(57)【要約】  Ｆｃエフェクター機能が増強されたヒトＩｇＧ１抗体を生成する方法を開示する。その方法を実施する際に、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ中にあるＦｃＣＨ２部分の４つの受容体接触領域を対象とするＩｇＧ１Ｆｃルックスルー突然変異生成（ＬＴＭ）コードライブラリーを、突然変異Ｆｃ断片を発現細胞の表面上に提示する系中で発現させる。次いで、選択されたＦｃ受容体または他のＦｃ結合タンパク質に対する結合親和性の変化で断片をスクリーニングする。選択された突然変異を使用して、所望の結合特性を有するさらなるＦｃ断片突然変異を生成するウォークスルー突然変異（ＷＴＭ）ライブラリーの構築における複数の置換の選択を誘導することができる。そのように産生された抗体は、様々な治療的診断的実用性を有する。2008538908.tif 000057
2008538908.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エフェクター機能が増強されたヒトＩｇＧ１抗体を生成する方法であって、
（ａ）（ｉ）抗体のＦｃ断片のＣＨ２およびＣＨ３領域をそれぞれ表す配列番号１および２によって特定される２つのＩｇＧ１Ｆｃ領域のうち少なくとも１つ、ならびに複数の各アミノ酸について、前記２つのＩｇＧ１Ｆｃ領域のうち少なくとも１つの中にある複数のアミノ酸位での個々のアミノ酸置換物をコードする領域ＬＴＭライブラリーと、
（ｉｉ）配列番号１によって特定されるＩｇＧ１ＦｃＣＨ２領域内に含まれる配列番号３〜６によって特定される４つの各領域、および複数の選択された各アミノ酸について、各領域内にある複数のアミノ酸位での個々の置換物をコードする小領域ＬＴＭライブラリー
のうち１つから選択されるＩｇＧ１Ｆｃルックスルー突然変異生成（ＬＴＭ）コードライブラリーを構築するステップと、
（ｂ）選択可能な発現系中でＬＴＭライブラリーによってコードされるＩｇＧ１Ｆｃ断片を発現させるステップと、
（ｃ）（ｉ）選択されたＩｇＧ１Ｆｃ結合タンパク質に対する、天然ＩｇＧ１Ｆｃと比べた結合親和定数（ＫＤ）の変化；および
（ｉｉ）選択されたＩｇＧ１Ｆｃ結合タンパク質に対する、天然ＩｇＧ１Ｆｃと比べた解離速度定数（Ｋｏｆｆ）の変化
のうち少なくとも１つと関係するエフェクター機能の増強を特徴とする、（ｂ）で発現させたＩｇＧ１Ｆｃ断片を選択するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記ライブラリーによってコードされる発現Ｆｃ断片を、ウイルス粒子、原核細胞、および真核細胞からなる群から選択される粒子を有する選択可能な発現系中で発現させ、発現Ｆｃ粒子を発現系粒子の表面と結合し、その発現Ｆｃ粒子がその表面上で前記Ｆｃ結合タンパク質による結合に利用可能となる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記発現系が、（ｉ）臨床用品質のモノクローナル抗体を産生することができ、（ｉｉ）培養中で非付着性であり、（ｉｉｉ）レトロウイルスで導入することが容易である哺乳動物細胞を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記発現系細胞が、ＢａＦ３、ＦＤＣＰ１、ＣＨＯおよびＮＳＯ細胞からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記発現系が、その表面上に前記Ｆｃ断片を発現する哺乳動物細胞を含み、ステップ（ｃ）が、（ｉ）前記ＬＴＭライブラリーの単一クローン変異体に対応する発現細胞を、複数の各アッセイ用ウェルに添加するステップと、（ｉｉ）各ウェルに、Ｆｃ結合タンパク質を含み、前記表面に結合したＦｃ断片と相互作用し、それと結合するレベルに応じて前記細胞を溶解するのに有効な試薬を添加するステップと、（ｉｉｉ）細胞溶解産物が存在するかどうか前記ウェルの内容物についてアッセイを行うステップと、（ｉｖ）最大レベルの細胞溶解を示す、細胞上に発現したＩｇＧ１Ｆｃ断片を選択するステップとを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｃｉｉ）で添加する試薬が、抗体依存性細胞性細胞傷害作用によりその表面上にＦｃ断片を発現する細胞を溶解することができる末梢血単核細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｃ）が、ステップ（ｃｉ）の前に、Ｆｃ結合タンパク質ＦｃγＲＩまたはＦｃγＲＩＩＩａに対して高い結合親和定数または低い解離速度定数を有するＦｃ断片を発現するものについて、そのような細胞を濃縮するステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｃｉｉ）で添加する試薬が、補体媒介性細胞死により細胞を溶解することができるヒトＣ１ｑ複合体およびヒト血清である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｃ）が、ステップ（ｃｉ）の前に、Ｆｃ結合タンパク質Ｃ１ｑに対して高い結合親和定数または低い解離速度定数を有するＦｃ断片を発現するものについて、そのような細胞を濃縮するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｃｉ）の前に、
（ｉ）Ｆｃ結合タンパク質Ｃ１ｑ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩａに対する高い結合親和定数または低い解離速度定数、
（ｉｉ）Ｆｃ結合タンパク質ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩｂに対する低い結合親和定数または高い解離速度定数；ならびにＦｃ結合タンパク質ＦｃＲＮおよびプロテインＡに対するそれぞれ高いもしくは低い結合親和定数または低いもしくは高い解離速度定数
のうち１つを有するＦｃ断片を発現するものについて、そのような細胞を濃縮するステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
Ｃ１ｑ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃＲＮおよびタンパク質からなる群から選択されるＦｃ結合タンパク質に対して、天然ＩｇＧ１Ｆｃ断片の結合親和定数と比べて高い結合親和定数を有する前記Ｆｃ断片を選択し、ステップ（ｃ）が、（ｃｉ）提示されたＦｃ断片を有する発現粒子およびＦｃ結合タンパク質の混合物を形成するステップと、（ｃｉｉ）Ｆｃ受容体を混合物中の提示されたＦｃ断片と結合させて、Ｆｃ結合複合体を形成するステップと、（ｃｉｉｉ）混合物から前記Ｆｃ結合複合体を単離するステップとを含み、前記結合タンパク質に対して最高の結合親和定数を有するＦｃ断片を発現する粒子を単離する、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
Ｃ１ｑ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃＲＮおよびプロテインＡからなる群から選択されるＦｃ結合タンパク質に対して、天然ＩｇＧ１Ｆｃ断片の結合親和定数と比べて高い平衡結合親和定数を有するＦｃ断片を選択する請求項２に記載の方法であって、ステップ（ｃ）が、（ｃｉ）高い結合親和定数を有するＦｃ断片を発現する粒子ほど強く標識されるように、提示されたＦｃ断片を有する発現粒子と、限定的な量の溶解型蛍光標識Ｆｃ結合タンパク質の混合物を形成するステップと、（ｃｉｉ）混合物中の結合が平衡に達した後に、結合した蛍光標識の量に基づいて前記粒子を選別するステップと、（ｃｉｉｉ）最高レベルの結合した蛍光を有する粒子を選択するステップとを含む方法。
【請求項１３】
ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、ＦｃＲＮおよびプロテインＡからなる群から選択されるＦｃ結合タンパク質に対して、天然ＩｇＧ１Ｆｃ断片の結合親和定数と比べて低い解離速度定数を有するＦｃ断片を選択する請求項２に記載の方法であって、ステップ（ｃ）が、（ｃｉ）低い結合親和定数を有するＦｃ断片を発現する粒子ほど強く標識されなくなるように、提示されたＦｃ断片を有する発現粒子と、限定的な量の溶解型蛍光標識Ｆｃ結合タンパク質の混合物を形成するステップと、（ｃｉｉ）混合物中の結合が平衡に達した後に、結合した蛍光標識の量に基づいて前記粒子を選別するステップと、（ｃｉｉｉ）最低レベルの結合した蛍光を有する粒子を選択するステップとを含む方法。
【請求項１４】
Ｃ１ｑ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃＲＮおよびプロテインＡからなる群から選択されるＦｃ結合タンパク質に対して、天然ＩｇＧ１Ｆｃ断片の結合親和定数と比べて低い解離速度親和定数を有するＦｃ断片を選択する請求項２に記載の方法であって、ステップ（ｃ）が、（ｃｉ）提示されたＦｃ断片を有する発現粒子と、飽和量の溶解型蛍光標識Ｆｃ結合タンパク質の混合物を形成するステップと、（ｉｉ）ステップ（ｃｉ）後の選択された時間に、飽和量の非標識Ｆｃ結合タンパク質を添加するステップと、（ｃｉｉｉ）ステップ（ｃｉｉ）から結合の平衡までの選択された時間に、結合した蛍光標識の量に基づいて前記粒子を選別するステップと、（ｃｉｖ）最高レベルの結合した蛍光を有する粒子を選択するステップとを含む方法。
【請求項１５】
ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、ＦｃＲＮおよびプロテインＡからなる群から選択されるＦｃ結合タンパク質に対して、天然ＩｇＧ１Ｆｃ断片の結合親和定数と比べてそのように高い解離速度親和定数を有するＦｃ断片を選択する請求項２に記載の方法であって、ステップ（ｃ）が、（ｃｉ）提示されたＦｃ断片を有する発現粒子と、飽和量の溶解型蛍光標識Ｆｃ結合タンパク質の混合物を形成するステップと、（ｉｉ）ステップ（ｃｉ）後の選択された時間に、飽和量の非標識Ｆｃ結合タンパク質を添加するステップと、（ｃｉｉｉ）ステップ（ｃｉｉ）から結合の平衡までの選択された時間に、結合した蛍光標識の量に基づいて前記粒子を選別するステップと、（ｃｉｖ）最低レベルの結合した蛍光を有する粒子を選択するステップとを含む方法。
【請求項１６】
ＩｇＧ１抗体中に組み込まれたときに、抗体依存性細胞毒性を増強する能力を有するＦｃ断片を選択する際に使用する請求項１に記載の方法であって、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する高い結合親和定数または低い解離速度定数を特徴とするＩｇＧ１Ｆｃ断片を同定した後、ＦｃγＲＩＩＢ受容体に対して低い結合親和定数または高い解離速度定数を示すＦｃγＲＩＩＢ受容体に対する結合親和性で、前記の同定した断片を選択するステップをさらに含む方法。
【請求項１７】
ＩｇＧ１抗体中に組み込まれたときに、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を増強する能力を有するＦｃ断片を選択する際に使用する請求項１に記載の方法であって、ステップ（ｃ）が、Ｃ１ｑ複合体に対する高い結合親和定数または低い解離速度定数を特徴とするＩｇＧ１Ｆｃ断片を同定した後、ＦｃγＲＩＩＢ受容体に対して低い結合親和定数または高い解離速度定数を示すＦｃγＲＩＩＢ受容体に対する結合親和性で、前記の同定した断片をさらに選択するステップをさらに含む方法。
【請求項１８】
外因性治療用ＩｇＧ１抗体中に組み込まれたときに、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体における１５８位の受容体多型を有するヒト患者での抗体に対する治療反応を増強する能力を有するＦｃ断片を選択する際に使用する請求項１に記載の方法であって、そのようにステップ（ｃ）が、少なくともＦｃγＲＩＩＩＡ  Ｖ１５８受容体多型に対する結合親和性と同程度であるＦｃγＲＩＩＩＡ  Ｆ１５８受容体多型に対する結合親和性を特徴とする、（ｂ）で発現させたＩｇＧ１Ｆｃ断片を選択するステップを含む方法。
【請求項１９】
外因性治療用ＩｇＧ１抗体中に組み込まれたときに、ＦｃγＲＩＩＡ受容体における１３４位の受容体多型を有するヒト患者での抗体に対する治療反応を増強する能力を有するＦｅ断片を選択する際に使用する請求項８に記載の方法であって、ステップ（ｃ）が、少なくともＦｃγＲＩＩＡ  Ｈ１３１受容体多型に対する結合親和性と同程度であるＦｃγＲＩＩＡ  Ｒ１３１受容体多型に対する結合親和性を特徴とする、（ｂ）で発現させたＩｇＧ１Ｆｃ断片を選択するステップを含む方法。
【請求項２０】
（ｄ）ＬＴＭライブラリー中でアミノ酸置換がなされたＦｃコード領域の少なくとも１つについて、その領域内の複数のアミノ酸位での同じアミノ酸置換物をコードするウォークスルー突然変異生成（ＷＴＭ）ライブラリーを構築するステップであって、置換されたアミノ酸が、ステップ（ｃ）で選択されたＦｃ断片の少なくとも１つのアミノ酸位で認められたアミノ酸変異と対応するステップと、
（ｅ）選択可能な発現系中でＷＴＭライブラリーによってコードされたＩｇＧ１Ｆｃ断片を発現させるステップと、
（ｆ）選択されたＩｇＧ１Ｆｃ結合タンパク質に対する、天然Ｆｃ断片で測定した同じ定数と比較しての結合親和定数または解離速度定数の所望の変化を特徴とする（ｅ）で発現させたＩｇＧ１Ｆｃ断片を選択するステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１の（ｂ）で発現させ、ステップ（ｃ）で選択したＩｇＧ１Ｆｃ断片が、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ結合タンパク質に対する高い結合親和定数または低い解離速度定数を特徴とし、天然Ｆｃ断片で測定した同じ定数と比べての定数の変化が１．５倍より大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１の（ｂ）で発現させ、ステップ（ｃ）で選択したＩｇＧ１Ｆｃ断片が、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ結合タンパク質に対する低い結合親和定数または高い解離速度定数を特徴とし、天然Ｆｃ断片で測定した同じ定数と比べての定数の変化が１．５倍より大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
一本鎖ＤＮＡに対して複数部位特異的クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）突然変異生成を行う方法であって、
（ａ）複数の変異原性オリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ鋳型の別個の領域に相補的な別個のヌクレオチド配列領域を有する前記一本鎖の直鎖ＤＮＡ鋳型とハイブリダイズさせ、それによって、ＤＮＡ鋳型およびそれとハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドからなる部分的なヘテロ二重鎖が形成するステップと、
（ｂ）部分的なヘテロ二重鎖を完全長ヘテロ二重鎖に転換するステップであって、ハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドが鋳型配列中に突然変異を導入した領域以外はＤＮＡ鋳型と相補的な一本鎖となるステップと、
（ｃ）ＤＮＡ鋳型を除去するステップと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その断片を含めて、エフェクター機能が増強されたヒトＩｇＧ抗体、特にＩｇＧ１抗体を作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体−抗原複合体の形成および特殊化した免疫細胞による認識は、広範な免疫系の反応を引き起こす。最も一般的な抗体のアイソタイプはＩｇＧであり、それは、２本の同一の軽鎖とジスルフィド結合した２本の同一の重鎖からなる。抗原認識は、結合した重鎖および軽鎖の末端で形成される相補性決定領域中で行われる。他方の抗体の末端では、抗体のＦｃドメインとＦｃ受容体の結合を介して開始される相互作用により、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、細胞媒介性補体活性化（ＣＤＣ）や食作用（オプソニン作用）などのＦｃエフェクター機能が生じる。
【０００３】
Ｆｃ受容体は、抗体の末端Ｆｃ部分と結合することができる特定の免疫細胞上で認められる細胞表面糖タンパク質である。これらのＦｃ受容体は、その分布、イムノグロブリンのサブタイプの特異性および開始されるエフェクター反応によって定義される。例えば、マクロファージ、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ）上で認められるＦｃγＲ受容体は、ＩｇＧ型分子により特異的である。次いで、ＮＫ細胞のＦｃＲγＩＩＩａ受容体と、抗体が結合した標的の結合は、ＡＤＣＣ標的細胞溶解を媒介する。その一方で、補体カスケードの活性化は、血清補体タンパク質Ｃ１ｑと抗体−抗原複合体のＦｃ部分の結合によって開始される。Ｃ１ｑは、Ｃ３補体成分の沈着の動員、その後の様々な食細胞上のＣ３受容体による認識によってＣＤＣまたは食作用を誘導できるので、細胞表面分子ではないが、それでもＣ１ｑはＦｃ受容体とみなすことができる。
【０００４】
各ヒトＩｇＧ重鎖は、抗原を認識する可変ドメイン（Ｖ）および３つの相同な定常領域ドメイン；ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を有し、ＣＨ２およびＣＨ３はＦｃ領域を含む。突然変異生成の研究から、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインが、これらのＦｃ受容体媒介反応にとって最も重要であることが示されている。したがって、Ｆｃ受容体相互作用を媒介する重要なＦｃアミノ酸残基を同定することにより、抗体Ｆｃ工学は、Ｆｃ−エフェクター機能を選択的に高め、より効率のよい放射性核種へのＦｃＲの標的化または細胞傷害性薬物の標的化を変化させ、かつ／あるいは長期にわたる投与計画を必要とする治療薬の半減期の様相を最適化する新たな将来性および進歩を潜在的にもたらすことができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、それによって、選択したＦｃエフェクター特性についてのＦｃ領域全体にわたる有益な突然変異を迅速にかつ効率よく同定することができる、体系的な突然変異生成およびスクリーニングの方法を提供することが望ましい。そのスクリーニング方法を促進するために、その結果、Ｆｃ変異体を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣアッセイの読み取り情報によって直接スクリーニングすることができる、Ｆｃ突然変異を哺乳動物Ｆｃ変異体ライブラリーとして哺乳動物細胞の表面上に発現させる方法を提供することがさらに望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、一態様では、エフェクター機能が増強されたヒトＩｇＧ１抗体を生成する方法を含む。その方法を実施する際に、ＩｇＧ１Ｆｃルックスルー突然変異生成（ＬＴＭ）コードライブラリーを構築する。ライブラリーは、抗体のＦｃ断片のＣＨ２およびＣＨ３領域をそれぞれ表す配列番号１および２によって特定される２つのＩｇＧ１Ｆｃ領域のうち少なくとも１つ、ならびに複数の各アミノ酸について、２つのＩｇＧ１Ｆｃ領域のうち１つの中にある複数のアミノ酸位での個々のアミノ酸置換物をコードする領域ＬＴＭライブラリーでよい。あるいは、ライブラリーは、配列番号１によって特定されるＩｇＧ１ＦｃＣＨ２領域内に含まれる配列番号１４〜１７によって特定される４つの各領域、および複数の選択された各アミノ酸について、各領域内にある複数のアミノ酸位での個々の置換物をコードする小領域ＬＴＭライブラリーでよい。
【０００７】
ＬＴＭライブラリーによってコードされるＩｇＧ１Ｆｃ断片を選択可能な発現系中で発現させ、エフェクター機能の増強を特徴とする発現ＩｇＧ１Ｆｃ断片を選択する。エフェクター機能の増強は、（ｉ）選択されたＩｇＧ１Ｆｃ結合タンパク質に対する、天然ＩｇＧ１Ｆｃと比べた結合親和定数（ＫＤ）の変化；または（ｉｉ）選択されたＩｇＧ１Ｆｃ結合タンパク質に対する、天然ＩｇＧ１Ｆｃと比べた解離速度定数（Ｋｏｆｆ）の変化と関係し、それは、直接的なＫＤもしくはＫｏｆｆの測定に基づいてもよく、または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、細胞媒介性補体活性化（ＣＤＣ）や食作用（オプソニン作用）などの結合の間接的な尺度に基づいてもよい。
【０００８】
ライブラリーによってコードされる発現Ｆｃ断片を、ウイルス粒子、原核細胞、および真核細胞からなる選択可能な発現系中で発現させることができ、発現Ｆｃ粒子を発現系粒子の表面と結合し、その発現Ｆｃ粒子がその表面上でＦｃ結合タンパク質による結合に利用可能となる。例示的な発現系の１つは、ＢａＦ３、ＦＤＣＰ１、ＣＨＯやＮＳＯ細胞などの哺乳動物細胞を含み、それは、（ｉ）臨床用品質のモノクローナル抗体を産生することができ、（ｉｉ）培養中で非付着性であり、（ｉｉｉ）レトロウイルスを導入することが容易である。
【０００９】
発現系は、その表面上にＦｃ断片を発現し、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、細胞媒介性補体活性化（ＣＤＣ）や食作用（オプソニン作用）などのＦｃエフェクター機能の直接測定を可能にする哺乳動物細胞を含んでよい。この直接的方法は、（ｉ）ＬＴＭライブラリーの単一クローン変異体に対応する発現細胞を、複数の各アッセイ用ウェルに添加するステップと、（ｉｉ）各ウェルに、Ｆｃ結合タンパク質を含み、表面に結合したＦｃ断片と相互作用し、それと結合するレベルに応じて細胞を溶解するのに有効な試薬を添加するステップと、（ｉｉｉ）細胞溶解産物が存在するかどうかウェルの内容物についてアッセイを行うステップと、（ｉｖ）最大レベルの細胞溶解を示す、細胞上に発現したＩｇＧ１Ｆｃ断片を選択するステップとを含む。
【００１０】
ＡＤＣＣの直接測定では、ステップ（ｉｉ）で添加する試薬は、抗体依存性細胞性細胞傷害作用によりその表面上にＦｃ断片を発現する細胞を溶解することができる末梢血単核細胞でよい。その方法は、ステップ（ｉ）の前に、Ｆｃ結合タンパク質ＦｃγＲＩまたはＦｃγＲＩＩＩａに対して高い結合親和定数または低い解離速度定数を有するＦｃ断片を発現するものについて、そのような細胞を濃縮するステップをさらに含んでよい。
【００１１】
ＣＤＣの直接測定では、ステップ（ｉｉ）で添加する試薬は、補体媒介性細胞死により細胞を溶解することができるヒトＣ１ｑ複合体およびヒト血清である。その方法は、ステップ（ｉ）の前に、Ｆｃ結合タンパク質Ｃ１ｑに対して高い結合親和定数または低い解離速度定数を有するＦｃ断片を発現するものについて、そのような細胞を濃縮するステップをさらに含んでよい。
【００１２】
エフェクター機能を直接測定するどちらの場合でも、その方法は、（ｉ）Ｆｃ結合タンパク質Ｃ１ｑ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩａに対する高い結合親和定数または低い解離速度定数、（ｉｉ）Ｆｃ結合タンパク質ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩｂに対する低い結合親和定数または高い解離速度定数、ならびに（ｉｉｉ）Ｆｃ結合タンパク質ＦｃＲＮおよびプロテインＡに対するそれぞれ高いまたは低い結合親和定数あるいは低いまたは高い解離速度定数のうち１つを有するＦｃ断片を発現するものについて、細胞を濃縮するステップをさらに含んでよい。
【００１３】
Ｃ１ｑ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃＲＮおよびタンパク質からなる群から選択されるＦｃ結合タンパク質に対して、天然ＩｇＧ１Ｆｃ断片の結合親和定数と比べて高い結合親和定数を有する発現Ｆｃ断片の生成では、選択ステップは、（ｉ）提示されたＦｃ断片を有する発現粒子およびＦｃ結合タンパク質の混合物を形成するステップと、（ｉｉ）Ｆｃ結合タンパク質を混合物中の提示されたＦｃ断片と結合させて、Ｆｃ結合複合体を形成するステップと、（ｉｉｉ）混合物からＦｃ結合複合体を単離するステップとを含んでよく、結合タンパク質に対して最高の結合親和定数を有するＦｃ断片を発現する粒子を単離する。
【００１４】
Ｃ１ｑ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃＲＮおよびプロテインＡからなる群から選択されるＦｃ結合タンパク質に対して、天然ＩｇＧ１Ｆｃ断片の結合親和定数と比べて高い平衡結合親和定数を有するＦｃ断片の生成では、選択ステップは、（ｉ）高い結合親和定数を有するＦｃ断片を発現する粒子ほど強く標識されるように、提示されたＦｃ断片を有する発現粒子と、限定的な量の溶解型蛍光標識Ｆｃ結合タンパク質の混合物を形成するステップと、（ｉｉ）混合物中の結合が平衡に達した後に、結合した蛍光標識の量に基づいて粒子を選別するステップと、（ｉｉｉ）最高レベルの結合した蛍光を有する粒子を選択するステップとを含んでよい。
【００１５】
ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、ＦｃＲＮおよびプロテインＡからなる群から選択されるＦｃ結合タンパク質に対して、天然ＩｇＧ１Ｆｃ断片の結合親和定数と比べて低い解離速度定数を有するＦｃ断片の生成では、選択ステップは、（ｉ）低い結合親和定数を有するＦｃ断片を発現する粒子ほど強く標識されなくなるように、提示されたＦｃ断片を有する発現粒子と、限定的な量の溶解型蛍光標識Ｆｃ結合タンパク質の混合物を形成するステップと、（ｉｉ）混合物中の結合が平衡に達した後に、結合した蛍光標識の量に基づいて粒子を選別するステップと、（ｉｉｉ）最低レベルの結合した蛍光を有する粒子を選択するステップとを含んでよい。
【００１６】
Ｃ１ｑ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃＲＮおよびプロテインＡからなる群から選択されるＦｃ結合タンパク質に対して、天然ＩｇＧ１Ｆｃ断片の結合親和定数と比べて低い解離速度親和定数を有するＦｃ断片の生成では、選択ステップは、（ｉ）提示されたＦｃ断片を有する発現粒子と、飽和量の溶解型蛍光標識Ｆｃ結合タンパク質の混合物を形成するステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）後の選択された時間に、飽和量の非標識Ｆｃ結合タンパク質を添加するステップと、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）から結合の平衡までの選択された時間に、結合した蛍光標識の量に基づいて粒子を選別するステップと、（ｉｖ）最高レベルの結合した蛍光を有する粒子を選択するステップとを含んでよい。
【００１７】
ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、ＦｃＲＮおよびプロテインＡからなる群から選択されるＦｃ結合タンパク質に対して、天然ＩｇＧ１Ｆｃ断片の結合親和定数と比べて高い解離速度親和定数を有するＦｃ断片の生成では、その方法は、（ｉ）提示されたＦｃ断片を有する発現粒子と、飽和量の溶解型蛍光標識Ｆｃ結合タンパク質の混合物を形成するステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）後の選択された時間に、飽和量の非標識Ｆｃ結合タンパク質を添加するステップと、（ｉｉｉ）ステップ（ｃｉｉ）から結合の平衡までの選択された時間に、結合した蛍光標識の量に基づいて粒子を選別するステップと、（ｉｖ）最低レベルの結合した蛍光を有する粒子を選択するステップとを含んでよい。
【００１８】
ＩｇＧ１抗体中に組み込まれたときに、抗体依存性細胞毒性を増強する能力を有するＦｃ断片の生成では、その方法は、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する高い結合親和定数または低い解離速度定数を特徴とするＩｇＧ１Ｆｃ断片を同定した後、ＦｃγＲＩＩＢ受容体に対して低い結合親和定数または高い解離速度定数を示すＦｃγＲＩＩＢ受容体に対する結合親和性で、同定した断片を選択するステップをさらに含んでよい。
【００１９】
ＩｇＧ１抗体中に組み込まれたときに、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を増強する能力を有するＦｃ断片の生成では、ステップ（ｃ）は、Ｃ１ｑ複合体に対する高い結合親和定数または低い解離速度定数を特徴とするＩｇＧ１Ｆｃ断片を同定した後、ＦｃγＲＩＩＢ受容体に対して低い結合親和定数または高い解離速度定数を示すＦｃγＲＩＩＢ受容体に対する結合親和性で、同定した断片を選択するステップをさらに含む。
【００２０】
外因性治療用ＩｇＧ１抗体中に組み込まれたときに、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体における１５８位の受容体多型を有するヒト患者での抗体に対する治療反応を増強する能力を有するＦｃ断片の生成では、選択ステップは、少なくともＦｃγＲＩＩＩＡ  Ｖ１５８受容体多型に対する結合親和性と同程度であるＦｃγＲＩＩＩＡ  Ｆ１５８受容体多型に対する結合親和性を特徴とする発現ＩｇＧ１Ｆｃ断片を選択するステップを含んでよい。
【００２１】
外因性治療用ＩｇＧ１抗体中に組み込まれたときに、ＦｃγＲＩＩＡ受容体における１３４位の受容体多型を有するヒト患者での抗体に対する治療反応を増強する能力を有するＦｃ断片の生成では、選択ステップは、少なくともＦｃγＲＩＩＡ  Ｈ１３１受容体多型に対する結合親和性と同程度であるＦｃγＲＩＩＡ  Ｒ１３１受容体多型に対する結合親和性を特徴とする発現ＩｇＧ１Ｆｃ断片を選択するステップを含んでよい。
【００２２】
その方法は、最初の選択ステップの後に、ＬＴＭライブラリー中でアミノ酸置換がなされたＦｃコード領域の少なくとも１つについて、その領域内の複数のアミノ酸位での同じアミノ酸置換物をコードするウォークスルー突然変異生成（ＷＴＭ）ライブラリーを構築するステップであって、置換されたアミノ酸が、最初に選択されたＦｃ断片の少なくとも１つのアミノ酸位で認められたアミノ酸変異と対応するステップと、選択可能な発現系中でＷＴＭライブラリーによってコードされたＩｇＧ１Ｆｃ断片を発現させるステップと、選択されたＩｇＧ１Ｆｃ結合タンパク質に対する、天然Ｆｃ断片で測定した同じ定数と比較しての結合親和定数または解離速度定数の所望の変化を特徴とするそのように発現させたＩｇＧ１Ｆｃ断片を選択するステップとをさらに含んでよい。
【００２３】
その方法で生成されたＩｇＧ１Ｆｃ断片は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ結合タンパク質に対する高い結合親和定数または低い解離速度定数を特徴とする可能性があり、その場合、天然Ｆｃ断片で測定した同じ定数と比べての定数の変化は１．５倍より大きい。
【００２４】
その方法で生成されたＩｇＧ１Ｆｃ断片は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ結合タンパク質に対する低い結合親和定数または高い解離速度定数を特徴とする可能性があり、その場合、天然Ｆｃ断片で測定した同じ定数と比べての定数の変化は１．５倍より大きい。
【００２５】
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、添付図面と併せて下記の本発明の詳細な説明を読んだときにより十分に明らかとなるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
Ｉ．定義
以下の用語は、別段の指定がない限り本明細書において下記の定義を有する。
【００２７】
ＩｇＧ  Ｆｃ断片およびその断片を含む重鎖における残基の番号付けは、参照により本明細書に特に組み込まれている、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国国立衛生研究所公衆衛生局（Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）、メリーランド州Ｂｅｔｈｅｓｄａ（１９９１）にあるＥＵインデックスのものである。「ＫａｂａｔにあるＥＵインデックス」とは、ヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の残基の番号付けを指す。
【００２８】
「Ｆｃ領域」または「Ｆｃ断片」という用語は、図１に示すＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を定義するのに使用する。ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基からカルボキシル末端までの領域と定義される。「Ｆｃ領域含有ポリペプチド」という用語は、Ｆｃ領域を含む、抗体やイムノアドヘシン（下記の定義を参照）などのポリペプチドを指す。「Ｆｃ断片」という用語は、抗体のＦｃ領域またはその小領域、例えば、エフェクター機能を含むＣＨ２またはＣＨ３領域を指す。
【００２９】
ＩｇＧのＦｃ領域は、図１Ａに示すように、２つの定常ドメインＣＨ２およびＣＨ３を含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２」ドメイン（「Ｃγ２」ドメインとも呼ばれる）は通常、アミノ酸２３１〜アミノ酸３４０にわたっている。ＣＨ２ドメインは、それがしっかり他のドメインと対にならない点で独特である。むしろ、２つのＮ−結合型分枝糖鎖が、完全な天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に介在する。
【００３０】
「ヒンジ領域」は一般に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６〜Ｐｒｏ２３０にわたる領域と定義される（Ｂｕｒｔｏｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１〜２０６（１９８５））。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、同じ位置で重鎖間Ｓ−Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を並べることによってＩｇＧ１配列と整列させることができる。
【００３１】
「Ｃ１ｑ」とは、イムノグロブリンのＦｃ領域の結合部位を含むポリペプチドである。Ｃ１ｑは、２つのセリンプロテアーゼＣ１ｒおよびＣ１ｓと一緒に、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）経路の第１の成分である複合体Ｃ１を形成する。ヒトＣ１ｑは、例えば、Ｑｕｉｄｅｌ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏから商業的に購入することができる。
【００３２】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域と結合する受容体を示すのに使用する。好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（γ受容体）と結合するものであり、それには、対立遺伝子変異体および選択的スプライス型を含めたＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体がある。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、９：４５７〜９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４：２５〜３４（１９９４）；ならびにｄｅ  Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１２６：３３０〜４１（１９９５）で総説されている。他のＦｃＲは、本明細書において「ＦｃＲ」という用語によって包含される。その用語はまた、母のＩｇＧを胎児へと移行する役割を担う新生児の受容体ＦｃＲｎをも含む（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：２４９（１９９４））。その用語はまた、Ｃ１ｑペプチド複合体やプロテインＡなど、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域と特異的に結合することが知られている他のポリペプチドをも含む。
【００３３】
「結合ドメイン」という用語は、他の分子と結合するポリペプチドの領域を指す。ＦｃＲの場合、結合ドメインは、Ｆｃ領域と結合する役割を担うそのポリペプチド鎖（例えばそのα鎖）の一部を含み得る。有用な結合ドメインの１つは、ＦｃＲα鎖の細胞外ドメインである。
【００３４】
「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、特に、（全長モノクローナル抗体を含む）モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および所望の生物学的活性を示す限りで抗体断片を包含する。
【００３５】
本明細書において「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質の抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在する可能性がある、天然に存在する起こり得る突然変異を除いて同一である。
【００３６】
本明細書において「Ｋｏｆｆ」という用語は、動態選択の機構から決定される、抗体／抗原複合体からの抗体の解離についての解離速度定数を指すものとする。Ｋｏｆｆ速度定数の単位は秒−１であり、結合している複合体が解離する速度を示す。Ｋｏｆｆ定数が高値であることは、解離が高速であり、したがって２つの結合している種間の親和性が低いことを意味する。すなわち、２つの結合している種間の親和性は、そのＫｏｆｆを低下させ、かつ／またはそのＫｏｎを増大させることによって増大させることができる。
【００３７】
本明細書において「ＫＤ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を指し、平衡状態にある抗体分子の溶液中に存在するすべての抗体結合部位の半分を占めるのに必要な抗原の濃度（Ｍで表される）を示すものであり、抗体の結合および解離速度定数のＫｏｆｆ／Ｋｏｎに等しい。抗体の結合定数ＫＡは１／ＫＤである。ＫＤの測定から、結合作用物質がすべて溶液中にあることが想定される。例えば、哺乳動物細胞発現系で、抗体が細胞壁に繋がっている場合、対応する平衡速度定数はＥＣ５０として表され、それからＫＤの十分な近似値が得られる。ＫＤの値が低いほど結合定数は高くなり、すなわち、ＫＤ１０−８Ｍは、１０−７Ｍより親和性が高い。
【００３８】
本明細書で使用する３文字および１文字のアミノ酸の略記法ならびに単一文字のヌクレオチド塩基の略記法は、確立された慣例に従っている。
【００３９】
ＩＩ．Ｆｃ−ＬＴＭライブラリー
この節では、本発明の方法で使用するＦｃ−ＬＴＭライブラリーを説明する。下記の第ＩＶ節でより十分に論じるように、そのライブラリーの目的は、Ｆｃ断片の１つまたは複数の選択された領域においてそれぞれまたは実質的にそれぞれのアミノ酸位で選択されたアミノ酸置換突然変異を生成して、エフェクター機能が増強されたＦｃ断片についてスクリーニングすることができるＦｃ断片のライブラリーを生成することである。
【００４０】
ＩｇＧ抗体２０のＦｃ部分または断片を図１Ａに示し、それは、ＣＨ２およびＣＨ３と呼ばれる２つの相同な定常領域ドメイン２２、２４を含み、それらのドメインは、Ｆｃ受容体媒介反応にとって最も重要であるドメインであることが知られている。「不偏性」ＬＴＭライブラリーは、これらのドメインの一方または両方の中に局在し、「活性領域」ＬＴＭライブラリーは、典型的には、ＦｃとＦｃ受容体タンパク質の相互作用に関与するＣＨ２ドメインの１〜４つの領域中に局在する。
【００４１】
２つの重要なエフェクター機能は、図１Ｂおよび１Ｃでそれぞれ示される細胞媒介性細胞傷害作用（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）であり、その機能についてＦｃ機能の増強がスクリーニングされ、その機能を下記の第ＩＶ節でさらに検討する。これらおよび他の適用では、Ｆｃエフェクター機能の増強は、（ｉ）選択されたＩｇＧ１Ｆｃ結合タンパク質に対する、天然ＩｇＧ１Ｆｃと比べた結合親和定数（ＫＤ）の変化；および／または（ｉｉ）選択されたＩｇＧ１Ｆｃ結合タンパク質に対する、天然ＩｇＧ１Ｆｃと比べた解離速度定数（Ｋｏｆｆ）の変化と関係する。第ＩＶ節でみられるように、Ｆｃライブラリーを結合定数の変化で直接スクリーニングすることができ、その変化は、測定する結合定数、関与するＦｃ結合タンパク質、および結合定数の変化の所望される効果に応じて、結合定数の増大である可能性もあり、あるいは低下である可能性もある。あるいは、エフェクター機能の増強、例えば、ＣＤＣまたはＡＤＣＣの増大または低下を直接測定することができる。
【００４２】
下記で詳述するＬＴＭライブラリーおよびスクリーニング法を、ＩｇＧ１型抗体での増強されたＦｃの性質の生成に特に適用する。しかし、その方法を、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４サブタイプのＩｇＧ抗体にも同様に適用できることが理解されるであろう。下記のＢ節では、各ＩｇＧサブタイプで所望される可能性があるエフェクター機能の増強の様々な型について論じる。
【００４３】
Ａ．Ｆｃ−ＬＴＭライブラリー
ルックスルー突然変異生成（ＬＴＭ）の目的は、ポリペプチドの領域中で、多数の標的突然変異の各位置で選択された置換を導入することである。単一ポリペプチド中の１つ１つの位置での残基置換を可能にするコンビナトリアル法またはウォークスルー突然変異生成（ＷＴＭ）（下記を参照）と異なり、ＬＴＭでは、置換を単一の選択された位置に限定し、すなわち、定められた領域または小領域内で単一の置換を行う。
【００４４】
本発明は、ＬＴＭ分析用に構築される２つの一般的な型のＦｃライブラリーを意図するものであり、どちらも下記でＦｃ−ＬＴＭライブラリーと呼ばれる。第１のライブラリーは「不偏性」ＣＨ２×ＣＨ３ライブラリーと称され、各ライブラリーコード配列は、ＣＨ２領域中の１つの選択された残基の位置でのアミノ酸置換、およびＣＨ３領域中の１つの選択された残基の位置での単一アミノ酸を含み、ライブラリーは、好ましくは、両方の領域中のそれぞれまたは実質的にそれぞれの位置で、主要なアミノ酸のクラスを集合的に表す選択されたＬＴＭアミノ酸の各サブセットの置換物を含む。すなわち、天然Ｌ−アミノ酸２０種すべての効果を調べるのではなく、その群全体の化学的多様性を表すこれらのサブセットを使用するとより効率がよい。この基準を満たすＬ−アミノ酸の代表的なサブセットの１つは、アラニン、アスパラギン酸塩、リシン、ロイシン、プロリン、グルタミン、セリン、チロシン、およびヒスチジンのアミノ酸９種を含む。これらのアミノ酸は、抗体の特性の向上に必要な化学官能性について意味のある初期情報を提供する、サイズ、電荷、疎水性、および水素結合する能力における十分な化学的多様性を示す。
【００４５】
図２でみられるように、１９２６個のＬＴＭオリゴヌクレオチド（２１７個のＦｃドメインアミノ酸×Ｆｃの位置当たり９個のＬＴＭアミノ酸置換物）があり、それは平均して長さが６３塩基対である。「不偏性」Ｆｃドメインライブラリーでは、ＣＨ２（配列番号１）およびＣＨ３（配列番号２）領域を、長さ５〜７アミノ酸の並列させた小区分（それぞれ配列番号１２および１３）に人為的に分割する。したがって、１８個のＣＨ２および１６個のＣＨ３小区分は、連続した全長ＩｇＧ１Ｆｃ配列の部分を個々に表す。ＣＨ２およびＣＨ３の各ドメイン中の１つの位置に異なるアミノ酸９個のうち１個を置くことにより、９９０×９６３個の異なるライブラリー遺伝子、すなわち９．５×１０５個の異なるライブラリー遺伝子が得られる。
【００４６】
ＣＨ２およびＣＨ３の各ドメイン中の１つの位置で、例えばアミノ酸９個のうち１個の単一突然変異を含む不偏性ライブラリーを調製する代替スキームを図３に示す。その図は、ＣＨ２領域の（任意の）小領域１８個のうち１個、およびＣＨ３領域の小領域１６個のうち１個を示す。ここでの手法は、ＣＨ２における１８個の各小領域およびＣＨ３における１６個の各小領域について１８×１６個の「不偏性」サブライブラリーを作製するためのものであり、これらの各サブライブラリーは、選択された小領域、例えばＣＨ２における小領域−８中の１つの位置、および選択された小領域、例えばＣＨ３における小領域１中の１つの位置でアミノ酸突然変異９個のうち１個を含む。
【００４７】
第２の一般的な型のＦｃ  ＬＴＭライブラリーは、ＩｇＧ１ＦｃとＦｃγＲＩＩＩａの共結晶構造から同定された別々のＩｇＧ１ＦｃとＦｃγＲＩＩＩａの「接触」点４つのうち１つまたは複数の位置での突然変異に相当する（図４）。次いで、この第２のライブラリーから、全部の上記「不偏性」ＣＨ２×ＣＨ３ライブラリー内にある４つの小領域（配列番号１４〜１７）が描かれる。「接触」小領域１での所望のアミノ酸置換物を図５に示す。「接触」小領域１：ＬＬＧＧ（配列番号１４）は、ＤＮＡ配列：ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＧＧＧ  ＧＧＡによってコードされ、ＤＮＡ配列５’−ｃｃａ  ｃｃｇ  ｔｇｃ  ｃｃａ  ｇｃａ  ｃｃｔ  ｇａａおよびｃｃｇ  ｔｃａ  ｇｔｃ  ｔｔｃ  ｃｔｃ  ｔｔｃ  ｃｃｃ  ｃｃａ  ａａａ  ｃｃｃ−３’のフレームワークに隣接する。「接触」小領域１についてのグリシンＬＴＭ置換オリゴヌクレオチド４つを列挙する（配列番号１８）。ＬＴＭオリゴヌクレオチド配列：５’−ｃｃａ  ｃｃｇ  ｔｇｃ  ｃｃａ  ｇｃａ  ｃｃｔ  ｇａａ  ＧＧＧ  ＣＴＧ  ＧＧＧ  ＧＧＡ  ｃｃｇ  ｔｃａ  ｇｔｃ  ｔｔｃ  ｃｔｃ  ｔｔｃ  ｃｃｃ  ｃｃａ  ａａａ  ｃｃｃ−３’は、グリシン置換コドンを示す（太字）。「接触」小領域１では、アスパラギン（配列番号１９）、アスパラギン酸塩（配列番号２０）、ヒスチジン（配列番号２１）、トリプトファン（配列番号２２）、イソロイシン（配列番号２３）、アルギニン（配列番号２４）、プロリン（配列番号２５）、およびセリン（配列番号２６）の残りの対応するＬＴＭオリゴヌクレオチドは、類似した配列設計の戦略を示す。図６に、ＩｇＧ１Ｆｃ  ＣＨ２ドメインの第１の接触小領域でのアスパラギン置換のＬＴＭオリゴヌクレオチド４つを示す。
【００４８】
図７は、４つのＦｃ「接触」小領域を組み合わせる際に利用できる様々な組合せを表す図であり、各「接触」小領域がそれ自体９個のＬＴＭライブラリーである。例えば１つのライブラリーで、それは「接触」小領域１中の１つの位置でのアスパラギンＬＴＭ、「接触」小領域２中の１つの位置でのアスパラギン酸塩ＬＴＭ、「接触」小領域３中の１つの位置でのトリプトファン、および「接触」小領域４中の１つの位置でのプロリンからなり得る。異なるアミノ酸９個の組についてのライブラリーサイズは、したがって３６４である。
【００４９】
Ｂ．コンビナトリアル有益突然変異生成（ＣＢＭ）ライブラリー
機能アッセイを使用してＬＴＭ  Ｆｃ変異体をスクリーニングし選択した後、下記で詳述するように、次いでそれらのクローンを救済することにより、そのＤＮＡコード配列の同定が可能となる。コンビナトリアル有益突然変異の手法では、同定された有益なＬＴＭ突然変異の組合せに相当するコード配列をその後生成し、それらを一緒に混合して単一のライブラリーにする。これらの組合せは、単一の小領域内での、またはＦｃ内の２つ以上の小領域間での異なる有益な突然変異の組合せである可能性がある。したがって、複数の突然変異の相乗効果をこの過程で探ることができる。
【００５０】
コンビナトリアル手法は、Ｆｃ小領域内で選択されたコドン置換がＬＴＭによって同定された異なる有益なアミノ酸置換である以外はウォークスルー突然変異生成法（米国特許第５７９８２０８号、第５８３０６５０号、第６６４９３４０Ｂ１号、および米国特許出願第２００３０１９４８０７号）と類似している。図８に示すように、このコード配列ライブラリーは、可変コード領域中の異なる各位置に単一アミノ酸のコドンを置く代わりに、導入するコドンがＬＴＭ法で検出されたすべての有益な突然変異に対応するものである以外は、ＷＴＭ法の改変によって調製することができる。ＷＴＭのように、Ｆｃ  ＣＢＭライブラリー中の残基の位置がすべて突然変異を含むわけではなく、いくつかの位置はその位置で置換された複数の異なるアミノ酸を有する。全体的に、有益な突然変異のすべてではないが多い潜在的な組合せは、ライブラリー中のコード配列の少なくとも１つに相当する。
【００５１】
ＩＩＩ．エフェクター増強ＩｇＧ１Ｆｃ断片の生成
この節では、本発明に従ってＦｃ−ＬＴＭライブラリーのＦｃ断片を生成し発現させる方法を説明する。オリゴヌクレオチドＬＴＭおよびＣＢＭライブラリーの設計は、好ましくは、自動化された注文製ＤＮＡの合成機とつながったソフトウェアを使用して実施する。ＬＴＭおよびＣＢＭ戦略の実施では下記のステップを行う。選択された（複数の）Ｆｃ領域中に組み込む標的アミノ酸を選択した後、ソフトウェアが、選択された位置に標的アミノ酸を導入するのに必要なコドン配列を決定する。選択された提示およびスクリーニング用宿主、例えば哺乳動物発現系での発現に最適なコドン使用頻度を選択する。ソフトウェアはまた、この設計過程によって生じる可能性がある野生型配列の任意の重複をも削除する。次いでそれは潜在的な終止コドン、ヘアピン、ループおよび他の問題のある配列があるかどうか分析し、次いでそれを修正する。ソフトウェアは、（ＣＢＭの）合成で各ステップに添加する塩基の比を決定して、アミノ酸組み込み比を微調整する。次いで、完成したＬＴＭまたはＣＢＭ設計計画をＤＮＡ合成機に送り、それが、突然変異を誘発させた遺伝子を生成する際に使用するオリゴヌクレオチドのプライマーの自動合成を行う。
【００５２】
Ａ．ＬＴＭ分析用表面発現Ｆｃの構築
入手可能な供給源から野生型ＩｇＧ１遺伝子を得、標準的な技術によってそれを増幅することができる（実施例１Ａ）。キメラ表面発現Ｆｃ野生型遺伝子構築物（約０．６５ｋｂ）は、Ｎ末端で細胞外輸送シグナルを、Ｃ末端で膜アンカーシグナルを融合することによって、ＳＯＥ−ＰＣＲによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで構築することができる。潜在的なＮ末端細胞外輸送シグナルのリストには、ヒトＩｇＧ１およびネズミＩｇＧｋ由来のもの（配列番号７）が含まれる。潜在的なＣ末端膜アンカーシグナルのリストには、胎盤アルカリホスファターゼタンパク質（ＰＬＡＰ）、膜ＩｇＭおよび血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）（配列番号８）が含まれる。様々な融合構築物を図９で図式的に示す。実施例１Ｂで詳述するように、これらの成分をＰＣＲで増幅し集合させた。Ｎ末端ネズミＩｇＧκシグナルとＣ末端ＰＤＧＦ膜貫通領域（配列番号９）、Ｎ末端ヒトＩｇＧ１シグナルとＣ末端ＩｇＭ膜貫通領域（配列番号１０）、またはＮ末端ヒトＩｇＧ１シグナルとＣ末端ＰＬＡＰ膜脂質挿入シグナル（配列番号１１）を融合する際に、様々なＦｃ表面発現構築物（図９）が考えられる。この反復では、融合構築物は細胞膜に対して近位である（最も近い）ＣＨ３ドメインを有するが、ＣＨ２ドメインは遠位である（図１０Ａ）。図１１は、Ｎ末端ＩｇκリーダーとＣ末端ＰＤＧＦ受容体膜貫通アンカーの間にＦｃ−ＬＴＭ構築物をクローン化するためのｐＤｉｓｐｌａｙ発現ベクターを示す。
【００５３】
いくつかの適用では、ＩｇＧの標的結合の自然な提示を模倣するとき、ＣＨ２ドメインが細胞表面膜に対して近位であり、ＣＨ３が遠位である（図１０Ｂ）ことが望ましい可能性がある。この代替の位置付けのため、下記のベクターは、実施例１Ｃで詳述するように、Ｆｃ遺伝子領域に先行するようにＮ末端膜貫通リーダー／アンカーシグナル配列を融合することにより設計されている（図１２）。
【００５４】
Ｂ．クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）突然変異生成によるＦｃ−ＬＴＭライブラリーの調製
実施例２で詳述するように、本発明で使用するＦｃ−ＬＴＭライブラリーを、上記のＡ節で調製したＦｃ発現構築物のクンケル突然変異生成によって調製する。実施例２Ａと同様に、クンケル用一本鎖Ｆｃ鋳型を調製した。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：４８８〜９２；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．ら（１９８７）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５４：３６７〜８２；Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．およびＳｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１００：４６８〜５００；Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．（１９８３）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６６：５５７〜８０；ならびにＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌに詳述されている標準的な方法に従って、鋳型のクンケル突然変異生成を実施した。
【００５５】
図１３Ａは、鋳型の野生型Ｆｃコード配列中に単一コドン置換を導入するクンケル突然変異生成における一般的なステップを示す。最初に、一本鎖ウリジン化鋳型（ステップ１での破線の円）を、遺伝子のＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン中の選択された位置に選択されたコドン置換を有するオリゴヌクレオチド（実線の断片）とともにハイブリダイゼーション条件下で反応させる（図１３Ａでのステップ１）。相補鎖（ステップ２での実線）を合成して二本鎖の二重鎖を形成した後、ウリジン化鎖を変性して、コドン置換の変化が組み込まれた一本鎖の鋳型を得る（ステップ３）。この鎖を使用して二本鎖型の突然変異遺伝子を合成する（ステップ４）。突然変異遺伝子中にさらなる突然変異を導入するために、二本鎖遺伝子を操作して、遺伝子上の新たな位置に他のオリゴヌクレオチドを付加したウリジン化一本鎖鋳型を再生する（ステップ５）。例えば、その２つの領域は、Ｆｃコード配列のＣＨ２およびＣＨ３ドメインに相当する可能性もあり、あるいはＣＨ２ドメインの４つの接触領域のうち２つに相当する可能性もある。
【００５６】
実際には、鋳型に、そのコドン置換が遺伝子の所与の領域内の各位置での個々のアミノ酸置換のすべてに相当する異なるオリゴヌクレオチドを付加することによって、図１３Ａで示すような単一の反応スキームを実施する。例えば、Ｆｃ領域中の５個の各領域に９個の各アミノ酸のＬＴＭ突然変異を導入するには、合計４５個の異なるオリゴヌクレオチドを単一反応混合物に加えることになる。ステップ１〜５を行った後、十分な数の反応産物を調べて、所望の異なるＬＴＭ配列が存在することを確認する。例えば、上記の例で４５個の異なる配列がすべて存在することを確認するために、２０〜３０個の配列を決定して異なる配列が混合物中にそれぞれあることを実証すると十分となり得る。
【００５７】
野生型Ｆｃ遺伝子をクンケル鋳型として使用する代わりに、予め生成したＬＴＭライブラリー鋳型を選択する以外は上記の通りに、二重、三重および四重の領域ＬＴＭライブラリーを作り出すことができる。「接触」小領域１および３両方の二重ＬＴＭライブラリーを作り出すために、予め生成したＬＴＭ「接触」小領域１突然変異遺伝子を一本鎖の鋳型として使用して、それと１組の小領域３オリゴヌクレオチドをアニールして、二重ＬＴＭライブラリーを生成する。次いで、二重ＬＴＭライブラリーをＬＴＭ「接触」小領域４オリゴヌクレオチドを組み込む鋳型として使用して、三重ＬＴＭライブラリーを作製することができる。開始用単一および二重ＬＴＭライブラリーを累進的に利用することによって、より複雑な一連のＬＴＭライブラリーを、ＬＴＭアミノ酸の反復をすべて使用して開発することができる（図１５Ａ）。
【００５８】
図１３Ｂに、Ｆｃコード領域の各ライブラリー中で複数の突然変異を生成する、本発明の一態様によるクンケル法の新規な適用を示す。この手法では、それぞれがＦｃ遺伝子の選択された領域と対応する別々の組のオリゴヌクレオチド（図では３組）を、ステップ１でＦｃ鋳型に加える。例えば、その方法で使用する３組のオリゴヌクレオチドは、ＣＨ２ドメイン中の最初の３つの接触位置でＬＴＭに使用する３６、４５、および２７個の異なる配列に対応し得る。図に示すように、その方法の第１ステップの結果、各組のコドン置換突然変異から１つの構成要素が結合した一本鎖のウリジン化鋳型鎖が得られる。上記に記載の同じステップ２〜４を実施することにより、その方法の結果、それぞれが、標的とする３つの各Ｆｃコード領域で単一の選択された突然変異のいくつかの組合せを含む二本鎖Ｆｃコード領域が生成する。現実のＦｃ−ＬＴＭライブラリー中の配列の詳細は実施例２Ｃで示す。
【００５９】
クンケルＬＴＭ突然変異生成の前に、Ｆｃドメインを修飾して、ＬＴＭによって調べられる様々な小領域の読み枠中に終止コドンを導入することができる。例えば領域Ｆｃ−ＦｃγＲＩＩＩａ「接触」点ＬＴＭライブラリーでは、４個の別々の「終止修飾」した鋳型がある。配列番号２８で示すオリゴヌクレオチドを使用して、野生型Ｆｃ鋳型を「終止修飾」した。その目的は、クンケル突然変異生成を行わなかった、「終止修飾」した野生型の鋳型を、Ｎ末端切断型タンパク質として発現させることである。これらの切断構築物は、細胞外シグナルリーダーおよび様々な長さのＦｃドメインからなる。しかし、突然変異を誘発させていない読み枠の翻訳は、膜貫通アンカーシグナルまで続かない。したがって、「終止修飾」した鋳型は翻訳され、輸送されるが、細胞外の細胞表面上で保持されない（図１４Ａと１４Ｂを比較）。したがって、切断を有するライブラリー細胞は、その後添加されるＦｃ受容体および結合タンパク質では認識されない。
【００６０】
これらの「終止修飾」した鋳型は、野生型コード配列を再導入する補助的特徴を許容する。「オープンリーディングフレーム」オリゴヌクレオチド（配列番号２９）を加えると、終止コドンを元のＦｃコドンに置換することが可能となる。このように、「野生型」再導入突然変異生成は、ＬＴＭオリゴヌクレオチドによって導入されたものと釣り合っている。したがって、Ｆｃ−ＬＴＭ表面発現ライブラリーは、相対的過多とはならない内部野生型基準対照を有する。
【００６１】
Ｆｃ鋳型をＬＴＭ修飾した後、構築物をクローン化ベクターから切り出し、それを精製し、適切な発現ベクター（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）中に連結する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換およびＬＢａｍｐプレート上での選択の後、構築物の配列を決定して、Ｆｃの所望のコード変化、ならびに隣接する細胞外分泌および膜標的化領域を確認することができる。
【００６２】
Ｃ．Ｆｃ  ＬＴＭライブラリーの発現
選択可能な抗体の発現および提示の様々な方法が利用可能である。これには、バクテリオファージ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、酵母や哺乳動物細胞系統などの生物学的「粒子」（細胞またはウイルス粒子）がある。抗体発現の他の方法には、リボソームディスプレイや、ポリヌクレオチド（すなわち、遺伝子型）とポリペプチド（すなわち、表現型）を関連付けることを可能にするアレイ技術、例えばＰｒｏｆｕｓｉｏｎ（商標）などの無細胞系があり得る（例えば、米国特許第６，３４８，３１５号、第６，２６１，８０４号、第６，２５８，５５８号および第６，２１４，５５３号を参照）。
【００６３】
好ましい発現系の１つは哺乳動物細胞を含み、この細胞は、（ｉ）臨床用品質のモノクローナル抗体を産生することができ、（ｉｉ）培養中で非付着性であり、（ｉｉｉ）レトロウイルスを導入することが容易である。これらの性質を有する例示的な細胞は、ＢａＦ３、ＦＤＣＰ１、ＣＨＯおよびＮＳＯ細胞である。
【００６４】
既知の手順に従って、これらの細胞にＦｃライブラリー発現ベクターを導入することができる。実施例３で詳述する方法では、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介するプロモーターエレメント、Ｆｃコード配列、ならびに転写の終結および転写物のポリアデニル化に必要なシグナルを含むｐＬＸＳＮ哺乳動物発現ベクターを両栄養性パッケージング細胞系統ＰＡ３１７中にトランスフェクトする。図１５は、実施例３Ａおよび３Ｂで詳述する、ウイルス上清を直接収集する一過性トランスフェクションのプロトコールを示す。実施例３Ｃで詳述するように、発現細胞系統、例えばＮＳＯ細胞に、回収したウイルス上清を導入する。実施例３Ｄで説明するように、細胞表面上でのＦｃ断片の発現、およびＦｃγＲＩＩＩＡなどのＦｃ受容体と発現ポリペプチドの結合をＦＡＣＳ分析により確認することができる。
【００６５】
ＩＶ．エフェクター機能の増強についてのＦｃ断片のスクリーニング
この節では、エフェクター機能の増強について、上記のＦｃ−ＬＴＭライブラリーの発現Ｆｃ断片をスクリーニングする方法を検討する。下記のＡ小節では、いくつかのＦｃ受容体タンパク質を説明し、それぞれについて、スクリーニングすることができる結合親和性の所望の変化（増大または低下）を示す。第ＩＩ節で述べたように、このエフェクター機能は、（ｉ）選択されたＩｇＧ１Ｆｃ結合タンパク質に対する、天然ＩｇＧ１Ｆｃと比べた結合親和定数（ＫＤ）の変化；および／または（ｉｉ）選択されたＩｇＧ１Ｆｃ結合タンパク質に対する、天然ＩｇＧ１Ｆｃと比べた解離速度定数（Ｋｏｆｆ）の変化と関係する。したがって、下記のＢ小節で説明するように、発現Ｆｃライブラリーを結合定数の変化でスクリーニングすることができ、その変化は、測定する結合定数、関与するＦｃ結合タンパク質、および結合定数の変化の所望される効果に応じて、結合定数の増大である可能性もあり、あるいは低下である可能性もある。あるいは、本発明の新規スクリーニング方法に従って、Ｃ小節で開示するように、Ｆｃ発現細胞で細胞溶解の程度を直接測定することにより、ＣＤＣまたはＡＤＣＣと関係するエフェクター機能の増強についてＬＴＭライブラリーＦｃ断片を直接スクリーニングすることもできる。特定の受容体標的をＤ小節で示す。
【００６６】
Ａ．Ｆｃ受容体
この節では、様々なＦｃ受容体タンパク質（標的）、および４つの主要なサブクラスのＩｇＧ抗体についてＦｃとそのタンパク質の結合の増強または減弱を行う治療上の意味を検討する。一般に、Ｆｃ媒介エフェクター機能を増強する場合、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３と、エフェクター活性を媒介するＦｃγＩＩＩａ受容体などのＦｃ受容体の結合性を増大させることが通常望ましい。しかし、いくつかの適用では、任意の型のＦｃγＲ受容体との結合性の低下が必要となる。例えば、細胞傷害性ペイロード（放射性標識）と結合したＦｃ断片を有するすべてのアイソタイプのＩｇＧは、そうしないと、正常なＦｃγＲを有する免疫細胞をＦｃ−放射性結合体にし、それを死滅させる。他の適用では、エフェクター機能を有さない純粋に中和性の抗体を有することが望ましい可能性がある。この状況では、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４は、ほとんどのＦｃ受容体に対して親和性が低いが、Ｆｃ受容体とこれらのアイソタイプの結合性をさらに低下させることが望ましい可能性がある。例えば、ＩｇＧ４とＦｃγＲＩの結合性をさらに低下させ、ＩｇＧ２とＦｃγＲＩＩａの結合性を低下させて、エフェクター機能を最小限にすることができる。ＩｇＧ３はＦｃＲＮに対する親和性が低く、この受容体に対する親和性を増大させると、抗体の循環半減期が増大するはずである。
【００６７】
下記の表では、上向きの矢印↑を使用して、結合したＦｃ結合相手に対するＦｃ断片の親和性の増大を示す。この親和性の増大は、結合親和定数ＫＤの増大、またはＫｏｆｆ速度定数の低下によって実現することができる。結合親和定数の増大は、値が小さい数への変化、例えば、１０−７Ｍから１０−８Ｍへの変化を反映する。Ｋｏｆｆ値の低下はＫｏｆｆが低値であることを意味し、そのことからＦｃ−結合受容体複合体が解離する傾向が小さいことが示唆される。同様に、表↑中の下向きの矢印↓を使用して、結合したＦｃ結合相手に対するＦｃ断片の親和性の低下を示す。この親和性の低下は、結合親和定数ＫＤの低下、またはＫｏｆｆ速度定数の増大によって実現することができる。結合親和定数の低下は、値が大きい数への変化、例えば、１０−８Ｍから１０−７Ｍへの変化を反映する。Ｋｏｆｆ値の増大はＫｏｆｆが高値であることを意味し、そのことからＦｃ−結合受容体複合体が解離する傾向が大きいことが示唆される。表中の横向きの矢印→は、結合親和性の変化がない（または実質的にない）ことを意味する。
【００６８】
表中に列挙した様々なＦｃ受容体について検討すると、Ｃ１Ｑは、上記に記載のように、ＣＤＣにおいて不可欠な役割を果たす、血漿中に存在する補体結合複合体である。Ｃ１ｑと結合するＩｇＧ抗体によって認識された標的細胞は、補体媒介性細胞死（ＣＤＣ）を誘導する。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３に対するＣ１ｑの親和性を増大させると、ＣＤＣ機能が増大する（ＫＤが増大し、かつ／またはＫｏｆｆが低下する）。ＩｇＧ２に対するＣ１Ｑの親和性を低下させる（ＫＤを低下させ、かつ／またはＫｏｆｆを増大させる）と、ＩｇＧ２抗体受容体が関与する望まれていないエフェクター活性を低下させることができる。
【００６９】
【表１】
2008538908.tif 000003
【００７０】
ＦｃγＲＩ受容体は、単球、マクロファージ、好中球上で認められる高親和性受容体であり、食作用およびＡＤＣＣで機能する。ＦｃγＲＩは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３に対して高親和性であり、ＦｃγＲＩに対するＩｇＧ１およびＩｇＧ３Ｆｃの親和性を増大させると、ＡＤＣＣ機能が増大する。ＩｇＧ２およびＩｇＧ４に対するＦｃγＲＩの天然の親和性はそれぞれ認められずまたは非常に低い。ＩｇＧ２およびＩｇＧ４ＦｃのＦｃγＲＩ親和性をさらに低下させると、望まれていない受容体相互作用および望まれていないエフェクター活性を低下させることができる。
【００７１】
ＦｃγＲＩＩ受容体（ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ）は、Ｂ細胞、血小板、好塩基球、好酸球、好中球、単球およびマクロファージ上に認められ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３Ｆｃ断片と結合するが、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４とは弱くしか結合せず、または全く結合しない。ＦｃγＲＩＩａ／ｃ受容体は、Ｆｃ機能の正の制御因子であり、ＦｃγＲＩＩｂ受容体は、Ｉｇ産生のフィードバック阻害に関与する負の制御因子である。ＦｃγＲＩＩａ／ｃに対するＩｇＧ１およびＩｇＧ３Ｆｃの親和性を増大させると、Ｆｃが媒介するＡＤＣＣエフェクター機能が増大する。ＦｃγＲＩＩｂに対するＩｇＧ１およびＩｇＧ３Ｆｃの親和性を低下させると、フィードバック阻害が弱くなる。さらに、ＦｃγＲＩＩａ／ｃに対するＩｇＧ２Ｆｃの親和性を低下させると、ＩｇＧ２アイソタイプのＡＤＣＣ刺激が低下する。ＦｃγＲＩＩｂに対するＩｇＧ２およびＩｇＧ４Ｆｃの親和性を増大させると、ＡＤＣＣ活性がさらに負に制御される。
【００７２】
ＦｃγＲＩＩＩ受容体（ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂ）は、単球、マクロファージ、好中球およびＮＫ細胞上で認められる高親和性受容体であり、食作用および抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）で機能する。ＦｃγＲＩＩＩａはＦｃ機能の正の制御因子であり、ＦｃγＲＩＩＩｂは細胞内シグナル伝達を行わない負の制御因子である。ＦｃγＲＩＩＩは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３に対する親和性を有する。したがって、ＦｃγＲＩＩＩａに対するＩｇＧ１およびＩｇＧ３Ｆｃの親和性を増大させると、Ｆｃが媒介するＡＤＣＣエフェクター機能が増大する。
【００７３】
ＦｃＲＮ受容体は、一定のＩｇＧレベルの維持において、循環からＩｇＧを除去し、細胞内小胞を介して再循環させることにより機能する。ＦｃＲＮは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４に対して高親和性であり、再循環を介して３週間の循環半減期が可能となる。ＦｃＲＮはＩｇＧ３に対して低親和性であり、その結果、循環半減期がはるかに短くなる。したがって、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３に対するＦｃＲＮ親和性を維持しまたは増大させると、ＩｇＧの循環半減期が向上し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３のエフェクター機能の拡大が促進される。特定の実施形態では、半減期を短縮すると有利となる可能性がある。例えば、血液細胞に対する非特異的毒性を引き起こす可能性があるため、循環している放射標識抗体があると望ましくない可能性がある。ＦｃＲＮとの結合性を低下させると、結合していない放射標識抗体のより迅速な排除が可能となる。
【００７４】
プロテインＡは、細胞培養製造物からの抗体のアフィニティー精製を可能にするＩｇＧ結合タンパク質である。すべてのＩｇＧアイソタイプに対するプロテインＡ親和性を維持しまたは増大させると、他の細胞成分および増殖培地成分からのより良好な精製が可能となる。
【００７５】
実施例４は、ＫＤまたはＫｏｆｆ値を、適当な場合には受容体タンパク質のビオチン化を決定する下記に記載のスクリーニングアッセイで使用する、可溶型の様々なＦｃ受容体を得、または作製する方法を記載している。これには、ビオチン化Ｃｉｑ（実施例４Ａ）、ＦｃγＲＩＩＩａ１７６Ｖおよびその多型構築物であるＦｃγＲＩＩＩａ１７６Ｆ、ＦｃγＲＩＩＩａ１７６Ｖ、ＦｃγＲＩＩｂおよびＦｃγＲＩＩａの多型物、ＦｃγＲＩＩＩａ１７６Ｆおよびその多型構築物であるＦｃγＲＩＩＩａ１７６Ｖ（実施例４Ｂ）、ならびにＦｃＲ受容体（実施例４Ｃ〜４Ｅ）がある。図１６を参照しながら実施例５で詳述するように、ＢＩＡｃｏｒｅ分析を実施して、再び折り畳まれたＦｃγＲＩＩＩａ断片の機能的ＩｇＧ  Ｆｃ結合および予備的親和性（ＫＤ）を評価した。ＢＩＡｃｏｒｅ分析はまた、ＩｇＧ  ＦｃとＶ１５８およびＦ１５８多型のＦｃγＲＩＩＩａの結合親和性における既知の差とも一致する。
【００７６】
Ｂ．結合する性質が増強されたＦｃ断片についてのＦｃ産生細胞のスクリーニング
この小節では、ＫＤまたはＫｏｆｆの所望の変化（増大または低下）に基づいて、エフェクター機能が増強されたＦｃ−ＬＴＭライブラリーによって産生されたＦｃ断片をスクリーニングする方法を説明する。どちらの方法でも、発現している機能的Ｆｃ断片について細胞を事前選択し、すなわち、選択されたＦｃ受容体と少なくとも中程度の親和性で結合することができるＦｃ断片を発現している細胞を事前選択することが一般に望ましい。
【００７７】
Ｂ１．機能的Ｆｃについて濃縮する細胞の事前選択
図１７および１８に示す事前選択法では、Ｆｃ発現細胞、例えば、ＮＳＯ細胞を、平衡条件下でビオチン標識受容体、例えば、ビオチン標識ＦｃγＲＩＩＩａとともに、次いでストレプトアビジン標識磁性ビーズとともにインキュベートする。図１７の右側にみられるように、機能的Ｆｃ受容体を発現する細胞は、「磁性」細胞−受容体−ビーズ複合体を形成するが、非機能的Ｆｃ断片を発現する細胞は、大部分が反応しないままである。次いで、図１７の左側に示すように、反応混合物を含むカラムを磁場内に置き、反応しなかった細胞を溶出することによって、磁性標識細胞を反応しなかった細胞から分離する。残存している細胞混合物を磁場から除去した後、機能的Ｆｃ断片について濃縮した細胞集団をカラムから溶出する。
【００７８】
事前選択法に関与する反応ステップを図１８に示す。Ｆｃ産生細胞とビオチン標識ＦｃγＲＩＩＩａを平衡状態にした後（上段の中央フレーム）、ストレプトアビジン標識粒子を添加し（上段の右側）、機能的Ｆｃ断片を産生する細胞で細胞−受容体複合体を作製する。磁性（ＭＡＣＳ）カラム中でのカラム洗浄、その後の所望される細胞の溶出により磁性標識細胞を非標識細胞から分離し、濃縮した細胞を増殖させて、その後Ｆｃ受容体の結合親和特性に基づいて選択する。事前選択法の詳細は実施例６で示す。
【００７９】
Ｂ２．ＫＤが増強されたＦｃ断片のスクリーニング
結合親和定数が高い（または受容体および所望される治療効果に応じて低い）、すなわちＫＤが高い（低値である）Ｆｃ断片について、一部改変した図１７および１８に示す事前選択法も使用する。その方法では、選択されたビオチン化Ｆｃ受容体、例えばＦｃγＲＩＩＩａ受容体およびストレプトアビジン被覆磁性ビーズを使用して、哺乳動物細胞ライブラリーから高親和性分子を選択する。
【００８０】
最初に、（通常は機能的Ｆｃ発現について事前選択した）Ｆｃ発現細胞を、ビオチン化ＦｃγＲＩＩＩａと平衡状態にして、ビオチン化ＦｃγＲＩＩＩａが結合した細胞と低親和性非発現細胞の混合物を作製する。ＦｃγＲＩＩＩａとの結合の平衡状態の後、ストレプトアビジン被覆ビーズを混合物に添加して、高親和性発現細胞、ビオチン化ＦｃγＲＩＩＩａ、および磁性ビーズからなる結合複合体を形成する。磁石を使用して混合物から複合体を単離し、結合した複合体を厳密な条件下で数回洗浄して低親和性細胞および非特異的に結合した細胞の複合体を除去する。得られた精製複合体を、適切な解離用培地での処理により複合体から遊離させて、高親和性Ｆｃ断片の発現について濃縮された細胞を得る。
【００８１】
例示的なスクリーニング方法の１つでは、単離した細胞を低密度でプレートに播き、次いでクローン性コロニーを既知の細胞密度で培地中に懸濁する。次いで、ビオチン化ＦｃγＲＩＩＩａで、例えば、１０ｐＭ〜１０００ｎＭで示される既知の量のＦｃγＲＩＩＩａを添加することにより細胞を定量処理（ｔｉｔｒａｔｅ）する。平衡状態の後、遠心分離により細胞をペレットにし、それを１回または複数回洗浄して結合しなかったＦｃγＲＩＩＩａを除去し、次いでフルオレセイン化ストレプトアビジンを含む培地中に最後に再懸濁する。フルオレセイン化細胞をＦＡＣＳでスキャンして、細胞１個当たりに結合したフルオレセインの平均の程度を決定する。選択されたＦｃ断片は、選択された受容体に関して、野生型Ｆｃ断片より好ましくは少なくとも１．５倍高く、通常は１．５〜２．５倍高い（または、結合親和性の低下が所望される場合は低い）結合親和性を有する。
【００８２】
Ｂ３．Ｋｏｆｆが変化したＦｃ断片のスクリーニング
あるいは、Ｋｏｆｆの増強で、すなわち結合親和性の増大が所望される場合はＫｏｆｆが低値であることで、または結合親和性の低下が所望される場合はＫｏｆｆが高値であることで、発現細胞上で発現したＦｃ断片を選択することもできる。選択されたＦｃ断片は、同一の動態的結合条件下で測定したときに、好ましくは野生型Ｆｃ断片の測定されたＫｏｆｆと比べて１．５分の１以下、少なくとも５分の１〜２分の１である（または低親和性Ｆｃ断片が求められる場合は１．５〜２．５倍高い）Ｋｏｆｆ値を有する。
【００８３】
Ｋｏｆｆ値を決定する方法では、Ｆｃ発現細胞を、飽和量のビオチン化Ｆｃ受容体、例えばビオチン標識ＦｃγＲＩＩＩａとともに、例えば２５℃で３０分間の条件下で振盪しながらインキュベートして、受容体が結合した提示Ｆｃ断片を有効に飽和させる。次いで、細胞を、非ビオチン化ＦｃγＲＩＩＩａとともに、飽和条件下で、抗原の解離速度の関数として細胞と結合したビオチン化ＦｃγＲＩＩＩａの百分率が低下するのに十分である選択された時間インキュベートする。インキュベーション後、細胞を遠心分離し洗浄して結合しなかったビオチン化ＦｃγＲＩＩＩａを除去すると、抗体のＫｏｆｆの割合でビオチン化ＦｃγＲＩＩＩａと天然のＦｃγＲＩＩＩａの比を含む細胞が得られる。その方法の詳細は実施例７で示す。
【００８４】
次いで、フルオレセイン化ストレプトアビジン（ストレプトアビジン−ＰＥ）およびフルオレセイン化細胞マーカー（抗ｈｉｓ−フルオレセイン）とともに細胞をインキュベートし、細胞を洗浄しＦＡＣＳで選別することによってＫｏｆｆ値を決定する。既知の方法に従って、２つの蛍光マーカーの比からＫｏｆｆ値を決定する。実施例７でその方法についてさらに詳述する。
【００８５】
ある場合には、１つのＦｃ受容体に対する結合親和性が増強し、第２のＦｃ受容体に対する結合活性が変化した、例えば低下したＦｃ断片を選択すると有利となる可能性がある。図１９は、この型の選択についての選択スキームを示す。図の左の部分は、ＲＩＩＩａ受容体またはＣ１Ｑ複合体に対するＫｏｆｆ速度定数が増強されたＦｃ断片、すなわち、これらのＦｃ受容体の１つに関してＫｏｆｆ値が低値であるＦｃ断片を選択する（１回または複数回反復することがある）ステップを示す。これらのクローンのＦｃ断片は、その後ＣＤＣまたはＡＤＣＣアッセイで細胞溶解活性について試験したときにＣＤＣまたはＡＤＣＣ活性の増大を示す。所望されるＦｃ発現クローンの群を同定したとき、これらのクローンを、第２のＦｃ受容体、例えばＲＩＩｂに対する結合親和性の低下について、例えば、標的Ｆｃ受容体に関してＫｏｆｆ定数が高値であるＦｃ断片について細胞をスクリーニングする類似の方法を使用してさらにスクリーニングすることができる。
【００８６】
Ｂ４．細胞増殖および増強されたエフェクター配列の決定
結合親和性アッセイを行った後、Ｆｃの性質の所望される増強を示す細胞を、増殖拡大のため増殖させることができる。次いで、これらのクローンのＦｃ−ＬＴＭ配列を、Ｆｃ−ＬＴＭベクター特異的プライマーを用いたＰＣＲにより「救済」し、それを配列分析およびＬＴＭアミノ酸変化の同定に適した配列決定用ベクター中にサブクローン化する。こうして同定された、活性が増強した（特定のＦｃ受容体に関して結合親和性が増大または低下した）クローンを、現実のエフェクター機能について、例えば、下記に記載する型のＣＤＣまたはＡＤＣＣアッセイでさらに試験することができる。
【００８７】
例示的な受容体標的、および結合親和性の所望される増強は、（ｉ）Ｆｃ結合タンパク質Ｃ１ｑ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、およびＦｃγＲＩＩＩａに対する結合親和定数の上昇または解離速度定数の低下、（ｉｉ）Ｆｃ結合タンパク質ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩｂに対する結合親和定数の低下または解離速度定数の上昇；ならびにＦｃ結合タンパク質ＦｃＲＮおよびプロテインＡに対するそれぞれ結合親和定数の上昇もしくは低下または解離速度定数の低下もしくは上昇の１つを含む。
【００８８】
実験９で詳述するように、いくつかの実験では、その方法を使用して、ＦｃγＲＩＩＩａＦ１５８／Ｖ１５８および／またはＦｃγＲＩＩａＨ１３１／Ｒ１３１多型を有する個人間にある定量的なＡＤＣＣエフェクターの差をモニターした。
【００８９】
Ｂ５．コンビナトリアル有益突然変異
機能アッセイを使用してＬＴＭ  Ｆｃ変異体をスクリーニングし選択した後、次いでそれらのクローンを救済することにより、そのＤＮＡコード配列の同定が可能となる。コンビナトリアル有益突然変異（ＣＢＭ）の手法では、同定された有益なＬＴＭ突然変異の組合せに相当するコード配列をその後生成し、それらを一緒に混合して単一のライブラリーにする。これらの組合せは、単一の小領域内での、またはＦｃ内の２つ以上の小領域間での異なる有益な突然変異の組合せである可能性がある。したがって、複数の突然変異の相乗効果をこの過程で探ることができる。
【００９０】
コンビナトリアル手法は、Ｆｃ小領域内で選択されたコドン置換がＬＴＭによって同定された異なる有益なアミノ酸置換である以外はウォークスルー突然変異生成法（米国特許第５７９８２０８号、第５８３０６５０号、第６６４９３４０Ｂ１号、および米国特許出願第２００３０１９４８０７号）と類似している。図８に示すように、このコード配列ライブラリーは、可変コード領域中の異なる各位置に単一アミノ酸のコドンを置く代わりに、導入するコドンがＬＴＭ法で検出されたすべての有益な突然変異に対応するものである以外は、ＷＴＭ法の改変によって調製することができる。ＷＴＭのように、Ｆｃ  ＣＢＭライブラリー中の残基の位置がすべて突然変異を含むわけではなく、いくつかの位置はその位置で置換された複数の異なるアミノ酸を有する。全体的に、有益な突然変異のすべてではないが多い潜在的な組合せは、ライブラリー中のコード配列の少なくとも１つに相当する。
【００９１】
Ｃ．直接的機能スクリーニング
本発明の一態様によれば、Ｆｃ発現細胞をスクリーニングの標的細胞として使用して、ＣＤＣまたはＡＤＣＣの増強または阻害と関係するエフェクター機能の所望される増強を直接スクリーニングすることができる。図１Ｂおよび１Ｃを参照しながらその方法を説明し、実施例８で詳述する。ＣＤＣまたはＡＤＣＣのレベルを増強する発現Ｆｃ断片をスクリーニングする方法を説明する。しかし、どのようにその方法を改変するとＣＤＣまたはＡＤＣＣ機能が低下しまたは「中和」されたＦｃ断片を選択できるかが理解されるであろう。
【００９２】
図１Ｂは、細胞媒介性細胞傷害作用（ＣＤＣ）に関与する事象を示し、それは、抗原特異的抗体２６と、腫瘍細胞の表面上に発現した腫瘍特異的抗原など、細胞の表面上に発現した細胞表面抗原２８の最初の結合を含む。抗体が細胞と結合した状態で、Ｃ１ｑ補体因子３２と抗体のＦｃ断片３４が結合することにより、細胞の溶解および破壊が起こる。この細胞溶解機構は、身体から潜在的に有害な細胞を除去することを目的とする。
【００９３】
実施例８Ａおよび８Ｂで詳述する直接スクリーニング手順では、上記の通りに得られた、事前選択したライブラリーを希釈し、個々のクローン細胞をマイクロタイタープレートのウェルに入れ、同じ細胞を用いて第２の「レプリカ」プレートを形成する。Ｃ１ｑ複合体を含むヒト血清補体を実施例８Ｂと同様に調製し、それを段階希釈物においてマイクロタイタープレートのウェルに添加し、得られたＣＤＣ活性を蛍光定量的に測定する。添加した補体の量の点から表される最高のＣＤＣレベルを示す細胞を、所望の増強されたＣＤエフェクター機能を有するものとして同定することができ、かつ／またはＣＤＣ活性の所望される増強を示す細胞が同定されるまで増殖させＣＤＣ活性について再度スクリーニングすることができる。上記のように、増強されたＦｃ断片が同定されたとき、関係する細胞発現ベクターを分析してその断片のＦｃコード配列を決定することができる。
【００９４】
抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）における細胞溶解の機構を図１Ｃに示す。ＣＤＣと同様に、その機構には、腫瘍細胞４０上に発現した腫瘍特異的抗原など、細胞表面抗原３８と結合する抗原特異的抗体３６の最初の結合が関与する。次いで抗体のＦｃ断片４２はＦｃ受容体タンパク質４４、この場合ではナチュラルキラー（ＮＫ）細胞４６上にあるＦｃγＲＩＩＩａ受容体と結合して、腫瘍細胞の細胞媒介性の溶解を起こすことができる。
【００９５】
実施例８Ｃで詳述する直接スクリーニング手順では、上記の通りに得られた、事前選択したライブラリーを希釈し、個々のクローン細胞をマイクロタイタープレートのウェルに入れ、同じ細胞を用いて第２の「レプリカ」プレートを形成する。マイクロタイタープレートのウェルに、表面発現受容体を有するＮＫ細胞を含むＰＢＭＣを添加する。実施例８Ｃで詳述するように、インキュベーション後、細胞を遠心分離し、放出ＬＤＨについて細胞上清のアッセイを行う。最高レベルのＡＤＣＣ活性を示す細胞を、Ｆｃ活性の増強について選択することができ、かつ／またはＡＤＣＣの所望される増強を示す細胞が同定されるまで増殖させＡＤＣＣ活性について再度スクリーニングすることができる。
【００９６】
Ｆｃエフェクター細胞アッセイを行った後、所望されるレベルのＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性を示すその対応するレプリカの娘ウェルを、増殖拡大のため増殖させることができる。次いで、これらのクローンのＦｃ−ＬＴＭ配列を、Ｆｃ−ＬＴＭベクター特異的プライマーを用いたＰＣＲにより「救済」し、それを配列分析およびＬＴＭアミノ酸変化の同定に適した配列決定用ベクター中にサブクローン化する。
【００９７】
上記で論じたように、親和性が増強したＦｃ断片の同定および配列決定の後、同定された配列を、例えば、選択された抗原結合特異性および増強された受容体機能、例えば対象に投与したときにＣＤＣまたはＡＤＣＣを増強または抑制する能力を有する全長抗体または単鎖抗体の構築で使用することができる。実施例１０で、ＣＤＣまたはＡＤＣＣ機能が増強された全長リツキシン（Ｒｉｔｕｘｉｎ）抗体の構築について説明する。
【００９８】
下記の実施例は、限定することなく、本発明の様々な方法および適用について示すものである。
【実施例】
【００９９】
（実施例１）
Ａ．野生型ＩｇＧ１Ｆｃ遺伝子のクローン化
野生型ＩｇＧ１は、（ｉｍａｇｅクローン番号４７６５７６３、ＡＴＣＣ、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から入手した。個々のＣＨ２およびＣＨ３ドメインのアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を配列番号１〜４でそれぞれ示す。ＩｇＧ１Ｆｃ遺伝子（配列番号５および６）をＰＣＲで増幅し、増殖、ミニプレップＤＮＡ精製および一本鎖ＤＮＡ鋳型の作製（ＱＩＡｇｅｎ、カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ）用に、ｐＢＳＫＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）中にクローン化した。
【０１００】
プログラム可能なサーモサイクラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、マサチューセッツ州Ｗａｌｔｈａｍ）を使用して、フォワードＦｃ  ＰＣＲプライマー５’−ＴＡＴ  ＧＡＴ  ＧＴＴ  ＣＣＡ  ＧＡＴ  ＴＡＴ  ＧＣＴ  ＡＣＴ  ＣＡＣ  ＡＣＡ  ＴＧＣ  ＣＣＡ  ＣＣＧ  Ｔ−３’、リバースＦｃ  ＰＣＲプライマー５’−ＧＣＡ  ＣＧＧ  ＴＧＧ  ＧＣＡ  ＴＧＴ  ＧＴＧ  ＡＧＴ  ＡＧＣ  ＡＴＡ  ＡＴＣ  ＴＧＧ  ＡＡＣ  ＡＴＣ  Ａ−３’、１０ｕＭのオリゴヌクレオチドミックス５μｌ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μｌ）０．５μｌ、Ｐｆｘ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｌｓｂａｄ）５μｌ、１０ｍＭのｄＮＴＰ１μｌ、５０ｍＭのＭｇＳＯ４  １μｌおよびｄＨ２０  ３７．５μｌからなるＦｃドメインのＰＣＲ反応を行い、９４℃で２分間、その後９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、および６８℃で１分を２４サイクル、次いで６８℃で５分間のインキュベーションを行った。
【０１０１】
Ｂ．ＬＴＭ分析用表面発現Ｆｃ遺伝子の構築
キメラ表面発現Ｆｃ野生型遺伝子構築物（約０．６５ｋｂ）は、Ｎ末端で細胞外輸送シグナルを、Ｃ末端で膜アンカーシグナルを融合することによって、ＳＯＥ−ＰＣＲによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで構築した。潜在的なＮ末端細胞外輸送シグナルのリストには、ヒトＩｇＧ１およびネズミＩｇＧｋ由来のもの（配列番号７）が含まれる。潜在的なＣ末端膜アンカーシグナルのリストには、胎盤アルカリホスファターゼタンパク質（ＰＬＡＰ）、膜ＩｇＭおよび血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）（配列番号８）が含まれる。様々な融合構築物を図９で図式的に示す。簡潔に述べると、ＩｇＧｋ細胞外リーダーおよびＨＡタグ配列を、センス５’−ＡＧＴ  ＡＡＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＧＣＴ−３’およびアンチセンス５’−ＧＣＡ  ＣＧＧ  ＴＧＧ  ＧＣＡ  ＴＧＴ  ＧＴＧ  ＡＧＴ  ＡＧＣ  ＡＴＡ  ＡＴＣ  ＴＧＧ  ＡＡＣ  ＡＴＣ−３’オリゴヌクレオチドを使用してｐＤＩＳＰＬＡＹベクター（図４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からＰＣＲで増幅した。センス５’−ＴＣＣ  ＣＴＧ  ＴＣＣ  ＣＣＧ  ＧＧＴ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＣＡＡ  ＡＡＡ  ＣＴＣ  ＡＴＣ  ＴＣＡ  ＧＡＡ−３’およびアンチセンス５’−ＡＧＡ  ＡＧＧ  ＣＡＣ  ＡＧＴ  ＣＧＡ  ＧＧＣ  ＴＧＡ−３’を使用して、ｐＤＩＳＰＬＡＹのｍｙｃタグおよびＰＤＧＦ  Ｃ末端膜アンカーシグナルを増幅した。３つのＰＣＲ反応の産物はすべて、隣接する上流および下流のオリゴヌクレオチドによって導入される約２０塩基対の重複した相補的領域を有する。
【０１０２】
次いで、ＰＣＲ産物であるＮ末端リーダーシグナル、Ｆｃ遺伝子、およびＣ末端膜アンカーセクションをすべて一緒に混合物（１０ｕＭのオリゴヌクレオチドミックス５μｌ）としてインキュベートし、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μｌ）０．５μｌ、Ｐｆｘ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５μｌ、１０ｍＭのｄＮＴＰ１μｌ、５０ｍＭのＭｇＳＯ４  １μｌおよびｄＨ２０  ３７．５μｌを使用し、９４℃で２分間、その後９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、および６８℃で１分を２４サイクル、次いで６８℃で５分間のインキュベーションを行うＳＯＥ−ＰＣＲによって集合させた。ＳＯＥ−ＰＣＲ集合反応により、オリゴヌクレオチドの重複をアニールし、塩基対のギャップを埋め、別々のＤＮＡ断片を連結して、連続した遺伝子を形成することができた。次いで、ＰＣＲ反応由来のＦｃＤＮＡを抽出および精製して（ＱｉａｇｅｎＰＣＲ精製キット）、その後製造業者の使用説明書の通りにＸｈｏ  ＩおよびＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ消化を行った（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州Ｂｅｖｅｒｌｙ）。次いでキメラＦｃ表面発現構築物をｐＢＳＫＩＩベクター中にサブクローン化し、その配列を決定して、突然変異、欠失および挿入が導入されなかったことを確認した。確認した後、このＮ末端リーダーシグナル、Ｆｃ遺伝子、およびＣ末端膜アンカーのキメラ表面発現構築物を、その後のＦｃ−ＬＴＭライブラリーを構築する戦略用の野生型の鋳型として使用した。
【０１０３】
Ｎ末端ネズミＩｇＧ１シグナルとＣ末端ＰＤＧＦ膜貫通領域（配列番号９）、Ｎ末端ヒトＩｇＧ１シグナルとＣ末端ＩｇＭ膜貫通領域（配列番号１０）、またはＮ末端ヒトＩｇＧ１シグナルとＣ末端ＰＬＡＰ膜脂質挿入シグナル（配列番号１１）を融合する際に、様々なＦｃ表面発現構築物（図９）が考えられる。この反復では、融合構築物は細胞膜に対して近位である（最も近い）ＣＨ３ドメインを有するが、ＣＨ２ドメインは遠位である（図１０Ａ）。
【０１０４】
Ｃ．表面発現Ｆｃ遺伝子のＩＩ型提示物の構築
いくつかの適用では、ＩｇＧの標的結合の自然な提示を模倣するとき、ＣＨ２ドメインが細胞表面膜に対して近位であり、ＣＨ３が遠位である（図１０Ｂ）ことが望ましい可能性がある。この代替の位置付けのため、下記のベクターを、Ｆｃ遺伝子領域に先行するようにＮ末端膜貫通リーダー／アンカーシグナル配列を融合することにより設計している（図１２）。潜在的なＮ末端シグナルアンカーは、ＴＮＦ−α（配列番号３７および３８）などのＩＩ型膜貫通タンパク質由来のものを含み得る。ＴＮＦ−αは通常、細胞外提示のための小胞体膜（ＥＲ）を越える移動に必要な７６残基のリーダー配列を有する。しかし、このＴＮＦリーダー／アンカーシグナルはまた、細胞からＴＮＦを遊離させる天然のタンパク質分解性の切断部位を有する。どんなＦｃ融合構築物も膜輸送後に切断および放出されないような欠失により、ＴＮＦタンパク質分解性シグナルを最初に改変した。ＳＯＥ−ＰＣＲおよび配列番号３８で示す適当なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、Ｎ末端ＴＮＦ−Ｆｃ遺伝子融合物を上記の通りに構築した。次いで、キメラＮ末端ＴＮＦ−Ｆｃ遺伝子配列をＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１０５】
（実施例２）
Ａ．クンケル突然変異生成用のＦｃ一本鎖鋳型の調製
Ｆｃ一本鎖ＤＮＡを調製するため、上記のＦｃ発現構築物をすべてＰＢＳＫＩＩ中にクローン化した。大腸菌宿主ＣＪ２３６を、ＯＤ６００が約０．２〜０．５吸光度単位に達するまで２ＹＴ／Ａｍｐ液体培地中で増殖させた。この時点で、Ｍ１３  Ｋ０７ヘルパーファージ１ｍＬを細菌培養物に添加して３７℃でインキュベーションを継続した。３０分後、細菌およびファージの培養物を、０．２５ｕｇ／ｍＬのウリジンを含む体積の大きい２ＹＴ／Ａｍｐ液体培地（３０ｍＬ）に移して１晩増殖させた。
【０１０６】
次の日に、遠心分離（１００００ｇで１０分）により培地を清澄にし、その後上清を収集し１／５の体積のＰＥＧ−ＮａＣｌを添加して３０分置いた。その混合物をさらに２回遠心分離したが、各遠心の後、保持されたＰＥＧ／ファージペレットの方を選んで上清を捨てた。次いで、ＰＥＧ／ファージペレットをＰＢＳ（１ｍＬ）中に再懸濁し、それを再度遠心分離した（１４０００ｇで５分）。上清を収集し、次いでそれをＤＮＡ精製カラム（ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍ１３、Ｑｉａｇｅｎ）にかけて、一本鎖野生型ＩｇＧ１Ｆｃウリジン化ＤＮＡを溶出させた。
【０１０７】
Ｂ．ルックスルー突然変異生成（ＬＴＭ）オリゴヌクレオチド：
製造業者の使用説明書の通りに３９００  Ｏｌｉｇｏｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｓｙｎｇｅｎ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ）上で合成オリゴヌクレオチドを合成し、ＰＣＲまたはクンケル突然変異生成での使用の前にプライマーの品質をＰＡＧＥ電気泳動によって確認した。ＬＴＭ分析では、定められた領域内で（野生型アミノ酸がＬＴＭアミノ酸と同じでない限り）あらゆる位置に所定のアミノ酸を導入する（米国特許出願第２００４０２０３０６号）。他の確率論的な突然変異生成技術と異なり、ウリジン化一本鎖鋳型とアニールしたＬＴＭオリゴヌクレオチドは、１つの定められたアミノ酸位にしか突然変異を導入しないように設計されている。
【０１０８】
Ｃ．ＬＴＭオリゴヌクレオチドを用いたＦｃドメインのクンケル突然変異生成
本明細書の上記に記載のように、ＬＴＭ分析用に構築される２つのＦｃライブラリーがある。第１の実施形態は、「不偏性」ＣＨ２×ＣＨ３ライブラリーと称され、Ｆｃ領域中の各アミノ酸位が９種の選択されたＬＴＭアミノ酸によって置換される（図６）。合計で１９２６個のＬＴＭオリゴヌクレオチド（２１４個のＦｃドメインアミノ酸×Ｆｃの位置当たり９個のＬＴＭアミノ酸置換物）があり、それは平均して長さが６３塩基対である。「不偏性」Ｆｃドメインライブラリーでは、ＣＨ２（配列番号１）およびＣＨ３（配列番号２）領域を、長さ５〜７アミノ酸の並列させた小区分（それぞれ配列番号１２および１３）に人為的に分割した。したがって、１８個のＣＨ２および１６個のＣＨ３小区分は、連続した全長ＩｇＧ１Ｆｃ配列の部分を個々に表す。
【０１０９】
第２のＦｃ  ＬＴＭライブラリーは、ＩｇＧ１ＦｃとＦｃγＲＩＩＩａの共結晶構造から同定された別々のＩｇＧ１ＦｃとＦｃγＲＩＩＩａの「接触」点４つに相当する（図２Ａ）。次いで、この第２のライブラリーから、全部の上記「不偏性」ＣＨ２×ＣＨ３ライブラリー内にある４つの小領域（配列番号１４〜１７）が描かれる。したがって、４つの「接触」小領域ＬＴＭライブラリーは、単に上記で得られた「不偏性」ＣＨ２×ＣＨ３ＬＴＭ変異体のサブセットである。「接触」小領域１での所望のアミノ酸置換物を図２Ｂに示す。この「接触」小領域１：ＬＬＧＧ（配列番号１４）は、ＤＮＡ配列：ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＧＧＧ  ＧＧＡによってコードされ、ＤＮＡ配列５’−ｃｃａ  ｃｃｇ  ｔｇｃ  ｃｃａ  ｇｃａ  ｃｃｔ  ｇａａおよびｃｃｇ  ｔｃａ  ｇｔｃ  ｔｔｃ  ｃｔｃ  ｔｔｃ  ｃｃｃ  ｃｃａ  ａａａ  ｃｃｃ−３’のフレームワークに隣接する。「接触」小領域１についてのグリシンＬＴＭ置換オリゴヌクレオチド４つを列挙する（配列番号１８）。ＬＴＭオリゴヌクレオチド配列：５’−ｃｃａ  ｃｃｇ  ｔｇｃ  ｃｃａ  ｇｃａ  ｃｃｔ  ｇａａ  ＧＧＧ  ＣＴＧ  ＧＧＧ  ＧＧＡ  ｃｃｇ  ｔｃａ  ｇｔｃ  ｔｔｃ  ｃｔｃ  ｔｔｃ  ｃｃｃ  ｃｃａ  ａａａ  ｃｃｃ−３’は、グリシン置換コドンを示す（太字）。「接触」小領域１では、アスパラギン（配列番号１９）、アスパラギン酸塩（配列番号２０）、ヒスチジン（配列番号２１）、トリプトファン（配列番号２２）、イソロイシン（配列番号２３）、アルギニン（配列番号２４）、プロリン（配列番号２５）、およびセリン（配列番号２６）の残りの対応するＬＴＭオリゴヌクレオチドは、類似した配列設計の戦略を示す。図３に、イソロイシンについての４つのＬＴＭオリゴヌクレオチドを示す。図１７は、４つのＦｃ「接触」小領域を組み合わせる際に利用できる様々な組合せを表す図であり、各「接触」小領域がそれ自体９個のＬＴＭライブラリーである。例えば１つのライブラリーで、それは「接触」小領域１でのアスパラギンＬＴＭ、「接触」小領域２でのアスパラギン酸塩ＬＴＭ、「接触」小領域３でのトリプトファン、および「接触」小領域４でのプロリンからなり得る。
【０１１０】
「不偏性」ＣＨ２×ＣＨ３ライブラリーの例では、５つのグリシンＬＴＭ置換オリゴヌクレオチド（配列番号２７）を使用して、アミノ酸配列ＬＬＧＧＰＳＶ（配列番号１２）によって定義されるＣＨ２ドメインの最初の小領域での類似した置換を行う。次いで、図１８は、ヒスチジンＬＴＭを有する「不偏性」ＣＨ３小領域１と組み合わせたアスパラギン酸塩ＬＴＭを有する「不偏性」ＣＨ２小領域８の例である。以後、上記の通りに構築したライブラリーは、「接触」小領域であれ「不偏性」ＣＨ２×ＣＨ３小領域であれ、「Ｆｃ−ＬＴＭ」ライブラリーと呼ぶ。
【０１１１】
（実施例３）
Ａ．レトロウイルスｐＬＸＳＮの構築およびウイルス粒子の回収
ｐＬＸＳＮ哺乳動物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介する１つのプロモーターエレメント、ポリペプチドコード配列、ならびに転写の終結および転写物のポリアデニル化に必要なシグナルを含む。ｐＬＸＳＮは、モロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）ネズミ白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）およびモロニーネズミ肉腫ウイルス（ＭｏＭｕＳＶ）に由来するエレメントを含み、レトロウイルスによる遺伝子送達および発現用に設計されている。
【０１１２】
簡潔に述べると、ｐＬＸＳＮ／Ｆｃ構築物を、リン酸カルシウム沈殿により両栄養性パッケージング細胞系統ＰＡ３１７（または他の代替細胞）中にトランスフェクトする（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）。図１４は、ウイルス上清を直接回収する一過性トランスフェクションのプロトコールを示す。安定細胞系統では、濃度８００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ）を含む完全ＤＭＥＭ中で細胞を２週間培養することによってトランスフェクタントを選択する。その抗生物質選択から、組み込まれたベクターを安定して発現する細胞の集団を得ることができる。必要に応じて、別々のｐＬＸＳＮ／Ｆｃ変異ウイルス粒子産生ＰＡ３１７クローンをこの集団から単離し、（ネオマイシン耐性遺伝子とＦｃ  ｍＲＮＡの両方についての）逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲによって積極的に同定することができる。次いで、陽性ｐＬＸＳＮ／ＦｃクローンをＤＭＥＭ中で増殖させ、ウイルスを含有する上清を回収してネズミＮＳ０細胞系統（Ｓｉｇｍａ）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）に感染させる。レトロウイルス上清をすぐに回収できるとき、上清を穏やかに取り出し、４５μＭフィルターを通して濾過し、または遠心分離（５００ｇ、４℃で５分）して、生細胞を除去する。レトロウイルス上清を数時間以内に使用する場合、それを氷上で保持することができる。その他の場合、レトロウイルス上清を凍結し、−７０℃で貯蔵することができる。解凍したレトロウイルス上清は、その後の実験で直ちに使用できる。
【０１１３】
Ｂ．ＮＳ０導入のための一過性トランスフェクションおよびウイルス上清の回収
エコトロピック細胞系統ｐＥＣＯ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を増殖培地（１０％熱非働化ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミンを含むＤＭＥ）中で増殖させる。下記の手順は、図１４で図示されている。トランスフェクションの１日前に、細胞をプレート上に播き、均等に分布させてサブコンフルエント状態（５０〜６０％）にする。従来のリン酸カルシウムプロトコールまたはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などのカチオン性脂質を使用して、サブコンフルエント状態の細胞にトランスフェクトすることができる。簡潔に述べると、１枚のプレートで細胞にトランスフェクトするには、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ１２５μｌをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００  ５μｌと混合し、（ＲＴで）５分間置く。別々の反応で、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ混合物１２５μｌをＤＮＡ約５μｇに添加する。次いでこれら２つの溶液を混合し、２０分間置いた後それを細胞に添加する。次いで、増殖培地中のトランスフェクション試薬および細胞を３７℃で１晩インキュベートする。次の日に、１晩経た培地を新鮮なＧＭと交換する。トランスフェクションの２日（４８時間）後、細胞培養上清を１５ｍｌ管に収集し、遠心分離（２０００ｇで５分）して残骸をペレットにする。
【０１１４】
リンパ芽球の形態を有するマウス骨髄腫細胞系統であるＮＳ０などの懸濁細胞では、細胞を対数期まで増殖させて１ｍｌ当たり細胞約５×１０５個にする。ＮＳ０細胞を短時間遠心分離した後にペレットにし、希釈したレトロウイルス上清（＞１００倍）を含む新鮮な培地１ｍｌ中にそれを再懸濁し、３７℃で１２〜２４時間インキュベートする。レトロウイルス上清で一連の試験希釈を行って、導入効率を最適化することができる。次いで、その後のＦＡＣＳ分析により、導入効率およびＦｃ−ＬＴＭ発現についてＮＳ０ライブラリー細胞をモニターすることができる。
【０１１５】
Ｃ．レトロウイルス上清の添加による非付着性細胞の感染
ネズミ腫瘍細胞系統ＮＳ０に、回収したｐＬＸＳＮ／Ｆｃレトロウイルスベクター上清を導入する（図１４で示される一過性の系）。簡潔に述べると、合計体積が３ｍｌとなるような、ＲＰＭＩ増殖培地、（新鮮なまたは解凍した）レトロウイルス上清およびポリブレン（２μｇ／ｍｌ）からなる感染用カクテルを調製する。指数関数的に増殖しているＮＳ０標的細胞を遠心分離（５００ｇで５分）し、１ｍｌ当たり細胞１０５〜１０６個の濃度で感染用カクテル中に再懸濁する。感染から２４時間後、ＮＳ０細胞を遠心分離し、ＲＰＭＩ増殖培地中で再懸濁して、アッセイ前にさらに２４〜４８時間正常に増殖させる。ＲＰＭＩ増殖培地は、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１×非必須アミノ酸入りのＲＰＭＩ中に１０％確定ウシ血清（ｄｅｆｉｎｅｄ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州Ｌｏｇａｎ）を入れたものである（すべての補充物はＢｉｏ−Ｗｈｉｔａｋｅｒから入手）。
【０１１６】
Ｄ．Ｆｃ−ＬＴＭ変異体表面発現のＦＡＣＳ分析
スクリーニング過程の必須の目標は、各哺乳動物細胞でＬＴＭ  Ｆｃ−融合タンパク質をその細胞表面上に発現させることである。抗ヒト抗Ｆｃγフィコエリスリン抗体により、あるいはＭｙｃまたはＨＡタグの染色によっても（すべてＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）Ｆｃの表面発現を決定し、フローサイトメトリーによりそれを確認することができる。低速の遠心分離（５００ｇで５分）によりｐＬＸＳＮ／Ｆｃ  ＮＳ０導入細胞を収集し、ＣＳＢ（ＰＢＳおよび０．５％ＢＳＡ）で２回洗浄し、再懸濁し、次いで可溶性抗Ｆｃγ−ＰＥ抗体とともにインキュベートする。（暗所で、覆いをかけ氷上に置いて）１時間後、細胞を冷ＣＳＢで２回洗浄し、１ｍｌ当たり細胞１０×１０６個の濃度で再懸濁する。陰性対照細胞は空のｐＬＸＳＮベクターを導入したＮＳ０であり、陽性対照細胞は野生型Ｆｃを含むｐＬＸＳＮを導入したＮＳ０である。ｐＬＸＳＮ−Ｆｃ形質転換細胞は、空のｐＬＸＳＮベクターと比較して蛍光の著しい変化を示すはずである。次いで、製造業者の使用説明書の通りにＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用してＦＡＣＳｓｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で細胞を分析する。
【０１１７】
ＬＴＭライブラリー細胞上でのＦｃ表面発現を確認した後、次の作業は、細胞外Ｆｃ構築物が、Ｆｃ受容体、すなわちＦｃγＲＩＩＩａおよびＣ１ｑと結合できることを確認することである。これは、最初の事前選択手順として必須であり、その後のＦｃエフェクター機能アッセイは、Ｆｃ受容体の結合を必要とする。調べるには、野生型Ｆｃドメインを発現するＮＳ０細胞を上記の通りに収集し、標識したＦｃγＲＩＩＩａまたはＣ１ｑタンパク質とともにインキュベートする。ＦｃγＲＩＩＩａまたはＣ１ｑタンパク質は、下記に記載のようにフィコエリスリンまたはＦＩＴＣで蛍光標識しあるいはビオチン化することができる。例えば、次いで、ビオチン−Ｃ１ｑと結合できるＦｃ変異体を発現するＮＳ０細胞を二次のストレプトアビジン−ＰＥで対比染色し、ＦＡＣＳにより分析することができる。機能的ＦＣ−ＬＴＭ変異体は、標識したＦｃγＲＩＩＩａおよび／またはＣ１ｑタンパク質と結合し、そのことから高い蛍光の読み取り値が得られる。下記のプロトコールは、ＦｃγＲＩＩＩａまたはＣ１ｑタンパク質を単離し、精製し、ビオチン標識する手順を記載するものである。
【０１１８】
（実施例４）
Ｆｃ結合タンパク質の作製および精製：
Ａ．Ｃ１ｑのビオチン標識
生体活性Ｃ１ｑタンパク質は、ヘテロ三量体［配列番号３０〜３２］として構成され、精製された形で市販されている（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）。Ｃ１ｑタンパク質のビオチン化は、様々な方法によって実現できるが、過剰なビオチン化は、エピトープという、抗体と相互作用する部位を遮断する可能性があるので望ましくない。使用したプロトコールは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＰｒｏｂｅｓのＦｌｕｏＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ｂｉｏｔｉｎ−ＸＸ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（カタログ番号Ｆ−２６１０）から改変した。簡潔に述べると、０．９ｍｇ／ｍｌストックのＣ１ｑ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）１μｌを、ｐＨ８．３の１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液１００μｌおよびＢｉｏｔｉｎ−ＸＸ溶液（１０ｍｇ／ｍｌのＢｉｏｔｉｎ−ＸＸのＤＭＳＯ溶液）９．４μｌに添加した。その混合物を２５℃で１時間インキュベートした。その溶液を微小遠心分離フィルター管に移し、遠心分離しＰＢＳ溶液で（４回）反復して洗浄した。ビオチン化Ｃ１ｑ溶液を収集し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムを通して精製し、そのタンパク質濃度をＯＤ２８０で決定した。
【０１１９】
Ｂ．可溶性ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩａ、およびＦｃγＲＩＩｂの大腸菌での発現および精製
ＦｃγＲＩＩＩａ１７６ＶのＤＮＡ配列をＡＴＣＣから入手した（配列番号３３）。ＦｃγＲＩＩＩａ１７６Ｆ多型構築物を、上記に記載のクンケル突然変異生成によって再度作製した（配列番号３４）。下記の大腸菌精製プロトコールはまた、ＦｃγＲＩＩｂ（配列番号３５および３６）およびＦｃγＲＩＩａ（配列番号４０、４１および４２）の細胞外ドメインにも適切である。ＦｃγＲＩＩＩａ１７６ＦおよびＦｃγＲＩＩＩａ１７６ＶをｐＥＴ２０ｂ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）中にクローン化し、タンパク質にＣ末端６×ＨＩＳタグを追加した。次いでｐＥＴ２０ｂ−ＦｃγＲＩＩＩａＶ／Ｆ１７６構築物をＢＬ２１大腸菌宿主細胞中に形質転換した。大腸菌細胞の液体培養物（ＬＢ−Ａｍｐ）を、１晩小規模培養物（５ｍＬ）から２５０（ｍＬ）にして増殖させ、吸光度の値が６００ｎｍで０．５に達した後、ＦｃγＲＩＩＩａタンパク質を、ＩＰＴＧ（０．５ｍＭ）で、２５℃で４時間誘導した。下記の精製スキームで直ちに使用しない場合、その後増殖培養物をペレットにし、それを−８０℃で貯蔵した。次いで、目に見える大きな凝集塊がなくなるまで激しくボルテックスをかけることにより、細胞ペレットをＢ−ＰＥＲ（登録商標）ＩＩ溶解試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）６ｍｌ中に再懸濁した。均一に懸濁した後、細胞をＲＴで１０分間穏やかに振盪した。その後、細胞溶解混合物を遠心分離（１００００ＲＰＭで１０分）して、不溶性タンパク質から可溶性タンパク質を最初に分離した。同じ形式で、ＦｃγＲＩＩａＨ／Ｒ１３１多型の細胞外ドメインをクローン化した。
【０１２０】
Ｃ．封入体タンパク質の変性
溶解用上清は（収集し、蓄えた／捨てた）が、ペレットは、Ｂ−ＰＥＲ（登録商標）ＩＩ試薬６ｍｌ中に再度再懸濁した。終濃度２００μｇ／ｍｌで、再懸濁したペレットにライソザイムを添加し、ＲＴで５分間インキュベートした。次いで、遠心分離（１００００ＲＰＭで３０分）によって不溶性の封入体を収集した。Ｂ−ＰＥＲ（登録商標）ＩＩ１５ｍｌ中に得られたペレットを再度再懸濁し（Ｂ−ＰＥＲ希釈液に対して約１：２０のペレットの体積）、激しくボルテックスをかけることによってそれを混合した。遠心分離（１００００ＲＰＭで１５分）によって封入体を収集した。ペレットを再懸濁し、それにボルテックスをかけ、遠心分離するステップをさらに１０回反復し、その後、精製された封入体の最終的なペレットを蓄え貯蔵した。
【０１２１】
Ｄ．変性条件下でのＮｉ−ＮＴＡタンパク質精製
精製された封入体を氷上で解凍し、それを緩衝液Ｂ［１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリスＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ：８］１．５ｍｌ中に再懸濁した。泡立ちを避けるように注意しながら、約６０分間（ＲＴ）または（溶液が半透明になるときに観察される）溶解の終了まで懸濁液をゆっくりと撹拌した。その混合物を遠心分離（１００００ＲＰＭで１５分）して細胞の残骸をペレットにした。次いで、上清（清澄になった溶解液）を収集し、それにＮｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）５ｍＬを添加し、穏やかに混合した（４℃で６０分）。溶解液と樹脂の混合物を空のカラム中に注意深く充填し、緩衝液Ｂ（ｐＨ：６．３）１００ｍｌでそれを洗浄した。次いで、組換えタンパク質を緩衝液Ｂ（ｐＨ：４．５）２０ｍｌで溶出した。
【０１２２】
Ｅ．Ｎｉ−ＮＴＡ精製タンパク質の再折り畳み
上記から３ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ精製ＦｃＲタンパク質を、再折り畳み用緩衝液［０．１Ｍトリス／ＨＣｌ、１．４Ｍアルギニン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭ還元型グルタチオン、０．５ｍＭ酸化型グルタチオン、０．１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、０．０２％ＮａＮ３］に撹拌しながら６時間にわたって滴下し、次いでそれを７２時間撹拌した。次いで、再生したタンパク質の溶液を透析緩衝液［０．１Ｍトリス／ＨＣｌ、５ＭのＮａＣｌ、０．１ＭのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ］４Ｌに対して透析し、１晩の透析期間の前にそれを新鮮な緩衝液と２回さらに交換した。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（２ｍＬ）を再生したタンパク質の溶液に添加し、次いで穏やかに（ＲＴで）６０分間撹拌した。溶解液と樹脂の混合物を空のカラム中に注意深く充填し、洗浄緩衝液Ｂ（１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、３００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ：８．０）１００ｍｌでそれを洗浄した。次いで組換えタンパク質を溶出緩衝液（１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、３００ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ：８．０）１０ｍｌを用いて溶出した。
【０１２３】
（実施例５）
再び折り畳まれたＦｃγＲＩＩＩａタンパク質とヒトＩｇＧ１−Ｆｃの結合のＢｉａｃｏｒｅ分析
機能的なＩｇＧ  Ｆｃの結合を評価し、再び折り畳まれたＦｃγＲＩＩＩａ断片の予備的親和性（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を測定するために、ＢＩＡｃｏｒｅ−２０００表面プラズモン共鳴系分析を使用した（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗｙ）。製造業者の使用説明書（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ）に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボ−ジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロスクシンイミド（ＮＨＳ）を使用する共有結合により、リガンドであるヒト全長ＩｇＧ１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）をＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサーチップ表面上に固定化した。エタノールアミン溶液を遮断剤として注入した。
【０１２４】
フロー分析では、ＦｃγＲＩＩＩａをＢＩＡｃｏｒｅ流動緩衝液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝食塩水、ｐＨ７．０）中で希釈して、０．１３μＭ、０．２６μＭ、および０．５２μＭの３つの濃度にした。ＦｃγＲＩＩＩａのアリコートを流速２μｌ／分で注入して動態測定を行った。解離作用物質を含まない流動緩衝液中で解離を観察した。次いで、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ２．１ソフトウェアを使用して、結合反応の動態パラメーターを決定した。
【０１２５】
図１３Ａは、ＦｃγＲＩＩＩａとＩｇＧ１の結合のＢＩＡｃｏｒｅによる結果を示す。これらのプロットから、熱変性タンパク質の陰性対照と比較してのＲＵの増大（Ｋｏｎ）によって示されるように、再構成されたＦｃγＲＩＩＩａが、固定化されたＩｇＧと結合することが明らかである。さらに、ＲＵの増大は、適用したＦｃγＲＩＩＩａタンパク質濃度と比例していた。ＢＩＡｃｏｒｅプロファイルはまた、ＦｃγＲＩＩＩａの予想された解離プロファイルをも示した。
【０１２６】
ＦｃγＲＩＩＩａＶ１５８とＦｃγＲＩＩＩａＦ１５８多型の間にあるＫｏｆｆの動態的な差も測定し、それを下記の表に示す。これらの予備的な結果は、ＦｃγＲＩＩＩａＦ１５８多型がＩｇＧ１  Ｆｃに対して低い親和性を有し、そのことが、Ｋｏｆｆ動態が６倍速いことによって示された他の刊行物に一致する。
【０１２７】
【表２】
2008538908.tif 000004
【０１２８】
（実施例６）
磁性選別によるＦｃ−ＬＴＭ変異体ライブラリーのハイスループット事前選択
増殖培養後、ＮＳ０  Ｆｃ−ＬＴＭ細胞を、飽和濃度（４００ｎＭ）のビオチン化Ｃ１ｑとともに穏やかに回転させて３７℃で３時間インキュベートして標識付けする。次いで、結合しなかったビオチン化Ｃ１ｑを除去するために、ＮＳ０細胞をＲＰＭＩ増殖培地で２回洗浄した後、ＰＢＳ中に１μｌ当たり細胞１．０×１０５個に再懸濁する。細胞約１０７個の単一細胞懸濁液（１００μｌ）を、ストレプトアビジン被覆または抗ビオチンマイクロビーズ（ＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）１０μｌと混合し、それを周期的に転倒させながら氷上で２０分間インキュベートする。低速での遠心分離の後、次いでその混合物を緩衝液で２回洗浄し、それを０．５ｍＬ中に再懸濁する。これらの手順および細胞成分を図４Ａおよび４Ｂに図示する。
【０１２９】
細胞懸濁液を磁場分離器の保持器中に置いたＬＳ  ＭＡＣＳカラムにかける。次いで、ＭＡＣＳカラムを２×６ｍＬの緩衝液で洗浄して、流動の中で結合しなかった細胞を除去する。次いでＭＡＣＳカラムを分離器から取り出し、適切な収集管上に置く。緩衝液６ｍＬをＭＡＣＳカラム上に添加し、その直後に、カラムプランジャーにかけることにより、結合したＦｃ−ＬＴＭ細胞を流し出す。低親和性のまたは非機能的に結合しているＦｃ−ＬＴＭ変異細胞はこの形では保持されない。
【０１３０】
次いで、この積極的な選択により、Ｃ１ｑ／ＦｃｇＲＩＩＩａに対する機能的な親和性を有するＦｃ−ＬＴＭ変異細胞だけが回収される。このＭＡＣＳ濃縮ステップにより、望まれていない細胞を処理し選別するＦＡＣＳの必要がなくなる。次いで、溶出後、濃縮したＮＳ０細胞をインキュベートしてさらに培養する（図４Ｂ）。
【０１３１】
（実施例７）
Ｆｃ−ＬＴＭ変異体ライブラリー細胞のＦＡＣＳ選別
下記の方法では、ＦｃＲ結合親和性変異体の濃縮および単離について、ＬＴＭ  ＦｃライブラリーをＦＡＣＳでスクリーニングする。増殖培養後、上記のＮＳ０細胞を、飽和濃度（４００ｎＭ）のビオチン化Ｃ１ｑとともに穏やかに回転させて３７℃で３時間インキュベートする。（前記のように、適当な実験ではビオチン化ＦｃγＲＩＩＩａに置換することができる。）次いで、ＮＳ０細胞をＲＰＭＩ増殖培地で２回洗浄して、結合しなかったビオチン化Ｃ１ｑ／ＦｃγＲＩＩＩａを除去する。次いで、製造業者の使用説明書の通りにＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用してＦＡＣＳ−Ｖａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で細胞を選別する。
【０１３２】
所望される結合の性質に応じて、選別ゲートを調整して、Ｆｃ−ＬＴＭ集団の分画を収集する。例えば、ＦｃγＲＩＩＩａに対する親和性の増強が所望される場合、高い蛍光シグナル用にゲートを設定する。ＦＡＣＳのゲート設定により、他の細胞系統および結合した結合タンパク質を用いた試験系で、８０％を超える程度で高親和性部分集団を濃縮できることが示されている（図１９）。
【０１３３】
（実施例８）
Ａ．Ｆｃ−ＬＴＭ細胞ライブラリーに対するＦｃエフェクター機能アッセイ
下記の試験を実施して、ＮＳ０細胞によるＦｃ−ＬＴＭの表面発現により、単球や活性化顆粒球などのエフェクター細胞上のＦｃγＲの結合が生じ、それによってＦｃγＲ依存性エフェクター機能（図７：ＣＤＣ、ＡＤＣＣ）を惹起できることを示す。
【０１３４】
ＦＡＣＳで事前選別されたライブラリーを９６ウェルプレート中に希釈する。あるいは、ＮＳ０細胞のｐＬＸＳＮ／Ｆｃ導入後、小さいライブラリーしか作製しない場合（１０６個）、これらの細胞はまた、単一クローン／ウェルの希釈で直接プレートに播くこともできる。次いで、これらの単一クローンのウェルを増殖拡大して、娘プレートにすることができる。これらの娘プレートの１つを、後にＦｃ−エフェクターアッセイ用プレートとして使用することができる。したがって、ある場合には、小さいＦｃ−ＬＴＭライブラリーは、上記のＭＡＣＳおよび／またはＦＡＣＳ事前選別を必要としない。
【０１３５】
Ｆｃ受容体Ｃ１ｑ／ＦｃγＲＩＩＩａに対する高い親和性および関連するＦｃエフェクターＣ１ｑ／ＦｃγＲＩＩＩａ機能の増強についての下記の選択アッセイでは、ＦｃγＲＩＩｂなどの他のＦｃ受容体に対する低い親和性およびＦｃエフェクター機能の減弱についてスクリーニングするさらなるステップを並行して行うことができることに留意されたい（図５）。
【０１３６】
Ｂ．細胞依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）アッセイ
正常なヒト単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度分離勾配を通しての遠心分離によりヘパリン化骨髄試料から調製した。ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、カリフォルニア州Ｗｏｏｄｌａｎｄ）を、ヒト補体の供給源として使用した。ＮＳ０ライブラリー細胞の補体媒介性細胞傷害作用促進能を類似した形で測定した。簡潔に述べると、ＮＳ０細胞を上記の通りに培養し、プレートに播き（５×１０４個）、９６ウェル平底マイクロタイターウェル中に入れた。ヒト血清補体（Ｑｕｉｄｅｌ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を連続して希釈して、溶解の作用範囲を最初に測定した。次いで、希釈した補体とＮＳ０細胞懸濁液の混合物を、５％ＣＯ２インキュベーター中で、３７℃で２時間インキュベートしてＣＤＣを促進する。その後、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（Ａｃｃｕｍｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、オハイオ州Ｗｅｓｔｌａｋｅ）５０μｌを各ウェルに添加し、さらに３７℃で１晩インキュベートする。９６ウェル用蛍光計を使用して、５３０ｎｍで励起され５９０ｎｍで放出された蛍光の読み取り値を測定した。通常、結果は生細胞の数に比例する相対的蛍光単位（ＲＦＵ）で表す。次いで、Ａｂ濃度（Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅの添加前の終濃度）の対数に対して％ＣＤＣ活性をプロットすることにより、様々な突然変異体の活性を調べる。％ＣＤＣ活性は、下記の通りに計算した：％ＣＤＣ活性＝（試験ＲＦＵ−背景ＲＦＵ）×１００（細胞溶解全体でのＲＦＵ−背景ＲＦＵ）。
【０１３７】
Ｃ．ＡＤＣＣ用ＰＢＭＣエフェクター細胞の調製
正常ヒト志願者のヘパリン化全静脈血からエフェクターＰＢＭＣを調製する。全血を、５％デキストランを含むＲＰＭＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で２．５：１（ｖ／ｖ）の比で希釈する。次いで、氷上で４５分間赤血球を沈降させ、その後、上清中の細胞を新しい管に移し、遠心分離によりそれをペレットにする。次いで、残存している赤血球を低張溶解によって除去する。残っているリンパ球、単球および好中球は、結合アッセイで使用するまで氷上で維持することができる。あるいは、リンパ球分離培地（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＬＳＭ、Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｋａ、ノースカロライナ州Ｄｕｒｈａｍ）を使用して、供与者からエフェクター細胞を精製することもできる。
【０１３８】
Ｆｃ変異体を発現する標的ＮＳ０ライブラリー細胞をＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌ（最大のＡＤＣＣについて決定される濃度）の精製ＦｃＲ（すべての型）とともに２５℃で３０分間インキュベートする。上記で精製したＰＢＭＣエフェクター細胞を培地で３回洗浄し、９６ウェルＵ字底Ｆａｌｃｏｎプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中に入れる。これらの実験についてＡＤＣＣの作用範囲を最初に測定するために、１ウェル当たり細胞３×１０５個（エフェクター／標的比１００：１）から１ウェル当たり細胞６００個（０．２：１）の３倍連続希釈物をプレートに播く。通常は、５０倍過剰な回収ＰＭＢＣの存在下でＡＤＣＣのアッセイを行う。
【０１３９】
次いで、標的ＮＳ０細胞を各ウェルに１ウェル当たり細胞３×１０３個で添加する。エフェクター細胞を添加していないＮＳ０標的のウェルによって自発的放出（ＳＲ、陰性対照）を測定し、逆に、２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００をＮＳ０標的細胞のウェルに添加することによって最大放出（ＭＲ、陽性対照）を測定する。３７℃、５％ＣＯ２中で４時間インキュベートした後、ＡＤＣＣアッセイ用プレートを遠心分離する。次いで、上清を９６ウェル平底Ｆａｌｃｏｎプレートに移し、ＬＤＨ反応混合物（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）とともに２５℃で３０分間インキュベートする。次いで、１ＮのＨＣｌを５０ｍｌ添加することによって反応を停止する。その後、基準波長を６５０ｎｍにして試料を４９０ｎｍで測定する。％細胞傷害作用を［（ＬＤＨ放出試料−ＳＲエフェクター−ＳＲ標的）／（ＭＲ標的−ＳＲ標的）］×１００として計算した。各アッセイで、％細胞傷害作用対ｌｏｇ（エフェクター／標的比）をプロットし、曲線下面積（ＡＵＣ）を計算する。アッセイは３連で行う。
【０１４０】
（実施例９）
ＰＭＢＣ供与者の遺伝子型判定：ＦｃγＲＩＩＩａＦ１５８／Ｖ１５８多型およびＦｃγＲＩＩａＨ１３１／Ｒ１３１多型のスクリーニング。
ある実験では、詳細な説明で説明したように、ＦｃγＲＩＩＩａＦ１５８／Ｖ１５８および／またはＦｃγＲＩＩａＨ１３１／Ｒ１３１多型を有する個人間での定量的なＡＤＣＣエフェクターの差をモニターすることを必要とする。ＰＣＲ後の直接配列決定、対立遺伝子特異的プライマーを使用するＰＣＲ、またはＰＣＲ後の対立遺伝子特異的制限酵素消化を含めて、多型の遺伝子型を判定するいくつかの方法がある。本発明者らの目的で、ＦｃγＲＩＩＩａＦ１５８／Ｖ１５８での、後者の対立遺伝子特異的制限酵素消化の手順を説明するが、その方法は（異なるＰＣＲ増幅プライマーを使用するが）ＦｃγＲＩＩａＨ１３１／Ｒ１３１多型でも同様である。
【０１４１】
ＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖ／Ｆ多型の遺伝子型判定を、ＰＣＲに基づく対立遺伝子特異的制限分析アッセイによって行う。２つのＦｃγＲＩＩＩａ遺伝子特異的プライマー：５’−ＡＴＡ  ＴＴＴ  ＡＣＡ  ＧＡＡ  ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＡＧＧ−３’；アンチセンス配列番号：５’−ＧＡＣ  ＴＴＧ  ＧＴＡ  ＣＣＣ  ＡＧＧ  ＴＴＧ  ＡＡ−３’を使用して、多型部位を含む１．２ｋｂ断片を増幅する。このＰＣＲアッセイを、ゲノムＤＮＡ５ｎｇ、各プライマー１５０ｎｇ、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰ、およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）２Ｕを含む緩衝液中で、製造業者による推奨の通りに行った。最初のＰＣＲサイクルは、９５℃で１０分の変性、５６℃で１分半のプライマーアニーリング、および７２℃で１分半の伸長からなった。この後、変性時間を１分に短縮したサイクルを３５サイクル行った。最後のサイクルの後、７２℃で８分の完全伸長を行った。第２のＰＣＲ反応でのセンスプライマーは、ＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８ＶをコードするＤＮＡだけにＮｌａＩＩＩ制限部位を作り出すミスマッチを含み：５’−ａｔｃ  ａｇａ  ｔｔｃ  ｇＡＴ  ＣＣＴ  ＡＣＴ  ＴＣＴ  ＧＣＡ  ＧＧＧ  ＧＧＣ  ＡＴ−３’（大文字はアニールするヌクレオチドを示し、小文字はアニールしないヌクレオチドを示す）、アンチセンスプライマーは、第４イントロンのちょうど５’を選択した：５’−ａｃｇ  ｔｇｃ  ｔｇａ  ｇＣＴ  ＴＧＡ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＴＴＣ  ＡＣ−３’。この第２のＰＣＲ反応は、最初に増幅した断片１μＬ、各プライマー１５０ｎｇ、２００μｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰ、およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ２Ｕを、推奨される緩衝液中で希釈して行う。最初のサイクルは、９５℃で５分の変性、６４℃で１分のプライマーアニーリング、および７２℃で１分の伸長からなった。この後、変性時間が１分であるサイクルを３５サイクル行った。最後のサイクルの後、７２℃で９分半の完全伸長を行った。９４ｂｐの断片をＮｌａＩＩＩで消化し、消化した断片を、１０％ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、それをエチジウムブロマイドで染色し、ＵＶ光で視覚化した。
【０１４２】
遺伝子特異的なセンス：５’−ＧＧＡ  ＡＡＡ  ＴＣＣ  ＣＡＧ  ＡＡＡ  ＴＴＣ  ＴＣＧ  Ｃ−３’；アンチセンス配列番号：５’−ＣＡＡ  ＣＡＧ  ＣＣＴ  ＧＡＣ  ＴＡＣ  ＣＴＡ  ＴＴＡ  ＣＧＣＧ  ＧＧ−３’プライマーを使用して、ＦｃγＲＩＩａの遺伝子型を判定した。センスプライマーは、コドン１３１の上流にある第２の細胞外ドメインおよび多型部位のすぐ５’にある末端をコードするエキソンに由来する。それは、その次のヌクレオチドがＡでなくＧであるときにＰＣＲ産物中にＢｓｔ  ＵＩ部位（５’−ＣＧＣＧ−３’）を導入する１ヌクレオチド置換を含む。アンチセンスプライマーは、下流のイントロン中に位置し、このプライマーを使用するすべてのＰＣＲ産物中に絶対的なＢｓｔ  ＵＩ部位を導入する２ヌクレオチド置換を含む。ＰＣＲ条件は下記の通りであった：９６℃、５分間を１サイクル、９２℃、４０秒間および５５℃、３０秒間を３５サイクル、７２℃、１０分間を１サイクル。Ｒ１３１対立遺伝子の存在下では１度、Ｈ１３１対立遺伝子の存在下では２度切断するＢｓｔ  ＵＩを使用して産物を消化した。３％アガロースゲル上での電気泳動によって断片を分析した。
【０１４３】
（実施例１０）
ＡＤＣＣおよびＣＤＣ比較分析用の完全長リツキシン−Ｆｃ  ＬＴＭ変異体の構築
次いで、所望されるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＦｃ受容体結合特性を示すＣＢＭ−ＦｃまたはＬＴＭ−Ｆｃ変異体を、相関関係にあるＦｃエフェクター機能について試験する。これらのアッセイでは、ＣＢＭ−ＦｃまたはＬＴＭ−Ｆｃ変異体をリツキシンＦｃと比較して、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性に差があるかどうかを判定する。リツキシンは、非ホジキンリンパ腫の治療用に開発された、Ｂ細胞マーカーＣＤ２０に特異的なキメラモノクローナルＩｇＧ１抗体である。本発明者らの目的で、野生型リツキシン（野生型ＩｇＧ１Ｆｃ領域を有する）を、リツキシン（ＣＨ１：ＶＨおよびＶＬ）とＣＢＭ−ＦｃまたはＬＴＭ−Ｆｃ変異体（ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３）のキメラ置換物と比較する。
【０１４４】
適当なプライマーを用いたＰＣＲにより、ＣＢＭ−ＦｃまたはＬＴＭ−Ｆｃ変異体からヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３を増幅する。そのプライマーはまた、重鎖のヒンジおよびＣＨ３のＣ末端中にその後の制限消化およびクローン化用の制限部位をも導入する。リツキシンベクターは、アミノ酸配列の変化を伴わない、重鎖のヒンジ領域およびＣＨ３のＣ末端での同様の制限部位で改変されている。次いで、改変リツキシンベクターにより、ＣＤ２０に対するそのＶＨおよびＶＬの特異性を保持しつつＦｃドメインの単一置換が可能となる。
【０１４５】
配列の確認後、リツキシン−Ｆｃ−ＬＴＭ構築物をＰｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に再クローン化して、可溶性ＩｇＧ１として発現させる。簡潔に述べると、ＰｃＤＮＡ３−リツキシン−Ｆｃ−ＬＴＭを、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＣＨＯ−Ｋ１細胞中にトランスフェクトし、５％熱非働化ウシ胎児血清を入れたダルベッコ改変イーグル培地中で培養する。安定トランスフェクトクローンが所望される場合、Ｇ４１８（４００ｕｇ／ｍｌ）を補充したＤＭＥＭ増殖培地内で選択することができる。次いで、上記トランスフェクションからの上清を収集し、遠心分離により清澄にして、すべての脱離細胞および残骸をペレットにする。培養上清をプロテインＡセファロース４Ｂアフィニティーカラムに通過させることによって、分泌された完全長リツキシン−Ｆｃ−ＬＴＭＩｇＧ１を精製することができる。２〜３倍のカラム容量のＰＢＳで洗浄した後、結合したリツキシン−Ｆｃ−ＬＴＭＩｇＧ１タンパク質を、ＫＳＣＮ（３Ｍ）のリン酸緩衝食塩水（１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５４ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．３）溶液で溶出する。２８０ｎｍでの吸光度を使用してタンパク質濃度を概算し、アジ化ナトリウム（０．８ｍＭ）を含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．３）中で、それを−２０℃で長期間貯蔵することができる。
【０１４６】
次いで、精製された抗体をＷＩＬＳ−２標的細胞に添加して、ＡＤＣＣ、ＣＤＣまたはアポトーシスアッセイを行う。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州Ｅｕｇｅｎｅ）およびアネキシンＶ−ＦＩＴＣ（Ｃａｌｔａｇ、カリフォルニア州Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）を使用するフローサイトメトリー分析によってＷＩＬ２−Ｓ細胞のアポトーシスを分析することができる。簡潔に述べると、ＷＩＬ２−Ｓ細胞５×１０５個を、特定の濃度のリツキシン野生型またはリツキシンを移植したＦｃ−ＬＴＭとともに、３７℃およびＣＯ２５％で２４時間インキュベートする。次いで、標的ＷＩＬ２−Ｓ細胞をＰＢＳで洗浄し、氷冷アネキシン結合緩衝液（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）４００ｍｌ中に再懸濁し、それにアネキシンＶ−ＦＩＴＣ１０ｍｌおよびＰＩ  ０．１ｍｇを添加する。次いで、細胞をフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ、フロリダ州Ｍｉａｍｉ）上で分析する：４８８ｎｍで励起し、重複する放出スペクトルの補正後に５２５ｎｍ（ＦＩＴＣ）および６７５ｎｍ（ＰＩ）での放出を測定する。
【０１４７】
特定の実施形態および適用に関して本発明を説明してきたが、本発明から逸脱することなく様々な改変および変更を加えることができることが明らかとなるであろう。
【０１４８】
配列表
配列番号１：（ヒトＩｇＧ１ＦｃのＣＨ２領域のアミノ酸配列）：
【０１４９】
【表３】
2008538908.tif 000005
配列番号２：（ヒトＩｇＧ１ＦｃのＣＨ３領域のアミノ酸配列）：
【０１５０】
【表４】
2008538908.tif 000006
配列番号３：（ヒトＩｇＧ１ＦｃのＣＨ２領域のコード領域）：
【０１５１】
【表５】
2008538908.tif 000007
配列番号４：（ヒトＩｇＧ１ＦｃのＣＨ３領域のコード領域）：
【０１５２】
【表６】
2008538908.tif 000008
配列番号５：（完全なヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域のアミノ酸配列）：
【０１５３】
【表７】
2008538908.tif 000009
配列番号６：（完全なヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域のコード領域）：
【０１５４】
【表８】
2008538908.tif 000010
配列番号７：イムノグロブリン細胞外輸送シグナルのＤＮＡコード配列：
ヒトＩｇＧ１シグナル配列：
【０１５５】
【表９】
2008538908.tif 000011
ネズミＩｇκシグナル配列：
【０１５６】
【表１０】
2008538908.tif 000012
配列番号８：膜アンカーシグナルのＤＮＡコード配列：
膜ＩｇＭ膜貫通領域のコード配列：
【０１５７】
【表１１】
2008538908.tif 000013
ＰＤＧＦ−受容体膜貫通領域のコード配列：
【０１５８】
【表１２】
2008538908.tif 000014
ヒト胎盤アルカリホスファターゼタンパク質（ＰＬＡＰ）の最後の３３アミノ酸をコードする配列：
【０１５９】
【表１３】
2008538908.tif 000015
配列番号９：ネズミＩｇκシグナル配列、ＨＡタグ、ヒトＩｇＧ１ヒンジＣＨ２〜ＣＨ３、Ｍｙｃエピトープ＋ＰＤＧＦ−Ｒ膜貫通領域からなるＣ末端アンカーを有するＦｃ表面発現構築物のＤＮＡコード配列。これら５つのセクションは、連結した配列において異なる影を付けたブロックで示し、また以下で別々に示す：
【０１６０】
【表１４】
2008538908.tif 000016
ネズミＩｇＧκシグナル配列：
【０１６１】
【表１５】
2008538908.tif 000017
ＨＡエピトープタグ配列：
【０１６２】
【表１６】
2008538908.tif 000018
ヒトＩｇＧ１ヒンジＣＨ２〜ＣＨ３配列：
【０１６３】
【表１７】
2008538908.tif 000019
Ｍｙｃエピトープタグ配列：
【０１６４】
【表１８】
2008538908.tif 000020
ＰＤＧＦ−Ｒ膜貫通領域配列：
【０１６５】
【表１９】
2008538908.tif 000021
配列番号１０：ヒトＩｇＧ１輸送シグナル配列、ＨＡタグ、ＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２〜ＣＨ３、Ｍｙｃエピトープ、ネズミＩｇＭ膜貫通領域からなるＣ末端アンカーを有するＦｃ表面発現構築物のＤＮＡコード配列。上記の配列番号９と同様に、これら５つのセクション成分は、連結した配列において異なる影を付けたブロックで示す。
【０１６６】
【表２０】
2008538908.tif 000022
配列番号１１：ヒトＩｇＧ１シグナル配列、ＨＡタグ、ヒトＩｇＧ１ヒンジＣＨ２〜ＣＨ３、Ｍｙｃエピトープ、およびヒトＰＬＡＰ脂質付加シグナルからなるＣ末端アンカーを有するＦｃ表面発現構築物のＤＮＡコード配列。配列番号９と同様に、これら５つのセクション成分は、連結した配列において異なる影を付けたブロックで示す。
【０１６７】
【表２１】
2008538908.tif 000023
配列番号１２：アミノ酸２３１〜３４０（Ｋａｂａｔの定義）の不偏性ＬＴＭ分析でのＩｇＧ１ＦｃのＣＨ２小領域の分割：
Ｎ末端−
【０１６８】
【表２２】
2008538908.tif 000024
−Ｃ末端
配列番号１３：アミノ酸３４１〜４４７（Ｋａｂａｔの定義）の不偏性ＬＴＭ分析でのＩｇＧ１ＦｃのＣＨ３小領域の分割：
Ｎ末端−
【０１６９】
【表２３】
2008538908.tif 000025
−Ｃ末端
配列番号１４：ヒトＩｇＧ１ＣＨ２上のＦｃ受容体「接触」小領域１のアミノ酸配列）：
・ＬＬＧＧ
配列番号１５：ヒトＩｇＧ１ＣＨ２上のＦｃ受容体「接触」小領域２のアミノ酸配列）：
・ＤＶＳＨＥＤ
配列番号１６：ヒトＩｇＧ１ＣＨ２上のＦｃ受容体「接触」小領域３のアミノ酸配列）：
・ＮＳＴ
配列番号１７：ヒトＩｇＧ１ＣＨ２上のＦｃ受容体「接触」小領域４のアミノ酸配列）：
・ＫＡＬＰＡ（Ｐ）Ｉ
配列番号１８：ヒトＩｇＧ１ＦｃＣＨ２のＬＬＧＧ領域（「接触」小領域１）中の４つの各位置でのグリシン（ＧＬＹｃｉｎｅ）置換物のコード配列）
【０１７０】
【表２４】
2008538908.tif 000026
配列番号１９：ヒトＩｇＧ１ＦｃＣＨ２のＬＬＧＧ領域（「接触」小領域１）中の４つの各位置でのアスパラギン（ＡＳｐａｒａｇｉＮｅ）置換物のオリゴヌクレオチドコード配列）
【０１７１】
【表２５】
2008538908.tif 000027
配列番号２０：ヒトＩｇＧ１ＦｃＣＨ２のＬＬＧＧ領域（「接触」小領域１）中の４つの各位置でのアスパラギン酸塩（ＡＳＰａｒｔａｔｅ）置換物のコード配列）
【０１７２】
【表２６】
2008538908.tif 000028
配列番号２１：ヒトＩｇＧ１ＦｃＣＨ２のＬＬＧＧ領域（「接触」小領域１）中の４つの各位置でのヒスチジン（ＨＩＳｔｉｄｉｎｅ）置換物のコード配列）
【０１７３】
【表２７】
2008538908.tif 000029
配列番号２２：ヒトＩｇＧ１ＦｃＣＨ２のＬＬＧＧ領域（「接触」小領域１）中の４つの各位置でのトリプトファン（ＴＲｙＰｔｏｐｈａｎ）置換物のコード配列）
【０１７４】
【表２８】
2008538908.tif 000030
配列番号２３：ヒトＩｇＧ１ＦｃＣＨ２のＬＬＧＧ領域（「接触」小領域１）中の４つの各位置でのイソロイシン（ＩｓｏＬＥｕｃｉｎｅ）置換物のコード配列）
【０１７５】
【表２９】
2008538908.tif 000031
配列番号２４：ヒトＩｇＧ１ＦｃＣＨ２のＬＬＧＧ領域（「接触」小領域１）中の４つの各位置でのアルギニン（ＡＲＧｉｎｉｎｅ）置換物のコード配列）
【０１７６】
【表３０】
2008538908.tif 000032
配列番号２５：ヒトＩｇＧ１ＦｃＣＨ２のＬＬＧＧ領域（「接触」小領域１）中の４つの各位置でのプロリン（ＰＲＯｌｉｎｅ）置換物のコード配列）
【０１７７】
【表３１】
2008538908.tif 000033
配列番号２６：ヒトＩｇＧ１ＦｃＣＨ２のＬＬＧＧ領域（「接触」小領域１）中の４つの各位置でのセリン（ＳＥＲｉｎｅ）置換物のコード配列）
【０１７８】
【表３２】
2008538908.tif 000034
配列番号２７：ヒトＩｇＧ１ＦｃＣＨ２：不偏性ＣＨ２×ＣＨ３ライブラリーのアミノ酸ＬＬＧＧＰＳＶ小区分中の５つのアミノ酸位でのグリシン（ＧＬＹｃｉｎｅ）ＬＴＭ置換物のオリゴヌクレオチド配列。
【０１７９】
【表３３】
2008538908.tif 000035
配列番号２８：Ｆｃ受容体「接触」小領域１〜４に基づく「終止コドン」鋳型のヒトＩｇＧ１ＣＨ２アミノ酸配列。置換コドンを小文字で示す。
Ｆｃ受容体「接触」小領域１：
【０１８０】
【表３４】
2008538908.tif 000036
Ｆｃ受容体「接触」小領域２：
【０１８１】
【表３５】
2008538908.tif 000037
Ｆｃ受容体「接触」小領域３：
【０１８２】
【表３６】
2008538908.tif 000038
Ｆｃ受容体「接触」小領域４：
【０１８３】
【表３７】
2008538908.tif 000039
配列番号２９：「終止コドン」鋳型をオープンリーディングフレームに再置換する野生型オリゴヌクレオチド。置換コドンを小文字で示す。
Ｆｃ受容体「接触」小領域１：
【０１８４】
【表３８】
2008538908.tif 000040
Ｆｃ受容体「接触」小領域２：
【０１８５】
【表３９】
2008538908.tif 000041
Ｆｃ受容体「接触」小領域３：
【０１８６】
【表４０】
2008538908.tif 000042
Ｆｃ受容体「接触」小領域４：
【０１８７】
【表４１】
2008538908.tif 000043
配列番号３０：Ｃ１ｑ−ａアミノ酸配列
【０１８８】
【表４２】
2008538908.tif 000044
配列番号３１：Ｃ１ｑ−ｂアミノ酸配列
【０１８９】
【表４３】
2008538908.tif 000045
配列番号３２：Ｃ１ｑ−ｇアミノ酸配列
【０１９０】
【表４４】
2008538908.tif 000046
配列番号３３：Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ多型細胞外ドメインアミノ酸配列：
【０１９１】
【表４５】
2008538908.tif 000047
配列番号３４：Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｆ多型細胞外ドメインアミノ酸配列：
【０１９２】
【表４６】
2008538908.tif 000048
配列番号３５：Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩｂ細胞外ドメインアミノ酸配列：
【０１９３】
【表４７】
2008538908.tif 000049
配列番号３６：Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩｂのＤＮＡコード配列
【０１９４】
【表４８】
2008538908.tif 000050
配列番号３７：ＴＮＦ−α野生型と、修飾された、タンパク質分解で切断されないＴＮＦ−α膜貫通領域挿入物のアミノ酸配列の比較：２つの欠失およびＫからＱへの点突然変異を上段の配列上の修飾配列で示す。
【０１９５】
【表４９】
2008538908.tif 000051
配列番号３８：修飾された、タンパク質分解で切断されないＴＮＦ−α膜貫通領域挿入物のＳＯＥ−ＰＣＲ用オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列。
【０１９６】
【表５０】
2008538908.tif 000052
配列番号３９：Ｎ末端ＩＩ型ＴＮＦ細胞膜アンカー：
修飾ヒトＴＮＦ膜貫通領域配列、ＨＡタグ、ＩｇＧ１ヒンジＣＨ２〜ＣＨ３、およびＭｙｃエピトープを使用するＦｃ表面発現構築物のＤＮＡ配列。これら５つのセクションは、連結した配列において異なる影を付けたブロックで示す。
【０１９７】
【表５１】
2008538908.tif 000053
配列番号４０：Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩａのＤＮＡコード配列
【０１９８】
【表５２】
2008538908.tif 000054
配列番号４１：Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩａ−Ｈ１３１多型細胞外ドメインアミノ酸配列
【０１９９】
【表５３】
2008538908.tif 000055
配列番号４２：Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩａ−Ｒ１３１多型細胞外ドメインアミノ酸配列
【０２００】
【表５４】
2008538908.tif 000056
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】（１Ａ）そのＣＨ２およびＣＨ３領域を指し示すＦｃ部分を示すＩｇＧ１抗体の図式的構造、（１Ｂ）ＣＤＣ機能のための抗体のＣＨ２との結合による補体成分Ｃ１ｑの動員、ならびに（１Ｃ）ＡＤＣＣ機能のためのＣＨ２断片の結合によるＦｃγＲＩＩＩａの動員を示す図である。
【図２】「不偏性」ＦｃエフェクターライブラリーのＣＨ２およびＣＨ３領域を示す図である。描かれたセクションについては配列番号１２および１３を参照されたい。下にある計算は、９種の予め選択されたＬＴＭアミノ酸でＣＨ２とＣＨ３のライブラリーの組合せを作り出す際に考えられるＬＴＭ変異体の予測数である。
【図３】ＣＨ２とＣＨ３の両方の「不偏性」ドメインについての図式的な一連のＬＴＭライブラリーの組合せを示す図である。例えば、考えられる「二重」Ｆｃ−ＬＴＭライブラリーは、ＣＨ２小領域８中のＡｓｐＬＴＭライブラリー、その後にあるＣＨ３小領域１中のＨｉｓＦｃ−ＬＴＭからなり得る。
【図４】ＦｃドメインとＦｃγＲＩＩＩａの共結晶構造から同定されたＦｃＣＨ２の４つの「接触」小領域を示す図である。小さな差込み画像は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の三次元構造を描くものであり、４つのＦｃγＲＩＩＩａ「接触」小領域中のアミノ酸を強調している（淡黄色）。下にある計算は、接触残基をＬＴＭアミノ酸に置換し、「接触」小領域間でコンビナトリアル複数ＬＴＭ置換物ライブラリーを作り出す際に考えられるＬＴＭ変異体の予測数である。
【図５】本発明で使用するＬＴＭ選択法による、ＦｃＣＨ２ドメインの最初の「接触」小領域の各領域の位置での９種のＬＴＭアミノ酸置換物を示す図である。
【図６】図５に示したアスパラギン置換ポリペプチドに対応する４つのオリゴヌクレオチドコード配列を示す図である。
【図７】４つのＦｃ−ＦｃγＲＩＩＩａ「接触」小領域を分析するための、ＣＨ２ドメイン中の考えられるＦｃ−ＬＴＭライブラリーの組合せをすべて示す図である。各「接触」小領域ＬＴＭライブラリーは、「接触」小領域中の１つ１つの位置における９種の予め選択されたＬＴＭアミノ酸による単一のアミノ酸置換物からなる。例えば、考えられる「三重」Ｆｃ−ＬＴＭライブラリーは、「接触」小領域２中のＬＴＭ分析を有さず、「接触」小領域１中のＡｒｇＬＴＭライブラリー、その後にある「接触」小領域３中のＰｒｏＦｃ−ＬＴＭおよび「接触」小領域４中のＨｉｓＦｃ−ＬＴＭからなり得る。
【図８】コンビナトリアル有益突然変異分析（ＣＢＭ）用の変性オリゴヌクレオチドの例示的な例を示す図である。Ｆｃ受容体「接触」小領域２の野生型アミノ酸およびコードＤＮＡ配列を上段の部分で示す。Ｆｃ−ＬＴＭエフェクター増強アミノ酸置換物の仮定的な例は下段の図にある。これらのＦｃ−ＬＴＭ置換物は、野生型アミノ酸の上に示す。次いで、ＣＢＭ（実施例１１を参照）について、様々な組合せにおいて所望の変化を組み込むのに各コドンで必要なヌクレオチドを、下の変性オリゴヌクレオチド中で示す。
【図９】本発明に従って形成された種々の図式的なＩｇＧ１とＦｃ−断片の代表的キメラ分子を示す図である。上の４つのキメラ構築物は、細胞外輸送のためのＮ末端リーダー配列、Ｆｃドメイン、およびタンパク質を保持するためのＣ末端膜アンカーシグナルからなる。一番下のキメラ構築物は、ＩＩ型Ｎ末端アンカーの例を示し、それによって、修飾されたＴＮＦ−αリーダーが、細胞外分泌シグナルにもなり膜貫通アンカーシグナルにもなる。
【図１０】Ｃ末端（１０Ａ）およびＩＩ型Ｎ末端（１０Ｂ）アンカーＦｃ提示系を示す図である。ＩＩ型Ｎ末端提示系は、ＣＨ３が遠位に位置することが、細胞上の標的抗原と結合したＩｇＧ１の自然な提示により生物学的に類似することを示すものである。
【図１１】Ｎ末端ＩｇκリーダーとＣ末端ＰＤＧＦ受容体膜貫通アンカーの間にＦｃ−ＬＴＭ構築物をクローン化するためのｐＤｉｓｐｌａｙ発現ベクターを示す図である。
【図１２】ＴＮＦ細胞外リーダー由来のＩＩ型Ｎ末端アンカーおよび細胞表面提示用のＦｃ−ＬＴＭ構築物を利用するベクターの図式的設計を示す図である。
【図１３】単一オリゴヌクレオチドアニーリング反応（図１３Ａ）および複数オリゴヌクレオチドアニーリング反応（図１３Ｂ）を使用する、Ｆｃコード配列を生成する本発明で適用されるクンケル突然変異生成法を示す図であり、第１の修飾Ｆｃ−ＬＴＭ鋳型を再度単離し、それを第２の異なるオリゴヌクレオチドと再度アニールさせて、別々に位置する２つのＦｃ−ＬＴＭ突然変異を生成しなければならない。次いで、所望のＦｃ−ＬＴＭ突然変異が組み込まれるまでこれらの反復を繰り返す。
【図１４】Ｆｃ突然変異生成鋳型上で終止コドンを置換するオリゴヌクレオチドアニーリングの結果を示す図である。Ｆｃ−ＬＴＭオリゴヌクレオチドがアニールした鋳型では（１４Ａ）、完全長Ｆｃ−ＬＴＭタンパク質が、膜貫通シグナルと結合した状態で翻訳され、それによって細胞表面での保持が可能となる。切断型Ｆｃ−ＬＴＭタンパク質の翻訳によっても細胞外輸送が行われるが、（斑点の付いた楕円によって示されるように）細胞表面アンカータンパク質がないので、次いでこのキメラＦｃ−ＬＴＭは遊離して細胞から解離する（図１４Ｂ）。
【図１５】本発明による一過性レトロウイルス発現系の手順のステップを示す図である。ｐＤｉｓｐｌａｙ  Ｆｃ−ＬＴＭベクターの一過性トランスフェクション後、ｐＥｃｏ細胞培養上清を回収して、ｐＤｉｓｐｌａｙ  Ｆｃ−ＬＴＭレトロウイルスを収集する。次いで、レトロウイルスを適したライブラリー標的細胞に感染させ、所望の特性について個々のクローンをスクリーニングする。クローンを単離し、その後の配列分析用の保存されている隣接プライマーを使用するＰＣＲにより、対象とするＦｃ−ＬＴＭ遺伝子を回収する。
【図１６】固定化されたＩｇＧ１との近似された様々な濃度のＦｃγＲＩＩＩａの結合の結合動態のＢＩＡｃｏｒｅセンサーグラム決定を示す図である。
【図１７】ＦｃγＲＩＩＩａ受容体との平衡結合に基づく高い結合親和性についての、本発明に従って形成されたＩｇＧ１Ｆｃ断片の磁性事前選択における一般的なステップおよび細胞結合成分を示す図である。
【図１８】本発明に従って、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体との高い結合親和性についてＦｃ断片を事前選択する方法のステップを示す図である。
【図１９】蛍光標識ＦｃγＲ受容体との平衡結合に基づく高い結合親和性について、本発明に従って形成されたＩｇＧ１Ｆｃ−ＬＴＭ断片をスクリーニングするステップ、すなわち、平衡結合に基づくＦｃクローンのＦＡＣＳ選別のフロー図である。低いＦｃγＲＩＩｂ親和性を示すＦｃ−ＬＴＭ部分集団を同時にスクリーニングする任意選択のステップも示す。
【図２０】標識した結合タンパク質に対する結合親和性が増強された、対象とする細胞表面タンパク質を発現するクローンを同定するための選択ゲート（Ｐ２台形）を示すＦＡＣＳプロットである。平衡結合の後、ＦＡＣＳプロファイルにより、その高い蛍光シグナル（Ｙ軸）により親和性が高いクローンが順序付けられる。結合親和性の分布が選別前の集団中で観察され（Ａ）、高親和性クローンは、全体集団の６％を占めるに過ぎない。選別後（Ｂ）、所望の増強された結合親和性を目下示す選別集団が２５％を超えることが示される。
【図１】
2008538908.tif 000058
【図２】
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【図３】
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【図４】
2008538908.tif 000061
【図５】
2008538908.tif 000062
【図６】
2008538908.tif 000063
【図７】
2008538908.tif 000064
【図８】
2008538908.tif 000065
【図９】
2008538908.tif 000066
【図１０】
2008538908.tif 000067
【図１１】
2008538908.tif 000068
【図１２】
2008538908.tif 000069
【図１３】
2008538908.tif 000070
【図１４】
2008538908.tif 000071
【図１５】
2008538908.tif 000072
【図１６】
2008538908.tif 000073
【図１７】
2008538908.tif 000074
【図１８】
2008538908.tif 000075
【図１９】
2008538908.tif 000076
【図２０】
2008538908.tif 000077
【配列表】
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【国際調査報告】
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