(57)【要約】  本発明は治療抗体の分野に関する。本発明は特に、サンプル中の治療抗体の標的抗原を検出する方法であって、ａ）解析すべきサンプルを準備する工程、ｂ）前記サンプルと治療抗体とを、前記治療抗体を前記標的抗原に結合させるのに適切な条件下でインキュベートし、それにより標的抗原−治療抗体複合体を形成させる工程、及びｃ）工程（ｂ）で形成した複合体を検出する工程、を含んで成る方法、に関する。
2008545145.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の治療抗体の標的抗原を検出する方法であって、
ａ）解析すべきサンプルを準備する工程、
ｂ）前記サンプルと治療抗体とを、前記治療抗体を前記標的抗原に結合させるのに適切な条件下でインキュベートし、それにより標的抗原−治療抗体複合体を形成させる工程、及び
ｃ）工程（ｂ）で形成した複合体を検出する工程、
を含んで成る方法。
【請求項２】
前記検出が、イムノアッセイにより実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記イムノアッセイがサンドイッチイムノアッセイであることを更に特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記治療抗体がヒト又はヒト化抗体であることを更に特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒト又はヒト化抗体がモノクローナル抗体であることを更に特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記治療抗体がＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標）、Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録商標）、及びＺｅｎａｐａｘ（登録商標）から成る群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記標的抗原が、ＨＥＲ２、ＣＤ２０、及びインターロイキン−２受容体から成る群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
治療抗体が存在しているサンプル中の当該治療抗体の標的抗原を検出する方法であって、
ａ）解析すべきサンプルを準備する工程、
ｂ）前記サンプルと治療抗体とを、前記治療抗体を前記標的抗原に結合させるのに適切な条件下でインキュベートし、それにより標的抗原−治療抗体複合体を形成させる工程、及び
ｃ）工程（ｂ）で形成した複合体を検出する工程、
を含んで成る方法。
【請求項９】
治療抗体による治療を受けている患者から得たサンプル中の当該治療抗体の標的抗原を検出する方法であって、
ａ）解析すべきサンプルを準備する工程、
ｂ）前記サンプルと治療抗体とを、前記治療抗体を前記標的抗原に結合させるのに適切な条件下でインキュベートし、それにより標的抗原−治療抗体複合体を形成させる工程、及び
ｃ）工程（ｂ）で形成した複合体を検出する工程、
を含んで成る方法。
【請求項１０】
患者のフォローアップにおける請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対応治療抗体の有無に関係なく標的抗原を検出する方法に関する。本発明は特に、相当の治療抗体の存在下での標的抗原の測定に関する。本発明は、サンプル中の治療抗体の標的抗原を検出する方法であって、ａ）解析すべきサンプルを準備する工程、ｂ）前記サンプルと治療抗体とを、前記治療抗体を前記標的抗原に結合させるのに適切な条件下でインキュベートし、それにより標的抗原−治療抗体複合体を形成させる工程、及びｃ）工程（ｂ）で形成した複合体を検出する工程、を含んで成る方法、を開示する。本発明はまた、患者のフォローアップにおける前記方法の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９７４年のKohlerとMilsteinによる最初のモノクローナル抗体の開発以来、ヒトの治療にとって適切な抗体の開発に多大な努力が傾けられてきた。利用可能になった最初のモノクローナル抗体は、マウス及びラットで開発された。これらの抗体は、ヒトの治療に使用する場合、抗げっ歯類抗体に起因する不所望な副作用をもたらした。かかる不所望な副作用の軽減、また、更にはその除去に対して、多大な努力が傾けられてきた。
【０００３】
過去１０年間、益々多くのヒトモノクローナル抗体又はヒト化モノクローナル抗体が市場に届けられている。周知の例としては、例えば、Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ社（バーゼル）のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）及びＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標）がある。
【０００４】
極めて多くの数のヒトモノクローナル抗体又はヒト化モノクローナル抗体が開発中であり、そして、ヒトへの参加が最初の試験目的について考慮することができる前に、実験動物で研究される必要がある。
【０００５】
治療用のモノクローナル抗体は、典型的には、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌに及ぶ血清レベルで使用されなければならない。従って、治療抗体は、治療計画の間の少なくとも幾つかの時点で、極めて高濃度、例えば対応する標的抗原の濃度と同程度の高さ又はそれよりも高い濃度で存在する。
【０００６】
標的抗原自体の正確な測定は、治療後、特に対応治療抗体による治療後の患者のフォローアップにおいて特に、非常に重要であると考えられている。治療計画の経過中治療抗体の濃度は大幅に変化するので、かかる治療抗体についての、その対応する標的抗原の測定のために設定されているアッセイにおけるあらゆる干渉は前記標的抗原についての偽の測定結果をもたらすことがあり、そしてその可能性が非常に高い。
【０００７】
標的抗原のレベルは、任意の適切な方法によって検出されうる。臨床ルーチンにおいて、かかる方法は、多くの場合、標的抗原に対する抗体を利用しており、これはいわゆるイムノアッセイである。高濃度及び／又は可変濃度の治療抗体は、その標的抗原のレベルを測定するために使用されるイムノアッセイに干渉することがある。
【０００８】
当業者が容易に理解するように、治療抗体自体をその対応する標的抗原の検出において使用することは、可能ではないか、若しくは少なくとも容易な仕事ではない。治療抗体及びイムノアッセイで使用される抗体の少なくとも１つが標的抗原の同一エピトープと結合する場合、この様な困難にしばしば直面する。この事実が周知であり、且つ広く受け入れられているのに対し、今回、驚くべきことに、治療抗体が、対応する標的抗原についてのイムノアッセイに使用される１又は複数の抗体と結合されないエピトープと結合する場合であっても、標的抗原のイムノアッセイが治療抗体の存在又は不在によって損なわれることがあるということが明らかとなった。
【０００９】
Ｊｉｌａｎｉらは（Jilani, I., et al., Blood 1032 (2003) 3514-3520)、細胞表面上でリツキシマブを検出するために、リツキシマブのマウス配列を特異的に検出し、且つヒトＩｇと交差反応しない抗体を使用したことを報告した。ＷＯ０３／０２４９９３においては、治療抗体：抗原の複合体、可溶性抗原、遊離している治療抗体及び可溶性の総合的な治療抗体を検出し、モニタリングする方法が報告されている。
【００１０】
本発明の課題は、サンプル中の治療抗体の標的抗原を検出する方法が改善されうるかを調査することである。そのような方法は、対応治療抗体が存在するか否かに関係なく標的抗原の濃度についての真正な値をもたらずはずであり、そして連続測定、例えば患者のフォローアップにおける連続測定に役に立つはずである。
【００１１】
かかる課題は、以下の項目及び実施例で説明し、特許請求の範囲に記載の発明によって解決された。
【００１２】
本発明の要約
本発明は、サンプル中の治療抗体の標的抗原を検出する方法であって、
ａ）解析すべきサンプルを準備する工程、
ｂ）前記サンプルと治療抗体とを、前記治療抗体を前記標的抗原に結合させるのに適切な条件下でインキュベートし、それにより標的抗原−治療抗体複合体を形成させる工程、及び
ｃ）工程ｂ）で形成した複合体を検出する工程、
を含んで成る方法、を含んで成る。
【００１３】
本発明の詳細な説明
第一の態様において、本発明は、サンプル中の治療抗体の標的抗原を検出する方法であって、ａ）解析すべきサンプルを準備する工程、ｂ）前記サンプルと治療抗体とを、前記治療抗体を前記標的抗原に結合させるのに適切な条件下でインキュベートし、それにより標的抗原−治療抗体複合体を形成させる工程、及びｃ）工程ｂ）で形成した複合体を検出する工程、を含んで成る方法、に関する。
【００１４】
用語「標的抗原」は、その対応治療抗体と結合している生体分子に関する。例としては、ＨＥＲ２（＝ＥｒｂＢ２又はｐ１８５neu）に対する治療抗体、例えばＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）又はＯｍｎｉｔａｒｇ（登録商標）の標的抗原はＨＥＲＲ２であり、ＣＤ５２に対する治療抗体、例えばＣａｍｐａｔｈ（登録商標）の標的抗原はＣＤ５２であり、ＥＧＦｒに対する治療抗体、例えばＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）の標的抗原はＥＧＦｒであり、ＣＤ３３に対する治療抗体、例えばＭｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）の標的抗原はＣＤ３３であり、Ｔａｇ−７２に対する治療抗体、例えばＯｎｃｏＳｃｉｎｔ（登録商標）の標的抗原はＴａｇ−７２であり、１７−１Ａに対する治療抗体、例えばＰａｎｏｒｅｘ（登録商標）の標的抗原は１７−１Ａであり、ＣＤ２０に対する治療抗体、例えばＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）、ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標）、又はＺｅｖａｌｉｎ（登録商標）の標的抗原はＣＤ２０であり、ＣＤ２５に対する治療抗体、例えばＺｅｎａｐａｘ（登録商標）の標的抗原はＣＤ２５である。標的抗原は、可溶性の、すなわち分泌又は流出(shed)される、標的抗原でも、又は（細胞）膜結合型標的抗原でもよい。
【００１５】
別の態様において、工程ｂ）で形成した前記標的抗原−治療抗体複合体は、その総合的な標的抗原が前記治療抗体により複合体化されていることにより形成される。
【００１６】
用語「可溶性標的抗原」は、本願において使用する場合、治療抗体の膜結合型標的抗原の可溶性型、すなわち分泌型又は流出(shed)型を表す。治療抗体は、大部分、細胞表面抗原、例えば癌細胞の細胞表面抗原であって、それらが結合するもの、に対するものである。細胞表面抗原の膜結合型変異体に加え、当該抗原の、分泌型又は流出型、すなわち可溶性の変異体は、細胞によって産生されうる。可溶性標的抗原は、罹患者の体液で見ることができる。「可溶性標的抗原」は、膜結合型抗原の分泌型又は流出型変異体であり、それにより、この可溶性変異体は膜結合型抗原の細胞外ドメインの少なくとも一部と同一のアミノ酸配列及び同一の二次構造を有しており、そのため、（膜結合型）標的抗原の細胞外ドメインに対する抗体は前記可溶性標的抗原に結合することができる。
【００１７】
別の態様において、前記標的抗原は可溶性標的抗原である。
【００１８】
用語「エピトープ」は、本発明で使用する場合、抗体と特異的に結合することができるタンパク質の決定基を表す。エピトープは、通常、アミノ酸又は糖の側鎖等の化学的に活性な表面分子群から成り、そして特異的な電荷特性同様、通常特異的な三次元構造特性を有する。コンフォメーショナルエピトープとノンコンフォメーショナルエピトープとは、前者との結合は変性溶媒の存在下失われるが、後者とはそうではない点で区別される。エピトープが属する抗原のサイズにより、抗原１つ当たり複数のエピトープが利用可能なことがあり、これにより、同様に抗原１つ当たり複数の抗体結合部位（＝エピトープ）の可能性も生じる。
【００１９】
「サンプル」とは、本発明によれば、実験動物、好ましくは哺乳類から取り出した任意の組織又は液体であってもよい。好ましくは、サンプルは、唾液、尿、全血、血漿又は血清のような液体である。好ましくは、サンプルは、無細胞サンプル、すなわち、膜結合型標的抗原を有する細胞を含まないサンプルである。
【００２０】
標的抗原がその対応「治療抗体」と結合するのに適切な条件は当業者に周知であるか、又は容易に決定することができる。これらの条件のもと、治療抗体は、膜結合型又は可溶性変異体のいずれかの標的抗原と結合し、そして標的抗原と治療抗体との免疫学的複合体が形成され、標的抗原−治療抗体−複合体が生じる。この複合体は、任意の適当な手段によって検出することができる。
【００２１】
好ましい態様において、標的抗原−治療抗体−複合体は、イムノアッセイを用いて検出される。使用されるイムノアッセイは、好ましくは異種イムノアッセイである。標的抗原−治療抗体−複合体の検出を競合イムノアッセイ又はいわゆるサンドイッチイムノアッセイを用いて実施することも好ましい。
【００２２】
当業者は、全く問題なくイムノアッセイをセットアップして、標的抗原−治療抗体−複合体に存在するような標的抗原を検出することができる。一例として、かかる検出は、抗体が捕捉抗体として使用され、これが治療抗体のエピトープと重複しないエピトープにおいて標的抗原と結合する、サンドイッチタイプのイムノアッセイにおいて実施されうる。標的抗原−治療抗体−複合体の検出のために、標的抗原に対する二次抗体又は検出抗体であって、前記治療抗体でも捕捉抗体でも認識されないエピトープと結合する抗体を使用するのが好ましい。
【００２３】
好ましくは、検出抗体−標的抗原−治療抗体−複合体のサンドイッチを形成することができる検出抗体が使用される。前記第二抗体又は検出抗体は、好ましくは、直接的又は間接的な検出が容易となるように標識される。
【００２４】
直接検出のために、標識基は、任意の既知の検出マーカー基、例えば色素、蛍光標識基、例えばケミルミネセンス基、例えばアクリジニウムエステル又はジオキセタン、あるいは蛍光色素、例えばフルオレセイン、クマリン、ローダミン、オキサジン、レゾルフィン、シアニン及びそれらの誘導体から選択することができる。他の標識基の例として、発光金属複合体、例えばルテニウム又はユーロピウム複合体、酵素、例えばＥＬＩＳＡ又はＣＥＤＩＡ（クローン化酵素ドナーイムノアッセイ、例えばＥＰ００６１８８８）に使用されるものがある。
【００２５】
間接的な検出系には、例えば検出試薬、例えば検出抗体が、バイオアフィン(bioaffine)結合対の第一のパートナーで標識されるものが含まれる。適当な結合対の例には、ハプテン又は抗原／抗体、ビオチン又はビオチン類自体、例えばアミノビオチン、イミノビオチン又はデスチオビオチン／アビジン又はストレプトアビジン、糖／レクチン、核酸又は核酸類自体／相補核酸、及び受容体／リガンド、例えばステロイドホルモン受容体／ステロイドホルモンがある。好ましい第一結合対のメンバーは、ハプテン、抗原及びホルモンを含んで成る。特に好ましいのは、ハプテン、例えばジゴキシン、ジゴキシゲニン及びビオチン並びにそれらの類似体である。かかる結合対の第二のパートナー、例えば抗体、ストレプトアビジン等が、通常直接検出を可能にするために、上文で言及した標識で標識される。
【００２６】
イムノアッセイは当業者に周知である。かかるアッセイを実施するための方法並びに実際の適用及び手順は、関連の教科書に要約されている。関連の教科書の例には、Tijssen, P., Preparation of enzyme- antibody or other enzyme-macromolecule conjugates, in: Practice and theory of enzyme immunoassays, Burdon, R.H. and v. Knippenberg, P.H. (eds.), Elsevier, Amsterdam (1990) pp. 221-278;及び免疫学的検出方法を扱っているMethods in Enzymology, Colowick, S.P. and Caplan, N.O. (eds.), Academic Pressの各種の巻、特にvolume 70, 73, 74, 84, 92及び121、がある。
【００２７】
上記の全ての免疫学的検出方法において、試薬条件は、用いる試薬の結合を、例えば抗体がその対応する抗原に結合するのを可能にするものが選択される。本発明により検出される標的抗原−治療抗体−複合体は、技術水準の手順により、膜結合型又は可溶性型のいずれかの相当の濃度に補正される。
【００２８】
治療抗体によって認識されないエピトープにおいて標的抗原と結合する１又は複数の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、これらの抗体のフラグメント、並びに前記抗体の結合ドメインを含んで成る遺伝子コンストラクト、であってもよい。適切な抗体フラグメントも使用することができる。抗体並びに抗体フラグメントは、技術水準の手順、例えばTijssenにより記載されているもの(Tijssen, P., Practice and theory of enzyme immunoassays 11 (1990)の全体、特にpp. 43-78(Elsevier, Amsterdam))によって生成される。
【００２９】
用語「治療抗体」は、ヒトに使用することが意図されている任意の抗体調製物に関する。好ましくは、そのような治療抗体はモノクローナル抗体である。更に好ましくは、そのようなモノクローナル抗体は、大型類人猿から得られるか、あるいはヒトモノクローナル抗体又はヒト化抗体である。好ましくは、ヒトモノクローナル抗体である。そのような治療用モノクローナル抗体はヒト化モノクローナル抗体であることが更に好ましい。
【００３０】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用する場合、実質的に同種抗体群から得られる抗体を指し、すなわち、当該群が含んで成る個々の抗体は、僅かな量存在することがある、可能性のある天然の突然変異を除き同一である。モノクローナル抗体は、一つの抗原部位に対して高度に特異的である。更に、異なる抗原決定基（エピトープ）に対し異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は、その抗原上の１つの決定基に対するものである。それらの特異性に加え、モノクローナル抗体は、他の抗体により汚染されていない状態で作ることができる点で遊離である。「モノクローナル」の修飾語は、実質的に同種の抗体群から得られるような抗体の特徴を指し、そして何か特別の方法により抗体を産生することを要件とするとは解されない。例えば、本発明に使用するモノクローナル抗体は、Kohler, G., et al, Nature 256 (1975) 495-497に最初に記載されたハイブリドーマ法によって作られることもあれば、組換えＤＮＡ法により作られることもある（例えば、US 4,816,567を参照のこと）。「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson, T., et al., Nature, 352 (1991) 624-628 and Marks, J. D., et al., J. MoI. Biol. 222 (1991) 581-597に記載の技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。
【００３１】
非ヒト（例えばげっ歯類）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒトイムノグロブリン及びヒトイムノグロブリン由来の部分配列を含むキメラ抗体である。その大部分について、ヒト化抗体は、ヒトイムノグロブリン（レシピエント抗体）由来であり、当該レシピエントの超可変領域由来の残基は、ヒト以外の種（ドナー抗体）、例えばマウス、ラット、ウサギ又はヒト以外の霊長類の超可変領域由来の残基であって、所望の特異性及び親和性を有するものに置換されている。場合によって、ヒトイムノグロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、相当の非ヒト残基によって置換されている。更に、ヒト化抗体は、追加の修飾、例えば、レシピエント抗体又はドナー抗体には見られないアミノ酸残基を含んで成ることもある。かかる修飾は、相当の親配列と相同であるが同一ではない、レシピエント又はドナー抗体の変異体をもたらす。これらの修飾は、抗体の性能を更に洗練させるために行われる。通常、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含んで成り、ここで、超可変ループの全て又は実質的に全てが、非ヒトドナー抗体のものに対応し、そしてＲＦの全て又は実質的に全てがヒトレシピエント抗体のものである。ヒト化抗体は任意に、イムノグロブリンの定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒトイムノグロブリンの定常領域の少なくとも一部も含んで成る。
【００３２】
非ヒト抗体をヒト化する方法は当業界で説明されている。好ましくは、ヒト化抗体は、ヒト以外の供給源から導入された１又は複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「輸入」残基と称され、これは、典型的には「輸入」可変ドメインから取られる。ヒト化は、本質的には、Winter及びその共同研究者の方法 (Jones, P. T., et al., Nature 321 (1986) 522- 525; Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; Verhoeyen, M., et al., Science 239 (1988) 1534-1536;及びPresta, L. G., Curr. Op. Struct. Biol. 2 (1992) 593-596)に従い、超可変領域に相当のヒト抗体配列を置き換えることで実施することができる。従って、かかる「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり(US 4,816,567)、ここで、実質的に無傷でないヒト可変ドメインは、ヒト以外の種由来の対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は典型的にヒト抗体であって、幾つかの超可変領域残基、場合により幾つかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体の類似部位由来の残基によって置換されているものである。
【００３３】
ヒト化抗体をつく得るのに使用される、ヒト可変ドメインの選択は、軽鎖及び重鎖ともに、抗原性を減少させるのに非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法によると、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対しスクリーニングされる。このげっ歯類のものに最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク領域として受け入れられる(Sims, M. J., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308; Chothia, C, et al., J. MoI. Biol. 196 (1987) 901-917)。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定の亜集団の全てのヒト抗体の共通配列由来の特定のフレームワーク領域を使用する。同一のフレームワークを複数の異なるヒト化抗体に使用してもよい(Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; Presta, L. G., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632)。
【００３４】
イムノグロブリンは、例えば、ヒト、マウス、又はラットポリペプチドに対し生成することができる。標的抗原を特異的に認識する、ポリクローナルであるか、又はモノクローナルである、イムノグロブリンは本発明の範囲内である。かかるイムノグロブリンは、当業者に既知の標準的な免疫学的技術を用いて産生される。イムノグロブリンは、ポリクローナルでもモノクローナルでもよく、あるいは、ヒト化抗体のために、組換え的に産生してもよい。抗体が既知の治療抗体と同一のエピトープに結合していないことを確認することは競合試験系で容易に決定することができる。
【００３５】
同一の標的抗原と結合する２つの抗体が、可能性としてエピトープを重複していることは、競合試験系を用いて検出することができる。このために、例えば、酵素イムノアッセイを用いて、新規抗体が、固定化標的抗原との結合について機知の抗体と競合する程度に試験される。この目的のために、適切に固定化された標的抗原は、標識された基地の抗体及び且つ過剰の問題の抗体と一緒にインキュベートされる。結合した標識の検出により、問題の抗体が既知の抗体を結合部位（＝エピトープ）から置換することができる程度にまで容易に確認することができる。既知の抗体と称される、問題の抗体と同一濃度又はより高濃度で、好ましくは１０5倍過剰の濃度で、多くて２０％、好ましくは多くて１０％の置換がある場合、エピトープ重複は存在しない。
【００３６】
ヒト化治療抗体の周知の例には、いわゆるＥｒｂＢ２抗体、例えばｈｕＭＡｂ４Ｄ５−ｌ、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７及びｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８ (ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））であって、明示的に本明細書に援用されるＵＳ５，８２１，３３７の表３に記載のもの；並びにヒト化５２０Ｃ９（ＷＯ９３／２１３１９に記載のもの）及びＰＣＴ／ＵＳ０３／２１５９０に記載のヒト化２Ｃ４抗体がある。
【００３７】
好ましくは、本発明の方法で使用する治療抗体は、Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）、 ＯｎｃｏＳｃｉｎｔ（登録商標）、Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録商標）、Ｐａｎｏｒｅｘ（登録商標）、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）及びＺｅｎａｐａｘ（登録商標）から成る群から選択され、好ましくはＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標）、Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録商標）及びＺｅｎａｐａｘ（登録商標）から成る群から選択される。
【００３８】
Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）は、イブリツモマブとして知られている治療抗体の商品名である。この治療抗体は、ＣＤ２０と結合するモノクローナル抗体をベースとするものであり、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫の治療についてＦＤＡに認可されている。
【００３９】
Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）は、リツキシマブとして知られている治療抗体の商品名である。この治療抗体は、ＣＤ２０と結合するモノクローナル抗体をベースとするものであり、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫の治療についてＦＤＡに認可されている。
【００４０】
Ｐａｎｏｒｅｘ（登録商標）は、エドレコロマブとして知られている治療抗体の商品名である。この治療抗体は、１７−１Ａ抗原（Ｅｐ−ＣＡＭ）と結合するものであり、結腸直腸癌の治療について認可されている。
【００４１】
ＯｎｃｏＳｃｉｎｔ（登録商標）は、サツモマブとして知られている治療抗体の商品名である。この治療抗体は、汎性癌抗原Ｔａｇ−７２と結合するものであり、結腸及び卵巣癌の治療について認可されている。
【００４２】
Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）は、ゲムツズマブとして知られている治療抗体の商品名である。この治療抗体は、ＣＤ３３と結合するモノクローナル抗体をベースとするものであり、骨髄性白血病の治療についてＦＤＡに認可されている。
【００４３】
Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）は、セツキシマブとして知られている治療抗体の商品名である。この治療抗体は、上皮増殖因子受容体因子受容体（ＥＦＴｒ）と結合するものであり、結腸直腸癌の治療について認可されている。
【００４４】
Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）は、アレムツズマブとして知られている治療抗体の商品名である。この治療抗体は、ＣＤ５２と結合するモノクローナル抗体をベースとするものであり、慢性リンパ性白血病の治療についてＦＤＡに認可されている。
【００４５】
Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）は、トラスツズマブとして知られている治療抗体の商品名である。この治療抗体は、モノクローナル抗体４Ｄ５をベースとするものである。これはＨＥＲ２と結合する。ＨＥＲ２はＥｒｂＢ２又はｐ１８５neuとしても知られている。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）は、肺癌を有するＨＥＲ２−陽性患者の生存に陽性の結果を有することが証明されている(De Laurentiis, M., et al., Ann. Oncol. 16 (2005) iv7-ivl3)。
【００４６】
ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標）は、リツキシマブとして知られている治療抗体の商品名である。この治療抗体は、ＣＤ２０と結合するモノクローナル抗体をベースとするものである。ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標）は、緩慢性で且つ侵攻性の非ホジキンリンパ腫に罹患している患者の生存に陽性の結果を有することが証明されている(Di Bella, N., et al., Cancer 103 (2005) 978-984)。
【００４７】
Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録商標）は、ＨＥＲと結合する新規治療抗体ペルツズマブの商品名である。これはモノクローナル抗体２Ｃ４をベースとするものである。２Ｃ４及び４Ｄ５は、ＨＥＲ２の異なるエピトープと結合する。Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録商標）は現在臨床試験中である。これは、肺癌を有するＨＥＲ２−過剰発現陰性患者の生存に陽性の結果を有することが期待されている(Badache, A., et al., Cancer Cell 5 (2004) 299-301)。
【００４８】
Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標）は、インターロイキン−２と結合する治療抗体の商品名である。これは、腎移植のレシピエントの拒絶が低下、及び患者の生存の向上に関連している(Morris, J.A., et al., Clin. Transplant. 19 (2005) 340- 345)。
【００４９】
本発明の方法で検出される標的抗原は、ＨＥＲ２、インターロイキン−２受容体、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＧＦｒ、Ｔａｇ−７２、１７−１Ａ、ＣＤ５２、ＣＤ２５、ＣＤ３３又はＣＤ２０から成る群、好ましくはＨＥＲ２、インターロイキン−２受容体、ＩＧＦ−１Ｒ、及びＣＤ２０から成る群、好ましくはＨＥＲ２、インターロイキン−２受容体、又はＣＤ２０から成る群から選択される。
【００５０】
上文で言及したように、本発明者は、エピトープと結合する治療抗体だけでなく、当該エピトープと結合する、対応する標的抗原を検出するためのアッセイにおいて使用される抗体も当該アッセイを干渉することを見出した。干渉は、標的抗原上の非重複エピトープに対する抗体を用いるアッセイ方法においては生じても差し支えなく、観察されている。本実施例の項目で提示した具体的な観察は、ＨＥＲ２抗原と、この標的抗原と結合する２つの異なる治療抗体についてのアッセイにより行われてきた。しかしながら、他の標的抗原の正確な定量においても同様であることが予想されなければならない。実施例は、ＨＥＲ２に対する異なる抗体、すなわちＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）及びＯｍｎｉｔａｒｇ（登録商標）の両方について、本発明の方法が適用でき、そして標的抗原ＨＥＲ２は、研究されるサンプル中の対応治療抗体の存在又は不在とは無関係に容易に測定することができることを証明する。
【００５１】
１つの態様において、治療抗体はＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）であり、捕捉抗体はＯｍｎｉｔａｒｇ（登録商標）であり、そして検出抗体は抗ＥｒｂＢ２抗体７Ｃ２である。
【００５２】
別の態様において、治療抗体はＯｍｎｉｔａｒｇ（登録商標）であり、捕捉抗体はＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）であり、そして検出抗体は抗ＥｒｂＢ２抗体７Ｃ２である。
【００５３】
Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録商標）、及び抗ＥｒｂＢ２抗体７Ｃ２は、ＨＥＲ２抗原の異なるエピトープと結合する、抗ＥｒｂＢ２抗体７Ｃ２は、例えば、ＥｒｂＢ２のＮ末端の領域にあるエピトープを認識する（例えば、ＷＯ９８／１７７９７を参照のこと）。
【００５４】
本発明の方法の一態様において、工程ｂ）で形成した標的抗原−治療抗体複合体が形成されると、サンプル中の標的抗原がすべて前記治療抗体と複合体化される。
【００５５】
本発明は、サンプル中の治療抗体の標的抗原を検出する方法であって、
ａ）解析すべきサンプルを準備する工程、
ｂ）前記サンプルと治療抗体とを、前記治療抗体を前記標的抗原に結合させるのに適切な条件下でインキュベートし、それにより標的抗原−治療抗体複合体を形成させる工程、及び
ｃ）工程ｂ）で形成した複合体を検出する工程、
を含んで成る方法、を含んで成る。
【００５６】
標的抗原の信頼性のある測定は、干渉治療抗体を含んで成るあらゆるサンプルについて非常に有利なものである。従って、好ましい態様において、本発明は、治療抗体が存在しているサンプル中の当該治療抗体の標的抗原を検出する方法であって、ａ）解析すべきサンプルを準備する工程、ｂ）前記サンプルと治療抗体とを、前記治療抗体を前記標的抗原に結合させるのに適切な条件下でインキュベートし、それにより標的抗原−治療抗体複合体を形成させる工程、及びｃ）工程ｂ）で形成した複合体を検出する工程、を含んで成る方法、に関する。
【００５７】
本発明の方法はまた、治療抗体を受ける患者のフォローアップに非常に有益なものである。従って、好ましい態様において、本発明は、治療抗体による治療を受けている患者から得たサンプル中の治療抗体の標的抗原を検出する方法であって、ａ）解析すべきサンプルを準備する工程、ｂ）前記サンプルと治療抗体とを、前記治療抗体を前記標的抗原に結合させるのに適切な条件下でインキュベートし、それにより標的抗原−治療抗体複合体を形成させる工程、及びｃ）工程ｂ）で形成した複合体を検出する工程、を含んで成る方法、に関する。
【００５８】
対応する標的抗原の正確な決定は、好ましい態様において、治療の有効性を評価するのに有用であろう。更に好ましい態様において、本発明の方法は、基礎疾患の再発を評価するのに役立つであろう。
【００５９】
概して、臨床医は、治療抗体による治療を受けている患者のフォローアップの有益な情報を、本明細書で提示する方法を使用することで導き出することもできる。従って、本発明はまた、上文で提示したような方法を、患者のフォローアップにおいて使用することにも関連する。
【００６０】
提案する説明に縛られることを望むものではないが、治療抗体がその標的抗原に結合することが、例えば、他のエピトープの立体構造、及び／又は、標的抗原−治療抗体複合体に存在するようなこれらのエピトープに対する他の抗体の結合特性、に影響することもある。好ましくは、本発明の方法は、イムノアッセイにおいて使用されるような抗体及び治療抗体の標的抗原上のエピトープが、それぞれ重複しない場合であっても、使用される。
【００６１】
１つの態様において、本発明の方法はチップ上で実施される。
【００６２】
「チップ」は、固体の非多孔性材料、例えば金属、ガラス又はプラスチックである。当該材料は、任意に、全体的に、又はある領域においてコーティングしてもよい。前記材料の表面上で、任意のスポットアレイが、可視で又は座標内に存在することもあれば、あるいは存在している。各スポット上に、既定のポリペプチドが、前記材料へのリンカー又はスペーサーと一緒に、又はそれら無しで、固定化されうる。好ましくは、固定化されたポリペプチドは、標的抗原と結合することができる抗体の少なくともフラグメントである。
【００６３】
以下の実施例及び図面は、本発明の理解を助けるために提供するものであり、この真の範囲は請求の範囲に記載されている。本発明の精神を逸脱することなく、記載した手順を変更することもできると解される。
【００６４】
略語
Ｂｉ                    ビオチン
ＥＤＴＡ                エチレンジアミン四酢酸
ＥＬＩＳＡ              酵素結合性免疫吸着アッセイ
Ｆｃｙ（＝Ｆｃγ）      イムノグロブリンのＦｃガンマ−フラグメント
ＤＩＧ（Ｄｉｇ）        ジゴキシゲニン
ｈｕ，Ｈ                ヒト
ＩｇＧ                  イムノグロブリンＧ
ｎ．ｄ．                規定されていない
ＮＳＣＬＣ              非小細胞肺癌
ＯＤ                    光学密度
ＭＡＫ（＝Ｍａｂ）      モノクローナル抗体
ＰＡＫ（＝Ｐａｂ）      ポリクローナル抗体
Ｒ                      ウシ（Ｒｉｎｄ）
ＲＰＬＡ                ウシ血漿アルブミン
ＲＴ                    室温
ＴＡＰＳ                Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸
ＶＥＧＦ                血管内皮細胞増殖因子
【実施例】
【００６５】
ＨＥＲ２の市販のアッセイ
ａ）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ／Ｂａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ  ＬＬＣによって製造されたＨＥＲ−２／ｎｅｕＥＬＩＳＡ（カタログ番号ＤＡＫＯ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ  ＥＬ５０１１）
インキュベーション及び洗浄工程は、取り扱い説明書に従い実施した。３５、２５、１５、７．５、２．５、及び０ｎｇ／ｍｌのＨＥＲ２のスタンダードを、５００、２５０、０μｇ／ｍｌのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）でスパイクし、あるいはそれらを５００、２５０、０μｇ／ｍｌののＯｍｎｉｔａｒｇ（登録商標）でそれぞれスパイクした。これらのサンプルを、コーティングされたマイクロタイタープレート上でインキュベートした。検出抗体を添加してインキュベートした後、基質を添加し、そして吸光度を４９２ｎｍで読み取った。結果を表１に示す。
【００６６】
表１
干渉治療抗体を用いて、又は用いずに測定したサンプル中の光学密度（ＯＤ）
【表１】
2008545145.tif 000003
【００６７】
治療抗体Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録商標）をスパイクすることに起因するＨＥＲ２抗原の回収の差異は最大３８．１％であり、そしてＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）のスパイクに起因するのは最大２５．６％である。Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録商標）及びＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）による干渉は図１からも自明である。
【００６８】
ｂ）Ｂｅｎｄｅｒ  ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓにより製造されたｓｐ１８５HER-2モジュールセット（カタログ番号ＢＭＳ２０７ＭＳＴ）
インキュベーション及び洗浄工程は、取り扱い説明書に従い実施した。２０、１０、５、２．５、及び０ｎｇ／ｍｌのＨＥＲ２のスタンダードを、５００、２５０、０μｇ／ｍｌのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）でスパイクし、あるいはそれらを５００、２５０、０μｇ／ｍｌののＯｍｎｉｔａｒｇ（登録商標）でそれぞれスパイクした。これらのサンプルを、コーティングされたマイクロタイタープレート上でインキュベートした。検出抗体を添加してインキュベートした後、基質を添加し、そして吸光度を４０５ｎｍで読み取った。結果を表２に示す。
【００６９】
表２
干渉治療抗体を用いて、又は用いずに測定したサンプル中の光学密度（ＯＤ）
【表２】
2008545145.tif 000004
【００７０】
治療抗体Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）をスパイクすることに起因するＨＥＲ２抗原の回収の差異は最大９８．６％であり、そしてＯｍｎｉｔａｒｇ（登録商標）のスパイクに起因するのは最大２８．６％である。このことは図２にも表されている。
【００７１】
実施例２
Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録商標）の存在下でのＨＥＲ２の検出のためのアッセイ
当該アッセイは、ストレプトアビジンでコーティングしたポリスチレン製チップ上で実施した。ＨＥＲ２に対する抗体は、約１０の２５０ｐＬの液滴のラインとしてチップに適用された。ＭＡＫ＜Ｈｅｒ２＞Ｈ−４Ｄ５−ＩｇＧ−Ｂｉ（＝ＨＥＲ２に対するクローン４Ｄ５由来のビオチン化されたモノクローナル抗体）を捕捉抗体として使用して、Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録商標）による干渉のないアッセイを確立した。前記ビオチン化抗体の濃度は１００μｇ／ｍｌであった。前記チップは４℃で保存した。
【００７２】
ＭＡＫ＜Ｈｅｒ２＞Ｍ−７Ｃ２−ＩｇＧ−Ｄｉｇ（クローン７Ｃ２由来のジゴキシゲニン化されたモノクローナル抗体）をコンジュゲート抗体として使用した。このコンジュゲートのストック溶液を−２０℃で保存した。
【００７３】
ＨＥＲ２標準タンパク質ｓｐ１８５（ＨＥＲ−２）（ｓＨＥＲ２）は市販の製品（Ｂｉｏｚｏｌ＃ＭＧＳ２０７ＭＳＴ  Ｓ）であり、そして１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で−２０℃で保存した。
【００７４】
その基礎的なサンプル及びコンジュゲート緩衝液として、リン酸緩衝生理食塩水（５０ｍＭのリン酸二水素ナトリウム−一水和物、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７）に、防腐剤としてのアジ化ナトリウム（０．０９％  Ｎａ−アジド）、及び追加の添加物（０．０３５％ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）、２．００％  ＲＰＬＡ４（Ｒｏｃｈｅ  Ｎｒ．１７２６５４４００１）、０．１０％ＰＡＫ＜−＞Ｒ−ＩｇＧ（Ｒｏｃｈｅ  Ｎｒ．１１０８７５０００１）、１００μｇ／ｍｌのマウス−ＭＡＫ−３３−ＩｇＧ−ポリ（Ｒｏｃｈｅ  Ｎｒ．１９３９６６１００１））を含んで成るものを使用した。前記サンプル及びコンジュゲート緩衝液は濾過して（０．２μｍの孔径）、そして使用前に４℃で保存した。
【００７５】
Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨにより製造された治療抗体であるＯｍｎｉｔａｒｇ（登録商標）ヒト変異体Ｍａｂ２Ｃ４  Ｇ１８６ＣＰ  Ｒ９８０５Ｘのストック溶液は２５ｍｇ／ｍｌの濃度を有しており、これを−２０℃で保存した。
【００７６】
検出抗体として、１１０ｎｍの蛍光標識ラテックス粒子とコンジュゲートしたＭＡＫ＜Ｄｉｇ＞Ｍ１９−１１−ＩｇＧを使用した。当該検出抗体のコンジュゲートは４℃で保存した。
【００７７】
検出緩衝液として、５０ｍＭのＴＡＰＳ及び１ＭのＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に、防腐剤としてのアジ化ナトリウム（０．０９％  Ｎａ−アジド）、及び追加の添加物（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）、０．５０％  ＲＰＬＡ４（Ｒｏｃｈｅ  Ｎｒ．１７２６５４４００１）、１０μｇ／ｍｌのマウス−ＭＡＫ−３３−ＩｇＧ−ポリ（Ｒｏｃｈｅ  Ｎｒ．１９３９６６１００１））を含んで成るものを使用した。当該検出緩衝液は濾過して（０．２μｍの孔径）、そして使用前に４℃で保存した。
【００７８】
洗浄緩衝液には、０．００１％のオキシピリオン(Oxypyrion)、０．００１％ＭＩＴ，及び０．０１％Ｔｈｅｓｉｔを含んで成る１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液を使用した。当該洗浄緩衝液は、濾過して（０．２μｍの孔径）、そして使用前に４℃で保存した。
【００７９】
ａ）Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録商標）による潜在的な干渉の検出
本アッセイは室温で実施した。全ての試薬は、アッセイを実際に実施する前に室温に戻した。
【００８０】
２０ｎｇ／ｍｌのＨＥＲ２を含むサンプルを種々の量のＯｍｎｉｔａｒｇ（登録商標）と一緒にインキュベートすることで、図３に示す濃度にした。これらのサンプルは、サンプル緩衝液中で１：５に希釈した。それぞれ４０μｌの、二組の希釈サンプルをチップに添加し、そして室温で１０分間インキュベートする。その後、チップを自動洗浄工程で洗浄する。コンジュゲート抗体ＭＡＫ＜Ｈｅｒ２＞Ｍ−７Ｃ２−ＩｇＧ−Ｄｉｇをコンジュゲート緩衝液中３μｇ／ｍｌに希釈した。４０μｌの希釈コンジュゲート抗体を各チップに添加し、そして５分間インキュベートし、続けて自動洗浄工程にかけた。標識検出抗体を標識（＝検出）緩衝液中で１：５に希釈した。４０μｌの希釈した検出抗体を各チップに添加し、そして５分間インキュベートする。最終洗浄工程の後、結合した標識は、６３３ｎｍの励起光によるレーザーを用いて定量する。デジタル画像を適切なソフトウェアによりカウントに変換する。図３から分かるように、Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録商標）（終濃度２５μｇ／ｍｌ超）は、上記アッセイにおいて一定の範囲で干渉した。
【００８１】
ｂ）Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録商標）の存在下でのＨＥＲ２の測定
Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録商標）により干渉を示すことがあるサンプルの測定の場合、この薬物（ｒｈｕ  Ｍａｂ  ２Ｃ４  Ｇ１８６  ＣＰ  Ｒ９８０５ＡＸ）をサンプル緩衝液に６．２５μｇ／ｍｌの終濃度で添加した（＝サンプル緩衝液（Ａ））。
【００８２】
人工サンプルの調製のために、ＨＥＲ２のスタンダードの材料を５００、２００、１００、５０、２０、１０、５、２．５、１及び０ｎｇ／ｍｌにそれぞれマウス血清中で希釈した。これらのサンプルはサンプル緩衝液（Ａ）中で１：５に希釈した。それぞれ４０μｌの、二組の希釈サンプルをチップに添加し、そして室温で１０分間インキュベートする。その後、チップを自動洗浄工程で洗浄する。コンジュゲート抗体ＭＡＫ＜Ｈｅｒ２＞Ｍ−７Ｃ２−ＩｇＧ−Ｄｉｇをコンジュゲート緩衝液中３μｇ／ｍｌに希釈した。４０μｌの希釈コンジュゲート抗体を各チップに添加し、そして５分間インキュベートし、続けて自動洗浄工程にかけた。標識検出抗体を標識（＝検出）緩衝液中で１：５に希釈した。最終洗浄工程の後、結合した標識は、６３３ｎｍの励起光によるレーザーを用いて定量する。デジタル画像を適切なソフトウェアによりカウントに変換する。カウントを図３に示す。
【００８３】
表３
ＭＡＫ＜Ｈｅｒ２＞Ｍ−４Ｄ５−ＩｇＧ−Ｂｉスポットにより得られたカウント
（サンプル緩衝液（Ａ）中での検量線）
【表３】
2008545145.tif 000005
【００８４】
表３から分かるように、基礎レベルのＯｍｎｉｔａｒｇ（登録商標）の存在下で検量線を確立することは容易であった。
【００８５】
実施例３
Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の存在下でのＨＥＲ２の検出のためのアッセイ
当該アッセイは、ストレプトアビジンでコーティングしたポリスチレン製チップ上で実施した。ＨＥＲ２に対する抗体は、約１０の２５０ｐＬの液滴のラインとしてチップに適用された。ＭＡＫ＜Ｈｅｒ２＞Ｈ−２Ｃ４−ＩｇＧ−Ｂｉ（＝ＨＥＲ２に対するクローン２Ｃ４由来のビオチン化されたモノクローナル抗体）を使用して、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）による干渉のないアッセイを確立した。前記ビオチン化抗体の濃度は１００μｇ／ｍｌであった。前記チップは４℃で保存した。
【００８６】
ＭＡＫ＜Ｈｅｒ２＞Ｍ−７Ｃ２−ＩｇＧ−Ｄｉｇ（クローン７Ｃ２由来のジゴキシゲニン化されたモノクローナル抗体）をコンジュゲート抗体として使用した。このコンジュゲートのストック溶液を−２０℃で保存した。
【００８７】
ＨＥＲ２標準タンパク質ｓｐ１８５（ＨＥＲ−２）（ｓＨＥＲ２）は市販の製品（Ｂｉｏｚｏｌ＃ＭＧＳ２０７ＭＳＴ  Ｓ）であり、そして１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で−２０℃で保存した。
【００８８】
その基礎的なサンプル及びコンジュゲート緩衝液として、リン酸緩衝生理食塩水（５０ｍＭのリン酸二水素ナトリウム−一水和物、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７）に、防腐剤としてのアジ化ナトリウム（０．０９％  Ｎａ−アジド）、及び追加の添加物（０．０３５％ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）、２．００％  ＲＰＬＡ４（Ｒｏｃｈｅ  Ｎｒ．１７２６５４４００１）、０．１０％ＰＡＫ＜−＞Ｒ−ＩｇＧ（Ｒｏｃｈｅ  Ｎｒ．１１０８７５０００１）、１００μｇ／ｍｌのマウス−ＭＡＫ−３３−ＩｇＧ−ポリ（Ｒｏｃｈｅ  Ｎｒ．１９３９６６１００１））を含んで成るものを使用した。前記サンプル及びコンジュゲート緩衝液は濾過して（０．２μｍの孔径）、そして使用前に４℃で保存した。
【００８９】
Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨにより製造された治療抗体であるＨｅｒｃｅｐｔｉｎヒト変異体Ｍａｂ４Ｄ５のストック溶液は２５ｍｇ／ｍｌの濃度を有しており、これを−２０℃で保存した。
【００９０】
検出抗体として、１１０ｎｍの蛍光標識ラテックス粒子とコンジュゲートしたＭＡＫ＜Ｄｉｇ＞Ｍ１９−１１−ＩｇＧを使用した。当該検出抗体のコンジュゲートは４℃で保存した。
【００９１】
検出緩衝液として、５０ｍＭのＴＡＰＳ及び１ＭのＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に、防腐剤としてのアジ化ナトリウム（０．０９％  Ｎａ−アジド）、及び追加の添加物（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）、０．５０％  ＲＰＬＡ４（Ｒｏｃｈｅ  Ｎｒ．１７２６５４４００１）、１０μｇ／ｍｌのマウス−ＭＡＫ−３３−ＩｇＧ−ポリ（Ｒｏｃｈｅ  Ｎｒ．１９３９６６１００１））を含んで成るものを使用した。当該検出緩衝液は濾過して（０．２μｍの孔径）、そして使用前に４℃で保存した。
【００９２】
洗浄緩衝液には、０．００１％のオキシピリオン(Oxypyrion)、０．００１％ＭＩＴ，及び０．０１％Ｔｈｅｓｉｔを含んで成る１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液を使用した。当該洗浄緩衝液は、濾過して（０．２μｍの孔径）、そして使用前に４℃で保存した。
【００９３】
ａ）Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）による潜在的な干渉の検出
本アッセイは室温で実施した。全ての試薬は、アッセイを実際に実施する前に室温に戻した。
【００９４】
２０ｎｇ／ｍｌのＨＥＲ２を含むサンプルを種々の量のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）と一緒にインキュベートすることで、図４に示す濃度にした。これらのサンプルは、サンプル緩衝液中で１：５に希釈した。それぞれ４０μｌの、二組の希釈サンプルをチップに添加し、そして室温で１０分間インキュベートする。その後、チップを自動洗浄工程で洗浄する。コンジュゲート抗体ＭＡＫ＜Ｈｅｒ２＞Ｍ−７Ｃ２−ＩｇＧ−Ｄｉｇをコンジュゲート緩衝液中３μｇ／ｍｌに希釈した。４０μｌの希釈コンジュゲート抗体を各チップに添加し、そして５分間インキュベートし、続けて自動洗浄工程にかけた。標識検出抗体を標識（＝検出）緩衝液中で１：５に希釈した。最終洗浄工程の後、結合した標識は、６３３ｎｍの励起光によるレーザーを用いて定量する。デジタル画像を適切なソフトウェアによりカウントに変換する。図４から分かるように、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（終濃度２５μｇ／ｍｌ超）は、上記アッセイにおいて一定の範囲で干渉した。
【００９５】
ｂ）Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の存在下でのＨＥＲ２の測定
Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）により干渉を示すことがあるサンプルの測定の場合、この薬物（ＭＡＫ＜Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ＞７．４．０４）をサンプル緩衝液に６．２５μｇ／ｍｌの終濃度で添加した（＝サンプル緩衝液（Ｂ））。サンプル緩衝液（Ｂ）は、濾過して（０．２μｍの孔径）、そして使用前に４℃で保存した。
【００９６】
人工サンプルの調製のために、ＨＥＲ２のスタンダードの材料を５００、２００、１００、５０、２０、１０、５、２．５、１及び０ｎｇ／ｍｌにそれぞれマウス血清中で希釈した。これらのサンプルはサンプル緩衝液（Ｂ）中で１：５に希釈した。それぞれ４０μｌの、二組の希釈サンプルをチップに添加し、そして室温で１０分間インキュベートする。その後、チップを自動洗浄工程で洗浄する。コンジュゲート抗体ＭＡＫ＜Ｈｅｒ２＞Ｍ−７Ｃ２−ＩｇＧ−Ｄｉｇをコンジュゲート緩衝液中３μｇ／ｍｌに希釈した。４０μｌの希釈コンジュゲート抗体を各チップに添加し、そして５分間インキュベートし、続けて自動洗浄工程にかけた。標識検出抗体を検出緩衝液中で１：５に希釈した。４０μｌの希釈した検出抗体を各チップに添加し、そして５分間インキュベートする。最終洗浄工程の後、結合した標識は、６３３ｎｍの励起光によるレーザーを用いて定量する。デジタル画像を適切なソフトウェアによりカウントに変換する。カウントを図４に示す。
【００９７】
表４
ＭＡＫ＜Ｈｅｒ２＞Ｈ−２Ｃ４−ＩｇＧ−Ｂｉスポットにより得られたカウント
（サンプル緩衝液（Ｂ）中での検量線）
【表４】
2008545145.tif 000006
【００９８】
表４から分かるように、基礎レベルのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の存在下でＨＥＲ２についての検量線を確立することは容易であった。
【００９９】
実施例４
治療抗体を含む試料、及び治療抗体を含まない試料中でのＨＥＲ２の測定
腫瘍ＫＰＬ−４（ＨＥＲ２を産生することが知られているもの）を有するマウスの血清プールを調製し、そして４つのアリコートに分けた。
【０１００】
アリコート１及び２をサンプル緩衝液（Ｂ）及び（Ａ）においてそれぞれ１：５に希釈した（＝未処理サンプル）。
【０１０１】
アリコート３に対し、追加のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）を添加して、終濃度を２０００μｇ／ｍｌにした。これをサンプル緩衝液（Ｂ）で希釈して、これも最終的に１：５に希釈してアリコート１とした（＝処理サンプル３）。
【０１０２】
アリコート４に対し、追加のＯｍｎｉｔａｒｇ（登録商標）を添加して、終濃度を２０００μｇ／ｍｌにした。これをサンプル緩衝液（Ａ）で希釈して、これも最終的に１：５に希釈してアリコート２とした（＝処理サンプル４）。
【０１０３】
前記サンプルはそれぞれ実施例２ｂ）及び３ｂ）に記載のようにそくていした。結果を表５に示す。
【０１０４】
表５
高レベルの治療抗体の存在下でのサンプルの測定
【表５】
2008545145.tif 000007
【０１０５】
大量の治療抗体が添加されたのにも拘わらず、未処理サンプルと処理サンプルとの間の差異は１０％を超えていない。従って、両薬物Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録商標）及びＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の場合、大量の対応治療抗体の存在下でさえ機能するアッセイを確立することができた。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｓｃｈｉｅｎｃｅｓによって販売されている商業的アッセイを用いたＨＥＲ２−検出における２つの異なる治療抗体の干渉。
【図２】Ｂｅｎｄｅｒによって販売されている商業的アッセイを用いたＨＥＲ２−検出における２つの異なる治療抗体の干渉。
【図３】治療抗体Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録商標）の干渉の最大値の決定。
【図４】治療抗体Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の干渉の最大値の決定。
【図５】Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録商標）及びＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、それぞれによる干渉を欠くアッセイを用いたＨＥＲ２−検出の較正曲線。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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