(57)【要約】  本発明は、以下の段階、すなわち、ａ）流体中又は表面に存在する微生物をフィルターと接触させる段階、ｂ）増幅産物を得るために、フィルター上に存在する微生物由来の核酸を等温で特異的に増幅する段階、ｃ）増幅産物を検出する段階を含むことを特徴とする、流体中に存在する１種類以上の微生物をフィルター上で特異的に検出する方法に関する。本発明は、この方法の実施に適切な装置、キット及びオリゴヌクレオチドにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含むことを特徴とする、流体中又は表面に存在する１種類以上の微生物をフィルター上で特異的に検出する方法：
ａ）流体中又は表面に存在する微生物をフィルターと接触させる段階、
ｂ）増幅産物を得るために、フィルター上に存在する微生物由来の核酸を等温で特異的に増幅する段階、
ｃ）増幅産物を検出する段階。
【請求項２】
以下の段階を含むことを特徴とする、液体中、ガス中又は表面に存在する１種類以上の微生物をフィルター上で特異的に検出する方法：
ａ）フィルター上に微生物を捕捉するために、液体、ガス又は表面がフィルターと接触される段階、
ｂ）増幅産物を得るために、微生物中に存在する核酸がフィルター上で等温で特異的に増幅される段階、
ｃ）得られた増幅産物が前記フィルター上で検出される段階。
【請求項３】
段階ａ）において、微生物が、液体又はガスをフィルターに通すことによって捕捉されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
段階ａ）において、ガス中又は表面に存在する微生物が、フィルター上への微生物の固着（ｉｍｐａｃｔｉｏｎ）によって捕捉されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
検出しようとする微生物が水性媒体中に含まれることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
検出しようとする微生物が空気中に含まれることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
段階ｂ）において増幅される核酸がＤＮＡからなることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
段階ｂ）において増幅される核酸が、微生物に含まれるＲＮＡから出発して実施される特定の追加の逆転写段階によって得られるｃＤＮＡからなることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
逆転写段階が実施される出発ＲＮＡが、微生物に含まれるメッセンジャーＲＮＡであることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
核酸、又は逆転写によって得られるｃＤＮＡが、段階ｂ）においてＬＡＭＰ型増幅技術によって増幅されることを特徴とする、請求項７から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＬＡＭＰ型増幅技術が、増幅産物の形成速度を増加させるために、増幅産物中に存在するループのレベルでループＦ及びループＢプライマーがハイブリッド形成される局面を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
段階ｃ）において検出された増幅産物がＤＮＡからなることを特徴とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
核酸、又は逆転写によって得られるｃＤＮＡが、段階ｂ）においてＮＡＳＢＡ（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法又はＴＭＡ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法によって増幅されることを特徴とする、請求項７から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
マーカーが、段階ｂ）において得られる増幅産物に組み込まれて、段階ｃ）における増幅産物の検出を可能にすることを特徴とする、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
増幅産物に組み込まれるマーカーが、標識されたプリン又はピリミジン塩基であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
増幅産物に組み込まれるマーカーが、標識されたプライマーからなることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
増幅産物に組み込まれる標識されたプライマーが、請求項１２に定義されたループＦ及び／又はループＢプライマーからなることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
増幅産物に組み込まれたマーカーが、リガンドと相互作用し得る標識された分子と次いで反応するリガンドと結合することを特徴とする、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
リガンドがビオチンであることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
段階ｃ）において、ビオチンを含む増幅産物が、ストレプトアビジンの検出を可能にする分子と結合したストレプトアビジンと接触させられることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
リガンドが、標識された抗体又は抗原と次いで反応する、抗原又は抗体からなることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
段階ｂ）において増幅産物に組み込まれるマーカーが、ジオキシゲニン（ｄｉｏｘｙｇｅｎｉｎ）と結合することを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
段階ｃ）において、ジオキシゲニンを含む増幅産物が、抗ジオキシゲニン抗体の検出を可能にする分子と結合した抗ジオキシゲニン抗体と接触させられることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
リガンドと相互作用し得る標識された分子が、ブラックラディッシュ（ｂｌａｃｋ  ｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ又は大豆（ｓｏｙａ  ｓｅｅｄ）ペルオキシダーゼと複合化されることを特徴とする、請求項２０及び２３の一項に記載の方法。
【請求項２５】
このリガンドと相互作用し得る標識された分子が、アルカリホスファターゼと複合化していることを特徴とする、請求項２０及び２３の一項に記載の方法。
【請求項２６】
増幅産物に組み込まれたマーカーが蛍光による検出を可能にすることを特徴とする、請求項１４から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
蛍光による増幅産物の検出を可能にする分子が近赤外発光スペクトルを有することを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
段階ｃ）において、段階ｂ）で得られた増幅産物が、標識された特定のハイブリダイゼーションプローブとハイブリッド形成することを特徴とする、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
ハイブリダイゼーションプローブが、請求項１８から２７のいずれか一項に定義された蛍光性分子、リガンド、抗体又は抗原を用いてマークされる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
標識された特定のハイブリダイゼーションプローブがＰＮＡタイプであることを特徴とする、請求項２８及び２９の一項に記載の方法。
【請求項３１】
微生物の検出の段階ｃ）がフィルター上で直接実施されることを特徴とする、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
使用されるフィルターが、０．１から１．５ミクロン、好ましくは０．１５から０．８ミクロン、より優先的には０．２から０．６ミクロンの平均直径の孔を有することを特徴とする、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
フィルターが、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化（ビニリデン）、ポリカルボナート、ポリアミド、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、アセチルセルロース、混合セルロースエステル及びニトロセルロースから選択される１種類以上の材料で構成されることを特徴とする、請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
段階ａ）においてフィルター上に捕捉された微生物を、前記フィルターを栄養培地と接触させることによって培養する段階を更に含むことを特徴とする、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
微生物に含まれる核酸を放出させるために、フィルター上に捕捉された微生物の壁を溶解させる段階を更に含むことを特徴とする、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
生きている微生物の存在をＡＴＰ生物発光によって検出する段階を更に含むことを特徴とする、請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
微生物及び／又は前記微生物から生じる核酸をフィルターの上又は内部に固定する段階を更に含むことを特徴とする、請求項１から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
固定化段階が微生物又はその核酸を固定化溶液で処理することにあることを特徴とする、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
固定化溶液が、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド及びパラホルムアルデヒドから選択される架橋剤を含むことを特徴とする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
固定化段階が、フィルター、フィルター上に捕捉された微生物又はその核酸のＵＶ照射からなることを特徴とする、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
微生物又はその核酸が、ポリアミド系材料を含むフィルター上に固定されることを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
同じ流体由来の微生物の幾つかのタイプが、同じフィルター上で並行して特異的に検出され得ることを特徴とする、請求項１から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
検出しようとする微生物が、細菌、ウイルス、原生動物、マイコプラズマ、カビ及び酵母から選択されることを特徴とする、請求項１から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
検出しようとする微生物が、水である液体中に存在することを特徴とする、請求項１から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
微生物が、シュードモナス  エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）菌であることを特徴とする、請求項１から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
以下の段階を含むことを特徴とする、液体中に含まれるシュードモナス  エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）種の１種類以上の細菌をフィルター上で特異的に検出する方法：
ａ）液体がフィルターによってろ過される段階、
ｂ）液体中に含まれる細菌がフィルター上で捕捉される段階、
ｃ）これらの細菌に含まれるシュードモナス  エルジノーサの核酸が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択される配列を含む少なくとも１種類のプライマーを用いたＬＡＭＰ型増幅によって、ろ過膜の表面又は内部で等温で特異的に増幅される段階、
ｄ）フィルター上で得られた増幅産物が検出される段階。
【請求項４７】
配列番号１の配列を含むｃＤＮＡを得るために、ＬＡＭＰ型増幅が前記ｃＤＮＡから出発して実施される、細菌中に含まれるＲＮＡに対する逆転写段階を特徴とする、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
フィルターが膜であることを特徴とする、請求項１から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
ヌクレオチド配列が配列番号２から７から選択される配列を含むことを特徴とする、シュードモナス  エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）中に含まれる核酸の増幅によってシュードモナス  エルジノーサの特異的検出を可能にするオリゴヌクレオチド。
【請求項５０】
−  フィルター、
−  ＬＡＭＰ型増幅技術による増幅を可能にする少なくとも１種類の特異的ＦＩＰプライマー
を含む、１種類以上の微生物をフィルター上で特異的に検出するキット。
【請求項５１】
膜上の核酸を特異的に等温で増幅する手段が、ＬＡＭＰ型増幅の実施に必要なＦＩＰ及びＢＩＰオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項４９及び５０の一項に記載のキット。
【請求項５２】
−  フィルター、
−  配列番号２から７の配列から選択されるヌクレオチド配列を含む少なくとも１種類のオリゴヌクレオチド
を含む、シュードモナス  エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）菌をろ過膜上で特異的に検出するための、請求項５０及び５１の一項に記載のキット。
【請求項５３】
フィルターが膜であることを特徴とする、請求項５０から５２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５４】
増幅しようとする核酸を受けるフィルター（１）を含み、内部体積を画成する本体（２）を含み、この内部体積中で、フィルター（１）と、扁平な不透過性壁（３）との、また、フィルター（１）表面に複数のセルを形成するグリッド（４）との、接触を維持する手段を備えたことを特徴とする、請求項１から４８に記載の方法を実施するのに適切な核酸増幅装置。
【請求項５５】
前記セルが体積１から１００μｌ、好ましくは３から１０μｌの反応溶液を含むことができることを特徴とする、請求項５４に記載の装置。
【請求項５６】
本体（２）がフィルター（１）の外縁部と協働するのに適切な肩部（５）を有することを特徴とする、請求項５４及び５５の一項に記載の装置。
【請求項５７】
フィルター（１）が、前記肩部（５）に対してその外縁部によって固定されることを特徴とする、請求項５６に記載の装置。
【請求項５８】
扁平な壁（３）が、前記肩部（５）に対してフィルター（１）の外縁部を固着させることを特徴とする、請求項５４から５７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５９】
グリッド（４）が本体（２）と一体であることを特徴とする、請求項５４から５８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６０】
扁平な壁（３）が本体（２）と対向して脱着可能であることを特徴とする、請求項５４から６０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６１】
扁平な壁（３）が、横に広がるスカート（６）を有し、本体（２）が、スカート（６）と協働するようになされたスリーブ（７）を有することを特徴とする、請求項６０に記載の装置。
【請求項６２】
グリッド（４）と対向して配置されて、前記内部体積を閉鎖するのに適切である脱着可能なカバー（８）も有することを特徴とする、請求項５４から６１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６３】
本体（２）に取り付けられた貯蔵部（９）を有することを特徴とする、請求項５４から６２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６４】
貯蔵部（９）が、易破壊性領域（１０）によって本体（２）に取り付けられたことを特徴とする、請求項６３に記載の装置。
【請求項６５】
貯蔵部（９）を閉鎖するのに、又は前記内部体積を易破壊性領域（１０）のレベルで閉鎖するのに適切な脱着可能なカバーも有し得ることを特徴とする、請求項６４に記載の装置。
【請求項６６】
扁平な壁（３）が排液口（１１）を有することを特徴とする、請求項５４から６５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６７】
フィルター（１）が膜であることを特徴とする、請求項５４から６６のいずれか一項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前記微生物の核酸の特異的等温増幅段階を含む、流体中に存在する１種類以上の微生物をフィルター上で特異的に検出する方法、並びにこの方法を実施するための検出キット及び配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在で、産業又は医療分野において水及び空気並びに使用済み又は使い捨て用具（ｄｉｓｐｏｓｅｄ−ｏｆ  ｔｏｏｌｓ）及び材料の微生物学的品質のモニタリングは、ますます厳格な基準下に置かれている。
【０００３】
このため、工業及び衛生の当局は、微生物学的汚染を低コストでできるだけ早く改善できるように、微生物学的汚染をできるだけ早く検出することができるツールを持つことができなければならない。従来、微生物学的分析は寒天培地上で実施されている。これらのタイプの培養は、実施が容易であり、菌を裸眼で数えることができ、微生物を生かしたままにすることができ、適切であればキャラクタリゼーション試験を実施することもできる。
【０００４】
これらのキャラクタリゼーション試験は、一般に、微生物中に含まれる核酸の抽出、及び当業者に公知である幾つかの連鎖反応技術（ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応法又はＬＣＲ：リガーゼ連鎖反応）の１つによる前記核酸の特異的増幅からなる。
【０００５】
しかし、核酸増幅によるキャラクタリゼーション試験は極めて信頼性が高いが、微生物の培養、微生物からの核酸抽出、及び上記連鎖反応技術の１つの実施からなる各段階は時間がかかる。
【０００６】
裸眼でも見えるようにするために、微生物を少なくとも２４時間培養しなければならない。マイコバクテリアなどの増殖の遅い微生物、又は環境条件によるストレスを受けた微生物では、更に長い場合もある。
【０００７】
また、核酸の抽出は、寒天培地上で直接実施することができず、キャラクタリゼーション前に微生物をサンプリングする必要がある。
【０００８】
ＰＣＲは、異なる温度における多数の増幅サイクルからなり、最終的には、サーマルサイクラー中に置かれる小さな管中の溶液中で実施しなければならず、増幅前後に核酸を移す追加の作業が必要である欠点がある。
【０００９】
固体担体上に固定された核酸プローブとの種々のハイブリダイゼーション技術を用いたラボオンチップ（ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）設備の最近の進歩によって、微生物の分析段階における時間を節約することができる。しかし、これらの技術は、製造コストが更に高く、キャラクタリゼーション前の核酸の抽出及び移動の段階を省略することができない。
【００１０】
これらの条件下で、２４時間を超える時間が、微生物を数え、分析するのに依然として必要である。これは、生成物の品質を恒常的に確実に監視しなければならない工業的状況においては余りにも長すぎる。
【００１１】
注射用薬液組成物用の工業用水の品質を管理する特定分野においては、例えば、一連の製造に導入される水の品質についての情報は、実質的に瞬時に得ることができなければならない。
【００１２】
微生物は、その場で、可能であれば最低限の装置及び人員で、検出されなければならない。
【００１３】
検出は、所望の検出レベルが水１リットル当たりごく少数の微生物のオーダーである状況においては一層困難であり、微生物をろ過によって濃縮する前段階が必要である。
【００１４】
これらの制約に対処するために、微生物の有無を迅速に決定する手法が、本出願人によって国際出願ＷＯ０１／５９１５７号に最初に提案された。
【００１５】
この手法は、微生物の代謝活動に基づいて微生物を検出することによって培養期間を短縮することからなる。
【００１６】
例えば微生物中に含まれるＡＴＰ、又はＣＯ２放出であり得る、共通代謝マーカーを測定して、コロニーが寒天培地上で裸眼で見えようになる前に微生物の存在を確認する。
【００１７】
水の微生物学的モニタリングの例では、ある体積の水（１００ｍｌから１ｌ）をろ過膜によってろ過して、水中に含まれる微生物を捕捉する。次いで、微生物が成長を開始するのに利用する寒天培地上にろ過膜を置く。次いで、膜を回収して、光子を生成する酵素（ルシフェラーゼ）とＡＴＰを反応させることによって、その表面に存在する微生物のＡＴＰを検出する。ルミネッセンスを画像解析システムによって測定する。
【００１８】
このシステムは、Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ（登録商標）Ｒａｐｉｄシステムの名称で本出願人によって市販されており、液体中の微生物の有無を確認するのに必要な時間を既に数時間短縮している。
【００１９】
このシステムは、定性的ではなく、定量的な情報をもたらす。存在する微生物の性質を確認しなければならないとき、又は所与の微生物を特異的に捜し出さなければならないときには、ＰＣＲによって一般に実施されるキャラクタリゼーション段階を追加せねばならず、上述したように、試験時間がかなり増加する。
【００２０】
一方、核酸の特異的増幅技術がＬＡＭＰ（ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）という名称で開発された。その原理は、国際出願ＷＯ００／２８０８２号、ＷＯ０１／０７７３１７号及びＷＯ０２／０２４９０２号に記載されている。
【００２１】
ＰＣＲとは異なり、この方法は、高レベルの特異性を維持しつつ、恒温（等温条件）下で実施される特徴を有する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明の一目的は、初期の検出方法の欠点を取り除き、その核酸の増幅によってフィルター上で直接に検出することにある方法を提供することである。
【００２３】
驚くべきことに、通常は核酸の培養及び抽出後に溶液状態で実施される、ＬＡＭＰ法などの等温増幅技術を、微生物の培養段階、及びその核酸を増幅のために試験管に移す段階を必要とせずに、微生物が捕捉されたフィルター上で実施することができる。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
したがって、本発明の方法は、ある体積の水、ガスの中に、又は固体表面に存在する微生物を、ごく少数の微生物の検出いき値で、短時間で特異的に検出することができる。
【００２５】
好ましい態様においては、本発明は、膜上のその場で、すなわち膜の所与の部分において、膜上に捕捉された微生物を個々に数えることができる。
【００２６】
したがって、本発明は、以下の段階、すなわち、
ａ）流体中に存在する微生物をフィルター上で接触させる段階、
ｂ）増幅産物を得るために、フィルター上に存在する微生物由来の核酸を等温で特異的に増幅する段階、
ｃ）好ましくは前記フィルター上で、増幅産物を検出する段階
を含むことを特徴とする、流体中に存在する１種類以上の微生物をフィルター上で特異的に検出する方法に関する。
【００２７】
より具体的には、本発明は、以下の段階、すなわち、
ａ）フィルター上の微生物を捕捉するために、液体、ガス又は表面がフィルターと接触される段階、
ｂ）増幅産物を得るために、微生物中に存在する核酸がフィルター上で等温で特異的に増幅される段階、
ｃ）得られた増幅産物が検出される段階
を含むことを特徴とする、液体中、ガス中又は表面に存在する１種類以上の微生物をフィルター上で特異的に検出する方法に関する。
【００２８】
本発明は、本発明による方法の実施に特に適切な装置、キット及びプライマーにも関する。
【００２９】
下記図の目的は、本発明のある特徴を説明することである。
図１：本発明による検出方法の段階ｂ）において好ましく使用される、微生物に含まれるメッセンジャーＲＮＡの検出に適切なＬＡＭＰ増幅技術の原理を示す図である。
図２：本発明の方法によるＬＡＭＰ法によるシュードモナス  エルジノーサの特異的検出に使用されるプライマーを示すｏｐｒＬ遺伝子から生ずるＤＮＡ配列（５’−＞３’）を示す図である。本発明によって使用されるプライマーに対応する配列に陰影をつけ、その配向を矢印で示す。
図３：実施例１において実施される、本発明による方法の各段階を示す図である。
図４：実施例１に記載の、本発明による方法の段階ｂ）及びｃ）の説明図である。
図５：実施例２において実施される、本発明による検出方法の各段階を示す図である。
図６：実施例２に記載の、本発明による検出方法の段階ｂ）及びｃ）の図である。
図７：実施例３において実施される、本発明による検出方法の各段階を示す図である。
図８：本発明による方法を実施するための核酸増幅装置の斜視図である。
図９：図８の装置の断面図である。
図１０：扁平な壁及びカバーのない、図８の装置の断面図である。
図１１：図１０の装置図の上面図である。
図１２：図８の装置の分解組立斜視図である。
図１３：貯蔵部を取り外した後の図８の装置の斜視図である。
図１４：図１３の装置の横断面図である。
図１５：図１３の装置の分解組立斜視図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明による検出方法によって、液体、ガスなどの流体、更に表面の微生物学的品質のモニタリングが可能である。
【００３１】
したがって、この方法は、例えば、農産食品又は薬剤に関係した製造及び再処理中の水のモニタリング、空調システム又は屋内クリーンルームから放出される空気のモニタリング、実験室、工場及び手術室における作業面（ｗｏｒｋ  ｓｕｒｆａｃｅ）の無菌レベルのモニタリングなどの多数の工業用途及び衛生用途に適用可能である。
【００３２】
この方法は、診断目的、例えば、尿路感染症の場合には尿、髄膜炎の場合には脳脊髄液、胎児の感染若しくは異常の場合には羊水、ウイルス感染研究の場合には血しょう、又は気管支若しくは肺感染の場合には呼気の分析に使用することもできる。
【００３３】
より一般的には、この方法は、想定される用途にかかわらず、核酸のキャラクタリゼーションのためのラボオンチップの代替となる。
【００３４】
本発明の方法によって意図される微生物は、一般に、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属又はアエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属の病原菌；ジアルジア属、エントアメーバ属、クリプトスポリジウム属、シクロスポラ属の原生動物；マイコプラズマ属及びウレアプラズマ属のマイコプラズマ、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属又はペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属の真菌、環境中に存在する病原性汚染物質であるＡ型及びＥ型肝炎ウイルスから選択される。このリストは、限定的なものではなく、当業界で最も興味深い生物体を単に確認したにすぎない。他の生物体も興味深いものであり得る。それらも本発明に包含されるものとする。
【００３５】
本願では「微生物」という用語は、細菌、真菌及び酵母に限定されない。この用語は、ラン藻類などの単細胞藻類、アメーバ、線虫卵などの寄生生物の単細胞体、又は花粉、精子などの植物若しくは動物の配偶子、更に吸虫、回虫などの細胞周囲の微視的生物体のような他の微視的生命体（ｌｉｖｉｎｇ  ｆｏｒｍ）にも当てはまる。
【００３６】
本発明の一態様によれば、微生物は、最初に液体中、ガス中又は表面に存在する。
【００３７】
本発明の意味における液体は、懸濁した固相を含み得る溶液、より優先的には水性媒体溶液であり得る。ガスは、好ましくは空気などのガス混合物で構成されるが、拡張して、エアゾール剤など、固体粒子、液体粒子及びガス粒子の混合物からなることもできる。
【００３８】
表面は、好ましくは、例えばクリーンルームの床又は壁などの固体の表面である。
【００３９】
微生物は、ろ過によって、又はフィルターと汚染表面の接触によって、前記フィルター上又は前記フィルターの深部に捕捉、すなわち保持される。
【００４０】
「フィルター」とは、本発明では、主構成要素が、その性質、そのサイズ及び／又はその配列によって、フィルターを通過する液体又はガスの流れの中に懸濁して含まれる微生物を保持する材料である媒体を意味する。
【００４１】
したがって、「フィルター」という用語は、ろ過パッド、膜、又はマイクロビーズ、ゲル、樹脂などのクロマトグラフィー媒体が充填された微小カラムなど、種々のタイプのろ過製品を指す。
【００４２】
好ましい実施形態によれば、フィルターの主構成要素である材料は、微生物の外膜と、又は微生物に由来する核酸と相互作用して、生物体をフィルターに捕捉するのを、又は張り付けるのを助ける抗体又は化学基で被覆されている。
【００４３】
フィルターは単層でも多層でもよい。一般に、フィルターは、ガラス、ラテックス、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化（ビニリデン）、ポリカルボナート、ポリスチレン、ポリアミド、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、アセチルセルロース、混合セルロース及びニトロセルロースから選択される１種類以上の材料、又はろ過製品分野の当業者に公知の任意の材料で構成される。
【００４４】
好ましい実施形態においては、フィルターは膜である。膜の孔は、一般に、平均直径が０．１から１．５ミクロン、好ましくは０．１５から０．８ミクロン、より優先的には０．２から０．６ミクロンである。
【００４５】
材料は、好ましくは、本方法の段階ｂ）及びｃ）中に使用される溶媒に適合するように選択され、特に微生物をフィルター上に固定し、これらの微生物に含まれる核酸を放出させるのに使用することができるアルコール及びアルデヒドに適合するように選択される。
【００４６】
本願では「膜」とは、２つの表面を有する合成支持体で構成されたフィルターを意味し、その孔は平均の既知の直径を有する。この平均の既知の直径は、前記平均直径の寸法を有する微生物の少なくとも９９％が膜を通過するのを防止するように計算される。本発明の範囲内で使用される膜は、一般に、高い表面／体積比を有し、好ましくは９０から２００ミクロンの一定厚みを有する。
【００４７】
本発明による膜は、好ましくは、例えばＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって商品名ＭＸＨＶＷＰ１２４で市販されている膜などのＰＶＤＦろ過膜である。
【００４８】
本発明の好ましい態様によれば、微生物は、膜の２つの表面に圧力差をかけて液体又はガスを膜の孔を通過させることによって実施されるろ過によって膜上に捕捉される。次いで、微生物は、膜の表面及び／又は孔に保持される。
【００４９】
本発明の好ましい特徴によれば、本方法の段階ａ）は、液体又はガス中に存在する微生物を膜上で濃縮することを意図したろ過からなる。
【００５０】
酵母型及びカビ型の微生物を保持しようとするときには、平均孔径０．５から１．５ミクロン、好ましくは０．６から１ミクロンを選択することが望ましい。細菌微生物の場合、平均直径０．２から０．８ミクロン、好ましくは０．３から０．５ミクロンが選択される。マイコプラズマ型微生物及びウイルスの場合、直径０．２ミクロン未満、好ましくは０．１から０．２ミクロンが選択される。一般に孔は、各々不規則な多孔度を有する、同じ材料又は異なる材料の異なる層の重ね合わせから生ずるので、孔径は、統計学的計算によって得られる。
【００５１】
微生物が膜全体により良好に再分布し、段階ｃ）において微生物をより良く数えることができるように、炭化水素化（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅｄ）、非濡性ワックス、ワセリン、シリコーンワックス若しくはオイル、エポキシ樹脂、ポリフルオロエチレン又はポリスチレンの溶液のネットワークを形成する疎水性メッシュを含むろ過膜を使用することはろ過中に有利であり得る。
【００５２】
ろ過しない場合には、微生物をフィルター表面と接触させることによって捕捉する。この接触は、液体若しくはガスをフィルターの方向に能動的に放出することによって（気流、水流）、又は微生物が重力によってフィルター上に堆積するときに受動的に生じ得る。逆に、フィルターを微生物が存在する固体表面に適用することもできる。この捕捉方法の場合、フィルター表面が、微生物の付着を容易にするコーティングで覆われていることが有利であり得る。このコーティングは、例えばグリセリンで形成することができる。
【００５３】
必要に応じて、フィルター上に固定された微生物を培養する段階を、増幅段階ｂ）の前に実施することができる。かかる培養は、適切であれば、フィルター上の微生物の最初の位置を考慮しつつ、存在する微生物の数を増加させ得る栄養培地、特に寒天培地とフィルターを接触させることによって、膜のようなフィルター上で直接起こり得る。得られたコロニーは、段階ｃ）用の生体材料として保存することができ、又は例えばＡＴＰ生物発光による定量などの他の分析目的で試料採取することができる。
【００５４】
フィルターの上又は深部に捕捉された微生物に含まれる核酸は、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡから本質的になる。これらは、特に染色体ＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡからなり得る。
【００５５】
本発明の好ましい形態によれば、微生物の外壁は、微生物に含まれる核酸を放出させるために増幅段階ｃ）の前に溶解される。溶解段階は、例えばフィルターに溶解緩衝剤を含浸させることによって、フィルター上で直接実施することができる。溶解段階は、適切であれば、例えば核酸をアルコールによってフィルター表面又は内部に沈殿させることからなる精製段階によって、完結することができる。
【００５６】
本発明の好ましい形態によれば、フィルター上にその核酸と一緒に捕捉された微生物は、適切な処理によってフィルターに固定される。この固定化段階によって、異なる微生物から生じる核酸の遊走及び混合が防止される。この処理は、例えば、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドなどの架橋剤を含む、固定液によるフィルターの含浸からなり得る。グルタルアルデヒドは、ポリアミド系膜を使用するときには、特に有利である。
【００５７】
本発明による固定の別の形態は、フィルターを構成する材料と核酸の架橋反応を得るために、フィルターに紫外（ＵＶ）線を照射することからなる。
【００５８】
本発明による方法の段階ｂ）によれば、微生物中に存在する核酸は、増幅産物を得るために、フィルター上で等温で特異的に増幅される。
【００５９】
特異的増幅とは、本明細書では、テンプレートとして役立つ核酸を含む配列の全部又は一部を再生する目的で、テンプレートとして役立つ核酸に相補的な特異的プライマーのハイブリダイゼーションによって開始される核酸の重合反応を意味する。
【００６０】
ＰＣＲ法とは異なり、本発明による増幅段階ｂ）は、温度の周期的変化を必要とせず、したがってサーマルサイクラーも、反応媒体に確実に有効に熱伝達するように設計された、サーマルサイクラーに付随した小さい消耗品も不要である。
【００６１】
本発明の好ましい特徴によれば、増幅段階は、フィルター上で、すなわちフィルターの表面又は内部で、より優先的には囲い（ｅｎｃｌｏｓｕｒｅ）の中で制御温度で、実施される。一般に、温度は、３５から９０℃、優先的には５０から７０℃、より優先的には６０から６５℃に維持される。
【００６２】
一本鎖ＲＮＡ単位複製配列が得られる、例えば、ＮＡＳＢＡ法（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）など、核酸の等温増幅のための異なる方法を本発明の方法に適用することができる［Ｎａｔｕｒｅ，  １９９１，  ３５０：  ９１−９２］。
【００６３】
本発明による好ましい増幅技術は、ステムループを形成する単位複製配列を介してＤＮＡテンプレートが再生されるＬＡＭＰ法である。
【００６４】
ＬＡＭＰ法の原理は国際出願ＷＯ００／２８０８２号に記載されている。
【００６５】
本発明によるこの技術の好ましい翻案物を図１に示す。
【００６６】
ＬＡＭＰ型増幅技術とは、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって、ＤＮＡポリメラーゼに相補的なＤＮＡ鎖を核酸のテンプレートから特異的「ＦＩＰ」プライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｉｎｎｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒ）を介して合成する段階を少なくとも含む、ＬＡＭＰ法に由来するあらゆる等温増幅技術を意味する。ＦＩＰプライマーは、その３’部分ではなくその５’部分においてテンプレートとハイブリッド形成することを特徴とする。実際に、その３’部分は、形成された相補鎖の配列の１つと続いてハイブリッド形成し得る配列を有する。その結果、相補鎖が合成された後、ＦＩＰの３’部分は、合成鎖の３’部分自体とのハイブリダイゼーションに有利に働き、ステムループ構造を形成する。次いで、このステムループ構造は、後続の増幅段階において再生される。
【００６７】
ＬＡＭＰ型増幅は、ＦＩＰと同じ機能を、ただし反対側の鎖に対して有する第２の「ＢＩＰ」プライマー（Ｂａｃｋｗａｒｄ  Ｉｎｎｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒ）を優先的に必要とする。より優先的には、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３（Ｆ：順方向）及びＢ１、Ｂ２、Ｂ３（Ｂ：逆方向）と称する相補的プライマーを使用する。Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３プライマーは、コーディング鎖上に位置する配列に対応し、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３プライマーは、相補鎖上に位置する配列に対応する。Ｆ３及びＢ３は、増幅断片の５’末端に対応し、Ｆ２及びＢ２は、ＦＩＰ及びＢＩＰの５’末端に位置する配列に対応し、Ｆ１及びＢ１は、（Ｆ１ｃ及びＢ１ｃと呼ばれる）ＦＩＰ及びＢＩＰの３’末端に位置する配列の相補配列に対応する。
【００６８】
増幅しようとする核酸のタイプによっては、二本鎖ＤＮＡ分子のＤＮＡ鎖を分離することを目的として６０℃から８０℃に加熱することによってＤＮＡを変性する局面が、増幅手順の最初に必要となり得る。
【００６９】
一般に、ＬＡＭＰ型増幅技術は、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを出発テンプレートとして使用する。
【００７０】
本発明による方法の好ましい態様によれば、出発テンプレートはｃＤＮＡである。
【００７１】
本発明のより好ましい特徴によれば、図１に示すように、微生物のＲＮＡを、ＢＩＰプライマーを用いて逆転写酵素によってあらかじめ逆転写する。これによって、ステムループ構造を含むｃＤＮＡが得られ、ＬＡＭＰ型増幅を直接開始することができる。
【００７２】
本発明の更に好ましい特徴によれば、前の逆転写段階に用いた、微生物から生じるＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡである。実際に、メッセンジャーＲＮＡは、その転写に役立つＤＮＡ分子よりもはるかに多く存在する利点を有する。このようにして、本発明による方法の検出いき値を低下させることができる。
【００７３】
ＬＡＭＰ型増幅技術は、有利には、追加のプライマーのループＦ及びループＢが、ループを構成する配列のレベルで増幅産物とハイブリッド形成する局面を含む。これらのプライマーは、増幅産物を含むループから出発する新しい相補鎖の合成を促進し、増幅産物形成速度を増加させる。
【００７４】
ＬＡＭＰ型技術によって得られる増幅産物は、一般に、幾つかのステムループを含む二本鎖ＤＮＡ分子である。増幅産物のサイズは、合成されたループの数の関数として変動する。一般に、幾つかのサイズの断片が増幅方法の最後に共存し、図４に示すタイプの電気泳動プロファイルを生じる。
【００７５】
本発明の好ましい特徴によれば、増幅産物を検出する段階ｃ）を、標識された分子を直接又は間接的に用いる方法によって実施して、増幅産物の蛍光、比色又は化学発光によって検出することができる。
【００７６】
次いで、画像解析装置を使用して、標識された分子の発光スペクトル及びフィルター上の位置を記録することができる。特に非特異的増幅と関連した寄生信号を除去することを目的にして、信号を適切に処理することによって、増幅産物をその場で可視化することができる。これは、膜を使用したときに特に有用である。というのは、膜表面が大きいと定量的及び定性的な精度が得られるからである。
【００７７】
比色又は蛍光によって増幅産物を検出する手段は、当業者に公知である。
【００７８】
好ましくは、本発明の方法に従って用いられる検出手段は、特異的であり、その核酸が増幅される微生物を個々に特定することができる。
【００７９】
検出手段は、例えば、本方法の段階ｂ）中に修飾プリン又はピリミジン塩基を増幅反応の基質として増幅産物に組み入れることからなり得る。好ましくは、標識されたプリン又はピリミジン塩基は、ｄＮＴＰであり、より優先的にはｄＵＴＰである。
【００８０】
別の検出手段は、１種類以上の標識された特異的プローブを用いて得られる増幅産物を段階ｂ）の最後にハイブリッド形成することからなり得る。その空間的構造がＤＮＡの空間的構造を模倣している、例えばＰＮＡ型プローブ（ペプチド核酸）、すなわちプリン及びピリミジン塩基で置換されたポリペプチド鎖で構成されたプローブなど、異なるタイプのプローブを使用することができる［Ｎｉｅｌｓｅｎ，  Ｐ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｈｙｍｉｎｅ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｐｏｌｙａｍｉｄｅ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００］。
【００８１】
使用するプローブは、有利には「分子標識（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ）」型であり、すなわち蛍光団、消光基及びステムループ構造を有し、増幅産物とハイブリッド形成したときにのみプローブの蛍光を発する。
【００８２】
増幅産物をハイブリダイゼーションプローブを用いて検出するときには、特にＤＮＡ鎖を分離することを目的として、増幅産物の変性の予備的段階に進むことが必要であると判明する場合がある。
【００８３】
本発明の方法による別の検出手段は、特異的リガンド、好ましくは標識された抗原及び抗体を使用することからなる。この場合、修飾プリン又はピリミジン塩基、更に特異的プローブは、例えば抗ジオキシゲニン抗体などの抗体によって特異的に認識することができる、ジオキシゲニンなどの抗原として役立つ１種類以上の分子を用いてマークされる。或いは、検出プローブを抗体と結合させることができ、次いで標識された抗原と接触させる。抗体又は抗原は、ＦＩＴＣ（特定の形態のイソチオシアナート）などの蛍光団と複合化することができる。
【００８４】
修飾プリン若しくはピリミジン塩基のマーキング、又は特異的プローブのマーキングは、放射性同位体（Ｈ３、Ｐ３２、Ｐ３３、Ｓ３５．．．）によって実施することができ、又は例えば、複合アビジン若しくはストレプトアビジンを含有する溶液を西洋わさび（Ｒａｉｆｏｒｔ）ペルオキシダーゼ、大豆若しくはアルカリホスファターゼなどの酵素に添加することによって検出されるビオチンなどの、非放射性生成物によって実施することができる。これらの酵素の基質が、例えば膜表面に広がると、これらの酵素は、検出可能な発光反応を起こす光子を放出する。
【００８５】
本発明によるマーキングの好ましい方法は、上記ハイブリダイゼーション又はリガンドを蛍光性分子又は蛍光団と結合させることからなる。異なる発光スペクトルを有する蛍光団は、検出段階ｃ）中に有利に使用することができ、異なる微生物から生じる増幅産物を認識するように規定されたリガンド又はプローブと結合する。このために、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＰｒｏｂｅｓによってＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲＩＮＥ（登録商標）の名称で、又はＤｙｏｍｉｃｓによってＤＹ−（登録商標）の名称で市販されている蛍光団などの蛍光団は、異なる発光スペクトルを有するので、有利に使用される。その結果、異なる微生物種に対して並行して検出を実施することができる。適切な画像処理後、異なる微生物種の各々を色分けすることができ、それによって、捜し求める各種の異なる微生物又はコロニーを確認することができる。これは、フィルター媒体として膜を用いて実施するときには特に良好な画像を与える。
【００８６】
「量子ドット」として知られ、Ｑｄｏｔｓ（登録商標）の名称で市販されている微粒子を用いて、段階ｃ）において使用されるプローブ又はリガンドをマークすることもできる。これらは、ナノ結晶で構成される無機蛍光団であり、その蛍光は経時的に極めて安定になる。微粒子の使用は、画像解析装置によってデータを収集するのに長時間を要する、少ない標的の検出に特に適している。「量子ドット」は、多色マーキングにも適合し、したがって、異なる微生物種の同時検出が可能である。
【００８７】
本発明の範囲内で、膜をフィルターとして使用するときには、膜を構成する合成材料による蛍光を防止するために、ＬｉＣｏｒ（登録商標）によってＩＲｄｙｅ  ７００及びＩＲＤｙｅ  ８００の名称で市販されているＩＲｄｙｅ、又はＤｙｏｍｉｃｓ（登録商標）によって、例えばＤＹ−７００、ＤＹ−７３０、ＤＹ−７５０及びＤＹ−７８０の名称で市販されているＩＲｄｙｅなどの近赤外に蛍光を有する色素を使用することが好ましい。実際に、膜は、一般に、近赤外の蛍光が弱いことが観察された。
【００８８】
本発明による方法は、ガス中、液体中又は表面の１０００個未満の同種微生物、優先的には５０個未満の同種微生物、より優先的には５個未満の同種微生物、及びちょうど１個の所与の種の微生物を検出することを目的とする。
【００８９】
上記方法の段階の１つでフィルター表面の微生物又はその核酸が移動するのを防止するために、特にフィルターが膜であるときには、反応溶液を介して作用し得る、前記表面の異なる領域での交換を制限する手段を使用することが有利である。
【００９０】
これらの交換を制限する一手段は、例えば、反応溶液を含浸させたパッドを介して、反応溶液を微生物又は核酸と接触させることからなる。含浸パッドは、例えば、膜表面に置いた（ｐｌａｔｅ）ときには、隣接領域にあふれ出ることなしに、反応が起こるのに十分な体積の反応溶液を局所的に輸送する。
【００９１】
交換を制限する別の手段は、ゲル、好ましくはアクリルアミドゲルの形の反応溶液を処方することからなり得る。
【００９２】
本発明による交換を制限する別の手段は、フィルターの異なる領域を区切る、フィルター上に位置する垂直の仕切り（ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）からなる。有利には、この仕切りは、反応溶液を収容するように、膜表面にある体積を設けるように設計されている。好ましくは、仕切りは、フィルターと接触し続ける複数のセルを形成するグリッドの形で存在する。
【００９３】
本発明の好ましい特徴によれば、本方法は、以下の段階、すなわち、
ａ）液体がフィルター、好ましくは膜によってろ過される段階、
ｂ）液体中に含まれる細菌が前記フィルター上で捕捉される段階、
ｃ）これらの細菌に含まれるシュードモナス  エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の核酸が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択される配列を含む少なくとも１種類のプライマーを特に必要とするＬＡＭＰ型増幅によって、フィルターの表面又は内部で等温で特異的に増幅される段階、
ｄ）フィルター上で得られた増幅産物が検出される段階
を含むことを特徴とする、液体中に含まれるシュードモナス  エルジノーサ種の１種類以上の細菌をフィルター上で特異的に検出することに適用される。
【００９４】
本発明の特に好ましい特徴によれば、ＬＡＭＰ型技術によってシュードモナス  エルジノーサの核酸の増幅に使用されるプライマーは、以下の通りである。
【００９５】
【化１】
2008538910.tif 000002
（配列番号２）
【００９６】
【化２】
2008538910.tif 000003
（配列番号３）
【００９７】
【化３】
2008538910.tif 000004
（配列番号４）
【００９８】
【化４】
2008538910.tif 000005
（配列番号５）
【００９９】
【化５】
2008538910.tif 000006
（配列番号６）
【０１００】
【化６】
2008538910.tif 000007
（配列番号７）
【０１０１】
これらのプライマーによって、配列番号１で示される、シュードモナス  エルジノーサの領域の増幅が可能になる（ｏｐｒＬ遺伝子の領域）。
【０１０２】
シュードモナス  エルジノーサに含まれるメッセンジャーＲＮＡは、次いでＬＡＭＰ型増幅技術によって増幅される、配列番号１の配列を含むｃＤＮＡを得るために、段階ｂ）において好ましくは逆転写される。
【０１０３】
本発明の別の特徴は、本発明による上記方法の実施に適切な核酸増幅装置に関する。増幅しようとする核酸を受けるフィルター（１）を含むこの装置は、内部体積を画成する本体（２）を含み、この内部体積中で、フィルター（１）と、扁平な不透過性壁（３）との、また、フィルター（１）表面に複数のセルを形成するグリッド（４）との接触を維持する手段を備えたことを特徴とする。
【０１０４】
好ましくは、サイズ及び形状が可変であり得るセルは、一般に反応溶液１から１００μｌ、優先的には１から５０μｌ、より優先的には３から１０μｌを含むことができるように設計される。
【０１０５】
装置の本体（２）は、フィルター（１）の外縁部と協働するのに適切な肩部（５）を有し得るものであり、フィルター（１）は、その外縁部が前記肩部（５）に対して固定され得る。
【０１０６】
扁平な壁（３）は、前記肩部（５）に対して多孔質フィルター（１）の外縁部を固着させるのにも役立つ。扁平な壁（３）は、本体と対向して脱着可能であり、更に、横に広がるスカート（６）を有し得る。この場合、本体（２）は、有利には、スカート（６）と協働するようになされたスリーブ（７）を有する。スカート（６）は、扁平な壁（３）から離れて広がる形状を有し得る。
【０１０７】
グリッド（４）は、本体から独立していても、本体（２）と一体であってもよい。グリッド（４）が本体から独立しているときには、セルの仕切りがフィルター表面と均一に接触するように、本体内部の奥に設置することができる。セルは、好ましくは、等体積の反応溶液で満たすことができるように、同一サイズであり、正四角形又は平行六面体である。グリッドと本体が一体であるときには、フィルターは、有利には、セル間の交差汚染を防止するために、グリッド上で密閉することができる。
【０１０８】
本発明の別の特徴によれば、核酸増幅装置は、本体（２）に取り付けられた貯蔵部（９）を有する。この貯蔵部は、扁平な壁（３）の代わりにスリーブ（７）に装着された真空ポンプを例えば用いて、フィルター（１）（その場合はろ過フィルターである。）を通過することによってろ過される液体で満たされるようになされている。次いで、液体中に含まれる微生物は、フィルターの流入側又は上流側で捕捉される。この操作が終了した後、フィルターの下面又は下流の面に対して密封状態で、扁平な壁（３）を交換する。
【０１０９】
ろ過前の液体の汚染を防止するために、貯蔵部は、脱着可能なカバー（８）を備え得ることが想定される。
【０１１０】
貯蔵部（９）は、有利には、ろ過操作が終了した後、貯蔵部の水平方向上縁部に強い圧力を下方に加えることによって貯蔵部を取り外すことができるように、易破壊性領域（１０）によって本体（２）に取り付けることができる。
【０１１１】
本発明の好ましい特徴によれば、脱着可能なカバー（８）は、貯蔵部（９）を閉鎖するのに、又は前記内部体積を易破壊性領域（１０）のレベルで閉鎖するのに適切である。
【０１１２】
図１３及び１４に示すように、脱着可能なカバー（８）で易破壊性領域を閉鎖すると、カバーは、グリッド（４）の反対側に位置して、前記内部体積を閉鎖する。この形状の装置によって、フィルターは、扁平な壁（３）、本体（２）及びカバー（８）によって画成された体積中に閉じ込められ、グリッド（４）によって垂直に仕切られる。この体積は、増幅用の反応溶液、場合によっては、上記精製、固定、洗浄段階などの本方法の他の段階のための反応溶液を受けるものである。この体積は、好ましくは、溶液が失われないように密閉されている。
【０１１３】
フィルターを小さな反応体積に閉じ込めることは、増幅反応を満足な条件で実現させるのに重要である。実際に、一方では、外部環境に起因する汚染を防止せねばならず、一方では、酵素反応は、過大な体積で起きてはならない。酵素試薬は高価であり、温度を均一に調節しなければならないので、これは必要である。最後に、反応溶液の過剰な蒸発を防止しなければならない。
【０１１４】
前記溶液の付着は、好ましくは、カバーを一時的に外して実施され、マイクロピペット又は気化器を用いて、溶液をグリッド全体にかける。溶液の体積は、グリッドの高さを超えても、超えなくてもよい。
【０１１５】
本発明による装置の好ましい態様によれば、扁平な壁（３）は排液口（１１）を有し、適切であれば、排液口（１１）を密閉するのに適切な栓（１２）を有する。次いで、本発明の方法による増幅又はマーキング段階後、例えば、フィルター上に存在する核酸を過剰に懸濁させる恐れなしに、溶液を慎重に除去することができる。増幅及びマーキング段階を実施後、例えば画像解析装置を用いた生物発光分析などの選択された技術によってフィルターを分析するために、フィルターを装着した装置本体のみを、又は適切であればフィルターのみを保持することができる。
【０１１６】
本発明の別の特徴は、本発明による検出方法を実施するためのキットに関する。このキットは、少なくとも、
−  フィルター、好ましくは膜、
−  核酸の等温での増幅を可能にする１種類以上の特異的プライマー
を含む。
【０１１７】
キットは、ポリメラーゼ酵素を含む増幅溶液、溶解溶液、好ましくはグルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド又はパラホルムアルデヒドを含有する固定溶液、反応を停止させるブロッキング溶液、及び本願で参照する検出剤の１種類を含む検出溶液も含むことができる。
【０１１８】
「核酸の等温での増幅を可能にする特異的プライマー」とは、ＬＡＭＰ型増幅の場合には例えばＦＩＰ、ＢＩＰオリゴヌクレオチドなどのＤＮＡポリメラーゼの存在下で、又はＮＡＳＢＡ型増幅の場合にはＲＮＡポリメラーゼの存在下で、ハイブリッド形成可能な分子、及び重合反応を開始可能な分子を意味する。
【０１１９】
シュードモナス  エルジノーサ菌の検出をより具体的に意図した本発明によるキットは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択されるＤＮＡ配列を含む、少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドを含む。
【０１２０】
本発明の別の特徴は、シュードモナス  エルジノーサの特異的検出を、この細菌に含まれる核酸を増幅することによって可能にするオリゴヌクレオチドに関し、そのヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７から選択される配列を含むことを特徴とする。
【０１２１】
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明するためのものである。
【実施例１】
【０１２２】
本願の図４に示す試験は、図１に示すＬＡＭＰ法に従って、わずか５０個のシュードモナス  エルジノーサ細胞のメッセンジャーＲＮＡを増幅することからなった。このために用いたプライマーを本願の図２に示す。
【０１２３】
処理細胞数について正確を期するために、核酸を細菌から抽出し、管中の溶液２５μｌ（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８．８、２０ｍＭ  ＫＣｌ、０．６Ｍベタイン、ｄＮＴＰの各々１．５ｍＭ＋０．２ｍＭ  ＵＴＰビオチン、２０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、８ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）×１００界面活性剤、０．００５Ｕ／μｌ  ＡＭＶ  ＲＴａｓｅ、０．３２Ｕ／μｌ  Ｂ．  ｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ中のＦＩＰ＆ＢＩＰオリゴヌクレオチド２ｐｍｏｌ／μｌ；ループＦ＆ループＢオリゴヌクレオチド１ｐｍｏｌ／μｌ；Ｆ３＆Ｂ３オリゴヌクレオチド０．２ｐｍｏｌ／μｌ）を水浴中に６３℃で３時間放置して増幅した。
【０１２４】
増幅を以下の条件で実施した。
【０１２５】
−  管Ｎｏ．１：  ５０個のＰ．エルジノーサ細胞の処理、
−  管Ｎｏ．２：  細胞を含まない対照、
−  管Ｎｏ．３：  細胞を含まない対照＋ｄＵＴＰビオチン、
−  管Ｎｏ．４：  ５０個の細胞の処理＋ｄＵＴＰビオチン
増幅産物をアガロースゲル上で観察し、反応混合物１及び４における増幅産物の存在、並びに混合物２及び３における増幅の欠如を確認した。
【０１２６】
４つの反応の生成物をナイロン膜に塗布した。
【０１２７】
次いで、膜をブロッキング溶液（Ｐｉｅｒｃｅブロッキング緩衝剤＋１％ＳＤＳ）と一緒に４５分間インキュベートし、次いでブロッキング溶液で１：７５０希釈した、西洋わさびペルオキシダーゼと複合化されたストレプトアビジン（１ｍｇ／ｍｌ）の溶液と接触させた。４５分間のインキュベーション後、膜を洗浄溶液（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）界面活性剤、０．２％ｖ／ｖを含むＰＢＳ）で３０分間リンスした。発光反応を起こすために、ブラックラディッシュペルオキシダーゼの、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌによって市販されているルミノールを主成分とした基質を膜表面に噴霧した。
【０１２８】
図４のポイントＣ／は、分析装置（ＣＣＤカメラ）による画像処理後に得られた画像である。ビオチン標識増幅産物とペルオキシダーゼの間で得られる反応は、反応混合物Ｎｏ．４で容易に見ることができる。
【０１２９】
この実験によれば、シュードモナス  エルジノーサなどの微生物の５０個の細胞と等価な量の核酸から得られる増幅産物を膜上で容易に検出することができる。
【実施例２】
【０１３０】
図４に示す別の試験は、約１３０個のシュードモナス  エルジノーサ細胞を膜（ＭＸＨＶＷＰ１２４）に塗布することからなった。
【０１３１】
この塗布後、固定化溶液（変性アルコール９５％中の０．２５％グルタルアルデヒド）１．５ｍｌを含浸したセルロースパッド上に膜を周囲温度で５分間置き、次いで周囲温度で５分間乾燥させた。
【０１３２】
密封したペトリ皿中に膜を置き、次いで増幅溶液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８．８、２０ｍＭ  ＫＣｌ、０．６Ｍベタイン、ｄＮＴＰの各々１．５ｍＭ＋０．２ｍＭ  ＵＴＰビオチン、２０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、８ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）×１００界面活性剤、０．００５Ｕ／μｌ  ＡＭＶ  ＲＴａｓｅ、０．３２Ｕ／μｌ  ＤＮＡポリメラーゼ中のＦＩＰ＆ＢＩＰオリゴヌクレオチド２ｐｍｏｌ／μｌ；ループＦ＆ループＢオリゴヌクレオチド１ｐｍｏｌ／μｌ；Ｆ３＆Ｂ３オリゴヌクレオチド０．２ｐｍｏｌ／μｌ）０．５ｍｌを添加し、６３℃で１５０分間インキュベートした。
【０１３３】
次いで、膜をブロッキング溶液（Ｐｉｅｒｃｅブロッキング緩衝剤＋１％ＳＤＳ）と一緒に４５分間インキュベートし、次いでブロッキング溶液で１：７５０希釈した、西洋わさびペルオキシダーゼと複合化されたストレプトアビジン（１ｍｇ／ｍｌ）の溶液と接触させた。４５分間のインキュベーション後、膜を洗浄溶液（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）界面活性剤、０．２％ｖ／ｖを含むＰＢＳ）で３０分間リンスした。発光反応を起こすために、ブラックラディッシュペルオキシダーゼの、Ｐｉｅｒｃｅによって市販されているルミノールを主成分とした基質を膜表面に噴霧した。Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ（登録商標）Ｒａｐｉｄシステムを用いて信号を記録した。
【０１３４】
結果を図６のＢ及びＣに示す。図６のＣにおいて、膜への細胞の最初の塗布に対応する２個の増幅ピークを容易に見ることができる。
【０１３５】
並行して、増幅に役立つ溶液を回収し、アガロースゲル電気泳動によって分析した。その結果を図６のＢに示す。増幅産物の一部が増幅溶液中に存在することを容易に見ることができる。
【０１３６】
この実験によれば、シュードモナス  エルジノーサなどの微生物の１３０個の細胞と等価な量の核酸から得られる増幅産物を膜上で容易に検出することができる。それにもかかわらず、これらの増幅産物の一部は、膜によって溶出し、電気泳動によって検出することができる。
【実施例３】
【０１３７】
図６に示す別の試験は、図５に示す装置を用いて溶液１００ｍｌをろ過することからなり得る。
【０１３８】
ろ過後、固定化溶液（変性アルコール９５％中の０．２５％グルタルアルデヒド）１．５ｍｌを含浸したセルロースパッド上に装置を周囲温度で５分間置く。
【０１３９】
膜を周囲温度で５分間乾燥させ、次いでインキュベーション中の漏洩を防止するために装置の下部を閉鎖カセットを用いて閉鎖する。
【０１４０】
増幅溶液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８．８、２０ｍＭ  ＫＣｌ、０．６Ｍベタイン、ｄＮＴＰの各々１．５ｍＭ＋０．２ｍＭ  ＵＴＰビオチン、２０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、８ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）×１００界面活性剤、０．００５Ｕ／μｌ  ＡＭＶ  ＲＴａｓｅ、０．３２Ｕ／μｌ  ＤＮＡポリメラーゼ中のＦＩＰ＆ＢＩＰオリゴヌクレオチド２ｐｍｏｌ／μｌ；ループＦ＆ループＢオリゴヌクレオチド１ｐｍｏｌ／μｌ；Ｆ３＆Ｂ３オリゴヌクレオチド０．２ｐｍｏｌ／μｌ）１．５ｍｌを装置の膜全体に散布し、次いで、６３℃で１５０分間のインキュベーション中に蒸発するのを防止するために、その上部をカバーで再度閉鎖する。
【０１４１】
次いで、膜をブロッキング溶液と一緒に４５分間インキュベートし、次いでブロッキング溶液で１：７５０希釈した、西洋わさびペルオキシダーゼと複合化されたストレプトアビジン（１ｍｇ／ｍｌ）溶液と接触させる。４５分間のインキュベーション後、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）界面活性剤、０．２％ｖ／ｖを含むＰＢＳ溶液で膜を３０分間リンスした。発光反応を起こすために、Ｐｉｅｒｃｅによって市販されている、ブラックラディッシュペルオキシダーゼの、ルミノールを主成分とした基質を膜表面に噴霧する。Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ（登録商標）Ｒａｐｉｄシステムを用いて信号を記録する。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】本発明による検出方法の段階ｂ）において好ましく使用される、微生物に含まれるメッセンジャーＲＮＡの検出に適切なＬＡＭＰ増幅技術の原理を示す図である。
【図２】本発明の方法によるＬＡＭＰ法によるシュードモナス  エルジノーサの特異的検出に使用されるプライマーを示すｏｐｒＬ遺伝子から生ずるＤＮＡ配列（５’−＞３’）を示す図である。本発明によって使用されるプライマーに対応する配列に陰影をつけ、その配向を矢印で示す。
【図３】実施例１において実施される、本発明による方法の各段階を示す図である。
【図４】実施例１に記載の、本発明による方法の段階ｂ）及びｃ）の説明図である。
【図５】実施例２において実施される、本発明による検出方法の各段階を示す図である。
【図６】実施例２に記載の、本発明による検出方法の段階ｂ）及びｃ）の図である。
【図７】実施例３において実施される、本発明による検出方法の各段階を示す図である。
【図８】本発明による方法を実施するための核酸増幅装置の斜視図である。
【図９】図８の装置の断面図である。
【図１０】扁平な壁及びカバーのない、図８の装置の断面図である。
【図１１】図１０の装置図の上面図である。
【図１２】図８の装置の分解組立斜視図である。
【図１３】貯蔵部を取り外した後の図８の装置の斜視図である。
【図１４】図１３の装置の横断面図である。
【図１５】図１３の装置の分解組立斜視図である。
【図１】
2008538910.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
2008538910000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年12月20日(2007.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
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【国際調査報告】
2008538910.tif 000024
2008538910.tif 000025
2008538910.tif 000026
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