(57)【要約】  本発明は、リソソームマーカーをコードする遺伝子の発現レベルを測定することにある、アルツハイマー病の診断および／または予後診断方法に関する。
2008544242.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＤの診断および／または予後診断方法であって、
生体試料中のリソソームマーカーをコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程と、
前記発現レベルを参照値と比較する工程と、
を含み、前記レベルの変化がＡＤを示すことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載のＡＤの診断および／または予後診断方法であって、リソソームマーカーをコードする遺伝子がＬａｍｐ−１であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載のＡＤの診断および／または予後診断方法であって、リソソームマーカーをコードする遺伝子がＬａｍｐ−２であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のＡＤの診断および／または予後診断方法であって、前記生体試料が組織であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のＡＤの診断および／または予後診断方法であって、前記生体試料が体液であることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載のＡＤの診断および／または予後診断方法であって、前記体液が、脳脊髄液を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のＡＤの診断および／または予後診断方法であって、リソソームマーカーをコードする遺伝子の発現レベルの測定が、前記遺伝子またはそのフラグメントでコードされるｍＲＮＡの量を測定することによって実施されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７に記載のＡＤの診断および／または予後診断方法であって、ｍＲＮＡの量の測定が、ＲＴ−ＰＣＲ増幅によって実施されることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項７に記載のＡＤの診断および／または予後診断方法であって、ｍＲＮＡの量の測定が、ＤＮＡバイオチップによって実施されることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のＡＤの診断および／または予後診断方法であって、リソソームマーカーをコードする遺伝子の発現レベルの測定が、前記遺伝子および／またはそのフラグメントでコードされるタンパク質の量を測定することによって実施されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載のＡＤの診断および／または予後診断方法であって、タンパク質の量の測定が、ウェスタンブロット法によって実施されることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載のＡＤの診断および／または予後診断方法であって、タンパク質の量の測定が、プロテインチップによって実施されることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載のＡＤの診断および／または予後診断方法であって、タンパク質の量の測定が、免疫組織化学法によって実施されることを特徴とする方法。
【請求項１４】
リソソームマーカーをコードする遺伝子の発現レベルを請求項１から請求項１３のいずれか１項に従って測定するのに必要な試薬を含むことを特徴とする、ＡＤの診断および／または予後診断のためのキット。
【請求項１５】
請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のＡＤの診断および／または予後診断方法であって、リソソームマーカーをコードする遺伝子の発現レベルの測定が、前記遺伝子でコードされるｍＲＮＡまたはタンパク質に特異的に結合する指示物質によって実施されることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載のＡＤの診断および／または予後診断方法であって、リソソームマーカー遺伝子の発現レベルが、画像によって測定されることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１５から請求項１６のいずれか１項に記載のＡＤの診断および／または予後診断のためのキットであって、前記遺伝子でコードされるＲＮＡまたはタンパク質に特異的に結合するレポーター物質、および生理学上許容される担体液を含有する組成物を含み、前記レポーター物質が、検出方法によって検出できる標識で標識されることを特徴とするキット。
【請求項１８】
ＡＤの診断のための遺伝子マーカーとしてのＬａｍｐ−１およびＬａｍｐ−２から選択される、リソソームマーカーをコードする少なくとも１種の遺伝子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の適用分野は、健康領域、主として神経変性疾患に関連した領域内にあり、具体的にはアルツハイマー病の診断方法を目的とする。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、痴呆の主な原因であると考えられ、痴呆は先進国における第４番目の死因である（１）。アルツハイマー病は、中枢神経系の神経変性罹病として定義され、高次脳機能の進行性劣化で特徴付けられる。
【０００３】
ＡＤは、数あるその他の病理の中でも、老人斑（びまん性および古典型）、神経原線維変化、神経網糸屑、神経細胞変性、βＡ−アミロイドタンパク質沈着、顆粒球空胞変性および平野小体（Ｈｉｒａｎｏ  ｂｏｄｉｅｓ）の存在によって顕微鏡学的に特徴付けられる（２）。
【０００４】
米国精神医学会の「診断と統計マニュアル」の第４版（ＤＳＭ−ＩＶ）（３）によって、または神経、コミュニケーション障害および脳卒中学会−アルツハイマー病および関連疾患協会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ，Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｏｋｅ−Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ
Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ）（４）によって明確に確立された臨床的判断基準を使用してＡＤを診断する。しかし、これらの臨床的研究の最も大きなジレンマは診断の確実性である。現在、臨床的診断を確認する唯一の方法は、脳組織の剖検分析を実施して神経原線維変化およびプラークの存在を見出すことである。
【０００５】
最近、種々の遺伝子マーカーが、ＡＤの診断でのそれらの応用について研究されてきた。例えば、
−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子、プレセニリン−１（ＰＳ１）遺伝子、およびプレセニリン−２（ＰＳ２）遺伝子の突然変異の測定、これは、早発性または家族性発症を呈する少数のＡＤ症例に対してのみ有効（５）。
−ＡｐｏＥ遺伝子型の遺伝値、これは、ｐｒｏｂａｂｌｅ  ＡＤの臨床的判断基準を満たすＡＤ症例でのみ測定され、はなはだしい数の疑陽性を与えることが問題である。
【０００６】
これらの遺伝子マーカーに加えて、生化学マーカーが存在する。例えば、
−タウタンパク質：このタンパク質は、脳脊髄液中のタウを検出できる神経抗体を使用して測定されるが、ＡＤにおけるタウ濃度は、年齢、性、疾患の進行、または痴呆の程度に関連性がなく、加えて、髄膜炎、髄膜浸潤、前頭性痴呆およびクロイツフェルトヤコブ病などのその他の病理で高いタウ濃度を検出する。
−βＡ−アミロイドタンパク質：このタンパク質は、散発型ＡＤにおける診断上の有用性に欠ける（６）。
【０００７】
【非特許文献１】Ｐａｐｐｏｌｌａ  ＭＡ．Ｌａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｏｌｏｇｉａ  ｙ  ｌａ  Ｂｉｏｌｏｇｉａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅ  ｌａ  Ｅｎｆｅｒｍｅｄａｄ  ｄｅ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ．ｐｐ．５４３−５５３．Ｉｎ：Ｎｅｕｒｏｐａｔｏｌｏｇｉａ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｏ  ｙ  Ｃｌｉｎｉｃａ．Ｃｒｕｚ−Ｓａｎｃｈｅｚ  ＦＦ．Ｅｄ．Ｅｄｉｍｓａ．２０００．
【非特許文献２】Ｃｒｕｚ−Ｓａｎｃｈｅｚ  ＦＦ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ｂｒａｉｎ  ｂａｎｋｉｎｇ．  Ｅｄ．ＩＯＳ  Ｐｒｅｓｓ．１９９５．
【非特許文献３】Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｒｏｍ  ＤＳＭ−ＩＶ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ：ＡＰＡ；１９９４
【非特許文献４】Ｍｃ  Ｋｈａｎｎ  Ｇ，Ｄｒａｃｈｍａｎ  Ｄ，Ｆｏｌｓｔｅｉｎ  Ｍ，Ｋａｔｚｍａｎ  Ｒ，  Ｐｒｉｃｅ  Ｄ，  Ｓｔａｄｌａｎ  ＥＭ．“Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ：ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＩＮＣＤ  ＡＤＲＤＡ  ｗｏｒｋ  ｇｒｏｕｐ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ａｕｓｐｉｃｅｓ  ｏｆ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ＴａｓｋＦｏｒｃｅ  ｏｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １９８４；３４：９３９−４４．
【非特許文献５】Ｇｉｌ  Ｎｅｃｉｊａ  Ｅｕｌｏｇｉｏ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｏ  ｂｉｏｌｏｇｉｃｏ．Ｃｕａｒｔｏ  ｃｕｒｓｏ  ｎａｃｉｏｎａｌ  ｄｅ  Ｅｎｆｅｒｍｅｄａｄ  ｄｅ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ．Ｓｅｖｉｌｌａ，２３−２４  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９９．Ｅｄ．Ａｎｄｒｏｍｉｃｏ．
【非特許文献６】Ｇｕｉｅｒａ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．“Ａｃｔｕａｌｉｚａｃｉｏｎ  ｓｏｂｒｅ  ｌａ  ｐａｔｏｌｉｇｉａ  ｄｅ  ｌａ  ｅｎｆｅｒｍｅｄａｄ  ｄｅ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ”．Ｒｅｖ  Ｅｓｐ  Ｐａｔｏ］２００２；Ｖｏｌ  ３５，ｎｏ．１：２１−４８．
【非特許文献７】Ｈ．Ｂｒａａｋ  ａｎｄ  Ｅ．  Ｂｒａａｋ，Ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．Ｉｎ：Ａ．Ｐｅｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｈ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，（ｅｄｓ．），“Ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｃｏｒｔｅｘ，ｖｏｌ．１４，Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｃｏｒｔｅｘ”，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｍｏｓｃｏｗ，１９９９，４７５−５１２
【非特許文献８】Ａ．Ｍ  Ｃａｔａｌｄｏ，Ｐ．Ａ．Ｐａｓｋｅｖｉｃｈ，Ｅ．Ｋｏｍｉｎａｍｉ  ａｒｉｄ  Ｒ．Ａ．Ｎｉｘｏｎ．“Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃｌａｓｓｅｓ  ａｒｅ  ａｂｎｏｒｍａｌｌｙ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  ｉｎ  ｂｒａｉｎｓ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ”．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８（１９９１）１０９９８−＊１１００２．
【非特許文献９】Ａ．Ｍ．Ｃａｔａｌｄｏ，Ｊ．Ｌ．Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｄ．Ｍ．Ｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ａ．Ｎｉｘｏｎ．“Ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ａｎｄ  ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ  ｉｎ  ｄｉｆｆｕｓｅ  ｐｌａｑｕｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ  ａｎｄ  ｓｔｒｉａｔｕｍ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｄｏｗｎ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ”．Ｊ．Ｎｅｕｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５５（１９９６）７０４−７１５．
【非特許文献１０】Ａ．Ｍ．Ｃａｔａｌｄｏ，Ｊ．Ｌ．Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｃ．Ｐｉｅｒｏｎｉ  ａｎｄ  Ｒ．Ａ．Ｎｉｘｏｎ．“Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｅａｒｌｙ  ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｓｐｏｒａｄｉｃ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｅｓｉｓ”．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７（１９９７）６１４２−６１５１．
【非特許文献１１】Ｉ．Ｆｅｒｒｅｒ，Ｍ．Ｂｏａｄａ，Ｍ．Ｌ．Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｍ．Ｊ．Ｒａｙ  ａｎｄ  Ｆ．Ｃｏｓｔａ−Ｊｕｓｓａ．“Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ａｍｙｌｏｉｄ−１３  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ”．Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．１４（２００４）１１−２０．
【非特許文献１２】Ｎ．Ｋ．Ｇｏｎａｔａｓ，Ｗ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｉ．Ｅｖａｎｇｅｌｉｓｔａ  Ｉ．“Ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｓｙｎａｐｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｎｉｌｅ  ｐｌａｑｕｅ：Ａｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｅｍｅｎｔｉａ”．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．２６（１９６７）２５−３９．
【非特許文献１３】Ａ．Ｋｅｎｅｓｓｅｙ，Ｐ  Ｎａｃｈａｒａｊｕ，Ｌ．Ｗ．Ｋｏ  ａｎｄ  Ｓ．Ｈ．Ｙｅｎ．“Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｕ  ｂｙ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｅｎｚｙｍｅ  ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｄ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ”．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９（１９９７）２０２６−２０３８
【非特許文献１４】Ｆ．Ｌｉｍ，Ｆ．Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｊ．Ｋ．Ｌｕｃａｓ，Ｐ．Ｇｏｍｅｚ−Ｒａｍｏｓ，Ｍ．Ａ．Ｍｏｒａｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ａｖｉｌａ．“ＦＴＤＰ−１７  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔａｕ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｐｒｏｖｏｋｅ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｔａｕ  ｆｉｌａｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｆｏｒｅｂｒａｉｎ”．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８．（２００１）７０２−７１４．
【非特許文献１５】Ｐ．Ｍ．Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｃ．Ｂ．Ｇｕｅｒｒａ，Ｙ．Ｊｉａｎｇ，Ｏ．Ｍ．Ｇｒｂｏｖｉｃ，Ｂ．Ｈ．Ｋａｏ，Ｓ．Ｄ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．Ｄｉｎａｋａｒ，Ｍ．Ｍｅｒｃｈｋｅｎ，Ａ．Ｈｉｌｌｅ−Ｒｅｈｆｅｌｄ，Ｊ．Ｒｏｈｒｅｒ，Ｐ．Ｍｅｈｔａ，Ａ．Ｍ．Ｃａｔａｌｄｏ  ａｎｄ  Ｒ．Ａ．Ｎｉｘｏｎ．“Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍａｎｎｏｓｅ  ６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ａβ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ：ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｉｎ  β−ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｅｓｉｓ”．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（２００２）５２９９−５２３０７．
【非特許文献１６】Ｊ．Ａ．Ｒ．Ｎｉｃｏｌｌ，Ｄ．Ｗｉｋｉｎｓｏｎ，Ｃ．Ｈｏｌｍｅｓ，Ｐ．Ｓｔｅａｒｔ，Ｈ．Ｍａｒｋｈａｍ  ａｎｄ  Ｒ．Ｏ．Ｗｅｌｌｅｒ．“Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｆｔｅｒ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｍｙｌｏｉｄ−β  ｐｅｐｔａｉｄｅ：ａ  ｃａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔ”．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９（２００３）４４８−４５２
【非特許文献１７】Ａ．Ｍ．Ｃａｔａｌｄｏ，Ｃ．Ｍ．Ｐｅｔｅｒｈｏｆｆ，Ｓ．Ｄ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｎ．Ｂ．Ｔｅｒｉｏ，Ｋ．Ｄｕｆｆ  ａｎｄ  Ｍ．Ｂｅａｒｄ．“Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｆａｍｉｌｉａｌ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ”．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．６３（２００４）８２１−８３０．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
アルツハイマー病に対して適切な感度、特異性および予測値を備えたほとんど侵襲性のないいかなる診断手段も、現在の所まだ存在しない。さらに、この疾患は、中でも患者が自立する能力をもたないがゆえに、莫大な社会的コストを必要とし、従って、疾患の予防、治療の改善および進行の予測を可能にする、マーカーを使用する信頼できる診断方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、リソソームマーカーをコードする遺伝子の発現レベルを測定することによって、アルツハイマー病を診断および／または予後診断する方法を提供する。リソソームマーカーは、好ましくはＬａｍｐ−１またはＬａｍｐ−２である。
【００１０】
本発明の特定の態様は、生体試料中のリソソームマーカーをコードする遺伝子の発現レベルを測定すること、および前記レベルを参照レベルと比較することによって、アルツハイマー病をインビトロで診断および／または予後診断する方法を提供し、前記レベルの変化は、アルツハイマー病および前記疾患のステージを示す。
【００１１】
本発明で「参照値」とは、前記リソソームマーカー遺伝子でコードされるｍＲＮＡまたはタンパク質の濃度に影響を及ぼすＡＤまたはその他の疾患に罹患していない健常な個体中に存在するリソソームマーカー遺伝子でコードされるｍＲＮＡおよびタンパク質の濃度を指す。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態によれば、リソソームマーカーをコードする遺伝子は、好ましくは、Ｌａｍｐ−１またはＬａｍｐ−２である。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態によれば、生体試料は組織を含み、前記組織は、好ましくは組織ホモジェネートである。組織ホモジェネートは、好ましくは、神経組織細胞または末梢神経内分泌細胞から得られる。
【００１４】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、生体試料は生体液であり、前記生体液は、好ましくは、脳脊髄液、血液または血清を含む。
【００１５】
リソソームマーカーをコードする遺伝子の発現レベルの測定は、特定の実施形態で、前記遺伝子またはそのフラグメントでコードされるｍＲＮＡの量を測定することによって実施される。リソソームマーカー遺伝子は、好ましくはＬａｍｐ−１またはＬａｍｐ−２である。
【００１６】
前記遺伝子またはそのフラグメントでコードされるｍＲＮＡの量の分析は、ＰＣＲ、ＳＤＡに特有なオリゴヌクレオチドを使用する増幅、あるいはリソソームマーカー転写のレベルを定量的に見積ることを可能にする任意のその他のｃＤＮＡ増幅によって好ましくは実施される。
【００１７】
前記遺伝子またはそのフラグメントでコードされるｍＲＮＡの量の分析は、当業者に周知の任意の機構で沈着された、あるいはホトリソグラフィーによってまたは当業者に周知の任意のその他の機構によってインサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で合成されたオリゴヌクレオチドで構成されたＤＮＡバイオチップによって好ましくは実施される。
【００１８】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、リソソームマーカー（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｍａｒｋｅｒ）をコードする遺伝子の発現レベルの測定は、前記遺伝子またはそのフラグメントでコードされるタンパク質の量を測定することによって実施される。測定されるタンパク質は、好ましくはＬａｍｐ−１またはＬａｍｐ−２である。
【００１９】
前記遺伝子またはそのフラグメントでコードされるタンパク質の量の測定は、好ましくは、ウェスタンブロット法によって実施される。
【００２０】
前記遺伝子またはそのフラグメントでコードされるタンパク質の量の測定は、また、リソソームマーカーに対する特異的抗体の抗体またはフラグメントを使用するプロテインチップによって、あるいは質量分光法またはリソソームマーカーのタンパク質濃度を定量的に見積ることを可能にする任意のその他の機構によって実施されるタンパク質プロフィールによって実施される。
【００２１】
別の好ましい実施形態において、前記遺伝子またはそのフラグメントでコードされるタンパク質の量の測定は、免疫組織化学法によって実施される。
【００２２】
本発明の別の好ましい実施形態は、画像解析によって、リソソームマーカーをコードする遺伝子の発現レベルを測定することを含む。
【００２３】
本発明のより具体的な実施形態によれば、リソソームマーカーをコードする遺伝子の発現レベルの測定は、免疫組織化学画像上での定量化による画像解析によって実施される。定量化法の例には、限定はしないが、形態計測法、濃度計測法および蛍光強度法が含まれる。
【００２４】
本発明の別の態様は、リソソームマーカーをコードする遺伝子の発現レベルの測定を実施するのに、好ましくはＬａｍｐ−１またはＬａｍｐ−２の発現レベルを測定するのに必要な試薬類を含有する、アルツハイマー病を診断および／または予後診断するためのキットから構成される。該キットによって、いままで説明してきた本発明による方法を実施することが可能になる。
【００２５】
アルツハイマー病を診断および／または予後診断するためのキットは、リソソームマーカー遺伝子でコードされるｍＲＮＡの濃度を測定するのに必要な試薬類を好ましくは含有し、かつリソソームマーカー遺伝子でコードされるｍＲＮＡの濃度を増幅によって測定するのに必要な試薬類をより好ましくは含有する。
【００２６】
アルツハイマー病を診断および／または予後診断するためのキットは、リソソームマーカー遺伝子でコードされるｍＲＮＡの濃度を測定するのに必要な試薬類を好ましくは含有する。それは、ＤＮＡバイオチップによってリソソームマーカー遺伝子でコードされるｍＲＮＡの濃度を測定するのに必要な試薬類を好ましくは含有する。
【００２７】
一方、アルツハイマー病を診断および／または予後診断するためのキットは、リソソームマーカー遺伝子でコードされるタンパク質の濃度を測定するのに必要な試薬類を含有することができる。それは、ウェスタンブロット法によってリソソームマーカー遺伝子でコードされるタンパク質の濃度を測定するのに必要な試薬類を好ましくは含有する。
【００２８】
アルツハイマー病を診断および／または予後診断するためのキットは、リソソームマーカー遺伝子でコードされるタンパク質の濃度を測定するのに必要な試薬類を好ましくは含有する。それは、プロテインチップによってリソソームマーカー遺伝子でコードされるタンパク質の濃度を測定するのに必要な試薬類を好ましくは含有する。
【００２９】
アルツハイマー病を診断および／または予後診断するためのキットは、リソソームマーカー遺伝子でコードされるタンパク質の濃度を測定するのに必要な試薬類を好ましくは含有する。それは、免疫組織化学法によってリソソームマーカー遺伝子でコードされるタンパク質の濃度を測定するのに必要な試薬類を好ましくは含有する。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態によれば、リソソームマーカーをコードする遺伝子の発現レベルの測定は、前記遺伝子でコードされるｍＲＮＡまたはタンパク質に特異的に結合するレポーティング物質によって実施される。
【００３１】
本発明で「レポーティング物質」は、抗体、モノクロナ−ル抗体、オリゴヌクレオチド、巨大分子、有機分子、あるいは一般には、リソソームマーカー遺伝子でコードされるｍＲＮＡまたはタンパク質に特異的に結合できる任意の物質を指す。前記の指示物質は、酵素、放射性同位元素、染料、蛍光化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、金属キレートでよい標識、あるいは一般には、検出方法によって検出できる最新技術で周知の任意の標識を含む。
【００３２】
本発明の特定の態様は、リソソームマーカーをコードする遺伝子の発現レベルの測定を実施するのに必要な試薬類を含み、前記遺伝子でコードされるｍＲＮＡまたはタンパク質に特異的に結合するレポーター物質および生理学的に許容される液体を含有する組成物を含み、前記の指示物質が、検出可能なマーカーで標識されている、アルツハイマー病を診断および／または予後診断するためのキットによって構成される。
【００３３】
本発明の特定の態様は、アルツハイマー病を診断および予後診断するための遺伝子マーカーとして、Ｌａｍｐ−１およびＬａｍｐ−２から選択される、リソソームマーカーをコードする少なくと別の遺伝子マーカーの使用によって示される。
【００３４】
本発明のその他の態様も、当業者にとって明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明は、疾患の早期診断、およびＡＤ患者の進行評価に対して大きな重要性を有する、簡単かつ信頼できる方法でアルツハイマー病を診断および予後診断する方法を提供する。
【００３６】
実験は、ＡＤ患者の脳試料および対照脳試料における、Ｌａｍｐ−１ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現レベルを比較して実施した。
【００３７】
脳試料は、１１体のＡＤ患者および４体の対照の剖検によって獲得した。患者または親族のインフォームドコンセントが義務付けられ、研究は倫理委員会により承認された。
【００３８】
死亡と組織処理の間の時間は２〜１０時間であった。脳の半分を厚さ１ｃｍの冠状切片に切断し、ドライアイス中、−８０℃で使用するまで凍結した。
【００３９】
形態学的検査のために、脳を１０％ホルマリン緩衝液に２または３週間浸漬して固定した。
【００４０】
神経学的研究は、前頭（８野）、一次運動、一次感覚、頭頂、上側頭、下側頭、前帯状、前島および視覚の連合および一次皮質；内嗅皮質および海馬；尾状核、被殻および外套；中央および後視床；視床下部；マイネルト核；小脳扁桃；中脳、脳橋および延髄；ならびに小脳皮質および歯状核の厚さ４μｍのワックス不含パラフィン切片で実施した。
【００４１】
切片は、ヘマトキシリン−エオシンで、グリア線維酸性タンパク質の免疫組織化学法のためのクリューバーバレラ法を用いるルクソールファーストブルーで、ミクログリア（βＡ−アミロイド、全タウ、Ｔｈｒ１８１、Ｓｅｒ２０２、Ｓｅｒ２１４、Ｓｅｒ２６２、Ｓｅｒ３９６およびＳｅｒ４２２で特異的にリン酸化されたタウ、ならびにαＢ−クリスタリン、α−シヌクレインおよびユビキノン）用のＣＤ６８およびトマトレシチンで染色した。
【００４２】
ＡＤのステージは、アミロイド沈着量により、ならびにＢｒａａｋおよびＢｒａａｋ分類に従った神経原繊維病理により確立された（７）。すなわち、
ステージＡ：基底新皮質における初期沈着
ステージＢ：新皮質関連領域に拡大した沈着
ステージＣ：全皮質における広範な沈着
Ｉ〜ＩＩ：経嗅内における神経原線維の病理段階
ＩＩＩ〜ＩＶ：大脳周辺系の病理段階
Ｖ〜ＶＩ：新皮質の病理段階。
【００４３】
６体の患者をＡＤ  Ｉ〜ＩＩＡ／Ｂとして、および５体をＡＤ  Ｖ〜ＶＩＣとして分類した。主な臨床および神経病理学的データを表１に要約する。これらの患者は、いかなる関連病理（血管性、シヌクレイン症）も呈さない。アミロイドペプチドでの免疫感作後に脳炎を呈示しているＡＤ患者の脳（１１）を比較の目的で研究に含めた。
【００４４】
対照個体の前頭皮質試料をさらに含め、これらの試料は、死後３時間に得られ、若干のものは直ちに凍結し、その他のものは４℃で３、６、および２２時間貯蔵し、後に凍結し、処理組織における変動する剖検遅延、およびＬａｍｐ−１  ｍＲＮＡの保存における遅延の影響を限定した。
【００４５】
試料を調製したら、Ｌａｍｐ−１  ｍＲＮＡ、およびタンパク質の双方の測定を実施し、生化学的、免疫組織化学的および顕微鏡的研究を実施例に記載したように実施した。対照および罹病脳の試料を並行して処理した。これらの研究の結果は、進行したＡＤステージの大脳皮質におけるＬａｍｐ−１  ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現レベルが増加していることを示している。Ｌａｍｐ−１は、さらに、神経細胞の細胞質中、および老人斑を取り囲んでいるジストロフィー性神経炎中に存在する。
【実施例】
【００４６】
以下の実施例は、本発明を説明するのに有用であるが、本発明を限定するものではない。
【００４７】
実施例１：ｍＲＮＡの単離、ならびにｃＤＮＡ合成およびＴａｑＭａｎ  ＰＣＲによる結果の確認：
全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、続いてＲＮｅａｓｙ  Ｐｒｏｔｅｃｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。凍結ヒト脳組織を、１００ｍｇの組織につき１ｍｌのＴｒｉｚｏｌ中で直接にホモジナイズした。供給業者が提案しているプロトコールを利用して全ＲＮＡを抽出した。次いで、精製した全ＲＮＡを１００μｌのＲＮアーゼ（ＲＮａｓｅ）不含水中に再懸濁し、ｍＲＮＡを、最小の修正を伴うＲＮｅａｓｙ  Ｐｒｏｔｅｃｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔのプロトコールに従って精製した。Ｔｒｉｚｏｌでの抽出中にゲノムＤＮＡが排除されるため、ＤＮアーゼ（ＤＮａｓｅ）での処理は除外した。各試料の濃度をＡ260で測定し、ＲＮＡの完全性を、ホルムアルデヒド−アガロースゲル電気泳動によって確認した。
【００４８】
次いで、ｃＤＮＡ合成およびＴａｑＭａｎ  ＰＣＲを実施した。それぞれ１００μｌの逆転写反応の場合、２．５μＭのランダムヘキサマーを含む２μｇのヒトＲＮＡ、ＲＴ  ＴａｑＭａｎ  １ｘバッファー、５．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、それぞれ５００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ、０．４Ｕ／μｌのＲＮアーゼ阻害剤および１．２５Ｕ／μｌのＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）である。反応は、鋳型ＲＮＡのプライマーへの結合を最大にするため２５℃で１０分間、続いて４８℃で３０分間実施し、次いで、逆転写酵素を失活させるために９５℃で５分間インキュベートした。ゲノムＤＮＡによる汚染度をチェックするため、各ＲＮＡ試料についてＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素の不在下で並行反応を実施した。
【００４９】
ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、ダイレクト（ｄｉｒｅｃｔ）およびリバースプライマーの間の鋳型ＤＮＡ鎖に結合する。プローブは、増幅中にＴａｑポリメラーゼによって放出されるレポーター染料を含み、従って、発生する蛍光は、蓄積した産生物の量に比例する。
【００５０】
内部対照としてβ−アクチンおよびβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を使用した。Ｌａｍｐ−１、ＧＵＳおよびβ−アクチンのためのプライマーおよび特異的蛍光プローブは、Ｔａｑ−Ｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から購入した。
【００５１】
Ｌａｍｐ−１および内部対照に関するＴａｑＭａｎ  ＰＣＲアッセイは、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）上の９６穴プレート中のｃＤＮＡ試料について３回実施した。２０μｌのＴａｑＭａｎ反応の場合、９μｌのｃＤＮＡ（１／５０に希釈、ほぼ４ｎｇのＲＮＡに相当）を、１μｌの２０ｘ  ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓおよび１０μｌの２ｘ  ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  ３０Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）と混合した。標定のため、プライマーおよびβ−アクチンおよびＧＵＳを備えたプローブを使用して各試料に対して並行研究を実施した。反応は、次のパラメーター、すなわち、５０℃で２分間、９５℃で１０分間、および９５℃で１５秒および６０℃で１分間の４０サイクルを使用して実施した。Ｌａｍｐ−１および各内部対照に関して、ヒトＲＮＡ対照試料の希釈系列を使用して標準曲線を調製した。Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＳＤＳ  バージョン１．９；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用して、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲデータを最終的に取り込んだ。
【００５２】
Ｌａｍｐ−１  ｍＲＮＡ濃度は、対照脳試料およびＡＤを用いたＴａｑＭａｎ  ＰＣＲアッセイにより確認した。ＡＢＩ  ７７００は、ベースラインより高いレベルに手動で指定される自由裁量値であるサイクル閾値（Ｃｔ）を連続的に監視することによって、制約因子のない指数期のＰＣＲにおけるＰＣＲの蛍光累積値を測定する。Ｃｔ値は、試料増幅が閾値と交差する点を明らかにする（図１Ａ）。各試料に対して、全対照ＲＮＡ（ｎｇ）の対数に対するＣｔ（Ｙ）を示すようにプロットした標準曲線から、ターゲットおよび内部対照の量を決定する。各Ｌａｍｐ−１ターゲットの量を内部対照の量で除して、対照試料および病理試料における相対的Ｌａｍｐ−１  ｍＲＮＡ濃度の決定を可能にする標準ターゲット値を得る。Ｌａｍｐ−１  ｍＲＮＡ値を標定するのに使用される内部対照の濃度は、対照と比較される病理試料で修正されず、さらに、異なる病理の間で類似している。
【００５３】
結果は、対照と比較した場合、ステージＶ〜ＶＩＣに属するＡＤにおける前頭皮質中のＬａｍｐ−１  ｍＲＮＡ濃度の相対的増加を示した：ｐ＜０．０５、ＬＳＤ検定（ｐｏｓｔ−ｈｏｃフィッシャー最小有意差法）を用いたＡＮＯＶＡ（図２Ａ）。前頭皮質中のＬａｍｐ−１  ｍＲＮＡ濃度は、対照値と比較して早期ステージのＡＤ（ステージＩ〜ＩＩＡ／Ｂ）で変わらなかった（図２Ａ）。
【００５４】
実施例２：ゲル電気泳動およびウェスタンブロッティング：
凍結した前頭皮質試料（８野、１００ｍｇ）を１ｍｌの溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＮ  ＤＤＴ、２ｍＭ  ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌアプロチニン、ロイペプチンおよびペプスタチン）中で直接にホモジネートし、超音波処理にかけた。溶解物を４℃、５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、タンパク質濃度をＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ）によって測定した。５０μｇの全タンパク質を９５℃にさらし、次いで、Ｔｒｉｓ−グリシン溶離緩衝液を用いるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中に注入した。タンパク質をＭｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅｉｎ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用する電気泳動にかけ、Ｍｉｎｉ  Ｔｒａｎｓ  Ｂｌｏｔ電気泳動転写セル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に１００Ｖ、１時間で転写した。ニトロセルロース膜を、５％のスキムミルクを含むＴｗｅｅｎ２０ＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で３０分間ブロックした。次いで、膜を、３％ＢＳＡを含むＴＢＳＴ中、一次抗体の１つと共に４℃で一夜インキュベートした。次の抗体、すなわち、１：１０００希釈のａｎｔｉ−Ｌａｍｐ−１抗体（Ｈ−２２８、ｓｃ−５５７０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、１：５０００希釈のａｎｔｉ−β−アクチン抗体（ＡＣ−７４クローン、Ｓｉｇｍａ）を使用した。一次抗体と共にインキュベートした後、膜を、室温で５分間、ＴＢＳＴで洗浄し、次いで、１：１０００（β−アクチンには１：５０００）希釈のハツカダイコンペルオキシダーゼ（Ｄａｋｏ）で標識したウサギおよびマウスのａｎｔｉ−ＩｇＧ抗体と共に、室温で１時間インキュベートした。次いで、膜を、室温で４回（各回５分）、ＴＢＳＴで洗浄し、ＥＣＬウェスタンブロッティング化学発光装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で発光させ、次いで、膜を、オートラジオグラフィーフィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）に露光した。
【００５５】
ウェスタンブロットバンドの濃度計測定量は、ＴｏｔａｌＬａｂ  ｖ２．０１ソフトウェアによって実施した。統計解析にはＳｔａｔｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｐｌｕｓ  ｖ５を使用した。
【００５６】
結果は、Ｌａｍｐ−１タンパク質濃度が、Ｌａｍｐ−１  ｍＲＮＡ濃度と同様、対照試料に比較して、ステージＶ〜ＶＩＣのＡＤの前頭皮質中で増加していることを示したが（ｐ＜０．００１、ＬＳＤ検定でのＡＮＯＶＡ）、ステージＩ〜ＩＩＡ／Ｂの早期ＡＤでの増加はなかった（図３）。
【００５７】
実施例３：免疫組織化学：
前頭皮質、海馬および嗅内皮質の５μｍ厚ワックス不含切片を、標識化ストレプトアビジン−ビオチンペルオキシダーゼ（ＬＳＡＢ）法による免疫組織化学に向けて処理した。メタノールおよびＨ2Ｏ2／ＰＢＳで、および正常血清中でインキュベートした後、切片を、１：１００希釈のａｎｔｉ−Ｌａｍｐ−１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）でインキュベートした。一次抗体でインキュベートした後、切片を室温で１５分間、ＬＡＳＢでインキュベートした。ペルオキシダーゼ反応は、ジアミノベンジジンおよびＨ2Ｏ2で調べた。免疫染色対照は、一次抗体が脱落しており、二次抗体でのインキュベーションの後にシグナルはまったく得られなかった。切片は、ヘマトキシリンでわずかに染色された。
【００５８】
小さな細胞質顆粒で特徴付けられる中程度のＬａｍｐ−１免疫反応性が、対照試料の神経細胞およびミクログリア細胞中で見出され（図４Ａ、図４Ｂ）、一方、Ｌａｍｐ−１免疫反応性の増加が、ＡＤの皮質神経細胞中に見出された（図４Ｃ）。
【００５９】
奇妙なことに、この増加は、錯綜中にＬａｍｐ−１免疫反応性が見出されなかったので、個々の神経細胞のＮＦＴ病理に関係していなかった（図４Ｄ、図４Ｅ）。Ｌａｍｐ−１免疫反応性の増加は、海馬の顆粒球空胞変性をもつ神経細胞中にも見出され（図４Ｆ）、ステージＩ〜ＩＩＢのＡＤの前頭皮質中に限定されるが（症例８）、ステージＶ／ＶＩＣのＡＤの前頭皮質中で極めて目立つ強いＬａｍｐ−１免疫反応性が、神経炎プラーク細胞中に見出された（図５）。
【００６０】
実施例４：二重標識免疫蛍光法および共焦点顕微鏡法：
前頭皮質のワックス不含切片をスーダンブラックＢ飽和溶液（Ｍｅｒｃｋ）で３０分間染色して神経細胞体中に存在するリポフスチン顆粒の自己蛍光をブロックし、７０％エタノールで洗い流し、蒸留水で洗浄した。切片を、１：１００希釈を使用するマウスポリクロナールａｎｔｉ−Ｌａｍｐ−１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、および１：５０希釈のモノクロナールβＡ−アミロイド抗体（Ｄａｋｏ）、１：５０希釈のマウスａｎｔｉＡＴ８抗体（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｇｅｎｔ）、または１：１００希釈のＣＤ６８（Ｄａｋｏ）で、一夜４℃でインキュベートした。次いで、切片を、ＰＢＳで洗浄し、二次抗体カクテルで暗中にてインキュベートし、一次抗体と同じ担体溶液中に室温で４５分間希釈した。二次抗体は、１：４００希釈のウサギＡｌｅｘａ４８８（緑色）およびマウスＡｌｅｘａ５４６（赤色）（双方とも、オレゴン州、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから）とした。ＰＢＳで洗浄した後、切片を、Ｉｍｍｕｎｏ  Ｆｌｕｏｒｅ  マウンティング培地（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、バルセロナ）に載せ、密封し、一夜乾燥した。Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＬ共焦点顕微鏡で切片を調べた。
【００６１】
ＡＴ８抗体で示されるような、Ｌａｍｐ−１発現と神経原線維変性の共存がないことは、二重標識化免疫蛍光法および共焦点顕微鏡法でも示された。強いＬａｍｐ−１免疫反応性を示す神経細胞は、免疫反応性の低いリン酸化−タウタンパク質の沈着を有し、一方、神経原繊維プラーク神経細胞は、低いＬａｍｐ−１免疫反応性を示した（図６）。
【００６２】
プラークに関係した強い免疫反応性は、Ｌａｍｐ−１およびβＡ−アミロイドで免疫染色された切片中に現われたように、アミロイドの中央領域を取り囲んでいる細胞突起に限定されていた。Ｌａｍｐ−１免疫反応性は、びまん性プラーク関連して観察されることは稀であるが、若干の免疫反応性が、βＡ−アミロイド凝縮突起で生じた（図７）。
【００６３】
βＡで免疫感作した後の脳炎を伴うＡＤにおけるＬａｍｐ−１免疫反応性：
βＡで免疫感作した後の脳炎を伴うＡＤ患者は、通常のＡＤ患者と比べ、大脳アミロイド蓄積量の低減、残存プラーク中のリン酸化−タウの低減または不在、およびミクログリアおよびβＡ−アミロイド残渣を有する多核化巨大細胞の著しい活性化を示した（１３、１９）。ウェスタンブロット法での発現レベルは、この場合、通常のＡＤと同様であった（図８Ａ）。
【００６４】
しかし、神経病理学的観察によれば、Ｌａｍｐ−１免疫反応性は、密なβＡ−アミロイドプラークを取り囲むミクログリア細胞および多核化巨大細胞中で見出された（図８Ｂ）。
【００６５】
Ｌａｍｐ−１発現試験は、二重標識免疫蛍光、ミクログリアおよび多核化巨大細胞用のマーカーとして使用されるＬａｍｐ−１およびＣＤ６８でチェックし、それらの細胞を共焦点顕微鏡で調べた（図９）。
【００６６】
考察：
データは、ＡＤ患者の大脳皮質におけるＬａｍｐ−１の増加を示し、患者のｍＲＮＡおよびタンパク質濃度は、前記疾患の進行と共に増加する。免疫組織化学法、二重標識化免疫蛍光法、および共焦点顕微鏡は、アミロイドプラークを取り囲んでいる神経炎において目立つＬａｍｐ−１の局在性を示した。リソソーム加水分解酵素は、ＡＤ脳の皮質神経細胞中の周核体および隣接樹状突起に局在し、老人斑において高濃度であった（８、９）。
【００６７】
リソソームの攪乱がＡＤ脳におけるβＡ−アミロイド沈着を促進すること（１０、１５）、およびプレセニリンの突然変異が神経細胞のリソソーム病理の加速に関連していること（１７）を示唆するいくつかの研究が存在する。Ｌａｍｐ−１免疫反応性突起（ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｐｒｏｃｅｓｓ）は、また、びまん性皮質プラーク、小脳、およびびまん性線条体プラーク中に発生するが、Ｌａｍｐ−１発現は、老人斑のジストロフィー性神経炎、次いでびまん性アミロイド沈着により関連している（９）。この意味で、ＡＤにおける樹状突起およびシナプスは、増大した数のリソソームを含むことに留意すべきである（１２）。
【００６８】
カテプシンＤは、タウタンパク質の分解にも関連しており、このことはＡＤにおける神経原線維変化の分解でのリソソームの役割を示唆している（１３）。これに関連して、タウタンパク質の三重突然変異をもつトランスジェニックマウスは、異常形態、および皮質神経細胞および海馬における過剰リン酸化タウの沈着を示す（１４）。これらのデータは、リソソームの異常が、過剰リン酸化タウの沈着を伴う神経細胞変性の理由であり得ることを示唆している。
【００６９】
顆粒球空胞変性を伴う神経細胞中に著しい免疫反応性が見出されたが、結果は、Ｌａｍｐ−１発現とＡＤにおける神経原線維変化を伴う皮質神経細胞中の過剰リン酸化タウの沈着との間の逆の関係を示している。
【００７０】
βＡで免疫感作した後の脳炎を伴うＡＤ症例に関する研究は、隠された部分を明らかにするようなデータを示している。限られた数の症例における神経病理学的研究は、アミロイド蓄積量の低減、ならびにミクログリアの活性化およびアミロイド残渣に満ちた多核化巨大細胞の存在と一緒にアミロイドプラークの低減を示している；すなわち、神経原線維変化を伴う神経細胞は影響を受けないが、過剰リン酸化タウタンパク質は、崩壊したプラーク中に観察されなかった（１１、１６）。Ｌａｍｐ−１免疫反応性は、βＡで免疫感作した後の神経細胞突起中に見出されなかったが、それは、ミクログリア細胞、およびアミロイドおよび細胞残渣を含む多核化巨大細胞中に見出された。
【００７１】
【表１】
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表１：研究の主な臨床および病理データ。Ｂｒａａｋ  ａｎｄ  Ｂｒａａｋ分類によるＡＤステージおよび対照；Ｍ：男、Ｆ：女；ＮＦＴ：神経原線維変化
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１Ａ】対照ヒト脳のＲＮＡの逐次希釈を使用するＬａｍｐ−１の増幅を示す図であって、水平線は、指数期における手動調整の閾値線を示し、蛍光強度は、ＰＣＲサイクルの増加と共に増大し、蛍光強度が閾値線を超えるＰＣＲサイクル数を、相対的数量化を基準とするＣＴ値と定義した図である。
【図１Ｂ】対照ヒト脳のいくつかのＲＮＡ濃度から作図された、β−アクチンおよびＬａｍｐ−１に対する代表的な標準曲線を示す図であって、対照試料のＲＮＡ濃度の対数（Ｘ軸）に対するＣＴ値（Ｙ軸）は逆直線の相関関係を示した図である。
【図２Ａ】対照試料（Ｃ、ｎ＝４）、ステージＩ−ＩＩＡ／Ｂ（ＢｒａａｋおよびＢｒａａｋによる）の６つのＡＤ症例（ＡＤＩ、ｎ＝６）、およびステージＶ−ＶＩＣの５つのＡＤ症例（ＡＤＶ、ｎ＝５）の前頭皮質におけるＬａｍｐ−１  ｍＲＮＡ濃度（平均値±ＳＥＭ）を示し、Ｌａｍｐ−１  ｍＲＮＡ濃度はβ−アクチンで標定した図である。
【図２Ｂ】単一試料（死後３時間）の前頭皮質中のβ−アクチンおよびＧＵＳで正規化したＬａｍｐ−１  ｍＲＮＡ濃度を示し、試料は、液体窒素中で直接凍結する（０時間）か、あるいは室温で３、６、または２２時間放置し、次いで液体窒素中で凍結したものの図であり、２２時間までｍＲＮＡの明らかな分解は起こらず、対照試料と比較して＊ｐ＜０．０５（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ＬＳＤ検定でのＡＮＯＶＡ）であることを示す図である。
【図３】前頭皮質（８野）ホモジェネート中のウェスタンプロット法によって検出されるＬａｍｐ−１（約１２５ｋＤａ）を示す図であって、タンパク質の量の対照としてβ−アクチンを使用し、画像は、表１に示したすべての試料を代表している。Ｌａｍｐ−１タンパク質濃度（平均±ＳＥＭ）の濃度計測分析は、ＴｏｔａｌＬａｂ  ｖ２．０１ソルトウェアを用いて実施し、Ｌａｍｐ−１タンパク質値は、β−アクチンで正規化し、対照試料と比較して＊＊＊ｐ＜０．００１（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ＬＳＤ検定でのＡＮＯＶＡ）；ｎ．ｓ．：対照と比較して有意差のない差異であること示す図である。
【図４】前頭皮質（Ａ〜Ｅ）および海馬状隆起（Ｆ）、対照（Ａ、Ｂ）およびＡＤ症例（ステージＶＣ）（Ｃ〜Ｆ）におけるＬａｍｐ−１免疫反応性の画像分析を示す図であって、中程度のＬａｍｐ−１免疫反応性が、ＡＤの神経細胞細胞質中に見出され、神経原線維変化は、Ｌａｍｐ−１で染色されず（Ｄ、Ｅ）、顆粒球空胞変性を伴う神経細胞は、強いＬａｍｐ−１免疫反応性を示し、ＡおよびＣ、Ｃ中の線分＝５０μｍ、Ｂ、Ｄ〜Ｆ、Ｆ中の線分＝２５μｍであることを示す図である。
【図５】神経細胞中に加え、老人斑中（Ａ〜Ｄ）のアミロイド沈着を取り囲んでいる細胞突起中に配置されていることを示す、Ｌａｍｐ−１免疫反応性の画像分析を示す図であって、線分＝５０μｍを示す図である。
【図６】ＡＤにおけるＬａｍｐ−１（緑色）およびリン酸化−タウ（ＡＴ８抗体、赤色）に対する二重標識免疫蛍光法の画像分析を示す図であって（重ね合わせＣおよびＦ、黄色）、リン酸化−タウタンパク質の沈着を伴う神経細胞のほとんどは、Ｌａｍｐ−１の低い発現を示すが、一方、強いＬａｍｐ−１免疫反応性を伴うほんの僅かの神経細胞は、リン酸化−タウの沈着を示し（Ａ、ＢおよびＤ、Ｅ）、第２抗体のみで染色された対照断片は、陰性であった（Ｇ〜Ｉ）ことを示す図である。
【図７】Ｌａｍｐ−１（緑色）およびβＡ−アミロイド（赤色）、ならびに共焦点顕微鏡法（重ね合わせ、黄色）に対する二重標識免疫蛍光法の画像分析を示す図であって、免疫反応性Ｌａｍｐ−１の沈着が、アミロイドプラークの周辺に見出され（Ａ〜Ｃ）、Ｌａｍｐ−１免疫反応性は、老人斑におけるβＡ−アミロイド凝縮を伴って現われ、免疫反応性の無いまたはほとんど無いＬａｍｐ−１プロフィールが、びまん性プラーク中に現われ（Ｄ〜Ｆ）、一方、免疫反応性Ｌａｍｐ−１突起はアミロイド核を伴うプラーク中で増加し（Ｇ〜Ｉ）、第２抗体のみで染色された対照断片は、陰性であった（Ｊ〜Ｌ）ことを示す図である。
【図８Ａ】ウェスタンプロット法で分析した、βＡペプチドでの免疫感作後の脳炎を伴うＡＤ患者における大脳皮質中のＬａｍｐ−１タンパク質濃度を示す図である。それらをステージＶ〜ＶＩ／ＣのＡＤと比較した場合、発現レベルの差異は観察されなかった。
【図８Ｂ】免疫反応性は、崩壊したアミロイド沈着を取り囲んでいるミクログリア細胞（Ａ〜Ｃ）および多核化巨大細胞（Ｄ〜Ｅ）中に主として現われことを示している、Ｌａｍｐ−１免疫反応性の画像分析を示し、結果は、βＡ−アミロイド残渣の食作用であり、ＡおよびＢ、Ｂ中の線分＝５０μｍ、Ｃ〜Ｆ、Ｆ中の線分＝２５μｍを示す図である。
【図９】βＡペプチドで免疫感作後の脳炎を伴うＡＤ患者における、Ｌａｍｐ−１（緑色）およびＣＤ６８（赤色）、ならびに共焦点顕微鏡法（重ね合わせ、黄色）に対する二重標識免疫蛍光法についての画像分析を示す図であって、Ｌａｍｐ−１免疫反応性は、ミクログリア細胞および多核化巨大細胞中に見出され（Ａ〜Ｆ）、第２抗体のみで染色された対照切片は、陰性であった（Ｇ〜Ｉ）ことを示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年11月19日(2007.11.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトのＡＤの診断および／または予後診断方法であって、
生体試料中のＬａｍｐ−１をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程と、
前記発現レベルを参照値と比較する工程と、
を含み、前記レベルの変化がヒトのＡＤを示すことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載のヒトのＡＤの診断および／または予後診断方法であって、生体試料が細胞であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載のヒトのＡＤの診断および／または予後診断方法であって、前記生体試料が体液であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載のヒトのＡＤの診断および／または予後診断方法であって、前記体液が、脳脊髄液を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載のヒトのＡＤの診断および／または予後診断方法であって、Ｌａｍｐ−１をコードする遺伝子の発現レベルの測定が、前記遺伝子またはそのフラグメントでコードされるｍＲＮＡの量を測定することによって実施されることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載のヒトのＡＤの診断および／または予後診断方法であって、ｍＲＮＡの量の測定が、ＲＴ−ＰＣＲ増幅によって実施されることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項５に記載のヒトのＡＤの診断および／または予後診断方法であって、ｍＲＮＡの量の測定が、ＤＮＡバイオチップによって実施されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１に記載のヒトのＡＤの診断および／または予後診断方法であって、Ｌａｍｐ−１をコードする遺伝子の発現レベルの測定が、前記遺伝子および／またはそのフラグメントでコードされるタンパク質Ｌａｍｐ−１の量を測定することによって実施されることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８に記載のヒトのＡＤの診断および／または予後診断方法であって、タンパク質の量の測定が、ウェスタンブロット法によって実施されることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項８に記載のヒトのＡＤの診断および／または予後診断方法であって、タンパク質の量の測定が、プロテインチップによって実施されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項８に記載のヒトのＡＤの診断および／または予後診断方法であって、タンパク質の量の測定が、免疫組織化学法によって実施されることを特徴とする方法。
【請求項１２】
Ｌａｍｐ−１をコードする遺伝子の発現レベルを請求項１から請求項１１のいずれか１項に従って測定するのに必要な試薬を含むことを特徴とする、ＡＤの診断および／または予後診断のためのキット。
【請求項１３】
請求項１に記載のヒトのＡＤの診断および／または予後診断方法であって、Ｌａｍｐ−１をコードする遺伝子の発現レベルの測定が、前記遺伝子でコードされるｍＲＮＡまたはタンパク質に特異的に結合する指示物質によって実施されることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載のヒトのＡＤの診断および／または予後診断方法であって、Ｌａｍｐ−１の発現レベルが、画像によって測定されることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１３から請求項１４のいずれか１項に記載のヒトのＡＤの診断および／または予後診断のためのキットであって、遺伝子Ｌａｍｐ−１でコードされるＲＮＡまたはタンパク質に特異的に結合するレポーター物質、および生理学上許容される担体液を含有する組成物を含み、前記レポーター物質が、検出方法によって検出できる標識で標識されることを特徴とするキット。
【請求項１６】
ヒトのＡＤの診断のための遺伝子マーカーとしてのＬａｍｐ−１をコードする少なくとも１種の遺伝子の使用。
【国際調査報告】
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