(57)【要約】本発明は、循環腫瘍細胞および他の粒子を検出、富化および分析するための装置および方法を特徴とする。本発明は、さらに、被験体由来の細胞サンプルを分析することによって、被験体の状態（例えば、癌）を診断するための方法を特徴とする。本発明の方法は、以下の工程を包含する：ａ）第１の方向に癌細胞が濃縮される第１出力のサンプルを生成するように癌細胞を導き、そして第２の方向に第２の細胞が濃縮される第２出力のサンプルを生じるように一つ以上の第２の細胞を導く構造を有するチャネルを含んでいる装置に、細胞サンプルを導入する工程；ならびに、ｂ）第１出力のサンプルにおいて癌細胞の有無を検出する工程。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞サンプルにおいて癌細胞を検出する方法であって、該方法は、
（ａ）該癌細胞を第１の方向に方向付けて該癌細胞について濃縮された第１の出力サンプルを産生し、かつ１種以上の第２の細胞を第２の方向に方向付けて該第２の細胞について濃縮された第２の出力サンプルを産生する構造を備えるチャンネルを備えるデバイスに、該細胞サンプルを導入する工程；および
（ｂ）該第１の出力サンプルにおいて該癌細胞の存在または非存在を検出する工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
前記構造物は、ギャップのネットワークを形成する障害物のアレイを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記障害物は、前記癌細胞を選択的に捕捉し得る、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞サンプルは、血液サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）は、前記第１の出力サンプルを前記癌細胞についてのマーカーに対する抗体と反応させる工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記マーカーは、表１から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）は、前記第１の出力サンプルにおいて細胞の数を決定する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記決定する工程は、前記第１の出力サンプルにおいてＤＮＡの総量を決定する工程を包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｂ）は、前記第１の出力サンプルにおいて前記癌細胞の数を決定する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、該方法は、前記細胞サンプルにおいて内皮細胞の数を決定する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１１】
前記内皮細胞に対する前記癌細胞の比を決定する工程をさらに包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｂ）は、前記第１の出力サンプルにおいてＤＮＡ中の変異またはＲＮＡ中の変異を検出する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記変異は、表１に列挙されるポリペプチドをコードする遺伝子に存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｂ）は、前記第１の出力サンプルにおいてタンパク質のリン酸化、タンパク質のグリコシル化、ＤＮＡのメチル化、マイクロＲＮＡのレベル、または細胞の形態を分析する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｂ）は、前記第１の出力サンプルにおいてミトコンドリアＤＮＡ、テロメラーゼ、または核マトリックスタンパク質を検出する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｂ）は、前記第１の出力サンプルにおいて１種以上のミトコンドリア異常を検出する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｂ）は、前記第１の出力サンプルの細胞において核周囲部の区画の存在または非存在を検出する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｂ）は、前記第１の出力サンプルの遺伝子発現分析、インセルＰＣＲ、または蛍光インサイチュハイブリダイゼーションを行う工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記遺伝子発現分析は、前記癌細胞の起源の組織を決定するために使用される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記遺伝子発現分析は、単一の癌細胞に対して行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞サンプルは、１種以上の前駆内皮細胞を含み、そして該前駆内皮細胞の少なくとも１種は、前記第１の出力サンプルに存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の方法であって、前記デバイスは、第１の入口と、第１の出口と、第２の出口とを備える連続フローデバイスを備え、前記細胞サンプルは、該第１の入口に適用され、前記第１の出力サンプルは、該第１の出口から流出し、そして前記第２の出力サンプルは、該第２の出口から流出する、方法。
【請求項２３】
前記第２の細胞は、非癌細胞を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記デバイスは、第２の入口を備え、そして第２の流体が、該第２の入口に適用される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２の流体は、緩衝液、溶解試薬、核酸増幅試薬、容量オスモル濃度調節試薬、標識試薬、保存剤、または固定試薬を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
細胞サンプルにおいて癌細胞を検出する方法であって、該方法は、
（ａ）磁性粒子を使用せずに該細胞サンプルから該癌細胞の１種以上を濃縮する工程であって、該濃縮する工程が、細胞のサイズ、細胞の形状、または細胞の変形能に基づく、工程；および
（ｂ）該濃縮された癌細胞の数を決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項２７】
細胞サンプルにおいて癌細胞を検出する方法であって、該方法は、
（ａ）抗体またはそのフラグメントを使用せずに該細胞サンプルから該癌細胞の１種以上を濃縮する工程であって、該濃縮する工程が、細胞のサイズ、細胞の形状、または細胞の変形能に基づく、工程；および
（ｂ）該濃縮された癌細胞の数を決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項２８】
請求項２６または２７に記載の方法であって、該方法は、
（ｉ）前記細胞サンプルから１種以上の内皮細胞を濃縮する工程；および
（ｉｉ）該濃縮された内皮細胞の数を決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、該方法は、前記内皮細胞に対する前記癌細胞の比を決定する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３０】
工程（ｂ）は、前記濃縮された癌細胞を計測する工程を包含する、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項３１】
工程（ｂ）は、前記濃縮された癌細胞においてＤＮＡの総量を決定する工程を包含する、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項３２】
第２の細胞サンプルを用いて工程（ａ）および工程（ｂ）を繰り返す工程をさらに包含する、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞サンプルおよび前記第２の細胞サンプルは、単一の被験体から採取される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記検出する工程は、前記第１の出力サンプルのハイパースペクトルイメージングを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞サンプルは、工程（ａ）の前または工程（ａ）と同時に、前記癌細胞を優先的に標識する標識試薬に接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法であって、前記標識試薬は、ビーズを含み、標識された癌細胞の流体力学的サイズは、該標識の非存在下での該癌細胞の流体力学的サイズよりも少なくとも１０％大きい、方法。
【請求項３７】
被験体において病態を診断するための方法であって、該方法は、
（ａ）１種以上の癌細胞を第１の方向に方向付けて該癌細胞について濃縮された第１の出力サンプルを産生し、かつ１種以上の第２の細胞を第２の方向に方向付けて該第２の細胞について濃縮された第２の出力サンプルを産生する構造を備えるチャンネルを備えるデバイスに、該被験体由来の細胞サンプルを導入する工程；
（ｂ）該第１の出力サンプルにおいて該癌細胞の存在または非存在を検出する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）の結果に基づいて該病態の存在または非存在を診断する工程；
を包含する、方法。
【請求項３８】
前記診断の前に前記被験体の一部を画像化する工程をさらに包含し、該診断が、さらに、該画像化する工程の結果に基づく、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記画像化する工程は、コンピュータ連動断層撮影、陽電子断層撮影法、または磁気共鳴画像法を包含する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
請求項３７に記載の方法であって、該方法は、
（ｉ）前記細胞サンプルにおいて内皮細胞の数を決定する工程；および
（ｉｉ）該内皮細胞に対する前記癌細胞の比を決定する工程であって、前記診断が、さらに、該比に基づく、工程；
をさらに包含する、方法。
【請求項４１】
前記内皮細胞は、前駆内皮細胞を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記病態は、血液学的な病態、炎症性の病態、虚血性の病態、腫瘍性の病態、感染、外傷、子宮内膜症、または腎不全である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記チャンネルは、ギャップのネットワークを形成する障害物のアレイを備え、そして流体が、該流体が大きい流束および小さい流束へと不等に分けられるように該ギャップを通って流れる、請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
被験体において病態を診断するための方法であって、
（ａ）１種以上の第１の細胞を第１の方向に方向付けて該第１の細胞について濃縮された第１の出力サンプルを産生し、かつ１種以上の第２の細胞を第２の方向に方向付けて該第２の細胞について濃縮された第２の出力サンプルを産生する構造を備えるチャンネルを備えるデバイスに、該被験体由来の細胞サンプルを導入する工程；
（ｂ）該第１の出力サンプルを分析する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）の結果に基づいて該病態の存在または非存在を診断する工程；
を包含する、方法。
【請求項４５】
前記デバイスは、１２ミクロンより大きい流体力学的サイズを有する細胞を前記第１の方向に方向付け、かつ１２ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞を前記第２の方向に方向付けるように構成される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
請求項４４に記載の方法。前記デバイスは、１４ミクロンより大きい流体力学的サイズを有する細胞を前記第１の方向に方向付け、かつ１４ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞を前記第２の方向に方向付けるように構成される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記デバイスは、５ミクロン以上かつ１０ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞を前記第１の方向に方向付け、かつ１０ミクロンより大きい流体力学的サイズを有する細胞を前記第２の方向に方向付けるように構成される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記デバイスは、４ミクロン以上かつ８ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞を前記第１の方向に方向付け、かつ８ミクロンより大きい流体力学的サイズを有する細胞を前記第２の方向に方向付けるように構成される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記第１の出力サンプルは、前記細胞サンプル中の前記第１の細胞の少なくとも９０％を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
工程（ａ）〜工程（ｃ）を前記被験体由来のさらなる細胞サンプルを用いて１回以上繰り返す工程をさらに包含する、請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞サンプルは、一定間隔にて得られる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記一定間隔は、１日間、２日間、３日間、１週間、２週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、６ヶ月間、または１年間である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記第１の出力サンプルは、前記細胞サンプルと比較して前記第１の細胞について少なくとも１，０００倍濃縮される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５４】
前記病態は、血液学的な病態、炎症性の病態、虚血性の病態、腫瘍性の病態、感染、外傷、子宮内膜症、または腎不全である、請求項４４に記載の方法。
【請求項５５】
前記腫瘍性の病態は、急性リンパ芽球性白血病、急性または慢性のリンパ球性腫瘍または顆粒球性腫瘍、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、腺癌、腺腫、副腎癌、基底細胞癌、骨の癌、脳の癌、乳癌、気管支の癌、子宮頚部形成異常、慢性骨髄性白血病、結腸癌、類表皮癌、ユーイング肉腫、胆嚢癌、胆石性腫瘍、骨巨細胞腫、多形性神経膠芽腫、ヘアリーセル腫瘍、頭の癌、過形成、増殖性の角膜神経腫瘍、上皮内癌、腸の神経節細胞腫、ランゲルハンス島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、平滑筋の腫瘍、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、悪性カルチノイド、悪性高カルシウム血症、悪性黒色腫、マルファン様体型の腫瘍、髄様癌、転移性皮膚癌、粘膜神経腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄腫、首の癌、神経組織の癌、神経芽腫、骨原性肉腫、骨肉腫、卵巣腫瘍、膵臓癌、副甲状腺癌、褐色細胞腫、真性赤血球増加症、原発性脳腫瘍、前立腺癌、直腸癌、腎細胞腫瘍、網膜芽腫、横紋筋肉腫、精上皮腫、皮膚癌、小細胞肺腫瘍、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃癌、甲状腺癌、局所的な皮膚病変、細網肉腫、およびウィルムス腫瘍からなる群より選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞サンプルは、容量が５０ｍＬ未満である、請求項４４に記載の方法。
【請求項５７】
工程（ｂ）は、前記第１の出力サンプルにおいて癌生物マーカーの存在または非存在を検出する工程を包含する、請求項４４に記載の方法。
【請求項５８】
前記癌生物マーカーは、表１から選択されるポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
工程（ｂ）は、癌に関連する核酸の存在または非存在を同定する工程を包含する、請求項４４に記載の方法。
【請求項６０】
前記核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
工程（ｂ）は、癌に関連する核酸の発現パターンを分析する工程を包含する、請求項４４に記載の方法。
【請求項６２】
前記核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記核酸は、変異を含み、そして該核酸は、表１から選択されるポリペプチドをコードする、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
工程（ｂ）は、癌に関連する細胞表面マーカーを有する細胞の存在または非存在を同定する工程を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項６５】
前記細胞表面マーカーは、ＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、ムチン−１、サイトケラチン８、ＥＧＦＲ、および白血球関連レセプター（ＬＡＲ）からなる群より選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
工程（ｂ）は、前記第１の出力サンプルと、該第１の出力サンプル由来の１種以上の細胞を選択的に結合する１種以上の結合部分を有する表面を備えるデバイスとを接触させる工程をさらに包含する、請求項４４に記載の方法。
【請求項６７】
前記第１の出力サンプル由来の前記細胞は、上皮細胞または腫瘍性細胞を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記腫瘍性細胞の型は、急性リンパ芽球性白血病、急性または慢性のリンパ球性腫瘍または顆粒球性腫瘍、急性骨髄性白血病、前骨髄球性白血病、腺癌、腺腫、副腎癌、基底細胞癌、骨の癌、脳の癌、乳癌、気管支の癌、子宮頚部形成異常、慢性骨髄性白血病、結腸癌、類表皮癌、ユーイング肉腫、胆嚢癌、胆石性腫瘍、骨巨細胞腫、多形性神経膠芽腫、ヘアリーセル腫瘍、頭の癌、過形成、増殖性の角膜神経腫瘍、上皮内癌、腸の神経節細胞腫、ランゲルハンス島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、平滑筋の腫瘍、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、悪性カルチノイド、悪性高カルシウム血症、悪性黒色腫、マルファン様体型の腫瘍、髄様癌、転移性皮膚癌、粘膜神経腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄腫、首の癌、神経組織の癌、神経芽腫、骨原性肉腫、骨肉腫、卵巣腫瘍、膵臓癌、副甲状腺癌、褐色細胞腫、真性赤血球増加症、原発性脳腫瘍、前立腺癌、直腸癌、腎細胞腫瘍、網膜芽腫、横紋筋肉腫、精上皮腫、皮膚癌、小細胞肺腫瘍、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃癌、甲状腺癌、局所的な皮膚病変、細網肉腫、およびウィルムス腫瘍からなる群より選択される癌に関連する、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記癌は、甲状腺癌ではない、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記結合部分は、ポリペプチドを含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
前記ポリペプチドは、抗体またはそのフラグメントを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記抗体またはそのフラグメントは、モノクローナル性である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、ＥｐＣＡＭに結合する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記構造は、ギャップのネットワークを形成する障害物のアレイを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項７５】
前記障害物は、前記第１の細胞を選択的に捕捉し得る、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記障害物の間のギャップは、１５ミクロンより大きいか、２０ミクロンより大きいか、または６０ミクロン未満である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
、請求項４４に記載の方法。前記細胞サンプルは、血液、汗、涙、耳の流出物、痰、リンパ、骨髄懸濁物、尿、唾液、精液、経血、脳脊髄液、脳の流体、腹水、乳汁、呼吸器の分泌物、腸もしくは尿生殖器の管、羊水、または水サンプル．  
【請求項７８】
工程（ｂ）は、前記第１の出力サンプルのサイズ分布を分析する工程を包含する、請求項４４に記載の方法。
【請求項７９】
工程（ｂ）は、前記第１の細胞の数を決定する工程を包含する、請求項４４に記載の方法。
【請求項８０】
目的とする病態に関連する細胞パターンを同定するための方法であって、該方法は、
（ａ）複数のコントロール被験体の各々および該目的とする病態を有する複数の症例被験体の各々から細胞サンプルを得る工程；
（ｂ）１２ミクロンより大きい流体力学的サイズを有する細胞をそれぞれの該細胞サンプルからサイズによって濃縮する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で濃縮された細胞を分析する工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）で得られた結果を使用して関連研究を行なう工程；
を包含する、方法。
【請求項８１】
被験体において病態を診断するための方法であって、該方法は、
（ａ）該病態に関連する細胞パターンを提供する工程；
（ｂ）該被験体から細胞サンプルを得る工程；
（ｃ）１２ミクロンより大きい流体力学的サイズを有する細胞をそれぞれの該細胞サンプルからサイズによって濃縮する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で濃縮された細胞を分析する工程；および
（ｅ）工程（ａ）の該細胞パターンと工程（ｄ）の該分析とに基づいて該被験体における該病態の存在または非存在を診断する工程；
を包含する、方法。
【請求項８２】
工程（ｃ）は、工程（ｂ）で濃縮された前記細胞においてＲＮＡレベルを検出する工程を包含する、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡまたはマイクロＲＮＡを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記複数の症例被験体は、少なくとも５０の症例被験体を含み、そして前記複数のコントロール被験体は、少なくとも５０のコントロール被験体を含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８５】
工程（ｃ）は、工程（ｂ）で濃縮された前記細胞の数を決定する工程を包含する、請求項８０に記載の方法。
【請求項８６】
工程（ｃ）は、インピーダンス、光吸収、光散乱、および静電容量からなる群より選択される細胞の特徴を利用する、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
工程（ｃ）は、工程（ｂ）で濃縮された前記細胞のサイズ分布を分析する工程を包含する、請求項８０に記載の方法。
【請求項８８】
工程（ｃ）は、前記サイズ分布を決定するために顕微鏡、細胞計数器、磁石、生体腔レーザー、質量分析器、ＰＣＲデバイス、ＲＴ−ＰＣＲデバイス、マトリックス、マイクロアレイ、またはハイパースペクトルイメージングシステムを使用する工程を包含する、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記細胞サンプルは、血液、汗、涙、耳の流出物、痰、リンパ、骨髄懸濁物、尿、唾液、精液、経血、脳脊髄液、脳の流体、腹水、乳汁、呼吸器の分泌物、腸もしくは尿生殖器の管、羊水、または水サンプルを含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項９０】
工程（ｃ）は、工程（ｂ）で濃縮された前記の起源の組織を決定する工程を包含する、請求項８０に記載の方法。
【請求項９１】
工程（ｃ）は、工程（ｂ）で濃縮された前記細胞から、１種以上の上皮細胞、癌細胞、骨髄細胞、胎児細胞、前駆細胞、幹細胞、泡沫細胞、間葉細胞、免疫系細胞、内皮細胞、子宮内膜細胞、結合組織細胞、栄養膜、細菌、真菌、または病原体を同定する工程を包含する、請求項８０に記載の方法。
【請求項９２】
工程（ｅ）は、工程（ｂ）で濃縮された前記細胞と、前記第１の細胞を選択的に結合する１種以上の結合部分とを接触させる工程を包含する、請求項８０に記載の方法。
【請求項９３】
前記結合部分は、ポリペプチドを含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記ポリペプチドは、抗体またはそのフラグメントを含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記抗体またはそのフラグメントは、モノクローナル性である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、ＥｐＣＡＭに結合する、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記抗体またはそのフラグメントは、抗Ｂｅｒ−Ｅｐ４、抗ＥｐＣＡＭ、抗Ｅ−カドヘリン、抗ムチン−１、抗サイトケラチン８、および抗ＣＤ３４＋からなる群より選択される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９８】
前記デバイスは、１２ミクロンより大きい流体力学的サイズを有する前記細胞を前記第１の方向に方向付け、かつ１２ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞を前記第２の方向に方向付けるように構成される、請求項８０に記載の方法。
【請求項９９】
前記デバイスは、工程（ｂ）で濃縮された前記細胞を選択的に捕捉する、請求項８０に記載の方法。
【請求項１００】
被験体に適用された薬物処置の効力を決定するための方法であって、該方法は、
（ａ）該処置の前に該被験体から第１の細胞サンプルを得る工程；
（ｂ）１種以上の第１の細胞を第１の方向に方向付けて該第１の細胞について濃縮された第１の出力サンプルを産生し、かつ１種以上の第２の細胞を第２の方向に方向付けて該第２の細胞について濃縮された第２の出力サンプルを産生する構造を備えるチャンネルを備えるデバイスに、該第１の細胞サンプルを導入する工程；
（ｃ）該第１の出力サンプルを分析する工程；
（ｄ）該薬物処置と同時または該薬物処置の後に該被験体から第２の細胞サンプルを得る工程；
（ｅ）該第２の細胞サンプルに対して工程（ｂ）および工程（ｃ）を繰り返す工程；ならびに
（ｆ）該第１の細胞サンプルに対する工程（ｃ）の結果と該第２の細胞サンプルに対する工程（ｃ）の結果とを比較する工程であって、該比較する工程が、該薬物処置の効力を決定する、工程；
を包含する、方法。
【請求項１０１】
前記デバイスは、１２ミクロンより大きい流体力学的サイズを有する細胞を前記第１の方向に方向付け、かつ１２ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞を前記第２の方向に方向付けるように構成される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記デバイスは、６ミクロン以上かつ１２ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞を前記第１の方向に方向付け、かつ６ミクロン未満の流体力学的サイズを有する細胞または１２ミクロンより大きい流体力学的サイズを有する細胞を前記第２の方向に方向付けるように構成される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
工程（ｃ）は、前記第１の細胞サンプル由来の第１の細胞または前記第２の細胞サンプル由来の第１の細胞においてＲＮＡレベルを検出する工程を包含する、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡまたはマイクロＲＮＡを含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
工程（ｃ）は、前記第１の細胞サンプル由来の第１の細胞または前記第２の細胞サンプル由来の第１の細胞の数を決定する工程を包含する、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０６】
工程（ｄ）は、前記第１の細胞サンプル由来の第１の細胞または前記第２の細胞サンプル由来の第１の細胞から、１種以上の上皮細胞、癌細胞、骨髄細胞、胎児細胞、前駆細胞、幹細胞、泡沫細胞、間葉細胞、免疫系細胞、内皮細胞、子宮内膜細胞、結合組織細胞、栄養膜、細菌、真菌、または病原体を同定する工程を包含する、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０７】
前記チャンネルは、ギャップのネットワークを形成する障害物のアレイを備え、そして流体が、該流体が大きい流束および小さい流束へと不等に分けられるように該ギャップを通って流れる、請求項４４に記載の方法。
【請求項１０８】
細胞サンプルを処理するためのデバイスであって、該デバイスは、
（ａ）１種以上の第１の細胞を第１の方向に方向付けて該第１の細胞について濃縮された第１の出力サンプルを産生し、かつ１種以上の第２の細胞を第２の方向に方向付けて該第２の細胞について濃縮された第２の出力サンプルを産生する構造を備えるチャンネルであって、ここで該デバイスが、（ｉ）１２ミクロンより大きい流体力学的サイズを有する細胞を前記第１の方向に方向付け、かつ１２ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞を前記第２の方向に方向付けるか、あるいは（ｉｉ）６ミクロン以上かつ１２ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞を前記第１の方向に方向付け、かつ６ミクロン未満の流体力学的サイズを有する細胞または１２ミクロンより大きい流体力学的サイズを有する細胞を前記第２の方向に方向付けるかのいずれかであるように構成される、チャネル；および
（ｂ）該第１の出力サンプルまたは該第２の出力サンプルを分析するための検出モジュールであって、該検出モジュールが、流動工学的に該チャンネルに対して連結される、検出モジュール；
を備える、デバイス。
【請求項１０９】
前記デバイスは、６ミクロン以上かつ１２ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞を前記第１の方向に方向付け、かつ６ミクロン未満の流体力学的サイズを有する細胞または１２ミクロンより大きい流体力学的サイズを有する細胞を前記第２の方向に方向付けるように構成される、請求項１０８に記載のデバイス。
【請求項１１０】
前記デバイスは、８ミクロン以上かつ１０ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞を前記第１の方向に方向付け、かつ８ミクロン未満の流体力学的サイズを有する細胞または１０ミクロンより大きい流体力学的サイズを有する細胞を前記第２の方向に方向付けるように構成される、請求項１０８に記載のデバイス。
【請求項１１１】
前記検出モジュールは、前記第１の細胞において癌に関連するマーカーを同定するように適合される、請求項１０８に記載のデバイス。
【請求項１１２】
前記検出モジュールは、前記第１の細胞を特異的に結合する抗体を含む、請求項１０８に記載のデバイス。
【請求項１１３】
前記抗体は、表１から選択される１種以上のマーカーを特異的に結合する、請求項１１２に記載のデバイス。
【請求項１１４】
前記検出モジュールは、１種以上の上皮細胞、癌細胞、骨髄細胞、胎児細胞、前駆細胞、幹細胞、泡沫細胞、間葉細胞、免疫系細胞、内皮細胞、子宮内膜細胞、結合組織細胞、栄養膜、細菌、真菌、または病原体を検出するように構成される、請求項１０８に記載のデバイス。
【請求項１１５】
前記検出モジュールは、顕微鏡、細胞計数器、磁石、生体腔レーザー、質量分析器、ＰＣＲデバイス、ＲＴ−ＰＣＲデバイス、マトリックス、マイクロアレイ、またはハイパースペクトルイメージングシステムを含む、請求項１０８に記載のデバイス。
【請求項１１６】
細胞サンプルを処理するためのデバイスであって、該デバイスは、
（ａ）１種以上の第１の癌細胞を第１の方向に方向付けて該癌細胞について濃縮された第１の出力サンプルを産生し、かつ１種以上の第２の細胞を第２の方向に方向付けて該第２の細胞について濃縮された第２の出力サンプルを産生する構造を備えるチャンネル；および
（ｂ）該癌細胞または該第２の細胞を捕捉するための捕捉モジュールであって、該捕捉モジュールが、流動工学的に該チャンネルに対して連結され、そして該捕捉モジュールが、該癌細胞または該第２の細胞を選択的に結合する１種以上の結合部分を備える、捕捉モジュール；
を備える、デバイス。
【請求項１１７】
前記構造は、ギャップのネットワークを形成する障害物のアレイを備える、請求項１１６に記載のデバイス。
【請求項１１８】
前記１種以上の結合部分は、１種以上の上皮細胞、癌細胞、骨髄細胞、胎児細胞、前駆細胞、幹細胞、泡沫細胞、間葉細胞、免疫系細胞、内皮細胞、子宮内膜細胞、結合組織細胞、栄養膜、細菌、真菌、または病原体を特異的に結合する、請求項１１６に記載のデバイス。
【請求項１１９】
前記障害物は、前記結合部分を含む、請求項１１７に記載のデバイス。
【請求項１２０】
前記デバイスは、１２ミクロンより大きい流体力学的サイズを有する細胞を前記第１の方向に方向付けるように構成される、請求項１１６に記載のデバイス。
【請求項１２１】
前記デバイスは、１４ミクロンより大きい流体力学的サイズを有する細胞を前記第１の方向に方向付けるように構成される、請求項１１６に記載のデバイス。
【請求項１２２】
前記デバイスは、１６ミクロンより大きい流体力学的サイズを有する細胞を前記第１の方向に方向付けるように構成される、請求項１１６に記載のデバイス。
【請求項１２３】
流体工学的に前記捕捉モジュールに対して連結された細胞計数モジュールをさらに備える、請求項１１６に記載のデバイス。
【請求項１２４】
前記１種以上の結合部分は、ポリペプチドを含む、請求項１１６に記載のデバイス。
【請求項１２５】
前記ポリペプチドは、抗体またはそのフラグメントを含む、請求項１２４に記載のデバイス。
【請求項１２６】
前記抗体またはそのフラグメントは、モノクローナル性である、請求項１２５に記載のデバイス。
【請求項１２７】
前記モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、ＥｐＣＡＭに結合する、請求項１２６に記載のデバイス。
【請求項１２８】
細胞サンプルを処理するためのデバイスであって、該デバイスは、１種以上の第１の細胞を第１の方向に方向付けて該第１の細胞について濃縮された第１の出力サンプルを産生し、かつ１種以上の第２の細胞を第２の方向に方向付けて該第２の細胞について濃縮された第２の出力サンプルを産生する構造を備えるチャンネルを備え、該構造は、ギャップのネットワークを形成する障害物のアレイを備え、そして該障害物のうちの少なくともいくつかは、該第１の細胞または該第２の細胞を選択的に結合するモノクローナル抗ＥｐＣＡＭ抗体またはそのフラグメントを含む、デバイス。
【請求項１２９】
細胞サンプルを処理するためのデバイス、該デバイスは、
（ａ）該細胞サンプルにおいて細胞をサイズに基づいて濃縮し得る濃縮モジュール；および
（ｂ）該濃縮モジュールによって濃縮された細胞の数を決定するための細胞計数モジュールであって、該細胞計数モジュールが、流体工学的に該濃縮モジュールに対して連結される、濃縮モジュール；
を備える、デバイス
【請求項１３０】
前記濃縮モジュールは、１種以上の第１の細胞を第１の方向に方向付けて該第１の細胞について濃縮された第１の出力サンプルを産生し、かつ１種以上の第２の細胞を第２の方向に方向付けて該第２の細胞について濃縮された第２の出力サンプルを産生する構造を備えるチャンネルを備える、請求項１２９に記載のデバイス。
【請求項１３１】
前記デバイスは、１２ミクロンより大きい流体力学的サイズを有する細胞を前記第１の方向に方向付け、かつ１２ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞を前記第２の方向に方向付けるように構成される、請求項１３０に記載のデバイス。
【請求項１３２】
前記デバイスは、６ミクロン以上かつ１２ミクロン以下の流体力学的サイズを有する細胞を前記第１の方向に方向付け、かつ６ミクロン未満の流体力学的サイズを有する細胞または１２ミクロンより大きい流体力学的サイズを有する細胞を前記第２の方向に方向付けるように構成される、請求項１３０に記載のデバイス。
【請求項１３３】
前記第１の細胞は、癌細胞を含む、請求項１３０に記載のデバイス。
【請求項１３４】
前記構造は、ギャップのネットワークを形成する障害物のアレイを備える、請求項１３０に記載のデバイス。
【請求項１３５】
前記細胞計数モジュールは、前記第１の出力サンプルまたは前記第２の出力サンプルにおいて細胞の数を決定するためにインピーダンス、光学、または静電容量を利用する、請求項１２９に記載のデバイス。
【請求項１３６】
前記デバイスは、前記第１の出力サンプルまたは前記第２の出力サンプルを可視化するように適合された検出器をさらに備え、該検出器は、流体工学的に前記捕捉モジュールに対して連結される、請求項１１６、１２８、または１２９に記載のデバイス。
【請求項１３７】
前記チャンネルは、ギャップのネットワークを形成する障害物のアレイを備え、そして流体が、該流体が大きい流束および小さい流束へと不等に分けられるように該ギャップを通って流れる、請求項１０８に記載のデバイス。
【請求項１３８】
細胞サンプルを処理するためのデバイスであって、該デバイスは、１種以上の第１の細胞を第１の方向に方向付けて該第１の細胞について濃縮された第１の出力サンプルを産生し、かつ１種以上の第２の細胞を第２の方向に方向付けて該第２の細胞について濃縮された第２の出力サンプルを産生する構造を備えるチャンネルを備え、該デバイスは、１時間あたり少なくとも２０ｍＬの流体を処理し得る、デバイス。
【請求項１３９】
前記構造は、ギャップのネットワークを形成する障害物のアレイを備える、請求項１３８に記載のデバイス。
【請求項１４０】
前記ギャップは、サイズが２０ミクロンと１００ミクロンとの間である、請求項１３９に記載のデバイス。
【請求項１４１】
前記障害物のアレイは、障害物の互い違いに配置された二次元アレイを含む、請求項１３９に記載のデバイス。
【請求項１４２】
前記障害物のアレイは、複数の列を含み、それぞれの連続した列は、先の列の半分未満の周期でずらされる、請求項１３９に記載のデバイス。
【請求項１４３】
第１の障害物のアレイと直列または並列で障害物の１種以上のさらなるアレイをさらに備える、請求項１３９に記載のデバイス。
【請求項１４４】
前記第１の細胞は、前記第２の細胞よりも大きい平均流体力学的サイズを有する、請求項１３８に記載のデバイス。
【請求項１４５】
前記デバイスは、１時間あたり少なくとも５０ｍＬの流体を処理し得る、請求項１３８に記載のデバイス。
【請求項１４６】
前記細胞サンプルは、血液またはその分画を含む、請求項１３８に記載のデバイス。
【請求項１４７】
前記デバイスは、１２ミクロンより大きい流体力学的サイズを有する細胞を前記第１の方向に方向付けるように構成される、請求項１３８に記載のデバイス。
【請求項１４８】
前記デバイスは、１４ミクロンより大きい流体力学的サイズを有する細胞を前記第１の方向に方向付けるように構成される、請求項１３８に記載のデバイス。
【請求項１４９】
前記デバイスは、１６ミクロンより大きい流体力学的サイズを有する細胞を前記第１の方向に方向付けるように構成される、請求項１３８に記載のデバイス。
【請求項１５０】
請求項１３８に記載のデバイスであって、前記デバイスは、第１の入口と、第１の出口と、第２の出口とを備える連続フローデバイスを備え、前記細胞サンプルは、該第１の入口に適用され、前記第１の出力サンプルは、該第１の出口から流出し、そして前記第２の出力サンプルは、該第２の出口から流出する、デバイス。
【請求項１５１】
前記デバイスは、前記第１の細胞について濃縮された第１の出力サンプルを産生し得、該第１の出力サンプルの容量は、前記細胞サンプルの容量よりも小さい、請求項１３８に記載のデバイス。
【請求項１５２】
前記第１の出力サンプルは、前記細胞サンプル中の前記第１の細胞の少なくとも８０％を含む、請求項１３８に記載のデバイス。
【請求項１５３】
前記第２の出力サンプルは、前記細胞サンプル中の前記第１の細胞の２０％未満を含む、請求項１３８に記載のデバイス。
【請求項１５４】
前記デバイスは、第２の入口を備え、そして第２の流体が、該第２の入口に適用される、請求項１５０に記載のデバイス。
【請求項１５５】
前記第１の細胞は、上皮細胞、癌細胞、骨髄細胞、胎児細胞、前駆細胞、幹細胞、泡沫細胞、間葉細胞、免疫系細胞、内皮細胞、子宮内膜細胞、結合組織細胞、栄養膜、細菌、真菌、または病原体を含む、請求項１３８に記載のデバイス。
【請求項１５６】
請求項１３８に記載のデバイスであって、該デバイスは、流体工学的に前記チャンネルに対して連結された検出器モジュールをさらに備える、デバイス。
【請求項１５７】
前記検出器モジュールは、顕微鏡、細胞計数器、磁石、生体腔レーザー、質量分析器、ＰＣＲデバイス、ＲＴ−ＰＣＲデバイス、マトリックス、マイクロアレイ、またはハイパースペクトルイメージングシステムを備える、請求項１５６に記載のデバイス。
【請求項１５８】
前記検出器モジュールは、前記第１の細胞を選択的に結合する標識を検出する、請求項１５７に記載のデバイス。
【請求項１５９】
前記デバイスは、被験体における移植に適合される、請求項１３８に記載のデバイス。
【請求項１６０】
前記デバイスは、被験体の循環系または循環系の近傍における配置に適合される、請求項１５９に記載のデバイス。
【請求項１６１】
流体工学的に被験体の循環系に対して連結され得るシステムであって、該システムは、細胞サンプルを処理するためのデバイスを備え、該デバイスは、１種以上の第１の細胞を第１の方向に方向付けて該第１の細胞について濃縮された第１の出力サンプルを産生し、かつ１種以上の第２の細胞を第２の方向に方向付けて該第２の細胞について濃縮された第２の出力サンプルを産生する構造を備えるチャンネルを備える、システム。
【請求項１６２】
前記システムは、チュービングまたは動静脈シャントによって流体工学的に前記循環系に対して連結される、請求項１６１に記載のシステム。
【請求項１６３】
前記システムは、１種以上の被検体を前記循環系から取り出し得る、請求項１６１に記載のシステム。
【請求項１６４】
前記システムは、前記デバイスを通る連続的な血流に適合される、請求項１６１に記載のシステム。
【請求項１６５】
前記デバイスは、使い捨て可能である、請求項１６１に記載のシステム。
【請求項１６６】
被検体を細胞サンプルから枯渇させるための方法であって、該方法は、細胞サンプルを処理するためのデバイスに該細胞サンプルを導入する工程を包含し、該デバイスは、１種以上の第１の細胞を第１の方向に方向付けて該第１の細胞について濃縮された第１の出力サンプルを産生し、かつ１種以上の第２の細胞を第２の方向に方向付けて該第２の細胞について濃縮された第２の出力サンプルを産生する構造を備えるチャンネルを備え、該第１の出力サンプルまたは該第２の出力サンプルは、該細胞サンプルと比較して該被検体について枯渇している、方法。
【請求項１６７】
前記細胞サンプルは、血液、汗、涙、耳の流出物、痰、リンパ、骨髄懸濁物、尿、唾液、精液、経血、脳脊髄液、脳の流体、腹水、乳汁、呼吸器の分泌物、腸もしくは尿生殖器の管、羊水、または水サンプルを含む、請求項１６６に記載の方法。
【請求項１６８】
前記細胞サンプルは、血液学的な病態、炎症性の病態、虚血性の病態、腫瘍性の病態、感染、外傷、子宮内膜症、または腎不全を患う被験体から採取される、請求項１６６に記載の方法。
【請求項１６９】
前記腫瘍性の病態は、急性リンパ芽球性白血病、急性または慢性のリンパ球性腫瘍または顆粒球性腫瘍、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、腺癌、腺腫、副腎癌、基底細胞癌、骨の癌、脳の癌、乳癌、気管支の癌、子宮頚部形成異常、慢性骨髄性白血病、結腸癌、類表皮癌、ユーイング肉腫、胆嚢癌、胆石性腫瘍、骨巨細胞腫、多形性神経膠芽腫、ヘアリーセル腫瘍、頭の癌、過形成、増殖性の角膜神経腫瘍、上皮内癌、腸の神経節細胞腫、ランゲルハンス島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、平滑筋の腫瘍、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、悪性カルチノイド、悪性高カルシウム血症、悪性黒色腫、マルファン様体型の腫瘍、髄様癌、転移性皮膚癌、粘膜神経腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄腫、首の癌、神経組織の癌、神経芽腫、骨原性肉腫、骨肉腫、卵巣腫瘍、膵臓癌、副甲状腺癌、褐色細胞腫、真性赤血球増加症、原発性脳腫瘍、前立腺癌、直腸癌、腎細胞腫瘍、網膜芽腫、横紋筋肉腫、精上皮腫、皮膚癌、小細胞肺腫瘍、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃癌、甲状腺癌、局所的な皮膚病変、細網肉腫、およびウィルムス腫瘍からなる群より選択される、請求項１６６に記載の方法。
【請求項１７０】
被験体において病態を診断するための方法であって、該方法は、
（ａ）細胞サンプルを処理するためのデバイスに該被験体由来の細胞サンプルを導入する工程であって、該デバイスは、１種以上の第１の細胞を第１の方向に方向付けて該第１の細胞について濃縮された第１の出力サンプルを産生し、かつ１種以上の第２の細胞を第２の方向に方向付けて該第２の細胞について濃縮された第２の出力サンプルを産生する構造を備えるチャンネルを備え、該デバイスは、１時間あたり少なくとも２０ｍＬの流体を処理し得る、工程；
（ｂ）該第１の出力サンプルを分析する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）の結果に基づいて該病態の存在または非存在を診断する工程；
を包含する、方法。
【請求項１７１】
工程（ｂ）は、前記第１の出力サンプルの細胞を、接着、移動、結合、形態、分裂、遺伝子発現のレベル、および体細胞変異の存在からなる群より選択される１種以上の特徴について分析する工程を包含する、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
工程（ｂ）は、表１から選択される１種以上のマーカーの存在または非存在を検出する工程、表１から選択される１種以上のマーカーをコードする核酸において変異の存在または非存在を検出する工程、表１から選択される１種以上のマーカーをコードする核酸において欠失の存在または非存在を検出する工程、表１から選択される１種以上のマーカーの発現のレベルを検出する工程、または前記第１の出力サンプルにおいてマイクロＲＮＡのレベルを検出する工程を包含する、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７３】
前記病態は、血液学的な病態、炎症性の病態、虚血性の病態、腫瘍性の病態、感染、外傷、子宮内膜症、または腎不全である、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７４】
工程（ｂ）は、前記第１の出力サンプルにおいて前記第１の細胞の数を決定する工程を包含する、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７５】
前記チャンネルは、ギャップのネットワークを形成する障害物のアレイを備え、そして流体が、該流体が大きい流束および小さい流束へと不等に分けられるように該ギャップを通って流れる、請求項１３８に記載のデバイス。
【請求項１７６】
細胞サンプルを処理するためのデバイスであって、該デバイスは、ギャップのネットワークを形成する障害物のアレイを備えるチャンネルを備え、流体が、該流体が大きい流束および小さい流束へと不等に分けられるように該ギャップを通って流れ、そして該アレイは、上皮細胞を、該アレイにおける流れの平均した方向に平行ではない方向に方向付けるように構成される、デバイス。
【請求項１７７】
前記デバイスは、２個の入口をさらに備える、請求項１７６に記載のデバイス。
【請求項１７８】
前記デバイスは、２個の出口をさらに備える、請求項１７６に記載のデバイス。
【請求項１７９】
請求項１７６に記載の第２のデバイスをさらに備え、該デバイスは、流体工学的に連結される、請求項１７６に記載のデバイス。
【請求項１８０】
前記ギャップは、上皮細胞を前記出口のうちの１個へと方向付けるようにサイジングされる、請求項１７８に記載のデバイス。
【請求項１８１】
前記ギャップは、上皮細胞を、１つの前記入口に流入する流体から、別の前記入口に流入する流体へと方向付けるようにサイジングされる、請求項１７７に記載のデバイス。
【請求項１８２】
前記障害物は、ポリマー、ケイ素、ガラス、または融合したシリカを含む、請求項１７６に記載のデバイス。
【請求項１８３】
細胞サンプルを処理するためのデバイスであって、該デバイスは、
ａ．ギャップのネットワークを形成する障害物のアレイを備えるチャンネルであって、ここで流体が、該流体が大きい流束および小さい流束へと不等に分けられるように該ギャップを通って流れ、その結果、臨界サイズよりも大きい細胞の動きの平均した方向が、流体の流れの平均した方向に平行ではない、チャンネル；
ｂ．正常血球よりも大きい細胞を収集するように配置された出口；および
ｃ．細胞を計測する細胞検出器；
を備える、デバイス。
【請求項１８４】
上皮細胞の濃縮されたサンプルを産生する方法であって、該方法は、請求項１７６に記載のデバイスに細胞サンプルを導入する工程を包含し、ここで、該細胞サンプルが、該デバイスを通って流れる場合、該細胞サンプル中に存在する上皮細胞は、該細胞サンプルの平均した流れの方向に平行ではない方向に方向付けられ、そして該細胞サンプルの別の成分は、該平均した流れの方向に沿って方向付けられ、それによって該他の成分と比較して上皮細胞について濃縮されたサンプルが、産生される、方法。
【請求項１８５】
前記他の成分は、赤血球、血小板、白血球、または内皮細胞を含む、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８６】
前記上皮細胞は、直径が８μｍ〜３０μｍの範囲である、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８７】
前記細胞は、ＤＮＡ分析、ＲＮＡ分析、タンパク質分析、またはメタボローム分析を受け得る、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８８】
前記細胞は、インセルＰＣＲを使用して分析される、請求項１８７に記載の方法。
【請求項１８９】
前記細胞は、存在するサイトケラチンｍＲＮＡのレベルを決定することによって分析される、請求項１８７に記載の方法。
【請求項１９０】
前記上皮細胞は、癌細胞である、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１９１】
前記癌細胞は、癌幹細胞である、請求項１９０に記載の方法。
【請求項１９２】
前記濃縮されたサンプルの容量が、前記細胞サンプルの容量よりも実質的に小さく、前記上皮細胞の濃縮を生じる、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１９３】
溶解緩衝液が、前記デバイスに同時導入され、そして前記濃縮されたサンプルは、上皮細胞の成分を含む、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１９４】
交換緩衝液は、前記デバイスに同時導入され、そして前記濃縮されたサンプルは、交換緩衝液を含む、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１９５】
前記濃縮されたサンプルと、上皮細胞を優先的に標識する標識試薬とを接触させる工程をさらに包含する、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１９６】
前記濃縮されたサンプルにおいて細胞の数を定量する工程をさらに包含する、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１９７】
前記デバイスは、前記濃縮されたサンプルにおいて５００ｆＬよりも大きい細胞容量の細胞の数を決定する、請求項１９６に記載の方法。
【請求項１９８】
前記デバイスは、前記濃縮されたサンプルにおいて１４μｍよりも大きい直径の細胞の数を決定する、請求項１９６に記載の方法。
【請求項１９９】
前記デバイス内部の前記細胞の各々に対するずれ応力は、全ての時間において１０ダイン／ｃｍ２未満である、請求項１８４に記載の方法。
【請求項２００】
前記細胞サンプルは、上皮細胞を優先的に標識する標識試薬に接触され、ここで該標識試薬は、最初に、前記デバイスに対する該細胞サンプルの導入前または該デバイスに対する該細胞サンプルの導入後のいずれかにおいて該細胞サンプルと合わせられる、請求項１８４に記載の方法。
【請求項２０１】
前記標識試薬は、粒状標識試薬である、請求項２００に記載の方法。
【請求項２０２】
請求項２００に記載の方法であって、該方法は、前記標識された細胞を定量する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２０３】
前記標識試薬は、量子ドットを含み、そして前記標識された細胞は、２−光子励起を使用して分析される、請求項２０２に記載の方法。
【請求項２０４】
請求項２０３に記載の方法であって、該方法は、前記濃縮されたサンプルの容積測定を行なう工程をさらに包含する、方法。
【請求項２０５】
前記細胞に結合された標識試薬は、該細胞に結合されていないままの標識試薬から分離される、請求項２００に記載の方法。
【請求項２０６】
前記標識試薬は、前記デバイスに同時導入され、該デバイス内において前記細胞の標識化をもたらす、請求項２００に記載の方法。
【請求項２０７】
前記標識試薬は、量子ドット、抗体、ファージ、アプタマー、フルオロフォア、酵素、またはビーズを含む、請求項２００に記載の方法。
【請求項２０８】
前記ビーズは、アフィニティー試薬を含む、請求項２０７に記載の方法。
【請求項２０９】
前記ビーズは、ポリスチレンを含む、請求項２０７に記載の方法。
【請求項２１０】
前記ビーズは、天然に浮遊する、請求項２０７に記載の方法。
【請求項２１１】
前記ビーズは、抗体を含む、請求項２０７に記載の方法。
【請求項２１２】
前記標識試薬は、前記細胞のサイズを増加させる、請求項２００に記載の方法。
【請求項２１３】
前記サイズが、少なくとも１０％増加する、請求項２１２に記載の方法。
【請求項２１４】
前記サイズが、少なくとも１００％増加する、請求項２１２に記載の方法。
【請求項２１５】
前記サイズが、少なくとも１０００％増加する、請求項２１２に記載の方法。
【請求項２１６】
上皮細胞を定量する方法であって、該方法は、
ａ．細胞サンプルを提供する工程；
ｂ．請求項１７６に記載のデバイスに該細胞サンプルを導入して、上皮細胞について濃縮されたサンプルを産生する工程；および
ｃ．該上皮細胞を定量する工程；
を包含する、方法。
【請求項２１７】
ａ．請求項１７６に記載のデバイスに患者由来の細胞サンプルを導入して、正常血球よりも大きい細胞について濃縮されたサンプルを産生する工程；および
ｂ．該サンプルに存在する正常血球よりも大きい細胞の数を決定して、疾患状態を決定する工程；
を包含する、診断方法。
【請求項２１８】
ａ．請求項１７６に記載のデバイスに患者由来の細胞サンプルを導入して、正常血球よりも大きい細胞について濃縮されたサンプルを産生する工程；および
ｂ．疾患状態を決定するために、ＤＮＡ分析、ＲＮＡ分析、プロテオーム分析、またはメタボローム分析を該濃縮されたサンプルに対して行なう工程；
を包含する、診断方法。
【請求項２１９】
前記ＤＮＡ分析は、上皮増殖因子レセプター遺伝子において１種以上の変異の存在、および同一性、すなわち非存在を決定する工程を包含する、請求項２１８に記載の方法。
【請求項２２０】
前記ＤＮＡ分析は、
ｉ．前記濃縮されたサンプルからゲノムＤＮＡを単離する工程；ならびに
ｉｉ．前記上皮増殖因子レセプター遺伝子のエキソン１８、エキソン１９、エキソン２０、およびエキソン２１のうちの１種以上を増幅する工程；
を包含する、請求項２１９に記載の方法。
【請求項２２１】
ｉｉｉ．公知の上皮増殖因子レセプター変異に対応する前記増幅産物の下位領域を増幅し、さらなる増幅産物を生じる工程；
ｉｖ．該さらなる増幅産物を配列決定する工程；および
ｖ．該生じた配列を、該上皮増殖因子レセプター遺伝子の野生型配列および該上皮増殖因子レセプター遺伝子の公知の変異の一覧と比較する工程；
をさらに包含する、請求項２２０に記載の方法。
【請求項２２２】
前記正常血球よりも大きい細胞は、上皮細胞を含む、請求項２１７または２１８に記載の方法。
【請求項２２３】
前記疾患状態は、癌を含む、請求項２１７または２１８に記載の方法。
【請求項２２４】
前記正常血球よりも大きい細胞は、上皮細胞を含む、請求項１８３に記載のデバイス。
【請求項２２５】
細胞サンプルを処理するためのデバイスであって、前記デバイスは、ギャップのネットワークを形成する障害物のアレイ上に位置決めされたシーリングを備えるチャンネルを備え、該デバイスは、臨界サイズ以下の直径を有する細胞を該ギャップのネットワークを通して流させ、かつ該シーリングと該障害物との間の該臨界サイズよりも大きい直径を有する細胞を捕捉するように構成される、デバイス。
【請求項２２６】
前記臨界サイズは、５ミクロンと２０ミクロンとの間である、請求項２２５に記載のデバイス。
【請求項２２７】
前記臨界サイズは、１２ミクロンである、請求項２２５に記載のデバイス。
【請求項２２８】
前記臨界サイズは、１４ミクロンである、請求項２２５に記載のデバイス。
【請求項２２９】
前記臨界サイズよりも大きい直径を有する細胞は、１種以上の稀な細胞を含む、請求項２２５に記載のデバイス。
【請求項２３０】
前記稀な細胞は、１種以上の上皮細胞、癌細胞、骨髄細胞、胎児細胞、前駆細胞、幹細胞、泡沫細胞、間葉細胞、免疫系細胞、内皮細胞、子宮内膜細胞、結合組織細胞、栄養膜、細菌、真菌、または病原体を含む、請求項２２９に記載のデバイス。
【請求項２３１】
前記シーリングは、透明である、請求項２２５に記載のデバイス。
【請求項２３２】
細胞サンプルにおいて臨界サイズよりも大きい直径を有する細胞を処理する方法であって、該方法は、ギャップのネットワークを形成する障害物のアレイ上に位置決めされたシーリングを備えるチャンネルを備えるデバイスに、該細胞サンプルを導入する工程を包含し、該デバイスは、該臨界サイズ以下の直径を有する細胞を該ギャップのネットワークを通して流し得、かつ該シーリングと該障害物との間の該臨界サイズよりも大きい直径を有する細胞を捕捉し得るように構成される、方法。
【請求項２３３】
前記シーリングと前記障害物との間の前記臨界サイズよりも大きい直径を有する前記細胞の存在または非存在を検出する工程をさらに包含する、請求項２３２に記載の方法。
【請求項２３４】
前記シーリングは、透明であり、そして前記検出する工程は、顕微鏡を使用する工程を包含する、請求項２３３に記載の方法。
【請求項２３５】
前記デバイスに、緩衝液、溶解試薬、核酸増幅試薬、容量オスモル濃度調節試薬、標識試薬、保存剤、または固定試薬を導入する工程を、前記細胞サンプルを導入する工程の後にさらに包含する、請求項２３２に記載の方法。
【請求項２３６】
前記容量オスモル濃度調節試薬は、高浸透圧溶液を含む、請求項２３５に記載の方法。
【請求項２３７】
前記高浸透圧溶液は、前記シーリングと前記障害物との間の前記臨界サイズよりも大きい直径を有する前記細胞を放出させる、請求項２３６に記載の方法。
【請求項２３８】
癌に罹患したかまたは癌を発症する危険性があるヒト患者における上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）を標的する処置の効力の可能性を決定するための方法であって、該方法は、
１つの流体力学的サイズの第１の細胞を１つの方向に方向付けて第１の細胞について濃縮された第１の出力を産生し、かつ１種以上の第２の細胞を第２の方向に方向付けて第２の出力を産生する構造を備えるチャンネルを備えるデバイスに、該患者由来の細胞サンプルを適用する工程；および
該第１の出力の細胞または該第２の出力の細胞において、ＥＧＦＲ遺伝子における少なくとも１種の所定の核酸改変体の存在または非存在を検出する工程であって、該少なくとも１種の核酸改変体の存在は、ＥＧＦＲを標的する処置が有効である可能性が高いことを示す、工程；
を包含する、方法。
【請求項２３９】
前記改変体は、前記第１の出力の細胞のｅｒｂＢ１遺伝子のキナーゼドメインに位置し、該改変体は、野生型ｅｒｂＢ１遺伝子である、請求項２３８に記載の方法。
【請求項２４０】
前記核酸改変体は、キナーゼ活性を上昇させる、請求項２３９に記載の方法。
【請求項２４１】
前記第１の細胞は、癌細胞である、請求項２３８に記載の方法。
【請求項２４２】
前記癌は、胃腸癌、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、頭および首の癌、肺癌、非小細胞肺癌、神経系の癌、腎臓癌、網膜の癌、皮膚癌、肝臓癌、膵癌、生殖器−泌尿器の癌、および膀胱癌からなる群より選択される、請求項２４０に記載の方法。
【請求項２４３】
前記癌は、非小細胞肺癌である、請求項２４１に記載の方法。
【請求項２４４】
前記ｅｒｂＢ１遺伝子のキナーゼドメインにおける改変体は、ＡＴＰ結合ポケットの立体配座構造に影響を及ぼす、請求項２３９に記載の方法。
【請求項２４５】
ｅｒｂＢ  １の前記キナーゼドメインにおける前記改変体は、エキソン１８、エキソン１９、エキソン２０、およびエキソン２１からなる群より選択される前記ｅｒｂＢ１遺伝子のエキソンに存在する、請求項２３９に記載の方法。
【請求項２４６】
前記改変体は、エキソン１８、エキソン１９またはエキソン２１に存在する、請求項２４５に記載の方法。
【請求項２４７】
前記ｅｒｂＢ１遺伝子のキナーゼドメインにおける改変体は、インフレームの欠失、置換、または挿入である、請求項２３９に記載の方法。
【請求項２４８】
前記少なくとも１種の改変体の存在または非存在の検出は、核酸のセグメントを増幅する工程を包含する、請求項２３８に記載の方法。
【請求項２４９】
前記少なくとも１種の改変体の存在または非存在の検出は、前記ｅｒｂＢ１核酸と少なくとも１種の核酸プローブとを接触させる工程を包含し、該少なくとも１種のプローブは、該改変体を含む核酸配列と、選択的ハイブリダイゼーション条件下で優先的にハイブリダイズする、請求項２３９に記載の方法。
【請求項２５０】
少なくとも１種の改変体の存在または非存在の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行って前記ｅｒｂＢ１コード配列を含む核酸を増幅する工程、および該増幅された核酸のヌクレオチド配列を決定する工程を包含する、請求項２３９に記載の方法。
【請求項２５１】
前記構造は、前記細胞を分離するギャップのネットワークを形成する障害物の二次元アレイを含む、請求項２３８に記載の方法。
【請求項２５２】
前記第１の出力と、上皮細胞または腫瘍性細胞を選択的に結合する特異的結合部分を備えるデバイスとを接触させる工程をさらに包含する、請求項２５１に記載の方法。
【請求項２５３】
前記特異的結合部分は、抗体またはそのフラグメントである、請求項２５２に記載の方法。
【請求項２５４】
前記抗体は、Ｂｅｒ−Ｅｐ４、ＥｐＣａｍ、Ｅ−カドヘリン、ムチン−１、サイトケラチンまたはＣＤ−３４を特異的に結合する、請求項２５３に記載の方法。
【請求項２５５】
患者におけるＥＧＦＲを標的する処置の効力の可能性を決定するための方法であって、該方法は、
１つの流体力学的サイズの第１の細胞を１つの方向に方向付けて第１の細胞について濃縮された第１の出力を産生し、かつ１種以上の第２の細胞を第２の方向に方向付けて第２の出力を産生する構造を備えるチャンネルを備えるデバイスに、該患者由来の細胞サンプルを適用する工程；
該細胞をＥＧＦＲリガンドによって刺激する工程；および
該第１の細胞においてｅｒｂＢ１遺伝子にコードされるキナーゼのキナーゼ活性を決定する工程であって、コントロールと比較したキナーゼ活性の上昇は、ＥＧＦＲを標的する処置が有効である可能性が高いことを示す、工程；
を包含する、方法。
【請求項２５６】
前記第１の細胞は、癌細胞である、請求項２５５に記載の方法。
【請求項２５７】
前記癌は、胃腸癌、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、頭および首の癌、肺癌、非小細胞肺癌、神経系の癌、腎臓癌、網膜の癌、皮膚癌、肝臓癌、膵癌、生殖器−泌尿器の癌、および膀胱癌からなる群より選択される、請求項２５６に記載の方法。
【請求項２５８】
前記癌は、非小細胞肺癌である、請求項２５６に記載の方法。
【請求項２５９】
前記構造は、前記細胞を分離するギャップのネットワークを形成する障害物の二次元アレイを含む、請求項２５５に記載の方法。
【請求項２６０】
前記第１の出力と、上皮細胞または腫瘍性細胞を選択的に結合する特異的結合部分を備える前記デバイスとを接触させる工程をさらに包含する、請求項２５９に記載の方法。
【請求項２６１】
前記特異的結合部分は、抗体またはそのフラグメントである、請求項２６０に記載の方法。
【請求項２６２】
前記抗体は、Ｂｅｒ−Ｅｐ４、ＥｐＣａｍ、Ｅ−カドヘリン、ムチン−１、サイトケラチンまたはＣＤ−３４を特異的に結合する、請求項２６１に記載の方法。
【請求項２６３】
前記ＥＧＦＲを標的する処置は、チロシンキナーゼインヒビターである、請求項２５５に記載の方法。
【請求項２６４】
前記チロシンキナーゼインヒビターは、アニリノキナゾリンである、請求項２６３に記載の方法。
【請求項２６５】
前記アニリノキナゾリンは、合成アニリノキナゾリンである、請求項２６４に記載の方法。
【請求項２６６】
前記合成アニリノキナゾリンは、ゲフィチニブおよびエルロチニブからなる群より選択される、請求項２６５に記載の方法。
【請求項２６７】
癌に罹患したかまたは癌を発症する危険性があるヒト患者における上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）を標的する処置の効力の可能性を決定するための方法であって、該方法は、
１つの流体力学的サイズの第１の細胞を１つの方向に方向付けて第１の細胞について濃縮された第１の出力を産生し、かつ１種以上の第２の細胞を第２の方向に方向付けて第２の出力を産生する構造を備えるチャンネルを備えるデバイスに、該患者由来の細胞サンプルを適用する工程；
エキソン１８、エキソン１９、エキソン２０、またはエキソン２１の一部を増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによってエキソン１８、エキソン１９、エキソン２０、またはエキソン２１において少なくとも１種の核酸改変体の存在または非存在を検出する工程；および
該増幅されたエキソン１８、エキソン１９、エキソン２０、またはエキソン２１の少なくとも一部を配列決定することによって、該増幅された核酸のヌクレオチド配列を決定する工程であって、野生型ｅｒｂＢ１コントロールと比較してエキソン１８、エキソン１９、エキソン２０、またはエキソン２１における少なくとも１種のヌクレオチド改変体の存在は、ＥＧＦＲを標的する処置が有効である可能性が高いことを示す、工程；
を包含する、方法。
【請求項２６８】
前記構造は、前記細胞を分離するギャップのネットワークを形成する障害物の二次元アレイを含む、請求項２５５に記載の方法。
【請求項２６９】
前記第１の出力と、上皮細胞または腫瘍性細胞を選択的に結合する特異的結合部分を備えるデバイスとを接触させる工程をさらに包含する、請求項２６８に記載の方法。
【請求項２７０】
前記特異的結合部分は、抗体またはそのフラグメントである、請求項２６９に記載の方法。
【請求項２７１】
前記抗体は、Ｂｅｒ−Ｅｐ４、ＥｐＣａｍ、Ｅ−カドヘリン、ムチン−１、サイトケラチンまたはＣＤ−３４を特異的に結合する、請求項２７０に記載の方法。
【請求項２７２】
１つの流体力学的サイズの第１の細胞を１つの方向に方向付けて第１の細胞について濃縮された第１の出力を産生し、かつ１種以上の第２の細胞を第２の方向に方向付けて第２の出力を産生する構造を備えるチャンネルを備えるデバイス；および
ＥＧＦＲ遺伝子において少なくとも１種の核酸変異の存在または非存在を検出するための試薬；
を備える、キット。
【請求項２７３】
前記試薬は、核酸および生成物にアニーリングするように設計された少なくとも１つの縮重プライマー対ならびにＰＣＲ増幅を行うのに必要とされる試薬を含む、請求項２７２に記載のキット。
【請求項２７４】
前記構造は、前記細胞を分離するギャップのネットワークを形成する障害物の二次元アレイを含む、請求項２７２に記載のキット。
【請求項２７５】
前記第１の出力を受容するように適合されたデバイスをさらに備える請求項２７４に記載のキットであって、該デバイスは、上皮細胞または腫瘍性細胞を選択的に結合する特異的結合部分を備える、キット。
【請求項２７６】
前記特異的結合部分は、抗体またはそのフラグメントである、請求項２７５に記載のキット。
【請求項２７７】
前記抗体は、Ｂｅｒ−Ｅｐ４、ＥｐＣａｍ、Ｅ−カドヘリン、ムチン−１、サイトケラチンまたはＣＤ−３４を特異的に結合する、請求項２７６に記載のキット。
【請求項２７８】
前記試薬は、前記ＥＧＦＲキナーゼドメインタンパク質のＡＴＰ結合ポケットに結合し得る少なくとも１種のプローブを含む、請求項２７２に記載のキット。
【請求項２７９】
前記試薬は、抗体、抗体フラグメントまたはキメラ抗体を含む、請求項２７２または２７８記載のキット。
【請求項２８０】
前記試薬は、検出可能な標識をさらに含む、請求項２７９に記載のキット。
【請求項２８１】
患者由来の癌細胞のＥＧＦＲ遺伝子における二次変異の獲得を予測するための方法であって、該方法は、
該患者由来の細胞サンプルと、１つの流体力学的サイズの第１の細胞を１つの方向に方向付けて第１の細胞について濃縮された第１の出力を産生し、かつ１種以上の第２の細胞を第２の方向に方向付けて第２の出力を産生する構造を備えるチャンネルを備えるデバイスとを接触させる工程；
該第１の細胞と、致死量以下の用量のチロシンキナーゼインヒビターとを接触させる工程；
該チロシンインヒビターの効果に抵抗性である細胞を選択する工程；および
該抵抗性の細胞由来の核酸を二次変異の存在について分析する工程；
を包含する、方法。
【請求項２８２】
前記第１の細胞は、ｅｒｂＢ１遺伝子の改変体を有する、請求項２８１に記載の方法。
【請求項２８３】
前記構造は、前記細胞を分離するギャップのネットワークを形成する障害物の二次元アレイを含む、請求項２８１に記載の方法。
【請求項２８４】
前記第１の出力と、上皮細胞または腫瘍性細胞を選択的に結合する特異的結合部分を備えるデバイスとを接触させる工程をさらに包含する、請求項２７３に記載の方法。
【請求項２８５】
前記特異的結合部分は、抗体またはそのフラグメントである、請求項２８４に記載の方法。
【請求項２８６】
前記抗体は、Ｂｅｒ−Ｅｐ４、ＥｐＣａｍ、Ｅ−カドヘリン、ムチン−１、サイトケラチンまたはＣＤ−３４を特異的に結合する、請求項２８５に記載の方法。
【請求項２８７】
前記細胞は、腫瘍生検から得られる、請求項２８１に記載の方法。
【請求項２８８】
最初に前記第１の細胞と有効量の変異誘発因子とを接触させる工程をさらに包含する、請求項２８１に記載の方法。
【請求項２８９】
前記変異誘発因子は、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＥＮＵ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＭＮＵ）、塩酸ホカルバキシン（Ｐｒｃ）、メチルメタンスルホネート（ＭｅＭＳ）、クロラムブシル（Ｃｈｉ）、メルファラン、塩酸ポルカルバジン、シクロホスファミド（Ｃｐ）、ジエチル硫酸  （Ｅｔ２ＳＯ４）、アクリルアミドモノマー（ＡＡ）、メチレンメラミン（ＴＥＭ）、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジメチルニトロソアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、７，１２  ジメチルベンズアントラセン（ＤＭＢＡ）、酸化エチレン、ヘキサメチルホスホラミド、ビスルファン、およびエチルメタンスルホレート（ＥｔＭｓ）からなる群より選択される、請求項２８８に記載の方法。
【請求項２９０】
癌に罹患したかまたは癌を発症する危険性がある患者における上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）を標的する処置の効力の可能性を決定するための方法であって、該方法は、
患者由来の生物学的サンプルと、１つの流体力学的サイズの第１の細胞を１つの方向に方向付けて第１の細胞について濃縮された第１の出力を産生し、かつ１種以上の第２の細胞を第２の方向に方向付けて第２の出力を産生する構造を備えるチャンネルを備えるデバイスとを接触させる工程であって、該第１の細胞は、上皮細胞または腫瘍性細胞である、工程；および
Ａｋｔ、ＳＴＡＴ５、またはＳＴＡＴ３が該第１の出力由来の該第１の細胞において活性化されているか否かを決定する工程であって、活性化されたＡｋｔ、ＳＴＡＴＳ、またはＳＴＡＴＳは、該ＥＧＦＲを標的する処置が有効である可能性が高いことを示す、工程
【請求項２９１】
前記生物学的サンプルは、生検または吸引物である、請求項２９０に記載の方法。
【請求項２９２】
活性化されたＡｋｔ、ＳＴＡＴ３、またはＳＴＡＴＳは、リン酸化されている、請求項２９０に記載の方法。
【請求項２９３】
前記活性化されたＡｋｔ、ＳＴＡＴ３、またはＳＴＡＴＳは、免疫学的に決定される、請求項２９０に記載の方法。
【請求項２９４】
前記免疫学的検出方法は、免疫組織化学、免疫細胞学、ＦＡＣＳスキャニング、免疫ブロッティング、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、または酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）からなる群より選択される、請求項２９３に記載の方法。
【請求項２９５】
前記免疫学的検出方法は、抗ホスホＡｋｔ抗体、抗ホスホＳＴＡＴＳ抗体または抗ホスホＳＴＡＴＳ抗体を使用した免疫組織化学または免疫細胞化学である、請求項２９４に記載の方法。
【請求項２９６】
前記構造は、前記細胞を分離するギャップのネットワークを形成する障害物の二次元アレイを含む、請求項２９０に記載の方法。
【請求項２９７】
前記第１の出力と、上皮細胞または腫瘍性細胞を選択的に結合する特異的結合部分を備えるデバイスとを接触させる工程をさらに包含する、請求項２９６に記載の方法。
【請求項２９８】
前記特異的結合部分は、抗体またはそのフラグメントである、請求項２９７に記載の方法。
【請求項２９９】
前記抗体は、Ｂｅｒ−Ｅｐ４、ＥｐＣａｍ、Ｅ−カドヘリン、ムチン−１、サイトケラチン、またはＣＤ−３４を特異的に結合する、請求項２９８に記載の方法。
【請求項３００】
前記ＥＧＦＲ遺伝子は、配列番号５１１の野生型配列を含む、請求項２３８に記載の方法。
【請求項３０１】
前記改変体は、１個以上のヌクレオチド位置において配列番号５１１と異なる、請求項２３８に記載の方法。
【請求項３０２】
前記ＥＧＦＲ遺伝子によってコードされるポリペプチドは、配列番号５１２の野生型配列を含む、請求項２３８に記載の方法。
【請求項３０３】
前記改変体によってコードされるポリペプチドは、１個以上のアミノ酸位置において配列番号５１２と異なる、請求項２３８に記載の方法。
【請求項３０４】
前記改変体は、表３から選択される、請求項２３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医学診断法およびマイクロ・フルイディクスの分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
癌は、異常な細胞の抑制されていない激増によって記録される疾患である。正常組織において、細胞は、分かれて、細胞を囲むことから、信号に応答して組織の範囲内で有機化する。癌細胞は同様にこれらの信号に反応しない。そして、それらに増殖して、多くの器官において、腫瘍を形成させる。腫瘍の成長が続けるように、遺伝子の変更は蓄積することができる。そして、癌細胞のより積極的な発展フェノタイプとして現れる。
無処置のままにされる場合、転移（リンパ系または血流としての本体の遠い領域に対する癌細胞の拡散）は起こることができる。転移は多重サイトで結果として二次腫瘍の形成になる。そして、健康な組織に損傷を与える。大部分の癌死は、この種の二次腫瘍によって生じる。
【０００３】
癌診断および治療の進歩の数十年にもかかわらず、それらの現像をするのが遅れるまで、多くの癌は検知されていなくなり続ける。一つの例として、大部分の初期肺癌は症状がなくて、治療的処理に間に合って検出されない。そして、結果として１５％未満の肺癌患者のための全体の五生率になる。しかしながら、肺癌が初期で発見・治療されるそれらの例で、予後は、ずっと有利である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、疾患の発現の初期のステージで癌を発見する新規な方法を開発することは、必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、以下によって細胞サンプルの癌細胞を検出する方法を特徴とする：
ａ）細胞サンプルを第一の方向に癌細胞に癌細胞において濃縮される第一出力端サンプルおよび第２の細胞において豊かにされる第２の出力サンプルを生じる第２の指示の一つ以上の第２の細胞を生産するように指示する構造を有するチャネルを含んでいる装置にもたらすこと；
そして、
ｂ）第一出力端サンプルの癌細胞の有無を検出すること。
【０００６】
構造は、すきまのネットワークを形成する障壁の配列を含むことができる。障害物は、選択的に癌細胞を捕獲することができることがありえる。チャネルは、すきまのネットワークを形成している障壁の配列を含むことができる、そこにおいて、流体が等しくなく大きな流動および軽微な流動に分けられるように、流体はすきまの中を流れる。細胞サンプルは、例えば、血液サンプルまたはその分数である。
【０００７】
ステップｂ）は、例えば、第一出力端サンプルを標識に対する抗体と作用することを含むことができる。そして、癌細胞のために、表１から選択される。ステップｂ）は、例えば、第一出力端サンプルのＤＮＡの総量を決定することで第一出力端サンプルの細胞の数を測定することを含むこともできる。あるいは、ステップｂ）は、第一出力端サンプルの癌細胞の数を決定して、例えば、血管内皮細胞に癌細胞の比率を決定するために任意に細胞サンプルの血管内皮細胞の数を決定することを含む。ステップｂ）は、例えば、ＤＮＡの突然変異または第一出力端サンプルの表１にリストされるポリペチドをコード化している遺伝子のリボゾームリボ核酸を検出することを含むことができる。ステップｂ）は、分析タンパク質リン酸化、タンパク質グリコシル化、ＤＮＡメチル化、マイクロ・リボゾームリボ核酸レベルまたは細胞形態を第一出力端サンプルに含むこともできる。ステップｂ）は、検出ミトコンドリアＤＮＡ、テロメラーゼまたは核マトリックス蛋白を第一出力端サンプルに含むこともできる；第一出力端サンプルの一つ以上の糸粒体の異常を検出すること；第一出力端サンプルの細胞の核周囲の区画の有無を検出すること；または第一出力端サンプルの遺伝子形質発現分析、細胞のＰＣＲまたは蛍光その場ハイブリダイゼーションを実行すること。遺伝子形質発現分析は、癌細胞の起源の組織または組織を決定するために用いることができて、単一の癌細胞に対して行われることができる。
【０００８】
細胞サンプルは、一つ以上の原種血管内皮細胞を含むことができる、そこにおいて、
少なくとも一つの原種血管内皮細胞は、第一出力端サンプルにおいてある。
【０００９】
装置は、以下を更に含むことができる：第１の入口を有する連続流通系装置、第一出口、そして、第二出口、そこにおいて、細胞サンプルは第１の入口に適用される、第一出力端サンプルは第一出口から流出する、そして、第２の出力サンプルは第二出口から流出する。装置は、以下を更に含むことができる：１秒がはめ込まれて、そして、第２の流体（例えばバッファ、細胞溶解試薬、核酸増幅試薬、モル浸透圧濃度を調整している試薬、標識試薬、防腐剤または固定試薬）は、第２の入口につけられる。
【００１０】
検出することは、第一出力端サンプルのハイパー・スペクトル・イメージングを含むことができる。の前に、または、ステップａ）と並行して、細胞サンプルは、優先して癌細胞にラベルをつける標識試薬によって接触して、また、そうすることができる。標識試薬は、ビードを含むことができる、そこにおいて、標識癌細胞の水力学的サイズは、ラベルがない場合癌細胞の水力学的サイズより大きい少なくとも１０％である。
【００１１】
更なる本発明は、以下によって細胞サンプルの癌細胞を検出する方法を特徴とする：
ａ）磁粉を使用することのない、または、抗体または断片単独を使用することのない細胞サンプルから癌細胞の一つ以上を豊かにすること、
そこにおいて、
豊かにすることは、細胞サイズ、形状または変形能に基づく；
そして、
ｂ）豊かな癌細胞の数を決定すること。
【００１２】
方法は、以下を更に含むことができる：
ｉ）細胞サンプルから一つ以上の血管内皮細胞を豊かにすること；
そして、
ｉｉ）例えば、血管内皮細胞に癌細胞の比率を決定するために豊かな血管内皮細胞の数を決定すること。
【００１３】
ステップｂ）は、例えば、豊かな癌細胞を計数するかまたは豊かな癌細胞のＤＮＡの総量を決定することを含む。
例えば、ステップａ）およびｂ）は第２の細胞サンプルによって繰り返されることができる。そして、第１と同じ主題からとられる。
【００１４】
本発明も、以下によって主題の状態を診断する方法を特徴とする：
ａ）第一の方向に一つ以上の癌細胞に癌細胞において濃縮される第一出力端サンプルおよび第２の細胞において豊かにされる第２の出力サンプルを生じる第２の指示の一つ以上の第２の細胞を生産するように指示する構造を有するチャネルを含んでいる装置に主題から細胞サンプルを導くこと；
ｂ）第一出力端サンプルの癌細胞の有無を検出すること；
そして、
ｃ）ステップｂ）の結果に基づいて状態の有無を診断すること。
【００１５】
方法は、計算された軸性の断層撮影、ポジトロン放出断層撮影または磁気共鳴画像（診断より前の一部の主題）によってイメージングを、例えば、更に含むことができる、そこにおいて、診断は、イメージングの結果に更に基づく。
【００１６】
方法は、以下を含むこともできる：
ｉ）細胞サンプルの血管内皮細胞（例えば原種血管内皮細胞）の数を決定すること；
そして、
ｉｉ）血管内皮細胞に癌細胞の比率を決定すること、
そこにおいて、診断は、比率に更に基づく。
【００１７】
状態は、例えば、血液学的状態、炎症性の状態、虚血性の状態、腫瘍性の状態、感染、外傷、子宮内膜症または腎不全である。
【００１８】
更なる本発明は、主題の状態を診断する方法を特徴とする；方法は、次のステップを含む：
ａ）  第一の方向に一つ以上の第１の細胞に第１の細胞において濃縮される第一出力端サンプルおよび第２の細胞において豊かにされる第２の出力サンプルを生じる第２の指示の一つ以上の第２の細胞を生産するように指示する構造を有するチャネルを含んでいる装置に主題から細胞サンプルを導くこと；
ｂ）  第一出力端サンプルを分析すること；
そして、
ｃ）  ステップｂ）の結果に基づいて状態の有無を診断すること。
【００１９】
チャネルは、以下を含むことができる：すきまのネットワークを形成している障壁の配列は、前記流体が等しくなく大きな流動および軽微な流動に分けられるように、流体が前記すきまの中を流れるようなものを構成した。
【００２０】
装置は１２ミクロンより大きい水力学的サイズを有する直接循環セルに構成されることができる。そして、第１の方向において、好ましくは１４ミクロンを超えるおよび細胞が第２の方向の１２ミクロン以下の水力学的サイズを有する。
【００２１】
装置は、第１の方向の５ミクロンおよび１０ミクロン以下以上の水力学的サイズを有する直接循環セルおよび第２の方向の１０ミクロンより大きい水力学的サイズを有する細胞に構成されることもできる。
【００２２】
装置は、第１の方向の４ミクロンおよび８ミクロン以下以上の水力学的サイズを有する直接循環セルおよび第２の方向の８ミクロンより大きい水力学的サイズを有する細胞に構成されることもできる。
【００２３】
好ましい実施例において、第一出力端サンプルは、前記細胞サンプルで初めての細胞の少なくとも９０％を形成する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、ｃ）によるステップａ）は、相加を有する主題および細胞サンプルから細胞サンプルが一定の間隔（例えば一日、２日、３日、１週、２週、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、６ヵ月または１年）で得られる反復一つ以上時である。
【００２５】
他の実施態様において、第一出力端サンプルは、少なくとも１，０００倍に細胞サンプルと関連して第１の細胞において豊かにされる。
【００２６】
診断される状態は、血液学的状態、炎症性の状態、虚血性の状態、腫瘍性の状態、感染、外傷、子宮内膜症または腎不全でありえる。腫瘍性の状態は、急性リンパ芽球性白血病、急性であるか慢性ｌｙｍｐｈｏｃｙｃｔｉｃなまたは顆粒球腫瘍、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、腺癌、アデノーマ、副腎癌、基底細胞癌、骨癌、脳ガン、乳癌、気管支癌、子宮頸部異形成、慢性骨髄性白血病、大腸癌、類表皮癌、ユーイング肉腫、胆嚢癌、胆石腫瘍、巨細胞腫、神経グリア芽細胞腫マルチ形、有毛細胞腫瘍、頭の癌、過形成、増殖性炎角膜神経腫瘍、元の位置の癌、腸の神経節細胞腫、島細胞腺腫、カポシ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、平滑筋母腫瘍、肝癌、肺癌、リンパ腫、悪性カルチノイド、悪性高カルシウム血症、悪性黒色腫、ｍａｒｆａｎｏｉｄ体質腫瘍、髄様癌、転移性皮膚癌、粘膜神経腫、真菌症ｆｕｎｇｏｉｄｅ、骨髄異形成症候群、ミエローマ、首癌、神経組織癌、神経芽細胞腫からなるグループから選択されることができる、骨原性肉腫、骨肉腫、卵巣腫瘍、膵臓癌、副甲状腺癌、褐色細胞腫、真性多血症、主要な脳腫瘍、前立腺癌、直腸癌、腎臓細胞腫瘍、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、精上皮腫、皮膚癌、小細胞肺腫瘍、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃癌、甲状腺癌、局所皮膚病変、ｖｅｔｉｃｕｌｕｍ細胞肉腫またはＷｉｌｍの腫瘍。
【００２７】
いくつかの実施形態では、細胞サンプルは、ボリュームの５０ｍＬ未満である。
【００２８】
癌の診断のために、ステップｂ）は、第一出力端サンプルの癌生物マーカの有無を検出することが必要でありえる；癌生物マーカは、表１から選択されるポリペチドまたはポリペチドをコード化している核酸である。癌関連の核酸生物マーカは、ゲノムＤＮＡ５メッセンジャーＲＮＡまたはマイクロ・リボゾームリボ核酸でありえる。方法のステップｂ）は、癌に関連する核酸の発現パターンを分析することが必要でありえもする；核酸は、ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡまたはマイクロ・リボゾームリボ核酸でありえる。癌関連の核酸は、突然変異を含んで、表１（例えばＥｐＣＡＭ、ＥＣａｄｈｅｒｉｎ、Ｍｕｃｉｎ―１、Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ  ８、ＥＧＦＲまたは白血球関連のレセプタ（ＬＡＲ））から選択されるポリペチドをコード化するものでありえる。
【００２９】
上記方法において、ｂ）が第一出力端サンプルから選択的に一つ以上の細胞を結合する一つ以上の結合部分を有する表面を有する装置を有する第一出力端サンプルを接触させて更に含むことができるステップ、例えば、急性リンパ芽球性白血病を伴う、上皮であるか腫瘍性の細胞、鋭いか慢性的なｌｙｍｐｈｏｃｙｃｔｉｃなまたは顆粒球腫瘍、急性骨髄性白血病、鋭い前骨髄球白血病、腺癌、アデノーマ、副腎癌、基底細胞癌、骨癌、脳ガン、乳癌、気管支癌、子宮頸部異形成、慢性骨髄性白血病、大腸癌、類表皮癌、ユーイング肉腫、胆嚢癌、胆石腫瘍、巨細胞腫、神経グリア芽細胞腫マルチ形、有毛細胞腫瘍、頭の癌、過形成、増殖性炎角膜神経腫瘍、元の位置の癌、腸の神経節細胞腫、島細胞腺腫、カポシ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、平滑筋母腫瘍、肝癌、肺癌、リンパ腫、悪性カルチノイド、悪性高カルシウム血症、悪性腫瘍黒色腫、ｍａｒｆａｎｏｉｄ体質腫瘍、髄様癌、転移性皮膚癌、粘膜神経腫、真菌症ｆｕｎｇｏｉｄｅ、骨髄異形成症候群、ミエローマ、首癌、神経組織癌、神経芽細胞腫、骨原性肉腫、骨肉腫、卵巣腫瘍、膵臓癌、副甲状腺癌、褐色細胞腫、真性多血症、主要な脳腫瘍、前立腺癌、直腸癌、腎臓細胞腫瘍、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、精上皮腫、皮膚癌、小細胞肺腫瘍、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃癌、甲状腺癌、局所皮膚病変、ｖｅｔｉｃｕｌｕｍ細胞肉腫またはＷｉｌｍの腫瘍。
いくつかの実施形態では、癌は、甲状腺癌でない。
【００３０】
結合部分は、抗体（例えばモノクローナル）のようなポリペチドまたは、例えば、ＥｐＣＡＭと結合する断片単独でありえる。
【００３１】
他の実施例において：
構造は、以下を含む：すきまおよび障壁のネットワークを形成するずらりと並んだ障害物は、選択的に前記第１の細胞を捕獲することができる；そして、
障壁間のギャップは、１５ミクロン以上、２０ミクロン以上または６０ミクロン未満である。
【００３２】
細胞サンプルは、血液、汗、裂け目、耳フロー、痰、リンパ、骨髄中止、尿、唾液、精液、膣の流れ、脳脊髄液、脳流体、腹水、牛乳、呼吸であるか、腸であるか、性尿器の路の分泌物、羊水または試料水でありえる。
【００３３】
他の実施例において：
ステップｂ）は、第一出力端サンプルの粒度分布を分析することが必要である；そして、
ステップｂ）は、第１の細胞の数を決定することから成る。
【００３４】
本発明も、興味がある状態と関連した細胞パターンを確認する方法を特徴とする；方法は、次のステップを含む：
ａ）複数の対照被検者および複数のケースの各々から細胞サンプルを得ることは、興味がある状態があることを従属させる；
ｂ）各細胞サンプルから、サイズによって１２ミクロンより大きい水力学的サイズを有する細胞を濃縮すること；
ｃ）ステップｂ）において豊かにされる分析電池；
そして、
ｄ）ステップｃ）において得られた結果を使用している関連研究を実行すること。
本発明も、主題の状態を診断する方法を特徴とする；
方法は、次のステップを含む：
ａ）状態と関連した細胞パターンを提供すること；
ｂ）主題から細胞サンプルを得ること；
ｃ）細胞サンプルから、サイズによって１２ミクロンより大きい水力学的サイズを有する細胞を濃縮すること；
ｄ）ステップｃ）において豊かにされる分析電池；
そして、
ｅ）ステップｄ）の分析と共にステップａ）の細胞パターンに基づいて主題の状態の有無を診断すること。
【００３５】
この方法ステップにおいて、ｃ）は、検出リボゾームリボ核酸レベルをステップｂ）（例えばメッセンジャーＲＮＡまたはマイクロ・リボゾームリボ核酸）において濃縮される細胞に関係させる。
【００３６】
好ましくは、方法は、少なくとも５０のケース主題および少なくとも５０の対照被検者を使用する。
【００３７】
方法の一実施例において、ステップｃ）は、ステップｂ）において濃縮される細胞の数を決定することが必要である。これは、細胞特徴（例えばインピーダンス、光吸収、光散乱またはキャパシタンス）を働かせて達成されることができる。
【００３８】
他の実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）において濃縮される細胞の粒度分布を分析することが必要である。これは、粒度分布を決定するために顕微鏡、細胞カウンタ、磁石、バイオ空腔レーザー、マススペクトロメータ、ＰＣＲ装置、ＲＴ―ＰＣＲ装置、マトリックス、マイクロアレイまたはハイパー・スペクトル・イメージングシステムを使用して達成されることができる。
【００３９】
細胞サンプルは、血液、汗、裂け目、耳フロー、痰、リンパ、骨髄中止、尿、唾液、精液、膣の流れ、脳脊髄液、脳流体、腹水、牛乳、呼吸であるか、腸であるか、性尿器の路の分泌物、羊水または試料水でありえる。
【００４０】
他の実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）において濃縮される細胞の起源の組織または組織を決定することが必要である。
【００４１】
他の実施態様において、ステップｃ）は、ステップｂ）一つ以上の上皮細胞、癌細胞、骨髄細胞、胎児の細胞において濃縮される細胞から、始原細胞を確認することが必要である、幹細胞、泡末細胞、間葉系細胞、免疫系細胞、血管内皮細胞、子宮内膜細胞、結合組織細胞、栄養芽層、バクテリア、菌類または病原微生物。
【００４２】
他の実施態様において、ステップｅ）は、選択的に第１の細胞、例えば抗体（例えばモノクローナル）のようなポリペチドまたは断片単独（例えば反―Ｂｅｒ―Ｅｐ４、反ＥｐＣＡＭ、反―Ｅ―Ｃａｄｈｅｒｉｎ、反Ｍｕｃｉｎ―１、反Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ  ８または反ＣＤ３４＋）を結合する一つ以上の結合部分を有するステップｂ）において濃縮される細胞を接触させることが必要である。
【００４３】
他の実施形態では、装置は第一の方向に１２ミクロンより大きい水力学的サイズを有する細胞を導くように構成される、そして、細胞が第２の方向の１２ミクロン以下の水力学的サイズを有する。
【００４４】
他の実施形態では、装置は、選択的に、ステップｂ）において濃縮される細胞を捕獲する。
【００４５】
本発明も、主題に与えられる薬物療法の有効性を決定する方法を特徴とする；方法は、次のステップを含む：
ａ）処理の前に主題から第１の細胞サンプルを得ること；
ｂ）第１の細胞サンプルを第一の方向に一つ以上の第１の細胞に第１の細胞において濃縮される第一出力端サンプルおよび第２の細胞において豊かにされる第２の出力サンプルを生じる第２の指示の一つ以上の第２の細胞を生産するように指示する構造を有するチャネルを含んでいる装置にもたらすこと；
ｃ）第一出力端サンプルを分析すること；
ｄ）主題（と）同時にから第２の細胞サンプルを得ているか、薬物療法に続く；
ｅ）第２の細胞サンプルのための繰り返す段階ｂ）およびｃ）；そして、
ｆ）第１の細胞サンプルおよび第２の細胞サンプルのためのステップｃ）の結果を比較すること、そこにおいて、比較は、薬物療法の有効性を決定する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、装置は、第１の方向の１２ミクロンより大きい水力学的サイズを有する直接循環セルおよび第２の方向の１２ミクロン以下の水力学的サイズを有する細胞に構成される。
【００４７】
若干の実施例において、装置は、第１の方向の６ミクロンおよび１２ミクロン以下以上の水力学的サイズを有する直接循環セルおよび６ミクロン未満の水力学的サイズまたは第２の方向の１２ミクロンより大きい水力学的サイズを有する細胞を有する細胞に構成される。
【００４８】
ステップｃ）は、第１の細胞サンプルまたは第２の細胞サンプルから検出リボゾームリボ核酸レベルを第１の細胞に関係させることができる；
リボゾームリボ核酸は、メッセンジャーＲＮＡまたはマイクロ・リボゾームリボ核酸でありえる。
【００４９】
ステップｃ）は、第１の細胞サンプルまたは第２の細胞サンプルから第１の細胞の数を決定することが必要でありえもする。
【００５０】
ステップｄ）は、第１の細胞サンプルまたは第２の細胞サンプルからの第１の細胞から、一つ以上の上皮細胞、癌細胞、骨髄細胞、胎児の細胞を確認することが必要でありえる、始原細胞、幹細胞、泡末細胞、間葉系細胞、免疫系細胞、血管内皮細胞、子宮内膜細胞、結合組織細胞、栄養芽層、バクテリア、菌類または病原微生物。
【００５１】
本発明も、サンプルの他のより小さい構成要素とは異なる方向の所定サイズより大きい水力学的サイズを有する細胞を導くことによって患者から体液サンプルから細胞の寸法によって強化ステップを実行することで患者の状態の治療の有効性を測定して、治療の有効性の徴候として所定サイズより大きい細胞の評価を実行する方法を特徴とする。
状態は、例えば、炎症性の状態、虚血性の状態、感染症、外傷、子宮内膜症または腫瘍性の状態（例えば肺、胸部または前立腺癌）である。体液は、例えば、血液、汗、裂け目、リンパ、耳フロー、痰、骨髄中止、尿、唾液、精液、膣の流れ、脳脊髄液、脳流体、腹水、牛乳、呼吸、腸の、および、尿生殖器の路の分泌物、羊水または本体組織エキスである。評価は、数および／または細胞のタイプを確認するかまたは細胞のＤＮＡの総量を決定することを含むことができる。あるいは、評価は、血管内皮細胞の数を決定することからなるグループから選択される、血管内皮細胞に癌細胞の比率を決定すること、ＤＮＡまたはリボゾームリボ核酸の突然変異を検出して、ＳＮＰを分析して、細胞の形態を決定して、細胞（例えば、細胞を標識に特有である特定の結着剤と作用することによって）の標識を検出して、細胞の活性を検出すること。評価は、細胞のパターンを確認することを含むこともできる。方法は、複数の強化および評価ステップを更に含むことができる、そこにおいて、評価ステップの結果は、治療の有効性の徴候として比較される。例えば、毎日、毎週、隔週に、隔月で、毎月、年四回、二年に一度、または、毎年、複数の強化および評価ステップは、時間によって典型的に切り離される。方法は、少なくとも１の間、患者に対する治療に時間を提供することを更に含むことができる。強化ステップは、装置（例えば障壁の配列を含むミクロな液体の装置）で、好ましくは実行される。
【００５２】
本発明も、細胞（例えば癌細胞）を導くことによって患者から体液サンプルから細胞の寸法によって強化ステップを実行することによって、患者の状態のための治療薬の検査の方法を特徴とする、サンプルの他のより小さい構成要素とは異なる方向の所定サイズより大きい水力学的サイズを有すること、所定サイズより大きい細胞の第１の評価を実行して、少なくとも一つの治療薬を有する細胞を接触させて、細胞の第２の評価を実行して、治療薬のためのスクリーンとして細胞の第１および第２の評価を比較すること。細胞は、治療薬によって接触させる前に培養されることができる。方法は、以下を含むこともできる：異なる治療薬を有する強化細胞の接触別々の試料、そして、接触させた後に細胞の評価を比較すること。強化ステップは、障壁の配列から成る装置で、好ましくは実行される。
方法は、ふるい分けにおいて確認される最も有効な治療薬患者を治療することを更に含むことができる。評価は、細胞の細胞またはパターンの数を確認することを含むことができる。望ましく、細胞のいくつかは、保存される。保存された細胞のいくつかは、それから治療薬によって接触することができて、治療薬の有効性の徴候として評価されることができる。状態は、例えば、炎症性の状態、虚血性の状態、感染症、外傷、子宮内膜症または腫瘍性の状態（例えば肺、胸部または前立腺癌）である。体液は、例えば、血液、汗、裂け目、リンパ、耳フロー、痰、骨髄中止、尿、唾液、精液、膣の流れ、脳脊髄液、脳流体、腹水、牛乳、呼吸、腸の、および、尿生殖器の路の分泌物、羊水または本体組織エキスである。
【００５３】
本発明も、サンプルの他のより小さい構成要素とは異なる方向の所定サイズより大きい水力学的サイズを有する細胞を導くことによって身体組織サンプルから細胞の寸法によって強化ステップを実行することで状態のための有効な治療薬を測定する方法を特徴とする、所定サイズの収集電池、細胞の特徴を評価して、アーカイブのセルを保存して、細胞の特徴から状態のための有効な治療薬を確認すること。状態は、例えば、炎症性の状態、虚血性の状態、感染症、外傷、子宮内膜症または腫瘍性の状態（例えば肺、胸部または前立腺癌）である。方法は、遺伝子型またはＳＮＰの決定のための細胞を分析することを更に含むことができる。
【００５４】
更なる本発明は、細胞サンプルを処理する装置を特徴とする；
装置は、以下を含む：
ａ）第一の方向に一つ以上の第１の細胞に第１の細胞において濃縮される第一出力端サンプルおよび第２の細胞において豊かにされる第２の出力サンプルを生じる第２の指示の一つ以上の第２の細胞を生産するように指示する構造を含んでいるチャネル、
そこにおいて、
装置も、構成される：
ｉ）第１の方向の１２ミクロンより大きい水力学的サイズを有する細胞および第２の方向の１２ミクロン以下の水力学的サイズを有する細胞を導くこと；または
ｉｉ）第１の方向の６ミクロンおよび１２ミクロン以下以上の水力学的サイズを有する直接循環セルに対する、および６ミクロン未満の水力学的サイズまたは第２の方向の１２ミクロンより大きい水力学的サイズを有する細胞を有する細胞；そして、
ｂ）第一出力端サンプルまたは第２の出力サンプルを分析するための検出モジュール、そこにおいて、検出モジュールは、チャネルに流体工学的に連結する。
【００５５】
ｉｉ）チャネルは、すきまのネットワークを形成している障壁の配列を含むことができる、そこにおいて、流体が等しくなく大きな流動および軽微な流動に分けられるように、流体はすきまの中を流れる。
【００５６】
装置は、第１の方向の６ミクロンおよび１２ミクロン以下以上の水力学的サイズを有する直接循環セルおよび６ミクロン未満の水力学的サイズまたは第２の方向の１２ミクロンより大きい水力学的サイズを有する細胞を有する細胞に構成されることができる。
【００５７】
あるいは、装置は、８ミクロン以上の水力学的サイズを有していて、方向の１０ミクロンおよび８ミクロン未満の水力学的サイズまたは第２の方向の１０ミクロンより大きい水力学的サイズを有する細胞を有する細胞より少ないか、または同じ直接循環セルに構成されることができる。
【００５８】
装置の検出モジュールは、第１の細胞の癌と関連した標識を確認するのに適していることがありえる。検出モジュールは、以下を含むことができる：特に第１の細胞（例えば特に表１から選択される一つ以上の標識を結合する抗体）を結合する抗体。検出モジュールは、一つ以上の上皮細胞、癌細胞、骨髄細胞、胎児の細胞、始原細胞、幹細胞を検出するように構成されることができる、泡末細胞、間葉系細胞、免疫系細胞、血管内皮細胞、子宮内膜細胞、結合組織細胞、栄養芽層、バクテリア、菌類または病原微生物。
【００５９】
検出モジュールは、以下を含むことができる：顕微鏡、細胞カウンタ、磁石、バイオ空腔レーザー、マススペクトロメータ、ＰＣＲ装置、ＲＴ―ＰＣＲ装置、マトリックス、マイクロアレイまたはハイパー・スペクトル・イメージングシステム。
【００６０】
別の態様においては、本発明は、細胞サンプルを処理する装置を特徴とする；装置は、以下を含む：
ａ）第一の方向に一つ以上の癌細胞に癌細胞において濃縮される第一出力端サンプルおよび第２の細胞において豊かにされる第２の出力サンプルを生じる第２の指示の一つ以上の第２の細胞を生産するように指示する構造を含んでいるチャネル；そして、
ｂ）癌細胞または第２の細胞を捕獲するための捕獲モジュール、そこにおいて、捕獲モジュールはチャネルに流体工学的に連結する、そして、捕獲モジュールは選択的に癌細胞または第２の細胞を結合する一つ以上の結合部分を含む。
【００６１】
構造は、すきまのネットワークを形成する障壁の配列を含むことができる。結合部分は、特に一つ以上の上皮細胞、癌細胞、骨髄細胞、胎児の細胞、始原細胞、幹細胞、泡末細胞、間葉系細胞を結合するものでありえる、免疫系細胞（血管内皮細胞、子宮内膜細胞、結合組織細胞、栄養芽層、バクテリア、菌類または病原微生物）および障壁は、結合部分を含むことができる。装置は、第１の方向の１２、１４または１６ミクロンより大きい水力学的サイズを有する直接循環セルに構成されることができて、流体工学的に捕獲モジュールに連結する細胞計数モジュールを更に含むことができる。結合部分は、以下を含むことができる：抗体（それは、モノクローナルでありえる）（例えばＥｐＣＡＭと結合する１つ）のようなポリペチド。
【００６２】
別の態様においては、本発明は、細胞サンプルを処理する装置を特徴とする；
装置は、以下を含む：第一の方向に一つ以上の第１の細胞に第１の細胞において濃縮される第一出力端サンプルおよび第２の細胞において豊かにされる第２の出力サンプルを生じる第２の指示の一つ以上の第２の細胞を生産するように指示する構造を有するチャネル、そこにおいて、構造は、以下を含む：すきまのネットワークを形成する、そして、少なくとも障壁のいくつかが非常に選択的にモノクローン抗―ＥｐＣＡＭ抗体またはその断片を含むずらりと並んだ障壁は、第１の細胞または第２の細胞を結合する。
【００６３】
別の態様においては、本発明は、細胞サンプルを処理する装置を特徴とする；
装置は、以下を含む：
ａ）サイズに基づいて細胞サンプルの細胞を濃縮することができる強化モジュール；そして、
ｂ）強化モジュールによって濃縮される細胞の数を決定するための細胞計数モジュール、そこにおいて、細胞計数モジュールは、強化モジュールに流体工学的に連結する。
【００６４】
強化モジュールは、以下を含むことができる：第一の方向に一つ以上の第１の細胞（例えば癌細胞）に第１の細胞において豊かにされる第一出力端サンプルを生じるように指示する構造を含んでいるチャネルおよび１秒を生じる第２の指示の一つ以上の第２の細胞は、第２の細胞において豊かにされるサンプルを出力した。
【００６５】
装置は、第１の方向の１２ミクロンより大きい水力学的サイズを有する直接循環セルおよび第２の方向の１２ミクロン以下の水力学的サイズを有する細胞に構成されることができる。あるいは、装置は、第１の方向の６ミクロンおよび１２ミクロン以下以上の水力学的サイズを有する直接循環セルおよび６ミクロン未満の水力学的サイズまたは第２の方向の１２ミクロンより大きい水力学的サイズを有する細胞を有する細胞に構成されることができる。装置の構造は、すきまのネットワークを形成する障壁の配列を含むことができる。細胞計数モジュールは、第一出力端サンプルまたは第２の出力サンプルの細胞の数を決定するために、インピーダンス、光学またはキャパシタンスを利用することができる。
【００６６】
装置は、以下を更に含むことができる：第一出力端サンプルまたは第２を視覚化するのに適している探知器は、サンプルを出力した；探知器は、捕獲モジュールに流体工学的に連結する。
【００６７】
更なる本発明は、細胞サンプルを処理する装置を特徴とする；装置は、以下を含む：
第一の方向に一つ以上の第１の細胞に第１の細胞において濃縮される第一出力端サンプルおよび第２の細胞において豊かにされる第２の出力サンプルを生じる第２の指示の一つ以上の第２の細胞を生産するように指示する構造を含んでいるチャネル、
そこにおいて、
装置は、少なくとも２０ｍＬおよび時間当たりの好ましくは少なくとも５０ｍＬの流体を処理することができる。
【００６８】
構造は、以下を含むことができる：ずらりと並んだ障壁はすきまのネットワークを非常に形成する。そして、それが大きさにおいて２０および１００ミクロンの間にあることができる。
【００６９】
チャネルは、以下を含むことができる：流体が等しくなく大きな流動および軽微な流動に分けられるように、すきま、それで、その流体のネットワークを形成している障壁の配列はすきまの中を流れる。
【００７０】
障壁の配列は障壁のスタガー二次元アレーでありえる、または、配列は以下を含むことができる：複数の列、以前の列の期間の半分より少ないもので相殺されている各連続した列。装置は、一連の障壁の、または、障壁の第１の配列と並列の一つ以上の付加的な配列を更に含むことができる。第１の細胞は、第２の細胞より大きい平均水力学的サイズを有することができる。
【００７１】
細胞試料は、血液またはその断片でありえる。
【００７２】
装置は、第１の方向の１２ミクロン、１４ミクロンまたは１６ミクロンより大きい水力学的サイズを有する直接循環セルに構成されることができる。
【００７３】
装置は、以下を含むことができる：第１の入口を有する連続流通系装置、
第一出口、そして、第二出口、そこにおいて、細胞サンプルは第１の入口に適用される、第一出力端サンプルは第一出口から流出する、そして、第２の出力サンプルは第二出口から流出する。
【００７４】
装置は、第１の細胞において豊かにされる第一出力端サンプルを生じることができることがありえる、そこにおいて、第一出力端サンプルの量は、細胞サンプルの量より小さい。
【００７５】
第一出力端サンプルが細胞サンプルで初めての細胞の少なくとも８０％を含むように、そして、第２の出力サンプルが細胞サンプルで初めての細胞の２０％未満を含むように、装置は構成されることができる。
【００７６】
装置が連続流通系を提供するときに、それは以下を含むことができる：第２の入口（第２の流体が塗布される）。
【００７７】
第１の細胞は、上皮細胞、癌細胞、骨髄細胞、胎児の細胞、始原細胞、幹細胞、泡末細胞、間葉系細胞でありえる、免疫系細胞、血管内皮細胞、子宮内膜細胞、結合組織細胞、栄養芽層、バクテリア、菌類または病原微生物。
【００７８】
装置は、流体工学的にチャネルに連結する検出器モジュールを更に含むことができる；
検出器モジュールは、以下を含むことができる：システムおよびそれを撮像している顕微鏡、細胞カウンタ、磁石、バイオ空腔レーザー、マススペクトロメータ、ＰＣＲ装置、ＲＴ―ＰＣＲ装置、マトリックス、マイクロアレイまたはハイパー分光は、選択的に第１の細胞を結合するラベルを検出することができる。
【００７９】
例えば、装置は、主題の主題の循環系の、または、の近くの卵着床に適していることがありえる。
【００８０】
別の態様においては、本発明は、主題の循環系に流体工学的に連結することができるシステムを特徴とする；システムは、以下を含む：細胞サンプルを処理するために装置、そして、第１の細胞および第２の細胞において豊かにされる第２の出力サンプルを生じる第２の指示の一つ以上の第２の細胞において豊かにされる第一出力端サンプルを生じるために第一の方向に一つ以上の第１の細胞を導く構造を有するチャネルを含む。システムは、管または動静脈シャントによる循環系に流体工学的に連結することができて、循環系から一つ以上の検体を取り除くことができることがありえる。システムは、装置による連続血流に適していることがありえて、使い捨てでありえる。
【００８１】
別の態様においては、本発明は、細胞サンプルから検体を減少させる方法を特徴とする；方法は、細胞サンプルを細胞サンプルを処理する装置にもたらすことを含む；装置は、以下を含む：第一の方向に一つ以上の第１の細胞に第１の細胞において濃縮される第一出力端サンプルおよび第２の細胞において豊かにされる第２の出力サンプルを生じる第２の指示の一つ以上の第２の細胞を生産するように指示する構造を有するチャネル、そこにおいて、第一出力端サンプルまたは第２の出力サンプルは、細胞サンプルと関連して検体において減少する。
【００８２】
細胞サンプルは、血液、汗、裂け目、耳フロー、痰、リンパ、骨髄中止、尿、唾液、精液、膣の流れ、脳脊髄液、脳流体、腹水、牛乳、呼吸であるか、腸であるか、性尿器の路の分泌物、羊水または試料水でありえる。細胞サンプルは、血液学的状態、炎症性の状態、虚血性の状態、腫瘍性の状態、感染、外傷、子宮内膜症または腎不全で苦しめられる主題からとられることができる。腫瘍性の状態は、急性リンパ芽球性白血病、急性であるか慢性ｌｙｍｐｈｏｃｙｃｔｉｃなまたは顆粒球腫瘍、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、腺癌、アデノーマ、副腎癌、基底細胞癌、骨癌、脳ガン、乳癌、気管支癌、子宮頸部異形成、慢性骨髄性白血病、大腸癌、類表皮癌、ユーイング肉腫、胆嚢癌、胆石腫瘍、巨細胞腫、神経グリア芽細胞腫マルチ形、有毛細胞腫瘍、頭の癌、過形成、増殖性炎角膜神経腫瘍、元の位置の癌、腸の神経節細胞腫、島細胞腺腫、カポシ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、平滑筋母腫瘍、肝癌、肺癌、リンパ腫、悪性カルチノイド、悪性高カルシウム血症、悪性黒色腫、ｍａｒｆａｎｏｉｄ体質腫瘍、髄様癌、転移性皮膚癌、粘膜神経腫、真菌症ｆｕｎｇｏｉｄｅ、骨髄異形成症候群、ミエローマ、首癌、神経組織癌、神経芽細胞腫、骨原性肉腫、骨肉腫でありえる、卵巣腫瘍、膵臓癌、副甲状腺癌、褐色細胞腫、真性多血症、主要な脳腫瘍、前立腺癌、直腸癌、腎臓細胞腫瘍、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、精上皮腫、皮膚癌、小細胞肺腫瘍、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃癌、甲状腺癌、局所皮膚病変、ｖｅｔｉｃｕｌｕｍ細胞肉腫またはＷｉｌｍの腫瘍。
【００８３】
本発明も、主題の状態を診断する方法を特徴とする；
方法は、次のステップを含む：
ａ）細胞サンプルを処理する装置に主題から細胞サンプルを導くこと。そして、それは、以下を含む：
第一の方向に一つ以上の第１の細胞に第１の細胞において濃縮される第一出力端サンプルおよび第２の細胞において豊かにされる第２の出力サンプルを生じる第２の指示の一つ以上の第２の細胞を生産するように指示する構造を有するチャネル、
そこにおいて、
装置は、時間当たりの少なくとも２０ｍＬの流体を処理することができる；
ｂ）第一出力端サンプルを分析すること；
そして、
ｃ）ステップｂ）の結果に基づいて状態の有無を診断すること。
ステップｂ）は、粘着力、遊走、締め具、形態学、分割、遺伝子発現レベルまたは体細胞突然変異の存在の特徴の一つ以上のための第一出力端サンプルの細胞を分析することが必要でありえる。
【００８４】
あるいは、ステップｂ）は、表１から選択される一つ以上の標識の有無を検出することが必要でありえる、表１から選択される一つ以上の標識をコード化する核酸の突然変異の有無を検出すること、表１から選択される一つ以上の標識をコード化する核酸の削除の有無を検出するか、表１から選択される一つ以上の標識の発現レベルを検出するか、または第一出力端サンプルのマイクロＲＮＡの濃度を検出すること。
【００８５】
あるいは、ステップｂ）は、第一出力端サンプルで初めての細胞の数を決定することが必要でありえる。
【００８６】
方法は、血液学的状態、炎症性の状態、虚血性の状態、腫瘍性の状態、感染、外傷、子宮内膜症または腎不全を検出するために用いることができる。
【００８７】
更なる本発明は、細胞サンプルを処理する装置を特徴とする。装置は、以下を含む：すきまのネットワークを形成している障壁の配列を有するチャネル、そこにおいて、流体が等しくなく大きな流動および軽微な流動に分けられるように、流体はすきまの中を流れる、そして、配列は配列の平均流れの方向と平行して方向の上皮細胞を導かないように構成される。
【００８８】
装置の好ましい実施例において：装置は、２つの入口を更に含む；装置は、２つの放出口を更に含む；この種の装置が流体工学的にそうである２は、結合させた；すきまは、放出口のうちの１つに、直接の上皮細胞の大きさに合う；すきまは、１つの入口内に流入している流体から他の入口内に流入している流体まで直接の上皮細胞の大きさに合う；そして、障壁は、ポリマー、シリコン、ガラスまたは石英ガラスから成る。
【００８９】
細胞サンプルに存在する（細胞サンプルが装置の中を流れるにつれて）上皮細胞が細胞サンプルの平均流れの向きと平行して方向において目指さないように、装置は細胞サンプルを装置にもたらすことによって上皮細胞（例えば癌幹細胞のような癌細胞）の豊かなサンプルを生じるために用いることができる、そして、細胞試料の他の構成要素は平均流れの向きに沿って目指す。それによって、前記他の構成要素と関連して上皮細胞において豊かにされるサンプルを生じる。
【００９０】
構成要素は赤血球、血小板、白血球または血管内皮細胞を含むことができる。そして、それは８マイクロメートルから直径３０マイクロメートルにわたることができる。上皮細胞は、ＤＮＡ鑑定、リボゾームリボ核酸分析、タンパク質分析またはｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ分析を受けることができることがありえる；１つの分析法は、細胞のＰＣＲである。
細胞は、あるサイトケラチン・メッセンジャーＲＮＡのレベルを決定することによって分析されることもできる。
【００９１】
方法を実施することにおいて、強化試料の量は細胞サンプルの量より実質的に小さくありえる。そして、結果として上皮細胞の集中になる。
【００９２】
溶解緩衝液は装置に共同もたらされることができる、そして、強化試料は上皮細胞の構成要素を含むことができる。また、交換バッファは装置にもたらされるｃｏ―でありえる、そして、強化試料は交換バッファを含むことができる。
【００９３】
方法は、優先して上皮細胞にラベルをつける標識試薬を有する強化試料を接触させることを更に含むことができる。
【００９４】
方法は、例えば、強化試料の強化試料の５００ｆＬより大きい細胞容積の細胞の数を定量化することを含むこともできる。
【００９５】
方法の他の実施例において：手段は、前記強化試料の１４マイクロメートルより大きい直径の細胞の数を決定する；装置内部の細胞の各々上のずれ応力は、常に１平方センチメートルにつき１０ダイン以下である；そして、細胞サンプルは、優先して上皮細胞にラベルをつける標識試薬によって接触する、そこにおいて、標識試薬は、装置に対する細胞サンプルの導入の前に、または、装置に対する細胞サンプルの導入の後に細胞サンプルと最初に結合される；標識試薬は粒状標識試薬でありえる、そして、標識細胞は定量化されることができる。標識試薬は量子ドットでありえる、そして、標識細胞は２―光子励起を使用して分析されることができる。方法は、強化試料の大きさ測定をすることを更に含むことができる。セル行きの標識試薬は、解かれるままである標識試薬から前記細胞まで分離されることができる。標識試薬は装置に共同もたらされることができる。そして、装置の範囲内で結果として細胞の標識になる。
【００９６】
標識試薬は、以下を含むことができる：量子ドット、抗体、バクテリオファージ、アプタマ、蛍光団、酵素または、例えば、親和性試薬またはポリスチレンを含むことができるか、中立的に浮くことがありえるか、または、抗体を含むことができるビード。例えば、少なくとも１０％、少なくとも１００％、または、少なくとも１０００％、標識試薬は、前記細胞の寸法を増加させることができる。
【００９７】
装置は、以下によって上皮細胞を定量化するために用いることもできる：
ａ．細胞サンプルを提供すること；
ｂ．上皮細胞において豊かにされるサンプルを生じるために細胞サンプルを装置にもたらすこと；そして、
ｃ．上皮細胞を定量化する。
【００９８】
装置が、次のステップを含んでいる診断法において用いられることもできる：
ａ．通常の血液細胞より大きな細胞において豊かにされるサンプルを生じるために装置に患者から細胞サンプルを導くこと；そして、疾病状態を決定するサンプルに存在する通常の血液細胞より大きな細胞の数を決定しているｂ。
【００９９】
他の診断法は、次のステップを含む：
ａ．通常の血液細胞より大きな細胞において豊かにされるサンプルを生じるために装置に患者から細胞サンプルを導くこと；そして、疾病状態を決定するために豊かな検体に対してＤＮＡ鑑定、リボゾームリボ核酸分析、プロテオーム分析またはｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ分析を行っているｂ。
【０１００】
表皮成長因子受容体遺伝子の一つ以上の突然変異のうち、ＤＮＡ鑑定は、存在およびアイデンティティまたは不在をｄｅｔｅｒｎｉｉｎｉｎｇすることが必要でありえる；
この方法は、次のステップを含むことができる：
ｉ．豊かなサンプルから単離ゲノムＤＮＡ；そして、
ｉｉ。表皮成長因子受容体遺伝子の一つ以上のエキソン１８、１９、２０、および２１を増幅すること；この方法は、次のステップを更に含むことができる：
ｉｉｉ．周知の上皮細胞成長因子レセプタ突然変異に対応する増幅製品の亜区を増幅すること；（結果として更なる増幅製品になる）
ｉｖ．更なる増幅製品を配列決定すること；そして、
ｖ．結果として生じるシーケンスを表皮成長因子受容体遺伝子および表皮成長因子受容体遺伝子の周知の突然変異のリストの野生型シーケンスと比較すること。
【０１０１】
別の態様においては、本発明は、細胞サンプルを処理する装置を特徴とする。装置は、以下を含む：
ａ．すきまのネットワークを形成している障壁の配列を有するチャネル、そこにおいて、
臨界サイズより大きな細胞の平均移動方向が流体流れの平均方向と平行でないように流体が等しくなく大きな流動および軽微な流動に分けられるように、流体はすきまの中を流れる；
ｂ．放出口は、通常の血液細胞より大きな細胞を集めるために配置した；そして、
ｃ。細胞を計数する細胞探知器。
【０１０２】
更なる本発明は、細胞サンプルを処理する装置を特徴とする；装置は、以下を含む：
天井（それは、透明でありえる）を含むチャネルは、上に、すきまのネットワークを形成する障壁の配列を配置した；装置は、臨界サイズの以下の直径を有する細胞がすきまのネットワークの中を流れて、天井および障壁との間に前記臨界サイズを超える直径を有する細胞を捕獲することができるように構成される。
【０１０３】
臨界サイズが、５および２０ミクロン（例えば１２または１４ミクロン）の間にあることができる。
【０１０４】
前記臨界サイズより大きい直径を有する細胞は、一つ以上の珍しい細胞（例えば上皮細胞、癌細胞、骨髄細胞、胎児の細胞、始原細胞）を含むことができる、幹細胞、泡末細胞、間葉系細胞、免疫系細胞、血管内皮細胞、子宮内膜細胞、結合組織細胞、栄養芽層、バクテリア、菌類または病原微生物。装置は、天井および障壁との間に臨界サイズを超える直径を有する細胞の有無を検出するために用いることができる。天井が透明なときに、検出は顕微鏡を使用して成し遂げられることができる。
【０１０５】
装置を使用する若干の方法において、方法は、バッファ、細胞溶解試薬、核酸増幅試薬、モル浸透圧濃度を調整している試薬、標識試薬、防腐剤または固定試薬を細胞サンプルを導くことに続く装置にもたらすことを含むことができる。
モル浸透圧濃度を調整している試薬は、以下を含むことができる：
リリースされるための天井および障害との間に臨界サイズを超える直径を有する細胞が生じる高張液。
【０１０６】
本発明も、料金と引きかえに、患者の状態の治療のための治療薬を確認する事業方法を特徴とする、サンプルの他のより小さい構成要素とは異なる方向の所定サイズより大きい水力学的サイズを有する細胞を導くことによって患者から体液サンプルから細胞の寸法によって強化ステップを実行すること、治療薬のためのスクリーンとして所定サイズより大きい細胞の評価を実行すること。例えば、方法は、例えば、方法ステップを実行することを許可されるＣＬＩＡ研究室において実行される。
【０１０７】
方法は、複数の強化および評価ステップを更に含むことができる。細胞は、少なくとも一つの強化および６つの０１２７７８評価ステップとの間に治療薬によって接触することができる。細胞は、評価ステップの前に培養されることができる。少なくとも、所定サイズより大きい細胞のいくつかは、格納されることもできる。更なる本発明は、料金と引きかえに、状態患者の治療的な治療の有効性を測定する事業方法を特徴とする。サンプルの他のより小さい構成要素とは異なる方向の所定サイズより大きい水力学的サイズを干し草にしている細胞を導くことによって患者から体液サンプルから細胞の寸法によって強化ステップを実行すること、治療的な処理の有効性の徴候として所定サイズより大きい細胞を評価すること。方法は、治療的な処理のコースの上の複数の強化および評価ステップを含むこともできる。例えば、方法は、例えば、方法ステップを実行することを許可されるＣＬＩＡ研究室において実行される。ＣＬＩＡ研究室は、方法を実行するために、健康ケア提供者がかかることもできる。方法は、報告を結果を記載している保健プロバイダに提供しているＣＬＩＡ研究室を更に含むことができる。細胞は、例えば、少なくとも一つの強化および評価ステップとの間に治療薬によって接触する。
【０１０８】
本発明も、サンプルの他のより小さい構成要素とは異なる方向の所定サイズより大きい水力学的サイズを有する細胞を導くことによって患者から体液サンプルから細胞の寸法によって強化ステップを実行することで患者の状態の治療のための有効な治療薬を測定する事業方法を特徴とする、所定サイズより大きい細胞を集めること、細胞の特徴を評価して、細胞をアーカイブに格納して、細胞の特徴から状態のための有効な治療薬を確認すること。特徴は、遺伝子型またはＳＮＰによって細胞の分類を含む。特徴は、状態（例えば炎症性の状態、虚血性の状態、感染症、外傷、子宮内膜症または腫瘍性の状態（例えば肺、胸部または前立腺癌））のために有効な特定の治療薬と相関していることができる。例えば、方法は、方法を実行することを許可されるＣＬＩＡ研究室において実行されることができる。方法は、１２７７８が、例えば、有効な治療薬についての報告を状態を扱うために提供することを含むことを進めることができる。そこにおいて、報告は、保健専門家、研究所または薬品会社に提供される。
【０１０９】
本発明も、癌（例えば胸部、前立腺または肺）の可能性を決定する事業方法を特徴とする癌患者において再発生するによって、料金と引きかえに、サンプルの他のより小さい構成要素とは異なる方向の所定サイズより大きい水力学的サイズを有する細胞を導くことによって患者から身体組織サンプルから細胞の寸法によって強化ステップを実行すること、
癌再発生の可能性の徴候として所定サイズより大きい細胞を評価すること。身体組織サンプルは、例えば、血液、骨髄中止、体液または本体組織エキスである。方法は複数の強化および評価ステップを含むことができる。そして、それは時間によって切り離されることができる。患者は、強化および評価ステップのうちの少なくとも１つの後の癌のための既治療でもよい。さらに、複数の評価ステップの上の細胞の変化は、癌再発生の可能性の徴候である。評価することは、細胞の細胞または活性の数を決定することを含むことができる。保健専門家にとって、方法は、例えば、評価する結果について、ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ．ａ報告を含むこともできる。強化ステップは、例えば、障壁の配列から成る装置で実行される。
【０１１０】
更なる本発明は、癌によって影響を受けるヒト患者の処理を目標としている上皮細胞成長因子レセプタ（ＥＧＦＲ）の効果の可能性をｄｅｔｅｍｉｉｎｉｎｇする方法を特徴とする。方法には、野生型ｅｒｂＢｌ遺伝子と関連して患者のｅｒｂＢｌ遺伝子のキナーゼドメインの少なくとも一つの核酸異型の有無を検出することが具備されている。少なくとも一つの異型の存在は、ＥＧＦＲターゲッティング処理の効果を表す。好ましくは、核酸異型は、ＥＧＦＲのキナーゼ活性を増加させる。患者は、それからＥＧＦＲターゲッティング治療で治療されることができる。本発明の一実施例では、ＥＧＦＲターゲッティング処理はチロシンキナーゼ・インヒビター（例えばアニリノ・キナゾリン）である。そして、それは合成アニリノ・キナゾリンでもよい。しばしば、合成アニリノ・キナゾリンは、ゲフィチニブかエルロチニブである。
【０１１１】
他の実施形態では、ＥＧＦＲターゲッティング処理は不可逆性のＥＧＦＲインヒビターである。そして、４―ジメチルアミノ、しかし、２―エン酸［４―（３―塩化―４―フルオロ・フェニルアミノ）―３―シアノ―７―エトキシ―キノリン―６―イル］―アミドを含む、（「ＥＥ―Ｂ―５６９」（時々また、「ＥＫＩ―５６９」と呼ばれる）；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ公開番号ＷＯ  ２００５／０１８６７７および小Ｔｏｒｒａｎｃｅを参照アール、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ｖｏｌ  ６、Ｎｏ．９、２０００年９月、１０２４ページ）および／またはＨＫＩ―２７２またはＨＫＩ―３５７、（Ｗｙｅｔｈ；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒその他は、知る、第ｌ会報１イチョウガニ科Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ）のニュー麻薬にＮＣＩ  ＥＯＲＴＣ―ＡＡＣＲ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ。ｖｏｌ  ６  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２０００年１１月、ＩＳＳＮ  １０７８―０４３２；Ｒａｂｉｎｄｒａｎその他において、イチョウガニ科Ｒｅ。６４：３９５８−３９６５  （２００４）；全兄弟およびＨｙｎｅｓ（Ａｎｎ）。Ｒｅｖ．薬学。Ｔｏｘ．  ４４：１９５−２１７  （２００４）；Ｔｓｏｕなど、Ｊ．Ｍｅｄ。
化学２００５、４８、１１０７−１１３１；そして、Ｔｅｊｐａｒなど、Ｊ．Ｃｌｉｎ。
Ｏｎｃｏｌ．ＡＳＣＯ年会会報ｖｏｌ  ２２、Ｎｏ．１４Ｓ：３５７９  （２００４））．本発明の一実施例では、ＥＧＦＲは、癌を呈するための危険をもつ、または、の患者から、生体試料から得られる。ＥＧＦＲ（またはｅｒｂＢｌ遺伝子）のキナーゼドメインの異型は、ＡＴＰ結合ポケットの配座の構造に影響を及ぼす。好ましくは、ＥＧＦＲのキナーゼドメインの異型は、１インチ・フレーム削除またはエキソン１８、１９、２０、または２１の置換である。
【０１１２】
若干の実施例、突然変異および核酸において、ｅｒｂＢｌ遺伝子の異型は、グアニンのためのチミンまたは配列番号のヌクレオチド２１５５のグアニンのためのアデニンの置換である：５１１  ；配列番号のヌクレオチド２２３５〜２２４９、２２４０〜２２５１、２２４０〜２２５７、２２３６〜２２５０、２２５４〜２２７７または２２３６〜２２４４の削除：５１１  ；ヌクレオチド２３１６の後のヌクレオチド・グアニン、グアニンおよびチミン（ＧＧＴ）の、そして、配列番号のヌクレオチド２３１７の前の挿入：５１１  ；またはヌクレオチド２５７３のチミンのためのグアニンまたは配列番号のヌクレオチド２５８２のチミンのためのアデニンの置換：５１１．
他の実施形態では、有無または少なくとも一つの異型の検出は、少なくとも一つの核酸プローブを有する異型サイトを含んでいるＥＧＦＲ核酸を接触させることを提供する。プローブは、選択的なハイブリダイゼーション状況の下で異型サイトで異型サイトおよび含んでいる補完的なヌクレオチド塩基を含む核酸一次構造によって、優先して交雑する。ハイブリダイゼーションは、検出可能なラベルによって検出されることができる。
【０１１３】
さらに別の実施形態では、少なくとも一つの異型の有無の検出は、以下を有する：シークエンシング少なくとも一つの核酸一次構造、そして、得られたシーケンスを周知のｅｒｂＢｌ核酸一次構造と比較すること。
【０１１４】
好ましい実施例において、少なくとも一つの核酸異型の有無の検出は、ＰＣＲ法（ＰＣＲ）を実行することから成る。仮定的異型を含んでいるｅｒｂＢｌ核酸一次構造は増幅される、そして、増幅された核酸のヌクレオチド配列は決定される。増幅された核酸のヌクレオチド配列を決定することには、シークエンシング少なくとも一つの核酸部分が具備されている。あるいは、製品がそうすることができる増幅はそれらのサイズに従って増幅製品を分離することができるいかなる方法を用いても解析した。そして、オートメーション化したおよび手動ゲル電気泳動などを含んだ。
【０１１５】
あるいは、少なくとも一つの異型の有無の検出は、遺伝子の複数の異型のハプロタイプを決定することから成る。
【０１１６】
他の実施形態では、ＥＧＦＲ異型の有無は、ｅｒｂＢｌ遺伝子産物（タンパク質）を分析することによって検出されることができる。本実施例において、特に異型ＥＧＦＲと結合するプローブは、利用される。好ましい実施例において、プローブは、優先して異型ＥＧＦＲと結合する抗体である。異型ＥＧＦＲの存在は、ＥＧＦＲターゲッティング処理の効果の可能性を予測する。あるいは、プローブは、抗体フラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体またはアプタマでもよい。
【０１１７】
更なる本発明は、特に少なくとも一つの核酸異型をＥＧＦＲ遺伝子（ｅｒｂＢｌ）に含んでいる核酸一次構造に対する選択的な結合状況の下で結合するプローブを提供する。
実施例において、異型は、ＡＴＰ結合ポケットの構造変化を与えるｅｒｂＢｌのキナーゼドメインの突然変異である。
【０１１８】
本発明のプローブは、以下を有することができる：約５００のヌクレオチド塩基、好ましくは約１００のヌクレオチド・ベースおよび大部分の好ましくは約５０または約２５のヌクレオチド塩基の核酸一次構造または長さの少数の人。プローブは、ＤＮＡ、リボゾームリボ核酸またはペプチド核酸（ＰＮＡ）から成ることができる。さらにまた、プローブは、検出可能なラベル（例えば蛍光または酵素標識）を含むことができる。
【０１１９】
本発明は、加えて、癌によって影響を受ける患者の処理を目標としている上皮細胞成長因子レセプタ（ＥＧＦＲ）の効果の可能性を決定するために、方法を提供する。方法には、患者から生体試料のＥＧＦＲのキナーゼ活性を決定することが具備されている。ＥＧＦＲリガンドによるキナーゼ活性に続いている刺激の増加は、通常の制御と比較して、ＥＧＦＲターゲッティング処理が効果的になりそうなことを示す。
【０１２０】
さらに別の実施形態では、本発明は、異型上皮細胞成長因子レセプタ（ＥＧＦＲ）の触媒キナーゼ活性を阻害する化合物を選択する方法を開示する。第一段階として、異型ＥＧＦＲは、潜在的化合物によって接触する。異型ＥＧＦＲの結果として生じるキナーゼ活性はそれから検出される、そして、異型ＥＧＦＲのキナーゼ活性を阻害する化合物は選択される。実施例において、異型ＥＧＦＲは、セルの中で含まれる。
【０１２１】
方法は、ＴＫＩ（例えばゲフィチニブまたはエルロチニブ）に対する抵抗を与えるキナーゼドメインの第２の突然変異を有する異型ＥＧＦＲのキナーゼ活性を阻害する化合物を選択するために用いることもできる。
【０１２２】
他の実施形態では、ｅｒｂＢｌ遺伝子のキナーゼドメインの第２の突然変異（または突然変異のためのセレクティング）の獲得を予測する方法は、開示される。ｅｒｂＢｌ遺伝子の異型を表しているＡ細胞は、チロシンキナーゼ・インヒビターの有効であるが、亜致死の服用によって接触する。チロシンキナーゼ・インヒビターの成長停止効果に抵抗する細胞は選択される、そして、ｅｒｂＢｌ核酸はｅｒｂＢｌキナーゼドメインの更なる突然変異の存在のために分析される。実施例において、細胞は、ビトロにおいてある。
他の実施形態では、細胞は、トランスジェニック動物から得られる。実施例において、トランスジェニック動物は、マウスである。このマウスモデルにおいて、調査される細胞は、腫瘍生検から得られる。本発明によって選択されるｅｒｂＢｌキナーゼドメインの第２の突然変異を含んでいる細胞が、キナーゼドメインの第２の突然変異を有する異型ＥＧＦＲのキナーゼ活性を阻害する化合物を選択するために、上記方法で用いられることができる。
【０１２３】
ｅｒｂＢｌ遺伝子のキナーゼドメインの第２の突然変異の獲得を予測するための別の実施例において、ｅｒｂＢｌ遺伝子の異型を表している細胞は、突然変異を起こさせている剤の有効量によって、最初に接触する。突然変異を起こさせることは、例えば、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）Ｎ―エチル―Ｎ―ニトロン尿素（ＥＮＵ）Ｎ―メチル―Ｎ―ニトロソ尿素（ＭＮＵ）ｐｈｏｃａｒｂａｘｉｎｅ塩酸塩（Ｐｒｃ）メチル・メタンスルホン酸塩（ＭｅＭＳ）クロラムブシル（χ）メルファラン、孔炭素アジン塩酸塩、シクロホスファミド（Ｃｐ）ジエチル硫酸（Ｅｔ２ＳＯ４）アクリルアミド・モノマー（ＡＡ）ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｍｅｌａｍｉｎ（トリエチレンメラミン）ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ｄｉｍｅｔｈｙｍｉｔｒｏｓａｍｉｎｅである、Ｎ―メチルＮ´―ニトロ―Ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ（ＭＮＮＧ）７，１２ジメチルベンズ（ａ）アントラセン（ＤＭＢＡ）エチレンオキサイド、ヘキサメチルホスホルアミド、ｂｉｓｕｌｆａｎまたはエチルｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆは演説する（ＥｔＭｓ）。細胞は、それからチロシンキナーゼ・インヒビターの有効であるが、亜致死の服用によって接触する。チロシンキナーゼ・インヒビターの成長停止効果に抵抗する細胞は選択される、そして、ｅｒｂＢｌ核酸はｅｒｂＢｌキナーゼドメインの更なる突然変異の存在のために分析される。
【０１２４】
本出願の一実施例において、ＥＧＦＲ突然変異の存在は、公知技術の免疫学的な技術（例えば抗体法（例えば免疫組織化学）免疫細胞化学、ＦＡＣＳスキャン、イムノブロッティング、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット法、免疫沈降、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびＥＧＦＲの活性下流の標的に向けられる抗体を使用する派生的な技術）を使用して決定されることができる。この種の目標の実施例は、例えば、リン酸化されたＳＴＡＴ３を含んで、ＳＴＡＴ５をリン酸化して、Ａｋｔをリン酸化した。ホスホ―特異抗体を用いて、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５およびＡｋｔの活性化状態は、決定されることができる。ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５およびＡｋｔの活性化は、活性化ＥＧＦＲ突然変異の診断指標として有効である。実施例において、活性（リン酸化される）ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ３またはＡｋｔの存在は、ＥＧＦＲターゲッティング処理が効果的になりそうなことを示す。
【０１２５】
更なる本発明は、免疫組織化学的であるか免疫細胞化学的方法によって、ふるい分けの方法を試験生体試料のｅｒｂＢｌ遺伝子のキナーゼドメインの異型に提供する。
【０１２６】
抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）は、様々な商業的な供給元から購入されることができるか、または、例えば、Ｈａｒｌｏｗなど（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）にて説明したように、周知の方法を使用して製造されることができる：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２のＥｄ；コールドスプリングハーバー実験室用プレス、コールドスプリングハーバー、Ｎ．Ｙ．（１９８８）。一般に、本発明に役立つ抗体の例は、反ホスホ―ＳＴＡＴ３、反―ホスホ―ＳＴＡＴ５および反―ホスホ―Ａｋｔ抗体を含む。この種の抗体は、例えば、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）から購入されることができる。この種の検出分析に適当な生体試料としては、限定はされないが、細胞、組織生検、全血液、プラズマ、血清、痰、脳脊髄液、胸部吸引液、胸膜液、尿などが挙げられる。ダイレクト標識技術のために、標識抗体は、利用される。間接的な標識技術のために、サンプルは、標識物質と更に作用される。それらが少量の生物物質だけを必要とするので、本発明の免疫学的な方法は有利である。この種の方法は、細胞レベルでされることができて、このことにより最低１つの細胞を必要とすることができる。
【０１２７】
好ましくは、いくつかの細胞は、本発明の方法に従って癌を呈するための危険によって、または、で影響を受けて、検定される患者から得られる。
【０１２８】
検出用変異体ＥＧＦＲタンパク質のための剤は、変異体ＥＧＦＲタンパク質（好ましくは検出可能なラベルを有する抗体）と結合することができる抗体である。
抗体は、ポリクローン性でありえるか、より好ましくは、モノクローナルでありえる。
完全な抗体または断片単独（例えば、ＦａｂまたはＦ、（ａｂ）２）が、使われることができる。プローブまたは抗体の直接の標識は、検出可能な物質をプローブまたは抗体（プローブの間接的な標識または直接標識である他の試薬を有する反応性による抗体と同様に）に連結する（すなわち、物理的に連結している）ことによって達成されることができる。間接的な標識の例としては、それが蛍光性に標識ストレプトアビジンによって検出されることができるように、蛍光性に標識二次抗体を使用している抗体およびＤＮＡのｅｎｄ―標識がビオチンによって探索する第一の検出が挙げられる。
【０１２９】
他の実施形態では、変異体ＥＧＦＲタンパク質、メッセンジャーＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出することができる化合物または剤を有するコントロール試料を接触させて、更なる方法は対照被検者から制御生体試料を得ることが必要である。そうすると、変異体ＥＧＦＲタンパク質、メッセンジャーＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在は生体試料において検出されて、コントロール試料の変異体ＥＧＦＲタンパク質、メッセンジャーＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を測定用試料の変異体ＥＧＦＲタンパク質、メッセンジャーＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と比較している。
【０１３０】
異なる実施例において、診断検査法は、変異体ＥＧＦＲ活性のためにある。特定の実施態様において、変異体ＥＧＦＲ活性は、チロシンキナーゼ活性である。そのような診断検査法は、少なくとも一つのＥＧＦＲ基質のＥＧＦＲによって媒介されるリン酸化を検出するためにある。例えば、ＥＧＦＲ活性のレベルはさまざまな変異体ＥＧＦＲポリペチドのために検定されることができる。そして、さまざまな組織が変異体ＥＧＦＲを含む、と、癌組織から生検が少なくとも一つの変異体ＥＧＦＲ、などを有することで思った。
【０１３１】
同じことのこれらのさまざまな細胞、組織または抜粋のＥＧＦＲ活性のレベルの比較は、任意になされることができる。実施例において、高さは、ガン組織の活性が症候であるＥＧＦＲの中で水平になる一つ以上のチロシンキナーゼ・インヒビターを有する処理に影響されやすくてもよい癌。関連した実施例において、ＥＧＦＲ活動水準は処理したおよび無処置の生検サンプル、細胞系、トランスジェニック動物またはこれらのいずれかからの抜粋との間に決定されることができる。そして、未処置の制御と比較して、変異体ＥＧＦＲ活性上のされた治療の効果を決定する。
【０１３２】
実施例において、本発明は、方法をｅｒｂＢｌ遺伝子のキナーゼドメインの少なくとも一つのキナーゼ活性を増加させている核酸相違の有無を決定することによって癌を呈するための危険によって、または、で影響を受ける患者の治療を選択するために提供する。
他の実施形態では、異型は、複数の異型である、それによって複数は、以上１、２、３遺伝子座から、異型を含むことができる。
【０１３３】
ある種の実施形態では、少なくとも一つの異型の存在は、処理が患者において効果的であるかさもなければ有益である（またはより有益になりそうな）直説法である。
処理が効果的であると述べることは、有益な治療効果の確率がｅｒｂＢｌ遺伝子のキナーゼドメインの特定のキナーゼ活性を増加させている核酸異型の適当な存在を有する人の超過でないことを意味する。
【０１３４】
また、ＥＧＦＲ突然変異の検出のためのキットは、含まれる。これらのキットは、第２の出力に第一の方向に第一出力端および第２の方向の第２のセルに１つのサイズの第１の細胞を導く構造から成るチャネルから成る分離装置を含む。任意には、キットは、以下を含む：特に第１の細胞を結合する特異的結合部分から成るキャプチャ装置。キットもには、ｅｒｂＢｌ遺伝子のキナーゼドメインの目標核酸を増幅する変性プライマが具備されている。キットは、増幅製品の増幅および分析を実行するためのバッファ、酵素および容器を代わりに含むこともできる。キットは、他のツール（例えばＤＮＡマイクロアレイ）から成るスクリーニングであるか、診断用であるか、予後のキットの構成要素でもよい。
しばしば、キットも、一つ以上の制御テンプレート（例えば正常７８から分離される核酸）を提供する組織サンプルおよび／またはｅｒｂＢｌ遺伝子のキナーゼドメインの異なる異型を表している一連のサンプル。
【０１３５】
実施例において、キットは、二個以上のプライマ対（１つの反応またはいくつかの並発反応の生体試料のいくつかの遺伝子異型の表示の分析のためのキットを、それによって与えることで、ｅｒｂＢｌ遺伝子（潜在的相違の中で各領域サイト）の異なる領域を増幅することができる各対）を提供する。
【０１３６】
本発明の装置のいずれかが、装置のための一組の指示と共に用いられることができる。
【０１３７】
長さ、サイズ、面積の前後関係において「ほぼ等しい」ものによって、か何か測定値１０％まで意味された同等、５％、４％、３％、２％または１％でさえある。
【０１３８】
「生物学的粒子」によって、水性媒体に不溶性である生物学的起源のいかなる種も、意味される。実例は、タンパク質、脂質、核酸を含む細胞、粒状細胞成分、ウイルスおよび複合体、及び炭水化物を含む。
【０１３９】
「生体試料」によって、生物学的起源または含んでいる（または潜在的に含んでいる）生物学的粒子のいかなる試料も、意味される。好適な生体試料は、細胞サンプルである。
【０１４０】
「血液成分」によって、ホスト赤血球、白血球、血小板または上皮細胞を含んで、事項（ＣＴＣ）の全血液のいかなる構成要素も、意味される。現在であるか過去の妊娠、臓器移植、感染、損傷または疾患のため、血液成分も、プラズマ（例えばタンパク質、脂質、核酸および炭水化物）の構成要素および血液中、例えばあってもよい他のいかなる細胞も含む。
【０１４１】
「細胞サンプル」によって、その細胞または構成要素を含んでいるサンプルは、意味される。この種のサンプルは、細胞が導かれた（例えば培養基および液化性組織サンプル）自然に生じる流体（例えば血液、汗、裂け目、耳フロー、痰、リンパ、骨髄中止、尿、唾液、精液、膣の流れ、脳脊髄液、頸部洗浄、脳流体、腹水、牛乳、呼吸であるか、腸であるか、性尿器の路、羊水および試料水の分泌物）および流体を含む。
用語も、溶菌液を含む。
【０１４２】
「チャネル」によって、流体が流れることができるすきまは、意味される。
チャネルは、水性流体が限られるそれ以外は疎水表面上の毛細管、導管または１片の親水性パターンでもよい。
【０１４３】
「循環噂細胞」（ＣＴＣ）によって、主題の固形腫瘍からはぎ落されて、主題の循環血液で見つかる癌細胞は、意味される。
【０１４４】
細胞の「構成要素」によって、細胞の細胞溶解に少なくとも部分的に分離されることができる細胞のいかなる構成要素も、意味される。
細胞構成要素は、オルガネラ（例えば核、核周囲の区画、核膜、ミトコンドリア、クロロプラストまたは細胞膜）ポリマーまたは分子複合体（例えば脂質、多糖、タンパク質（膜、トランス膜または細胞内可溶質）核酸（固有であるか、治療的であるか、病原性の）ウィルス粒子またはリボソーム）または他の分子（例えばホルモン類、イオン、コファクタまたは薬）でもよい。
【０１４５】
細胞試料の「構成要素」によって、サンプルの中で含まれて、細胞またはその構成要素のサブセットは、意味される。
【０１４６】
障壁の配列に関する「密度」によって、面積の装置につき障壁の数またはあるいは、この種の障壁によって占められるボリュームのパーセンテージは、意味される。配列密度は、一緒に障壁閉筋を配置することによって、または、障壁間のギャップと関連して障壁のサイズを増加させることによって増加する。
【０１４７】
「強化試料」によって、『サンプルに典型的に存在する他の構成要素と関連して興味がある構成要素の相対的な人口を増加させるために処理するを有する構成要素を含んでいるサンプルは、意味される。例えば、サンプルは、少なくとも１，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、１００％または１０，０００，０００だけ興味がある細胞または１００，０００，０００のさえ相対的な人口を増加させることによって豊かにされることができる。
【０１４８】
例えば、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒなど（Ａｎｎ）において開示されるように、条件「ＥｒｂＢｌ」「上皮細胞成長因子レセプタ」および「ＥＧＦＲ」が取り換えられて本願明細書において使われて、自国のシーケンスＥＧＦＲを言及する。Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：その（例えば、Ｈｕｍｐｈｒｅｙのような欠失突然変異体ＥＧＦＲその他。ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８７：４２０７―４２１１の（１９９０））異型を含む８８１―９１４の（１９８７）。ＥｒｂＢｌとは、ＥＧＦＲタンパク質製品をコード化している遺伝子をいう。
【０１４９】
細胞サンプルの前後関係の「交換バッファ」によって、細胞サンプルが最初は懸架される、そして、細胞試料の一つ以上の構成要素が交換されることになっている媒体とは別の媒体は、意味される。
【０１５０】
「流れを抽出している境界線」によって、配列から流体を除去するように設計された境界線は、意味される。
【０１５１】
「流れ供給境界線」によって、流体を配列に加えるように設計された境界線は、意味される。
【０１５２】
「すきま」によって、流体または粒子が途切れずに続くことができる開口部は、意味される。例えば、すきまは、毛細管、流体が流れることができる２つの障壁とのすきままたは水性流体が限られるそれ以外は疎水表面上の親水性パターンでもよい。
本発明の好ましい実施例において、すきまのネットワークは、障壁の配列によって定義される。本実施例において、すきまは、隣接する障壁とのすきまである。好ましい実施例において、すきまのネットワークは、基質の表面上の障壁の配列によって造られる。
【０１５３】
流れ、障壁または他の粒子と相互に作用するときに、「水力学的サイズ」によって、粒子の有効径は意味される。それが、流れの粒子ボリューム、形状および変形能のための一般項として使われる。
【０１５４】
可視化処理または方法に関する「ハイパー」「分光」によって、５つ以上の波長の画像または波長のバンドの獲得は、意味される。
【０１５５】
「細胞内の活性化」によって、転写因子活性化に導いている二次メッセンジャ経路の活性化またはキナーゼまたは他の代謝経路の活性化は、意味される。
外部の細胞膜抗原の変調による細胞内の活性化は、レセプタ輸送の変化に導くこともできる。
【０１５６】
「標識試薬」によって、検体と結合することができる試薬は、意味される、内在化されるかまたはさもなければ吸収されること、例えば、形状、形態学、色、蛍光、発光、リン光、吸光度、磁気的性質または放射性発光で検出されること。
【０１５７】
そばに「ミクロな液体」「である」１ｍｍ．未満の少なくとも一つの寸法を有する意味する
表面に関する「ミクロ構造」によって、少なくとも一つの寸法の１ｍｍ未満を計量している一つ以上の個々の特徴を含む表面の顕微鏡建造物は、意味される。典型的なマイクロ特徴は、微障壁、マイクロ・ポスト、狭い溝の長時間レコード、マイクロ・フィンおよびマイクロ・コルゲーションである。
【０１５８】
「障壁」によって、チャネル（例えば１つの表面からの突起）の流れにとっての障害は、起こすつもりにされる。例えば、障壁は、基礎生地に顕著なポストまたは水性流体のための恐怖病のバリアを言及することができる。いくつかの実施形態では、障壁は、部分的に浸透してもよい。例えば、障壁は、多孔質材料でできているポストでもよい、そこにおいて、孔は、水性成分の浸透を許容するが、入るにはあまりに、分離されている粒子の割に小さい。
【０１５９】
「収縮試薬」によって、粒子の水力学的寸法を減少させる試薬は、意味される。収縮試薬は、体積を減少させるか、変形能を増加させるか、または、粒子の形状を変えることによって作用することができる。
【０１６０】
「膨張する試薬」によって、粒子の水力学的寸法を増加させる試薬は、意味される。
試薬を増大することは、体積を増加させるか、変形能を減らすか、または、粒子の形状を変えることによって行うことができる。
【０１６１】
他の特徴および効果は、以下の説明および請求項から明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１６２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）および他の粒子を検出して、濃縮して、分析する装置および方法を特徴とする。更なる本発明は、主題から細胞サンプルを分析することによって主題（例えば癌）の状態を診断する方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、本発明の装置は、ＣＴＣまたは他の液成分の置換を許容する障壁の配列を含む。
【０１６３】
この用途は、主にＣＴＣまたは上皮細胞の検出、強化および分析に集中するが、装置および本発明の方法は広範囲にわたる他の細胞および粒子（例えば赤血球、白血球、胎児の細胞）は細胞（例えば、未分化）骨髄細胞、始原細胞、泡末細胞、間葉系細胞、血管内皮細胞を止める、子宮内膜細胞（栄養芽層、癌細胞、免疫系細胞（ホストまたは移植片）結合組織細胞、バクテリア、菌類、細胞病原微生物（例えば、細菌性である、または、原生動物）細胞オルガネラおよび他の細胞構成要素（例えばミトコンドリアおよび核）およびウイルス）を加工することに役立つ。
【０１６４】
以下、典型的な装置および本発明の方法の詳細について説明する。
【０１６５】
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）
固形腫瘍からはぎ落される循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ細胞は高度な乳癌、コロン、肝臓、卵巣、前立腺および肺をもつ患者の循環の超低濃度で見つかった、そして、これらの細胞の存在または相対数は血液中全体の予後および治療への反応と相関していた。これらのＣＴＣは、腫瘍展開の早期指標または臨床症状の体裁の前の転移でもよい。ＣＴＣは概してほぼ１日の短い半減期を有する、そして、それらの存在は増殖性腫瘍から一般に最近の流入を示す。従って、ＣＴＣは、患者の病および治療反応の現在の臨床状態を反映することができる動的過程の一部である。
【０１６６】
ＣＴＣの列挙および特徴描写は、装置および本発明の方法を用いて、癌予後を評価する際に、そして、疾患再発に導くことができる治療失敗の早期発見のための監視治療効力において役立つ。加えて、本発明によるＣＴＣ分析は、治療のコースを完了した前駆症状性患者の初期の逆戻りの検出を可能にする。
【０１６７】
ＣＴＣは、大部分の血液細胞（図３３Ｂを参照、例えば）より一般に大きい。従って、血液中ＣＴＣを分析する１つの役立つ方法はサイズに基づいて細胞を濃縮することである。そして、結果としてＣＴＣにおいて豊かにされる菌体群になる。この菌体群は、それから更なる処理または分析を受けることができる。ＣＴＣの強化の他の方法も、本発明を使用して、可能である。次に、ＣＴＣを豊かにして、列挙して、分析する装置および方法について説明する。
【０１６８】
装置
一般に、装置はＣＴＣの横変位および体液の他の構成要素を許容する障壁の一つ以上の配列を含む。それによって、この種の構成要素を豊かにするかまたはさもなければ処理する機構を提供する。それらと異なる先行技術装置本発明、しかし、本発明のそれらがこの目的のために障壁を使用するように、いずれが、例えば、ＨｕａｎｇなどＳｃｉｅｎｃｅ  ３０４、９８７―９９０の（２００４）およびＵ．Ｓ．公開番号２００４０１４４６５１に記載されているか。サイズによる析出粒子のための本発明の装置は、概してすきまのネットワークの配列を使用する、そこにおいて、すきまが寸法において同一でもよい場合であっても、すきまを通過している流体は等しくなく次のすきまに分けられる。方法は、すきまの配列で分離される細胞を担持する流れを使用する。流れは、配列の見通し線に関して、小角（流れ角度）で整列配置される。臨界サイズより大きい水力学的サイズを有する細胞は配列によって見通し線に沿って、すなわち、横に、移動するが、臨界サイズより小さい水力学的サイズを有するそれらは平均流れの向きに続く。装置の流れは、薄層状の流動状態の下で発生する。本発明の装置は、連続流通系装置として任意に構成される。
臨界サイズは、いくつかの設計パラメータの機能である。
【０１６９】
図１Ａ〜Ｃの障壁配列に関して、障壁の各列は、Δλによって以前の列に関して水平に移される、そこにおいて、λは、障壁（図ＩＡ）間の中心―ｔｏ―中心距離である。
パラメータΔλ／λ（「分岐比」ε）は、次の障壁の左に二またに分けられる流れの比率を決定する。図１Ａ〜１Ｃにおいて、説明の便宜のために、εは、１／３である。一般に、２つの障壁間のギャップによる流動がφである場合、軽微な流動はεφである、そして、大きな流動は（ｌ―ε）φ（図２）である。この例では、すきまによる流動は、基本的に三等品（図ＩＢ）に分けられる。すきまによる３つの束の各々が障壁の配列周辺で織る一方、各流動の平均方向は全体の流れの方向においてある。
図は、１Ｃ、配列による臨界サイズより上に大きさを設定される粒子の動きを例示する。
この種の粒子は大きな流動とともに移動する。そして、順次、各すきまを通過している大きな流動へ移される。
【０１７０】
図２を参照する。臨界サイズは、ほぼ２Ｒｃｒｉｔｉｃａｌである、そこにおいて、Ｒｃｒｉｔｉｃａｌは、停滞したフローラインおよび障壁の間の距離である。粒子（例えば細胞）の質量中心がＲｃｒｉｔｉｃａｌの外側で落下する場合、粒子は大きな流動に続いて、配列で横に移動するだろう。すきま全体の流れプロフィールが公知である（図３）場合、Ｒｃｒｉｔｉｃａｌは決定されることができる；それは、軽微な流動を形成する流体の層の厚みである。所与の間隙の大きさ（ｄ）のために、Ｒｃｒｉｔｉｃａｌは、分岐比（ε）に基づいて洋服屋仕立てである。一般（より小さいε）においてより小さいＲｃｒｉｔｉｃａｌ。
【０１７１】
横変位のために配列、あたかもそれらが異なるサイズ（図４）を有するかのように、異なる形状のかけらはふるまう。例えば、リンパ球は￣５マイクロメートル直径の範囲である、そして、赤血球は厚く￣７マイクロメートル直径および￣１．５マイクロメートルの両凹のディスクである。赤血球（直径）の長軸はリンパ球のそれより大きい、しかし、短軸（厚み）はより小さい。流れによって障壁の配列に通されるときに赤血球が流れにそれらの長軸を整列配置する場合、それらの水力学的サイズは効果的にそれらの厚み（￣１．５マイクロメートル）である。そして、それはリンパ球より小さい。赤血球が水力学的流れによって障壁の配列に通されるときに、それは流れにその長軸を整列配置して、￣１．５マイクロメートルに広がる粒子のようにふるまう傾向がある。そして、それはリンパ球より効果的に「小さい」。方法および装置は従って、それらの形状に従って細胞を分離することができる。但し、細胞の量は同じことでありえた。加えて、あたかもそれらが異なるサイズ（図５）を有するかのように、異なる変形能を有する粒子はふるまう。例えば、それが配列および変化形状における障害と接触するときにより大きな変形能を有する細胞が変形することができるにつれて、同じ不具でない形状を有する２つの粒子は横変位によって分離されることができる。このように、装置の分離は、粒子の物理的な寸法、形状および変形能を含んでいる水力学的サイズに影響を及ぼすいかなるパラメータに基づいても成し遂げられることができる。
【０１７２】
図６を参照する。配列の最上部から異なる水力学的サイズのかけら（例えば細胞）の混成を供給して、示すように図式的に、一番下で粒子を集めることは、２つの出力、臨界サイズより大きな製品を含んでいる細胞、ＩＲｃπｔｉｃａｉｊおよび臨界サイズより小さい不用な含んでいる細胞を生産する。図６の「無駄」と分類されるにもかかわらず、臨界サイズより上の粒子が廃棄されると共に、臨界サイズの下の粒子は集められることができる。二個以上の小口試料にサンプルを分別するときに、例えば、両方のタイプの出力は望ましく集められることもできる。間隙の大きさより大きな細胞は、配列内部で止められる。従って、配列は、働くサイズ範囲を有する。細胞は、分離限界粒径＾Ｒｃｎｔｉｃａｉより大きくなければならない）そして、大きな流動に導かれる最大パススルー・サイズ（配列間隙の大きさ）より小さい。配列の「サイズ範囲」は、分離限界粒径に対する最大パススルー・サイズの比率として定義される。
【０１７３】
場合によっては、障壁間のギャップは、大きさにおいて１５ミクロン以上、２０ミクロン以上または６０ミクロン未満である。他の場合には、すきまは、大きさにおいて２０および１００ミクロンの間にある。
【０１７４】
ある種の実施形態では、本発明の装置は結合部分（例えばモノクローン抗―ＥｐＣＡＭ抗体またはその断片）を含む障壁を含むことができる。そして、非常に選択的に、特定の細胞に対するひもは、例えば、上皮の起源（例えば腫瘍細胞）の細胞を入力する。装置の障壁の全ては、これらの結合部分を含むことができる；あるいは、障壁のサブセットだけは、それらを含む。装置は、例えば、流体工学的に連結される追加モジュールを含むこともできる。そして、細胞がモジュールまたは検出モジュールを計数する。例えば、検出モジュールは、装置の出力サンプルを視覚化するように構成されることができる。加えて、本発明の装置は、一方向の選択されたサイズ範囲および第２の方向の他のセルの直接循環セルに構成されることができる。例えば、装置は、サンプルのより小さい細胞から１２ミクロン、１４ミクロン、１６ミクロン、１８ミクロンまたは２０ミクロンよりさえ大きい水力学的サイズを有する細胞を濃縮するように構成されることができる。あるいは、装置は、他の細胞から６ミクロンおよび１２ミクロン以下（例えば８ミクロンおよび１０ミクロン以下以上の水力学的サイズを有する細胞）以上の水力学的サイズを有する細胞を濃縮することができる。装置は、１０ミクロンより大きい水力学的サイズを有する細胞から、５ミクロンおよび１０ミクロン以下以上の水力学的サイズを有する細胞を濃縮することもできる；あるいは、それは、８ミクロンより大きい水力学的サイズを有する細胞から、４ミクロンおよび８ミクロン以下以上の水力学的サイズを有する細胞を濃縮することができる。一般に、装置は、細胞の２つのグループを切り離すように構成されることができる、そこにおいて、第一グループは、第二群より大きい平均水力学的サイズを有する。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、本発明の装置は、時間当たりの２０ｍＬ以上の流体または時間当たりの５０ｍＬの流体さえ処理することができる。
【０１７６】
上述の通り、本発明の装置は、すきまのネットワークを形成する障壁の配列を装備するのが当り前である。例えば、この種の装置は、以下を含むことができる：障壁（例えば各連続した列が以前の列の期間の半分より少ないもので相殺されるようであるもの）のスタガー二次元アレー。装置は、以下を含むこともできる：１秒は障壁の二次元アレーを驚かせた。そして、それは第１の配列より異なる方向において任意に正しい位置に置かれる。この場合、第１の配列は第２の配列の上流であることができる、そして、第２の配列は第１の配列より高い密度を有することができる。複数の配列はこのように構成されることができる。そうすると、各付加的な配列は付加的な配列の上流で、同等またはいかなる配列よりも高い密度を有する。
【０１７７】
本発明の装置は、主題の卵着床に適していてもよい。例えば、この種の装置は、血液サンプルを処理することが可能であるために、主題の循環系の、または、の近くの配置に適していてもよい。この種の装置は、例えば、主題の管または動静脈シャントによる循環系に流体工学的に連結する本発明の移植可能なシステムの一部でもよい。場合によっては、移植可能デバイス（例えば処理可能なシステム）を含む本発明のシステムは、循環系から一つ以上の検体、構成要素または材料を除去することができる。これらのシステムは、装置による連続血流に適していてもよい。
【０１７８】
試料動員装置
本発明は、加えて、細胞強化（例えばＣＴＣの強化、その雇用試料動員）の装置を含む。装置の特徴（例えば障壁）と関連して、試料動員装置は、細胞の動きまたは流体サンプルの他の構成要素を引き起こす。例えば、本発明の１台の装置は、以下を含む：細胞サンプルを保持することができる容器、選択的に興味がある細胞を捕獲する一つ以上の捕捉残基を含んでいる職能化された蓋面を含む容器の範囲内で適合するように構成される着脱可能に、取付けられた蓋、そして、サンプルｍｏｂｉｌｉｚｅｒは、容器か蓋に結合させた。任意には、容器は、選択的に第２の細胞型を捕獲する一つ以上の捕捉残基を含んでいる職能化された表面を有する。蓋面は、いかなる形状も、例えば、四角いか、矩形であるか、円を描くようにすることができる。装置は、公知技術のいかなる材料（例えばガラス、シリコンまたはプラスチック）も使用して製造されることができる。場合によっては、蓋面または容器面は、以下を含む：ミクロ構造（例えばマイクロ障壁、マイクロ・コルゲーション、狭い溝の長時間レコードまたはマイクロ・フィン）。捕捉残基は特に特定の細胞型と結合する一つ以上の抗体を含むことができる、そして、これらの抗体は配列において構成されることができる。本発明の他の装置と同様に、抗体は、特に多種多様な細胞（例えば白血球または上皮細胞）のいずれかと結合することができる。好ましくは、抗体は、特にＣＴＣと結合することが可能である。さらにまた、抗体は、特に表１から選択される細胞表面癌標識（例えばＥｐＣＡＭ、ＥＣａｄｈｅｒｉｎ、Ｍｕｃｉｎ―１、Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ  ８、上皮細胞成長因子レセプタ（ＥＧＦＲ）および白血球関連のレセプタ（ＬＡＲ））または標識を結合することができる。場合によっては、試料動員装置の蓋は、容器の壁に関して非直交性角度で容器に収まるように設計されていてもよい。容器は、サンプル（例えば１０ｍＬまたは５０ｍＬ）のいかなる望ましい量も入るように設計されていてもよい。
【０１７９】
【表１−１】
2008538282.tif 000002
【０１８０】
【表１−２】
2008538282.tif 000003
【０１８１】
【表１−３】
2008538282.tif 000004
【０１８２】
【表１−４】
2008538282.tif 000005
【０１８３】
任意の試料動員部品が、装置において用いられることができる。例えば、サンプルｍｏｂｉｌｉｚｅｒは、機械のロッカーまたは超音波処理器を含むことができる。あるいは、それは、遠心力を容器および蓋に提供するのに適していてもよい。遠心性のサンプルｍｏｂｉｌｉｚｅｒは、流体サンプル（例えば自由表面を有する流体サンプル）の中でサンプル成分（例えば細胞）を起動させるために用いることができる。遠心性のサンプルｍｏｂｉｌｉｚｅｒは、蓋面に沿って転がっている電池を動かすために用いることもできる。一つの実施例において、遠心性のサンプルｍｏｂｉｌｉｚｅｒは、容器を回転させる車軸を含むことができる；実施例によっては、装置を作動することによって発生する遠心力は、車軸に関して非直交性角度に蓋をドライブすることができる。
【０１８４】
装置において用いられることができる他の試料動員部品は２つの流体工学的に被結合室を利用する。そして、それぞれは容器の内部空間を有する接触面を有する。この種の装置（それは、圧力駆動流れを利用する）において、各室は、流体（例えば空気）で満たされる。そして、１つの室が圧縮されるときに、その中の一部の流体は他の室に入る。そして、その体積を増加させる。容器の細胞サンプルと接触するこれらの室を配置して、それらの体積を変えることによって、例えば、室を交替の中に押し込んで、サンプルは、起動する。
【０１８５】
本発明の装置の使用法
本発明はＣＴＣおよび他の粒子の濃縮の改良型の装置を特徴とする。そして、バクテリア、ウイルス、菌類、細胞、細胞構成要素、ウイルス、核酸、タンパク質およびタンパク質複合体を含む。そして、寸法通りに一致する。装置は、サンプルの粒子上のさまざまな操作を遂行するために用いることができる。この種の操作は、サイズ・ベースの分画を含んで、粒子または粒子自体の変更または粒子を担持している流体の強化または集中を含む。好ましくは、例えば、中止の液体を交換することによって、または、試薬を有する粒子を接触させることによって、装置は、不均質混合物からＣＴＣまたは他の珍しい粒子を濃縮するかまたは珍しい粒子を変えるために使用される。この種の装置は、細胞（例えば細胞の還元した機械の細胞溶解または細胞内の活性化）に対する限られた応力を有する高度な強化を考慮に入れる。
【０１８６】
配列設計
一段式配列を配列する。実施例において、単段は、すきまのネットワークを形成して、障壁（例えば円筒状障壁（図ＩＤ））の配列を含む。ある種の実施形態では、配列は、血液サンプルの他の細胞からＣＴＣを豊かにするときに、例えば、分離限界粒径より数回大きい最大パススルー・サイズを有する。この結果は、大きな間隙の大きさｄおよび小さい分岐比εの組合せを使用して成し遂げられることができる。他の好ましい実施形態では、εは、多くても１／２（例えば多くても１／３、１／１０、１／３０、１／１００、１／３００または１／１０００）である。このような実施例では、例えば、障壁形状はすきまの流れプロフィールに影響を及ぼすことができる。そうすると、すきまによる流体流れは障壁周辺に不規則に配布される；しかしながら、配列を短く（図ＩＥ）するために、障壁は、流れの向きにおいて圧縮されることができる。本願明細書において記載されているにつれて、単段配列はバイパスチャンネルを含むことができる。
【０１８７】
複数のステージ配列。他の実施形態では、複数のステージは、広いサイズ範囲以上の粒子を濃縮するために使用される。典型的な装置は、図７に示される。示される装置は３つのステージを有する、しかし、いかなる段数も使用されることができる。概して、第一期の分離限界粒径は第二期の分離より大きい、そして、第一期分離限界粒径は第二期（図８）の最大パススルー・サイズより小さい。同じことは、以下のステージにとって真実である。例えば、第一期は第二期の切りくず詰まりが生じる（そして、除去）粒子を偏らせる。その後に、それらは第二期に着く。同様に、第二期は後産期の切りくず詰まりが生じる（そして、除去）粒子を偏らせる。その後に、それらは後産期に着く。一般に、配列は要求されるのと同程度多くのステージを有することができる。そして、連続的に、または、並列に接続される。
【０１８８】
前述のように、例えば、複数のステージ配列（大径粒子）において細胞、切りくず詰まりの下流に原因となる場合がある最初に偏向して、そして、切りくず詰まりを回避するために下流のステージを迂回するこれらの偏る粒子必要である。
このように、本発明の装置は、配列から出力を取り除くバイパスチャンネルを含むことができる。臨界サイズより上に粒子を除去する観点からここで記載されているにもかかわらず、バイパスチャンネルは配列のいかなる部分からも出力を取り除くために使用されることもできる。
【０１８９】
バイパスチャンネルのための異なる計画は、以下の通りである。
【０１９０】
一つのバイパスチャンネル。この設計では、すべてのステージは１つのバイパスチャンネルを共有する、または、１つのステージだけがある。バイパスチャンネルの物理的な境界線は、一面上の配列境界線およびその他（図９―１１）上の側面によって定義されることができる。一つのバイパスチャンネルは、二重配列（図１２）によって使用されることもできる。
【０１９１】
装置（図１３）による恒常的な流動を維持する配列と連動して、一つのバイパスチャンネルは、設計されることもできる。バイパスチャンネルにはすべてのステージによる変更幅設計された保守定数流動がある。その結果、チャネルの流れは配列の流れを妨げない。この種の設計は、二重（図１４）配列によって使用されることもできる。一つのバイパスチャンネルは、すべてのステージ（図１５）による実質的に安定した流体抵抗を維持するために、配列と連動して設計されることもできる。この種の設計は、Ｍｕｌｔｉｐｌｅバイパスが向ける配列デュプレックス（図１６。）によって使用されることもできる。
【０１９２】
この設計（図１７）において、各段階はそれ自身のバイパスチャンネルを有する、そして、チャネルは側面によって各々から切り離される。例えば、大径粒子、細胞は、バイパスチャンネル（図１７のバイパスチャンネル１）において、右下に大きな流動に第一期およびその時の角を偏る。第二期の切りくず詰まりが生じないより小さい細胞は、第二期へ進む、そして、第二期の臨界サイズより上の細胞は、第二期の右下角に偏る、そして、に他のバイパスチャンネル（図１７のバイパスチャンネル２）の。この設計は、要求されるのと同程度多くのステージのために繰り返されることができる。本実施例において、バイパスチャンネルは流体工学的に接続されない。そして、複数の分数の収集または他の操作を考慮に入れる。バイパスチャンネルは、まっすぐであるかまたは各々（図１８）と物理的に平行の必要はない。複数のバイパスチャンネルは、二重配列（図１９）によって使用されることもできる。
【０１９３】
装置（図２０）による恒常的な流動を維持する配列と連動して、複数のバイパスチャンネルは、設計されることができる。この例では、バイパスチャンネルは流れの量を取り除くように設計されているので、すなわち、配列の流れは混乱しない。そして、実質的に一定である。この種の設計は、二重（図２１）配列によって使用されることもできる。この設計では、中心のバイパスチャンネルは、デュプレックスの２つの配列で分配されることができる。
【０１９４】
最適境界線設計。配列が無限に大きい場合、流れ場はあらゆるすきまの同じことであるだろう。すきまを通過している流動φは同じことである、そして、軽微な流動はあらゆるすきまのためのεφである。実際には、配列の境界は、この無限のフローパターンを混乱させる。配列の境界の部分は、無限の配列のフローパターンを生成するように設計されていてもよい。境界は、すなわち、境界線注入流体を配列に流れ入れていることができる、または、すなわち、境界線を流れ抽出することは流体を配列から抽出する。
【０１９５】
好適な流れを抽出している境界線は、εφ（図２２の矢によって表される）を境界線（ｄ＝２４マイクロメートル、ε＝１／６０）の各すきまから抽出するために、段階的に広がる。例えば、配列および側面の間の距離は、各すきまから境界線までεφの追加を考慮に入れるために、段階的に増加する。この配列内部のフローパターンは、境界線設計のため、バイパスチャンネルに影響を受けない。
【０１９６】
好適なｆｌｏｗ―を供給している境界線は、正確にεφ（図２３の矢によって代表した）を境界線（ｄ＝２４マイクロメートル、ε  ―  １／６０）の各すきまに入れるために、段階的に狭くなる。例えば、配列および側面の間の距離は、境界線から各すきまにεφの除去を考慮に入れるために、段階的に減少する。また、この配列内部のフローパターンは、境界線設計のため、バイパスチャンネルに影響を受けない。
【０１９７】
流れ供給境界線は、配列（図２４）（ｄ＝２４マイクロメートル、ε＝１／６０）のすきまと同程度広くてもよいか、より広くてもよい。境界線が、例えば、粒子の収集を考慮に入れるためにバイパスチャンネルとして役立つ場合、広い境界線は要求されることができる。境界線は、配列を供給するためにその全ての流れの一部を使用して、εφを境界線（図２４の矢によって代表した）の各すきまに入れる就業者でもよい。
【０１９８】
図２５は、二重配列（ε＝１／１０、ｄ＝８μｍ）の単一のバイパスチャンネルを示す。バイパスチャンネルは、２本の流れ供給境界を含む。バイパスチャンネルの破線１を横切る流動は、Φバイパスである。流れφは、すきまから破線の左へのΦバイパスと合流する。配列に入っている流れが境界の各すきまのεφであるように、境界の障壁の形状は調整される。破線２の流動は、再びΦバイパスである。
【０１９９】
いくつかの場合において、本発明の配列は以下を含むことができる：
障壁の複数の列、以前の列の期間の半分より少ないもので相殺されている各連続した列、この種のその少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または各々障壁間の９９％のギャップさえ、第１の長さパラメータにほぼ等しい長さを有する、そして、多くても５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％または１％さえ、それぞれ、障壁間のギャップの中で、各々、第１の長さパラメータより短い第２の長さパラメータにほぼ等しい長さを有する。第２の長さパラメータにほぼ等しい長さを有するすきまは、一様に、または、非一様に、配列の全体にわたって配布されることができる。第２の長さパラメータは、細胞サンプルからの所定サイズより大きい関心の細胞を捕獲するために大きさを設定されることができる。第１の長さパラメータは、第２の長さパラメータより長く、例えば、１．１、１．５、２、３、５、１０、２０、５０または１００倍にさえある。第１の長さパラメータのための典型的な距離は３０〜１００ミクロンの範囲である、そして、第２の長さパラメータのための典型的な距離は１０〜５０ミクロンの範囲である。
【０２００】
任意には、本発明の配列の各障壁は、ほぼ同一サイズを有する；あるいは、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の障壁さえ、ほぼ同一サイズを有する。場合によっては、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または各列における障害間の９９％のギャップさえ各々第１の長さパラメータにほぼ等しい長さを有する、そして、最高５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％または１％さえ、それぞれ、各列における障害間のギャップの中で各々第２の長さパラメータにほぼ等しい長さを有する。そして、それは第１の長さパラメータより短くてもよい。
【０２０１】
例えば若干の配列（障壁のサブセット）において、５０％（４０％、３０％、２０％、１０％、５％または１％さえ）は、それらの列における残りの障害の中心によって非同盟である。非同盟の障壁は、一様に、または、非一様に、配列の全体にわたって配布されることができる。
【０２０２】
本発明の配列は、異なる横断切片を有する障壁を有することができる；例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の障壁さえ第１の領域パラメータにほぼ等しい断面積を各々有することができる、そして、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％または１％さえ、それぞれ、障壁の中で第二領域パラメータにほぼ等しい断面積を各々有することができる。任意には、第二領域パラメータは、第１の領域パラメータより大きい。加えて、第１の領域パラメータまたは第二領域パラメータにほぼ等しい断面積を有する少なくとも一つの障壁は、非対称の横断切片を有することができる。
【０２０３】
本発明の配列は、以下を含むこともできる：障壁の第１のサブ配列および障壁、サブ配列の各々がそのサブ配列における２つの障害間のギャップを含むようであるものおよび、配列がいずれのサブ配列における２つの障害間のギャップよりも小さい制限されたすきまを含んでいる第１のサブ配列および第２のサブ配列の間のインターフェースを含むようなものの第２の．ｓｕｂａｒｒａｙ。サブ配列は、二次元の構成において配列されることができる；さらに、周期的に、または、一様に、それらは、驚くことができる。
各サブ配列は、いかなる数の障壁（例えば２〜２００、３〜５０または６〜２０）を含むことができる。サブ配列障壁のための典型的な直径は、例えば、２５〜２００ミクロンの範囲である。一般に、本発明の配列における２つの障害間のギャップは、例えば、少なくとも２０、４０、６０、８０、または１００ミクロンでもよい；上記の制限されたすきまの場合、このすきまは、例えば、最高でも１００、８０、６０、４０、または２０ミクロンでもよい。他のギャップの長さも、可能である。
【０２０４】
本発明の配列は、基質（例えばプラスチック）に連結することができて、ミクロな液体のすきまを含むことができる。配列は加えて、１つに連結することができる、または、より結合部分（例えば本願明細書において記載されている結合部分）は非常に選択的に興味がある細胞と結合する。配列が、容器（例えば透明カバーに連結する容器）内部であることもできる。
【０２０５】
他の実施形態では、障壁の二次元アレーはすきまのネットワークを形成する。そうすると、障壁の配列は以下を含む：装置による流体流路をつくるために表面上に配布される複数の列、そこにおいて、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の流路さえ各々第１の幅パラメータにほぼ等しい幅を有する、そして、多くても５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％または１％さえ、それぞれ、流路の中で各々第２の、より小さい幅パラメータにほぼ等しい幅を有する。この種の配列は、例えば、流体サンプルから検体を豊かにするために用いることができる。各々第２の幅パラメータにほぼ等しい幅を有している流路は一様に、または、非一様に装置の全体にわたって配布されることができる、そして、第２の幅パラメータはほぼ第２の幅パラメータの中である流路の中で所望の検体を捕獲するために大きさを設定されることができる。任意には、配列は、入口および放出口を含む。任意に、放出口を含む配列で、第２の幅に等しいか小さい流路幅を有する障壁の領域は、放出口を囲む。この種の装置は、例えば、３  ２を有することができる―第２の幅の流路のパーセンテージが装置による流体の流れの方向に増加するように、次元の配列は直列に流動的に接続した。
【０２０６】
配列は、本発明の装置を形成するために、他の要素に連結することができる。例えば、配列は、本願明細書において開示されるサンプルリザーバ、探知器または他の要素またはモジュールに流体工学的に連結することができる。配列は、添加元素またはモジュールの装置として機能することもできる。加えて、本発明の配列は二次元アレーでもよい、または、それらは他の幾何学を採用することができる。
【０２０７】
本願明細書において記載されている配列のいずれかが、装置または本発明の方法のいずれかと連動して使われることができる。
【０２０８】
配列設計
本発明の流れＤｅｖｉｃｅｓを定めて、安定させるためのデバイス設計Ｏｎ―チップ・フロー・レジスタは、配列の中で流れを定めて、安定させて、また、配列から集められる流れを定めるために、流体レジスタを使用することもできる。図２６は、プレーナーデバイスの回路図を示す；サンプル（例えば血液を含んでいるＣＴＣ、取水路）緩衝取水路、荒廃した排水路、そして、製品排水路は、配列に各々接続している。入口および放出口は、流れレジスタとして働く。図２６も、これらの異なる装置構成要素の対応する流体抵抗を示す。
【０２０９】
配列の範囲内の流れ定義
装置が恒常的な深さを有して、所与の呼吸抵抗によって作動されるときに、図２７および２８は配列の中でサンプルおよび緩衝流れの流れおよび対応する幅を示す。流れは、抵抗によって分けられる呼吸抵抗で測定される。この特定の装置において、ＩｂｌｏｏｄおよびＩｂｕｆｆｅｒは等価である、そして、これは血液の等価幅および配列の緩衝流れを決定する。
【０２１０】
収集分数
明確さが製品および荒廃した排水路の相対抵抗を制御して、１は、各分数に対する収集抵抗力を調整することができる。例えば、回路図のこの特定の一組で。そのとき、Ｒｐｒｏｄｕｃｔは、Ｒｗａｓｔｅより大きい＞不用な断片にとっての潜在的に増加した損失および薄めることの代価のより集中製品分数意志結果。逆にいえば、ＲｐｒｏｄｕｃｔがＲｗａｓｔｅ未満のときに、より薄いおよびより高い収率製品分数は廃液流から潜在的汚染の代価で集められる。
【０２１１】
多重化配列
本発明は、多重化配列を特徴とする。複数の配列を１台の装置に付けることは、ＣＴＣのサンプル処理スループットまたは興味がある他の細胞を増加させて、複数のサンプルの並列処理または異なる分数または操作のためのサンプルの部分を考慮に入れる。
多重は、調製用装置にとって更に望ましい。最も単純な複合装置は、連続（すなわちカスケード）において取り付けられる２台の装置を含む。例えば、１台の装置の主な束から出る出力は、第２の装置の入力に連結することができる。あるいは、１台の装置の軽微な束から出る出力は、第２の装置の入力に連結することができる。
【０２１２】
デュプレックス。鏡像（図２９）として、２つの配列は、並んで、例えば配置されることができる。この構成では、２つの配列の臨界サイズは、同じことでもよいか、異なってもよい。さらに、各配列またはそれらの組み合わせの端に、大きな流動が２つの配列との境界線へと流れるように、配列は配置されることができる。この種の多重化配列は、例えば、臨界サイズより上に粒子を集めるかまたは緩衝交換、反応または標識によってサンプルを、例えば、変えるために配列との間に配置される中央域を含むこともできる。
【０２１３】
装置上の多重。デュプレックスを形成することに加えて、入力を切り離した二個以上の配列は、同じ装置（図３０Ａ）に配置されていてもよい。この種の装置は複数のサンプルのために使用されることができる、または、複数の配列は同じサンプルの並列処理のための同じ入口に接続していることができる。同じサンプルの並列処理において、放出口は、流体工学的に接続されることができるかまたは接続されることができない。
例えば、複数の配列が同じ臨界サイズを有するときに、放出口は高いスループット・サンプル処理のために接続されることができる。他の例では、配列の全ては同じ臨界サイズを有することができない、または、配列の粒子の全ては同様に処理されることができない、そして、放出口は流体工学的に接続されることができない。
【０２１４】
多重は、複数の二重配列を単一デバイス（図３０Ｂ）に配置することによって達成されることもできる。複数の配列（デュプレックスまたはシングル）は、互いとの考えられるあらゆる三次元関係に置かれることができる。
【０２１５】
本発明の装置も、小さい足跡を特徴とする。配列の足跡を減らすことは、コストを下げることができて、粒子にいかなる潜在的機械的損傷もまたは他の効果を除去するための障害との衝突の数を減らすことができる。ステージの境界が流れの方向に対して垂直でない場合、複数のステージ配列の長さは還元していてもよい。段数が増加するにつれて、長さ減少は重要になる。図３１は、小さい足跡３―ステージ配列を示す。
【０２１６】
付加的な要素
加えてすきまの配列に付加的な成分、本発明の装置は、ＣＴＣの中で隔離、強化、収集、操作または検出のために、例えば、添加元素またはモジュールを、例えば、含むことができる。この種の要素は、公知技術である。例えば、装置は、サンプルまたは緩衝入力のための一つ以上の入口およびサンプル出力の一つ以上の放出口を含むことができる。配列は他のタイプの強化または他の操作のための構成要素を有する装置に携わっていることもできる。そして、親和性（磁気、電気泳動的、遠心性の、および、ジ電気泳動的強化）を含む。本発明の装置は、装置（例えばウェルまたは平坦面の配列）から出る出力の二次元のイメージングのための構成要素によって使用されることもできる。
好ましくは、すきまの配列、本願明細書において記載されているにつれて、親和性と連動する就業者は、強化である。
【０２１７】
一つの実施例において、検出モジュールは、本発明の分離またはパワー系統に流体工学的に連結する。検出モジュールは、本願明細書において開示されるいかなる検出方法もまたは従来技術において公知の他の方法を用いて作動することができる。例えば、検出モジュールは、以下を含む：顕微鏡、細胞カウンタ、磁石、バイオ空腔レーザー（Ｇｏｕｒｌｅｙその他を参照、例えば、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｄ：応用物理学３６：Ｒ２２８―Ｒ２３９（２００３））マススペクトロメータ、ＰＣＲ装置、ＲＴ―ＰＣＲ装置、マトリックス、マイクロアレイまたはハイパー・スペクトル・イメージングシステム（Ｖｏ―Ｄｉｎｈその他を参照、例えば、ＩＥＥＥ英Ｍｅｄ。生物学雑誌。２３：４０−４９  （２００４））．実施例において、コンピュータ端末は、検出モジュールに接続していることができる。例えば、検出モジュールは、選択的に興味がある細胞と結合するラベルを検出することができる。
【０２１８】
他の例では、捕獲モジュールは、本発明の分離またはパワー系統に流体工学的に連結する。例えば、捕獲モジュールは、選択的に特定の細胞型（例えば癌細胞または他の珍しい細胞）を結合する一つ以上の結合部分を含む。以下を含む捕獲モジュール実施例において：障壁の配列、障壁は、この種の結合部分を含むことができる。
【０２１９】
加えて、細胞計数モジュール（例えばコールターカウンタ）は、本発明の分離またはパワー系統に流体工学的に連結することができる。他のモジュール（例えばプログラム可能な発熱体）は、あるいは、流体工学的に連結されることができる。
【０２２０】
同じ装置に、または、異なる装置で、本発明の方法は、いかなる強化もまたは分析装置と関連して使用されることができる。例えば、実施例は、アフィニティーカラム（粒子ソータ）を含む蛍光活性セルソータ、キャピラリー電気泳動法、顕微鏡、分光光度計、サンプル記憶装置および試料調整装置。ミクロな液体の装置は、本願明細書において記載されているシステムと関連して特に興味がある。
【０２２１】
例えば、典型的な分析装置は、フィルタ、篩および強化を含む粒子または分離装置の寸法、形状または変形能ベースの強化に役立つ装置を含む。そして、それらが、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ出版物数字ＷＯ  ２００４／０２９２２１およびＷＯ  ２００４／１１３８７７（ＨｕａｎｇなどＳｃｉｅｎｃｅ  ３０４）に記載されている：９８７―９９０（２００４）Ｕ．Ｓ．公開番号２００４／０１４４６５１、米国特許番号５，８３７，１１５および６，６９２，９５２、そして、Ｕ．Ｓ．出願番号第６０／７０３，８３３号（６０／７０４，０６７）そして、１１／２２７，９０４；親和性に役立つ装置は、例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ公開番号ＷＯ  ２００４／０２９２２１およびＵ．Ｓ．公開番号２００５／０２６６４３３に記載されている人々を捕獲する；サンプル（例えばＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ公開番号ＷＯ  ２００４／０２９２２１、米国特許番号５，６４１，６２８およびＵ．Ｓ．出願番号第６０／６６８，４１５号に記載されているそれら）の細胞の優先細胞溶解に役立つ装置；細胞（例えばＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ公開番号ＷＯ  ２００４／０２９２２１、米国特許番号６，６９２，９５２、Ｕ．Ｓ．公開番号２００４／０１６６５５５およびＵ．Ｓ．出願番号第１１／１４６，５８１号に記載されているそれら）を配列することに役立つ装置；そして、流体配達（例えばＵ．Ｓ．公開番号２００５／０２８２２９３およびＵ．Ｓ．出願番号第１１／２２７，４６９号に記載されているそれら）に役立つ装置。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ公開番号ＷＯ  ２００４／０２９２２１にて説明したように、二個以上の装置は、直列に、例えば結合されることができる。
【０２２２】
製造方法
本発明の二次加工法Ｄｅｖｉｃｅｓは、公知技術の技術を使用して製造されることができる。製作技術の選択は、装置および配列のサイズのために使用される材料次第である。
本発明の装置を組み立てることのための典型的な材料は、ガラス、シリコン、鋼、ニッケル、ポリマーを含む、ポリメタクリル酸メチルで例えばある）（ＰＭＭＡ）ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、シリコーン（例えばポリ（ジメチルシロキサン））ポリプロピレン、ｃｉｓ―ポリイソプレン（ゴム）ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）ポリ（酢酸ビニル）（ＰＶＡｃ）ポリクロロプレン（ネオプレン）四フッ化エチレン樹脂（テフロン（登録商標））ポリ（塩化ビニリデン）（ＳａｒａｎＡ）そして、環状オレフィン・ポリマー（ＣＯＰ）そして、環状オレフィン・コポリマー（ＣＯＣ）およびそれらの組み合わせ。他の材料は、従来技術において周知である。例えば、深いＲｅａｃｔｉｖｅ  Ｉｏｎ  Ｅｔｃｈ（ＤＲＩＥ）は、小ギャップ、小さい障壁およびかなりの縦横比（横方向寸法に対する障壁高さの比率）を有するｓｉｌｉｃｏｎ―ベースのデバイスを組み立てるために用いる。例えば、プラスチック器具の熱成形（射出成形して、型押しする）が使われることもできる。そのとき、最も小さい横方向の特徴は＞２０ミクロンである、そして、これらの特徴のアスペクトレシオは＜１０である。付加的な方法は、写真平版（例えばステレオリソグラフィまたはＸ線写真平版）応形機能、エンボシング、シリコン・マイクロマシニング、湿式であるか乾燥した化学腐食、ミリング、ダイヤモンド・カット、Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｅ  ＧａｌｖａｎｏｆｏｒｍｕｎｇおよびＡｂｆｏｒｍｕｎｇ（ＬＩＧＡ）および電気鍍金を含む。例えば、ガラスのために、湿気（ＫＯＨ）またはドライエッチング（フッ素または他の反応性ガスを有する反応性イオンエッチング）が続く写真平版の従来のシリコン製作技術は、使用されることができる。レーザー・マイクロマシニングのような技術は、高い光子吸収効率を有する塑性物質のために採用されることができる。この技術は、方法の連続性質のため、下のスループット製作に適している。大量生産のプラスチック器具のために、射出成形していて、圧縮成形している熱可塑性物質は、適切でもよい。コンパクトディスク（それは、下位数ミクロンの特徴の忠実度を保存する）の大量加工のために使用する従来の熱可塑性押出鋳込は、本発明の装置を組み立てるために使用されることもできる。例えば、装置機能は、従来の写真平版によってガラス・マスターに複製される。ガラス・マスターは、堅い、熱耐衝撃（熱伝導、堅い型）を産生するために電鋳される。この型は、プラスチック器具に特徴を射出成形するかまたは圧縮成形することのマスター・テンプレートとして役立つ。装置および完成品の光学的特性およびスループット上の要件を作るために用いる塑性物質に応じて、圧縮成形または押出鋳込は、製造方法に選ばれることができる。圧縮成形（また、熱いエンボシングまたは救助刷込みと呼ばれる）は、高分子重合体と互換性を持つことの効果がある、それは、小さい構造のために優秀で、高いアスペクトレシオ構造を複製することができるより長いサイクルタイムを有する。押出鋳込は、低いアスペクトレシオ構造のためによくなって、低分子量のポリマーに最も適している。
【０２２３】
装置は、それからアセンブルされる一つ以上の部分において組み立てられることができる。装置の層は、表層グループ（例えば接着しているウェーハ）との間に、クランプ、接着剤、熱、陽極結合または反応によって一緒に保税倉庫留め置きでもよい。あるいは、一つ以上の平面のチャネルを有する装置は、単一部片として、例えば組み立てられることができるを用いてステレオリソグラフィまたはその他３―次元の製作技術。
【０２２４】
通信路の壁上へ溶解された細胞によってリリースされる細胞または化合物の非特異的吸着を減らすために、一つ以上の通信路の壁は、非付着するか、不快であるために化学的に改質していてもよい。壁は、市販こびりつかない試薬（例えばヒドロゲルを形成するために用いるそれら）の細いフィルムコーティング（例えば単層）でおおわれていることができる。通信路の壁を修正するために用いることができる付加的な実施例化学種は、乏エチレン・グリコール、フッ素化重合体、オルガノシラン、チオール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、ウシ血清アルブミン、ポリビニルアルコール、ムチン、ポリＨＥＭＡ、ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅｄされたＰＥＧおよびアガロースを含む。帯電ポリマーは、逆荷電される種をはね返すために使用されることもできる。反発のために使用する化学種のタイプおよびチャネル壁への接着の方法は、はね返されている種および取り付けられている壁および種の性質の性質次第である。この種の表面修飾技術は、公知技術である。
装置が組み立てられる前に、又は、その後に、壁は職能化されることができる。
通信路の壁は、サンプル（例えば膜断片またはタンパク質）の材料を捕獲するために被覆されていることもできる。
【０２２５】
製造方法
本発明の装置は、臨界サイズの上下に不変化詞で豊かにされるサンプルの生産が要求されるいかなるアプリケーションでも使用されることができる。装置の好適な使用は、ＣＴＣまたは他の珍しい細胞において豊かにされるサンプルを生じることである。一旦強化試料が生じると、それは分析のために集められることができるかまたはさもなければ操作されることができる。
【０２２６】
例えば、本発明の装置は、濃縮サンプルにおいて使用されることができるそこにおいて、粒子は、流体力学的に各々と対話して、接触しているかまたは他の粒子周辺で流れ場に対する効果を及ぼしている。例えば、方法は、ヒト・ドナーから全血液の他の細胞から、ＣＴＣを豊かにすることができる。血液が装備するのが当り前である人間―容量で４５％の細胞。それらが配列の中を流れるときに、細胞は物理的接点においてあっておよび／または流体力学的に各々に結合させた。図３２は、細胞が配列に高密度に包装されて、各々と物理的に対話することができることを図式的に示す。
【０２２７】
強化
実施例において、本発明の装置は、所望の水力学的サイズのかけらにおいて豊かにされるサンプルを生じるために使用される。この種の強化の応用は、ＣＴＣまたは関心およびサイズｆｒａｃｔｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（例えばサイズ・フィルタリング（特定のサイズ範囲のセレクティング・セル））の他の細胞に集中することを含む。装置は、細胞（例えば核）の構成要素を豊かにするために用いることもできる。望ましく、潜在的に一つ以上の望ましくない粒子と関連して少なくとも１００、１，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００または１００，０００，０００倍にさえ所望の粒子を濃縮すると共に、本発明の方法は初期混合物と比較して所望の粒子の少なくとも５０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％さえ保持する。望ましく、装置が強化試料に加えて出力サンプルを生じる場合、この付加的な出力サンプルは初期混合物と比較して所望の粒子の５０％未満、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％さえ含む。強化は原物のサンプルと比較して結果として強化粒子の希釈剤になることもできる。但し、サンプルの他の粒子と関連する強化粒子の濃度は増加した。好ましくは、希釈剤は、多くても９０％（例えば多くても７５％、５０％、３３％、２５％、１０％または１％）である。
【０２２８】
好ましい実施例において、装置は、珍しい粉末粒子（例えば細胞）において豊かにされるサンプルを生じる。一般に、珍しい粒子は、サンプルの１０％未満としてある粒子である。珍しい粒子は、例えばサンプル（珍しい細胞）に応じて、ＣＴＣ、上皮細胞、胎児の細胞、幹細胞（例えば、未分化）骨髄細胞、始原細胞、泡末細胞、間葉系細胞を含む、血管内皮細胞、子宮内膜細胞、栄養芽層、癌細胞、免疫系細胞（ホストまたは移植片）結合組織細胞、バクテリア、菌類および病原微生物（例えば、細菌性である、または、原生動物）。珍しい粒子も、ウイルス（細胞構成要素（例えばオルガネラ（例えばミトコンドリアおよび核））と同様に）を含む。珍しい粒子は、身体の流体（例えば血液）または環境ソース（例えば試料水の病原微生物）を含むサンプルから分離されることができる。
胎児の赤血球は、性交を決定して、発育中の胎児の異数性または遺伝子の特徴（例えば突然変異）を確認するために、母性末しょう血液から、例えば、豊かにされることができる。ＣＴＣ（それは上皮のタイプおよび起源である）は、診断の目的で末しょう血液から豊かにされることもできて、治療的な発展をモニタしていることもできる。
循環血管内皮細胞は、末しょう血液から同じように豊かにされることができる。
身体の流体または環境サンプルは大腸菌群のために病原微生物のために、例えば、映写されることもできる。そして、血液が疾患（例えば敗血症または細菌性であるかウィルス性髄膜炎）を抱かれる。珍しい細胞も、他の有機体（例えば移植臓器からの細胞）に存在する１つの有機体から、細胞を含む。
【０２２９】
珍しい粒子の濃縮に加えて、本発明の装置は、準備のアプリケーションのために使用されることができる。典型的な準備のアプリケーションは、血液からセル・パックの生成を含む。本発明の装置は、血小板、赤血球および白血球において豊かにされる分数を生じるように構成されることができる。多重化装置または多段式の装置を用いて、全３つの細胞画分は、並列に、または、直列に、同じサンプルから作り出されることができる。他の実施態様において、装置は、臍帯血ソースから有核を無核の細胞から、例えば、切り離すために使用されることができる。
【０２３０】
装置を使用することにより、本発明は、濃縮されている粒子が損害または他の低下に従属する状況において有利である。本願明細書において記載されているにつれて、本発明の装置は細胞および障壁との間に細胞を衝突の最小数で豊かにするように設計されていてもよい。この極小化は、機械的損傷をセルに引き下げて、更に衝突によって生じる細胞の細胞内の活性化を防止する。細胞のこの穏やかな取扱いは、サンプルの珍しい細胞の限定数を保存して、細胞内の構成要素によって汚染または低下に導いている細胞の破裂を防止して、細胞（例えば幹細胞または血小板）の成熟または活性化を防止する。他の好ましい実施形態では、３０％足らず、１０％、５％、１％、０．１％または０．０１％さえ起動するかまたは機械的に溶解されるように、細胞は濃縮される。図は、３３Ａ、ヒト末しょう血液の細胞の典型的粒度分布を示す。白血球は―４マイクロメートルから―１２マイクロメートルにわたるが、赤血球は＝１．５―３マイクロメートル（短軸）である。図３３Ｂは、ＣＴＣが通常―８から―２２マイクロメートルにわたっている大多数のＣＴＣによって、血液細胞より著しく大きいことを示す。このように、本発明の装置を使用しているサイズ・ベースの強化、そこにおいて、１２マイクロメートル（図３３Ｃ）例えば、分離が選択されるサイズはそうである。そして、他の血液細胞からＣＴＣを豊かにすることに効果的である。ＣＴＣに対する類似の配布を有するいかなる菌体群も、血液細胞（図３３Ｄ）から、同じように豊かにされることができる。
【０２３１】
代替実施形態では、細胞サンプルは装置の試料導入口によって加えられる、そして、緩衝媒体は流体流入口（図４２Ａ）によって加えられる。臨界サイズの下の細胞は非偏る装置によって移動する。そして、それらの原型のサンプル媒体の端放出口から現れる。
臨界サイズ（例えば上皮細胞）を越える細胞（ＣＴＣ）は、特に偏って、流体流入口によって加えられる緩衝媒体に含まれる中心の放出口から現れる。装置の動作は、このように、臨界サイズの上下に細胞において豊かにされるサンプルを生じる。上皮細胞が血流において最も大きな細胞の一つであるので、装置のすきまのサイズおよびジオメトリは実質的に他の全ての細胞型を端放出口にあてるために選択されることができる、その一方で、サンプルを装置を通る単一の流路の後で上皮細胞において実質的に豊かにされる中心の放出口から作り出す。
【０２３２】
本発明の装置は、本願明細書において記載されているにつれて、作動するために、図４２Ａに示すように二重化される必要はない。図４２Ｂに示される組織的に配列された表現は、二重装置か単一の配列を表すことができる。
【０２３３】
強化は、多数の方法で強化されることができる。例えば、的状赤血球は免疫親和性ビードで標識でもよい。それによって、それらのサイズ（図４４にて図示するように）を増加させる。上皮細胞（例えばＣＴＣ）の場合、これは、更にそれらのサイズを増加させることができて、このように結果としてさらに効果的な強化になることができる。あるいは、それらが溶液の最大の目的になるかまたは細胞試料の他の構成要素と比較して固有のサイズ範囲を占有する程度まで、または、それらが他の細胞によって共同清浄にするように、より小さい細胞の寸法は増加することができる。標識的状赤血球の水力学的サイズは、ラベルがない場合この種の細胞の水力学的寸法より大きい少なくとも１０％、１００％または１，０００％でさえもよい。ビードはポリスチレン（磁性材料）でできていてもよい、または、それがそうでもよい他のいかなる材料も細胞に付着した。望ましく、この種のビードは、本発明の装置による標識細胞の流れを中断させないために、中立的に浮く。
【０２３４】
本発明の強化方法は、選択的に細胞を捕獲することができる障害物が、例えば、上皮細胞（例えばＣＴＣ）に興味を起こさせることを含む装置を含む。
【０２３５】
本発明の方法は、例えば、上記の方法を使用している他の検体において豊かにされるサンプルを生じることによって検体を細胞サンプルから減少させるかまたは取り除くために用いることもできる。例えば、細胞サンプルは、１２ミクロンより大きい水力学的サイズを有する細胞のために富ませることによって、１２ミクロン以下の水力学的サイズを有する細胞の中で減少することができる。減少または除去のいかなる方法も、本発明の配列および装置と連動して用いられることができる。検体の除去の減少を特徴としている本発明の方法において、サンプル処理は、連続的でもよくて、ビボまたはエキソビボで起こることができる。さらに、実施例によっては、減少するかまたは取り除かれる検体が本発明の装置において保持される場合、検体は高張液を前記装置に適用することによって装置から自由にされることができる。検体は、それから装置から廃水において検出されることができる。
【０２３６】
変更
他の実施態様において、強化に加えて、ＣＴＣまたは興味がある他の細胞は、粒子または中止の流体を化学的に、または、物理的に変えることができる変わっている試薬によって接触する。この種のアプリケーションは、浄化、緩衝交換、標識（例えば免疫組織化学的、磁気、および、組織化学的標識、細胞染色および流れその場蛍光ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ））細胞固定、細胞安定化、溶菌および細胞活性化を含む。
【０２３７】
この種の方法は、異なる液体にサンプルから粒子（例えばＣＴＣ）の転送を考慮に入れる。図３４Ａは図式的に単段装置のためのこの効果を示す  ―  図３４Ｂが多段式の装置のためのこの効果に明らかにする  ―  図３４Ｃは二重配列のためのこの効果を示す、そして、図３４Ｄは多段式の二重配列のためのこの効果を示す。この種の方法を用いて、血液細胞は、プラズマから切り離されることができる。１つの液体からもう一方への粒子のこの種の転送は、一連の変更（例えばＷｒｉｇｈｔ染色血液ｏｎ―チップ）を遂行するために使用されることもできる。この種の連続は、以下を含むことができる：粒子を第１の試薬と作用すること、そして、それから、粒子を洗浄バッファへ動かすこと、そうすると、他の試薬。
【０２３８】
図３５Ａ〜３５Ｃは、２つのバイパスチャンネルを有する２台のステージ装置の変更の更なる実施例を例示する。この例では、大きな血液のかけらはステージＩにおいて血液からバッファまで移動して、集められる、中程度の血液のかけらは血液からステージ２のバッファまで移動する、そして、ステージ１および２の血液から移動しない小さい血液のかけらも集められる。図３５Ｂは２つのステージのサイズ中止を例示する、そして、図３５Ｃは集められる３分数の粒度分布を例示する。
【０２３９】
図３６は、配列の外側縁部および通信路の壁との間に配置されるバイパスチャンネルを有する２台のステージ装置の変更の一例を示す。図３７は図３６のそれと類似の装置を例示する。但し、次の場合は除く−２つのステージは流体チャネルによって接続される。図３８は、２つのステージを有する装置の変更を小さい足跡で例示する。図３９Ａ〜３９Ｂは、第１および第２のステージから出る出力がシングルチャネルにおいて捕獲される装置の変更を例示する。図４０は、本発明の方法用に、他の装置を例示する。
【０２４０】
図４１は、粒子上の複数の、経時的な変更を実行するために、装置の使用を例示する。
この装置において、血液粉末粒子は粒子と反応する摂政に血液から移動する、そして、反応された粒子はそれからバッファに持ち込まれる。それによって、未反応の試薬または反応副産物を取り除く。追加ステップは、加えられることができる。
【０２４１】
例えば、強化および変更は、結合されることもできる。そこにおいて、所望の細胞は溶解している試薬によって接触する、そして、細胞構成要素（例えば核）はサイズに基づいて豊かにされる。他の例では、粒子は粒状ラベル（例えば磁気ビーズ）によって接触することができる。そして、それは粒子と結合する。解放された粒状ラベルは、サイズに基づいて削除されることができる。
【０２４２】
細胞行きの標識試薬からの遊離標識試薬の分離
本発明の装置は、遊離標識試薬をＣＴＣまたは他のセル行きの標識試薬から分離するために使用されることができる。図４５に示すように、標識試薬は、装置への導入の前に、細胞サンプルによって前暖められることができる。望ましく、標識試薬は、特に、または、優先して、興味がある菌体群（例えば上皮細胞（例えばＣＴＣ））を結合する。典型的な標識試薬には、抗体、量子ドット、バクテリオファージ、アプタマ、蛍光団含有分子、検出可能な化学反応を実施することができる酵素または職能化されたビードが含まれる。
通常、標識試薬は興味がある細胞より小さい、または、興味がある細胞はビードと結合した；このように、標識試薬と結合される細胞サンプルが装置にもたらされるときに、遊離標識試薬は非偏る装置によって移動して、端放出口から現れる。その一方で、縛られた標識試薬は上皮細胞とともに中心の放出口から現れる。都合のよいことに、この方法は、縛られた標識試薬から同時に遊離標識試薬のサイズ分離および分離を成し遂げる。加えて、後述するように、分離のこの方法は、解放ステップまたは分析の破壊的な方法の下流のサンプル分析を容易にする。
【０２４３】
図４６は、より一般のケースを示す、そこにおいて、強化標識試料は、同程度のサイズのため的状赤血球によって共同分かれる非的状赤血球の人口を含む。対象外の細胞は縛られた標識試薬の検出に依存する下流のサンプル分析を妨げない。−その理由は、次のことにある。この試薬は選択的に興味がある細胞と結合する。
【０２４４】
緩衝交換
本発明の装置は、緩衝交換のために使用されることができる。
この結果を成し遂げるために、強化のために使用されるそれと類似のプロトコルは、従われる：細胞サンプルは装置の試料導入口によって加えられる、そして、所望の最終的な緩衝媒体は流体流入口によって加えられる。上述の通り、臨界サイズより上の細胞は、偏って、バッファに入る。
【０２４５】
集中
本発明の装置は、興味がある細胞サンプル（例えばＣＴＣを含んでいるサンプル）に集中するために使用されることができる。図４７に示すように、細胞サンプルは、装置の試料導入口にもたらされる。流体流入口にもたらされるバッファ量を減らすことによって、この体積が細胞サンプルの量より著しく小さいように、より少ない体積の的状赤血球の集中は起こる。この濃縮段階は、実行されるいかなる下流の分析の結果も改善することができる。
【０２４６】
細菌溶菌
本発明の装置は、溶菌のために使用されることができる。これを達成するために、強化のために使用されるそれと類似のプロトコルは、従われる：細胞サンプルは装置（図４８）の試料導入口によって加えられる、そして、溶解緩衝液は流体流入口によって加えられる。上述の通り、臨界サイズより上の細胞は偏って、溶解緩衝液に入る。そして、これらの細胞の細胞溶解に導く。その結果、中心の放出口から現れているサンプルはオルガネラを含んでいる溶解された細胞成分を含む。その一方で、非偏向する細胞全体は他の放出口から現れる。このように、装置は、方法を的状赤血球を選択的に溶解するために提供する。
【０２４７】
複数のステージ
本発明の装置は、強化および反応の複数の段階を提供するために結合されることができる。例えば、図４３  Ａは、「カスケード」構成を示す、  そこにおいて、１台の装置の放出口１は、第２の装置の試料導入口に取り付けられる。第２の装置にもたらされるサンプルが興味がある細胞のためにすでに豊かにされるように、これは第一装置を使用している最初の強化ステップを考慮に入れる。２台の装置は同一であるか異なる臨界サイズを有することができる。そして、意図されたアプリケーション次第である。
【０２４８】
図４９において、非標識細胞サンプルは試料導入口を経てカスケードの第一装置にもたらされる、そして、緩衝含んでいる標識試薬は流体入口導管を介して第一装置にもたらされる。上皮細胞（例えばＣＴＣ）は、偏向して、緩衝含んでいる標識試薬の中心の放出口から現れる。この強化標識試料はそれから試料導入口を経てカスケードの第２の装置にもたらされる。その一方で、バッファは流体入口導管を介して第２の装置に加えられる。
遊離標識試薬の的状赤血球および分離の更なる強化は成し遂げられる、そして、強化試料は更に分析されることができる。あるいは、標識試薬は、直接、第２の装置への導入の前に第一装置の中心の放出口から現れているサンプルに加えられることができる。
カスケード構成の使用は、図５５の単一デバイス構成より少ない出費で、より少ない量の使用または標識試薬のより高い濃度を許すことができる；加えて、発生することができるいかなる非特異的結合も、第一装置を使用している最初の強化ステップの存在下で、著しく還元している。
【０２４９】
二個以上の装置ステージの代替配置構造は、「帯域通過」構成である。図４３Ｂは、この構成を示す、そこにおいて、１台の装置のｏｕｔｌｅｔ．２は、第２の装置の試料導入口に取り付けられる。第２の装置にもたらされるサンプルが第一装置の範囲内で非偏るままだった細胞を含むように、これは第一装置を使用している最初の強化ステップを考慮に入れる。興味がある細胞がサンプル最大の細胞でないときに、この方法は役立ってもよい；この場合、第一期は、中心の放出口にそれらを偏らせることによって大きな対象外の細胞の数を減らすために用いることができる。カスケード構成のように、２台の装置は同一であるか異なる臨界サイズを有することができる。そして、意図されたアプリケーション次第である。例えば、異なる臨界サイズは、より小さい血管内皮細胞の強化を必要としているアプリケーションと比較すると上皮細胞（例えばＣＴＣ）の強化を必要としているアプリケーションに適当である。
【０２５０】
図５１において、標識試薬によって前暖められる細胞サンプルは帯域通過構成の第一装置の試料導入口にもたらされる、そして、バッファは流体入口導管を介して第一装置にもたらされる。第一装置は大きな、対象外の細胞が偏って、中心の放出口（。その一方で、的状赤血球の混成）から現れるこの種の方法に配置されている小さい対象外の細胞、そして、標識試薬は放出口２から現れるの。第一装置。この混合はそれから試料導入口を経て第２の装置にもたらされる。その一方で、バッファは流体入口導管を介して第２の装置に加えられる。遊離標識試薬の的状赤血球および分離の強化は成し遂げられる、そして、強化試料は更に分析されることができる。偏る細胞およびいかなる縛られた標識試薬もシステムから除去されるにつれて、第一期の偏る細胞に対する標識試薬の非特異的締め具はこの方法で受け入れられる。上記の複数の装置構成のいずれかにおいて、それらを接合している装置および接続は、単一デバイスに集積されることができる。例えば、二個以上のステージを含む単一のカスケード装置は可能である。そして、そのことは二個以上のステージを含んでいる単一の帯域通過装置である。
【０２５１】
下流の分析
多くの症候のための役立つステップが検定する下流の分析Ａは、分析されるサンプルからの遊離標識試薬の除去である。上述の通り、本発明の装置は、遊離標識試薬をセル（例えばＣＴＣ）行きの標識試薬から分離することが可能である。遊離標識試薬から背景干渉の有意水準のない標識サンプルの大きさ測定を実行することは、それから可能である。
例えば、ＥｐＣＡＭのような特定の上皮細胞標識のために選択的な蛍光抗体が、使われることができる。蛍光部分は、Ｃｙ染料、Ａｌｅｘａ染料または他の蛍光団含有分子を含むことができる。結果として生じる標識サンプルは、それから、蛍光光度計を使用している標識強化細胞の結果として生じる試料の蛍光を測定することによって分析される。
あるいは、発色団を含むラベルが、分光計（例えばＵＶまたは可視分光計）と連動して用いられることができる。得られた測定値は、的状赤血球の数またはサンプルのすべての細胞を定量化するために用いることができる。あるいは、サンプル（例えば血管内皮細胞に対する癌細胞の比率）の２セル・タイプの比率は、決定されることができる。この比率は各タイプの細胞の数の比率でもよい、または、あるいは、それは各タイプの細胞のいかなる測定された特徴の比率でもあってもよい。
【０２５２】
細胞（例えば癌（例えばＢｅｒ―Ｅｐ４、ＣＤ３４＋、ＥｐＣＡＭ、ＥＣａｄｈｅｒｉｎ、Ｍｕｃｉｎ―１、Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ  ８、ＥＧＦＲ）および白血球関連のレセプタ（ＬＡＲ）に関連した細胞表面マーカを備えている電池）を確認するいかなる方法も、用いられることができる。例えば、ＣＴＣの豊かなサンプルは、以下を含む装置で接触することができる：選択的に豊かなサンプルの一つ以上の細胞を結合する一つ以上の結合部分を有する表面。結合部分は、以下を含むことができる：例えば、モノクローナルで、ポリペチド（例えば抗体または断片単独）。例えば、この種の単クローン抗体は、ＥｐＣＡＭ（例えば抗ヒトＥｐＣＡＭ／ＴＲＯＰｌ（カタログ＃ＡＦ９６０、研究開発Ｓｙｓｔｅｍｓ））に特有でありえた。
【０２５３】
多くの他の測定法および標識試薬は、本発明の方法に役立つ。いかなる映像技術（例えばハイパー・スペクトル・イメージング）も、使われることができる。抗体に、例えば、いかなる癌標識（例えば表１にリストされるそれら）のためにも選択的な抗体とラベルをつけることは基質を切断する共有結合でに結び付いた酵素を所有することができる。そして、所与の波長でその吸光度を変える；裂開の範囲は、それから分光計によって定量化される。比色であるかルミネッセンス読み出しは可能である。そして、使用する基質次第である。都合のよいことに、酵素ラベルの使用は被測定信号の重要な増幅を考慮に入れる。そして、可聴閾値を低下させる。
【０２５４】
量子ドット（例えば、ＱｕａｎｔｕｍＤｏｔ社からのＱｄｏｔｓ（登録商標））は、ターゲッティング抗体に共有結合している標識試薬として利用されることもできる。Ｑｄｏｔｓが、光退色に抵抗して、２に関連して使われることができる―光子励起測定値。
【０２５５】
本発明の方法に役立つ他の可能な標識試薬は、バクテリオファージである。バクテリオファージ・ディスプレイは、結合ペプチドが標的タンパク質（例えば興味がある細胞の表面で見つかるそれら）のための強い結合能を有する設計されたバクテリオファージ圧力によって示される技術である。所与のバクテリオファージに対応するペプチド・シーケンスは、そのバクテリオファージの核酸（例えばＤＮＡまたはリボゾームリボ核酸）にコード化される。このように、バクテリオファージは、それらがＣＴＣのような上皮細胞と関連して小さくて、このように容易に切り離されることができるという、そして、それらが加えて、強化縛られた試料に存在する細胞の数の定量を可能にして、ＰＣＲまたは類似の技術を使用して分析されることができて、定量化されることができる核酸を担持するというの役立つ標識試薬である。
【０２５６】
図５０は、バクテリオファージの使用を２つの装置ステージがカスケード構成において配列される標識試薬として描写する。使用される標識試薬を除いては、図５０において表される方法は、図４９の一般的説明に合う。
【０２５７】
望ましく、下流の分析は、結果として分析されているサンプルの的状赤血球の数の正確な測定になる。正確な定量的結果をもたらすために、概して興味がある細胞に目標とされている表面抗原は周知であるか予測可能な発現量を有する、そして、標識試薬を結合することは予測可能な方法も続行しなければならない。そして、干渉物質がない。このように、標識試薬の導入の前に結果として非常に強化細胞試料になる本発明の方法は、特に役立つ。加えて、出される信号の増幅を考慮に入れる標識試薬は、的状赤血球の低い発生率のため、血流の上皮細胞（例えばＣＴＣ）のような好まれる。信号増幅を考慮に入れる試薬は、酵素およびバクテリオファージを含む。便利な増幅を考慮に入れなくて、にもかかわらず強い信号（例えば量子ドット）を出す他の標識試薬も、望ましい。
【０２５８】
それは、標識試薬を本発明の方法に含むのに必要でない。例えば、１つの方法は、細胞サンプル（例えば末しょう血液のサンプル）を本発明の装置にもたらすステップを含む。
例えば、装置は、サンプルのより小さい細胞から、１２ミクロン、１４ミクロン、１６ミクロン、１８ミクロンまたは２０ミクロンよりさえ大きい水力学的サイズを有する細胞を濃縮する。あるいは、装置は、他の細胞から６ミクロンおよび１２ミクロン以下（例えば８ミクロンおよび１０ミクロン以下以上の水力学的サイズを有する細胞）以上の水力学的サイズを有する細胞を濃縮することができる。装置は、１０ミクロンより大きい水力学的サイズを有する細胞から、５ミクロンおよび１０ミクロン以下以上の水力学的サイズを有する細胞を濃縮することもできる；あるいは、それは、８ミクロンより大きい水力学的サイズを有する細胞から、４ミクロンおよび８ミクロン以下以上の水力学的サイズを有する細胞を濃縮することができる。細胞のこれらのサブセットの各々はそれから集められることができて、例えば、例えば、特定の細胞型の存在を検出することによって分析されることができる。そして、サンプルのうちの１つの珍しい細胞（例えば上皮細胞または原種血管内皮細胞）がこのように集められる。この方法が一般に成し遂げる強化のため、珍しい細胞の濃度は始まっている細胞サンプルにおいてより回復されたサンプルにおいて高くてもよい。そして、様々な手段によって珍しい細胞検出を考慮に入れる。実施例において、細胞サンプルは、装置の入口に適用される；例えば、第２の試薬（例えばバッファ）緩衝含んでいるＢＳＡ（細胞溶解試薬、核酸増幅試薬、モル浸透圧濃度を調整している試薬、標識試薬、防腐剤または固定試薬）は、第２の入口に任意に適用される；そして、２つの出力サンプルは、装置の２つの放出口から流出する。例えば、装置の入口に癌細胞を含んでいる細胞サンプルの塗布は、結果としてこの種の細胞において豊かにされる１つの出力サンプルになることができる、他のサンプルがこれらの細胞において減少する、または、それらの中でさえ完全に欠けている。上記の第２の試薬のいずれか、装置および本発明（例えば装置が第２の入口を含むそれら）の方法のいずれかで使用されることができる。
【０２５９】
２つの細胞型が異なる方向へ目指す実施例において、最初に細胞ものは、タイプが他のいかなる細胞型でもあってもよい第２のセル、興味がある細胞型であることを入力する。
例えば、第２の細胞型は白血球を含むことができる、または、赤血球は、例えば、赤血球を摘出した。
【０２６０】
本発明の方法は、細胞サンプルから興味がある細胞（例えば癌細胞）を濃縮するために、抗体または断片単独を有する磁粉か相互作用を使用する必要はない。
細胞サイズ、形状または変形能に基づくいかなる方法も、興味がある細胞を濃縮するために用いられることができる；その後、細胞検出または他のいかなる下流のアプリケーション（例えば本願明細書において記載されているそれら）も、実行されることができる。
本発明の方法は、細胞の同一セットの強化、定量化および分子生物学分析を考慮に入れる。本発明（大きさ測定の記載されている方法に連結する）の装置の細胞の穏やかな処理は、更なる分析が必要に応じて実行されることができるように細胞の健全性を維持する。
例えば、細胞の健全性を破壊する技術は、大きさ測定に続いて実行されることができる；
この種の技術は、ＤＮＡまたはリボゾームリボ核酸分析、プロテオーム分析またはｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ分析を含む。例えば、ＤＮＡの総量またはサンプルのリボゾームリボ核酸は、決定されることができる；あるいは、例えば、特定のシーケンスの存在またはＤＮＡまたはリボゾームリボ核酸の突然変異（例えば削除）は検出されることができる。そして、遺伝子の突然変異が表１にリストされるポリペチドをコード化する。
さらにまた、サンプルのミトコンドリアＤＮＡ、テロメラーゼまたは核マトリックス蛋白は分析されることができる（癌の糸粒体の突然変異のために、Ｐａｒｒｅｌｌａなど（イチョウガニ科Ｒｅ）参照。６１：７６２３−７６２６  （２００１）ジョーンズなど、癌財産。６１：１２９９―１３０４の（２００１）およびＦｌｉｓｓなど（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７）：２０１７―２０１９の（２０００）；テロメラーゼのために、Ｓｏｒｉａなど（Ｃｌｉｎ）参照。癌財産。５：９７１−９７５  （１９９９））．例えば、あらゆる糸粒体の異常であるにせよ、サンプルは定量に分析されることができる（Ｃａｒｅｗその他を参照、例えば、ＭｏＩ。癌１：９つの（２００２）およびＷａｌｌａｃｅ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３）：１４８２―１４８８の（１９９９））または、核周囲の区画は、ある。ＤＮＡを分析する１つの役立つ方法は、ＰＣＲである、そこにおいて、細胞は溶解される、そして、特定のＤＮＡの塩基配列のレベルは増幅される。分離される的状赤血球の数が非常に低いときに、この種の技術は特に役立つ。細胞のＰＣＲは、使用されることができる；加えて、遺伝子形質発現分析（Ｇｉｏｒｄａｎｏその他を参照、例えば、Ａｍ。Ｊ．．Ｐａｔｈｏｌ．１５９：１２３１−１２３８  （２００１）そして、Ｂｕｃｋｈａｕｌｔｓなど（癌財産）。６３：４１４４−４１４９  ．（２００３））または、蛍光その場ハイブリダイゼーションは、例えば、分析されている細胞の源の組織または組織を決定するために用いることができる。様々な細胞特徴は、上記の技術（例えばタンパク質リン酸化、タンパク質グリコシル化、ＤＮＡメチル化）のいずれかを使用して測定されることができる（Ｄａｓその他を参照、例えば、Ｊ．Ｃｌｉｎ。Ｏｎｃｏｌ．
２２：４６３２−４６４２（２００４））マイクロ・リボゾームリボ核酸レベル（を参照、例えば、彼その他、自然４３５：８２８―８３３の（２００５）Ｌｕなど、自然４３５：８３４―８３８の（２００５）Ｏ´Ｄｏｎｎｅｌｌなど、自然４３５：８３９―８４３の（２００５）およびＣａｌｉｎなど（Ｎ．Ｅｎｇｌ）。Ｊ．ｍｅｄ．３５３：１７９３―１８０１の（２００５））細胞形態または他の構造特徴（例えばｐｌｅｏｍｏｒｐｈｉｓｒｈｓ、粘着力、遊走、締め具、分割）は、遺伝子形質発現および体細胞突然変異の存在の中で水平になる。この分析はいかなる数の細胞に対して行われることができる。そして、興味がある単細胞（例えば癌細胞）を含む。加えて、細胞の粒度分布は、分析されることができる。望ましく、好ましくは同じ主題から、下流の分析（例えば検出）は、一つ以上の検体に対して行われる。
【０２６１】
細胞の定量化
Ｃｅｌｌｓが血液中、さまざまなタイプの中であって、サイズの範囲にわたることを発見した細胞の定量化。本発明の方法を用いて、区別して、糊付けして、血液菌体群（例えばＣＴＣ）を計数することは、可能である。例えば、コールターカウンタが、使われることができる。図は、３３Ａ、通常の血液サンプルのための典型的粒度分布を示す。
若干の状況（例えば剥脱性腫瘍細胞である本体の腫瘍の存在）の下で、血液固有でない細胞は、末梢循環に現れることができる。隔てて、大細胞（または他の所望の細胞）が血液に非常に現れることができることを計数する能力は、強力な機会を疾病状態を診断するために提供する。
【０２６２】
望ましく、コールターカウンタまたは他の細胞探知器は本発明の装置の放出口に流体工学的に連結する、そして、細胞サンプルは本発明の装置にもたらされる。それから流体工学的にコールターカウンタに連結する放出口の中を流れている細胞はＣｏｕｌｔｅｒ開口を貫通する。そして、それは細胞が通過する、そして、各セルが開口部を通過するにつれて、位置がずれる体積を計量する開口部によって切り離される２本の電極を含む。好ましくは、コールターカウンタは、強化試料の５００ｆＬより大きい細胞容積の細胞の数を決定する。あるいは、コールターカウンタは、好ましくは強化試料の１４マイクロメートルより大きい直径の細胞の数を決定する。コールターカウンタまたは他の細胞探知器は、別々の装置を構成することよりむしろ本発明の装置の構成要素でもよい。カウンタは、いかなる細胞特徴（例えばインピーダンス、光吸収、光散乱またはキャパシタンス）も利用することができる。
【０２６３】
一般に、体細胞数を生成するいかなる手段も、本発明の方法に役立つ。この種の手段は、視覚（例えば散乱、吸収または蛍光手段）を含む。あるいは、非開口電気手段（例えば決定キャパシタンス）は、役立つ。
【０２６４】
強化技術との組合せ
本発明の装置を使用している強化および変更方法は、他の懸濁物質試料操作技術と結合されることができる。特に、ＣＴＣまたは他の粒子の更なる濃縮または浄化は、望ましくてもよい。更なる強化はいかなる技術によっても発生することができる。そして、親和性強化を含む。好適な親和性強化技術には、障壁の壁または配列を向けるにちがいない親和性剤によって興味がある粒子を接触させることが含まれる。この種の親和性剤は、いかなる細胞型（例えば癌細胞）のためにも選択的でもよい。これは、的状赤血球に特有の抗体が装置の範囲内で固定される本発明の装置を使用することを含む。これは、装置の範囲内で締め具および的状赤血球の強化を考慮に入れる；その後、的状赤血球は、より高い移動比、競争しているリガンドまたは他の方法を使用して溶出させられる。
【０２６５】
診断
本願明細書において記載されているにつれて、固形腫瘍からはぎ落される上皮細胞は乳癌、コロン、肝臓、卵巣、前立腺および肺をもつ患者の循環で見つかった。一般に、治療の後のＣＴＣの存在は、腫瘍発達および治療（疾患の再発）への広げられた、劣った反応と関係していておよび／または数年の期間にわたる生存を減少させた。従って、ＣＴＣの列挙は、最初の危険を予測する基本的な特徴および治療に対する応答に基づく次の危険のための患者を層化する手段を提供する。
【０２６６】
装置および本発明の方法は、例えば、癌の危険があり癌患者およびそれらを評価するために用いることができる。本願明細書において記載されている診断の方法のいずれかにおいて、癌（例えば癌細胞）の指標の、または、他のいかなる障害のも存在か欠如は、診断を生成するために用いることができる。一つの実施例において、血液サンプルは、患者から引き出されて、他の血液細胞から上皮細胞（例えばＣＴＣ）を豊かにするために適切に選択される臨界サイズを有する本発明の装置にもたらされる。本発明の方法を用いて、血液サンプルの上皮細胞の数は、決定される。例えば、細胞はＥｐＣＡＭと結合する抗体によって標識でもよい、そして、抗体は共有結合して縛られた蛍光ラベルを有することができる。大きさ測定はそれから、装置によってできる強化試料でできていてもよい、そして、この測定値から、最初の血液サンプルに存在する上皮細胞の数は決定されることができる。顕微鏡的な技術は、大きさ測定を血液サンプルの標識細胞の対応する数に関連させるために視覚的に細胞を定量化するために用いることができる。
【０２６７】
上皮性腫瘍細胞の他に、転移性腫瘍形成に関与している他の細胞型が、ある。研究は、証拠を造血骨髄前駆細胞の関係および転移（Ｋａｐｌａｎその他を参照、例えば、Ｎａｔｕｒｅ  ４３８：８２０―８２７の（２００５）およびＢｒｕｇｇｅｒなど（Ｂｌｏｏｄ  ８３）：６３６―６４０の（１９９４））の内皮の始原細胞に提供した。例えば、造血骨髄前駆細胞（例えば原種血管内皮細胞）は、第２の細胞型の細胞でより麻痺していてもよい決定する、そして、タイプが算出されることができる第２のセルの数に対する上皮性腫瘍細胞の比率。この種の比率は、適切な治療を選択する際の、そして、処理の有効性をモニタする際の診断学的価値である。
【０２６８】
転移性腫瘍形成に関係する細胞は、公知技術のいかなる方法も使用して検出されることができる。例えば、特定の細胞表面マーカに特有の抗体が、用いられることができる。
役立つ血管内皮細胞表面マーカは、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１４４およびＣＤ１４６を含む；役立つ腫瘍血管内皮細胞表面マーカは、ＴＥＭｌ、ＴＥＭ５およびＴＥＭ８を含む（Ｃａｒｓｏｎ―Ｗａｌｔｅｒその他を参照、例えば、イチョウガニ科Ｒｅ。６１：
６６４９−６６５５  （２００１））；そして、役立つ間葉系細胞表面マーカは、ＣＤ  １３３を含む。
標識が得られることができるこれらまたはその他に対する、例えば抗体、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、真横および研究開発Ｓｙｓｔｅｍｓ。
【０２６９】
一連の測定値になることによって、一定の間隔（例えば一日）２日、３日、１週、２週、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、６ヵ月または１年に任意に作られて、１は、時間の関数として、患者の血流に存在する上皮細胞のレベルを追跡することができる。
既存の癌患者の場合、これは、疾患の進行の役立つ徴候を提供して、町医者が増加、減少または患者の血流の上皮細胞（例えばＣＴＣ）の変化の不足に基づいて適切な治療的な選択をするのを援助する。癌の危険にさらされたそれらのために、検出される細胞の数の急増は、患者が腫瘍を呈した初期警告を提供することができる。この早期診断（次の治療的な介入に連結する）は、診断情報の欠如と比較して結果として改良された寛容な結果になりそうである。
【０２７０】
診断法は、血液（細胞の健全性を破壊する技術と同様に）から分離されて標識上皮細胞（例えばＣＴＣ）の大きさ測定値になることを含む。例えば、ＰＣＲは、分離される的状赤血球の数が非常に低いサンプルに実行されることができる；特定の癌標識に特有のプライマを用いて、情報は、分析細胞が始まった腫瘍の種類について得られることができる。
加えて、リボゾームリボ核酸分析、プロテオーム分析またはｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ分析は、患者に存在する癌の種類または種類を診断する手段として実行されることができる。
肺癌および他の癌のための１つの重要な診断インジケータは、ＥＧＦＲ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ出版物ＷＯ  ２００５／０９４３５７を参照、例えば）の特定の突然変異の有無である。
【０２７１】
ＥＧＦＲは、細胞外のｌｉｇａｎｄ―を結合している領域から成る、膜内外部分、
そして、細胞内のチロシンキナーゼ（ＴＫ）領域。ＥＧＦＲの通常の生理学的役割はＥｒｂＢリガンドを結合することである。そして、細胞増殖、生存、運動性および他の関連した動作に導いている下流の細胞内の信号のカスケードを起動させる細胞外の結合部で、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）を含む。ＥＧＦＲ突然変異を有する多くの非小細胞肺腫瘍は、小分子ＥＧＦＲインヒビター（例えばゲフィチニブ）に反応する（Ｉｒｅｓｓａ；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）しかし、しばしば結局、それらを薬剤抵抗性ようにする第２の突然変異を得る。本発明の装置および方法を用いて、１は、以下によってこの種の薬を飲んでいる患者をモニタすることができる：血液の頻繁なサンプルをすること、そして、時間の関数として、各サンプルの上皮細胞（例えばＣＴＣ）の数を決定すること。これは、疾患の過程に関しては、情報を提供する。例えば、減少の数の循環上皮細胞は、時間とともに疾患のひどさおよび腫瘍または腫瘍のサイズの減少を示唆する。すぐ上皮細胞の定量化の後に、これらの細胞は、どんな突然変異が上皮細胞において表されるＥＦＧＲ遺伝子に存在してもよいかについて決定するために、ＰＣＲによって分析されることができる。特定の突然変異（例えばＥＧＦＲ  ＴＫ領域のＡＴＰ結合ポケット周辺で集まっているそれら）は、癌細胞をゲフィチニブ抑制に影響されやすくすることは公知である。このように、これらの突然変異の存在は、処理を使用しているゲフィチニブに反応しそうである癌の診断法をサポートする。しかしながら、結局ゲフィチニブに応える多くの患者は第２の突然変異（しばしばＴＫ領域のエキソン２０の位置７９０のスレオニンに対するメチオニン置換）を開発する。そして、それによってそれらがゲフィチニブに対して耐性を示しなる。
本発明の装置および方法を用いて、１は同様にこの突然変異のために試験することができる。そして、疾患の過程およびそれがゲフィチニブまたは類似化合物に反応するという可能性について更なる診断情報を提供する。多くのＥＧＦＲ突然変異が、すべてのＥＧＦＲ突然変異を肺癌が感度またはゲフィチニブに対する耐性を与えることは公知であると現在まで報告したＮＳＣに含んで、エキソン１８〜２１のコード領域の中で位置するので、ＥＧＦＲ遺伝子のこの領域は突然変異（実施例４―６を参照）の存在のための分析法の開発において強調されることができる。
【０２７２】
本発明は、以下を含む：前記患者のｅｒｂＢｌ遺伝子のキナーゼドメインの少なくとも一つの核酸異型の有無を検出する方法。少なくとも一つの異型の存在は、ＥＧＦＲターゲッティング処理が効果的になりそうなことを示す。好ましくは、核酸異型は、ＥＧＦＲのキナーゼ活性を増加させる。患者は、それからＥＧＦＲターゲッティング治療で治療されることができる。本発明の一実施例では、ＥＧＦＲターゲッティング処理は、チロシンキナーゼ・インヒビターの管理を含む。
【０２７３】
したがって、本発明は、癌によって影響を受けるヒト患者の処理を目標としている上皮細胞成長因子レセプタ（ＥＧＦＲ）の効果の可能性を決定するために、方法を提供する。
方法は、野生型ｅｒｂＢｌ遺伝子と関連して前記患者のｅｒｂＢｌ遺伝子のキナーゼドメインの少なくとも一つの核酸異型の有無を検出することを含む。少なくとも一つの異型の存在は、ＥＧＦＲターゲッティング処理が効果的になりそうなことを示す。好ましくは、核酸異型は、ＥＧＦＲのキナーゼ活性を増加させる。患者は、それからＥＧＦＲターゲッティング治療で治療されることができる。本発明の一実施例では、ＥＧＦＲターゲッティング処理は、チロシンキナーゼ・インヒビターである。
【０２７４】
特定の異型の有無または発達中の癌のための危険をもつ、または、の患者のｅｒｂＢｌ遺伝子のキナーゼドメインの複数個の異型を決定することは、さまざまな方法で実行されることができる。この種の試験は生体試料（例えば組織生検、尿、スツール、痰、血液、細胞、組織切屑、胸部吸引液または他の細胞形質成分）から集められるＤＮＡまたはリボゾームリボ核酸を使用して共通に実行されて、ＰＣＲ、アレレに特有のプローブを有するハイブリダイゼーション、酵素突然変異検出、不適当な組合せの化学開裂、マススペクトル分析またはＤＮＡ塩基配列決定を含むがこれに限らず様々な方法によって実行されることができる。そして、ミニ・シークエンシングを含む。具体例において、アレレに特有のプローブを有するハイブリダイゼーションは、２つのフォーマットにおいて行われることができる：（１）  固相（例えばガラス、シリコンまたはナイロン製メンブラン）および、多くのＤＮＡチップ・アプリケーションのような、溶液の標識サンプル行きのアレレに特有のオリゴヌクレオチド、または、（２）  溶液（ハイブリダイゼーションによってシークエンシングを許容するために特定であるか短いいずれのアレレも）の縛られたサンプル（例えば、純化ＤＮＡまたはＰＣＲは、ＤＮＡを増幅した）および標識化オリゴヌクレオチド。
診断検査は、以下を含むことができる：しばしば固体担体に、異型の中でパネル。そして、それは、一つ以上の異型の同時定量を可能にする。方法は、患者のＥＧＦＲのキナーゼドメインが少なくとも一つの核酸異型を含むかどうかについて決定することが必要である。この種の異型の存在は、ＥＧＦＲ目標とされた処理（例えばチロシンキナーゼ・インヒビターの管理）の効果を表す。
【０２７５】
ＥＧＦＲ遺伝子のテストは、ＥＧＦＲのキナーゼドメインの突然変異を検出することができる。上で概説されるように、ＤＮＡは本発明のミクロな液体の装置を利用して豊かにされるＣＴＣから最初に得られる。ＥＧＦＲの７つのエキソン（１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４）のＤＮＡの塩基配列は、それから直接の双方向性遺伝子配列で測定される。得られたシーケンスは、ＤＮＡの塩基配列変化を確認するために、それから周知のＥＧＦＲシーケンスと比較してある。ＤＮＡの塩基配列変化がＣＴＣサンプルにおいて検出される場合、試験は原物の組織サンプルに繰り返されることができる。
【０２７６】
別の態様においては、ｅｒｂＢｌ遺伝子の少なくとも一つのキナーゼ活性を増加させている核酸異型の存在を決定することは、単タイピング試験を伴うことができる。
例えばのように、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ公開番号ＷＯ  ００／０４１９４で、決定ハプロタイプの方法は当業者に知られている。好ましくは、キナーゼ活性を増加させている核酸異型の有無の決定は、方法（例えばＰＣＲ法（ＰＣＲ））で異型サイトまたはサイトのシーケンスを測定することが必要である。あるいは、キナーゼ活性を増加させている核酸異型の有無の決定は、チェーンを終了しているＤＮＡ塩基配列決定またはミニ・シークエンシング（オリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーションまたはマススペクトル分析）を含むことができる。
【０２７７】
本発明の方法は、癌を呈するための危険によって、または、で影響を受ける患者のＥＧＦＲターゲッティング処理の効果（または効果の欠如）の可能性を予測するために用いることができる。好ましくは、癌は上皮の起源の癌を含む。そして、胃腸の癌、前立腺癌、卵嚢癌、乳癌、頭頚部癌、肺癌、肺非小細胞癌、神経系ガン、腎臓癌、網膜癌、皮膚癌、肝癌、膵臓癌、生殖器尿癌および膀胱癌を含むが、これに限定されるものではない。好ましい実施例において、癌は、肺非小細胞癌である。本発明は、一般に、癌を呈するための危険をもつ、または、の患者のＥＧＦＲターゲッティング処理の効果を表すｅｒｂＢｌ遺伝子のキナーゼドメインの異型の識別に関する。加えて、ＥＧＦＲのキナーゼドメインの特定の異型の識別が、効力があって、症候または予診検査として使われることができる。
例えば、ｅｒｂＢｌのキナーゼドメインの少なくとも一つの異型の存在は、患者がＥＧＦＲターゲッティング化合物（例えばチロシンキナーゼ・インヒビター）を有する処理からたぶん利益を得ることを示す。
【０２７８】
実施例において、本発明は、ふるい分けの方法をＰＣＲによる試験生体試料のｅｒｂＢｌ遺伝子のキナーゼドメインの、または、あるいは、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）の異型に提供する（Ｌａｎｄｅｇｒａｎその他を参照、例えば、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０；そして、Ｎａｋａｚａｗａなど、１９９４、会報Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３６０―３６４）いずれが特にＥＧＦＲ―遺伝子の位置模倣を検出することに役立つことがありえるかという後者（Ａｂｒａｖａｙａその他を参照、例えば、１９９５、Ｎｕｃｌ。酸財産。２３：６７５−６８２）．方法は、テンプレートとして、試験生体試料から得られたＤＮＡまたは相補ＤＮＡを使用していて、ＰＣＲ製品を分析しているプライマを有する反応を増幅して、標的配列（遺伝子の一つ以上の保全された領域に対応するプライマ）を増幅するための変性プライマを設計するステップを含む。
コントロール試料に対する試験生体試料のＰＣＲ製品の比較は、試験生体試料の異型を示す。変化は、試験生体試料の核酸異型の欠如か存在でありえる。
【０２７９】
代わりの増幅方法は、以下を含む：自己は、シーケンス複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉその他を参照、例えば、１９９０（会報Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４）−１  ８７８）（転写性増幅システム）を支持した（Ｋｗｏｈ、その他を参照、例えば、１９８９、会報Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：
１１７３―１１７７）Ｑｂ  Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ（Ｌｉｚａｒｄｉ、その他を参照、例えば、１９８８（ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７））または他のいかなる核酸増幅方法も、よく当業者に知られている技術を使用している増幅された分子の検出によって続いた。この種の分子が超低数に存在する場合、これらの検出方式は特に核酸分子の検出に役立つ。
【０２８０】
すべてのシーケンス異型は、複数の独立ＰＣＲ詳しい説明によって確認されることができる。本発明によって役立つプライマは、ガイド（例えば配列番号）としてタンパク質のアミノ酸配列またはｅｒｂＢｌ遺伝子のキナーゼドメインの核酸一次構造を使用して設計される：４９３、配列番号：４９４、配列番号：５０９および配列番号：５１０．プライマは少なくとも２つの相同領域が可変シーケンスの発散の領域によって切り離される遺伝子の相同領域において設計される。そして、シーケンスが長さまたは核酸一次構造において可変的である。
【０２８１】
ＰＣＲ反応のためのプライマは利用可能な私の方法を得て、従来技術において当業者に知られている。そして、周知のＥＧＦＲヌクレオチド／タンパク質配列を利用する。
例えば、レセプタ・チロシンキナーゼの相補ＤＮＡシーケンスは、ＧｅｎＢａｎｋから得られることができて、エキソン／イントロン境界線を確認するためにＢＬＡＴ配列を使用しているヒトゲノム組立てと比較されることができる。外部の遺伝子に特有のプライマ対は、ＰｒｉｍｅｒＳプログラムを使用している両側上のイントロン・シーケンスまたは隣接するエキソン・シーケンスの側面に位置するエキソン・シーケンスおよび少なくとも２５０の塩基対を増幅するように設計されている。結果として生じる予測されたアンプリコンは、それから、エキソン（一般にエキソン／イントロン境界線から５０の塩基対より大きい）の側面に位置していて、添付のＭ１３前方または後方のプライマ尾部を含んでいる内部プライマを設計するために用いる。これらの入れ子にされたプライマ・セットは、コントロールＤＮＡから適当なアンプリコン・サイズおよび高級のシーケンスを見つけるため検査される。４７のチロシンキナーゼのレセプタ・チロシン・キナーゼ活性化ループをコード化しているエキソンを含んでいるアンプリコンは、増幅されて、測定用試料（例えば本発明のミクロな液体の装置を利用して濃縮される細胞）から順序付けた。加えて、完全長ＥＧＦＲをカバーしているアンプリコンも、増幅される。本発明の方法に用いられる典型的なプライマおよび他のシーケンスは、表２に示される。
【０２８２】
【表２−１】
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【０２８３】
【表２−２】
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【０２８４】
【表２−３】
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【０２８５】
【表２−４】
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【０２８６】
【表２−５】
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【０２８７】
【表２−６】
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【０２８８】
【表２−７】
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【０２８９】
【表２−８】
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【０２９０】
【表２−９】
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【０２９１】
【表２−１０】
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【０２９２】
【表２−１１】
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【０２９３】
【表２−１２】
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【０２９４】
【表２−１３】
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【０２９５】
【表２−１４】
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【０２９６】
上記の如く、好ましくは、ＥＧＦＲのキナーゼドメインの異型は、１インチ・フレーム削除またはエキソン１８、１９、２０または２１の置換である。しかしながら、すべての分析が本願明細書において述べられて、すなわち、通常、ＥＧＦＲのキナーゼドメインの突然変異を検出する遺伝子検査は、相加またはすべてのエキソンに適用されることができる。実施例において、ＤＮＡは、血液（例えばＣＴＣ）から分離される細胞から、最初に得られる。ＥＧＦＲの７つのエキソン（１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４）のＤＮＡの塩基配列は、それから直接の双方向性遺伝子配列で測定される。得られたシーケンスは、それから周知のＥＧＦＲシーケンスと比較してある（例えば、配列番号５１１、図７１）ＤＮＡの塩基配列を確認することは、変化する。ＤＮＡの塩基配列変化が検出される場合、試験は原物のサンプルに繰り返されることができる。変化がｇｅｆｉｔｉｎｉｂ―またはｅｒｌｏｔｉｎｉｂ―応答者において前に報告されなかった場合、突然変異が腫瘍組織の構成型である（したがって、たぶん通常発生している染色体の多型）か発生された体細胞性であるかどうか決定するために、試験は、同じであるか異なるソース（例えば患者または動物）から、参照または対照細胞からサンプルによっても行われる。個々のサンプルのためのＩｆＰＣＲ増幅は失敗する、ＰＣＲの新ラウンドは入力ＤＮＡテンプレートの二倍の増加によって試みられなければならない。例えば、ＤＮＡは、前増幅を受けることができる。適切な前増幅方法は、多置換増幅および線形増幅方法（例えば生体外転写またはプライマー伸長全体ゲノムｐｒｅ―増幅）を含む。再びＩｆＰＣＲ増幅失敗、利用できる場合患者が獲得性でなければならないというのための新規なＤＮＡサンプル。
【０２９７】
実施例において、インフレーム削除は、ＥＧＦＲ（ｅｒｂＢｌ）のエキソン１９においてある。コードン７４７、７４８、７４９、および７５０で、エキソン１９のｉｎ―フレーム削除は、好ましくは最少のアミノ酸ロイシン、アルギニン、グルタミン酸およびアラニンでの削除を含む。実施例において、インフレーム削除は、ヌクレオチド２２３５〜２２４９を含んで、アミノ酸７４６〜７５０（シーケンス・グルタミン酸、ロイシン、アルギニン、グルタミン酸およびアラニン）を削除する。他の実施形態では、インフレーム削除は、ヌクレオチド２２３６〜２２５０を含んで、アミノ酸７４６〜７５０を削除する。あるいは、インフレーム削除は、ヌクレオチド２２４０〜２２５１またはヌクレオチド２２４０〜２２５７を含む。あるいは、ｉｎ―フレーム削除は、ヌクレオチド２２４８のグアニンのためのシトシンの置換またはヌクレオチド２２３７のアデニンのためのチミンの置換またはヌクレオチド２２５４〜２２７７の削除とヌクレオチド２２３８〜２２５５の削除と共にヌクレオチド２２３９〜２２４７を含む。あるいは、インフレーム削除は、ヌクレオチド２２３９―２２５０ｄｅｌＴＴＡＡＧＡＧＡＡＧＣＡを含む；２２５１Ａ＞Ｃ（または２２４０―２２５４ｄｅｌＴＡＡＧＡＧＡＡＧＣＡ）または２２５７―２２７のｌｄｅｌＣＣＧＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧ。更なる突然変異は、位置８５７（「Ｇ８５７Ｖ」）でグリシン（Ｇ）をバリン（Ｖ）と置換するＥＧＦＲ突然変異または転移性肉腫の位置８８３（「Ｌ８８３Ｓ」）でセリン（Ｓ）を有するロイシン（Ｌ）を置換するものでもよい。図７２Ａ―Ｅおよび図表３は典型的なＥＧＦＲ突然変異を示す。
【０２９８】
【表３】
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【０２９９】
他の実施形態では、置換は、ＥＧＦＲのエキソン２１においてある。エキソン２１の置換は、少なくとも一つのアミノ酸を含む。実施例において、エキソン２１の置換は、以下を含む：ヌクレオチド２５７３のチミンのためのグアニンの置換。この置換は、結果としてアミノ酸置換になる、そこにおいて、野生型Ｌｅｕｃｉｎｅは、アミノ酸８５８でＡｒｇｉｎｉｎｅと置き換えられる。あるいは、エキソン２１の置換は、以下を含む：ヌクレオチド２５８２のチミンのためのアデニンの置換。この置換は、結果としてアミノ酸置換になる、そこにおいて、野生型Ｌｅｕｃｉｎｅは、アミノ酸８６１でＧｌｕｔａｍｉｎｅと置き換えられる。
【０３００】
置換は、ＥＧＦＲのエキソン１８においてもよい。実施例において、置換は、１８がグアニンのためのチミンであるエキソンにおいてあるヌクレオチド２１５５。この置換は、結果としてアミノ酸置換になる、そこにおいて、野生型Ｇｌｙｃｉｎｅは、コードン７１９でＣｙｓｔｅｉｎｅによって置換される。他の実施形態では、エキソン１８の置換は、結果としてアミノ酸置換になっているヌクレオチド２１５５のグアニンのためのアデニンである、そこにおいて、野生型Ｇｌｙｃｉｎｅは、コードン７１９でＳｅｒインと置換される。
【０３０１】
他の実施形態では、置換は、ヌクレオチド２３１６の後のグアニン、グアニンおよびチミン（ＧＯＴ）の、そして、配列番号のヌクレオチド２３１７の前の挿入である：５１１（２３１６＿２３１７インチＧＧＴ）。これは、アミノ酸７７２（Ｐ７７２＿Ｈ７３３インチＶ）のバリン（Ｖ）の挿入と言われることもできる。他の突然変異は、例えば、ヌクレオチド２３０９の後、そして、配列番号のヌクレオチド２３１０の前にＣＡＡＣＣＣＧＧの挿入を含む：５１１およびヌクレオチド２３１１の後の、そして、配列番号のヌクレオチド２３１２の前のＧＣＧＴＧＧＡＣＡの挿入：５１１．置換は、エキソン２０においてもよくて、実施例において、ヌクレオチド２３３４および２３３５のＧＧのためのＡＡの置換でもある。
【０３０２】
従って、他の好ましい実施形態では、ｅｒｂＢｌ遺伝子の核酸異型は、グアニンのためのチミンまたは配列番号のヌクレオチド２１５５のグアニンのためのアデニンの置換である：５１１、ヌクレオチド２２３５〜２２４９の削除、２２４０〜２２５１、２２４０〜２２５７、２２３６〜２２５０、２２５４〜２２７７または配列番号のうちの２２３６〜２２４４：５１１、ヌクレオチド・グアニンの挿入、グアニンおよびヌクレオチド２３１６の後の、そして、配列番号のヌクレオチド２３１７の前のチミン（ＧＧＴ）：５１１およびヌクレオチド２５７３のチミンのためのグアニンまたは配列番号のヌクレオチド２５８２のチミンのためのアデニンの置換：５１１．
少なくとも一つの核酸異型の有無の検出は、レセプタをコード化している核酸の部分を増幅することによって決定されることができる。好ましくは、増幅される部分は、長さの１０００のヌクレオチドである長さの５００のヌクレオチドおよび長さまたはより少ないものの大部分の好ましくは１００のヌクレオチド。増幅される部分は、複数の異型を含むことができる。他の実施形態では、有無または少なくとも一つの異型の検出は、少なくとも一つの核酸プローブを有する異型サイトを含んでいるＥＧＦＲ核酸を接触させることを提供する。プローブは、選択的なハイブリダイゼーション状況の下で異型サイトで異型サイトおよび含んでいる補完的なヌクレオチド塩基を含む核酸一次構造によって、優先して交雑する。ハイブリダイゼーションは、検出可能なラベルによって検出されることができる。
【０３０３】
さらに別の実施形態では、少なくとも一つの異型の有無の検出は、以下を含む：シークエンシング少なくとも一つの核酸一次構造、そして、得られたシーケンスを周知のｅｒｂＢｌ核酸一次構造と比較すること。あるいは、少なくとも一つの異型の有無は、少なくとも一つの核酸一次構造の質量分析決定を含む。
【０３０４】
好ましい実施例において、少なくとも一つの核酸異型の有無の検出は、ＰＣＲ法（ＰＣＲ）を実行することを含む。仮定的異型を含んでいるｅｒｂＢｌ核酸一次構造は増幅される、そして、増幅された核酸のヌクレオチド配列は決定される。増幅された核酸のヌクレオチド配列が少なくとも一つの核酸部分を配列して含むＤｅｔｅｍｉｉｎｉｎｇ。あるいは、製品がそうすることができる増幅はそれらのサイズに従って増幅製品を分離することができるいかなる方法を用いても解析した。そして、オートメーション化したおよび手動ゲル電気泳動などを含んだ。あるいは、少なくとも一つの異型の有無の検出は、遺伝子の複数の異型のハプロタイプを決定することを含む。
【０３０５】
他の実施形態では、ＥＧＦＲ異型の有無は、ｅｒｂＢｌ遺伝子産物（タンパク質）を分析することによって検出されることができる。本実施例において、特に異型ＥＧＦＲと結合するプローブは、利用される。好ましい実施例において、プローブは、優先して異型ＥＧＦＲと結合する抗体である。異型ＥＧＦＲの存在は、ＥＧＦＲターゲッティング処理の効果の可能性を予測する。あるいは、プローブは、抗体フラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体またはアプタマでもよい。
【０３０６】
さらにまた、プローブは、具体的には、そうすることができるＥＧＦＲ遺伝子（ｅｒｂＢ  １）の少なくとも一つの核酸異型から成る核酸一次構造に対する選択的な結合状況の下で結合する。実施例において、異型は、ＡＴＰ結合ポケットの構造変化を与えるｅｒｂＢ  １のキナーゼドメインの突然変異である。本発明のプローブは、以下を有することができる：約５００のヌクレオチド塩基、好ましくは約１００のヌクレオチド・ベースおよび大部分の好ましくは約５０または約２５のヌクレオチド塩基の核酸一次構造または長さの少数の人。プローブは、ＤＮＡ、リボゾームリボ核酸またはペプチド核酸（ＰＮＡ）から成ることができる。さらにまた、プローブは、検出可能なラベル（例えば蛍光または酵素標識）を含むことができる。
【０３０７】
増幅製品の分析は、オートメーション化したおよび手動ゲル電気泳動、マススペクトル分析、などを含むそれらのサイズに従って増幅製品を分離することができるいかなる方法も使用して実行されることができる。あるいは、増幅製品は、核酸に対するハイブリダイゼーションが、例えば、配列するのと同程度上手にＳＳＣＰ、ＤＧＧＥ、ＴＧＧＥ、化学開裂または制限フラグメント染色体の多型を用いてシーケンス違いを使用して分離されることができる。
【０３０８】
配列分析および確証：前方に、（Ｆ）および逆（Ｒ）クロマトグラムはＭｕｔａｔｉｏｎ  Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  ２．０３（ＳｏｆｔＧｅｎｅｔｉｃｓ、Ｓｔａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ、ＰＡ）によってバッチで分析される。そして、手動再調査が続く。一方または両方の方向で見つかる高品質シーケンス・バリエーションは、候補突然変異として記録される。エキソンを停泊させている候補突然変異は、最初のＤＮＡサンプルからｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄされることができて、上記としてｒｅ―ｓｅｑｕｅｎｃｅｄされることができる。
【０３０９】
好ましくは、ヒトＥＧＦＲのエキソン１９および２１は、以下のプライマを使用しているＰＣＲ法（ＰＣＲ）によって増幅される：Ｅｘｏｎｌ９センスプライマ、５１―ＧＣＡＡＴＡＴＣＡＧＣＣＴＴＡＧＧＴＧＣＧＧＣＴＣ―Ｓ１（配列番号５０５）；エキソン１９アンチセンスプライマ、５´―ＣＡＴＡＧＡＡ  ＡＧＴＧＡＡＣＡＴＴＴＡＧＧＡＴＧＴＧ―Ｓ´（配列番号である５０６）；エキソン２１センスプライマ、５´―ＣＴＡＡＣＧＴＴＣＧ  ＣＣＡＧＣＣＡＴＡＡＧＴＣＣ―Ｓ´（配列番号である５０７）；そして、Ｅｘｏｎ２１アンチセンスプライマ、５．ｐｒｉｍｅ．―ＧＣＴＧＣＧＡＧＣＴＣＡＣＣＣＡＧ  ＡＡＴＧＴＣＴＧＧ―３１、（配列番号である５０８）．
代替実施形態では、試料セルからのＥＧＦＲ遺伝子の突然変異は、限定酵素裂開パターンの変更によって確認されることができる。例えば、サンプルおよびコントロールＤＮＡは、任意に増幅されて、一つ以上の限定エンドヌクレアーゼによって消化されて分離される、そして、断片長サイズはゲル電気泳動で測定されて、比較される。サンプルＤＮＡのサンプルおよびコントロールＤＮＡ指示突然変異間の断片長サイズの違い。さらに、シーケンスに特有のリボザイム（米国特許番号５，４９３，５３１を参照、例えば）の使用は、現像またはリボザイム切断部位の損失によって特定の突然変異の存在のためにスコアするために用いることができる。
【０３１０】
ＥＧＦＲ遺伝子の突然変異を検出する他の方法は、裂開剤からの保護がＫＮＡ／ＲＮＡまたはリボゾームリボ核酸／ＤＮＡヘテロデュプレックスの不釣合いなベースを検出するために用いる方法を含む。Ｍｙｅｒｓなど、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０参照：
１２４２．一般に、「不適当な組合せ裂開」の技術は、潜在的に突然変異のリボゾームリボ核酸を有する野生型ＥＧＦＲシーケンスを含んでいる（標識）リボゾームリボ核酸またはＤＮＡの雑種を作ることによって形成されるヘテロデュプレックスまたは組織サンプルから得られるＤＮＡを形成することから始める。二本鎖デュプレックスは、いずれが制御およびサンプル索の間にｂａｓｅｐａｉｒ不適当な組合せのため存在するかというデュプレックスの一本鎖領域を切断する剤を有する既治療である。例えば、リボゾームリボ核酸／ＤＮＡ二重螺旋はＲＮアーゼで処理されることができる、そして、酵素処理でにＳｌヌクレアーゼで処理されるＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは不釣合いな地方を消化する。他の実施態様において、ＤＮＡ／ＤＮＡかリボゾームリボ核酸／ＤＮＡ二重螺旋は、不釣合いな地方を消化するために、ヒドロキシルアミンまたはオスミウム酸によって、そして、ピペリジンによって処理されることができる。不釣合いな地方の消化の後、結果として生じる材料は、それから、突然変異のサイトを決定するためにポリアクリルアミドゲルを変性することのサイズによって分離される。Ｃｏｔｔｏｎなど、１９８８、８５：４３９７会報Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡおよびＳａｌｅｅｂａなど（１９９２）を参照手法Ｅｎｚｙｍｏｌ。２  １７：２８６−２９５．実施例において、コントロールＤＮＡまたはリボゾームリボ核酸は、検出のために標識でありえる。
【０３１１】
さらに他の実施例では、不適当な組合せ開裂反応は、細胞の試料から得られるＥＧＦＲ相補ＤＮＡの検出およびマッピング・ポイントミューテーションのための限定系のｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｅｄされたＤＮＡ（いわゆる「ＤＮＡ不適当な組合せ修理」酵素）の不適正塩基対を認識する一つ以上のタンパク質を使用する。例えば、大腸菌のｍｕｔＹ酵素はＧｒ／Ａ不適当な組合せでＡを切断する、そして、ヒーラー細胞からチミジンＤＮＡグリコシラーゼはＧ／Ｔ不適当な組合せでＴを切断する。Ｈｓｕなど、１９９４、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １５参照：１６５７―１６６２。例示的実施形態によれば、変異体ＥＧＦＲシーケンス（例えばＤＥＬ―５、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ８５７Ｖ、Ｌ８８３ＳまたはＬ８５８Ｒ  ＥＧＦＲシーケンスによるＤＥＬ―Ｉ）に基づくプローブは相補ＤＮＡまたは回復酵素に雑種を作られる、そして、切断産物は、あるとしても、電気泳動プロトコル等から検出されることができる。米国特許番号５，４５９，０３９参照。
【０３１２】
他の実施態様において、電気泳動易動度において変更ＥＧＦＲ遺伝子の突然変異を確認するために用いる。例えば、一本鎖コンフォメーション染色体の多型（ＳＳＣＰ）は、変異体および野生型核酸との間に電気泳動易動度の違いを検出するために用いることができる。Ｏｒｉｔａなど、１９８９、会報Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ参照：８６：２７６６；綿、１９９３、Ｍｕｔａｔ。Ｒｅｓ．  ２８５：１２５−１４４；Ｈａｙａｓｈｉ、１９９２、Ｇｅｎｅｔ。Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．出願９：７３―７９。サンプルおよび制御ＥＧＦＲ核酸の一重鎖ＤＮＡ断片は、ｒｅｎａｔｕｒｅに変性されて、許容される。一本鎖核酸の二次構造は、シーケンスに従って変化する；電気泳動易動度の結果として生じる変更は、一塩基変化の検出さえ可能にする。ＤＮＡフラグメントは、標識でもよいかまたは標識プローブで検出した。分析法の感度は、二次構造が順番に変化により影響されるリボゾームリボ核酸（ＤＮＡよりはむしろ）を用いて強化されることができる。実施例において、主題方法は、電気泳動易動度の変化を基礎として二本鎖ヘテロデュプレックス分子を分離するために、ヘテロデュプレックス分析を利用する。Ｋｅｅｎなど、１９９１、傾向Ｇｅｎｅｔ参照。７：５．
さらに別の実施形態では、変性剤の勾配を含んでいるポリアクリルアミドゲルの変異体または野生型断片の動きは、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を使用して検定される。
３１３：４９５にＭｙｅｒｓなど、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ参照。ＤＧＧＥが分析の方法として使われるときに、ＤＮＡはそれが、例えば、ＰＣＲによって高融点のＧＣの豊富なＤＮＡのほぼ４０の塩基対のＧＣクランプを加えることによって完全に変性しないことを確実にするために変更される。さらなる態様において、温度勾配が、制御およびサンプルＤＮＡの可動性の違いを確認するために、変性勾配の代わりに使われる。ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ、１９８７、Ｂｉｏｐｈｙｓ参照。２６５：１２７５３化学。
【０３１３】
検出ポイントミューテーションの他の技術の例には、制限されるわけではないが、選択的なオリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーション、選択的増幅または選択的なプライマー伸長が含まれる。例えば、プライマが周知の突然変異がいずれであるかについて用意されることができるオリゴヌクレオチドが、ａｌ．１９８９、会報Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６を中央に配置して、それから、完璧なマッチがＳｅｅ（例えばＳａｉｋｉなど、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３）であるとわかる場合だけ、ハイブリダイゼーションを許す状況の下の目標ＤＮＡおよび小Ｓａｉｋｉに交雑させた：
６２３０．オリゴヌクレオチドが交雑している膜に取り付けられて、標識目標ＤＮＡによって交雑するときに、この種のアレレに特有のオリゴヌクレオチドはＰＣＲ増幅された目標ＤＮＡまたは多くの異なる突然変異に交雑する。
【０３１４】
あるいは、選択的なＰＣＲ増幅によるアレレに特有の増幅技術が、本発明と連動して用いられることができる。特定の増幅のためのプライマとして使用するオリゴヌクレオチドは分子の中央に興味がある突然変異をもたらすことができる（それで、その増幅は、差動のハイブリダイゼーション次第である；Ｇｉｂｂｓ、など、１９８９、Ｎｕｃｌ参照。
酸財産。１７：２４３７―２４―４８）または、適当な状況の下で、不適当な組合せがＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ拡張を防止することができるかまたは減らすことができる１つのプライマの極度の３―終点で（Ｐｒｏｓｓｎｅｒを参照、例えば、１９９３、Ｔｉｂｔｅｅｌｉ。１１：２３８）．加えて、裂開ベースの検出をつくるために突然変異の領域の新しい制限サイトを導くことは、望ましくてもよい。Ｇａｓｐａｒｉｎｉ、など、１９９２、ＭｏＩ参照。細胞は、６：１に深く探る。特定の実施例で、増幅が増幅のためのＴａｑ  ＤＮＡリガーゼを使用して実行されることもできることが予期される。Ｂａｒａｎｙ  １９９１（会報Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８９）参照。そのような場合、完璧なマッチが３つ時にある場合だけ、ライゲーションは発生する―５´シーケンスの終点（増幅の有無を探すことによって特定のサイトで周知の突然変異の存在を検出することを可能にする）。
【０３１５】
ＰＣＲおよびゲノムＤＮＡのためのシークエンシング方法：チロシンキナーゼ・エキソンおよびフランキング・イントロン・シーケンスは、３８４―ウェルの特定のプライマが入れ子にされたＰＣＲ準備をフォーマット化することを使用して増幅されることができる。各ＰＣＲ反応は、１０ｕＬ反応ボリュームの５ｎｇのＤＮＡ、ＩＸ  ＨｏｔＳｔａｒ  Ｂｕｆｆｅｒ、０．８ｍＭのｄＮＴＰｓ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２Ｕ  ＨｏｔＳｔａｒ  Ｅｎｚｙｍｅ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）および０．２ｕＭ前方及び後方のプライマを含む。ＰＣＲ循環パラメータは、以下の通りである：
１５分間の１サイクルの９５度Ｃ、２０秒間の３５サイクルの９５度Ｃ、３０秒間の６００Ｃおよび１分（３分間の７２０Ｃの１つのサイクルが続く）間の７２度Ｃ。結果として生じるＰＣＲ製品は、汎用Ｍｌ  ３下塗りを有する双方向性染料―ターミネータ蛍光シークエンシングが続く固相可逆固定化化学によって精製される。シークエンシング断片は、キャピラリー電気泳動法を使用しているＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（印加Ｂｉｏｓｙ茎、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を介して検出される。ＰＣＲおよびシークエンシングは、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）によって実行される。
【０３１６】
ＥＧＦＲ突然変異
ゲフィチニブへの著明な反応をもつ患者からのＣＴＣサンプルは、本質的事項がこの種の患者に存在する腫瘍のこの成育因子の信号を送っている経路によって役割を演じたことを示しているＥＧＦＲ１の突然変異を収容しているかもしれない。この種の突然変異を探すために、ＥＧＦＲの細胞外の領域の中の再編成はテストされることができる。そして、膠腫に特徴的である。この種の再編成が検出されない場合、全てのコード領域は個々のエキソンのＰＣＲ―増幅を使用して配列決定されることができる。ヘテロの突然変異は、アミノ酸７４６―７５０（ｄｅｌＥ７５６―Ａ７５０）７４７〜７５０（ｄｅｌＬ７４７―Ｔ７５１）および７４７〜７５２（ｄｅｌＬ７４７―Ｐ７５３）を取り除いているインフレーム削除を含むことができる。後の２つの削除は、削除限界点で新しいコードンの生成から生じているセリン残基の挿入と関係している。更なる突然変異は、エキソン２１の中でアミノ酸置換を含むことができる：コードン８５８（Ｌ８５８Ｒ）のアルギニンに対するロイシンおよびコードン８６１（Ｌ８６１Ｑ）のグルタミンに対するロイシン。Ｌ８６１Ｑ突然変異は特に興味がある。−その理由は、次のことにある。マウスｅｇｆｒ遺伝子の同じアミノ酸変化はＤａｒｋ  Ｓｋｉｎ（ｄｓｋ５）特徴（変えられたＥＧＦＲシグナリングと関連した）の原因となる。キナーゼドメインのミスセンス突然変異は、エキソン１８（Ｇ７１９Ｃ）の中で、コードン７１９でシステイン置換に結果としてグリシンになることができる。
【０３１７】
突然変異が含む相加、ｄｅｌＬ７４７―Ｐ７５３およびｄｅｌＥ７４６―Ａ７５０。
（２２５３＿２２７６  ｄｅｌ）削除は、先に述べたエキソン１９削除に重なる。
削除は、２つのグループのうちの１つに分類されることができる：最低限（アミノ酸配列ＬＫＥ）のそれらの橋を架けているコードン７４７―７４９およびそれらの橋を架けているコードン７５２―７５９。１９の削除が現在まで報告したすべてのエキソンの分析は、多種多様なアミノ酸がコードン７４７―７５９にわたっているＴＫ領域から削除されることができることを示唆する。削除されるコードンは、必要な共有地であるために現れない。
【０３１８】
他の実施態様において、ＥＧＦＲ（エキソン１８―２４およびフランキング・イントロン地方）のキナーゼドメインは、一組の個々の入れ子にされたＰＣＲ法（ＰＣＲ）反応において増幅される。入れ子にされたＰＣＲ詳しい説明において使用するプライマは、下塗り（５１のｔｇｔａａａａｃｇａｃｇｇｃｃａｇｔ）の５´端への汎用シーケンスの追加に関して記載されている。ＰＣＲ製品は、染料―ターミネータ・シークエンシングによって二方向に直接配列決定されることができる。ＰＣＲは、１５ｕｌ含んでいる５ｎｇのゲノムＤＮＡ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．７５ｕｌ  ＤＭＳＯ５  １  Ｍ  Ｂｅｔａｉｎｅ、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、２０ｐｍｏｌのプライマ、０．２ｕｌ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄの量の３８４―ウエルプレートにおいて実行されるそして、ＩＸは、緩衝する（ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄを供給される）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。熱サイクル状況は、以下の通りである：１０分間の９５度Ｃ；３０秒間の９５０Ｃ、３０秒間の６００Ｃ、３０サイクルのための１分間の７２度Ｃ；そして、１０分間の７２度Ｃ。ＰＣＲ製品は、Ａｍｐｕｒｅによって精製される磁気Ｂｅａｄｓ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）。配列決定産物は、Ｃｌｅａｎｓｅｑ＝Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）を用いて純化されて、ＡＢＩ３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上のキャピラリー電気泳動法によって切り離される。配列分析は、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（ＳｏｆｔＧｅｎｅｔｉｃｓ、Ｓｔａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ、ＰＡ）によって、そして、手動で２人の論評家によって実行される。非同義のＤＮＡの塩基配列異型は、最初のゲノムＤＮＡサンプルの３―５の独立ＰＣＲ反応の分析によって確認される。制御または標準試料は、シーケンス変化が、豊かなＣＴＣを介して、腫瘍組織に特有であるかまたはｃｏｎｓｉｔｕｔｉｖｅであるか背景異型であるかどうか決定するために分析される。
【０３１９】
ＥＧＦＲの付加的なエキソン２〜２５は、ＣＴＣにおいて検出されることもできる。
例えば、ゲノムＤＮＡのエキソン・シークエンシングでＥＧＦＲのミスセンスおよび欠失突然変異がみられる。そして、それは通常キナーゼドメインのエキソン１８〜２１の中で発生する。シーケンス変更は、腫瘍ＤＮＡの異種接合体でもよい；いずれの場合においても、同じ患者からの対正常はい組織は野生型シーケンスを有する。そして、突然変異が起源において身体であることを確認する。置換突然変異の若干の実施例は、Ｇ７１９ＳおよびＬ８５８Ｒである。「Ｇ７１９Ｓ」突然変異は、セリンに位置７１９でグリシン（Ｇ）を変える。これらの突然変異は、領域またはＰ環を結合していて、それぞれ、活性化ループの非常に節約されたＤＦＧのモティーフと隣接しているヌクレオチド三燐酸のＧＸＧＸＸＧのモティーフに位置する。変異する残基はすべてのプロテインキナーゼにおいてほとんど不変量不変である、そして、Ｂ―Ｒａｆタンパク質セリンスレオニンキナーゼの類似した残基（Ｇ４６３およびＬ５９６）は結腸直腸ものにおいて変異する体細胞性、卵巣性および肺癌腫である。
【０３２０】
複数の欠失突然変異の例としては、ＥＧＦＲのキナーゼドメインの中でコードン７４６〜７５９にわたっている領域において集まっているそれらが挙げられる。例えば、ＥＧＦＲコードン７４６〜７５０を除去していて、いずれのヌクレオチド２２３５または２２３６（ＤｅＩ―Ｉ）からも始まっている２つの重なり１５―ヌクレオチド欠失のうちの１つ。他の腫瘍からのＥＧＦＲ  ＤＮＡは、コードン７５２〜７５９（ｄｅｌ―２）の削除に導いているヘテロの２４―ヌクレオチドのすきまを示した。
【０３２１】
我々は、次に１１９のＮＳＣＬＣ腫瘍の完全なコレクションのＥＧＦＲのエキソン２〜２５を検討した。ゲノムＤＮＡのエキソン・シークエンシングで、合計１６の腫瘍（キナーゼドメインのエキソン１８〜２１の中の全て）のＥＧＦＲのミスセンスおよび欠失突然変異がみられた。このグループのＡＵシーケンス変更は、腫瘍ＤＮＡの異種接合体であった；いずれの場合においても、同じ患者からの対正常はい組織は野生型シーケンスを示した。そして、突然変異が起源において身体であることを確認した。それぞれ、置換突然変異Ｇ７１９ＳおよびＬ８５８Ｒは、２つおよび３つの腫瘍において検出された。「Ｇ７１９Ｓ」突然変異は、セリン（Ｓ）に、位置７１９でグリシン（Ｇ）を変える。これらの突然変異は、領域またはＰ環を結合していて、それぞれ、活性化ループの非常に節約されたＤＦＧのモティーフと隣接しているヌクレオチド三燐酸のＧＸＧＸＸＧのモティーフに位置する。
【０３２２】
付加的な欠失突然変異は、ＥＧＦＲのキナーゼドメインの中でコードン７４６〜７５９にわたっている領域においてクラスター形成した。１０の腫瘍は、ＥＧＦＲコードン７４６〜７５０を除去していて、いずれのヌクレオチド２２３５または２２３６からも始まっている２つの重なり１５―ヌクレオチド欠失のうちの１つをもたらした。２つの他の突然変異は、ＥＧＦＲ突然変異Ｇ８５７ＶをＡｃｕｔｅ  Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ（ＡＭＬ）および転移性肉腫のＥＧＦＲ突然変異Ｌ８８３Ｓに含む。「Ｇ８５７Ｖ」突然変異はバリン（Ｖ）によって置換される位置８５７でグリシン（Ｇ）を有する。その一方で、「Ｌ８８３Ｓ」突然変異はセリン（Ｓ）によって置換される位置８８３でロイシン（Ｌ）を有する。ＥＧＦＲの突然変異は、いくつかの腫瘍型で生じることができる、このように、本願明細書において方法で概説されるように、ＣＴＣを豊かにして／選択することは、それがそうするＥＧＦＲインヒビターの選択に、判定を見込むこの種の突然変異を収容している患者の治療において有効である。これが、ＮＳＣＬＣ．以外の腫瘍型を処理して、例えば、例えばキナーゼ・インヒビター、チロシンキナーゼ・インヒビター・ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ＝として市場に出される）エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ＝として市場に出される）などの使用を拡大するさらに、１つの一団対もう一方に示すより高い反応については、ＥＧＦＲ突然変異は、チロシンキナーゼ・インヒビター・ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ＝）への反応の特異な患者特性を有する著しい相関を示すことができる。特異な患者特性の実施例は喫煙者、ｎｏｎ―喫煙者、性交、年齢、レースを含む、そして、慢性病患者対空気暴露汚染対でない鋭い。
【０３２３】
上記の本発明の方法は、上皮細胞および癌に限られていなくて、むしろ、いかなる状態も診断するために用いることができる。本発明の方法を用いて診断されることができる典型的な状況は、血液学的状況、炎症性の状況、虚血性の状況、腫瘍性の状況、感染症、外傷、子宮内膜症および腎不全である（Ｔａｋａｈａｓｈｉその他を参照、例えば、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．５：４３４―４３８の（１９９９）Ｈｅａｌｙなど、Ｈｕｍ。Ｒｅｐｒｏｄ．最新版４：７３６―７４０の（１９９８）およびＧｉｌｌなど（Ｃｉｒｃ）。Ｒｅｓ．  ８８：１６７−１７４  （２００１））．腫瘍性の状況は、急性リンパ芽球性白血病、急性であるか慢性ｌｙｍｐｈｏｃｙｃｔｉｃなまたは顆粒球腫瘍、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、腺癌、アデノーマ、副腎癌、基底細胞癌、骨癌、脳ガン、乳癌、気管支癌、子宮頸部異形成、慢性骨髄性白血病、大腸癌、類表皮癌、ユーイング肉腫、胆嚢癌、胆石腫瘍、巨細胞腫、神経グリア芽細胞腫マルチ形、有毛細胞腫瘍、頭の癌、過形成、増殖性炎角膜神経腫瘍、元の位置の癌、腸の神経節細胞腫、島細胞腺腫、カポシ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、平滑筋母腫瘍、肝癌、肺癌、リンパ腫、悪性カルチノイド、悪性高カルシウム血症、悪性黒色腫、ｍａｒｆａｎｏｉｄ体質腫瘍、髄様癌、転移性皮膚癌、粘膜神経腫、真菌症ｆｕｎｇｏｉｄｅ、骨髄異形成症候群、ミエローマ、首癌、神経組織癌、神経芽細胞腫、骨原性肉腫、骨肉腫を含む、卵巣腫瘍、膵臓癌、副甲状腺癌、褐色細胞腫、真性多血症、主要な脳腫瘍、前立腺癌、直腸癌、腎臓細胞腫瘍、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、精上皮腫、皮膚癌、小細胞肺腫瘍、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃癌、甲状腺癌、局所皮膚病変、ｖｅｔｉｃｕｌｕｍ細胞肉腫およびＷｉｌｍの腫瘍。実施例において、甲状腺癌を伴う新生細胞は、検出せずである。患者（例えば５０ｍＬ未満、４０ｍＬ、３０ｍＬ、２０ｍＬまたは１０ｍＬのさえサンプル）からとられる細胞サンプルは、興味があるいかなる細胞（例えば珍しい細胞）においても豊かにされるサンプルを生じるために、本発明の装置によって処理されることができる。強化試料のこの細胞の検出で、それから当業者は患者の特定の状態の有無を診断することができることができる。さらにまた、サンプルの細胞（例えば血管内皮細胞に対する癌細胞）の数の比率の測定は、診断を生成するために用いることができる。あるいは、癌生物マーカ（例えば表１にリストされるそれらのいずれか）の検出または癌（例えば表１にリストされるいかなる標識もｅｎｏｄｉｎｇしている核酸）に関連する核酸は、結果として癌または他の状態の診断になることができる。例えば、発現量の分析またはこの種のポリペチドまたは核酸（例えば細胞表面マーカ、ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡまたはマイクロ・リボゾームリボ核酸）のパターンは、結果として診断になることができる。
【０３２４】
患者を診断するために、細胞検出は、他の情報（例えば患者のイメージング研究）と結合されることができる。例えば、計算された軸性の断層撮影、ポジトロン放出断層撮影または磁気共鳴画像が、使われることができる。
【０３２５】
診断は、特定の状態と関連した細胞パターンを使用してなされることもできる。
例えば、強化試料（例えば１２ミクロンより大きい水力学的サイズを有する細胞を含んでいるサンプル）の細胞の粒度分布を状態（例えば癌）に関連した粒度分布と比較することによって、診断は、この比較に基づくようにされることができる。比較のＡ細胞ひな型は、いかなる方法によっても発生することができる。例えば、関連研究は複数の対照被検者（例えば５０）および興味がある状態を有する複数のケース主題（例えば５０）からのどの細胞サンプルが処理されるかについて実行されることができる、例えば、１２ミクロンより大きい水力学的サイズを有する細胞を濃縮することによって、結果サンプルは分析される、そして、分析の結果は比較される。この種の研究を実行するために、強化細胞のリボゾームリボ核酸レベル（例えばメッセンジャーＲＮＡまたはマイクロ・リボゾームリボ核酸レベル）を分析することは、役立ってもよい。あるいは、いずれの場合においても濃縮される細胞の数を計数するか、または顕微鏡、細胞カウンタまたはマイクロアレイ装置を用いて細胞粒度分布を、例えば、決定することは、役立つ。特定の細胞型（例えば珍しい細胞）の存在は、確認されることもできる。
【０３２６】
一旦薬物療法が患者に与えられると、本発明の方法を使用している薬物療法の有効性を決定することは可能である。例えば、薬物療法（寛容な（と）同時にからとられるかまたは薬物療法に続く一つ以上の細胞サンプルと同様に）の前に患者からとられる細胞サンプルは、本発明の方法を使用して処理されることができる。各被処理サンプルの分析の結果を比較することによって、１は、薬物療法の有効性を決定することができる。例えば、他の細胞から、パワー系統は、１２ミクロンより大きい水力学的サイズを有する細胞または６ミクロンおよび１２ミクロン以下以上の水力学的サイズを有する細胞を濃縮するために用いることができる。上記の他のいかなる検出または分析も（例えば存在の識別または特定の細胞型の量）実行されることができる。
【０３２７】
試料動員装置を使用する方法
本発明の試料動員装置は、サンプルからＣＴＣまたは他の細胞を濃縮するために用いることができる。実施例において、例えば、細胞サンプルは、試料動員装置に置かれる
以下を含む装置：容器、職能化された表面を有する蓋、そして、サンプルｍｏｂｉｌｉｚｅｒ。サンプルを含んでいる容器はそれから蓋でおおわれている、サンプルｍｏｂｉｌｉｚｅｒはサンプルを起動させるために使用される、そして、蓋は取り外される。この種の装置は、関心のＣＴＣまたは他の細胞を濃縮するために用いることができる。
【０３２８】
試料動員（例えば遠心）の任意型は、適用されることができる。すなわち公知技術のいかなる遠心力場（例えばｌＯＯｇおよび１０Ｏ５ＯＯＯｇ間の遠心力場）も、適用されることができる。例えば、遠心力場が、ｌ，０００ｇおよび１０，０００ｇの間にあることができる。この分野のアプリケーションは、結果としてサンプル上の遠心力になる。
付加的な力は、例えば、力を遠心力に印加されることもできる；さらに、力は繰り返し印加されることができる、そして、交替で、各々のアプリケーション間の任意の時間的間隔については、強制する。
【０３２９】
一般の考慮すべき問題
一般の考慮すべき問題Ｓａｍｐｌｅｓは、浄化（例えば特定の構成要素の安定化および除去）の有無にかかわらず本願明細書において記載されている方法で使用されることができる。若干のサンプルは、装置に希釈されることができるかまたははじめにの前に集中されることができる。
【０３３０】
実施例において、試薬はサンプルに加えられる、サンプルの中の粒子の水力学的寸法は選択的に、または、非選択的に増加する。この改質試料は、それから障壁配列を通してポンプ圧送される。粒子がふくらんで、増加した水力学的サイズを有するので、より大きいおよびより容易に製造された間隙の大きさを有する障壁配列を使用することは可能である。好ましい実施例において、膨張およびサイズ・ベースの強化のステップは、装置上の統合化方法で実行される。好適な試薬には、いかなる低張液（例えば脱イオン水、２％の糖溶液）もまたは整然とした非水溶溶媒が含まれる。他の試薬はビード（例えばマグネチックまたはポリマー）が選択的に非常に結合する（例えば、抗体またはアビジン―ビオチンによって）ことを含むまたは、非選択的に。
【０３３１】
もう一つの実施例では、試薬はサンプルに加えられる。そして、サンプルの中の粒子の水力学的寸法は選択的に、または、非選択的に減少する。サンプルの粒子の不均一性減少は、粒子との間に水力学的サイズの違いを増加させる。例えば、有核細胞は、細胞を縮小しているハイパー持続性によって、除核細胞から切り離される。除核細胞は非常に小さい粒子に縮小することができる。その一方で、有核細胞は核の寸法以下で縮むことができない。典型的な収縮試薬には、高張液が含まれる。
【０３３２】
代替実施形態では、親和性はビードを職能化した、そして、他の適当なビードはサンプルに存在する他の粒子と関連して興味がある粒子の量を増加させるために用いる。それによって、より大きいおよびより容易に製造された間隙の大きさを有する障壁配列の動作を考慮に入れた。
【０３３３】
流体は、能動的に、または、受動的に、装置に通されることができる。流体は、電界、遠心力場、圧力駆動流動、電気浸透流および毛管作用を使用して汲み出されることができる。他の好ましい実施形態では、分野の平均方向は、配列を含む通信路の壁と平行である。
【０３３４】
試料調整
Ｓａｍｐｌｅｓは、操作（例えば特定の構成要素の安定化および除去）の有無にかかわらず本願明細書において記載されている方法で使用されることができる。
実施例において、サンプルは、装置への本発明の導入の前に、関心のＣＴＣまたは他の細胞において豊かにされる。菌体群を豊かにする方法は技術（例えば親和性機構、アグルチネーション）において公知である、そして、サイズ、形状および変形能は強化の基礎を形成した。興味がある細胞のサンプルを豊かにする典型的な方法は、米国特許番号５，８３７，１１５および５，６４１，６２８（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ出版物数字ＷＯ  ２００４／０２９２２１およびＷＯ  ２００４／１１３８７７）およびＵ．Ｓ．公開番号２００４／０１４４６５１で見つかる。
【０３３５】
実施例１
本発明のミクロな液体の装置は、ＣＡＤ（ＣＡＤ）によって設計されて、写真平版によって微細作製された。二段法は、血液サンプルが小細胞の大集団を取り除くために非かさばって最初にいずれであるかについて開発された、そうすると、珍しい目標上皮細胞的状赤血球は、免疫親和性捕獲によって回復される。装置は、写真平版によって定義されて、ＣＡＤ―生成の設計に基づいてシリコン基板にエッチングされた。細胞強化モジュール（それはほぼ標準顕微鏡スライドの寸法である）は、一般のサンプルおよび緩衝入口および製品に接続して、放出口を浪費するチャネルを扱っている１４の平行したサンプル処理セクションおよび付随するサンプルを含む。各断面は、生成物流により大きな細胞の置換を経て水力学的サイズによって的状赤血球タイプを豊かにするために最適化される微細作製された障壁の配列を含む。この例では、マイクロチップは、赤血球（ＲＢＣ）および血小板をより大きい白血球およびＣＴＣから切り離すように設計されていた。的状赤血球の豊かな人口は、装置を通過する全血液から取り戻された。細胞強化マイクロチップのパフォーマンスは、ＲＢＣおよび血小板を通常の全血液（図５２）の白血球（ＷＢＣ）から切り離すことによって評価された。癌患者において、ＣＴＣは、より大きいＷＢＣ分数で見つかる。血液は最小限薄められた（３０％）そして、６ｍｌのサンプルは最高６ｍｌ／時間の流速で、処理された。製品および廃液流はＣｏｕｌｔｅｒモデル「Ａｃ―Ｔ  ｄｉｆｆ」臨床面血液アナライザで評価された。そして、それは自動的に区別して、糊付けして、異なる血液菌体群を計数する。強化チップは、ＷＢＣからＲＢＣの分離を成し遂げた、  そこにおいて、ＷＢＣ分数は、有核細胞の＞９９％保持を有した、＞ＲＢＣの９９％の減少および血小板の＞９７％減少。これらの細胞分画の代表的なヒストグラムは、図５３に示される。ルーチン細胞学は、ＷＢＣおよびＲＢＣ分数（図５４）の高い濃縮効果を確認した。
【０３３６】
次に、上皮細胞は、固定された抗体によって職能化されるｍｉｃｒｏｆｉｕｉｄｉｃなモジュールの親和性捕獲によって回復された。抗体コートの微細作製された障壁の規則的配列構造を含んでいる単一の室を有する捕獲モジュールは、設計された。これらの障壁は、４倍に、そして、細胞および固定された抗体との間に接触時間を増加させるための障害に隣接して層流の下で細胞の流れを遅らせることによってほぼ受波実効面積を増加させることによって細胞捕獲を最大にするために配置されている。捕獲モジュールは、細胞を損害から保護するために、低い剪断以外の比較的高い移動比の状態の下で、作動されることができる。捕獲モジュールの表面は１０％のシラン、０．５％のｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈｙｄｅおよびアビジンを有する経時的な処理によって職能化された。そして、ビオチン化された反ＥｐＣＡＭが続いた。活性サイトは、ＰＢＳの３％のウシ血清アルブミンによって防がれて、薄いトリスＨＣｌによって消光されて、希釈したＬ―ヒスチジンによって安定した。モジュールは、各段階の後、ＰＢＳで洗われて、最後に乾燥して、室温で、格納された。捕獲パフォーマンスは、ヒト高度な肺癌細胞系ＮＣＩ―Ｈ１６５０（ＡＴＣＣ数品種相似係数―５８８３）によって測定された。この細胞系は、それがゲフィチニブに影響されやすくなるＥＧＦＲのエキソン１９のヘテロの１５の塩基対インフレーム削除を有する。集密的な培養組織からの細胞は、トリプシンによって収集された、不可欠な染料で着色するセル・トラッカーＯｒａｎｇｅ（ＣＭＲＡ試薬、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）（新しい全血液において再懸濁されて、さまざまな移動比でミクロな液体のチップにおいて分別される）。これらの最初の実現可能性実験において、細胞懸濁液は、赤血球を非かさばらせるために、細胞強化モジュールの従来の分画のない捕獲モジュールで、直接処理された；それ故、サンプル流は、腫瘍細胞と同様に通常の血液赤血球および白血球を含んだ。細胞が捕獲モジュールで加工されたあと、装置は非特異的に縛られた細胞を除去するためにより高い移動比（３ｍｌ／時間）でバッファによって洗われた。接着性上部は取り除かれた、そして、接着細胞はパラホルムアルデヒドを有するチップに取り付けられて、蛍光顕微鏡法によって観察された。細胞回復は、血球計算板カウントから算出された；代表的な捕獲結果は、表４に示される。非分画性血液を有する還元研究の初期収率は、５％未満の非特異的締め具を有する６０％より大きかった。
【０３３７】
【表４】
2008538282.tif 000021
【０３３８】
つぎに、全血液に釘で打ちつけられて、上記の通りにサイズ分画および親和性捕獲によって復帰したＮＣＩ―Ｈ１６５０細胞は、元の位置にうまく分析された。
上皮細胞と白血球を区別するために試験において、フルオレセインのラベルが付いたＣＤ４５パン白血球単クローン抗体の原液の０．５ｍｌは、捕獲モジュールに通過して、３０分間の室温で暖められた。モジュールは解放された抗体を除去するためにバッファによって洗われた、そして、細胞は１％のパラホルムアルデヒドを有するチップに取り付けられて、蛍光顕微鏡法によって観察された。図５５に示すように、上皮細胞は、捕獲モジュールの障壁および床行きだった。ＣＤ４５パン白血球抗体を有する流通通路の背景染色は見える。そして、明らかに非特異的捕獲の低次のため、そのことはいくつかの着色された白血球である。
【０３３９】
実施例２：
装置実施例本発明の好適な装置実施例のための計画は図５７Ａに示される、そして、この設計を伴う３つの好適な装置実施例に対応するパラメータは図５７Ｂに示される。
これらの実施例は、特に血液から濃縮上皮細胞に役立つ。
【０３４０】
実施例３：
非上皮細胞タイプＵｓｉｎｇのためのカウントを決定する本発明の中で方法、１は、ＣＴＣまたは他の上皮細胞以外の細胞型を計数することに基づいて、診断をすることができる。癌の欠如、存在または進行の診断は、特定の区分のサイズより大きい細胞サンプルの細胞の数に基づいてもよい。例えば、１４ミクロン以上の水力学的サイズを有する細胞は、選択されることができる。この区分のサイズは、大部分の白血球を除去する。これらの細胞の性質は、それから下流の分子であるか細胞学的分析で測定されることができる。
【０３４１】
分析にとって有用である上皮細胞以外の細胞型は、疾病状態を表す血管内皮細胞、内皮の始原細胞、子宮内膜細胞または栄養芽層を含む。さらにまた、上皮細胞（例えば癌細胞および他の細胞型）のための別々のカウントを決定して、例えば、血管内皮細胞（上皮細胞の数および他の細胞型の数との間に比率の測定が続く）は、役立つ診断情報を提供することができる。
【０３４２】
図３３  Ａ―Ｄに示すように、本発明の装置は、上記のそれらのような細胞の目標とされた亜細胞を分離するように構成されることができる。大部分の自国の血液細胞が、赤血球、白血球および血小板を含んで、無駄へと流れるように、Ａ判分離は選択されることができる。その一方で、非本来の細胞（それは血管内皮細胞、内皮の始原細胞、子宮内膜細胞または栄養芽層を含むことができる）は強化試料において集められる。この強化試料は、更に分析されることができる。
【０３４３】
本発明の装置を用いて、従って、サイズに基づいて細胞の亜細胞を血液または他の身体の流体から分離することは可能である。そして、それは便利に、大きい細胞型が目標とされるかなりの自国の血液細胞の除去を考慮に入れる。図５６にて模式的に示すように、本発明の装置は強化試料の細胞の数を決定するために計数手段を含むことができる、または、豊かなサンプルの中で、特定のタイプ（例えば癌細胞）の細胞の数および強化試料の細胞の更なる分析は診断であるか他の目的に役立つ付加的情報を提供することができる。
【０３４４】
実施例４：
ＥＧＦＲ突然変異の検出のための方法
癌患者から血液サンプルは、結果として上皮細胞を含んでいるＣＴＣの豊かなサンプルになって、装置および本発明（例えば実施例１のそれら）の方法を使用して処理されて、分析される。
このサンプルは、それから、潜在的ＥＧＦＲ突然変異を確認するために分析される。
方法は、新しい突然変異の発見と同様に周知の、臨床的に関連したＥＧＦＲ突然変異の両方の識別ができるようにする。
このプロセスの概要は、図５８に示される。
下記は、検出に対する戦略の概略およびＥＧＦＲ突然変異の確認である：
１）  血液サンプルからシーケンスＣＴＣ  ＥＧＦＲメッセンジャーＲＮＡ  ａ）精製ＣＴＣ；
ｂ）  ＣＴＣから完全リボゾームリボ核酸を浄化する；
ｃ）  リボゾームリボ核酸を相補ＤＮＡを使用しているリバーストランスクリプターゼに変換する；
ｄ）  シークエンシング・テンプレートを生成するための第１および第２のＰＣＲ反応を実行するために、結果として生じる相補ＤＮＡを使用する；
そして、
ｅ）  入れ子にされたＰＣＲアンプリコンおよびシーケンスＥＧＦＲエキソン１８―２１に対するシークエンシング・テンプレートとしての用途を浄化する。
２）  ＣＴＣゲノムＤＮＡ  ａ）を使用しているリボゾームリボ核酸シーケンスが血液サンプルからＣＴＣを浄化することを確認する；
ｂ）  ＣＴＣからゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を浄化する；
ｃ）  エキソン１８、１９、２０および／またはＰＣＲ反応を経た２１を増幅する；
そして、
ｄ）  リボゾームリボ核酸シークエンシングを介して発見される突然変異の連続を確認するために、リアルタイム定量的アレレに特有のＰＣＲ反応の結果として生じるＰＣＲアンプリコンを使用する。
【０３４５】
上で概説される各ステップに関する詳細は、以下の通りである。
【０３４６】
１）  血液サンプルからシーケンスＣＴＣ  ＥＧＦＲメッセンジャーＲＮＡ
ａ）精製ＣＴＣ。
ＣＴＣは、本発明のサイズ・ベースの濃縮および／または親和性浄化装置のいずれかを使用して分離される。
【０３４７】
ｂ）  ＣＴＣから完全リボゾームリボ核酸を浄化する。
完全リボゾームリボ核酸は、それから、例えば、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏ  ＲＮｅａｓｙキットまたは他の製造業者からの類似の全体のリボゾームリボ核酸浄化プロトコルを使用している単離されたＣＴＣ人口から浄化される；あるいは、石炭酸／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿が続くグアニジウム・イソチオシアネート・ホモジナイゼーションのような標準リボゾームリボ核酸浄化プロトコルが、使われることができる。そのような方法は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｅ．Ｆ）によって、「分子Ｃｌｏｎｉｎｇ  ―  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓｅｃｏｎｄエディション）  ―  」（１９８９）に記載されている。ＦｒｉｔｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（７．２４ページ）。
【０３４８】
ｃ）  相補ＤＮＡを使用しているリバーストランスクリプターゼに対するリボゾームリボ核酸を変換する。相補ＤＮＡ反応は、リバーストランスクリプターゼの供給元のプロトコルに基づいて実施される。概して、相補ＤＮＡ反応への入力リボゾームリボ核酸の量は、２マイクログラム（μｇ）の完全リボゾームリボ核酸に、１０ピコグラム（ｐｇ）の範囲である。第１の索ＤＮＡ合成は、ランダムな７ｍｅｒ  ＤＮＡプライマの雑種を作ることによって実施される、または、乏チミジン・プライマまたは遺伝子に特有のプライマは、リボゾームリボ核酸テンプレートに６５０Ｃで氷上のｓｎａｐ―冷凍によって続いた。相補ＤＮＡ合成は、適当な酵素反応バッファとともに他の商業的なベンダーからｉＳｃｒｉｐｔ逆Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＢｉｏＲａｄ）またはＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（インビトロゲン）の加算またはリバーストランスクリプターゼによって始められる。ｉＳｃｒｉｐｔのために、リバーストランスクリプターゼ反応は、３０―４５分間の４２０Ｃで実施される。そして、８５０Ｃで５分間の酵素失活が続く。相補ＤＮＡは、格納される―使用まで２Ｏ０Ｃ、または、ＰＣＲ反応においてすぐ使用する。概して、相補ＤＮＡ反応は最終的な２０マイクロリットル量において実施される、そして、結果として生じる相補ＤＮＡの１０％（２マイクロリットル）が次のＰＣＲ反応において使われる。
【０３４９】
ｄ）  創成シークエンシング・テンプレートのための第１および第２のＰＣＲ反応を実行する結果として生じる相補ＤＮＡを用いる。リバーストランスクリプターゼ反応からの相補ＤＮＡは、関心領域（図５９）に特有のＤＮＡプライマを混ぜ合わせられる。エキソン１８―２１の増幅のために用いられることができるプライマーセットについて、表５を参照する。表５において、プライマ設定されたＭ１３（＋）／Ｍ１２（）がＭｌ  ｌ（＋）／Ｍ１４（−を課されるプライマに内であること）。プライマＭｌ  １（＋）およびＭ１４（）が展開の第１の回において使われる場合、このように、プライマＭ１３（＋）およびＭ１２（）が増幅の入れ子にされた回において使われることができる。同様に、プライマ設定されたＭｌ  ｌ（＋）／Ｍ１４（）は、Ｍｌ  ５（＋）を課されるプライマに内である／Ｍｌ  ６（）そして、プライマ設定されたＭ２３（＋）／Ｍ２４（）は、Ｍ２１（＋）／Ｍ２２（−を課されるプライマに内である）。熱いＳｔａｒｔ  ＰＣＲ反応はＱｉａｇｅｎ  Ｈｏｔ―Ｓｔａｒ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキット（またはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＴａｑＭａｎ  ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）または他のＨｏｔ  Ｓｔａｒｔ耐熱性ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用して実行される、または、ホットスタートを使用しているプロメガなしで、ＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは混合物、ＴａｑＭａｎ  ＤＮＡポリメラーゼまたは他の耐熱のＤＮＡポリメラーゼをマスターする。概して、反応体積は５０マイクロリットルである、ヌクレオチド三燐酸はヌクレオチドごとに２００μＭの終濃度に存在する、ＭｇＣｌ２は１―４ｍＭの終濃度に存在する、そして、ｏｌｉｇｏプライマは０．５μＭの終濃度である。ホットスタート・プロトコルは９５０Ｃで１０―１５分の培養から開始される。そして、１分（変質）間の９４０Ｃ、１分（アニーリング）間の５２０Ｃおよび１分（拡張）間の７２０Ｃの４０サイクルが続く。それらがＰＣＲで概数の第２（縮小の）のテンプレートとして使われるか、またはシークエンシングの前にＱｉａＱｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して純化されるまで、サンプルが４０Ｃで格納される前に、７２０ＣのｌＯ分入力端子拡張機構は実行される。ホットスタート・プロトコルが使われない場合、９５度Ｃの最初の培養は省略される。ＰＣＲ製品がＰＣＲの２回において用いられることになっている場合、最初のＰＣＲ製品の２マイクロリットル（４％）が２回反応のテンプレートとして用いられる、そして、同一の試薬濃度および循環パラメータが使われる。
【０３５０】
【表５】
2008538282.tif 000022
【０３５１】
ｅ）周辺の伸長ＥＧＦＲメッセンジャーＲＮＡのためにプライマＳｅｔｓ  Ｐｕｒｉｆｙ縮小のＰＣＲアンプリコン、そして、シーケンスＥＧＦＲエキソン１８―２１に対するシークエンシング・テンプレートとして使用。
シークエンシングは、蛍光ジデオキシヌクレオチド混合物を使用しているサンガー・スタイルのシークエンシング反応を経て発生するＡＢＩオートメーション化した蛍光シークエンシング機械および蛍光のラベルが付いたＤＮＡ塩基配列決定はしごによって実行される。ＰＣＲ製品は、他のベンダーから得られるＱｉａｇｅｎ  ＱｕｉｃｋＳｐｉｎ柱、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍまたはＰＣＲ製品浄化キットを使用して精製される。ＰＣＲの後、製品は精製されると、集中および純度がそうであるヌクレオチドがＮａｎｏｄｒｏｐ  ７０００分光光度計によって決定した、そして、ＰＣＲ製品濃度は２５ｎｇ／マイクロリットルの集中に至る。優良な抑制措置として、１．８より大きい紫外光吸光度比（Ａ２６ｏ／Ａ２８ｏ）を有するＰＣＲ製品だけが、シークエンシングのために用いられる。シークエンシング・プライマは、３．２ｐｍｏｌ／マイクロリットルの集中に至る。
【０３５２】
２）  ＣＴＣゲノムＤＮＡ  ａ）を使用しているリボゾームリボ核酸シーケンスが血液サンプルからＣＴＣを浄化することを確認する。
上のように、ＣＴＣは、本発明のサイズ・ベースの濃縮および／または親和性浄化装置のいずれかを使用して分離される。
【０３５３】
ｂ）  ＣＴＣからゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を浄化する。
ゲノムＤＮＡは、ｔｈｅ１  Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ  ｇＤＮＡキットまたは他の市販キットを用いて、または、以下のプロトコルで浄化される：
１．  細胞ペレットは、新たに溶解されるかまたは記憶される―８Ｏ０Ｃ、そして、細胞溶解の直前に解凍する。
２．  ５００マイクロリットルの５ＯｍＭトリスｐＨ  ７．９／１０ＯｍＭ  ＥＤＴＡ／０．５％ＳＤＳ（ＴＥバッファ）を加える。
３．＝０．５ｍｇ／ｍｌ最終版［ＰｒｏｔＫ］を生成して、１２．５マイクロリットルのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（ＩＢＩ５４０６、２０ｍｇ／ｍｌ）を加える。
４．  回転保育器の５５度Ｃ前夜に孵化する。
５．  ２０マイクロリットルのＲＮアーゼ・カクテル（５００ｕ／ｍｌのＲＮアーゼＡ＋２０，０００ｕ／ｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒ  ＲＮアーゼＴｌ、Ａｍｂｉｏｎ＃２２８８）を加えて、３７０Ｃで４時間を暖める。
６．Ｐｈｅｎｏｌ（コダック、ｐＨ  ８が平衡させたトリス）によって抽出して、混合物に振動して、卓上の遠心機の５分を回転させる。
７．  水相を新しい管へ転送する。
８．  石炭酸／クロロホルム／イソアミルアルコールを有する抽出物（ＥＭＤ、２５：
２４：１つの比率、ｐＨ  ８が平衡させたトリス）混じって、卓上の遠心機の５分を回転させるために、振動する。
９．  ５０マイクロリットルの３Ｍ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ＝６を加える。
１０．  ５００マイクロリットルのＥｔＯＨを加える。
１１．  混じるために、振動する。
沈殿するＤＮＡの列は、見えてもよい。
予想されたＤＮＡ濃度が非常に低い場合、キャリア・ヌクレオチド（通常イースト運搬ＲＮＡ）を加える。
１２．  卓上の遠心機の最大速度で、１分を回転させる。
１３．  上澄を取り除く。
１４．  ５００マイクロリットル７０％のＥｔＯＨ（室温（ＲＴ））を加える
１５．  混じるために、振動する。
１６．卓上の遠心機の最大速度で、１分を回転させる。
１７．  Ｔｅを加える前に、１０―２０分を空気乾燥する。
１８．  ４００マイクロリットルのＴｅにおいて再懸濁する。
１０分間の６５０Ｃで孵化する、そして、Ｎａｎｏｄｒｏｐ上の定量化の前に終夜ＲＴで去る。
【０３５４】
ｃ）  エキソン１８、１９、２０および／またはＰＣＲ反応を経た２１を増幅する。
ホットスタート入れ子にされたＰＣＲ増幅はステップＩｄで先に述べた通りに行われる。但し、次の場合は除く−増幅の入れ子にされた回がない。
最初のＰＣＲステップは、増幅の間、ａｌｌｅｌｅ―特殊情報の可能な損失を最小化するために、対数期の間、停止されることができる。
ＥＧＦＲエキソン１８―２１の展開のために使用するプライマ・セットは、表６（また、Ｐａｅｚその他を参照、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４：１４９７―１５００（補助機材）（２００４））にリストされる。
【０３５５】
【表６】
2008538282.tif 000023
【０３５６】
ｄ）Ｕｓｅ、リアルタイム定量的ａｌｌｅｌｅ―に特有のＰＣＲ反応の結果として生じるＰＣＲアンプリコンは、リボゾームリボ核酸シークエンシングを介して、突然変異の連続を確認するために発見した。ＰＣＲアンプリコンのアリクォットが、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ  ５´を使用している多重化アレレに特有の定量的ＰＣＲ反応のテンプレートとして使われるＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを有するヌクレアーゼ分析は、７５００台のＲｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ機械（図６０）をモデル化する。ＰＣＲのこの円は、興味がある各突然変異に特有の最初のＰＣＲ製品の亜区を増幅する。Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲのまさしくその高感度を与えられて、わずか１０のＣＴＣが分離される場合であっても、それはＥＧＦＲ遺伝子の突然変異状態上の完全情報を得るために可能である。
本当のＴｉｍｅ  ＰＣＲは、入力ＤＮＡ濃度の８つのログの上の対立形質のシーケンスの定量化を提供する；このように、汚い人口のヘテロの突然変異さえ、この方法を使用して容易に検出される。
【０３５７】
プローブおよびプライマ・セットは、ＮＳＣＬＣ患者のゲフィチニブ反応に影響を及ぼすすべての周知の突然変異のために設計される、上記は、４０以上を含むこの種の体細胞突然変異、上記は、ポイントミューテーション、削除および挿入を（医学文献において報告された）含む。説明の便宜上、プライマの例およびポイントミューテーションのうちの５つのためのプローブ・セットは、表７にリストされる。一般に、野生型ＥＧＦＲ  ＤＮＡの塩基配列と突然変異対立遺伝子を区別するために最適化されるハイブリダイゼーション状況については、オリゴヌクレオチドは、プライマ最適化ソフトウエアプログラム始動用燃料注入装置急行（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して設計されることができる。ＥＧＦＲ突然変異（例えばＨ３５８（野生型）Ｈ１６５０（１５―塩基対削除、Δ２２３５―２２４９）およびＨ  １９７５）をもたらすことは公知である肺癌細胞系から増幅されるＥＧＦＲゲノムＤＮＡ（２つのポイントミューテーション、２３６９Ｃ：Ｔ、２５７３のＴ：Ｇ）は、アレレに特有のＲｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ反応を最適化するために用いる。
ＴａｑＭａｎを用いて５´ヌクレアーゼが試験すること、野生型配列のために、または、周知のＥＧＦＲ突然変異のために特有のアレレに特有の標識プローブは、開発される。
オリゴヌクレオチドは容易にマッチと不適当な組合せを区別する融解温度を有するように設計されている、そして、Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ状況は野生型および突然変異対立遺伝子を区別するために最適化される。すべてのＲｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ反応は、三通りにおいて実施される。
【０３５８】
まず最初に、野生型配列を含んでいる標識プローブは、単一の変異体プローブを有する同じ反応において多重送信される。１つの突然変異対立遺伝子シーケンス対野生型配列の比率として結果を表すことは、所与の突然変異を含んでいるかまたは欠如しているサンプルを確認することができる。状況がセットされるされた調査のために最適化されたあと、それは同じＲｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ分析の範囲内で所与のエキソンの中で突然変異対立遺伝子の全てのための複合プローブにそれから可能である。そして、臨床設定のこの分析ツールの使いやすさを増加させる。
【０３５９】
ユニークなプローブは、野生型アレレおよび突然変異対立遺伝子シーケンスごとに設計される。野生型シーケンスは、５´端の蛍光染料ＶＩＣおよび蛍光団ＦＡＭを有する変異体シーケンスという特徴がある。蛍光失活剤およびＭｉｎｏｒ  Ｇｒｏｏｖｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ部分は、プローブの３´端に取り付けられる。ＲＯＸが、正常化目的のための受動的な参照染料として使われる。標準曲線が、野生型配列のために発生して、相対的な定量化のために使われる。入力菌体群が未知の（そして、変更）純度の中であるにつれて、変異体信号の正確な定量化は必要とされない。ＡＢＩ製品文献によって述べられるように、分析は準備される、そして、突然変異対立遺伝子の調査からの信号が蛍光（図６１）の背景レベルにそびえるときに、突然変異の存在は確認される、そして、この閾値サイクルは入力サンプルの突然変異対立遺伝子の相対度数を与える。
【０３６０】
【表７】
2008538282.tif 000024
【０３６１】
実施例５：白血球のＥＧＦＲ表現の欠如
ＥＧＦＲが背景白血球においてでなく目標癌細胞において表される場合、実施例４のプロトコルは最も役立つだろう。ＥＧＦＲメッセンジャーＲＮＡが白血球に存在するかどうか検査するために、いくつかのＰＣＲ実験は、実行された。４つのプライマーセット（表８に示される）は、４つの対応する遺伝子を増幅するように設計されていた：
１）  ＢＣＫＤＫ（分枝鎖ａ―ｋｅｔｏａｃｉｄデヒドロゲナーゼ複合体キナーゼ）−全ての種類の細胞（白血球および腫瘍細胞のための正の制御）において表される「家事」遺伝子；
２）  ＣＤ４５−白血球（白血球のための正の制御および腫瘍細胞のための陰性対照）において、特に表される；
３）  ＥｐＣａＭ−上皮細胞（白血球のための陰性対照および腫瘍細胞のための正の制御）において、特に表される；
そして、
４）  ＥＧＦＲ−検討される目標メッセンジャーＲＮＡ。
【０３６２】
【表８】
2008538282.tif 000025
【０３６３】
１０６の白血球が１６５０セル、本発明（４マイクロメートル区分のサイズ）および５ｘｌＯ６  Ｈの細胞パワー系統を用いて分離したほぼ９ｘの表８Ｔｏｔａｌリボゾームリボ核酸は、ＲＮｅａｓｙミニ・キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて分離された。白血球およびＨｌから２マイクログラムの完全リボゾームリボ核酸は、６５０セル、２０マイクロリットルの反応の１００ｐｍｏｌのランダムな六量体（ロシュ）および２００のＵ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（インビトロゲン）を使用している第１の索相補ＤＮＡを得るために転写される後退であった。次のＰＣＲは、全体で混合の２５マイクロリットル、第１の索相補ＤＮＡ反応および１０ｐｍｏｌの前方及び後方のプライマの０．５マイクロリットルを用いて実施された。ＰＣＲは、２０秒間の９５０Ｃ、２０秒間の５６０Ｃおよび３０秒間の７Ｏ０Ｃの４０サイクル動いた。増幅産物は、１％のアガロースゲルに切り離された。図６２Ａに示すように、ＢＣＫＤＫが、６５０セル、白血球およびＨｌにおいて表されるとわかった；ＣＤ４５は、白血球だけにおいて表された；そして、ＥｐＣＡＭおよびＥＧＦＲは、Ｈ１６５０細胞だけにおいて表された。これらの結果（それは図６２Ｂに示されるＥＧＦＲ表現の側面に完全に合わせている）はＥＧＦＲが白血球および癌細胞を含む細胞の試金混合物の特に役立つ目標であることを確認した。−その理由は、次のことにある。癌細胞だけは信号を出すと思われる。
【０３６４】
実施例６：目標リボゾームリボ核酸の低い量または背景リボゾームリボ核酸の高い量を有するＥＧＦＲ分析
実施例４に記載されている分析法の感度を決定するために、入力ＮＳＣＬＣ細胞系合計リボゾームリボ核酸のさまざまな量はテストされた。そして、１００ｐｇから５０ｎｇにわたった。第１および第２のＥＧＦＲ  ＰＣＲ反応（ステップＩｄ、実施例４）の結果は、図６３に示される。第１のＰＣＲ反応は１ｎｇの入力リボゾームリボ核酸を検出するために十分に感度が高いことを示した。その一方で、２回は感度を１００ｐｇ以下の入力リボゾームリボ核酸に増やした。これは１０セル、７―に対応する。そして、極めて希釈したサンプルさえこの分析を使用している検出可能な信号を生成することができることを証明する。
【０３６５】
次に、１ｎｇのＮＣＩ―Ｈ  １９７５リボゾームリボ核酸を含んでいるサンプルは、１ｎｇから１μｇにわたっていて、前の通りＰＣＲ反応において使用する多量の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）リボゾームリボ核酸を変化させることを混ぜ合わせられた。
図６４Ａに示すように、ＰＣＲ反応の第１のセットは、（増幅が全例で起こると共に）疑似バンドが最高汚染レベルで現れることを証明した。しかしながら、図６４Ｂに示すように、ＰＣＲ反応の第２の、入れ子にされた一組の後、所望の特定のアンプリコンが、最高汚染レベルでさえ疑似バンドなしでできた。従って、この実施例は、目標リボゾームリボ核酸がテストされているサンプルの完全リボゾームリボ核酸の小さい何分の１を占めるときでも、本願明細書において記載されているＥＧＦＲ  ＰＣＲ分析が効果的なことを証明する。
【０３６６】
表９はリボゾームリボ核酸収率を様々な細胞にリストして、細胞につき収率が広く可変的であることを示す。そして、細胞型次第である。この情報は、体細胞数に基づいてサンプルの目標および背景リボゾームリボ核酸の量を推定するために役立つ。例えば、１ｎｇのＮＣＬ―Ｈ１９７５リボゾームリボ核酸はほぼ１００セルに対応する。その一方で、１μｇのＰＢＭＣリボゾームリボ核酸はほぼ１０６セルに対応する。このように、上記の実験（１，０００）の最高汚染レベル：ＮＣＬ―Ｈ１９７５リボゾームリボ核酸に対するＰＢＭＣリボゾームリボ核酸のうちの１つは、実は１０，０００に対応する：１９７５セルＮＣＬ―Ｈに対するＰＢＭＣの１つの比率。このように、これらのデータは、ＥＧＦＲが１０６もの白血球によって汚染されるわずか１００のＣＴＣから配列決定されることができることを示す。
【０３６７】
【表９】
2008538282.tif 000026
【０３６８】
リボゾームリボ核酸Ｙｉｅｌｄ対セルつぎに、Ｔｙｐｅ全血液は１，０００セル／ｍｌによって封じたのセル、トラッカー（インビトロゲン）―のラベルが付いたＨ１６５０セル群は図５７Ｃの捕獲モジュール・チップに通された。Ｔｏは固定サンプル（細胞が運転の後、計数されて、ホルムアルデヒド固定のないリボゾームリボ核酸抽出のためにその後溶解されて直ちにあった捕獲されたＨ１６５０）からリボゾームリボ核酸抽出の非効率性を回避する。ほぼ８００はＨ１６５０細胞を捕獲した、そして、＞１０，０００の汚染された白血球は０．５ｍｌの４Ｍのグアニジン・チオシアン酸溶液を有するチップに溶解された。溶菌液は、０．５ｍｌの石炭酸／クロロホルムによって抽出されて、キャリアとして１０μｇのイースト運搬ＲＮＡがある場合には、エチルアルコールのＩｍＩによって沈殿した。沈殿するリボゾームリボ核酸は、３０分間にされて、石炭酸／クロロホルムによってそれから抽出されて、第１の索相補ＤＮＡ合成および次のＰＣＲ増幅の前にエチルアルコールによって沈殿するデオキシリボヌクレアーゼＩ―既治療であった。
これらのステップは、第２の血液サンプルおよび第２のチップで繰り返された。
Ｈ１６５０および白血球相補ＤＮＡとともにｃｈｉｐｌおよびｃｈｉｐ２リボゾームリボ核酸から合成される相補ＤＮＡは、ＥＧＦＲ＿５（前方のプライマ、５．ｐｒｉｍｅ．―ＧＴＴＣＧＧＣＡＣＧＧＴＧＴＡＴＡＡＧＧ―Ｓ´）と同様に２つのプライマーセットを使用して増幅されるＰＣＲ、ＣＤ４５＿１およびＣＤ４５＿２（表８）であった（配列番号である５２）  そして、ＥＧＦＲ＿６（復帰プライマ、５´―ＣＴＧＧＣＣＡＴＣＡＣＧＴＡＧＧＣＴＴＣ―Ｓ´）（配列番号である５３）．１３８の塩基対野生型が増幅したＥＧＦＲ＿５およびＥＧＦＲ＿６生産物は分解する、そして、１２３の塩基対変異体は１６５０セル、Ｈの断片を増幅した。ＰＣＲ製品は、２．５％のアガロースゲルに分離された。図６５に示すように、ＥＧＦＲ分析が強くて、非常に精製されたサンプルを必要としないことを証明して、高い白血球背景にもかかわらず、ＥＧＦＲ野生型および変異体増幅された断片は、直ちに検出された。
【０３６９】
実施例７：捕獲モジュールに連結する強化モジュールによる、血液サンプルを処理するためのプロトコル
健康な血液の検体が腫瘍細胞によってスパイクをつけた捕獲モジュールを含んでいる本発明の装置は、能力が腫瘍細胞を血液から豊かにして、とるためにテストされた。
【０３７０】
血液サンプル、人間の非小細胞肺癌線、ＡＴＣＣからＮＣＩ―Ｈｌ  ６５０を準備する）細胞トラッカ・オレンジ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＰｒｏｂｅｓからＣＭＲＡ）を有する着色して、そうすると、健常な患者（調査Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）からの新鮮血へのスパイクをつけた。スパイク・レベルは、１，０００セル／ｍｌであった。釘で打ちつけられた血液は、２：１（バッファ（ＰＢＳの１％のＢＳＡ）に対する血液）の比率に薄められた。白血球および腫瘍細胞は、核汚染性染料（ヘキスト３３３４２）で標識だった；添加された汚れ（細胞トラッカ・オレンジ）を有する腫瘍細胞にラベルをつけることは、腫瘍細胞と白血球を区別するのを助けた。
【０３７１】
次に、強化モジュール多様体、チップおよび管は準備された、そして、強化モジュール・チップは脱ガスされたバッファによって初回抗原刺激を受けていた。スパイクをつけられた血液サンプルは２．４ｐｓｉの圧力で強化モジュールに通された、そして、製品の移動比は６．９１ｍｌ／時間であった。
【０３７２】
製品を捕獲モジュールに通す前に、製品は、特徴づけられた。製品の希釈比を考慮して、等価な全血液のｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒにつき白血球の数は、７．０２ｘ  １０５であった。白血球の除去効率は、９０％であった。腫瘍細胞の収率は８９．５％であった、そして、腫瘍細胞の純度は０．１４％であった。
【０３７３】
強化モジュールからの製品はそれから捕獲モジュールに通された。そして、それは反―ＥｐＣＡＭコートの障壁を含んだ。上皮細胞接着分子を表している腫瘍細胞は、障壁に捕獲された。移動比は２．１２ｍｌ／時間であった、そして、実行時間は１時間であった。非特異的に縛られた細胞を除去するために、装置は、それからより高い移動比（３ｍｌ／時間）で、バッファによって洗われた。収率は、７４％であった。純度は、未検だった。これらの実験の結果は、表１０にまとめられる。
【０３７４】
【表１０】
2008538282.tif 000027
【０３７５】
実施例８：スタガー配列を使用している細胞捕獲
選ばれた区分のサイズより大きな本発明の一実施例、ＣＴＣまたは他の細胞において、サブ配列の配列に配置される障壁を含む装置を使用して捕えられることができる。
サブ配列はわずかな食違いまたは平坦でない間隔を有する分野を通じて配列される。そして、まず最初に、フローラインにおける変化を導いて、障壁を有する細胞の相互作用を促すために設計される。図６６  Ａに示すように、この装置の１つの効果は、各サブ配列が流路が狭くなる領域を引き起こすということである。図に示される配列において、障壁間の規則的なギャップは４６マイクロメートルである。その一方で、狭くなるすきまは１７マイクロメートルである。配列およびサブ配列は、結果としていかなる望ましい間隙の大きさ（規則的なすきまに関する狭くなるすきまのいかなる所望の密度と同様にも）にもなるために変化することができる。
【０３７６】
この種のスタガー配列は特に血液サンプルのＣＴＣの優先捕獲に役立つ。−その理由は、次のことにある。ＣＴＣは大部分の他の血液細胞より大きい傾向がある。ＣＴＣまたは他の大細胞は抗体または他の結合部分を含んでいる職能化された表面の配列の中で捕獲されることができる。−その理由は、次のことにある。細胞捕獲は配列ジオメトリに基づく。この種の装置の製作は、従って、単純化される。
【０３７７】
本発明のスタガー配列が、装置の全体にわたって定期的に分散することを図６６Ｂ．Ｎａｒｒｏｗｅｄ流路において明らかにする、そして、これらの経路は、所与の水力学的サイズの細胞を捕獲するために大きさを設定されることができる、以上、この区分のサイズより小さい細胞が保持されることのない配列の中を流れることができる。大細胞が、このことによりそれを防いで、狭い流路にはまり込む場合、図６６Ｃに示すように、より小さい細胞は非ブロック化されたより大きい流路を介して周辺で途切れずに続くことがまだ可能である。この設計は、同一の配列で起こることができる切りくず詰まりの課題を回避する。
【０３７８】
望ましく、関心のＣＴＣまたは他の細胞が統計学的に遭遇して、狭くなるすきまでは止められそうであるように、装置は構成される。装置は、的状赤血球の捕獲の確率を変えるために制限された流路の密度を変化させることによって、特定用途のために最適化されることができる。
【０３７９】
１つの構成において、装置放出口の近くの流路のより大きいパーセンテージは狭く（図６６Ｄ）設計されていてもよい。それによって、配列において他で捕獲されなかったいかなる大細胞の捕獲も考慮に入れる。すべての利用できる狭いすきまが的状赤血球によってふさがっているというわけではない限り、切りくず詰まりはこの構成においてまだ回避される。
【０３８０】
本発明の若干の装置はサンプルの高いスループットに適応するために比較的かなりの深さ寸法を有するが、捕獲された細胞が主に１つの焦点面で見つかって、顕微鏡の下で図により容易であるという結果、そのために、他の実施例では、深さ寸法は非常により少ない。図６６Ｅに示される装置において、深さ寸法は狭くなる流路を作成するために構築される。そして、結果として単一の焦点面（図６６Ｆ）のセルの占領になる。捕獲された細胞は、直接簡略視程のための透明窓の下にある。この種の装置の成形加工は、様々な手段（例えばポリマー基質の押出鋳込または熱いエンボシング）によって、直ちに達成されることができる。
【０３８１】
一旦捕えられると、細胞は、例えば、細胞に縮んで、装置から自由にさせられる低張液を有する処理によって放出されることができる。解放および収集に応じて、細胞は、それらの原物のモル浸透圧濃度に戻されることができて、更なる分析、ｅ．ｇ、分子分析を受けることができる。あるいは、分析は、細胞を放出することのない装置の範囲内で行われることができる。
【０３８２】
実施例９：スタガー配列を使用しているＨ１６５０セルの細胞占領
捕獲モジュール・チップ（図５７Ｃ）は、Ｈｌ  ６５０肺癌細胞の試料を処理するために用いた。捕獲モジュールのパラメータは、以下の通りである：チップ寸法は、６６．０ｘ２４．９ミリメートルである；障壁分野寸法は、５１．３ｘ１８．９ミリメートルである；障壁直径は、１０４マイクロメートルである；ポート寸法は、書類の表面上の２．８３ｘ２．８３ミリメートルおよび裏面上の１．６６×１．６６ｍｍである；基質は、シリコンである；そして、エッチング深は、１００マイクロメートルである。Ｈｌ  ６５０肺癌細胞は、バフィーコートに１０，０００セル／ｍｌで釘で打ちつけられて、１．６ｍｌ／時間（６６Ｇ図）に動いた。約１２，７００のＨｌは、６５０セル、装置を通過した。
装置は、放射面のほぼ７，２３０の捕獲場所を含んだ。実験後のＨ１６５０細胞の収率は１６％であった。そして、利用できる捕獲場所の実質部分がＨ１６５０細胞によって占められたことを示した。
【０３８３】
実施例１０：癌細胞の粒度分布
癌細胞（細胞系が装置（図６７Ａ）を計数しているベックマンＣｏｕｌｔｅｒモデルＺ２で渡されたいくつかの癌）の粒度分布を決定する癌細胞Ｉｎ＄ｏｒｄｅｒの粒度分布。
この実験においてテストされた細胞系はＨ３５８、Ｈ１６５０、Ｈ１９７５、ＨＴ２９およびＭＣＦ７細胞を含んだ。そして、それはコロン、肺および乳がん細胞を含む。
図６７Ａが示すように、これらの細胞系の各々は大部分の白血球より大きい細胞から成る。各癌細胞線の粒度分布は、各々と類似していて、示される白血球の配布から、よく切り離される。サイズ（図６７Ｃ）の８、１０または１２マイクロメートル以下のさえ細胞の小さい少数だけについては、癌細胞（図６７Ｂ）の粒度分布のクローズアップは、各ケースの細胞の一般にガウス配布を明らかにする。これらのデータは、サイズに基づいて他の血液細胞から強いサポートをＣＴＣの強化の原則に対して提供する。
【０３８４】
実施例１１：顕微鏡スライドを使用しているキャプチャ装置
本発明は、様々な細胞キャプチャ装置および方法を含む。実施例において、本発明のキャプチャ装置は、図６８Ａに示すように職能化された表面（例えばガラス顕微鏡スライド）を利用する。スライドは、抗体または興味がある細胞型に特有の他の捕捉残基によって（例えば標準化学を用いてＣＴＣ）職能化されることができる。装置は、以下を含む：
サンプル流体室。そして、それは、例えば、室の一番下上の職能化されたスライドで、１０ｍｌ以上の収容力を有することができる。いかなる流体（例えば血液または血液分数）も、処理のための室の中に配置されることができる。
【０３８５】
流体サンプルの中の細胞は、重力または任意に遠心（実施例１２を参照）（または他の力の加圧）を介して室の一番下に沈殿させて、職能化された表面に束縛される。残留する細胞を転落させ続けるために、室は、揺れることができる（図６８Ｂ）かまたは回転することができる（図６８Ｃ）。その後、室は洗われることができて、取り除かれることができる、そして、スライドはそれから染色、視覚化および／または他の次の分析に利用できる。
【０３８６】
この種の装置および方法のいくつかの効果は、明白である。例えば、平坦な捕獲面は、捕獲された細胞の簡単な視覚化を考慮に入れる。さらにまた、平面上の同一の細胞捕獲は、細胞定量化を単純化する。加えて、表面と接触している電池のための滞流時間は他の方法と比較して長い。そして、捕そく効率を改良して、短くなるために実験の全体の期間を考慮に入れる。この期間は、極限移動比がないという事実からみて短くなることもできる。細胞が装置の中を流れていないので、それらは流れによって誘発された剪断も受けない。
【０３８７】
他の効果は、ここで記載されている構成で、表面積が通常、珍しいセルの占領の限定要因でないという事実を含む。さらにまた、光学顕微鏡または他の視覚化技術を使用していて、形態学、オルガネラ特徴または他の細胞特徴の分析を考慮に入れている捕獲された細胞を分析することは、特に直接である。
【０３８８】
キャプチャ装置は、処理細胞サンプルまたは他の流体サンプルの他の装置に連結することができる、そして、それは、マイクロ捕獲技術と互換性を持つ。
【０３８９】
ｈｉ  １変化（図６８Ｄに示される）さらに２つの流体室は、装置に存在する。
流体室（それは空気で満たされることができる）は、あるいは満たされて、装置の主チャンバ内で流体運動を引き起こすために空にされる。気室は、それらを切り離している柔軟壁を有されて、満たされることができて、いかなる機構も使用して空にされる。装置は細胞サンプルまたは他の流体サンプルを起動させる。そして、沈殿させられた電池を転落して、職能化された表面上の捕捉部位の妨害物を防止させ続ける。
【０３９０】
上記の装置のいずれかの捕獲表面は、例えば、浅浮彫りによってマイクロ構築されることができる。そして、マイクロ・ポスト、マイクロ・フィンおよび／または微コルゲーションを含む。職能化された表面は、例えば、微細作製されたシリコン・チップ表面またはプラスチック表面でもよい。この方法は、例えば、表面上の複数の、空間的にパターン化された捕獲官能性を複数の菌体群（６８Ｅ図）の差動の捕獲、定量化および／またはターゲッティングに提供する。
【０３９１】
実施例１２：遠心性のキャプチャ装置が本発明のキャプチャ装置を使用することに顕微鏡スライドＰｒｉｏｒを使用して、本発明の細胞パワー系統を有するｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓベースの細胞強化を実行することは、有利である。例えば、第１の強化ステップを血液サンプルに適用することによって、大部分の赤血球、白血球および血小板は、除去される。実験のワンセットにおいて、血液サンプルが８マイクロメートル、１０マイクロメートルおよび１２マイクロメートルの中止を有する本発明の細胞パワー系統を使用して処理されるときに、赤血球および血小板はいずれの場合においても完全に除去された、そして、それぞれ、白血球集中は１．２５ｘ１０５細胞／ｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒ、２，９００セル／ｍｌおよび１１１セル／ｍｌに減少した。このように、血液サンプルまたは他の細胞サンプルの汚染している細胞の大きな部分は捕獲ステップの前に取り出されることができる。そして、職能化された表面上の非特異性の沈降を回避するのを助ける。しかしながら、結果として生じる強化試料は非常に希釈されることができる。それによって、興味がある細胞（例えばＣＴＣ）を捕獲するのに必要な作業時間を増加させる。
【０３９２】
サンプルを処理することを必要とする時間を減少させるために、実施例１１に記載されている装置が、遠心機（図６９Ａ）と結合して用いられることができる。この方法では、サンプルがＮｘｇの高い遠心力場にさらされるときに、興味がある細胞（例えばＣＴＣ）は職能化されたスライド（図６９Ｂ）に対して平らにされる、そこにおいて、例えば、Ｎは、かなりの数（例えば１，０００以上）である。この遠心分離法は、ＣＴＣおよび結合部分（例えば抗体）との間に実質的に接触場所および面積を増加させる。細胞沈降速度は、方程式によって推定されることができる：
【０３９３】
【化１】
2008538282.tif 000028
【０３９４】
そこにおいて、ｕは、速度、ｄ表現気泡直径、ｐ表現密度、μ表現粘性および表現加速（すなわち重力であるか遠心性の分野）を表す。パラメータＮｘｇとして表す、そこにおいて、Ｎは重力の場合１に等しい、そして、遠心の場合、Ｎは一般にかなりの数（例えば１，０００以上）に等しい。Ｎが１に等しいときに、すなわち、単独で重力がある場合には、１４マイクロメートル直径細胞が高さ２ｃｍの液面室に定着することはほぼ１時間をとる；しかしながら、Ｎｘｇの遠心力場については、沈降時間はＮ倍に還元している。それによって、実験を実行することを必要とする時間を著しく減らす。
【０３９５】
非特異的に職能化された表面に密接に結びつくＣＴＣ、白血球またはその他を汚染しているセルの以下の占領は、以下によって取り除かれることができる：室を逆にすること、
そして、もう一度それを高い遠心力（図６９Ｃ）に従属させること。このステップは、非常に、職能化された表面に取り付けられるままである細胞を汚染することの数を減らす。
実施例において、白血球のような細胞を汚染することに特有の抗体は興味がある（図６９Ｄ）細胞を捕獲するために用いる表面の反対側に職能化された表面に連結することができる。それによって、汚染している細胞を捕獲して、更に興味がある捕獲された細胞の汚染を最小化する。他のバリエーションにおいて、興味がある細胞を捕獲するために用いる職能化された表面はある角度に傾けられることができる。そして、結果として、遠心力（６９Ｅ図）の垂直な成分に加えて、平坦面に沿って転がっている電池を動かす遠心性の力の成分になる。転がっている電池を動かす遠心力の成分は、細胞のクラスタを広げるのを助けて、細胞捕獲の効率を上昇させる。
【０３９６】
印加遠心力場は、多くの方法（図６９Ｆ）で最適化されることができる。例えば、「スピンアップ」位相（遠心を始めて、所望の回転速度を達成することの間の期間）を含んで、遠心の各期間は、修正されることができる「時間を回転させる」（所望の回転速度の遠心の期間）「遠心沈殿」（ｃｅｎｔｒｉｆ＝ｉｇａｔｉｏｎを減速し始めて、止まることの間の期間）および「積分時間」（回転の間の期間）。いずれの場合においても、期間、回転速度および／または回転性加速は、アプリケーションに合うために最適化されることができる。上記の通りで、これは、両方の前方及び後方の方向の室を回転させることを含む。
【０３９７】
捕そく効率を改良するために、実施例１１のような、職能化された表面は、構築される（６９Ｇ図）微でもよい。
【０３９８】
実施例１３：
キャプチャ装置
障壁（図７ＯＡおよび記載されている上記）を含む本発明のパワー系統において、大細胞は一般に障壁を有する多数の相互作用を有する。その一方で、小細胞は障壁との最小の接触を有する装置の中を流れることが可能である。
配列された障壁の表面に取り付けられる抗体または他の結合部分を含むキャプチャ装置は、類似の原理を使用して設計されることができて、サイズおよび親和性選択性を結合する。
【０３９９】
障壁の規則的配列構造において、分離限界粒径は多くのパラメータ次第である。そして、間隙の大きさおよび、図７ＯＢに示すように、障壁（障壁オフセット）の間の距離を含む。上述の通り、分離限界粒径より大きい細胞は偏る。その一方で、このパラメータより小さい細胞は平均流れの向きにおいて移動する。このように、興味がある細胞型（例えば特定のタイプのＣＴＣ）のサイズに基づいて、分離限界粒径は、最適化されることができる。これは、例えば、適当な間隙の大きさを選択することによって達成されることができて、相殺されることができる。最適化された装置は、効果的な捕獲に非常に低い汚染を提供することができる。
【０４００】
一例を挙げると、障壁密度は、装置の全体にわたって変化することができる。例えば、障壁は装置の試料導入口または切りくず詰まりを防止しなさいという命令の近くに低い密度で配列されることができる。その一方で、捕獲を最大にするために、密度は装置放出口の近くで増加することができる。
【０４０１】
臨界サイズを一定に保つと共に、障壁の配列を変化させることは可能である。このように、本発明の装置は、移動比、減少切りくず詰まりまたは達成他の設計目的（図７０Ｃ）を増加させるために、屈折、間隙の大きさおよび／または障壁の間の距離の方向が装置の全体にわたって変化する可変障壁配列を含むことができる。
【０４０２】
若干の装置において、両方の的状赤血球（例えばＣＴＣ）および汚染している細胞（例えば白血球）は、装置の床と結合する。例えば、これは、以下を含む装置で起こることができる：職能化されたシリコン基板が障壁を含んで、全てとして、シリコン基板の暴露面は、抗体または他の結合部分によって典型的に職能化される。このように、キャプチャ装置は逆にされた方向において作動されることができる。そうすると、沈殿させるいかなる細胞も非職能化された表面と接触して、結合しない。これは、結果として還元した切りくず詰まりになることができて、通常、装置性能を高めることができる。
【０４０３】
この例で記載されているキャプチャ装置または本発明の他のキャプチャ装置は、強化または他の目的のために使われることができる非職能化された領域を含むこともできる。
【０４０４】
他の実施例
上記の仕様において記載のすべての刊行物、特許および特許出願は、本願明細書に引用したものとする。ここに記載した本発明の方法とシステムに本発明の範囲および精神から垂離することなく各種の改変および変更を加えることは当業者であれば自明のことであろう。本発明が特定実施例と関連して記載されていたにもかかわらず、それは、請求されてその本発明を理解されなければならないこの種の特定実施例に過度に制限してはならない。実際、当業者にとって明らかである本発明を実施するための記載されているモードのさまざまな変更態様は、本発明の範囲内のことを目的とする。
【０４０５】
他の実施例は、請求項においてある。
【０４０６】
図が、必ずしも一定の比率であるというわけではない。
【図面の簡単な説明】
【０４０７】
【図１Ａ】図１Ａは、横変位に基づいて細胞を分離する配列の模式的な描写である。次の列の横変位を例示する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、横変位に基づいて細胞を分離する配列の模式的な描写である。すきまによる流体流れがどのように次の列における障害周辺で等しくなく分けられるかについて説明する。
【図１Ｃ】図１Ｃは、横変位に基づいて細胞を分離する配列の模式的な描写である。臨界サイズより上の水力学的サイズを有する粒子がどのように装置において横に位置がずれるかについて説明する；
【図１Ｄ】図１Ｄは、横変位に基づいて細胞を分離する配列の模式的な描写である。円筒状障壁の配列を例示する。
【図１Ｅ】図１Ｅは、横変位に基づいて細胞を分離する配列の模式的な描写である。楕円障壁の配列を例示する。
【図２】図２は、次の列における障害周辺ですきまによる流動の不等な分割を例示している模式的な説明である。
【図３】図３は臨界サイズが流れプロフィール次第である方法の模式的な描写である。そして、それはこの例で放物線状である。
【図４】図４は、形状が装置による粒子の動きに影響を及ぼす方法の実例である。
【図５】図５は、変形能が装置による粒子の動きに影響を及ぼす方法の実例である。
【図６】図６は、横変位の模式的な描写である。臨界サイズより上の水力学的サイズを有する粒子は配列の端へ移動する。その一方で、臨界サイズの下の水力学的サイズを有する粒子は横変位のない装置を貫通する。
【図７】図７は、３台のステージ装置の模式的な描写である。
【図８】図８は、最大寸法の模式的な描写および図７の装置のための分離限界粒径である。
【図９】図９は、バイパスチャンネルの模式的な描写である。
【図１０】図１０は、バイパスチャンネルの模式的な描写である。
【図１１】図１１は、一般のバイパスチャンネルを有する３台のステージ装置の模式的な描写である。
【図１２】図１２は、３つのステージ（一般のバイパスチャンネルを有する二重装置）の模式的な描写である。
【図１３】図１３は、一般のバイパスチャンネルを有する３台のステージ装置の模式的な描写である、そこにおいて、装置による流れは、実質的に一定である。
【図１４】図１４は、３つのステージ（一般のバイパスチャンネルを有する二重装置）の模式的な描写であるそこにおいて、装置による流れは、実質的に一定である。
【図１５】図１５は、一般のバイパスチャンネルを有する３台のステージ装置の模式的な描写である、そこにおいて、バイパスチャンネルの流体抵抗および隣接するステージは、実質的に一定である。
【図１６】図１６は、３つのステージ（一般のバイパスチャンネルを有する二重装置）の模式的な描写であるそこにおいて、バイパスチャンネルの流体抵抗および隣接するステージは、実質的に一定である。
【図１７】図１７は、２（別々のバイパスチャンネル）を有する３台のステージ装置の模式的な描写である。
【図１８】図１８は２（別々のバイパスチャンネル）を有する３台のステージ装置の模式的な描写である。そして、それは任意の構成においてある。
【図１９】図１９は、３つのステージ、３を有する二重装置、別々のバイパスチャンネルの模式的な描写である。
【図２０】図２０は、２（別々のバイパスチャンネル）を有する３台のステージ装置の模式的な描写である、そこにおいて、各段階による流れは、実質的に一定である。
【図２１】図２１は、３つのステージ、３を有する二重装置、別々のバイパスチャンネルの模式的な描写である、そこにおいて、各段階による流れは、実質的に一定である。
【図２２】図２２は、流れを抽出している境界線の模式的な描写である。
【図２３】図２３は、流れ供給境界線の模式的な描写である。
【図２４】図２４は流れ供給境界線の模式的な描写である。そして、バイパスチャンネルを含む。
【図２５】図２５は、中心バイパスチャンネルの側面に位置している２本の流れ供給境界の模式的な描写である。
【図２６】図２６は、オンチップ流れレジスタとして働く４本のチャネルを有する装置の模式的な描写である。
【図２７】図２７は、装置の２つの流体流れの相対幅上のオンチップ・レジスタの効果の模式的な描写である。
【図２８】図２８は、装置の２つの流体流れの相対幅上のオンチップ・レジスタの効果の模式的な描写である。
【図２９】図２９は、２つの外側領域のための一般の入口を有する二重装置の模式的な描写である。
【図３０Ａ】図３０Ａは、装置上の複数の配列の模式的な描写である。
【図３０Ｂ】図３０Ｂは、一般の入口を有する複数の配列および装置上の製品放出口の模式的な描写である。
【図３１】図３１は、小さい足跡を有する多段装置の模式的な描写である。
【図３２】図３２は、装置を通過している血液の模式的な描写である。
【図３３Ａ】図３３  Ａは、体細胞数対通常の全血液のミクロな液体の分離のための水力学的サイズのグラフである。
【図３３Ｂ】図３３Ｂは、体細胞数対循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の人口を含んでいる全血液のミクロな液体の分離のための水力学的サイズのグラフである。
【図３３Ｃ】図３３Ｃは図３３Ｂのグラフである。そして、加えて、大部分の自国の血液細胞を除外するサイズ分離を示す。
【図３３Ｄ】図３３Ｄは、図３３Ｃ（加えて、サイズ分離より大きな細胞の人口を示していて、疾病状態を表す）のグラフである。
【図３４Ａ】図３４Ａ〜３４Ｄは、サンプルから単段（Ａ）３つのステージ（Ｂ）二重（Ｃ）または３台のステージ・デュプレックス（Ｄ）装置のバッファまで粒子を移動する模式的な描写である。
【図３４Ｂ】図３４Ａ〜３４Ｄは、サンプルから単段（Ａ）３つのステージ（Ｂ）二重（Ｃ）または３台のステージ・デュプレックス（Ｄ）装置のバッファまで粒子を移動する模式的な描写である。
【図３４Ｃ】図３４Ａ〜３４Ｄは、サンプルから単段（Ａ）３つのステージ（Ｂ）二重（Ｃ）または３台のステージ・デュプレックス（Ｄ）装置のバッファまで粒子を移動する模式的な描写である。
【図３４Ｄ】図３４Ａ〜３４Ｄは、サンプルから単段（Ａ）３つのステージ（Ｂ）二重（Ｃ）または３台のステージ・デュプレックス（Ｄ）装置のバッファまで粒子を移動する模式的な描写である。
【図３５Ａ】図３５  Ａは、３つの製品を生産するために血液からバッファまで粒子を移動するために使用される２台のステージ装置の模式的な描写である。
【図３５Ｂ】図３５Ｂは、最大寸法の概略グラフおよび２つのステージの分離限界粒径である。
【図３５Ｃ】図３５Ｃは、３つの製品の組成の概略グラフである。
【図３６】図３６は、変更の２台のステージ装置の模式的な描写である、そこにおいて、各段階は、バイパスチャンネルを有する。
【図３７】図３７は、装置の２つのステージを接続する流体通信路の利用の模式的な描写である。
【図３８】図３８は、装置の２つのステージを接続する流体通信路の利用の模式的な描写である、そこにおいて、２つのステージは、小さい足跡配列として構成される。
【図３９Ａ】図３９Ａは、両方のステージから出る出力を受け入れるバイパスチャンネルを有する２台のステージ装置の模式的な描写である。
【図３９Ｂ】図３９Ｂは、この装置で達成可能な製品のサイズ範囲の概略グラフである。
【図４０】図４０は、各段階の側面に位置して、同じ放出口に空になるバイパスチャンネルを有する変更の２台のステージ装置の模式的な描写である。
【図４１】図４１は、粒子の経時的な動きおよび変更の装置の模式的な描写である。
【図４２Ａ】図４２  Ａは、本発明およびその動作の装置の模式的な描写である。
【図４２Ｂ】図４２Ｂは、図４２  Ａの装置およびこの装置の更に組織的に配列された表現の実例である。
【図４３Ａ】図４３Ａは、２台の装置を結合するための２つの異なった構成の模式的な描写である。図４３Ａにおいて、カスケード構成は、示される、そこにおいて、１台の装置の放出口１は、第２の装置の試料導入口に取り付けられる。図４３Ｂにおいて、帯域通過構成は、示される、そこにおいて、１台の装置の放出口２は、第２の装置の試料導入口に取り付けられる。
【図４３Ｂ】図４３Ｂは、２台の装置を結合するための２つの異なった構成の模式的な描写である。図４３Ａにおいて、カスケード構成は、示される、そこにおいて、１台の装置の放出口１は、第２の装置の試料導入口に取り付けられる。図４３Ｂにおいて、帯域通過構成は、示される、そこにおいて、１台の装置の放出口２は、第２の装置の試料導入口に取り付けられる。
【図４４】図４４は、的状赤血球がｉｎｉｍｕｎｏａｆｆｍｉｔｙビードで標識であるサイズ分離の強化された方法の模式的な描写である。
【図４５】図４５は、サイズ分画を実行するための、そして、本発明の装置を用いて遊離標識試薬（例えば抗体）を縛られた標識試薬から分離するための方法の模式的な描写である。
【図４６】図４６は、図４５に示される方法の模式的な描写である。この場合、対象外の細胞は的状赤血球によって共同清浄にすることができる、しかし、これらの対象外の細胞は的状赤血球の定量化を妨げない。
【図４７】図４７は、混合から大細胞を豊かにして、これらの細胞の濃縮サンプルを生じる方法の模式的な描写である。
【図４８】図４８は、本発明の装置内部で細胞を溶解して、細胞全体をオルガネラおよび他の細胞構成要素から切り離す方法の模式的な描写である。
【図４９】図４９は、カスケード構成において配列されて、サイズ分画を実行するために、そして、本発明の装置を用いて遊離標識試薬を縛られた標識試薬から分離するために使用される２台の装置の模式的な描写である。
【図５０】図５０は、カスケード構成において配列されて、サイズ分画を実行するために、そして、本発明の装置を用いて遊離標識試薬を縛られた標識試薬から分離するために使用される２台の装置の模式的な描写である。この図において、バクテリオファージは、抗体よりもむしろ締め具および検出のために利用される。
【図５１】図５１は、帯域通過構成において配列される２台の装置の模式的な描写である。
【図５２】図５２は、体細胞数対通常の全血液のミクロな液体の分離のための水力学的サイズのグラフである。
【図５３】図５３は、Ｃｏｕｌｔｅｒ「Ａｃ―Ｔ  ｄｉｆｆ『臨床血液アナライザによって発生する入力、製品および荒廃したサンプルから一組のヒストグラムである。ｘ軸は、フェムトモルの細胞容積を表す。
【図５４】図５４は細胞強化モジュールで処理される胎児血の製品および廃液流から一対の代表的な顕微鏡写真である。そして、有核細胞および赤血球のはっきりした分離を示す。
【図５５】図５５は、パラホルムアルデヒドを有する細胞強化モジュールに取り付けられて、蛍光顕微鏡法によって観察される細胞を示している一対の画像である。的状赤血球は、捕獲モジュールの障壁および床行きである。
【図５６】図５６は、本発明の方法の模式的な描写である。細胞サンプルの中で大細胞を分離していて、計数しているこの方法機能、そこにおいて、カウントは患者の疾病状態を表す、そして。その後で、大きい細胞亜集団を更に分析する。
【図５７Ａ】図５７Ａは、本発明の好ましい実施例のための計画である。
【図５７Ｂ】図５７Ｂは、図５７Ａに対応する設計パラメータの表である。
【図５７Ｃ】図５７Ｃは、本発明の小片のマスク・デザインである。
【図５８】図５８は、血液中ＣＴＣの上皮細胞成長因子レセプタ（ＥＧＦＲ）突然変異を検出する方法の模式的な描写である。
【図５９】図５９は、ＥＧＦＲシークエンシング・テンプレートを生成する方法の模式的な描写である。ＥＧＦＲメッセンジャーＲＮＡは、相補ＤＮＡを作るために転写される後退である；次に、２つのＰＣＲ詳しい説明は、順次実行される。
【図６０】図６０は、アレレに特有のＴａｑＭａｎ  ５´の模式的な描写であるヌクレアーゼＲｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ分析は、興味がある特定の突然変異に特有のＥＧＦＲ亜区を増幅したものである。
【図６１】図６１は、蛍光の背景レベルを上回っていくつかのＥＧＦＲ突然変異（陰影のついた地方）の検出を示している一組のシークエンシング図である。
【図６２Ａ】図６２Ａは、ＥｐＣＡＭおよびＥＧＦＲが白血球においてでなく腫瘍細胞において表されることを示しているアガロースゲルのイメージである。ＢＣＫＤＫは両方のタイプの細胞において表される。その一方で、ＣＤ４５は白血球だけにおいて表される。
【図６２Ｂ】図６２Ｂは、ＥＧＦＲメッセンジャーＲＮＡ表現のＰｈａｒｍａｇｅｎｅ  ＸｐｒｅｓｓＷａｙ＝側面を示しているグラフおよびテーブルである。発現量は定量的ＲＴ―ＰＣＲを介して７２の組織において側面図を作られる、そして、細胞につき＞１０，０００のコピーは血液を除いて側面図を作られるほぼあらゆる組織において検出される。表は、グラフから組織＃１―４のためのメッセンジャーＲＮＡの定量化を示す。
【図６３】図６３は、ＰＣＲ分析の２セットの結果を示しているアガロースゲルの一対のイメージである。第１の設定された（左）において、ＰＣＲは、さまざまな集中でＥＧＦＲ入力リボゾームリボ核酸に実行される。分析の第２のセットにおいて、ＰＣＲ反応の第１の一組からサンプルは、入れ子にされたプライマによって増幅される。
【図６４Ａ】図６４Ａは、（ＰＢＭＣ）リボゾームリボ核酸および後退がＰＣＲの前に９７５のリボゾームリボ核酸が末梢血単核細胞のさまざまな量によって調合されるどのＮＣＩ―Ｈｌを転写したかという一組のＰＣＲ分析の結果を示しているアガロースゲルのイメージである。疑似増幅バンドは、最も高い希釈剤で見られる。
【図６４Ｂ】図６４Ｂは、図６４Ａに示されるサンプルが入れ子にされたプライマを使用して更に増幅される一組のＰＣＲ分析の結果を示しているアガロースゲルのイメージである。最も高い希釈剤でさえ、疑似増幅バンドが、できない。
【図６５】図６５は、一組のＰＣＲ分析の結果を示しているアガロースゲルのイメージである。合同実験において、Ｈ１６５０細胞によってスパイクをつけられる全血液は本発明の２台の装置に動いた、そして、相補ＤＮＡは結果として生じる強化試料から合成された。ＥＧＦＲおよびＣＤ４５プライマを用いたＰＣＲは、実行された。野生型（１３８の塩基対）および変異体（１２３の塩基対）ＥＧＦＲバンドは、ＥＧＦＲ詳しい説明を示しているレーンにおいて見える。
【図６６Ａ】図６６Ａは、スタガー・サブ配列を含んでいる本発明の配列の模式的な描写である。
【図６６Ｂ】図６６Ｂは、規則的配列構造をスタガー配列と対比している模式的な描写である。
【図６６Ｃ】図６６Ｃは、流れおよびスタガー配列のセルの占領を示している模式的な描写である。
【図６６Ｄ】図６６Ｄは、狭くなる流路の領域に囲まれている出口ポートを含んでいる装置を示している模式的な描写である。
【図６６Ｅ】図６６Ｅは、狭くなる流路を作成するために深さ寸法において構築される装置の模式的な描写である。
【図６６Ｆ】図６６Ｆは図６６Ｅの装置の模式的な描写である。そして、捕獲された細胞を示す。
【図６６Ｇ】図６６Ｇは、１６５０の細胞が本発明の装置の狭いフロー領域において捕えたしみをつけられたＨを示している一組の顕微鏡図である。
【図６７Ａ】図６７Ａは、装置を計数しているベックマンＣｏｕｌｔｅｒＺ２で測定されるにつれて、いくつかの細胞サンプルの粒度分布を示していて、白血球およびさまざまな癌細胞線を含んでいる図および挿入紙である。主図はボリューム軸のための対数目盛を使用する。その一方で、挿入紙はよりよく白血球の配布を表すために等分目盛を使用する。
【図６７Ｂ】図６７Ｂは、いくつかの癌細胞線の粒度分布を示している図である。
【図６７Ｃ】図６７Ｃは図６７Ｂの図である。そして、３つの典型的なサイズ分離を更に示す。
【図６８Ａ】図６８Ａは、試料室の一番下上の職能化された顕微鏡スライドを特徴とする本発明のキャプチャ装置の模式的な描写である。
【図６８Ｂ】図６８Ｂは、細胞を転落させ続けて、沈降を防止するために、キャプチャ装置のロッキング細胞の方法の模式的な描写である。
【図６８Ｃ】図６８Ｃは、振れに代わるものとしてキャプチャ装置を回転させる方法の模式的な描写である。
【図６８Ｄ】図６８Ｄはさらに２つの流体室を含むキャプチャ装置の模式的な描写である。そして、それはあるいは満たされることができて、装置の主チャンバ内で流体運動を引き起こすために空にされることができる。
【図６８Ｅ】図６８Ｅは、表面上の複数の、空間的にパターン化された捕獲官能性を有する顕微鏡スライドの模式的な描写である。
【図６９Ａ】図６９Ａは本発明の遠心装置の模式的な描写である。そして、安静で、そして、作動中に示される。
【図６９Ｂ】図６９Ｂは、重力場（上部）および遠心力場（最後の）の職能化された表面と結合している細胞の模式的な描写である。
【図６９Ｃ】図６９Ｃは、室が回転の間、逆にされる図６９Ａの装置の模式的な描写である。
【図６９Ｄ】図６９Ｄは図６９Ｃの装置の模式的な描写である。そして、細胞を汚染する捕獲のための第２の職能化された表面を更に示す。
【図６９Ｅ】図６９Ｅは、職能化されたスライドが回転の間、ある角度に傾けられる遠心力装置の模式的な描写である。
【図６９Ｆ】図６９Ｆはスピン速度対作動時間を示している一対の図である。そして、最適化されることができる期間を含む：「スピンアップ」（１）は、「時間を回転させる」（２）「遠心沈殿」（３）および積分時間（４）。
【図６９Ｇ】図６９Ｇは、職能化されたミクロ構造面を含む遠心力装置の模式的な描写である。
【図７０Ａ】図７０Ａは、小細胞（左）および大細胞（右）の流路を示しているパワー系統のイメージである。小細胞は基本的に平均流れの向きにおける障害および流れを有するごくわずかな相互作用しか有しないのを見られることができる。その一方で、大細胞はそのルートに沿って各障壁を接触させて、配列で横に目指す。
【図７０Ｂ】図７０Ｂは、障壁の規則的配列構造を含んでいる本発明の装置の模式的な描写である。
【図７０Ｃ】図７０Ｂは屈折、間隙の大きさおよび／または障壁の間の距離の方向が装置の全体にわたって変化する複数の配列を含む本発明の装置の模式的な描写である。その一方で、臨界サイズは一定に保たれる。
【図７１−１】図７１は、野生型上皮細胞成長因子レセプタ（ＥＧＦＲ）核酸のリストである（配列番号５１１）。そして、アミノ酸、（配列番号である５１２）配列。
【図７１−２】図７１は、野生型上皮細胞成長因子レセプタ（ＥＧＦＲ）核酸のリストである（配列番号５１１）。そして、アミノ酸、（配列番号である５１２）配列。
【図７１−３】図７１は、野生型上皮細胞成長因子レセプタ（ＥＧＦＲ）核酸のリストである（配列番号５１１）。そして、アミノ酸、（配列番号である５１２）配列。
【図７１−４】図７１は、野生型上皮細胞成長因子レセプタ（ＥＧＦＲ）核酸のリストである（配列番号５１１）。そして、アミノ酸、（配列番号である５１２）配列。
【図７２】図７２Ａ―Ｅは、ＥＧＦＲ異型のシーケンスの部分を示しているクロマトグラフィのシークエンシング・プロフィールである。
【図１Ａ−１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2008538282.tif 000035
【図６】
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【図７】
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【図８】
2008538282.tif 000038
【図９】
2008538282.tif 000039
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
2008538282.tif 000077
【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７Ａ】
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【図５７Ｂ】
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【図５７Ｃ】
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【図５８】
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【図５９】
2008538282.tif 000103
【図６０】
2008538282.tif 000104
【図６１】
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【図６２Ａ】
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【図６２Ｂ】
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【図６３】
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【図６４Ａ】
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【図６４Ｂ】
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【図６５】
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【図６６Ａ】
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【図６６Ｂ】
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【図６６Ｃ】
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【図６６Ｄ】
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【図６６Ｅ】
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【図６６Ｆ】
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【図６６Ｇ】
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【図６７Ａ】
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【図６７Ｂ】
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【図６７Ｃ】
2008538282.tif 000121
【図６８Ａ】
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【図６８Ｂ】
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【図６８Ｃ】
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【図６８Ｄ】
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【図６８Ｅ】
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【図６９Ａ】
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【図６９Ｂ】
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【図６９Ｃ】
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【図６９Ｄ】
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【図６９Ｅ】
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【図６９Ｆ】
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【図６９Ｇ】
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【図７０Ａ】
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【図７０Ｂ】
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【図７０Ｃ】
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【図７１】
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【図７１】
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【図７１】
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【図７１】
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【図７２Ａ−７２Ｅ】
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