(57)【要約】ヒトにおいて腫瘍を治療するための癌性疾患修飾性抗体（ＣＤＭＡＢ）１０Ａ３０４．７の使用並びにＣＤＭＡＢの単離方法及び製造方法。モノクローナル抗体１０Ａ３０４．７（ＡＴＴＣ受入番号ＰＴＡ−５０６５）は、癌細胞に対して細胞傷害性であり、その際、細胞傷害性には、抗体依存性細胞介在性の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）及び補体依存性の細胞傷害性（ＣＤＣ）が介在する。モノクローナル抗体１０Ａ３０４．７は、ヒト腫瘍の疾患の進行を遅延させるのに有用である。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類においてヒト腫瘍を治療することによって疾患の進行を遅延させる方法であって、前記腫瘍が、受入番号ＰＴＡ−５０６５としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされるモノクローナル抗体の識別特性を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片に特異的に結合する抗原を発現し、前記哺乳類の腫瘍量を低減し、それによって疾患の進行を遅延させるのに有効な量の前記モノクローナル抗体を前記哺乳類に投与することを含む方法。
【請求項２】
前記抗体が細胞傷害性部分に結合される請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記細胞傷害性部分が放射性同位元素である請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記抗体が補体を活性化させる請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記抗体が抗体依存性細胞性の細胞傷害性に介在する請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記抗体がヒト化抗体である請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記抗体がキメラ抗体である請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記ヒト腫瘍が、結腸、卵巣、前立腺及び乳腺の組織から成る群から選択される組織を起源とするとして同定される請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌性疾患修飾性抗体（ＣＤＭＡＢ）並びに任意で１以上の化学療法剤を併用した治療法及び診断法におけるこれらＣＤＭＡＢの使用に関する。本発明はさらに、本発明のＣＤＭＡＢを利用する結合アッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の症状を呈する各個人は、独特であり、その人の独自性と同じくらい他の癌とは異なる癌を有する。これにもかかわらず、現在の治療法では、同一種の癌患者すべてを同一段階にて同一方法で治療する。これらの患者の少なくとも３０％は、治療法の第一線で落伍するので、結果としてさらに次々と治療を受け、治療の失敗、転移及びついには、死亡の可能性が高まる。治療への優れたアプローチは、特定の個人に対する特注の治療法であろう。それ自体を特注にする現在の唯一の治療法は外科手術である。化学療法や放射線療法を患者に対して誂えることはできず、外科手術だけではほとんどの場合、治癒を生み出すには不適当である。
モノクローナル抗体の出現に伴って、各抗体を単一エピトープに向けることができるので、特注療法のための方法を開発する可能性が現実的になった。さらに、特定個人の腫瘍を独特に規定する様々なエピトープに向けられる抗体の組み合わせを作製することが可能である。
【０００３】
癌性細胞と正常細胞との間の有意な差異は、癌性細胞が形質転換された細胞に特異的な抗原を含有することであることを認識して、科学界は長いこと、これら癌抗原に特異的に結合することによって形質転換された細胞を特異的に標的とするようにモノクローナル抗体を設計することができると考えてきたので、モノクローナル抗体は癌細胞を排除する「特効薬」として作用することができるという考えを生じている。
直ちに開示された発明の教示に従って単離されたモノクローナル抗体は、患者にとって有益な様態で、たとえば、腫瘍量を軽減することによって癌性疾患の進行を修飾することが示され、本明細書では、癌性疾患修飾性抗体（ＣＤＭＡＢ）又は「抗癌」抗体と様々に呼ばれるであろう。
現在、癌患者は普通、治療の選択肢をほとんど有さない。癌治療法に対する統制的アプローチによって世界的な生存率及び罹患率は改善してきた。しかしながら、特定個人に対しては、これら統計上の改善は、個人的な状況における改善と必ずしも相関しない。
【０００４】
従って、開業医が同一コホート内のほかの患者から切り離して各腫瘍を治療することを可能にする方法が提案されたなら、これによってその１人の人だけに特化された治療法の独特のアプローチが可能になったであろう。そのような過程の治療法は理想的には、治癒率を高め、さらに良好な予後を生じ、それによって長い間の切実な要求が満たされたであろう。
歴史的には、ヒトの癌の治療でポリクローナル抗体が利用されたが、成功は限定されていた。リンパ腫及び白血病が、ヒトの血漿で治療されたが、寛解や応答の延長はほとんどなかった。さらに再現性を欠き、化学療法に比べて追加的な利点はなかった。たとえば、乳癌、黒色腫及び腎細胞癌のような固形腫瘍もヒトの血液、チンパンジーの血清、ヒトの血漿及びウマの血清で治療されたが、それに相当するような予想可能な又は有効な成績は得られなかった。
固形腫瘍に対するモノクローナル抗体の多数の臨床試験が存在している。１９８０年代では、ヒト乳癌に関する少なくとも４つの臨床試験があり、特異的抗原に対する抗体又は組織選択性に基づく抗体を用いて、少なくとも４７人の患者からたった１人の応答者を生じた。シスプラチンとの併用でヒト化抗Ｈｅｒ２抗体を用いた臨床試験が成功したのは１９９８年以降であった。この試験では、３７人の患者が応答にアクセスし、その約４分の１が部分応答率を有し、残りの半分は軽微な又は安定した疾患の進行を有した。
【０００５】
結腸直腸癌を検討する臨床試験には、糖タンパク質と糖脂質の双方の標的に対する抗体が関与する。腺癌に対して何らかの特異性を有する１７−１Ａのような抗体が、フェーズ２の臨床試験を受け、６０人を超える患者のうちたった１人が部分応答を有した。ほかの試験では、追加でサイクロホスファミドを使用したプロトコールにて、１７−１Ａの使用によって、５２人の患者中、たった１人が完全応答を生じ、２人が軽微な応答を生じた。１７−１Ａが関与するそのほかの試験では成績は類似していた。当初、画像診断に認可されたヒト化されたマウスモノクローナル抗体の使用も腫瘍の退行を生じなかった。今まで、結腸直腸癌に有効な抗体はなかった。同様に、肺癌、脳腫瘍、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌及び胃癌に関して乏しい成績しか存在しない。黒色腫については、抗ＧＤ３モノクローナル抗体を使用した限定された成功例がある。従って、ヒトの臨床試験の必須条件である小動物試験での成功にもかかわらず、今までに調べられた抗体はほとんど無効であると見ることができる。
【０００６】
従来の特許
特許文献１は、患者の細胞又は組織からクローニングしてもよいＭＨＣ遺伝子を患者の腫瘍に由来する細胞に形質移入する方法を開示している。形質移入された細胞は次いで、患者にワクチン接種するのに使用される。
特許文献２は、哺乳類の腫瘍細胞及び正常細胞の細胞外成分ではなく細胞内成分に特異的なモノクローナル抗体を得る工程、該モノクローナル抗体を標識する工程、腫瘍細胞を殺すような治療法を受けている哺乳類の組織と標識抗体を接触させる工程、及び変性している腫瘍細胞の細胞内成分への標識抗体の結合を測定することにより治療法の有効性を判定する工程を含む方法を開示している。ヒトの細胞内抗原に向けられた抗体を調製することにおいて、特許権所有者は、悪性細胞がそのような抗原の都合の良い供給源を代表することを認識している。
【０００７】
特許文献３は、新規の抗体及びその製造方法を提供している。具体的には、該特許は、ヒトの腫瘍、たとえば、結腸癌や肺癌に関連するタンパク質抗原に強く結合するが、正常細胞にははるかに弱く結合する特性を有するモノクローナル抗体の形成を教示している。
特許文献４は、ヒト癌患者から腫瘍組織を外科的に取りだすこと、腫瘍組織を処理して腫瘍細胞を得ること、生存可能ではあるが、腫瘍形成性ではないように腫瘍細胞に放射線を照射すること、及びこれらの細胞を用いて、患者が原発腫瘍の再発を阻止することができると同時に転移を阻止することができるようにワクチンを調製することを含む癌治療法の方法を提供している。該特許は、腫瘍細胞の表面抗原に反応性であるモノクローナル抗体の開発を教示している。４欄４５行目に述べられているように、以下参照、特許権所有者は、ヒト腫瘍において活性のある特異的な免疫療法を発現するモノクローナル抗体の開発に自己の腫瘍細胞を利用している。
特許文献５は、ヒト悪性腫瘍に特徴的な糖タンパク質抗原は、上皮組織の起源に依存しないことを教示している。
【０００８】
特許文献６は、Ｈｅｒ２を発現している細胞でアポトーシスを誘導する抗Ｈｅｒ２抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ細胞株、該抗体を用いて癌を治療する方法及び前記抗体を含む医薬組成物に惹かれている。
特許文献７は、腫瘍組織及び非腫瘍組織から精製されたムチン抗原に対するモノクローナル抗体を産生する新規のハイブリドーマ細胞株を記載している。
特許文献８は、所望の抗原に特異的な抗体を産生するヒトのリンパ球を生成する方法、モノクローナル抗体を産生する方法、並びに該方法によって産生されるモノクローナル抗体に惹かれている。該特許は特に、癌の診断及び治療に有用である抗ＨＤヒトモノクローナル抗体の産生に惹かれている。
特許文献９は、ヒトの悪性腫瘍細胞と反応性の抗体、抗体断片、抗体複合体及び単鎖免疫毒素に関する。これらの抗体が機能するメカニズムは、分子が、ヒト悪性腫瘍の表面に存在する細胞膜抗原と反応性であるという点、さらに、該抗体が、結合に続いて、悪性腫瘍細胞内に内部移行する能力を有するという点で二重であり、抗体薬及び抗体−毒素の複合体を形成するのにそれらを特に有用にしている。未修飾の形態で、該抗体は、特定の濃度で細胞傷害特性も示す。
特許文献１０は、腫瘍治療法及び予防法のために自己抗体の使用を開示している。しかしながら、この抗体は、加齢した哺乳類に由来する抗核自己抗体である。この場合、自己抗体は、免疫系で見出される自然抗体の一種であると言われる。自己抗体は「加齢哺乳類」に由来するので、自己抗体が実際に治療される患者に由来する必要性はない。さらに、該特許は、加齢哺乳類に由来する自然抗核自己抗体及びモノクローナル抗核自己抗体、並びにモノクローナル抗核自己抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を開示している。
【特許文献１】米国特許第５，７５０，１０２号
【特許文献２】米国特許第４，８６１，５８１号
【特許文献３】米国特許第５，１７１，６６５号
【特許文献４】米国特許第５，４８４，５９６号
【特許文献５】米国特許第５，６９３，７６３号
【特許文献６】米国特許第５，７８３，１８６号
【特許文献７】米国特許第５，８４９，８７６号
【特許文献８】米国特許第５，８６９，２６８号
【特許文献９】米国特許第５，８６９，０４５号
【特許文献１０】米国特許第５，７８０，０３３号
【発明の開示】
【０００９】
本発明者は、以前、癌性疾患を治療するのに有用である、個々に特注の抗癌抗体を選択する工程を指向する、「個別化された患者に特異的な抗癌抗体」と題する米国特許第６，１８０，３５７号を授与された。本文書の目的で、用語「抗体」及び「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は相互交換可能に使用されてもよく、ハイブリドーマ（たとえば、マウス、ヒト）によって産生される未処理の免疫グロブリン、免疫複合体、必要に応じて、免疫グロブリンに由来する免疫グロブリン断片及び組換えタンパク質、たとえば、キメラの、及びヒト化された免疫グロブリン、Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）２断片、単鎖抗体、組換え免疫グロブリンの可変領域（Ｆｖ）ｓ、融合タンパク質などを言う。本文書の目的で、用語「組織試料」は、哺乳類から得られる少なくとも１個の細胞又は細胞の凝集体を意味すると理解される。一部のアミノ酸配列は、タンパク質の構造又は機能に有意な影響を与えることなく、ポリペプチドに変異を持つことができることがよく認識される。抗体の分子再構成では、主鎖領域の核酸配列又はアミノ酸配列における修飾は、一般に容認されてもよい。これらには、置換（保存的置換が好ましい）、欠失又は付加が挙げられるが、それらに限定されない。さらに、標準的な化学療法の手段、たとえば、放射性核種を本発明のＣＤＭＡＢと結合し、それによって前記化学療法の使用の焦点を絞ることは本発明の範囲内である。ＣＤＭＡＢを毒素、細胞傷害性部分、酵素、たとえば、ビオチンを結合した酵素、又は血液原性細胞と結合させ、それによって抗体複合体を形成することができる。
【００１０】
本出願は、癌性疾患修飾性モノクローナル抗体をコードするハイブリドーマ細胞株を単離するために、’３５７号特許で教示されたような患者特異的抗癌抗体を産生する方法を利用する。これらの抗体は、１つの腫瘍に特異的に作製することができるので、癌治療法の特注が可能になる。本出願の背景の範囲内で、細胞殺傷（細胞傷害）特性又は細胞増殖阻害（細胞静止）特性のいずれかを有する抗癌抗体を以後、細胞傷害性という。これらの抗体は、癌の病期決定及び診断の助けとして使用することができ、腫瘍の転移を治療するのに使用することができる。
【００１１】
米国特許第６，１８０，３５７号の工程を実質的に使用して、ＳＣＩＤマウスで固形腫瘍として増殖していたヒトＨＴ−２９結腸癌細胞株の凍結細胞浮遊液によるマウスの免疫に続いて、マウスのモノクローナル抗体１０Ａ３０４．７を得た。これらの抗体は、癌の病期決定及び診断の助けとして使用することができ、腫瘍の転移を治療するのに使用することができる。１０Ａ３０４．７の抗原は、異なった組織起源の幅広いヒト細胞株の細胞表面に発現されていた。結腸癌細胞株ＳＷ１１１６、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ−７、前立腺癌細胞株ＰＣ−３及び卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ−３は、２００３年４月１４日に出願された出願Ｓ．Ｎ．１０／４１３，７５５、今や、２００４年９月２１日に発行された米国特許第６，７９４，４９４号で実証された１０Ａ３０４．７の細胞傷害性作用に感受性であることが調べられた細胞株である。
【００１２】
組織培養における乳癌細胞に対する１０Ａ３０４．７の細胞傷害性活性の結果は、その生体内での抗腫瘍活性を立証することによってさらに拡大された。ヒト乳癌の生体内モデルでは、特定の免疫細胞を欠くためにヒト腫瘍細胞を拒絶することができないので、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの首筋の皮下にＭＤＡ−ＭＢ−２３１癌細胞を移植した。前臨床の異種移植腫瘍モデルは、治療の有効性の妥当な予報因子とみなされている。マウスにおける異種移植片は、天然に生じる癌と同様に、間質、中央壊死及び新生脈管を発達させて固形腫瘍として増殖する。免疫不全マウスにおける生体内異種移植モデルとして乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を評価した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍の奏功な増大又は「増大比率」及び該腫瘍の通常の化学療法剤に対する感受性によってそれらが好適なモデルとして特徴付けられた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１親細胞株及び該細胞株の変異体は、異種移植腫瘍モデルで上手く使用され、今や臨床的な化学療法剤として使用されている幅広い範囲の治療剤を評価してきた。
【００１３】
１０Ａ３０４．７は、腫瘍増殖を妨害し、ヒト乳癌の生体内モデルでの腫瘍量を軽減した。移植後５６日目で、最後の治療投与後６日目での１０Ａ３０４．７治療群における平均腫瘍容積は、アイソタイプ対照群の腫瘍容積の１パーセントだった（ｔ検定、ｐ＝０．０００３）。試験を通して毒性の臨床的兆候はなかった。毎週測定した体重は健康体と変わりなかった。治療期間の終了時、群間の体重に有意差はなかった（ｔ検定、ｐ＝０．３５１２）。従って、１０Ａ３０４．７は、乳癌異種移植モデルにおいて耐容性であり、腫瘍量を減らした。
【００１４】
全体で、本発明は、治療剤に対する標的としての１０Ａ３０４．７抗原の使用を教示し、投与されるとそれが、哺乳類において該抗原を発現している癌の腫瘍量を軽減することができる。本発明はまた、ＣＤＭＡＢ（１０Ａ３０４．７）及びその誘導体を使用して、その抗原を標的として哺乳類において該抗原を発現している癌の腫瘍量を軽減することを教示する。さらに、本発明はまた、この抗原を発現する腫瘍を担う哺乳類の診断、治療法の予測及び予後に有用であることができる癌性細胞における１０Ａ３０４．７の検出の利用を教示する。
個別化された抗癌治療の予測は、患者が管理される方法に変化をもたらすであろう。有望な臨床的シナリオは、提示時に腫瘍試料を入手し、保存することである。この試料から、既存の癌性疾患修飾性抗体のパネルによって腫瘍をタイプ分けすることができる。従来のように患者の病期が決められるが、利用可能な抗体が患者のさらなる病期決定に役立つことができる。既存の抗体で患者を直ちに治療することができ、及び／又は本明細書で概説される方法を用いて、又は本明細書で開示されるスクリーニング法と併せてファージディスプレイライブラリの使用を介してのいずれかで腫瘍に特異的な抗体のパネルを作製することができる。ほかの腫瘍が治療されているものと同じエピトープの一部を持ちうる可能性があるので、生成された抗体はすべて抗癌抗体のライブラリに加えられるであろう。本方法に従って産生された抗体は、これらの抗体に結合する癌を有するどんな数の患者においても癌性疾患を治療するのに有用であってもよい。
【００１５】
患者が治療法の当初の経過に難治性であるか、又は転移が発生すれば、腫瘍に特異的な抗体を生成する工程を再治療のために反復することができる。さらに、その患者から得られた又は転移の治療のために再輸血される赤血球に抗癌抗体を結合することができる。転移癌には有効な治療はほとんどなく、転移は通常、死を招く芳しくない予後の前兆となる。しかしながら、転移癌は通常、よく脈管形成されており、赤血球による抗癌抗体の送達は、腫瘍部位に抗体を濃縮する効果を有しうる。転移に先立ってさえ、ほとんどの癌細胞は、その生存のために宿主の血液供給に依存しており、赤血球に結合された抗癌抗体は、同様にその場での腫瘍に対して有効でありうる。或いは、抗体は、その他の血液原性細胞、たとえば、リンパ球、マクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞などに結合してもよい。
抗体には５つのクラスがあり、それぞれ、重鎖によって付与される機能に関連する。むき出しの抗体による癌細胞の殺傷は、抗体依存性細胞介在性の細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性の細胞傷害（ＣＤＣ）のいずれかが介在すると一般に考えられている。たとえば、マウスのＩｇＭとＩｇＧ２ａの抗体は、補体系のＣ−１成分を結合することによりヒトの補体を活性化し、それによって、腫瘍溶解を招くことができる補体活性化の古典的経路を活性化する。ヒトの抗体については、有効な補体活性化抗体はほとんど一般にＩｇＭ及びＩｇＧ１である。マウスのＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ３アイソタイプの抗体は、単球、マクロファージ、顆粒球及び特定のリンパ球による細胞殺傷を招くＦｃ受容体を有する細胞傷害性細胞を動員するのに有効である。ヒトのＩｇＧ１及びＩｇＧ３双方のアイソタイプの抗体はＡＤＣＣに介在する。
【００１６】
癌細胞の殺傷に介在する抗体の別の可能性のあるメカニズムは、細胞膜における種々の化学結合及びそれに関連する糖タンパク質又は糖脂質の加水分解を触媒するように機能する抗体、いわゆる触媒抗体の使用を介するものであってもよい。
さらに広く受け入れられている、癌細胞の殺傷に介在する抗体について２つの追加的なメカニズムがある。第１は、癌細胞上に存在する推定上の抗原に対して免疫応答を生じるように生体を誘導するワクチンとしての抗体の使用である。第２は、増殖受容体を標的とし、その機能を効果的に喪失するようにその機能を妨害する又はその受容体を下方調節する抗体の使用である。
【００１７】
制癌剤の臨床的有用性は、患者に対する許容可能なリスク特性のもとでの薬剤の利点に基づく。癌治療法では、生存は、利点の後に一般に最も求められるものであるが、延命に加えて、よく認識されたそのほかの利点が多数存在する。治療が生存に有害に影響しないこれらそのほかの利点には、症状の軽減、有害事象に対する防護、再発までの時間の延長又は疾患から解き放たれた生存、及び進行までの時間の延長が挙げられる。これらの基準は一般に、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）のような許認可機関がこれらの利点を生じる薬剤を認可することである（Hirschfeld et al., Critical
Review in Oncology/Hematology 42:137-143, 2002）。これらの基準に加えて、これらの種類の利点を予測してもよいその他の評価項目があることがよく認識されている。一部には、米国ＦＤＡによって助成される加速された認可過程は、特許の利益を予測しそうな代わりのものが存在することを認めている。年末（２００３年）時点で、この過程で認可された薬剤が１６あり、そのうち、４つが、完全認可に進んだ。すなわち、代わりの評価項目によって予測されたように、追跡試験によって直接的な患者の利益が実証された。固形腫瘍における薬剤の効果を判定する重要な評価項目の１つは、治療に対する応答を測定することによる腫瘍量の評価である（Therasse et al., Journal of
the National Cancer Institute 92(3):205-216, 2000）。そのような評価のための臨床的基準（ＲＥＣＩＳＴ基準）は、癌における国際的な専門家のグループである固形腫瘍ワーキンググループにおける反応評価基準によって普及している。腫瘍量に対する実証された効果を持つ薬剤は、ＲＥＣＩＳＴによる客観的応答によって示されるように、適当な対照群と比べて、最終的に、直接的な患者の利益を生じる傾向がある。前臨床の設定では、腫瘍量は一般に評価し、記録するには、さらに率直である。そこでは、前臨床試験は、臨床設定に変換することができ、前臨床モデルで延命を生じる薬剤は、最も大きく期待される臨床有用性を有する。臨床的な治療に陽性の応答を生じる類縁体、前臨床の設定で腫瘍量を軽減する薬剤も疾患に対して有意な直接的影響を有してもよい。癌の薬物治療からの臨床的転帰の後、延命が最も求められるが、臨床的有用性を有するそのほかの利益があり、疾患の進行における遅延、延命、又はその双方に相関してもよい腫瘍量の低減が、直接的な利益を導き、臨床的影響を有しうることは明らかである（Eckhardt et al., Developmental
Therapeutics: Successes and failures of Clinical Trial Designs of Targeted
Compounds; ASCO Educational Book, 39th Annual Meeting 2003, pages 209-219）。
【００１８】
従って、本発明は、ハイブリドーマ細胞株及び相当する単離されたモノクローナル抗体及び前記ハイブリドーマ細胞株がコードするその断片を結合する抗原を単離するために、癌細胞に関して細胞傷害性であると同時に非癌性細胞には相対的に非毒性である、特定個人に由来する細胞からＣＤＭＡＢを作製する方法を活用することを目的とする。
本発明の追加の目的は、ＣＤＭＡＢ及びその断片を結合する抗原を教示することである。
本発明のさらなる目的は、その細胞傷害性にＡＤＣＣが介在するＣＤＭＡＢを作製することである。
本発明のさらなる追加の目的は、その細胞傷害性にＣＤＣが介在するＣＤＭＡＢを作製することである。
本発明のその上さらなる目的は、その細胞傷害性が、細胞性の化学結合の加水分解を触媒する能力の機能であるＣＤＭＡＢを作製することである。
本発明のその上さらなる目的は、癌の診断、予知及び監視のための結合アッセイに有用であるＣＤＭＡＢを作製することである。
本発明のその他の目的及び利点は、説明及び例示の目的で本発明の特定の実施態様が述べられる以下の記載から明らかになるであろう。
【００１９】
（図面の簡単な説明）
図１は、幾つかの癌細胞及び非癌細胞に対する１０Ａ３０４．７、アイソタイプ対照及び抗−ＥＧＦＲ抗体の代表的なＦＡＣＳヒストグラムである。
図２は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルにおける腫瘍増殖に対する１０Ａ３０４．７の効果である。点線は、抗体が投与された期間を示す。データにおける点は、平均値±ＳＥＭを表す。
図３は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルにおける体重に対する１０Ａ３０４．７の効果である。データにおける点は、平均値±ＳＥＭを表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
【実施例１】
【００２１】
Ｓ．Ｎ．１０／４１３，７５５に示されるように、ブダペスト条約に従って、受入番号ＰＴＡ−５０６５のもとで、２００３年３月１９日、ハイブリドーマ細胞株１０Ａ３０４．７は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、バージニア州２０１１０−２２０９、マナッサス、ユニバシティ通り１０８０１番地）に寄託された。３７ＣＦＲ１，８０８によれば、寄託者は、寄託された材料の公衆への利便性に課せられたあらゆる制約を特許付与の際、変更不可に取り除くことを保証する。
１０Ａ３０４．７モノクローナル抗体は、週に２回、回収及び再播種を行ってＣＬ−１０００フラスコ（オンタリオ州、オークビル、ＢＤバイオサイエンシズ）中でハイブリドーマを培養し、プロテインＧセファロース４ファストフロー（ケベック州、バリー・ドゥフェ、アマシャム・バイオサイエンシズ）による標準的な抗体精製法に従って精製することによって作製した。
【００２２】
Ｓ．Ｎ．１０／４１３，７５５に以前記載されたように、細胞傷害性アッセイにおいて、１０Ａ３０４．７を、陽性対照［抗Ｆａｓ（ＥＯＳ９．１、ＩｇＭκ、２０ｍｇ・ｍＬ、カリフォルニア州、サンディエゴのｅバイオサイエンス）、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＩｇＧ１κ、１０ｍｇ／ｍＬ、オンタリオ州、マーカムのインターメディオ）、抗ＥＧＦＲ（Ｃ２２５、ＩｇＧ１κ、５ｍｇ・ｍＬ、オンタリオ州、ホーンビーのセダーレーン）、サイクロヘキシミド（１００ｍＭ、オンタリオ州、オークビルのシグマ）、及びＮａＮ３（０．１％、オンタリオ州、オークビルのシグマ）］並びに陰性対照［１０７．３（抗ＴＮＰ、ＩｇＧ１κ、２０ｍｇ／ｍＬ、オンタリオ州、オークビルのＢＤバイオサイエンシズ）、ＭＰＣ−１１（抗原特異性不明、ＩｇＧ２ｂκ、２０ｍｇ／ｍＬ）、ＩｇＧ緩衝液（２％）］と比較した(表１）。乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１「ＭＢ−２３１］、ＭＣＦ−７）、結腸癌（Ｃａｃｏ−２、ＤＬＤ−１、Ｌｏｖｏ、ＨＴ−２９、ＳＷ１１１６、ＳＷ６２０）、卵巣癌（ＯＶＣＡＲ）、膵臓癌（ＢｘＰＣ−３）、前立腺癌（ＰＣ−３）の細胞株及び非癌細胞株（ＣＣＤ２７ｓｋ、Ｈｓ８８８．Ｌｕ）を調べた（すべてバージニア州、マナッサスのＡＴＣＣから入手）。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ細胞傷害性アッセイは、モレキュラープローブ（オレゴン州、ユージーン）から入手した。アッセイは、製造元の指示書に従い、以下にまとめた変更を含めて行った。アッセイの前に事前に定めた適当な濃度で細胞をプレートに播いた。２日後、１００μＬの精製抗体を培地で希釈し、細胞のプレートに移し、５％ＣＯ２のインキュベータにて５日間インキュベートした。次いで、逆さにすることによってプレートを空にし、ふき取って水分を除いた。ＭｇＣｌ２及びＣａＣｌ２を含有する室温のＤＰＢＳをマルチチャンネルの小型容器から各ウエルに分注し、３回軽く叩き、逆さにして空にし、ふき取って水分を除いた。ＭｇＣｌ２及びＣａＣｌ２を含有する室温のＤＰＢＳで希釈した蛍光Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ色素５０μＬを各ウエルに加え、５％ＣＯ２のインキュベータにて３７℃で３０分間インキュベートした。パーキンエルマーＨＴＳ７０００蛍光プレートリーダーでプレートを読み取り、マイクロソフトエクセルでデータを解析し、結果を表１にまとめた。データは、３連一組で調べた４回の実験の平均を表し、以下のやり方：４／４の実験で細胞傷害性がバックグラウンドより１５％を超えて高い（＋＋＋＋）、２／４の実験で細胞傷害性がバックグラウンドより１５％を超えて高い（＋＋＋）、少なくとも２／４の実験で細胞傷害性がバックグラウンドより１０〜１５％高い（＋＋）及び少なくとも２／４の実験で細胞傷害性がバックグラウンドより８〜１０％高い、で定量的に示した。表１で標示のついていない細胞は、一貫性のない細胞傷害性又は閾値の細胞傷害性よりも低い効果を表した。１０Ａ３０４．７抗体は、ＳＷ１１１６結腸癌細胞株に３１％の細胞傷害性を誘発した、よく記載される抗ＥＧＦＲ抗体の細胞傷害性作用の３５％を生じた。さらに、１０Ａ３０４．７は、Ｃ２２５に比べて、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（１１１％）及びＭＣＦ−７（８５０％）、前立腺癌細胞株ＰＣ−３（３７５％）、並びに卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ（６６７％）を含むその他の癌細胞に対して有意に高い細胞傷害性を誘導した。重要なことに、１０Ａ３０４．７は、多数の非癌細胞、たとえば、ＣＣＤ２７ｓｋ又はＨｓ８８８に対して細胞傷害性を生じなかったということは、該抗体が種々の癌細胞に向けられた機能的特異性を有することを示している。細胞傷害性の化学剤は、その予期された細胞傷害性を誘導したが、比較に含まれる多数のその他の抗体は、生体細胞アッセイの限界のもとで予期したとおり機能した。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
また、以前、Ｓ．Ｎ．１０／４１３，７５５に記載されたように、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって、上述の癌細胞株及び正常細胞株のパネルへの１０Ａ３０４．７の結合を測定した。先ず、単層の細胞をＤＰＢＳ（Ｃａ＋＋及びＭｇ＋＋なしで）で洗浄することによってＦＡＣＳ用に細胞を調製した。次いで、細胞離脱緩衝液(インビトロゲン)を用いて、３７℃にて細胞培養プレートから細胞を取り外した。遠心及び回収の後、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２及び２５％ウシ胎児血清を含有するダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（洗浄培地）に４℃にて再浮遊し、計数し、適当な細胞濃度に分注し、遠心して細胞をペレットにし、氷上にて３０分間、２０μｇ／ｍＬでの試験抗体（１０Ａ３０４．７）又は対照抗体(アイソタイプ対照、抗ＥＧＦＲ又は抗Ｆａｓ)の存在下、４℃にて染色培地（ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２及び２％ウシ胎児血清を含有するＤＰＢＳ）に再浮遊した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８結合の二次抗体を添加する前に細胞を洗浄培地で１回洗浄した。次いでＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８結合の抗体を２０分間加えた。次いで最後に細胞を洗浄し、１μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウムを含有する染色培地に再浮遊した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（ＢＤバイオサイエンシズ）を用いて、ＦＡＣＳｃａｎで細胞を流すことによって細胞のフローサイトメトリーデータを取得した。前方散乱光（ＦＳＣ）及び側方散乱光（ＳＳＣ）での電圧及び振幅の増幅率を調整することによって細胞のＦＳＣ及びＳＳＣを設定した。精製したアイソタイプ対照抗体次いで、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８結合の二次抗体で染色した細胞を流すことによって、細胞が、およそ１〜５単位の蛍光中央値強度を持つ均一なピークを有するように蛍光チャンネル（ＦＬ１、ＦＬ２及びＦＬ３）について検出器を調整した。ＦＳＣ及びヨウ化プロピジウムによる排除に対してゲートをかけることによって生細胞を取得した。各試料について、解析のためにおよそ１０，０００個の細胞を取得し、結果を表２に提示した。
【００２５】
表２は、アイソタイプ対照より上昇した平均蛍光強度の倍率をまとめ、３未満〜５（＋）、５〜２５（＋＋）、２５〜５０（＋＋＋）及び５０〜（＋＋＋＋）のように定量的に提示した。１０Ａ３０４．７抗体の代表的なヒストグラムを図１にまとめ、場合によっては二峰性のピークを含む結合特性の証拠にまとめた。１０Ａ３０４．７は、非癌細胞ＣＣＤ２７ｓｋ及びＨｓ８８８．Ｌｕへの高い結合を含めてすべての細胞株に非特異的に結合したが、結合の程度は種々の細胞株間で異なった。従って、１０Ａ３０４．７は、異なったレベルで細胞株に選択的に結合した。表１及び２の結果は、腫瘍細胞への１０Ａ３０４．７の結合は、抗体介在性の細胞傷害性に必要ではあるが、この事象を標的とするには不十分であることを示している。
【００２６】
【表２】
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【実施例２】
【００２７】
ＭＢ２３１腫瘍の生体内実験
図２及び３を参照して、首筋の皮下に注射された１００μＬの生理食塩水中の５００万個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞（ＭＢ−２３１）を４〜８週令のメスＳＣＩＤマウスに移植した。マウスを無作為に５匹ずつ２つの処理群に分けた。移植の翌日、２．７ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ及び２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４を含有する希釈液でストック濃度から希釈した後３００μＬの容積で２０ｍｇ／ｋｇの１０Ａ３０４．７抗体又はアイソタイプ対照抗体（ＭＢ−２３１に結合しないことが分かっている）を腹腔内に投与した。同様に、週１回７週間抗体を投与した。１０週目まで又は個々の動物がカナダ動物管理委員会（ＣＣＡＣ）の終点に達するまで、およそ７日に一度腫瘍の増殖をキャリパーによって測定した。試験期間中、動物の体重を記録した。試験の終了時、ＣＣＡＣの指針に従って動物はすべて安楽死させた。
１０Ａ３０４．７は腫瘍の増殖を妨げ、ヒト乳癌の生体内予防モデルで腫瘍量を低減させた。移植後、５６日目、最後の処理投与後６日目では、１０Ａ３０４．７処理群における腫瘍の平均容積は、アイソタイプ対照処理群における腫瘍容積の１パーセントであった（ｐ＝０．０００３、ｔ検定、図２）。試験を通して毒性の臨床的兆候はなかった。週間隔で測定された体重は正常と変わりなく、よく育った。処理期間の終了時、群間に体重における有意差はなかった（ｐ＝０．３５１２、ｔ検定）。従って、１０Ａ３０４．７は、乳癌の異種移植モデルで上手く容認され、腫瘍量を減らした。
【００２８】
本明細書で言及された特許及び出版物はすべて本明細書が関係する当業者のレベルを示している。特許及び出版物はすべて、各個々の出版物が具体的に且つ個々に参照によって組み入れられるように指示されたかのように、同一程度に参照によって本明細書に組み入れられる。
本発明のある形態が説明される一方で、本明細書で記載され、示される部分の特定の形態又は配置にそれが限定されるべきではないことが理解されるべきである。本発明の範囲から逸脱することなく、種々の変更を行ってもよく、本発明は、本明細書に示され、記載されたものに限定されるとみなされるべきではないことが当業者に明らかであろう。当業者は、本発明が、目的を実行し、言及された目的及び利点、並びにそれに固有のものを得るのに上手く適合することを容易に十分に理解するであろう。本明細書に記載されたオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関連する化合物、方法、手順及び技法はいずれも好ましい実施態様の代表例であり、例示を意図するものであり、範囲の限定を意図するものではない。本発明の範囲内に包含され添付のクレームの範囲によって定義される、その中の変更及びその他の使用が当業者に生じるであろう。特定の好ましい実施態様に関連して本発明を説明してきたが、請求されたような本発明は、そのような特定の実施態様に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、当業者に明らかである、本発明を実行するために記載されたモデルの種々の修正は、以下のクレームの範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】幾つかの癌細胞及び非癌細胞に対する１０Ａ３０４．７、アイソタイプ対照及び抗−ＥＧＦＲ抗体の代表的なＦＡＣＳヒストグラムである。
【図２】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルにおける腫瘍増殖に対する１０Ａ３０４．７の効果である。点線は、抗体が投与された期間を示す。データにおける点は、平均値±ＳＥＭを表す。
【図３】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルにおける体重に対する１０Ａ３０４．７の効果である。データにおける点は、平均値±ＳＥＭを表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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