(57)【要約】  本発明は、大腸菌中でより効率的にインターフェロンβを発現させるために、コドン最適化された新規核酸分子に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の配列を含んでなる核酸分子又はその相補体。
【請求項２】
請求項１の核酸分子を含んでなる発現ベクター。
【請求項３】
プラスミド又はバクテリオファージである、請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
請求項２に記載の発現ベクターを含んでなる大腸菌(Escherichia coli)。
【請求項５】
請求項４に記載の大腸菌(Escherichia coli)宿主細胞を培養すること、及び該宿主細胞により生産されたインターフェロンβ1bを単離することを含む、インターフェロンβ1bの生産方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法によって生産された、インターフェロンβタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Escherichia coli(以下、大腸菌)中でより効率的にインターフェロンβを発現させるためにコドン最適化された新規核酸分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
幅広い種類の疾患又は障害の治療への使用が大いに期待できる多くのタンパク質又はポリペプチドが知られている。インターフェロンは、様々な誘導因子への暴露に反応してほとんどの動物細胞で分泌される、比較的小さなポリペプチドタンパク質である。インターフェロンは抗ウイルス性、増殖抑制性、免疫調整性を有するので、治療薬として非常に有用である。インターフェロンは、細胞表面上の特異的な膜受容体に結合することによりその細胞活性を発揮する。インターフェロンは、いったん細胞膜に結合すると、細胞内で連続して起こる複雑な事象を開始させる。In vitro研究により、これらの事象には、ある種の酵素の誘導、細胞増殖の抑制、マクロファージの食細胞作用の増強や標的細胞に対するリンパ球の特異的細胞毒性の増強といった免疫調整、及びウイルス感染細胞におけるウイルス複製の阻害があることが実証された。このように、インターフェロンタンパク質はその機能が明らかになっており、また幅広い種類の天然型及び合成型又は組換え型インターフェロンが知られている。ヒトインターフェロン（IFN）には3種の主要なタイプがある。すなわち、白血球によりin vivoで生産される１型インターフェロンである白血球インターフェロン又はインターフェロンα、線維芽細胞によりin vivoで生産される1型インターフェロンである線維芽細胞インターフェロン又はインターフェロンβ、免疫系によりin vivoで生産される2型インターフェロンである免疫インターフェロン又はインターフェロンγである。
【０００３】
IFN-βは、多くの疾患又は障害の治療に極めて有用で、多発性硬化症（又はＭＳ）の治療に特に効果がある。天然型ヒトINF-βは、166個のアミノ酸糖タンパク質からなり、Taniguchiら, 1980, Gene 10: 11-15、及びR. Derynckら, supraによって、コードする遺伝子配列が決定されている。天然型INF-βは、それぞれ17、31、及び141位のアミノ酸として位置する３つのシステイン（cys）残基を有する。さらに、非常に多くの組換え型IFN-β変異体が知られている。
【０００４】
3種の組換え型IFN-β製品が、欧州及び米国において、MS治療に関して認可されている。これらは、インターフェロンβ-1a ("IFN-β-1a")又はAvonex（登録商標）(Biogen, Inc., Cambridge, Massachusettes)、別のIFN-β-1a市販品であるRebif（登録商標）(Ares-Serono, Norwood, Massachusettes)、及びSer17 インターフェロン-β-1b ("IFN-β-1bSer17")又はΒetaseron(登録商標)(Berlex, Richmond, California)である。
【０００５】
IFN β-1aは天然型ヒト遺伝子配列を用いて、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞のような哺乳類細胞で生産され、生産されたタンパク質はグリコシル化されている。例えば、引用により本明細書に含まれているものとする米国特許第5,795,779号, 5,376,567号及び4,966,843号を参照されたい。IFN β-1b Ser17は、タンパク質がグリコシル化されないように、17位のアミノ酸をシステインからセリンに置換するように工学的に処理されて改変されたヒト遺伝子配列を用いて、大腸菌中で生産されるので、IFN-β 1a(Avonex（登録商標）及びRebif（登録商標）)とは構造上異なる。例えば、引用により本明細書に含まれているものとする刊行物である、米国特許第4,588,585号及び4,737,462号を参照されたい。
【０００６】
Rebif(登録商標)及びAvonex（登録商標）はいずれもその添付文書に、方法によって異なるが、少なくとも2-3 × 108国際単位(IU)/mgの比活性を有することが記載されている。Βetaseron（登録商標）の添付文書は、約3 × 107 IU/mgの比活性があることを報告しており、有効性に関して10倍も異なることを示している。これらの活性は少々異なる方法によって測定されており、抗ウイルス及び抗腫瘍活性の大きさの違いの程度は推奨用量に反映される。すなわち、グリコシル化されたインターフェロンβ 1a製品であるRebif（登録商標）及びAvonex（登録商標）はマイクログラム（60-130 mcg/週）単位で測定され、グリコシル化されていないΒetaseron（登録商標）インターフェロンβ-1bでは0.25ミリグラム以上である。
【０００７】
IFN-βは各組換え型製剤で、ウイルス複製の阻害能を始めとする免疫系に対して多重の効果をもつ。IFN-β-1bは、サプレッサーＴ細胞活性を増強し、炎症誘発性サイトカインの生産を減少させ、抗原提示をダウンレギュレーションし、及び中枢神経系へのリンパ球の輸送を阻害することが、製造業者（Berlex, Richmond, California)により開示されている。他の供給業者は、INF-βがTリンパ球によるIFN-γの生産を減少させることを報告している。その他の有益な治療効果もまた予測される。
【特許文献１】米国特許第5,795,779号
【特許文献２】米国特許第5,376,567号
【特許文献３】米国特許第4,966,843号
【特許文献４】米国特許第4,588,585号
【特許文献５】米国特許第4,737,462号
【特許文献６】米国特許第4,588,585号
【特許文献７】米国特許第4,959,314号
【特許文献８】米国特許第4,450,103号
【特許文献９】米国特許第6,107,057号
【特許文献１０】米国特許第5,866,362号
【特許文献１１】米国特許第5,814,485号
【特許文献１２】米国特許第5,523,215号
【特許文献１３】米国特許第5,248,769号
【特許文献１４】米国特許第4,961,969号
【特許文献１５】米国特許第4,894,334号
【特許文献１６】米国特許第4,894,330号
【特許文献１７】米国特許第4,748,234号
【特許文献１８】米国特許第4,656,132号
【非特許文献１】Taniguchiら, 1980, Gene 10: 11-15
【非特許文献２】R. Derynckら, supra
【非特許文献３】Robinsonら, Nucleic Acids Res. 12:6663, 1984
【非特許文献４】Grantham R.ら; 1981; "Codon catalogue usage in genome strategy modulated for gene expressivity," Nucleic Acid Res. 9:r43-r47
【非特許文献５】Lathe, R. 1985; "Synthetic oligonucleotide probes deduced from amino acid sequence data, Theoretical and Practical considerations." J. Mol Biol; 183:1-12
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、細胞培養により組換え型タンパク質を生産することは、依然、高価な製法である。この理由のため、非常に改良されたベクター、及び特に非哺乳類細胞においてIFN-β組成物、特にIFN-β 1bを含む組成物を生産する方法を求める、従来から長く続く未解決なニーズが当技術分野では未だに存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述のニーズは、本明細書で説明されるIFN-β-1bをコードする核酸分子によって解決され、他の有利な効果も得られる。
【００１０】
本発明の結果として、INF-β-1bを経済的に生産するベクター及び大腸菌細胞培養系が提供される。本発明は、配列番号１の配列をもつ核酸分子又はその相補体を提供する。本発明はまた、配列番号１の核酸分子又はその相補体を含む発現ベクターを提供する。場合により、発現ベクターは、例えば大腸菌における本発明の核酸分子の発現に適した、プラスミド又はバクテリオファージである。
【００１１】
本発明はさらに、上記の大腸菌宿主細胞を培養し、宿主細胞で生産されたインターフェロンβ 1bを単離することを含む、インターフェロンβ 1bの生産方法を提供する。
【００１２】
さらに、本発明は上記方法にて生産されたインターフェロンβタンパク質を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
したがって、本発明は大腸菌中で非常に改善された発現及び／又はタンパク質生産を提供するために、様々なコドンが最適化されている点において、IFN-β-1bを生産するために既に使用されているポリヌクレオチド(例えば米国特許第4,588,585号及び4,737,462号を参照)と異なる、図１で示される配列（配列番号１）を有するポリヌクレオチドを提供する。
【００１４】
A. インターフェロンβ
本明細書で使用される「インターフェロン-β」又は「INF-β」という用語は、天然原料から単離、及び／又は当技術分野で開示されている組換えDNA技術によって生産された、配列相同性及び生物活性を含む天然型IFN-βの機能性を有するIFN-βを意味する。本明細書で使用される「インターフェロン-β 1b」又は「IFN-β 1b」という用語は、Cys17残基がSer17残基により置換されており、非グリコシル化型として発現され、N末端アミノ酸のメチオニンが翻訳後修飾で除去されるIFN-βのムテイン(mutein)を意味する。
【００１５】
多くの天然のヒト又は動物のIFN-βのムテインが知られており、本発明の実施の際に使用されることが意図される。好ましいムテインは、引用により本明細書に含まれているものとする米国特許第4,588,585号、4,959,314号、4,737,462号及び4,450,103号により、より詳細が開示されている。簡単にいうと、上述のとおり、好ましいムテインは、天然型ヒトIFN-βのCys17残基がセリン、スレオニン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン又はメチオニンにより置換されたものである。最も好ましいのは、IFN-βの非グリコシル化型のSer17ムテインであり、これは本明細書中でIFN-β 1bともいう。
【００１６】
宿主系からIFN-βタンパク質を発現及び単離する方法、及び原核性宿主細胞による発現に適したベクターは、非常に多く知られている。例えば、宿主系は原核性又は真核性の宿主細胞から選択される宿主細胞を含む。原核性宿主細胞は、大腸菌などの細菌を含む。真核性宿主細胞は、例えば培養下の酵母細胞、動物細胞を含む。該動物細胞は、例えば培養系では霊長類又はヒトの細胞などの哺乳類細胞、場合により、in vivoではヒト組織細胞を含みうる。好ましい哺乳類宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞のように連続培養に適する十分特性が明らかとなっている細胞株である。選択した宿主系での発現に適した発現ベクターを使用する。発現ベクターは、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、動物性又は植物性ウイルス、及び／又は選択された宿主系における複製に適した他の核酸分子を含む。
【００１７】
下記の例で使用するINF-βの多くは、例えば、次の方法にて生産した。IFN-β 1bなどのIFN-βをコードする合成遺伝子は、細菌発現のためにコドン最適化した後合成した。
【００１８】
IFN-β生産及び精製に使用する他の方法及び試薬は、例えば引用により全てが本明細書に含まれているものとする米国特許第6,107,057号、5,866,362号、5,814,485号、5,523,215号、5,248,769号、4,961,969号、4,894,334号、4,894,330号、4,748,234号、4,656,132号にて開示されるていが、他の参考文献に関しては多すぎるため言及できない。
【００１９】
IFN-βタンパク質を発現及び単離する方法、及びチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞などの真核性宿主細胞による発現に適したベクターは、例えば、引用により本明細書に含まれているものとする米国特許第4,966,843号、5,376,567号、及び5,795,779号で詳細が開示されている。
【００２０】
Ｂ. コドン最適化された核酸
本明細書で「核酸」という用語を使用した場合、別途特定されていない限り、デオキシリボ核酸(DNA)及びリボ核酸（RNA）のいずれも含む。異なる宿主生物における発現のためのコドン最適化及びタンパク質生産が、当技術分野では知られている。同一のベクターによる異なる宿主系における発現効率の違いは、中でも、異なる宿主細胞型の細胞質に存在しうるトランスファーRNA(t−RNA)の種によるものと考えられてきた。例えば、哺乳類のDNAでは通常、アミノ酸のアルギニンがAGA又はAGGというコドンでコードされるが、大腸菌ではアルギニンをコードするCGXというコドントリプレットにより確実に応答する。
【００２１】
原核生物における真核性遺伝子産物の発現は、大腸菌で頻繁には使用されないコドンの存在により制限されることがある。そのような遺伝子発現は、高発現の原核性遺伝子中で過剰発現しているコドンで内因性コドンを意図的に置換することによって、増強されうる(Robinsonら, Nucleic Acids Res. 12:6663, 1984)。いかなる理論又は仮説にも基づかないが、稀なコドン（その生物種が低頻度でしか使用していないコドン）はリボソームを休止させ、新生ポリペプチド鎖を完成させず、転写及び翻訳のアンカップリングを導くと一般的に考えられている。リボソームの休止は、mRNAの3’末端を細胞性リボヌクレアーゼに暴露することにつながると考えられる。異なる宿主生物においてより効率的に発現するために、遺伝子を最適化することが知られているが、そのなされた変更が、標的タンパク質の発現及び生産に所望の積極的な改善をもたらすかどうかは、事前に予測できない。これらの変更は、当技術分野で知られている何らかの合成又は生物学的手法を使用し、例えば、選択したコドンに置換されている、IFN-β 1b cDNAドメインに対応する合成オリゴヌクレオチドを合成し、その後PCR等の増幅方法を用いて、修飾されたオリゴヌクレオチドを標的cDNA分子に挿入することで実施できる。好ましくは、該遺伝子は、大腸菌中で最適に発現することが知られるコドンを使用し、IFN-β及び／又はIFN-β 1bをコードするよう当技術分野の標準的手法によって、新たに合成される。より好ましくは、該遺伝子は、後に標準的手法により完全な最適化されたDNA分子に組み立てられる、重複オリゴヌクレオチド断片のセットとして合成される。
【００２２】
本発明の最適化された遺伝子は上述のとおり、IFN-β、特にヒトIFN-β、及び最も特別にはINF-β 1bをコードするよう設計できる。
【実施例】
【００２３】
以下の実施例は本発明の一層の理解を助けるが、本発明の範囲をいかなる方法でも限定するものではない。
【００２４】
実施例１ 最適化されたDNA及びベクター
ヒトインターフェロンβ-1bの配列を、Grantham R.ら; 1981; "Codon catalogue usage in genome strategy modulated for gene expressivity," Nucleic Acid Res. 9:r43-r47、及びLathe, R. 1985; "Synthetic oligonucleotide probes deduced from amino acid sequence data, Theoretical and Practical considerations." J. Mol Biol; 183:1-12で開示されるコドン情報を用いて、大腸菌K12株の標準的細菌コドンを使用し、細菌発現のために最適化した。
【００２５】
対応するRNA配列は、その後ヘアピン構造又はループ構造の構成に関して分析し、最小自由エネルギーを計算した。最適化されたcDNA配列をさらに、核酸部位57, 81, 261, 及び315においてそれぞれTTAをCTGに置換することで、４つのロイシン残基を修飾した。インターフェロンβ-1bのロイシンコドンが修飾された配列について、再び最小自由エネルギーを計算したところ、初めの最適化と比較し、ごくわずかな自由エネルギーの変化を認めた(-110.05 k Calに対し、-117.8 k Calであった)。開示されたヒトIFN-β-1bの165個のアミノ酸配列をコードするインターフェロンβ-1 bのcDNAを、その後重複オリゴヌクレオチド断片の標準的な化学合成により、合成した。本発明のDNA分子は、例えば修飾されたコドンを有する断片を、PCRによりヒトIFN-β 1bをコードすると最初に報告されたcDNAに挿入するといった、当技術分野で知られている何らかの別の方法によっても、容易に調製することができる。遺伝子末端に制限酵素NdeI及びBamHIの切断部位が含まれていた。制限酵素NdeI及びBamHIによる合成DNAの消化に続いて、0.5Kbの遺伝子をT4 DNAリガーゼによってプラスミドベクターpET-27b(+)（Novagen Corporationから入手）につなぎ、これら２つの酵素で再び消化した。組換え型プラスミドをその後、BTX Electro Cell Manipulator 600を製造業者の指示書どおりに用いて、エレクトロポレーションにより大腸菌BLR(DE3)株に取り込んだ。形質転換混合物を、プラスミドpET-27b(+)/IF-β-1b (プラスミド番号１で示す)を含むコロニーの選択を可能とするため、15 μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天培地で培養した。単離したコロニーを、さらに培養により精製し、Novagen pET System Manual, Ninth Editionにて開示されるような標準的手法によって、IPTGで誘導された遺伝子の発現を分析した。
【００２６】
該形質転換宿主細胞は、以前より入手可能なIFN-βをコードする最適化されていないcDNAを用いて同じ型の宿主細胞で生産した場合よりも、1回のバッチにつき約10倍を超えるIFN βタンパク質を生産した。
【００２７】
本明細書は多くの参考文献を引用しており、その全体が引用により本明細書に含まれているものとする。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】配列番号１はIFN-β 1bをコードする最適化された遺伝子（コードするタンパク質は配列番号６である）のDNA配列を示す。
【図２】大腸菌中で、最適化された遺伝子を発現するのに使用するプラスミド番号１を示す。
【図３Ａ】配列番号２は、(5’末端から3’末端にかけて)BglII切断部位、T7プロモータープライマー、T7プロモーター、lacオペレーター、並びにXbaI及びNde1部位をそれぞれ含む、プラスミド番号１の上流調節因子を示す。
【図３Ｂ】配列番号3は、プラスミド番号１の中でIFN-β 1bをコードする最適化された遺伝子のDNA配列を示す。5’末端から順に、図3Aで示したのと同一のNdel部位、図１ではいずれも示されていない開始コドンATG（図中、下線で示す）、5600位のプライマー、及びTAA TGAの終止コドンを示す。
【図３Ｃ】配列番号４は、Sal 1、Hind III、Eag I/Not I、Xho I、Nhe I、単純ヘルペスウイルス(HSV)タグ、His-Tag（登録商標） Bpu1102I、ターミネータープライマー及びT7ターミネーターの配置を含み、IFN-β 1bをコードする最適化された遺伝子(コードするペプチドは配列番号５である)のDNA配列の下流要素を示す。
【図４Ａ】コドン番号300までに関して、本発明の最適化されたDNA分子（配列番号８）とIFN-β 1bをコードする天然型cDNA（配列番号７）とを比較して示す。
【図４Ｂ】コドン番号301-498に関して、本発明の最適化されたDNA分子（配列番号８）とIFN-β 1bをコードする天然型cDNA（配列番号７）とを比較して示す。
【図１】
2008507297.tif 000002
【図２】
2008507297.tif 000003
【図３Ａ】
2008507297.tif 000004
【図３Ｂ】
2008507297.tif 000005
【図３Ｃ】
2008507297.tif 000006
【図４Ａ】
2008507297.tif 000007
【図４Ｂ】
2008507297.tif 000008
【配列表】
2008507297000001.app
【国際調査報告】
2008507297.tif 000009
2008507297.tif 000010