(57)【要約】本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍及び自己免疫性疾患の治療のための改善されたヒト化ＣＤ２０結合抗体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＤ２０を結合するヒト化２Ｈ７抗体又はその抗原結合断片であって、配列番号２５のＬ鎖可変領域(ＶＬ)と配列番号８のＨ鎖可変領域(ＶＨ)を含んでなるが、ＶＨ-ＣＤＲ２のＤ５６Ａのアミノ酸置換を有しており、ＶＨ-ＣＤＲ３のＮ１００がＹ又はＷに置換されている抗体。
【請求項２】
前記Ｎ１００がＹに置換されている、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記Ｎ１００がＷに置換されている、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
さらに、ＶＨ-ＣＤＲ３に置換Ｓ１００ａＲを含有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
さらに、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を改善するＩｇＧ Ｆｃ領域内の少なくとも一のアミノ酸置換を含有する、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
アミノ酸置換Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｋ３２６Ａを含有するＩｇＧ１ Ｆｃを含んでなる、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
さらに、ＡＤＣＣを改善するがＣＤＣ活性を低減するＦｃ領域内の少なくとも一のアミノ酸置換を含有する、請求項４に記載の抗体。
【請求項８】
少なくともアミノ酸置換Ｋ３２２Ａを含有する、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
さらに、アミノ酸置換Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａを含有する、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
配列番号２６の軽鎖配列及び配列番号３４の重鎖配列を含んでなる、請求項６に記載の抗体。
【請求項１１】
抗体２Ｈ７.ｖ１６と比較して少なくとも３倍に増加した親和性でヒトＣＤ２０を結合する、請求項４に記載の抗体。
【請求項１２】
抗体２Ｈ７.ｖ１６と比較して少なくとも６倍に増加した親和性でヒトＣＤ２０を結合する、請求項４に記載の抗体。
【請求項１３】
２Ｈ７.ｖ１６の少なくとも２０倍の抗体依存生細胞障害性(ＡＤＣＣ)を示す、請求項６に記載の抗体。
【請求項１４】
２Ｈ７.ｖ１６の少なくとも２５倍の補体細胞障害性(ＣＤＣ)を示す、請求項６に記載の抗体。
【請求項１５】
細胞障害性剤とコンジュゲートされた、請求項１ないし１４の何れか一に記載の抗体。
【請求項１６】
前記細胞障害性剤が放射性同位体又は毒素である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体がＣＨＯ細胞内で産生される、請求項１ないし１４の何れか一に記載の抗体。
【請求項１８】
請求項１に記載の抗体をコードする単離された核酸。
【請求項１９】
請求項１又は請求項１０に記載の抗体をコードする発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１８に記載の核酸を含有する宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１ないし１４の何れか一に記載の抗体を産生する、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
配列番号２６の軽鎖配列と配列番号３４の重鎖配列を含んでなる抗体を産生する、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
ＣＨＯ細胞である請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
請求項２１に記載の宿主細胞を培養して、該細胞培養物をから抗体を回収することを含む、請求項１ないし１４の何れか一に記載の抗体の産生方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の抗体と担体を含有してなる組成物。
【請求項２６】
請求項１０に記載の抗体と薬剤的に受容可能な担体を含有してなる、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
容器と該容器に包含される組成物を具備する製造品であって、該組成物が請求項１ないし１７の何れか一に記載の抗体を含有してなる、製造品。
【請求項２８】
さらに、該組成物が非ホジキンリンパ腫を治療するために用いられることを示すパッケージ挿入物を具備するものであり、前記抗体が配列番号２６の軽鎖配列と配列番号３４の重鎖配列を含んでなるものである、請求項２７に記載の製造品。
【請求項２９】
さらに、前記組成物が関節リウマチを治療するために用いられることを示すパッケージ挿入物を具備する、請求項２７に記載の製造品。
【請求項３０】
ＣＤ２０陽性癌を有する患者に、治療的有効量の請求項１ないし１７の何れか一に記載のヒト化２Ｈ７抗体が投与されることを含む、ＣＤ２０陽性癌の治療方法。
【請求項３１】
前記ＣＤ２０陽性癌がＢ細胞リンパ腫又は白血病である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＣＤ２０陽性癌が非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記癌が慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)又はＳＬＬである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗体が、それぞれ配列番号２６及び３４の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を含んでなる、請求項３２又は請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗体が静脈内注入により投与される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗体が１用量当たりおよそ１００ｍｇ／ｍ２から３７５ｍｇ／ｍ２の範囲の投薬で投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗体が１用量当たり３７５ｍｇ／ｍ２の投薬で、少なくとも４回投与される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
さらに、少なくとも一の化学療法剤が患者に投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
前記癌が、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)であり、前記化学療法剤がドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン及びプレドニゾロンからなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
治療的有効量の請求項１ないし１４の何れか一に記載のヒト化２Ｈ７抗体が、自己免疫性疾患に罹患している患者に投与されることを含む、自己免疫性疾患を軽減する方法。
【請求項４１】
前記抗体が、それぞれ配列番号２６及び３４の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を含んでなる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記自己免疫性疾患が、関節リウマチ及び若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、例えばループス腎炎、ヴェゲナー病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、特発性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)、血栓性血小板減少性紫斑病(ＴＴＰ)、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡネフロパシ、ＩｇＭ多発性神経炎、重症筋無力症、ＡＮＣＡ関連血管炎、真正糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群、視神経脊髄炎(ＮＭＯ)及び糸球体腎炎からなる群から選択されるものである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記自己免疫性疾患が関節リウマチである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
さらに、前記患者に第二の治療剤が投与されることを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記の第二の治療剤が免疫抑制剤である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記免疫抑制剤がメトトレキセートである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記抗体が静脈内投与又は皮下投与される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記抗体が、１用量当たり１０ｍｇから５００ｍｇの範囲の投薬で静脈内投与される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗体が１００ｍｇ／用量の投薬で投与される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
さらに、前記患者に第二の治療剤が投与される、請求項４０に記載の方法。
【請求項５１】
前記の第二の治療剤がＢＡＦＦアンタゴニストである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＢＡＦＦアンタゴニストが抗ＢＲ３抗体又はＢＲ３-Ｆｃ融合タンパク質である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
さらに、前記患者にＶＥＧＦアンタゴニストが投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項５４】
２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、４％ トレハロース二水和物、０．０２％ ポリソルベート２０内におよそ２０ｍｇ／ｍｌのヒト化２Ｈ７.ｖ５１１抗体を含有してなる、静脈内投与のための液体製剤。
【請求項５５】
２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．３、２４０ｍＭ(８％) トレハロース二水和物、０．０２％ ポリソルベート２０内におよそ２０ｍｇ／ｍｌのヒト化２Ｈ７.ｖ１１４抗体を含有してなる液体製剤。
【請求項５６】
２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．３、４％ トレハロース二水和物、０．０２％ ポリソルベート２０内におよそ３０ｍｇ／ｍｌのヒト化２Ｈ７.ｖ１６抗体を含有してなる、静脈内投与のための液体製剤。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本出願は、全体の開示を出典明示によりここに援用する2005年2月7日出願の米国仮出願第60/651,111号、2005年6月10日出願の米国仮出願第60/689,404号、及び2005年7月25日出願の米国仮出願第60/702,571号の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、抗ＣＤ２０抗体とＢ細胞関連疾患の治療におけるその使用に関する。
【０００３】
（発明の背景）
リンパ球は幾つかの白血球細胞集団の一つである；リンパ球は外来の抗原を特異的に認識してそれに反応する。リンパ球の３つの主な分類は、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。Ｂリンパ球は抗体産生を担う細胞で、体液性免疫をもたらす。Ｂ細胞は骨髄内で成熟して、髄をしてその細胞表面上に抗原結合抗体を発現させる。未処置のＢ細胞がその膜結合抗体が特異的な抗原と初めて遭遇すると、細胞は速やかに分裂を開始し、その子孫はメモリーＢ細胞と「形質細胞(プラズマ細胞)」と呼ばれるエフェクター細胞に分化する。メモリーＢ細胞はより長い寿命を持ち、元の親細胞と同じ特異性を有する膜結合性抗体を発現し続ける。プラズマ細胞は、膜結合性抗体を発現しないがその代わりに抗体の分泌型を産生する。分泌型抗体は、体液性免疫の主要なエフェクター分子である。
【０００４】
ＣＤ２０抗原（ヒトＢリンパ球制限分化抗原Ｂｐ３５とも呼ばれる）はプレＢ及び成熟Ｂリンパ球上に位置するおよそ３５ｋＤの分子量を持つ疎水性膜貫通型タンパク質である（Valentine等, J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989)；及びEinfeld等, EMBO J. 7(3):711-717 (1988)）。その抗原はまたＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の９０％以上に発現されるが（Anderson等, Blood 63(6):1424-1433 (1984)）、造血幹細胞、プロＢ細胞、正常なプラズマ細胞又は他の正常な組織上には見出されない（Tedder等, J. Immunol. 135(2):973-979 (1985)）。ＣＤ２０は分化及び細胞分裂周期の開始の活性化過程における初期段階を調節し（上掲のTedder等）、おそらくはカルシウムイオンチャネルとして機能すると思われる（Tedder等, J. Cell. Biochem. 14D:195 (1990)）。
【０００５】
Ｂ細胞リンパ腫ではＣＤ２０が発現されるため、この抗原はこのようなリンパ腫を治療するための有用な治療標的であった。合衆国ではＢ細胞ＮＨＬの人々は３０００００人以上であり、毎年５６０００人以上の人々が新たに診断されている。例えば、ヒトＣＤ２０抗原に対する遺伝子的操作を施したキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体であるリツキシマブ(rituximab)（リツキサン(RITUXAN)(登録商標)）（ジェネンテック社, サウスサンフランシスコ, カリフォルニア, 合衆国から商業的に入手可能）は、再発性もしくは低抵抗性の（refractory low-grade）又は濾胞性の（follicular）、ＣＤ２０陽性、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫患者の治療に使用されている。リツキシマブは１９９８年４月７日に発行された米国特許第5,736,137号（Anderson等）及び米国特許第5,776,456号において「Ｃ２Ｂ８」と呼ばれている抗体である。インビトロの作用機構研究により、リツキサン(登録商標)がヒト補体を結合して、補体依存性細胞障害作用(ＣＤＣ)によりリンパ球Ｂ細胞系を溶解することが示されている(Reff 等 Blood 83(2): 435-445 (1994))。加えて、それは、抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)のアッセイにおいて有意な活性を有する。インビボ前臨床研究では、おそらく補体及び細胞媒介過程により、リツキサン(登録商標)がカニクイザルの末梢血液、リンパ節及び骨髄からＢ細胞を減少させることを示している(Reff 等 Blood 83(2): 435-445 (1994))。ＮＨＬの治療のための他の抗ＣＤ２０抗体には、放射性同位体であるイットリウム-９０(IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA)に結合したマウスの抗体ZevalinTMである、Ｉ-131にコンジュゲートされた他の完全マウス抗体であるBexxarTM(Corixa, WA)が含まれる。
【０００６】
ＣＤ２０は、また、自己免疫性疾患を治療するための有用な標的抗原である。リツキシマブは、Ｂ細胞と自己抗体が疾患の病態生理に所定の役割を担っていると思われる様々な非悪性自己免疫疾患についてもまた研究されてきた。Edwards等, Biochem Soc. Trans. 30:824-828 (2002)。リツキシマブは、例えば関節リウマチ（ＲＡ）（Leandro等, Ann. Rheum. Dis. 61:883-888 (2002)；Edwards等, Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9): S46 (2002)；Stahl等, Ann. Rheum. Dis., 62 (Suppl. 1): OP004 (2003)；Emery等, Arthritis Rheum. 48(9): S439 (2003)）、ループス（Eisenberg, Arthritis. Res. Ther. 5:157-159 (2003)；Leandro等 Arthritis Rheum. 46: 2673-2677 (2002)；Gorman等, Lupus, 13: 312-316 (2004)）、免疫性血小板減少性紫斑病（D'Arena等, Leuk. Lymphoma 44:561-562 (2003)；Stasi等, Blood, 98: 952-957 (2001)；Saleh等, Semin. Oncol., 27 (Supp 12):99-103 (2000)；Zaia等, Haematolgica, 87: 189-195 (2002)；Ratanatharathorn等, Ann. Int. Med., 133: 275-279 (2000)）、赤芽球癆（Auner等, Br. J. Haematol., 116: 725-728 (2002)）；自己免疫貧血症（Zaja等, Haematologica 87:189-195 (2002)（erratumはHaematologica 87:336 (2002)に記載）、寒冷凝集素症（Layios等, Leukemia, 15: 187-8 (2001)；Berentsen等, Blood, 103: 2925-2928 (2004)；Berentsen等, Br. J. Haematol., 115: 79-83 (2001)；Bauduer, Br. J. Haematol., 112: 1083-1090 (2001)；Damiani等, Br. J. Haematol., 114: 229-234 (2001)）、重篤のインスリン抵抗性Ｂ型症候群（Coll等, N. Engl. J. Med., 350: 310-311 (2004)、混合性クリオグロブリン血症（DeVita等, Arthritis Rheum. 46 Suppl. 9:S206/S469 (2002)）、重症筋無力症（Zaja等, Neurology, 55: 1062-63 (2000)；Wylam等, J. Pediatr., 143: 674-677 (2003)）、ヴェゲナー肉芽腫症（Specks等, Arthritis & Rheumatism 44: 2836-2840 (2001)）、治療抵抗性尋常性天疱瘡（Dupuy等, Arch Dermatol., 140:91-96 (2004)）、皮膚筋炎（Levine, Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9):S1299 (2002)）、シェーグレン症候群（Somer等, Arthritis & Rheumatism, 49: 394-398 (2003)）、ＩＩ活性型混合性クリオグロブリン血症 （Zaja等, Blood, 101: 3827-3834 (2003)）、尋常性天疱瘡（Dupay等, Arch. Dermatol., 140: 91-95 (2004)）、自己免疫神経障害（Pestronk等, J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 74:485-489 (2003)）、傍腫瘍性眼球クローヌス・ミオクローヌス症候群（Pranzatelli等 Neurology 60(Suppl. 1) PO5.128:A395 (2003)）、及び再発寛解型多発性硬化症（（RRMS）、Cross等 (abstract) "Preliminary results from a phase II trial of Rituximab in MS" Eighth Annual Meeting of the Americas Committees for Research and Treatment in Multiple Sclerosis, 20-21 (2003)）の徴候と症状を潜在的に軽減することが報告されている。
【０００７】
第ＩＩ相臨床試験が関節リウマチ（ＲＡ）の患者について実施され、リツキシマブの安全性と効果に関する４８週のフォローアップデータが得られている。Emery等 Arthritis Rheum 48(9):S439 (2003)；Szczepanski等 Arthritis Rheum 48(9):S121 (2003)。患者は４種の治療アーム：メトトレキセート、リツキシマブ単独、リツキシマブ＋メトトレキセート、及びリツキシマブ＋シクロホスファミド（ＣＴＸ）に均等に無作為化された。リツキシマブの治療法は１日目と１５日目に１グラムを静脈内投与するものであった。
【０００８】
リツキシマブでの治療に関する刊行物には次のものが含まれる：Perotta及びAbuel, “Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to rituximab” Abstract # 3360 Blood 10(1)(part 1-2): p. 88B (1998)；Perotta等, "Rituxan in the treatment of chronic idiopathic thrombocytopaenic purpura (ITP)", Blood, 94: 49 (abstract) (1999)；Matthews, R., “Medical Heretics” New Scientist (7 April, 2001)；Leandro等, “Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion” Ann Rheum Dis, 上掲；Leandro等, “Lymphocyte depletion in rheumatoid arthritis: early evidence for safety, efficacy and dose response"  Arthritis and Rheumatism 44(9): S370 (2001)；Leandro等, “An open study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus”, Arthritis and Rheumatism, 46:2673-2677 (2002)、ここでは２週間の間、各患者は５００ｍｇのリツキシマブ注入を２回、７５０ｍｇのシクロホスファミド注入を２回、及び高用量の経口コルチコステロイドを投与され、治療された患者の二人がそれぞれ７ヶ月及び８ヶ月目に再発し、異なるプロトコルでではあるが、再治療された；"Successful long-term treatment of systemic lupus erythematosus with rituximab maintenance therapy" Weide等, Lupus, 12: 779-782 (2003)、ここでは、患者はリツキシマブ（３７５ｍｇ／ｍ２×４、毎週間隔で繰り返し）で治療され、更にリツキシマブ投与が５−６ヶ月毎になされ、ついで３ヶ月毎に３７５ｍｇ／ｍ２のリツキシマブで維持治療を受け、治療抵抗性ＳＬＥの第二の患者はリツキシマブでの治療に成功し、３ヶ月毎に維持療法を受けたが、患者は双方ともリツキシマブでの治療法に良好に応答した；Edwards及びCambridge, “Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes” Rheumatology 40:205-211 (2001)；Cambridge等, "B lymphocyte depletion in patients with rheumatoid arthritis: serial studies of immunological parameters" Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9): S1350 (2002)；Edwards等, “B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders”上掲；Edwards等, “Efficacy and safety of rituximab, a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody: A randomized, placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism 46(9): S197 (2002)；Levine及びPestronk, “IgM antibody-related polyneuropathies: B-cell depletion chemotherapy using rituximab” Neurology 52: 1701-1704 (1999)；DeVita等, “Efficacy of selective B cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis” Arthritis & Rheum 46:2029-2033 (2002)；Hidashida等 “Treatment of DMARD-refractory rheumatoid arthritis with rituximab.” Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology Oct 24-29; New Orleans, LA 2002での発表；Tuscano, J. “Successful treatment of infliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab” Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; New Orleans, LA 2002での発表；"Pathogenic roles of B cells in human autoimmunity; insights from the clinic" Martin and Chan, Immunity 20:517-527 (2004)；Silverman及びWeisman, "Rituximab Therapy and Autoimmune Disorders, Prospects for Anti-B Cell Therapy", Arthritis and Rheumatism, 48: 1484-1492 (2003)；Kazkaz及びIsenberg, "Anti B cell therapy (rituximab) in the treatment of autoimmune diseases", Current opinion in pharmacology, 4: 398-402 (2004)；Virgolini及びVanda, "Rituximab in autoimmune diseases", Biomedicine & pharmacotherapy, 58: 299-309(2004)；Klemmer等, "Treatment of antibody mediated autoimmune disorders with a AntiCD20 monoclonal antibody Rituximab", Arthritis And Rheumatism, 48: (9) 9,S (SEP), S624-S624頁(2003)；Kneitz等, "Effective B cell depletion with rituximab in the treatment of autoimmune diseases", Immunobiology, 206: 519-527 (2002)；Arzoo等, "Treatment of refractory antibody mediated autoimmune disorders with an anti-CD20 monoclonal antibody (rituximab)" Annals of the Rheumatic Diseases, 61 (10), p922-4 (2002) Comment in Ann Rheum Dis. 61: 863-866 (2002)；"Future Strategies in Immunotherapy" Lake及びDionne, Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery (2003 by John Wiley & Sons, Inc.) 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【０００９】
ヒトの治療におけるマウス抗体の使用の主な制限は、ヒト抗マウス抗体(ＨＡＭＡ)応答である(例としてMiller, R.A. 等 "Monoclonal antibody therapeutic trials in seven patients with T-cell lymphoma" Blood, 62:988-995, 1983；及び、Schroff, R.W., 等 "Human anti-murine immunoglobulin response in patients receiving monoclonal antibody therapy" Cancer Res. , 45:879-885, 1985を参照)。齧歯目の抗体の可変(Ｖ)ドメインがヒトの定常(Ｃ)領域に融合しているキメラ分子でさえ、有意に免疫応答を誘発しうる(ＨＡＣＡヒト抗キメラ抗体) (Neuberger 等 Nature (Lond.), 314:268-270, 1985)。モノクローナル抗体の臨床使用におけるこれらの制限を克服するための強力な方法は、マウス抗体又は非ヒト種由来の抗体の「人間化」である(Jones 等 Nature (Lond), 321:522-525, 1986；Riechman 等, Nature (Lond), 332:323-327, 1988)。特に慢性治療のために患者に投与される場合、このような抗体は抗原性を最小限に又は全く持たないように作製されることが期待される。ヒト化抗ＣＤ２０抗体は、国際公開公報03/068821A2 (Hansen 等)、国際公開公報2004103404 (Watkins)及び国際公開公報04/056312 (Adams)において記述されている。ヒト抗ＣＤ２０抗体は、国際公開公報2004/035607 (Teeling 等)において記述されている。
ごく僅かな抗原性を有するだけでなく、生物学的性質及び臨床有効性を向上させた治療用ＣＤ２０結合抗体を提供することは、有益である。本発明はこれと他の必要性を満たすものである。本発明は、現在の治療組成物の制限を克服する抗ＣＤ２０抗体、並びに下記の詳細な説明から明らかとなる更なる利点を提供するものである。
【００１０】
ＣＤ２０抗体に関する特許及び特許文献には、米国特許第５７７６４５６号、同第５７３６１３７号、同第５８４３４３９号、同第６３９９０６１号、及び同第６６８２７３４号、並びに米国特許出願公開第２００２／０１９７２５５号、同第２００３／００２１７８１号、同第２００３／００８２１７２号、同第２００３／００９５９６３号、同第２００３／０１４７８８５号(Anderson等)；米国特許第６４５５０４３号及び国際公開第００／０９１６０号(Grillo-Lopez, A.)；国際公開第００／２７４２８号(Grillo-Lopez及びWhite)；国際公開第００／２７４３３号(Grillo-Lopez及びLeonard)；国際公開第００／４４７８８号(Braslawsky等.)；国際公開第０１／１０４６２号(Rastetter, W.)；国際公開第０１／１０４６１号(Rastetter及びWhite)；国際公開第０１／１０４６０号(White及びGrillo-Lopez)；米国特許出願公開第２００１／００１８０４１号、同第２００３／０１８０２９２号、国際公開第０１／３４１９４号(Hanna及びHariharan)；米国出願公開第２００２／０００６４０４号及び国際公開第０２／０４０２１号(Hanna及びHariharan)；米国出願公開第２００２／００１２６６５号及び国際公開第０１／７４３８８号(Hanna, N.)；米国出願公開第２００２／００５８０２９号(Hanna, N.)；米国出願公開第２００３／０１０３９７１号(Hariharan and Hanna)；米国出願公開第２００２／０００９４４４号、及び国際公開第０１／８０８８４号(Grillo-Lopez, A.)；国際公開第０１／９７８５８号(White, C.)；米国出願公開第２００２／０１２８４８８号及び国際公開第０２／３４７９０号(Reff, M.)；国際公開第０２／０６０９５５号(Braslawsky等.)；国際公開第２／０９６９４８号(Braslawsky等)；国際公開第０２／０７９２５５号(Reff及びDavies)；米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第９８／５６４１８号(Lam等.)；国際公開第９８／５８９６４号(Raju, S.)；国際公開第９９／２２７６４号(Raju, S.)；国際公開第９９／５１６４２号、米国特許第６１９４５５１号、同第６２４２１９５号、同第６５２８６２４号及び同第６５３８１２４号(Idusogie等.)；国際公開第００／４２０７２号(Presta, L.)；国際公開第００／６７７９６号(Curd等.)；国際公開第０１／０３７３４号(Grillo-Lopez等.)；米国出願公開第２００２／０００４５８７号及び国際公開第０１／７７３４２号(Miller及びPresta)；米国出願公開第２００２／０１９７２５６号(Grewal, I.)；米国出願公開第２００３／０１５７１０８号(Presta, L.)；米国特許第６５６５８２７号、同第６０９０３６５号、同第６２８７５３７号、同第６０１５５４２号、同第５８４３３９８号及び同第５５９５７２１号(Kaminski等)；米国特許第５５００３６２、同第５６７７１８０号、同第５７２１１０８号、同第６１２０７６７号、同第６６５２８５２号(Robinson等)；米国特許第６４１０３９１号(Raubitschek等)；米国特許第６２２４８６６号及び国際公開第００／２０８６４号(Barbera-Guillem, E.)；国際公開第０１／１３９４５号(Barbera-Guillem, E.)；国際公開第００／６７７９５号(Goldenberg)；米国出願公開第２００３／０１３３９３０号及び国際公開第００／７４７１８号(Goldenberg及びHansen)；国際公開第００／７６５４２号(Golay等.)；国際公開第０１／７２３３３号(Wolin及びRosenblatt)；米国特許第６３６８５９６号(Ghetie等)；米国特許第６３０６３９３号及び米国出願公開第２００２／０��４１８４７号(Goldenberg, D.)；米国出願公開第２００３／００２６８０１号(Weiner及びHartmann)；国際公開第０２／１０２３１２号(Engleman, E.)；米国特許出願公開第２００３／００６８６６４号(Albitar等)；国際公開第０３／００２６０７号(Leung, S.)；国際公開第  ０３／０４９６９４号、米国出願公開第２００２／０００９４２７号、及び同第２００３／０１８５７９６号(Wolin等)；国際公開第０３／０６１６９４号(Sing 及びSiegall)；米国出願公開第２００３／０２１９８１８号(Bohen等)；米国出願公開第２００３／０２１９４３３号及び国際公開第０３／０６８８２１号(Hansen等)；米国出願公開第２００２／０１３６７１９号(Shenoy等)；国際公開第２００４／０３２８２８号(Wahl等)；国際公開第２００４／０３５６０７号(Teeling等)；米国出願公開第２００４／００９３６２１号(Shitara等)がある。また米国特許第５８４９８９８号及び欧州特許出願第３３０１９１号(Seed等)；米国特許第４８６１５７９号及び欧州特許出願公開第３３２８６５号(Meyer及びWeiss)；国際公開第９５／０３７７０号(Bhat等)、米国出願公開第２００１／００５６０６６号(Bugelski等)；国際公開第２００４／０３５６０７号(Teeling等)；国際公開第２００４／０５６３１２号(Lowman等)；米国出願公開第２００４／００９３６２１号(Shitara等)；及び国際公開第２００４／１０３４０４号(Watkins等)を参照のこと。ＣＤ２０抗体に関する刊行物には、Teeling, J.等 “Characterisation of new human CD20 monoclonal antibodies with potent cytolytic activity against non-Hodgkin's lymphomas” Blood, Jun 2004; 10.1182が含まれる。
【００１１】
（発明の概要）
本発明は、ヒトＣＤ２０を結合して、インビボで霊長類Ｂ細胞を減少させる表１３及び１４に記載のヒト化２Ｈ７変異体抗体を提供する。具体的な実施態様では、ｈｕ２Ｈ７抗体は、バージョン４７２、４７３、５１１、５２３及び５１６である。本発明の組成物、方法、製造品、製剤の好ましい実施態様では、ヒト化２Ｈ７抗体は、ｈｕ２Ｈ７.ｖ５１１又はｈｕ２Ｈ７.ｖ１１４である。
本発明は、ヒトＣＤ２０を結合するヒト化２Ｈ７抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体がインビボで霊長類Ｂ細胞を減少させるために有効であり、配列番号２５のＬ鎖可変領域(ＶＬ)と配列番号８のＨ鎖可変領域(ＶＨ)を含んでなるが、ＶＨ-ＣＤＲ２のＤ５６Ａのアミノ酸置換を有しており、ＶＨ-ＣＤＲ３のＮ１００がＹ又はＷに置換されるものである抗体を提供する。一実施態様では、この抗体は、さらにＶＨ-ＣＤＲ３に置換Ｓ１００ａＲを含有する。前述の抗体の更なる実施態様では、抗体は、さらにＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を改善するＦｃ領域内の少なくとも一のアミノ酸置換を含有する。ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣエフェクター機能を向上させるために、一実施態様では、前述の抗体は、さらにアミノ酸置換Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ及びＫ３２６Ａ又はＫ３２６Ｗの何れかを含有してなるＩｇＧ１ Ｆｃを含んでなる。一実施態様では、前述の実施態様の抗体は、２Ｈ７.ｖ１６の少なくとも２０倍の抗体依存生細胞障害性(ＡＤＣＣ)を示し、２Ｈ７.ｖ１６の少なくとも２５倍の補体細胞障害性を示す。
【００１２】
これに対して、置換Ｓ１００ａＲを含有する抗体は、ＡＤＣＣを向上させるが、ＣＤＣ活性を減少させるＦｃの少なくとも一のアミノ酸変更又は置換を有しうる。この点で、抗体は、Ｆｃ内にアミノ酸置換Ｋ３２２Ａを少なくとも含有し、さらにアミノ酸置換Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａを含有しうる。
好ましい実施態様では、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を向上させた抗体はまた、配列番号１３及び１４のＬ鎖及びＨ鎖それぞれの配列を含んでなる抗体２Ｈ７.ｖ１６と比較して少なくとも３倍、好ましくは少なくとも６倍に増加した親和性でヒトＣＤ２０を結合する。
本発明は、ヒトＣＤ２０を結合し、配列番号２６の軽鎖配列と配列番号３４の重鎖配列からなるヒト化２Ｈ７抗体を提供する。
また、細胞障害性剤にコンジュゲートされた、前述の実施態様の何れかの抗体が本発明により提供される。一実施態様では、細胞障害性剤、放射性同位体又は毒素である。
一実施態様では、本発明の抗体はＣＨＯ細胞内で産生される。
本発明は、さらに、発現ベクターを含む、前記実施態様の抗体をコードする単離された核酸を提供する。抗体を産生する、核酸を含んでなる宿主細胞も同様に提供される。一実施態様では、宿主細胞は、抗体２Ｈ７.ｖ５１１を産生するものである。
【００１３】
前述の宿主細胞を培養して、該細胞培養物をから抗体を回収することを含む、上記の何れかの抗体を産生するための方法を提供する。
また、本発明の２Ｈ７抗体と担体を含有してなる組成物が提供される。一実施態様では、担体は薬学的に受容可能な担体である。
他の実施態様は、ｈｕ２Ｈ７.ｖ５１１を含有してなる組成物であって、該組成物中の抗体のおよそ８０〜１００％がフコースを欠いているものである。
さらに他の態様は、容器と該容器に包含される組成物を具備する製造品であって、該組成物が前述実施態様の何れかの抗体を含有してなるものである。組成物が所望される特定の治療に応じて、製造品は、前記組成物が非ホジキンリンパ腫を治療するために用いられる、又は前記組成物が関節リウマチを治療するために用いられることを示すパッケージ挿入物をさらに具備しうる。
本発明の更に別の態様は、前述の実施態様のヒト化２Ｈ７抗体を用いた、インビボでＢ細胞を減少させる方法である。
【００１４】
また、本発明は、ＣＤ２０陽性癌を有する患者に、治療的有効量の前述の実施態様に記載のヒト化２Ｈ７抗体が投与されることを含む、ＣＤ２０陽性癌の治療方法を提供する。前記ＣＤ２０陽性癌がＢ細胞リンパ腫又は白血病であることが好ましい。具体的な実施態様では、ｈＣＤ２０を結合するヒト化２Ｈ７抗体及びれの機能的な断片は、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、リンパ球優性ホジキン病(ＬＰＨＤ)、小リンパ球性リンパ腫(ＳＬＬ)、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)を治療するために用いられる。その具体的な実施態様では、ヒト化ＣＤ２０結合抗体又はその機能的な断片、特にｖ５１１及びｖ１１４は、再発した低悪性度ＮＨＬ及びリツキシマブ抵抗性低悪性度ＮＨＬを含む低悪性度ＮＨＬを治療するために用いられる。
これらの癌を治療するために、一実施態様では、抗体は静脈内注入により投与される。注入により投与される投薬は、一般的に週１回、１用量当たりおよそ１２．５ｍｇ／ｍ２から８００ｍｇ／ｍ２の範囲で、計１、２、３又は４回である。
【００１５】
また、本発明は、治療的有効量の前述の実施態様の何れか一のヒト化２Ｈ７抗体が、自己免疫性疾患に罹患している患者に投与されることを含む、自己免疫性疾患を軽減する方法を提供する。好ましい実施態様では、抗体は静脈内投与又は皮下投与される。抗体は１用量当たり１０ｍｇ〜５００ｍｇの範囲の投薬で静脈内に投与され、具体的な実施態様では、該用量は１００ｍｇ／用量である。
具体的な実施態様では、自己免疫性疾患は、関節リウマチ及び若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、例えばループス腎炎、ベゲナー病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、特発性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)、血栓性血小板減少性紫斑病(ＴＴＰ)、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡネフロパシ、ＩｇＭ多発性神経炎、重症筋無力症、ＡＮＣＡ関連血管炎、真正糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群、視神経脊髄炎(ＮＭＯ)及び糸球体腎炎からなる群から選択されるものである。
ｈｕ２Ｈ７.ｖ５１１及びｈｕ２Ｈ７.ｖ１１４抗体は、同時、連続して、又は投薬計画を変更して第二の治療剤と組み合わせて、自己免疫性疾患又はＢ細胞腫瘍を治療又は軽減するための方法に有用である。一実施態様では、第二治療薬はＢＡＦＦアンタゴニストである。ある実施態様では、ＢＡＦＦアンタゴニストは、ヒトＢＲ３を結合する抗体又はＢＲ３-Ｆｃ融合タンパク質である。
【００１６】
上述した疾患の治療方法の好ましい実施態様では、該疾患を患っている被検体又は患者は、霊長類、好ましくはヒトである。
また、２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、４％ トレハロース二水和物、０．０２％ ポリソルベート２０、ｐＨ５．５内におよそ２０ｍｇ／ｍｌのヒト化２Ｈ７.ｖ５１１抗体を含有してなる、静脈内投与のための液体製剤が提供される。また、２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２４０ｍＭ(８％) トレハロース二水和物、ｐＨ５．３、０．０２％ ポリソルベート２０内におよそ２０ｍｇ／ｍｌのヒト化２Ｈ７.ｖ１１４抗体を含有してなる液体製剤が提供される。２Ｈ７.ｖ１６に用いられうる他の液体製剤は、２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．３、４％ トレハロース二水和物、０．０２％ ポリソルベート２０(Tween20TM)内におよそ３０ｍｇ／ｍｌの抗体を含有するものである。
【００１７】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
「ＣＤ２０」抗原は、末梢血又はリンパ系器官のＢ細胞の９０％以上の表面に見出される分子量がおよそ３５ｋＤの非グルコシル化膜結合型リンタンパク質である。ＣＤ２０は初期のプレＢ細胞発育中に発現し、プラズマ細胞分化まで残る；ヒトの幹細胞、リンパ球祖先細胞（プロジェニタ）又は正常プラズマ細胞には見出されない。ＣＤ２０は正常なＢ細胞並びに悪性Ｂ細胞の双方に存在する。文献中でのＣＤ２０の他の名称には「Ｂリンパ球限局性分化抗原」及び「Ｂｐ３５」がある。ＣＤ２０抗原は、例えば、Clark及びLedbetter, Adv. Can. Res. 52:81-149 (1989)及びValentine等, J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989)に記載されている。
「抗体」なる用語は、最も広義に用いられ、特にモノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、多重特異的抗体（例えば二重特異的抗体）、及びそれらが所望の生物学的活性又は機能を示す限り、抗体断片を包含する。
【００１８】
本発明のヒト化ＣＤ２０結合抗体の生物活性には、少なくともヒトＣＤ２０への抗体結合、より好ましくはヒト及び他の霊長類ＣＤ２０（カニクイザル、アカゲザル、チンパンジーを含む）への結合が含まれるであろう。抗体は、１×１０−８より低いＫｄ値、好ましくは１×１０−９より低いＫｄ値でＣＤ２０に結合し、このような抗体で処置していない適当なネガティブコントロールと比較した場合、好ましくは少なくとも２０％のＢ細胞をインビボで死滅又は枯渇させうるであろう。Ｂ細胞の枯渇は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、アポトーシス、又は他のメカニズムの一又は複数の結果でありうる。ここでの疾患治療のある実施態様では、特定のエフェクター機能又はメカニズムが他のものよりも望まれ、ヒト化２Ｈ７のある変異体がＡＤＣＣなどの生物学的機能を達成するのに好ましい。
【００１９】
「抗体断片」には、完全長抗体の一部、一般にはその抗体の抗原結合又は可変領域が含まれる。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ断片；ダイアボディー(diabodies)；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異的抗体が含まれる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小限抗体断片である。この断片は、一重鎖と一軽鎖可変領域ドメインが密接に非共有結合した二量体からなる。この２つのドメインのフォールディングから６つの高頻度可変ループ（それぞれＨ鎖及びＬ鎖から３ループ）が生じ、それにより抗原結合にアミノ酸残基を寄与させて抗体に抗原結合特異性をもたらす。しかしながら、単一可変ドメイン（又は抗原に特異的なＣＤＲを３つしか含まないＦｖの半分）でさえ、結合部位全体より親和性は低いが、抗原を認識して結合する能力を持つ。
【００２０】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、モノクローナル抗体の産生中に生じ得、一般に少量で存在しうる可能な変異を除いて、同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。そのようなモノクローナル抗体は典型的には標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含む方法によって得られている。例えば、選択方法は、ハイブリドーマクローンのプール、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのような複数のクローンから独特のクローンを選択することでありうる。選択された標的結合配列は、例えば標的への親和性を改善し、標的結合配列をヒト化し、細胞培養においてその生産を改善し、インビボでのその免疫原性を減少させ、多重特異的抗体を作り出す等のために、更に改変することができ、改変された標的結合配列を含む抗体はまた本発明のモノクローナル抗体であることが理解されなければならない。異なった決定基（エピトープ）に対する異なった抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物と異なり、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対する。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、典型的には他の免疫グロブリンによって汚染されていない点で有利である。「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得たものとしての抗体の性質を表すものであり、抗体が何か特定の方法による生成を必要とするものであると考えてはならない。例えば、本発明で使用されるモノクローナル抗体は、例えばハイブリドーマ法（例えばKohler等, Nature, 256:495 (1975)；Harlow等, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2版 1988)；Hammerling等, Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)）、組換えＤＮＡ法（例えば米国特許第４８１６５６７号を参照）、ファージディスプレイ法（例えばClackson等, Nature, 352:624-628 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)；Sidhu等, J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004)；Lee等, J.Mol.Biol.340(5):1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；及びLee等 J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)を参照）、及びヒト免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子座又は遺伝子の一部又は全てを有する動物においてヒト又はヒト様抗体を産生する技術（例えば国際公開第１９９８／２４８９３号；同第１９９６／３４０９６号；同第１９９６／３３７３５号；同第１９９１／１０７４１号；Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggemann等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０６号；同第５５６９８２５号；同第５５９１６６９号(全てGenPharm)；同第５５４５８０７号；国際公開第１９９７／１７８５２号；米国特許第５５４５８０７号；同第５５４５８０６号；同第５５６９８２５号；同第５６２５１２６号；同第５６３３４２５号；及び同第５６６１０１６号； Marks等, Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)；Lonberg等, Nature, 368: 856-859 (1994)；Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996)；及びLonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995)を参照）を含む様々な技術によって作製することができる。
【００２１】
本発明のＣＤ２０結合抗体の「機能的断片」は、それ自体が由来する無傷の全長分子と実質的に同じ親和性でのＣＤ２０への結合を維持する断片であり、ここで開示するようなインビトロ又はインビボアッセイにより測定されるＢ細胞の枯渇を含む生物学的活性を示す。
「可変」という用語は、可変ドメインのあるセグメントが、抗体間で配列が広く異なることを意味する。Ｖドメインは抗原結合を仲介し、その特異的抗原に対する特異的抗体の特異性を規定する。しかしながら、可変性は可変ドメインの１１０アミノ酸スパンにわたって均一には分布していない。代わりに、Ｖ領域は、それぞれ９−１２アミノ酸長の「高頻度可変領域」と呼ばれる高度可変性のより短い領域により分離される１５−３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる相対的にインバリアントな伸展からなる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々４つのＦＲ領域を含み、これは主にβシート配置をとり、３つの高頻度可変領域に結合してループ状結合を形成するが、βシート構造の一部を形成する場合もある。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲ領域の直ぐ近傍に保持され、他の鎖からの高頻度可変領域と共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)を参照）。定常ドメインは抗体の抗原への結合には直接関与しないが、抗体依存的細胞障害（ＡＤＣＣ）への抗体の関与のような様々なエフェクター機能を示す。
【００２２】
ここで使用されるところの「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合に寄与する抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は一般には「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、ＶＬのおおよそ残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)及びＶＨのおおよそ３１−３５Ｂ(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)）及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基(例えば、ＶＬの残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)及びＶＨの残基２６−３２(Ｈ１)、５２Ａ−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３)（Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987)）を含む。
【００２３】
ここで示すように、「コンセンサス配列」又はコンセンサスＶドメイン配列は、既知のヒト免疫グロブリン可変領域配列のアミノ酸配列の比較から得た人工の配列である。これらの比較に基づいて、ヒトκ及びヒトＨ鎖サブグループIIIVドメイン由来の配列のコンセンサスであるＶドメインアミノ酸をコードする組換え核酸配列を調製した。コンセンサスＶ配列は如何なる抗体結合特異性も親和性も持たない。
「キメラ」抗体（免疫グロブリン）は特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ対応配列に一致するか又は相同である重鎖及び／又は軽鎖の一部を有するものであり、残りの鎖は他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ対応配列に一致するか又は相同であり、並びに所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片が含まれる（米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。ここで用いるヒト化抗体はキメラ抗体のサブセットである。
【００２４】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種からの高頻度可変領域の残基（ドナー抗体）によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント又はアクセプター抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は結合親和性のような抗体特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、たとえＦＲ領域が結合特性を改善するような一又は複数のアミノ酸置換を含んでも、全てあるいは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ＦＲ中のこれらアミノ酸置換の数は、典型的にはＨ鎖では６個以下、Ｌ鎖では３個以下である。ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものをまた含む。更なる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
【００２５】
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
「抗体依存性細胞媒介性障害活性」又は「ＡＤＣＣ」は、ある細胞障害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）上にあるＦｃレセプター(ＦｃＲ）に結合した分泌Ｉｇによりその細胞障害性エフェクター細胞が抗原担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒でその標的細胞を死滅させるという細胞障害性の形態を意味する。抗体は細胞障害性細胞を「武装させ（arm）」、そのような死滅に絶対に必要とされる。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞は、ＦＣγＲIIIのみを発現する一方、単球はＦＣγＲＩ、ＦＣγＲＩＩ及びＦＣγＲＩＩＩを発現する。造血性細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch及びKinet, Annu.Rev.Immunol., 9:457-92(1991)の４６４頁の表３に要約されている。対象分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号又はPrestaの米国特許第６７３７０５６号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイが実施されうる。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、又は加えて、対象分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等 PNAS(USA), 95:652-656(1998)に開示されたような動物モデルにおいて、インビボで評価することができる。抗体がＣＤ２０結合抗体である場合、ＡＤＣＣ活性は、以下に記載のようにヒトＣＤ２０と１６を発現するトランスジェニックマウス(hCD20+/hCD16+ Tgマウス)において試験することができる。
【００２６】
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行することが望ましい。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が好適である。エフェクター細胞は天然源、例えば血液から単離してもよい。
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するものである。好適なＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(ガンマレセプター)と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ(「活性型レセプター」)及びＦｃγＲＩＩＢ(「阻害型レセプター」)が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ＩＴＡＭ)を含んでいる。阻害型レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター阻害性モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif ;ＩＴＩＭ)を含んでいる(Daeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照)。ＦｃＲsに関しては、 Ravetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994); 及びde Haas等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。将来的に同定されるものも含む他のＦｃＲsはここでの「ＦｃＲ」という言葉によって包含される。また、該用語には、母性ＩｇＧの胎児への移送を担い(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) Kim等, J. Immunol.24:249 (1994))、免疫グロブリンのホメオスタシスを調節する新生児性レセプターＦｃＲｎも含まれる。
【００２７】
国際公開公報00/42072 (Presta) にＦｃＲへの結合を向上または減弱させた抗体変異型が述べられている。この特許公開の内容はここに出典明記により具体的に組み込まれる。Shields ら J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照のこと。
ＦｃＲｎへの結合親和性について、一実施態様では、抗体のＥＣ５０又は見かけのＫｄ(ｐＨ６．０での)は１００ｎＭ以下、より好ましくは１０ｎＭ以下である。ＦｃγＲIII(Ｆ１５８；すなわち低親和性アイソタイプ)への増加した結合親和性について、一実施態様では、ＥＣ５０又は見かけのＫｄは１０ｎＭ以下であり、ＦｃｇＲIII(Ｖ１５８；高親和性)について、ＥＣ５０又は見かけのＫｄは３ｎＭ以下であった。ＦｃＲｎへの結合の測定方法は公知であり(例としてGhetie 1997, Hinton 2004を参照)、以下に記載される。インビボでのヒトＦｃＲｎへの結合とヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又は形質転換されたヒト細胞株、又はＦｃ変異形ポリペプチドを投与された霊長類動物においてアッセイすることができる。ある実施態様では、本発明のヒト化２Ｈ７抗体は、ＩｇＧ Ｆｃ内にアミノ酸変異をさらに含有しており、野生型ＩｇＧ Ｆｃを有する抗体よりも少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１２５倍、さらにより好ましくは少なくとも１５０倍からおよそ１７０倍に亢進したヒトＦｃＲｎへの結合親和性を示す。
【００２８】
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。典型的な補体経路の活性化は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と結合した(適切なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。
Ｆｃ領域アミノ酸配列を変更してＣ１ｑ結合能力が増大又は減少したポリペプチド変異体は、米特許第6,194,551号B1及び国際公開公報99/51642に記述される。それらの特許文献の内容は、出典明記によって、特別に本願明細書に組み込まれるものとする。またIdusogie 等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)を参照のこと。
【００２９】
本明細書と特許請求の範囲を通して、特に明記しない限りは、免疫グロブリン重鎖の定常ドメイン中の残基の番号付けは、ここに出典を明示して取り込まれるKabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のＥＵインデックスのものである。「KabatのＥＵインデックス」とはヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の残基番号付けを意味する。配列又は他の番号付けシステムを特に示さない限りは、Ｖ領域内の残基はKabat番号付けに従って番号付けをした。
【００３０】
ＣＤ２０抗体には、今は「リツキシマブ」（「リツキサン(登録商標)」）（米国特許第５７３６１３７号）と呼ばれている「Ｃ２Ｂ８」；IDEC Pharmaceuticals社から市販されている「Ｙ２Ｂ８」又は「イブリツモマブ・チウキセタン」（ゼバリン(登録商標)）と命名されているイットリウム-[９０]標識２Ｂ８マウス抗体（米国特許第５７３６１３７号；１９９３年６月２２日に受託番号ＨＢ１１３８８でＡＴＣＣに寄託された２Ｂ８）；Corixaから市販されている「１３１Ｉ−Ｂ１」又は「ヨウ素Ｉ１３１トシツモマブ」抗体を産生するために１３１Ｉで標識されていてもよい「トシツモマブ」とも呼ばれるマウスＩｇＧ２ａ「Ｂ１」（ＢＥＸＸＡＲＴＭ、GlaxoSmithKline、米国特許第５５９５７２１号も参照）；マウスモノクローナル抗体「１Ｆ５」（Press等 Blood 69(2):584-591 (1987)及び「パッチフレームワーク」を含むその変異体又はヒト化１Ｆ５（国際公開第２００３／００２６０７, Leung, S.；ＡＴＣＣ寄託ＨＢ−９６４５０）；マウス２Ｈ７及びキメラ２Ｈ７抗体（米国特許第５６７７１８０号）；ヒト化２Ｈ７（国際公開第２００４／０５６３１２号 Lowman等）及び以下に記載のもの）；ＨＵＭＡＸ−ＣＤ２０ＴＭ完全ヒト抗体（Genmab, Denmark；例えばGlennie及びvan de Winkel, Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003)及びCragg等, Blood 101: 1045-1052 (2003)を参照）；国際公開第２００４／０３５６０７号（Teeling等）に記載されたヒトモノクローナル抗体；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（Shitara等）に記載されたＦｃ領域に複合Ｎ-グリコシド結合糖鎖が結合した抗体；国際公開第２００４／１０３４０４号（Watkins等, Applied Molecular Evolution）に記載されたＡＭＥ-１３３ＴＭ抗体のようなＡＭＥ抗体シリーズのようなＣＤ２０結合分子；キメラ又はヒト化Ａ２０抗体（それぞれｃＡ２０、ＩＭＭＵ-１０６ ａ.ｋ.ａ.ｈＡ２０）（米国特許出願公開第２００３／０２１９４３３号、米国特許出願公開２００５／００２５７６４；Immunomedics）のようなＡ２０抗体又はその変異体；及びInternational Leukocyte Typing Workshop(Valentine等, Leukocyte Typing III (McMichael編, p.440, Oxford University Press (1987))から入手可能なモノクローナル抗体Ｌ２７、Ｇ２８-２、９３-１Ｂ３、Ｂ-Ｃ１又はＮＵ-Ｂ２が含まれる。ここでの好ましいＣＤ２０抗体はヒト化、キメラ、又はヒトＣＤ２０抗体、より詳細にはヒト化２Ｈ７抗体、リツキシマブ、キメラ又はヒト化Ａ２０抗体(Immunomedics)、及びＨＵＭＡＸ-ＣＤ２０ＴＭヒトＣＤ２０抗体(Genmab)である。
【００３１】
ここで用いる場合、「Ｂ細胞枯渇」は、治療前のレベルと比較して、薬剤又は抗体治療後に動物又はヒトにおいてＢ細胞レベルが減少することを意味する。Ｂ細胞レベルは、全血球数を得て、既知のＢ細胞マーカーに対して染色するＦＡＣＳ分析により、また実験的実施例に記載したような方法などのよく知られたアッセイを用いて測定可能である。Ｂ細胞枯渇は部分的か又は完全なものでありうる。一実施態様では、ＣＤ２０発現Ｂ細胞の枯渇は少なくとも２５％である。Ｂ細胞枯渇剤を投与されている患者では、Ｂ細胞は、一般に、薬剤が患者体内を循環している間とＢ細胞が回復する時に枯渇される。
「腫瘍壊死因子α(ＴＮＦα)」とは、Pennica 等, Nature, 312:721 (1984)又はAggarwal 等, JBC, 260:2345 (1985)に記載のアミノ酸配列を含有するヒトＴＮＦα分子を意味する。本明細書中の「ＴＮＦαインヒビター」は、一般的にはＴＮＦαへの結合とその活性を中和することを介してＴＮＦαの生物学的活性をある程度阻害する薬剤である。本明細書中で考慮されるＴＮＦインヒビターの具体例は、エタネルセプト(ENBREL(登録商標))、インフリキシマブ(REMICADE(登録商標))及びアダリムマブ(HUMIRATM)である。
【００３２】
「ＴＮＦα-インヒビターに対する不十分な応答」なる用語は、毒性及び／又は不十分な有効性のためにＴＮＦα-インヒビターによる以前又は現在の治療への不十分な応答を指す。不十分な応答は、問題の疾患を治療することに熟練した臨床医によって評価されうる。「不十分な有効性」を経験する哺乳動物は、ＴＮＦα-インヒビターによる以前又は現在の治療後に活性な疾患が続いている。例えば、患者は、ＴＮＦα-インヒビターによる３か月の治療の後に活性な疾患活動性を有しうる。
【００３３】
ここで用いられる「ＢＡＦＦ」、「ＢＡＦＦポリペプチド」、「ＴＡＬＬ-１」又は「ＴＡＬＬ-１ポリペプチド」、「ＢＬｙＳ」、「ＴＨＡＮＫ」なる用語は、「天然配列ＢＡＦＦポリペプチド」及び「ＢＡＦＦ変異体」を包含する。「ＢＡＦＦ」は、以下に示すアミノ酸配列：
ヒトＢＡＦＦ配列(配列番号４６)
2008529499.tif 000002
(米国特許公開２００５／００９５２４３Ａ１の図３の配列も参照)
の何れか一によってコードされるポリペプチドと、それらのホモログ及び断片及び変異体であり、天然配列のＢＡＦＦの生物学的活性を有するものに対する名称である。ＢＡＦＦの生物学的活性は、Ｂ細胞生存を促進する、Ｂ細胞成熟を促進する、およびＢＲ３に結合することからなる群から選択されうる。「ＢＡＦＦ」なる用語は、Shu 等., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999)；GenBank寄託番号 AF136293；1998年5月7日公開のW098/18921；1998年10月7日公開のEP 869,180；1998年6月25日公開のW098/27114；1999年3月18日公開のW099/12964；1999年7月8日公開のW099/33980；Moore 等., Science, 285:260-263 (1999)；Schneider 等., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999)；Mukhopadhyay 等., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)に記載のポリペプチドを含む。
【００３４】
ここで用いられる「ＢＡＦＦアンタゴニスト」なる用語は、広義の意味で用いられ、(１)天然配列ＢＡＦＦポリペプチドないし天然配列ＢＲ３ポリペプチドに結合してＢＡＦＦポリペプチドと相互作用するＢＲ３を部分的又は完全にブロック(阻止)する、および(２)天然配列ＢＡＦＦシグナル伝達を部分的又は完全にブロック、阻害ないし中和(無効化)する任意の分子を含む。とりわけ、天然配列ＢＡＦＦポリペプチドシグナル伝達はＢ細胞生存およびＢ細胞成熟を促進する。ＢＡＦＦシグナル伝達の阻害、ブロックまたは中和により、とりわけＢ細胞数が減少する。本発明によるＢＡＦＦアンタゴニストはインビトロ又はインビボのＢＡＦＦポリペプチドの一以上の生物学的活性を部分的または完全にブロック、阻害ないし中和するであろう。一実施態様では、生物学的活性なＢＡＦＦはインビトロ又はインビボで以下の事象の何れか一またはそれらのいくつかを増強する：Ｂ細胞の生存促進、ＩｇＧ及び／又はＩｇＭレベルの増加、形質細胞の数の増加、及び脾臓Ｂ細胞のｐ５２ ＮＦ-κｂへのＮＦ-κｂ２／１００のプロセシング(例として、Batten, M 等, (2000) J. Exp. Med. 192:1453-1465；Moore, 等, (1999) Science 285:260-263；Kayagaki, 等, (2002) 10:515-524)。
【００３５】
ここで用いられる「ＢＲ３」、「ＢＲ３ポリペプチド」または「ＢＲ３レセプター」なる用語は、「天然配列ＢＲ３ポリペプチド」および「ＢＲ３変異体」を包含する(ここでさらに定義する)。「ＢＲ３」は以下のポリヌクレオチド配列及びそのホモログの何れか一を有するポリペプチドに対する名称である。
(a) ヒトＢＲ３配列(配列番号４７)
2008529499.tif 000003
(b) オルタナティブヒトＢＲ３配列(配列番号４８)
2008529499.tif 000004
【００３６】
いくつかの実施態様では、本発明に記載のＢＡＦＦアンタゴニストは、抗ＢＡＦＦ抗体、ＢＡＦＦ-結合ポリペプチド(イムノアドヘシン及びペプチドを含む)、及びＢＡＦＦ-結合小分子が含まれる。ＢＡＦＦアンタゴニストは、国際公開公報０２／０２６４１において記述されるＢＡＦＦ結合抗体(例えば、表１の１−４６、３２１−３２９、８３４−８７２、１５６３−１５９５、１８８１−１９０５の何れかのアミノ酸配列を含んでなる抗体)を含む。さらなる実施態様では、イムノアドヘシンは、ＢＡＦＦレセプターのＢＡＦＦ結合領域(例えばＢＲ３、ＢＣＭＡ又はＴＡＣＩの細胞外ドメイン)を含んでなる。なお更なる実施態様では、イムノアドヘシンはＢＲ３-Ｆｃである。ＢＡＦＦ結合Ｆｃタンパク質の他の例は、国際公開公報02/66516、国際公開公報00/40716、国際公開公報01/87979、国際公開公報03/024991、国際公開公報02/16412、国際公開公報02/38766、国際公開公報02/092620、国際公開公報01/12812に見られる。ＢＡＦＦアンタゴニストの作製方法は、上掲の米国特許公開2005/0095243A1、及び米国特許公開2005/0163775において記述される。
【００３７】
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療的な使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、タンパク質は、(１)ローリー法で測定した場合９５％を越える抗体、最も好ましくは９９重量％を超えるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほど、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一になるまで充分なほど精製される。抗体の自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツでの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一の精製工程により調製される。
「単離された」核酸分子は、同定され、抗体核酸の天然源に通常付随している少なくとも一の汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。故に、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体位置にある抗体を通常発現する細胞に含まれる核酸分子を含む。
【００３８】
「コントロール配列」なる表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合されたコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合され」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているならそのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合されている；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならばコード配列に作用可能に結合されている；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるならコード配列と作用可能に結合されている。一般的に、「作用可能に結合される」とは、結合されたＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読み取り枠内にある。しかし、エンハンサーは必ずしも近接しているわけではない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、通常の手法にしたがって、合成されたオリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００３９】
「ベクター」はシャトルおよび発現ベクターを含む。一般的に、プラスミドコンストラクトも複製起源(例として、ＣｏｌＥ１複製起源)および選択マーカー(例として、アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性)をそれぞれ細菌内のプラスミドの複製および選択を目的として含むであろう。「発現ベクター」は必要なコントロール配列または本発明の抗体断片を含む抗体の発現の調節因子を細菌または真核細胞内で含むベクターを表す。好適なベクターは以下に示す。
本発明のヒト化２Ｈ７抗体などのヒト化ＣＤ２０結合抗体を産生する細胞には、抗体をコードする核酸が導入されている細菌細胞及び真核細胞が含まれるであろう。好適な宿主細胞を以下に開示する。
本明細書中で用いられる「標識」なる用語は、抗体に直接的または間接的にコンジュゲートされる検出可能な化合物または組成物を指す。標識自体が検出可能なもの(例えば放射性標識または蛍光性標識)であってもよく、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物ないしは組成物の化学的変化を触媒するものであってもよい。
【００４０】
本発明の組成物及び方法
本発明は、２Ｈ７.ｖ１６の変異体であるヒト化２Ｈ７抗体を提供する。具体的な実施態様では、変異体はｈｕ２Ｈ７.ｖ５１１である。
完全長抗体では、本発明のヒト化ＣＤ２０結合抗体は、ヒト免疫グロブリンのＣドメインに結合したヒト化Ｖドメインを含んでなるであろう。好ましい実施態様では、Ｈ鎖Ｃ領域は、ヒトＩｇＧ、好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ３に由来する。Ｌ鎖Ｃドメインはヒトκ鎖由来であることが好ましい。
ここでの目的では、「ヒト化２Ｈ７」は、可変軽鎖(ＶＬ)配列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR (配列番号2)；と
可変重鎖(ＶＨ)配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS (配列番号 8)
を含んでなる完全抗体ないし抗体断片を指す。
【００４１】
ヒト化２Ｈ７抗体が完全な抗体である場合、ｖ１６軽鎖アミノ酸配列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (配列番号 13)；と
重鎖アミノ酸配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号 14)
を含んでなることが好ましい。
【００４２】
前述の２Ｈ７ ｍＡｂの変異体が、上記の配列番号１３と同じＬ鎖配列と、Ｈ鎖アミノ酸配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAP
GKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVY
YSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV
SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE
PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATI
SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号 15)
を有する２Ｈ７.ｖ３１である。
他の変異体は、配列番号26のＨ鎖アミノ酸配列を有する２Ｈ７.ｖ１３８である。
前述のヒト化２Ｈ７抗体の他の変異体は、配列番号２５のＶＬと２Ｈ７.ｖ５１１の配列番号３３のＶＨを含んでなるものである(表２参照)。
【００４３】
ｈｕ２Ｈ７.ｖ５１１は完全長ＩｇＧ１である。ある実施態様では、抗体は、２Ｈ７.ｖ５１１軽鎖(配列番号２６)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS
DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL
SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
と、２Ｈ７.ｖ５１１重鎖(配列番号３４)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSY
NQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTV
SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ
SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL
GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ
YNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSR
EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
を含んでなる。
【００４４】
バージョン１６に基づく全ての他の変異体のＶ領域は、以下の表１に示すアミノ酸置換の位置を除いてｖ１６のアミノ酸配列を有する。特段示さない限り、２Ｈ７変異体はｖ１６のものと同じＬ鎖を有する。ヒト化抗体２Ｈ７ｖ．１６はまたｒｈｕＭＡｂ２Ｈ７、ＰＲＯ７０７６９又はオクレリツマブ(Ocrelizumab)とも呼ばれる。
【００４５】
表１
2008529499.tif 000005
表２
2008529499.tif 000006
【００４６】
残基番号付けは、Kabat等, Sequences of Immunological Interest. 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)に従っており、配列図において挿入はａ、ｂ、ｃ、ｄ、及びｅで示し、間隙はダッシュで示す。Ｆｃ領域を含むＣＤ２０結合抗体において、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ番号付け系によると残基４４７）は、例えばＡｂの精製の間、又は抗体ポリペプチドをコードする核酸を組換え操作することによって、除去することができる。従って、本発明のヒト化２Ｈ７抗体組成物は、Ｋ４４７を持つ抗体、全てのＫ４４７が除去された抗体、又はＫ４４７残基を持つ抗体と持たない抗体の混合物を含みうる。
【００４７】
ＩｇＧ中のＮグリコシル化部位はＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にある。本発明のヒト化２Ｈ７抗体組成物は、Ｆｃ領域を有する前述のヒト化２Ｈ７抗体の任意のものの組成物を含み、ここで組成物中の抗体の約８０−１００％（好ましくは約９０−９９％）は糖タンパク質のＦｃ領域に結合したフコースを欠く成熟コア糖鎖構造を含む。そのような組成物は、ＦｃγＲIIIＡ（Ｆ１５８）への結合に驚くべき改善を示すことがここで実証されており、これは、ヒトＩｇＧとの相互作用においてＦｃγＲIIIＡ（Ｖ１５８）ほど効果的ではない。ＦｃγＲIIIＡ（Ｆ１５８）は、正常で健常なアフリカ系アメリカ人及び白人においてはＦｃγＲIIIＡ（Ｖ１５８）より一般的である。Lehrnbecher等 Blood 94:4220 (1999)を参照のこと。歴史的に、最も一般的に用いられる産業用宿主の一つであるチャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)で産生される抗体は、フコシル化されていない集団におよそ２〜６％を含有する。しかしながら、ＹＢ２／０及びＬｅｃ１３は、７８〜９８％のフコシル化されていない種を有する抗体を産生しうる。Shinkawa 等 J Bio. Chem. 278 (5), 3466-347 (2003)は、ＹＢ２／０及びＬｅｃ１３細胞で産生される抗体であってＦＵＴ８活性をほとんど持たない抗体がインビトロで有意に増加したＡＤＣＣ活性を示すことを報告した。また、フコース含量が低い抗体の作製は、例えばLi 等 (GlycoFi) "Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris" in Nature Biology online publication 22 Jan. 2006；Niwa R. 等 Cancer Res. 64(6): 2127-2133 (2004)；米国特許公開2003/0157108 (Presta)；米国特許第6,602,684号及び米国特許公開2003/0175884 (Glycart Biotechnology)；米国特許公開2004/0093621、米国特許公開2004/0110704、米国特許公開2004/0132140 (すべてKyowa Hakko Kogyo)に記載される。
【００４８】
二重特異性ヒト化２Ｈ７抗体は、抗体の１本のアームが本発明のヒト化２Ｈ７抗体のＨ及び／又はＬ鎖の抗原結合領域を少なくとも有し、他のアームは第二抗原に対してＶ領域結合特異性を有する抗体を包含する。具体的な実施態様では、第二抗原は、ＣＤ３、ＣＤ６４、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ又は他のＮＫ活性化リガンドからなる群から選択される。
一実施態様では、本発明のヒト化２Ｈ７抗体は、ＩｇＧ Ｆｃ内にアミノ酸変異をさらに含有し、野生型ＩｇＧ Ｆｃを有する抗体よりも少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１２５倍、さらにより好ましくは少なくとも１５０倍からおよそ１７０倍に亢進したヒトＦｃＲｎへの結合親和性を示す。
【００４９】
抗体の製造
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第4,816,567号)によって作製することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記したようにして免疫し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を誘導する。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。免疫化の後、リンパ球を単離して、次いでポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞株と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,59-103頁(Academic Press, 1986))。
【００５０】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞(融合パートナーとも称する)の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための選択培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
好ましい融合パートナーである骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、融合していない親の細胞に対して選択する選択培地に感受性である細胞である。好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫系、例えば、the Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USAから入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, Rockville, Maryland USAから入手し得るＳＰ-２及びその誘導体、例えばＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されたものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
【００５１】
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson等, Anal. Biochem., 107:220 (1980)に記載のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定されると、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が包含される。加えて、該ハイブリドーマ細胞は、例えばマウスに細胞を腹腔内注入することによって、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばアフィニティクロマトグラフィ(例えばプロテインＡ又はプロテインＧ-セファロース)又はイオン交換クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析などの常套的な抗体精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
【００５２】
モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、常法を用いて(例えば、マウスの重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、そうしないと免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中にトランスフェクトし、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を達成することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現に関する概説論文には、Skerra等, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPlueckthum, Immunol. Revs., 130:151-188(1992)がある。
更なる実施態様では、モノクローナル抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから単離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の単離を記述している。続く刊行物は、鎖混合による高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生産(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783(1992))、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266(1993))を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
【００５３】
抗体をコードするＤＮＡは、例えば、相同的マウス配列をヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン(ＣＨ及びＣＬ)配列に置換することにより(米国特許第4,816,567号；及びMorrison等, Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチド(異種性ポリペプチド)のコード配列の全部又は一部を融合させることによって、キメラ又は融合抗体ポリペプチドを生産するように修飾されうる。非免疫グロブリンポリペプチド配列は、抗体の定常ドメインに置換され、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換されて、抗原に対して特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対して特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【００５４】
ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法は従来からよく知られている。好ましくは、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくらかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗原性及び、抗体がヒトの治療用途に意図される場合にはＨＡＭＡ応答(ヒト抗マウス抗体)を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。齧歯動物のものと最も近いヒトＶドメイン配列を同定して、その中のヒトフレームワーク領域(ＦＲ)をヒト化抗体とする(Simsほか, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carterほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Prestaほか, J. Immunol., 151:2623(1993))。
【００５５】
更に、抗体を、抗原に対する高結合親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
ヒト化抗体は、抗体断片、例えばＦａｂ、場合によっては免疫コンジュゲートを作製するために１又は複数の細胞障害剤でコンジュゲートされたものであってもよい。あるいは、ヒト化抗体は、完全長抗体、例えば完全長ＩｇＧ１抗体であってもよい。
【００５６】
ヒト抗体及びファージディスプレイ法
ヒト化のための別法により、ヒト抗体を生産することができる。例えば、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993)；Bruggerman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第5,545,806号、同第5,569,825号、同第5,591,669号(すべてGenPharm)、同第5,545,807号；及び国際公開公報97/17852を参照されたい。
【００５７】
あるいは、ファージディスプレイ技術(McCafferty等, Nature 348：552-553(1990))を、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させるために使用することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３の大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子のいずれかにおいてイン-フレームをクローンする。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖のＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択により、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択がなされる。よって、ファージはＢ細胞の特性のいくつかを模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照のこと。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源がファージディスプレイのために使用可能である。Clackson等, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化されたマウス脾臓から得られたＶ遺伝子の小ランダム組合せライブラリーからの抗オキサゾロン抗体の異なった配列を単離した。非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構成可能で、抗原(自己抗原を含む)とは異なる配列の抗体を、Marks等, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術に本質的に従って単離することができる。また、米国特許第5,565,332号及び同5,573,905号を参照のこと。
前記したように、またヒト抗体は、活性化Ｂ細胞によりインビトロで生産してもよい(例えば米国特許第5,567,610号及び同第5,229,275号を参照)。
【００５８】
抗体断片
特定の状況では、全抗体よりもむしろ抗体断片を使用する利点がある。より小さいサイズの断片は迅速にクリアランスされ、固形腫瘍へのアクセスが向上しうる。
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、完全な抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片はすべて大腸菌で発現されて分泌されるため、これら断片の大量の生産が容易である。抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含有するインビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ(ａｂ')２断片は、米国特許第5,869,046号に記載される。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開93/16185；米国特許第5,571,894号；及び米国特許第5,587,458号を参照のこと。Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域が欠けている完全な結合部位を有する唯一の種類である；したがって、それらは、インビボ使用の間の非特異的結合を減らすために適する。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ末端又はカルボキシ末端で、エフェクタータンパク質の融合を得るために設定されうる。上記のAntibody Engineering, ed. Borrebaeckを参照。また、抗体断片は、例えば米国特許第5,641,870号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。このような直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってよい。
【００５９】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＣＤ２０タンパク質の２つの異なるエピトープに結合しうる。他のこのような抗体では他のタンパク質に対する結合部位と、ＣＤ２０結合部位とが結合しうる。あるいは、抗ＣＤ２０アームは、ＣＤ２０発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させて局所化させるために、ＩｇＧ(ＦｃγＲ)、例えばＦｃγＲI(ＣＤ６４)、ＦｃγＲII(ＣＤ３２)及びＦｃγＲIII(ＣＤ１６)、又はＮＫＧ２Ｄないし他のＮＫ細胞活性化リガンドに対するＦｃレセプター、又はＴ細胞レセプター分子(例えばＣＤ３)等の白血球上のトリガー分子に結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体はＣＤ２０を発現する細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はＣＤ２０結合アーム及び細胞障害剤(例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
国際公報96/16673には、二重特異性の抗ＥｒｂＢ２／ＦｃγＲIII抗体が記載され、米国特許第5,837,234号には、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／ＦｃγＲI抗体ＩＤＭ１(Osidem)が開示されている。二重特異性抗ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体は国際公報98/02463に示されている。米国特許第5,821,337号は二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＣＤ３抗体を教示する。
【００６０】
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Milstein等, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公報93/8829及びTrauneckerら、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。好ましくは、該融合は、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＩｇ重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主細胞に同時トランスフェクトする。これにより、組立に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が所望の二重特異性抗体の最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節により大きな融通性(フレキシビリティ)が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が所望の鎖組合せの収率に有意に影響しないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を単一の発現ベクターに挿入することが可能である。
【００６１】
このアプローチ法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公報94/04690に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
米国特許第5,731,168号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面はＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【００６２】
二特異性抗体とは架橋抗体や「ヘテロ抱合(ヘテロコンジュゲート)」抗体を含む。例えば、ヘテロ抱合体の一方の抗体がアビジンと結合し、他方はビオチンと結合していても良い。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせること(米国特許第4,676,980号)及びＨＩＶ感染の治療(国際公報91/00360、国際公報92/200373及び欧州特許第03089号)等の用途が提案されてる。ヘテロ抱合抗体は適当な架橋方法によって生成できる。当技術分野においては、適切な架橋剤は周知であり、それらは複数の架橋法と共に米国特許第4,676,980号に記されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は完全な抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【００６３】
最近の進歩により、大腸菌からＦａｂ'-ＳＨ断片の直接の回収が容易になり、これは科学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役させて二重特異性抗体を形成する。従って、形成された二重特異性抗体は、ヒト乳腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘発すると同時に、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞及び正常ヒトＴ細胞へ結合することが可能であった。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産された。Kostelny等, J.Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させられた。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーによりＶＬにＶＨを結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片製造方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
【００６４】
多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び／又は異化)されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は３ないし８、好ましくは４の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖(好ましくは２つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はＶＤ１-(Ｘ１)ｎ-ＶＤ２-(Ｘ２)ｎ-Ｆｃを有し、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の一つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は：ＶＨ-ＣＨ１-柔軟なリンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも２つ(好ましくは４つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約２〜約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはＣＬドメインを更に有する。
【００６５】
他のアミノ酸配列の修飾
ここで記載のＣＤ２０結合抗体のアミノ酸配列の修飾を考察する。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性が改善されることが望ましい。抗ＣＤ２０抗体のアミノ酸配列変異体は、適当なヌクレオチド変化を抗ＣＤ２０抗体核酸に導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、例えば、抗ＣＤ２０抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、最終構造物に達するまでなされるが、その最終構造物は所望の特徴を有する。また、アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数の変化などの抗ＣＤ２０抗体の翻訳後過程を変更しうる。
突然変異のための好ましい位置にある抗ＣＤ２０抗体の特定の残基又は領域の同定のために有用な方法は、Cunningham及びWells , Science 244: 1081-1085 (1989)に記載されているように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の残基又は基が同定され(例えば、arg, asp, his, lys,及びglu等の荷電残基)、中性又は負荷電アミノ酸(最も好ましくはアラニン又はポリペプチドアニリン)に置換され、アミノ酸とＣＤ２０抗原との相互作用に影響を及ぼす。次いで置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、置換部位において又はそれに対して更に又は他の置換を導入することにより精密にされる。即ち、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における変異の性能を分析するために、ａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現された抗ＣＤ２０抗体変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
【００６６】
アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲のアミノ-及び／又はカルボキシル末端融合物、並びに一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入物を含む。末端挿入物の例は、Ｎ-末端メチオニル残基を持つ抗ＣＤ２０抗体又は細胞障害ポリペプチドに融合した抗体を含む。抗ＣＤ２０抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を向上させる酵素(例えばＡＤＥＰＴ)又はポリペプチドの抗ＣＤ２０抗体のＮ-又はＣ-末端への融合物を含む。
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、異なる残基によって置換された抗ＣＤ２０抗体分子に少なくとも一つのアミノ酸残基を有する。置換突然変異について最も対象となる部位は高度可変領域を含むが、ＦＲ変化も考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して以下の表に示す。これらの置換により生物学的活性に変化が生じる場合、表に「例示的置換」と称した又はアミノ酸の分類を参照して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてよい。
【００６７】
アミノ酸置換の表
2008529499.tif 000007
【００６８】
抗体の生物学的性質における実質的な修飾は、(ａ)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、(ｂ)標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は(ｃ)側鎖の嵩を維持するそれらの効果において実質的に異なる置換を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる：
(１)疎水性：ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile；
(２)中性の親水性：cys、ser、thr；
(３)酸性：asp、glu；
(４)塩基性：asn、gln、his、lys、arg；
(５)鎖配向に影響する残基：gly、pro； 及び
(６)芳香族：trp、tyr、phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
【００６９】
抗ＣＤ２０抗体の適切な高次構造を維持するために関与しない任意のシステイン残基も、一般的には、セリンと置換して、分子の酸化的安定性を改善して、異常な交差を防いでもよい。逆に、システイン結合を抗体に付加して、その安定性を改善してもよい(特にこの場合、抗体はＦｖ断片などの抗体断片である)。
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む(例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体)。一般的に、さらなる発展のために選択され、得られた変異体は、それらが作製された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を作製する簡便な方法には、ファージディスプレイを使用する親和性突然変異がある。簡潔に言えば、幾つかの高頻度可変領域部位(例えば６−７部位)を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された多価抗体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子III産物への融合物としてディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体とヒトＣＤ２０の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択する。
【００７０】
抗体のアミノ酸変異の他の型は、抗体の元のグリコシル化パターンを変更する。変更とは、抗体に見い出される一又は複数の糖鎖部分の欠失、及び／又は抗体に存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。
抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン(ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸)のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを意味するが、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた用いられる。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位のもの)を含むように変化させることによって簡便に達成される。該変化は、元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ-結合グリコシル化部位の場合)。
【００７１】
抗ＣＤ２０抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定するものではないが、天然源からの単離(天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合)又は初期に調製された抗ＣＤ２０抗体の変異体又は非変異体のオリゴヌクレオチド媒介(又は部位特異的)突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製を含む。
エフェクター機能、例えば抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞障害性(ＡＤＣＣ)及び／又は補体依存性細胞障害性(ＣＤＣ)を向上させるために、本発明の抗体を修飾することが望ましい。このことは、抗体のＦｃ領域に一又は複数のアミノ酸修飾を導入することで達成される。代わりにまたは加えて、Ｆｃ領域にシステイン残基を導入することによってこの領域での鎖間のジスルフィド結合形成が起こりうる。故に、生成されたホモ二量体抗体は内部移行能を向上および／または補体媒介性細胞障害および抗体依存性細胞障害(ＡＤＣＣ)を増強する。Caron等, J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) およびShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照。抗腫瘍活性が亢進されたホモ二量体抗体もまた、Wolff ら Cancer Research 53:2560-2565 (1993)に記載されているような異種性二機能性交差結合を用いて調製されうる。または、抗体を二重のＦｃ領域を持つように操作して、それによって補体媒介性溶解およびＡＤＣＣ能を亢進した。StevensonらAnti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照。
抗体の血清半減期を延長するために、例として米国特許第5739277号に記載されているように抗体(特に抗体断片)内にサルベージレセプター結合エピトープを組み込む方法がある。ここで用いる、「サルベージレセプター結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期延長に関与するＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを表す。
【００７２】
他の抗体修飾
抗体の他の修飾がここで考えられる。例えば、抗体は様々な非タンパク様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーの一つに結合されてもよい。抗体はまた例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル中に(例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中に)、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中に、又はマイクロエマルション中に捕捉されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Science 16版, Oslo, A編(1980)に開示されている。
【００７３】
所望の性質を有する抗体のスクリーニング
実験的実施例に示すようにある生物学的特徴を有する抗体を選択する。
本発明の抗ＣＤ２０抗体の成長阻害効果は、当業者に知られた方法、例として、ＣＤ２０遺伝子を内因性または形質移入してＣＤ２０を発現する細胞を用いるなどの方法によって評価しうる。例えば、腫瘍細胞株およびＣＤ２０形質移入細胞を、様々な濃度の本発明の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体で２、３(例として２−７)日間処理し、クリスタル・バイオレットまたはＭＴＴで染色、または他の比色アッセイ法によって分析した。増殖を測定する他の方法には、本発明の抗ＣＤ２０抗体存在または非存在下にて処理した細胞による３Ｈ-チミジン取り込みを比較することによる。抗体処理後、細胞を回収して、ＤＮＡ内に取り込まれた放射線量をシンチレーションカウンターで定量した。細胞株の成長を阻害することが知られている成長阻害抗体で選択した細胞株を処理して適当な陽性コントロールとする。
【００７４】
細胞死を誘導する抗体を選択するために、プロピジウムヨウ素化物(ＰＩ)、トリファンブルーまたは７ＡＡＤ取り込みなどにより表される膜の完全性の欠損を対照と相対的に評価した。補体および免疫エフェクター細胞非存在下でＰＩ取り込みアッセイを行う。ＣＤ２０発現腫瘍細胞を単独培地または例として約１０μｇ／ｍｌの適当なモノクローナル抗体を含む培地で培養する。それぞれの処理後、細胞を洗浄して、細胞塊を除去するために３５ｍｍ濾過器をかぶせた１２×７５チューブ(１チューブ当たり１ｍｌ、各処理群につき３チューブ)に分注する。その後、ＰＩ(１０μｇ／ｍｌ)をチューブに加える。試料をFACSCANＴＭフローサイトメーターおよびFACSCONVERTTM CellQuestソフトウェア(Becton Dickinson)により分析しうる。ＰＩ取り込みにより決定されるような統計学上有意なレベルの細胞死を引き起こす抗体を細胞死誘導抗体として選択しうる。
【００７５】
対象の抗体により結合されるＣＤ２０上のエピトープに結合する抗体を検索するために、例としてAntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に示されているように平凡なクロスブロッキングアッセイを行うことができる。このアッセイは、試験抗体が本発明の抗ＣＤ２０抗体として同じ部位に結合するかエピトープに結合するかを決定するのに用いられる。代わりにまたは加えて、エピトープマッピングはこの分野でよく知られた方法によって行うことができる。例えば、接触する残基を同定するためにアラニンスキャニングによるように抗体の配列に突然変異が誘発される。変異した抗体は確実にフォールディングされるように初めにポリクローナル抗体との結合を試験する。異なる方法では、ＣＤ２０の異なる領域に一致するペプチドを用いて、試験抗体の競合アッセイ、または試験抗体と特徴のあるまたは既知のエピトープを持つ抗体の競合アッセイを行うことができる。
【００７６】
ベクター、宿主細胞及び組換え方法
本発明はまた、ヒト化２Ｈ７変異体抗体をコードしている単離された核酸、該核酸を含むベクター及び宿主細胞、及び抗体の生産に対する組換え方法を提供する。
抗体の組換え生産のために、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター中に挿入される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは直ぐに単離され、通常の手法を用いて(例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドを使用することによって)配列決定される。多くのベクターが公的に入手可能である。ベクター成分には、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列である。
【００７７】
(i) シグナル配列成分
この発明のヒト化２Ｈ７抗体は直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。天然ＣＤ２０結合抗体シグナル配列を認識せずプロセシングしない原核生物宿主細胞に対して、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。酵母での分泌に対して、天然シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含む)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー、又は国際公開第９０／１３６４６号に記載されているシグナルにより置換されうる。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のＤＮＡは、ヒト化２Ｈ７抗体をコードするＤＮＡにリーディングフレーム内でライゲーションさせる。
【００７８】
(ii) 複製開始点
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は宿主染色体ＤＮＡとは独立にベクターが複製することを可能にするものであり、複製開始点又は自律的複製配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である(ＳＶ４０開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる)。
【００７９】
(iii) 選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(ａ)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(ｂ)栄養要求性欠陥を補い、又は(ｃ)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
哺乳動物細胞に適切な選択マーカーの他の例は、細胞成分を同定してヒト化２Ｈ７抗体をコードする核酸を取り出すことができるもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Ｍｔｘ)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である(例として、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ-９０９６)。
【００８０】
あるいは、ヒト化２Ｈ７抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照のこと。
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である(Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979))。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。酵母宿主細胞ゲノムにｔｒｐ１破壊が存在することは、ついでトリプトファンの不存在下における増殖による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠陥酵母株(ＡＴＣＣ２０６２２あるいは３８６２６)は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
更に、１．６μｍの円形プラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、クルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)酵母の形質転換に用いることができる。あるいは、組換え仔ウシのキモシンの大規模生産のための発現系がＫ.ラクティス(lactis)に対して報告されている。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)。クルイヴェロマイシスの工業的な菌株による、組換え体成熟ヒト血清アルブミンの分泌のための安定した複数コピー発現ベクターもまた開示されている。Fleer 等, Bio/Technology,9:968-975 (1991)。
【００８１】
(iv) プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物体によって認識されヒト化２Ｈ７抗体をコードする核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、βラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターを含む。しかし、他の既知の細菌プロモーターも好適である。細菌系で使用するプロモータもまたＣＤ２０結合抗体をコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(Ｓ.Ｄ.)配列を有する。
真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に見出されるＡＴリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
【００８２】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ又は他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターは、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域である。酵母の発現に好適に用いられるベクターとプロモータは欧州特許７３６５７に更に記載されている。また酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に好適に用いられる。
【００８３】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのヒト化２Ｈ７抗体の転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、及び最も好ましくはサルウィルス４０(ＳＶ４０)などのウィルスのゲノムから得られるプロモーター、又は異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を更に含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄIIIＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現させる系が、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の変形例は米国特許第４６０１９７８号に開示されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞中でのヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyes等, Nature, 297：598-601(1982)を参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
【００８４】
(v) エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物によるこの発明のヒト化２Ｈ７抗体をコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、ＣＤ２０結合抗体コード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【００８５】
(vi) 転写終結成分
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、ＣＤ２０抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第94/11026号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
【００８６】
(vii) 宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日に公開された ＤＤ２６６７１０に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)であるが、他の大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３７)及び大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)のような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
【００８７】
完全長抗体、抗体断片、および抗体融合タンパク質は細菌内で生成することができ、特にグリコシル化およびＦｃエフェクター機能は必要でない、例として、治療的抗体が細胞障害性剤(例として、毒素)にコンジュゲートして、その免疫コンジュゲートが腫瘍細胞破壊に効果的である場合など。全長抗体は循環中で半減期が長い。大腸菌での生成がより早くよりコスト効率がよい。大腸菌における抗体断片およびポリペプチドの発現方法について、発現および分泌を最適化する転写開始領域(ＴＩＲ)およびシグナル配列を記載している米国特許第5,648,237号 (Carterら.)、同第5,789,199号(Jolyら)、および同第5,840,523号 (Simmonsら)を参照のこと。これらの特許文献はここ文献として組み込まれる。発現後、可溶性分画の大腸菌ペーストから抗体を単離し、例としてアイソタイプによるプロテインＡまたはＧカラムにより精製しうる。例としてＣＨＯ細胞での発現抗体精製工程と同様にして最終的精製を行う。
【００８８】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＣＤ２０結合抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能でここで使用できる、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ.ラクティス、Ｋ．フラギリス(ＡＴＣＣ１２４２４)、Ｋ.ブルガリカス(ＡＴＣＣ１６０４５)、Ｋ．ウィッケラミイ(ＡＴＣＣ２４１７８)、Ｋ.ワルチイ(ＡＴＣＣ５６５００)、Ｋ．ドロソフィラルム(ＡＴＣＣ３６９０６)、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアナス；ヤローウィア(ＥＰ４０２２２６)；ピチアパストリス(ＥＰ１８３０７０)；カンジダ；トリコデルマ・リーシア(ＥＰ２４４２３４)；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属宿主、例えば偽巣性コウジ菌及びクロカビが使用できる。
【００８９】
グリコシル化ヒト化２Ｈ７抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス・モリ ＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、そのようなウィルスは本発明においてここに記載したウィルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質転換に使用できる。
綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。
【００９０】
しかしながら、脊椎動物細胞におけるものが最も興味深く、培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１);ヒト胚腎臓株(２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977))；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))又はＣＨＯ-ＤＰ-一二株；マウスのセルトリ細胞(ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；サルの腎細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。
宿主細胞は、ＣＤ２０結合抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
【００９１】
(viii) 宿主細胞の培養
本発明のＣＤ２０結合抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ),(シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の増殖因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮増殖因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、GENTAMYCINTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【００９２】
(ix) 抗体の精製
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔に生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。Carter等, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌された抗体の単離方法を記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム(ｐＨ３．５)、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド(ＰＭＳＦ)の存在下で約３０分間解凍する。細胞細片は遠心分離で除去できる。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmicon又はPelliconの限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
【００９３】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、とりわけアフィニティクロマトグラフィが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986))。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Bakerbond ABXTM樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのSEPHAROSETMクロマトグラフィー(ポリアスパラギン酸カラム)、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
予備的精製工程に続いて、目的の抗体および混入物を含む混合液をｐＨ約２．５−４．５、好ましくは低塩濃度(例として、約０−０．２５Ｍ塩)の溶出緩衝液を用いて低ｐＨ疎水性作用クロマトグラフィを行う。
【００９４】
抗体コンジュゲート
抗体は細胞障害性剤、例として毒素または放射性同位体とコンジュゲートしうる。ある実施態様では、毒素はカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウリスタチンＥおよびその類似体または誘導体が好ましい。
好ましい薬剤／毒素には、ＤＮＡ阻害剤、微小管重合化または脱重合化阻害剤および代謝阻害剤を含む。細胞障害性剤の好ましいものには、例えば、酵素阻害剤、例としてジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、およびチミジル酸合成酵素阻害剤、ＤＮＡ干渉物質、ＤＮＡ切断物質、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリンファミリー剤、ビンカ剤、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞障害性ヌクレオシド、プテリジンファミリー剤、ジイネネス(diynenes)、ポドフィロトキシン、および分化誘導物質を含む。好ましい薬剤／毒素には、ＤＮＡ阻害剤、微小管重合化または脱重合化阻害剤および代謝阻害剤を含む。細胞障害性剤の好ましいものには、例えば、酵素阻害剤、例としてジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、およびチミジル酸合成酵素阻害剤、ＤＮＡ干渉物質、ＤＮＡ切断物質、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリンファミリー剤、ビンカ剤、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞障害性ヌクレオシド、プテリジンファミリー剤、ジイネネス(diynenes)、ポドフィロトキシン、および分化誘導物質を含む。特に有用なものの中には、例としてメトトレキサート、メトプテリン(methopterin)、ジクロロメトトレキセート(dichloromethotrexate)、5フルオロウラシルの、そして、6メルカプトプリンのシトシンアラビノシド、メルファラン、レウロシン(leurosine)、レウロシデイン(leurosideine)、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、N(5、5-ジアセトキシペンチル)ドキソルビシン、モルフォリノ-ドキソルビシン、1(2-クロエチル)-1、2-ジメタネスルホニル(dimethanesulfonyl)ヒドラジッド、N8-アセチルスペルミジン、アミノプテリンメトプテリン、エスペラマイシン、マイトマイシンC、マイトマイシンA、アクチノマイシン、ブレオマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシンおよびポドフィロトキシン誘導体、例としてエトポシドまたはエトポシドリン酸塩、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール、タキソテレ、レチノイン酸、酪酸、N8-アセチルスペルミジン、カンプトテシン、カリケアマイシン、ブリオスタチン、セファロスタチン、アンサマイトシン、アクトシン、メイタンシノイド、例としてＤＭ-１、メイタンシン、メイタンシノール、 N-デスメチル-4,5-デセポキシメイタンシノイド、C-19-デクロロメイタンシノイド、C-20-ヒドロキシメイタンシノール、 C-20-デメトキシメイタンシノール、C-9-SH メイタンシノール、C-14-アルコキシメチルメイタンシノール、C-14-ヒドロキシまたはアセチルオキシメチルメイタンシノール、C-15-ヒドロキシ／アセチルオキシメイタンシノール、C-15-メトキシメイタンシノール、 C-18-N-デメチルメイタンシノールおよび4,5-デオキシメイタンシノール、アウリスタチン、例としてアウリスタチンE、M、PHEおよびPE；ドロスタチン(dolostatin)、例としてドロスタチン A、ドロスタチン B、 ドロスタチン C、 ドロスタチン D、 ドロスタチン E (20-epi and 11-epi)、 ドロスタチン G、 ドロスタチン H、 ドロスタチン I、 ドロスタチン 1、 ドロスタチン 2、 ドロスタチン 3、 ドロスタチン 4、 ドロスタチン 5、 ドロスタチン 6、 ドロスタチン 7、 ドロスタチン 8、 ドロスタチン 9、 ドロスタチン 10、 deo-ドロスタチン 10、 ドロスタチン 11、 ドロスタチン 12、 ��ロスタチン 13、 ドロスタチン 14、 ドロスタチン 15、 ドロスタチン 16、 ドロスタチン 17、 and ドロスタチン 18；セファロスタチン(cephalostatin)、例として セファロスタチン 1、 セファロスタチン 2、 セファロスタチン 3、 セファロスタチン 4、 セファロスタチン 5、 セファロスタチン 6、 セファロスタチン 7、 25'-epi-セファロスタチン 7、 20-epi-セファロスタチン 7、 セファロスタチン 8、 セファロスタチン 9、 セファロスタチン 10、 セファロスタチン 11、セファロスタチン 12、セファロスタチン 13、セファロスタチン 14、 セファロスタチン 15、セファロスタチン 16、セファロスタチン 17、 セファロスタチン 18、およびセファロスタチン 19を含む。
【００９５】
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３，８９６，１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４，１５１，０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４，１３７，２３０号；同４，２４８，８７０号；同４，２５６，７４６号；同４，２６０，６０８号；同４，２６５，８１４号；同４，２９４，７５７号；同４，３０７，０１６号；同４，３０８，２６８号；同４，３０８，２６９号；同４，３０９，４２８号；同４，３１３，９４６号；同４，３１５，９２９号；同４，３１７，８２１号；同４，３２２，３４８号；同４，３３１，５９８号；同４，３６１，６５０号；同４，３６４，８６６号；同４，４２４，２１９号；同４，４５０，２５４号；同４，３６２，６６３号；及び同４，３７１，５３３号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。
【００９６】
メイタンシン及びメイタンシノイドは、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体と結合している。メイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第５，２０８，０２０号、同５，４１６，０６４号、欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。Liuら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞毒性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chariら, Cancer Research, 52：127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ.１に結合している免疫コンジュゲートが記載されている。
【００９７】
例えば、米国特許第5208020号又は欧州特許第0425235号B1、及びChari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)に開示されているもの等を含む、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、上記特許文献に開示されているように、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。
【００９８】
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能価性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能価性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])およびジスルフィド結合により提供されるＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。好ましい実施態様において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。
【００９９】
対象の他の免疫コンジュゲートには、１つ又は複数のカリケアマイシン分子とコンジュゲートしたＣＤ２０結合抗体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第5712374号、同5714586号、同5739116号、同5767285号、同5770701号、同5770710号、同5773001号、同5877296号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方とも、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
【０１００】
放射性同位元素
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗ＣＤ２０抗体を生成するために、種々の放射性同位元素が利用される。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位元素が含まれる。コンジュゲートが診断用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、mriとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
【０１０１】
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号)。
【０１０２】
治療的用途
本発明のヒト化２Ｈ７ ＣＤ２０結合抗体は、多くの悪性腫瘍および非悪性疾患、例えばＢ細胞リンパ腫及び白血病などのＣＤ２０陽性癌及び自己免疫性疾患の治療に有用である。骨髄の幹細胞(Ｂ細胞プロジェニター)はＣＤ２０抗原を欠損しており、治療後には健康なＢ細胞の再産生が可能となり、数か月以内には正常レベルにまで回復する。ｈｕ２Ｈ７.ｖ５１１は本明細書に記載の治療方法に用いられるべき好適な抗体である。
ＣＤ２０陽性癌は、細胞表面上にＣＤ２０を発現する細胞の異常な増殖を含むものである。ＣＤ２０陽性Ｂ細胞腫瘍には、リンパ球優性ホジキン病(ＬＰＨＤ)を含むＣＤ２０陽性ホジキン病；非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)；濾胞性中心細胞(ＦＣＣ)リンパ腫；急性リンパ球性白血病(ＡＬＬ)；慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)；線毛細胞白血病が含まれる。
【０１０３】
本明細書で使用する「非ホジキンリンパ腫」又は「ＮＨＬ」という用語は、ホジキンリンパ腫以外のリンパ系の癌を意味する。通常、ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫とは、ホジキンリンパ腫にはリードシュテルンベルク細胞が存在し、非ホジキンリンパ腫には前記細胞が不在であることにより区別することができる。本明細書で使用する用語に含まれる非ホジキンリンパ腫の例は、従来技術に既知の分類方式、例えばColor Atlas of Clinical Hematology第３版; A. Victor Hoffbrand及びJohn E. Pettit(編)(Harcourt Publishers Limited 2000)。特に図11.57、11.58及び11.59参照)に記載の改訂版European-American Lymphoma (REAL)方式に従って当業者(腫瘍学者または病理学者)によって認識されるあらゆるものを含む。より具体的な例としては、限定するものではないが、再発性又は抵抗性ＮＨＬ、前線低悪性度ＮＨＬ、第III／IV期ＮＨＬ、化学療法に抵抗性のＮＨＬ、前駆体Ｂリンパ芽球性白血病及び／又はリンパ腫、小リンパ球リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病及び／又は前リンパ球性白血病及び／又は小リンパ球リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、免疫細胞腫(immunocytoma)及び／又はリンパ形質細胞性リンパ腫、周辺帯Ｂ細胞リンパ腫、脾周辺帯リンパ腫、結節外周辺帯−ＭＡＬＴリンパ腫、結節周辺帯リンパ腫、有毛細胞白血病、プラズマ細胞腫及び／又は形質細胞骨髄腫、低悪性度／濾胞性リンパ腫、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、濾胞性中心リンパ腫(濾胞性)、中悪性度拡散性ＮＨＬ、広汎性大Ｂ細胞リンパ腫、高悪性度ＮＨＬ(高悪性度前線ＮＨＬ及び高悪性度再発性ＮＨＬを含む)、自己幹細胞移植後の又は自己肝細胞移植に抵抗性のＮＨＬ再発、原発性縦隔大Ｂ細胞リンパ腫、原発性浸出リンパ腫、高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度非切断小細胞性ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ、バーキットリンパ腫、前駆体(末梢性)大顆粒リンパ球性白血病、菌状息肉腫及び／又はセザリー症候群、皮膚(皮膚性)リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、血管動原体リンパ腫が挙げられる。
【０１０４】
具体的な実施態様では、ヒト化ＣＤ２０結合抗体及びその機能的な断片を用いて、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、リンパ球優性ホジキン病(ＬＰＨＤ)、小リンパ球性リンパ腫(ＳＬＬ)及び慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)、またこれらの症状の再発を含む疾患を治療する。
低悪性度リンパ腫は成長が遅い難病であり、平均的な患者は緩解と再発を繰返し６から１０年生存するものである。一実施態様では、ヒト化ＣＤ２０結合抗体またはその機能的断片は低悪性度ＮＨＬ、例えば再発した低悪性度ＮＨＬ及びリツキシマブ抵抗性低悪性度ＮＨＬの治療に用いられる。再発した低悪性度ＮＨＬ患者は、予め１クールのリツキシマブを投与し、６か月より長い期間応答したリツキシマブ応答者でありうる。
このヒト化２Ｈ７抗体又はその機能的断片は、例えば、再発性ないし抵抗性の低グレードないし濾胞性のＣＤ２０陽性のＢ細胞ＮＨＬのための単一薬剤治療(単一療法)として有用であるか、多剤投与計画において他の薬剤と組み合わせて患者に投与されうる。
【０１０５】
本発明のヒト化２Ｈ７抗体又は機能的な断片は最前線の治療として使用することができる。また、本発明は、リツキシマブ(Genentech)；オクレリズマブ(ocrelizumab)(Genentech, Inc.)；イブリツモマブチウキセタン(ZevalinTM, Biogen Idec)；トシツモマブ(BexxarTM, GlaxoSmithKline)；HuMAX-CD20TM(GenMab)；IMMU-106 (ヒト化抗CD20 a.k.a. hA20又は90Y-hLL2である, Immunomedics)；AME-133(Applied Molecular Evolution/Eli Lilly)；ゲムツズマブオゾガマイシン(MylotargTM, ヒト化抗ＣＤ３３抗体, Wyeth/PDL)；アレムツズマブ(CampathTM, 抗ＣＤ５２抗体, Schering Plough/Genzyme)；エピラツズマブ(IMMU-103TM, ヒト化抗ＣＤ２２抗体, Immunomedics)、の何れか一の薬剤による治療に非応答性であるか又は応答が不十分であるＣＤ２０陽性Ｂ細胞腫瘍患者、又はこれらの薬剤による治療後に再発した患者の治療のための、これらの抗体の使用を意図する。
本発明は、さらに、本発明のヒト化２Ｈ７抗体、具体的な実施態様では２Ｈ７.ｖ５１１及び２Ｈ７.ｖ１１４によるフルダラビン治療に失敗した患者を含むＣＬＬ患者を治療する方法を提供する。
【０１０６】
本明細書中の「自己免疫疾患」は、個体の自己組織又は同時分離又はその徴候又は結果として生じるその症状に対する及びそれらから生じる疾患又は症状である。自己免疫疾患又は症状の例として、限定するものではないが、関節炎(関節リウマチ(例えば急性の関節炎、慢性の関節リウマチ、痛風性関節炎、急性の痛風性関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節症、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬の関節炎、椎骨関節炎及び若年性発症関節リウマチ、骨関節炎、関節炎慢性化、関節炎変形、関節炎慢性原発、反応性関節炎、及び強直性脊椎炎)、炎症性過剰増殖性皮膚病、乾癬、例えばプラーク乾癬、滴状乾癬、膿疱性乾癬及び爪乾癬)、アトピー、例としてアトピー性疾患、例えば花粉症及びジョブ症候群、皮膚炎、例として接触皮膚炎、慢性接触皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、ヘルペス状の皮膚炎、貨幣状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、非特異的皮膚炎、一次刺激物接触皮膚炎及び過敏性皮膚炎、Ｘ連鎖性過剰ＩｇＭ症候群、蕁麻疹、例えば慢性アレルギー性蕁麻疹及び慢性特発性蕁麻疹、例として慢性自己免疫蕁麻疹、多発性筋炎／皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性上皮性表皮壊死症、強皮症(全身強皮症を含む)、硬化症、例えば全身性硬化症、多発性硬化症(ＭＳ)、例えば脊椎-眼(spino-optical) ＭＳ)、一次進行性ＭＳ(ＰＰＭＳ)及び再発性寛解ＭＳ(ＲＲＭＳ)、進行性全身性硬化症、アテローム性動脈硬化、動脈硬化症、硬化症汎発、失調性硬化症、炎症性腸疾患(ＩＢＤ)(例えばクローン病、自己免疫性胃腸疾患、大腸炎、例えば潰瘍性大腸炎、大腸性潰瘍、微細な大腸炎、膠原性大腸炎、大腸ポリープ、壊死性全腸炎及び経壁の大腸炎、及び自己免疫炎症性腸疾患)、膿皮症壊疽、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、上強膜炎、呼吸窮迫症候群、例として成人性又は急性の呼吸窮迫症候群(ＡＲＤＳ)、髄膜炎、葡萄膜の全部又は一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫血液疾患、リウマチ様脊椎炎、リウマチ様関節滑膜炎、突発性聴力障害、ＩｇＥ媒介性疾患、例えばアナフィラキシー及びアレルギー性鼻炎及びアトピー性鼻炎、脳炎、例えばラスマッセンの脳炎及び辺縁及び／又は脳幹脳炎、ブドウ膜炎、例として、前部ブドウ膜炎、急性前ブドウ膜炎、肉芽腫ブドウ膜炎、非顆粒性ブドウ膜炎、水晶体抗原性ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎又は自己免疫ブドウ膜炎、ネフローゼ症候群を有する又は有さない糸球体腎炎(ＧＮ)、例として、慢性又は急性の糸球体腎炎、例として原発性ＧＮ、免疫性ＧＮ、膜性ＧＮ(膜性ネフロパシ)、特発性膜性ＧＮ又は特発性膜性ネフロパシ、膜又は膜性増殖性ＧＮ(ＭＰＧＮ)(タイプＩ及びタイプＩＩを含む)、急速進行性ＧＮ、アレルギー性症状及び応答、アレルギー性反応、湿疹、例としてアレルギー性又はアトピー性湿疹、喘息、例えば喘息気管支炎、気管支喘息及び自己免疫喘息、Ｔ細胞の浸潤を伴う症状及び慢性炎症反応、外因性の抗原、例えば妊娠中の胎児のＡＢＯ血液型に対する免疫反応、慢性肺炎症性疾患、自己免疫心筋炎、白血球粘着力欠損、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)又は全身性ループスエリテマトーデス、例えば皮膚ＳＬＥ、亜急性の皮膚ＳＬＥ、新生児期ループス症候群(ＮＬＥ)、紅班性狼瘡汎発、ループス(例としてループス��炎、ループス脳炎、小児ループス、非腎性ループス、腎外ループス、円板状ループス、脱毛症ループス)、若年性開始型(Ｉ型)真正糖尿病、例として小児インシュリン依存性真正糖尿病(ＩＤＤＭ)、成人発症型真正糖尿病(ＩＩ型糖尿病)、自己免疫性糖尿病、特発性の尿崩症、サイトカイン及びＴリンパ球によって媒介される急性及び遅発性過敏症と関係する免疫応答、結核、サルコイドーシス、肉芽腫症、例としてリンパ腫肉芽腫症、ヴェゲナーの肉芽腫症、無顆粒球症、脈管炎、例として血管炎、大血管性血管炎(例えば大脈管脈管炎(リウマチ性多発性筋痛及び巨細胞(高安)動脈炎を含む)、中脈管脈管炎(川崎病及び結節性多発動脈炎／結節性動脈周囲炎を含む)、微小多発動脈炎、ＣＮＳ脈管炎、壊死性血管炎、皮膚性血管炎又は過敏性血管炎、全身性壊死性血管炎、及びＡＮＣＡ関連の脈管炎、例としてチャーグ-ストラウス脈管炎又は症候群(ＣＳＳ))、側頭動脈炎、無形成性貧血、自己免疫無形成性貧血、クームズ陽性貧血症、ダイアモンドブラックファン貧血症、溶血性貧血又は免疫溶血性貧血、例として自己免疫溶血性貧血(ＡＩＨＡ)、悪性貧血(貧血症悪性熱)、アジソン病、純粋な赤血球貧血症又は形成不全(ＰＲＣＡ)、第VIII因子欠損症、血友病Ａ、自己免疫好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球血管外遊出を伴う疾患、ＣＮＳ炎症性疾患、多器官損傷症候群、例えば敗血症、外傷又は出血の二次症状、抗原-抗体複合体関連疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット又はベーチェット病、カールスマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンスジョンソン症候群、類天疱瘡、例えば水疱性類天ぽうそう及び類天疱瘡皮膚、天疱瘡(尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、ペンフィグス粘液膜類天疱瘡及び天疱瘡エリテマトーデスを含む)、自己免疫多腺性内分泌障害、ライター病又は症候群、免疫複合体腎炎、抗体媒介性腎炎、視神経脊髄炎、多発性神経炎、慢性神経障害、例えばＩｇＭ多発性神経炎又はＩｇＭ媒介性神経障害、血小板減少(例えば心筋梗塞患者によるもの)、例えば血栓性血小板減少性紫斑病(ＴＴＰ)、輸血後紫斑病(ＰＴＰ)、ヘパリン誘導性血小板減少症、及び自己免疫性又は免疫媒介性血小板減少、例えば慢性及び急性のＩＴＰを含む特発性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)、自己免疫性精巣炎及び卵巣炎を含む精巣及び卵巣の自己免疫性疾患、一次甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、自己免疫内分泌性疾患、例えば甲状腺炎、例えば自己免疫性甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎(橋本甲状腺炎)又は亜急性の甲状腺炎、自己免疫甲状腺性疾患、特発性甲状腺機能低下症、グレーブ病、自己免疫多腺性症候群、例として多腺性症候群(又は、多腺性内分泌障害症候群)、腫瘍随伴症候群、例として神経系新生物関連症候群、例えばランバート-イートン筋無力症症候群又はイートン―ランバート症候群、スティッフマン又はスティッフマン症候群、脳脊髄炎、例として、アレルギー性脳脊髄炎又は脳脊髄炎性アレルギー及び実験的アレルギー性脳脊髄炎(ＥＡＥ)、重症筋無力症、例えば胸腺腫関連の重症筋無力症、小脳性退化、神経ミオトニ、眼球クローヌス又は眼球クローヌス筋硬直症候群(ＯＭＳ)及び感覚系��経障害、多病巣性運動神経障害、シーハン症候群、自己免疫肝炎、慢性肝炎、類狼瘡肝炎、巨細胞肝炎、慢性活動性肝炎又は自己免疫慢性活動性肝炎、リンパ系間隙間質性肺炎(ＬＩＰ)、閉塞性細気管支炎(非移植)対ＮＳＩＰ、ギラン‐バレー症候群、ベルガー病(ＩｇＡネフロパシ)、特発性ＩｇＡネフロパシ、線状ＩｇＡ皮膚病、原発性胆管萎縮症、肺線維症、自己免疫腸疾患症候群、セリアック病、コエリアック病、脂肪便症(グルテン腸疾患)、抵抗性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、アミロトロフィック側索硬化症(ＡＬＳ；筋萎縮性側索硬化症(Lou Gehrig's disease))、冠状動脈疾患、自己免疫性耳疾患、例として、自己免疫内耳疾患(ＡＩＥＤ)、自己免疫聴力障害、眼球クローヌス筋硬直徴候(ＯＭＳ)、多発性軟骨炎、例として、抵抗性又は再発性多発性軟骨炎、肺胞状蛋白症、アミロイドーシス、強膜炎、非癌性リンパ球増多症、一次リンパ球増多症、これにはモノクローナルＢ細胞リンパ球増多症(例えば良性モノクローナル免疫グロブリン症及び未同定の有意なモノクローナル免疫グロブリン血症(monoclonal gammopathy of undetermined significance)、ＭＧＵＳ)が含まれる、末梢性神経障害、腫瘍随伴症候群、チャネル病、例として、癲癇、片頭痛、不整脈、筋疾患、難聴、盲目、周期性麻痺及びＣＮＳのチャネル病、自閉症、炎症性ミオパシ、局所性分節性糸球体硬化症(ＦＳＧＳ)、内分泌性眼障害、ブドウ膜網膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性肝臓病、線維症、多内分泌性不全、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮、初老期痴呆、脱髄性疾患、例として、自己免疫脱髄性病及び慢性炎症性脱髄性多発性神経炎、糖尿病性ネフロパシ、ドレスラー症候群、円形脱毛症、ＣＲＥＳＴ症候群(石灰沈着、レイノー現象、食道運動障害、強指症及び毛細管拡張症)、雌雄自己免疫性不妊性、混合性結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、再発性中絶、農夫肺、多形性紅斑、心切開術後症候群、クッシング症候群、愛鳥家肺、アレルギー性肉芽腫性脈管炎、良性リンパ球血管炎、アルポート症候群、肺胞炎、例えばアレルギー性肺胞炎及び繊維化肺胞炎、間隙肺疾患、輸血反応、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、キパノソミアシス(kypanosomiasis)、住血吸虫症、蛔虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維形成、広汎性間質性肺線維形成、間質性肺線維形成、間質性肺線維症、特発性の肺線維形成、嚢胞性線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸性筋膜炎(eosinophilic faciitis)、シャルマン症候群、フェルティー症候群、フィラリア(flariasis)、毛様体炎、例えば慢性毛様体炎、ヘテロ慢性毛様体炎、虹彩毛様体炎(急性又は慢性)、又はＦｕｃｈの毛様体炎)、ヘーノホ-シェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)感染、エコーウィルス感染、心筋症、アルツハイマー病、パルボウィルス感染、風疹ウィルス感染、種痘後症候群、先天性風疹感染、エプスタインバーウイルス感染、耳下腺炎、エヴァンの症候群、自己免疫性腺機能不全、シドナム舞踏病、連鎖球菌感染後腎炎、閉塞性血栓性血管炎(thromboangitis ubiterans)、甲状腺中毒症、脊髄癆、脈絡膜炎、巨細胞多発性筋痛、内分泌性眼障害、慢性過敏性肺炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性腎臓症候群、微小変化ネフロパシ、良性家族性及び乏血-再灌流障害、網膜自己免疫、関節炎症、気管支炎、慢性閉塞性気道疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化症疾患、アスペルミオジェネース(aspermiogenese)、自己免疫性溶血、ベック病、クリオグロブリン血症、デュピュイトラン拘縮、水晶体過敏性眼内炎、腸炎アレルギー、結節性紅斑、leprosum、特発性顔麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ性熱、ハンマンリッチ病、感覚器性(sensoneural)聴力障害、血色素尿症発作(haemoglobinuria paroxysmatica)、性機能低下、回腸炎領域、白血球減少症、単核細胞増加症感染、横移動脊髄炎、一次特発性の粘液水腫、ネフローゼ、眼炎symphatica、精巣炎肉芽腫症、膵炎、多発性神経根炎急性、膿皮症壊疽、Ｑｕｅｒｖａｉｎ甲状腺炎、後天性脾臓萎縮、抗精子抗体による不妊性、非悪性胸腺腫、白斑、ＳＣＩＤ及びエプスタインバーウイルス関連疾患、後天性免疫不全症候群(エイズ)、寄生虫病、例えばLesihmania、毒性ショック症候群、食中毒、Ｔ細胞の浸潤を伴う症状、白血球-粘着力欠損、サイトカイン及びＴリンパ球に媒介される急性及び遅発性過敏症関連免疫応答、白血球血管外遊出を伴う疾患、多器官損傷症候群、抗原-抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、自己免疫多腺性内分泌障害、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫萎縮性胃炎、交感性眼炎、リウマチ性疾患、混合性結合組織病、ネフローゼ症候群、膵島炎、多内分泌性不全、末梢性神経障害、自己免疫多腺性症候群Ｉ型、成人発症型特発性副甲状腺機能低下症(ＡＯＩＨ)、完全脱毛症、拡張型心筋症、後天性表皮水疱症(ＥＢＡ)、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性又は非化膿性副鼻腔炎、急性又は慢性副鼻腔炎、篩骨、正面、上顎骨又は蝶形骨副鼻腔炎、好酸球性関連疾患、例えば好酸球増加症、肺浸潤好酸球増加症、好酸球増加症-筋肉痛症候群、レフラー症候群、慢性好酸性肺炎、熱帯肺好酸球増加症、気管支肺炎アスペルギルス症、アスペルギローム又は好酸球性を含有する肉芽腫、アナフィラキシー、血清陰性脊椎関節炎疹、多内分泌性自己免疫性疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性皮膚粘膜カンジダ症、ブラットン症候群、乳児期の一過性低ガンマグロブリン血症、ウィスコット‐アルドリッチ
症候群、毛細血管拡張性運動失調症候群、膠原病と関係する自己免疫疾患、リウマチ、神経病学的疾患、リンパ節炎、虚血性再灌流障害、血圧応答の減退、血管機能不全、antgiectasis、組織損傷、心血管乏血、痛覚過敏、脳虚血、及び脈管化を伴う疾患、アレルギー性過敏症疾患、糸球体腎炎、再灌流障害、心筋又は他の組織の再灌流損傷、急性炎症性成分を有する皮膚病、急性化膿性髄膜炎又は他の中枢神経系炎症性疾患、眼性及び眼窩の炎症性疾患、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘発性毒性、急性重症炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、肺線維症、糖尿病性網膜症、糖尿病性大動脈疾患、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎、及び子宮内膜症などがある。
【０１０７】
具体的な実施態様では、ヒト化２Ｈ７抗体及びその機能的な断片を用いて、関節リウマチ及び若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、例えばループス腎炎、ヴェゲナー病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、特発性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)、血栓性血小板減少性紫斑病(ＴＴＰ)、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、例えば再発性寛解ＭＳ、乾癬、ＩｇＡネフロパシ、ＩｇＭ多発性神経炎、重症筋無力症、ＡＮＣＡ関連血管炎、真正糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群、視神経脊髄炎(ＮＭＯ)及び糸球体腎炎を治療する。
【０１０８】
「治療すること」または「処置」または「寛解」は、治療的処置を表し、この目的は標的とした病態または疾患を治癒しない場合に衰退(減少)させる、又は症状の再発を予防することである。本発明の方法に従って本発明のヒト化ＣＤ２０結合抗体の治療的有効量を投与した後、患者のＣＤ２０陽性Ｂ細胞悪性腫瘍または自己免疫性疾患がうまく「治療」されれば、患者は特定の疾患の一またはそれ以上の兆候および症状が明らかにおよび／または測定可能な程度に減少または消失する。例えば、癌では、癌細胞数の有意な減少または癌細胞の消失；腫瘍の大きさの減少；腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度の遅延および好ましくは停止）；ある程度の腫瘍成長の阻害；緩解期の延長、および／または特定の癌が関与する一またはそれ以上の症状のある程度の除去；罹患率および死亡率の減少、および生活の質の改善がある。疾患の兆候または症状の減弱は患者が感じ得るものである。癌のすべての兆候の消失を定義するならば、腫瘍の大きさが好ましくは５０％以上、より好ましくは７５％以上減少すると、処置が完全な反応または部分的な反応を達成し得たことになる。患者が疾患の安定を体験するならば、患者も治療されたと考える。ある基準では、本発明のｈ２Ｈ７抗体により末梢血のＢ細胞が９５％より多く枯渇され、Ｂ細胞は基準の２５％に戻る。好ましい実施態様では、本発明の抗体による治療は、治療後４か月、好ましくは６か月、より好ましくは１年、さらにより好ましくは２年又は２年以上に癌患者に癌の進行がないほどに有効である。疾患の改善および治療の成功を評価するこれらのパラメーターは医師などの適切な当業者に知られた常法によって容易に測定可能である。
【０１０９】
「治療的有効量」という用語は、対象物の疾患又は疾病を「治療」するのに効果的な抗体または薬剤の量を指す。癌の場合は、治療的有効量の薬剤は、癌細胞の数を減少させ；腫瘍の大きさを小さくし；癌細胞の周辺器官への浸潤を阻害(すなわち、ある程度に遅く、好ましくは止める）し；腫瘍の転移を阻害(すなわち、ある程度に遅く、好ましくは止める）し；腫瘍の成長をある程度阻害し；及び／又は癌に関連する一つ或いはそれ以上の症状をある程度和らげることが可能である。「治療する」の定義を参照。自己免疫性疾患の場合、治療的有効量の抗体又は他の薬剤は、疾患の徴候及び症状が軽減する低度に有効である。
【０１１０】
腫瘍治療の効果又は成功を評価するパラメータは適切な疾患に技量のある医師には知られているであろう。一般に、技量のある医師は特定の疾患の徴候や症状の軽減を求めるであろう。パラメータには、疾患増悪の中央値、寛解期間及び安定期間が含まれうる。
次の文献は、リンパ腫及びＣＬＬ、それらの診断、治療、及び治療効果を測定するための標準的な医学的手法について記載している。Canellos GP, Lister, TA, Sklar JL: The Lymphomas. W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1998；van Besien K及びCabanillas, F: Clinical Manifestations, Staging and Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma, 70章, pp 1293-1338, Hematology, Basic Principles and Practice, 3版 Hoffman 等(編者) Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000；及びRai, K及びPatel, D: Chronic Lymphocytic Leukemia, 72章, pp1350-1362, Hematology, Basic Principles and Practice, 3版 Hoffman 等(編者) Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000。
自己免疫又は自己免疫関連疾患の治療の効果又は成功を評価するためのパラメータは適切な疾患に技量のある医師には知られているであろう。一般に、技量のある医師は特定の疾患の徴候や症状の減退を求めるであろう。以下は例として挙げる。
【０１１１】
一実施態様では、ヒト化２Ｈ７抗体及び具体的なｈｕ２Ｈ７.ｖ５１１及びその機能的断片を用いて関節リウマチを治療する。
ＲＡは、二百万を超える米国人が罹っており患者の日常の活動を妨げる消耗性自己免疫疾患である。ＲＡは身体自体の免疫系が不適切に関節組織を攻撃し健康な組織を破壊する慢性的な炎症を引き起こし関節内に損傷を生じる。症状には関節の炎症、腫れ、凝り、及び疼痛が含まれる。また、ＲＡは全身性の疾患であるので、肺、眼及び骨髄のような他の組織に影響を持ちうる。知られている治療法はない。治療には、様々なステロイド系及び非ステロイド系薬剤、免疫抑制剤、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、及び生物製剤が含まれる。しかしながら、多くの患者は治療に対して不十分な応答性のままである。
【０１１２】
抗体は初期ＲＡ（つまり、メトトレキセート(ＭＴＸ)を受けたことがない）の患者において第一選択治療薬として、また単剤療法として、あるいは例えばＭＴＸ又はシクロホスファミドとの併用で又はその後に、使用することができる。あるいは、抗体は、ＤＭＡＲＤ及び／又はＭＴＸに不応性の患者に対する二次療法として、また単剤療法あるいは例えばＭＴＸとの併用で、使用することができる。ヒト化ＣＤ２０結合抗体は、関節損傷の予防及び管理、構造損傷の遅延化、ＲＡの炎症に伴う疼痛の軽減、及び中程度から重篤なＲＡの症状及び徴候の低減一般に有用である。ＲＡ患者は、ＲＡの治療に使用される他の薬剤（以下の併用療法を参照）での治療に先立って、その治療後に、又はその治療と併せて、ヒト化ＣＤ２０結合抗体で治療することができる。一実施態様では、疾患修飾性抗リウマチ薬での治療が過去に失敗したか、及び／又はメトトレキセート単独に対しては不十分な応答であった患者が、本発明のヒト化ＣＤ２０結合抗体で治療される。この治療の一実施態様では、患者は、ヒト化ＣＤ２０結合抗体を単独で投与（１日目と１５日目に１ｇの静脈内注入）；ＣＤ２０結合抗体＋シクロホスファミド投与（３日目と１７日目に７５０ｍｇの静脈内注入）；又はＣＤ２０結合抗体＋メトトレキセート投与を受ける１７日の治療計画で治療される。
【０１１３】
ＲＡの間、身体が腫瘍壊死因子α(ＴＮＦα)を生産するので、ＴＮＦαインヒビターがその疾患の治療のために使われている。しかしながら、ＴＮＦαインヒビター、例としてエタネルセプト(ENBREL(登録商標))、インフリキシマブ(REMICADE(登録商標))、そして、アダリムマブ(HUMIRATM)は、ネガティブな副作用、例えば感染、心不全及び髄鞘脱落を生じうる。したがって、一実施態様では、ヒト化ＣＤ２０結合抗体又はその生物学上機能的な断片は、ＴＮＦαインヒビター薬剤によって経験されるこれらのネガティブな副作用のリスクを減らすべきＲＡ患者の治療に、又は毒性（例えば心臓毒性）を経験する傾向があると考慮される患者を治療するために、例えば第一線の治療として有用である。また、ヒト化ＣＤ２０結合抗体又はその生物学上機能的な断片は、ＴＮＦα-インヒビターで治療されたが、応答しない、ＴＮＦα-インヒビターに不十分な応答を有する(ＴＮＦ-ＩＲ患者)か、又は数回の応答の後で疾患の再発を有するＲＡ罹患被検体、又はＴＮＦα-インヒビターによる治療に応答しそうにない被検体であることが決定された被検体の治療方法に有用である。一実施態様では、ＴＮＦ-ＩＲは、ＴＮＦαインヒビターによる治療の前に、１００ｍｇ以下などの低用量で治療される。
【０１１４】
ＲＡの治療効果を評価する一方法は、American College of Rheumatology (ＡＣＲ)基準に基づくものであり、これはとりわけ圧痛及び腫大した関節の改善の割合を測定するものである。ＲＡ患者は、無抗体治療（例えば、治療前のベースライン）又はプラセボ治療と比較して例えばＡＣＲ２０（２０パーセントの改善）でスコア付けをすることができる。抗体治療の効果を評価する他の方法は、Ｘ線画像、例えば骨の侵食及び関節腔の狭小化等の構造的傷害のスコア付けに用いられるSharpＸ線スコアを含む。また、患者は、治療期間中又は治療後の時間期間においてHealth Assessment Questionnaire [ＨＡＱ]スコア、ＡＩＭＳスコア、ＳＦ-３６に基づいて能力障害の予防又は改善について評価をすることができる。ＡＣＲ２０基準は、圧痛（痛み）関節数と腫大関節数の両方に２０％の改善があり、かつ５つの追加測定のうち少なくとも３つに２０％の改善があることを含みうる。
１．視覚的アナログ尺度（ＶＡＳ）による患者の疼痛評価
２．疾患活動性の患者の全体評価（ＶＡＳ）
３．疾患活動性の医師の全体評価（ＶＡＳ）
４．Health Assessment Questionnaireにより測定した能力障害の患者の自己評価、及び
５．急性反応物質、ＣＲＰ又はＥＳＲ
ＡＣＲ５０及び７０も同様に定義される。好ましくは少なくともＡＣＲ２０のスコア、好ましくは少なくともＡＣＲ３０、より好ましくは少なくともＡＣＲ５０、更により好ましくは少なくともＡＣＲ７０、最も好ましくは少なくともＡＣＲ７５より高いスコアに達する用量の本発明のＣＤ２０結合抗体を患者に投与する。
【０１１５】
乾癬性関節炎は独特で明瞭なＸ線撮影像的特徴を有する。乾癬性関節炎の場合、関節侵食及び関節腔狭小化も同様にシャープ(Sharp)スコアにより評価しうる。本発明のヒト化ＣＤ２０結合抗体は関節損傷の予防並びに疾患の徴候及び疾病の症状の減弱に用いることができる。
本発明の更に他の態様は、本発明の治療的有効量のヒト化ＣＤ２０結合抗体が、ＳＬＥ又はループス腎炎に罹患している患者に投与されることによるＳＬＥ又はループス腎炎の治療方法である。ＳＬＥＤＡＩスコアは疾患活動性の数値的定量化を付与する。ＳＬＥＤＡＩは疾患活動性に相関することが知られている２４の臨床及び治験パラメータの荷重指数であり、０−１０３の数的範囲である。Bryan Gescuk及びJohn Davis, “Novel therapeutic agent for systemic lupus erythematosus” Current Opinion in Rheumatology 2002, 14:515-521を参照のこと。他のスコア法にはＢＩＬＡＧスコア法がある。二本鎖ＤＮＡに対する抗体は腎性発赤及び他のループスの症状を引き起こすと考えられている。抗体治療を受けている患者を、血清クレアチニン、尿タンパク、又は尿中の血液の有意で再現可能な増加として定義される腎性発赤までの時間についてモニターすることができる。あるいは又は加えて、抗核抗体及び二本鎖ＤＮＡに対する抗体のレベルについて患者をモニターできる。ＳＬＥの治療は高用量のコルチコステロイド及び／又はシクロホスファミド(ＨＤＣＣ)を含む。本明細書では、成功したループス治療は、紅斑が減少する、すなわち次の紅斑までの時間及び／又は重症度が軽減するであろう。
【０１１６】
脊椎関節症は一群の関節疾患であり、硬直性脊椎炎、乾癬性関節炎、クローン病を含む。治療成果は、確認された患者及び医師の全体的評価測定ツールによって決定しうる。
脈管炎に関しては、全身性血管炎の患者のおよそ７５％が抗好中球細胞質抗体を持ち、小／中サイズ血管を冒す３種の症状の一つにクラスター化される：ヴェーゲナー肉芽腫症（ＷＧ）、顕微鏡的多発性血管炎（ＭＰＡ）及びチャーグ・ストラウス症候群（ＣＳＳ）で、集合的にＡＮＣＡ関連脈管炎（ＡＡＶ）として知られているもの。
乾癬の治療効果は、医師の包括的評価（ＰＧＡ）変化、及び乾癬領域及び重症度指数（ＰＡＳＩ）スコア、乾癬症状評価（ＰＳＡ）を含む臨床兆候及び疾患の症状の変化をモニターし、ベースライン症状と比較することによって評価する。特定の時点で経験した掻痒の程度を表すために用いられる視覚的アナログ尺度で処置を通して定期的に、ｈｕ２Ｈ７.５１１などの本発明のヒト化ＣＤ２０結合抗体で治療された乾癬患者を測定することができる。
患者はその治療抗体の最初の注入で注入反応又は注入関連症状を経験する場合がある。これらの症状の重症度はまちまちで、一般に医学的介入で改善することが可能である。これらの症状には、限定されるものではないが、インフルエンザに似た発熱、悪寒／寒気、吐き気、掻痒、頭痛、気管支痙攣、血管性浮腫が含まれる。本発明の疾患治療法が注入反応を最小にすることが望ましい。そのような副作用を軽減又は最小にするために、患者には、抗体の初期順化又は寛容化用量の後に治療的に有効な用量が投与されうる。順化用量は治療的に有効な用量よりも少なく、患者をより多い用量に耐えるように順化させる。
【０１１７】
用量
治療される徴候及び当分野の技量のある医師が理解する投薬に関連する因子に応じて、本発明の抗体は、毒素及び副作用を最小化する一方で、その徴候の治療に効果のある用量で投与される。所望の用量は、疾患及び疾患の重症度、疾患の段階、望ましいＢ細胞調節のレベル、及び当分野の技量のある医師に知られる他の因子に依存しうる。
自己免疫疾患の治療の場合、個々の患者の疾患及び／又は症状の重症度に応じて、ヒト化２Ｈ７抗体の用量を調節することによってＢ細胞の枯渇の程度を調節することが望ましい。Ｂ細胞の枯渇は完全でなければならないものではない。あるいは、全Ｂ細胞の枯渇は初期治療で望まれるかもしれないが、続く治療では部分的な枯渇のみを達成するように用量を調節してもよい。一実施態様では、Ｂ細胞枯渇は少なくとも２０％であり、すなわち治療前のベースライン値と比較して８０％以下のＣＤ２０陽性Ｂ細胞が残っている。他の実施態様では、Ｂ細胞枯渇は２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％又はそれ以上である。好ましくは、Ｂ細胞枯渇は、疾患の進行を停止させるのに、より好ましくは治療の元で特定の疾患の兆候や症状を緩解するのに、更により好ましくは疾患を治癒するのに、十分である。
【０１１８】
ジェネンテック及びバイオジェン・アイデックの臨床試験では、１０ｍｇの少なさから１ｇの用量までの範囲の抗ＣＤ２０(ｈｕ２Ｈ７.ｖ１６及びリツキシマブ)の用量を使用して自己免疫疾患の治療効果が評価された（リツキシマブ研究に関する発明の背景の項目；及び国際公開公報04/056312の実施例１６を参照）。一般に、約２週間の間隔をあけて２用量の抗体をこれらの臨床試験において投与した。臨床試験で治験した治療計画の例は、関節リウマチではヒト化ＣＤ２０抗体２Ｈ７.ｖ１６に対して、２×１０ｍｇ（つまり１用量当たり１０ｍｇで２用量；７０ｋｇ、身長６７インチの患者に対して〜１０．１ｍｇ／ｍ２の全用量）、２×５０ｍｇ（７０ｋｇ、身長６７インチの患者に対して５５ｍｇ／ｍ２の全用量）、２×２００ｍｇ（７０ｋｇ、身長６７インチの患者に対して２２０ｍｇ／ｍ２の全用量）、２×５００ｍｇ（７０ｋｇ、身長６７インチの患者に対して〜５５０ｍｇ／ｍ２の全用量）及び２×１０００ｍｇ（７０ｋｇ、身長６７インチの患者に対して１１００ｍｇ／ｍ２の全用量）であり；リツキサンに対して、２×５００ｍｇ（７０ｋｇ、身長６７インチの患者に対して〜５５０ｍｇ／ｍ２の全用量）、２×１０００ｍｇ（７０ｋｇ、身長６７インチの患者に対して〜１１００ｍｇ／ｍ２の全用量）である。これらの用量のそれぞれにおいて、抗体の最初の用量の投与後に循環Ｂリンパ球の実質的な枯渇が観察された。現在、単一か二回の静脈内注入として１０ｍｇから２０００ｍｇの用量範囲も探求されている。
【０１１９】
自己免疫疾患を治療し、自己免疫疾患に罹っている患者のＢ細胞を枯渇させる方法では、一実施態様では、０．１ｍｇから１０００ｍｇの範囲の一定(フラット)な用量でヒト化２Ｈ７.５１１抗体が患者に投与される。我々は、３００ｍｇ未満の一定用量、また１０ｍｇの用量でさえ、大幅なＢ細胞枯渇が達成されることを見出した。よって、異なる実施態様の本Ｂ細胞枯渇及び治療方法では、ｈｕ２Ｈ７.５１１抗体は、０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、又は２５０ｍｇの投薬量で投与される。例えば２０ｍｇ、１０ｍｇ又はそれ以下の低い用量は部分的な又は短期間のＢ細胞枯渇が目的である場合に使用することができる。一実施態様では、本用量及び投薬計画は関節リウマチ(ＲＡ)を治療する際に用いられる。
【０１２０】
ＣＤ２０陽性癌の治療の場合、本発明の抗ＣＤ２０抗体の標的であるＢ細胞の枯渇を最大限にすることが望まれうる。よって、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞悪性腫瘍の治療の場合、Ｂ細胞を十分枯渇して、例えば腫瘍の成長（大きさ）、癌性細胞タイプの増殖、転移、特定の癌の他の徴候や症状をモニターすることによって技量のある医師によって評価され得る疾患の進行を少なくとも防ぐことが望まれる。好ましくは、Ｂ細胞の枯渇は、少なくとも２か月、より好ましくは３か月、更により好ましくは４か月、より好ましくは５か月、更により好ましくは６か月以上の間、疾患の進行を防ぐのに十分な程度である。更により好ましい実施態様では、Ｂ細胞の枯渇は、少なくとも６か月、より好ましくは９か月、より好ましくは１年、より好ましくは２年、より好ましくは３年、更により好ましくは５年以上緩解の時間を増やすのに十分な程度である。最も好ましい実施態様では、Ｂ細胞枯渇は十分に疾患を治癒する。好ましい実施態様では、癌患者のＢ細胞の枯渇は、治療の前の基本の値の少なくとも約７５％、及びより好ましくは８０％、８５％、９０％、９５％、９９％及び更に１００％である。
【０１２１】
ＮＨＬの治療の治験におけるｖ１６及びｖ５１１を含むｈｕ２Ｈ７抗体の用量及び投薬計画の例は、下記の実験的実施例１８−２０に記載する。
また、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０ｍｇ／用量のｍｇ／用量の用量が、ＮＨＬなどのＢ細胞悪性腫瘍の維持療法に用いられうる。
投薬の頻度はいくつかの因子に従って変化しうる。通常、患者は、ヒト化２Ｈ７ ＣＤ２０結合抗体を少なくとも２用量で投与される。異なる実施態様では、２−４、２−８用量、２−１０用量が投与されうる。一般的に、２用量は、１か月以内、一般に１、２又は３週空けて投与される。腫瘍学の一治療投薬計画では、２００ｍｇ／ｍ２から７５０ｍｇ／ｍ２の間の用量で８回の静注が考慮される。ＲＡのための一投薬計画では、患者は、ｖ１６、ｖ１１４又はｖ５１１などのヒト化抗体を、６か月ごとに５００ｍｇ、２回投与される。ＲＡのための他の投薬計画は、９か月ごとに１０００ｍｇ、２回である。ｖ１６、ｖ１１４又はｖ５１１によるＲＡの第三の投薬計画は、６か月ごとに１０ｍｇ、２回である。疾患又は再発の改善のレベルに応じて、更なる用量が、疾患過程を通じて、又は疾患維持療法として投与されうる。
【０１２２】
一又は複数の現行の治療法について十分に効果を示さない、耐性に乏しい又は禁忌を示す、自己免疫性疾患又はＢ細胞悪性腫瘍を有する患者は、本発明の何れかの投薬計画を用いて治療されうる。例えば、本発明は、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)インヒビター治療に、または、疾患を修飾している抗リウマチ剤(ＤＭＡＲＤ)治療に不十分な応答を有したＲＡ患者のための本治療方法を意図する。
「慢性」投与とは、初期の治療効果（活性）を長期間にわたって維持するようにするために、急性態様とは異なり連続的な態様での薬剤の投与を意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
【０１２３】
投与経路
ヒト化２Ｈ７抗体は既知の方法で、例えば静脈内投与、例えばボーラス又は一定期間の連続注入、皮下的、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、動脈血管内、滑膜内、クモ膜下腔内、又は吸入経路で、一般的には静脈内又は皮下投与で、ヒト患者に投与される。
一般的に亜、腫瘍学的な徴候のために、ヒト化２Ｈ７製剤は注入などの静脈内経由により投与される。一実施態様では、ヒト化２Ｈ７抗体が注入ビヒクルとして０．９％塩化ナトリウム溶液を用いる静脈内注入によって投与される。関節リウマチの第I／II相臨床試験では静脈内注入により抗体製剤が投与される(実施例２０を参照のこと)。
他の実施態様では、ヒト化２Ｈ７抗体は特に皮下注入により投与される。
【０１２４】
併用療法
上述のＢ細胞腫瘍の治療では、患者を、一又は複数の治療剤、例えば多剤併用療法の化学療法剤での治療と併せて本発明のヒト化２Ｈ７抗体で治療することができる。ヒト化２Ｈ７抗体は、化学療法剤と同時に、連続して、又は交互に、あるいは他の治療での非反応性後に、投与することができる。リンパ腫の治療に対する標準的な化学療法には、シクロホスファミド、シタラビン、メルファラン及びミトキサントロン＋メルファランが含まれうる。ＣＨＯＰは非ホジキンリンパ腫の治療に対する最も一般的な化学療法の一つである。次のものはＣＨＯＰ療法で用いられる薬剤である：シクロホスファミド（商品名シトキサン、ネオザール(neosar)）；アドリアマイシン（ドキソルビシン／ヒドロキシドキソルビシン）；ビンクリスチン（オンコビン）；及びプレドニゾロン（しばしばデルタゾン又はオラゾン(Orasone)と呼ばれる）。特定の実施態様では、ＣＤ２０結合抗体は、次の化学療法剤：ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン及びプレドニゾロンの一又は複数と併用して、それを必要とする患者に投与される。特定の実施態様では、リンパ腫（例えば非ホジキンリンパ腫）の患者はＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニゾロン）化学療法と併用して本発明のヒト化２Ｈ７抗体で治療される。他の実施態様では、癌患者がＣＶＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン及びプレドニゾロン）化学療法と併用して本発明のヒト化２Ｈ７ ＣＤ２０結合抗体で治療されうる。具体的な実施態様では、ＣＤ２０陽性ＮＨＬの患者はＣＶＰと組み合わせてヒト化２Ｈ７.ｖ５１１又はｖ１１４が、例えば３週ごとに８サイクル投与される。ＣＬＬの治療の具体的な実施態様では、２Ｈ７.ｖ５１１抗体が、フルダラビン及びシトキサンの一又は双方での化学療法と併用して投与される。
【０１２５】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシトキサン(CYTOXAN)(登録商標)シクロホスファミドのようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；ＴＬＫ２８６(TELCYTATM)；アセトゲニン類（特にブラタシン及びブラタシノン(bullatacinone)）；δ-９-テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、マリノール(登録商標)）；β-ラパコン；ラパコール；コルヒチン類；ベツリン酸；カンプトセシン（合成アナログトポテカン(HYCAMTIN(登録商標))、ＣＰＴ-１１（イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標)）、アセチルカンプトセシン、スコポレクチン(scopolectin)、及び９-アミノカンプトセシン）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン(podophyllinic)酸；テニポシド；クリプトフィシン類（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１；エレウテロビン(eleutherobin)；パンクラチスタチン；サルコジクチン(sarcodictyin)；スポンジスタチン；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチンなどのニトロソウレア類(nitrosureas)；クロドロネートなどのビスホスホネート類；抗生物質、例えばエンジイン系抗生物質（例えばカリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγＩＩ及びカリケアマイシンωＩＩ（例えば、Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)参照）及びアントラサイクリン類、例えばアナマイシン(annamycin)、ＡＤ３２、アルカルビシン、ダウノルビシン、デキストラゾキサン(dextrazoxane)、ＤＸ-５２-１、エピルビシン、ＧＰＸ-１００、イダルビシン、ＫＲＮ５５００、メノガリル、ダイネミシンＡを含むダイネミシン、エスペラマイシン、ネオカルチノスタチン発色団及び関連色素蛋白エンジイン抗生物質発光団、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン類(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin）、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、アドリアマイシン(登録商標)ドキソルビシン(モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシ���、２-ピロリノ-ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エソルビシン(esorubicin）、マルセロマイシン(marcellomycin）、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン類、ミコフェノール酸、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、及びゾルビシン(zorubicin)；デノプテリン(denopterin)、プテロプテリン(pteropterin)、及びトリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸アナログ；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、及びチオグアニンのようなプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、及びフロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジンアナログ；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、及びテストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、及びトリロスタンのような抗副腎剤；ホリニン酸(ロイコボリン)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；抗葉酸抗腫瘍剤、例えばＡＬＩＭＴＡ(登録商標)、ＬＹ２３１５１４ペメトレキセド、ジヒドロ葉酸レダクターゼインヒビター、例えばメトトレキセート、代謝拮抗物質、例えば５-フルオロウラシル（５-ＦＵ）及びそのプロドラッグ、例えばＵＦＴ、Ｓ-１及びカペシタビン、及びチミジル酸シンターゼインヒビター及びグリシンアミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼインヒビター、例えばラルチトレキセド(raltitrexed)(TOMUDEXRM、TDX)；ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼのインヒビター、例えばエニルウラシル(eniluracil)；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン(lonidainine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン類(ansamitocins)のようなメイタンシノイド類(maytansinoids)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダンモール(mopidanmol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン(losoxantron)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリジンＡ(roridin A)及びアングイジン(anguidine)）；ウレタン；ビンデシン（ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標)）；ダカルバジン；マンノムス��ン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド類及びタキサン類、例えばタキソール(登録商標)パクリタキセル（Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）、ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭパクリタキセルの無クレモホア(Cremophor)アルブミン操作ナノ粒子製剤（American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois）、及びタキソテール(登録商標）ドキセタキセル（Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；ゲンシタビン(gemcitabine)（GEMZAR(登録商標)）；６-チオグアニン；メルカプトプリン；プラチナ；シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナアナログ又はプラチナ系アナログ；ビンブラスチン（VELBAN(登録商標)）；エトポシド(ＶＰ-１６）；イフォスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ONCOVIN(登録商標)）；ビンカアルカロイド；ビノレルビン(NAVELBINE(登録商標))；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロネート(ibandronate)；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸のようなレチノイド類；上述したものの何れかの製薬的に許容可能な塩、酸又は誘導体；並びに上記のものの二以上の組合せ、例えばＣＨＯＰで、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの併用療法の省略形、及びＦＯＬＦＯＸで、５-ＦＵ及びロイコボリンと併用したオキサリプラチン（ELOXATINTM）での治療方法の省略形が含まれる。
【０１２６】
この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、例えばタモキシフェン(NOLVADEX(登録商標))、ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン（droloxifene）、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びFARESTON(登録商標)トレミフェンを含む抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節因子（ＳＥＲＭ）；例えば、４(５)-イミダゾール類、アミノグルテチミド、MEGASE(登録商標)メゲストール酢酸、AROMASIN(登録商標)エキセメスタン（exemestane）、フォルメスタン、ファドロゾール、RIVISOR(登録商標)ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ(登録商標)レトロゾール、及びARIMIDEX(登録商標)アナストロゾールなどの、副腎のエストロゲン産物を制御する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼインヒビター；及び抗アンドロゲン類、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びにトロキサシタビン（１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、Ｈ-Ｒａｓ、及び上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦ-Ｒ）；ワクチン、例えば遺伝子療法ワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン、及びVAXID(登録商標)ワクチン；PROLEUKIN(登録商標)ｒＩＬ-２；LURTOTECAN(登録商標)トポイソメラーゼ１インヒビター；ABARELIX(登録商標)ｒｍＲＨ；及び上記のものの製薬的に許容可能な塩、酸又は誘導体が含まれる。
【０１２７】
加えて、ｈｕ２Ｈ７抗体及びその機能的な断片は、抗腫瘍血管新生剤、例えば血管内皮性増殖因子(ＶＥＧＦ)アンタゴニストと組み合わせてＣＤ２０発現Ｂ細胞腫瘍(例えば、ＮＨＬ)を治療するために用いることができる。「抗血管形成剤」又は「血管形成インヒビター」は、小分子量物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、単離されたタンパク質、組換えタンパク質、抗体、又はそのコンジュゲートないしその融合タンパク質であって、血管新生、脈管形成又は望ましくない血管透過を直接又は間接的に阻害するものを指す。例えば、抗血管形成剤は、上記に定義した血管形成剤に対する抗体ないし他のアンタゴニスト、例えばＶＥＧＦに対する抗体、ＶＥＧＦレセプターに対する抗体、ＶＥＧＦレセプターシグナル伝達をブロックする小分子(例えばPTK787/ZK2284、SU6668)である。「ＶＥＧＦアンタゴニスト」は、一又は複数のＶＥＧＦレセプターへのＶＥＧＦの結合を含む、ＶＥＧＦ活性の中和、ブロック、阻害、抑制、低減又は妨げることができる分子を指す。一実施態様では、このようなＢ細胞腫瘍に罹患している患者はアバスチン(登録商標)(ベバシズマブ；Genentech)と組み合わせた２Ｈ７.ｖ511又は２Ｈ７.ｖ114で治療される。抗ＶＥＧＦ抗体である「ベバシズマブ(ＢＶ)」(「ｒｈｕＭＡｂ ＶＥＧＦ」又は「アバスチン(登録商標)」としても知られる)は、Presta 等 Cancer Res. 57: 4593-4599 (1997)に従って産生された組み換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である。
【０１２８】
ｈｕ２Ｈ７抗体及びその機能的な断片、具体的な実施態様では、２Ｈ７.ｖ５１１及び２Ｈ７.ｖ１１４はまた、ＴＲＡＩＬとも称されるＡｐｏ-２リガンド(Ａｐｏ２Ｌ)などの、サイトカインのＴＮＦファミリーのメンバーと組み合わせたＣＤ２０発現Ｂ細胞腫瘍の治療方法に有用である。完全長天然配列のヒトＡｐｏ-２のリガンドは、２８１アミノ酸長の、サイトカインの腫瘍壊死因子ファミリーのタイプＩＩ膜貫通型タンパク質である。Ａｐｏ-２リガンドの可溶性型、例えば細胞外ドメイン(ＥＣＤ)ないしはその一部を含んでなるものは、哺乳類の癌細胞のアポトーシスの活性を含む様々な活性を有することが明らかにされている。Apo2L/TRAIL(国際公開公報97/01633及び国際公開公報97/25428において開示される)は、ＥＣＤの断片である可溶性ヒトタンパク質であり、完全長Ａｐｏ-２Ｌタンパク質のアミノ酸１１４−２８１を含んでなる。
上述の自己免疫疾患又は自己免疫関連症状の治療では、患者を、例えば多剤治療法においては、免疫抑制剤のような第二の治療剤と併用して一又は複数のｈｕ２Ｈ７.ｖ５１１などのｈｕ２Ｈ７抗体で治療することができる。ｈｕ２Ｈ７抗体は、免疫抑制剤と同時に、連続して、又は交互に、あるいは他の治療での非反応性時に、投与することができる。免疫抑制剤は、当該分野で決められたものと同じか又は少ない用量で投与することができる。好適な補助免疫抑制剤は、治療される疾患のタイプ並びに患者の病歴を含む多くの因子に依存する。
【０１２９】
添加剤療法についてここで用いられる「免疫抑制剤」という用語は、患者の免疫系を抑制し又はマスクするように作用する物質を意味する。そのような薬剤には、サイトカイン産生を抑制し、自己抗原発現をダウンレギュレート又は抑制する、あるいはＭＨＣ抗原をマスクする物質が含まれる。そのような薬剤の例には、糖質コルチコステロイド類、例えばプレドニゾン、メチルプレドニゾン及びデキサメタゾン；２-アミノ-６-アリール-５-置換ピリミジン類（米国特許第４６６５０７７号参照）；アザチオプリン（又はアザチオプリンに対して副作用があるならばシクロホスファミド）；ブロモクリプチン；グルタルアルデヒド（米国特許第４１２０６４９号に記載されているように、ＭＨＣ抗原をマスクする）；ＭＨＣ抗原及びＭＨＣ断片に対する抗イディオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；抗インターフェロン-γ、-β又は-α抗体を含むサイトカイン又はサイトカインレセプターアンタゴニスト；抗腫瘍壊死因子-α抗体；抗腫瘍壊死因子-β抗体；抗インターロイキン-２抗体及び抗ＩＬ-２レセプター抗体；抗Ｌ３Ｔ４抗体；異種抗リンパ球グロブリン；Ｐａｎ-Ｔ抗体、好ましくは抗ＣＤ３又は抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；ＬＦＡ-３結合ドメインを持つ可溶型ペプチド（１９９０年７月２６日に公開の国際公開第９０／０８１８７号）；ストレプトキナーゼ；ＴＧＦ-β；ストレプトドルナーゼ；宿主からのＲＮＡ又はＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ-６１４４３；デオキシスペルグアリン(deoxyspergualin)；ラパマイシイン(rapamycin)；Ｔ細胞レセプター（米国特許第５１１４７２１号）；Ｔ細胞レセプター断片（Offner等, Science, 251:430-432 (1991)；国際公開第９０／１１２９４号；及び国際公開第９１／０１１３３号）；及びＴ１０Ｂ９等のＴ細胞レセプター抗体（欧州特許出願公開第３４０１０９号）を含む。
【０１３０】
関節リウマチの治療では、患者を、次の薬剤の任意の一又は複数と併用してＣＤ２０結合抗体（例えばリツキシマブ又はオクレリツマブ又はその変異体）で治療することができる：ＤＭＡＲＤＳ（疾患修飾性抗リウマチ薬（例えばメトトレキセート））、ＮＳＡＩ又はＮＳＡＩＤ（非ステロイド系抗炎症薬）、免疫抑制剤（例えばアザチオプリン；ミコフェノール酸モフェチル（CellCept(登録商標); Roche））、鎮痛薬、糖質コルチコステロイド、シクロホスファミド、ＨＵＭＲＩＡＴＭ（アダリムマブ；Abbott Laboratories）、ＡＲＡＶＡ(登録商標)（レフルノミド）、ＲＥＭＩＣＡＤＥ(登録商標)（インフリキシマブ；Centocor Inc., Malvern, Pa）、ＥＮＢＲＥＬ（エタネルセプト；Immunex, WA）、ＡＣＴＥＭＲＡ（トシリツマブ；Roche, Switzerland）、ＣＯＸ-２インヒビター。ＲＡに一般的に使用されるＤＭＡＲＤは、ヒドロキシクロロキン、サルファサラジン、メトトレキセート、レフルノミド、エタネルセプト、インフリキシマブ、アザチオプリン、Ｄ-ペニシルアミン、ゴールド（経口）、ゴールド（筋肉内）、ミノサイクリン、シクロスポリン、ブドウ球菌性プロテインＡ免疫吸着である。
【０１３１】
アダリムマブは、ＴＮＦαと結合するヒトモノクローナル抗体である。インフリキシマブは、ＴＮＦαと結合するキメラマウス-ヒトのモノクローナル抗体である。これは、ＲＡ及びクローン病を治療するために処方される免疫抑制剤である。インフリキシマブは、結核並びにＭＳとなる髄鞘脱落を含む感染及び心不全などの致命的な副作用と関係している。アクテムラ(トシリズマブ)は、ヒト化抗ヒトインターロイキン-６(ＩＬ-６)レセプターである。
エタネルセプトは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に結合されるヒトの７５ｋＤ(ｐ７５)腫瘍壊死因子レセプター(ＴＮＦＲ)の細胞外リガンド結合部分からなる「イムノアドヘシン」融合タンパク質である。エタネルセプト(ENBREL(登録商標))は、活動中のＲＡの治療のために米国で承認された注射剤である。エタネルセプトはＴＮＦαと結合して、関節及び血液からほとんどのＴＮＦαを取り除くように働くことによって、ＴＮＦαが関節リウマチの炎症及び他の症状を促進するのを防止する。この薬剤は、深刻な感染及び敗血症を含むネガティブな副作用である、多発性硬化症(ＭＳ)などの神経系疾患と関係している。例として、www.remicade-infliximab.com/pages/enbrel_embrel.htmlを参照のこと。
【０１３２】
ＲＡの一般的な治療については、例えば“Guidelines for the management of rheumatoid arthritis” Arthritis & Rheumatism 46(2): 328-346 (February, 2002)を参照。特定の実施態様では、ＲＡの患者はメトトレキセート(ＭＴＸ)と併用して本発明のｈｕ２Ｈ７ ＣＤ２０抗体で治療される。ＭＴＸの投薬量の例は、約７．５−２５ｍｇ／ｋｇ／週である。ＭＴＸは経口及び皮下的に投与することができる。
一例では、ＣＤ２０抗体の注入の３０分前に、メチルプレドニゾロン１００ｍｇ静注と、第２〜７日目にプレドニゾン６０ｍｇ経口、第８〜１４日目に３０ｍｇ経口、第１６日までに基礎用量に戻すことからなる副腎皮質ステロイド投薬計画と共に、併用ＭＴＸ(一経口投与(p.o.)又は一非経口投与につき１０〜２５ｍｇ／週)も患者に投与される。患者はまた、単回用量又は分割した一日量の何れかで、葉酸塩(５ｍｇ／週)が投与されうる。患者は、場合によって、治療期間の全体にわたって任意のバックグラウンド量の副腎皮質ステロイド(１０ｍｇ／日 プレドニゾン又は等量)が投与され続ける。
【０１３３】
強直性脊椎炎、乾癬性関節炎及びクローン病の治療では、患者を、例えばレミケード(Remicade)(登録商標)（インフリキシマブ；Centocor Inc., Malvern, Pa.)、エンブレル(ENBREL)(エタネルセプト；Immunex, WA)と併用して本発明のＣＤ２０結合抗体で治療される。
ＳＬＥの治療は、高用量コルチコステロイド及び／又はシクロホスファミド（ＨＤＣＣ）とのＣＤ２０抗体の併用を含む。ＳＬＥ、ＡＡＶ及びＮＭＯの患者は、次のコルチコステロイドの任意のものと併用して本発明のｈｕ２Ｈ７抗体で治療することができる：コルチコステロイド、ＮＳＡＩＤ、鎮痛薬、ＣＯＸ-２インヒビター、糖質コルチコステロイド、一般的なＤＭＡＲＤ（例えばメトトレキセート、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド）、生物学的ＤＭＡＲＤ、例えば抗Ｂｌｙｓ(例えばベリムマブ)、抗ＩＬ６Ｒ、例えばトシリツマブ；ＣＴＬＡ４-Ｉｇ（アバタセプト）、（抗ＣＤ２２、例えばエプラツズマブ）、免疫抑制剤（例えばアザチオプリン；ミコフェノール酸モフェチル（CellCept(登録商標); Roche））、及び細胞毒性剤（シクロホスファミド）。
【０１３４】
乾癬の治療では、患者には、局所治療剤、例えば局所ステロイド類、アントラリン、カルシポトリエン、クロベタゾール、及びタザロテンと併用して、あるいはメトトレキセート、レチノイド類、シクロスポリン、ＰＵＶＡ及びＵＶＢ療法と共に、ヒト化２Ｈ７抗体を投与することができる。一実施態様では、乾癬患者はシクロスポリンに連続して又はそれと同時にヒト化２Ｈ７抗体で治療される。
本発明のｈｕ２Ｈ７抗体、特にｈｕ２Ｈ７.ｖ５１１及びｈｕ２Ｈ７.ｖ１１４は、同時、連続又は選択的な投与計画のＢＡＦＦアンタゴニストと組み合わせて自己免疫性疾患又はＢ細胞腫瘍を治療するために有用である。ＢＡＦＦ及びＢＡＦＦアンタゴニストは前述に定義される。一実施態様では、ＢＡＦＦアンタゴニストは、ヒトＢＲ３を結合する抗体であり、この抗体は好ましくはヒト化抗体、ヒト抗体又はキメラ抗体である。他の実施態様では、ＢＡＦＦアンタゴニストはＢＲ３-Ｆｃ融合タンパク質である。Ｂ細胞を減少させる際のＢＡＦＦアンタゴニストと抗ＣＤ２０抗体の相乗効果は報告されている(例として、上掲の国際公開公報05/000351；Gong 等, (2005), J. Immunol. 174: 817-826を参照)。
毒性を最小にするために、伝統的な全身療法剤は、本投薬量のＣＤ２０結合抗体組成物と共により低用量の併用計画で、又は循環、連続、組合せ、又は間欠的な治療計画で投与することができる。
【０１３５】
医薬製剤
本発明に従って使用されるｈｕ２Ｈ７ ＣＤ２０結合抗体の治療用製剤は、所望の純度を有する抗体を、任意の薬剤的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤と混合して、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で貯蔵するために調製される(Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A.編(1980))。許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料（例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリン類を含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体）；及び／又はトゥイーン(TWEEN)TM、プルロニクス(PLURONICS)TM又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１３６】
例示的なｈｕ２Ｈ７抗体製剤は、出典明示によりここに援用される国際公開第９８／５６４１８号に記載されている。他の製剤は、２−８℃で２年間の最小限の貯蔵期間を持つｈｕ２Ｈ７抗体４０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍＭ酢酸塩、１５０ｍＭトレハロース、０．９％ベンジルアルコール、０．０２％ポリソルベート２０をｐＨ５．０で含む液体複数回用量製剤である。興味ある他の抗ＣＤ２０抗体製剤は、抗体１０ｍｇ／ｍＬ、９．０ｍｇ／ｍＬ塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍＬクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、及び注入用の滅菌水を含み、ｐＨ６．５のものである。更に、他の水性医薬製剤は、ｐＨ約４．８からｐＨ約５．５、好ましくはｐＨ５．５の１０−３０ｍＭ酢酸ナトリウム、界面活性剤として約０．０１−０．１％ｖ／ｖ量のポリソルベート、約２−１０％ｗ／ｖ量のトレハロース、及び保存剤としてベンジルアルコールを含む（米国特許第６１７１５８６号）。皮下投与に適合化させた凍結乾燥製剤は国際公開第９７／０４８０１号に記載されている。そのような凍結乾燥製剤は適当な希釈剤で高タンパク質濃度に再構成され得、また再構成製剤はここで治療される哺乳動物に皮下投与されうる。
【０１３７】
具体的な実施態様では、ヒト化２Ｈ７ ｖ１６の一静注用製剤は、３０ｍｇ／ｍｌの抗体を含む２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、４％ トレハロース二水和物、０．０２％ ポリソルベート２０(Tween20TM)、ｐＨ５．３である。この静注用製剤は、ＮＨＬなどの腫瘍学的な適応症、並びに関節リウマチのために投与されうる。ヒト化２Ｈ７.ｖ５１１変異体の一製剤は、１５〜３０ｍｇ／ｍｌの抗体、好ましくは２０ｍｇ／ｍｌの抗体を含む、１０ｍＭ 硫酸ヒスチジン、６０ｍｇ／ｍｌ スクロース(６％)、０．２ｍｇ／ｍｌ ポリソルベート２０(０．０２％)及び静注用滅菌水、ｐＨ５．８である。さらに他の実施態様では、静脈内投与のための、２Ｈ７変異体、特に２Ｈ７.ｖ５１１の製剤は、２０ｍｇ／ｍｌの２Ｈ７、２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、４％ トレハロース二水和物、０．０２％ ポリソルベート２０、ｐＨ５．５である。この製剤が、単回の静注のために使われうる。２Ｈ７.ｖ１１４の一製剤は、１５〜２５ｍｇ／ｍｌの抗体、好ましくは２０ｍｇ／ｍｌの抗体を含む、２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２４０ｍＭ(８％) トレハロース二水和物、０．０２％ ポリソルベート２０、ｐＨ５．３である。
【０１３８】
ここでの製剤は、治療される特定の効能に必要な一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものをまた含みうる。例えば、細胞障害性剤、化学療法剤、サイトカイン又は免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン又はＴ細胞に結合する抗体、例えばＬＦＡ-１に結合するもの等のＴ細胞に作用するもの）を更に提供することが望ましい場合がある。そのような他の薬剤の有効量は製剤中に存在する抗体の量、疾患又は疾病又は治療のタイプ、及び上で検討した他の因子に依存する。これらは一般に同じ用量でここに記載された投与経路又はこれまで用いられている用量の約１〜９９％量で用いられる。
また活性成分は、例えばコアセルべーション技術又は界面重合化により調製したマイクロカプセル、例えば、コロイド状のドラッグデリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョン中に、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセル中に封入されうる。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A.編 (1980)に開示されている。
【０１３９】
徐放製剤を調製することができる。徐放製剤の好適な例は、アンタゴニストを含む固形疎水性ポリマーの半透過性基質を含むものであり、該基質は、成形品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態である。徐放性基質の例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えばポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号), Ｌ-グルタミン酸及びＬ-グルタミン酸エチルの共重合体、非分解性のエチレンビニル酢酸塩、分解性の乳酸・グリコール酸共重合体、例えばLUPRON DEPOTＴＭ(乳酸・グリコール酸共重合体及びロイプロリド酢酸塩からなる注射可能なミクロスフィア)、及びポリＤ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸が含まれる。
インビボ投与に用いられる製剤は無菌でなければならない。これは滅菌濾過膜を通す濾過によって直ぐに達成できる。
【０１４０】
製造品及びキット
本発明の他の実施態様は、自己免疫性疾患及び関連症状及び非ホジキンリンパ腫などのＣＤ２０陽性癌の治療に有用な物質を含有する製造品である。この製造品は容器と容器に付与又は添付されるラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの多様な材料から形成されてよい。容器は、症状の治療に有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明のｈｕ２Ｈ７、例えばｈｕ２Ｈ７.ｖ５１１である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示す。ラベル又はパッケージ挿入物は、患者に抗体組成物を投与する際の注意書きをさらに含む。
パッケージ挿入物は、慣習的に治療用製品の市販パッケージに含まれる指示書を指し、効能、使用、用量、投与、禁忌及び／又はこのような治療用製品の使用に関する警告についての情報を含むものである。一実施態様では、パッケージ挿入物は、組成物が非ホジキンリンパ腫を治療するために用いられることを示す。
【０１４１】
製造品はさらに、製薬的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第２の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
種々の目的、例えばＢ細胞殺傷アッセイ、アポトーシスアッセイのポジティブコントロールとして、細胞からのＣＤ２０の精製又は免疫沈降に有用なキットも提供される。ＣＤ２０の単離及び精製において、キットはビーズ(例えばセファロースビーズ)に結合したｈｕ２Ｈ７.ｖ５１１抗体を含むことが可能である。インビトロにおけるＣＤ２０の検出及び定量化、例えばＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットのための抗体を含むキットを提供することもできる。製造品と同様、キットも容器と容器に付与又は添付されるラベル又は能書を含んでなる。容器には少なくとも１つの本発明の抗ＣＤ２０抗体を含有する組成物が収容されている。希釈液及びバッファー、コントロール抗体等を収容する付加的な容器を具備していてもよい。ラベル又はパッケージ挿入物(能書)は、組成物についての記載、並びに意図するインビトロ又は診断での使用に関する注意書きを提供するものである。
【実施例】
【０１４２】
材料
マウス：ヒトＣＤ２０(ｈＣＤ２０)＋マウスの作製は、ｈＣＤ２０遺伝子座を組み込んでいる細菌性人工染色体(ＢＡＣ)の使用によって行った。陽性ＢＡＣクローンを、ｈＣＤ２０を発現したトランスジェニック(Ｔｇ)樹立系統を作製するためにＦＶＢマウス由来の胚細胞にインジェクションした。Gong 等 (2005) J. Immunol. 174:817-826のｈＣＤ２０ Ｔｇ＋マウスの作製及び特徴づけの詳細な説明を参照のこと。その後、ＨＣＤ２０ Ｔｇ＋マウスを、ｈＣＤ１６Ｔｇ＋ｍＣＤ１６−／−と交配させて、ｈＣＤ２０Ｔｇ＋ｍＣＤ１６−／−ｈＣＤ１６Ｔｇ＋マウスを作製し、このマウスを後述の研究に用いた。
抗体：ＦＡＣＳ分析法で使用するすべての抗体は、BD PharMingenから購入した。
器材／ソフトウェア：ＦＡＣＳ分析は、FACScan又はFACSCalibur機と、Becton Dickinsonから購入したCellQuestソフトウェアを使用して行った。
【０１４３】
一般的な方法
単一細胞懸濁液の調製：５０μｇのマウス血液をＥＤＴＡ含有チューブを用いて眼窩から採取した後、ＡＣＫ溶解バッファ(Biosourceから購入)を用いて赤血球溶血を行った。それらを除去した後、マウスの脾臓を、凍結したガラススライドを用いて単一細胞懸濁液に細粒化した。次いで、細胞ペレットを洗浄し、再懸濁して、濾過した。５ｍｌの冷たいＰＢＳを用いて、各マウスの腹腔を洗浄した。洗浄体液を５ｍｌのシリンジに回収して遠心した。次いで、マウスの血液、脾臓及び腹膜からの白血球を洗浄して、計数した後にＦＡＣＳ分析のために染色した。
ＦＡＣＳ染色：１％のアルブミン(Sigma)を含む１００μｌのリン酸緩衝食塩水中で様々な細胞表面マーカー(ＦＡＣＳ分析の定義を参照)についておよそ１×１０６の細胞を染色した。氷上で３０分間インキュベーションした後、染色した細胞を洗浄して、再懸濁した後にＦＡＣＳ分析を行った。
ＦＡＣＳ分析：ＦＡＣＳ分析は、CellQuestソフトウェアとFACSCalibur又はFACScanを用いて行った。血液中のＢ細胞をCD21+CD23+と定義し、腹膜のＢ細胞をCD19+と定義し、脾臓のＢ細胞をB220+と定義した。ＭＺ(周辺帯)Ｂ細胞はCD21highCD23lowと定義し、ＦＯ(濾胞性)Ｂ細胞はCD21+CD23highと定義した。
統計学：データは、平均±標準誤差(ｎ＝５)として表した。統計学的分析は、両側の独立ｔ検定(two-tail unpaired T test)を用いて行った。
【０１４４】
実施例１
２Ｈ７抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体のヒト化
マウス抗ヒトＣＤ２０抗体の２Ｈ７（ここではマウスをｍとしてｍ２Ｈ７とも呼ぶ）のヒト化を一連の部位特異的突然変異誘発工程で実施した。マウス２Ｈ７抗体可変領域配列とマウスＶとヒトＣのキメラ２Ｈ７は開示されており、例えば米国特許第5,846,818号及び同第6,204,023号を参照のこと。２Ｈ７のＣＤＲ残基は、マウス２Ｈ７可変ドメインのアミノ酸配列（米国特許第5,846,818号に開示）を既知の抗体の配列と比較することにより同定された（Kabat等, Sequences of proteins of immunological interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。軽鎖と重鎖のＣＤＲ領域は配列高頻度可変性（上掲のKabat等）に基づいて定まり、図１Ａ及び図１Ｂにそれぞれ示す。合成オリゴヌクレオチド(表１)を用いて、部位特異的突然変異誘発(Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. 82:488-492 (1985))を使用して、プラスミドｐＶＸ４に含まれるコンセンサス配列ＶｋI,ＶＨIII(ＶＬカッパサブグループI，ＶＨサブグループIII)に対応する完全ヒトＦａｂフレームワーク中に６つ全てのマウス２Ｈ７ＣＤＲ領域を導入した（出典明記により本明細書中に組み込まれるＰＣＴ出願である、国際公開公報04/056342の図２を参照）。
【０１４５】
ファージミドｐＶＸ４を突然変異誘発並びに大腸菌中でのＦ(ａｂ)の発現に使用した。ｐＢ０４７５の誘導体（Cunningham等, Science 243: 1330-1336 (1989)）であるファージミドｐｂ０７２０に基づいて、ｐＶＸ４は、ヒト化コンセンサスκ-サブグループI軽鎖（ＶＬκI-ＣＬ）とヒト化コンセンサスIII重鎖（ＶＨIII-ＣＨ１）抗ＩＦＮ-α（インターフェロンα）抗体をコードするＤＮＡ断片を含む。ｐＶＸ４はまた共に別の過去に開示されたｐＵＣ１１９ベースのプラスミドｐＡＫ２（Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992)）から誘導されたアルカリホスファターゼプロモーター及びシャイン-ダルガーノ配列を有している。独特のＳｐｅｌ制限部位をＦ(ａｂ)軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡ間に導入した。抗ＩＦＮ-α重鎖及び軽鎖双方の最初の２３のアミノ酸はＳｔII分泌シグナル配列である（Chang等, Gene 55: 189-196 (1987)）。  
２Ｈ７のＣＤＲスワップバージョン(２Ｈ７.ｖ２)を構築するために、部位特異的突然変異誘発をｐＶＸ４のデオキシウリジン含有鋳型で実施した；抗ＩＦＮ-αの６つ全てのＣＤＲがマウス２Ｈ７ＣＤＲに変化した。得られた分子をヒト化２Ｈ７バージョン（２Ｈ７.ｖ２）又は２Ｈ７の「ＣＤＲスワップバージョン」と呼ぶ；これは図１Ａ及び１Ｂに示されるコンセンサスヒトＦＲ残基を有するｍ２Ｈ７ＣＤＲ残基を有する。ヒト化２Ｈ７.ｖ２は更なるヒト化に用いた。
【０１４６】
表３はＨ及びＬ鎖においてマウス２Ｈ７（ｍ２Ｈ７）ＣＤＲのそれぞれを作製するために用いたオリゴヌクレオチド配列を示す。例えば、ＣＤＲ-Ｈ１オリゴヌクレオチドを使用してｍ２Ｈ７のＨ鎖を再作製した。ＣＤＲ-Ｈ１、ＣＤＲ-Ｈ２及びＣＤＲ-Ｈ３はＨ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をそれぞれ意味する；同様に、ＣＤＲ-Ｌ１、ＣＤＲ-Ｌ２及びＣＤＲ-Ｌ３はＬ鎖ＣＤＲのそれぞれを意味する。ＣＤＲ-Ｈ２における置換はＣＤＲ-Ｈ２ＡとＣＤＲ-Ｈ２Ｂの二つのオリゴヌクレオチドを用いる二工程で行った。
表３．ｐＶＸ４のヒトフレームワーク中へのマウス２Ｈ７ＣＤＲのＣＤＲスワップの構築に使用したオリゴヌクレオチド配列。
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【０１４７】
ヒト化コンストラクトとの比較のために、キメラ２Ｈ７Ｆａｂ（マウスＶＬ及びＶＨドメイン、及びヒトＣＬ及びＣＨ１ドメインを含む）を発現するプラスミドを、２Ｈ７.ｖ２中にマウスフレームワーク残基を導入するために合成オリゴヌクレオチドを使用して部位特異的突然変異誘発（上掲のKunkel）によって構築した。２Ｈ７.ｖ６.８として知られているキメラＦａｂを発現させるための得られたプラスミドコンストラクトの配列を国際公開公報04/056342の図３に示す。Ｆａｂの各コード鎖は上にｐＶＸ４について記載された２３のアミノ酸のＳｔII分泌シグナル配列を有している。
ヒトＶｋI,ＶＨIIIコンセンサスフレームワーク（図１Ａ及び１Ｂ）及び過去のヒト化抗体（Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289 (1992)）とのマウス２Ｈ７フレームワーク残基の配列比較に基づいて、幾つかのフレームワーク変異を部位特異的突然変異誘発によって２Ｈ７.ｖ２Ｆａｂコンストラクト中に導入した。これらの変異により、ＣＤＲコンフォメーション又は抗原接触に影響を及ぼすかも知れない部位において、あるヒトコンセンサスフレームワーク残基がマウス２Ｈ７フレームワークに見出されたものに変化した。バージョン３はＶＨ（Ｒ７１Ｖ，Ｎ７３Ｋ）を、バージョン４はＶＨ（Ｒ７１Ｖ）を、バージョン５はＶＨ（Ｒ７１Ｖ，Ｎ７３Ｋ）及びＶＬ（Ｌ４６Ｐ）を、バージョン６はＶＨ（Ｒ７１Ｖ，Ｎ７３Ｋ）及びＶＬ（Ｌ４６Ｐ，Ｌ４７Ｗ）を含んでいた。
【０１４８】
ｍ２Ｈ７抗体のヒト化及びキメラＦａｂ型を次のようにして大腸菌中で発現させ、精製した。二本鎖及び一本鎖ＤＮＡの調製のためにプラスミドを大腸菌株ＸＬ-１ブルー（Stratagene, San Diego, CA）中に形質転換した。各変異体に対して、軽鎖と重鎖の双方をジデオキシヌクレオチド法（SEQUENASE(登録商標)標識プライマーサイクル配列決定法、Sequenase, U.S. Biochemical Corp.）を使用して完全に配列決定した。プラスミドを、ＭＭ２９４の誘導体である大腸菌株１６Ｃ９に形質転換し、５μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢプレート上に蒔き、単一のコロニーをタンパク質発現のために選択した。その単一のコロニーを３７℃で５−８時間、５ｍｌのＬＢ-１００μｇ／ｍｌカルベニシリン中で成長させた。５ｍｌの培養物を５００ｍｌのＡＰ５-１００μｇ／ｍｌカルベニシリンに添加して、３７℃で４Ｌの邪魔板振盪フラスコ中で１６時間成長させた。ＡＰ５培地は１．５ｇのグルコース、１１．０のHycase SF、０．６ｇの酵母エキス（保証付き）、０．１９ｇの無水ＭｇＳＯ４、１．０７ｇのＮＨ４Ｃｌ、３．７３ｇのＫＣｌ、１．２ｇのＮａＣｌ、１２０ｍｌの１Ｍトリエタノールアミン、ｐＨ７．４からなり、１Ｌの水に加えた後、０．１μｍのSealkeenフィルターを通して滅菌濾過した。
【０１４９】
細胞を、３０００×ｇにて１Lの遠心分離瓶（Nalgene）で遠心分離によって収集し、上清を除去した。１時間の凍結後、ペレットを２５ｍｌの非放射性１０ｍＭ ＭＥＳ-１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ５．０（バッファーＡ）中に再懸濁させた。２５０μｌの０．１Ｍ フッ化フェニルメチルスルホニル(ＰＭＳＦ)(Sigma)を添加してタンパク質分解を阻止し、３．５ｍｌの原液１０ｍｇ／ｍｌのニワトリの卵の白色リゾチーム(Sigma)を添加して細菌細胞壁の溶解を補助した。氷上で１時間、穏やかに振盪した後、試料を４００００×ｇで１５分、遠心分離した。上清をバッファーＡを用いて５０ｍｌにし、バッファーＡで平衡にした２ｍｌのＤＥＡＥカラムに充填した。ついで、バッファーＡで平衡にしたプロテインＧセファロースＣＬ-４Ｂ(Pharmacia)カラム（０．５ｍｌ床容積）に流通させた。カラムを１０ｍｌのバッファーＡで洗浄し、１．２５ｍｌの１Ｍトリス、ｐＨ８．０に入れた３ｍｌの０．３Ｍグリシン、ｐＨ３．０で溶出させた。ついで、Ｆ(ａｂ)をセントリコン-３０(Amicon)を使用してリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)中にバッファー交換し、０．５ｍｌの最終容積まで濃縮した。全てのＦ(ａｂ)のＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルを実施して純度を確保し、各変異体の分子量をエレクトロスプレー質量分析法によって証明した。
【０１５０】
細胞ベースのＥＬＩＳＡ結合アッセイ（以下に記載）においては、キメラ２Ｈ７Ｆａｂを含むＦａｂのＣＤ２０への結合は検出が難しかった。従って、２Ｈ７Ｆａｂバージョンをアッセイと更なる突然変異誘発のために完全長ＩｇＧ１抗体として再形態化した。
完全長ＩｇＧの発現のためのプラスミドは、キメラ２Ｈ７（ｖ６.８）ＦａｂのＶＬ及びＶＨドメイン並びにヒト化Ｆａｂバージョンないし６を、哺乳動物細胞の発現のための過去に記載されたｐＲＫベクター（Gorman等, DNA Prot. Eng. Tech. 2:3-10 (1990)）中にサブクローニングすることによって構築した。簡単に述べると、各ＦａｂコンストラクトをＥｃｏＲＶ及びＢｌｐＩを用いて消化させてＶＬ断片を切除し、これを、完全な軽鎖（ＶＬ-ＣＬドメイン）の発現のためにプラスミドｐＤＲ１（国際公開公報04/056312の図４）のＥｃｏＲＶ／ＢｌｐＩ部位にクローニングした。また、各ＦａｂコンストラクトをＰｖｕＩＩ及びＡｐａＩで消化させてＶＨ断片を切除し、これを、完全な重鎖（ＶＨ-ＣＨ１-ヒンジ-ＣＨ２-ＣＨ３ドメイン）の発現のためにプラスミドｐＤＲ２（国際公開公報04/056312の図５）のＰｖｕＩＩ／ＡｐａＩ部位中にクローニングした。各ＩｇＧ変異体に対して、軽鎖発現プラスミドと重鎖発現プラスミドをアデノウイルス形質転換ヒト胎児腎臓細胞株２９３（Graham等, J. Gen. Virol., 36:59-74, (1977)）中に同時形質移入することによって、一過性トランスフェクションを実施した。簡単に述べると、２９３細胞をトランスフェクションの前の日に分裂させ、血清含有培地に蒔いた。次の日に、リン酸カルシウム沈殿物として調製した二本鎖ＤＮＡと、続いてpAdVAntageTMDNA（Promega, Madison, WI）を添加し、細胞を３７℃で一晩インキュベートした。細胞を無血清培地で培養し４日後に収集した。抗体を、プロテインＡ-セファロースＣＬ-４Ｂを使用して培養上清から精製した後、バッファーを１０ｍＭコハク酸ナトリウム、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に交換し、Centricon-10(Amicon)を使用して濃縮した。タンパク質濃度は定量アミノ酸分析法によって決定した。
【０１５１】
ＣＤ２０抗原に対する相対的結合親和性を測定するために、細胞ベースのＥＬＩＳＡアッセイ法を開発した。ヒトＢリンパ芽球腫ＷＩＬ２-Ｓ細胞（ATCC CRL 8885, American Type Culture Collection, Rockville, MD）を、加湿した５％ＣＯ２インキュベーターにおいて、２ｍＭのＬ-グルタミン、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２及び１０％の熱不活化仔ウシ血清を補填したＲＰＭＩ１６４０中で成長させた。細胞を、１％胎仔ウシ血清(ＦＢＳ)含有ＦＢＳ（アッセイバッファー）で洗浄し、９６ウェルの丸底プレート（Nunc, Roskilde, Denmark）中で２５０−３０００００細胞／ウェルにて播種した。アッセイバッファー中、２倍の連続希釈標準（１５．６−１０００ｎｇ／ｍｌの２Ｈ７ｖ６.８キメラＩｇＧ）と３倍の連続希釈試料（２．７−２０００ｎｇ／ｍｌ）をプレートに添加した。プレートを氷中に埋設し、４５分間、インキュベートした。未結合抗体を除くために、ウェルに０．１ｍＬのアッセイバッファーを添加した。プレートを遠心分離し、上清を除去した。細胞を０．２ｍＬのアッセイバッファーでもう２回洗浄した。プレートに結合した抗体を、ペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）をプレートに添加することによって検出した。４５分のインキュベーション後、細胞を前に記載したようにして洗浄した。ＴＭＢ基質（３,３',５,５'-テトラメチルベンジジン；Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD）をプレートに添加した。１Ｍのリン酸を加えて反応を停止させた。滴定曲線を４変数非線形回帰曲線フィッティングプログラム（KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA）を用いてフィッティングさせた。滴定曲線の中点の吸光度（中央-ＯＤ）とその対応する標準濃度を決定した。ついで、この中央-ＯＤでの各変異体の濃度を決定し、標準の濃度を各変異体の濃度で割った。よって、値は、標準に対する各変異体の結合比である。相対親和性の標準偏差（等価濃度）は一般に実験値の＋／−１０％であった。
【０１５２】
表４に示されるように、ＣＤＲ-スワップ変異体（ｖ.２）のＣＤ２０結合はキメラ２Ｈ７（ｖ.６.８）と比較すると極めて低減していた。しかしながら、バージョン３ないし６は改善された結合性を示した。キメラ２Ｈ７のものに対する結合親和性を回復させるのに必要とされるかも知れない変異の最小数を決定するために、更なる変異及び変異の組み合わせを部位特異的突然変異誘発によって構築して、表５に示される変異体７から１７を産生した。特に、これらはＶＨ変異Ａ４９Ｇ、Ｆ６７Ａ、Ｉ６９Ｌ、Ｎ７３Ｋ、及びＬ７８Ａ；及びＶＬ変異Ｍ４Ｌ、Ｍ３３Ｉ、及びＦ７１Ｙを含んでいた。バージョン１６及び１７は、キメラバージョンの２倍内の、最良の相対的結合親和性を示し、２者間に有意差はなかった（標準偏差＝＋／−１０％）。よって、変異の数を最小にするために、マウスフレームワーク残基に対してヒトフレームワーク残基の４の変異のみを有するバージョン１６（表５）を、更なる特徴付けのためのヒト化型として選択した。
【０１５３】
表４．細胞ベースＥＬＩＳＡを使用してキメラ２Ｈ７と比較したＣＤ２０に対するヒト化２Ｈ７ＩｇＧ変異体の相対的結合親和性。相対的結合性は、等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対するキメラ２Ｈ７の濃度として表す；よって、比＜１は変異体に対する弱い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して＋／−１０％であった。可変ドメインのフレームワーク置換はＫａｂａｔ（上掲のKabat等）の番号付けに従ったＣＤＲ-スワップバージョンに対するものである。
2008529499.tif 000009
【０１５４】
表５．ヒト化２Ｈ７バージョン１６（２Ｈ７.ｖ１６）における変異ＶＨ（Ａ４９Ｇ、Ｒ７１Ｖ、Ｎ７３Ｋ）及びＶＬ（Ｌ４６Ｐ）の構築に使用したオリゴヌクレオチド配列。下線のコドンは示されたアミノ酸置換をコードする。ＶＨ（Ｒ７１Ｖ、Ｎ７３Ｋ）及びＶＬ（Ｌ４６Ｐ）に対して、オリゴは、Ｆａｂ鋳型での突然変異誘発に使用されたので、センス鎖として示される一方、ＶＨ（Ａ４９Ｇ）に対して、オリゴは、ｐＲＫ（ＩｇＧ重鎖）鋳型と共に使用されたので、アンチセンス鎖として示される。バージョン１６のタンパク質配列を上記の組成物の項目に示す。
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【０１５５】
実施例２
２Ｈ７ＣＤＲ領域内の更なる変異
Ａｌａスキャニングによって重要であると同定されたＣＤＲ位置での更なる残基の置換及び置換の組み合わせをまた試験した。幾つかの組み合わせた変異体、特にｖ.９６はｖ.１６よりもより強固に結合したようであった。
【０１５６】
表６．細胞ベースＥＬＩＳＡ（ＷＩＬ-２Ｓ細胞）を使用して測定したヒト化２Ｈ７.ｖ１６のＣＤＲ領域における変異と非アラニン置換の組み合わせの効果。ＣＤ２０に対する相対結合性は、等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対する２Ｈ７.ｖ１６親の濃度として表す；よって、比＜１は変異体に対する弱い親和性を示す；比＞１は変異体に対する高い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して＋／−１０％であった。可変ドメインのフレームワーク置換はＫａｂａｔ（上掲のKabat等）の番号付けに従った２Ｈ７.ｖ１６に対するものである。
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【０１５７】
実施例３
亢進したエフェクター機能を持つヒト化２Ｈ７変異体
２Ｈ７は補体依存性細胞障害性(ＣＤＣ)と抗体依存性細胞障害性(ＡＤＣＣ)の双方を介してＢ細胞の溶解を媒介しうるので、改善されたＣＤＣ及びＡＤＣＣ活性を持つヒト化２Ｈ７.ｖ１６の変異体の作製を試みた。補体成分Ｃ１ｑへの向上した結合性を介してＣＤＣを改善するために、他の抗体のＦｃ領域内でのある種の残基の変異は記載されている（Idusogie等, J. Immunol. 166:2571-2575 (2001)）。活性化ＦｃγレセプターへのＩｇＧ結合性の向上と阻害性ＦｃγレセプターへのＩｇＧ結合性の向上によってＡＤＣＣを改善するための変異もまた記載されている（Shields等, J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001); Presta等, Biochem. Soc. Trans. 30:487-490 (2002)）。特に、記載されているようにして（上掲のIdusogie等 (2001)；上掲のShields等）３の変異がＣＤＣ及びＡＤＣＣ活性の改善のために同定されている：Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ（ここでは、三重Ａｌａ変異又は変異体とも呼ぶ；Ｆｃ領域の番号付けはＥＵ番号付け法による；上掲のKabat等）。
【０１５８】
２Ｈ７のＣＤＣ及びＡＤＣＣ活性を向上させるために、２Ｈ７Ｆｃの三重Ａｌａ変異体を構築した。抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５のヒト化変異体は、変異Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａで産生されており、４Ｄ５Ｆｃ１１０として知られている（つまり、抗ｐ１８５ＨＥＲ２ＩｇＧ１（Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ）；上掲のShields等）。プラスミドである抗体４Ｄ５Ｆｃ１１０をコードするｐ４Ｄ５Ｆｃ１１０（上掲のShields等）をＡｐａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化させ、Ｆｃ断片（変異Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａを含む）を２Ｈ７重鎖ベクターｐＤＲ２-ｖ１６のＡｐａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に結合させ、ｐＤＲ２-ｖ３１を産生した。バージョン３１の完全Ｈ鎖のアミノ酸配列は上記の組成物の項目に示す。Ｌ鎖はｖ１６のものと同じである。
ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域の定常ドメインは与えられた種内にかなり保存されているが、対立遺伝子変異が存在している（Lefranc及びLefranc, The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function, and regulation, pp. 43-78, F. Shakib編, Pergammon Press, Oxford (1990)に概説）。
【０１５９】
表７．ＣＤ２０結合性に対するＦｃ領域中の置換の効果。ＣＤ２０への相対結合性は、フレームワーク置換の細胞ベース（ＷＩＬ２-Ｓ）アッセイで測定した。Ｆｃ変異（*）はＥＵ番号付け法（上掲のKabat）により、２Ｈ７.ｖ１６親に対するものである。ｖ.３１のＦｃ領域の３つのＡｌａ変化の組み合わせは「Ｆｃ１１０」と記載される。ＩｇＧ変異体は２Ｈ７.ｖ１６バックグラウンドに対する変異で示される。相対結合性は等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対する２Ｈ７.ｖ６.８キメラの濃度として表す；よって、比＜１は変異体に対する弱い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して＋／−１０％であった。
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【０１６０】
実施例４
向上した安定性を持つヒト化２Ｈ７変異体
治療用タンパク質としての開発のためには、好適な製剤バッファー中で、酸化、脱アミド化、又は生成物の品質に影響を及ぼしうる他のプロセスに対して安定なままである変異体を選択することが望ましい。２Ｈ７.ｖ１６では、幾つかの残基が不安定性の原因として同定された：ＶＬ（Ｍ３２）及びＶＨ（Ｍ３４、Ｎ１００）。従って、ｖ１６との比較でこれらの部位に変異を導入した。
【０１６１】
表８．細胞ベース（ＷＩＬ２-Ｓ）アッセイにおけるＣＤ２０に対する、安定性及び／又はエフェクター機能の向上のために設計された２Ｈ７変異体の相対結合性。ＩｇＧ変異体は２Ｈ７.ｖ１６バックグラウンドに対する変異で示される。相対結合性は等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対する２Ｈ７.ｖ６.８キメラの濃度として表す；よって、比＜１は変異体に対する弱い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して＋／−１０％であった。可変ドメインにおけるフレームワーク置換はＫａｂａｔの番号付けに従った２Ｈ７.ｖ１６に対するものであり、Ｆｃ変異（*）はＥＵ番号付けによって示される（上掲のKabat等）。（**）標準コンパレーターとして２Ｈ７.ｖ１６で測定された変異体；相対的な結合値はキメラの値に対して正規化してある。
更なるＦｃ変異が過去に報告された変異（Idusogie等 (2000)；Idusogie等 (2001)；Shields等 (2001)）に基づいてエフェクター機能を改変又は亢進するために安定性又は親和性亢進変異と組み合わせた。前述のようにこれらの変異にはＳ２９８、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａが含まれ；ＣＤＣ活性の低減のためのＫ３２２Ａ；ＡＤＣＣ活性の低減のためのＤ２６５Ａ；ＣＤＣ活性の亢進のためのＫ３２６Ａ又はＫ３２６Ｗ；及びＦｃ領域内のアロタイプ変異の効果の試験のためのＥ３５６Ｄ／Ｍ３５８Ｌが含まれる。これらの変異の何れもＣＤ２０結合親和性に有意な差異を生じなかった。
【０１６２】
2008529499.tif 000014
（**）コンパレーターとして２Ｈ７.ｖ１６で測定された変異体；
相対的な結合値はキメラの値に対して正規化してある。
【０１６３】
タンパク質の分解速度に対する安定性変異の効果を試験するために、２Ｈ７.ｖ１６と２Ｈ７.ｖ７３を１０ｍＭのヒスチジン、６％のスクロース、０．０２％のポリソルベート２０、ｐＨ５．８中１２−１４ｍｇ／ｍＬで処方し、４０℃で１６日間インキュベートした。ついで、インキュベートした試料につき、イオン交換クロマトグラフィーによって荷電変異体における変化を、サイズ排除クロマトグラフィーによって凝集と断片化を、細胞ベース（ＷＩＬ２-Ｓ）アッセイでの試験によって相対結合性をアッセイした。
結果は、加速された安定性条件下でのイオン交換クロマトグラフィーによる主ピークのフラクションの喪失について、２Ｈ７.ｖ７３が２Ｈ７.ｖ１６と比較して大なる安定性を有していることを示した。凝集、断片化又は結合親和性については有意差は見られなかった。
【０１６４】
実施例５
補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイ
２Ｈ７ＩｇＧ変異体について、本質的に開示されている（Idusogie等, J. Immunol. 164:4178-4184 (2000)；Idusogie等, J. Immunol. 166:2571-2575 (2001)）ＣＤ２０発現リンパ芽球腫Ｂ細胞株のＷＩＬ２-Ｓ細胞の補体依存性溶解を媒介するその能力をアッセイした。抗体を０．１ｍｇ／ｍＬ原液から１：３で連続希釈した。各希釈物の０．０５ｍＬのアリコートを、０．０５ｍＬの正常なヒト補体溶液（Quidel, San Diego, CA）を含んだ９６ウェル組織培養プレートに加えた。この混合物に、０．０５ｍＬ容積で５００００ＷＩＬ２-Ｓ細胞を加えた。３７℃で２時間のインキュベーション後、０．０５ｍＬのアラマーブルー（Accumed International, Westlake, OH）の溶液を加え、３７℃で更に１８時間、インキュベーションを継続した。ついで、カバーをプレートから除去し、それを軌道振盪器で室温にて１５分振盪した。相対蛍光単位（ＲＦＵ）を５３０ｎｍ励起フィルター及び５９０ｎｍ発光フィルターを使用して読み取った。KaLeidaGraphソフトウェアを使用して各抗体に対して濃度の関数としてＲＦＵをフィッティングさせることによってＥＣ５０を計算した。
結果（表９）は、ヒト化２Ｈ７抗体によるＣＤＣの驚くべき改善を示しており、ｖ.７３に対してはリツキサン(登録商標)と同様の相対作用強度で、ｖ.７５に対してはリツキサン(登録商標)より３倍強く、ｖ.１６に対してはリツキサン(登録商標)より３倍弱い。
【０１６５】
表９．リツキサンと比較した２Ｈ７抗体のＣＤＣ活性。＞１の数はリツキサン(登録商標)より弱いＣＤＣ活性を示しており、＜１の数はリツキサン(登録商標)より強い活性を示している。抗体は、（*）によって示したものが一過性に産生された以外は、安定なＣＨＯ株から産生された。
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【０１６６】
実施例６
抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ
２Ｈ７ＩｇＧ変異体について、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）読み取りを使用して、本質的に開示されている（Shields等, J.  Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001)）ＣＤ２０発現リンパ芽球腫Ｂ細胞株のＷＩＬ２-Ｓ細胞のナチュラルキラー細胞(ＮＫ細胞)溶解を媒介するその能力をアッセイした。ＮＫ細胞を、ＣＤ１６としても知られている（Koene等, Blood 90:1109-1114 (1997)）ＦｃγＲＩＩＩに対してアイソタイプであった正常なヒトドナーから得られた１００ｍＬのＰＢＳ(リン酸緩衝生理食塩水)で希釈した１００ｍＬのヘパリン処理血液から調製した。この実験では、ＮＫ細胞はＣＤ１６（Ｆ１５８／Ｖ１５８）に対してヘテロ接合性のヒトドナーからのものであった。希釈した血液を１５ｍＬのリンパ球分離培地（ICN Biochemical, Aurora, Ohio）上に層状にし２０００ＲＰＭで２０分間、遠心分離した。層間界面の白血球を４本の清浄な５０ｍＬチューブに分配し、それに１５％の胎仔ウシ血清を含むＲＰＭＩ培地を満たした。チューブを１４００ＲＰＭで５分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットをＭＡＣＳバッファー（０．５％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁させ、ビーズ（ＮＫ細胞単離キット，１３０-０４６-５０２）を製造者のプロトコール（Miltenyi Biotech）に従って使用してＮＫ細胞を精製した。ＮＫ細胞をＭＡＣＳバッファーで２×１０６細胞／ｍＬまで希釈した。
アッセイ培地（グリシンなしのＦ１２／ＤＭＥＭ５０：５０、１ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．２、ペニシリン／ストレプトマイシン（１００単位／ｍＬ；Ｇｉｂｃｏ）、グルタミン、及び１％熱不活化仔ウシ血清）中の抗体の連続希釈物（０．０５ｍＬ）を、９６ウェルの丸底組織培養プレートに加えた。ＷＩＬ２-Ｓ細胞をアッセイバッファーで４ｘ１０５／ｍＬの濃度まで希釈した。ＷＩＬ２-Ｓ細胞（ウェル当たり０．０５ｍＬ）を９６ウェルプレート中で希釈抗体と混合し、室温で３０分間、インキュベートしてＣＤ２０への抗体の結合を可能にした（オプソニン作用）。
【０１６７】
各ウェルに０．１ｍＬのＮＫ細胞を添加してＡＤＣＣ反応を開始させた。コントロールウェルでは、２％のTRITONＸ-１００アルキルアリルポリエーテルアルコールを添加した。ついで、プレートを３７℃で４時間インキュベートした。放出されたＬＤＨのレベルを、細胞傷害性（ＬＤＨ）検出キット（キット番号1644793, Roche Diagnostics, Indianapolis, Indiana）を製造者のプロトコールに従って使用して測定した。０．１ｍＬのＬＤＨ展開液を各ウェルに加えた後、１０秒間混合した。ついで、プレートをアルミフォイルで覆い、室温で１５分暗室でインキュベートした。ついで、４９０ｎｍでの光学密度を読み取り、コントロールウェル中で測定した全ＬＤＨで割ることによって溶解％を計算するために使用した。溶解を抗体濃度の関数としてプロットし、４変数曲線フィッティング（KaLeidaGraph）を用いてＥＣ５０濃度を決定した。
結果は、ヒト化２Ｈ７抗体がＡＤＣＣに活性があり、ｖ.３１に対してはリツキサン(登録商標)の２０倍強い相対作用強度で、ｖ.１６に対してはリツキサン(登録商標)より５倍強く、ｖ.７３に対してはリツキサン(登録商標)よりほぼ４倍強い。
【０１６８】
表１０．ｎ回の実験に基づいて２Ｈ７.ｖ１６と比較したＷＩＬ２-Ｓ細胞に対する２Ｈ７抗体のＡＤＣＣ活性。（＞１の値は２Ｈ７.ｖ１６より低い作用強度を示し、＜１の値はより大なる強度を示す。）
2008529499.tif 000016
更なるＡＤＣＣアッセイを実施してリツキサン(登録商標)と２Ｈ７の組み合わせ変異体を比較した。これらのアッセイの結果は、２Ｈ７.ｖ１１４及び２Ｈ７.ｖ１１５がリツキサン(登録商標)と比較して＞１０倍の改善されたＡＤＣＣ作用強度を有することを示している（表１１）。
【０１６９】
表１１．ｎ回の実験に基づいてリツキサン(登録商標)と比較したＷＩＬ２-Ｓ細胞に対する２Ｈ７抗体のＡＤＣＣ活性（＞１の値はリツキサン(登録商標)より低い作用強度を示し、＜１の値はより大なる強度を示す）。
2008529499.tif 000017
【０１７０】
実施例７
ＦｃＲｎ結合についてのアッセイ
Ｆｃ内にアミノ酸変異(例えばN434W、N434Y、N434F、N434A、N434H、N434A+E380A+T307A)を有する可溶性Ｆｃ変異体を発現させ、精製して、それらのヒト、カニクイザル、ラットおよびマウスのＦｃＲｎに対する親和性をBIAcore結合アッセイにて分析した。また、Ｆｃ変異体をサイズ排除クロマトグラフィによって分析して、それらの凝集傾向を決定した。
変異体Ｆｃ断片は、突然変異体ｐＷ０４３７ファジミドにて３４Ｂ８大腸菌細胞を形質転換して、無リン酸培地中で３０℃で２４時間生育してＦｃ遺伝子の発現を誘発し、細胞を回収した。細胞ペーストを終夜凍結して、１０ｍＭ トリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ中での浸透圧ショックによって、溶解した。溶解物を遠心によって、クリアにし、プロテインＡカラムに流した。カラムをＰＢＳにて洗浄して、可溶性ＦｃをプロテインＡクエン酸溶出バッファ(０．１Ｍ クエン酸塩、ｐＨ３．０)にて溶出して、トリスｐＨ７．５にて中和した。可溶性ＦｃをAmicon Centriprepにて濃縮した。
【０１７１】
ヒト、カニクイザル、ラット又はマウスのＦｃＲｎを、密度を変えて(１００−３０００のＲＵ)、Biacore CM5チップ上にＮＨＳ化学法によって固定した。Ｆｃ変異体はｐＨ６．０のＰＢＳにて１０μＭから１ｎＭまで段階的に希釈し、結合を時間とともにモニターした。親の無ヒンジＦｃ(すなわち野生型)では、ｈｕＦｃＲｎに対する結合はほぼすぐに平衡状態に達した。これは、とても速い会合係数と解離係数を有することを示し、平衡状態分析によって、測定するとおよそ７００ｎＭのＫｄであった。Ｎ４３４Ｗ変異体では、会合係数は有意に遅く、解離係数は非常に遅い。より遅い流量で長時間Ｎ４３４Ｗを注入することによって、平衡状態の分析が可能であり、Ｋｄはおよそ４ｎＭであった。変異体Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４Ｆ、Ｎ４３４Ａおよび３突然変異体Ｎ４３４Ａ＋Ｅ３８０Ａ＋Ｔ３０７Ａは、ｐＨ６．０において、野生型Ｆｃに対してそれぞれ１７０倍以下、９倍以下、２．７倍以下および１４倍以下の親和性の増加を示した。対照的に、ｐＨ７．４においては、ｈｕＦｃＲｎに対するＮ４３４変異体の親和性は、このアッセイで測定されないほど有意に低かった。野生型と比較してＮ４３４ＷはカニクイザルＦｃＲｎへの結合を有意に改善せず、ラットＦｃＲｎへの結合についてはおよそ１０倍改善されるだけで、マウスＦｃＲｎへの結合についてはＷＴと実質的に同じであることが示された。したがって、この突然変異による改善は、ヒトＦｃＲｎに特異的なものである。
【０１７２】
２Ｈ７.ｖ１３８のヒトＩｇＧ１変異体は、ビオチン化ＦｃＲｎを用いたＥＬＩＳＡにおいてヒトＦｃＲｎに対するｐＨ依存性の結合について分析した。MaxiSorp９６ウェルマイクロウェルプレート(Nunc, Roskilde, Denmark)は、２μｇ／ｍｌのＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ (Pierce, Rockford, IL)を含む５０ｍＭ 炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６、１００μｌ／ウェルにて４℃で終夜おいてコートした。プレートを、０．０５％ポリソルベートを含有するＰＢＳ(洗浄バッファ)、ｐＨ７．４にて洗浄し、１５０μｌ／ウェルの、０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４にてブロックした。室温で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄バッファ、ｐＨ７．４にて洗浄した。ヒトＦｃＲｎは、ビオチン-Ｘ-ＮＨＳ (Research Organics, Cleveland, OH)を使用してビオチン化した。ビオチン化ＦｃＲｎは、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０を含有するＰＢＳ(試料バッファ)、ｐＨ７．４に２μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェルの量で、プレートに添加した。プレートを１時間インキュベートして、洗浄バッファｐＨ６．０にて洗浄した。７つのＩｇＧ抗体の二倍段階希釈液(３．１−２００ｎｇ／ｍｌ)を含む試料バッファ、ｐＨ６．０をプレートに添加した。２時間インキュベートした後、プレートを、洗浄バッファ、ｐＨ６．０にて洗浄した。結合したＩｇＧは、ペルオキシダーゼ標識ヤギＦ(ａｂ')２抗ヒトＩｇＧ Ｆ(ａｂ')２(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)を試料バッファ、ｐＨ６．０中に１００μｌ／ウェルで添加することによって検出した。１時間インキュベートした後、プレートを洗浄バッファ、ｐＨ６．０にて洗浄し、次いで基質３,３',５,５'テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ) (Kirkegaard & Perry Laboratories)を１００μｌ／ウェルで添加した。１００μｌ／ウェルの１Ｍ リン酸を加えることによって反応を止めた。multiskanAscent読み取り器(Thermo Labsystems, Helsinki, Finland)にて４５０ｎｍの吸光度を読み取った。標準曲線の中間点(中間ＯＤ)の吸光度を算出した。この中間ＯＤの標準物質及び試料の対応する濃度は、４-パラメータ非線形回帰曲線フィッティングプログラム(KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA)を用いた滴定曲線から決定した。標準物質の中間ＯＤ濃度を試料の中間ＯＤ濃度で割って相対的な活性を算出した。
【０１７３】
ｐＨ６．０又はｐＨ７．４での結合ＩｇＧのＦｃＲｎからの解離を評価するために、同様にアッセイを行った。ただし、試料のインキュベーション工程の後とプレートを洗浄する場合にはｐＨ６．０又はｐＨ７．４の試料バッファを１００μｌ／ウェルで添加した。プレートを４５分間インキュベートして洗浄した。ついで、上記のようにアッセイを続けた。
【０１７４】
実施例８
ＦｃＲｎ突然変異を有するヒト化抗ＣＤ２０  ＩｇＧ１変異体の特徴づけ
また、ヒトＦｃのファージディスプレイによって特定される突然変異を、完全な抗体である２Ｈ７.ｖ１３８のバックグラウンドにおけるその変異の効果について試験した。２Ｈ７.ｖ１３８は、Ｆｃが以下の突然変異：Ｓ２９８Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａによる亢進したＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性のために修飾されているヒト化抗ＣＤ２０抗体である。位置Ｎ４３４の突然変異をこのバックグラウンドに導入し、ＩｇＧ(表１２)は前述のように２９３細胞の一過性形質移入によって調製した。いずれの場合においても、精製されたＩｇＧ変異体は、上記の通りにサイズ排除クロマトグラフィによって低レベルのタンパク質凝集であることが示された。
表１２  ヒト化抗ＣＤ２０抗体２Ｈ７.ｖ１３８の変異体
2008529499.tif 000018
【０１７５】
２Ｈ７.ｖ１３８のヒトＩｇＧ１変異体は、ビオチン化ＦｃＲｎを用いたＥＬＩＳＡにおいてヒトＦｃＲｎに対するｐＨ依存性の結合について分析した。MaxiSorp９６ウェルマイクロウェルプレート(Nunc, Roskilde, Denmark)は、２μｇ／ｍｌのＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ (Pierce, Rockford, IL)を含む５０ｍＭ 炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６、１００μｌ／ウェルにて４℃で終夜おいてコートした。プレートを、０．０５％ポリソルベートを含有するＰＢＳ(洗浄バッファ)、ｐＨ７．４にて洗浄し、１５０μｌ／ウェルの、０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４にてブロックした。室温で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄バッファ、ｐＨ７．４にて洗浄した。ヒトＦｃＲｎは、ビオチン-Ｘ-ＮＨＳ (Research Organics, Cleveland, OH)を使用してビオチン化した。ビオチン化ＦｃＲｎは、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０を含有するＰＢＳ(試料バッファ)、ｐＨ７．４に２μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェルの量で、プレートに添加した。プレートを１時間インキュベートして、洗浄バッファｐＨ６．０にて洗浄した。７つのＩｇＧ抗体の二倍段階希釈液(３．１−２００ｎｇ／ｍｌ)を含む試料バッファ、ｐＨ６．０をプレートに添加した。２時間インキュベートした後、プレートを、洗浄バッファ、ｐＨ６．０にて洗浄した。結合したＩｇＧは、ペルオキシダーゼ標識ヤギＦ(ａｂ')２抗ヒトＩｇＧ Ｆ(ａｂ')２(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)を試料バッファ、ｐＨ６．０中に１００μｌ／ウェルで添加することによって検出した。１時間インキュベートした後、プレートを洗浄バッファ、ｐＨ６．０にて洗浄し、次いで基質３,３',５,５'テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ) (Kirkegaard & Perry Laboratories)を１００μｌ／ウェルで添加した。１００μｌ／ウェルの１Ｍ リン酸を加えることによって反応を止めた。multiskanAscent読み取り器(Thermo Labsystems, Helsinki, Finland)にて４５０ｎｍの吸光度を読み取った。標準曲線の中間点(中間ＯＤ)の吸光度を算出した。この中間ＯＤの標準物質及び試料の対応する濃度は、４-パラメータ非線形回帰曲線フィッティングプログラム(KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA)を用いた滴定曲線から決定した。標準物質の中間ＯＤ濃度を試料の中間ＯＤ濃度で割って相対的な活性を算出した。
【０１７６】
ｐＨ６．０又はｐＨ７．４での結合ＩｇＧのＦｃＲｎからの解離を評価するために、同様にアッセイを行った。ただし、試料のインキュベーション工程の後とプレートを洗浄する場合にはｐＨ６．０又はｐＨ７．４の試料バッファを１００μｌ／ウェルで添加した。プレートを４５分間インキュベートして洗浄した。ついで、上記のようにアッセイを続けた。
結果は、Ｆｃ変異体で観察されたものと類似の相対的な結合能を示す。ｐＨ６．０での相対的な結合親和性はｖ４７７＞ｖ４７８＝ｖ４７９＞ｖ３６４＞ｖ１３８である。ｐＨ７．４での相対的な結合親和性は、ｐＨ６．０での同じ相対的な結合親和性より一貫して弱い：ｖ４７７＞ｖ４７８＝ｖ４７９＞ｖ３６４＞ｖ１３８。
これらのＦｃ突然変異は、概してヒトＩｇＧ抗体に適用できる。
【０１７７】
実施例９
カニクイザルでのパイロット研究における２Ｈ７変異体のインビボ効果
ＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクションによって産生した２Ｈ７変異体を、そのインビボ活性を評価するために、正常な雄カニクイザル（Macaca fascicularis）で試験した。Ｃ２Ｂ８（リツキサン(登録商標)）のような他の抗ＣＤ２０抗体では、正常な霊長類においてＢ細胞を枯渇させる能力が実証されている（Reff等, Blood 83: 435-445 (1994)）。
一研究では、ヒト化２Ｈ７変異体を比較した。並行した研究では、リツキサン(登録商標)をまたカニクイザルにおいて試験した。４匹のサルを５種の用量グループのそれぞれにおいて使用した：（１）ビヒクル、（２）０．０５ｍｇ／ｋｇ ｈｕ２Ｈ７.ｖ１６、（３）１０ｍｇ／ｋｇ ｈｕ２Ｈ７.ｖ１６、（４）０．０５ｍｇ／ｋｇ ｈｕ２Ｈ７．ｖ３１、及び（５）１０ｍｇ／ｋｇ ｈｕ２Ｈ７．ｖ３１。抗体は、全体で２用量について０、０．２、又は２０ｍｇ／ｍＬの濃度で、研究の１日目に一用量、８日目に他の用量、静脈内投与した。投薬の最初の日を１日目とし、その前の日を−１日目と標記する；回復の最初の日（各グループの２匹について）を１１日目と標記する。血液サンプルを−１９、−１２、１（投薬前）日目、及び最初の投薬後６時間目、２４時間目、及び７２時間目に集めた。更なるサンプルを８日目（投薬前）、１０日目（２匹／グループの屠殺前）、及び３６日目及び６７日目（回復した動物について）に採取した。
【０１７８】
末梢Ｂ細胞濃度を、ＣＤ３−／ＣＤ４０＋細胞をカウントするＦＡＣＳ法によって決定した。サルサンプル中における全リンパ球のＣＤ３−ＣＤ４０＋Ｂ細胞の割合を、次のゲーティング方策によって得た。前方散乱／側方散乱散乱図上にリンパ球集団をマークして領域１（Ｒ１）を決めた。Ｒ１での事象を使用して、ＣＤ４０及びＣＤ３マーカーに対して蛍光強度ドットプロットを表示した。蛍光的に標識したアイソタイプコントロールを用いて、ＣＤ４０及びＣＤ３陽性の各カットオフ点を決定した。
結果は、２Ｈ７.ｖ１６と２Ｈ７.ｖ３１の双方が１０ｍｇ／ｋｇ用量で完全な末梢Ｂ細胞枯渇を、また０．０５ｍｇ／ｋｇ用量で部分的な末梢Ｂ細胞枯渇を生じさせることができたことを示している。投薬の最初の７２時間の間に測定されたＢ細胞枯渇の時間経過と程度は二つの抗体について同様であった。回復動物の続く分析は、２Ｈ７．ｖ３１で処置した動物が２Ｈ７.ｖ１６を投薬したものと比較してＢ細胞の長い枯渇を示したことを示している。特に、１０ｍｇ／ｋｇの２Ｈ７.ｖ１６で処置した回復動物は１０日目と３６日目の採取の間のある時に実質的なＢ細胞回復を示した。しかしながら、１０ｍｇ／ｋｇの２Ｈ７．ｖ３１で処置した回復動物では、３６日目と６７日目の間のある時にならないとＢ細胞は回復を示さなかった。これは、２Ｈ７.ｖ１６と比較して２ｈ７．Ｖ３１の場合に約１か月完全な枯渇の期間が長くなることを示唆している。
【０１７９】
低用量又は高用量でのサルの試験では毒性は観察されず、全体的な症状は正常であった。他の試験では、ｖ１６はこれらのサルで２週間あけて２用量を静脈内投与した後（１００ｍｇ／ｋｇ×２＝１２００ｍｇ／ｍ２×２）の最も高い用量まで耐容性が良好であった。
２Ｈ７.ｖ１６対リツキサン(登録商標)を用いたカニクイザルでのデータは、ＣＤＣ活性の５倍の減少が作用強度には悪影響を及ぼさないことを示唆している。強力なＡＤＣＣ活性を持つが減少したＣＤＣ活性の抗体は、大なるＣＤＣ活性を持つものよりも最初の注入反応に対して好ましい安全性プロファイルを有しうる。
【０１８０】
実施例１０
腫瘍成長のインビボでの抑制
ＲａｊｉヒトＢ細胞のリンパ腫細胞株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ８６）の成長を阻害するｒｈｕＭＡｂ２Ｈ７.ｖ１６の能力をＢａｌｂ／ｃヌード（胸腺欠損）マウスで評価した。Ｒａｊｉ細胞はＣＤ２０を発現し、ヌードマウスに成長し、転移性疾患を生じると報告されている；腫瘍成長はリツキサン(登録商標)によって阻害される（Clynes等, Nature Medicine 6, 443-446 (2000)）。５６匹の８−１０週齢のＢａｌｂ／ｃヌードマウスを、各グループが８匹のマウスからなる７グループ（Ａ−Ｇ）に分けた。０日目に、各マウスに側部に５×１０６のＲａｊｉＢリンパ腫細胞の皮下注射をした。０日目に始まって、各マウスに、１００ｕＬのネガティブコントロール液（ＰＢＳ；リン酸緩衝生理食塩水）、リツキサン(登録商標)又は２Ｈ７.ｖ１６の何れかを投与した。投薬量は体重に依存し、薬剤送達は尾静脈を経る静脈内であった。グループＡのマウスにはＰＢＳを投与した。グループＢ−Ｄにはリツキサン(登録商標)を、それぞれ５．０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、及び０．０５ｍｇ／ｋｇ投与した。グループＥ−Ｇのマウスには、２Ｈ７ｖ．１６をそれぞれ５．０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、及び０．０５ｍｇ／ｋｇ投与した。注射は６週間の間、毎週繰り返した。処置の間、毎週の間隔で、各マウスにつき、注射部位での明白な腫瘍の存在を検査し、存在した場合には腫瘍体積を測定し記録した。最終検査は８週目に行った（処置なしの２週の間隔後）。
この研究の結果は、ｒｈｕＭＡｂ２Ｈ７.ｖ１６とリツキサン(登録商標)の両方がヌードマウスにおける皮下Ｒａｊｉ細胞腫瘍成長の阻害に効果的であったことを示している。腫瘍成長は４週目に始まりＰＢＳコントロールグループで観察された。しかしながら、８週の試験の間、５ｍｇ／ｋｇ又は０．５ｍｇ／ｋｇのリツキサン(登録商標)又は２Ｈ７.ｖ１６で処置したグループでは、腫瘍は観察されなかった。０．０５ｍｇ／ｋｇの低用量処置グループでは、２Ｈ７グループ中の一匹の動物と、リツキサン(登録商標)グループ中の一匹の動物に、腫瘍が観察された。
【０１８１】
実施例１１
中程度から重篤な関節リウマチにおけるｒｈｕＭＡｂ２Ｈ７（２Ｈ７.ｖ１６）の第Ｉ／ＩＩ相治験
目的
この研究の主要な目的は中程度から重篤な関節リウマチの患者におけるｒｈｕＭＡｂ２Ｈ７の増大静脈内（ＩＶ）用量の安全性と耐容性を評価することにある。
【０１８２】
研究計画
これは、中程度から重篤のＲＡ患者におけるＭＴＸと併用してのｒｈｕＭＡｂ２Ｈ７(ＰＲＯ７０７６９)の増大用量の安全性に関する無作為プラセボ対照、多施設、盲式第Ｉ／ＩＩ期の研究者及び患者盲式治験とした。治験は、用量増大相と多数の患者の登録を伴う第二相からなる。治験依頼人は治療割り当てについて非盲検とする。
現在はＭＴＸでの治療には満足できない臨床応答を示す１から５の疾患改変抗リウマチ剤又は生物薬剤で失敗した中程度から重篤のＲＡ患者が登録される。
患者は治験への参加の前に少なくとも１２週の間、毎週１０−２５ｍｇの範囲でＭＴＸを受け、試験薬（ＰＲＯ７０７６９又はプラセボ）の最初の用量を受ける前に少なくとも４週の間、安定した投薬を受けていることが必要であった。患者はまた安定用量の経口コルチコステロイド（毎日１０ｍｇまで又はプレドニゾン等価物）と安定用量の非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を受けていてもよい。患者は次の用量増大計画に従って１日目と１５日目に標示用量でＰＲＯ７０７６９又はプラセボ等価物の２回の静脈内注入を受けた。
【０１８３】
用量増大は、特定の基準に従って、かつ内部の安全性データ審査委員会による安全性データの審査と各コホートで治療された最後の患者への第二の注入の７２時間後の急性毒性の評価の後に行った。用量レベルが用量増大相の間、耐容性があると証明された場合には、用量増大相後に、４０名の更なる患者（３２名は活性及び８名はプラセボ）を、次の用量レベル：２×５０ｍｇ、２×２００ｍｇ、２×５００ｍｇ、及び２×１０００ｍｇのそれぞれに無作為化する。およそ２０５名の患者を研究に登録する。
Ｂ細胞数を得て、記録する。６ヶ月の効果評価を越えて４８週の追跡試験期間にフローサイトメトリーを使用して、Ｂ細胞数を評価する。Ｂ細胞枯渇は用量制限毒性（ＤＬＣ）とは考えられず、むしろＰＲＯ７０７６９処置の期待される薬物動態学的結果である。
一サブ治験では、血清及びＲＮＡ分析のための血液、並びに尿サンプルを様々な時点で患者から得た。これらのサンプルを用いて、中程度から重篤のＲＡの患者におけるＰＲＯ７０７６９処置への応答の予測となりうる生物マーカーを同定することができる。
【０１８４】
研究治療
患者のコホートは次の増大計画に従って１日目と１５日目に標示用量でＰＲＯ７０７６９又はプラセボの２回の静脈内注入を受ける。
−  １０ｍｇのＰＲＯ７０７６９又はプラセボ等価物：薬剤活性な４患者、１コントロール
−  ５０ｍｇのＰＲＯ７０７６９又はプラセボ等価物：薬剤活性な８患者、２コントロール
−  ２００ｍｇのＰＲＯ７０７６９又はプラセボ等価物：薬剤活性な８患者、２コントロール
−  ５００ｍｇのＰＲＯ７０７６９又はプラセボ等価物：薬剤活性な８患者、２コントロール
−  １０００ｍｇのＰＲＯ７０７６９又はプラセボ等価物：薬剤活性な８患者、２コントロール
効果
ＰＲＯ７０７６９の効果はＡＣＲ応答によって測定される。ＡＣＲ２０、ＡＣＲ５０、及びＡＣＲ７０応答を達成する被験者の割合は治療グループ毎にまとめられ、各グループに９５％の信頼区間が生じる。これらの応答の成分とベースラインからのその変化を、治療と往診によってまとめる。
【０１８５】
実施例１２
２Ｈ７.ｖ16の結晶構造の検査とアラニンスキャニングデータから、Ｎ１００(ＶＨ)と隣接する残基を含むＣＤＲ-Ｈ３の領域が抗原結合に関与しうることが明らかとなった。したがって、我々は、２Ｈ７.ｖ１６バックグラウンドに多くのアミノ酸置換を作る、Ｎ１００(ＶＨ)に注目した。その結果(表１３)から、Ｔｙｒ又はＴｒｐの何れかの置換がｖ１６と相対的に結合を向上させることが示された。
【０１８６】
表１３  形質移入した２９３細胞で産生されたＩｇＧ変異体による細胞ベースの(ＷＩＬ２-Ｓ)アッセイにおいて測定される、ＣＤ２０への結合親和性を向上するように設定した２Ｈ７変異体の相対的な結合。２Ｈ７.ｖ１６バックグラウンドに関して突然変異(カバット番号付け)を有するＩｇＧ変異体を示す。相対的な結合は、同等の結合に必要とされる変異体の濃度に対する２Ｈ７.ｖ１６の濃度として表される；したがって、比率＞１は、バージョン１６と比較してＣＤ２０に対する変異体の向上した結合親和性を示す。
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【０１８７】
更なる親和性改善がＳ１００ａ(ＶＨ)の置換によって得られうるかどうかを決定するために、２Ｈ７.ｖ４７２(表１３)のバックグラウンドの場合に、この位置に多くの突然変異を作製した。細胞ベースの結合比較の結果(表１４)から、２Ｈ７.ｖ５１１が細胞上のＣＤ２０に対して３倍より大きく結合が向上したことが示された。
２Ｈ７.ｖ５１１重鎖の遺伝子は、鋳型として２Ｈ７.ｖ１３８の重鎖をコードするプラスミドのｓｓＤＮＡとＣＡ１５６８として設定された５'リン酸化デオキシオリゴヌクレオチド：5'-CCA GAC GTC GAA GTA CCA GTA GCG GTA GCT ATA GTA TAC GAC GCG-3' (配列番号45)を用いた部位特異的突然変異により構築した。下線を付したヌクレオチドは、ＣＤＲ-Ｈ３変異Ｎ１００Ｙ、Ｓ１００ａＲをコードする、アンチセンスＤＮＡ鎖のコドンに対応する。２Ｈ７.ｖ５１１の軽鎖は２Ｈ７.ｖ１３８の軽鎖と同一であり、同じプラスミドを軽鎖の発現に用いた。
ｖ１３８及びｖ５１１などのＨｕ２Ｈ７変異体は、２Ｈ７.ｖ１６の発現に用いた図９に示すベクターを用いてＣＨＯ細胞において発現することができる。
【０１８８】
表１４  形質移入した２９３細胞で産生されたＩｇＧ変異体による細胞ベースの(ＷＩＬ２-Ｓ)アッセイにおいて測定される、ＣＤ２０への結合親和性を向上するように設定した２Ｈ７変異体の相対的な結合。２Ｈ７.ｖ１６バックグラウンドと比較してＣＤＲ部位に突然変異(カバット番号付け)を有するＩｇＧ変異体を示す。加えて、２Ｈ７.ｖ１６と比較すると、すべての変異体は、Ｆｃ変異Ｓ２９８Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｅ３３３Ａ及びＫ３３４Ａ(ＥＵ番号付け)を含有する。相対的な結合は、同等の結合に必要とされる変異体の濃度に対する２Ｈ７.ｖ１６の濃度として表される；したがって、比率＞１は、バージョン１６と比較してＣＤ２０に対する変異体の向上した結合親和性を示す。
2008529499.tif 000020
これらの変異体もＦｃ変異を含んだので、我々はさらに、見かけの平衡解離定数(Ｋｄ)を決定するために競合的スキャッチャードアッセイにおいて結合を測定した。
【０１８９】
平衡解離定数(Ｋｄ)は、放射性標識した抗体２Ｈ７.ｖ５１１及び２Ｈ７.ｖ１３８ ＩｇＧを用いたＷＩＬ２ｓ-Ｓ細胞への、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体結合を決定した。抗ＣＤ２０モノクローナル抗体はＣＨＯ細胞において生産された。すべての希釈は、結合アッセイバッファ(０．５％ウシ血清アルブミン、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．２及び０．０１％アジ化ナトリウムを含有するＤＭＥＭ培地)で行った。０．１ｎＭの濃度の125Ｉ-２Ｈ７.ｖ５１１及び125Ｉ-２Ｈ７.ｖ１３８(ラクトペルオキシダーゼによってヨード化される)の一定量(０．０５ｍＬ)を、Ｖ底９６ウェルマイクロアッセイプレートのウェルに分配した。非標識抗体の階段希釈物(０．０５ｍＬ)を添加し、混合した。０．０５ｍＬの容量の３０，０００個のＷＩＬ２-Ｓ細胞を各ウェルに加えた。プレートを密封して、室温で２４時間インキュベートして、２，５００回転数／分で１５分間遠心分離した。次いで、上清を吸引して、細胞ペレットを洗浄して、遠心分離した。上清を再度吸引して、ペレットを１Ｎ ＮａＯＨに溶解して、γ計数のためにチューブに移した。データは、プログラムLigand(McPherson, Comput. Programs Biomed. 17: 107-114 (1983))を用いたスキャッチャード分析(Munson and Rodbard, Anal. Biochem. 107:220-239 (1980))に用いた。下記の表１５に示される結果から、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体２Ｈ７.ｖ５１１及び２Ｈ７.ｖ１３８がＷＩＬ２-Ｓ細胞に発現されるＣＤ２０に高い親和性で結合すること、及び２Ｈ７.ｖ５１１が２Ｈ７.ｖ１６より２．２倍から７．３倍高い親和性で結合することが示された。標識した125Ｉ-２Ｈ７.ｖ５１１及び125Ｉ-２Ｈ７.ｖ１３８によって得られた値の相違は、２Ｈ７.ｖ５１１のＣＤＲ-Ｈ３の新規なＴｙｒのヨウ素化から生じる抗原結合の混乱を反映しうる。したがって、125Ｉ-２Ｈ７.ｖ１３８の結果はより正確に相対的な結合親和性を反映するようである。
【０１９０】
表１５  スキャッチャード分析からの抗ＣＤ２０ヒト化モノクローナル抗体の平衡結合親和性(±フィットの標準誤差)
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２Ｈ７変異体の結合活性の更なる比較として、可溶化したＣＤ２０を用いたＥＬＩＳＡを行った。比較のために、他の変異体２Ｈ７.ｖ５８８を、２Ｈ７.ｖ１６と同一のＣＤＲ領域及び２Ｈ７.ｖ５１１と同一のＦｃ領域によって構築した。
【０１９１】
NUNC MaxisorpTMプレートを、２．５μｇ／ｍｌの可溶性ＣＤ２０(Genentech；前述したように調製する)を含むＰＢＳにて４℃で終夜コートした後、０．５％のＢＳＡにて室温で１時間置いてブロックした。０．５％のＢＳＡにての試料の階段希釈物を、プレート上で２時間インキュベートした。洗浄後、結合した抗体は、基質として3,3',5,5'テトラメチルベンジジン(Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)を用いてＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＦａｂ抗体(ヤギ抗ヒトＩｇ、Ｆａｂ’２-ＨＲＰコンジュゲート、NBより)により検出した。吸光度は、４５０ｎｍで読み取った。滴定曲線は、４-パラメータ非線形回帰曲線フィッティングプログラムによりフィットした(KaleidaGraph;Synergy Software, Reading, PA)。標準物質の滴定曲線の中間吸光度に対応する抗体変異体の濃度を算出した。その結果(図３)から、２Ｈ７.ｖ５８８及び２Ｈ７.ｖ１６に対して同様な結合親和性が示された；しかしながら、２Ｈ７.ｖ５１１は、このアッセイにおいて可溶性ＣＤ２０への結合がおよそ９０倍亢進したようであった。
【０１９２】
実施例１３
ＡＤＣＣ活性
ＡＤＣＣ活性は、図４のアッセイではおよそ４のエフェクター：標的比のＷＩＬ２-Ｓ細胞と正常ヒトドナーから精製したＮＫ細胞、図１１のアッセイでは５：１の比のＷＩＬ２-Ｓ細胞とＮＫ細胞を用いて、前述したように評価した。図４と図１１に示す結果から、２Ｈ７.ｖ１６及び他の２Ｈ７変異体と比較して、２Ｈ７.ｖ５１１に対する最大の活性と増加したＡＤＣＣ効力が示された。２Ｈ７.ｖ５８８は２Ｈ７.ｖ５１１と同様の効力及び最大の活性を示したことから(図４)、更なるＣＤ２０の親和性改善がＡＤＣＣ活性を有意に亢進しないことが示唆された。
【０１９３】
実施例１４
ＣＤＣ活性
また、ＣＤＣ活性は、ＷＩＬ２-Ｓ細胞及びヒト補体を用いて上記の通りに評価した。図５に示される結果から、２Ｈ７.ｖ５８８と比較して２Ｈ７.ｖ５１１についてＣＤＣ効力の増加と、２Ｈ７.ｖ１６と比較して大いに増加したＣＤＣ効力が示された。先に述べた変異体に観察されるように、亢進したＣＤ２０親和性によりインビトロのＣＤＣ活性が亢進されるようであった。２Ｈ７.ｖ５１１を他の２Ｈ７変異体と比較した異なるＣＤＣアッセイにおいて、図１０に示すように、ｖ５１１もまた、ｖ３１、ｖ４８８及びｖ１１４よりも増加したＣＤＣ活性を表した。以下の修飾と、基本的には上記のように、９６マイクロウェルプレート形式にて図１０のＣＤＣアッセイを行った。５０μｌの段階希釈した２Ｈ７.ｖ５１１(３００〜１０００ｎＭで開始)(及び、実施例１５の図１２に要約した実験のリツキサン)を、５０μｌの正常Ｂ細胞(１×１０６／ｍｌ、１ウェルにつき５０，０００細胞)又は５０μlのＷＩＬ２-Ｓ細胞(３０，０００)と、５０μｌの１：４に希釈した正常ヒト血清補体(Quidel)とともにインキュベートした。正常Ｂ細胞は、ネガティブ選択(Rosettesep, StemCell Technologies)及びフィコール-Paque Plus (Amersham Biosciences)勾配分離を用いて、ヘパリンを加えた全血液から単離した。３７℃で２時間インキュベーションした後、５０μＬのアラマーブルー(Biosource International)を加えて３７℃でさらに１８時間インキュベートした。プレートを１５分間一時的に振とうして、蛍光プレート読み取り機(Ｅｘｔ. ５３５、Ｅｍｔ ５９５）にて読取って、相対的な蛍光単位(ＲＦＵ)を決定した。観察されたＲＦＵ値は、KaleidaGraphのｍＡｂの濃度と比較してプロットし、曲線を４パラメータフィットを用いて描いた。
【０１９４】
実施例１５
インビボでのＢ細胞枯渇
２Ｈ７.ｖ５１１のインビボ活性を、Ｂ細胞枯渇のトランスジェニックマウスモデルにおいて２Ｈ７.ｖ１６の活性と比較した。トランスジェニックマウス(hCD20 Tg+/+ mCD16-/- hCD16 Tg+/-)、ｎ＝５／グループは、１マウスにつき１２５μｇ又は１２．５μｇ(５及び０．５ｍｇ／ｋｇ等量)の抗体を静脈内投与した。図６、７、１３及び１４の各々のｈＩｇＧ１(白線)は、アイソタイプコントロール抗体である。２日目に、血液及び選択された組織区画のＢ細胞の数を、ＦＡＣＳ分析によって計数した。この結果(図６)から、２Ｈ７.ｖ５１１が、低用量及び高用量で、血液及び腹腔のＢ細胞を２Ｈ７.ｖ１６より効果的に減少することが示された。脾臓において(図７)、２Ｈ７.ｖ５１１は低用量でわずか〜有意に大きな枯渇を示したが、この相違は高用量では見られなかった。図８は、実験の概略図を示しており、ｖ１６及びｖ５１１間のＣＤ２０結合及びＦｃ機能のレベルを要約する。
また、２Ｈ７.ｖ５１１ Ｂ細胞枯渇を、マウスモデルにおけるリツキシマブ(リツキサン(登録商標))と比較した；実験は図１２に概説する。図１３に示すように、２Ｈ７.ｖ５１１は、低用量及び高用量で、血液及び腹腔のＢ細胞をリツキシマブより大きく枯渇した。図１４は脾臓のＢ細胞枯渇を示す。０．５ｍｇ／ｋｇ(図では１２．５μｇ)の低用量では、総量及び濾胞性脾臓のＢ細胞枯渇は、リツキシマブによるものよりもｖ５１１によってより効果があった；しかしながら、ｖ５１１は、周辺帯Ｂ細胞枯渇の媒介の際にはリツキシマブと同じかわずかに低い効果を示した。
また、上の実施例９に基本的には記述されるように、２Ｈ７.ｖ５１１のインビボ効果をカニクイザルにおいて調べる。
【０１９５】
実施例１６
腫瘍増殖のインビボ抑制
ＲａｊｉヒトＢ細胞であるリンパ腫細胞株(ＡＴＣＣ ＣＣＬ８６)の増殖を阻害する２Ｈ７.ｖ５１１の能力を、上の実施例１０に記載の手順に従って、Ｂａｌｂ／ｃヌード(胸腺欠損)マウスにおいて評価した。
【０１９６】
実施例１７
薬物動態に影響するＦｃＲｎ結合のインビボ研究
インビボでのＦｃ変異形抗体の薬物動態に対する亢進したＦｃＲｎ結合の効果を決定するために、カニクイザル(Macaca fascicularis)又は他の霊長類種に、各々の抗体変異体を静脈注射し、時間の経過につれて血液試料を回収して抗体のクリアランスをモニタした。複数の動物に一又は複数の用量レベルで注射する。一実験では、１−２０ｍｇ／ｋｇの単回静注用量を０時点とする第１日目に注射した。投与前及び投与後の６時間後、２４時間後及び７２時間後に各動物から血液(血清)試料を採取した。さらに、第８日目、第１０日目、第３０日目及び第６０日目に試料を採取した。血清試料中の抗体の濃度はＥＬＩＳＡを用いて決定した。血清中の抗体濃度の時間依存性の減少は、標準的な薬学技術(ShargelおよびYu, Applied Pharmaceutics and Pharmacokinetics, Fourth edition, pp. 67-98, Appleton and Lange, Stamford, CT (1999))を用いてモデル化した。２-区画モデルを用いて、組織に対する抗体の開始分布(α期)、その後に続く終末期又は除去期(β期)を明らかとした。ＦｃＲｎが循環中のＩｇＧを維持するように機能するので、このようにして算出された除去半減期(ｔ1／２β)は亢進したＦｃＲｎ結合の効果を示す。
【０１９７】
実施例１８
ＣＬＬ患者の細胞によるＡＤＣＣ、ＣＤＣ活性
この研究において、ＣＬＬ患者のＢ細胞に対する抗体２Ｈ７.ｖ５１１及びｖ１１４の補体活性を試験した。ＰＢＭＣを、３人のＣＤ２０陽性のＣＬＬ患者から単離した(ＣＬＬ患者では、ＰＢＭＣ分画において見られる大部分の細胞はＢ細胞である)。９６ウェルマイクロウェル形式において、各々の患者からの５０，０００のＰＢＭＣを、１０００ｎＭから始めて、抗体を１：３倍に階段希釈した、５０μｌの滴定したｍＡｂ(ｖ１１４、ｖ５１１又はリツキサンTM)と混合した。各ウェルに、１：４に希釈した５０μｌの正常ヒト血清補体を加えた。混合物を３７℃で２時間インキュベートして、５０μｌの代謝性色素指標であるアラマーブルー(細胞溶解の指標)を加え、３７℃で終夜(１６時間以内)インキュベーションを続けた。９６ウェルプレートを室温で１分間振とうして、５３５ｎｍ／５９０ｎｍの蛍光プレートにて読取った。抗体濃度に対する相対的な蛍光単位をプロットして、ＥＣ５０を得た。ＣＤＣ活性においてｖ１１４とリツキサンを比較した図１５と、ｖ５１１とリツキサンを比較した図１６に示される結果から、３人すべての患者についてｖ５１１及びｖ１１４は効力はおよそ等しいが、リツキサンとｖ１６よりも有意に良好であった。
【０１９８】
別の研究では、インビトロのアッセイにおいてＭＥＣ１ Ｂ-ＣＬＬ細胞株(Stacchini, A 等 (1999) Leukemia Res. 23, 127-136)とＢ-ＣＬＬ(Ｂ細胞関連ＣＬＬ)患者からのＢ細胞を用いて２Ｈ７ｖ.５１１及びリツキサンのＡＤＣＣ効力を比較した。実験は、以下の通りに行った。ＮＫ細胞は、製造者(RosetteSep, StemCell Technologies)の推奨プロトコールに従って、ネガティブ選択を用いて１００ｍＬの正常ヒト全血から単離した。全血ドナーは、ＮＫ細胞上のＣＤ16の表現形質の発現が異なっていた。対立形質の相違は位置１５８に生じており、バリン-バリン、バリン-フェニルアラニン、及びフェニルアラニン-フェニルアラニン表現型を含む。一般的に、アッセイは、バリン-フェニルアラニン表現型により行った。アッセイは、以下の通りに丸底９６マイクロウェルプレートにおいて行った。５０μＬの段階希釈した量のｍＡｂ(１０〜１００ｎｍで始める)を、５０μＬの標的細胞とともにインキュベートした。標的細胞は、Ｂ−ＣＬＬ ＭＥＣ１細胞株(５０μｌ当たり１０，０００)と、Ｂ-ＣＬＬ患者からのＰＢＭＣ(５０μＬ当たり３０，０００)とを含む。ＰＢＭＣは、標準的なフィコール-Paque Plus勾配分離を用いてＣＬＬドナーの全血液から単離した。段階希釈した抗体とともに室温で３０分間インキュベートした後、５０μＬのＮＫ細胞(５０，０００)を加えて、３７℃で更に４時間インキュベートした。プレートを１５００回転数／分で１０分間遠心分離して、１００μｌの細胞培地を除去した。細胞溶解のレベルは、溶解した細胞から放出される乳酸デヒドロゲナーゼ(LDHキット Roche)の量を計量することによって決定した。ｍＡｂ濃度との相対的なパーセント細胞溶解を決定して、４-パラメータ曲線フィットを用いたKaleidaGraphにプロットした。ＩＣ５０値は、ＭＥＣ１細胞株について報告された。点線グラフに対する点を用いてＣＬＬ ＰＢＭＣをプロットし、３０、５及び０．８ｎＭのパーセント死滅を記録した。
【０１９９】
この結果から、２Ｈ７ｖ.５１１のＡＤＣＣ活性が３人すべての患者試料においてリツキサンより高いことが示された。３０ｎＭ、５ｎＭ及び０．８ｎＭの抗体において、２Ｈ７ｖ.５１１の改善は、リツキサンのそれぞれ２．８倍、６．２倍及び５．４倍であった。ＮＫ細胞はＶＦ表現型のものであった。
２Ｈ７ｖ.５１１のＡＤＣＣ活性もまた、リツキサンが媒介するＭＥＣ１細胞の細胞溶解より高かった。２Ｈ７ｖ．５１１は、０．９５ｐＭの２Ｈ７ｖ．５１１及び０．０１２ＭのリツキサンのＩＣ５０で１３倍以上の活性を有した。ＮＫ細胞はＶＶ表現型のものであった。
【０２００】
結論
まとめると、２Ｈ７.ｖ５１１及びｖ１１４は、２Ｈ７.ｖ１６と比較して、ＣＤ２０結合親和性の増加、ＣＤＣ活性の増加、ＡＤＣＣ活性の増加、及びインビボＢ細胞枯渇についてのインビボ効力の増加を示した。
【０２０１】
実施例１９
以下の表に示す実験設定に従って、２Ｈ７.ｖ５１１及びｖ１１４を用いてカニクイザルにおいて実験を行って、安全性、霊長類のＰＫ及びインビボ正常Ｂ細胞枯渇を評価した。動物は、各服用レベルを４週ごとに投与した。２．５ｍｇ／ｋｇ、４投薬又は５０ｍｇ／ｋｇ、４投薬の何れかの動物の分析から、ｖ５１１及びｖ１１４の両方により末梢Ｂ細胞枯渇が示された。ｖ５１１によるパイロット試験では、５０ｍｇ／ｋｇで、末梢Ｂ細胞は、急速にかつ十分に減少した。剖検所見に基づいて、組織Ｂ細胞もまた、この用量で有意に減少した。
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【０２０２】
実施例２０
ＮＨＬについての第I相／II臨床試験
下記の表は、一試験の抗体ｈｕ２Ｈ７.ｖ１６と平行試験のｈｕ２Ｈ７.ｖ５１１を用いた非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)を治療するための一第I／II相臨床研究設定を示す。抗体は静脈内注入により投与した。また、この投薬計画は、前記の本発明の他のｈｕ２Ｈ７変異体を用いた。
非ホジキンリンパ腫のための２Ｈ７第I／II相試験−用量／注入比
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【０２０３】
実施例２１
ＮＨＬについての第I相臨床試験２
下記の表は、一試験の抗体ｈｕ２Ｈ７.ｖ１６と平行試験のｈｕ２Ｈ７.ｖ５１１を用いた非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)を治療するためのもう一つの第Ｉ相臨床研究設定を示す。抗体は静脈内注入により投与した。また、この投薬計画は、前記の本発明の他のｈｕ２Ｈ７変異体を用いた。各投薬は、３週間間隔で合計８用量とした。
３コホート(１０人の患者／コホート) ｑ3ｗｋｓｘ8
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【０２０４】
実施例２２
ＮＨＬについての第I／II相用量増大コホート試験
下記の表は、抗体ｈｕ２Ｈ７.ｖ５１１を用いた非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)を治療するための第I／II相臨床研究設定を示す。患者は、毎週、４週間投薬した。有効性を、例えばＣＴスキャンによる腫瘍収縮により測定した。
(１コホートにつき３〜６人の患者)
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【０２０５】
実施例２３
ＮＨＬについての第I／II相用量増大コホート試験
下記の表は、抗体ｈｕ２Ｈ７.ｖ５１１を用いた非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)を治療するためのもう一つの第I／II相臨床研究設定を示す。患者は、毎週、４週間投薬した。有効性を、例えばＣＴスキャンによる腫瘍収縮により測定した。
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【０２０６】
実施例２４
中程度〜重度の関節リウマチにおける２Ｈ７.ｖ５１１の第I／II相試験
研究治療の設定
被験者のコホートは以下の増大計画に従って１日目と１５日目に標示用量のｈｕ２Ｈ７.ｖ５１１又はプラセボ等量の２回の静脈内注入を与える：
−  １０ｍｇのｈｕ２Ｈ７.ｖ５１１又はプラセボ等価物：薬剤活性な８患者、２コントロール
−  ５０ｍｇのｈｕ２Ｈ７.ｖ５１１又はプラセボ等価物：薬剤活性な８患者、２コントロール
−  １００ｍｇのｈｕ２Ｈ７.ｖ５１１又はプラセボ等価物：薬剤活性な８患者、２コントロール
−  ２００ｍｇのｈｕ２Ｈ７.ｖ５１１又はプラセボ等価物：薬剤活性な８患者、２コントロール
−  ３００ｍｇのｈｕ２Ｈ７.ｖ５１1又はプラセボ等価物：薬剤活性な８患者、２コントロール
−  ５００ｍｇのｈｕ２Ｈ７.ｖ５１1又はプラセボ等価物：薬剤活性な８患者、２コントロール
【０２０７】
効果
２Ｈ７.ｖ５１１の効果はＡＣＲ応答によって測定される。ＡＣＲ２０、ＡＣＲ５０、及びＡＣＲ７０応答を達成する被験者の割合は治療グループ毎にまとめられ、各グループに９５％の信頼区間が生じる。
【０２０８】
参考文献
特許、出版された出願及び他の出版物を含め、本出願内で引用する文献は、出典明記によりここに組み込まれる。
本発明の実施は、特に明記しない限り、当分野の技術の範囲内である、分子生物学などの従来の技術を使用する。このような技術は文献において十分に説明される。例として、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (J. Sambrook 等., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)；Current Protocols in Molecular Biology (F. Ausubel 等, eds., 1987 updated); Essential Molecular Biology (T. Brown ed., IRL Press 1991); Gene Expression Technology (Goeddel ed., Academic Press 1991); Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes (A. Bothwell 等. eds., Bartlett Publ. 1990); Gene Transfer and Expression (M. Kriegler, Stockton Press 1990); Recombinant DNA Methodology II (R. Wu 等. eds., Academic Press 1995); PCR:  A Practical Approach (M. McPherson 等., IRL Press at Oxford University Press 1991); Oligonucleotide Synthesis (M. Gait ed., 1984); Cell Culture for Biochemists (R. Adams ed., Elsevier Science Publishers 1990); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. Miller & M. Calos eds., 1987); Mammalian Cell Biotechnology (M. Butler ed., 1991); Animal Cell Culture (J. Pollard 等. eds., Humana Press 1990); Culture of Animal Cells, 2nd Ed. (R. Freshney 等. eds., Alan R. Liss 1987); Flow Cytometry and Sorting (M. Melamed 等. eds., Wiley-Liss 1990); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.);Wirth M. and Hauser H. (1993); Immunochemistry in Practice, 3rd edition, A. Johnstone & R. Thorpe, Blackwell Science, Cambridge, MA, 1996; Techniques in Immunocytochemistry, (G. Bullock & P. Petrusz eds., Academic Press 1982, 1983, 1985, 1989); Handbook of Experimental Immunology, (D. Weir & C. Blackwell, eds.); Current Protocols in Immunology (J.  Coligan 等. eds. 1991); Immunoassay (E. P. Diamandis & T.K. Christopoulos, eds., Academic Press, Inc., 1996); Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed) Academic Press, New York; Ed Harlow and David Lane, Antibodies A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Antibody Engineering, 2nd edition (C. Borrebaeck, ed., Oxford University Press, 1995); and the series Annual Review of Immunology; the series Advances in Immunology.
【図面の簡単な説明】
【０２０９】
【図１】図１Ａは、マウス２Ｈ７(配列番号１)、ヒト化２Ｈ７. ｖ１６変異体(配列番号２)及びヒトκ軽鎖サブグループI(配列番号３)各々の軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)のアミノ酸配列を比較している配列アラインメントを示す。２Ｈ７及びｈｕ２Ｈ７.ｖ１６のＶＬのＣＤＲは以下の通りである：ＣＤＲ１(配列番号４)、ＣＤＲ２(配列番号５)及びＣＤＲ３(配列番号６)。図１Ｂは、マウス２Ｈ７(配列番号７)、ヒト化２Ｈ７.ｖ１６変異体(配列番号８)及び重鎖サブグループIIIのヒトコンセンサス配列(配列番号９)のＶＨ配列を比較する配列アラインメントを示す。２Ｈ７及びｈｕ２Ｈ７.ｖ１６のＶＨのＣＤＲは以下の通りである：ＣＤＲ１(配列番号１０)、ＣＤＲ２(配列番号１１)及びＣＤＲ３(配列番号１２)。図１Ａ及び図１Ｂにおいて、各鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は括弧で括っており、示されるように、フレームワーク領域であるＦＲ１-ＦＲ４に隣接している。２Ｈ７はマウス２Ｈ７抗体を指す。２列の配列間のアスタリスクは、２つの配列の間で異なる位置を示す。残基番号付けはKabat 等, Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)に従い、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅに示す挿入を有する。
【図２Ａ】ヒト化２Ｈ７.ｖ１６とｖ５１１のＬ鎖のタンパク質配列アラインメント。
【図２Ｂ】ヒト化２Ｈ７.ｖ１６とｖ５１１のＨ鎖のタンパク質配列アラインメント。
【図３】可溶化ＣＤ２０ ＥＬＩＳＡにおける２Ｈ７変異体の相対的な結合を示す。抗体２Ｈ７.ｖ１６(○)、２Ｈ７.ｖ５１１(■)及び２Ｈ７.ｖ５８８(△)を比較する(実施例１２を参照)。
【図４】ＷＩＬ２-Ｓ細胞と精製されたヒトＮＫ細胞を用いたＡＤＣＣ活性を示す。抗体２Ｈ７.ｖ１６(○)、２Ｈ７.ｖ５１１(■)及び２Ｈ７.ｖ５８８(△)を、インビトロでのＡＤＣＣを媒介する能力について比較した(実施例１３を参照)。
【図５】ＷＩＬ２-Ｓ細胞とヒト補体を用いたＣＤＣ活性を示す。抗体２Ｈ７.ｖ１６(○)、２Ｈ７.ｖ５１１(■)及び２Ｈ７.ｖ５８８(△)を、インビトロでのＣＤＣを媒介する能力について比較した(実施例１４を参照)。
【図６】抗体注射後２日目のインビボでの２Ｈ７変異体ｖ１６及びｖ５１１による、血液(左)及び腹膜腔(右)におけるＢ細胞枯渇を示す(実施例１５を参照)。
【図７】抗体注射後２日目の２Ｈ７変異体ｖ１６及びｖ５１１による、脾臓におけるＢ細胞枯渇を示す：脾臓Ｂ細胞(左)、周辺帯Ｂ細胞(真ん中)及び濾胞性Ｂ細胞(右)(実施例１５を参照)。
【図８】ヒトＣＤ２０及びヒトＣＤ１６を発現するhCD20 Tg+/+ / mCD16-/- / hCD16 Tg+/-トランスジェニックマウスの２Ｈ７.ｖ１６及び.ｖ５１１による、インビボＢ細胞枯渇を比較する(実施例１５を参照)。
【図９】ＣＨＯ細胞での２Ｈ７.ｖ１６の発現のためのベクター。
【図１０】ＷＩＬ２-Ｓ細胞でアッセイされるように、補体(ＣＤＣ)活性における他の２Ｈ７変異体ｖ１６、ｖ３１、ｖ１１４、ｖ１３８及びｖ４８８に対する２Ｈ７.ｖ５１１の比較を示す(実施例１４を参照)。
【図１１】実施例１３及び図４に記載のように、ＷＩＬ２-Ｓ細胞と精製したヒトＮＫ細胞を用いた抗体変異体２Ｈ７.ｖ５１１、ｖ１６、ｖ３１、ｖ１１４、ｖ１３８及びｖ４８８のＡＤＣＣ活性を比較する。
【図１２】ヒトＣＤ２０及びヒトＣＤ16を発現するhCD20 Tg+/+ / mCD16-/- / hCD16 Tg+/-トランスジェニックマウスにおける２Ｈ７.ｖ５１１とリツキシマブ(リツキサン(登録商標))のインビボＢ細胞枯渇分析を概説する、２つの抗体の活性を表にまとめる(実施例１５を参照)。
【図１３】抗体注射後２日目のインビボでの２Ｈ７.ｖ５１１及びリツキシマブによる、血液(左)及び腹膜腔(右)におけるＢ細胞枯渇を示す(実施例１５を参照)。
【図１４】抗体注射後２日目の２Ｈ７.ｖ５１１及びリツキシマブによる、脾臓におけるＢ細胞枯渇を示す：脾臓Ｂ細胞(左)、周辺帯Ｂ細胞(真ん中)及び濾胞性Ｂ細胞(右)(実施例１５を参照)。
【図１５Ａ】図１５Ａ及びＢは、２Ｈ７.ｖ１１４又はリツキサンTMとヒト血清補体で治療された３人のＣＬＬ患者から精製したＰＢＭＣのインビトロでのＣＤＣ活性の比較を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｃは、２Ｈ７.ｖ１１４又はリツキサンTMとヒト血清補体で治療された３人のＣＬＬ患者から精製したＰＢＭＣのインビトロでのＣＤＣ活性の比較を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａ及びＢは、２Ｈ７.ｖ５１１又はリツキサンTMとヒト血清補体で治療された３人のＣＬＬ患者(図１５と同じ患者)からのＰＭＢＣのインビトロでのＣＤＣ活性の比較を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｃは、２Ｈ７.ｖ５１１又はリツキサンTMとヒト血清補体で治療された３人のＣＬＬ患者(図１５と同じ患者)からのＰＭＢＣのインビトロでのＣＤＣ活性の比較を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年11月30日(2007.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＤ２０を結合するヒト化２Ｈ７抗体又はその抗原結合断片であって、配列番号２５のＬ鎖可変領域(ＶＬ)と配列番号８のＨ鎖可変領域(ＶＨ)を含んでなるが、ＶＨ-ＣＤＲ２のＤ５６Ａのアミノ酸置換を有しており、ＶＨ-ＣＤＲ３のＮ１００がＹ又はＷに置換されている抗体。
【請求項２】
前記Ｎ１００がＹに置換されている、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記Ｎ１００がＷに置換されている、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
さらに、ＶＨ-ＣＤＲ３に置換Ｓ１００ａＲを含有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
さらに、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を改善するＩｇＧ Ｆｃ領域内の少なくとも一のアミノ酸置換を含有する、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
アミノ酸置換Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｋ３２６Ａを含有するＩｇＧ１ Ｆｃを含んでなる、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
さらに、ＡＤＣＣを改善するがＣＤＣ活性を低減するＦｃ領域内の少なくとも一のアミノ酸置換を含有する、請求項４に記載の抗体。
【請求項８】
少なくともアミノ酸置換Ｋ３２２Ａを含有する、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
さらに、アミノ酸置換Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａを含有する、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
配列番号２６の軽鎖配列及び配列番号３４の重鎖配列を含んでなる、請求項６に記載の抗体。
【請求項１１】
抗体２Ｈ７.ｖ１６と比較して少なくとも３倍に増加した親和性でヒトＣＤ２０を結合する、請求項４に記載の抗体。
【請求項１２】
抗体２Ｈ７.ｖ１６と比較して少なくとも６倍に増加した親和性でヒトＣＤ２０を結合する、請求項４に記載の抗体。
【請求項１３】
２Ｈ７.ｖ１６の少なくとも２０倍の抗体依存生細胞障害性(ＡＤＣＣ)を示す、請求項６に記載の抗体。
【請求項１４】
２Ｈ７.ｖ１６の少なくとも２５倍の補体細胞障害性(ＣＤＣ)を示す、請求項６に記載の抗体。
【請求項１５】
細胞障害性剤とコンジュゲートされた、請求項１ないし１４の何れか一に記載の抗体。
【請求項１６】
前記細胞障害性剤が放射性同位体又は毒素である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体がＣＨＯ細胞内で産生される、請求項１ないし１４の何れか一に記載の抗体。
【請求項１８】
請求項１に記載の抗体をコードする単離された核酸。
【請求項１９】
請求項１又は請求項１０に記載の抗体をコードする発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１８に記載の核酸を含有する宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１ないし１４の何れか一に記載の抗体を産生する、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
配列番号２６の軽鎖配列と配列番号３４の重鎖配列を含んでなる抗体を産生する、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
ＣＨＯ細胞である請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
請求項２１に記載の宿主細胞を培養して、該細胞培養物をから抗体を回収することを含む、請求項１ないし１４の何れか一に記載の抗体の産生方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の抗体と担体を含有してなる組成物。
【請求項２６】
請求項１０に記載の抗体と薬剤的に受容可能な担体を含有してなる、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
容器と該容器に包含される組成物を具備する製造品であって、該組成物が請求項１ないし１７の何れか一に記載の抗体を含有してなる、製造品。
【請求項２８】
さらに、該組成物が非ホジキンリンパ腫を治療するために用いられることを示すパッケージ挿入物を具備するものであり、前記抗体が配列番号２６の軽鎖配列と配列番号３４の重鎖配列を含んでなるものである、請求項２７に記載の製造品。
【請求項２９】
さらに、前記組成物が関節リウマチを治療するために用いられることを示すパッケージ挿入物を具備する、請求項２７に記載の製造品。
【請求項３０】
治療的有効量の請求項１ないし１７の何れか一に記載のヒト化２Ｈ７抗体を含有してなる、ＣＤ２０陽性癌を治療するための医薬。
【請求項３１】
前記ＣＤ２０陽性癌がＢ細胞リンパ腫又は白血病である、請求項３０に記載の医薬。
【請求項３２】
前記ＣＤ２０陽性癌が非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)である、請求項３１に記載の医薬。
【請求項３３】
前記癌が慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)又はＳＬＬである、請求項３２に記載の医薬。
【請求項３４】
前記抗体が、それぞれ配列番号２６及び３４の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を含んでなる、請求項３２又は請求項３３に記載の医薬。
【請求項３５】
前記抗体が静脈内注入により投与される、請求項３１に記載の医薬。
【請求項３６】
前記抗体が１用量当たりおよそ１００ｍｇ／ｍ２から３７５ｍｇ／ｍ２の範囲の投薬で投与される、請求項３５に記載の医薬。
【請求項３７】
前記抗体が１用量当たり３７５ｍｇ／ｍ２の投薬で、少なくとも４回投与される、請求項３６に記載の医薬。
【請求項３８】
さらに、少なくとも一の化学療法剤が患者に投与される、請求項３０に記載の医薬。
【請求項３９】
前記癌が、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)であり、前記化学療法剤がドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン及びプレドニゾロンからなる群から選択される、請求項３８に記載の医薬。
【請求項４０】
治療的有効量の請求項１ないし１４の何れか一に記載のヒト化２Ｈ７抗体を含有してなり、自己免疫性疾患に罹患している患者の自己免疫性疾患を軽減するための医薬。
【請求項４１】
前記抗体が、それぞれ配列番号２６及び３４の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を含んでなる、請求項４０に記載の医薬。
【請求項４２】
前記自己免疫性疾患が、関節リウマチ及び若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、例えばループス腎炎、ヴェゲナー病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、特発性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)、血栓性血小板減少性紫斑病(ＴＴＰ)、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡネフロパシ、ＩｇＭ多発性神経炎、重症筋無力症、ＡＮＣＡ関連血管炎、真正糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群、視神経脊髄炎(ＮＭＯ)及び糸球体腎炎からなる群から選択されるものである、請求項４１に記載の医薬。
【請求項４３】
前記自己免疫性疾患が関節リウマチである、請求項４２に記載の医薬。
【請求項４４】
さらに、前記患者に第二の治療剤が投与されることを含む、請求項４３に記載の医薬。
【請求項４５】
前記の第二の治療剤が免疫抑制剤である、請求項４４に記載の医薬。
【請求項４６】
前記免疫抑制剤がメトトレキセートである、請求項４５に記載の医薬。
【請求項４７】
前記抗体が静脈内投与又は皮下投与される、請求項４３に記載の医薬。
【請求項４８】
前記抗体が、１用量当たり１０ｍｇから５００ｍｇの範囲の投薬で静脈内投与される、請求項４３に記載の医薬。
【請求項４９】
前記抗体が１００ｍｇ／用量の投薬で投与される、請求項４８に記載の医薬。
【請求項５０】
さらに、前記患者に第二の治療剤が投与される、請求項４０に記載の医薬。
【請求項５１】
前記の第二の治療剤がＢＡＦＦアンタゴニストである、請求項５０に記載の医薬。
【請求項５２】
前記ＢＡＦＦアンタゴニストが抗ＢＲ３抗体又はＢＲ３-Ｆｃ融合タンパク質である、請求項５１に記載の医薬。
【請求項５３】
さらに、前記患者にＶＥＧＦアンタゴニストが投与される、請求項３０に記載の医薬。
【請求項５４】
２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、４％ トレハロース二水和物、０．０２％ ポリソルベート２０内におよそ２０ｍｇ／ｍｌのヒト化２Ｈ７.ｖ５１１抗体を含有してなる、静脈内投与のための液体製剤。
【請求項５５】
２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．３、２４０ｍＭ(８％) トレハロース二水和物、０．０２％ ポリソルベート２０内におよそ２０ｍｇ／ｍｌのヒト化２Ｈ７.ｖ１１４抗体を含有してなる液体製剤。
【請求項５６】
２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．３、４％ トレハロース二水和物、０．０２％ ポリソルベート２０内におよそ３０ｍｇ／ｍｌのヒト化２Ｈ７.ｖ１６抗体を含有してなる、静脈内投与のための液体製剤。
【国際調査報告】
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