(57)【要約】本発明は所望の菌糸成長に関係するタンパク質をコードしている核酸を修飾することを含む、タンパク質及び及び化学物質を菌類の宿主細胞の中で生産する、方法を提供する。ｈｂｒＡ及びｈｂｒＢのアミノ酸及び核酸配列も提供する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号８で開示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の相同性を有する、菌類において菌糸成長に関係する単離されたタンパク質。
【請求項２】
配列番号８で開示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
配列番号８で示される配列を有するアミノ酸をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号７で示される配列を有するポリヌクレオチドに対して少なくとも６０％の相同性を有する、あるいは中から高ストリンジェンシー条件下において配列番号７で示される配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、あるいは配列番号７で示される配列を有するポリヌクレオチドに相補的であることを特徴とする請求項３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号７で開示される核酸配列を有することを特徴とする請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
糸状菌であることを特徴とする請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
前記糸状菌がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）及びフサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）を含むことを特徴とする請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
所望のタンパク質を製造するために適した条件下において前記所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え菌類を培養する工程を含む、菌類中で所望のタンパク質を製造する方法であって、ここで、組換え菌類が前記菌類において菌糸成長に関係するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを更に含み、前記タンパク質が配列番号８で開示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の相同性を有することを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記所望のタンパク質を回収する工程を更に含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドが前記菌類に相同であり、前記ポリペプチドが、天然発生の菌類において見られるよりも多数のコピー数で存在し、菌糸成長に関係するタンパク質をコードする特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
菌糸成長に関係するタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが前記菌類に対して異種であり、前記菌類中へ組換え的に導入されていることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記菌類の中において菌糸成長に関係するタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが複製プラスミドを含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記菌類の中において菌糸成長に関係するタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが菌類ゲノムに組み込まれていることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記菌糸成長に関係するタンパク質が配列番号８で示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
菌糸成長に関係するタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号７で示される配列を有するポリヌクレオチドに対して少なくとも６０％の相同性を有するか、又は中から高ストリンジェンシー条件において配列番号７で示される配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるか、又は配列番号７で示される配列を有するポリヌクレオチドに相補的であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチドが配列番号７で示される核酸配列を有することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記菌類が糸状菌であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
前記糸状菌がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）及びフサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種を含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種がアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニディユランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｉ）及びアスペルギルス・フミガタス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔａｕｓ）を含むことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
菌糸成長に関係するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え菌類を生産する方法であって、
（ａ）関係する前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得る工程と、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドを前記宿主細胞に導入する工程と、及び
（ｃ）菌糸成長に関係する前記タンパク質の生産に適した条件下で前記宿主細胞を生育する工程とを含む方法。
【請求項２３】
前記宿主細胞が糸状菌を含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記糸状菌がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）及びフサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）を含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）がアルペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニディユランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｉ）及びアスペルギルス・フミガタス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔａｕｓ）を含むことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号７で示される配列を有する核酸に少なくとも６０％の相同性を有することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
菌類変異体を得る工程と、前記変異体を所望の条件下で選択する工程と、及び所望の変異体を同定する工程とを含む、高度に枝分かれした菌類変異体を同定する方法。
【請求項２８】
前記同定する工程が菌糸成長についての選択を含むことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記選択する工程が限定された温度における異種タンパク質の育成及び分泌を含むことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記所望のタンパク質の生産に対して適した条件下で、前記所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え菌類を培養する工程を含む菌類の中で所望のタンパク質を生産するための方法であって、前記組換え菌類が菌糸成長に関係するタンパク質をコードする内因性核酸における変異を含み、前記変異が菌糸成長に関係するタンパク質の前記菌類による生成阻害を生じることを特徴とする方法。
【請求項３１】
前記菌糸成長に関係するタンパク質が配列番号８で開示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の相同性を有することを特徴とする請求項３０の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には菌類の菌糸成長に関係する、特に菌類の菌糸成長に関係する遺伝子の修飾について説明する。本発明は、菌糸成長に関係する遺伝子が修飾された菌類からタンパク質及び／または化学物質を生産するための方法及びシステムを提供する。
【背景技術】
【０００２】
既知の菌類の数は約６４，０００であるが、微生物の群は多様性があることから、実際には１００万を超える種が存在すると見積もられている。約９０％の菌類が、菌糸体として知られる分枝している菌糸を有する放射系形態で成長する。酵母のような単位生物とは異なる生物スタイルを有するこのような成長モデルは、基質の表面上を進入及び侵入するのに明らかに有利である（Ｃａｒｌｉｌｅ，１９９４，Ｔｈｅ  Ｇｒｏｗｉｎｇ  Ｆｕｎｇｕｓ，ｅｄ．Ｇｏｗ，Ｎ．Ａ．Ｒ．＆  Ｇａｄｄ，Ｇ．Ｍ．，Ｃｈａｐｍａｎｎ  ＆  Ｈａｌｌ，ｐｐ．３−１９）。これまで、菌類の分枝に作用すると特徴付けられた遺伝子はごくわずかである。現在最も特徴が明らかになっている遺伝子は、菌類のニューロスポラクラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  Ｃｒａｓｓａ）から単離されたｃｏｔ１である。Ｃｏｔ−１は過度な分岐を誘導する温度感受性変異であり、そしてその配列（その機能は未知である）はｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼをコードすると考えられている（Ｙａｒｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９２，ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：２１５９−２１６６）。
【０００３】
糸状菌は、抗生物質、酵素、ファインケミカル及び食物の生産者として工業上、重要であると考えられている（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ：５０  Ｙｅａｒｓ  Ｏｎ（１９９４）ｖｏｌ  ２９，ｅｄ  Ｓ．D．Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ  ＆  Ｊ．Ｒ．Ｋｉｎｇｈｏｒｎ  ｐｐ．５６１−５９６）。糸状菌においてタンパク質を生産するための方法が改良されることが当該技術分野において要求されている。糸状菌は植物及び動物の病原体としても知られている。よって、糸状菌の成長の遺伝上の基礎を理解することは、抗菌類治療の可能性に関しての見識を提供することになる。
【発明の開示】
【０００４】
発明の概要
本発明は、菌類の形態、特に菌糸の分枝に関係した、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）遺伝子の発見に一部基づいている。（菌糸成長の長さ単位として測定された）菌糸の分岐の程度と（流動系の羽車の上に及ぼされる粘度により測定される）発酵器中の培養物の粘度の間には直線関係が観察されてきた。過度に分岐している菌類変異体の単離及び菌類の過度な分岐に関係する遺伝子の同定は、菌類の形態を修飾するための手段を提供し、それにより粘度を制御するため及び発酵器の性能を改良するための手段も提供する。
【０００５】
本発明は、限定された温度、４２℃、において過度に分枝する表現型を示すＨｂｒＡ（この変異体はＨｂｒＡ２と呼ぶ）を生産するためのアスペルギルスニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）変異体の同定にも一部基づいている。該変異体ＨｂｒＡ２は２６℃においてアスペルギルスニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）の成長に影響しないが、４２℃においては過度な分枝に限定される成長表現型を示す。ムコールミエヘイ（Ｍ．ｍｅｉｈｅｉ）のプロテアーゼをコードする異種核酸を含むＨｂｒＡ２変異体は、２６℃において該プロテアーゼを分泌することが可能である。前記ＨｂｒＡ２変異体は３７℃においてはプロテアーゼを分泌することができないが、３７℃を超える温度においては内因性アルファアミラーゼを分泌することができる。本発明は、ｈｂｒＡに関するアミノ酸、ＨｂｒＡ、及びその核酸の配列、並びにＨｂｒＡのような菌糸成長に関係するタンパク質の発現を修飾することにより菌類において異種タンパク質または化学物質を生産するための方法を提供する。
【０００６】
従って、本発明は、配列番号２又は８に開示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の相同性を有する菌類の菌糸成長に関係した単離タンパク質を提供する。一の態様において、菌糸成長に関係したタンパク質は、配列番号２に開示されたアミノ酸配列を有するＨｂｒＡである。本発明は、配列番号２又は８に示された配列を有するアミノ酸をコードするポリヌクレオチド、並びに配列番号１又は７に示された配列を有するポリヌクレオチドに対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％相同性を有するポリヌクレオチドを提供する。一の態様において、前記ポリヌクレオチドは、中度から高度のストリンジェンシー条件下で配列番号１又は７に示された配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能であるか、あるいは配列番号１又は７に示された配列を有するポリヌクレオチドに相補である。別の態様において、前記ポリヌクレオチドは配列番号１又は７に表された核酸配列を有する。本発明は、配列番号２又は８をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞及び発現ベクターも提供する。
【０００７】
一の態様において宿主細胞は糸状菌であり、他の態様においては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）及びフサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）を含む糸状菌である。更に別の態様において、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種は、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）及びアスペルギルス・フミガタス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）を含むがこれらに限定されない。
【０００８】
本発明は、所望のタンパク質の生産に適した条件下で前記所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え菌類を培養する工程を含む、菌類において所望のタンパク質を生産する、方法も提供する。前記組換え菌類は前記菌類において菌糸成長に関係するタンパク質を更に含む。前記菌糸成長に関係するタンパク質は配列番号２又は８に開示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％相同性を有する。一の態様において、菌糸成長に関係したタンパク質をコードするポリヌクレオチドは前記菌類に対して相同であり、且つ天然の菌類中に見いだされるより大量に存在する。別の態様において、菌糸成長に関係するタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドは前記菌類に対して異種であり、且つ前記菌類へ遺伝子組換えにより導入される。前記方法は前記所望のタンパク質を回収する工程を更に含む場合もある。
【０００９】
本発明の他の側面において、培養物の粘度を低下させるために、菌糸成長に関係するタンパク質の発現をダウン制御することが望ましい。従って、本発明は所望のタンパク質の生産に適した条件下で前記所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え菌類を培養する工程を含む、菌類において所望のタンパク質を生産する、方法を提供する。前記組換え菌類は菌糸成長に関係するタンパク質をコードする内因性核酸に変異を含み、前記変異は前記菌類による菌糸成長に関係するタンパク質の生産の阻害をもたらす。
【００１０】
一の態様において、菌類において菌糸成長に関係するタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドは複製プラスミドを含む。別の態様において、菌類の菌糸成長に関係するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、菌類のゲノム中に組み込まれる。更に別の態様において、菌糸成長に関係するタンパク質は配列番号２又は８に示されたアミノ酸配列を有する。
【００１１】
本発明の更に別の態様において、菌糸成長に関係するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１又は７に示された配列を有するポリヌクレオチドに対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を有するか、または配列番号１又は７に示す配列を有するポリヌクレオチドに中から高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズすることができるか、または配列番号１又は７に示された配列を有するポリヌクレオチドに相補である。別の態様において、前記ポリヌクレオチドは配列番号１又は７に示された核酸配列を有する。
【００１２】
本発明は、菌糸成長に関係するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え菌類を生産する方法も提供し、前記方法は、菌糸成長に関係する前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得る工程；前記ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する工程；そして菌糸成長に関係する前記タンパク質の生成に適した条件下で前記宿主細胞を生育する工程を含む。一の態様において、前記宿主細胞は糸状菌である。別の態様において、糸状菌は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）及びフサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種を含む。更に別の態様において、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種は、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルスニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）及びアスペルギルス・フミガタス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）を含むがこれらに限定されない。一つの態様において、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１又は７に示された配列を有するポリヌクレオチドに対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の相同性を有するかまたは配列番号１又は７に示された配列を有するポリヌクレオチドに中から高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズできるか、または配列番号１に示される配列を有するポリヌクレオチドに相補である。別の態様において、上記ポリヌクレオチドは配列番号１又は７に示された核酸配列を有する。
【００１３】
本発明は、過度に分枝した表現型を呈し且つ異種タンパク質を分泌することができる変異体を選抜する（ｓｃｒｅｅｎ）方法にも関係する。従って、本発明は、菌類変異体を得る工程、前記変異体を所望の条件下で選択（ｓｅｌｅｃｔ）する工程、及び所望の表現型を有する変異体を同定する工程を含む、過度に分枝する変異体の同定法を提供する。一の態様において、同定は菌糸成長を選択する工程を含む。別の態様において、前記の同定する工程は、タンパク質を分泌できる変異体を選抜することを含む。別の態様において、前記の選択する工程は、所定の温度における成長及び／または異種タンパク質の分泌を含む。
【００１４】
発明の詳細な説明
定義
本明細書において使用する、「菌糸成長に関係するタンパク質」の語は菌類において菌糸成長を修飾することが可能なタンパク質を意味する。そのようなタンパク質の例示は、本明細書中の実施例に開示されたタンパク質ＨｂｒＡ  １−９である。「ＨｂｒＡ」の語は配列番号２に示されたアミノ酸配列を意味する。「ｈｂｒＢ」、「ＨｂｒＡ３」及び「ｈｂｒ３」は本明細書において互換的に使用する。本発明は配列番号２又は８に開示されたアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を有する菌類の菌糸成長に関係したタンパク質を包含する。核酸レベルのパーセント相同性はＦａｓｔＡプログラムを使用して計算し、そしてアミノ酸レベルのパーセント相同性はＴＦａｓｔＡを使用して計算し、両者はＰｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎの方法（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ,１９８８,８５：２４４４−２４４８）を使用する。本発明は、ＨｂｒＡ又はＨｂｒＢの変異体（ｍｕｔａｎｔｓ）、変更物（ｖａｒｉａｎｔｓ）及び誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）が菌類の菌糸成長を修飾出来る限り、前記の変異体、変更物及び誘導体も包含する。
【００１５】
本明細書において使用する、「核酸」の語は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列、及びそれらの断片または一部、そしてゲノミックまたは合成されたDNAまたはRNAを意味し、二本鎖または一本鎖であってよく、センス鎖またはアンチセンス鎖であってもよい。本明細書において使用される「アミノ酸」は、ペプチドまたはタンパク質配列またはそれらの一部を意味する。
【００１６】
本明細書において使用される「単離された」または「精製された」の語は、本来関係している少なくとも一つの成分から取り出された核酸またはアミノ酸を意味する。
【００１７】
本明細書において使用される、「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」の語は、菌糸成長に関係するタンパク質に言及する場合、菌類の細胞中で天然には生じないタンパク質を意味する。「同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」の語は、菌糸成長に関係するタンパク質に言及する場合、菌類の細胞中で自生の（ｎａｔｉｖｅ）タンパク質または天然に生じる（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）タンパク質を意味する。本発明は、天然の菌類宿主中に見いだされるよりも高いコピー数の菌糸成長に関係するタンパク質、及び組換えDNA技術を通して高いコピーレベルを生成する菌糸成長に関係するタンパク質を生成する菌類の宿主細胞を含む。
【００１８】
本明細書において使用される語「過剰発現される」は、宿主細胞中のタンパク質の生成に言及する場合、上記タンパク質がその天然環境においてのその生産よりも高い量にて生成されることを意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
好ましい態様の説明
本発明は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａ.ｎｉｄｕｌａｎｓ）におけるＨｂｒＡ及びＨｂｒＢの同定に関係する。本明細書においてＨｂｒＡ２と呼ぶＨｂｒＡの変異体は、擬似有性分析により染色体ＶＩＩに位置することが明らかである（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ：５０  Ｙｅａｒｓ  Ｏｎ（１９９４）ｖｏｌ  ２０,ｅｄ  Ｓ.D．Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ  ＆  Ｊ.Ｒ.Ｋｉｎｇｈｏｒｎ  ｐｐ.４１−４３）。３７℃において、変異体ｈｂｒＡ２は、野生型アスペルギルス・ニデュランス（Ａ.ｎｉｄｕｌａｎｓ）とは違い、組換え発現されたムコールミエヘイ（Ｍ.ｍｅｉｈｅｉ）のプロテアーゼを分泌することができない。ＨｂｒＡ２遺伝子の翻訳された配列は、酵母のＳＬＰ／ＶＰＳ３３のＳｅｃ１遺伝子産物に顕著な相同性を示す。ＳＬＰ／ＶＰＳ３３のＳｅｃ１が液胞タンパク質の選別（ｓｏｒｔｉｎｇ）に必須のタンパク質をコードすることが証拠である。ＳＬＰ１変異体はタンパク質を液胞に向けさせることができず、そしてそれらは既存の経路に沿って細胞質膜に送られる。ＳＬＰ１／ＶＰＳ３３のＳｅｃ１の厳密な性質及び機能は未知であるが、それはＳＥＣ１ファミリーのメンバーであり、そして小胞を液胞に向けさせることに関与する膜結合タンパク質であると考えられる。酵母におけるＶＰＳ３３の欠失は致死的ではないが、光学及び電子顕微鏡観察により明らかにされたところによれば、成長が遅くなり、温度感受性及び液胞の損失を導く。蛍光顕微鏡の観察によると、酵母のＳＬＰ１／ＶＳＰ３３のように、ＨｂｒＡ２は非許容温度においては液胞が構築されなかった。
【００２０】
変異ＨｂｒＡ２は２６℃においてアスペルギルス・ニデュランス（Ａ.ｎｉｄｕｌａｎｓ）の成長に影響を及ぼさないけれども、４２℃においては過度の分岐に限定される成長表現型を呈する。過度な分岐の表現型は、野生型アスペルギルス・ニデュランス（Ａ.ｎｉｄｕｌａｎｓ）とは異なり、先端区画に広範囲の分岐を示す。前記変異体は非許容温度において、成長が遅くなり、寒天培地中で高度に密集したコロニーを生じる。ムコールミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｅｉｈｅｉ）のプロテアーゼで野生型アスペルギルス・ニデュランス（Ａ.ｎｉｄｕｌａｎｓ）を形質転換し、そしてｈｂｒＡ２変異体と交配させた。ムコール・ミエヘイ（Ｍ.ｍｅｉｈｅｉ）プロテアーゼをコードする異種核酸を含むｈｂｒＡ２又はｈｂｒＢ３変異体は２６℃において上記プロテアーゼを分泌することができた。前記ｈｂｒＡ２及びｈｂｒＢ３変異体は３７℃において前記プロテアーゼを分泌することができなかったが、３７℃より高い温度において内因性アルファアミラーゼを分泌することができた。
【００２１】
複数のｈｂｒＡ変異体が異種タンパク質を生成できないとの観察から、菌糸成長に関係するタンパク質の発現を修飾するための遺伝子修飾された菌類の宿主、特に変異体ＨｂｒＡ  １−９は、菌類の宿主におけるタンパク質または化学物質の生成を増強する手段を提供すると考えられる。本発明の一の側面において、菌糸成長に関係するタンパク質の発現を増加させることが望まれる。本発明の別の側面においては、当業者には知られた手段により菌糸成長に関係するタンパク質の発現を低下させるかまたは排除することが望まれる。
【００２２】
Ｉ．ＨｂｒＡアミノ酸及びｈｂｒＡ核酸配列
本発明は、ＨｂｒＡに関してのアミノ酸（配列番号２）ＨｂｒＡ及び核酸（配列番号１）配列を提供する。本発明は、変異体が適切な菌糸成長をする限り、配列番号２に示す配列を有するアミノ酸に対して少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸変異体も包含する。核酸レベルのパーセント相同性はＦａｓｔＡプログラムを使用して計算し、そしてアミノ酸レベルのパーセント相同性はＴＦａｓｔＡを使用して計算し、両者はＰｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎの方法（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，１９８８，８５：２４４４−２４４８）を使用する。別法として、相同性は、Ｊｏｔｕｎ  Ｈｅｉｎ法（１９９０，Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３：６２６−６４５）によるＤＮＡｓｔａｒ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｉｄｓｏｎ，ＷＩ５３７１５）からのＭｅｇＡｌｉｇｎプログラムにより、ギャップペナルティ＝11、ギャップ長ペナルティ＝３及びＰａｉｒｗｉｓｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  Ｋｔｕｐｌｅ＝２を用いて決定した。様々なポリヌクレオチドがＨｂｒＡをコードし得ることは当業者が容易に理解する。本発明は、そのようなポリヌクレオチドの全てを包含する。ＨｂｒＡ、及び菌糸成長に関係するタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドは、例えばクローン化されたＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ「ライブラリー」）、ゲノミックＤＮＡライブラリーから当業界で公知の標準手法により、確立された化学合成により、ｃＤＮＡクローニングにより、あるいは所望の細胞から精製したゲノミックＤＮＡまたはその断片のクローニングにより、得ることができる。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．（ｅｄ．），１９８５，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＭＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，U.S.
Patent No.．Ｋ．Ｖｏｌ．Ｉ，ＩＩを参照）。ゲミックＤＮＡに由来する核酸配列はコーディング領域に加えて制御領域を含んでよい。源が何であれ、菌糸成長に関係するタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドは、遺伝子の増幅のために適切なベクターで、分子的にクローンすることができる。
【００２３】
ゲノミックＤＮＡからの遺伝子の分子クローニングにおいては、ＤＮＡ断片を生じさせ、そのいくつかが所望の遺伝子をコードすることになる。ＤＮＡは各種制限酵素を用いて所望の位置で切断させる。別法として、マンガン存在下においてＤＮＡｓｅを使用することによりＤＮＡを断片化してよく、あるいは例えば音波処理により、ＤＮＡを物理的に剪断することができる。次に、アガロース及びポリアクリルアミドゲル電気泳動及びカラムクロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない標準技術を用いて、直鎖状ＤＮＡ断片をサイズに従い分離することができる。
【００２４】
ＤＮＡ断片が生成されたら、上記遺伝子を含む特定のＤＮＡ断片の同定は、多数の方法により達成してよい。例えば、菌糸成長に関係するタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその特定のＲＮＡ、あるいはそれらの断片、例えばプローブまたはプライマーを単離して、標識して、次にハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用することにより、関係する遺伝子を検出してよい（Ｂｅｎｔｏｎ，Ｗ．ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，Ｒ．，１９７７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：１８０；Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｇｎｅｓｓ，Ｄ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７２：３９６１）。上記プローブに類似の実質同じ配列を共有するそれらのＤＮＡ断片はストリンジェント条件下でハイブリダイズすることになる。
【００２５】
中度から最大のストリンジェンシー条件下において配列番号１又は７のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる微生物のポリヌクレオチド配列も、本発明の範囲に包含される。ハイブリダイゼーション条件は、引用により本明細書に編入されるＢｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  １５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）に教示されており、核酸結合複合体の融点温度（Ｔｍ）に基づき、以下に説明する「ストリンジェンシー」が定義されている。
【００２６】
「最大のストリンジェンシー」は典型的には約Ｔｍ−５℃（上記プローブのＴｍより５℃下）；「高度のストリンジェンシー」はＴｍより約５から１０℃下；「中度のストリンジェンシー」はＴｍより約１０℃から約２０℃下；そして「低度のストリンジェンシー」はＴｍの約２０℃から２５℃下。最大のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを使用することにより同一のポリヌクレオチド配列を同定または検出することができ、一方中度または低度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを使用することによりポリヌクレオチド配列類似体を同定または検出することができることは当業者に理解されている。
【００２７】
本明細書にて使用される「ハイブリダイゼーション」の語は、「標準の核酸が塩基対合を通して相補鎖に接合するプロセス」を含む（Ｃｏｏｍｂｓ  Ｊ（１９９４）Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＮＹ）。
【００２８】
ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）技術において実施される増幅のプロセスは、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｋ  ＣＷ  ａｎｄ  ＧＳ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（１９９５，ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ  ＮＹ）に記載されている。配列番号１からの少なくとも約１０ヌクレオチドから約６０ヌクレオチドまで、好ましくは約１２から３０ヌクレオチド、より好ましくは約２０から２５ヌクレオチドの核酸配列をプローブまたはＰＣＲプライマーとして使用することができる。
【００２９】
発現システム
本発明は、宿主菌類中で所望のタンパク質を生産するための宿主細胞、発現方法及び発現システムを提供する。菌糸成長に関係するタンパク質をコードする核酸を得たなら、前記核酸を含む組換え宿主細胞を本技術分野で公知の技術を使用して構築してよい。分子生物学の技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に開示される。菌糸成長に関係するタンパク質をコードし且つｈｂｒＡに対して少なくとも６０％の相同性を有する核酸を得て、適切なベクターを使用して宿主細胞を形質転換する。菌類におけるクローニング、形質転換及び発現に適した様々なベクター及び形質転換及び発現カセットは当業者に知られている。
【００３０】
典型的には、前記ベクターまたはカセットは、前記核酸の転写及び翻訳を指示する配列、選択可能なマーカー、及び自律複製または染色体組み込みを可能にする配列を含む。適切なベクターは、転写開始制御を有する遺伝子の５’領域及び転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域を含む。これらの制御領域は選択された制御領域が宿主細胞中で機能できる限り、宿主に同種または異種の遺伝子に由来してよい。
【００３１】
宿主細胞において菌糸成長に関係するタンパク質の発現を制御するのに有用な、開始制御領域またはプロモーターは当業者に知られている。理想的には、これらのタンパク質を制御できるいかなるプロモーターも本発明には適している。前記タンパク質の有効な発現のために選択された発現制御領域へ、前記タンパク質をコードする核酸を開始コドンを介して作動可能に結合する。適切なカセットが構築されたなら、それらを使用して宿主細胞を形質転換する。
【００３２】
一般的な形質転換の手法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｌ．１，Ａｕｓｕｂｅｌらにより編纂、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９８７，９章）に記載されており、リン酸カルシウム法、ＰＥＧ及びエレクトロポレーションを使用した形質転換を含む。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）及びトリコデルマ（Ｔｒｙｃｈｏｄｅｒｍａ）に関しては、ＰＥＧ及びカルシウム媒介プロトプラスト形質転換を使用できる（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ，ＤＢ  １９９２  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｆｕｎｇｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ  ＆  Ｂｉｌｌ）１１３−１５６）。プロトプラストのエレクトロポレーションはＦｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ，ＤＢ  １９９２  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｆｕｎｇｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ  ＆  Ｂｉｌｌにより編纂）１１３−１５６に開示される。カンジダへのマイクロインジェクション砲撃はＦｕｎｇａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ  ｏｎ  ｉｎｔａｃｔ  ｃｏｎｉｄｉａ  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２５  ２９３−２９８に記載されている。アグロバクテリウムが媒介する形質転換は、Ｇｒｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６  ８３９−８４２に開示されている。
【００３３】
ｈｂｒＡの配列を含み且つ前記配列からタンパク質を発現する宿主細胞は当業者に知られた様々な手法を使用して同定してよい。これらの手法は、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション及びタンパク質バイオアッセイまたは核酸またはタンパク質の検出及び／または同定のための、膜に基づくか、溶液に基づくか、チップに基づく技術を含む免疫アッセイ技術を含むがこれらに限定されない。菌類の宿主細胞において所望のタンパク質を生産するためには、所望のタンパク質をコードする核酸を少なくとも１コピー含む発現ベクターで、菌糸成長に関係するタンパク質をコードする核酸を含む組換え宿主細胞を形質転換し、そして前記タンパク質の発現に適した条件下で培養する。所望のタンパク質の例は、酵素、例えば加水分解酵素であり、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カーボハイドラーゼ、及びリパーゼ；イソメラーゼ、例えばラセマーゼ、エピメラーゼ、トツモメラーゼ、またはムターゼ；トランスフェラーゼ、キナーゼ及びホスファターゼ並びに治療上の価値のあるタンパク質を含む。あるいは、発酵器中の粘度を低下させるために、菌糸成長に関係するタンパク質をダウン制御するかまたは変異させることが有効である。
【００３４】
III  ベクター配列
菌類の細胞においてｈｐｒＡを発現するかまたは菌類の細胞において所望のタンパク質を発現するのに使用される発現ベクターは、前記タンパク質に関連する少なくとも一つのプロモーターを含む。前記プロモーターは宿主細胞において機能する。本発明の一つの態様において、前記プロモーターは前記タンパク質の野生型プロモーターである。本発明の別の態様において、前記プロモーターは前記タンパク質に対しては異種のプロモーターであるが、菌類の宿主細胞において依然として機能する。本発明の一の好ましい態様において、前記タンパク質をコードする核酸は微生物のゲノムに安定に組み込まれる。
【００３５】
好ましい態様において、前記発現ベクターは、核酸の操作を容易にするために、好ましくはベクターに特異な少なくとも一つの制限エンドヌクレアーゼ部位を含む複数のクローニングカセットを含む。好ましい態様において、前記ベクターは、一又は複数の選択可能なマーカーも含む。本明細書において、選択可能なマーカーなる語は前記ベクターを含む宿主の選択を容易にする、宿主中で発現可能な、遺伝子を意味する。
【００３６】
IV．菌糸成長に関係するタンパク質の活性のアッセイ
実施例１及び２に示す結果は、菌類の分岐に作用する変異体を同定するためのスクリーニングおける使用温度を例示する。そのような温度に基づく選抜を使用することによる予測されない利点は、天然または内因性の遺伝子の輸送とは相対する、組換えにより導入された異種タンパク質の輸送において異なる作用を有する、ＨｂｒＡ変異体又は菌糸成長に関係するタンパク質の変異体を同定することができる点である。この種の選抜法により、異種タンパク質の分泌を増加することができる株の単離を促進することができる。従って、本発明は、複数の菌類変異体を得て、前記変異体を所望の条件下での選択に供し、そして所望の変異体を同定する工程を含む、タンパク質の分泌を増強する過剰に分枝する菌類変異体を同定する方法も提供する。一の態様において、同定は菌糸成長に対する選択を含む。一つの態様において、上記選択は、限定された温度における異種タンパク質の成長及び／または分泌を含む。
【００３７】
実施例
【実施例１】
【００３８】
この実施例はｈｂｒＡ遺伝子の単離を例示する。ｈｂｒＡ遺伝子を単離するため、ＦＧＳＣ（Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｋａｎｓａｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，ＫＳ６６１６０）から得たアスペルギルスニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来の野生型ＤＮＡの染色体分類されたコスミッドライブラリーのコスミッドプールからＤＮＡを調製した。２０の各コスミッドのうちの５つのプールを形質転換実験に使用した。形質転換効率を評価するため、ａｒｇＢ遺伝子と複製配列を輸送するコスミッドＤＮＡと形質転換ベクターＡｒｐの混合物を用いた同時形質転換のレシピエントとしてｈｂｒＡ２、ａｒｇＢ二重変異体を使用した。形質転換後に、プロトプラストを再生し、そして４２℃においてアルギニンを欠く培地上で選択した。コスミッドプールの一つは、Ａｒｇ＋Ｈｂｒ−形質転換体のバックグラウンドにおいて正常に分生しているコロニーであり、やや強い成長を示した。このプールを５つのコスミッドの４つのプールに細分し、形質転換を繰り返した。ｈｂｒＡ２変異を相補することができ、且つ野生型成長を取り戻した一つのコスミッドを単離した。このコスミッドのサブクローンにより、形質転換配列を有するＥｃｏＲＩ断片を同定することができた。このＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片は前記変異に対して相補ではなかったことから、ＢａｍＨＩ部位がｈｂｒＡ遺伝子中にあることが示唆された。この断片を単離して核酸配列決定に供した。このｈｂｒＡ遺伝子の核酸及びアミノ酸配列を図１Ａ−１Ｄに示す。表１はＨｂｒ２に関するプロテアーゼ活性、並びに許容温度及び非許容温度における別の同定された過剰分岐変異体を示す。
【表１】
2008504014.tif 000003
【００３９】
これらの発見は、明確には特徴付けられていないｈｂｒA糸状菌遺伝子が異種タンパク質の輸送において機能していることを示している。
【実施例２】
【００４０】
この実施例は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）の過剰分岐変異体の特性決定について記載する。以下はｈｂｒ変異体の染色体の位置を示す表２である。
【表２】
2008504014.tif 000004
【００４１】
全ての変異が劣性であり、互いに結合しておらず、そして菌類の過剰分岐及びタンパク質の分泌をもたらすこれまでに特性決定されていなかった変異を表している。ｈｂｒＡ２変異体が３７℃において内因性タンパク質アルファアミラーゼを分泌する能力を、ペトリ皿上にてスターチを単一炭素源としてｈｂｒＡ２：ｃｒｅＡ−二重変異体を生育させることにより試験した（ＣｒｅＡ遺伝子は炭素の代謝抑圧の陰性作用レギュレーターである。ＣｒｅＡの変異（ＣｒｅＡ−）はアルファアミラーゼのような酵素の炭素代謝の抑圧解除を引き起こす。）。ｈｂｒＡ２：ｃｒｅＡ−二重変異体は、ｈｂｒＡ＋：ｃｒｅＡ−のように、内因性タンパク質アルファアミラーゼを分泌可能でありことが示唆された。図３を参照のこと。これらの結果は、予測に反して、異種タンパク質の分泌においてｈｂｒＡ遺伝子が役割を担っていることを示す。
【００４２】
ｈｂｒ３変異体は、ｈｂｒＡ２変異体のように、２６℃において野生型よりもわずかに多いムコール・ミエヘイ（Ｍ．ｍｅｉｈｅｉ）プロテアーゼを生産する。３７℃において、ｈｂｒ３変異体はｈｂｒＡ２変異体のようにムコール・ミエヘイ（Ｍ．ｍｅｉｈｅｉ）プロテアーゼを生産しない。ｈｂｒＡ２変異は染色体ＶＩＩ上に位置し、そしてｈｂｒ３変異は染色体Ｉ上に位置する。これらの結果は、ｈｂｒ３遺伝子生成物も異種タンパク質輸送において役割を担っていることを示す。従って、野生型ｈｂｒ３遺伝子産物の発現を修飾することは異種タンパク質輸送を増加させることにおいて有利である。
【００４３】
それぞれ染色体III及びＩ上に位置するｈｂｒ６及びｈｂｒ８変異は、２６℃において野生型よりも顕著に高いレベルのムコール・ミエヘイ（Ｍ．ｍｅｉｈｅｉ）プロテアーゼを生産し、そして２６℃周辺の温度において成長させた糸状菌において異種タンパク質の分泌を増加させるはずである。よって、野生型のｈｂｒ６及びｈｂｒ８遺伝子産物の発現の修飾も異種タンパク質輸送を増加させることにおいて明らかに有用である。ｈｂｒ６とｈｂｒ８遺伝子の変異体バージョンは表３に示すとおり野生型に比して全くあるいはほとんど顕著に低いムコール・ミエヘイ（Ｍ．ｍｅｉｈｅｉ）プロテアーゼの分泌しか有さない。
【表３】
2008504014.tif 000005
【００４４】
表３は、ｈｂｒ５及びｈｂｒ７変異体は２６℃において７２時間後に野生型よりも顕著に多いムコール・ミエヘイ（Ｍ．ｍｅｉｈｅｉ）プロテアーゼを生産したが、３７℃において７２時間後は顕著に少ないプロテアーゼを生産したことを示している。
【００４５】
ｈｂｒ４変異体は、２６℃において７２時間後に、野生型よりも有意に多いムコール・ミエヘイ（Ｍ．ｍｅｉｈｅｉ）を生産したが、３７℃、７２時間後では有意により低いプロテアーゼを生産した。しかしながら、ｈｂｒ４：ｃｒｅＡ二重変異体はｃｒｅＡ−変異のみを含む野生型よりも顕著に高いレベルのアルファアミラーゼを単位面積当たり有する菌類コロニーを生産した。これらの結果は、天然のタンパク質の分泌を増加させる菌類の形態に関してのｈｂｒ４遺伝子産物の重要な役割のみならず、異種タンパク質の輸送における該遺伝子の役割も示している。
【００４６】
ｈｂｒ９変異は２６℃においてムコール・ミエヘイ（Ｍ．ｍｅｉｈｅｉ）のプロテアーゼの発現が貧困であったが、野生型よりも顕著に高いレベルのムコール・ミエヘイ（Ｍ．ｍｅｉｈｅｉ）プロテアーゼ及びアルファアミラーゼを単位面積あたり野生型よりも顕著に高いレベルで含む菌類コロニーを呈した。
【実施例３】
【００４７】
この実施例は、ｈｂｒＢ遺伝子の単離及び特徴づけについて説明する。実施例１の手順を用いて、ｈｂｒＢ遺伝子を単離し及び配列決定した。このｈｂｒＢ遺伝子の核酸及びアミノ酸配列を図４乃至６に示す。ｈｂｒＢは遺伝子であり、ｈｂｒＢ３は過剰分岐表現型を引き起こす遺伝子の温度感受性変異体である。
【００４８】
３．１プロモーター置換
プロモーター交換は、条件付で発現された遺伝子であるａｌｃＡを用いて行った。ｈｂｒＢの５’末端の１０５０ｂｐをｐＡＬ３発現ベクターの中のａｌｃＡプロモーターの後ろに結合した（Ｗａｒｉｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  ７９：１１９−１３０）。これを、アスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）野生型株、Ｇ１９１の中で形質転換させた。２５の軽質転換体が得られ、そのうちの５つが異なる媒体上で、制御下可能な形態を示した。ｈｂｒＢダウン制御の表現型の影響を研究するためにカルコフローラ（Ｃａｌｃｏｆｌｏｕｒ）染色を用いた。このダウン制御された発現型は本来の温度感受性変異体の発現形態とは異なっていた。胞子及び第一挿入成分は大きく膨張し、対立表現型のロスのようであった。組込みを確認するためにサザンブロットを行い、１の形質転換体であるＴ１２が正しい組込みパターンを示した。
【００４９】
１．２  ２−１６９及びＴ１２の間の有性交差
ｈｂｒＢ３に相補であるＤＮＡ配列がｈｂｒＢ遺伝子自身であるか、又は２の遺伝子の間の遺伝子外抑圧組換えであるかどうかを確かめる試験を行った。この試験のために、オリジナル温度感受性変異体２−１６９をＴ２プロモーター置換株と交差させた。もし、２つの遺伝子が同じ位置であるならこれらの間で組換えは起こらないであろうし、全子孫は完全に温度感受性であるか、あるいはグルコース抑制されるであろう。代わりに、もし、相補遺伝子が遺伝子外抑制であるなら、するために、自由にｈｂｒＢと組換えが起こり、５の表現型程度の子孫を生産すると考えられる。野性型クラス及び温度感受性であり且つａｌｃＡであるクラスの２の親クラスが得られるであろう。１２０の子孫をテストし、ｈｂｒＢ及びｈｂｒＢ３を同じ位置に含む２の親クラスが、約１：１の割合で得られた。
【００５０】
１．３  ｈｂｒＢ３における細胞外プロテアーゼ生産
アスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）の中のＳｏｄＶ１Ｃ１変異体は、細胞表面及び表面外分泌されるタンパクのプロセシングに影響を与える（Ｌｅｅ，  ＨＥＵＢＡＣＨ．  ｅｔ  ａｌ  （２００２）  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  ２０８：  ２５３−２５７）。ＳｏｄＶ１Ｃ遺伝子は、分泌経路の膜結合成分の間の細胞内タンパク質輸送に必須であり、極大化に必須である、α−関連遺伝子である。１％スキムミルクアガープレートにおいて、ＳｏｄＶ１Ｃ１変異体株は細胞外にハロの生産を欠失するプロテアーゼを分泌する能力を欠いている。ＰＳ１−Ｂｌａｓｔの結果により示唆される同様の役割をＨｂｒＢが有するかどうかを評価するために、野性型及びｈｂｒＢ３株を同じスキムミルクプレートに接種し、そして所定の温度（４２℃）でインキュベートした。両株はハロを生産し、ｈｂｒＢ３変異体がプロテアーゼ分泌において明らかな影響を示さないことが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１Ａ】図１Ａ−１Ｅは、ＨｂｒＡに関する核酸（配列番号１；ｈｂｒＡ）及びアミノ酸（配列番号２）配列を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ−１Ｅは、ＨｂｒＡに関する核酸（配列番号１；ｈｂｒＡ）及びアミノ酸（配列番号２）配列を示す。
【図１Ｃ】図１Ａ−１Ｅは、ＨｂｒＡに関する核酸（配列番号１；ｈｂｒＡ）及びアミノ酸（配列番号２）配列を示す。
【図１Ｄ】図１Ａ−１Ｅは、ＨｂｒＡに関する核酸（配列番号１；ｈｂｒＡ）及びアミノ酸（配列番号２）配列を示す。
【図１Ｅ】図１Ａ−１Ｅは、ＨｂｒＡに関する核酸（配列番号１；ｈｂｒＡ）及びアミノ酸（配列番号２）配列を示す。
【図２Ａ】図２Ａ−２Ｃは、ｈｂｒＡに関するアミノ酸配列のアミノ酸アラインメントを示す；アスペルギルス・フミガタス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）（ａｆｖａｃ）；ラット（ｒａｔｖａｃ）；酵母ｓｌｐ遺伝子（ｓｌｐ１  ｙｅａｓｔ）；Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ（ｓｌｐ１＿ｃｅｅｌ）。
【図２Ｂ】図２Ａ−２Ｃは、ｈｂｒＡに関するアミノ酸配列のアミノ酸アラインメントを示す；アスペルギルス・フミガタス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）（ａｆｖａｃ）；ラット（ｒａｔｖａｃ）；酵母ｓｌｐ遺伝子（ｓｌｐ１  ｙｅａｓｔ）；Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ（ｓｌｐ１＿ｃｅｅｌ）。
【図２Ｃ】図２Ａ−２Ｃは、ｈｂｒＡに関するアミノ酸配列のアミノ酸アラインメントを示す；アスペルギルス・フミガタス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）（ａｆｖａｃ）；ラット（ｒａｔｖａｃ）；酵母ｓｌｐ遺伝子（ｓｌｐ１  ｙｅａｓｔ）；Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ（ｓｌｐ１＿ｃｅｅｌ）。
【図３】図３は、ｈｂｒ／ｒｅｃＡ変異体によるアミラーゼの分泌を示す。
【図４Ａ】図４は、核酸配列（配列番号７、ｈｂｒＢ）を示す。開始コドンは１１１８であり、停止コドンは３９１０である。ＯＲＦは、長さで２７９３であり、＋２リーディングフレームの中を読む。イントロンは存在しない。
【図４Ｂ】図４は、核酸配列（配列番号７、ｈｂｒＢ）を示す。開始コドンは１１１８であり、停止コドンは３９１０である。ＯＲＦは、長さで２７９３であり、＋２リーディングフレームの中を読む。イントロンは存在しない。
【図４Ｃ】図４は、核酸配列（配列番号７、ｈｂｒＢ）を示す。開始コドンは１１１８であり、停止コドンは３９１０である。ＯＲＦは、長さで２７９３であり、＋２リーディングフレームの中を読む。イントロンは存在しない。
【図５】図５はＨｂｒＢに対するアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
【図６Ａ】図６は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）（Ａ．  ｎｉｄ．）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍａｇａｔｕｓ）（Ａ．  ｆｕｍ．）及びニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）（Ｎ．ｃｒａ．）、ＨｂｒＢに対するアミノ酸配列のアミノ酸アラインメントを示す。アスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｂｒＢとニューロスポラ・クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）の相同性は３６％（１７８／４８５）である。アスペルギルス・フミガタス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）との相同性は５３％である（４２２／７９１）。
【図６Ｂ】図６は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）（Ａ．  ｎｉｄ．）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍａｇａｔｕｓ）（Ａ．  ｆｕｍ．）及びニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）（Ｎ．ｃｒａ．）、ＨｂｒＢに対するアミノ酸配列のアミノ酸アラインメントを示す。アスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｂｒＢとニューロスポラ・クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）の相同性は３６％（１７８／４８５）である。アスペルギルス・フミガタス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）との相同性は５３％である（４２２／７９１）。
【図６Ｃ】図６は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）（Ａ．  ｎｉｄ．）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍａｇａｔｕｓ）（Ａ．  ｆｕｍ．）及びニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）（Ｎ．ｃｒａ．）、ＨｂｒＢに対するアミノ酸配列のアミノ酸アラインメントを示す。アスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｂｒＢとニューロスポラ・クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）の相同性は３６％（１７８／４８５）である。アスペルギルス・フミガタス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）との相同性は５３％である（４２２／７９１）。
【図６Ｄ】図６は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）（Ａ．  ｎｉｄ．）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍａｇａｔｕｓ）（Ａ．  ｆｕｍ．）及びニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）（Ｎ．ｃｒａ．）、ＨｂｒＢに対するアミノ酸配列のアミノ酸アラインメントを示す。アスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｂｒＢとニューロスポラ・クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）の相同性は３６％（１７８／４８５）である。アスペルギルス・フミガタス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）との相同性は５３％である（４２２／７９１）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2008504014.tif 000007
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【国際調査報告】
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