(57)【要約】  ＩＬ−１３Ｒα１に結合し、ＩＬ−１３生物活性を阻害し、可変重鎖および可変軽鎖を含む抗体であって、該抗体の可変重鎖アミノ酸配列ＣＤＲ３が配列番号１、３、５、７もしくは９の重鎖ＣＤＲ３配列からなる群から選択されることを特徴とする抗体であって、喘息やアレルギー性疾患の治療に有用である。
2008526187.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体の可変重鎖アミノ酸配列ＣＤＲ３が、配列番号１、３、５、７もしくは９の重鎖ＣＤＲ３配列からなる群から選択されることを特徴とする抗体。
【請求項２】
該抗体の可変重鎖アミノ酸配列ＣＤＲ１およびＣＤＲ２が、配列番号１、３、５、７もしくは９の重鎖ＣＤＲ１配列およびＣＤＲ２配列からなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の抗体。
【請求項３】
該抗体の可変軽鎖アミノ酸配列ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、配列番号２、４、６、８もしくは１０の可変軽鎖アミノ酸配列ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３からなる群から選択されることを特徴とする請求項１もしくは２記載の抗体。
【請求項４】
ａ）Ｇｌｙ２３６が欠失したアミノ酸配列Ｐｒｏ２３３Ｖａｌ２３４Ａｌａ２３５および／またはアミノ酸配列Ｇｌｙ３２７Ｌｅｕ３２８Ｐｒｏ３２９Ｓｅｒ３３０Ｓｅｒ３３１、
ｂ）アミノ酸配列Ａｌａ２３４Ａｌａ２３５もしくは
ｃ）アミノ酸Ａｌａ２６５およびＡｌａ２９７
を有するヒトγ１重鎖を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項記載の抗体。
【請求項５】
ヒト抗体であることを特徴とする請求項１〜４記載の抗体。
【請求項６】
ＩＬ−１３Ｒα１に結合する親和度が、１０−９Ｍ（ＫＤ）以下、好ましくは１０−９〜１０−１３Ｍであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項記載の抗体。
【請求項７】
ハイブリドーマ細胞系ＤＳＭ  ＡＣＣ２７０９、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７１０、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７１１もしくはＤＳＭ  ＡＣＣ２７１２から取得した請求項１〜６のいずれか一項記載の抗体。
【請求項８】
重鎖可変領域として配列番号１および軽鎖可変領域として配列番号２、重鎖可変領域として配列番号３および軽鎖可変領域として配列番号４、重鎖可変領域として配列番号５および軽鎖可変領域として配列番号６、重鎖可変領域として配列番号７および軽鎖可変領域として配列番号８、または重鎖可変領域として配列番号９および軽鎖可変領域として配列番号１０、を含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項記載の抗体。
【請求項９】
ａ）重鎖可変領域として配列番号１、軽鎖可変領域として配列番号２、κ軽鎖定常領域として配列番号１１、およびγ１重鎖定常領域として配列番号１２、ただし場合によって突然変異Ｌ２３４ＡとＬ２３５ＡもしくはＤ２６５ＡとＮ２９７Ａを有する、
ｂ）重鎖可変領域として配列番号３および軽鎖可変領域として配列番号４、κ軽鎖定常領域として配列番号１１およびγ１重鎖定常領域として配列番号１２、ただし場合によって突然変異Ｌ２３４ＡとＬ２３５ＡもしくはＤ２６５ＡとＮ２９７Ａを有する、
ｃ）重鎖可変領域として配列番号５および軽鎖可変領域として配列番号６、κ軽鎖定常領域として配列番号１１およびγ１重鎖定常領域として配列番号１２、ただし場合によって突然変異Ｌ２３４ＡとＬ２３５ＡもしくはＤ２６５ＡとＮ２９７Ａを有する、
ｄ）重鎖可変領域として配列番号７および軽鎖可変領域として配列番号８、κ軽鎖定常領域として配列番号１１およびγ１重鎖定常領域として配列番号１２、ただし場合によって突然変異Ｌ２３４ＡとＬ２３５ＡもしくはＤ２６５ＡとＮ２９７Ａを有する、または、
ｅ）重鎖可変領域として配列番号９および軽鎖可変領域として配列番号１０、κ軽鎖定常領域として配列番号１１およびγ１重鎖定常領域として配列番号１２、ただし場合によって突然変異Ｌ２３４ＡとＬ２３５ＡもしくはＤ２６５ＡとＮ２９７Ａを有する、
を含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項記載の抗体の医薬組成物の製造のための使用。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項記載の抗体を医薬的に有効な量を含む医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項記載の組換え抗体を産生可能な組換え宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか一項記載の抗体を医薬的に有効な量を含む医薬組成物の製造方法。
【請求項１４】
ポリペプチドが：
ａ）  配列番号１、３、５、７もしくは９の重鎖ＣＤＲを含む抗体重鎖、
ｂ）  配列番号２、４、６、８もしくは１０の軽鎖ＣＤＲを含む抗体軽鎖、
ここで、ＣＤＲは互いに独立して選択される、
のいずれかであって、それぞれ他方の抗体鎖と一緒に集合化が可能なポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１５】
請求項１４記載の核酸を含む発現ベクターであって、原核宿主細胞内もしくは真核宿主細胞内で該核酸を発現可能なベクター。
【請求項１６】
請求項１５記載のベクターを含む原核宿主細胞もしくは真核宿主細胞。
【請求項１７】
ＩＬ−１３Ｒα１に結合し、ＩＬ−１３がＩＬ−１３Ｒα１に結合するのを阻害するポリペプチドの生産方法であって、請求項１４記載の重鎖をコード化する核酸および軽鎖をコード化する核酸を原核宿主細胞内もしくは真核宿主細胞内で発現させ、該細胞から該ポリペプチドを回収することを特徴とする方法。
【請求項１８】
喘息治療もしくは抗アレルギー治療を必要とする患者の治療方法であって、請求項１〜９のいずれか一項記載の抗体の治療有効量を該患者に投与することを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１〜９のいずれか一項記載の抗体を組換え発現によって産生し、該抗体を回収し、かつ該抗体を医薬的に受容可能な緩衝剤および／またはアジュバントと組み合わせることを特徴とする医薬組成物の製造方法。
【請求項２０】
ハイブリドーマ細胞系ＤＳＭ  ＡＣＣ２７０９、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７１０、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７１１もしくはＤＳＭ  ＡＣＣ２７１２。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＬ−１３受容体α１（ＩＬ−１３Ｒα（アルファ）１）に対するヒト抗体、それらの産生方法および使用に関する。
【０００２】
発明の背景
ＩＬ−１３は、主としてＴｈ２細胞によって産生されるが、肥満細胞やＮＫ細胞によっても産生される分泌単量体ペプチドである。ＩＬ−１３の生体機能には、例えばＩｇＥ産生の調節とＴｈ２発達の調節がある。ＩＬ−１３は、ＩＬ−１３受容体アルファ１（ＩＬ−１３Ｒα１）鎖およびＩＬ−４受容体アルファ（ＩＬ−４Ｒα）鎖からなる受容体複合体に結合する。ＩＬ−１３が結合すると、主としてＳＴＡＴ６を介する信号伝達事象が誘発される。ＩＬ−１３は、単独ではＩＬ−１３Ｒα１に結合する親和性が低く、またＩｌ−４Ｒα１には結合しない。これに反して、ＩＬ−４は、ＩＬ−４Ｒαに単独で結合し、ＩＬ−１３Ｒα１には単独で結合しない。ＩＬ−１３には別の受容体すなわちＩＬ−１３Ｒα２が報告されている。ＩＬ−１３は、この受容体には高い親和性で結合するので、この受容体はおとり受容体として作用する可能性がある。
【０００３】
形質転換マウスにおいてＩＬ−１３の過剰発現が誘導されると、その結果生ずる表現型は喘息患者と多くの特徴を共有する。それらの特徴により、粘液化生、マクロファージ、リンパ球および好酸球の増殖性炎症、プロテアーゼ様ＭＭＰ−９、−１２、−１３、−２および−１４の亢進、カテプシンＢ、Ｈ、ＫおよびＳが現れるほか、上皮下線維症も顕わる。ＩＬ−１３のノックアウトマウスでは、Ｔｈ２の発達が阻害されて、Ｔｈ２サイトカインの産生が大幅に低下する。これらのマウスでは、好酸球性炎症が存在しているにもかかわらず気道過敏症（ＡＨＲ）は発現しない。ＩＬ−１３の投与によりＡＨＲが回復するので、このことから、マウスにおけるＡＨＲの誘導にはＩＬ−１３が必要かつ十分であることが示唆される。喘息に関連するＩＬ−１３の他の重要な生体機能には、例えば杯形細胞の化生と粘液の産生の誘導が挙げられる。ＩＬ−１３は、気道上皮細胞、線維芽および気道平滑筋細胞上に直接作用し、この細胞種のそれぞれにおける各種転写プログラムを誘導する。面白いことに、ＩＬ−１３は、平滑筋細胞におけるアルファ−アドレナリン反応を低下させ、気道狭窄の原因となる。ＩＬ−１３プロモーターの多型は、アレルギー性喘息発生リスクの増大と関連している。ＩＬ−１３遺伝子における多型は、血清ＩｇＥレベルが高いことと関連している。ＩＬ−４とＩＬ−１３の両遺伝子間における遺伝子間配列において単一のヌクレオチド多型が存在することは、アトピー性喘息と関連する。
【０００４】
ＩＬ−１３アンタゴニストは、動物モデルで利用されてきた。たとえば、可溶性のマウスＩＬ−１３Ｒα２−ＩｇＧＦｃ融合タンパクを使用することによって、オボアルブミン誘導ＡＨＲと粘液含有細胞の数を完全に逆転させる効果が示された。この逆転は、表現型が完全に発現してから治療した場合であっても達成された。さらに、ＩＬ−１３融合サイトトキシン分子でマウスを治療すると、慢性真菌誘発型アレルギー性炎症における気道疾患のあらゆる特徴が減少した。結論として、ＩＬ−１３はアレルギー応答を呈する奏功部位の重要な伝達物質である。
【０００５】
ＩＬ−１３Ｒα１は、多数のヘマポイチン受容体スーパーファミリー（１型サイトカイン受容体ファミリー）に属し、Obiri N. I.et al., J. Biol. Chem., 270 (1995) 8797-8804) およびWO96/29417によって特定および報告されている。これは、シグナル配列を含む４２７個のアミノ酸からなるタンパクである。このＤＮＡ配列およびタンパク配列が、WO97/15663およびSwissProt No. P78552に開示されている。ＩＬ−１３Ｒα１はグルコシル化タンパクであって、ＩＬ−１３への結合親和性は低いが、ＩＬ−４Ｒαに連結してヘテロ二量体になると、ＩＬ−１３への結合親和性は高くなる。この複合体もＩＬ−４の受容体である。
【０００６】
ＩＬ−１３Ｒα１に対する抗体は、WO96/29417、WO97/15663、WO03/080675、Graber P.,ら、Eur. J. Immunol., 28 (1998) 4286-4298; Poudrier J., et al, J. Immunol., 163 (1999) 1153-1161; Poudrier J.,ら、Eur. J. Immunol., 30 (2000) 3157-3164; Aikawa M.,ら、Cytokine, 13 (2001) 75-84から公知である。ＩＬ−１３Ｒα１に対する抗体は、R&D Systems Inc. (USA)から購入することができる。
【０００７】
発明の概要
本発明は、ＩＬ−１３Ｒα１に結合することによってＩＬ−１３の生物活性を阻害する抗体であって、該抗体の可変重鎖アミノ酸配列ＣＤＲ３が配列番号１、３、５、７もしくは９の重鎖ＣＤＲ３配列からなる群から選択されることを特徴とする抗体を含む。
【０００８】
抗体は、ヒト抗体であることが好ましい。
【０００９】
抗体は、好ましくは、ＩＬ−１３Ｒα１に結合する親和度が１０−９Ｍ（ＫＤ）以下、好ましくは１０−９〜１０−１３Ｍであることを特徴とする。
【００１０】
抗体は、好ましくは、その重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列が、配列番号１、３、５、７もしくは９の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列からなる群から選択されることを特徴とする。
【００１１】
抗体は、好ましくは、該抗体の可変軽鎖アミノ酸配列ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、配列番号２、４、６、８もしくは１０の軽鎖ＣＤＲ配列からなる群から選択されることを特徴とする。
【００１２】
抗体は、好ましくは、該抗体の可変重鎖アミノ酸配列ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、配列番号１、３、５、７もしくは９の重鎖ＣＤＲ配列からなる群から選択され、該抗体の可変軽鎖アミノ酸配列ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、配列番号２、４、６、８もしくは１０の軽鎖ＣＤＲ配列からなる群から選択されることを特徴とする。
【００１３】
ＣＤＲ配列は、好ましくは、相互に他から独立に選択され、ＦＲ（フレームワーク）領域によって分離される。
【００１４】
抗体は、好ましくは、重鎖ＣＤＲとして配列番号１のＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲとして配列番号２のＣＤＲ；重鎖ＣＤＲとして配列番号３のＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲとして配列番号４のＣＤＲ；重鎖ＣＤＲとして配列番号５のＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲとして配列番号６のＣＤＲ；重鎖ＣＤＲとして配列番号７のＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲとして配列番号８のＣＤＲ；あるいは、重鎖ＣＤＲとして配列番号９のＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲとして配列番号１０のＣＤＲを含むことを特徴とする。
【００１５】
ＣＤＲ配列は、Kabat ら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) の標準の定義に従って決定することができる。これを基準として、配列番号１〜８の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、以下の配列を有する。
【００１６】
重鎖ＣＤＲ：配列番号１、３、５、７、９のＣＤＲ１（ａａ３１−３５）、配列番号１、３、５、７、９のＣＤＲ２（ａａ５０−６６）、配列番号１、３、９のＣＤＲ３（ａａ９９−１０８）、配列番号５のＣＤＲ３（ａａ９９−１０７）、配列番号７のＣＤＲ３（ａａ９９−１１２）、
軽鎖ＣＤＲ：配列番号２、４、６、１０のＣＤＲ１（ａａ２４−３４）、配列番号８のＣＤＲ１（ａａ２４−３５）、配列番号２、４、６、１０のＣＤＲ２（ａａ５０−５６）、配列番号８のＣＤＲ２（ａａ５１−５７）および配列番号２、４、６、１０のＣＤＲ３（ａａ８９−９７）、配列番号８のＣＤＲ３（ａａ９０−９７）。
【００１７】
本発明は、好ましくは、相補性決定領域（ＣＤＲ）として下記の配列を有する抗体を提供する。
ａ）配列番号１、３、５、７もしくは９の重鎖ＣＤＲを含む抗体重鎖
ｂ）配列番号２、４、６、８もしくは１０の軽鎖ＣＤＲを含む抗体軽鎖
ここでＣＤＲは相互に他から独立に選択される。
【００１８】
抗体は、好ましくは、重鎖可変領域として配列番号１および軽鎖可変領域として配列番号２、重鎖可変領域として配列番号３および軽鎖可変領域として配列番号４、重鎖可変領域として配列番号５および軽鎖可変領域として配列番号６、重鎖可変領域として配列番号７および軽鎖可変領域として配列番号８、または重鎖可変領域として配列番号９および軽鎖可変領域として配列番号１０を含むことを特徴とする。
【００１９】
抗体は、好ましくは、下記を含むことを特徴とする。
ａ）重鎖可変領域として配列番号１および軽鎖可変領域として配列番号２、κ軽鎖定常領域として配列番号１１およびγ１重鎖定常領域として配列番号１２、ただし場合によって突然変異Ｌ２３４ＡとＬ２３５ＡもしくはＤ２６５ＡとＮ２９７Ａを有する、
ｂ）重鎖可変領域として配列番号３および軽鎖可変領域として配列番号４、κ軽鎖定常領域として配列番号１１およびγ１重鎖定常領域として配列番号１２、ただし場合によって突然変異Ｌ２３４ＡとＬ２３５ＡもしくはＤ２６５ＡとＮ２９７Ａを有する、
ｃ）重鎖可変領域として配列番号５および軽鎖可変領域として配列番号６、κ軽鎖定常領域として配列番号１１およびγ１重鎖定常領域として配列番号１２、ただし場合によって突然変異Ｌ２３４ＡとＬ２３５ＡもしくはＤ２６５ＡとＮ２９７Ａを有する、
ｄ）重鎖可変領域として配列番号７および軽鎖可変領域として配列番号８、κ軽鎖定常領域として配列番号１１およびγ１重鎖定常領域として配列番号１２、ただし場合によって突然変異Ｌ２３４ＡとＬ２３５ＡもしくはＤ２６５ＡとＮ２９７Ａを有する、または、
ｅ）重鎖可変領域として配列番号９および軽鎖可変領域として配列番号１０、κ軽鎖定常領域として配列番号１１およびγ１重鎖定常領域として配列番号１２、ただし場合によって突然変異Ｌ２３４ＡとＬ２３５ＡもしくはＤ２６５ＡとＮ２９７Ａを有する。
【００２０】
抗体は、好ましくは、抗体ＬＣ５００２−００２、ＬＣ５００２−００３、ＬＣ５００２−００５、ＬＣ５００２−００７および／またはＬＣ５００２−０１８と競合してＩＬ−１３Ｒα１に結合することを特徴とする。抗体は、好ましくは、可変領域としてＬＣ５００２−００２、ＬＣ５００２−００３、ＬＣ５００２−００５、ＬＣ５００２−００７もしくはＬＣ５００２−０１８の可変領域を含むことを特徴とする。これら抗体の可変領域は、配列番号１〜１０に示されている。有用な定常領域は、本技術分野で公知である。配列番号１１〜１２にその例が示されている。
【００２１】
抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体もしくは組み換えにより産生された抗体である。
【００２２】
本発明の一つの実施態様では、抗体は、クラス改変ヒト抗体である。
【００２３】
本発明の好ましい実施例では、抗体は、
ａ）Ｇｌｙ２３６が欠失したアミノ酸配列Ｐｒｏ２３３Ｖａｌ２３４Ａｌａ２３５および／またはアミノ酸配列Ｇｌｙ３２７Ｌｅｕ３２８Ｐｒｏ３２９Ｓｅｒ３３０Ｓｅｒ３３１、
ｂ）アミノ酸配列Ａｌａ２３４Ａｌａ２３５、もしくは
ｃ）アミノ酸Ａｌａ２６５およびＡｌａ２９７
を含むヒトγ１重鎖を含む。
【００２４】
本発明抗体は、好ましくは、ＩＬ−１３により誘発されるＳｔａｔ−６リン酸化を阻害し、そのＩＣ５０値は６ｎＭ以下であり、ＩＬ−１３より誘発されるエオタキシン産生を阻害し、そのＩＣ５０値は２０ｎＭ以下であり、さらに／またはＩＬ−１３もしくはＩＬ−４により誘発される細胞増殖、好ましくはＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ２００３）の細胞増殖を阻害し、そのＩＣ５０値は（ＩＬ−１３では）１０ｎＭ以下および（ＩＬ−４では）６０ｎＭ以下である。ＩＬ−１３により誘発されるＳｔａｔ−６リン酸化、エオタキシン産生および細胞増殖の誘発は、実施例６〜８によって決定される。
【００２５】
本発明抗体は、好ましくは、変性ＩＬ−１３Ｒα１には結合しない（結合親和度ＫＤは１０−６以上）。抗体は、好ましくは、ＩＬ−１３Ｒα２およびＩＬ−４Ｒαとの交差反応性を実質的に呈さないことを特徴とする（結合親和度ＫＤは１０−６以上）。
【００２６】
本発明は、さらに、ＩＬ−１３Ｒα１に対する拮抗性モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を提供する。
【００２７】
本発明による好ましいハイブリドーマ細胞系 (hu-MAB<h-IL-13Ｒ alpha>LC.5002-002 (DSM ACC2709)、hu-MAB<h-IL-13Ralpha>LC.5002-003 (DSM ACC2710)、hu-MAB<h-IL-13Ralpha>LC.5002-005 (DSM ACC2711)、hu-MAB<h-IL-13Ｒ alpha>LC.5002-007 (DSM ACC2712)) は、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Germanyに２００５年１月１３日に寄託された。
【００２８】
該細胞系から取得可能な抗体は、本発明の実施態様である。
【００２９】
本発明は、本発明抗体を構成するポリペプチドをコード化する該核酸、核酸を含む発現ベクターおよび、このような抗体の組み換え産生用の宿主細胞をさらに提供する。本発明はさらに、このような抗体の組み換え産生方法を提供する。
【００３０】
本発明の核酸によってコード化されるポリペプチドは、
ａ）配列番号１、３、５、７もしくは９の重鎖ＣＤＲを有する抗体重鎖と
ｂ）配列番号２、４、６、８もしくは１０の軽鎖ＣＤＲを有する抗体軽鎖である。
【００３１】
これらのポリペプチドは、それぞれ他方の抗体鎖と集合化して抗体を生成することが可能である。
【００３２】
本発明抗体により、コルチコステロイド療法を必要とする患者への利益が出現する。本発明抗体群には、喘息もしくはアレルギー性疾患の患者に利益を招来する新しい独創的な特性がある。
【００３３】
本発明はさらに、喘息およびアレルギー性疾患の治療方法を提供する。
【００３４】
本発明には、本発明抗体の使用であって喘息の治療ならびに本発明医薬組成物の製造のための使用が含まれる。さらに、本発明には、本発明医薬組成物の製造方法が含まれる。
【００３５】
本発明には、さらに、医薬的に有効な量の本発明抗体を含有し、場合によっては、抗体を医薬目的に製剤化するのに有用な緩衝剤および／またはアジュバントとともに含有する医薬組成物が含まれる。
【００３６】
本発明は、さらに、医薬的に受容可能な担体にこのような抗体を含有する医薬組成物を提供する。一つの実施態様では、その医薬組成物は、製造品もしくはキット製品に含まれていてもよい。
【００３７】
本発明には、さらに、本発明核酸を含むベクターであって、該核酸を原核宿主細胞もしくは真核宿主細胞内で発現することができるベクターが含まれる。
【００３８】
本発明には、さらに、本発明ベクターを含む原核宿主細胞もしくは真核宿主細胞が含まれる。
【００３９】
本発明には、さらに、本発明組み換えヒト抗体の産生方法であって、原核宿主細胞もしくは真核宿主細胞内で本発明核酸を発現し、該細胞から該抗体を回収することを特徴とする方法が含まれる。本発明には、さらに、このような組み換え方法によって取得可能な抗体が含まれる。
【００４０】
本発明には、さらに、医薬組成物の製造方法であって、該抗体を使用しないこのようなアッセイと比較して、複数の抗ＩＬ−１３Ｒα１抗体から一つの抗ＩＬ−１３Ｒα１抗体を選択し、組み換え発現によって該抗体を産生し、該抗体を回収し、医薬的に受容可能な緩衝剤および／もしくはアジュバントと該抗体を組み合わせることを特徴とする方法が含まれる。抗体は、上記追加特性の一以上を有することが好ましい。
【００４１】
発明の詳細な説明
「ＩＬ−１３Ｒα１、ネズミＩＬ−１３Ｒα１、ＩＬ−１３、ＩＬ−１３Ｒα２およびＩＬ−４Ｒα」という用語およびそれらのドメインは、当技術分野では公知であり、たとえば、SwissProt P78552、O09030、P35225、Q14627および P24394によって定義されている。したがって、特に記載しない限り、「ＩＬ−１３Ｒα１、ＩＬ−１３、ＩＬ−１３Ｒα２およびＩＬ−４Ｒα」という用語は、ヒトポリペプチドＩＬ−１３Ｒα１、ＩＬ−１３、ＩＬ−１３Ｒα２およびＩＬ−４Ｒαを表す。
【００４２】
本明細書で使用している「ヒト抗体」という用語には、所定のヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に帰属することができる可変領域および定常領域（ドメイン）を有する抗体が挙げられる。その理由は、その抗体の配列はヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列と類似性もしくは同一性が高いからである。ヒト抗体は、当技術分野では公知である(van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374)。ヒト抗体は、免疫時に内因性免疫グロブリンを産生せずにヒト抗体の全領域もしくは選択領域を産生可能である形質転換動物（たとえばマウス）でも産生することができる。ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子配列をこのような生殖細胞系突然変異マウスに移植すると、抗原の投与時にヒト抗体が産生する (たとえば、Jakobovits, A.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., ら, Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., ら, Year Immunol. 7 (1993) 33-40を参照) 。ヒト抗体は、ファージディスプレーライブラリーでも産生可能である (Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., ら, J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597)。ColeらおよびBoernerらによる技法もまたヒトモノクローナル抗体の調製に利用できる (Cole ら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985); and Boerner, P., ら, J. Immunol. 147 (1991) 86-95)。ヒト抗体には各種形態の抗体、好ましくはモノクロナール抗体が包含され、例えば抗体全体、抗体フラグメント、クラス改変抗体ならびに遺伝子操作による抗体（変異抗体もしくは突然変異抗体）が挙げられるが、本発明の特徴的特性が維持される限りこれらに限定されない。組み換えヒト抗体が特に好ましい。本明細書で使用されている「モノクローナル抗体」という用語は、全てが実質的に同じアミノ酸配列を有する抗体分子の調製物を言う。
【００４３】
本明細書で使用されている「組み換えヒト抗体」という用語は、組み換え手段によって調製、発現、生成もしくは単離したすべてのヒト抗体を包含することを意図としており、例えば、ＮＳＯ細胞またはＣＨＯ細胞由来の宿主細胞またはヒト免疫グロブリンを形質導入した動物（例えばマウスなど）から単離した抗体、あるいはそれら宿主細胞に形質導入した組み換え発現ベクターを用いて発現させた抗体が挙げられる。このような組み換えヒト抗体で可変領域および定常領域は再配列した形態にある。本発明組み換えヒト抗体は、生体内で体細胞レベルの超変異(somatic hypermutation)を受けている。したがって、組み換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、定義されたヒト生殖細胞系ＶＨおよびＶＬ配列に帰属可能であるが、生体内のヒト抗体生殖細胞系の配列領域内に天然には存在しないかもしれない。
【００４４】
「クラス改変抗体」という用語は、モノクローナル抗体、好ましくはヒト抗体であって、ただしそれに含まれる可変領域すなわち結合領域は或る種の細胞源もしくは生殖細胞系に由来し、他方定常領域の少なくとも一部は他の種の細胞源もしくは生殖細胞系由来の通常は組み換えＤＮＡ技法により調製された抗体の定常領域に一致する抗体を言う。このようなクラス改変抗体は、天然には生起しないので、異種移植したマウスから直接入手することはできない。本発明に包含される「クラス改変抗体」の形態においては、定常領域の配列は野生型定常領域の配列とは差異があり、その結果、この抗体の特性は本発明の特性と相違しており、特にＣｌｑ結合および／またはＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関してはＦＣが変化もしくは突然変異しているので相違する。クラス改変抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメントおよび免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含む免疫グロブリン遺伝子の発現の生成物である。クラス改変抗体の産生方法には従来の組み換えＤＮＡが含まれており、遺伝子の形質転換技術は当技術分野では公知である（たとえば、Morrison, S.L., ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US Patent Nos. 5,202,238と5,204,244を参照）。
【００４５】
本明細書で使用されている「可変領域」（軽鎖の可変領域（ＶＬ）、重鎖の可変領域（ＶＨ））は、対になっている軽鎖と重鎖のそれぞれにおいて抗原と抗体の結合に直接係わる部分を言う。ヒトの可変軽鎖と重鎖のドメインの一般構造は同じであり、各ドメインには４つのフレームワーク（ＦＲ）領域が含まれており、それらは、配列が広範囲に保存され、３つの「超可変領域」（もしくは相補的決定領域（ＣＤＲ）によって連結している。フレームワーク領域は、β（ベータ）−シート構造をとっており、そのＣＤＲがループを形成してベータシート構造に連結することがある。各鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域によって三次元構造に保持され、他方の鎖のＣＤＲと一体になって抗原接合部位を形成する。抗体重鎖および軽鎖のＣＤＲ３領域、好ましくは重鎖のＣＤＲ３は、本発明抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たし、本発明のさらなる目的を提供する。
【００４６】
本明細書で使用する、「超可変領域」もしくは「抗体の抗原結合部分」という用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を表す。超可変領域には、「相補的決定領域」すなわち「ＣＤＲ」のアミノ酸残基が含まれる。「フレームワーク」すなわち「ＦＲ」領域は、本明細書で定義する超可変領域残基を除く可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖および重鎖には、そのＮ末端からＣ端末に向けてドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４が含まれる。ＣＤＲおよびＦＲ領域は、Kabat., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)らの標準の定義に従って決定される。
【００４７】
「定常領域」は、抗原に対する抗体の結合には直接関与しないが、各種エフェクター機能を発揮する。重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体もしくは免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭのクラスに分けられ、これらのいくつかは更にサブクラス（イソタイプ）、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分類することができる。免疫グロブリンのクラスが異なるに応じて、重鎖定常領域はそれぞれγ、δ、μ、αおよびεと呼ばれる。本発明抗体はＩｇＧ１型であることが好ましい。
【００４８】
抗体のＦｃ部は、補体活性化、Ｃｌｑ結合、Ｃ３活性化およびＦｃ受容体結合に直接関与する。Ｃ１ｑに対する結合は、Ｆｃ部の所定の結合部位によって生じる。このような結合部位は、当技術分野では公知であり、たとえば、Lukas, T.J., ら, J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., ら, Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., ら, Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., ら, J. Immunol. 164 (2000)4128-4184; Hezareh, M., ら,aJ. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., ら, Immunology 86 (1995) 319-324; およびEP 0 307 434 に記述されている。このような結合部位の例として、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１およびＰ３２９（KabatのＥＵインデックスにしたがって符番、以下を参照）が挙げられる。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３の抗体は、通常、補体活性化、Ｃｌｑ結合およびＣ３活性化を呈するが、ＩｇＧ４抗体は、補体系を活性化させず、Ｃ１ｑ結合を行わずＣ３活性化も行わない。本明細書で使用している「ヒト起源由来のＦｃ部」という用語は、サブクラスＩｇＧ１のヒト抗体のＦｃ部のアミノ酸配列を有するのが好ましいＦｃ部を言うが、ただし修飾が加えられ、その結果Ｃｌｑ結合、Ｃ３活性化および／またはＦｃＲ結合が検出されないか、もしくは結合がヒトＩｇＧ１抗体に比べ少なくとも５０％、好ましくは７０％低減されたもの言う。「抗体のＦｃ部」は、熟練技術者にとっては公知の用語であり、パパインによる抗体の開裂の基本概念に基づいて定義されている。本発明抗体には、ヒト起源由来のＦｃ部のアミノ酸配列を持つＦｃ部、好ましくはヒト定常領域の他のすべての部分を含んでいることが好ましい。そのＦｃ部はヒトＩｇＧ１サブクラス由来の突然変異ヒトＦｃ部であるのが好ましい。もっとも好ましいFｃ部はＬ２３４ＡとＬ２３５ＡもしくはＤ２６５ＡとＮ２９７Ａの突然変異を有するγ１−重鎖定常領域（配列番号１１に例がある）を含む（WO99/51642）。
【００４９】
ヒト定常領域鎖、例えばγ１−重鎖については、Kabat ら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) およびBruggemann, M., ら, J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361; Love, T.W., ら, Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527に詳細な記述がある。本発明における好ましい定常ドメインによって補体結合は得られない。本明細書で使用されている「可変領域」（軽鎖の可変領域（ＶＬ）、重鎖の可変領域（ＶＨ））は、抗原に対する抗体の結合に直接関与する一対の軽鎖と重鎖のそれぞれを言う。
【００５０】
本明細書で使用されている核酸および核酸分子という用語は、ＤＮＡ分子とＲＮＡ分子とを含むことを意図している。核酸分子は、１本鎖もしくは２本鎖であってもよいが、２本鎖ＤＮＡであることが好ましい。
【００５１】
核酸は、他の核酸配列との機能的な関係に置かれると、「操作可能なように連結」される。例えば、前駆体配列もしくは分泌のリーダーとなるＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に参加する前駆体タンパクとして発現する場合には、ポリペプチドのＤＮＡに操作可能なように連結される。プロモーターもしくはエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合には、コーディング配列に操作可能なように連結される。あるいはリボソームへの結合部位は、それが翻訳を促進する位置に置かれる場合には、コーディング配列に操作可能なように連結される。包括的に「操作可能なように連結される」という用語は、連結されるＤＮＡ配列がｃｉｓであり、分泌リーダーとなる場合には連続的であり、読取り枠内にあることを意味する。ただし、エンハンサーは連続している必要はない。連結は、便利な制限部位のライゲーション反応によって達成される。このような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来の慣行に従って使用する。
【００５２】
本明細書で使用されている「細胞」、「細胞系」および「細胞培養」という表現は、相互に交換して使用することができ、このような名称にはすべて子孫が含まれる。したがって、「形質転換体」および「形質転換細胞」という用語には、一次対象細胞とその対象細胞に由来する培養物が包含され、転換の回数には関係がない。また、子孫のすべてがＤＮＡにおいて正確に一致しているとは限らないと理解される。理由は意図的な変異あるいは偶然の変異があるからである。変異子孫であっても、最初に形質転換した細胞をスクリーニングするのに使用した機能や生物活性が同じであれば、包含される。別の名称を意図する場合には、文脈から明らかとなる。
【００５３】
本明細書で用いられている「ＩＬ−１３Ｒα１に結合」という用語は、インビトロの測定において抗体がＩＬ−１３Ｒα１に結合することを意味し、ただしその結合測定においては抗体を表面に結合させ、ＩＬ−１３Ｒα１の結合を表面プラズモン共鳴(SPR)によって測定するのが好ましい。結合とは、結合の親和度（ＫＤ）が１０−８Ｍ以下、好ましくは１０−１３〜１０−９Ｍであることを意味する。「結合しない」とは、ＫＤが１０−６Ｍ以上であることを意味する。本発明抗体は、ヒトＩＬ−１３Ｒα１の細胞外ドメインに結合するが、マウスＩＬ−１３Ｒα１にも結合するのが好ましい。
【００５４】
ＩＬ−１３Ｒα１への結合は、ＢＩＡｃｏｒｅ測定によって検討可能である(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden)。結合の親和度は、ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体の会合の速度定数）、ｋｄ（解離速度）、およびＫＤ（ｋｄ／ｋａ）の項目によって定義される。
【００５５】
ＩＬ−１３のＩＬ−１３Ｒα１への結合は、本発明抗体によって阻害される。この阻害は、ＩＬ−１３のＩＬ−１３Ｒα１／ＩＬ−４Ｒα異種二量体への結合に対するＥＬＩＳＡによるＩＣ５０として測定される。この測定を実施するには、ＩＬ−１３Ｒα１を固定化してＩＬ−１３およびＩＬ−４Ｒαを添加する。ＩＬ−１３のＩＬ−１３Ｒα１への結合に対する本発明抗体のＩＣ５０値はせいぜい６ｎＭである。ＩＣ５０値は、少なくとも３回の独立した測定の平均値もしくは中央値として測定される。１個のＩＣ５０値が範囲外となってもよい。
【００５６】
本発明抗体は、抗体ＬＣ５００２−００２、ＬＣ５００２−００３、ＬＣ５００２−００５、ＬＣ５００２−００７もしくはＬＣ５００２−０１８からなる群から選択される抗体が結合するのと同じＩＬ−１３Ｒα１のエピトープに結合するのが好ましく、あるいはこれら抗体が結合して生ずる立体障害によってＩＬ−１３Ｒα１に対する結合を阻害される。結合の阻害はＳＰＲ測定で検出することができ、その測定では抗体ＬＣ５００２−００２、ＬＣ５００２−００３、ＬＣ５００２−００５、ＬＣ５０２−００７もしくはＬＣ５００２−０１８からなる群から選択された固定化抗体および２０〜５０ｎＭの濃度のＩＬ−１３Ｒα１、ならびに１００ｎＭの濃度で検出される抗体を用いる。信号が５０％以上減衰すれば、該抗体が、抗体ＬＣ５００２−００２、ＬＣ５００２−００３、ＬＣ５００２−００５、ＬＣ５００２−００７もしくはＬＣ５００２−０１８からなる群から選択された抗体と競合していることが判る。「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合可能なタンパク質上の決定因子を意味する。エピトープは通常は分子の化学的に活性な表面の基、例えばアミノ酸あるいは糖側鎖から構成され、通常は特異的な３次元的構造の特性および特異的な電荷特性を有する。立体構造エピトープと非立体構造エピトープとの識別は、変性溶剤の存在下で抗体は前者には結合性を喪失し、後者には喪失しないことにある。また本発明には、ＩＬ−１３Ｒα１に結合することによってＩＬ−１３の生体活性を阻害するヒト抗体が含まれ、その特徴であるＩＬ−１３Ｒα１への結合親和度は１０−９Ｍ（ＫＤ）以下、好ましくは１０−９〜１０−１３Ｍであり、またマウスＩＬ−１３Ｒα１への結合親和度は１０−７Ｍ（ＫＤ）以下、好ましくは１０−８〜１０−９Ｍである。
【００５７】
本発明の好ましい実施態様では、本発明抗体は、さらに、抗体ＬＣ５００２−００２、ＬＣ５００２−００３、ＬＣ５００２−００５、ＬＣ５００２−００７もしくはＬＣ５００２−０１８からなる群から選択される抗体が結合するのと同じエピトープに結合し、その結合パラメータＫａ、ＫｄおよびＫＤから選択された一以上の特性を特徴とする。
【００５８】
本発明による抗体は、組み換え法によって産生されることが好ましい。この方法は、当技術分野では広く公知であり、原核細胞と真核細胞でタンパク質発現後、抗体ポリペプチドの単離が続き、通常は医薬的に受容可能な純度まで精製する。タンパク質を発現するには、軽鎖と重鎖もしくはそのフラグメントをコードする核酸を標準の方法によって発現ベクターに挿入する。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母もしくはＥ．ｃｏｌｉ細胞のような適切な原核宿主細胞もしくは真核宿主細胞で行い、抗体を細胞（上清もしくは溶解細胞）から回収する。
【００５９】
抗体の組み換え産生は、当技術分野では公知であり、例えば、Makrides, S.C., ProteinExpr.Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., ら, Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880のレビュー記事に記述」されている。
【００６０】
抗体は、細胞体中に、細胞溶解液中に、あるいは部分的に精製されたまたは実質的に純粋な形態で存在しうる。他の細胞成分や他の混入物、例えば他の細胞核酸もしくはタンパク質を除去するために、標準的な技術、例えばアルカリ／ＳＤＳ処置、ＣｓＣｌ結合、カラムクロマトグラフィ、アガロースゲル電気泳動および当技術分野で公知の他の技術によって精製を行う。Ausube, F., ら, ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987) を参照されたい。
【００６１】
ＮＳ０細胞における発現は、Barnes, L.M., ら, Cytotechnology 32 (2000) 109-123; およびBarnes, L.M., ら, Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270による記述がある。一過的発現については、Durocher, Y., ら, Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9による記述がある。可変ドメインのクローニングについては、Orlandi, R., ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P.,ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289;およびNorderhaug, L., ら, J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87による記述がある。好ましい一過的発現系（ＨＥＫ  ２９３）については、Schalaeger, E.-J.,および Christernsen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83および Schlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199による記述がある。
【００６２】
例えば、原核細胞に好適な制御配列には、例えばプロモーター、場合によってはオペレータ配列およびリボソーム結合部位が含まれる。
【００６３】
真核細胞は、プロモーター、エンハンサーおよびポリアデニール化信号を利用することで知られている。
【００６４】
モノクローナル抗体を培地から好適に分離するには、従来の免疫グロブリン精製操作、例えばタンパクＡ−セファローズ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析法もしくはアフィニティ−クロマトグラフィーによる。このモノクローナル抗体をコードするＤＮＡおよびＲＮＡは容易に単離され、通常の操作により配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡおよびＲＮＡの提供源として機能することができる。このＤＮＡを一旦単離すれば発現ベクターに挿入し、次にそのベクターを宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞または形質導入しなければ免疫グロブリンタンパクを産生しないミエローマ細胞に形質導入し、宿主細胞での組み換えモノクローナル抗体の合成を達成する。
【００６５】
本発明抗体には、さらに、「保存的な配列修飾」、すなわち本発明抗体の上記特性に効果または改変を及ぼさないヌクレオチドおよびアミノ酸配列の修飾、を有する抗体が含まれる。修飾の導入は、特定部位突然変異誘発ならびにＣＰＲ介在突然変異誘発などの、当技術分野で公知の標準の技術によって可能である。保存的なアミノ酸置換には、例えばあるアミノ酸残基を側鎖が類似した他のアミノ酸残基で置き換える置換が含まれる。側鎖が類似したアミノ酸残基ファミリーは、当技術分野ですでに定義されている。これらのファミリーには、例えば塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジンなど）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸など）、非電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラリン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファンなど）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンなど）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシンなど）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンなど）を有するアミノ酸が含まれる。したがって、ヒト抗ＩＬ−１３Ｒα１抗体中の予測される非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基と置換可能であることが望ましい。
【００６６】
アミノ酸置換は、Riechmann, L., ら, Nature 332 (1988) 323-327およびQueen, C.,ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033によって記述されているように、分子モデリングに基づく突然変異誘発によって実施することができる。
【００６７】
ヒトＩＬ−１３Ｒα１抗体のアミノ酸配列変異体を作成するには、抗体ＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入するか、またはペプチド合成による。ただし、このような修飾は、例えば上記のようなごく限られた範囲内でのみ行うことができる。例えば、修飾によって、前述の抗体の特性、例えばＩｇＧイソタイプおよびエピトープ結合には変更がなく、組み換え体の産生収率やタンパク質の安定性が向上し精製が容易になるのがよい。
【００６８】
抗ＩＬ−１３Ｒα１抗体が適切な立体構造を維持するのに関与しないシステイン残基は全て一般的にセリンと置換してもよく、それによって分子の酸化安定性が向上し、異常な架橋は防止される。逆に、システイン結合（複数の場合もあり）を抗体に追加してもよく、それによって安定性が向上する（特に抗体がＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合）。
【００６９】
抗体の別の型のアミノ酸変異体では、抗体の本来のグルコシル化パターンが変化する。この変化とは、抗体に存在する１以上の炭水化物構成成分が除去され、さらに／または抗体に存在しない１以上のグリコシリ化部位が付加されることを意味する。抗体のグリコシル化は、一般にＮ−連結である。Ｎ−連結とは、アスパラギン残基の側鎖に炭水化物構成成分が結合することを言う。アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここでＸは、プロリンを除くアミノ酸である）のトリペプチド配列は、炭水化物構成成分がアスパラギン側鎖に酵素的に結合するための認識配列である。したがって、これらトリペプチド配列のどちらかがポリペプチドに存在すれば、グリコシル化の潜在的部位が形成される。抗体へのグリコシル化部位の付加が好都合に達成されるためには、アミノ酸配列を変化し抗体中に（Ｎ−連結グリコシル化部位のための）上記トリペプチド配列の１つ以上を含有させる。
【００７０】
抗ＩＬ−１３Ｒα１抗体のアミノ酸配列変異体をコード化する核酸分子は、当技術分野で公知のさまざまな方法によって調製される。これらの方法には、例えば天然源からの単離（自然起源のアミノ酸配列変異体の場合）、あるいはオリゴヌクレオチド介在（もしくは部位特異的）突然変異誘発による調製、ＰＣＲ突然変異誘発、および初期段階で調製された変異体または抗ＩＬ−１３Ｒα１抗体の非変異体のカセット式突然変異誘発が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
共有結合による別の型の修飾には、化学的もしくは酵素的に抗体にグリコシドを結合させることが必要である。これらの操作は、Ｎ−連結グリコシル化もしくはＯ−連結グリコシル化を呈するためのグリコシル化能を備えた宿主細胞で抗体を産生させる必要がないという利点がある。そのような結合モードを利用するかに応じて、糖（複数もあり）を結合させる相手は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボシキル基、（ｃ）システイン等の遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニンもしくはヒドリキシルプロリン等の遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファン等の芳香族残基もしくは（ｆ）グルタミンのアミノ基であってよい。これらの方法については、WO87/05330およびAplin, J.D., およびWriston, J.C.Jr., CRC Crit. Rev. Biochem. (1981) 259-306に記述がある。
【００７２】
抗体に存在している炭水化物構成成分は、化学的にもしくは酵素により除去することができる。化学的脱グリコシル化は、抗体を、トリフルオロメタンスルフォン酸もしくは同等の化合物に曝露させることによって実現できる。この処置の結果、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンもしくはＮ−アセチルガラクトサミン）を除く糖類の大部分もしくは全てが開裂し、無修飾の抗体が遊離される。化学的脱グリコシル化については、Sojahr, H.T., and Bahl, O.P., Arch. Biochem. Biophys. 259 (1987) 52-57およびEdge, A.S., ら, Anal. Biochem. 118 (1981) 131-137よって記述されている。抗体上の炭水化物構成成分の酵素による開裂を達成するには、Thotakura, N.R., and Bahl, O.P., Meth. Enzymol. 138 (1987) 350-359によって記述されているように、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼを使用する。
【００７３】
共有結合による別の型の抗体修飾には、非タンパク性の多様なポリマーの１つ、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレンに、米国特許第 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 号もしくは4,179,337号に記述されている方法で抗体を連結させることが含まれる。
【００７４】
さらに別の態様では、本発明は、本発明ヒト抗ＩＬ−１３Ｒα１抗体を発現する形質転換非ヒト動物、例えば形質転換マウスから単離したＢ細胞を提供する。単離Ｂ細胞は、ＩＬ−１３Ｒα１抗原の精製物または濃縮物および／またはＩＬ−１３Ｒα１を発現する細胞で免疫した形質転換非ヒト動物、例えば形質転換マウスから取得するのが好ましい。形質転換非ヒト動物、例えば形質転換マウスのゲノムには、本発明抗体の全部もしくは一部をコード化するヒト重鎖トランス遺伝子およびヒト軽鎖トランス遺伝子が含まれることが好ましい。次に単離したＢ細胞を不死化することにより、ヒト抗ＩＬ−１３Ｒα１抗体の供給源（例えば、ハイブリドーマ）が提供される。したがって、本発明はまた本発明ヒトモノクローナル抗体を産生可能なハイブリドーマを提供する。１つの実施態様では、ハイブリドーマ、例えばＢ細胞を形質転換非ヒト動物、例えば形質転換マウスから取得し、不死化細胞に融合させる。このマウスのゲノムには本発明抗体の全部もしくは一部をコード化するヒト重鎖トランス遺伝子およびヒト軽鎖トランス遺伝子が含まれる。
【００７５】
特定の実施態様では、形質転換非ヒト動物が形質転換マウスであり、このマウスのゲノムには本発明抗体の全部もしくは一部をコード化するヒト重鎖トランス遺伝子およびヒト軽鎖トランス遺伝子が含まれる。形質転換非ヒト動物は、ＩＬ−１３Ｒα１抗原の精製物または濃縮物および／もしくはＩＬ−１３Ｒα１を発現する細胞で免疫することができる。形質転換非ヒト動物、例えば形質転換マウスは、ＩＬ−１３Ｒα１に対するヒトモノクローナル抗体のＩｇＧ１イソタイプを産生することができる。
【００７６】
本発明ヒトモノクローナル抗体の産生を可能にするには、本発明抗体の全部もしくは一部をコード化するヒト重鎖トランス遺伝子およびヒト軽鎖トランス遺伝子をゲノムに含む形質転換非ヒト動物、例えば形質転換マウスをＩＬ−１３Ｒα１抗原の精製物または濃縮物および／もしくはＩＬ−１３Ｒα１を発現する細胞で免疫する。次に、その動物のＢ細胞（例えば、脾臓Ｂ細胞など）を骨髄腫細胞と融合させて、ＩＬ−１３Ｒα１に対するヒトモノクローナル抗体を分泌する不死のハイブリドーマ細胞を形成する。
【００７７】
好ましい実施態様では、ＩＬ−１３Ｒα１に対するヒトモノクローナル抗体の生成を可能にするために、マウスの免疫系ではなくヒトの免疫系部分を担持する形質転換マウスを使用する。本明細書で「ＨｕＭａｂ」マウスと呼ばれるこれらの形質転換マウスは、内在するμおよびκ鎖の遺伝子座を不活性化する標的突然変異とともに、重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖（定常領域遺伝子）を含む再構成されていないヒト免疫グロブリン遺伝子をコード化するヒト免疫グロブリン遺伝子のミニ遺伝子座を含む（Lonberg, N., ら, Nature 368 (1994) 856-859）。したがって、これらマウスでは、マウスＩｇＭもしくはＫの発現が低減し、免疫に応答して導入されたヒト重鎖トランス遺伝子および軽鎖トランス遺伝子がクラス変更と体細胞突然変異を受けて高親和性のヒトＩｇＧモノクローナル抗体を生成する（Lonberg, N., ら, Nature 368 (1994) 856-859; Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113 (1994) 49-101にレビュー; Lonberg, N., and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. 25 (1995) 65-93; および Harding, F., and Lonberg, N., Ann. N. Acad. Sci 764 (1995) 536-546）。ＨｕＭａｂマウスの調製については、Taylor, L., ら Nucleic Acids Research 20 (1992) 6287-6295; Chen, J., ら, International Immunology 5 (1993) 647-656; Tuaillon, N., ら, Proc. Natl. Acad. Sci USA 90 (1993) 3720-3724; Choi, T.K., ら, Nature Genetics 4 (1993) 117-123; Chen, J., ら, EMBO j. 12 (1993) 821-830; Tuaillon, N., ら, Immunol. 152 (1994) 2912-2920; Lonberg, N., ら, Nature 368 (1994) 856-859; Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113 (1994) 49-101; Taylor, L., ら, Int. Immunol. 6 (1994) 579-591; Lonber, N., and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. 25 (1995) 65-93; Harding, F., and Lonberg, N., Ann. N. Acad. Sci 764 (1995) 536-546; Fishwild, D.M., ら, Nat. Biotecnol. 14 (1996) 845-851に記述がある。これらすべての内容は、全体を本明細書に引用により編入される。（さらに、米国特許番号第 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 5,545,807; 5,770,429; WO 98/24884; WO 94/25585; WO 93/1227; WO 92/22645;およびWO 92/03918参照）。
【００７８】
ＩＬ−１３Ｒα１に対するヒトモノクローナル抗体を十分に生成するために、ＨｕＭａｂマウスをLonberg, N., ら, Nature 368 (1994) 856-859; Fishwild, D.M, ら, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851およびWO98/24884に記述されている一般的方法に従って、ＩＬ−１３Ｒα１抗原の精製物または濃縮物および／またはＩＬ−１３Ｒα１を発現する細胞で免疫することができる。マウスは、第１回の免疫時には週齢６〜１６であることが好ましい。例えば、可溶性ＩＬ−１３Ｒα１抗原の精製物または濃縮物（例えば、ＩＬ−１３Ｒα１発現細胞から精製）を使用してＨｕＭａｂマウスを腹腔内に免疫することができる。ＩＬ−１３Ｒα１抗原の精製物または濃縮物を用いて免疫しても結果的に抗体が生成されない場合には、ＩＬ−１３Ｒα１を発現する細胞、例えば腫瘍細胞系でマウスを免疫すれば免疫応答を促進することができる。各種抗原での蓄積された経験によれば、最初にフロイントの完全アジュバントと抗原を腹腔内（i.p.）に免疫付与し、次いで二週間毎にフロイントの不完全アジュバンドと抗原をi.p.またはs.cに.交互に免疫（例えば、全６回まで）すれば、ＨｕＭａｂ形質転換マウスの応答が最良になる。免疫プロトコルの全過程にわたって免疫応答を監視するには、眼窩後部を出血させて取得した血漿試料を使用する。血漿はELISAによってスクリーニングすることができ、十分な力価の抗ＩＬ−１３Ｒα１ヒト免疫グロブリンを有するマウスを、対応するＢ細胞の不死化のために使用することができる。抗体力価を高めるためにマウスに抗原を静脈注射し、３〜４日後に屠殺して脾臓とリンパ節を摘出する。抗原ごとに２〜３の融合を実施する必要があると想定される。抗原ごとに数匹のマウスに免疫する。例えば、合計５〜１２匹のＨＣｏ７およびＨＣｏ１２系ＨｕＭａｂマウスに免疫することができる。
【００７９】
ＨＣｏ７マウスでは、それらの内因性軽鎖（カッパ）遺伝子（Chen, J., ら, EMBO J. 12(1993) 821-830の記述のとおり）にＪＫＤの欠落があり、それらの内因性重鎖遺伝子（WO01/14424の実施例１に記載のとおり）にＣＭＤの欠落があり、ＫＣｏ５ヒトカッパ軽鎖遺伝子導入（Fishwild, D.M., ら, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851記載のとおり）およびＨＣｏ７ヒト重鎖遺伝子導入（US Patent No. 5,770,429に記載のとおり）がある。
【００８０】
ＨＣｏ１２マウスでは、それらの内因性軽鎖（カッパ）遺伝子（Chen, J., ら, EMBO J. 12(1993) 821-830の記述のとおり）にＪＫＤの欠落があり、それらの内因性重鎖遺伝子（WO 01/14424の実施例１に記載のとおり）にＣＭＤの欠落があり、ＫＣｏ５ヒトカッパ軽鎖遺伝子導入（Fishwild, D.M., ら, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851記載のとおり）およびＨＣｏ１２ヒト重鎖遺伝子導入（WO01/14424の実施例２に記載のとおり）がある。
【００８１】
マウスのリンパ球を単離し、標準のプロトコルに基づいてＰＥＧを使用してマウスの骨髄腫細胞系と融合してハイブリドーマを作成する。次に、作成したハイブリドーマを抗原特異的抗体の産生を求めてスクリーニングする。例えば、免疫マウスの脾臓およびリンパ節由来のリンパ球の単細胞懸濁液を、５０％ＰＥＧを使用してＳＰ２／０非分泌マウスミエローマ細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ  １５８１）の６分の１個数と融合させる。細胞を平底マイクロタイタープレートに約２×１０５で移植し、続いて選択培地で約２週間インキュベートする。
【００８２】
次に、個々のウェルをELISAによってスクリーニングし、ヒト抗ＩＬ−１３Ｒα１モノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体を求める。ハイブリドーマが広範に成長したなら、通常１０〜１４日後に培地を分析する。抗体を分泌しているハイブリドーマを再度プレートし、再度スクリーニングして、依然としてヒトＩｇＧ、抗ＩＬ−１３Ｒα１抗体陽性である場合には、少なくとも２回、限界希釈法によってサブクローニングすることができる。次に、安定なサブクローンをインビトロで培養することにより、特徴付けのために組織培養で抗体を産生する。
【００８３】
ＣＤＲ配列は抗原抗体相互作用の原因であるから、本発明組み換え抗体の発現を可能にするためには、別のヒト抗体由来のフレームワーク配列上に本発明ＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築する（例えば、Riechmann, L., ら, Nature 332 (1998) 323-327; Jones, P., ら, Nature 321 (1986) 522-525; およびQueen, C., ら, Proc. Natl. Acad. U.S.A 86 (1989) 10029-10033を参照）。このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系ヒト抗体遺伝子配列を格納している公開ＤＮＡデータベースから取得することができる。これらのヒト生殖細胞配列は成熟抗体遺伝子配列とは異なる。理由はヒト生殖細胞配列は完全に組立てられた可変遺伝子を含むことはなく、可変遺伝子はＢ細胞の成熟中にＶ（Ｄ）Ｊ接合によって形成されるからである。またヒト生殖細胞系遺伝子配列は、可変領域で個々に均等にある高親和性の二次範囲抗体の配列とも異なる。
【００８４】
本発明には、ＩＬ−１３がＩＬ−１３Ｒα１に結合するのを阻害するポリペプチドであって、
ａ）配列番号１、３、５、７もしくは９の重鎖ＣＤＲを有する抗体重鎖
ｂ）配列番号２、４、６、８もしくは１０の軽鎖ＣＤＲを有する抗体軽鎖
からなる群から選択されるＩＬ−１３Ｒα１に結合するポリペプチドをコード化する核酸フラグメントが含まれる。
【００８５】
再構築した重鎖および軽鎖の可変領域を、プロモーター、翻訳開始、定常領域、３‘非翻訳、ポリアデニール化および転写停止の各配列と組み合わせて、発現ベクター構築体を形成する。重鎖および軽鎖を発現する構築体を組み合わせて一個のベクターにまとめ、宿主細胞中に共形質転換、連続形質転換、または個別形質転換した後、融合させて両方の鎖を発現する一個の宿主細胞を形成する。
【００８６】
したがって、本発明は、本発明組み換えヒト抗体の産生方法であって、
ａ）  配列番号１、３、５、７もしくは９の重鎖ＣＤＲを有する抗体重鎖
ｂ）  配列番号２、４、６、８もしくは１０の軽鎖ＣＤＲを有する抗体軽鎖
をコード化する核酸の発現を含む方法を提供する。
【００８７】
本発明はさらに、インビトロでＩＬ−１３Ｒα１を検出するための、好ましくは試料中のＩＬ−１３Ｒα１と本発明抗体との間の結合を測定する免疫学的測定法によって検出するための、本発明抗体の使用を含む。
【００８８】
もう１つの態様では、本発明は、本発明ヒトモノクローナル抗体の１つもしくはそれらの組み合わせまたはその抗原結合部を、医薬的に受容可能な担体と共に配合させた組成物、例えば医薬的組成物を提供する。
【００８９】
本明細書で使用する「医薬的に受容可能な担体」には、例えば溶剤、分散媒体、被膜、抗菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等、生理学的に適合性のあるものが挙げられる。担体は、静脈、筋肉、皮下、腹部、脊髄もしくは皮膚投与に好適であることが望ましい（例えば、注射液や輸液など）。
【００９０】
「医薬的に受容可能な塩」は、抗体の所望の生物学的活性を維持し、望ましくない毒性効果を全く呈さない塩を言う（例えば、Berge, S.M., ら, J. Pharm. Sci. 66 (1977) 1-19参照）。このような塩は本発明に包含される。塩の例には、例えば酸付加塩類および塩基付加塩類が挙げられる。酸付加塩類は非毒性の無機酸から誘導され、例えば塩化水素塩である。
【００９１】
本発明組成物は、当技術分野で公知の多種多様な方法によって投与することができる。熟練技術者によって理解されるように、投与の経路および／もしくは方式は、どのような結果を所望するかに応じて変更される。
【００９２】
特定の投与経路によって本発明化合物を投与するには、その化合物の不活性化を防止するための材料で化合物をコーティングするかもしくは、その材料と一緒に化合物を同時に投与する必要があるかもしれない。例えば、リポソームなどの適切な担体や希釈液で対象者に化合物を投与することができる。医薬的に受容可能な希釈液には、生理食塩水および緩衝水溶液があげられる。
【００９３】
医薬的に受容可能な担体としては、殺菌水溶液もしくは分散液および、注射可能な滅菌溶液もしくは分散液の即時調製用の粉末滅菌剤が挙げられる。医薬的に活性のある物質のためにこのような媒体や薬剤を使用することは当技術分野では公知である。
【００９４】
本明細書で使用されている「非経口投与」および「非経口投与される」という語句は、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与方式を意味し、例えば静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心腔内、皮内、腹腔内、経胸腔、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外および胸骨内の各種注射と注入が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
組成物には、保存料、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの補助剤も含まれる。微生物の存在を確実に防止するには、殺菌処置し、さらには各種抗菌剤や抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸を含有させる。組成物に、等張剤、例えば糖類、塩化ナトリウムを含有させることも望ましいであろう。さらに、注入可能な吸収延長型製剤形を作成するには、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含有させてもよい。
【００９６】
どのような投与経路を選択するかとは関係なく、本発明化合物は好適な水和形態で使用してもよく、および／または本発明組成物は、当業者に公知の従来方法によって医薬的に受容可能な投与形態に製剤される。
【００９７】
所望の治療応答を達成する上で特定の患者、組成および投与方式にとって効果的な活性成分量を獲得し、かつ患者に対し毒性がないように、本発明医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルを変更することができる。多種多様な薬物動態学的因子、例えば採用した本発明の特定組成物、またはエステル、塩またはアミドの活性、投与経路、投与時間、特定の採用化合物の排泄速度、治療期間、採用する特定の組成物と組み合わせて使用する他の薬剤、化合物および／または材料、治療する患者の年齢、性別、体重、容態、全般的健康状態ならびにそれまでの病歴等の医療分野で公知の各種要因に応じて投与量レベルを選択する。
【００９８】
組成物は、無菌であり、かつ注射器で移送可能な程度にまで流状でなくてはならない。担体は、水のほかに、等張緩衝化食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびその好適な混合物のいずれであってもよい。
【００９９】
適切な流状性の維持を可能にするためには、例えば、被膜剤、例えばレシチンを使用し、分散の場合には必要な粒子サイズを維持し、および表面活性剤を使用する。多くの場合、組成物には等張剤、例えば糖類、ポリアルコール類、例えばマニトールやソルビトールおよび塩化ナトリウムを含有させるのが好ましい。長期的吸収型の注射可能な組成物の作成を可能にするには、吸収を遅延する薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムもしくはゼラチンを組成物中に含有させる。
【０１００】
以下の実施例、参考資料、配列リストおよび図は、本発明の理解を助けるために提供されており、本発明の真の対象範囲は付随する請求項に規定されている。修飾改変例は、規定の手順により本発明の要旨から逸脱することなく作成可能であるのが理解される。
【０１０１】
配列リストの記述
配列番号１  ＨｕＭａｂ  ＬＣ５００２−００２の重鎖可変ドメイン
配列番号２  ＨｕＭａｂ  ＬＣ５００２−００２の軽鎖可変ドメイン
配列番号３  ＨｕＭａｂ  ＬＣ５００２−００３の重鎖可変ドメイン
配列番号４  ＨｕＭａｂ  ＬＣ５００２−００３の軽鎖可変ドメイン
配列番号５  ＨｕＭａｂ  ＬＣ５００２−００５の重鎖可変ドメイン
配列番号６  ＨｕＭａｂ  ＬＣ５００２−００５の軽鎖可変ドメイン
配列番号７  ＨｕＭａｂ  ＬＣ５００２−００７の重鎖可変ドメイン
配列番号８  ＨｕＭａｂ  ＬＣ５００２−００７の軽鎖可変ドメイン
配列番号９  ＨｕＭａｂ  ＬＣ５００２−００１８の重鎖可変ドメイン
配列番号１０  ＨｕＭａｂ  ＬＣ５００２−００１８の軽鎖可変ドメイン
配列番号１１  κ軽鎖定常領域
配列番号１２  γ１重鎖定常領域
【０１０２】
実施例
実施例１
ハイブリドーマの作成
本発明ヒトモノクローナル抗体の産生を可能にするには、本発明抗体の全部もしくは一部をコード化するヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子をゲノムに含む形質転換非ヒト動物、例えば形質転換マウスをヒトＩＬ−１３Ｒα１を発現する細胞で免疫する。次に、その動物のＢ細胞（例えば、脾臓Ｂ細胞など）を得て骨髄腫細胞と融合させて、ＩＬ−１３Ｒα１に対するヒトモノクローナル抗体を分泌する不死のハイブリドーマ細胞を形成する。ＩＬ−１３Ｒα１に対するヒトモノクローナル抗体は、マウスの免疫系ではなくヒトの免疫系部分を担持する形質転換マウスを使用して生成することができる。本明細書で「ＨｕＭａｂ」マウスと呼ばれるこれらの形質転換マウスは、内在するμおよびκ鎖の遺伝子座を不活性化する標的突然変異とともに、重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖（定常領域遺伝子）を含む再構成されていないヒト免疫グロブリン遺伝子をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子のミニ遺伝子座（minilocus）を含む（Lonberg, N., ら, Nature 368 (1994) 856-859）。したがって、これらマウスでは、マウスＩｇＭもしくはＫの発現が低減し、免疫に応答して導入されたヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子がクラス変更と体細胞突然変異を受けて高親和性のヒトＩｇＧモノクローナル抗体を生成する。ＩＬ−１３Ｒα１に対するヒトモノクローナル抗体を十分に生成するために、ＨｕＭａｂマウスをLonberg, N., ら, Nature 368 (1994) 856-859; Fishwild, D.M, ら, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851およびWO98/24884に記述されている一般的方法に従って、ヒトＩＬ−１３Ｒα１を発現する細胞で免疫することができる。マウスは、第１回の免疫時には週齢６〜１６であることが好ましい。例えば、ＩＬ−１３Ｒα１の形質転換細胞を使用してＨｕＭａｂマウスを腹腔内に免疫することができる。免疫付与プロトコルの全過程にわたって免疫応答を監視するには、眼窩後部を出血させて取得した血漿試料を使用する。血漿はELISA及び／又はFACSによってスクリーニングすることができ、十分な力価の抗ＩＬ−１３Ｒα１ヒト免疫グロブリンを有するマウスを、対応するＢ細胞の不死化のために使用することができる。マウスに抗原を静脈注射し、３〜４日後に屠殺して脾臓とリンパ節を摘出する。例えば、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２系ＨｕＭａｂマウスに免疫することができる。ＨＣｏ７マウスでは、それらの内因性軽鎖（カッパ）遺伝子（Chen, J., ら, EMBO J. 12(1993) 821-830の記述のとおり）にＪＫＤの欠落があり、それらの内因性重鎖遺伝子（WO/14424の実施例１に記載のとおり）にＣＭＤの欠落があり、ＫＣｏ５ヒトカッパ軽鎖導入遺伝子（Fishwild, D.M., ら, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851記載のとおり）およびＨＣｏ７ヒト重鎖導入遺伝子（US Patent No. 5,770,429に記載のとおり）を有する。ＨＣｏ１２マウスでは、それらの内因性軽鎖（カッパ）遺伝子（Chen, J., ら, EMBO J. 12(1993) 821-830の記述のとおり）にＪＫＤの欠落があり、それらの内因性重鎖遺伝子（WO 01/14424の実施例１に記載のとおり）にＣＭＤの欠落があり、ＫＣｏ５ヒトカッパ軽鎖導入遺伝子（Fishwild, D.M., ら, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851記載のとおり）およびＨＣｏ１２ヒト重鎖導入遺伝子（WO01/14424の実施例２に記載のとおり）を有する。
マウスのリンパ球を単離し、標準のプロトコルに基づいてＰＥＧを使用してマウスの骨髄腫細胞系と融合してハイブリドーマを作成する。次に、作成したハイブリドーマを抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングする。例えば、免疫マウスの脾臓およびリンパ節由来のリンパ球の単細胞懸濁液を、５０％ＰＥＧを使用してＳＰ２／０非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ  １５８１）と融合させる。細胞を平底マイクロタイタープレートに約０．７５×１０７でプレートし、続いて選択培地で約２週間インキュベートする。次に、個々のウェルをELISAおよび／またはFACSによってヒト抗ＩＬ−１３Ｒα１モノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体についてスクリーニングする。ハイブリドーマが広範に成長したなら、抗体を分泌しているハイブリドーマを再度プレートし、再度スクリーニングして、依然としてヒトＩｇＧ、抗ＩＬ−１３Ｒα１抗体陽性である場合には、少なくとも２回、限界希釈法によってサブクローニングすることができる。次に、安定なサブクローンをインビトロで培養することにより、特徴付けのために組織培養培地で抗体を産生する。
【０１０３】
形質転換マウスの免疫手順
３匹のＨＣｏ７マウス（オス３匹）、ＧＧ２２０１系(Medares, San Jose, CA, USA)および２匹のＨＣｏ１２（オス1匹メス１匹）、ＧＧ２１９８系(Medares, San Jose, CA, USA)をＩＬ−１３Ｒα１の発現ベクターで形質転換した１×１０６ＨＥＫ２９３細胞により免疫した。腹腔内（ｉ．ｐ．）および尾の基底の皮下（ｓ．ｃ．）に交互に合計8回の免疫を実施した。第１回の免疫では、１００μｌの１×１０６ＨＥＫ２９３：ＩＬ−１３Ｒα１細胞を１００μｌの完全フロイントアジュバンド(CFA; Difco Laboratories, Detroit, USA)と混合した。その他の免疫では、ＰＢＳ内で１００μｌの細胞を１００μｌの不完全フロイントアジュバンド(ICFA; Difco)と混合した。
【０１０４】
マウスのブースト
抗ＩＬ−１３Ｒα１の血清力価が十分であることが判明した段階で、マウスを融合の４および３日前に静注（ｉ．ｖ．）により２００μｌＰＢＳ中の１×１０６ＨＥＫ２９３：ＩＬ−１３Ｒα１細胞を用いてさらに２回注射した。
【０１０５】
実施例２
ELISAによる固定化ＩＬ−１３Ｒα１に対するＨｕＭａｂの結合に関する試験
本発明の抗体が、組み換えＩＬ−１３Ｒα１に結合する能力を判定するために、ＩＬ−１３Ｒα１(R&D Systems, UK)の細胞外ドメインをＰＢＳ（１μｇ／ｍｌ）に溶解させ、４℃で終夜インキュベートし、マイクロタイタープレートに吸着させた。洗浄用緩衝液(WB=0.9 % Nacl; 0.1 % Tween（登録商標） 20)で平板を洗浄した後で、１００μｌのインキュベーション緩衝液(IB=PBS with 1 % crotein C および 0.1 % Tween（登録商標） 20)を添加し、室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートして、非特異的結合部位を遮断した。次に、連続的に希釈したＨｕＭａｂおよびコントロール抗体（１００μｌ／ウェル；ＩＢで希釈）を添加し、ＲＴで１時間培養した。再度プレートを洗浄し、そしてＩＢで１：５００に最終希釈したペルオキシターゼコンジュゲートウサギ抗ヒトカッパ(DAKO, Denmark)と共にインキュベートすることで、結合ヒト抗体を検出した。ポリクローナルヤギ抗ｈＩＬ−１３Ｒα１抗体を、ぺルオキシターゼコンジュゲートポリクローナルロバ抗ヤギＩｇＧ(Sant Cruz;ＩＢで１：１０００希釈)で検出した。ＲＴで１時間インキュベーションしてから洗浄した後で、プレートを暗所においてＲＴで既製のＡＢＴＳ（登録商標）溶液(Roch Diagnostics GmbH)で展開させた。もっとも高い濃度の吸収値が十分なＯＤに到達した後で、４０５ｎｍでの吸収値を測定した。
【０１０６】
試験したＩＬ−１３Ｒα１に対するすべての抗体が、ヒトＩＬ−１３Ｒα１の固定化細胞外ドメインに結合することができた。測定したＥＣ５０値は、試験した各種ＬＣ抗体で０．５〜２ｎＭの範囲内であった。陰性のコントロールＨｕＭａｂの抗ＫＬＨは、ＩＬ−１３Ｒα１の固定化細胞外ドメインに結合しなかった。陽性コントロールとして含めたポリクローナルヤギ抗ヒトＩＬ−１３Ｒα１抗体は、ＩＬ−１３Ｒα１の固定化細胞外ドメインに十分に結合した（図１）。
【０１０７】
実施例３
ＩＬ−１３Ｒα１／ＩＬ−４Ｒα異種二量体に対するＩＬ−１３結合の阻害(ELISA)
マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中に３μｇ／ｍｌのｈＩＬ−１３Ｒα１：ｈＦｃキメラタンパク(R&D Systems, UK) １００μｌにて振とう機上に終夜４℃で被覆した。ＷＢでプレートを洗浄した後に、連続希釈したＨｕＭａｂとコントロール抗体（１００μｌ／ウェル；ＩＢで希釈）を添加し、ＲＴで３０分間インキュベートした。プレートを再度洗浄してから、ＩＬ−１３の混合物(R&D Systems, UK;0.5μg/ml; IBで希釈)およびＩＬ−４Ｒα(R&D Systems, UK;0.75μg/ml; IBで希釈)を添加し、ＲＴで1時間インキュベートした。プレートを洗浄した後に、濃度０．４μｇ／ｍｌのビオチン化抗ＩＬ−１３抗体(BAF213; R&D Systems, UK) １００μｌを添加し、ＲＴで１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後に、結合ＩＬ−１３を、ＩＢで１：５０００の希釈率にしたペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン(Roche Diagnostics GmbH, DE)によって検出した（ＲＴで培養１時間）。最後にプレートを洗浄し、暗所で室温（ＲＴ）で既製のＡＢＴＳ（登録商標）溶液(Roche Diagnostics GmbH, DE)で展開した。４５〜６０分後に４０５ｎｍで吸収値を測定した。
【０１０８】
抗体ＬＣ５００２−００２、ＬＣ５００２−００３、ＬＣ５００２−００５、ＬＣ５００２−００７およびＬＣ５００２−０１８は、ヘテロ二量体受容体に対するＩＬ−１３の結合を阻害することができ、その最大阻害値は約５０％〜８０−８５％の範囲であった。陽性のコントロールは、ＡＦ１５２（ポリクローナルラビット抗体）であった。予想どおり、陰性のコントロール抗ＫＬＨは、ヘテロ二量体受容体に対するＩＬ−１３の結合を阻害しなかった。得られたＩＣ５０値は、抗体ＬＣ５００２−００２、ＬＣ５００２−００３、ＬＣ５００２−００５、ＬＣ５００２−００７およびＬＣ５００２−０１８に関しては１．５ｎＭと１０．１ｎＭとの間であった（図２）。
【０１０９】
実施例４
ラジオリガンド結合測定
１２５Ｉ−ＩＬ−１３結合測定を、結合緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．５％のウシ血清アルブミン、ｐＨ７．２に調整した）内でヒトＩＬ−１３Ｒα１とヒトＩＬ−４Ｒαを発現するＣＨＯ細胞を用いて実施した。１×１０５細胞／ウェルを、抗体と混合させ、１５分から１時間かけて前インキュベートした。０．１ｎＭ１２５Ｉ−ＩＬ−１３を添加し、この混合物を４時間４℃でインキュベートした。測定で使用した１２５Ｉ−ＩＬ−１３の濃度を、飽和結合分析、競合分析および細胞系との平衡結合に到達するまで投入した、１２５Ｉ−ＩＬ−１３の定量から測定した。試料を、１％ＰEＩ／０．５％ＢＳＡで前処理したＧＦ／Ｃフィルタープレート上で回収し、Packard TopCountシンチレーションカウンターでカウントした。非線形回帰曲線適合法を用いてＰＲＩＳＭでデータ分析を実施した(GraphPad Software, San Diego, CA)。
【０１１０】
試験したＩＬ−１３Ｒα１に対する抗体すべてがＩＬ−１３Ｒα１／ＩＬ−４Ｒα複合体に対する標識ＩＬ−１３の結合を阻止した。抗体ＬＣ５００２−００２、ＬＣ５００２−００３、ＬＣ５００２−００５、ＬＣ５００２−００７およびＬＣ５００２−０１８の計算したＩＣ５０値は、０．０９ｎＭと０．３２ｎＭとの間で、ＡＦ１５２の場合は８４．８ｎＭであった（図３）。
【０１１１】
実施例５
ヒトＢ細胞と単核細胞上でＩＬ−１３により誘発されるＣＤ２３の亢進をＨｕＭａｂが阻害
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をFicoll Hypaque密度勾配によって単離した。ＲＰＭＩで細胞を洗浄した後、ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中で再度懸濁し、９６ウェルの平底マイクロタイタープレート(Corning Incorporated Costar)内に３×１０５ＰＢＭＣ／ウェル（容積５０μｌ）で分配した。次に、ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中で最終濃度０．５μｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ４０抗体(Immunotech) ２５μｌおよび、ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中で最終濃度１０μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＡ＋ＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体 (Immunoresearch)２５μｌを添加した。次に、連続的に希釈したＨｕＭａｂとコントロール抗体（５０μｌ／ウェル；ＲＰＭＩ／１０％のＦＣＳ希釈）を添加し、細胞を培養器中で３０分間インキュベートした（３７℃；５％  ＣＯ２）。次に、０．６７ｎｇ／ｍｌの最終濃度の組み換えヒトＩＬ−１３(R&D Systems)を添加し（５０μｌ／ウェル）、さらに細胞を３７℃／５％ＣＯ２の条件下で７２時間インキュベートした。このインキュベート後に、プレートを遠心分離にかけ、培地を吸引した。付着した細胞を分離させるために、２００μｌのAccutase（ＰＡＡ）を添加し、細胞を３７℃；５％ＣＯ２の条件下で約５分間インキュベートした。細胞を、繰り返しフラッシングすることによって分離させ、丸底プレートに移した。上清の遠心分離および吸引後に、細胞を抗ＣＤ２３−ＰＥ、抗ＣＤ２０−ＦＩＴＣおよび抗ＣＤ１４−ＡＰＣ（すべてBD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA提供）の混合物２００μｌを用いてインキュベートした。細胞を４℃で３０分間インキュベートし、遠心分離にかけ上清を吸引した。この洗浄工程を１回繰り返し、最終的に細胞を２００μｌのＰＢＳ／０．１％のヒト血清アルブミンに再度懸濁し、ＦＡＣＳ Caliburフローサイトメーター(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)内で、CellQuestソフトウエアを用いて分析した。ほとんどの場合に１０，０００のイベントが取得され、光分散ゲート上に通して、生存リンパ球と単核球のみを取り込んだ。細胞を、Ｂリンパ球の場合ＣＤ１９陽性クラスターで、もしくは単核球の場合ＣＤ１４陽性クラスターで前通過させ、ＣＤ２３発現についてさらに分析を行った。
【０１１２】
Ｂリンパ球上でＣＤ２３の亢進を阻害する観察されたＩＣ５０値は、抗体ＬＣ５００２−００２、ＬＣ５００２−００３、ＬＣ５００２−００５、ＬＣ５００２−００７及びＬＣ５００２−０１８の場合、０．５ｎＭと＞７０ｎＭとの間で、ＡＦ１５２の場合１３．６ｎＭであった。ヒト単核球上でＩＬ−１３により誘発されるＣＤ２３の亢進を阻害するについても同様のプロファイルが観察された。単核球に関しては、ＩＣ５０の値は、抗体ＬＣ５００２−００２、ＬＣ５００２−００３、ＬＣ５００２−００５、ＬＣ５００２−００７及びＬＣ５００２−０１８の場合には、０．１ｎＭと６２．８ｎＭとの間であり、ＡＦ１５２の場合は６２．９ｎＭであった。
【０１１３】
実施例６
刺激因子としてのＩＬ−１３もしくはＩＬ−４に応答するＴＦ−１の増殖測定
ＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＃  ＣＲＬ  ２００３）を、ＡＴＣＣ修飾ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、１Ｘペニシリン／ストレプトマイシン、２ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦを含有する培地で成長させた。測定を実施する１日前に細胞を無ＧＭ−ＣＳＦ培地で保持した。５×１０３細胞／ウェルを１時間、３７℃で適切な濃度の抗ＩＬ−１３Ｒα１抗体を使用してインキュベートした。次に、細胞を２ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１３(R&D Systems, Minneapolis, MN)もしくは０．１ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−４(R&D Systems, Minneapolis, MN)で刺激し、４８時間、３７℃でインキュベートした。細胞に、０．５μＣｉ３Ｈ−チミジンをパルスし、１６〜１８時間３７℃でインキュベートした。Parkin Elmar Filtermate 96ハーベスターを用いて、１％のＰＥＩ／０．２５％ＢＳＡで前処理したＧＦＣプレート上に試料を回収した。ＧＦＣプレートを、Parkin Elmar TOPカウントシンチレーションカウンター上でカウントした。非線形回帰曲線適合法を用いて(GraphPad Software, San Diego, CA)ＰＲＩＳＭでデータ分析を行った。
【０１１４】
抗ＫＬＨ抗体は、本測定では阻害能を示さなかった。ＬＣ５００２−００７でも同様であった。他の抗体はすべて、たとえＬＣ５００２−００７が他の抗体よりも高いＩＣ値で反応を阻害した場合であっても、このような反応を阻害した。観察された各種抗体に関するＩＣ５０値は、ＡＦ１５２の場合１３．５０ｎＭ、ＬＣ５００２−００２の場合９．２１ｎＭ、ＬＣ５００２−００３の場合３．０７ｎＭおよびＬＣ５００２−００５の場合０．３９ｎＭであった。ＩＬ−４−誘発性ＴＦ−１細胞増殖に関しても同様のプロファイルが認められたが、抗体の効力はＩＬ−１３−誘発性反応に比べ低下していた。ＩＬ−４−誘発性増殖に関するＩＣ５０値は、抗ＩＬ４Ｒ抗体の場合０．０２ｎＭ、ＡＦ１５２の場合７４．３７ｎＭおよび抗体ＬＣ５００２−００２、ＬＣ５００２−００３、ＬＣ５００２−００５、ＬＣ５００２−００７およびＬＣ５００２−０１８の場合には４．６８ｎＭと６０ｎＭとの間であった。
【０１１５】
実施例７
ＩＬ−１３に応答したヒト肺繊維芽細胞のエオタキシン産生を阻害
ＨＦＬ−１細胞(Human Lung Fibroblast, ATCC # CCL-153)を使用して測定を実施した。細胞を、１２ウェルのプレート内の各プレートに100,000細胞の密度でプレートし、集密に達するまで７２時間、３７℃でインキュベートした。次に、細胞を２４時間、無血清培地で飢餓状態に置き、１時間３７℃で抗ＩＬ−１３Ｒα１抗体で処置をした。この処置の後に、細胞を４８時間３７℃で１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１３(R&D Systems, Minneapolis, MN)を用いて刺激した。上清を回収し、R&D Systems (Cat. No. DTX00)提供の市販のELISAを用いてエオタキシンの定量を行った。吸収値をSpectromaxマイクロプレートリーダーを用いて読み取り、ＰＲＩＳＭ(GraphPad Software, San Diego, CA)を用いてデータを分析した。
【０１１６】
試験した抗体は、エオタキシン放出を阻害するさまざまな能力を示した。ＬＣ５００２−００７を除き、試験の対象となった他のすべての抗体が、何らかの阻害を示した。３〜４種類の実験で得られた平均算出ＩＣ５０値は、ＡＦ１５２の場合１１．５ｎＭで、抗体ＬＣ５００２−００２、ＬＣ５００２−００３、ＬＣ５００２−００５、ＬＣ５００２−００７およびＬＣ５００２−００１８の場合には、２．４５ｎＭと１９．８ｎＭとの間であった。
【０１１７】
実施例８
ヒト気管支平滑筋細胞におけるＩＬ−１３誘発性Ｓｔａｔ−６リン酸化の阻害
ヒト気管支平滑筋細胞(BSMC; Clonetics, Cat. No CC-2576)を製造元の指示に従って成長させた。集密するまで、細胞を１２ウェルの組織培養プレートで成長させた。無血清培地で２４時間、細胞を飢餓状態に置き、各種量の抗体を添加した。プレートを１時間培養した後に、２．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１３(R&D Systems)で刺激した。１５分間インキュベートした後に、上澄みを取り除き、細胞をリン酸緩衝液で洗浄し、１００μｌの溶解緩衝液を添加した。氷上で短期間超音波にかけた後、さらに遠心分離にかけた。溶解液を用いてリン酸化Ｓｔａｔ−６をウエスタンブロット検出した。等量のタンパクをＳＤＳゲル上に付加し、流し込んで膜に移動させた。抗Ｓｔａｔ−６抗体をSanta Cruz Biotechnology (Cat. No. SC-11762R)から入手し、ペルオキシターゼに結合した二次抗体を用いた。検出は、Amersham (Cat No RPN 2132)提供のECL Plus Systemを用いて行った。定量は、Typhoon 9400 Imagerで実施した。
【０１１８】
本測定で試験した両方のＨｕＭａｂ（ＬＣ５０００２−００３とＬＣ５００２−００５）はいずれもＩＬ−１３誘発性Ｓｔａｔ−６リン酸化を阻害した。本測定で認められた効力は、他の機能測定で認められた効力と同等であった。計算されたＩＣ５０値は、ＡＦ１５２の場合１８．６４ｎＭ、ＬＣ５００２−００３の場合５．９８ｎＭおよびＬＣ５００２−００５の場合１．１８ｎＭであった。
【０１１９】
実施例９
抗ｈＩＬ−１３Ｒα１  ＨｕＭａｂ可変ドメイン（κ−軽鎖およびγ１−重鎖）のクローニングと配列分析
抗ｈＩＬ−１３Ｒα１  ＨｕＭａｂの軽鎖可変領域ＶＬと重鎖可変領域ＶＨをコードするヌクレオチド配列を標準のｃＤＮＡ合成／ＰＣＲ手順を用いて単離した。全ＲＮＡを、GeneRacer（商標）キット(Invitrogen)を用いて１×１０６−１×１０７ハイブリドーマ細胞から調製した。ハイブリドーマ由来のＲＮＡを、第一鎖ｃＤＮＡ合成およびGeneRacer（商標） Oligo-dT Primerの連結反応のためのテンプレートとして用いた。第二鎖ｃＤＮＡ合成およびｃＤＮＡフラグメントをコード化するＶＬおよびＶＨのさらなるＰＣＲ増幅を、それぞれκ−軽鎖およびγ１−重鎖定常領域ならびに、５’−特異的GeneRacer（商標）プライマーのヌクレオチド配列に相補的な逆軽鎖および重鎖プライマーで実施した。クローニングベクターとして、Invitrogen（商標）Life Technologies提供のTA クローニングキットおよび pCR4-TOPO（商標）TOPO（商標）を用いてクローニングした。ＥｃｏＬＩを用いて適切なプラスミドの制限マッピングによってクローン化されたＰＣＲ生成物を特定し、それぞれＶＬおよびＶＨに関する約７４０ｂｐおよび７９０ｂｐのＤＮＡフラグメントサイズを予測／計算した。クローン化したＰＣＲフラグメントのＤＮＡ配列を、二本鎖配列決定法によって判定した。GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin)ソフトウェアパッケージバージョン１０．２とVector-NTI 8 (InforMax, Inc)を汎用データ処理に用いた。ＤＮＡおよびタンパク配列をＧＣＧモジュールCLUSTALWを用いて整列させた。配列の整列は、GENEDOC (バージョン２．１)プログラムを用いて行った。
【０１２０】
実施例１０
抗ｈＩＬ−１３Ｒα１ＩｇＧ１ＨｕＭａｂの発現プラスミドの構築
抗ｈＩＬ−１３Ｒα１ＩｇＧ１ＨｕＭａｂの軽鎖および重鎖をコード化する遺伝子を哺乳動物の細胞発現ベクターに別々に集合化した（assemble）。これによって、抗ｈＩＬ−１３Ｒα１  ＨｕＭａｂ軽鎖可変領域（ＶＬ）とヒトκ軽鎖定常領域(CL, SEQ ID NO:11)をコード化する遺伝子セグメントが抗ｈＩＬ−１３Ｒα１ＨｕＭａｂ重鎖可変領域（ＶＨ）およびヒトγ１重鎖定常領域の遺伝子セグメントと同様に連結された(CH1-Hinge-CH2-CH3, SEQ ID NO: 12)。使用されているコドンのヒト軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、Kabat, E.A., Wu, T.T., Perry, H.M., Gottesman, K.S., およびFoeller, C., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH publication No.91-3242に記述されている。抗ｈＩＬ−１３Ｒα１ＨｕＭａｂκ軽鎖の転写ユニットは下記要素で構成されている。
・ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター、
・コザック配列を含む合成５’−ＵＴ、
・信号配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖信号配列、
・５’末端に特異なＢｓｍＩ制限部位および３’末端にスプライスドナー部位と特異なＮｏｔI制限部位を配列したクローン化抗ｈＩＬ−１３Ｒα  ＨｕＭａｂ可変軽鎖ｃＤＮＡ、
・イントロン２マウスIｇ−κエンハンサー［Picard, D., and Schaffner, W., Nature 307 (1984) 80-82］を含むゲノムヒトκ遺伝子定常領域、および
・ヒト免疫グロブリンκポリアデニル化（「ポリＡ」）信号配列。
【０１２１】
抗ｈＩＬ−１３Ｒα１  ＨｕＭａｂγ１重鎖の転写ユニットは下記要素から構成されている。
・ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター、
・コザック配列を含む合成５’−ＵＴ、
・信号配列イントロンを含む修飾マウス免疫グロブリン重鎖信号配列、
・５’末端に特異なＢｓｍＩ制限部位および３’末端にスライスドナー部位および特異なＮｏｔｌ制限部位配列したクローン化抗ｈＩＬ−１３Ｒα１  ＨｕＭａｂ可変重鎖ｃＤＮＡ、
・マウスＩｇμエンハンサー(Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378)を含む、ゲノムヒトγ１重鎖遺伝子定常領域、
・ヒトγ１免疫グロブリンポリアデニル化（「ポリＡ」）信号配列。
【０１２２】
抗ｈＩＬ−１３Ｒα１  ＨｕＭａｂ  κ軽鎖およびγ１重鎖発現プラスミドの機能的要素：
抗ｈＩＬ−１３Ｒα１  ＨｕＭａｂ  κ軽鎖およびγ１重鎖発現カセットのほかに、これらのプラスミドには以下が含まれている。
・ハイグロマイシン耐性遺伝子、
・Ｅｐｓｔａｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）のオリジン、ｏｒｉＰ、
・Ｅ．ｃｏｌｉにおけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８からのオリジン、
・Ｅ．ｃｏｌｉにおけるアンピシリン耐性を付与するβラクタマーゼ遺伝子。
【０１２３】
実施例１１
突然変異体（変異体）抗ｈＩＬ−１３Ｒα１ＩｇＧ１の発現プラスミドの構築
突然変異抗ｈＩＬ−１３Ｒα１γ１重鎖をコード化する発現プラスミドは、Quick Change（商標）Site-Directed mutagenesisキット（Stratagene）を用いて野生型発現プラスミドの特定部位突然変異誘発によって生成することができ、表１に記載されているとおりである。アミノ酸には、ＥＵ符番法にしたがって符番されている［Edelman, G.M., ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., Wu, T.T., Perry, H.M., Gottesman, K. S., およびFoeller, C., (1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No. 91-3242］。
【０１２４】
【表１】
2008526187.tif 000003
【０１２５】
実施例１２
組み換え抗ｈＩＬ−１３Ｒα１  ＨｕＭａｂの産生
組み換え抗ｈＩＬ−１３Ｒα１  ＨｕＭａｂは、１０％の超低ＩｇＧのＦＣＳ(Gibco)、２ｍＭのグルタミン(Gibco)、１％ｖ／ｖの非必須アミノ酸(Gibco)、および２５０μｇ／ｍｌのＧ４１８ (Roche Diagnostics GmbH, DE) を補充したＤＭＥＭ (Gibco) でインキュベートした付着性ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞 （ＡＴＴＣ  ＣＲＬ−１０８５２）の一過的形質転換によって作成した。形質転換では、Fugene（商標）6 (Roche Diagnostics GmbH, DE) 形質転換試薬を３：１〜６：１の範囲のＤＮＡ(μｇ)に対する試薬(μl)の割合で使用した。免疫グロブリン軽鎖および重鎖は、１：２〜２：１のプラスミドをコード化する重鎖に対する軽鎖のモル比を用いて２種類のプラスミドから発現させた。ＨｕＭａｂを含有する細胞培養上清を形質転換後４〜１１日目に収穫した。
【０１２６】
例えばＨＥＫ２９３におけるヒト抗体の組み換え発現の一般情報は、Meissner, P., ら, Biotechnol Bioeng 75 (2001) 197-203に記述されている。
【０１２７】
実施例１３
ａ）  キメラｈＩＬ−１３Ｒα１：ｈＦｃを用いた、ＨｕＭａｂ ＬＣ５００２−００３、−００５、およびー００７の親和性分析
相互作用を分析するために、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００計器を用いた。操作と反応用緩衝液としてＨＢＳ−Ｐ(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.005 % ポリ界面活性剤 P, pH 7.4)を２５℃で用いた。捕捉分子（ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ特異的）を、２０分間、５μl／分の流速で、２０μｇ／ｍｌの濃度でアミン結合した。ＨｕＭａｂを、１μg／mlの濃度で１０μl／分の流速で１分間注入した。遊離ヤギ抗ヒトＩｇＧのＦｃγを遮断するために、ヒトγグロブリン５００nMを３０μl／分で３分間注入した。被験体(hIL-13Rα1:hFc キメラタンパク)を、５．６３nM〜９０nM間の５種類の濃度で２分間注入し、５分間ＨＢＳ−Ｐで洗浄した。１００nMのＨＣｌを２回それぞれ１分間ずつ注入することによって表面の再生を達成した。注入のチップ、測定フォーマットおよび順序ならびに反応速度データは、表２の記述に対応する。系固有のベースラインドリフトを補正しノイズ信号を減少するために、試料曲線から陰性コントロールデータ（例えば、緩衝液曲線）を差し引いた。センサーグラムの分析と親和性データの計算のため、BiaEvalationバージョン４．０１を用いた。反応速度データは、１：１ラングミュアー結合モデルに反応速度データを適合させることによって計算した（表２）。
【０１２８】
【表２】
2008526187.tif 000004
【０１２９】
ｂ）  ｈＩＬ−１３Ｒα１：ｈＦｃキメラタンパク質から開裂したｈＩＬ−１３Ｒα１の細胞外ドメインを用いた、ＨｕＭａｂ  ＬＣ  ５００２−００３、−００５、およびー００７の親和性分析
親和性分析のためＢｉａｃｏｒｅ ３０００計器を用いた。操作と反応用緩衝は２５℃のＨＢＳ−Ｐであった（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ，  ０．００５％  ポリ界面活性剤  Ｐ，ｐＨ７．４）。捕捉抗体分子（抗ｈＦｃγ）を、２０分間、５μｌ／分の流速で、１００μｇ／ｍｌの濃度でアミン結合させた。ＨｕＭａｂを、３０秒間１０μｌ／分の流速で１０μｇ／ｍｌの濃度で注入した。開裂したｈＩＬ−１３Ｒα１分子（ＭＷ４０ｋＤａ）を１．５６ｎＭ〜１００ｎＭ間の７種類の濃度で２００秒間注入し、５分間ＨＢＳ−Ｐで洗浄した。表面の再生は、１０μｇ／ｍｌの流速で１００ｍＭ  ＨＣｌの注入を２回それぞれ１分間繰り返すことによって実現した。注入のチップ、測定フォーマットおよび順序ならびに反応速度データは下記の表３の記述に対応する。反応速度データは、ラングミュアー結合モデルに反応速度データを、適合させることによって計算した。
【０１３０】
【表３】
2008526187.tif 000005
【０１３１】
ｃ）  ｈＩＬ−１３Ｒα１：ｈＦｃキメラタンパクから開裂したｈＩＬ−１３Ｒα１細胞外ドメインを用いたＬＣ５００２−００５の組み換え変異体の比較親和性分析
これらの実験では、ハイブリドーマ由来の初代ＩｇＧ１の親和性を組み換え変異体ＩｇＧ１−Ａｌａ−Ａｌａの親和性と比較した。相互作用の分析のためＢｉａｃｏｒｅ ３０００計器を用いた。操作と反応用緩衝液は、２５℃のＨＢＳ−Ｐであった（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭのＮａＣｌ，０．００５％のポリ界面活性剤  Ｐ，ｐＨ７．４）。捕捉抗体分子（抗ｈＦｃγ）を、２０分間、５μｌ／分の流速で、２０μｇ／ｍｌの濃度でアミン結合させた。ＨｕＭａｂを、１分間１０μｌ／分の流速で１０μｇ／ｍｌの濃度で注入した。開裂したｈＩＬ−１３Ｒα１分子（被験体）を１．５６ｎＭ〜２００ｎＭ間の８種類の濃度で５分間注入し、５分間ＨＢＳ−Ｐで洗浄した。表面の再生は、１００ｍＭ  ＨＣｌの注入を２回それぞれ１分間繰り返すことによって実現した。注入のチップ、測定フォーマットおよび順序ならびに、反応速度データは、表４の記述に対応する。反応速度データは、二価被験体結合モデルに反応速度データを適合させることによって計算した。
【０１３２】
【表４】
2008526187.tif 000006
【０１３３】
実施例１４
ｈＩＬ−１３Ｒα２およびｈＩＬ−４RαとのＨｕＭａｂの交差反応のＥＬＩＳＡによる試験
キメラタンパクｈＩＬ−１３Ｒα２：ｈＦｃとｈＩＬ−４Ｒα：ｈＦｃ(R&D Systems, UK)をＰＢＳ(１μg/ml)に溶解し、４℃で終夜インキュベートしてマイクロタイタープレート(NUNC Maxisorb)に吸着させた。洗浄緩衝液（WB=０．９％NaCl；０．１％Tween（登録商標）２０）でプレートを洗浄後、非特異的部位を遮断するために、１００μｌの培養緩衝液（IB=１％Crotein C含有PBSおよび０．１％Tween（登録商標）２０）を加え、室温で３０分間インキュベートした。次に、連続希釈したＨｕＭａｂおよびコントロール抗体（１００μｌ／ウエル；IB中に希釈）を加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、ペルオキシダーゼコンジュゲートウサギ抗ヒトカッパ（DAKO、デンマーク）のIB中最終希釈１：５００にてインキュベートして結合抗体を検出した。室温で１時間インキュベートし、次に洗浄し、プレートを暗所室温にて既成のABTS（登録商標）溶液（Roche Diagnostics GmbH、DE）で展開した。最高濃度の吸収値が十分なOD値に到達してから４０５ｎｍで吸収値を測定した。
【０１３４】
ＩＬ−１３Rアルファ１に対する試験抗体の全てが、ヒトＩＬ−１３Ｒα１の固定化細胞外ドメインに結合することができたが、ｈＩＬ−１３Ｒα２にもｈＩＬ−４Ｒαには結合できなかった(図４)。
【０１３５】
実施例１５
マウスＩＬ−１３Ｒα１とのＨｕＭａｂの交差反応性
キメラタンパクマウスＩＬ−１３Ｒα１：ｈＦｃ(R&D Systems, UK)をＰＢＳ（１μｇ／ｍｌ）に溶解し、４℃で終夜培養することによってマイクロタイタープレート(NUNC Maxisorb)に吸着させた。洗浄用緩衝液（ＷＢ＝０．９％のＮａＣｌ；０．１％のTween（登録商標）20）でプレートを洗浄した後に、非特異的結合部位を遮断するために、１００μｌの培養緩衝液（ＩＢ＝１％ Crotein Cおよび０．１％ Tween（登録商標） 20を含むＰＢＳ）を添加し室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした。次に、連続希釈したＨｕＭａｂとコントロール抗体（ＨｕＭａｂ抗ＫＬＨおよびポリクロナールヤギ抗ｈＩＬ−１３Ｒα１ (R&D Systems)）をウェル（１００μｌ／ウエル；ＩＢで希釈）に分配し、ＲＴで１時間インキュベートした。再度プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼコンジュゲートウサギ抗ヒトカッパー(DAKO, Denmark)のＩＢ中１：５００の最終希釈にてインキュベートして結合ヒト抗体を検出した。プレートに結合したヤギ抗ｈＩＬ−１３Ｒα１抗体を、ペルオキシダーゼコンジュゲートロバ抗ヤギＩｇＧ(Santa Cruz; ＩＢ中に１：１０００)によって検出した。室温で１時間インキュベートし、続いて洗浄した後に、プレートを暗所ＲＴで既製のABTS（登録商標）溶液(Roche Diagnostics GmbH, DE)で展開した。最高濃度の吸収値が十分なＯＤに到達した後に、４０５ｎｍで吸収値を測定した（図５）。
【０１３６】
実施例１６
カニクイザルＩＬ−１３Ｒα１とのＨｕＭａｂの交差反応性
ＩＬ−１３Ｒα１をコードする遺伝子を、カニクイザルの組織からＲＴ−ＰＣＲによって単離し、マウス細胞系Ｂａ／Ｆ３に形質転換した。ＨｕＭａｂがカニクイザルＩＬ−１３Ｒα１と交差反応するか否かを試験するため、安定した形質転換Ｂａ／Ｆ３細胞と親Ｂａ／Ｆ３細胞を、１０μｇ／ｍｌのＨｕＭａｂとコントロール抗体とでインキュベートした。陽性コントロールとして、ポリクローナルヤギ抗ｈＩＬ−１３Ｒα１(R&D Systems)を用いた。含めた陰性コントロールは、ヒトＩｇＧ１骨髄腫タンパク(Nordic)および正常なヤギの血清であった。結合抗体をＦＡＣＳ分析によって検出するために、ヒトＩｇＧに対するＦＩＴＣコンジュゲート抗体を用いてＨｕＭａｂを検出し、またヤギＩｇＧに対するＦＩＴＣコンジュゲート抗体を使用してヤギ抗体を検出した。親細胞系に対して形質転換Ｂａ／Ｆ３で試験した個々の抗体について平均蛍光強度（ＭＦＩ）を比較した。
【０１３７】
本発明ＨｕＭａｂの全てが、形質転換Ｂａ／Ｆ３細胞内に発現しているカニクイザルＩＬ−１３Ｒα１に結合可能であった。ヒトとカニクイザルのＩＬ−１３Ｒα１の間の緊密な類似性から期待されるように、ポリクローナルＡＦ１５２抗体もカニクイザルＩＬ−１３Ｒα１に結合した。陰性のコントロール抗体では、形質転換Ｂａ／Ｆ３細胞系で試験した場合にＭＦＩがごくわずか増加しただけであった（表５）。
【０１３８】
【表５】
2008526187.tif 000007
【０１３９】
実施例１７
ＩＬ−１３Ｒα１  ＨｕＭａｂのＦｃγ受容体に対する結合（ＮＫ細胞上のＦｃγＲＩＩＩに対する結合）
本発明抗体がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上のＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６）に結合できるか否かを判定するため、抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、２０μｇ／ｍｌのＨｕＭａｂ抗体およびコントロール抗体と共に、ＦｃγＲＩＩＩａ（抗ＣＤ１６、クローン３G８、RDI、Flanders、NJ）に対する遮断用マウス抗体２０μｇ／ｍｌの存在下または不存在下でインキュベートし、ＦｃγＲＩＩＩａを介する結合を検証した。ＦｃγＲＩＩＩａに結合しないヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４(The Binding Site)を陰性コントロールとして使用した。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３(The Binding Site)を、ＦｃγＲＩＩＩａ結合のための陽性コントロールとして含めた。ＮＫ細胞上の結合抗体をＦＡＣＳ分析によって検出するために、ＰＥ標識マウス抗ヒトＣＤ５６（ＮＫ細胞表面マーカー）抗体(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)をＦＩＴＣ標識ヤギＦ（ａｂ）２抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体(Protos immunoresearch, Burlingame, CA)と組み合わせて使用した。試験したＨｕＭａｂは２０μｇ／ｍｌ(Bmax： MFI±標準偏差)において最大に結合することが判定された。
【０１４０】
ＬＣ５００２−００５は、５８０．６±２４５．８のＢｍａｘ（ＭＦＩ）値によって示されるとおり、ＦｃγＲＩＩＩａに効果的に結合することができた（コントロールIgG1抗体に比較する）。ＦｃγＲＩＩＩａに対する遮断用抗体を添加すると、ＬＣ５００２−００５のＮＫ細胞への結合を劇的に低下させ(２６０．４２±９５．９０のＢｍａｘ（ＭＦＩ）値）、このことはＦｃγＲＩＩＩａに特異的に結合することを示唆する。
【０１４１】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】固定化組み換えヒトＩＬ−１３Ｒα１ポリペプチドに対する抗ＩＬ−１３Ｒα１抗体の結合を示している。ポリクローナルウサギ抗ヒトＩＬ−１３Ｒα１抗体ＡＦ１５２（R&D Systems）および抗−ＫＬＨを、陰性のコントロールＨｕＭａｂとして含む。
【図２】ＩＬ−１３の固定化ＩＬ−１３Ｒα１／ＩＬ−４Ｒα受容体に対する結合を抗ＩＬ−１３Ｒα１抗体が阻害するのを示す。
【図３】ＩＬ−１３のＣＨＯ細胞（ＩＬ−１３Ｒα１およびＩＬ−４Ｒα２を発現）に対する結合を抗ＩＬ−１３Ｒα１抗体が遮断するのを示す。陽性のコントロールとして、市販のポリクローナル抗ＩＬ−１３Ｒα１抗体（AF152、R&D Systems, Minneapolis, MN)を含めた。
【図４】抗ＩＬ−１３Ｒα１抗体のｈＩＬ−１３Ｒα１に対する結合および機能的に関係のある受容体ｈｌＬ−１３Ｒα２およびｈｌＬ−４Ｒαに対する結合特性を示す。
【図５】固定化組み換えマウスＩＬ−１３Ｒα１ポリペプチドに対する抗ＩＬ−１３Ｒα１抗体の結合能力を示す。ポリクロナールヤギ抗ヒトＩＬ−１３Ｒα１抗体ＡＦ１５２(R&D Systems)および抗ＫＬＨを、陰性のコントロールＨｕＭａｂとして含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年7月15日(2006.7.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−１３Ｒα１に結合し、ＩＬ−１３を阻害する抗体であって、該抗体の可変重鎖アミノ酸配列ＣＤＲ３が配列番号１、３、５、７もしくは９の重鎖ＣＤＲ３配列からなる群から選択されることを特徴とする抗体。
【請求項２】
請求項１記載の抗体であって、該抗体の可変重鎖アミノ酸配列ＣＤＲ１およびＣＤＲ２が配列番号１、３、５、７もしくは９の重鎖ＣＤＲ１配列およびＣＤＲ２配列からなる群から選択されることを特徴とする抗体。
【請求項３】
請求項１もしくは２記載の抗体であって、該抗体の可変軽鎖アミノ酸配列ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、配列番号２、４、６、８もしくは１０の可変軽鎖アミノ酸配列ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３からなる群から選択されることを特徴とする抗体。
【請求項４】
ａ）Ｇｌｙ２３６が欠失したアミノ酸配列Ｐｒｏ２３３Ｖａｌ２３４Ａｌａ２３５、および／またはアミノ酸配列Ｇｌｙ３２７Ｌｅｕ３２８Ｐｒｏ３２９Ｓｅｒ３３０Ｓｅｒ３３１、
ｂ）アミノ酸配列Ａｌａ２３４Ａｌａ２３５、もしくは
ｃ）アミノ酸Ａｌａ２６５およびＡｌａ２９７
を含むヒトγ１重鎖を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項記載の抗体。
【請求項５】
ヒト抗体であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項記載の抗体。
【請求項６】
ＩＬ−１３Ｒα１に結合する親和度が１０−９Ｍ（ＫＤ）以下、好ましくは１０−９〜１０−１３Ｍであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項記載の抗体。
【請求項７】
ハイブリドーマ細胞系ＤＳＭ  ＡＣＣ２７０９、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７１０、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７１１もしくはＤＳＭ  ＡＣＣ２７１２から取得した請求項１〜６のいずれか一項記載の抗体。
【請求項８】
重鎖可変領域として配列番号１および軽鎖可変領域として配列番号２、重鎖可変領域として配列番号３および軽鎖可変領域として配列番号４、重鎖可変領域として配列番号５および軽鎖可変領域として配列番号６、重鎖可変領域として配列番号７および軽鎖可変領域として配列番号８、または重鎖可変領域として配列番号９および軽鎖可変領域として配列番号１０、を含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項記載の抗体。
【請求項９】
ａ）重鎖可変領域として配列番号１、軽鎖可変領域として配列番号２、κ軽鎖定常領域として配列番号１１、およびγ１重鎖定常領域として配列番号１２、ただし場合によって突然変異Ｌ２３４ＡとＬ２３５ＡもしくはＤ２６５ＡとＮ２９７Ａを有する、
ｂ）重鎖可変領域として配列番号３および軽鎖可変領域として配列番号４、κ軽鎖定常領域として配列番号１１およびγ１重鎖定常領域として配列番号１２、ただし場合によって突然変異Ｌ２３４ＡとＬ２３５ＡもしくはＤ２６５ＡとＮ２９７Ａを有する、
ｃ）重鎖可変領域として配列番号５および軽鎖可変領域として配列番号６、κ軽鎖定常領域として配列番号１１およびγ１重鎖定常領域として配列番号１２、ただし場合によって突然変異Ｌ２３４ＡとＬ２３５ＡもしくはＤ２６５ＡとＮ２９７Ａを有する、
ｄ）重鎖可変領域として配列番号７および軽鎖可変領域として配列番号８、κ軽鎖定常領域として配列番号１１およびγ１重鎖定常領域として配列番号１２、ただし場合によって突然変異Ｌ２３４ＡとＬ２３５ＡもしくはＤ２６５ＡとＮ２９７Ａを有する、または、
ｅ）重鎖可変領域として配列番号９および軽鎖可変領域として配列番号１０、κ軽鎖定常領域として配列番号１１およびγ１重鎖定常領域として配列番号１２、ただし場合によって突然変異Ｌ２３４ＡとＬ２３５ＡもしくはＤ２６５ＡとＮ２９７Ａを有する、
を含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１０】
医薬組成物の製造のための、請求項１〜９のいずれか一項記載の抗体の使用。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項記載の抗体を含む医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項記載の組換え抗体を産生可能な組換え宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか一項記載の抗体を含む医薬組成物の製造方法。
【請求項１４】
ポリペプチドが：
ａ）配列番号１、３、５、７もしくは９の重鎖可変領域を含む抗体重鎖、
ｂ）配列番号２、４、６、８もしくは１０の軽鎖可変領域を含む抗体軽鎖、
ここで、ＣＤＲは互いに独立して選択される、
のいずれかであって、それぞれ他方の抗体鎖と一緒に集合化が可能なポリペプチをコードする核酸。
【請求項１５】
原核宿主細胞内もしくは真核宿主細胞内で該核酸を発現することができる、請求項１４記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１５記載のベクターを含む原核宿主細胞もしくは真核宿主細胞。
【請求項１７】
ＩＬ−１３Ｒα１に結合することによってＩＬ−１３がＩＬ−１３Ｒα１に結合するのを阻害するポリペプチドの生産方法であって、請求項１４記載の重鎖をコードする核酸および軽鎖をコードする核酸を原核宿主細胞内もしくは真核宿主細胞内で発現させ、該細胞から該ポリペプチドを回収することを特徴とする方法。
【請求項１８】
喘息治療もしくは抗アレルギー治療を必要とする患者の治療方法であって、請求項１〜９のいずれか一項記載の抗体を該患者に投与することを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１〜９のいずれか一項記載の抗体を組換え発現によって産生し、該抗体を回収し、かつ該抗体を医薬的に受容可能な緩衝剤および／またはアジュバントと組み合わせることを特徴とする医薬組成物の製造方法。
【請求項２０】
ハイブリドーマ細胞系ＤＳＭ  ＡＣＣ２７０９、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７１０、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７１１もしくはＤＳＭ  ＡＣＣ２７１２。
【国際調査報告】
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