(57)【要約】ある疾患に罹患している患者についての予後を確立するために使用される１つ以上のマーカーを評価および最適化するための方法およびコンピュータープログラム製品が提供される。さらに詳細には、この方法は、組織学的スライドのような身体サンプルの画像から抽出され得る多数の特徴を体系的に評価するための工程であって、このサンプルが１つ以上のバイオマーカーに対して曝されて、１つ以上の抽出された特徴に基づいて予後的な決定規則を確立され、その結果、実際の患者転帰の予測に最適である予後がこの決定規則によって得られる工程を包含する。このように、この方法およびコンピュータープログラム製品によって、有効な患者の治療管理のためのストラテジーを臨床家が開発することを補助する最適の予測的な予後が得られた。
2008513793.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガン患者の予後を決定するために少なくとも１つのマーカーを分析するための方法であって：
該少なくとも１つのマーカーに対して身体サンプルを曝露する工程であって、該身体サンプルはガン患者から採取されている、工程と；
画像処理システムを用いて少なくとも１つのスライドから撮った画像から少なくとも１つの定量化可能な特徴を抽出する工程であって、該少なくとも１つのスライドは該身体サンプルから調製される工程と；
該少なくとも１つの定量化可能な特徴に対して決定規則を適用して、該少なくとも１つの定量化可能な特徴と該決定規則との間の関係に基づいて該ガン患者の予後を決定する工程と；
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記適用工程が、前記少なくとも１つの定量化可能な特徴に対してある閾値を適用して、該少なくとも１つの定量化可能な特徴と該閾値との間の関係に基づいて前記ガン患者の予後を決定する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記適用工程がさらに、前記閾値について見なし規則を適用する工程を包含し、該見なし規則が、該閾値に関連する少なくとも１つの定量化可能な特徴のうちのある値に対応する良好な予後または不良な予後のいずれかを確立し得る、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記抽出工程がさらに、目的領域であって、それから前記少なくとも１つの定量化可能な特徴を抽出する領域を特定する工程を包含し、該目的領域が、前記画像処理システムを用いて前記少なくとも１つのスライドから撮った画像内である、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記少なくとも１つのマーカーが：
比色定量的なバイオマーカー；
ＳＬＰＩ；
ＰＳＭＢ９；
ＮＤＲＧ−１；
Ｍｕｃ−１；
ホスホ−ｐ２７；
ｓｒｃ；
Ｅ２Ｆ１；
ｐ２１ｒａｓ；
ｐ５３；および
それらの組み合わせ、
からなる群より選択される、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記少なくとも１つの定量化可能な特徴が：
透過率；
光学密度；
細胞形態；
マーカー強度および細胞形態によって特徴付けられた細胞タイプの割合；ならびに
それらの組み合わせ、
からなる群より選択される、方法。
【請求項７】
少なくとも１つのマーカーを分析して、ガン患者の予後を決定するために画像処理システムを制御し得るコンピュータープログラム製品であって、該コンピュータープログラム製品は、コンピューター読み取り可能な記憶媒体を備え、該媒体はその中に記憶されたコンピューター読み取り可能なプログラムコード部分を有し、該コンピューター読み取り可能なプログラムコード部分は：
画像処理システムを用いて少なくとも１つのスライドから撮った画像から少なくとも１つの定量化可能な特徴を抽出するための実行可能部分であって、該少なくとも１つのスライドは、ガン患者から採取した身体サンプルから調製され、該身体サンプルは、該少なくとも１つのマーカーに曝されている、実行可能部分と；
該少なくとも１つの定量化可能な特徴に対して決定規則を適用して、該少なくとも１つの定量化可能な特徴と該決定規則との間の関係に基づいて該ガン患者の予後を決定するための実行可能部分と；
を備える、コンピュータープログラム製品。
【請求項８】
請求項７に記載のコンピュータープログラム製品であって、適用するための前記実行可能部分が、前記少なくとも１つの定量化可能な特徴に対して閾値を適用して、該少なくとも１つの定量化可能な特徴と該閾値との間の関係に基づいて前記ガン患者の予後を決定するための実行可能部分をさらに含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項９】
請求項８に記載のコンピュータープログラム製品であって、適用するための前記実行可能部分が、前記閾値についての見なし規則を適用するための実行可能部分をさらに含み、該見なし規則が、該閾値に関して前記少なくとも１つの定量化可能な特徴の値に対応する良好な予後または不良な予後のいずれかを確立し得る、コンピュータープログラム製品。
【請求項１０】
ガン患者の予後を決定するために適合された少なくとも１つのマーカーを評価するための方法であって、該方法は：
該少なくとも１つのマーカーに対して複数の身体サンプルを曝露する工程であって、該複数の身体サンプルは、各々既知の転帰を有する、対応する複数の患者から採取されている工程と；
画像処理システムを用いて複数のスライドの各々から撮った画像から少なくとも１つの定量化可能な特徴を抽出する工程であって、該複数のスライドが、各々の患者に対応する該複数の身体サンプルから調製されている工程と；
該複数のスライドの各々の少なくとも１つの定量化可能な特徴に対して複数の候補の決定規則を適用して、該複数の候補決定規則および該少なくとも１つの定量化可能な特徴の複数の組み合わせの各々について候補予後を提供する工程と；
最適な予後に対応する最適な決定規則を選択する工程であって、該最適な決定規則は、該少なくとも１つの定量化可能な特徴に関する候補決定規則から選択され、該最適な決定規則は該複数のスライドの各々についての最適な予後が該複数の患者の各々についての既知の転帰に最適に対応することを提供する、工程と、
を包含する、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記適用工程が、前記少なくとも１つの定量化可能な特徴に対して複数の候補閾値を適用して、前記複数の身体サンプルの各々についての該複数の候補閾値の各々に対応する複数の候補予後を生じる工程をさらに包含し、かつ前記選択工程が、前記複数のスライドの各々についての最適な予後が、前記複数の患者の各々についての既知の転帰に対して最適に対応するように、該複数の候補閾値から最適閾値を選択する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記適用工程がさらに、前記複数の候補閾値の各々についての見なし規則を決定する工程をさらに包含し、該見なし規則は、該複数の候補閾値の各々に関する少なくとも１つの定量化可能な特徴のうちの１つの値に対応する良好な予後または不良な予後のいずれかを確立し得る、方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の方法であって、前記選択工程がさらに：
前記複数の候補決定規則の各々に対応する複数の特異性と感度との対を決定する工程と；
該複数の特異性と感度との対を、受信者動作特性曲線上にプロットする工程と；
各々の前記複数の特異性と感度との対、および最適特異性と感度との対の間の複数のユークリッド距離を算出する工程と；
該最適特異性と感度との対に対して最小のユークリッド距離を有する特異性と感度との対に対応する最適な決定規則を選択する工程と；
を包含する、方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載の方法であって、前記抽出工程がさらに、前記少なくとも１つの定量化可能な特徴を抽出する目的領域を同定する工程を包含し、該目的領域が、前記画像処理システムを用いて複数のスライドの各々から撮った画像内である、方法。
【請求項１５】
請求項１０に記載の方法であって、前記少なくとも１つのマーカーの統計的な独立性を評価して、該少なくとも１つのマーカーが、少なくとも１つの相補的なマーカーと実質的に統計的に独立している予後を提供し得ることを保証する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記評価工程がさらに：
観察された転帰の頻度分布を、算出された理論上の予後の頻度分布と比較する工程であって、ここで、前記少なくとも１つのマーカーが、該少なくとも１つのマーカーおよび前記少なくとも１つの相補的なマーカーに曝された第一の複数の身体サンプルのさらなるマーカーと独立しており、該第一の複数の身体サンプルが既知の良好な転帰を有する患者に対応するならば、以下の工程を行う、工程、
観察された転帰の頻度分布を、算出された理論上の予後の頻度分布と比較する工程であって、ここで、該少なくとも１つのマーカーが、該少なくとも１つのマーカーおよび該少なくとも１つの相補的なマーカーに曝された第二の複数の身体サンプルの該さらなるマーカーと独立しており、該第二の複数の身体サンプルが既知の不良な転帰を有する患者に対応するならば、以下の工程を行う、工程、
該少なくとも１つの相補的なマーカーに関して該少なくとも１つのマーカーの独立性を評価する工程と、
を包含する、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記評価工程がさらに、カイ二乗分析を用いて前記少なくとも１つの相補的なマーカーに関して前記少なくとも１つのマーカーの独立性を評価する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１０に記載の方法であって、前記少なくとも１つのマーカーが：
比色定量的なバイオマーカー；
ＳＬＰＩ；
ＰＳＭＢ９；
ＮＤＲＧ−１；
Ｍｕｃ−１；
ホスホ−ｐ２７；
ｓｒｃ；
Ｅ２Ｆ１；
ｐ２１ｒａｓ；
ｐ５３；および
それらの組み合わせ、
からなる群より選択される、方法。
【請求項１９】
請求項１０に記載の方法であって、前記少なくとも１つの定量化可能な特徴が：
透過率；
光学密度；
細胞形態；
マーカー強度および細胞形態によって特徴付けられた細胞タイプの割合；ならびに
それらの組み合わせ、
からなる群より選択される、方法。
【請求項２０】
ガン患者の予後を決定するために適合した少なくとも１つのマーカーを評価するための画像処理システムを制御し得るコンピュータープログラム製品であって：該コンピュータープログラム製品は、コンピューター読み取り可能な記憶媒体を備え、該媒体はその中に記憶されたコンピューター読み取り可能なプログラムコード部分を有し、該コンピューター読み取り可能なプログラムコード部分は：
画像処理システムを用いて複数のスライドの各々から撮った画像から少なくとも１つの定量化可能な特徴を抽出するための実行可能部分であって、該複数のスライドは、各々既知の転帰を有する、対応する複数の患者から採取した複数の身体サンプルから調製され、該複数の身体サンプルは、該少なくとも１つのマーカーに曝されている、実行可能部分と；
該複数のスライドの各々の該少なくとも１つの定量化可能な特徴に対して網羅的な複数の候補決定規則を適用して、該網羅的な複数の候補決定規則および該少なくとも１つの定量化可能な特徴との複数の組み合わせの各々について候補予後を提供するための実行可能部分と；
最適な予後に対応する最適な決定規則を選択するための実行可能部分であって、該最適な決定規則は、該少なくとも１つの定量化可能な特徴についての候補決定規則から選択され、該最適な決定規則は、該複数のスライドの各々についての最適な予後が該複数の患者の各々について既知の転帰に最適に対応することを提供する、実行可能部分と、
を含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項２１】
請求項２０に記載のコンピュータープログラム製品であって、適用するための前記実行可能部分が、前記少なくとも１つの定量化可能な特徴に対して複数の候補閾値を適用して、前記複数の身体サンプルの各々についての複数の候補閾値の各々に対応する複数の候補予後を生成するための実行可能部分をさらに含み、かつ、該選択のための実行可能部分は、前記複数のスライドの各々についての最適な予後が前記複数の患者の各々についての既知の転帰に最適に対応するように、該複数の候補閾値から最適閾値を選択するための実行可能部分をさらに包含する、コンピュータープログラム製品。
【請求項２２】
請求項２１に記載のコンピュータープログラム製品であって、複数の候補閾値を適用するための前記実行可能部分が、該複数の候補閾値の各々について見なし規則を決定するための実行可能部分をさらに包含し、該見なし規則は、該複数の候補閾値の各々に関する前記少なくとも１つの定量化可能な特徴のうちの１つの値に対応する良好な予後または不良な予後のいずれかを確立し得る、コンピュータープログラム製品。
【請求項２３】
請求項２０に記載のコンピュータープログラム製品であって、前記選択工程のための実行可能部分がさらに：
前記網羅的な複数の候補決定規則の各々に対応する複数の特異性と感度との対を決定するための実行可能部分と；
該複数の特異性と感度との対を、受信者動作特性曲線上にプロットするための実行可能部分と；
各々の該複数の特異性と感度との対、および最適特異性と感度との対の間の複数のユークリッド距離を算出するための実行可能部分と；
該最適特異性と感度との対に対して最小のユークリッド距離を有する特異性と感度との対に対応する最適な決定規則を選択するための実行可能部分と；
を包含する、コンピュータープログラム製品。
【請求項２４】
請求項２０に記載のコンピュータープログラム製品であって、前記抽出のための実行可能部分がさらに、前記少なくとも１つの定量化可能な特徴を抽出する目的領域を同定するための実行可能部分を含み、該目的領域が、前記画像処理システムを用いて複数のスライドの各々から撮った画像内である、コンピュータープログラム製品。
【請求項２５】
請求項２０に記載のコンピュータープログラム製品であって、前記少なくとも１つのマーカーの統計的な独立性を評価して、該少なくとも１つのマーカーが、少なくとも１つの相補的なマーカーと実質的に統計的に独立している予後を提供し得ることを保証するための実行可能部分をさらに含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項２６】
請求項２５に記載のコンピュータープログラム製品であって、前記評価のための実行可能部分がさらに：
観察された転帰の頻度分布を、前記少なくとも１つのマーカーおよび前記少なくとも１つの相補的なマーカーに曝された第一の複数の身体サンプルについての理論上の予後の頻度分布と比較するための実行可能部分であって、該第一の複数の身体サンプルが、既知の良好な転帰を有する患者に対応している、実行可能部分と；
観察された転帰の頻度分布を、該少なくとも１つのマーカーおよび該少なくとも１つの相補的なマーカーに曝された第二の複数の身体サンプルについての理論上の予後の頻度分布と比較するための実行可能部分であって、該第二の複数の身体サンプルが、既知の不良な転帰を有する患者に対応している実行可能部分と；
該少なくとも１つの相補的なマーカーに関して該少なくとも１つのマーカーの独立性を評価するための実行可能部分と、
を含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項２７】
請求項２６に記載のコンピュータープログラム製品であって、評価のための前記実行可能部分が、カイ二乗分析を用いて前記少なくとも１つの相補的なマーカーに関して前記少なくとも１つのマーカーの独立性を評価するための実行可能部分をさらに含む、コンピュータープログラム製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ガンに罹患している患者の予後を確立するのにおける使用のための候補であり得るバイオマーカーを選択、分析および最適化するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
遺伝子増幅、遺伝子欠失および遺伝子変異は、異常なタンパク質発現を通じた異常な細胞挙動において顕著な役割を有することが公知である。懸念のある細胞挙動の範囲は、かなり多様な挙動、例えば、増殖または分化の調節を包含する。従って、例えば、種々の形態のガンのような複雑な疾患における有用な研究、診断および予後のツールを容易にするためには、遺伝子の増幅、欠失および変異、ｍＲＮＡ数量化またはタンパク質発現の分析における有効な検出および数量化が必要である。
【０００３】
遺伝子の増幅、欠失および変異における検出および数量化、ｍＲＮＡ数量化またはタンパク質発現分析に関する多くの実験室技術が存在する。例えば、このような技術としては、ウエスタンブロット、ノーザンブロットおよびサザンブロット、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）、酵素連結免疫分離アッセイ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）（「ＥＬＩＳＡ」）、および競合的ゲノムハイブリダイゼーション（「ＣＧＨ」）技術が挙げられる。しかし、顕微鏡は、慣用的に利用される。なぜなら、これは、細胞レベルでおよび細胞下のレベルで迅速な検討を可能にするが、比較的低コストで迅速に行なわれ得る情報技術であるからである。
【０００４】
顕微鏡が選択された実験室技術である場合、この生物学的サンプルは、特定の検出および顕色準備を最初に受けている。一旦サンプルを調製すれば、専門家は代表的には定量的な研究において顕微鏡のみで、または定量的および一般的には標準化された研究においてカメラおよびコンピューターと組み合わされた顕微鏡でサンプルを分析する。ある場合には、この顕微鏡は、完全に自動の分析のために構成されてもよく、この顕微鏡は、電動のステージおよび焦点、電動の対物チェンジャー、自動の光強度制御装置などで自動化されている。
【０００５】
検出のためのサンプルの調製は、例えば、ハイブリダイゼーションに基づくそして免疫標識に基づく準備技術のような、顕微鏡的な画像化分析に適している種々のタイプの準備技術に関与し得る。このような検出技術は、例えば蛍光ベースの技術そして可視色反応に基づく技術のような適切な顕色技術と組み合わされてもよい。
【０００６】
インサイチュハイブリダイゼーション（「ＩＳＨ」）および蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（「ＦＩＳＨ」）は、例えば、遺伝子情報増幅および変異技術における検出および数量化のために用いられる検出および顕色技術である。ＩＳＨおよびＦＩＳＨは両方とも、組織学的または細胞学的サンプルに適用され得る。これらの技術は、対応する正確な配列を認識するために特定の相補的なプローブを用いる。用いられる技術次第で、特定のプローブは、比色定量（ｃＩＳＨ）マーカーまたは蛍光（ＦＩＳＨ）マーカーを包含してもよく、次いで、このサンプルは、それぞれ透過顕微鏡または蛍光顕微鏡を用いて分析される。比色定量マーカーまたは蛍光マーカーの使用は、その使用者の目的に依存し、各々のタイプのマーカーは、特定の状況では他に比べて対応する利点を有する。
【０００７】
画像化および顕微鏡技術は、遺伝子増幅、遺伝子欠失、遺伝子変異および異常なタンパク質発現を検出および／または定量するために用いられ得る、比色定量マーカーまたは染色の読み取りを最適化および標準化するように開発されており、これらのマーカーまたは染色は、ガンのような疾患の診断および／または予後の決定において補助し得る、異常な細胞活性を強調するように選択された適切なマーカーで処理された組織切片スライドを分析する際に可視化され得る。
【０００８】
このような方法は、所定の組織サンプル内の標的分子種の定量的測定を行うために有用であるが、さらなる分子種がさらなるバイオマーカーにより、同じ組織サンプル内で強調される場合、それらは、直ちに認知できなくてもよく、そして組織サンプルをさらに体系的に分析して、ガンのような複雑な疾患に罹患している患者のさらに正確な予後を臨床家が得ることを可能にするためには、このような特徴を同定および定量する必要性が存在する。例えば、多くのタイプのガンでは、初期段階で診断される患者のうちわずかな割合が最終的に、１０年内の疾患再発、転移または死亡のように、１０年転帰が劣っている。しかし、初期段階で診断されたほとんどの癌患者が、良好な１０年予後を有し、そしてさらなる積極的なアジュバント療法（例えば、化学療法）を必要とすることはなく、またはその利点も無いようである。例えば、現在の臨床コンセンサスとは、少なくともある程度の初期段階のリンパ節転移陰性の乳癌患者は、アジュバント化学療法を受けなければならないというものであるが、現在のところ、さらに積極的な治療のために患者をリスク分類するためのＦＤＡの承認したアッセイは無い。これらの初期段階の乳癌患者のほとんどが、外科療法および／または放射線療法後にさらなる処置なしで長期生存を享受するので、これらの患者の全てについて、詳細にはガン化学療法に関連する有意な副作用という観点では、積極的なアジュバント療法を推奨することは不適切であると考えられる。良好な予後群および悪い予後群への最初の診断の時点で初期段階の乳癌患者のこれらの集団の識別を可能にする組成物および方法は、処置の適切な経過を選択するのにおいて臨床家を補助する。従って、乳癌患者、詳細には、初期段階の乳癌患者の予後を評価するための方法が必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
現在の予後基準およびマーカーの定量的なビデオ顕微鏡分析では、患者の転帰を予測することおよび処置の適切な経過を選択することにおいていくつかの手引きが得られるが、臨床的なビデオ顕微鏡データを利用して最適に特異的かつ感度のよいガン予後を、詳細には初期段階の患者で得る、体系的な方法が大いに必要とされる。さらに、ビデオ顕微鏡を介して同定された候補マーカーおよびその特徴を同定および評価して、ガンの予後の評価を補助するための方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
ガン患者の予後を決定するために適合した少なくとも１つのマーカーを分析するか、および／または評価するための方法およびコンピュータープログラム製品が提供される。ガン患者の予後を決定するために少なくとも１つのマーカーを分析するための方法は以下の工程を包含する：少なくとも１つのマーカーに対して身体サンプル（ガン患者から採取した）を曝露する工程と；画像処理システムを用いて少なくとも１つのスライドから撮った画像から少なくとも１つの定量化可能な特徴を抽出する工程であって、この少なくとも１つのスライドが、身体サンプルから調製される工程と；この少なくとも１つの定量化可能な特徴に対して決定規則を適用して、この少なくとも１つの定量化可能な特徴とこの決定規則との間の関係に基づいてこのガン患者の予後を決定する工程。少なくとも１つのマーカーを分析するための方法のいくつかの実施形態では、この適用工程がさらに、上記少なくとも１つの定量化可能な特徴に対してある閾値を適用して、この少なくとも１つの定量化可能な特徴とこの閾値との間の関係に基づいてガン患者の予後を決定する工程を包含する。少なくとも１つのマーカーを分析するための方法のさらに別の実施形態では、この適用工程は、上記閾値について見なし（ａｆｆｅｃｔａｔｉｏｎ）規則を適用する工程をさらに包含し、この見なし規則は、この閾値に関連する少なくとも１つの定量化可能な特徴のうちのある値に対応する良好な予後または不良な予後のいずれかを確立し得る。
【００１１】
少なくとも１つのマーカーを評価するための方法は、この少なくとも１つのマーカーに対して複数の身体サンプルを曝露する工程であって、この複数の身体サンプルは、各々既知の転帰を有する、対応する複数の患者から採取されている工程を包含する。この方法は、画像処理システムを用いて複数のスライドの各々から採取した画像から少なくとも１つの定量化可能な特徴を抽出する工程をさらに包含する。この複数のスライドは、各々の患者に対応する複数の身体サンプルから調製され得る。さらに、この方法は、この複数のスライドの各々の少なくとも１つの定量化可能な特徴に対して複数の候補の決定規則を適用して、この複数のスライドの各々について対応する候補予後を得る工程と；最適な決定規則を選択する工程であって、この最適な決定規則は、少なくとも１つの定量化可能な特徴に関しては、この候補決定規則から選択される工程とを包含する。最適な決定規則とは、この複数のスライドの各々についての候補予後がこの複数の患者の各々についての既知の転帰に最適に対応するものとする。例えば、最適な決定規則は、候補決定規則の各々についての特異性および感度を決定すること、そして（１，１）という最適の特異性と感度との対に最も近い特異性および感度を有する決定規則を選択することによって選択され得る。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態および本発明のコンピュータープログラム製品は、少なくとも１つのマーカーの統計的な独立性を評価して、この少なくとも１つのマーカーが、少なくとも１つの相補的なマーカーと実質的に統計的に独立している予後を提供し得ることを保証する工程をさらに包含する。さらに詳細には、上記の評価工程は、いくつかの実施形態では、以下の工程をさらに包含し得る：第一に、観察された転帰の頻度分布を、この少なくとも１つのマーカーに、および少なくとも１つの相補的なマーカーに曝された第一の複数の身体サンプルについての理論上の予後の頻度分布と比較する工程であって、この第一の複数の身体サンプルが公知の良好な転帰を有する患者に対応している工程と；第二に、観察された転帰の頻度分布を、この少なくとも１つのマーカーに、および少なくとも１つの相補的なマーカーに曝された第二の複数の身体サンプルについての理論上の予後の頻度分布と比較する工程であって、この第二の複数の身体サンプルが既知の不良な転帰を有する患者に対応している工程と；そして最終的に、この少なくとも１つの相補的なマーカーに関してこの少なくとも１つのマーカーの独立性を評価する（ある場合には、カイ二乗分析を用いて）工程。
【００１３】
いくつかの実施形態によれば、評価するための方法の適用工程は、各々の定量化可能な特徴に対して複数の候補閾値を適用して、この複数の身体サンプルの各々についてのこの複数の候補閾値の各々に対応する複数の候補予後を行う工程をさらに包含してもよい。さらに、この選択工程は、この複数のスライドの各々についての候補予後が、各々の複数の患者について既知の転帰に対して最適に対応するように、この複数の候補閾値から最適閾値を選択する工程をさらに包含してもよい。このような最適の閾値は、ある身体サンプル（例えば、組織学的スライド）に対して、マーカーの特定の定量化可能な特徴について決定された所定の値を適用した後に、その値を分類する、コンピューター制御された画像処理システムによる使用のためのツールを、例えば提供し得る。最適の閾値の上または下のいずれかとして一旦分類されれば、次いでこの所定の値を、適用された決定規則の結果に変換してもよく、次にこれを用いて、身体サンプルを採取した患者の予後を確立してもよい。
【００１４】
他の実施形態では、この適用工程は、複数の候補閾値の各々について見なし規則を決定する工程をさらに包含してもよく、この見なし規則は、この複数の候補閾値の各々に関して、少なくとも１つの定量化可能な特徴の値に対応する良好な予後または不良な予後のいずれかを確立し得る。
【００１５】
本発明の種々の実施形態によれば、この方法は、少なくとも１つのマーカーに対して複数の身体サンプルを曝露する工程を包含し得、このマーカーは、以下から選択され得る：比色定量バイオマーカー、ＳＬＰＩ、ＰＳＭＢ９、ＮＤＲＧ−１、Ｍｕｃ−１、ホスホ−ｐ２７、ｓｒｃ、Ｅ２Ｆ１、ｐ２１ｒａｓ、ｐ５３；およびそれらの組み合わせ。さらに、いくつかの実施形態では、この方法は、各々の複数のスライドから撮った画像から少なくとも１つの定量化可能な特徴を抽出する工程であって、この定量化可能な特徴が画像処理システムにより検出可能および定量化可能である工程を包含し得る。このような定量化可能な特徴としては以下を挙げてもよい：透過率；光学密度；細胞の形態；細胞タイプの割合；およびそれらの組み合わせ。
【００１６】
上記でまとめられたこの方法工程はまた、コンピューターデバイス（例えば、染色された組織学的スライドの画像を捕獲するために適切である、顕微鏡システムおよび／または画像分析システムと組み合わされたコンピューターデバイス）上で実行可能な、そして上記の方法実施形態と関連した種々の機能を達成し得る、１つ以上の適切なコンピュータープログラム製品で実現され得てもよい。例えば、１実施形態によれば、ガン患者の予後を決定する画像処理システムを制御し得るコンピュータープログラム製品が提供され、このコンピュータープログラムは以下を含む：（１）画像処理システムを用いて複数のスライドの各々から撮った画像からある特徴を抽出するための実行可能部分であって、この複数のスライドが複数の患者から採取した複数の身体サンプルから調製されており、この各々の患者の転帰が既知であり、この複数の身体サンプルは、少なくとも１つのマーカーに曝されている、実行可能部分と；（２）この複数のスライドの各々の特徴に対して複数の候補決定規則を適用して、この候補決定規則および特徴の各々の可能な組み合わせについて候補予後を得るための実行可能部分と；（３）最適な予後に対応する最適な決定規則を選択するための実行可能部分であって、この最適な決定規則が、この特徴について候補決定規則から選択され、この最適な決定規則は、この複数のスライドの各々についての最適な予後が患者の各々について既知の転帰に最適に対応するものとする実行可能部分と。
【００１７】
従って、最適な決定規則は、複数の患者の既知の転帰に基づいて、複数の患者の既知の転帰に比較した場合、予後が与える偽陽性の予後および偽因性の予後の数が最小になるような少なくとも１つの定量化可能な特徴を有する、少なくとも１つのマーカーの包括的な分析に基づく予後を提供し得る。従って、一旦選択すれば、この最適な決定規則を利用して、定量化可能な（例えば、画像処理システムにおける分析によって）１つ以上の特徴を有する１つ以上の比色定量マーカーの分析を最適化して、さらに正確に良好なまたは不良な転帰を予測し得る患者予後を得てもよい。従って、本発明の方法およびコンピュータープログラム製品によって、臨床家は、所定のマーカー（または１組のマーカー）を利用して、特定の疾患の初期段階の徴候しか示していない患者においてさえ不良な転機の頻度を予測することが可能になり得る。
【００１８】
本発明を一般的な用語で記載してきたが、ここで添付の図面について言及する。この図面では、必ずしも一定の縮尺で記載していない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、癌患者の予後を確立するのにおける使用のためのマーカーの候補を評価および最適化するための方法を提供する。以下に記載されるマーカー（およびその特定の特徴）は、乳癌患者、そしてさらに詳細には、初期段階の乳癌患者の予後を確立するには特に有用であるが、本明細書に開示された方法は、特定のタンパク質または例えば、比色定量バイオマーカー（マーカー）を介して染色しやすい他の標的分子の過剰発現に対して（例えば、臨床データを介して）関連し得る任意の疾患に罹患している患者の予後を確立するのにおける使用のためのマーカー候補物を評価および最適化するのに利用され得る。従って、当業者は、本明細書に開示される方法が、マークされて引き続き顕微鏡を介して分析され得るタンパク質または標的分子の発現に関連する、他の形態のガンまたは他の疾患を有する患者の予後を確立するのにおける使用のためのマーカーの分析および最適化に適用可能であり得るということを理解する。
【００２０】
本明細書に開示される方法はまた、選択された処置に対する乳癌患者の応答を予測するのに有用であり得るマーカーを評価するのに用途を見出す。「選択された処置に対する乳癌患者の応答を予測すること（ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ａ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｔｏ  ａ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、ある患者が特定の処置で正または負の転帰を被る可能性を評価することであるものとする。本明細書において用いる場合、「正の処置転帰の暗示（ｉｎｄｉｃａｔｉｖｅ  ｏｆ  ａ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｕｔｃｏｍｅ）」とは、選択された処置から患者が有益な結果（例えば、完全または部分的な寛解、腫瘍サイズの減少など）を受ける可能性の増大をいう。「負の処置転帰の暗示（ｉｎｄｉｃａｔｉｖｅ  ｏｆ  ａ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｕｔｃｏｍｅ）」とは、背景にある乳癌の進行に関して選択された処置から患者が利益を受けない確率の増大を意味する。本発明のいくつかの局面では、選択された処置とは化学療法である。
【００２１】
本明細書に開示される方法はまた、ガン、詳細には乳癌を同定または診断するのにおいて有用なマーカーを評価および／または最適化するのに用途を見出し得る。「乳癌を診断する（ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）」とは、例えば、乳癌の存在を診断または検出すること、疾患の進行をモニタリングすること、および乳癌の指標である細胞またはサンプルを同定または検出することを包含するものとする。ガンを診断、検出および同定するという用語は、本明細書において交換可能に用いられる。特定の実施形態では、本発明の方法は、所定のマーカーが身体サンプル（例えば、染色された組織学的スライドまたは細胞学的スライド）において過剰発現されるかまたは発現低下を妨げるかのいずれかである場合、このマーカーの検出によって特徴づけおよび／または診断され得る、乳癌または他の疾患を診断するのにおいて最も有効であるマーカーおよび／またはマーカーの組み合わせを最適化することによって、初期段階の乳癌の検出を容易にし得る。
【００２２】
本明細書に記載される方法は、所定のマーカー（バイオマーカーまたは比色定量バイオマーカー）であってその過剰発現が所定の患者の良好な転帰または不良な転帰のいずれかの指標であり得るマーカーの選択された特徴に対する複数の閾値の適用に関する。当業者は、本発明の方法が、例えば、黒色腫の場合には発現の低下を示すメラスタチンのような発現低下を示すマーカーに適用され得るということを理解する。さらに、本発明の方法によって、１つ以上のバイオマーカーに曝されている組織サンプル（例えば、調製された組織学的スライド）の比色定量分析によって強調され得る定量化可能な特徴（およびそれに適用される複数の閾値）の体系的な分析に基づいて、ガンがないままである可能性が高い（すなわち、予後が良好）患者から、疾患再発を被る可能性が高い（すなわち、予後が不良）患者の識別が可能になる。さらに詳細には、本発明の方法は、マーカー（例えば、比色定量バイオマーカー）に曝されている所定の組織サンプルの特徴を評価する工程、ならびにこのマーカーがこの特徴に関して分析され得るように各々の特徴の最適の閾値を選択し、そしてこのマーカー／閾値の組み合わせが既知の実際の患者の転帰に比較した場合最も正確である予後を与えるように対応する最適閾値を選択する工程といった体系的なプロセスを包含する。従って、本発明の方法はマーカー、その特徴および各々の特定の特徴についての閾値の最適の組み合わせを選択して、初期段階のガン患者のより正確な予測を得るためにさらに用いられ得る。
【００２３】
本発明によって評価されるバイオマーカーとしては遺伝子およびタンパク質が挙げられる。このようなバイオマーカーとしては、このバイオマーカーをコードする核酸配列の全体または部分的配列、またはこのような配列の相補体を含むＤＮＡが挙げられる。バイオマーカー核酸としてはまた、目的の任意の核酸配列の全体または部分的な配列を含むＲＮＡが挙げられる。バイオマーカータンパク質は、本発明のＤＮＡバイオマーカーによってコードされるかまたはそれに対応するタンパク質である。バイオマーカータンパク質は、任意のバイオマーカータンパク質またはポリペプチドの全体的または部分的なアミノ酸配列を含む。
【００２４】
「バイオマーカー（ｂｉｏｍｅｒｋｅｒ）」とは、組織または細胞中でのその発現レベルが正常または健常な細胞または組織の発現レベルに比較して変更されている任意の遺伝子またはタンパク質である。本発明の１実施形態によるバイオマーカーは、その過剰発現がガンの予後と、そして詳細には本明細書に提示される実施例では、乳癌の予後と相関している遺伝子またはタンパク質である。ある場合には、患者サンプルにおける目的のバイオマーカーまたはバイオマーカーの組み合わせの選択的な過剰発現は、乳癌の予後が劣っていることの兆候である。「予後が劣ることの兆候（ｉｎｄｉｃａｔｉｖｅ  ｏｆ  ｐｏｏｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）」とは、この特定のバイオマーカーの過剰発現が、背景にあるガンもしくは腫瘍、転移のぶり返しもしくは再発、または５年未満の死亡の可能性の増大を伴っているものとする。予後が劣ることの徴候であるバイオマーカーは、本明細書において、「悪い転帰のバイオマーカー（ｂａｄ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｂｉｏｍｅｒｋｅｒｓ）」と呼ばれ得る。本発明の他の局面では、目的のバイオマーカーまたはバイオマーカーの組み合わせの選択的な過剰発現は良好な予後の徴候である。本明細書において用いる場合、「良好な予後の徴候（ｉｎｄｉｃａｔｉｖｅ  ｏｆ  ｇｏｏｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）」とは、患者が少なくとも５年間ガンのないままである確率の増大をいう。このようなバイオマーカーは、「良い転帰のバイオマーカー（ｇｏｏｄ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｂｉｏｍｅｒｋｅｒｓ）」と呼ばれ得る。
【００２５】
本発明の方法によって評価され得るバイオマーカーとしては、その過剰発現が上記のようなガンの予後と相関する任意の遺伝子またはタンパク質が挙げられる。バイオマーカーとしては、ガンの予後が劣る徴候である遺伝子およびタンパク質（すなわち、悪い転帰のバイオマーカー）、および良好な予後の徴候である遺伝子およびタンパク質（すなわち、良好な転帰のバイオマーカー）が挙げられる。特定の目的のバイオマーカーとしては、細胞の成長および増殖の調節、細胞周期の制御、ＤＮＡ複製および転写、アポトーシス、シグナル伝達、血管形成／リンパ形成または転移に関与する遺伝子およびタンパク質が挙げられる。いくつかの実施形態では、このバイオマーカーは、組織再構築に関与するプロテアーゼ系、細胞外マトリックス変性および隣接組織の浸潤を調節する。任意のバイオマーカーであってその過剰発現がガン予後の徴候であるバイオマーカーは、本発明の方法において分析および／または利用され得るが、乳癌の予後を評価する特定の実施形態では、バイオマーカーは、ＳＬＰＩ、ｐ２１ｒａｓ、ＭＵＣ−１、ＤＡＲＰＰ−３２、ホスホ−ｐ２７、ｓｒｃ、ＭＧＣ１４８３２、ｍｙｃ、ＴＧＦβ−３、ＳＥＲＨＬ、Ｅ２Ｆ１、ＰＤＧＦＲα、ＮＤＲＧ−１、ＭＣＭ２、ＰＳＭＢ９、ＭＣＭ６およびｐ５３からなる群より選択される。さらに好ましくは、乳癌の予後を確立するのにおける目的のバイオマーカーは、ＳＬＰＩ、ＰＳＭＢ９、ＮＤＲＧ−１、Ｍｕｃ−１、ホスホ−ｐ２７、ｓｒｃ、Ｅ２Ｆ１、ｐ２１ｒａｓまたはｐ５３を含む。本発明の１局面では、本明細書に含まれる実験的な実施例に図示されるように、乳癌予後を評価するための方法は、Ｅ２Ｆ１ならびにＳＬＰＩ、ｓｒｃ、ホスホ−ｐ２７、ｐ２１ｒａｓおよびＰＳＭＢ９からなる群より選択される少なくとも１つの他のバイオマーカーの過剰発現を検出する工程を包含する。
【００２６】
本明細書において考察される「特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）」という用語は、所定のマーカーおよび／またはバイオマーカーに対する曝露によって身体サンプル中で生成された知覚可能および／または定量化可能な変動をいう。特徴としては、例えば、顕微鏡技術および画像処理システムを用いて検出され得る、比色定量マーカー（上で考察されるマーカーを含む）の染色特徴によって生成される透過率または光学密度値の変動を挙げることができる。このような顕微鏡技術および／または画像処理システムを用いて、目的の特定のバイオマーカーの存在を視覚的に示すように染色した（従って、対応する、目的の特定のタンパク質および／または標的分子の存在を示す）後に、生物学的サンプルの画像を得る。これらの方法および関連のシステムのいくつか、例えば、参照によって本明細書に援用される、Ｍａｒｃｅｌｐｏｉｌらに対する米国特許出願０９／９５７，４４６号（第‘４４６号出願）およびＭａｒｃｅｌｐｏｉｌらの米国特許出願１０／０５７，７２９号（第‘７２９号出願）に開示されるものは、画像システムおよび関連のソフトウェアによって決定されるような、それぞれカラー色素マーカーの光学密度または透過値によって示される代表的なカラー色素マーカーの存在に基づいて、所定の画像に存在する各々の分子種の相対量を決定するための、画像処理システム、方法および関連のコンピュータープログラム製品の使用を開示する。これらの技術によって、各々の標的分子またはタンパク質であってその過剰発現が組織サンプルスライドに適用された比色定量バイオマーカーによって明らかにされ得る分子またはタンパク質の相対量の定量的な決定をさらに行うことができる。例えば、所定のマーカーの特徴の発現は、マークされた組織サンプルスライドのデジタル画像を用いて明らかにされ得、ここでこのマーカーは、その成分の赤、緑および青（ＲＧＢ）の色の部分から色素原分離を用いてバックグラウンド染色および／または他のマーカーから分離され、その結果このマーカーの相対的な（バックグラウンドの染色および／または他のマーカーからの染色に対する）寄与は、患者から採取された身体サンプル内の細胞または目的領域（ＲＯＩ）内で決定され得る。
【００２７】
本発明の種々の実施形態によれば、種々の特徴（定量化可能および定量化不能の両方）は、目的領域（ＲＯＩ）、種々の視野（ＦＯＶ）または全体的な組織学的スライドの画像を捕獲し、かつその中に規定される形態学的境界、例えば、核、細胞質および細胞膜を含む細胞の種々の領域を決定し得る画像処理システムを用いて、マークされた組織サンプル（例えば、比色定量バイオマーカーで染色された調製された組織学的スライド）から撮った画像から抽出され得る。スライドおよび／または身体サンプル内の形態学的境界を決定するためのこの画像処理工程は、分割（セグメンテーション）として公知である。目的領域（ＲＯＩ）は、種々の実施形態に従って、スライド全体、スライドの一部、スライドの別個の選択された部分および／またはＦＯＶ全体にまたがってもよい。形態学的な境界の正確な分割（顕微鏡および／または画像分析を介する）が多くの特徴の決定に必要である。なぜなら、種々の異なるバイオマーカータイプが所定の身体サンプルの細胞内の別個の細胞下位置を示すからである。例えば、いくつかのバイオマーカーは、細胞の核内でのみ標的分子の過剰発現を明らかにする。他のマーカーは、細胞の細胞質内のまたは細胞膜内の標的分子の過剰発現を明らかにし得る。例えば、表１は、乳癌の予後および／または診断を確立するのに用いられるいくつかのマーカーを示しており、これは細胞下位置の各々の領域にそって列挙されている。
【００２８】
例示的な特徴の添付の付表に記載されるとおり、特定の細胞記述子特徴、例えば、ＣＥＬＬ、ＣＹＴＯ、ＭＥＭＢおよびＮＵＣＬ（それぞれ、細胞、細胞質、細胞膜および細胞の核をいう）は、身体サンプルの細胞内の位置記述子として機能し、ここで特定のマーカーによって示される特徴は、例えば、色素または染色液の色素原分離を用いて検出および／または定量化され得る。
【００２９】
また、添付の付表に示されるのは、所定のバイオマーカーまたはバイオマーカーの組み合わせの予後値を最適化するために、本発明の方法によって抽出、試験および／または定量化され得る種々のバイオマーカーの多数の他の例示的な特徴である。この特徴は、以下のように一般に分類される：形状記述子特徴；質感および／またはヒストグラムの記述子特徴（特定のバイオマーカーによって強調され得る標的分子過剰発現の量および変動に関して主に統計的な決定をいう）；スペクトル記述子特徴（例えば、標的分子の過剰発現を明らかにするために用いられ得る種々の比色定量バイオマーカーおよび／または対比染色の透過率または光学密度）；階層的な記述子特徴（画像システムによって捕獲される階層的な対象物に対して定量化可能な特徴を計算するために用いられる）；および細胞記述子特徴（ＣＥＬＬ、ＣＹＴＯ、ＭＥＭＢおよびＮＵＣＬを含む）（上記され、そして例示的な特徴の付表に詳細であるとおり）。一般に上記され、そしてそこに添付される付表にはさらに詳細である特徴の列挙は、排他的であるということを意味せず、そして例としてのみ機能するということを意味する。本発明の方法は、種々の異なる定量化可能な特徴（およびそれらの種々の組み合わせ）を利用して、所定のマーカーまたはマーカーの組み合わせの予後値を最適化し得る。本発明のコンピュータープログラム製品の実施形態によれば、本明細書に記載される特徴は、目的領域（ＲＯＩ）をマーク、細胞または組織サンプルの種々の区画および成分を区分する、および／または成分ＲＧＢ部分へ染色液または色素を分解する能力を有する画像処理システムを制御して、透過率、輝度、光学密度および／または他のスペクトル的な特徴を決定するように構成された、例えば、制御装置（例えば、コンピューターデバイス）によって自動方式で検出され得る。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態では、上記および他の特徴を組み合わせて、所定の患者の診断および／または予後を得る目的のために有用性を有し得る定量化可能な特徴を作成するために、いくつかのタイプの背景にある特徴を組み込む略式の特徴を作成してもよい。このような略式の特徴を構築するためには、他のさらに特異的な特徴を定量化して、試験し、バイオマーカーおよび／またはバイオマーカーの収集によって強調された特徴から予後および／または診断の値を得るために臨床家の探究にさらに重要性をある場合には有し得る略式の特徴を作成してもよい。例えば、本明細書に記載される実験的な実施例では、利用される特徴としては、身体サンプル（例えば組織学的スライド）において同定された特定の目的領域（ＲＯＩ）において強調され得る細胞の所定の収集物に存在するとみなされる種々の段階のガン細胞の数字的な割合が挙げられる。当業者は、病理学者が、目的領域（ＲＯＩ）（例えば、周囲の領域よりも濃く染色されると考えられる組織学的スライドの領域）に存在するマーカーの程度を確認することによって例えば顕微鏡を介してみられるようなマーカーで染色されている細胞を「類別（ｇｒａｄｅ）」し得るということを理解する。病理学者による視覚的な類別は、細胞に存在するマーカーの相対的なレベルを確認するために有用であるが、このような類別はかなり主観的であって、種々の臨床家によって、そして種々の状況で変化し得る。従って、本発明における略式の特徴を構築するには、疑わしいガン細胞を例えば、０（標的された細胞区画に存在するマーカーの完全な欠失を示す）、１（標的された細胞区画に存在するある程度少量のマーカーを示す）、２（標的された細胞区画に存在するマーカーの中度のレベルを示す）または３（標的された細胞区画に存在する高レベルのマーカーを示す）としてより客観的に類別してもよい。このような類別は、ビデオ−顕微鏡システムおよび／または画像処理システム、例えば、第‘４４６号出願および第‘７２９号出願に開示されるようなシステムを用いて自動方式で達成され得る。下で表２においてまとめるとおり、本発明の１実施例によれば、ＮＵＣＬ、ＣＹＴＯ、ＭＥＭＢ、ＤＹＥ２、ＯＤおよびＭＥＡＮによって示される特徴を組み合わせて、ある範囲の値を有する光学的な透過値を得てもよく、この値は、所定の細胞で所定の比色定量バイオマーカー（またはある場合には、その比色定量成分）（例えば、「ＤＹＥ２」で示される）のレベルを決定するために区分され得る。同じ色素を用いて、所定のバイオマーカーを比色定量バイオマーカー（例えば、通常用いられる色素染色液、例えば、ＤＡＢまたは当業者に周知の他のものなど）にさせてもよいが、本発明によって評価される種々の異なるバイオマーカーは、種々の細胞区画（例えば、核、細胞膜および／または細胞質）における標的分子の存在を明らかにし得る。この例示的な閾値（透過率の値に対応する）は、表２で示される場合、以下のカテゴリーのうちの１つへ各々の可視細胞をこのように送り出し得る：０、１、２または３。非染色細胞の期待される数に対応するカテゴリー０の評価（すなわち、マーカーに曝された場合、標的分子の過剰発現を示さないことが見出された細胞）は、画像処理システムおよび／または顕微鏡を用いて行われてもよい。０（非染色）細胞の適切な数はさらに、１、２および３つの細胞領域の算出（下に列挙される決定を用いる）から、この特定の実施形態において得られる、平均腫瘍細胞面積（例えば、ＣＥＬＬ＿ＡＥＲＡと呼ばれる特徴から評価される１１００ピクセル（例示的な特徴の付表を参照のこと））を用いて算出され得る：
【００３１】
【化１】
2008513793.tif 000003
他の実施形態では、細胞数は、細胞領域を決定する以外の方法を用いて算出されてもよい（例えば、核に局在するマーカーで染色されるＦＯＶ内の核をカウントすることによって）。一旦、０、１、２および３の細胞タイプの数（それぞれ、Ｎ０、Ｎ１、Ｎ２およびＮ３）が決定されれば（例えば、表２に示される種々の閾値を用いて）、０、１、２および３の細胞の割合が算出され得る。表３は、所定の割合で反映される細胞のタイプを示す数的な識別子とともに接頭語ＣＥＬＬ＿ＰＥＲＣＥＮＴを用いてこれらの新規な略式の特徴の名称を示す。これらの例示的な略式の特徴は、単なる割合として算出され得る。例えば、ＣＥＬＬ＿ＰＥＲＣＥＮＴ＿０は、以下のように算出され得る：
【００３２】
【化２】
2008513793.tif 000004
上記のＣＥＬＬ＿ＰＥＲＣＥＮＴの略式の特徴は、本明細書に記載の実験的な実施例において用いられるが、多数の可能性のある定量化可能な特徴は、本発明の方法およびコンピュータープログラム製品の実施形態の一部として評価され得る。例えば、例示的な特徴の付表に開示される１つ以上の比色定量特徴（例えば、画像分析システムを用いて、染色された組織学的スライドの分析に関連する）を組み合わせて別のタイプの略式の特徴を形成してもよく、またはこの付表に記載される個々の特徴を個々に用いて分析してもよい。
【００３３】
上記の種々の特徴および略式の特徴を身体サンプル（またはそれから調製されるスライド、例えば組織学的スライドなど）を染色するために用いられ得る１つ以上のマーカーの分析において適用して、ガン患者（例えば、初期段階の乳癌患者）の予後を確立（またはその確立を補助）してもよい。本発明の実施形態によれば、マーカーまたはその特徴の種々の組み合わせを、本発明の実施形態を用いて評価して、所定のマーカーまたはマーカーの組み合わせの感度および特異性が最適化され得るように、特徴、特徴の閾値（例えば、所定の目的領域（ＲＯＩ）における２型ガン細胞の所定のＣＥＬＬ＿ＰＥＲＣＥＮＴ）およびマーカーのタイプの最適の組み合わせを確立してもよい。さらに、他のタイプの患者ベースの特徴を、以下のような（限定はしないが）本明細書に開示される特徴と組み合わせてもよい；患者年齢；患者の医学的既往歴；およびガン患者の可能性のある予後および／または診断を示す他の要因。例えば、リンパ節転移、腫瘍サイズ、組織学的等級、エストロゲンおよびプロゲステロンのレセプターレベル、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ状態、腫瘍倍数性および家族歴は全てが、初期段階の乳癌患者の予後の達成を補助する予後因子および／または診断因子であり得る。
【００３４】
本発明の方法およびコンピュータープログラム製品を用いて、特徴、閾値およびマーカーの組み合わせを効率的にかつ体系的に分析し、そして評価して任意の所定のガン患者の予後を確立するのにおける最適の特異性および感度を決定してもよい。本発明の方法およびコンピュータープログラム製品では、特異性および感度を評価するためのエンドポイントは、予後（例えば、特定の候補マーカーおよび／または対応する候補の特徴（単数または複数）を用いて予測された転帰）と実際の臨床的な転帰（すなわち、患者がガンなしのままであるか、または５年以内に再発を被るか）との比較である。図２に示されるとおり、多数の候補の特徴／閾値の組み合わせによって得られる候補予後を、本発明の方法において用いられる身体サンプルの既知の転帰に基づいて示される４つの象限のマトリックスにプロットして、下にさらに詳細に記載されるような、所定のマーカー／特徴（および／または決定規則）の組み合わせによって得られた真の陽性２１０、真の陰性２４０、偽の陽性２２０および偽の陰性２３０の予後の数を決定してもよい。真の陽性２１０、真の陰性２４０、偽の陽性２２０および偽の陰性２３０の予後の相対的な数を算出した後、特徴的な感度および特異性の対を算出して、予後ツールとしてマーカー／特徴／決定規則の組み合わせの有効性を評価してもよい（下にさらに詳細に記載されるように）。
【００３５】
本明細書において用いる場合、「特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」とは、本発明の方法が真の陰性を正確に特定し得るレベルをいう。臨床研究では、特異性は、真の陰性の数を真の陰性および偽陽性の合計で割ることによって算出される（図２の象限において候補予後をプロットすることによって決定されるように）。「感度（ｓｅｎｓｉｉｔｉｖｉｔｙ）」とは、本発明の方法が、真に陽性であるサンプルを正確に特定し得るレベルであるものとする。感度は、臨床研究において真の陽性の数を真の陽性および偽因性の合計で割ることによって算出される（また図２の象限において候補予後をプロットすることによっても決定される）。いくつかの実施形態では、開示された方法によってカバーされないマーカー、特徴および閾値の所定の組み合わせの感度は、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上である。さらに、本発明の評価方法によって到達可能な特異性は好ましくは少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上である。
【００３６】
本明細書において用いる場合、「真の（ｔｒｕｅ）」および「偽の（ｆａｌｓｅ）」陽性および陰性という定義は、このマーカーまたはマーカーの組み合わせが、良好な転帰のマーカーとみなされるかまたは不良な転帰のマーカーとみなされるかに基づく。すなわち、良好な転帰のマーカー（すなわち、良好な予後の徴候）の場合、「真の陽性（ｔｒｕｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）」とは、本発明の方法（例えば、免疫組織化学による陽性染色）によって決定される場合、目的のバイオマーカーの過剰発現を示すサンプルであって、良好な実際の臨床転帰が確認されているサンプルをいう。対象的に、「偽陽性（ｆａｌｓｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）」は、良好な転帰のバイオマーカー（単数または複数）の過剰発現を示すが、不良な実際の臨床転帰が確認されている。良好な転帰のマーカーに関して「真の陰性（ｔｒｕｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅｓ）」および「偽陰性（ｆａｌｓｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅｓ）」は、マーカーの過剰発現を示さず（例えば、免疫組織化学の方法で陽性に染色しない）、そしてそれぞれ、不良および良好な実際の臨床的転帰が確認されている。
【００３７】
同様に、不良な転帰のマーカーの場合、「真の陽性（ｔｒｕｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）」とは、関心のあるマーカーまたはマーカーの組み合わせの過剰発現を示すサンプルであって、不良な実際の臨床転帰が確認されているサンプルをいう。まとめると、良好および不良な転帰のバイオマーカーの両方に関して「真の陽性」とは、実際の臨床転帰（すなわち、良好または不良）が正確に予測されるサンプルをいう。「偽陽性」は、良好な転帰のバイオマーカーの過剰発現を示すが、良好な実際の転帰が確認されている。不良な転帰のバイオマーカーに関して「真の陰性」および「偽陰性」は、バイオマーカーの過剰発現を示さず、そしてそれぞれ良好および不良な実際の臨床転帰が確認される。本発明の方法およびコンピュータープログラム製品は、多数のマーカー、マーカーの特徴および所定の特徴の閾値を用いて行われた予後と、実際の臨床転帰との体系的な比較を利用して、正確な臨床転帰によって規定される場合、マーカー、特徴および閾値のどの最適の組み合わせが最も正確であるかを決定する。
【００３８】
図１は、ガン患者の予後を決定するために利用され得る少なくとも１つのマーカーを評価するための本発明の１実施形態による方法の模式的なフロー図を示す。工程１１０は、暴露工程を示しており、これは、あるマーカー（またはある場合には複数のマーカー）に対して複数の身体サンプルを曝露する工程を包含する。この複数の身体サンプルは、例えば、対応する複数の患者であって、各々の患者の臨床的な転帰が既知である患者から採取されている。上記にさらに詳細に記載されるように、このマーカーは、所定の細胞において過剰発現され得る、種々の標的分子（例えば、タンパク質など）を検出するために用いられ得る種々の比色定量バイオマーカーを含んでもよい。この身体サンプルとしては、マーカーを評価するために本発明の方法を用いている疾患を有する患者から採取された生検組織サンプルを包含し得る。
【００３９】
工程１２０は、本発明の１方法による次の工程を示しており、この工程は、画像処理システムを用いて複数のスライドの各々からとった画像から少なくとも１つの定量化可能な特徴を抽出する工程を包含し、ここでこの複数のスライドは、既知の転帰を有する各々の患者に対応する複数の身体サンプルから調製される。このスライドは、生検コアサンプルまたは他の組織サンプルの連続切片を保持してもよく、そして本発明の方法の一部として評価の下にあり得る１つ以上のマーカーに曝されてもよい。このスライドは、定量化可能な特徴の抽出（例えば、色、陰影、輝度、透過率（ＴＲＡＮＳ）、光学密度（ＯＤ）、または上記にさらに詳細に記載される他の特徴における感知可能な変化）を容易にするように着色されるかおよび／または染色される組織学的スライドを包含し得る。例えば、スライドは、身体サンプルが曝されているマーカー（または複数のマーカー）を強調するように構成された染色液で処理されてもよい。さらに、このスライドは、目的のマーカー（単数または複数）の染色を強調する傾向の着色および／または染色の特徴を有する対比染色で処理されてもよい。当業者は、このような比色定量染色がＤＡＢ（マーカーの出現を茶に染色する傾向である）を含んでもよいこと、そして対比染色は、ヘマトキシリン（正常な形態の細胞を青に染色する傾向である）を含んでもよいことを理解する。さらに、任意の染色されたスライドを、例えば、第‘４４６号出願および第‘７２９号出願に開示される色素原分離技術を用いて分析してもよい。
【００４０】
上記のように、この抽出工程は、例えば、所定の画像（例えば、スライド全体、カメラの視野（ＦＯＶ）または選択された目的領域（ＲＯＩ））を分析するように構成された画像分析システムおよび関連の制御装置（例えばコンピューターデバイス）を用いて、スライドのビデオ−顕微鏡画像から特徴を抽出する工程を包含し得る。例示的な特徴の添付の付表に詳細に記載されるとおり、所定のマーカー（またはマーカーのセット）に曝されているスライドの画像に関連する多くの異なる特徴を抽出して分析してもよい。ある実施形態では、病理学者のような臨床家は、画像分析システムを利用してＲＯＩ（例えば、大量の所定のマーカーの存在を示すようにＤＡＢで濃く染色された顕微鏡画像のある領域に対応する）を選択し得る。ＲＯＩ内では、画像分析システム（およびそれと連絡されている制御装置）を用いて、添付の付表に記載される多数の特徴を隔離して分析してもよい。例えば、ＲＯＩ内の多数の細胞を計算してもよく、そしてその中の１型細胞の割合を同様に計算してもよい（例えば、ＲＯＩ内に含まれる種々の細胞区画（マーカーのタイプに依存する）を通じて透過される光の光学密度を決定した後に、表２に概説されるディスパッチャー（ｄｉｓｐａｔｃｈｅｒ）設定を適用することによって）。閾値または客観的な決定規則を適用することによって（（工程１３０を参照のこと）下に詳細に記載される）、この特徴は、ほとんどの場合、定量化可能な特徴、例えば、割合、細胞数、面積、輝度、透過率および／または光学密度である。例えば、添付の実験的な実施例では、種々のＲＯＩから抽出される略式の特徴としては、１型、２型および３型のガン細胞の割合（およびこれらの割合の組み合わせ）が挙げられ、ここでこの割合は、さらに特異的な特徴（細胞の染色された領域の透過率および／または光学密度などであって、これは所定の細胞に特定のタイプの記号（例えば、１型、２型または３型）を割り当てるために用いられる）を組み合わせることによって計算された。
【００４１】
本発明の方法の１実施形態の工程１３０は、複数のスライドの各々の抽出された定量化可能な特徴に対して複数の候補の決定規則を適用して、このスライドの各々について対応する候補予後を得る工程を包含する。「決定規則（ｄｅｃｉｓｉｏｎ  ｒｕｌｅ）」は、見なし規則（所定の閾値よりも大きい定量化可能な特徴が、良好な予後の徴候であるか、または不良な予後の徴候であるかの決定を包含する）を含むいくつかの成分および所定の定量化可能な特徴の閾値から構成され得る。単一の特徴を有する単一のマーカーの分析においては、この決定規則は、特定の特徴の二者択一であり得る。本発明の多くの実施形態によれば、全体的な決定規則は、良好な候補予後または不良な候補予後のいずれかを行う（候補閾値および対応する見なし規則に依存して）工程を包含する。例えば、１実施形態によれば、良好な予後は、ゼロ（０）と示されてもよいし、そして不良な予後は（１）と示され得る。しかし、各々の可能な閾値について、見なし規則について２つの可能な選択肢が存在する（すなわち、良好な予後（０）は、閾値未満の値を指してもよいし、あるいは不良な予後（１）は、閾値未満の値を指してもよい）。従って、各々の見なし規則（各々の可能性のある閾値について）は、各々の身体サンプル（転帰が既知である患者に対応する）について評価され得、そして図２に示されるような以下のカテゴリーのうちの１つに対応する４つの象限のうちの１つに位置される；真の陽性（象限ａ、２１０）、偽陽性（象限ｂ、２２０）、偽陰性（象限ｃ、２３０）、および真の陰性（象限ｄ、２４０）。次いで、各々の閾値についての最適の見なし規則が図２において各々の象限について、その象限における良好および不良な転帰の出現に基づいて、見なし規則を選択することによって決定され得るように、可能性のある予後を、各々の身体サンプル（既知の転帰を有する患者に対応する）についての各々の可能性のある閾値／見なし規則の組み合わせについて行ってもよい。
【００４２】
例えば、マーカーの特定の定量化可能な特徴（Ｆ）の閾値（Ｔ）を考慮すれば、２つの見なし規則が予後を決定するために可能である。第一の可能性のある規則は、ＦがＴより大きい場合、その予後は不良（１）であるということである。第二の可能性のある規則は：ＦがＴより大きい場合、その予後は良好（０）であるということである。これらの可能性のある見なし規則の各々について、その予測される予後は、正確な患者転帰を正確に予測し得る（すなわち、真の陽性または真の陰性を生じる）か、または正確な患者転帰を予測できないかもしれない（すなわち、偽陽性または偽陰性を生じる）。図２のどの象限が最も可能性のある予後を含むかを決定して、どの見なし規則が所定の定量化可能な特徴に最も適切であるかを決定することができる。例えば、図２を参照して、第一の可能性のある規則の可能性のある予後をプロットして、結果がどこに位置するかを決定してもよい。さらに、第二の可能性のある規則についての可能性のある予後をプロットして、結果が図２に描かれる象限内の何処に存在するかを決定し得る。適切な象限において両方の可能性のある見なし規則をプロットした後に、最適の見なし規則は、良好なおよび不良な転帰の全体的な数に対して正規化された、予測される良好な転帰対不良な転帰の比を決定することによって決定され得る。例えば、所定の特徴および閾値に関して、ほとんどのプロットされたポイントは、第一の可能な見なし規則（Ｆ＞Ｔである場合、予後＝不良（１））が用いられる場合、真の陽性象限に位置し得る。この場合、以下の候補決定規則が作成され得る：閾値を上回る定量化可能な特徴を示す患者は、不良な予後を有するとみなされる（疾患について陽性である）。別の実施例では、ほとんどのプロットされたポイントは、第一の可能な規則（Ｆ＜Ｔである場合、予後＝良好（０））が用いられる場合、偽陰性の象限に位置し得る。この場合、候補決定規則は以下のように読み取られ得る：閾値を上回る定量化可能な特徴を示す患者は、良好な予後を有するとみなされる（疾患について陰性である）。当業者は、他の統計的な方法が効率的な決定規則を見出すために利用され得ることを理解する。例えば、線形判別、二次判別、一般化線形モデル、ロジスティック回帰、ペナライズド判別（ｐｅｎａｌｉｚｅｄ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ）、フレキシブル判別、混合判別、および／または他の統計的な方法を利用して、このような決定規則を本発明の工程１３０の一部として見出してもよい。
【００４３】
図１に示されるとおり、工程１４０は、少なくとも１つの定量化可能な特徴について、候補決定規則から選択される、最適の決定規則を選択する工程を包含する。最適の決定規則は、複数のスライドの各々についての候補予後が、各々の複数の患者について既知の転帰に最適に対応するように選択される。例えば、決定規則は、身体サンプルを採取した患者の臨床転帰に比較した場合、偽陰性および偽陽性の数が最小になる最適な予後の予後ツールを得るように、複数の候補決定規則から選択される（工程１１０を参照のこと）。上記のとおり、候補決定規則は、閾値成分および見なし規則の成分の両方を有する。複数の候補閾値（および見なし規則）を体系的に評価することによって、複数のスライドの各々についてそれから生じる最適の予後が複数の患者（それからこの複数のスライドが作成される）の各々について既知の転帰に最も密接に対応し得るように、最適の閾値を選択してもよい。さらに、所定の決定規則の有効性は、式７および８において下に示されるような特異性および感度を用いて試験してもよい。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、最適の決定規則を選択することはさらに、複数の候補決定規則の各々に対応する複数の特異性と感度との対を決定する工程をさらに含む。このような実施形態では、各々の候補決定規則について（および複数の候補閾値および対応する見なし規則の各々について）の特異性および感度は、各々の候補決定規則由来の候補予後を、身体サンプルを採取した各々の患者についての実際の既知の転帰に対して比較することによって計算され得る。この比較を行うことにおいて、真の陽性（象限ａ）、偽陽性（象限ｂ）、偽陰性（象限ｃ）、および真の陰性（象限ｄ）の相対的な数の各々は、図２に示されるような象限系を用いて決定され得る。各々の象限についての相対的な数を用いて、感度および特異性の対（ｓｅｎｓ、ｓｐｅｃ）は、以下の式を用いて各々の候補決定規則および各々の複数の候補閾値について計算され得る：
【００４５】
【化３】
2008513793.tif 000005
従って、上に一般的に記載されるとおり、感度とは、マーカーに関して陽性であると評価されている（すなわち、真の陽性であるとみなされる）不良な転帰の患者の確率をいう。同様に、特異性とは、マーカーに関して陰性であると評価されている（すなわち、真の陰性であるとみなされる）良好な転帰の患者の確率をいう。
【００４６】
次いで、各々の感度および特異性の対を、図３に示されるように２次元の感度および特異性のチャートにプロットしてもよく、ここで各々のポイントは、複数の候補決定規則の各々について（そして複数の候補閾値の各々について）算出された特異性および感度の値をいう。図３に示されるチャートはまた、実際の臨床転帰に対応するデータのセットに比較して候補決定規則のセットについての感度値３１０および対応する特異性値３００のプロットを示す受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線として公知である。理想的な予後試験は、ポイント１でプロットされた理想的な感度および特異性の対３２０を有し、この１は、全ての予後結果が真の陽性または真の陰性のいずれかから構成されることを示す（図２における象限ａ２１０およびｄ２４０を参照のこと）。ＲＯＣ曲線上の各々のプロットされた感度および特異性について、ユークリッド距離は、プロットされた対と理想的な対との間の特異性の相違３５０および感度距離３４０を用いて、プロットされた対と理想的な対３２０との間で（１，１）で計算され得る。図３に示されるようなＲＯＣ曲線をプロットした後に、理想的な対３２０に対する最小ユークリッド距離３２０を有する特異性と感度との対を、この最適な決定規則（および対応する最適閾値および／または見なし規則）が評価されているマーカーおよび特徴的な組み合わせの特異的な感度および特異性の対を標的するために選択され得るように特定してもよい。さらに、いくつかの実施形態では、最適な決定規則は、評価されているマーカーおよび特徴の組み合わせの感度および特異性の両方を最大化する（すなわち、理想的な（１，１）感度および特異性の対にアプローチする）ように選択され得る。
【００４７】
図４に示されるように、本発明のいくつかの方法はさらに、ブロック１５０において体系的に示されるさらなる工程を包含し得、この工程は、少なくとも１つのマーカーの統計的な独立性を評価して、このマーカーが少なくとも１つの相補的なマーカーと実質的に統計的に独立している予後を得ることができることを保証する工程を包含する。従って、この実施形態は、身体サンプルに加えられたマーカーの所定の対について、それから得られた予後が実質的に統計的に独立しており、その結果１つのマーカーがこの相補的なマーカーに関して実質的に反復性の情報を提供しないこと確実にし得る。これによって、例えば、相補的なマーカーは、第一のマーカーと組み合わせては、この２つが実質的に統計的に独立していない場合は、用いられないことが確実にされ得る。この２つのマーカーの依存状態によって、それらが二重であること、および第二のマーカーの添加は、マーカーの所定の対の予後力（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｐｏｗｅｒ）に対してさらなる価値を付け加えないことが示され得る。マーカーの所定のパネルの予後力を最適化するためには、このパネルにおける別のマーカーに比較した場合、二重の予後情報を与えるマーカーの使用を最小化することによってシグナル「ノイズ（ｎｏｉｓｅ）」の量を減少させることも所望される。
【００４８】
２つのマーカーの統計的な独立性の評価は、例えば、いくつかの実施形態では、以下のさらなる工程を包含し得る：（１）第一のマーカーに対しておよび相補的なマーカーに対して曝した身体サンプルの第一のセットについての理論的な予後の頻度分布に対して、観察された転帰の頻度分布を比較する工程であって、ここでこの第一のセットの身体サンプルは良好な転帰が既知である患者に対応する工程および；（２）第一のマーカーに対しておよび相補的なマーカーに対して曝した身体サンプルの第二のセットについての理論的な予後の頻度分布に対して、観察された転帰の頻度分布を比較する工程であって、ここでこの第二のセットの身体サンプルは不良な転帰が既知である患者に対応する工程および；（３）カイ二乗（Ｘ２）分析を用いて、少なくとも１つの相補的なマーカーに関して少なくとも１つのマーカーの独立性を評価する工程。
【００４９】
例えば、Ｘ２分析は、ある時点で２つのマーカーを考慮して、患者（身体サンプルに対応する）の転帰を考慮する場合にマーカーの独立性を評価するために行われ得る。表７は、特定のマーカー対について良好および不良な転帰の患者小集団の両方についてどのようにしてＸ２値を得たかの詳細である。１実施例によれば、Ｘ２値は、０．０５というエラー確率（ｐ）で７．８１と計算された。従って、以下の結果を伴うようである：（１）もしＸ２Ｇｏｏｄ＜７．８１であるならば、Ｈ０Ｇｏｏｄは、拒絶できない；（２）もしＸ２Ｂａｄ＜７．８１であるならば、Ｈ０Ｂａｄは、拒絶できない；従って：（３）もし（Ｘ２Ｇｏｏｄ＜７．８１でかつＸ２Ｂａｄ＜７．８１）であるならば、Ｈ０は、拒絶できず、かつこのマーカーは独立しているとはみなせない。
【００５０】
本明細書に開示される方法はまた、コンピューターデバイス（例えば、染色された組織学的スライドまたは細胞学的スライドの画像を獲得するのに適切な顕微鏡システムおよび／または画像分析システムと組み合わされたコンピューターデバイス）上で実行可能であり、かつ本明細書に記載の方法および関連のシステムに関連する種々の機能を達成し得る１つ以上の適切なコンピュータープログラム製品で実現され得る。さらに詳細には、図１および４に図示される方法の実施形態の工程１２０、１３０、１４０および１５０は、理解されるべき方法工程を達成するかそうでなければ施行するための１つ以上の実行可能部分を有するコンピュータープログラム製品で達成され得る。例えば、このようなコンピュータープログラムの実施形態では、この実行可能部分は、コンピューターデバイス（または他の制御デバイス）と、本明細書に含まれる例示的な特徴の付表に記載されかつ詳細である１つ以上の特徴を抽出するために適切な顕微鏡システムまたは画像分析システムとの間の連絡を容易にすることによって、図１および図４に示される工程１２０を達成し得る。例えば、工程１２０によって模式的に図示される実行可能部分は、特定のマーカーの染色特徴に対応する染色された組織学的スライドのデジタル画像（画像分析システムを介して得た）から統計的なデータ（または別の定量化可能な特徴）を抽出し得る。
【００５１】
さらに、本発明のコンピュータープログラム製品の実行可能な部分はまた、網羅的な複数の決定規則の複数の組み合わせ（ある場合には、複数のマーカーの組み合わせおよびその特徴について、可能性のある閾値および／または見なし規則の体系的な評価を含む）の各々に対応するある順序の候補予後を作成するために、複数のスライドの各々から抽出した少なくとも１つの定量化可能な特徴に対する網羅的な複数の候補決定規則の体系的な適用を介して図１および図４に示される工程１３０を達成し得る。
【００５２】
いくつかの実施形態によれば、本発明のコンピュータープログラム製品の実行可能部分はまた、検討中の複数のスライドに対応する各々の患者についての既知の転帰を用いて各々の候補予後についての特異性と感度との対を算出することによって、図１および図４に示される工程１４０を行うかまたは容易にし得る。従って、工程１４０に模式的に図示される実行可能部分は、標的されたおよび／または最適の特異性と感度との対に対応する決定規則を決定し得る。
【００５３】
最終的に、図４の工程１５０に示されるとおり、本発明のコンピュータープログラム製品の実行可能部分はまた、カイ二乗分析または本発明の方法の実施形態に関する上記の他の技術を用いて２つ以上のマーカーのマーカー独立性の決定を指示および／または促進し得る。このような決定はまた、複数のスライド（およびその画像）を撮った患者集団における特定の転帰の有病率を考慮し得る。
【００５４】
従って、当業者は、本発明のコンピュータープログラム製品の実施形態が、マーカーのセットを評価して、標的されたおよび／または最適の特異性および感度レベルにアプローチするかおよび／または達する、マーカーの組み合わせおよびそれに対応する決定規則を決定する場合に生じ得る、閾値、見なし規則および対応する配列に基づく決定規則の複雑な組み合わせを体系的に評価するために利用され得ることを理解する。
【００５５】
当業者は、本発明の方法における任意のまたは全ての工程が、人によって行われるか、あるいは自動化された方式で行われ得ることを理解する。従って、身体サンプル調製（例えば、工程１１０を参照のこと）、サンプル染色（例えば、工程１１０を参照のこと）およびバイオマーカー発現の検出（例えば、工程１２０を参照のこと）の工程は自動化され得る。さらに、ある実施形態では、本発明の免疫組織化学的方法は、病理学者による陽性染色細胞の同定を容易にするために、コンピューター化された画像化装置および／またはソフトウェアと組み合わせて用いられる。本明細書に開示される方法はまた、他の予後予測方法または分析（例えば、腫瘍サイズ、リンパ節状態、他のバイオマーカー（例えば、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｋｉ６７、エストロゲンレセプター（ＥＲ）、プロゲステロンレセプター（ＰＲ）およびｐ５３を含む）の発現レベル）と組み合わされてもよい。この方式では、本明細書に記載される方法を用いるバイオマーカーの最適化および評価は、本発明によって評価される種々のバイオマーカーの過剰発現の検出を容易にして、この種々のバイオマーカーの１つ以上の過剰発現に関連し得る疾患に罹患している患者の予後のより正確な決定を可能にし得る。
【００５６】
さらに、本発明の多くの改変および他の実施形態は、前述の記載および関連の図面、付表および実施例において呈示された教示の利点を有する、本発明が関係する当該分野の当業者には思いつくものである。従って、本発明は開示された特定の実施形態に限定されないこと、そして改変および他の実施形態は添付の特許請求の範囲内に含まれるものであることが理解される。本明細書において特定の用語が使用されるが、それらは、一般的かつ記述的な意味でのみ用いられ、そして限定の目的ではない。
【００５７】
以下の実験的な実施例は、乳癌患者の予後を確立するのに用いられ得る４つの候補バイオマーカーおよび定量化可能な略式の特徴の例示的なパネルを評価するのにおける本発明の実施形態の使用を記載する。これは例示のために提供されるのであって、限定の目的ではない。
【実施例】
【００５８】
（実験的な実施例：乳癌予後を確立するためのバイオマーカー（ＳＬＰＩ、ｐ２１ｒａｓ、Ｅ２Ｆ１およびｓｒｃ）のパネルの評価）
序：  
本明細書に含まれる実験的な実施例によれば、本発明の実施形態は、バイオマーカーであってその過剰発現が種々のタイプの乳癌を有する患者の診断および予後を確立するのに有用であり得るバイオマーカーの組み合わせを評価するために用いられ得る。添付の実験的な実施例の場合、および本発明の他の実施形態において、マーカーのパネルは、最適の配列ベースの決定規則を決定するために評価され得る。「乳癌（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）」とは、例えば、悪性の病変として生検によって分類される状態であるものとする。乳癌予後の臨床的な描写は、医学の分野で周知である。当業者は、乳癌が、例えば、癌腫および肉腫を含む、乳房組織の任意の悪性腫瘍をいうことを理解する。特定の実施形態では、乳癌とは、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ）または粘液性癌である。乳癌はまた、浸潤性導管癌（ＩＤＣ）または浸潤性小葉癌（ＩＬＣ）をいう。本発明のほとんどの実施形態では、目的の被験体は、乳癌と疑われるかまたは実際に乳癌と診断されたヒト患者である。
【００５９】
Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ（ＡＪＣＣ）は、「ＴＮＭ」分類スキームを用いる乳癌病期分類のための標準化システムを開発している。患者は、原発性の腫瘍サイズ（Ｔ）、局所リンパ節状態（Ｎ）および遠隔転移（Ｍ）の有／無について評価され、次いで要因のこの組み合わせに基づいて病期０〜ＩＶに分類される。このシステムでは、原発性の腫瘍サイズは、０〜４のスケールに分類される（Ｔ０＝原発性腫瘍の証拠なし；Ｔ１＝≦２ｃｍ；Ｔ２＝＞２ｃｍ−≦５ｃｍ；Ｔ３＝＞５ｃｍ；Ｔ４＝胸壁または皮膚に直接拡大した任意のサイズの腫瘍）。リンパ節状態は、Ｎ０〜Ｎ３に分類される（Ｎ０＝局所リンパ節に転移がない；Ｎ１＝移動可能な、同じ側の腋窩リンパ節への転移；Ｎ２＝一方に対してまたは他の構造に対して固定された同じ側のリンパ節（単数または複数）への転移；Ｎ３＝胸骨の真下の同じ側のリンパ節への転移）。転移は、遠位の転移が無い（Ｍ０）かまたは存在することによって分類される。任意の臨床段階で乳癌患者の予後を確立するために用いられるマーカーの評価は、本発明によって包含されるが、初期段階の乳癌での乳癌患者の予後を確立するために用いられるマーカーの評価および最適化は、特に目的とされる。「初期段階の乳癌（ｅａｒｌｙ−ｓｔａｇｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）」とは、病期０（その場所の乳癌）、Ｉ（Ｔ１、Ｎ０、Ｍ０）、ＩＩＡ（Ｔ０−１、Ｎ１、Ｍ０またはＴ２、Ｎ０、Ｍ０）およびＩＩＢ（Ｔ２、Ｎ１、Ｍ０またはＴ３、Ｎ０、Ｍ０）であるものとする。初期段階の乳癌患者は、リンパ節転移をほとんどまたは全く示さない。本明細書において用いる場合、「リンパ節転移（ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ）」または「リンパ節状態（ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｓｔａｔｕｓ）」とは、ガンがリンパ節に転移しているか否かをいう。乳癌患者は、これに基づいて、「リンパ節陽性」または「リンパ節陰性」と分類される。乳癌患者を同定して疾患を病期分類する方法は、周知であり、これには手動による検査、生検、患者のおよび／または患者の家族歴の検討、および画像化技術、例えば、マンモグラフィー、核磁気共鳴（ＭＲＩ）およびポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）を挙げることができる。
【００６０】
「予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）」という用語は、当該分野において認識され、そして特に疾患緩和、疾患再発、腫瘍再発、転移および死亡の確率に関して、乳癌または乳癌予後のありそうな経過についての予測を包含する。本明細書に記載される実施例の目的に関して、「良好な予後（ｇｏｏｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）」とは、乳癌に罹患している患者が少なくとも５年間にわたって疾患がない（すなわちガンがない）ままである確率をいうが、「不良な予後（ｐｏｏｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）」とは、５年未満内の、背景にあるガンまたは腫瘍、転移の再燃もしくは再発、または死亡の確率を意味するものとする。「良好な転帰（ｇｏｏｄ  ｏｕｔｃｏｍｅ）」を有すると分類された癌患者は、少なくとも５年間にわたって背景にあるガンまたは腫瘍がないままである。対照的に、「不良な転帰（ｂａｄ  ｏｕｔｃｏｍｅ）」の癌患者は、５年内の疾患再燃、腫瘍再発、転移または死亡を被る。本明細書において用いる場合、予後または疾患なしの生存時間を評価するための相対的な時間は、腫瘍または抑制の外科的な除去、緩和または腫瘍増殖の阻害で始まる。
【００６１】
本明細書において上記されるように、多数の臨床的および予後の乳癌要因は、当該分野で公知であり、そして処置の転帰および疾患の再発の確率を予測するために用いられる。このような要因としては、リンパ節転移、腫瘍サイズ、組織学的等級、エストロゲンおよびプロゲステロンのホルモンレセプター状態（ＥＲ／ＰＲ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕレベルおよび腫瘍倍数性が挙げられる。本発明の方法を用いて、初期段階の乳癌患者の予後を確立するのに用いられるマーカーおよびその特徴の組み合わせの評価は、これらの評価または他の臨床的および予後要因と独立してまたはそれと組み合わせて体系的な方式で達成され得る。
【００６２】
本発明の方法によって、他の公知の予後指標（例えば、リンパ節転移、腫瘍サイズ、組織学的等級、エストロゲンおよびプロゲステロンのレセプターのレベル、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ状態、腫瘍倍数性および家族歴）の分析に比較して乳癌予後の優れた評価が得られるような、候補バイオマーカー（およびその特徴）の体系的な評価が可能になる。
【００６３】
乳癌は、例えば、手術、放射線療法、ホルモン療法、化学療法またはそれらのいくつかの組み合わせを含み得るいくつかの別のストラテジーによって管理される。当該分野で公知であるように、個々の乳癌患者についての処置決定は、転移したリンパ節の数、エストロゲンおよびプロゲステロンレセプターの状態、原発性腫瘍のサイズおよび診断時の疾患の状態に基づき得る。本明細書に開示される方法を用いる診断の時点での不良な予後または良好な予後のリスク群への患者の層別化によって、さらなるまたは別の処置決定作成要因を得てもよい。本発明の方法によって、良好な予後を有する乳癌患者を、再発を被る可能性が高い乳癌患者（すなわち、診断の時点でさらなる積極的な処置が必要であるかまたはその利点があるかもしれない患者）から識別するために用いられる候補バイオマーカーの分析および評価が可能になる。本発明の方法は、初期段階の乳癌患者のより正確な予後を確立するのにおいて候補バイオマーカー（またはバイオマーカーのパネル）の予後価値を最大化するように、適切なバイオマーカー、その特徴および特徴の閾値を選択するのにおいて特定の使用を見出す。上記で考察されるとおり、疾患の初期段階で診断された乳癌患者のほとんどが、外科および／または放射線療法後にアジュバント療法なしに長期生存を享受する。しかし、これらの患者のうちかなりの割合（約２０％）が、疾患再発または死亡を被り、これは、初期段階の乳癌患者の幾例かまたは全てがアジュバント療法（例えば、化学療法）を受けなければならないという臨床的な推奨につながる。本発明の方法は、バイオマーカーおよびその特徴であって、この高リスクの、初期段階の乳癌患者の劣った予後集団をより強調し得る、バイオマーカーおよびその特徴を評価すること、およびそれによって、どの患者が継続したおよび／またはより積極的な治療および処置後の緻密なモニタリングの利益があるかを決定することにおいて用途を見出す。
【００６４】
この実験的な実施例では、本発明の方法を利用して、４つの候補バイオマーカー（ＳＬＰＩ、ｐ２１ｒａｓ、Ｅ２Ｆ１およびｓｒｃ）のパネルおよび各々のバイオマーカーに対応する単一の略式の特徴（画像処理システムを用いて抽出される）を評価した。この実施例は、本発明の１実施形態に従って、最適の配列ベースの決定規則の決定を示す。この実施例において利用される特徴は、病理学者によって目的領域（ＲＯＩ）として特定された乳癌腫瘍領域における１＋、２＋および３＋細胞の割合に関連する。これらの特徴に基づいて、感度および特異性の対は、最適の配列ベースの決定規則（閾値および見なし規則から構成される）を用いて選択されたマーカー／特徴の組み合わせについて最大化された。
【００６５】
（材料および方法：）
この実験的な実施例では、２００例を超える患者を分析して、乳癌予後を確立するために異なるマーカーおよび特徴の組み合わせを評価および最適化した。表４にまとめられるとおり、患者のこの集団は、全く異種であって、Ｔ１Ｎ０〜Ｔ３Ｎ０にまたがる種々の段階の腫瘍を示す。患者の標的化される特徴は、それらの良好な転帰または良好な転帰の状態である。良好な転帰の患者は、５年後に疾患のないままの患者である；不良な転帰の患者は、５年内に再発または死亡を有する患者として規定された。身体サンプルおよびそれからとった対応するスライドは、特異性と感度との対が上記のような各々の可能性のあるマーカー／特徴／閾値の組み合わせについて決定できるように、既知の転帰を有する身体サンプルが得られるように、各々の患者から採取した。
【００６６】
次いで、この研究由来の身体サンプル（表４に概説される同じ患者集団由来）を、４のバイオマーカーのパネルに曝して（表５を参照のこと）、マークされたスライドを本発明の方法に供するように、対応するスライドを作成した。以下の工程は、本発明の方法を、これがこの実験的な実施例に適用されるとおり、強調している：（１）色素原分離は、最良の染色を示した各々のマーカーについて最適であった（第‘４４６号出願および第‘７２９号出願の色素原分離方法に従う）；（２）分割設定は、その細胞下局在化に従って各々のマーカーについてカスタマイズした；表１を参照のこと（核、細胞質または膜）。（また、例示的な特徴の添付の付表に強調されたＮＵＣＬ、ＣＹＴＯおよびＭＥＭＢの特徴も参照のこと）；そして（３）特徴は、規定のＲＯＩ内で、細胞、視野（ＦＯＶ）および焦点のレベルで抽出され、そして出力ファイルに運ばれた（ＸＭＬ形式）。
【００６７】
次いで、本発明の１実施形態による特定のコンピュータープログラム製品（この実施例では「マルチマーカーアナライザー（Ｍｕｌｔｉ  Ｍａｒｋｅｒ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）」と命名される）を用いて、このマーカーの組み合わせの評価および最適化を完了した。１実施形態によれば、このコンピュータープログラム製品は、顕微鏡を用いて得られた組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）または組織切片ＸＭＬファイルのいずれかの全部または一部をローディングされて、ＴＭＡキーを記載しているＸＭＬファイル（ＴＭＡ分析の場合）、または患者の臨床状態および患者評価を得るＥｘｃｅｌファイル（組織切片分析の場合）ならびに全てのさらなる分析を用いて、これらのファイルに含まれるデータを併合し得るように構成される。この併合プロセスは、各々の身体サンプル（各々の患者に対応する）について顕微鏡を介して抽出された特徴と、患者：識別番号および医学的状態（良好または不良な転帰を含む）および病理学者の評価について、それがＸＭＬ形式のファイルに含まれない場合、ＴＭＡキー（またはＥｘｃｅｌファイル）において保持される情報との会合からなる。
【００６８】
表５は、この実施例において評価されたマーカー（ＳＬＰＩ、ｐ２１ｒａｓ、Ｅ２Ｆ１およびｓｒｃ）および各々のマーカータイプについて抽出された対応するＣＥＬＬ＿ＰＥＲＣＥＮＴ略式の特徴を列挙する（この実施例は、４つのマーカーについての配列ベースの決定規則の評価を示しており、ここでは単一のマーカー／単一の特徴の閾値を分析して、最適の配列ベースの決定規則を決定した）。この決定規則は、図１に概説される本発明の方法を用いて作成され、ここでこの予測される予後（マーカーの各々の可能性のある配列について、この各々のマーカーは、「オン（ｏｎ）」（１）または「オフ（ｏｆｆ）」（０）のいずれかである。各々の特定のマーカーについて評価された特徴についての閾値を決定するために（表５を参照のこと）、各々の可能性のある閾値の量（０〜１００％）を分析して、この実施例について身体サンプルを採取した研究における種々の患者についての転帰と比較した。例えば、図５は、Ｅ２Ｆ１マーカーに対応するＣＥＬＬ＿ＰＥＲＣＥＮＴ＿２についての分布曲線を示す。このプロットは、不良な転帰の患者５２０の分布および良好な転帰の患者５１０の分布を、ＣＥＬＬ＿ＰＥＲＣＥＮＴ＿２値の関数として示す。図５に示されるように、上限を２〜３パーセント上って、不良な転帰の患者（５２０）は、良好な転帰の患者（５１０）よりも有意に高い頻度である。２．４６％の閾値５５０を用いて、予後の指標としてＥ２Ｆ１マーカー単独の使用でそれぞれ０．５４および０．７５という感度および特異性が得られる。表５のカラム３は、図５におけるデータからのＥ２Ｆ１マーカーについて決定された得られた決定規則を示す（これは、２．４６％の閾値およびＥ２Ｆ１についての見なし規則（２．４６％より大きいＣＥＬＬ＿ＰＥＲＣＥＮＴ＿２である場合「オン」）の両方を含む）。
【００６９】
候補予後（配列の各々の可能性のある組み合わせに対応する）を生成し、次いで真の陽性２１０、偽陽性２２０、偽陰性２３０および真の陰性２４０の数を決定するために、図２における象限系を用いて評価される各々の身体サンプルについて実際の転帰と比較した。上記に詳細に記載されるように、一旦適切な象限にプロットされれば、各々の可能性のある決定規則に対応する特異性および感度の値を算出した（このような計算の結果は表６に示す）。表６のデータから決定された配列ベースの決定規則は、以下のように読むことができる：Ｅ２Ｆ１がＯＮ（すなわち１）であり、かつＯＮである唯一のマーカーではないならば、この患者は、不良な転帰、そうでなければ良好な転帰とみなされる。
【００７０】
結果：  
ＳＬＰ１、ｐ２１ｒａｓ、Ｅ２Ｆ１およびｓｒｃについての唯一の割合の特徴を、表５に規定される閾値および決定規則とともに用いて、６０％の感度および８０％の特異性が、むしろ単一の配列ベースの決定規則を用いてこのサンプルセットで達成された：Ｅ２Ｆ１がＯＮ（すなわち１）であり、かつＯＮである唯一のマーカーではないならば、この患者についての最適な予後は、不良な転帰である。従って、この患者についての予後は、そうでなければ良好な転帰である。
【００７１】
上記のとおり、Ｅ２Ｆ１単独に基づく予後決定規則は、それぞれ、５４％および７５％の感度および特異性を与える。しかし、解釈に基づくマーカー組み合わせを用いて、Ｅ２Ｆ１がＯＮであり、かつＳＬＰＩ，ｐ２１ｒａｓまたはｓｒｃのいずれかがＯＮである場合、６０％の感度および８０％の特異性がもたらされる（表６の結果によって規定される配列ベースの決定アルゴリズムを用いて）。
【００７２】
（付表：例示的な特徴）
以下の特徴は、例えば、コンピューターデバイスのような制御装置と組み合わせて、画像化システムまたはビデオ−顕微鏡システムを用いて、身体サンプル（例えば、染色された組織学的スライドまたは細胞学的スライド）の画像から調製され得る定量化可能な特徴のタイプの徴候である。さらに、以下の特徴を、本明細書に記載のコンピュータープログラム製品の実施形態を用いて抽出および／または計算してもよい。いくつかの実施形態では、特定の標的分子の過剰発現（および得られた色素染色）に関連し得る特定の疾患についての予後徴候に対応し得る値を定量するために臨床家によって容易に利用され得る略式の特徴を構築するために、以下の特徴を計算および／または組み合わせてもよい。
【００７３】
特徴の以下の付表は、例示の目的で提供されるものであって、限定のためではないことが理解されるべきである。当業者は、他の特徴が目的の特徴であってもよく、そして本発明の方法およびコンピュータープログラムの製品の実施形態を用いて１つ以上のマーカーを評価するために抽出かつ分析されてもよいことを理解する。
【００７４】
（Ａ．形状記述子特徴）
（１．面積（ＡＲＥＡ））
これは、ブロブ（ｂｌｏｂ）中の前面のピクセル数であり（ホールはカウントしない）、マスク（２進法表示）はＭである。ピクセル−ミクロン対応（ｋ）が利用可能である場合、これはスライド上のブロブ（Ｍ）の物理的面積を表す（マイクロメートル２）。ピクセル−ミクロンの物理的対応（ｋ）が利用可能でない場合、面積（ＡＲＥＡ）は測定されたピクセルの数である（ｋ＝１）。
【００７５】
【化４】
2008513793.tif 000006
ここで、Ｅ＝｛ｐ｜ｐ∈Ｍ｝であり、
範囲は、［０，∞［である。
【００７６】
（２．周長（ＰＥＲＩＭＥＴＥＲ））
これは、ブロブの稜（任意のホールの稜を含む）のトータルの長さであり、マスク（２進法表示）はＭである。ここで、対角の稜がデジタル化される場合に生成される階段効果についても考慮に入れる（内側の角は、２ではなく、√２としてカウントされる）。単一のピクセルのブロブ（面積＝１）は、４．０という周長を有する。ピクセル−ミクロン対応（ｋ）が利用可能である場合、これはスライド上のブロブ（Ｍ）の物理的周長を表す（マイクロメートル）。ピクセル−ミクロンの物理的対応が利用可能でない場合（ｋ＝１）。
【００７７】
【化５】
2008513793.tif 000007
ｐが内部でかつｐが角である場合、ｑ（ｎｐ）＝√２であり、
それ以外の場合、ｑ（ｎｐ）＝４−Σ（ｔ，ｌ，ｒ，ｂ）である。
範囲は、［０，∞［である。
【００７８】
（３．ＭＩＮＦＥＲＥＴ）
これは、最小Ｆｅｒｅｔ直径（ある特定数の角をチェックした後に見出される、対象物にフィットする長方形のボックスの最小境界直径）である。ピクセル−ミクロン対応（ｋ）が利用可能である場合、これはスライド上のブロブ（Ｍ）の物理的なＭｉｎＦｅｒｅｔ直径を表す（マイクロメートル）。ピクセル−ミクロンの物理的対応が利用可能でない場合（ｋ＝１）。
範囲は、［０，∞［である。
【００７９】
（４．ＭＡＸＦＥＲＥＴ）
これは、最大Ｆｅｒｅｔ直径（ある特定数の角をチェックした後に見出される、対象物にフィットする長方形のボックスの最大境界直径）である。ピクセル−ミクロン対応（ｋ）が利用可能である場合、これはスライド上のブロブ（Ｍ）の物理的なＭａｘＦｅｒｅｔ直径を表す（マイクロメートル）。ピクセル−ミクロンの物理的対応が利用可能でない場合（ｋ＝１）。
範囲は、［０，∞［である。
【００８０】
（５．コンパクト度（ＣＯＭＰＡＣＴＮＥＳＳ））
この値は、円について最小であり（１．０）、そして周長（Ｐ）と面積（Ａ）とから得られる。形状が回旋状であればあるほど、この値は大きくなる。
【００８１】
【化６】
2008513793.tif 000008
範囲は、［１，∞［である。
【００８２】
（６．粗さ（ＲＯＵＧＨＮＥＳＳ））
これは、ブロブがどれほど粗いかの尺度であり、周長（Ｐ）を凸面の周長（Ｐｃ）で割ったものに等しい。滑らかな凸面の対象物は、１．０という最小の粗さを有する。
【００８３】
【化７】
2008513793.tif 000009
範囲は、［０，１］である。
【００８４】
（７．ＥＬＯＮＧＡＴＩＯＮ）
この値は、真の長さ／幅に等しい。これは、細長い対象物に用いられるべきである。
範囲は、［０、∞［である。
【００８５】
（Ｂ．ヒストグラム記述子特徴）
（１．合計（ＳＵＭ））
ＳＵＭは、個々のピクセルスコア全ての合計である。
【００８６】
【化８】
2008513793.tif 000010
範囲は、透過率、および光学密度について［０，∞［である。
【００８７】
（２．平均値（ＭＥＡＮ））
算術的な平均値は、一般に平均と呼ばれるものである：「平均値（ｍｅａｎ）」という言葉は、修飾語なしで用いる場合、算術的な平均値を指すものと仮定され得る。この平均値は、全てのスコアの合計をスコアの数で割ったものである。平均値はほぼ対称な分布の中心の傾向の優れた尺度であるが、非対称な分布ではミスリードされ得る。なぜなら、これは、極端なスコアによって大きく影響され得るからである。従って、中央値のような他の統計値が、高頻度に極めて非対称な反応時間または家計所得のような分布についてのさらなる情報であり得る。
【００８８】
それらの平均値からのスコアの二乗偏差の合計は、任意の他の数からのそれらの二乗偏差よりも小さい。
【００８９】
正規分布に関しては、平均は最も有効である。従って中心の傾向の全ての尺度のサンプル変動に対して最も影響を受けない。
【００９０】
【化９】
2008513793.tif 000011
範囲は透過率について、［０，１］であり、
範囲は光学密度について、［０．００００，２．４０６５］である。
【００９１】
（３．最小値（ＭＩＮ））
最小値とは、分布の最小値である。
【００９２】
【化１０】
2008513793.tif 000012
範囲は透過率について、［０，１］であり、
範囲は光学密度について、［０．００００，２．４０６５］である。
【００９３】
（４．Ｑ１）
Ｑ１は、分布の２５番目のパーセンタイルである。スコアの２５％はＱ１の下であり、そして７５％はＱ１の上である。
【００９４】
【化１１】
2008513793.tif 000013
範囲は透過率について、［０，１］であり、
範囲は光学密度について、［０．００００，２．４０６５］である。
【００９５】
（５．中央値（ＭＥＤＩＡＮ））
中央値は、分布の中央である：スコアの半分が中央値の上であり、半分が中央値の下である。この中央値は、極端なスコアに対しては平均よりも感度が低い。このため、中央値は、高度に非対称な分布については平均値よりも優れた尺度になる。
【００９６】
中央値からの各数の絶対偏差の合計は、任意の他の数からの絶対偏差の合計よりも低い。
【００９７】
平均値、中央値および最頻値は、対称的な分布では等しい。平均は、正に傾斜した分布においては中央値よりも高く、負に傾斜した分布においては中央値よりも低い。
【００９８】
【化１２】
2008513793.tif 000014
範囲は透過率について、［０，１］であり、
範囲は光学密度について、［０．００００，２．４０６５］である。
【００９９】
（６．Ｑ３）
Ｑ３は、分布の７５番目のパーセンタイルである。スコアの７５％はＱ３の下であり、そして２５％はＱ３の上である。
【０１００】
【化１３】
2008513793.tif 000015
範囲は透過率について、［０，１］であり、
範囲は光学密度について、［０．００００，２．４０６５］である。
【０１０１】
（７．最大値（ＭＡＸ））
最大値は、分布の最大値である。
【０１０２】
【化１４】
2008513793.tif 000016
範囲は透過率について、［０，１］であり、
範囲は光学密度について、［０．００００，２．４０６５］である。
【０１０３】
（８．最頻値（ＭＯＤＥ））
最頻値は、分布において最も頻繁に存在するスコアであり、中心の傾向の尺度として用いられる。中心の傾向の尺度としての最頻値の利点は、その意味が明らかであるということである。さらに、これは名目データとともに用いられ得る中心の傾向の唯一の尺度である。
【０１０４】
最頻値は、サンプル変動に対して大きく影響を受ける。従って、中心の傾向の唯一の尺度として用いることは推奨されない。この最頻値のさらなる不利な点は、多くの分布が２つ以上の最頻値を有することである。これらの分布は「多モード」と呼ばれる。
【０１０５】
正規分布では、平均値、中央値および最頻値は同一である。
【０１０６】
【化１５】
2008513793.tif 000017
範囲は透過率について、［０，１］であり、
範囲は光学密度について、［０．００００，２．４０６５］である。
【０１０７】
（９．３平均値（ＴＲＩＭＥＡＮ））
３平均値は、２５番目のパーセンタイル＋５０番目のパーセンタイル（中央値）の二倍＋７５番目のパーセンタイルを加算して４で割ることによって算出される。
【０１０８】
３平均値はほとんど、中央値として極端なスコアに影響を受けず、そして非対称な分布においては算術的平均値よりもサンプリングの変動には支配されにくい。これは正規分布についての平均よりも有効ではない。
【０１０９】
【化１６】
2008513793.tif 000018
範囲は透過率について、［０，１］であり、
範囲は光学密度について、［０．００００，２．４０６５］である。
【０１１０】
（１０．トリム平均（ＴＲＩＭＭＥＤＭＥＡＮ）５０）
トリム平均は、特定の割合の最低スコアおよび最高スコアを捨て、残りのスコアの平均を算出することによって計算される。５０％トリム平均は、スコアの低方２５％および高方２５％を捨て、残りのスコアの平均を取ることによって、算出される。中央値とは、１００％トリム平均であり、そして算術的平均値とは０％トリム平均である。
【０１１１】
トリム平均は明白に、算術的な平均値よりも、極端なスコアの影響は受けにくい。従って、非対称な分布の平均値よりも、サンプリングの変動に対する影響を受けにくい。これは正規分布については平均値よりも有効でない。
【０１１２】
【化１７】
2008513793.tif 000019
範囲は透過率について、［０，１］であり、
範囲は光学密度について、［０．００００，２．４０６５］である。
【０１１３】
（１１．範囲（ＲＡＮＧＥ））
範囲とは、散らばりまたはばらつきの最もシンプルな尺度である：これは、最大の値と最も簡単な値との差に等しい。この範囲は、散らばりの有用な尺度であり得る。なぜなら、これはそのように容易に理解されるからである。しかし、これは極端なスコアに対しては極めて鋭敏である。なぜなら、わずか２つの値に基づくだけであるからである。この範囲はほぼ、散らばりの唯一の尺度としては用いられるべきではないが、標準偏差または半−四分位範囲のような散らばりの他の尺度に対する補充として用いられる場合、有益であり得る。
【０１１４】
【化１８】
2008513793.tif 000020
範囲は透過率について、［０，１］であり、
範囲は光学密度について、［０．００００，２．４０６５］である。
【０１１５】
（１２．半−四分位範囲（ＳＥＭＩＩＮＴＥＲＱＵＡＲＴＩＬＥＲＡＮＧＥ）
半−四分位範囲は、散らばりまたはばらつきの尺度である。これは、７５番目のパーセンタイル（しばしば（Ｑ３）と呼ばれる）と２５番目のパーセンタイル（Ｑ１）との差の二分の一として算出される。
【０１１６】
ある分布におけるスコアの半分は、Ｑ３とＱ１との間にあるので、半−四分位範囲は、スコアの１／２をカバーするのに必要な距離の１／２である。対称的な分布では、中央値の下の１つの半−四分位範囲から中央値の上の１つの半−四分位範囲まで広がる区間は、このスコアの１／２を含む。しかし、これは、非対称な分布については真ではない。
【０１１７】
この半−四分位範囲は、極端なスコアの影響はほとんど受けない。なぜなら、これは、非対称な分布については散らばりの良好な尺度であるからである。しかし、これは、標準偏差よりも正規分布におけるサンプルの変動の影響を受けやすい。従って、ほぼ正規的に分布しているデータについてはあまり用いられない。
【０１１８】
【化１９】
2008513793.tif 000021
範囲は透過率について、［０，１］であり、
範囲は光学密度について、［０．００００，２．４０６５］である。
【０１１９】
（１３．分散（ＶＡＲＩＡＮＣＥ））
分散は、分布がどの程度散らばっているかの尺度である。これは、平均値からの各数の平均二乗偏差として計算される。
【０１２０】
【化２０】
2008513793.tif 000022
範囲は、［０，∞［である。
【０１２１】
（１４．標準偏差（ＳＴＤＥＶ））
この特徴は、サンプルに基づく標準偏差を評価する。標準偏差は、値が平均の値（平均値）からどの程度広く分散しているかの尺度である。この標準偏差は、分散の平方根である。これは、散らばりの最も一般に用いられる尺度である。
【０１２２】
極端なスコアに対して範囲よりは感度はないが、標準偏差は半四分位範囲よりも感度がある。従って、半四分位範囲は、極端なスコアの可能性が存在する場合に標準偏差を補完するはずである。
【０１２３】
【化２１】
2008513793.tif 000023
範囲は、［０，∞［である。
【０１２４】
（１５．歪曲（ＳＫＥＷ））
この特徴は、分布の歪度を返す。歪度は、平均値まわりの分布の非対称の程度を特徴付ける。分布は、一方のテールがもう一方よりも長い場合に歪む。正の歪度は、より正の値に向かって広がる非対称のテールを有する分布を示す。負の歪度は、より負の値に向かって広がる非対称のテールを有する分布を示す。
【０１２５】
【化２２】
2008513793.tif 000024
範囲は、］−∞，＋∞［であり、
Ｓはサンプル標準偏差である。
【０１２６】
（１６．尖度（ＫＵＲＴＯＳＩＳ））
この特徴は、データセットの尖度を返す。尖度は、正規分布と比較した分布の相対的な先鋭度または平坦度を特徴付ける。正の尖度は、比較的先鋭な分布を示す。負の尖度は、比較的平坦な分布を示す。尖度は分布のテールのサイズに基づく。
【０１２７】
【化２３】
2008513793.tif 000025
範囲は、］−∞，＋∞［であり、
Ｓはサンプル標準偏差である。
【０１２８】
（Ｃ．透過率および光学密度特徴（ＴＲＡＮＳ、ＯＤなど））
（１．ＴＲＡＮＳ−透過率）
透過率は、入射光束に対する、透過性物体によって透過されたトータルの光点または光束の比である（通常は垂直入射について与えられる）。
【０１２９】
【化２４】
2008513793.tif 000026
範囲は、［０，１］である。
【０１３０】
画像内では、透過率は８ビットで特徴付けられ、［０，２５５］範囲内で２５６の値をもたらす。背景にある計算が、このような離散値に基づく場合、しかし、計算された特徴は、［０，１］の範囲中で０％〜１００％の透過率で表される。
【０１３１】
【化２５】
2008513793.tif 000027
（２．ＯＤ−光学密度）
光学密度は、透過率の対数の負の値として、透過率に関連する。画像内では、透過率は、８ビットで識別され、［０，２５５］範囲内で２５６の値をもたらす。
【０１３２】
【化２６】
2008513793.tif 000028
範囲は、透過率の８ビットの識別に起因して、［０．００００，２．４０６５］であり一時的なＯＤ画像バッファも離散バッファである。
【０１３３】
【化２７】
2008513793.tif 000029
背景にある計算がこのような離散値に基づく場合、しかし、計算された特徴は、０から無限（理論上）に及ぶ実ＯＤ値に従って表現され、実際には８ビットの制約に起因して２．４０６５へ上限をおく。
【０１３４】
３．輝度および色素特徴（ＬＵＭＩＮ、ＤＹＥ１、ＤＹＥ２、ＤＹＥ３）
透過率または光学密度ヒストグラム上で計算したヒストグラム特徴は、ＲＧＢ画像の輝度（「ＬＵＭＩＮ」）またはピクセル（Ｒ、Ｇ、Ｂ）値（「ＤＹＥ１」、「ＤＹＥ２」、または「ＤＹＥ３」）についての色素原モデルを解析した後に算出された目的の色素のいずれかを反映する。ＲＧＢ色素原分離モデルは、例えば、‘４４６号出願および‘７２９号出願に記載される。
【０１３５】
ＬＵＭＩＮ（Ｙ）＝０．２９９Ｒ  ０．５８７Ｇ＋０．１１４Ｂ従来の浮動小数点式（３３）
ＬＵＭＩＮ（Ｙ）＝［（９７９８Ｒ＋１９２３５Ｇ＋３７３６Ｂ）／３２７６８］コードによって用いられる式（３４）
注記：色素原の誤差、色素の確かさ
解析した場合、ＲＧＢ色素原分離モデルは、再構築誤差を評価するが、これは各々の色素の寄与に由来するＲＧＢ値の再構築に基づいてピクセルの入力ＲＧＢと再計算されたＲＧＢとの間のＲＧＢ空間内のユークリッド距離である。この誤差は、上記のＲＧＢ色素原分離モデルの方法および装置を用いて報告された目的の対象物の各々全てのピクセルについて評価され得る。
【０１３６】
シェーディング補正および画像正規化を行うために用いられる白色参照画像を獲得する場合、光学システム内で記録された各々のＲＧＢ値およびノイズレベル（ＮＯＩＳＥ）について測定した色素原の誤差に依存して、確かさは、このピクセルについて評価される透過率が、異なる透過率の間を識別するためのヒトの眼の能力から統計的に変化していない確率に基づいて、各々の色素について算出される。
【０１３７】
Ｄ．階層的記述子特徴
スライド（例えば、組織学的スライド）またはスライドの画像内で異なる階層的な対象（例えば、細胞、細胞膜、核または他の対象物）に対して特徴を計算する場合、この特徴は、以下の階層的な参照視野に関して評価され得る：その対象物に関してスライド（ＳＬＩＤＥ）、焦点（ＦＯＣＵＳ）、視野（ＦＯＶ）または細胞（ＣＥＬＬ）。
【０１３８】
・スライド：「ＳＬＩＤＥ」、および関連の「ＦＯＣＵＳ」、「ＦＯＶ」、「ＣＥＬＬ」
・焦点：「ＦＯＣＵＳ」、および関連の「ＦＯＶ」、「ＣＥＬＬ」
・視野：「ＦＯＶ」、および関連の「ＣＥＬＬ」
・細胞：「ＣＥＬＬ」。
【０１３９】
Ｅ．細胞の記述子特徴
細胞特徴を計算する場合、その特徴は、以下の細胞または細胞下位置の１つ以上において反映される：細胞全体（ＣＥＬＬ）、核（ＮＵＣＬ）、細胞質（ＣＹＴＯ）または細胞膜（ＭＥＭＢ）。
【０１４０】
・細胞全体：「ＣＥＬＬ」
・核：「ＮＵＣＬ」
・細胞質：「ＣＹＴＯ」
・膜：「ＭＥＭＢ」。
【０１４１】
付随する表：  
（表１：例示的なマーカーおよびそれらのそれぞれの細胞下局在のリスト）
【０１４２】
【表１】
2008513793.tif 000030
（表２：選択された細胞のカテゴリー１、２または３への見なすことをもたらすディスパッチャー設定）
【０１４３】
【表２】
2008513793.tif 000031
（表３：略式の特徴のパーセンテージ）
【０１４４】
【表３】
2008513793.tif 000032
（表４：身体サンプルを採取した患者の詳細および転帰（例示的な実施例））
【０１４５】
【表４】
2008513793.tif 000033
（表５：例示的な実施例のための略式の特徴のパーセンテージ（配列ベースの決定規則のために決定された閾値を示す））
【０１４６】
【表５】
2008513793.tif 000034
（表６：例示的な実施例由来のＳＬＰＩ、ｐ２１ｒａｓ、Ｅ２Ｆ１およびＳＲＣの組み合わせのための配列解釈アプローチを用いる感度および特異性の対。（配列Ｓ０１１０は、以下のように読み取られなければならない：ＳＬＰＩ＝ＯＦＦ／ｐ２１ｒａｓ＝ＯＮ／Ｅ２Ｆ１＝ＯＮ／ｓｒｃ＝ＯＦＦ））
【０１４７】
【表６】
2008513793.tif 000035
（表７：良好な転帰の患者についてのＸ２値（Ｘ２Ｇｏｏｄ）および不良な転帰の患者についてのＸ２値（Ｘ２Ｂａｄ）の計算が得られるＸ２分析式の詳細）
【０１４８】
【表７】
2008513793.tif 000036
本明細書において言及される全ての刊行物および特許出願は、本発明が関与する当該分野の当業者のレベルの指標となる。全ての刊行物および特許出願は本明細書において、各々の個々の刊行物および特許出願が特異的にかつ個々に参照によって援用されるように示されるのと同じ程度まで参照によって援用される。
【０１４９】
前述の本発明は、理解の明確化の目的のために図示および実施例によっていくらか詳細に記載されているが、添付の実施形態の範囲内において、特定の変化および改変が実施され得ることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】図１は、本発明の１実施形態による少なくとも１つのマーカーを評価するための方法およびコンピュータープログラム製品のブロック図を示す。
【図２】図２は、対応する実際の転帰に比較した場合に候補予後がその中に存在し得る４つの可能性のある象限のグラフ表示を示す−示した象限を用いて、候補予後についての感度および特異性を作成してもよい；
【図３】図３は、マーカーの特徴および／または閾値の最適の組み合わせを選択して、本発明の１実施形態によるマーカーまたはマーカーの組み合わせによって達成された予後の感度および特異性の両方を最大化するために用いられ得る、プロットされた感度および特異性の対のＲＯＣ曲線の例を示す。
【図４】図４は、本発明の１実施形態に従って、少なくとも１つのマーカーを評価し、そして少なくとも１つの相補的なマーカーに関してこの少なくとも１つのマーカーの独立性を評価するための方法およびコンピュータープログラム製品のブロック図を示す。
【図５】図５は、候補閾値のスケールに対して良好および不良な転帰の分布をプロットすることによる、単独のマーカー分析における所定の特徴についての最適閾値の決定の視覚表示を示す。
【図１】
2008513793.tif 000037
【図２】
2008513793.tif 000038
【図３】
2008513793.tif 000039
【図４】
2008513793.tif 000040
【図５】
2008513793.tif 000041
【手続補正書】
【提出日】平成18年7月20日(2006.7.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガン患者の予後を決定するために少なくとも１つのマーカーを分析するための方法であって：
該少なくとも１つのマーカーに対して身体サンプルを曝露する工程であって、該身体サンプルはガン患者から採取されている、工程と；
画像処理システムを用いて少なくとも１つのスライドから撮った画像から少なくとも１つの定量化可能な特徴を抽出する工程であって、該少なくとも１つの定量化可能な特徴は該画像の色素原分離から少なくとも部分的に決定され、該少なくとも１つのスライドは該身体サンプルから調製される工程と；
該少なくとも１つの定量化可能な特徴に対して決定規則を適用して、該少なくとも１つの定量化可能な特徴と該決定規則との間の関係に基づいて該ガン患者の予後を決定する工程と；
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記適用工程が、前記少なくとも１つの定量化可能な特徴に対してある閾値を適用して、該少なくとも１つの定量化可能な特徴と該閾値との間の関係に基づいて前記ガン患者の予後を決定する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記適用工程がさらに、前記閾値について見なし規則を適用する工程を包含し、該見なし規則が、該閾値に関連する少なくとも１つの定量化可能な特徴のうちのある値に対応する良好な予後または不良な予後のいずれかを確立し得る、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記抽出工程がさらに、目的領域であって、それから前記少なくとも１つの定量化可能な特徴を抽出する領域を特定する工程を包含し、該目的領域が、前記画像処理システムを用いて前記少なくとも１つのスライドから撮った画像内である、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記少なくとも１つのマーカーが：
比色定量的なバイオマーカー；
ＳＬＰＩ；
ＰＳＭＢ９；
ＮＤＲＧ−１；
Ｍｕｃ−１；
ホスホ−ｐ２７；
ｓｒｃ；
Ｅ２Ｆ１；
ｐ２１ｒａｓ；
ｐ５３；および
それらの組み合わせ、
からなる群より選択される、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記少なくとも１つの定量化可能な特徴が：
透過率；
光学密度；
細胞形態；
マーカー強度および細胞形態によって特徴付けられた細胞タイプの割合；ならびに
それらの組み合わせ、
からなる群より選択される、方法。
【請求項７】
少なくとも１つのマーカーを分析して、ガン患者の予後を決定するために画像処理システムを制御し得るコンピュータープログラム製品であって、該コンピュータープログラム製品は、コンピューター読み取り可能な記憶媒体を備え、該媒体はその中に記憶されたコンピューター読み取り可能なプログラムコード部分を有し、該コンピューター読み取り可能なプログラムコード部分は：
画像処理システムを用いて少なくとも１つのスライドから撮った画像から少なくとも１つの定量化可能な特徴を抽出するための実行可能部分であって、該少なくとも１つの定量化可能な特徴は該画像の色素原分離から少なくとも部分的に決定され、該少なくとも１つのスライドは、ガン患者から採取した身体サンプルから調製され、該身体サンプルは、該少なくとも１つのマーカーに曝されている、実行可能部分と；
該少なくとも１つの定量化可能な特徴に対して決定規則を適用して、該少なくとも１つの定量化可能な特徴と該決定規則との間の関係に基づいて該ガン患者の予後を決定するための実行可能部分と；
を備える、コンピュータープログラム製品。
【請求項８】
請求項７に記載のコンピュータープログラム製品であって、適用するための前記実行可能部分が、前記少なくとも１つの定量化可能な特徴に対して閾値を適用して、該少なくとも１つの定量化可能な特徴と該閾値との間の関係に基づいて前記ガン患者の予後を決定するための実行可能部分をさらに含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項９】
請求項８に記載のコンピュータープログラム製品であって、適用するための前記実行可能部分が、前記閾値についての見なし規則を適用するための実行可能部分をさらに含み、該見なし規則が、該閾値に関して前記少なくとも１つの定量化可能な特徴の値に対応する良好な予後または不良な予後のいずれかを確立し得る、コンピュータープログラム製品。
【請求項１０】
ガン患者の予後を決定するために適合された少なくとも１つのマーカーを評価するための方法であって、該方法は：
該少なくとも１つのマーカーに対して複数の身体サンプルを曝露する工程であって、該複数の身体サンプルは、各々既知の転帰を有する、対応する複数の患者から採取されている工程と；
画像処理システムを用いて複数のスライドの各々から撮った画像から少なくとも１つの定量化可能な特徴を抽出する工程であって、該少なくとも１つの定量化可能な特徴は該画像の色素原分離から少なくとも部分的に決定され、該複数のスライドが、各々の患者に対応する該複数の身体サンプルから調製されている工程と；
該複数のスライドの各々の少なくとも１つの定量化可能な特徴に対して複数の候補の決定規則を適用して、該複数の候補決定規則および該少なくとも１つの定量化可能な特徴の複数の組み合わせの各々について候補予後を提供する工程と；
最適な予後に対応する最適な決定規則を選択する工程であって、該最適な決定規則は、該少なくとも１つの定量化可能な特徴に関する候補決定規則から選択され、該最適な決定規則は該複数のスライドの各々についての最適な予後が該複数の患者の各々についての既知の転帰に最適に対応することを提供する、工程と、
を包含する、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記適用工程が、前記少なくとも１つの定量化可能な特徴に対して複数の候補閾値を適用して、前記複数の身体サンプルの各々についての該複数の候補閾値の各々に対応する複数の候補予後を生じる工程をさらに包含し、かつ前記選択工程が、前記複数のスライドの各々についての最適な予後が、前記複数の患者の各々についての既知の転帰に対して最適に対応するように、該複数の候補閾値から最適閾値を選択する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記適用工程がさらに、前記複数の候補閾値の各々についての見なし規則を決定する工程をさらに包含し、該見なし規則は、該複数の候補閾値の各々に関する少なくとも１つの定量化可能な特徴のうちの１つの値に対応する良好な予後または不良な予後のいずれかを確立し得る、方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の方法であって、前記選択工程がさらに：
前記複数の候補決定規則の各々に対応する複数の特異性と感度との対を決定する工程と；
該複数の特異性と感度との対を、受信者動作特性曲線上にプロットする工程と；
各々の前記複数の特異性と感度との対、および最適特異性と感度との対の間の複数のユークリッド距離を算出する工程と；
該最適特異性と感度との対に対して最小のユークリッド距離を有する特異性と感度との対に対応する最適な決定規則を選択する工程と；
を包含する、方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載の方法であって、前記抽出工程がさらに、前記少なくとも１つの定量化可能な特徴を抽出する目的領域を同定する工程を包含し、該目的領域が、前記画像処理システムを用いて複数のスライドの各々から撮った画像内である、方法。
【請求項１５】
請求項１０に記載の方法であって、前記少なくとも１つのマーカーの統計的な独立性を評価して、該少なくとも１つのマーカーが、少なくとも１つの相補的なマーカーと実質的に統計的に独立している予後を提供し得ることを保証する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記評価工程がさらに：
観察された転帰の頻度分布を、算出された理論上の予後の頻度分布と比較する工程であって、ここで、前記少なくとも１つのマーカーが、該少なくとも１つのマーカーおよび前記少なくとも１つの相補的なマーカーに曝された第一の複数の身体サンプルのさらなるマーカーと独立しており、該第一の複数の身体サンプルが既知の良好な転帰を有する患者に対応するならば、以下の工程を行う、工程、
観察された転帰の頻度分布を、算出された理論上の予後の頻度分布と比較する工程であって、ここで、該少なくとも１つのマーカーが、該少なくとも１つのマーカーおよび該少なくとも１つの相補的なマーカーに曝された第二の複数の身体サンプルの該さらなるマーカーと独立しており、該第二の複数の身体サンプルが既知の不良な転帰を有する患者に対応するならば、以下の工程を行う、工程、
該少なくとも１つの相補的なマーカーに関して該少なくとも１つのマーカーの独立性を評価する工程と、
を包含する、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記評価工程がさらに、カイ二乗分析を用いて前記少なくとも１つの相補的なマーカーに関して前記少なくとも１つのマーカーの独立性を評価する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１０に記載の方法であって、前記少なくとも１つのマーカーが：
比色定量的なバイオマーカー；
ＳＬＰＩ；
ＰＳＭＢ９；
ＮＤＲＧ−１；
Ｍｕｃ−１；
ホスホ−ｐ２７；
ｓｒｃ；
Ｅ２Ｆ１；
ｐ２１ｒａｓ；
ｐ５３；および
それらの組み合わせ、
からなる群より選択される、方法。
【請求項１９】
請求項１０に記載の方法であって、前記少なくとも１つの定量化可能な特徴が：
透過率；
光学密度；
細胞形態；
マーカー強度および細胞形態によって特徴付けられた細胞タイプの割合；ならびに
それらの組み合わせ、
からなる群より選択される、方法。
【請求項２０】
ガン患者の予後を決定するために適合した少なくとも１つのマーカーを評価するための画像処理システムを制御し得るコンピュータープログラム製品であって：該コンピュータープログラム製品は、コンピューター読み取り可能な記憶媒体を備え、該媒体はその中に記憶されたコンピューター読み取り可能なプログラムコード部分を有し、該コンピューター読み取り可能なプログラムコード部分は：
画像処理システムを用いて複数のスライドの各々から撮った画像から少なくとも１つの定量化可能な特徴を抽出するための実行可能部分であって、該少なくとも１つの定量化可能な特徴は該画像の色素原分離から少なくとも部分的に決定され、該複数のスライドは、各々既知の転帰を有する、対応する複数の患者から採取した複数の身体サンプルから調製され、該複数の身体サンプルは、該少なくとも１つのマーカーに曝されている、実行可能部分と；
該複数のスライドの各々の該少なくとも１つの定量化可能な特徴に対して網羅的な複数の候補決定規則を適用して、該網羅的な複数の候補決定規則および該少なくとも１つの定量化可能な特徴との複数の組み合わせの各々について候補予後を提供するための実行可能部分と；
最適な予後に対応する最適な決定規則を選択するための実行可能部分であって、該最適な決定規則は、該少なくとも１つの定量化可能な特徴についての候補決定規則から選択され、該最適な決定規則は、該複数のスライドの各々についての最適な予後が該複数の患者の各々について既知の転帰に最適に対応することを提供する、実行可能部分と、
を含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項２１】
請求項２０に記載のコンピュータープログラム製品であって、適用するための前記実行可能部分が、前記少なくとも１つの定量化可能な特徴に対して複数の候補閾値を適用して、前記複数の身体サンプルの各々についての複数の候補閾値の各々に対応する複数の候補予後を生成するための実行可能部分をさらに含み、かつ、該選択のための実行可能部分は、前記複数のスライドの各々についての最適な予後が前記複数の患者の各々についての既知の転帰に最適に対応するように、該複数の候補閾値から最適閾値を選択するための実行可能部分をさらに包含する、コンピュータープログラム製品。
【請求項２２】
請求項２１に記載のコンピュータープログラム製品であって、複数の候補閾値を適用するための前記実行可能部分が、該複数の候補閾値の各々について見なし規則を決定するための実行可能部分をさらに包含し、該見なし規則は、該複数の候補閾値の各々に関する前記少なくとも１つの定量化可能な特徴のうちの１つの値に対応する良好な予後または不良な予後のいずれかを確立し得る、コンピュータープログラム製品。
【請求項２３】
請求項２０に記載のコンピュータープログラム製品であって、前記選択工程のための実行可能部分がさらに：
前記網羅的な複数の候補決定規則の各々に対応する複数の特異性と感度との対を決定するための実行可能部分と；
該複数の特異性と感度との対を、受信者動作特性曲線上にプロットするための実行可能部分と；
各々の該複数の特異性と感度との対、および最適特異性と感度との対の間の複数のユークリッド距離を算出するための実行可能部分と；
該最適特異性と感度との対に対して最小のユークリッド距離を有する特異性と感度との対に対応する最適な決定規則を選択するための実行可能部分と；
を包含する、コンピュータープログラム製品。
【請求項２４】
請求項２０に記載のコンピュータープログラム製品であって、前記抽出のための実行可能部分がさらに、前記少なくとも１つの定量化可能な特徴を抽出する目的領域を同定するための実行可能部分を含み、該目的領域が、前記画像処理システムを用いて複数のスライドの各々から撮った画像内である、コンピュータープログラム製品。
【請求項２５】
請求項２０に記載のコンピュータープログラム製品であって、前記少なくとも１つのマーカーの統計的な独立性を評価して、該少なくとも１つのマーカーが、少なくとも１つの相補的なマーカーと実質的に統計的に独立している予後を提供し得ることを保証するための実行可能部分をさらに含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項２６】
請求項２５に記載のコンピュータープログラム製品であって、前記評価のための実行可能部分がさらに：
観察された転帰の頻度分布を、前記少なくとも１つのマーカーおよび前記少なくとも１つの相補的なマーカーに曝された第一の複数の身体サンプルについての理論上の予後の頻度分布と比較するための実行可能部分であって、該第一の複数の身体サンプルが、既知の良好な転帰を有する患者に対応している、実行可能部分と；
観察された転帰の頻度分布を、該少なくとも１つのマーカーおよび該少なくとも１つの相補的なマーカーに曝された第二の複数の身体サンプルについての理論上の予後の頻度分布と比較するための実行可能部分であって、該第二の複数の身体サンプルが、既知の不良な転帰を有する患者に対応している実行可能部分と；
該少なくとも１つの相補的なマーカーに関して該少なくとも１つのマーカーの独立性を評価するための実行可能部分と、
を含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項２７】
請求項２６に記載のコンピュータープログラム製品であって、評価のための前記実行可能部分が、カイ二乗分析を用いて前記少なくとも１つの相補的なマーカーに関して前記少なくとも１つのマーカーの独立性を評価するための実行可能部分をさらに含む、コンピュータープログラム製品。
【国際調査報告】
2008513793.tif 000042
2008513793.tif 000043
2008513793.tif 000044