(57)【要約】  本発明は、進化したインターフェロンαポリペプチド、およびその複合体、およびポリペプチドをコードする核酸を提供する。本発明には、これらのポリペプチド、複合体、および核酸を含む組成物；該ポリペプチド、複合体、および核酸も含む、または発現する細胞；該ポリペプチド、複合体、および核酸の作製方法；および該ポリペプチド、複合体、核酸の使用方法が含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドが抗ウイルス活性を示す、以下の配列番号から選択される配列とは０〜８個の位置のアミノ酸が異なる配列を含む単離または組換えポリペプチド；配列番号３１２；配列番号２６２；配列番号２６６；配列番号２３２；配列番号８８；配列番号２９７；配列番号１６７；配列番号１０７；配列番号２０８；配列番号９４；配列番号１４１；配列番号４６；配列番号１７１；配列番号３１０；配列番号１７６；配列番号２６；配列番号８９；配列番号２９６；配列番号１４８；配列番号１８；配列番号１０；配列番号８７；配列番号１０３；配列番号２３４；配列番号３０；配列番号１７９；配列番号２；配列番号２６０；配列番号３０６；配列番号１４０；配列番号１２７；配列番号２９３；配列番号１９５；配列番号１９１；配列番号２６３；配列番号１；配列番号２９８；配列番号２４；配列番号２５８；配列番号１２４；配列番号７；配列番号９；配列番号３０３；および配列番号６。
【請求項２】
以下の配列番号から選択される配列とは０〜６個の位置のアミノ酸が異なる配列を含む、請求項１記載のポリペプチド；配列番号３１２；配列番号２６２；配列番号２６６；配列番号２３２；配列番号８８；配列番号２９７；配列番号１６７；配列番号１０７；配列番号２０８；配列番号９４；配列番号１４１；配列番号４６；配列番号１７１；配列番号３１０；配列番号１７６；配列番号２６；配列番号８９；配列番号２９６；配列番号１４８；配列番号１８；配列番号１０；配列番号８７；配列番号１０３；配列番号２３４；配列番号３０；配列番号１７９；配列番号２；配列番号２６０；配列番号３０６；配列番号１４０；配列番号１２７；配列番号２９３；配列番号１９５；配列番号１９１；配列番号２６３；配列番号１；配列番号２９８；配列番号２４；配列番号２５８；配列番号１２４；配列番号７；配列番号９；配列番号３０３；および配列番号６。
【請求項３】
以下の配列番号から選択される配列を含む、請求項２記載のポリペプチド；配列番号３１２；配列番号２６２；配列番号２６６；配列番号２３２；配列番号８８；配列番号２９７；配列番号１６７；配列番号１０７；配列番号２０８；配列番号９４；配列番号１４１；配列番号４６；配列番号１７１；配列番号３１０；配列番号１７６；配列番号２６；配列番号８９；配列番号２９６；配列番号１４８；配列番号１８；配列番号１０；配列番号８７；配列番号１０３；配列番号２３４；配列番号３０；配列番号１７９；配列番号２；配列番号２６０；配列番号３０６；配列番号１４０；配列番号１２７；配列番号２９３；配列番号１９５；配列番号１９１；配列番号２６３；配列番号１；配列番号２９８；配列番号２４；配列番号２５８；配列番号１２４；配列番号７；配列番号９；配列番号３０３；および配列番号６。
【請求項４】
請求項１記載のポリペプチドであつて、前記ポリペプチドの前記抗ウイルス活性が、ＨｅＬａ／ＥＭＣＶ抗ウイルスアッセイにおいてｈｕＩＦＮα２ｂまたはｈｕＩＦＮα２ａの抗ウイルス活性の少なくとも２倍大きい、ポリペプチド。
【請求項５】
（ａ）請求項１記載のポリペプチド；および
（ｂ）前記ポリペプチドに共有結合した非ポリペプチド部分、
を含む複合体。
【請求項６】
少なくとも２つの非ポリペプチド部分を含む、請求項５記載の複合体。
【請求項７】
システイン残基に共有結合した非ポリペプチド部分を含む、請求項５記載の複合体。
【請求項８】
リジン残基またはＮ末端アミノ基と共有結合している非ポリペプチド部分を含む、請求項５記載の複合体。
【請求項９】
リジン残基と共有結合している非ポリペプチド部分を含む、請求項５記載の複合体。
【請求項１０】
Ｎ末端アミノ基と共有結合している非ポリペプチド部分を含む、請求項５記載の複合体。
【請求項１１】
前記非ポリペプチド部分がポリエテレングリコールである、請求項５記載の複合体。
【請求項１２】
前記非ポリペプチド部分が糖である、請求項５記載の複合体。
【請求項１３】
前記糖が前記ポリペプチドのＮ−グリコシル化部位に結合している、請求項５記載の複合体。
【請求項１４】
請求項１記載のポリペプチドおよび医薬的に許容され得る賦形剤を含む組成物。
【請求項１５】
請求項５記載の複合体および医薬的に許容され得る賦形剤を含む組成物。
【請求項１６】
請求項１記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離または組換えポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１６記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１６記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１９】
プロモーターに機能的に連結した前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターである、請求項１８記載のベクター。
【請求項２０】
請求項１８記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１６記載のポリヌクレオチドおよび医薬的に許容され得る賦形剤を含む組成物。
【請求項２２】
請求項１記載のポリペプチドの調製方法であって、前記方法には：
宿主細胞を含む培養物を提供することにおいて、前記宿主細胞はポリヌクレオチドに機能的に連結しているプロモーターを含む発現ベクターを含み、前記ポリヌクレオチドは前記ポリペプチドをコードする核酸配列を含み、
前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で前記培養物を培養すること、
および前記ポリペプチドを回収すること、が含まれる方法。
【請求項２３】
前記宿主細胞が真核生物の宿主細胞である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記宿主細胞が細菌の宿主細胞である、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
複合体の調製方法であって、
（ｉ）請求項１記載のポリペプチドを提供すること、および
（ｉｉ）少なくとも１つの非ポリペプチド部分をポリペプチドに結合させること、を含み、結果として得られる前記複合体が抗ウイルス活性を示す方法。
【請求項２６】
請求項２５記載の方法であって、前記ポリペプチドを提供する工程には：
宿主細胞を含む培養物を提供することにおいて、前記宿主細胞はポリヌクレオチドに機能的に連結しているプロモーターを含む発現ベクターを含み、前記ポリヌクレオチドは前記ポリペプチドをコードする核酸配列を含み、
前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で前記培養物を培養すること、
および前記ポリペプチドを回収すること、が含まれる方法。
【請求項２７】
前記宿主細胞が真核生物の宿主細胞または細菌の宿主細胞である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
ウイルス感染した細胞内でのウイルスの複製を阻害する方法であって、前記方法には前記細胞に、前記細胞内でのウイルス複製を阻害するのに有効な量の、請求項１記載のポリペプチド、または請求項５記載の複合体を投与し、前記細胞内でウイルス複製を阻害すること、が含まれる方法。
【請求項２９】
ウイルス感染した細胞内でのウイルスの複製コピー数を減らす方法であって、前記方法には、前記細胞に、前記細胞内でのウイルスのコピー数を減らすのに有効な量の、請求項１記載のポリペプチド、または請求項５記載の複合体を投与し、前記細胞内でのウイルスのコピー数を減らすこと、が含まれる方法。
【請求項３０】
ＨＣＶ感染患者の血清中のＨＣＶ  ＲＮＡレベルを減らす方法であって、前記方法には、前記患者に、治療開始前に存在するＨＣＶ  ＲＮＡレベルに比べて、ＨＣＶ  ＲＮＡレベルを減らすために有効な量の、請求項１記載のポリペプチド、または請求項５記載の複合体を投与すること、が含まれる方法。
【請求項３１】
ＨＣＶ感染患者の血清中のＨＢＶ  ＤＮＡ濃度を減らす方法であって、前記方法には、前記患者に、治療開始前に存在するＨＢＶ  ＤＮＡ濃度に比べて、ＨＢＶ  ＤＮＡ濃度を減らすために有効な量の、請求項１記載のポリペプチド、または請求項５記載の複合体を投与すること、が含まれる方法。
【請求項３２】
ＨＣＶ感染患者の血清中のＨＩＶ  ＲＮＡレベルを減らす方法であって、前記方法には、前記患者に、治療開始前に存在するＨＩＶ  ＲＮＡレベルに比べて、ＨＩＶ  ＲＮＡレベルを減らすために有効な量の、請求項１記載のポリペプチド、または請求項５記載の複合体を投与すること、が含まれる方法。
【請求項３３】
医薬品として使用するための、請求項１記載のポリペプチド、または請求項５記載の複合体。
【請求項３４】
前記ウイルスに感染した細胞内でのウイルスの複製を阻害する医薬品の製造のための、請求項１記載のポリペプチド、または請求項５記載の複合体の使用。
【請求項３５】
前記ウイルスに感染した細胞内でのウイルスの複製コピー数を減らす医薬品の製造のための、請求項１記載のポリペプチド、または請求項５記載の複合体の使用。
【請求項３６】
前記ウイルスに感染した患者の血清中のウイルス濃度を減らす医薬品の製造のための、請求項１記載のポリペプチド、または請求項５記載の複合体の使用。
【請求項３７】
前記ウイルスがＨＣＶ、ＨＢＶまたはＨＩＶである、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載による使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に従って、本出願では２００５年５月１８日に出願された米国仮出願番号第６０／６８２，７６９号の出願日の利益を享受するものであり、そのすべての開示内容は、参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
技術分野
本発明は概して、コード化されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド、該ポリペプチドの複合体、ならびにベクター、細胞、抗体、および該ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および複合体を使用・産生する方法に関する。
【０００３】
背景技術
インターフェロンαは、サイトカイン遺伝子の多様なヘリックス束スーパーファミリーの一員である（Sprang, S.R.ら、(1993) Curr. Opin. Struct. Biol. 3:815-827)。ヒトインターフェロンαは、２０を超える縦列重複非対立遺伝子のファミリーおよびアミノ酸レベルで８５〜９８％の配列同一性を有する偽遺伝子によってコードされる（Henco, K.ら、(1985) J. Mol. Biol. 185:227-260)。活性型インターフェロンαタンパク質を発現する遺伝子が、遺伝子座に従って１３ファミリーにグループ分けされている。既知のインターフェロンαタンパク質の発現およびそれらの対立遺伝子変異がAllen G. and Diaz M.O. (1996) J. Interferon and Cytokine Res. 16:181-184に示されている。
【０００４】
インターフェロンαは各種の細胞増殖を阻害することが示されており、癌に関連することの多い多様な細胞増殖疾患、白血病などの特に血液学的悪性腫瘍の治療に特に有用である。これらのタンパク質は、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、低悪性度のリンパ腫、カポジ肉腫、慢性骨髄性白血病、腎細胞癌、膀胱腫瘍、卵巣癌に対する増殖抑制活性を示している（Bonnem, E.M.ら、(1984) J. Biol. Response Modifiers 3:580; Oldham, R.K. (1985) Hospital Practice 20:71)。
【０００５】
インターフェロンαは、各種のウイルス感染に対しても有用である（Finter, N.B.ら、(1991) Drugs 42(5):749)。インターフェロンαは、ヒトパピローマウイルス感染、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎の感染に対して活性を有する（Finter, N.B.ら、1991, 上記を参照; Kashima, H.ら、(1988) Laryngoscope 98:334; Dusheiko, G.M.ら、(1986) J. Hematology 3 (Supple.2):S199;  Davis, GL ら、.(1989) N. England J. Med. 321:1501)。ある種の自己免疫疾患および炎症性疾患の発生機構におけるインターフェロンとインターフェロン受容体の役割についても研究されてきた（Benoit, P.ら、(1993) J. Immunol. 150(3):707)。
【０００６】
これらのタンパク質は多くの疾患の治療において治癒的価値を有するが、それらは医薬品としての使用のために最適化されていなかった。例えば、用量規定毒性、受容体交差反応性、短い血清半減期のため、これらのサイトカインの多くの臨床的有用性が大幅に低下する（Dusheiko, G. (1997) Hepatology 26:112S-121S; Vial, T. and Descotes, J. (1994) Drug Experience 10:115-150; Funke, I.ら、 (1994) Ann. Hematol. 68:49-52; Schomburg, A.ら、(1993) J. Cancer Res. Clin. Oncol. 119:745-755)。インターフェロン投与に伴う、多様かつ重度の副作用プロフィールには、インフルエンザ様症状、疲労、幻覚、発熱、肝酵素上昇、白血球減少症が含まれる（Pontzer, C.H.ら、(1991) Cancer Res. 51:5304; Oldham, 1985, 上記を参照）。
【０００７】
Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）は複製率の非常に高い宿主非組込みＲＮＡウイルスであり、従って高い遺伝的多様性と関連付けられる。ＨＣＶ  ＲＮＡについては少なくとも６種の遺伝子型および３０種以上のサブタイプが同定されている。ＨＣＶ遺伝子型は、ＩＦＮ−α治療に対する反応の予測因子であることを示している。ＨＣＶ遺伝子型２、３に感染した患者は、概して、インターフェロン治療に十分に反応することが見出されている。遺伝子型４、５、６に感染した患者では、反応が不十分となる傾向がある。ＨＣＶ遺伝子型１に感染している患者は、インターフェロン治療に非常に弱くしか反応しない傾向があり、遺伝子型１の患者の約５０％がＩＦＮ−α治療に対する「非応答者」に分類される。遺伝子型１は現在、Ｃ型肝炎の最も流行している型であり、米国の患者の約７０％、そしてヨーロッパの患者の５０％が感染している。明らかに、ＨＣＶ感染、特に遺伝子型１系統の感染に対するより効果的な治療が差し迫って必要とされている。
【０００８】
遺伝子型１ＨＣＶ（および他のサブタイプ）が、ｄｓＲＮＡ活性型セリン／トレオニンタンパク質キナーゼＰＫＲなどの重要なＩＦＮ応答性タンパク質を阻害することで、ＩＦＮ−α情報伝達経路を積極的に弱めるとの遺伝的・生化学的な証拠がある（Katze M.G.,ら、(2002) Nat. Rev. Immunol. 2(9):675-687)。この遺伝的多様性および抗ウイルス反応の活性阻害、の起こりそうな結果として、ＨＣＶ（特に遺伝子型１）は宿主の免疫監視からの回避能力を有しており、慢性感染症の高い感染率を招く。ＨＣＶの広範な遺伝的異質性には診断・臨床上の意味があり、臨床経過のばらつき、ワクチン開発の問題、治療に対する反応の欠如の説明となる可能性がある。
【０００９】
本発明では、抗ウイルスおよび／または免疫調節能の増強を示すインターフェロンα分子の必要性について取り上げている。本発明は、新規インターフェロンαポリペプチドおよびポリペプチド複合体、該ポリペプチドをコードする核酸、該分子の使用方法を提供する。該分子は、例えば、治療・予防的治療、特にウイルス感染およびウイルス感染に伴う疾患や病状などの様々な用途で有効利用されるであろう。本発明はこれらの必要性および他の必要性を満たす。
【００１０】
発明の要約
本発明は、ポリペプチドの変異体および該ポリペプチドを含む融合タンパク質を包含する、新規ポリペプチドを提供する。本発明は、１つ以上の非ポリペプチド部分に共有結合している本発明のポリペプチドを含む複合体も提供する。本発明は、本発明のポリペプチドのいずれかをコードする核酸、該核酸を含むベクターおよび宿主細胞も提供する。さらに、本発明は、該ポリペプチド、複合体、核酸の作製方法および使用方法、そして更なる検討で明らかとなる他の特徴を提供する。
【００１１】
一態様では、本発明は、単離または組換えポリペプチド、すなわち配列番号１〜３１９のいずれか一項に分類される配列を含むポリペプチドを提供する。本発明は、これらのポリペプチドのいずれかを含む融合タンパク質および複合体、これらのポリペプチドをコードする核酸、およびこれらのポリペプチドの作製方法と使用方法も提供する。
【００１２】
本発明は、配列番号１〜３１９から選択される配列とは、例えば、０、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個の位置のアミノ酸、例えば、０〜１６個の位置のアミノ酸、０〜１５個の位置のアミノ酸、０〜１４個の位置のアミノ酸、０〜１３個の位置のアミノ酸、０〜１２個の位置のアミノ酸、０〜１１個の位置のアミノ酸、０〜１０個の位置のアミノ酸、０〜９個の位置のアミノ酸、０〜８個の位置のアミノ酸、０〜７個の位置のアミノ酸、０〜６個の位置のアミノ酸、０〜５個の位置のアミノ酸、０〜４個の位置のアミノ酸、０〜３個の位置のアミノ酸、０〜２個の位置のアミノ酸、０〜１個の位置のアミノ酸が異なる配列をそれぞれ含む単離または組換えポリペプチドも提供する。いくつかの該ポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３０、配列番号４６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９４、配列番号１０３、配列番号１０７、配列番号１２４、配列番号１２７、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４８、配列番号１６７、配列番号１７１、配列番号１７６、配列番号１７９、配列番号１９１、配列番号１９５、配列番号２０８、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２５８、配列番号２６０、配列番号２６２、配列番号２６３、配列番号２６６、配列番号２９３、配列番号２９６、配列番号２９７、配列番号２９８、配列番号３０３、配列番号３０６、配列番号３１０、配列番号３１２から選択される配列とは０〜１６個の位置のアミノ酸が異なる配列を含む。いくつかの該ポリペプチドが、インターフェロンα活性（例、抗ウイルス活性、ＴＨ１分化活性、および／または増殖抑制活性）を示す。
【００１３】
本発明は、配列番号３１２（Ｍ０１）、配列番号２６２（Ｍ０４）、配列番号２６６（Ｍ０５）、配列番号２３２（Ｍ２３）、配列番号８８（Ｍ４５）、配列番号２９７（Ｍ２０）、配列番号１６７（Ｍ２７）、配列番号１０７（Ｍ０９）、配列番号２０８（Ｍ０２）、配列番号９４（Ｍ３３）、配列番号１４１（Ｍ３７）、配列番号４６（Ｍ３０）、配列番号１７１（Ｍ２２）、配列番号３１０（Ｍ２４）、配列番号１７６（Ｍ４４）、配列番号２６（Ｍ３１）、配列番号８９（Ｍ１０）、配列番号２９６（Ｍ１４）、配列番号１４８（Ｍ０３）、配列番号１８（Ｍ４６）、配列番号１０（Ｍ２６）、配列番号８７（Ｍ２１）、配列番号１０３（Ｍ３８）、配列番号２３４（Ｍ２８）、配列番号３０（Ｍ１９）、配列番号１７９（Ｍ１１）、配列番号２（Ｍ３４）、配列番号２６０（Ｍ０７）、配列番号３０６（Ｍ１８）、配列番号１４０（Ｍ４０）、配列番号１２７（Ｍ１６）、配列番号２９３（Ｍ２５）、配列番号１９５（Ｍ２９）、配列番号１９１（Ｍ３６）、配列番号２６３（Ｍ０６）、配列番号１（Ｍ３２）、配列番号２９８（Ｍ３９）、配列番号２４（Ｍ４２）、配列番号２５８（Ｍ０８）、配列番号１２４（Ｍ３５）、配列番号７（Ｍ４１）、配列番号９（Ｍ１２）、配列番号３０３（Ｍ１７）、配列番号６（Ｍ４３）から選択される配列とは０〜１６個の位置のアミノ酸（例、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個の位置のアミノ酸、例えば、０〜１６個の位置のアミノ酸、０〜１５個の位置のアミノ酸、０〜１４個の位置のアミノ酸、０〜１３個の位置のアミノ酸、０〜１２個の位置のアミノ酸、０〜１１個の位置のアミノ酸、０〜１０個の位置のアミノ酸、０〜９個の位置のアミノ酸、０〜８個の位置のアミノ酸、０〜７個の位置のアミノ酸、０〜６個の位置のアミノ酸、０〜５個の位置のアミノ酸、０〜４個の位置のアミノ酸、０〜３個の位置のアミノ酸、０〜２個の位置のアミノ酸、０〜１個の位置のアミノ酸）が異なる配列をそれぞれ含む単離または組換えポリペプチド（例えば、上記のポリペプチド）も含む。いくつかの該ポリペプチドはインターフェロンα活性（例、抗ウイルス活性、ＴＨ１分化活性、および／または増殖抑制活性）を示す。いくつかの該ポリペプチドは、ＨｅＬａ／ＥＭＣＶ抗ウイルス分析試験において、ヒトＩＦＮ−α２ａよりも少なくとも２倍高い抗ウイルス活性を示す。いくつかの該ポリペプチドは、ＩＦＮ−α２ａに対するよりも高い親和性（より低いＥＣ５０）でヒトインターフェロンα受容体に結合する。該ポリペプチドは、１つ以上の追加アミノ酸（例、Ｎ末端へのメチオニン付加）をさらに含むことができる。本発明は、これらのポリペプチドを含む融合タンパク質および複合体、そしてこれらのポリペプチドをコードする単離または組換え核酸も提供する。
【００１４】
本発明は、上記の本発明のいずれかのポリペプチド、そしてポリペプチドの連結基に結合した少なくとも１つの非ポリペプチド部分など、本発明のポリペプチドを含む複合体も提供しており、該複合体はインターフェロンα活性を示す。場合によっては、非ポリペプチド部分は、重合体（例、モノメトキシポリエチレングリコールグリコール（ｍＰＥＧ）などのポリエテレングリコール（ＰＥＧ）といったポリアルキレンオキシド分子）もしくは糖部分である。少なくとも１つの非ポリペプチド部分は、例えば、システイン、リジン、ポリペプチドのＮ末端アミノ基、またはインビボでのポリペプチドのグリコシル化部位に結合しうる。本発明は、該複合体の作製方法および使用方法も提供する。
【００１５】
本発明は、本発明のいずれかのポリペプチドをコードする単離または組換え核酸も提供する。本発明は、該核酸を含むベクターおよび宿主細胞、および該核酸を含む宿主細胞の培養を含む、本発明のポリペプチドの作製方法も提供する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、ウイルス感染細胞におけるウイルス複製の阻害方法、本発明のポリペプチドまたは複合体とウイルス感染細胞との接触を含む方法を提供する。本発明は、本発明のポリペプチドまたは複合体とウイルス感染細胞との接触を含む、ウイルス感染細胞におけるウイルスのコピー数の低減方法も提供する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、病状に苦しむ被験体に対する、該病状に伴う症状を改善させるための有効量の本発明のポリペプチドまたは複合体を含む組成物の投与を含む、インターフェロンα反応性の病状の治療方法を提供する。該病状としては、慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染、慢性Ｂ型肝炎ウイルス感染、ヘアリー細胞白血病、悪性黒色腫、濾胞性リンパ腫、尖圭コンジローム、エイズ関連のカポジ肉腫、非ホジキンリンパ腫、慢性骨髄性白血病、基底細胞癌、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍、膀胱癌、クローン病、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、腎細胞癌、多発性硬化症、ＡＩＤＳが挙げられる。本発明には、例えば上記の病状など、インターフェロンα反応性の病状を治療するための本発明のポリペプチドまたは本発明の複合体を含む組成物の使用も含まれる。
【００１８】
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、添付の図面とともに以下の詳細な説明を読むことで、更に十分に明らかとなるであろう。
【００１９】
発明の詳細な説明
定義
本明細書、または本明細書の残り部分において別段の規定がない限り、本明細書において使用する全ての技術用語／科学用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者が通常理解しているのと同じ意味を持つ。
【００２０】
「ポリペプチド配列」（例、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなど）は、文脈に応じて、天然のアミノ酸または人工的なアミノ酸類似体、もしくはアミノ酸重合体を表す文字列を含むアミノ酸の重合体である。遺伝暗号の縮重を前提として、特定のポリペプチド配列をコードする１つ以上の核酸またはその相補的核酸は、該ポリペプチド配列から決定できる。
【００２１】
「ポリヌクレオチド配列」（例、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドなど）は、文脈に応じて、ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｔ、Ｕ、Ｇ、または他の天然ヌクレオチドまたは人工ヌクレオチド類似体、もしくは核酸を表す文字列を含むヌクレオチドの重合体である。任意の核酸または相補的核酸のいずれかは、特定のポリヌクレオチド配列から決定できる。
【００２２】
任意の重合体成分の位置（例、アミノ酸、ヌクレオチド、総称的に「残基」とも呼ばれる）を、任意の重合体成分の実際の数値位置によってよりはむしろ、選択されたアミノ酸または核酸重合体の同じまたは同等の位置を基準にして、指定する場合、任意のアミノ酸重合体または核酸重合体の番号付けは、選択されたアミノ酸重合体または核酸重合体の番号付けに「対応する」または「関連する」。したがって、例えば、任意のポリペプチド配列内の任意のアミノ酸の位置の番号付けは、参照配列として使用する選択されたポリペプチド配列内の同じまたは同等のアミノ酸の位置に対応する。
【００２３】
「同等の位置」（例、「同等のアミノ酸の位置」または「同等の核酸の位置」または「同等の残基の位置」）は、本明細書に記載するアラインメントアルゴリズムを利用して最適に配置される場合、参照ポリペプチド（または参照ポリヌクレオチド）の対応する位置と並ぶ、試験ポリペプチド（または試験ポリヌクレオチド）配列の位置（例、アミノ酸の位置または核酸の位置または残基の位置）と本明細書で定義する。試験ポリペプチドの同等のアミノ酸の位置は、参照ポリペプチドの対応する位置と同じ数値位置の番号を有する必要はなく、同様に、試験ポリヌクレオチドの同等のアミノ酸の位置は、参照ポリヌクレオチドの対応する位置と同じ数値位置の番号を有する必要はない。一例として、図１に、様々な既知のヒトインターフェロンαポリペプチド配列と最適に配置された、本明細書で配列番号１（クローンＭ３２）と定める本発明のポリヌクレオチドの配列を示している。この例では、配列番号１のアミノ酸番号９０が配列番号３２１のアミノ酸番号８９と並ぶため、配列番号１のアミノ酸の位置の番号９０（Ｔｙｒ９０、すなわちＹ９０）は、配列番号３２１（ヒトＩＦＮ−α２ｂ）のアミノ酸の位置の番号８９（Ｔｙｒ８９、すなわちＹ８９）と同等のアミノ酸の位置（すなわち、「同等」）と見なされる。言い換えると、配列番号１のアミノ酸の位置９０は、配列番号３２１のアミノ酸の位置８９に「対応する」。同様に、配列番号１の残基Ｙ９０（Ｔｙｒ９０）は、例えば、配列番号３１２内の残基Ｄ９０（Ａｓｐ９０）（クローンＭ０１、図２参照）に対応しており、ひいては、例えば、配列番号１に関する置換Ｙ９０Ｆは、例えば、配列番号３１２などに関する置換Ｄ９０Ｆに対応すると理解されたい。
【００２４】
その配列ペアについて可能な最高の類似性スコアに達するために、規定したパラメータ（すなわち、規定したアミノ酸置換マトリクス、ギャップ存在ペナルティ（ギャップ存在ペナルティ）（別名、ギャップ開始ペナルティ）、ギャップ伸長ペナルティ）を利用して並べられた場合、２つのポリペプチド配列は「最適に配置される」。ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(22):10915-10919)は、ポリペプチド配列アラインメントアルゴリズム（ＢＬＡＳＴＰなど）においてデフォルトスコアリング置換マトリックスとして使用する場合が多い。ギャップ存在ペナルティは配置された配列の１つにおける単一のアミノ酸ギャップの導入に課せられ、ギャップ伸長ペナルティはギャップ内の各残基の位置に課せられる。特に記載のない限り、本明細書で使用するアラインメントパラメータは、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス、ギャップ存在ペナルティ＝１１、ギャップ伸長ペナルティ＝１である。「Ｐｅｒｃｅｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｉｄｅｎｔｉｔｙ」という表題を付けた章において以下でさらに詳述するとおり、最も高い類似性スコアに達するように、アラインメントが始まり、そして終わる（例、アラインメントウインドウ）各配列のアミノ酸の位置によって、および１つまたは複数のギャップを１つまたは両方の配列に挿入することによって、アラインメントスコアを定義する。
【００２５】
アミノ酸の位置およびアミノ酸の置換を同定するために使用する用語を、以下の通りに説明する：位置番号５２を示すＱ５２は、参照アミノ酸配列（配列番号１などの）においてグルタミン（Ｇｌｕ）残基で占められる。Ｑ５２Ｅは、５２個の位置のグルタミン残基がグルタミン酸（Ｇｌｕ）残基で置換されていることを示す。別の置換を「／」で示しており、例えばＱ５２Ｅ／Ｐは５２個の位置のグルタミン残基がグルタミン酸残基またはプロリン残基で置換されたアミノ酸配列を意味する。複数の置換を「＋」で示す場合があり、例えばＡ５１Ｔ＋Ｑ５２Ｅ／Ｐはスレオニン残基による５１個の位置のアラニン残基の置換、そしてグルタミン酸残基またはプロリン残基による５２個の位置のグルタミン残基の置換を含むアミノ酸配列を示す。欠失は星印（＊）で示す。例えば、Ｑ５２＊は５２個の位置のグルタミン残基が欠失されたことを示す。２つ以上の連続アミノ酸の欠失を以下の通りに示し、例えばＲ１６１＊−Ｅ１６６＊はＲ１６１−Ｅ１６６を含む残基の欠失（すなわち、１６１、１６２、１６３、１６４、１６４、１６６残基が欠失される）を示す。挿入は以下の様に示す：５２番目に位置するグルタミン残基の後に追加されるセリン残基の挿入はＱ５２ＱＳで示される。置換と挿入の組み合わせは以下の様に示す：セリン残基による５２個の位置のグルタミン残基の置換、および５２個のアミノ酸残基の後へのアラニン残基の挿入は、Ｑ５２ＳＡで示す。
【００２６】
特に断りのない限り、本明細書に列挙するアミノ酸残基の番号付けは、アミノ酸配列の配列番号１に関連する。配列番号１に関して（または別の特定の配列に関して）、例および親ポリペプチドへの修飾を与えることができるが、例は本発明の他のポリペプチドに関連しており、本明細書に記載の修飾を本明細書に記載の他のいずれかのポリペプチドと同等のアミノ酸の位置（上記）に行うことができることを理解されたい。したがって、一例としては、配列番号１に関する置換Ｙ９０Ｆは、配列番号３１２などの置換Ｄ９０Ｆに対応すると理解されたい。
【００２７】
「インターフェロンα活性を示す（例、示す、または有する）」という用語は、本発明のポリペプチドまたは複合体が参照インターフェロンαポリペプチド（例えば、本明細書に配列番号３２１と記載するｈｕＩＦＮ−α２ｂ、本明細書に配列番号３２２と記載するｈｕＩＦＮ−α２ａ、本明細書に配列番号３２７と記載するｈｕＩＦＮ−α８ｂなどのヒトインターフェロンαポリペプチド、もしくは当該技術分野において周知の他の任意のインターフェロンαポリペプチド、例えば、Ａｌｌｅｎ  Ｇ．＆Ｄｉａｚ  Ｍ．Ｏ．（１９９６、上記を参照）記載のインターフェロンαポリペプチド）の示す少なくとも１つの活性を有することを指し示すことを意図している。該活性には、例えば、ウイルス複製の抑制またはウイルス感染細胞における細胞変性効果の抑制（「抗ウイルス活性」）、無感作Ｔ細胞のＴＨ１表現型への分化の促進および／または無感作Ｔ細胞のＴＨ２表現型への分化の抑制（「ＴＨ１分化活性」）、細胞増殖の抑制（「増殖抑制活性」）の１つ以上によって証拠付けられるインターフェロンα受容体を介したシグナル伝達能が含まれる。１つ以上のインターフェロンα活性は当該技術分野で周知である、および／または実施例に記載している分析試験を使って１つ以上のインターフェロンα活性を分析する。
【００２８】
インターフェロンα活性を示す、ポリペプチドまたは複合体は、それが測定可能な活性を呈する場合、該活性、例えば、測定可能な抗ウイルス活性、増殖抑制活性、ＴＨ１分化活性（例、当該技術分野において周知で、および／または実施例に記載の分析試験によって測定）を有すると考えられている。測定可能な活性を構成するものは行われる分析試験の性質に一部左右されるが、一般的ガイドラインとして、測定可能な活性は、試験化合物（例、本発明のポリペプチド）の存在下で生じる分析シグナルが、試験化合物の非存在下で生じる分析シグナルとは定量的に異なるような活性である、ことを当業者は認識している。本発明のポリペプチドまたは複合体が、特定の参照インターフェロンαの周知の活性の全てを示すか、もしくは参照インターフェロンαと同程度に該活性を示す必要がないことを理解されたい。場合によっては、本発明のポリペプチドまたは複合体が示す活性（例えば、ＥＣ５０、比率活性度、もしくは他の活性と関連する値によって実証される）は、参照インターフェロンαによって示される特定の活性と同程度、未満、もしくはそれ以上でありうる。
【００２９】
「変異体」は、親ポリペプチド配列と１つ以上のアミノ酸の位置が異なる配列を含むポリペプチドである。例えば、変異体は、親ポリペプチド配列の残基の総数の最高１０％、残基の最高８％（例えば親ポリペプチド配列の残基の総数の最高６％、５％、４％、３％、２％、１％）において親ポリペプチド配列とは異なる配列を含むことができる。例えば、配列番号１の変異体は、配列番号１とは１〜１６個の位置のアミノ酸（例、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個の位置のアミノ酸）、例えば１〜１５個の位置のアミノ酸、１〜１４個の位置のアミノ酸、１〜１３個の位置のアミノ酸、１〜１２個の位置のアミノ酸、１〜１１個の位置のアミノ酸、１〜１０個の位置のアミノ酸、１〜９個の位置のアミノ酸、１〜８個の位置のアミノ酸、１〜７個の位置のアミノ酸、１〜６個の位置のアミノ酸、１〜５個の位置のアミノ酸、１〜４個の位置のアミノ酸、１〜３個の位置のアミノ酸、１〜２個の位置のアミノ酸が異なる配列を含むことができる。
【００３０】
「親ポリペプチド」または「親インターフェロンα」という用語は、本発明に従って修飾されるポリペプチド配列を示すことを意図している。親ポリペプチド配列は天然ＩＦＮ−αの配列でありうる（哺乳動物のＩＦＮ−α、例えば、霊長類ＩＦＮ−α、ヒトＩＦＮ−α、本明細書において配列番号３２０〜３３２に分類されるｈｕＩＦＮ−αポリペプチド、本明細書および／またはＡｌｌｅｎ  Ｇ．＆Ｄｉａｚ  Ｍ．Ｏ．（１９９６）（上記を参照）記載の他のｈｕＩＦＮ−α配列など）。親ポリペプチド配列は、ＩＦＮ−αＣｏｎ１（配列番号３３３）などの非天然（すなわち、「合成の（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）」）インターフェロンαの配列でありうる。場合によっては、修飾される親ポリペプチドはそれ自体が、例えば配列番号１〜３１９のいずれかといった本発明のポリペプチドでありうる。
【００３１】
対象物に適用される「天然の」とは、該対象物が人工的に産生されたものとは異なり、自然界で見られることを示す。例えば、自然の材料から単離可能であり、実験室において人によって意図的に修飾されていない生物（ウイルス、細菌、単細胞動物、昆虫、植物、または哺乳動物の組織を含む）に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は天然である。対象物に適用される「非天然の」（別に「合成の」または「人工の」とも呼ばれる）とは、該対象物が天然ではない、すなわち該対象物が人工産物とは異なり、自然界に見られないことを意味する。
【００３２】
「断片」または「サブシークエンス」は配列全体の一部であり、配列全体までで、配列全体は含まない。したがって、断片またはサブシークエンスは、アミノ酸（例、ポリペプチド）または核酸（例、ポリヌクレオチド）の一部以上を含むアミノ酸または核酸の配列を示す。
【００３３】
本発明で検討したある種の断片は、親ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端（もしくは両方）からアミノ酸残基が取り除かれた断片であり、該ポリペプチドは「Ｎ−末端が切断された」または「Ｃ−末端が切断された」と見なされる。少なくともＮ末端から最初の４個のアミノ酸の欠失では、インターフェロンα活性に重要な影響はない（Lydon, N.B.ら、(1985) Biochemistry 24: 4131-41)。さらに、インターフェロンα活性を保持する変異体について記述されており、ここでは７〜１１個のアミノ酸がＣ末端から欠失されている（Cheetham B.F.ら、(1991) Antiviral Res. 15(1):27-39; Chang N.T.ら、(1983) Arch. Biochem Biophys. 221(2): 585-589;  Franke A.E.ら、(1982) DNA 1(3):223-230)。
【００３４】
「受容体」、例えば「インターフェロンα受容体」（別名「Ｉ型インターフェロン受容体」）は、インターフェロンαによって細胞内で活性化される受容体であり、例えばインターフェロンαに結合して、受容体サブユニットＩＦＮ−ＡＲ−２およびＩＦＮ−ＡＲ−１を含むＩ型インターフェロン受容体などの細胞内シグナル伝達を開始させる（Domanskiら、(1998) J. Biol. Chem. 273(6):3144-3147; Mogensenら、 (1999) Journal of Interferon and Cytokine Research, 19:1069-1098)。本発明に照らして、受容体は、例えば膜結合部分を欠く受容体分子、例えばインターフェロンαには結合するが、必ずしも膜に結合せず、および／または細胞内シグナル伝達を開始させない、完全長の受容体分子の切断型を含む細胞外ドメインから成る可溶性の受容体分子（別名「可溶性の受容体」）も意味する。
【００３５】
２つの分子間、例えばリガンドと受容体との「特異的結合の親和性」とは、分子の混合物における１つの分子と別の分子との選択的な結合を意味する。結合親和性が約１×１０４Ｍ−１〜約１×１０９Ｍ−１以上（すなわち、ＫＤが約１×１０−４Ｍ〜約１×１０−９Ｍ以下）の場合、分子の結合は通常特異的と見なされる。リガンドと受容体との結合親和性は、当業者には周知の標準的技術によって測定できる。結合親和性を測定するための周知の技術の非限定的な例としては、Biacore technology（Biacore AB、スウェーデン），Isothermal titration microcalorimetry（MicroCal LLC, Northampton、米国マサチューセッツ州）、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー（例、ＦＡＣＳ）が挙げられる。例えば、フローサイトメトリー法は、関連する結合パートナー（受容体など）に特異的に結合する分子集団（例えば、細胞表面ディスプレイリガンドなど）について選択するのに使用できる。リガンド−受容体の複合体は蛍光（例、複合体を認識する蛍光抗体と複合体との反応、もしくはストレプトアビジン結合蛍光プローブとビオチン化リガンドを含む複合体との反応による）によって検出・選別できる。関連する結合パートナー（例、受容体）に結合する対象分子をより低濃度の受容体の存在下においてプールして、再選別する。受容体の濃度を漸減させながら（濃度範囲の例としては、リガンド−受容体の相互作用の性質に応じて、１０−６Ｍ〜１０−９Ｍ、１マイクロモル（μＭ）〜１ナノモル（ｎＭ）以下）細胞選別を複数回実施することで、受容体に対する特異的な結合親和性を示す濃縮された分子集団を得ることができる。
【００３６】
ポリペプチド、核酸、または他の成分は、それが通常結合している成分（他のペプチド、ポリペプチド、タンパク質（例えば天然配列を伴いうるポリメラーゼやリボソームなどの複合体を含む）、核酸、細胞、合成試薬、細胞混入物質、細胞成分など）、例えば本来由来している細胞内において通常結合している他の成分から部分的または完全に分離されている場合には「単離されている」。ポリペプチド、核酸、または他の成分は、それが成分、混合物、または成分の集合物中に存在する主な種となるように（すなわち、モルベースで、成分中において他の個々の種よりも豊富となるように）、自然環境の他の成分から部分的または完全に回収または分離される場合には単離されている。場合によっては、調製品は約６０％以上、７０％または７５％、通常約８０％以上、好ましくは約９０％以上の単離種から成る。
【００３７】
「実質的に純粋な」または「単離された」核酸（例、ＲＮＡまたはＤＮＡ）、ポリペプチド、タンパク質、または成分は、目的の種（例、核酸またはポリペプチド）が、存在する全ての巨大分子種において少なくとも５０、６０、７０重量パーセント（モルベース）含まれる場合も意味する。実質的に純粋な、または単離された組成物は、該組成物に存在する全ての巨大分子種の少なくとも約８０、９０、９５％重量パーセントを占めうる。単離された目的種は、実質的に均質にまで精製することも可能であり（混入種が従来の検出方法によって該組成物中において検出不可能である）、ここで該組成物は実質的に１つの巨大分子種の派生物から成る。「精製した」という用語は、一般に核酸、ポリペプチド、またはタンパク質が電気泳動的ゲル内において実質的に１本のバンドを生じることを示す。一般的に、核酸、ポリペプチド、またはタンパク質が少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、好ましくは少なくとも約８５％、最も好ましくは少なくとも９９％純粋であることを意味する。
【００３８】
「単離された核酸」という用語は、本発明の核酸が由来する生物の天然ゲノム中において、すぐ近くで隣接する（すなわち、５’末端に１つ、３’末端に１つ）コード配列のいずれともすぐ近くで隣接していない核酸（例、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を示すことができる。したがって、この用語には、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または制限酵素処理によって産生されるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片が含まれ、ここで該ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片がベクター内に組み込まれているか否か、同種もしくは例えば本来それが由来するウイルスなどの生物以外の異種のゲノムに挿入されているか否か、追加のコード配列に連結してキメラポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝子を形成しているか、もしくは任意の他のＤＮＡ配列とは独立しているかを問わない。ＤＮＡは二重鎖または一本鎖、もしくはセンスまたはアンチセンスでありうる。
【００３９】
「組換えポリヌクレオチド」または「組換えポリペプチド」は、１つより多い原料の核酸またはポリペプチドにそれぞれ由来する核酸またはアミノ酸配列を含むことができる非天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであり、このような原料の核酸またはポリヌクレオチドは天然の核酸またはポリペプチドであるか、もしくはそれ自体が突然変異生成または他の種類の修飾を受けうる核酸またはポリヌクレオチドは、それが合成または人工または改変である、もしくは合成または人工または改変ポリペプチドまたは核酸に由来する場合、「組換え体」と判断できる。組換え核酸（例、ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、通常一緒には含まれない、通常互いに結合しない、もしくは通常互いに分離していない配列の少なくとも２つの部位の組み合わせ（例、人工的組み合わせ）によって作製可能である。組換え核酸は、異なる原料すぐ近くに隣接する由来の核酸断片を互いに連結して、もしくは組み合わせて形成される、および／または人工的に合成される核酸分子から成りうる。「組換えポリペプチド」とは、クローンされた、もしくは組換え核酸から生じるポリペプチドを示す。異なる核酸またはアミノ酸配列が由来する供給源のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは相同となる場合があり（すなわち、同じまたは類似の構造および／または機能をコードするポリペプチドを有する、もしくはコードする）、そして例えば、生物の異なる分離株、血清型、株、種、または異なる病状に由来することが多い。
【００４０】
「組換え体」という用語は、例えば、細胞、ポリヌクレオチド、ベクター、タンパク質、ポリペプチドと関連して使用する場合、細胞、ポリヌクレオチド、ベクターが異種（外来）核酸の導入または天然核酸の改変によって修飾されている、もしくはタンパク質またはポリペプチドが異種アミノ酸の導入によって修飾されている、もしくは細胞がこのように修飾された細胞に由来することを通常示す。組換え細胞は、天然型（非組換え）細胞においては認められない核酸配列を発現している、もしくは本来なら異常発現している、発現不足である、全く発現されていない天然の核酸配列を発現する。「組換え体」という用語は、細胞に関連して使用する場合、細胞が異種核酸を複製する、もしくは異種核酸によってコードされるポリペプチドを発現することを示す。組換え細胞は、天然型（非組換え）細胞内では認められないコード配列を含むことができる。組換え細胞は、天然型の細胞で認められるコード配列も含むことができるが、該コード配列は人工的な方法によって修飾されて、細胞内に再導入される。該用語には、細胞から核酸を除去することなく修飾された細胞に内在的な核酸を含む細胞も含まれており、該修飾には遺伝子置換、部位特異的突然変異、組換え、そして関連技術によって得られるものが含まれる。
【００４１】
「組換え技術によって作製した」という用語は、化学合成の方法、核酸部分の反復的配列組換えまたはヌクレオチドの他の多様性作製方法（例、シャッフリングなど）、もしくは核酸の単離部位の操作、例えば、当業者には周知の遺伝子工学技術によって通常達成される人工的な組換えを示す。「組換え技術によって発現された」とは、インビトロでの組換え核酸の産生技術、そして組換え核酸が発現または増幅されうる、インビボ、インビトロ、エクソビボでの該組換え核酸の細胞内への移入を通常示す。
【００４２】
「組換え発現カセット」または単に「発現カセット」は、該配列に適合する宿主内での構造遺伝子の発現を引き起こすことの可能な核酸エレメントとともに、組換え技術によって、もしくは合成的に作製した核酸構造物である。発現カセットには、少なくともプロモーター、そして任意で転写終結シグナルが含まれる。通常、組換え発現カセットは転写される核酸（例、所望のポリペプチドをコードする核酸）およびプロモーターを含む。発現を引きき起こす際に必要または有用な追加因子も本明細書に記載のとおりに使用できる。例えば、発現カセットには宿主細胞からの発現タンパク質の分泌を促すシグナル配列をコードするヌクレオチド配列が含まれうる。遺伝子発現に影響を及ぼす、転写終結シグナル、エンハンサー、他の核酸配列も発現カセットに含まれうる。
【００４３】
「免疫原」とは免疫反応を誘発可能な物質を示し、例えば、抗原、自己免疫疾患の誘発において役割を果たす自己抗原、癌細胞において発現する腫瘍関連抗原が挙げられる。免疫反応は、一般に、抗原またはその断片などの物質、もしくは該物質をコードする核酸に対する細胞性または抗体媒介性の反応の発生を示す。場合によっては、該反応には、目的の抗原を発現する抗原提示細胞を特異的に標的とする、ＣＴＬ、Ｂ細胞、または様々なクラスのＴ細胞の少なくとも１つのまたは組み合わせの産生が含まれる。
【００４４】
「抗原」とは、宿主において抗体形成を引き起こすことの可能な物質、もしくは該物質に対して反応性の特異的なリンパ球集団を発生可能な物質を示す。抗原は、通常、宿主にとって外来の高分子（例、タンパク質、多糖類）である。
【００４５】
「アジュバント」とは、抗原の免疫刺激特性または薬剤の薬理学的作用を高める物質を示す。アジュバントは抗原に対する免疫反応を非特異的に高めることができる。「フロイント完全アジュバント」は、例えば、免疫原、乳化薬剤、放線菌を含む油と水の乳剤である。別の例では、「フロイント不完全アジュバント」は同じであるが、放線菌を含まない。
【００４６】
ベクターとは、選択された核酸による細胞の形質転換またはトランスフェクション、または細胞内での該核酸の発現を促進させる成分または組成物である。ベクターとしては、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、イースト人工染色体（ＹＡＣｓ）、細菌、ポリリジンなどが挙げられる。「発現ベクター」は、宿主細胞において特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを用いて、組換え技術によって、もしくは合成的に生成した、核酸構造物または配列である。発現ベクターは、プラスミドの一部、ウイルス、または核酸断片でありうる。発現ベクターは、通常、プロモーターに機能的に結合されて転写される核酸を含む。転写される核酸は、通常、プロモーターの指示または制御下にある。
【００４７】
「実質的な全長ポリヌクレオチド配列」または「実質的な全長ポリペプチド配列」とは、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の長さの、少なくとも５０％、一般には少なくとも約６０％、７０％、または７５％、通常、少なくとも約８０％、または通常、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上を示す。
【００４８】
「イムノアッセイ」という用語には、抗原に結合する、または特異的に結合する抗体または免疫原を使用する分析試験が含まれる。イムノアッセイは、通常、抗原を単離して、標的とし、および／または定量化するための特定の抗体の特異的な結合特性の利用を特徴とする。
【００４９】
本明細書で使用する「被験体」という用語には、限定はされないが、例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類（例、ヒヒ、オランウータン、サル）、ネズミ、ブタ、ウシ、ヤギ、ネコ、ウサギ、ネズミ、モルモット、ハムスター、ウマ、サル、ヒツジ、または他のヒト以外の哺乳動物、そして例えば鳥（例、ニワトリ、アヒル）または魚などの非哺乳類脊椎動物、そして非哺乳類無脊椎動物などの非哺乳類動物が含まれる。
【００５０】
「医薬組成物」という用語は、動物またはヒトを含めた被験体における医薬用途に適した組成物を意味する。医薬組成物は、一般に、有効量の有効成分、そして例えば医薬的に許容され得る担体などの担体を含む。
【００５１】
「有効量」という用語は、所望の結果をもたらすために十分な用量または量を意味する。所望の結果には、該用量または量の受容者における客観的または主観的な改善を含むことができる。
【００５２】
「予防的治療」とは、疾患、病状、医学的障害の徴候または症状を示さない被験体、または疾患、病状、医学的障害の初期の徴候または症状のみを示す被験体に施される治療であり、該治療は疾患、病状、医学的障害の発症リスクを軽減、予防、低下させる目的で施される。予防的治療は、病気または障害に対する予防的治療の役割を果たす。「予防活性」とは、核酸、ベクター、遺伝子、ポリペプチド、タンパク質、物質、またはその組成物などの作用物の活性であり、疾患、病状、障害の徴候または症状を示さない被験体、または疾患、病状、障害の初期の徴候または症状のみを示す被験体に施される場合、該被験体における疾患、病状、障害の発症リスクを軽減、予防、低下させる。「予防的に有用な」薬剤または化合物（例、核酸、ポリペプチド）とは、病状、疾患、または障害の発症を軽減、予防、低下させる際に有用な薬剤または化合物を示す。
【００５３】
「治療上の処置」とは、病状、疾患、障害の徴候または症状を示す被験体に施される処置であり、ここで該処置は病状、疾患、障害の徴候または症状を軽減、予防、低下させる目的で被験体に施される。「治療活性」とは、核酸、ベクター、遺伝子、ポリペプチド、タンパク質、物質、またはその成分などの作用物の活性であり、該徴候または症状に苦しむ被験体に投与された場合、病状、疾患、障害の徴候または症状を除去ないし軽減させる。「治療的に有用な」薬剤または化合物（例、核酸、ポリペプチド）とは、薬剤または化合物が、病状、疾患、または障害の徴候または症状を軽減、治療、除去させる際に有用であることを示す。
【００５４】
「遺伝子」とは総括的に生物学的機能と関連するＤＮＡ部分を示す。遺伝子には、それらの発現に必要とされるコード配列および／または制御配列が含まれる。遺伝子には、例えば他のタンパク質の認識配列を形成する未発現のＤＮＡ核酸部分（例、プロモーター、エンハンサー、他の制御領域）も含まれる。遺伝子は、目的の原料からのクローニング、もしくは既知のまたは予測される配列情報からの合成などの様々な原料から入手可能であり、所望のパラメータを有するように設計された配列を含むことができる。
【００５５】
一般に、以下で使用する命名法、そして後述の細胞培養、分子遺伝学、分子生物学、核酸化学、タンパク質化学の実験プロトコールは、当業者には周知であり一般的に使用するものである。組換え核酸方法、核酸合成、細胞培養法、トランス遺伝子の組み込み（例、エレクトロポレーション、インジェクション、遺伝子銃、皮膚を介した圧痕、リポフェクション）については、Sambrookら、Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 (以下、“Sambrook”)およびCurrent Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubelら、 eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc.(1994, supplemented through 1999) (以下、“Ausubel”)に記載の標準的な方法を利用した。一般に、オリゴヌクレオチドの合成／精製段階は本明細書に従って実施される。技術および手順は、一般に、当該技術分野での従来の方法、および本文書を通して提供する様々な一般的な参考文献に従って実施される。その中の手順は当業者には周知と考えられ、読み手の便宜のため、提供される。
【００５６】
本明細書で使用するとおり、「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的または部分的にコードされる１つ以上のポリペプチドを含むタンパク質を示す。抗体という用語は、抗体全体およびその結合断片を意味するために使用する。認められている免疫グロブリン遺伝子には、無数の免疫グロブリン可変領域の遺伝子の他、κ、λ、α、γ、δ、ε、μ定常領域の遺伝子が含まれる。軽鎖はκまたはλに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、εに分類され、これらはそれぞれ順に免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥを定義する。典型的な免疫グロブリン（例、抗体）構造単位には四量体が含まれる。各四量体は同じ２つのポリペプチド鎖の対から成っており、各対が１本の軽鎖（約２５KDa）および１本の重鎖（約５０〜７０KDa）を伴う。各鎖のＮ末端は、抗原認識に関与する約１００〜１１０個以上のアミノ酸の可変領域を定める。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれこれらの軽鎖、重鎖を示す。
【００５７】
抗体には、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体の他、可変軽鎖および可変重鎖が（直接的に、もしくはペプチドリンカーを介して）互いに連結して、連続的なポリペプチドを形成する、一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）などのシングルアーム複合材料であるモノクローナル抗体、一本鎖抗体も含まれる（Packら、(1995) J Mol Biol 246:28; Biotechnol 11:1271; and Biochemistry 31:1579)。該抗体は、例えば、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、単鎖、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって作製した断片などである。
【００５８】
「エピトープ」という用語は、抗体への特異的結合を可能にするタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、アミノ酸または糖鎖などの分子の化学的に活性な表面基から成り、通常、特定の荷電特性の他、特定の三次構造を有する。立体構造／非立体構造エピトープは、前者が界面活性剤の存在下で失われるのに対して、後者は失われない点で区別される。
【００５９】
抗体の「抗原−結合断片」とは、抗原に結合する抗体のペプチドまたはポリペプチド断片である。抗原−結合部位は、抗原の結合に寄与する、関与する、もしくは影響を与える抗体のこれらアミノ酸でできている。Scott, T.A. and Mercer, E.I., Concise Encyclopedia: Biochemistry and Molecular Biology (de Gruyter, 3d ed.1997)、Watson, J.D.ら、Recombinant DNA (2d ed.1992)  (以下、“Watson, Recombinant DNA”)を参照すること。それぞれは、実際的には参照によりすべて本明細書に援用される。
【００６０】
「スクリーニング」という用語は、一般に、本発明のポリペプチドおよび該分子をコードする核酸など、本発明の最適な分子を同定する工程を述べている。これらの各分子のいくつかの特性は、例えば、試験系またはインビトロ、エクソビボ、インビトロの用途における、分子によるリガンドまたは受容体への結合、細胞増殖の抑制、ウイルス感染細胞におけるウイルス複製の抑制、細胞のサイトカイン産生の誘導または抑制、免疫反応の改変（例、所望の免疫反応を誘導または抑制）の能力に関するスクリーニングに利用できる。抗原の場合、該抗原のいくつかの特性は、抗原の発現、折りたたみ、安定性、免疫原性、数種の関連抗原からのエピトープの存在を含めた、選択およびスクリーニングに利用できる。
【００６１】
「選択」とは、同定と物理的分離を同時に行うスクリーニングの一形式である。１つの選択方法は遺伝子選択であり、例えば、いくつかの環境においてマーカー発現細胞の生存を可能にして、他の細胞を死滅させる（その逆もある）選択マーカーの発現によって遺伝子選択を達成できる。選択マーカーには薬物や毒素抵抗性遺伝子などが含まれる。スクリーニングマーカーとしては、例えば、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、緑色螢光タンパク質などが挙げられる。別の選択方法には、リガンドの受容体への結合、基質の酵素との反応、または直接的（例、発色性／蛍光性基質またはリガンドの利用による）ないし間接的（例、発色性／蛍光性二次抗体または発色性／蛍光性リガンドとの反応による）に検出可能なシグナルを生じる他の物理的工程などの検出可能な事象に基づく物理的ソーティングが含まれる。
【００６２】
物理的ソーティングによる選択は、例えば細胞全体または微液滴において、フローサイトメトリーなどの様々な方法によって実施できる。例えば、ライブラリーは細胞表面上でのポリペプチドの発現を可能にする表面ディスプレイベクター内にサブクローニングできる。表面に発現されたポリペプチドのライブラリーは、その後、フローサイトメトリーを利用して、受容体に結合するポリペプチドについて濃縮できる。例えば、受容体に結合するポリペプチドを提示する細胞は、蛍光標識化された抗受容体抗体を使用して検出し、これは、受容体に結合した場合、表面に提示されたポリペプチドと受容体との相互作用のために細胞を間接的に標識化する。この方法で蛍光標識化された細胞は、その後、フローサイトメトリーによって選別されて、これによって受容体に結合する発現・折り畳まれたポリペプチドをコードするメンバーについてライブラリーがあらかじめ濃縮される。受容体への結合物についてあらかじめ濃縮されたライブラリーは、その後、競合アッセイを利用した選択にかけられて、参照ペプチドと比較して、受容体に強固に結合する、および／または受容体からの遅い離脱速度を示すポリペプチドをコードするメンバーがさらに濃縮される。この方法では、受容体を細胞表面上においてポリペプチドを発現する細胞集団に添加する。細胞を洗い、そして次に参照ポリペプチドが添加される。細胞集団は様々な回数のフローサイトメトリーによって選別され、参照ポリペプチドの存在下においてより長時間にわたって受容体に結合したままの表面提示ポリペプチドが選択される。この方法で選択された細胞集団は、同種の受容体へのより強固な結合を示すポリペプチドをコードするライブラリーのメンバーについて濃縮されていることが予測され、強固な受容体結合と関連する活性を伴うポリペプチドの単離・同定が可能となる。
【００６３】
本明細書で使用する、「外来性核酸」、「外来性ＤＮＡ断片」、「異種配列」、または「異種核酸」は、特定の宿主細胞に対して外来の原料に由来する、もしくは同じ原料である場合、その元の形状が修飾を受けている。このように、宿主細胞内の異種遺伝子には、特定の宿主細胞に内因性ではあるが、修飾を受けている遺伝子が含まれる。本明細書に記載の用途において異種配列の修飾は、通常、反復配列組換えの利用を通じて生じる。該用語は、細胞にとって外来または外来性である、もしくは細胞にとって同種であるが、エレメントが本来は認められない宿主細胞の核酸内の位置にあるＤＮＡ断片を示す。外来性ＤＮＡ断片は発現されて、外来性ポリペプチドを生じる。
【００６４】
「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖いずれかの形状のデオキシリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼ、そしてその重合体を示す。特に限定はされないが、該用語には、参照核酸と類似の結合特性を有しており、天然のヌクレオチドと同様の代謝を受ける、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸が含まれる。特に断りのない限り、特定の核酸配列には、明示した配列の他、その保存的に修飾された変異体（例、縮重コドン置換）および相補的配列も間接的に含まれる。具体的には、縮重コドン置換は、選択された１つ以上（または全て）のコドンの３個の位置が混合基および／またはデオキシイノシン残基と置換された配列を作製することで得ることができる（Batzerら、(1991) Nucleic Acid Res 19:5081; Ohtsukaら、(1985) J Biol Chem 260:2605-2608; Cassolら、(1992) ; Rossoliniら、(1994) Mol Cell Probes 8:91-98)。核酸という用語を、遺伝子、遺伝子がコードするｃＤＮＡ、ｍＲＮＡと互換的に使用する。
【００６５】
「遺伝子由来の核酸」とは、その合成、遺伝子、サブシークエンスが最終的には鋳型としての役割を果たした核酸を示す。したがって、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡ、ｃＤＮＡから転写されるＲＮＡ、ｃＤＮＡから増幅ＤＮＡ、増幅ＤＮＡから転写されるＲＮＡなどは全て遺伝子に由来しており、由来する産物の検出は検体中での元の遺伝子および／または遺伝子転写産物の有無および／または存在量を示唆している。
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれる場合、「機能的に連結している」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写を増大させる場合、コード配列に機能的に連結している。「機能的に連結している」とは、通常、連結したＤＮＡ配列が連続的であり、必要に応じて、２つのタンパク質のコード領域を連続的かつ読み枠内で結合させることを意味する。一方で、通常、プロモーターから数ｋｂ隔たれている場合にエンハンサーは機能し、イントロン配列の長さが可変的であるため、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは機能的に連結しているが、連続的ではない。
【００６６】
「サイトカイン」という用語には、例えば、インターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、造血成長因子、腫瘍壊死因子、形質転換成長因子が含まれる。一般に、これらは、免疫系細胞の成熟、増殖、分化を制御する低分子量タンパク質である。
本説明および請求項では、例えば、非ポリペプチド部分、アミノ酸残基、置換、緩衝液、炭素などとの関連で、「ある」成分とは、特に指定のない限り、あるいは上記が当てはまらないことが個々の状況から明確ではない場合、該成分の１つ以上を述べることを意図している。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃから成るグループから選択されるある成分」には、Ａ、Ｂ、Ｃの全ての組み合わせ、例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ａ＋Ｂ、Ａ＋Ｃ、Ｂ＋Ｃ、Ａ＋Ｂ＋Ｃが含まれることを意図している。
【００６７】
さらに様々な用語を、本明細書で定義もしくは特性付けしている。
【００６８】
本発明の分子および方法
本発明の分子（例えば、本発明のポリペプチド、本発明の複合体、そして該ポリペプチドをコードする核酸）は、インターフェロンαでの治療に反応性の疾患および障害、特に例えばＨＣＶ感染などのウイルス感染に伴う疾患の治療に有用である。
【００６９】
慢性のＨＣＶ伝染を伴う患者は、通例、治療前に１０４〜１０７コピーＨＣＶ  ＲＮＡ／ｍｌ（血清）の範囲のウイルス量を有する。ＩＦＮ−α治療時に、これらの患者におけるウイルス量は、２つの異なる対数−直線期の低下を起こすことを特徴とする（Neumann A.U.,ら、(1998) Science 282:103-107)。ＩＦＮ−α治療の最初の２日間以内に起こるウイルス量の最初の急激な低下は、感染肝臓細胞におけるウイルス賛成のインターフェロンαを介した減少、および感染に対する未感作細胞の同時保護に起因すると考えられる。ウイルス生産の速度は、２日目前後に新しい定常状態に達し、その時にウイルスクリアランスのそれほど急速ではない２番目の対数−直線期が観察される。この第二期のウイルスクリアランスは通常、Ｔ細胞を介した感染肝臓細胞の殺傷に部分的に起因すると考えられる（Neumann,ら、上記を参照）。ＩＦＮ−αは、抗原特異的Ｔ細胞のＴＨ１細胞への分化刺激を介したこの生物学的反応において重要な役割を果たすと考えられる。さらに、リバビリンの作用機構はＴＨ１反応の増強に起因すると考えられており、ＩＦＮ−αとの併用療法におけるその有効性の基本メカニズムであると考えられる。現在使用中のインターフェロンα治療に反応しないＨＣＶ感染患者（一般に「非応答者」と呼ばれる）は、ずっと浅いウイルス量のクリアランスプロファイルを示す。
【００７０】
本発明は特定の発症機構の理論に限定されることを意図していないが、代理アッセイ系（本明細書にさらに詳述するアッセイ系など）での抗ウイルス活性は、例えば第一段階のウイルスクリアランスにおけるインターフェロンαの有効性を予測できることが提案されている。実施例の章に記載の例示的な抗ウイルスアッセイでは、ヒト肝臓細胞におけるＨＣＶに対する有効性の代理システムとして、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頚部癌細胞）の細胞変性作用に対する保護におけるＩＦＮ−αの有効性がモニターされている。他の有用なウイルス／細胞アッセイ系としては、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の他、ＷＩＳＨヒト羊膜由来細胞におけるＥＭＣＶ、ＨｕＨ７ヒト肝臓由来細胞におけるＥＭＣＶ、ＨｕＨ７細胞における水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ＨｅＬａ細胞におけるワクシニアウイルス（ＶＶ）、ＨｅｐＧ２ヒト肝臓癌細胞における黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）が挙げられる。実施例２および図３には、ＥＭＣＶ／ＨｅＬａ抗ウイルス分析試験における本発明の代表的なポリペプチドの抗ウイルス活性を示している。
【００７１】
感染肝臓細胞におけるＨＣＶに対する有効性のモニタリングに有用な他の代理アッセイ系には、例えばLohmann V.,ら、(1999) Science 285(5424):285-293; Randall G. and Rice C.M. (2001) Curr Opin Infect Dis 14(6):743-7477、そしてBartenschlager, R. (2002) Nature Reviews/Drug Discovery 1:911に記載のＨＣＶレプリコン系が挙げられる。ＨＣＶ抗ウイルス効果をモニタリングするための有用なインビボでの宿主系の一例は、Mercer,ら、(2001) Nature Medicine 7(8):927-933に記載のキメラヒト肝臓ＳＣＩＤマウスである。
【００７２】
理論によって限定はされないが、ＩＦＮ−αによるＴＨ１分化の促進および／またはＴＨ２分化の抑制は、例えば第二段階のウイルスクリアランスにおけるインターフェロンαの有効性の要因となりうることが更に提示されている。この理論に従って、これらの生物活性（すなわち、ＴＨ１分化の促進および／またはＴＨ２分化の抑制）の有効性が増大した進化型ＩＦＮ−αは、例えば、同用量で投与された現在認可されている治療用インターフェロンα分子と比較して有効性が増大していることが予測される。本明細書の実施例に記載の例示的なアッセイでは、ＥＬＩＳＡまたは細胞内染色およびＦＡＣＳソーティングによる、ＴＨ１表現型（例、ＩＦＮ−γ）および／またはＴＨ２表現型（例、ＩＬ−５、ＩＬ−４）と関連するサイトカイン産生を測定することで、未感作ＴＨ０細胞におけるＩＦＮ−αによるＴＨ１分化の促進および／またはＴＨ２分化の抑制がモニターされる。
【００７３】
ＩＦＮ−α分子の治療効力は、例えば血小板減少症と好中球減少などの用量規程毒性に部分的に起因して低下する傾向がある。本発明では特定の発症機構の理論に限定されることを意図していないが、前記の毒性は血小板および好中球の前駆細胞に及ぼすＩＦＮ−αの増殖抑制作用と関連しており、代理アッセイ系（本明細書に記載のアッセイ系など）における増殖抑制活性によってインターフェロンα分子の相対的毒性を予測しうることが提示されている。したがって、ＩＦＮ−α治療に伴う用量規定毒性は、例えば現在認可されている治療用インターフェロンα分子である、ROFERON(登録商標)-A（インターフェロンα−２ａ、組換え；Hoffmann-La Roche Inc.）、INTRON(登録商標)A(インターフェロンα−２ｂ、組換え；Schering Corporation）、INFERGEN(登録商標)（インターフェロンａｌｆａｃｏｎ−１；InterMune, Inc.）と比較して増殖抑制活性の減少を示すＩＦＮ−α分子では低下しうる。本明細書の実施例に記載の例示的な増殖抑制活性アッセイでは、Ｄａｕｄｉリンパ球様細胞の増殖に及ぼすＩＦＮ−αの作用がモニターされる。または、もしくは加えて、現在認可されている分子よりも低濃度またはより少ない回数での投与が可能となる、より治療効果の高い分子の投与の結果として、用量規定毒性は低下されうる。
【００７４】
新規インターフェロンαポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードする核酸を提供することが本発明の目的である。本発明のポリペプチドは、インターフェロンα治療に対して反応性の疾患および障害、特に例えばＨＣＶ感染などのウイルス感染に伴う疾患の治療に有用である。本発明のいくつかのポリペプチドは、例えば抗ウイルス活性、増殖抑制活性、および／または分化活性などのインターフェロンα活性を示す。本発明のいくつかのポリペプチドは、以下の特性の１つ以上を示す：参照ＩＦＮ−αポリペプチドと比較した抗ウイルス活性の上昇または低下、参照ＩＦＮ−αポリペプチドと比較したＴＨ１分化活性の上昇または低下、参照ＩＦＮ−αポリペプチドと比較した増殖抑制活性の上昇または低下。参照ＩＦＮ−αポリペプチドは、ＩＦＮ−αＣｏｎ１（配列番号３３３）などの非天然インターフェロンαの配列、もしくは天然（すなわち、野生型）インターフェロンαポリペプチドの配列を含むことができる。天然インターフェロンαポリペプチドの例示的な配列としては、例えば、ｈｕＩＦＮ−α２ｂ（配列番号３２１）、ｈｕＩＦＮ−α２ａ（配列番号３２２）、ｈｕＩＦＮ−α２ｃ（配列番号３２２、３４個の位置がＡｒｇ）、ｈｕＩＦＮ−α８ｂ（配列番号３２７）、ｈｕＩＦＮ−α８ａ（配列番号３２７、９８個の位置がＶａｌ、９９個の位置がＬｅｕ、１００個の位置がＣｙｓ、１０１個の位置がＡｓｐ）、ｈｕＩＦＮ−α８ｃ（配列番号３２７、１６１個の位置がＡｓｐ、１６２〜１６６個の位置のアミノ酸が欠失されている）、ｈｕＩＦＮ−α１４ａ（配列番号３２９）、ｈｕＩＦＮ−α１４ｃ（配列番号３２９、１５２個の位置がＬｅｕ）などのヒトＩＦＮ−αポリペプチドの配列、もしくはAllen G. and Diaz M.O.(1996)、上記に記載の他の天然ヒトインターフェロンαポリペプチドの配列が挙げられる。
【００７５】
別の態様では、本発明は、治療薬として現在使用されている参照インターフェロンα分子（例えば、ROFERON-A、INTRON A、INFERGENなど）と比較して、ウイルス感染細胞からのウイルス除去において有効性の増大を示すインターフェロンαポリペプチドを提供する。例示的なウイルスとしては、限定はされないが、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、牛ウイルス性下痢ウイルスなどのフラビウイルス科のウイルス、例えば、Ｂ型肝炎ウイルスなどのヘパドナウイルス科のウイルス、脳心筋炎ウイルス、ヒトライノウイルス、Ａ型肝炎ウイルスなどのピコルナウイルス科のウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス、ラウス肉腫ウイルスなどのレトロウイルス科のウイルス、例えば、ＳＡＲＳコロナウイルスなどのコロナウイルス科のウイルス、例えば、狂犬病ウイルス、水疱性口内炎ウイルスなどのラブドウイルス科のウイルス、例えば、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウィルスなどのパラミクソウイルス科のウイルス、例えば、ヒト乳頭腫ウイルスなどのパピローマウイルス科のウイルス、例えば単純疱疹ウイルスなどのヘルペスウイルス科のウイルスが挙げられる。このように強化された有効性は、参照分子と比較した、ウイルス活性の増大、ＴＨ１分化活性の増大、もしくはこのいずれにも起因しうる。例えば、本発明のいくつかのインターフェロンαポリペプチドは、例えばＨＣＶの遺伝子型１など現在使用されているインターフェロンα分子での治療に反応性の低いウイルスまたはウイルス株の除去に特に有用となりうる。
【００７６】
本発明のいくつかのポリペプチドは、参照ＩＦＮ−α分子と比較して（抗ウイルス活性／増殖抑制活性）の比率が上昇し、および／または参照ＩＦＮ−α分子と比較して（ＴＨ１分化活性／増殖抑制活性）の比率が上昇する。このような特性を示すポリペプチドは、例えば上記のウイルスでの感染などのウイルス感染の治療に特に有効でありうる。該ポリペプチドによっては、二相ウイルス・クリアランス・プロファイルの一方またはいずれの場合でもＨＣＶ治療において現在認可されているインターフェロンα分子よりも治療効果が向上しており、および／または毒性を低下できる。該ポリペプチドによっては、遺伝子型１ＨＣＶの治療において現在認可されているインターフェロンα分子よりも治療効果が向上できる。
【００７７】
本発明のポリペプチドに連結した１つ以上の非ポリペプチド部分を含む複合体などの複合体を提供することが本発明の別の目的であり、非複合体ポリペプチドと比較して、複合体がインターフェロンα活性（上記の１つ以上の活性）を示し、そして任意で血清半減期および／または機能的なインビボでの半減期、および／または抗原性の低下などの別の所望の特性を示す。いくつかの該複合体は、現在治療薬として使用されているインターフェロンα複合体などの参照インターフェロンα分子（例えば、PEGASYS(登録商標)（Ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｌｆａ−２ａ；Hoffmann-La Roche, Inc.）またはPEG-INTRON(登録商標)（Ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｌｆａ−２ｂ；Schering Corporation））と比較して、ウイルス感染細胞からウイルスを除去するのに有効性を向上させることができる。例示的なウイルスとしては、限定はされないが、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、牛ウイルス性下痢ウイルスなどのフラビウイルス科のウイルス、例えば、Ｂ型肝炎ウイルスなどのヘパドナウイルス科のウイルス、脳心筋炎ウイルス、ヒトライノウイルス、Ａ型肝炎ウイルスなどのピコルナウイルス科のウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス、ラウス肉腫ウイルスなどのレトロウイルス科のウイルス、例えば、ＳＡＲＳコロナウイルスなどのコロナウイルス科のウイルス、例えば、狂犬病ウイルス、水疱性口内炎ウイルスなどのラブドウイルス科のウイルス、例えば、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウィルスなどのパラミクソウイルス科のウイルス、例えば、ヒト乳頭腫ウイルスなどのパピローマウイルス科のウイルス、例えば単純疱疹ウイルスなどのヘルペスウイルス科のウイルスが挙げられる。このように強化された有効性は、参照分子と比較した、ウイルス活性の増大、ＴＨ１分化活性の増大、もしくはこのいずれにも起因しうる。例えば、本発明のいくつかのインターフェロンαポリペプチドは、例えばＨＣＶの遺伝子型１など現在使用されているインターフェロンα分子での治療に反応性の低いウイルスまたはウイルス株の除去に特に有用となりうる。
【００７８】
本発明のいくつかのポリペプチドは、参照ＩＦＮ−α分子と比較して（抗ウイルス活性／増殖抑制活性）の比率が上昇し、および／または参照ＩＦＮ−α分子と比較して（ＴＨ１分化活性／増殖抑制活性）のの比率が上昇する。このような特性を示すポリペプチドは、例えば上記のウイルスでの感染などのウイルス感染の治療に特に有効となりうる。該ポリペプチドによっては、例えば、二相ウイルス・クリアランス・プロファイルの一方またはいずれの場合でもＨＣＶ治療において現在認可されているインターフェロンα分よりも治療効果が向上しており、および／または毒性を低下できる。該ポリペプチドによっては、遺伝子型１ＨＣＶの治療において現在認可されているインターフェロンα分子よりも治療効果が向上できる。
【００７９】
ウイルス感染細胞におけるウイルス複製の抑制方法の提供は、本発明の別の目的であり、該方法には、ウイルス感染細胞に対する、該細胞におけるウイルス複製を抑制するための有効量の本発明のポリペプチドまたは複合体の投与が含まれる。本発明では、ウイルス感染細胞におけるウイルスのコピー数を減少させる方法も提供されており、該方法には、ウイルス感染細胞に対する、該細胞におけるウイルスのコピー数を減少させるための有効量の本発明のポリペプチドまたは複合体の投与が含まれる。ウイルスは、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、牛ウイルス性下痢ウイルスなどのフラビウイルス科のウイルス、例えば、Ｂ型肝炎ウイルスなどのヘパドナウイルス科のウイルス、脳心筋炎ウイルス、ヒトライノウイルス、Ａ型肝炎ウイルスなどのピコルナウイルス科のウイルス、例えばえば、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス、ラウス肉腫ウイルスなどのレトロウイルス科のウイルス、例えば、ＳＡＲＳコロナウイルスなどのコロナウイルス科のウイルス、例えば、狂犬病ウイルス、水疱性口内炎ウイルスなどのラブドウイルス科のウイルス、例えば、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウィルスなどのパラミクソウイルス科のウイルス、例えば、ヒト乳頭腫ウイルスなどのパピローマウイルス科のウイルス、例えば単純疱疹ウイルスなどのヘルペスウイルス科のウイルスでありうる。ウイルスは、例えば、ＨＣＶなどのＲＮＡウイルス、ＨＢＶなどのＤＮＡウイルス、ＨＩＶなどのレトロウイルスでありうる。細胞は培養下にある、または哺乳動物から単離され（すなわち、インビトロまたはエクソビボ）、もしくはインビトロ、例えば哺乳動物（例、Mercer,ら、(2001) Nature Medicine.7(8): 927-933に記載のＳＣＩＤマウスモデルなど）、霊長類、ヒトでありうる。
【００８０】
本発明は、ＴＨ０細胞を含む集団に対する、該集団におけるＴＨ１表現型（例、ＩＦＮ−γ）と関連するサイトカインの産生を増大させる、および／またはＴＨ２表現型（例えば、ＩＬ−４またはＩＬ−５）と関連するサイトカインの産生を減少させる有効量の本発明のポリペプチドまたは複合体の投与を含む、ＴＨ０細胞のＴＨ１分化を促進させる方法も提供する。該集団は培養下にある、または哺乳動物から単離される（すなわち、インビトロまたはエクソビボにて）、もしくはインビトロ、例えば哺乳動物、霊長類、ヒトでありうる。
【００８１】
本発明は、細胞集団と、該細胞集団の増殖を低下させるための有効量だけ本発明のポリペプチド、変異体、複合体とを接触させることを含む、細胞集団の増殖の抑制方法も提供する。該細胞集団は培養下にある、または哺乳動物から単離される（すなわち、インビトロまたはエクソビボで）、もしくはインビトロ、例えば哺乳動物、霊長類、ヒトでありうる。
【００８２】
本発明のこれら、および他の目的は以下でさらに詳細に論じる。
【００８３】
本発明のポリペプチド
本発明は、本明細書において集合的に「本発明のポリペプチド」と呼ばれる、新規インターフェロンαポリペプチドを提供する。「本発明のポリペプチド」という用語は、本明細書で開示のポリペプチド配列の変異体を終始一貫して含むことを意図している。本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質、および本発明のポリペプチドを含む複合体も本発明に含まれる。
【００８４】
ヒトのインターフェロンα核酸の断片は、反復的に組み合わされて、組換えポリヌクレオチドを含むシャッフル体ライブラリーを形成し、本発明のポリペプチドはこれに由来する。組換えポリヌクレオチドライブラリーを得る方法、および／または反復配列組換えの基質として使用する核酸の多様性を得る方法を以下に記述している。
【００８５】
本発明の例示的なポリペプチドとしては、図６Ａ−６Ｖに示される、配列番号１〜配列番号３１９（すなわち、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、配列番号２２４、配列番号２２５、配列番号２２６、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５２、配列番号２５３、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２６１、配列番号２６２、配列番号２６３、配列番号２６４、配列番号２６５、配列番号２６６、配列番号２６７、配列番号２６８、配列番号２６９、配列番号２７０、配列番号２７１、配列番号２７２、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、配列番号２７７、配列番号２７８、配列番号２７９、配列番号２８０、配列番号２８１、配列番号２８２、配列番号２８３、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２８８、配列番号２８９、配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号２９４、配列番号２９５、配列番号２９６、配列番号２９７、配列番号２９８、配列番号２９９、配列番号３００、配列番号３０１、配列番号３０２、配列番号３０３、配列番号３０４、配列番号３０５、配列番号３０６、配列番号３０７、配列番号３０８、配列番号３０９、配列番号３１０、配列番号３１１、配列番号３１２、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３１５、配列番号３１６、配列番号３１７、配列番号３１８、配列番号３１９）と本明細書において識別される配列を含むポリペプチドが挙げられる。該ポリペプチドは、ＨｅＬａ／ＥＭＣＶ抗ウイルス分析試験における抗ウイルス活性などのインターフェロンα活性を示す。ポリペプチドは、例えばＮ末端に付加したメチオニンなど、１つ以上の追加アミノ酸をさらに含むことができる。本発明は、これらのポリペプチドを含む融合タンパク質および複合体、そしてこれらのポリペプチドをコードする単離または組換え核酸も提供する。
【００８６】
本発明は、配列番号１〜３１９から選択される配列と、０〜１６個の位置のアミノ酸、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個の位置のアミノ酸、例えば０〜１６個の位置のアミノ酸、０〜１５個の位置のアミノ酸、０〜１４個の位置のアミノ酸、０〜１３個の位置のアミノ酸、０〜１２個の位置のアミノ酸、０〜１１個の位置のアミノ酸、０〜１０個の位置のアミノ酸、０〜９個の位置のアミノ酸、０〜８個の位置のアミノ酸、０〜７個の位置のアミノ酸、０〜６個の位置のアミノ酸、０〜５個の位置のアミノ酸、０〜４個の位置のアミノ酸、０〜３個の位置のアミノ酸、０〜２個の位置のアミノ酸、または０〜１個の位置のアミノ酸が異なる配列をそれぞれ含む、単離または組換えポリペプチドも含む。いくつかの該ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３０、配列番号４６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９４、配列番号１０３、配列番号１０７、配列番号１２４、配列番号１２７、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４８、配列番号１６７、配列番号１７１、配列番号１７６、配列番号１７９、配列番号１９１、配列番号１９５、配列番号２０８、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２５８、配列番号２６０、配列番号２６２、配列番号２６３、配列番号２６６、配列番号２９３、配列番号２９６、配列番号２９７、配列番号２９８、配列番号３０３、配列番号３０６、配列番号３１０、配列番号３１２から選択される配列とは０〜１６個の位置のアミノ酸が異なる配列も含む。
【００８７】
本発明は、配列番号３１２（Ｍ０１）、配列番号２６２（Ｍ０４）、配列番号２６６（Ｍ０５）、配列番号２３２（Ｍ２３）、配列番号８８（Ｍ４５）、配列番号２９７（Ｍ２０）、配列番号１６７（Ｍ２７）、配列番号１０７（Ｍ０９）、配列番号２０８（Ｍ０２）、配列番号９４（Ｍ３３）、配列番号１４１（Ｍ３７）、配列番号４６（Ｍ３０）、配列番号１７１（Ｍ２２）、配列番号３１０（Ｍ２４）、配列番号１７６（Ｍ４４）、配列番号２６（Ｍ３１）、配列番号８９（Ｍ１０）、配列番号２９６（Ｍ１４）、配列番号１４８（Ｍ０３）、配列番号１８（Ｍ４６）、配列番号１０（Ｍ２６）、配列番号８７（Ｍ２１）、配列番号１０３（Ｍ３８）、配列番号２３４（Ｍ２８）、配列番号３０（Ｍ１９）、配列番号１７９（Ｍ１１）、配列番号２（Ｍ３４）、配列番号２６０（Ｍ０７）、配列番号３０６（Ｍ１８）、配列番号１４０（Ｍ４０）、配列番号１２７（Ｍ１６）、配列番号２９３（Ｍ２５）、配列番号１９５（Ｍ２９）、配列番号１９１（Ｍ３６）、配列番号２６３（Ｍ０６）、配列番号１（Ｍ３２）、配列番号２９８（Ｍ３９）、配列番号２４（Ｍ４２）、配列番号２５８（Ｍ０８）、配列番号１２４（Ｍ３５）、配列番号７（Ｍ４１）、配列番号９（Ｍ１２）、配列番号３０３（Ｍ１７）、配列番号６（Ｍ４３）から選択される配列と、０〜１６個の位置のアミノ酸、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個の位置のアミノ酸、例えば、０〜１６個の位置のアミノ酸、０〜１５個の位置のアミノ酸、０〜１４個の位置のアミノ酸、０〜１３個の位置のアミノ酸、０〜１２個の位置のアミノ酸、０〜１１個の位置のアミノ酸、０〜１０個の位置のアミノ酸、０〜９個の位置のアミノ酸、０〜８個の位置のアミノ酸、０〜７個の位置のアミノ酸、０〜６個の位置のアミノ酸、０〜５個の位置のアミノ酸、０〜４個の位置のアミノ酸、０〜３個の位置のアミノ酸、０〜２個の位置のアミノ酸、または０〜１個の位置のアミノ酸が異なる配列をそれぞれ含む、例えば後述のポリペプチドなどの単離または組換えポリペプチドも含む。いくつかの該ポリペプチドはインターフェロンα活性（例えば、抗ウイルス活性、ＴＨ１分化活性、および／または増殖抑制活性など）を示す。いくつかの該ポリペプチドは、ＨｅＬａ／ＥＭＣＶ抗ウイルス分析試験において、ヒトＩＦＮ−α２ａよりも少なくとも２倍高い抗ウイルス活性を示す。いくつかの該ポリペプチドは、ＩＦＮ−α２ａよりも高い親和性（より低いＥＣ５０）でヒトのインターフェロンα受容体に結合する。ポリペプチドは、例えばＮ末端に付加したメチオニンなどの１つ以上のアミノ酸をさらに含むことができる。本発明は、これらのポリペプチドを含む融合タンパク質および複合体、そしてこれらのポリペプチドをコードする単離または組換え核酸も提供する。
【００８８】
本発明には、配列番号１（クローンＭ３２）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号１とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号１８、配列番号４４、配列番号６９、配列番号１１６、配列番号１６３、配列番号２０１、配列番号２０７、配列番号２４７、配列番号２５５、配列番号２６０、配列番号２９０、または配列番号３０２の配列を含むポリペプチド）も含まれる。ここから本発明には、配列番号１とは０〜６個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号１とは少なくとも９６％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号１８、配列番号４４、配列番号２６０、または配列番号３０２の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号１とは０〜３個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号１とは少なくとも９８％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１、配列番号１８、または配列番号４４の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【００８９】
本発明には、配列番号２（クローンＭ３４）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２６、配列番号２９、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４８、配列番号４９、または配列番号２９３の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号２とは０〜６個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２とは少なくとも９６％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１１、配列番号２１、配列番号４２、配列番号４９、または配列番号２９３の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号２とは０〜３個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２とは少なくとも９８％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１１、配列番号２１、配列番号４９、または配列番号２９３の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【００９０】
本発明には、配列番号６（クローンＭ４３）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号６とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２６、配列番号２９、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４８、配列番号４９、または配列番号２９３の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号６とは０〜６個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号６とは少なくとも９６％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１１、配列番号２１、配列番号４２、配列番号４８、配列番号４９、または配列番号２９３の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号６とは０〜３個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号６とは少なくとも９８％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１１、配列番号２１、配列番号４９、または配列番号２９３の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【００９１】
本発明には、配列番号７（クローンＭ４１）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号７とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号７、配列番号２４、配列番号２５、配列番号３７、または配列番号３１３の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号７とは０〜６個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号７とは少なくとも９６％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号７、配列番号２５、配列番号３７、または配列番号３１３の配列を含むポリペプチド）が含まれる。本発明には、配列番号７とは０〜３個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号７とは少なくとも９８％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号７または配列番号３１３の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【００９２】
本発明には、配列番号９（クローンＭ１２）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号９とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１９、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５１、配列番号７３、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２４、配列番号２３１、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２９４、または配列番号３０５の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号９とは０〜６個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号９とは少なくとも９６％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号９、配列番号１３、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５１、配列番号７３、配列番号２２１、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２９４、または配列番号３０５の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【００９３】
本発明には、配列番号１０（クローンＭ２６）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号１０とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号５、配列番号１０、配列番号２３、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３６、配列番号４７、配列番号７１、配列番号２０５、配列番号２３０、配列番号３０６、または配列番号３０８の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号１０とは０〜６個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号１０とは少なくとも９６％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１０、配列番号２３、配列番号４７、配列番号２０５、または配列番号２３０の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【００９４】
別の態様では、本発明には、配列番号１８（クローンＭ４６）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号１８とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号１８、配列番号４４、配列番号６９、配列番号１０９、配列番号１１３、配列番号１１６、配列番号１４５、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１８４、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号２０１、配列番号２０７、配列番号２１８、配列番号２３７、配列番号２４７、配列番号２５５、配列番号２６０、配列番号２７０、配列番号２７６、配列番号２８３、配列番号２９０、または配列番号３０２の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号１８とは０〜６個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号１８とは少なくとも９６％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号１８、配列番号４４、配列番号１１６、配列番号２０１、配列番号２０７、配列番号２５５、配列番号２６０、配列番号２９０、または配列番号３０２の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号１８とは０〜３個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号１８とは少なくとも９８％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１、配列番号１８、配列番号４４、または配列番号２６０の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【００９５】
別の態様では、本発明には、配列番号２４（クローンＭ４２）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２４とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号７、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３２、または配列番号４３の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号２４とは０〜６個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２４とは少なくとも９６％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号２４、または配列番号３２の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【００９６】
本発明には、配列番号２６（クローンＭ３１）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２６とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２６、配列番号２９、配列番号４２、配列番号４９、または配列番号２９３の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号２６とは０〜６個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２６とは少なくとも９６％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号２６、配列番号２９、配列番号４２、または配列番号２９３の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【００９７】
本発明には、配列番号３０（クローンＭ１９）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号３０とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１０、配列番号３０、配列番号４０、または配列番号７１の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号３０とは０〜６個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号３０とは少なくとも９６％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号３０または配列番号７１の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【００９８】
本発明には、配列番号４６（クローンＭ３０）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号４６とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号３９、配列番号４６、配列番号７７、配列番号２１３、配列番号２１６、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２５０、配列番号２６４、配列番号２９７、配列番号３０４、配列番号３１０、または配列番号３１２の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号４６とは０〜６個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号４６とは少なくとも９６％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号３９、配列番号４６、配列番号７７、配列番号２４１、配列番号２５０、配列番号３１０、または配列番号３１２の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【００９９】
本発明には、配列番号８７（クローンＭ２１）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号８７とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号８７、配列番号２６１、または配列番号２９９の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【０１００】
本発明には、配列番号８８（クローンＭ４５）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号８８とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号６６、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９３、配列番号１０３、配列番号１１３、配列番号１１７、配列番号１２０、配列番号１２４、配列番号１４５、配列番号１４９、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１９９、配列番号２０２、配列番号２２３、配列番号２８４、配列番号２８８、配列番号２８９、配列番号２９０、配列番号２９５、配列番号２９６、または配列番号３１４の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号８８とは０〜６個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号８８とは少なくとも９６％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号６６、配列番号８４、配列番号８８、配列番号９１、配列番号１１３、配列番号１１７、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１９９、配列番号２８４、配列番号２８８、配列番号２９０、配列番号２９５、配列番号２９６、または配列番号３１４の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号８８とは０〜３個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号８８とは少なくとも９８％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号８８または配列番号２８８の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【０１０１】
本発明には、配列番号８９（クローンＭ１０）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号８９とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号８９または配列番号２９８の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【０１０２】
本発明には、配列番号９４（クローンＭ３３）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号９４とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号５７、配列番号９４、配列番号２３７、配列番号２５５、または配列番号２７３の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【０１０３】
本発明には、配列番号１０３（クローンＭ３８）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号１０３とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号５８、配列番号８５、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１１３、配列番号１１７、配列番号１２０、配列番号１２４、配列番号１２８、配列番号１４５、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１８４、配列番号１９９、配列番号２２３、配列番号２４４、配列番号２７６、配列番号２８３、配列番号２８４、配列番号２９０、配列番号２９５、配列番号２９６、配列番号３０９、または配列番号３１４の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号１０３とは０〜６個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号１０３とは少なくとも９６％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号５８、配列番号８５、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１１３、配列番号１２０、配列番号１２４、配列番号１２８、配列番号１４５、配列番号１８４、配列番号１９９、配列番号２９０、配列番号２９５、配列番号２９６、配列番号３０９、または配列番号３１４の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号１０３とは０〜３個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号１０３とは少なくとも９８％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号５８、配列番号８５、配列番号１０３、配列番号１１３、配列番号１２０、配列番号１２４、配列番号１４５、配列番号１９９、配列番号２９５、または配列番号２９６の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【０１０４】
本発明には、配列番号１０７（クローンＭ９）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号１０７とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１０７または配列番号３０１の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【０１０５】
本発明には、配列番号１２４（クローンＭ３５）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号１２４とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号５８、配列番号８５、配列番号８８、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１７、配列番号１２０、配列番号１２４、配列番号１２８、配列番号１４５、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１８４、配列番号１９９、配列番号２９０、配列番号２９５、配列番号２９６、配列番号３０９、または配列番号３１４の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号１２４とは０〜６個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号１２４とは少なくとも９６％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号８５、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１１３、配列番号１２０、配列番号１２４、配列番号１２８、配列番号１４５、配列番号１９９、配列番号２９０、配列番号２９５、配列番号２９６、または配列番号３１４の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号１２４とは０〜３個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号１２４とは少なくとも９８％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１１３、配列番号１２０、配列番号１２４、配列番号１４５、または配列番号２９５の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【０１０６】
本発明には、配列番号１２７（クローンＭ１６）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号１２７とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１２７、配列番号１９７、配列番号２６１、または配列番号２６８の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【０１０７】
本発明には、配列番号１４０（クローンＭ４０）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号１４０とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１０８、配列番号１４０、配列番号２７２、または配列番号２７８の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【０１０８】
本発明には、配列番号１４１（クローンＭ３７）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号１４１とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１４１または配列番号１６０の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【０１０９】
本発明には、配列番号１４８（クローンＭ３）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号１４８とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１４８、配列番号１７０、または配列番号２０６の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号１４８とは０〜６個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号１４８とは少なくとも９６％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１４８または配列番号１７０の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【０１１０】
本発明には、配列番号１６７（クローンＭ２７）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号１６７とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号６５、配列番号１０２、配列番号１１８、配列番号１４３、配列番号１５９、配列番号１６７、配列番号１８１、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２７１、または配列番号３１５の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号１６７とは０〜６個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号１６７とは少なくとも９６％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１５９、配列番号１６７、配列番号１８１、または配列番号３１５の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号１６７とは０〜３個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号１６７とは少なくとも９８％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１５９、配列番号１６７、配列番号１８１、または配列番号３１５の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【０１１１】
本発明には、配列番号１９１（クローンＭ３６）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号１９１とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１３３または配列番号１９１の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【０１１２】
本発明には、配列番号１９５（クローンＭ２９）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号１９５とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号８０、配列番号８２、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０５、配列番号１０８、配列番号１３１、配列番号１３７、配列番号１５０、配列番号１９５、配列番号２３４、または配列番号２７８の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号１９５とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号１９５とは少なくとも９６％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１０８、配列番号１９５、または配列番号２７８の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号１９５とは０〜３個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号１９５とは少なくとも９８％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１９５または配列番号２７８の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【０１１３】
本発明には、配列番号２０８（クローンＭ０２）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２０８とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号６７または配列番号２０８の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【０１１４】
本発明には、配列番号２３２（クローンＭ２３）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２３２とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１２、配列番号１６７、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２６２、または配列番号３１２の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号２３２とは０〜６個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２３２とは少なくとも９６％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号２３２または配列番号２６２の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【０１１５】
本発明には、配列番号２３４（クローンＭ２８）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２３４とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１０５、配列番号１３９、配列番号１８８、配列番号１９５、配列番号２３４、配列番号２７８、または  配列番号２８５の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号２３４とは０〜６個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２３４とは少なくとも９６％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１０５、配列番号１３９、配列番号２３４、配列番号２７８、または配列番号２８５の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号２３４とは０〜３個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２３４とは少なくとも９８％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１０５または配列番号２３４の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【０１１６】
本発明には、配列番号２５８（クローンＭ８）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２５８とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号９９または配列番号２５８の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【０１１７】
本発明には、配列番号２６０（クローンＭ０７）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２６０とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号１８、配列番号４４、配列番号６９、配列番号１０９、配列番号１１３、配列番号１１６、配列番号１４５、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１８４、配列番号１８８、配列番号２０１、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２１８、配列番号２２８、配列番号２３７、配列番号２４７、配列番号２５５、配列番号２５７、配列番号２６０、配列番号２７６、または配列番号２９０の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号２６０とは０〜６個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２６０とは少なくとも９６％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号１８、配列番号４４、配列番号６９、配列番号１１６、配列番号２０１、配列番号２０７、配列番号２４７、配列番号２５５、配列番号２６０または配列番号２９０の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号２６０とは０〜３個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２６０とは少なくとも９８％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１８または配列番号２６０の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【０１１８】
本発明には、配列番号２６２（クローンＭ０４）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２６２とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１２、配列番号３９、配列番号７７、配列番号２１６、配列番号２３２、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２５０、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２９７、配列番号３０４、配列番号３１０、または配列番号３１２の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号２６２とは０〜６個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２６２とは少なくとも９６％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１２、配列番号７７、配列番号２１６、配列番号２３２、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２５０、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２９７、配列番号３０４、配列番号３１０、または配列番号３１２の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【０１１９】
本発明には、配列番号２６６（クローンＭ０５）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２６６とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号７９、配列番号９０、配列番号１１４、配列番号２１５、配列番号２２９、配列番号２４５、配列番号２６６、配列番号２７４の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号２６６とは０〜６個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２６６とは少なくとも９６％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、列番号：７９、配列番号９０、配列番号２１５、配列番号２２９、配列番号２４５、配列番号２６６、配列番号２７４の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【０１２０】
本発明には、配列番号２９３（クローンＭ２５）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２９３とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２６、配列番号２９、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４８、配列番号４９、または配列番号２９３の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号２９３とは０〜６個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２９３とは少なくとも９６％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２６、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４９、または配列番号２９３の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号２９３とは０〜３個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２９３とは少なくとも９８％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１１、配列番号２１、配列番号４９、または配列番号２９３の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【０１２１】
本発明には、配列番号２９６（クローンＭ１４）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２９６とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号５８、配列番号６６、配列番号８５、配列番号８８、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１１３、配列番号１１７、配列番号１２０、配列番号１２４、配列番号１２８、配列番号１４５、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１８４、配列番号１９９、配列番号２０２、配列番号２２３、配列番号２４４、配列番号２８４、配列番号２８８、配列番号２９０、配列番号２９５、配列番号２９６、配列番号３０６、配列番号３０９、または配列番号３１４の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号２９６とは０〜６個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２９６とは少なくとも９６％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号５８、配列番号８５、配列番号８８、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１１３、配列番号１１７、配列番号１２０、配列番号１２４、配列番号１４５、配列番号１８４、配列番号１９９、配列番号２８４、配列番号２９０、配列番号２９５、配列番号２９６、配列番号３０９、または配列番号３１４の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号２９６０とは０〜３個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２９６とは少なくとも９８％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１０３、配列番号１１３、配列番号１４５、配列番号１８４、配列番号１９９、配列番号２９０、配列番号２９５、配列番号２９６、または配列番号３１４の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【０１２２】
本発明には、配列番号２９７（クローンＭ２０）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２９７とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１２、配列番号３９、配列番号４６、配列番号７７、配列番号２１６、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２５０、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２９７、配列番号３０４、配列番号３１０、または配列番号３１２の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号２９７とは０〜６個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２９７とは少なくとも９６％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１２、配列番号３９、配列番号７７、配列番号２１６、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２５０、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２９７、配列番号３０４、配列番号３１０、または配列番号３１２の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号２９７とは０〜３個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２９７とは少なくとも９８％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号７７、配列番号２１６、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２５０、配列番号２６４、配列番号２９７、配列番号３０４、配列番号３１０、または配列番号３１２の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【０１２３】
本発明には、配列番号２９８（クローンＭ３９）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２９８とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号５３、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８６、配列番号８９、配列番号１０２、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１８、配列番号１４３、配列番号１５０、配列番号２１２、配列番号２２７、配列番号２７１、配列番号２９２、または配列番号２９８の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号２９８とは０〜６個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２９８とは少なくとも９６％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号８２、配列番号８６、配列番号１０２、配列番号１０６、配列番号１０８、または配列番号２９８の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号２９８とは０〜３個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号２９８とは少なくとも９８％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号８２、配列番号８６、配列番号１０２または配列番号２９８の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【０１２４】
本発明には、配列番号３０３（クローンＭ１７）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号３０３とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２７、配列番号７４、配列番号２３５、配列番号２５６、または配列番号３０３の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号３０３とは０〜６個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号３０３とは少なくとも９６％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２７、配列番号７４、配列番号２５６、または配列番号３０３の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号３０３とは０〜３個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号３０３とは少なくとも９８％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号２０、配列番号２５６、または配列番号３０３の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【０１２５】
本発明には、配列番号３０６（クローンＭ１８）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号３０６とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号５、配列番号１０、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３６、配列番号４７、配列番号６５、配列番号７１、配列番号１５３、配列番号１５９、配列番号１６６、配列番号２００、配列番号２０５、配列番号２３０、配列番号３０６、または配列番号３０８の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号３０６とは０〜６個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号３０６とは少なくとも９６％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号５、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３６、配列番号４７、配列番：号６５、配列番号１５３、配列番号１６６、配列番号２００、配列番号２０５、配列番号２３０、配列番号３０６、または配列番号３０８の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号３０６とは０〜３個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号３０６とは少なくとも９８％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号５、配列番号３１、配列番号４７、配列番号２０５、配列番号２３０、配列番号３０６、または配列番号３０８の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【０１２６】
本発明には、配列番号３１０（クローンＭ２４）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号３１０とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１２、配列番号３９、配列番号４６、配列番号７７、配列番号２１６、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２５０、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２９７、配列番号３０４、配列番号３１０、または配列番号３１２の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号３１０とは０〜６個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号３１０とは少なくとも９６％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号３９、配列番号４６、配列番号７７、配列番号２１６、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２５０、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２９７、配列番号３０４、配列番号３１０、または配列番号３１２の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号３１０とは０〜３個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号３１０とは少なくとも９８％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号３９、配列番号７７、配列番号２１６、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２５０、配列番号２６４、配列番号２９７、配列番号３０４、配列番号３１０、または配列番号３１２）も含まれる。
【０１２７】
本発明には、配列番号３１２（クローンＭ０１）とは０〜８個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号３１２とは少なくとも９５％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号１２、配列番号３９、配列番号４６、配列番号７７、配列番号２１６、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２５０、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２９７、配列番号３０４、配列番号３１０、または配列番号３１２の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号３１２とは０〜６個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号３１２とは少なくとも９６％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号３９、配列番号４６、配列番号７７、配列番号２１６、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２５０、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２９７、配列番号３０４、配列番号３１０、または配列番号３１２の配列を含むポリペプチド）も含まれる。本発明には、配列番号３１２とは０〜３個のアミノ酸の位置が異なる配列、すなわち配列番号３１２とは少なくとも９８％同一であり、インターフェロンα活性を示す配列、を含む単離または組換えポリペプチド（例えば、配列番号７７、配列番号２１６、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２５０、配列番号２６４、配列番号２９７、配列番号３０４、配列番号３１０、または配列番号３１２の配列を含むポリペプチド）も含まれる。
【０１２８】
本発明のポリペプチドにおいて考えられる他の修飾には、以下に記載のものおよび「インターフェロンα複合体」の項に記載のものが含まれる。
【０１２９】
配列変異
上述のように、本発明のポリペプチドには、配列番号１〜３１９のうち１つの配列と、０〜１６個のアミノ酸の位置において異なる配列を有するポリペプチドが含まれる。これらのポリペプチドのうちいくつかは、インターフェロンα活性を示す。
【０１３０】
例えば、本発明のポリペプチドのうちいくつかは、約１５１アミノ酸長、例えば、親ポリペプチド配列（例えば、配列番号１〜３１９のうち１つの配列）からの１〜１５アミノ酸の欠失に相当する、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５アミノ酸長を有する配列を含んでいる。ある場合において、１〜１１個、例えば、１〜７個等の１〜１０個、例えば、１〜３個等の１〜５個のアミノ酸残基がＣ端側から欠失しており、すなわち、ポリペプチドは、親ポリペプチド配列（例えば、配列番号１〜３１９のうち１つの配列）に比べ、１〜１１アミノ酸残基（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１アミノ酸残基）、１〜１０、１〜７、例えば、１〜５、１〜３個のアミノ酸残基が、Ｃ端側から欠失している。その代わりに、またはそれに加えて、該ポリペプチドのうちいくつかは、親ポリペプチド配列（例えば、配列番号１〜３１９のうち１つの配列）に比べ、１〜４個のアミノ酸残基（例えば、１、２、３、４個のアミノ酸残基）、例えば、１〜４個、１〜３個、１〜２個、または１個のアミノ酸残基がＮ端側から除去される。該ポリペプチドのうちいくつかは、Ｎ端側にさらにメチオニンを含んでいる。該ポリペプチドのうちいくつかは、インターフェロンα活性を示す。
【０１３１】
他の例として、本発明のポリペプチドのうちいくつかは、配列番号１に対して１〜１６個のアミノ酸の置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個のアミノ酸の置換）、例えば、１〜１４、または１〜１２、１〜１０、または１〜８、または１〜６、または１〜５、または１〜４、または１〜３、または１〜２個のアミノ酸の置換を含む配列を有している。ポリペプチド配列において、１つまたは複数のアミノ酸の置換を、後述するもの等の置換基（同類置換基等）によって行うことができる。その代わりに、またはそれに加えて、ポリペプチド配列において、非ペプチド残基のための結合基を含むアミノ酸残基を導入または除去する、１つまたは複数のアミノ酸の置換をさらに行うことができる。例としては、１つまたは複数のＮ−グリコシル化部位の導入または除去、１つまたは複数のシステイン残基またはリジン残基またはヒスチジン残基の導入または除去等が含まれる。該ポリペプチドのうちいくつかは、インターフェロンα活性を示す。
【０１３２】
非限定的な例として、本発明のポリペプチドは、配列番号１の配列と、最大１６個の位置において異なる配列（上述の配列を含む、アミノ酸の置換、欠失および／または挿入の組み合わせであってよい）を有していてよい。場合によっては、いずれの置換も、以下に定義する置換基によらず、あるいは、いくつか、または全ての置換が、以下に定義する置換基にしたがう置換である。
【０１３３】
本発明によるアミノ酸置換には、１つ以上の同類アミノ酸置換が含まれるが、これらに限定されない。機能的に類似のアミノ酸を生じる同類置換表は、当該分野で周知である。以下の表（表１）に一例を示すが、これには、互いに「同類置換」であると考えられるアミノ酸を含む６つの典型的な基を記載している。
【０１３４】
【表１】
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【０１３５】
アミノ酸の他の置換基が考えられる。例えば、アミノ酸は、類似の機能または化学構造または組成（例えば、酸性、塩基性、脂肪族、芳香族、含硫黄）によって分類する。例えば、脂肪族アミノ酸の集団は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）を含む。互いに同類置換と考えられるアミノ酸を含む集団には、芳香族アミノ酸：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；含硫黄アミノ酸：メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）；塩基性アミノ酸：アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸性アミノ酸：アスパラギン酸（Ａ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）が含まれる。アミノ酸の他の集団について、Creighton (1984) Proteins, W. H. Freeman and Companyを参照されたい。上記の置換基に関連して、本明細書中のポリペプチド配列のリストによって、同類置換された全てのポリペプチド配列の発現リストが与えられる。
【０１３６】
配列同一性パーセント
１つの態様では、本発明は、単離ポリペプチドまたは組換えポリペプチドを提供し、これらは各々、配列番号１〜３１９のうち少なくとも１つの配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性）を有する配列を含む。場合によっては、ポリペプチドはインターフェロンα活性を示す。
【０１３７】
配列（ポリペプチドまたは核酸）が別の配列と類似する程度は、その２つの配列について構造的特性および機能的特性の同一性の指標を提供する。したがって、本発明の状況において、任意の所定の標本配列に類似する配列を有する配列は、本発明の特長である。特に、以下に定義するような配列同一性パーセントを有する配列は、本発明の特長である。
【０１３８】
手動アラインメントならびにコンピュータ補助の配列アラインメントおよび分析を含め、配列同士の関係を決定する種々の方法を用いることができる。配列アラインメントを実施するための種々のコンピュータプログラムが利用可能であり、または後述するように、当業者が作製することができる。
【０１３９】
上記のように、本発明で使用する核酸およびポリペプチドの配列は、必ずしも相同である必要はないが、本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸の配列に対して実質的に相同であってよい。例えば、本発明のポリペプチドについて、種々の変更（例えば、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換（同類または非同類のいずれか））を行うことができ、例えば、該変更が、その使用（例えば、治療上の使用もしくは予防的使用または投薬または診断上の適用）において特定の利点をもたらすことができる場合が含まれる。本発明の核酸はまた、種々の変更（例えば、特定のコドンが同一のまたは異なるアミノ酸をコードし、サイレントな変更（本明細書中で定義したように）またはサイレントでない変更を生じるような、１つ以上のコドンにおける１つ以上の核酸の１つ以上の置換、あるいは配列中の１つ以上の核酸（またはコドン）の１つ以上の欠失）に供することができる。また、核酸は、発現系（例えば、細菌またはヒト）において最適な発現を提供する１つ以上のコドンを含むように改変することができ、一方で、必要に応じて、この１つ以上のコドンは依然として同じアミノ酸をコードする。該核酸の変更により、その治療上の使用もしくは予防的使用または投薬、または診断上の適用において特定の利点を提供することができる。該核酸およびポリペプチドは、それらが本発明の代表的な核酸またはポリペプチドの配列と実質的に同一の配列を含む限りにおいて、多くの方法を用いて改変することができる。
【０１４０】
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の状況において、「同一の」または「同一性」という用語は、以下に記載する配列比較アルゴリズムを使用し、または目視によって決定するような最大類似度について、比較およびアラインメントを行った場合に、同一の２つ以上の配列か、または特定パーセンテージの同じアミノ酸残基、もしくはヌクレオチドを有する２つ以上の配列をいう。
【０１４１】
参照（クエリー）配列に対する対象配列の「配列同一性パーセント」（「同一性％」）は、その対象配列が、比較長にわたってクエリー配列と特定の割合だけ（ポリペプチド配列においては、アミノ酸同士を基準に、またはポリヌクレオチド配列においては、ヌクレオチド同士を基準に）同一であることを意味する。
【０１４２】
クエリー配列に対する対象配列の配列同一性パーセントは、以下のように計算する。まず、２つの配列の最適アラインメントを、特定のアラインメントパラメータと共に配列比較アルゴリズムを使用して決定する。この最適アラインメントの決定は、コンピュータを使用して行われても、以下に記載するように手動で計算してもよい。次いで、２つの最適に整列された配列が、比較長にわたって比較され、同一の残基が両方の配列に存在する最適アラインメントにおける位置の数が決定され、一致した位置の数が得られる。次いで、一致した位置の数を、比較長（特記しない限り、クエリー配列の長さである）の位置の数の総数で除し、その結果を１００倍することにより、クエリー配列に対する対象配列の配列同一性パーセントを得る。
【０１４３】
ポリペプチド配列に関して、通常、１つの配列が、「クエリー配列」（例えば、本発明のポリペプチド配列）と見なされ、それに対して１つ以上の他の配列（すなわち、「対象配列」）（例えば、配列データベースに存在する配列）を比較する。配列比較アルゴリズムは、指定のアラインメントパラメータを使用して、クエリー配列と対象配列との間の最適アラインメントを決定する。配列データベース（例えば、GENBANK（登録商標）（遺伝子配列データバンク、米国保健福祉省））またはGENESEQ（登録商標）（Thomson Derwent社、STNデータベース中のDGENE（登録商標））に対してクエリー配列を比較する場合、通常、クエリー配列およびアラインメントパラメータのみをコンピュータに入力すると、クエリー配列と、データベース中に存在する、通常、所望の数以下の各々の対象配列との間の最適アラインメントが返される。
【０１４４】
２つのポリペプチド配列は、それらが規定したパラメータ（規定したアミノ酸置換マトリックス、ギャップ存在ペナルティ（ギャップオープンペナルティともいう）、およびギャップ伸長ペナルティ）を使用して、その配列の対について可能な最も高い類似性スコアを実現するように整列する場合に、「最適に整列される」。BLOSUM62マトリックス（HenikoffおよびHenikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 （22): 10915-10919)は、多くの場合、ポリペプチド配列アラインメントアルゴリズム（例えば、後述するBLASTP）における初期スコアリング置換マトリックスとして使用する。ギャップ存在ペナルティは、整列された配列の一方における単一のアミノ酸ギャップの導入を強いられ、そしてギャップ伸長ペナルティは、ギャップにおける各残基位置に課せられる。他に明記しない限り、本明細書中で使用するアラインメントパラメータは：BLOSUM62スコアリングマトリックス、ギャップ存在ペナルティ＝１１、およびギャップ伸長ペナルティ＝１。アラインメントスコアは、各配列の個のアミノ酸の位置によって規定され、その位置にてアラインメントが始まり、終わり（例えば、アラインメントウインドウ）、必要に応じて、最も高い可能な同一性スコアに達するように一方または両方の配列にギャップまたは複数のギャップの挿入によって定義する。
【０１４５】
２つ以上の配列間の最適アラインメントは、手動で（以下に記載）決定することができるが、Altschulら、(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載され、米国国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のウェブサイトを通じて一般公開されたBLAST（登録商標）（米国国立医学図書館）、例えば、ポリペプチド配列用のBLASTP、核酸配列用のBLASTN等のコンピュータで実行するアラインメントアルゴリズムを用いることにより、このプロセスを促進する。コンピュータ化したBLASTインタフェースを用いる場合、「低複雑性フィルター」の使用が選択可能である場合には、オフ（フィルターを用いない）に設定する必要がある。
【０１４６】
また、上で特定したのと同一のアラインメントパラメータ（行列＝BLOSUM６２、ギャップオープンペナルティ＝１１、およびギャップ伸長ペナルティ＝１）を用いて、BLASTPアルゴリズムを手作業で（コンピュータを用いずに）計算することにより、２つのポリペプチド配列間の最適アラインメントを決定することができる。まず、２つの配列を目視検査によって最初にアラインメントする。次いで、初期アラインメントスコアを、以下のように計算する。アラインメントの各それぞれの位置（すなわち、アラインメントした残基の各対）について、BLOSUM62行列（図４）にしたがって数値を代入する。アラインメントにおける残基の各対に代入する値の合計が、初期アラインメントスコアである。アラインメントする２つの配列が非常に類似している場合、多くの場合、この最初のアラインメントにより、最大のアラインメントスコアが得られる。最大のアラインメントスコアを有するアラインメントは、使用するアラインメントパラメータに基づく最適アラインメントである。図５Ａは、２つの配列（本明細書中で配列番号１の残基２９〜５０として同定される「参照」配列（上側）、および本明細書中で配列番号３１２の残基３０〜５２として同定される「目的」配列（下側））についてのアラインメントスコアの計算例を示す。配列を、目視でアラインメントした。アラインメントされた個々のアミノ酸の対についてBLOSUM62行列に代入した数値を、アラインメント中の各位置の下に示す（見やすいように、アラインメント中のアミノ酸の各同一の対を太字で示す）。この例において、この初期アラインメントは、最大のアラインメントスコア（各並列位置の下に示す値の合計）を与えた。これら２つの配列の以外のアラインメントは全て（ギャップの有無によらず）、より低いアラインメントスコアを生じる。
【０１４７】
場合によっては、アラインメント内に１つ以上のギャップを導入することにより、より高いアラインメントスコアが得られる。ギャップがアラインメント内に導入する場合は常に、そのギャップ内の各残基の位置について、ギャップオープンペナルティが代入され、さらに、ギャップ伸長ペナルティが代入される。したがって、上述のアラインメントパラメータ（ギャップオープンペナルティ＝１１およびギャップ伸長ペナルティ＝１を含む）を用いて、アラインメント中の１残基のギャップは、ギャップに代入する値−（１１＋（１×１））＝−１２に相当し、３残基のギャップは、ギャップに代入する値−（１１＋（３×１））＝−１４に相当し、以下同様である。この計算は、アラインメント内に導入された各ギャップについて繰り返される。アラインメント内にギャップを導入することにより、ギャップペナルティにもかかわらず、より高いアラインメントスコアがいかにして得られるかを実証する例を、図５Ｂおよび図５Ｃに示す。図５Ｂは、目視によって作成された、配列番号３１２の残基２９〜５０（上側、参照配列）および配列番号３２１の残基３０〜５０（下側、対象配列）の最初のアラインメントを示し、このアラインメントは、６７の初期アラインメントスコアを生じる。図５Ｃは、アラインメントスコアに対する配列番号３２における１残基ギャップの効果を示し、−１２のギャップペナルティにもかかわらず、２つの配列の全体のアラインメントスコアは、８８まで増加した。この例において、図５Ｃに示されるアラインメントは、可能な限り最も高いアラインメントスコアを提供し、したがって、これが、これら２つの配列の最適なアラインメントであり、これらの２つの配列の任意の他のアラインメント（ギャップありまたはギャップなし）からは、より低いアラインメントスコアを生じる。
【０１４８】
上述の、比較的短い配列を用いた配列アラインメント計算の例は、単なる例示であることを理解されたい。実際には、使用するアラインメントパラメータ（BLOSUM62行列、ギャップオープンペナルティ＝１１、およびギャップ伸長ペナルティ＝１）は、８５アミノ酸以上の長さのポリペプチド配列に最適である。NCBIウェブサイトは、他の長さの配列について以下のアラインメントパラメータ（コンピュータを使用したアラインメント計算および手作業によるアラインメント計算のために好適であり、上述と同じ手順を用いる）を提供する。５０〜８５アミノ酸長の配列について、最適パラメータは、ＢＬＯＳＵＭ８０行列（HenikoffおよびHenikoff、前出）、ギャップオープンペナルティ＝１０、およびギャップ伸長ペナルティ＝１である。３５〜５０アミノ酸長の配列について、最適パラメータは、ＰＡＭ７０行列（Dayhoff, M.O., Schwartz, R. M. & Orcutt, B. C. (1978)「A model of evolutionary change in proteins.」In Atlas of Protein Sequence and Structure, vol.5, 補遺3, M. O. Dayhoff （編）, pp. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D C.）、ギャップオープンペナルティ＝１０、およびギャップ伸長ペナルティ＝１である。３５アミノ酸長未満の配列について、最適パラメータは、ＰＡＭ３０行列（Dayhoff, M. O.、前出）、ギャップオープンペナルティ＝９、およびギャップ伸長ペナルティ＝１である。
【０１４９】
配列の最適なアラインメントが得られると、最適アラインメント中の同一残基対を含む位置の数を計数し、これを比較の長さ（これは、他に特定しない限り、参照配列の長さである）における残基の数で除し、得られた数を１００倍することにより、参照配列に対する目的の配列の同一性％が計算される。図５に示す例を参照すると、各例において、参照配列と呼ばれる配列は、２２アミノ酸長である。図５Ａのアラインメントを参照すると、並列したアミノ酸残基の２０対（太字で示す）が、参照配列（上側）と目的配列（下側）の最適アラインメントにおいて同一である。したがって、特定の目的配列は、参照配列に対し、（２０／２２）×１００＝９１．１％の同一性を有する。図５Ｃにおいて示すアラインメントにおいて、最適アラインメント中のアミノ酸残基の１８対（太字で示す）が、同一である；この特定の目的配列は、参照配列に対し、（１８／２２）×１００＝８１．８％同一性を有する。
【０１５０】
ポリペプチドに適用する場合、用語「実質的同一性」（または「実質的に同一である」）は、通常、２つのアミノ酸配列（参照配列および目的配列）が、上述の適切なパラメータを用いるBLASTPアルゴリズムを用いて（手作業またはコンピュータを用いて）最適にアラインメントする場合、目的の配列は、参照配列に対し、少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の％のアミノ酸配列同一性を有することを意味する。場合によっては、実質的同一性は、少なくとも約１００アミノ酸残基（例えば、少なくとも約１１０、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、または１６６アミノ酸残基）の比較長にわたって存在する。
【０１５１】
同様に、２つの核酸配列に関して適用する場合、実質的同一性（または実質的に同一である）という用語は、２つの核酸配列（すなわち、参照配列および目的配列）が、以下の適切なパラメータを用いるBLASTNアルゴリズムを用いて（手作業またはコンピュータを用いて）最適にアラインメントする場合、目的の配列は、参照配列に対し、少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の％の核酸配列同一性を有することを意味する。核酸配列アラインメントのために使用したパラメータは、以下のとおりである。マッチ報酬：１、ミスマッチペナルティ：−３、ギャップ存在ペナルティ：５、ギャップ伸長ペナルティ：２（置換行列は、BLASTNアルゴリズムにおいて使用されない）。場合によっては、実質的同一性は、少なくとも３００ヌクレオチド残基（例えば、少なくとも３３０、３６０、３７５、３９０、４０５、４２０、４３５、４５０、４６５、４８０、４８３、４８６、４８９、４９２、４９５、または４９８ヌクレオチド）の比較長にわたって存在する。
【０１５２】
他の態様
本発明の任意のポリペプチドは、より長いポリペプチド配列（例えば、１つ以上のドメインの付加によって生じる融合タンパク質）の一部、またはサブシークエンスとして、このポリペプチドの安定化または検出または精製のために、存在することができる。ポリペプチド精製用サブシークエンスには、例えば、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列、ＧＳＴ融合、または当該分野で公知の他の検出／精製サブシークエンスまたは「タグ」が含まれる。これらのさらなるドメインまたはサブシークエンスは、本発明のポリペプチドの活性にほとんどまたは全く影響を与えず、プロテアーゼ処理、インテインの包含等の合成後の処理工程によって除去することができる。
【０１５３】
本発明は、例えば、ヒトＩｇＧのＦｃ（「結晶化可能断片」または相補的結合断片）ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域等のＩｇ分子に融合した、本明細書に記載のもの等の本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質、および該融合タンパク質をコードする核酸配列を含んでいる。Ｆｃは、細胞上の抗体受容体および補体のＣ１ｑ成分との結合に関与する抗体の部分である。これらの融合タンパク質およびそれらをコードする核酸は、予防剤および／または治療剤として、または診断用のツールとして有用である（Challita-Eid, P. ら、(1998) J Immunol 160:3419-3426、Sturmhoefel, Kら、(1999) Cancer Res 59:4964-4972等も参照されたい）。また、本発明は、例えば、米国特許第５，８７６，９６９号に記載のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等のアルブミン分子と融合した本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質、および該融合タンパク質をコードする核酸配列を含んでいる。Ｉｇおよびアルブミンと融合したタンパク質は、ポリペプチドの血清中での半減期および／もしくはインビボにおける機能的半減期の増大、ポリペプチドの抗原性の低下、ポリペプチドの保存安定性の増大、またはバイオアベイラビリティーの増大、例えば、ＡＵＣＳＣの増大を示し、したがって、予防剤および／または治療剤として有用である。
【０１５４】
また、本発明の任意のポリペプチドは、１つ以上の修飾アミノ酸を含んでいる。修飾アミノ酸は、例えば、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質残基と結合したアミノ酸、または有機誘導体化剤に結合したアミノ酸であってよい。修飾アミノ酸の存在は、例えば、（ａ）ポリペプチドの血清中での半減期および／もしくはインビボにおける機能的半減期を延長する、（ｂ）ポリペプチド抗原性を低下する、（ｃ）ポリペプチド保存安定性を高める、または（ｄ）バイオアベイラビリティを高める（例えば、ＡＵＣＳＣを増大する）際に有利であってよい。アミノ酸は、例えば、組換え産生（例えば、哺乳動物細胞における発現の間のＮ−Ｘ−Ｓ／ＴモチーフにおけるＮ連結グリコシル化）の間、翻訳と同時にまたは翻訳後に修飾するか、または合成手段によって修飾する。この態様については、本明細書中「インターフェロンα複合体」の項において詳述する。
【０１５５】
本発明はまた、少なくとも１種の本発明のポリペプチド、および賦形剤または担体を有する組成物を提供する。ある態様では、この組成物は、医薬的に受容可能な賦形剤またはキャリアを含む組成物であってよい。組成物および担体の例については後述する。
【０１５６】
ポリペプチドの作製
本発明のポリペプチドの産生または単離のための組換え方法は、本明細書中に記載する。組換え産生に加えて、このポリペプチドは、固相技術（例えば、Stewartら、(1969) Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co, San Francisco、Merrifield J.(1963) J Am Chem Soc 85: 2149-2154を参照されたい）を用いる直接ペプチド合成によって産生することができる。ペプチド合成は、手動の技術を用いるかまたは自動的に実施することができる。自動化合成は、例えば、Applied Biosystems 431 A Peptide Synthesizer（Perkin Elmer,Foster City,Calif.）をメーカーによる取扱説明書にしたがって用いることにより実現することができる。例えば、サブシークエンスは、化学的方法を用いて、別々に合成するかまたは組み合わせて合成し、全長ポリペプチドまたはその断片を提供することができる。あるいは、該配列を、ポリペプチドの産生を専門とする多数の任意の企業に注文することができる。最も一般的には、本発明のポリペプチドは、コード核酸を発現させ、ポリペプチドを回収すること（例えば、以下に記載するように）により産生することができる。
【０１５７】
また、本発明のポリペプチドの産生のための方法も含まれる。該方法の１つは、細胞の集団内に、本明細書中に記載する本発明の任意の核酸を、コードするポリペプチドを産生するために効果的な制御配列に作動可能に連結するように導入する工程、培養培地中で細胞を培養し、ポリペプチドを発現させる工程、および細胞または培養培地からポリペプチドを単離する工程を含んでいる。細胞による取り込み（トランスフェクション）を促進しかつ／またはポリペプチドを発現するために十分な核酸の量を利用する。核酸は、該細胞に、本明細書中に記載する任意の送達方法によって導入され、この送達方法としては、例えば、注射、遺伝子銃、受動的取り込みなどが含まれる。核酸は、ベクター（例えば、ＤＮＡプラスミドベクターを含む組換え発現ベクター、または本明細書中に記載する任意のベクター）の一部であってよい。本発明の核酸または核酸を含むベクターは、上述のように調製することができ、かつ製剤化することができる。該核酸または発現ベクターは、取り込みおよびコードされたポリペプチドの発現を生じるために十分な量で、哺乳動物の細胞の集団内にインビボで導入することができるか、または選択された哺乳動物細胞（例えば、腫瘍細胞）が哺乳動物から取り出することができ、そして核酸発現ベクターは、該細胞の集団内にエクソビボで導入することができる。あるいは、本発明の核酸または核酸を含むベクターを、培養細胞を用いてインビトロで産生する。ある態様では、本発明のポリペプチドを産生する方法は、細胞の集団内に、本明細書中に記載する本発明の任意の核酸を含む組換え発現ベクターを、ベクターの取り込みおよびコードされたポリペプチドの発現が結果的に起こる量および処方で導入する工程、発現ベクターを、本明細書中に記載する任意の導入／送達方法で哺乳動物内に投与する工程、および哺乳動物由来のポリペプチドまたは哺乳動物の副産物由来のポリペプチドを単離する工程を含んでいる。
【０１５８】
抗体
本発明の他の態様では、本発明のポリペプチド（またはその抗原性断片）を使用し、例えば、診断用途、治療用途、または予防用途（例えば、ポリペプチドおよびその断片の活性、分布、発現に関連する）を有する抗体が産生する。本発明のポリペプチドは、当該分野で周知の方法によって産生することができる。該抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片およびＦａｂ発現ライブラリーによって産生された断片が含まれるが、これらに限定されない。抗体（例えば、レセプター結合を遮断する抗体）は、治療用途および／または予防用途のために特に好ましい。
【０１５９】
抗体誘導のためのポリペプチドは、生物学的活性を必要としない。しかし、このポリペプチドまたはペプチドは、抗原性を有する必要がある。特定の抗体を誘導するために使用するポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸、好ましくは少なくとも約１５または２０アミノ酸、または少なくとも約２５または３０アミノ酸からなるアミノ酸配列を有していてよい。ポリペプチドの短い鎖は、別のタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン）と融合することができ、キメラ分子に対する抗体を産生する。
【０１６０】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生する方法は公知であり、多くの抗体を用いることができる。例えば、Current Protocols in Immunology, John’Colliganら編、第I〜第IV巻 （John Wiley & Sons,Inc.,NY,1991および2001,補遺）、ならびにHarlowおよびLane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press,NY、Stitesら（編）、Basic and Clinical Immunology （第４版） Lange Medical Publications, Los Altos,CAおよびこれら中の引用文献、ならびにGoding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice （第２版） Academic Press, New York, NY、ならびにKohlerおよびMilstein (1975) Nature 256: 495-497を参照されたい。抗体調製のための他の好適な技術には、ファージまたは類似のベクター中の組換え抗体のライブラリーの選択が含まれる。Huseら、(1989) Science 246: 1275-1281、およびWardら(1989) Nature 341: 544-546を参照されたい。特定のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体と抗血清とは、通常、少なくとも約０．１μM、好ましくは少なくとも約０．０１μM以下、最も好ましくは０．００１μM以下のＫＤで結合する。
【０１６１】
キメラ（ヒト化）抗体の調製のための詳細な方法は、米国特許第５，４８２，８５６号で見ることができる。ヒト化技術および他の抗体産生技術ならびに操作技術のさらなる詳細は、Borrebaeck （編） (1995) Antibody Engineering,第２版、Freeman and Company, NY （Borrebaeck）、McCaffertyら(1996) Antibody Engineering, A Practical Approach IRL, Oxford Press, Oxford, England （McCafferty）、およびPaul (1995) Antibody Engineering Protocols Humana Press, Towata, NJ（Paul）で見ることができる。
【０１６２】
ある態様では、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその断片に対する完全ヒト化抗体を提供する。ヒト化抗体は、抗体が、治療剤および／または予防剤として、ヒト患者においてインビボで使用する場合、特に望ましい。ヒト抗体は、特徴上、ヒト免疫グロブリン配列からなる。本発明のヒト抗体は、広範な種々の方法を用いて産生することができる（例えば、Larrickら、米国特許第５，００１，０６５号、ならびに概説については、Borrebaeck McCaffertyおよびPaul、前出を参照されたい）。ある態様では、本発明のヒト抗体は、最初にトリオーマ細胞において産生される。次いで、抗体をコードする遺伝子が、他の細胞（例えば、非ヒト哺乳動物細胞）においてクローン化され、発現される。トリオーマ技術によってヒト抗対を産生するための一般的アプローチは、Ostbergら(1983), Hybridoma 2: 361-367、Ostberg、米国特許第４，６３４，６６４号、およびEngelmanら，米国特許第４，６３４，６６６号によって記載されている。この方法によって得た抗体産生細胞株は、３種の細胞（２種のヒト細胞および１種のマウス細胞）の流れをくむため、トリオーマと呼ばれる。
【０１６３】
本発明のポリペプチドついて考えられる他の用途については、明細書の全体にわたって示す。
【０１６４】
インターフェロンα複合体
他の態様では、本発明は、インターフェロンα活性を示すポリペプチドを含む複合体に関するもので、この複合体は、配列番号１〜３１９およびポリペプチドに結合する少なくとも１種の非ポリペプチド部分、例えば、ポリペプチドの結合基に結合する、例えば、１〜６種、１〜５種、１〜４種、１〜３種、例えば、１種または２種の非ポリペプチド部分のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。当然のことながら、この複合体はまた、インターフェロンα活性（例えば、抗ウィルス活性、ＴＨ１分化活性、および／または抗増殖活性）を示す。該複合体のいくつかは、ポリペプチドのＮ−端側に付加されたメチオニン等の、１つ以上のアミノ酸をさらに含んでいる。
【０１６５】
他の態様では、複合体は、０〜１６個のアミノ酸の位置（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個のアミノ酸の位置）で、例えば、０〜１４個のアミノ酸の位置、０〜１２個のアミノ酸の位置、０〜１０個のアミノ酸の位置、０〜８個のアミノ酸の位置、０〜６個のアミノ酸の位置、０〜５個のアミノ酸の位置、０〜４個のアミノ酸の位置、０〜３個のアミノ酸の位置、０〜２個のアミノ酸の位置、または０〜１個のアミノ酸の位置で、配列番号１〜３１９のうちいずれか１つの配列と異なるアミノ酸配列を含む。本発明のある態様では、非ポリペプチド部分に対する結合基を含むアミノ酸残基を、（例えば、非ポリペプチド部分に対する結合基を含む異なった残基でのアミノ酸残基の置換、または非ポリペプチド部分に対する結合基を含む他のアミノ酸残基の挿入によって）導入する。
【０１６６】
「複合体」という用語（または、交換可能に「ポリペプチド複合体」または「結合ポリペプチド」）は、本発明の１つ以上のポリペプチドが１つ以上の非ポリペプチド部分に共有結合によって形成する、不均一（複合体の意味で）分子を意味する。「共有結合」という用語は、ポリペプチドと非ポリペプチド部分とが、互いに直接的に共有結合するか、または介在する基（例えば、架橋、スペーサー、または連結部分）を介して互いに間接的に共有結合するかのいずれかを意味する。好ましくは、結合ポリペプチドは、関連する濃度および条件において可溶であり、すなわち、生理学的液体（例えば、血液）に可溶である。本発明の結合ポリペプチドの例としては、グリコシル化および／またはＰＥＧ化ポリペプチドが含まれる。「非結合ポリペプチド」という用語は、結合ポリペプチドのポリペプチド部分を示すために用いることができる。
【０１６７】
「非ポリペプチド部分」という用語は、ポリペプチドの結合基に結合可能な分子を意味することを意図している。非ポリペプチド部分の好ましい例には、ポリマー分子、糖部分、親油性化合物、または有機誘導体化剤が含まれ、特に、ポリマー分子または糖部分である。当然のことながら、非ポリペプチド部分が、ポリペプチドの結合基を介してこのポリペプチドに結合する。ポリペプチドに結合する非ポリペプチド部分（例えば、ポリマー分子）の数を明確に示す場合を除き、ポリペプチドに結合し、または本発明で他に用いる、それぞれの「非ポリペプチド部分」への言及は、ポリペプチドに結合する１つ以上の非ポリペプチド部分への言及であるものとする。
【０１６８】
「ポリマー残基」という用語は、２以上のモノマーの共有結合によって形成され、モノマーがどれもアミノ酸残基ではない分子として定義される。「ポリマー」という用語は、「ポリマー分子」という用語と交換可能に用いることができる。
【０１６９】
「糖部分」という用語は、インビボまたはインビトロのグリコシル化（例えば、Ｎ−グリコシル化またはＯ−グリコシル化）によって結合する炭水化物分子を示すことを意図している。
【０１７０】
「Ｎ−グリコシル化部位」は、配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ／Ｃを有し、ここで、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸残基であり、Ｎは、アスパラギンであり、Ｓ／Ｔ／Ｃは、セリン、トレオニンまたはシステインのいずれか、好ましくはセリンまたはトレオニン、最も好ましくはトレオニンである。
【０１７１】
「Ｏ−グリコシル化部位」は、セリンまたはトレオニン残基ＯＨ−基を含む。
【０１７２】
「結合基」という用語は、関連する非ポリペプチド部分（例えば、ポリマー分子または糖部分）にカップリング可能なアミノ酸残基の基を示すことを意図している。有用な結合基およびいくつかの対応する非ポリペプチド部分の非限定的な例を、以下の表２に示す。
【０１７３】
【表２】
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【０１７４】
インビボにおけるＮ−グリコシル化について、「結合基」という用語は、型にはまらない方法で使用され、Ｎ−グリコシル化部位（配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ／Ｃを有し、ここで、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸残基であり、Ｎは、アスパラギンであり、Ｓ／Ｔ／Ｃは、セリン、トレオニンまたはシステインのいずれか、好ましくはセリンまたはトレオニン、最も好ましくはトレオニンである）を構成するアミノ酸残基を示す。Ｎ−グリコシル化部位のアミノ酸残基は、グリコシル化の間に糖部分が結合する残基であるが、該結合は、Ｎ−グリコシル化部位の他のアミノ酸残基が存在しない限り実現することができない。したがって、非ポリペプチド部分が糖部分であり、結合をＮ−グリコシル化によって実現する場合、「非ポリペプチド部分のための結合基を含むアミノ酸残基」という用語は、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の改変に関して使用する場合、Ｎ−グリコシル化部位を構成する１、２または全てのアミノ酸残基が、機能的Ｎ−グリコシル化部位がアミノ酸配列内に導入されるか、この配列から除去され、または機能的Ｎ−グリコシル化部位がアミノ酸配列内で維持される（例えば、既にＮ−グリコシル化部位の一部を構成するセリン残基のトレオニンによる置換、またはその逆による）方法で改変すると理解される。
【０１７５】
「導入する」という用語（「導入された」アミノ酸残基、アミノ酸残基の「導入」）は、存在するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換することを主に意味することを意図しているが、さらなるアミノ酸残基の挿入を意味する場合もある。
【０１７６】
「除去する」という用語（すなわち、「除去された」アミノ酸残基、アミノ酸残基の「除去」）は、アミノ酸残基が別のアミノ酸残基と入れ替わる置換を意味することを意図しているが、アミノ酸残基を欠失（置換しないで）して取り除くことを意味する場合もある。
【０１７７】
「非ポリペプチド部分のための結合基を含むアミノ酸残基」という用語は、非ポリペプチド部分が結合し（導入されたアミノ酸残基の場合）、または結合を有する（除去されたアミノ酸残基の場合）アミノ酸残基を示すことを意図している。
【０１７８】
「インビボにおける機能的半減期」という用語は、通常の意味（すなわち、ポリペプチドの生物学的活性の５０％が、体内／標的器官においてなお存在する時点、またはポリペプチドの活性が初期値の５０％である時点）で用いることができる。インビボにおける機能的半減期は、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、イヌまたはサル）において決定することができる。好ましくは、インビボにおける機能的半減期は、非ヒト類人猿（例えば、サル）において決定する。さらに、インビボにおける機能的半減期は、静脈内または皮下に投与するサンプルについて決定することができる。
【０１７９】
インビボにおける機能的半減期を決定する代りに、「血清中での半減期」（すなわち、ポリペプチドの５０％が血漿または血流中に循環し、排除される前の時点）を決定することができる。血清中での半減期の決定は、しばしば、インビボにおける機能的半減期の決定より単純であり、血清中での半減期の大きさは、通常、インビボにおける機能的半減期の大きさのよい指標である。あるいは、血清中での半減期に対する用語には、「血漿半減期」、「循環半減期」、「血清クリアランス」、「血漿クリアランス」および「クリアランス半減期」が含まれる。血清中での半減期は、インビボにおける機能的半減期の決定に関連して、上述のように決定することができる。
【０１８０】
「血清」という用語は、その通常の意味で、すなわち、フィブリノゲンおよび他の凝固因子を含まない血漿を意味するものとして用いられる。
【０１８１】
インビボにおける機能的半減期または血清中での半減期に関して使用する場合、用語「延長した」という用語は、本発明の複合体の対応する半減期が、参照分子の対応する半減期と比較して統計的に有意に延長していることを意味し、参照分子は、例えば、ヒトインターフェロンαのような野生型インターフェロンα（例えば、配列番号３２０〜配列番号３３２のうちの１つ（または、本明細書中および／またはAllen G.およびDiaz M.O.(1996)（前出）に示す他のｈｕＩＦＮ−α配列）または対応する非結合ポリペプチドである。したがって、本発明の目的の複合体には、上述の参照分子と比較して延長したインビボ半減期または延長した血清中での半減期を有する複合体が含まれる。
【０１８２】
「ＡＵＣＳＣ」または「皮下投与された場合の曲線下領域」という用語は、その通常の意味で使用する。すなわち、結合分子を実験動物に皮下投与する場合の血清中インターフェロンα活性−時間曲線である。実験的インターフェロン活性時点が決定すると、ＡＵＣＳＣは、コンピュータプログラム（例えば、GraphPad Prism 3.01）によって従来法により計算することができる。
【０１８３】
ＡＵＣＳＣに関して使用する場合、「増大した」という用語は、皮下投与した場合の、本発明の複合体についての曲線下領域を示すために使用され、比較可能条件下で決定した場合の参照分子（例えば、ヒトインターフェロンαのような野生型インターフェロンα（例えば、配列番号３２０〜配列番号３３２のうちの１つ（または本明細書中および／またはAllen G.およびDiaz M.O.(1996)（前出）に示す他のｈｕＩＦＮ−α配列））または対応する非結合ポリペプチド）のそれと比較して、統計的に有意な増加である。明白に、本発明の複合体および参照分子について、同量のインターフェロンα活性が投与するべきである。したがって、異なるインターフェロンα分子間の直接比較を行うために、ＡＵＣＳＣは、通常、標準化するべきであり、すなわち、投与するＡＵＣＳＣ／用量として表されるべきである。
【０１８４】
「Ｔｍａｘ，ＳＣ」という用語は、血清中インターフェロンα活性−時間曲線において、血清中で最高のインターフェロンα活性が観察された時点について用いる。
【０１８５】
親ポリペプチドに対する例および修飾は、本明細書中で、一般に配列番号１の配列に関連して提供するが、開示の修飾はまた、上述の本発明の任意の他のポリペプチド（配列番号２〜３１９、ならびにこれらの改変体）に等しいアミノ酸位置で行うことができる。
【０１８６】
非ポリペプチド部分のための結合基を含むアミノ酸の除去および／または導入によって、ポリペプチドを特定に適合させ、選抜された非ポリペプチド部分に対する複合体に対してより感受性の分子を作製し、結合方法を最適化する（例えば、インターフェロンα分子の表面上の非ポリペプチド部分の選りすぐった最適な分布を確実にし、それによって、例えば、エピトープおよびポリペプチドの他の表面部分を、その機能を大きく損なうことなく有効に保護する）ことを可能にする。例えば、結合基の導入により、インターフェロンαポリペプチドは、関連の非ポリペプチド部分が結合する特定のアミノ酸残基に関連して改変され、それにより、より有効な、特異的かつ／または広範囲の結合が実現する。１つ以上の結合基の除去により、非ポリペプチド部分のポリペプチド部分に対する結合を避けることが可能になり、ここで、該結合（例えば、ポリペプチドの機能部位またはその近傍に位置するアミノ酸への結合）は不利である（該部位における結合は、インターフェロンα活性の不活性化または減少をもたらすことができ、レセプター認識しない複合体を生成することができるからである）。さらに、別の結合基に近接した結合基を除去することが有利であってよい。
【０１８７】
非ポリペプチド部分に対する結合基を含むアミノ酸残基が、除去されるか導入されるかに関わりなく、その非ポリペプチド部分の特性に基づいて選択され、場合によっては、使用する結合法に基づいて選択される。例えば、その非ポリペプチド部分がポリマー分子（例えば、該ポリエチレングリコール誘導分子またはポリアルキルレンオキシド誘導分子）である場合、結合基として機能しうるアミノ酸鎖残基は、システイン、リジン（および／またはそのポリペプチドのＮ末端アミノ基）、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジンおよびアルギニンからなる群より選択することができる。その非ポリペプチド部分が、糖部分である場合、その結合基は、インビボまたはインビトロのＮ−グリコシル化部位またはＯ−グリコシル化部分であり、好ましくは、Ｎ−グリコシル化部位である。
【０１８８】
場合によっては、非ポリペプチド部分に対する結合基が、そのインターフェロンαポリペプチドに導入され、またはそのポリペプチドから除去すると、その改変するインターフェロンαポリペプチドの位置が、以下のように好都合に選択される。
【０１８９】
改変される位置は、そのインターフェロンαポリペプチドの表面（例えば、溶媒に対して２５％を超える側鎖が露出されるアミノ酸（例えば、その溶媒に対して５０％を超えるその側鎖が露出するアミノ酸）によって占められる位置）に位置づけることができる。該位置は、本明細書中の「材料および方法」の項に記載の、ヒトインターフェロンα２ａの３次元構造の分析に基づいて同定された。
【０１９０】
結合基の最適な分布を決定するために、そのインターフェロンα分子の表面に位置づけられるアミノ酸の間の距離を、そのインターフェロンαポリペプチドの３次元構造に基づいて計算した。より具体的には、該結合基を含むアミノ酸残基の間の距離、または、結合基を含むあるアミノ酸残基の官能基（リジンに関してはＮＺ、アスパラギン酸にかんしてはＣＧ、グルタミン酸に関してはＣＤ、システインに関してはＳＧ）と、結合基を含む別のアミノ酸残基のＣＢとの間の距離を決定する。グリシンの場合、ＣＡが、ＣＢの代わりに使用された。本発明の複合体のインターフェロンαポリペプチド部分において、上記の距離のいずれかが、不均一な結合を回避または低減し、そして、結合基の一様な分布を提供するために、例えば、エピトープシールディングの目的で、８Åを超え、例えば、１０Åを超えてもよい。
【０１９１】
さらに、本発明のインターフェロンαポリペプチド部分において、場合によっては、インターフェロンαのレセプター結合部位に位置し、またはその近位に位置にする結合基は、例えば、該基を含むアミノ酸残基の置換によって除去される。場合によっては、非ポリペプチド部分に対する結合基を含むアミノ酸残基（例えば、システインまたはリジン）は、そのインターフェロンα分子のレセプター結合部分またはその近位では導入されないことが多い。
【０１９２】
インターフェロンポリペプチドを改変するための別のアプローチは、非ポリペプチド部分に対する結合によって、その親インターフェロンαにおいて存在するエピトープをシールドして、そして、それによってそのエピトープを改変または破壊するか、あるいはさもなければ、そのエピトープを不活性化することである。インターフェロンαポリペプチドのエピトープは、当該分野で公知の方法、または、エピトープマッピングとして知られているような方法によって同定することができる。例えば、Romagnoliら、J.Biol Chem., 1999, 380 （5): 553-9、De Lisser HM, Methods Mol Biol, 1999, 96: 11-20、Van de Waterら、Clin Immunol Immunopathol, 1997, 85 （3) :229-35、Saint-Remy JM, Toxicology, 1997, 119 (1): 77-81ならびにLane DPおよびStephen CW, Curr Opin Immunol, 1993, 5 （2): 268-71を参照されたい。１つの方法は、例えば、９アミノ酸酸のランダムオリゴペプチドを発現するファージディスプレイライブラリーを確立することである。ヒトインターフェロンαに対する特異的抗血清に由来するＩｇＧ１抗体は、免疫沈降法によって精製され、そして、その反応性ファージが、免疫ブロッティングによって同定される。それらの精製した反応性ファージのＤＮＡをスクリーニングすることによって、そのオリゴペプチドの配列は、決定され、その後、そのインターフェロンαの３次元構造上にその配列を位置づけることができる。あるいは、エピトープは、米国特許第５，０４１，３７６号に記載する方法にしたがって同定することができる。その構造上でそれによって同定された領域は、非ポリペプチド部分に対する結合基の導入のため標的領域として選択することができる。好ましくは、インターフェロンαの少なくとも１つのエピトープ（例えば、２、３または４個のエピトープ）は、本発明にしたがう非ポリペプチド部分によってシールドする。したがって、１つの態様では、本発明の複合体は、野生型ヒトインターフェロンα（市販のインターフェロンαの任意のものを含む）と比較して少なくとも１個、シールドされたエピトープを有する。これは、所定のエピトープの近傍（すなわち、その一次配列上で、アミノ酸４残基以内であるか、またはその３次元配列において約１０Å内にある）に位置づけられる位置に非ポリペプチド部分に対する結合基を導入することによって行われる。ＣＢ（グリシンにおいてはＣＡ）の間で、１０Åの距離が測定される。該具体的な導入は、以下の項に記載する。
【０１９３】
結合基を取り除く場合、該基を含み、かつ上記のように規定した関連するアミノ酸残基を、問題としている非ポリペプチド部分に対する結合基を含まない様々なアミノ酸残基で置換するか、または除去する。Ｎグリコシル基を取り除くことは、モチーフＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ／Ｃ内のアミノ酸残基の挿入または除去によって実現することができる。
【０１９４】
結合基を導入する場合、該基を含むアミノ酸残基は、例えば、該位置を占めるアミノ酸残基の置換によって、その位置に導入される。
【０１９５】
結合に利用でき、かつインターフェロンαポリペプチド中に存在する、結合基の正確な数は、結合によって達成される所望の効果に依存する。得られる効果は、例えば、結合の性質および程度（例えば、非ポリペプチド部分の同一性、そのポリペプチドに結合することが望ましく、または結合することができる非ポリペプチド部分（ここで、これらの残基が結合するか、または結合が回避される、等）に依存する。例えば、免疫原性を低減することが望ましい場合、結合基の数（および位置）は、ほとんどまたは全てのエピトープをシールドするのに十分なものであるべきである。これは、さらに多くの集団のインターフェロンαポリペプチドがシールドする場合に、通常得ることができる。エピトープの効果的なシールドは、結合に利用可能である結合基の総数が、１〜６個の結合基の範囲（例えば、１〜５、１〜３の範囲、１、２、または３の結合基）にある。
【０１９６】
インビボにおける機能的半減期は、その複合体の分子量に依存し、したがって、半減期の増大を提供するために必要な結合基の数は、問題とする非ポリペプチド部分の分子量に依存する。該いくつかの複合体は、１〜６、例えば、１〜５（例えば、１〜３）、例えば、１、２、または３の非ポリペプチド部分を含み、それらの各々は、約２〜４０kDa（例えば、約２kDa、約５kDa、約１２kDa、約１５kDa、約２０kDa、約３０kDaまたは約４０kDa）の分子量を有する。
【０１９７】
本発明の複合体において、いくつかの、ほとんど、または実質的に全ての、結合可能基は、関連する非ポリペプチド部分によって占有される。
【０１９８】
本発明の複合体は、以下のように１つ以上性質を改善することができる。
【０１９９】
例えば、その複合体は、対応する非結合ポリペプチドと比較して低減した免疫原性、例えば、非結合ポリペプチドと比較した場合、またはヒトインターフェロンと比較した場合に、例えば、少なくとも１０％の低減、例えば、少なくとも２５％の低減、少なくとも５０％の低減、少なくとも７５％の低減を示すことができる。
【０２００】
他の態様では、この複合体は、対応する非結合ポリペプチドと比較して、ヒトインターフェロンα（例えば、配列番号３２０〜３３２、または本明細書および／またはAllen G.およびDiaz M. O. (1996)、前出に記載するような他のｈｕＩＦＮ−αのいずれか）で処置した患者に由来する中和抗体との反応が低減されたか（例えば、少なくとも１０％の中和の減少、２５％の中和の減少、５０％の中和の減少、少なくとも７５％の中和の減少を示し、または全く反応しない。
【０２０１】
本発明の他の態様では、その複合体は、ヒトインターフェロンα（例えば、配列番号３２０〜３３２、または本明細書および／またはAllen G.およびDiaz M. O. (1996)、前出に記載するような他のｈｕＩＦＮ−αのいずれか）のような参照分子と比較する場合、または、その対応する非結合ポリペプチドと比較した場合の、インビボにおける機能的半減期の増大および／または血清の半減期の増大を示すことができる。特定の好ましい結合は、上述の複合体の機能インビボ半減期（または血清中における半減期）と上述の参照分子の機能インビボ半減期（または血清中での半減期）の比が、少なくとも１．２５、少なくなくとも、１．５０、少なくとも１．７５、少なくとも２、少なくとも３、少なくなくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８である。上述のように、その半減期は、実験動物（例えば、ラットまたはサル）において決定することができ、静脈投与または皮下投与を用いて決定することができる。
【０２０２】
さらなる態様では、その複合体は、ヒトインターフェロンα（例えば、配列番号３２０〜３３２、または本明細書および／またはAllen G.およびDiaz M. O. (1996)、前出に記載するような他のｈｕＩＦＮ−αのいずれか）のような参照分子または対応する非結合ポリペプチドと比較した場合に、バイオアベイラビリティーの増大を示すことができる。例えば、その複合体は、参照分子（例えば、ヒトインターフェロンαまたはその対応する非結合ポリペプチド）と比較した場合に、ＡＵＣＳＣの増大を示すことができる。したがって、例示的な複合体は、上述のＡＵＣＳＣと上述の参照分子のＡＵＣＳＣとの間の比が、皮下投与したときに、特に、ラットまたはサルのような実験動物の皮下に投与する場合に、少なくとも１．５、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、例えば、少なくとも１６、少なくとも１８、または少なくとも２０であるような複合体である。同様に、本発明のいくつかの複合体は、上記複合体についてのＴｍａｘと上記参照分子（例えば、ヒトインターフェロンαまたはその対応する非結合ポリペプチド）についてのＴｍａｘとの間の比が、皮下投与したときに、特に、ラットまたはサルのような実験動物の皮下に投与する場合に、少なくとも１．２、少なくとも１．４、少なくとも１．６、少なくとも１．８、少なくとも２、少なくとも２．５、少なくとも３、少なくとも４、例えば、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、例えば、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０であるような複合体である。
【０２０３】
場合によっては、本発明の複合体の抗ウィルス活性の大きさは、ヒトインターフェロンα（例えば、配列番号３２０〜３３２、または本明細書および／またはAllen G.およびDiaz M. O. (1996)、前出に記載するような他のｈｕＩＦＮ−αのいずれか）の抗ウィルス活性の大きさ、または対応する非結合ポリペプチドの抗ウィルス活性の大きさに対して、（例えば、少なくとも７５％分、少なくとも５０％分、少なくとも２５％分、少なくとも１０％分）低減しているか、または（例えば、少なくとも１０％分）増大しているか、あるいは、ほぼ等しい（例えば、約±１０％または約±５％）。場合によっては、本発明の複合体の抗増殖性活性と比較したときの抗ウィルス活性の程度を変化させることができ、したがって、ヒトインターフェロンαの抗ウィルス活性またはその対応する非結合ポリペプチドの抗ウィルス活性に対して、高く、低く、またはほぼ等しい。
【０２０４】
非ポリペプチド部分がリジン残基またはＮ−末端のアミンに結合する本発明の複合体
ある態様では、本発明は、インターフェロンα活性を示し、配列番号１〜３１９から選択する配列を含むインターフェロンαポリペプチドの少なくとも１つのリジン残基および／またはＮ−端側のアミノ基に結合した少なくとも１つの非ペプチド残基を有する複合体に関する。
【０２０５】
他の態様では、本発明は、インターフェロンα活性を示し、１〜１６個のアミノ酸の位置（例えば、１〜１５個のアミノ酸の位置、１〜１４個のアミノ酸の位置、１〜１３個のアミノ酸の位置、１〜１２個のアミノ酸の位置、１〜１１個のアミノ酸の位置、１〜１０個のアミノ酸の位置、１〜９個のアミノ酸の位置、１〜８個のアミノ酸の位置、１〜７個のアミノ酸の位置、１〜６個のアミノ酸の位置、１〜５個のアミノ酸の位置、１〜４個のアミノ酸の位置、１〜３個のアミノ酸の位置、または１〜２個の個のアミノ酸の位置）において、配列番号１〜３１９のうち１つの配列と異なる配列を有する、インターフェロンαポリペプチドの少なくとも１つのリジン残基に結合した少なくとも１つの非ペプチド残基を有する複合体に関する。この態様に係るいくつかの複合体は、少なくとも１つの除去されたリジン残基、および／または少なくとも１つの除去されたヒスチジン残基、および／または少なくとも１つの導入されたリジン残基を含んでいる。
【０２０６】
本発明のこの態様で意図している非ポリペプチド部分としては、「ポリマー分子に対する結合」の項において述べた分子のいずれかのようなポリマー分子（例えば、ＰＥＧまたはｍＰＥＧ）が含まれる。リジン含有ポリペプチドとポリマー分子との間の結合は、例えば、「ポリマー分子に対する結合」との表題の節に記載されたような任意の適切な方法、例えば、上記の項に記載の一段階法により、または多段階法により実現することができる。インターフェロン−αポリペプチドをＰＥＧ化するための方法の例は、リジン反応性のＰＥＧを用いてＰＥＧをリジン残基に共有結合することである。異なる基および異なる分子量の直鎖または分枝鎖状ＰＥＧ（例えば、プロピオン酸スクシンイミジル（ＳＰＡ）、ブタノール酸スクシンイミジル（ＳＢＡ）、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）およびアルデヒド（例えば、ＢｕｔｙｒＡＬＤ））が、例えば、Nektar Therapeutics Inc、米国アラバマ州ハンツビル、またはSunBio社、韓国安陽市から市販されている。
【０２０７】
非ポリペプチド部分がシステイン残基に結合する本発明の複合体
他の態様では、本発明は、インターフェロンα活性を示し、１〜１６個のアミノ酸の位置（例えば、１〜１５個のアミノ酸の位置、１〜１４個のアミノ酸の位置、１〜１３個のアミノ酸の位置、１〜１２個のアミノ酸の位置、１〜１１個のアミノ酸の位置、１〜１０個のアミノ酸の位置、１〜９個のアミノ酸の位置、１〜８個のアミノ酸の位置、１〜７個のアミノ酸の位置、１〜６個のアミノ酸の位置、１〜５個のアミノ酸の位置、１〜４個のアミノ酸の位置、１〜３個のアミノ酸の位置、または１〜２個の個のアミノ酸の位置）において、配列番号１〜３１９のうち１つの配列と異なる配列を有する、インターフェロンαポリペプチドの少なくとも１つのシステイン残基に結合した少なくとも１つの非ペプチド残基を有する複合体に関する。この態様に係る複合体のいくつかは、少なくとも１つの導入されたシステイン残基を含んでいる。
【０２０８】
場合によっては、２つ以上の導入されたシステイン残基の間でジスルフィド結合が形成するのを防ぐために、システイン残基は１つだけ導入する。
【０２０９】
インターフェロンαにおいて、１／９９位、および２９／１３９位のシステイン残基間でジスルフィド結合が形成する。２９／１３９位のジスルフィド結合は、生体活性に対して本質的であるが、１／９９位の結合は、生体活性にほとんど影響を与えずに還元することができる（Beilharz M.Wら、(1986) J. Interferon Res. 6（6):677-685)。したがって、本発明の他の態様では、Ｃ１またはＣ９９の一方が、好ましくは置換、例えば、Ｃ１ＳまたはＣ９９Ｓにより除去され、それにより、他方のシステイン残基が、非ポリペプチド部分との結合に利用可能なように残される。
【０２１０】
本発明のこの態様において意図している非ポリペプチド部分としては、「ポリマー分子に対する結合」の項において言及された分子のいずれかのようなポリマー分子（例えば、ＰＥＧまたはｍＰＥＧ）が含まれる。システイン含有ポリペプチドとポリマー分子との間の結合は、例えば、「ポリマー分子に対する結合」との表題の節に記載されたような任意の適切な方法、例えば、上記の項に記載の一段階法を用いて、または多段階法で実現することができる。インターフェロン−αポリペプチドをＰＥＧ化するための例示的な方法は、システイン反応性のＰＥＧを用いてＰＥＧをシステイン残基に共有結合することである。異なる基および異なる分子量の直鎖または分枝鎖状ＰＥＧ（例えば、２〜４０kDa（例えば、２kDa、５kDa、１２kDa、１５kDa、２０kDa、３０kDaまたは４０kDa））を有する多数の高度に特異的なシステイン反応性のＰＥＧ（例えば、オルトピリジルジスルフィド  （ＯＰＳＳ）、マレイミド（ＭＡＬ）、およびビニルスルホン（ＶＳ））が、例えば、Nektar Therapeutics Inc、米国アラバマ州ハンツビル、またはSunBio社、韓国安陽市から市販する。
【０２１１】
本発明の複合体の非ポリペプチド部分
上記に示したように、発明の複合体の非ポリペプチド部分は、一般的に、ポリマー分子、親油性化合物、糖部分（例えば、インビボＮ−グリコシル化による）、および有機誘導体化剤からなる群より選択される。これらの薬剤の全ては、この複合体のポリペプチド部分に所望の特性（例えば、低下した免疫原性、増加したインビボにおける機能的半減期、増加した血清中での半減期、増加したバイオアベイラビリティ、および／または増加したＡＵＣＳＣ）を与える。この複合体のポリペプチド部分は、しばしば１つの型の非ポリペプチド部分にのみ結合するが、二以上の異なる型の非ポリペプチド部分（例えば、ポリマー分子および糖部分など）にも結合することができる。二以上の異なる非ポリペプチド部分への結合は、同時にまたは順次行うことができる。非ポリペプチド部分の選択は、特に、この結合によって達成される所望の効果に依存する。例えば、糖部分は、免疫原性を減少するために特に有用であり、一方ポリマー分子（例えば、ＰＥＧ）は、インビボにおける機能的半減期、および／または血清中での半減期を増加するために特に使用する。ポリマー分子および糖部分の組み合わせの使用は、免疫原性の減少およびインビボにおける機能的半減期または血清中での半減期の増加を増強させることができる。
【０２１２】
以下の「親油性化合物との結合」、「ポリマー分子との結合」、「糖部分との結合」、および「有機誘導体化剤との結合」の項において、特定の型の非ポリペプチド部分への結合について述べる。
【０２１３】
親油性化合物との結合
親油性化合物との結合のため、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端、アミノ酸残基、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｙｒのヒドロキシ基、Ｌｙｓのε−アミノ基、ＣｙｓのＳＨ基またはＡｓｐおよびＧｌｕのカルボキシル基は、結合基として作用することができる。このポリペプチドおよび親油性化合物は、直接、またはリンカーの使用によってのいずれかで互いに結合することができる。親油性化合物は、天然化合物（例えば、飽和または不飽和脂肪酸、脂肪酸ジケトン、テルペン、プロスタグランジン、ビタミン、カロテノイドまたはステロイド、または炭素酸、アルコール、アミンおよび１つ以上のアルキル、アリール、アルキニルまたは他の複数の非飽和化合物を有するスルホン酸のような合成化合物）であってよい。必要に応じてリンカーを介したポリペプチドと親油性化合物との結合は、公知の方法（例えば、Peptide Synthesis, John Wiley, New York, 1976においてBodanszkyにより記載の方法、および国際公開第９６／１２５０５号における方法）にしたがって行うことができる。
【０２１４】
ポリマー分子との結合
ポリペプチドに結合するポリマー分子は、任意の適切なポリマー分子（例えば、天然または合成のホモポリマーまたはヘテロポリマー）であって、通常、約３００〜１００，０００Daの範囲、例えば、約１，０００〜５０，０００Da（例えば、約１，０００〜４０，０００Daの範囲）の分子量を有する。より特別には、ポリマー分子（例えば、ＰＥＧ、特にｍＰＥＧ）は、通常、２kDa、５kDa、１０kDa、１２kDa、１５kDa、２０kDa、３０kDa、４０kDaまたは５０kDaの分子量（特に、約５kDa、約１０kDa、約１２kDa、約１５kDa、約２０kDa、約３０kDa、または約４０kDaの分子量）を有する。ＰＥＧ分子は、分枝されてもよく（例えば、ｍＰＥＧ２）、または分枝を有していなくても（直鎖であっても）よい。
【０２１５】
本明細書においてポリマー分子について使用する場合、「約」という用語は、おおよその平均分子量を示し、所定のポリマー調製物中に、通常、特定の分子量の分布があるという事実を反映する。
【０２１６】
ホモポリマーの例としては、ポリオール（すなわち、ポリ−ＯＨ）、ポリアミン（すなわち、ポリ−ＮＨ２）およびポリカルボン酸（すなわち、ポリ−ＣＯＯＨ）が含まれる。ヘテロポリマーは、１つ以上の異なる結合基（例えば、ヒドロキシ基およびアミン基）を含むポリマーである。
【０２１７】
適切なポリマー分子の例としては、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）およびポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ））、分枝ＰＥＧ（ＰＥＧ２）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリスチレン−無水マレイン酸無水物コポリマー、カルボキシメチルデキストランを含むデキストラン、あるいは免疫原性を低下させ、ならびに／またはインビボにおける機能的半減期および／または血清中における半減期を増加する任意の他の生体高分子からなる群より選択されるポリマーが含まれる。通常、ポリアルキレングリコールに由来するポリマーは、生体適合性、無毒性、非抗原性、非免疫原性であり、種々の水溶性特性を有し、そして生体から容易に排出される。
【０２１８】
ＰＥＧは、例えば、デキストランのような多糖類と比べて、数個の架橋可能な反応基しか有さないため、使用に好ましいポリマー分子である。その結合反応が比較的単純（ただ１つの反応基が、ポリペプチド上の結合基との結合に利用可能）であるため、特に、単官能性のＰＥＧ、例えばモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）が興味深い。結果として、架橋の危険性が消失し、得られるポリペプチド複合体は均一であり、ポリマー分子のポリペプチドとの反応は容易に制御することができる。
【０２１９】
ポリマー分子がポリペプチドに共有結合するために、ポリマー分子のヒドロキシル末端基を、活性形態で、すなわち、反応性の官能基とともに提供しなければならない（例としては、一級アミノ基、ヒドラジド（ＨＺ）、チオール、スクシネート（ＳＵＣ）、スクシニミジルスクシネート（ＳＳ）、スクシニミジルスクシナミド（ＳＳＡ）、スクシニミジルプロピオネート（ＳＰＡ）、スクシニミジルブタノエート（ＳＢＡ）、スクシニミジルカルボキシメチレート（ＳＣＭ）、ベンゾトリアゾールカルボネート（ＢＴＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）、アルデヒド、ニトロフェニルカルボネート（ＮＰＣ）、およびトレシレート（ＴＲＥＳ）が含まれる。）適切に活性化されたポリマー分子が市販されている（例えば、Nektar Therapeutics Inc、米国アラバマ州ハンツビル、PolyMASC Pharmaceuticals plc、英国、またはまたはSunBio社、韓国安陽市より）。あるいは、ポリマー分子は、当該技術分野で公知の従来の方法（例えば、国際公開第９０／１３５４０号に開示の方法）によって活性化することができる。本発明における使用に適切な活性化された直鎖状または分枝状ポリマー分子の特定の例は、参照により本明細書に援用され、Nektar Therapeutics, Inc. 2003カタログ（「Nektar Molecule Engineering: Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced Pegylation, Catalog 2003」）に開示している。活性化されたＰＥＧポリマーの特定の例としては、以下の直鎖状ＰＥＧ、ならびに分枝鎖状ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ２−ＮＨＳ、ＰＥＧ２−ＭＡＬ）、ならびに米国特許第５，９３２，４６２号および米国特許第５，６４３，５７５号（これらは共に、参照により本明細書に援用される）に開示のＰＥＧポリマーが含まれる。さらに、以下の刊行物（参照により本明細書に援用される）：米国特許第５，８２４，７７８号、米国特許第５，４７６，６５３号、国際公開第９７／３２６０７号、欧州特許第２２９，１０８号、欧州特許第４０２，３７８号、米国特許第４，９０２，５０２号、米国特許第５，２８１，６９８号、米国特許第５，１２２，６１４号、米国特許第５，２１９，５６４号、国際公開第９２／１６５５５号、国際公開第９４／０４１９３号、国際公開第９４／１４７５８号、国際公開第９４／１７０３９号、国際公開第９４／１８２４７号、国際公開第９４／２８０２４号、国際公開第９５／００１６２号、国際公開第９５／１１９２４号、ＷＯ９５／１３０９０号、国際公開第９５／３３４９０号、国際公開第９６／０００８０号、国際公開第９７／１８８３２号、国際公開第９８／４１５６２号、国際公開第９８／４８８３７号、国際公開第９９／３２１３４号、国際公開第９９／３２１３９号、国際公開第９９／３２１４０号、国際公開第９６／４０７９１号、国際公開第９８／３２４６６号、国際公開第９５／０６０５８号、欧州特許第４３９５０８号、国際公開第９７／０３１０６号、国際公開第９６／２１４６９号、国際公開第９５／１３３１２号、欧州特許第９２１１３１号、米国特許第５，７３６，６２５号、国際公開第９８／０５３６３号、欧州特許第８０９９９６号、米国特許第５，６２９，３８４号、国際公開第９６／４１８１３号、国際公開第９６／０７６７０号、米国特許第５，４７３，０３４号、米国特許第５，５１６，６７３号、欧州特許第６０５９６３号、米国特許第５，３８２，６５７号、欧州特許第５１０３５６号、欧州特許第４００４７２号、欧州特許第１８３５０３号、および欧州特許第１５４３１６号に、有用なポリマー分子および／またはＰＥＧ化反応は開示している。
【０２２０】
ポリペプチドと活性化されたポリマー分子との結合は、例えば、以下の参考文献に開示するような任意の従来の方法（これらの参考文献はまた、ポリマー分子の活性化のための適切な方法を開示する）の使用によって実施する：HarrisおよびZalipsky（編）、Poly （ethylene glycol） Chemistry and Biological Applications, AZC, Washington、R. F. Taylor, (1991)「Protein immobilisation. Fundamental and applications」,Marcel Dekker,N.Y.、 S.S. Wong, (1992), 「Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking」,CRC Press, Boca Raton、G.T.Hermansonら(1993),「Immobilized Affinity Ligand Techniques」, Academic Press, N.Y.。
【０２２１】
システイン残基のＰＥＧ化のため、ポリペプチドは、通常、ＰＥＧ化の前にジチオスレイトール（ＤＤＴ）のような還元剤で処理する。還元剤は、その後任意の従来の方法で（例えば、脱塩によって）除去する。ＰＥＧのシステイン残基への結合は、通常、適切な緩衝液中において、ｐＨ６〜９、４℃〜２５℃の種々の温度で、約１６時間までの期間で起こる。システイン残基と結合するための活性化されたＰＥＧポリマーの例としては、ビニルスルホン−ＰＥＧ（ＰＥＧ−ＶＳ）（例えば、ビニルスルホン−ｍＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ＶＳ）、オルトピリジル−ジスルフィド−ＰＥＧ（ＰＥＧ−ＯＰＳＳ）（例えば、オルトピリジル−ジスルフィド−ｍＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ＯＰＳＳ）、ならびにマレイミド−ＰＥＧ（ＰＥＧ−ＭＡＬ）（例えば、マレイミド−ｍＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ＭＡＬ）および分枝したマレイミド−ｍＰＥＧ２（ｍＰＥＧ２−ＭＡＬ））等の直鎖状および分枝鎖状ＰＥＧが含まれる。
【０２２２】
リジンのＰＥＧ化には、多くの場合、ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド（例えば、ｍＰＥＧ−ＮＨＳまたはｍＰＥＧ２−ＮＨＳ）、またはエステル（例えば、ＰＥＧプロピオン酸スクシンイミジル（例えば、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）またはＰＥＧスクシンイミジルブタノエート（例えば、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ））が用いられる。ほぼ等モル量のＰＥＧとタンパク質とが混合する場合、１つ以上のＰＥＧが、ｐＨ８〜９．５、室温で、３０分以内にタンパク質に結合することができる。タンパク質アミノ基に対するＰＥＧのモル比が、１に対して１〜５であれば、通常十分である。ｐＨの上昇は反応速度を上昇させ、一方、ｐＨが低いと反応速度が低下する。これらの、より反応性の高い活性エステルは生理学的ｐＨで結合することができるが、より反応性の低い誘導体は、通常、より高いｐＨを必要とする。不安定なタンパク質を用いる必要がある場合、低温条件を用いることができる。低温条件下では、反応時間をより長くすることができる。
【０２２３】
Ｎ−末端ＰＥＧ化は、Ｎ−末端アミノ酸のα−アミノ基のｐＫａ値（約７．６〜８．０）とリジンのε−アミノ基のｐＫａ値（約１０）との間の差によって促進する。Ｎ−末端アミノ基のＰＥＧ化には、ＰＥＧ−アルデヒド（例えば、ｍＰＥＧ−プロピオンアルデヒドまたはｍＰＥＧ−ブチルアルデヒド）をしばしば利用する（これらは、アミンに対してより選択的であり、したがってヒスチジンのイミダゾール基と反応する可能性がより低い）；加えて、リジン結合のために使用するＰＥＧ試薬（例えば、ｍＰＥＧ−ＳＰＡまたはｍＰＥＧ−ＳＢＡ）はまた、Ｎ−末端アミンの結合のために用いることができる。Ｎ−末端アミノ基に対するＰＥＧ−アルデヒドの結合は、通常、適切な緩衝液（例えば、２０mMシアノ水素化ほう素ナトリウムを含む１００mM酢酸ナトリウムまたは１００mMリン酸水素ナトリウム緩衝液）中において、ｐＨ約５．０で終夜、約４℃〜２５℃の種々の温度で起こる。有用なＮ−末端ＰＥＧ化法および反応は、米国特許第５，９８５，２６５号および同第６，０７７，９３９号（これら両方は、参照により本明細書に援用される）にも開示している。
【０２２４】
通常、直鎖状のＰＥＧまたはｍＰＥＧポリマーは、約５kDa、約１０kDa、約１２kDa、約１５kDa、約２０kDa、または約３０kDaの分子量を有する。分枝鎖状ＰＥＧ（ＰＥＧ２またはｍＰＥＧ２）ポリマーは、通常、約１０kDa、約２０kDa、または約４０kDaの分子量を有する。場合によっては、２０kDaまたは４０kDaのＰＥＧ２のような、より高い分子量の分枝したＰＥＧ試薬（例えば、リジンＰＥＧ化のためのｍＰＥＧ２−ＮＨＳ、システインＰＥＧ化のためのｍＰＥＧ２−ＭＡＬ、またはＮ−末端ＰＥＧ化のためのＭＰＥＧ２−アルデヒドが含まれる。これらは全て、Nektar Therapeutics Inc、米国アラバマ州ハンツビルから入手可能）が用いることができる。ＰＥＧ２化合物の分枝構造は比較的大きな分子容を生じ、したがってより少ない結合分子（または１つの結合分子）を用いることにより、ＰＥＧ化された分枝の所望の特徴を付与することができる。
【０２２５】
当業者は、使用する活性法および／または結合反応が、インターフェロン−αポリペプチドの吸着基およびポリマーの官能基（例えば、アミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒドまたはスルフヒドリル）に依存することを承知している。ＰＥＧ化は、ポリペプチド上の全ての利用可能な結合基（すなわち、ポリペプチドの表面に露出する吸着基）上で起こさせ、または特定の結合基（例えば、システイン残基、リジン残基またはＮ−末端アミノ基）上で起こさせることができる。さらに、この結合は、一工程または複数段階で（例えば、国際公開第９９／５５３７７に開示するように）実施することができる。
【０２２６】
場合によっては、ポリマー結合は、可能な限り多数の利用可能なポリマー吸着基とポリマー分子とを反応させることを目的とする条件下で行われる。これは、ポリペプチドに対して適切なモル過剰のポリマーによって実施する。活性化されたポリマー分子のポリペプチドに対する代表的なモル比は、約１０００：１以下（例えば、約２００：１以下、または約１００：１まで）である。場合によっては、この比はある程度低いが、例えば、約５０：１、１０：１、または５：１以下である。また、等モル比も用いることができる。
【０２２７】
本発明にしたがって、リンカーを通じてポリマー分子をポリペプチドに結合することも、検討する。適切なリンカーは当業者に周知である。好ましい例は、塩化シアヌルである（Abuchowskiら(1977), J. Biol. Chem., 252, 3578-3581、米国特許第４，１７９，３３７号、Shaferら(1986), J. Polym. Sci. Polym. Chem. （編） 24, 375-378)。
【０２２８】
この結合に続いて、残りの活性化されたポリマー分子は、公知の方法にしたがって（例えば、反応混合物への一級アミンの添加により）ブロックされ、得られた不活性化ポリマー分子は適切な方法で除去する。
【０２２９】
インターフェロンαのアミノ酸残基への糖分子のインビトロ共有結合は、糖置換基の数またはプロフィールを改変または増加するのに用いることができる。使用する結合方法に依存して、炭水化物は、ａ）アルギニンおよびヒスチジン（LundbladおよびNoyes Chemical Reagents for Protein Modification, CRC Press Inc. Boca Raton, FI）、ｂ）（例えば、Ｃ−末端アミノ酸残基、アスパラギンまたはグルタミンの）遊離カルボキシル基；ｃ）遊離スルフヒドリル基（例えば、システイン）、ｄ）遊離ヒドロキシル基（例えば、セリン、トレオニン、チロシンまたはヒドロキシプロリンの遊離ヒドロキシル基）、ｅ）芳香族残基（例えば、フェニルアラニンまたはトリプトファンの芳香族残基）、またはｆ）グルタミンのアミド基に結合する。これらのアミノ酸残基は、インターフェロンαポリペプチドにおいて導入および／または除去することができる糖部分に対する吸着基の例を構成する。インビトロ結合の適切な方法は、国際公開第８７／０５３３０号およびAplinら、CRC Crit Rev. Biochem., pp.259-306,1981に開示している。タンパク質結合Ｇｌｎ残基およびペプチド結合Ｇｌｎ残基への糖部分またはＰＥＧのインビトロ結合はまた、によって例えば、Ｓａｔｏら、１９９６ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，１３０７２−１３０８０または欧州特許第７２５１４５号に開示するように、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）によって実施することができる。
【０２３０】
糖部分との結合
１つ以上のグリコシル化部位の導入によって改変されたインターフェロン−αポリペプチドのインビボグリコシル化を実施するため（「非ポリペプチド部分が糖部分である、本発明の複合体」の章を参照されたい）、この複合体のポリペプチド部分をコードするヌクレオチド配列が、グリコシル化する真核生物発現宿主に挿入する。発現宿主は、真菌（糸状菌または酵母）、昆虫、哺乳動物細胞から、トランスジェニック植物細胞から、またはトランスジェニック動物から選択することができる。さらに、グリコシル化は、本発明の複合体のポリペプチド部分または遺伝子治療おける本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を用いて、ヒト体内で実施することができる。１つの態様では、宿主細胞は哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫまたはＨＥＫ２９３等のＨＥＫ細胞）、または昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）、または酵母細胞（例えばSaccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、または任意の他の適切なグリコシル化宿主（例えば、以下にさらに開示するような宿主）である。必要に応じて、インビトログリコシル化によってインターフェロン−αポリペプチドに結合された糖部分は、糖転移酵素の使用によって（例えば、Neose社、米国ペンシルベニア州ホーシャムによって販売されるGlycoAdvanceTM技術を用いて）さらに改変する。これらによって、例えば、ＣＨＯ細胞による発現およびインビボグリコシル化に続くグリコシル化インターフェロンαポリペプチドのシアリル化を促進することができる。
【０２３１】
有機誘導体化剤との結合
インターフェロン−αポリペプチドの共有結合性改変は、ポリペプチドの吸着基を有機誘導化剤と反応させることによって行うことができる。適切な有機誘導体化剤および方法は、当該分野で公知である。例えば、最も一般的なシステイニル残基は、α−ハロアセテート（および対応するアミン）（例えば、クロロ酢酸またはクロロアセトアミド）と反応し、カルボキシチル誘導体またはカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β（４−イミダゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀ベンゾエート、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によって誘導体化する。ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５〜７でのジエチルピロカルボネートとの反応によって、誘導体化する。なぜなら、この薬剤は、ヒスチジル側鎖に対して相対的に特異的だからである。パラ−ブロモフェナシルブロミドもまた有用である；この反応は、好ましくは０．１Mカコジル酸ナトリウム中で、ｐＨ６．０で行われる。リジニルおよびアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応する。これらの薬剤との誘導体化は、リジニル残基の電荷を逆にする効果を有する。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な薬剤としては、イミドエステル（例えば、メチルピコリンイミデート）、リン酸ピリドキサール、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン、およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。アルギニル残基は、１種類またはいくつかの従来の試薬、特に、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリンとの反応によって改変する。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫａのため、アルカリ条件で行われる反応を必要とする。さらに、これらの試薬は、リジンのアミノ基およびアルギニンのグアニジノ基と反応することができる。カルボキシル側基（アスパラチルもしくはグルタミル、またはＣ−末端アミノ酸残基）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミド等のカルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）（ここで、ＲおよびＲ’は異なるアルキル基である）との反応によって選択的に改変する。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル残基およびグルタミニル残基に変換する。
【０２３２】
官能部位のブロッキング
過剰なポリマー結合は、そのポリマーが結合するインターフェロン−αポリペプチドの活性の消失をさせるため、官能部位に位置する結合基を除去すること、または結合前に官能部位をブロックすることは、有利であってよい。これらのうち後者の戦略は、本発明のさらなる態様を構成する（最初の戦略の例は、上述の官能部位に近接して配置することができるリジン残基の除去等による）。より具体的には、第二戦略にしたがって、インターフェロン−αポリペプチドと非ポリペプチド部分との間の結合は、このポリペプチドの官能部位が、このポリペプチドの官能基に結合することができるヘルパー分子によってブロックする条件下で行われる。好ましくは、このヘルパー分子は、ポリペプチドの１つの官能部位を特異的に認識する分子（具体的にはＩ型インターフェロン受容体等の受容体）である。あるいは、このヘルパー分子は、抗体、特にインターフェロン−αポリペプチドを認識するモノクローナル抗体であってよい。特に、このヘルパー分子は、中和モノクローナル抗体であってよい。
【０２３３】
ポリペプチドは、結合を実現する前にヘルパー分子と相互作用することができる。これにより、ポリペプチドの官能部位がブロックされ、または保護されて、結果としてポリマーのような非ポリペプチド部分による誘導体化のために利用できなくなることが確実となる。ヘルパー分子からの溶出に続いて、非ポリペプチド部分とポリペプチドとの間の結合は、少なくとも部分的に保存された官能部位によって回復することができる。
【０２３４】
ブロックされた官能部位を有するポリペプチドの、ポリマー、親油性化合物、有機誘導化剤または他の任意の化合物とのその後の結合は、通常の方法で（例えば、上述の「・・・との結合」の項に記載するように）行われる。
【０２３５】
ポリペプチドの官能部位の結合からの遮蔽に使用するヘルパー分子の性質に関係なく、ヘルパー分子が、その分子の一部に選択された非ポリペプチド部分に対する結合基を全く含まないかほとんど含まないことが、該基との結合が、結合されたポリペプチドのヘルパー分子からの脱離を妨害する場合には望ましい。これによって、ポリペプチドの非遮断部分に存在する吸着基との選択的結合を実施することができ、そしてこのヘルパー分子を結合の繰り返しサイクルのために再使用することが可能となる。例えば、非ポリペプチド部分が、吸着基としてリジンのεアミノ基またはＮ−末端アミノ酸残基を有するＰＥＧのようなポリマー分子である場合、ヘルパー分子が実質的に結合可能なεアミノ基を含まないこと、好ましくはεアミノ基を全く含まないことが望まれる。したがって、場合によっては、ヘルパー分子は、ポリペプチドの官能部位と結合することができるタンパク質またはペプチドであり、このタンパク質またはペプチドは、あらゆる選択された非ポリペプチド部分に対して結合可能な吸着基を含まない。
【０２３６】
さらなる態様では、ヘルパー分子は、初めにカラムパッキング材料のような固相（例えば、Sephadexまたはアガロースビーズ、または表面（例えば、反応容器））に共有結合する。続いて、ポリペプチドは、ヘルパー分子を有するカラム材料にローディングされて、当該分野で公知の方法にしたがって（例えば、「・・・との結合」の項に記載するように）結合が行われる。この手順は、ポリペプチド複合体を溶出することによってヘルパー分子から分離することを可能にする。ポリペプチド複合体は、ポリペプチド複合体の実質的分解をもたらさない物理化学的条件下で、従来技術によって溶出する。ポリペプチド複合体を含む流体相は、ヘルパー分子が共有結合したままの固相から分離する。分離は、他の方法で実現することができる。例えば、ヘルパー分子は、特異的結合剤（例えば、ストレプトアビジン）によって認識することができる第二分子（例えば、ビオチン）で誘導体化する。特異的結合剤は、固相に連結することができ、それによって、第二ヘルパー−固相カラム（これは、後の溶出の際、ヘルパー分子−第二分子複合体を保持するが、ポリペプチド複合体は保持しない）上の通過を通して、ヘルパー分子−第二分子複合体からのポリペプチド結合の分離を可能にする。ポリペプチド複合体は、任意の適切な形式でヘルパー分子から放出する。脱保護は、ヘルパー分子が、結合するインターフェロン−αの官能部位から解離する条件を提供することによって、実施する。例えば、ポリマーが結合する抗体と抗イディオタイプ抗体との間の複合体は、ｐＨを酸性またはアルカリ性ｐＨへと調整することによって解離させることができる。
【０２３７】
標識インターフェロン−αポリペプチドの結合
他の態様では、インターフェロン−αポリペプチドは、標識を有する融合タンパク質（すなわち、例えば、ポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に付加された、通常、１〜３０（例えば、１〜２０または１〜１５または１〜１０または１〜５）のアミノ酸残基で構成されるアミノ酸配列またはペプチド）として発現される。標識は、迅速および簡易な精製を可能にするほかに、標識ポリペプチドと非ポリペプチド部分との間の結合を実現するのに便利な手段である。特に、タグは、マイクロタイタープレートや他のキャリア（例えば、標識ポリペプチドが、その標識を介して固定される常磁性ビーズ）中での結合を実現するために用いることができる。例えば、マイクロタイタープレートにおける標識ポリペプチドへの結合は、標識ポリペプチドが培養ブロスからマイクロタイタープレートに（原則として精製をせずに）直接的に固定させることができ、そして結合に供することができるという利点を有する。これによって、プロセス工程の総数（発現から結合まで）を減少させることができる。さらに、標識は、結合するべき固定されたポリペプチドに対する改善した接触性を保証するスペーサー分子として機能することができる。標識ポリペプチドを用いた結合は、本明細書に開示の非ポリペプチド部分のいずれか（例えば、ＰＥＧのようなポリマー分子）を対象とする。
【０２３８】
使用する特定の標識の同一性は、標識がポリペプチドとともに発現することができる限り、および適切な表面またはキャリア材料上に固定することができる限り、重要ではない。多くの適切な標識は、例えば、Unizyme Laboratories社（デンマーク）から市販されている。該標識に対する抗体は、例えば、ADI社、Aves Lab and Research Diagnostics社から市販される。
【０２３９】
本発明のポリヌクレオチド
本発明は、単離核酸または組み換え型の核酸（本明細書において、やはりポリヌクレオチドと呼ばれる）を提供する。これらは、「本発明の核酸（またはポリヌクレオチド）」と総称され、本発明のポリペプチドをコードする。本発明のポリヌクレオチドは、種々の用途に有用である。上記で議論するように、ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドを産生するに有用である。加えて、本発明のポリヌクレオチドは、以下でより詳細に記載するような遺伝子治療、ＤＮＡワクチン接種、および免疫治療に有用な発現ベクターに組み込まれていてよい。
【０２４０】
ある態様では、本発明は、それぞれが、配列番号１〜３１９から選択するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列、またはこれらに相補的な核酸配列を含む、単離ポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを提供する。
【０２４１】
また、本発明は、インターフェロンα活性を示し、１〜１６個のアミノ酸の位置（例えば、１〜１５個のアミノ酸の位置、１〜１４個のアミノ酸の位置、１〜１３個のアミノ酸の位置、１〜１２個のアミノ酸の位置、１〜１１個のアミノ酸の位置、１〜１０個のアミノ酸の位置、１〜９個のアミノ酸の位置、１〜８個のアミノ酸の位置、１〜７個のアミノ酸の位置、１〜６個のアミノ酸の位置、１〜５個のアミノ酸の位置、１〜４個のアミノ酸の位置、１〜３個のアミノ酸の位置、１〜２個の個のアミノ酸、または１個のアミノ酸の位置）において、配列番号１〜３１９のうち１つの配列と異なる配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列、またはこれらに相補的な核酸配列を含む、単離ポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドによってコードするポリヌクレオチドのいくつかは、ポリペプチドのＮ−端側に付加されたメチオニン等の、１つ以上のアミノ酸をさらに含んでいる。場合によっては、コードされたポリペプチドは、インターフェロンα活性を示す。
【０２４２】
また、本発明は、各々が、配列番号ｌ〜３１９のいずれか１つの配列と、少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離核酸または組み換え型の核酸を提供する。場合によっては、コードされたポリペプチドは、インターフェロンα活性を示す。
【０２４３】
他の態様
本発明のポリヌクレオチド（上述のものを含む）のうち任意のものは、分泌／局在化配列、ポリヌクレオチドの安定化または固定化（例えば、細胞表面表示のため）に有用な配列、ポリヌクレオチドの検出および／または精製に有用な配列（例えば、エピトープタグのようなポリペプチド精製配列、ポリヒスチジン配列等）、またはタンパク質の安定化もしくはインビボにおける半減期の増大のための配列（Ｉｇ融合配列またはアルブミン融合配列等）等の、少なくとも１つの付加的なアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする。
【０２４４】
他の態様では、本発明は、１つ以上の本発明の核酸を含む細胞を提供する。該細胞は、本発明の核酸によってコードする１つ以上のポリペプチドを発現することができる。
【０２４５】
また、本発明は、本発明の任意の核酸を含むベクターを提供する。該ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ファージ、ウィルス、またはウィルス断片が含まれる。該ベクターは発現ベクターを含み、所望する場合、その核酸は、本明細書および以下で議論するプロモーターを含むプロモーターに操作可能に連結する。さらに、他の態様では、本発明は、賦形剤および担体、ならびに少なくとも１つの本発明の核酸、またはベクター、細胞、または該核酸を含む宿主を含む組成物を提供する。該組成物は、医薬的組成物であってよく、そして賦形剤および担体は、医薬的に受容可能な賦形剤および担体であってよい。
【０２４６】
本発明はまた、本発明の２つ以上の核酸またはそれらの断片（例えば、組換えのための基質としての断片）を含む組成物を含んでいる。組成物は、組換え核酸のライブラリーを含んでいてよく、そのライブラリーは、上記の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、または少なくとも１００以上の核酸を含む。この核酸は、必要に応じて発現ベクター中にクローン化され、発現ライブラリーを提供する。
【０２４７】
本発明の核酸およびその断片、ならびに該ポリヌクレオチドを含むベクターは、適切な担体（例えば、医薬用担体）と組み合わされて、治療的用途または予防的用途に用いることができる。該組成物は、治療上有効な量および／または予防上有効な量の化合物、ならびに医薬として許容され得る担体または賦形剤を含んでいる。該キャリアまたは賦形剤には、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。製剤は、その投与方法に好適である。核酸、ポリペプチドおよびタンパク質の投与方法は周知であり、以下でさらに議論する。
【０２４８】
本発明はまた、本発明の１つ以上の任意の核酸を、（例えば、上述の特定の組換え形式で実施するように）制限エンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅまたはＤＮａｓｅで消化することにより産生する組成物、および本発明の１つ以上の核酸を、機械的方法（例えば、超音波処理、ボルテックスなど）で断片化またはせん断することにより産生する組成物を含む。また、機械的方法は、本明細書に記載の方法における組換えのための基質の準備にも用いることができる。また、本発明は、本発明の核酸の任意のもののうち少なくとも１つを切断することにより産生する組成物を提供する。この切断は、機械的切断、化学的切断、または酵素的切断を含んでいてよく、この酵素的切断は、制限エンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ、またはＤＮａｓｅでの切断を含んでいてよい。
【０２４９】
本発明にさらに含まれるのは、本発明の１つ以上の断片化された核酸を、リボヌクレオチド三リン酸またはデオキシリボヌクレオチド三リン酸および核酸ポリメラーゼの存在下でインキュベートすることを含むプロセスにより産生する組成物である。得られる組成物は、上述の組換えフォーマットの多くについて組換え混合物を形成する。核酸ポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、またはＲＮＡ指向型ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、「逆転写酵素」）であってよく、このポリメラーゼは、例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＶＥＮＴ、ＴＡＱ等）であってよい。
【０２５０】
同様に、本発明の１つ以上の核酸に対応するオリゴヌクレオチドのセットを含む組成物は、組換え基質として有用であり、本発明の特徴である。便宜上、これらの断片化された混合物、せん断された混合物、またはオリゴヌクレオチド合成混合物を、断片化された核酸のセットという。
【０２５１】
また、本発明は、インターフェロンα活性（本発明の少なくとも１つの核酸への変異の導入、または本発明の少なくとも１つの核酸の組換えにより産生する）を示すポリペプチドをコードする、単離核酸または組換え核酸を提供する。
【０２５２】
ポリヌクレオチドの作製
本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、および核酸断片は、公知の合成方法にしたがって、標準的固相法を用いて調製することができる。通常、約１００塩基までの断片は、個々に合成され、その後、（例えば、酵素的連結法または化学的連結法によって、またはポリメラーゼ媒介性組換え法によって）連結し、任意の所望の連続配列を基本的に形成する。（例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、例えば、古典的ホスホロアミダイト法（例えば、Beaucageら (1981) Tetrahedron Letters 22: 1859-69に記載の方法）、または、例えば、Matthesら(1984)、EMBO J 3: 801-05に記載の方法を用いて）化学合成により調製することができる（通常、自動合成法で実施する）。ホスホロアミダイト法にしたがい、オリゴヌクレオチドが合成する（例えば、自動ＤＮＡ合成機で合成され、精製され、アニールされ、連結され、適切なベクター中に連結する）。
【０２５３】
さらに、基本的に任意のポリヌクレオチドは、Operon Technologies Inc.（米国アラバマ州ハンツビル）およびその他多数のうち、種々の任意の供給元に特別注文することができる。同様に、ペプチドおよび抗体は、AnaSpec Inc.（米国カリフォルニア州サンホセ）、Washington Biotechnology, Inc.（米国メリーランド州バルチモア）等の種々の任意の供給元に特別注文することができる。
【０２５４】
本発明の特定のポリヌクレオチドはまた、インターフェロン−αポリペプチドおよびそれらのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドプローブ、またはインターフェロン−αポリペプチドおよびそれらのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ｃＤＮＡライブラリー（例えば、代表的な反復配列組換え法におけるような、相同核酸の組換えにより産生するライブラリー）をスクリーニングすることによって得ることができる。ｃＤＮＡクローンのスクリーニングおよび単離の手順は、当業者に十分に公知である。該技術は、例えば、Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymol.152巻, Acad. Press, Inc., San Diego, CA（「Berger」）、Sambrook（前出）、およびCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel（前出）に記載している。本発明のいくつかのポリヌクレオチドは、天然に存在する配列の変更（例えば、突然変異誘発、反復配列組換え（例えば、シャッフリング））、またはオリゴヌクレオチド組換えにより得ることができる。他の場合では、該ポリヌクレオチドは、コンピュータ内でまたは本明細書に引用する参考文献に記載するようなオリゴヌクレオチド組換え法により作製することができる。
【０２５５】
本明細書に詳述するように、本発明のポリヌクレオチドとして、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列、および少なくともストリンジェントな条件下で本明細書に定義する配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドが含まれる。コード配列とは、特定のポリペプチドまたは上記ポリペプチドのドメイン、領域、または断片をコードするポリヌクレオチド配列をいう。コード配列は、上に記載のようにインターフェロン活性を示す本発明のポリペプチドをコードすることができる。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡの形態であってよく、本発明のポリヌクレオチドとして、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、合成ＲＮＡおよび合成ＤＮＡ、ならびにｃＤＮＡが含まれる。そのポリペプチドは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。そして一本鎖の場合、そのポリヌクレオチドは、コード鎖であってよいか、または非コード鎖（アンチセンス鎖、相補鎖）であってよい。本発明のポリヌクレオチドは、（ｉ）単離物としての本発明のポリペプチドのコード配列、（ｉｉ）例えば、融合タンパク質、プレタンパク質、プレプロタンパク質などをコードするように、１つ以上の追加のコード配列と組み合わせた本発明のポリペプチドのコード配列、（ｉｉｉ）非コーディング配列（例えば、イントロン、制御エレメント（例えば、プロモーター（例えば、天然に存在するプロモーターまたは組換えプロモーターまたはシャッフルプロモーター）、ターミネーターエレメント、または適切な宿主細胞中でのコード配列の発現に有効な５’および３’非翻訳領域）と組み合わせた本発明のポリペプチドのコード配列、ならびに／あるいは（ｉｖ）コード配列が異種遺伝子である、ベクター、細胞、宿主環境における本発明のポリペプチドのコード配列を含む。
【０２５６】
また、本発明のポリヌクレオチドは、通常の核酸の組成処方物（当業者に知られているように、キャリア、緩衝液、アジュバント、賦形剤などを含む処方物を含む）との組み合わせで見出すことができる。ポリヌクレオチド断片は、通常少なくとも約２００ヌクレオチド塩基（例えば、少なくとも約２５０塩基、少なくとも約３００塩基、少なくとも約３５０塩基、少なくとも約４００塩基、少なくとも約４５０塩基、少なくとも約４６０塩基、少なくとも約４７０塩基、あるいはそれ以上の塩基）を含む。本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド断片は、高ストリンジェントな条件下で本明細書に記載のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができ、かつ／または本明細書に記載の本発明のポリペプチドの特性の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードすることができる。
【０２５７】
改変コード配列
当業者に理解することができるように、コード配列を改変し、特定の宿主中での発現を増大することは有利である。遺伝暗号は、６４個の可能性のあるコドンに関して重複しているが、ほとんどの生物は、優先的にこれらのコドンのサブセットを用いる。ある種において最も頻繁に使用するコドンは、最適コドンと考えられ、それほど頻繁に使用されないコドンは、まれに使用するコドンまたは低使用のコドン（例えば、Zhang, S. P.ら(1991), Gene 105: 61-72を参照されたい）と分類される。宿主の好ましいコドン使用を反映するように、コドンは置換することができる。これは、「コドンの最適化」または「種コドンの偏りについての制御」と呼ばれることのあるプロセスである。
【０２５８】
例えば、翻訳速度の増加、または所望の特性（例えば、非最適化配列から産生された転写物と比較して、より長い半減期）を有する組換えＲＮＡ転写物を産生するために、特定の原核生物宿主または真核生物宿主によって好まれるコドンを含む改変コード配列（例えば、Murray, E.ら(1989)、 Nuc Acids Res 17: 477-508を参照されたい）を調製することができる。また、翻訳終止コドンは、宿主の優先度を反映するように改変することができる。例えば、出芽酵母にとって好ましい終止コドンおよび哺乳動物にとって好ましい終止コドンは、それぞれ、ＵＡＡおよびＵＧＡである。単子葉植物にとって好ましい終止コドンはＵＧＡであり、一方、昆虫および大腸菌は、終止コドンとしてＵＡＡを使うことを好む（Dalphin, M. E.ら(1996) Nucl. Acids Res.24: 216-218)。
【０２５９】
本発明のポリヌクレオチド配列は、本発明のコード配列を種々の理由で変更するために、操作することができる。変更としては、その遺伝子産物のクローニング、プロセシングおよび／または発現を改変する変更が含まれるが、これらに限定されない。例えば、変更は当該分野で周知の技術（例えば、新たな制限酵素部位を挿入するための部位特異的突然変異誘発、グリコシル化型を変更するための部位特異的突然変異誘発、結合基（例えば、ＰＥＧ化または他の結合のための結合基）を導入または除去するための部位特異的突然変異誘発、コドンの優先度を変化させるための部位特異的突然変異誘発、スプライス部位を導入するための部位特異的突然変異誘発等）の技術を用いて導入することができる。
【０２６０】
サイレントな変更
遺伝コードの縮重のために、非常に多くの機能的に同一の核酸は、任意の既定ペプチドをコードする。例えば、以下のコドン表（表３）は、コドンＡＧＡ，ＡＧＧ，ＣＧＡ，ＣＧＣ，ＣＧＧおよびＣＧＵの全てが、アミノ酸アルギニンをコードすることを示す。したがって、アルギニンがコドンにより特定される核酸配列中の各々の部位において、そのコドンは、コードするポリペプチドを変更することなしに、上で記述された対応するコドンの任意のものに変更することができる。該核酸の変更は、「サイレントな変更」である。ＲＮＡ配列におけるＵが、ＤＮＡ配列のＴに対応することは理解されたい。
【０２６１】
【表３】
2008545393.tif 000004
【０２６２】
したがって、遺伝コードの縮重により、本発明のポリペプチドをコードする多数の核酸配列は産生することができ、これらのうちのいくつかは、本明細書に明確に開示する核酸配列に対して最小限の配列同一性を有していてよいことは、当業者には当然のことである。核酸における各々のコドン（ＡＵＧおよびＵＧＣを除き、通常はそれぞれメチオニンおよびトリプトファンに対する唯一のコドンである）は、機能的に同じポリペプチドをコードするので、標準的技術により改変することができるということを当業者ならば理解するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントバリエーションは、記載した任意の配列において黙示的である。本発明はまた、可能性のあるコドン選択に基づいて組み合わせを選択することにより行うことができる、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の、各々および全ての可能性のあるバリエーションを提供する。本発明のポリペプチドをコードする核酸配列に適用する場合、これらの組み合わせは、標準的トリプレット（コドン）遺伝子コード（例えば、表３に記載しているような）にしたがって作られる。本明細書のあらゆる核酸の、該すべてのバリエーションは、遺伝子コードと組み合わせた配列を考慮して、詳細に提供され、そして記述する。技術の１つは、本明細書に列挙した配列の、任意の静的変換を十分に引き起こすことができる。
【０２６３】
ポリヌクレオチドの用途
本発明のポリヌクレオチドには、種々の用途がある。これらの用途は、例えば、本発明のポリペプチドの組換え産生（すなわち、発現）（通常、ポリペプチドまたはその断片をコードする配列を含むプラスミド発現ベクターの発現による）、治療剤として、予防剤として、診断ツールとして、免疫原として、アジュバントとして、相補的核酸または部分的相補的核酸の存在についての診断プローブ（野生型インターフェロンα核酸の検出を含む）、さらなる反応（例えば、新規バリエーションおよび／または改善バリエーションを産生するための反復配列組換え反応または変異反応）の基質等である。
【０２６４】
ベクター、プロモーターおよび発現系
また、本発明は、上で広く記述したような、１つ以上の核酸配列を含む組換え構造物を含む。その構造物は、本発明の核酸配列が順方向または逆方向に挿入するベクター（例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウィルス、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）等を含む。場合によっては、構造物はさらに調節配列（例えば、核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含む）を含んでいる。多くの適切なベクターおよびプロモーターは、当業者に公知であり、市販されている。
【０２６５】
本明細書において有用な分子生物学的技術（ベクターの使用、プロモーターの使用および他の多くの関連するトピックの使用を含め）を記述する一般的な教科書としては、Berger（前出）、Sambrook(1989)（前出）、およびAbsubel（前出）が含まれる。例えば、本発明の同一性核酸の産生については、インビトロ増幅方法（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ−レプリカーゼ増幅および他のＲＮＡポリメラーゼを介した手法（ＮＡＳＢＡ等）を含む）によって熟練者を指導していくのに十分な技術例は、Berger, SambrookおよびAusubel（すべて前出）、ならびにMullisら（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号、PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications（Innnisら編）Academic Press Inc. San Diego, CA(1990)（「Innnis」）; Arnheim & Levinson(1990年10月1日） C&EN 36-47、The Journal Of NIH Research (1991) 3: 81-94、Kwohら (1989) Proc Natl  Acad Sci USA 86: 1173-1177、Guatelliら (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87: 1874-1878、Lomeliら (1989) J Clin Chem 35: 1826-1831、Landernら (1988) Science 241: 1077-1080、Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291-294、WuおよびWallace (1989) Gene 4: 560-569、Berringerら (1990) Gene 89: 117-122、およびSooknananおよびMalek (1995) Biotechnology 13: 563-564)が含まれる。増幅された核酸をインビトロでクローニングする改良方法は、Wallaceら、米国特許第５，４２６，０３９号に記載する。大きな核酸をＰＣＲによって増幅する改良方法は、Chengら(1994) Nature 369: 684-685およびその中の参考文献に要約する。その改良方法では、４０キロ塩基（kb）までのＰＣＮアンプリコンを産生する。当業者ならば、基本的にいかなるＲＮＡも、逆転写酵素およびポリメラーゼを用いて、制限消化、ＰＣＲ増幅、および配列決定に適した二本鎖ＤＮＡへと変えることができることを十分理解するであろう。Ausubel, SambrookおよびBerger（全て前出）を参照されたい。
【０２６６】
また、本発明は、本発明のベクターを用いて形質導入された宿主細胞を提供し、組換え技術によって本発明のポリペプチドの産生を提供する。宿主細胞は、本発明のベクターを用いて、（例えば、形質導入するか、形質転換され、またはトランスフェクトされ）遺伝的に操作する。そのベクターは、例えば、クローニングベクターであってよいか、または発現ベクターであってよい。そのベクターは、例えば、プラスミド、ウィルス粒子、ファージなどの形態であってよい。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化するか、形質転換体を選択するか、または遺伝子を増幅するのに適切であるように改変された、従来の栄養培地で培養することができる。その培養条件（温度、ｐＨなど）は、発現用に選択された宿主細胞に対して、従来用いられている条件であり、そしてその培養条件は、当業者には明らかであり、および本明細書に引用した参考文献（例えば、Freshney（ 1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique,第3版,Wiley-Liss, New Yorkおよびその参考文献を含む）で明白である。
【０２６７】
また、本発明のポリペプチドを、非動物細胞（例えば、植物、酵母、真菌、細菌など）中で産生させることができる。Sambrook, BergerおよびAusubel以外に、細胞培養に関する詳細は、例えば、Payneら(1992) Plant Cell Tissue Culture in Liquid Systems John Wilney & Sons, Inc. New York, NY、GamborgおよびPhillips編(1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture、Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag （Berlin Heidelberg NY）、Atlas & Parks（編） The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FLに記載する。
【０２６８】
本発明のポリヌクレオチドおよびその断片は、ポリペプチド発現用の種々の発現用発現ベクターのいずれか１つに包含できる。該ベクターには、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列（例えば、ＳＶ４０、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウィルス、酵母プラスミド、プラスミドＤＮＡおよびファージＤＮＡの複合体由来のベクター、ウィルスＤＮＡ（例えば、ワクチニアウィルス、アデノウィルス、家禽ジフテリアウィルス、仮性狂犬病ウィルス、アデノ随伴ウィルス、レトロウィルス）およびその他多くのものの誘導体）が含まれる。遺伝的物質を細胞中に形質導入する任意のベクター、および、複製が必要な場合には、適切な宿主中で複製可能でかつ生存可能なベクターを用いることができる。
【０２６９】
発現ベクター中の核酸配列は、適切な転写制御配列（プロモーター）に作動可能に連結し、ｍＲＮＡ合成を指令する。該プロモーターの例として、ＬＴＲプロモーターまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌のｌａｃプロモーターまたはｔｒｐプロモーター、ファージλＰＬプロモーター、ＣＭＶプロモーター、および原核生物細胞または真核生物細胞またはそのウィルス中で遺伝子の発現を制御することが公知の他のプロモーターが含まれる。その発現ベクターは、また、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写ターミネーターを含む。そのベクターは、必要に応じて、発現を増幅するのに適切な配列（例えば、エンハンサー）を含む。さらに、その発現ベクターは、必要に応じて、１つ以上の選択可能マーカー遺伝子を含み、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型上の特性（例えば、真核生物細胞培養物に対するジヒドロ葉酸還元酵素耐性またはネオマイシン耐性、または大腸菌におけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）を提供する。
【０２７０】
本発明のポリペプチドをコードする適切なＤＮＡ配列、および適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターは、適切な宿主を形質転換し、その宿主にそのポリペプチドを発現させるために用いることができる。適切な発現宿主の例としては、細菌細胞（例えば、大腸菌、ストレプトミセスおよびサルモネラ菌）、真菌細胞（例えば、出芽酵母、ピチアパストリス、およびアカパンカビ）、昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエおよびシロイチモンジヨトウ）、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３またはBowesメラノーマ細胞）、植物細胞等が含まれる。全ての細胞または細胞株が、本発明の機能的なポリペプチドおよびその断片を必ずしも十分に産生できるわけではないということが理解され、例えば、ポリペプチドの抗原性断片は、細菌発現系または他の発現系において産生することができる。本発明は、使用する宿主細胞に限定されない。
【０２７１】
細菌系において、そのポリペプチドおよびその断片の目的とする用途に応じて、多くの発現ベクターを選択することができる。例えば、抗体の誘導に大量のポリペプチドまたはその断片が必要となる場合、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現のためのベクターが望ましい。該ベクターとしては、配列をコードするヌクレオチドが、ベクター中にインフレームでアミノ末端メチオニンおよびそれに続くβ−ガラクトシダーゼの７残基の配列と連結することができ、その結果、ハイブリッドタンパク質を産生する多機能大腸菌クローニングおよび発現ベクター（例えば、BLUESCRIPT（Stratagene））、ｐＩＮベクター（Van Heeke & Schuster (1989) J Biol Chem 264: 5503~5509)、ｐＥＴベクター（Novagen社、米国ウィスコンシン州マジソン）等が含まれるが、これらに限定されない。
【０２７２】
同様に、出芽酵母において、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えば、α−因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨ）を含む多くのベクターが本発明のポリペプチドの産生のために用いることができる。総説として、Ausubel（前出）, Berger（前出）,およびGrantら (1987) Methods in Enzymology 153: 516-544を参照されたい。
【０２７３】
哺乳動物宿主細胞においては、多数の発現系（例えば、ウィルスを用いた系）を用いることができる。アデノウィルスが発現ベクターとして用いられる場合、必要に応じてコード配列を、後期プロモーターおよび３つの部分に分かれたリーダー配列からなるアデノウィルス転写／翻訳複合体中に連結することができる。ウィルスゲノムを、非必須なＥ１およびＥ３領域中に挿入することにより、感染宿主細胞中で本発明のポリペプチドを発現可能な、生存可能なウィルスを生じる（LoganおよびShenk (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81: 3655-3659)。さらに、転写エンハンサー（例えば、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）エンハンサー）が、哺乳動物宿主細胞での発現を増大するために用いられる。宿主細胞、培地、発現系、および産生方法は、種々の哺乳動物インターフェロンα（例えば、ヒトインターフェロンα）のクローニングおよび発現について公知のものを含んでいる。
【０２７４】
他の発現要素
特定の開始シグナルは、本発明のポリヌクレオチドコード配列および／またはその断片の効率的な翻訳を補助することができる。これらのシグナルは、例えば、ＡＴＧ開始コドンおよびその隣接配列を含んでいてよい。コード配列、コード配列の開始コドンおよび上流の配列が適切な発現ベクター中に挿入された場合、他の翻訳制御シグナルは、不要である。しかし、コード配列（例えば、成熟タンパク質コード配列）またはその一部分のみが、挿入された場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外来性核酸転写制御シグナルが提供されねばならない。さらに、開始コドンは、挿入部分全体の転写を保証するために、正確なリーディングフレーム中に存在しなければならない。外来性転写エレメントおよび開始コドンは、種々の起源を有していてよく、天然物および合成物のいずれであってもよい。発現効率は、使用中の細胞系に適したエンハンサーの含有により増大させることができる（例えば、Scharf D. ら (1994) Results Probl Cell Differ 20: 125-62、およびBittnerら(1987) Methods in Enzymol 153: 516-544を参照されたい）。
【０２７５】
分泌／局在化配列
また、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、例えば、分泌／局在化配列をコードする核酸にインフレームで融合させることができ、ポリペプチドの発現を所望の細胞内コンパートメント、膜またはオルガネラに標的化させ、またはポリペプチドを細胞膜周辺腔もしくは細胞培養培地中に分泌させることができる。該配列は当業者に公知であり、該配列として、分泌リーダーまたはシグナルペプチド、オルガネラ標的化配列（例えば、核局在化配列、ＥＲ保持シグナル、ミトコンドリア輸送配列、葉緑体輸送シグナル）、膜局在化／アンカー配列（例えば、終止トランスファー配列、ＧＰＩアンカー配列）等が含まれる。
【０２７６】
発現宿主
別の態様では、本発明は、上記の、本発明の核酸、ベクター、または他の構造物のいずれかを含有する宿主細胞に関する。該宿主細胞は、真核細胞、例えば哺乳類細胞、酵母細胞、または植物細胞であってよく、あるいは該宿主細胞は、原核細胞、例えば細菌細胞であってよい。該構造物の宿主細胞内への導入は、インビボ、エクソビボまたはインビトロ法に関して、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、遺伝子銃またはワクチン銃、インジェクション、または他の一般的な技術（例えばDavis, L., Dibner, M., およびBattey, I. (1986) Basic Methods in Molecular Biologyを参照されたい）によって達成することができる。
【０２７７】
宿主細胞株は、場合により、挿入配列の発現を調節するか、あるいは発現済みタンパク質を所望の方法で処理するその能力に関して選択される。タンパク質の該修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が含まれるが、それらに限定されない。「プレ」または「プレプロ」形式のタンパク質を切断する翻訳後の処理は、正しい挿入、フォールディングおよび／または機能に関して重要であることもある。種々の宿主細胞、例えば大腸菌（E. coli）、バシラス属の種（Bacillus sp.）、酵母または哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＷＩ３８、等は、特定な細胞メカニズムおよび該翻訳後活性に特徴的なメカニズムを有し、導入された外来タンパク質が的確な修飾および処理が確実に行なわれるように選択してよい。
【０２７８】
組換えタンパク質の長期の高収量生産のために安定発現を使用することができる。例えば、ウイルスの複製起点または内因性発現要素および選択マーカー遺伝子を含有する発現ベクターを使用して、本発明のポリペプチドを安定に発現する細胞株を形質導入する。ベクターの導入後、強化培地中で１〜２日間、細胞を成長させてよく、その後、それらを選択培地に切り換える。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、その存在によって、導入配列を首尾良く発現する細胞の成長および回収が可能になる。例えば、安定に形質転換された細胞の耐性凝集塊は、該細胞タイプに適切な組織培養技術を使用して増殖させることができる。
【０２７９】
本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、場合により、細胞培養由来のコード対象のタンパク質の発現および回収に好適な条件下で培養される。.組換え細胞によって生産されるポリペプチドは、使用される配列および／またはベクターに応じて、分泌型、膜結合型であってよく、あるいは細胞内に含有されていてよい。当業者に理解されるように、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターは、原核細胞膜または真核細胞膜を通過する成熟ポリペプチドの分泌を導くシグナル配列を念頭に入れて設計することができる。
【０２８０】
追加の配列
本発明のポリヌクレオチドは、場合により、例えばコード対象のポリペプチドの精製および／または検出を容易にするマーカー配列とインフレームで融合されたコード配列を含む。該精製サブシークエンスには、非限定的であるが、金属キレートペプチド、例えば固定された金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール、グルタチオンを結合する配列（例えばＧＳＴ）、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ（インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに相当する；Wilson, I.ら (1984) Cell 37:767)、マルトース結合タンパク質配列、ＦＬＡＧＳ伸長／親和性精製系で利用されるＦＬＡＧエピトープ、等が含まれる。精製ドメインとポリペプチド配列の間に、プロテアーゼによって切断可能なポリペプチドリンカー配列を含ませることは、精製を容易にするために有用である。
【０２８１】
例えば、本明細書に記載の組成物および方法において使用することが可能な発現ベクターの１つは、エンテロキナーゼ切断部位によって分離されているポリヒスチジン領域に融合された本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質の発現を提供する。該ヒスチジン残基は、ＩＭＩＡＣ（固定金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（Porathら (1992) Protein Expression and Purification 3:263-281に記載されている）上での精製を容易にする。一方、該エンテロキナーゼ切断部位は、ポリヒスチジン領域から所望のポリペプチドを分離するための方法を提供する。場合により、ｐＧＥＸベクター（Promega; Madison, WI）を使用して、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させる。一般に、該融合タンパク質は可溶性であり、リガンド−アガロースビーズ（例えばＧＳＴ融合物の場合、グルタチオン−アガロース）に吸着させた後、遊離リガンドの存在下で溶出させることによって、溶解細胞から容易に精製することができる。
【０２８２】
本明細書中に記載の組成物および方法をさらに構築することにより、本発明のポリペプチド（または１以上のその断片）を含むタンパク質、およびそれらをコードする核酸が提供される。それは、例えば、本明細書に記載のように、Ｉｇ分子、例えばヒトＩｇＧ Ｆｃ（「結晶化可能断片」または補体結合性）ヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン（およびそれらをコードするヌクレオチド配列）に融合されている。Ｆｃは、細胞上の抗体受容体および補体のＣ１ｑ成分への結合を担う抗体の部分である。これらの融合タンパク質またはその断片およびそれらをコードする核酸は、場合により、予防および／または治療薬として、あるいは診断ツールとして有用である（さらに、例えばChallita-Eid, P.ら (1998) J Immunol 160:3419-3426; Sturmhoefel, K.ら (1999) Cancer Res 59:4964-4972を参照されたい）。
【０２８３】
ポリペプチド生産および回収
好適な宿主株に形質導入し、該宿主株を適切な細胞密度に成長させた後、適切な手段（例えば温度変化または化学的誘導）によって選択プロモーターを誘導し、追加の期間、細胞を培養する。典型的には、遠心分離によって細胞を収集し、物理的または化学的手段によって破壊し、得られた粗製の抽出物を追加の精製のために保持する。タンパク質の発現に使用された真核細胞または微生物細胞は、任意の好都合な方法によって破壊することができる。該方法には、凍結解凍サイクル処理、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用、または当業者に周知の他の方法が含まれる。
【０２８４】
周知のように、多数の細胞の培養および生産に関して多数の参考文献が入手可能である。該細胞には、細菌、植物、動物（特に哺乳類）および古細菌起源の細胞が含まれる。例えばSambrook, Ausubel, およびBerger (すべて上記)、ならびにFreshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New Yorkおよび該文献で引用されている参考文献; DoyleおよびGriffiths (1997) Mammalian Cell Culture: Essential Techniques John Wiley and Sons, NY; Humason (1979) Animal Tissue Techniques, fourth edition W.H. Freeman and Company; およびRicciardelliら (1989) In vitro Cell Dev Biol 25:1016-1024を参照されたい。植物細胞培養および再生に関しては、例えばPayneら (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; GamborgおよびPhillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) およびPlant Molecular Biology (1993) R.R.D. Croy (ed.) Bios Scientific Publishers, Oxford, U.K. ISBN 0 12 198370 6を参照されたい。概して、細胞培養培地は、AtlasおよびParks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FLに記載されている。細胞培養に関する追加の情報は、市販の文献、例えばSigma-Aldrich, Inc（St Louis, MO）のLife Science Research Cell Culture Catalogue（「Sigma-LSRCCC」）および例えば、同様にSigma-Aldrich, Inc（St Louis, MO）のPlant Culture Catalogueおよび補遺 （「Sigma-PCCS」）から入手できる。
【０２８５】
本発明のポリペプチドは、当技術分野において周知の多数の方法のいずれかによって、組換え細胞培養から回収および精製することができる。該方法には、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、本明細書に記載のタギング系のいずれかを使用する）、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが含まれる。成熟タンパク質またはその断片の立体配置を完成させる際に、所望であれば、タンパク質リフォールディング工程を使用することができる。最終的に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して最終精製工程を行うことができる。上記参考文献に加えて、種々の精製方法が当技術分野において周知であり、それには、例えば、Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollagら (1996) Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ; HarrisおよびAngal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; HarrisおよびAngal Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY; JansonおよびRyden (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY; およびWalker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJに記載の方法が含まれる。
【０２８６】
インビトロ発現系
本発明のポリヌクレオチドを使用して本発明のポリペプチドを生産するために、無細胞の転写／翻訳系を用いることもできる。いくつかの該系が市販されている。一般的なインビトロ転写および翻訳プロトコールの手引はTymms (1995) In vitro Transcription and Translation Protocols: Methods in Molecular Biology Volume 37, Garland Publishing, NYから入手できる。
【０２８７】
インビボ使用および適用
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドの相補体（例えばアンチセンスまたはリボザイム分子が含まれる）を、場合により、細胞に投与して、治療的に有用なプロセスを達成するか、あるいは治療的に有用な産物を発現させる。遺伝子治療を含めたこれらのインビボ適用には、細胞における遺伝子発現を改変する多数の技術が含まれる。該方法には、例えば、本発明のポリペプチドのような、例えば治療的および／または予防的に有用なポリペプチドを発現させるための遺伝子の導入が含まれる。
【０２８８】
インビボポリペプチド発現
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当業者に周知の技術を使用するインビボでの治療的適用に特に有用である。例えば、少なくとも１種の本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）および／または、例えば少なくとも１種の抗原、サイトカイン、他の共刺激分子、アジュバント、等をコードする他のポリヌクレオチド配列、等を含むように培養細胞をエクソビボで遺伝子操作し、そして該遺伝子操作済み細胞を患者に戻す。本発明のポリペプチドおよび／または抗原ペプチドを含めた１種以上のポリペプチドをインビボで発現するように、細胞をインビボで遺伝子操作してもよい。
【０２８９】
生体インビボ形質導入および発現に好適な多数のウイルスベクターが知られている。該ベクターには、レトロウイルスベクター（例えばMiller, Curr Top Microbiol Immunol (1992) 158:1-24; SalmonsおよびGunzburg (1993) Human Gene Therapy 4:129-141; Millerら (1994) Methods in Enzymology 217:581-599を参照されたい）およびアデノ随伴ベクター（Carter (1992) Curr Opinion Biotech 3:533-539; Muzcyzka (1992) Curr Top Microbiol Immunol. 158:97-129でレビューされている）が含まれる。使用される他のウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびシンドビスウイルスベクターが含まれ、概して、例えばJolly (1994) Cancer Gene Therapy 1:51-64; Latchman (1994) Molec Biotechnol 2:179-195; およびJohanningら (1995) Nucl Acids Res 23:1495-1501に記載されている。
【０２９０】
一態様では、ポックスウイルスベクターを使用することができる。ｅＩＬ−２ポリペプチドのような本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列でポックスウイルスベクターをトランスフェクトすると、免疫応答の増強、例えば増加または改善されたＴ細胞増殖が所望である場合の予防的、治療的および診断的適用に有用である。例えば、Berencsiら、J Infect Dis (2001)183(8):1171-9; Rosenwirthら、Vaccine 2001 Feb 8;19(13-14):1661-70; Kittlesenら、J Immunol (2000) 164(8):4204-11; Brownら、Gene Ther 2000 7(19):1680-9; Kanesa-thasanら、Vaccine (2000) 19(4-5):483-91; Sten (2000) Drug 60(2):249-71で考察されているウイルスベクターを参照されたい。該ベクターおよび許容され得る賦形剤を含む組成物もまた、本発明の特徴である。
【０２９１】
遺伝子治療および遺伝子ワクチンによって、慢性感染症（例えばＨＩＶ感染、ウイルス性肝炎）、ならびに非感染症、例えば癌およびいくつかの形式の先天性欠損、例えば酵素欠損と闘うための方法が提供され、該方法を、本発明のポリヌクレオチド、例えばベクターおよび、該ポリヌクレオチドを含む細胞とともに使用することができる。インビボ、エクソビボおよびインビトロで細胞内に核酸およびベクターを導入するためのいくつかのアプローチが使用されており、本発明のポリヌクレオチド、および該ポリヌクレオチドを含むベクターとともに使用することができる。これらのアプローチには、リポソームベースの遺伝子送達（DebsおよびZhu (1993) 国際公開公報第93/24640号および米国特許第5,641,662号; ManninoおよびGould-Fogerite (1988) BioTechniques 6(7):682-691; Rose, 米国特許第5,279,833号; Brigham (1991) 国際公開公報第91/06309号; およびFelgnerら (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84:7413-7414; Brighamら (1989) Am J Med Sci 298:278-281; Nabelら (1990) Science 249:1285-1288; Hazinskiら (1991) Am J Resp Cell Molec Biol 4:206-209; およびWangおよびHuang (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84:7851-7855)；アデノウイルスベクター媒介性遺伝子送達（例えば癌治療用）（例えばChenら (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:3054-3057; Tongら (1996) Gynecol Oncol 61:175-179; Claymanら (1995) Cancer Res. 5:1-6; O'Malleyら (1995) Cancer Res 55:1080-1085; Hwangら (1995) Am J Respir Cell Mol Biol 13:7-16; Haddadaら (1995) Curr Top Microbiol Immunol. 1995 (Pt. 3):297-306; Addisonら (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92:8522-8526; Colakら (1995) Brain Res 691:76-82; Crystal (1995) Science 270:404-410; Elshamiら (1996) Human Gene Ther 7:141-148; Vincentら (1996) J Neurosurg 85:648-654を参照されたい）、および多数の他の方法が含まれる。特に単純なＭｕＬＶベクターに関して、治療用ポリヌクレオチド配列をレトロウイルスゲノムの部分として保持する複製欠損レトロウイルスベクターがさらに使用されている。例えばMillerら (1990) Mol Cell Biol 10:4239 (1990); Kolberg (1992) J NIH Res 4:43, およびCornettaら (1991) Hum Gene Ther 2:215を参照されたい。リガンド特異的な、カチオンベースの輸送系と共役した核酸輸送（WuおよびWu (1988) J Biol Chem, 263:14621-14624)がさらに使用されている。裸のＤＮＡの発現ベクターも報告されている（Nabelら (1990), 上記); Wolffら (1990) Science, 247:1465-1468)。概して、これらのアプローチは、本発明のポリペプチドをコードする核酸を適切なベクター中に組込むことによって本発明に適合させることができる。
【０２９２】
本発明の核酸を患者に導入することによって本発明に適合させることができる遺伝子治療プロトコールを記載する一般的なテキストには、例えばRobbins (1996) Gene Therapy Protocols, Humana Press, NJ, およびJoyner (1993) Gene Targeting: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, Englandが含まれる。
【０２９３】
アンチセンステクノロジー
遺伝子置換核酸としての本発明の核酸の発現に加えて、該核酸は、例えば、細胞における核酸の発現がもはや所望でなくなったら、あるいはそれが所望でない時に本発明の核酸の発現を下方制御するための、発現のセンスおよびアンチセンス抑制に有用でもある。同様に、本発明の核酸、またはそのサブシークエンスもしくはアンチセンス配列を使用して、天然に存在する相同核酸の発現をブロックすることもできる。種々のセンスおよびアンチセンステクノロジーが当技術分野において知られていて、例えばLichtensteinおよびNellen (1997) Antisense Technology: A Practical Approach IRL Press at Oxford University, Oxford, England, およびAgrawal (1996) Antisense Therapeutics Humana Press, NJ, および該文献で引用されている参考文献に記載されている
【０２９４】
プローブとしての使用
さらに、典型的に少なくとも１２塩基、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも２０、少なくとも３０、または少なくとも５０以上の塩基を有する、本明細書中でオリゴヌクレオチドとしても称されるポリヌクレオチドであって、高度にストリンジェントな条件下で本発明のポリヌクレオチドまたはその断片にハイブリダイズするポリヌクレオチドの使用が意図される。該ポリヌクレオチドは、上記方法にしたがって、プローブ、プライマー、センスおよびアンチセンス物質、等として使用してよい。
【０２９５】
治療的使用
種々のインターフェロン−アルファポリペプチドおよびインターフェロン−アルファ複合体が、種々の症状、例えば慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、有毛細胞白血病、悪性黒色腫、濾胞性リンパ腫、尖圭コンジローム、ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫、非ホジキンリンパ腫、慢性骨髄性白血病、基底細胞癌、多発性骨髄腫、カルチノイド腫瘍、膀胱癌、クローン疾患、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、腎細胞癌、多発性硬化症、およびＡＩＤＳの治療に関して、承認されているか、あるいは、現在、臨床開発中である。したがって、本発明には、インターフェロン−アルファに反応性の症状、例えば上記症状を治療する方法であって、該症状に罹患している被験体に、該症状に伴う徴候を改善するために有効な量の本発明のポリペプチドまたは本発明の複合体を含む組成物を投与する工程を含む方法が含まれる。本発明には、さらに、インターフェロン−アルファに反応性の症状、例えば上記症状、または本発明のポリペプチドもしくは本発明の複合体に反応性の任意の他の症状を治療するための本発明のポリペプチドまたは本発明の複合体を含む組成物（すなわち「本発明の組成物」）の使用が含まれる。
【０２９６】
ウイルス感染およびウイルス感染に伴う症状の治療
一態様では、本発明は、ウイルスに感染している被験体を治療するための方法であって、該被験体に、該被験体中のウイルスのレベルを減少させ、ならびに／あるいは該ウイルス感染に伴う徴候または症状を改善するために有効な量の本発明の組成物を投与する工程を含む方法を提供する。本発明の治療方法に関して意図される典型的なウイルス感染には、非限定的であるが、フラビウイルス科ファミリーのウイルス、例えばＣ型肝炎ウイルス、黄熱ウイルス、ウエストナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルス、またはウシウイルス性下痢症ウイルスによる感染；ヘパドナウイルス科ファミリーのウイルス、例えばＢ型肝炎ウイルスによる感染；ピコルナウイルス科ファミリーのウイルス、例えば脳心筋炎ウイルス、ヒトライノウイルス、またはＡ型肝炎ウイルスによる感染；レトロウイルス科ファミリーのウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ヒトＴリンパ指向性ウイルス、またはラウス肉腫ウイルスによる感染；コロナウイルス科ファミリーのウイルス、例えばＳＡＲＳコロナウイルスによる感染；ラブドウイルス科ファミリーのウイルス、例えば狂犬病ウイルスまたは水疱性口内炎ウイルスによる感染、パラミクソウイルス科ファミリーのウイルス、例えば呼吸器合胞体ウイルスまたはパラインフルエンザウイルスによる感染、パピローマウイルス科ファミリーのウイルス、例えばヒトパピローマウイルスによる感染、およびヘルペスウイルス科ファミリーのウイルス、例えば単純ヘルペスウイルスによる感染が含まれる。
【０２９７】
以下に、本発明のポリペプチドおよび複合体を使用する、典型的なウイルス感染ならびに該感染に伴う疾患および症状の治療に対する非限定的な例を提供する。それには、本発明のポリペプチドおよび複合体に関する投薬スケジュールの提案および該治療の効力をモニターするためのアプローチが含まれる。当業者は、他のウイルス感染ならびにウイルス感染に伴う疾患および症状を治療するための本発明のポリペプチドまたは複合体の投薬スケジュール、および該治療の効力をモニターするためのアプローチを突き止めることができる。
【０２９８】
Ｃ型肝炎ウイルス
一態様では、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染している患者を治療する方法であって、１種以上の本発明のポリペプチドまたは複合体を含む有効量の本発明の組成物を患者に投与する工程を含む方法を提供する。本発明は、さらに、ＨＣＶに感染している患者の治療に使用するための組成物であって、１種以上の本発明のポリペプチドまたは複合体および医薬的に許容され得る担体または賦形剤を含む組成物を提供する。ＨＣＶに感染していると診断される患者には、血液中のＨＣＶ ＲＮＡを示すか、ならびに／あるいは血清中の抗ＨＣＶ抗体を示す患者が含まれる。
【０２９９】
本発明のポリペプチドを含む組成物は、概して、臨床的に承認されているインターフェロン−アルファポリペプチド、例えばROFERON（登録商標）-A（組換えインターフェロンアルファ−２ａ；Hoffmann-La Roche Inc.）、INTRON（登録商標）A（組換えインターフェロンアルファ−２ｂ；Schering Corporation）、およびINFERGEN（登録商標）（インターフェロンアルファコン−１（interferon alfacon-1)；InterMune, Inc.）を使用するＨＣＶの治療レジメンで使用されるのと同様の用量および頻度で投与される。慢性ＨＣＶを治療するための、ROFERONまたはINTRON Aの典型的な推奨投薬スケジュールは、例えば２４〜４８週にわたる、皮下注射による週３回の３００万IU（約１５マイクログラム（mcg））である。慢性ＨＣＶを治療するためのINFERGENの典型的な推奨投薬スケジュールは、例えば２４〜４８週にわたる、皮下注射による週３回の９mcgである。いくつかの要因（非限定的であるが、本発明のポリペプチドの活性および薬物動態ならびに患者のサイズおよび健康が含まれる）に応じて、上記より少ない量（例えば約２、３、４、５、６、７、または８mcg）および／または少ない頻度（例えば週１回または週２回）で該ポリペプチドを投与してよい。
【０３００】
同様に、本発明の複合体を含む組成物は、概して、臨床的に承認されているインターフェロン−アルファ複合体、例えばPEGASYS（登録商標）（ペグインターフェロンアルファ−２ａ；Hoffmann-La Roche, Inc.）またはPEG-INTRON（登録商標）（ペグインターフェロンアルファ−２ｂ；Schering Corporation）を使用するＨＣＶの治療レジメンで使用されるのと同様の用量および頻度で投与される。慢性ＨＣＶを治療するためのPEGASYSの典型的な推奨投薬スケジュールは、例えば２４〜４８週にわたる、皮下注射による週１回の１８０mcgである。いくつかの要因（非限定的であるが、本発明の複合体の分子量、活性、および薬物動態ならびに患者のサイズおよび健康が含まれる）に応じて、上記より少ない量（例えば約２５、５０、７５、１００、１２５、または１５０mcg）および／または少ない頻度（例えば１０日に１回または２週間に１回）で該複合体を投与してよい。
【０３０１】
本発明のポリペプチドまたは複合体を１種以上の追加の治療物質（群）と組み合わせて投与する場合もある。例えば、本発明のポリペプチドまたは複合体を小分子の抗ウイルス剤、例えばリバビリンと組み合わせて投与してよい。リバビリンは、COPEGUS（登録商標）（Hoffmann-La Roche, Inc）およびREBETOL（登録商標）（Schering Corporation）という名称で販売されている。別法では、あるいは小分子の抗ウイルス剤に加えて、本発明のポリペプチドまたは複合体は、１種以上の追加のサイトカイン、例えばＩＦＮ−ガンマ（Actimmune（登録商標）（インターフェロンガンマ−１ｂ；InterMune, Inc.）の名称で販売）、ＩＬ−２（PROLEUKIN（登録商標）IL-2（アルデスロイキン組換えヒトインターロイキン−２（ｒｈＩＬ−２）；Chiron Corp.）の名称で販売）、またはＩＬ−１２（インターロイキン−１２）と組み合わせて投与してよい。
【０３０２】
本発明のポリペプチドまたは複合体の投与についての厳密な量および頻度は、いくつかの要因、例えば、当業者に既知の他の要因の中でも、該ポリペプチドまたは複合体の比活性および薬物動態学的特性、ならびに治療対象の症状の性質（例えば治療対象のＣ型肝炎ウイルスの遺伝子型）に依存する。通常、該用量は、治療対象の徴候の重症度または拡大を予防し、あるいは減少させることが可能なはずであろう。該用量は「有効」量または「治療有効」量と称されることがある。当業者に明らかであるように、本発明のポリペプチド、複合体または組成物の有効量は、とりわけ、治療対象の症状、用量、投与スケジュール、該ポリペプチドまたは複合体または組成物を単独で投与するか、あるいは他の治療物質と組み合わせて投与するか、該ポリペプチド、複合体または組成物の血清半減期および他の薬物動態学的特性、ならびに患者のサイズ、年齢、および全般的健康に依存する。当業者は、既知の技術を使用して、投与の用量および頻度を突き止めることができる。
【０３０３】
治療の有効性は、ウイルス量を測定することによって、例えば当技術分野において既知の方法を使用して血清または血漿中のウイルスの力価またはレベルを決定することによって、例えば定量的ＰＣＲベースの試験、例えばCOBAS AMPLICOR（登録商標）HCV Test, v2.0またはCOBAS AMPLICOR HCV MONITOR（登録商標）Test, v2.0（ともにRoche Diagnostics）を使用してウイルスＲＮＡレベルをモニターすることによって、決定してよい。ある症例では、本発明の組成物の有効量は、治療経過にわたって、治療前のウイルス量（慢性ＨＣＶ患者では概して１０５〜１０７コピーの範囲のＨＣＶ ＲＮＡ／ml）と比較して、少なくとも２対数単位、少なくとも３対数単位、少なくとも４対数単位、少なくとも５対数単位、少なくとも６対数単位または少なくとも７対数単位分のウイルス量の減少を達成するために十分な量である。ある症例では、本発明の組成物の有効量は、ウイルス量を本質的に検出不可能なレベルに減少させるために十分な量であり、それは、例えば約５００コピー／血清ml未満または約１００コピー／血清ml未満である。本発明には、ＨＣＶに感染している患者の血清中のＨＣＶ ＲＮＡのレベルを減少させる方法であって、治療開始前に存在するＨＣＶ ＲＮＡレベルと比較してＨＣＶ ＲＮＡのレベルを減少させるために有効な量の本発明の組成物を患者に投与する工程を含む方法が含まれる。
【０３０４】
治療の有効性は、あるいはまたはさらに、ＨＣＶ感染に伴う症状、例えば肝障害の指標であるパラメータを測定することによって決定してよい。例えば、標準的アッセイを使用してアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の血清レベルを測定してよい。概して、約５０国際単位／血清ml（IU／ml）未満のＡＬＴレベルが正常であると見なされる。より高いＡＬＴレベルは、進行中の肝障害を示すかもしれない。ある症例では、本発明の組成物の有効量は、正常ＡＬＴレベルより高い値を有する患者のＡＬＴレベルを、約５０IU／血清ml未満に減少させるために有効な量である。ゆえに、本発明には、５０IU／mlを超える初期ＡＬＴレベルを示すＨＣＶ感染患者の血清ＡＬＴレベルを減少させる方法であって、該患者に、ＡＬＴレベルを約５０IU／ml未満に減少させるために有効な量の本発明の組成物を投与する工程を含む方法が含まれる。
【０３０５】
ヒト免疫不全ウイルス
別の態様では、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、例えばＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に感染している患者、あるいはＨＩＶ感染に伴う疾患または症状、例えばＡＩＤＳ関連カポジ肉腫に罹患している患者を治療する方法であって、該患者に、１種以上の本発明のポリペプチドまたは複合体を、場合により、下記の他の抗ウイルス療法物質と併せて含む有効量の本発明の組成物を投与する工程を含む方法を提供する。本発明は、さらに、ＨＩＶに感染しているか、あるいはＨＩＶ感染に伴う疾患または症状に罹患している患者の治療に使用するための組成物であって、１種以上の本発明のポリペプチドまたは複合体および医薬的に許容され得る担体または賦形剤を含む組成物を提供する。ＨＩＶに感染していると診断される患者には、血液中の検出可能なレベルのＨＩＶ ＲＮＡまたはプロウイルスＤＮＡを示し、ならびに／あるいは血清中の検出可能なレベルのｐ２４抗原または抗ＨＩＶ抗体を示す患者が含まれる。
【０３０６】
本発明のポリペプチドを含む組成物は、概して、インターフェロン−アルファポリペプチド、例えばROFERON（登録商標）-A（組換えインターフェロンアルファ−２ａ；Hoffmann-La Roche Inc.）、INTRON（登録商標）A（組換えインターフェロンアルファ−２ｂ；Schering Corporation）、およびINFERGEN（登録商標）（インターフェロンアルファコン−１；InterMune, Inc.）を使用するＨＩＶの治療レジメンで使用されるのと同様の用量および頻度で投与される。上記のように、慢性ＨＣＶを治療するためのROFERONまたはINTRON Aの典型的な推奨投薬スケジュールは、例えば２４〜４８週間にわたる、皮下注射による週３回の３００万IU（約１５マイクログラム（mcg））であり、慢性ＨＣＶを治療するためのINFERGENの典型的な推奨投薬スケジュールは、例えば２４〜４８週間にわたる、皮下注射による週３回の９mcgである。ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫を治療するためのROFERONの典型的な推奨投薬スケジュールは、１０〜１２週間毎日の３６００万単位、その後の、週３回の３６００万単位である。ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫を治療するためのINTRON Aの典型的な推奨投薬スケジュールは、皮下投与される週３回の３０００万IU／m2である。該投薬スケジュールでは、ＨＩＶまたはＨＩＶ感染に伴う疾患もしくは症状を治療するための本発明のポリペプチドの用量に関する有用な範囲が提供される。いくつかの要因（非限定的であるが、本発明のポリペプチドの活性および薬物動態ならびに患者のサイズ、年齢および健康を含み）に依存して、上記より少ない量および／または少ない頻度で本発明のポリペプチドを投与してよい。
【０３０７】
同様に、本発明の複合体を含む組成物は、概して、インターフェロン−アルファ複合体、例えばPEGASYS（登録商標）（ペグインターフェロンアルファ−２ａ；Hoffmann-La Roche, Inc.）またはPEG-INTRON（登録商標）（ペグインターフェロンアルファ−２ｂ；Schering Corporation）を使用するＨＩＶの治療レジメンで使用されるのと同様の用量および頻度で投与される。ＨＩＶを治療するためのPEG-INTRONの典型的な投薬スケジュールは、例えば２４〜４８週間の、皮下注射による約１．０mcg／kg／週〜３．０mcg／kg／週の範囲である。該投薬スケジュールでは、ＨＩＶを治療するための本発明の複合体の用量に関する有用な範囲が提供される。いくつかの要因（非限定的であるが、本発明の複合体の分子量、活性、および薬物動態ならびに患者のサイズ、年齢および健康を含み）に応じて、上記より少ない量（例えば約０．１、０．２５、０．５０、または０．７５mcg／kg／週）および／または少ない頻度（例えば１０日に１回または２週間に１回）で該複合体を投与してよい。
【０３０８】
ある症例では、本発明のポリペプチドまたは複合体を１種以上の追加の治療物質（群）と組み合わせて投与する。ヒト（man）におけるＨＩＶ−１感染の最近の臨床治療には、高活性抗レトロウイルス治療（「ＨＡＡＲＴ」）と一般に称される多剤併用療法が含まれる。ゆえに、本発明のポリペプチドまたは複合体は、ＨＡＡＲＴまたは他の抗ウイルス療法化合物と組み合わせて投与してよい。種々の組み合わせのヌクレオシド逆転写酵素インヒビター（「ＮＲＴＩ」）、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター（「ＮＮＲＴＩ」）およびＨＩＶプロテアーゼインヒビター（「ＰＩ」）が含まれる、ＨＡＡＲＴの典型的な成分は、例えば、A.M. Vandammeら (1998) Antiviral Chemistry & Chemotherapy, 9:187-203; "Drugs for HIV Infection" in The Medical Letter Vol. 39 (Issue 1015) December 5, 1997, pages 111-116; および公開されている米国特許出願第US 20020182179 A1号（各文献は参照により本明細書中に援用される）に記載されている。ＨＩＶ感染患者がＨＣＶにも感染している場合、本発明のポリペプチドまたは複合体を、ＨＡＡＲＴとともに、抗ウイルス剤、例えばリバビリンと組み合わせて投与してよい。リバビリンは、COPEGUS（登録商標）（Hoffmann-La Roche, Inc）およびREBETOL（登録商標）（Schering Corporation）という名称で販売されている。
【０３０９】
本発明のポリペプチドまたは複合体の投与、および追加の治療物質、例えばＨＡＡＲＴおよび／またはリバビリンの投与についての厳密な量および頻度は、いくつかの要因、例えば、当業者に既知の他の要因の中でも、該ポリペプチドまたは複合体の比活性および薬物動態学的特性、ならびに治療対象の症状の性質（例えばＨＣＶ等の追加のウイルス感染の存在）に依存する。通常、該用量は、治療対象の徴候の重症度または拡大を予防し、あるいは減少させることが可能であるはずであろう。該用量は「有効」量または「治療有効」量と称されることがある。当業者に明らかであるように、本発明のポリペプチド、複合体または組成物の有効量は、とりわけ、治療対象の症状、用量、投与スケジュール、該ポリペプチドまたは複合体または組成物を単独で投与するか、あるいは他の治療物質と組み合わせて投与するか、該ポリペプチド、複合体または組成物の血清半減期および他の薬物動態学的特性、ならびに患者のサイズ、年齢、および全般的健康に依存する。当業者は、既知の技術を使用して、投与の用量および頻度を突き止めることができる。
【０３１０】
上記の一般的使用に加えて、以下のサブセットのＨＩＶ感染患者に本発明のポリペプチドまたは複合体を投与してよい：例えば上記のＨＡＡＲＴに対する補助療法として；ウイルス量が概して多い初期患者における単独療法または併用療法として；構造化された治療の中断（ＳＴＩ）または「休薬期間」を経験する患者のための併用の抗ウイルス剤および免疫調節物質として；ＨＡＡＲＴ選択肢が制限される患者におけるサルベージ療法として；ＨＡＡＲＴ耐性ウイルスの出現を遅延させるためにＨＡＡＲＴ療法を開始することなくウイルス量を抑制するための抗ウイルス性の治療方法として投与してよい。
【０３１１】
治療の有効性は、ウイルス量を測定することによって、例えば当技術分野において既知の方法を使用して血清または血漿中のウイルスの力価またはレベルを決定することによって、例えば定量的ＲＴ−ＰＣＲベースの試験、例えばAMPLICOR HIV-1 MONITOR（登録商標）Test, v1.5（Roche Diagnostics）を使用してＨＩＶ−１ウイルスＲＮＡレベルをモニターすることによって、決定できる。ある症例では、本発明の組成物の有効量は、治療経過にわたって、治療前のウイルス量と比較して、少なくとも０．５対数単位、少なくとも１対数単位、少なくとも２対数単位、少なくとも３対数単位、少なくとも４対数単位、少なくとも５対数単位、少なくとも６対数単位または少なくとも７対数単位分のウイルス量の減少を達成するために十分な量である。ある症例では、本発明の組成物の有効量は、ウイルス量を本質的に検出不可能なレベルに減少させるために十分な量であり、それは、例えば、約５０〜１００コピーのＨＩＶ−１ ＲＮＡ／血清ml未満である。本発明には、ＨＩＶに感染している患者の血清中のＨＩＶ ＲＮＡのレベルを減少させる方法であって、治療開始前に存在するＨＩＶ ＲＮＡレベルと比較してＨＩＶ ＲＮＡのレベルを減少させるために有効な量の本発明の組成物を患者に投与する工程を含む方法が含まれる。
【０３１２】
治療の有効性は、あるいはまたはさらに、ＨＩＶ複製に関する血清マーカー、例えば血液中のＨＩＶ ｐ２４抗原の存在によって決定してよい。ある症例では、本発明の組成物の有効量は、血液中のｐ２４抗原のレベルを、治療開始前に存在するレベルの５０％、２５％、１０％または５％に減少させるために十分な量である。ある症例では、本発明の組成物の有効量は、ｐ２４抗原のレベルを本質的に検出不可能なレベルに減少させるために十分な量である。本発明には、ＨＩＶに感染している患者の血清中のｐ２４抗原のレベルを減少させる方法であって、治療開始前に存在するｐ２４抗原レベルと比較してｐ２４抗原のレベルを減少させるために有効な量の本発明の組成物を患者に投与する工程を含む方法が含まれる。
【０３１３】
Ｂ型肝炎ウイルス
別の態様では、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染している患者を治療する方法であって、１種以上の本発明のポリペプチドまたは複合体を含む有効量の本発明の組成物を患者に投与する工程を含む方法を提供する。本発明は、さらに、ＨＢＶに感染している患者の治療に使用するための組成物であって、１種以上の本発明のポリペプチドまたは複合体および医薬的に許容され得る担体または賦形剤を含む組成物を提供する。
【０３１４】
ＨＢＶに感染していると診断される患者は、血清中の検出可能なＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を示す。慢性ＨＢＶ感染は、「複製的」または「非複製的」感染としてさらに分類される。複製的感染では、患者は、通常、相対的に高いウイルスＤＮＡの血清中濃度および検出可能なＨＢｅＡｇを有し、それは、代替的に処理された、高ウイルス複製条件下で合成されるＨＢＶ前核遺伝子のタンパク質である。しかし、前核遺伝子に突然変異を有するＨＢＶのまれな系統では、検出可能な血清ＨＢｅＡｇの不存在下で複製的感染が生じうる。慢性Ｂ型肝炎および複製的感染を有する患者は、概して、ＨＢｅＡｇを有さない患者より悪い予後を有し、硬変および／または肝細胞癌を発生する可能性が高い。非複製的感染では、肝臓におけるウイルス複製の割合は低く、血清ＨＢＶ ＤＮＡ濃度は概して低く、肝炎Ｂｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）は検出されない。
【０３１５】
本発明のポリペプチドを含む組成物は、概して、臨床的に承認されているインターフェロン−アルファポリペプチド、例えばINTRON（登録商標）A（組換えインターフェロンアルファ−２ｂ；Schering Corporation）を使用するＨＢＶの治療レジメンで使用されるのと同様の用量および頻度で投与される。成体における慢性ＨＢＶを治療するためのINTRON Aの典型的な推奨投薬スケジュールは、１６週間にわたる５００万IU／日（ｑｄ）または週３回の１０００万IU（ｔｉｗ）としての、皮下または筋肉内注射による３０００〜３５００万IU／週である。いくつかの要因（非限定的であるが、本発明のポリペプチドの活性および薬物動態、ならびに患者のサイズおよび健康を含み）に応じて、上記より少ない量（例えば約５００、１０００、１５００、２０００、または２５００万IU／週）および／または少ない頻度（例えば週１回または週２回）で本発明のポリペプチドを投与してよい。
【０３１６】
同様に、本発明の複合体を含む組成物は概して、例えばPEGASYS（登録商標）（ペグインターフェロンα−２ａ; Hoffmann-La Roche, Inc.）などの現在臨床試験を受けているインターフェロン−アルファ複合体を使用するＨＢＶ治療計画で採用されているものと同じ用量および回数で投与するとしている。慢性ＨＢＶの治療に対するPEGASYS の典型的な投薬スケジュールは、週一回９０〜２７０mcgであり、合わせて２４週間行う。因子の数（本発明の複合体の分子量、活性および薬物動態、ならびに患者の大きさおよび健康状態を含むがこれらに限定されるものではない）に応じて、複合体は上述よりも低用量（例えば約２５、５０、７５、１００、１２５、１５０または２００mcgなど）および／または少ない回数（１０日毎に１回、または２週間に１回など）で投与してよい。
【０３１７】
ある症例では、本発明のポリペプチドまたは複合体を、１つ以上の追加的治療薬と組み合わせて投与する。例えば、本発明のポリペプチドまたは複合体を、Epivir-HBV（登録商標）（GlaxoSmithKline）の名の元で販売されているラミブジン（３ＴＣとしても知られている）またはHepsera（登録商標）（Gilead Sciences）の名の元で販売されているアデホビルピボキシルなどの抗ウイルス薬と組み合わせて投与してもよい。
【０３１８】
本発明のポリペプチドまたは複合体を投与する場合の正確な量および回数は、ポリペプチドまたは複合体の特異的活性および薬物動態特性などの因子の数に依存し、ならびに当業者に公知の他の因子の中では、治療される条件の性質（例えば慢性ＨＢＶ感染では、その感染が複製的か非複製的か）に依存するとされている。通常、用量は治療の適応症の重症度または拡大を予防または低減できることが好ましい。該用量は「有効な」または「治療的に有効な」量と称してもよい。本発明のポリペプチド、複合体または組成物の有効量は、とりわけ、治療の条件、用量、投与スケジュール、該ポリペプチド、複合体または組成物が単独か他の治療薬との組み合わせで投与されるかの違い、該ポリペプチド、複合体または組成物の血清半減期および他の薬物動態特性、ならびに患者の大きさ、年齢および総体的な健康状態に依存していることは当業者には明白なことであろう。投与の用量および回数は、公知の技術を使用して当業者が確認できることである。
【０３１９】
治療効果は、例えば当技術分野で公知の方法を使用してウイルス負荷、例えば血清または血漿中ウイルスＤＮＡのレベルを測定することで判定してよい。ＨＢＶのＤＮＡレベルを監視する方法には、COBAS AMPLICOR HBV MONITOR（登録商標）試験、v2.0またはAMPLICOR HBV MONITOR（登録商標）試験、v2.0（両製品ともRoche Diagnostics)などの定量的ＰＣＲをベースにした試験が含まれる。ある症例では、本発明の組成物の有効量は、例えば約５００，０００コピー／血清ml未満または約１００，０００コピー／血清ml未満または約１０，０００コピー／血清ml未満まで、または本質的に検出不可能なレベル（例えば約１０００コピー／血清ml未満、約５００コピー／血清ml未満、または約２００コピー／血清ml未満）までウイルスＤＮＡを減少させるために十分な量である。本発明は、ＨＢＶに感染した患者の血清中ＨＢＶのＤＮＡレベルを低下させる方法を含んでおり、該方法は、治療開始前に存在するＨＢＶのＤＮＡレベルと比較して、ＨＢＶのＤＮＡレベルを低下させる有効量で本発明の組成物を患者に投与することを含む。
【０３２０】
治療効果は、ＨＢｅＡｇなどのＨＢＶ複製のための他の血清マーカーを測定することで代替的にまたは付加的に判定してよい。ある症例では、本発明の組成物の有効量は、血清中ＨＢｅＡｇのレベルを治療開始前に存在するレベルの５０％、２５％、１０％または５％まで低下させるのに十分な量である。ある症例では、本発明の組成物の有効量は、ＨＢｅＡｇのレベルを本質的に検出不可能なレベルまで低下させるのに十分な量である。本発明は、ＨＢＶに感染した患者の血清中ＨＢｅＡｇレベルを低下させる方法を含んでおり、該方法は、治療開始前に存在するＨＢｅＡｇレベルと比較して、ＨＢｅＡｇレベルを低下させる有効量で本発明の組成物を患者に投与することを含む。
【０３２１】
上述のように、ＨＢＶ感染の指標となる他の血清マーカーはＨＢｓＡｇである。したがって、治療効果は、血清中ＨＢｓＡｇレベルを測定することで代替的にまたは付加的に判定してよい。ある症例では、本発明の組成物の有効量は、血清中ＨＢｓＡｇのレベルを治療開始前に存在するレベルの５０％、２５％、１０％または５％まで低下させるのに十分な量である。ある症例では、本発明の組成物の有効量は、ＨＢｓＡｇのレベルを本質的に検出不可能なレベルまで低下させるのに十分な量である。本発明は、ＨＢＶに感染した患者の血清中ＨＢｓＡｇレベルを低下させる方法を含んでおり、該方法は、治療開始前に存在するＨＢｓＡｇレベルと比較して、ＨＢｓＡｇレベルを低下させる有効量で本発明の組成物を患者に投与することを含む。
【０３２２】
治療効果は、例えば肝臓障害などのＨＢＶ感染に伴う状態の指標となるパラメーターを測定することで代替的にまたは付加的に判定してよい。例えば、血清アラニン・アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）のレベルは標準アッセイを使用して測定してもよい。一般的に、約５０国際単位／血清ml（IU/ml）未満のＡＬＴレベルは正常と考えられている。高めのＡＬＴレベルは肝臓障害が進行中であることを示している可能性がある。ある症例では、本発明の組成物の有効量は、ＡＬＴレベルが通常より高い患者において、血清中約５０IU/ml未満までＡＬＴレベルを低下させるのに有効な量である。したがって、本発明は、ＨＢＶに感染し、初期のＡＬＴレベルが５０IU/mlを超える患者の血清中ＡＬＴレベルを低下させる方法を含んでおり、該方法は、ＡＬＴレベルを約５０IU/ml未満に低下させる有効量で本発明の組成物を患者に投与することを含む。
【０３２３】
ヒトＴリンパ球向性ウイルス１型
他の態様では、本発明はヒトＴリンパ球向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）、または、例えば成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症（ＨＡＭ）、熱帯性痙性不全対麻痺症（ＴＳＰ）、ブドウ膜炎または関節症などのＨＴＬＶ−１感染に伴う疾患または症状に感染した患者を治療する方法を提供する。該方法は、本発明の１つ以上のポリペプチドまたは複合体を含む本発明の有効量の組成物を患者に投与することを含む。本発明はまた、ＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−１感染に伴う疾患または症状に感染した患者を治療する場合に使用するための組成物も提供し、該組成物は本発明の１つ以上のポリペプチドまたは複合体および医薬的に許容可能な担体または賦形剤を含む。ＨＴＬＶ−１に感染したと診断された患者には、血液中にＨＴＬＶ−１プロウイルスＤＮＡが見られる、および／または血清中にＨＴＬＶ−１抗原に対する抗体を持つ患者が含まれる。
【０３２４】
本発明のポリペプチドを含む組成物は一般的に、例えばROFERON （登録商標）−A（インターフェロンα−２ａ、組み換え体、Hoffmann-La Roche Inc.）およびINTRON（登録商標）A（インターフェロンα−２ｂ、組み換え体、Schering Corporation）などの 臨床認可されたインターフェロンαポリペプチドを使用したＨＣＶまたは腫瘍治療計画に採用されているものと類似の用量および回数で投与されるとしている。慢性ＨＣＶを治療するためのROFERONおよびINTRON Aの推奨投薬スケジュールの代表的な例としては、週３回３百万IU（約１５マイクログラム（mcg））の皮下注射を、例えば２４〜４８週間行うことが含まれる。有毛細胞白血病を治療するためのROFERON の推奨投薬スケジュールの代表的な例としては、１日３〜５百万単位の皮下注射を、１６〜２４週間、その後週３回３百万単位を維持して行うことが含まれる。有毛細胞白血病を治療するためのINTRON Aの推奨投薬スケジュールの代表的な例としては、週３回２百万IU/m2（体表面平方メートル）の皮下投与を６か月間行うことが含まれる。該投薬スケジュールは、ＨＴＬＶ−１感染、もしくは成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症（ＨＡＭ）または熱帯性痙性不全対麻痺症（ＴＳＰ）などのＨＴＬＶ−１感染に伴う疾患または症状を治療するための本発明のポリペプチドの投薬量を有用な範囲にする。因子の数（本発明のポリペプチドの活性および薬物動態ならびに患者の大きさ、年齢および健康状態を含むがこれらに限定されるものではない）に依存して、ポリペプチドは上述よりも少ない量および／または回数で投与してよい。
【０３２５】
同様に、本発明の複合体を含む組成物は概して、例えばPEGASYS（登録商標）（ペグインターフェロンα−２ａ; Hoffmann-La Roche, Inc.）またはPEG-INTRON（登録商標）（ペグインターフェロンα−２ｂ; Schering Corporation）などの臨床認可されているインターフェロン−アルファ複合体を使用するＨＣＶ治療または腫瘍治療計画で採用されているものと同じ用量および回数で投与するとしている。慢性ＨＣＶを治療するためのPEGASYSの推奨投薬スケジュールの代表的な例としては、週１回１８０mcgの皮下注射を、例えば２４〜４８週間行うことが含まれる。慢性骨髄性白血病を治療するためのPEG-INTRON の推奨投薬スケジュールの代表的な例としては、週１回６mcg/体重kgの皮下注射を、例えば５２週間行うことが含まれる。該投薬スケジュールは、ＨＴＬＶ−１感染、もしくは成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症（ＨＡＭ）または熱帯性痙性不全対麻痺症（ＴＳＰ）などのＨＴＬＶ−１感染に伴う疾患または症状を治療するための本発明の複合体の投薬量を有用な範囲にする。因子の数（本発明の複合体の分子量、活性および薬物動態ならびに患者の大きさ、年齢および健康状態を含むがこれらに限定されるものではない）に依存して、複合体は上述よりも少ない量および／または回数で投与してよい。
【０３２６】
本発明のポリペプチドまたは複合体を、１つ以上の追加的治療薬(と組み合わせて投与するある症例もある。例えば、本発明のポリペプチドまたは複合体を、ジドブジン（ＡＺＴ）および／またはラミブジン（３ＴＣ）などの抗レトロウイルス薬と組み合わせて投与してもよい。それは末梢血幹細胞移植、通常化学療法、もしくは自家または同種骨髄移植を用いた高用量化学療法を併用して投与してもよい。あるいは、本発明のポリペプチドまたは複合体は他の免疫療法、例えば抗インターロイキン−２受容体モノクローナル抗体またはウイルス抗原に向けられた細胞毒性Ｔ細胞の注入と組み合わせてもよい。
【０３２７】
本発明のポリペプチドまたは複合体を投与する場合の正確な量および回数は、ポリペプチドまたは複合体の特異的活性および薬物動態特性などの因子の数に依存し、ならびに当業者に公知の他の因子の中では、治療される条件の性質に依存するとされている。通常、治療の適応症の重症度または拡大を予防または低減できることが好ましい。該用量は「有効な」または「治療的に有効な」量と称してもよい。本発明のポリペプチド、複合体または組成物の有効量は、とりわけ、治療の条件、用量、投与スケジュール、該ポリペプチド、複合体または組成物が単独か他の治療薬との組み合わせで投与されるかの違い、該ポリペプチド、複合体または組成物の血清半減期および他の薬物動態特性、ならびに患者の大きさ、年齢および総体的な健康状態に依存していることは当業者には明白なことであろう。投与の用量および回数は、公知の技術を使用して当業者が確認できることである。
【０３２８】
治療効果は、ＨＴＬＶ−１ウイルス負荷を測定することで、例えばSaitoら、(2004) J. Infect Dis. 189(1):29-40.に記載されている定量ＰＣＲによる当技術分野で公知の方法を使用して血液中ＨＴＬＶ−１プロウイルスＤＮＡレベルを測定することで判定してよい。ある症例では、本発明の組成物の有効量は、治療前ウイルス負荷と比較して、治療過程にわたって少なくとも０．５対数単位、例えば少なくとも１対数単位、少なくとも２対数単位、少なくとも３対数単位、少なくとも４対数単位、少なくとも５対数単位、少なくとも６対数単位または少なくとも７対数単位、ウイルス負荷を減少させるために十分な量である。ある症例では、本発明の組成物の有効量は、ウイルス負荷を本質的に検出不可能なレベルまで低下させるのに十分な量である。本発明は、ＨＴＬＶ−１に感染した患者の血中ＨＴＬＶ−１プリウイルスＤＮＡレベルを低下させる方法を含んでおり、該方法は、治療開始前に存在するＨＴＬＶ−１プロウイルスＤＮＡレベルと比較して、ＨＴＬＶ−１プロウイルスＤＮＡレベルを低下させる有効量で本発明の組成物を患者に投与することを含む。
【０３２９】
治療効果は、当技術分野で公知の方法を使用して、例えばINNO-LIA（登録商標）HTLV I/II (Innogenetics; Gent Belgium)およびAbbott HTLV-I/HTLV-II EIA (Abbott Laboratories; Abbott Park, IL)などの市販の試薬によって血清中抗ＨＴＬＶ−１抗体の力価を測定することで代替的にまたは付加的に判定してよい。ある症例では、本発明の組成物の有効量は、血清中抗ＨＴＬＶ−１抗体の力価を治療開始前に存在する力価の５０％、２５％、１０％または５％まで低下させるのに十分な量である。ある症例では、本発明の組成物の有効量は、血清中抗ＨＴＬＶ−１抗体の力価を本質的に検出不可能なレベルまで低下させるのに十分な量である。本発明は、ＨＴＬＶ−１に感染した患者の血清中抗ＨＴＬＶ−１抗体の力価を低下させる方法を含んでおり、該方法は、治療開始前に存在する血清中抗ＨＴＬＶ−１抗体の力価と比較して、血清中抗ＨＴＬＶ−１抗体の力価を低下させる有効量で本発明の組成物を患者に投与することを含む。
【０３３０】
ヒトパピローマウイルス
他の態様では、本発明はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、または、例えば手足の疣、ならびに口腔、肛門および生殖腔の粘膜病変などのＨＰＶ感染に伴う疾患または症状に感染した患者を治療する方法提供する。ＨＰＶの多くのタイプは比較的無害ではあるが、それ以外でもＨＰＶの多くのタイプは、性的接触を通じて広がり、子宮頸癌および他の性器癌の原因となることがある生殖器疣または性病性疣（尖圭コンジローム）を引き起こす。該方法は、本発明の１つ以上のポリペプチドまたは複合体を含む本発明の有効量の組成物をＨＰＶに感染した患者に投与することを含む。本発明はまた、ＨＰＶまたはＨＰＶ感染に伴う疾患または症状に感染した患者を治療する場合に使用するための組成物も提供し、該組成物は本発明の１つ以上のポリペプチドまたは複合体および医薬的に許容可能な担体または賦形剤を含む。ＨＰＶに感染したと診断された患者には、生検を行った生殖器組織中にＨＰＶウイルスＤＮＡが見られる、および生殖器組織に目に見える病変が見られることもある（常にではない）患者が含まれる。
【０３３１】
本発明のポリペプチドを含む組成物は一般的に、例えばINTRON（登録商標）A（インターフェロンα−２ｂ、組換え体、Schering Corporation）などの 臨床認可されたインターフェロンαポリペプチドを使用したＨＰＶ治療計画に採用されているものと類似の用量および回数で投与されるものである。尖圭コンジローマを治療するためのINTRON Aの推奨される用量としては、ツベルクリンまたは類似のシリンジおよび２５〜３０ゲージ針を用いて週３回隔日に、５つまでの各病変に百万IUを３週間注入する。６〜１０個のコンジローマがある患者は上記の投薬スケジュールでの治療の２回目の過程を（連続的に）行ってもよく、治療の過程ごとに追加コンジローマは５つまで治療してもよい。１０個を超えるコンジローマがある患者には、コンジローマの数がどのくらい多く存在するかによって一連の過程を追加してもよい。インターフェロンは代替的にまたは付加的に、例えばクリームまたは軟膏の形態で局所塗布してよい（例えばStentellaら、(1996) Clin. Exp. Obstet. Gynecol. 23(1):29-36に記載されている）。該投薬スケジュールは、ＨＰＶ感染、もしくは尖圭コンジローマなどのＨＰＶ感染に伴う疾患または症状を治療するための本発明のポリペプチドの投薬量を有用な範囲にする。因子の数（本発明のポリペプチドの活性および薬物動態ならびに患者の大きさ、年齢および健康状態を含むがこれらに限定されるものではない）に依存して、本発明のポリペプチドは上述よりも少ない量および／または回数で投与してよい。同様に、本発明の複合体を含む組成物は概して、例えば静脈内または局所的に、罹患組織中のＨＰＶウイルスＤＮＡ量を、または感染個体中の生殖器病変のサイズ／または数を減少させるために有効な容量で投与するとしている。
【０３３２】
本発明のポリペプチドまたは複合体を、１つ以上の追加的治療薬と組み合わせて投与するある症例もある。例えば、本発明のポリペプチドまたは複合体を、Podofilox（Condylox）および／またはPodophyllin（Pododerm、Podocon-25)などの抗ＨＰＶ治療法と組み合わせて投与してもよい。
【０３３３】
本発明のポリペプチドまたは複合体を投与する場合の正確な量および回数は、ポリペプチドまたは複合体の特異的活性および薬物動態特性などの因子の数に依存し、ならびに当業者に公知の他の因子の中では、治療される条件の性質に依存するとされている。通常、用量は治療の適応症の重症度または拡大を予防または低減できることが好ましい。該用量は「有効な」または「治療的に有効な」量と称してもよい。本発明のポリペプチド、複合体または組成物の有効量は、とりわけ、治療の条件、用量、投与スケジュール、該ポリペプチドまたは複合体または組成物が単独か他の治療薬との組み合わせで投与されるかの違い、該ポリペプチド、複合体または組成物の血清半減期および他の薬物動態特性、ならびに患者の大きさ、年齢および総体的な健康状態に依存していることは当業者には明白なことであろう。投与の用量および回数は、公知の技術を使用して当業者が確認できることである。
【０３３４】
治療効果は、ＨＰＶウイルス負荷を測定、例えば生検組織中ＨＰＶウイルスＤＮＡレベルを測定することで判定してよい。ある症例では、本発明の組成物の有効量は、治療前ウイルス負荷と比較して、治療過程にわたって少なくとも０．５対数単位、例えば少なくとも１対数単位、少なくとも２対数単位、少なくとも３対数単位、少なくとも４対数単位、少なくとも５対数単位、少なくとも６対数単位または少なくとも７対数単位、ウイルス負荷を減少させるために十分な量である。ある症例では、本発明の組成物の有効量は、ウイルス負荷を本質的に検出不可能なレベルまで低下させるのに十分な量である。本発明は、ＨＰＶに感染した患者の組織中ＨＰＶウイルスＤＮＡレベルを低下させる方法を含んでおり、該方法は、治療開始前に存在するＨＴＬＶ−１ウイルスＤＮＡレベルと比較して、ＨＰＶウイルスＤＮＡレベルを低下させる有効量で本発明の組成物を患者に投与することを含む。
【０３３５】
治療効果は、感染した個体中の生殖器病変（コンジローマ）のサイズまたは数を見て代替的にまたは付加的に判定してよい。ある症例では、本発明の組成物の有効量は、感染した個体中のコンジローマのサイズおよび／または数を減少させるのに十分な量である。本発明は、ＨＰＶに感染した患者のコンジローマのサイズおよび／または数を低下させる方法を含んでおり、該方法は、治療開始前に存在するコンジローマと比較して、患者中のコンジローマのサイズおよび／または数を低下させる有効量で本発明の組成物を患者に投与することを含む。
【０３３６】
製剤および投与経路
本発明のポリペプチドまたは複合体の治療製剤は１つ以上の医薬的に許容可能な担体または賦形剤を含む組成物として局所的に投与される。該医薬組成物は当技術分野で自体公知の方法で調製してよく、その結果として保存性が十分安定しており、しかもヒトまたは動物に投与に適しているポリペプチド医薬が得られる。
【０３３７】
剤形
本発明のポリペプチドまたは複合体は、「そのままで」および／またはその塩の形態で使用可能である。好適な塩は、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウムなどのアルカリ金属やアルカリ土類金属の塩ならびに例えば亜鉛塩を含むが、これらに限定されるものではない。これらの塩は結晶性および／または非結晶性構造として存在する場合がある。
【０３３８】
賦形剤
「医薬的に許容できる」は、採用された投薬量および濃度で、それを投与される患者に悪影響を全く及ぼさない担体または賦形剤を意味する。該医薬的に許容できる担体および賦形剤は当技術分野で周知である（Remington's Pharmaceutical Sciences, 第１８版、A. R. Gennaro編、Mack Publishing Company (1990); Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. FrokjaerおよびL. Hovgaard編、Taylor & Francis (2000) ; およびHandbook of Pharmaceutical Excipients、第３版、A. Kibbe編、Pharmaceutical Press (2000)を参照されたい）。
【０３３９】
薬剤の混合
本発明の組成物は単独で、または他の治療薬と併用して投与してもよい。例えばリバビリンは、ＩＦＮ−アルファと併用することがよくあり、ＨＣＶ治療などの抗ウイルス治療において効果を高めることが分かっている。様々な小分子が、ウイルス標的（ウイルスプロテアーゼ、ウイルスポリメラーゼ、ウイルス複製複合体の集合）と宿主標的（ウイルス処理に必要な宿主プロテアーゼ、ＮＳ５Ａなどのウイルス標的のリン酸化に必要な宿主キナーゼ、およびウイルスＩＲＥＳを効果的に利用するのに必要な宿主因子の阻害剤）の両方に対して開発されている。他のサイトカインは、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７またはＩＦＮ−ガンマなどと併用しても良い。これらの薬剤は、同一の医薬組成物の一部として組み込むこと、もしくは本発明のポリペプチドまたは複合体から別々に投与することを同時に、あるいはもう一方の治療スケジュールに合わせて行ってよい。さらに、本発明のポリペプチド、複合体または組成物はアジュバントとして他の療法に使用してよい。
【０３４０】
患者
本発明の対象の「患者」には、ヒトおよび他の動物の両方が含まれる。したがって方法はヒトの治療および獣医科への応用の両方に適用可能である。
【０３４１】
組成物のタイプおよび投与経路
本発明のポリペプチドまたは複合体を含む医薬組成物は、例えば液体、ゲル、凍結乾燥型または圧縮固体などの様々な形態で処方してよい。好ましい形態は、治療対象の、当業者に明確である特定の適応症に依存するとされている。
【０３４２】
本発明の製剤の投与は様々な形態、経口、皮下、静脈内、大脳内、鼻腔内、経皮的、腹腔内、筋肉内、肺内、経膣的、直腸内、眼内投与または任意の他の許容可能な方法で行うことが可能であるが、これらに限定されるものではない。ポンプ（例えば皮下浸透圧ポンプ）または移植などの当技術分野で周知の技術を使用しボーラス注射が許容可能であるにもかかわらず、製剤は点滴にて連続的に投与することが可能である。ある症例では、製剤は溶液またはスプレーとして直接塗布してもよい。 
【０３４３】
非経口投与薬
医薬組成物の例としては、非経口投与のために設計された溶液が含まれる。多くの症例で薬剤溶液製剤は即時に使用するのに適当な液体の形態で提供されているが、該非経口製剤は冷凍形態で、または凍結乾燥形態で提供されてもよい。前者の例では、組成物は使用前に解凍しなければならない。後者の形態は、より多岐にわたる保存条件下で組成物中に含まれる活性化合物の安定性を促進するためによく使用される。何故なら凍結乾燥した調製物は概してその液体形態よりも安定していることが当業者に認識されているからである。該凍結乾燥した調製物は、注射用滅菌水または滅菌生理食塩水などの１つ以上の好適な医薬的に許容可能な希釈剤を添加することによって、使用前に再構成する。
【０３４４】
非経口投与薬は凍結乾燥製剤または水溶液として保存するために、必要に応じて、所望の純度のポリペプチドと、当技術分野で典型的に使用されている１つ以上の医薬的に許容できる担体、賦形剤または安定剤（これらすべては「賦形剤」と称する）、例えば緩衝剤、安定薬剤、保存料、等張化剤、非イオン洗剤、酸化防止剤および／または他の様々な添加物とを混合することによって調製してよい。
【０３４５】
緩衝剤は、生理学的条件に近づく範囲にｐＨを維持するために役立つ。典型的には緩衝剤は約２ｍＭから約５０ｍＭの濃度範囲で存在する。本発明で使用するのに好適な緩衝剤には、クエン酸バッファー（例えばクエン酸モノナトリウム−クエン酸ジナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸トリナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸モノナトリウム混合物等）、コハク酸バッファー（例えばコハク酸−コハク酸モノナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸ジナトリウム混合物等）、酒石酸バッファー（例えば酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物等）、フマル酸バッファー（例えばフマル酸−フマル酸モノナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸ジナトリウム混合物、フマル酸モノナトリウム−フマル酸ジナトリウム混合物等）、グルコン酸バッファー（例えばグルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物等）、シュウ酸バッファー（例えばシュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物等）、乳酸バッファー（例えば乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物等）および酢酸バッファー（例えば酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物等）などの有機および無機酸ならびにその塩が含まれる。追加としてリン酸バッファー、ヒスチジンバッファーおよびＴｒｉｓなどのトリメチルアミン塩が含まれる可能性がある。
【０３４６】
保存料は微生物の増殖を遅延させるために添加し、典型的には約０．２％〜１％（w/v）という量で添加する。本発明で使用するのに好適な保存料には、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、ハロゲン化ベンザルコニウム（例えば塩化、臭化またはヨウ化ベンザルコニウム）、塩化ヘキサメトニウム、メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノールおよび３−ペンタノールがある。
【０３４７】
等張化剤は液体組成物の等張性を確実にするために添加し、多価糖アルコール、好ましくはグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールなどの三価以上の糖アルコールが含まれる。多価アルコールは、他の成分の相対量を考慮し、総重量中０．１％〜２５％、典型的には１％〜５％の範囲で存在することが可能である。
【０３４８】
安定剤は、膨張性薬剤から添加物までの機能におよび得る賦形剤の範囲を意味し、治療薬を可溶化し、あるいは変性や容器壁への付着を防止することに役立つ。典型的な安定剤は、（上に列挙した）多価糖アルコール；アルギニン、リシン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニン等などのアミノ酸、イノシトールなどのシクリトールを含む、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロール等などの有機糖または糖アルコール；ポリエチルグリコール；アミノ酸ポリマー；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウムなどの硫黄含有還元剤；低分子量ポリペプチド（すなわち＜１０残基）；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；キシロース、マンノース、フルクトースおよびグルコースなどの単糖；ラクトース、マルトースおよびスクロースなどの二糖；ラフィノースなどの三糖、およびデキストランなどの多糖であり得る。安定剤は典型的に、活性タンパク質量に対して０．１〜１０，０００重量部の範囲で存在する。
【０３４９】
（「湿潤剤」としても知られる）非イオン界面活性剤または洗剤は、治療薬を安定化することならびに治療ポリペプチドの攪拌誘発凝集を防止することを支援するために存在し、ポリペプチドを変性せずに、せん断面応力にさらされる処方をも可能にする。好適な非イオン界面活性剤には、ポリソルベート（２０、８０等）、ポリオキサマー（１８４、１８８等）、Pluronic（登録商標）、ポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（Tween（登録商標）-20、Tween（登録商標）-80等）が含まれる。
【０３５０】
追加的な種々の賦形剤には、膨張性薬剤または充填剤（例えばスターチ）、キレート剤（例えばＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）および共溶媒が含まれる。
【０３５１】
有効成分は、例えばコアセルベーション技術または界面重合で調整したマイクロカプセル、例えばコロイド薬送達システム（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョンにおけるヒドロキシメチルセルロース、ゼラチンまたはポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに封入してもよい。該技術は、上述のRemington's Pharmaceutical Sciencesに開示している。
【０３５２】
インビボ投与に使用の非経口投与薬製剤は滅菌していなければならない。これは例えば滅菌ろ過膜でろ過することで容易になされる。
【０３５３】
徐放性調製物
徐放性調製物の好適な例としては、ポリペプチドまたは複合体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、該マトリックスはフィルムまたはマイクロカプセルなどの好適な形態を有する。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ハイドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸、Ｌ−グルタミン酸およびエチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、ProLease（登録商標）技術またはLupron Depot（登録商標）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから成る注射可能な微小球）およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日間まで、またはそれ以上といった長い期間にわたって分子が放出されるのを可能にする一方、特定のハイドロゲルは短期間のタンパク質を放出する。カプセル封入されたポリペプチドが長期間体内に残存する場合、３７℃で水分に接触した結果、変性または凝集する場合があり、それにより生物活性が喪失し、免疫原性が変化する可能性がある。関連したメカニズムに依存している安定化のために合理的戦略を考案することができる。例えば、凝集のメカニズムが、チオ−ジスルフィド交換を経た分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが分かれば、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含量を調節し、適当な添加物を使用し、また特定のポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成される可能性がある。
【０３５４】
経口投与
経口投与では、医薬組成物は固体または液体形態で、例えばカプセル、タブレット、懸濁液、乳濁液または溶液の形態でよい。医薬組成物は、所定量の有効成分を含む投薬単位の形態で作成されることが好ましい。ヒトまたは他の哺乳動物に対する好適な１日量は患者の状態および他の因子に非常に広く依存してよいが、通常の方法を用いて当業者が決定できる。
【０３５５】
経口投与に対する固体剤形としては、カプセル、タブレット、坐薬、パウダーおよび顆粒であってよい。該固体剤形において、有効化合物はスクロース、ラクトースまたはでんぷんなどの少なくとも１つの不活性希釈剤と混合してよい。該剤形は、通常の診療のように、添加物質、例えばステアリン酸マグネシウムなどの平滑剤を含んでもよい。カプセル、タブレットおよびピルの場合、剤形は緩衝剤を含んでもよい。タブレットおよびピルはさらに腸溶コーティングで調製できる。
【０３５６】
ポリペプチドまたは複合体は、ラクトース、スクロース、でんぷん粉末、アルカン酸のセルロースエステル、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウムおよびカルシウム塩、アカシア、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンおよび／またはポリビニルアルコールなどのアジュバントと混合してもよく、また通常投与用に錠剤にしてもカプセル封入してもよい。あるいは、それらを生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、油（コーン油、ピーナツ油、綿実油またはゴマ油）、トラガカントゴムおよび／または様々なバッファーに溶解してよい。投与の他のアジュバントおよびモードは医薬分野で周知である。担体または希釈剤は、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンなどの遅延物質を、単独あるいはワックスまたは当技術分野で周知の他の物質とともに含んでよい。
【０３５７】
該医薬組成物は、滅菌などの通常の製薬工程に供してもよく、および／または例えば本明細書の別の場所で開示された保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、バッファー、充填剤等などの通常アジュバント含んでもよい。
【０３５８】
経口投与用の液体剤形は、水などの当技術分野で通常使用の不活性希釈剤を含む、医薬的に許容可能なエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシル剤を含んでよい。該組成物は湿潤剤、甘味料、香味料および芳香剤などのアジュバントを含んでもよい。
【０３５９】
肺送達
ネブライザー、噴出機または超音波での使用に好適な製剤は典型的に、例えば１mLの溶液につき約０．０１〜２５mgの複合体、好ましくは約０．１〜１０mg/mLの濃度で、水中に溶解したポリペプチドまたは複合体を含むとされている。製剤はバッファーおよび単糖（例えばタンパク質安定化および浸透圧の調整用）を、および／または０．１〜１０mg/mlの濃度範囲のヒト血清アルブミンを含んでもよい。使用してもよいバッファーの例としては、酢酸ナトリウム、クエン酸塩およびグリシンが挙げられる。バッファーは、溶液のｐＨを３〜９に調整するのに適した組成物およびモル濃度を有することが好ましいとされている。該して、１mM〜５０mMのバッファーモル濃度が本目的に適している。利用し得る糖の例としては、ラクトース、マルトース、マンニトール、ソルビトール、トレハロースおよびキシロースがあり、通常、製剤の１〜１０重量％の範囲の量である。
【０３６０】
ネブライザー製剤は界面活性剤を含んで、エアロゾルを形成する場合の溶液の噴霧によって生じたタンパク質の表面誘発凝集を抑制または防止してもよい。様々な通常界面活性剤を使用することが可能で、例えばポリオキシエチレン脂肪酸エステルおよびアルコール、およびポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルが挙げられる。量は概して、製剤の０．００１〜４重量％の範囲であるとされている。本発明の目的に特に好ましい界面活性剤はポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートである。
【０３６１】
本発明の液体粒子の好適な分散を発生させる特定の製剤および方法は国際公開第９４／２００６９号、米国特許第５，９１５，３７８号、米国特許第５，９６０，７９２号、米国特許第５，９５７，１２４号、米国特許第５，９３４，２７２号、米国特許第５，９１５，３７８号、米国特許第５，８５５，５６４号、米国特許第５，８２６，５７０号および米国特許第５，５２２，３８５号に記載されており、これらは参照により本明細書に援用される。
【０３６２】
計量式吸入装置での使用のための製剤は概して、微分包散剤を含むとしている。この粉末は、液体複合体製剤を凍結乾燥し、次いで製粉することで生産し、またヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの安定化剤も含んでよい。典型的には、０．５％（w/w）を超えるＨＳＡを添加する。さらに、必要ならば１種以上の糖または糖アルコールを調製物に添加してよい。例として、ラクトース、マルトース、マンニトール、ソルビトール、ソルビトース、トレハロース、キシリトールおよびキシロースが含まれる。製剤に添加する量は、存在する複合体の約０．０１〜２００％（w/w）、好ましくは約１〜５０％の範囲にすることが可能である。該製剤はその後、所望の粒子径にするために凍結乾燥し、製粉する。
【０３６３】
適切にサイズ分けされた粒子をその後、界面活性剤を使用して噴霧剤に懸濁する。噴霧剤は本目的に対して採用された任意の通常の材料であってよく、例えばクロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボンまたはハイドロカーボンがあり、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノールおよび１，１，１，２−テトラフルオロエタンまたはそれらの組み合わせを含む。好適な界面活性剤には、トリオレイン酸ソルビタンや大豆レシチンがある。オレイン酸もまた界面活性剤として有用である可能性がある。この混合物はその後、送達手段に詰め込む。本発明に使用するのに適した市販の計量式吸入器の例として、Glaxo社（Research Triangle Park, NC, USA）製のVentolin計量式吸入器が挙げられる。
【０３６４】
粉末吸入器の製剤は複合体を含有する微粉化乾燥粉末を含むとされており、ラクトース、ソルビトール、スクロースまたはマンニトールなどの膨張性薬剤も含んでよい。その量は、粉末を装置から分散させることを容易にする量で、例えば製剤の５０〜９０重量％である。粉末の粒子は、約１g/cm2の密度を有する粒子に対応する肺中の空力的特性を持つものであり、平均粒子径は１０μm未満であり、好ましくは０．５〜５μmであり、最も好ましくは１．５〜３．５μmである。本明細書での教示にしたがって使用するのに適した粉末吸入器の例として、Fisons社（Bedford, MA, USA）製のSpinhaler粉末吸入器が挙げられる。
【０３６５】
これらの装置用の粉末は、米国特許第５，９９７，８４８号、米国特許第５，９９３，７８３号、米国特許第５，９８５，２４８号、米国特許第５，９７６５７４号、米国特許第５，９２２，３５４号、米国特許第５，７８５，０４９号および米国特許第５，６５４，００７号に開示されている方法によって生産および／または送達されてよい。
【０３６６】
治療製品の肺送達のために設計された機械装置としては、ネブライザー、計量式吸入器および粉末吸入器が含まれるがこれらに限定されるものではなく、これら全ては当業者によく知られている。本発明を実行するのに適した市販の装置の具体例として、Mallinckrodt 社（St. Louis, MO, USA）製のUltraventネブライザー；Marquest Medical Products 社（Englewood, CO, USA）製のAcorn IIネブライザー；Glaxo 社（Research Triangle Park, NC, USA）製のVentolin計量式吸入器；Fisons 社（Bedford, MA, USA）製のSpinhaler粉末吸入器、Nektar Therapeutics 社（San Carlos, CA, USA）の「standing cloud」装置；Alkermes 社（Cambridge, MA, USA）製のAIR吸入器；およびAradigm 社（Hayward, CA, USA）製のAERx肺薬剤送達システムが挙げられる。
【０３６７】
キット
本発明はまた、ポリペプチド、複合体、ポリヌクレオチド、発現ベクター、細胞、方法、組成物およびシステム、ならびに本発明の器具を含むキットを提供する。本発明のキットは、本発明の以下のもののうち少なくとも１つを任意で含む：（１）本明細書に記載の器具、システム、システム部品または器具の部品；（２）本発明のポリペプチドまたは複合体またはポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのキット部品；本発明のポリヌクレオチドをコードするプラスミド発現ベクター；本発明のポリペプチドを発現する細胞；または該部品のいずれかのうち少なくとも１つを含む組成物；（３）治療法または予防法を含む、本明細書に記載の任意の方法を実施するための説明書、（２）で同定された任意の部品、または該部品のうちの任意の組成物を使用するための説明書；および／もしくは本明細書に記載の任意の器具、システムまたは部品を操作するための説明書；（４）該前記部品または組成物のうちの少なくとも１つを保管するための容器、および（５）包装材料。
【０３６８】
さらなる態様では、本発明は、上記および本明細書に記述した任意の器具、部品、組成物またはキットの使用、本明細書に記載の任意の方法またはアッセイの実行、および／または本明細書に記載の任意のアッセイまたは方法を実行する任意の器具、部品、組成物またはキットの使用を提供する。
【０３６９】
実施例
以下の実施例は本発明を説明するために示すが、本発明の趣旨または範囲を決して限定するものではない。
【０３７０】
材料と方法
Ｉ．表面接触可能残基の判定
接触可能表面領域（ＡＳＡ）
コンピュータープログラムのAccess（B. LeeおよびF.M. Richards, J. Mol. Biol. 55: 379-400 (1971)）のバージョン２（（著作権）1983 Yale大学）を使用し、構造体の個々の原子の接触可能表面領域（ＡＳＡ）を算出した。本方法は典型的に、プローブサイズを１．４Åとし、接触可能表面領域（ＡＳＡ）をプローブの中心により形成された領域であると定義している。この計算に先んじて、他の原子がタンパク質に直接関係しているのは好ましくないので水分子および水素原子はすべて配位設定から除くことが好ましい。
【０３７１】
側鎖の画分ＡＳＡ
側鎖原子の画分ＡＳＡは、側鎖における原子のＡＳＡの合計を、拡張したＡＬＡ−ｘ−ＡＬＡトリペプチド中のそういった残基型の側鎖原子のＡＳＡを表す値別に分けることで算出される。Hubbard, Campbell & Thornton (1991) J. Mol. Biol. 220, 507-530を参照されたい。この実施例では、CA原子はグリシン残基の側鎖の一部と見なされるが、残留残基としては見なされない。以下の値は側鎖に対して標準的な１００％のＡＳＡとして使用される（表６）：
【表４】
2008545393.tif 000005
【０３７２】
構造体で検出されなかった残基を、柔軟領域中残基と考えて１００％曝露と定義する。ＮＭＲ構造の集合体を分析する場合、集合体の平均ＡＳＡ値を使用する。
【０３７３】
三次元構造が利用不能な場合の表面曝露残基の判定：
三次元構造が利用不能な場合、あるいは構造体が表面接触性を判定するに十分詳細ではない場合（例えばＣＡ原子の位置が分かってさえいれば）、表面接触性は以下のように作られる配列アラインメントから推論してよい：
Ａ：構造体が分かってはいるが表面接触性を判定するに十分詳細ではない場合：
構造ベースの配列アラインメントにおいて、あまり詳細ではない該構造体を、Molecular Simulations社製のMODELERプログラムを使用し、配列ファミリーの既知の構造体に含ませる。
Ｂ：構造が全く分からない場合：
配列を、配列ファミリーの既知の構造の配列を含む所定の配列アラインメントに配列し、プログラムClustalW の「プロファイル／構造アラインメント」のオプションを使用して調製してよい（Thompsonら、(1994) Nucleic Acids Research 22:4673-4680)。
【０３７４】
ＡまたはＢで得られた配列アラインメントから、既知の構造を有する他の配列の少なくとも１つに曝露した残基と同等の位置で分析する配列中の残基を、曝露していると定義する。曝露の程度は、他の配列中の同等の残基についての最大値であると考えられる。分析する配列が挿入部位である場合（すなわち他の配列中に同等残基が無い場合）、この残基はターン／ループ領域に位置している可能性が高いので、完全に曝露していると定義する。あまり詳細ではない構造が存在する場合、構造体に見られないこれらの残基は、柔軟領域にあると考えられるので完全に曝露していると定義する。
【０３７５】
原子間距離の判定：
原子間距離は、分子グラフィックスソフトウエア、例えばMolecular Simulations 社製のInsightII（登録商標）９８．０を使用して容易に判定する。
【０３７６】
ＩＩ．タンパク質発現および精製
乱雑になっているインターフェロンαポリペプチドをコードする配列をHerculase（Stratagene）またはPhusion（Finnzyme）ポリメラーゼを使用してＰＣＲ増幅し、ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩ制限部位を隣接領域中に導入した。ＰＣＲ産物をQiagenＰＣＲ精製キットで精製し、ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩ酵素（ＮＥＢ）で消化し、１％アガロースゲル上で分離した。適当なバンド（〜５２０ｂｐ）を切り取り、Qiagen Gel-extractionキットでＤＮＡ抽出した。このように得られた挿入ＤＮＡを、ｐＣＭＶ−Ｍｋａｎベクターの誘導体にライゲーションする（Punnonen J.ら、ＰＣＴ公報、国際公開公報第２００４／００７６６４号）。このベクターは、インターフェロン発現を操作するＣＭＶプロモーター、挿入部位のＮ末端のＩＦＮ−α５様シグナル配列、挿入部位のＣ末端のＥ−タグ（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ；配列番号３３４）およびＳ−タグ（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ；配列番号３３５）、ならびに大腸菌での選択のためのカナマイシンマーカーを含んでいる。得られた連結体をQiagenＰＣＲ精製キットで脱塩し、１０mMのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０バッファーに再懸濁し、１〜２μlを、販売元が指定したXL1-Blue Electroporationコンピテント細胞（Stratagene）へとエレクトロポレーションした。
【０３７７】
トランスフェクトの１日前に、５〜８ｘ１０６のＣＯＳ−７細胞を、抗生物質および１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Hyclone）を補った３５mlのＤＭＥＭのＴ１７５フラスコに播種した。トランスフェクトの直前に、培地を吸引し、１０mlのOptiMEM （Gibco/Invitrogen）で一回洗い流した後、抗生物質を補った３５mlのOptiMEMと取り替えた。各Ｔ１７５フラスコでは、トランスフェクト混合物を以下のように調製した：１mlのOptiMEM＋５０ulのFugene6 Transfection Reagent（Roche Diagnostics）を室温で５分間インキュベートした。このとき、１０mgの無内毒素ＤＮＡ（メーカーのプロトコールに記載のとおりに調整したQiagen endotoxin-free maxiprep）を添加し、混合物を、細胞に添加する前に室温でさらに３０分間インキュベートした。２４時間後に粗上清を回収し、１０００rpmで１０分間遠心分離して透明にし、−８０℃で保存した。
【０３７８】
インターフェロンポリペプチドを、AKTA Explorer HPLCシステム（Amersham）を使用して粗上清から精製した。約１４０ml（４つのＴ１７５フラスコから得た上清）を、ＰＢＳで平衡化したＥ−タグカラム（RPAS Purification module, Amersham 71-5000-87)に装填した。初めにカラム４つ分の量のＰＢＳ（ｐＨ７．４）でカラムを洗浄し、その後カラム３つ分の量のBuffer B1（２０mMのＮａＯＡｃ、１５０mMのＮａＣｌ、１mMのＥＤＴＡ、ｐＨ５．０）で洗浄した。カラム３つ分の量について、タンパク質を低ｐＨのBuffer B2（３０mMのクエン酸、１５０mMのＮａＣｌ、１mMのＥＤＴＡ、ｐＨ３．０）の段階溶出で溶出した。主要なＵＶ吸収ピーク（約６ml）を７００μlの１MのＴｒｉｓ（ｐＨ ８．０）に集め、ｐＨを中和し、４℃で保存した。１０kDaのMWCO Pierce 透析カセット／スライドを使用した透析により、Sterile Water For Irrigation （ＷＦＩ；B. Braun Medical Inc.)中で、タンパク質試料を２０mMのＴｒｉｓ ｐＨ８．０にバッファー交換し、次いでAmiconユニット（１０kDaのMWCO）を使用し、３５００rpm、４℃で１５分間遠心分離し濃縮した。タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡ（Pierce cat #23210)を使用したＢＣＡタンパク質アッセイキットで測定し、５％ＢＳＡ／ＰＢＳ（ｐＨ６．５）中で処方し、−８０℃で保存するために等分した。
【０３７９】
ＩＩＩ．活性アッセイ
ＩＦＮＡＲ結合アッセイ
ヒトインターフェロンα受容体（ＩＦＮＡＲ）へのインターフェロンαポリペプチドの結合は、フローサイトメトリー競合結合アッセイで測定してもよい。このアッセイは、ＩＦＮＡＲ発現細胞源としてヒトリンパ腫細胞系（Ｄａｕｄｉ）を、トレーサーとしてビオチン化ＩＦＮ−α参照ポリペプチドを、検出用にフィコトリエン共役ストレプトアビジン（ＳＡ−ＰＥ）を使用している。
【０３８０】
すなわち、Ｄａｕｄｉ細胞を、試験される様々な濃度の非標識ポリペプチド（「競合」ポリペプチド）とともに、約４時間、ビオチン化ＩＦＮ−α参照ポリペプチド（「トレーサー」ポリペプチド）の存在下で、そのＫＤと等しい一定の濃度でインキュベートする。競合ポリペプチドの各濃度でＩＦＮＡＲと結合したままでいるトレーサーポリペプチドの量は、その後ＳＡ−ＰＡで染色し、フローサイトメトリーによる評価で判定する。トレーサー結合を５０％（ＥＣ５０値）減少させる競合ポリペプチド濃度は、インターフェロンα受容体に対する競合ポリペプチドの内因性結合親和性に直接関連している。
【０３８１】
ＤａｕｄｉヒトＢ細胞リンパ腫細胞系はAmerican Tissue Culture Collection（ATCC #CCL-213)から入手してもよい。３０日未満、培地内に保管しているＤａｕｄｉ細胞で、競合結合アッセイを行う。Ｄａｕｄｉ細胞は、１０％のウシ胎仔血清（Hyclone, #SH30071.03)、グルコース４．５g/L（Sigma #G8769、４５０g/L）、ピルビン酸ナトリウム１mM（Gibco, #11360-039、１００mM）、ペニシリン（１００U/ml）およびストレプトマイシン（１００mg/ml）を含む完全なRPMI1640培地（BioWhittaker #BE12-702F/U1)で培養する。３７℃の加湿したインキュベーター中、５％のＣＯ２雰囲気下で、週２、３回新鮮な培地を添加し週１回培地を交換することで０．５ｘ１０６〜２ｘ１０６細胞個/mLの細胞濃度で細胞を保管する。
【０３８２】
メーカーのプロトコールを用いて、EZ-Link（登録商標）NHS-PEO Solid Phase Biotinylation Kit（Pierce Biotechnology, Inc., product # 21450)を使用してＩＮＦα参照ポリペプチド（例えばヒトＩＦＮ−α２ａなど）をビオチン化することによってトレーサーポリペプチドを調製する。メーカーのプロトコールを用いて、EZ Biotin Quantitation Kit（Pierce Biotechnology, Inc., product # 28005)を使用して、トレーサーポリペプチドのモル濃度に対するビオチンのモル濃度を定量する。トレーサーポリペプチドの様々な量でＤａｕｄｉ細胞をインキュベートし、ＳＡ−ＰＥ（BD Pharmingen社製、製品番号#554061、またはDako社製、製品番号#R0438)で細胞を処理して、Ｄａｕｄｉ 細胞に結合するトレーサーポリペプチドのＫＤを判定する。トレーサーの特定の濃度についての平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、１つの細胞に対する結合リガンドの量の指標である。ＳＡ−ＰＥのみで検出したバックグラウンドを、得られたＭＦＩ値から減算し、その後これらの値をトレーサーの濃度に対してプロットし、飽和結合曲線を求める。この曲線から、非線形回帰、一部位曲線当てはめを利用してＫＤを算出する。続く競合結合アッセイで、トレーサーの濃度としてこのＫＤを使用する。
【０３８３】
競合結合アッセイでは、Ｄａｕｄｉ細胞を、１ウェル５０ulにつき２００，０００細胞の濃度で、２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）をプラスしたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の９６ウェル丸底アッセイプレート（VWR, #29442-066など） に添加する。競合ポリペプチドの８〜１２の倍数希釈物を、例えば４μM〜１pMの範囲で調製する。１００μLの２倍希釈競合調製物を細胞プレートに移し、最終競合濃度を各ウェル例えば２μM〜０．５pMにする。（上述のとおり）４倍ＫＤの５０μLのビオチン化トレーサーポリペプチドを、競合をプラスした１５０ulの細胞に添加し、アッセイにおける１倍ＫＤの終濃度にする。プレートを軌道シェーカー上で間欠振盪しながら４℃で４時間インキュベートする。次いで細胞を、２％ＦＢＳをプラスしたＰＢＳで洗浄し、その後５０ulのＳＡ−ＰＥ（２５倍希釈のBD Pharmingen #554061または４０倍希釈のDako #R0438)を使用し、氷上で遮光し３０分間染色を行う。続いて細胞を、２％ＦＢＳをプラスしたＰＢＳで２回洗浄し、その後、多ウェルオートサンプラー（BD Bioscience）、CellQuestProソフトウエア（BD Bioscience）および多ウェルプレート管理ソフトウエア、MPM ver3.1（AMS CytekまたはBD Bioscience）を使用しフローサイトメトリー（FacsCalibur, BD Bioscience）によって回収する。
【０３８４】
（トレーサーまたは競合の非存在下でＳＡ−ＰＥで染色した細胞のＭＦＩと定義した）バックグラウンドＭＦＩを各競合濃度で発生したＭＦＩから減算する。得られた値を競合濃度の関数としてプロットし、非線形回帰、一部位競合結合分析方程式を用いてＥＣ５０値を決定する。 
【０３８５】
ＨｅＬａ−ＥＭＣＶ抗ウイルスアッセイ
下記に挙げたものは、本発明のインターフェロンαポリペプチドおよび複合体の抗ウイルス活性についてのアッセイの好適な例である。アッセイは、薬剤の抗ウイルス作用強度を評価するために使用される細胞ベースの用量反応アッセイであり、「細胞変性効果からの保護」（またはＰＣＰＥ）アッセイと称されることがあり、また細胞変性効果（ＣＰＥ）の阻害アッセイとも称される。すなわち、細胞を薬剤とともにインキュベートし、ウイルスに接触させる。薬剤が存在しない状態では、ウイルスに接触した細胞は死滅する。薬剤の濃度が高い場合、細胞生存率も高くなる。生存細胞の数は、代謝速度を見積もることで直接に（例えば目視計数）または間接的に測定できる。例えば、ＭＴＴまたはＷＳＴ−１などの代謝染料を、細胞生存の間接的測定として使用してよい。生存細胞は該染料を代謝し、分光光度法（光学密度）により定量できる代謝産物を形成する。
【０３８６】
材料と試薬：
ＨｅＬａ細胞：ヒト子宮頸癌細胞系（ATCC # CCL-2)。ＨｅＬａ細胞系は、３５歳の女性の子宮頸部腺癌から得た。ＨｅＬａ細胞はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ−１８）配列を含むと報告される。細胞系は継代数１０７でのＡＴＣＣから受け取った。
【０３８７】
Ｌ−９２９細胞：マウス線維芽細胞系（ATCC # CCL-1)。Ｌ−９２９細胞系は、１９４８年に親株、株Ｌの継代９５から単離した単一細胞クローンである。株Ｌは、正常１００日齢の雄Ｃ[３]Ｈ／Ａｎマウスの疎性結合組織および脂肪組織から単離した。
【０３８８】
脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）：組織培養適合株（ATCC # VR-129B）。脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）の組織培養適合株をATCC（# VR-129B）から購入した。ＨｅＬａ抗ウイルスアッセイでは、高力価ＥＭＣＶのストックをＬ９２９細胞中で作成した。Ｌ９２９で作成したウイルスのストックのウイルス力価は、Ｌ９２９細胞のプラークアッセイの結果に基づいて４．０ｘ１０８PFU/mlであった。
【０３８９】
完全ＭＥＭ：
最小必須培地（MEM、Gibco Cat. No. 10370-021)
１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Hyclone Cat. No. SH30071.03)
１ｘペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン（ＰＳＧ、Gibco Cat. No. 10378-016)
１mMのピルビン酸ナトリウム（Gibco Cat. No. #11360-070)
還元血清ＭＥＭ：
最小必須培地（MEM、Gibco Cat. No. 10370-021)
２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Hyclone Cat. No. SH30071.03)
１ｘペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン（ＰＳＧ、Gibco Cat. No. 10378-016)
１mMのピルビン酸ナトリウム（Gibco Cat. No. #11360-070)
トリプシン／ＥＤＴＡ（Gibco Cat. No. 25300-054)
ＷＳＴ−１（Roche; Cat. No. 1 644 807)
【０３９０】
ＨｅＬａ細胞は、加湿５％ＣＯ２インキュベーターで、３７℃の完全ＭＥＭ中で維持した。細胞をトリプシンで回収し、Ｔ１７５フラスコ中で２５mlにつき２〜４ｘ１０６細胞という最終密度へとコンフルエントな状態になったとき週２回分割した。アッセイの一日前に細胞をトリプシン処理し、２５mlにつき６ｘ１０６細胞という密度で新たなＴ１７５フラスコに播種し、アッセイ前に細胞が対数期に確実に入るようにした。
【０３９１】
ＨｅＬａ−ＥＭＣＶ抗ウイルスアッセイ手順：
アッセイの１日目に、対数期ＨｅＬａ細胞をトリプシンで回収し、還元血清ＭＥＭに再懸濁し遠心分離で濃縮した。細胞の５つのＴ１７５フラスコに対応する細胞ペレットを１０mlの還元血清ＭＥＭに再懸濁し、４０ミクロンのナイロン細胞ろ過器でろ過し、Coulter Counterで計数した。細胞生存能を、血球計数器を用いてトリパンブルー排除によって判定した。細胞を還元血清ＭＥＭに再懸濁し、最終密度を１ｘ１０５細胞/mlにした。１００μLの希釈細胞を９６ウェルアッセイプレート（１ｘ１０４細胞／ウェル）の各ウェルに添加し、プレートを加湿５％ＣＯ２インキュベーターで、３７℃で２４時間インキュベートした。
【０３９２】
本発明の「参照」インターフェロンαおよびインターフェロンαポリペプチド（いわゆる「試験サンプル」）の作用強度を用量反応分析で判定した。概して、１プレートにつき９つの試験サンプルおよび１つの参照ＩＦＮ−αがあった。１アッセイにつき、複製プレートの単一曲線として各サンプルを試験した。１アッセイにつき４つの異なる参照を試験し、２つを複製において試験し、６つの複製物のうち１つは一貫したアッセイの質と性能を確実にするものであった。２つのアッセイを２人の異なるオペレーターで週１回行い、アッセイを全工程で２週間行い、合計で４回の独立したアッセイを行った。週毎に、２回のアッセイにおいて、１プレートについてサンプルと参照を異なる配置にし、サンプルの配置による何らかの影響を制御した。参照ＩＦＮ−αの用量反応曲線は概して、参照に依存して１００ng/ml〜１ng/mlの範囲の初期希釈物とともに８つの５倍希釈物から構成されていた。最終希釈物はその後０．００１３ng/ml〜０．００００１ng/mlの範囲になる。ＩＦＮ−α試験サンプルでは、５倍希釈物は１ng/ml〜０．００００１ng/mlの範囲であった。細胞の８つのウェルをウィルスで処理し、ＩＦＮでは処理せず、各プレートには対象として８個の細胞のみが含まれていた。
【０３９３】
ＩＦＮ−α希釈物を、還元血清ＭＥＭを用いて調製した。１００μLの希釈ＩＦＮ−α調製物をアッセイプレートに移した。アッセイプレートを加湿５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１６時間インキュベートした。
【０３９４】
３日目、細胞をＥＭＣウイルスに攻撃させた。培地をアッセイプレートの各ウェルから吸引した。ＥＭＣＶストックをＭＥＭ＋２％ＦＢＳで１：１６７に希釈した。３ｘ１０５個のウイルス粒子に対応する１００μLの希釈ウイルスを各ウェルに添加した。細胞を加湿５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間インキュベートした。
【０３９５】
４日目、各ウェルの生存細胞の数をＷＳＴ−１で定量した。ＷＳＴ−１試薬は還元血清ＭＥＭに１：２．３に希釈し、１３μlの希釈ＷＳＴ−１試薬を、ウイルスをプラスした１００μlの培地または培地のみを含む各ウェルに、最終希釈が１：２０になるように添加した。プレートを加湿５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で６０分間インキュベートした。各ウェルの生存細胞の数を、プレートリーダーで４５０nmでのＯＤを測定することによって定量した。
【０３９６】
分析：
参照ＩＦＮ−αおよび試験サンプルの抗ウイルス作用強度を次式で算出した：
抗ウイルス作用強度＝（生存細胞Ｃ＋Ｉ＋Ｖ−生存細胞Ｃ＋Ｖ）／（生存細胞Ｃ＋Ｉ−生存細胞Ｃ＋Ｖ）＊１００％
式中、Ｃ＋Ｖ＝細胞＋ＥＭＣＶ、Ｃ＋Ｉ＝細胞＋ＩＦＮ−αおよびＣ＋Ｉ＋Ｖ＝細胞＋ＩＦＮ−α＋ＥＭＣＶ
用量反応曲線を、GraphPad Prism 4（GraphPad Software Inc.）を使用した非線形回帰で分析した。下式は曲線当てはめに使用した：
【表５】
2008545393.tif 000006
【０３９７】
ＢｏｔｔｏｍはボトムプラトーでのＹ値である；ＴｏｐはトッププラトーでのＹ値であり、ＬｏｇＥＣ５０は、反応がボトムとトップの中間にあるときのＸ値である。Levenberg-Marquardt法を最適化アルゴリズムとして使用した。
【０３９８】
ＴＨ１分化アッセイ
以下に挙げるものは、本発明のインターフェロンαポリペプチドおよび複合体のＴＨ１分化活性に対するアッセイの好適な例である。
【０３９９】
アッセイ手順：
５００mlの血液から調製した白血球および赤血球を含むヒト軟膜（２５〜３０ml）を、アッセイ開始の日（アッセイ当日の１日前）にStanford Blood Bankから取り寄せ、室温で一晩保存した。各軟膜をＴ７５フラスコに注意深く移し、ＰＢＳで１００mlに希釈した。各軟膜に対して、１３mlのHistopaque/Ficoll（Sigma H8889)を４つの５０ml遠心管の中にピペットで移し、２５mlの希釈血液サンプルを、界面を壊さないようにHistopaque/Ficollの上に注意深く重ねた。次に試験管を２０分間遠心分離した（２０℃、２５００rpm）。プラスチック製の移送用３mlピペットを使用し、ＰＢＭＣを含む単核細胞層を２つの５０ml円錐管に移した（細胞を２つのHistopaque／Ficoll／軟膜試験管から１つの試験管に移した）。次にＰＢＭＣを、５０ml／試験管の割合にてＰＢＳで希釈し、１０分間遠心分離し（２０℃、１０００rpm）、血小板を除去した。ＰＢＳの除去後、ＰＢＭＣおよび残留ＲＢＣを混合し凝集を防止した。１０mlのＲＢＣ溶解バッファー（塩化アンモニウムバッファー）を添加し、２つの試験管にある細胞を１つにまとめた。１人のドナーから単離したＰＢＭＣおよびＲＢＣをそのときに含んでいる各試験管を室温で１０分間インキュベートした。細胞を細胞ろ過器（７０um、Falcon Cat. No. 2350)でろ過して血液細胞が凝固しないようにした。総量が５０mlになるようにＰＢＳを添加し、その後１０分間遠心分離（２０℃、１０００rpm）した。最後に細胞数を、血球計数器を使用して計数した。
【０４００】
次に、各ＰＢＭＣ調製物の画分を事前に染色し、ＦＡＣＳで分析し、ｎａｉｖｅ ＴＨ０細胞の割合が１５％を超えるＰＢＭＣ調製物を選択した。３００μlのＰＢＭＣを、２０μlのFITC共役抗ヒトＣＤ４５ＲＡ（Pharmigen, Cat. No. 555488)、２０μlのCy-chrome 共役抗ヒトＣＤ４（Pharmigen, Cat. No. 555348)、５μlのＰＥ共役抗ヒトＣＤ８（Pharmigen, Cat. No. 555367)、５μlのＰＥ共役抗ヒトＣＤ１４（Pharmigen, Cat. No.555398)、および５μlのＰＥ共役抗ヒトＣＤ２０（Pharmigen, Cat. No.555623)で染色し、氷上で４５分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、１mlのＰＢＳに再懸濁し、４０μmの細胞ろ過器（Falcon, Cat. No. 2340)でろ過した。ｎａｉｖｅ ＴＨ０細胞（positive to ＣＤ４およびＣＤ４５ＲＡに陽性、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ２０に陰性）の割合をＦＡＣＳで定量し、１５％を超えるｎａｉｖｅ ＴＨ０細胞を有するＰＢＭＣ調製物をアッセイ用に選択した。
【０４０１】
選択したＰＢＭＣ調製物を５００μlのＦＩＴＣ共役抗ヒトＣＤ４５ＲＡ、５００μlのCy-chrome共役抗ヒトＣＤ４、２００μlのＰＥ共役抗ヒトＣＤ８、５０μlのＰＥ共役抗ヒトＣＤ１４および５０μlのＰＥ共役抗ヒトＣＤ２０で染色し、氷上で６０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＩを添加し、１０mlのＰＢＳで細胞を希釈し、４０μmの細胞ろ過器でろ過した。細胞をＦＡＣＳで選別し、１ｘ１０４のｎａｉｖｅ ＴＨ０細胞（ＣＤ４およびＣＤ４５ＲＡに陽性、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ２０に陰性）を、ペニシリン−ストレプトマイシンおよび２mMのグルタミンをプラスした１６０μlのDMEMおよび１０％のウシ胎仔血清（Hyclone Cat. No. SH30071.03)を含む９６ウェル丸底プレートの各ウェルに、ＭＯＦＬＯによって移した。
【０４０２】
１箇所につき７μlのDynabeads CD3/CD28 T細胞増幅剤（Dynal, Cat. No.111.32)を各ウェルに添加した。実験に先立ってDynabeadsの促進作用を較正し、ロット間の相違を回避した。次に、２０μl/ウェルタンパク質サンプルをアッセイプレートに添加した。概して、ＩＬ−４およびＩＬ−１２の標準品（R&D Systemsから入手）の濃度範囲は０．０４pg/ml〜１０ng/mlであり、ＩＦＮ−α試験サンプルおよびＩＦＮ−α参照サンプルの濃度範囲は０．７６pg/ml〜２００ng/mlであった。
【０４０３】
細胞を加湿５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で６日間インキュベートした。各ウェルから上清を回収し、標準ＥＬＩＳＡ（R&D Systems, Cat. # DIF50)を利用して、ＩＦＮγ含有量を定量することでＴＨ１分化の程度を判定した。
【０４０４】
分析：
反応＝ＩＦＮ−γ濃度（pg/ml）
下式は曲線当てはめに使用した：
【表６】
2008545393.tif 000007
【０４０５】
変更可能なＢｏｔｔｏｍはボトムプラトーでのＹ値である；ＴｏｐはトッププラトーでのＹ値であり、ＬｏｇＥＣ５０は、反応がボトムとトップの中間にあるときのＸ値である。Levenberg-Marquardt法を最適化アルゴリズムとして使用した。
【０４０６】
Ｄａｕｄｉ 抗増殖アッセイ
下記に挙げたものは、本発明のインターフェロンαポリペプチドおよび複合体の抗増殖活性についてのアッセイの好適な例である。
【０４０７】
材料：
Ｄａｕｄｉ細胞：ヒトＢｕｒｋｉｔｔ’ｓリンパ腫細胞（ATCC Number: # CCL-213)。
完全ＲＰＭＩ：
RPMI 1640（RPMI, Gibco Cat. No. 11875-143)
１０％ウシ胎仔血清（FBS, Hyclone Cat. No. SH30071.03)
１ｘペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン（ＰＳＧ、Gibco Cat. No. 10378-01
【０４０８】
懸濁液中で培養したＤａｕｄｉ  Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓリンパ腫細胞を、加湿５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で、５０mlの完全ＲＰＭＩを含むＴ１７５組織培養フラスコで保管した。細胞をコンフルエントな状態になったとき１：１０に分割した。
【０４０９】
アッセイ手順：
Ｄａｕｄｉ細胞を沈降させ、１ｘＰＢＳで洗浄した。細胞数を１０５細胞/mlに調整した。８０μlの培地を、９６ウェルの丸底アッセイプレートの各ウェルに添加し、その後１００μlの細胞（１０４細胞／ウェル）を各ウェルに移した。
【０４１０】
ＩＦＮ−α参照物質およびＩＦＮ−α試験サンプルの、２００ng/ml〜０．２pg/ml（４倍希釈）の範囲の１１個の希釈物を、培地を用いた希釈プレート中で調製した。次いで２０μlの希釈ＩＦＮ−α調製物をアッセイプレートに移した。
【０４１１】
細胞を加湿５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃でインキュベートした。４８時間後に１μCiのメチル−３Ｈ  チミジン（Amersham Pharmacia, Cat. No. TRK758)を各ウェルに添加し、その後加湿５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で２４時間インキュベートした。翌日、細胞を回収し、チミジンの取り込みを判定した。
【０４１２】
あるいは、インターフェロン処理の後に培地ウェルに存在するＡＴＰの量に基づいて、生存している代謝的に活性なＤａｕｄｉ細胞の数を測定することによってＤａｕｄｉ抗増殖アッセイを行ってもよい。この手順では、８０００個のＤａｕｄｉ細胞を、９６ウェルの丸底アッセイプレート中に５０μlの量で添加する。インターフェロン希釈液の追加に先立って細胞を５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２時間インキュベートさせる。インターフェロンは、一般的に５〜１０ng/mlから開始し６倍希釈（９箇所）する。インターフェロンの追加後に、加湿５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７２時間インキュベートする。次いで各ウェルの生存細胞の数を、１００μlのCellTiter-Glo（商標）（Promega, Cat #G7572)を添加して判定する。細胞とCellTiter-Glo（商標）試薬とを２分間混合し、遮光して室温で３０〜６０分間インキュベートする。各ウェルの蛍光シグナルの量をAnalyst HT 装置を使用して判定する。
【０４１３】
分析：
参照ＩＦＮ−αおよびサンプルのＥＣ５０を、式を用いて算出した：
【表７】
2008545393.tif 000008
【０４１４】
式中ＢｏｔｔｏｍはボトムプラトーでのＹ値である；ＴｏｐはトッププラトーでのＹ値であり、ＬｏｇＥＣ５０は、反応がボトムとトップの中間にあるときのＸ値である。Levenberg-Marquardt法を最適化アルゴリズムとして使用した。
【０４１５】
実施例１： インターフェロンαの表面接触可能残基の判定
ヒトインターフェロンα２ａ残基の表面曝露：
Klausら、J. Mol. Biol., 274: 661-675 (1997)で報告したヒトインターフェロンα２ａの２４個のＮＭＲ構造体に基づいて、側鎖の画分ＡＳＡを算出した。下記で用いられた配列の番号付けはヒトインターフェロンα２ａタンパク質に基づいている（配列番号３２２として本明細書に同定されている）。この構造体は、それぞれＣｙｓ１−Ｃｙｓ９８およびＣｙｓ２９−Ｃｙｓ１３８を含む２つのジスルフィド架橋を有していることはよく知られている。ＡＳＡおよび画分ＡＳＡを算出し、２４個の構造体の平均を求め、側鎖のＡＳＡに注視することによって、以下の残基について画分ＡＳＡが２５％を超えていると判定した：Ｄ２、Ｌ３、Ｐ４、Ｑ５、Ｔ６、Ｈ７、Ｓ８、Ｌ９、Ｇ１０、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｍ１６、Ａ１９、Ｑ２０、Ｒ２２、Ｋ２３、Ｉ２４、Ｓ２５、Ｌ２６、Ｆ２７、Ｓ２８、Ｌ３０、Ｋ３１、Ｒ３３、Ｈ３４、Ｄ３５、Ｇ３７、Ｑ４０、Ｅ４１、Ｅ４２、Ｇ４４、Ｎ４５、Ｑ４６、Ｑ４８、Ｋ４９、Ａ５０、Ｅ５１、Ｅ５８、Ｑ６１、Ｑ６２、Ｎ６５、Ｓ６８、Ｔ６９、Ｋ７０、Ｄ７１、Ｓ７３、Ａ７４、Ｄ７７、Ｅ７８、Ｔ７９、Ｌ８０、Ｄ８２、Ｋ８３、Ｔ８６、Ｙ８９、Ｑ９０、Ｎ９３、Ｄ９４、Ｅ９６、Ａ９７、Ｖ９９、Ｉ１００、Ｑ１０１、Ｇ１０２、Ｖ１０３、Ｇ１０４、Ｔ１０６、Ｅ１０７、Ｔ１０８、Ｐ１０９、Ｌ１１０、Ｍ１１１、Ｋ１１２、Ｅ１１３、Ｄ１１４、Ｌ１１７、Ｒ１２０、Ｋ１２１、Ｑ１２４、Ｒ１２５、Ｔ１２７、Ｌ１２８、Ｋ１３１、Ｅ１３２、Ｋ１３３、Ｋ１３４、Ｙ１３５、Ｓ１３６、Ｐ１３７、Ｃ１３８、Ａ１４５、Ｍ１４８、Ｒ１４９、Ｓ１５２、Ｌ１５３、Ｎ１５６、Ｑ１５８、Ｅ１５９、Ｓ１６０、Ｌ１６１、Ｒ１６２、Ｓ１６３、Ｋ１６４ およびＥ１６５であり、位置の番号付けは、配列番号３２２として本明細書で同定されているヒトインターフェロンα２ａ配列のものと関連している。
【０４１６】
以下の残基について、その側鎖の画分ＡＳＡが平均５０％を超えていると判定した：Ｄ２、Ｌ３、Ｐ４、Ｑ５、Ｔ６、Ｈ７、Ｓ８、Ｌ９、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｍ１６、Ａ１９、Ｓ２５、Ｆ２７、Ｓ２８、Ｋ３１、Ｒ３３、Ｈ３４、Ｄ３５、Ｇ３７、Ｅ４１、Ｇ４４、Ｎ４５、Ｑ４６、Ｑ４８、Ｋ４９、Ｎ６５、Ｋ７０、Ａ７４、Ｄ７７、Ｅ７８、Ｔ７９、Ｄ８２、Ｋ８３、Ｔ８６、Ｙ８９、Ｑ９０、Ｎ９３、Ｄ９４、Ｉ１００、Ｑ１０１、Ｇ１０２、Ｇ１０４、Ｔ１０６、Ｅ１０７、Ｔ１０８、Ｐ１０９、Ｌ１１０、Ｅ１１３、Ｄ１１４、Ｌ１１７、Ｒ１２０、Ｋ１２１、Ｑ１２４、Ｒ１２５、Ｌ１２８、Ｋ１３１、Ｅ１３２、Ｋ１３４、Ｐ１３７、Ｒ１４９、Ｅ１５９、Ｌ１６１、Ｒ１６２、Ｓ１６３、Ｋ１６４およびＥ１６５、であり，位置の番号付けは、配列番号３２２として本明細書に同定されているヒトインターフェロンα２ａ配列のものと関連している。
【０４１７】
配列番号１に対応する残基の表面曝露
例えばインターフェロンα２ｂ（配列番号３２１）インターフェロンα２ａ（配列番号３２２）などのヒトインターフェロンα２サブタイプの位置４４の後のアミノ酸挿入のために、−− 全ての既知のヒトインターフェロンα配列（ＩＦＮ−α２サブタイプとは別に）および本発明の特定のポリペプチドを含む多くのインターフェロンα配列において、表面曝露残基の位置番号付けは、例えばアラインメントの図１に示す配列にある位置番号４４を越えた１つの残基によって変更されるとされ、配列表示されたｈＩＦＮａｌｐｈａ ２ｂ（配列番号３２１）の番号付けと相関している。
【０４１８】
上記の分析に基づいて、配列番号１に相関して番号付けした以下の位置について、２５％を超える画分ＡＳＡを有するアミノ酸残基を含むと考えられる。：位置２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１６、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３１、３３、３４、３５、３７、４０、４１、４２、４４、４６、４７、４９、５０、５１、５２、５９、６２、６３、６６、６９、７０、７１、７２、７４、７５、７８、７９、８０、８１、８３、８４、８７、９０、９１、９４、９５、９７、９８、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１８、１２１、１２２、１２５、１２６、１２８、１２９、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４６、１４９、１５０、１５３、１５４、１５７、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５および１６６。
【０４１９】
同様に、配列番号１に相関して再度番号付けした以下の位置について、その側鎖の画分ＡＳＡが平均５０％を超えるアミノ酸残基を含むと考えられている：２、３、４、５、６、７、８、９、１２、１３、１６、１９、２５、２７、２８、３１、３３、３４、３５、３７、４１、４４、４６、４７、４９、５０、６６、７１、７５、７８、７９、８０、８３、８４、８７、９０、９１、９４、９５、１０１、１０２、１０３、１０５、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１４、１１５、１１８、１２１、１２２、１２５、１２６、１２９、１３２、１３３、１３５、１３８、１５０、１６０、１６２、１６３、１６４、１６５および１６６。
【０４２０】
実施例２：インターフェロンαポリペプチドの抗ウイルス活性
ＨＣＶでの主要な技術的課題は、該ウイルスはインビトロでは増殖できず、最近になってやっと、扱いやすい動物モデルで培養できるようになったことである。しかしながら、ＨＣＶウイルス複製の有用な代用物と考えられるインビトロで複製するウイルスもある。インビトロＨＣＶ抗ウイルス活性の前兆となると考えられているインビトロ代用物アッセイは、前記の材料と方法の項に記述したアッセイを含み、これは、ヒト子宮頸癌由来ＨｅＬａ細胞系における脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）を使用し、ウイルス感染の細胞変性効果（ＣＰＥ）から細胞を保護する試験分子の能力を測定するものである。
【０４２１】
図３は、参照インターフェロンαポリペプチドｈｕＩＦＮα−２ａ（配列番号３２２）およびｈｕＩＦＮα−２ｂ（配列番号３２１）と比較した、以下の本発明のポリペプチドの好適な例についての、ＥＣ５０（ng/ml）で表したＨｅＬａ／ＥＭＣＶアッセイでの抗ウイルス活性を示している：Ｍ０４（配列番号２６２）；Ｍ０５（配列番号２６６）；Ｍ２３（配列番号２３２）；Ｍ４５（配列番号８８）；Ｍ０１（配列番号３１２）；Ｍ２０（配列番号２９７）；Ｍ２７（配列番号１６７）；Ｍ０９（配列番号１０７）；Ｍ０２（配列番号２０８）；Ｍ３３（配列番号９４）；Ｍ３７（配列番号１４１）；Ｍ３０（配列番号４６）；Ｍ２２（配列番号１７１）；Ｍ２４（配列番号３１０）；Ｍ４４（配列番号１７６）；Ｍ３１（配列番号２６）；Ｍ１０（配列番号８９）；Ｍ１４（配列番号２９６）；Ｍ０３（配列番号１４８）；Ｍ４６（配列番号１８）；Ｍ２６（配列番号１０）；Ｍ２１（配列番号８７）；Ｍ３８（配列番号１０３）；Ｍ２８（配列番号２３４）；Ｍ１９（配列番号３０）；Ｍ１１（配列番号１７９）；Ｍ３４（配列番号２）；Ｍ０７（配列番号２６０）；Ｍ１８（配列番号３０６）；Ｍ４０（配列番号１４０）；Ｍ１６（配列番号１２７）；Ｍ２５（配列番号２９３）；Ｍ２９（配列番号１９５）；Ｍ３６（配列番号１９１）；Ｍ０６（配列番号２６３）；Ｍ３２（配列番号１）；Ｍ３９（配列番号２９８）；Ｍ４２（配列番号２４）；Ｍ０８（配列番号２５８）；Ｍ３５（配列番号１２４）；Ｍ４１（配列番号７）；Ｍ１２（配列番号９）；Ｍ１７（配列番号３０３）およびＭ４３（配列番号６）。
【０４２２】
実施例３：インターフェロンαポリペプチドのペグ化
以下に、本発明の複合体を調製する手順の好適な例を提供する。
Ｃｙｓ−ペグ化
遊離システインを含む本発明のポリペプチドは以下のようにシステイン−ペグ化してよい。最初にポリペプチドを、５０mMのＭＥＳ、１００mMのＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中、４℃で３０分間、ＴＣＥＰ（トリスカルボキシエチルホスフィン）と等モル濃度で部分的に還元する。次いで還元ポリペプチドを、同条件下で、４倍増モル濃度のｍＰＥＧ−ＭＡＬ試薬と（２０ｋＤａまたは３０ｋＤａの直鎖ｍＰＥＧもしくは４０kDaの分岐ｍＰＥＧ２などのＰＥＧ部分と）４℃で１時間反応させる。ペグ化反応混合物を、５０mMのＭＥＳ（ｐＨ ６．０）および１００mMのＮａＣｌで平衡化したSP-Sepharose HPカラムに添加する。１０CV（カラムボリューム）の洗浄工程の後、０〜６００mMのＮａＣｌ勾配を、ペグ化および非ペグ化画分を分画することに適用する。画分を回収し、アリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。単一ペグ化種を含む画分を貯め、上述のようにインターフェロンα活性について分析試験するために処方する。
【０４２３】
Ｎ末端ペグ化
ｍＰＥＧブチルアルデヒド（２０kDaまたは３０kDaの直鎖ｍＰＥＧ、または４０kDa の分岐ｍＰＥＧ２を有する）でのＮ末端ペグ化は、５０mMのＭＥＳ（ｐＨ５．５）、１００mMのＮａＣｌおよび２０mMのシアノ水素化ほう素ナトリウム中で、あるいは５０mMの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、１００mMのＮａＣｌおよび２０mMのシアノ水素化ほう素ナトリウム中で、５倍増モル濃度のＰＥＧ試薬：ポリペプチドを使用し４℃で４〜８時間行うことがある。５０mMのＭＥＳ（ｐＨ５．５）、１００mMのＮａＣｌ中で平衡化したSP-Sepharose HPカラムでのクロマトグラフィーによって、１００〜６００mMのＮａＣｌを含む５０mMのＭＥＳ（ｐＨ５．５）の勾配を使用し、複合体を単離する。単一ペグ化種を含む画分を貯め、上述のようにインターフェロンα活性について分析試験するために処方し、また例えば分析ＨＰＬＣ、アミノ酸分析および／またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を利用してさらに特徴付けをしてよい。
【０４２４】
リシンペグ化
リシン−ペグ化はFoserら、(2003) Protein Expression & Purification 30:78-87の記述に基づいた手順を利用して行ってもよい。すなわち、５０mMのホウ酸塩バッファー（ｐＨ９．０）中、ポリペプチド：ＰＥＧのモル比１：３で、ポリペプチドをｍＰＥＧ−ＮＨＳ試薬（２０kDaまたは３０kDaの直鎖ｍＰＥＧ、または４０kDaの分岐ｍＰＥＧ２）と４℃で２時間反応させる。SP-Sepharose HP を利用して陽イオン交換クロマトグラフィーによって複合体を単離する。単一ペグ化種を含む画分を貯め、上述のようにインターフェロンα活性について分析試験するために処方し、またアミノ酸分析および／またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によってさらに特徴付けをしてよい。
【０４２５】
実施例４：インビボアッセイ
本発明のポリペプチドまたは複合体の、薬物動態学的（ＰＫ）および薬力学的（ＰＤ）プロファイルの測定
生物学的または血清半減期は文献に記載の多くの方法で測定してよい。例えば、生物学的半減期はＥＬＩＳＡ法を利用して、例えば皮下または筋肉内投与後、血清中インターフェロンαレベルを検出して判定してもよい。皮下投与したインターフェロンαの薬物動態を判定するためのＥＬＩＳＡ法の使用は、例えばRostaingら、(1998), J. Am. Soc. Nephrol. 9(12): 2344-48. Merimskyら、(1991), Cancer Chemother. Pharmacol. 27(5); 406-8に記載されており、筋肉内投与されたインターフェロンαの血清レベルの判定が記述してある。
【０４２６】
例えば、本発明の複合体の薬物動態学的（ＰＫ）および薬力学的（ＰＤ）プロファイルは、以下の手順にしたがってカニクイザル（Macaca fascicularis）で試験してもよい。試験には平均体重５〜６kgで３〜４歳の雌の動物を使用する。動物は到着から治療開始の間、最低限の６週間で順応させ、最低限の３週間の試験居住条件への順応も設ける。動物らをステンレス製網ケージ（少なくとも５４０ｘ８１０ｘ７６０mm）に一匹ずつ収容し、化学物質汚染および細菌汚染が無いことを調べてある多めにした完全市販霊長類用飼料（１００グラム／動物／日）で飼育する。さらに、毎日動物に果物を与える（リンゴまたはバナナ）。麻酔を必要とするすべての手順の前には動物を断食させる。
【０４２７】
試験開始の３日前、および試験開始当日の化合物投与前に、すべての動物から血液サンプルを採取する。試験の全工程で、麻酔をせず手動で抑止した動物の大腿または頭部／伏在血管から血液サンプル（１mlの全血）を採取する。採取の間、正常な給餌体制を維持する。抗凝固剤が存在しない試験管にサンプルを回収し、その後３０００rpm（約１７６０g）、４℃で１０分間遠心分離する。次いで血清サンプルを２つのアリコート（各約２００μl）に分割し、−２０℃で保存する。
【０４２８】
試験開始に先立って、本発明の複合体を２０mMの酢酸ナトリウム（ｐＨ ６．０）および１４０mMの塩化ナトリウム中で処方した。試験開始時に、１匹につき１回、３０mcg複合体／動物体重kgで（４匹）、あるいは３００mcg/kgで（４匹）のいずれかで、エチルアルコールの水溶液で局所消毒した後、滅菌シリンジおよび注射針を使用し、複合体を皮下注射する。複合体の投与後、以下の時点で血液サンプルを採取する：４時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、１４４時間、２４０時間、３３６時間、４５６時間、５５２時間、６００時間、６２４時間、６４８時間、６７２時間、６９６時間、７２０時間および７４４時間（または必要に応じて他の時点）。
【０４２９】
動物は毎日観察し、あらゆる臨床的兆候または治療に対する反応を検出する。局所耐性を評価するために、毎日注射部位を目視で検討する。治療の開始前および試験開始時に臨床実験を詳細に行う。
【０４３０】
ＥＬＩＳＡアッセイを利用し、単離血清サンプル中の複合体の濃度を試験完了後に行う。次いでカニクイザルにおける複合体のインビボでの半減期を、規定の時点で化合物の血清中濃度に基づいて判定する。
【０４３１】
カニクイザルにおいて、本発明の複合体を用いた治療への薬力学的反応を、各血清サンプルの２’，５’−オリゴアデニレートシンテターゼおよびネオプテリンのレベルを測定することで評価し、これにはそれぞれ市販のＲＩＡ（Eiken Chemical Co., Tokyo）および市販のＥＬＩＳＡ（IBL Immuno Biological Laboratories, Hamburg.）を使用する。血清サンプル中のインターフェロン活性に対するこれら２つの生物マーカーの測定濃度に基づいて、濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を求め、２種の投薬量の各々において各化合物のインビボ活性を定量化する。
【０４３２】
インビトロでの免疫原性の判定
参照分子に相関する本発明のポリペプチドまたは複合体の抑制された免疫原性は、参照分子または調製物、典型的には既知のインターフェロンαタンパク質に相関する分子の免疫原性を測定するＥＬＩＳＡ法を利用し判定することが可能である。ＥＬＩＳＡ法は参照タンパク質で治療した患者由来の抗体に基づいている。本発明のポリペプチドまたは複合体が参照分子または調製物よりもアッセイにおいて統計的に有意に低い反応を示す場合、免疫原性は抑制されていると考えられる。
【０４３３】
先行の発明を明瞭性と理解を目的としてやや詳細に述べている一方、本発明の範囲から逸脱することなく様々な形態の変化や詳述は成立し得ることは本開示を読むことで当業者には明らかであろう。本明細書に記載の実施例および実施態様は実例となる目的のみのためにあり、また、それを考慮した様々な改良または変化が当業者らに提案されており、本出願の趣旨と意図、および添付の請求項の範囲中に含まれていることは理解されている。例えば、上述の技術および装置のすべては、様々な組み合わせで使用してもよい。すべての出版物、特許、特許出願および／または本出願に引用された他の文献は、あたかも個々の出版物、特許、特許出願および／または他の文献が、すべての目的のために参照によりすべて本明細書に援用されることがそれぞれ示されているのと同程度に、すべての目的のため参照によりすべて本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０４３４】
【図１】図１は、以下のヒトインターフェロンα（ｈｕＩＦＮ−α）のポリペプチド配列と本発明のポリペプチドの配列（配列番号：１）のアラインメントを示している：ｈｕＩＦＮα１ａ（配列番号：３２０）、ｈｕＩＦＮ−α２ｂ（配列番号：３２１）、ｈｕＩＦＮ−α４ｂ（配列番号：３２３）、ｈｕＩＦＮ−α５（配列番号：３２４）、ｈｕＩＦＮ−α６（配列番号：３２５）、ｈｕＩＦＮ−α７ａ（配列番号：３２６）、ｈｕＩＦＮ−α８ｂ（配列番号：３２７）、ｈｕＩＦＮ−α１０ａ（配列番号：３２８）、ｈｕＩＦＮ−α１４ａ（配列番号：３２９）、ｈｕＩＦＮ−α１６（配列番号：３３０）、ｈｕＩＦＮ−α１７ｂ（配列番号：３３１）、およびｈｕＩＦＮ−α２１ｂ（配列番号：３３２）。ｈｕＩＦＮ−α配列の命名規定については、Ａｌｌｅｎ  Ｇ．  ａｎｄ  Ｄｉａｚ  Ｍ．Ｏ．（１９９６）Ｊ．  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．１６：１８１−１８４に従った。配列番号：１と同一である配列番号：３２０〜３２１、および３２３〜３３２のアミノ酸残基の位置をピリオド（．）で示しており、配列内のギャップをダッシュ（−）で示している。
【図２】図２は、上記のとおり、ヒトインターフェロンαポリペプチドの配列番号：３２０〜３２１、および３２３〜３３２と本発明のポリペプチドの配列（配列番号：３１２）のアラインメントを示している。配列番号：３１２と同一である配列番号：３２０〜３２１、および３２３〜３３２のアミノ酸残基の位置をピリオド（．）で示しており、配列内のギャップをダッシュ（−）で示している。
【図３】図３は、本発明の以下の典型的なポリペプチドについて、基準であるインターフェロンαポリペプチドｈｕＩＦＮα−２ａ（配列番号：３２２）、およびｈｕＩＦＮα−２ｂ（配列番号：３２１）と比較した場合、ＥＣ５０（ｎｇ／ｍｌ）と表した、ＨｅＬａ／ＥＭＣＶ分析試験での抗ウイルス活性を示している：Ｍ０４（配列番号：２６２）、Ｍ０５（配列番号：２６６）、Ｍ２３（配列番号：２３２）、Ｍ４５（配列番号：８８）、Ｍ０１（配列番号：３１２）、Ｍ２０（配列番号：２９７）、Ｍ２７（配列番号：１６７）、Ｍ０９（配列番号：１０７）、Ｍ０２（配列番号：２０８）、Ｍ３３（配列番号：９４）、Ｍ３７（配列番号：１４１）、Ｍ３０（配列番号：４６）、Ｍ２２（配列番号：１７１）、Ｍ２４（配列番号：３１０）、Ｍ４４（配列番号：１７６）、Ｍ３１（配列番号：２６）、Ｍ１０（配列番号：８９）、Ｍ１４（配列番号：２９６）、Ｍ０３（配列番号：１４８）、Ｍ４６（配列番号：１８）、Ｍ２６（配列番号：１０）、Ｍ２１（配列番号：８７）、Ｍ３８（配列番号：１０３）、Ｍ２８（配列番号：２３４）、Ｍ１９（配列番号：３０）、Ｍ１１（配列番号：１７９）、Ｍ３４（配列番号：２）、Ｍ０７（配列番号：２６０）、Ｍ１８（配列番号：３０６）、Ｍ４０（配列番号：１４０）、Ｍ１６（配列番号：１２７）、Ｍ２５（配列番号：２９３）、Ｍ２９（配列番号：１９５）、Ｍ３６（配列番号：１９１）、Ｍ０６（配列番号：２６３）、Ｍ３２（配列番号：１）、Ｍ３９（配列番号：２９８）、Ｍ４２（配列番号：２４）、Ｍ０８（配列番号：２５８）、Ｍ３５（配列番号：１２４）、Ｍ４１（配列番号：７）、Ｍ１２（配列番号：９）、Ｍ１７（配列番号：３０３）、およびＭ４３（配列番号：６）。
【図４】図４は、ＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリックスを示している。
【図５】図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃは、以下のパラメータを用いて、最適な配列アラインメントを決定するために使用したアライメントスコアの計算例を示している：ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス、ギャップ開始ペナルティ＝１１、ギャップ伸長ペナルティ＝１。図５Ａは、配列番号：３１２（下側）の残基３０〜５２とともに配列番号：１（上側）の残基２９〜５０のアラインメントを示している。図５Ｂおよび５Ｃは、配列番号：３２１（下側）の残基３０〜５０とともに配列番号：３１２（上側）の残基２９〜５０のアラインメントをそれぞれ示しており、図５Ｂは該アライメント内においてギャップの導入を伴わない該アライメントスコアの計算を示しており、図５Ｃは該アライメント内においてギャップの導入を伴う該アライメントスコアの計算を示している。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｖは、本明細書において配列番号：１〜３１９と認定されている本発明の典型的なポリペプチドのアミノ酸配列を示している。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｖは、本明細書において配列番号：１〜３１９と認定されている本発明の典型的なポリペプチドのアミノ酸配列を示している。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｖは、本明細書において配列番号：１〜３１９と認定されている本発明の典型的なポリペプチドのアミノ酸配列を示している。
【図６Ｄ】図６Ａ〜６Ｖは、本明細書において配列番号：１〜３１９と認定されている本発明の典型的なポリペプチドのアミノ酸配列を示している。
【図６Ｅ】図６Ａ〜６Ｖは、本明細書において配列番号：１〜３１９と認定されている本発明の典型的なポリペプチドのアミノ酸配列を示している。
【図６Ｆ】図６Ａ〜６Ｖは、本明細書において配列番号：１〜３１９と認定されている本発明の典型的なポリペプチドのアミノ酸配列を示している。
【図６Ｇ】図６Ａ〜６Ｖは、本明細書において配列番号：１〜３１９と認定されている本発明の典型的なポリペプチドのアミノ酸配列を示している。
【図６Ｈ】図６Ａ〜６Ｖは、本明細書において配列番号：１〜３１９と認定されている本発明の典型的なポリペプチドのアミノ酸配列を示している。
【図６Ｉ】図６Ａ〜６Ｖは、本明細書において配列番号：１〜３１９と認定されている本発明の典型的なポリペプチドのアミノ酸配列を示している。
【図６Ｊ】図６Ａ〜６Ｖは、本明細書において配列番号：１〜３１９と認定されている本発明の典型的なポリペプチドのアミノ酸配列を示している。
【図６Ｋ】図６Ａ〜６Ｖは、本明細書において配列番号：１〜３１９と認定されている本発明の典型的なポリペプチドのアミノ酸配列を示している。
【図６Ｌ】図６Ａ〜６Ｖは、本明細書において配列番号：１〜３１９と認定されている本発明の典型的なポリペプチドのアミノ酸配列を示している。
【図６Ｍ】図６Ａ〜６Ｖは、本明細書において配列番号：１〜３１９と認定されている本発明の典型的なポリペプチドのアミノ酸配列を示している。
【図６Ｎ】図６Ａ〜６Ｖは、本明細書において配列番号：１〜３１９と認定されている本発明の典型的なポリペプチドのアミノ酸配列を示している。
【図６Ｏ】図６Ａ〜６Ｖは、本明細書において配列番号：１〜３１９と認定されている本発明の典型的なポリペプチドのアミノ酸配列を示している。
【図６Ｐ】図６Ａ〜６Ｖは、本明細書において配列番号：１〜３１９と認定されている本発明の典型的なポリペプチドのアミノ酸配列を示している。
【図６Ｑ】図６Ａ〜６Ｖは、本明細書において配列番号：１〜３１９と認定されている本発明の典型的なポリペプチドのアミノ酸配列を示している。
【図６Ｒ】図６Ａ〜６Ｖは、本明細書において配列番号：１〜３１９と認定されている本発明の典型的なポリペプチドのアミノ酸配列を示している。
【図６Ｓ】図６Ａ〜６Ｖは、本明細書において配列番号：１〜３１９と認定されている本発明の典型的なポリペプチドのアミノ酸配列を示している。
【図６Ｔ】図６Ａ〜６Ｖは、本明細書において配列番号：１〜３１９と認定されている本発明の典型的なポリペプチドのアミノ酸配列を示している。
【図６Ｕ】図６Ａ〜６Ｖは、本明細書において配列番号：１〜３１９と認定されている本発明の典型的なポリペプチドのアミノ酸配列を示している。
【図６Ｖ】図６Ａ〜６Ｖは、本明細書において配列番号：１〜３１９と認定されている本発明の典型的なポリペプチドのアミノ酸配列を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図６Ｊ】
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【図６Ｋ】
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【図６Ｌ】
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【図６Ｍ】
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【図６Ｎ】
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【図６Ｏ】
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【図６Ｐ】
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【図６Ｑ】
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【図６Ｒ】
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【図６Ｓ】
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【図６Ｔ】
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【図６Ｕ】
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【図６Ｖ】
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【配列表】
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