(57)【要約】  本発明は、関節の変性抑制及び／又は抗炎症用の医薬組成物を含む、細胞外マトリックス分解を抑制するためのインビボ及びインビトロ方法、薬剤並びに化合物スクリーニングアッセイ、並びに対象で細胞外マトリックス分解が関与する疾患を治療及び／又は予防する際のその使用に関する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分解を抑制する化合物の同定方法であって；
化合物を、配列番号１０１〜１２５及び５０１〜５６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させること；及び
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分解に関係する化合物−ポリペプチド特性を測定することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記ポリペプチドがインビトロ無細胞調製物内にある、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドが哺乳動物細胞に存在する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記特性が、前記ポリペプチドに対する前記化合物の結合親和性である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記特性が、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分解の指標となる生化学的マーカーを産生する生物学的経路の活性化である、請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記指標がＭＭＰ１である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、配列番号１０１〜１２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記化合物が、市販のスクリーニングライブラリーの化合物、及び配列番号１０１〜１２５及び５０１〜５６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと結合親和性を有する化合物からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記化合物がファージディスプレイライブラリー又は抗体断片ライブラリーのペプチドである、請求項２記載の方法。
【請求項１０】
アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）からなる群から選択される細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分解を抑制する薬剤であって、配列番号１〜２５からなる群から選択される核酸配列の約１７から約３０の連続したヌクレオチドの天然ポリヌクレオチド配列と相補的であるか、又はそれから操作された核酸配列を含む、前記方法。
【請求項１１】
哺乳動物細胞のベクターが前記薬剤を発現する、請求項１０記載の薬剤。
【請求項１２】
前記ベクターがアデノウイルス、レトロウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス又はセンダイウイルスのベクターである、請求項１１記載の薬剤。
【請求項１３】
前記アンチセンスポリヌクレオチド及び前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に相補的な１７〜２５のヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号１〜２５からなる群から選択される核酸配列の１７〜２５の連続したヌクレオチドから選択される、請求項１０記載の薬剤。
【請求項１４】
前記ｓｉＲＮＡが前記センス鎖をさらに含む、請求項１３記載の薬剤。
【請求項１５】
前記センス鎖が配列番号２０１〜３２４からなる群から選択される、請求項１４記載の薬剤。
【請求項１６】
前記ｓｉＲＮＡが、前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖を接続するループ領域をさらに含む、請求項１５記載の薬剤。
【請求項１７】
前記ループ領域が、配列番号２６で規定される核酸配列を含む、請求項１６記載の薬剤。
【請求項１８】
前記薬剤が、配列番号２０１〜３２４からなる群から選択される核酸配列を含むアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム又はｓｉＲＮＡである、請求項１７記載の薬剤。
【請求項１９】
前記薬剤が、配列番号２０１〜３２４からなる群から選択される核酸配列を含むアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム又はｓｉＲＮＡである、請求項１８記載の薬剤。
【請求項２０】
治療的有効量の請求項１０記載の薬剤を、医薬として許容し得る担体との混合物として含む、ＥＣＭ分解抑制医薬組成物。
【請求項２１】
前記対象に請求項２０記載の医薬組成物を投与することを含む、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分解が関与する疾患の、その疾患に患っているか感受性の対象における治療及び／又は予防方法。
【請求項２２】
前記疾患が関節変性疾患である、請求項２２記載の方法。
【請求項２３】
前記疾患が関節リウマチである、請求項２３記載の方法。
【請求項２４】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分解が関与する疾患の治療及び／又は予防のための医薬品の製造における、請求項１０から１９記載の薬剤の使用。
【請求項２５】
前記疾患が、関節の変性疾患及び炎症性疾患からなる群から選択される、請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
前記疾患が関節リウマチである、請求項２４又は２５記載の使用。
【請求項２７】
治療的有効量の請求項１０記載のマトリックスメタロプロテイナーゼ抑制剤を投与することを含む、異常なマトリックスメタロプロテイナーゼ活性を特徴とする病態の治療方法。
【請求項２８】
ＭＭＰ１の異常な細胞発現が関与する疾患から選択される病態の治療方法であって、請求項１０記載の薬剤のマトリックスメタロプロテイナーゼを抑制する治療的有効量を投与することを含む、前記方法。
対象において細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分解に関係する病的状態又はその病態に対する感受性を診断するための方法であって、前記対象から得られる生体試料中に存在する配列番号１０１〜１２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの第１の量を測定することと、前記第１の量を健康者集団で測定されるポリペプチド量の範囲と比較することとを含み、健康者で測定した量の範囲と比較した前記生体試料中のポリペプチドの量の増加は前記病的状態の存在を示すものである方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(発明の分野)
本発明は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の分解をもたらす経路に関係するタンパク質の発現を抑制することができる化合物及び発現抑制剤の同定方法に関し、前記抑制は関節変性及びそのような分解及び／又は炎症が関与する疾患の予防及び治療に役立つ。
【背景技術】
【０００２】
細胞外マトリックスの分解が関与する疾患としては、それらには限定されないが、乾癬性関節炎、若年性関節炎、初期の関節炎、反応性関節炎、変形性関節炎、強直性脊椎炎、骨粗鬆症、腱炎及び歯周疾患のような骨格筋の疾患、癌転移、気道疾患（ＣＯＰＤ、喘息）、腎臓及び肝臓の線維症、アテローム性動脈硬化症及び心不全のような心臓血管疾患並びに神経炎及び多発性硬化症のような神経系疾患がある。主に関節の変性が関与する疾患としては、それらには限定されないが、乾癬性関節炎、若年性関節炎、初期の関節炎、反応性関節炎、変形性関節炎、強直性脊椎炎がある。
【０００３】
関節リウマチ（ＲＡ）は慢性の関節変性疾患であり、関節構造の炎症及び破壊を特徴とする。阻止されないと疾患は関節機能の喪失による実質的な障害及び疼痛を、また早死にさえもたらす。ＲＡ療法の狙いは、したがって、関節の破壊を止めるために疾患を遅らせることではなく、寛解を達成することである。疾患予後の重大度の他に、ＲＡの高い有病率（世界中で成人の約０．８％が影響を受ける）は、大きな社会経済的影響を意味する。（ＲＡに関するレビューについては、Smolen及びSteiner (2003)；Lee及びWeinblatt (2001)；Choy及びPanayi (2001)；O'Dell (2004)及びFirestein (2003)を参照する）。
【０００４】
ＲＡが自己免疫疾患であることは広く受け入れられているが、疾患の「開始段階」を作動させる正確なメカニズムに関してコンセンサスはない。知られていることは、素因のある宿主で最初の引き金がカスケード事象を媒介し、それらが様々な細胞型（Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、線維芽細胞、内皮細胞、樹状細胞その他）の活性化を導くことである。同時に、様々なサイトカインの増産が関節及び関節周囲の組織で観察される（例えばＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８その他）。疾患が進行するとき、細胞活性化及びサイトカイン産生カスケードは無際限に継続するようになる。この初期段階で、関節構造の破壊はこのような早い段階ですでに非常に明白である。患者の３０パーセントは診断時点で骨性浸食のエックス線撮影像を有し、この割合は２年後に６０パーセントまで増加する。
【０００５】
ＲＡ患者の関節の組織学的分析は、明らかにＲＡ関連の分解過程に関係するメカニズムを明示する。滑膜は細胞層であり、下内張り、及び滑膜の空洞から関節嚢を分離する内層領域から構成される。炎症を起こした滑膜は、ＲＡの病態生理学にとって重要である。正常患者及びＲＡ患者の間の滑膜の組織学的差を、図１で示す。Ａ．滑膜関節は、２つの隣接した骨末端から構成され、それぞれは軟骨層で覆われ、関節空間によって分離され、滑膜層及び関節嚢によって囲まれる。滑膜層は、滑膜細胞の薄い（１〜３細胞）層及び非常に血管の多い下内張り結合組織層からなる滑膜内層（軟骨及び骨に面する）で構成される。滑膜層は、軟骨を除いてほとんどすべての関節腔内の構造物を覆う。Ｂ．他の多くの形態の関節炎と同様に、関節リウマチ（ＲＡ）は、最初に、局所の又は浸潤した単核細胞の活性化と同様に各種の単核細胞の重要な流入を特徴とする滑膜層の炎症性反応（「滑膜炎」）を特徴とする。内膜層は過形成を生じ（＞２０細胞の厚さとなることもある）、滑膜層は拡大する。しかし、さらに、ＲＡの特質は関節の破壊である。「浸食」とも呼ばれる軟骨分解及び隣接骨の破壊の徴候が起こるにしたがって、関節空間は狭くなるか消失する。滑膜層の破壊部分は、「パンヌス」と呼ばれる。滑膜細胞によって分泌される酵素は、軟骨分解を導く。
【０００６】
この分析は、ＲＡ関連の関節分解を担う主なエフェクターはパンヌスであり、ここにおいて滑膜線維芽細胞は多様なタンパク質分解酵素を産生することから、軟骨及び骨の浸食の主要な作動因子であることを示す。進行したＲＡ患者では、パンヌスは隣接した軟骨の分解を媒介して関節空間の狭小化を導き、また、隣接した骨及び軟骨に侵入する能力を有する。骨及び軟骨の組織はそれぞれ主にコラーゲンＩ又はＩＩで構成されるので、パンヌスの破壊的及び浸潤的な特性はコラーゲン溶解性プロテアーゼ、主にマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の分泌によって媒介される。軟骨の下の骨及び隣接した骨の浸食もＲＡ過程の一部であり、主に骨及びパンヌスの境界面の破骨細胞の存在に起因する。破骨細胞は骨組織に付着して閉鎖コンパートメントを形成し、その中で破骨細胞は骨組織を分解するプロテアーゼ（カテプシンＫ、ＭＭＰ９）を分泌する。関節内の破骨細胞集団は、活性化されたＳＦ及びＴ細胞によるＮＦkＢリガンド（ＲＡＮＫＬ）の受容体活性化剤の分泌によって誘導される前駆細胞からの骨芽細胞形成によって、異常に増加する。
【０００７】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の安定性を規定する上で、各種のコラーゲンが重要な役割を果たす。コラーゲンＩ型及びコラーゲンＩＩ型は、例えば、それぞれ骨及び軟骨の主成分である。コラーゲンタンパク質は、一般的に、コラーゲン原繊維と称される多量体の構造物に組織化する。未変性のコラーゲン原繊維は、タンパク分解性の切断に非常に抵抗性である。僅かの種類のＥＣＭ分解タンパク質が未変性のコラーゲンを分解する能力を有すると報告されており、それらはマトリックスメタロプロテアーゼ類（ＭＭＰ）及びカテプシン類である。カテプシンの中では、主に破骨細胞で活性であるカテプシンＫの特徴が最も解明されている。ＭＭＰの中では、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ８、ＭＭＰ１３及びＭＭＰ１４がコラーゲン溶解性特性を有することが知られている。滑膜線維芽細胞（ＳＦ）によるＭＭＰ１の発現増加及び関節炎疾患の進行間の相互関係は立証されていて、関節浸食過程の前兆となる（Cunnaneら、2001）。したがってＲＡとの関連で、ＭＭＰ１は関連性の高いコラーゲン分解タンパク質を表す。インビトロでは、ＲＡ病理学と関連したサイトカイン（例えばＴＮＦ−α及びＩＬ１β）による培養ＳＦの処理は、これらの細胞によるＭＭＰ１の発現を増加させる（Andreakosら、2003）。したがって、ＳＦによって発現されるＭＭＰ１のレベルを監視することはインビボで軟骨分解を担う浸食性表現型へのＳＦの活性化を示すものなので、ＲＡの分野では重要な読み出し情報である。ＳＦによるＭＭＰ１発現の抑制は、ＲＡの治療のための価値ある治療手段となる。
【０００８】
ＥＣＭ分解タンパク質の活性は、ＲＡと異なる様々な疾患、例えば関節の分解と関連する他の疾患の進行の原因となるか又は相関する可能性もある。これらの疾患としては、それらには限定されないが、乾癬性関節炎、若年性関節炎、初期の関節炎、反応性関節炎、変形性関節炎、及び強直性脊椎炎がある。本発明によって同定される化合物により、本明細書で記載されているＭＭＰの発現に関係する標的を用いて治療することができる他の疾患は、骨粗鬆症、腱炎及び歯周疾患のような骨格筋の疾患（Gapskiら、2004）、癌転移（Coussensら、2002）、気道疾患（ＣＯＰＤ、喘息）（Suzukiら、2004）、肺、腎臓線維症（Schanstraら、2002）、慢性Ｃ型肝炎と関連する肝臓線維症（Reiffら、2005）、アテローム性動脈硬化症及び心不全のような心臓血管疾患（Creemersら、2001）、並びに神経炎及び多発性硬化症のような神経系疾患（Rosenberg、2002）である。そのような疾患を患っている患者は、（ＥＣＭを分解から保護することによって）ＥＣＭを安定させることから利益を受けることができる。
【０００９】
（報告された開発）
ＮＳＡＩＤ（非ステロイド系抗炎症薬剤）は、ＲＡと関連する疼痛を低減し、患者の生活の質を改善するために用いられる。しかし、これらの薬剤はＲＡ関連の関節破壊を減速させない。
コルチコステロイドはＸ線撮影で検出されたようにＲＡの進行を低減することが発見されており、ＲＡ患者の一部（３０〜６０％）を治療するために低用量で用いられる。しかし、重大な副作用が長いコルチコステロイド使用に伴う（皮膚菲薄化、骨粗鬆症、白内障、高血圧、高脂血症）。
【００１０】
合成ＤＭＡＲＤ（疾患修飾性抗リウマチ薬剤）（例えばメトトレキセート、レフルノミド（leflunomide）、スルファサラジン）は、主にＲＡの免疫炎症性成分に対処する。主な短所として、これらの薬剤は限定された効力を有するだけである（関節破壊はＤＭＡＲＤによって遅延するだけであり阻止されず、長期的には疾患が進行する）。効力の欠如は、メトトレキセートによる２４ヵ月の治療の後、平均して患者の僅か３０％がＡＣＲ５０スコアを達成するという事実が示す。このことは、米国リウマチ学会によると、患者の僅か３０％が彼らの症状の５０％の改善を成し遂げることを意味する（O'Dellら、1996）。さらに、ＤＭＡＲＤの正確な作用機構はしばしば不明である。
【００１１】
生物学的ＤＭＡＲＤ（インフリキシマブ、エタナーセプト、アダリムマブ、リツキシマブ、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）は、ＲＡ病態生理学で重要な役割を演じるサイトカイン（例えばＴＮＦ−α）又は細胞（例えばＴ細胞若しくはＢ細胞）を不活性化する、タンパク質治療薬である（Kremerら、2003；Edwardsら、2004）。ＴＮＦ−α−遮断薬（インフリキシマブ、エタナーセプト、アダリムマブ）及びメトトレキセートの併用療法は今日利用できる最も有効なＲＡ治療法であるけれども、この療法でさえ１２ヵ月の療法の後に患者の５０〜６０％で病徴の５０％の改善（ＡＣＲ５０）を達成するだけであることは、特筆すべきである（St Clairら、2004）。抗ＴＮＦ−α薬剤の有害事象の警告がいくつか存在し、この種の薬剤に関連する副作用が明らかにされている。感染症（結核）、血液学的事象及び脱髄性障害に対するリスクの増加が、ＴＮＦ−α遮断薬に関して記載されている。（Gomez-Reinoら、2003も参照）。重大な副作用の他に、ＴＮＦ−α遮断薬は生物製剤クラスの薬物治療法の一般的短所も共有するが、それらは不快な投与方法（注入部位反応を伴う頻繁な注射）及び高い生産コストである。後期開発段階のより新しい剤は、Ｔ細胞共刺激分子及びＢ細胞を標的とする。これらの薬剤の効力は、ＴＮＦ−α遮断薬のそれと類似すると予想される。様々な標的療法は類似するが限定された効力を有するという事実は、ＲＡについて複数の病原性因子があることを示唆する。このことも、ＲＡに関連する病原性事象の理解が欠乏していることを示す。
【００１２】
ＲＡの現在の療法は、限定された効力（患者の３０％で十分な療法が存在しない）のために十分でない。このことは、寛解を達成するための更なる手法を要求する。残りの疾患は進行性の関節損傷の、したがって進行性の障害のリスクを抱えているので、寛解が要求される。ＲＡ治療のために現在用いられる薬剤の主な標的である、ＲＡ疾患の免疫炎症性成分を抑制しても、この疾患の主要な特質である関節の悪化は阻止されない。
【００１３】
ＲＡ患者の関節の組織学的分析は、パンヌスを関節分解の主な犯人となる攻撃的で浸潤性の組織としてはっきりと同定する。パンヌス内では、滑膜線維芽細胞は、ＲＡ発生病理の基礎である異常に引き起こされた免疫系の開始及び最終的な関節浸食の間の関係を象徴する。現在のＲＡ療法は長期的にパンヌスの浸食活性を有効に消滅させるものではないので、パンヌスの生成及び／又は活性を抑制する新規薬剤及び／又は薬剤標的の発見は、新規ＲＡ治療法の開発のための重要な道標を意味する。
【００１４】
本発明は、ＭＭＰ１などの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分解プロテアーゼの発現をもたらす経路である種類のタンパク質が機能し、これらのタンパク質の活性の阻害剤はそのようなプロテアーゼの異常に高い発現が関与する疾患の治療に役立つという発見に基づく。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
(発明の要約)
本発明は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の分解を抑制する化合物の同定方法に関するものであり、この方法は、化合物を、配列番号１０１〜１２５（以下、「ターゲット」）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド及びその断片と、前記ポリペプチドとその化合物との結合を可能にする条件下で接触させること、及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分解に関連した化合物−ポリペプチド特性を測定することを含む。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本方法の態様としては、配列番号５０１〜５６４からなる群から選択されるものを含むターゲット及びその断片のポリペプチドを用いる化合物のインビトロアッセイ、並びに、ターゲット抑制に続いて効力の指標、例えば、ターゲット発現レベル及び／又はマトリックスメタロプロテイナーゼ１レベルを観察する細胞アッセイがある。
【００１７】
本発明は、関節リウマチのような慢性関節変性疾患の治療又は予防に役立つ、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の群から選択されるポリヌクレオチドを含む発現抑制剤、前記薬剤を含む医薬組成物にも関し、前記ポリヌクレオチドは配列番号１０１〜１２５及び５０１〜５６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする天然ポリヌクレオチド配列と相補的であるか、又はそれから操作された核酸配列を含む。
【００１８】
本発明の他の態様は、その疾患に患っているか感受性の対象において、発現抑制剤のターゲット発現を抑制するのに有効な量を含む医薬組成物を投与することによる、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の分解が関与する病態の治療方法又は予防方法である。
本発明の他の態様は、細胞外マ        トリックス（ＥＣＭ）の分解を特徴とする病状に関する診断のための、対象におけるターゲット発現レベル指標の測定を含む方法である。
【００１９】
本発明の他の態様は、炎症が関与する疾患、特に異常なマトリックスメタロプロテアーゼ活性を特徴とする疾患の治療に役立つ、治療法における本化合物の使用、医薬組成物及びそのような組成物の製造に関するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
(詳細な説明)
以下の用語はそれとともに下で提示される意味を有するものとし、本発明の記載及び対象とする範囲を理解するために役立つ。
用語「薬剤」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド及び小分子を含む任意の分子を意味する。
【００２１】
用語「アゴニスト」は、最も広い意味ではリガンドが結合する受容体を刺激するリガンドを指す。
用語「アッセイ」は、化合物の特定の特性を測定するために用いられる任意の方法を意味する。「スクリーニングアッセイ」は、化合物の集団からそれらの活性に基づいて化合物の特徴を明らかにするかそれらを選択するために用いられる方法を意味する。
用語「結合親和性」は、２つ以上の化合物が互いに非共有結合でどの程度強く結合するかを記述する特性である。結合親和性は、質的に（例えば「強い」、「弱い」、「高い」又は「低い」）、或いは量的に（例えば、ＫＤの測定）特徴付けることができる。
【００２２】
用語「担体」は、医薬組成物に媒体、嵩及び／又は使用可能な形態を提供するために医薬組成物の製剤で用いる無毒性材料を意味する。担体は賦形剤、安定剤又は水性のｐＨ緩衝溶液などのそのような材料の１つ又は複数を含むことができる。生理的に許容できる担体の例としては：リン酸、クエン酸及び他の有機酸を含む水性又は固体の緩衝成分；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子（約１０未満残基）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖、二糖及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；並びに／或いはＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などの非イオン性界面活性剤である。
【００２３】
用語「複合体」は、２つ以上の化合物が互いと結合するときに形成される実体を意味する。
用語「化合物」は、本明細書では本発明のアッセイと関連して記載される「試験化合物」又は「薬剤候補化合物」との関連で用いられる。そうしたものとして、これらの化合物は合成又は天然供給源由来の有機又は無機の化合物を含む。化合物には、無機又は有機の化合物、例えば比較的低分子量を特徴とするポリヌクレオチド、脂質又はホルモン類似体が含まれる。他のバイオポリマー有機試験化合物としては、約２から約４０のアミノ酸を含むペプチド及び約４０から約５００のアミノ酸を含むより大きなポリペプチド、例えば抗体若しくは抗体複合体がある。
【００２４】
用語「病態」又は「疾患」は、症状（すなわち病気）の明白な提示又は異常な臨床指標（例えば生化学指標）の現れを意味する。或いは、用語「疾患」は、そのような症状又は異常な臨床指標を起こす遺伝的若しくは環境的リスク又はその傾向を指す。
用語「接触」又は「接触させる」は、インビトロ系であれインビボ系であれ、少なくとも２つの部分を一緒にすることを意味する。
【００２５】
用語「ポリペプチド誘導体」は、ポリペプチドの一続きの連続したアミノ酸残基を含み、そのタンパク質の生物的活性を保持するペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質及び酵素に関し、その例としては、そのポリペプチドの天然形態のアミノ酸配列と比較してアミノ酸変異を有するポリペプチドがある。誘導体は、ポリペプチドの天然形態のアミノ酸配列と比較して別の天然の、変化させられた、グリコシル化された、アシル化された、又は非天然のアミノ酸残基をさらに含むことができる。それは、ポリペプチドの天然形態のアミノ酸配列と比較して１つ又は複数の非アミノ酸置換基を含むこともでき、その例としてはそのアミノ酸配列と共有結合又は非共有結合で結合したリポーター分子又は他のリガンドがある。
【００２６】
用語「ポリヌクレオチドの誘導体」は、ポリヌクレオチドの一続き又は核酸残基を含むＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子及びオリゴヌクレオチドに関するものであり、その例として、ポリヌクレオチド天然形態の核酸配列と比較して核酸の変異を有することができるポリヌクレオチドがある。誘導体は、ＰＮＡ、ポリシロキサン、及び２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチルホスホロチオエートなどの修飾された骨格を有する核酸、非天然の核酸残基、又は１つ又は複数の核酸置換基、例えばメチル−、チオ−、サルフェート、ベンゾイル−、フェニル−、アミノ−、プロピル−、クロロ−及びメタノカルバヌクレオシド、或いはその検出を容易にするリポーター分子をさらに含むことができる。
【００２７】
用語「ＥＣＭ分解性タンパク質」及び「ＥＣＭ分解活性」は、骨及び軟骨で見られる細胞外マトリックスを分解することが可能なタンパク質及び活性をそれぞれ指す。
用語「有効量」又は「治療的有効量」は、医師又は他の臨床医によって探求されている対象の生物学的又は医学的な反応を導き出す化合物又は剤の量を意味する。
【００２８】
用語「内因性」とは、哺乳類が自然に産生する物質を意味する。用語「プロテアーゼ」、「キナーゼ」又はＧタンパク質結合受容体（「ＧＰＣＲ」）に関して内因性とは、それが哺乳類（例えばそれには限定されないがヒト）によって自然に産生されるものを意味する。対照的に、この関係における用語非内因性は、哺乳類（例えばそれには限定されないがヒト）によって自然に産生されないものを意味する。両用語は、「インビボ」及び「インビトロ」系の両方を記載するために用いることができる。例えば、それらには限定されないが、スクリーニング手法において、内因性又は非内因性のターゲットはインビトロスクリーニング系に関することでよい。それには限定されないが他の例として、哺乳類のゲノムが非内因性のターゲットを含むように操作された場合、インビボ系による候補化合物のスクリーニングが有効である。
用語「発現可能な核酸」は、タンパク性分子をコードする核酸、ＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子を意味する。
【００２９】
用語「発現」は、トランスダクションによる内因性の発現と過剰発現をどちらも含む。
用語「発現抑制剤」は、正常に細胞内で発現する特定のポリペプチド又はタンパク質の転写、翻訳及び／又は発現に選択的に干渉するように設計されたポリヌクレオチドを意味する。より詳しくは、「発現抑制剤」は少なくとも、特定のポリペプチド又はタンパク質をコードするポリリボヌクレオチド配列中の少なくとも約１７の連続したヌクレオチドと同一であるか相補的なヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含む。例示的な発現抑制分子としては、リボザイム、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子、自己相補的一本鎖ｓｉＲＮＡ分子、遺伝子のアンチセンス構築物及び修飾された安定化骨格を有する合成ＲＮＡアンチセンス分子がある。
【００３０】
用語「発現可能な核酸」は、タンパク性分子をコードする核酸、ＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子を意味する。
用語「ポリヌクレオチド断片」は、完全な配列と実質的に類似するが必ずしも同一でない活性を示す一続きの連続した核酸残基を含むオリゴヌクレオチドに関するものである。
用語「ポリペプチド断片」は、一続きの連続したアミノ酸残基を含み、完全な配列と実質的に類似するが必ずしも同一でない機能的活性を示すペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質及び酵素に関するものである。
【００３１】
用語「ハイブリダイゼーション」は、塩基対形成を通して核酸鎖と相補鎖とを結合させる任意の方法を意味する。用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的塩基間での水素結合の形成によって、２つの核酸配列間で形成される複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は溶液中で形成することができ（例えばＣ０ｔ又はＲ０ｔ分析）、又は溶液中に存在する１つの核酸配列と固体支持体（例えば紙、膜、フィルター、チップ、ピン又はガラススライド、又は細胞若しくはそれらの核酸が固定された他のいかなる適当な基質）上で固定された他の核酸配列との間で形成することができる。用語「ストリンジェントな条件」は、ポリヌクレオチドと請求されたポリヌクレオチドとの間でのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す。ストリンジェントな条件は塩濃度、有機溶剤、例えばホルムアミドの濃度、温度及び当技術分野で公知である他の条件によって規定することができる。詳細には、塩濃度を低くするか、ホルムアミドの濃度を高くするか、ハイブリダイゼーション温度を上昇させることにより、ストリンジェンシーを増大させることができる。
【００３２】
用語「反応」との関係で用語「抑制する」又は「抑制性」は、化合物がない場合と対照的に化合物の存在下で反応が減少するか、阻止されることを意味する。
用語「抑制」は、過程の減少、ダウンレギュレーション、又はタンパク質若しくはポリペプチドの発現の消失又は最小化をもたらす、過程への刺激の除去を指す。
用語「誘導」は、タンパク質又はポリペプチドの発現をもたらす過程の誘導、アップレギュレーション又は刺激を指す。
用語「リガンド」は、内因性の天然の受容体に特異的な内因性の天然分子を意味する。
【００３３】
用語「医薬として許容し得る塩類」は、本発明の化合物の、非毒性の無機及び有機の酸付加塩、並びに塩基付加塩を指す。これらの塩類は、本発明で役立つ化合物の最終的な単離及び精製の間に、in situで調製することができる。
用語「ポリペプチド」は、タンパク質、タンパク性分子、タンパク質の分画、ペプチド、オリゴペプチド、酵素（例えばキナーゼ、プロテアーゼ、ＧＣＰＲ、その他）に関するものである。
【００３４】
用語「ポリヌクレオチド」は、一本鎖又は二本鎖の、センス又はアンチセンスの配向性のポリ核酸、ストリンジェントな条件で特定のポリ核酸にハイブリダイズする相補的なポリ核酸、及びその塩基対の少なくとも約６０パーセントで相同的なポリヌクレオチドを意味し、より好ましくはその塩基対の７０パーセント、最も好ましくは９０パーセント、特別な実施形態ではその塩基対の１００パーセントが共通するポリヌクレオチドが好ましい。ポリヌクレオチドには、ポリリボ核酸、ポリデオキシリボ核酸及びそれらの合成類似体が含まれる。それには、修飾された骨格を有する核酸、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）、ポリシロキサン及び２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチルホスホロチオエートも含まれる。ポリヌクレオチドは、長さの範囲が約１０から約５０００の塩基、好ましくは約１００から約４０００の塩基、より好ましくは約２５０から約２５００の塩基の配列によって記述される。ポリヌクレオチドの一実施形態は、長さが約１０から約３０の塩基を含む。ポリヌクレオチドの特別な実施形態は、約１０から約２２のヌクレオチドのポリリボヌクレオチド、より一般的には低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と記載されるポリリボヌクレオチドである。他の特別な実施形態は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ポリシロキサン、及び２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチルホスホロチオエートなどの修飾された骨格を有する核酸であり、又は非天然の核酸残基、又は１つ若しくは複数の核酸置換基、例えばメチル−、チオ−、サルフェート、ベンゾイル−、フェニル−、アミノ−、プロピル−、クロロ−及びメタノカルバヌクレオシド、又はその検出を容易にするリポーター分子を含む。
【００３５】
用語「ポリペプチド」は、タンパク質（例えばターゲット）、タンパク性分子、タンパク質分画、ペプチド及びオリゴペプチドに関するものである。
用語「溶媒和物」は、本発明に役立つ化合物と１つ以上の溶媒分子との物理的結合を意味する。この物理的結合には、水素結合が含まれる。ある例では、溶媒和物は、例えば１つ以上の溶媒分子が結晶質固体の結晶格子内に組み込まれた場合などに、単離が可能である。「溶媒和物」は、溶相及び単離可能な溶媒和物の両方を含む。代表的な溶媒和物としては、水和物、エタノレート及びメタノレートがある。
【００３６】
用語「対象」は、ヒト及び他の哺乳動物を含む。
用語「ターゲット」又は「ターゲット類」は、本アッセイに従ってＭＭＰ１レベルの誘導に関与していることが同定されたタンパク質を意味する。好ましいターゲットは、表１の配列番号１０１〜１２５と同定される。より好ましいターゲットは、表１で同定されるキナーゼ、プロテアーゼ及びＧタンパク質結合型受容体（ＧＰＣＲ）である。
【００３７】
「治療的有効量」は、医師又は他の臨床医によって探求されている対象の生物学的又は医学的な反応を導き出す薬剤又は医薬の量を意味する。詳細には、細胞外マトリックスの分解を特徴とする病状を治療することに関して、用語「マトリックスメタロプロテアーゼ抑制有効量」は、対象の疾患患部組織でＭＭＰ１の産生の生物学的に意味がある減少をもたらし、細胞外マトリックス分解が有意に減少するような、本発明化合物の有効量を意味するものとする。マトリックスメタロプロテアーゼ抑制特性を有する化合物、又は「マトリックスメタロプロテアーゼ抑制化合物」は、細胞に有効量を投与するとそのような細胞内でＭＭＰ−Ｉの産生の生物学的に意味がある減少を引き起こすことができる化合物を意味する。
【００３８】
用語「治療する」は、それらの障害若しくは病態の１つ又は複数の症状を含めて障害、疾患若しくは病態の発生を予防するかその病理を変更し、それによって軽減することを目的に実施する診療行為を意味する。したがって、「治療する」は治癒的な治療及び予防的若しくは防止的な処置の両方を指す。治療を要する者としては、すでにその障害を有する者、並びにその障害を予防すべき者が含まれる。用語「治療する」が上で定義されているように、本明細書で使用する関連語「治療」は、障害、症状、疾患又は病態を治療する行為を指す。
【００３９】
（細胞外マトリックス分解とのターゲット関係に基づく出願人の発明）
上記したように、本発明はターゲットポリペプチドが細胞外マトリックス分解のアップレギュレーションおよび／又は誘導における因子であるという本発明者の発見に基づく。ＥＣＭ分解タンパク質の活性は、関節の分解と関係する疾患を含め、細胞外マトリックスの分解の増加と関連する様々な疾患の原因となり、またその進行と相関すると考えられている。
【００４０】
本発明は、細胞外マトリックスの分解を抑制する薬剤候補化合物のアッセイ方法に関するものであり、化合物を配列番号１０１〜１２５及び５０１〜５６４のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、前記ポリペプチドとその化合物との結合を可能にする条件下で接触させること、及び前記ポリペプチドと前記化合物との間の複合体の形成を検出することを含む。複合体形成を測定する好ましい１手段は、前記ポリペプチドとの前記化合物の結合親和性を測定することである。
【００４１】
より詳細には、本発明は細胞外マトリックス分解を抑制する薬剤の方法同定に関し、前記方法は、
（ａ）哺乳動物細胞の集団を、ターゲットポリペプチドとの結合親和性を示す１つ又は複数の化合物と接触させることと
（ｂ）細胞外マトリックス分解に関係する化合物ポリペプチド特性を測定することと
をさらに含む。
【００４２】
上で言及した化合物ポリペプチド特性は、ターゲットの発現に関連し、当業者によって選択される測定可能な現象である。測定可能な特性は、例えば、ポリペプチドターゲットのペプチドドメイン、例えば配列番号５０１〜５６４との結合親和性でよく、又は、細胞外マトリックス分解のいくつかの生化学的マーカーレベルのいずれか１つのレベルでよい。細胞外マトリックス分解は、例えばその過程で誘導される酵素のレベル、例えばＭＭＰ及び／又はカテプシンポリペプチドの発現を測定することによって測定することができる。
【００４３】
本発明の好ましい一実施形態では、ターゲットポリペプチドは表１のリストに記載されている配列番号１０１〜１２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【表１】
2008502355.tif 000003
2008502355.tif 000004
【００４４】
当業者の選択に従い、本アッセイ方法は一連の測定として機能するように設計することができ、そのそれぞれは薬剤候補化合物が実際にポリペプチドに作用して細胞外マトリックス分解を抑制するかどうかを決定するように設計される。例えば、化合物のポリペプチド又はその断片に対する結合親和性を測定するように設計されたアッセイは、試験化合物が対象に投与されたときに細胞外マトリックス分解の抑制に役立つかどうかを確認するために必要かもしれないが十分ではない。
【００４５】
そのような結合情報は、生化学経路のさらに下の異なる特性、例えばＭＭＰ−１発現を測定するアッセイで使用するための一組の試験化合物を同定する際に役立つはずである。そのような第２のアッセイは、ポリペプチドに結合親和性を有する試験化合物が実際に細胞外マトリックス分解を抑制することを確認するように設計することができる。偽陽性の読取値でないことを保証するために、適当な対照を常に設置しなければならない。
【００４６】
これらの測定の順序は本発明の実施に重要であるとは考えられておらず、任意の順序で実行することができる。例えば、情報が知られていない一組の化合物のスクリーニングアッセイを、ポリペプチドに対するそれらの化合物の結合親和性を考慮しながら最初に実施することができる。或いは、ポリペプチドドメインに対して結合親和性を有すると同定された一組の化合物、又はそのポリペプチドの阻害剤であると同定された化合物のクラスをスクリーニングすることができる。しかし、本アッセイが薬剤候補化合物の究極の用途に意味があるようにするために、細胞外マトリックス分解活性の測定が必要である。対照及び本発明のポリペプチドへの結合親和性の測定を含むバリデーション試験は、それにもかかわらず任意の治癒的又は診断的用途で有用な化合物を同定する際に役立つ。
【００４７】
本アッセイ方法は、１つ以上のターゲットタンパク質又はその断片を用いて、インビトロで実行することができる。選択されたターゲットの例示的なタンパク質ドメイン断片のアミノ酸配列は下記の表１Ａのリストに記載された配列番号５０１〜５６４である。
【表２】
2008502355.tif 000005
2008502355.tif 000006
【００４８】
ポリペプチドターゲットを有する化合物の結合親和性は、当技術分野で公知の方法、例えば表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Biacore）、標識化合物による飽和結合分析（例えばScatchard及びLindmo分析）、示差ＵＶ分光光度計、蛍光偏光アッセイ、蛍光定量的イメージングプレートリーダー（FLIPR（商標））系、蛍光共鳴エネルギー転移及びバイオルミネセンス共鳴エネルギー転移によって測定することができる。化合物の結合親和性は、解離定数（Ｋｄ）、又はＩＣ５０若しくはＥＣ５０として表すこともできる。ＩＣ５０は、他のリガンドのポリペプチドとの結合の５０％抑制に必要な、化合物濃度を意味する。ＥＣ５０は、ターゲット機能を測定する任意のアッセイで最大効果の５０％を得るために必要な濃度を意味する。解離定数Ｋｄは、リガンドがどの程度ポリペプチドに結合するかを見るための測定手段であり、ポリペプチド上の結合部位の正確に半分を飽和させるために必要なリガンド濃度と等価である。高親和性結合を有する化合物は、低いＫｄ、ＩＣ５０及びＥＣ５０値を有し、すなわち１００ｎＭから１ｐＭの範囲である。中等度から低い親和性の結合は、高いＫｄ、ＩＣ５０及びＥＣ５０値と関連し、すなわちマイクロモル濃度の範囲である。
【００４９】
本アッセイ方法は細胞アッセイで実行することもできる。ターゲットを発現する宿主細胞としては、内因性発現を有する細胞、又は例えばトランスダクションによってターゲットを過剰発現する細胞が可能である。ポリペプチドの内因性発現が、容易に測定することができるベースラインを測定するのに十分でないときは、ターゲットを過剰発現する宿主細胞を用いることができる。過剰発現は、ターゲット基質最終産物のレベルが内因性の発現による活性レベルより高い利点を有する。したがって、現在利用できる手法を用いてそのようなレベルを測定することは、より簡単である。
【００５０】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分解を減少させる化合物を同定するための本方法の一実施形態は、ターゲットポリペプチド又はその機能的断片若しくは誘導体を発現する哺乳動物細胞の集団を培養すること、前記細胞集団でＥＣＭ分解の第１のレベルを測定すること、前記細胞集団を化合物又は化合物の混合物へ露出させること、前記細胞集団の前記化合物又は前記化合物の混合物への露出の間又は後に前記細胞集団でＥＣＭ分解の第２のレベルを測定すること、並びに、ＥＣＭ分解を減少させる化合物を同定することを含む。上記したように、ＥＣＭ分解はターゲットポリペプチド及び／又は既知のＥＣＭ分解タンパク質の発現及び／又は活性を測定することによって測定することができる。好ましい実施形態では、前記ＥＣＭ分解タンパク質はコラーゲンを分解することができ、より好ましくは、コラーゲンＩ型及び／又はコラーゲンＩＩ型を分解することができる。本発明の他の好ましい実施形態では、前記ＥＣＭ分解タンパク質はマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）であって、より好ましくはＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３及びＭＭＰ１４からなる群から選択される。これとの関係で、最も好ましいＥＣＭ分解タンパク質は、マトリックスメタロプロテアーゼ１（ＭＭＰ１）である。さらに他の好ましい実施形態では、前記ＥＣＭ分解タンパク質は、カテプシンＫである。
【００５１】
ＥＣＭ分解タンパク質の発現は、当技術分野で公知の方法、例えば特異抗体を用いるウェスタンブロット法又は特定のＥＣＭ分解タンパク質を特異的に認識する抗体を用いるＥＬＩＳＡで測定することができる。
ＥＣＭ分解タンパク質の活性は、蛍光発生性の小ペプチド基質を用いて測定することができる。しかし、これらの基質の特異性はしばしば限定される。一般に、これらの基質の使用は、他のプロテアーゼの干渉を避けるために生化学アッセイでの精製プロテアーゼの試験に限定される。
本発明者らは、培養細胞の上清などの複合媒体中のコラーゲン分解酵素の活性のハイスループット検出を可能にするプロトコルを開発した。このプロトコルは、基質として蛍光標識された未変性のコラーゲンを利用する。
【００５２】
本発明者らは、「ノックイン」ライブラリーを用いてＥＣＭ分解に関係する標的遺伝子を同定した。この種のライブラリーは、細胞内の特定の遺伝子及び対応する遺伝子産物の発現及び活性を誘導する組換えアデノウイルスによってｃＤＮＡ分子が細胞内に形質導入されるスクリーンである。ウイルスベクター内の各ｃＤＮＡは、特定の天然遺伝子に対応する。ＥＣＭ分解を刺激するｃＤＮＡを同定することによって、特定の遺伝子発現とＥＣＭ分解との間の直接的な相互関係を導くことができる。ノックインライブラリーを用いて同定したターゲット遺伝子（そのタンパク質発現産物は本明細書では「ターゲット」ポリペプチドと称す）は、次に、ＥＣＭ分解を阻止するために用いることができる化合物を同定するための本発明の方法で用いる。実際は、表３のリストに記載した配列（配列番号２０１〜３２４）を含むｓｈＲＮＡ化合物及びそれに対応するアンチセンス配列は、これらのターゲット遺伝子の発現及び／又は活性を抑制し、細胞のＥＣＭ分解活性を低減することから、ＥＣＭ分解におけるこれらのターゲット遺伝子の役割が確認される。
【表３】
2008502355.tif 000007
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【００５３】
表１で示すターゲット遺伝子は、異なる種類のポリペプチドをコードすることを理解されたい。例えば、本明細書で開示される（表１）配列番号１１４、１１７〜１１９で示すターゲットは、ＧＰＣＲである。これらのＧＰＣＲのそれぞれはエフェクタータンパク質を活性化することができ、それにより細胞内の二次伝達物質レベルの変化が生じる。ＧＰＣＲの活性は、そのような二次伝達物質の活性レベルを測定することによって測定することができる。細胞内の２つの重要で有用な二次伝達物質は、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）及びＣａ２＋である。活性レベルは当業者に公知の方法を用い、ＥＬＩＳＡ若しくは放射能技術により直接、又はＣａ２＋と接触すると蛍光又はルミネッセンスシグナルを生成する基質を用いることにより、或いはリポーター遺伝子分析によって間接に測定することができる。
【００５４】
１つ又は複数の二次伝達物質の活性レベルは、一般的にプロモーターによって調節されるリポーター遺伝子で測定することができ、このプロモーターはその二次伝達物質に反応性である。当技術分野で公知でありそのような目的のために用いられるプロモーターは、細胞内の環状ＡＭＰレベルに反応性である環状ＡＭＰ反応性プロモーター、及び細胞内の細胞質Ｃａ２＋レベルに感受性のＮＦ−ＡＴ反応性プロモーターである。リポーター遺伝子は、一般的に、容易に検出することができる遺伝子産物を有する。リポーター遺伝子は、宿主細胞内で安定して感染すること又は一過性にトランスフェクションすることができる。有用なリポーター遺伝子は、アルカリホスファターゼ、強調緑色蛍光タンパク質、不安定化緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ及びβ−ガラクトシダーゼである。
【００５５】
本明細書で開示されるターゲットの多くは、配列番号１０１〜１０８で示されるターゲットなどのキナーゼ及びホスファターゼである。化合物の存在下又は非存在下で実施される、基質のリン酸化をキナーゼ又はホスファターゼで測定することによるキナーゼ又はホスファターゼの活性を測定する特定の方法は、当技術分野で公知であり、一部は実施例で記載される。
【００５６】
配列番号１１１、１１５、１１６、１２２、１２３及び１２５で表されるターゲットは、プロテアーゼ類である。プロテアーゼであるポリペプチドによる基質の切断を測定することによる化合物による抑制を測定する特定の方法は、当技術分野で公知である。
ポリペプチドを発現する細胞は自然にポリペプチドを発現する細胞でよく、又は先に述べたように、細胞はポリペプチドを発現するようにトランスフェクションすることができることを理解されたい。
【００５７】
一実施形態では、本発明の方法は細胞の集団をポリペプチドのアゴニストと接触させる段階をさらに含むことが好ましい。このことは、ある選択された細胞集団内でのポリペプチドの発現がその活性の適当な検出にとって低過ぎる場合の方法で役立つ。アゴニストを用いるとポリペプチドを誘導することができ、化合物がポリペプチドを抑制するならば適当な読み出しを可能にする。類似の考慮事項がＥＣＭ分解の測定に適用される。好ましい一実施形態では、本方法で用いられる細胞は哺乳類の滑膜線維芽細胞であり、ＥＣＭ分解活性を誘導するために用いることができる引き金は、関節炎の分野で関連するサイトカイン、例えばＴＮＦα、ＩＬ１β、ＩＬ６、ＯＳＭ、ＩＬ１７及びＭＩＦ１αである。他の好ましい実施形態では、引き金は関節炎の分野で関連するサイトカイン産生細胞、例えば単球、マクロファージ、Ｔ細胞及びＢ細胞を接触させることによって生成する因子の混合物である。サイトカイン産生細胞は、因子の複合体及び偏らない混合物を産生することによって接触に応答する。用いられるサイトカイン産生細胞がパンヌスでも見られ、この引き金に適用されるサイトカインが関節リウマチ患者の滑液で見られるならば、最終的に産生される因子混合物は関節炎患者の関節に存在する因子の一部を含む。
【００５８】
本発明は、さらに、細胞外マトリックス分解を抑制する化合物の方法同定に関し：
（ａ）化合物を、配列番号１０１〜１２５及び５０１〜５６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させることと；
（ｂ）ポリペプチドへの化合物の結合親和性を測定することと；
（ｃ）前記ポリペプチドを発現する哺乳動物細胞の集団を少なくとも１０マイクロモルの結合親和性を示す化合物と接触させることと；
（ｄ）細胞外マトリックス分解を抑制する化合物を同定することを含む。
【００５９】
細胞集団は、異なる手段を通して、例えば媒体内での直接インキュベーションによって又は細胞内への核酸移動によって、化合物又は化合物の混合物に露出させることができる。そのような移動は多種多様な手段により、例えば裸の単離されたＤＮＡ若しくはＲＮＡの直接的トランスフェクションにより、又は組換えベクターなどの送達系によって達成することができる。リポソーム又は他の脂質ベースのベクターなどの他の送達手段を用いることもできる。好ましくは、核酸化合物は、組換えウイルスなどの（組換え）ベクターによって送達される。
【００６０】
ハイスループット目的のためには、抗体断片ライブラリー、ペプチドファージディスプレイライブラリー、ペプチドライブラリー（例えばLOPAP（商標）、Sigma Aldrich）、脂質ライブラリー（BioMol）、合成化合物ライブラリー（例えばLOPAC（商標）、Sigma  Aldrich）、又は天然化合物ライブラリー（Specs、TimTec）などの化合物ライブラリーを用いることができる。
【００６１】
好ましい薬剤候補化合物は、低分子量化合物である。低分子量化合物、すなわち５００ダルトン以下の分子量のものは、生物系で優れた吸収性及び浸透性を有し、したがって５００ダルトンを超える分子量を有する化合物よりも候補薬として成功する可能性が高い（Lipinskiら(1997)）。ペプチドには、他の好ましいクラスの薬剤候補化合物が含まれる。多くのＧＰＣＲは、アゴニスト又はアンタゴニストとしてペプチドを有する。ペプチドは優れた候補薬であることができ、生殖ホルモン及び血小板凝集阻害薬など、商業的に価値あるペプチドの複数の例がある。天然化合物は、他の好ましいクラスの薬剤候補化合物である。そのような化合物は天然供給源で見られまたそれらから抽出され、それらはその後合成することができる。脂質は、他の好ましいクラスの薬剤候補化合物である。多くのＧＰＣＲは、リガンドとして脂質を有する。
【００６２】
他の好ましいクラスの薬剤候補化合物は抗体である。本発明は、ターゲットを対象とした抗体も提供する。これらの抗体は細胞中で内因的に産生されてターゲットと結合することができるか、組織に加えて細胞外に存在するターゲットポリペプチドと結合することができる。これらの抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体でよい。本発明は、キメラ、単鎖及びヒト化の抗体、さらにはまた、ＦＡｂフラグメント、ＦＡｂ発現ライブラリーの生成物、並びにＦｖフラグメント及びＦｖ発現ライブラリーの生成物を含む。他の実施形態では、化合物は天然の単一ドメイン抗体の最も小さな機能的断片であるナノ体でよい（Cortez-Retamozoら2004）。
【００６３】
ある実施形態では、本発明の実施においてポリクローナル抗体を用いることができる。当業者は、ポリクローナル抗体を調製する方法を知っている。ポリクローナル抗体は哺乳動物で、例えば免疫化剤、及び所望によりアジュバントの１つ又は複数の注射によって作製することができる。一般的に、免疫化剤及び／又はアジュバントは、哺乳類では皮下又は腹腔内の複数の注射によって注入される。抗体は、無傷のターゲットタンパク質若しくはポリペプチドに対して、又はターゲットタンパク質若しくはポリペプチドの断片、コンジュゲート体を含む誘導体、若しくは他のエピトープに対して、例えば細胞膜中に包埋されたターゲット、又はファージディスプレイライブラリーなどの抗体可変部のライブラリーに対して作製することもできる。
【００６４】
免疫化する哺乳動物で免疫原性であることが知られているタンパク質に免疫化剤をコンジュゲートすることは、役立つ可能性がある。そのような免疫原性タンパク質の例としては、それらには限定されないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシのサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターがある。使用することができるアジュバントの例としては、フロインド完全アジュバント及びＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（一リン酸化リピドＡ、合成トレハロースジコリノミコレート）がある。当業者は、過度の実験をしなくても免疫化プロトコルを選択することができる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体でよい。モノクローナル抗体は、当業界周知の方法によって調製することができる。本発明のモノクローナル抗体は、宿主が抗体に対して免疫応答を起こすことを予防するために「ヒト化」されたものでよい。「ヒト化抗体」は、軽鎖及び／又は重鎖可変ドメインフレームワークの相補性決定部（ＣＤＲ）及び／又は他の部分はヒト以外の免疫グロブリンに由来するが、分子の残りの部分は１つ又は複数のヒト免疫グロブリンに由来するものである。ヒト化抗体には、供与体又は受容体の非修飾軽鎖又はキメラ軽鎖と結合したヒト化重鎖、又はその逆を特徴とする抗体も含まれる。抗体のヒト化は、当技術分野で公知の方法によって達成することができる（例えば、Mark及びPadlan、(1994)「第４章。モノクローナル抗体のヒト化」、The Handbook of Experimental Pharmacology Vol. 113, Springer-Verlag, New York、を参照）。ヒト化抗体を発現するために、トランスジェニック動物を用いることができる。
【００６６】
ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含めて当技術分野で公知の様々な手法を用いて産生することもできる（Hoogenboom及びWinter、(1991) J. Mol. Biol. 227:381-8；Marksら、(1991) J. Mol. Biol. 222:581-97）。Coleら及びBoernerらの手法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用できる（Coleら、(1985)「モノクローナル抗体及び癌療法」Alan R. Liss,p. 77；Boernerら、(1991) J. Immunol., 147(1): 86-95）。
【００６７】
単鎖抗体の産生のための当技術分野で公知の手法は、本発明のターゲットポリペプチド及びタンパク質に対する単鎖抗体を産生するために応用することができる。抗体は、一価抗体でよい。一価抗体の調製法は当技術分野で公知である。例えば、１つの方法は、免疫グロブリン軽鎖及び修飾された重鎖の組換え発現を含む。重鎖は、重鎖架橋性を阻止するために、一般にＦｃ部の任意の点でトランケーションされる。或いは、架橋性を阻止するために関連するシステイン残基が他のアミノ酸残基で置換されるか削除される。
【００６８】
二重特異性抗体は少なくとも２つの異なる抗原に対して、好ましくは細胞表面タンパク質又は受容体又は受容体サブユニットに対して結合特異性を有する、モノクローナルの、好ましくはヒトの又はヒト化の抗体である。この場合は、結合特異性の１つはターゲットの１ドメインに対するものであり、他の１つは、同じか異なるターゲットの他のドメインに対するものである。
【００６９】
二重特異性抗体の作製法は当技術分野で公知である。従来法では、二重特異性抗体の組換え産生は２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の共発現に基づき、２つの重鎖は異なる特異性を有する（Milstein及びCuello、(1983) Nature 305:537-9）。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな組合せのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０の異なる抗体分子の潜在的混合物を産生するが、僅か１つだけが正しい二重特異性構造を有する。アフィニティークロマトグラフィ段階は、通常、正しい分子の精製を達成する。類似した手法は、Trauneekerら、(1991) EMBO J. 10:3655-9、で開示される。
【００７０】
他の好ましい実施形態によると、ターゲットへの結合親和性を有すると同定され、且つ／又は１つ又は複数のターゲットに対するアンタゴニスト活性などのダウンレギュレーション活性を有するとすでに同定された薬剤候補化合物を、アッセイ方法は用いる。
【００７１】
さらに、本発明は細胞外マトリックス分解を抑制するための、哺乳動物細胞を、配列番号１〜２５からなる群から選択されたヌクレオチド配列の少なくとも約１７〜約３０の連続したヌクレオチドと相補するポリリボヌクレオチド配列を含む発現抑制剤と接触させることを含む方法に関する。
【００７２】
本発明の他の態様は、哺乳動物細胞を、ターゲットポリペプチドをコードするポリリボヌクレオチドの細胞内での翻訳を抑制する発現抑制剤と接触させることを含む、細胞外マトリックス分解の抑制方法に関するものである。特定の実施形態は、剤をターゲットｍＲＮＡと対合してそれによってターゲットポリペプチドの発現をダウンレギュレート又は阻止する働きをする少なくとも１つのアンチセンス鎖を含むポリヌクレオチドを含む組成物に関するものである。抑制剤は好ましくはアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含み、前記薬剤は配列番号１〜２５からなる群から選択される天然ポリヌクレオチド配列と相補的であるかそれから操作される核酸配列を含む。
【００７３】
本発明の特別な実施形態は、発現抑制剤がアンチセンスＲＮＡ、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、配列番号１〜２５をコードするポリリボヌクレオチドを切断するリボザイム、配列番号１〜２５に対応するポリリボヌクレオチドの一部に十分に相同的であり、その結果そのｓｉＲＮＡ、好ましくはｓｈＲＮＡがターゲットポリペプチドへのターゲットポリリボヌクレオチドの翻訳に干渉する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、好ましくはｓｈＲＮＡ）からなる群から選択される方法に関するものである。
【００７４】
本発明の他の実施形態は、発現抑制剤がアンチセンスＲＮＡ、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、配列番号１〜２５によってコードされるポリリボヌクレオチドを切断するリボザイム、配列番号１〜２５に対応するポリリボヌクレオチドの一部に十分に相同的であり、その結果そのｓｉＲＮＡ、好ましくはｓｈＲＮＡがターゲットポリペプチドへのターゲットポリリボヌクレオチドの翻訳に干渉する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、好ましくはｓｈＲＮＡ）を発現する核酸である方法に関するものである。好ましくは、発現抑制剤はアンチセンスＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、又はｓｉＲＮＡ、好ましくはｓｈＲＮＡであり、配列番号１〜２５からなる群から選択されたヌクレオチド配列の少なくとも約１７から約３０の連続したヌクレオチドと相補するポリリボヌクレオチド配列を含む。より好ましくは、発現抑制剤はアンチセンスＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、又はｓｉＲＮＡ、好ましくはｓｈＲＮＡであり、配列番号１〜２５からなる群から選択されたヌクレオチド配列の少なくとも約１７から約２５の連続したヌクレオチドと相補するポリリボヌクレオチド配列を含む。特別な実施形態は、配列番号２０１〜３２４からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列と相補するポリリボヌクレオチド配列を含む。
【００７５】
アンチセンス核酸を用いる遺伝子発現のダウンレギュレーションは、翻訳又は転写のレベルで達成することができる。本発明のアンチセンス核酸は、好ましくはターゲットポリペプチド又は対応するメッセンジャーＲＮＡをコードする核酸の全部又は一部と特異的にハイブリダイズすることができる核酸断片である。さらに、その転写一次産物のスプライシングを抑制することによってターゲットポリペプチドをコードすることができる核酸配列の発現を減少させる、アンチセンス核酸を設計することができる。それがターゲットをコードする核酸の発現をダウンレギュレートするか阻止することができる限り、任意の長さのアンチセンス配列が本発明の実施のために適当である。好ましくは、アンチセンス配列は長さが少なくとも約１７ヌクレオチドである。アンチセンス核酸、アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡの調製及び使用、並びにオリゴ及び遺伝子アンチセンスの使用は当技術分野で公知である。
【００７６】
発現抑制剤の一実施形態は、配列番号１〜２５を含む核酸にアンチセンスである核酸である。例えば、アンチセンス核酸（例えばＤＮＡ）は、配列番号１〜２５を含む核酸の細胞内発現を抑制するための遺伝子治療として、インビトロで細胞に導入することができるか、又は対象にインビボ投与することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは好ましくは、約１７から約１００のヌクレオチドを含む配列を含み、より好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは約１８から約３０のヌクレオチドを含む。アンチセンス核酸は、逆向きで表される配列番号１〜２５の配列から選択される約１７から約３０の連続したヌクレオチドから調製することができる。
【００７７】
アンチセンス核酸は好ましくはオリゴヌクレオチドであり、デオキシリボヌクレオチドのみ、修飾されたデオキシリボヌクレオチドのみ又は両者の組合せからなり得る。アンチセンス核酸は、合成オリゴヌクレオチドでよい。安定性及び／又は選択性を改善するために、オリゴヌクレオチドは所望により化学的に修飾することができる。オリゴヌクレオチドは細胞内ヌクレアーゼによる分解に感受性であるので、修飾としては、例えば、ホスホジエステル結合の遊離酸素を置換する硫黄基の使用があり得る。この修飾は、ホスホロチオエート結合と呼ばれる。ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、水溶性で、ポリ陰イオン性で、内因性のヌクレアーゼに抵抗性である。さらに、ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドがそのターゲット部位にハイブリダイズするとき、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖は、ハイブリッド分子のｍＲＮＡ成分を切断する内因性の酵素リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）Ｈを活性化する。
【００７８】
さらに、ホスホラミダイト及びポリアミド（ペプチド）とのアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合は、合成することができる。これらの分子は、ヌクレアーゼ分解に非常に抵抗性でなければならない。さらに、安定性を強化してターゲット部位へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合を促進するために、化学基を糖部分の２’炭素及びピリミジンの５炭素（Ｃ−５）に加えることができる。修飾としては、２’−デオキシ、Ｏ−ペントキシ、Ｏ−プロポキシ、Ｏ−メトキシ、フルオロ、メトキシエトキシホスホロチオエート、修飾塩基、並びに当業者に公知の他の修飾があり得る。
【００７９】
ターゲットのレベルを低減する他の種類の発現抑制剤は、リボザイムである。リボザイムは、別々の触媒及び基質の結合ドメインを有する触媒性ＲＮＡ分子（ＲＮＡ酵素）である。基質結合配列はヌクレオチド相補性により、また恐らく非水素結合相互作用により、そのターゲット配列と結合する。触媒部分は、特定の部位でターゲットＲＮＡを切断する。リボザイムの基質ドメインは、それを指定されたｍＲＮＡ配列に向けるように工作することができる。リボザイムは、相補的な塩基対形成を通してターゲットｍＲＮＡを認識して、次に結合する。一旦それが正しいターゲット部位に結合するならば、リボザイムは酵素的にターゲットｍＲＮＡを切断する働きをする。リボザイムによるｍＲＮＡの切断は、対応するポリペプチドの合成を指示するその能力を無効にする。一旦リボザイムがそのターゲット配列を切断したならば、それは放出されて、他のｍＲＮＡで繰り返し結合及び切断することができる。
【００８０】
リボザイム形態には、ハンマーヘッドモチーフ、ヘアピンモチーフ、デルタ型肝炎ウイルス、Ｉ群イントロン若しくはリボヌクレアーゼＰ  ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列と結合）モチーフ又はNeurospora VS RNAモチーフがある。これらの触媒ＲＮＡ分子は細胞中で真核生物のプロモーターから発現させることができるので、ハンマーヘッド又はヘアピン構造を有するリボザイムは容易に調製される（Chenら、(1992) Nucleic Acids Res. 20:4581-9）。本発明のリボザイムは、真核細胞で適当なＤＮＡベクターから発現させることができる。所望により、リボザイムの活性は、第２のリボザイムによる転写一次産物からのその放出によって高めることができる（Venturaら(1993) Nucleic Acids Res. 21: 3249-55）。
【００８１】
リボザイムは、オリゴデオキシリボ核酸を、転写後にターゲットｍＲＮＡにハイブリダイズする配列に連なるリボザイム触媒ドメイン（２０ヌクレオチド）と結合することによって、化学的に合成することができる。オリゴデオキシリボ核酸は、基質結合配列をプライマーとして用いることにより増幅される。増幅生成物は、真核生物の発現ベクターにクローン化される。
【００８２】
リボザイムは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はウイルスのベクターに挿入された転写単位から発現される。リボザイム配列の転写は、真核生物のＲＮＡポリメラーゼＩ（ポルＩ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ポルＩＩ）又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ポルＩＩＩ）のプロモーターから始動される。ポルＩＩ又はポルＩＩＩプロモーターからの転写産物は、全ての細胞で高レベルで発現される。与えられた細胞型内の与えられたポルＩＩプロモーターのレベルは、近くの遺伝子調節配列によって決まる。原核生物のＲＮＡポリメラーゼ酵素が適当な細胞で発現されるならば、原核生物のＲＮＡポリメラーゼプロモーターも用いられる（Gao及びHuang、(1993) Nucleic Acids Res. 21: 2867-72）。これらのプロモーターから発現されるリボザイムは、哺乳動物細胞で機能することが証明された（Kashani-Sabetら(1992) Antisense Res. Dev. 2: 3-15）。
【００８３】
特に好ましい抑制剤は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、好ましくは小さなヘアピンＲＮＡ、「ｓｈＲＮＡ」）である。ｓｉＲＮＡ、好ましくはｓｈＲＮＡは、抑制されたＲＮＡに配列が相同的である二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって、遺伝子抑制の転写後過程を媒介する。本発明によるｓｉＲＮＡは、配列番号１〜２５で記載される配列の群、好ましくは配列番号２０１〜３２４で記載される配列の群から選択される連続した１７〜２５のヌクレオチド配列と相補的又は相同な１７〜２５のヌクレオチドのセンス鎖、並びにこのセンス鎖に相補的な１７〜２５のヌクレオチドのアンチセンス鎖を含む。最も好ましいｓｉＲＮＡは、互いに１００パーセント相補的なセンス鎖及びアンチセンス鎖、及びターゲットポリヌクレオチド配列を含む。好ましくは、ｓｉＲＮＡはセンス鎖及びアンチセンス鎖を結合するループ領域をさらに含む。
【００８４】
本発明による自己相補一本鎖ｓｈＲＮＡ分子ポリヌクレオチドは、ループ領域リンカーによって接続されたセンス部分及びアンチセンス部分を含む。好ましくは、ループ領域配列は、長さが４〜３０ヌクレオチド、より好ましくは長さが５〜１５ヌクレオチド、最も好ましくは長さが８ヌクレオチドである。最も好ましい実施形態では、リンカー配列はＵＵＧＣＵＡＵＡ（配列番号２６、図１６を参照）である。自己相補的一本鎖ｓｉＲＮＡはヘアピンループを形成して、普通のｄｓＲＮＡよりも安定である。さらに、それらはベクターからより容易に産生される
【００８５】
アンチセンスＲＮＡに類似して、ｓｉＲＮＡは核酸溶解性分解に対する抵抗性を保証するために、又は活性を強化するために、又は細胞分布を強化するために、又は細胞取り込みを強化するために修飾することができ、そのような修飾は修飾されたヌクレオシド間結合、修飾された核酸塩基、修飾された糖及び／又は１つ又は複数の部分若しくはコンジュゲート体へのｓｉＲＮＡ化学結合からなる。ｓｉＲＮＡ設計規則に適合しないヌクレオチド配列と比較してターゲット配列の減少が改善されたヌクレオチド配列が、これらのｓｉＲＮＡ設計規則に従って選択される（これらの規則及びｓｉＲＮＡ調製例の議論については、国際公開2004094636、２００４年１１月４日公表、及びUA20030198627が本明細書で参照により組み込まれている）。
【００８６】
本発明は、細胞外マトリックス分解を抑制することができるポリヌクレオチドを発現することができるＤＮＡ発現ベクターを含み、本明細書で先に発現抑制剤として記載されている組成物及び前記組成物を用いる方法にも関する。
【００８７】
これらの組成物及び方法の具体的な態様は、ターゲットポリペプチドと選択的に相互作用することができる細胞内結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの誘導された発現による、ターゲットポリペプチドの発現のダウンレギュレーション又は阻止に関する。細胞内結合タンパク質には、それが発現される細胞内のポリペプチドと選択的に相互作用又は結合して、ポリペプチドの機能を中和することができる任意のタンパク質が含まれる。好ましくは、細胞内結合タンパク質は、配列番号１０１〜１２５のターゲットポリペプチドのエピトープに、好ましくは配列番号５０１〜５６４のドメインに結合親和性を有する中和抗体又は中和抗体の断片である。より好ましくは、細胞内結合タンパク質は単鎖抗体である。
【００８８】
この組成物の具体的な実施形態は、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、配列番号１０１〜１２５をコードするポリリボヌクレオチドを切断するリボザイム、配列番号１〜２５に対応するポリリボヌクレオチドの一部に十分に相同的であり、その結果そのｓｉＲＮＡがターゲットポリペプチドへのターゲットポリリボヌクレオチドの翻訳に干渉する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）からなる群から選択される発現抑制剤を含む。
【００８９】
発現抑制剤を発現するポリヌクレオチドは、好ましくはベクター内に含まれる。ポリ核酸は核酸配列の発現を可能にするシグナルに作動可能的に結合されて、好ましくは組換えベクター構築物を利用して細胞内に導入され、この構築物は一旦ベクターが細胞に導入されるとアンチセンス核酸を発現する。様々なウイルスベースの系が利用でき、それらにはアデノウイルス、レトロウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス又はセンダイウイルスのベクター系が含まれ、全てはターゲット細胞内に発現抑制剤のポリヌクレオチド配列を導入して発現するために用いることができる。
【００９０】
好ましくは、本発明の方法で用いられるウイルスベクターは、複製に欠陥がある。そのような複製不完全なベクターは、感染細胞内でのウイルスの複製のために必要な少なくとも１つの領域を通常含む。これらの領域は、当業者に公知の任意の手法によって除去する（全体若しくは一部）か、又は機能不全にすることができる。これらの手法には、全除去、置換、部分欠失又は必須の（複製のために）領域への１つ又は複数の塩基の付加が含まれる。そのような手法はインビトロ（単離されたＤＮＡ上で）又はin situで遺伝子操作手法を用いて、又は突然変異誘発物質での処理により実施することができる。好ましくは、複製欠陥ウイルスはそのゲノムのウイルス粒子の封入に必要な配列を保持する。
【００９１】
好ましい一実施形態では、ウイルス要素はアデノウイルスに由来する。好ましくは、媒体はアデノウイルスカプシドに封入されたアデノウイルスベクター、その機能性部分、誘導体及び／又は類似体を含む。アデノウイルスの生物学的特徴は、分子レベルで比較的よく知られている。アデノウイルスベクターのための多くのツールがすでに開発され、これからも開発が継続されるので、アデノウイルスカプシドは本発明のライブラリーに組み込むための好ましい媒体となる。アデノウイルスは、多種多様な細胞に感染することができる。しかし、アデノウイルス血清型が異なると、細胞に対する好みも異なる。好ましい一実施形態で本発明のアデノウイルスカプシドが入ることができるターゲット細胞集団を組み合わせて拡張するために、媒体は少なくとも２つのアデノウイルスからのアデノウイルス繊維タンパク質を含む。好ましいアデノウイルス繊維タンパク質配列は、血清型１７、４５及び５１である。これらのキメラベクターの手法又は構築及び発現は米国公表特許出願20030180258及び20040071660で開示され、これらは本明細書で参照によって組み込まれる。
【００９２】
好ましい一実施形態では、アデノウイルスに由来する核酸としては、アデノウイルス後期タンパク質、その機能部分、誘導体及び／又は類似体をコードする核酸がある。アデノウイルス後期タンパク質、例えばアデノウイルス繊維タンパク質は、好ましくはある細胞を媒体の標的にするために、又は媒体の細胞への送達増を誘導するために用いることができる。好ましくは、アデノウイルスに由来する核酸は基本的に全てのアデノウイルス後期タンパク質をコードし、アデノウイルスカプシド全体又はその機能部分、類似体及び／又は誘導体の形成を可能にする。好ましくは、アデノウイルスに由来する核酸としては、アデノウイルスＥ２Ａ、又はその機能部分、誘導体及び／又は類似体をコードする核酸がある。好ましくは、アデノウイルスに由来する核酸としては、少なくとも１つのＥ４領域タンパク質又はその機能部分、誘導体及び／又は類似体をコードする核酸があり、それらは少なくとも部分的に、細胞内でのアデノウイルス由来核酸の複製を促進する。この用途の実施例で用いられるアデノウイルスベクターは、本発明の治療方法に役立つベクターの例である。
【００９３】
本発明のある実施形態では、レトロウイルス系を用いる。レトロウイルスは分裂細胞に感染する組み込み型ウイルスであり、それらの構築は当技術分野で公知である。レトロウイルスベクターは異なる種類のレトロウイルスから、例えばＭｏＭｕＬＶ（「マウスモロニー白血病ウイルス」）、ＭＳＶ（「マウスモロニー肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「ハーベイ肉腫ウイルス」）；ＳＮＶ（「脾臓壊死ウイルス」）；ＲＳＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）及びフレンドウイルスから構築することができる。レンチウイルス系も本発明の実施において用いることができる。レトロウイルス系及びヘルペスウイルス系は、神経細胞のトランスフェクションのための好ましい媒体である。
【００９４】
本発明の他の実施形態では、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）が利用される。ＡＡＶウイルスは、安定して部位特異的に感染細胞のゲノムに組み込む、比較的小さな大きさのＤＮＡウイルスである。それらは、細胞成長、形態及び分化に対するどんな影響をも誘導することなく広範囲の細胞に感染することができ、しかも、それらはヒトに病原性ではないようである。
【００９５】
ベクターの構築において、本発明のポリヌクレオチド剤は、１つ又は複数の調節領域に結合することができる。１つ又は複数の適当な調節領域の選択は、当業者の技術レベルの範囲で解決できる日常の問題である。調節領域はプロモーターを含み、エンハンサー、サプレッサー、その他を含むことができる。
【００９６】
本発明の発現ベクターで用いることができるプロモーターは、構成プロモーター及び調節された（誘導可能な）プロモーターの両方を含む。プロモーターは、宿主によっては原核生物性又は真核生物性でよい。本発明の実施に役立つ原核生物の（バクテリオファージを含む）プロモーターには、ｌａｃ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ラムダＰ．ｓｕｂ．ｒ、Ｐ．ｓｕｂ．ｌ及びｔｒｐプロモーターがある。本発明の実施に役立つ真核生物（ウイルスのものを含む）プロモーターとしては以下のものがある。遍在性のプロモーター（例えば、ＨＰＲＴ、ビメンチン、アクチン、チューブリン）、中間フィラメントプロモーター（例えばデスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰ）、治療的遺伝子プロモーター（例えばＭＤＲ型、ＣＦＴＲ、第ＶＩＩＩ因子）、組織特異プロモーター（例えば平滑筋細胞のアクチンプロモーター、又は内皮細胞で活性なＦｌｔ及びＦｌｋプロモーター）、例えば動物転写調節領域であり、これらは組織特異性を示し、トランスジェニック動物で利用されている：膵臓腺房細胞で活性なエラスターゼＩ遺伝子調節領域（Swiftら(1984) Cell 38:639-46；Ornitzら(1986) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409；MacDonald(1987) Hepatology 7:425-515）；膵臓β細胞で活性なインシュリン遺伝子調節領域（Hanahan(1985) Nature 315:115-22）、リンパ系細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子調節領域（Grosschedlら(1984) Cell 38:647-58；Adamesら(1985) Nature 318:533-8；Alexanderら(1987) Mol. Cell. Biol. 7:1436-44）、精巣、乳腺、リンパ細胞及び肥満細胞で活性なマウス乳癌ウイルス調節領域（Lederら(1986) Cell 45:485-95）、肝臓で活性なアルブミン遺伝子調節領域（Pinkertら(1987) Genes and Devel. 1:268-76）、肝臓で活性なアルファフェトプロテイン遺伝子調節領域（Krumlaufら(1985) Mol. Cell. Biol., 5:1639-48；Hammerら(1987) Science 235:53-8）、肝臓で活性なα１抗トリプシン遺伝子調節領域（Kelseyら(1987) Genes and Devel., 1: 161-71）、骨髄性細胞で活性なβ−グロビン遺伝子調節領域（Mogramら(1985) Nature 315:338-40；Kolliasら(1986) Cell 46:89-94）、脳の乏突起神経膠細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（Readheadら(1987) Cell 48:703-12）、骨格筋で活性なミオシン軽鎖２遺伝子調節領域（Sani (1985) Nature 314.283-6）、並びに視床下部で活性な性腺刺激ホルモン放出因子遺伝子調節領域（Masonら(1986) Science 234:1372-8）。
【００９７】
本発明の実施において用いることができる他のプロモーターとしては、分裂細胞で優先して活性化されるプロモーター、刺激に応答するプロモーター（例えばステロイドホルモン受容体、レチン酸受容体）、テトラサイクリン調節転写モジュレータ、前初期のサイトメガロウイルス、レトロウイルスＬＴＲ、メタロチオネイン、ＳＶ４０、Ｅｌａ及びＭＬＰプロモーターがある。
【００９８】
更なるベクター系としては、患者へのポリヌクレオチド剤の導入を促進する非ウイルス性の系がある。例えば、所望の配列をコードするＤＮＡベクターは、インビボでリポフェクションによって導入することができる。リポソーム媒介トランスフェクションで遭遇する問題点を制限するように設計された合成陽イオン脂質は、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製するために用いることができる（Felgnerら(1987) Proc. Natl. Acad Sci. USA 84:7413-7)；Mackeyら(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8027-31；Ulmerら(1993) Science 259:1745-8を参照）。陽イオン脂質の使用は、負に荷電した核酸の被包性を促進し、そのうえ負に荷電した細胞膜との融合を促進することができる（Felgner及びRingold、(1989) Nature 337:387-8）。核酸移動に特に役立つ脂質化合物及び組成物は、国際特許公開95/18863、国際公開96/17823、及び米国特許第5459127号で記載されている。インビボで外来性の遺伝子を特定の臓器に導入するためのリポフェクションの使用は、一定の実用上の利点を有し、特定の細胞型にトランスフェクションを導入することは、細胞異質性の組織、例えば膵臓、肝臓、腎臓及び脳で特に有利である。脂質は、ターゲティング目的のために他の分子と化学的に結合することができる。ホルモン類若しくは神経伝達物質などの標的のペプチド、及び抗体などタンパク質、又は非ペプチド分子は、化学的にリポソームに結合することができた。他の分子も、インビボでの核酸のトランスフェクションを促進するために有用であり、例としては陽イオンオリゴペプチド（例えば国際特許公開95/21931）、ＤＮＡ結合タンパク質に由来するペプチド（例えば国際特許公開96/25508）、又は陽イオンポリマー（例えば国際特許公開95/21931）がある。
【００９９】
裸のＤＮＡプラスミドとしてインビボでＤＮＡベクターを導入することも可能である（米国特許第5693622号、第5589466号及び第5580859号を参照）。治療目的のための裸のＤＮＡベクターは、当技術分野で公知の方法、例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用、又はＤＮＡベクタートランスポータの使用などで、所望の宿主細胞に導入することができる（例えば、Wilsonら(1992) J. Biol. Chem. 267:963-7；Wu及びWu、(1988) J. Biol. Chem. 263:14621-4；Hartmutら、１９９０年３月１５日に出願のカナダ特許出願2012311；Williamsら(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726-30参照）。受容体媒介ＤＮＡ送達手法を用いることができる（Curielら(1992) Hum. Gene Ther. 3:147-54；Wu及びWu、(1987) J. Biol. Chem. 262:4429-32）。
【０１００】
本発明は、本明細書で先に記載したようにターゲット阻害剤及び／又は発現抑制剤として同定された１つ又は複数の化合物の有効量を含む、生体適合性の細胞外マトリックス分解抑制組成物も提供する。
【０１０１】
生体適合性組成物は、本発明の化合物、ポリヌクレオチド、ベクター及び抗体が活性型で、例えば生物的活性を発揮することが可能な形態で維持されている、固体、液体、ゲル、又は他の形態であることができる組成物である。例えば、本発明の化合物はターゲットに対する逆作動薬、すなわちアンタゴニスト活性を有し、核酸は複製すること、メッセージを解釈すること、又はターゲットの相補的なｍＲＮＡにハイブリダイズすることができ、ベクターは、本明細書で先に記載されているように、ターゲット細胞をトランスフェクションすること、及びアンチセンス、抗体、リボザイム又はｓｉＲＮＡを発現することができ、抗体は、ターゲットポリペプチドドメインと結合する。
【０１０２】
好ましい生体適合性組成物は、例えば、トリス、リン酸又はＨＥＰＥＳ緩衝液を用いて緩衝される、塩イオンを含む水溶液である。通常、塩イオンの濃度は生理的レベルと類似する。生体適合性溶液は、安定化剤及び保存料を含むことができる。より好ましい実施形態において、生体適合性組成物は医薬として許容し得る組成物である。そのような組成物は、局所、経口、腸管外、鼻腔内、皮下及び眼内の各経路による投与のために製剤化することができる。非経口的投与は、静脈内注射、筋肉内注射、動脈内注射又は注入手法を含むものとする。組成物は、所望により標準で公知の非毒性の生理的に許容される担体、アジュバント及び媒体を含む投薬単位製剤で、非経口的に投与することができる。
【０１０３】
本組成物発明の特に好ましい実施形態は、本明細書で先に記載されている発現抑制剤の治療的有効量を医薬として許容し得る担体と混合して含む、細胞外マトリックス分解抑制医薬組成物である。他の好ましい実施形態は、ＥＣＭ分解に関係する病態又はその病態に対する感受性の治療又は予防のための医薬組成物であり、ターゲットアンタゴニスト又は逆作動薬、その医薬として許容し得る塩、水和物、溶媒和物又はそのプロドラッグの細胞外マトリックス分解抑制有効量を、医薬として許容し得る担体との混合物として含む。
【０１０４】
経口投与のための医薬組成物は、当技術分野で公知の医薬として許容し得る担体を経口投与に適当な投薬量で用いて製剤化することができる。そのような担体は、医薬組成物が患者による摂取のために錠剤、丸剤、糖衣丸、カプセル、液体、ゲル、シロップ剤、スラリー、懸濁液、などとして製剤化されるのを可能にする。経口用の医薬組成物は、活性化合物を固体賦形剤と組み合わせ、生じる混合物を任意選択に粉砕し、錠剤又は糖衣丸コアを得るために所望により適当な補助剤を加えた後に顆粒剤の混合物を加工することによって調製することができる。適当な賦形剤は、炭水化物又はタンパク質の充填剤、例えばラクトース、ショ糖、マンニトール又はソルビトールを含む糖類、トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモ又は他の植物からの澱粉、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はナトリウムカルボキシメチルセルロースなどのセルロース、アラビアゴム及びトラガカンタゴムを含むゴム、及びゼラチン及びコラーゲンなどのタンパク質である。所望により、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はその塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤又は可溶化剤を加えることができる。糖衣丸コアは適当なコーティングとともに用いることができ、例としてはアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポルゲル、ポリエチレングリコール及び／又は二酸化チタンを含むこともできる濃縮糖液、ラッカー溶液並びに適当な有機溶媒又は溶媒混合物がある。色素又は顔料を製品識別のために、又は活性化合物の量、すなわち投薬量を明らかにするために、錠剤又は糖衣丸コーティングに加えることができる。
【０１０５】
経口的に用いることができる医薬用製剤としては、ゼラチンで作られた押込嵌めカプセル、並びにゼラチン及び、グリセリン又はソルビトールなどのコーティングで作られた柔らかく、密封されたカプセルがある。押込嵌めカプセルは、ラクトース若しくは澱粉などの充填剤又は結合剤、タルク若しくはステアリン酸マグネシウムなどの滑剤、及び任意選択に安定剤と混合した有効成分を含むことができる。軟カプセルでは、活性化合物を、安定剤の有無にかかわらず、適当な液体、例えば脂肪油、液体、液体ポリエチレングリコールの中に溶かすか懸濁することができる。
【０１０６】
好ましい無菌の注射製剤は、無毒性の非経口的に許容できる、溶媒又は希釈液の溶液又は懸濁液でよい。医薬として許容し得る担体の例は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、等張性生理食塩水（例えばリン酸一ナトリウム若しくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウム若しくはマグネシウム、又はそのような塩類の混合物）、リンガー液、ブドウ糖、水、滅菌水、グリセリン、エタノール、及びそれらの組合せである。１，３−ブタンジオール及び無菌の不揮発性油は、溶媒又は懸濁媒体として便利に使用される。いかなる低刺激性の不揮発性油も使用することができ、例としては合成のモノグリセリド又はジグリセリドがある。さらに、オレイン酸などの脂肪酸も、注射剤の調製で使用することができる。
【０１０７】
組成物媒体はヒドロゲルでもよく、それは任意の生体適合性又は非細胞傷害性のホモポリマー又はヘテロポリマー、例えば薬剤吸収スポンジの働きをする親水ポリアクリル酸ポリマーから調製される。それらのあるものは、例えば特にエチレン及び／又はプロピレンオキシドから得られるものは市販されている。ヒドロゲルは、例えば外科的インターベンションの間に、治療する組織の表面へ直接置くことができる。
【０１０８】
本発明の医薬組成物の実施形態は、本発明のポリヌクレオチド抑制剤をコードする複製欠陥組換えウイルスベクター、及びポロキサマー（poloxamer）などのトランスフェクションエンハンサーを含む。ポロキサマーの例はPoloxamer４０７であり、それは市販（ＢＡＳＦ、Parsippany、N.J.）されている無毒性、生体適合性のポリオールである。組換えウイルスを含浸させたポロキサマーは、例えば外科的診療行為の間に、治療する組織の表面へ直接置くことができる。ポロキサマーは基本的にヒドロゲルと同じ利点を有するが、粘度は低い。
【０１０９】
活性発現抑制剤は、コロイド薬剤送達系（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョンにおいて、例えば界面重合により調製したマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタシレート）マイクロカプセルに封入することもできる。そのような手法は、Remington's Pharmaceutical Sciences (1980)、第１６版、Osol, A.編、で開示されている。
【０１１０】
徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の適当な例としては、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスがあり、そのマトリックスは造形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形状である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル類、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、若しくはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第3773919号）、Ｌ−グルタミン酸及びγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なマイクロスフェア）などの分解可能な乳酸グリコール酸コポリマー、並びにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸がある。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸グリコール酸などのポリマーは１００日以上の分子の放出を可能にするが、あるヒドロゲルはより短い期間、タンパク質を放出する。カプセル化抗体が長い間体内に残るときは、それらは３７℃の湿気に曝露する結果変性又は凝集を起こし、結果として生物的活性の消失及び免疫原性の変化の可能性をもたらす。関係するメカニズムに応じて、安定化のために合理的な手法を考案することができる。例えば、凝集メカニズムがチオジスルフィド相互変換を通しての分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが判明した場合、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、適当な添加剤を用いて含水量を制御し、特定のポリマーマトリックス組成物を開発することにより安定化を達成することができる。
【０１１１】
上で定義されたように、治療有効量はタンパク質、ポリヌクレオチド、ペプチド又はその抗体、アゴニスト若しくはアンタゴニストの、症状又は病態を改善する量を意味する。そのような化合物の治療効力及び毒性は、細胞培養又は実験動物で標準的な薬学手法、例えばＥＤ５０（集団の５０％で治療効果の見られる用量）及びＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）で測定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比を治療指数といい、ＬＤ５０／ＥＤ５０で表される。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒトで使用される用量の範囲を処方するために使用される。そのような化合物の投薬量は、好ましくはほとんど毒性がなく、ＥＤ５０を含む循環濃度範囲内にある。投薬量は、使用される剤形、患者の感受性及び投与経路に従ってこの範囲内で変動する。
【０１１２】
任意の化合物について、最初に、細胞培養アッセイで、又は動物モデルで、通常はマウス、ウサギ、イヌ若しくはブタで、治療有効量を推定することができる。動物モデルは、望ましい濃度域及び投与経路に到達するためにも用いられる。そのような情報は、次にヒトで役立つ用量及び投与経路を決定するために用いることができる。正確な投薬量は、治療される患者を考慮して個々の医師によって選択される。用量及び用法は、活性部分の十分なレベルを提供するために、又は所望の効果を維持するために調節される。考慮することができる更なる要素としては、患者の疾病状態の重症度、年齢、体重及び性別、食事、所望の治療期間、投与方法、投与の時間及び頻度、併用薬、反応感度並びに治療に対する寛容性／反応がある。長時間作用の医薬組成物は、特定の製剤の半減期及びクリアランス速度次第で３〜４日ごとに、毎週、又は２週間に１回投与してもよい。
【０１１３】
本発明による医薬組成物は、様々な方法によって対象に投与することができる。それらは標的組織に直接加えることができ、陽イオン脂質との複合体を形成することができ、リポソーム中に封入することができ、又は当技術分野で公知の他の方法によって標的細胞に送達することができる。所望の組織への局所投与は、直接注入、経皮吸収、カテーテル、注入ポンプ又はステントによって実施することができる。ＤＮＡ、ＤＮＡ／媒体複合体、又は組換えウイルス粒子は、治療部位に局所的に投与される。代替の送達経路としては、それらには限定されないが、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、エアゾール吸入、経口用（錠剤若しくは丸剤）、局所、全身、目、腹腔内及び／又はクモ膜下の送達がある。リボザイム送達及び投与の例は、Sullivanら国際公開94/02595で提供されている。
【０１１４】
本発明による抗体は、ボーラスとしてだけ送達すること、経時的に注入すること、又はボーラスとしての投与及び経時的注入の両方が可能である。当業者は、タンパク質のものとは異なる製剤をポリヌクレオチドのために使用することができる。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの送達は、特定の細胞、病態、部位、その他に特異的である。
【０１１５】
本明細書で先に議論されたように、本発明に役立つポリヌクレオチド剤をコードするＤＮＡを導入するために、組換えウイルスを用いることができる。本発明による組換えウイルスは、通常、約１０４から約１０１４のｐｆｕの用量の形で製剤化及び投与される。ＡＡＶ及びアデノウイルスの場合、約１０６から約１０１１のｐｆｕの用量を用いるのが好ましい。用語ｐｆｕ（「プラーク形成単位」）は、ビリオン懸濁液の感染力に対応して、適当な細胞培養を感染させて形成されるプラーク数を測定することで決定される。ウイルス溶液のｐｆｕ力価を測定するための手法は、先行技術で十分記載されている。
【０１１６】
本発明は、細胞外マトリックス分解を抑制するための、細胞外マトリックス分解に関係する病状を患っている対象に対して、本明細書で記載した細胞外マトリックス分解抑制医薬組成物を、好ましくは本発明の発現抑制剤の治療的有効量を投与することを含む方法も提供する。細胞外マトリックスの分解が関与する疾患としては、乾癬性関節炎、若年性関節炎、初期の関節炎、反応性関節炎、変形性関節炎、強直性脊椎炎、骨粗鬆症、腱炎及び歯周疾患のような骨格筋の疾患、癌転移、気道疾患（ＣＯＰＤ、喘息）、腎臓及び肝臓の線維症、アテローム性動脈硬化症及び心不全のような心臓血管疾患並びに神経炎及び多発性硬化症のような神経系疾患がある。本発明に従う治療のためのより好ましい疾患は、乾癬性関節炎、若年性関節炎、初期の関節炎、反応性関節炎、変形性関節炎、強直性脊椎炎などの変形性関節疾患である。本方法に従う治療について最も好ましい変形性関節疾患は、関節リウマチである。
【０１１７】
本発明の発現抑制剤の対象患者への投与は、自己投与及び他の人による投与を含む。患者は既存の疾患又は医学的な状態のために治療が必要であることもあり、骨代謝の障害に影響される疾患及び医学的な状態のリスクを予防又は低減するために、予防的処置が必要かもしれない。本発明の発現抑制剤は、対象患者に対して経口、経皮、吸入、注射、経鼻、経直腸、又は徐放性製剤により送達することができる。
【０１１８】
本方法の好ましい療法は、炎症を特徴とする病状を患う対象に対して、その患者で異常なレベルの細胞外マトリックス分解を減少させ、好ましくは前記分解を担う無際限に継続する過程を終了させるのに十分な時間、本発明の発現抑制剤の有効抑制量を投与することを含む。本方法の特別な実施形態は、関節リウマチを患うかその発症に感受性の対象に対して、前記患者の関節でコラーゲン及び骨分解をそれぞれ低減又は予防し、好ましくは前記分解を担う自己永続的過程を終了させるのに十分な時間、本発明の発現抑制剤の有効なマトリックスメタロプロテアーゼ抑制量を投与することを含む。
本発明は、細胞外マトリックス分解が関与する疾患を治療又は予防するための医薬品の調製のための先に述べた剤の使用にも関する。
好ましくは、病的状態は関節炎である。より好ましくは、その病的状態は関節リウマチである。
【０１１９】
本明細書で記載される本発明の実施で役立つポリペプチド及びポリヌクレオチドは、溶液中で遊離状態でも、固体支持体に固定されても、細胞表面で運ばれても、細胞内に置かれてもよい。本方法を実施するために、ターゲットポリペプチド又は化合物を固定してそのポリペプチドの非複合形態から複合体の分離を促進し、且つアッセイをオートメーション化することが可能である。化合物とのターゲットポリペプチドの相互作用（例えば、結合）は、反応体を収納するのに適当な任意の容器内で達成することができる。そのような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管及び微量遠心管がある。一実施形態では、ポリペプチドのマトリックスへの結合を可能にするドメインを加える、融合タンパク質を提供することができる。例えば、ターゲットポリペプチドは「Ｈｉｓ」タグを付け、次にＮｉ−ＮＴＡマイクロタイタープレート上へ吸着させることができ、又は、ターゲットポリペプチドとのＰｒｏｔＡ融合をＩｇＧに吸着させ、それを次に細胞溶解物（例えば、（３５）ｓ標識）及び候補化合物と組み合わせ、混合物は複合体形成に好都合な条件下（例えば、生理的条件の塩及びｐＨ）でインキュベートする。インキュベーションに続いて、プレートを洗浄して未結合の標識があれば除去し、マトリックスを固定化する。放射能の量は直接、又は複合体の解離後に上清で測定することができる。或いは、複合体をマトリックスから解離してＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ターゲットタンパク質へのタンパク質結合のレベルを標準の電気泳動手法を用いてゲルから定量化することができる。
【０１２０】
マトリックス上のタンパク質の固定化のための他の手法も、化合物の同定方法で用いることができる。例えば、ターゲット又は化合物は、ビオチン及びストレプトアビジンのコンジュゲーションを利用して固定化することができる。ビオチン化ターゲットタンパク質分子は、当技術分野で公知の技術（例えばビオチン化キット、Pierce Chemicals、Rockford、Ill.）を用いてビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製して、ストレプトアビジンでコーティングされた９６穴プレート（Pierce Chemical）のウェル内に固定化することができる。或いは、ターゲットと反応性であるがターゲットと化合物との結合を干渉しない抗体をプレートのウェルに誘導することができ、ターゲットは抗体コンジュゲーションによってウェルに捕捉することができる。先に述べたように、標識候補化合物の調製物はターゲットを提示するプレートのウェル内でインキュベートされ、ウェルに捕捉された複合体の量は定量することができる。
【０１２１】
ターゲットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１〜２５と同定される。出願人は、発現可能な形でのこれらのポリヌクレオチドによる哺乳動物細胞のトランスフェクションは細胞外マトリックス分解を促進する因子の放出を増加させることを明らかにした。
本発明は、ＥＣＭ分解に関係する病的状態の診断のための、対象のゲノムＤＮＡ中の配列番号１〜２５の遺伝子の少なくとも１つの核酸配列を決定すること、その配列をデータベース及び／又は健康者から得られる核酸配列と比較すること、及び病的状態の開始に関するいかなる差をも同定すること、とを含む方法にも関する。
【０１２２】
本発明の他の態様は、対象で細胞外マトリックス分解を伴う病的状態又はその病態への感受性を診断するための方法であって、生体試料中の配列番号１０１〜１２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの量を測定することと、その量を健康対象におけるそのポリペプチドの量と比較することとを含む方法に関し、このとき、健康対象と比較してのポリペプチド量の増加はその病的状態の存在の指標となる。
本発明は、以下の図及び実施例でさらに記述される。
【実施例】
【０１２３】
整列させたアデノウイルスライブラリー（その作製及び使用は、国際公開99/64582に記載される）と組み合わせて用いると、以下のアッセイは軟骨の主成分であるコラーゲンを分解する滑膜の線維芽細胞（ＳＦ）の能力を調整する因子の発見に役立つ。候補因子は最初は一次アッセイで、続いて二次アッセイで篩にかけられる。実施例１は、マトリックスメタロプロテアーゼ１（ＭＭＰ１）のタンパク質レベルの検出のためにＥＬＩＳＡを用いるアデノウイルスｃＤＮＡライブラリーの一次アッセイスクリーニングの開発及び設定を記載し、本明細書で「ＭＭＰ１アッセイ」と称する。実施例２は、該一次アッセイスクリーニング及びその結果を記載する。実施例３及び４は、より機能中心的で、ＳＦの上清中でコラーゲン分解を検出し、本明細書では「コラーゲン分解アッセイ」と称する二次アッセイを記載する。実施例５は、ＳＦにおける因子の内因性発現の試験を記載する。この方法は、様々なＲＡに由来するＳＦ（ＲＡＳＦ）のヒットの「発現プロファイリング」と称される。実施例６は、サイトカイン誘導性のＳＦ  ＭＭＰ１発現に及ぼす様々な遺伝子活性の低下の影響を記載し、それによりＲＡＳＦのコラーゲン溶解活性を決定する。
【０１２４】
（用いた対照ウイルス）
これらの試験において用いた対照ウイルスを、下で列記する。国際公開99/64582で記載されているように、ｄＥ１／ｄＥ２Ａアデノウイルスは、ＰＥＲ．Ｅ２Ａパッケージング細胞内のヘルパープラスミドｐＷＥＡｄ５ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲ．ｄＥ２Ａの同時トランスフェクションによってこれらのアダプタープラスミドから生成される。
【０１２５】
（Ａ）陰性対照ウイルス：
Ａｄ５−ＬａｃＺ：  国際公開02/070744でｐＩＰｓｐＡｄＡｐｔ６−ｌａｃＺと記載される。
Ａｄ５−ＡＬＰＰ：  １．９ｋｂインサートは、ｐＧＴ６５−ＰＬＡＰ（Invitrogen）からＮｓｉＩによる消化によって単離され、平滑末端化され、ＥｃｏＲＩで消化され、ＥｃｏＲＩ及びＨｐａＩで消化されたｐＩＰｓｐＡｄＡｐｔ６へクローン化される。
Ａｄ５−ｅＧＦＰ：  国際公開02/070744でｐＩＰｓｐＡｄＡｐｔ６−ＥＧＦＰと記載される。
Ａｄ５−ｅＧＦＰ＿ＫＤ：  標的配列：  ＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣ（配列番号４０１）。国際公開03/020931で記載されているようにＳａｐＩ部位を用いてベクターへクローン化され、ウイルスが生成される。
Ａｄ５−ルシフェラーゼ＿ＫＤ＿ｖ１３：  標的配列：  ＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣ（配列番号４０２）。国際公開03/020931で記載されているようにＳａｐＩ部位を用いてベクターへクローン化され、ウイルスが生成される。
Ａｄ５−Ｍ６ＰＲ＿ＫＤ＿ｖ１：  標的配列：  ＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣ。国際公開03/020931で記載されているようにＳａｐＩ部位を用いてベクターへクローン化され、ウイルスが生成される。
【０１２６】
（Ｂ）陽性対照ウイルス：
Ａｄ５−ＲＥＬＡ：  ＲＥＬＡをコードするｃＤＮＡは、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーでの以下のプライマーを用いたＰＣＲで得られる：
上流側：  ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＡＣＴＧＴ（配列番号４０３）及び
下流側：  ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＣＡＧＧＣＧＴＣＡＣＣＣＣＣＴＴＡＧ（配列番号４０４）。
１６８１ｂｐのＤＮＡインサートが生成され、その５’配列はＮＭ＿０２１９７５に対応する。プライマーは、ＰＣＲ生成物がＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩクローニングによってｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６ベクターに挿入できるように設計される。
【０１２７】
Ａｄ５−ＭＭＰ１：  ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６プラスミドにクローン化されたＭＭＰ１をコードするｃＤＮＡは、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（国際公開02/070744を参照）から、古典的なフィルターコロニーハイブリダイゼーション手法によって単離する。ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーは細菌に形質転換されて、寒天プレート上へプレーティングされる。何千もの個々のコロニーを選択して（Q-pix装置（Genetix）を用いる）、寒天プレート上で再整列させる。細菌を成長させた後、これらのプレートをハイブリダイゼーションフィルター上へオーバーレイする。これらのフィルターを対象に、ＭＭＰ１特異的プローブによる古典的なハイブリダイゼーション法を実施する。このプローブは、以下のプライマーを用いて胎盤ｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲによって得られる：
上流側：  ＧＴＴＣＴＧＧＧＧＴＧＴＧＧＴＧＴＣＴＣＡＣＡＧＣ（配列番号４０５）、及び
下流側：  ＣＡＡＡＣＴＧＡＧＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＡＣＴＣＣ（配列番号４０６）。
ハイブリダイゼーション後のフィルター上の陽性シグナル点のそれに対応する位置の細菌コロニーを選択して、プラスミド調製のために用いる。５’配列の検証は、インサートの５’配列はＮＭ＿００２４２１に対応することを確認する。
【０１２８】
Ａｄ５−ＴＲＡＦ６：  ＴＲＡＦ６をコードするｃＤＮＡは、ＭＭＰ１で記載したものと同じコロニーハイブリダイゼーション手法によって単離される。このＴＲＡＦ６特異的プローブは、以下のプライマーを用いて胎盤ｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲによって得られる：
上流側：  ＣＣＡＧＴＣＴＧＡＡＡＧＴＧＡＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＧ（配列番号４０７）、及び
下流側：  ＣＡＡＣＴＧＧＡＣＡＴＴＴＧＴＧＡＣＣＴＧＣＡＴＣＣ（配列番号４０８）。
ハイブリダイゼーション後のフィルター上の陽性シグナル点のそれに対応する位置の細菌コロニーを選択して、プラスミド調製のために用いる。５’配列の検証は、インサートの５’配列はＮＭ＿００４６２０．２に対応することを確認する。
【０１２９】
Ａｄ５−ＭＭＰ１３：  ＭＭＰ１３のｃＤＮＡは、ヒト滑膜の線維芽細胞からのｃＤＮＡ調製物から、ＰＣＲによって単離される。１４９８ｂｐのＰＣＲ生成物を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩクローン化手法を用いてｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６へクローン化する。配列検証は、インサートがＮＭ＿００２４２７の塩基対１８〜１４９７に対応することを確認する。
【０１３０】
Ａｄ５−ＭＹＤ８８：  このｃＤＮＡは、ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６に構築されたヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーから単離される。ＭＹＤ８８の発現を媒介するウイルスは、Galapagos Genomicsで実施されたゲノムスクリーンの１つにおけるヒットとして同定される。インサートの配列検証は、インサートがＮＭ＿００２４６８の塩基対４０〜９３０に対応することを確認する。
【０１３１】
Ａｄ５ＴＮＦＲＩＡ：  このウイルスは、ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６に構築されたヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーから単離される。ＭＹＤ８８の発現を媒介するウイルスは、Galapagos Genomicsで実施されたゲノムスクリーンの１つにおけるヒットとして同定される。１．４ｋｂインサートの５’配列の検証は、インサートがＮＭ＿００１０６５の塩基対９５８から始まることを示す。国際公開03/020931で記載されているようにウイルスが生成される。
【０１３２】
Ａｄ５−ＭＭＰ１＿ＫＤ＿ｖ１０：  標的配列：  ＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣ（配列番号４０９）。国際公開03/020931で記載されているようにＳａｐＩ部位を用いてベクターへクローン化され、ウイルスが生成される。
【０１３３】
（実施例１：ＭＭＰアッセイの開発）
マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）は様々な生理的役割を有し、例えば、それらは他のプロテアーゼ、成長因子の成熟、及び細胞外マトリックス成分の分解に関係する。ＭＭＰ１はＭＭＰファミリーのメンバーであって、骨及び軟骨の主成分である未変性のコラーゲンを分解することができる。滑膜線維芽細胞（ＳＦ）によるＭＭＰ１の発現増加は関節炎疾患の進行の診断指標であり、関節浸食過程の前兆となる（Cunnaneら、2001）。ＭＭＰ１のＳＦによる発現は、サイトカインＴＮＦ−α及びＩＬ１βなどの関節リウマチに関連した引き金によるＳＦの活性化によって増加し得る（Andreakosら、2003）。活性化されたＳＦによって生じるＭＭＰ１レベルの測定はＲＡとの関連で大いに意義があり、その理由はこの事象がパンヌスで見られるような浸食性表現型へ向けたＳＦの活性化レベルを反映するからである。活性化されたＳＦにおける候補標的タンパク質の発現の減少がこれらの細胞内でのＭＭＰ１発現の減少を導くならば、その標的はＭＭＰ１発現の調節に関与することが示され、したがってＲＡの治療のための治療的手法の開発に適切と考えられる。そのような標的タンパク質の同定は、さらに「Ａｄ−ｃＤＮＡ」と称される、ｃＤＮＡライブラリーの発現を媒介する組換えアデノウイルスの集団のスクリーニングを含む。本明細書で用いられる集団は、さらに「アデノウイルスｃＤＮＡライブラリー」又は「FlexSelect集団」（国際公開99/64582を参照）と称される。
【０１３４】
ＭＭＰ１アッセイは、最初に滑膜線維芽細胞（ＳＦ）のＭＭＰ１を産生する能力を試験することによって開発される。
Ａ．ＭＭＰ１を産生するＳＦの能力を評価するために、ＴＲＡＦ６及びＭＹＤ８８の発現を媒介する一組のアデノウイルス、ＩＬ１β経路のアダプター分子、並びにＭＭＰ１発現を増加させると予想される免疫及び炎症性反応に関係する因子の発現を増加することが公知のＮＦκＢ転写因子のサブユニットであるｐ６５／ＲｅｌＡが、ＳＦを感染させるために用いられる（Vincenti及びBrinckerhoff、2002、を参照）。
【０１３５】
６穴プレートの１ウェルにつき４０，０００のＳＦをＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに接種して、細胞あたり７５００のウイルス粒子（ｖｐ／細胞）の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。ＳＦによるＭＭＰ１の発現を、先ずリアルタイムの定量ＰＣＲによってｍＲＮＡレベルで測定する。対照ウイルスに感染した細胞のＲＮＡは、メーカーの説明書に従ってＳＶ  ＲＮＡ単離キット（Promega）を用いて感染の４８時間後に調製する。ｃＤＮＡは、Multiscribe逆転写酵素（５０U/μl、Applied Biosystems）及びランダム六量体を用いてこのＲＮＡから調製する。ｃＤＮＡ合成を、１×ＴａｑＭａｎ緩衝液Ａ（ＰＥ Applied Biosystems）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５００ｍＭ総ｄＮＴＰ、２．５ｍＭランダム六量体、０．４Ｕ／μｌ  ＲＮアーゼ阻害剤、及び１．２５Ｕ／μｌ  MultiScribe逆転写酵素から成る２５μｌの総容積で実施する。混合物を、２５℃で１０分、４８℃で３０分及び９５℃で５分間、インキュベートする。特定のＤＮＡ生成物を、結果として生じるｃＤＮＡから、適したプライマー対を用いて４０ＰＣＲサイクルの間、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（pplied Biosystems）で増幅する。特定のＤＮＡ生成物の増幅は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７０００配列検出システム上で監視する。以降のリアルタイムＰＣＲ反応では、１×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎミックス（pplied Biosystems）、３００ｎＭ順方向プライマー及び３００ｎＭ逆方向プライマーからなる２５μｌの総容積中に、５μｌのＲＴ反応生成物が含まれた。各試料は、２反復で分析する。ＰＣＲ反応を以下のプログラムを用いて実施する：９５℃で１０分間に続いて、９５℃で１５秒、６０℃で１分のサイクルを４０サイクル。各ＰＣＲ反応の後、９５℃で１５秒間及び６０℃で１５秒間インキュベートし、続いて２０分間９５℃に温度を上昇させ、最後は９５℃で１５秒間にすることによって解離曲線を測定することによって生成物を分析する。ＭＭＰ１、１８Ｓ及びβ−アクチンの発現の検出のために用いられるプライマー対の配列は、表２で列記する。
【０１３６】
【表４】
2008502355.tif 000012
【０１３７】
ＭＭＰ１はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ法を用いて検出されるが、ＰＣＲ反応のための内部較正物質として使用される１８Ｓ  ｒＲＮＡのレベルは、Taqmanプローブ（TaqMan（登録商標）リボソームＲＮＡ調節試薬、Applied Biosystems）を用いて測定される。増幅グラフ、及び生じる閾値Ｃｔ値は、試料中に存在する特定のｍＲＮＡの量の指標である。δ−δＣｔ値が提示され、これはＡｄ５−ｅＧＦＰに感染した対照試料における発現レベルと比較して、陽性対照ウイルスに感染した試料におけるＭＭＰ１  ｍＲＮＡの標準化された（１８Ｓ較正物質と比較して）レベルを意味する。結果は、感染していないかＡｄ５−ｅＧＦＰに感染したＳＦと比較して、ＳＦにおけるｐ６５／ＲｅｌＡ、ＴＲＡＦ６又はＭＹＤ８８の発現によるＭＭＰ１  ｍＲＮＡレベルの強いアップレギュレーションを示す。
【０１３８】
ＳＦによって発現されたＭＭＰ１のレベルは、ウェスタンブロット法によってタンパク質レベルでも測定される。感染の２日後に、リアルタイムＰＣＲ実験のために示した様々な組換えアデノウイルスに感染した細胞の上清を収集して、古典的なＴＣＡ沈殿によって１５倍に濃縮する。上清の１５μｌは、１０％ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析する。これらの実験のために用いる培地は、Ｍ１９９培地＋１％ＦＢＳである。ＭＭＰ１対照試料のために、Ａｄ５−ＭＭＰ１に感染した細胞の濃縮されない上清をゲルへ添加する。解析されたタンパク質を、ニトロセルロース膜上に移す。移動物の品質及び試料の均等の添加は、膜のPonceau-S染色で検査する。一次抗体としてヤギ抗ＭＭＰ１ポリクローナル抗体（R&D Systems、１／５００希釈溶液）及び二次抗体としてＨＲＰ結合ウサギ抗ヤギ抗体（ＤＡＫＯ、１／１００００希釈溶液）、及びＥＣＬプラスＨＲＰ基質（Amersham Biosciences）を用いて、免疫検出を実施する。ウェスタンブロット法は、Ａｄ５−ｅＧＦＰ感染細胞と比較して、ｐ６５／ＲｅｌＡ、ＴＲＡＦ６又はＭＹＤ８８の発現を媒介するアデノウイルスに感染したＳＦの上清中の、ＭＭＰ１タンパク質レベルの大きな増加を示す。Ａｄ５−ＭＭＰ１感染細胞の上清では、非常に強いシグナルが検出される（図２、パネルＢ及びＣ）。
【０１３９】
Ａｄ５−ｐ６５／ＲｅｌＡ、Ａｄ５−ＴＲＡＦ６又はＡｄ５−ＭＹＤ８８感染ＳＦの上清に存在する高レベルのＭＭＰ１タンパク質は、市販のＭＭＰ１活性ＥＬＩＳＡ（ＲＰＮ２６２９、Amersham Biosciences）を用いて確認される。このＥＬＩＳＡでは、ＭＭＰ１はウェルに固定された抗体によって捕捉され、その量はその後ＭＭＰ１基質の変換に基づいて定量化される。メーカーによる推奨通り、ＳＦの非濃縮上清（ウェスタンブロット法実験について示したように調製する）の５０μｌをこのＥＬＩＳＡで処理する。
これらの実験は、ＳＦ一般、及びスクリーニング及び検証実験で用いる細胞バッチの、炎症経路の誘起後にＭＭＰ１タンパク質を産生する能力を確認する。
【０１４０】
ＭＭＰ１の測定のための３８４穴フォーマットＥＬＩＳＡが開発される。様々なＥＬＩＳＡプロトコルと同様に様々な一次抗体が試験される。３８４穴プレートでＳＦ上清中のＭＭＰ１レベルを測定するために、以下のプロトコルが開発、検証される：白色Ｌｕｍｉｔｒａｃ６００  ３８４穴プレート（Greiner）を２μg/mlの抗MMP１抗体MAB１３４６（Chemicon）でコーティングする。抗体は、緩衝液４０（１ＬのｍｉｌｌｉＱ水中に１．２１ｇのトリスベース（Sigma）、０．５８ｇのNaCl（Calbiochem）及び５mlの１０%NaN３（Sigma）、pH８．５に調節）で希釈する。４℃で一晩インキュベーションの後、プレートをＰＢＳ（１０ＬのｍｉｌｌｉＱ中に８０ｇのＮａＣｌ、２ｇのＫＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、１１．５ｇのＮａ２ＨＰＯ４．７Ｈ２Ｏ及び２ｇのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）で洗浄して、１００μｌ／ウェルのカゼイン緩衝液（ＰＢＳ中に２％カゼイン（VWR International））でブロックする。翌日、カゼイン緩衝液をＥＬＩＳＡプレートから除去して、５０μｌ／ウェルのＥＣ緩衝液（１Ｌ  ｍｉｌｌｉＱ中に４ｇのカゼイン、２．１３ｇのNa２HPO４（Sigma）、２ｇのウシアルブミン（Sigma）、０．６９ｇのNaH２PO４．H２O（Sigma）、０．５ｇのCHAPS（Roche）、２３．３gのＮａＣｌ、４ｍｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８（Invitrogen）、５ｍｌの１０％ＮａＮ３、ｐＨ７．０に調節）によって置換する。０．２５ｍＭのDTT（Sigma）を、解凍した試料プレートに加える。ＥＣ緩衝液を除去した後、試料の２０μｌをＥＬＩＳＡプレートへ移す。４℃で一晩のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳで２回、ＰＢＳＴ（０．０５％ツイーン２０を含むPBS（Sigma））で１回洗浄して、３５μｌ／ウェルのビオチン化抗ＭＭＰ１抗体溶液（Ｒ＆Ｄ）とインキュベートする。この二次抗体は、緩衝液Ｃ（２ＬのｍｉｌｌｉＱ中に０．８２ｇのＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏ、４．８２ｇのＮａ２ＨＰＯ４、４６．６ｇのＮａＣｌ、２０ｇのウシアルブミン及び４ｍｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８、ｐＨ７．０に調節）で、５μｇ／ｍｌの濃度に希釈する。室温で２時間のインキュベーションの後、プレートは先に述べたように洗浄して、５０μｌ／ウェルのストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート体（Biosource）とインキュベートする。ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート体は、緩衝液Ｃで０．２５μｇ／ｍｌの濃度に希釈する。４５分後に、プレートを前記の通り洗浄して、５０μｌ／ウェルのBM Chem ELISA基質（Roche）と５分間インキュベートする。読み出しは、Luminoscan Ascent Liminometer（Labsystems）上で２００ミリ秒の積分時間で、又はEnvisionリーダー（Perkin Elmer）で実施する。
【０１４１】
開発したＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡで得られた典型的結果は、図３で示す。この実験のために、３０００のＳＦを９６穴プレートのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ内に接種する。２４時間後に、ＳＦはＡＬＰＰ、ＭＹＤ８８、ＭＭＰ１の発現を媒介するアデノウイルスにより１００００のＭＯＩで感染させるか、未感染のままにする。感染の１日後、細胞の培地を、１％ＦＢＳを添加したＭ１９９培地（Invitrogen）で置換する。４８時間のインキュベーションの後、上清を収集して３８４穴プレートへ移し、上述のＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡ手法を実施する。頑健で、３．５倍を超えるアップレギュレーションのシグナルが観察される。この実験は、ＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡの頑健性及び特異性を示した。
【０１４２】
ＲＡの分野に関連するサイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ１β及びＯＳＭ）又はその組合せによる処理後のＳＦによるＭＭＰ１発現の増加を監視する。結果を、図１０の白色バーで示す。この実験のために、ＳＦを９６穴プレートに３０００細胞／ウェルで接種する。２４時間後に、培地は１％ＦＢＳを添加したＭ１９９培地に変更する。培地変更の１日後、サイトカイン又はその組合せを、各サイトカインが２５ｎｇ／ｍｌの最終濃度になるように培養物に加える。図３で記載されているように、サイトカイン添加の７２時間後に上清を収集して、ＥＬＩＳＡで処理する。図１０の白色のバーで示すように、ＴＮＦαだけがＭＭＰ１発現のほぼ３倍の増加を誘導する。ＴＮＦα及びＯＳＭ及び／又はＩＬ１βの組合せによるＳＦの誘起は、より高いＭＭＰ１発現レベルを導く。この実験は、ＲＡ発生病理に関係するサイトカインによって誘発されるＳＦによるＭＭＰ１発現の増加を測定するのに、開発したＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡの感度が十分であることを証明する。
【０１４３】
（実施例２：ＭＭＰ１アッセイにおける４２２４の組換えアデノウイルスのスクリーニング）
異なるスクリーニングにおけるアッセイの品質を評価するために、３８４穴対照プレートが作製される。このプレートの組成を図で４Ａ示す。ウェルは、FlexSelectアデノウイルスｃＤＮＡライブラリーと同じ条件の下で産生された対照ウイルスで満たす。この対照プレートは、対角線に配列されて、３組の４８陰性対照ウイルス（Ｎ１（Ａｄ５−ｅＧＦＰ）、Ｎ２（Ａｄ５−ＬａｃＺ）、Ｎ３（Ａｄ５−ＡＬＰＰ）、Ｂｌ：ブランコ、非感染）が介在する、３組の４８陽性対照ウイルス（Ｐ１（Ａｄ５−ＭＭＰ１）、Ｐ２（Ａｄ５−ＴＲＡＦ６）、Ｐ３（Ａｄ５−ＭＹＤ８８））を含む。全てのウェルは、５０μｌのウイルス粗溶解液を含む。対照プレートに含まれるウイルスは、FlexSelect収集の構築のために適用したプロトコルに従って生成される。この対照プレートの複数の一定量を作製し、−８０℃で保存する。
【０１４４】
最適スクリーニングプロトコル：ＲＡＳＦを、１０％ウシ胎仔血清（ＩＣＮ）、１００単位／ｍｌのペニシリン（Invitrogen）及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Invitrogen）を添加したＤＭＥＭ培地（Invitrogen）で培養し、３７℃及び１０％ＣＯ２でインキュベートする。細胞は、週に一度、１／３分割によって継代培養する。スクリーニングで用いたＲＡＳＦの最大継代数は、１１である。スクリーニングのために、ＳＦは０．１％ゼラチン（Ｍｅｒｃｋ）でコーティングされた透明な３８４穴プレート（Greiner）の２５μlの滑膜細胞増殖培地（Cell Applications社）内に、１５００細胞／ウェルの密度で接種する。一晩インキュベーションの後、細胞はGalapagos FlexSelectアデノウイルスｃＤＮＡライブラリーからの、３μｌのＡｄ−ｃＤＮＡに感染させる。アデノウイルスライブラリーの平均力価が３×１０９ウイルス粒子／ｍｌであるので、これは６０００のＭＯＩを意味する。感染の２４時間後に、培地を１％ＦＣＳを添加した５０μｌのＭ１９９培地に変更する。４０μｌの上清を７２時間後に新しい透明な３８４穴プレート（Greiner）に収集して、さらにＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡで処理するまで−８０℃で保存する。感染、培地変更及び培地収集段階は、TECAN Freedomピペッタで実施する。ＥＬＩＳＡ段階は実施例１で示すように実施する。
【０１４５】
上述のプロトコルで試験された対照プレートの性能の代表例を、図４Ｂに示す。滑膜線維芽細胞は、ＴＥＣＡＮ３８４チャンネルピペッタを用いて、対照プレートに整然と含まれるウイルスの３μｌで感染させる。培地は感染翌日に一新し、上清は７２時間の産生時間後に収集して、前の実施例で記載した３８４穴フォーマットＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡを実施した。得られた生の発光シグナルを示す。
【０１４６】
ストリンジェントなカットオフ、つまり全１４４の陰性対照ウイルスの平均プラスこれらの試料の標準偏差の４．５倍を適用した。予想通りに、Ａｄ５−ＭＭＰ１対照ウイルスは、アッセイで高スコアをマークし、４８のＡｄ５−ＭＭＰ１ウイルスの全てはこのカットオフより上のヒットとして選択された。Ａｄ５−ＭＹＤ８８対照ウイルスも頑健にスコアし、Ａｄ５−ＭＹＤ８８対照ウイルスの８４％は適用したカットオフより上で選択された。ＭＭＰ１  ｍＲＮＡレベルのより弱い増加をもたらしたより弱いＡｄ５−ＴＲＡＦ６対照（実施例１を参照）の成績は良くなく、このカットオフが強いＭＭＰ１インデューサーを同定する可能性が高いことを示す。
【０１４７】
上述のＲＡＳＦのＭＭＰ１アッセイは、Galapagos Genomicsで開発されたアデノウイルスｃＤＮＡライブラリー（ＦｌｅｘＳｅｌｅｃｔ（商標）収集）に対してスクリーニングされる。このアデノウイルス収集の主要部は、ＧＰＣＲ、キナーゼ、プロテアーゼ、ホスホジエステラーゼ及び核ホルモン受容体のような「医薬とし得る」クラスからの遺伝子のｃＤＮＡを含む。これらのｃＤＮＡの大部分は、下で簡単に説明したＰＣＲに基づく手法によって得られる。ＲｅｆＳｅｑデータベースから得られる選択された遺伝子の配列に基づき、ＰＣＲプライマーはＡＴＧ開始コドンから終止コドンまでの完全な読取り枠の増幅のために設計される。プライマーは、順方向プライマー及び逆方向プライマーが９６穴プレート内でＰＣＲレディ濃度で混合された整列したフォーマットで受け取られる。この時点から後は、整列したフォーマットは全ての取扱い（ＰＣＲからウイルス産生まで）を通して維持され、その結果整列したアデノウイルスｃＤＮＡライブラリーが得られる。ＰＣＲ反応のテンプレートとして、胎盤、胎児肝臓、胎児脳及び脊髄のｃＤＮＡライブラリーが用いられる（Invitrogen又はEdge  Biosystemsから）。単一のエクソンによってコードされる遺伝子については、ヒトゲノムＤＮＡでＰＣＲ反応が実施される。増幅反応の後、ＰＣＲ生成物の大きさが推定されて、配列情報に基づく予測された大きさと比較される。得られたＰＣＲ生成物は、９６穴ＰＣＲクリーンアップ系（Wizard magnesil、Promega、Madison、WI、USA）で精製され、適当な制限酵素で消化され（ＡｓｃＩ、ＮｏｔＩ又はＳａｌＩの制限部位はプライマーに含まれる）、ＤＮＡライゲーションキットバージョン２（TaKaRa、Berkeley、CA、USA）を用いてアデノウイルスアダプタープラスミドｐＩｓｐＡｄＡｄａｐｔ−１０−Ｚｅｏ（米国特許第6340595号で記載される）へ直接クローン化される。形質転換及び選択段階の後、国際公開99/64582で記載される手法に従い、１遺伝子につき、配列が確認されているクローンの複数がプラスミドＤＮＡの調製及び以降のアデノウイルスの生成のために用いられる。
【０１４８】
全FlexSelectアデノウイルスｃＤＮＡライブラリーは、スクリーニングされた時点で１１×３８４穴プレートで構成された。４２２４試料は１７０５遺伝子を意味する。
ＭＭＰ１アッセイは、上述の最適化されたプロトコルを用いてFlexSelectアデノウイルスｃＤＮＡライブラリーに対してスクリーニングされる。あらゆるｃＤＮＡライブラリープレートは、一次スクリーニング及び再スクリーニングで２反復でスクリーニングされる。このように、４つのデータポイントが各ｃＤＮＡクローンについて得られる。スクリーニング結果及びヒットを同定するために実施された分析の代表例を、図５に示す。
【０１４９】
ＳＦを３８４穴プレートに接種して、３８４穴プレート内に整列して含まれる（TECANピペッタを用いる）FlexSelect収集の３８４の異なる組換えアデノウイルスの３μｌで感染させる。培地は、感染の翌日に一新する。上清を７２産生時間後収集し、発光基質を用いてＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡを実施した。得られた生の発光シグナルを示す。あらゆる個々のウイルス、特にＰＲＫＣＥ、ＣＡＳＰ１０及びＵＳＰ２１の発現を媒介するウイルスについて、一次スクリーニング（図５Ａ）及び再スクリーニング（図５Ｂ）で得られた２つのデータポイント（図５Ａ及びＢ）を示す。
【０１５０】
ヒットコーリングのためのカットオフ値を決定するために、１０％の最高値及び１０％の最低値を除いた後にスクリーニングバッチ毎に得られた全てのデータポイントについて標準偏差の他に平均値も計算する。次にカットオフ値を、標準偏差の３倍プラス平均値と定義する。このカットオフは、図５のグラフで水平線として示される。スクリーニング及び再スクリーニング結果は、ＰＲＫＣＥをコードする４つのｃＤＮＡ、ＵＳＰ２１をコードする５つのｃＤＮＡ及びＣＡＳＰ１０をコードする４つのｃＤＮＡについて図６で示す。全４つのＰＲＫＣＥ  ｃＤＮＡクローンは一次スクリーニングと再スクリーニングの両方で２反復ともカットオフより上のスコアをマークし、５つのＵＳＰ２１クローン中４つは一次スクリーニング及び再スクリーニングでカットオフより上のスコアをマークし、４つのＣＡＳＰ１０ｃＤＮＡクローン中３つは２反復とも一次スクリーニング及び再スクリーニングでスコアをマークした。これらのデータは、スクリーニング及びFlexSelect  ｃＤＮＡ収集の品質を示す。
【０１５１】
指摘したように、あらゆるスクリーニングプレートは２反復でスクリーニング及び再スクリーニングされる。４データポイント中３つについてカットオフ値（平均値プラス標準偏差の３倍）より上のスコアをマークした試料だけを、ヒットとして選択する。さらに、複数のクローンがプラスのスコアの場合は、遺伝子につき最大で２つのクローンがコラーゲン分解アッセイによりさらに処理される。このように、２２９の遺伝子を表す２５３のヒットしたＡｄ−ｃＤＮＡを最終的に選択し、増殖させて、コラーゲン分解アッセイで試験する。
【０１５２】
表１に列記される各種の標的遺伝子の発現を媒介する「ノックインウイルス」は、以下の通りに試験される。１日目に、３０００細胞／ウェルの密度でゼラチンコーティングされた９６穴プレートに、又は１５００細胞／ウェルの密度で３８４穴プレート内の滑膜増殖培地にＳＦを接種する。接種の１日後に、細胞を図で示す量で又はＭＯＩで感染させる。３日目に、培地は１％ＦＢＳを添加したＭ１９９培地に一新する。６日目に上清を収集して、上述のプロトコルに従ってそれに対してＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡを実施する。Ａｄ５−ルシフェラーゼ、Ａｄ５−ｅＧＦＰ又はＡｄ５−空ウイルスは、陰性対照ウイルスとして用いる。ＳＥＰＴ１、ＴＰＳＴ１、ＵＳＰ２１、ＭＫＮＫ１、ＲＩＰＫ２（図１３Ａ）、ＰＧＰＥＰ１、ＲＩＴ１（図１３Ｂ）、ＣＡＭＫ４、ＭＳＴ３、ＰＲＫＣＥ（図１３Ｃ）及びＣＤ７２、ＴＭ７ＳＦ１、ＧＰＲ２１（図１３Ｄ）の発現を誘起する組換えアデノウイルスによるＳＦの感染は、その感染ＳＦによるＭＭＰ１の発現増加を明らかに媒介した。図１３で示す結果は、２反復のデータポイントの平均である。
【０１５３】
（実施例３：一次滑膜線維芽細胞（ＳＦ）のコラーゲン溶解活性の測定のためのスクリーニング法の開発：コラーゲン分解アッセイ）
ＭＭＰ１アッセイは、ＳＦにおけるＭＭＰ１発現の増加を媒介したヒットを選択するための第１のフィルターとして用いる。しかし、ＳＦの上清に存在するＭＭＰ１の量は、未変性のコラーゲンの分解を媒介するのに十分でないかもしれない。さらに、ＭＭＰ１の他に、単独で又はＭＭＰ１との相乗効果でコラーゲン分解を媒介する更なるプロテアーゼが、ＳＦによって発現されるかもしれない。我々のヒットをＳＦのコラーゲン溶解活性を増加させるそれらの潜在能力の順に並べるために、本発明者らは、ＳＦ上清内で未変性コラーゲンの分解の程度を測定する機能性アッセイを開発した。以下に記すアッセイを実施するために用いた様々な試薬及び緩衝液は、特に指摘しない限りChondrex（Redmond、USA）からのものである。
【０１５４】
第１に、一次ヒト細胞のｃＤＮＡライブラリースクリーニングに適合するように、アッセイを開発する。第２の開発段階として、整列させた、中程度の処理能力アッセイに適合するように、そのアッセイを小型化する。小型化された構成での一次細胞で実施されたコラーゲンアッセイの感度は、非小型化された構成でのアッセイと比較して保存されることを実験は確認した。この知見を例示する典型的な実験の結果を、図６に示す。この実験のために、ＳＦ（３０００細胞／ウェルの密度で９６穴プレート内の１％ＦＢＳ添加Ｍ１９９培地に接種）をＡｄ５−ＡＬＰＰ、ＡＤ５−ＴＲＡＦ６又はＡｄ５−ＭＹＤ８８に感染させる（ＭＯＩ  １０，０００）。４８時間（感染後）のインキュベーション時間の後、上清を収集して小型化及び非小型化のコラーゲン分解アッセイで試験する。コラーゲン分解レベルに比例する蛍光シグナルを示す。
【０１５５】
「非小型化」コラーゲン分解アッセイプロトコル：１００μｌのＳＦ上清又はｒＭＭＰ１（R&D systems）若しくはキモトリプシン（Sigma）の指示量を添加したＭ１９９培地＋１％ＦＢＳの１００μｌを、９０μｌの緩衝液Ｂと混合する。これらの混合物は、１０μｌのトリプシン活性化溶液又は１０μｌのＡＰＭＡ（４−アミノフェニル酢酸水銀、最終２ｍＭ、Sigma）活性化溶液に加える。これらの活性化溶液は、これらのプロテアーゼを不活性態に保つＭＭＰのプロドメインの除去を媒介する。トリプシン活性化の場合、混合物は３５℃で６０分間インキュベートし、続いて全ての非コラーゲン溶解性プロテアーゼを不活性化するためにＳＢＴＩ（大豆トリプシンインヒビター）を添加するが、ＡＰＭＡ活性化の場合は、混合物は３５℃で１０分間インキュベートする。１００μｌの緩衝液Ａ及び１００μｌの未変性のＦＩＴＣ標識ウシコラーゲンＩ型（１ｍｇ／ｍｌ、０．０１Ｎ酢酸溶液）を混合して活性化試料に加え、その後３５℃で２時間のインキュベーション段階が続き、その間にコラゲナーゼはＦＩＴＣ標識コラーゲンを典型的な１／４及び３／４断片に切断する。反応は、停止液（１，１０フェナントロリン、最終１０ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）を１０μｌ添加して停止させる。大きなコラゲナーゼ断片は、１０μｌのエラスターゼ（「エンハンサー」溶液）の添加及び３５℃で３０分間のインキュベーションによってさらに消化する。試料を冷却した後に、未切断のコラーゲン断片を沈殿させるために４００μｌの抽出緩衝液を加える。これらの断片は、遠心工程（１０，０００  ｒｐｍ、１０分）によって消化されたコラーゲン断片から分離される。試料の２００μｌは、Ｆｌｕｏｓｔａｒリーダー（ＢＭＧ）上で実施する蛍光測定（放射及び励起波長としてそれぞれ５２０ｎｍ、４８０ｎｍ）のために、黒い９６穴プレートへ移す。
【０１５６】
「小型化されたコラーゲン分解アッセイ」プロトコル：９６穴プレート（Ｖ底、Ｇｒｅｉｎｅｒ）を、１ウェルにつき９μｌの溶液Ｂ及び１μｌのトリプシン溶液で満たす。１０μｌの試料を各ウェルに加え、３４℃で１５分間インキュベーションを行う。インキュベーションの後、１μｌのＳＢＴＩを加える。２０μｌのＦＴＴＣ−コラーゲン混合物（１０μｌ  ＦＩＴＣ標識コラーゲンＩ型＋１０μｌ溶液Ａ）を活性化された試料に加えて３４℃で２４時間の間インキュベーションを行う。１μｌの１．１０フェナントロリン（Sigma）を、反応混合物に加える。１μｌのエンハンサー溶液（エラスターゼ）を加え、３４℃で３０分の間インキュベーションを行う。反応混合物が室温であるときは、４０μｌの抽出緩衝液を加え、プレートを密封して（Nuncシール）撹拌する。４０００ｒｐｍで２５分間の遠心（Beckman遠心機）の後、上清の５０μｌを黒いＦ底プレート（Greiner）に移し、Fluostarリーダー（ＢＭＧ）を用いて４８０ｎｍの励起波長、５２０ｎｍの放射波長で蛍光を測定する。実験結果は図８に示すが、それらはＡｄ５−ＴＲＡＦ６並びにＡｄ５−ＭＹＤ８８感染細胞の上清におけるコラーゲンＩ型の分解の増加を示す。このように、ＳＦの「ＭＭＰ１アッセイ」で同定された２つの陽性対照も、ＳＦのコラーゲン溶解能力の増加を媒介する。このことは、「ＭＭＰ１アッセイ」におけるｃＤＮＡの能力は、ＳＦの大局的コラーゲン溶解活性を増加させるその能力の予測を可能にするものであることを示唆する。小型化されたアッセイにおける蛍光シグナルのレベルは非小型化のアッセイと比較して低いけれども、Ａｄ５−ＡＬＰＰ対照と比較しての陽性試料中の蛍光の相対的増加は維持される。このように、非小型化アッセイと同等の感度レベルを有する、ＳＦの小型化コラーゲン分解アッセイが開発された。この結果は、上述のコラーゲン分解アッセイのために用いた方法が、一次細胞（この実施例ではヒトＳＦ）のｃＤＮＡライブラリー（この実施例ではアデノウイルスフォーマット）のスクリーニングに適合することを立証する。様々な実験は、以下のプロトコルの態様が重要であることを証明した：
・細胞上清中の潜在性ＭＭＰの活性化のためのトリプシンの使用は、このアッセイを用いたコラゲナーゼ活性の検出に役立つ。
・未感染細胞の上清は、いかなる検出可能なバックグラウンドコラゲナーゼ活性も含まない。この低バックグラウンドシグナルを得るためには、血清含有量が低く（１％ＦＢＳ）フェノールレッドを含まない培地（Ｍ１９９培地、フェノールレッドを含まない、Invitrogen）の使用が好ましいとされる。
・変性コラーゲン（ゼラチン）を分解する能力を有する酵素であるキモトリプシンによってコラーゲン分解は全く媒介されないので、このアッセイのために用いるコラーゲンはほとんど未変性の、３重ヘリックス構造である。用いるコラーゲンの未変性の特徴は、このアッセイにも好ましい。
【０１５７】
上記の小型化アッセイはコラーゲン分解について他の低処理能力検出法と比較され、そこでは以下の試料が試験される：Ａｄ５−ＡＬＰＰ、Ａｄ５−ＴＲＡＦ６、Ａｄ５−ＰＲＫＣＤ、Ａｄ５−ＭＭＰ１３（ＭＭＰ１３は強力なコラゲナーゼである）又はＡｄ５−ＴＮＦＲ１Ａに、全て１０，０００のＭＯＩで、非感染であるか感染したＳＦ（９６穴プレート内の１％ＦＢＳ添加Ｍ１９９培地で培養）の上清。これらの試料で（前実施例で記載したプロトコルに従って）実行された小型化コラーゲン分解アッセイの結果を、図７に示す。示した組換えアデノウイルスによるＳＦの感染後、及び４８時間の産生時間後に得られた上清について、小型化（蛍光ベースの）コラーゲン分解アッセイ及びコラーゲン分解の低処理能力視覚評価を実施する。後の試験のために、様々な上清を未変性コラーゲンとインキュベートする。反応混合物をポリアクリルアミドゲルで解析し、未変性コラーゲン（バンドＡ及びＢ）から３／４Ｎ末端ＴＣＡ断片（バンドＣ及びＤ）へのヘテロトリマーコラーゲンＩ型原線維の分解を、クーマシー染色後に評価する。
【０１５８】
この実験のヒット対非ヒットのカットオフ値は、未感染対照試料のデータポイントの平均プラスこれらのデータポイントの標準偏差の３倍と定義し、図７の棒グラフ上の点線で示す。これらのデータは、Ａｄ５−ＴＲＡＦ６及びＡｄ５−ＭＭＰ１３陽性対照に加えて、ＰＲＫＣＤ及びＴＮＦＲ１Ａの過剰発現後にＳＦのコラーゲン溶解能力が増加したことを示す。ＴＮＦａｌｐｈａはＲＡ発生病理に関係する公知の作動因子であるので、ＴＮＦａ受容体であるＴＮＦＲ１Ａの過剰発現はコラーゲン分解の増加を導くことが予想される。この結果は、ＲＡ発生病理に関係する関連ｃＤＮＡを同定するための我々の手法の正当性をさらに立証する。この実験では、ＰＲＫＣＤはＳＦによるコラーゲン分解の他の重要な媒介物質として同定される。
【０１５９】
次に、同じ試料を以下の設定で試験する：試料の１０μｌを１０μｌのＥＤＡＮＳ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０５％Ｂｒｉｊ−３５、５０μＭ  ＺｎＣｌ２）、１０μｌのコラーゲンＩ型溶液（ＩＢＦＢ、Ｇｅｒｍａｎｙ、１ｍｇ／ｍｌを０．０１Ｎ酢酸に溶解する）と混合する。ＡＰＭＡを、２ｍＭの最終濃度までこの反応混合液に加える。反応混合液を、３５℃で４８時間インキュベートする。２５μｌの反応混合液を次に沸騰させ、８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（Novex）で解析し、次にクーマシーブルー染色を行う。未変性コラーゲンＩ型は、２つのα１及び１つのα２鎖から構成される３重へリックスである。これらの鎖は対照試料ではゲルの上で見ることができ、図７の下部の矢印Ａ及びＢで示す。陽性対照試料Ａｄ５−ＭＭＰ１３、Ａｄ５−ＴＲＡＦ６及びＡｄ５−ＰＲＫＣＤでは、これらの２つのバンドは矢印Ｃ及びＤで示す３／４Ｎ末端の「ＴＣＡ」断片に切断される。この典型的制限パターンは、単一の位置でコラーゲン３重へリックスを切断して、それにより特徴的な１／４Ｃ末端「ＴＣＢ」及び３／４Ｎ末端「ＴＣＡ」断片を生成するＭＭＰ型コラゲナーゼの作用を示す。これらの結果は、コラーゲン分解アッセイで得られるシグナルと試験試料に存在するコラーゲン分解活性との間に存在する直接的関係を視覚的に確証する。これらのデータは、コラーゲン分解アッセイで得られるシグナルはＭＭＰ型コラゲナーゼの活性作用の結果であることも確証する。
【０１６０】
軟骨の主成分はコラーゲンＩＩ型であるので、我々はＦＩＴＣ標識コラーゲンＩ型及びＦＩＴＣ標識コラーゲンＩＩ型で実施されたコラーゲン分解アッセイ読み出し情報を比較した。代表的な実験の結果は、図８に示す。この実験のために、Ａｄ５−ＴＲＡＦ６、Ａｄ５−ＡＬＰＰ又はＡｄ５−ＭＹＤ８８を１０，０００のＭＯＩで感染させたＳＦ（９６穴プレートで培養、Ｍ１９９＋１％ＦＢＳ中に３０００細胞／ウェル）の上清を用いる。これらの細胞の上清を感染後４８時間に収集し、図８で記載した非小型化コラーゲン分解アッセイ法を、ＦＩＴＣ標識未変性コラーゲンＩ型又はＦＩＴＣ標識コラーゲンＩＩ型（ＦＩＴＣ標識コラーゲンＩ型と同じ量）を用いて実施した。図８に示す結果は、コラーゲンＩＩ型の分解は低い蛍光シグナルを発生することを示し、コラーゲンＩ型と比較してコラーゲンＩＩ型のタンパク分解性に対する高い抵抗性を示唆する。コラーゲンＩＩ型を用いたときに得られる低いシグナルレベルにもかかわらず、本明細書でＡｄ５−ＴＲＡＦ６によって例証されるように、コラーゲンＩＩ型分解の増加を媒介するｃＤＮＡが同定される。コラーゲン分解の誘導に向けたヒットの能力の順序は、コラーゲンＩ型で実行したアッセイと比較してコラーゲンＩＩ型で実行したコラーゲン分解アッセイで維持される。これらの結果は、このアッセイでコラーゲンＩ型の分解を誘導するヒットの能力は、コラーゲンＩＩ型の分解を誘導するその能力の予測を可能にするものであることを示す。
【０１６１】
（実施例４：コラーゲン分解アッセイにおける、「ＭＭＰ１アッセイ」の２５３のヒットの試験及び１６７９の組換えアデノウイルスのスクリーニング）
一次滑膜線維芽細胞（ＳＦ）上のＭＭＰ１アッセイのヒットとして同定されたアデノウイルスをFlexSelectアデノウイルスｃＤＮＡライブラリーから選択し、ＰＥＲ．Ｅ２Ａプロデューサー細胞に感染させて９６穴プレートフォーマットで再増殖させる（国際公開99/64582を参照）。これらのプレートは、「ＭＭＰ１ヒット増殖プレート」とさらに称される。これらのプレート上では、４つのＡｄ５−ＡＬＰＰ及び４つのＡｄ５−ルシフェラーゼ対照ウイルスも含まれる。これらのプレートの境界ウェルは、実験での偶発的な「周辺効果」を避けるために用いられない。ＭＭＰ１ヒット増殖プレートは、５０のヒットウイルス及び１０の陰性対照ウイルスを含む。このウイルス材料は、次に３種類のＭＯＩで、ＳＦのコラーゲンＩ型分解アッセイにより２反復で以下の通りに試験される。ＳＦをトリプシン処理して、９６穴プレート（Ｎｕｎｃ、透明プレート、組織培養処理）に接種する。トリプシン処理をしたＳＦを３０，０００細胞／ｍｌの密度で滑膜細胞増殖培地（Cell Applications）の中に再懸濁し、この懸濁液の１００μｌをマルチドロップディスペンサー（Labsystems）により各ウェルに注入する。細胞を接種してから約２４時間後に、Tecan Freedom２００ピペッタ（Tecan）を用いて９６穴ＭＭＰ１ヒット増殖プレートに存在するウイルス材料の６、１２又は１８μｌで細胞の２重感染を実施する。このように、ＭＭＰ１ヒット増殖プレートの内容物を、接種されたＳＦを含む６つの９６穴プレートへ移す。コラーゲン分解アッセイで各ヒットウイルスにつき６つのデータポイントを生成する。感染の約２４時間後に、８チャンネルVacusafe装置（Integra）を用いてウイルス及び培地をセルから除去し、０．５％ＦＢＳ添加Ｍ１９９培地の６０μｌを各ウェルに加える。
【０１６２】
培地更新の７２時間後に、Tecan Freedom２００ピペッタで上清を９６穴プレート（Ｖ底、Greiner）へ移す。上清を使用まで−８０℃で保存する。アッセイを実施するには、上清を解凍して、上の実施例３で記載した小型化コラーゲンＩ型分解アッセイのプロトコルに従ってアッセイを実施する。
【０１６３】
ヒット選択は、以下の通りに実施される：各プレートについて、対照ウイルスを感染させた８つのウェルで得られた蛍光測定について、平均値及び標準偏差を計算する。ヒット対ノーヒットのカットオフは、これらの対照試料の平均プラス標準偏差の２倍と規定される。ウイルスが６データポイントの少なくとも３つについてカットオフ値より上のシグナルを誘導するならば、そのウイルスはヒットとみなされる。ＭＭＰ１アッセイで同定された２５３のヒットは、この手法で再試験された。これらの中で、６１のＡｄ−ｃＤＮＡがＳＦのコラーゲン溶解活性をかなり増加させ、冗長性を考慮したとき５５の個々の遺伝子に相当した。これらの５５のヒットの他に、スクリーニングで拾われた２つのＡｄ−ｃＤＮＡは、スクリーニングに対して原理の証明を与えた。これらのヒットの１つは、ＭＭＰ１をコードした。他のヒットは、ＩＫＫβ（ＩＫＢＫＢ）をコードする。このキナーゼはＴＮＦαなどの炎症作動因子に対する細胞の反応で中心的な役割を担う。ＲＡを治療指標とする小さな薬剤阻害剤は、現在ＩＫＫβを対象に設計されている（Andreakosら、２００３）。ＲＡの分野に関連するヒットが拾われるという事実は、我々のスクリーニング概念の品質及び用いた材料（アッセイ及びライブラリー）の品質を確証する。
【０１６４】
これらのヒットＡｄ−ｃＤＮＡに関する最終的な品質管理として、それらの同一性を配列分析によって確認される。配列分析のための手順は、以下の通りである。９６穴プレートでＰＥＲ．Ｅ２Ａプロデューサー細胞を用いてヒットウイルスを増殖させる。ＰＥＲ．Ｅ２Ａ細胞は、９６穴プレート内の１８０μｌの培地に、４０，０００細胞／ウェルの密度で接種する。細胞は、３９℃で一晩、ＣＯ２濃度が１０％の加湿インキュベータでインキュベートする。１日後、ヒットＡｄ−ｃＤＮＡを含むFlexSelect原液からの粗細胞溶解液の１μｌで細胞を感染させる。細胞は、細胞変性効果（一般的に感染後７日に出現する細胞の膨張及び球状化）が現れるまで、さらに３４℃、１０％のＣＯ２濃度でインキュベートする。上清を収集して、ウイルスの粗溶解物をプロテイナーゼＫで処理する。１２μｌの粗溶解物を、無菌のＰＣＲ管内で４μｌの緩衝液（１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Roche Molecular Biochemicals、カタログ番号745723）及び０．４５%ツイーン２０（Roche Molecular Biochemicals、カタログ番号1335465）を添加した、ＭｇＣｌ２を含む１×Expand High Fidelity緩衝液（Roche Molecular Biochemicals、カタログ番号1332465）に加える。これらを５５℃で２時間インキュベートした後、９５℃で１５分の不活化段階が続く。ＰＣＲ反応については、１μｌの溶解液を５μｌのＭｇＣｌ２を含む１０× Expand High Fidelity緩衝液、０．５μｌのｄＮＴＰ混合液（各ｄＮＴＰが１０ｍＭ）、１μｌの「順方向プライマー」（１０ｍＭ原液、配列：５’ＧＧＴ  ＧＧＧ  ＡＧＧ  ＴＣＴ  ＡＴＡ  ＴＡＡ  ＧＣ；配列番号４５２）、１μｌの「逆方向プライマー」（１０ｍＭ原液、配列：５’ＧＧＡ  ＣＡＡ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＡＣＴ  ＡＧＡ  ＡＴＧ  Ｃ；配列番号４５３）、０．２μｌのExpand High Fidelity  ＤＮＡポリメラーゼ（３．５Ｕ／μｌ、Roche Molecular Biochemicals）及び４１．３μｌのＨ２Ｏから構成されるＰＣＲマスター混合液に加える。
【０１６５】
ＰＣＲは、PE Biosystems GeneAmp  ＰＣＲシステム９７００で、以下の通りに実施される：ＰＣＲ混合物（合計５０μｌ）を９５℃で５分の間インキュベートする；各サイクルは９５℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で４分間で実行し、３５サイクルを繰り返す。６８℃での最終的なインキュベーションは、７分間実施する。５μｌのＰＣＲ混合物を２μｌの６×ゲルローディング緩衝液と混合し、増幅生成物を解析するために０．５μｇ／μｌ臭化エチジウムを含む０．８％アガロースゲル上に加える。増幅した断片の大きさを、同じゲルに加えた標準のＤＮＡラダーから推定する。配列決定分析については、標的アデノウイルスによって発現されたｃＤＮＡを、ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６プラスミドのＳａｐＩ部位と連なるベクター配列に相補的なプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅する。ＰＣＲ断片の配列を決定して、予想される配列と比較する。
【０１６６】
（コラーゲン分解アッセイにおけるFlexSelect収集サブセットのスクリーニング）
ある因子が、ＭＭＰ１以外のコラゲナーゼを通してＳＦのコラーゲン溶解活性の増加を媒介する可能性が存在する。そのような因子を同定するために、FlexSelect収集のサブセットを、ＳＦのコラーゲン分解アッセイでスクリーニングする。キナーゼ及びＧＰＣＲの発現を媒介するＡｄ−ｃＤＮＡを主に含む、FlexSelect収集からの３８４穴プレートをスクリーニングする。以下のスクリーニングプロトコルを適用する。ＳＦをトリプシン処理して、３０，０００細胞／ｍｌの密度で滑膜細胞増殖培地（Cell Applications）の中に再懸濁する。この細胞懸濁液の１００μｌを、「マルチドロップ」ディスペンサー（Labsystems）により９６穴プレート（Nunc、組織培養処理済）の各ウェルに注入する。細胞接種の約２４時間後に、それらは以下の通りにライブラリーＡｄ−ｃＤＮＡに感染させる。処理するFlexSelectライブラリーアリコートプレート（３８４穴フォーマット、−８０℃で保存）を、層流キャビネット内で室温で１時間解凍する。次に、更なる処理までプレートを４℃で保存する。
【０１６７】
３８４穴アデノウイルスｃＤＮＡライブラリーアリコートプレートの４分の１の各ウェルのために、ＳＦを含む９６穴プレートのウェルへ１０μｌのウイルス粗溶解液を移す。この動作は、TECAN Freedom２００ピペッタの９６ニードルヘッドで実施する。各ウイルスは、２反復で分析する。このように、各３８４穴ウイルスライブラリーアリコートプレートのために、ＳＦを含む８つの９６穴プレートを感染させる。各ピペット操作段階の合間に、ピペッタの針を漂白洗浄場所で空にして、１７５μｌの漂白剤（５％）で２回、２００μｌの水で２回、最後に２００μｌのエタノール（２０％）で洗浄する。感染の約２４時間後に、細胞の培地を更新する。ウイルス及び培地はVacusafe（Integra）デ除去し、０．５％ＦＢＳを添加した６０μｌの新しいＭ１９９培地を加える。培地の更新の７２時間後に、TECAN Freedom２００ピペッタを用いて細胞上清を感染ＳＦを含む９６穴プレートから９６穴プレート（Ｖ底、Greiner）に移す。次いで、この試料について、小型化コラーゲンＩ型分解アッセイを実施する。このアッセイでは全体で１６７９の試料を２反復でスクリーニングし、これらは４４９の遺伝子に相当する。
【０１６８】
ヒット選択のために以下の分析を実施する：各スクリーニングバッチにつき、最大値の１０％及び最低値の１０％を除去した後、平均及び標準偏差を全ての試料について計算する。上記のように、スクリーニングされた各Ａｄ−ｃＤＮＡ試料について２つのデータポイントが得られる。両データポイントのスコアが平均プラス標準偏差の２倍よりも高い試料と同様に、２つのデータポイントの１つのスコアが平均プラス標準偏差の４倍よりも高いＡｄ−ｃＤＮＡ試料をヒットとして選択する。２反復でスクリーニングした９６のウイルス（１アッセイプレート）についてのスクリーニングで得られた結果の代表例を、図９に示す。各個々のウイルスについて、一次スクリーニングで得られた２つのデータポイント（Ａ及びＢ）を示す。ＣＡＳＰ１０及びＭＭＰ３の発現を媒介するウイルスを示す。試料について得られたシグナルは、下記式を用いて標準偏差及び平均と比較して表す：［平均からの標準偏差の倍数＝（試料値−平均値）／標準偏差］。ヒットコーリングのためのカットオフ（平均プラス標準偏差の２倍又は４倍）は、それぞれ実線又は点線で示す。スクリーニング結果を示した９６のＡｄ−ｃＤＮＡの中で、４つ（その内３つは選択基準に従って評価された）はＭＭＰ３の発現を媒介し、４つ（その内３つは選択基準に従って評価された）はＣＡＳＰ１０の発現を媒介した。冗長性を考慮すると７９の遺伝子に相当する１０８のＡｄ−ｃＤＮＡは、この方法に従ってヒットとして選択される。
【０１６９】
これらのヒットを再増殖させ、コラーゲン分解アッセイにおけるＭＭＰ１アッセイのヒットのスクリーニングのために記載した手法を用いて、再度スクリーニングする。１０８の一次ヒットの中で、２０の個々の遺伝子に相当する３１のヒットは、再スクリーニングでかなりのレベルのコラーゲンＩ型分解を媒介した。「ＭＭＰ１アッセイ」を通してヒットとして同定され、コラーゲン分解アッセイで実証された５５遺伝子の中の４つは、コラーゲン分解アッセイのＦｌｅｘＳｅｌｅｃｔ収集のサブセットのスクリーニングでヒットとして同定された２０の遺伝子にも存在するので、一次ヒトＳＦで発現又は活性化されるときコラーゲン溶解能力を増加させる合計７１の遺伝子が同定された。このアッセイで同定された好ましいヒット遺伝子を、表１に列記する。コラーゲン分解アッセイにおけるこれらの性能を、表４に要約する。
【表５】
2008502355.tif 000013
【０１７０】
（実施例５：ＲＡ患者の滑膜に由来するヒト一次滑膜線維芽細胞で同定されたターゲットの発現分析）
同定された全てのターゲットの発現量を、一次ヒト滑膜線維芽細胞の少なくとも３つの異なる分離株で測定する。
【０１７１】
ＲＡＳＦの１分離株を、Cell Applications Inc．から低温保存された２継代目の細胞として得る（カタログ番号４０４−０５）。これらの細胞を、１０％（ｖ／ｖ）熱不活化ＦＢＳ（ＩＣＮ）及び１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Invitrogen）を添加したＤＭＥＭ（Invitrogen）で培養して増殖させる。
【０１７２】
ＲＡと診断された患者の膝関節鏡検査法の間に得られた滑膜層生検材料を元に、他の２つの分離株を確立する。切除後、組織試料を１５％（ｖ／ｖ）熱不活化ＦＢＳ、１×ピルビン酸ナトリウム（Invitrogen）、１×抗生物質（Invitrogen）及び10%（v/v）DMSO（Sigma）を含むＤＭＥＭ（Invitrogen）中で凍結させて、液体窒素中で保存する。細胞培養は、以下の通りにこれらの滑膜組織試料から開始する。２×抗生物質を添加したハンクス均衡塩類溶液（Invitrogen）で組織を完全に洗浄し、１０％（ｖ／ｖ）熱不活化ＦＢＳ、１×ピルビン酸ナトリウム、２×抗生物質を含むＤＭＥＭ中で、３７℃で一晩、０．２％（ｖ／ｖ）ＩＶ型コラゲナーゼ（Invitrogen）で消化する。細胞を収集して洗浄し、増殖培地（１０％熱不活化ＦＢＳ、１×ピルビン酸ナトリウム、１×抗生物質を加えたＤＭＥＭ）中に再懸濁して、最後に６穴組織培養プレートの３つの異なるウェルにプレーティングする。非付着細胞は、３日後に増殖培地を変えることによって除去する。細胞が９０〜９５％の密集度に到達したとき、それらをトリプシン処理（０．２５％トリプシン／１ｍＭ  ＥＤＴＡ）によって収集し、２５ｃｍ２の組織培養フラスコへ継代する。１／３分割によって更なる継代培養を行い、増殖培地は週に２回変更する。発現分析のためには、細胞は６〜１０の継代培養で用いる。
【０１７３】
ＲＮＡ調製のためには、一次ヒト滑膜線維芽細胞を１０ｃｍペトリ皿（５００，０００細胞／皿）に接種する。一晩インキュベーションの後、培地を１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含む１％（ｖ／ｖ）熱不活化ＦＢＳを加えた６ｍｌのＭ１９９培地に更新する。２４時間後に、「SV Total RNA Isolationキット」（Promega）を用いて全ＲＮＡを抽出する。収集する前に特定の試料を刺激する。この場合、収集する前の２４時間、以下の培地を皿に加える：組換えヒトＴＮＦα（２５ｎｇ／ｍｌ）により、Ｍ１９９培地＋新しいＭ１９９＋１％ＦＢＳ中で２倍希釈した１％ＦＢＳの液中で７２時間誘起したＴＨＰ１細胞（ヒト単核球性細胞系）の上清。
【０１７４】
各試料中のＲＮＡ濃度は、「Ribogreen  ＲＮＡ定量キット」（Molecular Probes）を用いて蛍光定量的に定量化する。各調製物からのＲＮＡの同程度の量を、Applied Biosystemsからの「Taqman逆転写キット」で第１の鎖のｃＤＮＡに逆転写する。つまり、４０ｎｇのＲＮＡが、５０ｐｍｏｌのランダム六量体、１０Ｕのリボヌクレアーゼ阻害剤、２５ＵのMultiscribe逆転写酵素、５ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．５ｍＭの各ｄＮＴＰを含む反応混合物の各２０μｌに含まれる。反応混合物は２５℃で１０分間インキュベートし、続いて４８℃で３０分間のインキュベーション、及びサーモサイクラー（Dyad、MJ Research）内での逆転写酵素の熱失活（９５℃で５分間）を実施する。反応液は、プログラムの終了直後に４℃に冷やす。得られたｃＤＮＡの複数回の凍結／解凍サイクルを避けるために、異なる試料を９６穴プレートに貯留して等分し、−２０℃で保存する。
【０１７５】
リアルタイムＰＣＲ反応を実施して、「ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７０００配列検出システム機器」（Applied Biosystems）を用いて監視する。プライマーは「Primer Expressソフトウェアバージョン２．０」（Applied Biosystems）で設計され、Sigma-Genosysから購入した。プライマーの特異性は、BLASTN検索によって確認する。ＰＣＲ混合物は、１×Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒミックス（Applied Biosystems）、７．５  ｐｍｏｌの順方向プライマー及び逆方向プライマー、及び２μｌの逆転写反応生成物からなり、総容積は２５μｌである。９５℃で１０分間の最初の変性段階の後、ｃＤＮＡ生成物を９５℃で１５秒、及び６０℃で１分間からなるサイクルを４０回繰り返して増幅し、その後６０〜９５℃のスローランプと規定される解離プロトコルを実施する。非特異的増幅を除外するために、解離プロトコルを用いて、各種遺伝子のＰＣＲ反応で単一のピークを確認する。異なる試料間でのｃＤＮＡの初期量の変動を標準化するために、ヒト１８Ｓ  ｒＲＮＡ及び「Taqman  Universal  ＰＣＲ  Mastermix  ｎｏ  ＡｍｐＥｒａｓｅ  ＵＮＧ」のために自家製β−アクチンプライマー及びＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、又は「前開発したプライマー及びTaqmanプローブミックス」（全てApplied Biosystems）をメーカーの説明書に従って用いて、ハウスキーピング遺伝子β−アクチン／１８Ｓ  ｒＲＮＡについて同じｃＤＮＡを用いた増幅反応を実施する。残留ゲノムＤＮＡから生じるいかなる汚染を同定するために、各試料について、逆転写酵素を添加しなかった以外は同じ条件下で実施した対照（−ＲＴ）の逆転写反応からの生成物に対する、リアルタイムＰＣＲ反応が含まれる。閾値サイクル値（Ｃｔ）、すなわち、関心の増幅遺伝子の量が一定の閾値に到達したサイクル数を、各試料について測定する。各試料について、内因性対照（β−アクチン）のＣｔ値を標的遺伝子で得たＣｔ値から引き算することによって、ΔＣｔ値を決定する。活性化されているか否かにかかわらず入手できる３つの滑膜分離株の少なくとも１つにおいて、このヒットで得たΔＣｔ値が１３．３のように低いならば、遺伝子は一次ヒトＳＦで発現されるとみなす。発現プロファイリング実験の結果を、表５に要約する。誘起されていないＳＦ又は２５％「複合サイトカイン混合物」で誘起されたＳＦにおける全ての標的遺伝子（表１で列記される）について得られたβ−アクチンと比較したＤＣｔ値は、この表５で示す。この研究で用いたプライマーを、表２に列記する。
【表６】
2008502355.tif 000014
【０１７６】
（実施例６Ａ：ｓｉＲＮＡ技術を用いて同定されたターゲットの試験）
ＳＦにおけるアデノウイルスの発現又は因子の活性化がこれらの細胞のコラーゲン分解能力を増加させるときは、この因子の活性化はこれらの細胞によるコラーゲン分解を増加させるのに十分である。このことは、その因子がＭＭＰ１及び／又はコラーゲン分解に関係する他のプロテアーゼの調節にとって重要な情報伝達経路を制御するか、それらに働きかけをしていることを示す。しかし、因子がＭＭＰ１の発現又はコラーゲン分解に不可欠であることを確認するために、以下の「逆ＭＭＰ１アッセイ」実験を実施する。これらの実験は、ターゲットタンパク質の抑制がサイトカイン誘導性のＭＭＰ１発現、コラーゲン分解を低減し、したがってＥＣＭ分解が関与する疾患に治療効力を有するかどうかを判断する上で重要である。
【０１７７】
このアッセイでは、ＳＦ内で過剰発現又は活性化されたときに、ＭＭＰ１を発現するかコラーゲンを分解するこれらの細胞の効力を増加させるターゲット遺伝子に対応する複数の「ノックダウン」ウイルスを用いた。特定の「ノックダウン」ウイルスは、「ＭＭＰアッセイ」でFlexSelect収集のスクリーニングを通して同定されない他の３つの標的遺伝子（ＭＡＰＫＡＰＫ５、ＦＸＹＤ５及びＦＺＤ４）に対しても設計される。「ノックダウン」ウイルスは、自己相補性一本鎖ｓｉＲＮＡ分子ポリヌクレオチドの発現を起動し、結果として標的ポリペプチドをコードする対応するｍＲＮＡレベルを減少させるアデノウイルスと定義される。ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、ターゲットポリペプチドをコードする遺伝子配列に基づいて設計され、ｓｉＲＮＡ設計規則に適合しないヌクレオチド配列と比較して標的配列の発現の減少が改善されたこれらのｓｉＲＮＡ設計規則に従って選択されるPCT/EP03/04362を参照）。必ずしも全てのｓｉＲＮＡが与えられたターゲット遺伝子のｍＲＮＡレベルの低減に有効ではないので、複数のウイルスを生成して各ターゲット遺伝子について試験する。
【０１７８】
ＳＦを３８４穴又は９６穴プレートに接種し、ＳＦ  ＭＭＰ１発現又はＳＦコラーゲン分解を調整するプレーヤーとして同定された標的に対して生成されたノックダウンウイルスを様々なＭＯＩで感染させる。感染から５日後の、ＳＦ中の標的ｍＲＮＡのレベルがノックダウンウイルスによって有効に低減された時点で、ＳＦを関節炎の分野に関連した作動因子又は作動因子の混合物で「活性化」する。非感染ＳＦ、又は対照のノックダウンウイルスに感染したＳＦでは、この作動因子又は作動因子の混合物は、ＭＭＰ１の発現及びコラーゲンを分解させる細胞の能力の増加を導く。
【０１７９】
作動因子の適用の２日後に、ＳＦの上清中のＭＭＰ１のレベルをＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡで測定するか、又は、ＳＦの上清によるコラーゲン分解をコラーゲン分解アッセイで測定する。ある標的遺伝子の発現量の減少が、適用したＲＡ関連の作動因子に対する細胞反応の低下を導くならば、それはＳＦがこの作動因子に応答するためにこの標的遺伝子が不可欠なことを示す。したがって、この遺伝子のポリペプチド生成物の活性の抑制、又はこの遺伝子の発現の減少は、ＲＡの治療のための適当な手法を表すかもしれない。
【０１８０】
偏りのない研究のために、ＲＡの分野に関連した因子の複合混合物を、以下の通りに生成する：代表的なヒト単球細胞系であるＴＨＰ−１細胞を、ヒト組換えＴＮＦα（Ｓｉｇｍａ、２５ｎｇ／ｍｌ）の存在下で４８時間培養する。この細胞系の上清を次に収集して、更なる使用まで−８０℃で保存する。単球はＴＮＦアルファ作動因子に対して他の様々なサイトカイン及び因子を産生することによって応答するが、そのほとんどは炎症誘発性である。高レベルのＴＮＦアルファに加えて単球（マクロファージ）もＲＡ患者の罹患関節に存在するので、このように産生された作動因子混合物はＲＡの分野に関連し、ＲＡ患者の関節に存在する因子混合物を代表するものである。産生された混合物はまさに複合体であって、ＲＡに関係することが未知の因子又は現在まで知られていない因子さえも含むかもしれないので、この方法の偏りがない特徴は重要な利点を意味する。
【０１８１】
図１０の白色バーは、ＲＡの分野に関連するサイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ１β及びＯＳＭ）又はそれらの組合せによる処理後のＳＦ  ＭＭＰ１の発現の増加を示す。この実験のために、ＳＦを９６穴プレートに３０００細胞／ウェルで接種する。２４時間後、培地は１％ＦＢＳを添加したＭ１９９培地に交換する。培地交換の１日後、サイトカイン又はそれらの組合せを、各サイトカインが２５ｎｇ／ｍｌの最終濃度になるように培養物に加える。サイトカイン添加の７２時間後に上清を収集して、ＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡで処理する。この実験と平行して、未処理のままの、又は同じサイトカイン若しくはサイトカインの組合せによりＭ１９９培地＋１％ＦＢＳ中で４８時間処理されたＴＨＰ１細胞の上清（Ｍ１９９＋１％ＦＢＳで２倍に希釈）を用いて、同じプロトコルによりＳＦを誘起する。これらの試料のＭＭＰ１レベルは、図１０に灰色バーで示す。ＴＮＦα処理ＴＨＰ１細胞の上清によるＭＭＰ１発現レベルの誘導は、組換えＴＮＦα単独による誘導（３倍の誘導）と比較して強く（＞４．５倍の誘導）、３つの精製サイトカイン（ＴＮＦアルファ、ＩＬ１β、ＯＳＭ）の混合物によって得られる誘導のほぼ５倍に等しい。この結果は、ＴＮＦα誘導ＴＨＰ１細胞の上清が、ＭＭＰ１産生の方へＳＦを誘導する更なる炎症誘発因子を含むことを示す。
【０１８２】
他の実験では、ＴＮＦα誘起ＴＨＰ１細胞のＳＮ（上清）に対するＳＦの反応の抑制を調査する。ＳＦを３８４穴プレートに１５００細胞／ウェルで接種し、感染させずにそのままにするか、対照のノックダウンウイルスＡｄ５−ｅＧＦＰ＿ＫＤ又は対照のノックインウイルスＡｄ５−ＭＭＰ１に感染させる。感染から１日後、古典的な消炎剤デキサメサゾン及びＳＢ２０３５８０（ｐ３８アルファ及びｐ３８ベータ（ＴＮＦα及び他のサイトカインに対する細胞の反応に関係するキナーゼ類）の阻害剤、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍで購入、１００％ＤＭＳＯに溶解）を、ＴＮＦα活性化ＴＨＰ１細胞のＳＮの２倍希釈液で細胞を誘起する１時間前に、それぞれ１００ｎＭ及び５μＭの最終濃度でＳＦ培養物に加える。処理の７２時間後にＳＮを収集して、ＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡを実施する。結果を図１１に示す：ＳＦは感染させずにそのままにするか、対照のノックインウイルス（Ａｄ５−ＭＭＰ１＿ＫＩ）又は対照のノックダウンウイルス（Ａｄ５−ｅＧＦＰ＿ＫＤ）に感染させる。ＭＭＰ１レベルに比例する生の発光シグナルを示す。
【０１８３】
細胞の誘起は、ＭＭＰ１発現の６倍の増加を導いた。さらに高いＭＭＰ１レベルがＡｄ５−ＭＭＰ１に感染させた試料で測定され、このことはＴＨＰ１  ＳＮ誘導のＭＭＰ１レベルはＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡを飽和させるものではないことを示す。デキサメサゾン及びＳＢ２０３５８０で処理した試料で得られたＭＭＰ１レベルは、対照レベルよりもそれぞれ４倍及び３倍低く、このことは設定されたアッセイがＳＦの炎症性反応の阻害剤の同定に適当なことを示す。ＳＦにおける遺伝子発現の有効な減少は、ノックダウンウイルスを用いるＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）又はｓｉＲＮＡ二重鎖のトランスフェクションで得られる。
【０１８４】
（実施例６Ｂ：Ａｄ−ｓｉＲＮＡによるターゲット遺伝子のｍＲＮＡ発現の減少の分析）
一次ヒト滑膜線維芽細胞を、ゼラチンでコーティングした６穴プレート内の１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Invitrogen）を添加した２ｍｌの滑膜増殖培地（Cell Applications Inc.）に接種する（７５，０００細胞／ウェル）。一晩インキュベーションの後、細胞を対象とする遺伝子を標的にするＡｄ５−ｓｉＲＮＡに３０００のＭＯＩで感染させる。陰性対照として、他のウェルを、蛍ルシフェラーゼ遺伝子を標的にするＡｄ５−ｓｉＲＮＡに同じＭＯＩで感染させる。感染から５日後、培地を１％（ｖ／ｖ）熱不活化ＦＢＳを加えた２ｍｌのＭ１９９培地に更新する。同時に、Ｍ１９９＋１％ＦＢＳで２倍に希釈した「複合サイトカイン混合物」の溶液の２ｍｌで培地を更新することによって、並行試料を刺激する。４８時間後に、「SV Total RNA Isolationキット」（Promega）を用いて全ＲＮＡを抽出する。ＲＮＡを定量して、実施例５で記載されているようにｃＤＮＡを調製する。各試料について、ターゲット及び１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子についてリアルタイムＰＣＲ反応を実施して、ΔＣｔ値を実施例５で前述の通り計算する。Ａｄ５−ｓｉＲＮＡによる感染の後に内因性のターゲットｍＲＮＡのノックダウン率を計算するために、方程式：相対発現＝２ΔΔＣｔとΔΔＣｔ＝ΔＣｔ（Ａｄ５−ルシフェラーゼ−ｖ１３＿ＫＤに感染させた試料）−ΔＣｔ（ターゲット特異的Ａｄ５−ｓｉＲＮＡに感染させた試料）、を用いて、先ずＡｄ５−ルシフェラーゼ−ｖ１３＿ＫＤウイルスに感染させた対照試料と比較して値を表す。ＤＣｔ値は、実施例５で示すようにβ−アクチンと比較しての発現を示す。表６は、大部分の選択されたＡｄ５−ｓｉＲＮＡによる感染後の、細胞が「複合サイトカイン混合物」で刺激されたかどうかに関係のない、ターゲットｍＲＮＡの６０％を超える減少を示す。略記号「Ｒｅｌ  Ｅｘｐｒ」は、相対発現を意味する。
【表７】
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【０１８５】
（実施例６Ｃ：Ａｄ−ｓｉＲＮＡウイルスは、ＭＡＰＫＡＰＫ５、ＰＲＫＣＥ及びＣＡＭＫ４の発現をタンパク質レベルでノックダウンする働きをする。）
図１４は、ヒト細胞でターゲット遺伝子（ＰＲＫＣＥ、ＭＡＰＫＡＰＫ５及びＣＡＭＫ４）の発現をタンパク質レベルで減少させるＡｄ−ｓｉＲＮＡの機能を例示する。
ＭＡＰＫＡＰＫ５、ＰＲＫＣＥ及びＣＡＭＫ４を標的にするｓｉＲＮＡの発現を媒介する組換えアデノウイルスは、国際公開03/020931で記載されている手法によって生成する。それらに基づいてｓｉＲＮＡが設計され組換えアデノウイルスを生成するために用いたこれらの遺伝子内の標的配列を、表３に列記する。
【０１８６】
ＭＡＰＫＡＰＫ５を標的にするアデノウイルスの機能は、以下の通りに試験する。１日目に、５００，０００の一次ヒトＳＦを各ペトリ皿に接種する。１日後、４０００のＭＯＩ（それらのウイルスについてＱ−ｒｔ−ＰＣＲによって規定された力価（ｍｌあたりのウイルス粒子数）に基づく）で、Ａｄ５−ＭＡＰＫＡＰＫ５−ｖ２＿ＫＤ、Ａｄ５−ＭＡＰＫＡＰＫ５−ｖ８＿ＫＤ又はＡｄ５−ｅＧＦＰ−ｖ５＿ＫＤに細胞を感染させる。７日目に、トリプシンＥＤＴＡ溶液を用いる標準の手順により、細胞をペトリ皿から分離する。次に１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ増殖培地を加えて、トリプシンを中和する。次に、細胞を遠心工程（１０００ｒｐｍ、５分）により収集する。ペレットを、１００μｌの新しいＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭトリスｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％デオキシコレート、１％トリトンＸ１００、０．１％ＳＤＳ）に溶解する。次に試料を１０秒間超音波処理する。次に、業者によって説明されているようにＢＣＡキット（Pierce、カタログ番号23227）を用い、ＢＳＡを標準として用いて試料のタンパク質濃度を測定する。ＲＩＰＡ緩衝液で１９．５μｌに希釈した３０μｇの細胞溶解物に対し、３．５μｌの還元剤（ＮｕＰａｇｅ還元剤Ｎｏ１０、Invitrogen  ＮＰ０００４）及び７．５μｌの試料緩衝液（ＮｕＰａｇｅ  ＬＤＳ試料緩衝液、Invitrogen  ＮＰ０００７）を加える。次に３０μｌの試料を５分間沸騰して、１０％ポリアクリルアミドゲル（Invitrogen  ＮＰ０３０１）上に加える。次にゲルを、１×ＭＯＰＳ／ＳＤＳ  ＮｕＰａｇｅ流動緩衝液（Invitrogen  ＮＰ００１）中で１００Ｖで２時間流す。ゲル上のタンパク質の大きさを推定するために、１０μｌのSeablue Plus Prestained標準（Invitrogen  ＬＣ５９２５）を用いる。次にゲル上のタンパク質を、１００ｍｌのＮｕＰａｇｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ緩衝液２０＊（ＮＰ０００６−１）、４００ｍｌメタノール及び１５００ｍｌのＭｉｌｌｉ  Ｑ水を混ぜることによって調製したトランスファー緩衝液を用いてウェットブロッティング法により、ＰＶＤＦ膜（Invitrogen  ＬＣ２００２）の上に移す。移動の前に、膜はメタノール及びトランスファー緩衝液に先ず浸漬する。移動は、１００Ｖで９０分間実施する。次に膜を３０分間ブロック緩衝液（PBST（0.1%ツイーン20添加PBS（Sigma、Ｐ１３７９））で調製した２％ブロックパウダー（Amersham、ＲＰＮ２１０９））に浸漬してブロックする。ブロックした後に、ブロック緩衝液で２５０倍に希釈したＭＡＰＫＡＰＫ５に対するマウスモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号６１２０８０）を用いて、免疫検出を実施する。この一次抗体との一晩のインキュベーションの後、膜を３回ＰＢＳＴで洗浄して、ブロック緩衝液で５００００倍に希釈した二次抗体（（ポリクローナルヤギ抗マウスＩｇ、ＨＲＰ標識（ＤＡＫＯ  Ｐ０４４７））と１時間インキュベートする。次にブロットを３回ＰＢＳＴで洗浄し、メーカーの説明に従ってKodakimager上のＥＣＬアドバンス（ＲＰＮ２１０９、Amersham）で検出を実施する。ウェスタンブロット法は、Ａｄ５−ｅＧＦＰ−ｖ５＿ＫＤ陰性対照ウイルスに感染した細胞と比較して、Ａｄ５−ＭＡＰＫＡＰＫ５−ｖ２＿ＫＤ及びＡｄ５−ＭＡＰＫＡＰＫ５−ｖ８＿��Ｄ感染細胞内での低いＭＡＰＫＡＰＫ５発現量を明らかにした。３０μｇ試料の等量の添加は、「ストリッピング手法」（ＰＢＳＴ中で膜を５分間沸騰）によるＭＡＰＫＡＰＫ５抗体の除去後、β−アクチンの免疫検出によって実証する。β−アクチンの免疫検出はＭＡＰＫＡＰＫ５検出のために記載した方法で実施するが、一次抗体としてβ−アクチンに対するヤギポリクローナル抗体（Santa Cruz、ＳＣ-１６１５）を１０００倍希釈で、及び二次抗体としてウサギ抗ヤギ抗体を５００００倍希釈で用いる。この実験の結果を、図１４Ｃに示す。
【０１８７】
ＰＲＫＣＥを標的にするアデノウイルス（Ａｄ５−ＰＲＫＣＥ−ｖ１１＿ＫＤ）の機能はＭＡＰＫＡＰＫ５のために上述したものと同じプロトコルに従って試験するが、細胞の感染のために２０００のＭＯＩを用いることが異なる。ウェスタンブロット手法は、ＭＡＰＫＡＰＫ５の検出のために記載したものと同じであるが、ＰＲＫＣＥ特異抗体（BD Biosciences、カタログ番号６１００８５）を２５０倍希釈で用いた点が異なる。ＭＡＰＫＡＰＫ５の検出に関しては同じ二次抗体を用いる。結果を図１４Ｂに示す。
【０１８８】
ＣＡＭＫ４を標的にするアデノウイルスの機能は、以下の通りに試験する：これらのアデノウイルスを用いて、以下の通りに６穴プレートで培養されたＨｅｋ２９３Ｔ細胞を感染させる。１日目に、４０００００のＨｅｋ２９３Ｔ細胞を各６穴プレートのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ内に接種する。１日後、５００（それらのウイルスについてＱ−ｒｔ−ＰＣＲによって定義された力価（ｍｌあたりのウイルス粒子数）に基づく）のＭＯＩ（感染多重度）で、Ａｄ５−ＣＡＭＫ４−ｖ１＿ＫＤ、ＣＡＭＫ４−ＣＡＭＫ４−ｖ９＿ＫＤ又はＡｄ５−ｅＧＦＰ−ｖ５＿ＫＤで細胞を感染させる。感染から１日後、培地を更新する。７日目に、トリプシンＥＤＴＡ溶液を用いる標準の手順により、細胞をペトリ皿から分離する。細胞ペレット、ゲルの流動／ブロッティング及び免疫検出手法の取扱いはＭＡＰＫＡＰＫ５のために記載したものと同じであるが、４０μｇのタンパク質をゲル上に加え、ＣＡＭＫ４に対するマウスモノクローナル抗体（Santa Cruz、Ｓｃ−１７７６２、ブロック緩衝液で１００倍に希釈）を用いることが異なる。ウェスタンブロット法は、Ａｄ５−ｅＧＦＰ−ｖ５＿ＫＤ陰性対照ウイルスに感染した細胞と比較して、Ａｄ５−ＣＡＭＫ４−ｖ１＿ＫＤ及びＡｄ５−ＣＡＭＫ４−ｖ９＿ＫＤ感染細胞内での低いＣＡＭＫ４発現量を明らかにする。３０μｇ試料の等量の添加を、「ストリッピング手法」によるＣＡＭＫ４抗体の除去後、β−アクチンの免疫検出によって実証する。この実験の結果を、図１４Ａに示す。
これらの実験は、Ａｄ−ｓｉＲＮＡウイルスがヒト細胞で対応するＭＡＰＫＡＰＫ５、ＣＡＭＫ４及びＰＲＫＣＥのポリペプチドの発現レベルを低減する働きをすることを証明する。
【０１８９】
（実施例６Ｄ：一次ＳＦにおけるＡｄ−ｓｉＲＮＡによる様々なターゲット遺伝子の発現の減少は、ＳＦ誘導性のＭＭＰ１発現を抑制する。）
図１２は、ターゲット遺伝子の発現を低減するＡｄ−ｓｉＲＮＡによるサイトカイン誘導性のＳＦ  ＭＭＰ１発現の減少を例示する。これらのＡｄ−ｓｉＲＮＡは、国際公開03/020931で記載されている手法によって生成する。それらに基づいてｓｉＲＮＡが設計され組換えアデノウイルスを生成するために用いたこれらの遺伝子内の標的配列（ＫＤ  ＳＥＱ）を、表３に列記する。
【０１９０】
「ＭＭＰアッセイ」におけるＡｄ５−ｓｉＲＮＡの効力は、以下の通りに試験する。１日目に、ＳＦ（継代培養９〜１０）を３０００細胞／ウェルの密度で９６穴プレートの完全滑膜増殖培地（Cell Applications）に接種する。１日後、細胞を次第に多くなる量（図１２Ａで示す実験では３、７．５、１２又は１５μｌ、図１２Ｂで示す実験では３、６、９、１２及び、１５μｌ、また、図１２Ｃ及び１２Ｄで示す実験では３、６、９及び１２μｌ）のＡｄ−ｓｉＲＮＡで感染させる。以下のウイルスを陰性対照として用いる。Ａｄ５−ｅＧＦＰ−ｖ５＿ＫＤ、Ａｄ５−ルシフェラーゼ−ｖ１３＿ＫＤ及びＡｄ−Ｍ６ＰＲ−ｖ１＿ＫＤ。Ａｄ５−ＭＭＰ１−ｖ１０＿ＫＤを陽性対照ウイルスとして用いる。ウイルス負荷を中性ウイルスＡｄ５−ルシフェラーゼ−ｖ１３＿ＫＤの添加によって矯正し、細胞上の最終ウイルス量を各ウェルで１５μｌにする。この矯正により、観察された影響が細胞に加えられたウイルス負荷の差から生じるものではないことが保証される。次に、活性化段階の前に細胞を５日間インキュベートする。この段階は、２５μｌの「複合作動因子」を添加した７５μｌのＭ１９９培地による、各ウェルの増殖培地の置換を含む。活性化段階から４８時間後、上述のように上清を収集してそれに対してＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡを実施する。
【０１９１】
この実験の結果を、図１２Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤに示す。２反復のデータポイントの平均を、これらの図に示す。実験の品質は、ＭＭＰ１自体を標的にするＡｄ−ｓｉＲＮＡウイルスの効力によって示される。この陽性対照ウイルスはＳＦによるＭＭＰ１発現を強く低減するが、ルシフェラーゼ、Ｍ６ＰＲ及びｅＧＦＰの発現を標的にするように設計された陰性対照ウイルスは、予想通りＭＭＰ１の発現レベルに影響しない。ターゲット遺伝子（ＧＰＲ２１、ＦＺＤ４、ＴＭ７ＳＦ１、ＰＧＰＥＰ１、ＳＥＰＴ１、ＣＤ７２、ＦＸＹＤ５（図１２Ａ．）；ＰＲＫＣＥ、ＣＡＭＫ４、ＭＡＰＫＡＰＫ５（図１２Ｂ．）；ＲＩＰＫ２、ＲＩＴ１（図１２Ｃ．）及びＰＰＳＴ１、ＵＳＰ２１及びＳＴＫ２４（図１２Ｄ．））に対して設計されたＡｄ−ｓｉＲＮＡは、一次ヒトＳＦによる複合作動因子によって誘導されたＭＭＰ１発現の明らかな減少も導く。特定のターゲット遺伝子（例えばＣＡＭＫ４、ＭＡＰＫＡＰＫ５）については、２つの独立したＡｄ−ｓｉＲＮＡがＳＦによるサイトカイン誘導性のＭＭＰ１発現を減少させる効力を示した。図１２Ａ及びＢではＭＭＰ１発現レベルを生データ（ＲＬＵ）で示すが、図１２Ｃ及び１２Ｄでは、ＭＭＰ１発現レベルを１００％に設定したＡｄ５−ルシフェラーゼ−ｖ１３＿ＫＤだけで感染させた試料と比較して表す。
【０１９２】
大部分のターゲット遺伝子については、各ターゲット遺伝子について設計された５つのＡｄ−ｓｉＲＮＡの少なくとも１つは、ＳＦによるサイトカイン誘導性のＭＭＰ１発現の減少を媒介した。ＭＫＮＫ１及びＣＡＳＰ１０の場合はそうではなかった。ＵＳＰ２１及びＭＳＴ３で観察された影響はより弱かった。
これらの遺伝子はＳＦでＭＭＰ１の発現を調整することが示される価値ある薬剤標的を代表することが、この実験から結論することができる。同様に、小分子化合物によるこれらの遺伝子のタンパク質生成物の活性の抑制は、「ＭＭＰアッセイ」において「複合サイトカイン」誘導性のＭＭＰ１発現を低減することが予想される。小分子化合物によるこれらの遺伝子のタンパク質生成物の活性の抑制は、ＲＡと関連する関節の分解を低減することも予測される。
【０１９３】
（実施例６Ｅ：一次ＳＦにおけるＡｄ−ｓｉＲＮＡによるＭＡＰＫＡＰＫ５及びＣＡＭＫ４の発現の減少は、サイトカイン誘導性のコラーゲン分解を抑制する）
この実験では、未変性コラーゲンの分解はＭＭＰ１と異なるプロテアーゼの作用によるかもしれないので、ＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡよりもさらにストリンジェントである、コラーゲンＩ型のサイトカイン誘導性の分解を低減するＡｄ−ｓｉＲＮＡの能力を測定する。この実験で用いるＡｄ−ｓｉＲＮＡを、国際公開03/020931に記載されている手法に従って生成する。この実験で用いる組換えＡｄ−ｓｉＲＮＡは、表３で列記した標的遺伝子の標的配列に基づいて生成した。
【０１９４】
上記「小型化未変性コラーゲンＩ型分解アッセイ」におけるＡｄ５−ｓｉＲＮＡの効力は、以下の通りに試験する：１日目に、ＳＦ（継代培養９〜１０）を３０００細胞／ウェルの密度で９６穴プレートの完全滑膜増殖培地（Cell Applications）に接種する。１日後に、細胞を次第に増加する量（３、６、９、１２及び１５μｌ）の図で示したＡｄ−ｓｉＲＮＡで感染させる。以下のウイルスを陰性対照として用いる：Ａｄ５−ｅＧＦＰ−ｖ５＿ＫＤ及びＡｄ５−ルシフェラーゼ−ｖ１３＿ＫＤ。ウイルス負荷を中性ウイルスＡｄ５−ルシフェラーゼ−ｖ１３＿ＫＤの添加によって矯正し、各ウェルに加える最終ウイルス量を１５μｌにする。この矯正により、観察された影響が細胞に加えられたウイルス負荷の差から生じるものではないことが保証される。次に、活性化段階の前に細胞を５日間インキュベートする。この段階は、１５μｌの「複合作動因子」を添加した４５μｌのＭ１９９培地による、各ウェルの増殖培地の置換を含む。４日後に上清を収集して、前記プロトコルに従って小型化コラーゲンＩ型分解アッセイを実施する。この実験の結果を、図１５に示す。
【０１９５】
ルシフェラーゼ及びｅＧＦＰの発現を標的にするように設計された陰性対照ウイルスは、予想通りコラーゲン分解のレベルに影響しない。ＭＡＰＫＡＰＫ５及びＣＡＭＫ４を標的にするＡｄ−ｓｉＲＮＡは、一次ヒトＳＦによる複合作動因子誘導性のコラーゲン分解の明らかな減少を媒介する。これらの遺伝子は、ＳＦによるコラーゲン分解を調整することが示される価値ある薬剤標的を代表することが、この実験から結論することができる。同様に、小分子化合物によるこれらの遺伝子のタンパク質生成物の活性の抑制は、ＳＦによる「複合サイトカイン」誘導性のコラーゲン分解を低減することが予想される。小分子化合物によるこれらの遺伝子のタンパク質生成物の活性の抑制は、ＲＡと関連する関節の分解を低減することも予測される。類似した実験では、Ａｄ５−ＭＭＰ１−ｖ１０＿ＫＤウイルスは、ＳＦによるサイトカイン誘導性のコラーゲン分解を大きく低減することが示され、そのことは、ＭＭＰ１自体がＳＦによるサイトカイン誘導性のコラーゲン分解を担う主なコラゲナーゼであるという事実を意味する。このように、このことは、ＲＡと関連する軟骨の分解を低減するために、ＳＦによるＭＭＰ１発現を調整することが十分であることを意味する。
【０１９６】
（参考文献）
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Vincenti MP, Brinckerhoff CE. (2002). Arthritis Res 4:157-64
【０１９７】
前述の記載は本来例示的及び説明的であり、本発明及びその好ましい実施形態を例示することが目的であることを、当業者は理解されよう。日常の実験を通して、本発明の精神から逸脱することなく加えることができる明らかな修正及び変更を、当業者は認めるであろう。このように、本発明は、上記の記載によってではなく、前記請求項及びそれらの同等物によって規定されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１９８】
【図１】正常関節及び関節リウマチにおけるその変化の略図である（Smolen及びSteiner、2003、から）。
【図２】滑膜線維芽細胞によるＭＭＰ１発現の特徴を示す図である。パネルＡでは、ＳＦ溶解物に存在するＭＭＰ１のｍＲＮＡレベルは、リアルタイムＰＣＲで測定される。これらのＭＭＰ１レベルは、同じ試料についてリアルタイムＰＣＲによっても測定される１８Ｓレベルに標準化される。パネルＢは、ＭＭＰ１特異的ポリクローナル抗体を用いて、ＭＭＰ１タンパク質レベルの検出のためにウェスタンブロット法にかけた上清から検出されるＭＭＰ１シグナルを示す。パネルＣは、上清を市販のＭＭＰ１「活性ＥＬＩＳＡ」（Amersham Biosciences）にかけた結果を示す。表したシグナルは、試験試料に存在するＭＭＰ１活性に比例する。
【図３】様々なモデルアデノウイルスで引き起こされた、ＳＦによるＭＭＰ１の発現の増加を示す図である。ＳＦ上清の非感染性ＳＦ及び示したモデル組換えアデノウイルスに感染したＳＦをＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡにかけ、発光生成基質を用いて測定したＭＭＰ１レベルを示す。
【図４】ＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡアッセイのために作製された対照プレートのレイアウト及び性能を示す図である。
【図５】１次スクリーン（Ａ）及び再スクリーン（Ｂ）で２反復で試験したＦｌｅｘＳｅｌｅｃｔ集団の３８４のＡｄ−ｃＤＮＡのサブセットで実施したＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡの性能の代表例を示す図である。
【図６】コラーゲン分解アッセイの規模縮小を示す図である。
【図７】コラーゲン分解アッセイ読み出し情報と、コラーゲン分解の視覚評価との突き合わせを示す図である。
【図８】コラーゲン分解アッセイでの、ＦＩＴＣ標識コラーゲンＩＩ型及びＦＩＴＣ標識コラーゲンＩ型の分解の比較を示す図である。
【図９】コラーゲン分解アッセイの性能を示す図である。
【図１０】様々な複合サイトカイン混合物によるＳＦの活性化を示す図である。表示の組換えサイトカイン又は表示のサイトカインで活性化されたＴＨＰ１細胞の上清を用いて引き起こされてから７２時間後に収集されたＳＦの上清のＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡ測定値からの生の発光シグナルを示す。これらの測定値は、ＭＭＰ１レベルに比例する。
【図１１】２つの阻害剤による複合サイトカイン混合物に対するＳＦの反応の抑制を示す図である。
【図１２】様々な「ノックダウン」ウイルスによる感染による、複合サイトカイン混合物への反応としてのＳＦによるＭＭＰ１の発現の抑制を示す図である。
【図１３】標的遺伝子のアデノウイルス媒介性発現によるＳＦによるＭＭＰ１の発現の誘導を示す図である。
【図１４】これらの遺伝子を標的する様々なＡｄ−ｓｉＲＮＡウイルスによる細胞の感染による、ＭＡＰＫＡＰＫ５、ＰＲＫＣＥ及びＣＡＭＫ４の発現のタンパク質レベルでの減少を示す図である。
【図１５】様々な「ノックダウン」ウイルスによる細胞の感染による、複合サイトカイン混合物への反応としてのＳＦによるコラーゲン分解の抑制を示す図である。
【図１６】ヒト受容体相互作用セリンスレオニンキナーゼ２（ＲＩＰＫ２）ｍＲＮＡを標的にしたショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の構造を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年6月28日(2007.6.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分解を抑制する化合物の同定方法であって；
化合物を、配列番号２７〜５１及び２３２〜２９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させること；及び
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分解に関係する化合物−ポリペプチド特性を測定することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記ポリペプチドがインビトロ無細胞調製物内にある、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドが哺乳動物細胞に存在する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記特性が、前記ポリペプチドに対する前記化合物の結合親和性である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記特性が、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分解の指標となる生化学的マーカーを産生する生物学的経路の活性化である、請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記指標がＭＭＰ１である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、配列番号２７〜５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記化合物が、市販のスクリーニングライブラリーの化合物、及び配列番号２７〜５１及び２３２〜２９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと結合親和性を有する化合物からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記化合物がファージディスプレイライブラリー又は抗体断片ライブラリーのペプチドである、請求項２記載の方法。
【請求項１０】
アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）からなる群から選択される細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分解を抑制する薬剤であって、配列番号１〜２５からなる群から選択される核酸配列の約１７から約３０の連続したヌクレオチドの天然ポリヌクレオチド配列と相補的であるか、又はそれから操作された核酸配列を含む、前記方法。
【請求項１１】
哺乳動物細胞のベクターが前記薬剤を発現する、請求項１０記載の薬剤。
【請求項１２】
前記ベクターがアデノウイルス、レトロウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス又はセンダイウイルスのベクターである、請求項１１記載の薬剤。
【請求項１３】
前記アンチセンスポリヌクレオチド及び前記ｓｉＲＮＡが、センス鎖に相補的な１７〜２５のヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号１〜２５からなる群から選択される核酸配列の１７〜２５の連続したヌクレオチドから選択される、請求項１０記載の薬剤。
【請求項１４】
前記ｓｉＲＮＡが前記センス鎖をさらに含む、請求項１３記載の薬剤。
【請求項１５】
前記センス鎖が配列番号５２〜１７５からなる群から選択される、請求項１４記載の薬剤。
【請求項１６】
前記ｓｉＲＮＡが、前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖を接続するループ領域をさらに含む、請求項１５記載の薬剤。
【請求項１７】
前記ループ領域が、配列番号２６で規定される核酸配列を含む、請求項１６記載の薬剤。
【請求項１８】
前記薬剤が、配列番号５２〜１７５からなる群から選択される核酸配列を含むアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム又はｓｉＲＮＡである、請求項１７記載の薬剤。
【請求項１９】
前記薬剤が、配列番号５２〜１７５からなる群から選択される核酸配列を含むアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム又はｓｉＲＮＡである、請求項１８記載の薬剤。
【請求項２０】
治療的有効量の請求項１０記載の薬剤を、医薬として許容し得る担体との混合物として含む、ＥＣＭ分解抑制医薬組成物。
【請求項２１】
前記対象に請求項２０記載の医薬組成物を投与することを含む、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分解が関与する疾患の、その疾患に患っているか感受性の対象における治療及び／又は予防方法。
【請求項２２】
前記疾患が関節変性疾患である、請求項２２記載の方法。
【請求項２３】
前記疾患が関節リウマチである、請求項２３記載の方法。
【請求項２４】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分解が関与する疾患の治療及び／又は予防のための医薬品の製造における、請求項１０から１９記載の薬剤の使用。
【請求項２５】
前記疾患が、関節の変性疾患及び炎症性疾患からなる群から選択される、請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
前記疾患が関節リウマチである、請求項２４又は２５記載の使用。
【請求項２７】
治療的有効量の請求項１０記載のマトリックスメタロプロテイナーゼ抑制剤を投与することを含む、異常なマトリックスメタロプロテイナーゼ活性を特徴とする病態の治療方法。
【請求項２８】
ＭＭＰ１の異常な細胞発現が関与する疾患から選択される病態の治療方法であって、請求項１０記載の薬剤のマトリックスメタロプロテイナーゼを抑制する治療的有効量を投与することを含む、前記方法。
対象において細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分解に関係する病的状態又はその病態に対する感受性を診断するための方法であって、前記対象から得られる生体試料中に存在する配列番号２７〜５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの第１の量を測定することと、前記第１の量を健康者集団で測定されるポリペプチド量の範囲と比較することとを含み、健康者で測定した量の範囲と比較した前記生体試料中のポリペプチドの量の増加は前記病的状態の存在を示すものである方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
(発明の要約)
本発明は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の分解を抑制する化合物の同定方法に関するものであり、この方法は、化合物を、配列番号２７〜５１（以下、「ターゲット」）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド及びその断片と、前記ポリペプチドとその化合物との結合を可能にする条件下で接触させること、及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分解に関連した化合物−ポリペプチド特性を測定することを含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本方法の態様としては、配列番号２３２〜２９５からなる群から選択されるものを含むターゲット及びその断片のポリペプチドを用いる化合物のインビトロアッセイ、並びに、ターゲット抑制に続いて効力の指標、例えば、ターゲット発現レベル及び／又はマトリックスメタロプロテイナーゼ１レベルを観察する細胞アッセイがある。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本発明は、関節リウマチのような慢性関節変性疾患の治療又は予防に役立つ、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の群から選択されるポリヌクレオチドを含む発現抑制剤、前記薬剤を含む医薬組成物にも関し、前記ポリヌクレオチドは配列番号２７〜５１及び２３２〜２９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする天然ポリヌクレオチド配列と相補的であるか、又はそれから操作された核酸配列を含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
本発明の他の態様は、その疾患に患っているか感受性の対象において、発現抑制剤のターゲット発現を抑制するのに有効な量を含む医薬組成物を投与することによる、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の分解が関与する病態の治療方法又は予防方法である。
本発明の他の態様は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の分解を特徴とする病状に関する診断のための、対象におけるターゲット発現レベル指標の測定を含む方法である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
用語「対象」は、ヒト及び他の哺乳動物を含む。
用語「ターゲット」又は「ターゲット類」は、本アッセイに従ってＭＭＰ１レベルの誘導に関与していることが同定されたタンパク質を意味する。好ましいターゲットは、表１の配列番号２７〜５１と同定される。より好ましいターゲットは、表１で同定されるキナーゼ、プロテアーゼ及びＧタンパク質結合型受容体（ＧＰＣＲ）である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
本発明は、細胞外マトリックスの分解を抑制する薬剤候補化合物のアッセイ方法に関するものであり、化合物を配列番号２７〜５１及び２３２〜２９５のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、前記ポリペプチドとその化合物との結合を可能にする条件下で接触させること、及び前記ポリペプチドと前記化合物との間の複合体の形成を検出することを含む。複合体形成を測定する好ましい１手段は、前記ポリペプチドとの前記化合物の結合親和性を測定することである。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
上で言及した化合物ポリペプチド特性は、ターゲットの発現に関連し、当業者によって選択される測定可能な現象である。測定可能な特性は、例えば、ポリペプチドターゲットのペプチドドメイン、例えば配列番号２３２〜２９５との結合親和性でよく、又は、細胞外マトリックス分解のいくつかの生化学的マーカーレベルのいずれか１つのレベルでよい。細胞外マトリックス分解は、例えばその過程で誘導される酵素のレベル、例えばＭＭＰ及び／又はカテプシンポリペプチドの発現を測定することによって測定することができる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
本発明の好ましい一実施形態では、ターゲットポリペプチドは表１のリストに記載されている配列番号２７〜５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【表１】
2008502355.tif 000069
2008502355.tif 000070
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
本アッセイ方法は、１つ以上のターゲットタンパク質又はその断片を用いて、インビトロで実行することができる。選択されたターゲットの例示的なタンパク質ドメイン断片のアミノ酸配列は下記の表１Ａのリストに記載された配列番号２３２〜２９５である。
【表２】
2008502355.tif 000071
2008502355.tif 000072
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
本発明者らは、「ノックイン」ライブラリーを用いてＥＣＭ分解に関係する標的遺伝子を同定した。この種のライブラリーは、細胞内の特定の遺伝子及び対応する遺伝子産物の発現及び活性を誘導する組換えアデノウイルスによってｃＤＮＡ分子が細胞内に形質導入されるスクリーンである。ウイルスベクター内の各ｃＤＮＡは、特定の天然遺伝子に対応する。ＥＣＭ分解を刺激するｃＤＮＡを同定することによって、特定の遺伝子発現とＥＣＭ分解との間の直接的な相互関係を導くことができる。ノックインライブラリーを用いて同定したターゲット遺伝子（そのタンパク質発現産物は本明細書では「ターゲット」ポリペプチドと称す）は、次に、ＥＣＭ分解を阻止するために用いることができる化合物を同定するための本発明の方法で用いる。実際は、表３のリストに記載した配列（配列番号５２〜１７５）を含むｓｈＲＮＡ化合物及びそれに対応するアンチセンス配列は、これらのターゲット遺伝子の発現及び／又は活性を抑制し、細胞のＥＣＭ分解活性を低減することから、ＥＣＭ分解におけるこれらのターゲット遺伝子の役割が確認される。
【表３】
2008502355.tif 000073
2008502355.tif 000074
2008502355.tif 000075
2008502355.tif 000076
2008502355.tif 000077
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
表１で示すターゲット遺伝子は、異なる種類のポリペプチドをコードすることを理解されたい。例えば、本明細書で開示される（表１）配列番号４０、４３〜４５で示すターゲットは、ＧＰＣＲである。これらのＧＰＣＲのそれぞれはエフェクタータンパク質を活性化することができ、それにより細胞内の二次伝達物質レベルの変化が生じる。ＧＰＣＲの活性は、そのような二次伝達物質の活性レベルを測定することによって測定することができる。細胞内の２つの重要で有用な二次伝達物質は、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）及びＣａ２＋である。活性レベルは当業者に公知の方法を用い、ＥＬＩＳＡ若しくは放射能技術により直接、又はＣａ２＋と接触すると蛍光又はルミネッセンスシグナルを生成する基質を用いることにより、或いはリポーター遺伝子分析によって間接に測定することができる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
本明細書で開示されるターゲットの多くは、配列番号２７〜３４で示されるターゲットなどのキナーゼ及びホスファターゼである。化合物の存在下又は非存在下で実施される、基質のリン酸化をキナーゼ又はホスファターゼで測定することによるキナーゼ又はホスファターゼの活性を測定する特定の方法は、当技術分野で公知であり、一部は実施例で記載される。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
配列番号３７、４１、４２、４８、４９及び５１で表されるターゲットは、プロテアーゼ類である。プロテアーゼであるポリペプチドによる基質の切断を測定することによる化合物による抑制を測定する特定の方法は、当技術分野で公知である。
ポリペプチドを発現する細胞は自然にポリペプチドを発現する細胞でよく、又は先に述べたように、細胞はポリペプチドを発現するようにトランスフェクションすることができることを理解されたい。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
本発明は、さらに、細胞外マトリックス分解を抑制する化合物の方法同定に関し：
（ａ）化合物を、配列番号２７〜５１及び２３２〜２９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させることと；
（ｂ）ポリペプチドへの化合物の結合親和性を測定することと；
（ｃ）前記ポリペプチドを発現する哺乳動物細胞の集団を少なくとも１０マイクロモルの結合親和性を示す化合物と接触させることと；
（ｄ）細胞外マトリックス分解を抑制する化合物を同定することを含む。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
本発明の他の実施形態は、発現抑制剤がアンチセンスＲＮＡ、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、配列番号１〜２５によってコードされるポリリボヌクレオチドを切断するリボザイム、配列番号１〜２５に対応するポリリボヌクレオチドの一部に十分に相同的であり、その結果そのｓｉＲＮＡ、好ましくはｓｈＲＮＡがターゲットポリペプチドへのターゲットポリリボヌクレオチドの翻訳に干渉する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、好ましくはｓｈＲＮＡ）を発現する核酸である方法に関するものである。好ましくは、発現抑制剤はアンチセンスＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、又はｓｉＲＮＡ、好ましくはｓｈＲＮＡであり、配列番号１〜２５からなる群から選択されたヌクレオチド配列の少なくとも約１７から約３０の連続したヌクレオチドと相補するポリリボヌクレオチド配列を含む。より好ましくは、発現抑制剤はアンチセンスＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、又はｓｉＲＮＡ、好ましくはｓｈＲＮＡであり、配列番号１〜２５からなる群から選択されたヌクレオチド配列の少なくとも約１７から約２５の連続したヌクレオチドと相補するポリリボヌクレオチド配列を含む。特別な実施形態は、配列番号５２〜１７５からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列と相補するポリリボヌクレオチド配列を含む。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
特に好ましい抑制剤は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、好ましくは小さなヘアピンＲＮＡ、「ｓｈＲＮＡ」）である。ｓｉＲＮＡ、好ましくはｓｈＲＮＡは、抑制されたＲＮＡに配列が相同的である二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって、遺伝子抑制の転写後過程を媒介する。本発明によるｓｉＲＮＡは、配列番号１〜２５で記載される配列の群、好ましくは配列番号５２〜１７５で記載される配列の群から選択される連続した１７〜２５のヌクレオチド配列と相補的又は相同な１７〜２５のヌクレオチドのセンス鎖、並びにこのセンス鎖に相補的な１７〜２５のヌクレオチドのアンチセンス鎖を含む。最も好ましいｓｉＲＮＡは、互いに１００パーセント相補的なセンス鎖及びアンチセンス鎖、及びターゲットポリヌクレオチド配列を含む。好ましくは、ｓｉＲＮＡはセンス鎖及びアンチセンス鎖を結合するループ領域をさらに含む。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
これらの組成物及び方法の具体的な態様は、ターゲットポリペプチドと選択的に相互作用することができる細胞内結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの誘導された発現による、ターゲットポリペプチドの発現のダウンレギュレーション又は阻止に関する。細胞内結合タンパク質には、それが発現される細胞内のポリペプチドと選択的に相互作用又は結合して、ポリペプチドの機能を中和することができる任意のタンパク質が含まれる。好ましくは、細胞内結合タンパク質は、配列番号２７〜５１のターゲットポリペプチドのエピトープに、好ましくは配列番号２３２〜２９５のドメインに結合親和性を有する中和抗体又は中和抗体の断片である。より好ましくは、細胞内結合タンパク質は単鎖抗体である。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
この組成物の具体的な実施形態は、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、配列番号２７〜５１をコードするポリリボヌクレオチドを切断するリボザイム、配列番号１〜２５に対応するポリリボヌクレオチドの一部に十分に相同的であり、その結果そのｓｉＲＮＡがターゲットポリペプチドへのターゲットポリリボヌクレオチドの翻訳に干渉する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）からなる群から選択される発現抑制剤を含む。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２２】
本発明の他の態様は、対象で細胞外マトリックス分解を伴う病的状態又はその病態への感受性を診断するための方法であって、生体試料中の配列番号２７〜５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの量を測定することと、その量を健康対象におけるそのポリペプチドの量と比較することとを含む方法に関し、このとき、健康対象と比較してのポリペプチド量の増加はその病的状態の存在の指標となる。
本発明は、以下の図及び実施例でさらに記述される。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
（Ａ）陰性対照ウイルス：
Ａｄ５−ＬａｃＺ：  国際公開02/070744でｐＩＰｓｐＡｄＡｐｔ６−ｌａｃＺと記載される。
Ａｄ５−ＡＬＰＰ：  １．９ｋｂインサートは、ｐＧＴ６５−ＰＬＡＰ（Invitrogen）からＮｓｉＩによる消化によって単離され、平滑末端化され、ＥｃｏＲＩで消化され、ＥｃｏＲＩ及びＨｐａＩで消化されたｐＩＰｓｐＡｄＡｐｔ６へクローン化される。
Ａｄ５−ｅＧＦＰ：  国際公開02/070744でｐＩＰｓｐＡｄＡｐｔ６−ＥＧＦＰと記載される。
Ａｄ５−ｅＧＦＰ＿ＫＤ：  標的配列：  ＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣ（配列番号１７９）。国際公開03/020931で記載されているようにＳａｐＩ部位を用いてベクターへクローン化され、ウイルスが生成される。
Ａｄ５−ルシフェラーゼ＿ＫＤ＿ｖ１３：  標的配列：  ＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣ（配列番号１８０）。国際公開03/020931で記載されているようにＳａｐＩ部位を用いてベクターへクローン化され、ウイルスが生成される。
Ａｄ５−Ｍ６ＰＲ＿ＫＤ＿ｖ１：  標的配列：  ＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣ（配列番号１８０）。国際公開03/020931で記載されているようにＳａｐＩ部位を用いてベクターへクローン化され、ウイルスが生成される。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２６】
（Ｂ）陽性対照ウイルス：
Ａｄ５−ＲＥＬＡ：  ＲＥＬＡをコードするｃＤＮＡは、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーでの以下のプライマーを用いたＰＣＲで得られる：
上流側：  ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＡＣＴＧＴ（配列番号１８１）及び
下流側：  ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＣＡＧＧＣＧＴＣＡＣＣＣＣＣＴＴＡＧ（配列番号１８２）。
１６８１ｂｐのＤＮＡインサートが生成され、その５’配列はＮＭ＿０２１９７５に対応する。プライマーは、ＰＣＲ生成物がＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩクローニングによってｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６ベクターに挿入できるように設計される。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
Ａｄ５−ＭＭＰ１：  ｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６プラスミドにクローン化されたＭＭＰ１をコードするｃＤＮＡは、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（国際公開02/070744を参照）から、古典的なフィルターコロニーハイブリダイゼーション手法によって単離する。ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーは細菌に形質転換されて、寒天プレート上へプレーティングされる。何千もの個々のコロニーを選択して（Q-pix装置（Genetix）を用いる）、寒天プレート上で再整列させる。細菌を成長させた後、これらのプレートをハイブリダイゼーションフィルター上へオーバーレイする。これらのフィルターを対象に、ＭＭＰ１特異的プローブによる古典的なハイブリダイゼーション法を実施する。このプローブは、以下のプライマーを用いて胎盤ｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲによって得られる：
上流側：  ＧＴＴＣＴＧＧＧＧＴＧＴＧＧＴＧＴＣＴＣＡＣＡＧＣ（配列番号１８３）、及び
下流側：  ＣＡＡＡＣＴＧＡＧＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＡＣＴＣＣ（配列番号１８４）。
ハイブリダイゼーション後のフィルター上の陽性シグナル点のそれに対応する位置の細菌コロニーを選択して、プラスミド調製のために用いる。５’配列の検証は、インサートの５’配列はＮＭ＿００２４２１に対応することを確認する。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２８】
Ａｄ５−ＴＲＡＦ６：  ＴＲＡＦ６をコードするｃＤＮＡは、ＭＭＰ１で記載したものと同じコロニーハイブリダイゼーション手法によって単離される。このＴＲＡＦ６特異的プローブは、以下のプライマーを用いて胎盤ｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲによって得られる：
上流側：  ＣＣＡＧＴＣＴＧＡＡＡＧＴＧＡＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＧ（配列番号１８５）、及び
下流側：  ＣＡＡＣＴＧＧＡＣＡＴＴＴＧＴＧＡＣＣＴＧＣＡＴＣＣ（配列番号１８６）。
ハイブリダイゼーション後のフィルター上の陽性シグナル点のそれに対応する位置の細菌コロニーを選択して、プラスミド調製のために用いる。５’配列の検証は、インサートの５’配列はＮＭ＿００４６２０．２に対応することを確認する。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
Ａｄ５−ＭＭＰ１＿ＫＤ＿ｖ１０：  標的配列：  ＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣ（配列番号１８７）。国際公開03/020931で記載されているようにＳａｐＩ部位を用いてベクターへクローン化され、ウイルスが生成される。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
【表４】
2008502355.tif 000078
2008502355.tif 000079
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６４】
これらのヒットＡｄ−ｃＤＮＡに関する最終的な品質管理として、それらの同一性を配列分析によって確認される。配列分析のための手順は、以下の通りである。９６穴プレートでＰＥＲ．Ｅ２Ａプロデューサー細胞を用いてヒットウイルスを増殖させる。ＰＥＲ．Ｅ２Ａ細胞は、９６穴プレート内の１８０μｌの培地に、４０，０００細胞／ウェルの密度で接種する。細胞は、３９℃で一晩、ＣＯ２濃度が１０％の加湿インキュベータでインキュベートする。１日後、ヒットＡｄ−ｃＤＮＡを含むFlexSelect原液からの粗細胞溶解液の１μｌで細胞を感染させる。細胞は、細胞変性効果（一般的に感染後７日に出現する細胞の膨張及び球状化）が現れるまで、さらに３４℃、１０％のＣＯ２濃度でインキュベートする。上清を収集して、ウイルスの粗溶解物をプロテイナーゼＫで処理する。１２μｌの粗溶解物を、無菌のＰＣＲ管内で４μｌの緩衝液（１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Roche Molecular Biochemicals、カタログ番号745723）及び０．４５%ツイーン２０（Roche Molecular Biochemicals、カタログ番号1335465）を添加した、ＭｇＣｌ２を含む１×Expand High Fidelity緩衝液（Roche Molecular Biochemicals、カタログ番号1332465）に加える。これらを５５℃で２時間インキュベートした後、９５℃で１５分の不活化段階が続く。ＰＣＲ反応については、１μｌの溶解液を５μｌのＭｇＣｌ２を含む１０× Expand High Fidelity緩衝液、０．５μｌのｄＮＴＰ混合液（各ｄＮＴＰが１０ｍＭ）、１μｌの「順方向プライマー」（１０ｍＭ原液、配列：５’ＧＧＴ  ＧＧＧ  ＡＧＧ  ＴＣＴ  ＡＴＡ  ＴＡＡ  ＧＣ；配列番号２３０）、１μｌの「逆方向プライマー」（１０ｍＭ原液、配列：５’ＧＧＡ  ＣＡＡ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＡＣＴ  ＡＧＡ  ＡＴＧ  Ｃ；配列番号２３１）、０．２μｌのExpand High Fidelity  ＤＮＡポリメラーゼ（３．５Ｕ／μｌ、Roche Molecular Biochemicals）及び４１．３μｌのＨ２Ｏから構成されるＰＣＲマスター混合液に加える。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９６】
（参考文献）
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【手続補正２９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１６】
2008502355.tif 000080
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008502355000001.app
【国際調査報告】
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2008502355.tif 000084
2008502355.tif 000085
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