(57)【要約】  本発明は、微生物細胞からのＡＴＰレベルの一段階抽出および検出のための組成物および方法に関する。開示された組成物は、一般的な一段階試薬組成物を使用して、幅広い異なる微生物中でＡＴＰのバイオルミネセンスの検出を効率的に引き出すように調合される。その他の有用な抽出剤を同定するための、または微生物細胞に対するそれらの薬学的または生物学的効果について化合物をスクリーニングするための、追加的なルミネセンスベースの方法が提供される。
2008504841.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）反応緩衝液、
（ｂ）１つ以上のＡＴＰ抽出剤、
（ｃ）第１の濃度の二価カチオン、
（ｄ）第２の濃度の二価カチオンキレート剤、および
（ｅ）ルシフェラーゼ酵素
を含んでなり、
第１の濃度と第２の濃度の間の差が約５ｍＭ未満である、微生物を含有することが疑われるサンプル中のＡＴＰを検出するための組成物。
【請求項２】
第１の濃度と第２の濃度との差が約２．５ｍＭ未満である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
第１の濃度と第２の濃度との差が約１．０ｍＭ未満である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
第２の濃度が少なくとも第１の濃度の２分の１である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
第２の濃度が第１の濃度に少なくともほぼ等しいかまたはそれを超える、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
第１の濃度が少なくとも１０ｍＭである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
第１の濃度が少なくとも２０ｍＭである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
第１の濃度が少なくとも約２０ｍＭであり、第２の濃度が少なくとも約２０ｍＭである、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
微生物がグラム陰性細菌である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
微生物が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
１つ以上のＡＴＰ抽出剤がセチルトリメチル臭化アンモニウムを含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
１つ以上のＡＴＰ抽出剤がクロロヘキシジンおよび非イオン性洗剤を含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
１つ以上のＡＴＰ抽出剤が、セチルトリメチル臭化アンモニウム、クロロヘキシジン、および非イオン性洗剤を含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
二価カチオンがＭｇ2+、Ｃａ2+またはＭｎ2+である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
二価カチオンキレート剤がＥＤＴＡまたはＣＤＴＡである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
二価カチオンがＭｇ2+であり、二価カチオンキレート剤がＥＤＴＡである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
（ａ）反応緩衝液、
（ｂ）１つ以上のＡＴＰ抽出剤、
（ｃ）約５ｍＭ未満である第１の濃度の二価カチオン、
（ｄ）ルシフェラーゼ酵素
を含んでなる、微生物を含有することが疑われるサンプル中のＡＴＰを検出するための組成物。
【請求項１８】
第１の濃度が約２．５ｍＭ未満である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
第１の濃度が約１ｍＭ未満である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
第１の濃度が約０．５ｍＭ未満である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２１】
二価カチオンキレート剤をさらに含んでなる、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２２】
微生物がグラム陰性細菌である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２３】
微生物が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２４】
１つ以上のＡＴＰ抽出剤がセチルトリメチル臭化アンモニウムを含んでなる、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２５】
１つ以上のＡＴＰ抽出剤がクロロヘキシジンおよび非イオン性洗剤を含んでなる、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２６】
１つ以上のＡＴＰ抽出剤が、セチルトリメチル臭化アンモニウム、クロロヘキシジン、および非イオン性洗剤を含んでなる、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２７】
二価カチオンがＭｇ2+、Ｃａ2+またはＭｎ2+である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２８】
二価カチオンキレート剤がＥＤＴＡまたはＣＤＴＡである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２９】
二価カチオンがＭｇ2+であり、二価カチオンキレート剤がＥＤＴＡである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項３０】
（ａ）反応緩衝液、
（ｂ）１つ以上のＡＴＰ抽出剤、
（ｃ）第１の濃度の二価カチオン、
（ｄ）第２の濃度の二価カチオンキレート剤
を含んでなり、
第２の濃度が第１の濃度に少なくともほぼ等しいかまたはそれを超える、グラム陰性微生物からＡＴＰを抽出するための組成物。
【請求項３１】
第１の濃度が少なくとも１０ｍＭである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
第１の濃度が少なくとも２０ｍＭである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
第１の濃度が少なくとも約２０ｍＭであり、第２の濃度が少なくとも約２０ｍＭである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３４】
（ａ）サンプルと、第１の濃度の二価カチオン、第２の濃度の二価カチオンキレート剤、１つ以上のＡＴＰ抽出剤、およびルシフェラーゼ酵素を含んでなる組成物とを接触させて、混合物を形成するステップと、
（ｂ）ルミネセンスを検出するステップ
を含んでなり、
第１の濃度と第２の濃度との差が約５ｍＭ未満である、微生物を含有するまたは含有することが疑われるサンプル中のＡＴＰを検出する方法。
【請求項３５】
組成物中の二価カチオンキレート剤濃度が、組成物中の二価カチオン濃度に少なくともほぼ等しいかまたはそれを超える、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
混合物中の二価カチオンキレート剤濃度が、混合物中の二価カチオン濃度の少なくとも２分の１である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
微生物がグラム陰性細菌である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
微生物が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
サンプルが微生物細胞の異種性集団を含有するまたは含有することが疑われる、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
サンプルが病原菌を含有するまたは含有することが疑われる、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
検出可能なルミネセンス信号が、サンプルと組成物とを接触させた後１０分以内に生じる、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
検出可能なルミネセンス信号が、サンプルと組成物とを接触させた後５分以内に生じる、請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
ルミネセンスが少なくとも３０分の半減期があるルミネセンス信号を生じる、請求項３４に記載の方法。
【請求項４４】
ルミネセンスがサンプル中の少なくとも１×１０-14モルのＡＴＰを検出するのに十分なルミネセンス信号を生じる、請求項３４に記載の方法。
【請求項４５】
組成物が少なくとも１０００個の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を検出するのに十分なルミネセンス信号を生じる、請求項３４に記載の方法。
【請求項４６】
（ａ）サンプルと、二価カチオン、１つ以上のＡＴＰ抽出剤、およびルシフェラーゼ酵素を含んでなる組成物とを接触させて、混合物を形成するステップと、
（ｂ）ルミネセンスを検出するステップ
を含んでなり、
二価カチオンが組成物中に約５ｍＭ未満の濃度で存在する、微生物を含有するまたは含有することが疑われるサンプル中のＡＴＰを検出する方法。
【請求項４７】
二価カチオンが約２．５ｍＭ未満の濃度で組成物中に存在する、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
二価カチオンが約１ｍＭ未満の濃度で組成物中に存在する、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４９】
二価カチオンが約０．５ｍＭ未満の濃度で組成物中に存在する、請求項４６に記載の組成物。
【請求項５０】
微生物がグラム陰性細菌である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
微生物が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
サンプルが微生物細胞の異種性集団を含有するまたは含有することが疑われる、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
サンプルが病原菌を含有するまたは含有することが疑われる、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
検出可能なルミネセンス信号がサンプルと組成物とを接触させた後１０分以内に生じる、請求項４６に記載の方法。
【請求項５５】
検出可能なルミネセンス信号がサンプルと組成物とを接触させた後５分以内に生じる、請求項４６に記載の方法。
【請求項５６】
ルミネセンスが少なくとも３０分の半減期があるルミネセンス信号を生じる、請求項４６に記載の方法。
【請求項５７】
（ａ）微生物源からの微生物サンプルに、二価カチオン、二価カチオンキレート剤、少なくとも１つのＡＴＰ抽出剤、ルシフェラーゼ酵素、およびルシフェラーゼ基質を含んでなる組成物を添加して、混合物を形成するステップと、
（ｂ）前記混合物中のルミネセンスの程度を測定して、微生物サンプル中のＡＴＰを検出するのに使用するための少なくとも１つのＡＴＰ抽出剤の適合性を判定するステップ
を含んでなり、
二価カチオンが混合物中に約０．５ｍＭ以下の濃度で存在し、
ルミネセンスの程度が検出に十分であれば、前記少なくとも１つのＡＴＰ抽出剤が微生物源中のＡＴＰを検出するのに適する、微生物サンプル中のＡＴＰを検出するのに適したＡＴＰ抽出剤を同定する方法。
【請求項５８】
二価カチオンが約０．１ｍＭ以下の濃度で混合物中に存在する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
（ａ）微生物源からの第１の微生物サンプルに、第１の濃度の二価カチオン、二価カチオンキレート剤、少なくとも１つのＡＴＰ抽出剤、ルシフェラーゼ酵素、およびルシフェラーゼ基質を添加して、第１の混合物を形成するステップと、
（ｂ）（ａ）の微生物源からの第２の微生物サンプルに、第２の濃度の二価カチオン、二価カチオンキレート剤、少なくとも１つのＡＴＰ抽出剤、ルシフェラーゼ酵素、およびルシフェラーゼ基質を添加して、第２の混合物を形成するステップと、
（ｃ）前記第１および第２の混合物中のルミネセンスを別々に検出して、微生物サンプル中のＡＴＰを判定するのに使用するための少なくとも１つのＡＴＰ抽出剤の適合性を判定するステップ
を含んでなり、
第２の混合物中の二価カチオンの第２の濃度が、第１の混合物中の二価カチオンの第１の濃度を超え、
第１の混合物中のルミネセンスが第２の混合物中のルミネセンスを超えれば、前記少なくとも１つのＡＴＰ抽出剤が微生物源中のＡＴＰを検出するのに適する、微生物サンプル中のＡＴＰを検出するのに適したＡＴＰ抽出剤を同定する方法。
【請求項６０】
（ａ）第１の微生物の培養を少なくとも１つの候補抗生剤で処理するステップと、
（ｂ）前記少なくとも１つの候補抗生物質剤で処理された第１の微生物の培養、および前記少なくとも１つの候補抗生物質剤で処理されていない第２の微生物の対照培養を第２の微生物の対照培養中の生育を検出するのに十分な期間生育させるステップと、
（ｃ）第１の微生物の培養および第２の微生物の対照培養を、二価カチオン、二価カチオンキレート剤、少なくとも１つのＡＴＰ抽出剤、およびルシフェラーゼ含んでなる組成物に別々に接触させて、それぞれ第１および第２の混合物を形成するステップと、
（ｄ）ルミネセンスを検出するステップと、
（ｅ）候補抗生物質が抗生物質活性を有するかどうかを判定するステップ
を含んでなり、
前記第１および第２の混合物それぞれの中の二価カチオンと二価カチオンキレート剤との量の差が約２．５ｍＭ未満である、候補抗生剤をスクリーニングする方法。
【請求項６１】
前記第１および第２の混合物それぞれの中の二価カチオンと二価カチオンキレート剤の量の差が約１．２５ｍＭ未満である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記第１および第２の混合物それぞれの中の二価カチオンと二価カチオンキレート剤の量の差が約０．４ｍｍ未満である、請求項６０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌およびその他の微生物細胞を溶解して、ＡＴＰを検出および定量化するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生細胞を死細胞から識別する特性の１つは、ＡＴＰの存在である。ＡＴＰは広く使用されるバイオルミネセンスの検出系中の基質であるため、それは細胞生存度または細胞汚染のための代理マーカーを提供できる。ルシフェリン−ルシフェラーゼ系を使用してＡＴＰを細胞から抽出し検出する方法が、技術分野で知られている。しかし細胞のタイプ次第で、ＡＴＰの抽出および検出のための要件は異なるかもしれない。構造的に可撓性のリン脂質二層膜がある体細胞は、中性洗剤で容易に中断してＡＴＰを放出できる。より硬質の細胞壁がある細菌、酵母、および真菌は、より大きな課題をもたらす。
【０００３】
Ｋｏｌｅｈｍａｉｎｅｎらに付与された米国特許第４，３０３，７５２号明細書では、生きた体細胞および微生物細胞からのヌクレオチド（ＡＴＰなど）の選択的判定のためのプロセスについて述べられてる。Ｋｏｌｅｈｍａｉｎｅｎらは、様々なイオン性および非イオン性表面活性剤を使用して、体細胞および微生物細胞の異なった透過性を活用する多段階プロセスを開発した。エトキシル化アルキルフェノールなどの非イオン性洗剤による処理に続いて、体細胞がＡＴＰを放出する一方で、細菌細胞は影響を受けないことが分かった。この観察は、エトキシル化アルキルフェノールによる体細胞の処理、放出された体ＡＴＰの洗い落とし、エトキシル化四級アミンとエトキシル化アミンを含有するより強力なイオン性界面活性剤混合物で残存細胞（ＡＴＰ含有微生物細胞およびＡＴＰ欠如体細胞）を処理して微生物のＡＴＰを放出することを伴う、体細胞および細菌細胞の混合集団を処理する手段を提供した。最終ステップでは、バイオルミネセンスアッセイで、放出されたＡＴＰを測定した。
【０００４】
近年、Ｗｏｏｄら（米国特許出願公開第２００３／０１０４５０７号明細書）は、一段階で細胞ＡＴＰを抽出し検出するための全構成要素を含有する均質試薬組成物を使用して、細胞中のＡＴＰを検出する方法を開示した。ルシフェラーゼを犠牲にすることなくＡＴＰ放出機能を保持するように独自に調合された反応構成要素は、経済と時間の観点で顕著な進歩を提供した。しかし微生物細胞にはより硬質な細胞壁があるので、開示された方法はそれらに対して最適でない。
【０００５】
微生物に必要とされるイオン性洗剤などのより強力な透過処理剤の使用に結びついた１つの問題は、ルシフェラーゼ酵素を不活性化するそれらの能力である。この試薬不適合性問題は、ＡＴＰ検出を開始させる最終ルシフェラーゼ／ルシフェリン添加ステップに先だつ追加的な中和または希釈ステップを必然的に伴い、一段階ＡＴＰ抽出／検出試薬組成物開発の障害となる。
【０００６】
微生物細胞からのＡＴＰの放出および検出に結びついた困難さを考えると、微生物細胞中のＡＴＰの一段階検出のための改善された試薬組成物および方法に対する技術分野における必要性がある。細胞壁がある細胞からのＡＴＰ放出に結びついた課題に加えて、微生物細胞は典型的に体細胞よりもはるかに小さい。これは感度に関するさらなる改善を必然的に伴う。本発明は微生物細胞への一段階ＡＴＰ検出法の応用における進歩を提供し、微生物細胞がＡＴＰの放出および検出を支持するそれらの能力に関してある程度、予想外の違いを示すという発見に基づく。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は微生物細胞からＡＴＰを抽出し検出する試薬組成物および方法に関する。本発明はある程度、ＡＴＰを抽出し検出するための反応条件が微生物細胞と体細胞の双方の間で異なり、試薬組成物が、幅広い微生物細胞からのＡＴＰの効率的な一段階検出を容易にするように調合されてもよいという発見に基づく。
【０００８】
一態様では、本発明は、反応緩衝液、少なくとも１つのＡＴＰ抽出剤、二価カチオン、二価カチオンキレート剤および／またはルシフェラーゼ／ルシフェリン混合物を含む試薬組成物を含み、その中で二価カチオン濃度は十分に低く、またはカチオンキレート剤で十分に中和されて、ＡＴＰ抽出に対する二価カチオンの悪影響を低下させる。一実施形態では、試薬組成物中の二価カチオンキレート剤濃度と二価カチオン濃度との差は、約５ｍＭ未満である。別の実施形態では、二価カチオンキレート剤濃度は二価カチオン濃度の少なくとも２分の１である。二価カチオンキレート剤は、二価カチオン濃度が低い（例えば約５ｍＭ、２．５ｍＭまたは１ｍＭ未満の）場合には、不必要であってもよい。特に好ましい実施形態では、キレート剤濃度は二価カチオン濃度以上であり、二価カチオンはＭｇ2+であり、二価カチオンキレート剤はＥＤＴＡであり、少なくとも１つのＡＴＰ抽出剤はセチルトリメチル臭化アンモニウム、クロロヘキシジン、およびトリトン−Ｘ１００などの非イオン性洗剤を含む。
【０００９】
別の態様では、本発明は微生物細胞中のＡＴＰを検出する方法を含み、その中で微生物サンプルは、反応緩衝液、少なくとも１つのＡＴＰ抽出剤、二価カチオン、および二価カチオンキレート剤を含む試薬組成物と接触して混合物を形成し、その中で二価カチオン濃度は十分に低く、またはカチオンキレート剤によって十分に中和されてＡＴＰ抽出に対する二価カチオンの悪影響を低下させ、そして二価カチオンレベルは引き続くルシフェラーゼ媒介ＡＴＰ検出ステップに十分である。混合物中の二価カチオンキレート剤濃度と二価カチオン濃度との差は、約５ｍＭ未満であってもよい。代案としては、二価カチオンキレート剤濃度は混合物中の二価カチオン濃度の少なくとも２分の１であり、好ましくはそれ以上の濃度でさえあってもよい。二価カチオンキレート剤は、二価カチオン濃度が低い（例えば約５ｍＭ、２．５ｍＭ、または１ｍＭ未満）場合には不必要であってもよい。好ましい実施形態では、方法は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのグラム陰性微生物を含有するまたは含有することが疑われる微生物サンプル中のＡＴＰを検出する方法に関する。
【００１０】
さらに別の態様では、本発明は、微生物サンプル中のＡＴＰを検出するのに適したＡＴＰ抽出剤を同定する方法を含み、その中で二価カチオン、二価カチオンキレート剤、少なくとも１つのＡＴＰ抽出剤、ルシフェラーゼ酵素、およびルシフェラーゼ基質を含有する組成物がサンプルに添加されて、混合物を形成する。ルミネセンスの程度が測定されて、サンプル中のＡＴＰを検出するのに適した試薬組成物が同定される。典型的に、ＡＴＰ抽出剤は、ルミネセンスの程度が微生物サンプル中のＡＴＰを検出するのに十分であれば、微生物源中のＡＴＰを検出するのに適している。好ましい実施形態では、二価カチオンが混合物中に約０．５ｍＭ未満、より好ましくは約０．１ｍＭ未満の濃度で存在する。微生物サンプルは、グラム陽性またはグラム陰性細菌、古細菌、真菌などを含んでもよい。
【００１１】
代案としては、微生物サンプルと、二価カチオン、二価カチオンキレート剤、少なくとも１つのＡＴＰ抽出剤、およびルシフェラーゼ酵素を含む試薬組成物とを接触させて、第１の二価カチオン濃度を有する第１の混合物を形成し、微生物サンプルを接触させて、第１の混合物よりも高い二価カチオン濃度を第２の混合物中に有することだけが第１の混合物と違う第２の混合物を形成し、ＡＴＰの放出および検出に適した微生物ＡＴＰ抽出剤濃度を同定し、その中で第１の混合物中のルミネセンスは第２の混合物中のルミネセンスよりも高い。
【００１２】
さらに別の態様では、本発明の微生物ＡＴＰ抽出／検出系を使用して、微生物細胞生存度を試験しても、または微生物細胞生存度および／または生育に影響するそれらの能力に基づいて、薬学的活性剤（例えば抗生剤候補）または生物学的活性剤を同定してもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
Ａ．定義
明細書および特許請求の範囲の明確で一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。特に断りのない限り、全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。参照した全ての特許および公報は、特に断りのない限り、参照によってその全体をここに援用する。
【００１４】
「単離された」または「精製された」ルシフェラーゼとは、同定され、その天然環境の構成要素から分離および／または回収されたものである。
【００１５】
「サンプル」という用語は、ここでの用法では、最も広い意味で使用される。サンプルは、本発明を使用して分析されるＡＴＰを含有することが疑われる組成物である。サンプルは、任意に増殖培地または細胞溶解産物中で、細胞または細胞集団を含有することが知られている、または含有することが疑われることが多い一方で、サンプルはまた、付着細胞または細胞集団を含有することが疑われる固体表面（例えば綿棒、膜、フィルター、粒子）であってもよい。このような固体サンプルでは、固体と本発明の試薬組成物または本発明の試薬組成物が添加された別の水性溶液とを接触させて、水性サンプルを作ることが考察される。例えば本発明のプロセスによって液体または気相サンプルを試験する際、場合によってはサンプルを生成するために濾過が望ましい。濾過は、サンプルが大容積の希釈気体または液体から採取される場合に好ましい。
【００１６】
「試薬組成物」という用語は、ここではサンプルからＡＴＰを抽出および／または検出するための１つ以上の構成要素を呼ぶために使用される。試薬組成物は、サンプルからＡＴＰを抽出および／または検出するのに十分な構成要素のいくらか、または全てを含んでもよい。
【００１７】
「反応混合物」という用語は、ここでの用法では、ＡＴＰを含有するまたはＡＴＰを含有することが疑われるサンプルと、サンプルからＡＴＰを抽出し検出するのに集合的に十分な１つ以上の試薬組成物とを接触させた後に、存在する（または得られる）内容物を指す。
【００１８】
「検出」という用語は、ここでの用法では、サンプル内の構成要素の存在または不在を定量的にまたは定性的に判定することを指す。
【００１９】
「ＡＴＰ抽出剤」という用語は、ここでの用法では、細胞膜または細胞壁透過度を変化させ、または微生物源の膜および／または細胞壁の完全性を中断して（すなわち溶解するまたは孔形成を引き起こす）、ＡＴＰの抽出または放出をもたらす、あらゆる化合物または化合物の組み合わせを指す。概してＡＴＰ抽出剤は、ポリミキシンＢ（例えばポリミキシンＢ１およびポリミキシンＢ２）、ポリミキシン−β−ノナペプチド（ＰＭＢＮ）、およびクロロヘキシジン（ＣＨＥＸ）などの抗生物質と、オクチル−β−Ｄ−１−チオグルコピラノシドなどのアルキルグルコシドまたはアルキルチオグルコシド（参照によってその全体をここに援用する米国特許第６，１７４，７０４号明細書を参照されたい）と、トリトン−Ｘ１００（ＴＸ−１００）などの非イオン性洗剤と、カルボキシプロピルベタイン（ＣＢ−１８）などのベタイン洗剤と、臭化トリメチルオクタデシルアンモニウム（ＴＭＡ−１８）などの四級アンモニウム塩と、プロタミンと、トリエチルアミン（ＴＥＡ）およびトリエタノールアミン（ＴｅｏｌＡ）などのアミンと、ポリリジン、ナイシン、マガイニン、メリチン、ホスホリパーゼ（ｐｈｏｐｈｏｌｉｐａｓｅ）Ａ2、ホスホリパーゼＡ2活性化ペプチド（ＰＬＡＰ）などのカチオン性、抗細菌、孔形成、膜活性、および／または細胞壁活性ポリマーと、バクテリオファージなどをはじめとするがこれに限定されるものではない、多様な作用物質を含んでもよい。例えばＭｏｒｂｅら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．（１９９７年）第１５２巻、３８５〜３９４頁を参照されたい。
【００２０】
「安定信号」という用語は、ルシフェラーゼ反応開始時のルミネセンスと比べて、半時間あたり５０％未満のルミネセンス損失を示すルミネセンス信号と定義される。
【００２１】
「信号対雑音比」（Ｓ：Ｎ）という用語は、式Ｓ：Ｎ＝（サンプルの平均ルミネセンスからバックグラウンドの平均を減じたもの）／バックグラウンドルミネセンスの標準偏差、によって定義される。
【００２２】
本発明は、微生物細胞からＡＴＰレベルを検出し定量化する試薬組成物および方法に向けたものであり、引き続くルミネセンス検出ステップに先だつ、またはその中に組み込まれる中和ステップを必要とせずに、微生物細胞からのＡＴＰ放出および検出のための反応条件が実現できる、という予想外の発見に基づく。本発明は、広範な微生物細胞からのＡＴＰの安定ルミネセンスの検出を容易にできる試薬組成物を開示する。さらに反応構成要素の適切な組み合わせを注意深く選択することで、事実上あらゆる細菌または微生物細胞から、ＡＴＰの効率的な一段階放出を得ることができる。
【００２３】
Ｂ．マグネシウム反転効果
本発明の一態様では、本発明者らは、最適化されていない二価カチオン濃度が、いくつかの微生物細胞からのＡＴＰの効果的な放出および検出を妨害できることを見いだした。典型的なルシフェラーゼ媒介ＡＴＰ検出法は、１０〜２０ｍＭ程度の二価カチオン濃度および約１〜２ｍＭの二価カチオンキレート剤濃度（例えばＷｏｏｄら、米国特許出願公開第２００３／０１０４５０７号明細書を参照されたい）を有する試薬組成物を利用する。図１は、Ｂ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）（図１Ａ）および緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（図１Ｂ）のための二価カチオン濃度の関数としてのＡＴＰ検出の動態の違いを実証する実験について述べる。二価カチオンはＡＴＰ検出に必須であるにもかかわらず、この実験からの結果は、予期される二価カチオン量よりも低い量を使用して、実際に微生物細胞中により良いルミネセンスが得られるかもしれないという驚くべき知見を立証する。さらに本発明の発明者らは、試薬組成物または反応混合物中の遊離の二価カチオン（例えばＭｇ2+）濃度をＥＤＴＡなどの二価カチオンキレート剤で減少させることにより、特定のＡＴＰ抽出剤組み合わせの使用から得られるバイオルミネセンスが選択的に増強できることを意外にも見いだした（図２）。この「マグネシウム反転効果」は、その中でＣＤＴＡなどのキレート剤化合物の添加がルミネセンス（図３）を活性化することが見いだされた実験によって、さらに支持される。本発明の発明者らは、ＡＴＰ抽出／検出試薬組成物または反応混合物中に存在する二価カチオンよりも高い濃度で二価キレート剤を使用した（またはキレート剤ありまたはなしで、単により低い二価カチオン量を使用した）場合の、ＡＴＰ抽出および検出の予想外の利点をさらに立証した。試薬組成物を最適化してこれらの観察を活用することで、同一試薬組成物を使用して、多種多様な微生物源から効率的なＡＴＰ放出および検出を得ることができた。
【００２４】
理論による拘束は望まないが、異なる微生物の構造的な特性が、ＡＴＰ放出に関する二価カチオンの阻害効果の説明になってもよい考えられる。例えばグラム陽性およびグラム陰性細菌の細胞壁は、それらのペプチドグリカン層の密度および組成物に関して、および外側脂質二層膜の存在または不在によって異なる。グラム陽性細菌の細胞壁は、グラム陽性細胞壁の６０〜９０％を構成する多数の相互連結する層ペプチドグリカンからなる、幅広く緻密な壁（厚さ２０〜８０ｎｍ）であるように見える。細胞壁中に織り交るのは、タイコ酸および様々な糖タンパク質（ｇｌｙｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）である。グラム陽性細胞壁とは対照的に、グラム陰性細胞壁は、グラム陰性細胞壁の１０〜２０％のみを構成する２〜３層のペプチドグリカン含有内壁（厚さ２〜３ｎｍ）、およびリン脂質、リポ多糖類（ＬＰＳ）、およびタンパク質から構成される外膜（厚さ約７ｎｍ）を含む。グラム陰性細菌の外膜中のＬＰＳは、グラム陽性細胞壁の糖タンパク質およびタイコ酸と同様の様式で、外膜に強度を加えると考えられる。細菌とは対照的に、酵母および真菌の細胞壁は、細菌細胞壁よりもなおさらに強く、キチンなどのその他の物質を含有してその中の脆い細胞膜を保護する。
【００２５】
グラム陰性細菌の外膜は、隣接するＬＰＳ分子中の負に帯電した群間の静電反発を安定化する二価カチオンによって強化されたバリア機能を提供する（Ｎｉｋａｉｄｏ、「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ」より「Ｏｕｔｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ」、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、２９〜４７頁）。バリア機能が、ナフシリン、疎水性ペニシリンなどの特定の抗生物質化合物の相対的な不透過性を説明する。ＥＤＴＡ、二価カチオンキレート剤、および／またはトリスなどのかさ高いアミンの添加は、ＬＰＳ分子間の密接な会合を阻害すると考えられる。本発明のＡＴＰ抽出剤を使用すると、ＥＤＴＡまたはＣＤＴＡなどの二価カチオンキレート剤は、外膜を不安定化して、瞬間的破裂および細胞構成要素（ＡＴＰなど）の放出を容易にできる。
【００２６】
二価カチオンはＡＴＰ放出を阻害できるが、一方、それらはＡＴＰを検出するためのルミネセンスの反応の必須構成要素である。ＡＴＰ検出における最大の感度のために、二価カチオン、特にマグネシウムの濃度は、典型的に約１０ｍＭを超える濃度で使用される（図１Ｂ参照）。微生物を含有するサンプル中のＡＴＰを抽出し検出するための一段階試薬組成物は、二価カチオンのためのこれらの相反する要件の折り合いを付けなくてはならない。さらに本発明者らは、微生物からのＡＴＰの最適抽出および検出が、サンプルへの試薬組成物の添加後に、迅速に、１０分以内に、好ましくは５分以内に達成できることを見いだした。試薬組成物中で使用する二価カチオンまたはカチオンキレート剤の最適量を判定することは、微生物のタイプおよび構造、二価カチオンが細胞壁および／または細胞膜構成要素を安定化する程度、微生物サンプル中に既に存在するＡＴＰ、カチオン、および／またはカチオンキレート剤の量、および試薬組成物または反応混合物中のルシフェラーゼの量または安定性をはじめとするがこれに限定されるものではない、多様な要因に左右される。
【００２７】
Ｃ．試薬組成物
１．ＡＴＰ抽出剤
本発明の一態様は、微生物細胞からのＡＴＰ放出を促進するための１つ以上のＡＴＰ抽出剤使用を含む。微生物ＡＴＰ抽出剤は、ポリミキシンＢ（例えばポリミキシンＢ１およびポリミキシンＢ２）、ポリミキシン−β−ノナペプチド（ＰＭＢＮ）、およびクロロヘキシジン（ＣＨＥＸ）などの抗生物質と、オクチル−β−Ｄ−１−チオグルコピラノシドなどのアルキルグルコシドまたはアルキルチオグルコシドと（参照によってその全体をここに援用する米国特許第６，１７４，７０４号明細書を参照されたい）、エトキシル化オクチルフェノールトリトンＸ−１００（ＴＸ−１００）およびその他のエトキシル化アルキルフェノールをはじめとするが、これに限定されるものではない、非イオン性エトキシル化アルキルフェノールなどの非イオン性洗剤と、カルボキシプロピルベタイン（ＣＢ−１８）などのベタイン洗剤と、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）などの四級アンモニウム塩と、臭化トリメチルオクタデシルアンモニウム（ＴＭＡ−１８）と、プロタミンと、トリエチルアミン（ＴＥＡ）およびトリエタノールアミン（ＴｅｏｌＡ）などのアミンと、ポリリジン、ナイシン、マガイニン、メリチン、ホスホリパーゼ（ｐｈｏｐｈｏｌｉｐａｓｅ）Ａ2、ホスホリパーゼＡ2活性化ペプチド（ＰＬＡＰ）などのカチオン性、抗細菌、孔形成、膜活性、および／または細胞壁活性ポリマーと、バクテリオファージなどをはじめとするが、これに限定されるものではない、微生物細胞壁および／または膜を透過処理してＡＴＰ放出を容易にできる、多様な作用物質を含んでもよい。例えば参照によってその全体をここに援用するＭｏｒｂｅら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．（１９９７年）第１５２巻、３８５〜３９４頁、およびイオン性表面活性化合物を開示する米国特許第４，３０３，７５２号明細書を参照されたい。
【００２８】
ＡＴＰ抽出剤は、好ましくは本発明のルシフェラーゼ酵素を不活性化しないように選択される。ＡＴＰ放出のためにより強力な作用物質（例えばイオン性洗剤など）を必要とする微生物のためには、これらの作用物質存在下で強化された安定性を示す、その内容全体を本願明細書に引用した米国特許出願公開第２００３／０１０４５０７号明細書で開示されるものなどの改質ルシフェラーゼが特に好ましい。
【００２９】
発明の一実施形態では、ＡＴＰ抽出剤はＣＴＡＢ、四級アンモニウム塩を含む。好ましい実施形態では、ＣＴＡＢは試薬組成物中に約０．０４％〜０．１５％（ｗ／ｖ）の間の濃度で存在する。別の実施形態では、ＡＴＰ抽出剤は、ＣＨＥＸと、トリトンＸ−１００などのエトキシル化アルキルフェノールとを含んでもよい。好ましい実施形態では、ＣＨＥＸは好ましくは約０．０４％〜０．１６％（ｗ／ｖ）の間であり、エトキシル化アルキルフェノールは約０．２５％〜１．０％（ｗ／ｖ）の間で存在する。特に好ましい実施形態では、試薬組成物は２種以上のＡＴＰ抽出剤を含んでもよい。好ましい一実施形態は、ＣＨＥＸ（約０．０４％〜０．１６％（ｗ／ｖ）の間）、トリトンＸ−１００などのエトキシル化アルキルフェノール（約０．２５％〜１．０％（ｗ／ｖ）の間）、およびＣＴＡＢなどの四級アンモニウム塩（約０．０２％〜０．０８％（ｗ／ｖ）の間）を含む。
【００３０】
本発明の方法において機能する最も好ましい濃度または濃度範囲は、異なる微生物および異なるＡＴＰ抽出剤に対して変動し、本願明細書で述べられる、または一般に当業者に知られている方法を使用して、経験的に判定されてもよいことが完全に予期される。
【００３１】
２．二価カチオン
カブトムシルシフェラーゼ−ルシフェリン反応は、ＡＴＰだけでなく二価カチオンにも依存する。したがってルシフェラーゼ活性を容易にするために、（サンプル中に既に存在する場合を除いて）二価カチオンが典型的に提供される。二価カチオンとしては、マグネシウム、カルシウム、およびマンガンが挙げられる。二価カチオンは、スルフェート、スルホネート、グルコネート、カーボネート、塩化物、および臭化物などの塩またはハロゲン化物として供給されてもよい。例えばマグネシウムカチオンは、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、臭化マグネシウム、炭酸マグネシウムなどとして提供されてもよい。好ましくは二価カチオンは、マグネシウムの塩化物または硫酸塩から選択される。
【００３２】
特定の細胞膜または壁の透過度は、二価カチオンの存在によって悪影響を受けるかもしれないので、特定微生物または特定抽出／検出系について二価カチオン濃度を経験的に調合して、例えばＡＴＰの細胞放出とＡＴＰ検出との間に適切なバランスを提供してもよい。
【００３３】
さらに二価カチオンキレート剤がＡＴＰ抽出に対する二価カチオンの悪影響を中和する能力を有することを考えると、試薬組成物または反応混合物中に存在する二価カチオンキレート剤のレベル次第で、二価カチオン濃度を調節してもよい。二価カチオンキレート剤が低い（例えば約５ｍＭ、２．５ｍＭまたは１ｍＭ未満）場合、二価カチオン濃度はそれに応じてより低く、好ましくは２．５ｍＭ未満、より好ましくは０．２〜１ｍＭの間である。しかし二価カチオンキレート剤がより高い（例えば２〜２０ｍＭ）場合、二価カチオン濃度はそれに応じてより高く、好ましくは二価カチオンキレート剤濃度以下の濃度である。
【００３４】
３．二価カチオンキレート剤
二価カチオンキレート剤としては、制限なく、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールテトラ酢酸（ＥＧＴＡ）、および１，２−シクロヘキサンジニトリロテトラ酢酸（ＣＤＴＡ）、ニトリロ酢酸（ＮＴＡ）、クエン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸、リグノスルホネートの塩、およびそれらの混合物が挙げられる。好ましくはキレート剤は、それらの一般入手可能性および比較的低価格から、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、およびＣＤＴＡよりなる群から選択される。二価カチオンキレート剤の適切なレベルは、ＡＴＰ抽出に対する二価カチオンの悪影響を中和するのに十分であるが、カチオン依存性のルシフェラーゼ触媒ＡＴＰ検出を防止する程度ではないレベルを提供することに基づいて、経験的に判定されてもよい。
【００３５】
概してキレート剤濃度は、二価カチオン濃度の少なくとも約５０％であり、好ましくは二価カチオン濃度の約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％である。最も好ましくはキレート剤濃度は、二価カチオン濃度にほぼ等しく、またはそれを超える。特に好ましい実施形態では、キレート剤濃度は約２０〜２５ｍＭの範囲にある。二価カチオン濃度が低い（例えば約５ｍＭ、２．５ｍＭ、または１ｍＭ未満）場合には、二価カチオンキレート剤が不必要かもしれない。
【００３６】
しかし当業者は、異なるキレート剤が、ｐＨ次第で異なるキレート能力を有するかもしれないことを認識する。したがって本発明の外部パラメーターとしては、その他の点では同一のルシフェラーゼアッセイ反応条件下で（例えばｐＨ７．０〜８．０などで）、ＥＤＴＡのそれと比較できるキレート剤能力を提供するのに釣り合ったキレート剤のためのキレート剤濃度における可変性の程度が挙げられる。換言すれば、二価カチオンキレート剤の量は、その他の点では同一の一段階ＡＴＰ反応条件（二価キレート剤を除いて、その他の全ての試薬および試薬濃度が同一）下で、ＥＤＴＡのキレート能力と比較できるまたはそれを超えるキレート能力を提供するように調節されてもよく、またはＡＴＰの抽出および検出に対する二価カチオンの悪影響と好ましい効果それぞれのバランスをとるのに、十分な量に調節してもよい。
【００３７】
４．ルシフェラーゼ／ルシフェリン
それらの最も基礎的レベルでは、ルシフェラーゼはルミネセンスを生じるそれらの能力によって画定される。より具体的には、ルシフェラーゼは基質ルシフェリンの酸化を触媒することで、オキシルシフェリンおよび光子を生成する。その触媒生成物が光を含むルシフェラーゼは、感度、検出可能な生成物、およびＡＴＰの容易な測定を提供する。あらゆるＡＴＰ依存性ルミネセンス生成酵素が、本発明の試薬組成物および方法中で使用するために考察される。
【００３８】
今日までに、少なくとも５つのクラスのルシフェラーゼが同定されている（Ｊｏｎｅｓら、１９９９年；Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９７年）。これらの内、一般的なホタル（ホタル科（Ｌａｍｐｙｒｉｄａｅ））のもののようなカブトムシルシフェラーゼは、ユニークな進化上の起源がある特徴的なクラスを形成する（ＭｃＥｌｒｏｙら、１９６９年；Ｗｈｉｔｅら、１９６９年；Ｗｈｉｔｅら、１９７５年）。カブトムシルシフェラーゼは文献でホタルルシフェラーゼと称されることが多い。しかしホタルルシフェラーゼは、実際のところカブトムシルシフェラーゼクラスの下位集団である。カブトムシルシフェラーゼは、カブトムシそれ自体のランタンから、または技術分野でよく知られているタンパク質発現系から精製されてもよい（ＢａｌｄｗｉｎおよびＧｒｅｅｎ、２０００年；ＢｅｎｙおよびＤｏｌｉｖｏ、１９７６年；Ｂｒａｎｃｈｉｎｉら、１９８０年；Ｆｉｌｉｐｐｏｖａら、１９８９年）。
【００３９】
参照によってその内容全体をここに援用する米国特許出願公開第２００３／０１０４５０７号明細書で開示されるものをはじめとするが、これに限定されるものではない、ＡＴＰ−依存反応を触媒してルミネセンスを発生させる全てのルシフェラーゼ、ルシフェラーゼ変異型、ルシフェラーゼ断片、および変異型ルシフェラーゼ断片が、本発明で使用するために考察される。カブトムシルシフェラーゼ、特に北米のホタルＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓからのホタルルシフェラーゼが技術分野でよく知られている。Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ（ＬｕｃＰｐｙ）は、遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質による計算でＭr６１ｋＤａのおよそ５５０個のアミノ酸からなる。本発明に従ったその他のホタルルシフェラーゼとしては、Ｐｈｏｔｕｒｉｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａホタルルシフェラーゼ（ＬｕｃＰｐｅ２、５４５個のアミノ酸残基、ＧｅｎＢａｎｋ２１９０５３４；Ｙｅら、１９９７年）、ならびにＬｕｃＰｐｅ２（例えばＬｕｃＰｐｅ２ｍ７８（７８−０Ｂ１０としても知られている）、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ９０（９０−１Ｂ５としても知られている）、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ１３３（１３３−１Ｂ２としても知られている）、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ１４６（１４６−１Ｈ２としても知られている））に由来する米国特許出願公開第２００３／０１０４５０７号明細書で開示される様々な突然変異体ルシフェラーゼ、およびＵｌｔｒａＧｌｏTMルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）などの様々な市販のルシフェラーゼが挙げられる。ＬｕｃＰｐｅ２ｍ７８、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ９０、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ１３３、およびＬｕｃＰｐｅ２ｍ１４６を作る方法は、米国特許出願公開第２００３／０１０４５０７号明細書で開示され、その全体を参照によってここに援用する。
【００４０】
本発明では、単離および／または精製されたルシフェラーゼが典型的に使用される。それらの天然環境に由来する、診断または治療的使用を妨害できる汚染物質構成要素としては、酵素、ホルモン、およびその他のタンパク様または非タンパク様物質が挙げられる。純度を確実にする一技術は、クマシー・ブルーまたは銀染色を使用して、非還元または還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を実施することである。ルシフェラーゼは、天然ルシフェラーゼ産生源から、または外来性ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを発現する組換え細胞から単離されてもよい。ルシフェラーゼ酵素を生成および／または精製する技術は、当業者によく知られている。
【００４１】
カブトムシルシフェラーゼの天然由来基質は、多複素環式有機酸Ｄ−（−）−２−（６’−ヒドロキシ−２’−ベンゾチアゾリル）−Δ2−チアゾーリン−４−カルボン酸（ルシフェリン）であるホタルルシフェリンである。ルシフェリンは、自然界から（例えばホタルから）単離されても、または合成されてもよい。合成ルシフェリンは自然発生的ルシフェリンと同一構造を有することができ、または同じように機能さえすれば変異型または誘導体化であることができる（Ｂｏｗｉｅら、１９７３年；Ｂｒａｎｃｈｉｎｉ、２０００年；Ｃｒａｉｇら、１９９１年；ＭｉｓｋａおよびＧｅｉｇｅｒ、１９８７年；ＹａｎｇおよびＴｈｏｍａｓｏｎ、１９９３年）。本発明で使用するための例示的なルシフェリン誘導体としては、６−デオキシアミノルシフェリン、Ｄ−ルシフェリンメチルエステル、Ｄ−ルシフェリル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｄ−ルシフェリル−Ｌ−Ｎα−アルギニン、Ｄ−ルシフェリン−Ｏ−スルフェートおよびＤ−ルシフェリン−Ｏ−ホスフェート（ＭｉｓｋａおよびＧｅｉｇｅｒ、１９８７年）、サンプル中の構成要素によりエステラーゼによって加水分解されまたは作用されてルシフェリンになったルシフェラーゼのエステル（Ｃｒａｉｇら、１９９１；ＹａｎｇおよびＴｈｏｍａｓｏｎ、１９９３年）が挙げられるが、これに限定されるものではない。その他の有用なルシフェリン類似物の例としては、それぞれ緑色および赤色光スペクトルにおいて発光するナフチルシフェリンおよびキノリルルシフェリンが挙げられる（Ｂｒａｎｃｈｉｎｉら、１９８９年）。ルシフェリンの商業的供給源は数多くある（例えばＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）。
【００４２】
ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応からルミネセンス信号を生じる、カブトムシルシフェラーゼ触媒反応は、ルシフェラーゼ酵素、ルシフェリン、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、マグネシウム（またはその他の二価カチオン）、および分子酸素を必要とする。最初の反応では、ルシフェリンとＡＴＰが反応して無機ピロリン酸塩が除去され、アデニル酸ルシフェリルを形成する。アデニル酸ルシフェリルは、ルシフェラーゼの触媒部位に密接に結合したままである。この形態の酵素が分子酸素に曝露すると、酵素に結合したアデニル酸ルシフェリルは酸化されて、電子的に励起状態のオキシルシフェリンを生じる。励起した酸化ルシフェリンは、基底状態に戻る際に発光する。
【化１】
2008504841.tif 000003
【００４３】
ＡＴＰ類似体（例えばｄＡＴＰ）もまた、上の反応を進められる。さらに上の反応でマグネシウムをその他の二価カチオン（例えばＭｎ2+またはＣａ2+）で置き換えてもよい。酸素は反応の反応物質であるので、反応は嫌気性条件下で行うことができない。しかし空気中に存在する以上に酸素を提供することは、概して不必要である。反応溶液中に十分な酸素があれば、反応は閉鎖容器内で実施できる。
【００４４】
ほとんどのルシフェラーゼ−ルシフェリン反応は、束の間の閃光を発生させる。しかし例えばＬｕｃＰｐｅ２ｍ１４６およびＬｕｃＰｐｅ２ｍ９０ルシフェラーゼなどの本発明で使用するのに好ましいいくつかのルシフェラーゼは、本発明の条件下で、試薬組成物とサンプルとを合わせて混合物を形成した後に、１時間あたり５０％未満のルミネセンス損失がある「グロータイプ」のルミネセンス信号を発生させる。本発明の範囲内の好ましいルシフェラーゼ、ルシフェラーゼ変異型、ルシフェラーゼ断片、または変異型ルシフェラーゼ断片としては、同一試薬組成物の文脈中で、試薬組成物環境内で安定性を維持でき、安定ルミネセンスを発生させる能力を保持できるものが挙げられる。
【００４５】
ルシフェラーゼ触媒反応の完了を容易にするために、ルシフェリンなどのルシフェラーゼのための基質が試薬組成物中に含まれてもよい。本発明の範囲内のいくつかの実施形態では、ルシフェリンを除外し、使用者が好みのルシフェリンを提供できるようにしても良い。代案としては、その他の反応構成要素に添加するためにルシフェリンが別々に提供されてもよい。提供されるルシフェリンのタイプは異なってもよいが、それは特定用途で使用するための特定のルシフェラーゼの基質でなくてはならない。
【００４６】
天然酵素はこのような組成物でも機能するかもしれないので、均質な一段階抽出および検出試薬組成物を作り出す能力は、必ずしもルシフェラーゼの化学または温度安定性に依存しない。しかしＡＴＰ抽出剤などの調合物中のその他の構成要素からの活性損失の影響をより受けにくく、より広範な反応条件（すなわち周囲温度および／またはより高い温度）でより大きな選択性および／または感度、およびより大きな適合性を提供するかもしれないことから、熱安定性ルシフェラーゼの使用が好ましい。同様に、「化学安定ルシフェラーゼ」がより上手く活性を保持でき、または感度および／または性能を増大させることができる範囲で、それらは化合物または条件の存在下で（例えば野生型酵素と比べて）好ましい。
【００４７】
本発明の試薬組成物、混合物、または方法中で使用するのに好ましいルシフェラーゼは安定信号を発生させ、すなわちこのようなルシフェラーゼは、ルシフェラーゼ反応で使用すると、ルシフェラーゼ反応開始時のルミネセンスに対して半時間あたり５０％未満のルミネセンス損失と定義される強化された持続期間でルミネセンスを生じる。好ましいルシフェラーゼとしては、（ルミネセンスによる測定で）少なくとも１時間にわたり、好ましくは少なくとも２時間にわたり、さらにより好ましくは少なくとも４時間にわたり、少なくとも約３０％（好ましくは少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％）の酵素活性を維持するものが挙げられる。
【００４８】
５．ＡＴＰ代謝のＡＴＰ分解酵素阻害物質または阻害物質
微生物細胞は、経時的に細胞中に存在するＡＴＰ量を歪められる物質を含んでもよい。これはＡＴＰ分解酵素、ＡＴＰ分解酵素阻害物質、および／またはＡＴＰ生成酵素の阻害物質の存在に起因してもよい。ＡＴＰ濃度は特定時間に判定されるので、そのままにしておくと、ＡＴＰ生成または損失と結びついた不適切な活性が、微生物細胞中に存在するＡＴＰ濃度の過大評価をもたらすかもしれない。
【００４９】
サンプル中のＡＴＰレベルを正確に測定するために、微生物のＡＴＰプールを分解できる、またはＡＴＰの新しい供給源を不適切に生成できる酵素を阻害することが好ましい。適切な阻害物質を組み込み損なうと、ＡＴＰ濃度の不正確な判定がもたらされるかもしれない。例示的なＡＴＰ分解酵素阻害物質としては、本発明のＡＴＰ抽出剤（ＣＴＡＢなど）、カチオン性または非イオン性洗剤、または米国特許出願公開第２００３／０１０４５０７号明細書で開示されるＡＴＰ分解酵素阻害物質のいずれかが挙げられる。ＤＴＡＢなどの阻害物質が特定のＡＴＰ分解酵素を不活性化してもよいのに対し、フッ化ナトリウム（ＮａＦ）などのその他の分子は脱リン酸酵素を不活性化して、ＡＴＰ代謝の調節に関与する微生物キナーゼの活性に影響を与えてもよい。
【００５０】
米国特許出願公開第２００３／０１０４５０７号明細書で開示されるように、ＡＴＰ生成酵素の例示的な阻害物質としては、キナーゼまたは脱リン酸酵素阻害物質（ＮａＦなど）が挙げられる。好ましい実施形態では、本発明の試薬組成物は、少なくとも約０．２ｍＭ、好ましくは少なくとも約１ｍＭ、より好ましくは少なくとも約２ｍＭの濃度のＮａＦを含んでなってもよい。ＡＴＰ生成酵素のその他の阻害物質としては、バナジン酸塩、ＡＭＰ、ＤＡＰＰ（Ｂｏｓｔｉｃｋら、１９８２年）およびジクロロ酢酸（Ｋｉｅｃｈｌｅら、１９８０年）などのその他のキナーゼ阻害物質が挙げられる。
【００５１】
ＡＴＰの不適切な生成または損失を防止するための阻害物質の使用は、長時間にわたり多数のサンプルプレートを読み取る必要がある高処理能力用途において特に有用であってもよく、サンプル中に存在する元のＡＴＰレベルを歪めるより大きな機会を提供する。
【００５２】
６．緩衝液
適切な緩衝液の選択は、ｐＨ緩衝能力およびルシフェラーゼ−ルシフェリン反応との相互作用に依存する。作用溶液に適切なｐＨを維持し、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応を妨げないあらゆる緩衝液が考察される。好ましいｐＨ範囲は約ｐＨ４．５から約ｐＨ９．０の間であり、より好ましくは約ｐＨ６．０から約ｐＨ８．０の間である。ＭＥＳおよびクエン酸緩衝液に加えて、典型的な緩衝液としては、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、トリス、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ホウ酸塩、および当業者に適切であるかもしれないことが知られているその他のあらゆる緩衝液が挙げられる。典型的な緩衝剤としては、トリシン、ＨＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、トリス、グリシルグリシン、および適切なｐＨおよびイオン強度を維持するのに使用されるリン酸塩が挙げられる。好ましい緩衝液濃度は、約５０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲である。
【００５３】
７．脱泡剤
気泡に起因するサンプルの損失および／またはサンプルの相互汚染を防止するために、脱泡剤が望ましい。脱泡剤の添加はまた、製造または使用中の生成物の定量供給を容易にするかもしれない。適切な脱泡剤としては、商品名ＭＡＺＵ（登録商標）（ＰＰＧ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｇｕｒｎｅｅ，ＩＬ）の下に入手できるものが挙げられ、有機またはシリコーンベースであってもよい。脱泡剤の選択は、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応への妨害性なしに泡を除去するそれらの能力に左右されてもよい。
【００５４】
８．その他の作用物質
試薬組成物はまた、安定剤または揮発性制御剤を含んでもよい。安定剤または揮発性制御剤は、ルシフェラーゼを分解から安定化する、および／またはルシフェラーゼおよび／またはルシフェリンの凍結乾燥を助けるあらゆる化合物であってもよい。適切な酵素安定剤としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｐｒｉｏｎｅｘ（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ  Ｌｔｄ．、Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）などのＢＳＡ代用品、ゼラチン、および洗剤（好ましくは非イオン性洗剤、最も好ましくはＴＨＥＳＩＴ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５５】
本発明の試薬組成物はまた、ナトリウムピロリン酸塩（ＮａＰＰＩ、例えば約２５ｍＭの）、補酵素Ａ（ＣｏＡ）、ジチオスレイトールおよびβメルカプトエタノール（Ｗｏｏｄに付与された米国特許第５，２８３，１７９号明細書、１９９４年；Ｗｏｏｄに付与された米国特許第５，６５０，２８９号明細書、１９９７年）などのチオール試薬、金属イオンキレート剤（ＡＴＰ抽出／検出におけるそれらの使用に加えて）またはプロテアーゼ阻害物質（Ｓｃｈｅｉｒｅｒに付与された米国特許第５，６１８，６８２号明細書、１９９７年；Ｓｃｈｅｉｒｅｒに付与された米国特許第５，８６６，３４８号明細書、１９９９年）、または高濃度の塩（Ｖａｎ  ＬｕｎｅおよびＴｒｅｒ  Ｗｉｅｌに付与された国際公開第００／１８９５３号パンフレット、２０００年）をはじめとするが、これに限定されるものではない、ルミネセンス持続期間を増強する（検出半減期を延長する）ことが知られている物質を含んでもよい。
【００５６】
Ｄ．微生物細胞中のＡＴＰを抽出し検出するための方法
本発明の方法、組成物、およびキットは、微生物サンプル中のＡＴＰ（またはルシフェラーゼ基質として機能できるＡＴＰ類似体）の単純な定性的または定量的検出を提供する。概してサンプル中のルミネセンスを実証する単純な定性実験は、ＡＴＰの存在を示す。
【００５７】
一態様では、本発明は、その中で微生物サンプルと、反応緩衝液、少なくとも１つの微生物ＡＴＰ抽出剤、二価カチオン、および二価カチオンキレート剤を含有する試薬組成物とが接触され、その中で二価カチオンキレート剤濃度と二価カチオン濃度との差が約５ｍＭ未満である、微生物細胞中のＡＴＰを検出するための方法を含む。代案としては、試薬組成物または反応混合物中の二価カチオンキレート剤濃度は、二価カチオン濃度の少なくとも２分の１、好ましくはそれ以上でさえあってもよい。しかし二価カチオン濃度が低い（例えば約５ｍＭ、２．５ｍＭ、または１ｍＭ未満）場合には、二価カチオンキレート剤が不必要であってもよい。好ましくは検出可能なルミネセンス信号は、微生物サンプルと試薬組成物とを接触させた後、５または１０分以内に生じる。本質的に、本発明の方法における使用のために、本開示で述べられるあらゆる試薬組成物が考察される。
【００５８】
微生物サンプルと試薬組成物とを接触させることは、試薬組成物中に存在する適切なバイオルミネセンス試薬との反応のための、微生物細胞からのＡＴＰの抽出または放出を容易にし、それによって容易に検出可能なバイオルミネセンス信号が生じる。微生物サンプルは、精製された微生物サンプル、微生物細胞の混合集団、または微生物細胞を含有することが疑われる供給源物質を構成しても良い。好ましい実施形態では、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含有することが疑われる微生物源物質から、ＡＴＰを抽出し検出する方法に関する。
【００５９】
例えばカチオン性または非カチオン性洗剤などの少なくとも１つのＡＴＰ抽出剤と、マグネシウムなどの二価カチオンと、ＥＤＴＡなどの二価キレート剤と、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ７８、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ９０、ＬｕｃＰｐｅ２ｍ１３３またはＬｕｃＰｐｅ２ｍ１４６などのルシフェラーゼ供給源と、ルシフェリンなどの１つ以上のルシフェラーゼ基質（凍結乾燥製剤またはその他の適切なルシフェリン類似体基質から水で戻してもよい）とを含有する試薬組成物を使用して、適切なルミネセンス信号を生じさせてもよい。試薬組成物は、１つ以上のＡＴＰ生成酵素阻害物質、酵素安定剤、脱泡剤などをさらに含んでもよい。
【００６０】
１．微生物細胞源
一態様では、本発明は、細菌、酵母またはその他の真菌などの微生物サンプル中、または微生物サンプルを含有することが疑われるサンプル中のＡＴＰを抽出し検出する方法を提供する。真正細菌（グラム陽性細菌、グラム陰性細菌の双方）、古細菌、酵母または真菌をはじめとするが、これに限定されるものではない、本発明に従って使用するのに適した多様な微生物源がある。例えば本発明の試薬組成物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、フラボバクテリウム・オケアノコイテス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｋｅａｎｏｋｏｉｔｅｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、およびフランシセラ・フィロミラジア（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ）などのグラム陰性細菌、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅａｕｓ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシラス・セレウス（Ｂａｃｉｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、アルスロバクター・ルテウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｌｕｔｅｕｓ）などのグラム陽性細菌、およびサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）などの真核生物の微生物をはじめとするが、これに限定されるものではない多様な異なる微生物の生物体で機能することが見いだされている。好ましい実施形態では、サンプルは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を含有する、または含有することが疑われる。本発明の方法は、あらゆる量のＡＴＰを含有するサンプルと共に使用してもよいが、非飽和量のＡＴＰ（すなわちルミネセンスがＡＴＰ濃度に正比例する範囲）を含有するサンプルを使用することが好ましい。
【００６１】
微生物サンプルは、細胞溶解産物と、無処置細胞と、生検材料と、食物と、飲料と、動物、植物、または無生物対象物などの表面をぬぐった綿棒などの微生物を含有することが疑われるあらゆるものであってもよい。対照サンプルは、既知のＡＴＰ濃度を含んで標準曲線を発生させ、サンプル中のＡＴＰレベルの定量的な判定を容易にしてもよい。
【００６２】
細胞溶解産物は、もはや認識可能な無処理細胞構造に組織化できない細胞構成要素を含んでなる。細胞溶解産物は可溶性および不溶性の構成要素を有してもよく、どちらも溶解産物を使用する前に除去してもよい。溶解産物は、超音波処理、ダウンス、乳鉢と乳棒、凍結解凍サイクリング、または細胞の物理的完全性を破壊するその他のあらゆる装置またはプロセスを使用した物理的中断や、または両性イオン性および非イオン性洗剤、またはカチオン性洗剤ＤＴＡＢまたはＣＴＡＢなどその中でＬｕｃＰｐｅ２ｍ１４６が活性を維持するような洗剤による溶解をはじめとするあらゆる手段によって調製してもよい。好ましくは細胞溶解産物は、細胞収集時にＡＴＰ濃度の完全性が保持されるように生成される。
【００６３】
２．ＡＴＰ抽出
微生物源からの効率的なＡＴＰ抽出または放出は、微生物源によって呈される構造的な制約に左右されるかもしれない。これらの状況は、二価キレート剤化合物量のバランスを取って、十分なレベルの二価カチオンがＡＴＰのバイオルミネセンスの検出を促進しながら、二価カチオン媒介安定化を逆転させることを必然的に伴うかもしれない。ＡＴＰを抽出し検出するための適切なＡＴＰ抽出剤の選択は、特定微生物源について経験的に判断してもよい。好ましくはこれらの化合物の選択は、本発明に従った一段階抽出およびＡＴＰ検出のための効率的なＡＴＰ抽出、およびＡＴＰ検出活性（例えばルシフェラーゼ活性など）の維持を前提としている。
【００６４】
３．ＡＴＰ検出
カブトムシルシフェラーゼ−ルシフェリン反応は、光（「ルミネセンス」）生成をもたらす。カブトムシルシフェラーゼ−ルシフェリン反応はＡＴＰ依存性であるため、ルシフェラーゼを使用してＡＴＰをアッセイできる。反応は顕著に高感度であり、わずか１０-16モル以下のＡＴＰを含有するサンプル中のＡＴＰを検出できるようにする。本発明の組成物、方法、およびキットは、ルミネセンスの量を定量化することで、使用者がサンプル中のＡＴＰ量を定量できるようにする。本発明は関心のあるサンプル、および既知量のＡＴＰ（対照）含有サンプルにも適用される。未知のＡＴＰ濃度のサンプルから発生した信号と、内部対照から発生した信号（例えばサンプルへの既知量のＡＴＰ添加と引き続いくルミネセンス測定）とを、またはいくつかの既知ＡＴＰ濃度サンプルのルミネセンスを測定しグラフにプロットして作成した外部標準曲線とを相関させてもよい。このような方法は当業者に知られている（ＭｏｙｅｒおよびＨｅｎｄｅｒｓｏｎ、１９８３年；Ｒｏｎｎｅｒら、１９９９年；Ｓｔａｎｌｅｙ、１９８９年；Ｗｏｏｄら、１９８９年）。
【００６５】
ルシフェラーゼ反応によって生じるルミネセンスは、典型的に照度計で検出されるが、その他の検出手段を使用してもよい。ルミネセンスを測定し、それによって試薬組成物活性を判定するために、試薬組成物とサンプルを合わせた後の関心ある時点で、ルシフェラーゼ反応によって発じる相対光単位（ＲＬＵ）の値を測定してもよい。バックグラウンドレベルを超える光の存在は、サンプル中のＡＴＰの存在を示唆する。ルミネセンスのバックグラウンドレベルは、サンプルが存在するのと同一反応条件（例えば試薬組成物など）下であるが、サンプル不在で測定してもよい。ＡＴＰを伴う正の対照反応を用いて、サンプル中に存在するＡＴＰ量の判定を容易にしてもよい。これらおよびその他の対照反応は、当業者によって判定されてもよい。
【００６６】
本発明の組成物および方法で使用するのに好ましいルシフェラーゼは、持続期間が明白で、ルシフェラーゼ反応開始時に発生するルミネセンス信号に比べて半時間あたり５０％未満のルミネセンス損失を示す、安定ルミネセンス信号を発生させる。本発明の組成物および方法で使用するのに好ましいルシフェラーゼは、強化された熱安定性特性を有してもよく、および／またはルシフェラーゼ反応開始後１時間、より好ましくは２時間、最も好ましくは開始後４時間以上をはじめとするが、これに限定されるものではない、経時的なサンプルの複数分析または経時的な多数のサンプルの分析に好ましい動態学的特性を有してもよい。
【００６７】
放射光量を定量化することで、サンプル中のＡＴＰの定量化を可能にし、それによって生微生物細胞量の定量化を可能にしてもよい。例えば試験サンプルから放出される光量と、対照サンプルから放出される光量とを、または既知量のＡＴＰおよび同一ルシフェラーゼ、基質、および反応条件（すなわち温度、ｐＨなど）を使用して判定された標準曲線とを比較すると、定量的なＡＴＰ値が分かる。定量化はバックグラウンド値の減算を伴うことが理解される。例えば試験化合物の存在または不在におけるサンプルの比較などのように、１つのサンプルから放出されるルミネセンスと、別のサンプルから放出されるルミネセンスとを比較すると、サンプル中に存在するＡＴＰの絶対量を知る必要なしに定性的ＡＴＰ値が分かる。このような多数の実験は当業者によって容易にデザインされる。
【００６８】
本発明に従った好ましい実施形態は、ＡＴＰの抽出および検出を容易にする構成要素の完全なセットを含有する一段階試薬組成物を使用した、ＡＴＰ検出方法に関する。しかし当業者に知られているその他の「二段階」ＡＴＰ検出法に従い、最終ＡＴＰ検出ステップにおける中和剤（例えば緩衝液）および／または外来性ルシフェラーゼおよび／またはルシフェリン剤の添加に先だって、最初に細胞を溶解するために、ルシフェラーゼおよびルシフェリン試薬と独立して、本発明のＡＴＰ抽出剤を含有する試薬組成物を使用してもよい。
【００６９】
４．細胞生存度
ＡＴＰの存在は、生細胞に特徴的な活性代謝プロセスの反映である。したがって本発明の組成物、方法、およびキットを使用して、細胞生存度をアッセイできる（Ｃｒｅｅ、１９９８年；Ｊａｓｓｉｍら、１９９０年；Ｐｅｔｔｙら、１９９５年）。細胞生存度の正確な測定は、細胞に対する物質の効果の正確なアセスメントを可能にする。細胞生存度に関するその他の応用は、当業者に知られている。細胞生存度を判定することは、例えば細胞毒性、細胞増殖、壊死、細胞代謝の変化などを評価するのに有用であってもよい。
【００７０】
細胞生存度を評価するのに使用される微生物サンプルは、自然の生細胞であってもよく、あるいは（細胞生存度の代理マーカーとしての）細胞溶解産物、または細胞を含有することが疑われる、細胞に由来することが疑われる、または微生物源材料の生存度を反映することが予測される、あらゆるその他の微生物源材料を含んでもよい。
【００７１】
５．アッセイキット
均質な溶解および検出試薬を作成するための構成要素、および使用説明のセットを含んでもよい、本発明に従って使用されるアッセイキットが考察される。好ましくはキットは、ルシフェリン／ルシフェラーゼの凍結乾燥供給源、均質な溶解および検出試薬を作成するためのＡＴＰ抽出剤を含有する水戻し緩衝液のバイアルを含んでもよい。水戻し緩衝液は、固定濃度のカチオンおよび／またはキレート剤と共に供給されてもよく、またはこれらの構成要素は別々に供給されて、特定の微生物細胞源材料（例えば個々の細胞、集団など）次第で、使用者が二価カチオンおよび／またはキレート剤を使用に適した濃度で添加できるようにしてもよい。
【００７２】
Ｅ．細菌サンプル中のＡＴＰを溶解し検出するのに適した試薬組成物を同定する方法
異なる微生物は、本プロセスに影響する構造的な差違に基づいて、それらが一段階細胞溶解−ＡＴＰ検出プロセスをサポートをできる程度において違いを示すので、本発明は別の態様では、特定の微生物または微生物群中のＡＴＰの効率的な一段階溶解および検出に適した適切な反応条件を同定する方法を提供する。特に本発明は、ＡＴＰの抽出および検出に個々にまたは集合的に影響できる、微生物ＡＴＰ抽出剤、二価カチオン、および二価キレート剤化合物間の最適バランスを評価または判定するためのアッセイを提供する。
【００７３】
好ましい実施形態では、本発明は、微生物サンプル中のＡＴＰの抽出および検出に適したＡＴＰ抽出剤を同定する方法を提供し、その中では、（１）第１の濃度の二価カチオン、二価カチオンキレート剤、１つ以上の微生物ＡＴＰ抽出剤、ルシフェラーゼ酵素、およびルシフェラーゼ基質（例えばルシフェリン）を含む第１の試薬組成物と、増殖培地中の細菌サンプルとを合わせて、第１のルミネセンス信号を生じる第１の混合物を生成し、（２）第１の試薬組成物におけるよりも高い濃度の二価カチオン、二価カチオンキレート剤、１つ以上の微生物ＡＴＰ抽出剤、ルシフェラーゼ酵素、およびルシフェラーゼ基質（例えばルシフェリン）を含む第２の試薬組成物と同一細菌サンプルとを合わせて、第２のルミネセンス信号を生じる第２の混合物を生成し、第１の混合物からの第１のルミネセンス信号が、第２の混合物から得られる第２のルミネセンス信号を超える場合、第２の試薬組成物は細菌サンプル中のＡＴＰを抽出し検出するのに適する。
【００７４】
好ましくは第１の試薬組成物中の二価カチオン濃度は、第２の試薬組成物中の二価カチオン濃度よりも好ましくは少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約２５倍、なおもより好ましくは少なくとも約１００倍、濃度が低い。第１の試薬組成物中の二価カチオン濃度は、約０〜２ｍＭの間、約０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭの間、約０．１〜０．３ｍＭの間で変動してもよく、または約０．２ｍＭである。好ましくは第２の試薬組成物中の二価カチオン濃度は、約２０ｍＭ〜２００ｍＭの間、約５ｍＭ〜５０ｍＭの間、約１０ｍＭ〜３０ｍＭの間または約２０ｍＭである。
【００７５】
上の方法のバリエーションを使用して、幅広い微生物細胞から効率的にＡＴＰを抽出し検出するのに適した試薬組成物を同定してもよい。簡単に述べると、この方法はルシフェラーゼ（例えば熱安定、化学安定または未変性）、ルシフェリン、固定Ｍｇ2+濃度（例えば５ｍＭ）、および緩衝液を含む試薬組成物を調製するステップと、関心のある推定上のＡＴＰ抽出剤を試薬組成物に添加して、外来性ＡＴＰ（正の対照）および異なる微生物細胞源の収集物いずれかの存在下で、ルミネセンスの相対的差違を調べるステップを伴ってもよい。一実施形態では、微生物細胞源は、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、古細菌、および真菌をはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかのクラスを代表する多様な異なる微生物を含んでもよい。別の実施形態では、微生物細胞源は、特定の微生物のクラス（例えばグラム陰性細菌、グラム陽性細菌、古細菌、または真菌）に特異的な多様な微生物を含んでもよい。選択されるＡＴＰ抽出剤は、ＡＴＰ対照サンプルのルミネセンスに対して最小の影響を有するが、十分な抽出および安定ルミネセンス信号（例えば少なくとも２４分の半減期）生成を提供すべきである。いくつかのＡＴＰ抽出剤は個々に試験してもよく、または組み合わせてそれらの投薬効果をマトリックス形式で評価し、各活性化合物の最良の組み合わせおよび濃度を同定してもよい。試薬組成物中のその他の全構成要素を等しく保ちながら、様々な濃度のＭｇ2+で滴定してＭｇ2+の効果をさらに評価できる。
【００７６】
Ｆ．微生物細胞中のＡＴＰ検出の使用
１．生微生物細胞または微生物の汚染の存在を判定する
本発明の主要な用途は、上で開示される方法を使用して、微生物細胞サンプルの相対生存度、微生物の細胞個体数、または疑われる微生物汚染源を判定することである。
【００７７】
２．化合物の薬学的活性または生物学的活性を評価する
本発明に従った細胞生存度アッセイの使用は、薬学的活性剤または生物学的活性剤の開発および試験にさらに応用してもよい。好ましい実施形態では、本発明の組成物、方法、およびキットを使用して、抗生物質候補化合物の有効性を評価してもよく、または細菌代謝に対する無機物、小型有機物、ペプチド、タンパク質、およびポリペプチドなどの化合物の効果を試験してもよい（Ａｉｇｉｎｇｅｒら、１９８０年；Ａｎｄｒｅｏｔｔｉら、１９９５年；Ｂｒａｄｂｕｒｙら、２０００年；ＣｒｅｅおよびＡｎｄｒｅｏｔｔｉ、１９９７年；Ｃｒｏｕｃｈら、１９９３年；Ｋａｎｇａｓら、１９８４年）。薬学的活性または生物学的活性剤（例えば抗生物質など）による微生物細胞の処置に続く細胞生存度の測定は、微生物の生育に悪影響を与える新しい薬学的または生物学的活性剤をスクリーニングし、同定する手段を提供するかもしれない。
【００７８】
例えば本発明の組成物および方法を使用して、適切な培養装置（例えばマルチウェルプレートなど）内の微生物の培養を（未処理対照培養と平行して）候補抗生剤のプールで処理し、微生物の生育に十分な時間生育させ、ＡＴＰ（ルミネセンスアッセイ）について試験してもよい。概して、未処理対照培養から検出されたルミネセンスが処理済み培養からのルミネセンスよりも高い場合、候補抗生物質剤は抗生物質活性を示すことが見いだされるであろう。反対に、未処理対照培養と比べて処理済み培養中でルミネセンスが同等である（またはそれよりも高い）場合、候補抗生物質剤は典型的に抗生物質活性を有さないことが見いだされるであろう。
【００７９】
さらに本発明の適用は、生得免疫学的防御機序で使用されるものと類似した抗菌剤ペプチドをスクリーニングする方法を提供する（例えばＬｅｈｒｅｒおよびＧａｎｚ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１（１）：２３〜２７頁、１９９９年を参照されたい）。この方法はパートＥで述べられる方法の変法を使用して、微生物細胞を中断できる抗菌剤ペプチドを同定し、その中で抗菌剤ペプチド（または適切なペプチドライブラリー）が上のパートＥ中のＡＴＰ抽出剤と置き換えられる。選択された微生物標的（抗生物質抵抗性微生物など）をＡＴＰ抽出剤に代えて例えばペプチドライブラリーで処理し、ＡＴＰの効率的な抽出および検出の促進に基づき、バイオルミネセンスについてスクリーンし、微生物細胞を溶解する選択的能力を有する有望な殺菌剤を同定できる。しかし方法は必ずしもペプチドのスクリーニングに限られない。多様な異なる化学または生化学化合物を試験し、開示されたＡＴＰアッセイ系を使用して得られた結果に基づいて、微生物細胞を溶解する選択的能力を示す候補作用物質を同定してもよい。以下の実施例は、限定することなく本発明を例証することを意図する。
【実施例】
【００８０】
実施例１  異なるＭｇＣｌ2濃度における微生物細胞中のＡＴＰ検出の動態
水戻し試薬（２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５（Ｓｉｇｍａ）、ＭｇＣｌ2（０ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭまたは２０ｍＭ）、０．０８％ＣＴＡＢ（Ｓｉｇｍａ）、０．１６％ＣＨＥＸ（Ｓｉｇｍａ）、１％トリトン−Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭナトリウムフッ化物（Ｓｉｇｍａ）、２５μＭ  ＮａＰＰＩ（Ｓｉｇｍａ））および基質（４ｍＭクエン酸塩、ｍＭルシフェリン、０．４％Ｐｒｉｏｎｅｘ（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ，Ｌｔｄ）、約０．０８ｍｇ／ｍｌの熱安定性ルシフェラーゼ、１ｍＭ硫酸マグネシウム、および１．２５ｍＭ  ＣＤＴＡ）を含んでなるルシフェラーゼ試薬組成物を使用して、微生物細胞中のＡＴＰ検出の動態を評価した。１００μｌの緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）培養物または１００μｌの１×１０-9Ｍ  ＡＴＰ原液（対照）のいずれかを１００μｌのルシフェラーゼ試薬組成物に添加して、３５分間かけてルミネセンスを周期的に測定した。ウェルあたりおよそ１０6個の細胞で、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を試験した。この分析結果（図１）は、二価カチオン濃度の関数としてＡＴＰ検出の違いを明らかにする。
【００８１】
実施例２  異なるＡＴＰ抽出剤存在下におけるＡＴＰの検出
ＡＴＰ検出に対する異なるＡＴＰ抽出剤の組み合わせの効果を低い（０．２ｍＭ）および高い（２０．０ｍＭ）二価カチオン濃度で試験した。ＢａｃＴｉｔｅｒ−ＧｌｏTM試薬組成物（０．３５８ｍｇ／ｍｌ  ＵｌｔｒａＧｌｏTMルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、６ｍＭカブトムシルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ）、２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ）、０．０８％ＣＴＡＢ（Ｓｉｇｍａ）、０．１６％ＣＨＥＸ（Ｓｉｇｍａ）、１％トリトン−Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭ  ＮａＦ（Ｓｉｇｍａ）、２５μＭ  ＮａＰＰＩ（Ｓｉｇｍａ））中において、「高い」（＋；２０ｍＭ）または「低い」（−；０．２ｍＭ）濃度のＭｇＣｌ2の存在下で、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を異なるＡＴＰ抽出剤で処理した。１００μｌの緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）培養物を１００μｌのＢａｃＴｉｔｅｒ−ＧｌｏTM試薬組成物に添加して、ルミネセンスを測定した。緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）をウェルあたりおよそ１０6個の細胞で試験した。この分析結果（図２）は、試薬組成物または混合物中のマグネシウムレベルを２０ｍＭから０．２ｍＭに減少させたときに、時間枠内の当量点（例えばｔ＝０分）において増大するルミネセンスによって特徴づけられる、「マグネシウム反転」効果を実証する。
【００８２】
実施例３  二価キレート剤の添加に続くＡＴＰ検出の刺激
キレート剤による二価カチオンの中和が、低い二価カチオン濃度条件下で得られる、より高いルミネセンスを模倣できることを実証するために、水戻し試薬（２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．０８％ＣＴＡＢ（Ｓｉｇｍａ）、０．１６％ＣＨＥＸ（Ｓｉｇｍａ）、１％トリトン−Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭ  ＮａＦ（Ｓｉｇｍａ）、２５μＭ  ＮａＰＰＩ（Ｓｉｇｍａ））および基質（４ｍＭクエン酸塩、５ｍＭルシフェリン、０．４％Ｐｒｉｏｎｅｘ（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ，Ｌｔｄ）、約０．０８ｍｇ／ｍｌの熱安定性ルシフェラーゼ、１ｍＭ硫酸マグネシウム、および１．２５ｍＭ  ＣＤＴＡ）を含んでなるルシフェラーゼ試薬組成物で、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、およびＢ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）培養物を処理した。１００μｌの細菌培養または１００μｌの１×１０-9Ｍ  ＡＴＰ原液（対照）のいずれかを１００μｌの水戻し試薬に添加して、ルミネセンスを３５分間にわたり周期的に測定した。ウェルあたりおよそ１０6個の細胞で、微生物の培養物を試験した。追加的ＣＤＴＡをｔ＝１２分に各サンプルに添加した（最終濃度＝２０ｍＭ  ＣＤＴＡ）。この分析結果（図３）は、ＣＤＴＡが緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）中の二価カチオンの阻害効果を中和できることを示唆する。
【００８３】
実施例４  二価カチオンキレート剤存在下のＡＴＰ検出
二価カチオンキレート剤の存在下におけるＡＴＰ検出を実証するために、異なる濃度のＥＤＴＡ（０ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、および２５ｍＭ）を含有する水戻し試薬組成物（２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ）、０．０８％ＣＴＡＢ（Ｓｉｇｍａ）、０．１６％ＣＨＥＸ（Ｓｉｇｍａ）、１％トリトン−Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭ  ＮａＦ（Ｓｉｇｍａ）、２５μＭ  ＮａＰＰＩ（Ｓｉｇｍａ）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2（Ｓｉｇｍａ））を調製した。次に水戻し試薬組成物と基質（４ｍＭクエン酸塩、５ｍＭルシフェリン、０．４％Ｐｒｉｏｎｅｘ（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ，Ｌｔｄ）、約０．０８ｍｇ／ｍｌの熱安定性ルシフェラーゼ、１ｍＭ硫酸マグネシウム、および１．２５ｍＭ  ＣＤＴＡ）とを混合して、ルシフェラーゼ試薬組成物を生じさせた。１００μｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（図４Ａ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（図４Ｂ）または１×１０-9ＭのＡＴＰ原液（図示せず）を１００μｌのルシフェラーゼ試薬組成物に添加して、ルミネセンスを４０分間にわたり周期的に測定した。ウェルあたりおよそ１０6個の細胞で細菌培養を試験した。この分析結果（図４Ａ、４Ｂ）は、ＡＴＰの放出と検出の間の適切なバランスを促進するのに最適化された二価キレート剤濃度を使用して、阻害的二価カチオン効果が中和されてもよいことを示唆する。
【００８４】
実施例５  異なる微生物細胞間のＡＴＰ検出に対する異なる二価カチオン濃度の効果
異なる細菌間でのＡＴＰ検出に対する二価カチオン濃度の効果を判定するために、水戻し試薬（２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ）、０．０８％ＣＴＡＢ（Ｓｉｇｍａ）、０．１６％ＣＨＥＸ（Ｓｉｇｍａ）、１％トリトン−Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭ  ＮａＦ（Ｓｉｇｍａ）、２５μＭ  ＮａＰＰＩ（Ｓｉｇｍａ））を異なる濃度のＭｇＣｌ2（０ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、および２０ｍＭ）に添加）を調製して、基質（４ｍＭクエン酸塩、５ｍＭルシフェリン、０．４％Ｐｒｉｏｎｅｘ（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ，Ｌｔｄ）、約０．０８ｍｇ／ｍｌの熱安定性ルシフェラーゼ、１ｍＭ硫酸マグネシウム、および１．２５ｍＭ  ＣＤＴＡ）に添加した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（図５Ａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（図５Ｂ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（図５Ｃ）、およびＢ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）（図５Ｄ）をウェルあたりおよそ１０6個の細胞で試験した。対照として、精製ＡＴＰ溶液もまた試験した（図示せず）。１００μｌの細菌培養または１００μｌの１×１０-9ＡＴＰ  Ｍ原液のいずれかを１００μｌの試薬に添加し、ルミネセンスを３５分間にわたり周期的に測定した。この分析結果（図５Ａ〜５Ｄ）は、微生物および二価カチオン濃度に依存するＡＴＰ検出の差違を明らかにする。
【００８５】
実施例６  大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）におけるＡＴＰ抽出剤パネルを使用した低い（０．２ｍＭ）および高い（２０ｍＭ）二価カチオン濃度でのＡＴＰ検出の動態
低い（０．２ｍＭ）および高い（２０．０ｍＭ）二価カチオン濃度におけるＡＴＰ検出の動態を評価するために、低い（０．２ｍＭ）または高い（２０．０ｍＭ）濃度のＭｇＣｌ2を含有する試薬組成物（２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭ  ＮａＦ（Ｓｉｇｍａ）、２５μＭ  ＮａＰＰＩ（Ｓｉｇｍａ）、０．３５８ｍｇ／ｍｌ  ＵｌｔｒａＧｌｏTMルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、および６ｍＭカブトムシルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ））に、様々な異なるＡＴＰ抽出剤の組み合わせを含めて、そこに含有される抽出剤および／または二価カチオン濃度に関してそれぞれ異なる一連の試薬組成物を形成した。１００μｌの異なる各試薬組成物を小型ウェル内の１００μｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（図６Ａ、６Ｂ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（図６Ｃ、６Ｄ）、または１×１０-9Ｍ  ＡＴＰ対照溶液（図６Ｅ、６Ｆ）に添加した。ルミネセンスを５０分間にわたり周期的に測定した。この分析結果（図６Ａ〜６Ｆ）は、微生物、ＡＴＰ抽出剤の組み合わせ、および二価カチオン濃度に依存するｇｌｏ動態の差違を示唆する。
【００８６】
実施例７  ＡＴＰの抽出および検出に対する二価カチオンの影響はＭｇ2+に限定されない
低い（０．２ｍＭ）および高い（２０ｍＭ）二価カチオン濃度におけるＡＴＰ抽出および検出に対する代案の二価カチオン効果を評価するために、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ２７８５３）をミュラー−ヒントンＩＩ（ＭＨＩＩ）ブロス中において３７℃で一晩生育させた。一晩培養物を新鮮なＭＨＩＩブロス中で５０倍に希釈して、次に数時間インキュベートして対数期にした。細胞をウェルあたりおよそ１×１０6個の細胞に希釈した。ＡＴＰ対照溶液をおよそ１０-9Ｍに希釈した。１００μｌのＢａｃＴｉｔｅｒ−ＧｌｏTM試薬組成物（０．００２、０．０２、０．２、２．０または２０ｍＭの異なる濃度のＭｇＣｌ2（図７Ａ）、ＣａＣｌ2（図７Ｂ）、またはＭｎＣｌ2（図７Ｃ）のいずれかを含有する、２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ）、０．０８％ＣＴＡＢ（Ｓｉｇｍａ）、０．１６％ＣＨＥＸ（Ｓｉｇｍａ）、１％トリトン−Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭ  ＮａＦ（Ｓｉｇｍａ）、２５μＭ  ＮａＰＰＩ（Ｓｉｇｍａ）、０．３５８ｍｇ／ｍｌ  ＵｌｔｒａＧｌｏTMルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、および６ｍＭカブトムシルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ））を調製して、１００μｌの細菌またはＡＴＰ対照サンプルに添加した。Ｔｕｒｎｅｒ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍからのＶｅｒｉｔａｓTMマイクロプレート照度計上で、ルミネセンスを記録した。高いＣａ2+（図７Ｂ）およびＭｎ2+（図７Ｃ）の使用が、ＡＴＰ検出を同様に妨害することが見いだされることから、この分析結果（図７Ａ〜７Ｃ）は、ＡＴＰの抽出および検出に対する二価カチオンの影響がＭｇ2+に限定されないことを示唆する。
【００８７】
実施例８  ＡＴＰの抽出および検出に対する二価カチオンの影響は熱安定性ルシフェラーゼに限定されない
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ２７８５３）をミュラー−ヒントンＩＩ（ＭＨＩＩ）ブロス中において３７℃で一晩生育させた。一晩培養物を新鮮なＭＨＩＩブロス中で５０倍に希釈して、次に数時間インキュベートして対数期にした。細胞をウェルあたりおよそ１×１０6個の細胞に希釈した。ＡＴＰ対照溶液をおよそ１０-9Ｍに希釈した。１００μｌのＢａｃＴｉｔｅｒ−ＧｌｏTM試薬組成物（低い（０．２ｍＭ）または高い（２０ｍＭ）ＭｇＣｌ2濃度のいずれかを含有する、２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ）、０．０８％ＣＴＡＢ（Ｓｉｇｍａ）、０．１６％ＣＨＥＸ（Ｓｉｇｍａ）、１％トリトン−Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭ  ＮａＦ（Ｓｉｇｍａ）、２５μＭ  ＮａＰＰＩ（Ｓｉｇｍａ）、０．３５８ｍｇ／ｍｌ  ＱｕａｎｔｉＬｕｍ組換えルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、および６ｍＭカブトムシルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ））を調製して、細菌またはＡＴＰ対照サンプルのいずれかに添加した。Ｔｕｒｎｅｒ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍからのＶｅｒｉｔａｓTMマイクロプレート照度計上で、ルミネセンスを記録した。この分析結果（図８）は、ＡＴＰの一段階抽出および検出に対する二価カチオンの阻害効果が、熱安定性ルシフェラーゼの使用に限定されないことを示唆する。
【００８８】
実施例９  微生物細胞数とバイオルミネセンス信号間の相関
４種の細菌株を使用して、微生物細胞数とルミネセンス間の関係をを評価した。細菌株大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＡＴＣＣ２５９２２）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＡＴＣＣ２５９２３）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ２７８５３）、およびバシラス・セレアス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）（ＡＴＣＣ１０９８７）をミュラー−ヒントンＩＩ（ＭＨＩＩ）ブロス中において３７℃で一晩生育させた。一晩培養物を新鮮なＭＨＩＩブロス中で５０倍に希釈して、次に数時間インキュベートして対数期にした。９６−ウェルプレート内のＭＨＩＩブロスを使用して、培養物のサンプルを連続的に希釈した。水戻ししたＢａｃＴｉｔｅｒ−ＧｌｏTM試薬組成物（２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ）、０．０８％ＣＴＡＢ（Ｓｉｇｍａ）、０．１６％ＣＨＥＸ（Ｓｉｇｍａ）、１％トリトン−Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２３ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＮａＦ（Ｓｉｇｍａ）、２５μＭ  ＮａＰＰＩ（Ｓｉｇｍａ）、０．３５８ｍｇ／ｍｌ  ＵｌｔｒａＧｌｏTMルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、および６ｍＭカブトムシルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ））を感度改善のために室温で１．５時間平衡化して、異なる各培養サンプルに添加した。Ｔｕｒｎｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）からのＶｅｒｉｔａｓTMマイクロプレート照度計上で、ルミネセンスを記録した。
【００８９】
細菌細胞数とバイオルミネセンス間の相関を描写するグラフである図９にこの分析結果を示す。ルミネセンス信号は各測定に対する三連の反復の平均を表す。ルリア−ベルターニ寒天プレート上のコロニー形成単位のプレートカウントによって、細菌細胞数を判定した。Ｓ：Ｎ＝［信号平均−バックグラウンド平均］／バックグラウンドの標準偏差］の場合の信号対雑音比を計算した。図９は、５桁にわたるルミネセンス信号と細胞数間の直線的相関を実証する。この実験から引き出された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、およびＢ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）の検出限界は、それぞれおよそ４０、１５０、７０、および１０個の細胞である。
【００９０】
実施例１０  安定したグロータイプのルミネセンス信号を発生させるＢａｃＴｉｔｅｒ−ＧｌｏTMアッセイ
実施例９で述べられるようにして４種の異なる細菌（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、およびＢ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ））を生育させ、アッセイした。各アッセイでおよそ１０6個の細胞を使用した。ルミネセンス信号の安定性を経時的にモニターした。Ｔｕｒｎｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）からのＶｅｒｉｔａｓTMマイクロプレート照度計上で、ルミネセンスを記録した。この分析結果（図１０）は、本発明の微生物アッセイ系が、一連の微生物細胞において、半減期（Ｔ1/2）＞３０分である安定した「グロータイプ」のルミネセンス信号を生じられることを示唆する。
【００９１】
実施例１１  ＢａｃＴｉｔｅｒ−ＧｌｏTMアッセイは時間の関数として、細菌生育の強化されたバイオルミネセンス検出を提供する
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ２５９２２株をＭＨＩＩブロス中において３７℃で一晩生育させた。一晩培養物を５０ｍｌの新鮮なＭＨＩＩブロス中で１：１０6に希釈して、２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃でインキュベートした。サンプルを様々な時点で採取し、実施例９で述べられるようにしてルシフェラーゼ検出アッセイを実施した。ＶｅｒｉｔａｓTMマイクロプレート照度計上で、ルミネセンスを記録した。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＵ６５０分光光度計を使用して、光学濃度を６００ｎｍ（Ｏ．Ｄ．６００）で測定した。ＲＬＵおよびＯ．Ｄ．の読み取りがそれぞれ１０8および１を超える場合は、希釈サンプルを使用した。この分析結果（図１１）は、ＡＴＰ検出アッセイが、従来の光学濃度測定よりも高感度の細菌生育の測定を提供することを示唆した（結果を挿入図と比較されたい）。
【００９２】
実施例１２  ｔ＝５ｈｒにおける低下したルミネセンスの関数として、９６−ウェルプレート内で抗菌剤化合物をスクリーニングする
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ２５９２３株をＭＨＩＩブロス中において３７℃で一晩生育させた。一晩培養物を新鮮なＭＨＩＩブロス中で１００倍に希釈して、抗菌剤スクリーンのための接種材料として使用した。ＬＯＰＡＣ化合物の作業原液（５０×）および標準抗生物質をＤＭＳＯ中で調製した。９６−ウェルマルチウェルプレートの各ウェルは、２４５μｌの接種材料および５μｌの５０×作業原液を含有した。マルチウェルプレートを３７℃で５時間インキュベートした。１００μｌの培養物を各ウェルから取り出して、実施例９で述べられるようにしてルシフェラーゼ検出アッセイを実施した。Ｔｕｒｎｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）からのＶｅｒｉｔａｓTMマイクロプレート照度計上で、ルミネセンスを記録した。サンプルおよび濃度は次のとおり。ウェル１〜４および９３〜９６、２％ＤＭＳＯの負の対照；ウェル５〜８および８９〜９２、３２μｇ／ｍｌの標準抗生物質テトラサイクリン、アンピシリン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、オキサシリン、カナマイシン、ピペラシリン、およびエリスロマイシンの正の対照；ウェル９〜８８、１０μＭのＬＯＰＡＣ化合物。この分析結果（図１２）は、抗生剤を同定するためのこのスクリーニング方法の使用を確証する（枠で囲んだ正の対照との比較で、円で示した）。
【００９３】
実施例１３  抗生物質用量曝露の関数としての細菌生育のバイオルミネセンスの検出
実施例８で述べられるようにして、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ２５９２３株およびオキサシリンを調製し、３７℃でインキュベートした。ＮＣＣＬＳ（６）によってＭＩＣ判定で推奨されるように、１９時間のインキュベーション後にＡＴＰ検出アッセイを実施した。オキサシリンなしの対照と比べたＲＬＵの相対百分率を示す。Ｔｕｒｎｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）からのＶｅｒｉｔａｓTMマイクロプレート照度計上で、ルミネセンスを記録した。この分析結果（図１３）は、ＡＴＰ検出に対する抗生物質の用量依存効果を実証する。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１Ａ】異なるＭｇＣｌ2濃度における緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）中のＡＴＰ検出動態を描写するグラフである。
【図１Ｂ】対照として精製ＡＴＰを使用した、ＡＴＰ検出動態を描写するグラフである。
【図２】低い（−；０．２ｍＭ）および高い（＋；２０．０ｍＭ）二価カチオン（ＭｇＣｌ2）濃度における緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）中のＡＴＰ検出に対する、異なるＡＴＰ抽出剤の組み合わせの効果を描写するグラフである。
【図３】様々な微生物（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、およびＢ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ））中で、低二価カチオン濃度条件下において得られるより高いルミネセンスを模倣するためにキレート剤を使用した、阻害的二価カチオン効果の中和を描写するグラフである。２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含有する反応混合物に、ＣＤＴＡをｔ＝１２分に添加した（最終濃度＝２０ｍＭ  ＣＤＴＡ）。
【図４Ａ】２０ｍＭの二価カチオン（ＭｇＣｌ2）濃度の存在下における、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のＡＴＰ検出に対する増大するキレート剤濃度（０ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、および２５ｍＭのＥＤＴＡ）の効果を描写するグラフである。
【図４Ｂ】２０ｍＭの二価カチオン（ＭｇＣｌ2）濃度の存在下における、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）中のＡＴＰ検出に対する増大するキレート剤濃度（０ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、および２５ｍＭのＥＤＴＡ）の効果を描写するグラフである。
【図５Ａ】様々な二価カチオン（ＭｇＣｌ2）濃度（０ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のＡＴＰ検出の動態を描写するグラフである。
【図５Ｂ】様々な二価カチオン（ＭｇＣｌ2）濃度（０ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）における黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）中のＡＴＰ検出の動態を描写するグラフである。
【図５Ｃ】様々な二価カチオン（ＭｇＣｌ2）濃度（０ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）における緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）中のＡＴＰ検出の動態を描写するグラフである。
【図５Ｄ】様々な二価カチオン（ＭｇＣｌ2）濃度（０ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）におけるＢ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）中のＡＴＰ検出の動態を描写するグラフである。
【図６Ａ】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でＡＴＰ抽出剤のパネルを使用した、低い（０．２ｍＭ）二価カチオン濃度におけるＡＴＰ検出の動態を描写するグラフである。
【図６Ｂ】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でＡＴＰ抽出剤のパネルを使用した、高い（２０ｍＭ）二価カチオン濃度におけるＡＴＰ検出の動態を描写するグラフである。
【図６Ｃ】緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）中でＡＴＰ抽出剤のパネルを使用した、低い（０．２ｍＭ）二価カチオン濃度におけるＡＴＰ検出の動態を描写するグラフである。
【図６Ｄ】緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）中でＡＴＰ抽出剤のパネルを使用した、高い（２０ｍＭ）二価カチオン濃度におけるＡＴＰ検出の動態を描写するグラフである。
【図６Ｅ】精製ＡＴＰを対照として使用した、低い（０．２ｍＭ）二価カチオン濃度におけるＡＴＰ検出の動態を描写するグラフである。
【図６Ｆ】精製ＡＴＰを対照として使用した、高い（２０ｍＭ）二価カチオン濃度におけるＡＴＰ検出の動態を描写するグラフである。
【図７Ａ】低い（０．２ｍＭ）および高い（２０ｍＭ）二価カチオン濃度での緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）中のＡＴＰの抽出および検出に対するＭｇ2+の効果を描写するグラフである。
【図７Ｂ】低い（０．２ｍＭ）および高い（２０ｍＭ）二価カチオン濃度での緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）中のＡＴＰの抽出および検出に対するＣａ2+の効果を描写するグラフである。
【図７Ｃ】低い（０．２ｍＭ）および高い（２０ｍＭ）二価カチオン濃度での緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）中のＡＴＰの抽出および検出に対するＭｎ2+の効果を描写するグラフである。
【図８】（熱安定性ルシフェラーゼでなく）組換えホタルルシフェラーゼを使用した、低い（０．２ｍＭ）および高い（２０ｍＭ）二価カチオン濃度での緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）中のＡＴＰ検出を描写するグラフである。
【図９】４種の細菌株（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、およびＢ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ））における細菌細胞数とルミネセンス間の相関を描写するグラフである。
【図１０】微生物のＡＴＰアッセイによって生じたルミネセンス信号の持続期間を描写するグラフである。
【図１１】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の生育をモニタリングするためのＡＴＰ検出感度を描写するグラフである。
【図１２】ｔ＝５ｈｒにおける低下するルミネセンスの関数としての９６−ウェルプレート内での抗菌剤化合物スクリーニングを描写するグラフである。
【図１３】抗生物質用量の関数としての細菌生育のバイオルミネセンス検出を描写するグラフである。
【図１Ａ】
2008504841.tif 000004
【図１Ｂ】
2008504841.tif 000005
【図２】
2008504841.tif 000006
【図３】
2008504841.tif 000007
【図４Ａ】
2008504841.tif 000008
【図４Ｂ】
2008504841.tif 000009
【図５Ａ】
2008504841.tif 000010
【図５Ｂ】
2008504841.tif 000011
【図５Ｃ】
2008504841.tif 000012
【図５Ｄ】
2008504841.tif 000013
【図６Ａ】
2008504841.tif 000014
【図６Ｂ】
2008504841.tif 000015
【図６Ｃ】
2008504841.tif 000016
【図６Ｄ】
2008504841.tif 000017
【図６Ｅ】
2008504841.tif 000018
【図６Ｆ】
2008504841.tif 000019
【図７Ａ】
2008504841.tif 000020
【図７Ｂ】
2008504841.tif 000021
【図７Ｃ】
2008504841.tif 000022
【図８】
2008504841.tif 000023
【図９】
2008504841.tif 000024
【図１０】
2008504841.tif 000025
【図１１】
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【図１２】
2008504841.tif 000027
【図１３】
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【国際調査報告】
2008504841.tif 000029
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