLの水で1:2の比で希釈されている解凍されたヒト血漿の39.3mLを含む希釈血漿溶液の117.8mLが負荷された。希釈血漿溶液のpHは、カラムへの添加の前に1M HClでpH5.0に調整され、負荷比は、樹脂の1リットルあたり血漿溶液の1.5リットルであった。
【０１８０】
段階3. 希釈血漿溶液の負荷後、カラムは、10mMクエン酸ナトリウム、pH5.0を含む溶出緩衝液1の3.7カラム容量(580.9mL)で溶出された。これは、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するα-1-プロテイナーゼ阻害剤を含む、結合していないタンパク質、脂質、および他の物質の取り出しを生じた。
【０１８１】
段階4. 上の段階3後、カラムは、5g/Lカプリル酸ナトリウム/HCl、pH6.0を含む溶出緩衝液2の3.6カラム容量(565.2mL)で溶出された。段階4は、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するアルブミンの溶出を生じた。
【０１８２】
段階4a. 上の段階4に記載されているようにカラムの溶出後、カラムは、1Mクエン酸ナトリウム、pH8.0の1.0カラム容量(157mL)で洗浄された。
【０１８３】
段階5. 上の段階4aに記載されているようにカラムの洗浄後、カラムは、0.3Mクエン酸ナトリウム、pH8.0を含む溶出緩衝液3の5.4カラム容量(847.8mL)で溶出された。この段階は、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在する免疫グロブリンの溶出を生じた。
【０１８４】
段階6. 上の段階5に記載されているようにカラムの溶出後、カラムは、pH8.0での0.1M塩化ナトリウムを含む20mMクエン酸ナトリウムの1.7カラム容量(266.9mL)を含む溶出緩衝液4で溶出された。この段階は、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するフィブリノーゲンの溶出を生じた。
【０１８５】
段階7. 段階6に記載されているようにカラムの溶出後、カラムは、1M水酸化ナトリウムの1カラム容量(157mL)で再生され、40mMクエン酸ナトリウム、pH4.5の2.6カラム容量(408.2mL)で再平衡化された。
【０１８６】
分析測定：
上の実施例についてのすべての収率は、比較一元放射免疫拡散法（comparative single radial immunodiffusion）により測定された(Agnete Ingild：Handbook of Immunoprecipitation-in-Gel Techniques, ed. Nils H. Axelsen, Scandinavian Journal of Immunology, Suppl. No. 10, Vol 17, pp.41-57, 1983を参照)。
【０１８７】
実施例10  −  未処理の血漿からの第VIII因子および第IX因子の単離
段階1. 固体分離媒体：マトリックスバックボーンは、アガロース-タングステンカーバイド樹脂であり、スペーサーは、エポキシ基由来であり、リガンドは、p-キシリレン-ジアミンまたはm-キシリレン-ジアミンである。ビーズはEBAカラム(FastLine 10, UpFront Chromatography A/S, Copenhagen, Denmark)(1cm直径；25cm固定ベッド高さ；固定ベッド容量＝20mL)に入れられる。平衡は、5.0cm/minの直線的流速における20 mMクエン酸ナトリウムおよびpH6.0で25℃の温度において行われる。
【０１８８】
段階2(負荷段階). このカラム上へ、希釈されていない未処理の血漿の300mLが負荷された。血漿のpHは、カラムへの添加の前に1M HClでpH6.0に調整され、負荷比は、樹脂の1リットルあたり血漿の15リットルであった。
【０１８９】
段階3(溶出1). 血漿の負荷後、カラムは、20mMクエン酸ナトリウム、pH6.0を含む溶出緩衝液1の9カラム容量(180mL)で溶出された。これは、結果として、結合していないタンパク質の取り出しを生じた。
【０１９０】
段階4. カラムは、その後、20mMクエン酸ナトリウム＋0.2M塩化ナトリウム、pH6.0を含む洗浄緩衝液の6.4カラム容量(128mL)で洗浄された。
【０１９１】
段階5(溶出2). 上の段階4後、カラムは、20mMクエン酸ナトリウム＋1.0M塩化ナトリウム、pH8.0を含む溶出緩衝液2の6.0カラム容量(120mL)で溶出された。この段階は、結果として、カラムに添加された血漿に存在する第VIII因子活性の45%より多い溶出を生じた。この段階はまた、結果として、カラムに添加された血漿に存在する第IX因子活性の85%の溶出を生じる。
【０１９２】
段階6. 段階5に記載されているようにカラムの溶出後、カラムは、1M水酸化ナトリウムの1カラム容量(20mL)で再生され、20mMクエン酸ナトリウム、pH6.0の2.0カラム容量(40mL)で再平衡化された。
【０１９３】
第VIII因子活性の測定
相対的第VIII因子活性は、Coamaticからの第VIII因子活性キット(カタログ番号822585-63)を用いて未処理の血漿およびEBAタンパク質画分において測定された。標準曲線は、希釈されていない(100%活性)、ならびに最初の活性の80%、60%、40%、20%および0%(ブランク)まで希釈された、未処理の血漿を用いて作成された(示さず)。カラムからの通過液、洗浄液および溶出液(溶出2)からの画分が分析され、溶出液における活性収率は、標準曲線を参照することにより決定された(表7参照)。表7から、固体分離媒体が、適用された条件下で第VIII因子活性の45%を結合かつ溶出することを見ることができる。
【０１９４】
（表７）第VIII因子、画分容量および活性収率
2008511546.tif 000006
【０１９５】
第IX因子抗原の測定：
相対的第IX因子抗原濃度は、市販用抗体を用いて第IX因子サンドイッチELISAにより未処理の血漿およびEBAタンパク質画分において測定された。標準曲線は、希釈されていない(100%)、ならびに最初の濃度の80%、60%、40%、20%および0%(ブランク)まで希釈された、未処理の血漿を用いて作成された(示さず)。カラムからの通過液、洗浄液および溶出液(溶出2)からの画分が分析され、溶出液(溶出2)における抗原収率は、標準曲線を参照することにより決定された(表8参照)。表8から、固体分離媒体が、適用された条件下で第IX因子抗原の85%を結合かつ溶出することを見ることができる。
【０１９６】
（表８）第IX因子、画分容量および抗原収率
2008511546.tif 000007
【０１９７】
選択性
図8は、溶出液(溶出2)が添加されたタンパク質の非常に小さな割合を含むことをSDS-PAGEにより示している。未処理の血漿との直接的比較のために希釈された場合、IgG、アルブミンおよび他のタンパク質のほんの非常にわずかなバンドが目に見え、FVIII/FIXタンパク質画分へのこれらのタンパク質の損失は取るに足らないことを示している。通過液画分もまた、未処理の血漿との直接的比較のために希釈され、タンパク質の有意な損失は観察されない。RIDは、同様に、通過液画分におけるα-1-PIおよびフィブリノーゲンの完全な回収を示した(示さず)。
【０１９８】
実施例11  −  第一局面の過程と第二局面の過程の互換性
実施例10からの通過液画分は、第VIII因子および第IX因子の事前除去が、第一局面の単離過程にいくらかのネガティブな影響を及ぼすかどうかを決定するために第一局面の過程における未処理の材料として用いられた。
【０１９９】
段階1. 固体分離媒体：2-メルカプトニコチン酸で官能性を持たせたアガロース-タングステンカーバイドビーズ。アガロース-タングステンカーバイドビーズは、70ミクロンの平均直径をもつ40〜120ミクロンの間のサイズ分布をもつ。ビーズの密度は、2.9g/mlであった(Fast Line UFC NNSDWカタログ番号：CS48, UpFront Chromatography A/S, Copenhagen, Denmark)。ビーズはEBAカラム(FastLine 20, UpFront Chromatography A/S, Copenhagen, Denmark)(2cm直径；50cm固定ベッド高さ；固定ベッド容量＝157mL)に入れられる。平衡は、25℃の温度においてpH4.5での40mMクエン酸ナトリウムの2.5カラム容量(392.5mL)、続いて、7.5cm/minの直線的流速における40 mMクエン酸ナトリウムおよびpH5.0のさらなる2.5カラム容量(392.5mL)で行われる。
【０２００】
段階2. このカラム上へ、未処理血漿の1部分（part）＋水の2部分に調整された実施例10に記載されたカラムからの通過液が負荷された。希釈血漿溶液のpHは、カラムへの添加の前に1M HClでpH5.0に調整され、負荷比は、樹脂の1リットルあたり血漿溶液の1.5リットルであった。
【０２０１】
段階3. 希釈血漿溶液の負荷後、カラムは、10mMクエン酸ナトリウム、pH5.0を含む溶出緩衝液1の3.3カラム容量(518mL)で溶出された。これは、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するα-1-プロテイナーゼ阻害剤を含む、結合していないタンパク質、脂質、および他の物質の取り出しを生じた。
【０２０２】
段階4. 上の段階3後、カラムは、5g/Lカプリル酸ナトリウム/HCl、pH6.0を含む溶出緩衝液2の2.6カラム容量(408mL)で溶出された。段階4は、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するアルブミンの溶出を生じた。
【０２０３】
段階4a. 上の段階4に記載されているようにカラムの溶出後、カラムは、1Mクエン酸ナトリウム、pH8.0の1.0カラム容量(157mL)で洗浄された。
【０２０４】
段階5. 上の段階4aに記載されているようにカラムの洗浄後、カラムは、0.3Mクエン酸ナトリウム、pH7.4を含む溶出緩衝液3の4.9カラム容量(769mL)で溶出された。この段階は、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在する免疫グロブリンの溶出を生じた。
【０２０５】
段階6. 上の段階5に記載されているようにカラムの溶出後、カラムは、pH7.4での0.1M塩化ナトリウムを含む20mMクエン酸ナトリウムの2.6カラム容量(408mL)を含む溶出緩衝液4で溶出された。この段階は、結果として、カラムに添加された希釈血漿溶液に存在するフィブリノーゲンの溶出を生じた。
【０２０６】
段階7. 段階6に記載されているようにカラムの溶出後、カラムは、1M水酸化ナトリウムの1カラム容量(157mL)で再生され、40mMクエン酸ナトリウム、pH4.5の2.0カラム容量(314mL)で再平衡化された。
【０２０７】
図7から見られうるように、第VIII因子/第IX因子除去された血漿で得られた定性的パターンは、実施例4で得られたパターンと同一である。各画分について得られた過程容量もまた、実施例4に記載されたものと等しかった。
【０２０８】
図8A〜Bは、異なるタンパク質画分におけるアルブミンおよびIgGの定量分析を示し、見られうるように、アルブミンのほとんどすべてが溶出2において回収され、かつIgGのほとんどすべてが溶出3において回収された。アルブミンおよびIgGは、他の画分においてほとんど検出できない。
【０２０９】
α-1-プロテイナーゼ阻害剤およびフィブリノーゲンもまた、第一局面の過程において記載されているのと同じ様に挙動することが見出された。
【０２１０】
結果は、p-キシリレンジアミンおよびm-キシリレンジアミンが、第一局面の過程のようにその後の過程において単離されうる他の血漿タンパク質のレベルを有意に低下させることなく、効率的な様式で、希釈されていない血漿から第VIII因子および第IX因子を選択的に抽出する能力があることを実証している。第VIII因子/第IX因子単離過程は、第一局面のアルブミン/IgG/フィブリノーゲン/α-1-プロテイナーゼ阻害剤単離過程と適合性がある。
【図面の簡単な説明】
【０２１１】
【図１】単離されたタンパク質画分のさらなる精製を示す、本発明によるプロセスを示す。
【図２】本発明の1つの態様によるプロセスを用いた産物回収を示す。
【図３】本発明の第1の局面の1つの態様によるSDS-PAGE解析を示す。
【図４】本発明の第1の局面の1つの態様から得られる画分に対する一元放射免疫拡散（Single Radial Immunodiffusion）解析を示す。
【図５】本発明の第1および第2の局面を順に用いて特定のタンパク質画分を単離する、本発明の1つの態様を図示する。
【図６】第VIII因子吸着に由来する画分のSDS-PAGE解析を示す。レーン1は未加工の（raw）血漿を表し、レーン2は通過液（run-through）画分を表し、レーン3は第VIII因子/第IX因子の溶出を表す。第VIII因子/第IX因子溶出物は、アプライした血漿と直接比較するため、すなわち収量を視覚的に概算できるように、溶出容量に対して希釈した。
【図７】用いる原材料（タンパク質を含む溶液）が第2の局面のプロセスから得られる通過液画分である、第1の局面のタンパク質単離プロセスから得られるタンパク質画分のSDS-PAGE解析を示す。レーン1はヒト血漿を表し、レーン2は通過液画分（α-1-PI）を表し、レーン3は溶出2（アルブミン）を表し、レーン4は溶出3（IgG）を表し、レーン5は溶出4（フィブリノーゲン）を表す。
【図８】用いる原材料（タンパク質を含む溶液）が第2の局面のプロセスから得られる通過液画分である、第1の局面のタンパク質単離プロセスから得られる画分の一元放射免疫拡散解析を示す。画分1〜4はそれぞれ、通過液画分、溶出2、溶出3、および溶出4を表す。図8Aはアルブミンの定量を示し、図8BはIgGの定量を示す。8Aおよび8Bの上部2行は、未加工の血漿100-20%の標準曲線を表す（二重判定）。AおよびBの下部2行は以下を表す：1：通過液画分；2：溶出2；3：溶出3；4：溶出4。
【図１】
2008511546.tif 000008
【図２】
2008511546.tif 000009
【図３】
2008511546.tif 000010
【図４】
2008511546.tif 000011
【図５】
2008511546.tif 000012
【図６】
2008511546.tif 000013
【図７】
2008511546.tif 000014
【図８】
2008511546.tif 000015
【国際調査報告】
2008511546.tif 000016
2008511546.tif 000017
2008511546.tif 000018