(57)【要約】  本発明は、腫瘍を有するまたは腫瘍を有すると疑われる哺乳動物を、ｅｒｂＢ受容体への薬剤を用いての治療に関して選択する方法であって、当該哺乳動物由来の生物学的サンプルを、本明細書に定義したような表１または２に列記した遺伝子のいずれか１つの発現について検査して、それによりｅｒｂＢ受容体への薬剤に対する応答の可能性が高いことを予測することを包含する前記方法に関する。好ましい遺伝子は、ＮＥＳ、ＧＳＰＴ２、ＥＴＲ１０１、ＴＡＺ、ＣＨＳＴ７、ＤＮＡＪＣ３、ＮＰＡＳ２、ＰＩＮ１、ＴＣＥＡ２、ＶＡＭＰ４、ＤＡＰＫ１、ＤＡＰＫ２、ＭＬＬＴ３、ＴＮＮＣ１、ＫＩＡＡ０９３１、ＡＣＯＸ２、ＥＭＰ１、ＳＬＣ２０Ａ１、ＳＰＲＹ２、またはＰＧＭ１のいずれか１つを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍を有するまたは腫瘍を有すると疑われる哺乳動物を、ｅｒｂＢ受容体への薬剤による治療に関して選択する方法であって、当該哺乳動物由来の生物学的サンプルを、表１に列記した遺伝子のいずれか１つまたはＤＡＰＫ２の発現について検査して、それによりｅｒｂＢ受容体への薬剤に対する応答の可能性が高いことを予測することを包含する、前記方法。
【請求項２】
哺乳動物由来の生物学的サンプルを、ＮＰＡＳ２、ＮＥＳ、ＣＨＳＴ７、ＤＡＰＫ１、ＡＣＯＸ２、ＧＳＰＴ２、ＴＮＮＣ１、またはＤＡＰＫ２のいずれか１つの発現について検査することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳動物由来の生物学的サンプルを、ＮＰＡＳ２、ＮＥＳ、ＣＨＳＴ７、またはＤＡＰＫ１のいずれか１つの発現について検査することを包含する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
哺乳動物由来の生物学的サンプルを、ＮＰＡＳ２、ＮＥＳ、ＣＨＳＴ７、またはＤＡＰＫ１の少なくとも２つの発現について検査することを包含する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物由来の生物学的サンプルを、ＮＰＡＳ２、ＮＥＳ、ＣＨＳＴ７、またはＤＡＰＫ１の少なくとも３つの発現について検査することを包含する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
哺乳動物由来の生物学的サンプルを、ＮＰＡＳ２、ＮＥＳ、ＣＨＳＴ７、およびＤＡＰＫ１の発現について検査することを包含する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
哺乳動物由来の生物学的サンプルを、本明細書において定義するような表２に列記したいずれかの遺伝子の発現について検査することを包含する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物由来の生物学的サンプルを、ＥＭＰ１、ＳＬＣ２０Ａ１、ＳＰＲＹ２またはＰＧＭ１のいずれか１つの発現について検査することを包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物由来の生物学的サンプルを、ＥＭＰ１の発現について検査することを包含する、請求項７〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
腫瘍が、白血病、多発性骨髄腫、リンパ腫、胆管、骨、膀胱、脳、ＣＮＳ、神経膠芽腫、乳腺、結腸直腸、子宮頚部、子宮内膜、胃、頭部、頚部、肝臓、肺、筋肉、神経、食道、卵巣、膵臓、胸膜、腹膜、前立腺、腎臓、皮膚、精巣、甲状腺、子宮および外陰部から成る群より選択される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
腫瘍が、非小細胞肺、膵臓、頭部または頚部の１つより選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ｅｒｂＢ受容体への薬剤が、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ＰＫＩ−１６６、ＥＫＢ−５６９、ＨＫＩ−２７２、ラパチニブ、カネルチニブ、ＡＥＥ７８８、ＸＬ６４７、ＢＭＳ ５５９９６２６、セツキシマブ、マツズマブ、パニツムマブ、ＭＲ１−１、ＩＭＣ−１１Ｆ８、またはＥＧＦＲＬ１１のいずれか１つより選択される、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ｅｒｂＢ受容体への薬剤がゲフィチニブである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物がヒトであり、そしてその場合当該方法が、ヒト由来の生物学的サンプルをＤＡＰＫ１の増大した発現、およびＮＰＡＳ２、ＮＥＳ、ＣＨＳＴ７およびＥＭＰ１の減少した発現について検査して、それによりゲフィチニブに対する応答の可能性が高いことを予測することを包含する、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍の遺伝子発現プロフィールから予測することができる治療薬に対する腫瘍の感受性、そしてそのため、そのような治療薬を用いての治療に関する癌患者の適性を、腫瘍組織の特定の遺伝子の相対的発現レベルを測定することにより決定することができることに関する。
【背景技術】
【０００２】
チロシン残基でのタンパク質のリン酸化は、細胞内のシグナル伝達の鍵となる要素である。そのような反応を触媒することのできる酵素をチロシンキナーゼという。これらの酵素のいくつかは、膜貫通受容体分子の構成要素として存在し、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）として分類される。ＲＴＫのこのファミリーには数種のメンバーがあり、それらのクラスＩは、ｅｒｂＢファミリー、例えば上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ３およびｅｒｂＢ４を含む。細胞外領域への多様なリガンドの結合は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ領域を活性化する。この活性化は、ＥＧＦＲそのものおよびいくつかの細胞の基質が、チロシン残基でリン酸化されるようになる要因となる。これらのリン酸化反応は、細胞の増殖が惹起される増殖因子の主要な要素である。
【０００３】
受容体チロシンキナーゼのｅｒｂＢファミリーは、腫瘍細胞の増殖および生存の推進にしばしば関与することが知られている（Olayioye et al., EMBO J., 2000, 19, 3159にまとめられている）。この関与が起こりうる１つのメカニズムは、例えば遺伝子の増幅の結果としてのタンパク質レベルでの受容体の過剰発現である。このような状態は多くの一般的なヒトの癌（Klapper et al., Adv. Cancer Res., 2000, 77, 25にまとめられている）、例えば腺癌を含む非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（Cerny et al., Brit. J. Cancer, 1986, 54, 265; Reubi etal., Int. J. Cancer, 1990, 45, 269; Rusch et al., Cancer Research, 1993, 53, 2379; Brabender et al, Clin. Cancer Res., 2001, 7, 1850）、ならびに肺のその他の癌（Hendler et al., Cancer Cells, 1989, 7, 347）において観察されている。
【０００４】
レトロウイルスを介しての細胞の形質転換の研究が、悪性の形質転換への我々の理解に大変革を起こし始めて以来、今日数十年を経る。形質転換は、ウイルスによりもたらされた発癌遺伝子に依存することが示され、これらは、哺乳類の細胞の対応物である癌原遺伝子を有することが示された。１９８４年にＥＧＦＲは、レトロウイルスの発癌遺伝子であるｖ−ｅｒｂＢの哺乳類の対応物として記載された（Downward et al)。このことは、ＥＧＦリガンドおよびその受容体であるＥＧＦＲから成る、癌細胞における２つの成分のオートクリン増殖促進メカニズムについて記述するより早期の観察結果とカップルし、ＥＧＦＲのシグナル伝達が腫瘍産生への重要な寄与因子であるという仮説を強化した。その後の報告は、ＥＧＦＲが癌における治療介入のための魅力的な標的であるというエビデンスを、継続して提供してきた（まとめとしてYarden & Sliwkowskiを参照のこと）。ＥＧＦＲは広く多様な上皮癌にわたり顕著に過剰発現されており（Salomon et alを参照のこと）、いくつかの免疫化学的研究は、ＥＧＦＲの発現が予後不良を伴うことを示した。過剰発現に加えて、ｉ）ＥＧＦＲの変異、ｉｉ）リガンドの増大した発現および増強されたオートクリンのループ、ならびにｉｉｉ）他のｅｒｂＢ受容体ファミリーのメンバーとのヘテロダイマー化およびクロストークを含むいくつかの代替メカニズムを介しての、腫瘍において制御の効かないＥＧＦＲのシグナル伝達の可能性があると認識されている。
【０００５】
加えて前臨床の情報の豊富な蓄積は、受容体チロシンキナーゼのｅｒｂＢファミリーが細胞の形質転換に関与することを示唆する。これに加えていくつかの前臨床研究は、小分子の阻害薬、優位抑制型または阻害性の抗体により、１つまたはそれより多くのｅｒｂＢ活性をノックアウトすることにより、抗増殖効果を惹起することができることを示した（Mendelsohn et al., Oncogene, 2000, 19, 6550にまとめられている）。
【０００６】
このようにこれらの受容体チロシンキナーゼの阻害薬は、哺乳類の癌細胞の選択的阻害薬としての価値があるはずであると認識されてきた（Yaish et al. Science, 1988, 242, 933, Kolibaba et al, Biochimica et Biophysica Acta, 1997, 133, F217-F248; Al-Obeidi et al, 2000, Oncogene, 19, 5690-5701; Mendelsohn et al, 2000, Oncogene, 19, 6550-6565）。
【０００７】
受容体チロシンキナーゼのｅｒｂＢファミリーのいくつかの小分子阻害薬は、特にＥＧＦ受容体およびｅｒｂＢ２受容体のチロシンキナーゼの阻害薬であることが知られている。例えば欧州特許出願第０５６６２２６号、ならびに国際特許出願ＷＯ  ９６/３３９８０およびＷＯ  ９７/３００３４は、アニリノ置換基を４位に有するある種のキナゾリン誘導体がＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害活性を有し、そして癌組織の阻害薬であることを開示している。
【０００８】
J R Woodburn らのProc. Amer. Assoc. Cancer Research, 1997, 38, 633 およびPharmacol. Ther., 1999, 82, 241-250 により、化合物  Ｎ−(３−クロロ−４−フルオロフェニル)−７−メトキシ−６−(３−モルホリノプロポキシ)キナゾリン−４−アミンが強力なＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬であることが開示された。この化合物はまたイレッサ（登録された商標名）、ゲフィチニブ（米国一般名）として、コード番号ＺＤ１８３９およびケミカルアブストラクト番号１８４４７５−３５−２により知られている。この化合物は本明細書において以下、主にゲフィチニブとして同定する。
【０００９】
ゲフィチニブは、上皮増殖因子受容体−チロシンキナーゼ（ＥＧＦＲ−ＴＫ）の阻害薬として開発され、癌細胞の増殖、浸潤、および生存の推進の原因であるシグナル伝達経路を遮断する（Wakeling, A.E., et al. Cancer Res, 2002, 62(20), p5749）。ゲフィチニブはＥＧＦＲの小分子阻害薬との臨床的に確認された。プラチナを基本とする化学療法に応答しなかった進行ＮＳＣＬＣの患者に行った臨床試験において、強力な抗腫瘍効果、ならびにＮＳＣＬＣに関連する症状およびクオリティーオブライフにおける急速な改善が観察された。第ＩＩ相の‘ＩＤＥＡＬ’の試みは、単剤のゲフィチニブが、進行ＮＳＣＬＣの、細胞傷害性化学療法で先に治療を行った患者において、目的の抗腫瘍活性、症状の改善および限定された毒性との結果を得られたことを示した（Fukuoka et al., Kris et al）。目的の応答比率（完全応答＋部分応答）は、ＩＤＥＡＬ１およびＩＤＥＡＬ２の試みにおいて各々１８．４％および１１．８％であった。これらの臨床的試みにおける応答の差異は、２つの試みにおける異なる母集団群、すなわちＩＤＥＡＬ１では主に日本人、そしてＩＤＥＡＬ２では主にヨーロッパ由来の母集団であることに起因するものであった。目的の応答を上回ってさらなる患者が、患者全体のほぼ５０％がゲフィチニブからの利益を得られたことを意味する、疾患の進行停止および/または症状の改善を経験した。この腫瘍の応答データが、いくつかの市場における進行ＮＳＣＬＣでのゲフィチニブの最初の規制当局の認可の基本となってきた。
【００１０】
抗癌治療薬、例えばゲフィチニブに対する応答の基本を理解することができることは、このことから、可能であればゲフィチニブ治療から最も利益を得られる可能性のある患者を同定するための診断テストの開発を介して、臨床医が各患者に関する利益/リスク比を最大にすることが可能になるため、重要である。ゲフィチニブに対する応答の明白な候補マーカーは、ＥＧＦＲ発現レベルであった。しかしいくつかの癌由来細胞株および腫瘍の異種移植の成長のゲフィチニブによる阻害は、ＥＧＦＲの発現レベルに十分に相関してはいない。さらにＩＤＥＡＬの試みに平行しての試験は、ＩＨＣにより測定した場合のＥＧＦＲタンパク質の発現がゲフィチニブに対する応答の正確な予測因子ではないことを示した（Bailey et al）。今日、遺伝学、ゲノミクス、プロテオミクス、生化学およびその他の研究に基づいたいくつかのさらなる仮説があるが、規制当局により現在認可されているゲフィチニブへの応答の治療前予測バイオマーカーはまだない。ゲフィチニブへの応答を理解する上でおそらく最も有意な最近のブレイクスルーは、ＥＧＦＲキナーゼ領域の変異がＮＳＣＬＣ患者におけるゲフィチニブ過敏症を予測することを示す、最近のデータ（(Lynch et al, Paez et al）による。過敏症はあいまいな用語であるが、本分野においては一般に、目的の腫瘍の応答を経験する患者（すなわち顕著な腫瘍の緩解、通常約５０％）を意味することと理解されている。ゲフィチニブに関する作用のＥＧＦＲのメカニズムを実証すると同様に、このデータは他の疾患の状態への挑戦、例えばＮＳＣＬＣ患者およびＥＧＦＲ変異を有する他のタイプの癌の標的亜集団における、ＥＧＦＲ阻害薬を用いての１次（治療）、アジュバント（治療）、およびおそらくより早期の癌への介入、の基礎を提供すると思われる。
【００１１】
しかし、変異ＥＧＦＲを保有する腫瘍サブグループにゲフィチニブの処方を限定することは、ゲフィチニブからの利益を得ることができるであろう多くの患者からその利益を奪ってしまう可能性がある。第一に、その腫瘍中に検出可能なＥＧＦＲ変異のないゲフィチニブ過敏症の患者、およびゲフィチニブに応答しないＥＧＦＲ変異を有するその他の患者について報告が挙げられてきている。第二に、ＡＳＣＯ２００４（Shepherd et al）に報告されたデータは、ＥＧＦＲの小分子チロシンキナーゼ阻害薬であるエルロチニブ（Roche, Genentech, OSI）が、先に化学療法にて治療した進行ＮＳＣＬＣにおいて、母集団全体で〜２ヶ月まで生存を延長し、１年での死亡リスクの４１％低減に至ったことを示した。最も興味深いことに、それが認められる生存の利益は、疾患の進行停止の応答母集団中の患者、ならびに過敏症の患者に由来する。このことは、ＥＧＦＲ変異を保有する患者という枠を超えて、ゲフィチニブに応答する可能性のある患者を同定することが重要であるという可能性を強調する。決定的な生存の利益はまた、現在行われているゲフィチニブを用いての臨床の試みからも実証されそうである。
【発明の開示】
【００１２】
化学療法の治療に対する患者の異なる応答は、特定の患者にどの治療レジメンが最も適するかを予測する方法を見出す必要があることを示している。
多数の薬剤に対する患者の応答は、患者の遺伝学、ゲノミクス、プロテオミクス、生化学、または（発現）プロフィールに関連すると思われ、そして例えば特定の薬剤への応答に影響を及ぼす遺伝的因子の決定を使用して、個別化した治療レジメンを患者に提供することができることを示唆する、増加する一連のエビデンスがある。そのような個別化した治療レジメンは、患者への治療の利益を最大とする可能性を提供し、一方では代替のそしてより有効でない治療レジメンに伴うと思われる例えば副作用を最小とする。
【００１３】
したがって、患者が治療に応答する、または治療に耐性がある可能性があるかどうかを示す検査の結果に基づいて、ある薬剤に対する患者の応答を予測することのできる方法が必要である。
【００１４】
本発明は、治療物質に対する腫瘍の感受性を、腫瘍の遺伝子発現プロフィールから予測することができ、それ故にそのような治療物質を用いての治療に関する腫瘍患者の適性を、腫瘍組織中の特定の遺伝子の相対的発現レベルを測定することにより決定することができるという発見に基づく。
【００１５】
本発明の１つの側面に従って、腫瘍を有するまたは腫瘍を有すると疑われる哺乳動物を、ｅｒｂＢ受容体への薬剤を用いての治療に関して選択する方法であって、当該哺乳動物由来の生物学的サンプルを、本明細書において定義したような表１に列記した遺伝子のいずれか１つの発現について検査して、それによりｅｒｂＢ受容体への薬剤に対する反応の可能性が高いことを予測することを包含する、前記方法を提供する。
【００１６】
本発明のもう１つの側面に従って、腫瘍を有するまたは腫瘍を有すると疑われる哺乳動物を、ｅｒｂＢ受容体への薬剤を用いての治療に関して選択する方法であって、当該哺乳動物由来の生物学的サンプルを、表１に列記した遺伝子のいずれか１つまたはＤＡＰＫ２の発現について検査して、それによりｅｒｂＢ受容体への薬剤に対する応答の可能性が高いことを予測することを包含する、前記方法を提供する。
【００１７】
１つの態様において当該方法は、哺乳動物由来の生物学的サンプルを、ＡＣＯＸ２、ＮＰＡＳ２、ＮＥＳ、ＣＨＳＴ７、ＧＳＰＴ２、ＤＡＰＫ１、ＤＡＰＫ２、またはＴＮＮＣ１のいずれか１つの発現について検査することを包含する。より好ましくは当該方法は、哺乳動物由来の生物学的サンプルを、ＮＰＡＳ２、ＮＥＳ、ＣＨＳＴ７、またはＤＡＰＫ１のいずれか１つの発現について検査することを包含する。より好ましくは当該方法は、哺乳動物由来の生物学的サンプルを、ＮＰＡＳ２、ＮＥＳ、ＣＨＳＴ７、またはＤＡＰＫ１の少なくとも２つの発現について検査することを包含する。より好ましくは当該方法は、哺乳動物由来の生物学的サンプルを、ＮＰＡＳ２、ＮＥＳ、ＣＨＳＴ７、またはＤＡＰＫ１の少なくとも３つの発現について検査することを包含する。なおより好ましくは当該方法は、哺乳動物由来の生物学的サンプルを、ＮＰＡＳ２、ＮＥＳ、ＣＨＳＴ７、およびＤＡＰＫ１の発現について検査することを包含する。
【００１８】
代わりの態様において当該方法は、哺乳動物由来の生物学的サンプルを、ＮＥＳ、ＧＳＰＴ２、ＥＴＲ１０１、ＴＡＺ、ＣＨＳＴ７、ＤＮＡＪＣ３、ＮＰＡＳ２、ＰＩＮ１、ＴＣＥＡ２、ＶＡＭＰ４、ＤＡＰＫ１、ＤＡＰＫ２、ＭＬＬＴ３、ＴＮＮＣ１、またはＫＩＡＡ０９３１のいずれか１つの発現について検査することを包含する。より好ましくは当該方法は、哺乳動物由来の生物学的サンプルを、ＤＡＰＫ１、ＤＡＰＫ２またはＮＥＳのいずれか１つの発現について検査することを包含する。より好ましくは当該方法は、哺乳動物由来の生物学的サンプルを、ＤＡＰＫ１、ＤＡＰＫ２またはＮＥＳの少なくとも２つの発現について検査することを包含する。より好ましくは当該方法は、哺乳動物由来の生物学的サンプルを、ＤＡＰＫ１、ＤＡＰＫ２およびＮＥＳの発現について検査することを包含する。
【００１９】
好ましい態様において当該方法は加えて、哺乳動物由来の生物学的サンプルを、本明細書において定義したような表２に列記したいずれかの遺伝子の発現について検査することを包含する。より好ましくは当該方法は、哺乳動物由来の生物学的サンプルを、ＥＭＰ１、ＳＬＣ２０Ａ１、ＳＰＲＹ２またはＰＧＭ１の発現について検査することを包含する。より好ましくは当該方法は、哺乳動物由来の生物学的サンプルを、ＥＭＰ１の発現について検査することを包含する。
【００２０】
代わりの好ましい態様において当該方法は加えて、哺乳動物由来の生物学的サンプルを、本明細書において定義したような表２に列記したいずれかの遺伝子の発現について検査することを包含する。より好ましくは当該方法は、哺乳動物由来の生物学的サンプルを、ＥＭＰ１、ＨＣＡ１２７、ＵＢＬ５、ＺＮＦ２３、ＵＲＯＤ、ＣＤ４４、ＳＰＲＹ１、ＲＡＰＧＥＦ２、ＳＬＣ２０Ａ１、ＮＲＰ１、ＰＧＭ１、ＳＰＲＹ２、ＰＴＧＥＲ３、ＳＣＮ１０Ａ、ＫＩＴＬＧ、ＣＤＨ１、ＨＯＰ、ＢＣＬ３、またはＯＬＦＭ１の発現について、検査することを包含する。より好ましくは当該方法は、哺乳動物由来の生物学的サンプルをＥＭＰ１の発現について検査することを包含する。
【００２１】
好ましくは腫瘍は、白血病、多発性骨髄腫、リンパ腫、胆管、骨、膀胱、脳、ＣＮＳ、神経膠芽腫、乳腺、結腸直腸、子宮頚部、子宮内膜、胃、頭部、頚部、肝臓、肺、筋肉、神経、食道、卵巣、膵臓、胸膜、腹膜、前立腺、腎臓、皮膚、精巣、甲状腺、子宮および外陰部から成る群より選択される。より好ましくは腫瘍は、非小細胞肺、膵臓、頭部または頚部の１つより選択される。より好ましくは腫瘍は、非小細胞肺、頭部または頚部の１つより選択される。
【００２２】
好ましくはｅｒｂＢ受容体への薬剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ＰＫＩ−１６６、ＥＫＢ−５６９、ＨＫＩ−２７２、ラパチニブ、カネルチニブ(canertinib)、ＡＥＥ７８８、ＸＬ６４７、ＢＭＳ ５５９９６２６、セツキシマブ、マツズマブ、パニツムマブ、ＭＲ１−１、ＩＭＣ−１１Ｆ８、またはＥＧＦＲＬ１１のいずれか１つより選択される。最も好ましくはｅｒｂＢ受容体への薬剤は、ゲフィチニブである。
【００２３】
本発明の方法のさらに好ましい態様において、哺乳動物はヒトであり、そして当該方法はヒト由来の生物学的サンプルを、ＤＡＰＫ１の増大した発現、およびＮＰＡＳ２、ＮＥＳ、ＣＨＳＴ７またはＥＭＰ１の減少した発現について検査して、それによりゲフィチニブに対する応答の可能性が高いことを予測することを包含する。本発明の方法の代わりの好ましい態様において、哺乳動物はヒトであり、そして当該方法はヒト由来の生物学的サンプルを、ＤＡＰＫ１およびＤＡＰＫ２の増加した発現、ならびにＮＥＳおよびＥＭＰ１の減少した発現について検査して、それによりゲフィチニブに対する応答の可能性が高いことを予測することを包含する。
【００２４】
本発明のもう１つの側面に従って、ｅｒｂＢ受容体への薬剤に対して感受性である腫瘍細胞および耐性である腫瘍細胞間で、異なる発現を有するものとして同定されたマーカー遺伝子の単離した１セットを提供し、その場合前記遺伝子セットは、少なくとも本明細書において定義した表１に列記された遺伝子またはＤＡＰＫ２（前記遺伝子由来の遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを含む）から成る群より選択される、１つまたはそれより多くの遺伝子を包含する。好ましくは当該セットは、少なくとも２つの遺伝子、より好ましくは少なくとも３つの遺伝子、より好ましくは少なくとも４つの遺伝子を包含する。より好ましくは当該セットは、本明細書において定義したような表２より選択される少なくとも１つの遺伝子を包含する。
【００２５】
本発明のもう１つの側面に従って、ｅｒｂＢ受容体への薬剤に対して感受性である腫瘍細胞および耐性である腫瘍細胞間で、異なる発現を有するものとして同定されたマーカー遺伝子の単離した１セットを提供し、その場合前記遺伝子セットは、少なくとも本明細書において定義した表１に列記した遺伝子（前記遺伝子由来の遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを含む）から成る群より選択される、１つまたはそれより多くの遺伝子を包含する。好ましくは当該セットは、少なくとも２つの遺伝子、より好ましくは少なくとも３つの遺伝子を包含する。より好ましくは当該セットは、本明細書において定義したような表２より選択される少なくとも１つの遺伝子を包含する。
【００２６】
本発明は、ｅｒｂＢ受容体への薬剤に対する応答の可能性が高いことを予測する手段として、ｅｒｂＢ受容体への薬剤を用いての治療に関して、腫瘍を有するまたは腫瘍を有することが疑われる患者の改善された選択を可能にする。
【００２７】
１つの態様において当該方法は、哺乳動物由来の生物学的サンプルを、感受性細胞においてより低レベルで見出される表１からの以下の遺伝子、すなわちＮＰＡＳ２、ＮＥＳ、ＣＨＳＴ７、ＡＣＯＸ２もしくはＧＳＰＴ２の少なくとも１つもしくはそれより多くの発現について、または感受性細胞においてより高レベルで見出される以下の遺伝子、すなわちＤＡＰＫ１もしくはＴＮＮＣ１の少なくとも１つもしくはそれより多くの発現について検査することを包含する。これらの遺伝子に関するAffymetrix IDおよびAffymetrixプローブの配列を表１に示す。好ましい態様において当該方法はさらに、哺乳動物由来の生物学的サンプルを、感受性細胞においてより高いレベルで見出されるＤＡＰＫ２の発現について検査し、それによりｅｒｂＢ受容体への薬剤に対する応答の可能性が高いことを予測することを包含する。
【００２８】
代わりの態様において当該方法は、哺乳動物由来の生物学的サンプルを、感受性細胞においてより低レベルで見出される表１からの以下の遺伝子、すなわちＮＥＳ、ＧＳＰＴ２、ＥＴＲ１０１、ＴＡＺ、ＣＨＳＴ７、ＤＮＡＪＣ３、ＮＰＡＳ２、ＰＩＮ１、ＴＣＥＡ２もしくはＶＡＭＰ４の少なくとも１つもしくはそれより多くの発現について、または感受性の細胞においてより高レベルで見出される以下の遺伝子、すなわちＤＡＰＫ１、ＤＡＰＫ２、ＭＬＬＴ３、ＴＮＮＣ１もしくはＫＩＡＡ０９３１の少なくとも１つもしくはそれより多くの発現について検査することを包含する。これらの遺伝子に関するAffymetrix IDおよびAffymetrixプローブの配列を表１に示す。
【００２９】
好ましい態様において当該方法はさらに、哺乳動物由来の生物学的サンプルを表２に列記した遺伝子のいずれか１つの発現について検査して、それによりｅｒｂＢ受容体への薬剤に対する応答の可能性が高いことを予測することを包含する。好ましい態様において当該方法は、哺乳動物由来の生物学的サンプルを、感受性細胞においてより低レベルで見出される表２に列記した以下の遺伝子、すなわちＥＭＰ１、ＳＬＣ２０Ａ１、ＳＰＲＹ２またはＰＧＭ１のいずれか１つの発現について検査し、それによりそれによりｅｒｂＢ受容体への薬剤に対する応答の可能性が高いことを予測することを包含する。より好ましくは当該方法は、哺乳動物由来の生物学的サンプルをＥＭＰ１の発現について検査することを包含する。
【００３０】
代わりの好ましい態様において当該方法はさらに、哺乳動物由来の生物学的サンプルを、表２に列記した遺伝子のいずれか１つの発現について検査し、それによりｅｒｂＢ受容体への薬剤に対する応答の可能性が高いことを予測することを包含する。好ましい態様において当該方法は、哺乳動物由来の生物学的サンプルを、感受性細胞においてより低レベルで見出される表２に列記した以下の遺伝子、すなわちＥＭＰ１、ＨＣＡ１２７、ＵＢＬ５、ＺＮＦ２３、ＵＲＯＤ、ＣＤ４４、ＳＰＲＹ１、ＲＡＰＧＥＦ２、ＳＬＣ２０Ａ１、ＮＲＰ１、ＰＧＭ１もしくはＳＰＲＹ２のいずれか１つの発現について、または感受性細胞においてより高レベルで見出される以下の遺伝子、ＰＴＧＥＲ３、ＳＣＮ１０Ａ、ＫＩＴＬＧ、ＣＤＨ１、ＨＯＰ、ＢＣＬ３もしくはＯＬＦＭ１の少なくとも１つもしくはそれより多くの発現について検査し、それによりそれによりｅｒｂＢ受容体への薬剤に対する応答の可能性が高いことを予測することを包含する。より好ましくは当該方法は、哺乳動物由来の生物学的サンプルをＥＭＰ１の発現について検査することを包含する。
【００３１】
特に好ましい態様において当該方法は、哺乳動物由来の生物学的サンプルを、ＮＰＡＳ２、ＮＥＳ、ＣＨＳＴ７、ＤＡＰＫ１およびＥＭＰ１の発現について検査することを包含する。ＮＰＡＳ２、ＮＥＳ、ＣＨＳＴ７およびＥＭＰ１の高いレベルはゲフィチニブへの耐性に伴い、そしてＤＡＰＫ１の高いレベルは、ゲフィチニブへの感受性に伴う。好ましくは発現の評価は、ＤＡＰＫ１レベルが増大されているかどうか、そしてＮＰＡＳ２、ＮＥＳ、ＣＨＳＴ７およびＥＭＰ１のレベルが低減されているかどうかの決定を包含する。
【００３２】
代わりの特に好ましい態様において当該方法は、哺乳動物由来の生物学的サンプルを、ＤＡＰＫ１、ＤＡＰＫ２、ＮＥＳおよびＥＭＰ１の発現について検査することを包含する。ＥＭＰ１およびＮＥＳの高いレベルはゲフィチニブへの耐性に伴い、そしてＤＡＰＫ１およびＤＡＰＫ２の高いレベルは、ゲフィチニブへの感受性に伴う。好ましくは発現の評価は、ＤＡＰＫ１およびＤＡＰＫ２のレベルが増大されているかどうか、そしてＥＭＰ１およびＮＥＳのレベルが低減されているかどうかの決定を包含する。最も好ましい態様において本発明は、ＤＡＰＫ１およびＥＭＰ１のレベルを決定することを包含する。
【００３３】
本発明のもう１つの側面に従って、腫瘍を有するまたは腫瘍を有することが疑われる哺乳動物に関して、ｅｒｂＢ受容体への薬剤を用いての治療の臨床結果を予測するための方法であって、腫瘍または腫瘍と疑われるものから採取した生物学的サンプル中の、本明細書において上に記載したような遺伝子のいずれかのレベルを決定することを包含する前記方法を提供する。ここで、以下の：
ａ）ＤＡＰＫ１の発現レベルが低減されている；ならびに/または
ｂ）ＮＰＡＳ２、ＮＥＳ、ＣＨＳＴ７およびＥＭＰ１の発現レベルが増大されている
場合には、不良な結果が予測される。
【００３４】
本発明のもう１つの側面に従って、腫瘍または腫瘍と疑われるものから採取した生物学的サンプル中の、本明細書において上に記載したような遺伝子のいずれかのレベルを決定することを包含する癌を分類する方法であって、その場合ＤＡＰＫ１の上昇したレベル、ならびに/またはＮＰＡＳ２、ＮＥＳ、ＣＨＳＴ７およびＥＭＰ１の低減したレベルを発現している腫瘍が、ｅｒｂＢ受容体への薬剤を用いての治療に対して感受性であると予測する、前記方法を提供する。
【００３５】
本発明のもう１つの側面に従って、腫瘍を有するまたは腫瘍を有することが疑われる哺乳動物に関して、ｅｒｂＢ受容体への薬剤を用いての治療の臨床結果を予測するための方法であって、腫瘍または腫瘍と疑われるものから採取した生物学的サンプル中の、本明細書において上に記載したような遺伝子のいずれかのレベルを決定することを包含する前記方法を提供する。ここで、以下の：
ａ）ＤＡＰＫ１またはＤＡＰＫ２の発現レベルが低減される；ならびに/または
ｂ）ＥＭＰ１もしくはＮＥＳの発現レベルが増大される
場合には、不良な結果が予測される。
【００３６】
本発明のもう１つの側面に従って、腫瘍または腫瘍と疑われるものから採取した生物学的サンプル中の、本明細書において上に記載したような遺伝子のいずれかのレベルを決定することを包含する癌を分類するための方法であって、その場合ＤＡＰＫ１もしくはＤＡＰＫ２の上昇したレベル、ならびに/またはＥＭＰ１もしくはＮＥＳの低減したレベルを発現している腫瘍は、ｅｒｂＢ受容体への薬剤を用いての治療に対して感受性であると予測する、前記方法を提供する。
【００３７】
本発明のもう１つの側面に従って、本明細書において記載したような遺伝子のいずれかのレベルに基づいて、ｅｒｂＢ受容体への薬剤の治療に対して耐性または不応性であると予測した腫瘍を有するまたは腫瘍を有することが疑われる哺乳動物における疾患の状態を治療するための方法であって、ｅｒｂＢ受容体への薬剤の耐性を克服する量を提供すること、および該哺乳動物にｅｒｂＢ受容体への薬剤の耐性を克服する量を投与することを包含する前記方法を提供する。
【００３８】
好ましい態様において、哺乳動物は霊長類である。もっとも好ましい態様において、哺乳動物はヒトである。好ましい態様において患者は霊長類である。もっとも好ましい態様において、患者はヒトである。
【００３９】
“ｅｒｂＢ受容体への薬剤”という用語は、上の発明の背景において記載したようなＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ２ (ＨＥＲ)、ｅｒｂＢ３およびｅｒｂＢ４を含む、受容体チロシンキナーゼのｅｒｂＢファミリーに作用する薬剤を含む。好ましい態様においてｅｒｂＢ受容体への薬剤は、ｅｒｂＢ受容体チロシンキナーゼ阻害薬である。好ましい態様においてｅｒｂＢ受容体への薬剤は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬である。
【００４０】
より好ましい態様において、ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害薬は、ゲフィチニブ、エルロチニブ(ＯＳＩ−７７４, ＣＰ−３５８７７４)、ＰＫＩ−１６６、ＥＫＢ−５６９、ＨＫＩ−２７２（ＷＡＹ−１７７８２０）、ラパチニブ(ＧＷ２０１６、ＧＷ−５７２０１６)、カネルチニブ(ＣＩ−１０３３, ＰＤ１８３８０５)、ＡＥＥ７８８、ＸＬ６４７、ＢＭＳ５５９９６２６、またはＷＯ  ０３／０８２８３１、ＷＯ  ０５／０１２２９０、ＷＯ  ０５／０２６１５７、ＷＯ  ０５／０２６１５０、ＷＯ  ０５／０２６１５６、ＷＯ  ０５／０２８４７０、ＷＯ  ０５／０２８４６９、ＷＯ  ２００４／００６８４６  ＷＯ  ０３０８２８３１、ＷＯ  ０３／０８２２９０  もしくはＰＣＴ／ＧＢ２００５／０００２３７に開示されているような化合物のいずれかより選択される。
【００４１】
もう１つの好ましい態様においてｅｒｂＢ受容体への薬剤は、抗ＥＧＦＲ抗体、例えばセツキシマブ（Ｃ２２５）、マツズマブ（ＥＭＤ-７２０００）、パニツムマブ（ＡＢＸ-ＥＧＦ/ｒＨｕＭＡｂ-ＥＧＦｒ）、ＭＲ１−１、ＩＭＣ−１１Ｆ８、またはＥＧＦＲＬ１１の１つである。
【００４２】
ｅｒｂＢ受容体への薬剤は単剤療法として、または同じまたは異なるクラスの他の薬剤と組み合わせて使用してよいことを意図する。特に好ましい態様において、ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害薬はゲフィチニブである。
【００４３】
好ましい態様において本発明は、ｅｒｂＢチロシンキナーゼ受容体にのみ、または該受容体に部分的に依存する腫瘍を有する患者または患者母集団において、本明細書において先に記載したようなｅｒｂＢ受容体への薬剤に対する応答を予測する上での使用に特に適する。そのような腫瘍は、例えば非固形腫瘍、例えば白血病、多発性骨髄腫またはリンパ腫、ならびに固形腫瘍、例えば、胆管、骨、膀胱、脳/ＣＮＳ、神経膠芽腫、乳腺、結腸直腸、子宮頚部、子宮内膜、胃、頭部および頚部、肝臓、肺、筋肉、神経、食道、卵巣、膵臓、胸膜/腹膜、前立腺、腎臓、皮膚、精巣、甲状腺、子宮および外陰部を含む。
【００４４】
好ましい態様において本発明は、頭部、頚部、膵臓、神経膠芽腫、結腸直腸または乳腺の腫瘍の患者を、薬剤治療について同定するために特に適する。特に好ましい態様において本発明はまた、本明細書において先に定義したようなｅｒｂＢ受容体への薬剤を用いての治療に応答するであろうＮＳＣＬＣの患者、より特定すれば進行腺癌を含む進行ＮＳＣＬＣの患者を同定するために特に適する。
【００４５】
本発明は、腫瘍、例えばＮＳＣＬＣ、特に進行ＮＳＣＬＣの治療において、ＮＳＣＬＣの“個々の癌のプロフィール”を同定し、そうしてその腫瘍がｅｒｂＢ受容体への薬剤  例えばゲフィチニブに対して応答するであろうと決定することにより、利点を提供する。
【００４６】
本発明は、以前に行った化学療法、例えばプラチナを基本とした化学療法に失敗した進行ＮＳＣＬＣの患者の治療において、特に有用である。本発明はまた、以前に化学療法  例えばプラチナを基本とした化学療法を受けている、局所的に進行した（ステージＩＩＩＢ）または転移した（ステージＩＶ）ＮＳＣＬＣの患者の治療においても、特に有用である。本発明はまた、アジュバント治療において、または一次治療としても有用である。
【００４７】
好ましい態様において、ゲフィチニブを用いての治療に関して、腫瘍を有するまたは腫瘍を有すると疑われるヒトを選択する方法であって、哺乳動物由来の生物学的サンプルを、ＮＰＡＳ２、ＮＥＳ、ＣＨＳＴ７、ＤＡＰＫ１およびＥＭＰ１の発現について検査し、それによりゲフィチニブに対する応答の可能性が高いことを予測することを包含する前記方法を提供する。
【００４８】
好ましい態様において、ゲフィチニブを用いての治療に関して、腫瘍を有するまたは腫瘍を有すると疑われるヒトを選択する方法であって、哺乳動物由来の生物学的サンプルを、ＤＡＰＫ１、ＤＡＰＫ２、ＮＥＳ、およびＥＭＰ１の発現について検査し、それによりゲフィチニブに対する応答の可能性が高いことを予測することを包含する前記方法を提供する。
【００４９】
本発明のもう１つの側面に従って、本明細書において記載した遺伝子のいずれかの差異のある発現を比較することを包含する、化学療法薬、特にｅｒｂＢ受容体への薬剤を用いての治療に対する、癌  例えば肺癌の患者または患者母集団の応答性を予測する方法を提供する。
【００５０】
１つの態様において発現の評価は、特に多数の遺伝子を同時に分析するあらゆるタイプの、オリゴヌクレオチドに基づいたアレイまたはｃＤＮＡに基づいたアレイを用いての、遺伝子発現プロファイリングにより行う。代わりの態様において、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写−ポリメラーゼ連鎖応答）、リアルタイムＰＣＲ、in-situハイブリダイゼーション、ノーザンブロット法、例えばVelculescu et al Science 270 (5235): 484-487に記載されているような連続遺伝子発現解析（ＳＡＧＥ）、またはＲＮＡレベルで遺伝子発現を測定するディファレンシャル・ディスプレイもしくはあらゆる他の方法を、使用することができるだろう。これら、およびその他の一般的な分子生物学の技術の詳細は、Current Protocols in Molecular Biology Volumes1-3, F M Asubel, R Brent およびR E Kingston編; John Wiley出版 1998、ならびにSambrook, J.および Russell, D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第３版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001に見出すことができる。
【００５１】
もう１つの態様において発現の評価は、前述の遺伝子によりコードされたタンパク質レベルの測定により行う。例えば免疫組織学に基づいたアッセイ、または別のプロテオミクスの方法の適応がある。
【００５２】
もう１つの態様において発現の評価は、例えばバイオアッセイにおける、前述の遺伝子によりコードされたタンパク質の活性の測定により行う。
好ましい態様において生物学的サンプルは、腫瘍または腫瘍を疑われるものの小さなサンプルを入手するための最小限の侵襲的技術を用いて採取して、そのサンプルから遺伝子発現プロフィールを決定することになるだろう。そのような技術は、例えば腫瘍の組織診、例えば伝統的な経気管支組織診を含む。そのサイズが約１ｍｍである経気管支組織診の検体の遺伝子発現プロフィールは、例えば適切な増幅法を用いて測定してよい。
【００５３】
本発明のもう１つの側面は、本明細書において上に記載したような遺伝子のいずれかのレベルを測定するための方法を包含する、化学療法薬、特にｅｒｂＢ受容体への薬剤を用いての治療に対する、腫瘍の患者または患者母集団の応答性を予測する方法において使用するためのキットを提供する。好ましくは遺伝子は、支持材または支持膜、例えばニトロセルロース、またはナイロンまたはプラスチックのフィルムもしくはスライドに付着させる。
【００５４】
さらなる好ましい態様において本発明は、本明細書において上に記載した方法に従って選択された哺乳動物に対する、ｅｒｂＢ受容体への薬剤の投与を含む。
本発明のもう１つの側面に従って、ｅｒｂＢ受容体への薬剤の適当な投与量を決定する上で、上に記載した方法の結果を使用する方法を提供する。
【００５５】
好ましい態様において生物学的サンプルは、本明細書において上に記載したような遺伝子のいずれかの発現について検査してよい１つのサンプル、または本明細書において上に記載したような遺伝子の１つもしくはそれより多くの発現について検査してよい複数のサンプルのどちらかを包含する。
【実施例】
【００５６】
本発明を以下の非限定的実施例により説明する：
実施例１
[ゲフィチニブ耐性または感受性の腫瘍細胞株における遺伝子の発現−細胞培養および異種移植の試験］
筆者らは、臨床においてｅｒｂＢ受容体への薬剤に対する応答を予測するために有用な遺伝子を同定した。この同定はゲフィチニブを用いての試験に基づくが、この所見は一般のｅｒｂＢ受容体への薬剤にも適用可能である。
【００５７】
遺伝子リストは、ゲフィチニブに対して感受性、またはゲフィチニブに対して耐性のいずれかであることを示した腫瘍細胞株を比較することにより作製した。この定義は、腫瘍細胞株をヌードマウスに植え付け、異種移植として成長させた時に観察された応答に基づく。この定義は、本明細書に記載したすべての前臨床試験について使用した。
【００５８】
最初に６つのヒト腫瘍細胞株の小さなパネルを作製した。このうち３つは上に定義した異種移植の状態においてゲフィチニブに対して感受性であり、３つはゲフィチニブに対して耐性である。
【００５９】
感受性細胞株は以下の通りであった；
１．Ｌｏｖｏ (ＡＴＣＣ１ Ｎｏ. ＣＣＬ−２２９)−結腸腫瘍細胞株
２．ＫＢ (ＡＴＣＣ Ｎｏ. ＣＣＬ−１７)−上咽頭腫瘍細胞株として最初に報告された（しかしながらより最近、Ｈｅｌａ由来（子宮頸癌）として報告されている）
３．ＨＴ２９ (ＡＴＣＣ Ｎｏ. ＨＴＢ−３８)−結腸腫瘍細胞株
耐性細胞株は以下の通りであった；
１．ＭＫＮ ４５(入手元− Nottingham University, UK)−胃腫瘍細胞株
２．Ｃａｌｕ  ６(ＡＴＣＣ  Ｎｏ.ＨＴＢ−５６)−肺腫瘍細胞株
３．ＰＣ３(ＡＴＣＣ  Ｎｏ.ＣＲＬ−１４３５)−前立腺腫瘍細胞株
1ＡＴＣＣ＝American Type Culture Collection
【００６０】
細胞株は細胞培養において、そして異種移植片としての双方にて成長させ、ＲＮＡを調製し、Affymetrixマイクロアレイプラットホーム上でのＲＮＡ発現を測定することにより、基底発現プロフィールを決定した。当該研究の一部分として、“基底の”という用語は、（細胞に対するｅｒｂＢリガンドまたはゲフィチニブの投与の結果として修飾される発現レベルではなく）構成的または安定な状態の発現レベルを示すために使用した。図１は、ゲフィチニブを用いての治療に対するＡ５４９異種移植（以下の実施例３において使用した）の感受性を示す。図２は、ゲフィチニブに対するＭＫＮ４５異種移植の耐性を示す。結果の分析に関しては以下の実施例２を参照のこと。
【００６１】
実施例２
［細胞培養および異種移植のデータセットの統計分析］
以下の統計分析は、細胞培養および異種移植のデータセットについて別々に行った。プローブセットは、それらのシグナルがセット中のすべてのＲＮＡサンプルにわたるバックグラウンドノイズから区別できない場合には除外した。混合ＡＮＯＶＡ（分散分析）（例えばScheffe, 1959を参照のこと）を残りの各プローブセットに対して別々に適用して、ｐ値を得た。次にｐ値を用いてＱ値を算出した(Storey）。Ｑ値は、本当は差異のある発現はされないのに誤って発見された、遺伝子リスト中の遺伝子の期待比率（False Discovery Rate またはＦＤＲ）を示す。異なる試験における適当なＱ値のカットオフは、発現倍数の変化(fold change)と合わせてのｐ値およびＱ値の結果のグラフによる検討に基づいて、同定し、適用した。各試験に関する最終的な遺伝子リストを、Ｑ値および発現倍数の変化（ＦＣ）のカットオフを用いて作成した。次に異なる遺伝子リストを組み合わせて、感受性群および耐性群の細胞株間で発現プロフィールに一貫した差異を示した遺伝子の全体のリストを表示した。
【００６２】
分析方法のさらなる詳細を以下に提供する。発現倍数の変化（ＦＣ）は、感受性細胞の平均を耐性細胞の平均で割った値に基づいて算出した。遺伝子リストの作成にあたって、どちらかの方向に２倍（２×）の変化とするＦＣカットオフをすべてのケースに用いた。さらにＦＤＲ  Ｑ値を用いてリストを絞り、感受性細胞株  対  耐性細胞株の全体での最も有意な遺伝子の変化を得た。細胞培養のケースでは、Ｑ値のカットオフは０．３である。異種移植のケースでは、Ｑ値のカットオフは０．６である。異なるカットオフを使用したことは、各実験に伴う異なるデザインおよび分散値を反映する。
【００６３】
細胞培養の試験においてはリストは、培地を含有する全血清または活性炭処理した血清のどちらかにおいて成長させた細胞について、上の基準に基づいて得た。異種移植試験において、１８時間の間隔を置いて採取した腫瘍の別々のセットについて上と同様に行った。遺伝子リストは、例えば異なるプローブセットを用いて得られる結果が一致することを説明するためにそれが適当である場合には、遺伝子においていくつかの重複を含有する。
【００６４】
実施例３
［予測遺伝子の同定］
ｅｒｂＢ受容体への薬剤感受性を予測するとしてこれまでに同定されていなかった遺伝子を、表１に列記する。所望により表１の遺伝子と組み合わせて使用するために筆者らが同定したその他の遺伝子を、表２に列記する。
【００６５】
表のキーワード：
‘Affymetrix ID’−Affymetrixプローブセット識別子 (identifier)
‘配列’−‘Affymetrix ID’により示されるAffymetrix プローブセットに関する標的配列、“＋  感受性細胞において増大の場合”は、その遺伝子が感受性細胞において相対的に高く発現されることを意味する。（結果として“＋”が書かれていないものは、その遺伝子が耐性細胞において相対的に高く発現されることを意味する）。
‘遺伝子名’−UniGene 133に基づいての‘Affymetrix ID’に関する遺伝子の現在のアノテーション
‘遺伝子記号’−遺伝子名に関する短縮形のシノニム
‘Locus Link および RefSeq Transcript ID’は遺伝子の同定の目的のため提供する。
【００６６】
複数の遺伝子を組み合わせることは、単離して使用した遺伝子を上回る改善された診断を得られる可能性を有する。集合的な遺伝子発現プロフィール（ＲＮＡレベルおよび/またはタンパク質レベルで）は、単離した１つの遺伝子の発現レベルよりむしろ、ゲフィチニブから利益を最も得られる可能性のある患者を同定するより高い可能性があると思われる。
【００６７】
治療前の応答予測診断を開発する際に、表１および/または２から絞った遺伝子リストを用いて作業することは、より実際的であると思われる。いくつかの基準を使用して遺伝子リストを縮小し、最も応答を予測できる遺伝子を同定した。第１に統計学（ｐ値およびＱ値またはＦＤＲ値）から、遺伝子の統計学的有意性を示すことができる。
【００６８】
第２に、感受性群および耐性群間での差異のある発現（発現倍数の変化）は、診断検査に使用するためのマーカーとしての潜在的感受性を示す（感受性群および耐性群間での最大の発現倍数の変化が好ましい）。
【００６９】
第３に、各遺伝子の発現プロフィールが真に予測性であるという信頼度を高めるために、ゲフィチニブ感受性および耐性のヒト腫瘍細胞株のより広範囲のパネルにわたる発現プロファイリングに基づいてＲＴ−ＰＣＲを行った。図３、４、５および６は、以下に述べるように細胞株のより広範囲のパネルにわたりプロファイリングした特定の遺伝子の発現の例を示す。
【００７０】
感受性のヒト腫瘍細胞株、ここで感受性の定義は異種移植として成長させた時のイレッサへの応答に基づく：
ａ．ＢＴ４７４ (ＡＴＣＣ Ｎｏ. ＨＴＢ−２０) -乳腺腫瘍細胞株
ｂ．ＤＵ１４５ (ＡＴＣＣ Ｎｏ. ＨＴＢ−８１)−結腸腫瘍細胞
ｃ．ＭＣＦ７ (ＡＴＣＣ Ｎｏ. ＨＴＢ−２２、ＩＣＲＦ (現在ＣＲ−ＵＫ), Londonより入手)−乳腺腫瘍細胞株
ｄ．ＧＥＯ結腸腫瘍細胞株。ＲＮＡは、Fortunato Ciardiello, Cattedra di Oncologia Medica, Dipartimento Medico-Chirurgico di Internistica Clinica e Sperimentale "F. Magrassi e A. Lanzara, " Seconda Universita delgi Studi di Napoli, Via S. Pansini, 5-80131, Naples, Italy.より得た。
【００７１】
ｅ．Ａ５４９ (ＡＴＣＣ Ｎｏ.ＣＣＬ−１８５)−肺腫瘍細胞株
ｆ．Ａ４３１ (ＡＴＣＣ Ｎｏ. ＣＲＬ−１５５)-類表皮細胞株
耐性のヒト腫瘍細胞株、ここで感受性の定義は異種移植として成長させた時のイレッサへの応答に基づく：
１）ＨＸ１４７−(入手元: ＩＣＲＦ(現在ＣＲ−ＵＫ),London)−肺腫瘍細胞株
２）ＲＴ１１２−膀胱腫瘍細胞株(ＤＳＭＺ  Ｎｏ  ＡＣＣ  ４１８)
３）ＭｉａＰａｃ２(ＥＣＡＣＣ  ８５０６２８０６、参照番号００１６１１)−膵臓腫瘍細胞株
４）ＭＤＡＭＢ２３１(ＡＴＣＣ  Ｎｏ.ＨＴＢ−２６)−乳腺腫瘍細胞株
５）ＳＷ６２０(ＥＣＡＣＣ ＣＣＬ−２２７)−結腸腫瘍細胞株
ＡＴＣＣ＝American Type Culture Collection（米国の細胞培養コレクション）
ＤＳＭＺ−Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (ドイツの微生物および細胞培養のコレクション)
ＥＣＡＣＣ ＝ European Collection of Cell Cultures（ヨーロッパの細胞培養コレクション）
【００７２】
単独でもこれらの各遺伝子はゲフィチニブへの応答の納得のいく予測ができるが、集合的にこれらを適用して、より高いレベルの信頼度で予測を行うことができる。
【００７３】
上の診断用遺伝子リスト中の遺伝子に関するAffymetrixプローブセット識別子を、表１および２に示す。現在Affy IDは、Affy U133チップセット基づく。紛らわしさを避けるため、列記した遺伝子を同定したAffymetrixプローブセットの標的配列もまた、表１および２に提供する。
【００７４】
理論的考察に拘束されたくはないが、実施例において標的遺伝子を検出するために使用した特定の配列は、相同な遺伝子中の特定のスプライスバリアントまたは配列と定義してよいことを意図する。したがって１つの態様において、本発明の方法において使用するための列記した遺伝子は、前記実施例において使用した特定の配列により定義される。もう１つの態様において、本発明の方法において使用するための遺伝子は、これらの実施例で使用した特定の配列に限定されない。実際に、表１および２のいくつかの遺伝子は、異なる配列（遺伝子の“冗長性redundancy”）および確証のためのＲＴ−ＰＣＲ試験（実施例４を参照のこと）を用いて同定されているという事実は、本発明の方法における有用性は一般に、標的遺伝子を測定するために使用する特定の遺伝子に限定されない、というエビデンスを提供する。
【００７５】
注意、表１および２、ならびに配列リスト間での配列の不一致という事象においては、表に提供した配列が好ましいことに注意されたい。
表１：
【００７６】
【表１−１】
2008507264.tif 000002
【００７７】
【表１−２】
2008507264.tif 000003
【００７８】
【表１−３】
2008507264.tif 000004
【００７９】
【表１−４】
2008507264.tif 000005
【００８０】
【表１−５】
2008507264.tif 000006
【００８１】
【表１−６】
2008507264.tif 000007
【００８２】
【表１−７】
2008507264.tif 000008
【００８３】
【表１−８】
2008507264.tif 000009
【００８４】
【表１−９】
2008507264.tif 000010
【００８５】
【表１−１０】
2008507264.tif 000011
【００８６】
【表１−１１】
2008507264.tif 000012
【００８７】
【表１−１２】
2008507264.tif 000013
【００８８】
【表１−１３】
2008507264.tif 000014
【００８９】
表２：
【００９０】
【表２−１】
2008507264.tif 000015
【００９１】
【表２−２】
2008507264.tif 000016
【００９２】
【表２−３】
2008507264.tif 000017
【００９３】
【表２−４】
2008507264.tif 000018
【００９４】
【表２−５】
2008507264.tif 000019
【００９５】
【表２−６】
2008507264.tif 000020
【００９６】
【表２−７】
2008507264.tif 000021
【００９７】
【表２−８】
2008507264.tif 000022
【００９８】
【表２−９】
2008507264.tif 000023
【００９９】
【表２−１０】
2008507264.tif 000024
【０１００】
【表２−１１】
2008507264.tif 000025
【０１０１】
【表２−１２】
2008507264.tif 000026
【０１０２】
【表２−１３】
2008507264.tif 000027
【０１０３】
【表２−１４】
2008507264.tif 000028
【０１０４】
【表２−１５】
2008507264.tif 000029
【０１０５】
【表２−１６】
2008507264.tif 000030
【０１０６】
【表２−１７】
2008507264.tif 000031
【０１０７】
【表２−１８】
2008507264.tif 000032
【０１０８】
【表２−１９】
2008507264.tif 000033
【０１０９】
実施例４
［ＲＴ−ＰＣＲの確証試験］
加えて、図３、４、５および６において強調したような確証のためのフォローアップ試験で使用したＲＴ−ＰＣＲのプライマーの配列を表３に列記する。ＤＡＰＫ２はAffymetrix分析では同定されず、ＲＴ−ＰＣＲによるＤＡＰＫ遺伝子ファミリーのフォローアップ、続いてのＤＡＰＫ１の予測性の発見を通してしか同定されなかった。したがってＤＡＰＫ２に関しては、Affymetrix IDまたはAffymetrix ID配列は提供していない。
【０１１０】
【表３】
2008507264.tif 000034
【０１１１】
実施例５
［臨床試験のための診断検査］
上の予測用遺伝子リストは、記載した前臨床試験を用いて作成した。以下のアプローチを使用して、このデータに基づいた臨床の状態に関する診断検査を開発する。
【０１１２】
ａ）診断検査から利益を得られることが期待されると思われる個体の集団を代表する患者であって、該患者に関する治療前の腫瘍サンプルおよびゲフィチニブ治療の結果がわかる、または入手可能となる前記患者を同定する。各サンプルについて、筆者らの興味ある遺伝子に関する発現レベルを、例えばＲＴ−ＰＣＲからのＲＮＡシグナルを用いて評価する。ＱＣ法を適用して、サンプルおよび遺伝子のセットを同定して、ステップｂ）に進める。
【０１１３】
ａ）ゲフィチニブに対して異なる応答を示す患者間を、協同して識別することのできる遺伝子のサブセットを同定する。遺伝子のサブセットを選択し、そしてそれらの発現の値を組み合わせて、予測、すなわち異なる患者群間を識別するおそらく予測値および対応する閾値を提供するために有用である多様な方法がある。一例は段階的な線形判別分析であり、その場合患者群間を十分に識別できる遺伝子を、さらなる遺伝子付加しても付加的な予測のパワーが得られなくなるまで、線形的に組み合わせて連続的に付加する(Mardia et al.)。次に線形的組み合わせの閾値を選択して、適当な感受性および特異性の特性を与える。
【０１１４】
ｄ）ツールの確認(tool validation)は、部分的にはステップ２の開発中に、例えば交差検定およびノンパラメトリック検定(permutation tests)を用いて行うことになる。加えて、最終的に開発された診断法（遺伝子のサブセット、ならびに予測および生物学的分析に関するプラットホームを得るための組み合わせの方法、）を検査し、ステップｂ）のツールの開発の範囲内で使用しなかったサンプルの独立したセットを用いて、その完全性において評価する。
【０１１５】
参考文献
Bailey et al  Lung Cancer (2003) 41 S2 , S71
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Fukuoka et al (2003) J. Clin. Oncol., 21, p2237
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Lynch et al.(2004) New England Journal of Medicine, 350(21) p2129
Mardia K.V., Kent J.T., Bibby J.M. (1979) "Multivariate Analysis" London, Academic Press Inc. Ltd.
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Yarden & Sliwkowski (2001) Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2, p127
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】図１は、胸腺欠損マウスにおいて異種移植として成長させた時にゲフィチニブに対して感受性である異種移植（Ａ５４９細胞株）について示す。このデータは、指示された用量での１日１回の経口投与に関する。Ｙ軸＝ｃｍ３にて腫瘍の容積を意味する；ｘ＝治療後日数。
【図２】図２は、胸腺欠損マウスにおいて異種移植として成長させた時にゲフィチニブに対して耐性である異種移植（ＭＫＮ４５細胞株）について示す。このデータは、指示された用量での１日１回の経口投与に関する。Ｙ軸＝ｃｍ３にて腫瘍の容積を意味する；ｘ＝治療後日数。
【図３】図３、４、５および６は、各遺伝子の発現プロフィールが真に予測性であるとの信頼度を高めるため、ゲフィチニブ感受性株および耐性株のより広範囲のパネルにわたりプロファイリングした特定の遺伝子の発現の例を示す。ここで感受性の定義は、異種移植として成長させた時のゲフィチニブに対する応答に基づく。イレッサ感受性は、異種移植データに基づく。細胞株およびそれらの由来する腫瘍は以下の通りである；ＫＢ−頭部および頚部、ＨＴ２９−結腸、ＢＴ４７４−乳腺、ＤＵ１４５−前立腺、ＬｏＶｏ−結腸、ＭＣＦ７−乳腺、ＧＥＯ−結腸、Ａ５４９−肺、Ａ４３１−類表皮、Ｈ３２２−肺、ＨＸ１４７−肺、ＲＴ１１２−膀胱、ＭｉａＰａＣａ２−膵臓、ＭＫＮ４５−胃、ＭＤＡＭＢ２３１−乳腺、ＰＣ３−前立腺、Ｃａｌｕ６−肺、ＳＷ６２０−結腸。  記号はＳ＝感受性、Ｕ＝不明、およびＲ＝耐性である。  図３は、より広範囲の細胞パネルでの細胞培養におけるＥＭＰ１の基底発現を示す(Taqman ＲＴ-ＰＣＲ)。
【図４】図４は、より広範囲の細胞パネルでの細胞培養におけるＤＡＰＫ１の基底発現を示す(Taqman ＲＴ-ＰＣＲ)。
【図５】図５は、より広範囲の細胞パネルでの細胞培養におけるＤＡＰＫ２基底発現を示す(Taqman ＲＴ-ＰＣＲ)。
【図６】図６は、より広範囲の細胞パネルでの細胞培養におけるＮＥＳの基底発現を示す(Taqman ＲＴ-ＰＣＲ)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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