(57)【要約】  本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体、前記抗体を含む組成物、およびそのような抗体を生成する方法を提供する。特に、本発明は、ヒトメタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合し、ヒトメタニューモウイルスを中和するモノクローナル抗体を提供する。本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質、哺乳動物呼吸器合胞体ウイルスのFタンパク質の双方と交差反応し、両ウイルスを中和する抗体も提供する。さらに、本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスに対するヒト化抗体などの組換え抗体、およびそのような組換え抗体を生成する方法を提供する。さらに、本発明は、ヒトメタニューモウイルスなどの哺乳動物メタニューモウイルスによる感染の症状を治療、管理、改善し、および/またはその感染を予防する方法を提供する。本発明は、トリニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体も提供する。トリニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、トリニューモウイルスによる感染症の診断および治療に有用である。
2008538353.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)配列番号33〜116のいずれか1つのアミノ酸配列からなるタンパク質に免疫特異的に結合し、かつ(ii)以下のドメイン:
(a)配列番号2または10と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するVH、
(b)配列番号4または12と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するVH CDR1、
(c)配列番号6または14と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するVH CDR2、
(d)配列番号8または16と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するVH CDR3、
(e)配列番号18または26と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するVL、
(f)配列番号20または28と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するVL CDR1、
(g)配列番号22または30と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するVL CDR2、および
(h)配列番号24または32と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するVL CDR3
の1つ以上を含む、精製した抗体または抗体の断片。
【請求項２】
(i)配列番号33〜116のいずれか1つのアミノ酸配列を含むタンパク質に免疫特異的に結合し、かつ(ii)以下のドメイン:
(a)配列番号2または10のアミノ酸配列を有するVH、
(b)配列番号4または12のアミノ酸配列を有するVH CDR1、
(c)配列番号6または14のアミノ酸配列を有するVH CDR2、
(d)配列番号8または16のアミノ酸配列を有するVH CDR3、
(e)配列番号18または26のアミノ酸配列を有するVL、
(f)配列番号20または28のアミノ酸配列を有するVL CDR1、
(g)配列番号22または30のアミノ酸配列を有するVL CDR2、および
(h)配列番号24または32のアミノ酸配列を有するVL CDR3
の1つ以上を含む、精製した抗体または抗体の断片。
【請求項３】
モノクローナル抗体である、請求項1または2に記載の抗体。
【請求項４】
キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体である、請求項1または2に記載の抗体。
【請求項５】
0.05μg/ml〜2μg/mlのIC50で哺乳動物メタニューモウイルスを中和する、請求項1または2に記載の抗体。
【請求項６】
mAb234またはmAb338である、請求項1または2に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体または断片が、請求項1または2に列挙したドメインのうち2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、または全てを含む、請求項1または2に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体または断片が、請求項1または2に列挙したドメイン(a)、(b)、(c)および(d)を含む、請求項1または2に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体または断片が、請求項1または2に列挙したドメイン(a)を含む、請求項1または2に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体または断片が、請求項1または2に列挙したドメイン(b)を含む、請求項1または2に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体または断片が、請求項1または2に列挙したドメイン(c)を含む、請求項1または2に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体または断片が、請求項1または2に列挙したドメイン(d)を含む、請求項1または2に記載の抗体。
【請求項１３】
前記抗体または断片が、請求項1または2に列挙したドメイン(e)を含む、請求項1または2に記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体または断片が、請求項1または2に列挙したドメイン(f)を含む、請求項1または2に記載の抗体。
【請求項１５】
前記抗体または断片が、請求項1または2に列挙したドメイン(g)を含む、請求項1または2に記載の抗体。
【請求項１６】
前記抗体または断片が、請求項1または2に列挙したドメイン(h)を含む、請求項1または2に記載の抗体。
【請求項１７】
RSVのFタンパク質に免疫特異的に結合する、請求項1または2に記載の抗体。
【請求項１８】
配列番号132〜154のアミノ酸配列のいずれか1つに免疫特異的に結合する、請求項17に記載の抗体。
【請求項１９】
請求項1または2に記載の抗体の有効量と、製薬上許容しうる担体とを含む医薬組成物。
【請求項２０】
請求項19に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む、哺乳動物メタニューモウイルスによる感染の症状を予防、治療、管理または改善する方法。
【請求項２１】
請求項19に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む、呼吸器合胞体ウイルスによる感染の症状を予防、治療、管理または改善する方法。
【請求項２２】
前記哺乳動物メタニューモウイルスがヒトメタニューモウイルスである、請求項20に記載の方法。
【請求項２３】
前記呼吸器合胞体ウイルスがヒト呼吸器合胞体ウイルスである、請求項21に記載の方法。
【請求項２４】
APVのFタンパク質に免疫特異的に結合する、請求項1または2に記載の抗体。
【請求項２５】
APVのFタンパク質に免疫特異的に結合する、請求項1または2に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2005年4月8日出願の米国特許出願第60/669,939号(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)の35 U.S.C. §119(e)の下での利益を請求する。
【０００２】
1.  発明の分野
本発明は、哺乳動物メタニューモウイルス(metapneumovirus)のポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体、前記抗体を含む組成物、およびそのような抗体を生成する方法を提供する。特に、本発明は、ヒトメタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合し、ヒトメタニューモウイルスを中和するモノクローナル抗体を提供する。本発明は、ヒトメタニューモウイルスのFタンパク質、哺乳動物呼吸器合胞体ウイルスのFタンパク質の双方と交差反応し、両種ウイルスを中和する抗体も提供する。さらに、本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスに対する、ヒト化抗体、完全ヒト抗体などの組換え抗体、およびそのような組換え抗体を生成する方法も提供する。さらに、本発明は、ヒトメタニューモウイルスなどの哺乳動物メタニューモウイルスによる感染の症状を治療、管理、改善し、および/またはその感染症を予防する方法も提供する。本発明は、トリニューモウイルス(pneumovirus)のFタンパク質と免疫特異的に結合する抗体も提供する。トリニューモウイルスのFタンパク質と免疫特異的に結合する抗体は、トリニューモウイルスによる感染の診断および治療に有用である。
【背景技術】
【０００３】
2.  発明の背景
呼吸器合胞体ウイルス、トリメタニューモウイルスおよび哺乳動物メタニューモウイルス
呼吸器ウイルスは、ヒトにおける上部/下部気道病の大きな割合を占めている。過去数十年で、気道疾患の多くの病原体が特定されてきた。この中で呼吸器合胞体ウイルス(respiratory syncytial virus)(RSV)は、幼児期および若年児童期での呼吸器感染症の最も重要な単独原因である(Welliver、2003、J.Pediatr.143:S112-S117)。しかし、臨床手当てをした幼児および児童の呼吸器感染症のうち、原因が分かっているものは60%にすぎない(Sinaniotis、2004、Paediatr Respiratory Rev.5:S197-S200)。最近、ヒト呼吸器合胞体ウイルス(「hRSV」)感染で起こる症状を想起させ、軽度の上気道疾患から重度の細気管支炎および肺炎に及ぶ臨床症状を示す児童28名から、パラミクソウイルス(Paramyxoviridae)科の新種ウイルスが分離された(Van Den Hoogen他、2001、Nature Medicine 7:719-724)。この新種ウイルスは、配列相同性および一連の遺伝子に基づいてヒトメタニューモウイルス(hMPV)と命名された。さらに、その研究によれば、ほぼ全てのオランダ人児童が、5歳までにhMPVに曝されており、このウイルスが少なくとも半世紀の間、ヒトの間で蔓延していること示された。その上、この感染症の流行時季はRSVに類似し、冬季がピークとなる(Robinson、2005、J.Med.Virol.76:98-105;Williams、2004、New Engl.J.Med.350:443-450)。しかし、RSVとは異なり、hMPVは、その率は低下するが通年分離することができる(Robinson、2005、J.Med.Virol.76:98-105;Williams、2004、New Engl.J.Med.350:443-450)。hMPV感染の危険因子も、RSVに対して見出されるものに類似している。ヒトメタニューモウイルスによる最高の感染率は、児童や、高齢で免疫力の弱い人々に見出されてきた。ヒトメタニューモウイルスによる感染は、危険な状態にある早産児の疾患、未熟児の慢性肺疾患、うっ血性心疾患および免疫不全症にとって相当な負担となる(Robinson、2005、J.Med.Virol.76:98-105;Williams、2004、New Engl.J.Med.350:443-450)。
【０００４】
ヒトメタニューモウイルスのゲノム構成は、van den Hoogen他、2002、Virology 295:119-132に記載されている。ヒトメタニューモウイルスは、最近北米の患者から分離された(Peret他、2002、J.Infect.Diseases 185:1660-1663)。
【０００５】
hMPVは、RSVと類似の遺伝子構造を共有するが、RSVに見出される非構造遺伝子を欠いている(van den Hoogen、2002、Virology 295:119-132)。両ウイルスとも、表面糖タンパク質(G)タンパク質および融合(F)タンパク質と定義される、類似の表面タンパク質をコードしている。GおよびFタンパク質のアミノ酸配列間の差に基づいて、RSV、hMPVは、共にAグループとBグループにさらに分けられている。しかし、hMPVでは、AおよびBサブグループが、A1、A2、B1およびB2の各分類にさらに分岐している(Boivin、2004、Emerg.Infect.Dis.10:1154-1157、25)。RSV、hMPV両ウイルスについて、Gタンパク質の配列はサブグループ間で大きな差異を示し、hMPV のGタンパク質は、A、Bサブグループ間で30%の同一性を有するにすぎない。RSV、hMPV両者について、Fタンパク質はもっと保存されており、既知のhMPV分離株間で、Fタンパク質のアミノ酸配列が95%保存されている(Biacchesi、2003、Virology 315:1-9;Boivin、2004、Emerg.Infect.Dis.10:1154-1157;van den Hoogen、2004、Emerg.Infect.Dis.10:658-666)。ウイルスの構造的類似性にもかかわらず、hMPVおよびRSVのFタンパク質は、33%のアミノ酸配列同一性を共有するにすぎず、RSV、hMPVのいずれかに対する抗血清は、ニューモウイルス群全体を中和するわけではない(Wyde、2003、Antiviral Research.60:51-59)。RSVでは、融合(F)タンパク質に対する単一のモノクローナル抗体が、重度の下気道RSV感染症を予防することができる。同様に、hMPVサブグループ間でFタンパク質の配列が高度に保存されているために、このタンパク質は、サブグループ間横断的な中和抗体の生成に対する好ましい抗原標的になると思われる。
【０００６】
ヒトメタニューモウイルスは、トリメタニューモウイルスと近縁である。例えば、hMPVのFタンパク質は、トリニューモウイルス(「APV」)のFタンパク質に対して高い相同性を有する。ヒトメタニューモウイルスのFタンパク質をマガモ(Mallard Duck)から単離したトリニューモウイルスのFタンパク質とアライメントすると、外部ドメインにおいて85.6%の同一性を示す。ヒトメタニューモウイルスのFタンパク質をシチメンチョウ(サブグループB)から単離したトリニューモウイルスのFタンパク質とアライメントすると、外部ドメインにおいて75%の同一性を示す。例えば、HallerおよびTangにより2002年2月21日に出願され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる「Recombinant Parainfluenza Virus Expression System and Vaccines Comprising Heterologous Antigens Derived from Metapneumovirus」という発明の名称の、同時所有され同時係属中の仮出願第60/358,934号を参照されたい。
【０００７】
APVが原因の呼吸器疾患は、1970年代後半に南アフリカで初めて記載された(Buys他、1980、Turkey 28:36-46)が、それによりシチメンチョウ産業が壊滅的な打撃を受けた。このシチメンチョウ疾患は、副鼻腔炎および鼻炎を特徴とし、シチメンチョウ鼻気管炎(TRT)と呼称された。欧州のAPV分離株も、ニワトリにおける頭部膨脹症候群(SHS)の要因として深く関与していた(O'Brien、1985、Vet.Rec.117:619-620)。当初、その疾患は、ニューカッスル病ウイルス(Newcastle disease virus)(NDV)に感染したブロイラーの群れに出現し、ニューカッスル病(ND)に付随する二次的問題とみなされた。欧州APVに対する抗体が、罹患したニワトリでSHS発症後に検出され(Cook他、1988、Avian Pathol.17:403-410)、APVがその原因であると関係付けられた。
【０００８】
このトリニューモウイルスは、パラミクソウイルス科ニューモウイルス(Pneumovirinae)亜科のメタニューモウイルス属に属する一本鎖非セグメント化RNAウイルスである(Cavanah and Barrett、1988、Virus Res.11:241-256;Ling他、1992、J.Gen.Virol.73:1709-1715;Yu他、1992、J.Gen.Virol.73:1355-1363)。パラミクソウイルス科は、パラミクソウイルス(Paramyxovirinae)亜科およびニューモウイルス亜科の2つに分けられる。パラミクソウイルス亜科としては、限定されるものではないが、パラミクソウイルス(Paramyxovirus)属、ルブラウイルス(Rubulavirus)属および麻疹ウイルス(Morbillivirus)属が挙げられる。最近、ニューモウイルス亜科が、遺伝子順序に基づいて2つの属、即ちニューモウイルスおよびメタニューモウイルスに分けられた(Naylor他、1998、J.Gen.Virol.、79:1393-1398;Pringle、1998、Arch.Virol.143:1449-1159)。ニューモウイルス属には、ヒト呼吸器合胞体ウイルス(hRSV)、ウシ呼吸器合胞体ウイルス(bRSV)、ヒツジ呼吸器合胞体ウイルス、およびマウスニューモウイルスが挙げられるが、それだけに限らない。メタニューモウイルス属には、ニューモウイルス属の基準種であるhRSVとは区別される、欧州トリニューモウイルス(サブグループAおよびB)が挙げられるが、それだけに限らない(Naylor他、1998、J.Gen.Virol.、79:1393-1398;Pringle、1998、Arch.Virol.143:1449-1159)。APVの米国分離株は、欧州分離株とは抗原および遺伝子から見て異なることが判明したので、メタニューモウイルス属内の第3のサブグループ(サブグループC)に相当する(Seal、1998、Virus Res.58:45-52;Serine他、1998、Proc.47th WPDC、California、pp.67-68)。
【０００９】
陰性染色したAPVの電子顕微鏡検査により、長さ1000〜2000nmに及ぶ長いフィラメントを有する直径80〜200nmの多形性で時には球形のビリオンが明らかとなっている(Collins and Gough、1988、J.Gen.Virol.69:909-916)。エンベロープは、長さ13〜15nmのスパイクが付いた膜でできている。ヌクレオキャプシドは、直径14nm、ピッチ7nmのらせん状である。該ヌクレオキャプシドは、直径が普通約18nmのパラミクソウイルス属および麻疹ウイルス属のものより小さい。
【００１０】
トリニューモウイルス感染症は、世界各地の家禽で長年存在していたのだが、米国ではようやく出現してきた疾患である。1996年5月、非常に伝染力の強いシチメンチョウの呼吸器疾患がコロラド州に出現し、その後APVが、アイオワ州エイムズ(Ames)の国立動物試験場(NVSL)で分離された(Senne他、1997、Proc.134th Ann.Mtg.、AVMA、pp.190)。この時以前には、米国およびカナダにはトリニューモウイルスがいないと考えられていた(Pearson他、1993、In:Newly Emerging and Re-emerging Avian Diseases:Applied Research and Practical Applications for Diagnosis and Control、pp.78-83;Hecker and Myers、1993、Vet.Rec.132:172)。1997年の初め、ミネソタ州のシチメンチョウにAPVの存在が血清試験で検出された。最初に確認した診断がなされた時までに、APV感染症は多数の農場へ既に広がっていた。この疾患は、上気道における臨床症状の泡沫眼、鼻汁および副鼻腔の腫脹を付随する。この疾患は二次感染症により悪化する。感染した鳥類の罹患率は100%に達することもある。致死率は、1〜90%の範囲に及ぶこともあり、6〜12週齢の家禽で最も高い。
【００１１】
トリニューモウイルスは接触により伝染する。鼻汁、罹患鳥類の運動、汚染水、汚染機器、汚染飼料トラックおよび出荷作業が、ウイルスの伝染に寄与し得る。回復したシチメンチョウはキャリヤーと考えられる。該ウイルスは、産卵シチメンチョウの卵管上皮に感染することが示されており、APVが若鳥で検出されてきたので、卵からの伝染も考えられる。
【００１２】
hMPVに関する最近の研究に基づけば、hMPVも同様に、ヒト、特に年少者の呼吸器疾患における重要な要因と思われる。
【００１３】
系統学的解析によれば、hMPV株は、APVウイルスとは異なるサブグループAおよびBと称する2つの遺伝子クラスターに分けられる(Bastien他、2003年aおよびb;Biacchesi他、2003年;Peret他、2002年および2004年;van den Hoogen、2002年)。これらのサブグループ内で、hMPVはさらに、A1、A2、B1およびB2のサブタイプにさらに分けることができる(van den Hoogen、2003年)。
【００１４】
相補性決定領域
重鎖および軽鎖の各可変領域には3個のCDRがあり、各可変領域に対してCDR1、CDR2およびCDR3と命名されている。これらのCDRの厳密な境界に対して、システム毎に異なった定義がなされてきた。Kabat記載のシステム(Kabat他、Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health、Bethesda、MD(1987)and(1991))は、抗体の任意の可変領域に適用できる明確な残基ナンバリングシステムを提供するだけでなく、3個のCDRを規定する正確な残基境界も示している。3個のCDRはKabat CDRと称してもよい。Chothiaとその共同研究者(Chothia & Lesk、J.Mol.Biol.196:901-917(1987)およびChothia他、Nature 342:877-883(1989))は、Kabat CDR内のある種の小部分が、アミノ酸配列レベルでの多様性が大きいにもかかわらず、ペプチド骨格のほぼ同一のコンホメーションを取っていることを見出した。これらの小部分は、L1、L2およびL3、またはH1、H2およびH3と命名されたが、ここで「L」および「H」は、各々軽鎖および重鎖の領域を指している。これらの領域は、Chothia CDRと称してもよく、Kabat CDRと重複する境界を有している。Kabat CDRと重複してCDRを規定する他の境界は、Padlan(FASEB J.9:133-139(1995))およびMacCallum(J Mol Biol 262(5):732-45(1996))によって記載された。CDR境界のさらに他の規定は、前記システム中の1つに厳密には従わない場合があるが、それでもKabat CDRとは重複するであろう。しかし、このような規定は、特定の残基もしくは残基中の基、またはCDR全体さえも抗原結合に有意な影響を及ぼさないという予測または実験的知見に鑑みて、短縮または延長する場合もある。本明細書で使用する方法は、これらのシステムのいずれでも、それに従って定義したCDRを利用してもよいが、好ましい実施形態ではKabatまたはClothia定義のCDRを使用する。
【発明の開示】
【００１５】
3.  発明の要旨
本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合し、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30および32のアミノ酸配列の少なくとも1つを含む抗体を提供する。特定の実施形態では、本発明の抗体は、ヒト抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。
【００１６】
本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体を生成する方法を提供する。
【００１７】
本発明は、さらに、本発明の抗体を用いて、ヒトメタニューモウイルスなどの哺乳動物メタニューモウイルスによる感染を治療し、診断する方法も提供する。本発明の抗体および製薬上許容しうる担体を含む医薬組成物も、提供される。
【００１８】
本発明は、本発明の抗体、または本発明の抗体の断片を含むキットも提供する。
【００１９】
本発明は、トリニューモウイルスに免疫特異的に結合する抗体も提供する。
【００２０】
本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質、哺乳動物呼吸器合胞体ウイルスのFタンパク質の双方と交差反応し、両方のウイルスを中和する抗体も提供する。
【００２１】
3.1  用語
本明細書で使用する場合、タンパク質性作用物質(例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび抗体)の「誘導体」とは、該タンパク質性作用物質の修飾型を指し、該修飾は、以下のもの:(i)アミノ酸残基置換の1個または複数の導入、(ii)1個または複数の欠失の導入、(iii)1個または複数の付加、(iv)該タンパク質性作用物質への任意の分子種の共有結合であって、例えばグリコシル化、アセチル化、ホルミル化、PEG化、リン酸化、アミド化、既知の保護基/封鎖基による誘導体化、タンパク質切断、細胞性のリガンドまたは他のタンパク質への結合を起こす共有結合、(v)1種または複数の非古典的アミノ酸の付加、および(vi)1種または複数の非古典的アミノ酸による置換、の1つまたは複数とし得る。タンパク質性作用物質の誘導体は、例えば化学修飾または組換えDNA技術により生成し得る。
【００２２】
本明細書で使用する場合、用語「有効量」とは、被験体における哺乳動物メタニューモウイルス感染の重度および/または期間を低減および/または改善し、哺乳動物メタニューモウイルス感染の進行を阻止し、哺乳動物メタニューモウイルス感染の退行を起こし、哺乳動物メタニューモウイルス感染に付随する1つまたは複数の症状の再発、発現または発症を予防し、あるいは別の療法(例えば、抗ウイルス剤の投与、および/または被験体の免疫系を強化する作用物質の投与)の予防または治療効果(複数も)を向上または改善するために、十分である治療剤の量(例えば、本発明の抗体の量)を指す。
【００２３】
本明細書で使用する場合、用語「成人」(「human adult」または「adult」)とは、18歳以上のヒトを指す。
【００２４】
本明細書で使用する場合、用語「子供」(「human child」もしくは「child」)またはその変形語とは、24カ月齢から18歳までのヒトを指す。
【００２５】
本明細書で使用する場合、用語「老人」(「elderly human」、「elderly」)またはその変形語とは、65歳以上、好ましくは70歳以上のヒトを指す。
【００２６】
本明細書で使用する場合、用語「幼児」(「human infant」もしくは「infant」)またはその変形語とは、24カ月齢未満、12カ月齢未満、6カ月齢未満、3カ月齢未満、2カ月齢未満、または1カ月齢未満のヒトを指す。
【００２７】
本明細書で使用する場合、用語「未熟児」(「human infant born prematurely」、「preterm infant」もしくは「premature infant」)またはその変形語とは、妊娠期間40週未満、妊娠期間35週未満で生まれた、6カ月齢未満、3カ月齢未満、2カ月齢未満、または1カ月齢未満のヒトを指す。
【００２８】
本明細書で使用する場合、用語「管理」(「manage」、「managing」および「management」)とは、疾患、例えば哺乳動物メタニューモウイルス感染症の治癒には到らないが、該疾患の進行または悪化を防止できる療法(例えば、哺乳動物メタニューモウイルスに対する抗体の投与)から、被験体が得る有益な効果を指す。
【００２９】
本明細書で使用する場合、用語「予防」(「prevent」、「preventing」および「prevention」)とは、被験体において治療剤の投与(例えば、哺乳動物メタニューモウイルスに対する抗体の投与)で得られる、疾患または障害(例えば、哺乳動物メタニューモウイルス感染症)の発現または発症の抑制、あるいはこのような疾患または障害の1つまたは複数の症状の再発、発症または発現の防止を指す。
【００３０】
本明細書で使用する場合、用語「予防有効量」とは、疾患または障害(例えば、哺乳動物メタニューモウイルス感染症)の発現、再発または発症を防止するのに十分である、治療剤(例えば、哺乳動物メタニューモウイルスに対する抗体の投与)の量を指す。
【００３１】
本明細書で使用する場合、用語「被験体」および「患者」は互換的に使用される。本明細書で使用する場合、用語「被験体」(「subject」および「subjects」)とは、哺乳類や鳥類などの動物を指す。哺乳類は、非霊長類(例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットおよびマウス)ならびに霊長類(例えば、カニクイザル、アフリカミドリザル、チンパンジーなどのサル、およびヒト)を包含する。鳥類は、それだけに限らないが、シチメンチョウ、ニワトリ、アヒルおよびガチョウを包含する。
【００３２】
本明細書で使用する場合、用語「治療有効量」とは、疾患または障害(例えば、哺乳動物メタニューモウイルス感染症)の重度を低減し、呼吸器病態の期間を減少させ、このような疾患または障害の1つまたは複数の症状を改善し、このような疾患または障害の進行を予防し、このような疾患または障害の退行を起こし、あるいは別の療法の治療効果(複数も)を向上または改善するために十分である、治療剤(例えば、哺乳動物メタニューモウイルスに対する抗体の投与)の量を指す。
【００３３】
3.2  略称および慣例
2008538353.tif 000003
変異の名称は、最初に野生型アミノ酸配列中のアミノ酸(1文字記号)、次に変異アミノ酸の位置、最後に変異アミノ酸(1文字記号)を示す。
【００３４】
3.3  生物材料の寄託
マウスハイブリドーマクローンhMPV 168A5.234.114は、寄託番号PTA-6713でATCC(American Type Culture Collection)に寄託した。また、マウスハイブリドーマクローンhMPV 168A5.338.284は、寄託番号PTA-6714でATCCに寄託した。ATCCの住所は、10801 University Blvd Manassas、VA 201 10-2209である。該寄託物は2005年5月12日に受領された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
4.  図面の簡単な説明
（図面の簡単な説明については後述）
5.  発明の詳細な説明
本発明は、ヒトメタニューモウイルス(hMPV)などの哺乳動物メタニューモウイルスに対する抗体を提供する。特に、本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合し、哺乳動物メタニューモウイルスに対して中和活性を有するモノクローナル抗体を提供する。本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質、哺乳動物呼吸器合胞体ウイルスのFタンパク質の双方と交差反応し、両方のウイルスを中和する抗体も提供する。本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスに対する組換え抗体、およびそのような組換え抗体を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明の組換え抗体は、哺乳動物メタニューモウイルス、例えばヒトメタニューモウイルスのFタンパク質に結合する。ある種の態様では、本発明の組換え抗体は、mAb338(ATCC寄託番号PTA6714)またはmAb234(ATCC寄託番号PTA6713)のCDRの少なくとも1つを含む。
【００３６】
本発明の抗体は、ヒトメタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する。ヒトメタニューモウイルスの例示的Fタンパク質は、配列番号33〜116のうち1つのアミノ酸配列を有する。異なるFタンパク質配列が、表2に示すようなヒトメタニューモウイルスの異なるウイルス分離株から誘導される。
【００３７】
表2: 異なるFタンパク質配列の起源             
配列番号33  分離株NL/1/00のFタンパク質配列
配列番号34  分離株UK/1/00のFタンパク質配列
配列番号35  分離株NL/2/00のFタンパク質配列
配列番号36  分離株NL/13/00のFタンパク質配列
配列番号37  分離株NL/14/00のFタンパク質配列
配列番号38  分離株FL/3/01のFタンパク質配列
配列番号39  分離株FL/4/01のFタンパク質配列
配列番号40  分離株FL/8/01のFタンパク質配列
配列番号41  分離株UK/1/01のFタンパク質配列
配列番号42  分離株UK/7/01のFタンパク質配列
配列番号43  分離株FL/10/01のFタンパク質配列
配列番号44  分離株NL/6/01のFタンパク質配列
配列番号45  分離株NL/8/01のFタンパク質配列
配列番号46  分離株NL/1O/01のFタンパク質配列
配列番号47  分離株NL/14/01のFタンパク質配列
配列番号48  分離株NL/20/01のFタンパク質配列
配列番号49  分離株NL/25/01のFタンパク質配列
配列番号50  分離株NL/26/01のFタンパク質配列
配列番号51  分離株NL/28/01のFタンパク質配列
配列番号52  分離株NL/30/01のFタンパク質配列
配列番号53  分離株BR/2/0lのFタンパク質配列
配列番号54  分離株BR/3/01のFタンパク質配列
配列番号55  分離株NL/2/02のFタンパク質配列
配列番号56  分離株NL/4/02のFタンパク質配列
配列番号57  分離株NL/5/02のFタンパク質配列
配列番号58  分離株NL/6/02のFタンパク質配列
配列番号59  分離株NL/7/02のFタンパク質配列
配列番号60  分離株NL/9/02のFタンパク質配列
配列番号61  分離株FL/1/02のFタンパク質配列
配列番号62  分離株NL/1/81のFタンパク質配列
配列番号63  分離株NL/1/93のFタンパク質配列
配列番号64  分離株NL/2/93のFタンパク質配列
配列番号65  分離株NL/4/93のFタンパク質配列
配列番号66  分離株NL/1/95のFタンパク質配列
配列番号67  分離株NL/2/96のFタンパク質配列
配列番号68  分離株NL/3/96のFタンパク質配列
配列番号69  分離株NL/1/98のFタンパク質配列
配列番号70  分離株NL/17/00のFタンパク質配列
配列番号71  分離株NL/22/01のFタンパク質配列
配列番号72  分離株NL/29/01のFタンパク質配列
配列番号73  分離株NL/23/01のFタンパク質配列
配列番号74  分離株NL/17/01のFタンパク質配列
配列番号75  分離株NL/24/01のFタンパク質配列
配列番号76  分離株NL/3/02のFタンパク質配列
配列番号77  分離株NL/3/98のFタンパク質配列
配列番号78  分離株NL/1/99のFタンパク質配列
配列番号79  分離株NL/2/99のFタンパク質配列
配列番号80  分離株NL/3/99のFタンパク質配列
配列番号81  分離株NL/11/00のFタンパク質配列
配列番号82  分離株NL/12/00のFタンパク質配列
配列番号83  分離株NL/1/01のFタンパク質配列
配列番号84  分離株NL/5/01のFタンパク質配列
配列番号85  分離株NL/9/01のFタンパク質配列
配列番号86  分離株NL/19/01のFタンパク質配列
配列番号87  分離株NL/21/01のFタンパク質配列
配列番号88  分離株UK/11/01のFタンパク質配列
配列番号89  分離株FL/1/01のFタンパク質配列
配列番号90  分離株FL/2/01のFタンパク質配列
配列番号91  分離株FL/5/01のFタンパク質配列
配列番号92  分離株FL/7/01のFタンパク質配列
配列番号93  分離株FL/9/01のFタンパク質配列
配列番号94  分離株UK/10/01のFタンパク質配列
配列番号95  分離株NL/1/02のFタンパク質配列
配列番号96  分離株NL/1/94のFタンパク質配列
配列番号97  分離株NL/1/96のFタンパク質配列
配列番号98  分離株NL/6/97のFタンパク質配列
配列番号99  分離株NL/7/00のFタンパク質配列
配列番号100  分離株NL/9/00のFタンパク質配列
配列番号101  分離株NL/19/00のFタンパク質配列
配列番号102  分離株NL/28/00のFタンパク質配列
配列番号103  分離株NL/3/01のFタンパク質配列
配列番号104  分離株NL/4/01のFタンパク質配列
配列番号105  分離株NL/11/01のFタンパク質配列
配列番号106  分離株NL/15/01のFタンパク質配列
配列番号107  分離株NL/18/01のFタンパク質配列
配列番号108  分離株FL/6/01のFタンパク質配列
配列番号109  分離株UK/5/01のFタンパク質配列
配列番号110  分離株UK/8/01のFタンパク質配列
配列番号111  分離株NL/12/02のFタンパク質配列
配列番号112  分離株HK/1/02のFタンパク質配列
配列番号113  HMPV分離株NL/1/00のFタンパク質配列
配列番号114  HMPV分離株NL/17/00のFタンパク質配列
配列番号115  HMPV分離株NL/1/99のFタンパク質配列
配列番号116  HMPV分離株NL/1/94のFタンパク質配列
ある種の実施形態では、本発明の抗体は、ヒトメタニューモウイルスの任意のFタンパク質に結合する。他の実施形態では、本発明の抗体は、該抗体がヒトメタニューモウイルスの異なる株のFタンパク質に結合するより、少なくとも2倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、500倍、または1000倍高い親和性で、ヒトメタニューモウイルスの1つの株のFタンパク質に結合する。
【００３８】
ある種の実施形態では、本発明の抗体は、ヒトMPVのFタンパク質に結合し、それにより前記ヒトMPVを中和することに加え、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)のFタンパク質に結合し、前記RSVを中和する。配列番号132〜154は、RSVのFタンパク質の例示的断片であって、RSVに対する抗体の免疫特異的結合を受ける断片の部分のアミノ酸配列を示す。ある種の実施形態では、本発明の抗体は、ヒトメタニューモウイルスなどの哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質、および配列番号132〜154のいずれか1つのアミノ酸配列に結合する。ある種の実施形態では、本発明の抗体は、ヒトメタニューモウイルスなどの哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質、および配列番号132〜154のいずれか1つと少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%、または少なくとも99.5%同一のアミノ酸配列に結合する。
【００３９】
本発明の抗体は、当分野で公知の任意の定常領域、好ましくは、それだけに限らないが、ヒト軽鎖カッパ(κ)、ヒト軽鎖ラムダ(λ)、IgG1の定常領域、IgG2の定常領域、IgG3の定常領域、またはIgG4の定常領域を含めた、当分野で公知の任意のヒト定常領域をさらに含み得る。
【００４０】
本発明は、ヒトメタニューモウイルスなどの哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する1つまたは複数の抗体を含む、医薬組成物、キットおよび製造品を提供する。
【００４１】
本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に結合する抗体を組換えDNA技術を用いて生成する方法も提供する。ある種の実施形態では、組換えDNA技術を用いて、mAb338またはmAb234のCDRのアミノ酸配列、あるいはmAb338またはmAb234のCDRと少なくとも85%、90%、95%、98%、99%、または少なくとも99.5%同一のアミノ酸配列を有するCDRを有する抗体を操作/作製する。ある種の実施形態では、組換えDNA技術を用いて、mAb338またはmAb234のVHおよび/またはVLを含んだ抗体を操作/作製する。ある種の実施形態では、組換えDNA技術を用いて、mAb338またはmAb234のVHおよび/またはVLと少なくとも85%、90%、95%、98%、99%、または少なくとも99.5%同一のアミノ酸配列を含んだ抗体を作製する。
【００４２】
ある種の実施形態では、本発明は、APVのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体も提供する。ある種の態様では、APVのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30または32のうちの1つまたは複数と少なくとも85%、90%、95%、98%、または100%同一のアミノ酸配列を含む。ある種の実施形態では、APVのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、mAb338またはmAb234の1つまたは複数の相補性決定領域(「CDR」)のアミノ酸配列を含む。ある種の実施形態では、第5.1節に記載したような哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、APVのFタンパク質にも結合する。トリニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、トリニューモウイルス感染の診断および治療に有用である。
【００４３】
ある種の実施形態では、本発明の抗体は、ヒトメタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合し、トリメタニューモウイルスのFタンパク質には交差反応しない。
【００４４】
ある種の実施形態では、本発明は、RSVのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体も提供する。ある種の実施形態では、抗体は、RSVの異なるFタンパク質の抗原性領域のアミノ酸配列である配列番号132〜154のいずれか1つと、少なくとも85%、90%、95%、98%、または100%同一のアミノ酸配列に免疫特異的に結合する。ある種の実施形態では、RSVのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、mAb338またはmAb234の1つまたは複数の相補性決定領域(「CDR」)のアミノ酸配列を含む。ある種の実施形態では、第5.1節に記載したような哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、RSVのFタンパク質にも結合する。
【００４５】
5.1  本発明の抗体
本発明の方法を用いて生成できる抗体または抗体断片は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、一本鎖Fv(scFv)、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Fab断片、F(ab')断片、ジスルフィド結合Fv(sdFv)、ならびに抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、本発明の抗体に対する抗Id抗体を含む)、細胞内発現抗体(intradoby)、および前記いずれかのエピトープ結合性断片を包含する。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性断片、即ち抗原結合部位を含む分子を包含する。免疫グロブリン分子は、いずれのタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)またはサブクラスであってもよい。
【００４６】
本発明の方法で使用できる抗体または抗体断片は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、一本鎖Fv(scFv)、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Fab断片、F(ab')断片、ジスルフィド結合Fv(sdFv)、ならびに抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、本発明の抗体に対する抗Id抗体を含む)、細胞内発現抗体、および前記いずれかのエピトープ結合性断片を包含する。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫活性断片、即ち抗原結合部位を含む分子を包含する。免疫グロブリン分子は、いずれのタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)またはサブクラスであってもよい。
【００４７】
本発明は、ヒトメタニューモウイルスなどの哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体を提供する。ある種の態様では、本発明の抗体は、最大で0.001nM、0.005nM、0.01nM、0.05nM、0.1nM、0.5nM、1nM、5nM、10nM、50nM、100nM、または最大で500nMのKDで哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に結合する。ある種の態様では、本発明の抗体は、最小で0.001nM、0.005nM、0.01nM、0.05nM、0.1nM、0.5nM、1nM、5nM、10nM、50nM、100nM、または最小で500nMのKDで哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に結合する。ある種の態様では、本発明の抗体のKDは0.5nM〜5nMである。
【００４８】
ある種の態様では、本発明の抗体は、最大で0.001μg/ml、0.005μg/ml、0.01μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、または最大で500μg/mlのIC50で、哺乳動物メタニューモウイルスを中和する。ある種の態様では、本発明の抗体は、少なくとも0.001μg/ml、0.005μg/ml、0.01μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、または少なくとも500μg/mlのIC50で、哺乳動物メタニューモウイルスを中和する。ある種の態様では、哺乳動物メタニューモウイルスを中和するための本発明の抗体のIC50は、0.01μg/ml〜10μg/ml、0.01μg/ml〜1μg/ml、0.1μg/ml〜1μg/ml、0.01μg/ml〜0.1μg/ml、0.5μg/ml〜5μg/ml、または0.05μg/ml〜2μg/mlである。
【００４９】
特に、本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する以下の抗体:mAb338(ATCC寄託番号PTA-6714)またはmAb234(ATCC寄託番号PTA-6713)を提供する。本発明は、mAb338(ATCC寄託番号PTA-6714)またはmAb234(ATCC寄託番号PTA-6713)の断片であって、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する断片も提供する。
【００５０】
本発明は、mAb338(ATCC寄託番号PTA-6714)またはmAb234(ATCC寄託番号PTA-6713)の可変重鎖(「VH」)ドメインおよび/または可変軽鎖(「VL」)ドメインのアミノ酸配列を各々有する、VHドメインおよび/またはVLドメインを含む抗体も提供する。本発明は、mAb338(ATCC寄託番号PTA-6714)またはmAb234(ATCC寄託番号PTA-6713)の1個または複数個の相補性決定領域(「CDR」)を含む抗体を提供する。各々mAb338およびmAb234のVL配列およびVH配列は、図6〜9に示されている。
【００５１】
本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体であって、mAb234(配列番号2)のVHドメインまたはmAb338(配列番号10)のVHドメインのアミノ酸配列を有する、VHドメインを含む抗体を提供する。ある種の実施形態では、本発明の抗体は、mAb234(配列番号2)のVHドメインのアミノ酸配列と、少なくとも85%、90%、95%、98%、99%、または少なくとも99.5%同一のアミノ酸配列を有するVHドメインを含む。ある種の実施形態では、本発明の抗体は、mAb338(配列番号10)のVHドメインのアミノ酸配列と、少なくとも85%、90%、95%、98%、99%、または少なくとも99.5%同一のアミノ酸配列を有するVHドメインを含む。
【００５２】
本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体であって、mAb234(配列番号18)のVLドメインまたはmAb338(配列番号26)のVLドメインのアミノ酸配列を有する、VLドメインを含む抗体を提供する。ある種の実施形態では、本発明の抗体は、mAb234(配列番号18)のVLドメインのアミノ酸配列と、少なくとも85%、90%、95%、98%、99%、または少なくとも99.5%同一のアミノ酸配列を有するVLドメインを含む。ある種の実施形態では、本発明の抗体は、mAb338(配列番号26)のVLドメインのアミノ酸配列と、少なくとも85%、90%、95%、98%、99%、または少なくとも99.5%同一のアミノ酸配列を有するVLドメインを含む。
【００５３】
ある種の実施形態では、本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質中にある、mAb234またはmAb338と同じエピトープに免疫特異的に結合する抗体を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質中にあるエピトープに、mAb234またはmAb338より2倍、5倍、10倍、25倍、50倍、または100倍高い親和性で結合する抗体を提供する。ある種の特定の実施形態では、本発明は、ヒトメタニューモウイルスのFタンパク質中にあって、ヒトメタニューモウイルスのFタンパク質のアミノ酸位置238、241および/または242を含むエピトープに、2倍、5倍、10倍、25倍、50倍、または100倍、より高い親和性で結合する抗体を提供する。ある種の特定の実施形態では、本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質中にあって、ヒトメタニューモウイルスのFタンパク質のアミノ酸位置238、241および/または242に相同なアミノ酸位置(複数も)を含むエピトープに、2倍、5倍、10倍、25倍、50倍、または100倍、より高い親和性で結合する抗体を提供する。相同な該アミノ酸位置は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質アミノ酸配列をヒトメタニューモウイルスのFタンパク質のアミノ酸配列とアライメントすることによって、確定できる。
【００５４】
ある種の実施形態では、本発明は、mAb234またはmAb338より高い親和性で、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に結合する抗体を同定する方法を提供する。ある種の態様では、試験抗体が、mAb234またはmAb338より高い親和性で、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に結合するか否かを決定するために、競合的結合アッセイを行う。例示的な実施形態では、mAb234またはmAb338を標識し、該試験抗体は標識しない。哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質は、固体表面上に固定化し、標識mAb234またはmAb338および該試験抗体と、抗体類のFタンパク質への結合を補助する条件下でインキュベートする。固体支持体上に検出できる標識(即ち、標識は、Fタンパク質および該抗体を介して固体支持体に結合される)の量は、mAb234またはmAb338がFタンパク質にどれ程結合しているかを示す尺度である。mAb234またはmAb338と比較して該試験抗体の親和性が高いほど、検出できる標識量は少ない。当業者に公知の任意の比較結合試験が、本発明の方法と共に使用できる。
【００５５】
本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体であって、下記の表1に列挙するVH CDRのいずれか1つのアミノ酸配列を有するVH CDR、または下記の表1に列挙するVH CDRのいずれか1つと少なくとも85%、90%、95%、98%、99%、もしくは少なくとも99.5%同一のアミノ酸配列を有するVH CDRを含む抗体を提供する。ある種の実施形態では、CDR配列はKabatまたはClothiaで定義したCDRを用いて推定される。
【００５６】
特に、本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体であって、下記の表1に列挙するVH CDRのいずれかのアミノ酸配列を有するVH CDRを1、2、3、4、5つまたはそれよりも多く含む(あるいはそれらからなる)抗体を提供する。一実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、配列番号4または配列番号12のアミノ酸配列を有するVH CDR1を含む。別の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、配列番号6または配列番号14のアミノ酸配列を有するVH CDR2を含む。別の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、配列番号8または配列番号16のアミノ酸配列を有するVH CDR3を含む。別の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、配列番号4または配列番号12のアミノ酸配列を有するVH CDR1と、配列番号6または配列番号14のアミノ酸配列を有するVH CDR2とを含む。別の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、配列番号4または配列番号12のアミノ酸配列を有するVH CDR1と、配列番号8または配列番号16のアミノ酸配列を有するVH CDR3とを含む。別の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、配列番号6または配列番号14のアミノ酸配列を有するVH CDR2と、配列番号8または配列番号16のアミノ酸配列を有するVH CDR3とを含む。別の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、配列番号4または配列番号12のアミノ酸配列を有するVH CDR1と、配列番号6または配列番号14のアミノ酸配列を有するVH CDR2と、配列番号8または配列番号16のアミノ酸配列を有するVH CDR3とを含む。
【００５７】
本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体であって、mAb234(配列番号18)またはmAb338(配列番号26)のVLドメインのアミノ酸配列を有する、VLドメインを含む抗体を提供する。本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体であって、mAb234(配列番号18)またはmAb338(配列番号26)のVLドメインのアミノ酸配列に、少なくとも85%、90%、95%、98%、99%、または少なくとも99.5%同一のアミノ酸配列を有するVLドメインを含む抗体を提供する。
【００５８】
本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体であって、下記の表1に列挙するVL CDRのいずれか1つのアミノ酸配列を有するVL CDRを含む抗体も提供する。本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体であって、下記の表1に列挙するVL CDRのいずれか1つのアミノ酸配列に、少なくとも85%、90%、95%、98%、99%、または少なくとも99.5%同一のアミノ酸配列を有するVL CDRを含む抗体も提供する。
【００５９】
特に、本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体であって、下記の表1に列挙するVL CDRのいずれかのアミノ酸配列を有するVL CDRを1、2、3つまたはそれよりも多く含む(あるいはそれらからなる)抗体を提供する。一実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、配列番号20または配列番号28のアミノ酸配列を有するVL CDR1を含む。別の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、配列番号22または配列番号30のアミノ酸配列を有するVL CDR2を含む。別の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、配列番号24または配列番号32のアミノ酸配列を有するVL CDR3を含む。別の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、配列番号20または配列番号28のアミノ酸配列を有するVL CDR1と、配列番号22または配列番号30のアミノ酸配列を有するVL CDR2とを含む。哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体の別の実施形態では、配列番号20または配列番号28のアミノ酸配列を有するVL CDR1と、配列番号24または配列番号32のアミノ酸配列を有するVL CDR3とを含む。別の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、配列番号22または配列番号30のアミノ酸配列を有するVL CDR2と、配列番号24または配列番号32のアミノ酸配列を有するVL CDR3とを含む。別の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、該抗体の一部として、配列番号20または配列番号28のアミノ酸配列を有するVL CDR1と、配列番号22または配列番号30のアミノ酸配列を有するVL CDR2と、配列番号24または配列番号32のアミノ酸配列を有するVL CDR3とを含む。
【００６０】
ある種の実施形態では、本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体であって、mAb234またはmAb338の1つまたは複数のCDRのアミノ酸配列(即ち、配列番号4、6、8、12、14、16、20、22、24、28、30または32のアミノ酸配列)、あるいはmAb234またはmAb338のCDRのアミノ酸配列(即ち、配列番号4、6、8、12、14、16、20、22、24、28、30または32のアミノ酸配列)に比して1、2、3、4、5、6または7個のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、またはアミノ酸付加を有する少なくとも1つのアミノ酸配列、を含む抗体を提供する。より特定の実施形態では、該アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。ある種の実施形態では、該アミノ酸置換は、1個のアミノ酸残基が側鎖に類似の電荷を有するアミノ酸残基で置換されたものである。側鎖に類似の電荷を有するアミノ酸残基の各群は、当分野で規定されてきた。こうした各群には、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)のアミノ酸が含まれる。ある種の実施形態では、該アミノ酸置換は、表1中の配列内の太字フォントで示されたアミノ酸位置にある。
【００６１】
2008538353.tif 000004
本発明は、ヒトメタニューモウイルスなどの哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体であって、mAb234もしくはmAb338のVHドメイン(即ち、配列番号2もしくは10)またはその相同体を、mAb234もしくはmAb338のVLドメイン(即ち、配列番号18もしくは26)またはその相同体と組み合わせて含む抗体を提供する。前記抗体は、mAb234またはmAb338の1つまたは複数のCDR(即ち、配列番号4、6、8、12、14、16、20、22、24、28、30または32のアミノ酸配列)、あるいはmAb234またはmAb338のCDRのアミノ酸配列(即ち、配列番号4、6、8、12、14、16、20、22、24、28、30または32のアミノ酸配列)に比して1、2、3、4、5、6または7個のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、またはアミノ酸付加を有する少なくとも1つのアミノ酸配列をさらに含み得る。
【００６２】
本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体であって、上記の表1に列挙した1つ以上のVH CDRと、1つ以上のVL CDRとを含む抗体を提供する。特に、本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体であって、VH CDR1およびVL CDR1;VH CDR1およびVL CDR2;VH CDR1およびVL CDR3;VH CDR2およびVL CDR1;VH CDR2およびVL CDR2;VH CDR2およびVL CDR3;VH CDR3およびVH CDR1;VH CDR3およびVL CDR2;VH CDR3およびVL CDR3;VH1 CDR1、VH CDR2およびVL CDR1;VH CDR1、VH CDR2およびVL CDR2;VH CDR1、VH CDR2およびVL CDR3;VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR2;VH CDR2、VH CDR2およびVL CDR3;VH CDR1、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR1、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR1;VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR2;VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR3;VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR2、VH CDR3、VL CDR2およびVL CDR3;VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3;VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3;VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3、または上記の表1に列挙したVH CDRおよびVL CDRの任意の組合せを含む(あるいは、それからなる)抗体を提供する。
【００６３】
一実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、配列番号4または配列番号12のアミノ酸配列を有するVH CDR1と、配列番号20または配列番号28のアミノ酸配列を有するVL CDR1とを含む。別の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、配列番号4または配列番号12のアミノ酸配列を有するVH CDR1と、配列番号22または配列番号30のアミノ酸配列を有するVL CDR2とを含む。別の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、配列番号4または配列番号12のアミノ酸配列を有するVH CDR1と、配列番号24または配列番号32のアミノ酸配列を有するVL CDR3とを含む。
【００６４】
一実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、配列番号6または配列番号14のアミノ酸配列を有するVH CDR2と、配列番号20または配列番号28のアミノ酸配列を有するVL CDR1とを含む。別の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、配列番号6または配列番号14のアミノ酸配列を有するVH CDR2と、配列番号22または配列番号30のアミノ酸配列を有するVL CDR2とを含む。別の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、配列番号6または配列番号14のアミノ酸配列を有するVH CDR2と、配列番号24または配列番号32のアミノ酸配列を有するVL CDR3とを含む。
【００６５】
一実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、配列番号8または配列番号16のアミノ酸配列を有するVH CDR3と、配列番号20または配列番号28のアミノ酸配列を有するVL CDR1とを含む。別の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、配列番号8または配列番号16のアミノ酸配列を有するVH CDR3と、配列番号22または配列番号30のアミノ酸配列を有するVL CDR2とを含む。別の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、配列番号8または配列番号16のアミノ酸配列を有するVH CDR3と、配列番号24または配列番号32のアミノ酸配列を有するVL CDR3とを含む。
【００６６】
本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する(前記したような)本発明の抗体をコードする、一般には単離された核酸分子を提供する。特に、本発明は、本発明の抗体をコードする単離核酸分子であって、以下のヌクレオチド配列:配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29および/または31のうち1つまたは複数、あるいは配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29および/または31と少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、または99.5%同一のヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を提供する。
【００６７】
特定の実施形態では、本発明はmAb234またはmAb338をコードする核酸を提供する。
【００６８】
本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体をコードする核酸分子であって、前記抗体が上記の表1に列挙した1種または複数のVH CDRおよび1種または複数のVL CDRを含む核酸分子を提供する。特に、本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体をコードする単離核酸分子であって、前記抗体がVH CDR1およびVL CDR1;VH CDR1およびVL CDR2;VH CDR1およびVL CDR3;VH CDR2およびVL CDR1;VH CDR2およびVL CDR2;VH CDR2およびVL CDR3;VH CDR3およびVH CDR1;VH CDR3およびVL CDR2;VH CDR3およびVL CDR3;VH1 CDR1、VH CDR2およびVL CDR1;VH CDR1、VH CDR2およびVL CDR2;VH CDR1、VH CDR2およびVL CDR3;VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR2;VH CDR2、VH CDR2およびVL CDR3;VH CDR1、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR1、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR1;VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR2;VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3およびVL CDR3;VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR2、VH CDR3、VL CDR2およびVL CDR3;VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR2;VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1およびVL CDR3;VH CDR1、VH CDR2、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3;VH CDR1、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3;VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、およびVL CDR3、または上記の表1に列挙したVH CDRおよびVL CDRの任意の組合せを含む(あるいは、それからなる)単離核酸分子を提供する。異なるドメインをコードするヌクレオチド配列の配列識別番号も、表1に列挙されている。
【００６９】
特定の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29および/または31のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を、含む。したがって、本発明は、表1に列挙し、前記したようなmAb234またはmAb338のドメインの組合せを含む抗体、および表1に列挙したmAb234またはmAb338のドメインの組合せを含む抗体であって該ドメインの1つまたは複数が配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29または31にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされている抗体を提供する。
【００７０】
別の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、mAb234またはmAb338のVHまたはVLドメインをコードするヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされたVHドメインのアミノ酸配列またはVLドメインのアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、mAb234またはmAb338のVHおよびVLドメインをコードするヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされたVHドメインのアミノ酸配列およびVLドメインのアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、表1に列挙されるVH CDRまたはVL CDRのいずれか1つをコードするヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされた、VH CDRのアミノ酸配列またはVL CDRのアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、表1に列挙されるVH CDRのいずれか1つ、および表1に列挙されるVL CDRのいずれか1つをコードするヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされたVH CDRのアミノ酸配列およびVL CDRのアミノ酸配列を含む。
【００７１】
別の実施形態では、本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体であって、mAb234またはmAb338のVHドメインおよび/またはVLドメイン(それぞれ、配列番号1および/または17、あるいは配列番号9および/または25)をコードするヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされたVHドメインおよび/またはVLドメインを含む抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体であって、mAb234またはmAb338のVH CDRおよび/またはVL CDRのヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされたVH CDRおよび/またはVL CDRを含む抗体を提供する。
【００７２】
本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体であって、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する、本明細書に記載のVHドメイン、VH CDR、VLドメインまたはVL CDRの誘導体を含む抗体を提供する。当業者に公知の標準的技法、例えば、部位特異的変異誘発およびアミノ酸置換を起こすPCR媒介変異誘発を含む技法を用いて、本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列中に変異(例えば、欠失、付加および/または置換)を導入することができる。好ましくは、該誘導体は、元の分子に対して25個未満のアミノ酸置換、20個未満のアミノ酸置換、15個未満のアミノ酸置換、10個未満のアミノ酸置換、5個未満のアミノ酸置換、4個未満のアミノ酸置換、3個未満のアミノ酸置換、または2個未満のアミノ酸置換を含む。好ましい実施形態では、該誘導体は、1個または複数の推定上の非必須アミノ酸残基(即ち、その抗体が哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合するのに重要ではないアミノ酸残基)においてなされた保存的アミノ酸置換を有する。ある種の実施形態では、変異は、飽和変異誘発などによりコード配列の全体または一部に沿ってランダムに導入できる。変異誘発の後、コードされた抗体を発現させることができ、該抗体が哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に結合する能力を決定することができる。当業者に公知のいずれの方法も、抗体の生物活性を試験するために使用できる。このような方法には、それだけに限らないが、直接的結合試験(例えば、Biacore)、mAb234もしくはmAb338との競合的結合、または哺乳動物メタニューモウイルスの増殖阻害が含まれる。
【００７３】
特定の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、mAb234もしくはmAb338、またはその抗原結合性断片のアミノ酸配列と、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%同一のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、mAb234またはmAb338のVHドメインと、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%同一のVHドメインのアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、mAb234またはmAb338のVLドメインと、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%同一のVLドメインのアミノ酸配列を含む。
【００７４】
別の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、表1に列挙するVL CDRのいずれかと、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%同一の1つまたは複数のVL CDRのアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、表1に列挙するVL CDRのいずれか1つと、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%同一の1つまたは複数のVL CDRのアミノ酸配列を含む。
【００７５】
別の実施形態では、本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体であって、mAb234またはmAb338をコードするヌクレオチド配列と、少なくとも65%、好ましくは少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%同一のヌクレオチド配列によりコードされる抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体であって、mAb234またはmAb338のVHドメインおよび/またはVLドメインのヌクレオチド配列(表1を参照されたい)と、少なくとも65%、好ましくは少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%同一のヌクレオチド配列によりコードされるVHドメインおよび/またはVLドメインを含む抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体であって、mAb234またはmAb338のVH CDRおよび/またはVL CDRのヌクレオチド配列と、少なくとも65%、好ましくは少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%同一のヌクレオチド配列によりコードされるVH CDRおよび/またはVL CDRを含む抗体を提供する。
【００７６】
本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質への結合について、本明細書に記載の抗体と競合する抗体を包含する。特に本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質への結合ついて、mAb234もしくはmAb338、またはその抗原結合性断片と競合する抗体を包含する。特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の競合アッセイまたは当分野で周知の競合アッセイにおいて、mAb234またはmAb338の哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に対する結合性を、対照に比して少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%もしくはそれより高い比率、25%〜50%、45〜75%、または75〜99%低下させる抗体を包含する。別の実施形態では、本発明は、ELISA競合アッセイにおいて、mAb234またはmAb338の哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に対する結合性を、対照に比して少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%もしくはそれより高い比率、または25%〜50%、45〜75%、もしくは75〜99%低下させる抗体を包含する。
【００７７】
特定の実施形態では、ELISA競合アッセイは以下のようにして行い得る。哺乳動物メタニューモウイルスの組換えFタンパク質を1μg/mlの濃度でPBS中に調製する。この溶液100μlをELISA用98穴マイクロタイタープレートの各ウェルに添加し、4〜8℃で終夜インキュベートする。該ELISA用プレートを0.1%Tween補足PBSで洗浄することにより、過剰の組換えFタンパク質を除く。PBS中に調製したウシ血清アルブミン(BSA)100μlを1%の最終濃度となるように添加することによって、非特異的タンパク質-タンパク質相互作用をブロックする。室温で1時間後、該ELISA用プレートを洗浄する。非標識競合抗体をブロッキング溶液中に様々な濃度で調製する。該非標識競合抗体の濃度は、10μg/ml〜0.01μg/mlの範囲としてよい。対照ウェルは、ブロッキング溶液だけを含むか、または1μg/ml〜0.01μg/mlの濃度範囲の対照抗体を含有する。西洋ワサビペルオキシダーゼまたはビオチンで標識した試験抗体(例えば、mAb234またはmAb338)を、一定の最終濃度1μg/mlで競合抗体希釈液に添加する。試験抗体の濃度は、アッセイ感度を高めるために下げることができ、例えば、試験抗体の濃度を500ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、10ng/mlまたは1ng/mlとしてもよい。試験抗体、競合抗体の混合液100μlをELISA用ウェルに三つずつ添加し、そのプレートを室温で1時間インキュベートする。未結合の残存抗体は洗い落とす。結合済み試験抗体は、各ウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ基質100μlを添加することにより、検出する。そのプレートを室温で30分間インキュベートし、自動プレートリーダーを用いて吸光度を読み取る。3つのウェルの平均値を計算する。試験抗体と十分に競合する抗体は、対照ウェルと比較して吸光度測定値を低下させる。
【００７８】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載または当業者に周知の競合アッセイ、例えばELISA競合アッセイにおいて、mAb234またはmAb338の抗原結合性断片(例えば、VHドメイン、VH CDR、VLドメインまたはVL CDR)を含む(あるいは、それからなる)抗体の哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に対する結合性を、対照に比して少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または25%〜50%、45〜75%、もしくは75〜99%低下させる抗体を包含する。
【００７９】
本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質への結合について、mAb234またはmAb338のVHドメインと競合するVHドメインを含む(あるいは、それからなる)、ポリペプチドまたはタンパク質を包含する。本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質への結合について、mAb234またはmAb338のVLドメインと競合するVLドメインを含む(あるいは、それからなる)、ポリペプチドまたはタンパク質も包含する。
【００８０】
本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質への結合について、上記表1に列挙したVH CDRと競合するVH CDRを含む(あるいは、それからなる)、ポリペプチドまたはタンパク質を包含する。本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質への結合について、上記表1に列挙したVL CDRと競合するVL CDRを含む(あるいは、それからなる)、ポリペプチドまたはタンパク質も包含する。
【００８１】
ある種の実施形態では、本発明は、前記したような哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体であって、例えば、任意種の分子の該抗体への共有結合により修飾されている抗体を提供する。限定するものではないが、例えば、該抗体は、例えばグリコシル化、アセチル化、PEG化、リン酸化、アミド化、既知の保護基/封鎖基による誘導体化、タンパク質切断、細胞性のリガンドまたは他のタンパク質への結合などにより、修飾することができる。多数の化学修飾のいずれでも、それだけに限らないが特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、チュニカマイシンの代謝合成などを包含する公知の技法によって、実行できる。その上、本発明の抗体は、1つまたは複数の非古典的アミノ酸を含有するように修飾し得る。
【００８２】
本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体であって、当業者に公知のフレームワーク領域(例えば、ヒト性または非ヒト性フレームワーク)を含む抗体も提供する。該フレームワーク領域は、天然またはコンセンサスフレームワーク領域でもよい。好ましくは、本発明の抗体の断片領域は、ヒト性である(ヒト性フレームワーク領域の一覧表については、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれているChothia他、1998、J.Mol.Biol.278:457-479を参照されたい)。
【００８３】
ある種の実施形態では、本発明の抗体はヒト化抗体である。抗体をヒト化するための当業者に公知の任意の方法を使用してもよい。特定の実施形態では、本発明の抗体は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている2004年8月20日出願の米国特許出願第10/923,068号(2005年2月24日にUS2005/0042664として公開)に教示される方法を用いてヒト化される。
【００８４】
ある種の実施形態では、本発明の抗体は完全なヒト抗体である。
【００８５】
完全なヒト抗体は、ヒト被験体の治療的処置にとって特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを用いる前記ファージディスプレー法を含めた、当分野で公知の多様な方法により作製できる。その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第4,444,887号および第4,716,111号、ならびに国際公開WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、WO98/16654、WO96/34096、WO96/33735、およびWO91/10741も参照されたい。
【００８６】
ヒト抗体は、機能性の内因性免疫グロブリンを発現できないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを用いても生成できる。例えば、ヒト重鎖/軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体は、ランダムに、または相同的組換えにより、マウス胚性幹細胞中に導入してもよい。あるいは、ヒト重鎖/軽鎖遺伝子以外に、ヒトの可変領域、定常領域および多様性領域をマウス胚性幹細胞中に導入してもよい。マウス重鎖/軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同的組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別に、またはそれと同時に非機能的にし得る。特に、JH領域のホモ接合的欠失によって、内因性抗体産生が阻止される。該改変胚性幹細胞を増殖させ、胚盤胞内にマイクロインジェクションすることにより、キメラマウスを作製できる。次いで、キメラマウスを繁殖させることにより、ヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を作製する。該トランスジェニックマウスは、選択した抗原、例えば、本発明のポリペプチドの全部または一部で通常通り免疫される。該抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いて免疫したトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスが保持するヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、B細胞の分化中に再構成され、その後クラススイッチおよび体細胞変異を受ける。したがって、このような技法を用いて、治療上有用なIgG、IgA、IgMおよびIgE抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概説については、LonbergおよびHuszar(1995、Int.Rev.Immunol.13:65-93)を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術、ならびにそのような抗体を産生するための処方に関する詳細な考察については、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、PCT公開WO98/24893、WO96/34096およびWO96/33735、ならびに米国特許第5,413,923号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,569,825号、第5,661,016号、第5,545,806号、第5,814,318号および第5,939,598号を参照されたい。さらに、Abgenix,Inc.(Freemont、CA)、Genpharm(San Jose、CA)などの企業は、前記類似の技術を用いて選択した抗原に対するヒト抗体を供給する業務を行うことができる。
【００８７】
ある種の実施形態では、本発明は、前記したような哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体であって、定常領域および/またはフレームワーク領域が、その抗体を投与するつもりの種、例えば、ヒト、霊長類、鳥類(例えば、シチメンチョウまたはニワトリ)、ウマ、ヤギまたはウシに由来する抗体を提供する。
【００８８】
本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体であって、フレームワーク領域中に変異(例えば、1個または複数のアミノ酸置換)を有するmAb234またはmAb338のアミノ酸配列を含む抗体を包含する。ある種の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、VHおよび/またはVLドメインのフレームワーク領域中に、1個または複数のアミノ酸残基置換を有するmAb234またはmAb338のアミノ酸配列を含む。ある種の実施形態では、本発明のヒト化抗体は、そのフレームワーク中にアミノ酸置換などの1個または複数の変異を含むように、さらに修飾されている。
【００８９】
一実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、本明細書に記載または当業者に周知のin vivoおよび/またはin vitroアッセイ(例えば、ELISAなどの免疫アッセイ)において、PBSや対照IgG抗体などの対照に比して、Fタンパク質と宿主細胞との相互作用を約25%、約30%、約35%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、または約98%抑制する、および/または低下させる。一実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、本明細書に記載または当業者に周知のin vivoおよび/またはin vitroアッセイ(例えば、ELISAなどの免疫アッセイ)において、PBSや対照IgG抗体などの対照に比して、Fタンパク質と宿主細胞との相互作用を少なくとも25%、30%、35%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または少なくとも98%抑制する、および/または低下させる。一実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、本明細書に記載または当業者に周知のin vivoおよび/またはin vitroアッセイ(例えば、ELISAなどの免疫アッセイ)において、PBSや対照IgG抗体などの対照に比して、Fタンパク質と宿主細胞との相互作用を多くとも25%、30%、35%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または多くとも98%抑制する、および/または低下させる。
【００９０】
ある種の実施形態では、本発明の抗体は、in vivoおよび/またはin vitroアッセイにおいて、PBSや対照IgG抗体などの対照に比して、哺乳動物宿主細胞などの宿主細胞に感染する、ヒトメタニューモウイルスなどの哺乳動物メタニューモウイルスの能力を、少なくとも25%、好ましくは少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%抑制する、および/または低下させる。
【００９１】
特定の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、哺乳動物メタニューモウイルスによる感染を抑制および/または低減するために、抗ウイルス剤と協働的に作用する。
【００９２】
哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する本発明の抗体は、単一特異的、二重特異的、三重特異的でもよく、またはそれより大きな多重特異性を示してもよい。多重特異抗体は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質の異なるエピトープに対して特異的でもよく、または哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質、ならびに該哺乳動物メタニューモウイルスの別種タンパク質のエピトープ双方に対して特異的でもよい。例えば、国際公開WO93/17715、WO92/08802、WO91/00360およびWO92/05793、Tutt,et.al.、J.Immunol.147:60-69(1991)、米国特許第4,474,893号、第4,714,681号、第4,925,648号、第5,573,920号および第5,601,819号、ならびにKostelny他、J.Immunol.148:1547-1553(1992)を参照されたい。
【００９３】
本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に対して高い結合親和性を有する抗体を提供する。特定の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスポリペプチドのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、会合速度定数、即ちkon速度(抗体(Ab)+抗原(Ag)→Ab-Ag)として、少なくとも10 5M-1s-1、少なくとも1.5×105 M-1s-1、少なくとも2×105 M-1s-1、少なくとも2.5×105 M-1s-1、少なくとも5×105 M-1s-1、少なくとも106 M-1s-1、少なくとも5×106 M-1s-1、少なくとも107 M-1s-1、少なくとも5×107 M-1s-1、もしくは少なくとも108 M-1s-1、または105〜108 M-1s-1、1.5×105 M-1s-1〜1×107 M-1s-1、2×105〜1×106 M-1s-1、もしくは4.5×105×107 M-1s-1を有する。好ましい実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、BIAcoreアッセイで決定した場合、少なくとも2×105 M-1s-1、少なくとも2.5×105 M-1s-1、少なくとも5×105 M-1s-1、少なくとも106 M-1s-1、少なくとも5×106 M-1s-1、少なくとも107 M-1s-1、少なくとも5×107 M-1s-1、または少なくとも108 M-1s-1のkonを有する。
【００９４】
ある種の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、BIAcoreアッセイで決定した場合、多くとも108 M-1s-1、多くとも109 M-1s-1、多くとも1010 M-1s-1、多くとも1011 M-1s-1、または多くとも1012 M-1s-1のkonを有する。
【００９５】
別の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、koff速度(抗体(Ab)+抗原(Ag)→Ab-Ag)として、10-3s-1未満、5×10-3s-1未満、10-4s-1未満、2×10-4s-1未満、5×10-4s-1未満、10-5s-1未満、5×10-5s-1未満、10-6s-1未満、5×10-6s-1未満、10-7s-1未満、5×10-7s-1未満、10-8s-1未満、5×10-8s-1未満、10-9s-1未満、5×10-9s-1未満もしくは10-10s-1未満、または10-3〜10-10s-1、10-4〜10-8s-1もしくは10-5〜10-8s-1を有する。別の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、koff速度(抗体(Ab)+抗原(Ag)→Ab-Ag)として、10-3s-1超、5×10-3s-1未満、10-4s-1未満、2×10-4s-1未満、5×10-4s-1未満、10-5s-1未満、5×10-5s-1未満、10-6s-1未満、5×10-6s-1未満、10-7s-1未満、5×10-7s-1未満、10-8s-1未満、5×10-8s-1未満、10-9s-1未満、5×10-9s-1未満もしくは10-10s-1未満、または10-3〜10-10s-1、10-4〜10-8s-1もしくは10-5〜10-8s-1を有する。
【００９６】
別の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、親和性定数、即ちKa(kon/koff)として、少なくとも102M-1、少なくとも5×102M-1、少なくとも103M-1、少なくとも5×103M-1、少なくとも104M-1、少なくとも5×104M-1、少なくとも105M-1、少なくとも5×105M-1、少なくとも106M-1、少なくとも5×106M-1、少なくとも107M-1、少なくとも5×107M-1、少なくとも108M-1、少なくとも5×108M-1、少なくとも109M-1、少なくとも5×109M-1、少なくとも1010M-1、少なくとも5×1010M-1、少なくとも1011M-1、少なくとも5×1011M-1、少なくとも1012M-1、少なくとも5×1012M-1、少なくとも1013M-1、少なくとも5×1013M-1、少なくとも1014M-1、少なくとも5×1014M-1、少なくとも1015M-1、または少なくとも5×1015M-1、または102〜5×105M-1、104〜1×1010M-1、または105〜1×108M-1を有する。別の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスポリペプチドのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、親和性定数、即ちKa(kon/koff)として、多くとも102M-1、多くとも5×102M-1、多くとも103M-1、多くとも5×103M-1、多くとも104M-1、多くとも5×104M-1、多くとも105M-1、多くとも5×105M-1、多くとも106M-1、多くとも5×106M-1、多くとも107M-1、多くとも5×107M-1、多くとも108M-1、多くとも5×108M-1、多くとも109M-1、多くとも5×109M-1、多くとも1010M-1、多くとも5×1010M-1、多くとも1011M-1、多くとも5×1011M-1、多くとも1012M-1、多くとも5×1012M-1、多くとも1013M-1、多くとも5×1013M-1、多くとも1014M-1、多くとも5×1014M-1、多くとも1015M-1、または多くとも5×1015M-1を有する。
【００９７】
別の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、解離定数、即ちKd(koff/kon)として、10-5M未満、5×10-5M未満、10-6M未満、5×10-6M未満、10-7M未満、5×10-7M未満、10-8M未満、5×10-8M未満、l0-9M未満、5×l0-9M未満、10-10M未満、5×10-10M未満、10-11M未満、5×10-11M未満、10-12M未満、5×10-12M未満、10-13M未満、5×10-13M未満、10-14M未満、5×10-14M未満、10-15M未満、または5×10-15M未満または10-2M〜5×10-5M、10-6〜10-15M、または10-8〜10-14Mを有する。別の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、解離定数、即ちKd(koff/kon)として、10-5M超、5×10-5M超、10-6M超、5×10-6M超、10-7M超、5×10-7M超、10-8M超、5×10-8M超、10-9M超、5×10-9M超、10-10M超、5×10-10M超、10-11M超、5×10-11M超、10-12M超、5×10-12M超、10-13M超、5×10-13M超、10-14M超、5×10-14M超、10-15M超、または5×10-15M超を有する。
【００９８】
本発明の抗体は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する、当分野公知の抗体を包含しない。しかし、本発明の抗体は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質、呼吸器合胞体ウイルスのFタンパク質の双方と交差反応する抗体を包含し得る。
【００９９】
本発明は、本明細書に記載の抗体の1個または複数の可変または超可変領域を含むペプチド、ポリペプチドおよび/またはタンパク質を提供する。好ましくは、本発明の抗体の1個または複数の可変または超可変領域を含むペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、異種アミノ酸配列をさらに含む。ある種の実施形態では、このような異種アミノ酸配列は、少なくとも5個連続したアミノ酸残基、少なくとも10個連続したアミノ酸残基、少なくとも15個連続したアミノ酸残基、少なくとも20個連続したアミノ酸残基、少なくとも25個連続したアミノ酸残基、少なくとも30個連続したアミノ酸残基、少なくとも40個連続したアミノ酸残基、少なくとも50個連続したアミノ酸残基、少なくとも75個連続したアミノ酸残基、少なくとも100個連続したアミノ酸残基、またはそれより多数個連続したアミノ酸残基を含む。このようなペプチド、ポリペプチドおよび/またはタンパク質は、融合タンパク質と呼んでもよい。
【０１００】
特定の実施形態では、本発明の抗体の1個または複数の可変または超可変領域を含むペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、長さが10アミノ酸残基、15アミノ酸残基、20アミノ酸残基、25アミノ酸残基、30アミノ酸残基、35アミノ酸残基、40アミノ酸残基、45アミノ酸残基、50アミノ酸残基、75アミノ酸残基、100アミノ酸残基、125アミノ酸残基、150アミノ酸残基、またはそれより多数のアミノ酸残基である。ある種の実施形態では、本発明の抗体の1個または複数の可変または超可変領域を含むペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する。
【０１０１】
特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載する抗体の1種のVHドメインおよび/またはVLドメイン(表1を参照されたい)を含むペプチド、ポリペプチドおよび/またはタンパク質を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、表1に列挙するCDRのいずれかのアミノ酸配列を有する1個または複数のCDRを含むペプチド、ポリペプチドおよび/またはタンパク質を提供する。こうした実施形態に従えば、該ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、異種アミノ酸配列をさらに含み得る。
【０１０２】
1個または複数の可変または超可変領域を含むペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、例えば、抗イディオタイプ抗体の作製に有用である。作製された該抗イディオタイプ抗体は、例えばELISAなどの免疫アッセイにおいて、該抗イディオタイプ抗体の作製に使用されるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の中に含有される可変または超可変領域を含む抗体の検出に利用もできる。
【０１０３】
ある種の特定の実施形態では、本発明の抗体は、ヒトメタニューモウイルスのサブグループ、即ちサブグループAまたはサブグループBに特異的に結合する。ある種の態様では、本発明の抗体は、サブグループAヒトメタニューモウイルスのFタンパク質と、サブグループBヒトメタニューモウイルスのFタンパク質より、少なくとも5倍、10倍、50倍、100倍または1000倍高い親和性で結合する。ある種の態様では、本発明の抗体は、サブグループAヒトメタニューモウイルスのFタンパク質と、サブグループBヒトメタニューモウイルスのFタンパク質より、多くとも5倍、10倍、50倍、100倍または1000倍高い親和性で結合する。ある種の態様では、本発明の抗体は、サブグループBヒトメタニューモウイルスのFタンパク質と、サブグループAヒトメタニューモウイルスのFタンパク質より、少なくとも5倍、10倍、50倍、100倍または1000倍高い親和性で結合する。ある種の態様では、本発明の抗体は、サブグループBヒトメタニューモウイルスのFタンパク質と、サブグループAヒトメタニューモウイルスのFタンパク質より、多くとも5倍、10倍、50倍、100倍または1000倍高い親和性で結合する。ある種の態様では、本発明の抗体は、ヒトメタニューモウイルスのサブグループAおよびBの双方に同等の親和性で特異的に結合する。
【０１０４】
ある種の特定の実施形態では、抗体は、ヒトメタニューモウイルスのあるサブタイプ、即ちサブタイプA1、A2、B1およびB2に特異的に結合する。ある種の態様では、本発明の抗体は、ヒトメタニューモウイルスの1サブタイプのFタンパク質と、ヒトメタニューモウイルスの異なるサブタイプのFタンパク質より、少なくとも5倍、10倍、50倍、100倍または1000倍高い親和性で結合する。ある種の態様では、本発明の抗体は、ヒトメタニューモウイルスの1サブタイプのFタンパク質と、ヒトメタニューモウイルスの異なるサブタイプのFタンパク質より、多くとも5倍、10倍、50倍、100倍または1000倍高い親和性で結合する。
【０１０５】
ある種の実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物メタニューモウイルスの全サブタイプ、即ちサブタイプA1、A2、B1およびB2に結合する。ある種の実施形態では、抗体は、ヒトメタニューモウイルスのあるサブタイプ、即ちサブタイプA1、A2、B1およびB2に特異的に結合する。
【０１０６】
ある種の実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物メタニューモウイルスの感染から哺乳動物を防御する。ある種のより特定な実施形態では、本発明の抗体は、ヒトメタニューモウイルスの感染からヒトを防御する。ある種の実施形態では、本発明の抗体は、トリメタニューモウイルスの感染から鳥類(例えば、ニワトリ、シチメンチョウおよびアヒル)を防御する。
【０１０７】
ある種の実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に、mAb338またはmAb234に対する耐性を付与することが確認されたアミノ酸置換(図5、第6.2節)のいずれか1つの近傍、即ち50アミノ酸以内、25アミノ酸以内、10アミノ酸以内、5アミノ酸以内、または2アミノ酸以内で結合する。特定の実施形態では、本発明の抗体は、mAb338またはmAb234に対する耐性を付与する変異により、やはり耐性が付与される抗体である。
【０１０８】
ある種の実施形態では、配列同一性の記述は、各配列番号のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の全長に亘るアラインメントを指す。
【０１０９】
5.1.1  半減期が拡大した抗体
本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合し、in vivo半減期が延長した抗体を提供する。特に、本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合し、被験体、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおいて、3日超、7日超、10日超、好ましくは15日超、25日超、30日超、35日超、40日超、45日超、2カ月超、3カ月超、4カ月超、または5カ月超の半減期を有する抗体を提供する。
【０１１０】
抗体(例えば、モノクローナル抗体、1本鎖抗体およびFab断片)のin vivoでの血清循環を延長するために、例えば、高分子量ポリエチレングリコール(PEG)などの不活性ポリマー分子を、多官能基リンカーを用い、または用いずに、抗体N末端もしくはC末端へのPEGの部位特異的結合により、またはリジン残基上に存在するε-アミノ基を介して、抗体に結合することができる。生物活性の減少を最小限に抑える線状または分枝ポリマーによる誘導体化が、使用されよう。PEG分子の抗体への適切な結合を保証するために、SDS-PAGEおよび質量分析によって結合度を綿密にモニターすることができる。未反応PEGは、サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーによって抗体-PEGコンジュゲート(conjugate)から分離できる。抗体のPEG誘導体は、当業者周知の方法、例えば本明細書に記載の免疫アッセイを用いて、その結合活性ならびにin vivo効力について試験できる。
【０１１１】
in vivo半減期が増加した抗体も、1個または複数のアミノ酸修飾(即ち、置換、挿入または欠失)をIgG定常ドメインまたはそのFcRn結合断片(好ましくはFcもしくはヒンジFcドメイン断片)を導入して、生成することができる。例えば、各々その全体が参照により本明細書に組み込まれている、国際公開WO98/23289、国際公開WO97/34631、国際公開WO02/060919、および米国特許第6,277,375号を参照されたい。
【０１１２】
さらに、抗体をアルブミンに結合することによって、抗体または抗体断片のin vivoでの安定性を高め、あるいはin vivoでの半減期を延長することができる。その技法は当分野で周知であり、例えば、いずれも参照により本明細書に組み込まれている、国際公開WO93/15199、WO93/15200およびWO01/77137、ならびに欧州特許第413,622号を参照されたい。
【０１１３】
5.1.2  抗体コンジュゲート
本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体またはその断片であって、該抗体が、融合タンパク質を生成するために、異種のタンパク質もしくはポリペプチド(またはその断片、好ましくはアミノ酸個数が少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、または少なくとも100のポリペプチド)に組換え融合または化学結合(共有、非共有両方の結合を含めて)している抗体またはその断片を提供する。特に、本発明は、本明細書に記載の抗体の抗原結合性断片(例えば、Fab断片、Fd断片、Fv断片、F(ab)2断片、VHドメイン、VH CDR、VLドメインまたはVL CDR(表1を参照されたい))と、異種のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。好ましくは、抗体または抗体断片が融合する異種タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、哺乳動物メタニューモウイルスに感染している、または哺乳動物メタニューモウイルスに感染する危険性がある組織をその抗体の標的とするのに有用である。特定の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体は、抗ウイルス剤に融合または結合される。タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを抗体または抗体断片に融合または結合する方法は、当分野で公知である。例えば、米国特許第5,336,603号、第5,622,929号、第5,359,046号、第5,349,053号、第5,447,851号および第5,112,946号、欧州特許EP307,434およびEP367,166、国際公開WO96/04388、およびWO91/06570、Ashkenazi et el.、1991、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10535-10539;Zheng他、1995、J.Immunol.154:5590-5600およびViI et el.、1992、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:11337-11341(前記引例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている)を参照されたい。
【０１１４】
追加の融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリング、および/またはコドンシャッフリング(「DNAシャッフリング」と総称される)の技法により生成し得る。DNAシャッフリングを用いて本発明の抗体またはその断片の活性を変化させ得る(例えば、親和性が増加し、解離速度が低下した抗体またはその断片)。全般的には、米国特許第5,605,793号、第5,811,238号、第5,830,721号、第5,834,252号および第5,837,458号、Patten他、1997、Curr.Opinion Biotechnol.8:724-33;Harayama、1998、Trends Biotechnol.16(2):76-82;Hansson他、1999、J.MoI.Biol.287:265-76およびLorenzo and Blasco、1998、Biotechniques 24(2):308-313(これらの特許および刊行資料は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている)を参照されたい。抗体もしくはその断片、またはコードされた抗体もしくはその断片は、変異性PCR、ランダムヌクレオチド挿入または他の組換え前の方法によるランダム変異誘発を受けることによって、改変し得る。哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する、抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドは、1種または複数種の異種分子の1種または複数種の構成要素、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などで組み換え得る。
【０１１５】
さらに、抗体またはその断片は、精製を促進するペプチドなどのマーカー配列に融合することができる。好ましい実施形態では、該マーカーアミノ酸配列は、その多くが市販されている中にあって、特に、pQEベクター(QIAGEN,Inc.、9259 Eaton Avenue、Chatsworth、CA、91311)中に入れるタグなどの6連ヒスチジンペプチドである。Gentz et el.、1989、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824に記載のように、例えば、6連ヒスチジンにより融合タンパク質が都合よく精製される。精製に有用な他のペプチドタグには、それだけに限らないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープ(Wilson他、1984、Cell 37:767)に相当するヘマグルチニン(「HA」)タグ、および「フラッグ」タグが含まれる。
【０１１６】
他の実施形態では、本発明の抗体またはその断片は、診断薬または検出薬に結合される。このような抗体は、哺乳動物メタニューモウイルス感染症の発症、発現、進行および/または重度を監視または予知するために、有用となり得る。このような診断および検出は、検出可能な物質に抗体を連結することにより実現できるが、そうした物質には、それだけに限らないが、多様な酵素、例えば、それだけに限らないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼ;補欠分子団、例えば、それだけに限らないが、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチン;蛍光物質、例えば、それだけに限らないが、ウンベリフェロン、フルオレッセイン、フルオレッセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレッセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリン;発光物質、例えば、それだけに限らないが、ルミノール;生物発光物質、例えば、それだけに限らないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリン;放射性物質、例えば、それだけに限らないが、ヨウ素(131I、125I、123Iおよび121I)、炭素(14C)、硫黄(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(115In、113In、112Inおよび111In)、テクネチウム(99Tc)、タリウム(201Ti)、ガリウム(68Ga、67Ga)、パラジウム(103Pd)、モリブデン(99Mo)、キセノン(133Xe)、フッ素(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Snおよび117Sn;ならびに様々なポジトロンCTを用いる陽電子放出金属、さらに非放射性常磁性金属イオンが含まれる。
【０１１７】
治療成分を抗体に結合する技法は周知であり、例えば、Arnon他、「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」、in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy、Reisfeld他(eds.)、pp.243-56(Alan R.Liss,Inc.1985);Hellstrom他、「Antibodies For Drug Delivery」、in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)、Robinson他(eds.)、pp.623-53(Marcel Dekker,Inc.1987);Thorpe、「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review」、in Monoclonal Antibodies 84:Biological And Clinical Applications、Pinchera他(eds.)、pp.475-506(1985);「Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」、in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy、Baldwin他(eds.)、pp.303-16(Academic Press 1985)およびThorpe他、1982、Immunol.Rev.62:119-58を参照されたい。
【０１１８】
代替法として、本発明の抗体を第2の抗体に結合することにより、米国特許第4,676,980号にSegalが記載するような抗体ヘテロコンジュゲート、あるいは米国特許第5,470,570号にTaylorが記載し、または国際特許出願公開WO2004/024889にMohamed他が記載するような抗体ヘテロポリマーを形成できるが、いずれもその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０１１９】
本発明の抗体はまた、哺乳動物メタニューモウイルスまたは哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質の免疫アッセイまたは精製に特に有用である固定支持体に結合し得る。そのような固定支持体にはそれだけに限らないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、塩化ポリビニルまたはポリプロピレンが含まれる。
【０１２０】
5.1.3.MPV Fタンパク質特異抗体の生成戦略
ヒトメタニューモウイルスなどの哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体を生成するために、当業者に公知の任意の技法を使用できる。このような技法には、それだけに限らないが、マウス、ハムスターまたはHu-mAbマウスを用いる標準的ハイブリドーマ技術、および組換え技術が含まれる。ハイブリドーマ技法のための免疫は、例えば、DNA免疫、Fタンパク質を発現するキメラウイルスによる感染、Fタンパク質を発現する被トランスフェクション細胞による免疫、哺乳動物メタニューモウイルスによる感染、MPV感染細胞による免疫、アデノウイルス媒介MPV Fタンパク質による免疫、およびhMPV Fタンパク質による免疫によって行うことができる。例示的な組換え技術は、標的として可溶性MPV Fを用いるファージディスプレー(Dyax)である。Fタンパク質の個々の断片またはエピトープも、免疫に使用することができる。
【０１２１】
モノクローナル抗体は、当業者に公知の任意の方法を用いて選択し、単離することができる。例示的な実施形態では、感染細胞ELISAを用いて陽性ハイブリドーマを選択する。バックグランド細胞に対して反応性が5倍のハイブリドーマを選択する。陽性ハイブリドーマは、ウェル24個まで増殖させ、感染細胞ELISAを用いて再試験する。in vitroでの中和もこの段階で試験する。その後、限界希釈クローニングを行う。そのハイブリドーマは、感染細胞ELISAおよび中和作用を用いて再試験する。次いで、その陽性ハイブリドーマを用いることにより、当業者に公知の任意の方法を用いて抗体を産生し、精製することができる。
【０１２２】
5.2  治療
本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスによる感染症を予防、管理、治療および/または改善する方法も提供する。本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する1つまたは複数の抗体と、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体以外の1つまたは複数の予防剤または治療剤とを含む組成物、ならびに前記組成物を利用して疾患または障害を予防、管理、治療および/または改善する方法も提供する。治療剤または予防剤には、それだけに限らないが、小分子、合成薬、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸(例えば、それだけに限らないが、アンチセンスヌクレオチド配列、三重らせん、RNAi、および生物活性なタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含めた、DNAおよびRNAヌクレオチド)、抗体、合成または天然無機分子、模倣剤、および合成または天然有機分子が含まれる。
【０１２３】
本発明の抗体は、他のウイルスに対する他の抗ウイルス剤と併用して、広範囲の抗ウイルス治療および/または予防をもたらすことができる。このような広範囲抗ウイルス治療は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、2003年7月25日出願の米国特許出願第10/628,088号(US2004/0096451として2004年5月20日に公開)に記載されている。
【０１２４】
ある種の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスによる感染症を治療または予防するために、1つまたは複数の免疫賦活剤が、本発明の抗体と組み合わせて投与される。
【０１２５】
本発明のある種の実施形態では、本発明で同定したMARM(図5、13〜16)を含むペプチドを被験体に投与することができる。より特定な実施形態では、該ペプチドは、該ペプチドが保持するMARMの選択に用いた抗体と組み合わせて投与される。理論にこだわるわけではないが、該MARM保有ペプチドは、投与しようとしている抗体の中和作用を逃れるために、被験体内で進化する恐れのある任意のウイルスに対して抗体を誘導するであろう。ある種の実施形態では、該ペプチドの長さは、少なくとも5、10、15、25、50、75、100、250または500アミノ酸である。ある種の実施形態では、該ペプチドの長さは、多くとも5、10、15、25、50、75、100、250または500アミノ酸である。
【０１２６】
5.2.1  抗ウイルス剤
本発明の抗体以外に、当業者に周知の任意の抗ウイルス剤を本発明の組成物および方法において使用することができる。抗ウイルス剤の非限定的な例には、ウイルスの受容体への結合、ウイルスの細胞内への取り込み、ウイルスの複製、またはウイルスの細胞からの放出を抑制および/または低減する、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク抗体、核酸分子、有機分子、無機分子および小分子が含まれる。特に、抗ウイルス剤には、それだけに限らないが、ヌクレオシド類縁体(例えば、ジドブジン、アシクロビル、ガンシクロビル、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルリジンおよびリバビリン)、フォスカーネット、アマンタジン、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、リトナビル、α-インターフェロンおよび他のインターフェロン、ならびにAZTなどが挙げられる。
【０１２７】
特定の実施形態では、該抗ウイルス剤は、ウイルス抗原に免疫特異的な免疫賦活剤である。本明細書で使用する場合、用語「ウイルス抗原」には、それだけに限らないが、免疫反応を誘発できる任意のウイルスペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質(例えば、HIV gpl20、HIV nef、RSV F糖タンパク質、RSV G糖タンパク質、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン、HTL V tax、単純疱疹ウイルス(herpes simplex virus)糖タンパク質(例えば、gB、gC、gDおよびgE)および肝炎B表面抗原、ならびにPIV抗原)が含まれる。ウイルス感染症の治療のために本発明において有用な抗体には、それだけに限らないが、病原性ウイルスの抗原に対する抗体が含まれ、該病原性ウイルスには、それだけに限らないが、例えば:アデノウイルス科(例えば、マストアデノウイルス(mastadenovirus)およびアビアデノウイルス(aviadenovirus))、ヘルペスウイルス科(例えば、単純疱疹ウイルス1、単純疱疹ウイルス2、単純疱疹ウイルス5および単純疱疹ウイルス6)、レヴウイルス科(例えば、レヴウイルス(levivirus)、腸内細菌フェーズ(phase)MS2、アロレヴウイルス(allolevirus))、ポックスウイルス科(例えば、コードポックスウイルス(chordopoxvirinae)、パラポックスウイルス(parapoxvirus)、アビポックスウイルス(avipoxvirus)、カプリポックスウイルス(capripoxvirus)、レポリポックスウイルス(leporiipoxvirus)、スイポックスウイルス(suipoxvirus)、モルスキポックスウイルス(molluscipoxvirus)およびエントモポックスウイルス(entomopoxvirinae))、パポバウイルス科(例えば、ポリオーマウイルス(polyomavirus)およびパピローマウイルス(papillomavirus))、パラミクソウイルス科(例えば、パラミクソウイルス(paramyxovirus)、パラインフルエンザウイルス(parainfluenza virus)1、モビリウイルス(例えば、はしかウイルス(measles virus))、ルブラウイルス(例えば、ムンプスウイルス(mumps virus))、ニューモノウイルス(例えば、ニューモウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス)、およびトリニューモウイルス)、ピコルナウイルス科(例えば、エンテロウイルス(enterovirus)、リノウイルス(rhinovirus)、ヘパトウイルス(hepatovirus)(例えば、ヒトA型肝炎ウイルス(human hepatits A virus))、カルジオウイルス(cardiovirus)およびアプトウイルス(apthovirus))、レオウイルス科(例えば、オルトレオウイルス(orthoreovirus)、オルビウイルス(orbivirus)、ロタウイルス(rotavirus)、サイポウイルス(cypovirus)、フィジーウイルス(fijivirus)、ファイトレオウイルス(phytoreovirus)およびオリザウイルス(oryzavirus))、レトロウイルス科(例えば、哺乳類B型レトロウイルス(retrovirus)、哺乳類C型レトロウイルス、鳥類C型レトロウイルス、D型レトロウイルス群、BLV-HTLVレトロウイルス、レンチウイルス(例えば、ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)1およびヒト免疫不全ウイルス2)、スプーマウイルス(spumavirus))、フラビウイルス科(例えば、C型肝炎ウイルス(hepatitis C virus))、ヘパドナウイルス科(例えば、B型肝炎ウイルス)、トガウイルス科(例えば、アルファウイルス(alphavirus)(例えば、シンドビスウイルス(sindbis virus))およびルビウイルス(例えば、ルベラウイルス(rubella virus)))、ラブドウイルス科(例えば、ベシクロウイルス(vesiculovirus)、リッサウイルス(lyssavirus)、エフェメロウイルス(ephemerovirus)、サイトラブドウイルス(cytorhabdovirus)およびネクレオラブドウイルス(necleorhabdovirus))、アレナウイルス科(例えば、アレナウイルス(arenavirus)、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(lymphocytic choriomeningitis virus)、イッピーウイルス(Ippy virus)およびラッサウイルス(lassa virus))、ならびにコロナウイルス科(例えば、コロナウイルス(coronavirus)およびトロウイルス(torovirus))が含まれる。
【０１２８】
ウイルス感染症の治療に有用な入手可能な抗体の具体例には、それだけに限らないが、HIV感染症の治療に有用なCD4融合抗体であるPRO542(Progenies)、B型肝炎の治療に有用なヒト抗体であるOstavir(Protein Design Labs,Inc.、CA)およびサイトメガロウイルス(CMV)の治療に有用なヒト化IgG1抗体であるProtovir(Protein Design Labs,Inc.、CA)、ならびにRSVの治療に有用なヒト化抗体であるパリビツマブ(SYNAGIS(登録商標)、Medimmune、国際公開WO02/43660)が含まれる。
【０１２９】
特定の実施形態では、本発明の組成物および方法に使用される抗ウイルス剤は、肺または呼吸器ウイルス感染症を抑制または軽減し、肺または呼吸器感染症を起こすウイルスの複製を抑制または軽減し、あるいは肺または呼吸器感染症を起こすウイルスの他の細胞または被験体への拡大を抑制または軽減する。別の好ましい実施形態では、本発明の組成物および方法に使用される抗ウイルス剤は、RSV、hMPVまたはPIVによる感染を抑制または軽減し、RSV、hMPVまたはPIVの複製を抑制または軽減し、あるいは他の細胞または被験体に対するRSV、hMPVまたはPIVの拡大を抑制または軽減する。RSV、hMPVおよび/またはPIVを治療するこのような薬剤および方法の例には、それだけに限らないが、ジドブジン、アシクロビル、ガンシクロビル、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルリジン、リバビリンなどのヌクレオシド類縁体、ならびにフォスカーネット、アマンタジン、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、リトナビルと、α-インターフェロン、ならびに国際特許出願公開WO2005/061513にBond他により開示されているヌクレオチド類縁化合物414Bおよび363Bが含まれる。
【０１３０】
ある種の実施形態では、本発明の方法および組成物は、哺乳動物メタニューモウイルスおよびRSVによる感染症を治療および/または予防するために、使用される。例示的な実施形態では、RSV抗原に免疫特異的に結合する抗体および本発明の抗体は、哺乳動物メタニューモウイルスおよびRSVによる感染症を治療するために、同時に投与される。ある種の実施形態では、抗RSV抗原抗体は、RSVのAグループのRSV抗原に免疫特異的に結合する。他の実施形態では、抗RSV抗原抗体は、RSVのBグループのRSV抗原に免疫特異的に結合する。他の実施形態では、抗体は、一方のグループのRSV抗原に結合し、他方のグループの類似抗原と交差反応をする。特定の実施形態では、該抗RSV抗原抗体は、RSV核タンパク質、RSVリンタンパク質、RSVマトリックスタンパク質、RSV小型疎水性タンパク質、RSV RNA依存性RNAポリメラーゼ、RSV Fタンパク質および/またはRSV Gタンパク質に免疫特異的に結合する。別の特定の実施形態では、該抗RSV抗原抗体は、RSV核タンパク質、RSVヌクレオキャプシドタンパク質、RSVリンタンパク質、RSVマトリックスタンパク質、RSV付着糖タンパク質、RSV融合糖タンパク質、RSVヌクレオキャプシドタンパク質、RSVマトリックスタンパク質、RSV小型疎水性タンパク質、RSV RNA依存性RNAポリメラーゼ、RSV Fタンパク質、RSV Lタンパク質、RSV Pタンパク質および/またはRSV Gタンパク質の対立遺伝子変異体に結合する。
【０１３１】
RSV抗原に免疫特異的に結合する抗体は当分野で公知であることを認識されたい。例えば、パリビツマブ(SYNAGIS(登録商標))は、小児患者におけるRSV感染の予防に現在使用されているヒト化モノクローナル抗体である。特定の実施形態では、本発明の方法と共に使用すべき抗体は、パリビツマブまたはその抗体結合性断片である(例えば、1個または複数の相補性決定領域(CDR)を含有する断片、好ましくはパリビツマブの可変ドメイン)。パリビツマブのアミノ酸配列は、例えば、Johnson他、1997、J.Infectious Disease 176:1215-1224および米国特許第5,824,307号、ならびにYoung他による「Methods of Administering/Dosing Anti-RSV Antibodies for Prophylaxis and Treatment」という名称の国際特許出願公開WO02/43660に開示されているが、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０１３２】
RSV抗原に免疫特異的に結合し、パリビツマブのFcドメインよりFcRn受容体に対して高い親和性を有するFcドメインを含む、1つまたは複数の抗体またはその抗原結合性断片も、本発明に従って使用することができる。このような抗体は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、2001年12月12日出願の米国特許出願第10/020,354号に記載されている。さらに、抗RSV抗原抗体であるA4B4;P12f2 P12f4;PIld4;Ale9;A12a6;A13c4;A17d4;A4B4;1X-493L1;FR H3-3F4;M3H9;Y10H6;DG;AFFF;AFFF(I);6H8;L1-7E5;L2-15B10;A13al1;Alh5;A4B4(1);A4B4-F52SまたはA4B4L1FR-S28Rのうち1つまたは複数を、本発明に従って使用することができる。これらの抗体は、Young他による「Methods of Administering/Dosing Anti-RSV Antibodies for Prophylaxis and Treatment」という名称の国際特許出願公開WO02/43660、および「Methods of Treating and Preventing RSV,HMPV,and PIV Using Anti-RSV,Anti-HMPV,and Anti-PIV Antibodies」という名称の2002年7月25日出願の米国仮特許出願第60/398,475号に開示されているが、いずれもその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３３】
ある種の実施形態では、該抗RSV抗原抗体は、Young他によるいずれも「Methods of Administering/Dosing Anti-RSV Antibodies for Prophylaxis and Treatment」という名称の2000年11月28日出願の米国特許出願第09/724,531号、2001年11月28日出願の同第09/996,288号、および2003年5月15日公開の米国特許公開第US2003/0091584A1号の方法の抗RSV抗原抗体であるか、その方法により調製されるが、いずれもその全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明の方法に使用できる安定化抗体製剤のための方法および組成物は、2002年6月14日出願の米国仮特許出願第60/388,921号および2002年6月14日出願の同第60/388,920号に開示されているが、いずれもその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０１３４】
抗ウイルス治療剤およびその投与量、投与経路ならびに推奨使用法は、当分野で公知であり、Physician's Desk Reference(第56版、2002年)などの文献中に記載されてきた。呼吸器ウイルス感染症に関する追加情報は、Cecil Textbook of Medicine(第18版、1988年)で入手できる。
【０１３５】
5.2.2  抗細菌剤
ある種の実施形態では、本発明の抗体、本発明の組成物、および本発明の方法は、哺乳動物における肺系の細菌感染症などの、細菌感染症の治療および予防のための組成物および方法と組み合わせて使用することができる。
【０１３６】
細菌感染症の予防、治療、管理または改善を目的とした当業者に周知の抗細菌剤および治療剤は、本発明の組成物および方法において使用することができる。抗細菌剤の非限定的な例には、細菌感染症を抑制または軽減し、細菌の複製を抑制または軽減し、あるいは細菌の他の被験体への拡大を抑制または軽減する、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、抗体、核酸分子、有機分子、無機分子および小分子が含まれる。特に、抗細菌剤の例には、それだけに限らないが、ペニシリン、セファロスポリン、イミペネム、アクストレオナム(axtreonam)、バンコマイシン、サイクロセリン、バシトラシン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、クリンダマイシン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、ゲンタマイシン、アミカシン、カナマイシン、ネオマイシン、スペクチノマイシン、トリメトプリム、ノルフロキサシン、リファンピン、ポリミキシン、アンホテリシンB、ナイスタチン、ケトカナゾール、イソニアジド、メトロニダゾールおよびペンタミジンが含まれる。
【０１３７】
好ましい実施形態では、該抗細菌剤は、肺または呼吸器細菌感染症を抑制または軽減し、肺または呼吸器感染症を起こす細菌の複製を抑制または軽減し、あるいは肺または呼吸器感染症を起こす細菌の他の被験体への拡大を抑制または軽減する薬剤である。肺または呼吸器細菌感染症がマイコプラズマ感染症(例えば、咽頭炎、気管気管支炎および肺炎)である場合、該抗細菌剤は、好ましくはテトラサイクリン、エリスロマイシンまたはスペクチノマイシンである。肺または呼吸器細菌感染症が、好気性グラム陰性桿菌(GNB)により起こる肺炎である場合、該抗細菌剤は、好ましくはペニシリン、第1、第2または第3世代セファロスポリン(例えば、セファクロル、セファドロキシル、セファレキシンまたはセファゾリン)、エリトリオマイシン(erytliomycin)、クリンダマイシン、アミノグリコシド(例えば、ゲンタマイシン、トブラマイシンまたはアミカシン)、あるいはモノラクタム(例えば、アズトレオナム)である。肺または呼吸器細菌感染症が結核である場合、該抗細菌剤は、好ましくはリファンプシン(rifampcin)、イソニアジド、ピランジナミド、エタンブトールおよびストレプトマイシンである。呼吸器感染症が再発性吸引性肺炎である場合、該抗細菌剤は、好ましくはペニシリン、アミノグリコシド、または第2もしくは第3世代セファロスポリンである。
【０１３８】
抗細菌治療剤およびその投与量、投与経路ならびに推奨使用法は、当分野で公知であり、Physician's Desk Reference(第56版、2002年)などの文献中に記載されてきた。呼吸器感染症および抗細菌治療剤に関する追加情報は、Cecil Textbook of Medicine(第18版、1988年)で入手できる。
【０１３９】
5.2.8  抗真菌剤
ある種の実施形態では、本発明の抗体、本発明の組成物、および本発明の方法は、哺乳動物における肺系の真菌感染症などの、真菌感染症の治療および予防のための組成物および方法と組み合わせて使用することができる。
【０１４０】
真菌感染症または1つもしくは複数の症状(例えば、真菌呼吸器感染症)の予防、管理、治療および/または改善を目的とした当業者に周知の抗真菌剤および治療剤は、本発明の組成物および方法において使用することができる。抗真菌剤の非限定的な例には、真菌感染症を抑制および/または軽減し、真菌の複製を抑制および/または軽減し、あるいは真菌の他の被験体への拡大を抑制および/または軽減する、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、抗体、核酸分子、有機分子、無機分子および小分子が含まれる。抗真菌剤の具体例には、それだけに限らないが、アゾール薬物(例えば、ミコナゾール、ケトコナゾール(NIZORAL(登録商標))、酢酸カスポファンジン(CANCIDAS(登録商標))、イミダゾール、トリアゾール(例えば、フルコナゾール(DIFLUCAN(登録商標))およびイトラコナゾール(SPORANOX(登録商標)))、ポリエン(例えば、ナイスタチン、アンホテリシンB(FUNGIZONE(登録商標))、アンホテリシンB脂質複合体(「ABLC」)(ABELCET(登録商標))、アンホテリシンBコロイド分散液(「ABCD」)(AMPHOTEC(登録商標))、リポソーム型アンホテリシンB(AMBISONE(登録商標))、ヨウ化カリウム(KI)、ピリミジン(例えば、フルシトシン(ANCOBON(登録商標))、ならびにボリコナゾール(VFEND(登録商標))が含まれる。
【０１４１】
ある種の実施形態では、該抗真菌剤は、呼吸器真菌感染症を抑制または軽減し、肺または呼吸器感染症を起こす真菌の複製を抑制または軽減し、あるいは肺または呼吸器感染症を起こす真菌の他の被験体への拡大を抑制または軽減する薬剤である。肺または呼吸器真菌感染症がブラストミセスデルマチチジス(Blastomyces dermatitidis)である場合、該抗真菌剤は、好ましくはイトラコナゾール、アンホテリシンB、フルコナゾールまたはケトコナゾールである。肺または呼吸器真菌感染症が肺アスペルギルス腫である場合、該抗真菌剤は、好ましくはアンホテリシンB、リポソーム型アンホテリシンB、イトラコナゾールまたはフルコナゾールである。肺または呼吸器真菌感染症がヒストプラスマ症である場合、該抗真菌剤は、好ましくはアンホテリシンB、イトラコナゾール、フルコナゾールまたはケトコナゾールである。肺または呼吸器真菌感染症がコクシジオイデス症である場合、該抗真菌剤は、好ましくはフルコナゾールまたはアンホテリシンBである。肺または呼吸器真菌感染症がクリプトコッカス症である場合、該抗真菌剤は、好ましくはアンホテリシンB、フルコナゾールまたはその2剤の組合せである。肺または呼吸器真菌感染症がクロモミコーシスである場合、該抗真菌剤は、好ましくはイトラコナゾール、フルコナゾールまたはフルシトシンである。肺または呼吸器真菌感染症がムコール菌症である場合、該抗真菌剤は、好ましくはアンホテリシンBまたはリポソーム型アンホテリシンBである。肺または呼吸器真菌感染症がシュードアレシェリア症である場合、該抗真菌剤は、好ましくはイトラコナゾールまたはミコナゾールである。
【０１４２】
抗真菌治療剤およびその投与量、投与経路ならびに推奨使用法は、当分野で公知であり、Dodds他、2000 Pharmacotherapy 20(11)1335-1355、Physician's Desk Reference(第57版、2003年)、およびMerck Manual of Diagnosis and Therapy(第17版、1999年)などの文献中に記載されてきた。
【０１４３】
5.3  抗体の予防的および治療的使用
本発明は、疾患もしくは障害または1つもしくは複数のその症状を予防、治療、管理および/または改善するために、本発明の1種または複数の抗体および前記抗体を含む組成物を被験体、好ましくはヒト被験体に投与することを伴う治療剤に関する。一実施形態では、本発明は、疾患もしくは障害または1つもしくは複数のその症状を予防、治療、管理および/または改善する方法であって、本発明の1種または複数の抗体の有効量をそれを必要とする被験体に投与することを含む方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明の1種または複数の抗体または抗体断片を含む、1種または複数のポリペプチド、ペプチドおよびタンパク質の有効量が、哺乳動物メタニューモウイルス感染症または1つもしくは複数のその症状を予防、治療、管理および/または改善するために、それを必要とする被験体に投与される。
【０１４４】
本発明は、疾患もしくは障害または1つもしくは複数のその症状を予防、治療、管理および/または改善する方法であって、本発明の1種または複数の抗体と、本発明の抗体以外の1種または複数の治療剤(例えば、1種または複数の予防または治療剤)であって、哺乳動物メタニューモウイルス感染症、あるいは哺乳動物メタニューモウイルス感染症と1種または複数の他の感染体またはそのような感染症の1つもしくは複数の症状との予防、治療、管理および/または改善において、現在使用されているか、これまで使用されてきたか、または有用であることが知られている治療剤とを、それを必要とする被験体に投与することを含む方法も提供する。
【０１４５】
本発明の併用療法の予防剤または治療剤は、順次または同時に投与することができる。特定の実施形態では、本発明の併用療法は、本発明の1種または複数の抗体の有効量と、哺乳動物メタニューモウイルスをやはり標的とする少なくとも1種の他の治療剤の有効量とを含む。別の特定の実施形態では、本発明の併用療法は、本発明の1種または複数の抗体の有効量と、哺乳動物メタニューモウイルス以外の感染体を標的とする少なくとも1種の他の治療剤の有効量とを含む。ある種の実施形態では、本発明の併用療法は、本発明の1種または複数の抗体と共に相加効果または相乗効果を示すように機能することによって、該抗体の予防効果または治療効果を改善する。ある種の実施形態では、本発明の併用療法は、予防剤または治療剤に付随する副作用を緩和する。
【０１４６】
該併用療法の予防剤または治療剤は、同一の医薬組成物中で被験体、好ましくはヒト被験体に投与することができる。あるいは、該併用療法の予防剤または治療剤は、別々の医薬組成物中で被験体に同時に投与することができる。該予防剤または治療剤は、同じまたは異なる投与経路によって被験体に投与してもよい。
【０１４７】
以下の各節では、本発明の抗体、本発明の組成物、および本発明の方法が、広範囲の抗生的治療を実現するために、他の治療剤と共にどのように使用できるかを記述する。理論にこだわるわけではないが、RSV感染症などのある種のウイルス感染症は、哺乳動物メタニューモウイルス感染症が引き起こす症状に類似した症状を引き起こす場合がある。したがって、哺乳動物メタニューモウイルス感染症および1種または複数の他の感染体であると診断された場合、あるいは哺乳動物メタニューモウイルス感染症および1種または複数の他の感染体の可能性がある場合、本発明の抗体を別の治療剤と共に投与することにより、他の感染体による感染症を治療することができる。
【０１４８】
5.3.1  哺乳動物メタニューモウイルス感染症に加わるウイルス感染症
本発明の1種または複数の抗体および前記抗体を含む組成物は、哺乳動物メタニューモウイルスによるウイルス感染症または1つもしくは複数のその症状を予防、治療、管理および/または改善するために、被験体に投与することができる。さらに、本発明の1種または複数の抗体および前記抗体を含む組成物は、哺乳動物メタニューモウイルスによるウイルス感染症および1種または複数の他のウイルスを予防、治療、管理または緩和するために、1種または複数の他の治療剤(例えば、1種または複数の予防剤もしくは治療剤)と組み合わせて投与してもよい。
【０１４９】
ある種の実施形態では、本発明の1種または複数の抗体の有効量は、ウイルス感染症、好ましくは呼吸器ウイルス感染症、または1つもしくは複数のその症状の予防、管理、治療および/または改善において現在使用されているか、これまで使用されてきたか、または有用であることが知られている1種または複数の治療剤(例えば、1種または複数の予防剤または治療剤)の有効量と組み合わせて、それを必要とする被験体に投与される。ウイルス感染症、好ましくは呼吸器ウイルス感染症用の治療剤には、それだけに限らないが、アマンタジン、オセルタミビル、リバビラン(ribaviran)、パリビツマブ、アナミビルなどの抗ウイルス剤が挙げられる。ある種の実施形態では、本発明の1種または複数の抗体の有効量は、ウイルス感染症、または1つもしくは複数のその症状を予防、管理、治療および/または改善するために、1種または複数の支持的手段と組み合わせてそれを必要とする被験体に投与される。支持的手段の非限定的な例には、超音波噴霧器による空気の加湿、ラセミ体エピネフリンエアロゾル(aerolized)、経口デキサメサゾン、静脈内輸液、挿管、解熱剤(例えば、イブプロフェン、アセトメタフィン)、ならびに抗生および/または抗真菌治療剤(即ち、細菌の二次感染症を予防または治療するため)が含まれる。
【０１５０】
ウイルス感染から生じる、またはそれに付随する任意型のウイルス性感染症または疾病状態(例えば、呼吸器系疾病状態)は、本発明の1種または複数の抗体の有効量を単独で、または別の治療剤(例えば、本発明の抗体以外の予防剤または治療剤)の有効量と組み合わせて投与することを含む本発明の方法により、予防、治療、管理および/または改善することができる。ウイルス性感染症を引き起こすウイルスの例には、それだけに限らないが、レトロウイルス(例えば、ヒトT細胞向性ウイルス(HTLV)I型およびII型、ならびにヒト免疫不全ウイルス(HIV))、ヘルペスウイルス(例えば、単純疱疹ウイルス(HSV)I型およびII型、Epstein-Barrウイルス、HHV6-HHV8、ならびにサイトメガロウイルス)、アレナウイルス(例えば、ラッサ熱ウイルス)、パラミクソウイルス(例えば、麻疹ウイルスィルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、ムンプス、hMPVおよびニューモウイルス)、アデノウイルス、ブニアウイルス(例えば、ハンタウイルス)、コルナウイルス、フィロウイルス(例えば、エボラウイルス)、フラビウイルス(例えば、C型肝炎ウイルス(HCV)、黄熱病ウイルスおよび日本脳炎ウイルス)、ヘパドナウイルス(例えば、B型肝炎ウイルス(HBV))、オルトミクソウイルス(例えば、インフルエンザウイルスA、BおよびC、ならびにPIV)、パポバウイルス(例えば、パピローマウイルス)、ピコルナウイルス(例えば、リノウイルス、エンテロウイルス、およびA型肝炎ウイルス)、ポックスウイルス、レオウイルス(例えば、ロタウイルス)、トガウイルス(例えば、ルベラウイルス)、ならびにラブドウイルス(例えば、狂犬病ウイルス)が含まれる。ウイルス感染症に対する生体反応には、それだけに限らないが、IgE抗体量の増加、T細胞の増殖および/または浸潤の増加、B細胞の増殖および/または浸潤の増加、上皮過形成、ならびにムチン産生が含まれる。特定の実施形態では、本発明は、風邪、咽頭炎、喉頭炎、ウイルス性クループ、気管支炎、インフルエンザ、パラインフルエンザウイルス性疾患(「PIV」)疾患(例えば、クループ、細気管支炎、気管支炎、肺炎)、呼吸器合胞体ウイルス(「RSV」)性疾患、メタニューモウイルス性疾患およびアデノウイルス性疾患(例えば、熱性呼吸器疾患、クループ、気管支炎、肺炎)と関連する、またはその原因となる呼吸器感染症を予防、治療、管理および/または改善する方法であって、本発明の1種または複数の抗体の有効量を単独で、または別の治療剤の有効量と組み合わせて投与することを含む方法も提供する。
【０１５１】
特定の実施形態では、インフルエンザウイルス感染症、PIV感染症、アデノウイルス感染症および/またはRSV感染症、あるいは1つまたは複数のその症状と合併した哺乳動物メタニューモウイルス感染症は、本発明の方法に従って予防、治療、管理および/または改善される。特定の実施形態では、本発明は、RSV呼吸器感染症、または1つもしくは複数のその症状を予防、治療、管理および/または改善する方法であって、それを必要とする被験体に、本発明の1種または複数の抗体の有効量を単独で、または1種または複数の抗ウイルス剤と組み合わせて投与することを含み、前記抗ウイルス剤が、それだけに限らないが、アマンタジン、リマンタジン、オセルタミビル、ズナミビル、リバビラン(ribaviran)、RSV-IVIG(例えば、静脈内免疫グロブリン注射液)(RESPIGAM(商標))、国際特許出願公開WO2005/061513にてBond他が開示したヌクレオチド類縁化合物414Bおよび363B、ならびにパリビツマブなどである方法を提供する。特定の実施形態では、本発明は、PIV感染症、または1つもしくは複数のその症状を予防、治療、管理および/または改善する方法であって、それを必要とする被験体に、本発明の1種または複数の抗体の有効量を単独で、または1種または複数の抗ウイルス剤の有効量と組み合わせて投与することを含み、前記抗ウイルス剤が、それだけに限らないが、アマンタジン、リマンタジン、オセルタミビル、ズナミビル、リバビラン(ribaviran)およびパリビツマブなどである方法を提供する。別の特定の実施形態では、本発明は、hMPV感染症、または1つもしくは複数のその症状を予防、治療、管理および/または改善する方法であって、それを必要とする被験体に、本発明の1種または複数の抗体の有効量を単独で、またはそれだけに限らないが、アマンタジン、リマンタジン、オセルタミビル、ズナミビル、リバビラン(ribaviran)、パリビツマブなどの1種または複数の抗ウイルス剤の有効量と組み合わせて投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態では、本発明は、インフルエンザを予防、治療、管理および/または改善する方法であって、それを必要とする被験体に、本発明の1種または複数の抗体の有効量を単独で、またはそれだけに限らないが、ザナミビル(RELENZA(登録商標))、オセルタミビル(TAMIFLU(登録商標))、リマンタジン、アマンタジン(SYMADINE(登録商標);SYMMETREL(登録商標))などの抗ウイルス剤の有効量と組み合わせて投与することを含む方法を提供する。
【０１５２】
ウイルス感染症治療剤およびその投与量、投与経路ならびに推奨使用法は、当分野で公知であり、Physician's Desk Reference(第57版、2003年)などの文献中に記載されてきた。
【０１５３】
5.3.2  細菌感染症
本発明は、細菌感染による感染症、またはそのような感染症の1つもしくは複数の症状と合併した哺乳動物メタニューモウイルス感染症を予防、治療、管理および/または改善する方法であって、それを必要とする被験体に、抗細菌剤と組み合わせて本発明の1種または複数の抗体の有効量を投与することを含む方法を提供する。
【０１５４】
細菌感染から起こり、またはそれに関連する細菌性感染症または病状のタイプいずれでも(例えば、呼吸器感染症)、本発明の方法に従って予防、治療、管理および/または改善することができる。細菌感染症を起こす細菌の例には、それだけに限らないが、アクアスピリルム(Aquaspirillum)科、アゾスピリルム(Azospirillum)科、アゾトバクテラシアエ(Azotobacteraceae)科、バクテロイドシアエ(Bacteroidaceae)科、バルトネラ(Bartonella)種、ブデロビブリオ(Bdellovibrio)科、カンピロバクター(Campylobacter)種、クラミジア(Chlamydia)種(例えば、クラミジア肺炎菌(Chlamydia pneumoniae))、クロストリジウム(Clostridium)、腸内細菌(Enterobacteriaceae)科(例えば、シトロバクター(Citrobacter)種、エドワードシエラ(Edwardsiella)、エンテロバクターアエロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エルウィニア(Erwinia)種、大腸菌(Escherichia coli)、ハフニア(Hafnia)種、クレブシエラ(Klebsiella)種、モルガネラ(Morganella)種、変形菌(Proteus vulgaris)、プロビデンシア(Providencia)、サルモネラ(Salmonella)種、霊菌(Serratia marcescens)、およびフレクスナー(赤痢)菌(Shigella flexneri))、ガルジネラ(Gardinella)科、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、ハロバクテリアシアエ(Halobacteriaceae)科、ヘリコバクター(Helicobacter)科、レジオネラシアエ(Legionallaceae)科、リステリア(Listeria)種、メチロコッカシアエ(Methylococcaceae)科、マイコバクテリア(mycobacteria)(例えば、ヒト結核菌(Mycobacterium tuberculosis))、ナイセリアシアエ(Neisseriaceae)科、オーシャノスピリルム(Oceanospirillum)科、パスツレラシアエ(Pasteurellaceae)科、肺炎球菌(Pneumococcus)種、シュードモナス(Pseudomonas)種、リゾビアシアエ(Rhizobiaceae)科、スピリルム(Spirillum)科、スピロソーマシアエ(Spirosomaceae)科、ブドウ球菌(Staphylococcus)(例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)および パイロゲネスブドウ球菌(Staphylococcus pyrogenes))、連鎖球菌(Streptococcus)(例えば、腸炎連鎖球菌(Streptococcus enteritidis)、ファシエ連鎖球菌(Streptococcus fasciae)および肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae))、バンピロビブルヘリコバクター(Vampirovibr Helicobacter)科、ならびにバンピロビブリオ(Vampirovibrio)科が含まれる。
【０１５５】
ある種の実施形態では、本発明は、細菌感染症、好ましくは呼吸器細菌感染症、または1つもしくは複数のその症状を合併した哺乳動物メタニューモウイルス感染症を予防、治療、管理および/または改善する方法であって、それを必要とする被験体に、本発明の1種または複数の抗体と、細菌感染症の予防、治療、管理および/または改善のために使用される、本発明の抗体以外の1種または複数の治療剤(例えば、1種または複数の予防剤または治療剤)の有効量とを組み合わせて投与する方法を提供する。細菌感染症、特に呼吸器細菌感染症の治療法には、それだけに限らないが、抗細菌剤(例えば、アミノグリコシド(例えば、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネチリミシン)アズトレオナム、セファロスポリン(例えば、セファクロル、セファドロキシル、セファレキシン、セファゾリン)、クリンダマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン(例えば、ペニシリンV、結晶性ペニシリンG、プロカイン、ペニシリンG )、スペクチノマイシンおよびテトラサイクリン(例えば、クロルテトラサイクリン、デオキシサイクリン、オキシテトラサイクリン))、および補助的/機械的換気などの呼吸器支持療法が挙げられる。ある種の実施形態では、本発明の1種または複数の抗体は、細菌感染症または1つもしくは複数のその症状を予防、管理、治療および/または改善するために、それを必要とする被験体に1種または複数の支持手段と組み合わせて投与される。支持手段の非限定的な例には、超音波噴霧器による空気の加湿、ラセミ体エピネフリンエアロゾル(aerolized)、経口デキサメサゾン、静脈内輸液、挿管、解熱剤(例えば、イブプロフェン、アセトメタフィン)、より好ましくは、抗生または抗ウイルス療法(即ち、二次感染症を予防または治療するため)が含まれる。
【０１５６】
特定の実施形態では、本発明の方法は、肺炎球菌、マイコバクテリア、好気性グラム陰性桿菌、連鎖球菌もしくはヘモフィルス、または1つもしくは複数のその症状により引き起こされる呼吸器細菌感染症による感染症を合併した哺乳動物メタニューモウイルス感染症を予防、治療、管理および/または改善するために利用され、それを必要とする被験体に、本発明の1種または複数の抗体の有効量を、本発明の抗体以外の1種または複数の他の治療剤(例えば、1種または複数の予防剤または治療剤)の有効量と組み合わせて投与することを含む。
【０１５７】
細菌感染症治療剤およびその投与量、投与経路ならびに推奨使用法は、当分野で公知であり、Physician's Desk Reference(第57版、2003年)などの文献中に記載されてきた。
【０１５８】
5.3.3  真菌感染症
本発明は、真菌による感染症、またはそのような感染症の1つもしくは複数の症状を合併した哺乳動物メタニューモウイルス感染症を予防、治療、管理および/または改善する方法であって、それを必要とする被験体に、抗真菌剤と組み合わせて本発明の1種または複数の抗体の有効量を投与することを含む方法を提供する。抗真菌剤を併用する本発明の1種または複数の抗体は、哺乳動物メタニューモウイルスおよび真菌による感染症、またはそのような感染症の1つもしくは複数の症状を予防、治療、管理および/または改善するために、投与することができる。
【０１５９】
真菌感染から起こり、またはそれに関連する真菌性感染症または疾病状態のタイプいずれでも(例えば、呼吸器感染症)、哺乳動物メタニューモウイルス感染症の予防、治療、管理および/または改善と組み合わせて、予防、治療、管理および/または改善することができる。真菌感染症を起こす真菌の例には、それだけに限らないが、アブシディア種(例えば、アブシディアコリンビフェラ(Absidia corymbifera)およびアブシディアラモサ(Absidia ramosa))、アスペルギルス種(例えば、アスペルギルスフラブス(Aspergillus flavus)、アスペルギルスフミガツス(Aspergillus fumigatus)、アスペルギルスニドゥランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)およびアスペルギルステレウス(Aspergillus terreus))、バシディオボールスラナルム(Basidiobolus ranarum)、ブラストミセスデルマチチジス(Blastomyces dermatitidis)、カンジダ種(例えば、カンジダアルビカンスCandida albicans、カンジダグラブラータ(Candida glabrata)、カンジダケル(Candida kerr)、カンジダクルゼイ(Candida krusei)、カンジダパラプシローシス(Candida parapsilosis)、カンジダシュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)、カンジダクルイレルモンディ(Candida cluillermondii)、カンジダルゴーサ(Candida rugosa)、カンジダステラトイデア(Candida stellatoidea)およびカンジダトロピカリス(Candida tropicalis))、コクシジオイデスイヌニティス(Coccidioides inunitis)、コニジオボルス(Conidiobolus)種、クリプトコッカスネオフォルムス(Cryptococcus neoforms)、カニンガメラ(Cunninghamella)種、皮膚糸状菌(dermatophyte)、ヒストプラズマカプスラツム(Histoplasma capsulatum)、石膏状小胞子菌(Microsporum gypseum)、ムコールプシルス(Mucor pusillus)、パラコクシジオイデスブラジリエンス(Paracoccidioides brasiliensis)、シュードアレシェリアボイディ(Pseudallescheria boydii)、ライノスポリジウムセーベリ(Rhinosporidium seeberi)、ニューモシスティスカリニ(Pneumocystis carinii)、クモノスカビ種(例えば、リゾプスアリズス(Rhizopus arrhizus)、リゾプスオリーゼ(Rhizopus oryzae)およびリゾプスミクロスポルス(Rhizopus microsporus))、サッカロミセス(Saccharomyces)種、スポロトリクスシェンキ(Sporothrix schenckii)、接合菌(zygomycetes)、ならびに接合菌(Zygornycetes)、子嚢菌(Ascomycetes)、担子菌(Basidiomycetes)、不完全菌(Deuteromycetes)、卵菌(Oomycetes)などの各綱が含まれる。
【０１６０】
ある種の実施形態では、1種または複数の抗体の有効量が、真菌感染症、好ましくは呼吸器真菌感染症の予防、管理、治療または改善において現在使用されているか、これまで使用されてきたか、または有用であることが知られている、本発明の抗体以外の1種または複数の治療剤(例えば、1種または複数の予防剤または治療剤)の有効量と組み合わせて、それを必要とする被験体に投与される。真菌感染症の治療剤には、それだけに限らないが、ミコナゾール、ケトコナゾール(NIZORAL(登録商標))、酢酸カスポファンジン(CANCIDAS(登録商標))、イミダゾール、トリアゾール(例えば、フルコナゾール(DIFLUCAN(登録商標)))、イトラコナゾール(SPORANOX(登録商標))などのアゾール薬物と、ポリエン(例えば、ナイスタチン、アンホテリシンBコロイド分散液(「ABCD」)(AMPHOTEC(登録商標)))、リポソーム型アンホテリシンB(AMBISONE(登録商標))、ヨウ化カリウム(KI)、ピリミジン(例えば、フルシトシン(ANCOBON(登録商標))、およびボリコナゾール(VFEND(登録商標))が含まれる。ある種の実施形態では、本発明の1種または複数の抗体の有効量が、真菌感染症または1つもしくは複数のその症状を予防、管理、治療および/または改善するために、1種または複数の支持手段と組み合わせて、それを必要とする被験体に投与される。支持手段の非限定的な例には、超音波噴霧器による空気の加湿、ラセミ体エピネフリンエアロゾル(aerolized)、経口デキサメサゾン、静脈内輸液、挿管、解熱剤(例えば、イブプロフェンおよびアセトメタフィン)、ならびに抗ウイルスまたは抗細菌療法(即ち、ウイルスまたは細菌の二次感染症を予防または治療するため)が含まれる。
【０１６１】
真菌感染症治療剤およびその投与量、投与経路ならびに推奨使用法は、当分野で公知であり、Physician's Desk Reference(第57版、2003年)などの文献中に記載されてきた。
【０１６２】
5.4  抗体を投与する組成物および方法
ある種の実施形態では、本発明の組成物は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する、本発明の1種もしくは複数の抗体またはその断片を含む。別の実施形態では、組成物は、本発明の1種または複数の抗体と、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症などの感染性疾患の予防、治療、管理および/または改善のために有用であるか、これまで使用されてきたか、または現在使用されていることが知られている、本発明の抗体以外の1種または複数の予防剤または治療剤とを含む。
【０１６３】
一実施形態では、組成物は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する本発明の抗体の断片を含んだ、1種または複数のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む。別の実施形態では、組成物は、本発明の抗体の断片を含むペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質以外の1種または複数の治療剤(例えば、1種または複数の予防剤または治療剤)と組み合わせて、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する本発明の抗体の断片を含んだ、1種または複数のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む。
【０１６４】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、1種または複数の免疫増強剤、1種または複数の抗ウイルス剤、1種または複数の抗細菌剤、1種または複数の抗真菌剤、および/または抗炎症剤をさらに含む。
【０１６５】
本発明の組成物は、単位剤形の調製に使用できる医薬組成物(例えば、被験体または患者への投与に適した組成物)の製造に有用である、バルク薬物組成物を包含する。好ましい実施形態では、本発明の組成物は医薬組成物である。このような組成物は、1種または複数の予防剤または治療剤(例えば、本発明の抗体、本発明の抗体断片を含むポリペプチド、ペプチドもしくはタンパク質、または他の予防剤もしくは治療剤)の予防有効量または治療有効量と、製薬上許容しうる担体とを含む。好ましくは。該医薬組成物は、被験体への投与経路に適するように製剤化される。例示的非限定的な実施形態では、本発明の医薬組成物は、pH6.0の10mMヒスチジン緩衝液と150mM塩化ナトリウムとを含有する滅菌液として、単一用量バイアル中に製剤化される。溶液各1.0mL中には、最適な安定性および溶解性を得るために、水中にタンパク質100mg、ヒスチジン1.6mgおよび塩化ナトリウム8.9mgが含まれる。
【０１６６】
特定の実施形態では、「製薬上許容しうる」担体は、動物、より特定すればヒトに使用するために、連邦政府または州政府の規制機関により認可されているか、あるいは米国薬局方または他の一般に認知されている薬局方に掲載されている。用語「担体」とは、治療薬と一緒に投与される、希釈剤、アジュバント(例えば、フロイントアジュバント(完全および不完全))、賦形剤または媒体を指す。このような医薬担体は、水と、石油、動物、植物または合成品起源のものを含めた、ピーナツ油、大豆油、鉱油、ごま油などの油のような滅菌液であってもよい。医薬組成物を静脈内に投与する場合は、水が好ましい担体である。食塩水、ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液も、液担体として、特に注射液用に用いることができる。適当な医薬賦形剤には、澱粉、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。所望であれば、該組成物は、湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤も少量含有することができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル、散剤、持続放出製剤などの形態とすることができる。
【０１６７】
一般に、本発明の組成物の成分は、単位剤形中に個別に、または混合物として供給され、例えば、活性剤の量を表示したアンプルまたは小袋(sachette)などの密封容器中の凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給される。該組成物を注入により投与しようとする場合、医薬用滅菌水または滅菌食塩水を含んだ輸液瓶で調合することができる。該組成物を注射により投与する場合、注射用滅菌水または食塩水のアンプルを用意して、各成分を投与前に混合することができる。
【０１６８】
本発明の組成物は、中和形または塩形として製剤することができる。製薬上許容しうる塩には、塩酸、リン酸、酢酸、蓚酸、酒石酸などから誘導されるような陰イオンを用いて形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されるような陽イオンを用いて形成される塩が含まれる。
【０１６９】
哺乳動物メタニューモウイルスによる感染に伴う疾患または障害を予防、治療、管理および/または改善するために、本発明の予防または治療用の作用剤または組成物を投与するための多様な送達系が、当分野では公知であり、使用することができる。本発明の治療剤(例えば、予防剤または治療剤)を投与する方法には、それだけに限らないが、非経口投与(例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下)、硬膜外投与、腫瘍内投与、粘膜投与(例えば、鼻腔および経口経路)が挙げられる。その上、肺投与も、例えば吸入器または噴霧器、およびエアゾール化剤を用いる製剤の使用により、採用することができる。例えば、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第6,019,968号、第5,985,320号、第5,985,309号、第5,934,272号、第5,874,064号、第5,855,913号、第5,290,540号および第4,880,078号;ならびにPCT公開WO92/19244、WO97/32572、WO97/44013、WO98/31346およびWO99/66903を参照されたい。一実施形態では、本発明の抗体、複合治療剤(combination therapy)または組成物は、Alkermes AIR(商標)肺薬物送達技術(Alkermes,Inc.、Cambridge、MA)を用いて投与される。特定の実施形態では、本発明の予防剤または治療剤は、筋肉内、静脈内、腫瘍内、経口、鼻腔内、肺または皮下に投与される。該予防剤または治療剤は、都合よい任意の経路、例えば、注入またはボーラス注入、上皮または粘膜皮膚の被膜を介した吸収(例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など)により投与してもよく、他の生物活性剤と共に投与してもよい。投与は、全身的または局所的の場合もある。
【０１７０】
特定の実施形態では、本発明の予防剤または治療剤を治療が必要な局所域に投与することが望ましいこともある。これは、限定するわけではないが、例えば、局所注入、注射またはインプラントによって実現し得るが、その際の前記インプラントは、シアラスティック(sialastic)膜、ポリマー、繊維基材(例えば、Tissuel(登録商標))またはコラーゲン基材などの膜および基材を包含する、多孔性または無孔性材料である。一実施形態では、本発明の1種または複数の抗体の有効量は、哺乳動物メタニューモウイルスの感染に伴う疾患または障害の恐れがある、またはそれに罹っている被験体の患部に局所的に投与される。別の実施形態では、本発明の1種または複数の抗体の有効量は、本発明の抗体以外の1種または複数の治療剤(例えば、1種または複数の予防剤または治療剤)の有効量と組み合わせて、哺乳動物メタニューモウイルスおよび別の感染体の感染に伴う、またはその感染を特徴とする疾患または障害の恐れがある、またはそれに罹っている被験体の患部に局所的に投与される。
【０１７１】
さらに別の実施形態では、本発明の治療剤は、制御放出系または持続放出系の中で送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用して制御放出または持続放出を実現してもよい(上記Langer;Sefton、1987、CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:20;Buchwald他、1980、Surgery 88:507;Saudek他、1989、N.Engl.J.Med.321:574を参照されたい)。別の実施形態では、ポリマー材料を使用して本発明の治療剤の制御放出または持続放出を実現することができる(例えば、Medical Applications of Controlled Release、Langer and Wise(eds.)、CRC Pres.、Boca Raton、Florida(1974);Controlled Drug Bioavailability、Drug Product Design and Performance、Smolen and Ball(eds.)、Wiley、New York(1984);Ranger and Peppas、1983、J.,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61を参照されたい;さらにLevy他、1985、Science 228:190;During他、1989、Ann.Neurol.25:351;Howard他、1989、J.Neurosurg.7 1:105);米国特許第5,679,377号;米国特許第5,916,597号;米国特許第5,912,015号;米国特許第5,989,463号;米国特許第5,128,326号;国際公開WO99/15154および国際公開WO99/20253も参照されたい)。持続放出製剤中で使用されるポリマーの例には、それだけに限らないが、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン-co-酢酸ビニル)、ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコリド(PLG)、ポリアンヒドリド、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリラクチド(PLA)、ポリ(ラクチド-co-グリコリド)(PLGA)およびポリオルトエステルが挙げられる。好ましい実施形態では、持続放出製剤中で使用されるポリマーは、不活性で、溶出性不純物を含まず、保存時に安定で、無菌であり、生分解性である。さらに別の実施形態では、制御放出系または持続放出系は、予防または治療標的の近傍に配置し、したがって全身投与量のほんの一部だけで済ますことができる(例えば、Goodson、in Medical Applications of Controlled Release、supra、vol.2、pp.115-138(1984)を参照されたい)。
【０１７２】
制御放出系は、Langer(1990、Science 249:1527-1533)による総説において考察されている。本発明の1種または複数の治療剤を含む持続放出製剤を製造するために、当業者に公知の任意の技法を使用することができる。例えば、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第4,526,938号、国際公開WO91/05548、国際公開WO96/20698、Ning他、1996、「Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained Release Gel」、Radiotherapy & Oncology 39:179 189、Song他、1995、「Antibody Mediated Lung Targeting of Long Circulating Emulsions」、PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372 397、Cleek et aI.、1997、「Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application」、Pro.Int'1.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853 854およびLam他、1997、「Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery」、Proc.Int'l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759 760を参照されたい。
【０１７３】
ある種の実施形態では、本発明の抗体またはその断片をコードする核酸は、哺乳動物メタニューモウイルス感染症を治療および/または予防するために、被験体に投与することができる。さらに、本発明の抗体またはその断片をコードする核酸を導入した細胞は、哺乳動物メタニューモウイルス感染症を治療および/または予防するために、被験体に投与することができる。したがって、本発明は、本発明の抗体またはその断片をコードする核酸を含む組成物も提供する。特定の実施形態では、本発明の組成物が核酸である場合、該核酸を適当な核酸発現ベクターの一部として構築し、それが細胞内に入るように、例えば、レトロウイルスベクターの使用(例えば、米国特許第4,980,286号を参照されたい)か、直接注入か、微粒子衝撃の使用(例えば、遺伝子銃で、DupontのBiolistic)、または脂質、細胞表面受容体、導入剤いずれかでの被覆によるか、あるいは核に進入することが知られているホメオボックス様ペプチド(例えば、Joliot他、1991、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1864-1868を参照されたい)に連結してそれを投与することによって、それのコード抗体またはその断片の発現を促進するように、該核酸を投与することができる。ある種の実施形態では、核酸は、細胞中に導入し、相同的組換えによる発現のために宿主細胞DNA内に組み込むことができる。さらに、該核酸はex vivoで宿主細胞中に導入することができ、本発明の抗体またはその断片をコードするその核酸を有する宿主細胞が、哺乳動物メタニューモウイルス感染症の治療および/または予防を要する被験体に投与される。
【０１７４】
本発明の医薬組成物は、意図する投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例には、それだけに限らないが、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口、鼻腔内(例えば、吸入)、経皮(例えば、局所)、経粘膜、直腸投与などが挙げられる。特定の実施形態では、該組成物は、ヒトへの静脈内、皮下、筋肉内、経口、鼻腔内または局所投与に適合した医薬組成物として、常套的手順に従って製剤化される。静脈内投与組成物は、通常、無菌で等張の緩衝水溶液である。必要である場合、該組成物は、可溶化剤、および注射部位の痛みを緩和するために、リグノカムネ(lignocamne)などの局所麻酔薬も含んでもよい。
【０１７５】
本発明の組成物を局所投与しようとする場合、該組成物は、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、シャンプー、スプレー、エアゾール、溶液、乳濁液の形態、または当業者に周知の他の形態に製剤化することができる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms、19th ed.、Mack Pub.Co.、Easton、PA(1995)を参照されたい。非噴霧型局所剤形に関しては、局所塗布に適合する担体または1種もしくは複数の賦形剤を含み、好ましくは水より大なる動的粘度を有する粘性ないしは半固形または固形の形態が、通常用いられる。適切な製剤には、それだけに限らないが、溶液、懸濁液、乳濁液、クリーム、軟膏(ointment)、粉末、塗布薬、軟膏(salve)などが挙げられるが、そうした製剤は、所望であれば、滅菌され、または例えば浸透圧などの多様な性質を調節するために、助剤(例えば、防腐剤、安定剤、湿潤剤、緩衝剤または塩)と混合される。他の適切な局所剤形には、噴霧型エアゾール製剤が含まれるが、その場合、好ましくは固体または液体の不活性担体と組み合わさった活性成分は、加圧揮発性物質(例えば、フレオンなどの高圧ガス)との混合物中、またはスクイーズボトル中に詰められる。所望であれば、医薬組成物および剤形に保湿剤または加湿剤も添加することができる。このような追加成分の例は、当分野で周知である。
【０１７６】
本発明の方法が組成物の鼻腔内投与を含む場合、該組成物は、エアゾール形、スプレー、ミスト、または液滴形に製剤化することができる。特に、本発明に従って使用される予防剤または治療剤は、加圧容器または噴霧器から供給され、適当な高圧ガス(例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガス)を使用したエアゾールスプレーの形態で、都合よく送達させることができる。加圧エアゾールの場合、投与量単位は、計測量を送達するためのバルブを備えることによって決定し得る。吸入器または吹送器に使用するためのカプセルおよびカートリッジ(例えば、ゼラチンからなる)を、当該化合物とラクトースまたは澱粉などの適当な粉末基剤との混合粉末を含有するように製剤化してもよい。
【０１７７】
本発明の方法が経口投与を含む場合、組成物は、錠剤、カプセル、カプセル(cachet)、ジェルキャップ、溶液、懸濁液などの形態に経口的に製剤化することができる。錠剤またはカプセルは、製薬上許容しうる賦形剤を用いる従来手段によって調製することができるが、該賦形剤としては、結合剤(例えば、予備ゼラチン化トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース)、充填剤(例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム)、滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ)、崩壊剤(例えば、ジャガイモ澱粉またはグリコール酸澱粉ナトリウム)、あるいは湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)などがある。錠剤は、当分野で周知の方法によりコーティングしてもよい。経口投与の液体製剤は、溶液、シロップまたは懸濁液の形態をとってもよいが、それだけに限らず、あるいは、使用前に水または他の適当な媒体で戻すための乾燥製品として供給してもよい。このような液体製剤は、製薬上許容しうる添加剤を用いる従来手段によって調製してもよいが、該添加剤としては、懸濁剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂肪)、乳化剤(例えば、レシチンまたはアラビアゴム)、非水性媒体(例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分留植物油)、ならびに防腐剤(例えば、p-ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル、またはソルビン酸)などがある。該製剤は、緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤も適宜含有してもよい。経口投与製剤は、予防剤または治療剤の徐放、制御放出または持続放出のために適切に製剤してもよい。
【０１７８】
本発明の方法は、例えば吸入器または噴霧器を使用する、エアゾール化剤を用いて製剤した組成物の肺投与を含み得る。例えば、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第6,019,968号、第5,985,320号、第5,985,309号、第5,934,272号、第5,874,064号、第5,855,913号、第5,290,540号および第4,880,078号、ならびに国際公開WO92/19244、WO97/32572、WO97/44013、WO98/31346およびWO99/66903を参照されたい。特定の実施形態では、本発明の抗体、複合治療剤および/または本発明の組成物は、Alkermes AIR(商標)肺薬物送達技術(Alkermes,Inc.、Cambridge、MA)を用いて投与される。
【０１７９】
本発明の方法は、注射(例えば、ボーラス注入または連続注入)による非経口投与のために製剤した組成物の投与を含み得る。注射製剤は、防腐剤を添加した単位剤形(例えば、アンプル中または多回用量容器中)で供給し得る。該組成物は、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液または乳濁液などの形態をとってもよく、懸濁剤、安定剤および/または分散剤などの製剤助剤を含有してもよい。あるいは、活性成分が、使用前に適当な媒体(例えば、発熱物質非含有滅菌水)で液戻しするための粉末形態をしてもよい。
【０１８０】
本発明の方法は、デポー製剤として製剤化した組成物の投与をさらに含み得る。このような長期作用製剤は、埋め込み(例えば、皮下もしくは筋肉内に)または筋肉注射により投与してもよい。したがって、該組成物は、例えば、適当なポリマー性もしくは疎水性物質(例えば、許容可能な油中の乳濁液として)またはイオン交換樹脂を用いて、あるいは難溶性誘導体(例えば、難溶性塩)として製剤してもよい。
【０１８１】
特に、本発明は、本発明の予防剤もしくは治療剤の1種もしくは複数、または医薬組成物が、その作用物質の量を表示した、アンプルまたは小袋(sachette)などの密封容器中に包装されることも規定する。一実施形態では、本発明の予防剤もしくは治療剤の1種もしくは複数、または医薬組成物は、密封容器中の乾燥滅菌した凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給された後、被験体に投与するための適切な濃度に液戻し(例えば、水または食塩水で)することができる。好ましくは、本発明の予防剤もしくは治療剤の1種もしくは複数、または医薬組成物は、密封容器中の乾燥滅菌した凍結乾燥粉末として、少なくとも5mg、より好ましくは少なくとも10mg、少なくとも15mg、少なくとも25mg、少なくとも35mg、少なくとも45mg、少なくとも50mg、少なくとも75mg、または少なくとも100mgの単位用量で供給される。本発明の予防剤もしくは治療剤または医薬組成物の凍結乾燥品は、元の容器中2℃〜8℃で保存すべきであり、本発明のその予防剤もしくは治療剤または医薬組成物は、液戻し後1週間以内、好ましくは5日以内、72時間以内、48時間以内、24時間以内、12時間以内、6時間以内、5時間以内、3時間以内、または1時間以内に投与すべきである。代替的実施形態では、本発明の予防剤もしくは治療剤の1種もしくは複数、または医薬組成物は、その作用物質の量および濃度を表示した密封容器中に液状形態で供給される。好ましくは、該投与組成物の液状形態は、密封容器中に少なくとも0.25mg/ml、より好ましくは少なくとも0.5mg/ml、少なくとも1mg/ml、少なくとも2.5mg/ml、少なくとも5mg/ml、少なくとも8mg/ml、少なくとも10mg/ml、少なくとも15mg/kg、少なくとも25mg/ml、少なくとも50mg/ml、少なくとも75mg/ml、または少なくとも100mg/mlで供給される。該液状形態は、元の容器中2℃〜8℃で保存すべきである。
【０１８２】
一般に、哺乳動物メタニューモウイルス感染症の治療または予防を要する被験体に投与しようとする本発明の抗体は、その被験体の種に適合するものである。したがって、好ましい実施形態では、ヒトまたはヒト化抗体は、治療または予防のためにヒト患者に投与される。特定の実施形態では、被験体に投与しようとする抗体の定常領域は、その被験体における自己抗体の定常領域のアミノ酸配列と同一である。
【０１８３】
5.4.1  遺伝子治療
特定の実施形態では、本発明の抗体または別の予防剤もしくは治療剤をコードする核酸を含むヌクレオチド配列は、遺伝子治療によって哺乳動物メタニューモウイルス感染症または1つもしくは複数のその症状を治療、予防、管理および/または改善するために、投与される。遺伝子治療とは、発現済みまたは発現可能な核酸の被験体への投与で行う治療を指す。本発明のこの実施形態では、核酸は本発明のコードされた抗体を産生する。
【０１８４】
当分野で利用できる遺伝子治療の方法のいずれでも、本発明に従って使用することができる。遺伝子治療の方法に関する全般的な総説については、Goldspiel他、1993、Clinical Pharmacy 12:488-505;Wu and Wu、1991、Biotherapy 3:87-95;Tolstoshev、1993、Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596;Mulligan、Science 260:926-932(1993)、およびMorgan and Anderson、1993、Ann.Rev.Biochem.62:191-217;May、1993、TIBTECH 11(5):155-215を参照されたい。使用できる組換えDNA技術に関して当分野で一般に知られている方法は、Ausubel他(eds.)、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、NY(1993)およびKriegler、Gene Transfer and Expression、A Laboratory Manual、Stockton Press、NY(1990)に記載されている。
【０１８５】
一実施形態では、本発明の方法は、本発明の抗体またはその断片をコードし、発現ベクターの一部をなす核酸を含んだ組成物の投与を含む。特に、このような核酸は、抗体コード領域に作動的に連結したプロモーター、好ましくは異種プロモーターを有し、前記プロモーターは、誘導的または構成的であり、場合により組織特異的である。別の実施形態では、本発明の抗体または別の予防剤もしくは治療剤のコード配列、および所望の任意の他の配列が、ゲノム中の所望部位において相同的組換えを促進する領域に隣接し、したがって抗体コード核酸の染色体内発現が実現される、核酸分子が使用される(Koller and Smithies、1989、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932-8935;Zijlstra他、1989、Nature 342:435-438)。特定の実施形態では、本発明の発現抗体または別の予防剤もしくは治療剤は、一本鎖抗体である。あるいは、その核酸配列は、本発明の抗体または別の予防剤もしくは治療剤の重鎖、軽鎖の両方またはその断片をコードする配列を含む。
【０１８６】
被験体中への該核酸の送達は、被験体を核酸または核酸保持ベクターに直接曝す直接送達、または最初に細胞をin vitroで核酸により形質転換した後、被験体中に移植する間接送達のいずれでもよい。これらの2種の手法は、それぞれin vivoまたはex vivo遺伝子治療として知られている。
【０１８７】
特定の実施形態では、該核酸配列は、in vivoで直接投与され、コードされたその産物を生成するように発現される。これは、当分野で公知の多数の方法のいずれでも、例えば、該核酸配列を適当な核酸発現ベクターの一部として構築し、該核酸配列が細胞内に入るように、それを投与することによって実現できるが、その投与は、例えば、欠損もしくは弱毒化レトロウイルスまたは他のウイルスベクターを用いる感染(例えば、米国特許第4,980,286号を参照されたい)か、裸DNAの直接注入か、微粒子衝撃法の使用(例えば、遺伝子銃で、DupontのBiolistic)、または脂質、細胞表面受容体、導入剤いずれかでの被覆、リポソーム、微粒子もしくはマイクロカプセル中への封入によるか、あるいは核に進入することが知られているペプチドに連結してそれを投与するか、受容体媒介エンドサイトーシスを受けるリガンド(例えば、Wu and Wu、1987、J.Biol.Chem.262:4429-4432)(その受容体を特異的に発現する細胞型を標的とするために使用できる)に連結してそれを投与することによって、なされる。別の実施形態では、リガンドがエンドソームを破壊する融合誘導(fusogenic)ウイルスペプチドを含み、そのため核酸のリソソームによる分解が回避される、核酸-リガンド複合体を形成することができる。さらに別の実施形態では、特異的受容体を標的とすることによる、細胞の特異的取り込みおよび発現のために、核酸の標的誘導をin vivoで行うことができる(例えば、国際公開WO92/06180、WO92/22635、WO92/20316、WO93/14188およびWO93/20221を参照されたい)。あるいは、核酸を細胞内に導入し、相同組換えによる発現のために宿主細胞DNA内に組み込むことができる(Koller and Smithies、1989、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932-8935およびZijlstra他、1989、Nature 342:435-438)。
【０１８８】
特定の実施形態では、本発明の抗体またはその断片をコードする核酸配列を含有するウイルスベクターは、該抗体またはその断片に対する発現ベクターとして使用される。例えば、レトロウイルスベクターが使用できる(Miller他、1993、Meth.Enzymol.217:581-599を参照されたい)。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングおよび宿主細胞DNA中への組み込みに必要な成分を含んでいる。遺伝子治療に用いようとする本発明の抗体または別の予防剤もしくは治療剤をコードする核酸配列は、1種または複数のベクター中にクローニングされ、それにより当該遺伝子の被験体中への送達が促進される。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Boesen他、1994、Biotherapy 6:291-302に見出すことができ、そこでは造血幹細胞へmdr 1遺伝子を送達することにより、該幹細胞の化学療法剤に対する耐性を高めるためのレトロウイルスベクターの使用が記載されている。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を例示した他の参考文献は、Clowes他、1994、J.Clin.Invest.93:644-651;Klein他、1994、Blood 83:1467-1473;Salmons and Gunzberg、1993、Human Gene Therapy 4:129-141およびGrossman and Wilson、1993、Curr.Opin.in Genetics and Devel.3:110-114である。
【０１８９】
アデノウイルスは、遺伝子治療に使用できる他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、遺伝子を呼吸器上皮へ送達するための特に魅力的な媒体である。アデノウイルスは、自然界では呼吸器上皮に感染し、そこで軽度の疾患を引き起こす。アデノウイルス主体送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染できるという利点を有している。Kozarsky and Wilson、1993、Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503には、アデノウイルス主体遺伝子治療に関する総説が提示されている。Bout他、1994、Human Gene Therapy 5:3-10では、赤毛猿の呼吸器上皮に遺伝子を導入するためのアデノウイルスベクターの使用が示された。遺伝子治療におけるアデノウイルスの他の使用例は、Rosenfeld他、1991、Science 252:431-434;Rosenfeld他、1992、Cell 68:143-155;Mastrangeli他、1993、J.Clin.Invest.91:225-234、国際公開WO94/12649、およびWang他、1995、Gene Therapy 2:775-783に見出すことができる。好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。
【０１９０】
アデノ随伴ウイルス(AAV)も、遺伝子治療に使用するために提案されてきた(Walsh他、1993、Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204:289-300および米国特許第5,436,146号)。
【０１９１】
遺伝子治療に対する他の手法は、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染などの方法により、組織培養中の細胞へex vivoで遺伝子を導入することを伴う。普通は、該導入法には選択マーカーの細胞への導入が含まれる。次いで、該細胞は、導入遺伝子を取り込んだ後、発現している細胞を分離するための選択の下におかれる。次いで、そのような細胞が被験体に送達される。この実施形態では、核酸を細胞に導入した後に、生成した組換え細胞をin vivoで投与する。このような導入は、当分野で公知の任意の方法、それだけに限らないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含有するウイルスまたはバクテリオファージベクターを用いる感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子導入、微小核体(microcell)媒介遺伝子導入、スフェロプラスト融合などを包含する方法によって、実行することができる。細胞中に外来遺伝子を導入するための多数の技法が、当分野で知られており(例えば、Loeffler and Behr、1993、Meth.Enzymol.217:599-618;Cohen他、1993、Meth.Enzymol.217:618-644;Clin.Pharma.Ther.29:69-92(1985)を参照されたい)、受容細胞の必要な発生上および生理上の機能が失われない限り、本発明に従って使用してもよい。該技法は、核酸を細胞に安定に導入することによって、核酸が細胞により発現でき、好ましくはその子孫細胞により遺伝でき、発現できるようにすべきである。
【０１９２】
生成した組換え細胞は、当分野で公知の多様な方法により被験体へ送達することができる。組換え血液細胞(例えば、造血幹細胞または前駆細胞)は、好ましくは静脈内に投与される。使用に対して想定される細胞量は、それだけに限らないが、所望の効果および患者の状態を含めた数種の要因に依存し、当業者によって決定することができる。
【０１９３】
遺伝子治療のために核酸を導入できる細胞は、任意の所望の入手可能な細胞型を包含し、それだけに限らないが、上皮細胞、内皮細胞、角化細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞と、Tリンパ球、Bリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、肥満細胞、巨核球、顆粒球などの血液細胞と、多様な幹細胞または前駆細胞、特に造血幹細胞または前駆細胞(例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝などから得られるような細胞)とを包含する。好ましい実施形態では、遺伝子治療のために使用される細胞は被験体にとって自己細胞である。
【０１９４】
組換え細胞が遺伝子治療に使用される一実施形態では、抗体またはその断片をコードする核酸配列を細胞中に導入することにより、細胞またはその子孫細胞により発現可能な状態とし、次いでその組換え細胞を治療効果のためにin vivoで投与する。特定の実施形態では、幹細胞または前駆細胞が使用される。分離し、in vitroで維持できる任意の幹細胞および/または前駆細胞が、本発明のこの実施形態に従って潜在的に使用できる(例えば、国際公開WO94/08598、Stemple and Anderson、1992、Cell 7 1:973-985;Rheinwald、1980、Meth.Cell Bio.21A:229およびPittelkow and Scott、1986、Mayo Clinic Proc.61:771を参照されたい)。
【０１９５】
特定の実施形態では、遺伝子治療のために導入しようとする核酸は、核酸の発現が、適切な転写誘導因子の有無を制御することにより制御できるように、コード領域に作動的に連結した誘導プロモーターを含む。
【０１９６】
5.5  投与の用量および頻度
哺乳動物メタニューモウイルスによる感染に関係する障害の予防、治療、管理および/または改善に有効である、本発明の予防剤もしくは治療剤または組成物の量は、標準的な臨床法によって決定することができる。その頻度および用量も、投与される特定の治療剤(例えば、1種または複数の特定の治療剤または予防剤)、障害、疾患または病状の重度、投与経路、ならびに年齢、体重、反応、および患者の病歴に応じた各患者特有の要因に従って変動することになろう。例えば、哺乳動物メタニューモウイルスによる感染に関係する障害の治療、予防、管理および/または改善に有効である、本発明の予防剤もしくは治療剤または組成物の用量は、動物モデル、例えば、本明細書に開示されているか、または当業者に公知である動物モデルに該組成物を投与することによって、決定することができる。その上、in vitroアッセイを場合により用いて最適な用量範囲を特定する補助としてもよい。適切な投与計画は、このような要因を考慮し、例えば、文献中に報告され、Physician's Desk Reference(第57版、2003年)中で推奨されている用量に従うことによって、当業者が選択することができる。
【０１９７】
本発明により包含される抗体、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび融合タンパク質については、患者に投与される用量は、患者の体重に対して通常0.0001mg/kg〜100mg/kgである。好ましくは、患者に投与される用量は、患者の体重に対して0.0001mg/kg〜20mg/kg、0.0001mg/kg〜10mg/kg、0.0001mg/kg〜5mg/kg、0.0001〜2mg/kg、0.0001〜1mg/kg、0.0001mg/kg〜0.75mg/kg、0.0001mg/kg〜0.5mg/kg、0.0001mg/kg〜0.25mg/kg、0.0001〜0.15mg/kg、0.0001〜0.10mg/kg、0.001〜0.5mg/kg、0.01〜0.25mg/kg、0.01〜0.10mg/kgである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリペプチドに対する免疫反応のために、他種由来の抗体より人体内の半減期が長い。したがって、被験体がヒトである場合、ヒト抗体の方が、用量が低く、投与頻度が少ないことが多い。さらに、本発明の抗体またはその断片の用量および投与頻度は、例えば脂質化などの修飾により該抗体の取り込みおよび組織浸透を強化することによって、減少させることもできる。
【０１９８】
特定の実施形態では、患者に投与される用量は、キログラム(kg)単位の患者体重にmg/kg単位の投与予定用量を掛けた値を用いて計算されよう。次いで、投与予定の所要体積(mL単位)が、所要mg用量を製剤中の抗体またはその断片の濃度(100mg/mL)で割ることにより、決定される。計算した最終所要体積は、必要個数分のバイアルの中味を薬物を投与するためのシリンジ(複数も)中に貯めることによって得られよう。製剤中の抗体またはその断片の最大体積2.0mLを1部位当たり注射することができる。
【０１９９】
特定の実施形態では、患者における、哺乳動物メタニューモウイルスによる感染に関係する障害を予防、治療、管理および/または改善するために投与される、本発明の抗体、組成物または複合治療剤の用量は、患者の体重に対して150μg/kg以下、好ましくは125μg/kg以下、100μg/kg以下、95μg/kg以下、90μg/kg以下、85μg/kg以下、80μg/kg以下、75μg/kg以下、70μg/kg以下、65μg/kg以下、60μg/kg以下、55μg/kg以下、50μg/kg以下、45μg/kg以下、40μg/kg以下、35μg/kg以下、30μg/kg以下、25μg/kg以下、20μg/kg以下、15μg/kg以下、10μg/kg以下、5μg/kg以下、2.5μg/kg以下、2μg/kg以下、1.5μg/kg以下、1μg/kg以下、0.5μg/kg以下、または0.5μg/kg以下である。別の実施形態では、患者における、哺乳動物メタニューモウイルスによる感染に関係する障害、または1つもしくは複数のその症状を予防、治療、管理および/または改善するために投与される、本発明の抗体、組成物または複合治療剤の用量は、0.1mg〜20mg、0.1mg〜15mg、0.1mg〜12mg、0.1mg〜10mg、0.1mg〜8mg、0.1mg〜7mg、0.1mg〜5mg、0.1〜2.5mg、0.25mg〜20mg、0.25〜15mg、0.25〜12mg、0.25〜10mg、0.25〜8mg、0.25mg〜7mg、0.25mg〜5mg、0.5mg〜2.5mg、1mg〜20mg、1mg〜15mg、1mg〜12mg、1mg〜10mg、1mg〜8mg、1mg〜7mg、1mg〜5mg、または1mg〜2.5mgの単位用量である。
【０２００】
ある種の実施形態では、被験体は、本発明の1種または複数の抗体、組成物または複合治療剤の有効量の1または複数用量を投与され、前記抗体、組成物または複合治療剤の有効量は、被験体中の哺乳動物メタニューモウイルスの少なくとも20%〜25%、好ましくは少なくとも25%〜30%、少なくとも30%〜35%、少なくとも35%〜40%、少なくとも40%〜45%、少なくとも45%〜50%、少なくとも50%〜55%、少なくとも55%〜60%、少なくとも60%〜65%、少なくとも65%〜70%、少なくとも70%〜75%、少なくとも75%〜80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または95%〜100%が、被験体の細胞にさらに感染するのを予防する。
【０２０１】
他の実施形態では、被験体は、本発明の1種または複数の抗体の有効量の1または複数用量を投与され、有効量の該1用量は、本発明の抗体の少なくとも0.1μg/ml、少なくとも0.5μg/ml、少なくとも1μg/ml、少なくとも2μg/ml、少なくとも5μg/ml、少なくとも6μg/ml、少なくとも10μg/ml、少なくとも15μg/ml、少なくとも20μg/ml、少なくとも25μg/ml、少なくとも50μg/ml、少なくとも100μg/ml、少なくとも125μg/ml、少なくとも150μg/ml、少なくとも175μg/ml、少なくとも200μg/ml、少なくとも225μg/ml、少なくとも250μg/ml、少なくとも275μg/ml、少なくとも300μg/ml、少なくとも325μg/ml、少なくとも350μg/ml、少なくとも375μg/ml、または少なくとも400μg/mlの血清力価を実現する。さらに他の実施形態では、被験体は、本発明の1種または複数の抗体の有効量の1用量を投与されることにより、該抗体の少なくとも0.1μg/ml、少なくとも0.5μg/ml、少なくとも1μg/ml、少なくとも、2μg/ml、少なくとも5μg/ml、少なくとも6μg/ml、少なくとも10μg/ml、少なくとも15μg/ml、少なくとも20μg/ml、少なくとも25μg/ml、少なくとも50μg/ml、少なくとも100μg/ml、少なくとも125μg/ml、少なくとも150μg/ml、少なくとも175μg/ml、少なくとも200μg/ml、少なくとも225μg/ml、少なくとも250μg/ml、少なくとも275μg/ml、少なくとも300μg/ml、少なくとも325μg/ml、少なくとも350μg/ml、少なくとも375μg/ml、または少なくとも400μg/mlの血清力価を実現し、本発明の1種または複数の抗体の有効量の次の1用量を投与することにより、少なくとも0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、少なくとも、2μg/ml、少なくとも5μg/ml、少なくとも6μg/ml、少なくとも10μg/ml、少なくとも15μg/ml、少なくとも20μg/ml、少なくとも25μg/ml、少なくとも50μg/ml、少なくとも100μg/ml、少なくとも125μg/ml、少なくとも150μg/ml、少なくとも175μg/ml、少なくとも200μg/ml、少なくとも225μg/ml、少なくとも250μg/ml、少なくとも275μg/ml、少なくとも300μg/ml、少なくとも325μg/ml、少なくとも350μg/ml、少なくとも375μg/ml、または少なくとも400μg/mlの血清力価を維持する。これらの実施形態によれば、被験体に後続の用量数1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12またはそれより多数投与してもよい。
【０２０２】
特定の実施形態では、本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスの感染に伴う、またはその感染を特徴とする疾患または障害、あるいは1つまたは複数のその症状を予防、治療、管理または治療する方法であって、それを必要とする被験体に、本発明の1種または複数の抗体、複合治療剤または組成物を少なくとも10μg、少なくとも15μg、少なくとも20μg、少なくとも25μg、少なくとも30μg、少なくとも35μg、少なくとも40μg、少なくとも45μg、少なくとも50μg、少なくとも55μg、少なくとも60μg、少なくとも65μg、少なくとも70μg、少なくとも75μg、少なくとも80μg、少なくとも85μg、少なくとも90μg、少なくとも95μg、少なくとも100μg、少なくとも105μg、少なくとも110μg、少なくとも115μg、または少なくとも120μgの1用量で投与することを含む方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明の抗体の1用量は、3日毎に1回、4日毎に1回、5日毎に1回、6日毎に1回、7日毎に1回、8日毎に1回、10日毎に1回、2週毎に1回、3週毎に1回、または1月に1回投与してもよい。
【０２０３】
本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスの感染に伴う、またはその感染を特徴とする疾患または障害、あるいは1つまたは複数のその症状を予防、治療、管理または予防する方法であって、(a)それを必要とする被験体に、本発明の1種または複数の抗体、複合治療剤または組成物の予防または治療有効量の1または複数用量を投与し、(b)前記1種または複数の抗体のある一定数の用量を投与した後、前記被験体中の1種または複数の前記投与抗体の血漿レベル/濃度をモニターすることを含む方法を提供する。さらに、好ましくは、前記ある一定数の用量は、本発明の1種または複数の抗体、組成物または複合治療剤の予防または治療有効量の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12用量である。該抗体の血漿レベルが閾値より低下した場合、投与予定を加速することにより、本発明の抗体の投与頻度を増やすことができる。
【０２０４】
多様な実施形態では、本発明の抗体および任意の第2治療剤(例えば、哺乳動物メタニューモウイルス感染症以外の感染症を治療または予防するため)は、5分未満間隔で、30分未満間隔で、1時間間隔で、約1時間間隔で、約1〜約2時間間隔で、約2時間〜約3時間間隔で、約3時間〜約4時間間隔で、約4時間〜約5時間間隔で、約5時間〜約6時間間隔で、約6時間〜約7時間間隔で、約7時間〜約8時間間隔で、約8時間〜約9時間間隔で、約9時間〜約10時間間隔で、約10時間〜約11時間間隔で、約11時間〜約12時間間隔で、約12時間〜約18時間間隔で、18時間〜24時間間隔で、24時間〜36時間間隔で、36時間〜48時間間隔で、48時間〜52時間間隔で、52時間〜60時間間隔で、60時間〜72時間間隔で、72時間〜84時間間隔で、84時間〜96時間間隔で、または96時間〜120時間間隔で投与される。好ましい実施形態では、2種以上の治療剤が同じ患者通院時に投与される。
【０２０５】
ある種の実施形態では、本発明の1種または複数の抗体および1種または複数の他の治療剤(例えば、予防剤または治療剤)は、循環的に投与される。循環治療には、ある期間は第1治療剤(例えば、第1予防剤または治療剤)の投与、続いてある期間は第2治療剤(例えば、第2予防剤または治療剤)の投与、場合により、続いてある期間は第3治療剤(例えば、予防剤または治療剤)の投与など、およびこの順次投与の反復、即ち、該治療剤の1種に対する耐性の発現を抑制し、該治療剤の1種の副作用を回避もしくは抑制し、および/または該治療剤の効力を改善するための循環を伴う。
【０２０６】
ある種の実施形態では、本発明の同じ抗体の投与を反復してもよく、その反復間隔は、少なくとも1日、2日、3日、5日、10日、15日、30日、45日、2カ月、75日、3カ月、または少なくとも6カ月であってもよい。他の実施形態では、本発明の抗体以外の同じ治療剤(例えば、予防剤または治療剤)の投与を反復してもよく、その反復間隔は、少なくとも1日、2日、3日、5日、10日、15日、30日、45日、2カ月、75日、3カ月、または少なくとも6カ月であってもよい。
【０２０７】
5.6  生物アッセイ
5.6.1  本発明の抗体の免疫特異性
本発明の抗体またはその断片は、当業者に周知の多様な方法でその特性を決定し得る。特に、本発明の抗体またはその断片は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する能力に対してアッセイしてもよい。このようなアッセイは、溶液中(例えば、Houghten、1992、Bio/Techniques 13:412 421)、ビーズ上(Lam、1991、Nature 354:82 84)、チップ上(Fodor、1993、Nature 364:555 556)、細菌上(米国特許第5,223,409号)、胞子上(米国特許第5,571,698号、第5,403,484号、第5,223,409号)、プラスミド上(Cull他、1992、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1865 1869)、またはファージ上(Scott and Smith、1990、Science 249:386 390;Cwirla他、1990、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6378 6382および Felici、1991、J.Mol.Biol.222:301 310)(これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれている)で行ってもよい。哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合することが確認された抗体またはその断片は、次いで、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に対する特異性および親和性ついて、アッセイすることができる。
【０２０８】
本発明の抗体またはその断片は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に対する免疫特異的結合および他の抗原との交差反応性について、当分野で公知の任意の方法によってアッセイし得る。免疫特異的結合および交差反応性を分析するために使用できる免疫アッセイには、ほんのいくつか名を挙げれば、ウェスタンブロット、放射免疫法、ELISA(酵素免疫吸着法)、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降法、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散法、凝集法、補体結合法、免疫放射定量測定法、蛍光免疫アッセイ、プロテインA免疫アッセイ、結合タンパク競合測定法(competitive binding assay)、BIAcore速度分析などの技法を用いた競争的および非競争的なアッセイ系が挙げられるが、それだけに限らない。このようなアッセイは常套的であり、当分野で周知である(例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ausubel他、eds.、1994、Current Protocols in Molecular Biology、Vol.1、John Wiley & Sons,Inc.、New Yorkを参照されたい)。
【０２０９】
本発明の抗体またはその断片は、哺乳動物メタニューモウイルスの宿主細胞との融合を阻害する能力についても、当業者に公知の技法を用いてアッセイすることができる。本発明の抗体またはその断片は、哺乳動物メタニューモウイルスによる宿主細胞の感染を阻害する能力についても、当業者に公知の技法を用いてアッセイすることができる。
【０２１０】
5.6.2  in vitroおよびin vivoアッセイ
本発明の抗体、組成物または複合治療剤は、哺乳動物メタニューモウイルスによる感染から被験体を防御する能力、被験体における哺乳動物メタニューモウイルスの力価を低減する能力、または被験体における哺乳動物メタニューモウイルスの力価増加を抑制する能力について、in vitroおよび/またはin vivoで試験することができる。動物モデルが、本発明の抗体、組成物または複合治療剤の効力を評価するために、使用することができる。
【０２１１】
該ウイルスの、または該ウイルスによる感染、複製、増殖および/または構築を防止する本発明の抗体の能力は、細胞培養系において試験することができる。例示的な実施形態では、Vero細胞が後出の第6.1節に記載のように使用される。
【０２１２】
特定の実施形態では、ハムスターに本発明の抗体、組成物または併用療法を本発明の方法に従って投与し、哺乳動物メタニューモウイルスを接種し、4日以上後にハムスターを堵殺し、哺乳動物メタニューモウイルスの力価および抗哺乳動物メタニューモウイルス抗体の血清力価を決定する。さらに、この実施形態に従って、堵殺ハムスターからの組織(例えば、肺組織)に対して、組織学的変化を調べることができる。他の実施形態では、コトンラットがin vivoアッセイに使用される。
【０２１３】
本発明の抗体、組成物または併用療法は、ウイルス感染症の時間的経過を短縮する能力について試験することができる。本発明の抗体、組成物または併用療法は、ウイルス感染症に罹っているヒトの生存期間を少なくとも25%、好ましくは少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、または少なくとも99%延長する能力についても、試験することができる。さらに、本発明の抗体、組成物または併用療法は、ウイルス感染症に罹っているヒトの入院期間を少なくとも60%、好ましくは少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、または少なくとも99%短縮する能力についても、試験することができる。本発明の抗体、組成物または併用療法の機能をin vivoで分析するために、当業者に公知の技法を使用することができる。
【０２１４】
本発明の抗体を用いた治療または予防の異なる側面に対して、異なる動物モデル系を使用することができる。本発明の方法で使用できる異なる動物モデル系は、Schmidt他、2004、Virus Research 106:1-13に記載されている。
【０２１５】
細胞培養系、動物モデル系または被験体における哺乳動物メタニューモウイルスの増殖速度に対する本発明の抗体の効果を決定するために、幾種ものアッセイを使用し得る。
【０２１６】
本明細書に記載のアッセイは、ウイルス力価を経時的に測定することにより、ウイルスの増殖特性に対する本発明の抗体の効果を決定するために、使用してもよい。特定の実施形態では、ウイルス力価は、感染細胞または感染被験体から試料を取り、試料の連続希釈液を調製し、該ウイルスに感染しやすい細胞の単層を、ウイルス性タンパク発現を求めて染色できる感染病巣の出現を起こす該ウイルスの希釈液で感染させることにより、決定される。次いでその病巣を計数し、ウイルス力価を試料1ml当たりのプラーク形成単位として表す。好ましい実施形態では、動物またはヒトにおける哺乳動物メタニューモウイルスの増殖速度は、宿主の体液を感染後の多時点で採取し、ウイルス力価を測定することにより試験するのが最良である。
【０２１７】
被験体からの試料は、当業者に公知の任意の方法によって得ることができる。ある種の実施形態では、該試料は、吸引鼻汁、咽頭スワブ、唾液または気管支肺胞洗浄液からなる。
【０２１８】
ある種の実施形態では、細胞培養物または被験体におけるウイルス力価の決定は、マーカー遺伝子を発現する組換え哺乳動物メタニューモウイルスの試験によって促進することができる。例示的な実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスは、細胞中または動物中で検出できる蛍光タンパク質を発現する。次いで、細胞培養系または動物系におけるウイルス力価に対する本発明の抗体の効果を、細胞中または動物中でのその蛍光の強度を測定することにより試験することができる。本発明の抗体存在下での減少は、該抗体が哺乳動物メタニューモウイルスの中和に有効であることを示す。
【０２１９】
感染発生率の測定
感染発生率は、当分野で周知の任意の方法によって決定することができ、例えば、以下に限るわけではないが、臨床試料(例えば、鼻腔スワブ)を、免疫蛍光法(IFA)による哺乳動物メタニューモウイルスの力価について試験することにより、哺乳動物メタニューモウイルス感染に対する本発明の抗体の有効性を検定することができる。
【０２２０】
ある種の実施形態では、無傷細胞を含んだ試料を直接処理できるが、無傷細胞を含まない分離物を許容性細胞系(例えば、Vero細胞またはLLC-MK2細胞)上でまず培養すべきである。例示的な実施形態では、培養済み細胞懸濁液を例えば、300×g、室温5分間の遠心分離により清澄化した後、同一条件下でPBS、pH7.4(Ca++およびMg++なし)で洗浄すべきである。細胞ペレットを分析用に小容量のPBS中に再懸濁する。無傷細胞を含んだ一次臨床分離物をPBSと混合し、300×g、室温5分間で遠心分離する。その界面から滅菌ピペットチップで粘液を除き、細胞ペレットを同条件下でPBSでもう1度洗浄する。次いで、ペレットを分析用に小容量のPBS中に再懸濁する。各細胞懸濁液5〜10μlをアセトン洗浄12ウェルHTC超硬化スライドグラス上の5mmウェル1個につきスポットし、風乾する。スライドを冷アセトン(-20℃)中10分間固定する。PBS-1%BSAを各ウェルに添加後、室温で10分間インキュベーションすることにより、反応をブロックする。スライドをPBS-0.1%Tween-20中で3回洗浄し、風乾する。ブロッキング緩衝液中250ng/mlに希釈した各一次抗体試薬10μlをウェル1個につきスポットし、反応物を37℃の加湿雰囲気中30分間インキュベートする。次いで、スライドをPBS-0.1%Tween-20中3回取り替えて徹底的に洗浄し、風乾する。ブロッキング緩衝液中250ng/mlに希釈した適当な二次コンジュゲート抗体試薬10μlを各1個のウェルにつきスポットし、反応物を37℃の加湿雰囲気中、さらに30分間インキュベートする。次いで、スライドをPBS-0.1%Tween-20中3回取り替えて洗浄する。PBS-50%グリセロール-10mM Tris pH8.0-1mM EDTAを5μl、反応ウェル1個につきスポットし、スライド上にカバーグラスを載せる。その後、各反応ウェルを倍率200でB-2Aフィルター(EX 450〜490nm)を用いる蛍光顕微鏡により分析する。非染色細胞または二次試薬だけで染色した細胞から得られる自己蛍光背景に対して、陽性反応を採点する。陽性反応は、感染細胞の細胞質中にある小封入体で途切れた明るい蛍光を特徴とする。
【０２２１】
血清力価の測定
生体系における本発明の抗体の半減期を決定するために、本発明の抗体の血清力価を当分野で周知の任意の方法によって決定することができ、例えば、以下に限るわけではないが、血清試料中の抗体または抗体断片の量を、サンドイッチELISAによって定量することができる。手短に言えば、該ELISAは、血清中の抗体または抗体断片を認識する、ある抗体でマイクロタイタープレートを4℃で終夜、被覆することからなる。次いで、プレートをPBS-Tween-0.5%BSAで室温、約30分間ブロックする。PBS-TWEEN-BSA中で希釈した精製抗体または抗体断片を用いて標準曲線を作成し、試料はPBS-BSA中で希釈する。試料および標準をアッセイプレートの2ウェル1組に添加し、室温で約1時間インキュベートする。次に、非結合抗体をPBS-TWEENで洗い落とし、結合抗体は、標識二次抗体(例えば、西洋ワサビ結合ヤギ抗ヒトIgG)で室温、約1時間処理する。該標識抗体の結合は、標識特異的発色性基質を添加し、基質の代謝回転速度を例えば分光計で測定することにより、検出される。血清中の抗体または抗体断片量の濃度は、試料の基質代謝回転速度をある一定の希釈度での標準曲線の基質代謝回転速度と比較することにより、決定される。
【０２２２】
本発明の抗体の血清濃度を決定するための例示的実施形態では、哺乳動物MPVのFタンパク質を固体支持体に連結する。その後、本発明の抗体の濃度について試験しようとする物質を、該抗体の哺乳動物MPV成分との結合を促進する条件下で、固体支持体とインキュベートする。その後、いずれの非特異結合抗体も除く条件下で固体支持体を洗浄する。洗浄工程の後、結合抗体の存在を当業者に公知の任意の技法を用いて検出することができる。特定の実施形態では、哺乳動物MPVタンパク質-抗体複合体を、本発明の抗体を認識する検出可能標識抗体と、哺乳動物MPVの該成分と結合している抗体への検出可能標識抗体の結合を促進する条件下で、インキュベートする。特定の実施形態では、検出可能標識抗体は酵素活性と結合している。別の実施形態では、検出可能標識抗体は放射標識されている。次いで、哺乳動物MPVタンパク質-抗体-検出可能標識抗体複合体を洗浄し、その後、検出可能標識抗体の存在を当業者に公知の任意の技法で定量するが、使用する技法は、検出可能標識抗体の標識種に依存する。
【０２２３】
BIACOREアッセイ
抗体結合の速度パラメーターの決定は、例えば、0.05%Tween-20を含んだHBS緩衝液中の様々な濃度のモノクローナル抗体(「mAb」)250μLを、抗原を固定化したセンサーチップ表面上に注入することにより、決定することができる。抗原は哺乳動物MPVのFタンパク質でもよい。その流速は75μL/分に一定に維持される。解離データは、15分間、必要であればそれより長く集められる。注入/解離の各サイクル後、結合mAbは、希酸、通常10〜100mM HClの短い1分パルスを用いて抗原表面から除かれるが、状況が許せば他の再生剤が使用される。
【０２２４】
より具体的には、会合速度konおよび解離速度koffの測定のために、抗原は、標準のアミンカップリング試薬、即ちEDC/NHS法(EDC=N-ジエチルアミノプロピル-カルボジイミド)の使用により、センサーチップ表面上に直接固定化される。手短に言えば、10mM NaOAc、pH4またはpH5中の5〜100nM抗原溶液を調製し、EDC/NHS活性化表面上に、抗原約30〜50RU(Biacore Resonance Unit)相当が固定化されるまで通液する。この後、未反応活性エステルの「キャップ」を1M Et-NH2の注入で除去する。参照のために、抗原を含んでいないブランク表面を同一の固定化条件下で調製する。適当な表面を調製し終えたら、抗体試薬の各1種の適切な希釈系列をHBS/Tween-20中で調製し、連続的に接続されている抗原表面、参照細胞表面の双方の上に通液する。調製する抗体濃度の範囲は、平衡結合定数KDの見積り値に応じて変動する。前記したように、結合抗体は、注入/解離の各サイクル後、適当な再生剤を使用して除かれる。
【０２２５】
全データセットの収集後、生成した結合曲線は、その機器製造業者BIAcore,Inc.(Piscataway、NJ)により供給されるアルゴリズムを用いて全体的な適合を受ける。全データが1:1ラングミュア結合モデルに適合される。これらのアルゴリズムによって、konおよびkoffが計算され、その値から見掛け平衡結合定数KDが、2つの速度定数の比(即ち、koff/kon)として導かれる。個々の速度定数の誘導法に関するより詳細な取扱いは、BIAevaluation Software Handbook(BIAcore,Inc.、Piscataway、NJ)に見出すことができる。
【０２２６】
微量中和アッセイ
本発明の抗体またはその抗原結合性断片がウイルス感染性を中和する能力は、微量中和アッセイによって決定される。この微量中和アッセイは、Anderson他(その開示の全体が、参照により本明細書に組み込まれている1985、J.Clin.Microbiol.22:1050-1052)により記載された手順の改変である。この手順は、その開示の全体が、参照により本明細書に組み込まれているJohnson他、1999、J.Infectious Diseases 180:35-40にも記載されている。
【０２２７】
抗体希釈液を3点1組で96穴プレートを用いて作製する。50〜1000 TCID50の哺乳動物MPVを、抗体またはその抗原結合性断片の連続希釈液とインキュベートすることにより、96穴プレートのウェル中で37℃、2時間試験する。ウイルス混合物を、それだけに限らないが、Vero細胞などの哺乳動物MPV感染に感受性の80〜95%集密細胞へ添加し、37℃、5日間5%CO2中で培養する。5日後、培地を吸引してから、細胞を洗浄し、80%アセトンおよび20%PBSでプレートに固定する。次いで、ウイルスの複製をFタンパク質などのウイルス抗原の発現により確認する。固定化細胞を、抗Fタンパク質モノクローナル抗体などのビオチン結合抗ウイルス抗原とインキュベートし、洗浄してから、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合アビジンをそのウェルに添加する。そのウェルを再び洗浄し、基質TMB(チオニトロ安息香酸)の代謝回転を450nmで測定する。中和力価は、ウイルスだけの対照細胞から得られる450nmでの吸光度(OD450)を少なくとも50%減少させる抗体濃度として表示する。
【０２２８】
ここに記載の微量中和アッセイは一例にすぎない。代替法として、標準的中和アッセイを用いて、ウイルスがどの程度有意に抗体の影響を受けるかを決定することができる。
【０２２９】
ウイルス融合阻害アッセイ
ある種の実施形態では、ウイルス融合阻害アッセイを用いてもよい。このアッセイは、細胞を各ウイルスで4時間感染させた後、抗体を添加し、読出しは、細胞の融合の有無によることを別とすれば、原理的に微量中和アッセイと同じである(Taylor他、1992、J.Gen.Virol.73:2217-2223)。
【０２３０】
チャレンジ試験(CHALLENGE STUDIES)
このアッセイは、動物モデル系、それだけに限らないが、コトンラットまたはハムスターなどにおける哺乳動物メタニューモウイルスによる感染を防止する、本発明の抗体の能力を決定するために使用される。本発明の抗体は、静脈内(IV)経路、筋肉内(IM)経路または鼻腔内(IN)経路により、投与することができる。感染は、当業者に周知の任意の方法により起こすことができる。このアッセイは、抗体の血清濃度を、該抗体が結合するウイルスの肺力価の減少と相関させるためにも使用される。
【０２３１】
0日に各群の動物、それだけに限らないが、コトンラット(Sigmodon hispidis、平均体重100g)またはカニクイザル(cynomolgous macacques、平均体重2.0kg)に、本発明の抗体またはBSAを筋肉注射、静脈注射または鼻腔内経路により投与する。本発明の抗体の投与の前、それと同時、またはその後に、野生型ウイルスの野生型哺乳動物メタニューモウイルスに動物を感染させる。ある種の実施形態では、野生型ウイルスに動物を感染させるのは、本発明の抗体を投与してから、少なくとも1日、少なくとも2日、少なくとも3日、少なくとも4日、少なくとも5日、少なくとも6日、1週間、または1カ月以上後である。
【０２３２】
感染後、コトンラットを堵殺し、その肺組織を収集し、感染病巣の力価測定により肺ウイルス力価を決定する。ウシ血清アルブミン(BSA)10mg/kgが陰性対照として使用される。チャレンジ時の血清抗体濃度は、サンドイッチELISAを用いて決定する。同様にして、カニクイザルでは鼻腔および肺の洗浄液中のウイルス力価を決定することができる。
【０２３３】
5.6.3  毒性試験
本発明の予防および/または治療処方の毒性および/または効力は、細胞培養物または実験動物における標準的薬学手順、例えばLD50(集団の50%に対する致死用量)およびED50(集団の50%に対して治療上有効な用量)を決定するための手順によって、決定することができる。毒作用と治療効果との用量比が治療指数であり、比率LD50/ED50として表すことができる。大きな治療指数を示す治療剤が好ましい。有毒な副作用を示す治療剤を使用してもよいが、このような作用物質を患部組織の部位に誘導することにより、非感染細胞の潜在的損傷を最小限とし、それにより副作用を低減する送達系を設計するように、配慮すべきである。
【０２３４】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトに使用するための予防剤および/または治療剤の用量範囲を処方する際に使用することができる。このような作用物質の用量は、ED50を含み、毒性がほとんどないかまったくない循環濃度の範囲内にあるのが好ましい。この用量は、使用する剤形および利用する投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本発明の方法で使用する任意の治療剤について、その治療有効用量は、細胞培養アッセイから当初に見積もることができる。動物モデルにおける用量は、細胞培養で決定したIC50(即ち、症状を最大で半分抑制する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度の範囲を実現するように、処方してもよい。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために、使用することができる。血漿中の濃度は、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定し得る。
【０２３５】
さらに、当業者に公知の任意のアッセイは、哺乳動物メタニューモウイルス感染に関連する、またはそれを特徴とする疾患もしくは障害、または1つもしくは複数のその症状に対する、本明細書開示の抗体、組成物、併用療法の予防的および/または治療的使用を評価するために、使用することができる。
【０２３６】
5.7  抗体の診断的使用
哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する本発明の抗体(抗体断片またはその変異体を含む、あるいはそれからなる分子を包含する)は、哺乳動物メタニューモウイルス感染を検出するための診断目的に使用することができる。
【０２３７】
ある種の実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物メタニューモウイルスの検出を促進する検出可能な標識と結合される。
【０２３８】
本発明の抗体は、生体試料中の哺乳動物メタニューモウイルスの力価を、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を用いて測定するために、使用することができる(例えば、Jalkanen他、1985、J.Cell.Biol.101:976-985およびJalkanen他、1987、J.Cell .Biol.105:3087-3096を参照されたい)。タンパク質遺伝子発現の検出に有用な他の抗体基準法には、酵素免疫吸着法(ELISA)、放射免疫法(RIA)などの免疫アッセイが含まれる。適切な抗体アッセイ用標識は、当分野で公知であり、それには、グルコースオキシダーゼなどの酵素標識、ヨウ素(125I、121I)、炭素(14C)、硫黄(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(121m)、テクネチウム(99Tc)などの放射性同位体、ルミノールなどの発光標識、およびフルオレッセイン、ローダミンなどの蛍光標識、ならびにビオチンが含まれる。
【０２３９】
ある種の実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物メタニューモウイルスの全サブタイプ、即ちサブタイプA1、A2、B1およびB2のFタンパク質に結合する。ある種の実施形態では、抗体は、ヒトメタニューモウイルスのサブタイプ、即ちサブタイプA1、A2、B1およびB2に特異的に結合する。したがって、哺乳動物メタニューモウイルスの特定のサブタイプによる感染を、その抗体の特異性に応じて診断することができる。
【０２４０】
理論にこだわるわけではないが、本発明の方法は、被験体の症状から明確な診断が得られない場合に特に有用である。
【０２４１】
ある種の実施形態では、本発明の抗体は、鳥類におけるトリニューモウイルス感染症を診断するためにも、使用することができる。
【０２４２】
5.8  キット
本発明は、上記方法に使用できるキットを提供する。一実施形態では、キットは、本発明の抗体、好ましくは精製抗体を1個または複数の容器中に含む。別の実施形態では、キットは、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する、本発明の抗体断片を含む。ある種の実施形態では、本発明のキットは、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質と反応しない対照抗体をさらに含む。別の特定の実施形態では、本発明のキットは、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に対する抗体の結合を検出する手段を含む(例えば、該抗体が、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物もしくは発光化合物などの検出可能な基質に結合していてもよく、または該第1抗体を認識する第2抗体が、検出可能な基質に結合していてもよく、あるいは該抗体が、Fタンパク質もしくはウイルス全体の結合により、固体表面の光学的性質の変化を起こすような固体表面に結合していてもよい)。
【０２４３】
追加の実施形態では、本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質を含有する血清のスクリーニングに使用する診断キットを提供する。該診断キットは、本発明の実質的に単離された抗体と、該抗体に対する哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質の結合を検出する手段とを含む。一実施形態では、該抗体は固体支持体に結合されている。特定の実施形態では、該抗体はモノクローナル抗体であってもよい。キットの検出手段は、第2の標識モノクローナル抗体を含んでもよい。代替または追加として、検出手段は標識された競合抗原を含んでもよい。
【０２４４】
5.9  製造品
本発明は、包装され、標識された最終医薬品も包含する。この製造品は、ガラスバイアルまたは密封される他の容器などの適当な入れ物または容器中に、適当な単位剤形を含む。該医薬品は、pH6.0の10mMヒスチジン緩衝液および150mM塩化ナトリウムを含んだ滅菌液として、単一用量バイアル中に製剤してもよい。溶液各1.0mLは、注射用の水中にタンパク質100mg、ヒスチジン1.6mgおよび塩化ナトリウム8.9mgを含み得る。製造プロセス中に、製剤緩衝液のpHは塩酸を用いて6.0に調節される。非経口投与に適当な剤形の場合、活性成分、例えば、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する本発明の抗体は、滅菌されており、微粒子非含有溶液として投与に適当である。即ち、本発明は、非経口溶液、凍結乾燥粉末の双方を包含し、その各々が滅菌されており、後者は注射前の液戻しに適当である。あるいは、該単位剤形は、経口、経皮、鼻腔内または局所送達に適当な固体でもよい。
【０２４５】
好ましい実施形態では、該単位剤形は、静脈内、筋肉内、鼻腔内、経口、局所または皮下送達に適当である。したがって、本発明は、各送達経路に適当な、好ましくは滅菌してある溶液を包含する。
【０２４６】
任意の医薬品の場合のように、包装用の材料および容器は、保存および発送中の製品の安定性を保護するように設計されている。さらに、本発明の製品は、医者、技術者または患者に、当の疾患または障害の適切な予防法または治療法を助言する使用説明書または他の情報材料も含む。即ち、該製造品は、それだけに限らないが、実際の用量および監視手順を含めた投与計画を指示または提案する教示手段を含んでいる。
【０２４７】
具体的には、本発明は、箱、瓶、チューブ、バイアル、容器、噴霧器、吸入器、静脈注入液(i.v.)用バッグ、封筒袋などの包装材料と、前記包装材料内に入れた薬剤の少なくとも1単位の剤形とを含む製造品を提供し、前記薬剤は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体を含み、前記包装材料は、哺乳動物メタニューモウイルスの感染に伴う障害に関連する1つもしくは複数の症状、またはその障害の1つもしくは複数の症状を、特定の用量を投与し、本明細書に記載の特定の投与計画を用いることにより、予防、管理、治療および/または改善するために使用できることを示す、教示手段を含む。
【０２４８】
5.10  抗体の生成方法
抗原に免疫特異的に結合する抗体は、抗体合成のための当分野で公知の任意の方法、特に化学合成、または好ましくは組換え発現技法により生成することができる。
【０２４９】
抗原に免疫特異的に結合するポリクローナル抗体は、当分野で周知の多様な手順により生成することができる。例えば、ヒト抗原を、それだけに限らないが、ウサギ、マウス、ラットなどを含めた様々な宿主動物に投与することにより、ヒト抗原に特異的なポリクローナル抗体を含んだ血清の生成を引き起こすことができる。免疫応答を高めるために、宿主の種に応じて多様なアジュバントを使用してもよく、そうしたものには、それだけに限らないが、フロイントのアジュバント(完全および不完全)、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、リゾレシチンなどの表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、乳濁液、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノール、およびBCG(bacille Calmette-Guerin)、コリネバクテリウムパルヴム(corynebacterium parvum)などの潜在的に有用なヒト用アジュバントが挙げられる。
【０２５０】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換えおよびファージディスプレーの各技法、またはその組合せを含めた、当分野で公知の広範囲の技法を用いて調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当分野で公知であり、例えば、Harlow他、Antibodies:A Laboratory Manual、(Cold Spring Harbor Laboratory Press、2nd ed.1988);Hammerling他、in:Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas 563 681(Elsevier、N.Y.、1981)(前記各参考文献は、その全体が参照により組み込まれている)で教示される技法を含めた、ハイブリドーマ技法を用いて生成することができる。本明細書で使用する場合の用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術によって生成する抗体に限らない。用語「モノクローナル抗体」とは、真核、原核またはファージクローンを含む単一クローンから誘導される抗体を指し、その生成方法を指すのではない。
【０２５１】
ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を生成し、スクリーニングする方法は、常套的であり、当分野で周知である。手短に言うと、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質でマウスを免疫することができ、免疫反応が検出されたら、例えば、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に特異的な抗体がマウス血清中に検出されたら、マウスの脾臓を採集し、脾臓細胞を分離する。次いで、脾臓細胞を周知の技法により適当な任意の骨髄細胞、例えば、ATCCから入手できる細胞系SP20からの細胞と融合する。ハイブリドーマは、限界希釈によって選択され、クローニングされる。その上、RIMMS(反復免疫多重部位)技法を用いて、動物を免疫することもできる(その全体が参照により組み込まれているKilptrack他、1997 Hybridoma 16:381-9)。次いで、ハイブリドーマクローンを、本発明のポリペプチドと結合できる抗体を分泌する細胞を得るために、当分野公知の方法によりアッセイする。マウスを陽性のハイブリドーマクローンで免疫することにより、一般に高濃度の抗体を含んだ腹水を生成することができる。
【０２５２】
したがって、本発明は、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞の培養により抗体を生成する方法であって、好ましくは、該ハイブリドーマが、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質で免疫したマウスから分離した脾臓細胞を骨髄細胞と融合した後、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質と結合できる抗体を分泌するハイブリドーマクローンを得るために、融合で生じたハイブリドーマをスクリーニングすることによって生成される方法を提供する。
【０２５３】
哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体断片を、当業者に公知の任意の技法によって生成してもよい。例えば、本発明のFabおよびF(ab')2断片を、パパイン(Fab断片を生成する)またはペプシン(F(ab')2断片を生成する)などの酵素を用いた免疫グロブリン分子のタンパク分解切断によって、生成してもよい。F(ab')2断片は、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のCH1ドメインを含有する。さらに、本発明の抗体は、当分野で公知の多様なファージディスプレー法を用いて生成することもできる。
【０２５４】
ファージディスプレー法では、機能性抗体ドメインが、それをコードするポリヌクレオチド配列を保持するファージ粒子の表面上にディスプレーされる。特に、VHおよびVLドメインをコードするDNA配列は、動物cDNAライブラリー(例えば、罹患組織のヒトまたはマウスcDNAライブラリー)から増幅される。VHおよびVLドメインをコードする該DNAは、PCRによってscFvリンカーと共に組換えられ、ファージミドベクター中にクローニングされる。そのベクターは大腸菌中にエレクトロポレーションを受け、大腸菌はヘルパーファージに感染する。こうした方法で使用されるファージは、通常fdおよびM13を含めた糸状ファージであり、VHおよびVLドメインは、普通、ファージの遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIに組換え融合される。特定の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原、例えば標識抗原、または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉された抗原を用いて、選択または同定することができる。本発明の抗体を作製するために使用できるファージディスプレー法の例には、Brinkman他、1995、J .Immunol.Methods 182:41-50;Ames他、1995、J.Immunol.Methods 184:177-186;Kettleborough他、1994、Eur.J.Immunol.24:952-958;Persic他、1997、Gene 187:9-18;Burton他、1994、Advances in Immunology 57:191-280、PCT出願PCT/GB91/0l 134、国際公開WO90/02809、WO91/10737、WO92/01047、WO92/18619、WO93/11236、WO95/15982、WO95/20401およびWO97/13844、ならびに米国特許第5,698,426号、第5,223,409号、第5,403,484号、第5,580,717号、第5,427,908号、第5,750,753号、第5,821,047号、第5,571,698号、第5,427,908号、第5,516,637号、第5,780,225号、第5,658,727号、第5,733,743号および第5,969,108号に開示されるものが含まれるが、そうしたものの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０２５５】
上記参考文献に記載のように、ファージの選択後、ファージからの抗体コード領域を単離し、ヒト抗体を含めた抗体全体、またはいずれか他の所望の抗原結合性断片を生成するために用い、例えば下記のような哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含めた任意の所望の宿主中で発現させることができる。国際公開WO92/22324、Mullinax他、1992、BioTechniques 12(6):864-869;Sawai他、1995、AJRI 34:26-34およびBetter他、1988、Science 240:1041-1043(前記参考文献は、その全体が参照により組み込まれている)に開示されるような当分野で公知の方法を用いて、Fab、Fab'およびF(ab')2断片を組換え生成する技法も使用することができる。
【０２５６】
抗体全体を生成するために、VHまたはVLヌクレオチド配列、制限酵素部位、および制限酵素部位を保護するための隣接配列を含むPCRプライマーを使用して、scFvクローン中のVHまたはVL配列を増幅することができる。当業者に公知のクローニング技法を利用して、PCR増幅VHドメインをVH定常領域、例えばヒトγ4定常領域を発現するベクター中にクローニングすることができ、PCR増幅VLドメインをVL定常領域、例えばヒトκまたはλ定常領域を発現するベクター中にクローニングすることができる。好ましくは、VHまたはVLドメインを発現するためのベクターは、EF-1αプロモーター、分泌シグナル、該可変ドメイン用のクローニング部位、定常ドメイン、およびネオマイシンなどの選択マーカーを含む。VHおよびVLドメインを、必要な定常領域を発現する1つのベクター中にクローニングしてもよい。次いで、当業者に公知の技法を用いて、重鎖変換ベクターおよび軽鎖変換ベクターを細胞系中に同時トランスフェクションを行うことにより、全長抗体、例えばIgGを発現する安定的または一過的細胞系を生成する。
【０２５７】
ヒトにおける抗体のin vivo使用およびin vitro検出アッセイを含めた一部の使用に対しては、ヒトまたはキメラ抗体を使用することが好ましい場合もある。完全ヒト抗体は、ヒト被験体の治療処置にとって特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いる、上記ファージディスプレー法を含めた当分野公知の多様な方法によって、作製することができる。その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第4,444,887号および第4,716,111号、ならびに国際公開WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、WO98/16654、WO96/34096、WO96/33735およびWO91/10741も参照されたい。抗体のヒト化は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、2004年8月20日に出願し、2005年2月24日にUS2005/0042664として公開された米国特許出願第10/923,068号に教示された技法を用いても実現することができる。
【０２５８】
ヒト抗体は、機能的内因性免疫グロブリンを発現できないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを用いて生成することもできる。例えば、ヒト重鎖/軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体をマウス胚性幹細胞中に、ランダムに、または相同的組換えにより導入してもよい。あるいは、該ヒト重鎖/軽鎖遺伝子以外に、ヒトの可変領域、定常領域および多様性領域をマウス胚性幹細胞中に導入してもよい。マウス重鎖/軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同的組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別に、またはそれと同時に機能不全にし得る。特に、JH領域のホモ接合的欠失により、内因性抗体の産生が防止される。該改変胚性幹細胞を増殖させ、胚盤胞中にマイクロインジェクションすることにより、キメラマウスを作製する。次いで、そのキメラマウスを育種することにより、ヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を作製する。トランスジェニックマウスは、通常通り、選択した抗原、例えば、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質の全部または一部で免疫される。その抗原に対するモノクローナル抗体は、従来からのハイブリドーマ技術を用いて免疫済みトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスが保持するヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、B細胞の分化中に再配列した後、クラススイッチおよび体細胞変異を受ける。したがって、このような技法を用いて、治療上有用なIgG、IgA、IgMおよびIgE抗体を作製することが可能である。ヒト抗体を作製するためのこの技術を概観するためには、LonbergおよびHuszar(1995、Int.Rev.Immunol.13:65-93)を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのこの技術、ならびにこのような抗体を作製するための手順に関する詳細な考察については、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、国際公開WO98/24893、WO96/34096およびWO96/33735、ならびに米国特許第5,413,923号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,569,825号、第5,661,016号、第5,545,806号、第5,814,318号および第5,939,598号を参照されたい。その上、Abgenix,Inc.(Freemon
t、CA)、Genpharm(San Jose、CA)などの企業は、上記同様の技術を用いて、選択した抗原に対するヒト抗体を作製する業務を行うことができる。
【０２５９】
キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる免疫グロブリン分子に由来する分子である。キメラ抗体を作製する方法は当分野で公知である。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Morrison、1985、Science 229:1202;Oi他、1986、BioTechniques 4:214;Gillies他、1989、J.Immunol.Methods 125:191-202、ならびに米国特許第5,807,715号、第4,810,567号、第4,816,397号および第6,331,415号を参照されたい。
【０２６０】
ヒト化抗体は、所定の抗原に結合でき、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域と、対象とする抗原(「ドナー抗体」)、例えば哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に結合することが知られている免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するCDRとを含む、抗体もしくはその変異体またはそれらの断片である。ヒト化抗体は、CDR領域の全体または実質的に全体がドナー抗体に対応し、フレームワーク領域の全体または実質的に全体がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列と同じである、少なくとも1つ、通常2つの可変ドメイン(Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc、Fv)の全体を実質的に含んでいる。好ましくは、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域、通常はヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部(Fc)も含んでいる。普通、該抗体は、軽鎖と、重鎖の少なくとも可変ドメインとを共に含んでいよう。該抗体は、重鎖のCH1、ヒンジ、CH2、CH3、およびCH4の各領域も含み得る。該ヒト化抗体は、IgM、IgG、IgD、IgAおよびIgEを含めた任意のクラスの免疫グロブリン、ならびにIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を含めた任意のアイソタイプから選択することができる。普通、その定常ドメインは、該ヒト化抗体が細胞毒性を示すことが望ましい場合、補体結合定常ドメインであり、そのクラスは通常IgGサブクラス1である。細胞毒性が望ましくない場合、その定常ドメインはIgGサブクラス2のクラスである。該ヒト化抗体は、複数のクラスまたはアイソタイプからの配列を含み得るものであり、所望のエフェクター機能を最適化するために特定の定常ドメインを選択することは、当分野における普通の技術に入る。ヒト化抗体のフレームワークおよびCDR領域は、親配列に厳密に一致する必要はなく、例えば、ドナーCDRまたはコンセンサスフレームワークは、少なくとも1個の残基の置換、挿入または欠失により変異誘発を受け、そのため、その部位のCDRまたはフレームワーク残基が、コンセンサス抗体、導入抗体のいずれにも一致しなくてもよい。しかし、このような変異は広範なものではなかろう。普通、ヒト化抗体残基の少なくとも75%、より頻繁には90%、最も好ましくは95%超が、親のFRおよびCDR配列の残基に一致するであろう。ヒト化抗体は、当分野で公知の多様な技法を用いて作製することができ、そうした技法には、それだけに限らないが、CDRグラフト化(欧州特許EP239,400、国際公開WO91/09967、ならびに米国特許第5,225,539号、第5,530,101号および第5,585,089号)、化粧張り(veneering)または表面更新(resurfacing)(欧州特許EP592,106およびEP519,596、Padlan、1991、Molecular Immunology 28(4/5):489-498;Studnicka他、1994、Protein Engineering 7(6):805-8 14および Roguska他、1994、PNAS 91:969-973)、連鎖シャッフリング(米国特許第5,565,332号)、ならびに例えば、米国特許第6,407,213号、米国特許第5,766,886号、WO9317105、Tan他、J.Immunol.169:1119 25(2002)、Caldas他、Protein Eng.13(5):353 60(2000)、Morea他、Methods 20(3):267 79(2000)、Baca他、J.Biol.Chem.272(16):10678 84(1997)、Roguska他、Protein Eng.9(10):895 904(1996)、Couto他、Cancer Res.55(23 Supp):5973s-5977s(1995)、Couto他、Cancer Res.55(8):1717-22(1995)、Sandhu JS、Gene 150(2):409 10(1994)およびPedersen他、J.Mol.Biol.235(3):959-73(1994)に開示されている技法が挙げられる。フレームワーク領域内のフレームワーク残基は、抗原結合性を変化させる、好ましくは改善するために、CDRドナー抗体から���対応残基で置換されることがしばしばあろう。こうしたフレームワーク置換は、当分野で周知の方法、例えば、CDRおよびフレームワークの残基の相互作用のモデル化による、抗原結合性に重要なフレームワーク残基の同定、ならびに配列比較による特定位置の異常なフレームワーク残基の同定によって、同定される(例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Queen他、米国特許第5,585,089号、およびRiechmann他、1988、Nature 332:323を参照されたい)。
【０２６１】
単一ドメイン抗体、例えば軽鎖を欠いた抗体は、当分野で周知の方法により作製することができる。その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、Riechmann et aI.、1999、J.Immuno.231:25-38;Nuttall他、2000、Curr.Pharm.Biotechnol.1(3):253-263;Muylderman、2001、J.Biotechnol.74(4):277302、米国特許第6,005,079号、ならびに国際公開WO94/04678、WO94/25591およびWO01/44301を参照されたい。
【０２６２】
さらに、抗原(例えば、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質)に免疫特異的に結合する抗体は、次に、当業者に周知の技法を用いて、抗原を「模倣」する抗イディオタイプ抗体を生成するために利用することができる。(例えば、Greenspan & Bona、1989、FASEB J.7(5):437-444およびNissinoff、1991、J.Immunol.147(8):2429-2438を参照されたい)。
【０２６３】
5.10.1  抗体をコードするポリヌクレオチド配列
本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する、抗体またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドに、例えば上記に規定したような高ストリンジェンシー、中度または低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下、ハイブリダイズするポリヌクレオチドも包含する。
【０２６４】
当分野で任意の公知の方法により、該ポリヌクレオチドを得てもよく、該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定してもよい。mAb234およびmAb338のアミノ酸配列は公知であるので、こうした抗体をコードするヌクレオチド配列は、当分野で周知の方法を用いて決定することができる、即ち、特定のアミノ酸をコードすることが知られているヌクレオチドコドンが、該抗体をコードする核酸を生成するように組み立てられている。該抗体をコードするこのようなポリヌクレオチドは、化学合成オリゴヌクレオチド(例えば、Kutmeier他、1994、BioTechniques 17:242に記載のような)から構築してもよいが、それには、手短に言うと、該抗体、断片またはその変異体をコードする配列の各部分を含んだ重複オリゴヌクレオチドの合成、そうしたオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、次いでPCRによる連結オリゴヌクレオチドの増幅が必要である。
【０２６５】
あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適当な供給源から得た核酸から生成してもよい。特定の抗体をコードする核酸を含んだクローンは入手できないが、その抗体分子の配列が既知である場合、その免疫グロブリンをコードする核酸は、化学的に合成してもよいし、あるいは、適当な供給源(例えば、抗体cDNAライブラリー、あるいは、本発明の抗体を発現するように選択したハイブリドーマ細胞などの、該抗体を発現する任意の組織もしくは細胞から生成したcDNAライブラリー、またはそれから単離した核酸、好ましくはポリA+RNA)から、該配列の3'および5'末端にハイブリダイゼーションできる合成プライマーを用いるPCR増幅によって、またはその特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いるクローニングによる、例えば、該抗体をコードするcDNAライブラリー由来のcDNAクローンの同定によって、得てもよい。PCRにより生成した増幅核酸は、次いで、当分野で任意の公知の方法を用いて、複製可能なクローニングベクター中にクローニングしてもよい。
【０２６６】
該抗体のヌクレオチド配列が決定されると、該抗体のヌクレオチド配列は、当分野で周知のヌクレオチド配列の操作法、例えば組換えDNA技法、部位特異的変異誘発、PCRなど(例えば、共にその全体が参照により本明細書に組み込まれている、Sambrook他、1990、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、2d Ed.、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NYおよびAusubel他、eds.、1998、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、NYに記載の技法を参照されたい)を用いて操作することにより、異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成する、例えば、アミノ酸の置換、欠失および/または挿入を創出することをしてもよい。
【０２６７】
特定の実施形態では、表1に列挙したCDRの1種または複数が、常套的な組換えDNA技法を用いてフレームワーク領域内に挿入される。該フレームワーク領域は、天然またはコンセンサスフレームワーク領域であってもよく、好ましくはヒトフレームワーク領域である(ヒトフレームワーク領域の一覧表については、例えば、Chothia他、1998、J.Mol.Biol.278:457-479を参照されたい)。好ましくは、フレームワーク領域とCDRとの組合せで生成するポリヌクレオチド配列は、ヒトメタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、1個または複数のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で起こすのがよく、好ましくは、アミノ酸置換は、抗体の抗原への結合性を改善する。その上、このような方法を用いて、連鎖内ジスルフィド結合にかかわる1個または複数の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を起こすことにより、1個または複数の連鎖内ジスルフィド結合を欠いた抗体分子を生成してもよい。該ポリヌクレオチドに対する他の変更も、本発明により包含され、当分野の技術に属する。
【０２６８】
5.10.2  抗体の組換え発現
哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に免疫特異的に結合する、本発明の抗体(例えば、本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖またはその断片、あるいは本発明の一本鎖抗体)の組換え発現には、該抗体をコードするポリヌクレオチドを含んだ発現ベクターの構築が必要である。本発明の抗体分子、抗体の重鎖もしくは軽鎖、またはその断片(必ずではないが、好ましくは重鎖または軽鎖可変ドメインを含有する)をコードするポリヌクレオチドが得られてしまうと、該抗体分子産生用ベクターが、当分野周知の技法を用いる組換えDNA技術により生成し得る。したがって、抗体コードヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの発現によるタンパク質の調製法は、本明細書に記載されている。当業者に周知の方法を用いて、抗体コード配列と、適当な転写および翻訳制御シグナルとを含有する発現ベクターを構築することができる。こうした方法には、例えば、in vitro組換えDNA技法、合成技法、in vivo遺伝子組換えなどが挙げられる。したがって、本発明は、プロモーターに作動可能に連結した、本発明の抗体分子、抗体の重鎖もしくは軽鎖、抗体の重鎖もしくは軽鎖可変ドメイン、またはその断片、あるいは重鎖もしくは軽鎖CDRをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。このようなベクターは、該抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含んでもよく(例えば、国際公開WO86/05807および国際公開WO89/01036、ならびに米国特許第5,122,464号を参照されたい)、該抗体の可変ドメインを重鎖全体、軽鎖全体、重鎖/軽鎖全体のいずれかの発現のために、このようなベクター中にクローニングしてもよい。
【０２６９】
該発現ベクターは、従来技法により宿主細胞に移され、導入細胞は、次いで従来技法により培養されることにより、本発明の抗体を産生する。したがって、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結した、本発明の抗体もしくはその断片、またはその重鎖もしくは軽鎖、またはその断片、あるいは本発明の一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を包含する。二重鎖抗体を発現するための好ましい実施形態では、以下に詳述するような免疫グロブリン分子全体の発現のために、重鎖、軽鎖両方をコードするベクターを宿主細胞中で同時発現させ得る。
【０２７０】
多様な宿主-発現ベクター系を利用して、本発明の抗体分子を発現するために利用し得る(例えば、米国特許第5,807,715号を参照されたい)。このような宿主-発現系は、対象とするコード配列を産生し、その後精製する媒体であるが、適当なヌクレオチドコード配列で形質転換され、またはそれを導入されると、本発明の抗体分子をその場で発現し得る細胞でもある。こうした系には、それだけに限らないが、抗体コード配列を含んだ組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌(例えば、大腸菌および枯草菌)、抗体コード配列を含んだ組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母(例えば、サッカロミセスピキア(Saccharomyces Pichia))、抗体コード配列を含んだ組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系、抗体コード配列を含んだ、組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)に感染した、または組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換された植物細胞系、あるいは哺乳動物細胞のゲノム(例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳動物ウイルス(例えば、アデノウイルス後期プロモーター;ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)に由来するプロモーターを含んだ組換え発現構築体を保持する哺乳動物細胞系(例えば、COS、CHO、BHK、293、NSOおよび3T3細胞)が挙げられる。好ましくは大腸菌などの細菌細胞、より好ましくは、特に、組換え抗体分子全体の発現用の真核細胞が、組換え抗体分子の発現のために使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルスからの主要中初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと共用する、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)などの哺乳動物細胞は、抗体にとって有効な発現系である(Foecking他、1986、Gene 45:101およびCockett他、1990、Bio/Technology 8:2)。特定の実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質、またはその断片に免疫特異的に結合する、本発明の抗体、その誘導体、類縁体または断片をコードするヌクレオチド配列の発現は、構成プロモーター、誘導プロモーター、または組織特異的プロモーターにより調節される。
【０２７１】
細菌系では、発現しようとする抗体分子に対する使用目的に応じて、幾種もの発現ベクターを有利に選択し得る。例えば、抗体分子の医薬組成物を作製するために、このような抗体を多量に生成しようとする場合、精製容易な融合タンパク産物の高レベル発現を指示するベクターが、望ましいものとなり得る。このようなベクターには、抗体コード配列が、lac Zコード領域とフレーム内でそのベクター中に個別に連結されることにより、融合タンパク質を産生し得る、大腸菌発現ベクターpUR278(Ruther他、1983、EMBO 12:1791)と、pINベクター(Inouye & Inouye、1985、Nucleic Acids Res.13:3101-3109;Van Heeke & Schuster、1989、J.Biol.Chem.24:5503-5509)などが挙げられるが、それだけに限らない。pGEXベクターも、グルタチオン5-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として、外来ポリペプチドを発現するために使用し得る。一般に、このような融合タンパク質は、可溶性であり、マトリックスグルタチオンのアガロースビーズへ吸着、結合した後、遊離グルタチオンの存在下で溶出することにより、溶解細胞から容易に精製することができる。該pGEXベクターは、トロンビンまたはXa因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計することにより、クローニングした標的遺伝子産物をGST部分から放出させることができる。
【０２７２】
昆虫系では、オートグラファカニフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcNPV)が、外来遺伝子を発現するベクターとして使用される。該ウイルスは、スポドプテラフルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞中で増殖する。抗体コード配列は、このウイルスの非必須領域(例えば、ポリヘドリン遺伝子)中に個別にクローニングし、AcNPVプロモーター(例えば、ポリヘドリンプロモーター)の制御下に配置し得る。
【０２７３】
哺乳動物宿主細胞では、多数のウイルス性発現系を利用し得る。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、対象とする抗体コード配列は、アデノウイルス転写/翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび3部構成リーダー配列に連結し得る。このキメラ遺伝子は、次いで、in vitroまたはin vivoの組換えによりアデノウイルスゲノム中に挿入し得る。このウイルスゲノムの非必須領域(例えば、E1またはE3領域)中に挿入すると、生存可能で、感染宿主中に抗体分子を発現できる組換えウイルスが生成されよう(例えば、Logan & Shenk、1984、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8 1:355-359を参照されたい)。挿入した抗体コード配列の効率的翻訳のためには、特定の開始シグナルも必要となり得る。こうしたシグナルには、ATG開始コドンおよび隣接配列が含まれる。さらに、挿入配列全体の翻訳を保証するために、開始コドンは、所望のコード配列のリーディングフレームと同位相(in phase)でなければならない。こうした外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然、合成双方の多様な起源のものでもよい。発現効率は、適当な転写促進エレメント、転写終結配列などを含めることにより、増加させ得る(例えば、Bittner他、1987、Methods in Enzymol.153:51-544を参照されたい)。
【０２７４】
その上、挿入配列の発現を調節し、または遺伝子産物を所望する特定様式で修飾し、プロセシングする宿主細胞株を選択してもよい。タンパク産物のこのような修飾(例えば、グリコシル化)およびプロセシング(例えば、切断)は、そのタンパク質の機能にとって重要となり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾をするための特有で、特定の機構を有している。表現する外来タンパク質の適正な修飾およびプロセシングを保証するために、適切な細胞系または宿主系を選択することができる。この目的のために、一次転写産物の適当なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化をするための細胞機構を保有する真核宿主細胞を使用してもよい。このような哺乳動物宿主細胞には、それだけに限らないが、CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2OおよびT47D、NSO(免疫グロブリン鎖をまったく内生しないマウス骨髄腫細胞系)、CRL7O3OならびにHsS78Bstの各細胞が挙げられる。
【０２７５】
組換えタンパク質を長期間、高収率で生成するためには、安定な発現が好ましい。例えば、該抗体分子を安定に発現する細胞系を操作/作製してもよい。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写終結配列、ポリアデニル化部位など)および選択マーカーにより制御されたDNAで形質転換することができる。外来DNAの導入後、作製細胞を富化培地中で1〜2日間増殖させてもよく、次いで選択培地に切り換える。組換えプラスミド中の選択マーカーは、その選択に対する耐性を付与するため、細胞は、プラスミドを染色体中に安定に組み込み、増殖してフォーカスを形成することができ、その後、細胞系にクローニングされ、増殖することができる。この方法は、抗体分子を発現する細胞系を操作/作製するために、有利に使用し得る。このような作製細胞系は、その抗体分子と直接的または間接的に相互作用する組成物のスクリーニングおよび評価において、特に有用となり得る。
【０２７６】
幾種もの選択系を使用してもよく、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ(Wigler他、1977、Cell 11:223)、ヒポキサンチングァニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski、1992、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:202)、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy他、1980、Cell 22:8-17)は、各々tk細胞、hgprt細胞、またはaprt細胞において使用できるが、選択系はそれだけに限らない。抗代謝産物耐性を以下の遺伝子に対する選択基準として使用することもできる。そのような遺伝子は、メソトレキセート耐性を付与するdhfr(Wigler他、1980、Natl.Acad.Sci.USA 77:357;O'Hare他、1981、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527)、ミコフェノール酸耐性を付与するgpt(Mulligan & Berg、1981、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072)、アミノグリコシドG-418耐性を付与するneo(Wu and Wu、1991、Biotherapy 3:87-95;Tolstoshev、1993、Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596;Mulligan、1993、Science 260:926-932およびMorgan and Anderson、1993、Ann.Rev.Biochem.62:191-217;May、1993、TIB TECH 11(5):155-2 15)、およびハイグロマイシン耐性を付与するhygro(Santerre他、1984、Gene 30:147)である。組換えDNA技術の分野で一般的に知られている方法の常套的な適用により、所望の組換えクローンを選択してもよく、このような方法は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ausubel他(eds.)、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、NY(1993);Kriegler、Gene Transfer and Expression、A Laboratory Manual、Stockton Press、NY(1990)、およびDracopoli他(eds)、Current Protocols in Human Genetics、John Wiley & Sons、NY(1994)の12、13章、Colberre-Garapin他、1981、J.Mol.Biol.150:1に記載されている。
【０２７７】
抗体分子の発現量は、ベクター増幅により増加させることができる(総説としては、Bebbington and Hentschel、The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning、Vol.3.(Academic Press、New York、1987)を参照されたい)。抗体を発現するベクター系中のマーカーが増幅できる場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤の量的増加によって、マーカー遺伝子のコピー数が増加することになろう。その増幅領域は抗体遺伝子と関連しているので、抗体産生も増加することになろう(Grouse他、1983、Mol.Cell.Biol.3:257)。
【０２７８】
宿主細胞は、本発明の2種の発現ベクター、重鎖由来ポリペプチドをコードする第1ベクターおよび軽鎖由来ポリペプチドをコードする第2ベクターで同時トランスフェクションを受けてもよい。この2種ベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの同等発現を可能にする同一の選択マーカーを含有してもよい。あるいは、重鎖、軽鎖両ポリペプチドをコードし、発現できる単一ベクターを使用してもよい。このような状況では、軽鎖を重鎖の前に配置することにより、過剰量の有毒な遊離重鎖を避けるべきである(Proudfoot、1986、Nature 322:52およびKohler、1980、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:2 197)。重鎖および軽鎖に対するコード配列は、cDNAまたはゲノムDNAを含んでもよい。
【０２７９】
本発明の抗体分子が組換え発現により生成した際、当分野で公知の任意の免疫グロブリン分子精製法、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、アフィニティー、特にプロテインA後の特異抗原に対するアフィニティー、およびサイズ選別のカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、溶解度差によって、または他の任意の標準的なタンパク質精製法によって、それを精製してもよい。さらに、本発明の抗体またはその断片は、精製を促進するために、本明細書に記載されている、あるいは当分野で知られている異種ポリペプチド配列と融合してもよい。
【０２８０】
上記のような組換え発現は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質に由来する免疫原を生成するためにも、使用し得る。
【０２８１】
本発明は、本発明の例示として示す以下の非限定的な実施例を参照することにより、その理解を深めることができる。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより十分に例示するために、提示されている。しかし、該実施例は、本発明の広い範囲を限定するものと、断じて見なすべきものではない。
【実施例】
【０２８２】
6.実施例：ヒトメタニューモウイルスに対する強力なin vitroおよびin vivo中和活性を有するモノクローナル抗体の生成
6.1.材料および方法
細胞およびウイルス:  hMPVおよびb/hPIV3(下記を参照)由来のウイルスの増殖に使用するVero、WI-38、LLC-MK2(ATCC)細胞は、10%ウシ胎児血清(FBS)を補給したイーグル改変最小必須培地(EMEM)中に維持した後、ウイルスの増殖に使用した。アデノウイルスベクターは、DMEM+10% FBS中で培養したHEK-293細胞内で増殖させた。
【０２８３】
原型(prototype)hMPV株は、A.Osterhausから入手した。その原型株は、以下の通りであった：A1 NL＼N＼OO、A2 NL＼17＼00、B1 NL＼1＼99およびB2 NL＼1＼94(1)。hMPVの増殖に関しては、半集密細胞単層を2.5μg/mlのトリプシンを添加したFBS非含有EMEM中に感染多重度0.1で感染させた。5〜9日の間に凍結融解細胞破壊をした後、ウイルス粒子を細胞から採集した。細胞破片を1500×gの遠心分離で除去し、上清をウイルスストックとして保持した。ウイルス試料は、10×SPG(2.18Mスクロース、0.038M KH2PO4、0.054M L-グルタミン酸)を1/10容添加して安定化させた。ウイルス力価は、VeroまたはLLC-MK2細胞に対する連続希釈により決定した。次いで、ウイルス複製量は、Fタンパク質特異的ELISAを用いて測定した。TCTD50は、Karber法(5)を用いて算出した。
【０２８４】
PIV3ベクター化hMPV融合タンパクウイルス(b/hPIV3/hMPV F)が、以前に報告されており、Vero細胞で記載したように増殖させた(2)。ウイルス濃度は、Vero細胞上でのプラークアッセイにより決定した。
【０２８５】
hMPV株、NL＼1＼OOおよびNL＼1＼99に由来する融合タンパク質を発現するアデノウイルス構築体を、pShuttle-CMV導入ベクターと共にAdEasyアデノウイルス系を用いて生成した。生じたアデノウイルスを、製造業者の使用説明書(AdEasy、Stratagene、LaJolla、CA)に従ってHEK293細胞中で増殖させた。ウイルス力価は、HEK293細胞に対する連続希釈液の細胞変性作用により決定した場合、TCID50として算出した。
【０２８６】
ハイブリドーマ細胞系の生成:  アルメニアハムスター(Cytogen Resesarch and Development,Inc.Boston、MA)およびBALB/cマウス(Jackson Laboratory、Bar Harbor、ME)を、以下のいくつかまたは全部の組合せを用いて免疫した：NL＼1＼7＼00、NL＼1＼00またはNL＼1＼99のいずれかの、動物1匹当たり106 TCID50のhMPVによる鼻腔内感染、106 PFU b/hPIV2/hMPV FNL＼1＼00による鼻腔内感染、用量9×107 TCID50での腹腔内アデノウイルスベクター化hMPV FNL＼1＼00またはhMPV FNL＼1＼99、GMPD(N-アセチルグルコサミニル-β1-4N-アセチルムラムル-L-アラニル-D-イソグリタミン)2μgおよび脂質(塩化ジメチルジステアロイルヒドロキシエチルアンモニウム)4μgの用量のGERBUアジュバント(C-C Biotech)と共にまたはアジュバント非含有溶液中で用いるNL＼1＼00およびNL＼1＼99に由来する精製した可溶性hMPV融合タンパク質の腹腔内注射。最終免疫から4日後、脾臓リンパ球を、前記(3)のように、ポリエチレングリコール融合法によってNS-O細胞と融合した。融合細胞を96穴プレート中の半固体培地(ClonaCell、Stem Cell Technologies、Vancouver、BC)または液体培地に播種した。hMPV特異抗体を産生するハイブリドーマ上清を、hMPV感染細胞に対するELISAによって同定した。
【０２８７】
マウスモノクローナルCDRの配列決定:  対象とするマウス抗体を発現するハイブリドーマ細胞から、RNAを単離した。マウスCDRの配列は、市販プローブ(EMD Biosciences、La Jolla、CA)を用いるPCRにより増幅し、トポイソメラーゼ結合TAオーバーハングプラスミドベクター(Invitrogen)中にクローニングした。プラスミドベクターの複数のクローンを単離し、マウス超可変領域のコンセンサス配列を誘導するために、その配列を決定した。
【０２８８】
Fタンパク質構築体の生成:  全長、および膜貫通ドメインを欠いた末端切断型Fタンパク質を、A.Osterhausの研究室から得たプラスミドRF516およびRF515をPCR鋳型として用いて作製した。プラスミドRF516およびRF515は、プラスミドpSA91(Virus Res.2002 Feb 26;83(1-2):43-56)中に、hMPV FをクローニングするためのこのベクターのHindIIIおよびEcoR1部位を用いてクローニングした、NL＼1＼00およびNL＼1＼99のそれぞれからのHMPV Fタンパク質の全長配列である。hMPV Fタンパク質の可溶性ヒスチジンタグ形態を得るために、以下のオリゴヌクレオチドを使用した。NL＼1＼00(SFNL＼1＼00)からの可溶性融合タンパク質については、
2008538353.tif 000005
を、NL＼1＼99(sFNL＼1＼99)からの可溶性融合タンパク質については、
2008538353.tif 000006
を用いた。該PCR産物は、NL＼1＼00配列に対しては制限エンドヌクレアーゼEcoR1およびHindIIIを用いて、NL＼1＼99配列に対してはBamHIおよびHindIIIを用いて切断し、同じエンドヌクレアーゼで消化したベクターpcDNA3.1(+)に連結した。そのpcDNAクローンは、リポフェクタミンを用いて293細胞中に一過性に導入され、その細胞中にDNAを導入した。hMPV Fタンパク質を安定に発現する構築体を作製するために、DNAの同じプラスミド源を用いてPCR産物を生成した。しかし、NL＼1＼00、NL＼1＼99の両配列に対して以下のプライマーを使用した:
2008538353.tif 000007
そのPCR産物は、RsrIIおよびEcoR1で切断し、同じ制限エンドヌクレアーゼで切断したpEE15.1ベクター(Lonza)に連結した。安定なNS-O細胞系をBebblington(4)が記載するようにして作製した。全長Fタンパク質構築体は、以下のオリゴヌクレオチドを用いて作製した：NL＼1＼00に対しては、
2008538353.tif 000008
を、NL＼1＼99に対しては
2008538353.tif 000009
を用いた。PCR産物は、BamHIおよびHindIIIエンドヌクレアーゼで切断し、同じエンドヌクレアーゼで切断したpcDNA3.1(+)に連結した。これらのベクターは、アデノウイルス導入ベクターpShuttle-CMVの構築用のDNA源として使用した。全長Fタンパク質含有断片は、制限エンドヌクレアーゼHindIIIおよびEcoRVによるpcDNA3.1クローンの切断により得られ、それを同じエンドヌクレアーゼで切断したpShuttle-CMVベクターに連結した。
【０２８９】
Fタンパク質およびモノクローナル抗体の精製:  マウスハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体は、0.1Mグリシン、pH2.8を溶離液として利用するプロテインAクロマトグラフィーにより精製した。ハムスターハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体は、50mMクエン酸、pH4.0を溶離液として利用するメルカプトエチルピリジン(Ciphergen、Freemont、CA)クロマトグラフィーにより精製した。可溶性Fタンパク質は、hmpv Fタンパク質に対するハムスターモノクローナル抗体を利用するアフィニティークロマトグラフィーにより、細胞培養上清から精製した。ハムスターモノクローナル抗体121-1071-133または121-757-243を、製造業者の使用説明書(Amersham、Piscataway、NJ)に従って、臭化シアン活性化アガロースに1〜2mg/ml樹脂の濃度で結合した。細胞上清を樹脂に載せ、0.1Mグリシン、pH2.8で溶出させた。
【０２９０】
血清学的アッセイ:  hMPV感染WI-38細胞の単層を用いてELISAアッセイを行った。細胞単層は、96穴プレート中、感染多重度1.0で感染させ、感染後3〜5日間インキュベートした。上清を除き、細胞を37℃で乾燥し、使用するまで4℃で保存した。そのプレートを0.1%(v/v)Tween-20および0.5%(w/v)BSAを含有するPBSを用いてブロックした。希釈血清試料またはハイブリドーマ上清をプレート上で1時間インキュベートし、PBS/Tweenで洗浄した。プレートを、ペルオキシダーゼをコンジュゲートした、抗マウスまたは抗アルメニアハムスター・ビオチン化抗体(Jackson ImmunoReasearch、West Grove、PA)と共にさらに1時間インキュベートした。ハムスター試料については、ストレプトアビジン-HRP(Amersham、Piscataway、NJ)を用いる追加のインキュベーションステップを追加した後、TMB基質で発色させた。
【０２９１】
注入した抗体の血清濃度を決定するために、捕捉ELISAアッセイを以下のように行った：PBS緩衝液中のsFNL＼1＼00の0.5mg/ml溶液100μlをMaxisorbマイクロタイタープレート上に、4℃にて終夜で被覆した。翌日、プレートをPBS中1%カゼインを用いてブロックした。in vivoチャレンジ試験から得た血清試料をPBS緩衝液中に希釈し、プレートに適用した。対照の正常ハムスター血清中に希釈した同一濃度範囲にある対応の抗体を用いて、標準曲線を作成し、抗体の血清濃度を算出した。抗体濃度は、SoftMaxプロソフトウェア(Molecular Devices、Sunnyvale、CA)を用いて算出した。
【０２９２】
中和アッセイ:  血清、精製抗体またはハイブリドーマ上清の連続的2倍希釈液をウイルス50〜1000 TCID50のウイルスと共に37℃、1時間インキュベートした。インキュベーション後、ウイルス抗体混合物を96穴プレート中のVero細胞単層へ添加し、プレートを25℃で15分間、2000×gで遠心分離した。細胞から培地を除き、細胞を、FBSを含まない新鮮培地中で洗浄し、最後に、2.5μg/mlのトリプシンを補給したがFBSを含まないMEM培地を重層した。細胞を37℃で5〜7日間増殖させた後、培地を除き、細胞を80%アセトンの添加により固定した。細胞を4℃で20分間かけて固定し、プレートを風乾した。プレートを1%(w/v)カゼイン(Pierce、Rockford、IL)でブロックし、hMPV融合タンパク質に対するビオチン化モノクローナル抗体でプローブした。ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートをTMB試薬による検出のために使用した。EC50の算出は、Graphpad Prismソフトウェア(GraphPad Software、San Diego、CA)を用いて行った。
【０２９３】
Biacore分析:  比較試験で、固定化したsFNL＼1＼99(2374 RUを固定化)またはsFNL＼1＼00(2566 RUを固定化)に対する、個々の200nM mAb溶液の結合を特性決定した。これらの実験では、各抗体溶液の250μLの注入液が、流速75μL/分で一連に連結したこれらの表面上を通過するようにした。注入と注入の間に、Fタンパク質表面を1M NaCl/50mM NaOHの1分パルスで再生させた。速度分析を行うことにより、80〜300 RUの固定化密度で固定化したsFNL＼1＼99およびsFNL＼1＼00に対するモノクローナル抗体168-A5-338-284および168-A5-234-114の相互作用に対し、速度および結合定数も決定した。流速、注入量および再生条件は上記の通りであり、10分または15分のいずれかの解離データを収集した。個々の速度定数は、BIAevaluation 3.2ソフトウェア(Biacore、Piscataway、NJ)を用いて算出した。
【０２９４】
防御のin vivo評価:  6〜8週齢のゴールデンシリアハムスターに、精製モノクローナル抗体またはウシ血清アルブミンの100μlをウイルスチャレンジの前日、筋肉注射をした。翌日、その動物たちをイソフルランで麻酔し、それらから採血し、hMPVウイルス100〜200μl(106〜5×107  TCID50)を鼻腔内注入した。感染から4日後、動物をCO2窒息で安楽死させ、その肺を取り出して、ホモジナイズした。肺ホモジェネート中のhMPV量は、LLC-MK2細胞に対するTCID50分析によって決定した。注入したIgGの血清レベルは、捕捉ELISA(上記の血清アッセイ内の説明を参照されたい)によって決定した。
【０２９５】
材料および方法において引用した参考文献
1.van den Hoogen BG、Herfst S、Sprang L、Cane PA、Forleo-Neto E、de Swart RL、Osterhaus AD、Fouchier RA.(2004)Antigenic and genetic variability of human metapneumoviruses.Emerg Infect Dis 10,658-666.
2.Tang RS.Schickli JH.MacPhail M.Fernandes F.Bicha L.Spaete J.Fouchier RA.Osterhaus AD.Spaete R.Haller AA.(2003)Effects of human metapneumovirus and respiratory syncytial virus antigen insertion in two 3' proximal genome positions of bovine/human parainfluenza virus type 3 on virus replication and immunogenicity.Journal of Virology.77,10819-10828.
3.de St Groth、FS and Scheidegger、D.Production of monoclonal antibodies:strategy and tactics Journal of Immunological Methods 35(1980)、1-21.
4.Bebbington C. et al. High level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker.Bio/Technology 1992;10:169-175.
5.Karber, G.(1931)50% end-point calculation.Arch.Exp.Pathol.Pharmak.、162、480-483.
6.2.結果
hMPV Fタンパク質特異抗体の生成
異なる免疫化技法、即ちDNA免疫化、Fタンパク質を発現するキメラウイルスによる感染、Fタンパク質を発現するトランスフェクト細胞による免疫化、哺乳動物メタニューモウイルスによる感染、MPV感染細胞による免疫化、アデノウイルスベクター化MPV Fタンパク質による免疫化、およびhMPV Fタンパク質による免疫化を使用した。中和モノクローナル抗体を生成した免疫化を表3に列挙してある。
【０２９６】
2008538353.tif 000010
hMPV Fタンパク質特異抗体の中和効果
異なるhMPVサブタイプ、即ちA1、A2、B1およびB2に対する異なるhMPV Fタンパク質特異抗体の中和力価を決定し、表4(データはμg/mlで表示している)および表5(データはnMで表示している)に示してある。
【０２９７】
2008538353.tif 000011
【０２９８】
2008538353.tif 000012
このように、hMPV Fタンパク質特異抗体は、hMPVのAおよびBサブタイプに対して高い中和作用を示す。
【０２９９】
hMPV Fタンパク質特異抗体の結合親和性の決定
NL/1/00、NL/1/99の各可溶性Fタンパク質に対するhMPV Fタンパク質特異抗体168-A5-234-114(mAb234)の結合親和性の反応速度を、Biacore分析を用いて決定した。その結果を図1に示してある。
【０３００】
NL/1/00、NL/1/99の各可溶性Fタンパク質に対するhMPV Fタンパク質特異抗体168-A5-338-284(mAb338)の結合親和性の反応速度を、Biacore分析を用いて決定した。その結果を図2に示してある。
【０３０１】
このように、これらのhMPV Fタンパク質特異抗体は、hMPVのFタンパク質に特異的に、かつ高い親和性で結合する。
【０３０２】
表6には、各種hMPV Fタンパク質特異抗体とhMPV Fタンパク質との間の結合の解離定数を示す。
【０３０３】
2008538353.tif 000013
図3は、ウイルスのAおよびBサブタイプに対する微量中和の比較を示す。抗体は、0.6μM(100μg/ml)から始めて2倍ずつ連続希釈し、個々の各ウイルスのTCID50 50〜1000の量と混合した。ウイルスの中和反応は、Vero細胞に感染してから5日後の細胞染色により確認した。細胞の感染は、ビオチン化抗hMPV融合タンパク抗体を用いたhMPV融合タンパク質の染色により、評価した。基質TMBを用いてFタンパク質発現を可視化するために、ストレプトアビジン-HRPを使用した。IC50濃度は、Graphpad Prismの線適合(line fitting)を用いて決定した。
【０３０４】
Synagis(登録商標)、NuMax(商標)、mAb338およびmAb234の特性の比較を表7に示してある。
【０３０５】
2008538353.tif 000014
NL＼1＼00チャレンジに対するin vivo防御
ハムスターにおけるhMPVチャレンジに対するhMPV Fタンパク質特異抗体によるin vivo防御を、上記のようにして確認した。肺ウイルス力価および血清IgGを図4に示してある。第1日に、ゴールデンシリアハムスターに様々な用量のmAb338、mAb234またはBSAを筋肉注射した。その翌日、そのハムスターにhMPVのNL＼1＼00株を1×107のTCID50で用いて鼻腔内にチャレンジした。感染から4日後、肺を取り出し、ホモジナイズし、ウイルスのTCID50力価を測定した。IgG濃度の測定用血清試料は、チャレンジ前に採取した。IgG濃度は、捕捉抗原にsFNL＼1＼00を、検出試薬に抗マウスIgG-HRPコンジュゲートを用いたサンドイッチELISAを使用して得た。IgG濃度は、正常ハムスター血清中にスパイク注入した対応のmAbの標準曲線と比べて決定した(図4を参照)。
【０３０６】
このように、hMPV Fタンパク質特異抗体は、動物モデル系においてhMPV感染に対して防御する。
【０３０７】
モノクローナル抗体耐性変異体の同定および配列決定
モノクローナル抗体耐性変異体(MARM)はmAb338とのインキュベーションから分離された。変異体の配列決定により、(i)mAb338に対する耐性を付与する以下の変異：A238EおよびK242N、A238EおよびK242T、A238TおよびK242T、K242N、またはI241Rと、(ii)mAb234に対する耐性を付与する以下の変異：K242Nが判明した。天然のHMPV Fタンパク質の配列アライメントを図5に示す(配列番号127〜131)。図5はhMPV Fタンパク質とRSV Fタンパク質とのアライメントも示す。異なる抗体に対する耐性を付与する変異のアミノ酸位置も、下線によって示されている。これらの変異は、hMPVおよびRSVのFタンパク質中の類似位置に位置づけられる。したがって、Fタンパク質の抗原構造はRSVとhMPVとの間で保存されている。
【０３０８】
a. Marmのデータを下記に示す(変異残基は下線で示す)。
【０３０９】
NL＼1＼00 WT   P T S A G Q I K L M
MARM 4         P T S A G Q R K L M
MARM 47        P T S A G Q I N L M
MARM 64        P T S E G Q I N L M
MARM 69        P T S T G Q I N L M
MARM 76        P T S A G Q R K L M
MARM 86        P T S E G Q I T L M
追加のMarmデータを図13〜16に示す。図17に示すように、MARMを選択するために使用した抗体に対する耐性を付与する変異は、他の抗体に対する耐性も付与する。
【０３１０】
7.ヒトメタニューモウイルスをIN VITROおよびIN VIVOで中和するモノクローナル抗体の単離および特性決定
7.1.緒言
ヒトメタニューモウイルス(hMPV)は、パラミクソウイルス科の最近記載されたメンバーである。このウイルスは、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)と共にニューモウイルス亜科に入り、RSVと共通の特徴を多数共有している。hMPVは、主に冬季の数カ月に発生し、症状が軽度〜重度の咳、細気管支炎および肺炎に及ぶ症状を伴う気道疾患を引き起こす。配列データに基づけば、hMPVおよびRSVの分離株は2つのサブグループAおよびBに分けられ、hMPVの場合は、AおよびBの分類内でさらに分岐が存在する。ウイルスの全サブグループに亘る高度の配列保存性のため、その融合(F)タンパク質は、サブグループ交差性の中和抗体を生成するためのターゲットとすることのできる優勢な抗原決定因子であろう。RSV Fタンパク質に対する単一のモノクローナル抗体が、動物とヒトの両方においてRSVによる重度の下気道感染症を予防できることが示された。hMPVのFタンパク質に対する一連の中和モノクローナル抗体が生成されたが、その抗体はin vitroでウイルスの複製を抑制でき、またその一部は、in vivoでhMPVのA、Bサブタイプ両方でのチャレンジに対して防御できる。これらの抗体は、hMPV感染細胞を用いる競合的結合実験の結果に基づき、異なる6つの分類に分けることができた。これらの中和抗体を用いてhMPV回避変異体を生成することにより、Fタンパク質上の中和エピトープをマッピングした。こうしたエピトープの多くは、RSV のFタンパク質上の以前に規定された中和エピトープと相同な、hMPV Fタンパク質上の領域に、位置づけられた。これらのデータから、ニューモウイルス亜科の異なるメンバー間でFタンパク質の抗原構造が保存されていることが示唆される。
【０３１１】
7.2  材料および方法
細胞およびウイルス:  hMPVおよびPIV3由来のウイルスの増殖に使用するVero、WI-38、LLC-MK2細胞は、10%ウシ胎児血清(FBS)を補給したイーグル改変最小必須培地(EMEM)中に維持した。アデノウイルスベクターは、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)+10% FBS中で増殖させたHEK-293細胞内で増殖させた。マウス骨髄腫細胞系NSOをDMEM+20% FBS中で維持した。骨髄腫融合細胞系はExcell610(JRH Biosciences、Lenexa、KS)+10% FBS中で維持した。ウイルスストックの力価は、Vero細胞でのTCID50測定(12)により決定した。ウイルス感染は、後の節に記載するようにして、hMPVに対する抗体との反応性により確認した。
【０３１２】
hMPVの増殖のために、半集密細胞単層を2.5μg/mlのトリプシンを添加したFBS非含有EMEM中に感染多重度0.1 TCID50/細胞で感染させた。感染から5〜9日後に、細胞の凍結融解破壊によりウイルス粒子を採集した。ウイルス試料は、10×SPG(2.18Mスクロース、0.038M KH2PO4、0.054M L-グルタミン酸)を添加して安定化させ、-80℃で保存した。試験した原型hMPV株(A.Osterhausにより提供)は、以下の通りであった：A1 NL＼1＼0O、A2 NL＼17＼00、B1 NL＼1＼99およびB2 NL＼1＼94。
【０３１３】
パラインフルエンザウイルス3(PIV3)ベクター化hMPV Fタンパクウイルス(b/hPIV3/hMPV F)は、以前に報告されており、Vero細胞において記載のようにして増殖させた(21)。PIV3構築体のウイルス濃度の推定値は、Vero細胞でのウイルスストック1ml当たりのプラーク形成単位の測定により見積もった。株NL＼1＼00およびNL＼1＼99配列に由来するFタンパク質を発現するアデノウイルス構築体は、導入ベクターpShuttle-CMVを用いるAdEasyアデノウイルス系(AdEasy、Stratagene、LaJolla、CA)を用いて生成した。得られたアデノウイルスを、製造業者の使用説明書に従ってHEK293細胞中で増殖させた。アデノウイルスのウイルス力価は、読み出し値として細胞変性作用(CPE)を用いるTCID50アッセイを用いて決定した。
【０３１４】
ハイブリドーマ細胞系の作製:  アルメニアハムスター(Cytogen Research and Development,Inc. Boston、MA)およびBALB/cマウス(Jackson Laboratory、Bar Harbor、ME)を、以下のいくつかまたは全部の組合せを用いて免疫した：NL＼1＼7＼00、NL＼1＼00またはNL＼1＼99のいずれかの、動物1匹当たり106 TCID50でのhMPVによる鼻腔内感染、106 PFU b/hPIV2/hMPV FNL＼1＼00による鼻腔内感染、用量9×107 TCID50でのアデノウイルスベクター化hMPV FNL＼1＼00またはhMPV FNL＼1＼99の腹腔内注射、GERBU MMアジュバント(CC Biotech、Valley Center、CA)と共にまたはアジュバント非含有溶液中で腹腔内に注射されるNL＼1＼00およびNL＼1＼99配列に由来する精製された可溶性hMPV Fタンパク質。最終免疫から4日後、脾臓リンパ球を、前記(6)のようにして、分離し、さらにポリエチレングリコールを用いてNSO細胞と融合した。融合細胞を96穴プレート中の半固体培地(ClonaCell、Stem Cell Technologies、Vancouver、BC)または液体培地に播種した。hMPV特異抗体を産生するハイブリドーマ上清を、hMPV感染細胞上でのELISAによって同定した。
【０３１５】
モノクローナル抗体(mAb)の同定および配列決定:  対象とする抗体を発現するハイブリドーマ細胞から、RNAeasyシステム(Qiagen、Germantown、MD)を用いてRNAを単離した。CDR配列を市販プローブ(EMD Biosciences、La Jolla、CA)を用いるPCRにより増幅し、トポイソメラーゼ結合TAオーバーハングプラスミドベクター(Invitrogen、Carlsbad、CA)中にクローニングした。CDR含有プラスミドベクターの複数のクローンを単離し、BigDye Terminator v3(ABI、Foster City、CA)反応を用いてシークエンス反応し、超可変領域のコンセンサス配列を得るために、ABI 3100またはABI 3730シークエンサーに掛けた。
【０３１６】
mAbの精製:  mAbを溶出するために、ハムスターモノクローナル抗体は、MEP Hypercel(Pall Corp.、East Hills、NY)カラム上、pH4.0の50mMクエン酸を用いて精製した。溶出液は、1/10容の1M Tris-HCl、pH8.0で直ちに中和した。マウスモノクローナル抗体は、プロテインAセファロース上で精製した。マウスIgG1は50mM Tris、pH8.5および1M NaSO4を含有するハイブリドーマ培地中に添加し、一方、他のマウスサブタイプはすべてハイブリドーマ培地から直接添加した。プロテインAカラムをpH2.8の0.1Mグリシンで溶出し、溶出液を1/10容の1M Tris-HCl、pH8.0で直ちに中和した。
【０３１７】
hMPV Fタンパク質構築体の作製:  全長Fタンパク質、および膜貫通ドメインを欠いたFタンパク質の末端切断型を、各分離株NL＼1＼00およびNL＼1＼99からの融合タンパク質の全長配列を含有する、プラスミドRF516およびRF515(A.Osterhausの研究室から得た)をPCR反応用鋳型としてそれぞれ用いて、作製した。hMPV Fタンパク質の可溶性ヒスチジンタグ形態を得るために、以下のオリゴヌクレオチドを使用してクローンを生成した：
NL＼1＼00配列ものについては、
5' AACCAAAAGCTTCACCATGTCTTGGAAAGTGGTGATC 3'および
5' TTAATTGAATTCTTAGTGATGGTGATGGTGATGGCCAGTGTTTCCTTTCTCTGC 3'、
NL＼1＼99 配列からのものについては、
5' TTCCTTAAGCTTCACCATGTCTTGGAAAGTGATGATCATC 3'および
5' TTAATTGGATCCTTAGTGATGGTGATGGTGATGACCAGTGTTFCCTTTTTCTGCACT 3'。該PCR産物は、NL＼1＼00配列に対しては制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびHindIII、NL＼1＼99配列に対してはBamHIおよびHindIIIを用いて切断し、次いでそれを同じエンドヌクレアーゼで消化したベクターpcDNA3.1(+)に連結した。そのpcDNAクローンは、リポフェクタミン2000(Invitrogen、Carlsbad、CA)を用いてHEK-293細胞中に一過性に導入し、その細胞中にDNAを導入した。安定なhMPV Fタンパク質発現性構築体を作製するために、DNAの同じプラスミド源を用いてPCR産物を生成したが、NL＼1＼00、NL＼1＼99の両配列に対して以下の代替プライマーを使用した:5'- AATCAACGGTCCGCCACCATGTCTTGGAAAGTG -3'および 5' TTAATTGAATTCTTAGTGATGGTGATGGTGATGGCCAGTGTTTCCTTTCTCTGC 3'。そのPCR産物を、RsrIIおよびEcoRIで切断し、同じ制限エンドヌクレアーゼで切断したpEE15.1(Lonza、Allendale、NJ)ベクターに連結した。安定なNSO細胞系をBebblington(2)が記載するように作製した。全長Fタンパク質構築体は、以下のオリゴヌクレオチドを用いて作製した：NL＼1＼00については5' AACCAAAAGCTTCACCATGTCTTGGAAAGTGGTGATC 3'および5' AATTAAGGATCCTAATTATGTGGTATGAAGCCATT 3'、NL＼1＼99については5' TTCCTTAAGCTTCACCATGTCTTGGAAAGTGATGATCATC 3'および5' AATTAAGGATCCTAATTATGTGGTATGAAACCGCC。PCR産物は、BamHIおよびHindIIIエンドヌクレアーゼで切断し、同じエンドヌクレアーゼで切断したpcDNA3.1(+)に連結した。これらのベクターは、アデノウイルス導入ベクターpShuttle-CMVの構築用のDNA源として使用した。全長Fタンパク質含有断片は、制限エンドヌクレアーゼHindIIIおよびEcoRVによるpcDNA3.1クローンの切断により得られ、同じエンドヌクレアーゼで切断したpShuttle-CMVベクターに連結した。
【０３１８】
hMPV Fタンパク質の精製:  ヒスチジンタグ化可溶性Fタンパク質は、最初にNi-NTA(Qiagen、Germantown、MD)クロマトグラフィーにより精製されたが、これによりSDS-PAGEで測定すると純度60%のタンパク質が得られた。その後、Fタンパク質特異的モノクローナル抗体(mAb1017)を単離した後、臭化シアン活性化セファロースに結合したmAb1017上でのアフィニティークロマトグラフィーにより、該Fタンパク質を精製し、pH2.8の0.1Mグリシンで溶出した。溶出液は1/10容の1M Tris-HCl、pH8.0で中和し、PBS中に透析した。アフィニティー精製したFタンパク質の純度は、SDS-PAGEで判定すると>90%であった。
【０３１９】
ELISAアッセイ:  hMPV感染したWI-38細胞単層を用いて、ハイブリドーマ上清中または動物血清中の抗hMPV抗体を検出するELISAを開発した。96穴プレート中の細胞単層は、感染多重度1.0でhMPVに感染させた後、感染後3〜5日間インキュベートした。上清を除き、細胞を37℃で乾燥し、使用するまで4℃で保存した。ELISAのために、そのプレートを0.1%(v/v)Tween-20および0.5%(w/v)BSAを含有するPBSでブロックした。これとその後の全段階を室温で行った。希釈血清試料またはハイブリドーマ上清をプレート上で1時間インキュベートした後、プレートをPBS/Tweenで洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合したビオチン化抗マウスまたは抗アルメニアハムスター抗体(Jackson ImmunoReasearch、West Grove、PA)を添加し、プレートをさらに1時間インキュベートした後、洗浄した。ハムスター試料については、ストレプトアビジン-HRP(Amersham Biosciences、Piscataway、NJ)を添加し、1時間インキュベートした。プレートは、Sure Blue TMB基質(KPL、Gaitherburg、MD)を用いて発色させた。血清試料のエンドポイント力価は、対照吸光度の最低2倍の吸光度を示す最終希釈度として定義した。
【０３２０】
競合ELISA実験を、ビオチン化したmAb242、mAb338、Mab659、mAb757、mAb836、mAb1017およびmAb1025を用いて行った。抗体は、biotin-XX-SSE(Invitrogen、Carlsbad、CA)、Biotin-XX-SE(Vector Laboratories、Burlingame、CA)のいずれかを用い、製造業者の使用説明書に従ってビオチン化した。各ビオチン化抗体に対する標準結合曲線を、検出試薬としてストレプトアビジン-HRPを用いてhMPV感染したWI-38細胞について作成した。競合実験に用いたビオチン化抗体の濃度は、標準曲線上で最大値の半分のシグナルを示した。競合ELISAでは、競合モノクローナル抗体を50〜0.03μg/mlの範囲の濃度で使用した。ビオチン化抗体濃度の100倍以下の濃度でシグナルの50%を超える減少を示した非標識競合mAbは、競合するとした。
【０３２１】
注入抗体の血清濃度を決定するために、捕捉ELISAアッセイを以下のように行った。PBS緩衝液(Pierce、Rockford、IL)中、NL＼1＼00からのhMPV可溶性Fタンパク質(50ng/ウェル)をNunc Maxisorb(Nalge Nunc、Rochester、NY)マイクロタイタープレート上に4℃、終夜で被覆した。翌日、プレートをPBS中1%カゼインを用いてブロックした。血清試料をPBS中に希釈し、プレートにアプライした。正常ハムスター血清中の同一濃度の対応抗体を用いて作成した標準曲線を用いて、抗体の血清濃度を算出した。抗マウスHRPコンジュゲートを用いて、SureBlue TMB試薬による検出を行った。
【０３２２】
中和アッセイ:  血清、ハイブリドーマ上清または精製抗体の連続2倍希釈液を50〜1000 TCID50のウイルスと共に37℃、1時間インキュベートした。インキュベーション後、ウイルス抗体混合物を96穴プレート中のVero細胞単層へ添加し、次いでプレートを25℃、15分間2000×gで遠心分離した。細胞から培地を除き、FBSを含まない新鮮培地中で該細胞を洗浄し、最後に2.5μg/mlのトリプシンを補給したFBSを含まないEMEM培地を重層した。この細胞を37℃、5〜7日間増殖させた後、培地を除き、次いで細胞を80%アセトンの添加により4℃、20分間固定した。この後、プレートを風乾した。発色の前に、プレートを1%(w/v)カゼインでブロックし、その後ウイルスで免疫した動物から得たポリクローナル血清、またはビオチン化mAb1017を用いてプローブした。ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートを使用してそのビオチン化抗体を検出した。その代わりに、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗種特異的二次抗体を、ポリクローナル血清を用いた検出に使用した。プレートは、Sure Blue試薬を用いて発色させた。ハイブリドーマ上清またはポリクローナル血清については、中和力価は、非感染対照細胞の吸光度の2倍未満の吸光度を示す最終希釈度と定義される。IC50値は、非線形S字状用量応答に対する曲線適合を用いてGraphPad Prismソフトウェアを用いて決定した。
【０３２３】
Biacore分析:  固定化した可溶性hMPV Fタンパク質に対する、抗体mAb338およびmAb234の結合定数を決定するために、反応速度分析を行った。可溶性FNL＼1＼00および可溶性FNL＼1＼99タンパク質は、以前に記載された(11)ようなアミンカップリングキットを用いて、固定化密度80〜300 RUでCM5センサーチップ(BiaCore、Uppsala、Sweden)上に固定化した。過剰の反応性エステルは、pH8.5の1M塩酸エタノールアミン溶液70μlで失活させた。その各表面は、BiaCore 3000で一連に連結した。各mAb溶液250μLを濃度0.39nM〜400nMまたは3.13nM〜100nMの範囲で注入し、その流速は75μL/分とし、解離データを15分間収集した注入と注入の間に、該表面を1M NaCl-50mM NaOHの1分パルスを用いて再生した。データは、Biacore,Inc.が供給するBIAevaluationソフトウェアを用いて分析した。
【０３２４】
防御のin vivo評価:  6〜8週齢のゴールデンシリアハムスター(6〜7匹/群)に、様々な濃度の精製モノクローナル抗体またはウシ血清アルブミンを100μl容で、チャレンジの前日、筋肉注射した。翌日、その動物たちをイソフルランで麻酔し、それらから採血し、ウイルス100〜200μl(1×107 TCID50/ml)を鼻腔内に注入した。感染から4日後、動物をCO2窒息で安楽死させ、その肺を取り出し、ダウンスホモジナイザーを用いてハンクス平衡塩類溶液中でホモジナイズした。鼻甲介を分離し、それを乳鉢/乳棒を用いてハンクス平衡塩類溶液中で磨砕した。肺および鼻甲介のホモジェネートのTCID50測定は、以下のように行った。ホモジェネートおよびそのホモジェネートの連続10倍希釈液を洗浄したLLC-MK2細胞にアプライし、室温で1時間インキュベートした。上清を除き、細胞に、ブタ由来トリプシン(Biowhittaker、Walkersville、MD)5μg/mlを含有するOpti-MEM(Invitrogen、Carlsbad、CA)培地を重層した。その細胞を37℃、6〜7日間インキュベートした。培地を除き、その細胞を80%メタノールを用いて固定した。プレートは、5%脱脂粉乳中、30分間かけてブロックした。hMPV感染動物で生成されたポリクローナル血清を細胞の染色に使用した。HRPに結合した種特異的二次抗体を、4CNペルオキシダーゼ基質(KPL、Gaithersburg、MD)を用いる検出に使用した。感染は、個々のウェルの目視検査により評価し、以前に記載した(19)ようにlog10 TCID50/g組織として示した。
【０３２５】
7.3  結果
hMPV Fタンパク質に特異的であり、かつ低濃度でhMPVを中和する、一群のモノクローナル抗体を生成した。アルメニアハムスター、BALB/cマウス双方において頑強なFタンパク質特異的免疫反応を引き出すために、多数の免疫化戦略を使用した。全ての場合に、最初の免疫化は、動物を初回免疫刺激するための、野生型hMPVによる鼻腔内感染であった。この後、hMPV Fタンパク質を発現する組換えアデノウイルスまたは組換えウシパラインフルエンザウイルスのいずれかを用いる免疫化であった。一部の場合には、可溶性組換えhMPV Fタンパク質によるそれに続く免疫化を行った(表8)。このようにして、動物中に高力価の抗Fタンパク質特異的反応を生じることができた。その上、hMPVの両サブタイプに反応する免疫応答を引き起こすために、原型A(NL＼1＼00)、原型B(NL＼1＼99)の両方のFタンパク質配列を含有する免疫化も用いた。表8に示すように、この免疫化戦略の結果、マウスとハムスターの双方で、1タイプまたは両タイプのhMPVを中和する高力価抗体が産生された。
【０３２６】
2008538353.tif 000015
免疫化後、マウスおよびハムスターの脾臓を融合処理してハイブリドーマ細胞を生成し、ハイブリドーマ上清をhMPV(NL＼1＼00)に感染した細胞NL＼1＼00または非感染細胞に対する反応性についてスクリーニングした。感染細胞と非感染細胞との最低5倍の吸光度差を、次段階の分析用抗体を選択する基準として用いた。感染細胞に反応性を示したハイブリドーマ上清を、増殖させ、ウイルス中和アッセイにおける非分画上清として試験した。ハイブリドーマ上清は、それが含有する抗体量が大きく変動したが、濃度調整をせずにhMPV中和について試験した。したがって、このスクリーニング法では、抗体を高濃度で産生するか、または抗体は低濃度でしか産生されないが高い中和活性を有するハイブリドーマを選択した。少なくとも1つのhMPVタイプに対して1:2を超える希釈度で中和活性を含むハイブリドーマ上清を、限界希釈によりクローン化し、次いで増殖させることにより、精製およびさらなる分析用の抗体を生成させた。表9は、限界希釈により単離でき、その効力の評価に十分な抗体を産生した抗体全種のIC50力価を示す。4つの場合に、rtPCRと重鎖および軽鎖の配列決定とにより確認したところ、同一のモノクローナル抗体が複数の細胞系から単離された。各配列について単一の単離体だけを、中和効力の完全な評価のために次に回した。広範囲の中和効力が認められ、単離抗体の多くは、試験した原型ウイルス4種の1つまたは複数を実際に中和した。上位3つの抗体mAb338、mAb234およびmAb628については、4原型株すべてに対し中和能が2μg/ml未満のIC50であったが、これは強い汎中和能を示す。別の汎中和性mAb1017は、4原型すべてに亘って同等の中和を示したが、前記上位3種の抗体の25〜100分の1の効力であった。一部の抗体は、mAb242、mAb757、mAb710およびmAb344について認められるように、Bタイプウイルスに対する中和の増強(10〜100倍低いIC50)を示す。mAb1025およびmAb967は、Aタイプウイルスの中和においてより強力だが、両者は以下の点で異なっている：即ち、mAb1025は、B1とB2の原型の両方に対して本質的に中和能を有しないが、一方、mAb967は、B1原型を中和しないが、B2原型を中和する能力を有している。2種の抗体mAb659およびmAb836は、A、Bのサブタイプ別には分けられない、中和能の差を示す。これらの抗体は、A1およびB2サブグループよりも、A2およびB1サブグループをより良く中和するが、そのことは、サブグループ特異的ではないアミノ酸変化が、これらの抗体のエピトープに対する結合にかかわっていることを示す。
【０３２７】
2008538353.tif 000016
これらの抗体が認識する抗原部位の個数を決定するために、競合ELISAマトリックスを設けた。この12個の単離体のうち7つがビオチン化されたが、非標識モノクローナル抗体がhMPV感染細胞との結合に対して競合する能力。この試験結果は表10に示してある。結局、6種の異なる競合パターンがある。その抗体のうち2つ(mAb1017およびmAb757)は、完全一致した抗体によってしか競合を受けない。mAb967およびmAb1025は、同一部位または重複部位に対して競合する。その他のモノクローナル抗体は、もっと複雑な度合の競合を示す。mAb338はそれ自体により、またmAb234およびmAb628により競合を受けるが、他のビオチン化抗体mAb242およびmAb836は、非標識mAb338による競合を受ける。mAb242およびmAb836は同じ競合パターンを示すが、mAb338およびmAb628による競合を受ける能力の点でmAb659とはそのパターンが異なる。このデータは図10に示したエピトープマップを裏付けている。このマップは本エピトープの重複性を例示している。
【０３２８】
2008538353.tif 000017
選択したhMPV Fタンパク質特異的なモノクローナル抗体全てのうち、抗体234および338が、4つのhMPVサブタイプ全体の中で最も強力なウイルス中和活性を示した(表9)。その結合特性を決定するために、固定化したhMPV NL＼1＼00またはNL＼1＼99の可溶性Fタンパク質(それぞれsFNL＼1＼00およびsFNL＼1＼99)を用いるBiacore分析を行った。Biacore分析から得られたKon、KoffおよびKd値を表11に示す。抗体234および338は、同等なonおよびoff速度ならびにその両方のhMPVタイプのFタンパク質に対するナノモル親和性を示した。
【０３２９】
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抗体のhMPV中和能をさらに調べるために、mAb234および338を、以前に記載された(15)ように、ゴールデンシリアハムスターを用いるウイルス感染予防モデルにおいてin vivoで試験した。hMPV NL＼1＼00を1〜2×106 TCID50の用量で鼻腔内チャレンジする24時間前に、該mAbを、シリアハムスター(7匹/群)に筋肉注射で投与した。対照動物は、抗体の代わりにBSAを投与された。チャレンジから4日後、動物を安楽死させ、動物の肺および鼻甲介中のhMPV量を測定した。mAb234および338のいずれかを用量3mg/kg以上で投与された動物は、その肺中に検出可能なレベルのウイルスを示さなかった。抗体の最少有効用量を決定するために、0.1〜3.0mg/kgの抗体の用量力価決定について図11に示してある。3.0mg/kgでは、mAb338および234は両方とも、肺ウイルス力価において最低でも3 logの減少(BSA対照と比べ)を生じた(図11、パネルA)。1 mg/kgでは、mAb338は、肺ウイルス力価において最低でも3 logの減少をなお生じたが、mAb234は平均2 logの減少を生じた。0.3および0.1mg/kgの用量では、肺中にはより高レベルのウイルスが認められたが、これらの用量群での対照と比較した肺ウイルス力価の減少は統計学的に有意であった。したがって、抗体338および234は、動物の肺中のウイルス負荷量をわずか0.1mg/kgの用量で減少させることができた。しかし、上気道でのウイルス複製の予防はあまり顕著ではなく、その効果はより高い抗体用量を用いた場合しか認められなかった。用量3〜0.1mg/kgでのmAb 338および234の筋肉注射を受けた動物の鼻甲介から回収されたlog10 TCID50/グラムのhMPVを、図11、パネルBに示す。対照と比べたウイルス力価の減少は、いずれの抗体の用量3.0および1.0mg/kgでも認められたが、統計学的にはmAb 338の3 mg/kgの用量についてのみ有意性が示された。
【０３３０】
抗体の血清濃度は、筋肉内投与の24時間後に測定した(図11、パネルC)。血清試料は、hMPVを鼻腔内チャレンジする直前に採集した。予想通り、投与抗体の用量が増加すると、動物血清中に測定される抗体濃度も増加した。これらのデータから、mAb 338の血清濃度5〜10μg/mlは、感染動物の肺中ウイルス力価における最低3 logの減少と相関することが示唆される。mAb 234は、上気道、下気道双方でのウイルス減少の効力はやや低いと思われ、肺ウイルス力価を検出限界未満の量に減少させるためには、この抗体の循環濃度を>10μg/mlとすることが必要である。
【０３３１】
同様な実験は、B1サブグループ原型ウイルスを用いて行った。NL＼1＼99を鼻腔内チャレンジする24時間前に、mAb338またはmAb234をシリアハムスターに筋肉注射で投与した。以前の実験のように、対照動物にはBSAを投与したが、それら動物にはそれと同日に抗体を投与しなかったので、各抗体について別個にBSA対照を実施した。対照動物の肺から回収したhMPV NL＼1＼99の最大量は、NL＼1＼00で得た最大量より少なかった。このため、mAb 234、mAb 338のいずれかによる3 logの減少は、アッセイの検出限界のため、認めることはできなかった。それでもなお、NL＼1＼00ウイルスの使用により見られたのと同様に、3mg/kgおよび1mg/kgの用量で、両抗体は肺ウイルス力価を2 logを超えて減少させた(図12、パネルA)。同様に、0.3mg/kgの用量では、肺ウイルス力価の統計学的に有意な減少がmAb 338、mAb 234の双方により生じたが、0.1mg/kgの用量では、mAb338だけが肺ウイルス力価の統計学的に有意な減少を示した。抗体の血清濃度の評価は、チャレンジ時の血清中に存在するIgG量の相違を示したものであることに留意した(図12、パネルC)。これらの濃度を考慮すると、NL＼1＼00ウイルスを用いた実験で認められた濃度と同様の血清濃度で、肺力価が2 log減少した。
【０３３２】
NL＼1＼99ウイルスに対する上気道の防御は、NL＼1＼00ウイルス感染に対して認められた防御よりもずっと顕著であった。mAb338またはmAb 234のいずれかの存在下でNL＼1＼99ウイルスをチャレンジすると、3 mg/kg用量で鼻甲介から得たウイルス力価が統計学的に有意に減少した(図12、パネルB)。mAb 234は2 logの減少を起こし、mAb338は2.5 logの減少を示した。これらのデータは、上気道に存在する抗体が、A型ウイルスよりもB型ウイルスに対してより有効であったことを実証している。この差異は、これらの抗体に対するIC50値についてin vitroで認められた差異と相関していた。mAb338のIC50値は、A1ウイルスに比してB1ウイルスに対して10倍低く、mAb 234のその値は、A1中和をB1中和と比較すると、50倍異なる。
【０３３３】
hMPV Fタンパク質を含有するウイルスベクターによる免疫化は、hMPVチャレンジに対し防御できる強力な中和免疫応答を誘発できることが確証されている(19、21)。これらの試験によれば、Fタンパク質単独に対して特異的な免疫応答が、他のhMPV特異抗原に対する細胞性または体液性免疫が存在しない状態で、in vivoでウイルスを中和できることが示される。最近の論文には、感染細胞による免疫化で得られた、hMPVに対するモノクローナル中和抗体の単離が記載されている(14)。これらの抗体は、hMPVのFタンパク質に反応性であり、PCRベースのアッセイでウイルスを中和した。しかし、そうした試験では、in vivoでの防御が確認されなかった。したがって、そうした試験では、Fタンパク質単独に対するmAbが動物をウイルスチャレンジから防御できることは、今までのところ示されていない。その上、その以前の試験(14)では精製抗体が使用されなかったので、in vitroまたはin vivoでのmAb中和の効力は確証されていない。
【０３３４】
本報告では、モノクローナル中和抗体を、ヒトメタニューモウイルスのFタンパク質で免疫化した動物から得ることができること、またこれらの抗体が、細胞をin vitro感染から防御し、動物をin vivo感染から防御できることが示されている。Fタンパク質配列の保存性(95%)から大多数の抗体が汎中和性であろうことが示唆されているとしても、少数の抗体だけが、4つのhMPV原型サブグループ全てと交差中和したことが判明した。単離された抗体の多くは、4つのウイルスタイプのうち少なくとも1つを同等の効力で中和できなかった。このことから、中和エピトープは、恐らく選択圧の結果、最も多様性が大きい領域であることが示唆される。
【０３３５】
ウイルスサブグループを中和する抗体の示差的能力、およびmAbがFタンパク質との結合について相互に交差競合する能力を比較した結果、6種のエピトープが同定された。この中で、mAb1017、mAb757および mAb967/mAb1025ペアにより認識される3種の異なる非重複エピトープが見出された。その他の3種のエピトープは、2種の別個のエピトープの一方を認識するか、またはこれら2種のエピトープ間の重複を認識する抗体を有する(図10)。hMPVウイルスのモノクローナル抗体耐性変異体であって、そのような抗体が結合するFタンパク質配列上の的確な位置の決定を可能にするであろう変異体が、生成されている。
【０３３６】
4つのサブグループ原型全てを<5μg/mlのIC50で中和した抗体2種、mAb234およびmAb338は、さらに研究すべき良い候補である。この抗体は両方とも、危険状態の幼児におけるRSV感染の予防に現在使用されているパリビツマブ(10、28)の特性に類似した特性を有する。hMPV抗体の中和特性および結合特性と、パリビツマブのそのRSV標的に対する中和特性および結合特性との比較が、表12に示されている。両抗体mAb234およびmAb338は、Aグループ、Bグループ双方の配列に由来する可溶性Fタンパク質に対して高い親和結合性を示す。mAb234およびmAb338は両方とも、可溶性Fタンパク質の両タイプ(AおよびB)に対して、2〜8×105 M-1s-1のkon速度を有する。これらのKon速度は、RSV可溶性Fタンパク質に対するパリビツマブのKon速度(1.2×105 M-1s-1)(wu 2005)と同等である。mAb234およびmAb338のkoff速度は、そのFタンパク質に対するパリビツマブ(7×10-4 s-1)と同等である。総合すると、2種の抗hMPV mAbおよびパリビツマブのKd値は10nM未満である。
【０３３７】
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パリビツマブと比較すると、mAb234およびmAb338抗体のAサブグループウイルスに対するin vitro中和能(1.2〜0.4μg/mlのIC50)は、パリビツマブのそのAグループウイルスに対する0.5μg/mlのIC50と同等であった。Bサブグループウイルスに対してmAb234およびmAb338抗体により認められる中和は、それよりやや強力で、B2、B1の各サブグループの中和に対してIC50は0.2〜0.01μg/mlであった。Bグループ分離株に対する効力の増加は、パリビツマブを用いても認められた。顕著なことには、hMPVモノクローナル抗体のin vivo効力は、使用したげっ歯類モデルにおける肺中ウイルス負荷量の低減において、パリビツマブと同等であった。mAb234およびmAb338が、より広範囲のウイルス分離株を中和し、ウイルス誘導病変を予防する能力のさらなる試験が、進行中である。したがって、mAb338および234のヒト化および最適化により、hMPV感染から生じる下気道疾患の予防能について試験できる有望な臨床候補が得られよう。最終的には、これによって、最もリスクが大きい個体を重症肺感染から防御する我々の能力を、拡張できるだろう。
【０３３８】
第7節で引用された刊行物
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27) Welliver, R.C. 2003.Review of Epidemiology and Clincal Risk Factors for Severe Respiratory Syncytial Virus (RSV) Infection. J. Pediatr. 143:S112-S117.
28) Wu, H., D.S. Pfarr, Y. Tang, L.L. An, N.K. Patel, J.D. Watkins, W.D. Huse, P.A. Kiener and J. F. Young. 2005. Ultra-potent Antibodies Against Respiratory Syncytial Virus: Effects of Binding Kinetics and Binding Valence on Viral Neutralization. J. Mol. Biol. 350:126-144.
29) Wyde, P.R., S.N.  Chetty,  A.M. Jewell, G. Boivin and P.A. Piedra. 2003. Comparison of the inhibition of human metapneumovirus and respiratory syncytial virus by ribavirin and immune serum globulin in vitro. Antiviral Research. 60, 51-59.
本明細書に引用された参考文献
当業者には明らかであろうが、本発明の多数の改変および変更が、その趣旨および範囲から逸脱することなくなし得る。本明細書に記載の特定の実施形態は、例示のためだけに提示されており、本発明は、添付の特許請求の範囲が権利を及ぼす等価物の全範囲に対し、そのような特許請求の範囲によってのみ制限されるべきである。このような改変は、添付の特許請求の範囲内に入ることを意図している。
【０３３９】
本明細書に引用した全ての参考文献は、特許、非特許にかかわらず、それぞれ個々の刊行物または特許もしくは特許出願が、あらゆる目的でその全体が参照により組み込まれることを明確かつ個別に示されているのと同程度に、あらゆ目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０３４０】
さらに、2004年4月23日に出願され、2005年1月27日にUS2005/0019891A1として公開された、「Metapneumovirus Strains And Their Use In Vaccine Formulations And As Vectors For Expression Of Antigenic Sequences And Methods For Propagating Virus」という発明の名称の米国特許出願第10/831,780号の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３４１】
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【図面の簡単な説明】
【０３４２】
【図１−Ａ】可溶性Fタンパク質表面に対する168-A5-234-114(mAb234)の結合速度を示す図である。
【図１−Ｂ】可溶性Fタンパク質表面に対する168-A5-234-114(mAb234)の結合速度を示す図である。
【図２−Ａ】可溶性Fタンパク質表面に対する168-A5-338-284(mAb338)の結合速度を示す図である。
【図２−Ｂ】可溶性Fタンパク質表面に対する168-A5-338-284(mAb338)の結合速度を示す図である。
【図３】ウイルスのAおよびBサブタイプの微量中和を比較した図である。
【図４】NL＼1＼00チャレンジに対するin vivo防御を示す図である。投与した抗体の量および種類がx軸に示され、肺ウイルス力価および血清IgG濃度が、各々y軸に示されている。
【図５】様々なhMPVおよびRSV分離株のFタンパク質の断片のアミノ酸配列アライメントの図である。様々なモノクローナル抗体に対する耐性を付与する変異体が、アライメントの下方に示されている。これらの変異の位置が下線で示されている。
【図６】168-A5-234-114(mAb234)のγ鎖を示す図である。
【図７】168-A5-338-284(mAb338)のγ鎖を示す図である。
【図８】168-A5-234-114(mAb234)のκ鎖を示す図である。
【図９】168-A5-338-284(mAb338)のκ鎖を示す図である。
【図１０】モノクローナル抗体が認識するエピトープを描写した図である。各円は個々のエピトープを表し、その円内にmAb番号が示されている。円同士の交差部内のmAb番号は、2種のエピトープの一部からなる認識部位を有するモノクローナル抗体である。
【図１１】NL＼1＼00チャレンジに対するin viv防御を示す図である。NL＼1＼00の鼻腔内チャレンジの24時間前に、様々な用量のmAb234およびmAb338またはBSAをゴールデンシリアンハムスターに注射した。チャレンジ前に動物から採血し、チャレンジ時に存在する血清抗体量を測定した。感染から4日後に肺(パネルA)および鼻甲介(パネルB)を採集し、ウイルス力価を材料および方法に記載したように決定した。ウイルス力価の検出限界LODは1.2 log/g組織であった。血清試料中のIgGを定量するために、血清を1:100および1:500に希釈した(パネルC)。実施時のこのアッセイの定量限界は0.1μg/ml血清であった。*p=0.008。
【図１２】NL＼1＼99チャレンジに対するin vivo防御を示す図である。NL＼1＼99の鼻腔内チャレンジの24時間前に、様々な用量のmAb234およびmAb338またはBSAをゴールデンシリアンハムスターに注射した。チャレンジ前に動物から採血し、チャレンジ時に存在する血清抗体量を決定した。感染から4日後に肺(パネルA)および鼻甲介(パネルB)を採集し、ウイルス力価を材料および方法に記載したように決定した。ウイルス力価の検出限界LODは1.2 log/g組織であった。血清試料中のIgGを定量するために、血清を1:100および1:500に希釈した(パネルC)。実施時のこのアッセイの定量限界は0.1μg/ml血清であった。*p=0.0006、#p<0.0001。
【図１３】NL＼1＼00由来のhMPV Fタンパク質の野生型配列と、mAb338、mAb628またはmAb234を用いてhMPVを選択することにより得たモノクローナル耐性変異体に由来するFタンパク質の配列とを比較した図である。hMPV Fタンパク質の配列下方に、長鎖株由来のRSV Fタンパク質の対応する相同領域が、Synagis(登録商標)(パリビツマブ)で選択したFタンパク質のモノクローナル耐性変異体配列との比較で示されている(Zhao他、2004、J.Inf.Dis. 190:1941-1946を参照されたい)。
【図１４】NL＼1＼00由来のhMPV Fタンパク質の野生型配列と、mAb338、mAb628またはmAb234を用いてhMPVを選択することにより得たモノクローナル耐性変異体に由来するFタンパク質の配列とを比較した図である。変異体配列の下方に、これら抗体で中和されないhMPV NL＼1＼99の野生型配列がある。RSV Fタンパク質の対応する相同領域は、Corvaisier他(Corvaisier、1997、Arch.Virol. 142:1073-1086)により中和応答を誘発することが示されたこの領域内のアミノ酸を指し示すために、示されている。
【図１５】NL＼1＼99由来のhMPV Fタンパク質の野生型配列と、mAb757を用いてhMPVを選択することにより得たモノクローナル耐性変異体に由来するFタンパク質の配列とを比較した図である。下方にはウシRSV Fタンパク質の配列がある。下線を付したイタリックの部分は、該RSV Fタンパク質の第1の七連リピート中にある保存された中和モチーフとして、Langedijk他(Langedijik、1998、Arch.Virol.143:313-320)により規定された領域である。
【図１６】NL＼1＼99由来のhMPV Fタンパク質の野生型配列と、mAb836、mAb710またはmAb659を用いてhMPVを選択することにより得たモノクローナル耐性変異体に由来するFタンパク質の配列とを比較した図である。
【図１７】hMPV中和抗体によるMARMSの交差中和を示す図である。モノクローナル抗体(第1列)に対し、特定の中和抗体(第1行)を用いて選択することにより生成されたウイルス変異体を中和する能力について試験した。中和表現型は、当該mAbが該変異体が由来する対応の野生型ウイルスを同等の効力で中和した場合には、野生型(WT)と評価した。耐性表現型(R)は、対応する野生型ウイルスを用いて認められた中和に比較して、中和の損失があるものとして定義した。
【図１−Ａ】
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【図１−Ｂ】
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【図２−Ａ】
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【図２−Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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