(57)【要約】  抗菌性および坑炎症性を有し、口腔ムチンに結合し、ビタミンＫを産生する乳酸菌株を選択する方法。口腔炎症により引き起こされる歯肉出血および歯肉炎の処置および予防のために、株、例えばラクトバチルス・ロイテリの使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトへの外用投与（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）のための乳酸菌株を選択する方法であって、抗菌性、坑炎症性ならびに口腔ムチン接着性を有し、ビタミンＫを産生する能力を有するラクトバチルス株を選択することを含んでなる方法。
【請求項２】
ヒトの口内の歯肉出血を減少させ、歯肉炎を軽減させる方法であって、請求項１に記載の方法により選択された乳酸菌株のヒトの細胞に投与することを含んでなる方法。
【請求項３】
乳酸菌株の１０５〜１０８コロニー形成単位を、ヒトに毎日投与する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細胞を、ヒトに経口投与する請求項２に記載の方法。
【請求項５】
乳酸菌株の１０５〜１０８コロニー形成単位を、ヒトに毎日投与する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ヒトへの外用投与のために請求項１に記載の方法により選択された乳酸菌株の細胞を含有する製品。
【請求項７】
歯肉出血および歯肉炎の処置または予防のための薬剤をさらに含んでなる請求項６に記載の製品。
【請求項８】
製品が、含そう剤、チューイングガム、および口内錠よりなる群から選択される製品として製剤化される請求項７に記載の製品。
【請求項９】
乳酸菌株が、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）「プロデンチス（Ｐｒｏｄｅｎｔｉｓ）」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５２８９）、ラクトバチルス・ロイテリＦＪ３（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５２９０）およびラクトバチルス・ロイテリ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ５５７３０）よりなる群から選択される請求項６に記載の製品。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法により選択された乳酸菌株。
【請求項１１】
ヒトの口内の歯肉出血を減少させ、歯肉炎を軽減させる医薬品製造のために、抗菌性、坑炎症性ならびに口腔ムチン接着性を有し、ビタミンＫを産生する能力を有するラクトバチルス株の使用。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本発明は、２００４年６月１４日の出願日を有する同時係属米国特許仮出願第６０／５８０，２７９号からの優先権を主張し、その開示は、参照として本明細書に援用されている。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、非病原性、坑炎症性ならびに坑出血性乳酸菌株の選択と使用に関するものであり、口内炎により引き起こされる歯肉出血および歯肉炎の処置および予防のために、このような株を使用する製品および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
歯肉からの出血は、主として歯肉ラインにおける歯からのプラーク除去が不十分のためと考えられている。プラークは、細菌、粘液、および食物片よりなる、歯の露出された部分に発生する粘着物質である。それは、齲蝕の主要原因である。除去されないプラークは、歯の基部に捕捉される歯石と呼ばれる硬質沈着物へと無機化される。プラークおよび歯石は、歯肉を刺激し、炎症を起こさせる。最終的に、これは、出血を増加させ、歯周病として知られている歯肉疾患および下顎骨疾患のより進行した形態へと至る。
【０００４】
歯肉炎は、ヒトにおいて最も一般的に発生する慢性炎症の１つである。歯周病の一形態である歯肉炎は、歯肉が、その正常な外観を失い、膨潤し、軟質化し、赤色になった場合の病態である。
【０００５】
また、歯肉炎などの歯肉および歯の問題の一般的な原因としてはまた、歯周病（歯肉炎の進行形態）、コーマジン（ワーファリン）およびヘパリンなどの坑凝血剤、歯ブラシ擦過傷、不適当なフロッシング、歯または歯肉のいずれかに関連し得る感染症、ビタミンＣ欠乏、ビタミンＫ欠乏、妊娠中のホルモン変化、アスピリンなどの化学的刺激物質、白血病、義歯性触痛／刺激を招く新義歯の配置、および特発性血小板減少性紫斑病が挙げられる。歯周病は、一般に、歯肉（歯ぎん）、歯根膜、および歯槽（歯槽骨）など、歯を支持する組織を破壊する場合である。歯の誤整列、充填物の荒いエッジ、および固定不良または不潔な口腔器具（矯正装置、義歯、ブリッジ、および歯冠など）は、歯肉を刺激し、歯肉炎の危険性を増加させ得る。フェニトインおよび産児調節ピルなどの薬剤、ならびに鉛およびビスマスなどの重金属の摂取もまた、歯肉炎に関連している。
【０００６】
歯肉炎および歯周病は、炎症反応を開始させる歯嚢内の細菌の蓄積およびプラーク沈着の長期作用など、幾つかのメカニズムにより引き起こされる。コラーゲンの炎症および分解が増加し、さらに歯嚢内へと達すると、歯肉炎は歯周病に進展する。触痛および歯肉出血の直接的な結果として、患者は歯のクリーニングをするのが困難になる。急性および重症な場合、患者は、より全身的に影響を受け、発熱が生じ得る。さらに、口腔の炎症および出血の副作用は、心臓病および早期自然分娩の双方に関連することが報告されている。合併症としては、歯肉炎の再発、歯周病、歯肉または下顎骨の感染または膿瘍、塹壕口内炎が挙げられる。
【０００７】
歯肉炎は、歯周病に至る第１期であることから、処置および予防処置は、今日の歯科医にとってとりわけ一般的な課題である。今日、歯肉炎を処置するための第１の手段は、患者の口腔衛生を改善することであり、時にはクロロヘキシジンまたは抗生物質による処置が用いられる。
【０００８】
患者が、何らかの骨喪失を有するか、または歯肉が歯から後退していることを歯科医が判定する場合、標準的な処置は、集中的深部クリーニング、スケーリング・歯根プランニング（ＳＲＰ）と呼ばれる非手術法である。スケーリングは、歯肉ラインの上部および下部からプラークおよび歯石を削り落とす。歯根プランニングは、細菌が集まっている歯根上の粗いスポットを平滑化し、疾患の一因となり得る細菌の除去を助ける。この平滑で清浄な表面は、歯肉を歯に再付着させることを促進する。
【０００９】
重篤な歯肉病に対してペリオスタット（Ｐｅｒｉｏｓｔａｔ）（デオキシサイクリンヒクレート）と呼ばれる多くの比較的新規な薬物は、ＳＲＰと併用することが１９９８年にＦＤＡにより承認された。ＳＲＰは主として細菌を排除するが、経口摂取されるペリオスタットは、歯および歯肉の破壊を引き起こす酵素であるコラゲナーゼ作用を抑制する。抗生物質の処置は、外科手術および他の療法と併用するか、または単独で使用して、歯周病に関連する細菌を減少できるか、または一時的に除去できる。しかしながら、これらの抗生物質の過剰使用が、細菌のこれら薬物耐性の危険性を増大させることへの、医師、歯科医および公衆衛生士の懸念がさらに増している。歯肉が抗生物質耐性になると、薬物は、感染症と戦う能力を失う。感染歯嚢に直接適用される抗生物質のゲル、繊維またはチップがある。幾つかの場合、歯科医は、プラークおよび歯肉炎のコントロールを助けるためにクロロヘキシジンを含有する特別の抗病原菌マウスリンスを処方する。また、抗菌トリクロサンを含有する一般販売用練り歯磨きが市販されている。抗菌成分が、プラークおよび生じた歯肉炎を軽減すると主張されているが、臨床的有効性は弱い。
【００１０】
幾つかの種々の細菌種（他の中でも、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、ポルフィロモナス・ギンギバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、バクテリオイデス・フォルシタス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｉｄｅｓ  ｆｏｒｓｙｔｈｕｓ）、カンピロバクター・レクタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｒｅｃｔｕｓ）、およびセレノモナス・ノキシア（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｎｏｘｉａ））は、歯周病の病因に関係していることが公知である。これらの細菌が疾患を引き起こすのかどうか、または生体膜の組成変化の日和見結果としてそれらが存在するようになり、次いでその疾患を進行性させるのかどうかは知られていない。この疾患の進行は、微生物叢の幾つかの変化、歯肉溝液および先天性宿主防御との相互作用に依存する。
【００１１】
歯周病は、産業世界において極めて広範に存在している。多くの人々が、様々な程度の歯肉炎を経験する。歯周病は通常、思春期または成人期早期のホルモン変化によって発生し、歯および歯肉の健康状態に依存して持続し、または再発し得ることが多い。年齢および性別に依って、１３才超の米国市民の４５〜７０％は、歯肉出血に罹っている。罹患率は、中でも１３〜１７才で最も高く、３５〜４４歳で最も低く、その後罹患率は、再びわずかに上昇する。歯周病の最も重症な形態になると、歯周病（３ｍｍ超の付着損失と定義された）は、３０〜３９才の人々の３０〜４０％に生じ、次に年齢が増すにつれ８０〜９０才で８５〜９０％へと直線的に増加する。この状況は、ヨーロッパおよび他の産業世界においても同様であると思われる。スウェーデンのデータでは、３百万人近い住民が、歯肉出血問題を有していることが示されている。
【００１２】
通常、歯科医は、歯肉炎の徴候が存在するかどうかの診察が求められる。歯科医は、口内および歯を調べて、軟質で膨潤した赤紫色の歯肉を探す。プラークおよび歯石の沈着は、歯の基部に見ることができる。歯肉は通常、無痛か、または軽い圧痛がある。通常、さらに試験は行わないが、歯科用ｘ線および歯科用歯肉調査（骨量の測定）を、歯周病（歯の支持構造に対する炎症の広がり）が発現しているかどうかを判定するために実施できる。炎症を起こした歯肉からのプラーク除去は、不快であると言える。一般販売用抗炎症薬剤は、厳密なクリーニングよる不快を和らげるために時には用いられる。健康な歯肉はピ
ンク色で、引き締まった外観である。患者の生活全体にわたって厳密な口内衛生を維持することが推奨され、さもないと歯肉炎は再発する。
【００１３】
歯肉炎処置の目標は、歯肉の炎症および出血を軽減することである。通常の処置は、歯科医または歯科衛生士による完全な清浄が含まれる。これは、種々の装置または器具を用いて歯から沈着物をほぐし、除去する（スケーリング）ことを含み得る。歯科医または衛生士は、ブラッシング法およびフロッシング法をしばしば実際にやってみせる。重症例に関しては、ブラッシング法およびフロッシング法に加えて、専門的な歯のクリーニングが、しばしば年に２回以上推奨され得る。抗菌マウスリンスまたは他の補助は、頻回の慎重な歯のブラッシング法およびフロッシング法に加えて推奨され得る。
【００１４】
歯周病処置に関して、主な方式は、歯肉炎処置と同様であるが、この疾患の重症性のため、さらなる方法が必要であり得る。処置目標は、炎症を軽減し、存在する場合は歯嚢を除き、根本的な原因に対処することである。歯または歯科器具の粗面などの歯科刺激物は、修理すべきである。歯を完全に清浄にすることが重要である。したがって、スケーリングが、強く推奨される。詳細に規定された家庭での口内衛生法は、さらなる破損を制限するために専門的な歯のクリーニング後に必要である。歯科医または衛生士は、ブラッシング法およびフロッシング法を実際にやってみせる。歯周病については、専門的な歯のクリーニングが、標準的な年に２回よりも多い頻度で推奨されることが多い。手術処置も必要となり得る。深部歯嚢を開いて清浄にする必要があり得る。緩んだ歯は、支持する必要があり得る。進行した歯周病には、隣接する歯に破壊は広がらないように歯の摘出（除去）が必要であり得る。
【００１５】
専門医により実施された緊急処置が比較的成功しているにもかかわらず、診断され処置された多くの患者が、次の診断指定時に同様のまたはより悪い病態に戻ることがよく知られている。丁寧なブラッシングおよびフロッシングによっても発生し得るプラークを除去するために定期的、専門的な歯のクリーニングが重要である。歯科医の多くは、少なくとも６ヵ月毎に歯を専門的に清浄にすることを推奨している。
【００１６】
一般に数種のラクトバチルスが有効な抗菌活性を有している可能性は周知であるが、宿主の炎症を軽減する能力についての乳酸菌株間の差異についても、またこのような株を選択できることも公知ではないが、これは現在可能である（国際公開第２００４０３１３６８号パンフレット）。
【００１７】
ヒトおよび他の哺乳動物の口腔は、多くの異なる種の乳酸菌を含めて、多くの異なる種の細菌を含有している。乳酸菌は、口内炎症に良い影響を及ぼす可能性があり、歯肉炎および歯肉出血の軽減に関して有益であり得るという幾つかの推測があった。例えば、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）は、天然にヒトおよび動物に宿るラクトバチルス集団の主成分である。この生物は、この１０年にわたりプロバイオティック（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ）として広範に研究されており、多数の興味深い性質を有することが判明している。本明細書に記載された発明は、該細菌を摂取する必要がないという点で、乳酸菌の一般的なプロバイオティック使用と異なっており、本発明の坑出血作用にとって、歯肉領域に近接した口腔生体膜上に乳酸菌が局所的に存在することで十分である。このロケールにおいて本発明の株を利用するために、人は、乳酸菌を有するチューインガム製品またはマウスリンス製品を使用し、十分な時間後に該製品を吐き出すだけでよい。坑出血および坑炎症作用は、数日以内に認めることができる。
【００１８】
ラクトバチルス・ロイテリを含んでなる多種多様のラクトバチルス種の株が、抗菌製剤に使用されている。ラクトバチルス・ロイテリは、動物の胃腸管の天然在来菌の１種であり、ヒトなどの健全な動物の腸管に、時には分娩チャネル（ｂｉｒｔｈ  ｃｈａｎｎｅｌ
）、母乳および口内に、日常的に見られる。これは、抗菌活性を有することが公知である。例えば、米国特許第５，４３９，６７８号明細書、米国特許第５，４５８，８７５号明細書、米国特許第５，５３４，２５３号明細書、米国特許第５，８３７，２３８号明細書、および米国特許第５，８４９，２８９号明細書を参照されたい。ラクトバチルス・ロイテリ細胞は、グリセロールの存在下、嫌気的条件下で増殖させる場合、ロイテリン（ｒｅｕｔｅｒｉｎ）（βーヒドロキシ−プロピオンアルデヒド）として公知の抗菌物質を生産する。伝統的有機酸類の他に「ロイテリサイクリン（Ｒｅｕｔｅｒｉｃｙｃｌｉｎ）」などの他の抗菌物質も報告されている（ヘルツェル  Ａ．（Ｈｏｅｌｔｚｅｌ，Ａ．）ら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ３９、２７６６−２７６８頁、２０００年）および「ＰＣＡ（ピログルタミン酸）」（ヤング  Ｚ．（Ｙａｎｇ，Ｚ．）、ヘルシンキ大学の学位論文、２０００年３月）、および「ロイテリシン（Ｒｅｕｔｅｒｉｃｉｎ）６」（トーバ  Ｔ（Ｔｏｂａ  Ｔ）ら、Ｌｅｔｔ
Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １３：２８１−６頁）。ラクトバチルス・ロイテリを含むラクトバチルスは、栄養物の局所競合および他の代謝相互作用により種々の病原性生物を阻害する能力を有することも周知である。
【００１９】
ラクトバチルス・ロイテリのムチン結合タンパク質が、単離されており、記載されている。例えば、米国特許第６，１００，３８８号明細書を参照されたい。ラクトバチルス株は、種々の細胞系および宿主粘液に接着することが報告されている（クレム  Ｐ．（Ｋｌｅｍｍ，Ｐ．）およびシェンブリ  Ｍ．Ａ．（Ｓｃｈｅｍｂｒｉ，Ｍ．Ａ．）（２０００）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｄｈｅｓｉｎｓ：ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９０、２７−３５頁）。しかしながら、経口ムチンおよび他の出所からムチンに接着するラクトバチルス株の能力間に重要な差異があることが、それほどよく知られていなかった。幾つかの株は、口腔ムチンおよび他のムチン、例えば、胃ムチンの双方への接着が良好であり、他の株は、胃ムチンへの接着だけが良好であるが、口腔ムチンに対してあまり良く接着せず、また他の株は、何れの種類のムチンに対してもあまり接着しない。したがって、最良株を見出すために、口腔ムチンを使用することは本発明の選択方法の一部である。
【００２０】
ラクトバチルス・ロイテリおよび幾つかの他の乳酸菌による有効な抗菌、抗炎症、および結合特性、ならびにビタミンＫ（メナキノン類）を分泌させる幾つかの細菌能力は公知であるが、歯肉出血を減少させ、歯肉炎を軽減する能力において乳酸菌株の間で相当な差異が存在することも、このような株が選択できることも以前には知られていなかった。また、メナキノン類の生合成が、嫌気生活において増加することも、現在一般に認識されており（ベントリー（Ｂｅｎｔｌｅｙ）ら、微生物学的レビュー、１９８２年９月、２４１−２８０頁）、これは、出血の減少に役立つビタミンＫを産生する能力をもつ選択株が、最高に必要とされる歯肉に最も近い領域に増加することを意味している。
【００２１】
ビタミンＫは、３種の関連物質、すなわち、Ｋ１−フィトナジオン−植物由来、Ｋ２−メナキオン−細菌由来、Ｋ３−メナジオン−合成の一群である。ビタミンＫは、正常な血液凝固に必要である。ビタミンＫは、血液凝固に関与するプロトロンビンおよび他のタンパク質（因子ＩＸ、ＶＩＩ、およびＸ）の合成に必要である。
【００２２】
抗生物質を摂取する人々に数例の多量出血が、報告されている（ヒュールゴル  ＶＲ（Ｈｕｉｌｇｏｌ  ＶＲ）ら、Ａｍ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  １９９７年；９２：７０６−７頁）。この副作用は、細菌によるビタミンＫ活性の減少および／またはビタミンＫ産生の減少の結果であり得る。一研究では、広域スペクトルの抗生物質を摂取した人々は、ビタミンＫ２（メナキノン）の肝濃度がより低かったが、ビタミンＫ１（フィロキノン）濃度は正常のままであることが示された。数種の抗生物質は、ビタミンＫ活性に対して強力な作用を及ぼすと思われるが、他の抗生物質は、いずれも作用を有さないと思
われる。さらに、大抵の総合ビタミン剤はビタミンＫを含有していない。
【００２３】
抗菌、抗炎症、口腔ムチン（歯の生体膜）の接着性およびビタミンＫ（メナキノン類）を産生する能力に関して本発明により特に選択されたラクトバチルス株は、歯肉出血の減少および歯肉炎の軽減により良好であることが予想外に見出されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
したがって、ポルフィロモナス・ギンギバリスにより、ビタミンＫの良好な分泌と組合せて口腔ムチンに接着する良好な能力、またそれによって歯肉出血および歯肉炎の予防、軽減または処置が成功するように、抗菌活性、抗炎症活性により口内の歯肉出血を減少させ、歯肉炎を軽減する能力に関して選択的された乳酸菌のより良好な株を提供することが本発明の目的である。ヒトへの投与のために該株を含有する製品を提供することが本発明のさらなる目的である。このような製品は、皮膚および身体の他の局所表面の炎症および出血を減少させるためにも用いることができるであろう。
【００２５】
また、ポルフィロモナス・ギンギバリス、また歯肉出血を減少させるビタミンＫの良好な産生株のような株など、口内炎症を軽減する能力に関して選択された乳酸菌株を提供することが本発明の目的である。ヒトへの投与のために、歯肉出血および歯肉炎の処置または予防用の薬剤など、該株を含有する製品を提供することが本発明のさらなる目的である。
【００２６】
他の目的および利点は、以下の開示および添付された特許請求の範囲からより十分に明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本明細書の発明は、非病原性、抗炎症かつ坑出血性乳酸菌株の使用、ならびに口内炎症により引き起こされた歯肉出血および歯肉炎の処置または予防のためにこのような株を用いる製品と方法に関する。
【００２８】
本発明の他の目的および特徴は、以下の開示および添付された特許請求の範囲からより十分に明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本明細書の発明は、非病原性、坑炎症性および坑出血性乳酸菌株の使用、ならびに口内炎症により引き起こされた歯肉出血および歯肉炎の処置と予防に関してこのような株を用いる製品および使用に関する。
【００３０】
本発明は、特にラクトバチルス・ロイテリ「プロデンチス」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５２８９）およびラクトバチルス・ロイテリＦＪ３（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５２９０）などのラクトバチルス・ロイテリから選択される、このような製品中の選択株を利用して歯肉出血を減少させ、歯肉炎を軽減するための製品を提供する。これらの株は、２００３年７月２９日に寄託され、さらに１９９５年１２月１８日に寄託されたラクトバチルス・ロイテリ（ＡＴＣＣ  ５５７３０）をアメリカンタイプ・カルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）（メリーランド州ロックビレ）から公に入手できる。ラクトバチルス・ロイテリ「プロデンチス」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５２８９）、ラクトバチルス・ロイテリＦＪ３（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５２９０）およびラクトバチルス・ロイテリ（ＡＴＣＣ  ５５７３０）の寄託は、ブダペスト条約の要件に合致する。
【００３１】
本明細書に用いられる選択方法において、歯周病の病因に関係がある細菌種（他の中でも、とりわけアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス、ポルフィロモナス・ギンギバリス、バクテリオイデス・フォルシタス、カンピロバクター・レクタス、およびセレノモナス・ノキシア）の阻害効果を、細菌細胞を用いて伝統的微生物学的方法により調べる。接着能力は、マイクロタイターウェル内にコーティングされた口腔ムチンを用いて測定する（ジョンソン（Ｊｏｎｓｓｏｎ）ら２００１年ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ｌｅｔｔ．２０４：１９−２２頁を参照）。
【００３２】
ビタミンＫを産生する乳酸菌の選択は、ＭＲＳ培地中で嫌気的に増殖させた試験菌のＨＰＬＣ分析（コンリー  ＪＭ（Ｃｏｎｌｙ  ＪＭ）、スタイン  Ｋ．（Ｓｔｅｉｎ  Ｋ．）、Ａｍ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１９９２年３月；８７（３）：３１１頁−ビタミンＫの定量的および定性的測定（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｋ  ｖｉｔａｍｉｎｓ）を参照）などの標準的方法、または試験菌の遺伝子プローブ分析により行われる。当業者により公知のとおり、株の増殖およびビタミンＫに関する分析は全て、該物質が光酸化に鋭敏であるので黄色光下で行う必要がある。
【００３３】
本発明の製品は、歯肉出血および歯肉炎に関する局所予防または処置として口内配置用の任意の製品、また、含そう剤または他の特定の健康製品、チューインガム、口内錠などの製品であり得る。
【００３４】
選択されたラクトバチルス細胞の本発明の製品の有効性に必要とされる濃度は、用いられる製剤のタイプ（または口内での使用時間）に依存するが、通常、製品の毎日の口腔内配置当り約１０５〜１０８ＣＦＵ（コロニー形成単位）等量以上を有することが好ましい。約１０１０〜１０１１ＣＦＵまでの量が可能であり、製品の感覚受容特性（風味または臭い）に悪影響を及ぼすことなく有効性を増加させるために使用できる。
【００３５】
本発明の製品は、他の抗菌成分、少なくとも選択された乳酸菌株を阻害するか、または死滅させるか、もしくは抗炎症活性または坑出血活性を妨害する抗菌成分を含有しない。
【００３６】
しかしながら、本発明の製品は、歯肉炎に対して活性であり、本発明によるラクトバチルスを妨害しない任意の他の成分を含んでなり得る。該製品はまた、当業界に公知の賦形剤および添加物を含んでなり得る。本明細書に用いられる表現の「含んでなる」は、記述された項目に限定されずに含んでなると解すべきである。
【００３７】
そのタイプの製品製剤に関して当業界に公知の手段により乳酸菌株は、成分に混合されるか、混練されるか、または製品にコーティングされる添加物であり得る。細胞を用いる場合、また本発明の選択された食品または他の製品の調製が加熱ステップを必要とする場合、乳酸菌株は、加熱後に添加すべきである。選択された乳酸菌細胞を製品に入れたら、製品を６０〜７０℃超で長時間加熱することは好ましくない。
【００３８】
本発明の特徴は、以下の例を参照してより明確に理解されるであろうが、本発明を限定するものとして解釈すべきではない。
【実施例】
【００３９】
実施例１  株の選択方法
本発明により用いられる乳酸菌株の選択は、以下の４つのステップ様式で実施することができる。
【００４０】
ａ）乳酸菌株細胞によるポルフィロモナス・ギンギバリスの阻害効果の評価
阻害効果を測定するために使用する株の一例は、ポルフィロモナス・ギンギバリス、ＡＴＣＣ３３２７７（米国ヴァージニア州マナサス所在、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手できる）である。この単離体を、０．５％酵母抽出液（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）、米国デトロイト）（ＴＳＢＹ）を添加したトリプチカーゼダイズブロス（ディフコ）中で増殖させる。細胞を、指数増殖期中に１０００ｘｇでの遠心分離により採取し、ＰＢＳで２回洗浄し、同じ緩衝液中に再懸濁する。細菌凝集物を分散させるために、細胞懸濁液を低強度音波装置に供す。
【００４１】
試験乳酸菌株を、ＭＲＳブロス（ディフコ）中で増殖させ、１０００ｘｇでの遠心分離により指数増殖期中に採取し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ６．８）で２回洗浄し、同じ緩衝液中に再懸濁する。
【００４２】
細菌懸濁液の光学密度を、１ｃｍの光路を備えた１．０ｍｌのキュベット中で測定し、この懸濁液を、１．０×１０８ＣＦＵ（コロニー形成単位）／ｍｌの最終濃度に調整する。
【００４３】
阻害アッセイを以下のとおり実施する。すなわち、ポルフィロモナス・ギンギバリスの懸濁液および乳酸菌の懸濁液を、滅菌遠心分離管（１００μＬの全容量）中１００−０、７５−２５、５０−５０および２５−７５の比率で混合し、１０ｍｌまでのＢＨＩブロスを加え、１０秒間渦巻き混合し、静かに振とうしながら３７℃で９０分間インキュベートする。対照としてポルフィロモナス・ギンギバリスの懸濁液を、対照管（乳酸菌のない）中、等しい量のＰＢＳと混合する。その後、各懸濁液を１０００ｘｇでの遠心分離により洗浄し、ＰＢＳで２回洗浄し、ポルフィロモナス・ギンギバリスのＣＦＵカウントを測定するためにＭＳ寒天上に置く。ポルフィロモナス・ギンギバリスの生存％を、以下の式から得る。
【数１】
2008502714.tif 000002
【００４４】
本アッセイは、サンプルを最少、三重の反復試験により実施すべきである。得られた数値データは全て、統計解析すべきである。
【００４５】
上記の方法を用いる本実施例において、ラクトバチルス・ロイテリ「プロデンチス（Ｐｒｏｄｅｎｔｉｓ）」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５２８９）、ラクトバチルス・ロイテリＦＪ３（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５２９０）およびラクトバチルス・ロイテリ（ＡＴＣＣ  ５５７３０）が選択される。
【００４６】
ｂ）口内ムチン／口内バイオフィルムに対する乳酸菌株の接着能力の評価
試験する乳酸菌株を採取する。該菌は、ＭＲＳブロス（ディフコ）中、３７℃で１６時間増殖させる。プレートを、ＣＯ２＋Ｎ２雰囲気下の嫌気的ジャー（ガスパックシステム（ＧａｓＰａｋ  Ｓｙｓｔｅｍ）、ＢＢＬ、ベクトン・ディッキンソン・マイクロバイオロジーシステムズ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、米国メリーランド州コッキースビレ）中にインキュベートする。
【００４７】
ヒト唾液としての口腔粘液を採取し、遠心分離し、滅菌ろ過し、記載されているようにマイクロタイターウェルに塗布する。該粘液を、０．０５％ツイーン２０（ＰＢＳＴ）を添加した２００ｍｌの氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｄＨ２Ｏの１０００ｍｌ当りの８．０ｇ  ＮａＣｌ、０．２ｇ  ＫＣｌ、１．４４ｇのＮａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏおよび０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４）に採取する。生じた懸濁液を、細胞および粒状物質を除去するために先ず１１０００ｇで１０分間、次に２６０００ｇで１５分間遠心分離する。代わりのムチンとしては、胃ムチン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ｍ１７７８）が使用される。粗製の粘液調製物を２０℃で保存する。該粘液物質の約１００μｇを、５０ｍＭのＮａ２ＣＯ３緩衝液、ｐＨ９．７の１ｍｌに希釈し、ゆっくりと回転させながら４℃でマイクロタイターウェル（グレイナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ））（１ウェル当り１５０μｌ）内で一晩インキュベートする。ウェルを１％ツイーン２０を有するＰＢＳで１時間ブロックし、その後ＰＢＳＴで洗浄する。ＢＳＡで塗布されたウェルを対照として用いる。
【００４８】
試験する株を上記に従って増殖させ、０．０５％ツイーン２０（ＰＢＳＴ）を添加したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．３）により１回洗浄し、同一の緩衝液中でＯＤ６０００．５に希釈する。１００マイクロリットルの細菌懸濁液を、各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートする。このウェルをＰＢＳＴにより４回洗浄し、倒立顕微鏡により結合を調べる。緩衝液を注ぎ出し、ウェルを乾燥した後、バイオラッド・ゲルドック（ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｌ  Ｄｏｃ）２０００装置（バイオラッドラボラトリーズ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、米国カリフォルニア州ヘルクレス）内でウェルの全面にわたり結合を測定する。全ての測定は、三重反復試験で行われる。
【００４９】
上記の方法を用いる本実施例において、ラクトバチルス・ロイテリ「プロデンチス（Ｐｒｏｄｅｎｔｉｓ）」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５２８９）が最初に選択され、ラクトバチルス・ロイテリＦＪ３（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５２９０）およびラクトバチルス・ロイテリ（ＡＴＣＣ  ５５７３０）を第２の代替物として選択される。
【００５０】
ｃ）乳酸菌株の坑炎症性能力の評価
試験乳酸菌を、それぞれデ・マン・ロゴーサ・シャーペ（ｄｅ  Ｍａｎ，Ｒｏｇｏｓａ，Ｓｈａｒｐｅ）（ＭＲＳ）媒体およびルリア・ベルタニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）媒体（ディフコ、メリーランド州スパークス）中で増殖させる。乳酸菌の一晩培養物を、１．０のＯＤ６００（凡そ１０９個の細胞／ｍｌを表す）に希釈し、さらに１：１０に希釈し、さらに４時間、８時間および２４時間増殖させる。ポルフィロモナス・ギンギバリス、ＡＴＣＣ３３２７７を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）ブロス（ディフコ）中で４８時間培養する。培養物を１：１０に希釈し、さらに２４時間および４８時間増殖させる。無細菌細胞の馴化培地を、４℃の８５００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により採取する。馴化培地を、細胞ペレットから分離してから、０．２２μｍポアフィルタユニット（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、米国マサチューセッツ州ベドフォード）を通してろ過する。
【００５１】
マウス単球／マクロファージ細胞系、ＲＡＷ  ２６４．７（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−７１）およびＲＡＷ  ２６４．７ガンマＮＯ（−）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２２７８）は、炎症応答経路を研究するためのレポーター細胞として用いられる。ＲＡＷ  ２６４．７細胞は、８０〜９０％集密まで、３７℃の５％ＣＯ２で１０％ＦＢＳおよび２％抗生物質（５０００単位／ｍｌペニシリンおよび５ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、シグマを添加したダルベッコー修飾イーグル培地（野生型）またはＲＰＭＩ培地１６４０（ガンマＮＯ−）（ギブコ・インビトロゲン（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールスバッド）中で増殖させる。凡そ５×１０４細胞を、９６ウェル細胞培養クラスターに接種し、リポ多糖（ＬＰＳ）活性化および馴化培地の添加前に２時間接着させる。未処置ＲＡＷ  ２６４．７細胞を、大腸菌血清型Ｏ１２７：Ｂ８（シグマ）由来の精製ＬＰＳに曝
露させる。活性化培地は、２ｎｇ  ＬＰＳを１ウェル当り２０μｌの馴化培地を添加することにより作製する。マクロファージは、無細胞乳酸菌馴化培地とプレインキュベートまたはコインキュベート（ｃｏ−ｉｎｃｕｂａｔｅ）する。組換えｍＩＬ−１０（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネソタ州ミネアポリス）を陽性対照として使用する。細胞生存度を、トリパンブルー（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））排除により評価する。細胞培養上澄液中ＴＮＦ−αの存在を、サンドイッチ酵素免疫アッセイであるクアンチカイン・エム（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｍ）（登録商標）マウスＴＮＦ−α免疫アッセイ（Ｒ＆Ｄシステムズ）により測定する。
【００５２】
上記の方法を用い、ラクトバチルス・ロイテリ「プロデンチス」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５２８９）、ラクトバチルス・ロイテリＦＪ３（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５２９０）が選択される。
【００５３】
ｄ）乳酸菌株のビタミンＫ分泌能力の評価
ビタミンＫ産生乳酸菌の選択は、ＭＲＳ媒体中嫌気的に増殖させた試験細菌のＨＰＬＣ分析（コンリー  ＪＭ（Ｃｏｎｌｙ  ＪＭ）、スタイン  Ｋ．（Ｓｔｅｉｎ  Ｋ．）、Ａｍ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１９９２年３月；８７（３）：３１１頁−ビタミンＫの定量的および定性的測定（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｋ  ｖｉｔａｍｉｎｓ）を参照）などの標準法により、または試験細菌を遺伝子プローブ分析により行われる。当業者により公知のように、株の増殖およびビタミンＫに関する分析は全て、該物質が光酸化に感受性であるため、黄色光下で行う必要がある。
【００５４】
上記アッセイにより乳酸菌細胞を用いるポルフィロモナス・ギンギバリスの阻害における最良の結果ならびに口腔ムチンへの接着、坑炎症性効果およびビタミンＫ分泌における最良の結果の双方を示す乳酸菌株が選択される。
【００５５】
実施例２  選択株を含有するチューインガム製品の製造
本実施例において、実施例１で先に記述された選択において一般的に良好な増殖特性および好ましい結果に基づいてラクトバチルス・ロイテリＦＪ１「プロデンチス」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５２８９）が、該株をチューインガムに添加させるために選択される。ラクトバチルス・ロイテリのプロテクチス（ｐｒｏｔｅｃｔｉｓ）株を、産業界においてラクトバチルスを増殖させる標準法を用いて増殖させ、凍結乾燥する。
【００５６】
選択株を含有する以下の例の製造工程のステップ、賦形剤、充填剤、香料、カプセル化剤、潤滑剤、凝結防止剤、甘味剤および当業界に公知であるチューインガム製品の他の成分を、製品の有効性に影響を及ぼすことなく使用できることは理解されている。すなわち、
１  融解。ソフチサン（Ｓｏｆｔｉｓａｎ）１５４（サソール  ＧＭＢＨ（ＳＡＳＯＬ  ＧＭＢＨ）、ドイツ国Ｂａｄ  Ｈｏｍｂｕｒｇ）を容器に溶解し、７０℃に加熱して結晶構造の完全破壊を確実にする。次いで５２〜５５℃（その固化点のすぐ上）に冷却する。２  顆粒化。ラクトバチルス・ロイテリの凍結乾燥粉末を、ディオスナ（Ｄｉｏｓｎａ）高せん断ミキサー／造粒機、または等価の機器に移す。融解したソフチサン１５４を、ラクトバチルス・ロイテリ粉末に凡そ１分間でゆっくりと加える。さらに集結させる時間は必要としない。添加時にチョッパを使用する。
３  湿性篩い分け。顆粒化直後、トルネードミルを用いて顆粒を１−ｍｍの篩い分けネットに通過させる。篩い分けられた顆粒を、ＰＶＣコーティングアルミニウムフォイル製のアルポーチに包装し、乾燥ポーチと共にポーチを形成するためにヒートシーラにより密封し、混合まで冷凍保存する。顆粒化バッチを２つの錠剤用バッチに分ける。
４  混合。ミキサー中の全成分を均一混合物へと混合する。
５  圧縮。最終混合物を、回転式錠剤プレスのホッパに移し、キリアン（Ｋｉｌｌｉａｎ）コンプレッサ中、全重量が７６５ｍｇの錠剤に圧縮する。
６  バルク包装。モレキュラーシーブの乾燥ポーチと共にアルバッグ中に該チューインガムを包装する。アルポーチをプラスチック製バケツに入れ、最終包装の前に少なくとも１週間冷所で保存する。
【００５７】
産業界に標準的な工程間管理は、以下の表１に示される。
【００５８】
【表１】
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【００５９】
本明細書の実施例において、次に選択されたラクトバチルス・ロイテリ培養物を、１０７ＣＦＵ／グラムの製品濃度で上記のとおり添加し、該チューインガムは、歯肉出血を減少させ、歯肉炎を軽減する方法としてヒトによって用いられる。
【００６０】
上述のとおり、本発明の製品は、チューインガム以外の、例えば、口内錠および他の製剤としての形態であってもよく、選択されたラクトバチルス・ロイテリ培養物を含んでなる本発明の製品を調製するために、当業界に公知である基礎製品を調製する標準法を使用することは有益である。
【００６１】
ある一定の代表的な実施態様を本明細書に記載したが、当業者は、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、変更が成され得ることを容易に認識するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】歯肉出血／歯肉炎に対する目視による改善効果について乳酸菌の効果を示す棒グラフである。Ｌ．ｒ．プロデンチス対プラセボ：ｐ＜０．００５、Ｌ．ｒ．プロデンチス対Ｌ．ｒ．ＡＴＣＣ５５７３０：ｐ＜０．０５、Ｌ．ｒ．ＡＴＣＣ５５７３０対プラセボ：ｎ．ｓ．（フィッシャーの精度）。
【図１】
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【国際調査報告】
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