(57)【要約】化合物の免疫調節効果を評価する小動物モデルを提供する。本発明は、癌を処置するための方法であって、癌に罹患している被験体に対して、ｉ）ＣＤ２００とＣＤ２００レセプターとの間の相互作用を妨害して、それによりＣＤ２００の免疫抑制効果を阻害し、かつｉｉ）ＯＸ−２／ＣＤ２００またはＯＸ−２／ＣＤ２００レセプターに結合する部分を含むポリペプチド融合分子を使用して癌細胞を殺す治療組成物を投与する工程を包含する方法を提供する。
2008513354.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を処置するための方法であって、
癌に罹患している被験体に対して、
ｉ）ＣＤ２００とＣＤ２００レセプターとの間の相互作用を妨害して、それによりＣＤ２００の免疫抑制効果を阻害し、かつ
ｉｉ）ＯＸ−２／ＣＤ２００またはＯＸ−２／ＣＤ２００レセプターに結合する部分を含むポリペプチド融合分子を使用して癌細胞を殺す
治療組成物を投与する工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
前記治療組成物を投与する工程が、前記被験体に対して、ＯＸ−２／ＣＤ２００に結合する抗体を投与することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記治療組成物を投与する工程が、前記被験体に対して、ＯＸ−２／ＣＤ２００に結合するモノクローナル抗体を投与することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記治療組成物を投与する工程が、前記被験体に対して、ＯＸ−２／ＣＤ２００レセプターに結合する抗体を投与することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記治療組成物を投与する工程が、前記被験体に対して、ＯＸ−２／ＣＤ２００レセプターに結合するモノクローナル抗体を投与することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記癌に罹患している被験体が、ＣＬＬ患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記融合分子が、毒素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記融合分子が、高エネルギー放射線エミッターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記融合分子が、細胞傷害性Ｔ細胞活性またはＮＫ細胞活性を増強するサイトカインもしくはケモカインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記融合分子が、Ｔ細胞を誘引するケモカインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
癌を処置するための方法であって、
ＣＤ２００に結合する抗体を投与する工程；
を包含し、
ａ）ＣＤ２００とそのレセプターとの間の相互作用が遮断され、
ｂ）ＣＤ２００を発現する癌細胞が殺される、
方法。
【請求項１２】
癌を処置するための方法であって、
ＣＤ２００に結合する抗体を投与する工程；
を包含し、
ａ）ＣＤ２００とそのレセプターとの間の相互作用が遮断され、
ｂ）該癌に対する細胞傷害性Ｔ細胞活性またはＮＫ細胞活性が増強される、
方法。
【請求項１３】
前記細胞傷害性Ｔ細胞活性またはＮＫ細胞活性の増強が、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−１３、およびＩＬ−５からなる群より選択されるサイトカインと融合したＣＤ２００に結合する抗体によって達成される、請求項１２に記載の癌を処置するための方法。
【請求項１４】
癌を処置するための方法であって、
ＣＤ２００に結合する抗体を投与する工程；
を包含し、
ａ）ＣＤ２００とそのレセプターとの間の相互作用が遮断され、
ｂ）Ｔ細胞が腫瘍細胞に誘引される、
方法。
【請求項１５】
Ｔ細胞誘引が、ＭＩＧ、ＩＰ−１０およびＩ−ＴＡＣからなる群より選択されるケモカインと融合したＣＤ２００に結合する抗体によって達成される、請求項１４に記載の癌を処置するための方法。
【請求項１６】
ＯＸ−２／ＣＤ２００抗原を保持する細胞を標的とする第一の部分と；
細胞の死を促進する第二の部分と；
を含む、融合分子。
【請求項１７】
前記第一の部分が、ＯＸ−２／ＣＤ２００に結合する抗体を含む、請求項１６に記載の融合分子。
【請求項１８】
前記第一の部分が、ＯＸ−２／ＣＤ２００に結合するモノクローナル抗体を含む、請求項１６に記載の融合分子。
【請求項１９】
癌を処置するための方法であって、
癌患者に対して、
（ｉ）ＣＤ２００とＣＤ２００レセプターとの間の相互作用を妨害して、それによりＣＤ２００の免疫抑制効果を阻害し、かつ
（ｉｉ）補体媒介性細胞傷害または抗体依存性細胞傷害によって癌細胞を殺す、
抗体を投与する工程；
を包含する、
方法。
【請求項２０】
（ｉ）ＣＤ２００とＣＤ２００レセプターとの間の相互作用を妨害して、それによりＣＤ２００の免疫抑制効果を阻害し、かつ（ｉｉ）補体媒介性細胞傷害または抗体依存性細胞傷害によって癌細胞を殺す、抗体。
【請求項２１】
請求項２０に記載の抗体と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、組成物。
【請求項２２】
前記治療組成物を投与する工程が、配列番号５、１２および１３からなる群より選択される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１領域を含む抗体を投与することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記治療組成物を投与する工程が、配列番号２１および２３からなる群より選択される配列を有する軽鎖ＣＤＲ２領域を含む抗体を投与することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記治療組成物を投与する工程が、配列番号２９、３７および３８からなる群より選択される配列を有する軽鎖ＣＤＲ３領域を含む抗体を投与することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記治療組成物を投与する工程が、配列番号５０、５５および５６からなる群より選択される配列を有する重鎖ＣＤＲ１領域を含む抗体を投与することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記治療組成物を投与する工程が、配列番号６９、７４および７５からなる群より選択される配列を有する重鎖ＣＤＲ２領域を含む抗体を投与することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記治療組成物を投与する工程が、配列番号８８、９３および９４からなる群より選択される配列を有する重鎖ＣＤＲ３領域を含む抗体を投与することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記第一の部分が、配列番号５、１２、１３、２１、２３、２９、３７、３８、５０、５５、５６、６９、７４、７５、８８、９３および９４からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項１６に記載の融合分子。
【請求項２９】
前記治療組成物が、ヒト化抗体を含む、請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記治療組成物が、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２を含む、請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体が、ヒト化抗体を含む、請求項１１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記抗体が、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２を含む、請求項１１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記抗体が、ヒト化抗体を含む、請求項１７〜１８のいずれかに記載の融合分子。
【請求項３４】
前記抗体が、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２を含む、請求項１７〜１８のいずれかに記載の融合分子。
【請求項３５】
前記治療組成物が、ヒト化抗体を含む、請求項２２〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記治療組成物が、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２を含む、請求項２２〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記抗体が、ヒト化抗体を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３８】
前記抗体が、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３９】
前記ポリペプチドが、ヒト化抗体を含む、請求項２８に記載の融合分子。
【請求項４０】
前記ポリペプチドが、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２を含む、請求項２８に記載の融合分子。
【請求項４１】
配列番号１１１〜１９９からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む、ＣＤ２００を発現する細胞に結合する抗体。
【請求項４２】
配列番号１１１、１１４、１１８、１３３、１３６、１４０、１４１、１４９、１５５、１６２、１６３、１６５、１７４、１８１、１８７、１８８、１８９、１９５および１９９からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む、請求項４１に記載の抗体。
【請求項４３】
配列番号２００〜２１１からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む、請求項４１に記載の抗体。
【請求項４４】
前記抗体が、ヒト化抗体を含む、請求項４１に記載の抗体。
【請求項４５】
前記抗体が、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２を含む、請求項４１に記載の抗体。
【請求項４６】
癌を処置するための方法であって、
癌に罹患している被験体に対して、ＣＤ２００を発現する細胞に結合する抗体を含有する治療組成物を投与する工程；
を包含し、該抗体は、１つ以上のＴｈ１サイトカインの生成を促進するのに十分な量で存在する、方法。
【請求項４７】
前記抗体が、配列番号１１１〜１９９からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記抗体が、配列番号１１１、１１４、１１８、１３３、１３６、１４０、１４１、１４９、１５５、１６２、１６３、１６５、１７４、１８１、１８７、１８８、１８９、１９５および１９９からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗体が、配列番号２００〜２１１からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗体が、ヒト化抗体を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗体が、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
前記癌が、ＣＬＬである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
腫瘍細胞を殺すための方法であって、
癌に罹患している被験体に対して、ＣＤ２００を発現する細胞に結合する抗体を含む治療組成物を投与する工程；
を包含し、該抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を引き起こすのに十分な量で存在する、方法。
【請求項５４】
前記抗体が、配列番号１１１〜１９９からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記抗体が、配列番号１１１、１１４、１１８、１３３、１３６、１４０、１４１、１４９、１５５、１６２、１６３、１６５、１７４、１８１、１８７、１８８、１８９、１９５および１９９からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記抗体が、配列番号２００−２１１からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記抗体が、ヒト化抗体を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記抗体が、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
前記癌が、ＣＬＬである、請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
ＯＸ−２／ＣＤ２００抗原を保持する細胞を標的とする第一の部分であって、配列番号１１１〜１９９からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む第一の部分と；
細胞の死を促進する第二の部分と；
を含む、融合細胞。
【請求項６１】
前記第一の部分が、配列番号１１１、１１４、１１８、１３３、１３６、１４０、１４１、１４９、１５５、１６２、１６３、１６５、１７４、１８１、１８７、１８８、１８９、１９５および１９９からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む、請求項６０に記載の融合分子。
【請求項６２】
前記第一の部分が、配列番号２００〜２１１からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む、請求項６１に記載の融合分子。
【請求項６３】
配列番号１１１〜１９９からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む抗体と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、組成物。
【請求項６４】
前記抗体が、ヒト化抗体を含む、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
前記抗体が、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２を含む、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６６】
癌を処置するための方法であって、
癌に罹患している被験体に対して、ＣＤ２００を発現する細胞に結合する抗体を含む治療組成物を投与する工程；
を包含し、該抗体は、１つ以上のＴｈ１サイトカインの生成を促進するのに十分な量、かつ補体媒介性細胞傷害または抗体依存性細胞傷害を引き起こすのに十分な量で存在する、方法。
【請求項６７】
配列番号２００〜２１１からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む、ＣＤ２００を発現する細胞に結合するキメラ抗体。
【請求項６８】
ＯＸ−２／ＣＤ２００が被験体においてアップレギュレートされるかどうかを判定する工程；および
該被験体に対して、免疫反応を向上させる療法を投与する工程；
を包含する、方法。
【請求項６９】
前記療法が、ＯＸ−２／ＣＤ２００に結合するかまたはＯＸ−２／ＣＤ２００レセプターに結合するポリペプチドを投与することを包含し、該ポリペプチドは、ＯＸ−２／ＣＤ２００の免疫抑制効果を阻害するのに十分な量で投与される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記被験体が、癌患者である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記被験体が、ＣＬＬ患者である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記ポリペプチドが、抗体を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
前記ポリペプチドが、ヒト化抗体を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７４】
前記ポリペプチドが、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７５】
前記ＯＸ−２／ＣＤ２００が被験体においてアップレギュレートされるかどうかを判定する工程が、
癌患者から組織を取得すること；
ＣＤ２００レベルが、対応する正常組織で見出されたレベルの少なくとも２倍であるかどうかを評価すること；
を包含する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７６】
血液が、前記癌患者から取得される組織である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
組織が生検を行うことによって癌患者から取得される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
ＣＤ２００レベルが、抗ＣＤ２００抗体を癌細胞マーカーと組合せて使用するＦＡＣＳ分析を実施することによって評価される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
前記癌細胞マーカーが、ＣＤ３８またはＣＤ１９である、請求項７５に記載の方法。
【請求項８０】
前記患者が、造血癌に罹患している、請求項７５に記載の方法。
【請求項８１】
前記患者が、ＣＬＬに罹患している、請求項７５に記載の方法。
【請求項８２】
前記療法が、ＯＸ−２／ＣＤ２００に結合するかまたはＯＸ−２／ＣＤ２００レセプターに結合するポリペプチドを投与する前に既存の調節Ｔ細胞を排除することを包含し、該ポリペプチドは、ＯＸ−２／ＣＤ２００免疫抑制効果を阻害するのに十分な量で投与される、請求項６９に記載の方法。
【請求項８３】
前記療法が、抗ＣＤ２５抗体およびシクロホスファミドからなる群より選択される試薬の調節Ｔ細胞排除量を投与することを包含する、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記療法が、骨髄切除療法を投与することをさらに包含する、請求項６９に記載の方法。
【請求項８５】
前記療法が、骨髄移植をさらに包含する、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記療法が、ＣＬＬ反応性Ｔ細胞の移動をさらに包含する、請求項８４に記載の方法。
【請求項８７】
前記療法が、癌ワクチンを投与することをさらに包含する、請求項６９に記載の方法。
【請求項８８】
前記癌ワクチンが、ＣＬＬ細胞を負荷した樹状細胞；ＣＬＬ細胞を負荷した樹状細胞に由来するタンパク質、ペプチドまたはＲＮＡ；患者由来熱ショックタンパク質タンパク質；腫瘍ペプチド；および腫瘍タンパク質；からなる群より選択される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記療法が、免疫賦活化合物の有効免疫刺激量を投与することをさらに包含する、請求項６９に記載の方法。
【請求項９０】
前記免疫賦活化合物が、ＣｐＧ、ｔｏｌｌ様レセプターアゴニストおよび抗ＣＴＬＡ−４抗体からなる群より選択される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記療法が、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＩＬ−１０抗体および抗ＩＬ−６抗体からなる群より選択される化合物の有効免疫抑制性遮断量を投与することをさらに包含する、請求項６９に記載の方法。
【請求項９２】
前記療法が、Ｔ細胞または抗原提示細胞の負の調節を遮断可能な因子の有効量を投与することを包含する、請求項６９に記載の方法。
【請求項９３】
前記因子が、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤＬ−２抗体および抗ＰＤ−１抗体からなる群より選択される、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記療法が、Ｔ細胞の正の副刺激を増強可能な因子の有効量を投与することを包含する、請求項６９に記載の方法。
【請求項９５】
前記因子が、抗ＣＤ４０抗体および抗４−１ＢＢ抗体からなる群より選択される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記療法が、癌ワクチンを投与することを包含する、請求項６９に記載の方法。
【請求項９７】
前記癌ワクチンが、ＣＬＬ細胞を負荷した樹状細胞；ＣＬＬ細胞を負荷した樹状細胞に由来するタンパク質、ペプチドまたはＲＮＡ；患者由来熱ショックタンパク質タンパク質；腫瘍ペプチド；および腫瘍タンパク質；からなる群より選択される、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記療法が、先天免疫系のレセプターを活性化可能な因子の有効量を投与することを包含する、請求項６９に記載の方法。
【請求項９９】
前記因子が、ＣｐＧ、Ｌｕｉｖａｃ、Ｂｉｏｓｔｉｍ、Ｒｉｂｏｍｉｎｙｌ、Ｉｍｕｄｏｎ、Ｂｒｏｎｃｈｏｖａｘｏｍからなる群より選択される、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記療法が、サイトカインの有効な免疫増強量を投与することを包含する、請求項６９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記サイトカインが、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γからなる群より選択される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
治療処置の進行をモニターするための方法であって、
被験体に対して、免疫調節療法を投与する工程；および
該療法の有効性を判定するために、被験体において少なくとも２倍のＯＸ−２／ＣＤ２００レベルを判定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１０３】
前記被験体におけるＯＸ−２／ＣＤ２００レベルが、前記免疫調節療法の投与前に判定され、次に、該被験体におけるＯＸ−２／ＣＤ２００レベルが、該療法の少なくとも１回の後に判定される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記免疫調節療法の投薬量または頻度を調整する工程をさらに包含する、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０５】
ＯＸ−２／ＣＤ２００レベルが、ＯＸ−２／ＣＤ２００と相関するマーカーを検出することによって判定される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０６】
癌細胞によって発現される分子の免疫調節効果を評価するための方法であって、
被験体に対して、癌細胞によって自然に発現された分子、癌細胞およびリンパ球を投与する工程；および
該癌細胞の増殖の速度をモニターする工程；
を包含し、
該癌細胞およびドナーリンパ球のみが投与された場合の増殖速度と比較して、該癌細胞の増殖速度に何らかの変化が観察された場合に、該分子は免疫調節効果を有すると見なされる、方法。
【請求項１０７】
前記癌細胞およびドナーリンパ球のみが投与された場合の増殖速度と比較して該癌細胞の増殖の速度の低下が観察される場合に、前記分子は、免疫増強性であると見なされる、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記癌細胞およびドナーリンパ球のみが投与された場合の増殖速度と比較して該癌細胞のより高い増殖速度が観察される場合に、前記分子は、免疫抑制性であると見なされる、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０９】
前記癌細胞によって自然に発現される分子が、該化合物を自然に発現する細胞を注射することによって投与される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１０】
前記癌細胞によって自然に発現される分子が、該分子を発現するように操作された細胞を注射することによって投与される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１１】
前記癌細胞によって発現される分子をデータベースから同定する工程をさらに包含する、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１２】
前記癌細胞によって発現される分子を実験的に同定する工程をさらに包含する、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１３】
前記リンパ球が、ヒトである、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１４】
前記ヒトリンパ球が、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および樹状細胞からなる群より選択される、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記リンパ球が、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１６】
前記投与されるリンパ球の数が、癌細胞の増殖速度を低下させるのには不十分である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１７】
前記投与されるリンパ球の数が、投与される癌細胞の数よりも少ない、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記投与されるリンパ球の数が、約１００万細胞〜約２００万細胞である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１９】
前記投与されるリンパ球の数が、癌細胞の増殖速度を低下させるのに十分である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１２０】
前記投与されるリンパ球の数が、投与される癌細胞の数以上である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１２１】
前記投与されるリンパ球の数が、約５００万細胞〜約１，０００万細胞である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１２２】
前記癌細胞の投与が、ＲＡＪＩおよびＮａｍａｌｗａからなる群より選択される少なくとも１つのリンパ腫細胞株を前記被験体に対して注射することを包含する、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１２３】
前記被験体が、免疫不全マウスである、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１２４】
前記投与されるリンパ球の数が、前記癌細胞の増殖を減速するのに十分であり、前記癌細胞により発現される分子は、前記癌細胞およびリンパ球のみが投与された場合の増殖速度と比較して観察される癌細胞の増殖速度が高い場合に、免疫抑制性であると見なされる、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１２５】
前記投与されるリンパ球の数が、癌細胞の増殖を減速するのに不十分であり、前記癌細胞によって発現される分子は、前記癌細胞およびリンパ球のみが投与された場合の増殖速度と比較して観察される癌細胞の増殖速度が低い場合に、免疫増強性であると見なされる、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１２６】
リンパ球および癌細胞のみを対照被験体に投与することによって、前記癌細胞の増殖速度を判定する工程；
をさらに包含する、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１２７】
前記癌細胞によって発現される分子を投与する前に、リンパ球および癌細胞のみを前記被験体に対して投与することによって、前記癌細胞の増殖速度を判定する工程；
をさらに包含する、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１２８】
化合物の免疫調節効果を評価するための方法であって、
被験体に対して、評価される化合物、癌細胞およびリンパ球を投与する工程；および
前記癌細胞の増殖の速度をモニターする工程；
を包含し、
該癌細胞およびドナーリンパ球のみが投与された場合の増殖速度と比較して、該癌細胞の増殖速度に何らかの変化が観察された場合に、該化合物は、免疫調節効果を有すると見なされる、方法。
【請求項１２９】
前記癌細胞およびドナーリンパ球のみが投与された場合の増殖速度と比較して前記癌細胞の増殖の速度の低下が観察される場合に、前記化合物は、免疫増強性であると見なされる、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記化合物の存在下での前記癌細胞の増殖速度が、前記癌細胞およびドナーリンパ球のみが投与される場合の増殖速度よりも高い場合に、該化合物は、免疫抑制性であると見なされる、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３１】
前記評価される化合物が、抗体である、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３２】
前記癌細胞の投与が、前記被験体に対して、ＲＡＪＩおよびＮａｍａｌｗａからなる群より選択される少なくとも１つのリンパ腫細胞株を注射することを包含する、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３３】
前記投与される癌細胞が、免疫抑制分子を発現する、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３４】
前記投与される癌細胞が、ＣＤ２００を発現する、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３５】
ＣＤ２００の発現が、前記投与される癌細胞によってアップレギュレートされる、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３６】
前記リンパ球が、ヒトである、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３７】
前記ヒトリンパ球が、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および樹状細胞からなる群より選択される、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
前記リンパ球が、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）である、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３９】
前記投与されるヒトＰＢＬの数が、投与される癌細胞の数よりも少ない、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
前記投与されるヒトＰＢＬの数が、約１００万細胞〜約２００万細胞である、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４１】
前記投与されるヒトＰＢＬの数が、投与される癌細胞の数以上である、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４２】
前記投与されるヒトＰＢＬの数が、約５００万細胞〜約１，０００万細胞である、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４３】
前記被験体が、免疫不全マウスである、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１４４】
前記投与されるリンパ球の数が、前記癌細胞のみと投与された場合に該癌細胞の増殖速度を減速するのに十分であり、前記化合物は、該化合物の存在下での該癌細胞の増殖速度が、前記癌細胞およびドナーリンパ球のみが投与された場合の増殖速度よりも大きい場合に、免疫抑制性であると見なされる、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１４５】
前記投与されるリンパ球の数が、前記癌細胞のみと投与された場合に該癌細胞の増殖速度を減速するのには不十分であり、前記化合物は、前記癌細胞およびドナーリンパ球のみが投与された場合の増殖速度と比較して該癌細胞の増殖の速度の低下が観察される場合に、免疫増強性であると見なされる、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１４６】
化合物の免疫調節効果を評価するための方法であって、
評価される化合物、癌細胞および約２×１０６個未満のリンパ球を、被験体に対して投与する工程；および
該癌細胞の増殖の速度をモニターする工程；
を包含し、
該癌細胞およびドナーリンパ球のみが投与された場合の増殖速度と比較して該癌細胞の増殖の速度の低下が観察される場合に、該化合物は、免疫増強性であると見なされる、方法。
【請求項１４７】
前記投与される癌細胞が、免疫抑制分子を発現する、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
前記投与される癌細胞が、ＣＤ２００を発現する、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４９】
ＣＤ２００の発現が、前記投与される癌細胞によってアップレギュレートされる、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１５０】
化合物の免疫調節効果を評価するための方法であって、
評価される化合物、癌細胞および約５×１０６個のリンパ球を被験体に対して投与する工程；および
該癌細胞の増殖の速度をモニターする工程；
を包含し、
該化合物の存在下での該癌細胞の増殖の速度が、該癌細胞およびドナーリンパ球のみが投与される場合の増殖速度よりも高い場合に、該化合物は、免疫抑制性であると見なされる、方法。
【請求項１５１】
前記投与される癌細胞が、免疫抑制分子を発現する、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記投与される癌細胞が、ＣＤ２００を発現する、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５３】
ＣＤ２００の発現が、前記投与される癌細胞によってアップレギュレートされる、請求項１５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００５年６月３０日に提出された米国特許出願第１１／１７１，５６７号に対する優先権を主張する。この米国特許出願第１１／１７１，５６７号は、２００４年１１月２３日に提出された米国特許出願第１０／９９６，３１６号の一部継続である。米国特許出願第１０／９９６，３１６号は、２００４年７月２０日に提出された米国特許出願第１０／８９４，６７２号の一部継続である。米国特許出願第１０／８９４，６７２号は、２００３年１２月１５日に提出された米国特許出願第１０／７３６，１８８号の一部継続である。米国特許出願第１０／７３６，１８８号は、次に、２００１年１２月１０日に提出されたＰＣＴ／ＵＳ０１／４７９３１の一部継続である。ＰＣＴ／ＵＳ０１／４７９３１は、２０００年１２月８日に提出された米国仮出願第６０／２５４，１１３号に対する優先権を主張する国際出願である。米国仮出願第６０／２５４，１１３号は、２００３年３月４日に提出された米国特許出願第１０／３７９，１５１号の一部継続である。上述の米国出願、国際出願および仮出願の開示全体は、参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
（技術分野）
２つの機構の組合せを提供する療法を使用する癌処置を開示する。さらに詳細には、本開示は：１）免疫抑制を遮断して、それにより癌細胞の根絶を促進するために、ＣＤ２００とそのレセプターとの間の相互作用を妨害する；２）ａ）補体媒介性または抗体依存性細胞傷害、あるいはｂ）ＣＤ２００標的部分を含む融合分子を使用して細胞を標的化することのどちらかによって、癌細胞を直接殺す療法を使用して、癌を処置することに関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）は、白血球の疾患であり、西半球における白血病の最も一般的な形である。ＣＬＬは、ゆっくり増殖するが、長い寿命を持つ悪性リンパ球の増殖に関連する疾患の別の群を示す。ＣＬＬは、たとえば古典型および混合型のＢ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、Ｂ細胞およびＴ細胞前リンパ球性白血病、ヘアリー細胞白血病、および大顆粒リンパ球性白血病を含む各種のカテゴリーに分類される。
ＣＬＬのすべての異なる種類のうち、Ｂ−ＣＬＬは全白血病の約３０パーセントを占める。５０歳を超えた個人でより頻繁に発生するが、より若年者にも次第に見られるようになっている。Ｂ−ＣＬＬは、形態的に正常であるが、生物学的に未成熟であり、機能損失につながるＢリンパ球の蓄積を特徴とする。リンパ球は正常には、感染と戦うように機能する。しかしながらＢ−ＣＬＬでは、リンパ球が血液および骨髄に蓄積して、リンパ節の腫れを引き起こす。正常な骨髄および血液細胞の生成が減少して、患者は重篤な貧血はもちろんのこと、血小板数の減少もしばしば経験する。このことは、生命を脅かす出血の危険および白血液細胞数の減少による深刻な感染の発現をもたらす可能性がある。
【０００４】
白血病などの疾患をさらに理解するために、その病因論、病原および生物学に関する研究のためのツールとして使用できる適切な細胞株を有することが重要である。悪性ヒトＢリンパ細胞株の例は、プレＢ急性リンパ芽球性白血病（Ｒｅｈ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２）、およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症（ＷＳＵ−ＷＭ）を含む。あいにく既存の細胞株の多くは、白血病およびリンパ腫の臨床的に最も一般的な種類を示さない。
【０００５】
インビトロでのエプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）感染の使用は、悪性細胞を代表する一部のＣＬＬ由来細胞株、特にＢ−ＣＬＬ細胞株をもたらした。これらの細胞株の表現型は、生体内腫瘍の表現型とは異なり、代わりにＢ−ＣＬＬ系の特徴は、リンパ芽球様細胞株の特徴と類似する傾向がある。ＥＢＶ感染を用いてＢ−ＣＬＬ細胞を不死化する試みは、あまり成功しなかった。この理由ははっきりしないが、ＥＢＶレセプター発現、結合または摂取の不足によらないことは既知である。Ｗｅｌｌｓらは、Ｂ−ＣＬＬ細胞が細胞周期のＧ１／Ｓ期で停止されることと、変換関連ＥＢＶ  ＤＮＡが発現されなかったことを見出した。ＥＢＶとＢ−ＣＬＬ細胞との間の相互作用が、正常なＢ細胞との間の相互作用と異なることを示唆する。ＥＢＶ変換ＣＬＬ細胞株はさらに分化して、ＥＢＶによって不死化されたリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）にさらに類似した形態を示すと思われる。
【０００６】
ＥＢＶ陰性ＣＬＬ細胞株のＷＳＵ−ＣＬＬが以前に確立されている（非特許文献１）。しかしながら、他のそのような細胞株は知られていない。
【０００７】
各種の機構が、癌およびＣＬＬを含む疾患状態に対する生体反応で役割を果たす。たとえばＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、刺激因子をエフェクター細胞に供給することによって、各種の悪性腫瘍に対して有効な免疫反応で不可欠な役割を果たす。細胞傷害性Ｔ細胞は、癌細胞を除去するのに最も有効な細胞であると考えられ、Ｔヘルパー細胞は、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γなどのＴｈ１サイトカインを分泌することによって細胞傷害性Ｔ細胞を刺激する。各種の悪性腫瘍において、Ｔヘルパー細胞は、健常者に見られる細胞と比べて変化した表現型を有することが示されている。顕著に変化した特徴の１つは、Ｔｈ１サイトカイン生成の低下およびＴｈ２サイトカイン生成への変化である（たとえば非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０を参照）。Ｔｈ１プロフィールへのそのサイトカイン変化を逆転することは、Ｔ細胞の抗腫瘍効果を増強することが証明されている（非特許文献１１；非特許文献１２を参照）。
【０００８】
腫瘍細胞がＴｈ１からＴｈ２へのＴヘルパー細胞のサイトカイン発現を駆動させる能力の基礎を成す機構は、ＩＬ−１０またはＴＧＦ−βなどのサイトカインの分泌はもちろんのこと、免疫系の細胞と相互作用する表面分子の発現も含む。免疫グロブリン遺伝子ファミリの分子に高度の相同性を持つ樹状細胞の表面に発現された細胞である、ＯＸ−２／ＣＤ２００は、免疫抑制に関与しており（非特許文献１３）、ＯＸ−２／ＣＤ２００発現細胞をＴｈ１サイトカイン生成の刺激を阻害できる証拠が提供されている。Ｇｏｒｃｚｙｎｓｋｉらはマウスモデルにおいて、ＯＸ−２／ＣＤ２００  Ｆｃの輸液が白血病腫瘍細胞を使用した動物モデルにおける腫瘍細胞の拒絶を抑制することを示した（非特許文献１４）。
【０００９】
特にＴ細胞の活性を増強できる範囲で、癌またはＣＬＬの罹患者を処置する改良方法が望ましい。
【非特許文献１】Ｍｏｈａｍｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，，Ｌｅｕｋｅｍｉａ（１９９６）１０（１）：１３０−７
【非特許文献２】Ｋｉａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ（２００３）８８：７５４−７６１
【非特許文献３】Ｍａｇｇｉｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ（２００２）１３  Ｓｕｐｐｌ  １：５２−５６
【非特許文献４】Ｉｔｏ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ（１９９９）８５：２３５９−２３６７
【非特許文献５】Ｐｏｄｈｏｒｅｃｋａ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋ  Ｒｅｓ（２００２）２６：６５７−６６０
【非特許文献６】Ｔａｔｓｕｍｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ（２００２）１９６：６１９−６２８
【非特許文献７】Ａｇａｒｗａｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｎｖｅｓｔ（２００３）３２：１７−３０
【非特許文献８】Ｓｍｙｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ（２００３）１０：４５５−  ４６２
【非特許文献９】Ｃｏｎｔａｓｔａ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ（２００３）１８：５４９−５５７
【非特許文献１０】Ｌａｕｅｒｏｖａ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｏｐｌａｓｍａ（２００２）４９：１５９−１６６
【非特許文献１１】Ｗｉｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００３）１０８：４０９−４１９
【非特許文献１２】Ｉｎａｇａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（１９９８）１８：３９５７−３９６４
【非特許文献１３】Ｇｏｒｃｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（１９９８）６５：１１０６−１１１４
【非特許文献１４】Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００１）１２６：２２０−２２９
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（概要）
１つの実施形態において、ＥＢＶによる不死化によって確立されていない悪性起源のＣＬＬ細胞株が提供される。細胞株は一次ＣＬＬ細胞に由来し、ＡＴＣＣアクセション番号ＰＴＡ−３９２０で寄託されている。好ましい実施形態において、細胞株はＣＬＬ−ＡＡＴである。ＣＬＬ−ＡＡＴはＢ−ＣＬＬ一次細胞に由来するＢ−ＣＬＬ細胞株である。
【００１１】
さらなる局面において、ＣＬＬ−ＡＡＴ細胞株を使用して、ＣＬＬの診断および／または処置に有用なモノクローナル抗体を産生させる。抗体は、本明細書で免疫原として開示された細胞を使用することによって産生でき、それゆえモノクローナル抗体を単離できる動物での免疫反応を上昇させる。そのような抗体の配列が決定でき、抗体またはその変異体は組換え技法によって生成できる。この局面において、「変異体」は、モノクローナル抗体の配列に基づくキメラ、ＣＤＲグラフト、ヒト化および完全ヒト抗体を含む。
【００１２】
さらに組換えライブラリーに由来する抗体（「ファージ抗体」）は、本明細書で述べた細胞、またはそれに由来するポリペプチドを、標的特異性に基づいて抗体を単離するためのベイトとして用いて選択できる。
なおさらなる局面において、抗体は、一次ＣＬＬ細胞、またはそれに由来する抗原を用いて抗体ライブラリーをパニングすることによって産生でき、そしてＣＬＬ細胞株、たとえば本明細書で述べるＣＬＬ細胞株を使用してさらにスクリーニングおよび／または特徴付けできる。したがって、ＣＬＬ細胞株への抗体の結合を評価することを含む、ＣＬＬに特異性の抗体を特徴付ける方法が提供される。
【００１３】
さらなる局面において、当業者に公知の方法によって、たとえば免疫沈降とそれに続く質量分光分析によって、ＣＬＬ−ＡＡＴ細胞株を利用してＣＬＬ細胞内で特異的に発現されるタンパク質を同定するための方法が提供される。そのようなタンパク質は、ＣＬＬ−ＡＡＴ細胞株において、またはＣＬＬ患者に由来する一次細胞において特異的に発現できる。
【００１４】
低分子ライブラリー（多くが市販されている）は、細胞の増殖特徴を調節できる因子を同定するための細胞ベースアッセイにおいて、ＣＬＬ−ＡＡＴ細胞株を使用してスクリーニングできる。たとえばＣＬＬ−ＡＡＴ細胞株でアポトーシスを調節する、またはその増殖および／または増殖を阻害する因子を同定できる。そのような因子は、治療化合物の開発のための候補である。
【００１５】
ＣＬＬ−ＡＡＴ細胞株から単離された核酸は、ＣＬＬ特異性遺伝子を同定するサブトラクティブハイブリダイゼーション実験で、またはマイクロアレイ分析（たとえば遺伝子チップ実験）で使用できる。転写がＣＬＬ細胞において調節される遺伝子を同定できる。この方法で同定されたポリペプチドまたは核酸遺伝子生成物は、ＣＬＬの抗体または小型細胞療法の開発のための手がかりとして有用である。
【００１６】
好ましい局面において、ＣＬＬ−ＡＡＴ細胞株は、細胞によってインターナライズされる細胞表面成分に結合する、インターナライズする抗体を同定するために使用できる。そのような抗体は、治療に使用するための候補である。特に、細胞質内で安定なままであり、細胞内結合活性を維持する単鎖抗体は、この方法でスクリーニングできる。
【００１７】
なお別の局面において、患者が悪性癌細胞によってアップレギュレートされたポリペプチドについてスクリーニングされ、アップレギュレートされたポリペプチドの代謝経路を妨害する抗体が患者に投与される治療処置が説明されている。
【００１８】
本開示はさらに、ＯＸ−２／ＣＤ２００が被験体においてアップレギュレートされるかどうかに関する判定が行われ、もしそうならば被験体に免疫反応を増強する療法投与するための方法に関する。ＯＸ２／ＣＤ２００のアップレギュレーションは、ＯＸ２／ＣＤ２００レベルを測定することによって直接、またはＯＸ２／ＣＤ２００と相関する任意のマーカーのレベルをモニターすることによって判定できる。適切な免疫調節療法は、Ｔ細胞または抗原提示細胞の負の調節を遮断する因子の投与、Ｔ細胞、癌ワクチン、免疫系を刺激する一般的なアジュバントの正の副刺激を増強する因子の投与あるいはＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γなどのサイトカインによる処置を含む。特に有用な実施形態において、免疫反応を増強する療法は、１つ以上の他の免疫調節療法と場合により組合せた、ＯＸ−２／ＣＤ２００に結合するポリペプチドの投与を含む。別の実施形態において、ポリペプチドはＯＸ−２／ＣＤ２００レセプターに結合する。
【００１９】
別の局面において、本開示による方法を使用して、ＯＸ−２／ＣＤ２００が被験体にてアップレギュレートされる疾患状態を、ＯＸ−２／ＣＤ２００に結合するポリペプチドまたはＯＸ−２／ＣＤ２００レセプターを該疾患状態に罹患した被験体に投与することによって処置する。１つの実施形態において、これらの方法によって処置される疾患状態は、癌、特に他の実施形態においてＣＬＬを含む。
【００２０】
特に有用な実施形態において、本開示による癌療法は、ｉ）免疫抑制を遮断して、それにより癌細胞の根絶を促進するために、ＣＤ２００とそのレセプターとの間の相互作用を妨害する抗体を投与することと；ｉｉ）癌細胞を直接殺すために、ＣＤ２００標的部分を含む融合分子を投与することとを含む。あるいは抗体は、補体媒介性または抗体依存性細胞傷害によって癌細胞を直接殺す。
【００２１】
本開示による別の実施形態において、治療処置の進行をモニターするための方法が提供される。該方法は、免疫調節療法を投与する工程と、療法の有効性を判定するために、被験体におけるＯＸ−２／ＣＤ２００レベルを少なくとも２回判定する工程とを含む。
【００２２】
別の局面において、本開示は、癌細胞によって発現された分子の免疫調節効果を評価するための方法を提供する。これらの方法では、癌細胞によって発現またはアップレギュレートされる分子を同定する（たとえば実験的に、またはデータベースから）。癌細胞、リンパ球および癌細胞によって発現またはアップレギュレートされる分子を被験体に投与して、癌細胞の増殖の速度をモニターする。投与されるリンパ球の数は、ａ）癌細胞の増殖を減速するのに十分であるように、またはｂ）癌細胞の増殖を減速するのに不十分であるようにのいずれかに規定される。癌細胞によって発現またはアップレギュレートされる分子は、分子または分子自体の活性部分として、あるいは分子またはその部分を自然に生成または発現する細胞を投与することによって、あるいは分子またはその部分を生成または発現するように操作された細胞を投与することによって投与できる。腫瘍細胞およびドナーリンパ球が単独で投与された場合の増殖速度と比較して、癌細胞の増殖速度の何らかの変化が観察される場合、該分子は免疫調節効果を有すると考えられる。たとえば投与されるリンパ球の数が癌細胞の増殖を減速するのに十分であり、観察された腫瘍細胞の増殖速度が腫瘍細胞およびドナーリンパ球が単独で投与されたときの増殖速度と比較して高い場合、癌細胞によって発現またはアップレギュレートされる分子は免疫抑制性であると見なされる。別の例として、投与されるリンパ球の数が癌細胞の増殖を減速するのに不十分であり、観察された腫瘍細胞の増殖速度が腫瘍細胞およびドナーリンパ球が単独で投与されたときの増殖速度と比較して低い場合、該化合物は免疫増強性であるとみなされる。いったん分子の免疫調節効果が確立されると、本明細書で述べた実施形態に従って、分子の活性を増強または阻害する化合物が同定できる。増強または阻害効果は、癌細胞によって発現またはアップレギュレートされた分子との直接作用の結果でありうるか、あるいは癌細胞によって発現またはアップレギュレートされた化合物の代謝経路における他の分子との間の相互作用の結果でありうる。
【００２３】
別の局面において、本開示は化合物の免疫調節効果を評価するための方法を提供する。これらの方法では、癌細胞、リンパ球および評価される化合物を被験体に投与して、癌細胞の増殖の速度をモニターする。投与されるリンパ球の数は、ａ）癌細胞の増殖を減速するのに十分であるように、またはｂ）癌細胞の増殖を減速するのに不十分であるように、のいずれかに規定される。評価される化合物は、化合物自体として、または該化合物を自然に生成する細胞を投与することによって、または該化合物を生成するように操作された細胞を投与することによって投与できる。腫瘍細胞およびドナーリンパ球が単独で投与された場合の増殖速度と比較して、癌細胞の増殖速度の何らかの変化が観察される場合、該分子は免疫調節効果を有すると考えられる。たとえば投与されるリンパ球の数が癌細胞の増殖を減速するのに十分であり、観察された腫瘍細胞の増殖速度が腫瘍細胞およびドナーリンパ球が単独で投与されたときの増殖速度と比較して高い場合、癌細胞によって発現またはアップレギュレートされる分子は免疫抑制性であると見なされる。別の例として、投与されるリンパ球の数が癌細胞の増殖を減速するのに不十分であり、観察された腫瘍細胞の増殖速度が腫瘍細胞およびドナーリンパ球が単独で投与されたときの増殖速度と比較して低い場合、該化合物は免疫増強性であるとみなされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本開示により、ＯＸ−２／ＣＤ２００が被験体においてアップレギュレートされるかどうかを判定して、そうならば被験体に免疫反応を増強する療法を投与するための方法を提供する。適切な免疫調節療法の説明例は、Ｔ細胞または抗原提示細胞の負の調節を遮断する因子（たとえば抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤＬ−２抗体、抗ＰＤ−１抗体など）の投与、あるいはＴ細胞の正の副刺激を増強する因子（たとえば抗ＣＤ４０抗体または抗４−１ＢＢ抗体）の投与、あるいＮＫ細胞数またはＴ細胞活性を増加させる因子（たとえば単独の、あるいはＩＭｉＤ、サリドマイド、またはサリドマイド類似物質などのインヒビタと組合された、抗ＣＤ２００抗体）の投与を含む。さらに免疫調節療法は、癌ワクチン、たとえば腫瘍細胞、腫瘍ＲＮＡまたは腫瘍ＤＮＡを負荷（ｌｏａｄ）した樹状細胞、腫瘍タンパク質または腫瘍ペプチド、患者由来熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）あるいはＣｐＧ、Ｌｕｉｖａｃ、Ｂｉｏｓｔｉｍ、Ｒｉｂｏｍｉｎｙｌ、Ｉｍｕｄｏｎ、Ｂｒｏｎｃｈｏｖａｘｏｍなどの免疫系を各種のレベルで刺激する一般的なアジュバントあるいは先天免疫系のレセプター（たとえばｔｏｌｌ様レセプター）を活性化する他の任意の化合物でありうる。また免疫調節療法は、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γなどのサイトカインによる処置を含むことができる。
【００２５】
特に有用な実施形態において、免疫反応を増強する療法は、単独での、または上述した免疫調節療法の１つと組合せた、ＯＸ−２／ＣＤ２００に結合するポリペプチドの投与である。一般に、本開示で利用するポリペプチドは、当業者に公知である各種の技法を使用して構成できる。１つの実施形態において、ポリペプチドは化学合成によって得られる。他の実施形態において、ポリペプチドは抗体であるか、あるいは１つ以上の抗体の１つの断片または複数の断片から構成される。
【００２６】
好ましくは、本開示の方法で利用するポリペプチドは、ＣＬＬ細胞株から得られる。「ＣＬＬ」は本明細書で使用するように、これに限定されるわけではないが、Ｂ細胞ＣＬＬ（「Ｂ−ＣＬＬ」）を含むＢ細胞およびＴ細胞の、これに限定されるわけではないが、各種の発生ステージを含む、任意のリンパ球を伴う慢性リンパ球性白血病を指す。Ｂ−ＣＬＬは本明細書で使用するように、ＣＤ５＋、ＣＤ２３＋、ＣＤ２０ｄｉｍ＋、ｓＩｇｄｉｍ＋であり、細胞周期のＧ０／Ｇ１にて停止する成熟Ｂ細胞表現型による白血病を指す。さらなる局面において、ＣＬＬ細胞株は、癌およびＣＬＬを含む、ＯＸ−２／ＣＤ２００がアップレギュレートされる疾患状態の診断および／または処置で有用な、抗体を含むポリペプチドを産生するために使用される。
【００２７】
本明細書で使用するように、「抗体」という用語は、選択した標的に結合できる完全抗体または抗体断片を指す。Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、操作された抗体（キメラ、ＣＤＲグラフトおよびヒト化、完全ヒト抗体、および人工的に選択された抗体を含む）、ならびにファージ提示または代わりの技法を使用して生成された合成または半合成抗体が含まれる。小型断片、たとえばＦｖおよびｓｃＦｖは、その小さなサイズおよび結果として生じる優れた組織分布によって、診断および治療用途のために好都合な特性を所有する。
【００２８】
抗体は、本明細書で免疫原として開示された細胞を使用することによって産生でき、それによりモノクローナル抗体を単離できる動物における免疫反応を上昇させる。そのような抗体の配列を決定でき、組換え技法によって抗体またはその変異体を生成できる。本局面において、「変異体」は、モノクローナル抗体の配列をベースとするキメラ、ＣＤＲグラフト、ヒト化および完全ヒト抗体はもちろんのこと、ＯＸ−２／ＣＤ２００に結合できるポリペプチドも含む。
【００２９】
さらに組換えライブラリー（「ファージ抗体」）に由来する抗体は、標的特異性に基づいて抗体またはポリペプチドを単離するためのベイトとして、本明細書で述べた細胞、またはそれに由来するポリペプチドを使用して選択できる。
【００３０】
なおさらなる局面において、抗体またはポリペプチドは、一次ＣＬＬ細胞、またはそれに由来する抗原を使用して抗体ライブラリーをパニングすることによって、そしてさらにＣＬＬ細胞株、たとえば本明細書で述べるＣＬＬ細胞株を使用してスクリーニングおよび／または特徴付けることによって産生できる。したがってＣＬＬに対して特異性の抗体またはポリペプチドを特徴付ける方法が提供され、該方法は抗体またはポリペプチドのＣＬＬ細胞株への結合を評価する工程を含む。
【００３１】
（細胞株の調製）
細胞株は、当業者に公知の確立された方法に従って生成できる。一般に細胞株は、患者に由来する一次細胞を、培養物中に不死化細胞が自発的に産生されるまで培養することによって生成される。これらの細胞を次に単離して、さらに培養してアポトーシスに対して耐性を示すクローン細胞個体群または細胞を生成する。
【００３２】
たとえばＣＬＬ細胞は、ＣＬＬに罹患している患者から採取した末梢血から単離できる。細胞を洗浄して、場合により存在する細胞の種類を決定するために免疫分類できる。次に細胞を培地、たとえばＩＬ−４を含有する培地中で培養できる。好都合には、培養プロセスの間に培地の全部または一部を１回以上交換する。それによって細胞株を単離でき、培養物中の増殖向上によって同定できるであろう。
【００３３】
１つの実施形態において、ＥＢＶによる不死化によって確立されない悪性起源のＣＬＬ細胞株が提供される。「悪性起源」は、たとえばＥＢＶによって形質転換される非増殖性細胞とは対照的に、悪性ＣＬＬ一次細胞からの細胞株の誘導を指す。本開示による有用な細胞株は、表現型においてそれ自体悪性であっても、なくてもよい。「悪性」表現型を有するＣＬＬ細胞は、細胞増殖の反復サイクルを特徴とする、基材培地とは結合していない細胞増殖を示し、アポトーシスに対する耐性を示す。一次ＣＬＬ細胞に由来した細胞株は、ＡＴＣＣアクセション番号ＰＴＡ−３９２０で寄託されている。好ましい実施形態において、細胞株はＣＬＬ−ＡＡＴである。ＣＬＬ−ＡＡＴは、Ｂ−ＣＬＬ一次細胞に由来するＢ−ＣＬＬ細胞株である。
【００３４】
１つの実施形態において、ＣＬＬ細胞で特異的に発現されたタンパク質は、当業者に公知の方法、たとえば免疫沈降とそれに続く質量分光分析によって、ＣＬＬ−ＡＡＴ細胞株を利用して同定される。そのようなタンパク質は、ＣＬＬ−ＡＡＴ細胞株において、またはＣＬＬ患者に由来する一次細胞において特異的に発現できる。
【００３５】
小型細胞ライブラリー（多くは市販されている）は、細胞の増殖特徴を調節できる因子を同定するために、細胞ベースアッセイでＣＬＬ−ＡＡＴ細胞株を使用してスクリーニングできる。たとえばＣＬＬ−ＡＡＴ細胞株においてアポトーシスを調節する、またはその増殖および／または増殖を阻害する因子を同定できる。そのような因子は、治療化合物の開発のための候補である。
【００３６】
ＣＬＬ−ＡＡＴ細胞株から単離された核酸は、ＣＬＬ特異性遺伝子を同定するサブトラクティブハイブリダイゼーション実験またはマイクロアレイ分析（たとえば遺伝子チップ実験）で使用できる。ＣＬＬ細胞において調節される遺伝子を同定できる。この方法で同定されるポリペプチドまたは核酸遺伝子生成物は、ＣＬＬの抗体または低分子療法の開発のための手がかりとして有用である。
【００３７】
１つの実施形態において、ＣＬＬ−ＡＡＴ細胞株は、細胞表面成分に結合して、次に細胞によってインターナライズされる、インターナライズする抗体を同定するために使用できる。そのような抗体は、治療用途の候補である。特に細胞質中で安定のままであり、細胞内結合活性を保持する単鎖抗体は、この方法でスクリーニングできる。
【００３８】
（モノクローナル抗体の調製）
組換えＤＮＡ技術は、本開示によって生成された抗体を改良するために使用できる。それゆえキメラ抗体は、診断または治療用途においてその免疫原性を低下させるために構成できる。さらに免疫原性は、ＣＤＲグラフト、そして場合によりフレームワーク修飾によって抗体をヒト化することによって最小限にできる。その内容が参考として本明細書中に援用されるＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，２２５，５３９を参照。
【００３９】
抗体は動物血清から得られるか、あるいはモノクローナル抗体またはその断片の場合は細胞培養で生成できる。組換えＤＮＡ技術を使用して、細菌または好ましくは哺乳類細胞培養物中で確立された手順に従って抗体を生成できる。選択した細胞培養系は好ましくは抗体生成物を分泌する。
【００４０】
別の実施形態において、本明細書で開示した抗体の生成のためのプロセスは、ハイブリッドベクターによって形質転換された宿主、たとえばＥ．ｃｏｌｉまたは哺乳類細胞を培養することを含む。該ベクターは、適正な読み枠内にて抗体タンパク質をコードする第２のＤＮＡ配列に連結されたシグナルペプチドをコードする第１のＤＮＡ配列に作動的に連結されたプロモータを含有する１つ以上の発現カセットを含む。該抗体タンパク質は次に収集および単離される。場合により、発現カセットは、適正な読み枠内でシグナルペプチドのそれぞれ個別に作動的に連結された抗体タンパク質をコードする多シストロン性、たとえば２シストロン性ＤＮＡ配列に作動的に連結されたプロモータを含むことができる。
【００４１】
ハイブリドーマ細胞または哺乳類細胞のインビトロでの増殖は、哺乳類血清（たとえばウシ胎仔血清）、または微量元素および増殖維持サプリメント（たとえばフィーダー細胞、たとえば正常マウス腹腔滲出細胞、脾臓細胞、骨髄マクロファージ、２−アミノエタノール、インスリン、トランスフェリン、低密度リポタンパク質、オレイン酸など）を場合により補充した、慣例の標準培地（たとえばダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはＲＰＭＩ１６４０培地）を含む適切な培地中で実施される。細菌細胞または酵母細胞である宿主細胞の増殖は、当分野で公知の適切な培地中で同様に実施される。たとえばバクテリアでは適切な培地は、培地ＬＥ、ＮＺＣＹＭ、ＮＺＹＭ、ＮＺＭ、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ、ＳＯＢ、ＳＯＣ、２ｘＹＴ、またはＭ９最小培地を含む。酵母では、適切な培地は、培地ＹＰＤ、ＹＥＰＤ、最小培地、またはＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｄｒｏｐｏｕｔ  Ｍｅｄｉｕｍを含む。
【００４２】
インビトロ生成は、比較的純粋な抗体調製物を提供し、より多くの量の所望の抗体を与えるためのスケールアップを可能にする。細菌細胞、酵母、植物、または哺乳類細胞培養のための技法は当分野で公知であり、均質懸濁培養（たとえばエアリフトリアクタ内または連続スターラーリアクタ内で）、そして固定化またはエントラップ細胞培養（たとえば中空繊維、マイクロカプセル内、アガロースマイクロビーズまたはセラミックカートリッジ上で）を含む。
【００４３】
大量の所望の抗体は、哺乳類細胞を生体内で増殖することによっても得られる。この目的のために、所望の抗体を生成するハイブリドーマ細胞を組織適合哺乳類に注射して、抗体生成腫瘍の増殖を引き起こす。場合により、該動物は炭化水素、特にプリスタン（テトラメチル−ペンタデカン）などの鉱油によって刺激できる。１〜３週間後に、抗体をこれらの哺乳類の体液から単離する。たとえば適切なミエローマ細胞とＢａｌｂ／ｃマウスからの抗体生成脾臓細胞との、または所望の抗体を生成するハイブリドーマ細胞株Ｓｐ２／０に由来するトランスフェクション細胞との融合によって得たハイブリドーマ細胞を、場合によってプリスチンによって前処置したＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射する。１〜２週間後に腹水を該動物から採取する。
【００４４】
上述の、または他の技法は、たとえばその開示が参照により本明細書にすべて組み入れられているＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，３７６，１１０；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（１９８８）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒで議論されている。組換え抗体分子の調製技法は、上の参考文献に、またたとえばＷＯ９７／０８３２０；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，４２７，９０８；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，５０８，７１７；Ｓｍｉｔｈ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２２５，ｐｐ  １３１５−１３１７；Ｐａｒｍｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９８８，Ｇｅｎｅ  ７３，ｐｐ  ３０５−３１８；Ｄｅ  Ｌａ  Ｃｒｕｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６３  ｐｐ  ４３１８−４３２２；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，４０３，４８４；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５２２３４０９；ＷＯ８８／０６６３０；ＷＯ９２／１５６７９；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５７８０２７９；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５５７１６９８；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６０４０１３６；Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．，１８（４）：４２１−５；Ｔａｙｌｏｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０（１９９２）：６２８７−６２９５；Ｔｏｍｉｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ９７（２）（２０００）：７２２−７２７にも述べられている。これらのすべての参考文献の内容は、参考として本明細書中に援用される。
【００４５】
細胞培養物上澄みを所望の抗体について、ＣＬＬ細胞の免疫蛍光染色によって、免疫ブロッティングによって、酵素イムノアッセイによって、たとえばサンドイッチアッセイまたはドットアッセイ、あるいはラジオイムノアッセイによって選択的にスクリーニングする。
【００４６】
抗体の単離では、培養物上澄み中または腹水中の免疫グロブリンを、たとえば硫酸アンモニウムによる沈降、ポリエチレングリコールなどの吸湿材による透析、選択膜による濾過などによって濃縮できる。必要および／または所望ならば、慣習的なクロマトグラフィー法、たとえばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロースでのクロマトグラフィーおよび／または（免疫）アフィニティクロマトグラフィー、たとえば本開示によるＣＬＬ細胞株に由来する１つ以上の表面ポリペプチドによって、あるいはタンパク質−ＡまたはＧを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって精製される。
【００４７】
別の実施形態は、適切な哺乳類、たとえばウサギがプールされたＣＬＬ患者サンプルによって免疫化されることを特徴とする、細胞株に対して作られた抗体を分泌する細菌細胞株の調製のためのプロセスを提供する。免疫化ウサギから生成されたファージ提示ライブラリーが当分野で公知の方法（たとえば参考として本明細書中に援用される、各種の参考文献で開示された方法）に従って、構成され、所望の抗体についてパニングされる。
【００４８】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞も検討される。好ましいハイブリドーマ細胞は遺伝的に安定であり、所望の特異性の本明細書で述べたモノクローナル抗体を分泌して、解凍および再クローニングによって深温冷凍培養物から活性化できる。
【００４９】
別の実施形態において、本明細書で述べるＣＬＬ細胞株に対して作られたモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株の調製のためのプロセスが提供される。そのプロセスでは、適切な哺乳類、たとえばＢａｌｂ／ｃマウスを、本開示で述べた細胞に由来する１つ以上のポリペプチドまたはその抗原断片、細胞株自体、あるいは上述したような精製ポリペプチドを含有する抗原キャリアによって免疫化する。免疫化哺乳類の抗体生成細胞を培養物中で短期間増殖させるか、適切なミエローマ細胞株の細胞と融合させる。融合で得られたハイブリッド細胞をクローニングして、所望の抗体を分泌する細胞クローンを選択する。たとえば本細胞株によって免疫化したＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞をミエローマ細胞株ＰＡＩまたはミエローマ細胞株Ｓｐ２／０−Ａｇ  １４の細胞と融合させて、得られたハイブリッド細胞を所望の抗体の分泌についてスクリーニングして、陽性ハイブリドーマ細胞をクローニングする。
【００５０】
好ましいのは、本開示に従って複数回、たとえば４〜６回、数ヶ月に渡って、たとえば２〜４ヶ月の間、細胞株１０６〜１０７細胞を皮下および／または腹腔内注射することによって、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫化することを特徴とする、ハイブリドーマ細胞株の調製のプロセスである。免疫化マウスからの脾臓細胞は、最後の注射から２〜４日後に採取して、融合プロモータ、好ましくはポリエチレングリコールの存在下でミエローマ細胞株ＰＡＩの細胞と融合させる。好ましくは、約３０％〜約５０％のポリエチレングリコール（分子量約４０００）を含有する溶液中で、ミエローマ細胞を３〜２０倍過剰の免疫化マウスからの脾臓細胞と融合させる。融合後、細胞を、選択培地、たとえばＨＡＴ培地を添加した上述したような適切な培地中にて、正常ミエローマ細胞が所望のハイブリドーマ細胞を過剰増殖させるのを防止するために一定間隔で膨張させる。
【００５１】
さらなる実施形態において、上述した細胞株に対して作られた抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするインサートを含む組換えＤＮＡが生成される。ＤＮＡという用語は、コード単鎖ＤＮＡ、前記コードＤＮＡおよびその相補性ＤＮＡより成る２本鎖ＤＮＡ、またはこれらの相補性（単鎖）ＤＮＡ自体を含む。
【００５２】
さらに本明細書で開示された細胞株に対して作られた抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡは、重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードする真正ＤＮＡ配列を有する酵素または化学合成ＤＮＡ、あるいはその変異体でありうる。真正ＤＮＡの変異体は、１つ以上のアミノ酸が除去または１つ以上の他のアミノ酸と交換された、上述の抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡである。好ましくは前記修飾は、ヒト化および発現最適化用途における抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインのＣＤＲの外側である。変異体ＤＮＡという用語は、１つ以上のヌクレオチドが同じアミノ酸をコードする新しいコドンを持つ他のヌクレオチドと交換される、サイレント変異体も含む。変異体配列という用語は、縮重配列も含む。縮重配列は、最初にコードされたアミノ酸配列の変化を生じることなく、制限数のヌクレオチドが他のヌクレオチドによって置換されるという点で、遺伝子コードの意味の範囲内で縮重される。そのような縮重配列は、重鎖マウス可変ドメインおよび／または軽鎖マウス可変ドメインの最適発現を得るために、特異性宿主、特にＥ．ｃｏｌｉによって好まれる、その各種の制限部位および／または特定のコドンの頻度のために有用なことがある。
【００５３】
変異体という用語は、当分野で周知の方法に従って真正ＤＮＡのインビトロ変異誘発によって得られたＤＮＡ変異体を含むものとする。
【００５４】
完全テトラマー免疫グロブリン分子の構築およびキメラ抗体の発現では、重鎖および軽鎖可変ドメインをコードする組換えＤＮＡインサートを重鎖および軽鎖定常ドメインをコードする対応するＤＮＡと融合させて、たとえばハイブリッドベクター内への包含後に、適切な宿主細胞内へ移動させる。
【００５５】
ヒト定常ドメインｇに融合された本明細書で開示された細胞株に対して作られた抗体の重鎖マウス可変ドメインをコードするインサートを含む組換えＤＮＡ、たとえばγ１、γ２、γ３またはγ４、好ましくはγ１またはγ４も提供される。ヒト定常ドメインκまたはλ、好ましくはκに縮合された本明細書で開示された細胞株に対して作られた抗体の軽鎖マウス可変ドメインをコードするインサートを含む組換えＤＮＡも提供される。
【００５６】
別の実施形態は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインが、宿主細胞における抗体の処理を促進するシグナル配列を場合により含むスペーサー基によって連結される組換えポリペプチドをコードする組換えＤＮＡおよび／または抗体および／または開裂部位および／またはペプチドスペーサーおよび／またはエフェクター分子の精製を促進するペプチドをコードするＤＮＡに関する。
【００５７】
エフェクター分子をコードするＤＮＡは、診断または治療用途で有用なエフェクター分子をコードするＤＮＡであるものとする。それゆえ毒素または酵素、特にプロドラッグの活性化を触媒できる酵素であるエフェクター分子が特に示される。そのようなエフェクター分子をコードするＤＮＡは、天然発生型酵素または毒素コードＤＮＡ、またはその変異体の配列を有し、当分野で周知の方法によって調製できる。
本抗体／ポリペプチドの使用
本明細書で利用するポリペプチドおよび／または抗体は、特に診断および治療用途のために示されている。
【００５８】
本抗体は、治療剤として癌患者、特にこれに限定されるわけではないがＣＬＬ患者に投与できる。一部の実施形態において、抗体はＣＤ２００とそのレセプターとの間の相互作用を妨害できる。この妨害は、ＣＤ２００の免疫抑制効果を遮断できる。この方法で免疫反応を改善することによって、そのような抗体は癌細胞の根絶を促進できる。
【００５９】
抗ＣＤ２００抗体は、他の免疫調節化合物、ワクチンまたは化学療法と組合せて投与することもできる。たとえば抗ＣＤ２５またはシクロホスファミドなどの試薬による既存の調節Ｔ細胞の除去は、抗ＣＤ２００処置を開始する前に、１つの特定の有用な実施形態で実現される。また骨髄切除療法と、それに続く骨髄移植またはＣＬＬ細胞と反応するＴ細胞の養子移入の治療有効性は、抗ＣＤ２００療法によって向上する。さらに抗ＣＤ２００処置は、癌ワクチン、たとえばＣＬＬ細胞を負荷（ｌｏａｄ）した樹状細胞、そのような細胞に由来するタンパク質、ペプチドまたはＲＮＡ、患者由来熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）、腫瘍ペプチドまたは腫瘍タンパク質の有効性を実質的に向上させることができる。他の実施形態において、抗ＣＤ２００抗体は免疫賦活化合物、たとえばＣｐＧ、ｔｏｌｌ様レセプターアゴニストまたは他の任意のアジュバント、抗ＣＴＬＡ−４抗体などと組合せて使用される。なお他の実施形態において、抗ＣＤ２００処置の有効性は、免疫抑制性機構、たとえば抗ＰＤＬ１および／または２抗体、抗ＩＬ−１０抗体、抗ＩＬ−６抗体などを遮断することによって改善される。なお他の実施形態において、抗ＣＤ２００処置の有効性は、ＮＫ細胞数またはＴ細胞を増加させる因子、たとえば低分子インヒビタＩＭｉＤ、サリドマイド、またはサリドマイド類似物質の投与によって改善される）。
【００６０】
本開示による抗ＣＤ２００抗体は、診断ツールとして使用できる。たとえば造血性癌の患者から採取した血液を使用して、ＣＤ２００の発現は、ＣＬＬ細胞上のたとえばＣＤ３８およびＣＤ１９などの適切な癌細胞マーカーと組合せて抗ＣＤ２００抗体を使用するＦＡＣＳ分析によって、癌細胞上で評価できる。抗ＣＤ２００抗体による処置には、正常Ｂ細胞で見出されるレベルよりも少なくとも１．４倍高いＣＤ２００レベルの患者を選択できる。
【００６１】
本抗ＣＤ２００抗体を診断ツールとして使用する別の例において、悪性腫瘍を持つ患者からの生検を採取して、抗ＣＤ２００抗体を使用するＦＡＣＳ分析によってＣＤ２００の発現を判定する。腫瘍細胞がＣＤ２００を、対応する正常組織と比較して少なくとも１．４倍高いレベルで発現する場合、免疫調節療法のために癌患者を選択する。免疫調節療法は抗ＣＤ２００療法でありうるが、患者の免疫系に影響を及ぼす他の任意の療法でもよい。適切な免疫調節療法の例は、Ｔ細胞または抗原提示細胞の負の調節を遮断する因子（たとえば抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤＬ−２、抗ＰＤ−１）の投与またはＴ細胞の正の副刺激を増強する因子（たとえば抗ＣＤ４０または抗４−１ＢＢ）の投与を含む。さらに免疫調節療法は、ＮＫ細胞数またはＴ細胞活性を増加させる因子（たとえば単独の、あるいはＩＭｉＤ、サリドマイド、またはサリドマイド類似物質などのインヒビタと組合された、抗ＣＤ２００抗体）の投与あるいは調節Ｔ細胞を消耗する因子（たとえば単独の、またはＯＮＴＡＫと組合せた抗ＣＤ２００抗体）の投与でもよい。さらに免疫調節療法は、癌ワクチン、たとえば腫瘍細胞、腫瘍ＲＮＡまたは腫瘍ＤＮＡを負荷（ｌｏａｄ）した樹状細胞、腫瘍タンパク質または腫瘍ペプチド、患者由来熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）あるいはＣｐＧ、Ｌｕｉｖａｃ、Ｂｉｏｓｔｉｍ、Ｒｉｂｏｍｉｎｙｌ、Ｉｍｕｄｏｎ、Ｂｒｏｎｃｈｏｖａｘｏｍなどの免疫系を各種のレベルで刺激する一般的なアジュバントあるいは先天免疫系のレセプター（たとえばｔｏｌｌ様レセプター）を活性化する他の任意の化合物でありうる。または療法は、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γなどのサイトカインによる処置を含む。
【００６２】
本開示による別の実施形態において、治療処置の進行および／または有効性をモニターするための方法が提供される。該方法は、療法の有効性を決定するために、被験体におけるＯＸ−２／ＣＤ２００レベルを少なくとも２回決定する工程とを含む。たとえばＯＸ−２／ＣＤ２００の前処置レベルが確認でき、療法の少なくとも１回の投与の後に、ＯＸ−２／ＣＤ２００のレベルを再度決定できる。ＯＸ−２／ＣＤ２００レベルの低下は、有効な処置を示す。ＯＸ−２／ＣＤ２００レベルの測定は、開業医によって療法の投薬量または頻度を増加するための指針として使用できる。ＯＸ−２／ＣＤ２００レベルを直接モニターできることを、あるいはＯＸ−２／ＣＤ２００に相関する任意のマーカーをモニターできることをもちろん理解すべきである。
【００６３】
本抗体はまた、生体内で癌性細胞を検出するために利用できる。これは抗体を標識することと、標識した抗体を被験体に投与することと、次に被験体を撮像することとによって実現される。本開示による診断撮像に有用な標識の例は、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、９９ｍＴｃ、３２Ｐ、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、および１８８Ｒｈなどの放射性標識、フルオレセインおよびローダミンなどの蛍光標識、核磁気共鳴活性標識、陽電子放出断層撮影（「ＰＥＴ」）スキャナによって検出できる陽電子放出同位体、ルシフェリンなどの化学発光剤、ならびにペルオキシダーゼまたはホスファターゼなどの酵素マーカーである。短距離検出器プローブ、たとえば経直腸プローブによって検出可能な短距離放射線エミッター、たとえば同位体も利用できる。抗体は、そのような試薬によって、当分野で公知の技法を使用して標識できる。たとえば抗体の放射性標識に関する技法については、参考として本明細書中に援用されるＷｅｎｓｅｌ  ａｎｄ  Ｍｅａｒｅｓ，Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８３）を参照。参考として本明細書中に援用されるＤ．Ｃｏｌｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｓ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ｉｎ  Ａｔｈｙｍｉｃ  Ｍｉｃｅ”，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：８０２−８１６（１９８６）も参照。
【００６４】
本開示による放射性標識抗体は、インビトロ診断試験に使用できる。抗体、その結合部分、プローブ、またはリガンドの特異性活性は、半減期、放射性標識の同位体純度、および生物因子に標識が包含される方法によって変わる。イムノアッセイ試験では、一般に特異性活性が高くなればなるほど、感度がより良好になる。放射性同位体によって抗体を標識するための手順は、当分野で一般に公知である。
【００６５】
放射性標識抗体は患者に投与することができ、患者内で抗体が反応する抗原を持つ癌細胞に局在化して、たとえばγカメラまたは放出断層撮影を使用する放射核スキャンなどの公知の技法を用いて、生体内で検出または「撮像」される。たとえば参考として本明細書中に援用されるＡ．Ｒ．Ｂｒａｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ”，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒ．Ｗ．Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），ｐｐ．６５−８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）を参照。あるいは、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに配置されているＰｅｔ  ＶＩと呼ばれるような陽電子放出横断断層撮影スキャナを放射性標識が陽電子（たとえば１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏ、および１３Ｎ）を放出するところで使用できる。
【００６６】
蛍光団および発色団標識生物因子は、当分野で周知の標準部分から調製できる。抗体および他のタンパク質は約３１０ｎｍまでの波長を有する光を吸収するため、蛍光部分は、３１０ｎｍを超える、好ましくは４００ｎｍを超える波長にて実質的な吸収を有するように選択すべきである。各種の適切な蛍光団および発色団は、参考として本明細書中に援用されるＳｔｒｙｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６２：５２６（１９６８）およびＢｒａｎｄ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１：８４３−８６８（１９７２）によって述べられている。抗体は、参考として本明細書中に援用されるＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．３，９４０，４７５、４，２８９，７４７、および４，３７６，１１０に開示された手順などの従来手順によって、蛍光発色団基によって標識できる。
【００６７】
他の実施形態において、二重特異性抗体が検討される。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に結合特異性を有するモノクローナル、好ましくはヒトまたはヒト化抗体である。この場合では、結合特異性の一方が癌細胞のＣＤ２００抗原に対してであり、他方が他の任意の抗原に対して、好ましくは細胞表面タンパク質またはレセプターまたはレセプターサブユニットに対してである。
【００６８】
二重特異性抗体を作成するための方法は、当業者の範囲内である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生成は、２つの重鎖が異なる特異性を有する、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づいている（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。所望の結合特異性を持つ抗体可変ドメイン（抗体−抗原複合部位）を免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合することができる。融合は好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖定常ドメインによってである。免疫グロブリン重鎖融合、そして所望ならば免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、独立した発現ベクターに挿入されて、適切な宿主生物内へ同時トランスフェクションされる。二重特異性抗体を産生する説明的な現在周知のさらなる詳細事項については、たとえばＳｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）；ＷＯ  ９６／２７０１１；Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）；Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）；およびＧｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）；およびＴｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）を参照。
【００６９】
本抗体は、癌性細胞を生体内で直接殺すために、または切除するためにも使用できる。これは、（場合により細胞傷害薬に融合できる）抗体を、そのような処置を必要とする被験体に投与することを含む。抗体は癌細胞のＣＤ２００を認識するため、抗体が結合するそのような任意の細胞が破壊される。
【００７０】
癌細胞を殺すために、または切除するために抗体を単独で使用するとき、そのような致死または切除は、内因性宿主免疫機能、たとえば補体媒介性または抗体依存性細胞傷害を開始することによって実施できる。細胞をこの方法で殺すかどうかを判断するためのアッセイは、当業者の範囲内である。
【００７１】
本開示の抗体は、各種の細胞傷害性化合物を送達するために使用できる。任意の細胞傷害性化合物を本抗体に融合できる。融合は化学的または遺伝子的に実現できる（たとえば発現を介して、単一の融合分子として）。細胞傷害性化合物は生物製剤、たとえばポリペプチド、または低分子でありうる。当業者が認識するように、低分子には化学融合が使用されるが、これに対して生物化合物では、化学または遺伝子融合のどちらかを使用できる。
【００７２】
細胞傷害性化合物の非制限的な例は、治療薬は治療薬、放射線を放出する化合物、植物、真菌、または細菌起源の分子、生物タンパク質、およびその混合物を含む。細胞傷害性薬は、細胞内作用細胞傷害性薬、たとえば短距離、高エネルギーα−エミッターを含む、たとえば短距離放射線エミッターでありうる。酵素活性毒素およびその断片はたとえば、ジフテリア毒素Ａ断片、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａからの）外毒素Ａ、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ−サクリン、あるＡｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、あるＤｉａｎｔｈｉｎタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、Ｍｏｒｏｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａインヒビタ、クルシン、クロチン、Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビタ、ゲロニン、マイトジリン、レストリクトシン、フェノマイシン、およびエノマイシンによって例示される。免疫毒素の酵素活性ポリペプチドを調製する手順は、参考として本明細書中に援用されるＷＯ８４／０３５０８およびＷＯ８５／０３５０８に述べられている。ある細胞傷害性部分は、たとえばアドリアマイシン、クロラムブシル、ダウノマイシン、メトトレキサート、ネオカルチノスタチン、および白金に由来する。
【００７３】
抗体を細胞傷害性剤と結合する手順は上述されており、当業者の範囲内である。
【００７４】
あるいは抗体は高エネルギー放射線エミッター、たとえば放射性同位体、たとえば１３１Ｉ、腫瘍部位に局在化するときに複数の細胞直径の致死を引き起こすγ−エミッターに結合できる。たとえば参考として本明細書中に援用される、Ｓ．Ｅ．Ｏｒｄｅｒ，“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒ．Ｗ．Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ  ３０３−３１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）を参照。他の適切な放射性同位体は、α−エミッター、たとえば２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、および２１１Ａｔ、ならびにβ−エミッター、たとえば１８６Ｒｅおよび９０Ｙを含む。
【００７５】
本抗体（純抗体、標識抗体、毒素に融合された抗体などにかかわらず）の抗体投与の経路は、公知の方法、たとえば静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、皮下、眼内、動脈内、髄腔内、吸入または病巣内経路による注射または輸液、あるいは持続放出システムによる。該抗体は好ましくは、輸液によって、またはボーラス注射によって連続的に投与される。抗体を局所的または全身的方法で投与できる。
【００７６】
本抗体は、薬学的に受容可能なキャリアとの混合物として調製できる。本出願の化合物の処方および投与のための技法は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，最新版に見出すことができる。本治療組成物は静脈内に、あるいは鼻または肺を通じて、好ましくは液体または粉末エアゾール（凍結乾燥）として投与できる。該組成物は、所望通りに非経口的に、または皮下的にも投与できる。全身投与する場合、該治療組成物は、滅菌されており、発熱物質を含まず、ｐＨ、等張性、および安定性に十分に注意を払った非経口的に許容される溶液とすべきである。これらの条件は当業者に公知である。
【００７７】
使用するのに適した製薬組成物は、本抗体の１つ以上がその本来の目的を達成するために有効な量で含有される組成物を含む。さらに詳細には、治療的有効量は、疾患の症状を防止、軽減または改善するために、あるいは処置される被験体の生存を延長するために有効な抗体の量を意味する。治療的有効量の決定は、特に本明細書で提供する詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。治療的有効投薬量は、インビトロおよび生体内方法を使用して決定できる。
【００７８】
一部の実施形態において、本ＣＤ２００結合抗体は、ＣＤ２００によって白血病細胞を直接標的化することによって、ＣＬＬにおける免疫抑制を遮断する利益を提供する。詳細には、免疫系の刺激によって、脾臓およびリンパ節からのＣＬＬ細胞の根絶を可能にできる。出願人は、これらの微環境からのＣＬＬ細胞の根絶が、単にＢ細胞を標的とする因子（たとえばアレムツズマブ）によって成功したことを一切認識していない。これに対して、ＣＬＬ反応性Ｔ細胞は、抗体よりもこれらの臓器へより良好なアクセスを有することができる。他の実施形態において、直接細胞致死は、ＣＬＬ細胞に抗ＣＤ２００Ａｂをタグ付けすることによって実現される。
【００７９】
特に有用な実施形態において、直接細胞致死およびＴｈ１プロフィールへの免疫反応の推進の組合せは、癌処置への特に強力な手法を提供する。それゆえ１つの実施形態において、ＣＤ２００に結合して、ａ）ＣＤ２００とそのレセプターとの間の相互作用を遮断して、同時にｂ）ＣＤ２００を発現する癌細胞を直接殺す抗体または抗体断片を癌患者に投与する癌処置が提供される。癌細胞が殺す機構は、これに限定されるわけではないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；毒素との融合；放射性標識との融合；細胞致死に関与する生物因子、たとえばグランザイムＢまたはパーフォリンとの融合；細胞傷害性ウイルスとの融合；ＴＮＦ−αまたはＩＦＮ−αなどのサイトカインとの融合を含むことができる。代わりの実施形態において、癌処置は、ａ）ＣＤ２００とそのレセプターとの間の相互作用を遮断して、同時にｂ）腫瘍に対する細胞傷害性Ｔ細胞またはＮＫ細胞活性を増強する抗体を投与することを含む。細胞傷害性Ｔ細胞またはＮＫ細胞活性のそのような増強はたとえば、たとえばＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−１３、およびＩＬ−５などのサイトカインと融合させることにより組合せられる。加えてそのような増強は、ＩＭｉＤ、サリドマイド、またはサリドマイド類似物質などのインヒビタと組合せた抗ＣＤ２００抗体の投与によって実現できる。
【００８０】
なお別の実施形態において、癌処置は、ａ）ＣＤ２００とそのレセプターとの間の相互作用を遮断して、同時にｂ）Ｔ細胞を腫瘍細胞に誘引する抗体を投与することを含む。Ｔ細胞誘引は、ＡｂをＭＩＧ、ＩＰ−１０、１−ＴＡＣ、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ５またはＬＩＧＨＴなどのケモカインと融合することによって実現できる。免疫抑制の遮断および腫瘍細胞の抗体標的化による直接致死の複合作用は、有効性の向上をもたらす独自の手法である。
【００８１】
上の開示は抗体に関してであったが、一部の実施形態では、そのような抗体に由来するポリペプチドを本開示に従って利用できる。
【００８２】
（ＣＬＬ細胞株の使用）
ＣＬＬ細胞株は、ＣＬＬ、癌、およびＯＸ−２／ＣＤ２００のアップレギュレートされたレベルを特徴とする他の疾患状態、たとえばメラノーマの診断および処置を開発するための重要なツールを提供するため、その開発には多くの利点がある。
【００８３】
本開示による細胞株は、ＣＬＬおよびＯＸ−２／ＣＤ２００のアップレギュレートされたレベルを特徴とする他の疾患状態に関する病因論、病原および生物学についてのインビトロ試験に使用できる。これはこれらの疾患の療法に有用である適切な因子の同定を補助する。
【００８４】
細胞株は、上で言及したようなＣＬＬ、癌、およびＯＸ−２／ＣＤ２００のアップレギュレートされたレベルを特徴とする他の疾患状態（たとえばメラノーマ）のインビトロおよび生体内診断のための、そして他の方法によって、たとえば抗体ライブラリーをＣＬＬ患者に由来する一次細胞および／または抗原によってパニングすることによって生成された抗体のスクリーニングおよび／または特徴付けのための、ポリペプチドおよび／またはモノクローナル抗体を生成するためにも使用できる。
【００８５】
細胞株はそのようなものとして使用できるか、またはそれから抗原を誘導できる。好都合なことに、そのような抗原は、ＣＬＬに対して特異性の細胞表面抗原である。それらは本開示による細胞株から直接単離できる。あるいは本明細書で述べた細胞株から作成したｃＤＮＡ発現ライブラリーは、抗ＣＬＬ抗体の選択および特徴付けならびに新規ＣＬＬ特異性抗原の同定に有用である、ＣＬＬ特異性抗原を発現するために使用できる。
【００８６】
モノクローナル抗体療法を使用するＣＬＬの処置は、当分野で提案されている。近年、Ｈａｉｎｓｗｏｒｔｈ（Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  ５（５）（２０００）３７６−３８４）は、モノクローナル抗体に由来する最新の療法について述べている。リンパ球性白血病は特に、リンパ球腫瘍での複数のリンパ球特異性抗原の存在によるこの治療手法のための良好な候補であると考えられる。
【００８７】
既存の抗体療法（たとえば、Ｂリンパ球の表現で発現される、ＣＤ２０抗原に対して作られたリツキシマブＴＭ）は、あるリンパ球性疾患に対してうまく使用されてきた。しかしながら低密度ＣＤ２０抗原は、ＣＬＬにおけるＢリンパ球の表面で発現される（Ａｌｍａｓｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，４０（４）（１９９２）２５９−２６３）。
【００８８】
それゆえ本明細書で述べるＣＬＬ細胞株は、本ＣＬＬ細胞株の１つ以上の抗原決定基に対して特異性を有する新規の抗ＣＬＬ抗体およびポリペプチドの開発、そしてＣＬＬ、癌、およびＯＸ−２／ＣＤ２００のアップレギュレートされたレベルを特徴とする他の疾患状態の療法および診断でのその使用を可能にする。
【００８９】
抗体またはポリペプチドは、ＯＸ−２／ＣＤ２００が通常相互作用するレセプターに結合して、それによりＯＸ−２／ＣＤ２００が該レセプターに結合するのを防止または阻害できる。なお別の代案として、抗体はＯＸ−２／ＣＤ２００の発現を調節する抗原に結合して、それによりＯＸ−２／ＣＤ２００の正常な、または上昇した発現を防止または阻害できる。ＯＸ−２／ＣＤ２００の存在が免疫反応の低下と関連しているため、ＯＸ−２／ＣＤ２００の代謝経路を妨害することが望ましいので、患者の免疫系は疾患状態、たとえば癌またはＣＬＬから、さらに効果的に防御できる。
【００９０】
特に有用な実施形態において、ポリペプチドはＯＸ−２／ＣＤ２００に結合する。１つの実施形態において、ポリペプチドは、ＯＸ−２／ＣＤ２００に結合して、ＯＸ−２／ＣＤ２００が他の分子またはレセプターと相互作用するのを防止または阻害する抗体でありうる。ＯＸ−２／ＣＤ２００を過剰発現するＣＬＬ細胞および他の細胞がＴｈ１サイトカインの生成を大幅に減少させるので、ＯＸ−２／ＣＤ２００に結合する抗ＣＤ２００抗体またはポリペプチドの、ＯＸ−２／ＣＤ２００のアップレギュレートされたレベルを有する被験体への投与は、Ｔｈ１サイトカインプロフィールを回復する。それゆえこれらのポリペプチドおよび／または抗体は、ＣＬＬおよび他の癌またはＯＸ−２／ＣＤ２００を過剰発現する疾患の処置における有用な治療剤でありうる。
【００９１】
それゆえ別の実施形態において、本開示の方法は、被験体をＯＸ−２／ＣＤ２００の存在についてスクリーニングする工程と、ＯＸ−２／ＣＤ２００に結合するポリペプチドを投与する工程とを含む。もちろん、ＯＸ−２／ＣＤ２００の存在を直接モニターできること、あるいはＯＸ−２／ＣＤ２００と相関する任意のマーカーを検知できることを理解すべきである。特に有用な実施形態において、ＣＬＬ患者をＯＸ−２／ＣＤ２００の過剰発現についてスクリーニングして、ＯＸ−２／ＣＤ２００に結合する抗体を患者に投与する。１つのそのような抗体は、Ｓｅｒｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．（３２００  Ａｔｌａｎｔｉｃ  Ａｖｅ，Ｓｕｉｔｅ  １０５，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ  ２７６０４）から市販されている抗ＣＤ２００抗体である。以下で詳細に述べるように、別のそのような抗体は、ＯＸ−２／ＣＤ２００に結合するｓｃＦｖ−９である（図９Ｂ）。
【００９２】
別の局面において、本開示は、癌細胞によって発現された分子の免疫調節効果を評価するための方法を提供する。これらの方法では、癌細胞によって発現またはアップレギュレートされる分子を最初に同定する。該分子は、データベースから、または実験的に同定できる。癌細胞によって発現またはアップレギュレートされる分子を同定するデータベースが公知であり、たとえばＮＣＩ６０癌マイクロアレイプロジェクト（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｎｃｉ６０／）（Ｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２４：２２７−３４，２０００）、癌腫分類（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｎｆ．ｏｒｇ／ｃａｎｃｅｒ／ｅｐｉｃａｎ／）（Ａｎｄｒｅｗ  Ｉ．Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｂｙ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ．”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６１：７３８８−７３９３，２００１）、およびリンパ腫／白血病分子プロファイリングプロジェクト（ｈｔｔｐ：／／ｌｌｍｐｐ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｌｙｍｐｈｏｍａ／）（Ａｌｉｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０３：５０３−１１，２０００）を含む。
【００９３】
癌細胞によって発現またはアップレギュレートされる分子を同定するための実験方法も公知であり、たとえばマイクロアレイ実験、定量的ＰＣＲ、ＦＡＣＳ、およびノーザン分析を含む。
【００９４】
癌細胞、リンパ球および癌細胞によって発現される以前に同定された分子を被験体に投与して、癌細胞の増殖の速度をモニターする。本方法では、任意の種類の癌細胞を利用できる。一部の実施形態において、癌細胞は免疫抑制性化合物を発現する。特に有用な実施形態において、癌細胞はＣＤ２００を発現、または過剰発現さえする。適切な癌細胞は、これに限定されるわけではないが、ＲＡＪＩまたはＮａｍａｌｗａ細胞株などのリンパ腫細胞株を含む。投与される癌細胞の量は、約１×１０６〜約２０×１０６個の範囲である。
【００９５】
本プロセスでは、任意の種類のリンパ球を利用できる。適切なリンパ球はたとえばＰＢＬ、Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、樹状細胞またはＮＫ細胞を含む。特に有用な実施形態において、リンパ球はヒトリンパ球、詳細にはヒトＰＢＬである。投与されるリンパ球の数は、ａ）癌細胞の増殖を減速するのに十分であるように、またはｂ）癌細胞の増殖を減速するのに不十分であるようにのいずれかで規定される。投与されるリンパ球の量は、投与されるリンパ球の数が癌細胞の増殖を減速するのに十分であるようにするときには、投与された癌細胞の数と同じか、それ以上でよい。実施形態において、投与されるリンパ球の数が癌細胞の増殖を減速するのに十分であるようにするときには、投与されるリンパ球の数は約５×１０６〜約１０×１０６個でよい。投与されるリンパ球の量は、投与されるリンパ球の数が癌細胞の増殖を減速するのに不十分であるようにするときは、投与された癌細胞の数よりも少なくてよい。実施形態において、投与されるリンパ球の数が癌細胞の増殖を減速するのに不十分であるようにするときは、投与されるリンパ球の量は約１×１０６〜約４×１０６個の範囲でありうる。上述の量は例示的であり、他の適切な量を実験的に決定して本方法で使用できる。
【００９６】
癌細胞によって発現またはアップレギュレートされる分子は、（単離されたか、または組換え産生されたかのいずれかの）分子またはその活性部分自体として、あるいは分子を自然に生成する細胞を投与することによって、あるいは分子またはその部分を生成するために操作された細胞を投与することによって、投与できる。所望の分子を発現させるために細胞を操作するための方法は、当業者に公知である。投与される分子の量は、健常者に見出される量を超える任意の量でよい。たとえば投与される分子の量は、健常者の同じ種類の細胞で見出される量の１．４倍超〜健常者の同じ種類の細胞で見出される量の約１０，０００倍超でよい。評価される分子がある程度の免疫調節活性を有することが既知であること、または既知でないことを理解すべきである。それゆえ本方法は、分子の免疫調節効果を確認するためにはもちろんのこと、最初からそのような活性を判定するためにも使用される。
【００９７】
癌細胞、リンパ球および分子を投与する被験体として、任意の小動物を選択できる。被験体は好都合に免疫不全にすることができる。適切な小動物はたとえば免疫不全マウス、照射ラット、照射モルモットなどを含む。
【００９８】
癌細胞の増殖速度は、旧来の技法を使用してモニターできる。たとえば腫瘍増殖は、長さおよび幅をカリパスで測定することによってモニターできる。腫瘍体積はたとえば、腫瘍の長さに腫瘍の幅を掛けて、次に腫瘍の幅の半分を掛けることに基づいて算出できる。癌細胞増殖の速度は、たとえば週に３回など、定期的に測定できる。癌細胞およびリンパ球のみが投与されたときの癌細胞の増殖速度は、癌細胞およびリンパ球のみを対照被験体に投与して、腫瘍サイズを定期的に測定することによって決定できる。あるいは癌細胞およびリンパ球のみを最初に投与することができ、いったんベースライン増殖速度が確立されたら、癌細胞によって発現またはアップレギュレートされる分子を次に被験体に投与でき、第２の投与後の癌細胞の増殖の速度を測定できる。あるいは全身モデルによって、癌細胞増殖の速度をＦＡＣＳ、生存または他の旧来の技法を使用してモニターできる。
【００９９】
腫瘍細胞およびドナーリンパ球のみが投与されたときの増殖速度と比較して、癌細胞の増殖速度の何らかの変化が観察される場合、分子は免疫調節効果を有すると考えられる。投与されるリンパ球の数が癌細胞の増殖を減速させるのに十分であり、観察された腫瘍細胞の増殖速度が、腫瘍細胞およびドナーリンパ球のみが投与されたときの増殖速度と比較して高い場合、癌細胞によって発現またはアップレギュレートされる分子は免疫抑制性であると見なされる。投与されるリンパ球の数が癌細胞の増殖を減速するのに不十分であり、観察された腫瘍細胞の増殖速度が、腫瘍細胞およびドナーリンパ球のみが投与されたときの増殖速度と比較して低い場合、分子は免疫増強性であると見なされる。通例、観察された癌細胞の増殖速度は、腫瘍細胞およびドナーリンパ球のみが投与されたときの増殖速度よりも約２０〜約１，０００％高く、免疫抑制または免疫増強効果が統計的に有意となる。
【０１００】
分子の免疫調節効果がいったん確立されると、本明細書に述べた実施形態によって、分子の活性の増強または阻害のどちらかを行う化合物を同定できる。免疫調節効果を有することが以前に見出された、分子の活性の増強または阻害のどちらかを行う化合物は、免疫調節効果を提供するタンパク質／タンパク質相互作用を変化させる任意の化合物でありうる。増強または阻害効果は、癌細胞によって発現またはアップレギュレートされる化合物との直接相互作用の結果でありうるか、あるいは癌細胞によって発現またはアップレギュレートされる化合物の代謝経路において他の化合物との間の相互作用の結果でありうる。
【０１０１】
たとえば、免疫調節効果を有することが以前に見出された分子、分子が相互作用するレセプター、または免疫調節効果に関与する代謝経路におけるある他の分子と相互作用する、抗体または機能性抗体断片を同定できる。抗体（抗体ライブラリーを含む）を作成するための、そしてそれらを阻害または増強効果についてスクリーニングするための技法は、当業者に明らかとなるであろう。別の例として、低分子を阻害または増強効果についてスクリーニングできる。低分子ライブラリーを阻害または増強効果についてスクリーニングする技法は、当業者に明らかとなるであろう。
【０１０２】
別の局面において、化合物の免疫調節効果を評価するための方法が本開示によって検討される。ヒト免疫系に作用する化合物または分子の免疫調節特性を証明することは、小動物モデルでは非常に困難である。しばしば該化合物は小動物の免疫系に作用せず、マウスにおけるヒト免疫系の再構成を必要とする。再構成は、各種の胎生免疫臓器をマウスにグラフトすることによって、またはヒトリンパ球の注射によって実現できるが、今日までに説明されたモデルのいずれも、化合物または分子の免疫調節特性の証明に有用であることが判明していない。免疫系は癌細胞の根絶に重要な役割を果たすと考えられている。癌細胞は、免疫抑制性レセプターのアップレギュレーションによって免疫系を回避するための方法を見出している。
【０１０３】
化合物の免疫調節効果を評価する本方法は、ドナーリンパ球（たとえばＰＢＬ）を輸液される白血病患者で観察されたグラフト対白血病効果を模倣するモデルによって実現され、患者の８０％で寛解を引き起こす。該方法は、癌細胞、リンパ球および評価される化合物を被験体に投与することを含み、癌細胞の増殖の速度をモニターする。
【０１０４】
本方法では任意の種類の癌細胞を利用できる。一部の実施形態では、癌細胞は免疫抑制性化合物を発現する。特に有用な実施形態において、癌細胞はＣＤ２００を発現、または過剰発現さえする。適切な癌細胞は、これに限定されるわけではないが、ＲＡＪＩまたはＮａｍａｌｗａ細胞株などのリンパ腫細胞株を含む。投与される癌細胞の量は、約１×１０６〜約２０×１０６個の範囲である。
【０１０５】
本プロセスでは、任意の種類のリンパ球を利用できる。適切なリンパ球はたとえば、ＰＢＬ、樹状細胞、Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫ細胞を含む。特に有用な実施形態において、リンパ球はヒトリンパ球、詳細にはヒトＰＢＬである。投与されるリンパ球の数は、ａ）癌細胞の増殖を減速するのに十分であるように、またはｂ）癌細胞の増殖を減速するのに不十分であるように、のいずれかで規定される。投与されるリンパ球の量は、投与されるリンパ球の数が癌細胞の増殖を減速するのに十分であるようにするときには、投与された癌細胞の数と同じか、それ以上でよい。実施形態において、投与されるリンパ球の数が癌細胞の増殖を減速するのに十分であるようにするときには、投与されるリンパ球の数は約５×１０６〜約１０×１０６個でよい。投与されるリンパ球の量は、投与されるリンパ球の数が癌細胞の増殖を減速するのに不十分であるようにするときは、投与された癌細胞の数よりも少なくてよい。実施形態において、投与されるリンパ球の数が癌細胞の増殖を減速するのに不十分であるようにするときは、投与されるリンパ球の量は約１×１０６〜約４×１０６個の範囲でありうる。上述の量は例示的であり、他の適切な量を実験的に決定して本方法で使用できる。
【０１０６】
評価される化合物は、免疫調節効果が決定されることを求めている任意の化合物でよい。化合物の説明例は、本明細書で上述した抗体およびペプチドを含む。投与される、評価される化合物の量は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇの範囲でありうる。評価される化合物は、化合物自体として、あるいは化合物を自然に生成する細胞を投与することによって、あるいは化合物を生成するために操作された細胞を投与することによって、投与できる。評価される化合物がある程度の免疫調節活性を有することが既知であること、または既知でないことを理解すべきである。それゆえ本方法は、分子の免疫調節効果を確認するためにはもちろんのこと、最初からそのような活性を判定するためにも使用される。
【０１０７】
癌細胞、リンパ球および分子を投与する被験体として、任意の小動物を選択できる。被験体は好都合に免疫不全にすることができる。適切な小動物はたとえば免疫不全マウス、照射ラット、照射モルモットなどを含む。
【０１０８】
癌細胞の増殖速度は、旧来の技法を使用してモニターできる。たとえば腫瘍増殖は、長さおよび幅をカリパスで測定することによってモニターできる。腫瘍体積はたとえば、腫瘍の長さに腫瘍の幅を掛けて、次に腫瘍の幅の半分を掛けることに基づいて算出できる。癌細胞増殖の速度は、たとえば週に３回など、定期的に測定できる。癌細胞およびリンパ球のみが投与されたときの癌細胞の増殖速度は、癌細胞およびリンパ球のみを対照被験体に投与して、腫瘍サイズを定期的に測定することによって決定できる。あるいは癌細胞およびリンパ球のみを最初に投与することができ、いったんベースライン増殖速度が確立されたら、評価される化合物を次に被験体に投与でき、第２の投与後の癌細胞の増殖の速度を測定できる。
【０１０９】
リンパ腫細胞株ＲＡＪＩまたはＮａｍａｌｗａなどの癌細胞を免疫不全マウスに注射するとき、５００万〜１０００万個のＰＢＬの投与は、腫瘍増殖の著しい減速を引き起こす。これに対して、少ない数のＰＢＬ（ドナーによって１〜２００万個）は、腫瘍増殖を減速しない。
【０１１０】
腫瘍細胞およびドナーリンパ球のみが投与されたときの増殖速度と比較して、癌細胞の増殖速度の何らかの変化が観察される場合、分子は免疫調節効果を有すると考えられる。投与されるリンパ球の数が癌細胞の増殖を減速させるのに十分であり、観察された腫瘍細胞の増殖速度が、腫瘍細胞およびドナーリンパ球のみが投与されたときの増殖速度と比較して高い場合、化合物は免疫抑制性であると見なされる。投与されるリンパ球の数が癌細胞の増殖を減速するのに不十分であり、観察された腫瘍細胞の増殖速度が、腫瘍細胞およびドナーリンパ球のみが投与されたときの増殖速度と比較して低い場合、化合物は免疫増強性であると見なされる。
【０１１１】
当業者が本明細書で述べた組成物および方法をより良好に実施できるようにするために、以下の実施例を例示目的で与える。
【実施例】
【０１１２】
（実施例１）
（細胞株ＣＬＬ−ＡＡＴの単離）
（細胞株の確立）
ＣＬＬと診断された患者から末梢血を採取した。ＷＢＣカウントは１．６×１０８／ｍｌであった。単核細胞をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７密度勾配遠心分離（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，セントルイス、ミズーリ州）によって単離した。細胞を１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したイスコーブ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で２回洗浄して、氷冷ＩＭＤＭ／１０％  ＦＢＳ  ５ｍｌ中で再懸濁させた。トリパンブルーで染色することによって生細胞をカウントした。細胞を同じ体積の８５％  ＦＢＳ／１５％  ＤＭＳＯと混合して、貯蔵するために液体窒素中で１ｍｌの分割量として凍結させた。
【０１１３】
免疫表現型検査は、ＣＤ４５＋リンパ球個体群の＞９０％がＩｇＤ、カッパ軽鎖、ＣＤ５、ＣＤ１９、およびＣＤ２３を発現することを示した。この個体群は、低レベルのＩｇＭおよびＣＤ２０も発現した。細胞の約５０％が高レベルのＣＤ３８を発現した。細胞はラムダ軽鎖、ＣＤ１０およびＣＤ１３８では陰性であった。
【０１１４】
細胞の分割量を解凍、洗浄、そして２０％熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、および５ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＩＬ−４（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）を添加したＩＭＤＭ中で１０７個／ｍＬの密度にて再懸濁させた。細胞を３７℃にて加湿５％  ＣＯ２雰囲気中で培養した。一定の増殖が観察されるまで、培地を４日ごとに一部交換した。５週間後、培養物中の細胞の数は、約４日ごとに倍増しはじめた。この細胞株をＣＬＬ−ＡＡＴと名付けた。
【０１１５】
（細胞株の特徴付け）
フローサイトメトリーによる細胞株の免疫表現型検査は、ＩｇＭ、カッパ軽鎖、ＣＤ２３、ＣＤ３８、およびＣＤ１３８の高い発現、ＣＤ１９およびＣＤ２０の中程度の発現、そしてＩｇＤおよびＣＤ５の弱い発現を示した。細胞株はラムダ軽鎖、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ１０に対して陰性であった。
細胞株の免疫表現型検査も、全細胞ＥＬＩＳＡによって、一次Ｂ−ＣＬＬ細胞への特異性結合のために選択されたウサギｓｃＦｖ抗体のパネルを使用して実施した。これらのＣＬＬ特異性ｓｃＦｖ抗体はすべて、ＣＬＬ−ＡＡＴ細胞株も認識した。これに対して、ｓｃＦｖの大多数は、Ｂ細胞リンパ腫に由来する２つの細胞株：バーキットリンパ腫細胞株のＲａｍｏｓ、および非ホジキンリンパ腫細胞株のＲＬに結合しなかった。
【０１１６】
（実施例２）
（抗体ファージ提示および細胞表面パニングを使用する、Ｂ−ＣＬＬ特異性細胞表面抗原に対するｓｃＦｖ抗体の選択）
（免疫化およびｓｃＦｖ抗体ライブラリー構成）
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＳｃｒｉｐｐｓ  Ｃｌｉｎｉｃ（ラホーヤ、カリフォルニア州）にてＣＬＬ患者から採取した血液から単離した。ウサギ２匹をＣＬＬの異なるドナー１０名からプールしたＰＢＭＣ  ２×１０７個によって免疫化した。３回の免疫化、すなわち２回の皮下注射と、それに続く１回の静脈内注射を３週間の間隔で実施した。血清力価は、フローサイトメトリーを使用して血清ＩｇＧの一次ＣＬＬ細胞への結合を測定することによって確認した。最後の免疫化の５日後に、該動物から脾臓、骨髄、およびＰＢＭＣを採取した。Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ）を使用して、全ＲＮＡをこれらの組織から単離した。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体ファージ提示ライブラリーを前に述べたように構成した（Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州）。細胞表面パニングでは、再増幅ライブラリーからのファージミド粒子をポリエチレングリコー（ＰＥＧ）によって沈降させ、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で再懸濁させて、ＰＢＳで一晩透析した。
【０１１７】
（細胞表面パニングによる抗体選択）
ライブラリーは、Ｓｉｅｇｅｌら（１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０６：７３−８５）によって述べられているように、磁気活性化細胞分離装置（ＭＡＣＳ）を用いた正負の選択によりＣＬＬ細胞表面特異性抗体について濃縮した。簡潔には、ｓｃＦｖ抗体ライブラリーからのファージミド粒子をＭＰＢＳ（２％脱脂粉乳、ＰＢＳ中０．０２％アジ化ナトリウムＰＢＳ、ｐＨ７．４）中で１時間、２５℃にてプレインキュベートして、非特異性結合部位を遮断した。一次ＣＬＬ細胞約１０７個を常磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，サニーベール、カリフォルニア州）に結合したマウス抗ＣＤ５  ＩｇＧおよびマウス抗ＣＤ１９  ＩｇＧで標識した。未結合マイクロビーズを洗浄によって除去した。標識ＣＬＬ細胞（「標的細胞」）を過剰な「抗原−負のアブゾーバ細胞」と混合して、ペレット化して、ファージ粒子５０μｌ（ｃｆｕ  １０１０〜１０１１ｃｆｕ）中へ再懸濁させた。アブゾーバ細胞は、細胞表面に非特異的に付着するファージはもちろんのこと、標的およびアブゾーバ細胞の両方に存在する「共通」抗原に対して特異性のファージも吸収するように作用する。使用したアブゾーバ細胞は、免疫磁気的負の選択（ＳｔｅｍＳｅｐ  ｓｙｓｔｅｍ，ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，バンクーバー、カナダ）によって末梢血から単離されたＴＦ−１細胞（ヒト赤白血病細胞株）または正常ヒトＢ細胞のどちらかであった。アブゾーバ細胞の標的細胞に対する比は体積で約１０倍であった。２５℃での３０分間のインキュベーションの後、細胞／ファージ混合物をＭｉｎｉＭＡＣＳ  ＭＳ＋分離カラムに移した。カラムをＭＰＢＳ  ０．５ｍｌで２回、そしてＰＢＳで１回洗浄して、未結合ファージおよびアブゾーバ細胞を除去した。標的細胞をＰＢＳ  １ｍｌ中でカラムから溶出させて、最高速度の微量遠心機で１５秒間に渡ってペレット化した。捕獲されたファージ粒子は、酸溶出緩衝液（グリシンによってｐＨを２．２に調整した０．１Ｎ  ＨＣｌ、および１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）２００μｌ中で標的細胞を再懸濁させることによって溶出させた。２５℃での１０分間のインキュベーションの後、緩衝液を２Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基、ｐＨ１０．５  １２μＬによって中和して、溶出したファージを次回のパニングの間に、Ｅ．ｃｏｌｉ中で増幅した。各回のパニングでは、インプットおよびアウトプットファージ力価を決定した。インプット力価は、標的細胞／アブゾーバ細胞混合物に添加した再増幅ファージ粒子の数であり、アウトプット力価は、標的細胞から溶出した捕獲ファージの数である。濃縮因子（Ｅ）は、式Ｅ＝（Ｒｎアウトプット／Ｒｎインプット）／（Ｒ１アウトプット／Ｒ１インプット）、式中、Ｒ１＝１回およびＲｎ＝２、３、または４回を使用して計算する。大半の場合、１０２〜１０３倍の濃縮因子は、３回目または４回目に達成されるはずである。
【０１１８】
（パニング後の濃縮抗体プールの分析）
３〜５回のパニングの後、捕獲ファージのプールをＣＬＬ細胞への結合について、フローサイトメトリーおよび／または全細胞ＥＬＩＳＡによってアッセイした：
１．ＨＡ−ｔａｇｇｅｄ溶解性抗体の形で全体のプールを生成するために、非サプレッサ系のＥ．ｃｏｌｉ（たとえばＴＯＰ１０Ｆ’）２ｍｌにファージミド粒子１μｌ（ｃｆｕ  １０９〜１０１０）を感染させた。元のパニングされていないライブラリーを負の対照として使用した。カルベニシリンを最終濃度１０μＭまで添加して、培養物を３７℃にて２５０ｒｐｍで振とうしながら１時間インキュベートした。５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有するＳＢ培地８ｍｌを添加して、培養物を〜０．８のＯＤ  ６００まで培養した。ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭまで添加して、ＬａｃプロモータからｓｃＦｖ発現を誘発して、３７℃での振とうを４時間継続した。培養物を３０００ｘｇにて１５分間遠心分離にかけた。溶解性抗体を含有する上澄みを濾過して、−２０℃にて１ｍｌの分割量で貯蔵した。
【０１１９】
２．ｓｃＦｖ抗体プールの標的細胞対アブゾーバ細胞への結合を、フローサイトメトリーによって、高親和性ラット抗ＨＡ（クローン３Ｆ１０、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を二次抗体として、ＰＥ結合ロバ抗ラットを三次抗体として使用して決定した。
【０１２０】
３．抗体プールの標的細胞対アブゾーバ細胞への結合も、全細胞ＥＬＩＳＡによって以下に述べるように決定した。
【０１２１】
（パニング後の個別ｓｃＦｖクローンのスクリーニング）
パニング後に個別ｓｃＦｖクローンをスクリーニングするために、ＴＯＰ１０Ｆ’細胞にファージプールを上述のように感染させて、カルベニシリンおよびテトラサイクリンを含有するＬＢプレートに散布して、３７℃にて一晩インキュベートした。個別のコロニーを、ウェル当たりＳＢ−カルベニシリン培地を０．６〜１．０ｍｌ含有する深９６ウェルプレートへ接種した。培養物をＨｉＧｒｏ振とうインキュベータ（ＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅｓ，サンカルロス、カリフォルニア州）で５２０ｒｐｍおよび３７℃にて６〜８時間培養した。この時点で、各ウェルから９０μｌの分割量をＤＭＳＯ  １０μｌを含有する深９６ウェルプレートに移した。この複製プレートを−８０℃にて貯蔵した。元のプレートにＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭまで添加して、振とうを３時間継続した。プレートを３０００ｘｇにて１５分間遠心分離にかけた。溶解性ｓｃＦｖ抗体を含有する上澄みを別の深９６ウェルプレートに移して、−２０℃にて貯蔵した。
【０１２２】
ＨＡ−ｔａｇｇｅｄ  ｓｃＦｖ抗体をスクリーニングするための感受性全細胞ＥＬＩＳＡ方法を開発した：
１．ＥＬＩＳＡプレートをコンカナバリンＡ（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．６、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２中１０ｍｇ／ｍｌ）でコーティングする。
【０１２３】
２．プレートをＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ  ５０μｌ中の標的細胞またはアブゾーバ細胞０．５〜１×１０５個を各ウェルに添加して、プレートを２５０ｘｇにて１０分間遠心分離にかける。
【０１２４】
３．ＰＢＳ中の０．０２％グルタルアルデヒド５０μｌを添加して、細胞を４０℃にて一晩固定する。
【０１２５】
４．ＰＢＳで洗浄した後、非特異性結合部位を、４％脱脂粉乳を含有するＰＢＳによって室温にて３時間遮断する。
【０１２６】
５．細胞を溶解性、ＨＡ−ｔａｇｇｅｄ  ｓｃＦｖまたはＦａｂ抗体（ＴＯＰ１０Ｆ’上澄み）５０μｌによって室温で２時間インキュベートして、次にＰＢＳで６回洗浄する。
【０１２７】
６．結合した抗体を、マウス抗ＨＡ二次抗体（クローン１２ＣＡ５）およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合抗マウスＩｇＧ三次抗体を使用して検出する。シグナルの約１０倍の増幅は、ＡＭＤＥＸ  ＡＰ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧを三次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）として使用することによって得られる。ＡＭＤＥＸ抗体はデキストラン主鎖を介して複数のＡＰ分子に結合される。アルカリホスファターゼ基質ＰＮＰＰによって呈色され、マイクロプレートリーダーを使用して４０５ｎｍにて測定する。
【０１２８】
ｓｃＦｖクローンの一次スクリーニングは、一次ＣＬＬ細胞対正常ヒトＰＢＭＣに対するＥＬＩＳＡによって行った。ＣＬＬ細胞で陽性であり、正常ＰＢＭＣで陰性であるクローンは、正常ヒトＢ細胞、ヒトＢ細胞株、ＴＦ−１細胞、およびＣＬＬ−ＡＡＴ細胞株に対するＥＬＩＳＡによって再スクリーニングした。クローンは別個の患者３名から単離したＣＬＬ細胞に対するＥＬＩＳＡによっても再スクリーニングして、患者特異性または血液型特異性抗原を認識するクローンを除去した。代表的なＥＬＩＳＡによる結果を図２〜６に示し、図９Ａ〜９Ｃにまとめる。
【０１２９】
得られたユニークなｓｃＦｖ抗体クローンの数をＤＮＡフィンガープリンティングおよび配列決定によって決定した。ｓｃＦｖ  ＤＮＡインサートをプラスミドからＰＣＲによって増幅して、制限酵素ＢｓｔＮＩによって消化した。得られた断片を４％アガロースゲル上で分離して、臭化エチジウムによって染色した。異なる制限断片パターンを有するクローンは、異なるアミノ酸配列を持つ必要がある。同一パターンを持つクローンはおそらく、同様または同一の配列を有する。ユニークなＢｓｔＮＩフィンガープリントを有するクローンは、ＤＮＡ配列決定によってさらに分析した。２５個の異なる配列が見出され、密接に関連する相補性決定領域を持つ１６グループの抗体にクラスター化できた（図９Ａ〜９Ｃ）。
【０１３０】
（ｓｃＦｖ抗体のフローサイトメトリーによる特徴付け）
複数のｓｃＦｖ抗体の結合特異性を３色フローサイトメトリーによって分析した（図７）。正常ドナーから単離したＰＢＭＣをＦＩＴＣ結合抗ＣＤ５およびＰｅｒＣＰ結合抗ＣＤ１９によって染色した。ｓｃＦｖ抗体による染色は、ビオチン結合抗ＨＡを二次抗体として、そしてＰＥ結合ストレプトアビジンを使用して行った。３つの抗体、すなわちｓｃＦｖ−２、ｓｃＦｖ−３、およびｓｃＦｖ−６は、ＣＤ１９＋Ｂリンパ球個体群を特異的に認識することが見出された（データは示さず）。第４の抗体ｓｃＦｖ−９は、２つの別個の細胞個体群：ＣＤ１９＋Ｂリンパ球およびＣＤ５＋Ｔリンパ球のサブセットを認識した（図７）。Ｔ細胞サブセットのさらなる特徴付けは、それがＣＤ４＋ＣＤ８−ＴＨ細胞のサブ個体群であることを示した（データは示さず）。
【０１３１】
ｓｃＦｖ抗体によって認識された抗原が一次ＣＬＬ細胞で過剰発現されるかどうかを判定するために、ＣＬＬ患者５名および正常ドナー５名からのＰＭＢＣをｓｃＦｖで染色して、フローサイトメトリーによって比較した（図８および表２）。陽性細胞個体群の平均蛍光強度を比較することによって、ＣＬＬ細胞対正常細胞での抗原の相対発現レベルを決定できる。１つの抗体、すなわちｓｃＦｖ−２は正常ＰＢＭＣよりも低い強度でＣＬＬ細胞を常に染色したのに対して、ｓｃＦｖ−３およびｓｃＦｖ−６はどちらも、正常ＰＢＭＣよりも鮮やかにＣＬＬ細胞を常に染色した。第４の抗体ｓｃＦｖ−９は、ＣＬＬサンプル５つのうち２つを正常ＰＢＭＣよりもはるかに強く染色したが、残り３つのＣＬＬサンプルには中程度に鮮やかな染色のみを与えた（図８および表２）。これはｓｃＦｖ−３およびｓｃＦｖ−６の抗原が、すべてではないにしても大半のＣＬＬ腫瘍にて約１．４倍過剰発現されるのに対して、ｓｃＦｖ−９がＣＬＬ腫瘍のサブセットにて３〜６倍過剰発現されることを示す。
【０１３２】
ＣＬＬ患者は２つのほぼ等しい群に分割できる：不十分な予後の患者（中間生存期間８年）および好ましい予後の患者（中間生存期間２６年）。ＣＬＬについて複数の好ましくない予後の指標が確認されており、最も顕著には体細胞変異のないＶＨ遺伝子の存在および高いパーセンテージのＣＤ３８＋Ｂ細胞の存在である。ＣＬＬ患者のサブセットのみで過剰発現された抗原を認識するため、ｓｃＦｖ−９抗原過剰発現がＣＬＬ患者１０名からの血液サンプル中のパーセンテージと相関したかどうかを判定することが求められた（図１１）。結果は、ｓｃＦｖ−９抗原過剰発現およびＣＤ３８＋細胞のパーセントが相互に完全に独立していることを示す。
【０１３３】
（ｓｃＦｖ抗体によって認識された抗原の、免疫沈降（ＩＰ）および質量分光分析（ＭＳ）による同定）
これらの抗体に対する抗原を同定するために、ｓｃＦｖを使用して、細胞表面ビオチン化ＣＬＬ−ＡＡＴ細胞のミクロソーム画分から調製した溶解物から抗原を免疫沈降させた（図１２）。免疫沈降された抗原をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって精製して、マトリックス支援レーザーイオン化質量分光分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）または毛細管逆相ＨＰＬＣナノ電子スプレータンデム質量分光分析（μＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）によって同定した（データは示さず）。ｓｃＦｖ−２は、１１０ｋｄ抗原をＲＬおよびＣＬＬ−ＡＡＴ細胞の両方から免疫沈降させた（図１２）。この抗原をＭＡＬＤＩ−ＭＳによってＢ細胞特異性マーカーＣＤ１９として同定した。ｓｃＦｖ−３およびｓｃＦｖ−６はどちらも、４５ｋｄ抗原をＣＬＬ−ＡＡＴ細胞から免疫沈降させた（示さず）。この抗原はＭＡＬＤＩ−ＭＳによって、ＣＬＬおよび活性化Ｂ細胞の公知のマーカーであるＣＤ２３として同定された。ｓｃＦｖ−９は、５０ｋｄ抗原をＣＬＬ−ＡＡＴ細胞から免疫沈降させた（図１２）。この抗原はμＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって、Ｂ細胞、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞、および胸腺細胞の公知のマーカーであるＯＸ−２／ＣＤ２００として同定された。ＯＸ−２／ＣＤ２００は、一部の非リンパ球細胞、たとえばニューロンおよび内皮細胞でも発現される。
【０１３４】
（実施例３）
ＯＸ−２／ＣＤ２００を発現する細胞が、サイトカイン反応をＴｈ１反応（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ）からＴｈ２反応（ＩＬ−４、ＩＬ−１０）に変化させる能力を、ドナー１名からの単球由来マクロファージ／樹状細胞および別のドナーからの血液由来Ｔ細胞を用いた混合リンパ球反応にて評価した。ＯＸ−２／ＣＤ２００発現細胞源として、以下で述べるＯＸ−２／ＣＤ２００トランスフェクションＥＢＮＡ細胞またはＣＬＬ患者サンプルのどちらかを使用した。
【０１３５】
（２９３−ＥＢＮＡ細胞のトランスフェクション）
２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１００ｍｍ皿に２．５×１０６個にて播種した。２４時間後、Ｐｏｌｙｆｅｃｔ試薬（ＱＩＡＧＥＮ）をメーカーの説明書に従って使用して、細胞を一過性トランスフェクションした。細胞を、ベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のＯＸ−２／ＣＤ２００  ｃＤＮＡ  ７．２μｇおよびｐＡｄＶＡｎｔａｇｅベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．８μｇと同時トランスフェクションした。負の対照として、空のｐＣＥＰ４ベクターおよびｐＡｄＶＡｎｔａｇｅと同時トランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、ｓｃＦｖ−９抗体を用いたフローサイトメトリーで決定されたように、細胞の約９０％がＯＸ−２／ＣＤ２００をその表面で発現した。
【０１３６】
（血液単球からの樹状細胞／マクロファージの成熟）
軟膜をＳａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋから取得し、Ｆｉｃｏｌｌを使用して一次血液リンパ球（ＰＢＬ）を単離した。２％ヒト血清を含有するイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）中で細胞を１時間に渡って付着させ、続いてＰＢＳによって激しく洗浄した。細胞をＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γまたはＭ−ＣＳＦのいずれかの存在下で、３日後にリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を添加して、または添加せずに５日間培養した。成熟した細胞を収集して、γ−照射器（Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  Ｍａｒｋ  Ｉ  Ｍｏｄｅｌ  ３０照射器（Ｃｓ１３７））を使用して２０００ＲＡＤを照射した。
【０１３７】
（混合リンパ球反応）
混合リンパ球反応は、２４ウェルプレートに樹状細胞／マクロファージ５００，０００およびレスポンダ細胞１×１０６個を使用して構成した。レスポンダ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌを使用して末梢血から精製したＴ細胞濃縮リンパ球であった。Ｔ細胞は、細胞を組織培養フラスコ内で１時間インキュベートして、非付着性細胞画分を取ることによって濃縮した。ＯＸ−２／ＣＤ２００トランスフェクションＥＢＮＡ細胞またはＣＬＬ細胞５００，０００個を抗ＣＤ２００抗体（完全ＩｇＧに変換されたｓｃＦｖ−９）３０μｇ／ｍｌの存在下または非存在下で、リンパ球添加の２〜４時間前にマクロファージ／樹状細胞に添加した。上澄みを４８時間および６８時間後に採取して、サイトカインの存在について分析した。
【０１３８】
（ｓｃＦｖ−９の完全ＩｇＧへの変換）
ｓｃＦｖ−９の軽鎖および重鎖Ｖ遺伝子をオーバーラップＰＣＲによって、各遺伝子の可変領域をヒトラムダ軽鎖定常領域遺伝子、およびヒトＩｇＧ１重鎖定常領域ＣＨ１遺伝子とそれぞれ連結するプライマーを用いて増幅した。ｓｃＦｖ−９の軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子の可変領域は、特異性プライマーによって増幅して、ヒトラムダ軽鎖定常領域遺伝子およびＩｇＧ１重鎖定常領域ＣＨ１遺伝子は以下のような特異性プライマーによって個別に増幅した：
【０１３９】
【化１】
2008513354.tif 000003
増幅生成物を精製して、オーバーラップＰＣＲを実施した。
【０１４０】
最終生成物は、Ｘｂａ  Ｉ／Ｓａｃ  Ｉ（軽鎖）およびＸｈｏ  Ｉ／Ｐｉｎ  ＡＩ（重鎖）によって消化して、ヒトＦａｂ発現ベクターのＰＡＸ２４３ｈＧＬ内へクローニングした（その開示が参照によって本明細書に組み入れられている、公開されたＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＷＯ  ２００４／０７８９３７を参照）。ＤＮＡクローンをＰＣＲエラーについてＤＮＡ配列決定によって分析した。ｈＣＭＶ  ＩＥプロモータ遺伝子をＮｏｔ  Ｉ／Ｘｈｏ  Ｉ部位（重鎖の前）に挿入した。ベクターをＸｂａ  Ｉ／Ｐｉｎ  ＡＩ／ＥｃｏＲ  Ｉ／Ｎｈｅ  Ｉにならびに軽鎖およびｈＣＭＶ  ＩＥプロモータを含有する３４７２ｂｐ断片よって消化して、重鎖遺伝子をＩｇＧ１発現ベクターのＸｂａ  Ｉ／Ｐｉｎ  ＡＩ部位に移動した。
【０１４１】
（サイトカイン分析）
完全ＩｇＧに変換されたｓｃＦｖ−９の、混合リンパ球反応におけるサイトカインプロフィールに対する効果を判定した。
【０１４２】
組織培養物上澄み中に見出されたＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−６などのサイトカインを、ＥＬＩＳＡを使用して定量した。各サイトカインの一致した捕獲および検出抗体の対をＲ＋Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネアポリス、ミネソタ州）から取得して、組換えヒトサイトカインを使用して各サイトカインの標準曲線を作成した。抗サイトカイン捕獲抗体をＰＢＳ中のプレートに最適濃度にてコーティングした。一晩のインキュベーションの後、プレートを洗浄して、１％  ＢＳＡおよび５％スクロースを含有するＰＢＳによって１時間遮断した。０．０５％  Ｔｗｅｅｎを含有するＰＢＳによる３回の洗浄の後、１％  ＢＳＡを含有するＰＢＳ中に上澄みを２倍または１０倍希釈として添加した。捕獲サイトカインを適切なビオチン化抗サイトカイン抗体によって検出して、アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジンおよびＳｉｇｍａＳ基質の添加を続けた。呈色は、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって評価した。
【０１４３】
図１４に示すように、ＯＸ−２／ＣＤ２００トランスフェクションされたが、未トランスフェクションではない細胞の存在は、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γなどのＴｈ１サイトカインのダウンレギュレーションを生じた。３０μｇ／ｍｌでの抗ＣＤ２００抗体の添加はＴｈ１反応を完全に回復し、抗体がＯＸ−２／ＣＤ２００とそのレセプターとの間の相互作用を遮断したことを示す。
【０１４４】
図１５および１６に示すように、混合リンパ球反応におけるＣＬＬ細胞の存在は、Ｔｈ１反応のダウンレギュレーションを生じた（図１５はＩＬ−２の結果を示す；図１６はＩＦＮ−γの結果を示す）。このことは、ＯＸ−２／ＣＤ２００を過剰発現する細胞（ＩＢ、ＥＭ、ＨＳ、ＢＨ）だけでなく、ＯＸ−２／ＣＤ２００を過剰発現しなかったＣＬＬ細胞（ＪＲ、ＪＧおよびＧＢ）（これらの細胞の発現レベルを図１１に示す）にも当てはまる。しかしながら抗ＣＤ２００抗体はＯＸ−２／ＣＤ２００を過剰発現する細胞においてＴｈ１反応を回復するだけであり、ＯＸ−２／ＣＤ２００を発現する患者では、マクロファージでのＯＸ−２／ＣＤ２００のそのレセプターとの間の相互作用を排除することがＴｈ１反応を回復するのに十分であることを示した。ＯＸ−２／ＣＤ２００を過剰発現しなかった患者では、Ｔｈ１反応のダウンレギュレーションに他の機構が関与しているように思われた。
抗ＣＤ２００の腫瘍拒絶に対する効果を試験するための動物モデル
ＲＡＪＩリンパ腫の腫瘍増殖がＰＢＬの同時注射によって防止されるモデルを確立した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにＲＡＪＩ細胞４×１０６個、異なるドナーからのヒトＰＢＬ  １×１０６、５×１０６または１０×１０６細胞の存在下または非存在下のどちらかで皮下注射した。腫瘍の長さおよび幅はもちろんのこと、体重も週に３回測定した。すべての群の腫瘍体積の平均＋／−ＳＤを図１７ＡおよびＢに示す。２つのパラメトリック検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定およびＷｅｌｃｈの検定）および１つのノンパラメトリック検定（Ｗｉｌｃｏｘ検定）を使用して、統計分析を実施した。統計分析の結果は図１８に見出される。ＲＡＪＩ細胞は許容される変動の皮下腫瘍を形成する。拒絶は、特定のドナーおよびＰＢＬ細胞数に依存する。ＰＢＬ  １×１０６個は腫瘍増殖を防止するには不十分であった。第２２〜４３日がＰＢＬ  ５×１０６個のドナー２および第３６日から開始するＰＢＬ  ５×１０６または１×１０７個のドナー３は、腫瘍増殖を著しく低減した。ドナー４は、第４８日以降はほとんど有意である。
【０１４５】
抗ＣＤ２００の効果を試験するために、ＲＡＪＩ細胞にＣＤ２００を安定にトランスフェクションする。動物には、前の段落で述べたように注射する。ＣＤ２００トランスフェクション細胞の存在下では、腫瘍はヒトＰＢＬが存在しても増殖する。このモデルでの腫瘍拒絶を評価するために、抗ＣＤ２００抗体を投与する。
【０１４６】
また液状腫瘍モデルを確立する。ＲＡＪＩ細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに腹腔内注射する。細胞は骨髄、脾臓、リンパ節および他の臓器に分散して、麻痺を引き起こす。ヒトＰＢＬの同時注射は、腫瘍増殖を防止または減速する。マウスを運動障害および麻痺の徴候について評価することによって、腫瘍増殖をモニターする。いったんこのような徴候が観察されたら、マウスを殺処分して、腫瘍細胞の数を骨髄、脾臓、リンパ節および血液を含む各種の臓器において、ＦＡＣＳ分析およびＰＣＲによって評価する。
【０１４７】
皮下モデルと同様に、ＣＤ２００トランスフェクション細胞を腹腔内注射する。それらはヒトＰＢＬが存在しても増殖する。抗ＣＤ２００による処置は、腫瘍拒絶または腫瘍増殖の減速を生じる。
【０１４８】
（実施例４）
（ライブラリー構成）
マウスは、マウスＩｇＧ  Ｆｃに融合されたバキュロウイルス発現組換えＣＤ２００細胞外ドメイン（ＣＤ２００−Ｆｃ）（Ｏｒｂｉｇｅｎ  Ｉｎｃ．，サンディエゴ、カリフォルニア州）および全長ＣＤ２００を含有するベクターを一過性トランスフェクションされた２９３−ＥＢＮＡ細胞によって交互に免疫化した。全ＲＮＡは、マウス脾臓からＴＲＩ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．，シンシナティ、オハイオ州）をメーカーのプロトコルに従って使用して調製した。メッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．，バレンシア、カリフォルニア州）をメーカーのマニュアルに従って使用して精製した。第１鎖ｃＤＮＡはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カールスバッド、カリフォルニア州）をメーカーのプロトコルに従って使用して合成した。第１鎖ｃＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼによって消化して、第２鎖ｃＤＮＡを、２００３年３月２７日に公開された、公開ＰＣＴ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＷＯ０３／０２５２０２Ａ２で十分に説明されている方法に従って合成した。第２鎖ｃＤＮＡをＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）によって浄化して、シングルプライマー増幅を２００３年３月２７日に公開された、公開ＰＣＴ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＷＯ０３／０２５２０２Ａ２に述べられている方法に従って実施した。増幅生成物をプールして、ＰＣＲ精製キットによって精製した。カッパ軽鎖をＸｂａ  ＩおよびＢｓｐＥ  Ｉで消化して、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ重鎖をＸｈｏ  ＩおよびＢｉｎ  Ｉによって消化した。消化した断片はゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてアガロースゲルから精製して、２００４年９月１６日に公開された公開ＰＣＴ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＷＯ／０４０７８９３７Ａ２で述べられているように、ＰＡＸ３１３ｍ／ｈＧベクター内へクローニングした。
【０１４９】
（ライブラリーのパニング）
ライブラリー（ＩｇＧ１カッパおよびＩｇＧ２ａカッパ）は、マイクロタイター（Ｃｏｓｔａｒ  Ｇｒｏｕｐ，ベテスダ、メリーランド州）に直接コーティングされた、またはヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ特異性抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．，セントルイス、ミズーリ州）によって捕獲されたいずれかのＣＤ２００−Ｆｃにパニングした。ライブラリーファージの調製では、エレクトロコンピテントＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラホーヤ、カリフォルニア州）をライブラリーＤＮＡによって電気穿孔して、ＳＯＣ培地中で１時間、そしてＳＢ培地中で２時間、カルベニシリンを用いて培養した。ファージ生成は、ＶＣＳ  Ｍ１３ヘルパーファージ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，ピスカタウェイ、ニュージャージー州）および１ｍＭ  ＩＰＴＧの添加により、３０℃にて一晩に渡って誘発させた。培養物を遠沈させて、ファージを４％ポリエチレングリコールおよび３％  ＮａＣｌによって沈降させた。ファージを遠沈させて、関係のない抗原である、マウスＩｇＧ  Ｆｃに融合されたバキュロウイルス発現細胞外ドメイン（ＦＬＪ３２０２８−Ｆｃ）であるＦＬＪ３２０２８（Ｏｒｂｉｇｅｎ，サンディエゴ）を溶解性競合物として含有する、１％  ＢＳＡ／ＰＢＳに再懸濁させた。直接コーティングしたＣＤ２００−Ｆｃに対するパニングでは、４つのウェルをＣＤ２００−Ｆｃ（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ８．６の５μｇ／ｍｌ）１００μｌによって４℃にて一晩コーティングした。ウェルをリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．０で５回洗浄して、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳによって３７℃にて１時間に渡って遮断した。ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃに捕獲されたＣＤ２００−Ｆｃに対するパニングでは、４つのマイクロタイターウェルをヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ  １００μｌ（ＰＢＳ中２０μｇ／ｍｌ）によって４℃にて一晩コーティングした。ウェルをＰＢＳによって５回洗浄して、ＣＤ２００−Ｆｃ（ＰＢＳ中の２０μｇ／ｍｌ）１００μｌによって３７℃にて１時間に渡ってインキュベートした。ウェルをＰＢＳによって５回洗浄して、１％  ＢＳＡ／ＰＢＳによって３７℃にて１時間に渡って遮断した。パニングの直接コーティングおよび捕獲方法では、ブロッカーは別のライブラリー（その開示全体が参考として本明細書中に援用される、２００４年６月２日に提出されたＰＣＴ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｓｅｒｉａｌ  Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ０４／１７１１８（未公開）の実施例３に述べたライブラリー）のＦＬＪ３２０２８に対するパニングから得られた溶解性Ｆａｂの混合物によって置換されて、マウスＩｇＧ  Ｆｃのエピトープをマスクして、ウェルを３７℃にて３０分間インキュベートした。これらのマスキングＦａｂは、ＣＤ２００−Ｆｃにも結合することが示されている。ライブラリーファージをマスキングＦａｂの上部に添加して、ウェルを３７℃にて約１．５時間インキュベートした。未結合ファージをＰＢＳによって厳密性を増強しながら洗浄して（１回目は３回、２回目は５回、３回目および４回目は１０回）、各洗浄のたびに５分間のインキュベーションならびにピペットによる出し入れ５回を行った。結合フ��ージは、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む０．１Ｍ  ＨＣｌ  １００μｌ、ｐＨ２．２によって２回溶出させ、２Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基、ｐＨ１１．５で中和した。新しく培養したＥＲ２７３８細胞を溶出させたファージによって感染させて、カルベニシリンおよびグルコースを含有するＬＢアガロースプレート上へ滴定した。次回のパニングのために、残りのファージをＶＣＳ  Ｍ１３ヘルパーファージおよび１ｍＭ  ＩＰＴＧの添加によって３０〜３７℃にて一晩増殖させる。
【０１５０】
（ライブラリーのスクリーニング）
３および４回目の滴定プレートからの９５コロニーを１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリンおよび５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有するＳＢ  １ｍｌ中で３７℃にて約６時間培養した。ＶＣＳ  Ｍ１３ヘルパーファージを添加して、培養物を３７℃にて２時間インキュベートした。１ｍＭ  ＩＰＴＧおよび７０μｇ／ｍｌカナマイシンを添加して、Ｆａｂ−ファージ生成を３０℃にて一晩誘発した。マイクロタイターウェルをウサギ抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２（ＰＢＳ中４μｇ／ｍｌ）５０μｌ、ＣＤ２００−Ｆｃ（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３中４μｇ／ｍｌ、ｐＨ８．６）、またはＦＬＪ３２０２８−Ｆｃ（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３中４μｇ／ｍｌ、ｐＨ８．６）によって４℃にて一晩コーティングした。ウェルをＰＢＳによって３回洗浄して、１％  ＢＳＡ／ＰＢＳ  １００μｌによって３７℃にて１時間遮断した。培養物を遠沈させた。Ｆａｂ−ファージを含有する培養物上澄みとブロッカーを交換して、ウェルを３７℃にて１．５〜２時間インキュベートした。残りのＦａｂ−ファージは、フローサイトメトリーのために−８０℃にて貯蔵した。プレートをＰＢＳで３回洗浄して、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧＦ（ａｂ’）２抗体５０μｌ（Ｐｉｅｒｃｅ）（１％  ＢＳＡ／ＰＢＳ中１：５００）によって３７℃にて１時間に渡って検出した。プレートをＰＢＳによって３回洗浄して、ＡＰ基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によってｐＮＰＰ緩衝液中で展開した。３回目からのクローンのほぼすべてがすでに、ＣＤ２００に対して特異的に陽性である（図１９Ａ〜Ｄ）。クローンを高スループットフローサイトメトリー分析によってもスクリーニングした。ＣＤ２００（１×１０５細胞）を含む２９３細胞一過性トランスフェクション１００マイクロリットルを９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に分割した。Ｆａｂ−ファージ５０マイクロリットルを細胞に添加して、ピペット操作によって混合して、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を０．０１％  ＮａＮ３を含有する１％  ＢＳＡ／ＰＢＳによって２回洗浄した。細胞を０．０１％  ＮａＮ３を含有する１％  ＢＳＡ／ＰＢＳ中のＰＥ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体１００μｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中に再懸濁させて、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を０．０１％  ＮａＮ３を含有する１％  ＢＳＡ／ＰＢＳによって２回洗浄して、ＰＢＳ中１％パラホルムアルデヒド２００μｌに再懸濁させた。ＣＤ２００発現細胞への陽性結合を示す代表的なクローンを図２０Ａ〜Ｄに示す。
【０１５１】
ＤＮＡ配列を分析して、重鎖の推定アミノ酸配列を相補性決定領域３（ＣＤＲ３）に従ってグループ化した（図２１Ａ、Ｂ）。それらを１７の群に分けた。
【０１５２】
（蛍光ビーズアッセイ）
さらなる分析のために２３個のクローンを選択した。それらはｃＧ２ａＲ３Ｂ５、ｄＧ１Ｒ３Ａ５、ｃＧ２ａＲ３Ａ２、ｄＧ２ａＲ３Ｂ２、ｄＧ１Ｒ３Ａ１、ｃＧ２ａＲ３Ａｌ、ｃＧ２ａＲ３Ｂ、ｄＧ１Ｒ３Ｂ、ｃＧ１Ｒ３Ａ、ｃＧ１Ｒ３Ａ、ｃＧ１Ｒ３Ａ１、ｄＧ１Ｒ３Ｂ、ｄＧ１Ｒ３Ｂ、ｃＧ１Ｒ３Ｃ、ｄＧ２ａＲ３Ｃ、ｄＧ２ａＲ３Ａ１、ｃＧ２ａＲ３Ｂ、ｃＧ２ａＲ３Ｂ、ｄＧ１Ｒ３Ｂ、ｃＧ２ａＲ３Ｂ、ｃＧ２ａＲ３Ｃ、ｄＧ１Ｒ３Ｈ、およびｄＧ２ａＲ３Ａ６であった。選択したＦａｂのＤＮＡをＳｐｅ  Ｉ／Ｎｈｅ  Ｉによって、遺伝子ＩＩＩ除去および溶解性Ｆａｂ発現および精製のために消化した。精製したＦａｂは、ＣＤ２００とそのレセプター（ＣＤ２００Ｒ）との間の相互作用を遮断するその能力について蛍光ビーズアッセイで評価した。ＴｒａｎｓＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓカルボキシラート修飾ミクロスフェア（４８８／６４５）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ユージーン、オレゴン州）にストレプトアビジンを、続いてビオチン標識抗ヒトＦｃ抗体および暴露ウイルス生成ＣＤ２００−Ｆｃタンパク質ををコーティングした。２９３個の細胞にＣＤ２００Ｒを一過性トランスフェクションした。細胞表面発現をＦＡＣＳ分析によって確認した。ＣＤ２００コーティングビーズ１００万個を各種の量の抗ＣＤ２００ＦａｂまたはキメラＩｇＧによって１０分間プレインキュベートしてから、ＣＤ２００Ｒトランスフェクション細胞５０，０００個を添加した。３７℃でのインキュベーションの３０分後、１％  ＢＳＡを含有するＴｒｉｓ緩衝液によって細胞を洗浄して、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒを使用して分析した。Ｆａｂのｃ１Ａ１０、ｃ２ａＢ７、およびｄ１Ａ５は、Ｆａｂ  ６．７μｇ／ｍｌにてＣＤ２００およびＣＤ２００Ｒの相互作用の最善の遮断を示した（図２２）。これらのクローンは、図２１Ａおよび／またはＢにおいてそれぞれｃＧ１Ｒ３Ａ１０、ｃＧ２ａＲ３Ｂ７およびｄＧ１Ｒ３Ａ５と呼ばれる。
【０１５３】
（キメラ化およびＩｇＧ変換）
キメラ化およびＩｇＧ変換のために６つの抗体を選択した（図２３を参照）。それらはｃ１Ａ１０（ｃＧ１Ｒ３Ａ１０）、ｃ２ａＡ１０（ｃＧ２ａＲ３Ａ１０）、ｃ２ａＢ７（ｃＧ２ａＲ３Ｂ７）、ｄ１Ａ５（ｄＧ１Ｒ３Ａ５）、ｄ１Ｂ５（ｄＧ１Ｒ３Ｂ５）、およびｄ１Ｂ１０（ｄＧ１Ｒ３Ｂ１０）であった。キメラ化のために、オーバーラップＰＣＲを実施して、マウスカッパ鎖可変領域およびヒトカッパ鎖定常領域を連結した。マウス重鎖可変領域をクローニングのために、部分ヒトＩｇＧ１定常領域およびＡｐａ  Ｉ部位を含有する３’プライマーによって増幅した。増幅されたカッパ鎖断片および重鎖断片を、カッパ軽鎖ではＸｂａ  Ｉ／Ｎｏｔ  Ｉに、重鎖断片ではＸｈｏ  Ｉ／Ａｐａ  ＩにヒトＩｇＧ１定常領域を含有するＰＡＸ２４３ｈＧＫベクター内へクローニングした（公開されたＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＷＯ  ２００４／０７８９３７を参照）。キメラＦａｂのＣＤ２００への結合は、ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーによって確認した。Ｎｏｔ  Ｉ／Ｘｈｏ  Ｉでの重鎖発現、次に軽鎖および重鎖の、Ｘｂａ  Ｉ／Ｐｉｎ  ＡＩ部位におけるヒトＩｇＧ１発現ベクター内への移動のために、これらのキメラＦａｂは、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモータ（ｈＣＭＶ  ＩＥ  Ｐｒｏ）配列の挿入によって、ＩｇＧへ変換される。このベクターは、哺乳類細胞での軽鎖発現のために、追加のｈＣＭＶ  ＩＥ  Ｐｒｏ配列上流Ｘｂａ  Ｉ部位を含む。ＤＮＡ配列を確認して、哺乳類細胞トランスフェクションのためにＨｉＳｐｅｅｄ  Ｍａｘｉ  ｐｒｅｐカラム（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してｍａｘｉ  ｐｒｅｐ  ＤＮＡを調製した。２９３−ＥＢＮＡ細胞での一過性トランスフェクションをＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（ＱＩＡＧＥＮ）をメーカーのプロトコルに従って使用し、ｐＡｄＶＡｎｔａｇｅベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＵＳ，マジソン、ウィスコンシン州）を添加して実施した。ＮＳ０細胞への安定な細胞株トランスフェクションは、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅをメーカーのプロトコルに従って使用して実施した。小規模一過性トランスフェクションの後、各抗体の培養物上澄みをＥＬＩＳＡによって試験した（図２４）。大規模一過性トランスフェクションの後、各ＩｇＧを培養物上澄みから、ＦＰＬＣを用いた抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２アフィニティカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって精製した。
【０１５４】
精製したＩｇＧは、Ｆａｂについて述べたようにビーズ阻害アッセイで試験した。ＣＤ２００に対して作られた抗体はすべて、以下の図２５に示すように、レセプターリガンド相互作用を非常に良好に遮断した。
【０１５５】
（混合リンパ球反応）
ＣＤ２００のそのレセプターとの間の相互作用の遮断も、ＣＤ２００の存在下での混合リンパ球反応で観察されたＴｈ１からＴｈ２へのサイトカイン移動を防止するかどうかを評価した。Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋから軟膜を取得して、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ−  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して血液リンパ球（ＰＢＬ）を単離した。２％ヒト血清を含有するＥＭＥＭ中で細胞を１時間に渡って付着させ、続いてＰＢＳによって激しく洗浄した。細胞をＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γの存在下で５日間培養した。成熟した細胞を収集して、γ−照射器（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を使用して２０００ＲＡＤを照射した。混合リンパ球反応は、２４ウェルプレートに樹状細胞／マクロファージ５００，０００個およびレスポンダ細胞１×１０６個を使用して構成した。レスポンダ細胞は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅを使用して末梢血から精製したＴ細胞濃縮リンパ球であった。Ｔ細胞は、細胞を組織培養フラスコ内で１時間インキュベートして、非付着性細胞画分を取ることによって濃縮した。ＣＤ２００発現一次照射ＣＬＬ細胞５０００００個を、各種の量の抗ＣＤ２００抗体の存在下または非存在下で樹状細胞に、リンパ球添加の２〜４時間前に添加した。上澄みを４８時間および６８時間後に採取して、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−６などのサイトカインをＥＬＩＳＡを使用して定量した。各サイトカインの一致した捕獲および検出抗体の対をＲ＋Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネアポリス、ミネソタ州）から取得して、組換えヒトサイトカインを使用して各サイトカインの標準曲線を作成した。抗サイトカイン捕獲抗体をＰＢＳ中のプレートに最適濃度にてコーティングした。一晩のインキュベーションの後、プレートを洗浄して、１％  ＢＳＡおよび５％スクロースを含有するＰＢＳによって１時間遮断した。０．０５％  Ｔｗｅｅｎを含有するＰＢＳによる３回の洗浄の後、１％  ＢＳＡを含有するＰＢＳ中の指示された希釈物に上澄みを添加した。捕獲サイトカインを適切なビオチン化抗サイトカイン抗体によって検出して、アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジンおよびＳｉｇｍａＳ基質の添加を続けた。呈色は、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，サニーベール、カリフォルニア州）によって評価した。図２６ＡおよびＢに示すように、ＣＬＬ細胞の存在は、混合リンパ球反応で観察されたＩＦＮ−γおよびＩＬ−２生成の大半を完全に排除した。いずれかの抗体の存在は、Ｔｈ１サイトカインの生成を許容した（図２６ＡおよびＢ）。これに対して、ＩＬ−１０の生成は、抗体の存在下でダウンレギュレートされた（図２６Ｃを参照）。
【０１５６】
（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性アッセイ）
さらに６つのキメラマウス抗ＣＤ２００抗体を、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性アッセイ（ＡＤＣＣ）でＣＤ２００発現腫瘍細胞を殺すその能力について評価した。ＣＤ２００をトランスフェクションされた２９３−ＥＢＮＡ細胞に培地０．５ｍｌ中、３７℃にて、１００μＣｉ／１００万細胞で標識した。３回の洗浄後、細胞をカウントして、培地（１０％  ヒトＡＢ血清を添加したＲＰＭＩ）中で２０万／ｍｌにて再懸濁させて、５０μｌ（１０，０００細胞／ウェル）を３つずつ、９６ウェル丸底プレートに分配した。最終濃度２０μｇ／ｍｌを達成するために、抗ＣＤ２００抗体２０μｌを各ウェルに分配した。末梢血単核細胞（エフェクター細胞）をＦｉｃｏｌｌ勾配で単離して、赤血球を塩化アンモニウムによって溶解させ、洗浄して、培地に再懸濁させて、細胞５０μｌを各ウェルに分配した。アッセイプレートを回転させて（１，５００ｒｐｍ／５分／弱ブレーキ）、細胞培養インキュベータに移した。４時間後、アッセイプレートを前と同様に回転させた。上澄み３６μｌをピコプレートに移して、ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−２０カクテル２５０μｌと混合して、オービタルシェーカーに２分間置いて、Ｔｏｐ  ｃｏｕｎｔで読み取った。図２７に示すように、ＣＤ２００陽性細胞と培養したときに、マウスキメラＣＤ２００抗体すべてが同様の溶解レベルを生じた。ＣＤ２００陰性細胞では溶解は観察されなかった。加えて溶解の程度は、アイソタイプ対照抗体ｄ２Ａ６（抗ＦＬＪ３２０２８抗体）と比較したときに、統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。
【０１５７】
（実施例５）
（Ｒａｊｉ／ＰＢＬモデル）
ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ＜ｓｃｉｄ＞マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、ＲＡＪＩ細胞４×１０６個（ＡＴＣＣ）を含有するＲＰＭＩ  ２００μｌをＰＢＬ  ０、１００万、５００万または１０００万個と共に皮下注射した。各群にマウス９または１０匹を入れた。ＰＢＬを全塩化アンモニウム２５０ｍｌから単離した。腫瘍増殖は、カリパスで長さおよび幅を測定することによって、週３回モニターした。腫瘍増殖は、長さｘ幅ｘ幅／２に基づいて計算した。
【０１５８】
腫瘍細胞のみを与えた群と比較したＰＢＬを注射した群間の相違を、対応のない両側Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定によって分析した。有意差は、ＰＢＬ  ５００万または１０００万個を与えた群では見られたが、第３２日からＰＢＬ  １００万個を与えた群では見られなかった。図２８に示したデータは、各種のＰＢＬドナーを使用した実験１０回の代表的な例である。
【０１５９】
（Ｎａｍａｌｗａ  ＰＢＬモデル）
ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ＜ｓｃｉｄ＞マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、バーハーバー、メイン州）に、Ｎａｍａｌｗａ細胞４×１０６個（ＡＴＣＣ）を含有するＲＰＭＩ  ２００μｌを、ＰＢＬ  ０、２００万または１０００万個と共に皮下注射した。各群にマウス９または１０匹を入れた。ＰＢＬを全血２５０ｍｌからｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配で単離して、０．９％塩化アンモニウムを使用して赤血球溶解を続けた。腫瘍増殖は、カリパスで長さおよび幅を測定することによって、週３回モニターした。腫瘍増殖は、長さｘ幅ｘ幅／２に基づいて計算した。
【０１６０】
図２９は、対応のない両側Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定によって分析した、腫瘍細胞のみを与えた群と比較したＰＢＬを注射した群間の相違を示す。有意差は、両方のドナーでＰＢＬ  １０００万個を与えた群で見られたが、第８日からＰＢＬ  ２００万個を与えた群では見られなかった。
【０１６１】
（安定なＣＤ２００発現細胞株の生成）
安定なＣＤ２００発現ＲａｊｉおよびＮａｍａｌｗａ細胞株は、Ｖｉｒａｐｏｗｅｒ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールスバッド、カリフォルニア州）を使用して産生した。ＣＤ２００  ｃＤＮＡを一次ＣＬＬ細胞からＲＴ−ＰＣＲによって、フォワードプライマー５’−ＧＡＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＧＧＡＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＧＧＴＧＡ−３’（配列番号２１２）およびリバースプライマー５’−ＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＣＣＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＴＴＴＣＴＣ−３’（配列番号２１３）を使用して単離した。ＰＣＲ生成物をＧａｔｅｗａｙエントリベクターｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯ−ＴＡへクローニングして、個々のクローンを配列決定した。正しい配列のクローンをセンスおよびアンチセンス方向の両方でレンチウイルスベクターｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５／ＤＥＳＴおよびｐＬｅｎｔｉ６／ＵｂＣ／Ｖ５／ＤＥＳＴ内へ、Ｇａｔｅｗａｙ技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールスバッド、カリフォルニア州）を用いて組込んだ。この２つのベクターの主な相違は、ＣＤ２００発現を引き起こすために使用されたプロモータである：ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５／ＤＥＳＴがヒトＣＭＶ前初期プロモータを含有するのに対して、ｐＬｅｎｔｉ６／ＵｂＣ／Ｖ５／ＤＥＳＴはヒトユビキチンＣプロモータを含有する。
【０１６２】
高力価ＶＳＶ−Ｇシュードタイプレンチウイルスストックを２９３−ＦＴ細胞の一過性同時トランスフェクションによって、製造者が推奨するように生成した。ＲａｊｉまたはＮａｍａｌｗａ細胞は、１２μｇ／ｍｌポリブレンを含有する増殖培地１ｍｌ中に細胞１０６個を再懸濁させて、レンチウイルスストック１ｍｌを添加することによって形質導入した。３７℃にて一晩インキュベートした後、ウイルスを含有する培地を除去して、新しい培地４ｍｌと交換した。２日後、感染した細胞をＣＤ２００発現についてフローサイトメトリーによって分析した。すべての実験で、細胞の≧７０％がＣＤ２００＋であったのに対して、親細胞株および負の対照（アンチセンスＣＤ２００）ウイルスを形質導入された細胞ではＣＤ２００は検出できなかった。
【０１６３】
ＣＤ２００を過剰発現するクローン細胞株を単離するために、感染した細胞をブラストサイジンによって１３日間に渡って選択した。使用したブラストサイジンの濃度はＲａｊｉ細胞では６μｇ／ｍｌ、Ｎａｍａｌｗａ細胞では２μｇ／ｍｌであった。次に安定なクローンを、ブラストサイジン耐性細胞の希釈を制限することによって９６ウェルプレート内へ単離した。クローンは、９６ウェル形式でフローサイトメトリーによって、ＰＥ結合マウス抗ヒトＣＤ２００（クローンＭＲＣ  ＯＸ１０４、Ｓｅｒｏｔｅｃ）および高スループットサンプラーを装備したＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを使用してスクリーニングした。２０００  Ｒａｊｉおよび２０００  Ｎａｍａｌｗａクローン全体をスクリーニングした後、ＣＤ２００発現が最高であるこれらのクローンをさらなる特徴付けの後に旧来の技法を用いて膨張させた。
【０１６４】
（ＲＡＪＩ／ＰＢＬモデルにおけるＣＤ２００の免疫抑制効果）
開示した方法に従って、ＣＤ２００をＣＬＬ細胞でアップレギュレートされることを証明した。この分子のアップレギュレーションは、潜在的に免疫抑制性でありうる。ＣＤ２００を発現する癌細胞が免疫系に癌細胞を根絶させるかどうかを試験するために、通常はＣＤ２００を発現しないＲＡＪＩ細胞に、ＣＤ２００をコードするレンチウイルスベクター系を上述のように感染させた。ＣＤ２００を安定して発現するＲＡＪＩクローンを選択した。ベクター感染の効果を確実なくすための対照として、ＣＤ２００の逆転非機能形（ＣＤ２００ｒｅｖ）を発現するクローンも選択した。ＣＤ２００を発現するＲＡＪＩ細胞、ＣＤ２００ＲＥＶまたは親ＲＡＪＩ細胞をＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ＜ｓｃｉｄ＞マウスに皮下注射した。試験には以下の群を含めた：
群１：ＲＡＪＩ  ４×１０６個、皮下；マウス９匹
この群は、レンチウイルス形質導入細胞が親細胞と同様の増殖を示すようにする必要があった。
【０１６５】
群２：ＲＡＪＩＣＤ２００  ４×１０６個、皮下；マウス９匹
この群は、ＣＤ２００形質導入細胞が親細胞と同様の増殖を示すようにする必要があった。またこの群は、最大の腫瘍増殖を与えるであろう。群３および群４をこの群と比較した。
【０１６６】
群３：ＲＡＪＩＣＤ２００  ４×１０６個＋ＰＢＬ  ５×１０６個、皮下；マウス９匹
このＰＢＬ数は、以前の実験で一部のマウスの腫瘍増殖を低減することが示されている。拒絶は、細胞１０００万個ほど強力ではないが、ＣＤ２００がある数の細胞のみに影響を及ぼしうるかどうか判定するためであり、５×１０６個は、拒絶を得るために使用できるＰＢＬの最小量である；拒絶は、ＣＤ２００の存在によって防止されるはずである。
【０１６７】
群４：ＲＡＪＩＣＤ２００  ４×１０６個＋ＰＢＬ  １０×１０６個、皮下；マウス８匹
これはＲＡＪＩ／ＰＢＬモデルで拒絶を確認するための、ＰＢＬの最適数である。目的は、ＣＤ２００発現がこの拒絶を防止するということである。
【０１６８】
群５：ＲＡＪＩＣＤ２００ｒｅｖ  ４×１０６個、皮下；マウス９匹
この群は、レンチウイルス形質導入細胞が親細胞と同様の増殖を示すようにする必要があった。
【０１６９】
群６：ＲＡＪＩＣＤ２００ｒｅｖ  ４×１０６個＋ＰＢＬ  ２×１０６個、皮下；マウス９匹
この数のＰＢＬは、強力な拒絶または腫瘍増殖の低減を生じるはずがない。これは群３および群４（最大予想腫瘍増殖）の正の対照である。この群で拒絶がない場合、ドナーＰＢＬは過剰に活性化されて、ＣＤ２００による効果の不足を説明できるほうから開始する。
【０１７０】
群７：ＲＡＪＩＣＤ２００ｒｅｖ  ４×１０６個＋ＰＢＬ  ５×１０６個、皮下；マウス９匹
ＣＤ２００群３で観察されたすべての効果がＣＤ２００に実際に関連しており、レンチウイルス形質導入には関連していないという対照。
【０１７１】
群８：ＲＡＪＩＣＤ２００ｒｅｖ  ４×１０６個＋ＰＢＬ  １０×１０６個、皮下；マウス８匹
ＣＤ２００群４で観察されたすべての効果がＣＤ２００に実際に関連しており、レンチウイルス形質導入には関連していないという対照。
【０１７２】
許容限界を超えたサイズに達した腫瘍に基づいて、第３８日に動物を殺処分した。動物４匹／群から腫瘍を除去した。腫瘍２個／群をＯＣＴで凍結させて、他の２個は細胞を単離して、ＦＡＣＳによってＣＤ２００発現について分析するために使用した。図３０（ａ〜ｃ）は、本試験の結果を示す。
【０１７３】
ＲＡＪＩＣＤ２００細胞は多少より低速に増殖するように思われるが、形質導入細胞と親細胞との増殖差は、図３０（ａ）に示すように統計的有意には達しなかった。
【０１７４】
ＰＢＬ  ５または１０×１０６個を注射したときに、ＰＢＬの存在は腫瘍増殖を８４％まで減速したが、一般にＰＢＬ  １０×１０６個は、ＰＢＬ  ５×１０６個と比較して、時間に関してより強力な減速を引き起こした。親腫瘍細胞と比較した増殖の減速は第２０日から著しかった。ＰＢＬ  ２×１０６個は第２２日〜第２９日に著しい腫瘍増殖の減速を引き起こしたが、その減速は後の時点で克服された（図３０（ｂ））。本試験は、この特定のドナーがＲＡＪＩ腫瘍細胞を非常に強力に拒絶することを示した。
【０１７５】
ＣＤ２００発現ＲＡＪＩ細胞およびＰＢＬを投与した群の腫瘍増殖は、ＲＡＪＩ細胞のみを投与した群の腫瘍増殖とは著しく異なっていなかったが、ＰＢＬ  １０×１０６個を投与されたマウスは腫瘍増殖減速の傾向を示し、ただし差は、腫瘍が１００ｍ３に達した後のどの時点でも統計的有意には達しなかった。ＲＡＪＩ細胞およびＰＢＬ  ５×１０６個を投与した群の各マウスは第２の腫瘍を発症して、一部のマウスは第７日という早期に発症したが、これは任意の他の群では観察されなかった。分析のために、第２の腫瘍を第１の腫瘍に加えて、合せたサイズを図３０（ｃ）に示す。
【０１７６】
このような結果は、腫瘍細胞でのＣＤ２００発現が実際に、免疫系による腫瘍増殖の減速を防止することを示す。また本試験は、免疫抑制性化合物または分子を評価するための、ＲＡＪＩ／ＰＢＬモデルの有用性を証明する。
【０１７７】
（Ｎａｍａｌｗａ／ＰＢＬモデルでのＣＤ２００の免疫抑制効果）
ＲＡＪＩ／ＰＢＬモデルで見られる効果が他の腫瘍モデルでも見られるかどうかを評価するために、Ｎａｍａｌｗａ腫瘍細胞もレンチウイルスＣＤ２００系によって感染させて、安定なクローンを選択した。ベクター感染の効果を確実なくすための対照として、ＣＤ２００の逆転非機能形（ＣＤ２００ｒｅｖ）を発現するクローンも選択した。ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ＜ｓｃｉｄ＞マウスに、以下のスキームに従って図３１（ａ）〜（ｄ）に示すように注射した：
群１：Ｎａｍａｌｗａ  ４×１０６個、皮下；マウス９匹
この群は、レンチウイルス形質導入細胞が親細胞と同様の増殖を示すようにする必要があった。
【０１７８】
群２：Ｎａｍａｌｗａ  ＣＤ２００（１Ｄ１２Ｕｂ）４×１０６個、皮下；マウス９匹
この群は、ＣＤ２００形質導入細胞が親細胞と同様の増殖を示すようにする必要があった。またこの群は、最大の腫瘍増殖を与えるであろう。群３および群４をこの群と比較した。
【０１７９】
群３：Ｎａｍａｌｗａ  ＣＤ２００（１Ｄ１２Ｕｂ）４×１０６個＋ＰＢＬ  ５×１０６個、皮下；マウス９匹
このＰＢＬ数は、以前の実験で一部のマウスの腫瘍増殖を低減することが示されている。拒絶は、細胞１０００万個ほど強力ではないが、ＣＤ２００がある数の細胞のみに影響を及ぼすことが可能で、これが最小ＰＢＬである場合、拒絶を得るために使用できる；拒絶はＣＤ２００の存在によって防止されるであろう。
【０１８０】
群４：Ｎａｍａｌｗａ  ＣＤ２００（１Ｄ１２Ｕｂ）４×１０６個＋ＰＢＬ  １０×１０６個、皮下；マウス８匹
これはＮａｍａｌｗａ／ＰＢＬモデルで拒絶を確認するための、ＰＢＬの最適数である。これはＣＤ２００発現がこの拒絶を防止することを示すために実施した。
【０１８１】
群５：Ｎａｍａｌｗａ  ＣＤ２００ｒｅｖ（Ｃ５Ｕｂｒｅｖ）４×１０６個、皮下；マウス９匹
この群は、レンチウイルス形質導入細胞が親細胞と同様の増殖を示すようにする必要があった。
【０１８２】
群６：Ｎａｍａｌｗａ  ＣＤ２００ｒｅｖ  ４×１０６個＋ＰＢＬ  ２×１０６個、皮下；マウス９
この数のＰＢＬは、強力な拒絶または腫瘍増殖の低減を生じるはずがない。これは群３および群４（最大予想腫瘍増殖）の正の対照である。この群で拒絶がない場合、ドナーＰＢＬは過剰に活性化されて、ＣＤ２００による効果の不足を説明できるほうから開始する。
【０１８３】
群７：Ｎａｍａｌｗａ  ＣＤ２００ｒｅｖ  ４×１０６個＋ＰＢＬ  ５×１０６個、皮下；マウス９匹
この群は、ＣＤ２００に関連するが、レンチウイルス形質導入には関連しないＣＤ２００群３の任意の効果を検出するための対照として必要であった。
【０１８４】
群８：Ｎａｍａｌｗａ  ＣＤ２００ｒｅｖ  ４×１０６個＋ＰＢＬ  １０×１０６個、皮下；マウス８匹
この群は、ＣＤ２００に関連するが、レンチウイルス形質導入には関連しないＣＤ２００群４の任意の効果を検出するための対照として必要であった。
【０１８５】
腫瘍の長さおよび幅を週３回評価した。
【０１８６】
すべての腫瘍細胞が迅速な腫瘍増殖を引き起こした。形質導入細胞と親細胞との間に著しい増殖差はなかった。腫瘍は図３１（ａ）に示すように、以前に観察されたよりも侵襲的に増殖する。
【０１８７】
図３１（ｂ）は、ＰＢＬの存在が腫瘍増殖を約５０％減速することを示す。この傾向は第２日から観察された。ＰＢＬ処置群対腫瘍細胞のみを投与した群の差は、ＰＢＬを２００万個または１０００万個注射したときに、第１７日および第１９日に統計的に有意である（両側Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定によって決定されたように）。ＰＢＬ  ５００万個の注射は、腫瘍増殖の減速を引き起こしたが、有意には達しなかった。
【０１８８】
ＣＤ２００発現Ｎａｍａｌｗａ細胞およびＰＢＬを投与した群の腫瘍増殖は、Ｎａｍａｌｗａ細胞のみを投与した群の腫瘍増殖と同様であった（図３１（ｃ））。
【０１８９】
これらのデータは、腫瘍細胞でのＣＤ２００発現がヒト免疫系による腫瘍増殖の減速を防止することを確認している。
【０１９０】
（抗ＣＤ２００抗体による、ＲＡＪＩ／ＰＢＬモデルにおけるＣＤ２００の免疫抑制効果の遮断）
抗ＣＤ２００抗体が腫瘍細胞で発現されたＣＤ２００の免疫抑制効果を遮断できるかどうかを評価するために、ＣＤ２００が形質導入されたＲＡＪＩ細胞をＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ＜ｓｃｉｄ＞マウスに皮下注射して、キメラ抗ＣＤ２００抗体ｄ１Ｂ５およびｃ２ａＢ７ならびに腫瘍細胞を結合しない抗体（ａｌｘｎ４１００）の存在下または非存在下でＰＢＬが腫瘍増殖を低減する能力を評価した。抗体を最初に腫瘍細胞と共に１０ｍｇ／ｋｇまた２．５ｍｇ／ｋｇで、次に以下に示す濃度で週２回静脈内投与した。以下の群を構成した：
１．ＲＡＪＩＣＤ２００  ４×１０６個；マウス１０匹
２．ＲＡＪＩＣＤ２００  ４×１０６個＋ＰＢＬ  ５×１０６個；マウス１０匹
３．ＲＡＪＩＣＤ２００  ４×１０６個＋ＰＢＬ  ５×１０６個＋１００ｍｇ／ｋｇ  ｄ１Ｂ５；マウス１２匹
４．ＲＡＪＩＣＤ２００  ４×１０６個＋ＰＢＬ  ５×１０６個＋２０ｍｇ／ｋｇ  ｄ１Ｂ５；マウス９匹
５．ＲＡＪＩＣＤ２００  ４×１０６個＋ＰＢＬ  ５×１０６個＋１００ｍｇ／ｋｇ  ｃ２ａＢ７；マウス１１匹
６．ＲＡＪＩＣＤ２００  ４×１０６個＋ＰＢＬ  ５×１０６個＋２０ｍｇ／ｋｇ  ｃ２ａＢ７；マウス９匹
７．ＲＡＪＩＣＤ２００  ４×１０６個＋ＰＢＬ  ５×１０６個＋１００ｍｇ／ｋｇ  ａｌｘｎ４１００；マウス９匹。
【０１９１】
腫瘍の長さおよび幅を週に３回測定して、腫瘍体積を腫瘍の長さ＊幅＊幅／２によって計算した。図３３は、予想通り、腫瘍細胞でのＣＤ２００発現が免疫細胞による腫瘍増殖の低減を防止することを示している。しかしながら抗ＣＤ２００抗体の添加は、腫瘍体積を５０〜７５％縮小した。抗体による増殖の低減は、第１８日から試験の終りまでのＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定およびＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ検定によって決定されたように、統計的に有意であった。これに対して、対照抗体による処置は、腫瘍増殖を低減しなかった。これらのデータは、抗癌処置での抗ＣＤ２００の有用性を証明する。また本試験は、免疫調節治療を評価するための、ＲＡＪＩ／ＰＢＬモデルの有用性を証明する。
【０１９２】
（抗ＣＤ２００抗体による、Ｎａｍａｌｗａ／ＰＢＬモデルにおけるＣＤ２００の免疫抑制効果の遮断）
ＲＡＪＩ／ＰＢＬモデルにおいて抗ＣＤ２００抗体によって見られた効果が他の腫瘍モデルでも観察できるかどうかを評価するために、ＣＤ２００が形質導入されたＲＡＪＩ細胞をＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ＜ｓｃｉｄ＞マウスに皮下注射して、キメラ抗ＣＤ２００抗体ｄ１Ｂ５およびｃ２ａＢ７ならびに腫瘍細胞を結合しない抗体（ａｌｘｎ４１００）の存在下または非存在下でＰＢＬが腫瘍増殖を低減する能力を評価した。以下に示す濃度の抗体を最初に腫瘍細胞と共に、次に腫瘍０．５ｃｍ以内では週２回、皮下投与した。以下の群を構成した（別途記載しない限り、マウス１０匹／群）：
１．ＮａｍａｌｗａＣＤ２００  ４×１０６個
２．ＮａｍａｌｗａＣＤ２００  ４×１０６個＋ＰＢＬ  ５×１０６個；マウス１２匹
３．ＮａｍａｌｗａＣＤ２００  ４×１０６個＋ＰＢＬ  ５×１０６個＋１０ｍｇ／ｋｇ  ｄ１Ｂ５；マウス１２匹
４．ＮａｍａｌｗａＣＤ２００  ４×１０６個＋ＰＢＬ  ５×１０６個＋２．５ｍｇ／ｋｇ  ｄ１Ｂ５
５．ＮａｍａｌｗａＣＤ２００  ４×１０６個＋ＰＢＬ  ５×１０６個＋１０ｍｇ／ｋｇ  ｃ２ａＢ７；マウス１２匹
６．ＮａｍａｌｗａＣＤ２００  ４×１０６個＋ＰＢＬ  ５×１０６個＋２．５ｍｇ／ｋｇ  ｃ２ａＢ７
７．ＮａｍａｌｗａＣＤ２００  ４×１０６個＋ＰＢＬ  ５×１０６個＋１０ｍｇ／ｋｇ  ａｌｘｎ４１００。
【０１９３】
腫瘍の長さおよび幅を週に３回測定して、腫瘍体積を腫瘍の長さ＊幅＊幅／２によって計算した。図３４は、予想通り、腫瘍細胞でのＣＤ２００発現が免疫細胞による腫瘍増殖の低減を防止することを示している。しかしながら抗ＣＤ２００抗体の添加は、腫瘍体積を最大９７％縮小した。抗体による増殖の低減は、第１２日から試験の終りまでのＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定およびＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ検定によって決定されたように、統計的に有意であった。これに対して、対照抗体による処置は、腫瘍増殖を低減しなかった。これらのデータによって、抗癌処置での抗ＣＤ２００の有用性、および免疫調節療法での腫瘍／ＰＢＬモデルの使用が確認される。
【０１９４】
（ＲＡＪＩ／ＰＢＬモデルにおける化合物の潜在的な免疫増強効果の検出）
ＣＤ３カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用してＰＢＬから単離したＴ細胞を、ＡＺＮＤ１（抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体）の腹水調製物または対照抗体（ＢＢ５）の腹水調製物と共にインビトロでインキュベートした。ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ＜ｓｃｉｄ＞マウスに次のスキームに従って注射した：
群６：マウス８匹、ＲＡＪＩ  ４×１０６個＋ＡＺＮＤ１増強Ｔ細胞０．８×１０６＋ＰＢＬ  ２×１０６皮下
群５：マウス１０匹、ＲＡＪＩ  ４×１０６個、皮下
群４：マウス８匹、ＲＡＪＩ  ４×１０６個＋ＰＢＬ  ８×１０６個、皮下
群３：マウス８匹、ＲＡＪＩ  ４×１０６個＋新しいＴ細胞０．８×１０６個、皮下
群２：マウス８匹、ＲＡＪＩ  ４×１０６個＋ＡＺＮＤ１増強Ｔ細胞０．８×１０６個、皮下
群１：マウス８匹、ＲＡＪＩ  ４×１０６個＋ＢＢ５．１増強Ｔ細胞０．８×１０６個、皮下
腫瘍の長さおよび幅を３回／週で測定した。
【０１９５】
Ｔ細胞は負の対照ＢＢ５でインキュベートしたＴ細胞は腫瘍増殖を低減しなかったが、ＡＺＮＤ１処置Ｔ細胞は腫瘍増殖を著しく低減しなかった（図３２を参照）。
【０１９６】
これらの結果は、免疫増強化合物の有効性を評価するためにＲＡＪ／ＰＢＬモデルを使用できることを証明する。
【０１９７】
（実施例６）
（ＣＬＬ患者でのＣＤ２００アップレギュレーションの判定）
ＣＬＬ患者１５名からのリンパ球をＦＩＴＣ結合抗ＣＤ５（ｅ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＡＰＣ結合抗ＣＤ１９（ｅ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＰＥ結合抗ＣＤ２００（Ｓｅｒｏｔｅｃ）によって染色した。健常ドナーからのリンパ球をそれに従って染色した。ＣＤ５＋ＣＤ１９＋細胞でのＣＤ２００発現を判定した。以下の表に示すように、ＣＤ２００発現のレベルはＣＬＬ患者サンプル間で変化したが、すべてのＣＬＬサンプルが、正常Ｂ細胞でのＣＤ２００発現と比較して、上昇したレベル（１．６〜４倍の範囲）のより高いＣＤ２００発現を示した。上昇したレベルのＣＤ２００発現を示すＣＣＬ患者を、本明細書で述べる方法によるＣＤ２００処置のために選択した。
【０１９８】
（正常Ｂ細胞と比較したＢ−ＣＬＬ細胞でのＣＤ２００発現のＦＡＣＳ分析）
【０１９９】
【化２】
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（参考文献）
以下の参考文献は、本発明が関係する最新技術をより十分に説明するために、参考として本明細書中に援用される。以下のこのような刊行物または上で参照により組み入れられたものと、本開示との不一致は、本開示を支持して解決されるものとする。
【０２００】
【化３】
2008513354.tif 000005
本明細書で開示された実施形態に対して各種の改良を行えることが理解されるであろう。たとえば当業者が認識するように、本明細書で述べた特異性配列は、ＯＸ−２／ＣＤ２００を結合するのに使用されるポリペプチド、抗体または抗体断片の機能に必ずしも悪影響を及ぼすことなく、わずかに変更できる。たとえば抗体配列内の１個または複数のアミノ酸の置換は、抗体または断片の機能を破壊することなく頻繁に行うことができる。それゆえ本明細書で述べた特異性抗体に対して７０％を超える同一性の程度を有するポリペプチドまたは抗体が本開示の範囲内であることを理解すべきである。特に有用な実施形態において、本明細書で述べた特異性抗体に対して約８０％を超える同一性を有する抗体が検討される。他の有用な実施形態において、本明細書で述べた特異性抗体に対して約９０％を超える同一性を有する抗体が検討される。したがって上の記述は、制限的としてではなく、単に好ましい実施形態の例示として解釈すべきである。当業者は、本開示の範囲および精神から逸脱せずに他の改良を構想するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】磁気活性化細胞分離（ＭＡＣＳ）による抗体ライブラリーの細胞表面パニングに関与する代表的な工程を図式的に示す。
【図２】選択したｓｃＦｖクローンの一次Ｂ−ＣＬＬ細胞への結合および正常ヒトＰＢＭＣへの結合の非存在を示す、全細胞ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。この図および他の図の呼称２°＋３°は、マウス抗ＨＡによって染色され、抗マウス抗体のみを検出する負の対照ウェルを指す。この図および他の図の呼称であるＲＳＣ−Ｓライブラリーは、元のウサギｓｃＦｖ非パニングライブラリーから調製した溶解性抗体を指す。この図および他の図の呼称であるＲ３／ＲＳＣ−Ｓプールは、３回目のパニングによるｓｃＦｖ抗体のプール全体から調製した溶解性抗体を指す。抗ＣＤ５抗体を正の対照として使用して、同数のＢ−ＣＬＬおよびＰＢＭＣ細胞が各ウェルにて平板培養されることを検証した。
【図３ａ】選択したｓｃＦｖ抗体の一次Ｂ−ＣＬＬ細胞および正常一次ヒトＢ細胞への結合を比較する、全細胞ＥＬＩＳＡの結果を示す。抗ＣＤ１９抗体を正の対照として使用して、同数のＢ−ＣＬＬおよび正常Ｂ細胞が各ウェルにて平板培養されることを検証した。他の対照は図２の凡例に示した通りであった。
【図３ｂ】選択したｓｃＦｖ抗体の一次Ｂ−ＣＬＬ細胞および正常一次ヒトＢ細胞への結合を比較する、全細胞ＥＬＩＳＡの結果を示す。抗ＣＤ１９抗体を正の対照として使用して、同数のＢ−ＣＬＬおよび正常Ｂ細胞が各ウェルにて平板培養されることを検証した。他の対照は図２の凡例に示した通りであった。
【図４ａ】ｓｃＦｖクローンが患者特異性（すなわちイディオタイプ）または血液型特異性（すなわちＨＬＡ）抗原に結合するかどうかを判定するために使用された全細胞ＥＬＩＳＡの結果を示す。各クローンを３名の別個のＢ−ＣＬＬ患者から単離したＰＢＭＣへの結合について試験した。１つの患者サンプルのみに結合したクローンを患者または血液型特異性と見なした。
【図４ｂ】ｓｃＦｖクローンが患者特異性（すなわちイディオタイプ）または血液型特異性（すなわちＨＬＡ）抗原に結合するかどうかを判定するために使用された全細胞ＥＬＩＳＡの結果を示す。各クローンを３名の別個のＢ−ＣＬＬ患者から単離したＰＢＭＣへの結合について試験した。１つの患者サンプルのみに結合したクローンを患者または血液型特異性と見なした。
【図５ａ】ｓｃＦｖクローンの一次Ｂ−ＣＬＬ細胞および３つのヒト白血病細胞株への結合を比較する全細胞ＥＬＩＳＡの結果を示す。Ｒａｍｏｓは、バーキットリンパ腫に由来する成熟Ｂ細胞株である。ＲＬは、非ホジキンリンパ腫に由来する成熟Ｂ細胞株である。ＴＦ−１は、赤白血病に由来する赤芽球細胞株である。
【図５ｂ】ｓｃＦｖクローンの一次Ｂ−ＣＬＬ細胞および３つのヒト白血病細胞株への結合を比較する全細胞ＥＬＩＳＡの結果を示す。Ｒａｍｏｓは、バーキットリンパ腫に由来する成熟Ｂ細胞株である。ＲＬは、非ホジキンリンパ腫に由来する成熟Ｂ細胞株である。ＴＦ−１は、赤白血病に由来する赤芽球細胞株である。
【図６ａ】ｓｃＦｖクローンの一次Ｂ−ＣＬＬ細胞およびＢ−ＣＬＬ患者に由来する細胞株であるＣＬＬ−ＡＡＴへの結合を比較する全細胞ＥＬＩＳＡの結果を示す。ＴＦ−１細胞は負の対照として含まれている。
【図６ｂ】ｓｃＦｖクローンの一次Ｂ−ＣＬＬ細胞およびＢ−ＣＬＬ患者に由来する細胞株であるＣＬＬ−ＡＡＴへの結合を比較する全細胞ＥＬＩＳＡの結果を示す。ＴＦ−１細胞は負の対照として含まれている。
【図６ｃ】ｓｃＦｖクローンの一次Ｂ−ＣＬＬ細胞およびＢ−ＣＬＬ患者に由来する細胞株であるＣＬＬ−ＡＡＴへの結合を比較する全細胞ＥＬＩＳＡの結果を示す。ＴＦ−１細胞は負の対照として含まれている。
【図７】３色フローサイトメトリーによって分析した、本開示によるｓｃＦｖ抗体の結合特異性を示す。正常な末梢血単核細胞において、ｓｃＦｖ−９によって認識された抗原は、Ｂリンパ球で中程度に発現され、Ｔリンパ球のサブ個体群で弱く発現される。正常ドナーからのＰＢＭＣは、抗ＣＤ５−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ１９−ＰｅｒＣＰ、およびｓｃＦｖ−９／抗ＨＡ−ビオチン／ストレプトアビジン−ＰＥを使用して、３色フローサイトメトリーによって分析した。
【図８ａ】本開示によるｓｃＦｖ抗体によって認識された抗原の発現レベルを示す。ｓｃＦｖ−３およびｓｃＦｖ−９によって認識された抗原は、ＣＬＬ−ＡＡＴ細胞株が由来する一次ＣＬＬ腫瘍で過剰発現される。ＣＬＬ−ＡＡＴ細胞株を確立するために使用したＣＬＬ患者からの一次ＰＢＭＣまたは正常ドナーからのＰＢＭＣをｓｃＦｖ抗体で染色して、フローサイトメトリーによって分析した。ｓｃＦｖ−３およびｓｃＦｖ−９は、平均蛍光強度によって測定されたように、ＣＬＬ細胞を正常ＰＢＭＣよりも明るく染色する。
【図８ｂ】本開示によるｓｃＦｖ抗体によって認識された抗原の発現レベルを示す。ｓｃＦｖ−３およびｓｃＦｖ−９によって認識された抗原は、ＣＬＬ−ＡＡＴ細胞株が由来する一次ＣＬＬ腫瘍で過剰発現される。ＣＬＬ−ＡＡＴ細胞株を確立するために使用したＣＬＬ患者からの一次ＰＢＭＣまたは正常ドナーからのＰＢＭＣをｓｃＦｖ抗体で染色して、フローサイトメトリーによって分析した。ｓｃＦｖ−３およびｓｃＦｖ−９は、平均蛍光強度によって測定されたように、ＣＬＬ細胞を正常ＰＢＭＣよりも明るく染色する。
【図８ｃ】本開示によるｓｃＦｖ抗体によって認識された抗原の発現レベルを示す。ｓｃＦｖ−３およびｓｃＦｖ−９によって認識された抗原は、ＣＬＬ−ＡＡＴ細胞株が由来する一次ＣＬＬ腫瘍で過剰発現される。ＣＬＬ−ＡＡＴ細胞株を確立するために使用したＣＬＬ患者からの一次ＰＢＭＣまたは正常ドナーからのＰＢＭＣをｓｃＦｖ抗体で染色して、フローサイトメトリーによって分析した。ｓｃＦｖ−３およびｓｃＦｖ−９は、平均蛍光強度によって測定されたように、ＣＬＬ細胞を正常ＰＢＭＣよりも明るく染色する。
【図９ａ−１】選択したｓｃＦｖ抗体のＣＤＲ配列および結合特異性の概要を提供する。
【図９ａ−２】選択したｓｃＦｖ抗体のＣＤＲ配列および結合特異性の概要を提供する。
【図９Ｂ−１】選択したｓｃＦｖ抗体のＣＤＲ配列および結合特異性の概要を提供する。
【図９Ｂ−２】選択したｓｃＦｖ抗体のＣＤＲ配列および結合特異性の概要を提供する。
【図９Ｃ】選択したｓｃＦｖ抗体のＣＤＲ配列および結合特異性の概要を提供する。
【図１０】図８ａ〜８ｃで説明した一次ＣＬＬ細胞対正常ＰＢＭＣでのｓｃＦｖ抗原の発現レベルを比較する、フローサイトメトリー結果の概要を示す表２である。
【図１１】ｓｃＦｖ−９抗原の発現レベルを、ＣＬＬ患者から単離した末梢血単核細胞中のＣＤ３８＋細胞のパーセンテージと比較する、フローサイトメトリー結果の概要を示す表である。
【図１２】免疫沈降および質量分光分析によるｓｃＦｖ抗原の同定を示す。ＣＬＬ−ＡＡＴ細胞を０．５ｍｇ／ｍｌスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）のＰＢＳによる溶液、ｐＨ８．０によって３０分間標識した。未反応ビオチンを除去するためのＰＢＳによる徹底的な洗浄の後、細胞を窒素キャビテーションによって破壊して、ミクロソーム画分を分画遠心法によって単離した。ミクロソーム画分をＮＰ４０溶解緩衝液中に再懸濁させて、正常ウサギ血清およびタンパク質Ａセファロースによって徹底的に前処理した。抗原をラット抗ＨＡアガロースビーズ（Ｒｏｃｈｅ）に結合したＨＡ−ｔａｇｇｅｄ  ｓｃＦｖ抗体によって免疫沈降させた。免疫沈降の後、抗原をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離して、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ＡＰ）を使用したウェスタンブロットによって、またはＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｇ−２５０染色によって検出した。ＣＬＬ−ＡＡＴ細胞に結合しない抗体であるｓｃＦｖ−７を負の対照として使用した。抗原バンドをＣｏｏｍａｓｓｉｅ染色ゲルから切除して、質量分光分析（ＭＳ）によって同定した。Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ラホーヤ、カリフォルニア州）にてＭＡＬＤＩ−ＭＳを実施した。μＬＣ／ＭＳ／ＭＳはＨａｒｖａｒｄ  Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）にて実施した。
【図１３】３つのｓｃＦｖ抗体がヒトＯＸ−２／ＣＤ２００  ｃＤＮＡクローンによって一時的にトランスフェクションされた２９３−ＥＢＮＡ細胞に特異的に結合することを示す。ＯＸ−２／ＣＤ２００  ｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲによってＣＬＬ細胞からクローニングして、哺乳類発現ベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に挿入する。ＰＣＥＰ４−ＣＤ２００プラスミドまたは対応する空のベクターｐＣＥＰ４は、Ｐｏｌｙｆｅｃｔ試薬（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、２９３−ＥＢＮＡ細胞内にトランスフェクションした。トランスフェクションの２日後、細胞を、ｓｃＦｖ抗体への結合についてフローサイトメトリーによって分析した。
【図１４】ＯＸ−２／ＣＤ２００トランスフェクション細胞の存在が、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γなどのＴｈ１サイトカインのダウンレギュレーションを引き起こしたことを示す。抗ＯＸ−２／ＣＤ２００抗体の３０μｇ／ｍｌでの添加は、Ｔｈ１反応を完全に回復した。
【図１５】混合リンパ球反応におけるＣＬＬ細胞の存在が、ＩＬ−２に対するＴｈ１反応のダウンレギュレーションを引き起こしたことを示す。
【図１６】混合リンパ球反応におけるＣＬＬ細胞の存在が、ＩＦＮ−γに対するＴｈ１反応のダウンレギュレーションを引き起こしたことを示す。
【図１７Ａ】ヒトＰＢＬ細胞の存在下または非存在下のどちらかでのＲＡＪＩ細胞４×１０６個を皮下注射されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのすべての群の腫瘍体積の平均＋／−ＳＤを示す。
【図１７Ｂ】ヒトＰＢＬ細胞の存在下または非存在下のどちらかでのＲＡＪＩ細胞４×１０６個を皮下注射されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのすべての群の腫瘍体積の平均＋／−ＳＤを示す。
【図１８】２つのパラメトリック検定（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定およびＷｅｌｃｈの検定）および１つのノンパラメトリック検定（Ｗｉｌｃｏｘ検定）を使用して実施した統計解析の結果を示す。
【図１９Ａ】ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ抗体に捕獲されたＣＤ２００−Ｆｃに対する３回目のパニングの後の、代表的なＩｇＧ１カッパクローンのＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図１９Ｂ】ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ抗体に捕獲されたＣＤ２００−Ｆｃに対する３回目のパニングの後の、代表的なＩｇＧ２ａカッパクローンのＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図１９Ｃ】マイクロタイターウェルに直接コーティングしたＣＤ２００−Ｆｃに対する３回目のパニングの後の、代表的なＩｇＧ１カッパクローンのＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図１９Ｄ】マイクロタイターウェルに直接コーティングしたＣＤ２００−Ｆｃに対する３回目のパニングの後の、代表的なＩｇＧ２ａカッパクローンのＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図２０Ａ】ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃに捕獲されたＣＤ２００−Ｆｃで選択された代表的なＩｇＧ１クローンのフローサイトメトリーの結果を示す。
【図２０Ｂ】ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃに捕獲されたＣＤ２００−Ｆｃで選択された代表的なＩｇＧ２ａクローンのフローサイトメトリーの結果を示す。
【図２０Ｃ】直接コーティングされたＣＤ２００−Ｆｃで選択された代表的なＩｇＧ１クローンのフローサイトメトリーの結果を示す。
【図２０Ｄ】直接コーティングされたＣＤ２００−Ｆｃで選択された代表的なＩｇＧ２ａクローンのフローサイトメトリーの結果を示す。
【図２１ａ−１】ＣＤ２００特異性クローンの重鎖相補性領域の推定アミノ酸配列を示す。
【図２１ａ−２】ＣＤ２００特異性クローンの重鎖相補性領域の推定アミノ酸配列を示す。
【図２１ｂ−１】ＣＤ２００特異性クローンの重鎖相補性領域の推定アミノ酸配列を示す。
【図２１ｂ−２】ＣＤ２００特異性クローンの重鎖相補性領域の推定アミノ酸配列を示す。
【図２２】蛍光ビーズアッセイにおける、選択したクローンがＣＤ２００のそのレセプター（ＣＤ２００Ｒ）との間の相互作用を遮断する能力を示す。
【図２３】キメラ化のための選択されたＣＤ２００  Ｆａｂの推定アミノ酸配列を示す。
【図２４】小規模一過性トランスフェクションの培養上澄みから得たキメラＩｇＧのＥＬＩＳＡ結果を示す。
【図２５】ＣＤ２００に対して作られたすべての抗体がレセプターリガンド相互作用を非常によく遮断することを示す、精製ＩｇＧのビーズ阻害アッセイの結果を示す。
【図２６Ａ】ＣＬＬ細胞の存在が混合リンパ球反応で観察されたＩＦＮ−γおよびＩＬ−２生成の大半を完全に排除したが、抗体のいずれかの存在がこれらのＴｈ１サイトカインの生成を許容したことを示す。
【図２６Ｂ】ＣＬＬ細胞の存在が混合リンパ球反応で観察されたＩＦＮ−γおよびＩＬ−２生成の大半を完全に排除したが、抗体のいずれかの存在がこれらのＴｈ１サイトカインの生成を許容したことを示す。
【図２６Ｃ】抗体の存在下でＩＬ−１０生成がダウンレギュレートされたことを示す。
【図２７】抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性アッセイ（ＡＤＣＣ）での腫瘍細胞を発現するＣＤ２００を殺す能力を示す。マウスキメラＣＤ２００抗体すべてが、ＣＤ２００陽性細胞と共に培養されたときに、同様の溶解レベルを生じた。
【図２８】対応のない両側Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定によって解析され、腫瘍細胞のみを投与された群と比較された、各種のＰＢＬドナーを使用する１０回の実験の代表的な例を示す。有意差は５００万または１０００万のＰＢＬを投与された群で観察されたが、第３２日以降１００万のＰＢＬを投与された群では観察されなかった。
【図２９】対応のない両側Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定によって解析され、腫瘍細胞のみを投与された群と比較された、各種のＰＢＬドナーを使用する１０回の実験の代表的な例を示す。有意差は両方のドナーで１０００万のＰＢＬを投与された群で観察されたが、第８日以降２００万のＰＢＬを投与された群では観察されなかった。
【図３０ａ】レンチウイルスベクターから形質導入された腫瘍細胞を発現するＣＤ２００に感染したＲＡＪＩ細胞が、その親ＲＡＪＩ細胞よりもいくらか低速に増殖するように見えたことを示す。形質導入細胞および親細胞との増殖差は、統計的有意性には達しなかった。
【図３０ｂ】ＰＢＬ  ５または１０×１０６を注射したときに、ＰＢＬの存在が逆ＣＤ２００（非機能性ＣＤ２００）によって形質導入されたＲＡＪＩ細胞における腫瘍増殖を最大８４％減少させたことを示し、この特定のドナーがＲＡＪＩ腫瘍細胞を非常に強く拒絶することを示唆している。
【図３０ｃ】腫瘍細胞でのＣＤ２００発現が免疫系に腫瘍増殖の減速を実際に防止させることを示唆する結果を示す。またこの試験は、免疫抑制性化合物または分子を評価するためのＲＡＪＩ／ＰＢＬモデルの有用性を証明する。
【図３１ａ】〜
【図３１ｄ】ＲＡＪＩ／ＰＢＬモデルで見られる効果が、他の腫瘍細胞モデルでも観察できるかどうかを示す。
【図３１ａ】Ｎａｍａｌｗａ腫瘍細胞が、形質導入細胞と親細胞との間での有意差なしに、迅速な腫瘍増殖を生じたことを示す。
【図３１ｂ】ＰＢＬの存在が腫瘍増殖を約５０％減速させたことを示す。両側Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定の結果は、ＰＢＬ処置群と、腫瘍細胞のみを投与された群との差が統計的に有意であることを示した。
【図３１ｃ】Ｎａｍａｌｗａ細胞を発現するＣＤ２００およびＰＢＬを投与された群の腫瘍増殖が、Ｎａｍａｌｗａ細胞を投与された群の腫瘍増殖と同様であったことを示す。これらのデータにより、腫瘍細胞でのＣＤ２００発現がヒト免疫系による腫瘍増殖の減速を防止することが確認される。
【図３１ｄ】Ｎａｍａｌｗａ細胞を発現するＣＤ２００およびＰＢＬを投与された群の腫瘍増殖が、Ｎａｍａｌｗａ細胞を投与された群の腫瘍増殖と同様であったことを示す。これらのデータにより、腫瘍細胞でのＣＤ２００発現がヒト免疫系による腫瘍増殖の減速を防止することが確認される。
【図３２】ＲＡＪＩ  ＰＢＬモデルが免疫増強化合物の有効性を評価する効率的な方法であることを証明する結果を示す。
【図３３】腫瘍細胞におけるＣＤ２００発現が、免疫細胞による腫瘍増殖の抑制を防止したことを示す。
【図３４】腫瘍細胞におけるＣＤ２００発現が、免疫細胞による腫瘍増殖の抑制を防止したことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図９ａ−１】
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【図９ａ−２】
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【図９Ｂ−１】
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【図９Ｂ−２】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１ａ−１】
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【図２１ａ−２】
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【図２１ｂ−１】
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【図２１ｂ−２】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０ａ】
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【図３０ｂ】
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【図３０ｃ】
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【図３１ａ】
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【図３１ｂ】
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【図３１ｃ】
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【図３１ｄ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年7月30日(2007.7.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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