(57)【要約】本発明は、XIII因子ポリペプチドを生物学的材料から精製するための方法に関し、該方法は前記材料を陰イオン交換マトリックスおよび疎水性相互作用マトリックスでの連続的なクロマトグラフィーに供試することを備える。【特許請求の範囲】
【請求項１】
XIII因子ポリペプチドを生物学的材料から精製するための方法であって、該材料を陰イオン交換マトリックスおよび疎水性相互作用マトリックスでの連続的なクロマトグラフィーに供試することを備える方法。
【請求項２】
請求項1に記載の方法であって、前記XIII因子ポリペプチドは、組換えXIII因子である方法。
【請求項３】
請求項1または2に記載の方法であって、前記XIII因子ポリペプチドは、ヒトXIII因子である方法。
【請求項４】
請求項1または2に記載の方法であって、前記XIII因子ポリペプチドは、Aサブユニットのダイマーである方法。
【請求項５】
請求項4に記載の方法であって、前記XIII因子ポリペプチドは、ヒトのAサブユニットのダイマーである方法。
【請求項６】
請求項1〜5の何れか１項に記載の方法であって、前記生物学的材料が生物学的流体である方法。
【請求項７】
請求項6に記載の方法であって、前記生物学的流体は、細胞溶解物の上清である方法。
【請求項８】
請求項7に記載の方法であって、前記生物学的流体は、酵母の細胞溶解物の上清である方法。
【請求項９】
請求項1〜8の何れか１項に記載の方法であって、以下の工程を備える方法：
(a)XIII因子ポリペプチドを含んでいる生物学的材料を、第1の陰イオン交換クロマトグラフィー材料においてクロマトグラフィーに供試すること、該クロマトグラフィーは以下を備える：
(i)前記生物学的材料を前記第1の陰イオン交換クロマトグラフィー材料に適用すること；
(ii)非結合性の材料を前記第1の陰イオン交換クロマトグラフィー材料から緩衝液Aで溶出すること（ここで緩衝液Aは、前記第1の陰イオン交換クロマトグラフィー材料に結合しない材料を溶出するために適切である）；および
(iii)前記XIII因子ポリペプチドを前記第1の陰イオン交換クロマトグラフィー材料から緩衝液Aでグラジエント溶出で溶出すること（ここで緩衝液Aは、前記XIII因子ポリペプチドを前記第1の陰イオン交換クロマトグラフィー材料から溶出するために適切である）；
(b)工程(iii)からの溶出液を又は工程(iii)からの溶出液の使用により調製された流体を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料を用いたクロマトグラフィーに供試すること、該クロマトグラフィーは以下を備える：
(iv)工程(iii)からの溶出液を又は工程(iii)からの溶出液の使用により調製された流体を、前記疎水性相互作用クロマトグラフィー材料に適用すること；
(v)非結合性の材料を前記クロマトグラフィー材料から緩衝液Bで溶出すること（ここで緩衝液Bは、前記疎水性相互作用クロマトグラフィー材料に結合しない材料を溶出するために適切である）；および
(vi)前記XIII因子ポリペプチドを前記クロマトグラフィー材料から緩衝液Bでグラジエント溶出で溶出すること（ここで緩衝液Bは、XIII因子を前記疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から溶出するために適切である）。
【請求項１０】
請求項9に記載の方法であって、前記緩衝液Aは、XIII因子ポリペプチドの安定性を増加させる能力のある１以上の安定化剤を含む方法。
【請求項１１】
請求項10に記載の方法であって、前記緩衝液Aは、安定化剤である糖、アルコール、またはアルジトールを含む方法。
【請求項１２】
請求項11に記載の方法であって、前記緩衝液Aは、安定化剤である糖、C3-C8-アルコール、またはアルジトールを含む方法。
【請求項１３】
請求項12に記載の方法であって、前記緩衝液Aは、安定化剤であるポリアルコールを含む方法。
【請求項１４】
請求項12に記載の方法であって、前記緩衝液は、グリセロール, プロピレングリコール, プロパン-1,3-ジオール, プロピルアルコールおよびイソプロピルアルコールからなる群から選択される安定化剤を含む方法。
【請求項１５】
請求項14に記載の方法であって、前記緩衝液は、グリセロール, プロピレングリコールおよびプロパン-1,3-ジオールからなる群から選択される安定化剤を含む方法。
【請求項１６】
請求項10〜15の何れか１項に記載の方法であって、前記安定化剤が約5%(v/v)〜約50%(v/v)の濃度で存在する方法。
【請求項１７】
請求項16に記載の方法であって、前記安定化剤が約10%(v/v)〜約50%(v/v)の濃度で存在する方法。
【請求項１８】
請求項17に記載の方法であって、前記安定化剤が約10%(v/v)〜約20%(v/v)の濃度で存在する方法。
【請求項１９】
請求項18に記載の方法であって、前記安定化剤が約10%(v/v)の濃度で存在する方法。
【請求項２０】
請求項18に記載の方法であって、前記安定化剤が約20%(v/v)の濃度で存在する方法。
【請求項２１】
請求項9〜20の何れか１項に記載の方法であって、緩衝液AのpHが、約6.5および約9の間である方法。
【請求項２２】
請求項21に記載の方法であって、緩衝液AのpHが、約7および約9の間である方法。
【請求項２３】
請求項22に記載の方法であって、緩衝液AのpHが、約8である方法。
【請求項２４】
請求項9〜23の何れか１項に記載の方法であって、緩衝液Aが約2mS/cm未満の伝導率を有する方法。
【請求項２５】
請求項9〜24の何れか１項に記載の方法であって、XIII因子ポリペプチドの結晶性沈殿物を形成する沈殿が、工程(iii)および工程(iv)の間で行なわれない方法。
【請求項２６】
請求項25に記載の方法であって、XIII因子ポリペプチドの結晶性沈殿物を形成する酢酸ナトリウムを用いる沈殿工程が、工程(iii)および工程(iv)の間に行われない方法。
【請求項２７】
請求項1〜26の何れか１項に記載の方法であって、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料が、リガンドとしてフェニルを使用する方法。
【請求項２８】
請求項27に記載の方法であって、前記疎水性相互作用クロマトグラフィー材料が、Source TM 15Pheである方法。
【請求項２９】
請求項27に記載の方法であって、前記疎水性相互作用クロマトグラフィー材料が、Phenyl Sepharose TM 6 Fast Flow High Substitutionである方法。
【請求項３０】
請求項27に記載の方法であって、前記疎水性相互作用クロマトグラフィー材料が、Phenyl Sepharose TM High Performance High Substitutionである方法。
【請求項３１】
請求項9〜30の何れか１項に記載の方法であって、緩衝液BのpHが、約6〜約8である方法。
【請求項３２】
請求項31に記載の方法であって、緩衝液BのpHが、約7.5である方法。
【請求項３３】
請求項9〜32の何れか１項に記載の方法であって、緩衝液Bが約25mS/cmを超える伝導率を有する方法。
【請求項３４】
請求項33に記載の方法であって、緩衝液Bが、最大で50mS/cmの伝導率を有する方法。
【請求項３５】
請求項9〜34の何れか１項に記載の方法であって、段階（vi）からの溶出物又は段階（vi）からの溶出物を使用することによって調製される流体が、下記の工程を備えている方法を使用することによって処理される方法：
(1)XIII因子ポリペプチドの安定性を増加させる能力を有する１以上の安定化剤を、その安定性を有意に改善させるのに効果的な量で添加すること、および／または、
(2)段階（vi）からの溶出物の又は段階（vi）からの溶出物を使用して調製された流体のpHを、約7および約8の間のpHへと調整すること。
【請求項３６】
請求項35に記載の方法であって、工程（１）で使用される安定化剤が、糖、アルコール、またはアルジトールである方法。
【請求項３７】
請求項36に記載の方法であって、工程（１）で使用される安定化剤が、糖、C3-C8-アルコール、またはアルジトールである方法。
【請求項３８】
請求項37に記載の方法であって、工程（１）で使用される安定化剤が、ポリアルコールである方法。
【請求項３９】
請求項37に記載の方法であって、工程（１）で使用される安定化剤が、グリセロール, プロピレングリコール, プロパン-1,3-ジオール, プロピルアルコールおよびイソプロピルアルコールからなる群から選択される方法。
【請求項４０】
請求項39に記載の方法であって、工程（１）で使用される安定化剤が、グリセロール, プロピレングリコール, およびプロパン-1,3-ジオールからなる群から選択される方法。
【請求項４１】
請求項35〜40の何れか１項に記載の方法であって、工程（１）で使用される安定化剤が、約5%(v/v)〜約50%(v/v)の濃度で添加される方法。
【請求項４２】
請求項41に記載の方法であって、工程（１）で使用される安定化剤が、約10%(v/v)〜約50%(v/v)の濃度で添加される方法。
【請求項４３】
請求項42に記載の方法であって、工程（１）で使用される安定化剤が、約10%(v/v)〜約20%(v/v)の濃度で添加される方法。
【請求項４４】
請求項35〜43の何れか１項に記載の方法であって、段階（vi）からの溶出物の又は段階（vi）からの溶出物を使用することによって調製された流体のpHが、工程（２）において、約7および約8の間のpHへと調整される方法。
【請求項４５】
請求項44に記載の方法であって、段階（vi）からの溶出物の又は段階（vi）からの溶出物を使用することによって調製された流体のpHが、工程（２）において、約7.5のpHへと調整される方法。
【請求項４６】
請求項9〜45の何れか１項に記載の方法であって、XIII因子ポリペプチド含有沈殿物を産生させるための沈殿工程が、工程(vi)の後に行われない方法。
【請求項４７】
請求項1〜46の何れか１項に記載の方法であって、疎水性相互作用クロマトグラフィーからの溶出物を又は疎水性相互作用クロマトグラフィーからの溶出物の使用によって調製される材料を、陰イオン交換マトリックスでのクロマトグラフィーに供試する工程をさらに備える方法。
【請求項４８】
請求項9〜47の何れか１項に記載の方法であって、以下の工程をさらに備える方法：
段階(vi)からの溶出液を又は段階(vi)からの溶出液の使用により調製された流体を、第２の陰イオン交換クロマトグラフィー材料でのクロマトグラフィーに供試すること、該クロマトグラフィーは以下を備える：
(vii)段階(vi)からの溶出液を又は段階(vi)からの溶出液の使用により調製された流体を、前記第２の陰イオン交換クロマトグラフィー材料に適用すること；
(viii)非結合性の材料を前記第２の陰イオン交換クロマトグラフィー材料から緩衝液Cで溶出すること（ここで緩衝液Cは、前記第２の陰イオン交換クロマトグラフィー材料に結合しない材料を溶出するために適切である）；および
(ix)前記XIII因子ポリペプチドを前記第２の陰イオン交換クロマトグラフィー材料から緩衝液C'で溶出すること〔ここで緩衝液C'は、工程（viii）で前記第２の陰イオン交換クロマトグラフィー材料に結合するXIII因子ポリペプチドを溶出するために適切である〕。
【請求項４９】
請求項48に記載の方法であって、緩衝液Cおよび／または緩衝液C'は、XIII因子ポリペプチドの安定性を増加させる能力のある１以上の安定化剤を含む方法。
【請求項５０】
請求項49に記載の方法であって、緩衝液Cおよび／または緩衝液C'は、安定化剤である糖、アルコール、またはアルジトールを含む方法。
【請求項５１】
請求項50に記載の方法であって、緩衝液Cおよび／または緩衝液C'は、安定化剤である糖、C3-C8-アルコール、またはアルジトールを含む方法。
【請求項５２】
請求項51に記載の方法であって、緩衝液Cおよび／または緩衝液C'は、安定化剤であるポリアルコールを含む方法。
【請求項５３】
請求項51に記載の方法であって、緩衝液Cおよび／または緩衝液C'は、グリセロール, プロピレングリコール, プロパン-1,3-ジオール, プロピルアルコールおよびイソプロピルアルコールからなる群から選択される安定化剤を含む方法。
【請求項５４】
請求項53に記載の方法であって、緩衝液Cおよび／または緩衝液C'は、グリセロール, プロピレングリコールおよびプロパン-1,3-ジオールからなる群から選択される安定化剤を含む方法。
【請求項５５】
請求項49〜54の何れか１項に記載の方法であって、前記安定化剤が約5%(v/v)〜約50%(v/v)の濃度で存在する方法。
【請求項５６】
請求項55に記載の方法であって、前記安定化剤が約10%(v/v)〜約50%(v/v)の濃度で存在する方法。
【請求項５７】
請求項56に記載の方法であって、前記安定化剤が約10%(v/v)〜約20%(v/v)の濃度で存在する方法。
【請求項５８】
請求項57に記載の方法であって、前記安定化剤が約10%(v/v)の濃度で存在する方法。
【請求項５９】
請求項57に記載の方法であって、前記安定化剤が約20%(v/v)の濃度で存在する方法。
【請求項６０】
請求項48〜59の何れか１項に記載の方法であって、緩衝液Cおよび／または緩衝液C'は、約7.5のpHを有する方法。
【請求項６１】
請求項48〜60の何れか１項に記載の方法であって、XIII因子ポリペプチドを含有している工程（ix）からの溶出物の伝導率が、約10mS/cmに調整される方法。
【請求項６２】
請求項48〜61の何れか１項に記載の方法であって、XIII因子ポリペプチドを含有している工程（ix）からの溶出物のpHが、約7.5に調整される方法。
【請求項６３】
請求項48〜62の何れか１項に記載の方法であって、XIII因子ポリペプチド含有沈殿物を産生させるための沈殿工程が、工程(ix)の後に行われない方法。
【請求項６４】
請求項1〜62の何れか１項に記載の方法であって、XIII因子ポリペプチド含有沈殿物を産生させるための沈殿工程が、行われない方法。
【請求項６５】
XIII因子ポリペプチドを生物学的材料から精製する方法であって、前記生物学的材料を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料を用いるクロマトグラフィーに供試する工程を備え、該疎水性相互作用クロマトグラフィー材料は、Phenyl Sepharose TM High Performance High Substitution, Source TM 15 Phe およびSepharose TM 6 Fast Flow High Substitutionから選択される方法。
【請求項６６】
請求項65に記載の方法であって、前記XIII因子ポリペプチドは、組換えXIII因子である方法。
【請求項６７】
請求項65または66に記載の方法であって、前記XIII因子ポリペプチドは、ヒトXIII因子である方法。
【請求項６８】
請求項65または66に記載の方法であって、前記XIII因子ポリペプチドは、Aサブユニットのダイマーである方法。
【請求項６９】
請求項68に記載の方法であって、前記XIII因子ポリペプチドは、ヒトのAサブユニットのダイマーである方法。
【請求項７０】
請求項65〜69の何れか１項に記載の方法であって、前記生物学的材料が生物学的流体である方法。
【請求項７１】
請求項65〜70の何れか１項に記載の方法であって、XIII因子ポリペプチド含有沈殿物を産生させるための沈殿工程が、行われない方法。
【請求項７２】
請求項1〜71の何れか１項に記載の方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドを含んでいる薬学的組成物。
【請求項７３】
請求項72に記載の薬学的組成物であって、前記薬学的組成物は、水性組成物であり且つ20%(v/v)のプロピレングリコールを含む薬学的組成物。
【請求項７４】
請求項72に記載の薬学的組成物であって、前記薬学的組成物は、水性組成物であり且つ1.5%(w/v)スクロースおよび3.5%(w/v)マンニトールを含む薬学的組成物。
【請求項７５】
請求項72〜74の何れか１項に記載の薬学的組成物の、失血を減少させるための使用。
【請求項７６】
請求項72〜74の何れか１項に記載の薬学的組成物の、未熟児における脳室内出血を予防するための使用。
【請求項７７】
請求項72〜74の何れか１項に記載の薬学的組成物の、患者における手術の間または後の手術に関連する失血を減少させるための使用。
【請求項７８】
請求項72〜74の何れか１項に記載の薬学的組成物の、血友病Aを治療するための使用。
【請求項７９】
請求項72〜74の何れか１項に記載の薬学的組成物の、血友病Bを治療するための使用。
【請求項８０】
請求項72〜74の何れか１項に記載の薬学的組成物の、血小板障害を治療するための使用。
【請求項８１】
請求項72〜74の何れか１項に記載の薬学的組成物の、フォンウィルブランド病を治療するための使用。
【請求項８２】
請求項1〜71の何れか１項に記載の方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドの、失血を減少させることに使用する薬学的組成物の製造における使用。
【請求項８３】
請求項1〜71の何れか１項に記載の方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドの、未熟児における脳室内出血の予防のための薬学的組成物の製造における使用。
【請求項８４】
請求項1〜71の何れか１項に記載の方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドの、患者における手術の間または後の手術に関連する失血を減少させる薬学的組成物の製造における使用。
【請求項８５】
請求項1〜71の何れか１項に記載の方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドの、血友病Aを治療するための薬学的組成物の製造における使用。
【請求項８６】
請求項1〜71の何れか１項に記載の方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドの、血友病Bを治療するための薬学的組成物の製造における使用。
【請求項８７】
請求項1〜71の何れか１項に記載の方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドの、血小板障害を治療するための薬学的組成物の製造における使用。
【請求項８８】
請求項1〜71の何れか１項に記載の方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドの、フォンウィルブランド病を治療するための薬学的組成物の製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、生物学的材料からタンパク質を精製（特に、生物学的な流体からのXIII因子およびXIII因子ポリペプチドの精製）する方法に関する。
【０００２】
［発明の背景］
血液凝固XIII因子(FXIII)、フィブリン安定化因子は、トランスグルタミナーゼであり、止血栓中でフィブリンモノマーに結合し、クロスリンクし、これによって機械的な強度が増加し、フィブリン溶解に対する耐性を有するフィブリン構造が提供される〔Ariens et al, Blood 100(3), 743-754 (2002)を参照されたい〕。XIII因子は、「フィブリノリガーゼ（fibrinoligase）」および「フィブリン安定化因子（fibrin stabilizing factor）」としても知られている。活性化の際に、XIIIa因子はフィブリン分子および他の基質の側鎖間で分子内ガンマ―グルタミル―ε―リジンのクロスリンクを形成することができる。XIII因子は、血漿および血小板に認められる。前記酵素は、２つのA-サブユニット(「a」とも称される)および２つのBサブユニット(「b」とも称される)からなるテトラマー酵素原〔このテトラマー酵素原は、A2B2と称される（「a2b2」とも称される）〕として血漿中に並びに２つのA-サブユニットからなる酵素原(「a2-ダイマー」とも称される)として血小板中に存在する。
【０００３】
XIII因子を、先天性XIII因子欠損を有している患者における同様に先天性XIII因子欠損を有していない患者における出血を治療するために使用しえることが記載されている〔例えば、US5,114,916, US5,607,917, WO2002038167, WO2002036155, WO200267981, およびWO200267980を参照されたい〕。
【０００４】
US 5,612,456は、酢酸沈殿工程と組み合わせて陰イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーとを用いる、生物学的流体からのXIII因子の調製に関する。
【０００５】
［発明の概要］
本発明は、XIII因子ポリペプチドを生物学的材料から精製するための方法に関し、該方法は前記材料を陰イオン交換マトリックスおよび疎水性相互作用マトリックスでの連続的なクロマトグラフィーに供試することを備える。一態様において、XIII因子ポリペプチドを生物学的材料から精製する方法は、XIII因子-含有沈殿物を産生するための沈殿工程を備えていない。
【０００６】
本発明は、XIII因子ポリペプチドを生物学的材料から精製する方法であって、前記生物学的材料を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料を用いるクロマトグラフィーに供試する工程を備える方法にも関する（ここで、該疎水性相互作用クロマトグラフィー材料は、アマシャムからのPhenyl SepharoseTM High Performance High Substitutionである）。
【０００７】
本発明は、失血を減少させるための、上記方法によって調製されるポリペプチドの使用にも関する。
【０００８】
［発明の詳細な記載］
本発明は、XIII因子ポリペプチドを生物学的材料から精製するための方法に関し、該方法は前記材料を陰イオン交換マトリックスおよび疎水性相互作用マトリックスでの連続的なクロマトグラフィーに供試することを備える。
【０００９】
一態様において、本発明は、以下の工程を備える、XIII因子ポリペプチドを生物学的材料から精製するための方法に関する：
(a)XIII因子ポリペプチドを含んでいる生物学的材料を、第1の陰イオン交換クロマトグラフィー材料上でクロマトグラフィーに供試すること、該クロマトグラフィーは以下を備える：
(i)前記生物学的材料を前記第1の陰イオン交換クロマトグラフィー材料に適用すること；
(ii)非結合性の材料を前記第1の陰イオン交換クロマトグラフィー材料から緩衝液Aで溶出すること（ここで緩衝液Aは、前記第1の陰イオン交換クロマトグラフィー材料に結合しない材料を溶出するために適切である）；および
(iii)前記XIII因子ポリペプチドを前記第1の陰イオン交換クロマトグラフィー材料から緩衝液Aでグラジエント溶出（gradient-elution）で溶出すること（ここで緩衝液Aは、前記XIII因子ポリペプチドを前記第1の陰イオン交換クロマトグラフィー材料から溶出するために適切である）；
(b)工程(iii)からの溶出液を又は工程(iii)からの溶出液の使用により調製された流体を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料を用いたクロマトグラフィーに供試すること、該クロマトグラフィーは以下を備える：
(iv)工程(iii)からの溶出液を又は工程(iii)からの溶出液の使用により調製された流体を、前記疎水性相互作用クロマトグラフィー材料に適用すること；
(v)非結合性の材料を前記クロマトグラフィー材料から緩衝液Bで溶出すること（ここで緩衝液Bは、前記疎水性相互作用クロマトグラフィー材料に結合しない材料を溶出するために適切である）；および
(vi)前記XIII因子ポリペプチドを前記クロマトグラフィー材料から緩衝液Bでグラジエント溶出で溶出すること（ここで緩衝液Bは、前記XIII因子ポリペプチドを前記疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から溶出するために適切である）。
【００１０】
XIII因子ポリペプチドの精製は、サンプル中のXIII因子ポリペプチドの濃度を増加させる方法であり（前記サンプルの他の成分との関係において）、XIII因子ポリペプチドの純度の増加を生じる。サンプル中のXIII因子ポリペプチドの濃度が、該サンプルの他の成分との関係において、前記サンプル中のXIII因子ポリペプチドの濃度と均等ではないことが理解されるべきである。前記XIII因子ポリペプチドの純度の増加は、当該技術分野において既知の方法〔例えば、一例を挙げるとSDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動), HPLC(高速液体クロマトグラフィー)またはBerichromeアッセイ(Dade Behring Diagnostics)〕を使用することによって測定しえる。
【００１１】
XIII因子ポリペプチドには、完全なXIII因子の酵素前駆体テトラマー、A2B2中間体（intermediate）およびXIIIa因子、同様に、そのサブユニット（AサブユニットおよびA2ダイマーが含まれる）、同様に、XIII因子の天然の対立形質バリアントおよびXIII因子の遺伝子改変バリアント（これは特徴的なXIII因子のクロスリンク活性の少なくとも一部を保持している）が含まれる；係るバリアントの例は、野生型ヒトXIII因子のVal34Leuバリアント（即ち、野生型ヒトXIII因子のアミノ酸配列におけるポジション34でのVal残基が、Leu残基で置換されているバリアント）である。係るポリペプチドの誘導体および断片（ここで、誘導体および断片は、特徴的なXIII因子のクロスリンク活性の少なくとも重要な部分が保持されている）も、包含される。ヒトXIII因子の野生型配列は、EP268772およびEP236978に認められる。
【００１２】
本発明の１つの態様において、前記XIII因子ポリペプチドは、組換えXIII因子である。本発明の１つの態様において、前記XIII因子ポリペプチドは、ヒトXIII因子である。本発明の１つの態様において、前記XIII因子ポリペプチドは、Aサブユニットのダイマーである。本発明の１つの態様において、前記XIII因子ポリペプチドは、ヒトAサブユニットのダイマーである。
【００１３】
生物学的材料は、細胞、細胞成分（cell components）または細胞産物（cell products）から由来する又はそれを含有している任意の材料であってもよい。生物学的材料は、生物学的流体（biological fluid）であってもよい。
【００１４】
生物学的流体は、細胞、細胞成分または細胞産物から由来する又は含有している任意の流体であってもよい。生物学的流体には、細胞培養物、細胞培養上清、細胞溶解物（cell lysates）、清澄された細胞溶解物（cleared cell lysates）、細胞抽出物、組織抽出物、血液、血漿、血清、が含まれるが、これらに限定されず、それらの全てはその均質化物（homogenizates）および濾過物、並びにその画分（一例を挙げると、分画されていない生物学的流体のクロマトグラフィーによって収集されるもの）であってもよい。
【００１５】
XIII因子ポリペプチドは、広範囲の生物学的材料から精製してもよく、これには天然でXIII因子ポリペプチドを産生する細胞の溶解物、均質化物、又は抽出物が含まれるが、XIII因子ポリペプチドをコード化しているＤＮＡで形質転換された酵母細胞（一例をあげると、Saccharomyces cerevisiae細胞）などの遺伝的に修飾されてXIII因子ポリペプチドを産生する細胞のものをも含んでいる。
【００１６】
前記生物学的材料は、前記第1の陰イオン交換クロマトグラフィー材料に適用する前に、幾つかの方法を使用することによって処理してもよい。係る方法には、遠心分離、溶解、均質化（homogenization）、及び高圧破壊が含まれるが、これらに限定されない。一態様において、前記生物学的材料は、生物学的流体である。本発明の一態様において、前記生物学的流体は、細胞溶解物の上清である。本発明の一態様において、前記生物学的流体は、酵母の細胞溶解物の上清である。
【００１７】
本発明の一態様において、前記XIII因子ポリペプチドは、上記のような酵母細胞培養物などの細胞培養物から精製される。工程(a)におけるクロマトグラフィー前に、酵母細胞は、溶解緩衝液中で溶解されてもよい。そして、生じた上清を、高圧での破砕（一例を挙げると、約2.0kBar以下、約1.0kBar〜約2.0kBarの圧力、約1.5kBarの圧力などで行われる）に供試してもよく、任意で均質化工程が引き続く。本発明の一態様において、前記細胞を溶解することに使用される緩衝液は、緩衝液Ａである。前記溶解緩衝液は、EDTA(エチレンジアミン四酢酸)、フェナントロリン、ペプスタチン、および特にPMSF(フェニルメチルスルホニルフッ化物)などのプロテアーゼインヒビターを含んでもよいが、他の市販のプロテアーゼインヒビターを使用してもよい。
【００１８】
緩衝液は、特定の物質を含んでいる溶液である。この物質は、少量の酸または塩基が添加された溶液のｐＨの有意な変化を阻止する能力を有し、これによって溶液の最初の酸性度または塩基性度を維持するものである。通常、緩衝液は、弱酸または弱塩基を、その塩と共に含む。
【００１９】
工程(a)におけるクロマトグラフィー前に、緩衝液Ａを、例えば、約１容量で、約２容量で、約３容量で、又は約３容量以上で、前記生物学的材料に添加してもよい。緩衝液Aを使用して、生物学的流体を調製してもよい（例えば、細胞のペレットを緩衝液Ａに再懸濁することによって）。一態様において、緩衝液Aは、細胞の溶解に使用される。
【００２０】
生物学的流体は、遠心分離され、工程(a)におけるクロマトグラフィー前に、任意で濾過されてもよい。
【００２１】
生物学的流体のpHを、工程(a)におけるクロマトグラフィー前に、緩衝液ＡのｐＨに調整してもよい（一例をあげると、1M HClまたは1M NaOHを用いることによって又は当該技術分野における他の既知の手段によって）。
【００２２】
生物学的流体の伝導率を、工程(a)におけるクロマトグラフィー前に、緩衝液Ａの伝導率に調整してもよい（一例をあげると、緩衝液Ａを前記生物学的流体に添加することによって又は当該技術分野における他の既知の手段によって）。
【００２３】
前記第1の陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、１セットの条件下でXIII因子ポリペプチドと結合し、それを異なるセットの条件下で放出する能力を有する、当該技術分野における任意の陰イオン交換クロマトグラフィー材料であってもよい（例えば、四級アンモニウムイオンを含んでいる陰イオン交換クロマトグラフィー材料）。陰イオン交換クロマトグラフィー材料の限定されない更なる例には、誘導化デキストラン（derivatised dextrans）、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、および専門のシリカ（specialty silicas）、例えば、PEI、DEAE、QAE、およびQの誘導体が含まれる。適切な陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、XIII因子ポリペプチドを含んでいる生物学的流体を、選択した陰イオン交換クロマトグラフィー材料上でクロマトグラフィーに供試すること、画分を収集すること、画分の純度および内容量（content）を決定すること〔例えば、SDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動)、HPLC(高速液体クロマトグラフィー)またはBerichromeアッセイ(Dade Behring Diagnostics)を使用することによって〕、溶出物の吸光度を280nmでモニターすることによって、及び当該技術分野において既知の他の方法を使用することによって同定してもよい。適切な陰イオン交換クロマトグラフィー材料の例には、SourceTM 30Q(Amersham Biosciences)、Toyopearl（登録商標）SuperQ-650M(Tosoh Bioscience)、Q-sepharoseTM(Amersham Biosciences)、およびDEAEFast-Flow Sepharose(Amersham Biosciences)が含まれるが、これらに限定されない。第1の陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、生物学的材料の適用前に、緩衝液Ａで前平衡化（pre-equilibrated）されてもよい。
【００２４】
本発明の一態様において、緩衝液Aおよび／または緩衝液A'は、XIII因子ポリペプチドの物理的および／または化学的な安定性を増加させる能力を有する１以上の安定化剤を含む。
【００２５】
本明細書中に使用されるXIII因子ポリペプチドの「物理的な安定性（physical stability）」の用語は、タンパク質の熱機械的ストレス（thermo-mechanical stresses）への暴露の及び／又は不安定な界面（interfaces）および表面（例えば、疎水性の表面および界面）との相互作用の結果として、タンパク質の生物学的に不活性および／または不溶性の凝集物を形成するタンパク質の潜在的な傾向を意味する。緩衝液Aに存在する際のXIII因子ポリペプチドの物理的な安定性は、適切なコンテナ(例えば、カートリッジまたはバイアル)に充填した前記製剤を、機械的／物理的なストレス(例えば、撹拌)に異なる温度で様々な時間で暴露した後で、視覚的な点検および／または濁度測定の手段によって評価されえる。前記製剤の視覚的な点検（Visual inspection）は、暗い背景で焦点を絞った光源（a sharp focused light）において行われえる。前記製剤の濁度（turbidity）は、濁度の度合を、例えば、0から3のスケール（濁りを呈していない製剤は視覚スコア0に対応し、昼光中で視覚的な濁りを呈している製剤は視覚スコア3に対応する）で、視覚的にスコアをつけることによって特徴づけられえる。製剤が昼光中で視覚的な濁度を呈した場合、タンパク質凝集に関して物理的に不安定であると分類される。或いは、製剤の濁度を、当業者に周知の単純な濁度測定によって評価しえる〔一例をあげると、溶液の光学濃度を波長405nm(OD405)で測定すること〕。また、水性のタンパク質製剤の物理的な安定性は、タンパク質のコンホメーション状態の分光学的な薬剤またはプローブを用いることによって評価しえる。前記プローブは、好ましくは、タンパク質の非天然コンフォーマー（non-native conformer）へと優先的に結合する小分子である。タンパク質構造の小分子の分光学的なプローブの一例は、チオフラビンTである。チオフラビンTは、アミロイドフィブリルの検出に広く使用されている蛍光色素である。フィブリルの存在下（おそらく他のタンパク質配置も同様）で、チオフラビンTは、フィブリルタンパク質形態に結合した場合に、新たな最大励起を約 450 nmで及び増強した発光を約 482 nmで発生する。非結合型のチオフラビンTは、前記波長で基本的に非蛍光性（non-fluorescent）である。
【００２６】
他の小分子は、タンパク質構造における天然から非天然の状態への変化のプローブとして使用することができる。一例を挙げると、「疎水性パッチ（hydrophobic patch）」プローブは、タンパク質の暴露した疎水性パッチに優先的に結合する。一般的に、疎水性パッチは、天然の状態においてタンパク質の三次構造内で埋没しているが、タンパク質がアンフォールドする又は変性しはじめると暴露される。これらの小分子、分光学的なプローブの例は、芳香族の、疎水性色素、例えば、アントラセン（antrhacene）、アクリジン、フェナントロリンなどである。他の分光学的なプローブは、金属アミノ酸複合体（metal-amino acid complexes）、例えば、疎水性アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、およびバリンなど）のコバルト金属複合体である。
【００２７】
本明細書中に使用される緩衝液Aに存在する際のXIII因子ポリペプチドの「化学的な安定性（chemical stability）」の用語は、タンパク質構造における化学的な共有結合性の変化であって、天然のタンパク質構造と比較して、潜在的に低い生物学的な作用強度および／または潜在的に増加した免疫原性の特性を有する化学的なデグラデーション産物の形成に至る変化を意味する。様々な化学的なデグラデーション産物は、天然タンパク質のタイプおよび性質に並びに前記タンパク質が暴露される環境に依存して形成されえる。化学的なデグラデーションの除去は、完全に避けることは多分不可能である。そして、化学的なデグラデーション産物の量の増加は、当業者に周知のように、タンパク質製剤の貯蔵および使用の間にしばしば認められる。大抵のタンパク質は、脱アミド（グルタミニルまたはアスパラギニル残基中の側鎖アミド基が加水分解されて、遊離カルボン酸を形成するプロセス）する傾向がある。他のデグラデーション経路には、高分子量転換産物（high-molecular-weight transformation products）の形成が関与し、ここでは２以上のタンパク質分子がアミド基転移および／またはジスルフィド相互作用を介して互いに共有結合で結合されて、共有結合性のダイマー、オリゴマーおよびポリマーのデグラデーション産物の形成に至る(Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, New York 1992)。酸化（例えば、メチオニン残基の）を、化学的なデグラデーションの別のバリアントとして言及することができる。緩衝液Aに存在する際のXIII因子ポリペプチドの化学的な安定性は、異なる環境条件(デグラデーション産物の形成は、例えば、温度を増加させることによってしばしば促進させることができる)に暴露後に、化学的なデグラデーション産物の量を様々な時点で測定することによって評価することができる。各々の個々のデグラデーション産物の量は、分子サイズおよび／または電荷に依存した様々なクロマトグラフィー技術(例えば、SEC-HPLCおよび／またはRP-HPLC)を用いて、デグラデーション産物を分離することによって度々決定される
。
【００２８】
緩衝液Ａに存在する場合に、XIII因子ポリペプチドの物理的および／または化学的な安定性を有意に改善する能力を有する任意の薬剤（例えば、濁度をOD405である期間にわたり測定することによって決定されるような）は緩衝液Ａまたは緩衝液Ａ’における安定化剤（stabilizing agent）として使用しえる。
【００２９】
緩衝液Ａ中の安定化剤として使用するために適切な薬剤は、例えば、塩(例えば、塩化ナトリウム)、糖、アルコール(例えば、C3-C8アルコール)、アルジトール、アミノ酸(例えば、グリシン、L-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、またはスレオニン)、ポリエチレングリコール(例えば、PEG400)、又は１以上のその混合物であってもよい。任意の糖（例えば、モノ-、ジ-、またはポリサッカライド、又は水溶性のグルカン）を、使用しえる。アルジトールは、構造HOCH2-[CH(OH)]n-CH2OH,のポリアルコール（式中のnは、0, 1, 2, 3...）。糖、アルコールまたはアルジトールである物質の限定されることのない例は、果糖, グルコース, マンノース, ソルボース, キシロース, マルトース, ラクトース, スクロース, トレハロース, デキストラン, プルラン, デキストリン, シクロデキストリン, 可溶性デンプン, ヒドロキシエチルスターチ, カルボキシメチルセルロース-Na, マンニトール, ソルビトール, イノシトール, ガラクティトール, ズルシトール, キシリトール, アラビトール, グリセロール(glycerine), プロパン-1,2-ジオール(プロピレングリコール), プロパン-1,3-ジオール, およびブタン-1,3-ジオールである。上記の糖、アルコール、およびアルジトールは、個々に（individually）又は組み合わせて使用してもよい。前記物質が液体の調製物中で可溶性で、溶液中のXIII因子ポリペプチドの物理的な安定性を改善するかぎり、使用される量に定められた制限はない。この点に関して、文献（Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995）を参照されたい。
【００３０】
本発明の一態様において、緩衝液Aは、ポリアルコール型の1以上の安定化剤を含む。
【００３１】
本発明の一態様において、緩衝液Aは、グリセロール(プロパン-1,2,3-triol)、プロピレングリコール(プロパン-1,2-ジオール)、プロパン-1,3-ジオール、プロピルアルコール(1-プロパノール)、およびイソプロピルアルコール(2-プロパノール)からなる群から選択される1以上の安定化剤を含む。本発明の一態様において、緩衝液Aは、グリセロール、プロピレングリコール、およびプロパン-1,3-ジオールからなる群から選択される1以上の安定化剤を含む。本発明の一態様において、緩衝液Aは、プロピレングリコールを含む。
【００３２】
本発明の更なる態様において、緩衝液Aにおける前記安定化剤が液体アルコールまたは液体ポリアルコール[例えば、グリセロール、プロピレングリコール、プロパン-1,3-ジオール、プロピルアルコール、またはイソプロピルアルコール]である場合、前記安定化剤は約5%(v/v)〜約50%(v/v)の濃度で存在する。更なる一態様において、緩衝液Aにおける液体アルコールまたは液体ポリアルコール型の安定化剤は、約10%(v/v)〜約50%(v/v)の濃度で存在する。更なる一態様において、緩衝液Aにおける液体アルコールまたは液体ポリアルコール型の安定化剤は、約10%(v/v)〜約20%(v/v)の濃度で存在する。更なる一態様において、緩衝液Aにおける液体アルコールまたは液体ポリアルコール型の安定化剤は、約10%(v/v)の濃度で存在する。なお更なる一態様において、緩衝液Aにおける液体アルコールまたは液体ポリアルコール型の安定化剤は、約20%(v/v)の濃度で存在する。
【００３３】
緩衝液Aは、プロテアーゼインヒビター、例えば、EDTA(エチレンジアミン四酢酸)、フェナントロリン、ペプスタチン、および特にPMSF(フェニルメチルスルホニルフッ化物)を含んでいてもよいが、他の商業的に利用可能なプロテアーゼインヒビターも使用しえる。
【００３４】
本発明の一態様において、緩衝液AのpHは、6.5および9の間である。更なる一態様において、緩衝液AのpHは、7および9の間である。更なる一態様において、緩衝液AのpHは、約8である。
【００３５】
本発明の一態様において、緩衝液Aの伝導率は、約2mS/cm未満である。
【００３６】
緩衝液A'は、グラジエント溶出によるXIII因子ポリペプチドの溶出に使用される。グラジエント溶出は、緩衝液A'が溶出の過程で変化することを意味する。典型的には、工程(ii)における洗浄に使用される緩衝液（このケースでは緩衝液Ａ）の１以上の成分の濃度が、溶出の過程で増加する若しくは減少する又は新規の成分が前記緩衝液に添加される。そして、この成分の濃度は、次に溶出の過程で増加する。この増加または減少は、当該技術分野において既知の、連続的な又は別々の工程で生じえる。陰イオン交換クロマトグラフィー材料に結合する材料を溶出させるために、塩（一例を挙げると、NaCl）を緩衝液Aに添加すること（緩衝液A'が作出される）は慣習的になされており、少なくとも大多数の結合XIII因子ポリペプチドが溶出されるまで、前記塩の濃度が増加される。さらなる処理（一例を挙げると、XIII因子ポリペプチド溶出の最初に又は最後に溶出してくる望まれない不純物を除去するための）のためにプールするXIII因子ポリペプチドを、どの画分が含有しているかを決定することは、当業者の知識の範囲内である。同様に、陰イオン交換クロマトグラフィーを行う一般的な技術（一例を挙げると、陰イオン交換クロマトグラフィー材料の前平衡, 溶出時間, 洗浄, 再生に関する）は、周知である。
【００３７】
XIII因子ポリペプチドを工程(iii)で溶出した後に、XIII因子ポリペプチドを含有している溶出物が、工程（iv）のために、XIII因子ポリペプチドの沈殿が関与する仲介的な工程を行うことなく得られる。幾つかのXIII因子ポリペプチドは溶出物の取扱いおよび処理に依存して沈殿しえる。しかし、意図的にXIII因子ポリペプチドを沈殿させる工程を行なうべきではない。他の介在的な工程を、設けてもよい。溶出液を、例えば、4゜Cで24時間以上（または、例えば、-80゜Cで）で維持してもよい。
【００３８】
工程(b)で使用するための疎水性相互作用クロマトグラフィー材料は、１セットの条件下でXIII因子ポリペプチドと結合し、それを異なるセットの条件下で放出する能力を有する、当該技術において既知の任意の疎水性相互作用クロマトグラフィー材料であってもよい（例えば、フェニル、ブチル、またはオクチル基で、またはポリアクリルレジンで誘導体化された疎水性相互作用クロマトグラフィー材料）。適切な疎水性相互作用クロマトグラフィー材料の限定されない例は、AmberchromTM CG71(Tosoh Bioscience), Phenyl SepharoseTM High Performance(Amersham, cat no 17-1082), Phenyl SepharoseTM 6 Fast Flow High Substitution(Amersham, cat no 17-0973), Toyopearl（登録商標）Butyl 650(Tosoh Bioscience), Toyopearl（登録商標）Phenyl (Tosoh Bioscience), SourceTM 15Phe(Amersham, cat no 17-0147), Butyl SepharoseTM High Performance High Substitution(Amersham, cat no 17-3100), Octyl-SepharoseTM(Amersham, cat no 17-0946)およびPhenyl SepharoseTM High Performance High Substitution(Amersham)などである。本発明の一態様において、前記疎水性相互作用クロマトグラフィー材料は、フェニルをリガンドとして使用する。
【００３９】
緩衝液Bを、段階（iii）からの溶出物に、又は工程（ｂ）でのクロマトグラフィー前に段階（iii）からの溶出物を約１から３容量以上で使用することによって調製された流体に、添加してもよい、或いは、濃縮バージョンの緩衝液Ｂ（緩衝液Ｂと同じ構成成分を含んでいるが、例えば、４倍の濃度を有する）が、段階（iii）からの溶出物に又は段階（iii）からの溶出物を濃縮緩衝液（２倍濃縮された緩衝剤が、１容量の量に添加される）の強度に相当する量で使用することによって調製された流体に、添加される。次に、pHが、緩衝液ＢのpHに調整される。
【００４０】
緩衝液Bは、プロテアーゼインヒビター、例えば、EDTA(エチレンジアミン四酢酸)、フェナントロリン、ペプスタチン、および特にPMSF(フェニルメチルスルホニルフッ化物)を含んでいてもよいが、他の商業的に利用可能なプロテアーゼインヒビターも使用しえる。
【００４１】
緩衝液Bは、約6〜約8（一例を挙げると、約7.5）のpHを有してもよい。本発明の一態様において、緩衝液Bは、25mS/cmを超える伝導率を有する。本発明の別の態様において、緩衝液Bは、最大で50mS/cmの伝導率を有する。これは、例えば、リン酸緩衝液の使用によって又は当該技術において既知の他の手段によって達成されえる。本発明の一態様において、工程(iii)からの溶出液の又は工程(iii)からの溶出液を使用することによって調製される流体の伝導率は、少なくとも約25mS/cmの伝導率に調整される。
【００４２】
緩衝液B'は、グラジエント溶出によるXIII因子ポリペプチドの溶出に使用される。グラジエント溶出において、組成物B'の組成は、溶出の過程で変化する。典型的には、工程(v)における洗浄に使用される緩衝液（このケースでは緩衝液B）の１以上の成分の濃度が、溶出の過程で増加する若しくは減少するか又は新規の成分が前記緩衝液に添加される。そして、この成分の濃度は、次に溶出の過程で増加する。この増加または減少は、当該技術分野において周知の、連続的な又は別々の工程で生じえる。疎水性相互作用クロマトグラフィー材料に結合する材料を溶出させるために、少なくとも大多数の結合XIII因子ポリペプチドが溶出されるまで、洗浄緩衝液を水で希釈することが慣習的になされている。さらなる処理（一例を挙げると、XIII因子ポリペプチド溶出の最初に又は最後に溶出してくる望まれない不純物を除去するための）のためにプールするXIII因子ポリペプチドを、どの画分が含有しているかを決定することは、当業者の知識の範囲内である。同様に、疎水性相互作用クロマトグラフィーを行う一般的な技術（一例を挙げると、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料の前平衡, 溶出時間, 洗浄, 再生に関する）は、周知である。
【００４３】
本発明の一態様において、段階（vi）からの溶出物又は段階（vi）からの溶出物を使用することによって調製される流体は、下記の工程を備えている方法を使用することによって処理される：
(1)XIII因子ポリペプチドの安定性を増加させる能力を有する１以上の安定化剤を、その安定性を有意に改善させるのに効果的な量で添加すること、および／または、
(2)段階（vi）からの溶出物の又は段階（vi）からの溶出物を使用して調製された流体のpHを、約7および約8の間のpHへと調整すること。
【００４４】
これらの工程（及び、任意で、当該技術において、既知の後処理の他の工程）は、単独で又は組合わせて実施しえる（前記工程が実施される順番は、重要ではない）。当業者は、これらの工程を、如何にして、いつ実施するかを決定することができる。
【００４５】
工程(1)で言及した安定化剤は、上記のとおり、XIII因子ポリペプチドの物理的および／または化学的な安定性を増加させる能力を有するべきである。XIII因子ポリペプチドの物理的および／または化学的な安定性を有意に改善する能力を有する任意の薬剤（例えば、濁度をOD405である期間にわたり測定することによって決定されるような）を、工程(1)における安定化剤として使用しえる。
【００４６】
工程(1)中の安定化剤として使用するために適切な薬剤は、例えば、塩(例えば、塩化ナトリウム)、糖、アルコール(例えば、C3-C8アルコール)、アルジトール、アミノ酸(例えば、グリシン、L-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、またはスレオニン)、ポリエチレングリコール(例えば、PEG400)、又は１以上のその混合物であってもよい。任意の糖（例えば、モノ-、ジ-、またはポリサッカライド、又は水溶性のグルカン）を、使用しえる。糖、アルコールまたはアルジトールである物質の限定されることのない例は、果糖, グルコース, マンノース, ソルボース, キシロース, マルトース, ラクトース, スクロース, トレハロース, デキストラン, プルラン, デキストリン, シクロデキストリン, 可溶性デンプン, ヒドロキシエチルスターチ, カルボキシメチルセルロース-Na, マンニトール, ソルビトール, イノシトール, ガラクティトール, ズルシトール, キシリトール, アラビトール, グリセロール(glycerine), プロパン-1,2-ジオール(プロピレングリコール), プロパン-1,3-ジオール, およびブタン-1,3-ジオールである。上記の糖、アルコール、およびアルジトールは、個々に（individually）又は組み合わせて使用してもよい。前記物質が液体の調製物中で可溶性で、溶液中のXIII因子ポリペプチドの物理的な安定性を改善するかぎり、使用される量に定められた制限はない。この点に関して、文献（Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995）を参照されたい。
【００４７】
本発明の一態様において、工程(1)で使用される安定化剤は、ポリアルコールである。
【００４８】
本発明の一態様において、工程(1)で使用される安定化剤は、グリセロール(プロパン-1,2,3-トリオール), プロピレングリコール(プロパン-1,2-ジオール), プロパン-1,3-ジオール, プロピルアルコール(1-プロパノール)およびイソプロピルアルコール(2-プロパノール)からなる群から選択される。本発明の一態様において、工程(1)で使用される安定化剤は、グリセロール, プロピレングリコールおよびプロパン-1,3-ジオールからなる群から選択される。本発明の一態様において、工程(1)で使用される安定化剤は、プロピレングリコールである。
【００４９】
本発明の更なる態様において、工程(1)で使用される安定化剤が液体アルコールまたは液体ポリアルコール[例えば、グリセロール、プロピレングリコール、プロパン-1,3-ジオール、プロピルアルコール、またはイソプロピルアルコール]である場合、それは約5%(v/v)〜約50%(v/v)の濃度で添加される。更なる一態様において、工程（１）で使用される液体アルコールまたは液体ポリアルコール型の安定化剤は、約10%(v/v)〜約50%(v/v)の濃度まで添加される。更なる一態様において、工程（１）で使用される液体アルコールまたは液体ポリアルコール型の安定化剤は、約10%(v/v)〜約20%(v/v)の濃度まで添加される。更なる一態様において、工程（１）で使用される液体アルコールまたは液体ポリアルコール型の安定化剤は、約10%(v/v)の濃度まで添加される。なお更なる一態様において、工程（１）で使用される液体アルコールまたは液体ポリアルコール型の安定化剤は、約20%(v/v)の濃度まで添加される。
【００５０】
本発明の一態様において、工程（１）で使用された安定化剤は、緩衝液Ａに使用された安定化剤と同じである。本発明の更なる態様において、安定化剤は、緩衝液Ａに使用された安定化剤の濃度と類似する濃度で添加される。
【００５１】
本発明の一態様において、工程（２）のpHは、約7.5に調整される。
【００５２】
XIII因子ポリペプチドを工程(vi)で溶出した後、XIII因子ポリペプチドを含有している溶出物は、沈殿工程に供試すべきではない。幾つかのXIII因子ポリペプチドは溶出物の取扱いおよび更なる処理に依存して沈殿する可能性がある。しかし、意図的にXIII因子ポリペプチドを沈殿させる工程を行なうべきではない。他の介在的な工程を、設けてもよい。溶出液を、例えば、4゜Cで24時間以上（または、例えば、-80゜Cで）で維持してもよい。
【００５３】
本発明の一態様において、前記方法は、段階（vi）からの溶出物を又は段階（vi）からの溶出物の使用によって調製される流体を、第２の陰イオン交換クロマトグラフィー材料上でクロマトグラフィーに供試する工程をさらに備え、該クロマトグラフィーは以下を備える：
(vii)段階(vi)からの溶出液を又は段階(vi)からの溶出液の使用により調製された流体を、前記第２の陰イオン交換クロマトグラフィー材料に適用すること；
(viii)非結合性の材料を前記第２の陰イオン交換クロマトグラフィー材料から緩衝液Cで溶出すること（ここで緩衝液Cは、前記第２の陰イオン交換クロマトグラフィー材料に結合しない材料を溶出するために適切である）；および
(ix)前記XIII因子ポリペプチドを前記第２の陰イオン交換クロマトグラフィー材料から緩衝液C'で溶出すること〔ここで緩衝液C'は、工程（viii）で前記第２の陰イオン交換クロマトグラフィー材料に結合するXIII因子ポリペプチドを溶出するために適切である〕。
【００５４】
段階(vi)からの溶出物を使用することによって調製された流体は、一例を挙げると、上記の工程(1)および(2)の１つ又は両方を備えている方法を使用することによって調製されてもよい。
【００５５】
本発明の一態様において、段階(vi)からの溶出液の又は段階(vi)からの溶出液を使用することによって調製される流体の伝導率は、少なくとも約2mS/cm未満に調整される。
【００５６】
緩衝液Cおよび緩衝液C'の成分は、XIII因子ポリペプチドの所望の最終の薬学的組成物の観点で選択されえる。係る考慮は、当業者の知識の範囲内である。
【００５７】
本発明の一態様において、緩衝液Cは、1以上の安定化剤を含む；この安定化剤は、上記のとおり、XIII因子ポリペプチドの物理的および／または化学的な安定性を増加させる能力がある。緩衝液Cに存在する場合に、XIII因子ポリペプチドの物理的および／または化学的な安定性を有意に改善する能力を有する任意の薬剤（例えば、濁度をOD405である期間にわたり測定することによって決定されるような）を、緩衝液Cまたは緩衝液C'における安定化剤として使用しえる。
【００５８】
緩衝液C中の安定化剤として使用するために適切な薬剤は、例えば、塩(例えば、塩化ナトリウム)、糖、アルコール(例えば、C3-C8アルコール)、アルジトール、アミノ酸(例えば、グリシン、L-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、またはスレオニン)、ポリエチレングリコール(例えば、PEG400)、又は１以上のその混合物であってもよい。任意の糖（例えば、モノ-、ジ-、またはポリサッカライド、又は水溶性のグルカン）を、使用しえる。糖、アルコールまたはアルジトールである物質の限定されることのない例は、果糖, グルコース, マンノース, ソルボース, キシロース, マルトース, ラクトース, スクロース, トレハロース, デキストラン, プルラン, デキストリン, シクロデキストリン, 可溶性デンプン, ヒドロキシエチルスターチ, カルボキシメチルセルロース-Na, マンニトール, ソルビトール, イノシトール, ガラクティトール, ズルシトール, キシリトール, アラビトール, グリセロール(glycerine), プロパン-1,2-ジオール(プロピレングリコール), プロパン-1,3-ジオール, およびブタン-1,3-ジオールである。上記の糖、アルコール、およびアルジトールは、個々に（individually）又は組み合わせて使用してもよい。前記物質が液体の調製物中で可溶性で、溶液中のXIII因子ポリペプチドの物理的な安定性を改善するかぎり、使用される量に定められた制限はない。この点に関して、文献（Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995）を参照されたい。
【００５９】
本発明の一態様において、緩衝液Cは、ポリアルコール型の1以上の安定化剤を含む。
【００６０】
本発明の一態様において、緩衝液Cは、グリセロール(プロパン-1,2,3-triol)、プロピレングリコール(プロパン-1,2-ジオール)、プロパン-1,3-ジオール、プロピルアルコール(1-プロパノール)、およびイソプロピルアルコール(2-プロパノール)からなる群から選択される1以上の安定化剤を含む。本発明の一態様において、緩衝液Cは、グリセロール、プロピレングリコール、およびプロパン-1,3-ジオールからなる群から選択される1以上の安定化剤を含む。本発明の一態様において、緩衝液Cは、プロピレングリコールを含む。
【００６１】
本発明の更なる態様において、緩衝液C中の安定化剤が液体アルコールまたは液体ポリアルコール[例えば、グリセロール, プロピレングリコール, プロパン-1,3-ジオール, プロピルアルコールまたはイソプロピルアルコールなど]である場合、それは約5%(v/v)〜約50%(v/v)の濃度で存在する。更なる一態様において、緩衝液Cにおける液体アルコールまたは液体ポリアルコール型の安定化剤は、約10%(v/v)〜約50%(v/v)の濃度で存在する。更なる一態様において、緩衝液Cにおいて使用される液体アルコールまたは液体ポリアルコール型の安定化剤は、約10%(v/v)〜約20%(v/v)の濃度で存在する。更なる一態様において、緩衝液Cにおける液体アルコールまたは液体ポリアルコール型の安定化剤は、約10%(v/v)の濃度で存在する。なお更なる一態様において、緩衝液Cにおける液体アルコールまたは液体ポリアルコール型の安定化剤は、約20%(v/v)の濃度で存在する。
【００６２】
本発明の一態様において、緩衝液Cは、緩衝液Aに使用されたものと同じ安定化剤を含む。本発明の更なる態様において、緩衝液Cは、緩衝液A中の安定化剤と類似する濃度の安定化剤を含む。
【００６３】
XIII因子ポリペプチドの凍結乾燥製剤が考慮される場合、緩衝液Cおよび／または緩衝液C'は、例えば、プロピレングリコールなどの代わりに、凍結乾燥に適切なスクロースまたはマンニトールまたは1以上の他の構成成分（ingredients）を具備すべきである。
【００６４】
緩衝液C'はグラジエント溶出によるXIII因子ポリペプチドの溶出に使用され、緩衝液C'の組成物は溶出の過程で変化する。緩衝液C'は、典型的には工程(viii)での洗浄に使用される緩衝液に由来する（このケースでは緩衝液C）、後者の緩衝液の１以上の成分の濃度は、溶出の過程で増加する又は減少する。或いは、新たな成分が、後者の緩衝液に添加される。そして、本成分の濃度は、溶出の過程で増加する。この増加または減少は、当該技術分野において周知の、連続的な又は別々の工程で生じえる。陰イオン交換クロマトグラフィー材料に結合する材料の溶出に関して、緩衝液Cは、典型的には緩衝液Cに塩（例えば、NaCl）を添加することに由来するものであり、少なくとも大多数の結合XIII因子ポリペプチドが溶出されるまで、前記塩の濃度が増加される。さらなる処理（一例を挙げると、XIII因子ポリペプチド溶出の最初に又は最後に溶出してくる望まれない不純物を除去するための）のためにプールされたXIII因子ポリペプチドが、どの画分に含有されているかを決定することは、当業者の知識の範囲内である。同様に、陰イオン交換クロマトグラフィーを行う一般的な技術（一例を挙げると、陰イオン交換クロマトグラフィーの前平衡, 溶出時間, 洗浄, 再生に関する）は、周知である。
【００６５】
伝導率およびpH、同様にXIII因子ポリペプチドを含んでいる溶出物の他のパラメーターは、当該技術分野において既知の手段による溶出後に調整されてもよい。
【００６６】
本発明の一態様において、前記方法は、段階(vi)からの溶出物を又は段階(vi)からの溶出物の使用によって調製された流体を、当該技術分野において既知の様式で限外濾過へと供試する工程をさらに備える。
【００６７】
本発明の一態様において、前記方法は、段階(vi)からの溶出物を又は段階(vi)からの溶出物の使用によって調製された流体を、当該技術分野において既知の様式でダイアフィルトレーション（diafiltration）へと供試する工程をさらに備える。
【００６８】
本発明による方法の一態様において、該方法はXIII因子ポリペプチド含有沈殿物を産生させるための沈殿工程を備えない。幾つかのXIII因子ポリペプチドは、XIII因子ポリペプチドを含有している流体の取扱いおよび処理に依存して沈殿しえるが、意図的にXIII因子ポリペプチドを沈殿させるための工程を行なうべきではない。
【００６９】
本発明は、本発明による方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドを含んでいる薬学的組成物を提供する。一態様において、係る薬学的組成物は、約2.0〜約10.0のpHを有する。薬学的組成物は、緩衝系、保存剤、張性調整剤（tonicity-adjusting agent）、キレート剤、安定剤（stabilizer）および／または界面活性剤をさらに具備してもよい。本発明の一態様において、薬学的製剤は水性製剤（即ち、液体の水を含んでいる製剤）である。係る製剤は、典型的には溶液または懸濁物である。本発明の更なる態様において、前記薬学的組成物は、水溶液である。本発明に使用される「水性製剤（aqueous formulation）」の用語は、少なくとも50重量%(w/w)の水を含んでいる製剤を意味する。同様に、「水溶液（aqueous solution）」の用語は、少なくとも50%（w/w）の水を含んでいる溶液を意味する。また「水性懸濁物（aqueous suspension）」の用語は、少なくとも50%（w/w）の水を含んでいる懸濁物を意味する。
【００７０】
一態様において、水性製剤の形態での本発明の薬学的組成物のXIII因子ポリペプチドは、約0.2mg/ml〜約30mg/ml、例えば、約0.2mg/ml〜約10mg/ml、例えば、約0.5mg/ml〜約10mg/ml、例えば、約1mg/ml〜約10mg/mlの濃度で存在する。
【００７１】
一態様において、前記薬学的製剤は、医師または患者によって使用前に溶媒および／または希釈剤が添加されることが意図される乾燥製剤（例えば、フリーズドライまたはスプレードライ製剤）である。
【００７２】
一態様において、本発明は、本発明による方法の使用によって調製されるXIII因子ポリペプチドの水溶液と共に緩衝剤を含んでいる薬学的組成物に関する（ここで前記製剤は、約2.0〜約10.0のpHを有する）。
【００７３】
本発明の一態様において、前記製剤のpHは、2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, および 10.0からなるリストから選択される。
【００７４】
本発明の更なる態様において、前記緩衝液は、酢酸緩衝液, 炭酸緩衝液, クエン酸緩衝液, グリシルグリシン緩衝液, ヒスチジン緩衝液, グリシン緩衝液, リジン緩衝液, アルギニン緩衝液, リン酸緩衝液（例えば、リン酸二水素ナトリウム, リン酸水素二ナトリウム, リン酸三ナトリウムを含有する）, トリス［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］緩衝液, ビシン緩衝液, トリシン緩衝液, リンゴ酸緩衝液, スクシナート緩衝液, マレイン酸緩衝液, フマル酸緩衝液, 酒石酸緩衝液, アスパラギン酸緩衝液及びその混合物からなる群から選択される。
【００７５】
本発明の一態様において、前記製剤は、さらに薬学的に許容される保存剤を含む。本発明の更なる態様において、前記保存剤は、フェノール, o-クレゾール, m-クレゾール, p-クレゾール, クロロクレゾール, メチル p-ヒドロキシルベンゾアート, エチル p-ヒドロキシルベンゾアート, プロピル p-ヒドロキシルベンゾアート, ブチル p-ヒドロキシルベンゾアート, 2-フェノキシエタノール, 2-フェニルエタノール, ベンジルアルコール, クロロブタノール, チメロサール（thiomerosal）, ブロノポール, 安息香酸, イミド尿素（imidurea）, クロロヘキシジン（chlorohexidine）, デヒドロ酢酸ナトリウム, 塩化ベンゼトニウム, クロルフェネシン(3p-クロルフェノキシプロパン-1,2-ジオール)及びその混合物からなる群から選択される。本発明の更なる態様において、前記保存剤は、0.1 mg/ml〜20 mg/mlの濃度で存在する。本発明の更なる態様において、前記保存剤は、0.1 mg/ml〜5 mg/mlの濃度で存在する。本発明の更に別の態様において、前記保存剤は、5 mg/ml〜10 mg/mlの濃度で存在する。本発明の更に別の態様において、前記保存剤は、10 mg/ml〜20 mg/mlの濃度で存在する。薬学的組成物における保存剤の使用は、当業者に周知である（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995を参照されたい）。
【００７６】
本発明の一態様において、製剤は、張性調整剤（通常、製剤を実質的に等張にする目的で導入される）を更に含む。本発明の更なる態様において、前記張性調整剤は、塩(例えば、塩化ナトリウム), 糖, アルコール(例えば、C3-C8 アルコール), アルジトール, アミノ酸(例えば、グリシン, L-ヒスチジン, アルギニン, リジン, イソロイシン, アスパラギン酸, トリプトファンまたはスレオニン), ポリエチレングリコール(例えば、PEG400), 及びその混合物のなかから選択される。任意の糖（例えば、モノ-、ジ-、またはポリサッカライド、又は水溶性のグルカン）を、使用しえる。糖、アルコールまたはアルジトールである物質の限定されることのない例は、果糖, グルコース, マンノース, ソルボース, キシロース, マルトース, ラクトース, スクロース, トレハロース, デキストラン, プルラン, デキストリン, シクロデキストリン, 可溶性デンプン, ヒドロキシエチルスターチ, カルボキシメチルセルロース-Na, マンニトール, ソルビトール, イノシトール, ガラクティトール, ズルシトール, キシリトール, アラビトール, グリセロール(glycerine), プロパン-1,2-ジオール(プロピレングリコール), プロパン-1,3-ジオール, およびブタン-1,3-ジオールである。上記の糖、アルコール、およびアルジトールは、個々に（individually）又は組み合わせて使用してもよい。前記物質が液体の調製物中で可溶性であるかぎり、使用される量に定められた制限はない。
【００７７】
一態様において、前記張性調整剤は、約1 mg/ml〜約150 mg/mlの濃度で存在する。本発明の更なる態様において、前記張性調整剤は、約1 mg/ml〜約50 mg/mlの濃度で存在する。本発明の別の態様において、前記張性調整剤は、約1 mg/ml〜約7 mg/mlの濃度で存在する。本発明の更なる態様において、前記張性調整剤は、約8 mg/ml〜約24 mg/mlの濃度で存在する。本発明の更なる態様において、前記張性調整剤は、約25 mg/ml〜約50 mg/mlの濃度で存在する。薬学的組成物における張性調整剤の使用は、当業者に周知である（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995を参照されたい）。
【００７８】
本発明の一態様において、前記製剤は、さらにキレート剤を含む。本発明の更なる態様において、前記キレート剤は、EDTA、クエン酸、およびアスパラギン酸の塩、並びにその混合物から選択される。本発明の更なる態様において、前記キレート剤は、0.1 mg/ml〜5 mg/mlの濃度で存在する。本発明の一態様において、前記キレート剤は、0.1 mg/ml〜2 mg/mlの濃度で存在する。本発明の別の態様において、前記キレート剤は、2 mg/ml〜5 mg/mlの濃度で存在する。薬学的組成物におけるキレート剤の使用は、当業者に周知である（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995を参照されたい）。
【００７９】
本発明の薬学的組成物には、治療的に活性な成分として、液体の薬学的組成物中で保存される間に凝集物形成を呈する可能性のあるポリペプチドが含まれる。「凝集物形成（aggregate formation）」の用語は、オリゴマー（可溶性が残存しえる）または溶液から沈殿した大きな可視の凝集物の形成を生じるポリペプチド分子間の物理的な相互作用を指摘することを意図している。「貯蔵される間（during storage）」の用語は、一度調製された液体の薬学的組成物または製剤が被験者に即座に投与されないことを意味する。むしろ、調製に引続いて、それは被験者への投与に適切な、後の液体形態または他の形態への再構成のために、液体形態、凍結状態、又は乾燥形態への何れかでの貯蔵のためにパッケージされる。「乾燥形態（dried form）」の用語は、液体の薬学的組成物または製剤が、フリーズドライ［即ち、凍結乾燥;例えば、Williams and Polli (1984), J. Parenteral Sci. Technol. 38:48-59を参照されたい］により、スプレードライ［Masters (1991) in Spray-Drying Handbook (5th ed; Longman Scientific and Technical, Essex, U.K.), pp. 491-676; Broadhead et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206; およびMumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11:12-20を参照されたい］により、又は空気乾燥［Carpenter and Crowe (1988), Cryobiology 25:459-470; およびRoser (1991) Biopharm. 4:47-53］により乾燥されることを意味する。液体の薬学的組成物の貯蔵間のポリペプチドによる凝集物形成は、そのポリペプチドの生物活性に不利に影響しえるものであり、前記薬学的組成物の治療上の有効性の欠損を生じる。さらにまた、凝集物形成は、ポリペプチド含有薬学的組成物が輸液システムを用いて投与されるときのチュービング（tubing）、膜、又はポンプの閉塞（blockage）などの他の問題の原因となりえる。
【００８０】
本発明の一態様において、薬学的組成物は、前記組成物の貯蔵間のポリペプチドによる凝集物形成を減少させるために十分なアミノ酸塩基の量を含む。「アミノ酸塩基（amino acid base）」の用語は、任意の所与のアミノ酸が、その遊離塩基の形態（its free base form）又はその塩の形態（its salt form）の何れかで存在する、アミノ酸又はアミノ酸の組合わせを指摘する。アミノ酸の組合わせが使用される場合、全てのアミノ酸は、それらの遊離塩基の形態で存在してもよい、全てがそれらの塩の形態で存在してもよい、又は幾つかがそれらの遊離塩基の形態で存在し、他方で他はそれらの塩の形態で存在してもよい。一態様において、本発明の組成物を調製することに使用するアミノ酸は、例えば、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸などの荷電側鎖を保持しているものである。特定のアミノ酸(メチオニン, ヒスチジン, アルギニン, リジン, イソロイシン, アスパラギン酸, トリプトファン, スレオニン及びその混合物)の任意の立体異性体（即ち、LまたはD）又はこれらの立体異性体の組合わせ又はグリシン又は有機塩基（例えば、イミダゾールであるが、限定されない）は、前記特定のアミノ酸または有機塩基がその遊離塩基の形態又はその塩の形態の何れかで存在するかぎり、本発明の薬学的組成物に存在してもよい。一態様において、アミノ酸のL-立体異性体が使用される。また、本発明の組成物は、これらのアミノ酸のアナログと処方されてもよい。「アミノ酸アナログ（amino acid analogue）」は、本発明の液体の薬学的組成物の貯蔵間のポリペプチドによる凝集物形成を減少させる所望の効果を生じせしめる天然アミノ酸の誘導体（derivative）を意図している。適切なアルギニンアナログには、例えば、アミノグアニジン（aminoguanidine）、オルニチンおよびN-モノエチルL-アルギニンが含まれる。適切なメチオニンアナログには、エチオニンおよびブチオニン（buthionine）が含まれる。並びに適切なシステインアナログには、S-メチル-Lシステインが含まれる。他のアミノ酸と同様に、アミノ酸アナログは、それらの遊離塩基の形態又はそれらの塩の形態の何れかで前記組成物に導入される。化合物イミダゾールも、本発明によるアミノ酸アナログとして認められる。
【００８１】
本発明の一態様において、前記アミノ酸またはアミノ酸アナログは、前記タンパク質の凝集を阻止する又は遅延（delay）させるのに十分な濃度で使用される。
【００８２】
本発明の一態様において、本発明の薬学的組成物は、XIII因子ポリペプチドがメチオニン残基のスルホキシド型への酸化に感受性の少なくとも１つのメチオニン残基を具備しているポリペプチドである場合に、係る酸化を阻害するために、メチオニン(または他の硫黄性アミノ酸またはアミノ酸アナログ)を含む。「酸化の阻害（inhibit oxidation）」の用語は、酸化種（メチオニンの）の時間経過に伴う蓄積の最小化を指摘することを意図している。メチオニン酸化の阻害によって、前記ポリペプチドを、その適切な分子形態によりよく保持することとなる。メチオニン(LまたはD異性体)の任意の立体異性体又はその組合わせを使用することができる。添加すべき量は、メチオニン残基の酸化を阻害するために十分な量にすべきであり、メチオニンのスルホキシド型の量が管理機関（regulatory agencies）に認可されるような量にすべきである。典型的には、この事項は、前記組成物が約10%〜約30%のメチオニンスルホキシド型以下を含有することを意味している。一般に、この事項は、付加されるメチオニンとメチオニン残基とのモル比が約1:1〜約1000:1（例えば、10:1〜約100:1）の範囲であるような量でメチオニンを添加することで達成することができる。
【００８３】
本発明の一態様において、薬学的組成物は、さらに安定剤を含む。薬学的組成物における安定剤の使用は、当業者に周知である（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995を参照されたい）。本発明の一態様において、薬学的組成物は、高分子量ポリマーから又は低分子化合物から選択される安定剤を含む。更なる態様において、安定剤は、ポリエチレングリコール(例えば、PEG3350)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルピロリドン、カルボキシル-/ヒドロキシセルロース（hydroxycellulose）及びその誘導体(HPC, HPC-SL, HPC-LおよびHPMCが含まれる)、シクロデキストリン、モノチオグリセロール、チオグリコール酸および2-メチルチオエタノールのようなイオウ含有物質、並びに様々な塩(例えば、塩化ナトリウム)、グリセロール, プロピレングリコール, プロパン-1,3-ジオール, プロピルアルコール(1-プロパノール)およびイソプロピルアルコール(2-プロパノール)から選択される。
【００８４】
また、本発明の薬学的組成物は、そのなかの治療的に活性なポリペプチドの安定性をさらに増強する付加的な安定化剤を具備する。本発明に関する特に重要な安定化剤には、メチオニンおよびEDTA（メチオニン酸化に対して前記ポリペプチドを防御する）、および非イオン性界面活性剤（凍結融解または機械的剪断に関連する凝集に対して前記ポリペプチドを防御する）が含まれるが、これらに限定されない。
【００８５】
本発明の一態様において、薬学的な組成物または製剤は、さらに界面活性剤を含む。更なる態様において、前記界面活性剤は、洗剤（detergent）, エトキシル化ヒマシ油（ethoxylated castor oil）, ポリグリコール化グリセリド（polyglycolyzed glycerides）, アセチル化モノグリセリド, ソルビタン脂肪酸エステル, ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロックポリマー(例えば、ポロキサマー、例えば、Pluronic(登録商標) F68, ポロキサマー 188 および407, トリトン X-100), ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル, ポリオキシエチレンおよびポリエチレン誘導体（例えば、アルキル化およびアルコキシル化誘導体(tweens, 例えば、 Tween-20, Tween-40, Tween-80 およびBrij-35), モノグリセリド及びそのエトキシル化誘導体, ジグリセリド及びそのポリオキシエチレン誘導体, アルコール, グリセロール, レクチンおよびリン脂質(例えば、ホスファチジルセリン, ホスファチジルコリン, ホスファチジルエタノールアミン, ホスファチジルイノシトール, ジホスファチジルグリセロールおよびスフィンゴミエリン), リン脂質の誘導体(例えば、ジパルミトイルホスファチジン酸)およびリゾリン脂質(例えば、パルミトイルリゾホスファチジル-L-セリンおよびエタノールアミン, コリン, セリンまたはスレオニンの1-アシル-sn-グリセロ-3-リン酸エステル)、およびリゾホスファチジルおよびホスファチジルコリンのアルキル, アルコキシル(アルキルエステル)およびアルコキシ(アルキルエーテル)-誘導体、例えば、リゾホスファチジルコリンのラウロイルおよびミリストイル誘導体, ジパルミトイルホスファチジルコリン, および, 極性の頭部基（head group）の修飾体, 即ち、コリン, エタノールアミン, ホスファチジン酸, セリン, スレオニン, グリセロール, イノシトール, および陽性荷電のDODAC, DOTMA, DCP, BISHOP, リゾホスファチジルセリンおよびリゾホスファチジルスレオニン, およびグリセロリン脂質(例えば、セファリン), グリセロ糖脂質 (例えば、ガラクトピラノシド), スフィンゴ糖脂質 (例えば、セラミド, ガングリオシド), ドデシルホスホコリン, ニワトリ卵リゾレシチン, フシジン酸誘導体-(例えば、タウロ-ジヒドロフシジン酸ナトリウムなど), 長鎖脂肪酸［C6-C12(例えば、オレイン酸またはカプリル酸)］及びその塩, アシルカルニチン及びその誘導体, リジン, アルギニンおよびヒスチジンのNα-アシル化誘導体, リジンおよびアルギニンの側鎖アシル化誘導体（side-chain acylated derivatives）, リジン, アルギニンおよびヒスチジンおよび中性または酸性アミノ酸の何れかの組合わせを具備しているジペプチドのNα-アシル化誘導体, 中性アミノ酸および２荷電化アミノ酸（two charged amino acids）の何れかの組合わせを具備しているトリペプチドのNα-アシル化誘導体, DSS (ドキュセートナトリウム, CAS登録番号[577-11-7]), ドキュセートカルシウム, CAS登録番号[128-49-4]), ドキュセートカリウム, CAS登録番号[7491-09-0]), SDS (ドデシル硫酸ナトリウムまたはラウリル硫酸ナトリウム), カプリル酸ナトリウム, コール酸及びその誘導体, 胆汁酸及びその塩、およびグリシンまたはタウリン結合体, ウルソデオキシコール酸, コール酸ナトリウム, デオキシコール酸ナトリウム, タウロコール酸ナトリウム, グリココール酸ナトリウム, N-ヘキサデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホナート, 陰イオン性(アルキル-アリール-スルホナート)一価  界面活性剤, 双性イオン性界面活性剤〔例えば、N-アルキル-N,N-ジメチルアンモニオ-1-プロパンスルホナート, 3-コラミド（cholamido）-1-プロピルジメチルアンモニオ-1-プロパンスルホナート〕, 陽イオン性界面活性剤(四級アンモニウム塩基；例えば、セチル-トリメチルアンモニウム  ブロミド, 塩化セチルピリジニウム), 非イオン性界面活性剤(例えば、ドデシルβ-D-グルコピラノシド), およびポロキサミン(例えば、 Tetronic's), 即ち、プロピレンオキシドおよびエチレンオキシドをエチレンジアミンに順次付加することから派生する四官能性ブロック  コポリマー（tetrafunctional block copolymers）；又はイミダゾリン誘導体, 又はその混合物からなる群から選択されえる界面活性剤、から選択される。
【００８６】
薬学的組成物における界面活性剤の使用は、当業者に周知である（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995を参照されたい）。
【００８７】
他の構成成分も、本発明の薬学的組成物中に導入しえる。係る付加的な構成成分は、湿潤剤, 乳化剤, 抗酸化剤, バルキング剤（bulking agents）, 張性修飾剤（張性調整剤）, キレート剤, 金属イオン, 油性ビヒクル（oleaginous vehicles）, タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン, ゼラチンまたは他のタンパク質)および双性イオン物質(例えば、ベタイン, タウリン, またはアルギニン, グリシン, リジン および ヒスチジンなどのアミノ酸)を含んでもよい。係る付加的な構成成分は、もちろん、本発明の薬学的組成物の全体の安定性に不利に影響すべきではない。
【００８８】
本発明による方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドを含有している薬学的組成物は、係る治療を必要とする患者に幾つかの異なる経路、例えば、局所的経路（例えば、皮膚への又は粘膜への投与）、吸収をバイパスする経路（例えば、動脈における、静脈における、又は心臓における投与）、吸収が関与する経路（例えば、皮膚における、皮膚下における、筋肉における又は腹部における投与）で投与しえる。
【００８９】
本発明による薬学的組成物の、それを必要とする患者への投与は、舌（lingual）, 舌下（sublingual）, 頬, 経口, 胃および腸中（in the stomach and intestine）, 経鼻, 肺（例えば, 細気管支および肺胞又は両方）, 上皮（epidermal）, 真皮（dermal）, 経皮（transdermal）, 膣, 直腸, 眼球（例えば, 結膜を介して）, 尿道（urethral）, または非経口などの様々な投与経路を介するものであってもよい。
【００９０】
本発明の薬学的組成物は、溶液, 懸濁物, エマルジョン剤, マイクロエマルジョン剤, 複合エマルジョン, 泡剤（foams）, 軟膏剤（salves）, ペースト剤（pastes）, プラスター, 軟膏（ointments）, 錠剤, 被覆錠剤, リンス剤（rinses）, カプセル〔例えば, 硬いゼラチンカプセルまたは柔らかいゼラチンカプセル〕, 坐剤, 直腸カプセル, ドロップ剤（drops）, ゲル, スプレー, 粉末剤, エアロゾル, 吸入剤（inhalants）, 点眼液, 眼軟膏, 眼のリンス剤（ophthalmic rinses）, 膣のペッサリー, 膣のリング, 膣軟膏, 注射溶液, インサイチュー転換溶液〔例えば、インサイチューゲル化剤, インサイチュー硬化剤（in situ setting）, インサイチュー沈殿剤, またはインサイチュー結晶化剤〕, 輸液溶液, またはインプラントなどの様々な剤形（dosage forms）で投与しえる。
【００９１】
本発明の薬学的組成物は、例えば、共有結合性、疎水性及び静電気性の相互作用を介して、薬担体、薬物送達システムまたは高度な薬物送達システムに、XIII因子ポリペプチドの安定性をさらに増強させる、バイオアベイラビリティーを増加させる、溶解度を増加させる、有害な作用を減少させる、当業者に周知の時間療法（chronotherapy）を達成する、および／または患者のコンプライアンスを増加させるために、さらに配合され（compounded）、又は結合または抱合されてもよい。担体（carriers）、薬物送達システムおよび高度な薬物送達システムの例には、ポリマー, 例えば、セルロース及びその誘導体, 他のポリサッカライド（例えば、デキストラン及びその誘導体, デンプン及びその誘導体）, ポリ(ビニルアルコール), アクリラートおよびメタクリレートポリマー, ポリ乳酸およびポリグリコール酸及びそのブロックコポリマー, ポリエチレングリコール, 担体タンパク質（例えば、アルブミン）, ゲル〔例えば、サーモジェリング（thermogelling）システム, 例えば、当業者に周知のブロックコポリマーシステム〕, ミセル, リポソーム, ミクロスフェア, ナノ微粒子（nanoparticulates）, 液体結晶（liquid crystals）及びその分散剤, 脂質-水システムにおける相行動（phase behaviour）の当業者に周知のL2相及びその分散剤, ポリマー性ミセル, 複合エマルジョン剤〔自己乳化（self-emulsifying）および自己ミクロ乳化〕, シクロデキストリン及びその誘導体, およびデンドリマー（dendrimers）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９２】
本発明による方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドを含有している薬学的組成物は、定量吸入器（a metered dose inhaler）、乾燥粉末吸入器（dry powder inhaler）またはネブライザー（全て当業者に周知の装置である）などを用いて、肺投与するための、固体、半固体（semisolids）、粉末および溶液の製剤における使用に適切である。
【００９３】
本発明の方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドを含んでいる薬学的組成物は、制御放出（controlled-release）、持続性放出（sustained-release）、遅延性放出（protracted-release）、遅延放出（retarded-release）、又は緩徐放出（slow-release）の薬物送達システムにおける使用に適切である。本発明の方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドを含んでいる薬学的組成物は、例えば、当業者に周知のタイプの非経口の制御放出および持続性放出（両システムによって、投与数を何分の１へと減少させることが達成される）の製剤に有用であり、これは皮下投与のための制御放出および持続性放出などである。本発明の範囲は限定されないが、有用な制御性放出システムおよび組成物の例は、ヒドロゲル、油性の（oleaginous）ゲル、液体結晶（liquid crystals）、重合体ミセル（polymeric micelles）、ミクロスフェア、およびナノ粒子（nanoparticles）である。
【００９４】
本発明の方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドを含んでいる薬学的組成物に有用な、制御性放出システムを生産する方法には、結晶化, 凝縮, 共結晶化（co-crystallization）, 沈殿, 共沈殿, 乳化, 分散剤, 高圧均質化（high pressure homogenisation）, カプセル化（encapsulation）, スプレードライ, マイクロカプセル化（microencapsulation）, コアセルベーション, 相分離（phase separation）, 溶媒蒸発によるミクロスフェアの産生, 押出し成形（extrusion）および超臨界流体プロセス（supercritical fluid processes）が含まれるが、これらに限定されない。一般的な参照は、文献〔Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D.L., ed., Marcel Dekker, New York, 2000)およびDrugs and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Formulation and Delivery (MacNally, E.J., ed. Marcel Dekker, New York, 2000)〕によってなされる。
【００９５】
非経口投与は、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内の注射で、注射器（例えば、ペン型装置の注射器）の手段によって実施し得る。或いは、非経口投与は、輸液ポンプの手段で実施することができる。本発明の方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドを含んでいる溶液剤または懸濁剤の形態の組成物の投与に関する更なるオプションは、鼻または肺の噴霧としての投与である。別のオプションとして、本発明による方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドを含有している薬学的組成物は、経皮投与〔例えば、針なし注射（needle-free injection）による、パッチ（例えば、イオントフォレーシス性パッチ）の適用による、又は経粘膜（例えば、頬）投与による〕に適用しえる。
【００９６】
本発明の一態様において、本発明による方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドを含有している薬学的組成物は、6週以上の使用の間に及び3年以上の貯蔵の間に安定である。
【００９７】
本発明の別の態様において、本発明による方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドを含有している薬学的組成物は、4週以上の使用の間に及び3年以上の貯蔵の間に安定である。
【００９８】
本発明の更なる態様において、本発明による方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドを含有している薬学的組成物は、4週以上の使用の間に及び2年以上の貯蔵の間に安定である。
【００９９】
本発明のなお更なる態様において、本発明による方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドを含有している薬学的組成物は、2週以上の使用の間に及び2年以上の貯蔵の間に安定である。
【０１００】
また、本発明は、出血の発症を治療するための方法に関し、該方法は本発明による方法を使用することによって調製された効果的な量のXIII因子ポリペプチドを含んでいる薬学的組成物を、それを必要とする被験者に投与することを備える。
【０１０１】
別の側面において、本発明は、被験者における凝固時間を減少させる方法に関し、該方法は本発明による方法を使用することによって調製された効果的な量のXIII因子ポリペプチドを含んでいる薬学的組成物を、それを必要とする被験者に投与することを備える。
【０１０２】
更なる側面において、本発明は、哺乳類の血漿における血餅溶解時間（clot lysis time）を延長させる方法に関し、該方法は本発明による方法を使用することによって調製された効果的な量のXIII因子ポリペプチドを含んでいる薬学的組成物を、それを必要とする被験者に投与することを備える。
【０１０３】
別の側面において、本発明は、哺乳類の血漿における血餅強度（clot strength）を増加させる方法に関し、該方法は本発明による方法を使用することによって調製された効果的な量のXIII因子ポリペプチドを含んでいる薬学的組成物を、それを必要とする被験者に投与することを備える。
【０１０４】
更なる側面において、本発明は、哺乳類の血漿におけるフィブリン血餅形成（fibrin clot formation）を増強させる方法に関し、該方法は本発明による方法を使用することによって調製された効果的な量のXIII因子ポリペプチドを含んでいる薬学的組成物を、それを必要とする被験者に投与することを備える。
【０１０５】
別の側面において、本発明は、未熟児（premature infants）における脳室内出血（intraventricular haemorrhage）を予防する方法に関し、該方法は本発明による方法を使用することによって調製された効果的な量のXIII因子ポリペプチドを含んでいる薬学的組成物を、それを必要とする被験者に投与することを備える。
【０１０６】
更なる側面において、本発明は、被験者における手術の間または後の手術に関連する失血を減少させる方法に関し、該方法は本発明による方法を使用することによって調製された効果的な量のXIII因子ポリペプチドを含んでいる薬学的組成物を、それを必要とする被験者に投与することを備える。
【０１０７】
別の側面において、本発明は、血友病Aを治療する方法に関し、該方法は本発明による方法を使用することによって調製された効果的な量のXIII因子ポリペプチドを含んでいる薬学的組成物を、それを必要とする被験者に投与することを備える。
【０１０８】
更なる側面において、本発明は、血友病Bを治療する方法に関し、該方法は本発明による方法を使用することによって調製された効果的な量のXIII因子ポリペプチドを含んでいる薬学的組成物を、それを必要とする被験者に投与することを備える。
【０１０９】
別の側面において、本発明は、血小板障害（platelet disorders）を治療する方法に関し、該方法は本発明による方法を使用することによって調製された効果的な量のXIII因子ポリペプチドを含んでいる薬学的組成物を、それを必要とする被験者に投与することを備える。
【０１１０】
更なる側面において、本発明は、フォンウィルブランド病を治療する方法に関し、該方法は本発明による方法を使用することによって調製された効果的な量のXIII因子ポリペプチドを含んでいる薬学的組成物を、それを必要とする被験者に投与することを備える。
【０１１１】
これらの方法の更なる態様において、本発明による方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドは、WO200185198に記載の効果的な量のVIIa因子ポリペプチドと組み合わせて投与される。更なる態様において、VIIa因子ポリペプチドおよび本発明による方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドは、指摘された治療のために被験者に投与される唯一の活性剤（sole active agents）である。一態様において、本発明による方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドおよびVIIa因子ポリペプチドは、同時に１剤形（one-dosage form）で投与される。別の一態様において、本発明による方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドおよびVIIa因子ポリペプチドは、同時に投与される。更なる態様において、本発明による方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドおよびVIIa因子ポリペプチドは、互いが約1〜2時間以内、例えば、互いが30分間以内、一例を挙げると互いが10分間以内で投与される。VIIa因子ポリペプチドおよびXIII因子ポリペプチドは、例えば、本発明による方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドを第１の単位剤形（a first unit-dosage form）に及びVIIa因子ポリペプチドを第２の単位剤形に含んでいるキットの形態で提供されえる。一態様において、効果的な量のXIII因子ポリペプチドは、0.05mg/日〜500mg/日(70kgの被験者に関して)である。一態様において、効果的な量のVIIa因子ポリペプチドは、0.05mg/日〜500mg/日(70kgの被験者)である。
【０１１２】
一態様において、治療される被検者はヒトであり；もう１つの態様において、被検者は、トロンビン産生が損なわれており；１つの態様において、被検者は、フィブリノーゲンの血漿濃度が低下している（例えば、多回輸血された被検者のケースにおいて）。
【０１１３】
本発明において、VIIa因子ポリペプチドの「効果的な量（effective amount）」およびXIII因子ポリペプチドの「効果的な量」は、共に、疾患及びその合併症を治癒（cure）させる、軽減（alleviate）する、または部分的に抑止（arrest）するために、出血もしくは失血を防止または減少させるために十分な、VIIa因子ポリペプチドまたはXIII因子ポリペプチドの量として規定される。
【０１１４】
また、本発明は、本発明による方法の使用によって調製されたXIII因子ポリペプチドの、出血の発症（bleeding episodes）を治療するための使用に関する。
【０１１５】
別の側面において、本発明は、本発明による方法の使用によって調製されたXIII因子ポリペプチドの、被験者における凝固時間を減少させるための使用に関する。
【０１１６】
更なる側面において、本発明は、本発明による方法の使用によって調製されたXIII因子ポリペプチドの、哺乳類の血漿における血餅溶解時間を延長させるための使用に関する。
【０１１７】
別の側面において、本発明は、本発明による方法の使用によって調製されたXIII因子ポリペプチドの、哺乳類の血漿における血餅強度を増大させるための使用に関する。
【０１１８】
更なるの側面において、本発明は、本発明による方法の使用によって調製されたXIII因子ポリペプチドの、哺乳類の血漿におけるフィブリン血餅形成を増強させるための使用に関する。
【０１１９】
別の側面において、本発明は、本発明による方法の使用によって調製されたXIII因子ポリペプチドの、未熟児における脳室内出血を予防するための使用に関する。
【０１２０】
更なる側面において、本発明は、本発明による方法の使用によって調製されたXIII因子ポリペプチドの、患者における手術の間または後の手術に関連する失血を減少させるための使用に関する。
【０１２１】
別の側面において、本発明は、本発明による方法の使用によって調製されたXIII因子ポリペプチドの、血友病Aを治療するための使用に関する。
【０１２２】
更なる側面において、本発明は、本発明による方法の使用によって調製されたXIII因子ポリペプチドの、血友病Bを治療するための使用に関する。
【０１２３】
別の側面において、本発明は、本発明による方法の使用によって調製されたXIII因子ポリペプチドの、血小板障害を治療するための使用に関する。
【０１２４】
更なる側面において、本発明は、本発明による方法の使用によって調製されたXIII因子ポリペプチドの、フォンウィルブランド病を治療するための使用に関する。
【０１２５】
また、本発明は、本発明による方法の使用によって調製されたXIII因子ポリペプチドの、出血の発症を治療する医薬を製造するための使用に関する。
【０１２６】
別の側面において、本発明は、本発明による方法の使用によって調製されたXIII因子ポリペプチドの、被験者における凝固時間を減少させる医薬を製造するための使用に関する。
【０１２７】
更なる側面において、本発明は、本発明による方法の使用によって調製されたXIII因子ポリペプチドの、哺乳類の血漿における血餅溶解時間を延長させる医薬を製造するための使用に関する。
【０１２８】
別の側面において、本発明は、本発明による方法の使用によって調製されたXIII因子ポリペプチドの、哺乳類の血漿における血餅強度を増大させる医薬を製造するための使用に関する。
【０１２９】
更なる側面において、本発明は、本発明による方法の使用によって調製されたXIII因子ポリペプチドの、哺乳類の血漿におけるフィブリン血餅形成を増強させる医薬を製造するための使用に関する。
【０１３０】
別の側面において、本発明は、本発明による方法の使用によって調製されたXIII因子ポリペプチドの、未熟児における脳室内出血を予防する医薬を製造するための使用に関する。
【０１３１】
更なる側面において、本発明は、本発明による方法の使用によって調製されたXIII因子ポリペプチドの、患者における手術の間または後の手術に関連する失血を減少させる医薬を製造するための使用に関する。
【０１３２】
別の側面において、本発明は、本発明による方法の使用によって調製されたXIII因子ポリペプチドの、血友病Aを治療する医薬を製造するための使用に関する。
【０１３３】
更なる側面において、本発明は、本発明による方法の使用によって調製されたXIII因子ポリペプチドの、血友病Bを治療する医薬を製造するための使用に関する。
【０１３４】
別の側面において、本発明は、本発明による方法の使用によって調製されたXIII因子ポリペプチドの、血小板障害を治療する医薬を製造するための使用に関する。
【０１３５】
更なる側面において、本発明は、本発明による方法の使用によって調製されたXIII因子ポリペプチドの、フォンウィルブランド病を治療する医薬を製造するための使用に関する。
【０１３６】
一態様において、上記の本発明の特定の側面に関連する哺乳類の血漿は、ヒト血漿である。別の態様において、哺乳類の血漿は正常な血漿であり；更なる一態様において、血漿は正常なヒト血漿であり；別の態様において、哺乳類血漿はトロンビン生成が損なわれている被験者(例えば、ヒト被験者)からの血漿である。なお更なる態様において、哺乳類の血漿は、フィブリノーゲンの濃度が低下した被検者（例えば、ヒト被験者）からのものである。
【０１３７】
本発明の更なる側面において、問題のXIII因子ポリペプチドは、正常なヒト血漿中でインビトロの血餅溶解時間を延長させる。
【０１３８】
本発明の態様のリストを、以下に記載する：
態様1．  XIII因子ポリペプチドを生物学的材料から精製するための方法であって、前記材料を陰イオン交換マトリックスおよび疎水性相互作用マトリックスでの連続的なクロマトグラフィーに供試すること（subjecting）を備える方法。
【０１３９】
態様2．  態様1に記載の方法であって、前記XIII因子ポリペプチドは、組換えXIII因子である方法。
【０１４０】
態様3．  態様1または態様2に記載の方法であって、前記XIII因子ポリペプチドは、ヒトXIII因子である方法。
【０１４１】
態様4．  態様1または態様2に記載の方法であって、前記XIII因子ポリペプチドは、Aサブユニットのダイマーである方法。
【０１４２】
態様5．  態様4に記載の方法であって、前記XIII因子ポリペプチドは、ヒトのAサブユニットのダイマーである方法。
【０１４３】
態様6．  態様1〜5の何れか１つに記載の方法であって、前記生物学的材料は、生物学的流体である方法。
【０１４４】
態様7．  態様6に記載の方法であって、前記生物学的流体は、細胞溶解物の上清である方法。
【０１４５】
態様8．  態様7に記載の方法であって、前記生物学的流体は、酵母の細胞溶解物の上清である方法。
【０１４６】
態様9．  態様1〜8の何れか１つに記載の方法であって、以下の工程を備える方法：
(a)XIII因子ポリペプチドを含んでいる生物学的材料を、第1の陰イオン交換クロマトグラフィー材料においてクロマトグラフィーに供試すること、該クロマトグラフィーは以下を備える：
(i)前記生物学的材料を前記第1の陰イオン交換クロマトグラフィー材料に適用すること；
(ii)非結合性の材料を前記第1の陰イオン交換クロマトグラフィー材料から緩衝液Aで溶出すること（ここで緩衝液Aは、前記第1の陰イオン交換クロマトグラフィー材料に結合しない材料を溶出するために適切である）；および
(iii)前記XIII因子ポリペプチドを前記第1の陰イオン交換クロマトグラフィー材料から緩衝液Aでグラジエント溶出（gradient-elution）で溶出すること（ここで緩衝液Aは、前記XIII因子ポリペプチドを前記第1の陰イオン交換クロマトグラフィー材料から溶出するために適切である）；
(b)工程(iii)からの溶出液を又は工程(iii)からの溶出液の使用により調製された流体を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料を用いたクロマトグラフィーに供試すること、該クロマトグラフィーは以下を備える：
(iv)工程(iii)からの溶出液を又は工程(iii)からの溶出液の使用により調製された流体を、前記疎水性相互作用クロマトグラフィー材料に適用すること；
(v)非結合性の材料を前記クロマトグラフィー材料から緩衝液Bで溶出すること（ここで緩衝液Bは、前記疎水性相互作用クロマトグラフィー材料に結合しない材料を溶出するために適切である）；および
(vi)前記XIII因子ポリペプチドを前記クロマトグラフィー材料から緩衝液Bでグラジエント溶出で溶出すること（ここで緩衝液Bは、XIII因子を前記疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から溶出するために適切である）。
【０１４７】
態様10．  態様9に記載の方法であって、前記緩衝液Aは、XIII因子ポリペプチドの安定性を増加させる能力のある１以上の安定化剤を含む方法。
【０１４８】
態様11．  態様10に記載の方法であって、前記緩衝液Aは、安定化剤である糖、アルコール、またはアルジトールを含む方法。
【０１４９】
態様12．  態様11に記載の方法であって、前記緩衝液Aは、安定化剤である糖、C3-C8-アルコール、またはアルジトールを含む方法。
【０１５０】
態様13．  態様12に記載の方法であって、前記緩衝液Aは、安定化剤であるポリアルコールを含む方法。
【０１５１】
態様14．  態様12に記載の方法であって、前記緩衝液は、グリセロール, プロピレングリコール, プロパン-1,3-ジオール, プロピルアルコールおよびイソプロピルアルコールからなる群から選択される安定化剤を含む方法。
【０１５２】
態様15．  態様14に記載の方法であって、前記緩衝液は、グリセロール, プロピレングリコールおよびプロパン-1,3-ジオールからなる群から選択される安定化剤を含む方法。
【０１５３】
態様16．  態様13〜15の何れか１つに記載の方法であって、前記安定化剤が約5%(v/v)〜約50%(v/v)の濃度で存在する方法。
【０１５４】
態様17．  態様16に記載の方法であって、前記安定化剤が約10%(v/v)〜約50%(v/v)の濃度で存在する方法。
【０１５５】
態様18．  態様17に記載の方法であって、前記安定化剤が約10%(v/v)〜約20%(v/v)の濃度で存在する方法。
【０１５６】
態様19．  態様18に記載の方法であって、前記安定化剤が約10%(v/v)の濃度で存在する方法。
【０１５７】
態様20．  態様18に記載の方法であって、前記安定化剤が約20%(v/v)の濃度で存在する方法。
【０１５８】
態様21．  態様9〜20の何れか１つに記載の方法であって、緩衝液AのpHが、約6.5および約9の間である方法。
【０１５９】
態様22．  態様21に記載の方法であって、緩衝液AのpHが、約7および約9の間である方法。
【０１６０】
態様23．  態様22に記載の方法であって、緩衝液AのpHが、約8である方法。
【０１６１】
態様24．  態様9〜23の何れか１つに記載の方法であって、緩衝液Aが約2mS/cm未満の伝導率を有する方法。
【０１６２】
態様25．  態様9〜24の何れか１つに記載の方法であって、XIII因子ポリペプチドの結晶性沈殿物を形成する沈殿が、工程(iii)および工程(iv)の間で行なわれない方法。
【０１６３】
態様26．  態様25に記載の方法であって、XIII因子ポリペプチドの結晶性沈殿物を形成する酢酸ナトリウムを用いる沈殿工程が、工程(iii)および工程(iv)の間で行われない方法。
【０１６４】
態様27．  態様1〜26の何れか１つに記載の方法であって、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料が、リガンドとしてフェニルを使用する方法。
【０１６５】
態様28．  態様27に記載の方法であって、前記疎水性相互作用クロマトグラフィー材料が、Source TM 15Pheである方法。
【０１６６】
態様29．  態様27に記載の方法であって、前記疎水性相互作用クロマトグラフィー材料が、Phenyl Sepharose TM 6 Fast Flow High Substitutionである方法。
【０１６７】
態様30．  態様27に記載の方法であって、前記疎水性相互作用クロマトグラフィー材料が、Phenyl Sepharose TM High Performance High Substitutionである方法。
【０１６８】
態様31．  態様9〜30の何れか１つに記載の方法であって、緩衝液BのpHが、約6〜約8である方法。
【０１６９】
態様32．  態様31に記載の方法であって、緩衝液BのpHが、約7.5である方法。
【０１７０】
態様33．  態様9〜32の何れか１つに記載の方法であって、緩衝液Bが約25mS/cmを超える伝導率を有する方法。
【０１７１】
態様34．  態様33に記載の方法であって、緩衝液Bが、最大で50mS/cmの伝導率を有する方法。
【０１７２】
態様35．  態様9〜34の何れか１つに記載の方法であって、段階（vi）からの溶出物又は段階（vi）からの溶出物を使用することによって調製される流体が、下記の工程を備えている方法を使用することによって処理される方法：
(1)XIII因子ポリペプチドの安定性を増加させる能力を有する１以上の安定化剤を、その安定性を有意に改善させるのに効果的な量で添加すること、および／または、
(2)段階（vi）からの溶出物の又は段階（vi）からの溶出物を使用して調製された流体のpHを、約7および約8の間のpHへと調整すること。
【０１７３】
態様36．  態様35に記載の方法であって、工程（１）で使用される安定化剤が、糖、アルコール、またはアルジトールである方法。
【０１７４】
態様37．  態様36に記載の方法であって、工程（１）で使用される安定化剤が、糖、C3-C8-アルコール、またはアルジトールである方法。
【０１７５】
態様38．  態様37に記載の方法であって、工程（１）で使用される安定化剤が、ポリアルコールである方法。
【０１７６】
態様39．  態様37に記載の方法であって、工程（１）で使用される安定化剤が、グリセロール, プロピレングリコール, プロパン-1,3-ジオール, プロピルアルコールおよびイソプロピルアルコールからなる群から選択される方法。
【０１７７】
態様40．  態様39に記載の方法であって、工程（１）で使用される安定化剤が、グリセロール, プロピレングリコール, およびプロパン-1,3-ジオールからなる群から選択される方法。
【０１７８】
態様41．  態様38〜40の何れか１つに記載の方法であって、工程（１）で使用される安定化剤が、約5%(v/v)〜約50%(v/v)の濃度で添加される方法。
【０１７９】
態様42．  態様41に記載の方法であって、工程（１）で使用される安定化剤が、約10%(v/v)〜約50%(v/v)の濃度で添加される方法。
【０１８０】
態様43．  態様42に記載の方法であって、工程（１）で使用される安定化剤が、約10%(v/v)〜約20%(v/v)の濃度で添加される方法。
【０１８１】
態様44．  態様35〜43の何れか１つに記載の方法であって、段階（vi）からの溶出物の又は段階（vi）からの溶出物を使用することによって調製された流体のpHが、工程（２）において、約7および約8の間のpHへと調整される方法。
【０１８２】
態様45．  態様44に記載の方法であって、段階（vi）からの溶出物の又は段階（vi）からの溶出物を使用することによって調製された流体のpHが、工程（２）において、約7.5のpHへと調整される方法。
【０１８３】
態様46．  態様9〜45の何れか１つに記載の方法であって、XIII因子ポリペプチド含有沈殿物を産生させるための沈殿工程が、工程(vi)の後に行われない方法。
【０１８４】
態様47．  態様1〜46の何れか１つに記載の方法であって、疎水性相互作用クロマトグラフィーからの溶出物を又は疎水性相互作用クロマトグラフィーからの溶出物の使用によって調製される材料を、陰イオン交換マトリックスでのクロマトグラフィーに供試する工程をさらに備える方法。
【０１８５】
態様48．  態様9〜47の何れか１つに記載の方法であって、以下の工程をさらに備える方法：
段階(vi)からの溶出液を又は段階(vi)からの溶出液の使用により調製された流体を、第２の陰イオン交換クロマトグラフィー材料でのクロマトグラフィーに供試すること、該クロマトグラフィーは以下を備える：
(vii)段階(vi)からの溶出液を又は段階(vi)からの溶出液の使用により調製された流体を、前記第２の陰イオン交換クロマトグラフィー材料に適用すること；
(viii)非結合性の材料を前記第２の陰イオン交換クロマトグラフィー材料から緩衝液Cで溶出すること（ここで緩衝液Cは、前記第２の陰イオン交換クロマトグラフィー材料に結合しない材料を溶出するために適切である）；および
(ix)前記XIII因子ポリペプチドを前記第２の陰イオン交換クロマトグラフィー材料から緩衝液C'で溶出すること〔ここで緩衝液C'は、工程（viii）で前記第２の陰イオン交換クロマトグラフィー材料に結合するXIII因子ポリペプチドを溶出するために適切である〕。
【０１８６】
態様49．  態様48に記載の方法であって、緩衝液Cおよび／または緩衝液C'は、XIII因子ポリペプチドの安定性を増加させる能力のある１以上の安定化剤を含む方法。
【０１８７】
態様50．  態様49に記載の方法であって、緩衝液Cおよび／または緩衝液C'は、安定化剤である糖、アルコール、またはアルジトールを含む方法。
【０１８８】
態様51．  態様50に記載の方法であって、緩衝液Cおよび／または緩衝液C'は、安定化剤である糖、C3-C8-アルコール、またはアルジトールを含む方法。
【０１８９】
態様52．  態様51に記載の方法であって、緩衝液Cおよび／または緩衝液C'は、安定化剤であるポリアルコールを含む方法。
【０１９０】
態様53．  態様52に記載の方法であって、緩衝液Cおよび／または緩衝液C'は、グリセロール, プロピレングリコール, プロパン-1,3-ジオール, プロピルアルコールおよびイソプロピルアルコールからなる群から選択される安定化剤を含む方法。
【０１９１】
態様54．  態様53に記載の方法であって、緩衝液Cおよび／または緩衝液C'は、グリセロール, プロピレングリコールおよびプロパン-1,3-ジオールからなる群から選択される安定化剤を含む方法。
【０１９２】
態様55．  態様52〜54の何れか１つに記載の方法であって、前記安定化剤が約5%(v/v)〜約50%(v/v)の濃度で存在する方法。
【０１９３】
態様56．  態様55に記載の方法であって、前記安定化剤が約10%(v/v)〜約50%(v/v)の濃度で存在する方法。
【０１９４】
態様57．  態様56に記載の方法であって、前記安定化剤が約10%(v/v)〜約20%(v/v)の濃度で存在する方法。
【０１９５】
態様58．  態様57に記載の方法であって、前記安定化剤が約10%(v/v)の濃度で存在する方法。
【０１９６】
態様59．  態様57に記載の方法であって、前記安定化剤が約20%(v/v)の濃度で存在する方法。
【０１９７】
態様60．  態様48〜59の何れか１つに記載の方法であって、緩衝液Cおよび／または緩衝液C'は、約7.5のpHを有する方法。
【０１９８】
態様61．  態様48〜60の何れか１つに記載の方法であって、XIII因子ポリペプチドを含有している工程（ix）からの溶出物の伝導率が、約10mS/cmに調整される方法。
【０１９９】
態様62．  態様48〜61の何れか１つに記載の方法であって、XIII因子ポリペプチドを含有している工程（ix）からの溶出物のpHが、約7.5に調整される方法。
【０２００】
態様63．  態様48〜62の何れか１つに記載の方法であって、XIII因子含有沈殿物を産生させるための沈殿工程が、工程(ix)の後に行われない方法。
【０２０１】
態様64．  態様1〜62の何れか１つに記載の方法であって、XIII因子含有沈殿物を産生させるための沈殿工程が、行われない方法。
【０２０２】
態様65．  XIII因子ポリペプチドを生物学的材料から精製する方法であって、前記生物学的材料を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料を用いるクロマトグラフィーに供試する工程を備え、該疎水性相互作用クロマトグラフィー材料は、Phenyl Sepharose TM High Performance High Substitution, Source TM 15 Phe およびSepharose TM 6 Fast Flow High Substitutionから選択される方法。
【０２０３】
態様66．  態様65に記載の方法であって、前記XIII因子ポリペプチドは、組換えXIII因子である方法。
【０２０４】
態様67．  態様65または態様66に記載の方法であって、前記XIII因子ポリペプチドは、ヒトXIII因子である方法。
【０２０５】
態様68．  態様65または態様66に記載の方法であって、前記XIII因子ポリペプチドは、Aサブユニットのダイマーである方法。
【０２０６】
態様69．  態様68に記載の方法であって、前記XIII因子ポリペプチドは、ヒトのAサブユニットのダイマーである方法。
【０２０７】
態様70．  態様65〜69の何れか１つに記載の方法であって、前記生物学的材料が生物学的流体である方法。
【０２０８】
態様71．  態様65〜70の何れか１つに記載の方法であって、XIII因子含有沈殿物を産生させるための沈殿工程が、行われない方法。
【０２０９】
態様72．  態様1〜71の何れか１つに記載の方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドを含んでいる薬学的組成物。
【０２１０】
態様73.  態様72に記載の薬学的組成物であって、前記薬学的組成物は、水性組成物（aqueous composition）であり且つ20%(v/v)のプロピレングリコールを含む薬学的組成物。
【０２１１】
態様74.  態様72に記載の薬学的組成物であって、前記薬学的組成物は、水性組成物（aqueous composition）であり且つ1.5%(w/v)スクロースおよび3.5%(w/v)マンニトールを含む薬学的組成物。
【０２１２】
態様75.  態様72〜74の何れか１つに記載の薬学的組成物の、失血を減少させるための使用。
【０２１３】
態様76.  態様72〜74の何れか１つに記載の薬学的組成物の、未熟児における脳室内出血を予防するための使用。
【０２１４】
態様77.  態様72〜74の何れか１つに記載の薬学的組成物の、患者における手術の間または後の手術に関連する失血を減少させるための使用。
【０２１５】
態様78.  態様72〜74の何れか１つに記載の薬学的組成物の、血友病Aを治療するための使用。
【０２１６】
態様79.  態様72〜74の何れか１つに記載の薬学的組成物の、血友病Bを治療するための使用。
【０２１７】
態様80.  態様72〜74の何れか１つに記載の薬学的組成物の、血小板障害を治療するための使用。
【０２１８】
態様81.  態様72〜74の何れか１つに記載の薬学的組成物の、フォンウィルブランド病を治療するための使用。
【０２１９】
態様82．  態様1〜71の何れか１つに記載の方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドの、失血を減少させることに使用する薬学的組成物の製造における使用。
【０２２０】
態様83．  態様1〜71の何れか１つに記載の方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドの、未熟児における脳室内出血の予防のための薬学的組成物の製造における使用。
【０２２１】
態様84．  態様1〜71の何れか１つに記載の方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドの、患者における手術の間または後の手術に関連する失血を減少させる薬学的組成物の製造における使用。
【０２２２】
態様85．  態様1〜71の何れか１つに記載の方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドの、血友病Aを治療するための薬学的組成物の製造における使用。
【０２２３】
態様86．  態様1〜71の何れか１つに記載の方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドの、血友病Bを治療するための薬学的組成物の製造における使用。
【０２２４】
態様87．  態様1〜71の何れか１つに記載の方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドの、血小板障害を治療するための薬学的組成物の製造における使用。
【０２２５】
態様88．  態様1〜71の何れか１つに記載の方法を使用することによって調製されたXIII因子ポリペプチドの、フォンウィルブランド病を治療するための薬学的組成物の製造における使用。
【０２２６】
本発明は、以下の限定されない例によって説明される。
【０２２７】
［例］
例1
酵母細胞の破壊
ヒトXIII因子のアミノ酸配列1〜731を発現している酵母（Saccharomyces cerevisiae）の細胞を含んでいる培養物を、Sorvall SLA遠心分離（6000 rpm、4゜C）で8 min.遠心した。細胞を、3ml緩衝液／グラム（細胞ペレット）の量で、新たに作製した緩衝液(20%(v/v) プロピレングリコール, 20 mM Tris, 1 mM PMSF, pH 8.0)中に再懸濁した。前記懸濁液を、次に1.5kBar圧に、15゜C未満の温度で供試した。生じた懸濁液を、Sorvall SLA遠心分離（9000rpm、4゜C）で30min.遠心した。そして、上清のｐＨを、8.0に1M NaOHで調整した。前記上清を、次にフィルター〔Advantec GF75 0.7 μm GF075090 + round filter MN GF5 0.4 μm 001201 art no. 415009〕で濾過し、更に使用するまで4゜Cで維持した（例２）。
【０２２８】
例2
Source TM 30Qを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー
例1からの濾過された上清の伝導率を、2 mS/cm未満に、新たに作製した緩衝液A(20%(v/v)プロピレングリコール, 20mM Tris, 1mM PMSF, pH 8.0)を用いて調整した。Source TM 30Qマトリックスを、5カラム容量(cv；column volumes)の緩衝液Aで平衡化した。そして、1.3g酵母細胞によって産生されたポリペプチドの量に対応する供試物（load）を、前記カラムに適用した。前記カラムを、7cvの緩衝液Aで、それから5cv の10%溶出緩衝液〔20%(v/v)プロピレングリコール, 20mM Tris, 0.2M NaCl, 1mM PMSF, pH8.0〕で洗浄した。次に、グラジエント溶出を、10%溶出緩衝液から100%溶出緩衝液までを２５ＣＶで行い、次に5cvの100%溶出緩衝液で12cv/hourの流速で行った。画分を、約30%溶出緩衝液から約70%溶出緩衝液で収集した。XIII因子ポリペプチド含有画分の分析を、DEAE-NPR (TosoHaas, cat. no. 13075, 4.6x35 mm)を用いたＨＰＬＣ（下記参照）と、NUpage 4-12% Bis/Tris Gel(Invitrogen)上でMOPS泳動緩衝液で還元条件下で行うSDS-PAGEとによって実施した。XIII因子ポリペプチドを含有している画分を、更に使用するまで、冷蔵庫でapprox. +4゜Cで維持するか又は-80゜Cで凍結した（例３）。
【０２２９】
例3
Source TM 15Pheを用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー
400mM K2HPO4+400mM KH2PO4を含有している緩衝液１容量を、例２からのXIII因子ポリペプチドを含有している画分の混合物に添加した。そしてｐＨを、7.5にNaOHで調整した。Source TM 15Pheマトリックスを、4cvの緩衝液B(100 mM K2HPO4, 100 mM KH2PO4, pH 7.5)で平衡化した。そして、約2mg/mlに相当する供試物を前記カラムに適用した。前記カラムを、次に4cvの緩衝液Bで洗浄し、次に緩衝液Bから100%溶出緩衝液（5 mM K2HPO4, 5 mM KH2PO4, pH 7.5）までのグラジエント溶出を２０ＣＶで行い、次に２cvの100%溶出緩衝液で行った（8cv/hの流速）。画分を、約4cvの溶出後に18cvまで収集した。XIII因子ポリペプチド含有画分の分析を、DEAE-NPR (TosoHaas, cat. no. 13075, 4.6x35 mm)を用いたＨＰＬＣ（下記参照）と、NUpage 4-12% Bis/Tris Gel(Invitrogen)上でMOPS泳動緩衝液で還元条件下で行うSDS-PAGEとによって実施した。1/4容量のプロピレングリコールを、XIII因子ポリペプチド含有画分のプールに、終濃度20%(v/v)プロピレングリコールまで添加した。そして、生じたプールを、更に使用するまで、冷蔵庫でapprox. +4゜Cで維持するか又は凍結した（例５）。
【０２３０】
例4
Phenyl Sepharose TM High Performance High Substitutionを用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー
400mM K2HPO4+400mM KH2PO4を含有している緩衝液１容量を、例２からのXIII因子ポリペプチドを含有している画分の混合物に添加した。そしてｐＨを、7.5にNaOHで調整した。Phenyl SepharoseTM High Performance High Substitutionマトリックスを、4cvの緩衝液B(100 mM K2HPO4, 100 mM KH2PO4, pH 7.5)で平衡化した。そして、約2mg/mlに相当する供試物を前記カラムに適用した。前記カラムを、次に4cvの緩衝液Bで洗浄し、次に緩衝液Bから100%溶出緩衝液（5 mM K2HPO4, 5 mM KH2PO4, pH 7.5）までグラジエント溶出を２０ＣＶで行い、次に２cvの100%溶出緩衝液で行った（8 cv/hの流速）。画分を、約10cvの溶出後に20cvまで収集した。XIII因子ポリペプチド含有画分の分析を、DEAE-NPR (TosoHaas, cat. no. 13075, 4.6x35 mm)を用いたＨＰＬＣ（下記参照）と、NUpage 4-12% Bis/Tris Gel(Invitrogen)上でMOPS泳動緩衝液で還元条件下で行うSDS-PAGEとによって実施した。1/4容量のプロピレングリコールを、XIII因子ポリペプチド含有画分のプールに、終濃度20%(v/v)プロピレングリコールまで添加した。そして、生じたプールを、例５に記載の処理で使用するまで、approx. +4゜Cで維持するか又は凍結した。
【０２３１】
例5
Source TM 30Qを用いた第2の陰イオン交換クロマトグラフィー（代替１）
例3のXIII因子ポリペプチド含有画分のプールのpHを7.5に調製し、緩衝液C(20%(v/v)プロピレングリコール, 10mMグリシル-グリシン, pH7.5)を2mS/cm未満の伝導率まで添加した。Source TM 30Qマトリックスを、5cvの緩衝液Cで平衡化した。そして、5mg/mlのゲルに相当する供試物を前記カラムに適用した。次に前記カラムを、8cvの緩衝液Cで洗浄し、67%の緩衝液Cおよび33%の溶出緩衝液(20%(v/v)プロピレングリコール, 10mMグリシル-グリシン, 0.5M NaCl, pH7.5)を含んでいる緩衝液を使用して、XIII因子ポリペプチドを小画分に溶出した。XIII因子ポリペプチド画分を含んでいるプールの伝導率を、約10mS/cmへと、20%(v/v)プロピレングリコール, 10mMグリシル-グリシン, 2M NaCl(pH7.5)を含んでいる緩衝液で調整した。
【０２３２】
例6
Source TM 30Qを用いた第2の陰イオン交換クロマトグラフィー（代替2）
例3のXIII因子ポリペプチド含有画分のプールのpHを7.5に調製し、緩衝液D(1.5%(w/v)スクロース, 3.5%(w/v)マンニトール, 10mMグリシル-グリシン, pH7.5)を2mS/cm未満の伝導率まで添加した。Source TM 30Qマトリックスを、5cvの緩衝液Dで平衡化した。そして、5mg/mlのゲルに相当する供試物を前記カラムに適用した。次に前記カラムを、8cvの緩衝液Dで洗浄し、67%の緩衝液Dおよび33%の溶出緩衝液(1.5%(w/v)スクロース, 3.5%(w/v)マンニトール, 0.5M NaCl, pH7.5)を含んでいる緩衝液を使用して、XIII因子ポリペプチドを小画分に溶出した。XIII因子ポリペプチド画分を含んでいるプールの伝導率を、約10mS/cmへと、1.5%(w/v)スクロース, 3.5%(w/v)マンニトール, 2M NaCl(pH7.5)を含んでいる緩衝液で調整した。
【０２３３】
HPLC分析手順
高性能液体クロマトグラフィー(HPLC；上記の例２〜４において記載）を、TosoHaasのDEAE-NPRカラムマトリックス材料（cat. No. 13075, 4.6x35 mm）を用いて実施した。その際の緩衝液は以下のとおりである：
緩衝液I:20mM K2HPO4, pH8.0(HClで調整)
緩衝液II:20mM K2HPO4, 0.4M KCl, pH8.0(HClで調整)。
【０２３４】
前記カラムの平衡化を、95%(v/v)緩衝液Iと5%(v/v)緩衝液IIとの混合物を用いて、2.5分間行った(流速0.5ml/min.)。
【０２３５】
カラムの溶出を、95%緩衝液I/5%緩衝液IIから60%緩衝液I/40%緩衝液IIまでのグラジエントを用いて、17分間行った(流速0.5ml/min.)。
【０２３６】
カラムの再生を、100%緩衝液IIで1.4分間洗浄することによって実施した(流速0.5 ml/min.)カラム使用前の各日で、次の操作をすることが有利であることが見出された；つまり、新しいサイクルの平衡化、溶出および再生を実施する前にカラムに、100μlの0.2M NaOHと次に100μlの1M K2HPO4とを注入することである。1Mクエン酸(pH 3.0)を、代替的に使用してもよい。
【０２３７】
使用された検出波長は、220nmであった。
【０２３８】
2〜30μgのサンプルを、カラムに適用した；サンプルを水で４倍希釈することによって、30μgのサンプル（注入容量と無関係に）を100μlまで適用することが可能であった。より多い注射容量および多量のサンプル適用を使用することは、試験されなかった。
【表１】
2008510476.tif 000002
【国際調査報告】
2008510476.tif 000003
2008510476.tif 000004
2008510476.tif 000005
2008510476.tif 000006
2008510476.tif 000007