(57)【要約】  本発明は、グリセロール分岐のＰＥＧを用いたヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のＰＥＧ化に関する。本発明はまた、ｈＧＨをＰＥＧ化する方法に関する。さらに、本発明は、ＰＥＧ化したｈＧＨを含む医薬組成物に関する。更なる態様は、成長障害及び発達障害の治療のためのＰＥＧ化したｈＧＨの使用である。
2008511610.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造：
【化１】
2008511610.tif 000012
（式中、
ｎは、６０〜７５の間の整数であり；
ｍは、４５０〜４６０の間の整数であり；そして、
Ｒは、ヒト成長ホルモンである）
を有するポリエチレングリコール−ヒト成長ホルモン（ＰＥＧ−ｈＧＨ）結合体。
【請求項２】
前記（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n部分が平均分子量：約３Ｋｄを有し、そして、各々の（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）m部分が平均分子量：約２０Ｋｄを有する、請求項１に記載のＰＥＧ−ｈＧＨ結合体。
【請求項３】
ヒト成長ホルモンが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載のＰＥＧ−ｈＧＨ結合体。
【請求項４】
ＰＥＧが、配列番号１のＮ末端のフェニルアラニンに結合している、請求項３に記載のＰＥＧ−ｈＧＨ結合体。
【請求項５】
前記結合体が、モノＰＥＧ化されている、請求項４に記載のＰＥＧ−ｈＧＨ結合体。
【請求項６】
少なくとも８０％のＰＥＧが、配列番号１のＮ末端のフェニルアラニンのアルファ−アミノ基に結合している、請求項４に記載のＰＥＧ−ｈＧＨ結合体。
【請求項７】
少なくとも９０％のＰＥＧが、配列番号１のＮ末端のフェニルアラニンのアルファ−アミノ基に結合している、請求項５に記載のＰＥＧ−ｈＧＨ結合体。
【請求項８】
少なくとも９５％のＰＥＧが、配列番号１のＮ末端のフェニルアラニンのアルファ−アミノ基に結合している、請求項５に記載のＰＥＧ−ｈＧＨ結合体。
【請求項９】
少なくとも９８％のＰＥＧが、配列番号１のＮ末端のフェニルアラニンのアルファ−アミノ基に結合している、請求項５に記載のＰＥＧ−ｈＧＨ結合体。
【請求項１０】
治療的に有効量の請求項１、２、３、４、５、６、７、８又は９に記載のヒト成長ホルモン−ＰＥＧ結合体を成長障害又は発達障害を患っている患者に投与することを含む、前記患者を治療する方法。
【請求項１１】
前記成長障害又は発達障害が、成長ホルモン欠損症（ＧＨＤ）、ターナー症候群、慢性腎不全、及び妊娠期間の短縮（ＳＧＡ）から成る群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記成長障害又は発達障害が、勃起不全、ＨＩＶリポジストロフィー、線維筋痛、骨粗鬆症、記憶障害、うつ病、クローン病、骨形成異常、外傷性脳損傷、くも膜下出血、ヌーナン症候群、ダウン症候群、特発性小人症（ＩＳＳ）、末期腎不全（ＥＳＲＤ）、極小出生時体重（ＶＬＢＷ）、骨髄系幹細胞救出、メタボリックシンドローム、グルココルチコイドミオパシー、小児のグルココルチコイド処置による小人症、及び早産児のための成長捕捉欠如から成る群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２００４年８月３１日に出願された米国仮出願シリアル第６０／６０５，９４５号に対する合衆国法典第３５巻第１１９条による優先権を主張し、本明細書に記載されているかのように参照により全体として本明細書中に援用される。
【０００２】
発明の分野
［００１］本発明は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の化学的及び／又は生理学的な性質を変化させることができるｈＧＨのＰＥＧ化に関する。ＰＥＧ化したｈＧＨ結合体は、血漿中の停留期間の増加、浄化率の減少、安定性の改善、抗原性の減少、ＰＥＧ化異種性の減少、又はそれらの組み合わせを有することができる。本発明はまた、ｈＧＨを修飾するための方法に関する。さらに、本発明は、修飾したｈＧＨを含む医薬組成物に関する。更なる態様は、成長障害及び発達障害を治療するための修飾したｈＧＨの使用である。
【０００３】
発明の背景
［００２］天然のヒト成長因子（ｈＧＨ）は、２つのジスルフィドブリッジによって架橋された１９１個のアミノ酸の１本鎖を含むタンパク質であって、その単量体の形態は分子量２２ｋＤａを有する。ヒトＧＨは、脳下垂体によって分泌され、組換え遺伝子工学によって生産することもできる。ｈＧＨは、成長可能な全身の組織における成長を引き起こすであろう。ｈＧＨは、ヒトの成長段階における成長促進だけでなく、正常な身体組成、同化、及び脂質代謝の維持においても有用な役割を果たす（Ｋ．Ｂａｒｎｅｉｓ．及びＵ．Ｋｅｌｌｅｒ，Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ  Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｌｏ．Ｍｅｔａｂ．１０：３３７（１９９６））。
【０００４】
［００３］組換えｈＧＨは、数年間で商業的に利用可能となってきた。２つのタイプの治療として有効な組換えｈＧＨ調合剤は、市場に出回っている：認証されたもの、例えば、ゲノトロピン（Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ）（商標）、又はニュートロピン（Ｎｕｔｒｏｐｉｎ）（商標）、及びＮ末端で追加のメチオニン残基を有する類似体、例えば、ソマトノーム（Ｓｏｍａｔｏｎｏｒｍ）（商標）。ｈＧＨは、成長ホルモン欠損（ＧＨＤ）又はターナー症候群としても言及される下垂体機能低下性小人症を患っている患者における線形成長を刺激するために使用されるが、妊娠期間の短縮（ＳＧＡ）によって生まれた小児における成長障害の長期治療、プラダー−ウィリー症候群（ＰＷＳ）、慢性腎不全（ＣＲＩ）、ＡＩＤＳ消耗症、及び加齢の治療を含む他の適応症もまた指示されている。成人のＧＨ欠損（ａＧＨＤ）患者は、種々の問題、例えば、脂肪塊の増加、脂肪のない体及び細胞外液の減少、並びに骨ミネラル密度の減少、脂質の代謝異常、そして、心臓血管機能不全を含む身体組成における特徴的な変化を有する。これらの問題の多くは、ｈＧＨ代謝治療によって改善される（Ｊ．Ｖｅｒｈｅｌｓｔ  Ｊ  ａｎｄ  Ｒ．Ａｂｓ．Ｄｒｕｇｓ．；６２：２３９９（２００２））。
【０００５】
［００４］成長ホルモン（ＧＨ）の主要な生物学的効果は、幼若動物における成長、及び高齢動物における組織維持を促進することである。影響を受ける臓器系は、骨格、結合組織、筋肉、並びに肝臓、腸及び腎臓のような内臓を含む。成長ホルモンは、標的細胞の膜上の特異的受容体との相互作用を介してそれらの効果を発揮する。ｈＧＨは、胎盤性ラクトゲン、プロラクチン、並びに他の遺伝性及び種による変異体又は成長ホルモンを含むホモロガスなホルモンのファミリーのメンバーである（Ｎｉｃｏｌｌ，Ｃ．Ｓ．ら（１９８６）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ７：１６９）。ｈＧＨは、幅広い種特異性を提示し、クローン化した体形成受容体（Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．ら［１９８７］Ｎａｔｕｒｅ  ３３０；３５７）又はプロラクチン受容体（Ｂｏｕｔｉｎ，Ｊ．Ｍ．ら［１９８８］Ｃｅｌｌ；５３：６９）に結合するという点において、これらの中では異常である。ｈＧＨに関してクローニングされた遺伝子は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）において分泌型で発現される（Ｃｈａｎｇ，Ｃ．Ｎ．ら［１９８７］Ｇｅｎｅ  ５５：１８９）、及びそのＤＮＡ及びアミノ酸配列が報告されている（Ｇｏｅｄｄｅｌら［１９７９］Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：５４４；Ｇｒａｙら［１９８５］Ｇｅｎｅ  ３９：２４７）。
【０００６】
［００５］ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、正常なヒトの成長及び発達の制御の大半において関与する。この下垂体ホルモンは、特に、線形成長（体形成）、授乳、マクロファージの活性化、インスリン様及び糖尿病誘発性の効果を含む数多くの生物学的効果を提示する（Ｃｈａｗｌａ，Ｒ．Ｋ．（１９８３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．３４，５１９；Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｃ．Ｋ．ら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９，７６９；Ｔｈｏｍｅｒ，Ｍ．Ｏ．ら（１９８８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８１：７４５）。小児における成長ホルモン欠損は、小人症へと導き、ｈＧＨの外因性投与によって１０年以上首尾よく治療されている。
【０００７】
［００６］成人並びに小児において、ｈＧＨは、窒素保持の増加及び骨格筋成長の刺激、並びに体脂肪の可動によって正常な身体組成を維持する。内臓の脂肪組織は、特にｈＧＨに反応性である。脂肪分解の増加に加えて、ｈＧＨは、体脂肪貯蔵にトリグリセリドの取り込みを減少する。ＩＧＦ−１（インスリン様増殖因子−１）及びＩＧＦＢＰ３（インスリン様増殖因子結合タンパク質３）の血清濃度はｈＧＨによって増加する。
【０００８】
［００７］ｈＧＨは、とりわけ、窒素、リン、カリウム、カルシウムの保持により強力なタンパク質同化剤である。脳下垂体を摘出したラットのＧＨを用いた処置は、ラットの成長速度の少なくとも一部を回復することができる。Ｍｏｏｒｅら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２２：２９２０−２９２６（１９８８）。中でも、下垂体機能低下（ＧＨ欠損）患者における最も顕著な効果は、身長の増大に起因する骨−成長−皿−軟骨の線形成長の加速である。Ｋａｐｌａｎ，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｉｎ  Ｃｈｉｌｄｒｅ  ａｎｄ  Ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｓ（Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＩＬ：Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｃ．Ｔｈｏｍａ，１９６４）。
【０００９】
［００８］ｈＧＨは、種々の動物モデルにおいて、線形骨成長、授乳、マクロファージの活性化、インスリン様及び糖尿病誘発性の効果、及びその他を含む種々の生理学的及び代謝効果を引き起こす（Ｒ．Ｋ．Ｃｈａｗｌａら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．３４：５１９（１９８３）；Ｏ．Ｇ．Ｐ．Ｉｓａｋｓｓｏｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｆ．Ｐｈｙｓｏｌ．４７、４８３（１９８５）；Ｃ．Ｋ．Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９，７６９（１９８８）；Ｍ．Ｏ．Ｔｈｏｍｅｒ及びＭ．Ｌ．Ｖａｎｃｅ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８２：７４５（１９８８）；Ｊ．Ｐ．Ｈｕｇｈｅｓ及びＨ．Ｇ．Ｆｒｉｅｓｅｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４７：４６９（１９８５））。とりわけ閉経後の女性において、ＧＨ分泌は年齢とともに下降することが報告されている。Ｍｉｌｌａｒｄら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ，１１：２２９−２３５（１９９０）；Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｎｅｕｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  Ｍ，Ｌ６−１３７−１４２（１９８７）。Ｒｕｄｍａｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，６７：１３６１−１３６９（１９８１）及びＢｌａｃｋｍａｎ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ，１６：９８１（１９８７）も参照されたい。さらに、線形な体重の減少、脂肪組織塊の拡大、及び皮膚の薄層化を含むいくつかの加齢の兆候が、１週間に３回のＧＨ処置によって減少することができたという報告がある。例えば、Ｒｕｄｍａｎら，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２３：１−６（１９９０）、及びＤｒ．Ｖａｎｃｅによる同じような雑誌刊行物（ｐｐ．５２−５４）の付随する記事を参照されたい。これらの生物学的効果は、ｈＧＨ及び特異的な細胞の受容体との間の相互作用から誘導される。２種の異なったヒトの受容体、ｈＧＨ肝臓受容体（Ｄ．Ｗ．Ｌｅｕｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３０：５３７（１９７））及びヒトのプロラクチン受容体（Ｊ．Ｍ．Ｂｏｕｔｉｎら，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．３：１４５５（１９８９））がクローニングされている。しかしながら、ヒト胎盤性ラクトゲン受容体を含む他のものであるらしい（Ｍ．Ｆｒｅｅｍａｒｋ，Ｍ．Ｃｏｍｅｒ，Ｇ．Ｋｏｍｅｒ，及びＳ．Ｈａｎｄｗｅｒｇｅｒ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２０：１８６５（１９８７））。これらのホモロガスな受容体は、グリコシル化した細胞外ホルモン結合ドメイン、１つの膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを含有し、配列及び大きさにおいてかなり異なっている。１又はそれより多くの受容体は、ｈＧＨに対する生理学的な応答において決定的な役割を果たすと想定されている。
【００１０】
［００９］体内に投与された生理学的に活性なタンパク質は、体内での高い浄化率により短い期間だけ生理学的な活性を示すことができる。さらに、これらのタンパク質の相対的な疎水性は、それらの安定性及び／又は可溶性を制限するかもしれない。
【００１１】
［００１０］浄化率の減少、安定性の改善又は治療用タンパク質の抗原性の廃止を目的として、いくつかの方法が提案されており、ここで、このタンパク質は、水溶性ポリマーで化学的に修飾されている。この種の化学的修飾は、タンパク質の骨格それ自体との物理な接触からタンパク質分解酵素を効果的に遮断することができ、つまり、分解を防ぐことができる。ある種の水溶性ポリマーの化学的付着は、分子の疎水性容積の増加により、効果的に腎臓による浄化を減少することができる。追加の利点は、ある環境下で治療用タンパク質の安定性及び循環時間の増加、可溶性の増加、及び免疫原性の減少を含む。ポリ（アルキレンオキシド）、特にポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）は、治療用タンパク質生産物の製造において使用されているような化学的部分の１つである（動詞「ＰＥＧ化する」は少なくとも１つのＰＥＧ分子を付着することを意味する）。ポリ（エチレングリコール）の結合は、タンパク質分解から保護することが示され（Ｓａｄａら，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７１：１３７−１３９（１９９１）、及びある種のポリ（エチレングリコール）部分の付着方法が利用可能である。１９７９年１２月１８日に発行された米国特許第４，１７９，３３７号（Ｄａｖｉｓら、非免疫原性ポリペプチド）；及び１９７７年１月１１日に発行された米国特許第４，００２，５３１号（Ｒｏｙｅｒ、ポリエチレングリコールを有する酵素の修飾及びそれによって製造された生産物）を参照されたい。概説については、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ．（Ｊ．Ｓ．Ｈｏｌｃｅｒｂｅｒｇ及びＪ．Ｒｏｂｅｒｓ編集、ｐｐ．３６７−３８３（１９８１））を参照されたい。
【００１２】
［００１１］他の水溶性ポリマー、例えば、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（−１，３−ジオキソラン）、ポリ（−１，３，６−トリオキサン）、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリ−アミノ酸（ホモポリマー又はランダム共重合体のいずれか）が使用されている。
【００１３】
［００１２］ポリ（エチレングリコール）については、様々な方法が、ポリ（エチレングリコール）分子をタンパク質に付着させるために使用されている、一般的に、ポリ（エチレングリコール）分子は、タンパク質に見られえる反応基を介してタンパク質に連結させる。リジン残基又はＮ末端のアミノ基は、このような付着にとって好都合である。例えば、Ｒｏｙｅｒ（米国特許第４，００２，５３１号、上述）は、還元アルキル化が、酵素へのポリ（エチレングリコール）分子の付着に使用したことを言及している。Ｃｈａｍｏｗら（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：１３３−１４０（１９９４））は、還元アルキル化を介してモノメトキシポリ（エチレングリコール）無水物を用いたＣＤ４の免疫接着の修飾を報告する。米国特許第５，８２４，７８４号は、還元アルキル化の条件で、Ｎ末端を含むＧ−ＣＳＦのＰＥＧ化を示す。
【００１４】
［００１３］ＷＯ９３／００１０９は、３日以上の期間、持続的であり有効な血漿のＧＨ濃度を維持することを含む、哺乳類又は鳥類のＧＨ応答組織を刺激するための方法に関する。このような血漿濃度を達成する１つの方法は、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）のような高分子物質に連結したＧＨの使用によってなされることが記載される。高分子物質への連結は、半減期の改善に帰着することが記載される。ＰＥＧ化したヒト成長ホルモンは、ＷＯ９３／００１０９に報告されており、記述されるように腎臓ろ過による分離された７０Ｋより大きな分子量の流体力学的容積を達成するために、ｍＰＥＧアルデヒド−５０００及びｍＰＥＧ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ−５０００）を用いている（Ｋｎａｕｆ，Ｍ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５０６４−１５０７０，１９８８）。ｍＰＥＧ−ＮＨＳの使用は、ｈＧＨの複合的にＰＥＧ化された形態の不均一な混合物に帰着した。ＷＯ９３／００１０９はまた、システインｈＧＨ変形体をＰＥＧ化するためにｍＰＥＧ−マレイミドの使用を開示する。
【００１５】
［００１４］ＷＯ９９／０３８８７は、ＰＥＧ化されるシステイン変形の成長ホルモンを開示する。ＢＴ−００５と称され、この結合体は、成長ホルモン欠損ラットにおける体重増加の刺激により効果的であり、ｈＧＨより長い半減期を有すると主張される。
【００１６】
［００１５］ＰＥＧ化したヒト成長ホルモンはまた、Ｃｌａｒｋらに報告されており、カルボキシメチル化ＰＥＧのスクシンイミジルエステルを用いている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７１：２１９６９−２１９７７，１９９６）。Ｃｌａｒｋらは、第１級アミンに選択的に結合するｍＰＥＧ−ＮＨＳ−５０００を用いてサイズを増加したｈＧＨの誘導体を記載する。ＰＥＧ修飾レベルの増加は、その受容体のアフィニティーを減少させ、細胞を基礎としたアッセイにおいてＥＣ50を１５００倍まで増加させた。Ｏｌｓｏｎら（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ  ３８：５６８−５６９，１９９７）は、複合的にＰＥＧ化されたｈＧＨ種を達成するためにＮ−ヒドロｋシスクシンイミド（ＮＨＳ）ＰＥＧ及びスクシンイミジルプロピオン酸（ＳＰＡ）ＰＥＧの使用を開示する。
【００１７】
［００１６］ＷＯ９４／２００６９は、肺への輸送のための製剤の一部としてＰＥＧ化したｈＧＨを開示する。
［００１７］米国特許第４，１７９，３３７号は、生理学的に活性な非免疫原性であり、水溶性ポリペプチド結合体を得るために酵素とホルモンをＰＥＧ化する方法を開示する。ＧＨは、ＰＥＧ化されるホルモンの一例として記載される。
【００１８】
［００１８］ＥＰ４８０６４Ａ２は、ソマトトロピンにおける誘導した又は天然に存在するシステイン残基のＰＥＧ化を開示する。ＥＰ４５８０６４Ａ２は、さらに、野生型のウシソマトトロピンの１０２−１１２残基に位置されていると言われるオメガループと呼ばれるループにおける２つのシステイン残基の導入に言及し、より具体的には、ＥＰ４５８０６４Ａ２は、ウシソマトトロピンの１０２と１１２番号の残基のそれぞれＳｅｒからＣｙｓ及びＴｙｒからＣｙｓへの置換を開示する。
【００１９】
［００１９］ＷＯ９５／１１９８７は、親分子に存在するか又は部位特異的突然変異によって誘導したいずれかのシステイン残基のチオ基へのＰＥＧの付着を示唆する。ＷＯ９５／１１９８７は、プロテアーゼのネキシン−１のＰＥＧ化に関するが、しかしながら、ｈＧＨ及び他のタンパク質の一般的なＰＥＧ化は同様に示唆される。
【００２０】
［００２０］ＷＯ９９／０３８８７は、例えば、２５位のセリンをシステイン残基で置換し、導入したシステイン残基にＰＥＧを結合することによって修飾した成長ホルモンを開示する。
【００２１】
［００２１］ＷＯ００／４２１７５は、ＰＥＧの付着のための遊離のシステイン残基を含有するタンパク質を作製する方法に関する。ＷＯ００／４２１７５は、下記のｈＧＨの突然変異タンパク質：Ｔ３Ｃ、Ｓ１４４Ｃ及びＴ１４８Ｃ、並びにそれらのシステインＰＥＧ化を開示する。
【００２２】
［００２２］ＷＯ９７／１１１７８（並びに米国特許第５，８４９，５３５号、米国特許第６，００４，９３１号、及び米国特許第６，０２２，７１１号）は、ｈＧＨのアゴニスト又はアンタゴニストとしてのＧＨ変異体の使用に関する。ＷＯ９７／１１１７８はまたリジンＰＥＧ化を含むｈＧＨのＰＥＧ化、及びリジンの導入又は置換（例えば、Ｋ１６８Ａ及びＫ１７２Ｒ）を開示する。ＷＯ９７／１１１７８はまた、置換Ｇ１２０Ｋを開示する。
【００２３】
［００２３］ＷＯ０３／０４４０５６は、リジン分岐の４０Ｋ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨ結合体を含む様々なＰＥＧ化ｈＧＨ種を開示する。
［００２４］ＵＳ２００４／０１２７４１７は、リジン分岐したＰＥＧブチルアルデヒドｈＧＨ結合体を開示する。
【００２４】
［００２５］ＷＯ０４／４６２２２、ＵＳ２００５／００５８６２０、ＪＰ０８−０５９８１８、ＪＰ１１−２２８６８５、及びＪＰ２０００−００１５４１は、グリセロール骨格の１位での第一炭素で反応基を有し、２及び３位でポリアルキレングリコールを有するポリアルキレングリコール誘導体を開示する。
【００２５】
［００２６］ｒｈＧＨの目下の投与は、長期間毎日であり、したがって、投与頻度の低下が非常に望ましいであろう。より長期の循環半減期を有するｈＧｈ分子は、必要な投与数を減少し、付随した治療効果の増加を伴って、より最適な治療用ｈＧＨレベルを提供するであろう。
【００２６】
［００２７］ＰＥＧ化ｈＧＨを含むｈＧＨの長続きする形態を開発する多くの試みにもかかわらず、実行可能な商業的生産物となるために適した特性を有するＰＥＧ化したｈＧＨ分子に対して未だに満たされていない必要性がある。本発明は、ｈＧＨのＮ末端のフェニルアラニンで主に付着した１つのＰＥＧを有するＰＥＧ−ｈＧＨ結合体を提供し、他のＰＥＧ−ｈＧＨ結合体を上回った利点を提供する。ｍＰＥＧアルデヒド−５０００又はｍＰＥＧ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ−５０００）を用いたα−又はε−アミノ部位（ｈＧＨのＮ−末端及び９個のリジン）での複数の低分子量（５Ｋｄ）ＰＥＧの付着がＷＯ９３／００１０９、Ｃｌａｒｋら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７１：２１９６９−２１９７７，１９９６）、及びＯｌｓｏｎら（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ  ３８：５６８−５６９，１９９７）に記載されている。これは、不均一な集団の原因となる。例として、９個のリジンを有するｈＧＨは、１０個のＰＥＧが付着したいくつかの分子、９個付着した分子、８個付着した分子、７個付着した分子、６個付着した分子、５個付着した分子、４個付着した分子、３個付着した分子、２個付着した分子、１個付着した分子、及び０個付着した分子を有する。そして、７個付着した分子の中には、ＰＥＧは、異なる分子上の同じ位置に結合しなくてもよい。得られたこの不均一性は、結合、精製及び特徴付けを困難、高価及び再生不可能なものにする治療用生産物を開発する場合の欠点となる。別のアプローチ（ＷＯ００／４２１７５）は、ＰＥＧの付着に対して遊離のシステイン残基を含有するｈＧＨ変異体を使用することである。しかしながら、このアプローチは、非天然のｈＧＨ変異体に帰着し、また、システインのいくつか又は全てに付着したＰＥＧを有する不均一なＰＥＧ化産物に帰着する誤って対をなしたジスルフィド結合を有する間違って折り畳まれたタンパク質に導く可能性がある。複数の部位に付着した複数のＰＥＧを有することは、ＰＥＧと種々の部位との間の結合の安定性が低下した分子へと導くかもしれず、異なる比率で分離することができるようになる。これは、不正確な投与に帰着する製造物の薬物動態を正確に予測することを困難にする。不均一な製造物はまた、治療薬に関して規制許可を得ることに無用な問題を引き起こす。
したがって、１つの部位で結合した１つのＰＥＧを有するＰＥＧ化したｈＧＨ分子を有することが期待されるであろう。
【発明の開示】
【００２７】
発明の開示
［００２８］本発明は、グリセロール分岐のポリ（エチレングリコール）部分を用いてＰＥＧ化したｈＧＨに関し、限定されないが、浄化率の減少、血漿停留期間の増加、安定性の増加、溶解性の減少、及び抗原性の減少から選択される少なくとも１つの化学的又は生理学的性質を有してもよい。このように、より詳細には下記に記載するように、本発明は、グリセロール分岐のポリ（エチレングリコール）分子を用いてｈＧＨを化学的に修飾することに関する多くの側面を有する。
【００２８】
［００２９］本発明はまた、限定されないが、ａ）グリセロール骨格の安定性の増加、ｂ）受容体結合の増加、ｃ）費用の低下、ｄ）Ｎ−末端の結合選択性の増加、ｅ）溶解性の増加、ｆ）免疫原性の減少、ｇ）結合体の安定性の増加、ｈ）製造可能性の増加、及びｉ）タンパク質分解の減少を含む、リジンを基礎とした分岐のＰＥＧヒト成長ホルモン結合体と比べて１又はそれより多くの改善された性質を有してもよい。
【００２９】
［００３０］本発明は、ＰＥＧ化したｈＧＨを製造する方法に関する。特に、本発明は、グリセロール分岐のＰＥＧを用いてＰＥＧ化したｈＧＨを製造する方法に関する。
【００３０】
［００３１］本発明はまた、ＰＥＧ化したｈＧＨを単独で、又は別の治療薬とともに含む組成物に関する。本発明はまた、ＧＨ治療が有用である障害及び／又は疾患の予防及び／又は治療における本発明のＰＥＧ化したｈＧＨの単独又は別の治療薬を併用した使用に関する。
【００３１】
発明の詳細な説明
［００４１］本発明は、グリセロール分岐のポリエチレングリコール−ヒト成長ホルモン結合体に関する。特定の側面において、グリセロール分岐のポリエチレングリコール誘導体は、ｈＧＨ結合体を作製するために、アルデヒド反応基、及び、場合により、ポリエチレングリコール及びグリセロール骨格の１位の第一炭素での反応性官能基との間のリンカーを有し、ＷＯ０４／４６２２２又はＵＳ２００５／００５８６２０（参照により援用される）に記載した２−及び３−位でポリアルキレングリコール鎖を有する。リンカーは、共有結合であれが、特に限定されないが、好ましくは、アルキレン基及びエステル結合、ウレタン結合、アミド結合、エーテル結合、炭酸結合、又は第２級アミノ基を含有するアルキレン基を含む。好ましいアルキレン基は、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、プロピレン基、イソプロピレン基、テトラメチレン基、ブチレン基、イソブチレンン基、ペンタメチレン基、及びヘキサメチレン基を含む。
【００３２】
［００４２］本発明の特定の態様において、式：
【化１】
2008511610.tif 000003
（式中、
ｎは、６０〜７５の間の整数であり；
ｍは、４５０〜４６０の間の整数であり；
Ｒは、ヒト成長ホルモンポリペプチドである）
で表される構造を有するヒト成長ホルモン−ＰＥＧ結合体である。
【００３３】
［００４３］特別な態様において、ｎは、約６４〜約７２の間の整数である。
［００４４］特別の態様において、（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n部分は、約２．６〜約３．５Ｋｄの間の平均分子量を有し、具体的には、平均分子量は約３Ｋｄである。
【００３４】
［００４５］特別の態様において、各々の（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n部分は、約１７．６〜約２２Ｋｄの間の兵権分子量を有し、具体的には、平均分子量は約２０Ｋｄである。
［００４６］特別の態様において、各々の（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n部分は、約３Ｋｄの平均分子量を有し、各々の（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）m部分は、約２０Ｋｄの平均分子量を有する。
【００３５】
［００４７］用語「約」は、ＰＥＧ部分の分子量と関連して使用される場合、ポリエチレングリコールの製造において、ある分子は、規定の分子量より多いと計量され、ある分子は少ないと計量されるであろうし、そして、規定の分子量は、平均分子量を意味する。ポリ（エチレングリコール）のようなポリマーと関連したある程度の多分散性があることが理解される。低い多分散性を有するＰＥＧを使用することが好ましい。特定の態様において、末端のポリマーのヒドロキシル末端基の１つは、メチル基に変換され又はキャップされる。本明細書中で使用されるとき、用語「ｍＰＥＧ」は、メチル基で１端をキャップされたＰＥＧを意味する。ｍＰＥＧは、構造的には、
ＣＨ3Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−Ｈ
のように表すことができる。
【００３６】
［００４８］用語「ヒト成長ホルモンポリペプチド」、「ｈＧＨポリペプチド」又は「ｈＧＨタンパク質」は、本明細書中で使用されるとき、成長段階、及び正常な身体組織、同化、及び脂質代謝の維持において成長を促進することによって特徴付けられる全てのｈＧＨポリペプチドを包含する。好ましくは、用語「ｈＧＨポリペプチド」は、配列番号１のｈＧＨポリペプチドを意味する。
【００３７】
［００４９］本発明のｈＧＨポリペプチドは、任意の適した方法で調製することができる。このようなｈＧＨポリペプチド及びその断片は、天然供給源から精製され、化学的に合成され、インビトロ翻訳技術若しくはｈＧＨ  ｃＤＮＡを発現することができる組換え細胞における発現を含む組換え技術、又はこれらの方法の組み合わせによって、当業者に既知の手法を用いて製造することができる（例えば、タンパク質を精製する様々な方法については、“Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３”；タンパク質の化学合成については、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．２ｎｄＥｄ．，Ｔ．Ｅ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；及び、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ．３１０（５９７３）：１０５−１１、及び組換え技術については、Ｄａｖｉｓら（１９８６）Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照されたい。これらの開示は参照により全体として援用される）。本発明のポリペプチドは、好ましくは単離した形態で提供され、部分的に又は好ましくは実質的に精製されていてもよい。
【００３８】
［００５０］本発明の特定の態様は、ヒト成長ホルモン−ＰＥＧ結合体であり、ここで、８０％以上、より好ましくは８１％以上、より好ましくは８２％以上、より好ましくは８３％以上、より好ましくは８４％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは８６％以上、より好ましくは８７％以上、より好ましくは８８％以上、より好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、そして、より好ましくは９８％以上のポリエチレングリコールが、配列番号１のヒト成長ホルモンのアミノ末端のフェニルアラニンに結合する。
【００３９】
［００５１］本発明の別の態様は、場合により医薬として許容される希釈剤、担体又はアジュバント中のＮ末端でＰＥＧ化したｈＧＨの実質的に均一な調製物であり、前記調製物は、本質的に、Ｎ末端以外の部位でＰＥＧ化したｈＧＨがないものである。用語「実質的に均一な調製物」は、８０％以上、より好ましくは８１％以上、より好ましくは８２％以上、より好ましくは８３％以上、より好ましくは８４％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは８６％以上、より好ましくは８７％以上、より好ましくは８８％以上、より好ましくは８９％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、そして、より好ましくは９８％以上がモノＰＥＧ化されている調製物を意味する。
【００４０】
［００５２］本発明の一態様において、第２級アミン連結は、ｈＧＨポリペプチドのＮ末端の第一のα−アミノ基とグリセロール分岐鎖のＰＥＧアルデヒドとの間で、Ｃｈａｍｏｗら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：１３３−１４０（１９９４）、米国特許第４，００２，５３１号、ＷＯ９０／０５５３４、及び米国特許第５，８２４，７８４号に記載されるような還元アルキル化によって、ＮａＣＮＢＨ3、ＮａＢＨ3、ピリジンボラン等のような適した還元剤を用いて形成される。グリセロール分岐のＰＥＧアルデヒドは、ｈＧＨポリペプチドと共にインキュベートし、シッフ塩基形成を介したアミノ基へのＰＥＧ部分の付加に帰着する。これらの連結は、還元剤を用いた還元によって安定な第２級アミンへと変換される。
【００４１】
【化２】
2008511610.tif 000004
【００４２】
［００５３］結合反応は、「ＰＥＧ化反応」を意味し、過剰なモル濃度のポリマーを含む溶液中で、ポリマーがタンパク質に付着するであろうことは関係なく、歴史的に実行した。しかしながら、このような一般的な手法は、典型的には、十分な生物活性を保持しながら、非抗原性ポリマーに生物活性なタンパク質を結合するのに十分であることがわかっている。ｈＧＨ生物活性を維持する１つの方法は、ポリマーカップリング過程において、受容体結合部位（又は複数）と関連したｈＧＨの反応基の結合を実質的に避けることである。本発明の別の側面は、保持した活性の高レベルを維持するｈＧＨにポリ（エチレングリコール）を結合する方法を提供することである。
【００４３】
［００５４］共有結合を介した化学修飾は、生物学的に活性な基質と活性化したポリ（エチレングリコール）との反応において一般的に採用される任意の適した条件下で実行することができる。結合反応は、ｈＧＨの不活化を避けるために相対的に穏やかな条件下で実行される。穏やかな条件は、反応溶液のｐＨを３〜１０の範囲で、反応温度を約０℃〜３７℃の範囲内で維持することを含む。ｈＧＨ中の反応性アミノ酸残基が遊離アミノ基を有する場合には、上記の修飾は、好ましくは、リン酸、ＭＥＳ、クエン酸、酢酸、コハク酸又はＨＥＰＥＳを含む適した緩衝剤（ｐＨ４〜１０）、１〜４８時間、４℃〜３７℃の非制限的リストで実行される。ＰＥＧアルデヒドのような試薬を用いたＮ末端のアミノ基の標的において、ｐＨ４〜８が維持されることが好ましい。活性化したポリ（エチレングリコール）は、ｈＧＨの遊離アミノ基の数のモル量に対して、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．０１−２．５倍で使用することができる。
【００４４】
［００５５］本明細書中に記載された反応条件は、結果としてかなり量の未修飾のｈＧＨをもたらすが、未修飾のｈＧＨは、追加の結合反応に対して将来のバッチにおいて容易にリサイクルすることができる。本発明の方法は、驚くべきことに非常に少ない、即ち、約２０％未満、より好ましくは約１０％未満の高分子量種、及びｈＧＨ当り１より大きい数のポリマー鎖を含有する種を生じる。これらの反応条件は、重合性結合反応に典型的に使用されるものとは対照的であるべきであり、活性化したポリマーは、標的に関して数倍過剰なモル濃度で存在する。
【００４５】
［００５６］本発明の結合反応は、初期には、反応混合物、即ち、モノ−ＰＥＧ−ｈＧＨ結合体、未反応のｈＧＨ、未反応のポリマー、及び約２０％未満の高分子量種を含有するプールを提供する。高分子量種は、１より多くのポリマー鎖及び／又は重合したＰＥＧ−ｈＧＨ種を含有する結合体を含む。未反応の種及び高分子量種を除去した後、主にモノ−ＰＥＧ化ｈＧＨ結合体を含有する組成物を回収する。結合体の大部分が１つのポリマー鎖を含むという事実が得られれば、結合体は実質的に均一である。これらの修飾したｈＧＨは、標準的なＦＤＣ−Ｐ１細胞増殖アッセイ（Ｃｌａｒｋら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７１：２１９６９−２１９７７，１９９６）、受容体結合アッセイ（米国特許第５，０５７，４１７号）、又は脳下垂体を摘出したラットの成長（Ｃｌａｒｋら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７１：２１９６９−２１９７７，１９９６）を用いて測定した天然又は未修飾のｈＧＨと関連した少なくとも約０．１％のインビトロの生物活性を有する。しかしながら、本発明の好ましい側面において、修飾したｈＧＨは、約２５％のインビトロの生物活性を有し、より好ましくは、修飾したｈＧＨは、約５０％のインビトロの生物活性を有し、より好ましくは、修飾したｈＧＨは約７５％のインビトロの生物活性を有し、そして、最も好ましくは、修飾したｈＧＨは、同等の又は改善したインビトロの生物活性を有する。
【００４６】
［００５７］本発明の方法は、好ましくは、ポリマーとｈＧＨの幾分制限した比を含む。つまり、ｈＧＨ結合体は、ただ１つのポリマー鎖を含有する種に主に制限されることが見出された。さらに、ポリマーのｈＧＨ反応基への付着は、より高い過剰なモルのポリマーリンカーが使用される場合よりも実質的に少ないランダム的である。結合反応を停止した後、反応プール中の未修飾のｈＧＨは、イオン交換若しくはサイズ排除クロマトグラフィー又は同様の分離手法を用いて将来の反応にリサイクルすることができる。
【００４７】
［００５８］ポリ（エチレングリセロール）修飾のｈＧＨは、タンパク質の精製に使用される簡便な方法、例えば、透析、塩析、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ゲルクロマトグラフィー及び電気泳動によって反応混合物から精製することができる。イオン交換クロマトグラフィーは、未反応のポリ（エチレングリコール）及びｈＧＨの除去に特に効果的である。本発明の更なる態様では、モノＰＥＧ化したｈＧＨ種は、高分子量種及び未修飾のｈＧＨを除去するために反応混合物から単離される。分離は、約０．５〜１０ｍｇ／ｍＬのｈＧＨ−ポリマー結合体を含有する緩衝溶液中に混合した種を置くことによって達成される。適した溶液は、約４〜１０のｐＨを有する。溶液は、好ましくは、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、Ｋ2ＨＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ4、Ｎａ2ＨＰＯ4、ＮａＨ2ＰＯ4、ＮａＨＣＯ3、ＮａＢＯ4、ＣＨ3ＣＯ2Ｈ、及びＮａＯＨから選択される１又はそれより多くの緩衝塩を含有する。
【００４８】
［００５９］反応緩衝に依存して、ｈＧＨポリマー結合体溶液は、任意の未反応のポリマーを除去するためにバッファー交換／限外ろ過をまず受けなければならないかもしれない。例えば、ＰＥＧ−ｈＧＨ結合体溶液は、低分子量カットオフ（１０，０００〜３０，０００ダルトン）メンブレンを通して限外ろ過して、存在すれば、未反応のポリマー、界面活性剤等のような最も望ましくない物質を除去することができる。
【００４９】
［００６０］所望の種を含有するプール中への結合体の分別は、好ましくは、イオン交換クロマトグラフィー媒体を用いて実行される。このような媒体は、幾分予測できるやり方で変化する、電荷の差異を介してＰＥＧ−ｈＧＨ結合体を選択的に結合することができる。例えば、ｈＧＨの表面電荷は、タンパク質表面上の利用可能な帯電した基の数によって測定される。これらの帯電した基は、典型的には、ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーの潜在的な付着点として役立つ。したがって、ｈＧＨ結合体は、選択的な単離を可能にする他の種とは異なった電荷を有するであろう。
【００５０】
［００６１］強力な極性陰イオン又は陽イオン交換レジン、例えば、それぞれ第４級アミン又はスルホプロピルレジンは、本発明の方法に使用される。陰イオン交換レジンが特に好ましい。本発明での使用に適した商業的に利用可能な陽イオン交換レジンの非制限的なリストは、ＳＰ−ｈｉｔｒａｐ（登録商標）、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（登録商標）、及びＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ｆａｓｔ  ｆｌｏｗである。他の適した陽イオン交換レジン、例えば、Ｓ及びＣＭレジンもまた使用することができる。本発明での使用に適した商業的に利用可能な陰イオン交換レジンを含む陰イオン交換レジンの非制限的なリストは、Ｑ−ｈｉｔｒａｐ（登録商標）、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（登録商標）、及びＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ｆａｓｔ  ｆｌｏｗである。他の適した陰イオン交換レジン、例えば、ＤＥＡＥレジンもまた使用することができる。
【００５１】
［００６２］例えば、陰イオン又は陽イオン交換レジンは、好ましくは、カラム中に詰められ、慣用的な手段によって平衡化される。ポリマー結合したｈＧＨと同じｐＨ及び浸透圧を有するバッファーが使用される。溶離バッファーは、好ましくは、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、Ｋ2ＨＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ4、Ｎａ2ＨＰＯ4、ＮａＨ2ＰＯ4、ＮａＨＣＯ3、ＮａＢＯ4、及び（ＮＨ4）2ＣＯ3から選択される１又はそれより多くの塩を含有する。次に、結合体を含有する溶液は、カラム上に吸着され、未反応のポリマー及びある高分子量種は保持されない。充填が完了した時点で、溶離バッファーの塩濃度を増加した勾配フローがカラムに適用され、ポリアルキレンオキシド結合したｈＧＨの所望の分画を溶離する。溶離したプールされた分画は、好ましくは、陽イオン又は陰イオン交換分離工程の後にポリマー結合体を均一にするために制限される。次に、任意の結合しないｈＧＨ種は、慣用的な手法によりカラムから後洗いし得る。必要に応じて、モノ及び複合的にＰＥＧ化したｈＧＨ種が、さらに、付加的なイオン交換クロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィーを介して互いに分別することができる。
【００５２】
［００６３］塩濃度又はｐＨの増加の複数の等張的な工程を利用する手法もまた使用することができる。濃度増加の複数の等張な溶離工程は、ジ−、その後のモノ−ｈＧＨ−ポリマー結合体の連続溶離に帰着するであろう。
【００５３】
［００６４］溶離のための温度範囲は、約４℃〜約２５℃の間である。好ましくは、溶離は、約４℃〜約２２℃の温度で実行される。例えば、ＰＥＧ−ｈＧＨ分画の溶離は、２８０ｎｍでのＵＶ吸収によって検出される。分画の回収は、単純時間溶出プロフィールを介して達成することができる。
【００５４】
［００６５］界面活性剤は、ｈＧＨ部分でポリ（エチレングリコール）ポリマーを結合する方法で使用することができる。適した界面活性剤は、イオン性試薬、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む。他のイオン性界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸リチウム、第４級アンモニウム化合物、タウロコール酸、カプリル酸、スルホン酸デカン等もまた使用することができる。非イオン性界面活性剤もまた使用することができる。例えば、ポリ（オキシエチレン）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ）、ポリ（オキシエチレン）エーテル（Ｔｒｉｔｏｎ）のような物質を使用することができる。またＮｅｕｇｅｂａｕｅｒ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９２）Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．も参照されたい。本発明の方法で使用される界面活性剤の唯一の制限は、ｈＧＨの実質的に不可逆な変性を引き起こさず、及びポリマー結合を完全に阻害しない条件及び濃度でそれらが使用されることである。界面活性剤は、約０．０１〜０．５％；好ましくは０．０５〜０．５％；そして、最も好ましくは約０．０７５〜０．２５％の量で反応混合物に存在する。界面活性剤の混合物もまた企図される。
【００５５】
［００６６］界面活性剤は、ポリマー結合過程で一時的に可逆性の保護システムを提供するものと考えられる。界面活性剤は、リジンを基礎とした又はアミノ末端を基礎とした結合を進行中に、選択的に抑止するポリマー合成に効果的であることが示されている。
【００５６】
［００６７］本発明のポリ（エチレングリコール）修飾したｈＧＨは、より永続的な薬理学的効果を有し、インビボで長期の半減期におそらくは起因するかもしれない。
［００６８］本発明の別の態様は、ＧＨ、好ましくはｈＧＨの使用が有益となる疾患又は障害の予防及び／又は治療のための方法に関し、治療的に有効量の本発明のポリ（エチレングリコール）修飾したｈＧＨ又はそのアゴニスト変形体を単独で又は別の治療薬と併用して、それを必要とする患者に投与することを含む。本発明はまた、ＧＨ、好ましくはｈＧＨの使用が有益となる疾患又は障害の予防及び／又は治療のための薬剤の製造における本発明のポリ（エチレングリコール）修飾したｈＧＨ又はそのアゴニスト変形体の使用に関する。さらに、本発明はまた、ＧＨ、好ましくはｈＧＨの使用が有益となる疾患又は障害の予防及び／又は治療のために本発明のポリ（エチレングリコール）修飾したｈＧＨ又はそのアゴニスト変形体を含む医薬組成物に関する。
【００５７】
［００６９］ＧＨの使用が有益となる疾患又は障害には、限定されないが、成長ホルモン欠損症（ＧＨＤ）、成人成長ホルモン欠損症（ａＧＨＤ）、ターナー症候群、妊娠期間の短縮（ＳＧＡ）によって生まれた小児における成長障害、プラダー・ウィリー症候群（ＰＷＳ）、慢性腎不全（ＣＲＩ）、ＡＩＤＳ消耗症、及び加齢、末期腎不全、嚢胞性線維症、勃起不全、ＨＩＶリポジストロフィー、線維筋痛、骨粗鬆症、記憶障害、うつ病、クローン病、骨形成異常、外傷性脳損傷、くも膜下出血、ヌーナン症候群、ダウン症候群、特発性小人症（ＩＳＳ）、末期腎臓病（ＥＳＲＤ）、極低出生体重（ＶＬＢＷ）、骨髄系幹細胞救出、メタボリックシンドローム、グルココルチコイドミオパシー、小児のグルココルチコイド処置による小人症、及び早産児のための成長捕捉欠如が含まれる。
【００５８】
［００７０］本発明のより特定の態様は、本発明のポリ（エチレングリコール）修飾したｈＧＨ又はそのアゴニスト変形体は、ＧＨＤ、ａＧＨＤ、ＳＧＡ、ＰＷＳ、ターナー症候群及びＣＲＩから成る群から選択される障害又は疾患の予防及び／又は治療において使用される。
【００５９】
［００７１］本発明の別のより特定の態様は、本発明のポリ（エチレングリコール）修飾したｈＧＨ又はそのアゴニスト変形体は、特発性小人症、極低出生体重、外傷性脳損傷、メタボリックシンドローム、及びヌーナン症候群から成る群から選択される障害又は疾患の予防及び／又は治療において使用される。
【００６０】
［００７２］本発明の別の態様は、本発明のポリ（エチレングリコール）修飾したｈＧＨを単独で、又は別の治療薬と併用して、そして、少なくとも１つの医薬として許容される賦形剤又は担体を含む医薬組成物に関する。次に、本発明のポリ（エチレングリコール）修飾したｈＧＨは、それらを患者に投与するために、医薬として許容される希釈剤、等張溶液を調製する試薬、ｐＨ調節剤等も含有する医薬品に調合することができる。
【００６１】
［００７３］上記医薬品は、治療目的に応じて、皮下、筋内、静脈、肺、皮内、又は経口的に投与することができる。投与量はまた、治療される患者の障害の種類や状態に基づき、通常、成人に対する注射では０．１ｍｇ〜５ｍｇの間、及び経口投与では０．１ｍｇ〜５０ｍｇの間である。
【００６２】
［００７４］本明細書中で使用されるとき、本発明のポリ（エチレングリコール）修飾したｈＧＨ又はそのアゴニスト変形体は、別の治療薬と併用して使用することができる。本明細書中で使用されるとき、用語「同時投与」、「同時投与した」及び「併用して」は、化合物Ａ及び１又はそれより多くの他の治療薬に言及して、下記を意味することが意図され、下記を意味し、そして下記を含む：
○Ａ及び治療薬（又は複数）が単一の剤形に一緒に調合される場合、実質的に同時に患者にこのような成分が放出される、治療を必要とする患者へのこのような成分の併用剤の同時投与；
○Ａ及び治療薬（又は複数）が、患者によって実質的に同時に取り上げられる別個の剤形中にそれぞれ分別して調合される場合、これらの成分が実質的に同時に患者に放出される、治療を必要とする患者へのこのような成分の併用剤の実質的に同時である投与；
○Ａ及び治療薬（又は複数）が、各投与間の有意な時間間隔を設けて、患者によって連続的な時間で取り上げられる別個の剤形中にそれぞれ分別して調合される場合、これらの成分が実質的に異なった時間で患者に放出される、治療を必要とする患者へのこのような成分の逐次投与；そして、
○Ａ及び治療薬（又は複数）が、制御された方法でこれらの成分を放出する単一の剤形に一緒に調合される場合、それらが患者によって同時及び／又は異なった時間で同時に、連続的に、及び／又は重複して投与される、治療を必要とする患者へのこのような成分の併用剤の逐次投与。
【００６３】
［００７５］Ａ、医薬として許容されるそれらの塩及び／又はそれらの誘導形態を併用して使用することができる他の治療薬の適した例は、決して限定されることはなく、アロマターゼ阻害剤、例えばフォルメスタン、アタメスタン、ファドロゾール、レトロゾール、ボロゾール及びアナストロゾール；フィブリン酸誘導体（例えばフェノフィブラート、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、ベザフィブラート及びシプロフィブラート）及びアシピモックスのようなニコチン酸誘導体を含む遊離脂肪酸制御因子；限定されないが、ビグアニド、例えばメトフォルミン、ＰＰＡＲガンマ−インスリン感作剤及びチアゾロデニオン、例えばトログリタゾン及びロシグリタゾン  トログリタゾン、５−［［４−［３，４−ジヒドロ−６−ヒドロ−２，５，７，８−テトラメチル−２Ｈ−］−ベンゾピラン−２−イル）メトキシ］フェニル］メチル３−２，４−チアゾロリジンジオンＶ４１１（ＤＩＡＢＩＩ、Ｇｌａｕｃａｎｉｎ）ピオグリタゾン（ＡＣＴＯＳ、ＡＤ４８３３、Ｕ７２１０７、Ｕ７２１０７Ａ、Ｕ７２１０７Ｅ、ＺＡＣＴＯＳ）化学名：２，４−トリアゾリジンジオン、５−［［４−［２−（５−エチル−２−ピリジニル）エトキシ］フェニル］メチル］−、モノヒドロクロリド、（ａ／−）；ロシグリタゾン（Ａｖａｎｄｉａ、ＢＲＬ４９６５３、ＢＲＬ４９６５３Ｃ）化学名：２，４チアゾリジンジオン、５−［［４−［２−（メチル−２−ピリジニルアミノ）エトキシ］フェニル］メチル］；２５ベキサロテン−オーラル（ＬＧＤ１０６９オラール、タルグレチンオラール、タルグレチン、タルグレチンオーラルタルグレキシンオラール）化学名：４−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル）エテニル］安息香酸；ＺＤ２０７９（ＩＣＩ  Ｄ２０７９）化学名：（Ｒ）−Ｎ−［２−４−（カルボキシメチル）３０フェノキシ）−Ｎ−（２−ヒドロキシ−２−フェネチル）アンモニウムクロリド：ネトグリタゾン（イサグリタゾン、ＭＣＣ５５５、ＲＷＪ２４１９４７）（化学名：５−［６（２−フルオロベンジルオキシ）ナフタレン−２−イルメチル］チアゾリジン−２，４−ジオン）；ＩＮＳ（登録商標）（Ｄ−チロ−イノシトール）（化学名：Ｄ−１，２，３，４，５，６−ヘキサヒドロキシシクロヘキサン）、ＯＮ２３４４（ＤＲＦ２５９３）；デキシリポタム、化学名：５（Ｒ）−（１，２−ジチオラン−３−イル）ペンタロイック３５酸；ＨＱＬ９７５、化学名：３−［４−［２−（５−メチル−２−フェニルオキサゾール−４−イル）エトキシ］フェニル］−２（Ｓ）−（プロピルアミノ）プロピオン酸；ＹＭ２６８、化学名：５，５’−メチレン−ビス（１，４−フェニレン）ビスメチレンビス（チアゾリジン−２，４−ジオン）を含む。
【００６４】
開発中のＩＰＰＡＲアゴニストは、レグリタザール（ＪＴＴ５０１、ＰＮＵ１８２７１６、ＰＮＵ７１６）（化学名：イソキサゾリジエン−３，５−ジオン、ｉ４−［［４−（２−フェニル−５−メチル）−１，３−オキサゾリル］エトキシフェニル−４］メチル−、（４ＲＳ））；Ｉ（ＲＰ２９７、化学名：１０  ５−（２，４−ジオキソチアゾリジン−５−イルメチル）−２−メトキシ−Ｎ−［４−（トリフルオロメチル）ベンジルベンズアミド；Ｒ１１９７０２（ＣＩ１０３７、ＣＳ０１１）化学名：（ｌ−）−５−［４−（５−メトキシ−１Ｈ  ベンズイミダゾール−２−イルメトキシ）ベンジル］チアゾリン−２，４−ジオン；ヒドロクロリド；１５ＤＲＦ２１８９、化学名：５−［［４−［２−（１−インドリル）エトキシ］フェニル］メチル］チアゾリジン−２，４−ジオン；コルチゾール合成阻害剤、例えばケトコナゾール、エコナゾール又はミコナゾール；成長ホルモン、例えばソマトロピン又はソマトノーム及びそれらの誘導体、例えばヒト成長ホルモン融合タンパク質、例えばアルブトロピン；ポリエチレングリコール成長ホルモン、例えばシステイン−ＰＥＧ化成長ホルモン、ＢＴ００５（Ｂｏｌｄｅｒ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）；成長ホルモン分泌促進剤、例えばＳＭ１３０６８６（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ）カプロモレリン（Ｐｆｉｚｅｒ）、メカセルミン（Ｆｕｊｉｓａｗａ）、セエルモレリン（Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｅｎｅｒａｌ）、ソマトレム、ソマオメジン（Ｃ  Ｌｌｏｒｅｎｔｅ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）エキサモレリン、タビモレリン；ＣＰ４６４７０９（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＬＹ４２６４１０及びＬＹ４４４７１１（Ｌｉｌｌｙ）；８−（アミノアルコキシイミノ）−８Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｅ］チアゾロ［４，５−ｃ］シクロヘプテン（ＷＯ２００２０５７２４１に開示される）、２−置換ジベンゾ［ａ，ｅ］１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｃ］［７］アヌレン−８−オン（ＷＯ２００２０５６８７３に記載される）、成長ホルモン放出ペプチドＧＨＲＰ−６及びＧＨＲＰ−１（米国特許第４，４１１，８９０号、及び公報ＷＯ８９／０７１１０、ＷＯ８９／０７１１１に記載される）、Ｂ−ＨＴ９２０、ヘキサレリン及びＧＨＲＰ−２（ＷＯ９３／０４０８１に記載される）、又は成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ、ＧＲＦとも称する）及びその類似体、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２及びそれらの誘導体、例えばソマトキン−インスリン様増殖因子−１及びその結合タンパク質、ＢＰ−３、アルファ−２−アドレナリン作動性アゴニスト、例えばクロニジン、キシラジン、デトミジン及びメデトミジン又はセロトニン５ＨＴＩＤアゴニスト、例えばクロニジン、キシラジン、デトミジン及びメデトミジン又はセロトニン５ＨＴＩアゴニスト、例えばスミトリプタン、又はソマトスタチン及びその放出を阻害する試薬、例えばフィソスチブミン及びフィリドスチグミン、ＴｈＧＲＦ１−４４（Ｔｈｅｒａｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むソマトメジン；Ｌ１６５１６６（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏｍｐａｎｙ）；ジペプチド誘導体（ＷＯ９８５８９４７に記載される）、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの阻害剤、��えばアミノ−アシルピロリジンニトリル（米国特許第６，５２１，６４４号、ＷＯ９５／１５３０９、及びＷＯ９８／１９９９８に記載される）；ベータ−アミノへテロ環式ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤、例えばＵＳ２００３０１００５６３及びＷＯ２００３０８２８１７に記載されるもの；成長ホルモン放出化合物（ＵＳ２００３００５５２６１、ＵＳ２００３００４０４８３、ＥＰ１８０７２、ＥＰ８３８６４、ＷＯ８９／０７１１０、ＷＯ８９／０１７１１、ＷＯ８９／１０９３３、ＷＯ８８／９７８０、ＷＯ８３／０２２７２、ＷＯ９１／１８０１６、ＷＯ９２／０１７１１、ＷＯ９３／０４０８１、ＷＯ９５１４６６６，ＥＰ０９２３５３９、米国特許第５，２０６，２３５号、第５，２８３，２４１号、第５，２８４，８４１号、第５，３１０，７３７号、第５，３１７，０１７号、第５，３７４，７２１号、第５，４３０，１４４号、第５，４３４，２６１号、第５，４３８，１３６号、第５，４９４，９１９号、第５，４９４，９２０号、第５，４９２，９１６号、第５，５３６，７１６号、及び第５，５７８，５９３号、ＷＯ９４／１３６９６、ＷＯ９４／１９３６７、ＷＯ９５／０３２８９、ＷＯ９５／０３２９０、ＷＯ９５／０９６３３、ＷＯ９５／１１０２９、ＷＯ９５／１２５９８、ＷＯ９５／１３０６９、ＷＯ９５／１４６６６、ＷＯ９５／１６６７５、ＷＯ９５／１６６９２、ＷＯ９５／１７４２２、ＷＯ９５／１７４２３、ＷＯ９５／３４３１１、及びＷＯ９６／０２５３０に記載される）、ピペリジン、ピロリジン及びヘキサヒドロ−１Ｈ−アゼピン（米国特許第５，８０４，５７８号、米国特許第５，７８３，５８２号、ＷＯ２００４００７４６８に記載される）、アミドスピロピペリジン、例えばＷＯ０１０４１１９に開示されるもの、２−［（５，６−ジメチル−２−ベンゾイミダゾリル）アミノ］−４−ヒドロキシ−６−メチル−５−ピリミジン−酢酸（２）及び２−［（５，６−ジメチル−２−ベンゾイミダダゾイル）アミノ］−４−ヒドロキシ−６−メチル−５−ピリミジン酢酸、米国特許第６，３２９，３８３号に記載されるエチルエーテル、ＥＰ１１５５０１４に記載されるベンズイミダゾール、ＧＲＦ関連類似性ペプチジル化合物、米国特許第４，４１１，８９０号のペプチド、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体、例えばＷＯ０１７０２２８、ＷＯ０１７０２２７、ＷＯ０１７０２２８、ＷＯ００６９４３３、ＷＯ０００４０１３、ＷＯ９９５１５６、ＷＯ９９５１５９５、ＷＯ９９５１２３１−４、ＷＯ９９４１２５１−２、ＷＯ９９２１５５７、ＷＯ９９２１５５３に記載されるもの、及び６−アザインドール化合物（ＷＯ００５３６０２、ＷＯ００５３１８１、ＷＯ００５３１８０、ＷＯ００５３１７９、ＷＯ００５３１７８、米億特許第６，２８８，０７８号に記載される）を含む２−アミノ−５−ピリミジン酢酸化合物；ＩＧＦ−１分泌促進剤；インスリン様増殖因子−２（ＩＧＦ−２又はソマトメジンＡ）及びＩＧＦ−２分泌促進剤；ミオスタチンアンタゴニスト、及び線維芽細胞増殖因子受容体−３（ＦＧＦＲ−３）チロシンキナーゼを阻害する化合物を含む。
【００６５】
［００７６］含まれる重合性物質はまた、好ましくは、室温で水溶性である。このようなポリマーの非制限的なリストは、ポリ（アルキレンオキシド）ホモポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）又はポリ（プロピレングリコール）、ポリ（オキシエチレン化ポリオール）、それらの共重合体、及びそれらのブロック共重合体を含み、ただし、ブロック共重合体の水溶性は維持されることが条件である。
【００６６】
［００７７］ＰＥＧを基礎としてポリマーの代替物として、効果的に非抗原性の物質、例えばデキストラン、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（ビニルアルコール）、糖質を基礎としたポリマー等が使用することができる。確かに、これらの重合性物質のα−及びε−末端基の活性化は、ポリ（アルキレンオキシド）を変換するために使用されるのと同じようにして達成することができ、つまり、当業者に明確であろう。当業者は、前述のリストが、単なる例示であり、本明細書に記載された性質を有する全てのポリマーが企図されることを認識するであろう。本発明の目的のために、「効果的に非抗原性の」は、無毒性であり、哺乳動物において感知できる免疫原性応答を発揮しないものとして当該技術分野において理解される全ての物質を意味する。
【００６７】
定義
［００７８］下記は、本明細書中で互いに交換して使用される省略形と対応する意味のリストである。
【００６８】
【表１】
2008511610.tif 000005
【００６９】
［００７９］本明細書に引用した全ての刊行物、特許、及び特許出願の全内容は、各々が個々の公開、特許、又は特許出願が参照により取り込まれたものと具体的に及び個別的に指示されるように、参照により本明細書中に援用される。
【００７０】
［００８０］前述の発明は、明確な理解を目的として図解及び実施例の方法によって幾分詳細に記載してあるけれども、変更や修飾が本発明の精神及び範囲から逸脱することなしに行うことができることを本発明の教示に照らして当業者に容易に明らかになるであろう。下記の実施例は、例示を目的とするだけで提供され、発明の範囲を制限することを意図とせず、上記の広い用語に記載されている。
【００７１】
［００８１］下記の実施例において、ｈＧＨは、配列番号１のものである。他のｈＧＨポリペプチドはまた、その後の実施例に例示されるのと同じやり方でＰＥＧ化され得る。
【実施例】
【００７２】
実施例
実施例１  グリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨ
【化３】
2008511610.tif 000006
｛式中、
（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nは、平均分子量：約３Ｋｄを有し、各々の（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）mは、平均分子量：約２０Ｋｄを有する｝
（ＧＬ３−４００ＡＬ２）
【００７３】
［００８２］本実施例は、還元アルキル化によってＮ末端のモノＰＥＧ化したｈＧＨの生成を示す。約４３，０００ＭＷのグリセロール分岐のＰＥＧアルデヒド試薬（ＧＬ３−４００ＡＬ２  ＮＯＦコーポレーション）は、Ｎ末端の第１級アミンの相対的ｐＫa値とリジン残基のε−アミノ位置の第１級アミンのｐＫa値における差異を生かすことによって、ｈＧＨのＮ末端に還元アルキル化を介して結合した。２５ｍＭ  ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）ｐＨ５．８又は２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０に４、７又は１０ｍｇ／ｍＬで溶解したｈＧＨタンパク質は、１．５：１、２：１、３．４：１、４：１又は５：１の相対的ＰＥＧ：ｈＧＨのモル比を生じるために試薬の添加によってグリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドと反応させた。反応物を最終濃度１０ｍＭまでピリジンボラン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の添加によって触媒した。反応は、暗所で４℃、１６〜８７時間で実行した。反応は、精製用に適したバッファー中に希釈することによって反応を停止さた。
【００７４】
［００８３］表１は、複数のＰＥＧ化した種、モノＰＥＧ化した結合体、反応していないｈＧＨ、及びｐＨ５．８で６３時間、１．５：１：１モル比で反応させたグリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨの最終精製収率パーセントを示す。
【００７５】
【表２】
2008511610.tif 000007
【００７６】
実施例２  ＰＥＧ化したｈＧＨの精製
［００８４］
ＰＥＧ化したｈＧＨ種は、１つのイオン交換クロマトグラフィー工程を用いて、反応混合物から＞９５％まで精製した（ＳＥＣ分析  図１）。
【００７７】
陰イオン交換クロマトグラフィー
［００８５］ＰＥＧ化ｈＧＨ種は、１つの陰イオン交換クロマトグラフィー工程を用いて、反応混合物から＞９５％まで精製した（ＳＥＣ分析  図１）。陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて未修飾のｈＧＨ及び複合的にＰＥＧ化したｈＧＨ種からモノ−ＰＥＧ化ｈＧＨを精製した。典型的なグリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨ反応混合物（８０又は１５００ｍｇのタンパク質）は、上記で記載されるように、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３（バッファーＡ）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｔｒａｐカラム（５ｍＬ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｈｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）又はＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（２６／２０、７０ｍＬカラム体積）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上で精製した。反応混合物をバッファーＡで７倍に希釈し、流速２．５ｍＬ／分でカラムに充填した。カラムをバッファーＡの３〜１０カラム体積で洗浄した。その後、種々のｈＧＨ種が、バッファーＡの２０カラム体積、及び０〜１００ｍＭのＮａＣｌの直線勾配でカラムから溶離した。溶離物は、吸光度２８０ｎｍ（Ａ２８０）によって監視し、適切なサイズの分画を回収した。分画をＰＥＧ化の程度、例えば、モノ、ジ、トリ等についてプールした（実施例３で評価した）。次に、プールをＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ＹＭ１０濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）中で、又は希釈ろ過によって、０．５〜５ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。プールのタンパク質濃度は、０．７８の減衰係数を用いてＡ２８０によって決定した。
【００７８】
実施例３  生化学的な特徴付け
［００８６］精製したＰＥＧ化したｈＧＨプールは、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、非変性サイズ排除クロマトグラフィー、及びペプチドマッピングによって特徴付けた。
【００７９】
サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）
［００８７］グリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドとｈＧＨの反応混合物、陰イオン交換精製プール、及び最終精製した生産物は、非変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて評価した。分析的な非変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣは、カラムＴＳＫ  Ｇ４０００ＰＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈａａｓ）又はＳｈｏｄｅｘ  ＫＷ−８０４（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ）を用いて、２０ｍＭ  リン酸塩  ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、流速０．５ｍＬ／分（場合によっては、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ７．８ｍｍ×３０ｃｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で実行した。ＰＥＧ化は、初期の保持時間のシフトに帰着するタンパク質の流体力学的体積を大いに増大させる。新種が、未反応のｈＧＨと一緒にＰＥＧアルデヒドｈＧＨ反応混合物に観察された。これらのＰＥＧ化した種及び非ＰＥＧ化の種は、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー上で分別し、得られた精製したモノＰＥＧ−アルデヒドｈＧＨ種は、その後、非変性のＳＥＣ上で単一のピークとして溶離することが示された（＞９５％純度、図１）。Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー工程は、モノＰＥＧ化したｈＧＨから、遊離のＰＥＧ、ｈＧＨ、及び複合的にＰＥＧ化したｈＧＨ種を効率的に分離した。
【００８０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
［００８８］ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、グリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドとｈＧＨとの反応及び精製した最終産物を評価するために使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、１ｍｍの厚さの１０−ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）上で、還元及び非還元条件で実行し、Ｎｏｖｅｘ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｃｏｏｍａｓｓｉ（商標）Ｇ−２５０染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて染色した。
【００８１】
Ｎ末端配列
［００８９］自動化されたエドマン分解化学を用いて、ＮＨ2末端のタンパク質の配列を決定する。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ４９４  Ｐｒｏｃｉｓｅシークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）を分解のために使用した。それぞれのＰＴＨ−ＡＡ誘導体は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ｂｒｏｗｎｌｅｅ  ２．１ｍｍ  ｉ．ｄ．ＰＴＨ−Ｃ１８カラムを装備したＡｐｐｌｉｃｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  １４０Ｃ  ＰＴＨアナライザーを用いるオンライン様式でＲＰ−ＨＰＬＣによって同定される。
【００８２】
ペプチドマッピング
［００９０］トリプシン消化は、１ｍｇ／ｍＬの濃度で行い、典型的には、消化物当たり２５μｇの物質を使用した。トリプシンは、トリプシンとＰＥＧ−ｈＧＨの比率が１：３０（ｗ／ｗ）になるように添加した。このバッファーは、３０ｍＭ、ｐＨ７．５で存在した。試料を室温で１６±０．５時間インキュベートした。反応は、消化溶液１ｍＬ当たり１Ｎ  ＨＣｌの５０μＬの添加によって停止させた。自動サンプラーに試料を置く前に、試料を最終濃度の６．２５％アセトニトリル中０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度まで希釈した。アセトニトリルを初めに添加し（１９．８％アセトニトリルになるまで）、穏やかに混合し、その後、水を最終体積（出発容積の４倍）まで添加した。余分の消化溶液を除去し、１週間は−２０℃で保存してもよい。
【００８３】
［００９１］Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５  ＨＰＬＣシステムは、分析のために使用したが、他のシステムは同様の結果を生じるべきである。５μｍの粒子を装填したＡｓｔｅｃ  Ｃ−４重合性２５ｃｍ×４．６ｍｍカラムを使用した。実験は、周囲温度で試料当たり５０μｇのタンパク質を典型的な充填で行った。バッファーＡは、水中０．１％のトリフルオロ酢酸であり；バッファーＢは、アセトニトリル中０．０８５％のトリフルオロ酢酸であった。試料は、９０分かけて０〜４５％の直線勾配で溶離した。
【００８４】
［００９２］２１０と３００ｎｍの間で、データを回収するＷａｔｅｒｓ  ９９６  ＰＤＡ検出器を用いてピークを検出した。
［００９３］トリプシンマップは、２：１（ＰＥＧ：ｈＧＨ）のモル比で反応したｈＧＨ及びグリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドについて行った（図２）。Ｎ末端のトリプシン断片は、Ｔ−１と称した。ＰＥＧ化されていないｈＧＨと比較した存在するＴ−１のパーセントは、９９％を超えるＰＥＧ修飾がＮ−末端であり、残りがいくつかの可能なリジン残基の１つに明確に結合していることを示唆する。
【００８５】
【表３】
2008511610.tif 000008
【００８６】
実施例４  インビトロの生物学
グリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨによるヒト受容体を認識する能力は、結合体及びヒト成長ホルモン受容体（ｈＧＨＲ）（２８ｋＤａ細胞外ドメイン）間の特異的な相互作用の評価に適したアッセイにおいて、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００装置を用いて試験した。表面プラズモン共鳴（ＳＲＰ）実験による結果は、下記の表３に示される。
【００８７】
【表４】
2008511610.tif 000009
【００８８】
aＫa（結合速度）及びＫd（解離速度）は、ΔＲＵ＝３０００〜５０００で、アミンカップリング化学を介してＣＭ５チップ上に標識したヒト成長因子を結合しているタンパク質（２８ｋＤａ、細胞外ドメイン）を用いてＨＥＰ−ＢＥＳバッファー（０．０１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び０．００５％  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）中、３７℃で５０μＬ／分の流速で測定した。Ｋaは、Ｍ-1ｓ-1として表され、Ｋdは、ｓ-1として表され、両者は、１チップ上で少なくとも３回の測定の平均値±標準偏差である。データは、１：１の比でＧＨＢＰ上の高アフィニティー部位１に対するｈＧＨ結合を測定ことを推測する。
【００８９】
実施例５  薬力学試験
インビトロの有効性−１１日のラットアッセイにおける有効性（体重増加、脛骨成長、血清ＢＵＮ低下）
［００９４］雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットは、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｓで脳下垂体を摘出され、４〜１０日の期間、成長についてプレスクリーニングを行った。ラットを６個のグループに分けた。０日を開始として、対照ラットは、０．３ｍｇ／ｋｇのｈＧＨ又はベヒクルのいずれかを連続１１日間、皮下に毎日１回受けた。試験グループは、０日目と６日目に１．８ｍｇ／ｋｇのグリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨの１回（週に一度）投与を受けた。動物の体重は毎日計量した。図４は、それぞれの試験において体重増加におけるｈＧＨ及びグリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨの効果を示す。
【００９０】
［００９５］図４に記載した試験によって表されたデータとｈＧＨ（対照）で処置したラットについての経時的に１１日の成長試験プラス４３Ｋ  グリセロール分岐のＰＥＧアルデヒドｈＧＨ結合体を用いる追加の成長試験とを併合すると、１．８ｍｇ／ｋｇの結合体で週に一度処置した動物に関する平均的な体重増加は、毎日のｈＧＨ投与によって達成されたものの１０９％であった（累積３．３ｍｇ／ｋｇ）。
【００９１】
ラット脛骨の長さ
［００９６］１１日の体重増加試験の動物は、１１日目に屠殺され、左脛骨を取り出し、Ｘ線で観察し、骨の長さをカリパスを用いて測定した。図５は、グリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨで処置した動物についての頚骨の長さの測定を示す。
【００９２】
ラットＢＵＮレベル
［００９７］ｈＧＨ処理後の代謝効果についての生物マーカーとして、血中尿素窒素レベルを第１１日目の血液試料から測定した。図６は、ｈＧＨ（毎日）処置及びグリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨ（週に一度）処置が血中尿素窒素の有意な減少に帰着することを示す。
【００９３】
ラットの体重増加の６日投与量増加の試験
［００９８］脳下垂体を摘出したラットを種々の１回服用のグリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨで処置し、その他は、ｈＧＨで毎日処置し、体重増加を６日間監視した。図７は、種々の処置グループについて得られた体重増加を示す。血液試料を指定した時間で採取し、血清ＩＧＦ−１レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。平均±ＳＥＭをプロットした。グループ（ｎ＝６）は、測定値における一元配置分散分析を用いてＩＧＦ−１応答を計算するために使用し、そして、ＡＵＣｄ０−６（ｍｇ−ｈｒ／ｍＬ）値：２０，０４０、２２，９５８、２８，１２９、及び３７，８３９は、それぞれ、０．０６７、０．２、０．６、及び１．８ｍｇ／ｋｇ投与群について測定した。
【００９４】
ラット体重増加の１１日投与量増加の試験
［００９９］二次試験では、動物は、１．８ｍｇ／ｋｇ又はそれより高い投与量、即ち、５．１ｍｇ／ｋｇの４３Ｋ  グリセロール分岐のＰＥＧアルデヒドｈＧＨ結合体のいずれかを用いて０日及び再度６日に処置した。表４は、ベヒクル又は毎日のｈＧＨ（０．３ｍｇ／ｋｇ／日）のいずれかの毎日（ＱＤ１１）の投与に従って達成されるもの比較して、６日及び１１日の投与量に関連した体重増加を示す。
【００９５】
【表５】
2008511610.tif 000010
【００９６】
*Ｐ＜０．０５対ベヒクル、+Ｐ＜０．０５対ｈＧＨ；０日から測定した平均プラス体重増加（ｇ）
ＢＷ、体重；ｈＧＨ、ヒト成長ホルモン
値は平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）
カッコ内の値は０日からの変化を表す（平均±ＳＥＭ）
【００９７】
ＩＧＦ−１試験
［００１００］６日の体重増加試験の動物を使用した。血液試料を研究期間の種々の時間で採取し、血清ＩＧＦ−１レベルを図８に示されるようにＥＬＩＳＡにより測定した。ラットのＩＧＦ−１レベルは免疫アッセイキット（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって監視した。
【００９８】
実施例６  薬物動態試験
［００１０１］薬物動態試験は、正常な、カニューレを挿入されたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄性ラットで行った。グループ当り６匹のラットを用いて、ｈＧＨ又はグリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨの１．０ｍｇ／ｋｇの１回の静脈投与又は１．８ｍｇ／ｋｇの１回の皮膚ボーラスとして注入を行った。血液試料を関連するＰＫパラメータの評価のために必要に応じて０〜５日に渡って採取する。ｈＧＨ及びグリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨ血中レベルを免疫アッセイを用いて各サンプリング時に監視した。表４は、グリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨのためのラットＰＫパラメータを示す。ＰＥＧ化の効果は、このパラメータが結合体について６時間を超えるにつれて排除のために観察された半減期において明らかとなり、一方、同様の試験からのｈＧＨについて報告されたデータは、１．３５±０．２（Ｃｌａｒｋ、同書）、０．７７〜１．７（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎら、“Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”、ＰＳＴＴ  １（８）、Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １９９８）、又は１時間（Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎｎ（登録商標）（ＰＮＵ−１８０３０７）Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ  Ｂｒｏｃｈｕｒｅ）として報告される。
【００９９】
ｈＧＨ免疫アッセイ
［００１０２］ラットの血漿におけるｈＧＨ及びグリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨタンパク質の濃度レベルをｈＧＨ  ＡｕｔｏＤＥＬＦＩＡキット蛍光免疫アッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて測定した。
【０１００】
【表６】
2008511610.tif 000011
【０１０１】
血漿の薬物レベルとＩＧＦ−１応答との関係もまた、１回服用のグリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨ（１．８ｍｇ／ｋｇ）を脳下垂体を摘出した雌性げっ歯類に皮下注射して包括的な試験において直接測定した。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】［００３２］図１は、ＴＳＫ  Ｇ４０００ＰＷＸＬカラム上の精製したモノＰＥＧ化したグリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨ反応産物の溶出プロフィールを示すサイズ排除ＨＰＬＣ追跡である。
【図２】［００３３］図２は、ｈＧＨ及びグリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨのトリプシン様マップ解析のＨＰＬＣ追跡である。上段パネルは、ｈＧＨのトリプシン様マップである。下段パネルは、グリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨのトリプシン様マップである。Ｔ１は、Ｎ末端のトリプシン断片である。
【図３】［００３４］図３は、ヒト成長ホルモンのアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図４】［００３５］図４は、１１日のラット体重増加アッセイにおけるグリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨの有効性を示す。脳下垂体を摘出された雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを４〜５週齢（８５〜１１０ｇ）でＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｓから購入した。動物施設に入れ、動物を華氏８０度の一定の室温で維持した。３日の環境順応後、基底の成長速度を確立するために４〜１０日間毎日体重を測定した。０日で開始し、その後、対照群のラット（約１００ｇ）を約０．３ｍｇ／ｋｇ  ｈＧＨ（黒三角）、又はＰＢＳベヒクル（●）の皮下注射を連続１１日間、毎日一度受けた。グリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨ試験群（黒四角）は、０日目と６日目に１．８ｍｇ／ｋｇのグリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨの１回投与を受けた。グループ当り６匹の動物であった。プロットした値は、平均体重±ＳＥＭを表す。
【図５】［００３６］図５は、グリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨに応答した１１日の脛骨の成長を示す。動物は図４で処置したものであった。動物を１１日の計量後に屠殺し、左の脛骨をＸ線撮影し、骨の長さをカリパスを用いて計測した。平均長±ＳＥＭをプロットする。アスタリスクは、対照グループからの有意差を示す（Ｐ＜０．０５）。グループ当り６匹であった。
【図６】［００３７］図６は、グリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨに応答した１１日の血中尿素窒素を示す。血液試料を図４で処理した動物から採取した。血清を調製し、尿素窒素レベルを計測した。平均±ＳＥＭをプロットする（グループ当り６匹）。アスタリスクは、対照グループからの有意差を示す（Ｐ＜０．０５）。
【図７】［００３８］図７は、グリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨに対する６日の投与量増加の有効性試験を示す。この成長試験は、図４に記載したのと同じやり方で実行したが、グリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨの多様な１回投与は０日でのみ投与し、試験は６日間行ったことを除く。対照グループは、６日間連続して、０．３ｍｇ／ｋｇ  ｈＧＨ（◆）又はＰＢＳベヒクル（○）のいずれかを毎日１回の皮下注射を受けた。グリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨ試験群は、０日にグリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨの１回投与を受けた。グリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨの投与量は、１．８ｍｇ／ｋｇ（黒四角）、０・６ｍｇ／ｋｇ（Ｘ）、０．２ｍｇ／ｋｇ（＋）、０．０６７ｍｇ／ｋｇ（黒三角）であった。グループ当り６匹の動物であった。
【図８】［００３９］図８は、６日の有効性試験の血清ＩＧＦ−１レベルを示す。動物を図７に記載したように処置した。血中試料をプロットした様々な時間で採取し、血清ＩＧＦ−１レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。グループ（ｎ＝６）平均を使用して、測定した値に関する一元配置分散分析を用いてＩＧＦ−１応答を計算し、ＡＵＣ  ｄ０−６（ｎｇ／ｍＬ*２４時間）値：３７，８３９、２８，１２９２、２２，９５８、及び２０，０４０は、それぞれ１．８、０．６、０．２、及び０．０６７ｍｇ／ｋｇ投与グループについて測定した。
【図９】［００４０］図９は、脳下垂体を切除した雌性ラットにグリセロール分岐の４３ｋＫ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨの１回投与後のＰＫ／ＰＤ評価を示す。血漿薬物レベル（ａ）又は血漿ＩＧＦ−１応答（ｂ）におけるグリセロール分岐の４３Ｋ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨの１回の１．８ｍｇ／ｋｇ  ＳＣ投与の効果。
【図１】
2008511610.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2008511610.tif 000019
【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年3月3日(2008.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造：
【化１】
2008511610.tif 000022
（式中、
ｎは、６０〜７５の間の整数であり；
ｍは、４５０〜４６０の間の整数であり；そして、
Ｒは、ヒト成長ホルモンである）
を有するポリエチレングリコール−ヒト成長ホルモン（ＰＥＧ−ｈＧＨ）結合体。
【請求項２】
前記（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n部分が平均分子量：２．６〜３．５Ｋｄを有し、そして、各々の（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）m部分が平均分子量：１７．６〜２２Ｋｄを有する、請求項１に記載のＰＥＧ−ｈＧＨ結合体。
【請求項３】
ヒト成長ホルモンが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載のＰＥＧ−ｈＧＨ結合体。
【請求項４】
ＰＥＧが、配列番号１のＮ末端のフェニルアラニンに結合している、請求項３に記載の
ＰＥＧ−ｈＧＨ結合体。
【請求項５】
前記結合体が、モノＰＥＧ化されている、請求項４に記載のＰＥＧ−ｈＧＨ結合体。
【請求項６】
少なくとも８０％のＰＥＧが、配列番号１のＮ末端のフェニルアラニンのアルファ−アミノ基に結合している、請求項４に記載のＰＥＧ−ｈＧＨ結合体。
【請求項７】
少なくとも９０％のＰＥＧが、配列番号１のＮ末端のフェニルアラニンのアルファ−アミノ基に結合している、請求項５に記載のＰＥＧ−ｈＧＨ結合体。
【請求項８】
少なくとも９５％のＰＥＧが、配列番号１のＮ末端のフェニルアラニンのアルファ−アミノ基に結合している、請求項５に記載のＰＥＧ−ｈＧＨ結合体。
【請求項９】
少なくとも９８％のＰＥＧが、配列番号１のＮ末端のフェニルアラニンのアルファ−アミノ基に結合している、請求項５に記載のＰＥＧ−ｈＧＨ結合体。
【請求項１０】
治療的に有効量の請求項１、２、３、４、５、６、７、８又は９に記載のヒト成長ホルモン−ＰＥＧ結合体を含む、成長障害又は発達障害を治療するための医薬組成物。
【請求項１１】
前記成長障害又は発達障害が、成長ホルモン欠損症（ＧＨＤ）、ターナー症候群、慢性腎不全、及び妊娠期間の短縮（ＳＧＡ）から成る群から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記成長障害又は発達障害が、勃起不全、ＨＩＶリポジストロフィー、線維筋痛、骨粗鬆症、記憶障害、うつ病、クローン病、骨形成異常、外傷性脳損傷、くも膜下出血、ヌーナン症候群、ダウン症候群、特発性小人症（ＩＳＳ）、末期腎不全（ＥＳＲＤ）、極小出生時体重（ＶＬＢＷ）、骨髄系幹細胞救出、メタボリックシンドローム、グルココルチコイドミオパシー、小児のグルココルチコイド処置による小人症、及び早産児のための成長捕捉欠如から成る群から選択される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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