(57)【要約】  本発明は単離抗体を提供し、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ-ＣｏＶ）のスパイクタンパク質の受容体結合領域と結合し、競合的にＳＡＲＳ-ＣｏＶと宿主細胞との結合を阻害することを特徴とする。前記ｍＡｂ又は基質は、１）ＳＡＲＳ-ＣｏＶ感染予防のための受動的免疫化剤として、２）ＳＡＲＳ-ＣｏＶ感染診断のための生物剤として、３）ＳＡＲＳ-ＣｏＶ感染初期治療のための免疫療法として、及び４）ＳＡＲＳ-ＣｏＶＳタンパク質の免疫性、抗原性、構造及び機能を研究するためのプローブとして使用可能である。【選択図】図３
2008529504.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ）のスパイクタンパク質における受容体結合領域と結合可能であり、又は、
重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ）と宿主細胞での受容体もしくは無細胞系受容体との結合が競合的に抑制可能であることを特徴とする単離抗体。
【請求項２】
請求項1記載の前記抗体の相補性決定領域を備える物質であって、
前記物質は、
請求項１記載の前記抗体と同じエピトープに対して結合可能であり、又は請求項１記載の前記抗体の如く前記エピトープの結合を競合的に抑制可能であることを特徴とする物質。
【請求項３】
前記物質が抗体であることを特徴とする請求項２記載の物質。
【請求項４】
前記抗体が中和抗体であることを特徴とする請求項１記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体は、ＡＴＣＣ（米国菌株保存機関）の取得番号ＰＴＡ‐６５２１であるハイブリドーマ１８Ｄ９によって生成されることを特徴とする抗体。
【請求項６】
請求項５記載の前記抗体によって認識されることを特徴とするエピトープ。
【請求項７】
ＡＴＣＣ（米国菌株保存機関）の取得番号ＰＴＡ‐６５２２であるハイブリドーマ１９Ｂ２によって生成されることを特徴とする抗体。
【請求項８】
請求項７記載の前記抗体によって認識されることを特徴とするエピトープ。
【請求項９】
ＡＴＣＣ（米国菌株保存機関）の取得番号ＰＴＡ‐６５２３であるハイブリドーマ３０Ｆ９によって生成されることを特徴とする抗体。
【請求項１０】
請求項９記載の前記抗体によって認識されることを特徴とするエピトープ。
【請求項１１】
ＡＴＣＣ（米国菌株保存機関）の取得番号ＰＴＡ‐６５２４であるハイブリドーマ３１Ｈ１２によって生成されることを特徴とする抗体。
【請求項１２】
請求項１１記載の前記抗体によって認識されることを特徴とするエピトープ。
【請求項１３】
ＡＴＣＣ（米国菌株保存機関）の取得番号ＰＴＡ‐６５２５であるハイブリドーマ３２Ｈ５によって生成されることを特徴とする抗体。
【請求項１４】
請求項１３記載の前記抗体によって認識されることを特徴とするエピトープ。
【請求項１５】
ＡＴＣＣ（米国菌株保存機関）の取得番号ＰＴＡ‐６５２６であるハイブリドーマ３３Ｇ４によって生成されることを特徴とする抗体。
【請求項１６】
請求項１５記載の前記抗体によって認識されることを特徴とするエピトープ。
【請求項１７】
単鎖抗体又は抗体融合コンストラクトであることを特徴とする請求項１記載の抗体。
【請求項１８】
前記抗体がヒト化抗体であることを特徴とする請求項1記載の抗体。
【請求項１９】
前記抗体がキメラ抗体であることを特徴とする請求項１記載の抗体。
【請求項２０】
前記抗体が直接的に又は間接的に細胞傷害性物質と連結することを特徴とする請求項１記載の単離抗体。
【請求項２１】
請求項１記載の前記抗体を含むことを特徴とする細胞。
【請求項２２】
請求項１記載の前記抗体をコードすることを特徴とする核酸分子。
【請求項２３】
請求項２２記載の前記分子特異的にハイブリッド形成することが可能であることを特徴とする核酸分子。
【請求項２４】
前記核酸分子が合成ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、相補ＤＮＡ、又はＲＮＡであることを特徴とする請求項２２記載の核酸分子。
【請求項２５】
請求項２４記載の前記核酸分子又は前記核酸分子の一部分を含むことを特徴とするベクター。
【請求項２６】
請求項２４記載の前記核酸分子を含むことを特徴とする細胞。
【請求項２７】
抗体を生成する方法であって、
前記抗体は重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ）のスパイクタンパク質における受容体結合領域と結合可能な、又は、
前記抗体は重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ）と宿主細胞との結合を競合的に抑制可能な抗体であり、
前記方法は、
請求項２２記載の前記核酸分子が適当な調節要素と適切に結合することにより、前記調節要素が前記抗体を発現する段階、
前記結合された核酸分子を、前記抗体の発現を可能とするための適当な条件下に置く段階、及び、
前記発現された抗体を回収する段階を備えることを特徴とする抗体を生成する方法。
【請求項２８】
請求項２７記載の前記方法によって生成されることを特徴とする抗体。
【請求項２９】
請求項1記載の前記抗体の有効量と、適切な担体を含むことを特徴とする組成物。
【請求項３０】
請求項１記載の前記抗体の有効量と、薬学的に許容可能な担体を含むことを特徴とする薬学的組成物。
【請求項３１】
請求項３０記載の前記薬学的組成物を使用する段階を備えることを特徴とする、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ）の感染を治療する方法。
【請求項３２】
請求項３０記載の前記薬学的組成物を使用する段階を備えることを特徴とする、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ）の感染を予防する方法。
【請求項３３】
重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ）もしくはＳＡＲＳ‐ＣｏＶに感染した細胞を検知する方法であって、
前記方法は、
前記抗体もしくはその誘導体と接触する段階を備え、
前記段階において、前記抗体もしくはその誘導体は、前記抗体もしくはその誘導体と重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ）のスパイクタンパク質における受容体結合領域との間で複合体の形成が可能である状況下で、前記ウイルスのスパイクタンパク質における受容体結合領域と結合可能であり、
更に前記方法は、
前記形成された複合体を検知する段階を備えることを特徴とする方法。
【請求項３４】
化合物をスクリーニングする方法であって、
前記化合物は、前記ウイルスと宿主細胞の受容体との結合を阻止することにより、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルスの感染を抑制することが可能であり、
前記方法は、
（a）請求項１記載の前記抗体が重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ）のスパイクタンパク質における受容体結合領域と結合する系を構築する段階を備え、
（b）前記化合物が前記系（a）と接触する段階を備え、前記段階において、請求項１記載の前記抗体が重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ）のスパイクタンパク質における受容体結合領域との結合を減少させることにより、前記化合物は前記結合を妨げることが可能となるとともに、前記化合物は重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ）のスパイクタンパク質における受容体結合領域の感染を抑制することが可能となることを特徴とする化合物をスクリーニングする方法。
【請求項３５】
請求項３４記載の前記方法によって得られることを特徴とする化合物。
【請求項３６】
請求項１記載の前記抗体を含むコンパートメントを備えることを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）は、近年認められた発熱を伴う重症の呼吸器疾患で、新型のコロナウイルス（ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ）（非特許文献1-5）に感染して引き起こされる。ＳＡＲＳの世界的大流行は沈静化したが、将来の再発可能性、特に最近報告された研究室内での感染（非特許文献6）には懸念が残る。しかしながら、この致命的ウイルス（非特許文献7,8）に対抗できる治療法や予防法は現在ない。
【０００２】
他のコロナウイルスと同様に、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶはエンベロープウイルスであり、大きいプラス鎖ＲＮＡゲノムを含む。プラス鎖ＲＮＡゲノムはウイルスレプリカーゼタンパク質と、スパイク（S）、メンブラン（M）、エンベロープ（E）、ヌクレオカプシド（N）及びいくつかの性質不明のタンパク質を含む構造タンパク質（非特許文献4,5,9）をコードする。ＳＡＲＳ‐ＣｏＶは３つある既知のコロナウイルスの抗原性グループと性質が異なることが系統的分析により示されている。ゆえに、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶのポストゲノム特性解析は抗ＳＡＲＳ治療薬やワクチン（非特許文献10,11）を創るのに重要である。
【０００３】
コロナウイルスの感染はＳタンパク質が特殊な宿主受容体に付着することにより起こり、Ｓタンパク質内の構造変化を誘発する。ＳＡＲＳ‐ＣｏＶのSタンパク質は、リーダー（残基1-14）、細胞外ドメイン（残基15-1190）、膜貫通ドメイン（残基1191-1227）及び短い細胞の尾部（残基1227-1255）（非特許文献5）を含む１２５５アミノ酸の予測される長さの１型膜貫通糖タンパクである。例えばマウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）（非特許文献12,13）のような他の多くのコロナウイルスと異なり、翻訳後にＳ１とＳ２に切断されるＳタンパク質において、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶのＳタンパク質（非特許文献5）で典型的な切断モチーフが同定されることはない。それにも関わらず、そのＳ１及びＳ２ドメインは他のコロナウイルスのＳタンパク質（非特許文献5,14）の配列アライメントにより予測された。推定融合ペプチドと２つの７アミノ酸繰り返し（ＨＲ１及びＨＲ２）の領域を含むＳＡＲＳ‐ＣｏＶのＳタンパク質はウイルスと標的細胞膜間の融合に関与している。ＨＲ１及びＨＲ２の領域は結合して、６へリックス束構造（非特許文献15-18）を形成する。この６ヘリックス束構造はＨＩＶ ｇｐ４１（非特許文献19）及びＭＨＶのＳタンパク質（非特許文献20,21）の融合活性の核に類似する。ＳＡＲＳ‐ＣｏＶのＳプロテインのＳ１領域は、感受性細胞（非特許文献22-25）におけるＳＡＲＳ‐ＣｏＶの機能受容体であるアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）とのウイルス結合を仲介する。最近では、Ｓ１領域内（残基318-510）の１９３アミノ酸の小断片が受容体結合領域（ＲＢＤ）であると認められており、この領域はＡＣＥ２（非特許文献26-28）と結合する。
【０００４】
本出願は、２００５年２月８日提出の米国特許出願第60/651,046号の利益を請求し、また本出願は２００５年５月３１日提出の米国特許出願第11/141,925号の一部継続出願であり、この出願は２００４年６月２日提出の米国特許出願第60/576,118号の利益を請求するものである。この出願には様々な文献が参照するためあげられている。従って、本発明の関係する当該技術分野についてより詳細に記述するため、そのような文献やそれに付随する開示は、それらの全体を参照することによりこの出願に含むこととする。
【０００５】
【非特許文献１】Drosten, C, S. Gunther, W. Preiser, W.S. Van Der, H.R. Brodt, S. Becker, H. Rabenau, M. Panning, L. Kolesnikova, R.A. Fouchier, A. Berger, A.M. Burguiere, J. Cinatl, M. Eickmann, N. Escriou, K. Grywna, S. Kramme, J.C. Manuguerra, S. Muller, V. Rickerts, M. Sturmer, S. Vieth, H.D. Klenk, A.D. Osterhaus, H. Schmitz, and H. W. Doerr. 2003. Identification of a novel coronavirus in patients with severe acute respiratory syndrome. N. Engl J. Med. 348:1967-1976.
【非特許文献２】Ksiazek, T.G., D. Erdman, CS. Goldsmith, S.R. Zaki, T. Peret, S. Emery, S. Tong, C. Urbani, J. A. Comer, W. Lim, P.E. Rollin, S.F. Dowell, A.E. Ling, CD. Humphrey, WJ. Shieh, J. Guarner, CD. Paddock, P. Rota, B. Fields, J. DeRisi, J. Y. Yang, N. Cox, J.M. Hughes, J. W. LeDuc, WJ. Bellini, and LJ. Anderson. 2003. A novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome. N. Engl. J. Med. 348:1953-1966.
【非特許文献３】Peiris, J.S., S.T. Lai, L.L. Poon, Y. Guan, L. Y. Yam, W. Lim, J. Nicholls, W.K. Yee, W.W. Yan, M.T. Cheung, V.C Cheng, K.H. Chan, D.N. Tsang, R. W. Yung, T.K. Ng, and K. Y. Yuen. 2003. Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome. Lancet 361 :1319-1325.
【非特許文献４】Marra, M.A., S J.M. Jones, CR. Astell, R.A. Holt, A. Brooks- Wilson, Y.S.N. Butterfield, J. Khattra, J.K. Asano, S. A. Barber, S. Y. Chan, A. Cloutier, S. M. Coughlin, D. Freeman, N. Girn, O.L. Griffith, S.R. Leach, M. Mayo, H. McDonald, S.B. Montgomery, P.K. Pandoh, A.S. Petrescu, A.G. Robertson, J.E. Schein, A. Siddiqui, D.E. Smailus, J.M. Stott, G.S. Yang, F. Plummer, A. Andonov, H. Artsob, N. Bastien, K. Bernard, T.F. Booth, D. Bowness, M. Czub, M. Drebot, L. Fernando, R. Flick, M. Garbutt, M. Gray, A. Grolla, S. Jones, H. Feldmann, A. Meyers, A. Kabani, Y, Li, S. Normand, U. Stroher, G. A. Tipples, S. Tyler, R. Vogrig, D. Ward, B. Watson, R.C. Brunham, M. Krajden, M. Petric, D.M. Skowronski, C Upton, and R.L. Roper. 2003. The genome sequence of the SARS-associated coronavirus. Science 300:1399-1404.
【非特許文献５】Rota, P.A., M.S. Oberste, S.S. Monroe, W.A. Nix, R. Campagnoli, J.P. Icenogle, S. Penaranda, B. Bankamp, K. Maher, M.H. Chen, S. Tong, A. Tamin, L. Lowe, M. Frace, J.L. DeRisi, Q. Chen, D. Wang, D.D. Erdman, T.C.T. Peret, C. Bums, T.G. Ksiazek, P.E. Rollin, A. Sanchez, S. Liffick, B. Holloway, J. Limor, K. McCaustland, M. Olsen-Rasmussen, R. Fouchier, S. Gunther, A.D.M.E. Osterhaus, C. Drosten, M. A. Pallansch, LJ. Anderson, and W.J. Bellini. 2003. Characterization of a Novel Coronavirus Associated with Severe Acute Respiratory Syndrome. Science 300:1394-1399.
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【非特許文献１０】Holmes, K. V. and L. Enjuanes. 2003. Virology: The SARS coronavirus: a postgenomic era.      Science 300:1377-1378.
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【非特許文献４８】Zwick, M.B., L.L. Bonnycastle, A. Menendez, M.B. Irving, CF. Barbas, III, P. W. Parren, D.R. Burton, and J.K. Scott. 2001. Identification and characterization of a peptide that specifically binds the human, broadly neutralizing anti-human immunodeficiency virus type 1 antibody bl2. J Virol 75:6692-6699.
【非特許文献４９】Sui, J., W. Li5 A. Murakami, A. Tamin, LJ. Matthews, S.K. Wong, MJ. Moore, A.S. Tallarico, M. Olurinde, H. Choe, LJ. Anderson, WJ. Bellini, M. Farzan, and W.A. Marasco. 2004. Potent neutralization of severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus by a human mAb to Sl protein that blocks receptor association. Proc. Natl. Acad. Sci. USA lOl :2536-2541.
【非特許文献５０】Subbarao, K., J. McAuliffe, L. Vogel, G. Fahle, S. Fischer, K. Tatti, M. Packard, WJ. Shieh, S. Zaki, and B. Murphy. 2004. Prior infection and passive transfer of neutralizing antibody prevent replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus in the respiratory tract of mice. J Virol 78:3572-3577.
【非特許文献５１】ter Meulen, J., A.B.H. Bakker, E.N. van den Brink, GJ. Weverling, B.E.E. Martina, B.L. Haagmans, T. Kuiken, J. de Kruif, W. Preiser, W. Spaan, H.R. Gelderblom, J. Goudsmit, and A.D.M.E. Osterhaus. 2004. Human monoclonal antibody as prophylaxis for SARS coronavirus infection in ferrets. Lancet 363:2139-2141.
【非特許文献５２】Traggiai, E., S. Becker, K. Subbarao, L. Kolesnikova, Y. Uematsu, M.R. Gismondo, B.R. Murphy, R. Rappuoli, and A. Lanzavecchia. 2004. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10:871-875.
【非特許文献５３】WeIt5 S., CR. Divgi, F.X. Real, S.D. Yeh, P. Garin-Chesa, CL. Finstad, J. Sakamoto, A. Cohen, E.R. Sigurdson, N. Kemeny, and . 1990. Quantitative analysis of antibody localization in human metastatic colon cancer: a phase I study of monoclonal antibody A33. J Clin Oncol 8:1894-1906.
【非特許文献５４】Welt, S. and G. Ritter. 1999. Antibodies in the therapy of colon cancer. Semin. Oncol. 26:683-690.
【非特許文献５５】Breedveld, F.C. 2000. Therapeutic monoclonal antibodies. Lancet 355:735-740.
【非特許文献５６】Xu, Z.K., L.X. Wei, L. Y. Wang, H.T. Wang, and S. Jiang. 2002. The In vitro and in vivo protective activity of monoclonal antibodies directed against Hantaan virus: potential application for immunotherapy and passive immunization. Biochem. Biophys. Res. Commun. 298:552-558.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
コロナウイルスのＳタンパク質は中和抗体（非特許文献29,30）の生産を誘発する主要な抗原決定基である。従って、必然的にＳタンパク質はワクチン開発用（非特許文献30）の抗原として使用される。最近では、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶのＳタンパク質が構造タンパク質（非特許文献31）間で防御免疫の主要誘発物質であることがわかっている。ヤン、他（非特許文献32）は、Ｓタンパク質をコードするＤＮＡワクチン候補はＳＡＲＳ‐ＣｏＶの中和（中和抗体の力価は１：２５から１：１５０の範囲）及びマウスの中の防御免疫を誘発し、Ｔ細胞依存メカニズムではなく中和抗体により保護作用が仲介されると報告した。ビシュト、他（非特許文献33）は、弱毒化ワクシニアウイルス（ＭＶＡ）により発現したＳＡＲＳ‐ＣｏＶのＳタンパク質はＳＡＲＳ‐ＣｏＶ中和抗体力価１：２８４を用いてＳ特異抗体とＳＡＲＳ‐ＣｏＶ感染に対するマウスの防御免疫を誘発すると立証した。これは攻撃感染後にマウスの呼吸器内のＳＡＲＳ‐ＣｏＶの減少した力価により示される。ブクレイェフ、他（非特許文献34）は、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶのＳタンパク質を発現する弱毒化パラインフルエンザウイルス（ＢＨＰＩＶ３）を用いたアフリカグリーンモンキーの粘膜免疫は、１：８から１：１６の範囲で中和された力価での中和抗体を誘発し、動物たちを攻撃感染から保護すると報告した。これらのデータによりＳＡＲＳ‐ＣｏＶのＳタンパク質は中和抗体を誘発することができる感染防御抗原であると示されるが、その抗原決定基は依然明らかにされていない。
【０００７】
近年我々は、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶのＳタンパク質の受容体結合領域はＳＡＲＳ‐ＣｏＶに感染した患者及び不活性化ウイルスやＳタンパク質（非特許文献35,36）で免疫された動物において誘発される中和抗体の主な標的であることを立証した。従って、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶのＳタンパク質の組換えＲＢＤをモノクローナル抗体中和（ｍＡｂ）を誘発する免疫原として使用した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ）のスパイク（Ｓ）タンパク質における受容体結合領域（ＲＢＤ）と結合可能であり、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶと宿主細胞との結合が競合的に抑制可能である単離抗体を提供する。更に本発明は、前記モノクローナル抗体の相補性決定領域を備える物質を提供し、該物質は前記モノクローナル抗体と同一のエピトープを認識可能である。
【０００９】
一の実施例において、上述の物質は抗体である。一の好適な実施例において、該抗体は中和抗体である。本発明は、また、単鎖抗体又は抗体融合コンストラクト（ヒト化抗体及び上述のキメラ抗体）を提供する。
【００１０】
本出願の意図するところは、本発明の抗体を用いた異なったキメラコンストラクトを包含するものとする。本発明は、また、該抗体のヒト化コンストラクト全てを包含する。一の実施例では、上述の単離抗体は、直接的に又は間接的に細胞傷害性物質と連結する。
【００１１】
本発明はまた、前記抗体を含む細胞を提供する。本発明は更に、前記抗体をコードする核酸分子を提供する。本発明は更に、前記分子特異的にハイブリッド形成することが可能である核酸分子を提供する。該核酸分子は、合成ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ並びにＲＮＡを含むが、限定されるものではない。
【００１２】
本発明は更に、前記核酸分子又は前記核酸分子の一部分を含むベクターを提供する。一の実施例では、該ベクターは発現ベクターであり、上記核酸分子によりコードされたタンパク質を発現可能である。本発明は更に、上記核酸分子を含む細胞を備える。該細胞は発現用に使用可能である。
【００１３】
本発明は、抗体を生成する方法である。前記抗体は、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶのスパイク（Ｓ）タンパク質における受容体結合領域（ＲＢＤ）と結合可能であり、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶと宿主細胞との結合を競合的に抑制可能である。前記方法は、前記記載の核酸分子が適当な調節要素と適切に結合することにより、前記調節要素が前記抗体を発現する段階、前記結合された核酸分子を前記抗体の発現を可能とするための適当な条件下に置く段階、及び、前記発現された抗体を回収する段階を備え、これにより前記抗体を生成する。本発明はまた、前記方法によって生成された抗体を提供する。
【００１４】
本発明は、前記モノクローナル抗体の有効量と適切な担体を含む組成物を提供する。本発明は更に、前記モノクローナル抗体の有効量と薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物を提供する。
【００１５】
本発明はまた、前記薬学的組成物を使用してＳＡＲＳ‐ＣｏＶの感染を治療する方法を提供する。本発明は更に、前記医薬成分を使用してＳＡＲＳ‐ＣｏＶの感染を予防する方法を提供する。
【００１６】
本発明はまた、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ（又はＳＡＲＳ‐ＣｏＶに感染した細胞）を検知する方法を提供する。前記方法は、前記抗体又はその誘導体と接触する段階を備え、前記抗体又はその誘導体は、ＳＡＲＳ-ＣｏＶスパイク（Ｓ）タンパク質における受容体結合領域（ＲＢＤ）との間で複合体の形成が可能である状況下で、前記ウイルスのＳタンパク質のＲＢＤと結合可能であり、前記形成された複合体の検知を可能とする。
【００１７】
最後に、本発明は、化合物をスクリーニングする方法を提供する。前記化合物は、急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ-ＣｏＶ）と宿主細胞の受容体との結合を阻止することにより、前記ウイルスの感染を抑制することが可能である。前記方法は、（ａ）前記抗体がＳＡＲＳ-ＣｏＶのスパイク（Ｓ）タンパク質における受容体結合領域（ＲＢＤ）と結合する系を構築する段階を備え、（ｂ）前記化合物が前記系（ａ）と接触する段階を備える。前記段階において、前記抗体がＳＡＲＳ-ＣｏＶのＳタンパク質におけるＲＢＤとの結合を減少させることにより、前記化合物は前記結合を妨げることが可能となるとともに、前記化合物はＳＡＲＳ-ＣｏＶのＳタンパク質におけるＲＢＤによる感染を抑制することが可能となる。本発明は更に、スクリーニングの結果得られる化合物を提供する。該化合物は重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の治療又は予防として使用可能である。
【００１８】
本発明は、ＳＡＲＳウイルスを認識可能な抗体を含むコンパートメントを備えるキットを提供する。
【００１９】
本発明において、受容体結合領域（ＲＢＤ）は、複数の高次構造依存的中和エピトープを含み、該エピトープは一群の強力な中和モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を誘起し、該ＲＢＤはＳＡＲＳの治療、診断、及び予防に使用可能であることを明示する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、単離モノクローナル抗体を提供する。該抗体は、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ）スパイク（Ｓ）タンパク質の受容体結合領域（ＲＢＤ）と結合することで、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶと宿主細胞との結合を競合的に抑制する。
【００２１】
本発明はまた、上述モノクローナル抗体の相補性決定領域を備える物質を提供する。該物質は上述モノクローナル抗体と同じエピトープと結合可能である。該物質には、ポリペプチド、小分子、抗体又は抗体の断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。一の好適な実施例において、抗体は中和抗体である。他の実施例において、抗体は単鎖抗体又は抗体融合コンストラクト、ヒト化抗体もしくは上述のキメラ抗体である。本出願の意図するところは、発明したコンストラクトを用いた異なったキメラコンストラクトを包含するものとする。また本発明は、全てのヒト化抗体コンストラクトに及ぶ。キメラ又はヒト化抗体を作成する技術は公知のものである。例えば、キメラ抗体は参考文献（非特許文献37,38）を、ヒト化抗体は参考文献（非特許文献39-41）を参照。当業者であれば、本開示に基づき上述物質の配列を改変することも可能であろう。該改変には、断片中特定アミノ酸配列の付加、欠失、又は変異が含まれる。抗体を生成する一般的な方法は、当業者の周知の事項である。参照（例えば、Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol No. 1 by Ed. Harlow (1998)）。
【００２２】
一の実施例では、上述の単離抗体は、一以上の細胞有害物質と直接又は間接的に連結する。該細胞有害物質には、放射性ヌクレオチド又は他の毒素が含まれるが、限定されるものではない。本発明は、また、抗体を備える細胞を提供する。本発明は更に上述の抗体をコードする核酸分子を提供する。抗体が単離されると、該抗体をコードする遺伝子の単離が可能となり、核酸配列が同定される。従って、本発明は更に、上述の分子と特異的にハイブリッド形成可能な核酸分子を提供する。該核酸分子は、合成ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ並びにＲＮＡを含むが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
本発明は、また、上述の核酸分子又はその一部分を含むベクターも提供する。該一部分は特定の働きをする機能的部分であってもよい。断片又は部分配列は、機能を持つタンパク質の機能領域をコードすることも可能である。一の実施例では、該ベクターは発現ベクターであり、核酸分子にコードされたタンパク質の発現が可能である。本発明は更に上述の核酸分子を備える細胞を提供する。該細胞は発現用にも使用可能である。ベクターは当業者に公知のものである。参照（例えば、Graupner, U.S. Patent. No. 6,337,208, "Cloning Vector," issued January 8, 2002）。参照（Schumacher et. al., U.S. Patent. No. 6,190,906, "Expression Vector for the Regulatable Expression of Foreign Genes in Prokaryotes," issued February. 20, 2001）。一の実施例では、ベクターはプラスミドである。
【００２４】
本発明は、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶのスパイク（Ｓ）タンパク質受容体結合領域（ＲＢＤ）と結合可能な抗体の生成方法を提供する。該抗体は、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶと宿主細胞との結合を競合的に抑制する。該方法は、上述の核酸分子を調節要素と適切に結合することで前記調節要素が該抗体を発現する段階、前記結合された核酸分子を、前記抗体の発現を可能とするための適当な条件下に置く段階、前記発現された抗体を回収する段階を備え、抗体を生成する。本発明はまた、前記方法によって生成された抗体も提供する。
【００２５】
ハイブリドーマ細胞系、３２Ｈ５(Ｃｏｎｆ Ｉ)、３１Ｈ１２(Ｃｏｎｆ ＩＩ)、１８Ｄ９（Ｃｏｎｆ ＩＩＩ）、３０Ｆ９（Ｃｏｎｆ ＩＶ）、３３Ｇ４（Ｃｏｎｆ Ｖ）及び１９Ｂ２（Ｃｏｎｆ ＶＩ）を、特許手続き上の微生物の寄託の国際承認に関するブタベスト条約に基づき、２００５年１月１３日に米国菌株保存機関(ＡＴＣＣ)、（10801 University Blvd., Manassas, VA. 20110, U.S.A.）に寄託した。細胞系３２Ｈ５(Ｃｏｎｆ Ｉ)、３１Ｈ１２(Ｃｏｎｆ ＩＩ)、１８Ｄ９（Ｃｏｎｆ ＩＩＩ）、３０Ｆ９（Ｃｏｎｆ ＩＶ）、３３Ｇ４（Ｃｏｎｆ Ｖ）及び１９Ｂ２（Ｃｏｎｆ ＶＩ）は、ＡＴＣＣ取得番号ＰＴＡ‐６５２５、ＰＴＡ‐６５２４、ＰＴＡ‐６５２１、ＰＴＡ‐６５２３、ＰＴＡ‐６５２６、 及びＰＴＡ‐６５２２をそれぞれ与えられた。
【００２６】
本発明はまた、上述モノクローナル抗体が認識するエピトープを提供する。該エピトープの配列又は高次構造は、診断上又は治療的使用に重要である。
【００２７】
本発明は、有効量の上述モノクローナル抗体及び適当な担体を備える組成物を提供する。 該有効量は一連の実験により決定される。本発明は更に、有効量の上述モノクローナル抗体及び薬学的に許容可能な担体を備える薬学的組成物を提供する。本明細書に用いられる薬学的に許容可能な担体とは、一般的な薬学的担体を意味する。適当な担体の例としては、当業者に公知の担体が挙げられるが、限定されるものではなく、一般的な薬学的担体であればよく、リン酸緩衝食塩水、Ｐｏｌｙｓｏｒｂ８０を含むリン酸緩衝食塩水、水、油／水乳化剤などの乳化剤及び各種の湿潤剤等が挙げられる。他の担体としては、無菌水溶液、錠剤、コーティングされた錠剤及びカプセル剤も含まれる。一般的には、前記担体は澱粉、乳、糖、ある種の粘土、ゼラチン、ステアリン酸もしくはステアリン酸塩、マグネシウムもしくはステアリン酸カルシウム、タルク、植物性脂肪もしくは植物性油、樹脂、並びにグリコール又は他の公知の賦形剤等の賦形剤を含む。前記担体は、香味及び着色添加剤又は他の成分を含むことも可能である。上記担体からなる組成物は、公知の従来技術を用いて処方する。
【００２８】
本発明は、上述の薬学的組成物を用いたＳＡＲＳ‐ＣｏＶ感染の治療方法を提供する。本発明は更に、上述の薬学的組成物を用いたＳＡＲＳ‐ＣｏＶ感染の予防方法を提供する。本発明は更に、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ（又はＳＡＲＳ‐ＣｏＶ感染細胞）の検知方法を提供し、該方法は、抗体又はその誘導体と接触する段階と、形成された複合体を検知する段階を備える。該抗体又はその誘導体は、抗体又はその誘導体とＳＡＲＳ‐ＣｏＶのＳタンパク質ＲＢＤが複合体を形成可能な条件下で、該ウイルスのスパイク（Ｓ）タンパク質受容体結合領域（ＲＢＤ）と結合可能である。
【００２９】
最後に、本発明は、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ感染を抑制可能な化合物をスクリーニングする方法を提供する。該抑制は該ウイルスと宿主細胞の受容体との結合を阻害することでなされる。スクリーニング方法は、以下の段階を備える。
（ａ）抗体がＳＡＲＳ‐ＣｏＶスパイク（Ｓ）タンパク質受容体結合領域（ＲＢＤ）と結合する系の構築
（ｂ）化合物を（ａ）の系と接触させ、それによる上記抗体とＳＡＲＳ‐ＣｏＶＳタンパク質受容体結合領域（ＲＢＤ）との結合減少は、化合物が上記結合を阻害できることを示し、これによりＳＡＲＳ‐ＣｏＶのＳタンパク質ＲＢＤによる感染を抑制する。
本発明は更に、スクリーニングの結果得られる化合物を提供する。化合物は重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の治療又は予防に使用可能である。
【００３０】
本発明は、ＳＡＲＳウイルスを認識可能な抗体及び／又は該抗体との結合を競合的に抑制する物質を含むコンパートメントを備えるキットを提供する。
【００３１】
本発明は、ＲＢＤが複数の高次構造依存的中和エピトープを持ち、該エピトープは一群の強力な中和モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を誘起し、該ＲＢＤは、ＳＡＲＳの治療、診断及び予防に使用可能であることを明示する。
【００３２】
本発明は以下の実験の詳細を参照することにより、より良く理解されるものであるが、当業者にとっては、実験によっては、詳細は単に実例にすぎず、本明細書に記載の以下の請求項に定義される本発明を限定するものではないことに留意されたい。
【００３３】
［実験の詳細］
ＳＰ２／０骨髄細胞とＢａｌｂ／ｃマウス由来の脾細胞を融合し、２７ハイブリドーマクローンを作成した。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶのスパイク（Ｓ）タンパク質受容体結合領域（ＲＢＤ）と結合したヒトＩｇＧ１のＦｃ断片（ＲＢＤ‐Ｆｃと示す）を含む融合タンパク質により免疫化したものを用いた。ハイブリドーマクローンから生成された２７モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のうち、隣接の直鎖エピトープと結合した２ｍＡｂ以外、全てのｍＡｂが高次構造依存的エピトープを認識した。結合競合試験から得られた結果に基づき、これらの２５高次構造特異的ｍＡｂは６群に分類され、ＣｏｎｆＩ‐ＶＩと示す。ＣｏｎｆＩＶ及びＣｏｎｆＶｍＡｂはＲＢＤ‐ＦｃとＡＣＥ２（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ受容体）との結合を著しく阻害したことから、これらのエピトープはＳタンパク質受容体結合部位とオーバーラップすると示唆される。ほとんどのｍＡｂ（２３／２５）は高次構造的エピトープを認識し、該ｍＡｂはＳＡＲＳ偽ウイルスに対し強力な中和活性を持ち、５０％中和量（ＮＤ５０）は０．００５から６．５６９μｇ／ｍｌに及ぶ。
【００３４】
該ＳＡＲＳ−ＣｏＶを中和するｍＡｂは以下の１）〜３）のように用いることができる。
１）ＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染初期治療のための免疫療法
２）ＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染診断のための生物剤
３）ＳＡＲＳ−ＣｏＶＳタンパク質の免疫原性、抗原性、構造及び機能を研究するためのプローブ
更にこれらのマウスｍＡｂをＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染治療及び予防用にヒト化することができる。
【００３５】
［材料と方法］
〈マウスの免疫化及びｍＡｂの生成〉
５Ｂａｌｂ／ｃマウス（４週齢）をプロテインＡセファロース精製ＲＢＤ‐Ｆｃ（２０μｇ）の皮下注射により、ＭＬＰ＋ＴＤＭアジュバント系（Sigma, Saint Louis, MI）を併用し免疫化した。ＲＢＤ‐ＦｃのプロテインＡセファロースの調整は、上述のように（非特許文献35）行った。その後、同抗原１０μｇ及びＭＬＰ＋ＴＤＭアドジュバントにより３週間間隔で追加免疫した。マウス抗血清を回収し、抗ＲＢＤ抗体及びＳＡＲＳ−ＣｏＶ中和抗体を検出した。
【００３６】
抗ＲＢＤｍＡｂを生成するハイブリドーマは、通常の方法を用いて作成した。簡単に説明すると、免疫化したマウスから脾細胞を収集し、ＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合した。ハイブリドーマコロニーを含むウェルから回収した細胞培養上清は、Ｓ１‐Ｃ９を上述のように（非特許文献35）被覆抗原として調整し、これを用い酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によりスクリーニングした。陽性反応を示したウェルの細胞量を増やし、再測定した。陽性反応を示した培養を継代培養し、安定したハイブリドーマ細胞系を作成した。プロテインＡセファロース４ファーストフロー（Amersham Biosciences）を用い、ｍＡｂを培養上清から精製した。
【００３７】
〈ＥＬＩＳＡ及び結合競合〉
マウス血清又はｍＡｂと各種抗原との反応性をＥＬＩＳＡにより決定した。簡単に説明すると、１μｇ／ｍｌ組換えタンパク質（ＲＢＤ‐Ｆｃ又はＳ１‐Ｃ９）又は精製ヒトＩｇＧ（Zymed, South San Francisco, CA）をそれぞれ用い、９６ウェルマイクロタイタープレート（Corning Costar, Acton, MA）を被膜した。被膜は、０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中、４℃で一晩放置することで行った。２％無脂肪乳でブロッキング後、段階希釈したマウス血清又はｍＡｂを加え、３７℃で１時間温置し、０．１％Tween 20含有ＰＢＳで４回洗浄した。結合した抗体は、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Zymed）を用い、３７℃で１時間温置し、洗浄後検知した。反応は、基質である３，３’，５，５’，テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加することで可視化し、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Tecan US, Research Triangle Park, NC）を用い４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００３８】
ジスルフィド結合の還元がＲＢＤ特異ｍＡｂの結合へ与える影響を決定するために、ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌ濃度の組換えＲＢＤ−Ｆｃ又はＳ１‐Ｃ９で被膜し、１０ｍＭ濃度のジチオスレイトール（ＤＤＴ）で１時間、３７℃で処理し、洗浄した。その後、ウェルを５０ｍＭヨードアセトアミドで１時間、３７℃で処理した。洗浄後、上述の標準的なＥＬＩＳＡを行った。
【００３９】
競合的ＥＬＩＳＡを行い、ビオチン化ｍＡｂとＲＢＤ‐Ｆｃとの結合に対するＲＢＤ特異ｍＡｂの抑制活性を決定した。簡単に説明すると、上述のようにＥＬＩＳＡプレートのウェルを１μｇ／ｍｌＲＢＤ‐Ｆｃで被膜した。５０μｇ／ｍｌ非標識ｍＡｂ及び１μｇ／ｍｌビオチン化ｍＡｂを含む混合液を添加し、３７℃で１時間温置した。ビオチン化ｍＡｂの結合は、ＨＲＰ結合ストレプトアビジン（Ｚｙｍｅｄ）及びＴＭＢを順次加え、検知した。ｍＡｂのビオチン化は、ＥＺ結合ＮＨＳ−ＰＥＯ固相ビオチン化キット｛EZ-link NHS-PEO Solid Phase Biotinylation Kit｝（Pierce, Rockford, IL）を用い、添付の手順に従い行なった。
【００４０】
〈ＳＡＲＳ偽ウイルス感染の中和〉
従来の生きたＳＡＲＳ‐ＣｏＶを用いた中和検定は面倒であり、ＢＳＬ‐３設備中で行なう必要がある。従って、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ偽ウイルス系（非特許文献27,32,42,43）を実験室で改作した。該検定は感度がよく、定量的で、ＢＳＬ‐２設備中で行うことが可能である。ＳＡＲＳ−ＣｏＶＳタンパク質を生産するＳＡＲＳ偽ウイルス、及び、レポーターとしてルシフェラーゼを発現する欠損ＨＩＶ‐１ゲノムは上述のように準備した（非特許文献27,42,43）。簡単に説明すると、２９３Ｔ細胞を、コドンを最適化したＳＡＲＳ‐ＣｏＶＳタンパク質をコードするプラスミド、及び、Ｅｎｖが欠損してルシフェラーゼを発現するＨＩＶ‐１ゲノムをコードするプラスミド（pNL4-3.luc.RE）を用い、FuGENE 6トランスフェクション試薬｛Fugene 6 reagents｝（Boehringer Mannheim）により同時形質転換した。ＳＡＲＳ偽ウイルスを含む上清を感染後４８時間培養し、ＡＣＥ２により形質転換した２９３Ｔ（２９３Ｔ／ＡＣＥ２）細胞の単一サイクル感染に用いた。簡単に説明すると、２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞を１０４細胞／ウェルで９６ウェル組織培養プレートに蒔き、一晩培養した。細胞に添加する前に、２倍に段階希釈したマウス血清又はｍＡｂを用い、３７℃で一時間偽ウイルス含有上清を前培養した。２４時間後に新しい培地を加え、更に４８時間培養した。細胞をＰＢＳで洗浄し、ルシフェラーゼキット（Promega Madison, WI）付属の溶解剤で溶解した。溶解した細胞の一定分量を９６ウェル・コースター・フラットボトム・ルミノメーター・プレート｛96 wel Coster Flat-bottom luminometer plate｝（Corning Costar, Corning, NY）に移し、ルシフェラーゼの基質（Promega）を添加した。相対発光量（ＲＬＵ）を直ちにウルトラ３８４ルミノメーター｛Ultra 384 luminomter｝（Tecan US）で決定した。
【００４１】
〈ｍＡｂによるＲＢＤ‐Ｆｃと受容体の結合抑制〉
ＲＢＤ‐ＦｃとＡＣＥ２発現細胞との結合に対するｍＡｂの抑制は、フローサイトメトリーを用いて測定した。簡単に説明すると、１０６の２９３／ＡＣＥ２細胞を剥離、回収し、ハンク平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）（Sigma, St. Louis, MO）で洗浄した。ＲＢＤ−Ｆｃを最終濃度１μｇ／ｍｌになるように、５０μｇ／ｍｌｍＡｂ存在下、又はｍＡｂ非存在下で細胞に添加し、室温で３０分温置した。細胞をＨＢＳＳで洗浄し、１：５０希釈の抗ヒトＩｇＧ‐ＦＩＴＣ接合体（Zymed）を用い室温で更に３０分培養した。洗浄後、１％ホルムアルデヒド含有ＰＢＳで固定し、ベクトン・ＦＡＣＳＣ・カリバー・血球計算器｛Becton FACSC Calibur flow cytometer｝（Mountain View, CA）でセル・クエスト・ソフトウェア｛CellQuest software｝を用い解析した。
【００４２】
ｍＡｂによる水溶性ＡＣＥ２に対するＲＢＤ‐Ｆｃの結合抑制は、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。簡単に述べると９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Corning Costar）を２μｇ／ｍｌ組換え水溶性ＡＣＥ２（R&D systems, Inc., Minneapolis, MN）を用い、０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中、４℃で一晩放置し、被覆した。２％無脂肪乳でブロッキング後、１μｇ／ｍｌＲＢＤ‐Ｆｃを５０μｇ／ｍｌマウスｍＡｂ存在下又は非存在下でウェルに添加し、３７℃で１時間温置した。洗浄後、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Zymed）を添加し、更に１時間温置した。洗浄後、基質であるＴＭＢを用い検知した。
【００４３】
［結果］
〈ＲＢＤ特異ｍＡｂの単離及び初期評価〉
ＲＢＤ‐Ｆｃ融合タンパク質を一過的に２９３Ｔ細胞で発現させ、プロテインＡを用い等質性により精製した。５匹のマウス（ＡからＥ）を、ＲＢＤ−ＦｃによりＲｉｂｉアドジュバント存在下で４回免疫化した。全ての動物は初回追加免疫後、ＲＢＤ−Ｆｃに対しかなりの抗体反応を示し、免疫化に伴い抗体力価は増加した。抗血清は三次追加免疫後４日目に採集し、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ及びＳタンパク質を生産するＳＡＲＳ偽ウイルスに対し非常に強力な中和活性を示した。
【００４４】
一群の２７つのＲＢＤ特異ｍＡｂは、ＲＢＤ‐Ｆｃ免疫化マウス由来の脾細胞及びＳｐ２／０骨髄腫細胞を融合させ、Ｓ１‐Ｃ９を抗原としてハイブリドーマを検出し、作成した。該ｍＡｂのエピトープ特異性は、ＲＢＤ‐Ｆｃ、ＤＴＴ還元型ＲＢＤ‐Ｆｃ、Ｓ１‐Ｃ９、ＤＴＴ還元型Ｓ１‐Ｃ９及び精製ヒトＩｇＧを被覆抗体として用い、ＥＬＩＳＡにより初期決定した（表１）。ほとんどのｍＡｂ（２５／２７）は、天然ＲＢＤ‐Ｆｃ及びＳ１‐Ｃ９と反応したが、ＤＴＴ還元型ＲＢＤ‐Ｆｃ及びＤＴＴ還元型Ｓ１‐Ｃ９は反応を示さなかった。これにより、該ｍＡｂは、Ｓタンパク質ＲＢＤ上に発現したジスルフィド結合依存的高次構造エピトープを認識していることが示唆された。他の２ｍＡｂ（４Ｄ５及び１７Ｈ９）は、両天然並びに還元型ＲＢＤ‐Ｆｃ及びＳ１‐Ｃ９を認識したことから、該ｍＡｂはＲＢＤ上の直鎖エピトープを認識していることが示唆された。Ｓ１‐Ｃ９により検出したｍＡｂは、いずれもヒトＩｇＧと反応しなかったが、一方、ＲＢＤ‐Ｆｃで免疫化したマウス由来の対照抗血清は、ヒトＩｇＧと反応した（表１）。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
ｍＡｂ４Ｄ５及び１７Ｈ９が還元型ＲＢＤ‐Ｆｃ及びＳ１‐Ｃ９と反応した為、該エピトープを合成ペプチドによりマップできる可能性があった。Ｓタンパク質ＲＢＤを網羅する、オーバーラップする一群の２７ペプチドを用い、ＥＬＩＳＡにより４Ｄ５及び１７Ｈ９エピトープの位置決定をした。図１に示す様に、４Ｄ５はペプチド４３５‐４５１（NYNYKYRYLRHGKLRPF）と反応し、１７Ｈ９はオーバーラップする４４２‐４５８（YLRHGKLRPFERDISNV）及び４４９‐４６５（RPFERDISNVPFSPDGK）の２ペプチドと反応した。１７Ｈ９のエピトープは、ペプチド４４２−４５８と４４９‐４６５がオーバーラップする配列（RPFERDISNV）に明確にマップされたのに対し、４Ｄ５のエピトープはペプチド４３５‐４５１のほとんどの配列を必要とした。ペプチド４３５‐４５１はペプチド４４２−４５８と４４９‐４６５の部分配列とオーバーラップする。従って、該２ｍＡｂはＲＢＤ中の隣接する直鎖エピトープを認識する。高次構造依存的ｍＡｂはどれも試験したペプチドと反応しなかった（データ示さず）。
【００４７】
〈結合競合測定法により同定されたＲＢＤ特異ｍＡｂのエピトープ特異性〉
高次構造依存的エピトープの評価をする為に、ＲＢＤ特異ｍＡｂを結合競合測定法により分類した（表２）。２７ｍＡｂ中１ｍＡｂ（１０Ｅ７）をまずビオチン化し、１０Ｅ７とＲＢＤ−Ｆｃとの結合に対する２７ｍＡｂの抑制活性を測定した。ｍＡｂ４Ｄ５及び１７Ｈ９は直鎖エピトープを認識した。該エピトープは上述ペプチドによりマップされ、該競合測定法では対照として用いられた。約半分の高次構造依存的ｍＡｂ（１３／２５）がビオチン化１０Ｅ７と競合したが、残りのｍＡｂは１０Ｅ７とＲＢＤ−Ｆｃとの結合を阻害しなかった。次に４つの非競合ｍＡｂ（１１Ｅ１２、３３Ｇ４、４５Ｂ５、及び１７Ｈ９）をビオチン化し、結合競合測定法と同様に試験した。１３ｍＡｂのうち５はビオチン化１０Ｅ７と競合し、ビオチン化４５Ｂ５とＲＢＤ−Ｆｃとの結合を阻害した為、一の群として命名した。従って、該２５高次構造依存的ｍＡｂは６の異なる競合群（ＣｏｎｆＩ‐ＶＩと命名した）に分類された。２つの直鎖エピトープ依存的ｍＡｂ（４Ｄ５及び１７Ｈ９）はいずれの高次構造特異的ｍＡｂとも競合しなかった。これらの結果により、Ｓタンパク質ＲＢＤは複数の抗原構造を持つことが示唆される。該構造は、マウスにおいて抗体特異的反応を誘発する。しかし、ＲＢＤの免疫優勢エピトープは高次構造依存的である。
【００４８】
【表２】
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【００４９】
〈受容体結合を阻害するｍＡｂの評価解析〉
ＲＢＤ−Ｆｃは２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞上に発現したＡＣＥ２及び水溶性ＡＣＥ２と効果的に結合することが可能であり、それぞれフローサイトメトリー及びＥＬＩＳＡにより測定した（データ示さず）。ＲＢＤ特異ｍＡｂがＲＢＤ−Ｆｃと細胞内又は水溶性ＡＣＥ２との結合を抑制するかを試験した。図２に示すように、ＣｏｎｆＩＶ群（２８Ｄ６、３０Ｆ９及び３５Ｂ５）及びＣｏｎｆＶ群（２４Ｆ４、３３Ｇ４及び３８Ｄ４）全てのｍＡｂは、ＲＢＤ−Ｆｃと両細胞内及び水溶性ＡＣＥ２の結合を高度に一貫した方法で完全に阻害した。ＣｏｎｆＩＩＩ群２ｍＡｂ全て（１１Ｅ１２及び１８Ｄ９）及びＣｏｎｆＶ群４ｍＡｂ中２ｍＡｂ（１９Ｂ２及び４５Ｆ６）は、ＲＢＤ−Ｆｃと２９３Ｔ／ＡＥＣ２細胞上に発現したＡＣＥ２及び水溶性ＡＣＥ２との結合を部分的に抑制した。他のｍＡｂは、直鎖配列を認識する２ｍＡｂを含み、いずれも受容体結合に対する顕著な抑制作用を示さなかった。これらの結果により、ＣｏｎｆＩＶ及びＣｏｎｆＶ群ｍＡｂはＳタンパク質の高次構造的受容体結合部位とオーバーラップするエピトープを認識することが示唆されるが、ｍＡｂ自体は、結合競合測定法において相互に競合しなかった。ＣｏｎｆＩＩＩ群ｍＡｂ及びＣｏｎｆＶＩ群２ｍＡｂ（１９Ｂ２及び４５Ｆ６）は受容体結合に関与する高次構造エピトープと結合する可能性がある。ＣｏｎｆＩ及びＣｏｎｆＩＩ群ｍＡｂはいずれも受容体結合を阻害しないことから、該ｍＡｂはＲＢＤ受容体結合部位とオーバーラップしない高次構造エピトープを認識していると示唆される。これらの結果は、ＲＢＤ特異ｍＡｂエピトープの異性を明らかにし、更にＳタンパク質ＲＢＤが複数の抗原性高次構造を有することを示唆する。
【００５０】
〈ＲＢＤ特異ｍＡｂは強力な中和活性を有する〉
各ＲＢＤ特異ｍＡｂのＳＡＲＳ偽ウイルスに対する中和活性について試験した。顕著に、ほとんどの高次構造依存的ｍＡｂ（２３／２５）は強力な中和活性を有し、５０％中和量（ＮＤ５０）は０．００５から６．５６９μｇ／ｍｌに及んだが（表３）、一方、直鎖エピトープを認識する２ｍＡｂ（４Ｄ５及び１７Ｈ９）及びＣｏｎｆＶＩ群１ｍＡｂ（４４Ｂ５）は、１００μｇ／ｍｌまでの高濃度で試したがＳＡＲＳ偽ウイルス感染を中和しなかった。ＣｏｎｆＶ群３３Ｇ４ｍＡｂ及びＣｏｎｆＩＶ群３０Ｆ９ｍＡｂは受容体結合を阻害し、偽ウイルスに対し高い中和活性を示した。興味深いことに、ＣｏｎｆＶＩ群４５Ｆ６は比較的低い偽ウイルス中和活性を有し、ＲＢＤ−ＦｃとＡＣＥ２との結合を部分的に阻害した。各群代表的なｍＡｂの用量依存的な中和活性を図３に示す。これらの結果により、Ｓタンパク質ＲＢＤは高次構造エピトープを認識する中和抗体を優位に誘起することが示唆される。
【００５１】
【表３】
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【００５２】
［実験の考察］
近年の研究により、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶのＳタンパク質は、感染中に免疫反応を誘発する主要抗原の一つであることが示されている（非特許文献44-46）。これにより、Ｓタンパク質は、中和ｍＡｂを誘起する免疫原の役割をする可能性が示唆される。本研究では、組換え融合タンパク質であるＲＢＤ‐Ｆｃをマウスを免疫化する免疫原として用い、ハイブリドーマクローンを作成し２７ｍＡｂを作成した。ほとんどのｍＡｂ（２５／２７）は高次構造エピトープを認識し、そのうち２３ｍＡｂは強力な中和活性を有した。そのうち２ｍＡｂだけは、オーバーラップするペプチドにより直鎖エピトープ近くにマップされ、ＳＡＲＳ偽ウイルスによる感染を中和できなかった。興味深いことに、高次構造依存的ｍＡｂは結合競合実験に基づき６つの異なった群に分類可能であることから（例えば、ＣｏｎｆＩ-ＶＩ）、ＲＢＤには幾つかの異なった構造エピトープが存在し、中和抗体を誘発可能であることが示唆される。
【００５３】
ＲＢＤに対する全ての中和ｍＡｂは、ＲＢＤとＡＣＥ２との相互作用を阻害することができると予想される。ＡＣＥはＳＡＲＳ‐ＣｏＶの機能的受容体である。一方、我々はＣｏｎｆＩＶ及びＶを認識するｍＡｂだけがＲＢＤとＡＣＥとの結合を効果的に阻害できることを見出した。ＣｏｎｆＩＩＩ及びＩＶと反応するｍＡｂには、部分的にＲＢＤとＡＣＥ２との間の相互作用を抑制するものがある。これにより、該エピトープはＲＢＤ上受容体結合部位とオーバーラップすること、又は該ｍＡｂとＲＢＤとの結合が受容体結合部位の高次構造的変化を引き起こす可能性が示唆され、その結果、ＲＢＤのＡＣＥ２に対する結合を抑制することが考えられる。ＣｏｎｆＩ及びＩＩを認識するｍＡｂは、ＲＢＤとＡＣＥ２との結合に対し顕著な影響は示さないが、強力な中和活性を有することから、該ｍＡｂは、ＲＢＤ‐ＡＣＥ２間の相互作用には影響せずにＳＡＲＳ‐ＣｏＶ感染を抑制することが示唆される。これらｍＡｂの機能機構は更に解明される必要がある。これらのデータにより、ＲＢＤは受容体結合部位に限らず、他の特徴的な高次構造特異的に中和抗体を誘起することから抗原の異性が示唆され、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶＳタンパク質ＲＢＤは複数の高次構造エピトープを有することが示唆され、強力な抗体中和反応を誘起することが示唆される。
【００５４】
本明細書記載のＳＡＲＳ‐ＣｏＶ中和ｍＡｂの高次構造感受性は、他のエンベロープを持つウイルスに対する中和ｍＡｂの特性と一致し、一般的には、結合に対してより天然な高次構造を必要とする（非特許文献47,48）。ＳＡＲＳ‐ＣｏＶＳタンパク質ＲＢＤは１９３アミノ酸から成る小断片であるが、７システインを持ち、そのうち５はＡＣＥ２結合に必須である。システイン間のジスルフィド結合は複雑な三次構造を形成し、複数の抗原性高次構造を構成可能である。一方、非免疫性ヒト抗体ライブラリーから選択したヒト中和ｍＡｂは、ＤＤＴ‐還元型Ｓタンパク質と反応可能で、受容体結合を阻害することができる（非特許文献49）。従って、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶＳタンパク質ＲＢＤに対する中和決定要因の同定には、更なる評価が必要とされ、これにより抗ＳＡＲＳ治療及びワクチン開発に重要な情報がもたらされる。
【００５５】
マウス免疫血清の受動移植が、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶに暴露したマウスにおいて肺ウイルスの複製を減少させたとの報告（非特許文献33,50）、並びに、中和ｍＡｂの予防注射によりマウス及びフェレットにおいて感染が予防されたとの報告（非特許文献51,52）から、抗ＳＡＲＳ抗体による受動免疫化はＳＡＲＳ制御の戦略として有用であると示唆される。従って、高量のＳＡＲＳ‐ＣｏＶ中和活性を持つｍＡｂは、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ感染の初期治療として使用可能である。一方、マウスｍＡｂのヒトへの応用は、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応（非特許文献53-55）により制限される。少量のマウスｍＡｂが短期間（１から２週間）、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ感染の初期段階で用いられた場合、重篤なＨＡＭＡは起こらない可能性があり、該緊急治療によりＳＡＲＳ患者の命を救う可能性がある。我々は同様の戦略を用い、ヒトハンターンウイルス（ＨＴＮＶ）感染の初期治療をマウス抗ＨＴＮＶｍＡｂを用いて行った（非特許文献56）。さらに、マウス中和ｍＡｂをヒト化することにより、治療又は免疫学的予防として、感染の可能性が高い集団に対し、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ感染に対する即効性の予防としても使用可能である。
【００５６】
本研究の優位性は三点ある。まず、非常に強力なＲＢＤ特異中和ｍＡｂが複数作成され、ＳＡＲＳ緊急治療の為の免疫療法として開発可能である。第二に、該ｍＡｂはＳＡＲＳ‐ＣｏＶ感染の診断用薬として開発可能である。第三に、該ｍＡｂはＳＡＲＳ‐ＣｏＶＳタンパク質の免疫性、抗原性、構造及び機能を研究するためのプローブとして使用可能である。該ｍＡｂは更にＳＡＲＳ治療及び予防のためにヒト化が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１はｍＡｂ４Ｄ５及び１７Ｈ９のエピトープマッピングを示す。このマッピングは、Ｓタンパク質のＲＢＤを含むペプチドをオーバーラップさせて行った。各々のペプチドを５μｇ／ｍｌで被覆し、１０μｇ／ｍｌのｍＡｂを用いて試験した。
【図２】図２はｍＡｂによるＲＢＤ−ＦｃとＡＣＥ２との結合抑制を示す。上パネルは、ＲＢＤ−Ｆｃと２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞で発現させた細胞内ＡＣＥ２との結合抑制を示し、フローサイトメトリーで測定した。下パネルは、ＲＢＤ−Ｆｃと水溶性ＡＣＥ２との結合抑制を示し、ＥＬＩＳＡで測定した。ＲＢＤ−Ｆｃは１μｇ／ｍｌ、ｍＡｂは５０μｇ／ｍｌを使用し、抑制率（％）は各ｍＡｂごとに計算した。
【図３】図３はｍＡｂによるＳＡＲＳ偽ウイルスの中和を示す。図中２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞におけるＳＡＲＳ偽ウイルス感染阻害を示す。阻害は、各群の代表的なｍＡｂにより行った。各ｍＡｂは２倍希釈系列により試験し、中和度（％）を計算した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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