(57)【要約】  ＣＣＲ７受容体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、選択的に、ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞を死滅させ、その遊走を低減し、および／またはその拡散を阻止することができる。前記腫瘍を死滅させるか、またはそのアポトーシスを誘発するための前記抗体の使用が開示され、これにより、腫瘍細胞がＣＣＲ７受容体を発現するガンを治療するための代替療法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞を死滅させるか、またはそのアポトーシスを誘発するための医薬組成物の製造における、ＣＣＲ７受容体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
【請求項２】
前記腫瘍細胞が慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）細胞またはマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）細胞である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項３】
ＣＣＲ７受容体に結合する前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、治療的に活性な更なる化合物と組み合わせて使用されるものである、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞を死滅させるか、またはそのアポトーシスを誘発するための方法であって、前記ＣＣＲ７受容体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントと前記細胞を接触させることを含んでなる、方法。
【請求項５】
治療を必要とする被験体において、ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞を死滅させるか、またはそのアポトーシスを誘発するための方法であって、ＣＣＲ７受容体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを治療的に有効な量で前記被験体に投与することを含んでなる、方法。
【請求項６】
前記腫瘍細胞が慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）細胞またはマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）細胞である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞の二次リンパ組織への遊走を低減するため、および／または二次リンパ組織内への腫瘍細胞の拡散を阻止するための方法であって、ＣＣＲ７受容体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントと前記腫瘍細胞を接触させることを含んでなる、方法。
【請求項８】
治療を必要とする被験体において、ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞の二次リンパ組織への遊走を低減するため、および／または二次リンパ組織内への腫瘍細胞の拡散を阻止するための方法であって、ＣＣＲ７受容体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを治療的に有効な量で前記被験体に投与することを含んでなる、方法。
【請求項９】
前記腫瘍細胞が慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）細胞またはマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）細胞である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞を死滅させるか、またはそのアポトーシスを誘発するための化合物を同定する方法であって、
ａ）ＣＣＲ７受容体を発現する細胞を、抗ＣＣＲ７抗体またはそのフラグメントに連結した候補化合物と接触させ、
ｂ）前記候補化合物がＣＣＲ７受容体を発現する前記細胞を死滅させるかどうかを判定することを含んでなり、
ＣＣＲ７受容体を発現する前記細胞を死滅させる化合物が、腫瘍細胞を死滅させるか、またはそのアポトーシスを誘発するのに潜在的に有用な化合物とされる、方法。
【請求項１１】
前記細胞が慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）細胞またはマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）細胞である、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、一般にガンの治療に関する。より詳細には、本発明は、選択的に腫瘍細胞を死滅させ、その遊走を低減しおよび／またはその拡散を阻止することが可能なＣＣＲ７受容体に対する抗体を使用することにより、腫瘍細胞がＣＣＲ７受容体を発現する細胞であるガンを治療することに関する。
【発明の背景】
【０００２】
ガンは、制御されない細胞分裂（または、生存率もしくはアポトーシス耐性の増大）を特徴とし、ならびに他の近隣組織に浸潤して（浸潤）、通常では細胞が位置しない身体の他の領域にリンパ管および血管を介して広がり（転移）、血流を介して循環して、身体中の他の場所に浸潤するという前記細胞の能力を特徴とする疾患群である。前記細胞が浸潤および転移によって広がり得るか否かに応じて、腫瘍は良性または悪性のいずれかに分類される。良性腫瘍は、浸潤または転移によって広がることができない腫瘍であり、即ち、局在的に成長するのみである。一方、悪性腫瘍は、浸潤および転移によって広がることができる腫瘍である。
【０００３】
ガンは、由来する細胞の種類によって、および細胞の位置によって幾つかの種類に分類することができる。即ち、外側および内側体表面（例えば皮膚、消化管または腺）を被覆する細胞から発生するガン腫；骨髄などの血液形成組織において発生し、多数の異常血液細胞を生成させ、血流に進入させる白血病；身体免疫系のリンパ節および組織において発生するガンであるリンパ腫；メラノサイト（メラニン形成細胞）で発生するメラノーマ（黒色腫）；骨または筋肉の結合組織で発生する肉腫；ならびに胚細胞内で発生する奇形腫である。
【０００４】
ガンは、外科手術、化学療法、放射線療法、免疫療法または他の方法によって治療可能である。療法の選択は、腫瘍の位置およびグレード、ならびに疾患の段階に応じて決まる。
【０００５】
腫瘍治療計画において対処すべき重大な問題は、「細胞全滅（total cell kill）」に対する要望である。これは、治療計画が有効であればあるほど、いわゆる「クローン原性」悪性腫瘍、即ち、制御されずに成長し、療法によって除去されるであろう腫瘍塊の形成を引き起こす能力を有する全ての細胞の死滅に近づくことを意味している。
【０００６】
別の腫瘍治療法は「免疫毒素」の使用であり、抗腫瘍細胞抗体を使用して、毒素を腫瘍細胞へ送達する。しかしながら、上述の化学療法的アプローチと同様、免疫毒素療法も重大な欠点を抱えている。例えば、抗原陰性細胞または抗原欠失細胞は生存し、腫瘍を再形成する (repopulate)か、または更なる転移を生じる可能性がある。原発性ガンを完全に排除する場合でさえ、悪性腫瘍は転移することがしばしばある。多かれ少なかれ身体の遠隔位置に存在する原発性腫瘍から始まる悪性腫瘍の転移形成は、ガンの最も深刻な作用の１つであり、現在のところ、それに対する十分な治療プロトコルは利用不可能である。現在利用できるガン療法は、転移の阻止という点で不十分であるか、または深刻で望ましくない副作用を生じるものである。
【０００７】
抗細胞剤、毒素および凝固因子などの治療剤を腫瘍塊に対して特異的に送達することにより、ガン治療プロトコルにおける大きな利点が得られるが、依然として、更なる療法または代替療法を検討する余地がある。インビボでの特異的な腫瘍破壊を可能とするための更なる標的を同定することは、標的の選択肢の数を拡大する上で当然に有益である。
【０００８】
ガンを治療するための新たな療法は、現在、疾患を治癒すると期待される、腫瘍細胞により発現される様々な抗原に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）などの特異的治療の使用に向かって動いている。
【０００９】
免疫療法における抗原選択では、抗原の腫瘍特異性、腫瘍細胞の表面における抗原密度、および抗原調節、または細胞死を起こす能力を低減できる抗原−抗体複合体の内在化を考慮しなければならない。大半の場合、補体依存性細胞溶解（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）が未結合ｍＡｂの臨床的有用性に関与していると考えられているが、他の場合には、アポトーシスまたは細胞周期停止の誘発も実質的な役割を果たす可能性がある。
【００１０】
ガン細胞は、幾つかの分子受容体を発現し得る。様々な研究により、ＣＣケモカイン受容体７（ＣＣＲ７）が、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、乳ガン細胞、悪性乳房腫瘍などの様々な腫瘍細胞で発現されることが示されている。更に、ＣＣＲ７受容体は、胃ガン、黒色腫、非小細胞肺ガン、Ｔ細胞白血病細胞などの様々なガンのリンパ節転移において役割を果たしているようである。従って、前記ケモカイン受容体（ＣＣＲ７）を、ガンにおけるｍＡｂ療法のための可能な標的として選択することができる。
【００１１】
ＣＣＲ７は、７回膜貫通型ドメインＧタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）である。Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）のファミリーとしては、ホルモン、神経伝達物質、増殖因子およびウイルスの受容体が挙げられる（Yoshie O, Imai T, Nomiyama H. Novel lymphocyte-specific CC chemokines and their receptors. J Leukoc Biol. 1997; 62:634-644; Kim CH, Pelus LM, White JR, Applebaum E, Johanson K, Broxmeyer HE. CK beta-l1/macrophage inflammatory protein-3 beta/EBI1-ligand chemokine is an efficacious chemoattractant for T and B cells. J Immunol. 1998; 160: 2418-2424; Dieu MC, Vandervliet B, Vicari A, et al. Selective recruitment of immature and mature dendritic cells by distinct chemokines expressed in different anatomic sites. J Exp Med. 1998; 188: 373-386; Willimann K, Legler DF, Loetscher M, et al. The chemokine SLC is expressed in T cell areas of lymph nodes and mucosal lymphoid tissues and attracts activated T cells via CCR7. Eur J Immunol. 1998; 28: 2025-2034; Yoshida R, Nagira M, Imai T, et al. EBI1-ligand chemokine (ELC) attracts a broad spectrum of lymphocytes: activated T cells strongly up-regulate CCR7 and efficiently migrate toward ELC. Int Immunol. 1998; 10:901-910; Sallusto F, Schaerli P, Loetscher P, et al. Rapid and coordinated switch in chemokine receptor expression during dendritic cell maturation. Eur J Immunol. 1998; 28: 2760-2769）。
【００１２】
腫瘍細胞がＣＣＲ７受容体を発現する特定の白血病は慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）であり、これは最も一般的な種類のヒト成人白血病である。この白血病は、プログラム細胞死に関与する細胞外または細胞内シグナリング事象の脱制御に起因して生じる、アポトーシス耐性が高いＣＤ５＋Ｂ細胞の単一クローンの蓄積を特徴とするＢ細胞白血病である。その非常に低い増殖指数にもかかわらず、末梢血リンパ球数は、５ｘ１０３／μＬより大きい値に達し、白血病細胞は、リンパ節、脾臓および骨髄に浸潤する傾向を顕著に示す。
【００１３】
ＣＬＬの治療は、最先端の治療計画として、プリン類似体、特にフルダラビンを単独で、または組み合わせて使用することに基づいている。今日まで、フルダラビンを用いて得られるよりも高い完全寛解率をもたらす唯一の併用療法は、抗ＣＤ−２０モノクローナル抗体であるリツキシマブを、フルダラビンと組み合わせて、またはフルダラビンおよびシクロフォスファミドと組み合わせて使用することであった。更に、骨髄突刺液中での分子寛解が、上述の組み合わせを用いてＣＬＬ患者において達成された。これにより、ＣＬＬが幹細胞移植をせずに潜在的に治癒可能であるという可能性が提起される。自家移植を受ける患者に接種する際にＣＬＬ細胞の排除と共に最良の初期応答を得ることは、ＣＬＬにおける主要な治療課題の一部である。
【００１４】
マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）は、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫の攻撃的なサブタイプである。これらの細胞は、ｔ（１１；１４）およびサイクリンＤ１の過剰発現を伴うＣＤ２０＋、ＣＤ５＋、ＣＤ２３−として特徴付けられている。患者は通常、リツキシマブ−ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ヒドロキシルダウノルビシン、オンコビンおよびプレドニゾン）とその後の幹細胞移植、またはリツキシマブ−ＨｙｐｅｒＣＶＡＤ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、アドリアマイシンおよびデキサメタゾン）のいずれかにより治療される。しかしながら、ＭＣＬは、ほとんどの場合に治癒せずに残存するので、新たな治療アプローチに対する明確な必要性が示される。
【００１５】
近年、臨床的リンパ節症を呈するＣＬＬ患者は、ＣＣＲ７のリガンド、即ち、恒常性ケモカインＣＣＬ１９（ＭＩＰ３−β）およびＣＣＬ２１（６Ｃｋｉｎｅ）に対するＣＬＬ細胞のインビトロ遊走反応がより高いことが証明された。故に、抗ＣＣＲ７  ｍＡｂを用いて二次リンパ組織内へのＣＬＬ細胞の進入を阻止することは別の利点であり得る。また、この意味において、異所性ＣＣＲ７を発現する非リンパ腫瘍は二次リンパ器官内へ転移する能力を有するが、一方、この分子または二次リンパ器官へのホーミングに関与する他のケモカイン受容体が欠如している腫瘍が呈する節転移（nodal dissemination）は最小である。
【００１６】
故に、更なるガン療法、特にＣＣＲ７受容体を発現するガンおよび腫瘍細胞に対するガン療法の必要性が存在する。有利には、前記療法は、例えば、腫瘍細胞を死滅させ、腫瘍細胞の遊走を低減し、および／またはその拡散を阻止することによって、インビボでの特異的な腫瘍破壊を可能とする。
【発明の概要】
【００１７】
本発明は、ＣＣＲ７受容体が、一部の腫瘍細胞で高度に発現され、リンパ節（ＬＮ）などの二次リンパ器官へのリンパ細胞の進入に主に関与し、その発現がナイーブＴおよびＢリンパ球および成熟樹状細胞（ＤＣ）に制限され、従って、前記ＣＣＲ７受容体が、ガン、特に腫瘍細胞がＣＣＲ７受容体を発現するガンにおけるｍＡｂの興味深い標的となるという知見に基づいている。驚くべきことに、本発明者らは、ＣＣＲ７に対するｍＡｂ、即ちＣＣＲ７受容体におけるエピトープを認識し、前記ＣＣＲ７受容体に結合できる抗体が、ＣＬＬおよびＭＣＬ細胞、即ち、ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで死滅させることができるが、その一方で、Ｔ細胞リンパ球などのＣＣＲ７受容体を発現する非腫瘍細胞を実質的に死滅させることはできないということを見出した。
【００１８】
故に、本発明は、一般に、ガンを治療するための医薬組成物の製造における、ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞を死滅させるか、またはそのアポトーシスを誘発するための、ＣＣＲ７受容体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントの使用に関し、特定の実施態様では、治療すべきガンは、ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞を特徴とする。
【００１９】
従って、一つの態様では、本発明は、ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞を死滅させるか、またはそのアポトーシスを誘発するための医薬組成物の製造における、ＣＣＲ７受容体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントの使用に関する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞を死滅させるか、またはそのアポトーシスを誘発するための方法であって、前記ＣＣＲ７受容体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントと前記細胞を接触させることを含んでなる方法に関する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、治療を必要とする被験体において、ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞を死滅させるか、またはそのアポトーシスを誘発するための方法であって、前記ＣＣＲ７受容体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを治療的に有効な量で前記被験体に投与することを含んでなる方法に関する。
【００２２】
別の態様では、本発明は、ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞の二次リンパ組織への遊走を低減するため、および／または二次リンパ組織内への腫瘍細胞の拡散を阻止するための方法であって、ＣＣＲ７受容体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントと前記腫瘍細胞を接触させることを含んでなる方法に関する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、治療を必要とする被験体において、ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞の二次リンパ組織への遊走を低減するため、および／または二次リンパ組織内への腫瘍細胞の拡散を阻止するための方法であって、ＣＣＲ７受容体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを治療的に有効な量で前記被験体に投与することを含んでなる方法に関する
【００２４】
別の態様では、本発明は、ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞を死滅させるか、またはそのアポトーシスを誘発するための化合物を同定する方法であって、
ａ）ＣＣＲ７受容体を発現する細胞を、抗ＣＣＲ７抗体またはそのフラグメントに連結した候補化合物と接触させ、
ｂ）前記候補化合物がＣＣＲ７受容体を発現する前記細胞を死滅させるかどうかを判定することを含んでなり、
ＣＣＲ７受容体を発現する前記細胞を死滅させる化合物が、ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞を死滅させるか、またはそのアポトーシスを誘発するのに潜在的に有用な化合物とされる方法に関する。
【発明の具体的説明】
【００２５】
本発明は、一般に、腫瘍細胞を死滅させるか、またはそのアポトーシスを誘発させることによって、ガン、特に、前記腫瘍細胞がＣＣＲ７受容体を発現するガンを治療するための医薬組成物の製造における、ＣＣＲ７受容体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントの使用に関する。
【００２６】
故に、一つの態様では、本発明は、ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞を死滅させるか、またはそのアポトーシスを誘発するための医薬組成物の製造における、ＣＣＲ７受容体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントの使用に関する。
【００２７】
治療すべきガンの腫瘍細胞は、ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞である。腫瘍細胞がＣＣＲ７受容体を発現する前記ガンの種類の代表的な非限定例としては、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、ホジキン病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、菌状息肉腫、慢性骨髄増殖性症候群の急性転化、骨髄異形成症候群の急性転化、ガン（例えば、乳ガン、非小細胞肺ガン、黒色腫、胃ガン、または頭部および頸部の扁平上皮細胞ガン、ならびに大腸ガン）が挙げられる。
【００２８】
ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞は、従来法によって同定することができる。例えば、ＣＣＲ７受容体の表面発現を、Lopez-Giral S.らによって開示されている方法（Journal of Leyukocyte Biology, Vol. 76, Aug. 2004, 462-471）に従ってフローサイトメトリにより分析できる。
【００２９】
本明細書において、「ガンを治療する」との用語は、腫瘍細胞の増殖を阻害するか、または制御することを意味し、ここで、前記腫瘍細胞はＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞である。この用語には、とりわけ、前記腫瘍細胞を死滅させること、前記腫瘍細胞のアポトーシスを誘発すること、前記腫瘍細胞の二次リンパ組織への遊走を低減すること、および／または前記腫瘍細胞の二次リンパ組織内への拡散を阻止することが含まれる。
【００３０】
本発明によれば、ＣＣＲ７受容体に対する、またはそれに特異的である、つまりＣＣＲ７受容体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（本発明の抗体と称されることもある）を使用して、ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞を死滅させるか、またはそのアポトーシスを誘発することができる。従って、本発明の抗体は、前記腫瘍細胞を死滅させるか、またはそのアポトーシスを誘発するための医薬組成物の製造において使用することができる。結果として、本発明は、ガン、特に腫瘍細胞がＣＣＲ７受容体を発現するガンを治療するための代替アプローチを提供する。
【００３１】
本明細書において、「腫瘍細胞を死滅させる」との用語は、ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞などの腫瘍細胞を特異的に溶解することによって前記細胞を排除する機構をいう。このような溶解または細胞障害作用は、通常、補体タンパク質（ＣＤＣ）またはＮＫ細胞などのエフェクタ細胞（ＡＤＣＣ）のいずれかを採用することによって媒介されるものであり、前記タンパク質およびＮＫ細胞はそれぞれ、抗ＣＣＲ７抗体で処理した後において、前記腫瘍細胞を特異的に標的とし、その溶解を生じることができる。
【００３２】
本明細書において、「腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する」との用語は、抗ＣＣＲ７抗体で処理した後において、ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞がアポトーシス、即ちプログラム細胞死を起こす機構をいう。
【００３３】
本明細書において、「本発明の抗体」との用語は、標的分子、即ちＣＣＲ７受容体（抗原）に対して特異的な結合活性を呈するγ−グロブリン、またはそのフラグメントをいう。故に、本発明の抗体は、ＣＣＲ７のエピトープに結合することができる。典型的には、エピトープを形成するには、少なくとも６、８、１０または１２個の連続するアミノ酸が必要となるが、連続しないアミノ酸を含むエピトープは、更に多くの、例えば少なくとも１５、２５または５０個のアミノ酸を必要とすることもある。「本発明の抗体」との用語には、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、改変または修飾抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、ヒト抗体、抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントなど）、ダイアボディ（diabodies）二重特異性抗体、およびヘテロ結合（heteroconjugate）抗体が含まれる。更に、本発明の抗体はまた、治療剤、毒素などの更なる化合物に結合していてもよい。このような抗体は様々な方法で製造することができ、そのような方法としては、ハイブリドーマ培養、細菌類または哺乳類細胞培養物における組み換え発現、およびトランスジェニック動物における組み換え発現が挙げられる。また、抗体は、繊維状ファージ、細菌類、酵母またはリボソームなどのディスプレイ系において発現される配列ライブラリから配列を選択することによって製造することもできる。具体的な製造方法を選択するための文献、例えば、Chadd and Chamow, Curr. Opin. Biotechnol., 12:188-194 (2001) 中には十分なガイダンスがある。製造方法の選択は、所望の抗体構造、抗体上の炭水化物部分の重要性、培養および精製のしやすさ、ならびに費用などの幾つかの要因に応じて決まる。多くの異なる抗体構造は標準的な発現技術を用いて製造することができ、これには、全長抗体、抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦｖフラグメント）、ならびに異なる種からの成分を含むキメラ抗体が含まれる。エフェクタ機能を有さず、薬物動態活性が限られている、ＦａｂおよびＦｖフラグメントなどの小型抗体フラグメントは、細菌発現系において製造することができる。一本鎖Ｆｖフラグメントは低免疫原性を示し、血液から迅速に一掃さ
れる。
【００３４】
ＣＣＲ７受容体のエピトープに特異的に結合する本発明の抗体は、治療的に使用することができると共に、免疫化学的アッセイにおいて使用することができ、この免疫化学的アッセイとしては、免疫蛍光アッセイ、フローサイトメトリ、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、放射免疫測定、免疫組織化学アッセイ、免疫沈降または当技術分野において既知の他の免疫化学的アッセイなどが挙げられる。様々な免疫学的アッセイを使用して、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。競合結合アッセイまたは免疫放射定量測定法についての多数のプロトコルが当技術分野において周知である。このような免疫学的アッセイは、典型的には、免疫原と、ＣＣＲ７受容体免疫原に特異的に結合する抗体との間の複合体形成の測定を含む。
【００３５】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であってもよい。このようなポリクローナル抗体は、免疫剤、および好ましくはアジュバントを１回以上注入した後に、非ヒト哺乳類などの哺乳類において製造することができる。典型的には、一連の皮下注射または腹腔内注射により、免疫剤および／またはアジュバントが哺乳類に注入される。免疫剤としては、ＣＣＲ７受容体、もしくはそのフラグメント、もしくはその融合タンパク質、またはＣＣＲ７受容体を発現する細胞が挙げられる。あるいは、ＣＣＲ７受容体を富化した粗タンパク質調製物またはそのフラグメントを使用して抗体を製造することもできる。このようなタンパク質、フラグメントまたは調製物は、適切なアジュバントの存在下で非ヒト哺乳類に導入される。他の免疫原投与形態は、細胞表面にある膜貫通タンパク質としてである（例えば、Spiller et al., J. immunol. Methods, 224:51-60 (1999)に記載された方法）。これらの細胞は、細胞膜内で抗原を天然に発現するか、または、特に抗原をコードするＤＮＡ配列や細胞内での十分な発現に必要なＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築物で細胞をトランスフェクトした後にこの発現が得られるあらゆる細胞であり得る。このアプローチは、抗体が発現される天然部位が細胞膜である場合だけでなく、一旦細胞内で合成された抗原が、抗原コード配列に付加されるシグナルペプチドによりこれらの位置に向けられている場合にも可能である。血清が望ましくないエピトープに対するポリクローナル抗体を含有する場合、免疫親和性クロマトグラフィによってポリクローナル抗体を精製することができる。
【００３６】
あるいは、前記抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマによって製造することができ、マウス、ハムスターまたは他の適切な宿主動物を免疫剤で免疫して、免疫剤に特異的に結合する抗体を生成するか、またはそれを生成することができるリンパ球を誘導する（例えば、Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975)）。免疫剤としては、典型的には、ＣＣＲ７受容体もしくはそのフラグメント、または融合タンパク質、場合によっては、ＣＣＲ７受容体もしくはそのフラグメントまたはＣＣＲ７受容体を発現する細胞を富化したキャリアまたは粗タンパク質調製物が挙げられる。このようなタンパク質、フラグメントまたは調製物は、適切なアジュバントの存在下で非ヒト哺乳類に導入される。他の免疫原投与形態は、細胞表面の膜貫通タンパク質としてである（例えば、Spiller et al., J. Immunol. Methods, 224:51-60 (1999)に記載の方法）。これらの細胞は、その細胞膜内で抗原を天然に発現させるか、または、特に抗原をコードするＤＮＡ配列や細胞内でのその十分な発現に必要なＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築物で細胞をトランスフェクトした後にこの発現が得られるあらゆる細胞であり得る。このアプローチは、抗体が発現される天然部位が細胞膜である場合だけでなく、一旦細胞内で合成された抗原が抗原コード配列に付加されるシグナルペプチドによりこれらの位置に向けられている場合にも可能である。あるいは、リンパ球はインビトロで免疫してもよい。一般に、非ヒト哺乳類源が望ましい場合には脾臓細胞またはリンパ節細胞が使用され、ヒト由来の細胞が望ましい場合には末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用される。リンパ球は、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を用いて不死化細胞系と融合され、ハイブリドーマ細胞を生成する。一般に、不死化細胞系は、ラット、マウス、仔ウシまたはヒト由来の骨髄腫細胞である。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは融合していない不死化細胞の増殖または生存を阻害する１種以上の物質を含有する好適な培養培地内で培養される。クローンは限界希釈法を用いて単離され、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地（上澄み）を、フローサイトメトリもしくは免疫沈降、または他のイ
ンビトロ結合アッセイ（ＲＩＡまたはＥＬＩＳＡなど）のような従来技術により、ＣＣＲ７受容体に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。クローンはまた、動物の腹水腫瘍としてインビボで培養することもできる。
【００３７】
好ましくは、ハイブリドーマ細胞のクローンにより生成されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降により、またはインビトロ結合アッセイ（放射免疫測定（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など）により、または免疫蛍光技術（蛍光顕微鏡検査法もしくはフローサイトメトリなど）によって測定される。
【００３８】
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析または親和性クロマトグラフィなどの従来の免疫グロブリン精製手順により、培養培地、腹水または血清から好適に分離される。
【００３９】
モノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載されるような組換えＤＮＡ法によって作製してもよい。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、ＣＣＲ７受容体に特異的なハイブリドーマ細胞から単離され、従来の手順によって、例えば、ネズミ抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて配列決定され得る。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源としての役割を果たす。ＤＮＡは、一旦単離されると、発現ベクターに挿入され、次いで、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または別の方法では免疫グロブリンタンパク質を生成しない骨髄腫細胞などの宿主細胞内にトランスフェクトされ、組み換え宿主細胞内でのモノクローナル抗体の合成が行われ得る。
【００４０】
標的分子に対して反応する特異的抗体または抗体フラグメントを生成する別の方法は、細菌類、酵母、繊維状ファージ、リボソームまたはリボソームサブユニットおよび他のディスプレイ系において発現する免疫グロブリン遺伝子またはその一部分をコードする発現ライブラリをスクリーニングすることである。これらの方法は、通常、健常なドナー、患者、または健常なもしくはそうでない動物などの様々な供給源から得られた抗体配列または抗体フラグメント配列の大規模なライブラリを使用する。これらの配列はクローニングされ、適切な系で発現され、抗原に対するその結合親和性により選択される。所望の特性（中和、アゴニストなど）を有する抗体またはフラグメントを選択する様々なアプローチが文献に記載されている（Fernandez, Curr. Op. Biotech., 15:364-373 (2004); Schmidt, Eur. J. Biochem., 268:1730-1738 (2001)）。一つの実施態様では、本発明のハイブリドーマに特有の抗体および抗体フラグメントはまた、メッセンジャーＲＮＡを抽出する、ｃＤＮＡライブラリを構築する、および抗体分子のセグメントをコードするクローンを選択することにより、組換え手段によって製造することができる。
【００４１】
改変抗体または修飾抗体：
多くのアプローチは、臨床用途または他の用途のために免疫グロブリンの特性を改良することを目的として、免疫グロブリンの遺伝的特徴および構造についての十分な知識などの分子生物学および遺伝子工学を利用して免疫グロブリン分子の様々な変異体を構築する。それらのアプローチの中には、使用すべき種において分子の免疫原性を低減する傾向を有するものもあり、結果として生じた分子は、この種とより相同な配列を有する。健常なヒトにおける倫理的に許容できない手順を避けて、ヒト由来のｍＡｂを得るために、様々な方法が使用されている。他のアプローチでは、例えば、固形腫瘍内への分子の分散を改良するために、分子量およびサイズが低減される。他の可能性としては、２種以上の標的分子（二重特異性抗体または三重特異性抗体など）に対する結合ドメインの分子内での結合、または所望の機能を有する他の分子（例えば、毒剤、ホルモン、増殖因子、免疫調節剤（免疫抑制剤または免疫刺激剤）、細胞増殖阻害剤など）と、抗体またはフラグメントとの結合である。一般に、結果として生じた全ての分子は、抗体の少なくとも一つの可変ドメインを保持しており、このドメインにより、抗原−抗体結合の特異性および親和特性が高くなる。これらの構築物の例としては、以下のものが挙げられる。
【００４２】
キメラ抗体：
これは、ある種（通常は、ｍＡｂが生成された哺乳類）の抗体に由来する可変領域と、他の種（キメラ抗体が使用されるべきもの）の定常領域とで構築された抗体をいう。このような構築の目的は、元来のｍＡｂではあるが、治療すべき被験体において免疫原性がより低くて耐性がより高く、血清中半減期が向上しており、且つ、エフェクタ免疫機構、即ち補体、細胞障害性細胞のＦｃ受容体または種特異性を示す免疫グロブリンに特異的な他の受容体について認識され得る抗体を得ることである。
【００４３】
ヒト化抗体：
「ヒト化抗体」とは、非ヒト抗体、典型的にはネズミ抗体に由来する抗体を意味し、この抗体は、親抗体の抗原結合特性を保持するが、ヒトにおける免疫原性はより低い。これは、（ａ）ヒト定常領域上に非ヒト可変ドメイン全体をグラフトし、キメラ抗体を生成すること、（ｂ）重要なフレームワーク残基を保持して、または保持しないで、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）のみをヒトフレームワーク領域および定常領域内へグラフトすること、および（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってそれらをヒト様部分で「覆う（cloaking）」こと、を含む様々な方法によって達成され得る。
【００４４】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野において説明されてきた。好ましくは、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入される１種以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と呼ばれ、典型的には「インポート」可変ドメインから採取される。
【００４５】
ヒト化は、本質的には、Winterおよび共働者らの方法(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988))に従って、ヒト抗体の対応する配列を超可変領域配列に置換することにより行うことができる。実際、ヒト化抗体は、典型的には、幾つかの超可変領域残基と、おそらくは幾つかのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、齧歯類抗体における相同部位からの残基で置換されているヒト抗体である。ヒト化抗体を作製する際に使用すべき（重鎖および軽鎖の両方の）ヒト可変ドメインの選択は、抗原に対する特異性および親和性を保持しつつ、免疫原性を低減するのに非常に重要である。いわゆる「最適な」方法に従って、齧歯類抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリに対してスクリーニングされる。次いで、齧歯類の配列に最も近いヒトの配列は、ヒト化抗体のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）として認められる（Suns et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 (1987)）。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定サブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定フレームワーク領域が使用される。同フレームワークは幾つかの異なるヒト化抗体のために使用されてもよい(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993) )。
【００４６】
抗原に対する高い親和性および他の好ましい生物学的特性を保持しつつ抗体をヒト化することは更に重要である。この目的を達成するために、好ましい方法によれば、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用した親配列および様々な概念上のヒト化生成物の分析プロセスによって調製される。
【００４７】
霊長類化抗体：
抗体をよりヒトに類似させるというこのアプローチでの更なる工程は、いわゆる霊長類化抗体、即ち、サル（または他の霊長類）抗体、特に、カニクイザル抗体の重鎖および軽鎖可変ドメインを含有するように改変され、ヒト定常ドメイン配列、好ましくはヒト免疫グロブリンガンマ１またはガンマ４定常ドメイン（またはＰＥ変異体）を含有する組み換え抗体を調製することである。このような抗体の調製は、Newman et al., Biotechnology, 10:1458-1460 (1992)；米国特許第５，６５８，５７０号明細書および米国特許第６，１１３，８９８号明細書に記載されている。これらの抗体は、ヒト抗体と高い相同性、即ち８５〜９８％の相同性を呈するものとして報告されており、ヒトエフェクタ機能を示し、免疫原性が低下しており、且つヒト抗原に対して高い親和性を呈することもある。組換え抗体を製造するための別の非常に効果的な手段は、Newman, Biotechnology, 10:1455-1460 (1992)に開示されている。
【００４８】
「ヒト抗体」とは、既知の標準的な方法のいずれかによって製造される、ヒトの軽鎖および重鎖、ならびに定常領域を完全に含有する抗体を意味する。
【００４９】
ヒト化に替わり得るものとして、ヒト抗体を製造することができる。例えば、免疫化により、内因性免疫グロブリンを生成せずにヒト抗体の完全なレパートリーを生成することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することが現在可能である。例えば、キメラ型生殖系（germ-line）変異体マウスにおける抗体の重鎖結合領域ＰＨ遺伝子のホモ接合体が欠失することにより、内因性抗体の生成が完全に阻害されることが説明されている。ヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子アレイをこのような生殖系変異体マウスに移入することにより、免疫化後にヒト抗体が生成される。例えば、Jakobovits et al., Proc. Mad. Acad. Sci. USA, 90:255 1(1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)を参照のこと。
【００５０】
あるいは、ファージディスプレイ技術（McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)）を使用して、ドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからインビトロでヒト抗体および抗体フラグメントを生成することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子が、Ｍ１３またはｆｄなどの線状バクテリオファージの主要なまたは微量のコートタンパク質遺伝子内へ読み枠内でクローニングされ、ファージ粒子の表面上に機能的抗体フラグメントとして提示される。線状粒子は、ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するので、抗体の機能的特性に基づいた選択により、それらの特性を呈する抗体をコードする遺伝子も選択される。故に、ファージは、Ｂ細胞の特性の一部を模倣する。ファージディスプレイは、様々な様式で行われ得る。それらを検討するためには、例えば、Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)を参照のこと。
【００５１】
ヒト抗体はまた、インビトロで活性化されたＢ細胞、またはその免疫系がヒト細胞で再構築されているＳＣＩＤマウスによって製造してもよい。
【００５２】
ヒト抗体を入手したら、そのＤＮＡコード配列を単離し、クローニングし、好ましくは哺乳類からの適切な発現系、即ち細胞系に導入し、その後発現させて、抗体が単離され得る培養培地内にそれを遊離させる。
【００５３】
抗体フラグメント：
抗体フラグメントは、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’およびｓｃＦｖなどの抗体のフラグメントである。抗体フラグメントを製造するための様々な技術が開発されている。伝統的には、これらのフラグメントは、無傷の抗体をタンパク分解することにより得られていたが、より近年では、これらのフラグメントは、組み換え宿主細胞によって直接生成させることができる。他の実施態様では、最適な抗体は、更に単一特異性または二重特異性であり得る一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントである。
【００５４】
抗体のパパイン分解により、各々が単一の抗原結合部位を有する２種の同じ抗原結合フラグメント（「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる）と、残りの「Ｆｃ」フラグメント（この名称は、容易に結晶化するというこのフラグメントの能力を反映している）とが生成される。ペプシン処理によりＦ（ａｂ’）２フラグメントが生成され、このフラグメントは２つの抗原結合部位を有し、やはり抗原を架橋することができる。
【００５５】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含有する最小抗体フラグメントである。この領域は、１つの重鎖可変領域と１つの軽鎖可変領域とが強固に、且つ非共有的に結合した二量体からなる。各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を規定するのは、この構成においてである。集約すると、６つの超可変領域は、抗体に対して抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または、抗原に特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）は、抗原を認識し、結合する能力を有するが、結合部位全体よりも親和性が低い。
【００５６】
Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインと、重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）とを含有する。Ｆａｂ’フラグメントは、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に抗体ヒンジ領域からの１以上のシステインを含む幾つかの残基が付加されている点がＦａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書では、定常ドメインの１以上のシステイン残基が少なくとも１つの遊離チオール基を有するＦａｂ’についての名称である。Ｆ（ａｂ’）Ｚ抗体フラグメントは、元来、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメント対として製造されていた。抗体フラグメントの他の化学的連結も既知である。
【００５７】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、更に、ＶＨおよびＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーを含み、これによりｓｃＦｖは抗原結合のための望ましい構造を形成することができる。ｓｃＦｖの検討のためには、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, N.Y., pp. 269-315 (1994)を参照のこと。
【００５８】
「ダイアボディ」との用語は、２つの抗原結合部位を有する小型抗体フラグメントをいい、そのフラグメントは、同ポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接合された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。あまりに短すぎて同鎖上での２つのドメイン間でのペアリングを行えないリンカーを使用することにより、これらのドメインは別の鎖の相補的ドメインとのペアリングを余儀なくされ、２つの抗原結合部位を形成する。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１、およびHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)に、より十分に記載されている。
【００５９】
本発明に包含されるＣＣＲ７受容体に結合する抗体の機能的フラグメントは、それらが由来する全長抗体の少なくとも１種の結合機能および／または調節機能を保持する。好ましい機能的フラグメントは、対応する全長抗体の抗原結合機能（例えば、哺乳類のＣＣＲ７受容体に結合する能力）を保持する。特に好ましい機能的フラグメントは、哺乳類のＣＣＲ７受容体に特徴的な１種以上の機能、例えば結合活性、シグナリング活性および／または細胞応答の刺激などを阻害する能力を保持する。例えば、一つの実施態様では、機能的フラグメントは、ＣＣＲ７とそのリガンドの１種以上との相互作用を阻害する、および／または１種以上の受容体媒介性機能を阻害することができる。
【００６０】
二重特異性抗体：
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。代表的な二重特異性抗体は、Ｂ細胞表面マーカーの２つの異なるエピトープに結合し得る。他のこのような抗体は、第一のＢ細胞マーカーに結合し、更に第二のＢ細胞表面マーカーに結合し得る。あるいは、抗Ｂ細胞マーカーの結合アームは、Ｂ細胞に対する細胞防御機構に集中させるために、白血球上のトリガー分子（例えば、Ｔ細胞受容体分子（ＣＤ２またはＣＤ３））またはＩｇＧに対するＦｃ受容体（ＦｃｙＲ）（例えば、ＦｃｙＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃｙＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃｙＲＩＩＩ（ＣＤ１６）)に結合するアームと結合され得る。二重特異性抗体はまた、Ｂ細胞に対して細胞毒性剤を局在化させるためにも使用され得る。これらの抗体は、Ｂ細胞マーカーの結合アームと、細胞障害剤（例えば、サポリン、抗インターフェロンα、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセートまたは放射性同位元素ハプテン）に結合するアームとを有している。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ）２二重特異性抗体）として調製することができる。
【００６１】
二重特異性抗体を作製する方法は当技術分野において既知である。全長の二重特異性抗体の伝統的な製造は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づいており、これら２つの鎖は異なる特異性を有している（Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)）。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖を無作為にアソートするので、これらのハイブリドーマ（クワドローマ）は１０種の異なる抗体分子の潜在的な混合物を生成し、このうち１つだけが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、通常は親和性クロマトグラフィ工程によって行われるもので、かなり面倒であり、生成収量は低い。同様の手順が、ＷＯ９３／０８８２９およびTraunecker et al., EMBOJ, 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
【００６２】
別のアプローチによれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）は、免疫グロブリンの定常ドメイン配列と融合される。この融合は、免疫グロブリン重鎖の定常ドメインと行われるのが好ましく、この定常ドメインは、少なくともヒンジ部、ＣＨ２およびＣＨ３領域の一部を含む。前記融合体の少なくとも１つに存在する、軽鎖結合に必要な部位を含有する第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有するのが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、および所望であれば免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別個の発現ベクター内に挿入され、好適な宿主生物に共トランスフェクトされる。これにより、構築に使用される３種のポリペプチド鎖の比が同じでないことによって最適な収量が得られる実施態様において、３種のポリペプチドフラグメントの相互比率を調節する上でのフレキシビリティが大きくなる。しかしながら、少なくとも２種のポリペプチド鎖が同じ比で発現することによって収量が高くなる場合、またはそれらの比が特に重要ではない場合には２種または３種全てのポリペプチド鎖についてのコード配列を１種の発現ベクターに挿入することも可能である。
【００６３】
二重特異性抗体としては、架橋抗体または「ヘテロ結合」抗体が挙げられる。例えば、ヘテロ結合抗体の一方をアビジンに結合させ、他方の抗体をビオチンに結合させることができる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を望ましくない細胞にターゲッティングするべく提案されてきた。ヘテロ結合抗体は、いかなる便利な架橋方法を用いて作製してもよい。好適な架橋剤は当分野で周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号明細書に、多数の架橋技術と共に開示されている。
【００６４】
抗体フラグメントから二重特異性抗体を作製する技術もこの文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学的連結により調製することができる。
【００６５】
抗体結合：
ガンの細胞毒性化学療法または放射線療法は、悪性細胞に対して選択性ではないので、感受性のある正常な細胞に対する、重大な、時に生命を脅かす毒性による副作用によって制限されている。これらの問題を回避する一つの方策は、腫瘍関連抗原を認識する抗体または他のリガンドに治療剤を連結することである。これは、リガンド標的化治療剤に対する悪性細胞の曝露を増大させ、正常細胞の曝露を低減する。Allen, Nature, 2:750-763 (2002)を参照のこと。
【００６６】
治療剤は、免疫抑制剤、即ち、本明細書中で治療される哺乳類の免疫系を抑制または隠蔽するべく作用する物質であり得る。これには、サイトカイン生成を抑制する物質、自己抗原の発現を下方制御もしくは抑制する物質、またはＭＨＣ抗原を隠蔽する物質が含まれる。
【００６７】
治療剤はまた、細胞毒性剤、即ち、細胞の機能を阻害もしくは防止する、および／または細胞の破壊を招く物質でもあり得る。この用語は、放射性アイソトープ、化学療法薬、即ち、ガンの治療に有用な化学化合物、およびトキシン（例えば、小分子トキシン、または細菌類、真菌類、植物もしくは動物に由来する酵素的に活性なトキシン）、またはそれらのフラグメントを含むことが意図されている。
【００６８】
治療剤はまた、サイトカイン、ホルモン、増殖因子、壊死因子、即ち、細胞間メディエーターとして別の細胞に作用するか、または同じ細胞集団内でさえそのように作用する一つの細胞集団によって放出されるタンパク質またはペプチドでもあり得る。本明細書において、サイトカインという用語には、天然由来の、または組み換え細胞培養物由来のタンパク質およびペプチド、ならびに天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる。
【００６９】
治療剤はまた、医薬的に活性な物質の前駆体または誘導体形態を指すプロドラッグでもあり得る。このプロドラッグは、親薬物と比較して腫瘍細胞に対する細胞障害作用がより低く、且つ、酵素的に活性化されるか、またはより活性な親形態へ変換されることができる。
【００７０】
抗体および１種以上の小分子トキシンの結合体。本発明の一つの好ましい実施態様では、拮抗薬は、１種以上のトキシン分子に結合される。使用可能である酵素的に活性なトキシンおよびそれらのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリアトキシンの非結合活性フラグメント、エクソトキシンＡ鎖（Pseudomonas aeruginosa由来）、リシンＡ鎖、アビリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファサルシン、Aleurites fordiiタンパク質、ジアンチンタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、momordica charantia阻害剤、クルシン、クロチン、sapaonaria officinalis阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトチン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコセセンが挙げられる。
【００７１】
本発明は、更に、核酸分解活性（例えば、リボヌクレアーゼ、またはデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）などのＤＮＡエンドヌクレアーゼ）を有する化合物、または細胞組織もしくはオルガネラに損傷を与え、これにより細胞を死滅させるか、もしくはその生命力を減退させることができる他の化合物と結合した抗体を想定している。
【００７２】
本発明の抗体はまた、プロドラッグを活性な抗ガン薬に変換するプロドラッグ活性化剤と結合していてもよい。このような結合体の薬剤成分としては、プロドラッグを、そのより活性で細胞障害性である形態に変換するべくプロドラッグに作用することができるいずれかの薬剤が挙げられる。
【００７３】
あるいは、本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に連結した本発明の拮抗薬の少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質を、当技術分野において周知の組換えＤＮＡ技術を用いて構築することができる（例えば、Neuberger et al., Nature, 312:604-608 (1984)を参照のこと)。
【００７４】
抗体および細胞毒性剤の結合体は、様々な二重特異性タンパク質連結剤またはリンカーを用いて作製してもよい。リンカーは、細胞内での細胞毒性剤の放出を促進させる「開裂可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカーを使用してもよい。
【００７５】
あるいは、抗体および細胞毒性剤を含む融合タンパク質は、例えば組換え技術またはペプチド合成によって作製してもよい。
【００７６】
他の潜在的に有用な修飾：
本明細書に記載されるタンパク質またはペプチド拮抗薬の１種以上のアミノ酸配列修飾が想定される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合もある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードする核酸に、適切なヌクレオチドの変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。このような修飾としては、例えば、拮抗薬のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／またはそれらへの挿入、および／またはそれらの置換が挙げられる。欠失、挿入および置換のいずれかの組み合わせを行って最終構築物を達成するが、但し、最終構築物が望ましい特性を有することが条件である。アミノ酸変化はまた、グリコシル化部位の数または位置を変更するなど、拮抗薬の翻訳後プロセスを改変する場合もある。
【００７７】
アミノ酸配列の挿入物としては、１残基から１００残基以上を含有するポリペプチドまでの長さを有するアミノおよび／またはカルボキシル末端融合物、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入物が挙げられる。末端挿入物の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する拮抗薬、または細胞毒性ポリペプチドと融合された拮抗薬が挙げられる。拮抗薬分子の他の挿入変異体としては、拮抗薬のＮ末端またはＣ末端と酵素または拮抗薬の血清中半減期を増加させるポリペプチドとの融合物が挙げられる。
【００７８】
変異体の別の型は、アミノ酸置換変異体である。この変異体は、拮抗薬分子内に、異なる残基で置換された少なくとも一つのアミノ酸残基を有する。抗体拮抗薬の置換型突然変異誘発のための最大の関心部位としては超可変領域が挙げられるが、ＦＲ改変もまた想定される。
【００７９】
抗体のアミノ酸変異体の別の型は、該拮抗薬の元のグリコシル化パターンを改変したものである。改変とは、拮抗薬内に見られる１種以上の炭水化物部分を欠失する、および／または拮抗薬内に存在しない１種以上のグリコシル化部位を付加することを意味する。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的にはＮ−結合型またはＯ−結合型のいずれかである。Ｎ結合型は、アスパラギン残基の側鎖に炭水化物部分が結合していることをいう。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（式中、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に炭水化物部分を酵素的に結合させるための認識配列である。故に、ポリペプチドにおけるこれらトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位となる。Ｏ−結合型グリコシル化は、単糖類または単糖類の誘導体、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースの１種をヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへ結合させることをいうが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンを使用してもよい。グリコシル化部位の抗体への付加は、アミノ酸配列が（Ｎ−結合型グリコシル化部位のための）上述のトリペプチド配列の１種以上を含有するようにアミノ酸配列を改変することによって好都合に達成される。この改変はまた、（Ｏ−結合型グリコシル化部位のための）１種以上のセリンまたはスレオニン残基を元の抗体の配列に付加することによって、または元の抗体の配列をそれら残基で置換することによって行ってもよい。抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野において既知の様々な方法によって調製される。これらの方法としては、天然供給源からの単離（天然由来のアミノ酸配列変異体の場合）、またはオリゴヌクレオチド媒介型（または部位指向型）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、および予め調製された拮抗薬の変異体もしくは非変異体バージョンのカセット突然変異誘発による調製が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
本発明で使用する抗体を修飾してエフェクタ機能を改善するために、例えば、抗体のＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを向上させることが望ましい場合もある。これは、抗体のＦｃ領域に１以上のアミノ酸置換を導入することによって達成され得る。
【００８１】
抗体などの糖タンパク質のアミノ酸骨格に付加されたグリコシル基は、幾つかの単糖類または単糖類誘導体によって形成されるので、異なる哺乳類または組織からの細胞において生成された同じ抗体でも組成が異なる可能性がある。更に、グリコシル基の組成が異なると、抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）を媒介する力が変化し得ることが示されている。故に、異なる供給源からの抗体のグリコシル化パターンを研究することにより、それらの特性を向上させることができる。このようなアプローチの例は、Niwa et al., Cancer Res. 2004 Mar 15; 64(6):2127-33である。
【００８２】
あるいは、または更に、１以上のシステイン残基をＦｃ領域に導入し、それによりこの領域に鎖間ジスフフィド結合を形成してもよい。そのようにして生成されたホモ二量体抗体は、内在化能力が向上する、および／または補体媒介性細胞死滅および抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）が増大し得る。Caron et al., J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)およびShopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)を参照のこと。また、向上した抗腫瘍活性を持つホモ二量体抗体は、Wolff et al., Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されているように、ヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製してもよい。あるいは、２つのＦｃ領域を有する抗体を改変することにより、補体溶解およびＡＤＣＣ能力を改善してもよい。Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)を参照のこと。
【００８３】
抗体の血清中半減期を増加するために、例えば米国特許第５，７３９，２７７号明細書に記載されるように、抗体にサルベージ受容体結合エピトープを包含させてもよい。本明細書において、「サルベージ受容体結合エピトープ」との用語は、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープをいい、これはＩｇＧ分子のインビボ血清中半減期の増加に関与する。
【００８４】
好ましくは、本発明の抗体（例えばモノクローナル抗体、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント）または本発明のモノクローナル抗体由来の他の結合組成物は、ＣＣＲ７受容体に対して高い親和性を有する。モノクローナル抗体および関連分子のＣＣＲ７受容体に対する親和性は、従来技術によって測定され得る。
【００８５】
抗原に対する抗体の親和性は、その抗原に結合するための抗体の効力として定義することができる。抗原−抗体結合は可逆的な結合であるので、十分な時間の後、両分子が同じ溶液で希釈されると、この溶液は平衡に達し、抗原−抗体複合体（ＡｇＡｂ）、遊離抗原（Ａｇ）および遊離抗体（Ａｂ）の濃度は一定である。故に、[ＡｇＡｂ]／［Ａｇ］＊［Ａｂ］比はまた、Ｋａと称される結合定数として定義される定数であり、この定数は、そのそれぞれのエピトープに対する幾つかの抗体の親和性を比較するのに使用することができる。
【００８６】
親和性を測定するための一般的な方法は、結合曲線を実験により決定することである。これは、遊離抗原の濃度の関数として、抗体−抗原複合体の量を測定することを含む。この測定を行う一般的な方法は２つある：（ｉ）Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析を用いた伝統的な平衡透析、および（ｉｉ）抗体または抗原のいずれかが導電性表面に結合され、抗原または抗体それぞれの結合がこの表面の電気的特性に影響を及ぼす表面プラズモン共鳴法。
【００８７】
同じエピトープを接合する２つ以上のｍＡｂの相対親和性を測定するだけでよいことも多い。この場合には競合アッセイを行うことができ、ここでは、ｍＡｂの１つを連続希釈したものを、一定量のリガンドでインキュベートし、次いで、いずれかの好適なトレーサーで標識した第二のｍＡｂを付加する。このｍＡｂを結合させ、結合していない抗体を洗浄した後、第二のｍＡｂの濃度を測定し、第一のｍＡｂの濃度に関してプロットし、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ法で分析する。一例は、Tamura et al., J. Immunol. 163:1432-1441 (2000)である。
【００８８】
更に、本発明の抗体は、ＣＣＲ７受容体を検出するのに有用であり得る。このような検出方法は、腫瘍細胞がＣＣＲ７受容体を発現する細胞であるガンの診断および／または予後のために有利に適用される。
【００８９】
更に、本発明の抗体は、免疫蛍光、フローサイトメトリ、親和性クロマトグラフィまたは免疫沈降などの標準的な技術によってＣＣＲ７受容体を発現する細胞を同定するために使用することができる。例えば、本発明の抗体は、ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞の同定を促進することができる。更に、本発明の抗体を使用して、ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞を同定し、特定組織内でのそのレベルを評価することができる。従って、本発明の抗体は、臨床的試験手順の一部として組織内でＣＣＲ７受容体を発現する細胞のレベルをモニタリングして、例えば所与の治療計画の効果を測定するための診断に使用することができる。抗体を標識基に連結する（即ち、物理的に連結する）ことによって検出を促進することができる。
【００９０】
以下に記載されるように、特定の実施態様では、本発明の抗体は、治療的に活性な更なる化合物、例えばサイトカイン、鎮痛剤、免疫抑制剤および／または化学療法薬と組み合わせて使用することができる。この併用投与としては、別個の製剤または単一の医薬製剤を用いた共投与、およびいずれかの順序での連続投与が挙げられ、両方の（または全ての）活性薬剤が同時にそれらの生物学的活性を発揮する時間があるのが好ましい。
【００９１】
他の態様では、本発明は医薬組成物（本発明の医薬組成物と称することもある）に関し、この組成物は、被験体に投与するための、本発明の抗体、即ち、ＣＣＲ７受容体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント、またはその医薬的誘導体もしくはプロドラッグを、医薬的に許容可能なキャリア、アジュバントまたは賦形剤と共に含む。前記医薬組成物は、ガンを有する被験体に投与することにより、ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞を死滅させるか、またはそのアポトーシスを誘発するために使用することができる。本明細書において、「被験体」との用語は、哺乳類として分類される全ての動物をいい、家畜（domestic and farm animals）、霊長類およびヒトを含むが、これらに限定されない。被験体は、いずれかの年齢または人種の男性または女性のヒトであるのが好ましい。
【００９２】
本明細書において、「医薬的に許容可能なキャリア」との用語は、医薬投与と適合するあらゆる全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを包含する。医薬的に活性な物質のためにこのような媒質および薬剤を使用することは当技術分野において周知である。従来の媒質または薬剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、組成物中でのその使用が想定されている。許容可能なキャリア、賦形剤または安定剤は、採用される用量および濃度では受容者に無毒であり、このようなものとしては、緩衝剤（例えば、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸類）；抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオニンなど）；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン（例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノールおよびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシン）；単糖類、二糖類および他の炭水化物類（グルコース、マンノースまたはデキストリンなど）；キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖類（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール）；塩形成対イオン類（例えば、ナトリウム）；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））が挙げられる。
【００９３】
本発明の抗体は、同じ処方であってもよいし、異なる処方で投与されてもよい。投与は、同時または連続であることができ、いずれの順番でも効果的であり得る。
【００９４】
また、補足の活性化合物を本発明の医薬組成物に配合することもできる。従って、特定の実施態様では、本発明の医薬組成物はまた、治療される特定の適応症に必要であるような２種以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する化合物を含有してもよい。例えば、更に、化学療法薬、サイトカイン、鎮痛剤または免疫抑制剤を付与することが望ましい場合もある。このような他の活性薬剤の有効量は、とりわけ、医薬組成物中に存在する本発明の抗体の量、疾患もしくは障害または治療の種類などに応じて決定される。
【００９５】
一つの実施態様では、本発明の抗体は、身体から迅速に除去されないように前記化合物を保護するキャリア（例えば制御放出製剤）を用いて調製され、このキャリアとしては、インプラントおよびマイクロカプセル化されたデリバリシステムが挙げられる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性且つ生体適合性ポリマーが使用可能である。このような製剤を調製する方法は、当業者にとって自明である。これらの材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から商業的に入手可能である。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する、感染細胞を標的とするリポソームを包含する）も医薬的に許容可能なキャリアとして使用可能である。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載されるような、当技術分野において既知の方法に従って調製することができる。
【００９６】
本発明の抗体（またはそのフラグメント）の投与経路は、経口投与、非経口投与、吸入による投与、または局所投与であってもよい。
【００９７】
本明細書において、「非経口」との用語には、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸または膣内投与が含まれる。非経口投与のうち皮下形態および筋肉内形態が一般的には好ましい。
【００９８】
「吸入」は、鼻腔内または経口吸入投与を意味する。エアロゾル製剤または定量吸入器などの、このような投与に適切な投薬形態は、従来技術によって調製することができる。
【００９９】
更に、「局所」投与は、非全身投与を意味し、表皮や口腔に対する本発明の抗体の外用、ならびに耳、目および鼻内へのこのような抗体の滴下を含み、この抗体は血流へはほとんど入らない。「全身投与」は、口腔、静脈内、腹腔内および筋肉内投与を意味する。治療または予防効果に必要な抗体の量は、無論、選択した抗体、治療される症状の性質および重篤性、ならびに患者に応じて変わる。
【０１００】
更に、抗体は、例えばその用量を減らして、パルス注入によって投与されるのが適切であることもある。好ましくは、投薬は、投与が短期的であるか、長期的であるかに一部応じて、注入により、もっとも好ましくは静脈注射または皮下注射により行われる。
【０１０１】
従って、特定の実施態様では、本発明の医薬組成物は、固形または液体のいずれかの経口投与に適した投与形態であり得る。経口投与に適する剤形は、錠剤、カプセル、シロップまたは溶液であってもよく、結合剤（例えばシロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトールまたはポリビニルピロリドン）、充填剤（例えば、ラクトース、糖、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビトールまたはグリシン）、錠剤化潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）、崩壊剤（例えば、デンプン、ポリビニルピロリドン、デンプングリコール酸ナトリウムまたは微晶性セルロース）、または医薬的に許容可能な湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）など、当技術分野で既知である従来の賦形剤を含有してもよい。固形経口組成物は、従来のブレンド、充填または錠剤化方法によって調製されてもよい。多量の充填剤を使用して活性剤をそれら組成物全体に分散させるために、ブレンド操作を繰り返し行ってもよい。このような操作は、当技術分野において慣習的である。錠剤は、例えば、湿式または乾式造粒によって調製され、場合により、通常の医薬的慣習において周知の方法に従って、特に腸溶コーティングで被覆されてもよい。
【０１０２】
別の実施態様では、本発明の医薬組成物は、適切な単位剤形で、滅菌溶液、懸濁液または凍結乾燥製品など、非経口投与に適合されていてもよい。注射用途に適合した医薬組成物としては、滅菌水溶液（水溶性である場合）または分散液、および滅菌性注射溶液または分散液の即時調製用滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与に適したキャリアとしては、生理的食塩水、静菌水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＭ（ＢＡＳＦ、Parsippany, N.J.）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。いかなる場合も、組成物は滅菌性でなければならず、容易に注射できる程度の流体であるべきである。この組成物は、製造および保存の条件下では安定であり、細菌類および真菌類などの微生物の汚染作用から保護されているべきである。キャリアは、例えば、水、エタノール、医薬的に許容可能なポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）およびこれらの適切な混合物を含有する溶剤または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合には所要の粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖類、多価アルコール類（例えば、マンニトール）、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物に配合することが好ましい。注射組成物の長期間吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどを組成物に配合することによって行うことができる。
【０１０３】
滅菌性注射溶液は、先に列挙した成分の１つまたはその組み合わせを必要に応じて含む適切な溶剤に活性化合物（例えば、ポリペプチドまたは抗体）を所要量配合し、次いでろ過滅菌することによって調製することができる。一般的に、分散液は、塩基性分散媒と、先に列挙したものからの他の所要成分とを含有する滅菌性賦形剤に活性化合物を配合することによって調製される。滅菌性注射溶液を調製するための滅菌性粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、活性成分と、予め滅菌ろ過したその溶液からの更なる所望成分との粉末が得られる。
【０１０４】
特定の実施態様では、前記医薬組成物は、静脈（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）を介して投与される。増量剤、緩衝剤または界面活性剤などの十分な賦形剤が使用可能である。上述の製剤は、スペインおよび米国薬局方ならびに同様の参考文献に記載されているか、または言及されているもののような標準的な方法を用いて調製される。
【０１０５】
投与のしやすさおよび均一な投薬のための単位剤形で、医薬組成物、即ち経口または非経口組成物を処方することが特に有利である。本明細書において、単位剤形とは、治療される被験体に対するまとまった投薬として好適な物理的に別個の単位をいう。各単位は、所望の治療効果を生むように計算された所定量の活性化合物（本発明の抗体）を、所要の医薬キャリアと共に含有する。本発明の単位剤形に関する詳細は、活性化合物の独特な特性および達成すべき特定の治療効果、ならびに個体を治療するためのこのような活性化合物を化合する分野において特有の制限事項に応じて変更され、且つそれらの事項に直接左右される。
【０１０６】
一般的に、本発明の抗体の有効な投与量は、選択された化合物の相対的効果、治療される障害の重篤性および患者の体重によって決まる。しかしながら、活性化合物は、典型的には、１日１回以上、例えば１日１、２、３または４回投与され、典型的な総日用量は、０．００１〜１，０００ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、最も好ましくは約０．０５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。
【０１０７】
患者に対する抗体投与とは別に、本出願は、遺伝子治療による抗体投与も想定している。ＷＯ９６／０７３２１は、遺伝子治療を用いて細胞内抗体を生成することに関する。
【０１０８】
医薬組成物は、投与に関する説明書と共に、容器、パックまたはディスペンサー内に包含され得る。
【０１０９】
本発明の抗体および医薬組成物を他の薬剤と共に使用して、併用療法としてもよい。他の薬剤は、同組成物の一部を形成してもよく、または同時にもしくは別時に投与するための別個の組成物として提供されてもよい。
【０１１０】
本発明の抗体および医薬組成物は、ガンに関連する障害または疾患などの病状の治療において有用であり、特にＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞を特徴とするガンの治療に、より特定的にはＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞を死滅させるか、またはそのアポトーシスを誘発するのに有用である。本発明に従って治療され得る、腫瘍細胞がＣＣＲ７受容体を発現するガンの代表的且つ非制限例としては、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、ホジキン病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、菌状息肉腫、慢性骨髄増殖性症候群の急性転化、骨髄異形成症候群の急性転化、乳ガン、非小細胞肺ガン、黒色腫、胃ガン、または頭部および頸部の扁平上皮細胞ガン、ならびに大腸ガンが挙げられる。好ましい実施態様では、本発明に従って治療され得るガンとしては、乳ガン、非小細胞肺ガン、黒色腫、胃ガン、または頭部および頸部の扁平上皮細胞ガン、ならびに大腸ガンが挙げられる。最も好ましい実施態様では、本発明に従って治療され得るガンとしては、濾胞性リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、バーキットリンパ腫、慢性骨髄増殖性症候群の急性転化、および骨髄異形成症候群の急性転化が挙げられる。更に好ましい実施態様では、本発明に従って治療され得るガンとしては、ＣＬＬおよびＭＣＬが挙げられる。
【０１１１】
特定の実施態様では、本発明の抗体は、本明細書に記載される病状の他の治療法、例えば化学療法、放射線療法、免疫療法または外科的方法（アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗ホルモン、様々な症状に対する治療薬（鎮痛薬、利尿薬、抗利尿薬、抗ウイルス薬、抗生物質、サイトカイン、栄養補助剤、貧血治療薬、血液凝固治療薬、骨治療薬、精神学的および心理学的治療薬など）を含む）と組み合わせてもよい。
【０１１２】
骨髄または抹消血幹細胞は、自家骨髄移植または幹細胞移植を行うために、抗ＣＣＲ７抗体での治療後に前記患者から採取されてもよい。
【０１１３】
また、本発明の抗体を投与する前に、ガン性Ｂ細胞の表面上でのＣＣＲ７または他の標的タンパク質の発現を上方制御するべくサイトカインで患者を治療することも有用であり得る。また、免疫エフェクタ機能を刺激するべく、減少抗体（depleting antibody）または放射性標識抗体の投与と同時に、またはその前に、またはその後にサイトカインを投与してもよい。
【０１１４】
一つの実施態様では、本明細書に開示される療法を補うために、化学療法計画を用いてもよく、また、前記放射性標識抗体の投与と同時に、またはいずれかの順序で逐次的に投与を行ってもよい。化学療法計画は、ＣＨＯＰ（シクロフォスファミド、ドキソルビシン（ヒドロキシダウノルビシンとも呼ばれる）、ビンクリスチン（オンコビンとも呼ばれる）およびプレドニゾン）、ＩＣＥ（イダルビシン、シタラビンおよびエトポシド）、ミトザントロン、シタラビン、ＤＶＰ（ダウノルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾロン）、ＡＴＲＡ（オールトランス型レチノイン酸）、イダルビシン、ｈｏｅｌｚｅｒ化学療法計画、Ｌａ化学療法計画、ＡＢＶＤ（ブレオマイシン、ダカルバジン、デキソルビシンおよびビンクリスチン）、ＣＥＯＰ（シクロフォスファミド、エピルビシン、ビンクリスチンおよびプレゾニドン）、２−ＣｄＡ（２−クロロデオキシアデノシン）、ＦＬＡＧ＆ＩＤＡ（フルダラビン、シタラビン、フィルガストリムおよびイダルビシン）（後続のＧ−ＣＳＦ（顆粒球−コロニー刺激因子）治療を伴う、または伴わない）、ＶＡＤ（ビンクリスチン、ドキソルビシンおよびデキサメタゾン）、Ｍ＆Ｐ（メルファラン（melphlan）およびプレドニゾン）、Ｃ（シクロフォスファミド）−毎週、ＡＢＣＭ（アドリアマイシン、ブレオマイシン、シクロフォスファミドおよびミトマイシン−Ｃ）、ＭＯＰＰ（メクロレタミン、ビンクリスチン、プレドニゾンおよびプロカルバジン）およびＤＨＡＰ（デキサメタゾン、シタラビンおよびシスプラチン）からなる群から選択されてもよい。好ましい化学療法計画はＣＨＯＰである。
【０１１５】
従って、他の態様では、本発明は、ガン、特に、腫瘍細胞がＣＣＲ７受容体を発現するガンを治療するための方法に関し、この方法は、前記治療を必要とする被験体に、本発明の抗体、即ち、ＣＣＲ７受容体に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または本発明の医薬組成物を治療的に有効な量で投与することを含んでなる。特定の実施態様では、前記ガンは、ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞を特徴とするガンである。本発明に従って治療される代表的且つ非制限的なガンとしては、ＣＬＬ、ＭＣＬ、濾胞性リンパ腫、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、ホジキン病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、菌状息肉腫、慢性骨髄増殖性症候群の急性転化、骨髄異形成症候群の急性転化、乳ガン、非小細胞肺ガン、黒色腫、胃ガン、または頭部および頸部の扁平上皮細胞ガン、ならびに大腸ガンが挙げられる。好ましい実施態様では、本発明に従って治療されるガンとしては、乳ガン、非小細胞肺ガン、黒色腫、胃ガン、または頭部および頸部の扁平上皮細胞ガン、ならびに大腸ガンが挙げられる。最も好ましい実施態様では、本発明に従って治療されるガンとしては、濾胞性リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、バーキットリンパ腫、慢性骨髄増殖性症候群の急性転化、および骨髄異形成症候群の急性転化が挙げられる。更に好ましい実施態様では、本発明に従って治療されるガンとしては、ＣＬＬおよびＭＣＬが挙げられる。
【０１１６】
他の態様では、本発明は、ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞を死滅させるか、またはそのアポトーシスを誘発するための方法に関し、この方法は、本発明の抗体、即ち、ＣＣＲ７受容体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントと前記細胞を接触させることを含んでなる。特定の実施態様では、前記腫瘍細胞は、ＣＣＬおよびＭＣＬ細胞などの、ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞である。
【０１１７】
他の態様では、本発明は、前記治療を必要とする被験体において、ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞を死滅させるか、またはそのアポトーシスを誘発するための方法に関し、この方法は、本発明の抗体、即ち、ＣＣＲ７受容体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを治療的に有効な量で前記被験体に投与することを含んでなる。
【０１１８】
他の態様では、本発明は、ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞の二次リンパ組織への遊走を低減するため、および／または二次リンパ組織内への腫瘍組織の拡散を阻止するための方法に関し、この方法は、本発明の抗体、即ち、ＣＣＲ７受容体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントと腫瘍細胞を接触させることを含んでなる。
【０１１９】
他の態様では、本発明は、前記治療を必要とする被験体において、ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞の二次リンパ組織への遊走を低減するため、および／または二次リンパ組織内への腫瘍組織の拡散を阻止するための方法に関し、この方法は、本発明の抗体、即ち、ＣＣＲ７受容体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを治療的に有効な量で前記被験体に投与することを含んでなる。
【０１２０】
本発明の方法により治療され得るＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞、抗体、投与計画および投薬量に関する情報は上述されている。特定の実施態様では、上述の方法により治療され得るＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞は、ＣＬＬまたはＭＣＬ細胞である。
【０１２１】
あらゆる場合において、「治療的に有効な量」という表現は、先に定義したような、ガンを治療する上で有効な量を意味する。この量は、所望の応答を行うか、または、転移の症状もしくは徴候など、または原発性腫瘍の進行、大きさまたは成長を改善するのに十分な量であり得る。特定の被験体にとって治療的に有効な量は、治療される症状、被験体の全健康状態、投与方法、経路および用量、ならびに副作用の重篤性に応じて異なる。好ましくは、その効果により、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、５０％、７０％、または更に９０％以上の量的変化が生じる。組み合わせた場合、治療的に有効な量は、成分の組み合わせに対する比であり、その効果は個々の単独成分に制限されない。
【０１２２】
治療的に有効な量は、典型的には少なくとも約１０％、通常では少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、またはより好ましくは少なくとも約５０％症状を調節する。あるいは、遊走の調節とは、様々な細胞種の遊走または輸送が影響を受けることを意味する。これにより、影響を受ける細胞の数が、例えば、統計的に有意に、且つ定量可能に変化する。この変化は、ある時間または標的領域内で誘引される標的細胞数の低下であってもよい。原発性腫瘍の進行速度、大きさ、転移または成長をモニタリングしてもよい。
【０１２３】
上述の治療方法のいずれかを、哺乳類（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も好ましくはヒト）を含む、このような治療が必要ないずれかの被験体に適用してもよい。
【０１２４】
他の態様では、本発明は、ＣＣＲ７受容体を発現する腫瘍細胞を死滅させるか、またはそのアポトーシスを誘発するための化合物を同定する方法に関し、この方法は、
ａ）ＣＣＲ７受容体を発現する細胞を、抗ＣＣＲ７抗体またはそのフラグメントに連結した候補化合物と接触させ、
ｂ）前記候補化合物がＣＣＲ７受容体を発現する前記細胞を死滅させるかどうかを判定することを含んでなり、
ＣＣＲ７受容体を発現する前記細胞を死滅させる化合物は、腫瘍細胞を死滅させるか、またはそのアポトーシスを誘発するのに潜在的に有用な化合物とされる。
【０１２５】
実際、ＣＣＲ７受容体を発現する細胞は、腫瘍細胞または非腫瘍細胞のいずれであっても、先に定義した方法を実施するために使用することができる。特定の実施態様では、ＣＣＲ７受容体を発現する前記細胞は、ＣＬＬまたはＭＣＬ細胞である。
【０１２６】
ＣＣＲ７受容体を発現する細胞の死は、いずれかの従来方法によって、例えば、本明細書に添付される実施例に開示される方法に従って判定することができる。
【０１２７】
以下の実施例は、本発明を例証するのに役立つ。
【実施例】
【０１２８】
ＣＬＬを治療するためのツールとしてのＣＣＲ７に対する抗体
Ｉ．材料および方法
サンプル、試薬およびフローサイトメトリ（ＦＣＭ）
ＣＣＬ（慢性リンパ性白血病）およびＭＣＬ（マントル細胞リンパ腫）患者および健常なドナーからの抹消血サンプルを、本人の同意を得た後に入手した。ヒト表面抗原であるＣＤ４５、ＣＤ１９、カッパ軽鎖、ラムダ軽鎖、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ５およびＣＤ３（全てBD Biosciences, San Jose, CAから購入）に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いた標準的な４色ＦＣＭによって、全血液細胞の当初免疫表現型の特徴付けを行った。単核サブポピュレーションについて、ＣＬＬまたはＭＣＬ細胞が６０％未満であるサンプルは破棄した。次いで、電子的にゲートされた腫瘍Ｂ細胞または正常なＴおよびＢリンパ球について、ＣＣＲ７発現の分析を行った。フィコエリトリン（ＰＥ）結合マウス抗ヒトＣＣＲ７をR&D Systems（McKinley Place, MN）から購入した。全ての場合において、適切なアイソタイプの対照を含んでいた。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（BD Biosciences）を用いて、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター上で免疫蛍光染色を分析した。
【０１２９】
抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）をフィコール勾配遠心分離（Histopaque-1077, Sigma-Aldrich, Madrid, Spain）によって単離した。
【０１３０】
精製したネズミ抗ヒトＣＣＲ７  ｍＡｂ（以下「抗ＣＣＲ７  ｍＡｂ」という）をBD Biosciences（１５０５０３クローン、ＩｇＧ２ａアイソタイプ）およびR&D Systems（２Ｈ４クローン、ＩｇＭアイソタイプ）から入手した。細胞周期分析および／または細胞生存率アッセイで使用するＤＮＡ色素７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）はBD Biosciencesからのものであった。組換えヒトケモカインＣＣＬ１９およびＣＸＣＬ１２はR&D Systemsから購入した。
【０１３１】
受容体エンドサイトーシスアッセイ
抗ＣＣＲ７  ｍＡｂの結合がケモカイン受容体（ＣＣＲ７）の内在化を引き起こすかどうかを試験するため、５ｘ１０５個のＣＬＬ細胞を、５％ＣＯ２雰囲気中、異なる時間（３０秒〜１時間）、３７℃にて、２μｇ／ｍＬの抗ＣＣＲ７  ｍＡｂとともにインキュベートした。ＣＣＲ７の生理的リガンドの１つであるＣＣＬ１９はそのエンドサイトーシスを引き起こすものであり、陽性対照として使用された。結合したｍＡｂまたはＣＣＬ１９のいずれかを酸性洗浄液（０．１Ｍ  グリシン、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ＝２．５）で除去した後、ＣＬＬ細胞上でのＣＣＲ７発現を上述のようなＦＣＭ分析によって測定した。
【０１３２】
補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）
１０５個の細胞を含有するＰＢＭＣ懸濁液５０μＬを、所望濃度（０．５〜１６ｍｇ／ｍＬ）の精製した抗ＣＣＲ７  ｍＡｂまたはアイソタイプ対照（ＩＣ）と共に９６丸底ウェルプレートに載せた。３７℃で３０分インキュベートした後、細胞を遠心分離し、洗浄した。次いで、ＲＰＭＩ１６４０培地において２５％に希釈した乳児ウサギ補体（Serotec, Oxford, UK）を添加した。３７℃で１〜２時間後、フルオレセイン−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合抗ＣＤ１９、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合抗ＣＤ５  ｍＡｂおよび７−ＡＡＤで細胞を染色した。いずれの表面マーカーも、ＣＬＬ細胞、ＭＣＬ細胞およびＴ細胞集団のＦＣＭによる識別を可能とし、７−ＡＡＤは生存度排除色素（viability exclusion dye）として使用した。非生存細胞のパーセンテージは各集団において別個に測定し、熱により不活性化された補体による溶解のパーセンテージは式［１］による特異的溶解を計算するのに使用した。
【０１３３】
【数１】
2008545000.tif 000002
【０１３４】
抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）
軟膜から得られたＰＢＭＣからナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を単離した。ＰＥ結合抗ＣＤ５６  ｍＡｂで染色し、次いで抗ＰＥ結合マイクロビーズ（Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany）を用いた磁気細胞選別を行うことによって、ＮＫ細胞の正の選択を行った。ＦＣＭによって測定されたＮＫ細胞の純度は９５％〜９８％であった。（細胞溶解のエフェクタとして）ＮＫ細胞を用いてＣＬＬ細胞（標的細胞）のインキュベーションを４時間行った後、５〜４０の異なるエフェクタ−標的（Ｅ／Ｔ）比で、抗ＣＣＲ７  ｍＡｂまたはそのアイソタイプ対照の存在下または不存在下で、ＦＣＭにより抗ＣＣＲ７依存性細胞媒介性細胞障害作用を測定した。次いで、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ１９  ｍＡｂ、ＰＥ結合抗ＣＤ５６  ｍＡｂおよび７−ＡＡＤで細胞を染色することにより、ＣＬＬ細胞とエフェクタＮＫ細胞とを識別し、ＣＬＬ細胞の生存率を分析した。ＮＫ細胞を用いないでインキュベートしたＣＬＬ細胞を自然死の対照として使用し、特異的溶解をＣＤＣアッセイにおけるのと同様に計算した。
【０１３５】
走化性アッセイ
予め２μｇ／ｍＬの抗ＣＣＲ７  ｍＡｂとともに３０分間インキュベートしたＣＬＬおよびＭＣＬ細胞の、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１およびＣＸＣＬ１２（ＣＸＣＲ４のリガンド）に応答する走化性を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ細胞培養チャンバ（直径６．５ｍｍ、厚さ１０μｍ、孔径５μｍ（Coster, Cambridge, MA）内でアッセイした。走化性アッセイのために、０．５％ＢＳＡを含む１００μｌのＲＰＭＩ１６４０に懸濁された５ｘ１０５個の腫瘍細胞を、チャンバの上部区画に添加し、最適濃度（ＣＸＣＬ１２の場合は１００ｎｇ／ｍＬおよびＣＣｌ１９およびＣＣＬ１２の場合は１μｇ／ｍＬ）の同培地６００μｌ中のケモカインを下部ウェルに添加した。５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で４時間、遊走を進行させた。下部チャンバから遊走細胞を回収し、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ１９  ｍＡｂで染色し、Ｔｒｕｃｏｕｎｔチューブ（BD Biosciences）で流速を較正した後、６０秒間ＦＣＭによってカウントした。ゲートされたＢ細胞集団内で事象を分析し、当初の細胞懸濁液中でカウントされた細胞数と比較し、挿入パーセントを計算した（１００ｘ遊走細胞数／最初の懸濁液中でカウントされた細胞数）。各サンプルを２回測定した。
【０１３６】
アポトーシスおよび細胞周期分析
幾つかの実験では、抗ＣＣＲ７  ｍＡｂを、１０５個のＣＬＬ細胞を含む５０μＬの培養懸濁液で２μｇ／ｍＬに希釈した。他の実験では、抗ＣＣＲ７  ｍＡｂを、ＲＰＭＩ１６４０内で一晩インキュベートすることにより、９６平底ウェルプレートに付着させた。次いで、プレートを洗浄し、１０５個のＣＬＬ細胞を添加した。いずれの場合も、細胞を３７℃で最大４８時間インキュベートした。細胞を冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ１９  ｍＡｂで染色し、０．５ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、５ｍＬの氷冷７０％エタノールで希釈し、−２０℃で一晩固定した。翌日、固定した細胞を遠心分離し、洗浄し、２０μｇ／ｍＬの７−ＡＡＤで染色し、ＤＮＡ含有量を分析した。最低でも合計１０，０００事象を得て、Ｃｅｌｌ−Ｑｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェア（BD Biosciences）を用いて分析した。簡潔には、ＣＤ１９陽性事象をゲートし、７−ＡＡＤ蛍光のパルス面積およびパルス幅を用いてダブレットを破棄した。アポトーシスを起こした細胞としてのサブＧ１ピークのパーセンテージを７−ＡＡＤ蛍光ヒストグラムにおいて分析した。
【０１３７】
増殖アッセイ
ＰＢＭＣを健常なドナーから単離し、抗ＣＣＲ７  ｍＡｂおよびそれらの各アイソタイプ対照の両方で予めコーティングした９６ウェルプレート内で７２時間培養した。抗ＣＤ３およびＩＬ２などの陽性対照も含まれていた。全ての測定を３回行った。培養の最後の１６時間、ウェル毎に１μＣｉの［３Ｈ］−チミジン（Amersham Biosciences GmbH, Freiburg, Germany）で細胞を標識した。次いで、細胞を採取し、シンチレーションカウンティングに付した。
【０１３８】
統計分析
全ての統計試験を、ＳＰＳＳ  ８．０版で行った。ウィルコクソンの検定およびケンドールのＷノンパラメトリック検定を行い、大半のアッセイにおける様々な処理の結果と比較した。［３Ｈ］−チミジン増殖アッセイのために、ＡＮＯＶＡを行ってグループ間の比較を行った。ピアソン相関係数を計算して、ＣＣＲ７の平均蛍光強度（ＭＦＩ）と、ＣＤＣにおける溶解パーセンテージとの関連性を調べた。
【０１３９】
ＩＩ．結果
抗ＣＣＲ７  ｍＡｂはそれらの標的の内在化を誘発しない
治療ｍＡｂを非結合形態で使用するには、標的抗原が高密度であることだけでなく、補体を活性化するため、または細胞障害性細胞のＦｃ受容体に結合するために細胞表面上に抗原−抗体複合体が存在することが必要となる。即ち、抗原に対するｍＡｂの結合がその内在化を誘発しないことが重要である。その理由は、内在化がｍＡｂの治療効果を低下させる可能性があるからである。これに関し、幾つかのケモカイン受容体に結合する抗体が、受容体のエンドサイトーシスを引き起こし、次いで、抗体劣化後にそのタンパク分解または再発現を生じることが示唆されてきた。発明者らは、ｍＡｂがＣＣＲ７に結合することにより、ＣＬＬ細胞におけるその内在化が生じるかどうかを分析した。ＣＬＬ細胞表面上でのＣＣＲ７の発現は、正常なＢまたはＴ細胞におけるよりも、ＣＬＬ細胞において２〜４倍高く（図１Ａ）、最大６０分までの異なる時間、抗ＣＣＲ７  ｍＡｂとともにそれらをインキュベートした後には低下しなかった（図１Ｂ）。逆に、陽性対照としての役割を果たす１μｇ／ｍＬのＣＣＬ１９とのインキュベーションの最初の５分では約６０％低下した。
【０１４０】
抗ＣＣＲ７  ｍＡｂは、インビトロでのＣＬＬおよびＭＣＬ細胞の強力且つ特異的なＣＤＣを媒介する
補体タンパク質（ＣＤＣ）またはＮＫ細胞などのエフェクタ細胞（ＡＤＣＣ）のいずれかを採用することによって調節される細胞障害作用は、未結合の治療ｍＡｂによる腫瘍細胞のインビボでの排除を目的として提案された主たる作用機序である。故にＣＤＣを媒介する抗ＣＣＲ７  ｍＡｂの能力を、様々な患者からのＣＬＬおよびＭＣＬサンプルを用いて試験した。抗ＣＣＲ７  ＩｇＭ  ｍＡｂとともにプレインキュベートしたＣＬＬ細胞は、ウサギ補体での処理を１時間行った後に、非常に高い割合で死滅した（図２Ａ）。同様に、ＩｇＧアイソタイプの抗ＣＣＲ７  ｍＡｂは有意なＣＤＣを媒介した（図２Ｂ）。
【０１４１】
ＣＬＬと同様、ＭＣＬ細胞も有意なレベルのＣＣＲ７を発現し（図３Ａ）、ＣＤＣ実験では、抗ＣＣＲ７  ｍＡｂはいずれもＣＣＲ７陽性ＭＣＬ細胞を効果的に死滅させることが示された（図３Ｂ）。同アイソタイプの無関係な免疫グロブリンを用いた場合には有意なＣＤＣは観察されなかった（図２Ａ、図２Ｂおよび図３Ｂ）。
【０１４２】
ＣＤＣを生じさせる上でＩｇＧアイソタイプの抗ＣＣＲ７  ｍＡｂの効力が比較的低いにもかかわらず、動態アッセイは、その補体活性化能力が補体源とのインキュベーション時間を延長することによって著しく増大され得ることを示した（データは示さず）。これは、ＩｇＧ２ａアイソタイプのｍＡｂにより補体カスケードの活性化がより緩慢になることに起因し得る。
【０１４３】
ＣＣＲ７は、ＣＬＬまたはＭＣＬ細胞に限定されるものではなく、幾つかの正常なリンパ球サブポピュレーション（主にナイーブＢおよびＴリンパ球）によっても発現され、抗ＣＣＲ７  ｍＡｂにより媒介された細胞障害作用に影響を受ける可能性がある。興味深いことに、抗ＣＣＲ７  ｍＡｂによって媒介されたＣＤＣは、同じ患者からのＴ細胞におけるよりも、ＣＬＬ細胞において著しく高い（ＩｇＭおよびＩｇＧ  ｍＡｂそれぞれの場合、Ｐ＝０．００１およびＰ＝０．０１６）。同様に、健常なドナーからのＢおよびＴリンパ球は、上述したのと同じ実験状況下で、用量反応アッセイによってさらに実証されるように、抗ＣＣＲ７  ｍＡｂの両方をより高い用量で用いて処理した場合も、補体活性に対して耐性があった（図４Ａおよび図４Ｂ）。これは、おそらくはサンプルに存在するＣＬＬ細胞による補体消費が高く、且つ迅速であるので、ほとんど溶解されていないＣＬＬ患者からのＴ細胞の場合に特に当てはまった（図４Ａおよび図４Ｂ）。一方、抗ＣＣＲ７  ｍＡｂはいずれの濃度が１μｇ／ｍＬという低い値であっても、ＣＬＬ細胞のＣＤＣを媒介するには十分である（図４Ａおよび図４Ｂ）。
【０１４４】
考えられる理由は、正常なＴおよびＢリンパ球におけるＣＣＲ７の発現がＣＬＬ細胞におけるよりもはるかに低いので、ＣＤＣ活性に対する感受性が異なるということである（図１Ａ）。実際、ＣＬＬ細胞におけるＣＣＲ７の発現レベルは、異なるサンプルのＣＤＣに対する感受性と著しく（ｒ＝０．６０２、Ｐ＝０．０２５、ｎ＝１１）相関しており（図５）、免疫療法の標的を選択する上での抗原密度の重要性を裏付けている。
【０１４５】
更に、ＣＤＣ活性の差は、ＣＤ５５またはＣＤ５９などの補体調節タンパク質の発現差には関係していないようである。その理由は、それらの発現レベルは、様々なＣＬＬサンプル間で、およびこれら患者からのＣＬＬ細胞とＴリンパ球との間で非常に類似しているからである。
【０１４６】
ＣＬＬ細胞のインビトロＡＤＣＣ
治療ｍＡｂの有利な効果を媒介する他の主要な機構は、細胞により媒介される細胞障害作用（ＡＤＣＣ）である。故に、発明者らは抗ＣＣＲ７  ＩｇＧ  ｍＡｂで予め処理したＣＬＬ細胞の溶解を生じるＮＫ細胞の能力を試験した。Ｅ／Ｔ比を５〜４０として６つの実験を行ったが、同アイソタイプの無関係な免疫グロブリン（平均溶解＝１２％±５、ｎ＝６）と比較して、この抗ＣＣＲ７  ｍＡｂ（平均溶解＝１３％±１、ｎ＝６）の存在下では有意なＡＤＣＣは見られなかった（図６）。これはおそらく、ネズミｍＡｂに対するヒトＦｃ受容体の親和性が低いことに関連している。逆に、周知のキメラ型抗ＣＤ２０  ｍＡｂ（ＩｇＧ１アイソタイプ）であるリツキシマブは、平均溶解＝３４％±２（ｎ＝６）でＣＬＬ細胞に対するＡＤＣＣを媒介した（図６）。抗ＣＣＲ７  ＩｇＭ  ｍＡｂの存在下でのＡＤＣＣは試験しなかった。その理由は、このアイソタイプはこの種の細胞障害作用を媒介するには有効でないからである。
【０１４７】
抗ＣＣＲ７  ｍＡｂに応答するアポトーシスおよび増殖
増えつつある証拠によれば、治療ｍＡｂに対する有利な応答の実質部分は標的細胞の細胞周期または生存率に対する直接的な効果に起因することが示唆される。ＣＬＬ細胞のアポトーシスに対する抗ＣＣＲ７  ｍＡｂの効果は、細胞ＤＮＡの７−ＡＡＤ染色およびサブＧ１ピーク分析によって試験した。可溶性の抗ＣＣＲ７  ＩｇＭ  ｍＡｂで２４時間処理したＣＬＬ細胞のアポトーシス率は、ＩＣで処理したＣＬＬ細胞のアポトーシス（データ示さず）と実質的には変わらなかった。同様に、最大で４８時間の抗ＣＣＲ７  ｍＡｂのプレート結合によりＣＣＲ７を架橋してもアポトーシスは誘発されない（データ示さず）。
【０１４８】
抗ＣＣＲ７  ｍＡｂに応答する細胞増殖を調査するために、ＣＬＬ細胞が４８〜７２時間インキュベーションした後に高いアポトーシス自然発生率を呈する際、健常なドナーからのＰＢＭＣを用いて、伝統的な［３Ｈ］−チミジン取り込み増殖アッセイを行った。これらのアッセイから、ＩｇＭ  ＩＣで得られたものと実質的に変わらないＩｇＭアイソタイプの抗ＣＣＲ７  ｍＡｂとともにインキュベートした後、細胞内への［３Ｈ］−チミジンの取り込みは緩やかに増加することが明らかになった。逆に、ＩｇＧアイソタイプの抗ＣＣＲ７  ｍＡｂも、そのＩＣも増殖を誘発しなかった（図７）。陽性対照として、ＰＢＭＣは、抗ＣＤ３  ｍＡｂおよびＩＬ２によるインキュベーションに応答して増殖した。
【０１４９】
抗ＣＣＲ７  ｍＡｂによるＣＬＬおよびＭＣＬ細胞のインビトロ遊走の阻害
ＣＣＲ７は、ナイーブリンパ球および成熟樹状細胞の生理的ホーミングだけでなく、それを発現する腫瘍（ガン）細胞、特に、ＣＬＬおよびＭＣＬ細胞の転移性遊走においても主要な役割を果たす。このケモカイン受容体の機能を中和することは、これら疾患のリンパ組織への拡散を阻止するための、ＣＬＬおよびＭＣＬ患者における関心事項であり得る。これに関して、本発明者らは、ＣＣＬ１９またはＣＣＬ２１に応答したＣＬＬおよびＭＣＬ細胞のインビトロ遊走を中和する抗ＣＣＲ７  ｍＡｂの能力をアッセイした。ＩｇＧアイソタイプの抗ＣＣＲ７  ｍＡｂは、ＣＣＬ１９またはＣＣ２１へのこれらの細胞の遊走を阻止する上で非常に効果的であったが、一方、ＩｇＭアイソタイプの抗ＣＣＲ７  ｍＡｂはそれを僅かに低下させるのみであった（図８Ａ〜図８Ｂ）。
【０１５０】
これらのアッセイでは、ＣＸＣＬ１２（ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４のリガンド）に応答するＣＬＬ細胞の遊走は、使用した２種のｍＡｂのいずれによっても影響を受けなかった。
【０１５１】
ＩＩＩ．考察
本発明者らからの以前のデータによれば、Ｂ細胞リンパ球増殖性障害に関するケモカイン受容体ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ５の発現レベルは、組織学的サブタイプに応じてきわめて非相同的であり、リンパ節（ＬＮ）転移に大いに関与していることが示された。その理由は、これらの分子が、二次リンパ組織へのリンパ球の進入および位置決定を媒介するからである。ＣＣＲ７の発現はＣＬＬおよびマントル細胞リンパ腫において特に高く、これらの疾患がＬＮに侵入する傾向が高いことを説明している。同様に、最近の研究は、ホジキン病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫および菌状息肉腫などの他の血液悪性腫瘍、または乳ガン、非小細胞肺ガン、黒色腫、胃ガン、頭部および頸部の扁平上皮細胞ガン、または大腸ガンのような非血液固形組織のいずれかからの悪性細胞上でＣＣＲ７が発現することを報告している。興味深いことに、この発現は、全ての場合において、リンパ組織への遊走および転移の特徴的なパターンと相関している。
【０１５２】
これらのデータは、幾つかの悪性細胞においてＣＣＲ７の濃度が高いことに起因するだけでなく、疾患の進行におけるそれらの重大な役割および病原性にも起因して、免疫療法においてＣＣＲ７を治療標的として使用できる可能性を示唆している。
【０１５３】
ＣＤＣは、ＡＤＣＣの約１０倍以上の表面抗原濃度を必要とすると考えられているので、標的抗原が高度に発現される際の未結合の治療ｍＡｂの主要な作用機序として認められている。故に、本発明者らは、補体を固定し、且つＣＬＬ患者からのＣＬＬ細胞、ＭＣＬ細胞および正常なＴリンパ球に対する細胞障害作用を媒介する抗ＣＣＲ７  ｍＡｂの能力をアッセイした。それらの結果は、抗ＣＣＲ７  ｍＡｂおよび補体の濃度が飽和している条件下でさえ、Ｔ細胞をほとんど損傷することなく、補体の固定に起因して生じるＣＬＬおよびＭＣＬ細胞の溶解が重要であることを示した。これは、ＣＬＬ細胞と比較すると、正常なＴ細胞上でのＣＣＲ７発現がより低いことに起因する可能性がある。これに関して、本発明者らは、ＣＬＬ細胞表面上のＣＣＲ７密度と、同じ実験条件下で溶解した細胞のパーセンテージとの間には密接な相関関係がある（ｐ＝０．０２５、ｒ＝０．６０２）ことを見出した。重要なことに、これらの結果から、抗ＣＣＲ７  ｍＡｂでＣＬＬまたはＭＣＬを処理すると、ｍＡｂ濃度が低くても、当該分子（ＣＣＲ７）を発現する正常なリンパ球を溶解することなく、腫瘍細胞を効果的に排除し得ることが示唆される。ＣＣＲ７陰性のエフェクタリンパ球は損傷を受けていないので、抗ＣＣＲ７  ｍＡｂでの処理による続発性免疫不全は非常に重要であるという仮設を立てることが可能である。ＣＣＲ７欠失マウスを特徴付ける免疫不全から、抗ＣＣＲ７  ｍＡｂで治療したＣＬＬまたはＭＣＬ患者について推測するのは何にせよ困難である。その理由は、これら個々の患者が、ＣＣＲ７のノックアウトには存在しない免疫記憶を既に確立しているからである。
【０１５４】
ＣＤＣに関する知見とは異なり、試験したＩｇＧアイソタイプの抗ＣＣＲ７  ｍＡｂは、おそらくはそれがネズミ由来であるために、ＡＤＣＣの活性化因子ではなかった。にもかかわらず、分子工学技術によってキメラ抗体またはヒト化抗体の発現が可能となり、それにより単球、好中球およびＮＫ細胞のＦｃ受容体を介して細胞障害性を媒介するｍＡｂの能力などの臨床的特性が向上することは周知である。いずれの場合にせよ、悪性細胞の大増殖およびこれら患者のＴ細胞およびＮＫ細胞における機能不全のため、ＣＬＬに対する免疫療法におけるＡＤＣＣの重要性は目下検討中である。これに関し、最近では、健常なドナーまたはＣＬＬ患者からの細胞障害性リンパ球およびＮＫ細胞を増殖させるか、または活性化させて、治療ｍＡｂの作用機序を活用するための幾つかのプロトコルが発表されている。
【０１５５】
標的抗原の機能を阻止することは、治療ｍＡｂの別の作用機序である。本発明では、阻害性抗ＣＣＲ７  ｍＡｂは、リンパ系腫瘍およびそれを発現する非血液悪性腫瘍のリンパ節転移に関与する主要な分子の機能を阻害するという更なる利点を有し得る。この点に関して、リツキシマブもアレムツズマブ（alemtuzumab）も、ＣＬＬ患者のリンパ節症を低減する上であまり効果的でないことは周知である。
【０１５６】
これらの結果により、それら病変に対する新たな治療可能性が広がり、阻害性抗ＣＣＲ７  ｍＡｂによりＬＮへの遊走が低下するので、ＣＤＣまたはＡＤＣＣにより細胞を死滅させることに加えて、腫瘍の拡散が阻止される。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】図１（Ａ）は、ＣＣＲ７の表面発現が、正常なＢおよびＴリンパ球よりも、腫瘍ＣＬＬ細胞における方がより大きいことを示している。１１人のＣＬＬ患者と６人の健常なドナーからの抹消血サンプルをフローサイトメトリ（ＦＣＭ）によって分析し、様々なリンパ球集団および平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定されるそれらの相当するＣＣＲ７表面密度を識別した。棒は、平均±ＳＤを示している。図１（Ｂ）は、抗ＣＣＲ７  ｍＡｂが受容体のエンドサイトーシスを引き起こさないことを示している。ＣＬＬ患者者からの抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、使用した抗ＣＣＲ７  ｍＡｂ（２μｇ／ｍＬ）、ＩｇＭ  ｍＡｂ（クローン２Ｈ４）およびＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ（クローン１５０５０３）により、または陽性対照としてＣＣＲ７の生理的リガンドであるＣＣＬ１９（１μｇ／ｍＬ）により、３０秒から６０分までの様々な期間インキュベートした。次いで、ＣＣＲ７のＭＦＩを、電子的にゲートされたＣＤ１９＋ＣＤ５＋のＣＬＬ細胞内でＦＣＭにより測定した。線はＣＣＲ７の基準ＭＦＩに対するＣＣＲ７の発現を示している。代表的な事例が示されている。
【図２】図２は、抗ＣＣＲ７  ｍＡｂがいずれもＣＬＬ細胞の強力且つ特異的な補体依存性細胞溶解（ＣＤＣ）を媒介することを示している。ＣＬＬ患者からのＰＢＭＣを抗ＣＣＲ７  ｍＡｂまたはそれらの各アイソタイプ対照（ＩＣ）によりインキュベートし、次いでウサギ補体に１時間曝露した。電子的にゲートされたＣＬＬ細胞および正常なＴ細胞において、７−ＡＡＤの取り込みおよびＦＣＭ分析によって細胞溶解を測定した。棒は、１１事例の平均±ＳＤを示している。（Ａ）抗ＣＣＲ７  ＩｇＭ  ｍＡｂ（２μｇ／ｍＬ）、（Ｂ）抗ＣＣＲ７  ＩｇＧ  ｍＡｂ（２μｇ／ｍＬ）。
【図３】図３Ａは、フローサイトメトリによって測定された、代表的なマントル細胞リンパ腫細胞（ＭＣＬ）を伴う患者からの腫瘍細胞におけるＣＣＲ７の表面発現（黒線）を示しており、対応するＩＣ（灰色線）も含まれている。図３Ｂは、抗ＣＣＲ７  ｍＡｂまたはそれらの各ＩＣの存在下でのＭＣＬ細胞のＣＤＣを示している。４事例の平均±ＳＤを示している。
【図４】図４は、ＣＤＣに関する用量反応曲線を記載している。ＣＬＬ患者（ｎ＝５）および健常なドナー（ｎ＝２）からのＰＢＭＣを用いたＣＤＣアッセイを、０．５μｇ／ｍＬ〜１６μｇ／ｍＬの抗ＣＣＲ７  ｍＡｂ濃度で行った。ＣＤＣによる細胞溶解のパーセンテージを、電子的にゲートされたＣＬＬ細胞、ＣＬＬ患者からのＴリンパ球、および健常なドナーからの正常なＢおよびＴ細胞において、７−ＡＡＤの取り込みおよびＦＣＭ分析により測定した。線は、細胞溶解の平均を示している。（Ａ）抗ＣＣＲ７  ＩｇＭ  ｍＡｂ、（Ｂ）抗ＣＣＲ７  ＩｇＧ  ｍＡｂ。
【図５】図５は、ＣＤＣ能力がＣＣＲ７発現レベルと相関することを示している。ウサギ補体によるインキュベーションを１時間行った後、ＣＬＬ細胞のＣＣＲ７表面密度は、２μｇ／ｍＬの抗ＣＣＲ７  ＩｇＭ  ｍＡｂにより媒介されたＣＤＣによる溶解のパーセンテージと相関した（ｒ＝０．６０２、Ｐ＝０．０２５、ｎ＝１１）ことを示している。
【図６】図６は、ネズミ抗ＣＣＲ７  ＩｇＧ  ｍＡｂがＣＬＬ細胞のＡＤＣＣを媒介しないことを示している。抗ＣＣＲ７  ＩｇＧ  ｍＡｂ（２μｇ／ｍＬ）、ＩＣまたはリツキシマブ（陽性対照として）で予めインキュベートしたＣＬＬ細胞を、ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に４時間曝露した。次いで、電子的にゲートされたＣＬＬ細胞において、死んだ細胞を７−ＡＡＤ取り込みおよびＦＣＭ分析によって測定した。棒線は、６回の実験の平均±ＳＤを示している。
【図７】図７は、抗ＣＣＲ７  ｍＡｂがリンパ球の増殖を誘発しないことを示している。健常なドナーからのＰＢＭＣを、抗ＣＣＲ７  ｍＡｂ、ＩＣ、抗ＣＤ−３  ｍＡｂおよびＩＬ２または培地のみを用いて７２時間培養した。培養の最後の１６時間におけるＤＮＡ合成を、［３Ｈ］−チミジン取り込みにより測定した。棒は、３回行った６事例の平均±ＳＤを示している。
【図８】図８は、抗ＣＣＲ７  ｍＡｂが、ＣＣＬ１９またはＣＣＬ２１に応答したＣＬＬおよびＭＣＬ細胞の遊走を阻止することを示している。２μｇ／ｍＬの抗ＣＣＲ７  ＩｇＧ（黒棒）、ＩｇＭ（灰色棒）ｍＡｂを用いて、またはｍＡｂを用いないで（白棒）、細胞のプレインキュベーションを３０分間行った後、「方法」の章に記載するように走化性アッセイを行った。（Ａ）ＣＣＬ１９（１μｇ／ｍＬ）に応答したＣＬＬ細胞の遊走を、抗ＣＣＲ７  ｍＡｂによる影響を受けなかった基準の遊走およびケモカイン受容体ＣＸＣＲ４のリガンドであるＣＸＣＬ１２（１００μｇ／ｍＬ）の存在下での遊走と比較した。代表的な事例が示されている。（Ｂ）いずれもＣＣＲ７のリガンドであるＣＣＬ１９（１μｇ／ｍＬ）およびＣＣＬ２１（１μｇ／ｍＬ）に応答したＭＣＬ細胞の遊走を、基準の遊走と比較した。代表的な事例が示されている。
【図１】
2008545000.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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