(57)【要約】  デンプンと、当該デンプンが水不溶性の形態であるとき当該デンプン上に吸着される、ザクロジュースの抗ＨＩＶ−１活性成分又は抗ＨＩＶ−２活性成分とを含む(comprising)複合体に関する。当該複合体は、ＨＩＶ−１感染(infection)又はＨＩＶ−２感染(infection)を阻害し、ＣＤ４受容体(receptor)並びにＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４共受容体(coreceptors)とのＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２の結合をブロックする。当該複合体は、薬学的に有効な量の抗ＨＩＶ−１又は抗ＨＩＶ−２を含む当該複合体をヒトの粘膜に投与することを含む(comprising)、ＨＩＶ−１感染(infection)又はＨＩＶ−２感染(infection)を予防する方法において使用される。
2008513468.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デンプンと、該デンプンが水不溶性の形態であるとき該デンプン上に吸着される、ザクロジュースの抗ＨＩＶ−１活性成分又は抗ＨＩＶ−２活性成分とを含む(comprising)複合体であって、ＨＩＶ−１感染(infection)又はＨＩＶ−２感染(infection)を阻害し、ＣＤ４受容体(receptor)並びにＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４共受容体(coreceptors)とのＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２の結合をブロックする複合体。
【請求項２】
ＨＩＶ−１感染(infection)を阻害する、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
ＨＩＶ−２感染(infection)を阻害する、請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
デンプン１００〜２５０ｍｇをザクロジュース１ｍｌと混合することにより製造される、請求項１に記載の複合体。
【請求項５】
薬学的に有効な量の抗ＨＩＶ−１又は抗ＨＩＶ−２を有する請求項１に記載の複合体、及び薬学的に許容可能なキャリアを含む(comprising)薬学的組成物。
【請求項６】
薬学的に有効な量の抗ＨＩＶ−１又は抗ＨＩＶ−２を有する請求項１に記載の複合体をヒトの粘膜に投与することを含む(comprising)、ヒトにおけるＨＩＶ−１感染(infection)又はＨＩＶ−２感染(infection)を予防する方法。
【請求項７】
ＨＩＶ−１感染(infection)を予防するための、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＨＩＶ−２感染(infection)を予防するための、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記投与が膣投与によって行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記投与が直腸投与によって行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
薬学的に有効な量の抗ＨＩＶ−１又は抗ＨＩＶ−２を有する請求項５に記載の薬学的組成物をヒトの粘膜に投与することを含む(comprising)、ヒトにおけるＨＩＶ−１感染(infection)又はＨＩＶ−２感染(infection)を予防する方法。
【請求項１２】
ＨＩＶ−１感染(infection)を予防するための、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＨＩＶ−２感染(infection)を予防するための、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記複合体が０．５〜３ｇ投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記投与が膣投与によって行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記投与が直腸投与によって行われる、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２侵入阻害剤及び局所殺菌剤として使用することができるデンプン−ザクロジュース複合体、並びに女性に経膣的に複合体を投与することによりＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２感染(infection)を予防する方法に関する。
【０００２】
［政府の権利］
本発明は、アメリカ国立衛生研究所（“ＮＩＨ”）からのＰＯ１  ＨＤ４１７６１の付与下での米国政府の支援によってなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
【０００３】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００４年９月２１日に出願された米国仮出願番号第６０／６１１，７７８号に関して、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づき優先権の利益を請求しており、この内容全体が本明細書中に参照により援用される。
【背景技術】
【０００４】
［発明の背景］
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）流行病は、およそ２４年間で、およそ３，０００万人の命を奪い、２００３年には世界で１日に約１４，０００の新たなヒト免疫不全ウイルス型（ＨＩＶ−１）感染(infections)を引き起こしている。感染(infections)の約８０％は異性間伝播(transmission)によるものである。ワクチンがないため、ウイルス伝播(transmission)をブロックすることが期待される局所殺菌剤が、この流行病を制御するための希望を与える。抗レトロウイルスの化学療法剤は先進工業国のＡＩＤＳ死亡率を低減させているが、発展途上国ではその効果は最小限にすぎない。類似の二分のもの(an analogous dichotomy)を予防するために、殺菌剤が、開発からマーケティングへの移行において、許容可能、利用可能、手軽に入手可能及び促進性であるべきである。安全記録を確立し、相当の抗ＨＩＶ−１活性を有する、既に市場に出された医薬品賦形剤又は食品は、このオプションを提供することができる。
【０００５】
世界的なＡＩＤＳ禍は、およそ２４年間、目に見えて有望な予防薬の市場介入も期待されないまま、執拗に進行している。２００３年には、新たに５００万人がＨＩＶ感染(infection)し、３００万人がＡＩＤＳによって死亡した［ＵＮＡＩＤＳ：ＡＩＤＳ流行最新情報(AIDS Epidemic Update)（２００３年１２月）２００４年(http://www.unaids.org/en/other/functionalities/ViewDocument.asp?href=http%3a%2f%2fgva-doc-owl%2fWEBcontent%2fDocuments%2fpub%2fPublications%2fIRC-pub06%2fJC943-EpiUpdate2003_en%26%2346%3bpdf) ］。生存しているＨＩＶ−１感染(infection)／ＡＩＤＳ患者の数は、今までに４，０００万人に達し、上述のように、この流行病の発生からもう既におよそ３，０００万人の人々がＡＩＤＳにより亡くなっている［ＵＮＡＩＤＳ：ＡＩＤＳ流行最新情報（２００３年１２月）２００４年；ＷＨＯ／ＳＥＡＲＯ  ＣＤＳ  ＨＩＶ／ＡＩＤＳ：２０００年末の世界推定（子供及び成人）、２００１年(http://w3.whosea.org/hivaids/fact.htm#End-2000%20global%20estimates) ］。新たな感染(infections)の多くは粘膜経路でもたらされ、異性間伝播(transmission)が主要な役割をになっている（約８０％）。無防備な性交行動１回による伝播(transmission)の発生率は低いと推測されるが（０．０００１−０．００４）、急性感染した(infected)個人が関与する場合に、際立って増加し［Shattock, R.J., Moore, J.P.著「ＨＩＶ−１感染の性的伝播の阻害(Inhibiting sexual transmission of HIV-1 infection)」Nat. Rev. Microbiol., (2003), 1:25-34;  Pilcher, C.D., Tien, H., Eron, J.J., Vernazza, P.L., Leu, S-Y, Stewart, P.W., Goh, L-E, Cohen, M.S.著「簡潔だが有効な：急性ＨＩＶ感染及びＨＩＶの性感染(Brief but efficient: Acute HIV infection and the sexual transmission of HIV)」J. Infect. Dis., (2004), 189:1785-1792］、この蓄積的影響は、計り知れない。
【０００６】
世界的な免疫予防接種プログラムに適用可能な抗ＨＩＶ−１ワクチンが利用可能になるとは、長年期待されていない。したがって、他の予防戦略が緊急に必要とされている。これには、教育的努力並びに機械的及び／又は化学的遮断方法の適用が含まれる。性交する前に経膣的に（及び直腸内の場合もある）適用されるとき、後者（機械的及び／又は化学的遮断方法）は殺菌剤、すなわちＨＩＶ−１感染(infection)（及び他の性感染症(transmitted diseases)の伝播(transmission)の場合もある）をブロックするのに設計された局所製剤に相当する［Shattock, R.J., Moore, J.P.著「ＨＩＶ−１感染の性的伝播の阻害(Inhibiting sexual transmission of HIV-1 infection)」Nat. Rev. Microbiol., (2003), 1:25-34; Stone, A.著「殺菌剤：ＨＩＶ及び他の性伝播する感染を予防するための新たな試み(Microbicides: A new approach to preventing HIV and other sexually transmitted infections)」Nat. Rev. Drug Discov., (2002), 1:977-985; Shattock, R., Solomon, S.著「殺菌剤−安全な性交への補助(Microbicides - aids to safer sex)」Lancet, (2004), 363:1002-1003; Brown, H.著「驚異的な殺菌剤。膣内ジェルが何百万の命を救うことができるであろうが、始めに誰かがこれらの働きを証明しなければならない(Marvellous microbicides.  Intravaginal gels could save millions of lives, but first someone has to prove that they work)」Lancet, (2004), 363:1042-1043］。概念的に、殺菌剤製剤の活性成分（複数可）が、（１）細胞受容体(receptor)ＣＤ４、共受容体(coreceptors)ＣＸＣＲ４／ＣＣＲ５、及び樹状／遊走細胞上の受容体(receptors) 、それぞれとのＨＩＶ−１の結合を防ぐ（ウイルス複製に直接関与する細胞にウイルスを捕捉、及び伝播する(transmitting)）ことによって、ウイルスの感受性細胞への侵入をブロックすることが好ましく［Shattock, R.J., Moore, J.P.著「ＨＩＶ−１感染の性的伝播の阻害(Inhibiting sexual transmission of HIV-1 infection)」Nat. Rev. Microbiol., (2003), 1:25-34;  Moore, J.P., Doms, R.W.著「侵入阻害剤の侵入：科学と医学との融合(The entry of entry inhibitors: a fusion of science and medicine)」 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, (2003), 100:10598-10602; Pierson, T.C., Doms, R.W.著「ＨＩＶ−１侵入阻害剤：新たな標的、新規の治療法(HIV-1 entry inhibitors: new targets, novel therapies)」Immunol. Lett., (2003), 85:113-118; Davis, C.W., Doms, R.W.著「ＨＩＶ伝播：全てのドアを閉めること(HIV Transmission: Closing all the Doors)」J. Exp. Med., (2004), 199:1037-1040; Hu, Q., Frank, I., Williams, V., Santos, J.J., Watts, P., Griffin, G.E., Moore, J.P., Pope, M., Shattock, R.J.著「付着及び融合受容体の阻止が、ヒト頸部組織のＨＩＶ−１感染を阻害する(Blockade of attachment and fusion receptors inhibits HIV-1 infection of human cervical tissue)」J. Exp. Med., (2004), 199:1065-1075］、及び／又は、（２）殺ウイルス性であることが好ましい。この製剤は、標的組織に悪影響を及ぼしてはならず、これらの組織が殺菌剤の除去後により感染(infection)しやすくさせないものとすべきである［Fichorova, R.N., Tucker, L.D., Anderson, D.J.著「ノノキシノール−９誘導性の膣炎症の分子基盤、及びそのヒト免疫不全ウイルス１型伝播への考えられる関連性(The molecular basis of nonoxynol-9-induced vaginal inflammation and its possible relevance to human immunodeficiency virus type 1 transmission)」J. Infect. Dis., (2001), 184:418-428; Fichorova, R.N., Bajpai, M., Chandra, N., Hsiu, J.G., Spangler, M., Ratnam, V., Doncel, G.F.「インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−６、及びＩＬ−８が膣殺菌剤避妊薬の粘膜毒性を予測する(Interleukins (IL)-1, IL-6 and IL-8 predict mucosal toxicity of vaginal microbicidal contraceptives)」Biol. Reprod. Epub ahead of print May 5 2004 (http://www.biolreprod.org/cgi/rapidpdf/biolreprod.104.029603v1)］。
【０００７】
抗レトロウイルス剤による治療が、先進工業国におけるＡＩＤＳによる死亡率を低減させているが、今までのところ発展途上国ではその効果は最小限である［Weiss, R.:ＡＩＤＳ著「その無敵の２０年(AIDS: unbeatable 20 years on)」Lancet, (2001), 357:2073-2074］。殺菌剤に対する同様の二分を避けるために、調査及び開発及びこれらのマーケティング及び流通の間の時間をできるだけ短縮しながら、抗菌剤を手軽に入手可能に、且つ幅広く利用可能にするために、設計及び選択しなければいけない。安全記録を確立した大量の工業製品に抗ＨＩＶ−１活性があることが見出された場合、これは容易となるであろう。殺菌剤の開発のために検討される適格な候補は、抗ウイルス特性に関して、医薬品賦形剤（＝薬剤の投薬形態の“ｉｎａｃｔｉｖｅ”成分）及び食品をそれぞれスクリーニングすることにより見出されるだろう。この試みによって、有望な候補殺菌剤として、（腸溶錠及びカプセルのコーティングに使用される）セルロースアセテート１，２−ベンゼンジカルボキシレートの発見が既にもたらされた［Neurath, A.R., Strick, N., Li, Y-Y, Lin, K., Jiang, S.著「「不活性」の医薬品賦形剤を使用する性感染症の予防のための「殺菌剤」の設計(Design of a "microbicide" for prevention of sexually transmitted diseases using "inactive" pharmaceutical excipients)」Biologicals， (1999), 27:11-21; Neurath, A.R., Strick, N., Li, Y-Y, Debnath, A.K.著「一般的な医薬品賦形剤であるセルロースアセテートフタラートがＨＩＶ−１を不活性化し、ウイルスエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０上の共受容体結合部位をブロックする(Cellulose acetate phthalate, a common pharmaceutical excipient, inactivates HIV-1 and blocks the coreceptor binding site on the virus envelope glycoprotein gp120)」BMC Infect. Dis., (2001), 1:17; Neurath, A.R., Strick, N., Jiang, S., Li, Y-Y, Debnath, A.K.著「セルロースアセテートフタラートの抗ＨＩＶ−１活性：可溶性ＣＤ４と「終末」ｇｐ４１  ６−へリックス束の誘導との相乗効果(Anti-HIV-1 activity of cellulose acetate phthalate: Synergy with soluble CD4 and induction of "dead-end" gp41 six-helix bundles)」BMC Infect. Dis., (2002), 2:6; Neurath, A.R., Strick, N., Li Y-Y著「アニオン性ポリマーの抗ＨＩＶ−１活性：候補殺菌剤の比較研究(Anti-HIV-1 activity of anionic polymers: A comparative study of candidate microbicides)」BMC Infect. Dis., (2002), 2:27; Neurath, A.R., Strick, N., Li, Y-Y著「水分散性の殺菌性セルロースアセテートフタラートフィルム(Water dispersible microbicidal cellulose acetate phthalate film)」BMC Infect. Dis., (2003), 3:27］。酸度によって引き起こされる非特異的な効果を差し引く(discount)ためにｐＨをおよそ７に中性化したフルーツジュースのスクリーニング結果を本明細書中に記載している。
【０００８】
ザクロは、その医薬特性のために何千年間も崇拝されおり、世界的に主要な宗教の多くが神聖なものであると考えてきた。ザクロに敬意を表して、英国医師会及び幾つかの英国王立大学はその紋章がザクロを特徴としている。ロンドンの王立医科大学(Royal College of Physicians of London)は、１６世紀の半ばまで、その紋章にザクロを採用していた［Langley, P.著「なぜザクロなのか(Why a Pomegranate?)」BMJ, 2000, 321:1153-1154］。ザクロの種の避妊能力に関する最もよく知られた参考文献は、古典ギリシア神話である。ペルセポネが、ザクロの実（ここからジュースが得られる）を６つ食べると、地上では、秋及び冬の何ヶ月もの間、土地がやせたままになった。皮肉にも、本出願は、ザクロジュースには、未だ開発が十分ではない抗レトロウイスル剤の分類に対応しているＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２侵入阻害剤が含まれていることを示している［Greene, W.C.著「ＨＩＶ治療学の明るい未来(The brightening future of HIV therapeutics)」Nat. Immunol., 2004, 5:867-871］。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
［発明の概要］
本発明の目的は、ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２侵入阻害剤として使用することができるデンプン−ザクロジュース複合体を提供することである。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２感染(infection)を予防することである。
【００１１】
これらの目的、並びに他の目的及びこれらの利点は本発明によって提供される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、デンプンと、デンプンが水不溶性の形態であるとき当該デンプン上に吸着される、ザクロジュースの抗ＨＩＶ−１活性成分又は抗ＨＩＶ−２活性成分とを含む(comprising)複合体を提供する。上記複合体は、ＨＩＶ−１感染(infection)又はＨＩＶ−２感染(infection)を阻害する。上記複合体は、ＣＤ４受容体(receptor)並びにＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４共受容体(coreceptors)とのＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２の結合をブロックする。
【００１３】
本発明はまた、デンプン上に吸着される、ザクロジュースの抗ＨＩＶ−１活性成分又は抗ＨＩＶ−２活性成分を含む(comprising)、薬学的に有効な量の抗ＨＩＶ−１又は抗ＨＩＶ−２を有する上記の複合体を、ヒトの粘膜に投与することを含む(comprising)、ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２感染(infection)を予防する方法に関する。
【００１４】
本発明はまた、薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせて、薬学的に有効な量の抗ＨＩＶ−１又は抗ＨＩＶ−２を有する上記の複合体を含む(comprising)、薬学的組成物に関する。
【００１５】
本発明はまた、薬学的に有効な量の抗ＨＩＶ−１又は抗ＨＩＶ−２を有する上記の薬学的組成物をヒトの粘膜に投与することを含む(comprising)、ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２感染(infection)を予防する方法に関する。
【００１６】
本発明を図示するために、図面が提供される。しかし、本発明は図面に示される明確な主題に限定されないことを理解されたい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
［発明の詳細な説明］
本発明による複合体は、デンプンと、当該デンプンが水不溶性の形態であるときデンプン上に吸着される、ザクロジュースの抗ＨＩＶ−１活性成分又は抗ＨＩＶ−２活性成分とを含有する(comprises)。このデンプンはザクロジュースの抗ＨＩＶ−１活性成分又は抗ＨＩＶ−２活性成分を選択的に吸着するデンプンである。
【００１８】
本発明の複合体はＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２感染(infection)を阻害する。したがって、この複合体は、ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２の感染(infection)をブロックするために、局所殺菌剤として作用する。この複合体は、ＣＤ４受容体(receptor)並びにＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４共受容体(coreceptors)とのＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２の結合をブロックするので、ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２侵入阻害剤である（すなわち、ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２の細胞への侵入を予防する）。
【００１９】
上記複合体は、デンプン１００〜２５０ｍｇをザクロジュース１ｍｌと混合することによって、好ましくはデンプン１５０〜２２５ｍｇをザクロジュース１ｍｌと混合することによって、製造される。
【００２０】
本発明のデンプン−ザクロジュース複合体をＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２感染(infection)を予防するために、男性又は女性の粘膜に投与することができる。したがって、このデンプン−ザクロジュース複合体を膣又は直腸等の身体内部領域に投与することができる。投与形態としては、局所的、経膣的又は直腸内が挙げられる。
【００２１】
本発明は、性交等の性的接触間のＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２感染(infection)を予防するのに特に効果的である。
【００２２】
ヒトへの投与のためには、本発明の複合体が薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせて、薬学的に有効な量の抗ＨＩＶ−１又は抗ＨＩＶ−２を有する複合体を含む(comprising)薬学的組成物の形態であることが好ましい。
【００２３】
好ましくは、薬学的に許容可能なキャリアは、本発明によるデンプン−ザクロジュース複合体を坐薬、水分散性フィルム、水分散性錠剤、スポンジ、又はジェルの形態で投与することができるようなものとすべきである。
【００２４】
キャリアが固体である場合の直腸投与又は膣投与に好適な薬学的な製剤は、坐薬の単位用量として表すのが最も好ましい。好適なキャリアとしては、「ＦＡＴＴＩＢＡＳＥ」として既知の脂肪酸の坐薬の基剤（又は水素化植物油の坐薬の基剤）、ココアバター及び当該技術分野で一般的に使用される他の物質が挙げられ、これらの坐薬は本発明の複合体と軟化又は溶融キャリア（複数可）との混合、これに続く冷却及び鋳型成形によって好都合に製造することができる。
【００２５】
粘膜付着性で即効性の分散性（水分散性）錠剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（「ＨＰＭＣ」）、「ＰＨＡＲＭＡＢＵＲＳＴ」（かさ密度０．４５０、タップ密度０．５３６及びカール指数１６．０％の素早く溶解するデリバリープラットホーム(SPI Pharma製)）、「ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９４７Ｐ」ポリマー（オハイオ州クリーブランドのNoreon, Inc.製）及び「ＣＡＲＢＯＰＨＩＬ」（オハイオ州クリーブランドのNoreon, Inc.製）と組み合わせ、凍結乾燥したザクロ／デンプン複合体から調製することができる。
【００２６】
本発明によるこの複合体を（広く利用可能な「呼吸コントロール」ストリップと同様に）水分散性フィルムに組み込むことができる。
【００２７】
また、本発明の複合体を、局所適用の後にジェルに変換される水分散性スポンジに組み込むことができる［Neurath他(BMC Infect. Dis., 2003, 3:27); ＵＳＰ６，５７２，８７５;及びＵＳＰ６，５９６，２９７（ＵＳＰ６，５７２，８７５及びＵＳＰ６，５９６，２９７の内容全体が、本明細書中で参照により援用される）を参照のこと］。
【００２８】
また、本発明に従って使用される薬学的組成物は、殺精子剤、抗菌剤、防腐剤又は他の抗ウイルス剤といった他の活性成分を含み得る。
【００２９】
また、本発明の薬学的組成物は、防腐剤、風味剤及び芳香剤等の添加剤を含み得る。これらの添加剤は、任意の所望の濃度で存在し得る。これらの添加剤の濃度は、所望の特性、放出される作用物質(agent)、その有効性、所望の用量、溶解時間等によって変わるであろう。
【００３０】
上記の各製剤は、以下の要求を満たすべきである：（１）殺菌性のジェル／クリームの送出に必要な塗布器の使用に伴う廃棄物処理問題の最小化；（２）簡易性；（３）購入、携帯及び保存に関する小型包装及び裁量(discretion)；（４）低製造コスト；（５）世界的な複数の地点での産業的大量生産への対応性及び（６）直腸殺菌剤としての潜在用途。
【００３１】
上記複合体は、０．５〜３ｇ、好ましくは１〜１．５ｇの濃度で投与することができる。
【００３２】
さらに、局所使用のために保存期限が制限されたＰＪ−Ｓ２１系のゲル製剤を製造することは依然可能であり、これは適切な低温乾燥プロセスを介した乾燥ＰＪ−Ｓ２１粉末の製造コストを抑えるであろう。
【００３３】
これらの製剤のどちらが選択されるとしても、最終製品（複数可）の均質な抗ＨＩＶ−１又は抗ＨＩＶ−２活性を確保する、又は製造における再生産条件を確立するのに、十分な品質管理が必要であるだろう。
【００３４】
本発明を達成する際、細胞受容体(cell receptors)としてＣＤ４及びＣＸＣＲ４を使用して、ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢに対する阻害活性に関してフルーツジュースをスクリーニングした。（１）細胞共受容体(cellular coreceptor)としてＣＣＲ５を利用するＨＩＶ−１  ＢａＬによる感染(infection)阻害、（２）ＣＸＣＲ４及びＣＣＲ５とのｇｐ１２０  ＩＩＩＢ及びｇｐ１２０  ＢａＬのそれぞれの結合阻害に関して、最適なジュースを試験した。最も着色したジュース成分を除去するために、分散性賦形剤及び他の食品への有効成分（複数可）の吸着を調査した。最初のＨＩＶ−１分離株による感染(infection)の阻害に関して、選択された複合体を分析した。
【００３５】
ザクロジュースからのＨＩＶ−１侵入阻害剤は、コーンスターチ上へ吸着されることがわかった。この得られた複合体はＣＤ４及びＣＸＣＲ４／ＣＣＲ５とのウイルスの結合をブロックし、最初のウイルス分岐群(clade：クレード)Ａ〜Ｇ及び群Ｏによる感染(infection)を阻害する。
【００３６】
本明細書中での結果は、抗ＨＩＶ−１殺菌剤の品質を十分に標準化し、モニタリングするのであれば、その安全性が何百年もの間ずっと立証されている、安価で広く利用可能なソースから抗ＨＩＶ−１殺菌剤を製造することの実現可能性を実証している。
【００３７】
ザクロジュースは、幾つかの成分を含有し［Poyrazoglu, E., Goekmen, V., Artik, N.著「トルコで成長したザクロ（Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍ  Ｌ．）の有機酸及びフェノール化合物(Organic acids and phenolic compounds in pomegranates (Punica granatum L.) Grown in Turkey)」J. Food Composition and Analysis, (2002, 15:567-575; Module 2:植物化学物質（ミネラル、フィタミン、及びビタミン)(Phytochemicals (minerals, phytamins and vitamins))］、この成分はザクロジュース以外の天然産物から単離され、抗ＨＩＶ活性を有すると報告された：例えば、カフェー酸［Mahmood, N., Moore, P.S., Detomassi, N., Desimone, F., Colman, S., Hay, A.J.P.C.著「カフェオイルキナ酸誘導体によるＨＩＶ感染の阻害(Inhibition of HIV-infection by caffeoylquinic acid-derivatives)」Antivir. Chem. Chemother., (1993), 4:235-240］、ウルソル酸［Ma, C., Nakamura, N., Miyashiro, H., Hattori, M., Shimotohno, K.著「シノモリウム・ソンガリカム由来のウルソル酸誘導体、及びヒト免疫不全ウイルスプロテアーゼに対する関連のトリテルペンの阻害効果(Inhibitory effects of ursolic acid derivatives from cynomorium songaricum, and related triterpenes on human immunodeficiency viral protease)」Phytotherapy Research, (1998), 12 :s138-142］、カテキン及びケルセチン［Mahmood, N., Piacente, S., Pizza, C., Burke, A., Khan, A.I., Hay, A.J.著「ロサ・ダマスケナから単離された純粋化合物の抗ＨＩＶ活性及び作用の仕組み(The anti-HIV activity and mechanisms of action of pure compounds isolated from Rosa damascena)」Biochem. Biophys. Res. Commun., (1996), 229:73-79; DeTommasi, N., Piacente, S., Rastrelli, L., Mahmood, N., Pizza, C.著「Ｍａｒｇｙｒｉｃａｒｐｕｓ  ｓｅｔｏｓｕｓの抽出物の分画に関する抗ＨＩＶ活性 (Anti-HIV activity directed fractionation of the extracts of Margyricarpus setosus)」Pharmaceutical Biology, (1998), 36:29-32］。しかし、精製形態での市販のこれらの化合物は、ザクロジュースからの侵入阻害剤（複数可）とは違って、本明細書中で記載されるＥＬＩＳＡで測定されるｇｐ１２０−ＣＤ４結合を（２００μｇ／ｍｌで）ブロックせず、コーンスターチに吸着しなかった。事実上は、デンプンによるザクロジュースの処理、及び上記侵入阻害剤の除去後の上澄みは、デンプン上に吸着したＨＩＶ−１侵入阻害剤とは違って、抗ＨＩＶ−１活性を維持し、またヘルペスウイルス１型による感染(infection)を阻害した。したがって、この上澄みの抗ウイルス活性は非特異的であり、おそらく、ザクロ外皮からの抽出物の活性と同様であると考えられ［Reuters NewMedia, Inc「ザクロは、ＡＩＤＳとの戦いに有効であり得る(Pomegranates could help in battle against AIDS)」1996 Mar 10. http://www.aegis.com/news/re/1996/RE960310.html; British Muslims Monthly Survey: 医学的大発明、 1996 March; IV:6 (http://artsweb.bham.ac.uk/bmms /1996/03March96.html#Medical%20breakthrough］、さらには特徴付けられなかった。
【００３８】
さらなる情報［Jassim, S.A.A., Denyer, S.P., and Stewart, G.S.A.B.「ザクロ外皮若しくは他の植物の抽出物を含む抗ウイルス又は抗菌組成物及びその使用方法(Antiviral or antifungal composition comprising an extract of pomegranate rind or other plants and method of use)」１９９８年１１月２４日に発行された米国特許第５，８４０，３０８号; Shehadeh, A.A.「免疫増進能を伴うハーブの抽出組成物及びその方法(Herbal extract composition and method with immune-boosting capability)」２０００年２月２９日に発行された米国特許第６，０３０，６２２号; Jassim, S.A.A., Denyer, S.P., and Stewart, G.S.A.B.「抗ウイルス組成物又は抗菌組成物及びその方法(Antiviral or antifungal composition and method)」２００１年２月２日に発行された米国特許第６，１８７，３１６号; Jassim, S.A.A. and Denyer, S.P.「抗ウイルス組成物又は抗菌組成物及びその方法(Antiviral or antifungal composition and method)」２００２年５月３０日に公開された米国特許出願第２００２／００６４５６７号］は、この知見が本明細書中で記載されるＨＩＶ−１侵入阻害剤を破壊する条件下で高温で調製されるザクロ外皮からの粗製抽出物に適用することを示している。
【００３９】
ＣＤ４とのｇｐ１２０の結合を阻害する阻害剤（複数可）（図２及び図５）は、ＣＸＣＲ４／ＣＣＲ５共受容体(coreceptors)（図４、図６、及び図７）との相互作用を伴うｇｐ１２０（図３）上の付加的な部位をブロックした。このことは、完全には予想されておらず、ＰＪ−Ｓ２１の異なる若しくは重複した特異性を有する複数の阻害剤の存在によって、又は、ｇｐ１２０の構造変化の誘導によってのいずれかで説明することができ［Hsu, S-T, Bonvin, A.M.J.J.著「ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０のＣＤ４結合誘導性構造変化への原子的な見識(Atomic insight into the CD4 binding-induced conformational changes in HIV-1 gp120)」Proteins, (2004), 55:582-593］、その結果、ｇｐ１２０上のＣＤ４結合部位及びＣＸＣＲ４／ＣＣＲ５結合部位の両方の阻止をもたらす。同様の効果が他の小分子の阻害剤について報告されている［Neurath, A.R., Strick, N., Lin, K., Debnath, A.K., Jiang, S.著「ヒトのヘム代謝の制御に使用されるスズプロトポルフィリンＩＸは、ＨＩＶ−１感染を効果的に阻害する(Tin protoporphyrin IX used in control of heme metabolism in humans effectively inhibits HIV-1 infection)」Antiviral Chem. Chemother., (1994), 5:322-330］。ウイルス侵入に関するＨＩＶ−１上の単一部位より多くの同時阻止は、候補殺菌剤の有効性を増大することが期待される［Hu, Q., Frank, I., Williams, V., Santos, J.J., Watts, P., Griffin, G.E., Moore, J.P., Pope, M., Shattock, R.J.著「付着及び融合受容体の阻止がヒト頸部組織のＨＩＶ−１感染を阻害する(Blockade of attachment and fusion receptors inhibits HIV-1 infection of human cervical tissue)」J. Exp. Med., (2004), 199:1065-1075］。（末端マンノース残基に特異的な）標識化したガランサス・ニバリス(Galanthus nivalis)のレクチン［Hammar, L., Hirsch, I., Machado, A.A., de Mareuil, J., Baillon, J.G., Bolmont, C., Chermann, J-C著「ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨＩＶ１型感染のレクチン介在性の効果(Lectin-mediated effects of HIV type 1 infection in vitro)」AIDS Res. Hum. Retroviruses, (1995), 11:87-95］、及び他のレクチンのｇｐ１２０オリゴ糖への結合がザクロジュース又はＰＪ−Ｓ２１の存在下で低減しなかったので（データは図示せず）、阻害剤（複数可）に対する標的部位がｇｐ１２０のタンパク質部分内に位置している可能性が高い。
【００４０】
モノクローナル抗体又はＣＤ４−ＩｇＧ２組み換えタンパク質によるＨＩＶ−１  ｇｐ１２０上のＣＤ４結合部位の阻止は、ｅｘ  ｖｉｖｏでのヒト頸部組織のＨＩＶ−１感染(infection)を阻害するのに十分であり［Hu, Q., Frank, I., Williams, V., Santos, J.J., Watts, P., Griffin, G.E., Moore, J.P., Pope, M., Shattock, R.J.著「付着及び融合受容体の阻止が、ヒト頸部組織のＨＩＶ−１感染を阻害する(Blockage of attachment and fusion receptors inhibits HIV-1 infection of human cervical tissue)」J. Exp. Med., 2004, 199:1065-1075］、及び経膣的に投与するときのマカクザルへのウイルス伝播(transmission)を予防するのに十分である［Veazey, R.S., Shattock, R.J., Pope, M., Kirijan, J.C., Jones, J., Hu, Q., Ketas, T., Marx, P.A., Klasse, P.J., Burton, D.R., Moore, J.P.著「ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０に経膣的に投与されるモノクローナル抗体によるマカクザルへのウイルス伝播の予防(Prevention of virus transmission to macaque monkeys by a vaginally applied monoclonal antibody to HIV-1 gp120)」Nat. Med., 2003, 9:343-346］ことが示されている。したがって、ＰＪ−Ｓ２１が同様に効果的であろうことが予測される。
【００４１】
局所抗ＨＩＶ−１殺菌剤としてのＰＪ−Ｓ２１の投与は、異なった時間及び位置で製造されるバッチ間での適度な均一性(reasonable uniformity)を要求する。未知の保存された異なる、新たに調製したジュースと市販のジュースとの間のｇｐ１２０−ＣＤ４結合阻害活性の類似点（図２）は、このことが実現可能であるはずであることを示唆している。８５℃での３０秒間のジュースの低温殺菌によって、阻害活性の完全な損失がもたらされた。６１℃にさらされた市販のザクロジュース濃縮物１つと、及びおそらく高温での蒸発により調製された２つの別の濃縮物は、活性が全くないか、又は劇的に低減していた。ＰＪ３（フルクトース及びクエン酸添加ジュース）からのｇｐ１２０−ＣＤ４の阻害活性によって、デンプンと結合しなかった。これらの化合物がコーンスターチとの結合を阻害剤によって阻害することが、別々の実験によって明らかになった。したがって、ＰＪ−Ｓ２１複合体の製造用の(intended for)ザクロジュースは、濾過により殺菌されなければならず、添加剤を含んではならない。
【００４２】
ザクロジュースからのウイルス侵入阻害剤の効果的な結合のために膣製剤において一般的に使用される医薬品賦形剤であるデンプンの選択に、特に注意しなければならない［Garg, S., Tambweker, K.R., Vermani, K., Garg, A., Kaul, C.L., Zaneveld, L.J.D.著「膣製剤に関する医薬品賦形剤の概要(Compendium of pharmaceutical excipients for vaginal formulations)」Pharmaceutical Technology Drug Delivery, (2001), Sept.:14-24. (http://ptech.adv100.com/pharmtech /data/articlestandard/pharmtech/512001/5133/article.pdf)］。試験した１２個のデンプンの中では、ＰＵＲＩＴＹ（登録商標）２１コーンスターチＮＦグレード（Ｓ２１）で最も良好な結果が得られた。しかし、異なるブランドのデンプンが効果的である場合もあり、本発明はＳ２１に限定されないと考えられる。試験した他のデンプンのブランドでは、阻害剤の吸着が不完全であったか、又はこれらの結合が、おそらくザクロジュース阻害剤の不可逆的結合のために、ｇｐ１２０−ＣＤ４結合阻害を測定するＥＬＩＳＡでの活性を有する複合体をもたらさなかった（ＡＲＧＯ（登録商標）コーンスターチ）。
興味深いことに、異なる化合物に対する吸着剤としてのデンプンの使用に関して利用することができる参考文献がほんのわずかだけ存在した：風味剤［Yao, W., Yao, H.著「多孔性デンプンの吸着特性(Adsorbent characteristics of porous starch)」Starch/Starke, 2002, 54:260-263; Whistler, R.L.「微小孔性の粒状デンプンマトリクス組成物(Microporous granular starch matrix compositions)」１９９１年１月１５日に発行された米国特許第４，９８５，０８２号］、染料［Berset, C., Clermont, H., Cheval, S.著「吸収性支持体により影響される天然の赤色着色剤の有効性(Natural red colorant effectiveness as influenced by absorptive supports)」J. Food Sci., 1995, 60:858-861, 879; Stute, R., Woelk, H.U.著「デンプンの研究に関する新たな技術である、デンプンと反応染料との相互作用。ＩＩ．デンプンの固定反応の影響(Interaction between starch and reactive dyes, New technique for the investigation of starch. II. Influence of fixation reaction of starch)」Starch/Starke, 1974, 26:1-9; Seguchi, M.著「コムギデンプン粒の表面と結合する染料(Dye binding to the surface of wheat starch granules)」Cereal Chemistry, 1986, 63:518-520］、低分子量の単糖類［Tomasik, P., Wang, Y-J, Jane, J.L.著「低分子糖類とのデンプンの複合体(Complexes of starch with low-molecular saccharides)」Starch/Starke, 1995, 47:185-191)、脂質(Zhang, G., Maladen, M.D., Hamaker, B.R.著「デンプン、タンパク質、及び遊離脂肪酸から成る複合体の新規の３つの成分の検出(Detection of novel three component complex consisting of starch, protein, and free fatty acids)」J. Agric. Food Chem., 2003, 51:2801-2805; Johnson, J.M., Davis, E.A., Gordon, J.著「加工コーンスターチの脂質結合の電子スピン共鳴による研究(Lipid binding of modified corn starches studies by electron spin resonance)」Cereal Chemistry, 1990, 67:236-240］、タンパク質［Tomazic-Jezic, V.J., Lucas, A.D., Sanchez, B.A.著「グローブ粉末上の天然ゴムラテックスタンパク質の結合及び測定(Binding and measuring natural rubber latex proteins on glove powder)」J. Immunoassay Immunochem., 2004, 25:109-123］、及びヨウ素［Conde-Petit, B., Nuessli, J., Handshin, S., Escher, F.著「光学顕微鏡、流量計、及びヨウ素結合の挙動による水溶性デンプンの分散の比較特性(Comparative characterization of aqueous starch dispersions by light microscopy, rheometry, and iodine binding behavior)」Starch/Starke, 1998, 50:184-192］。
【００４３】
本発明の複合体の所望の用量、例えば膣投与のためのＰＪ−Ｓ２１は、１．０〜１．５ｇ（＝デンプン上に吸着されるザクロジュースからの固形分３．１７〜４．７６ｍｇ）、すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨＩＶ−１感染(infection)をブロックするのに必要な用量の１００倍以上であり（図１０、表１）、したがって、膣への攻撃(challenge)に対する適当なｉｎ  ｖｉｖｏ保護の要件を満たすことが期待される［Moore, J., Wainberg, M., Amman, A., Veazey, R., Pope, M., Shattock, R.J., Doms, R.W.著「局所殺菌剤としての融合／侵入阻害剤の開発(Development of fusion/entry inhibitors as topical microbicides)」In Proceeding of the Microbicides, (2004): 28-31 March 2004; London (http://www.microbicides2004.org.uk/progtue.html)］。この量のＰＪ−Ｓ２１は、ザクロジュース５〜７．５ｍｌ、すなわち、この提案される候補の局所殺菌剤の安全性、実現可能性、及び経済性を実証する、一回分のジュース(a single serving of juice)（１５０ｍｌ）の５％以下から製造される。
【実施例】
【００４４】
本発明は、以下の非限定的な実施例に関して、これから記載されるであろう。
【００４５】
試薬
ザクロジュース（「ＰＪ」）は、米国ニューヨーク州ニューヨークの地元の小売店で購入し、これらの製造元は丸かっこ内に与えられる：ＰＪ１(Madeira Enterprises Inc.,カルフォルニア州マディラ)；ＰＪ２は、本発明者の研究所において新鮮で完熟したザクロから調製された；ＰＪ３(Sadaf7; Sadaf7 Foods,カルフォルニア州ロサンゼルス; 付加成分：フルクトース、クエン酸)；ＰＪ４(Cortas Canning & Refrigeration Co. S.A.L.,レバノン国ベイルート)；ＰＪ５(Kradjian, Import & Wholesale Distribution,カルフォルニア州グレンデール,イラン製)；ＰＪ６(R.W. Knudson; Just Pomegranate; Knudsen & Sons, Inc.,カルフォルニア州チーコ)；ＰＪ７(Aromaproduct Ltd.,ジョージア製;販売元：Tamani, Inc.,ニューヨーク州ニューヨーク)。使用されるデンプンは、以下の通りであった：ＰＵＲＥ−ＤＥＮＴ（登録商標）Ｂ８１５コーンスターチＮＦ、ＰＵＲＥ−ＤＥＮＴ（登録商標）Ｂ８１６コーンスターチＵＳＰ、Ｓｐｒｅｓｓ（登録商標）Ｂ８２５アルファ化コーンスターチＮＦ、Ｓｐｒｅｓｓ（登録商標）Ｂ８２０アルファ化コーンスターチＮＦ、ＩＮＳＴＡＮＴ  ＰＵＲＥ−ＣＯＴＥ（商標）Ｂ７９２食品用加工デンプン、ＩＮＳＣＯＳＩＴＹ（商標）Ｂ６５６食品用加工デンプン(Grain Processing Corporation,インディアナ州マスカティーン)；ＰＵＲＩＴＹ（登録商標）２１コーンスターチＮＦ及びＰＵＲＩＴＹ（登録商標）８２６コーンスターチＮＦ(National Starch and Chemical Company,ニュージャジー州ブリッジウォーター)；Ｒｅｍｙｌｉｎｅ  ＡＸ−ＤＲもち米デンプン及びＲｅｍｙ  ＤＲ天然米デンプン、中挽き(medium grind)(A&B Ingredients,ニュージャジー州フェアフィールド)；ＡＲＧＯ（登録商標）コーンスターチ(Best Foods Division, CPC International Inc.,ニュージャジー州イーグルウッドクリフ)、ＳＴＡＬＥＹ（登録商標）純食品用粉末デンプン(Tate & Lyle,イリノイ州ディケーター)；ＳＴＡＲＣＨ１５００アルファ化デンプンＮＦ(Colorcon,ペンシルバニア州ウェストポイント)。
【００４６】
以下のポリマーを使用した：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１０００ＮＦ、１５００ＮＦ、及び８０００ＮＦ；並びにヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）, ５０  ｃｐｓ、ＵＳＰ(Spectrum,ニュージャジー州ニューブランズウィック)；Ｃａｒｂｏｐｏｌ９７４Ｐ−ＮＦ(B. F. Goodrich Co.,オハイオ州クリーブランド)；Ｃａｒｂｏｐｈｉｌ, Ｎｏｖｅｏｎ  ＡＡ１(Noveon, Inc.,オハイオ州クリーブランド);並びにＰｈａｒｍａｂｕｒｓｔ  Ｂ２(SPI Pharma,デラウェア州ニューカッスル)。Ｆａｔｔｉｂａｓｅは、Paddock Laboratories, Inc.（ミネソタ州ミネアポリス）製であった。
【００４７】
以下の組み換えタンパク質を使用した：ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢ  ｇｐ１２０、ビオチニル−ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢ  ｇｐ１２０、ＣＤ４、及びビオチニル−ＣＤ４(ImmunoDiagnostics, Inc.,マサチューセッツ州ウォバーン)；(トランスフェクトした２９３Ｔ細胞［Zhao, Q., Alespeiti, G., Debnath, A.K.著「ＣＣＲ５とのＨＩＶ−１  ｇｐ１２０の結合をブロックする侵入阻害剤を同定するための新規のアッセイ(A novel assay to identify entry inhibitors that block binding of HIV-1 gp120 to CCR5)」Virol., 326:299-309］内で作られた）ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢ  ＢａＬ  ｇｐ１２０及びＦＬＳＣ（２０個のアミノ酸リンカーによりＣＤ４のＤ１Ｄ２ドメインと結び付くＢａＬ  ｇｐ１２０から成る全長単鎖タンパク質）。
【００４８】
フィコエリトリン（ＰＥ）標識化ストレプトアビジンは、R & D Systems（ミネソタ州ミネアポリス）製であった。ビオチニル化ガランサス・ニバリスのレクチンは、EY Laboratories, Inc.（カルフォルニア州サンマテオ）製であった。
【００４９】
ｇｐ１２０からの合成ペプチドに対するウサギ抗体(Neurath, A.R., Strick, N., Jiang, S.著「ウイルス集合に関与するドメイン間の相互作用を研究するためのプローブとしての合成ペプチド及び抗ペプチド抗体：ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）のエンベロープ(Synthetic peptides and anti-peptide antibodies as probes to study interdomain interactions involved in virus assembly: The envelope of the human immunodeficiency virus (HIV-1))」Virol. (1992), 188:1-13)の通りの残基の番号付け)は、Neurath他, Virol., (1992), 188:1-13で記載されるように調製された。
【００５０】
ＣＤ４結合部位に特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）５８８Ｄ、及びｇｐ１２０Ｖ３ループに特異的な９２８４はそれぞれ、Dr. S. Zolla-Pazner及びNEN Research Products, Du Pont（マサチューセッツ州ボストン）から入手した。非核酸系ＨＩＶ−１逆転写酵素阻害剤ＴＭＣ−１２０の“ｇｅｎｅｒｉｃ”版［Van Herrewege, Y., Michiels, J., Van Roey, J., Fransen, K., Kestens, L., Balzarini, J., Lewi, P., Vanham, G., Janssen, P.著「ヒト免疫不全ウイルス殺菌剤としての非核酸系逆転写酵素阻害剤であるＵＣ−７８１及びＴＭＣ１２０−Ｒ１４７６８１のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの評価(In vitro evaluation of nonnucleoside reverse transcriptase inhibitors UC-781 and TMC120-R147681 as human immunodeficiency virus microbicides)」Antimicrob. Agents Chemother., (2004), 48:337-339］がAlbany Molecular Research, Inc.（ニューヨーク州アルバニー）により合成され、５μＭの最終濃度で対照実験に使用した。
【００５１】
ペレット化した、１，０００倍の濃度のＨＩＶ−１  ＩＩＩＢ（６．８×１０１０ウイルス粒子／ｍｌ）及びＢａＬ（２．４７×１０１０ウイルス粒子／ｍｌ）は、Advanced Biotechnologies, Inc.（メリーランド州コロンビア）製であった。
【００５２】
最初のＨＩＶ−１分離株、ＭＴ−２細胞、ＨｅＬａ−ＣＤ４−ＬＴＲ−β−ｇａｌ及びＵ３７３−ＭＡＧＩ−ＣＣＲ５Ｅ細胞並びにＣｆ２Ｔｈ／ｓｙｎＣＣＲ５細胞は、McKesson BioServices Corporation（メリーランド州ロックビル）で運営されるエイズ研究及び参考試薬プログラム(the AIDS Research and Reference Reagent Program)から得られた。
【００５３】
ＣＤ４及びＣＸＣＲ４並びにＣＣＲ５共受容体(coreceptors)を発現する、ＨＩＶ−１の長い末端反復配列の（ＬＴＲ）−緑色蛍光タンパク質及びルシフェラーゼレポーター構築物で変換したＣＥＭｘ１７４  ５．２５Ｍ７細胞［Hsu, M., Harouse, J.M., Gettie, A., Buckner, C., Blanchard, J., Cheng-Mayer, C.著「エンベロープｇｐ１２０に関するＣＣＲ５指向性(CCR5-tropic)のサルＡＩＤＳ誘導性のサル／ヒト免疫不全ウイルスＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３マップは粘膜伝播を増大するが、病原性を増大しない(Increased mucosal transmission but not enhanced pathogenicity of the CCR5-tropic, simian AIDS-inducing simian/human immunodeficiency virus SHIVSF162P3 maps to envelope gp120)」J. Virol., (2003), 77:989-998］は、Dr. Cecilia Cheng-Mayerから得られた。この細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１μｇ／ｍｌのピューロマイシン及び２００μｇ／ｍｌのＧ４１８が補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地で維持された。これらの細胞は、Ｘ４及びＲ５  ＨＩＶ−１両方の分離株の滴定、並びに信頼できる再現性を伴う抗ＨＩＶ−１剤の有効性の決定に適している。異なる個体由来の細胞間のＨＩＶ−１感染(infection)に対する感受性の違いのため、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用することによりこのことを達成することは不可能である［Schwartz, D.H., Castillo, R.C., Arango-Jaramillo, S., Sharma, U.K., Song, H.F., Sridharan, G.著「長期間もしくは近年感染したＨＩＶ−１陽性患者における低ウイルス血症に相互関係するヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏでのケモカイン非依存性の耐性(Chemokine-independent in vitro resistance to human immunodeficiency virus (HIV-1) correlating with low viremia in long-term and recently infected HIV-1-positive persons)」J. Infect. Dis., 1997, 176:1168-1174; Wu, L., Paxton, W.A., Kassam, N., Ruffing, N., Rottman, J.B., Sullivan, N., Choe, H., Sodroski, J., Newman, W., Koup, R.A., Mackay, C.R.著「ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのマクロファージ指向性のＨＩＶ−１による感染力に相互関係するＣＣＲ５レベル及び発現パターン(CCR5 levels and expression pattern correlate with infectability by macrophage-tropic HIV-1, in vitro)」J. Exp. Med., 1997, 185:1681-1691; Blaak, H., Ran, L.J., Rientsma, R., Schuitmaker, H.著「ＮＳ１  ＨＩＶ−１に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激したＰＢＭＣの感染しやすさは、ＣＣＲ５発現及びβ−ケモカイン生成のレベルに関する(Susceptibility of in vitro stimulated PBMC to infections with NS1 HIV-1 is associated with levels of CCR5 expression and beta-chemokine production)」Virol., 2000, 167:237-246］。ＰＢＭＣは、記載されているように、ＨＩＶ−１陰性ドナーから単離された［Gartner, S., Popovic, M.著「ウイルス単離及び生成(Virus isolation and production)」In Techniques in HIV Research, Edited by Aldovini, A., Walker, B.D., New York; M., Stockton Press; 1990:53-70］。
【００５４】
製剤
ｇｐ１２０−ＣＤ４結合阻害活性をザクロジュースの他の成分のほとんどから分離する試みにおいて、ザクロジュース１ｍｌにつき、２００ｍｇの異なるデンプン調製物を添加した。２０℃で１時間混合後、過剰なジュースをデカントし、このペレットを１ｍｌの蒸留水で再懸濁した。酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）の結果に基づき、ＰＵＲＩＴＹ（登録商標）２１コーンスターチ、ＮＦグレード（Ｓ２１）をさらなる研究のために選択し、対応するザクロジュース複合体をＰＪ−Ｓ２１として表した。ＰＪ−Ｓ２１は凍結乾燥し、以下の製剤を調製するために使用した：ＰＥＧ坐薬（５０％ＰＪ−Ｓ２１、４５％ＰＥＧ  １０００、５％ＰＥＧ  １５００）；Ｆａｔｔｉｂａｓｅ坐薬（５０％ザクロジュースＳ２１、５０％Ｆａｔｔｉｂａｓｅ）；及び粘膜付着性の即効性の分散性錠剤（５０％ＰＪ−Ｓ２１、２０％ＨＰＭＣ、２０％Ｐｈａｒｍａｂｕｒｓｔ、７．５％Ｃａｒｂｏｐｏｌ９７４Ｐ及び２．５％Ｃａｒｂｏｐｈｉｌ）。
【００５５】
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢ及びＢａＬによるそれぞれの感染(infection)の阻害は、β−ガラクトシダーゼ読み出しシステムに従って決定された［Neurath, A.R., Strick, N., Li, Y-Y著「アニオン性ポリマーの抗ＨＩＶ−１活性：候補殺菌剤の比較研究(Anti-HIV-1 activity of anionic polymers: A comparative study of candidate microbicides)」BMC Infect. Dis., (2002), 2:27］。この酵素は、Ｍｉｃｒｏｌｉｇｈｔ  ＭＬ２２５０照度計(Dynatech Laboratories, Inc.,バージニア州シャンティリー)を使用してＧａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ  Ｐｌｕｓシステム化学発光レポーター分析(Applied Biosystems,カルフォルニア州フォスターシティ)によって定量された。殺ウイルス活性を測定するために、ＰＥＧ８０００での遠心分離及び／又は沈殿により過剰な不活性化剤からウイルスを分離した［Neurath, A.R., Strick, N., Li, Y-Y著「アニオン性ポリマーの抗ＨＩＶ−１活性：候補殺菌剤の比較研究(Anti-HIV-1 activity of anionic polymers: A comparative study of candidate microbicides)」BMC Infect. Dis. (2002), 2:27; Neurath, A.R., Strick, N., Li, Y-Y著「水分散性の殺菌性セルロースアセテートフタラートフィルム(Water dispersible microbicidal cellulose acetate phthalate film)」BMC Infect. Dis. (2003), 3:27］。処理ウイルスの連続希釈液の感染性(infectivity)を上記のように試験した。処理ウイルス及び対照ウイルスに関する用量反応曲線（すなわち、蛍光対希釈）が得られ、ウイルスの不活性化の割合を算出した［Neurath, A.R., Strick, N., Li, Y-Y著「水分散性の殺菌性セルロースアセテートフタラートフィルム(Water dispersible microbicidal cellulose acetate phthalate film)」BMC Infect. Dis., (2003), 3:27］。最初のＨＩＶ−１株による感染(infection)の阻害を決定するために、３７℃で３日間、段階的濃度でＰＪ−Ｓ２１非存在又は存在下、最初のＨＩＶ−１株の１００×ＴＣＩＤ５０で、ＣＥＭｘ１７４  ５．２５  Ｍ７細胞をインキュベートした。この実験は３点併行で行われた(done in triplicate)。Ｕｌｔｒａ３８４照度計(Tecan,ノースカロライナ州リサーチトライアングルパーク)でPromega(ウィスコンシン州マディソン)製のキットを使用して、ルシフェラーゼ活性を測定することで感染(infection)を定量化した［Hsu, M., Harouse, J.M., Gettie, A., Buckner, C., Blanchard, J., Cheng-Mayer, C.著「エンベロープｇｐ１２０に関するＣＣＲ５指向性のサルＡＩＤＳ誘導性のサル／ヒト免疫不全ウイルスＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ３マップは粘膜伝播を増大するが、病原性を増大しない(Increased mucosal transmission but not enhanced pathogenicity of the CCR5-tropic, simian AIDS-inducing simian/human immunodeficiency virus SHIVSF162P3 maps to envelope gp120)」J. Virol., (2003), 77:989-998］。
【００５６】
ＣＤ４−ＨＩＶ−１のｇｐ１２０との結合及びその阻害をＥＬＩＳＡにより測定した。９６ウェルのポリスチレンプレートのウェル(Immulon II, Dynatech Laboratories, Inc.,バージニア州シャンティリー)を１００ｎｇ／ウェルのｇｐ１２０  ＩＩＩＢ又はｇｐ１２０  ＢａＬのいずれかで被覆して、記載されているように後被覆した(post-coated)［Neurath, A.R., Strick, N., Li, Y.Y., Debnath, A.K.著「一般的な医薬品賦形剤であるセルロースアセテートフタラートがＨＩＶ−１を不活性化し、ウイルスエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０上の共受容体結合部位をブロックする(Cellulose acetate phthalate, a common pharmaceutical excipient, inactivates HIV-1 and blocks the coreceptor binding site on the virus envelope glycoprotein gp120)」BMC Infect. Dis., (2001), 1:17］。１００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む０．１４ＭのＮａＣｌ、０．０１ＭのＴｒｉｓ、０．０２％ナトリウムメルチオレート（ｐＨ７．０）（ＴＳ）中のザクロジュース及びＰＪ−Ｓ２１のそれぞれの希釈液を３７℃で１時間、上記ウェルに添加した。このウェルをＴＳで５回洗浄した。ＴＳ−１％のゼラチン中のビオチニル−ＣＤ４（１μｇ／ｍｌ）を３７℃で５時間、上記ウェルに添加した。ＴＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で１回、及びＴＳで５回の洗浄後、ＴＳ−２％ゼラチン−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中でセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ストレプトアビジン（０．６２５μｇ／ｍｌ; Amersham,イリノイ州アーリントンハイツ）を添加した。３７℃で３０分後、このウェルをＴＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で４回、及びＴＳで２回洗浄した。Kirkegaard and Perry Laboratories Inc. (メリーランド州ゲイサーズバーグ)製のキットを使用して、結合したＨＲＰを検出し、４５０ｎｍで吸光度（Ａ）を読み取った。阻害剤の非存在下においてＡは、１．０〜１．５であり、ビオチニル−ＣＤ４の非存在下では０〜０．００５であった。代替的なアッセイでは、２０℃で３０分間、阻害剤の存在下、又は非存在下において、ビオチニル−ｇｐ１２０（１μｇ／ｍｌ）でＣＤ４（５００ｎｇ／ｍｌ）を混合した。この混合物の連続希釈液を抗ＣＤ４  ｍＡｂ  ＯＫＴ  ４(Ortho-Clinical Diagnostics,ニューヨーク州ロチェスター)で被覆したウェルに添加し、捕捉されたビオチニル−ｇｐ１２０を上記のようにＨＲＰ−ストレプトアビジンで検出した。ｇｐ１２０ペプチドに対する抗体のｇｐ１２０との結合を測定するために、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＦＢＳとヤギ血清との（９：１）混合物（ｐＨ８．０）中で、それぞれのウサギ抗血清を５０倍に希釈し、ｇｐ１２０ウェルに添加した。結合したＩｇＧをＨＲＰ標識化抗ウサギＩｇＧで検出した（Sigma,ミズーリ州セントルイス;ＴＳ−１０％ヤギ血清−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中の１μｇ／ｍｌ）。細胞に基づいたＥＬＩＳＡを使用して、ＰＪ及びＰＪ−Ｓ２１のそれぞれによるＨＩＶ−１  ＢａＬ  ｇｐ１２０上のＣＣＲ５結合部位の阻止を測定した［Zhao, Q., Alespeiti, G., Debnath, A.K.著「ＣＣＲ５とのＨＩＶ−１  ｇｐ１２０の結合をブロックする侵入阻害剤を同定するための新規のアッセイ(A novel assay to identify entry inhibitors that block binding of HIV-1 gp120 to CCR5)」Virol., 326:299-309］。簡潔に述べると、阻害剤の非存在下、又は段階的な量の存在下におけるＦＬＳＣ（１２５ｎｇ／ｍｌ）を９６ウェルプレートのウェルに５％ホルムアルデヒドで固定化されたＣｆ２Ｔｈ／ｓｙｎＣＣＲ５細胞に添加した。３７℃で１時間後、ＣＤ４のＤ２ドメインに特異的なｍＡｂ  Ｍ−Ｔ４４１（１２５ｎｇ／ｍｌ；Ancell,ミネソタ州ベイポート）で、続いてビオチニル化した抗マウスＩｇＧ及びＨＲＰ−ストレプトアビジンで、結合したＦＬＳＣを検出した。
【００５７】
［結果］
ザクロジュースの抗ＨＩＶ−１活性
ジュース（リンゴ、ブラックチェリー、ブルーベリー、ココナッツミルク、クランベリー、エルダーベリー、ブドウ（赤）、グレープフルーツ、ハチミツ、レモン、ライム、パイナップル、ザクロ、及びレッドビート（１０％再構成乾燥粉末））の連続した２倍希釈液をＣＤ４及びＣＸＣＲ４の受容体(receptors)及び共受容体(coreceptors)を発現する細胞のＨＩＶ−１  ＩＩＩＢによる感染(infection)の阻害に関して試験した。ブルーベリー、クランベリー、ブドウ及びライムジュースそれぞれを除くほとんどのジュース（４倍希釈）は、阻害活性を有していなかった［５０％の感染(infection)阻害における終点（ＥＤ５０）が１／１６〜１／６４］。常に、異なる地理上の区域からのザクロジュースは、最も高い阻害活性を有していた（図１;斜線部分）。共受容体(coreceptor)としてＣＣＲ５を利用するＨＩＶ−１ウイルス（＝Ｒ５ウイルス）が主に性的に伝播される(transmitted)ので［Shattock, R.J., Moore, J.P.著「ＨＩＶ−１感染の性的伝播の阻害(Inhibiting sexual transmission of HIV-1 infection)」Nat. Rev. Microbiol., (2003), 1:25-34; Shattock, R.J., Doms, R.W.著「ＡＩＤＳモデル：殺菌剤はワクチンから学ぶことができる(AIDS models: Microbicides could learn from vaccines)」Nat. Med., (2002), 8:425］、ザクロジュースは共受容体(coreceptor)としてＣＸＣＲ４を利用するウイルス（＝Ｘ４ウイルス）であるＨＩＶ−１  ＩＩＩＢによる感染(infection)だけでなく、Ｒ５ウイルスであるＨＩＶ−１  ＢａＬによる感染(infection)も阻害することができるかどうかを試験することが重要であった。図１の結果（非斜線部分）は、ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢによる感染ほど効果的ではないが、後者のウイルスによる感染(infection)も阻害されることを示す。
【００５８】
ウイルス侵入をブロックすることは、殺菌剤開発における主な目的である［Shattock, R.J., Moore, J.P.著「ＨＩＶ−１感染の性的伝播の阻害 (Inhibiting sexual transmission of HIV-1 infection)」Nat. Rev. Microbiol., (2003), 1:25-34; Moore, J.P., Doms, R.W.著「侵入阻害剤の侵入：科学と医学との融合(The entry of entry inhibitors: a fusion of science and medicine)」Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2003), 100:10598-10602; Pierson, T.C., Doms, R.W.著「ＨＩＶ−１侵入阻害剤：新たな標的、新規の治療法(HIV-1 entry inhibitors: new targets, novel therapies)」Immunol. Lett., (2003), 85:113-118; Davis, C.W., Doms, R.W.著「ＨＩＶ伝播：全てのドアを閉めること(HIV Transmission: Closing all the Doors)」J. Exp. Med., (2004), 199:1037-1040; Hu, Q., Frank, I., Williams, V., Santos, J.J., Watts, P., Griffin, G.E., Moore, J.P., Pope, M., Shattock, R.J.著「付着及び融合受容体の阻止が、ヒト頸部組織のＨＩＶ−１感染を阻害する(Blockade of attachment and fusion receptors inhibits HIV-1 infection of human cervical tissue)」J. Exp. Med., (2004), 199:1065-1075］。したがって、ザクロジュースがＸ４及びＲ５ウイルス両方についての共通の受容体(common receptor)であるＣＤ４に対するＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０の結合を阻害するか否かを決定することが重要であった(of interest)。ザクロジュースによるｇｐ１２０  ＩＩＩＢ及びＢａＬ両方の前処理が可溶性の標識化ＣＤ４のその後の結合を阻害した（図２）。このことは、１つ又は複数のザクロジュース成分がｇｐ１２０上のＣＤ４結合部位と強く、又は不可逆的に結合することを示唆していた。ポリスチレンプレート上に固定化されたｇｐ１２０を使用して、ＥＬＩＳＡで得られたこれらの結果が、ｇｐ１２０及びＣＤ４の両方が可溶性形態であった別のアッセイで確認された（データは図示せず）。反対の実験では(In reverse experiments)、ザクロジュースによるＣＤ４の前処理により、その後のｇｐ１２０結合をブロックすることができなかった。抗ＨＩＶ−１活性を有する他のジュース（ブルーベリー、クランベリー、ブドウ、及びライム）では、ｇｐ１２０−ＣＤ４結合をブロックすることができなかった。
【００５９】
ザクロジュース阻害剤（複数可）によってブロックされるｇｐ１２０上の部位を描写するために、ｇｐ１２０のアミノ酸配列由来のペプチドに対する抗体のｇｐ１２０  ＩＩＩＢとの結合に関するザクロジュースの阻害効果が研究された。ペプチド（１０２−１２６）、（３０３−３３８）、（３０６−３３８）、（３６１−３９２）、（３８６−４１７）、（３９１−４２５）、（４１１−４４５）及び（４７７−５０８）に対する抗体の結合は、有意に（約５０％）阻害された（図３）。ｇｐ１２０  Ｖ３ループ（残基３０３−３３８）及びＣＤ４結合部位にそれぞれ特異的なモノクローナル抗体９２８４及び５８８Ｄのｇｐ１２０  ＩＩＩＢとの結合［Skinner, M.A., Ting, R., Langlois, A.J., Weinhold, K.J., Lyerly, H.K., Javaherian, K., Matthews, T.J.著「ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質に対する中和モノクローナル抗体の特性(Characteristics of a neutralizing monoclonal antibody to the HIV envelope glycoprotein)」AIDS Res. Hum. Retroviruses, (1988), 4:187-197; Laal, S., Zolla-Pazner, S.著「ヒト免疫システムにより認識されるＨＩＶ−１糖タンパク質のエピトープ(Epitopes of HIV-1 glycoproteins recognized by the human immune system)」In Immunochemistry of AIDS, Chemical Immunology, Volume 56, Edited by Norrby E. Basel: Karger; 1993:91-111］は、それぞれ９７％阻害された。この関連ペプチドの幾つかには、ＣＤ４結合に関与する残基が含まれており［Kwong, P.D., Wyatt, R., Robinson, J., Sweet, R.W., Sodroski, J., Hendrickson, W.A.著「ＣＤ４受容体及び中和ヒト抗体を伴う複合体中のＨＩＶ  ｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質の構造(Structure of an HIV gp120 envelope glycoprotein in complex with the CD4 receptor and a neutralizing human antibody)」Nature, (1998), 393:648-659; Xiang, S.H., Kwong, P.D., Gupta, R., Rizzuto, C.D., Casper, D.J., Wyatt, R., Wang, L., Hendrickson, W.A., Doyle, M.L., Sodroski, J.著「ＣＤ４結合状態の変異原性の安定化及び／又は崩壊が、ヒト免疫不全ウイルス１型のｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質の異なる構造を明らかにする(Mutagenic stabilization and/or disruption of a CD4-bound state reveals distinct conformations of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein)」J. Virol., (2002), 76:9888-9899; Pantophlet, R., Ollmann Saphire, E., Poignard, P., Parren, P.W.I., Wilson, I.A., Burton, D.R.著「中和及び非中和モノクローナル抗体のヒト免疫不全ウイルス１型のｇｐ１２０のＣＤ４結合部位との相互作用の精細なマッピング(Fine mapping of the interaction of neutralizing and nonneutralizing monoclonal antibodies with the CD4 binding site of human immunodeficiency virus type 1 gp120)」J. Virol., (2003), 77:642-658］、その一方で全ての識別されるペプチドには、共受容体(coreceptor)結合に関与する残基が含まれる［Westervelt, P., Gendelman, H.E., Ratner, L.著「一次単球の増殖感染にとって重要であるヒト免疫不全ウイルス１の表面エンベロープ糖タンパク質内の決定基の同定(Identification of a determinant within the human immunodeficiency virus 1 surface envelope glycoprotein critical for productive infection of primary monocytes)」Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1991), 88:3097-3101; Westervelt, P., Trowbridge, D.B., Epstein, L.G., Blumberg, B.M., Li, Y., Hahn, B.H., Shaw, G.M., Price, R.W., Ratner, L.著「ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒト免疫不全ウイルス１型のマクロファージ指向性の決定基(Macrophage tropism determinants of human immunodeficiency virus type 1 in vivo)」J. Virol., (1992), 66:2577-2582; Rizzuto, C.D., Wyatt, R., Hernandez-Ramos, N., Sun, Y., Kwong, P.D., Hendrickson, W.A., Sodroski, J.著「ケモカ���ン受容体結合に関与する保存されたＨＩＶ  ｇｐ１２０糖タンパク質構造(A conserved HIV gp120 glycoprotein structure involved in chemokine receptor binding)」Science, (1998), 80:1949-1953; Cormier, E.G., Dragic, T.著「Ｖ３ループの頂部及び基部はＣＣＲ５共受容体とのヒト免疫不全ウイルス１型エンベロープ糖タンパク質の相互作用において異なる役割を果たす(The crown and stem of the V3 loop play distinct roles in human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein interactions with the CCR5 coreceptor)」J. Virol., (2002), 76:8953-8957; Suphaphiphat, P., Thitithanyanont, A., Paca-Uccaralertkun, S., Essex, M., Lee, T-H著「ＣＣＲ５利用に対するヒト免疫不全ウイルス１型Ｃ亜型のｇｐ１２０におけるＶ３及び架橋シート残基のアミノ酸置換の効果(Effect of amino acid substitution of the V3 and bridging sheet residues in human immunodeficiency virus type 1 subtype C gp120 on CCR5 utilization)」J. Virol., (2003), 77:3832-3837; Liu, S., Fan, S., Sun, Z.著「分子モデリング研究によるＨＩＶ  ｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質とＣＤ４受容体との複合体におけるヒトＣＣＲ５受容体の構造的及び機能的特性(Structural and functional characterization of the human CCR5 receptor in complex with HIV gp120 envelope glycoprotein and CD4 receptor by molecular modeling studies)」J. Mol. Model (Online) (2003), 9:329-336］。ｇｐ１２０のＸ線結晶構造上で結合している受容体(receptor)／共受容体(coreceptor)に関する上記ペプチド及び残基の位置を図４に示す。これらの結果は、ザクロジュース阻害剤（複数可）がｇｐ１２０−共受容体(coreceptor)結合もブロックすることができることを示唆している。
【００６０】
ザクロジュースからの抗ＨＩＶ−１阻害剤（複数可）の分離
ザクロジュースは強い色調である。したがって、ザクロジュースが衣類を染めては良くないので、直接殺菌剤に処方することができない。ザクロジュースから活性成分（複数可）を分離又は単離する試みが為された。これを達成するために４年を超える断続的な努力の後、ｇｐ１２０−ＣＤ４結合の阻害剤（複数可）をコーンスターチの選択されたブランド上で効果的に（９９％以上）吸着することができることを発見し（図５）、結果としてほぼ無色の製品ができ、ＰＪ−Ｓ２１として表した。水又は非緩衝(unbuffered)０．１４ＭのＮａＣｌ中で懸濁したＰＪ−Ｓ２１はｐＨ３．２であり、これは適用後に安定を保つであろう酸性の膣環境に適合する（本明細書を参照のこと）。ｇｐ１２０−ＣＤ４結合の阻害剤は、５：４のエタノール／アセトンでの抽出によってＰＪ−Ｓ２１から溶出することができた。この抽出物の乾燥に続く重量測定によって、この抽出物が１ｇのＰＪ−Ｓ２１に付き３．１７ｍｇの固体を含むことが示された。
【００６１】
ＰＪ−Ｓ２１は、フローサイトメトリーによって測定したところ、元のザクロジュースと同程度まで、ＣＸＣＲ４を発現する細胞とのｇｐ１２０  ＩＩＩＢ−ＣＤ４複合体の結合を阻害した（図６）。同様に、細胞に基づいたＥＬＩＳＡによって測定したところ、ＣＣＲ５を発現する細胞とのｇｐ１２０  ＢａＬ−ＣＤ４融合タンパク質の結合が、ザクロジュース及びＰＪ−Ｓ２１によってブロックされた［Zhao, Q., Alespeiti, G., Debnath, A.K.著「ＣＣＲ５とのＨＩＶ−１  ｇｐ１２０の結合をブロックする侵入阻害剤を同定するための新規のアッセイ(A novel assay to identify entry inhibitors that block binding of HIV-1 gp120 to CCR5)」Virol., 326:299-309］（図７）。したがって、ＰＪ−Ｓ２１は、細胞受容体(receptor)ＣＤ４及び共受容体(coreceptors)ＣＸＣＲ４／ＣＣＲ５へのＸ４及びＲ５ウイルス両方の結合の阻害剤である。また、ＰＪ−Ｓ２１は、フローサイトメトリーにより測定したところ、ＰＢＭＣとのｇｐ１２０の結合を阻害した（図８−Ａ及び図８−Ｂ）。ＰＪ−Ｓ２１がウイルス侵入阻害剤として働くことを確認するために、ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢ及びＢａＬのそれぞれによる細胞感染(infection)の前後、時間の間隔をおいて、上記複合体を細胞に添加した。図９で示される結果は、ＰＪ−Ｓ２１がウイルス複製サイクルの初期段階で阻止することを実証している。
【００６２】
ＰＪ−Ｓ２１が局所殺菌剤と考えられるためには、熱帯環境での保存に耐えるように処方しなければいけない。熱安定性の加速(Accelerated)研究は、ＰＪ−Ｓ２１の水懸濁液が、６０℃で３０分間、及び５０℃で又は４０℃で１週間保存したとき、それぞれ、（ｇｐ１２０−ＣＤ４結合の阻害によって測定された）この元の活性の４、１１、及び３３％だけ維持したことを明らかにした。その一方で、乾燥ＰＪ−Ｓ２１粉末は５０℃での１２週間（評価において利用した最長時間）の保存後にも完全な活性を保った。結果として、無水製剤が望ましいであろう。
【００６３】
３つのこのような製剤を調製した：３７℃で溶解する２種類の坐薬、及び錠剤（本明細書で記載される組成物）。ＰＪ−Ｓ２１の阻害活性は、錠剤で５０℃、及び坐薬で３０℃（溶解を妨げると思われる最高温度）での１２週間の保存のあと、完全に保存された。ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢ及びＢａＬそれぞれによる感染(infection)の、ＰＪ−Ｓ２１及びその製剤による阻害を示すデータ（ＰＪ−Ｓ２１以外の抗ＨＩＶ−１阻害剤も含む錠剤、すなわち、Ｃａｒｂｏｐｏｌ９７４Ｐ［Neurath, A.R., Strick, N., Li, Y-Y著「アニオン性ポリマーの抗ＨＩＶ−１活性：候補殺菌剤の比較研究(Anti-HIV-1 activity of anionic polymers: A comparative study of candidate microbicides)」BMC Infect. Dis., (2002), 2:27］を除いた）を図１０に要約する。元のザクロジュースの阻害活性（図１）とは違って、ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢ及びＢａＬに対するこれらの阻害活性は同程度であった。感染(infection)の阻害に十分な組成物のより高い濃度であっても、これらの製剤は殺ウイルス性でもあった。また、これらの実験は、利用される実験条件下でＰＪ−Ｓ２１が細胞毒性ではなかったことを明らかにした。この阻害／殺ウイルス活性が、精液（ＳＦ）とＰＪ−Ｓ２１との比が１：１（ｗ／ｗ）であるＳＦの存在下で維持された（データは図示せず）。
【００６４】
殺菌剤が、異なるウイルスクレード及び表現型に属する最初のウイルス分離株に対する抗ウイルス活性を有する場合に限り、成功する可能性があると考えることができる。ＰＪ−Ｓ２１がＲ５及びＸ４Ｒ５（＝二重指向性）表現型を有する試験された全てのクレードの一次ＨＩＶ−１株による感染(infection)を阻害したので、ＰＪ−Ｓ２１はこの要件を満たす（表１）。
【００６５】
ＰＪ−Ｓ２１は、“ＡＡＡＡ”候補殺菌剤、すなわち、開発からマーケティングへの移行において、許容可能、利用可能、手軽に入手可能及び促進性であるとして分類することができる。したがってＰＪ−Ｓ２１は、抗レトロウイルス剤及びおそらく幾つかの他の候補殺菌剤に関する幾つかの問題、すなわち、副作用の可能性に関する不確定性、安価で大規模な製造を確立するのに必要な資本及び時間、並びに供給の独占を回避することが期待されるだろう。
【００６６】
【表１】
2008513468.tif 000003
＊ＥＤ５０（９０）＝感染(infection)の５０％（９０％）阻害に関する有効量（複数可）
【００６７】
１ｇのＰＪ−Ｓ２１には、ザクロジュースからデンプンに吸着した阻害剤がおよそ３．２ｍｇ含まれている。
【００６８】
本明細書は、例示として記載されるが、これに限定されず、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な修正及び変更が為され得ることが理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】ザクロジュース（ＰＪ）による、ＨｅＬａ−ＣＤ４−ＬＴＲ−β−ｇａｌ細胞及びＵ３７３−ＭＡＧＩ−ＣＣＲ５Ｅ細胞のそれぞれのＨＩＶ−１感染(infection)の阻害を示すグラフである。斜線部分＝ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢ、非斜線部分＝ＨＩＶ−１  ＢａＬ。４つの異なるザクロジュース（ＰＪ１〜ＰＪ４）を試験した。感染(infection)は、β−ガラクトシダーゼを測定することによってモニタリングされた。
【図２】ザクロジュース（ＰＪ）による、組み換えｇｐ１２０  ＩＩＩＢ及びＢａＬのそれぞれとのＣＤ４の結合の阻害を示すグラフである。ザクロジュースの希釈液を３７℃で１時間、ウェルにインキュベートした。ジュースの除去、及びウェルの洗浄後、ビオチニル−ＣＤ４が添加され、ウェルとの結合がＥＬＩＳＡにより測定された。
【図３】ザクロジュース（ＰＪ）による、ｇｐ１２０配列からの合成ペプチドに対する抗体のｇｐ１２０との結合の阻害を示すグラフである。４倍希釈したザクロジュースを３７℃で１時間、ｇｐ１２０  ＩＩＩＢで被覆されたポリスチレンプレートのウェルにインキュベートした。ザクロジュースの除去後、ウェルを洗浄し、５０倍に希釈した抗ペプチド抗血清［Neurath, A.R., Strick, N., Jiang, S.著「ウイルス集合に関与するドメイン間の相互作用を研究するためのプローブとしての合成ペプチド及び抗ペプチド抗体：ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）のエンベロープ(Synthetic peptides and anti-peptide antibodies as probes to study interdomain interactions involved in virus assembly: The envelope of the human immunodeficiency virus (HIV-1))」Virol., (1992), 188:1-13］が添加された。結合したＩｇＧは、ＥＬＩＳＡにより定量化された。ザクロジュースは、対照ウェルには添加されなかった。それぞれの対照ウェルと比較した吸着の低減が、プロットされた。
【図４】Ｘ線結晶構造から得られ、抗ペプチド抗体に対応する部分のｇｐ１２０構造上の位置を示す図であり、抗ペプチド抗体のｇｐ１２０との連結は、ザクロジュース（斜線部分）及びＣＤ４及びＣＸＣＲ４／ＣＣＲ５共受容体(coreceptor)結合に関与するアミノ酸残基の存在下でそれぞれ５０％以上阻害される。この構造の非斜線部分が、ｇｐ１２０との連結がザクロジュースによって有意には阻害されていない、抗ペプチド抗体に対応している。中和抗体のＣＤ４ドメイン及び抗原結合性フラグメントをｇｐ１２０−ＣＤ４−抗体複合体の構造から取り出した［Kwong, P.D., Wyatt, R., Robinson, J., Sweet, R.W., Sodroski, J., Hendrickson, W.A.著「ＣＤ４受容体及び中和ヒト抗体を伴う複合体中のＨＩＶ  ｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質の構造(Structure of an HIV gp120 envelope glycoprotein in complex with the CD4 receptor and a neutralizing human antibody)」Nature, (1998), 393:648-659］。(タンパク質データバンク（ｐｄｂ）(http://www.rcsb.org/pdb/)から取ってきた１ｇｃ１)。ホモロジーモデリングで生成したＶ３ループを上記のようにｇｐ１２０構造に付与した［Neurath, A.R., Strick, N., Li, Y-Y, Debnath, A.K.著「一般的な医薬品賦形剤であるセルロースアセテートフタラートがＨＩＶ−１を不活性化し、ウイルスエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０上の共受容体結合部位をブロックする(Cellulose acetate phthalate, a common pharmaceutical excipient, inactivates HIV-1 and blocks the coreceptor binding site on the virus envelope glycoprotein gp120)」BMC Infect. Dis., (2001), 1:17］。この図は、Ｍｏｌｓｃｒｉｐｔ［Kraulis, P.J.著「ＭＯＬＳＣＲＩＰＴ：タンパク質構造の詳細なプロット及び概要のプロットの両方を作り出すプログラム(MOLSCRIPT: a program to produce both detailed and schematic plots of protein structures)」J. Appl. Cryst., (1991), 24:946-950)及びＲａｓｔｅｒ３Ｄ(Bacon, D.J., Anderson, W.F.著「空間充填の分子図を得るための高速アルゴリズム(A fast algorithm for rendering space-filling molecule pictures)」J. Mol. Graphics, (1988), 6:219-220; Merritt, E.A., Bacon, D.J.著「Ｒａｓｔｅｒ３Ｄ：写真のようにリアルな描写の分子グラフィクス(Raster3D, Photorealistic molecular graphics)」Methods Enzymol., (1997), 277:505-524］で作り出された。ｇｐ１２０可変ループ（Ｖ１−Ｖ５）並びにこの配列のＮ−末端及びＣ−末端の位置が表されている。
【図５】コーンスターチ上へのザクロジュース（ＰＪ）由来のｇｐ１２０−ＣＤ４結合阻害剤（複数可）の吸着を示すグラフである。コーンスターチ（ＰＵＲＩＴＹ（登録商標）２１、ＮＦグレード（Ｓ２１）、２００ｍｇ／ｍｌ）を微粒子を除去するために前濾過したザクロジュースに添加した。およそ２０℃で１時間の混合後、デンプンを沈澱させ、上澄みを吸引で除去した。リン酸緩衝生理食塩水で再懸濁した（２００ｍｇ／ｍｌ）ペレット及び上澄みを図２で記載されるように、ｇｐ１２０  ＩＩＩＢとのＣＤ４の結合の阻害に関して、連続希釈法で試験した。その後、ｇｐ１２０  ＢａＬ−ＣＤ４結合に対する再懸濁したペレットの阻害活性を確認した。対照のデンプンは、ｇｐ１２０−ＣＤ４結合を阻害しなかった。
【図６】ＣＸＣＲ４共受容体(coreceptors)を発現する細胞と結合するｇｐ１２０  ＩＩＩＢ−ＣＤ４複合体のザクロジュース（ＰＪ）及びＰＪ−Ｓ２１それぞれによる阻害を示すグラフである。ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢ  ｇｐ１２０（５μｇ）及びビオチニル−ＣＤ４（２．５μｇ）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＰＢＳ−ＢＳＡ）１００μｌに添加した。なおこのリン酸緩衝生理食塩水は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１００μｇ／ｍｌと、ザクロジュース（ＰＪ）（最終希釈３倍）又はＰＪ−Ｓ２１（６７ｍｇ）とを含む。２０℃で１時間後、それぞれの混合物を１０６個のＭＴ−２細胞に添加した。３０分後、細胞をＰＢＳ−ＢＳＡで３回洗浄して、ＰＥ−ストレプトアビジン（ビオチンに特異的な蛍光標識、０．１μｇ）を添加した。２０分後、この細胞を洗浄し、ＰＢＳ中の１％ホルムアルデヒドで固定化した。フローサイトメトリー分析をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで実施した（Becton Dickinson Immunocytometric Systems,カルフォルニア州サンノゼ）。ｇｐ１２０−ＣＤ４、ｇｐ１２０−ＣＤ４＋ＰＪ、ｇｐ１２０−ＣＤ４＋ＰＪ−Ｓ２１、及び対照細胞にさらされた細胞に関する平均の相対蛍光値は、それぞれ、１３．７、４．０、４．３、及び２．１であった。
【図７】ザクロジュース及びＰＪ−Ｓ２１それぞれによるＣｆ２Ｔｈ／ｓｙｎＣＣＲ５細胞を発現するＣＣＲ５と結合するＦＬＳＣの阻害を示すグラフである。ＦＬＳＣは、ＣＤ４のＤ１Ｄ２ドメインと結び付くｇｐ１２０  ＢａＬから成るキメラ組み換えタンパク質である。この阻害効果は、細胞に基づいたＥＬＩＳＡを使用して定量された［Zhao, Q., Alespeiti, G., Debnath, A.K.著「ＣＣＲ５とのＨＩＶ−１  ｇｐ１２０の結合をブロックする侵入阻害剤を同定するための新規のアッセイ(A novel assay to identify entry inhibitors that block binding of HIV-1 gp120 to CCR5)」Virol., 326:299-309］。ＰＪ−Ｓ２１の開始濃度は、２００ｍｇ／ｍｌだった。
【図８−Ａ】末梢血液の単核細胞（ＰＢＭＣ）と結合するビオチニル−ｇｐ  １２０  ＩＩＩＢのＰＪ−Ｓ２１による阻害を示すグラフである。ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢビオチニルｇｐ１２０（５μｇ）を段階的な量のＰＪ−Ｓ２１を含むＰＢＳ−ＢＳＡ１００μｌに添加した。２０℃で１時間後、それぞれの混合物を１０６個のＰＢＭＣに添加した。３０分後、細胞をＰＢＳ−ＢＳＡで３回洗浄して、ＰＥ−ストレプトアビジン（０．１μｇ）を添加した。続いて、上記の図６の手順を使用した。対照細胞並びにＰＪ−Ｓ２１の非存在下及び存在下（１００ｍｇ／ｍｌ）でビオチニル−ｇｐ  １２０にさらされた細胞に関する平均の相対蛍光値は、それぞれ、４．１、８１．３１、及び１２．２であった。１００ｍｇのＰＪ−Ｓ２１が、デンプン上のザクロジュースから吸収された固体およそ３２０μｇに対応する。
【図８−Ｂ】末梢血液の単核細胞（ＰＢＭＣ）と結合するビオチニル−ｇｐ  １２０  ＩＩＩＢのＰＪ−Ｓ２１による阻害を示すグラフである。ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢビオチニルｇｐ１２０（５μｇ）を段階的な量のＰＪ−Ｓ２１を含むＰＢＳ−ＢＳＡ１００μｌに添加した。２０℃で１時間後、それぞれの混合物を１０６個のＰＢＭＣに添加した。３０分後、細胞をＰＢＳ−ＢＳＡで３回洗浄して、ＰＥ−ストレプトアビジン（０．１μｇ）を添加した。続いて、上記の図６の手順を使用した。対照細胞並びにＰＪ−Ｓ２１の存在下（６．２５、及び３．１２ｍｇ／ｍｌ）でビオチニル−ｇｐ  １２０にさらされた細胞に関する平均の相対蛍光値は、それぞれ、４．１、３５．２、及び５０．０であった。
【図９】ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢ又はＢａＬ複製の阻害が、感染前(pre-infection)又は感染後(post-infrection)のＰＪ−Ｓ２１添加の時間によって変化することを示すグラフである。比較のために、ＨＩＶ−１後に、異なる間隔で細胞に添加される非核酸系の逆転写酵素阻害剤ＴＭＣ−１２０による感染(infection)の阻害を測定した（点線）。ウイルス感染(infection)をβ−ガラクトシダーゼの定量により測定した。
【図１０】ＰＪ−Ｓ２１及びこの製剤のＨＩＶ−１阻害性及び殺ウイルス活性を示すグラフである。ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢ及びＢａｌのそれぞれによる感染(infection)の阻害は、図１で記載されているように測定した。殺ウイルス活性を測定するために、それぞれのウイルスを段階的な量のＰＪ−Ｓ２１で３７℃で５分間、混合した。低速度の遠心分離のあと、ＰＥＧ８０００による沈澱及び遠心分離によりウイルスを分離させた。再懸濁したペレット及び対照の未処理のウイルスを連続して希釈し、希釈液の感染性(infectivity)を検査した。横座標上に与えられる濃度範囲は、ザクロジュースからデンプンに吸着される固体０．３１〜１，２６８μｇに対応する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−Ａ】
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【図８−Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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