(57)【要約】本発明は、アポトーシスを阻害することで低酸素状態下にある細胞生存率を改善するイネ科植物の抽出物を含む組成物に関する。よって、本発明のイネ科植物の１つであるTriticum aestivum L.の抽出物は、特に、虚血性疾患の動物モデルにおける脳、心臓、及び腎臓への損傷を予防し、アルツハイマー病の動物モデルにおける記憶も改善する。従って、イネ科植物の抽出物を含む組成物は虚血性疾患又は退行性脳疾患の予防及び治療のための治療薬又はヘルスケア食品として使用可能である【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
虚血性疾患の治療と予防のための、有効成分としてイネ科植物の未精製抽出物又は精製画分と、製剤的に許容可能な担体又はアジュバントとを含む医薬品組成物。
【請求項２】
該虚血性疾患が心筋梗塞、脳梗塞、虚血性急性腎不全、虚血性急性肝不全、糖尿病性の足壊疽、糖尿病性ネフロパシー、及び外科手術の副作用によって引き起こされる虚血性疾患又は臓器／組織障害等の様々な虚血性疾患を含む、請求項１に記載の医薬品組成物。
【請求項３】
該外科手術の副作用によって引き起こされる虚血性疾患が虚血性心不全、虚血性腎不全、虚血性肝不全又は虚血性脳卒中を含む、請求項２に記載の医薬品組成物。
【請求項４】
該外科手術の副作用によって引き起こされる臓器／組織障害が、臓器手術、臓器移植、又は事故により切断された身体部位の再連結を行う際の虚血−再かん流によって引き起こされる、請求項２に記載の医薬品組成物。
【請求項５】
該臓器／組織が、腎臓、肝臓、膵臓、肺又は心臓等の内臓、及び足、手、指又は耳等の外部器官を含む、請求項４に記載の医薬品組成物。
【請求項６】
アポトーシスによって引き起こされる、哺乳類及び人間における虚血性疾患の予防と治療のための治療薬の調製のための、イネ科植物の未精製抽出物又は精製画分の使用。
【請求項７】
退行性脳疾患の予防と治療のための、有効成分としてイネ科植物の未精製抽出物又は精製画分と、製剤的に許容可能な担体又はアジュバントとを含む医薬品組成物。
【請求項８】
該退行性脳疾患が、アルツハイマー型認知症（アルツハイマー病）、血管性認知症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病、又は脊髄損傷等の様々な退行性脳疾患を含む、請求項７に記載の医薬品組成物。
【請求項９】
該イネ科植物がTriticum aestivum L.、浮Triticum aestivum L.、Secale cereale L.、玄米、Horden vulgare L.、麦芽、Avena sativa L.、Zea mays L.、Sorghum bicolor MOENCH、Coix lacryma-jobi var. mayuen STAPF、Panicum miliaceum L.又はSetaria italica Beauv.等の様々なイネ科植物を含む、請求項１又は７に記載の医薬品組成物。
【請求項１０】
該未精製抽出物が水、低級アルコール、及びその混合物から成る群から選択された溶媒で抽出される、請求項１又は７に記載の医薬品組成物。
【請求項１１】
該精製画分が、以下の強塩基の添加により請求項１のイネ科植物の未精製抽出物をｐＨ７とｐＨ１２に調整する工程１と、当量の無極性溶媒を工程１で調製した抽出物に添加することで請求項１のイネ科植物の未精製抽出物中の無極性物質を除去し、その水溶性抽出物を得る工程２と、工程２で調製した水溶性抽出物を、当量の低級アルコールを添加することによる抽出及び分画に供して本発明のｐＨ１２の抽出物から単離したブタノール可溶性画分と水溶性画分、ｐＨ７の抽出物から単離したブタノール可溶性画分と水溶性画分を得る工程３を含む処理によって調製したイネ科植物から単離した精製画分を含む、請求項１又は７に記載の医薬品組成物。
【請求項１２】
該精製画分がｐＨ１２で調製した抽出物から単離したブタノール可溶性画分である、請求項１１に記載の医薬品組成物。
【請求項１３】
アポトーシスによって引き起こされる、哺乳類及び人間における退行性脳疾患の予防と治療のための治療薬の調製のための、イネ科植物の未精製抽出物又は精製画分の使用。
【請求項１４】
以下の強塩基の添加により請求項１のイネ科植物の未精製抽出物をｐＨ７とｐＨ１２に調整する工程１と、当量の無極性溶媒を工程１で調製した抽出物に添加することで請求項１のイネ科植物の未精製抽出物中の無極性物質を除去し、その水溶性抽出物を得る工程２と、工程２で調製した水溶性抽出物を、当量の低級アルコールを添加することによる抽出及び分画に供して本発明のｐＨ１２の抽出物から単離したブタノール可溶性画分と水溶性画分、ｐＨ７の抽出物から単離したブタノール可溶性画分と水溶性画分を得る工程３から成る工程を含む、イネ科植物から単離した精製画分を調製するための方法。
【請求項１５】
アポトーシスによって引き起こされる虚血性疾患又は退行性脳疾患の予防と改善のための、食品学的に許容可能な添加物と共にイネ科植物の未精製抽出物又は精製画分を有効成分として含む、ヘルスケア食品。
【請求項１６】
該ヘルスケア食品が粉末、顆粒、錠剤、チュアブル錠、カプセル、飲料タイプで提供される、請求項１５に記載のヘルスケア食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、虚血性疾患及び退行性脳疾患の予防と治療のための、イネ科植物抽出物を含む組成物とその使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
世界的に見て例年の主な死因である心疾患は全ての死因の約３０％を占め、その７５％は脳梗塞と心筋梗塞が原因である。脳梗塞及び心筋梗塞は虚血性疾患の代表的な２例であり、それぞれ脳及び心臓における組織の壊死によって引き起こされる。これらは、高血圧、高脂血症、糖尿病、喫煙等の様々な要因による動脈硬化により血管がすでに狭くなっている状態下で、血液を各組織に供給する大脳動脈又は冠状動脈が血栓又は塞栓によって閉塞すると起こる。心筋梗塞及び脳梗塞を軽減する最も良い方法は、可能な限り早く、閉塞した動脈を再かん流することであり、血栓又は塞栓を溶解するためには血栓溶解剤が使用されている。しかしながら、効果的に治療するためには、虚血組織が壊死する前、好ましくは閉塞から３−６時間以内に血栓溶解剤を投与すべきである。通常、閉塞から６時間以内に患者を治療することは困難である。従って、病院で閉塞した動脈を再かん流するまで組織の損傷を防ぐことが、脳梗塞及び心筋梗塞を軽減する別の方法である。脳梗塞及び心筋梗塞における細胞死の一因はアポトーシスによるものであることから（Crow MT et al., Circ. Res., 95(10), pp957-970, 2004; Friedlander RM, N. Engl. J. Med., 348(14), pp1365-1375, 2003）、抗アポトーシス剤を用いて虚血性疾患を防止することが可能である。
【０００３】
これらの抗アポトーシス剤は、腎臓移植や形成手術における移植組織への損傷を防止するためにも使用することができ、これは損傷が虚血とそれに続く再かん流の間のアポトーシスによっても引き起こされるからである（虚血−再かん流）（Daemen MA et al., Transplantation, 73(11), pp1693-1700, 2002; Gastman BR et al., Plast. Reconstr. Surg., 111, pp1481-1496, 2003）。また、心臓手術のために心拍を止める際、人工心肺装置から供給される酸素量が心臓の酸素需要より少ないと心筋障害が起こる可能性があり、或いは血圧低下により脳に十分な血液が供給されないと脳に損傷が生じる可能性がある。例えば、冠状動脈バイパス移植、脳動脈及び大動脈等における動脈瘤手術の最中に血液の供給が阻害されると、心筋障害による心不全、及び脳の損傷による片麻痺が起こる場合がある。統計的には、大動脈瘤に外科的療法又はインターベンション治療を行った患者の３−１６％が、虚血性心疾患、腎不全、対麻痺等の様々な副作用を示していることが報告されている。従って、手術に先立って抗アポトーシス剤を投与することで、こういった副作用を軽減できる可能性がある。
【０００４】
脳梗塞の際のアポトーシスによる神経細胞死の原因は、現在に至るまで十分に解明されてはいないが、一時的な脳の虚血とそれに続く脳への酸素とグルコースの供給のブロックにより神経細胞におけるＡＴＰ濃度が低下することが知られている。この状態は細胞外でのグルタミン酸塩の過剰蓄積を誘発し、続くグルタミン酸塩の細胞内への流入が細胞内カルシウムイオンの蓄積を引き起こし、神経細胞のアポトーシスにつながる（Kang TC et al., J. Neurocytol., 30(12), pp945-955, 2001）。この損傷は、虚血に引き続く血液供給の再かん流の際の急激な酸素供給によって発生する活性酸素種により悪化する（Won MH et al., Brain Res., 836(1-2), pp70-78, 1999）。これらの活性酸素種は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症等の一部の退行性脳疾患における、アポトーシスによる神経細胞死の一因でもある（Sayer LM et al., Curr Med Chem, 8, pp721-738, 2001）。従って、抗アポトーシス剤は、虚血性疾患のみならず退行性脳疾患の治療にも用いることが可能である。
【０００５】
抗アポトーシス剤として評価されてきたものの１つがテトラサイクリン系抗生剤のミノサイクリンである。動物モデルを使った実験により、ミノサイクリンが脳梗塞（Yrjanheikki J et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(23), pp13496-13500, 1999）、心筋梗塞（Scarabelli TM et al., J. Am. Coll. Cardiol., 43(5), pp865-874, 2004）及び虚血性急性腎不全（Wang J et al., J. Biol., Chem., 279(19), pp19948-19954, 2004）等の虚血性疾患、アルツハイマー病（Hunter CL, Eur. J. Neurosci., 19(12), pp3305-3316, 2004）、パーキンソン病（Wu DC et al., J. Neurosci., 22(5), pp1763-1771, 2002）、筋萎縮性側索硬化症（Zhu S et al., Nature, 417(6884), pp74-78, 2002）、ハンチントン病（Chen. M. et al., Nat. Med., 6(7), pp797-801, 2000）及び脊髄損傷（Teng YD et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(9), pp3071-3076, 2004）等の退行性脳疾患等のアポトーシスによって引き起こされる多くの疾患の治療に効果的であることが示されている。
【０００６】
本発明の発明者は、テトラサイクリン系抗生物質が、この研究で用いたものと同様の虚血状態下の細胞生存率を改善することも確認した（韓国特許登録番号第０４０４１３４号、米国特許番号第６７１６８２２号及び６８１８６２５号参照のこと）。更に、アミノグリコシド及びキノロン系抗生物質もまた、ミノサイクリンに用いたものと同じ虚血状態下において細胞生存率を改善した。特に、アミノグリコシド系抗生物質であるＧ４１８（ジェネティシン）は心筋梗塞の治療に効果的であった（米国特許番号第６７１６８２２号）。更なる実験により、Ｇ４１８が虚血状態下における細胞生存率をアポトーシスの阻害によって改善すること、又、Ｇ４１８が脳梗塞の治療にも効果的であることも示された。つまり、細胞生存率の改善においてＧ４１８と同効果を有するとスクリーニングされた薬剤は全て、虚血性疾患及び退行性脳疾患の治療に効果があると考えられる。
【０００７】
本発明の発明者は、植物の可食部は通常、化学物質より毒性が低いため、上述したスクリーニング法を応用して植物の可食部から抗アポトーシス剤を発見した。発明者は、以下に記載のイネ科植物の抽出物が低酸素状態下での細胞生存率を改善することを発見し、これはトリパンブルー排除試験、ＭＴＴ試験その他等の様々な試験管内試験で証明された。小麦としても知られるイネ科植物の１つTriticum aestivum L.を更なる実験におけるモデル植物として使用した。Triticum aestivum L.の種子から抽出した未精製抽出物は低酸素状態下でのアポトーシスを阻害し、これはＤＮＡ断片化試験によって証明された。加えて、Triticum aestivum L.の種子の未精製抽出物及び／又は精製画分は、心筋梗塞、脳梗塞、及び虚血性急性腎不全等の虚血性疾患の治療に効果的であり、又、退行性脳疾患、アルツハイマー病の治療にも効果的であり、その有効性は様々な動物モデル試験で立証された。
【０００８】
本発明では様々な種類のイネ科植物を試験し、組成や薬剤としての使用といったその種子の特徴を以下に示す。
【０００９】
オオムギとも称されるHorden vulgare L.の乾燥種子は、デンプンを６０−６８％、ペントサンを８−１２％、セルロースを４−５％、リグニンを４％、硝酸塩成分を７−１４％、エーテル抽出物を２−３％、灰分２−３％を含むことが報告されている。種子は、フォスファチジルセリン、フォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジン酸、ステロール、エステル、グリコシド、アラントイン等を含有する。加えて、種子の主な脂肪酸はパルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸である（Chung BS and Shin MK HyangyakDaesacheon, p218, Youngrimsa, Seoul,1998）。
【００１０】
発芽乾燥させたオオムギである麦芽は消化活動を刺激し、血糖値を下げると報告されている（Ahm DK, Illustrated Book of Korean Medicinal Herbs, 5th ed., p476, Kyo-Hak Publishing Co., Ltd. Seoul, 2002）。
【００１１】
もみ殻を外した米である玄米（Oryza sativa L.）は水分を１５．５％、たんぱく質を７．４％、脂肪分を３．０％、糖を７１．８％、繊維を１．０％、灰成分を１．３％、及びビタミンＢ１を０．５４ｍｇ／１００ｇ含有する。
【００１２】
Avena sativa L.（エンバク）の種子は玄米と同様のアミノ酸組成を有しており、大量のビタミンＢ群を有する。韓国漢方では下剤、及び便秘とガンの治療のための薬剤として用いられてきた。
【００１３】
Zea mays L.（トウモロコシ）の種子はデンプンを６１．２％、アルブミン、グロブリン、グルテリン等のたんぱく質を４．７５％、アルカロイドを０．２１％、及び種々のビタミンを含むことが報告されており、その種油はパルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸等を含む不飽和脂肪酸を含む（Chung BS and Shin MK, HyangyakDaesacheon, p234, Youngrimsa, Seoul, 1998）。
【００１４】
Sorghum bicolor MOENCH（スイートソルガム）の種子は主成分としてデンプンを７６．５％とたんぱく質を８．５％を含むことが報告されており、韓国漢方では胃痛と急性胃腸炎の治療に使用される（Ahn DK, Illustrated Book of Korean Medicinal Herbs, 5th ed., p441, Kyo-Hak Publishing Co., Ltd. Seoul, 2002）。
【００１５】
Coix lacryma-jobi var. mayuen STAPF（ハトムギ）の種子はデンプンを６７．７％、たんぱく質を１３．８％、脂質を５．１％、セルロースを０．７％含み、利尿、排尿その他に効果的なことが報告されている（Ahn DK, Illustrated Book of Korean Medicinal Herbs, 5th ed., p405, Kyo-Hak Publishing Co., Ltd. Seoul, 2002）。
【００１６】
Panicum miliaceum L.（キビ）の脱穀種子は、デンプンを５９．６５％、無機物質を２．８６％、パルミチン酸、カルナバ酸、マルガリン酸、オレイン酸、リノール酸、イソリノール酸等の脂肪酸を５．０７％、及びアルブミン、グルテリン、プロラミン等のたんぱく質を含むことが報告されている（Chung BS and Shin MK, HyangyakDaesacheon, p225-226, Youngrimsa, Seoul, 1998）。
【００１７】
Setaria italica Beauv.（アワ）の脱穀種子はデンプンを６３．２７％、脂肪を１．４１％、全窒素を２．４８％、たんぱく質を２．４１％、灰分を３．１５％、還元糖を２．０３％含むことが報告されている。その外皮はグルテリン、プロラミン、グロブリンその他等のたんぱく質を含有する（Chung BS and Shin MK, HyangyakDaesacheon, p229, Youngrimsa, 1998）。Setaria italica Beauv.は悪心、弱質、消化不良、下痢に効果的であることが報告されている（Ahn DK, Illustrated Book of Korean Medicinal Herbs, 5th ed., p705, Kyo-Hak Publishing Co., Ltd. Seoul, 2002）。
【００１８】
Secale cereale L.（ライムギ）の種子は、主成分としてデンプンを７０％、たんぱく質を１２％、脂肪を２％、無機成分を１．７％含むと報告されている。プロラミンとグルテニンが総たんぱく質含有量の４０％以上を占める。
【００１９】
小麦とも称されるTriticum aestivum Lの種子は、内胚乳約８２％、果皮１６％、胚芽２％から構成されると報告されている。内胚乳はデンプン及びグリアジン、グルテニン等のたんぱく質を含有する。また、果皮はセルロース、たんぱく質、灰分を含有する。最後に、胚芽はビタミンＥと、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸等の脂肪酸を含有する。Triticum aestivum L.は韓国漢方では精神安定剤として、又、熱、精神安定、出血を治療する薬剤として使用されてきた。浮小麦は、未成熟な小麦を乾燥させ、水に入れた際に水面に浮かぶ小麦を回収することで得られる（Ahn DK, Illustrated Book of Korean Medicinal Herbs, 5th ed., p727, Kyo-Hak Publishing Co., Ltd. Seoul, 2002）。
【００２０】
Triticum aestivum L.の種子及びその他の中国漢方を含む組成物が胸痛、肩甲骨痛、心疾患に効果的なことが報告されている（韓国特許公報第１０−２０００−００３３２８７号）。しかしながら、主成分としてのイネ科植物抽出物の、虚血性疾患と退行性脳疾患に対しての治療有効性に関しては、参照により本願に組み込まれるところの上記で引用の文献のいずれにも記載又は開示されていない。
【００２１】
本発明のこれら及びその他の目的は、以下に記載の本発明の詳細な開示から明らかとなる。
【発明の開示】
【００２２】
虚血性及び退行性脳疾患の一因は、壊死に加え、それぞれの臓器における細胞のアポトーシスである。従って、アポトーシスを阻害可能な医薬品組成物を用いて、虚血性及び退行性脳疾患を予防及び治療することが可能である。よって、アポトーシスの阻害による、虚血性疾患及び退行性脳疾患の予防と治療に効果的であり、同時に毒性問題を有さない医薬品組成物を開発することが重要である。
【００２３】
本発明は、製剤的に許容可能な担体又はアジュバントを含み、又、有効成分としてイネ科植物の未精製抽出物または精製画分を含む医薬品組成物を提供し、この組成物はアポトーシスを阻害することで虚血性疾患及び退行性脳疾患を防止することができる。
【００２４】
また、本発明は医薬品組成物を製造するための、上記のイネ科植物の未精製抽出物又は精製画分の使用を提供するものであり、この医薬品組成物はアポトーシスを阻害することで虚血性疾患及び退行性脳疾患を防止することができる。
【００２５】
また、本発明は、アポトーシスの阻害により虚血性疾患及び退行性脳疾患を予防又は改善するための、上述のイネ科植物の未精製抽出物又は精製画分を含むヘルスケア食品又は食品添加物を提供するものである。
【００２６】
本願で開示の「虚血性疾患」という用語は、心筋梗塞、脳梗塞、虚血性急性腎不全、虚血性急性肝不全、糖尿病性の足壊疽、糖尿病性ネフロパシー、及び外科手術の副作用によって引き起こされる虚血性疾患又は臓器／組織障害等の様々な虚血性疾患を含む。
【００２７】
本願で開示の「外科手術の副作用によって引き起こされる虚血性疾患」という用語は、虚血性心不全、虚血性腎不全、虚血性肝不全、又は虚血性脳卒中を含む。
【００２８】
本願で開示の「外科手術の副作用によって引き起こされる臓器／組織障害」という用語は、臓器手術、臓器移植、又は事故により切断された身体部位の再連結を行う際の虚血−再かん流によって引き起こされる障害を意味する。
【００２９】
上述の「臓器／組織」という用語は、腎臓、肝臓、膵臓、肺又は心臓等の内臓、及び足、手、指又は耳等の外部器官を含む。
【００３０】
本願で開示の「退行性脳疾患」という用語は、アルツハイマー型認知症（アルツハイマー病）、血管性認知症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病、又は脊髄損傷等の様々な退行性脳疾患を含む。
【００３１】
本願で開示の「イネ科植物」という用語は、Triticum aestivum L.、浮Triticum aestivum L.、Secale cereale L.、玄米、Horden vulgare L.、麦芽、Avena sativa L.、Zea mays L.、Sorghum bicolor MOENCH、Coix lacryma-jobi var. mayuen STAPF、Panicum miliaceum L.又はSetaria italica Beauv.等の様々なイネ科植物を含む。
【００３２】
本願で開示の「未精製抽出物」という用語は、植物材料を水、メタノール、エタノール等の低級アルコール、またはその混合物、好ましくは水で抽出することで調製した抽出物を含む。
【００３３】
また、本願で開示の「精製画分」という用語は、以下の工程を含む処理によって調製したイネ科植物から単離された精製画分を含む。工程１：水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の強塩基の添加によりイネ科植物の未精製抽出物をｐＨ７とｐＨ１２に調整する。工程２：当量の無極性溶媒を工程１で調製した抽出物に添加することでイネ科植物の未精製抽出物中の無極性物質を除去し、その水溶性抽出物を得る。工程３：工程２で調製した水溶性抽出物を、当量のブタノール等の低級アルコールを添加することによる抽出及び分画に供して本発明の４つの精製画分を得る。つまり、ｐＨ１２の抽出物から単離したブタノール可溶性画分と水溶性画分（以下、それぞれＨ１２ＢｕとＨ１２ＷＡと称する）、ｐＨ７の抽出物から単離したブタノール可溶性画分と水溶性画分であり（以下、それぞれＨ７Ｂｕ及びＨ７ＷＡである）、Ｈ１２Ｂｕが好ましい。
【００３４】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００３５】
本発明のイネ科植物の未精製抽出物又は精製画分は、以下の手順により詳細に調製することが可能である。
【００３６】
まず最初に、本発明のイネ科植物の未精製抽出物は以下の工程により調製することが可能である。例えば、Triticum aestivum L.、浮Triticum aestivum L.、Secale cereale L.、玄米、Horden vulgare L.、麦芽、Avena sativa L.、Zea mays L.、Sorghum bicolor MOENCH、Coix lacryma-jobi var. mayuen STAPF、Panicum miliaceum L.又はSetaria italica Beauv.を乾燥、切断、圧搾したあと、体積で１−１５倍、好ましくは約５−１０倍の蒸留水、メタノール、エタノール、ブタノール等の低級アルコール、又は２つの溶媒を約１：０．１１０で好ましくは水を一方の溶媒とした混合物と混合する。抽出対象の原料を含有する溶液を２０−１００℃、好ましくは５０−１００℃の温水で０．５−４８時間、好ましくは１−２４時間かけて、温水抽出、冷水抽出、還流抽出、超音波抽出等の抽出法で１−１２回、好ましくは温水抽出で３−４回連続して処理する。抽出物を濾過した後、濾液をロータリーエバポレータで２０−１００℃、好ましくは４０−７０℃で濃縮し、その後、濃縮した濾液を真空凍結乾燥、熱風乾燥、または噴霧乾燥して本発明のイネ科植物の乾燥未精製抽出物粉末を得る。この粉末は水、低級アルコール、又はその混合物に可溶である。
【００３７】
第二に、本発明のイネ科植物の精製画分は以下の工程により調製し得る。例えば、上述の工程で調整したイネ科植物の未精製抽出物、好ましくは未精製の水による抽出物を元々の体積の約１／５−１／２０、好ましくは１／１０に濃縮して、濃縮抽出物を得る。次に、濃縮抽出物を２つの群に等分し、水酸化ナトリウム等の強塩基を用いて一方の群をｐＨ１２に、もう一方をｐＨ７に調整し、続いて当量の酢酸エチルを各群に添加する。各群の濃縮抽出物層と酢酸エチル層とを強く振って混合した後、再度分離して各群の酢酸エチル層を除去、残りの濃縮抽出物層（水溶性画分）を回収する。次に、当量の水飽和ブタノールを各群の水溶性画分に添加し、各群の水溶性画分とブタノール層とを強く混合した後、再度分離して各群の水溶性画分とブタノール可溶性画分との双方を回収する（つまり、ｐＨ１２群とｐＨ７群）。次に、ｐＨ１２群のブタノール可溶性画分と水溶性画分とをまず最初にｐＨ７に中和し、次に濃縮、乾燥させてＨ１２ＢｕとＨ１２ＷＡ画分をそれぞれ得る。次に、ｐＨ７群のブタノール可溶性画分と水溶性画分とを濃縮、乾燥させてＨ７ＢｕとＨ７ＷＡ画分とをそれぞれ得る。上述の濃縮と乾燥工程には、ロータリーエバポレータによる濃縮と、凍結乾燥装置による乾燥をそれぞれ伴う。
【００３８】
本発明の目的は、アポトーシスによって引き起こされる、哺乳類及び人間における虚血性疾患及び退行性脳疾患の予防と治療のための治療薬の調製のための、上述した方法を用いて調製したイネ科植物の未精製抽出物又は精製画分の使用を提供するものである。
【００３９】
本発明の目的は、アポトーシスによって引き起こされる、哺乳類及び人間における虚血性疾患及び退行性脳疾患を予防及び治療する方法を提供するものであり、上述の方法により調製した有効量のイネ科植物の未精製抽出物又は精製画分をその製剤的に許容可能な担体と共に投与することを含む。
【００４０】
上述の手順で調製したイネ科植物の未精製抽出物又は精製画分の活性は、試験管内及び生体内実験によって試験され、試験管内実験において、低酸素状態のヒト肝細胞癌細胞がイネ科植物の未精製抽出物の薬能により改善されることは、トリパンブルー排除試験及びＭＴＴ試験により示されており、低酸素状態下における抽出物による細胞の改善は、細胞のアポトーシスの阻害により生じたものであり、これはＤＮＡ断片化試験により示された。加えて、イネ科植物であるTriticum aestivum L.の精製画分の薬能はＭＴＴ試験により示された。虚血性疾患に罹患した適切なラットモデルを使用した生体内実験により、Triticum aestivum L.の未精製抽出物と精製画分が心筋梗塞、脳梗塞及び虚血性急性腎不全を予防する薬能が示された。また、Triticum aestivum L.の未精製抽出物がアルツハイマー病における記憶障害を予防する薬能を有することが、アミロイド誘発ラットモデルを用いて示された。加えて、長期間にわたって安全に使用可能なことから、本発明の抽出物は疾患の予防目的で使用可能である。
【００４１】
従って、上述の方法で調製したイネ科植物の未精製抽出物又は精製画分は、虚血性疾患及び退行性脳疾患の予防と治療のための医薬品組成物の調製における有効成分として使用可能である。本発明の組成物は、補足的に、当該分野で慣用的に用いられる適切な担体、アジュバント又は希釈剤を含んでいてもよい。適切な担体、アジュバント又は希釈剤は特定の材料に限定されず、用途と適用方法に応じて選択することができる。適切な希釈剤はRemington's Pharmaceutical Science（Mack Publishing Co., Easton PA）に記載されている。
【００４２】
以下に製剤方法を示すが、これらは模範的な例にすぎず、本発明を制限するものでは全くない。
【００４３】
イネ科植物の未精製抽出物又は精製画分を有効成分として含む本発明の医薬品組成物には、乳糖、デキストロース、蔗糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱物油等の製剤的に許容可能な担体、アジュバント又は希釈剤も含有させることが可能である。処方には、補足的に増量剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、着香剤、乳化剤、保存料その他を含めてもよい。
【００４４】
本発明の組成物は、当該分野で周知のいずれの手順を用いて、患者への投与後に有効成分を迅速、徐放性、又は遅延性で放出するように処方してもよい。例えば、本発明の組成物は油類、プロピレングリコール、又は注射剤を製造する際に一般的に使用するその他の溶剤に溶解させることが可能である。
【００４５】
適切な担体の例には、生理食塩水、ポリエチレングリコール、エタノール、植物性油、ミリスチン酸イソプロピルその他が含まれるが、これらに限定はされない。局所的投与の場合、本発明の抽出物を軟膏やクリームの形態で処方することが可能である。
【００４６】
本発明の組成物を含有する医薬品製剤は、経口投薬形状（粉末、錠剤、カプセル、ソフトカプセル、水薬、シロップ、エリキシル剤、丸薬、粉末、サシェ剤、顆粒）、又は局所用調合物（クリーム、軟膏、ローション、ゲル、バーム、パッチ、ペースト、散布剤、エアロゾル等）、又は注射剤（水溶液、懸濁液、エマルジョン）等のいずれの形状で調製してもよい。
【００４７】
薬剤投与形態での本発明の組成物は、その製剤的な観点からみて許容範囲にある塩として使用してもよく、又、その他の製剤的に活性な化合物と組み合わせての使用はもちろん、単体で使用しても適当なものと組み合わせての使用であってもよい。
【００４８】
本発明の抽出物または組成物の望ましい投与量は、患者の状態や対象の体重、疾患の重症度、剤形、投与経路、投与期間によって異なり、当業者が選択してもよい。しかしながら、望ましい効果を得るためには、本発明の抽出物又は組成物を体重/日あたり、１０■／ｋｇ、好ましくは０．１−１０００■／ｋｇ投与することが一般的に勧められる。一日一回投与しても、何回かにわけて投与してもよい。
【００４９】
本発明の医薬品組成物は、哺乳類（ラット、マウス、家畜または人間）等の被験動物に様々な経路で投与することができる。全ての投与経路が考えられるが、例えば、経口投与、直腸投与、静脈内投与、筋肉投与、皮下投与、皮内投与、鞘内投与、硬膜外投与、または脳室内投与が挙げられる。
【００５０】
また、本発明は、アポトーシスによって引き起こされる虚血性疾患又は退行性脳疾患の予防と改善のための、食品学的に許容可能な添加物と共にイネ科植物の未精製抽出物又は精製画分を有効成分として含む、ヘルスケア食品を提供する。
【００５１】
本願で開示の「ヘルスケア食品」という用語には栄養補助食品、栄養補給食品、食品又は食品添加物を含む。
【００５２】
本発明のヘルスケア食品は、組成物の総重量に対し、上記の未精製抽出物又は精製画分を０．０１−９５重量％（好ましくは１−８０％）含む。
【００５３】
上記記載のヘルスケア食品は健康機能性食品及び健康飲料等を含み、粉末、顆粒、錠剤、チュアブル錠、カプセル、飲料等として使用してもよい。上述のイネ科植物の抽出物を含有する健康機能性及び健康飲料は、虚血性疾患及び退行性脳疾患の予防及び改善に使用することができる。
【００５４】
健康飲料は、一般的に、健康飲料組成物１００■あたり上記未精製抽出物又は精製画分を０．０２−５ｇ（好ましくは０．３−１ｇ）含んでいてもよい。特定の比率での未精製抽出物に加え、本発明の健康飲料組成物は、従来の飲料で使用している様々な着香料又は天然糖類を含有していてもよく、制限はされない。上記記載の着香料の例としては、ソーマチン、ステビア抽出物（レバウディオサイドＡ、グリシルリジン等）等の天然着香料、及びサッカリン、アスパルテーム等の合成着香料等が挙げられる。上述の天然糖類の例としては、グルコース、果糖等の単糖類；麦芽糖、蔗糖等の二糖類；デキストリン、シクロデキストリン等の一般的な糖；キシリトール、エリスリトール等の糖アルコールが例として挙げられる。健康飲料は、一般的に、健康飲料組成物１００ｍｌあたり上記天然糖類を約１−２０ｇ（好ましくは５−１２ｇ）含んでいてもよい。
【００５５】
上記記載の成分に加え、本発明の組成物は様々な栄養素、ビタミン、ミネラル（電解質）、合成及び天然着香料、着色料、品質改良剤（チーズ及びチョコレート等の場合）、ペクチン酸およびその塩、アルギニン酸およびその塩、有機酸、保護コロイド粘着剤、ｐＨ調整剤、安定剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料等で使用される炭酸化剤も含有していてもよい。本発明の組成物は、天然フルーツジュース、果汁飲料、野菜飲料を製造するために果肉も含有していてもよく、成分は独立して使用しても組み合わせて使用してもよい。成分の比率はあまり重要ではないが、通常、本発明の組成物１００ｗ／ｗ％に対して約０−２０ｗ／ｗ％である。
【００５６】
こういったものを添加する、上述の抽出物を含有する食品としては様々な食品、飲料、ガム、複合ビタミン剤、健康促進食品等が挙げられる。
【００５７】
それに加え、本発明の組成物は、クエン酸、フマル酸、アジピン酸、乳酸、リンゴ酸等の有機酸、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ピロリン酸塩、ポリリン酸塩等のリン酸塩、ポリフェノール、カテキン、トコフェノール、ローズマリー抽出物、ビタミンＣ、緑茶抽出物、甘草抽出物、キトサン、タンニン酸、フィチン酸等の天然抗酸化剤を１つ以上含んでいてもよい。
【００５８】
上記記載の本発明の抽出物は２０−９０％の高濃度液体、粉末、又は顆粒タイプであってもよい。
【００５９】
同様に、上記記載の本発明の抽出物は、乳糖、カゼイン、デキストロース、グルコース、蔗糖、及びソルビトールの１つ以上を更に含むことが可能である。
【００６０】
本発明の独創的な抽出物に毒性はなく、故に悪影響をもたらさず、安全に使用することが可能である。
【００６１】
本発明の精神又は範囲から外れることなく、本発明の組成物、その使用および調製に様々な改良や変更を加えうることは当業者には自明である
【００６２】
本発明のイネ科植物の抽出物は、虚血性疾患の動物モデルの梗塞部体積を低下させ、又、脳への損傷を予防し、アルツハイマー病の動物モデルの記憶を増強した。双方共にアポトーシスの阻害によるものである。抽出物は長期間摂取しても副作用がないことから、虚血性疾患又は退行性脳疾患を予防及び治療するための治療薬又はヘルスケア食品として使用することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
本発明の目的及び範囲から逸脱することなく、本発明の組成物、使用および調製に様々な改良や変更を加えうることは当業者には自明である。
【００６４】
本発明を以下の実施例を用いてより詳細に説明するが、いかなる方法によっても本発明はこれらの実施例に制限されるものではないことに留意しなくてはならない。
【００６５】
以下の参考例、実施例、および実験例は本発明をより詳しく説明するためのものであり、その範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００６６】
実施例１：イネ科植物の未精製抽出物の調製
市場で購入した１００ｇのTriticum aestivum L.を洗浄し、２Ｌの水と混合し、漢方用の電気抽出ポットを用いて２回抽出した（Daewoong製漢方薬電気抽出ポットDWP‐2000、Daewoong社）。抽出物を濾過して２Ｌの濾過抽出物を得た後、抽出物を凍結乾燥させ、Triticum aestivum L.の乾燥未精製抽出物を２２ｇ得る。以下、この抽出物をＨＹ６２２８と称する。
【００６７】
上述と同一の抽出法をその他の薬草にも適用し、１００ｇあたり８ｇのSecale cereale L.、６ｇのHorden vulgare L.、１１ｇの麦芽、１８ｇの浮Triticum aestivum L.、２０ｇの玄米、４４ｇのAvena sativa L.、９ｇのZea mays L.、１０ｇのSorghum bicolor MOENCH、１４ｇのCoix lacryma-jobi var. mayuen STAPF、３２ｇのPanicum miliaceum L.及び６ｇのSetaria italica Beauv.の未精製抽出物をそれぞれ得た。各抽出物を以下、それぞれＨＹ６２２８Ｂ、ＨＹ６２２８Ｃ、ＨＹ６１１３、ＨＹ６１３８、ＨＹ６２２８Ａ、ＨＹ６２２８Ｉ、ＨＹ６２２８Ｆ、ＨＹ６２２８Ｅ、ＨＹ６２２８Ｇ、ＨＹ６２２８Ｄ、及びＨＹ６２２８Ｈと称する。
【００６８】
実施例２：イネ科植物の精製画分の調製
実施例１で調製したTriticum aestivum L.の未精製抽出物２Ｌを減圧下でロータリーエバポレータで２００■（未精製抽出物の１／１０）にまで濃縮した。濃縮サンプルを２つの群に分割し、双方の群を水酸化ナトリウムを用いてｐＨ１２とｐＨ７に調整した。上記で調製したｐＨ調整後の各サンプルを当量の酢酸エチルと強く混合し、酢酸エチル画分と水溶性画分とに分割した。水溶性画分を回収し、当量のブタノールと強く混合し、ブタノール画分と水溶性画分とに分離した。上述の工程と同一の手順を３回繰り返し、それぞれ３００■のブタノール画分を回収した。
【００６９】
ｐＨ１２に調整した抽出物から得たブタノール画分と水溶性画分とをｐＨ７に中和、濃縮し、Triticum aestivum L.のブタノール可溶性画分を０．４ｇ（以下、Ｈ１２Ｂｕと称する）、水溶性画分を２ｇ（以下、Ｈ１２ＷＡと称する）をそれぞれ得た。ｐＨ７に調整された抽出物から得たブタノール画分と水溶性画分を直接濃縮して、Triticum aestivum L.のブタノール可溶性画分を０．１ｇ（以下、Ｈ７Ｂｕと称する）と水溶性画分を２ｇ（以下、Ｈ７ＷＡと称する）をそれぞれ得た。
【００７０】
参考例１：実験動物
体重２５０−３００ｇの雄のＳＤラット（Hyochang Science社、韓国）を温度（２１±１℃）で１２時間明暗サイクル、食料と水は自由摂取させて飼育した。実験に先立って、実験動物に１０分間にわたって取り扱った。
【００７１】
実験例１：イネ科植物の未精製抽出物が細胞生存率に与える改善効果の測定（試験管内）
イネ科植物の未精製抽出物が低酸素及び正常酸素条件下のＨｅｐＧ２細胞生存率に与える改善効果を求めるため、低酸素及び正常酸素条件下の生存細胞数を、文献に記載の修正トリパンブルー染色排除試験に従って、培地における濃度が様々に異なるＨＹ６２２８で測定した（Sambrook J and Russel DW, Molecular Cloning 3rd ed., Vol.3, A8.6-8.8, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001）。
【００７２】
ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝細胞癌細胞株、ＡＴＣＣ ＨＢ ８０６５、２ｘ１０５細胞／８００■）を１２ウェルプレートの各ウェルに播種し、ＥＭＥＭ（イーグルの最少必須培地、Invitrogen社、米国）で、ペニシリンＧナトリウム（１００単位／Ｌ、Invitrogen社、米億）、硫酸ストレプトマイシン（１００ｍｇ／Ｌ、Invitrogen社、米国）と１０％（ｗ／ｖ）ウシ胎児血清（Invitrogen社、米国）を補給して、５％ＣＯ２−９５％空気の培養装置内で温度３７℃で４８時間にわたって培養した。培地を新鮮なものと交換した後、５０％エタノールに溶解させたＨＹ６２２８の濃度０（ネガティブコントロール）、１００、１０００■／■で、低酸素（３％酸素濃度）と正常酸素条件下で、２日間にわたって生存細胞数を測定した。
【００７３】
培地を除去し、細胞をＰＢＳ溶液（リン酸緩衝生理食塩水）で一度洗浄し、次にトリプシン処理した。細胞を遠心分離機で回収し、新鮮な培地に再懸濁させて細胞懸濁液を調製した。懸濁液を同一容量の０．４％トリパンブルー溶液と混合した（Invitrogen社、米国）。５分後、それぞれ青色に染色された細胞を死細胞、非染色細胞を生存細胞とみなして、生存細胞数を血球計算板を用いて数えた。図１に図示されるように、低酸素条件下での培養１日後、ネガティブコントロール群（コントロール）では大半の細胞が死滅し（比率＝０）、１０００■／■の本発明の抽出物（ＨＹ６２２８）で処理した細胞はその大半がまだ生存していた（比率＞０）。図２に示されるように、１０００■／■のＨＹ６２２８で処理した細胞の増殖率は、正常酸素条件下のコントロール群の増殖率と同様であった。結果は、ＨＹ６２２８が、たとえ濃度が１０００■／■であっても正常酸素条件下での細胞増殖を阻害することなく、低酸素条件下での細胞生存率を著しく向上させることを示す。
【００７４】
実施例１で調製したＨＹ６２２８Ａ、ＨＹ６２２８Ｂ、ＨＹ６２２８Ｃ、ＨＹ６１１３、ＨＹ６１３８、ＨＹ６２２８Ｉ、ＨＹ６２２８Ｆ、ＨＹ６２２８Ｅ、ＨＹ６２２８Ｇ、ＨＹ６２２８Ｈ及びＨＹ６２２８Ｄが低酸素条件下で培地のＨｅｐＧ２細胞生存率に与える改善効果を調査するために、若干の修正を加えて、前述したようにＭＴＴ試験を行った(Hoffman RM, In Cell Biology (Celis JE(Ed.), Vol.1, pp369-370, Academic Press, New York, 1994）。
【００７５】
ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝細胞癌細胞株、ＡＴＣＣ ＨＢ ８０６５、２ｘ１０５細胞／８００■）を１２ウェルプレートの各ウェルに播種し、ＥＭＥＭ（イーグルの最少必須培地、Invitrogen社、米国）で、ペニシリンＧナトリウム（１００単位／Ｌ、Invitrogen社、米国）、硫酸ストレプトマイシン（１００ｍｇ／Ｌ、Invitrogen社、米国）と１０％（ｗ／ｖ）ウシ胎児血清（Invitrogen社、米国）を補給して、５％ＣＯ２−９５％空気の培養装置内で温度３７℃で４８時間にわたって培養した。次に、実施例１で調製し、５０％エタノールに溶解させた各ＨＹ６２２８Ａ、ＨＹ６２２８Ｂ、ＨＹ６１１３、ＨＹ６１３８、ＨＹ６２２８の未精製抽出物１０００■／■を、培地に添加した。同時に、細胞生存率を改善すると示された１０■／■のＧ４１８（Invitrogen社、米国）も別に加え、ポジティブコントロール（ポジティブ）として用いた。低酸素条件下での４８時間にわたる培養後、細胞生存率をＭＴＴ試験で測定した（図３）。
【００７６】
加えて、実施例１で調製され、５０％のエタノールと５０％のグリセリンに溶解し、最終濃度をエタノール０．５％／グリセリン０．５％とした各ＨＹ６２２８Ｃ、ＨＹ６２２８Ｄ、ＨＹ６２２８Ｅ、ＨＹ６２２８Ｆ、ＨＹ６２２８Ｇ、ＨＹ６２２８Ｈ及びＨＹ６２２８Ｉの未精製抽出物も培地に添加した。低酸素条件下での４８時間にわたる培養後、細胞生存率をＭＴＴ試験で測定した（図４）。
【００７７】
図３に示されるように、玄米（ＨＹ６２２８Ａ）、Secale cereale L.（ＨＹ６２２８Ｂ）、麦芽（ＨＹ６１１３）、及び浮Triticum aestivum L.（ＨＹ６１３８）の未精製抽出物はTriticum aestivum L.（ＨＹ６２２８）と同じぐらい、低酸素条件下における細胞生存率を改善した。
【００７８】
図４に示されるように、Coix lacryma-jobi var.mayuen STAPF（ＨＹ６２２８Ｇ）、Zea mays L.（ＨＹ６２２８Ｆ）、Sorghum bicolor MOENCH（ＨＹ６２２８Ｅ）、Panicum miliaceum L.（ＨＹ６２２８Ｄ）、Horden vulgare L.（ＨＹ６２２８Ｃ）、Avena sativa L.（ＨＹ６２２８Ｉ）、Setaria italica Beauv.（ＨＹ６２２８Ｈ）の未精製抽出物も、低酸素条件下での細胞生存率を強力に向上させた。
【００７９】
本発明の未精製抽出物の中でもTriticum aestivum L.（ＨＹ６２２８）とSecale cereale L.（ＨＹ６２２８Ｂ）の未精製抽出物が細胞生存率を最も向上させた。
【００８０】
要約すると、Triticum aestivum L.の未精製抽出物により動物モデルにおける虚血性疾患と退行性脳疾患の予防と治療が可能ならば、Triticum aestivum L.と同じイネ科に属するSecale cereale L.、玄米、麦芽、及び浮Triticum aestivum L.、Coix lacryma-jobi var.mayuen STAPF、Zea mays L.、Sorghum bicolor MOENCH、Panicum miliaceum L.、Horden vulgare L.、Avena sativa L.、Setaria italica Beauv.の未精製抽出物も疾患に対して同様の有効性を示すと結論づけることができる。
【００８１】
実験例２：Triticum aestivum L.の未精製抽出物が低酸素条件下でアポトーシスに与える阻害効果（試験管内）
ＨＹ６２２８が低酸素条件下での細胞生存率をいかにして改善するかのメカニズムを特定するために、引用文献で開示の手順に若干の修正を加えたものに従ってＤＮＡ断片化試験を行った（Yoshida A et al., In Apotosis: A practical approach, Studzinski GP (Ed.), pp47-48, Oxford University Press, New York, 1999）。
【００８２】
ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝細胞癌細胞株、ＡＴＣＣ ＨＢ ８０６５、１ｘ１０６細胞／４■）を６０■シャーレに播種し、ＥＭＥＭ（イーグルの最少必須培地、Invitrogen社、米国）で、ペニシリンＧナトリウム（１００単位／Ｌ、Invitrogen社、米国）、硫酸ストレプトマイシン（１００ｍｇ／Ｌ、Invitrogen社、米国）と１０％（ｗ／ｖ）ウシ胎児血清（Invitrogen社、米国）を補給して、５％ＣＯ２−９５％空気の培養装置内で温度３７℃で４８時間にわたって培養した。培地を新鮮なものと交換した後、ＤＮＡ断片化試験を実施例１で調製し５０％エタノールに溶解させたHY６２２８濃度０（ネガティブコントロール）と４００■／■で、低酸素（酸素濃度３％）と正常酸素条件下で２日間にわたって行った。
【００８３】
この結果、ＨＹ６２２８は、ネガティブコントロールと比較して、細胞生存率を効果的に向上させ（図５を参照のこと）、ＤＮＡラダーの出現を遅延させた（図７）。従って、ＨＹ６２２８が、アポトーシスを阻害することで、低酸素条件下の細胞生存率を改善すると結論づけることが可能である。
【００８４】
実験例３：Triticum aestivum L.から単離した精製画分が細胞生存率に与える改善効果（試験管内）
実施例２で調製したＨＹ６２２８から単離した精製画分の効果を調査するため、引用文献で開示の手順に若干の修正を加えたものに従ってＭＴＴ試験を行った（Hoffman RM, In Cell biology (Celis JE (Ed.)), Vol.1, pp369-370, Academic Press, New York, 1994）。
【００８５】
ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝細胞癌細胞株、ＡＴＣＣ ＨＢ ８０６５、２ｘ１０５細胞／８００■）を１２ウェルプレートに播種し、ＥＭＥＭ（イーグルの最少必須培地、Invitrogen社、米国）で、ペニシリンＧナトリウム（１００単位／Ｌ、Invitrogen社、米国）、硫酸ストレプトマイシン（１００ｍｇ／Ｌ、Invitrogen社、米国）と１０％（ｗ／ｖ）ウシ胎児血清（Invitrogen社、米国）を補給して、５％ＣＯ２−９５％空気の培養装置内で温度３７℃で４８時間にわたって培養した。培地を新鮮なものに交換した後、実施例２で調製し、ＤＭＳＯ（ブタノール可溶性画分の場合）又は５０％エタノール（水溶性画分の場合）に溶解させたHY６２２８から単離した精製画分を１００■／■又は１０００■／■含有する培地で細胞を処理し試験群とし、添加していない群をネガティブコントロール群とした。細胞生存率を改善すると周知の１０■／■のＧ４１８（Invitrogen社、米国）で処理した群をポジティブコントロール群とみなした。群を５％ＣＯ２−９５％空気制御した培養装置内で３７℃で４８時間にわたって培養し、細胞をＭＴＴ試験に供した。
【００８６】
図８に示されるように、実施例２で調製した１０００■／■のＨ７ＷＡとＨ７Ｂｕで処理した試験群は、低酸素条件下での細胞生存率を若干改善し、実施例２で調製した１０００■／■のＨ１２Ｂｕは、低酸素条件下での細胞生存率を若干改善した。一方、実施例２で調製した１０００■／■のＨ１２ＷＡは細胞生存率に何の効果も及ぼさなかった。従って、Ｈ１２Ｂｕ画分が細胞の生存率に対して強い改善効果を示す有効成分で強化されていることが確認された。
【００８７】
実験例４：腹腔内投与したTriticum aestivum L.の未精製抽出物が心筋梗塞に与える効果（生体内）
腹腔内投与したＨＹ６２２８の心筋梗塞への治療有効性を、文献で挙げられている手順に従って動物モデルを用いて求めた（Haisong J et al., Circulation, 97, pp892-899,1998）。
【００８８】
参考例１で準備したＳＤラットをケタミン（Yuhan社、韓国）１０■／■とキシラジン（Sigma社、米国）５■／■で麻酔し、気管挿管した。第三、第四肋骨の切除により開胸した後、心臓を肋間内側から取り出した。左冠状動脈を５−０プロレン糸で結紮し、心臓を胸部に戻した。皮下組織及び皮膚を縫合し、心筋梗塞動物モデルを完成させた。
【００８９】
実施例１で調製したＨＹ６２２８を心筋梗塞動物モデルに注入し、心筋梗塞部のサイズを測定した。安全かつ効果的な注入投与量を求めるために、試験は実験例１の結果に基づいた最低量から開始し、倍加投与法を用いて段階的に投与量を増大させ、例えば、投与量を５０、１００−２００■／■の順で増加した。
【００９０】
左冠状動脈の結紮の１時間前に、１■のＨＹ６２２８又はビークルをそれぞれ投与量４００■／■で腹腔内注入した。虚血から３日後、取り出した心臓をＴＴＣ（２，３，５−塩化トリフェニルテトラゾリウム、Sigma社、米国）溶液で染色し、梗塞部位の体積を画像分析システム（Qunatity One 4.2、Bio-Rad社、米国）で測定した。ビークル処理群とＨＹ６２２８処理群についてのＴＴＣ染色した心臓の断面例が図１０、１１にそれぞれ示されている。
【００９１】
有効性は、数式１で計算した虚血指数（％）で比較した。
【００９２】
（数式１）
虚血指数（％）＝Ａ／Ｂ×１００
であり、Ａ：心臓の梗塞部体積（■）、Ｂ：心臓の総体積（■）である。
【００９３】
ＨＹ６２２８処理群（ｎ＝７）の虚血指数（％）は１．８％、一方、ビークル処理群（ｎ＝６）の虚血指数は４．９％であり、ＨＹ６２２８が梗塞部のサイズを強力に減少させることを示す（６３％、ｐ＜０．０１）。従って、ＨＹ６２２８を腹腔内投与した場合、心筋梗塞の治療に効果的である。
【００９４】
実験例５：経口投与したTriticum aestivum L.の未精製抽出物が心筋梗塞に与える効果（生体内）
経口投与したＨＹ６２２８の心筋梗塞への治療有効性を、文献で挙げられている手順に従って動物モデルを用いて求めた（Haisong J et al., Circulation, 97, pp892-899,1998）。
【００９５】
参考例１で準備したＳＤラットにＨＹ６２２８を混ぜた（４００■／■）を餌を３日間与え、次に、左冠状動脈を結紮して虚血状態を誘発させた。虚血から３日後、心臓を取り出し、ＴＴＣ溶液で染色し、梗塞部位の体積を画像分析システム（Qunatity One 4.2、Bio-Rad社、米国）で測定した。数式１により虚血指数（％）を計算し、ＨＹ６２２８の有効性を比較した。加えて、心臓の薄片をヘマトキシリン及びエオシン（Sigma社、米国）で染色し、心臓組織への損傷を顕微鏡により細胞レベルで観察した。
【００９６】
ＨＹ６２２８処理群（ｎ＝１０）の虚血指数（％）は０．４６％、一方、ビークル処理群（ｎ＝４）の虚血指数は４．６％であり、ＨＹ６２２８が梗塞部のサイズを強力に減少させることを示す（９０％、ｐ＜０．００１）（図１２）。また、ヘマトキシリン及びエオシンで染色したところ、ＨＹ６２２８処理群（図１４）では、ビークル処理群（図１３）と比較して細胞損傷が著しく軽減されていた。従って、ＨＹ６２２８を経口投与した場合でも、心筋梗塞の治療に効果的である。
【００９７】
実験例６：経口投与したTriticum aestivum L.の未精製抽出物が脳梗塞に与える効果（生体内）
経口投与したＨＹ６２２８の脳梗塞への治療有効性を、文献で挙げられている手順に若干の修正を加えたものに従って動物モデルを用いて求めた（Han HS et al., J. Neurosci., 22, pp3921-3928, 2002）。
【００９８】
参考例１で準備したＳＤラットをエンフルラン（Choongwae Pharm.社、韓国）で吸引により麻酔した。ラットの首を切開して頚動脈を露出させ、頚動脈及び外頚動脈を結紮した。３−０ナイロン糸を内頚動脈内に挿入し、中大脳動脈（ＭＣＡ）をブロックして虚血状態を誘発させた。０．５■に溶解させた４００ｍｇ／ｋｇのＨＹ６２２８又は同容量のビークルを、虚血状態を誘発させる７日前から１日前まで毎日経口投与した。虚血から２時間後、糸を除去してＭＣＡ血流を回復させた。再かん流から２２時間後、ラットを安楽死させて脳を取り出し、脳組織をＴＴＣ溶液で染色した。ビークル処理群とＨＹ６２２８処理群についてのＴＴＣで染色した脳の断面例が図１６、１７にそれぞれ示されている。
【００９９】
大脳半球における梗塞部位体積を画像分析システム（Qunatity One 4.2、Bio-Rad社、米国）で測定した。有効性は、数式２で計算した梗塞指数（％）で比較した。
【０１００】
（数式２）
虚血指数（％）＝Ａ／Ｂ×１００
であり、Ａ：大脳半球の梗塞部体積（■）、Ｂ：大脳半球の総体積（■）である。
【０１０１】
ＨＹ６２２８処理群（ｎ＝７）の虚血指数（％）は６７％、一方、ビークル処理群（ｎ＝１２）の虚血指数は９３％であり、ＨＹ６２２８が梗塞部のサイズを強力に減少させることを示す（２８％、ｐ＜０．０５）（図１５）。従って、ＨＹ６２２８を経口投与した場合、脳梗塞の治療に効果的である。
【０１０２】
実験例７：腹腔内投与したTriticum aestivum L.の未精製抽出物とブタノール可溶性画分が虚血性急性腎不全に与える効果（生体内）
腹腔内投与したＨＹ６２２８又はＨ１２Ｂｕの虚血性急性腎不全への治療有効性を、文献で挙げられている手順に若干の修正を加えたものに従って動物モデルを用いて求めた（Wang J et al., J. Biol. Chem., 279(19), pp19948-19954, 2004）。
【０１０３】
７−１： Triticum aestivum L.の未精製抽出物が虚血性急性腎不全に与える効果（生体内）
参考例１で準備したＳＤラットをケタミン（Yuhan社、韓国）５０■／■とキシラジン（Sigma社、米国）２０■／■で麻酔し、腹腔を切開した。両方の腎臓を鉗子で止め血流をブロックすることで腎虚血を誘発させ、次に、右腎動脈を除去した。左腎動脈を遮断する１時間前、１■の０．９％生理食塩水に溶解させた４００ｍｇ／ｋｇのＨＹ６２２８又は同容量のビークルを腹腔内投与した。虚血から４５分後、鉗子を除去して再かん流させた。再かん流から２４時間後、血液サンプルを採取し、腎機能の一指標である血清クレアチニンレベル（■／■）を測定した。
【０１０４】
ＨＹ６２２８処理群（ｎ＝７）の血清クレアチニンレベルは２．２■／■、一方、ビークル処理群（ｎ＝４）の血清クレアチニンレベルは３．７■／■であり、ＨＹ６２２８が血清クレアチンレベルを強力に低下させることを示す（４０％、ｐ＜０．０５）（図１８）。この結果は、ＨＹ６２２８がクレアチニンの排出を促進することで血清クレアチニンレベルを下げ、腎臓の損傷の阻害によるものであることを示す。従って、ＨＹ６２２８を腹腔内投与した場合、虚血性急性腎不全の治療に有効である。
【０１０５】
７−２：腹腔内投与したTriticum aestivum L.から単離したブタノール可溶性画分が虚血性急性腎不全に与える効果（生体内）
上記実験例３で有効成分を豊富に含有していると示されたブタノール可溶性画分（Ｈ１２Ｂｕ）を、実験例７−１で用いたものと同一の手順で以下のように腹腔内投与した。
【０１０６】
左腎動脈を鉗子で止める１時間前、１■の０．９％生理食塩水に溶解させた１００ｍｇ／ｋｇのＨ１２Ｂｕ又は同容量のビークルを腹腔内投与した。虚血から４５分後、鉗子を除去して再かん流させた。再かん流から２４時間後、血液サンプルを採取し、血清クレアチニンレベル（■／■）を測定した。
【０１０７】
Ｈ１２Ｂｕ処理群（ｎ＝１０）の血清クレアチニンレベルは１．７■／■、一方、ビークル処理群（ｎ＝６）の血清クレアチニンレベルは３．６■／■であり、Ｈ１２Ｂｕが血清クレアチンレベルを強力に低下させることを示す（５３％、ｐ＜０．０５）（図１９）。この結果は、Ｈ１２Ｂｕもクレアチニンの排出を促進することで血清クレアチニンレベルを下げることを示した。従って、Ｈ１２Ｂｕも、腹腔内投与した場合に虚血性急性腎不全の治療に有効である。
【０１０８】
実験例８：経口投与したTriticum aestivum L.の未精製抽出物がアルツハイマー病に与える効果（生体内）
経口投与したＨＹ６２２８のアルツハイマー病への治療有効性を、文献で挙げられている手順に若干の修正を加えたものに従って動物モデルを用いて求めた（Yamaguchi Y and Kawashima S, Eur. J. Pharmacol., 412, pp265-272, 2001）。
【０１０９】
参考例１で準備したＳＤラットを５０■／■のペントバルビタール（Hanlim Pharm.社、韓国）で麻酔し、次に定位固定装置内に入れた。注入領域の頭皮を切開した。
【０１１０】
次に、ラムダ及びブレグマ点を顕微鏡での観察により特定した後、アミロイド１５ｎｍｏｌ（５■／日）を側脳室に１４日間にわたって注入した。アミロイド（５■）は流量１■／分でシリンジポンプで注入し、注射針は注入後５分間放置した。シャム群（シャム）について、アミロイドの代わりに生理食塩水（５■）を注入したこと以外、同一の手順を適用した。
【０１１１】
アルツハイマー病の誘発後、ラットに４００■／■のＨＹ６２２８（ＨＹ６２２８）又は生理食塩水（コントロール）を１４日間にわたって経口投与して治療し、１週間安静にさせた。８日間にわたり、ラット１匹につき水迷路試験を２４時間ごとに、１日３回の試験を連続的に実施した。水迷路試験は、温度約２２℃の透明な水道水で満たした円形槽（内部寸法：直径１８０ｃｍ、深さ５０ｃｍ）から成る水槽中で行い、避難用プラットフォーム（直径１０ｃｍ、高さ２５ｃｍ）を水面から２■水没させた。ラットの動きをビデオトラッキングシステム（Etho Vision（Ｒ）、Noldus Information Technology社、オランダ・ワーヘニンゲン）により自動録画した。
【０１１２】
試験において、「避難待ち時間」とはラットが水没したプラットフォームを発見、避難するまでにかかる時間と定義され、ラットが水没したプラットフォームに避難してからそこに３０秒を越えて留まった場合に認めるものとする。「平均避難待ち時間」は１日３度の避難試験の平均値である。平均避難待ち時間が９０秒を越える場合は、平均避難待ち時間を９０秒とする。プラットフォームの位置をラットが記憶してるかどうかを試験するために「プラットフォーム（ＰＦ）滞在時間」を行い、ラットがプラットフォーム位置に到着後、そのプラットフォーム位置近辺に留まる時間と定義され、この実験のためにプラットフォームは前もって除去される。ＰＦ滞在時間は２日ごとに、試験日にラットに行う試験の３回目に測定した（例えば、２日目の６回目試験時、４日目の１２回目試験時、６日目の１８回目試験時、８日目の２４回目試験時）。
【０１１３】
避難実験４、５、６、８日目のＨＹ６２２８処理群（ＨＹ６２２８）（ｎ＝４）の平均避難待ち時間はコントロール群（コントロール）（ｎ＝５）と比較して顕著に短縮された（ｐ＜０．０１、図２０）。ＨＹ６２２８とシャム群（ｎ＝４）との間に平均避難待ち時間における顕著な差は見られなかった。従って、ＨＹ６２２８の治療によりアミロイドによって誘発されると思われる記憶障害が予防され、記憶がほぼ正常に維持されることが確認された。
【０１１４】
加えて、ＨＹ６２２８群（ＨＹ６２２８）のＰＦ滞在時間は、避難試験４日目以降、コントロール群（コントロール）より顕著に長かった（ｐ＜０．０１）（つまり、４日目の１２回目試験、６日目の１８回目試験、８日目の２４回目試験。図２１）。こういった結果は全てＨＹ６２２８の摂取によりプラットフォームへの正確な方向を発見するだけでなく、プラットフォーム位置を特定する記憶が改善されることを示している。ＨＹ６２２８の摂取は脳の損傷を予防するのと同様に記憶を改善すると結論づけられる。
【０１１５】
実験例９：毒性試験
方法
ＳＤラット（平均体重３２０±２０ｇ）への急性毒性試験を実施例１のＨＹ６２２８を用いて行った。それぞれ１０匹のラットから成る２つの群にそれぞれ５００ｍｇ／ｋｇのＨＹ６２２８を腹腔内注入、又は生理食塩水に溶解させた５０００ｍｇ／ｋｇのＨＹ６２２８を経口投与し、２４時間にわたって観察した。
【０１１６】
結果
いずれの群においても、死亡率、臨床的徴候、体重変化、および全体の所見に処置による悪影響は見られなかった。これらの結果は、本発明で調製した抽出物が強力でありながらも安全であることを示唆している。
【０１１７】
以下に、製剤方法と賦形剤の種類とを説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。代表的な製剤例は以下に記載のとおりである。
【０１１８】
粉剤の調製
実施例１のＨＹ６２２８  ５０ｍｇ
乳糖  １００ｍｇ
タルク  １０ｍｇ
上記成分を混合して密封容器に充填することで粉剤を調製した。
【０１１９】
錠剤の調製
実施例１のＨＹ６２２８  ５０ｍｇ
コーンスターチ  １００ｍｇ
乳糖  １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム  ２ｍｇ
上記成分を混合、錠剤状にすることで錠剤を調製した。
【０１２０】
カプセルの調製
実施例１のＨＹ６２２８  ５０ｍｇ
コーンスターチ  １００ｍｇ
乳糖  １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム  ２ｍｇ
錠剤は、慣用のゼラチン調製方法で上記成分を混合し、ゼラチンカプセルに充填することで調製した。
【０１２１】
注射剤の調製
実施例１のＨＹ６２２８  ５０ｍｇ
注射用蒸留水  最適量
ｐＨ調整剤  最適量
注射剤は、慣用の注射剤調製法により有効成分を溶解し、ｐＨを約７．５に調整し、２ｍｌのアンプルに全成分を充填して殺菌することで調製した。
【０１２２】
液剤の調製
実施例１のＨＹ６２２８  ０．１−８０ｇ
糖  ５〜１０ｇ
クエン酸  ０．０５−０．３％
カラメル  ０．００５−０．０２％
ビタミンＣ  ０．１−１％
蒸留水  ７９−９４％
ＣＯ２ガス  ０．５−０．８２％
液剤は、慣用の液剤調製法によりまず有効成分を溶解し、全成分を充填し、殺菌することで調製した。
【０１２３】
ヘルスケア食品の調製
実施例１のＨＹ６２２８  １０００ｍｇ
ビタミン混合物  最適量
酢酸ビタミンＡ  ７０■
ビタミンＥ  １．０ｍｇ
ビタミンＢ１  ０．１３ｍｇ
ビタミンＢ２  ０．１５ｍｇ
ビタミンＢ６  ０．５ｍｇ
ビタミンＢ１２  ０．２ｇ
ビタミンＣ  １０ｍｇ
ビオチン  １０■
ニコチン酸アミド  １．７ｍｇ
葉酸  ５０■
パントテン酸カルシウム  ０．５ｍｇ
ミネラル混合物  最適量
硫酸鉄  １．７５ｍｇ
酸化亜鉛  ０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム  ２５．３ｍｇ
リン酸一カリウム  １５ｍｇ
リン酸二カルシウム  ５５ｍｇ
クエン酸カリウム  ９０ｍｇ
炭酸カルシウム  １００ｍｇ
塩化マグネシウム  ２４．８ｍｇ
上記記載のビタミンおよびミネラル混合物には様々な変更を加えてもよく、そういった変更は本発明の精神と範囲から外れるものとはみなされない。
【０１２４】
健康飲料の調製
実施例１のＨＹ６２２８  １０００ｍｇ
クエン酸  １０００ｍｇ
オリゴ糖  １００ｇ
アプリコット濃縮物  ２ｇ
タウリン  １ｇ
蒸留水  ９００■
健康飲料は、慣用の健康飲料調製方法により有効成分を溶解、混合、８５℃で１時間攪拌、濾過、全成分を１０００■のアンプルに充填・殺菌することで調製した。
【０１２５】
本発明の記載より、様々な変更を加えうることは明白である。そういった変更は本発明の精神と範囲から外れるものとはみなされない。また、当業者に自明なそういった改良は全て、以下に述べる請求項の範囲に含まれるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１２６】
本発明で記載のように、本発明のイネ科植物の抽出物は、虚血状態にある動物モデルでの細胞のアポトーシスを阻害することで梗塞部位を軽減する。本発明の抽出物は、副作用を伴うことなく心臓及び脳の損傷を防止し、アルツハイマー病動物モデルにおける記憶を改善する。従って、虚血性疾患又は退行性脳疾患の治療及び予防のための治療薬又はヘルスケア食品として使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
本発明の上記記載又はその他の目的、特徴、及びその他の利点は、添付の図面と共に以下の詳細な記載からより明確に理解されるものである。
【図１】異なる濃度のTriticum aestivum L.の未精製抽出物を成長培地に添加することによる低酸素条件下のＨｅｐＧ２細胞の生存率の改善を示す。
【図２】正常酸素条件下でのＨｅｐＧ２細胞の生存率に異なる濃度のTriticum aestivum L.の未精製抽出物が与える影響を示す。
【図３】ＭＴＴ試験で測定した、異なる濃度のイネ科植物（玄米、Secale cereale L.、麦芽、Triticum aestivum L.、及び浮Triticum aestivum L.）の未精製抽出物を成長培地に添加することによる低酸素条件下のＨｅｐＧ２細胞の生存率の改善を示す。
【図４】ＭＴＴ試験で測定した、異なる濃度のイネ科植物（Coix lacryma-jobi var.mayuen STAPF, Zea mays L.、Sorghum bicolor MOENCH、Panicum miliaceum L.、Horden vulgare L.、Avena sativa L.、Setaria italica Beauv.、Secale cereale L.、Triticum aestivum L.）の未精製抽出物を成長培地に添加することによる低酸素条件下のＨｅｐＧ２細胞の生存率の改善を示す。
【図５】Triticum aestivum L.の未精製抽出物４００■／■の成長培地への添加による、低酸素条件下のＨｅｐＧ２細胞の生存率の改善を示す。
【図６】低酸素条件下のＨｅｐＧ２細胞のＤＮＡ断片化パターンを示す。
【図７】低酸素条件下のＨｅｐＧ２細胞のＤＮＡ断片化にTriticum aestivum L.の未精製抽出物が及ぼす阻害効果。
【図８】ＭＴＴ試験で測定した、異なる濃度のTriticum aestivum L.のブタノール可溶性及び水溶性画分の成長培地への添加による、低酸素条件下のＨｅｐＧ２細胞の生存率の改善を示す。
【図９】心筋梗塞の動物モデルにおける、Triticum aestivum L.の未精製抽出物の腹腔内投与が梗塞部体積に与える阻害効果を示す。
【図１０】生理食塩水を腹腔内投与した場合の、ＴＴＣ（２，３，５−塩化トリフェニルテトラゾリウム）で染色した梗塞心臓の断面例を示す。
【図１１】Triticum aestivum L.の未精製抽出物を腹腔内投与した場合の、ＴＴＣ（２，３，５−塩化トリフェニルテトラゾリウム）で染色した梗塞心臓の断面例を示す。
【図１２】心筋梗塞の動物モデルにおける、Triticum aestivum L.の未精製抽出物の経口投与が梗塞部体積に与える阻害効果を示す。
【図１３】生理食塩水を経口投与した場合の、ヘマトキシリン・エオジン染色した梗塞心臓の薄片例を示す。
【図１４】Triticum aestivum L.の未精製抽出物を経口投与した場合の、ヘマトキシリン・エオジン染色した梗塞心臓の薄片例を示す。
【図１５】脳梗塞の動物モデルにおける、Triticum aestivum L.の未精製抽出物の経口投与が梗塞部体積に与える阻害効果を示す。
【図１６】生理食塩水を経口投与した場合の、ＴＴＣ（２，３，５−塩化トリフェニルテトラゾリウム）で染色した梗塞脳の断面例を示す。
【図１７】Triticum aestivum L.の未精製抽出物を経口投与した場合の、ＴＴＣ（２，３，５−塩化トリフェニルテトラゾリウム）で染色した梗塞脳の断面例を示す。
【図１８】血清クレアチニンレベルの測定による、虚血性急性腎不全の動物モデルにおける、Triticum aestivum L.の未精製抽出物の腹腔内投与が腎障害に与える阻害効果を示す。
【図１９】血清クレアチニンレベルの測定による、虚血性急性腎不全の動物モデルにおける、Triticum aestivum L.のブタノール可溶性画分の腹腔内投与が腎障害に与える阻害効果を示す。
【図２０】水迷路試験を用いて測定した、アルツハイマー病の動物モデルにおける、Triticum aestivum L.の未精製抽出物の経口投与が記憶障害に与える阻害効果を示す。
【図２１】水迷路試験を用いて測定した、アルツハイマー病の動物モデルにおける、Triticum aestivum L.の未精製抽出物の経口投与が記憶に与える改善効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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