(57)【要約】  本発明は、種々の型の癌、とりわけ結腸直腸癌に対する免疫応答を刺激するのに有用な新たなフリッツルド様の免疫原性ペプチドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類コリンタンパクのフリッツルド２ドメインのシステイン２からシステイン３までの領域に属するＱＫＥＡＳＩ（配列番号：１）配列を含む、免疫原性ペプチド。
【請求項２】
8アミノ酸長〜12アミノ酸長を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ＲＴＱＫＥＡＳＩ（配列番号：２）エピトープを含む、請求項１又は請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
九量体又は十量体である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項５】
ＨＲＴＱＫＥＡＳＩ（配列番号：３）配列又はＲＴＱＫＥＡＳＩＣ（配列番号：４）配列を含む、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
前記アミノ酸残基ＲがＭ若しくはＰで置き換えられ及び/又は前記アミノ酸残基ＴがＥで置き換えられた、請求項３又は請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
Ｃ末端システイン残基の末端を有することを特徴とする、請求項３〜請求項６のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項８】
ＨＲＴＱＫＥＡＳＩ（配列番号：３）、ＨＭＴＱＫＥＡＳＩ（配列番号：５）、ＨＲＥＱＫＥＡＳＩ（配列番号：６）、ＲＥＱＫＥＡＳＩ（配列番号：７）、ＭＴＱＫＥＡＳＩ（配列番号：８）、ＲＴＱＫＥＡＳＩ（配列番号：２）、ＨＲＴＱＫＥＡＳＩＣ（配列番号：９）、ＲＴＱＫＥＡＳＩＣ（配列番号：４）、ＭＴＱＫＥＡＳＩＣ（配列番号：１０）、ＲＥＱＫＥＡＳＩＣ（配列番号：１１）、ＨＭＴＱＫＥＡＳＩＣ（配列番号：１２）、ＨＲＥＱＫＥＡＳＩＣ（配列番号：１３）からなる群より選択された配列を有する、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項９】
Ｎ末端又はＣ末端が保護された、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜請求項８で定義されたペプチドを少なくとも一つコードする、ＤＮＡ配列。
【請求項１１】
請求項１０で定義されたＤＮＡ配列を少なくとも一つ含む、発現ベクター。
【請求項１２】
免疫調節性ケモカイン及び免疫調節性サイトカインからなる群より選択された免疫調節性化合物をコードする配列をさらに含む、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
前記のケモカイン及びサイトカインがＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＮＦ−γ、ＧＭ−ＣＳＦからなる群より選択された、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
コーカサス人種に属する被験者における腫瘍の予防的治療のためのワクチンを製造するための、請求項１〜請求項９のいずれか１項で定義されたペプチドの使用又は請求項１１〜請求項１３のいずれか１項で定義された発現ベクターの使用。
【請求項１５】
前記腫瘍が結腸直腸癌である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
少なくとも一つの化学療法薬と組み合わせた、請求項１４又は請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
薬理学的に許容されるアジュバント及び賦形剤と一体となった、請求項１〜請求項９のいずれか１項で定義された少なくとも一つのペプチド又は請求項１１〜請求項１３のいずれか１項で定義された発現ベクターを含む、抗腫瘍ワクチン。
【請求項１８】
前記ワクチンが結腸直腸癌に向けられた、請求項１７に記載のワクチン。
【請求項１９】
請求項１〜請求項８で定義されたペプチドの１つに対して特異的な、モノクローナル抗体又はオリゴクローナル抗体。
【請求項２０】
腫瘍の治療のための薬剤の製造のための、請求項１９に記載の抗体の使用。
【請求項２１】
前記腫瘍が結腸直腸癌である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
請求項１９で定義されたモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の使用を含む腫瘍発生又は腫瘍で苦しむ患者のフォローアップの生体サンプル中でのインビトロ判定方法。
【請求項２３】
請求項１９で定義されたモノクローナル抗体又はオリゴクローナル抗体を含む、生体サンプル中での腫瘍の存在の判定用診断キット。
【請求項２４】
前記腫瘍が結腸直腸癌である、請求項２３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍とりわけ結腸直腸癌に関連する新たな免疫原性ペプチド配列及びワクチンの製造のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
コリン（Corin）タンパクは、心臓における前心房性ナトリウム利尿性因子（natriuretic proatrial factor）（proANP）転換酵素として作用するタイプII膜貫通型セリンプロテアーゼであること（Yan et al. 1999）が知られている。従って、コリンの発現パターンは、ナトリウム利尿性ペプチドのものと非常に類似していると考えられている。
心臓のみならず、コリンの発現（AF133845）は、発生の間の腎臓、骨及び子宮のような他の組織中で認められている。さらに驚くべきことにはコリンの発現は、肺癌、小細胞肺癌（SCLC）のような様々な肉腫及び癌においても認められている（Wu et al. 2003）が、結腸又は結腸癌における発現解析結果は未だ開示されていない（PubMed http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi での参考文献調査による）。
【０００３】
コリンタンパクは、セリンプロテアーゼドメインに加えて、細胞外領域にWnt因子相互作用に共通するがトリプシン様プロテアーゼタンパク（セリンプロテアーゼ）には共通しない２つのシステインリッチドメイン（フリッツルド（Frizzled）様）を提示するプロテアーゼである。他の”フリッツルド”タンパク（Fz、可溶性又は膜貫通型のレセプター）と共にラット、マウス及びヒトのコリンアミノ酸配列は、図１の配列比較中に表され、システインリッチドメイン（CRD）の高度な保存を示す。これらのドメインは、10のシステイン残基（図の下部に番号が付されている）の不変パターンを有するおよそ120アミノ酸を含み、これにより5つのビスルフィドブリッジを形成し結果としてα-へリックス構造をもたらす。2番目のシステイン残基と3番目のシステイン残基との間の領域が、図２にさらに詳細に表される。Wnt/Fz因子伝達系の不適切な活性化と発癌との関連が知られている（Holcombe et al., 2002；Vincan et al. 2003）一方で、後者及びセリンプロテアーゼとフリッツルド様ドメイン、例えばコリンとの関連は知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
今までのところでは、化学療法又は放射線治療法と組み合わせて使用するための腫瘍増殖を抑制するのに適した免疫応答を引き起こすのに適した腫瘍に対する新たなワクチンを提供することの必要性が存在する。
これに関連して、国際公開番号：WO 01/62786は、抗腫瘍（とりわけ肺腫瘍）ワクチン中で抗原として使用するためのTLPタンパク系ペプチド（配列番号：２）又はその断片を開示する。具体的に言えば、国際公開番号：WO 98/15282は、抗腫瘍（とりわけ、肺癌、泌尿生殖器癌及び非小細胞肺癌（NSCLC））ワクチンの製造のためのイムノゲンとしての使用のために国際公開番号：WO-A-001458に既に記載されている配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３の配列を有するいくつかのTLPペプチドを開示する。
【０００５】
しかしながら、上記で報告されたペプチドは、国際公開番号：WO 03/045997で報告されるように乏しい免疫原性であるという不都合に苦しみ、そこには、これらのペプチド及びＩＬ−２由来の融合タンパク並びに様々な腫瘍の予防及び治療のための抗腫瘍抗原としてのその使用が開示される。
結腸癌は、先進国において最も頻出する病態の一つである。ヨーロッパでは男性及び女性の両方で、結腸直腸癌が二番目に最も広まった腫瘍である（Ferlay et al., 1999）。ヨーロッパのコーカサス人種におけるその発生率は、アジア人種及びアフリカ人腫のものと比べてより高い（Parkin et al. 2002）。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の著者らはここに、とりわけコーカサス人種（HLA A0210、HLA A03、HLAB0702、HLA B2705、HLA B5101対立遺伝子）向けにデザインされた抗腫瘍ワクチンを提供するためのイムノゲンとして作用することができるコリンシステインリッチドメインの一つ（NCBI NC_00004; gi: 37625049）を有するいくつかのペプチド配列を発見した。
【０００７】
Ｔ細胞及びＢ細胞は、本質的に異なるパターンに従ってタンパク抗原を認識する。Ｂ細胞レセプター及びＢ細胞抗体が溶液中の抗原を認識し、直線状または集合状の15アミノ酸〜22アミノ酸のエピトープを拘束する一方で、Ｔ細胞レセプターはタンパク質分解の後に抗原を認識し、結果として生じた8アミノ酸〜11アミノ酸の断片エピトープ及び12アミノ酸〜25アミノ酸の断片エピトープはそれぞれ、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によりコードされるクラスＩ分子及びクラスII分子に結合される。様々な長さのＭＨＣに与えられたペプチドは、その種及びその対象の特定のＭＨＣ Ｉ-II対立遺伝子の機能である。ヒトにおいてはとりわけ、HLAタイプIタンパクエピトープの平均の長さは、9アミノ酸〜10アミノ酸である。従って、コーカサス人種の様々なＨＬＡにより効果的に与えられた抗原として使用するためには、8アミノ酸ペプチド又は12アミノ酸ペプチドでの抗原提示がより効果的でない一方でヒトＭＨＣポーチが9アミノ酸〜10アミノ酸のペプチドをより好むことが知られているため、本発明に従ったペプチドは少なくとも九量体でなければならない。
【０００８】
筆者らは、ELISPOTアッセイ（実施例１、図３を参照）を用いて、これらのペプチドがより免疫原性であることを証明したが、その理由は、これらのペプチドが、国際公開番号：WO 98/15282及び国際公開番号：WO-A-001458に記載されその乏しい免疫原性が既に国際公開番号：WO 03/045997で報告されているＲＴＮＫＥＡＳＩ 配列番号：１を有するペプチドよりも、DHD-K12結腸腫瘍を接種したラットリンパ球でのより高い抗原特異的応答を引き起こすためである。その上、ＲＴＮＫＥＡＳＩエピトープは自然には発生せず、哺乳類のコリン配列内には認められない。免疫応答の効果は主として、エピトープ陽性細胞を浄化すること又はエピトープ発現を抑制すること及び関連する細胞の分化を引き起こすことである。ＲＴＮＫＥＡＳＩエピトープは自然に発生する配列ではないので、自然的でなく起こっているエピトープ認識による免疫応答において非自己又は擬陽性を有していない免疫原性エピトープを検出するのは不可能であった。
【０００９】
従って、哺乳類のコリンタンパクのフリッツルド2（Frizzled2）ドメインのシステイン２〜システイン３の領域に属するQKEASI（配列番号：１）配列を含む免疫原性ペプチドは、本発明の目的物である。好ましくは上述のペプチドは、8アミノ酸長〜12アミノ酸長である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
好ましい実施態様に従って、本発明に従ったペプチドは、コリンフリッツルド2ドメイン（フリッツルド2ドメイン、コリンポジション531〜570）のシステイン２残基とシステイン３残基との間に局在化したＲＴＱＫＥＡＳＩ（配列番号：２）エピトープを含む。
本発明のとりわけ好ましい側面に従って（結果として効果的な抗原提示をもたらすためのヒトＭＨＣポーチへの適応性）、ペプチドは九量体又は十量体であってもよい。好ましくは、本発明に従ったペプチドは、ＨＲＴＱＫＥＡＳＩ（配列番号：３）（コリンポジション548〜555）配列又はＲＴＱＫＥＡＳＩＣ（配列番号：４）配列を含んでいる。
【００１１】
さらなる実施態様に従って、上記で定義された本発明のペプチドは、様々なHLA-Iハプロタイプとのペプチドの相互作用をさらに最適化するために、アミノ酸残基ＲがＭ若しくはＰで置き換えられている及び/又はアミノ酸残基ＴがＥで置き換えられていてもよい。
本発明のさらなる側面に従って、ペプチドはＣ末端システイン残基の末端を有することで特徴づけされてもよい。
よりとりわけ、本発明に従ったペプチドは、ＨＲＴＱＫＥＡＳＩ（配列番号：３）、ＨＭＴＱＫＥＡＳＩ（配列番号：５）、ＨＲＥＱＫＥＡＳＩ（配列番号：６）、ＲＥＱＫＥＡＳＩ（配列番号：７）、ＭＴＱＫＥＡＳＩ（配列番号：８）、ＲＴＱＫＥＡＳＩ（配列番号：２）、ＨＲＴＱＫＥＡＳＩＣ（配列番号：９）、ＲＴＱＫＥＡＳＩＣ（配列番号：４）、ＭＴＱＫＥＡＳＩＣ（配列番号：１０）、ＲＥＱＫＥＡＳＩＣ（配列番号：１１）、ＨＭＴＱＫＥＡＳＩＣ（配列番号：１２）、ＨＲＥＱＫＥＡＳＩＣ（配列番号：１３）からなる群より選択されてもよい。
【００１２】
上記のペプチドはあるいは、免疫性刺激が起こる前の消化を回避するためにＮ末端又はＣ末端で保護されていてもよい。又は配列アミノ酸は、より加水分解の影響を受けにくい残基で置き換えられていてもよい。
上記で定義されたペプチドをコードするＤＮＡ配列は、本発明のさらなる目的物であり、様々な種（原核細胞、昆虫細胞など）における使用コドンの適合をも考慮する。本発明のさらなる目的物は、上記で定義されたＤＮＡ配列を少なくとも一つ含む発現ベクターにより表される。好ましい実施態様に従って、発現ベクターは、例えばＩＬ−１２、ＩＬ-２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＮＦ−γのワクチン接種アジュバント（破傷風毒素断片Ｃ）との融合タンパク（INF-gamma o fusion proteins with vaccination adjuvant（tetanic toxin fragment C）のような免疫調節性ケモカイン及び免疫調節性サイトカインからなる群より選択された免疫調節性化合物をさらに含んでいてもよい。
【００１３】
腫瘍、好ましくはコーカサス人種（HLA A0210、HLA A03、HLAB0702、HLA B2705、HLA B5101対立遺伝子）の患者における結腸直腸癌の予防的治療のためのワクチンを製造するための上記で定義されたペプチド又は発現ベクターの使用は、本発明の目的物である。とりわけ、本発明に従ったペプチドは、少なくとも一つの化学療法薬（例えば、シクロホスファミド）及び/又は本発明に従った抗体と共同して使用されてもよい。
本発明に従ったペプチドは、免疫応答を刺激するのに適切などんな経路によって及び単回投与又は複数回投与によって投与されてもよい。さらに、当該ペプチドは、ウイルス性ベクター、細菌性ベクター、プラスミドでのトランスフォーメーションによりインビボで発現されてもよく、さらに当該発現生成物は融合タンパクであってもよい。最終的に、当該ペプチドは、当該エピトープが、免疫応答の発生を可能にするために、効果的であり又はインビボでさらされる限りは、キャリア分子を用いて運搬されてもよい。
【００１４】
薬理学的に許容されるアジュバント及び賦形剤と一体となった上記で定義されたペプチド又は発現ベクターの少なくとも一つを含む抗腫瘍（好ましくは、抗結腸直腸癌）ワクチンは、さらなる本発明の目的物である。
本発明はさらに、本発明のペプチドの一つに対して特異的なモノクローナル抗体又はオリゴクローナル抗体に関する。本発明に従ったモノクローナル抗体は、癌病変へ直接投与するための腫瘍、好ましくは結腸直腸癌の治療のための薬剤の製造のために使用されてもよく、さらに、化学療法薬と共同して用いられてもよい。
上記で定義されたモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の使用を含む生体サンプル中での、腫瘍発生又は腫瘍、好ましくは結腸直腸癌で苦しむ患者のフォローアップのインビトロ判定のための方法が、本発明のさらなる目的物である。
最終的に、本発明の目的物は、腫瘍発生又は腫瘍、好ましくは結腸直腸癌で苦しむ患者のフォローアップの判定のための、上記で定義されたモノクローナル抗体又はオリゴクローナル抗体を含む診断キットである。
本発明はここに、実例を手段として記載されるが、ここに添付された図面への特定の言及と共にその好ましい実施態様に従った限定を意味するものではない。
【実施例】
【００１５】
実施例１：最も頻出するHLA-Iコーカサス人種対立遺伝子のコリンフリッツルド２領域エピトープの同定及び最適化
プログラム及びデータバンクＳＹＦＰＥＩＴＨＩを使用して、ヒトコリンタンパク及びマウスコリンタンパクのシステイン２からシステイン３までのフリッツルド２領域のアミノ酸配列を、このタンパク配列中に様々なMHC-1提示候補エピトープを検出するために決定した。
ヒトアミノ酸配列及びマウス（MHC-I：H2-Kk）アミノ酸配列のＳＹＦＰＥＩＴＨＩプラグラムを使用したコンピューター解析は、とりわけ二つのエピトープ、それぞれＨＲＴＱＫＥＡＳＩ及びＲＴＱＫＥＡＳＩを明示した。
【００１６】
この選択は、主として二つの考察から生じた。
両方のエピトープは、”中間”と定義される範囲、すなわち、10 < ｘ > 20 の範囲内のアフィニティースコアを示し、それぞれ、ＨＲＴＱＫＥＡＳＩヒトエピトープに対して12及びＲＴＱＫＥＡＳＩマウスエピトープに対して10である。
さらに、ＨＲＴＱＫＥＡＳＩヒトエピトープに関しては、同じものが、コーカサス人種で最も頻出する全てのHLA-I対立遺伝子（HLA - A0201、- B2705、-B0702、-A03、-B510）（人口のおよそ90 %）に対する優れた抗原性候補である。実際にはそれは、いずれかの考慮した対立遺伝子に対する以下のスコア値に従って、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩプログラムにより全てのこれらの対立遺伝子におけるMHC-Iの最適化への候補として選択される。
-  HLA-A0201  ＝  スコア12
-  HLA-A03    ＝  スコア10
-  HLA-B2705  ＝  スコア20
-  HLA-B0702  ＝  スコア7
-  HLA-B5101  ＝  スコア11
【００１７】
エピトープ予測から得られたスコア結果に関して、コーカサス人種でより頻出する対立遺伝子変種（HLA-A0201、-B27、-B0702、-A03 e-B5101）についてのヒトコリンフリッツルド２（FRI.2）タンパクに含まれるＨＲＴＱＫＥＡＳＩアミノ酸配列の役割がさらに評価された。
コーカサス人種でより頻出するMHC-I対立遺伝子、すなわち、HLA-0201に対して行われたエピトープ予測解析から、FRI.2のポジション454〜575のアミノ酸配列を考慮して、ポジション479〜487のアミノ酸配列を含むスコア12の九量体エピトープＨＲＴＱＫＥＡＳＩが選択された。このエピトープは、様々な上述のHLA-I対立遺伝子に対しての最も良い候補を構成する。
ＨＲＴＱＫＥＡＳＩエピトープ最適化
-  HLA-A0201（およそ 75 % のコーカサス人種を表す対立遺伝子）
ポジション                                          スコア
１    ２    ３    ４    ５    ６    ７    ８    ９
Ｈ    Ｒ    Ｔ    Ｑ    Ｋ    Ｅ    Ａ    Ｓ    Ｉ    12
↓                                              ↓
Ｍ                                              22
-  HLA-B27：
ポジション                                          スコア
１    ２    ３    ４    ５    ６    ７    ８    ９
Ｈ    Ｒ    Ｔ    Ｑ    Ｋ    Ｅ    Ａ    Ｓ    Ｉ    20
-  HLA-B0702：
ポジション                                          スコア
１    ２    ３    ４    ５    ６    ７    ８    ９
Ｈ    Ｒ    Ｔ    Ｑ    Ｋ    Ｅ    Ａ    Ｓ    Ｉ    7
↓                                              ↓
Ｐ                                              17
- HLA-B5101：
ポジション                                          スコア
１    ２    ３    ４    ５    ６    ７    ８    ９
Ｈ    Ｒ    Ｔ    Ｑ    Ｋ    Ｅ    Ａ    Ｓ    Ｉ    11
↓                                              ↓
Ｐ                                              21
【００１８】
2番目及び9番目は、コーカサス人種でより頻出するHLA-I対立遺伝子（-A0201、-B27、-B0702、-A03及び-B5101）に対する最適のエピトープの重要なアミノ酸である。上記に従って、あらゆるHLA-I対立遺伝子の特異的なポーチに関するこれらのエピトープポジションのアミノ酸の最適化は、アソシエーションスコアを増加させることを可能にし、結果としてより高い抗原提示効率をもたらす。
この検討から得られた結果として、つい最近の既知技術である対照条件として選択されたＲＴＮＫＥＡＳＩ（配列番号：１；WO-A-001458）八量体は、わずか8アミノ酸しか有していないという理由で効率的に提示されることができなかった。より頻出するHLA-I対立遺伝子に対するＲＴＮＫＥＡＳＩエピトープ予測が評価されれば、その結果はヌルである、すなわち、効率的に提示されない。
【００１９】
実施例２：抗-コリン抗体の構築及び免疫組織化学
上記の検討に基づいて、ＲＴＱＫＥＡＳＩペプチドを、初めに組織での抗原発現を検証するための免疫組織化学実験に使用する血清の産生のためのマウス（CD2F1系統）を免疫化するのに用いた。
ペプチドは、INBIOS S.r.lにより合成され、HPLCによる ＞ 70 % の純度、5 mg の水溶解度（0.1 % TFA）であった。
免疫化パターンは、下記のとおりであった。
-  4匹のCD2F1マウスを、皮下に 100 mg/mL のオボアルブミンアジュバント抱合型ペプチドで免疫化した。
-  1回目の免疫化は、フロイント（Freund's）コンプリートアジュバントで行った。
-  2回目からのフロイントインコンプリートアジュバント（Freund's not complete adjuvant）での免疫化は、合わせて5回の免疫化に使用した。
-  最後の免疫化後、5日目でサンプリングした。
【００２０】
抗-ＲＴＱＫＥＡＳＩ特異的抗体の存在を検証するために、よく吸着されたペプチド（10 mg/mL）を有するELISAアッセイを行った。
ELISAの結果は表３に示され、OD値として表される。
【００２１】
2008526194.tif 000002
【００２２】
これらの結果に基づき、4匹の動物中3匹が、ＲＴＱＫＥＡＳＩに対する抗体を構築した。
マウスによって提示されることのできる最小のエピトープが8アミノ酸長であることを考慮すると、生成された抗体は憶測的にモノクローナル抗体に類似するものと考えることができる。
【００２３】
（抗原の発現及び免疫組織化学）
予備的なデータは、以下のサイトで入手できる。
OMIM
（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM&itool=toolbar）；
GEO Profiles
（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD= search&DB=geo）； 
SAGE
（http://cgap.nci.nih.gov/SAGE/）；
SOURCE
（http://genome-www5.stanford.edu/cgi-bin/source/sourceResult）；
GeneNote
（http://genecards.weizmann.ac.il/cgibin/genenote/GN_results.pl?keyword_type=2_gc_id&keyword=GC04M047436&data_type=norm2&results=yes）；
GeneCard
（http://genome-www.stanford.edu/cgi-bin/genecards/carddisp?CORIN）
【００２４】
コリン（AF133845）に対する出願時の最新のものは、心臓（心筋細胞）、発生の間の腎臓及び骨においてタンパクの高発現水準を明示する。コリンの発現パターンは、ナトリウム利尿ペプチドのものと非常に類似していると考えられている。当該発現は一様でない様式でその他の組織（胸腺、肺、前立腺など）においても、さらに、骨肉腫、平滑筋肉腫、子宮内膜癌においてもまた実証されるが、結腸又は結腸癌における発現解析結果は、いまだ開示されていない（PubMedにおける同一年月日での”コリンと結腸”（"corin and colon"）の調査にまでも広げられた解析 - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi）。
コリン発現を、結腸及び結腸癌において免疫組織化学アッセイにより評価した。
分析された組織はそれぞれ、ヒト結腸腺癌及び対応する正常結腸粘膜断片であった。
腺癌及び腫瘍から遠い健常組織のサンプルは、新たに前もって回収し、-80 ℃ で直接凍結した。
病理解剖学基準に従って病変の特徴付け、ステージ付け及びグレード付けし、結果を表１に示す。
【００２５】
2008526194.tif 000003
【００２６】
免疫組織化学分析は、クリオスタット切断面標本を用いて行った。組織切断面を次にアセトンで固定した。
組織切断面を、1/100 希釈のマウス抗-ＲＴＱＫＥＡＳＩ免疫血清又はマウス抗-ＲＴＱＫＥＡＳＩ免疫前血清で処理した。反応は、アビジン-ビオチン及びジアミノベンジジンシステムを使用して検出した。
以下のコントロールを使用した。
-  結果として起こる交差反応性又は非特異的（aspecific）ジアミノベンジジン沈降を検出するための抗体なしのネガティブコントロール。
-  免疫前血清のネガティブコントロール。
-  免疫血清。
結果は表２に報告する；細胞膜上への局在化を排除することはできないが、免疫組織化学の結果では、細胞質への局在化が最も妥当である。
【００２７】
2008526194.tif 000004
【００２８】
さらに具体的に言うと、図４において、パネルＡ及びパネルＢはそれぞれ、抗体なしの免疫組織化学処置のネガティブコントロール並びに免疫組織化学処置及び免疫前血清をコントロールするための免疫前血清（1/100）を使用した免疫組織化学処置のネガティブコントロールを示す。図４のパネルＣには、免疫血清（17100）を使用した免疫組織化学実験が示される。免疫前血清のコントロール（パネルＢ）について、上皮腫瘍性細胞の細胞質陽性度は明らかである。
【００２９】
図４のパネルＤは、免疫前血清（1/100）を使用した正常結腸粘膜サンプルで行ったネガティブコントロールの免疫組織化学分析を示し、パネルＥは、免疫血清（1/100）を使用して行った免疫組織化学実験を表す。免疫前血清コントロールと比べて有意な染色の差異は観察されない。図４のパネルＥは、抗体なしのネガティブコントロールを示し、これは免疫組織化学処置のコントロールを可能にする。パネルＦは、免疫前血清（1/100）を使用したネガティブコントロールの免疫組織分析を示し、これは免疫血清のコントロールを可能にする。パネルＨは、免疫血清（1/100）を使用した免疫組織化学実験を示す。免疫前血清について、上皮腫瘍性細胞の細胞質陽性度は明らかである。
【００３０】
免疫組織化学データに基づき、対応する正常結腸粘膜（同一患者）における有意に検出可能でない発現と比較して、結腸癌における特異的なコリン発現は明白である。
この結果は、結腸癌に対してのキャリア若しくは治療薬としてこのタンパク若しくは構築した抗体を用いる診断方法又は治療方法を構築するために極めて注目に値する。
【００３１】
実施例３：ELISPOTアッセイによるＲＴＱＫＥＡＳＩＣの免疫原性についての検討
比較するための九量体配列を有する以下の合成ペプチドを取得した。ＲＴＱＫＥＡＳＩＣ（新規ペプチド）及びＲＴＮＫＥＡＳＩＣ（既知技術ペプチド）。
ＲＴＱＫＥＡＳＩＣ発現を、実験的なラット動物モデルで特徴づけした。
自系の結腸癌DHD-K12系統細胞を、BDIXラットの脾臓内に接種した。これらの細胞は、肺（polmonar）レベル及び肝臓レベルで転移し、自然にヒト結腸直腸癌にも共通するエピトープ（ＲＴＱＫＥＡＳＩＣ）を発現する。抗原特異的細胞障害性応答に対するＲＴＱＫＥＡＳＩＣ抗原の関与を評価するために、BDIXラットをDHD-K12で免疫化した。
【００３２】
DHD-K12細胞に対するBDIXラットのPBMC細胞障害活性（51Ｃｒ又はＬＤＨの放出に基づく細胞障害性試験）を、免疫化及び腫瘍接種の後に評価した。BDIXラットは、DHD-K12細胞に対する自発性の細胞障害活性を示さず、これは接種してから15日後〜30日後に起こった。九量体ＲＴＱＫＥＡＳＩＣ免疫化は、DHD-K12に対して高い細胞障害活性を誘導した。さらにこの活性は、免疫化していないラットと比較して、免疫化しておいたラットにおいて、腫瘍接種後有意に上昇した。
【００３３】
本検討において、合成ペプチドによってインビトロで直接的に特異的抗原を認識するDHD-K12で免疫化したBDIXラットのリンパ球の能力を評価した。
ラットリンパ球は、種々のグループ（コントロール及び免疫化された）由来のラットで心臓内血液サンプリングにより準備した。サンプリングは、腫瘍接種してから12日後〜20日後に行った。末梢血単核球（PBMC）は、フィコール（Ficoll）勾配分離により獲得した。リンパ球は、そのまま又は凍結して使用した。
【００３４】
免疫化したラットリンパ球の個々の細胞で発現された抗原特異的応答を、ＩＮＦ−γの検出により評価することを可能にするELISPOTアッセイを使用した。
ELISPOTは、個々の細胞の細胞活性の分析に対しての簡便で非常に感度のよい方法である。ELISPOTはとりわけ、抗原全体又は単一ペプチドにより引き起こされた免疫特異的応答の分析に特に用いられる。さらに、分析されたサイトカインに基づき、ELISPOTは、種々の細胞小集団から得られた応答を検出すること及び識別することを可能にする。
【００３５】
高親和性サイトカイン（ここではＩＮＦ−γ）特異的モノクローナル抗体を、PVDF 96ウェルプレート上にコートした。エフェクター細胞（200 ｘ 103 〜 250 x 103）を撒き、抗原存在下（4 μg 〜 10 μg のペプチド）で、24時間〜48時間インキュベートした。
この間、抗原特異的細胞はＩＮＦ−γを放出して応答する。このインキュベーションの間、抗体が細胞に隣接して固定化されるので、分泌されたサイトカインはプレート上に固定化される。細胞及び無用な物質を除去するために洗浄した後、二次サイトカインエピトープに向けられたビオチン化抗体を加えた。
【００３６】
次に、酵素（例えば西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））抱合型ストレプトアビジンを加えた。適切なインキュベーション及び洗浄の後、応答細胞の応答部位での染色スポットを生み出すのに適切な基質を加えた。後者をイメージアナライザー（AELVIS）により試験しカウントした。スポット及び撒いた細胞数を比較することにより、抗原認識細胞の発生頻度が得られる。
【００３７】
全ての実験において、アッセイされたサンプルは三つ組又は四つ組で使用され、結果は解析したウェルの平均値として表される（図３）。図３は、10 x 106 のDHD細胞を皮下接種したラットのリンパ球の二つのペプチドでの刺激によって行ったELISPOT試験の比較図を示す。この場合のELISPOTプロトコールは、2 x 106 cell/mL で、200000 cell/ウェル であってもよい。囲い枠内には、コントロールラットから得られた結果が示される。柱状図分析から、実際にＲＴＱＫＥＡＳＩＣ九量体が、ＲＴＮＫＥＡＳＩＣ九量体に比べてより免疫原性であるという結果が得られた。
【００３８】
実施例４：抗-ＲＴＱＫＥＡＳＩ抗体の特異性 対 抗-ＲＴＮＫＥＡＳＩ抗体の特異性についての検討
（材料及び方法）
ウェスタンブロット
抗-ＲＴＮポリクローナル抗体（ＲＴＮＫＥＡＳＩペプチド配列に向けられた）のＲＴＱＫＥＡＳＩペプチド配列に対しての反応をイムノブロッティングにより検証するために、5 μg のいずれか一つのペプチドを 18 % SDS-ゲルポリアクリルアミド上にロードし、PVDFメンブラン上に転写した。次に、このメンブランを、5 % PBS 粉ミルクを含む 0.05 % Tween（PBST）で飽和し、飽和バッファー中で 1：100 に希釈した抗-RTNと共にインキュベートしてペプチドを識別し、反応をペルオキシダーゼ抱合型二次抗体で検出した。PBSTで洗浄した後、Super Signal System（Pierce）を用いてブロットを行った。抗-ＲＴＮポリクローナル抗体及び抗-ＲＴＱモノクローナル抗体の両方を用いたDHD/K12細胞における抗原発現の検討のために、細胞を、1 % Triton-X 100、100 IU/mL のアプロチニン及び 1 mM のPMSFを含む、pH 6.8 のリン酸バッファーで溶解した。可溶化タンパク（42 μg）を 8 % SDS-ゲルポリアクリルアミド上にロードし、PVDFメンブラン上に転写した。抗原を特異的抗体（1：100 に希釈した抗-ＲＴＮ、1：20 に希釈した抗-ＲＴＱ）で識別し、ペルオキシダーゼ抱合型二次抗体で検出した。
【００３９】
蛍光顕微鏡法及び免疫組織化学
DHD/K12細胞での抗原発現の共焦点顕微鏡検出を、4 % パラホルムアルデヒドで固定し、Triton-X 100 で透過性にし、さらに、抗-ＲＴＮ（1：70 に希釈）ポリクローナル抗体及び抗-ＲＴＱ（1：20 に希釈）モノクローナル抗体で免疫標識したサンプルで行った。反応はAlexa 488 抱合型二次抗体を使用して検出した。細胞核はヨウ化プロピジウムで二重染色（contra-stained）した。観察はアルゴン/クリプトンレーザーを備えた共焦点LEICA TCS 4D 顕微鏡で行った。
【００４０】
組織的な（tissutal）抗原発現の分析のために、DMH処理したBDIXラット及びDMH処理していないBDIXラット由来の遠位結腸粘膜サンプルを緩衝フォルマリンで固定し、パラフィン包埋した。組織切断面を抗-ＲＴＱモノクローナル抗体（1：10 に希釈）を使用して免疫標識し、反応をDAKO Cytomation LSAB 2（登録商標）System HRP（Liquid DABN）キットを使用してペルオキシダーゼ抱合型二次抗体で検出した。
【００４１】
前臨床の使用モデル
インビボでの前臨床モデルのために、雄のBDIX系統で、アロタン（alotane）麻酔し、20 mg/kg の1,2-ジメチルヒドラジンヒドロクロライド（DMH）を7日間の間隔で5回筋肉内に投与したラットを使用した。腫瘍が発生した時点で、動物を屠殺し、遠位結腸粘膜を抗原発現の免疫組織化学分析のためにサンプリングした。
インビトロ前臨床モデルとして、ジメチルヒドラジンヒドロクロライドで処理することによりBDIX系統ラットから独自に取得したDHD/K12系統細胞を使用した。
【００４２】
フローサイトメトリー
細胞蛍光測定法分析によるDHD-K12細胞での抗原発現を検証するために、細胞をトリプシン/EDTAで剥離し、抗-ＲＴＱ（1：20 に希釈）モノクローナル抗体で標識し、細胞蛍光測定法的に分析した（FACscan Becton-Dickinson）。
免疫標識を、細胞膜上のみの抗原発現を検出するための非固定細胞及び細胞質内の抗原発現を検出するためのパラホルムアルデヒドで固定しTriton-X 100 で透過性にした細胞の両方を用いて行った。
【００４３】
（結果）
イムノブロッティングを、抗-ＲＴＮＫＥＡＳＩ（抗-ＲＴＮ）モノクローナル抗体を用いて、ＲＴＮＫＥＡＳＩ配列及びＲＴＱＫＥＡＳＩ配列に対して行った。図５に報告された結果は、ＲＴＮＫＥＡＳＩ（レーン１）との、さらにまたＲＴＱＫＥＡＳＩ（レーン３）との抗-ＲＴＮポリクローナル抗体の反応を示す。
蛍光抗体法分析及び蛍光顕微鏡法分析により、抗-ＲＴＱモノクローナル抗体に対するDHD-K12細胞の免疫陽性の検出が可能であった。抗-ＲＴＱＫＥＡＳＩモノクローナル抗体を用いて得られた結果は、DHD-K12細胞のもっぱら細胞質内陽性を示し、膜陽性を示さなかった（図６）。抗-ＲＴＮポリクローナル抗体は、膜陽性をも生じさせた。
【００４４】
さらに、抗-ＲＴＱモノクローナル抗体を使用する間接的な蛍光抗体法分析により、DHD-K12細胞があらかじめ抗-ＲＴＮポリクローナル抗体の使用で得られたものに重ね合わせることができる抗原分布を示すが、図７に示されるとおり後者についてより特異的であるということが発見された。図７は、小胞分布パターン、いくつかの細胞の核周囲領域（ゴルジ及びリソソーム）での蓄積及び多くの細胞の核領域での蓄積を伴う細胞質内に広くいきわたった抗-ＲＴＱモノクローナル抗体に対してのDHD-K12細胞陽性を示す。
【００４５】
最終的に、正常なBDIXラット結腸組織及びDMH処理したBDIXラット結腸組織に対して行われた免疫組織化学的分析により、抗-ＲＴＱモノクローナル抗体に対する免疫陽性を検証することが可能であった（最後にDMH投与してから、11週後（DMH6）及び26週後（DMH20）に行ったサンプリング）。正常結腸粘膜組織に対しての結果が陰性であった一方で、DMH処理したラット由来の組織は、その強度及び分布が腫瘍増殖で増加する特異的免疫陽性を示した（図８）。とりわけ図８は、ＲＴＱ抗原が正常結腸粘膜で発現されない一方で、腸管腔についての上皮細胞並びに粘膜陰窩の腫瘍性細胞及び間質細胞の両方では、DMHを最後に投与してから11週後に既に発現されることを示す。この陽性は、DMHの最後の投与から26週後に増大する。細胞内分布は主として細胞質であるが、いくつかの細胞では核にもまた分布した。抗-ＲＴＮと抗-ＲＴＱの組織分布は類似しているが、後者の方がより特異的である。
【００４６】
実施例５：近交系BDIXラットにおけるDNAでの免疫化による治療的ワクチン接種
（材料及び方法）
実験の初めに（T0）、DHD/K12腫瘍性細胞（動物あたり 2 x 106 / 0.5 mL）をBDIXラットの頚部の皮下に注射した。
翌日、実験群（DNA vax、ｎ＝８）を、インスリンシリンジ及び 29 1/2 ゲージ針（Becton Dickinson、Ref. No. 324804 microfine）を用いて頚骨筋の前部に筋肉内注射することにより投与して 200 μg/動物のDNA pRC11Fzワクチンをワクチン接種した。3週後、”DNA vax”群を、大腿四頭筋に 200 μg/足 のDNA pRC11Fzワクチンでのエレクトロポレーション（BTX ECM 830、100 ボルト/cm、20ms、1Hz エレクトロポレーター）により免疫化追加免疫投与にさらした。エレクトロポレーションは、ゾレチル（zoletil）及びキシロール（xilor）の一般的な麻酔下で行った。コントロール群（ｎ＝８）は実験の初めに（T0）、BDIXラットの頚部後方項部（retronuchal）領域へのDHD/K12腫瘍性細胞（動物あたり 2 x 106 / 0.5 mL）の皮下（s.c）接種にさらした。一週後、FCAアジュバント（600 μL のフロイント（Freund's）コンプリートアジュバント）と同体積の 1 % BSA のPBS溶液（1.2 mL/動物）を、動物の皮内に6部位（0.2 mL/部位）投与した。処置は毎週7回繰り返した。
【００４７】
結腸癌DHD-K12同質遺伝子的細胞の9週増殖後のBDIXラットワクチン接種は、本発明に従ったDNAワクチン（DNA vax）を含むＲＴＱＫＥＡＳＩ（1週目及び4週目の2回処置）及びコントロール（フロイント（Freund's）アジュバント；毎週7回処置）の両方で行った。
【００４８】
（結果）
図９は、結腸癌DHD-K12同一遺伝子的細胞の9週増殖後の同族BDIXラットのDNAワクチンでの治療的免疫化の結果を示し、腫瘍増殖（腫瘍体積）への効果が示唆される。表３は、DNAワクチン（DNA vax）及びコントロールで処理した後に得られた腫瘍体積及び生存率に関する値を示す。
【００４９】
2008526194.tif 000005
【００５０】
（参考文献）
-  Ferlay J, Bray F, Sankila R, Parkin DM. IARC Cancer Base No. 4; 1999
-  Parkin DM, Whelan SL, Ferlay J, Teppo L, Thomas DB. IARC Scient. Publ. No. 155; 2002
-  Ferlay J, Bray F, Pisani P, Parkin DM. IARC Cancer Base No. 5; 2001
-  W. Yan, N. Sheng, M. Seto, J. Morser, Q. Wu. J. Biol. Chem. 274: 1492614935, 1999
-  F. Wu, Q. Wu. Cancer Res. 63: 83188322, 2003
-  Holcombe RF, Marsh JL, Waterman ML, Lin F, Milovanovic T, Truong T. Mol Pathol. 55(4):220-6, 2002. 
-  WO 01/62786 
-  WO-A-001458
-  WO 03/045997
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、ヒトコリンフリッツルド２ドメイン、マウスコリンフリッツルド２ドメイン及びラットコリンフリッツルド２ドメインの、その他の膜フリッツルド配列又は分泌フリッツルド配列に関してのアライメントを示す。10のシステイン残基が下方に数字と共に表示される。
【図２】図２は、２〜３のコリンシステイン残基（フリッツルド２）のアミノ酸領域をより詳細に示す。
【図３】図３は、本発明の九量体ペプチド及び既知技術のペプチドのELISPOT比較アッセイを示す。
【図４】図４は、Ａ〜Ｈのパネルで、様々なコントロールサンプル、正常結腸粘膜、結腸腺癌の免疫組織化学法分析を示す。
【図５】図５は、抗-ＲＴＮＫＥＡＳＩポリクローナル抗体のイムノブロット及びそのＲＴＮＫＥＡＳＩ（レーン１）とＲＴＱＫＥＡＳＩ（レーン３の矢印）の両方との反応を示す。
【図６】図６は、細胞膜（左パネル）の抗-ＲＴＱモノクローナル抗体及び細胞質（右パネル）の抗-ＲＴＱモノクローナル抗体を用いたDHD-K12細胞の細胞蛍光測定法分析を示す。
【図７】図７は、細胞内分布（小胞体、細胞質、核周囲、核）を測定するための抗-ＲＴＱモノクローナル抗体を用いたDHD-K12細胞の蛍光抗体法分析を示す。
【図８】図８は、正常なBDIXラット組織結腸及びDMH処理したBDIXラット組織結腸の核の抗-ＲＴＱモノクローナル抗体及び細胞質の抗-ＲＴＱモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学法分析を示す。DMH6：DMHの最後の投与後11週目でサンプリング。DMH20：DMHの最後の投与後26週目でサンプリング。
【図９】図９は、結腸癌DHD-K12同質遺伝子的細胞の9週間増殖後のBDIX同族ラット（DHD-K12/BDIX）における腫瘍体積の縮小におけるDNA（DNA vax）ワクチンを含むＲＴＱＫＥＡＳＩでの治療的免疫化の、コントロール（フロイントアジュバント）と比較した効果を示す。
【図１】
2008526194.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2008526194.tif 000011
【図７】
2008526194.tif 000012
【図８】
2008526194.tif 000013
【図９】
2008526194.tif 000014
【配列表】
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【国際調査報告】
2008526194.tif 000015
2008526194.tif 000016