(57)【要約】  本発明は、細胞培養物中における少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの脱アミド化を制御する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養物中の少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの脱アミド化を制御する方法であって、該細胞培養物中の少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの総量を検出し、該細胞培養物中のその脱アミド化した少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの量を検出し、脱アミド化した少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの量が該ポリペプチドの総量に対して望ましい割合にある細胞を収穫する工程を含む、方法。
【請求項２】
少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの総量が最小許容濃度に達し、脱アミド化した少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの量が依然として修飾の許容限界に等しいか、またはそれよりも低いままである場合に、細胞を収穫するところの、請求項１記載の方法。
【請求項３】
検出工程の各々がＨＰＬＣを用いることを含むところの、請求項１記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つの検出工程がイオン交換ＨＰＬＣを用いることを含むところの、請求項３記載の方法。
【請求項５】
さらに、その少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチド全体をタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーによって精製することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドが抗体であるところの、請求項１記載の方法。
【請求項７】
細胞培養物がチャイニーズハムスター卵巣細胞を含むところの、請求項１記載の方法。
【請求項８】
さらに、その少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの力価を測定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
さらに、その脱アミド化した少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの産生率を測定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
細胞培養物中の少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの脱アミド化を制御する方法であって、該培養物中の少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの総量を検出し、該細胞培養物中のそのアミド化した少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの量を検出し、アミド化した少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの量が該ポリペプチドの総量に対して望ましい割合にある細胞を収穫する工程を含む、方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの総量が最小許容濃度に達し、アミド化した少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの量が依然としてアミド化したポリペプチドの許容限界よりも高いままである場合に、細胞を収穫するところの、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
検出工程の各々がＨＰＬＣを用いることを含むところの、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つの検出工程がイオン交換ＨＰＬＣを用いることを含むところの、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
さらに、その少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチド全体をタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーによって精製することを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドが抗体であるところの、請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
細胞培養物がチャイニーズハムスター卵巣細胞を含むところの、請求項１０記載の方法。
【請求項１７】
さらに、その少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの力価を測定することを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１８】
さらに、そのアミド化した少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの産生率を測定することを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１９】
細胞培養物中の少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの脱アミド化を制御する方法であって、アミド化した少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドと脱アミド化したものの割合を検出し、アミド化した少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドが脱アミド化したものに対して望ましい割合にある細胞を収穫する工程を含む、方法。
【請求項２０】
細胞を収穫する時には、細胞培養物中の脱アミド化した少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの量がアミド化した少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの量よりも少ないところの、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
検出工程がイオン交換ＨＰＬＣを用いることを含むところの、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドが抗体であるところの、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
細胞培養物がチャイニーズハムスター卵巣細胞を含むところの、請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
さらに、その少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの力価を測定することを含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２５】
さらに、そのアミド化した、および脱アミド化した少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの産生率を測定することを含む、請求項１９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は異種ポリペプチド発現の最適化に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養物の成長中およびポリペプチドの異種発現中に、ポリペプチドの機能および／または構造に影響を与えるいくつかの修飾が発現されたポリペプチドに起こりうる。例えば、ある種の修飾として、メチオニンの酸化、グリコシル化、グルコノイル化、ポリペプチド鎖配列中の変異、Ｎ末端グルタミンの環化および脱アミド化、ならびにアスパラギンの脱アミド化が挙げられる。これらの修飾の多くは、細胞培養中およびポリペプチド発現中に自然発生的に起こる。細胞収穫後に、修飾されているポリペプチドと無修飾のポリペプチドとを分離できるが、これは生産コストを増加させ、かつ生産の効率を低下させる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、細胞培養物中で発現または過剰発現される異種ポリペプチドの脱アミドの頻度および／または程度を制御する方法が大いに必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の一態様では、細胞培養物中の少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの脱アミド化を制御する方法であって、該細胞培養物中の少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの総量を検出し、該細胞培養物中のその脱アミド化した少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの量を検出し、脱アミド化した少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの量が該ポリペプチドの総量に対して望ましい割合にある細胞を収穫する工程を含む、方法が提供される。
【０００５】
本発明のもう一つ別の態様では、細胞培養物中の少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの脱アミド化を制御する方法であって、該培養物中の少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの総量を検出し、該細胞培養物中のそのアミド化した少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの量を検出し、アミド化した少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの量がその総量に対して望ましい割合にある細胞を収穫する工程を含む、方法が提供される。
【０００６】
本発明のもう一つ別の態様では、細胞培養物中の少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの脱アミド化を制御する方法であって、アミド化した少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドと脱アミド化したものの割合を検出し、アミド化した少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドが脱アミド化したものに対して望ましい割合にある細胞を収穫する工程を含む、方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
（用語）
「宿主細胞」は、単離されたおよび／または異種のポリヌクレオチド配列によって導入されている（例えば、形質転換、感染、または形質移入されている）か、もしくは導入（例えば、形質転換、感染、または形質移入）可能な細胞であって、限定されるものではないが、哺乳類細胞、昆虫細胞、細菌細胞、または微生物の細胞を含む、細胞である。
【０００８】
「形質転換されている」とは、当技術分野で知られている通り、単離されたおよび／または異種のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリットの導入を介した生物のゲノムまたはエピソームの改変、あるいはそのようなＤＮＡまたはＲＮＡの任意の他の安定的導入を指す。
【０００９】
「形質移入されている」とは、当技術分野で知られている通り、限定されるものではないが、組換えＤＮＡまたはＲＮＡを含めた、単離されたおよび／または異種のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリットの、宿主細胞または微生物への導入を指す。
【００１０】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関して、「同一性」は、場合に応じて、下記の（１）および（２）に提示するアルゴリズムを用いて計算される比較を意味する。
【００１１】
（１）ポリヌクレオチドの同一性は、所与の配列におけるヌクレオチドの総数に、同一性パーセントを定義する整数を１００で割ったものを掛け、前記配列中の前記ヌクレオチド総数からその積を引くこと、すなわち、
ｎｎ≦ｘｎ−（ｘｎ・ｙ）
によって計算し、式中、ｎｎはヌクレオチド変化の数であり、ｘｎは所与の配列のヌクレオチド総数であり、ｙは、９５％の場合０．９５、９７％の場合０．９７、もしくは１００％の場合１．００であり、・は、乗算演算子の記号であり、かつ、ｘｎおよびｙの積が非整数となった場合はそのいかなるものも、ｘｎからそれを引く前に最も近い整数に四捨五入する。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変化は、このコード配列中にナンセンス、ミスセンス、またはフレームシフト変異を生成し、それによって、そのポリヌクレオチドによってコードされているポリペプチドをそのような変化に従って変化させうるものである。
【００１２】
（２）ポリペプチドの同一性は、アミノ酸の総数に、同一性パーセントを定義する整数を１００で割ったものを掛け、前記アミノ酸の総数からその積を引くこと、すなわち、
ｎａ≦ｘａ−（ｘａ・ｙ）
によって計算し、式中、ｎａはアミノ酸変化の数であり、ｘａは配列中のアミノ酸の総数であり、ｙは、９５％の場合０．９５、９７％の場合０．９７、もしくは１００％の場合１．００であり、・は、乗算演算子の記号であり、かつ、ｘａおよびｙの積が非整数となった場合はそのいかなるものも、ｘａからそれを引く前に最も近い整数に四捨五入する。
【００１３】
「異種（的に）」は、（ａ）単離を介してある生物から取得し、例えば遺伝子操作またはポリヌクレオチド導入を介して別の生物に導入すること、および／または（ｂ）天然には存在しない手段を介してある生物から取得し、例えば、細胞融合、誘導された接合、または遺伝子導入操作を介して別の生物に導入することを意味する。異種物質は、例えば、その中にそれが導入される生物または細胞と同じ種またはタイプから取得されたものでも、異なった種またはタイプから取得されたものでもよい。
【００１４】
「単離された」は、「人の手によって」その自然状態から改変され、元の環境から変更されているか、取り出されているか、あるいはその両方であることを意味する。例えば、生物に天然に存在しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離されて」いないが、その自然状態における共存物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離されて」おり、これには、限定されるものではないが、そのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドが細胞に再導入された場合も含まれ、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドがそれから分離された細胞と同じ種またはタイプである場合さえ含まれる。
【００１５】
通常、「ポリヌクレオチド」は、いかなるポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシヌクレオシドも指し、これは、無修飾のＲＮＡもしくはＤＮＡでも、修飾されているＲＮＡもしくはＤＮＡでもよい。「ポリヌクレオチド」には、非限定的に、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域の混合物または一本鎖領域、二本鎖領域および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、ならびに、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む混成分子が含まれ、これらの混成分子は、一本鎖でもよいが、より典型的には二本鎖領域もしくは三本鎖領域、または一本鎖領域および二本鎖領域の混合物でありうる。加えて、「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域も指す。そのような領域の鎖は、同じ分子からのものでも、異なった分子からのものでもよい。上記領域は、１つまたは複数の分子のすべてを含むものでもよいが、より典型的には、それらの分子の一部の領域のみが関与するものである。三本鎖領域の分子の１つは、オリゴヌクレオチドであることが多い。本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語には、上述の通り、１つまたは複数の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。したがって、安定性のため、もしくは他の理由で修飾されているバックボーンを有するＤＮＡまたはＲＮＡは「ポリヌクレオチド」であり、この用語はそのように本明細書で意図されている。さらに、若干２例を挙げるだけでも、イノシンまたはトリチル化された塩基などの修飾塩基など、通常とは異なる塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡもポリヌクレオチドであり、本明細書ではこの用語をそのように用いる。ＤＮＡおよびＲＮＡには、これまで、当業者に知られている多くの有用な目的に寄与する極めて多様な修飾がなされていることが理解されよう。本明細書で用いられる場合、「ポリヌクレオチド」という用語には、化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチド、ならびにウイルスおよび例えば単純型細胞および複雑型細胞を含めた細胞に特徴的な化学形態のＤＮＡおよびＲＮＡが包含される。「ポリヌクレオチド」には、しばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれる短いポリヌクレオチドも含まれる。
【００１６】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合で相互に連結された２つ以上アミノ酸を含むいかなるペプチドまたはタンパク質も指す。「ポリペプチド」は、ペプチド、オリゴペプチド、およびオリゴマーと通常呼ばれる短鎖のもの、ならびにタンパク質と通常呼ばれる長鎖のものの両方を指す。ポリペプチドは、遺伝子によってコードされている２０種のアミノ酸以外のアミノ酸も含みうる。「ポリペプチド」には、プロセシングおよび他の翻訳後修飾など、天然の過程で修飾されたものも、化学修飾技法によって修飾されたものも含まれる。そのような修飾については、基礎的な教科書、およびより詳細な研究書、さらには多数の研究論文に詳細に記載されており、それらは当業者には周知である。同じタイプの修飾が、所与のポリペプチドのいくつかの部位に、同じ程度もしくは異なった程度で存在しうることが理解されよう。また、所与のポリペプチドが、多くのタイプの修飾を含有することもある。修飾は、ペプチドバックボーン、アミノ酸側鎖、アミノ酸末端、およびカルボキシル末端を含めた、ポリペプチドのいかなる箇所でも起こりうる。修飾には、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合化、ヘム部分の共有結合化、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合化、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合化、ホスファチジルイノシトールの共有結合化、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化反応、ヨウ化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマカルボキシル化、ヒドロキシル化反応、およびＡＤＰリボシル化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、アルギニン化などの転移ＲＮＡ媒介型のタンパク質へのアミノ酸付加、ならびにユビキチン結合が含まれる。例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３年）、および「ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＶＡＬＥＮＴ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ」、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８３年）中の、Ｗｏｌｄ，Ｆ．、「Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ」、１〜１２頁；Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０年）およびＲａｔｔａｎら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ」、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、６６３：４８−６２（１９９２年）を参照のこと。ポリペプチドは、分岐を有するものでも、環状のものでもよく、環状のものは分岐を有しても、有していな��てもよい。環状、分岐、分岐環状ポリペプチドは、翻訳後の天然の過程から生じることがあり、また、完全に合成的な方法で生成することもできる。
【００１７】
「組換え発現系」は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを産生するための発現系またはその部分、あるいは宿主細胞内もしくは宿主細胞溶解液中に導入された（例えば、形質移入、感染、または形質転換された）本発明のポリヌクレオチドを指す。
【００１８】
「変種」は、この用語が本明細書で使用され場合、それぞれ参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと相違を有するが、本質的な特性を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。ポリヌクレオチドの典型的な変種は、別の参照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が相違している。変種におけるヌクレオチド配列の変化は、参照ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドのアミノ酸配列を改変するものでも、改変しないものでもよい。ヌクレオチド変化は、下記に論じる通り、参照配列によってコードされたポリペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合タンパク質、および末端欠失をもたらしうる。ポリペプチドの典型的な変種は、別の参照ポリペプチドとはアミノ酸配列が相違している。通常、相違は限定的なものであり、そのため、参照ポリペプチドおよび変種の配列は、全体的に高い類似性を有し、多くの領域で同一である。変種および参照ポリペプチドにおけるアミノ酸配列の相違は、任意の組合せにおける１つまたは複数の置換、付加、欠失によるものでありうる。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされたものであっても、そうでなくてもよい。本発明は、本発明のポリペプチドそれぞれの変種も含み、上記変種は、保存的アミノ酸置換によって参照から相違し、それによって、ある残基が、同様な特徴を有する別のものによって置換されているポリペプチドである。そのような置換の典型的なものは、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの間におけるもの、ＳｅｒおよびＴｈｒの間におけるもの、酸性残基であるＡｓｐおよびＧｌｕの間におけるもの、ＡｓｎおよびＧｌｎの間におけるもの、そして、塩基性残基であるＬｙｓおよびＡｒｇ、または芳香族残基であるＰｈｅおよびＴｙｒの間におけるものである。詳細には、任意の組合せで、いくつか、５〜１０、１〜５、１〜３、１〜２または１つのアミノ酸が置換、欠失、または付加されている変種が好ましい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変種は、アレルの変種として天然に存在するものでもよく、あるいは天然に存在することが知られていない変種でもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの天然に存在しない変種は、変異導入技法によって、直接的合成によって、および当業者に知られている他の組換え法によって生成させることができる。
【００１９】
「微生物」は、（１）原核生物および（２）単細胞または糸状の真核生物を意味し、（１）原核生物は、限定されるものではないが、（ａ）細菌および（ｂ）古細菌を含み、（ａ）細菌は、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、ボルデテラ属、コリネバクテリウム属、マイコバクテリウム属、ナイセリア属、ヘモフィルス属、アクチノミセテス属、ストレプトマイセス属、ノカルジア属、エンテロバクター属、エルシニア属、ファンシセラ（Ｆａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、パスツレラ属、モラクセラ属、アシネトバクター属、エリジペロトリックス属、ブランハメラ属、アクチノバシラス属、ストレプトバシラス属、リステリア属、カリマトバクテリウム属、ブルセラ属、バシラス属、クロストリジウム属、トレポネマ属、エシェリヒア属、サルモネラ属、クレブシエラ属、ビブリオ属、プロテウス属、エルウィニア属、ボレリア属、レプトスピラ属、スピリルム属、カンピロバクター属、シゲラ属、レジオネラ属、シュードモナス属、アエロモナス属、リケッチア属、クラミジア属、ボレリア属、およびマイコプラズマ属などのメンバーを意味し、それらは、限定されるものではないが、以下の種または群、すなわち、Ａ群ストレプトコッカス、Ｂ群ストレプトコッカス、Ｃ群ストレプトコッカス、Ｄ群ストレプトコッカス、Ｇ群ストレプトコッカス、ストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・アガラクティエ、ストレプトコッカス・ファエカリス、ストレプトコッカス・ファエシウム、ストレプトコッカス・デュランス、ナイセリア・ゴノルヘア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ）、ナイセリア・メニンジャイティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミジス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、コリネバクテリウム・ジフテリアエ、ガルドネレラ・バギナリス、マイコバクテリウム・ツバキュロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ボビス、マイコバクテリウム・ウルセランス、マイコバクテリウム・レプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、アクチノマイセス・イスラエリ、リステリア・モノサイトゲネス、ボルデテラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｉｓ）、ボルデテラ・パラペルツシス（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｉｓ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ、エシェリヒア・コリ、シゲラ・ディゼンテリエ、ヘモフィルス・インフルエンザエ、ヘモフィルス・エジプティアス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ａｅｇｙｐｔｉｕｓ）、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ、ヘモフィルス・デュクレイ、ボルデテラ、サルモネラ・チフィ、シトロバクター・フレウンジ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、プロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、エルシニア・ペスティス、クレブシエラ・ニューモニアエ、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｓｅｎｓ）、セラチア・リクファシエンス、ビブリオ・コレラ、シゲラ・ジセンテリ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉｉ）、シゲ��・フレクスネリ、シュードモナス・エルジノーサ、フランシセラ・ツラレンシス、ブルセラ・アボルチス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｉｓ）、バシラス・アントラシス、バシラス・セレウス、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・テタニ、クロストリジウム・ボツリナム、トレポネーマ・パリダム、リケッチア・リケッチイ、およびクラミジア・トラコミチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍｉｔｉｓ）が含まれ、（ｂ）古細菌は、限定されるものではないが、アーキアバクター（Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒ）を含み、（２）単細胞または糸状の真核生物は、限定されるものではないが、原生動物類、真菌類、サッカロミセス属、クリヴェロミセス属、またはカンディダ属のメンバー、およびサッカロミセス・セレビシエ、クリヴェロミセス・ラクティス、またはカンジダ・アルビカンスのメンバーを含む。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「１つの型の異種発現ポリペプチド」は、すべての修飾および無修飾の異種発現ポリペプチドを含めた、宿主細胞内のすべての異種発現ポリペプチドの変種を意味する。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「修飾されている異種発現ポリペプチド」は、少なくとも１つのアミノ酸が化学修飾を含む、任意の異種発現ポリペプチドまたはその変種を意味する。化学修飾には、メチオニンの酸化、グリコシル化、グルコノイル化、Ｎ末端グルタミンの環化および脱アミド、ならびにアスパラギンの脱アミドが含まれうるが、これらに限定されない。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「グルコノイル化」は、タンパク質へのグルコン酸誘導体の結合を指す。グルコノイル化には、６−ホスファグルコノラクトン（６−ＰＧＬ）付加物形成、アセチル化、ホルミル化、脱ホルミル、グルコノラクトン化、またはグルコン酸誘導体化が含まれうるが、これらに限定されない。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「力価収率」は、溶液（例えば、培養ブロスまたは細胞溶解混合物または緩衝剤）中の産物（例えば異種発現ポリペプチド）の濃度を指し、ｍｇ／Ｌまたはｇ／Ｌで表すことができる。力価収率の増加は、特定の２セットの条件下で産生された産物の濃度の絶対的または相対的な増加を指すものでありうる。
【００２４】
本明細書で使用される場合、細胞を「収穫する」とは、細胞培養からの細胞の収集を指す。細胞は、収穫して培養ブロスからそれらを分離する間に、例えば遠心法または濾過法によって濃縮することができる。細胞を収穫することには、細胞を溶解させて、限定されるものではないが、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドなどの細胞内物質を得る工程をさらに含みうる。当業者ならば、限定されるものではないが、異種発現ポリペプチドを含めたある種の細胞性物質は細胞から培養物中に放出されうることを理解しているにちがいない。したがって、細胞が収穫された後に、対象とする産物（例えば異種発現ポリペプチド）が培養ブロス中に残留している場合もある。
【００２５】
本明細書で使用される場合、細胞培養物中における異種発現ポリペプチドの脱アミド化を「制御する」とは、限定されるものではないが、培養培地、ｐＨ、温度、および細胞収穫までの成長などの細胞培養成長条件を調節して、細胞培養物から得られた脱アミド異種ポリペプチドの量が、前記細胞培養中で産生された異種ポリペプチドの総量の望ましいパーセントを含むようにすることを意味する。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「最小許容濃度」は、培養培地中における少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの濃度であって、細胞を収穫することができ、前記培養から回収された異種発現ポリペプチドの量が、例えば精製され、かつ使用可能な異種発現ポリペプチドを生成するのに十分であると予測されている量など、望ましい量である濃度を意味する。最小許容濃度は、限定されるものではないが、細胞培養の費用、および／または発現後における異種発現ポリペプチドの予測された修飾率を含めた因子によって決定できる。少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの最小許容濃度の例は、２５．０ｍｇ／Ｌから１５００．０ｍｇ／Ｌまでの範囲内でありうるが、これに限定されない。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「修飾の許容限界」は、前記修飾を含まない異種発現ポリペプチドの望ましい量が残留するように、１つの型の異種発現ポリペプチド全体から除去できる、１つの型の修飾された異種発現ポリペプチドの濃度を意味する。１つの型の異種発現ポリペプチドの修飾の許容限界は、例えば、全異種発現ポリペプチドのパーセントとして、または修飾ポリペプチドの独立した濃度として測定できる。１つの型の異種発現ポリペプチドの修飾の許容限界は、全異種ポリペプチドの約０％から約９０％まで、約０％から約５０％まで、約０％から約１５％まで、または約０％から約１０％までの範囲でありうる。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「アミド化ポリペプチドの許容限界」は、全タイプの異種発現ポリペプチドから脱アミド異種発現ポリペプチドを除去した後に残留している１つの型のアミド化異種発現ポリペプチドの濃度を意味する。アミド化ポリペプチドの許容限界は、例えば、全異種発現ポリペプチドのパーセントとして、またはアミド化異種発現ポリペプチドの独立した濃度として測定できる。アミド化ポリペプチドの許容限界は、全異種ポリペプチドの約１００％から約９０％まで、約１００％から約５０％まで、約１００％から約１５％まで、または約１００％から約１０％までの範囲でありうる。
【００２９】
ポリペプチドの脱アミド化には、いくつかのスキームが知られているか、あるいは提案されている。例えば、Ｎ末端グルタミンの環化およびピログルタミン酸を形成する脱アミドは、以下の反応を介して起こりうる。
【００３０】
【化１】
2008529495.tif 000002
【００３１】
加えて、アスパラギンの脱アミドは、以下の反応を介して起こりうる。
【００３２】
【化２】
2008529495.tif 000003
【００３３】
脱アミド産物は、構造特性の変化、効力の低減、生物活性の低減、有効性の低減、またはアレルギーおよび／もしくは免疫原性特性、あるいは他の望ましくない特性を有する可能性があるので、この反応は重要である。
【００３４】
本発明の一態様では、本発明は、細胞培養物中における少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの脱アミド化を制御する方法を提供し、この方法は、前記培養物中における少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの総量を検出する工程と、前記細胞培養物中における前記少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの脱アミド化したものの量を検出する工程と、少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの総量と脱アミド化したものの量との比が望ましいものである細胞を収穫する工程とを含む。ポリペプチドは、上記ポリペプチドのアミノ酸配列内にある１つまたは複数のアスパラギン残基で脱アミノできる。ポリペプチドの脱アミドは、限定されるものではないが、イオン交換またはＨＰＬＣ、等電点電気泳動、キャピラリー電気泳動、未変性ゲル電気泳動などの電荷量に基づく分離；逆相、疎水性相互作用、または親和性クロマトグラフィー；質量分析；あるいはタンパク質Ｌ−イソアスパルチルメチルトランスフェラーゼの酵素的使用を含めたいくつかの方法によって測定することができる。
【００３５】
別の態様では、少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの総量が最小許容濃度に達し、かつ少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの脱アミド化したものの量が修飾の許容限界以下に維持されているときに細胞を収穫する方法を提供する。別の態様では、各検出工程がＨＰＬＣの使用を含む。別の態様では、少なくとも１つの検出工程がイオン交換ＨＰＬＣの使用を含む。少なくとも１つの型の前記異種発現ポリペプチド全体をタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーによって精製する工程をさらに含む方法も提供する。別の態様では、少なくとも１つの型の前記異種発現ポリペプチドが抗体である。細胞培養物は、チャイニーズハムスター卵巣細胞を含むものでよい。少なくとも１つの型の前記異種発現ポリペプチドの力価を測定する工程を含む方法も提供する。加えて、少なくとも１つの型の前記異種発現ポリペプチドの脱アミド化したものの産生率を測定する工程を含む、少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの脱アミド化を制御する方法も提供する。
【００３６】
本発明の別の態様では、本発明は、細胞培養物中における少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの脱アミド化を制御する方法を提供し、この方法は、前記培養物中における少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの総量を検出する工程と、前記細胞培養物中における前記少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドのアミド化したものの量を検出する工程と、少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの総量とアミド化したものの量との比が望ましいものである細胞を収穫する工程とを含む。細胞の収穫は、少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの総量が最小許容濃度に達し、かつ少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドのアミド化したものの量がアミド化ポリペプチドの許容限界超に維持されているときに実施できる。各検出工程は、ＨＰＬＣの使用を含んでもよく、上記ＨＰＬＣはイオン交換ＨＰＬＣでありうる。少なくとも１つのタイプの前記異種発現ポリペプチド全体をタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーによって精製する工程をさらに含む方法も提供する。一態様では、上記異種発現ポリペプチドが抗体である。別の態様では、上記細胞培養物がチャイニーズハムスター卵巣細胞を含む。さらに別の態様では、少なくとも１つの型の前記異種発現ポリペプチドの力価を測定する工程をさらに含む方法を提供する。少なくとも１つの型の前記異種発現ポリペプチドのアミド化したものの産生率を測定することもできる。
【００３７】
本発明の別の態様では、本発明は、細胞培養物中における少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの脱アミド化を制御する方法を提供し、この方法は、少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドのアミド化したものと脱アミド化したものとの比を検出する工程と、少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドのアミド化したものと脱アミド化したものとの比が望ましいものである細胞を収穫する工程とを含む。別の態様では、細胞を収穫するとき、前記細胞培養物中における前記少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの脱アミド化したものの量が、前記少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドのアミド化したものの量より少ない。異種発現ポリペプチドの脱アミド化したものとアミド化したものとの比は約１：９、すなわち、１つの型の異種発現ポリペプチドの脱アミド化したものが、１つの型の異種発現ポリペプチドの総量の約１０％を占める比でよい。限定されるものではないが、約１．５：８．５、約２：８、約３：７、または約４：６を含めた他の比も含まれる。別の態様では、上記検出工程がイオン交換ＨＰＬＣの使用を含む。上記異種発現ポリペプチドは抗体であり、細胞培養物はチャイニーズハムスター卵巣細胞を含むものでありうる。上記方法は、少なくとも１つの型の前記異種発現ポリペプチドの力価、ならびに／または少なくとも１つの型の前記異種発現ポリペプチドのアミド化したものおよび脱アミド化したものの産生率を測定する工程も含みうる。
【００３８】
以下の実施例は、本発明の様々な態様を例示するものである。これらの実施例は、添付されている特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【００３９】
（実施例１）
（データの速度論モデリング）
（脱アミドの反応順序）
ポリペプチドの脱アミド化を記述するために提案された、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞でのモノクローナル抗体（ｍＡＢ）の産生を用いたモデルを一例として提示する。ここに示す本発明は、このモデルによっても、本明細書に開示するいかなる他のモデルもしくは理論によっても、いかなる意味でも限定されない。例示したモノクローナル抗体は、既知数の潜在的脱アミド部位を有し、それにより、その反応生成物は単一脱アミド産物（本明細書では「ｄｅＡｍｉｄＡ」）と、二重脱アミド産物（本明細書では「ｄｅＡｍｉｄＢ」）とを含んでいた。部位数が限定的であったため、イミド中間体を介した平衡モデルの使用は実用的とは考えられなかった。また、ｉｓｏＡｓｐおよび環状イミド種は明らかに存在しないため、反応を、ｍＡＢにおける疑似１次モデルに単純に低減した。したがって、以下の反応順序をモデリングの対象とした。
【００４０】
【化３】
2008529495.tif 000004
【００４１】
（ｍＡＢ産生および脱アミドの反応スキーム）
上記の反応順序では、ｍＡＢは、存在している細胞数のみに依存して、０次過程によって産生される。脱アミド産物は、基質の一次産物である。上記の反応順序の含意である微分方程式セットを、下記のスキーム１に示す。このモデルは、単一脱アミド種および二重脱アミド種両方の濃度予測を可能にする。この微分方程式セットでは、単一脱アミド産物をｄｅＡｍｉｄＡと表示し、二重脱アミド産物をｄｅＡｍｉｄＢと表示している。ＮＣｅｌｌは細胞力価であり、生存率は活性がある細胞のパーセントである。括弧は、分子種もモル濃度を示し、ｋは速度定数を表す。
【００４２】
（スキーム１．ｍＡＢ産生および脱アミドの微分方程式スキーム）
【００４３】
【数１】
2008529495.tif 000005
【００４４】
ｋ０、ｋ１、およびｋ２の値は、ＨｉＱプログラミング環境（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、米国テキサス州Ａｕｓｔｉｎ）を用いて推算した。共役勾配最適化プログラムを用いて、方程式１によって示される目的関数が最小となるように、ｋ０、ｋ１、およびｋ２の値を選択した。そのような値を選択するのに、知られている他の方法を用いてもよい。下記方程式１において、ｎは時系列データポイントを示す。二重脱アミド産物残留量に因数１０の乗算を行って、その値を他の残留量とおおまかに均等化し、それによって、パラメータ推定ルーチンにおけるその重要度を均等化する。
【００４５】
【数２】
2008529495.tif 000006
【００４６】
ピーク面積比に個々の時点における各成分の力価値を掛けることによって、データ変換を行った。Ｎｃｅｌｌの値は、微分方程式への解決中、実際の細胞密度および生存率データを挿入することによって継続的に更新した。ｋ０が、培養物の比生産率に近似していることに留意されたい。培養物の比生産率は、培養物中の細胞密度に対して正規化された、培養物中におけるｍＡＢ蓄積の尺度である。
【００４７】
（実施例２）
Ｍａｂ産生は、チャイニーズハムスター卵巣細胞を用いた細胞培養において、Ｍａｂ蓄積の総量を定量化するＨＰＬＣ方法を用いて測定した。培養物の小量アリコートを収穫し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー媒体を充填した小さなカラム（１〜４ミリリットル）を用いて精製した。精製されたＭａｂをイオン交換ＨＰＬＣで処理し、様々な脱アミド種を分離して、定量化した。このイオン交換ＨＰＬＣ法によって観測された脱アミド産物およびアミド化産物の例を図４に示す。このデータを用いて、チャイニーズハムスター卵巣細胞の存在下および非存在下の両方における速度論パラメータを測定した。各実験で測定された速度定数を表１に示す。モデルを準備した際に使用した仮定を考慮すると、無細胞系におけるｋ１およびｋ２の値は、実際のバイオリアクター系の値と本質的に同じである。用いられた速度論モデルは、上記スキーム１に示されている。データ適合を図１〜３に示す。適合はすべて高質のものであった。別のデータセットのシミュレーションに任意のｋ１／ｋ２値を置換代入したところ、もう一方のデータセットに妥当な適合を与えた。したがって、無細胞系と、実際の系との間には相違がなかった。これは、脱アミド化が、細胞の存在によって触媒されるものではないことを示している。これらのデータは、細胞は脱アミド産物を発現せず、ｍＡＢは細胞外で自然発生的に脱アミド化されたことも示した。第１の脱アミドと、第２の脱アミドのｋ１値およびｋ２値にはほとんど相違がなかった。
【００４８】
【表１】
2008529495.tif 000007
【００４９】
実施例１で記載したスキーム１の速度論モデルを用い、Ｍａｂ蓄積および脱アミド種の蓄積に基づいて、収穫ウィンドウ（例えば、少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの総量が最小許容濃度に達し、少なくとも１つの型の異種発現ポリペプチドの脱アミド化したものの量が修飾の許容限界以下に維持されている）を決定した。決定された収穫ウィンドウ内で、細胞を収穫し、Ｍａｂを回収し、脱アミドＭａｂ種の蓄積と均衡したアミド化Ｍａｂ（すなわち脱アミド化していない）の産生を最適化した。本明細書に提示したアプローチは、中でもモノクローナル抗体を含めた、アスパラギンの脱アミド化を起こしうるポリペプチドに適用できる。異種発現ポリペプチドの治療効力が既知であれば、このモデルを用いて、あるバッチの性質、効力、および収率が、ある特定の望ましい最適値となるように選択できる。このモデルは、バッチ経過中にＭａｂ種の蓄積を推算、計画、または予測するのに用いることができ、さらに細胞増殖におけるバッチ相互の変動性を説明できる。
【００５０】
この出願が優先権を主張するいかなる特許出願も、参照により、本明細書で完全に記載されている場合と同様に、その全体において本明細書に組み込む。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】非細胞系へのデータ適合、３３．８℃における時系列を示す図である。
【図２】細胞系へのデータ適合、生産バッチ−１を示す図である。
【図３】細胞系へのデータ適合、生産バッチ−２を示す図である。
【図４】ＨＰＬＣによって測定された、Ｍａｂ２におけるＡｓｐおよびｐＧｌｕのアスパラギン脱アミド形成を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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