(57)【要約】  本発明は、シスタチオニン−−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼ活性の１つまたは幾つかを有し、かつ同時にγ−脱離活性が低い酵素が発現する微生物に関する。本発明はまた、シスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼ活性の１つまたは幾つかを有すると同時に、γ−エリミナーゼ活性が低く、アミノ酸、特にメチオニンの発酵生成に使用される組換え酵素に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼ活性の１つまたは幾つかを有し、かつ同時に低いγ−脱離活性を有する酵素が発現する、微生物。
【請求項２】
シスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼが、大腸菌シスタチオニン−γ−シンターゼと比較して少なくとも２倍劣る、好ましくは少なくとも１０倍劣るγ−脱離活性を有するものである、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
ホスホホモセリン受容シスタチオニン−γ−シンターゼ／ホスホホモセリンスルフヒドリラーゼが発現するものである、請求項１または２に記載の微生物。
【請求項４】
前記シスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼが、植物の、好ましくはArabidopsis thalianaのＭＥＴＢ遺伝子である、請求項３に記載の微生物。
【請求項５】
前記シスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼが、Saccharomyces cerevisiaeのＭＥＴＢ遺伝子である、請求項１または２に記載の微生物。
【請求項６】
前記シスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼが、古細菌、好ましくはMethanosarcina barkeri由来のものである、請求項１または２に記載の微生物。
【請求項７】
前記シスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼが、Chloroflexaceae、好ましくはChloroflexus aurantiacus由来のものである、請求項１または２に記載の微生物。
【請求項８】
前記酵素が、次の位置におけるそれぞれのアミノ酸：１０７Ｅ、１１１Ｙ、１６５Ｋ、および４０３Ｓの少なくとも２つを有するものである、請求項１または２に記載の微生物。
【請求項９】
前記シスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼが、グラム陽性細菌のｍｅｔＹおよび／またはｍｅｔＢ遺伝子である、請求項１または２に記載の微生物。
【請求項１０】
天然または異種のシスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼ酵素が最適化され、結果としてγ−エリミナーゼ活性が低下することにより、イソロイシンを犠牲にしてメチオニン選択性が増強されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１１】
３３７位にプロリンを有する、最適化されたシスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼ酵素が発現するものである、請求項１に記載の微生物。
【請求項１２】
３３５位にアラニンを有する、最適化されたシスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼ酵素が発現するものである、請求項１に記載の微生物。
【請求項１３】
３３５位にアラニンを有し、かつ３３７位にプロリンを有する、最適化されたシスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼ酵素が発現するものである、請求項１に記載の微生物。
【請求項１４】
前記シスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードするポリヌクレオチドが過剰発現するものである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１５】
前記シスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼの触媒特性が向上したものである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１６】
対応するアシルホモセリン受容シスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼの使用を許容する異種ホモセリンアシルトランスフェラーゼが導入されたものである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１７】
幾つかの異なるハイブリッド経路が、ホモセリンからホモシステインおよび／またはシスタチオニンを能動的に生成しているものである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１８】
生成すべき所望のアミノ酸の生合成経路の更なる遺伝子が更に増強されたものである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１９】
前記所望のアミノ酸の生成を低下させる代謝経路が、少なくとも部分的に低減されたものである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の微生物を用いて、アミノ酸、特にメチオニン、その前駆体または誘導体を発酵により製造するための方法であって、
ａ）所望のアミノ酸を生成する前記微生物を発酵させる工程と、
ｂ）前記細菌の細胞内または培地内の所望の生成物を濃縮する工程と、
ｃ）前記所望のアミノ酸／最終生成物の一部または全量（０〜１００％）において任意に残存する発酵ブロスおよび／またはバイオマスの構成成分を単離する工程と
を含んでなる、方法。
【請求項２１】
硫黄分子／化合物が、システインから任意の活性化ホモセリンに転移する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
硫黄分子／化合物が、Ｈ２Ｓから任意の活性化ホモセリンに直接転移する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記培地内の硫黄源が硫酸塩または誘導体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記培地内の硫黄源がチオ硫酸塩である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記培地内の硫黄源がＨ２Ｓである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記培地内の硫黄源がメチルメルカプタンである、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、シスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼ活性の１つまたは幾つかを有し、かつ同時に低いγ−脱離活性を有する酵素が発現する微生物に関する。本発明はまた、シスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼ活性の１つまたは幾つかを有し、かつ同時に低いγ−脱離活性を有する、アミノ酸、特にメチオニンの発酵生成に使用される組換え酵素に関する。
【従来技術】
【０００２】
システイン、ホモシステイン、メチオニンまたはS−アデノシルメチオニンなどの硫黄含有化合物は、細胞代謝にとって重要であり、かつ食品または飼料添加物および医薬品として使用されるべく工業的に製造されている。特に、動物が合成することのできない必須アミノ酸であるメチオニンは、多くの身体機能において重要な役割を果たす。タンパク質生合成におけるその役割とは別に、メチオニンは、メチル基転移（transmethylation）ならびにセレニウムおよび亜鉛のバイオアベイラビリティに関与している。メチオニンはまた、アレルギーやリウマチ熱のような医学的疾患の治療薬として直接的に用いられている。しかしながら、製造されるメチオニンの大部分は動物用飼料に添加されている。
【０００３】
化学的には、Ｄ，Ｌ−メチオニンは通常、アクロレイン、メチルメルカプタンおよびシアン化水素から製造されている。しかしながら、ラセミ混合物は、例えば鶏飼料用添加物において、純粋なＬ−メチオニンほど良好には機能しない（Saunderson, C.L., (1985) British Journal of Nutrition 54, 621-633）。純粋なＬ−メチオニンは、ラセミ型メチオニンから、例えばＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−メチオニンのアシラーゼ処理によって製造することができるが、製造コストは劇的に増加する。環境問題に関連して純粋なＬ−メチオニンに対する需要が高まりつつあるため、メチオニンの微生物生成は魅力的である。
【０００４】
メチオニン生合成を行えるのは、微生物および植物のみである。Ｌ−メチオニン合成経路は、多くの微生物および植物においてよく知られている（図１）。大腸菌におけるメチオニンは、アミノ酸であるアスパラギン酸（aspartate）に由来するが、その合成には、システイン生合成およびＣ１代謝（Ｎ−メチルテトラヒドロフォレート）という更なる２つの経路の収束が必要である。アスパラギン酸は、一連の３つの反応によりホモセリンに変換される。続いて、ホモセリンはトレオニン／イソロイシンまたはメチオニン生合成経路に入ることができる。大腸菌において、メチオニン経路に入るには、ホモセリンをアシル化してスクシニル−ホモセリンとすることが必要である。この活性化工程により、続いてシステインによる濃縮が行われ、それによりチオエーテル含有シスタチオニンが生じ、これが加水分解されてホモシステインが得られる。Ｂ１２依存性またはＢ１２独立性メチル基転移のいずれかによって最終的なメチル転移が行われて、メチオニンが生じる。
【０００５】
大腸菌におけるメチオニン生合成は、ＭｅｔＪおよびＭｅｔＲタンパク質を介してメチオニン生合成遺伝子を抑制および活性化することによって調節される。この転写調節に加え、メチオニン特異的経路への進入は、ホモセリントランススクシニラーゼをコードするｍｅｔＡ（ＥＣ  ２．３．１．４６）によって厳密に制御されている。ＭｅｔＪおよびＭｅｔＲによるｍｅｔＡの転写制御とは別に、当該酵素はまた、メチオニンおよびＳ−アデノシルメチオニン経路の主要な最終生成物によってフィードバック調節される（Lee, L.W. et al. (1966) Multimetabolite control of a biosynthetic pathway by sequential metabolites, JBC 241 (22), 5479-5780）。これら２つの生成物によるフィードバック阻害は相乗的であり、これは、低濃度の各代謝産物が単独では僅かに阻害性でしかないが、組み合わせると強い阻害作用を発揮することを意味している。
【０００６】
一方、大腸菌においては、ホモセリンが活性化されてスクシニル−ホモセリンとなり、次いでシスタチオニン−γ−シンターゼによってγ−シスタチオニンに変換されるが、グラム陽性細菌およびスピロヘータは、ホモセリンを活性化させてアセチル−ホモセリンとすると共に、アセチル−ホモセリンスルフヒドリラーゼ（グラム陽性細菌ではＭｅｔＹ、およびスピロヘータではＭｅｔＺと呼ばれる）を用いてアセチル−ホモセリンをホモシステインに直接変換することによってＨ２Ｓからの硫黄を組み込むことができる。
【０００７】
真正細菌におけるメチオニン生合成とは対照的に、植物においては、メチオニン生合成とトレオニン／イソロイシン生合成との分岐点は、ホスホホモセリンのレベルにある。ホモセリンがリン酸化されてホスホホモセリンを生じ、これが反応して、酵素トレオニンシンターゼにより触媒されてトレオニンを生成するか、またはシスタチオニン−γ−シンターゼおよびホスホホモセリンスルフヒドリラーゼ活性を有する植物酵素ＭＥＴＢを用いてγ−シスタチオニンおよび／またはホモシステインを生成することができる。最近のデータは、同様の経路が古細菌でも機能することを示しているが（White, 2003, The biosynthesis of cysteine and homocysteine in Methanococcus jannaschii, Biochim Biophys Acta. 1624 (1-3):46-53）、対応する酵素はまだ特徴付けられていない。故に、植物およびおそらくは数種の古細菌において、メチオニン生成に関連する工程は、ホスホホモセリンからのγ−シスタチオニン合成にある。植物において、メチオニン生合成は、重要な２つの酵素、シスタチオニン−γ−シンターゼ（ＣＧＳ）およびトレオニンシンターゼ（ＴＳ）の活性を通じて制御される。ＣＧＳは、細菌酵素には認められないＮ−末端調節領域を介して転写後調節される（Hacham et al. 2002 Plant Physiol. 128, 454-462）。ＴＳは、Ｓ−アデノシルメチオニン（高メチオニン濃度をシグナリングするメチオニン誘導体）によってフィードバック活性化される。これらの調節機構はいずれも炭素の流れをメチオニンから離れてトレオニンに向かわせるが、原核生物においては機能的ではない。
【０００８】
異なるシスタチオニン−γ−シンターゼの発現は、特許文献ＷＯ９３／１７１１２（Genencor）に教示されている。当時、シスタチオニン−γ−シンターゼについての正確な知識はなく、植物からの配列は知られていなかった。特許文献ＪＰ２０００−１３９４７１（Ajinomoto）では、大腸菌シスタチオニン−γ−シンターゼの過剰発現については記載されているが、異なる生物からのシスタチオニン−γ−シンターゼの使用は、いかなる生物におけるメチオニン生成についても評価されていない。
【０００９】
ＭｅｔＢ酵素およびそれらの対応物であるＭｅｔＹ／ＭｅｔＺは、表１に記載される様々な異なる基質を受容することができる。これらの酵素は４つの異なる反応を触媒することができ、それらの反応は全て活性化ホモセリンを必要とする。活性化ホモセリンは、ホスホ−、アセチル−またはスクシニル−ホモセリンのいずれかであり得る。（ｉ）システインと共に、シスタチオニン−γ−シンターゼはシスタチオニンを生成し、（ｉｉ）硫化水素と共に、スルフヒドリラーゼはホモシステインを合成し、（ｉｉｉ）メチルメルカプタンと共に、メチオニンシンターゼはメチオニンを生成し、（ｉｉｉｉ）第二基質の不存在下で、γ−エリミナーゼは、基質がα−ケト酪酸、アンモニアおよび活性化基（アセテート、スクシネート、フォスフェート）に分解されるのを触媒する。酵素の中には２つ以上の反応を触媒できるものもあるが、触媒効率は様々である。例えば、大腸菌ＭｅｔＢは、基質としてシステインおよびスクシニルホモセリンを用いると最も高い触媒効率を有し、システインの不存在下では比較的高いγ−エリミナーゼ活性を有する（Aitken et al. 2003, Biochemistry 42, 11297-11306）。植物酵素は、同じく良好にシスタチオニンを生産するが、γ−エリミナーゼ活性が低い。実際、γ−エリミナーゼ活性に関するA. thalianaＭＥＴＢのｋｃａｔは、大腸菌酵素のわずか１／１５００である（Ravanel et al. 1998 Biochem. J. 331, 639-648）。γ−脱離活性が低い酵素の幾つかは、大腸菌に導入されたときに、高いメチオニン生成を与えるはずである。
【００１０】
【表１】
2008529485.tif 000002
【００１１】
活性化ホモセリンの種類および好ましい反応は、異なる種または群からの酵素に関して示されている。詳細については、（Hacham et al. 2003, Mol. Biol. Evol. 20:1513-1520）を参照のこと。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、シスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼ活性を有すると共に、低いγ−脱離活性を有する酵素が発現すると、メチオニン生成が向上されるという発見に基づいている。これら酵素の使用により、発酵ブロス内に堆積する、イソロイシンに変換され得るα−ケト酪酸の生成が低下する。従って、本発明は、シスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼ活性を有すると共に、低いγ−エリミナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子を含んでなるＤＮＡ断片に関する。本発明はまた、メチオニン生成における、これら酵素の発現、特に過剰発現に関する。本発明は更に、上記酵素が発現する微生物、好ましくは腸内細菌、コリネフォルム細菌または酵母に関する。更に、本発明は、記載した特性を有する微生物を用いたメチオニン、その前駆体または誘導体の発酵生成方法についても記載している。
【発明の具体的説明】
【００１３】
メチオニンは、動物用食物および医薬用途において使用されている。多くの場合、特定の立体異性体、この場合には生物学的に活性なＬ体が好ましい種である。化学合成では分解しにくいラセミ混合物しか得られないので、発酵によってＬ−メチオニンを製造することは一般的に興味深い。従って、本発明の１つの目的は、遺伝子操作により株を最適化し、Ｌ−メチオニン、その前駆体または誘導体を多量に生成する発酵方法を改良することである。植物および微生物において、メチオニンの発酵生成には幾つかの酵素が必要である。大腸菌のシスタチオニン−γ−シンターゼ（配列番号１）は、メチオニン生合成に関与する重要な酵素の１つである。
【００１４】
＞大腸菌｜ＥＧ１０５８２｜ＭｅｔＢ：３８６ａａ−シスタチオニンγ−シンターゼ：
MTRKQATIAV RSGLNDDEQY GCVVPPIHLS STYNFTGFNE PRAHDYSRRG 
NPTRDVVQRA LAELEGGAGA VLTNTGMSAI HLVTTVFLKP GDLLVAPHDC 
YGGSYRLFDS LAKRGCYRVL FVDQGDEQAL RAALAEKPKL VLVESPSNPL 
LRVVDIAKIC HLAREVGAVS VVDNTFLSPA LQNPLALGAD LVLHSCTKYL 
NGHSDVVAGV VIAKDPDVVT ELAWWANNIG VTGGAFDSYL LLRGLRTLVP 
RMELAQRNAQ AIVKYLQTQP LVKKLYHPSL PENQGHEIAA RQQKGFGAML 
SFELDGDEQT LRRFLGGLSL FTLAESLGGV ESLISHAATM THAGMAPEAR 
AAAGISETLL RISTGIEDGE DLIADLENGF RAANKG
【００１５】
その主要なシスタチオニンγ−シンターゼ活性に加え、この酵素はスクシニル−ホモセリンγ−エリミナーゼという望ましくない副活性を有しており、これはスクシニル−ホモセリンをα−ケト酪酸、スクシネートおよびアンモニアに変換する。この活性は、少量のシステインしか存在しない場合には、特別に適切である。大腸菌では、この活性によりメチオニン生成が損なわれるが、この問題は、大腸菌酵素と比較してγ−エリミナーゼ活性が低下したシスタチオニン−γ−シンターゼを使用することにより回避することができる。
【００１６】
従って、本発明の目的は、シスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼを有するとともに、γ−エリミナーゼ活性が低い１つまたは幾つかの酵素が発現する、アミノ酸を発酵生成するための微生物である。
【００１７】
本発明によれば、低いγ−エリミナーゼ活性とは、好ましくは天然の大腸菌酵素で観察される活性よりも低いγ−エリミナーゼ活性を意味する。更に、低いγ−エリミナーゼ活性を有する酵素は、特定のシスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼ活性を有することが望ましい。前記活性は、天然の大腸菌酵素の活性よりも低くてもよい。
【００１８】
シスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼを有すると共に、低いγ−エリミナーゼ活性を有する前記発現酵素は、同じ生物に存在する天然酵素とは異なるのが好ましい。該酵素は、同一種の変異遺伝子であっても、他の種の天然または変異遺伝子であってもよい。
【００１９】
本発明の好ましい実施態様によれば、微生物は、このような低いγ−エリミナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子を導入するために形質転換される。
【００２０】
このような遺伝子は、当業者にとって利用可能な様々な手段によって導入すればよい：
−相同的組み換えにより天然遺伝子の組み換えを行って、前記遺伝子がコードする酵素に変異を導入することによりγ−エリミナーゼ活性を低下させ、酵素活性を保持する；
−γ−エリミナーゼ活性が低いことが知られている選択酵素をコードする外来遺伝子を微生物のゲノムに組み込む。前記外来遺伝子は、宿主微生物において機能的な調節因子の制御下にある；
−宿主微生物において機能的な調節因子の制御下で低いγ−エリミナーゼ活性を有することが知られている選択酵素をコードする外来遺伝子を含むプラスミドを導入する。
【００２１】
遺伝子を微生物のゲノムに組み込む際、有利には、該遺伝子を、天然遺伝子と置き替えるべく選択された遺伝子座に導入してもよい。
【００２２】
微生物を形質転換するのに使用する方法は当技術分野において周知であり、これには相同的組み換えが含まれる。
【００２３】
植物シスタチオニン−γ−シンターゼは、大腸菌酵素よりも低いγ−エリミナーゼ活性を有することが知られている（Ravanel et al. 1998, Biochem. J331, 639-648）。しかしながら、メチオニンの発酵生成の際に植物酵素を使用すると、天然の大腸菌酵素を使用する場合に比べて有利であることは全く示されていない。従って、本発明は、植物シスタチオニン−γ−シンターゼを使用することによって、メチオニンの発酵生成を増大することに関する。
【００２４】
植物酵素は基質としてホスホホモセリンを使用するが、一方で、大腸菌酵素はスクシニル−ホモセリン、およびある程度まではアセチル−ホモセリンを受容する。最近、古細菌におけるメチオニン生合成が、ホスホホモセリンを介して進行するであろうということが示された。今までのところ、その酵素は特徴付けられていない。従って、本発明はまた、メチオニンの発酵生成における、シスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼ活性を有する古細菌酵素の使用に関する。
【００２５】
細菌内での植物シスタチオニン−γ−シンターゼの最も近い相同体が、光合成細菌Chloroflexusにおいて認められている。植物酵素と該酵素との合致は、大腸菌酵素と植物酵素との構造比較から決定された（Steegborn et al. 2001 J. Mol Biol 311, 789-801）ホスホ基の結合に必要なアミノ酸がChloroflexus酵素において保存されていることを証明している（図２）。
【００２６】
従って、Chloroflexus遺伝子の相同体、例えば、Chloroflexus aurantiacusからの遺伝子＞ｇｉ｜５３７９８７５４｜ｒｅｆ｜ＺＰ＿０００２０１３２．２｜ＣＯＧ０６２６を発現する微生物も本発明の目的である。
【００２７】
本発明の更なる目的は、次の位置におけるそれぞれのアミノ酸：１０７Ｅ、１１１Ｙ、１６５Ｋ、および４０３Ｓ（図２のアラインメントを参照のこと）を保持した、シスタチオニン−γ−シンターゼ／ホスホホモセリンスルフヒドリラーゼを有する酵素である。この酵素は、基質としてのホスホホモセリンの使用を許容し、故に低いγ−脱離活性を示す。アミノ酸の位置は、Nicotiana tabacumの配列を参照することによって与えられる。同アミノ酸位置は、過度の実験を要することなく、単純な配列アラインメント（図２を参照）によって同定することができる。
【００２８】
トレオニンの生合成経路の一部として、ホスホホモセリンは大腸菌内で生成され、故にγ−シスタチオニンおよび／またはホモシステインに直接変換され得る。
【００２９】
植物および腸内細菌とは対照的に、グラム陽性細菌の中にはホモセリン活性化機構を使用するものもあり、この機構はアセチル基をホモセリン上に転移させてアセチル−ホモセリンを生成することに基づいている。その後、アセチル−ホモセリンは、アセチル−ホモセリンスルフヒドリラーゼＭｅｔＹを用いたスルフヒドリル化によってホモシステインに変換されるか、またはシスタチオニン−γ−シンターゼを用いてγ−シスタチオニンに変換される。この反応は、特許文献ＷＯ２００４０２４９３３およびＥＰ１３１３８７１に記載されるように、コリネフォルム細菌内で発酵によりメチオニンを生成するのに使用されてきた。しかしながら、対応する遺伝子は大腸菌内においては全く試験されず、それらのγ−エリミナーゼ活性も測定されていない。
【００３０】
従って、本発明はまた、大腸菌酵素に対して、γ−エリミナーゼ活性は低いが、スルフヒドリラーゼ活性は同等か、または高いＭｅｔＹ酵素を大腸菌において使用することに関する。
【００３１】
本発明の別の実施態様によれば、天然または導入酵素のγ−エリミナーゼ活性の低下はまた、該酵素を最適化することによって、例えば、Sambrookらの文献（1989 Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York）に記載されるような指向進化または部位特異的突然変異誘発によって得られる。酵素はまた、ＮＴＧまたはＥＭＳなどの突然変異誘発物質を使用するランダムな突然変異誘発を通じて、または特許出願ＰＣＴ／ＦＲ０４／００３５４に記載されるような生体内進化によって最適化することができる。最適化された酵素はまた、天然遺伝子に基づいていると共に、宿主生物に対して最適化されたコドン使用頻度およびＧＣ含量を有する合成遺伝子であり得る。故に、γ−エリミナーゼ活性が低下した、またはシスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼ活性が増強された最適化酵素の使用は、本発明の目的である。
【００３２】
最適化酵素の特定例は、最適化されたシスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼ酵素、特に大腸菌ＭｅｔＢ酵素であり、３３７位のアラニンが、異なる細菌属に由来する酵素および／または３３５位にアラニンを含む酵素において高度に保存されているプロリンに置換されている。別途記載しない限り、位置は、天然の大腸菌酵素を参照することにより与えられる。
【００３３】
本発明は更に、ヌクレオチド配列、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列に関し、これらの配列は、先に定義された、本発明によるシスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードする。
【００３４】
シスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼは、有利には、ＰＦＡＭ参照番号ＰＦ０１０５３ならびにＣＯＧ参照番号ＣＯＧ０６２６およびＣＯＧ２８７３に対応する酵素から選択される。
【００３５】
ＰＦＡＭ（アラインメントのタンパク質ファミリーデータベースおよび隠れマルコフモデル；http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/）は、タンパク質配列アラインメントを多数集めたものである。各ＰＦＡＭにより、多重アラインメントを視覚化し（タンパク質ドメインを参照のこと）、生物間での分布を評価し、他のデータベースへのアクセスを獲得し、既知のタンパク構造を視覚化することができる。
【００３６】
ＣＯＧ（タンパク質のオーソロガス群のクラスタ；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）は、３０個の主要な系統発生系を示す４３個の完全に配列決定されたゲノムからのタンパク質配列を比較することによって得られる。各ＣＯＧは少なくとも３つの系から画定されるので、太古の保存ドメインを同定することができる。
【００３７】
好ましい酵素は、Arabidopsis thalianaのシスタチオニン−γ−シンターゼ（受託番号  ｇｉ：１３８９７２５）、Methanosarcia barkeriの推定シスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはスルフヒドリラーゼ（受託番号  ｇｉ：４８８３９５１７）、Saccharomyces cerevisiaeのアセチル−ホモセリンスルフヒドリラーゼ（受託番号  ＹＬＲ３０３Ｗ）、Chloroflexus aurantiacus由来の推定シスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはスルフヒドリラーゼ（ｇｉ：５３７９８７５３）、ならびに大腸菌に適合する合成遺伝子としてのCorynebacterium glutamicum由来のアセチル−ホモセリンスルフヒドリラーゼ（ｇｉ：４１３２４８７７）である。これらの配列は、以下の代表的な配列と整合している：
＞ｇｉ｜８４３９５４１｜ｇｂ｜ＡＡＦ７４９８１．１｜ＡＦ０８２８９１＿１ シスタチオニン−γ−シンターゼ アイソフォーム１［Solanum tuberosum］；
＞ｇｉ｜４９５９９３２｜ｇｂ｜ＡＡＤ３４５４８．１｜ＡＦ１４１６０２＿１ シスタチオニン−γ−シンターゼ前駆体［Glycine max］；
＞ｇｉ｜２１９８８５３｜ｇｂ｜ＡＡＢ６１３４８．１｜シスタチオニン−γ−シンターゼ［Zea mays］；
＞ｇｉ｜４３２２９４８｜ｇｂ｜ＡＡＤ１６１４３．１｜シスタチオニン−γ−シンターゼ前駆体［Nicotiana tabacum］；
＞ｇｉ｜１１６０２８３４｜ｇｂ｜ＡＡＧ３８８７３．１｜ＡＦ０７６４９５＿１  シスタチオニン−γ−シンターゼ［Oryza sativa］；
＞ｇｉ｜３０５０４２｜ｇｂ｜ＡＡＢ０３０７１．１｜シスタチオニン−γ−シンターゼ［大腸菌］。
【００３８】
シスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼ活性を示すと共に、上述のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは９０％の相同性、より好ましくは９５％の相同性を示すこれらの配列の相同配列も同じく本発明の目的である。
【００３９】
相同配列およびそれらの相同性（％）を同定する手段は当業者にとって周知であり、これには特にＢＬＡＳＴプログラム、および特にＢＬＡＳＴＰプログラムが含まれ、このプログラムはウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/から、該サイト上に示されるデフォルトパラメータと共に使用することができる。
【００４０】
対応株に導入される際に、メチオニン生成にとっていずれの酵素が有益であるかを決定するために、γ−エリミナーゼ活性を酵素的に評価してもよい。例えば、活性化ホモセリンと、（ｉ）その他の基質を用いないで、または基質として（ｉｉ）システインもしくは（ｉｉｉ）Ｈ２Ｓを用いた酵素テストにおいて、シスタチオニン−γ−シンターゼ、γ−エリミナーゼ活性およびスルフヒドリラーゼ活性を決定することができる。対応酵素活性を有するタンパク質抽出物を添加することによって反応を開始し、タンパク質沈殿およびシリル化試薬を用いた誘導体化の後、ＧＣ−ＭＳによってホモシステインおよび／またはγ−シスタチオニンの形成をモニタリングする。
【００４１】
シスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードする遺伝子（１つまたは複数）は、染色体内で、または染色体外でコードされてもよい。染色体内では、当業者に既知の組み換え法によって導入され得る１つまたは複数のコピーがゲノム上にあってもよい。染色体外では、遺伝子は、複製起点が異なり、それに伴って細胞内でのコピー数が異なる様々な種類のプラスミドに担持されていてもよい。それら遺伝子は、１個〜５個のコピーとして存在してもよく、厳密な複製を有する低コピー数のプラスミド（ｐＳＣ１０１，ＲＫ２）、低コピー数のプラスミド（ｐＡＣＹＣ，ｐＲＳＦ１０１０）または高コピー数のプラスミド（ｐＳＫ  ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ）に相当する約２０個または最大５００個のコピーとして存在してもよい。
【００４２】
ｍｅｔＢ遺伝子は、誘導因子分子によって誘導される必要があるか、またはその必要がない、強度が異なるプロモータを用いて発現させてもよい。例としては、プロモータＰｔｒｃ、Ｐｔａｃ、Ｐｌａｃ、ラムダプロモータｃＩまたは当業者にとって既知である他のプロモータがある。
【００４３】
標的遺伝子の発現は、対応するメッセンジャーＲＮＡ（Carrier and Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64）またはタンパク質（例えば、ＧＳＴタグ（Amersham Biosciences））を安定化または不安定化させる因子によって、促進または低減されてもよい。
【００４４】
本発明はまた、本発明によるシスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはアシルホモセリンおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼをコードする１つまたは幾つかの対立遺伝子を含有する微生物に関する。
【００４５】
このような株は、ホスホホモセリン受容酵素のみを単独で使用することによって、α−ケト酪酸の生成量を低下させるか、またはアシルホモセリン受容酵素に加えてホスホホモセリン受容酵素を使用することによって、メチオニンへの流動を増加させるかのいずれかによって、メチオニンへ向かう流束を増加させることが可能なメチオニン代謝を有するという事実を特徴とする。
【００４６】
特に、本発明は、新規微生物を培養し、生成した硫黄含有化合物を単離することによって、L−メチオニン、その前駆体またはその誘導化合物を調製することに関する。
【００４７】
Ｌ−メチオニン、その前駆体またはその誘導化合物の生成の増加は、以下の遺伝子の発現レベルを低下させるか、またはそのうちの１つを欠失させることによって達成することができる。
【００４８】
【表２】
2008529485.tif 000003
【００４９】
Ｌ−メチオニン、その前駆体またはその誘導化合物の生成の更なる増加は、以下の遺伝子の１つまたは幾つかを過剰発現させることによって達成することができる：Rhizobium etli由来のピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ，Ｕ５１４３９）、またはその相同体の１つ、好ましくはフィードバック感度が低下した、遺伝子ｔｈｒＡによってコードされるホモセリン合成酵素（ホモセリンデヒドロゲナーゼ／アスパルトキナーゼ、１７８６１８３）、ｍｅｔＬ（ホモセリンデヒドロゲナーゼ／アルパルトキナーゼ、ｇ１７９０３７６）またはｌｙｓＣ（アスパルトキナーゼ、１７９０４５５）およびａｓｄ（アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、１７８９８４１）、またはこれらの組み合わせ。
【００５０】
Ｌ−メチオニン、その前駆体またはその誘導化合物の生成の更なる増加は、硫酸同化およびシステイン生成に関与する遺伝子を過剰発現させることによって可能である。硫黄含有化合物の量が増加すると、γ−エリミナーゼ活性が等しく低下する。これは、以下の遺伝子（以下参照）を過剰発現させることによって、またはCoyler and Kredich (1994 Mol Microbiol 13 797-805)に記載されるように、構成的ｃｙｓＢ対立遺伝子の導入により経路の制御を解除することによって、および、その阻害剤Ｌ−システインに対する感度が低下した、セリンアセチルトランスフェラーゼをコードするｃｙｓＥ対立遺伝子を導入することによって（米国特許第６，２１８，１６８号（Denk & Bock 1987 J Gen Microbiol 133 515-25））達成することができる。以下の遺伝子を過剰発現させる必要がある。
【００５１】
【表３】
2008529485.tif 000004
【００５２】
更に、Ｃ１（メチル）基の生成に関与する遺伝子は、以下の遺伝子を過剰発現させることによって増強されてもよい：
【表４】
2008529485.tif 000005
【００５３】
更に、メチオニン生成に直接関与する遺伝子を過剰発現させてもよい：
【表５】
2008529485.tif 000006
【００５４】
更に、メチオニンを分解する、またはメチオニン生成経路から逸脱する経路における遺伝子の発現を低減するか、または遺伝子を欠失させてもよい：
【表６】
2008529485.tif 000007
【００５５】
アナプレロティック（補充）反応は、以下の遺伝子を発現させることによって促進してもよい：
【表７】
2008529485.tif 000008
【００５６】
Ｌ−メチオニン、その前駆体またはその誘導化合物の生成の更なる増加は、ＪＰ２０００１５７２６７−Ａ／３（ＧｅｎＢａｎｋ  １７９０３７３も参照）に示唆されたように、メチオニンレギュロンの下方調節を担うリプレッサータンパク質の遺伝子ＭｅｔＪを欠失させることによって達成される。
【００５７】
メチオニン生成は、変性ｍｅｔＢ対立遺伝子を使用することによって更に増大させてもよく、この変性ｍｅｔＢ対立遺伝子は、優先的または排他的にＨ２Ｓを使用することにより、特許出願ＰＣＴ／ＦＲ０４／００３５４（この内容は参照することにより本明細書の一部とされる）に記載されたように、Ｏ−スクシニル−ホモセリンからホモシステインを生成する。
【００５８】
好ましい用途において、生物は、大腸菌またはC. glutamicumまたはSaccharomyces cerevisiaeのいずれかである。
【００５９】
本発明はまた、設計された細菌株の発酵によって通常調製されるＬ−メチオニン、その前駆体またはその誘導化合物の生成方法に関する。
【００６０】
本発明によれば、「培養」および「発酵」との用語は、単純な炭素源を含有する適切な培養培地上での微生物の増殖を示すために、区別なく使用される。
【００６１】
本発明によれば、単純な炭素源は、微生物、特に細菌を通常的に増殖させるべく、当業者によって使用され得る炭素源である。特に、グルコース、ガラクトース、スクロース、ラクトースまたはモラスなどの吸収可能な糖、またはこれら糖の副産物であり得る。特に好ましい単純な炭素源はグルコースである。別の好ましい単純な炭素源はスクロースである。
【００６２】
当業者は、本発明による微生物のための培養条件を規定することができる。特に、細菌は、２０℃〜５５℃、好ましくは２５℃〜４０℃、より特定的にはC. glutamicumの場合には約３０℃、および大腸菌の場合には約３７℃の温度で発酵される。
【００６３】
発酵は、一般的には、使用する細菌に適合した既知の規定された組成の無機培養培地を備えた発酵槽において行われ、この無機培養培地は、少なくとも１種の単純な炭素源と、必要であれば代謝産物の生成に必要な補基質(co-substrate)とを含有する。
【００６４】
特に、大腸菌の場合の無機培養培地は、Ｍ９培地（Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32: 120-128）、Ｍ６３培地（Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）またはSchaeferらによって規定されるもののような培地（1999, Anal. Biochem. 270:88-96）と同一または同様の組成のものであり得る。
【００６５】
同様に、C. glutamicumの場合の無機培養培地は、ＢＭＣＧ培地（Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32:205-210）またはRiedelら（2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3:573-583）によって記載されるもののような培地と同一または同様の組成のものであり得る。これらの培地を補充して、変異によって導入される栄養要求性を補うことができる。
【００６６】
発酵後、Ｌ−メチオニン、その前駆体またはその誘導化合物を回収し、必要であれば精製する。培養培地内で生成したメチオニンなどの化合物の回収および精製方法は、当業者に周知である。
【００６７】
Ｌ−メチオニン、その前駆体またはその誘導化合物の発酵による製造に使用される硫黄源は、硫酸塩、チオ硫酸塩、硫化水素、メチルメルカプタンのいずれであってもよい。
【実施例】
【００６８】
実施例１：メチオニン製造のための、低いγ−エリミナーゼ活性を有する植物ホスホホモセリン受容ＭＥＴＢを単独で使用した株の構築
植物ＣＧＳのγ−エリミナーゼ活性が大腸菌酵素よりも低いことを検証するために、ArabidopsisＭＥＴＢ酵素および大腸菌酵素のγ−エリミナーゼ活性とＣＧＳ活性との比率を、粗抽出物において測定した。この目的のために大腸菌株を構築し、これらの株では、ｍｅｔＢ遺伝子の染色体コピーを欠失させ、大腸菌またはArabidopsisのＣＧＳのいずれかをプラスミドから発現させた。ｍｅｔＢ欠失に付随して、ｍｅｔＪ遺伝子も排除された（下記参照）。
【００６９】
野生型または異種アシルホモセリンまたはホスホホモセリン受容シスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはスルフヒドリラーゼを担持する大腸菌ΔｍｅｔＪＢ株を、５ｇ／ｌのグルコースを含む最小培地内で培養し、その後の対数期に回収した。細胞を、冷リン酸カリウム緩衝液中に再懸濁し、氷上で超音波分解した（Ｂｒａｎｓｏｎソニファイアー、７０Ｗ）。遠心分離後、上澄みに含有されるタンパク質を定量した（Bradford, 1976）。
【００７０】
１０μｌの抽出物を、５ｍＭのＯ−スクシニル−ホモセリンまたはＯ−アセチル−ホモセリン、および１．５ｍＭの硫化ナトリウムまたはシステインとともに、３０℃にて１０分間インキュベートした。ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルトリフルオロアセトアミド（ＴＢＤＭＳＴＦＡ）による誘導体化の後、アセトンおよびホモシステインまたは酵素反応中に生成されたγ−シスタチオニンを用いてタンパク質を沈殿させ、ＧＣ−ＭＳによって定量した。Ｌ−セリン［１−１３Ｃ］を内部標準として添加した。あるいは、同プロトコルを用いて、システインの消失を測定した。
【００７１】
ｍｅｔＢおよびｍｅｔＪ遺伝子を不活性化するために、Datsenko & Wanner（２０００）によって記載される相同組み換え法を用いた。この方法により、クロラムフェニコール耐性カセットを挿入することができたが、関与する遺伝子の大分部は欠失した。このため、以下のオリゴヌクレオチドを使用した。
【００７２】
ＤｍｅｔＪＲ（配列番号２）：tgacgtaggc ctgataagcg tagcgcatca ggcgattcca ctccgcgccg ctcttttttg ctttagtatt cccacgtctc TGTAGGCTGG AGCTGCTTCG。
【００７３】
このオリゴヌクレオチドは以下の領域を有する：
−遺伝子ｍｅｔＪの配列（４１２５５９６−４１２５６７５）と相同な領域（下部ケース）（ウェブサイトhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/の参照配列）；
−クロラムフェニコール耐性カセットの増幅用領域（上部ケース）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:6640-6645の参照配列）。
【００７４】
ＤｍｅｔＪＢＦ（配列番号３）：tatgcagctg acgacctttc gcccctgcct gcgcaatcac actcattttt accccttgtt tgcagcccgg aagccatttt CAGGCACCAG AGTAAACATT。
【００７５】
このオリゴヌクレオチドは以下の領域を有する：
−遺伝子ｍｅｔＢの配列（４１２７４６０−４１２７３８１）と相同な領域（下部ケース）およびｍｅｔＬのプロモータと相同な領域（４１２６１１６−４１２６１９７）；
−クロラムフェニコール耐性カセットの増幅用領域（上部ケース）。
【００７６】
オリゴヌクレオチドＤｍｅｔＪＢＲおよびＤｍｅｔＪＢＦを使用して、プラスミドｐＫＤ３からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅した。次いで、得られたＰＣＲ産物をエレクトロポレーションによって株ＭＧ１６５５（ｐＫＤ４６）に導入した。この株では、相同組み換えを可能とするＲｅｄ組み換え酵素が発現していた。クロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、以下に規定するオリゴヌクレオチドＭｅｔＪＲおよびＭｅｔＪＦを用いたＰＣＲ分析により耐性カセットの挿入を検証した。保持された株はＭＧ１６５５（ΔｍｅｔＪＢ：：Ｃｍ）と命名した。
【００７７】
ＭｅｔＪＲ（配列番号４）：ggtacagaaa ccagcaggct gaggatcagc（４１２５４３１〜４１２５４６０の配列と相同）。
【００７８】
ＭｅｔＬＲ（配列番号５）：aaataacact tcacatcagc cagactactgc caccaaattt（４１２７５００〜４１５７４６０の配列と相同）。
【００７９】
次いで、クロラムフェニコール耐性カセットを除去した。クロラムフェニコール耐性カセットのＦＲＴ部位で作用する組み換えＦＬＰを担持するプラスミドｐＣＰ２０を、エレクトロポレーションによって組み換え株に導入した。４２℃での一連の培養後、以前に使用されたものと同じオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析によって、クロラムフェニコール耐性カセットの消失を検証した。
【００８０】
Arabidopsis thalianaからのホスホホモセリン受容ＭＥＴＢを用いたメチオニン生成のために、以下の大腸菌株を構築した。大腸菌ｍｅｔＢと共に、メチオニンレプレッサーｍｅｔＪを上述のように欠失させた。次いで、スクシニル−ホモセリントランスフェラーゼをコードする遺伝子ｍｅｔＡおよび／またはトレオニンシンターゼをコードする遺伝子ｔｈｒＣを欠失させた。この欠失方法は、ｍｅｔＪＢの欠失に関して例証されている。他の全ての遺伝子の欠失は、示されたオリゴヌクレオチドを用いた同一方法に基づくものであった。ｍｅｔＡおよびｔｈｒＣ遺伝子欠失用オリゴヌクレオチドを以下に示す。括弧内の数字は、大腸菌染色体と相同な領域を示している。Ｄから始まるオリゴヌクレオチドは実際の欠失のために使用し、他のオリゴヌクレオチドは、構築物の検証またはそれぞれに示す特定の目的のために使用した。
【００８１】
ｍｅｔＡ遺伝子の欠失には、以下のオリゴヌクレオチドを使用した：
ＤｍｅｔＡＦ（４２１１８６６−４２１１９４５；配列番号６）：ttcgtgtgcc ggacgagcta cccgccgtca atttcttgcg tgaagaaaac gtctttgtga tgacaacttc tcgtgcgtct TGTAGGCTGG AGCTGCTTCG；
ＤｍｅｔＡＲ（４２１２７８５−４２１２７０６；配列番号７）：atccagcgtt ggattcatgt gccgtagatc gtatggcgtg atctggtaga cgtaatagtt gagccagttg gtaaacagta CATATGAATA TCCTCCTTAG；
ＭｅｔＡＦ（４２１１７５９−４２１１７８８；配列番号８）：tcaccttcaa catgcaggct cgacattggc；
ＭｅｔＡＲ（４２１２８５７−４２１２８２８；配列番号９）：ataaaaaagg cacccgaagg tgcctgaggt。
【００８２】
ｔｈｒＣ遺伝子の欠失には、以下のオリゴヌクレオチドを使用した：
ＤｔｈｒＣＦ（３７４０−３８２１；配列番号１０）：ctctacaatc tgaaagatca caacgagcag gtcagctttg cgcaagccgt aacccagggg  ttgggcaaaa atcaggggcT GTAGGCTGGAG CTGCTTCG；
ＤｔｈｒＣＲ（５０１２−４９３２；配列番号１１）：gattcatcat caatttacgca acgcagcaaa atcggcgggc agattatgtg aaagcaaggg taaatcagca cgttctgcCA TATGAATATC CTCCTTAG；
ｔｈｒＣＦ（３４９０−３５１１；配列番号１２）：cgctgaaccc taccgtgaac gg；
ｔｈｒＣＲ（５２８４−５２６０；配列番号１３）：gcgaccagaa ccagggaaag tgcg。
【００８３】
ホモセリンの生成を更に促進するために、トレオニンに対するフィードバック耐性が低下したｔｈｒＡ＊対立遺伝子を、プロモータＰｔｒｃを用いて、プラスミドｐＣＬ１９２０（Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631）から発現させた。プラスミドｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ＊１を構築するために、ｔｈｒＡを、以下のオリゴヌクレオチドを用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した：
ＢｓｐＨ１ｔｈｒＡ（配列番号１４）：ttaTCATGAgagtgttgaagttcggcggtacatcagtggc；
Ｓｍａ１ｔｈｒＡ（配列番号１５）：ttaCCCGGGccgccgccccgagcacatcaaacccgacgc。
【００８４】
ＰＣＲ増幅した断片を、制限酵素ＢｓｐＨＩおよびＳｍａＩを用いて切断し、ベクターｐＴＲＣ９９Ａ（Stratagene）のＮｃｏＩ／ＳｍａＩ部位にクローニングした。低コピーベクターからの発現のため、プラスミドｐＭＥ１０１を以下のように構築した。プラスミドｐＣＬ１９２０を、オリゴヌクレオチドＰＭＥ１０１ＦおよびＰＭＥ１０１ＲならびにｌａｃＩ遺伝子を持つベクターｐＴＲＣ９９ＡからのＢｓｔＺ１７Ｉ−ＸｍｎＩ断片を用いてＰＣＲ増幅し、Ｐｔｒｃプロモータを増幅したベクターに挿入した。結果生じたベクターおよびｔｈｒＡ遺伝子を持つベクターを、ＡｐａＩおよびＳｍａＩによって制限処理し、ｔｈｒＡ含有断片をベクターｐＭＥ１０１にクローニングした。フィードバック阻害からＴｈｒＡを解放するために、オリゴヌクレオチドＴｈｒＡＦ  Ｆ３１８ＳおよびＴｈｒＡＲ  Ｆ３１８Ｓを用いた部位特異的突然変異誘発（Stratagene）によって変異体Ｆ３１８Ｓを導入し、結果としてｐＳＢ１と呼ばれるベクターｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ＊１を生じた。
【００８５】
ＰＭＥ１０１Ｆ（配列番号１６）：Ccgacagtaagacgggtaagcctg；
ＰＭＥ１０１Ｒ（配列番号１７）：Agcttagtaaagccctcgctag；
ＴｈｒＡＦ  Ｆ３１８Ｓ（ＳｍａＩ）（配列番号１８）：Ccaatctgaataacatggcaatg[tcc]agcgtttctggcccggg；
ＴｈｒＡＲ  Ｆ３１８Ｓ（ＳｍａＩ）（配列番号１９）：Cccgggccagaaacgct[gga]cattgccatgttattcagattgg。
【００８６】
生成したホモセリンの一部をホスホホモセリンに変換するために、ｔｈｒＢ遺伝子をベクターｐＳＢ１にクローニングした。ｔｈｒＢを、オリゴヌクレオチドｔｈｒＡ’ＢＦおよびｔｈｒＡ’ＢＲを用いてＰＣＲ増幅した。
【００８７】
ｔｈｒＡ’ＢＦ（配列番号２０）：tacga[tgtac a]tggccttaa tctggaaaac tggc；
ｔｈｒＡ’ＢＲ（配列番号２１）：tcc[cccggg]T TAGTTTTCCA GTACTCGTGC GCCC。
【００８８】
ＰＣＲ断片を、ＢｓｒＧ１およびＳｍａＩで消化し、同じ制限酵素によって切断されたベクターｐＳＢ１にクローニングすることによって、プラスミドｐＳＢ２を得た。
【００８９】
次いで、Arabidopsis thalianaからの酵素ＭＥＴＢを、オリゴヌクレオチドｇａｐＡ−ｃｇｓＡＦおよびｃｇｓＡＲを用いて、市販のｃＤＮＡクローン（ＴＡＩＲ，http://arabidopsis.org/contact/）からＰＣＲ増幅した。オリゴヌクレオチドｇａｐＡ−ｃｇｓＡＦは、ＭＥＴＢのヌクレオチド１〜３８（括弧内）と、ＧａｐＡプロモータ領域に属する大腸菌のヌクレオチド１８６０７６１〜１９６０７９９（下線）からなるものであった。
【００９０】
gａｐＡ−ｃｇｓＡＦ（配列番号２２）：ccttttattc actaacaaat agctggtgga atat[atgttg agctccatg ggagcctcac tgttcatgcc gg]；
ｃｇｓＡＲ（配列番号２３）：AATCGC[GGAT CC]GAATCCGG TCAGATGGCT TCGAGAGCTT GAAGAATGTC AGC。
【００９１】
同時に、大腸菌遺伝子ＧａｐＡのＧａｐＡプロモータ領域を、オリゴヌクレオチドｇａｐＡ−ｃｇｓＡＲおよびＧａｐＡＦを用いて増幅した。オリゴヌクレオチドｇａｐＡ−ｃｇｓＡＲは、ＭｅｔＢ遺伝子の塩基１〜３９およびＧａｐＡプロモータ領域に相当する大腸菌染色体からの塩基１８６０７９９〜１８６０７６１を有する。オリゴヌクレオチドＧａｐＡＦは、大腸菌ゲノムの塩基１８６０６３９〜１８６０６６１に相当する。
【００９２】
ｇａｐＡ−ｃｇｓＡＲ（配列番号２４）：ccggcatgaa cagtgaggct cccatcggag ctcaa[cat]at attccaccag ctatttgtta gtgaataaaag g；
ＧａｐＡＦ（配列番号２５）：acgt[cccggg] caagcccaaa ggaagagtga ggc。
【００９３】
次いで、オリゴヌクレオチドｃｇｓＡＲおよびＧａｐＡＦを用いて両断片を融合し（Horton et al. 1989 Gene 77:61-68）、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳｍａＩで切断し、ベクターｐＳＢ１およびｐＳＢ２の対応する制限部位にクローニングすることによって、ベクターｐＳＢ３（ｐＭＥ１０１ｔｈｒＡ＊−ｍｅｔＢＡｔ）およびｐＳＢ４（ｐＭＥ１０１ｔｈｒＡ＊−ｔｈｒＢ−ｍｅｔＢＡｔ）のそれぞれを得た。
【００９４】
次いで、ベクターｐＳＢ３およびｐＳＢ４を、株ΔｍｅｔＢＪ  ΔｍｅｔＡ  ΔｔｈｒＣに導入した。
【００９５】
実施例２：Ｏ−スクシニルホモセリンを介したメチオニン生成のための、低γ−エリミナーゼ活性を有する植物ＭＥＴＢを単独で用いた株の構築
スクシニルホモセリンを介したメチオニン生成に植物ＭＥＴＢを用いるべく、株ΔｍｅｔＢＪ  ｍｅｔＡ＊を構築した。構築は、実施例１に記載した株から開始し、フィードバック耐性ホモセリントランススクシニラーゼ  ｍｅｔＡ＊１１（特許出願ＰＣＴ  ＩＢ２００４／００１９０１に記載）をゲノムに導入した。この目的のため、ｍｅｔＡ＊１１対立遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチドを用いて大腸菌染色体から増幅した。
【００９６】
ＭｅｔＡｒｃＦ（４２１１７８６−４２１１８８３；配列番号２６）：ggcaaatttt ctggttatct tcagctatct ggatgtctaa acgtataagc gtatgtagtg aggtaatcag gttatgccga ttcgtgtgcc ggacgagc；
ＭｅｔＡｒｃＲ（４２１２８６２−４２１２７６４；配列番号２７）：cggaaataaa aaaggcaccc gaaggtgcct gaggtaaggt gctgaatcgc ttaacgatcg actatcacag aagattaatc cagcgttgga ttcatgtgc。
【００９７】
プラスミドｐＫＤ４６を、株ＭＧ１６５５  ΔｍｅｔＡ  ΔｔｈｒＣおよびＭＧ１６５５  ΔｍｅｔＡに導入し、ｍｅｔＡ＊１１対立遺伝子を持つＤＮＡ断片で形質転換した。修飾したＭ９プレート上で、メチオニン自家栄養（prototrophy）についてクローンを選択した。その後、変異ΔｍｅｔＢＪを上述のように添加した。プラスミドｐＳＢ３およびｐＳＢ４を２つの株に導入した。
【００９８】
実施例３：低γ−エリミナーゼ活性を有する植物ホスホホモセリン受容ＭＥＴＢを用いた株の構築および大腸菌ＭｅｔＢの併用
メチオニン合成を更に促進するべく、Ｏ−スクシニルホモセリンおよびホスホホモセリンを介して、同時にメチオニンを生成する株を構築した。この構築は、実施例１に記載した株ΔｍｅｔＡおよびΔｍｅｔＡ  ΔｔｈｒＣから開始し、以下のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子ｍｅｔＪを欠失させた。
【００９９】
１００塩基を有するＤｍｅｔＪＦ（配列番号２８）：caggcaccag agtaaacatt gtgttaatgg acgtcaatac atctggacat ctaaacttct ttgcgtatag attgagcaaa CATATGAATA TCCTCCTTAG；
１００塩基を有するＤｍｅｔＪＲ（配列番号２９）：tgacgtaggc ctgataagcg tagcgcatca ggcgattcca ctccgcgccg ctcttttttg ctttagtatt cccacgtctc TGTAGGCTGG AGCTGCTTCG；
ＭｅｔＪＲ（配列番号３０）：ggtacagaaa ccagcaggct gaggatcagc（４１２５４３１〜４１２５４６０の配列と相同）；
ＭｅｔＢＲ（配列番号３１）：ttcgtcgtca tttaacccgc tacgcactgc（４１２６３０５〜４１２６２７６の配列と相同）。
【０１００】
その後、フィードバック耐性ホモセリントランススクシニラーゼ  ｍｅｔＡ＊１１（特許出願  ＰＣＴ  ＩＢ２００４／００１９０１に記載）をゲノムに導入した。この目的のため、ｍｅｔＡ＊１１対立遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチドを用いて、大腸菌染色体から増幅した。
【０１０１】
ＭｅｔＡｒｃＦ（４２１１７８６−４２１１８８３；配列番号３２）：ggcaaatttt ctggttatct tcagctatct ggatgtctaa acgtataagc gtatgtagtg aggtaatcag gttatgccga ttcgtgtgcc ggacgagc；
ＭｅｔＡｒｃＲ（４２１２８６２−４２１２７６４；配列番号３３）：cggaaataaa aaaggcaccc gaaggtgcct gaggtaaggt gctgaatcgc ttaacgatcg actatcacag aagattaatc cagcgttgga ttcatgtgc。
【０１０２】
プラスミドｐＫＤ４６を、ｍｅｔＡ＊１１対立遺伝子を持つＤＮＡ断片で形質転換した株ＭＧ１６５５  ΔｍｅｔＪ  ΔｍｅｔＡ  ΔｔｈｒＣおよびＭＧ１６５５  ΔｍｅｔＪ  ΔｍｅｔＡに導入した。修飾Ｍ９プレート（必要であれば、トレオニンを補充）上でメチオニン自家栄養についてクローンを選択した。
【０１０３】
実施例１におけるｍｅｔＢＡｔを用いたｐＳＢ３およびｐＳＢ４の構築と同様に、その適切なプロモータを有する大腸菌のｍｅｔＢ遺伝子を、オリゴヌクレオチドＭｅｔＢＦおよびＭｅｔＢＲで増幅し、ＰＣＲ増幅産物を制限部位ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにクローニングすることによって、ベクターｐＳＢ１およびｐＳＢ２にクローニングした。
【０１０４】
ＭｅｔＢＦ（４１２５９５７−４１２５９８２）（配列番号３４）：ttagacagaa [ctgcag]cgcc gctccattca gccatgagatac；
ＭｅｔＢＲ（４１２７５００−４１２７４６９）（配列番号３５）：cgtaacgccc [aagctt]aaat aacacttcac atcagccaga ctactgcc。
【０１０５】
結果生じたベクターをｐＳＢ５（ｐＭＥ１０１ｔｈｒＡ＊−ｍｅｔＢＥｃ）およびｐＳＢ６（ｐＭＥ１０１ｔｈｒＡ＊−ｔｈｒＢ−ｍｅｔＢＥｃ）と命名する。
【０１０６】
次いで、プラスミドｐＳＢ３、ｐＳＢ４、ｐＳＢ５およびｐＳＢ６を、ＭＧ１６５５  ΔｍｅｔＪ  ｍｅｔＡ＊１１  ΔｔｈｒＣおよびＭＧ１６５５  ΔｍｅｔＪ  ｍｅｔＡ＊１１株に導入した。
【０１０７】
実施例４：硫酸または硫化水素を硫黄源として用いたホスホホモセリンおよび／またはＯ−スクシニルホモセリンを介したメチオニン生成
実施例１〜３で構築した株のアミノ酸生成を、５ｇ／ｌのＭＯＰＳ、５ｇ／ｌのグルコースおよびおそらくは２ｍＭのトレオニンが補充された修飾Ｍ９培地（Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128）を用いて、小エルレンマイヤーフラスコ培養において分析する。硫化水素を硫黄源として用いる場合、全ての硫酸含有塩を等モル量の塩化物含有塩に置き替える。硫化物を硫化アンモニウム（１０ｍＭ）として供給する。必要であれば、１００ｍｇ／ｌの濃度でスペクチノマイシンを添加する。一夜培養を行い、３０ｍｌの培養物を植菌してＯＤ６００を０．２とする。培養物のＯＤ６００が４．５〜５に達したら、１．２５ｍｌの５０％グルコース溶液および０．７５ｍｌの２Ｍ  ＭＯＰＳ（ｐＨ６．９）を添加し、培養物を１時間攪拌する。次いで、必要であれば、ＩＰＴＧを添加する。
【０１０８】
バッチ段階中に、細胞外代謝産物を分析する。ＯＰＡ／Ｆｍｏｃ誘導体化後、ＨＰＬＣによってアミノ酸を定量化し、シリル化後に、他の関連する代謝産物を、ＧＣ−ＭＳを用いて分析する。
【０１０９】
【表８】
2008529485.tif 000009
【０１１０】
γ−エリミナーゼ活性が低いA. thalianaからのＭＥＴＢを使用するメチオニン生成により、γ−エリミナーゼ反応を介したイソロイシン生成は著しく減少するが、メチオニン生成は強く影響を受けない。これは、大腸菌経路を単独で使用し、γ−脱離を介して、かなりの量の副産物イソロイシンが生成される実験と対照的である。
【０１１１】
実施例５：アセチル−ホモセリンおよびＨ２Ｓを基質として受容する酵母ＭｅｔＢ酵素を使用する、メチオニン生成株の構築および評価
酵母のγ−エリミナーゼ活性を生体内で試験し、そのメチオニン生成に関する潜在能力を評価するために、以下の株を構築した。Saccaromyces cerevisiaeのホモセリンアセチルトランスフェラーゼをコードするＭＥＴ２遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチドを使用して、ゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した：
Ｐｔａｃ−ｍｅｔＡｌｅｖＦ（配列番号３６）：tgctacagct ggagctgttg acaattaatc atcggctcgt ataatgtgtg gaaggaggac agaccatgtc gcatacttta aaatcgaaaa cgctccaaga gc；
Ｐｔａｃ−ｍｅｔＡｌｅｖＲ（配列番号３７）：CGTACTGACG ACCGGGTCCT ACCAGTTGGT AACTTCTTCG GCCTCACC。
【０１１２】
次いで、ＰＣＲ断片を、ベクターｐＡＣＹＣ１８４の制限部位ＰｖｕＩＩおよびＤｒｄＩにクローニングし、ベクターｐＳＢ７を得た。オリゴヌクレオチドＰｔａｃ−ｍｅｔＡｌｅｖＦは、ベクターｐＡＣＹＣ１８４から酵母ＭＥＴ２遺伝子の発現を引き起こすｐＴＡＣプロモータを有する。
【０１１３】
酵母アセチル−ホモセリンスルフヒドリラーゼ（ＭＥＴ１７）を、オリゴヌクレオチドｍｅｔＢｌｅｖおよびｇａｐＡ−ｍｅｔＢｌｅｖＦを用いて増幅した。同時に、大腸菌ｇａｐＡプロモータを、オリゴヌクレオチドｇａｐＡ−ｍｅｔＢｌｅｖＲおよびＧａｐＡＦを用いて増幅した。その後、ＭＥＴ１７遺伝子を、オリゴヌクレオチドｍｅｔＢｌｅｖおよびＧａｐＡＦのみを用いて、融合ＰＣＲによりｇａｐＡプロモータに融合した（詳細については先の記載を参照）。
【０１１４】
ｇａｐＡ−ｍｅｔＢｌｅｖＲ（３８−７５：１８６０７９７−１８６０７６１；配列番号３８）：GGCCGGCGTG TAGTTGAACA GTATCGAAAT GAGATGGCAT ATATTCCACC AGCTATTTGT TAGTGAATAA AAGG；
ｇａｐＡ−ｍｅｔＢｌｅｖＦ（１−３８：１８６０７６１−１８６０７９７；（配列番号３９））：ccttttattc actaacaaat agctggtgga atatatgcca tctcatttcg atactgttca actacacgcc ggcc；
ｍｅｔＢｌｅｖ（配列番号４０）：TAATCGC[GGAT CC]GCGTCATG GTTTTTGGCC AGCG；
ＧａｐＡＦ（１８６０６３９−１８６０６６１；配列番号４１）：acgt[cccggg] caagcccaaa ggaagagtga ggc。
【０１１５】
融合断片を、実施例１に記載したベクターｐＳＢ１のＳｍａＩおよびＢａｍＨＩ部位にクローニングし、ベクターｐＳＢ８を得た。
【０１１６】
ベクターｐＳＢ７およびｐＳＢ８の両方を株ΔｍｅｔＪ  ΔｍｅｔＢ  ΔｍｅｔＡに形質転換し、ＤｍｅｔＢＪ  ＤｍｅｔＣ  ＤｍｅｔＡ  ｐＳＢ７  ｐＳＢ８を得た。この株は、遅延期を経た後に、０．２１ｈ−１の増殖速度で増殖した。プラスミドおよび変異を検証し、メチオニン量を定量した。
【０１１７】
【表９】
2008529485.tif 000010
【０１１８】
表３は、メチオニン生成量が、酵母ＭＥＴ２およびＭＥＴ１７遺伝子の存在下では著しく増大することを示している。同時に、イソロイシン生成量は低下した。これは、ＭＥＴ１７酵素のγ−エリミナーゼ活性が低いことで説明された（酵母アセチル−ホモセリンスルフヒドリラーゼのγ−エリミナーゼ活性を、実施例１に記載されるように生体内で測定した）。
【０１１９】
実施例６：Methanosarcina barkeri由来の古細菌ｍｅｔＢを発現するメチオニン生成株（株Ｆｕｓａｒｏ）の構築および評価
植物と同様に、古細菌でも、メチオニン生合成はホスホホモセリンを介して進行すると考えられる。故に、植物酵素と同様、Methanosarcina由来のＭｅｔＢも低いγ−エリミナーゼ活性を有するものと仮定する。そこで、オリゴヌクレオチドｍｅｔＢｍｅｔｈａｎｏおよびｇａｐＡ−ｍｅｔＢｍｅｔｈａｎｏＲを用いて、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍｅｔＢをＰＣＲ増幅する。前述のように、次いで、プロモータを増幅するためにオリゴヌクレオチドｇａｐＡ−ｍｅｔＢｍｅｔｈａｎｏＦおよびＧａｐＡＦを用い、かつ実際の融合のためにｍｅｔＢｍｅｔｈａｎｏおよびＧａｐＡＦを用いて、大腸菌由来のｇａｐＡプロモータをｍｅｔＢ遺伝子に融合する。結果生じた断片をベクターｐＪＢ１３７の制限部位ＳｍａＩにクローニングし、プラスミドｐＳＢ９を得る。
【０１２０】
ＭｅｔＢｍｅｔｈａｎｏ（配列番号４２）：GTCCCCCGGG AATCTAGTCT AGATTAAATT ACTTCAAGG GCCTGTTTGA GG；
ｇａｐＡ−ｍｅｔＢｍｅｔｈａｎｏＲ（３２−６９：１８６０７９７−１８６０７６１）（配列番号４３）：cacattttgt tgcaaacttc acttctcttt ccatatattc caccagctat ttgttagtga ataaaagg；
ｇａｐＡ−ｍｅｔＢｍｅｔｈａｎｏＦ（１−３８：１８６０７６１−１８６０７９７）（配列番号４４）：ccttttattc actaacaaat agctggtgga atatatggaaa gagaagtgaa gtttgcaaca aaatgtg；
ＧａｐＡＦ（１８６０６３９−１８６０６６１）（配列番号４５）：acgt[cccggg] caagcccaaa ggaagagtga ggc。
【０１２１】
プラスミドｐＳＢ９を、株ΔｍｅｔＪ  ｍｅｔＡ＊１１、ΔｍｅｔＪ  ΔｍｅｔＡ  ΔｍｅｔＢおよびΔｍｅｔＪ  ΔｍｅｔＡ  ΔｍｅｔＢ  ΔｔｈｒＣに導入し、結果生じた株を実施例２に記載されるように発酵させる。大腸菌ｍｅｔＢ遺伝子を有するプラスミドｐＳＢ５を持つ株ΔｍｅｔＪ  ｍｅｔＡ＊１１と比較すると、メチオニン生成が増大し、イソロイシン生成が低下する。これは、おそらくは、古細菌ｍｅｔＢ酵素のγ−エリミナーゼ活性が低いことに起因するものと考えられる。
【０１２２】
実施例７：Chloroflexus aurantiacusのｍｅｔＢ遺伝子を発現する株の構築および評価
図２のアラインメントは、Chloroflexus aurantiacusのＭｅｔＢ酵素が、ホスホホモセリンを基質として認識するのに必要な幾つかのアミノ酸を所定の位置に有することを示している。故に、この酵素は、植物ＭＥＴＢと同様に、大腸菌酵素と比較してより低いγ−エリミナーゼ活性を有しているものと仮定する。ｍｅｔＢ酵素の使用が、メチオニン生成において有益であるかどうかを解明するために、オリゴヌクレオチドｍｅｔＢｃｈｌｏｒｏおよびｇａｐＡ−ｍｅｔＢｃｈｌｏｒｏＲを用いてChloroflexus ｍｅｔＢをＰＣＲ増幅する。上述のように、次いで、プロモータ増幅のためにオリゴヌクレオチドｇａｐＡ−ｍｅｔＢｃｈｌｏｒｏＦおよびＧａｐＡＦを用い、かつ実際の融合のためにｍｅｔＢｃｈｌｏｒｏおよびＧａｐＡＦを用いて、大腸菌由来のｇａｐＡプロモータをｍｅｔＢ遺伝子に融合する。結果生じた断片をべクターｐＡＣＹＣ１７７（Biolabs）の制限部位ＢａｍＨＩおよびＳｍａＩにクローニングし、ベクターｐＳＢ１０を得る。
【０１２３】
ｍｅｔＢｃｈｌｏｒｏ（配列番号４６）：ACGT[GGATCC] GAATTCCTTA TTCGTCGGCA AGAGCCTGTT GC；
ｇａｐＡ−ｍｅｔＢｃｈｌｏｒｏＲ（３３−７０：１８６０７９７−１８６０７６１）（配列番号４７）：ggccgtacgg gtccggtaaa ctgatcgata gccatatatt ccaccagcta tttgttagtg aataaaagg；
ｇａｐＡ−ｍｅｔＢｃｈｌｏｒｏＦ（１−３８：１８６０７６１−１８６０７９７）（配列番号４８）：ccttttattc actaacaaat agctggtgga atatatggct atcgatcagt ttaccggacc cgtacggcc；
ＧａｐＡＦ（１８６０６３９−１８６０６６１）（配列番号４９）：acgt[cccggg] caagcccaaa ggaagagtga ggc。
【０１２４】
メチオニン生合成における酵素を評価するために、プラスミドｐＳＢ１０を株ΔｍｅｔＪ  ｍｅｔＡ＊１１、ΔｍｅｔＪ  ΔｍｅｔＡ  ΔｍｅｔＢおよびΔｍｅｔＪ  ΔｍｅｔＡ  ΔｍｅｔＢ  ΔｔｈｒＣに導入し、結果生じた株を実施例２に記載されるように発酵させる。大腸菌ｍｅｔＢ遺伝子を有するプラスミドｐＳＢ６を持つ株ΔｍｅｔＪ  ｍｅｔＡ＊１１と比較すると、メチオニン生成が著しく増大する。
【０１２５】
実施例８：酵母ホモセリンアセチルトランスフェラーゼおよびCorynebacterium glutamicum由来のアセチルホモセリンスルフヒドリラーゼｍｅｔＹを発現する株の構築
C. glutamicumのγ−エリミナーゼ活性を生体内で試験し、そのメチオニン生成に関する潜在能力を評価するために、以下の株を構築する。
【０１２６】
C. glutamicumアセチル−ホモセリンスルフヒドリラーゼ遺伝子ｍｅｔＹのコドン使用頻度は大腸菌に適合しており、生体外で合成される。同時に、大腸菌のｇａｐＡプロモータを添加する。
【０１２７】
次いで、融合断片を実施例１に記載されたベクターｐＳＢ１のＳｍａＩおよびＢａｍＨＩ部位にクローニングし、ベクターｐＳＢ１１を得る。
【０１２８】
酵母ホモセリンアセチルトランスフェラーゼを担持するベクターｐＳＢ７およびｐＳＢ１１の双方を、株ＭＧ１６５５  ΔｍｅｔＪ  ｍｅｔＡ＊１１およびΔｍｅｔＪ  ΔｍｅｔＢ  ΔｍｅｔＡに形質転換し、メチオニン生成量を測定する。酵母ホモセリンアセチルトランスフェラーゼおよびコドン適合型コリネバクテリウム属アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼｍｅｔＹの存在下では、硫黄源として硫化水素または硫酸を用いて増殖させると、メチオニン生成量が著しく増大することが分かる。同時に、イソロイシン生成量は著しく低下する。あるいは、コリネバクテリウム属由来のコドン適合型ホモセリントランスフェラーゼを、酵母酵素の代わりに使用してもよい。
【０１２９】
実施例９：γ−脱離活性が低い大腸菌ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼを発現する株の構築
イソロイシンがその標準的な生合成経路を介して生成されないことを確保するために、遺伝子ｉｌｖＡおよび第２のトレオニンデアミナーゼを持つオペロンｔｄｃＡＢＣＤＥＦＧを欠失させた。
【０１３０】
上述の欠失方法および以下のオリゴヌクレオチドを用いて、ｉｌｖＡ遺伝子を欠失させた。
【０１３１】
ＤｉｌｖＡＦ（配列番号５０）：
GgctgactcgcaacccctgtccggtgctccggaaggtgccgaatatttaagagcagtgctgcgcgcgccggtttacgaggTGT AGGCTGGAGCTGCTTCG。
【０１３２】
このオリゴヌクレオチドは、以下の領域を有する：
−遺伝子ｉｌｖＡの配列（３９５２９５４−３９５３０３３）と相同な領域（下部ケース）（ウェブサイトhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/上の参照配列）；
−クロラムフェニコール耐性カセットの増幅用領域（上部ケース）（Datsenko, K.A. & Wanner. B.L., 2000, PNAS, 97:6640-6645における参照配列）。
【０１３３】
ＤｉｌｖＡＲ（配列番号５１）：
cctgaacgccgggttattggtttcgtcgtggcaatcgtagcccagctcattcagccgggtttcgaaatccggttcatggCATAT GAATATCCTCCTTAG。
【０１３４】
このオリゴヌクレオチドは、以下の領域を有する：
−遺伝子ｉｌｖＡの配列（３９５４４７８−３９５４４００）と相同な領域（下部ケース）；
−クロラムフェニコール耐性カセットの増幅用領域（上部ケース）。
【０１３５】
オリゴヌクレオチドＤｉｌｖＡＲおよびＤｉｌｖＡＦを使用して、プラスミドｐＫＤ３由来のクロラムフェニコール耐性カセットを増幅した。次いで、得られたＰＣＲ産物をエレクトロポレーションによって株ＭＧ１６５５  ΔｍｅｔＢＪ  ｍｅｔＡ１１（ｐＫＤ４６）およびΔｍｅｔＪ  ｍｅｔＡ１１（ｐＫＤ４６）に導入した。これらの株では、発現するＲｅｄ組み換え酵素により相同的組み換えが可能となる。次いで、クロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、以下に規定するオリゴヌクレオチドｉｌｖＡＲおよびｉｌｖＡＦを用いたＰＣＲ分析により検証した。結果生じた株は、ΔｍｅｔＢＪ  ｍｅｔＡ＊１１  ΔｉｌｖＡであった。
【０１３６】
ｉｌｖＡＲ（３９５４６９３−３９５４６７０）（配列番号５２）：gccccgaaccggtgcgtaaccgcg；
ｉｌｖＡＦ（３９５２７７５−３９５２７９５）（配列番号５３）：ggtaagcgatgccgaactggc。
【０１３７】
ＩｌｖＡに加えて、トレオニンデヒドラターゼ（ＴｄｃＢ）は、嫌気性または微好気性条件下でトレオニンのα−ケト酪酸への脱アミノ反応を触媒することが知られている。この酵素がα−ケト酪酸生成に寄与する可能性を取り除くために、株ΔｍｅｔＢＪ  ｍｅｔＡ＊１１  ΔｉｌｖＡのゲノムから遺伝子を欠失させた。ＴｄｃＢは、後述の４つのオリゴヌクレオチドを用いて、先の変異に関して上述したのと同様の方法で欠失させたオペロンｔｄｃＡＢＣＤＥＦＧの一部である。ＤｔｄｃＧＲおよびＤｔｄｃＡＦをカセットの増幅のために使用し、検証のためにｔｄｃＧＲおよびｔｄｃＧＦを使用した。
【０１３８】
ＤｔｄｃＧＲ（３２５５９１５−３２５５９９３）（配列番号５４）：
gctgacagcaatgtcagccgcagaccactttaatggccagtcctccgcgtgatgtttcgcggtatttatcgttcatatcCATATGAATATCCTCCTTAG；
ＤｔｄｃＡＦ（３２６４７２６−３２６４６４８）（配列番号５５）：
GgtaattaacgtaggtcgttatgagcactattcttcttccgaaaacgcagcacctggtagtctttcaggaagtcattagTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG；
ｔｄｃＧＲ（３２５５６１６−３２５５６４０）（配列番号５６）：
gcgtctgcaatgacgcctttattcg；
ｔｄｃＡＦ（３２６４９２２−３２６４８９９）（配列番号５７）：
Cgccataaaatatggttatccccg。
【０１３９】
結果生じた株は、ΔｍｅｔＢＪ  ｍｅｔＡ＊１１  ΔｉｌｖＡ  ΔｔｄｃＡＢＣＤＥＦＧと命名した。
【０１４０】
大腸菌シスタチオニン−γ−シンターゼ／スルフヒドリラーゼ（ＭｅｔＢ）のγ−エリミナーゼ活性を低下させるために、基質システインの結合に関与する領域に変異を導入した。この目的のために、大腸菌ｍｅｔＢを、オリゴヌクレオチドＭｅｔＢＦおよびＭｅｔＢＲ（括弧内の数字は、大腸菌ゲノム上の位置に相当する）を用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ断片をＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって制限し、ｐＵＣ１８の同じ制限部位にクローニングした。
【０１４１】
ＭｅｔＢＦ（４１２５９５７−４１２５９８２）（配列番号５８）：ttagacagaa [ctgcag]cgcc gctccattca gccatgagat ac；
ＭｅｔＢＲ（４１２７５００−４１２７４６９）（配列番号５９）：cgtaacgccc[a agctt]aaata acacttcaca tcagccagac tactgcc。
【０１４２】
次いで、大腸菌シスタチオニン−γ−シンターゼ／スルフヒドリラーゼに変異を導入すると、アミノ酸変異Ｔ３３５Ａ／Ａ３３７Ｐ、Ｒ４９ＬおよびＤ４５Ｖが生じた。
【０１４３】
以下のオリゴヌクレオチド対を使用してStratageneのQuick changeTM部位特異的突然変異誘発ＫＩＴに従って、部位特異的突然変異誘発により、各変異の導入を行った。制限部位（括弧内）を検証のために導入した。
【０１４４】
ｍｅｔＢＴ３３５Ａ／Ａ３３７ＰＦ（配列番号６０）：cgcgcttctg gtgccatgcc cggatgtg[cc atgg]ttgcgg cg；
ｍｅｔＢＴ３３５Ａ／Ａ３３７ＰＲ（配列番号６１）：cgccgcaa[cc atgg]cacatc cgggcatggc accagaagcg cg；
ｍｅｔＢＲ４９ＬＦ（配列番号６２）：gaac[ctcgag]cgcatgattactcgcgt[ctg]ggcaacccaacgcgcg；
ｍｅｔＢＲ４９ＬＲ（配列番号６３）：cgcgcgttgggttgcccagacgcgagtaatcatgcgctcgaggttc；
ｍｅｔＢＤ４５ＶＦ（配列番号６４）：gaacctcgagcgcatgtactcgcgtcgcggcaacccaacgcgcgat；
ｍｅｔＢＤ４５ＶＲ（配列番号６５）：atcgcgcgttgggttgccgcgacgcgagtacacatgcgctcgaggttc。
【０１４５】
結果生じた改変ｍｅｔＢ配列を、配列決定により検証し、ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで制限処理し、ベクターｐＳＢ１の同じ部位にクローニングした。結果生じたプラスミドを、株ΔｍｅｔＢＪ  ｍｅｔＡ＊１１  ΔｉｌｖＡ  ΔｔｄｃＡＢＣＤＥＦＧに形質転換した。上述のように、小エルレンマイヤーフラスコ培養において株を評価した。γ−脱離により生成するイソロイシン量は著しく低下したが、メチオニン合成は僅かに影響を受けただけであった。これは、低いγ−脱離活性および重要なシスタチオニン−γ−シンターゼ活性の保持と関連する。
【０１４６】
【表１０】
2008529485.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】図１は、オキサロアセテートをトレオニン、イソロイシンおよびメチオニンに転換する代謝経路を示している。ＭｅｔＢ相同体は、少なくとも３つの反応を触媒することができる：γ−シスタチオニンの合成、活性化ホモセリンのスルフヒドリル化またはγ−脱離。ホスホホモセリンを優先的に受容するＭｅｔＢ相同体は赤で示され、スクシニルホモセリンを受容する酵素は青で示され、アセチルホモセリン変換酵素（ＭｅｔＢ／ｍｅｔＺ）は緑で示されている。
【図２】図２は、植物および細菌種のシスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼおよび／またはアセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ活性を有する酵素のアラインメントを示している。灰色のボックスに示される残基により、該酵素はホスホホモセリン結合に特異的となる。高度に保存されたアミノ酸は赤で示され、保存された残基は青で示されている。
【図１】
2008529485.tif 000012
【図２】
2008529485.tif 000013
【図２】
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【図２】
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【図２】
2008529485.tif 000016
【図２】
2008529485.tif 000017
【配列表】
2008529485000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年10月10日(2007.10.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸、特にメチオニン、その前駆体または誘導体を発酵により製造するための方法であって、
ａ）所望のアミノ酸を生成する微生物を発酵させる工程と、
ｂ）前記細菌の細胞内または培地内の所望の生成物を濃縮する工程と、
ｃ）前記所望のアミノ酸／最終生成物の一部または全量（０〜１００％）において任意に残存する発酵ブロスおよび／またはバイオマスの構成成分を単離する工程と
を含んでなり、
前記微生物が、シスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼ活性の１つまたは幾つかを有し、かつ同時に、大腸菌シスタチオニン−γ−シンターゼと比較して少なくとも２倍劣るγ−脱離活性を有する酵素を発現するものである、方法。
【請求項２】
前記微生物において、前記酵素が、大腸菌シスタチオニン−γ−シンターゼと比較して少なくとも１０倍劣るγ−脱離活性を有するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物が、ホスホホモセリン受容シスタチオニン−γ−シンターゼ／ホスホホモセリンスルフヒドリラーゼを発現するものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物が、植物のＭＥＴＢ遺伝子によってコードされるシスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼを発現するものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ｍｅｔＢ遺伝子がArabidopsis thaliana由来のものである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記微生物が、Saccharomyces cerevisiaeのＭＥＴＢ遺伝子によってコードされるシスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼを発現するものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記微生物が、古細菌、好ましくはMethanosarcina barkeri由来のシスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼを発現するものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記微生物が、Chloroflexaceae、好ましくはChloroflexus aurantiacus由来のシスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼを発現するものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記微生物が、次の位置におけるそれぞれのアミノ酸：１０７Ｅ、１１１Ｙ、１６５Ｋ、および４０３Ｓの少なくとも２つを有する酵素を発現するものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記微生物が、グラム陽性細菌のｍｅｔＹおよび／またはｍｅｔＢ遺伝子によってコードされるシスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼを発現するものである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記微生物が、天然または異種のシスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼ酵素を発現するものであり、前記酵素が最適化され、結果としてγ−エリミナーゼ活性が低下することにより、イソロイシンを犠牲にしてメチオニン選択性が増強されたものである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物が、３３７位のプロリンおよび／または３３５位のアラニンを有する、最適化されたシスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼ酵素を発現するものである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記微生物が、シスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードするポリヌクレオチドを過剰発現するものである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記微生物が、向上した触媒特性を有するシスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはホスホホモセリンスルフヒドリラーゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼを発現するものである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
対応するアシルホモセリン受容シスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼの使用を許容する異種ホモセリンアシルトランスフェラーゼが前記微生物に導入されている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記微生物において、幾つかの異なるハイブリッド経路が、ホモセリンからホモシステインおよび／またはシスタチオニンを能動的に生成しているものである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記微生物において、生成すべき所望のアミノ酸の生合成経路の更なる遺伝子が更に増強されている、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記微生物において、所望のアミノ酸の生成を低下させる代謝経路が、少なくとも部分的に低減されている、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
硫黄分子／化合物が、システインから任意の活性化ホモセリンに転移する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
硫黄分子／化合物が、Ｈ２Ｓから任意の活性化ホモセリンに直接転移する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記培地内の硫黄源が硫酸塩または誘導体である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記培地内の硫黄源がチオ硫酸塩である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記培地内の硫黄源がＨ２Ｓである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記培地内の硫黄源がメチルメルカプタンである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
請求項６〜１２および１４〜１８のいずれか一項において定義された、微生物。
【請求項２６】
シスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼ活性の１つまたは幾つかを有し、かつ同時に、大腸菌シスタチオニン−γ−シンターゼと比較して少なくとも２倍劣るγ−脱離活性を有する酵素が発現する微生物であって、前記酵素が、Saccharomyces cerevisiae、Methanosarcina barkeriおよびChloroflexus aurantiacus種の１つに由来するものである、微生物。
【請求項２７】
シスタチオニン−γ−シンターゼおよび／またはアシルホモセリンスルフヒドリラーゼ活性の１つまたは幾つかを有し、かつ同時に、大腸菌シスタチオニン−γ−シンターゼと比較して少なくとも２倍劣るγ−脱離活性を有する酵素が発現する微生物であって、前記酵素が、Saccharomyces cerevisiae由来のｍｅｔＢ遺伝子、ならびにグラム陽性細菌のｍｅｔＹおよび／またはｍｅｔＢ遺伝子の１つによってコードされるものである、微生物。
【国際調査報告】
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