(57)【要約】  本発明は、分子（例えば、グリカン）が、切断可能なリンカーによりアレイに結合されている分子のアレイを提供する。また、本発明は、これらのアレイを使用するための方法、切断可能なリンカーを用いることによりこれらのアレイと結合している分子の構造要素、特に、試験サンプルとの結合に重要である構造要素を同定するための方法を提供する。さらに、本発明は、試験サンプル及び試験分子が、アレイ上の異なるグリカン及び本明細書で提供される方法及びアレイを用いて同定される有用なグリカンと結合することができるか否かを評価するための方法を提供する。【選択図】図１１Ａ
2008504531.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
切断可能なリンカーを介してアレイに結合されている分子のライブラリーを含む分子のアレイであって、切断可能なリンカーが、以下の構造を有するアレイ
Ｘ−Ｃｖ−Ｚ
［式中、
Ｃｖは切断部位であり、
Ｘは固体表面、固体表面に結合されているスペーサー基、又は固体表面とリンカーを結合するための反応性基を有するスペーサー基であり、
Ｚは分子を結合するための反応性部分、分子を結合するための反応性部分を有するスペーサー基、分子を有するスペーサー基、又は連結部分を介してリンカーに結合している分子である］。
【請求項２】
切断可能なリンカーが、化学切断、光切断、又は酵素切断可能である請求項１に記載のアレイ。
【請求項３】
リンカーが、式IVａ又は式IVｂを含む光切断可能なリンカーである請求項１に記載のアレイ。
【化１】
2008504531.tif 000060
【請求項４】
リンカーが、以下の構造を有するジスルフィドリンカーである請求項１に記載のアレイ。
Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｚ
【請求項５】
リンカーが、以下の構造を有するジスルフィドリンカーである請求項１に記載のアレイ。
【化２】
2008504531.tif 000061
【請求項６】
固体表面が、ガラス表面又はプラスチック表面である請求項１に記載のアレイ。
【請求項７】
固体表面が、スライドガラス又はマイクロタイタープレートである請求項１に記載のアレイ。
【請求項８】
リンカーが、結合の還元により切断される請求項１に記載のアレイ。
【請求項９】
リンカーが、光により切断される請求項１に記載のアレイ。
【請求項１０】
分子が、グリカン、核酸、又はタンパク質である請求項１に記載のアレイ。
【請求項１１】
分子が、マンノース含有グリカンである請求項１に記載のアレイ。
【請求項１２】
マンノース含有グリカンが、以下のグリカンのうちのいずれか１つ又はそれらの組合せを含む請求項１１に記載のアレイ。
【化３】
2008504531.tif 000062
【請求項１３】
分子が、以下の式のグリカンのうちの少なくとも１つ又はそれらの組合せを含む請求項１に記載のアレイ
【化４】
2008504531.tif 000063
［式中、Ｒ１は固体支持体に結合しているリンカーを含む］。
【請求項１４】
固体支持体及び固体支持体上の多数の画定されたグリカンプローブ位置を含み、各グリカンプローブ位置によって固体支持体の領域が画定され、その領域には１つのタイプの類似したグリカン分子のコピーが複数結合している、請求項１に記載のアレイ。
【請求項１５】
多数の画定されたグリカンプローブ位置が、約５〜２００のグリカンプローブ位置である請求項１４に記載のアレイ。
【請求項１６】
試験サンプル中のある分子が、請求項１から１５のいずれか一項に記載の分子のアレイと結合することができるか否かを試験する方法であって、（ａ）アレイを試験サンプルと接触させること、及び（ｂ）試験サンプル中のある分子が、アレイに結合している分子と結合するか否かを観察することを含む方法。
【請求項１７】
どの分子構造が、試験サンプル中の生体分子と結合するかを判定する方法であって、請求項１から１５のいずれか一項に記載の分子のアレイを試験サンプルと接触させること、アレイを洗浄すること、及び切断可能なリンカーを切断して、アレイに結合している分子の分子構造の構造解析又は機能解析を可能にすることを含む方法。
【請求項１８】
生体分子が、抗体、受容体又はタンパク質複合体である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
試験サンプルにおいて乳癌を検出する方法であって、（ａ）試験サンプルを、グリカン２５０若しくは２５１、又はそれらの組合せを含むグリカンと接触させること、
【化５】
2008504531.tif 000064
（式中Ｒ１は、水素、グリカン、リンカー又は固体支持体に結合しているリンカーである）及び
（ｂ）試験サンプル中の抗体が、２５０又は２５１を含む分子と結合するか否かを判定することを含む方法。
【請求項２０】
被験体のＨＩＶ感染を検出する方法であって、（ａ）被験体からの試験サンプルを、マンノース含有グリカンのアレイと接触させること、及び（ｂ）試験サンプル中の抗体が、グリカンの第一（α１−３）枝上にＭａｎα１−２Ｍａｎを含むグリカン、グリカンの第三（α１−６）枝上にＭａｎα１−２Ｍａｎを含むグリカン、又はそれらの組合せと結合するか否かを判定することを含む方法。
【請求項２１】
グリカンが、切断可能なリンカーによってアレイに結合している請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
マンノース含有グリカンが、以下のグリカンのうちの少なくとも１つ、又はそれらの組合せを含む請求項２１に記載の方法。
【化６】
2008504531.tif 000065
【請求項２３】
以下のグリカンのうちのいずれか１つ、又はそれらの組合せを含む単離されたグリカン
【化７】
2008504531.tif 000066
［式中、Ｒ１は水素、グリカン又は固体支持体に結合しうるリンカーである］。
【請求項２４】
グリカンの第一（α１−３）腕上にＭａｎα１−２Ｍａｎ、又はグリカンの（α１−６）第三腕上にＭａｎα１−２Ｍａｎ、又はそれらの組合せを含む単離されたグリカン。
【請求項２５】
第二（α１−３）腕を有さない請求項２４に記載の単離されたグリカン。
【請求項２６】
以下のオリゴマンノースグリカンのうちのいずれか１つ、又はそれらの組合せを含む単離されたグリカン。
【化８】
2008504531.tif 000067
【請求項２７】
薬学的に許容できる担体を含み、且つ、以下のオリゴマンノースグリカンのうちのいずれか１つ、又はそれらの組合せを含むグリカンを有効量含む医薬組成物
【化９】
2008504531.tif 000068
［式中、Ｒ１は水素、グリカン又はリンカーである］。
【請求項２８】
薬学的に許容できる担体を含み、且つ、グリカンの第一（α１−３）腕上にＭａｎα１−２Ｍａｎ、グリカンの（α１−６）第三腕上にＭａｎα１−２Ｍａｎ、又はそれらの組合せを含むグリカンを有効量含む医薬組成物。
【請求項２９】
薬学的に許容できる担体を含み、且つ、以下のオリゴマンノースグリカンのうちのいずれか１つ、又はそれらの組合せを含むグリカンを有効量含む医薬組成物。
【化１０】
2008504531.tif 000069
【請求項３０】
薬学的に許容できる担体を含み、且つ、以下のオリゴマンノースグリカンのうちのいずれか１つ、又はそれらの組合せを含むグリカンを有効量含む医薬組成物。
【化１１】
2008504531.tif 000070
【請求項３１】
グリカンがＨＩＶ ｇｏ１２０ペプチドに連結している、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
被験体の乳癌を治療又は予防する方法であって、薬学的に許容できる担体を含み、且つ、以下のオリゴマンノースグリカンのうちのいずれか１つ、又はそれらの組合せを含むグリカンを有効量含む医薬組成物を投与することを含む方法
【化１２】
2008504531.tif 000071
［式中、Ｒ１は水素、グリカン又はリンカーである］。
【請求項３３】
被験体のＨＩＶ感染を治療又は予防するための方法であって、薬学的に許容できる担体を含み、且つ、グリカンの第一（α１−３）腕上にＭａｎα１−２Ｍａｎ、グリカンの（α１−６）第三腕上にＭａｎα１−２Ｍａｎ、又はそれらの組合せを含む有効量のグリカンを含む医薬組成物を被験体に投与することを含む方法。
【請求項３４】
被験体のＨＩＶ感染を治療又は予防するための方法であって、薬学的に許容できる担体を含み、且つ、以下のオリゴマンノースグリカンのうちのいずれか１つ、又はそれらの組合せを含む有効量のグリカンを含む医薬組成物を被験体に投与することを含む方法。
【化１３】
2008504531.tif 000072
【請求項３５】
組成物がさらに以下のグリカンのうちのいずれか１つを含むグリカンを含む請求項３３に記載の方法。
【化１４】
2008504531.tif 000073
【請求項３６】
グリカンがＨＩＶ ｇｐ１２０ペプチドに連結している、請求項３３から３５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００４年６月２４日に出願した米国仮出願第６０／５８２７１３号の出願日の利益を主張するものであり、その内容は、参照により本明細書に援用されるものとする。
【０００２】
本明細書に記載されている発明は、国立衛生研究所により供与された助成金番号ＧＭ５８４３９及びＧＭ４４１５４の下で、米国政府のサポートにより行われた。米国政府は、この発明において特定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、切断可能なリンカー及び切断可能なリンカーを有するアレイを作製するための方法に関する。また、本発明は、アレイ上の様々なタイプの分子と結合する物質を同定するための方法及びそれらの物質と結合するアレイ上の分子の構造要素を規定する方法に関する。本明細書で提供されるアレイ及び方法は、エピトープ同定、薬物発見用に、及び分析ツールとして使用することができる。例えば、本発明は、癌及び／又はウイルス感染を治療及び予防するための組成物中で使用することができる有用なグリカンを提供する。
【背景技術】
【０００４】
通常、グリカンは、細胞とそれらの環境との間の第１の、場合によっては最も重要な境界面である。全生命系の重要な構成要素として、グリカンは、認識、接着、運動性及びシグナル伝達プロセスに関与している。なぜグリカンを研究すべきかには、（１）生命体におけるすべての細胞、及びウイルスは、多様なタイプのグリカンで被覆されている、（２）グリコシル化は、全生命体で生じる翻訳後又は翻訳時修飾の一形態である、及び（３）異常なグリコシル化は、ヒト病変の発生における初期の、恐らくは重要な時期の徴候であるという少なくとも３つの理由がある。Jun Hirabayashi, Oligosaccharide microarrays for glycomics; 2003, Trends in Biotechnology. 21(4): 141-143; Sen-Itiroh Hakomori, Tumor-associated carbohydrate antigens defining tumor malignancy: Basis for development of and-cancer vaccines（The Molecular Immunology of Complex Carbohydrates-2 (Albert M Wu, ed., Kluwer Academic/Plenum, 2001)）。これらの細胞を同定するグリコシル化分子には、糖タンパク質及び糖脂質が含まれ、「レクチン」と呼ばれる様々なグリカン認識タンパク質により特異的に認識される。しかしながら、これらの相互作用の大きな複雑性、並びに明確なグリカンライブラリー及び分析法の欠如は、グライコミクスの発展における大きな障害とされてきた。
【０００５】
ヌクレオチド及びタンパク質マイクロアレイの発展は、ゲノム、遺伝子発現及びプロテオーム研究に革命をもたらした。これらのアレイについての技術革新のペースは爆発的であったが、グリカンマイクロアレイの発展は比較的遅いものであった。この１つの理由は、化学的及び構造的に多様なグリカンの集団を確実に固定化することが困難であったことである。さらに、グリカンは、核酸及びタンパク質に対してごく普通に適用される多くの現在利用可能な分子技法（迅速な配列決定及びインビトロ合成など）による分析に容易にはなじまない。
【特許文献１】米国仮出願第６０／５８２７１３号
【非特許文献１】Jun Hirabayashi, Oligosaccharide microarrays for glycomics; 2003, Trends in Biotechnology. 21(4): 141-143
【非特許文献２】Sen-Itiroh Hakomori, Tumor-associated carbohydrate antigens defining tumor malignancy: Basis for development of and-cancer vaccines（The Molecular Immunology of Complex Carbohydrates-2 (Albert M Wu, ed., Kluwer Academic/Plenum, 2001)）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、グリカンと他のタイプの分子との間の相互作用についての構造的及び機能的意義を理解するための新たなツールが必要とされる。さらに、製薬会社及び研究機関は、抗体、受容体及び他の生体分子との結合に寄与するグリカンの構造要素の分析を容易にするアレイが含まれる様々なスクリーニング及び薬物発見用途のためのグリカンアレイから大きく恩恵を受けるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、様々な用途に使用することができる切断可能なリンカーを提供する。例えば、本発明の切断可能なリンカーを用い、分子を、固体表面又はアレイに結合することができる。切断可能なリンカーは、光切断可能、酵素切断可能又は化学切断可能なユニットである切断可能なユニットを有することができる。例えば、切断可能なリンカーは、ジスルフィド（化学切断可能）、ニトロベンゾ（光切断可能なユニット）、又はアミン、アミド若しくはエステル（酵素に感受性のある切断可能なユニット）などの切断可能なユニットを有することができる。
【０００８】
また、本発明は、切断可能なリンカーを有するアレイ（又はマイクロアレイ）を提供する。さらに、本発明は、そのようなグリカンアレイ又はマイクロアレイを作製するための方法を提供する。他の実施形態において、本発明は、そのようなアレイを用い、様々なタイプのグリカンが他の分子を相手とする相互作用を同定及び分析するための方法を提供する。これらのグリカンアレイ及びスクリーニング方法は、どのタンパク質、受容体、抗体、核酸又は他の分子若しくは物質が、どのグリカンと結合するかを同定するのに有用である。したがって、本発明のグリカンライブラリー及びグリカンアレイは、受容体リガンドの特徴付け、細胞膜上及び細胞内成分内の炭水化物の同定、抗体エピトープ同定、酵素の特徴付け並びにファージディスプレーライブラリースクリーニングに使用することができる。一実施形態において、本発明は、グリカンが切断可能なリンカーによりアレイに結合しているグリカンのアレイを提供する。
【０００９】
本発明のアレイ上で使用されるグリカンには、２個以上の糖ユニットが含まれる。本発明のグリカンには、直鎖及び分岐したオリゴ糖並びに天然に存在するグリカン及び合成グリカンが含まれる。本発明のグリカン中には、アロース、アルトロース、アラビノース、グルコース、ガラクトース、グロース、フコース、フルクトース、イドース、リキソース、マンノース、リボース、タロース、キシロース、ノイラミン酸又は他の糖ユニットが含まれる任意のタイプの糖ユニットが存在することができる。そのような糖ユニットは、様々な置換基を有することができる。例えば、糖ユニット上に通常存在する置換基の代わりに、又はそれらの他に存在することができる置換基には、アミノ、カルボキシ、チオール、アジド、Ｎ−アセチル、Ｎ−アセチルノイラミン酸、オキシ（＝Ｏ）、シアル酸、サルフェート（−ＳＯ４−）、ホスフェート（−ＰＯ４−）、低級アルコキシ、低級アルカノイルオキシ、低級アシル、及び／又は低級アルカノイルアミノアルキルが含まれる。脂肪酸、脂質、アミノ酸、ペプチド及びタンパク質も、本発明のグリカンに結合することができる。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、固体支持体及び固体支持体上の多数の画定されたグリカンプローブ位置が含まれるマイクロアレイを提供し、各グリカンプローブ位置によって固体支持体の領域が確定され、その領域には１つのタイプの類似したグリカン分子のコピーが複数結合しており、グリカンは、切断可能なリンカーによってマイクロアレイに結合している。これらのマイクロアレイは、例えば、約２〜１００，０００個の異なるグリカンプローブ位置、又は約２〜１０，０００個の異なるグリカンプローブ位置を有することができる。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、ある試験分子又は試験物質が、本発明のアレイ又はマイクロアレイ上に存在するグリカンと結合することができるか否かを同定する方法を提供する。この方法は、アレイを試験分子又は試験物質と接触させ、試験分子又は試験物質が、ライブラリー中又はアレイ上のグリカンと結合するか否かを観察するものである。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、ある試験分子又は試験物質がどのグリカンと結合することができるかを同定する方法を提供し、グリカンは、本発明のアレイ上に存在する。この方法は、アレイを試験分子又は試験物質と接触させ、試験分子又は試験物質がどのグリカンと結合することができるかを観察するものである。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、一連の別々のグリカン調製物が含まれるグリカンのライブラリーを提供し、ライブラリーの各グリカン調製物中の実質的にすべてのグリカンは、本発明のアレイを作製するための固体支持体上にグリカンを結合するために使用することができるアジド結合基を有する。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、アレイの固体支持体表面を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、アミノ（−−ＮＨ２）、チオール（−ＳＨ）、カルボキシル（ＣＯＯＨ）、イソチオシアネート（−−ＮＣＳ）、又はヒドロキシル（−−ＯＨ）などの反応性部分を有するトリアルコキシシランで誘導体化し、アレイ上に少なくとも１つの誘導体化されたグリカンプローブ位置を作製し、誘導体化されたプローブ位置を、式Ｉ又はIIのリンカー前駆体と接触させるものである本発明のアレイを製造する方法を提供し、
ＮＨ２−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｌ２    Ｉ
Ｌ１−ＮＨ−（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｌ２                                                             II
式中、Ｌ１及びＬ２は、各々別々に脱離基であり、各ｎは、別々に、１〜１０の整数である。誘導体化されたプローブ位置及びリンカー前駆体を、リンカー上のアミンとアレイの反応性部分との間で共有結合を形成するのに十分な時間と条件下でお互いに接触させ、それによって、少なくとも１つのリンカー−プローブ位置を作製する。例えば、式Ｉのリンカー前駆体が使用される場合、末端アミンは、アレイの反応性部分の１つと共有結合を形成する。式IIのリンカー前駆体が使用される場合、Ｌ１脱離基が失われ、Ｌ１基に隣接するアミンが、アレイの反応性部分の１つと共有結合を形成する。多くの実施形態において、リンカー前駆体は、アレイ上のすべてのプローブ位置に結合され、次いで、別々の異なるグリカン調製物が、アレイ上の別々の異なるプローブ位置に連結される。グリカン調製物をプローブ位置に結合するために、各グリカンが、結合部位、例えば、アジド結合部位を有するグリカンからなるグリカン調製物が使用される。したがって、リンカー前駆体の結合後、アレイ上のリンカー−プローブ位置を、グリカン上の連結部分とアレイに結合しているリンカー前駆体のカルボニルとの間の共有結合の形成に十分な条件下でグリカン調製物と接触させることができる。Ｌ２脱離基は、この反応中に失われる。
【００１５】
各グリカンプローブ位置におけるグリカンの密度は、誘導体化されたグリカンプローブ位置に塗布されるグリカン溶液の濃度を変えることにより調節することができる。
【００１６】
本発明の別の態様は、切断可能なリンカーを介してアレイに結合している分子のライブラリーを含む分子のアレイであり、切断可能なリンカーは、以下の構造を有し、
Ｘ−Ｃｖ−Ｚ
式中、
Ｃｖは、切断部位であり、
Ｘは、固体表面、固体表面に結合しているスペーサー基又は固体表面にリンカーを結合するための反応性基を有するスペーサー基であり、
Ｚは、分子を結合するための反応性部分、分子を結合するための反応性部分を有するスペーサー基、分子を有するスペーサー基、又は連結部分を介してリンカーに結合している分子である。
【００１７】
一部の実施形態において、リンカーは、式IVａ又は式IVｂのいずれかを含む光切断可能なリンカーである。
【００１８】
【化１】
2008504531.tif 000003
【００１９】
他の実施形態において、リンカーは、以下の構造を有するジスルフィドリンカーである。
Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｚ
【００２０】
他の実施形態において、リンカーは、以下の構造を有するジスルフィドリンカーである。
【００２１】
【化２】
2008504531.tif 000004
【００２２】
一部の実施形態において、固体表面は、ガラス表面又はプラスチック表面である。例えば、アレイの固体表面は、スライドガラス又はマイクロタイタープレートであってよい。
【００２３】
一部の実施形態において、リンカーは、結合の還元により切断される。他の実施形態において、リンカーは、光により切断される。分子には、例えば、グリカン、核酸又はタンパク質が含まれてよい。一部の実施形態において、アレイには、固体支持体及び固体支持体上の多数の画定されたグリカンプローブ位置が含まれ、各グリカンプローブ位置によって固体支持体の領域が画定され、その領域には１つのタイプの類似したグリカン分子のコピーが複数結合している。一部の実施形態において、多数の画定されたグリカンプローブ位置は、約５〜２００個のグリカンプローブ位置である。
【００２４】
本発明の別の態様は、試験サンプル中のある分子が、本発明の分子のアレイと結合することができるか否かを試験する方法であって、（ａ）アレイを試験サンプルと接触させること、及び（ｂ）試験サンプル中のある分子が、アレイに結合している分子と結合するか否かを観察することを含む方法である。
【００２５】
本発明の別の態様は、どの分子構造が、試験サンプル中の生体分子と結合するかを判定する方法であって、本発明の分子のアレイを試験サンプルと接触させること、アレイを洗浄すること、及び切断可能なリンカーを切断して、アレイに結合している分子の分子構造の構造解析又は機能解析を可能にする方法である。例えば、生体分子は、抗体、受容体又はタンパク質複合体であってよい。
【００２６】
本発明の別の態様は、試験サンプルにおいて乳癌を検出する方法であって、（ａ）試験サンプルを、グリカン２５０若しくは２５１（式中、Ｒ１は、水素、グリカン、リンカー又は固体支持体に結合しているリンカーである）、又はそれらの組合せを含むグリカンと接触させること、及び
【００２７】
【化３】
2008504531.tif 000005
【００２８】
（ｂ）試験サンプル中の抗体が、２５０又は２５１を含む分子と結合するか否かを判定することを含む方法である。
【００２９】
本発明の別の態様は、被験体においてＨＩＶ感染を検出する方法であって、（ａ）被験体からの試験サンプルを、マンノース含有グリカンのアレイと接触させること、及び（ｂ）試験サンプル中の抗体が、グリカンの第一（α１−３）腕上にＭａｎα１−２Ｍａｎを含むグリカン若しくはグリカンの（α１−６）第三腕上にＭａｎα１−２Ｍａｎを含むグリカン、又はそれらの組合せと結合するか否かを判定することを含む方法である。一部の実施形態において、抗体は、（α１−３）分岐からの第二腕を有するマンノース含有グリカンに対して親和性が低い。
【００３０】
本発明の別の態様は、以下のグリカンのうちのいずれか１つ、又はそれらの組合せを含む単離されたグリカンであり、
【００３１】
【化４】
2008504531.tif 000006
式中、Ｒ１は、水素、グリカン、リンカーである。一部の実施形態において、リンカーは、固体支持体であるか、或いは固体支持体に結合しうる。
【００３２】
本発明の別の態様は、グリカンの第一（α１−３）腕上にＭａｎα１−２Ｍａｎ、又はグリカンの（α１−６）第三腕上にＭａｎα１−２Ｍａｎを含む単離されたグリカン、又はそれらの組合せである。一部の実施形態において、グリカンは、第二（α１−３）腕を有さない。
【００３３】
本発明の別の態様は、以下のオリゴマンノースグリカンのうちのいずれか１つ、又はそれらの組合せを含む単離されたグリカンであり、
【００３４】
【化５】
2008504531.tif 000007
【００３５】
式中、ダッシュ記号（−）は、別の糖部分との共有結合、ｇｐ２０若しくはｇｐ４３ペプチドとの共有結合、水素との共有結合、リンカーとの共有結合又は固体支持体との共有結合である。オリゴマンノースグリカンが、医薬組成物及び疾患を治療する方法において使用される場合、ダッシュ記号（−）は、別の糖部分との共有結合、又は水素との共有結合若しくはリンカーとの共有結合であることが好ましい。リンカーは、抗ウイルス剤、抗菌剤又は抗癌剤に結合しうる。
【００３６】
本発明の別の態様は、薬学的に許容できる担体を含み、且つ、以下のグリカンのうちのいずれか１つ、又はそれらの組合せを含むグリカンを有効量含む医薬組成物であり、
【００３７】
【化６】
2008504531.tif 000008
【００３８】
式中、Ｒ１は、水素、グリカン又はリンカーである。一部の実施形態において、リンカーは、固体支持体であるか、或いは固体支持体に結合しうる。
【００３９】
本発明の別の態様は、薬学的に許容できる担体を含み、且つ、グリカンの第一（α１−３）腕上にＭａｎα１−２Ｍａｎ、又はグリカンの（α１−６）第三腕上にＭａｎα１−２Ｍａｎ、又はそれらの組合せを含むグリカンを有効量含む医薬組成物である。一部の実施形態において、グリカンは、第二（α１−３）腕を有さない。
【００４０】
本発明の別の態様は、薬学的に許容できる担体を含み、且つ、以下のオリゴマンノースグリカンのうちのいずれか１つ、又はそれらの組合せを含むグリカンを有効量含む医薬組成物であり、
【００４１】
【化７】
2008504531.tif 000009
【００４２】
式中、ダッシュ記号（−）は、別の糖部分との共有結合、ｇｐ２０若しくはｇｐ４３ペプチドとの共有結合、水素との共有結合、リンカーとの共有結合又は固体支持体との共有結合である。本発明の組成物には、他のマンノース含有グリカンが含まれていてもよい（例えば、図１７に示す構造のいずれかを有するマンノース含有グリカンが含まれていてもよい）。オリゴマンノースグリカンが、医薬組成物及び疾患を治療する方法において使用される場合、ダッシュ記号（−）は、別の糖部分との共有結合、又は水素との共有結合若しくはリンカーとの共有結合であることが好ましい。リンカーは、抗ウイルス剤、抗菌剤又は抗癌剤に結合しうる。
【００４３】
本発明の別の態様は、被験体において乳癌を治療又は予防する方法であって、薬学的に許容できる担体を含み、且つ、以下のグリカンのうちのいずれか１つ、又はそれらの組合せを含むグリカンを有効量含む医薬組成物を投与することを含む方法であり、
【００４４】
【化８】
2008504531.tif 000010
【００４５】
式中、Ｒ１は、水素、グリカン又はリンカーである。一部の実施形態において、リンカーは、固体支持体であるか、或いは固体支持体に結合しうる。
【００４６】
本発明の別の態様は、被験体においてＨＩＶ感染を治療又は予防するための方法であって、薬学的に許容できる担体を含み、且つ、グリカンの第一（α１−３）腕上にＭａｎα１−２Ｍａｎ、又はグリカンの（α１−６）第三腕上にＭａｎα１−２Ｍａｎ、又はそれらの組合せを含むグリカンを有効量含む医薬組成物を被験体に投与することを含む方法である。一部の実施形態において、グリカンは、第二（α１−３）腕を有さない。
【００４７】
本発明の別の態様は、被験体においてＨＩＶ感染を治療又は予防するための方法であって、薬学的に許容できる担体を含み、且つ、以下のオリゴマンノースグリカンのうちのいずれか１つ、又はそれらの組合せを含むグリカンを有効量含む医薬組成物を被験体に投与することを含む方法であり、
【００４８】
【化９】
2008504531.tif 000011
【００４９】
式中、ダッシュ記号（−）は、別の糖部分との共有結合、ｇｐ２０若しくはｇｐ４３ペプチドとの共有結合、水素との共有結合、リンカーとの共有結合又は固体支持体との共有結合である。ＨＩＶを治療又は予防するのに使用される組成物には、他のマンノース含有グリカンが含まれていてもよい。オリゴマンノースグリカンが、医薬組成物及び疾患を治療する方法において使用される場合、ダッシュ記号（−）は、別の糖部分との共有結合、又は水素との共有結合若しくはリンカーとの共有結合であることが好ましい。リンカーは、抗ウイルス剤、抗菌剤又は抗癌剤に結合しうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
本発明は、どのタイプのタンパク質、受容体、抗体、脂質、核酸、炭水化物並びに他の分子及び物質が、所与のグリカン構造と結合することができるかを同定するために使用することができるグリカンのライブラリー及びアレイを提供する。
【００５１】
本発明のライブラリー、アレイ及び方法は、いくつかの利点を有する。本発明のアレイのある特定の利点は、アレイ上のグリカンが、切断可能なリンカーにより結合していることである。例えば、本発明の切断可能なリンカーは、グリカンと他の生物学的分子との間に通常生じるタイプの結合相互作用に対して安定であるジスルフィド結合を有することができる。しかしながら、切断可能なリンカーは、結合しているグリカンを有するリンカーを他の目的でさらに分析又は利用することができるように、当業者が選択した場合には切断することができる。
【００５２】
また、本発明のアレイ及び方法は、極めて再現性のある結果を提供する。本発明のライブラリー及びアレイは、多数の且つ様々なグリカンを提供する。例えば、本発明のライブラリー及びアレイは、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも１０個、又は少なくとも１００個のグリカンを有する。一部の実施形態において、本発明のライブラリー及びアレイは、１アレイ当たり、約２〜約１００，０００、又は約２〜約１０，０００、又は約２〜約１，０００個の異なるグリカンを有する。そのような多数のグリカンは、多数のグリカンタイプの同時アッセイを可能にする。本明細書に記載されているように、本発明のアレイを用い、様々なグリカン結合タンパク質をスクリーニングすることに成功した。そのような実験は、グリカンの分解はほとんど生じず、スクリーニングアッセイ中には少量のグリカン結合タンパク質しか消費されないことを立証している。したがって、本発明のアレイは、２つ以上のアッセイに使用することができる。本発明のアレイ及び方法は、高いＳＮ比を提供する。本発明によって提供されるスクリーニング法が迅速且つ容易であるのは、それらが、１工程又は数工程を含むに過ぎないからである。通常、本発明のアッセイ手順中に、表面修飾及びブロッキング手順は一切必要とされない。本発明のアレイ上のグリカンの組成は、必要に応じて当業者が変えることができる。多くの異なる複合糖質を本発明のアレイ中に組み入れることができ、例えば、天然に存在するグリカン又は合成グリカン、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、細菌及び植物細胞壁グリカンなどが含まれる。本発明のアレイに様々なグリカンを結合するための固定化手順を容易に制御し、アレイ構築を容易にすることができる。
【００５３】
定義
以下の略語を使用することができる。α１−ＡＧＰは、α−酸性糖タンパク質を意味し、ＡＦ４８８は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｕｒ−４８８を意味し、ＣＦＧは、機能グライコミクスのためのコンソーシアム（Consortium for Functional Glycomics）を意味し、Ｃｏｎ  Ａは、コンカナバリンＡを意味し、ＣＶＮは、シアノビリン−Ｎを意味し、ＤＣ−ＳＩＧＮは、樹状細胞特異的なＩＣＡＭ接着性非インテグリンを意味し、ＥＣＡは、エリスリナ・クリスタガリ（Erythrina cristagalli）を意味し、ＥＬＩＳＡは、酵素結合免疫吸着アッセイを意味し、ＦＩＴＣは、フルオレセインイソチオシアネートを意味し、ＧＢＰは、グリカン結合タンパク質を意味し、ＨＩＶは、ヒト免疫不全ウイルスを意味し、ＨＡは、インフルエンザヘマグルチニンを意味し、ＮＨＳは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを意味し、ＰＢＳは、リン酸塩緩衝食塩水を意味し、ＳＤＳは、ドデシル硫酸ナトリウムを意味し、ＳＥＭは、平均値の標準誤差を意味し、Ｓｉｇｌｅｃは、シアル酸免疫グロブリンスーパーファミリーレクチンを意味する。
【００５４】
本明細書で使用する「画定されたグリカンプローブ位置」は、すべてが類似したグリカン構造を有するある密度のグリカン分子が結合している固体支持体の予め画定された領域である。本明細書において、用語「グリカン領域」、又は「選択された領域」、又は単に「領域」は、用語画定されたグリカンプローブ位置と同義的に使用される。画定されたグリカンプローブ位置は、任意の好都合な形状、例えば、円形、長方形、楕円形、楔形などを有することができる。一部の実施形態において、画定されたグリカンプローブ位置、したがって、各々の異なるグリカンタイプ又は異なる一群の構造的に関係があるグリカンが結合している面積は、約１ｃｍ２より小さいか、或いは１ｍｍ２未満、又は０．５ｍｍ２未満である。一部の実施形態において、グリカンプローブ位置は、約１０，０００μｍ２未満又は１００μｍ２未満の面積を有する。各々の画定されたグリカンプローブ位置内に結合しているグリカン分子は、実質的に同一である。さらに、各グリカンタイプの複数のコピーが各々の画定されたグリカンプローブ位置内に存在する。各々の画定されたグリカンプローブ位置内の各グリカンタイプのコピーの数は、数千から数百万であってよい。
【００５５】
本明細書で使用するように、本発明のアレイは、各々が「１つのタイプのグリカン分子」を有する画定されたグリカンプローブ位置を有する。用いられる「１つのタイプのグリカン分子」は、一群の実質的に構造が一致しているグリカン分子又は一群の構造的に類似したグリカン分子であってよい。画定されたグリカンプローブ位置内のあらゆるグリカン分子が、同一の構造を有する必要はない。一部の実施形態において、単一の画定されたグリカンプローブ位置内のグリカンは、構造異性体であり、可変数の糖ユニットを有するか、或いは若干異なる様式で分岐している。しかしながら、一般的に、画定されたグリカンプローブ位置内のグリカンは、実質的に同じタイプの糖ユニットを有し、且つ／又はほぼ同じ比率の各タイプの糖ユニットを有する。画定されたグリカンプローブ位置内のグリカンの糖ユニット上の置換基のタイプも実質的に同じである。
【００５６】
用語レクチンは、炭水化物と相互作用する、炭水化物と結合する、又は炭水化物と架橋する分子を指す。用語ガレクチンは、動物レクチンである。一般に、ガレクチンは、ガラクトース含有グリカンと結合する。
【００５７】
本明細書で使用する「被験体」は、哺乳類又はトリである。そのような哺乳類及びトリには、家畜（domesticated animals）、家畜（farm animals）、実験で使用される動物、動物園動物などが含まれる。例えば、被験体は、イヌ、ネコ、サル（monkey）、ウマ、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、サル（ape）又はヒト哺乳類であってよい。他の実施形態において、動物は、ニワトリ、アヒル、ガチョウ又はシチメンチョウなどのトリである。多くの実施形態において、被験体は、ヒトである。
【００５８】
本明細書に記載されているグリカンの構造要素の一部は、省略形で言及される。使用される多くの略語を表１に示す。さらに、本発明のグリカンは、糖ユニット、表１に示す単糖即ちコア構造のいずれかを有することができる。
【００５９】
【表１】
2008504531.tif 000012
【００６０】
本発明のグリカン中に存在する糖ユニット又は他の糖構造は、様々な方法で化学的に修飾することができる。本発明のグリカン中の糖ユニットが有することができる修飾及び置換のタイプの一部についての一覧表を、これらの修飾／置換の略語と一緒に以下の表２に示す。
【００６１】
【表２】
2008504531.tif 000013
【００６２】
糖ユニット間の結合は、アルファ（α）又はベータ（β）結合であり、糖環の平面に対して、アルファ結合は下に行き、ベータ結合は上に行くことを意味する。本明細書で時折使用される簡単な表記法において、文字「ａ」は、アルファ結合を示すために使用され、文字「ｂ」は、ベータ結合を示すために使用される。
【００６３】
切断可能なリンカー
本発明は、固体支持体又はアレイに結合させ、切断可能なリンカーを介して固体支持体又はアレイと結合している分子又は複合体の放出を可能にすることができる切断可能なリンカーを提供する。これらの切断可能なリンカーを用い、固体支持体及びアレイに様々な分子を結合することができる。例えば、切断可能なリンカーを用い、グリカン、核酸又はタンパク質などの分子を固体支持体又はアレイに結合することができる。一部の実施形態において、切断可能なリンカーを用い、グリカンを固体支持体又はアレイに結合する。
【００６４】
一実施形態において、本発明は、切断可能なリンカーを提供し、ここで、切断可能なリンカーは、以下の構造を有し、
Ｘ−Ｃｖ−Ｚ                      Ｉ
式中、
Ｃｖは、切断部位であり、
Ｘは、固体表面、固体表面に結合しているスペーサー基又は固体表面にリンカーを結合するための反応性基を有するスペーサー基であり、
Ｚは、分子を結合するための反応性部分、分子を結合するための反応性部分を有するスペーサー基、分子を有するスペーサー基、又は連結部分を介して切断可能なリンカーに結合している分子である。
【００６５】
別の実施形態において、本発明は、ジスルフィドリンカーを提供し、ここで、ジスルフィドリンカーは、以下の構造を有し、
Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｚ                    II
式中、
Ｘは、固体表面、固体表面に結合しているスペーサー基又は固体表面にリンカーを結合するための反応性基を有するスペーサー基であり、
Ｚは、分子を結合するための反応性部分、分子を結合するための反応性部分を有するスペーサー基、分子を有するスペーサー基、又は連結部分を介してリンカーに結合している分子である。
【００６６】
他の実施形態において、切断可能なリンカーは、以下の構造を有するジスルフィドリンカーであり、
【００６７】
【化１０】
2008504531.tif 000014
【００６８】
式中、
Ｘは、固体表面又は固体表面に結合しているスペーサー基であり、
Ｙは、脱離基又はトリアゾール部分を介してジスルフィドリンカーに結合しているグリカンである。
【００６９】
別の実施形態において、本発明は、以下の構造IVａかIVｂのどちらかを有する光切断可能なリンカーを提供し、
【００７０】
【化１１】
2008504531.tif 000015
【００７１】
式中、
Ｘは、固体表面又は固体表面に結合しているスペーサー基又は固体表面にリンカーを結合するための反応性基を有するスペーサー基であり、
Ｚは、分子を結合するための反応性部分、分子を結合するための反応性部分を有するスペーサー基、分子を有するスペーサー基、又は連結部分を介してリンカーに結合している分子である。
【００７２】
式IVａ及びIVｂの光切断可能なリンカーに結合している分子は、レーザーからの光、例えば、レーザーからの紫外光を用い、結合している固体支持体から切断することができる。一部の実施形態において、レーザーは、約３４０〜４００ｎｍ、又は約３６０ｎｍの光を提供する。分子は、分子の機能的又は構造的特徴付けを容易にするため、リンカーの光切断により固体支持体から放出される。
【００７３】
スペーサー分子又は基には、かなり安定な（例えば、実質的に化学的に不活性な）鎖又はポリマーが含まれる。例えば、スペーサー分子又は基は、アルキレン基であってよい。アルキレン基の一例は、−（ＣＨ２）ｎ−であり、ここで、ｎは、１〜１０の整数である。
【００７４】
適当な脱離基は、当技術分野においてよく知られており、例えば、−Ｃ≡ＣＨなどのアルキン；クロライド、ブロマイド、及びアイオダイドなどのハライド；アリール−又はアルキルスルホニルオキシ、置換アリールスルホニルオキシ（例えば、トシルオキシ又はメシルオキシ）；置換アルキルスルホニルオキシ（例えば、ハロアルキルスルホニルオキシ）；フェノキシ又は置換フェノキシ；及びアシルオキシ基が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７５】
別の実施形態において、本発明は、アレイの固体支持体表面を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、アミノ（−−ＮＨ２）、イソチオシアネート（−−ＮＣＳ）又はヒドロキシル（−−ＯＨ）などの反応性部分を有するトリアルコキシシランで誘導体化し、アレイ上に少なくとも１つの誘導体化されたグリカンプローブ位置を作製し、誘導体化されたプローブ位置を、式Ｖ又はVIのリンカー前駆体（式中、Ｌ１及びＬ２は、各々別々に脱離基であり、各ｎは、別々に、１〜１０の整数である）と接触させるものである本発明のアレイを製造する方法を提供する。
ＮＨ２−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｌ２    Ｖ
Ｌ１−ＮＨ−（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｌ２                                                      VI
【００７６】
したがって、誘導体化されたプローブ位置及びリンカー前駆体を、リンカー上のアミンとアレイの反応性部分との間で共有結合を形成するのに十分な時間と条件下でお互いに接触させ、それによって、少なくとも１つのリンカー−プローブ位置を作製することができる。例えば、式Vのリンカー前駆体が使用される場合、末端アミンは、アレイの反応性部分の１つと共有結合を形成する。式VIのリンカー前駆体が使用される場合、Ｌ１脱離基が失われ、Ｌ１基に隣接するアミンが、アレイの反応性部分の１つと共有結合を形成する。多くの実施形態において、リンカー前駆体は、アレイ上のすべてのプローブ位置に結合され、次いで、別々の異なるグリカン調製物が、アレイ上の別々の異なるプローブ位置に連結される。グリカン調製物をプローブ位置に結合するため、各グリカンが、結合部位、例えば、アジド結合部位を有するグリカンからなるグリカン調製物が使用される。したがって、リンカー前駆体の結合後、アレイ上のリンカー−プローブ位置を、グリカン上の連結部分とアレイに結合しているリンカー前駆体のカルボニルとの間で共有結合を形成するのに十分な条件下でグリカン調製物と接触させることができる。Ｌ２脱離基は、この反応中に失われる。
【００７７】
そのような方法は、任意の好都合な固体支持体との使用に適合させることができる。
【００７８】
本明細書で説明するように、リンカー１及び２を、固体支持体にアジド含有糖類を共有結合させるために合成した（図９〜１１及び実施例７を参照）。チオイソシアナート（２）は、アミンがコーティングされた固体支持体及びアレイとの使用のためにアミン１から作製した。
【００７９】
【化１２】
2008504531.tif 000016
【００８０】
そのような切断可能なリンカーは、上記に記載されているように固体支持体又はアレイに結合することができる。一実施形態において、リンカー１を、塩基性条件下、ＮＨＳがコーティングされた表面に結合し、アルキン官能基付き表面を得た。リンカーの結合は、質量分析（ＭＳ）を介して検証した。
【００８１】
リンカー１及び２のインキュベーション後、表面を、水で繰り返し洗浄した。リンカー１及び２のジチオスレイトール（ＤＴＴ）との反応は、ジスルフィド結合を還元し、それに連結している任意の実体（例えば、グリカン）を放出するはずである。Lack et al. Helv. Chim. Acta 2002, 85, 495-501；Lindroos et al. Nucleic Acids. Res. 2001, 29, E69；Rogers et al. Anal. Biochem. 1999, 266, 23-30；Guillier et al. Chem. Rev. 2000, 100, 2091-2158を参照されたい。切断は、ソニックスプレーイオン化（ＳＳＩ）及びエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ＭＳにより直接モニターしたが、これらは、リンカーの存在を検証しただけでなくＤＴＴ処理による低いバックグラウンドを示した。
【００８２】
次いで、アルキンで誘導体化された固体支持体上へのアジド含有グリカンの捕捉を、ＣｕＩの存在下、プローブ位置、即ち活性化アルキン脱離基を提示する官能基付き固体支持体表面をアジド含有糖と接触させることにより行った。図９〜１１及び実施例７を参照されたい。次いで、この結合法の効率を、ＤＴＴ又は光誘発性の切断を用いて経時的にモニターした。遊離した切断生成物を質量分析により直接分析し、生成物の構造の同一性を確認した。この結合戦略をマイクロモル以下の濃度を固体支持体表面に結合するために使用するのに成功し、多数のグリカンの共有結合に適用することに成功した。
【００８３】
グリカン
本発明は、多数の異なるタイプの炭水化物及びオリゴ糖が含まれるグリカンの組成物及びライブラリーを提供する。一般に、ライブラリー内の別々のグリカンの主要な構造的属性及び組成は、同定されている。一部の実施形態において、ライブラリーは、グリカン、炭水化物及び／又はオリゴ糖の別々の実質的に純粋なプールからなっている。本発明のライブラリーは、結合している本発明の切断可能なリンカーを有することができる。
【００８４】
本発明のグリカンには、直鎖及び分岐のオリゴ糖並びに天然に存在するグリカン及び合成グリカンが含まれる。例えば、グリカンは、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖脂質、グリコアミノグリカン（ＧＡＧ）、糖タンパク質、全細胞、細胞成分、複合糖質、グリコミメティック、糖リン脂質アンカー（ＧＰＩ）、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合型複合糖質、細菌性リポ多糖及び内毒素であってよい。
【００８５】
本発明のグリカンには、２つ以上の糖ユニットが含まれる。本発明のグリカン中には、例えば、アロース、アルトロース、アラビノース、グルコース、ガラクトース、グロース、フコース、フルクトース、イドース、リキソース、マンノース、リボース、タロース、キシロース、又は他の糖ユニットが含まれる任意のタイプの糖ユニットが存在することができる。本明細書に提供される表は、本発明のグリカンに使用することができる糖ユニットの他の例を列挙している。そのような糖ユニットは、様々な修飾及び置換を有することができる。本明細書において、企図されている修飾及び置換のタイプの一部の例を表で示す。例えば、糖ユニットは、ヒドロキシ（−ＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、及びメチレンヒドロキシ（−ＣＨ２−ＯＨ）置換基の代わりに様々な置換基を有することができる。したがって、低級アルキル部分は、本発明のグリカン中の糖ユニットのヒドロキシ（−ＯＨ）、カルボン酸（−ＣＯＯＨ）及びメチレンヒドロキシ（−ＣＨ２−ＯＨ）置換基由来のどの水素原子とも置き換わることができる。例えば、アミノアセチル（−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ３）は、本発明のグリカン中の糖ユニットのヒドロキシ（−ＯＨ）、カルボン酸（−ＣＯＯＨ）及びメチレンヒドロキシ（−ＣＨ２−ＯＨ）置換基由来のどの水素原子とも置き換わることができる。Ｎ−アセチルノイラミン酸は、本発明のグリカン中の糖ユニットのヒドロキシ（−ＯＨ）、カルボン酸（−ＣＯＯＨ）及びメチレンヒドロキシ（−ＣＨ２−ＯＨ）置換基由来のどの水素原子とも置き換わることができる。シアル酸は、本発明のグリカン中の糖ユニットのヒドロキシ（−ＯＨ）、カルボン酸（−ＣＯＯＨ）及びメチレンヒドロキシ（−ＣＨ２−ＯＨ）置換基由来のどの水素原子とも置き換わることができる。アミノ又は低級アルキルアミノ基は、本発明のグリカン中の糖ユニットのヒドロキシ（−ＯＨ）、カルボン酸（−ＣＯＯＨ）及びメチレンヒドロキシ（−ＣＨ２−ＯＨ）置換基上のどのＯＨ基とも置き換わることができる。サルフェート（−ＳＯ４−）又はホスフェート（−ＰＯ４−）は、本発明のグリカン中の糖ユニットのヒドロキシ（−ＯＨ）、カルボン酸（−ＣＯＯＨ）及びメチレンヒドロキシ（−ＣＨ２−ＯＨ）置換基上のどのＯＨ基とも置き換わることができる。したがって、糖ユニット上に通常存在する置換基の代わりに、又はそれらの他に存在することがある置換基には、Ｎ−アセチル、Ｎ−アセチルノイラミン酸、オキシ（＝Ｏ）、シアル酸、サルフェート（−ＳＯ４−）、ホスフェート（−ＰＯ４−）、低級アルコキシ、低級アルカノイルオキシ、低級アシル、及び／又は低級アルカノイルアミノアルキルが含まれる。
【００８６】
他に記載のない限り、以下の定義を用いる。アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニルなどは、直鎖の基と分岐鎖の基の両方を意味するが、「プロピル」などの個々の基への言及は、直鎖の基のみを包含し、「イソプロピル」などの分岐鎖異性体は具体的に呼ばれる。ハロは、フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨードである。
【００８７】
具体的に、低級アルキルは、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルを指し、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ペンチル、３−ペンチル、又はヘキシルであってよく、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、又はシクロヘキシルであってよく、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルは、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、２−シクロプロピルエチル、２−シクロブチルエチル、２−シクロペンチルエチル、又は２−シクロヘキシルエチルであってよく、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシは、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ｉｓｏ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ペントキシ、３−ペントキシ、又はヘキシルオキシであってよい。
【００８８】
当業者には当然のことながら、１つ又は複数のキラル中心を有する本発明のグリカンは、光学活性体及びラセミ体で存在し、光学活性体及びラセミ体で単離されることがある。一部の化合物は、多形性を示すことがある。当然のことながら、本発明は、本発明のグリカンのいかなるラセミ体、光学活性体、多形体、若しくは立体異性体、又はそれらの混合物も包含し、光学活性体を調製する方法（例えば、再結晶技法によるラセミ体の分割により、光学活性な出発材料からの合成により、キラル合成により、又はキラルな固定相を用いるクロマトグラフ分離により）は、当技術分野においてよく知られている。
【００８９】
置換基及び範囲について以下に列挙する具体的且つ好ましい値は、例に過ぎず、それらは、他の定義されている値又は定義されている範囲内若しくは置換についての他の値を除外するものではない。
【００９０】
本発明のライブラリーが特に有用であるのは、多様なグリカン構造を作製するのが困難であり、単一グリカンタイプの実質的に純粋な溶液を作製することが難しいからである。例えば、糖ユニットは、通常、いくつかのヒドロキシル（−ＯＨ）基を有するグリカン中に存在し、それらのヒドロキシル基の各々は、実質的に等しい化学反応性であるため、単一の選択されたヒドロキシル基の操作は困難である。１つのヒドロキシル基をブロックすること及び１つのヒドロキシル基を遊離させることは容易でなく、望ましい位置選択性及び立体選択性を得るための注意深く設計された一連の反応を必要とする。さらに、必要とされる操作数は、オリゴ糖の大きさとともに増加する。したがって、二糖の合成は、５〜１２工程を必要とすることがあるが、典型的な四糖の合成には４０もの化学的工程が関与することがある。したがって、以前は、オリゴ糖の化学合成は、精製の問題、低い収率及び高いコストを伴っていた。しかしながら、本発明は、多数の構造的に異なるグリカンのライブラリー及びアレイを提供することにより、これらの問題を解決した。
【００９１】
本発明のグリカンは、様々な手順によって得られている。例えば、ガラクトースの誘導体とＮ−アセチルグルコサミンの間のグリコシル化によりＮ−アセチルラクトサミンを調製するために開発された化学的アプローチの一部は、Aly, M. R. E.; Ibrahim, E. -S. I.; El-Ashry, E.-S. H. E. and Schmidt, R. R., Carbohydr. Res. 1999, 316, 121-132；Ding, Y.; Fukuda, M. and Hindsgaul, O., Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998, 8, 1903-1908；Kretzschmar, G. and Stahl, W., Tetrahedr. 1998, 54, 6341-6358に記載されている。これらの手順を用い、本発明のライブラリーのグリカンを製造することができるが、そのような化学合成に関わる複数の退屈な保護／脱保護工程があるため、これらの方法で得られる生成物の量は低く、例えば、ミリグラム量ということがある。
【００９２】
グリカン合成中に通常必要とされる保護−脱保護工程を回避する１つの方法は、単糖間のカップリング反応のために、グリコシルトランスフェラーゼと呼ばれる位置選択的且つ立体選択的酵素を用いることにより、オリゴ糖を合成する自然の方法を模倣することである。これらの酵素は、グリコシル供与体（通常、糖ヌクレオチド）からグリコシル受容体への単糖の移動を高い効率で触媒する。大部分の酵素は、水溶液（ｐＨ６〜８）中室温で働き、多段階反応をワンポットでいくつかの酵素を組み合わせることを可能にしている。高い位置選択性、立体選択性及び触媒効率は、オリゴ糖及び複合糖質の実用的合成にとって酵素を特に有用たらしめている。Koeller, K. M. and Wong, C.-H., Nature 2001, 409, 232-240；Wymer, N. and Toone, E. J., Curr. Opin. Chem. Biol. 2000, 4, 110-119；Gijsen, H. J. M.; Qiao, L.; Fitz, W. and Wong, C.-H., Chem. Rev. 1996, 96, 443-473を参照されたい。
【００９３】
哺乳類源及び細菌などの非哺乳類源からのグリコシルトランスフェラーゼの単離及びクローニングにおける最近の進歩は、様々なオリゴ糖の製造を容易にしている。DeAngelis, P. L., Glycobiol. 2002, 12, 9R-16R；Endo, T. and Koizumi, S., Curr. Opin. Struct. Biol. 2000, 10, 536-541；Johonson, K. F., Glycoconj. J. 1999, 16, 141-146。一般に、細菌のグリコシルトランスフェラーゼは、哺乳類のグリコシルトランスフェラーゼに比べ、供与体及び受容体特異性に関してより緩やかである。さらに、細菌の酵素は、酵素の過剰発現のために容易にスケールアップすることができる大腸菌（E. coli）などの細菌発現系で十分に発現される。細菌発現系は、哺乳類酵素の正確な折り畳み及び活性に必要とされる翻訳後修飾機構を欠くが、細菌源からの酵素は、この系に適合する。したがって、多くの実施形態において、哺乳類源からの酵素でなく、細菌酵素を、グリカンを作製するための合成ツールとして使用する。
【００９４】
例えば、反復Ｇａｌβ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ−ユニットは、β４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（β４ＧａｌＴ）とβ３−Ｎ−アセチルラクトサミニルトランスフェラーゼ（β３ＧｌｃＮＡｃＴ）の協奏作用により酵素的に合成することができる。Fukuda, M., Biochim. Biophys. Acta. 1984, 780: 2, 119-150；Van den Eijnden, D. H.; Koenderman, A. H. L. and Schiphorst, W. E. C. M., J. Biol. Chem. 1988, 263, 12461-12471。発明者は、以前に、細菌の髄膜炎菌（N. meningitidis）酵素β４ＧａｌＴ−ＧａｌＥ及びβ３ＧｌｃＮＡｃＴをクローニングして特徴付け、様々なガラクトシドの調製用合成におけるそれらの有用性を立証している。Blixt, O.; Brown, J.; Schur, M.; Wakarchuk, W. and Paulson, J. C., J. Org. Chem. 2001, 66, 2442-2448；Blixt, O.; van Die, I.,; Norberg, T. and van den Eijnden, D. H., Glycobiol. 1999, 9, 1061-1071。β４ＧａｌＴ−ＧａｌＥは、β４ＧａｌＴ及び安価なＵＤＰ−グルコースをＵＤＰ−ガラクトースへインサイツで変換するためのウリジン−５’−ジホスホ−ガラクトース−４’−エピメラーゼ（ＧａｌＥ）から構築された融合タンパク質であり、コスト効率の高い戦略を提供する。本発明のグリカン、ライブラリー及びアレイを作製するために使用される手順の他の例を実施例に示す。
【００９５】
任意のグリカンを、本発明のリンカー、アレイ及び方法とともに使用することができるが、グリカンの一部の例を表３に示す。省略名並びに完全な名前を示す。
【００９６】
【表３】
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【００９７】
表中で用いられる略語の多くは、本明細書又はウエブサイトｌｅｃｔｉｎｉｔｙ．ｃｏｍで定義されている。ｇｌｙｃｏｍｉｎｄｓ．ｃｏｍのウエブサイトは、直線略語の多くを説明している。特に以下の略語を使用した。
Ｓｐ１＝ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２；
Ｓｐ２＝Ｓｐ３＝ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２；
Ａ＝Ｇａｌ；ＡＮ＝ＧａｌＮＡｃ；Ｇ＝Ｇｌｃ；ＧＮ＝ＧｌｃＮＡｃ；
Ｆ＝フコース；ＮＮ；Ｎｅｕ５Ａｃ（シアル酸）；
ＮＪ＝Ｎｅｕ５Ｇｃ（Ｎ−グリコリルシアル酸）；ａ＝α；ｂ＝β；
Ｓｕ＝スルホ；Ｔ＝Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃ（Ｔ−抗原）；
Ｔｎ＝ＧａｌＮＡｃ（Ｔｎ−抗原）；ＫＤＮ＝５−ＯＨ−Ｓｉａ
【００９８】
本発明のグリカンは、それらに結合しているリンカー、標識、連結部分及び／又は他の部分を有することができる。これらのリンカー、標識、連結部分及び／又は他の部分を用い、グリカンを固体支持体に結合し、アッセイにおいて特定のグリカンを検出し、グリカンを精製するか、さもなければ操作することができる。例えば、本発明のグリカンは、結合しているアルキルアミン基、アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質によって提供されるアミン部分を有することができる。一部の実施形態において、グリカンは、連結部分（アミン）として有用でありスペーサー又はリンカーとして働く−ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２（Ｓｐ１と呼ばれる）又は−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２（Ｓｐ２又はＳｐ３と呼ばれる）などのアルキルアミン部分を有する。
【００９９】
アレイ
様々なグリカンの独特なライブラリーは、任意の利用可能な手順によりアレイ表面の固体支持体上の確定された領域に結合される。一般に、アレイは、グリカン分子のライブラリーを入手し、ライブラリー中のグリカンに連結部分を結合し、ライブラリーのグリカン上に存在する特定の連結部分と反応するように誘導体化された表面を有する固体支持体を入手し、連結部分と固体支持体の誘導体化された表面との間に共有結合を形成することによりグリカン分子を固体支持体に結合することにより製造される。
【０１００】
誘導体化試薬は、例えば、（ポリ）トリフルオロクロロエチレン表面を有する基板を用いるか、より好ましくはシロキサン結合により（例えば、固体基板のようなガラス又は酸化ケイ素を用い）、炭素−炭素結合を介して固体基板に結合することができる。一実施形態において、基板の表面とのシロキサン結合は、トリクロロシリル又はトリアルコキシシリル基を有する誘導体化試薬の反応を介して形成される。
【０１０１】
例えば、一級アミノ基を含むように修飾されたグリカンライブラリーを用いることができる。例えば、本発明のグリカンは、結合しているアルキルアミン基、アミノ酸、ペプチド、又はタンパク質によって提供されるアミノ部分を有することができる。一部の実施形態において、グリカンは、一級アミノ基を提供する結合している−ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２（Ｓｐ１と呼ばれる）又はＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２（Ｓｐ２又はＳｐ３と呼ばれる）などのアルキルアミン部分を有することができる。グリカン上の一級アミノ基は、固体支持体上のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で誘導体化された表面と反応することができる。そのようなＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で誘導体化された固体支持体は、市販されている。例えば、ＮＨＳで活性化されたスライドガラスは、Accelr8 Technology Corporation, Denver, COから入手できる。すべての望ましいグリカンの結合後、スライドを、エタノールアミン緩衝液とともにさらにインキュベートし、固体支持体上の残りのＮＨＳ官能基を非活性化することができる。このアレイは、それ以上表面を修飾せずに使用することができる。通常、非特異的結合を防ぐためのブロッキング手順は一切必要とされない。図１は、グリカン分子のアレイを製造するためのそのような方法の概念図を示している。
【０１０２】
各タイプのグリカンは、画定されたグリカンプローブ位置において固体支持体上に接触又はプリントされる。様々なグリカンを画定されたグリカンプローブ位置に塗布するため、マイクロアレイ遺伝子プリンターを使用することができる。例えば、画定されたグリカンプローブ位置当たりグリカン溶液約０．１ｎＬ〜約１０ｎＬ、又は約０．５ｎＬを塗布することができる。様々な濃度のグリカン溶液を、固体支持体上に接触又はプリントすることができる。例えば、グリカン約０．１〜約１０００μＭ又はグリカン約１．０〜約５００μＭ又はグリカン約１０〜約１００μＭのグリカン溶液を用いることができる。一般に、いくつか（例えば、３〜６個）の画定されたグリカンプローブ位置の複製に各濃度を塗布することが望ましい。そのような複製は、グリカンと試験分子の間の結合反応が本当の結合相互作用であるか否かを確認する内部対照を提供する。
【０１０３】
分析法
別の実施形態において、本発明は、試験サンプルがグリカンと結合することができるか否かを同定するために試験サンプルをスクリーニングするための方法を提供する。他の実施形態において、本発明は、どのグリカンが試験サンプル又は試験分子と結合することができるかを同定するための方法を提供する。本発明の切断可能なリンカーは、そのようなスクリーニング手順及び構造解析手順に特に適している。
【０１０４】
グリカンと結合する疑いのある分子を含有するいかなるサンプルも試験することができる。したがって、抗体、細菌タンパク質、細胞受容体、細胞型特異的抗原、酵素、核酸、ウイルスタンパク質などを、グリカンとの結合について試験することができる。さらに、これらの分子又は物質が結合するグリカンの具体的グリカンの構造的特徴又はタイプを同定することができる。
【０１０５】
試験される核酸には、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びリボソームＲＮＡ並びに任意の種由来の構造ＲＮＡが含まれる。
【０１０６】
本発明の方法によって同定されるグリカンは、抗原、ワクチン、酵素阻害剤、受容体のリガンド、受容体の阻害剤、及びそれらが結合する分子のマーカーとしてが含まれる多数の目的にとっての有用性を有することができる。
【０１０７】
本明細書で説明するように、ウイルス、動物及びヒトレクチン並びにモノクローナル抗体調製物を、グリカンとの結合について試験することに成功し、レクチン又は抗体が結合する特定のグリカンを同定した。
【０１０８】
結合の検出は、直接的、例えば、試験分子に直接結合している標識の検出によるものであってよい。或いは、検出は、間接的、例えば、試験分子と結合することができる標識二次抗体又は他の標識分子を検出することによるものであってよい。結合している標識は、どのような利用可能な検出法を用いても観察することができる。例えば、アレイスキャナーを用い、アレイと結合している蛍光標識された分子を検出することができる。本明細書で説明されている実験では、Scan Array 5000（GSI Lumonics、Watertown、ＭＡ）共焦点スキャナーを使用した。そのようなアレイスキャナーからのデータは、当技術分野において利用できる方法により、例えば、ＩｍａＧｅｎｅ画像解析ソフトウェア（BioDiscovery Inc.、El Segundo、ＣＡ）を用いることにより解析することができる。
【０１０９】
本発明により同定された有用なグリカン
本発明は、本発明の切断可能なリンカー、アレイ及び方法の使用によって同定されたグリカンも企図している。これらのグリカンには、抗体によって認識される抗原性グリカンが含まれる。例えば、感染因子及び癌細胞上のグリカンエピトープを認識する多くの中和抗体は、それらの感染因子及び癌細胞の感染性及び／又は病原性を中和することができる。本発明のアレイ及び方法を用い、そのようなグリカンエピトープの構造を正確に規定することができる。既知の有益な特性を有する中和抗体と結合するため、これらのグリカンエピトープは、動物において免疫原としての役割を果たし、感染症及び癌が含まれる疾患を治療及び予防するのに有用な免疫原性組成物に製剤化することができる。
【０１１０】
また、本発明の有用なグリカンには、抗体、受容体、又は生体分子の複合体中の１つの生体分子との結合をブロックするのに有用な非抗原性グリカンが含まれる。
【０１１１】
例えば、細胞表面スフィンゴ糖脂質Ｇｌｏｂｏ  Ｈは、一連の癌細胞系で高度に発現される抗原性炭水化物のファミリーのメンバーである。Kannagi et al.(1983) J. Biol. Chem. 258, 8934-8942；Zhang et al. (1997) Chem. Biol. 4, 97-104；Dube, D. H. & Bertozzi, C. R. (2005) Nature Rev. Drug Discov. 4, 477-488。Ｇｌｏｂｏ  Ｈエピトープは、モノクローナル抗体ＭＢｒ１の標的にされる。Menard, et al. (1983) Cancer Res. 43, 1295-1300；Canevari, et al. (1983) Cancer Res. 43, 1301-1305；Bremer, et al (1984) J. Biol. Chem. 259, 4773-4777。ＭＢｒ１抗体との結合を担うエピトープは、本発明の切断可能なアレイ及び方法を用いて同定され且つ特徴付けられている。最大の親和性でモノクローナル抗体ＭＢｒ１と結合することが分かったＧｌｏｂｏ  Ｈ抗原構造は、グリカン２０３ａ、２０３ｂ、２０４ａ及び２０４ｂであった。したがって、以下のグリカンのうちのいずれか１つ、又はそれらの組合せは、本発明の有用なグリカンであり、
【０１１２】
【化１３】
2008504531.tif 000024
【０１１３】
式中、Ｒ１は、水素、グリカン又はリンカーである。一部の実施形態において、リンカーは、固体支持体であるか、或いは固体支持体に結合しうる。
【０１１４】
本発明の有用なグリカンの別の例は、抗ＨＩＶ  ２Ｇ１２抗体と結合することができるマンノース含有グリカンである。本発明によれば、そのようなマンノース含有グリカンには、グリカンの第一（α１−３）腕上又はグリカンの（α１−６）第三腕上のＭａｎα１−２Ｍａｎ、又はそれらの組合せが含まれる。一部の実施形態において、マンノース含有グリカンは、（α１−３）鎖由来の第二腕を有さないことがある。他の実施形態において、マンノース含有グリカンは、（α１−３）鎖由来の第二腕を有することがある。一部の実施形態において、マンノース含有グリカンは、以下のオリゴマンノースグリカンのうちのいずれか１つ、又はそれらの組合せを有する。
【０１１５】
【化１４】
2008504531.tif 000025
【０１１６】
疾患を治療する方法
また、本発明は、疾患を治療及び予防するための免疫源として使用することができるグリカン組成物を提供する。即ち、例えば、本発明の組成物を用い、癌、細菌感染、ウイルス感染、炎症、移植拒絶、自己免疫疾患などの疾患を治療することができる。一部の実施形態において、本発明の組成物に含めるために選択されるグリカンは、抗原性であり、細菌種、ウイルス種、癌細胞タイプなどに対する免疫応答を引き起こすことができる。他の実施形態において、本発明の組成物に含めるために選択されるグリカンは、通常、抗原性である。しかしながら、一部の実施形態において、グリカンは、疾患の予後の一因となる抗体、受容体などと結合するか、或いはそれらの上の結合部位に対して競合することがある。したがって、例えば、非抗原性グリカンを投与し、ウイルスによる結合を妨げることができる。
【０１１７】
そのような組成物には、通常は疾患、感染又は免疫状態に伴う循環抗体により認識される１つ又は複数のグリカンが含まれる。例えば、乳癌を治療又は予防するため、通常は転移性乳癌のある被験体の循環抗体により認識されるグリカンを含有する組成物が調製される。したがって、乳癌を治療及び予防するための組成物に含めることができるグリカンの例には、本発明の切断可能なリンカー、アレイ及び方法によって同定される有用なグリカンが含まれる。
【０１１８】
一部の実施形態において、グリカンのタイプ及び量は、被験体における抗癌細胞免疫応答を引き起こすのに有効である。他の実施形態において、グリカンのタイプ及び量は、被験体における抗ウイルス免疫応答を引き起こすのに有効である。
【０１１９】
本発明の組成物は、被験体中、罹患器官中又は全身的に直接投与するか、或いは被験体又は続いて被験体に投与される細胞系に由来する細胞にエキソビボで投与するか、或いは被験体に由来する免疫細胞から亜集団を選択するためにインビトロで使用し、次いで、被験体に再投与することができる。この組成物は、アジュバント又はインターロイキン−２などの免疫刺激サイトカインと一緒に投与することができる。免疫刺激アジュバントの一例は、デトックスである。また、グリカンを、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）又はマンナンなどの適当な担体とコンジュゲートさせることができる（ＷＯ９５／１８１４５及びLongenecker et al (1993) Ann. NY Acad. Sci. 690, 276-291を参照）。グリカンは、被験体に、経口投与、筋肉内投与又は皮内投与又は皮下投与することができる。
【０１２０】
一部の実施形態において、本発明の組成物は、体液性応答を生み出す方法で投与される。したがって、１つ又は複数のグリカンを被験体とする抗体の産生は、免疫応答を得るのに成功したか否かの一尺度である。
【０１２１】
他の実施形態において、本発明の組成物は、細胞性免疫応答を生み出し、ＮＫ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による腫瘍細胞殺滅をもたらす方法で投与される。Ｔヘルパー細胞を活性化する投与の戦略は、特に有用である。上記に記載したように、体液性応答を刺激することも有用かもしれない。そのような応答を促進するため、特定のサイトカイン、例えば、インターロイキン−２、インターロイキン−１２、インターロイキン−６、又はインターロイキン−１０を同時投与することが有用かもしれない。
【０１２２】
免疫組成物を、注射の部位により、送達システムの使用により、又は被験体からのそのような細胞集団の選択的精製及びそのような抗原提示細胞への１つ又は複数のグリカンのエキソビボ投与により、特定の細胞集団、例えば、抗原提示細胞の標的とすることも有用かもしれない。例えば、樹状細胞を、Zhou et al (1995) Blood 86, 3295-3301；Roth et al (1996) Scand. J. Immunology 43, 646-651に記載されているように選別することができる。
【０１２３】
したがって、本発明の他の態様は、疾患のある被験体の循環抗体と結合している有効量のグリカンを含み疾患に対して有効なワクチンを提供する。
【０１２４】
用量、製剤及び投与経路
本発明の組成物は、疾患を治療又は予防するために投与される。一部の実施形態において、本発明の組成物は、組成物中のグリカンに対して免疫応答が得られるように投与される。一部の実施形態において、本発明の組成物は、癌、細菌感染、ウイルス感染、炎症、移植拒絶、自己免疫疾患などの疾患に伴う少なくとも１つの症状の軽減が得られるように投与される。
【０１２５】
望ましい１つ又は複数の効果を得るため、グリカン又はその組合せは、例えば、体重１ｋｇ当たり少なくとも約０．０１ｍｇから約５００〜７５０ｍｇ、少なくとも約０．０１ｍｇから約３００〜５００ｍｇ、少なくとも約０．１ｍｇから約１００〜３００ｍｇ又は少なくとも約１ｍｇから約５０〜１００ｍｇの単一用量又は分割用量として投与することができるが、他の用量も、有益な結果を提供することがある。投与される量は、どのタイプのグリカンが投与されるか、投与経路、疾患の進行若しくは疾患の進行の欠如、患者の体重、身体的状態、健康、年齢、予防又は治療を行うべきか否か、及びグリカンが化学的に修飾されるかどうかが含まれるがこれらに限定されない様々な要因に応じて変わるはずである。そのような要因は、当技術分野において利用できる動物モデル又は他の試験系を用いる臨床家によって容易に判定することができる。
【０１２６】
本発明による治療薬（グリカン）の投与は、例えば、レシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療的か予防的か、及び当業者に知られている他の要因に応じて、単回投与、複数回投与で、連続的又は間欠的であってよい。グリカン又はそれらの組合せの投与は、予め選択された期間にわたって本質的に連続的であるか、或いは一連の間隔をおいた投与であってよい。局所投与と全身投与は共に企図されている。
【０１２７】
組成物を調製するため、グリカンを合成するか、さもなければ購入し、必要に応じて、又は所望のように精製する。次いで、これらの治療薬を、凍結乾燥又は安定化することができ、それらの濃度を適切な量に調整することができ、治療薬を、場合により他の作用物質と混ぜ合わせることができる。単位投与量中に含まれる所与のグリカン、結合性物質、抗体又はそれらの組合せの絶対重量は、広範囲にわたって変わることがある。例えば、少なくとも１種のグリカン、結合性物質、又は特定のグリカンに特異的な抗体約０．０１ｇ〜約２ｇ、又は約０．１〜約５００ｍｇを投与することができる。或いは、単位用量は、約０．０１ｇから約５０ｇまで、約０．０１ｇから約３５ｇまで、約０．１ｇから約２５ｇまで、約０．５ｇから約１２ｇまで、約０．５ｇから約８ｇまで、約０．５ｇから約４ｇまで、又は約０．５ｇから約２ｇまで変わることがある。
【０１２８】
１つ又は複数のグリカン、結合性物質、抗体又はそれらの組合せの１日投与量は同様に変わることがある。そのような１日投与量は、例えば約０．１ｇ／日から約５０ｇ／日まで、約０．１ｇ／日から約２５ｇ／日まで、約０．１ｇ／日から約１２ｇ／日まで、約０．５ｇ／日から約８ｇ／日まで、約０．５ｇ／日から約４ｇ／日まで、及び約０．５ｇ／日から約２ｇ／日まで変動することがある。
【０１２９】
したがって、本発明の治療薬を含む１つ又は複数の適当な単位剤形は、経口、非経口（皮下、静脈内、筋肉内及び腹腔内が含まれる）、直腸、皮膚、経皮、胸腔内、肺内及び鼻腔内（呼吸器）経路が含まれる様々な経路により投与することができる。また、治療薬は、持続放出のために製剤化することができる（例えば、マイクロカプセル化を用い、ＷＯ９４／０７５２９、及び米国特許第４，９６２，０９１号を参照）。適切な場合、製剤は、別々の単位剤形として好都合に提供され、製薬技術でよく知られているどのような方法によっても調製することができる。そのような方法には、治療薬を、液体担体、固体マトリクス、半固体担体、微粉化した固体担体又はそれらの組合せと混ぜ、次いで、必要ならば、生成物を望ましい送達システムに導入又は成形する工程が含まれる。
【０１３０】
本発明の治療薬が経口投与のために調製される場合、それらは、通常、薬学的に許容できる担体、希釈剤又は賦形剤と混ぜ合わされ、医薬製剤、又は単位剤形を形成する。経口投与の場合、治療剤は、粉末、顆粒製剤、溶液、懸濁液、エマルジョンとして存在するか、或いはチューインガムからの活性成分の摂取のために天然又は合成のポリマー又は樹脂中に存在することがある。また、治療薬は、ボーラス、砥剤又はペーストとして提供することができる。経口投与される本発明の治療薬も、持続放出のために製剤化することができる。例えば、治療薬を、コーティングし、マイクロカプセル化するか、さもなければ持続性送達装置内に置くことができる。そのような製剤中の全活性成分は、製剤の０．１〜９９．９重量％を占める。
【０１３１】
「薬学的に許容できる」は、製剤の他の成分と適合し、そのレシピエントに対して有害でない担体、希釈剤、賦形剤、及び／又は塩を意味する。
【０１３２】
本発明の治療薬を含有する医薬製剤は、よく知られ且つ容易に入手できる成分を用い、当技術分野において知られている手順により調製することができる。例えば、治療薬を、一般的な賦形剤、希釈剤、又は担体と一緒に製剤化し、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、散剤、エアゾール剤などを形成することができる。そのような製剤に適している賦形剤、希釈剤、及び担体の例には、緩衝液、並びにデンプン、セルロース、糖、マンニトール、及びケイ酸誘導体などの充填剤及び増量剤が含まれる。また、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及び他のセルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン、並びにポリビニル−ピロリドンなどの結合剤が含まれていてもよい。グリセロールなどの加湿剤、炭酸カルシウム及び重炭酸ナトリウムなどの崩壊剤が含まれていてもよい。また、パラフィンなどの溶解を遅延させるための物質が含まれていてもよい。また、四級アンモニウム化合物などの吸収加速剤が含まれていてもよい。セチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロールなどの界面活性剤が含まれていてもよい。カオリン及びベントナイトなどの吸着性担体が添加されていることができる。また、タルク、ステアリン酸カルシウム及びマグネシウム、並びに固形ポリエチレングリコールなどの滑沢剤が含まれていてもよい。また、保存剤が添加されていることができる。また、本発明の組成物は、セルロース及び／又はセルロース誘導体などの粘稠剤を含有することができる。また、本発明の組成物は、キサンタン、グアー若しくは炭素ゴム又はアラビアゴムなどのゴム、或いは、ポリエチレングリコール、ベントン及びモンモリロナイトなどを含有することができる。
【０１３３】
例えば、本発明の治療薬を含有する錠剤又はカプレット剤には、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム及び炭酸マグネシウムなどの緩衝剤が含まれてよい。また、カプレット剤及び錠剤には、セルロース、アルファ化デンプン、二酸化ケイ素、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、微結晶性セルロース、デンプン、タルク、二酸化チタン、安息香酸、クエン酸、コーンスターチ、鉱油、ポリプロピレングリコール、リン酸ナトリウム、ステアリン酸亜鉛などの不活性成分が含まれてよい。本発明の少なくとも１つの治療薬を含有する硬質又は軟質ゼラチンカプセル剤は、ゼラチン、微結晶性セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、タルク、及び二酸化チタンなど、並びにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び植物油などの液体ビヒクルなどの不活性成分を含有することができる。さらに、本発明の治療薬のうちの１つ又は複数を含有する腸溶コーティングのカプレット剤又は錠剤は、胃における崩壊に抵抗し、より中性の十二指腸のアルカリ環境に溶解するように設計される。
【０１３４】
また、本発明の治療薬は、好都合な経口投与のためのエリキシル剤又は液剤として、又は、例えば、筋肉内、皮下、腹腔内又は静脈内経路による非経口投与に適している液剤として製剤化することができる。また、本発明の治療薬の医薬製剤は、水性又は非水性の溶液又は分散液の形態、或いはエマルジョン又は懸濁液又は軟膏の形態をとることができる。
【０１３５】
したがって、治療薬を、非経口投与（例えば、注射、例えば、ボーラス注射又は連続注入による）のために製剤化し、アンプル、プレフィルドシリンジ、小容量注入容器又はマルチドーズ容器中の単位剤形として提供することができる。上記に述べたように、保存剤を加え、剤形の有効期間を維持するのを助けることができる。活性物質及び他の成分は、油状又は水性ビヒクル中で懸濁剤、液剤又は乳剤を形成し、懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤などの製剤物質を含有することができる。或いは、治療薬及び他の成分は、使用前の適当なビヒクル、例えば、滅菌したパイロジェンフリーの水による構成のために、滅菌した固体の無菌分離又は溶液からの凍結乾燥により得られる粉末形態であってよい。
【０１３６】
これらの製剤は、当技術分野においてよく知られている薬学的に許容できる担体、ビヒクル及び補助剤を含有することができる。例えば、水の他に、アセトン、エタノール、イソプロピルアルコール、「Dowanol」という名で販売されている製品などのグリコールエーテル、ポリグリコール及びポリエチレングリコール、短鎖酸のＣ１−Ｃ４アルキルエステル、乳酸エチル若しくは乳酸イソプロピル、「Miglyol」という名で販売されている製品などの脂肪酸トリグリセリド、ミリスチン酸イソプロピル、動物油、鉱油及び植物油並びにポリシロキサンなどの溶媒から選択され、生理学的視点から許容できる１種又は複数の溶媒を用いて液剤を調製することが可能である。
【０１３７】
必要ならば、抗酸化剤、界面活性剤、他の保存剤、被膜形成剤、角質溶解剤又は面皰溶解剤、香料、矯味剤及び着色剤から選択される補助剤を添加することが可能である。ｔ−ブチルヒドロキノン、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン及びα−トコフェロール及びその誘導体などの抗酸化剤を添加することができる。
【０１３８】
さらに、治療薬は、持続放出剤形などのような製剤に適している。製剤は、例えば、血管系又は気道の特定の部分において、おそらく一定期間にわたって活性物質を放出するように構築することができる。コーティング、外皮、及び保護用マトリクスは、例えば、ポリラクチド−グリコール酸塩、リポソーム、マイクロエマルジョン、微小粒子、ナノ粒子、又はワックスなどのポリマー物質から製造することができる。これらのコーティング、外皮、及び保護用マトリクスは、留置装置、例えば、ステント、カテーテル、腹膜透析管、排液装置などをコーティングするのに有用である。
【０１３９】
局所投与の場合、治療薬を、当技術分野において知られているように、標的領域への直接塗布のために製剤化することができる。主に局所塗布のために調整される形態は、例えば、クリーム剤、ミルク剤、ゲル剤、分散液若しくはマイクロエマルジョン剤、多かれ少なかれ濃縮されたローション剤、含浸パッド剤、軟膏剤若しくはスティック剤、エアゾール製剤（例えば、スプレー剤又はフォーム剤）、石鹸、洗浄剤、ローション剤又は数個の石鹸の形態をとる。この目的のための他の従来の形態には、創傷包帯、コーティングされた絆創膏若しくは他のポリマー被覆剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、パスタ剤、ゼリー剤、スプレー剤及びエアゾール剤が含まれる。したがって、本発明の治療薬を、皮膚投与のためのパッチ又は絆創膏を介して送達することができる。或いは、治療薬を、ポリアクリレート又はアクリレート／酢酸ビニルコポリマーなどの粘着性ポリマーの一部として製剤化することができる。長期塗布の場合、皮膚の水和又は浸軟を最小限に抑えることができるように、微小孔性の且つ／又は通気性の良いバッキングラミネートを使用することが望ましいことがある。バッキング層は、望ましい保護及び支持機能を提供するいかなる適当な厚さであってもよい。通常、適当な厚さは、約１０〜約２００ミクロンであろう。
【０１４０】
軟膏剤及びクリーム剤は、例えば、適当な粘稠剤及び／又はゲル化剤を添加して水性又は油性基剤により製剤化することができる。ローション剤は、水性又は油性基剤により製剤化することができ、一般に、１種又は複数の乳化剤、安定剤、分散剤、懸濁化剤、粘稠剤、又は着色剤を含有する。活性成分は、例えば、米国特許第４，１４０，１２２号、第４，３８３，５２９号、又は第４，０５１，８４２号に開示されているように、イオントフォレーシスを介して送達することができる。局所製剤中に存在する本発明の治療薬の重量パーセントは、様々な要因によって異なるが、通常は、製剤の総重量の０．０１％〜９５％、通常は０．１〜８５重量％である。
【０１４１】
点眼剤又は点鼻剤などの点滴剤は、１種又は複数の分散剤、可溶化剤又は懸濁化剤も含む水性又は非水性基剤中で１つ又は複数の治療薬により製剤化することができる。液状スプレー剤は、加圧パックから送達されるのが好都合である。点滴剤は、簡単なフタ付き点眼瓶を介して、又は液状内容物を１滴ずつ送達するようになされたプラスチック瓶を介して、特別に成形された閉口を介して送達することができる。
【０１４２】
さらに、治療薬を、口又は咽頭における局所投与のために製剤化することができる。例えば、活性成分を、味を付けた基剤、通常はスクロース及びアカシア又はトラガカントをさらに含むロゼンジ剤；ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシアなどの不活性基剤中に組成物を含む香錠；及び適当な液状担体中に本発明の組成物を含む含漱剤として製剤化することができる。
【０１４３】
本発明の医薬製剤には、任意選択の成分として、薬学的に許容できる担体、希釈剤、可溶化剤又は乳化剤、及び当技術分野において利用できるタイプの塩が含まれてよい。そのような物質の例には、生理学的に緩衝された食塩溶液などの普通の食塩溶液及び水が含まれる。本発明の医薬製剤において有用な担体及び／又は希釈剤の具体的な非限定的例には、水及びリン酸塩緩衝食塩溶液ｐＨ７．０〜８．０などの生理学的に許容できる緩衝食塩溶液が含まれる。
【０１４４】
本発明の活性成分は、気道へも投与することができる。したがって、本発明は、本発明の方法において使用するためのエアゾール医薬製剤及び剤形を提供する。
【０１４５】
一般に、そのような剤形は、疾患の臨床症状を治療又は予防するのに有効な量の本発明の物質のうちの少なくとも１つを含む。本発明により企図されている疾患には、例えば、癌、細菌感染、ウイルス感染、炎症、移植拒絶、自己免疫疾患などが含まれる。疾患の１つ又は複数の症状のいかなる統計的に有意な減弱も、疾患の治療であると見なされる。
【０１４６】
或いは、吸入又は吹送による投与の場合、組成物は、乾燥粉末、例えば、治療薬とラクトース又はデンプンなどの適当な粉末基剤との粉末ミックスの形態をとることができる。粉末組成物は、例えば、カプセル剤若しくはカートリッジ剤、又は、例えば、吸入器、インサフレーター、又は定量吸入器を用いて粉末を投与することができるゼラチンパック剤若しくはブリスターパック剤中の単位剤形として提供することができる（例えば、Newman, S. P. （Aerosols and the Lung, Clarke, S. W. and Davia, D. eds., pp. 197-224, Butterworths, London, England, 1984）に開示されている加圧定量吸入器（ＭＤＩ）及び乾燥粉末吸入器を参照）。
【０１４７】
また、本発明の治療薬は、エアゾール又は吸入形態で投与される場合、水溶液で投与することができる。したがって、他のエアゾール医薬製剤は、例えば、治療される適応症又は疾患に特異的な本発明の治療薬のうちの１種又は複数約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌを含有する生理学的に許容できる緩衝食塩溶液を含むことができる。液体に溶解も懸濁もしない微粉化した固体治療薬の形態の乾燥エアゾールも、本発明の実施において有用である。本発明の治療薬は、散布剤として製剤化することができ、約１〜５μｍ、或いは２〜３μｍの平均粒径を有する微粉化した粒子を含むことができる。微粉化した粒子は、当技術分野においてよく知られている技法を用いる粉砕及びスクリーン濾過により調製することができる。粒子は、粉末の形態であってよい所定量の微粉化した材料を吸入することにより投与することができる。当然のことながら、複数の用量単位の投与によって必要な有効量に到達することができるため、各剤形の個々のエアゾール投与量に含まれる活性な１種又は複数の成分の単位内容量は、それ自体で、特定の免疫応答、血管系の状態又は疾患を治療するのに有効な量を構成している必要はない。さらに、有効量は、個々に、又は一連の投与で、剤形中の投与量未満を用いて達成することができる。
【０１４８】
吸入による上（鼻）気道又は下気道への投与の場合、本発明の治療薬は、ネブライザー又は加圧パック又はエアゾールスプレーを送達する他の好都合な手段から好都合に送達される。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適当なガスなどの適当な噴射剤を含むことができる。加圧エアゾールの場合、用量単位は、一定量を送達するためのバルブを提供することにより決定される。ネブライザーには、米国特許第４，６２４，２５１号、第３，７０３，１７３号、第３，５６１，４４４号、及び第４，６３５，６２７号に記載されているネブライザーが含まれるが、これらに限定されるものではない。本明細書に開示されているタイプのエアゾール送達システムは、Fisons Corporation（Bedford、Ｍａｓｓ．）、Schering Corp.（Kenilworth、ＮＪ）及びAmerican Pharmoseal Co.（Valencia、ＣＡ）が含まれる多くの商業ソースから入手できる。鼻腔内投与の場合、治療薬を、点鼻剤、液状スプレーを介し、プラスチック瓶アトマイザー又は定量吸入器を介して投与することができる。典型的なアトマイザーは、Mistometer（Wintrop社製）及びMedihaler（Riker社製）である。
【０１４９】
さらに、活性成分を、記載されている状態であれ他の状態であれ、他の治療薬、例えば、鎮痛剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗癌剤などと組み合わせて使用することができる。
【０１５０】
キット
さらに、本発明は、疾患を検出、管理、予防又は治療するためのキット又は他の容器などのパッケージ化された医薬組成物に関する。本発明のキットは、癌、細菌感染、ウイルス感染、炎症、移植拒絶、自己免疫疾患などの疾患を検出、管理、予防又は治療するために設計することができる。一実施形態において、キット又は容器は、疾患を検出するためのグリカンのアレイ又はライブラリー及び疾患を検出するためのグリカンのアレイ又はライブラリーを使用するための説明書を有する。アレイには、疾患のある人の血清サンプル中に存在する抗体が結合する少なくとも１つのグリカンが含まれる。アレイには、本発明の切断可能なリンカーが含まれてよい。
【０１５１】
別の実施形態において、キット又は容器は、疾患を治療、予防又は管理するための治療有効量の医薬組成物及び疾患を管理するための医薬組成物を使用するための説明書を有する。医薬組成物には、疾患が管理、予防又は治療されるように、本発明のグリカンのうちの少なくとも１つが治療有効量で含まれる。
【０１５２】
また、本発明のキットは、本発明の組成物を投与するのに有用なツールを有する容器を含むことができる。そのようなツールには、注射器、綿棒、カテーテル、無菌溶液などが含まれる。
【０１５３】
以下の実施例は、本発明の特定の態様を説明するためであって、本発明を限定することを意図していない。
【実施例１】
【０１５４】
グリカンの酵素合成
発明者は、以前に、細菌の髄膜炎菌（N. meningitidis）酵素β４ＧａｌＴ−ＧａｌＥ及びβ３ＧｌｃＮＡｃＴをクローニングして特徴付けた。Blixt, O.; Brown, J.; Schur, M.; Wakarchuk, W. and Paulson, J. C., J. Org. Chem. 2001, 66, 2442-2448；Blixt, O.; van Die, I.,; Norberg, T. and van den Eijnden, D. H., Glycobiol. 1999, 9, 1061-1071。β４ＧａｌＴ−ＧａｌＥは、β４ＧａｌＴ及び安価なＵＤＰ−グルコースをＵＤＰ−ガラクトースへインサイツで変換するためのウリジン−５’−ジホスホ−ガラクトース−４’−エピメラーゼ（ＧａｌＥ）から構築された融合タンパク質であり、コスト効率の高い戦略を提供する。
【０１５５】
両酵素、β４ＧａｌＴ−ＧａｌＥ及びβ３ＧｌｃＮＡｃＴは、大規模発酵槽（１００Ｌ）中、大腸菌（E. coli）ＡＤ２０２において過剰発現させた。細菌を、２ＹＴ培地中で培養し、ｉｓｏ−プロピル−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導すると、最終的に、細胞培地１Ｌ当たり８〜１０ｇの細菌細胞ペーストを生産した。次いで、酵素を、ミクロフルイダイザーにより細胞から放出させ、塩化マンガン（１０ｍＭ）及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ（０．２５％）を含有するトリス緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ７．５）に可溶化させると、それぞれβ４ＧａｌＴ−ＧａｌＥ及びβ３ＧｌｃＮＡｃＴが細胞培養１Ｌ当たり約５０Ｕ及び１１５Ｕの酵素活性に達した。
【０１５６】
β３ＧｌｃＮＡｃＴの特異性研究（表４）は、ラクトース（４）が良い受容体基質であること（１００％）を示したが、この酵素は、Ｎ−アセチルラクトサミン（６）について約７〜８％の活性を示す。これらの二糖の構造を以下に示す。
【０１５７】
【化１５】
2008504531.tif 000026
【０１５８】
受容体の還元末端にアグリコンとして疎水性のパラ−ニトロフェニル環を付加すると、酵素の活性は１０倍まで高まった（４を５と、及び６を７と比較せよ）。受容体糖に疎水性アグリコンを付加することによる酵素活性の増加は、それほどではないにせよ、β４ＧａｌＴについても明らかにされている（１２を１３、１４と比較せよ）。これらの酵素の緩やかな基質特異性は、それらを、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンが含まれる様々な炭水化物構造の調製用の合成にとって極めて有用たらしめている。
【０１５９】
【表４】
2008504531.tif 000027
【０１６０】
ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンは、シアリル化及び／又はフコシル化などの追加修飾のための骨格構造を提供するＮ−アセチルラクトサミン反復からなる独特な炭水化物構造である。これらの延長したオリゴ糖は、セレクチン又はガレクチンに対する特異的リガンドとして相互作用することにより様々な生物学的機能に関与していることが明らかにされている。Ujita, M.; McAuliffe, J.; Hidsgaul, O.; Sasaki, K.; Fukuda, M. N. and Fukuda, M., J. Biol. Chem. 1999, 274, 16717-16726；Appelmelk, B. J.; Shiberu, B,; Trinks, C.; Tapsi, N,; Zheng, P. Y.; Verboom, T.; Maaskant, J.; Hokke, C. H.; Schiphorst, W. E.C. M.; Blanchard, D.; SimoonsSmit, I. M.; vandenEijnden, D. H. and Vandenbroucke Grauls, C. M. J. E., Infect. Immun. 1998, 66, 70-76；Leppaenen, A.; Penttilae, L.; Renkonen, O.; McEver, R. P. and Cummings, R. D., J. Biol, Chem. 2002, 277, 39749-39759；Renkonen, O., Cell. Mol Life Sci. 2000, 57, 1423-1439；Baldus, S. E.; Zirbes, T. K.; Weingarten, M.; Fromm, S.; Glossmann, J.; Hanisch, F. G.; Monig, S. P.; Schroder, W.; Flucke, U.; Thiele, J.; Holscher, A. H. and Dienes, H. P., Tumor Biology, 2000, 21, 258-266；Cho, M. and Cummings, R. D., TIGG.. 1997, 9, 47-56, 171-178。
【０１６１】
表４における特異性データに基づき、ガラクトシド及びポリラクトサミンの酵素合成を複数グラム量で行うことができる。この方法は、様々なフコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ）を用いた。いくつかのフコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ）は、様々な研究室において基質特異性及び生物学的機能の面から特徴付けされている。Murray, B. W.; Takayama, S.; Schultz, J. and Wong, C. H., Biochem. 1996, 35, 11183-11195；Weston, B. W.; Nair, R. P.; Larsen, R. D. and Lowe, J. B., J. Biol. Chem. 1992, 267, 4152-4160；Kimura, H.; Shinya, N.; Nishihara, S.; Kaneko, M.; Irimura, T. and Narimatsu, H., Biochem. Biophys. Res. Comm. 1997, 237, 131-137；Chandrasekaran, E. V.; Jain, R. K.; Larsen, R. D.; Wlasichuk, K. and Matta, K. L., Biochem. 1996, 35, 8914-8924；Devries, T.; Vandeneijnden, D. H.; Schultz, J. and Oneill, R., FEBS Lett. 1993, 330, 243-248；Devries, T. and van den Eijnden, D. H., Biochem. 1994, 33, 9937-9944
【０１６２】
組換えＦＵＴの大規模生産と組み合わせた利用可能な特異性データは、複数グラム量で様々な貴重なフコシドを合成することを可能にした。スキームＩは、様々なＦＵＴ及びＧＤＰ−フコースを用いポリ−ＬａｃＮＡｃ骨格及び選択されたフコシル化構造を延長するために用いられる一般手順を示している。
【０１６３】
【化１６】
2008504531.tif 000028
【０１６４】
様々なフコシル化ラクトサミン誘導体の系統的なグラム規模の合成を、スキームＩ及び以下の組換えフコシルトランスフェラーゼ、ＦＵＴ−II、ＦＵＴ−III、ＦＵＴ−IV、ＦＵＴ−Ｖ、及びＦＵＴ−VIを用いて開始した。ＦＵＴ−Ｖを除き、上記のフコシルトランスフェラーゼはすべて、昆虫細胞発現系で産生させ、ＧＤＰ−セファロースアフィニティーカラムで精製するか、或いは粗製の酵素混合物としてTangential Flow Filtrator（ＴＦＦ−ＭＷＣＯ  １０ｋ）中で濃縮した。ＦＵＴ−Ｖは、Murray, B. W.; Takayama, S.; Schultz, J. and Wong, C. H., Biochem. 1996, 35, 11183-11195に記載されているように、クロカビ（A. niger）で発現させた。
【０１６５】
フコシル化ラクトサミン誘導体の製造の様々な段階についての収率は、ＬｅＸ（２つの酵素工程）の場合は７５〜９０％、二量体のＬａｃＮＡｃ構造（４つの酵素工程）の場合は４５〜５０％、三量体のｌａｃＮＡｃ構造（６つの酵素工程）の場合は３０〜３５％であった。
【実施例２】
【０１６６】
シアル酸含有オリゴ糖の合成
シアル酸は、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸に使用される総称である。この一連の単糖のうちで最も広く存在する誘導体は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）及び非アミノ化３−デオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロソン酸（ＫＤＮ）から誘導される誘導体である。シアル酸含有オリゴ糖は、様々な生物学的調節及び機能に関与している炭水化物の重要なカテゴリーである。シアル酸は、毒素／ウイルスの吸着、及び炭水化物結合タンパク質（ＣＢＰ）との相互作用を介する多様な細胞コミュニケーションに関与していることが明らかにされている。それらの中で、セレクチン及びシグレック（シアル酸結合性免疫グロブリンスーパーファミリーレクチン）は、シアル酸相互作用を介して生物学的に機能する良く特徴付けられたＣＢＰである。
【０１６７】
シアル酸を含有するオリゴ糖の合成は、簡単ではない。不幸にも、化学的アプローチは、共通していくつかの妨害要因を有する。例えば、一般に、シアル酸による立体選択的グリコシル化は、異性体生成物、その結果として、精製の問題及び低い収率をもたらす。また、その複雑な性質は、広範囲な保護基操作及び受容体基質と供与体基質双方の注意深い設計を必要とし、これらのビルディングブロックを調製するには相当量の努力が必要とされる。
【０１６８】
炭水化物構造をシアリル化するための迅速且つ効率的方法の場合、一般に好まれる方法は、シアリルトランスフェラーゼによる触媒を介するものである。Ｎｅｕ５Ａｃ含有オリゴ糖を生成する酵素的シアリル化は、分析目的と調製目的の両方でシアリル化炭水化物を作製する方法である。Koeller, K. M. and Wong, C.-H., Nature 2001, 409, 232-240；Gilbert, M.; Bayer, R.; Cunningham, A.-M.; DeFrees, S.; Gao, Y.; Watson, D. C.; Young, N. M. and Wakarchuk, W. W., Nature Biotechnol. 1998, 16, 769-772；Ichikawa, Y.; Look, G. C. and Wong, C. H., Anal. Biochem. 1992, 202, 215-238。しかしながら、Ｎｅｕ５Ｇｃ又はＫＤＮ構造を有するオリゴ糖を調製するための効率的方法は、これらのシアロシド誘導体の乏しさのため、これまで同じ程度には探索されていない。
【０１６９】
様々なシアロシド誘導体を得るための簡単な方法は、もとはＷｏｎｇ及び同僚により開発された方法の改変を用いて考案された。Crocker, P. R., Curr. Opin. Struct. Biol. 2002, 12, 609-615。この方法は、市販のＮｅｕ５Ａｃアルドラーゼ、ＳＴ３−ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンテターゼに加えて組換えシアリルトランスフェラーゼを用いた。Gilbert, M.; Bayer, R.; Cunningham, A.-M.; DeFrees, S.; Gao, Y.; Watson, D. C.; Young, N. M. and Wakarchuk, W. W., Nature Biotechnol. 1998, 16, 769-772。
【０１７０】
Ｎｅｕ５Ａｃ−オリゴ糖を作製するための好ましい経路は、スキームIIに記載されているワンポット手順を使用することであった（Ｂ及びＣ）。
【０１７１】
【化１７】
2008504531.tif 000029
【０１７２】
手短に言うと、ＳＴ３−ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンテターゼは、Ｎｅｕ５Ａｃ１当量及びＣＴＰ１当量からの定量的なＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃの形成を触媒した。膜濾過（ＭＷカットオフ１０ｋ）による融合タンパク質の除去後、表５に記載されているように、選択されたガラクトシド及び組換えシアリルトランスフェラーゼを導入し、望ましいＮｅｕ５Ａｃ−シアロシドを生成させた。
【０１７３】
【表５】
2008504531.tif 000030
【０１７４】
この合成スキームは、通常はシアリル化生成物の７０〜９０％回収の収率で複数グラム量の生成物を生産した。
【０１７５】
Ｎｅｕ５Ｇｃ及びＫＤＮ誘導体を合成するため、ワンポット系には、経路Ｂ及びＣ（スキームII）の他に別の酵素反応が含まれるであろう。この態様において、マンノース誘導体、ピルベート（３当量）及び市販の微生物Ｎｅｕ５Ａｃアルドラーゼ（Toyobo社製）を、ワンポット半サイクル中に導入した（スキームII、Ａ）。表５における酵素は、Ｎｅｕ５Ａｃ、ＫＤＮ及び９−アジド−９デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃ類縁体のいくつかのα（２−３）−、α（２−６）−又はα（２−８）結合シアル酸誘導体を有する様々なＮ−及びＯ−結合型オリゴ糖を許容できる収率（４５〜９０％）で作製することができた。Ｏ−結合型シアリル−オリゴ糖は、生物医学的共同体にとって別のクラスの望ましい化合物である。これらの構造は、様々な癌組織及びリンパ腫においてしばしば見出され、大腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、及び肺腺癌が含まれる多くのタイプのヒト悪性疾患で高度に発現される。Dabelsteen, E., J. Pathol. 1996, 179, 358-369；Itzkowitz, S. H.; Yuan, M.; Montgomery, C. K.; Kjeldsen, T.; Takahashi, H. K. and Bigbee, W. L., Cancer Res. 1989, 49, 197-204。
【０１７６】
発明者は、以前に、ニワトリＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉのクローニング、発現、及び特徴付け、並びにＯ−結合型シアロシド抗原、ＳＴｎ−、α（２−６）ＳｉａＴ−、α（２−３）ＳｉａＴ−及びジ−ＳｉａＴ−抗原の調製用合成におけるその使用について報告している。Blixt, O.; Allin, K.; Pereira, L.; Datta, A. and Paulson, J. C., J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 5739-5746。手短に言うと、組換え酵素を、昆虫細胞において発現させ、ＣＤＰ−セファロースアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより精製し、細胞培養液１Ｌ当たり約１０Ｕを生成した。酵素活性を一連の小さな受容体分子で評価すると（表６）、酵素活性の絶対的な要件は、ＧａｌＮＡｃ上のアノマー位置がスレオニンとα結合していることであると判明した。
【０１７７】
【表６】
2008504531.tif 000031
【０１７８】
したがって、保護されたスレオニンで終わっているＯ−結合型シアロシドを、スキームIIIを用い、グラム規模の反応で合成することに成功した。これらの化合物を他の官能基に結合することを可能にするため、スレオニン上のＮ−アセチル保護基を、ｃｈＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉによる酵素的延長前に、除去可能な９−フルオレニル（Ｆ−ｍｏｃ）誘導体で置換することができた。Blixt, O.; Collins, B. E.; Van Den Nieuwenhof, I. M.; Crocker, P. R. and Paulson, J. C., (2003 J. Biol. Chem. 15: 278)。表６を見るとわかるように、酵素は、この位置のかさばった基に対して敏感ではなかった（化合物６）。
【０１７９】
【化１８】
2008504531.tif 000032
【実施例３】
【０１８０】
ガングリオシドミミックの合成
ガングリオシドは、構造的に多様な一連のシアリル化分子を含む糖脂質である。ガングリオシドは、神経組織に結合して豊富にあり、成長因子、毒素及びウイルスの受容体として働き、ヒト黒色腫及び神経芽細胞腫細胞の接着を促進することが判明している。Kiso, M., Nippon Nogei Kagaku Kaishi. 2002, 76, 1158-1167；Gagnon, M. and Saragovi, H. U., Expert Opinion on Therapeutic Patents. 2002, 12, 1215-1223；Svennerholm, L., Adv. Gen. 2001, 44, 33-41；Schnaar, R. L., Carbohydr. Chem. Biol. 2000, 4, 1013-1027；Ravindranath, M. H.; Gonzales, A. M.; Nishimoto, K.; Tam, W.-Y.; Soh, D. and Morton, D. L., Ind. J. Exp. Biol. 2000, 38, 301-312；Rampersaud, A. A.; Oblinger, J. L.; Ponnappan, R. K.; Burry, R. W. and Yates, A. J., Biochem. Soc. Trans., 1999, 27, 415-422；Nohara, K., Seikagaku. 1999, 71, 337-341。
【０１８１】
これらのシアリル化ガングリオシド構造の重要性にもかかわらず、それらの効率的な調製のための方法は限定されている。糖脂質コア構造へのシアル酸の導入は、困難な作業であり、うまく考えられた合成戦略と合わせて複雑な操作を必要とすることが分かっている。
【０１８２】
最近、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）（ＯＨ４３８４）由来のいくつかのグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子が、この病原性細菌により発現される様々なガングリオシド関連リポオリゴ糖（ＬＯＳ）の産生に関与していることが同定されている。Gilbert, M.; Brisson, J.-R.; Karwaski, M.-F.; Michniewicz, J.; Cunningham, A.-M.; Wu, Y.; Young, N. M. and Wakarchuk, W. W., J. Biol. Chem. 2000, 275, 3896-3906。これらの遺伝子の中で、二機能性のα（２−３／８）シアリルトランスフェラーゼをコードするｃｓｔ−IIは、それぞれ、Ｎｅｕ５Ａｃα（２−３）及びα（２−８）のラクトース及びシアリルラクトースへの移動を触媒することが立証されている。β（１−４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（β４ＧａｌＮＡｃＴ）をコードする別の遺伝子ｃｇｔＡは、ＧａｌＮＡｃβ（１−４）をＮｅｕ５Ａｃα（２−３）ラクトース受容体に移動させ、ＧＭ２（Ｎｅｕ５Ａｃα（２−３）［ＧａｌＮＡｃβ（１−４）］Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃ−）エピトープを生成することが報告されている。
【０１８３】
２つのグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｃｓｔ−II及びｃｇｔＡ）の遺伝子産物を大規模（１００Ｌ大腸菌（E. coli）発酵）に過剰発現させることに成功し、様々なガングリオシドミミックの調製用合成で使用した。合成目的のため、これらの酵素の広範囲な特異性研究を、中性及びシアリル化構造を用いて行い、これらの酵素の合成的有用性をさらに明らかにした。
【０１８４】
ＧａｌＮＡｃ含有オリゴ糖のコスト効率の高い合成のため、高価なウリジン−５’−ジホスフェート−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）は、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ−４’−エピメラーゼ（ＧａｌＮＡｃ−Ｅ）により、安価なＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからインサイツで製造した。ＧａｌＮＡｃ−Ｅは、ラット肝臓から大腸菌（E. coli）発現ベクター（ｐＣＷｏｒｉ）中にクローニングし、大腸菌（E. coli）ＡＤ２０２細胞で発現させた。手短に言うと、ラクトース誘導体は、α（２−８）−シアリルトランスフェラーゼ及び粗製のＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃを用い、シアル酸反復で延長させた。この混合物からいくつかの生成物（ＧＭ３、ＧＤ３、ＧＴ３）が単離された。ＣＤＰ−Ｎｅｕ５Ａｃを２．５当量から４当量に増加させると、ＧＴ３の生成が優先し、微量のＧＤ３が単離された。典型的な収率は、主要化合物４０〜５０％、微量化合物１５〜２０％である。単離された化合物を、ＧＭ２−シンテターゼ（ＣｇｔＡ）及びＧａｌＥの作用でさらに磨くと、定量的収率で対応するＧＭ２、ＧＤ２、及びＧＴ２構造が得られた（スキームIV）。
【０１８５】
【化１９】
2008504531.tif 000033
【０１８６】
したがって、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン及びその対応するフコシル化及び／又はシアリル化化合物、Ｎ−及びＯ−結合型グリカンの様々なシアロシド誘導体、並びにガングリオシドミミック構造などの多様な一連のグリカンを作製するための方法が開発された。さらに、まれなシアル酸誘導体を製造する簡単な経路について記載した。この仕事は、複雑な炭水化物構造の化学酵素合成が、様々なグリコシルトランスフェラーゼの機能的ツールボックスを用いることにより容易且つ実用的なレベルに達することができることを示している。広範な構造的分類によりグリカン化合物のライブラリーを発展させるためには、これらの酵素の特異性についての詳細な情報が必要とされる。本発明は、そのような炭水化物のライブラリー及び炭水化物−タンパク質並びに炭水化物−炭水化物相互作用のハイスループット研究においてそのライブラリーを使用するための方法を提供する。
【実施例４】
【０１８７】
天然源からのグリカンの単離
本実施例は、ウシ膵臓リボヌクレアーゼＢから特定のタイプのマンノース含有グリカンをどのようにして単離することができるかを説明する。
【０１８８】
ウシ膵臓リボヌクレアーゼＢのプロナーゼ消化：ウシ膵臓リボヌクレアーゼＢ（Sigma社製Ｌｏｔ  ０６０Ｋ７６５０）を緩衝液（０．１Ｍトリス＋１ｍＭ  ＭｇＣｌ２＋１ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ８．０）に溶かし、プロナーゼ（Calbiochem社製Ｌｏｔ  Ｂ  ５０８７４）を加え、プロナーゼ１部に対して糖タンパク質５部の重量比とした。それを、６０℃にて３時間インキュベートした。消化されたサンプル中のマンノース含有グリカンを、緩衝液（０．１Ｍトリス、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ８．０）中の新たに調製したＣｏｎＡを用いてアフィニティー精製し、洗浄し、０．１Ｍメチル−ａ−Ｄ−マンノピラノシド（Calbiochem社製Ｌｏｔ  Ｂ３７５２６）２００ｍｌで溶出した。ＣｏｎＡで溶出したサンプルを、Carbograph固相抽出カラム（Alltech社製  １０００ｍｇ、１５ｍｌ）上で精製し、３０％アセトニトリル＋０．０６％ＴＦＡで溶出した。これを乾燥し、水１ｍｌで再構成した。質量分析は、ＭＡＬＤＩにより行い、グリカン定量は、フェノール硫酸アッセイにより行った。
【０１８９】
プロナーゼで消化したリボヌクレアーゼｂを、０．１ＭトリスｐＨ８．０  ５ｍｌで希釈し、０．１Ｍトリス、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ８．０中のＣｏｎＡカラム１５ｍｌ上にロードし、洗浄し、０．１Ｍメチル−ａ−Ｄ−マンノピラノシド５０ｍｌで溶出した。次いで、０．１％ＴＦＡを含有する８０％アセトニトリルで溶出されるCarbograph固相抽出カラム（Alltech社製  １０００ｍｇ、１５ｍｌ）上で精製し、乾燥し、水２ｍｌで再構成した。質量分析及びグリカン定量は、Voyager Elite MALDI-TOF（Perseptive BioSystems社製）を用い、ネガティブモードで行った。
【０１９０】
Ｄｉｏｎｅｘ上の分画の分離：プロナーゼで消化したリボヌクレアーゼｂを、ＰＡ−１００カラムを使用するＤＩＯＮＥＸ上に注入し、以下のグラジエント、すわなち、溶液Ａ＝０．１Ｍ  ＮａＯＨ、Ｂ＝０．１Ｍ  ＮａＯＨ中の０．５Ｍ  ＮａＯＡｃ；３分の０％Ｂ、次いで、３４分間の０％Ｂから６．７％Ｂまでの直線グラジエントで溶出した。個々のピーク分画を集め、０．１％ＴＦＡを含有する８０％アセトニトリルで溶出することにより、Carbograph固相カラム（Alltech社製  １５０ｍｇ、４ｍｌ）上で精製した。それらを乾燥し、水で再構成した。最終的な質量分析及びグリカン定量を行った。
【実施例５】
【０１９１】
グリカンアレイの作製
本実施例では、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２（Ｓｐ１と呼ばれる）又は−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２（Ｓｐ２又はＳｐ３と呼ばれる）基を結合させたグリカンを用いてアレイを作製した。これらのＳｐ１、Ｓｐ２及びＳｐ３部分は、誘導体化された固体支持体に結合するための一級アミノ基を提供する。用いられる固体支持体は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で誘導体化された表面を有し、Accelr8 Technology Corporation、Denver、ＣＯから入手した。すべての望ましいグリカンの結合後、スライドを、エタノールアミン緩衝液とともにインキュベートし、固体支持体上の残りのＮＨＳ官能基を非活性化した。このアレイは、それ以上表面を修飾せずに使用することができる。非特異的結合を防ぐためのブロッキング手順は一切必要とされない。
【０１９２】
各タイプのグリカンを、Scripps Instituteで入手できるマイクロアレイ遺伝子プリンターを用い、画定されたグリカンプローブ位置において固体支持体上にプリントした。画定されたグリカンプローブ位置当たりグリカン溶液約０．５ｎＬを塗布した。様々な濃度のグリカン溶液を、固体支持体上にプリントした。１０〜約１００μＭグリカンのグリカン溶液を用いることができる。各グリカン濃度の６個の複製を、画定されたグリカンプローブ位置上にプリントした。そのような複製は、グリカンと試験分子の間の結合反応が本当の結合相互作用であるか否かを確認する内部対照を提供する。この手順の概要を図１でさらに示す。
【実施例６】
【０１９３】
グリカンアレイの例示的結合研究及び最適化
グリカン構造の共有結合は、レクチンコンカナバリンＡのマンノース含有グリカンとの結合の検出により検証した。即ち、マンノースオリゴ糖（Ｍａ２Ｍａ３［Ｍａ２Ｍａ６］Ｍａ）を、４μＭ〜５００μＭの様々な濃度でプリントし、スライドを４０％の湿度にて空気に暴露しながら６時間にわたり６つの異なる時点でプリントした。各濃度について８個の複製を使用した。ＣｏｎＡ−ＦＩＴＣ標識レクチンにより認識されないグリカンリガンドを陰性対照として使用した。図２は、６０μＭを超えるグリカン濃度が、最大のレクチン結合シグナルを提供したことを示している。
【０１９４】
他のレクチンを検出するための５つの異なる濃度（６〜１００μＭ）でプリントされた３２個の他のリガンドによる類似研究において同様のデータが得られた。いくつかのグリカン特異的植物レクチン、ヒトレクチン及びモノクローナル抗体を、本明細書に示す実施例に記載されている方法と類似した方法を用い、様々な濃度（２〜３００μｇ／ｍＬ、５０μＬ／スライド）で評価した。結合の検出は、結合タンパク質にコンジュゲートされている蛍光色素を介するか、或いは結合タンパク質と結合している標識二次抗体を介した。蛍光強度は、Scan Array 5000（GSI Lumonics、Watertown、ＭＡ）共焦点スキャナーを用いて観察し、データ解析は、ImaGene画像解析ソフトウェア（BioDiscovery Inc.、El Segundo、ＣＡ）を用いて行う。
【０１９５】
特に、以下の試験分子を、本発明のグリカンアレイとの結合について調べた。図３及び４は、蛍光標識された植物レクチンＣｏｎＡ（図３）及びＥＣＡ（図４）についての結果を示している。同様のデータが、ＳＮＡ、ＬＴＡ及びＵＥＡ−１について得られた（データ省略）。図５は、ヒトレクチンに結合しているＦｃ部分を検出するために蛍光標識した二次抗体を用いるヒトレクチンヒトＣ型レクチン、Ｅセレクチン及びシグレック２、ＣＤ２２のグリカンアレイとの結合の結果を示している。図６は、特定の蛍光標識された抗体が、選択されたグリカン、例えば、ヒト抗グリカンＣＤ１５抗体と特異的に結合することを説明している。図７は、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンＨ１（１９１８）が、２つの後で添加された蛍光標識された二次抗体で検出されるように、選択されたグリカンと結合することを示している。
【０１９６】
また、これらの実験は、３０〜５０％の相対湿度における６時間までのプリント時間が、ＮＨＳ表面の加水分解非活性化により引き起こされるレクチン結合シグナルを有意には低減しないことを裏付けており、これは、より長いプリント実行、したがってアレイの拡大にとって重要である可能性がある。
【０１９７】
強力且つ安定に共有結合しているライブラリーは、分析物のインキュベーション前後の広範な洗浄手順に暴露されても、スライドがインタクトであるようにした。また、結合しているレクチンを、溶液中で、又は表面に塗布された塩、酸、塩基若しくは洗浄剤溶液との組合せでリガンドを競合させることにより除去することができた。ＣｏｎＡレクチンは、ＭａｎαＯＭｅ（１００ｍＭ）、ＨＯＡｃ（１Ｍ）、ＮａＯＨ（０．３Ｍ）及びＮａＣｌ（１Ｍ）の順序で繰り返し取り除かれ、いかなるシグナルの減少もバックグラウンドシグナルの有意な増加もなく、６回まで同じスライドに再塗布された（データ省略）。
【実施例７】
【０１９８】
グリカンアレイ上の切断可能なリンカーの作製
本実施例は、アレイ上のグリカンのタイプの切断及び分析を可能にする切断可能なリンカーの合成について説明する。抗体又は別の結合性物質がグリカンアレイと結合する場合、１つ又は複数の結合グリカンの正確な構造は、アレイからのグリカンの切断及び構造解析により決定することができる。
【０１９９】
切断可能なリンカーは、以下に記載されるように調製した。試薬は、供給会社から入手し、さらに精製することなく使用した。すべてのガラス製品及び注射器は、使用前に、オーブン中で一夜乾燥し、陽圧のアルゴン中で冷却して保存した。ジクロロメタンは、ＣａＨ２で乾燥した。無水メタノールは、Aldrich社から入手した。トリアゾールの形成に用いるメタノールは、使用前に脱ガスした。化合物は、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。ＴＬＣは、ＳｉＯ２  ６０Ｆ２５４（Merck社製）上で行い、ＵＶ、Ｈ２ＳＯ４及びＫＭｎＯ４試薬で検出した。１Ｈ及び１３ＣＮＭＲスペクトルは、４００及び５００ＭＨｚ（Bruker社製）で測定した。融点は補正しなかった。ＣｏｖａＬｉｎｋ−Ｎｕｎｃブランドのアミン官能基付きマイクロタイタープレートは、Nunc社から購入し、Ａｍｉｎｅ−Ｔｒａｐ  ＮＨＳマイクロタイタープレートは、NoAb Biodiscoveries社から購入した。フルオレセイン標識のロツス・テトラゴノロブス（Lotus tetragonolobus）及びエリスリナ・クリスタガリ（Erythrina cristagalli）レクチンは、Vector Labs社から購入した。フルオレセイン結合のヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体は、Jackson ImmunoResearch社から購入した。生物学的アッセイ用の残りの材料はすべて、Sigma社から購入した。吸光度及び蛍光測定にはPackard BioScience Company社製のFusion Universal Microplate Analyzerを利用し、ＳＳＩ及びＥＳＩ測定にはHitachi社製M-8000 Mass Spectrometerを使用した。
【０２００】
ジスルフィドリンカー
プロピン酸［２−（２−アミノ−エチルジスルファニル）−エチル］−アミド、トリフルオロ酢酸塩
【０２０１】
【化２０】
2008504531.tif 000034
【０２０２】
攪拌したジシクロヘキシルカルボイミド（ＤＣＣ）（３．８ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（１００ｍＬ）溶液に、アルゴン中、０℃にて、プロピン酸（３．２ｍｍｏｌ）を加えた。１０分後、無水ジクロロメタン５０ｍＬに溶かしたＮ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルシスタミン（Jacobson社製、１９９５＃２１）（３．２ｍｍｏｌ）を滴加し、得られた混合物を、０℃にて１時間及び室温にて１時間攪拌した。次いで、混合物を濾過し、溶液を減圧下で蒸発させた。粗生成物を、溶出液としてＡｃＯＥｔ／ｎ−ヘキサン（１：１）を用いるシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。この化合物（１．６４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン５ｍＬに溶かし、０℃で冷却した。次いで、ＴＦＡ（５ｍＬ）を加え、溶液を、０℃にて１５分間攪拌した。蒸発後、痕跡のＴＦＡを除去するため、粗生成物を水１０ｍＬに２回再溶解し、再度蒸発させた。さらに精製することなく、高純度のトリフルオロ酢酸塩としてアミンを得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ３．１４（ｓ，１Ｈ）、３．１２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．６０Ｈｚ）、２．８６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．６０Ｈｚ）、２．５４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．６０Ｈｚ）、２．４３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．６０Ｈｚ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ１５４．８７、７７．９１、７６．２１、３９．６３、３９．２７、３７．５６、３５．２１。ＨＲ−ＭＡＬＤＩ−ＦＴＭＳ：Ｃ７Ｈ１３Ｎ２ＯＳ２［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値、２０５．０４６４；実測値、２０５．０４６８。
【０２０３】
プロピン酸（２−｛２−［３−（４−イソチオシアナト−フェニル）−チオウレイド］−エチルジスルファニル｝−エチル）−アミド（２）
【０２０４】
【化２１】
2008504531.tif 000035
【０２０５】
１，４−フェニレンジイソチオシアネート（１．３８ｍｍｏｌ）を、２ｍＬの無水ＤＭＦ中にジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（０．３４ｍｍｏｌ）と一緒に溶かした。この攪拌した溶液に、２ｍＬの無水ＤＭＦに溶かしたプロピン酸［２−（２−アミノ−エチルジスルファニル）−エチル］−アミド、トリフルオロ酢酸塩（１）（０．３４ｍｍｏｌ）を３０分かけて加えた。反応物を室温にてさらに３０分間攪拌し、溶媒を、高真空中で留去した（浴温４０℃未満）。粗生成物を、溶媒としてｎ−ヘキサン／ＡｃＯＥｔ（１：１）を用いるＡｌｕｍｉｎｕｍ  Ｏｘｉｄｅ  ９０（活性中性）上のカラムクロマトグラフィーにより直接精製した。分画を、３０℃未満の温度で蒸発させた。イソチオシアネート誘導体２が４５％の収率で得られた（６０ｍｇ）。この化合物は、室温にて湿度に敏感且つ不安定であった。Ｄｒｉｅｒｉｔｅ（登録商標）上、フリーザー（Ｔ°＜−３０℃）中で保存すること。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８．７６（ｓ，１ＮＨ）、７．９５（ｓ，２ＮＨ）、７．４３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８０Ｈｚ）、７．１５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８０Ｈｚ）、３．９２（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝５．８７Ｈｚ）、３．５８（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝６．６０Ｈｚ）、２．９６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．８７Ｈｚ）、２．８６（ｓ，１Ｈ）、２．７５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９７Ｈｚ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１８０．８５、１５２．８０、１３７．０１、１３５．４２、１２７．９５、１２６．３８、１２４．７９、（ＣＤＣｌ３シグナルはアルキン炭素１個と重複）、７４．４３、４２．７７、３８．９８、３７．７５、３６．１５、３１．４４。ＨＲ−ＭＡＬＤＩ−ＦＴＭＳ：Ｃ１５Ｈ１７Ｎ４ＯＳ４［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値、３９７．０２８２；実測値、３９７．０２８２。
【０２０６】
アジド及びアミン含有グリカン
アジド又はアミンを含む糖類は、Fazio et al. Tetrahedron Lett. 45: 2689-92 (2004)；Fazio et al., J. Am. Chem. Soc. 124: 14397-14402 (2002)；Lee et al. Angew. Chem. Int. Ed. 43: 1000-1003 (2004)；Burkhart et al. Angew. Chem. Int. Ed. 40: 1274-77 (2001)によって報告されているように合成した。用いた合成手順を以下に記載し、図８〜９に示す。
【０２０７】
【化２２】
2008504531.tif 000036
【０２０８】
化合物１０３の合成：図８に示すように、化合物１０１（１．５ｇ、５．８８ｍｍｏｌ）を、アセトバニロン１０２（０．９ｇ、５．４１ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（１．１ｇ、７．９６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２０ｍＬ）溶液にアルゴン中室温にて加えた。反応混合物を７５℃まで温め、１２時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を、カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２／ヘキサン：ＥＡ＝３：１）により分離すると、１．３０ｇ（０．５２ｍｍｏｌ、９６％）の化合物１０３が得られた。
【０２０９】
【化２３】
2008504531.tif 000037
【０２１０】
化合物１０４の合成：発煙硝酸（０．９６ｍＬ）を、化合物３（０．７８ｇ、３．１２ｍｍｏｌ）の酢酸（９．６０ｍＬ）溶液に加え、添加中は、反応混合物を氷水浴により冷却した。反応混合物を７０℃にて１８時間攪拌し、氷水中に注加した。黄色の沈殿を濾過し、カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２／ヘキサン：ＥＡ＝２：１）により精製すると、０．６９ｇ（２．３４ｍｍｏｌ、７５％）の化合物１０４が得られた。
【０２１１】
【化２４】
2008504531.tif 000038
【０２１２】
化合物１０５の合成：水素化ホウ素ナトリウム（０．１８ｇ、４．９０ｍｍｏｌ）を、化合物１０４（１．２ｇ、４．０８ｍｍｏｌ）のメタノール（１５ｍＬ）溶液に加え、添加中は、反応混合物を氷水浴により冷却した。反応混合物を室温にて１時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を、カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２／ヘキサン：ＥＡ＝２：１）により分離すると、１．１８ｇ（４．０ｍｍｏｌ、９８％）の化合物１０５が得られた。
【０２１３】
【化２５】
2008504531.tif 000039
【０２１４】
化合物１０８の合成：化合物１０５（６８．５ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を乾燥アセトニトリル３．０ｍＬに溶かした。この溶液に、炭酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジル（９０ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）と、続いてトリエチルアミン（０．１８ｍＬ）を加えた。室温にて５時間攪拌した後、溶媒を蒸発乾固させた。残渣を、０．１Ｎ  ＮａＨＣＯ３、水及びＥＡで連続して洗浄し、次いで、乾燥すると、粗製の化合物１０６が得られた。粗製の化合物１０６のＤＭＦ溶液に、アミノ結合マンノース化合物１０７（６１．５ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）と、続いてトリエチルアミン（０．１８ｍＬ）を加えた。溶液を室温にて５時間攪拌し、溶媒を減圧下で除去し、残渣を、カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２／ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝１：３）により分離すると、９７．２ｍｇ（０．１６ｍｍｏｌ、７２％）の化合物１０８が得られた。
【０２１５】
【化２６】
2008504531.tif 000040
【０２１６】
化合物１０９の合成：３５６．２ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）のアジド化合物５のテトラヒドロフラン（８．０ｍＬ）溶液を、トリメチルホスフィンの１Ｍトルエン溶液２．０ｍＬ（２．０ｍｍｏｌ）で処理した。反応物を１時間攪拌し、次いで、水２．０ｍＬを加え、攪拌を２時間続け、反応混合物を濃縮し、残渣を、カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２／ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝１：３）により精製すると、２９１．７ｍｇ（１．０８ｍｍｏｌ、９０％）の化合物１０９が得られた。
【０２１７】
【化２７】
2008504531.tif 000041
【０２１８】
化合物１１１の合成：水素化ホウ素ナトリウム（１．４ｇ、３７．８４ｍｍｏｌ）を、化合物１１０（４．０７ｇ、２４．３５ｍｍｏｌ）のメタノール（３０ｍＬ）溶液に加え、添加中は、反応混合物を氷水浴により冷却した。反応混合物を室温にて１時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を、ＭｅＯＨ中で再結晶すると、４．０ｇ（２３．６２ｍｍｏｌ、９７％）の化合物１１１が得られた。
【０２１９】
【化２８】
2008504531.tif 000042
【０２２０】
化合物１１２の合成：化合物１０１（３．０ｇ、１１．７６ｍｍｏｌ）を、化合物１１１（１．８ｇ、１０．６９ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２．２ｇ、１５．９２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（４０ｍＬ）溶液にアルゴン中室温にて加えた。反応混合物を６０℃まで温め、１２時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を、カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２／ヘキサン：ＥＡ＝１：１）により分離すると、２．４ｇ（９．５６ｍｍｏｌ、９５％）の化合物１１２が得られた。
【０２２１】
【化２９】
2008504531.tif 000043
【０２２２】
化合物１１５の合成：化合物１１２（５８．０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を乾燥アセトニトリル３．０ｍＬに溶かした。この溶液に、炭酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジル（９０．０ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）と、続いてトリエチルアミン（０．１８ｍＬ）を加えた。室温にて５時間攪拌した後、溶媒を蒸発乾固させた。残渣を、０．１Ｎ  ＮａＨＣＯ３、水及びＥＡで連続して洗浄し、次いで、乾燥すると、粗製の化合物１１３が得られた。化合物１０６のＤＭＦ溶液に、アセチレン化合物１１４（３２．２ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）と、続いてトリエチルアミン（０．１８ｍＬ）を加えた。溶液を室温にて５時間攪拌し、溶媒を減圧下で除去し、残渣を、カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２／ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝１：３）により分離すると、６７．３２ｍｇ（０．１６ｍｍｏｌ、７０％）の化合物１１５が得られた。
【０２２３】
【化３０】
2008504531.tif 000044
【０２２４】
化合物１１６の合成：化合物１１２（５８．０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を乾燥アセトニトリル３．０ｍＬに溶かした。この溶液に、炭酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジル（９０ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）と、続いてトリエチルアミン（０．１８ｍＬ）を加えた。室温にて５時間攪拌した後、溶媒を蒸発乾固させた。残渣を、０．１Ｎ  ＮａＨＣＯ３、水及びＥＡで連続して洗浄し、次いで、乾燥すると、粗製の化合物１０６が得られた。粗製の化合物１０６のＤＭＦ溶液に、アミノ結合マンノース化合物１０７（６１．５ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）と、続いてトリエチルアミン（０．１８ｍＬ）を加えた。溶液を室温にて５時間攪拌し、溶媒を減圧下で除去し、残渣を、カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２／ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝１：３）により分離すると、１０２．６ｍｇ（０．１７ｍｍｏｌ、７６％）の化合物１１６が得られた。
【０２２５】
【化３１】
2008504531.tif 000045
【０２２６】
化合物１１７の合成：７０．５ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のアジド化合物１１６のテトラヒドロフラン（２．０ｍＬ）溶液を、トリメチルホスフィンの１Ｍトルエン溶液０．２ｍＬ（０．２ｍｍｏｌ）で処理した。反応物を１時間攪拌し、次いで、水０．２ｍＬを加え、攪拌を２時間続け、反応混合物を濃縮し、残渣を、カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２／ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ＝１：３：０．３）により精製すると、６０．６ｍｇ（１．０８ｍｍｏｌ、９０％）の化合物１１７が得られた。
【０２２７】
アルキン含有リンカー前駆体の表面との共有結合
チオイソシアネート捕捉：アミンがコーティングされたマイクロタイタープレートを、各々、５％ＤＩＥＡ／ＤＭＳＯ（１００μＬ）中のリンカー２の１ｍＭ溶液で室温にて８時間処理した。この時間後、溶液を取り除き、ウェルをＭｅＯＨ（２×２００μＬ）で洗浄した。この反応を図１０に示す。
【０２２８】
アミン捕捉：ＮＨＳがコーティングされたマイクロタイタープレートを、リンカー１（１ｍｇ／ｍＬ  ５％ＤＩＥＡ／ＭｅＯＨ；２００μＬ）で４℃にて８時間処理した。この時間後、溶液を取り除き、ウェルをＱＨ２Ｏ（３×２００μＬ）で洗浄した。この反応を図１０に示す。
【０２２９】
トリアゾール形成及び切断：ウェルに、５％ＤＩＥＡ／ＭｅＯＨ（２００μＬ）中のアジド含有糖類及びＣｕＩ（触媒量）を順に加えた。プレートをカバーし、４℃にて１２〜１４時間振盪した。次いで、溶液を取り除き、プレートをＱＨ２Ｏ（３×２００μＬ）で洗浄した。次いで、ジチオスレイトール（Ｈ２Ｏ中５０ｍＭ）をウェルに加え、プレートを、４℃にて２４時間インキュベートした。次いで、プレートを、直接質量スペクトル解析にかけた。この反応を図１１に示す。
【実施例８】
【０２３０】
切断可能なリンカーを有するアレイは、様々なスクリーニング反応に有用である
切断可能なリンカーを有するアレイを、上記の実施例に記載されているように合成し、どの分子が異なるグリカンと結合するかを決定するためのスクリーニングアッセイで使用することに成功した。
【０２３１】
スクリーニングアッセイ
ロツス・テトラゴノロブス（Lotus tetragonolobus）レクチン結合：ＱＨ２Ｏで洗浄した後、ウェルを、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５／０．１％ツイーン−２０を含有する１５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液（緩衝液Ａ；２００μＬ）で４℃にて１時間にわたりブロックした。次いで、緩衝液を取り除き、フルオレセイン標識のロツス・テトラゴノロブス（Lotus tetragonolobus）レクチン（２０μｇ／ｍＬ緩衝液Ａ；２００μＬ）を、暗所で４℃にて１時間にわたり、ウェル中でインキュベートした。次いで、ウェルを、ＱＨ２Ｏで５回（２００μＬ）洗浄し、蛍光を、励起波長４８５ｎｍ及び発光波長５３５ｎｍで測定した。
【０２３２】
エリスリナ・クリスタガリ（Erythrina cristagalli）レクチン結合：ＱＨ２Ｏで洗浄した後、ウェルを、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５／０．１％ツイーン−２０を含有する１５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液（緩衝液Ａ；２００μＬ）で４℃にて１時間にわたりブロックした。次いで、緩衝液を取り除き、フルオレセイン標識のエリスリナ・クリスタガリ（E. cristagalli）（５μｇ／ｍＬ緩衝液Ａ；２００μＬ）を、暗所で４℃にて１時間にわたり、ウェル中でインキュベートした。次いで、ウェルを、ＱＨ２Ｏで５回（２００μＬ）洗浄し、蛍光を、励起波長４８５ｎｍ及び発光波長５３５ｎｍで測定した。
【０２３３】
結果
このディスプレー法の生物学的適用性を特徴付けるため、レクチン結合研究を行った。２つのレクチン（糖認識タンパク質）、即ちＲ−ｌ−フコースを認識するロツス・テトラゴノロブス（Lotus tetragonolobus）レクチン（ＬＴＬ）、及びガラクトースを認識するエリスリナ・クリスタガリ（Erythrina cristagalli）（ＥＣ）を用い、結合している炭水化物を研究した。両レクチンを、簡単な単糖フコース−Ｏ（ＣＨ２）２−Ｎ３及びガラクトース−Ｏ（ＣＨ２）２−Ｎ３でアッセイすることに成功した。
【実施例９】
【０２３４】
乳癌抗原の同定及び特徴付け
本実施例は、乳癌患者の８５％に存在する乳癌細胞と結合するモノクローナルＭＢｒ１抗体によって認識される抗原性エピトープの分析について説明する。
【０２３５】
Ｇｌｏｂｏ  Ｈ類縁体２０１〜２０４を合成し、マイクロアレイプラットフォーム上に結合させた。
【０２３６】
【化３２】
2008504531.tif 000046
【０２３７】
２種の異なる固定化方法を用いて糖を分析するため、アミノ官能基付き誘導体（２０１〜２０４ａ）及び対応するアジド類縁体（２０１〜２０４ｂ）を調製した。マイクロアレイ分析の他に、構造確認を提供するための分析的配列決定のために、蛍光タグ付きＧｌｏｂｏ  Ｈ誘導体を作製した。この方法は、生物学的リガンドの構造を決定するための従来のＮＭＲをベースとした研究の補完物の役割を果たす。これらのマイクロアレイと配列決定ツールの組合せは、Ｇｌｏｂｏ  Ｈの重要な炭水化物エピトープ及び対応するモノクローナル抗体結合パートナー、ＭＢｒ１との相互作用の完全な特徴付けを可能にした。
【０２３８】
材料及び方法
一般。すべての化学物質は、購入してさらに精製することなく使用した。ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）は、水素化カルシウム上で蒸留した。ジエチルエーテル（Ｅｔ２Ｏ）は、ナトリウム上で蒸留した。グリコシル化に使用したモレキュラーシーブ（ＭＳ、ＡＷ−３００）は、使用前に粉砕して活性化させた。反応は、シリカゲル６０Ｆ２５４プレート上の分析的ＴＬＣでモニターし、ＵＶ（２５４ｎｍ）下、及び／又は酸性モリブデン酸セリウムアンモニウムによる染色により可視化した。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、シリカゲル（３５〜７５μｍ）又はＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ  ＲＰ１８上で行った。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、Bruker社製ＤＲＸ−５００（５００ＭＨｚ）又はＤＲＸ−６００（６００ＭＨＺ）分光計で２０℃にて記録した。化学シフト（ｐｐｍ単位）は、重水素化クロロホルム中のテトラメチルシラン（δ＝０ｐｐｍ）か重水中のアセトン（δ＝２．０５ｐｐｍ）のどちらかと比べて決定した。Ｈｚ単位の結合定数は、一次元スペクトルから測定した。１３Ｃ  Ａｔｔａｃｈｅｄ  Ｐｒｏｔｏｎ  Ｔｅｓｔ（１３Ｃ−ＡＰＴ）ＮＭＲスペクトルは、同じBruker社製ＮＭＲ分光計（１２５又は１５０ＭＨｚ）を用いることにより取得し、ＣＤＣｌ３（δ＝７７ｐｐｍ）で較正した。結合定数（Ｊ）は、Ｈｚで報告する。分裂パターンは、以下の略語、即ち、ｓ、一重線；ｂｒｓ、幅広い一重線；ｄ、二重線；ｔ、三重線；ｑ、四重線；ｍ、多重線を使用することにより記載する。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、この順、即ち化学シフト、多重度、プロトン数、結合定数の順で報告する。
【０２３９】
保護されたＧｌｏｂｏ  Ｈ（２０８）のワンポット合成
Ｇｌｏｂｏ  Ｈ（２０８）を以下の通り合成し、脱保護してグリカン２０４ａ及び２０４ｂを作製した。
【０２４０】
【化３３】
2008504531.tif 000047
【０２４１】
フコシル供与体２０５（１１８ｍｇ、１．２当量）、二糖ビルディングブロック２０６（２００ｍｇ、１当量）、及びＭＳを、ＣＨ２Ｃｌ２（７ｍｌ）中、室温にて１時間攪拌した。反応物を−５０℃まで冷却し、ＮＩＳ（４９ｍｇ、１．２当量）と、続いてＴｆＯＨ（１Ｍエーテル溶液、０．０５４ｍｌ、０．３当量）を加えた。混合物を−４０〜−５０℃にて２時間攪拌し、反応を、完了するまでＴＬＣにより追跡した。三糖２０７（２６３ｍｇ、１．０当量）をＣＨ２Ｃｌ２（１．５ｍｌ）に溶かし、反応混合物に加えた。次いで、ＮＩＳ（４９ｍｇ、１．２当量）と、続いてＴｆＯＨ（１Ｍエーテル溶液、０．０１５ｍｌ、０．１６当量）を加えた。反応物を−３０℃にて２時間攪拌し、次いで、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、数滴のトリエチルアミンでクエンチした。次に、反応混合物を、飽和水性ＮａＨＣＯ３及び飽和水性Ｎａ２Ｓ２Ｏ３で洗浄し、次いで、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。カラムクロマトグラフィー（１：１：０．１〜１：１：０．４  ヘキサン：ＣＨ２Ｃｌ２：ＥｔＯＡｃ）により精製すると、白色の泡として２０８（４２９ｍｇ、０．１５１ｍｍｏｌｅ、８３％）が得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）ｄ７．９６（ｄｔ，４Ｈ，Ｊ＝１．４５，９．５０Ｈｚ）、７．４８〜７．３７（ｍ，６Ｈ）、７．３６〜７．１３（ｍ，６７Ｈ）、７．０８〜６．９７（ｍ，８Ｈ）、６．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．２Ｈｚ）、５．６２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．６Ｈｚ）、５．５３（ｄ，１Ｈ，１＝２．２Ｈｚ）、５．２４（ｓ，１Ｈ）、５．１３〜５．０６（ｍ，５Ｈ）、５．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５Ｈｚ）、４．９７〜４．９０（ｍ，２Ｈ）、４．８８〜４．６６（ｍ，７Ｈ）、４．６４〜４．５５（ｍ，４Ｈ）、４．５４〜４．２８（ｍ，１５Ｈ）、４．２７〜４．２２（ｍ，３Ｈ）、４．１９〜３．９６（ｍ，９Ｈ）、３．９５〜３．５４（ｍ，１３Ｈ）、３．５１〜３．４５（ｍ，２Ｈ）、３．４１〜３．２２（ｍ，１０Ｈ）、３．１４〜３．０７（ｍ，２Ｈ）、１．６６〜１．５７（ｍ，２Ｈ）、１．５２〜１．４３（ｍ，２Ｈ）、１．４１〜１．３０（ｍ，２Ｈ）、０．７８（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝５．９Ｈｚ）。１３Ｃ−ＡＰＴ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）ｄ１６５．９、１６５．１、１５６．３、１５３．７、１３９．３、１３９．１、１３９．０、１３８．７２、１３８．７、１３８．６、１３８．３、１３８．２６、１３８．２、１３８．１、１３８．０、１３７．９、１３６．６、１２９．８、１２９．６、１２９．５９、１２９．５、１２９．０、１２８．５、１２８．４、１２８．３、１２８．２、１２８．１８、１２８．１、１２７．９、１２７．８、１２７．７９、１２７．７７、１２７．６、１２７．５４、１２７．５、１２７．４、１２７．３９、１２７．２３、１２７．２、１２７．１、１２７．０、１２６．７、１２６．２、１０３．９、１０３．４、１０３．１、１０．９、１００．４、９６．６、８２．８、８１．９、８１．４、８１．０、７９．３、７８．８、７７．５、７７．１、７５．０、７４．９、７４．７、７４．６６、７４．０、７３．８、７３．７、７３．６、７３．５、７３．１、７２．９、７２．８、７２．７、７２．４、７２．��、７１．８、７１．０、７０．３、６９．６、６９．０、６８．６、６８．５、６７．４、６６．９、６６．５、６３．０、６２．９、５５．７、４０．９、２９．７、２９．６、２９．３、２３．３、１６．４。単位ＭＳ：Ｃ１６４Ｈ１７１Ｃｌ３Ｎ２Ｏ３５Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値：２８５６  実測値：２８５６。
【０２４２】
保護された四糖（２１１）
保護された四糖（２１１）を以下の通り作製して脱保護し、グリカン２０３ａ及び２０３ｂを作製した。
【０２４３】
【化３４】
2008504531.tif 000048
【０２４４】
ＭＳをマイクロ波により活性化し、高真空中で一夜火力乾燥した。無水ＣＨ２Ｃｌ２中の供与体２１０（５４ｍｇ、１．５当量）及び受容体２０９（１３．７ｍｇ、１当量）にモレキュラーシーブを加え、反応物を室温にて１時間攪拌した。反応混合物を０℃まで冷却し、次いで、新たに合成したＤＭＴＳＴ（６当量）を加えた。反応物を０℃にて２時間攪拌し、次いで、トリエチルアミンでクエンチした。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、セライトパッドに通して濾過した。有機層を、飽和ＮａＨＣＯ３及び食塩水で洗浄し、次いで、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を、シリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝３：１〜１；１）により精製すると、生成物（３６．３ｍｇ、７６％）が得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．０８〜７．９５（ｍ，４Ｈ）、７．５９〜６．９５（ｍ，５１Ｈ）、５．５８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．６Ｈｚ）、５．３６（ｓ，１Ｈ）、５．０９（ｓ，２Ｈ）、４．８８〜４．７０（ｍ，６Ｈ）、４．６０〜４．２５（ｍ，１６Ｈ）、４．１０〜３．８７（ｍ，９Ｈ）、３．８３〜３．７６（ｍ，２Ｈ）、３．６５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．７５Ｈｚ）、３．６１〜３．５１（ｍ，３Ｈ）、３．５０〜３．３８（ｍ，３Ｈ）、３．３６〜３．１０（ｍ，２Ｈ）、３．２１〜３．１３（ｍ，２Ｈ）、１．６０〜１．４７（ｍ，４Ｈ）、１．３９〜１．３１（ｍ，２Ｈ）、０．８９（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ−ＡＰＴ  ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６５．９、１６５．３、１５６．３、１５４．０、１３８．９、１３８．７、１３８．２４、１３８．２、１３７．９３、１３７．９、１３６．６、１３３．１５、１３３．１、１２９．９、１２９．８、１２９．６、１２８．５、１２８．４、１２８．３７、１２８．３２、１２８．３、１２８．２、１２８．１１、１２８．１、１２８．０、１２７．９、１２７．８５、１２７．７３、１２７．７、１２７．６、１２７．５６、１２７．４、１２７．３７、１２７．２、１２７．１、１２７．０７１７、１２７．０、１２６．７、１２６．３、１２６．２、１２３．８、１０１．７、１００．６、９７．９、９６．６、９５．７、８２．８、７８．９、７７．５、７７．４、７４．９、７４．７、７４．６、７４．１、７４．０、７３．６、７３．４、７３．０、７２．９、７２．８６、７２．８、７２．４、７２．２、７１．６、７０．４、６９．０、６８．４、６７．９、６７．３、６６．５、６３．２、６２．６、５５．７、４０．９、２９．７、２９．６、２８．８、２３．３、１６．４。ＨＲＭＳ：Ｃ１１０Ｈ１１５Ｃｌ３Ｎ２Ｏ２５Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値：１９９１．６７４６、実測値：１９９１．６７７６。
【０２４５】
保護された三糖（２１２）
保護された三糖（２１２）を以下の通り作製して脱保護し、グリカン２０２ａ及び２０２ｂを作製した。
【０２４６】
【化３５】
2008504531.tif 000049
【０２４７】
ＭＳをマイクロ波により活性化し、高真空中で一夜火力乾燥した。無水ＣＨ２Ｃｌ２中の供与体２１０（１０９．６ｍｇ、１当量）及び受容体（２０．６ｍｇ、１．２当量）にモレキュラーシーブを加え、反応物を室温にて１時間攪拌した。反応混合物を０℃まで冷却し、次いで、新たに合成したＤＭＴＳＴ（６当量）を加えた。反応物を０℃にて２時間攪拌し、次いで、トリエチルアミンでクエンチした。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、セライトパッドに通して濾過した。有機層を、飽和ＮａＨＣＯ３及び食塩水で洗浄し、次いで、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を、シリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝９：１〜２；１）により精製すると、生成物（８９．８ｍｇ、７６％）が得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．０８〜７．９５（ｍ，４Ｈ）、７．５９〜７．０１（ｍ，４１Ｈ）、５．５８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０６Ｈｚ）、５．０８（ｓ，２Ｈ）、４．８７〜４．７２（ｍ，５Ｈ）、４．６４〜４．５２（ｍ，６Ｈ）、４．４８〜４．３２（ｍ，９Ｈ）、４．１３〜４．０４（ｍ，２Ｈ）、３．９７〜３．８９（ｍ，２Ｈ）、３．８７〜３．７２（ｍ，４Ｈ）、３．６４〜３．５８（ｍ，１Ｈ）、３．５７〜３．３８（ｍ，５Ｈ）、３．１８〜３．０９（ｍ，２Ｈ）、１．６１〜１．４９（ｍ，２Ｈ）、１．４７〜１．３９（ｍ，２Ｈ）、１．３５〜１．２８（ｍ，２Ｈ）、０．９９（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ−ＡＰＴ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６６．０、１６５．２、１５６．３、１５４．１、１３９．０、１３８．７、１３８．６、１３８．３、１３８．１、１３７．９、１３６．６、１３３．１、１３３．０、１２９．９６、１２９．８、１２９．７、１２９．５、１２８．４、１２８．３８、１２８．２、１２８．１４、１２８．１、１２８．０７、１２８．０、１２７．９、１２７．８、１２７．７、１２７．６８、１２７．６、１２７．４、１２７．３、１２７．２、１２７．１、１２６．７、１０２．８、１０１．０、９６．７、８３．１、７９．１、７７．６、７６．６、７４．６、７４．３、７４．１、７３．７、７３．５、７２．９、７２．８６、７２．６、７２．２、７１．８、７０．１、６９．８、６８．７、６７．２、６６．５、６３．０、５５．４、４０．９、２９．６、２９．５、２９．０、２３．０、１６．４。ＨＲＭＳ：Ｃ９０Ｈ９５Ｃｌ３Ｎ２Ｏ２０Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値：１６５１．５４３６  実測値：１６５１．５４８３。
【０２４８】
保護された二糖（２１４）
保護された四糖（２１４）を以下の通り作製して脱保護し、グリカン２０１ａ及び２０ｂｂを作製した。
【０２４９】
【化３６】
2008504531.tif 000050
【０２５０】
ＭＳをマイクロ波により活性化し、高真空中で一夜火力乾燥した。１，４−ジオキサン：ＣＨ２Ｃｌ２＝１：２溶液６ｍＬ中の供与体２０５（４７１．５ｍｇ、１．２当量）及び受容体２１３（４２８．７ｍｇ、１当量）に、室温にてモレキュラーシーブを加え、次いで、反応物を１時間攪拌した。反応混合物を−４０℃まで冷却し、次いで、ＮＩＳ（１．２当量）及びＴｆＯＨ（０．２当量）を加えた。反応物を２時間で−２０℃まで温めた。反応物を、飽和重炭酸ナトリウム及びチオ硫酸ナトリウムでクエンチした。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、セライトパッドに通して濾過した。有機層を、飽和ＮａＨＣＯ３、チオ硫酸ナトリウム及び食塩水で洗浄し、次いで、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を、シリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝４：１〜１；１）により精製すると、生成物（α異性体２５４．０ｍｇ、３９％、β異性体１２６．１ｍｇ、２０％）が得られた。α異性体：１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．５１〜６．９５（ｍ，３５Ｈ）、５．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６５Ｈｚ）、５．０７（ｓ，２Ｈ）、４．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．３５Ｈｚ）、４．８６〜４．７４（ｍ，４Ｈ）、４．６６〜４．３７（ｍ，９Ｈ）、４．２１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５５Ｈｚ，８．０５Ｈｚ）、４．０３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，３．６５Ｈｚ）、３．９８〜３．９１（ｍ，２Ｈ）、３．８４（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，８．８Ｈｚ）、３．７２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，２．２Ｈｚ）、３．６６（ｓ，１Ｈ）、３．６２〜３．５４（ｍ，３Ｈ）、３．３９（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，８．８Ｈｚ）、３．１２（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）、１．６１〜１．３７（ｍ，４Ｈ）、１．３２〜１．２２（ｍ，２Ｈ）、１．１１（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．７５Ｈｚ）。１３Ｃ−ＡＰＴ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１５６．３、１３８．９、１３８．７、１３８．３、１３８．２、１３７．８、１３６．５、１２８．４、１２８．４、１２８．３、１２８．２、１２８．１、１２８．０、１２７．９、１２７．８７、１２７．８、１２７．７、１２７．５、１２７．３、１２７．２９、１２７．２、１２７．１７、１２６．２、１０２．０、９７．１、８４．３、７９．５、７７．９、７５．６、７４．６、７４．３、７３．５、７３．２、７２．９、７２．５、７２．２、７１．９、７１．２、６９．２、６８．８、６６．５、６６．１、４０．９、２９．７、２９．３、２３．２、１６．５。ＨＲＭＳ：Ｃ６７Ｈ７５ＮＯ１２Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値：１１０８．５１８１  実測値：１１０８．５１７１。
【０２５１】
Ｇｌｏｂｏ  Ｈ（２０４ａ）、四糖（２０３ａ）、及び三糖（２０２ａ）の脱保護の一般手順
完全に保護されたオリゴ糖を酢酸に溶かす。ナノサイズの活性化されたＺｎ粉末（Aldrich社製）を加え、反応物を１時間激しく攪拌した。反応物を濾過し、溶媒を除去した。次いで、粗製の残渣をピリジン及び無水酢酸に溶かし、触媒量のＤＭＡＰを加えた。一夜攪拌した後、反応物をメタノールでクエンチし、溶媒を除去した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２に溶かし、２％ＨＣｌ、飽和水性ＮａＨＣＯ３、及び食塩水で洗浄した。溶媒の除去後、粗製材料をメタノール（２ｍｌ）及びＣＨ２Ｃｌ２（２ｍｌ）に溶かした。次いで、ＮａＯＭｅ溶液を加え、反応物を２時間攪拌した。反応物をＤＯＷＥＸ  ５０ＷＸ２−２００で中和し、濾過し、溶媒を除去した。次いで、材料を、メタノール中の５％ギ酸に溶かし、Ｐｄ黒を加えた。フラスコを水素で３回パージし、次いで、水素雰囲気中で一夜攪拌した。反応物をＮＨ４ＯＨで中和し、セライトに通して濾過し、濃縮した。生成物を、カラムクロマトグラフィー（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ  Ｒ１８、水〜１０％ＭｅＯＨ）により精製すると、白色の固体として生成物が得られた。
化合物２０４ａ：１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ５．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０４Ｈｚ）、４．８７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０３Ｈｚ）、４．５９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．７１Ｈｚ）、４．５２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．７０Ｈｚ）、４．４９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．７０Ｈｚ）、４．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０７Ｈｚ）、４．３７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）、４．２４〜４．１８（ｍ，２Ｈ）、４．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８３Ｈｚ）、４．０１（ｄ，１Ｈ，３．３Ｈｚ）、３．９９〜３．５３（ｍ，３３Ｈ）、３．２８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）、２．９８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．５２Ｈｚ）、２．０２（ｓ，３Ｈ）、１．７１〜１．６０（ｍ，４Ｈ）、１．４７〜１．４０（ｍ，２Ｈ）、１．１９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，）。１３Ｃ−ＡＰＴ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ１７５．９、１０５．６、１０５．０、１０３．７、１０３．６、１０２．１、１００．９、８０．４、７９．９、７８．８、７８．０、７７．４、７７．１、７６．７、７６．４、７６．３、７６．２、７５．２、７４．６、７３．７、７３．５、７２．５、７１．８、７１．７、７１．１４、７１．１、７０．８、７０．７、７０．１、６９．７、６９．５、６８．４、６２．６、６２．５９、６２．０、６１．７、５３．３、４１．０、２９．８、２８．１、２３．９、２３．７、１７．０  ＭＡＬＤＩ−ＦＴＭＳ  Ｃ４３Ｈ７６Ｎ２Ｏ３０［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値  １１０１．４５５５、実測値  １１０１．４５２５。
化合物２０３ａ：１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ５．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９６Ｈｚ）、４．７３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９６Ｈｚ）、４．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４４Ｈｚ）、４．３９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４４Ｈｚ）、４．０８（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝６．５４Ｈｚ）、４．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ）、３．９５（ｓ，１Ｈ）、３．８４〜３．７２（ｍ，５Ｈ）、３．７０〜３．５３（ｍ，１２Ｈ）、３．５２〜３．４６（ｍ，３Ｈ）、３．３９〜３．３５（ｍ，１Ｈ）、２．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）、１．８９（ｓ，３Ｈ）、１．５８〜１．４７（ｍ，４Ｈ）、１．３８〜１．２８（ｍ，２Ｈ）、１．０６（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）。１３Ｃ−ＡＰＴ  ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ１７５．０２、１０４．６、１０２．７、９９．９、９９．１、７９．３、７７．０、７６．８、７５．７、７５．３、７４．２、７２．５、７２．２、７１．０、７０．２、６９．７、６９．１、６８．７、６８．４、６８．３、６７．４、６１．８、６１．６、５２．３、４０．０、２８．７、２７．１、２３．０、２２．９、１６．０。ＨＲＭＳ：Ｃ３１Ｈ５６Ｎ２Ｏ２０Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値：７９９．３３１８  実測値：７９９．３３２３
化合物２０２ａ：１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ５．１４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０５Ｈｚ）、４．５１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ）、４．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ）、４．１３（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）、４．０１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．６Ｈｚ）、３．９０〜３．７８（ｍ，４Ｈ）、３．７６〜３．５９（ｍ，８Ｈ）、３．５８〜３．５０（ｍ，３Ｈ）、３．４７〜３．４１（ｍ，１Ｈ）、２．８９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）、１．９４（ｓ，３Ｈ）、１．６１〜１．５２（ｍ，２Ｈ）、１．５１〜１．４２（ｍ，２Ｈ）、１．３５〜１．２２（ｍ，２Ｈ）、１．１１（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）。１３Ｃ−ＡＰＴ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ１７４．３、１０３．４、１０２．８、９９．８、７７．４、７６．６、７５．７、７５．５、７４．２、７２．５、７０．７、７０．２、６９．８、６９．２、６８．７、６７．５、６１．７、６１．６、５２．１、４０．０、２８．８、２７．０、２２．９、２２．８、１５．９。ＨＲＭＳ：Ｃ２５Ｈ４７Ｎ２Ｏ１５［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：６１５．２９７１  実測値：６１５．２９７６。
【０２５２】
二糖（２０１ａ）の脱保護の手順
完全に保護された二糖２１４  １９０ｍｇを、メタノール中の５％ギ酸（３ｍｌ）に溶かし、Ｐｄ黒（１５０ｍｇ）を加えた。フラスコを水素で３回パージし、次いで、水素雰囲気中で一夜攪拌した。反応物をＮＨ４ＯＨで中和し、セライトに通して濾過し、濃縮した。生成物を、カラムクロマトグラフィー（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ  Ｒ１８、水〜１０％ＭｅＯＨ）により精製すると、白色の固体２０１ａ（４２．３ｍｇ、５９％）が得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ５．１２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０５Ｈｚ）、４．３７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０５Ｈｚ）、４．２０（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）、３．８７〜３．７７（ｍ，２Ｈ）、３．７６〜３．６８（ｍ，２Ｈ）、３．６７〜３．５２（ｍ，６Ｈ）、３．４６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，９．５Ｈｚ）、２．８８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ）、１．６２〜１．５１（ｍ，４Ｈ）、１．３７〜１．２８（ｍ，２Ｈ）、１．０９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）。１３Ｃ−ＡＰＴ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ１０２．２、１００．１、７７．５、７４．４、７２．５、７０．７、７０．２、６９．６、６９．０、６７．５、６１．６、４０．０、２９．１、２７．２、２２．９、１６．１。ＨＲＭＳ：Ｃ１７Ｈ３３ＮＯ１０Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値：４３４．１９９７  実測値：４３４．１９８８。
【０２５３】
ジアゾ転移反応の一般手順
アジ化ナトリウム（２０当量）を最少量の水に溶かし、０℃まで冷却した。等容積のジクロロメタンを加え、激しく攪拌した溶液に無水トリフルオロメタンスルホン酸（１０当量）をゆっくりと加えた。反応物を０℃にて２時間攪拌した。次いで、飽和重炭酸ナトリウムを加え、反応をクエンチした。混合物をジクロロメタンで２回抽出した。合わせた有機層を飽和重炭酸ナトリウムで１回洗浄し、その溶液を、さらに精製することなく次の反応に使用した。
【０２５４】
基質及び０．１当量のＣｕＳＯ４を、添加するアジ化トリフリル溶液の容積と同じ容積の水に溶かした。トリエチルアミン（３モル当量）を混合物に加えた。アジ化トリフリルの新たに調製したジクロロメタン溶液を、激しく攪拌しながら一度に加えた。メタノールを加え、水：メタノール：ジクロロメタンの望ましい３：１０：３の比とした。溶液を一夜攪拌した。反応物を蒸発させて残渣とし、次いで、カラムクロマトグラフィーにより精製した。
化合物２０４ｂ：１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９６Ｈｚ）、４．７５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９６Ｈｚ）、４．４８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８６Ｈｚ）、４．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４４Ｈｚ）、４．３７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４４Ｈｚ）、４．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２８Ｈｚ）、４．２６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）、４．１４〜４．０７（ｍ，２Ｈ）、３．９７（ｂｒ，ｓ，１Ｈ）、３．８９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０６Ｈｚ）、３．８７〜３．７４（ｍ，７Ｈ）、３．７３〜３．４３（ｍ，２４Ｈ）、３．２０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９６Ｈｚ）、３．１６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．３４Ｈｚ）、１．９０（ｓ，３Ｈ）、１．５９〜１．４５（ｍ，４Ｈ）、１．３６〜１．２４（ｍ，２Ｈ）、１．０８（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）。１３Ｃ−ＡＰＴ  ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ１７５．１、１０４．８、１０４．１、１０２．８２、１０２．８０、１０１．２、１００．１、７９．５、７９．１、７７．９、７７．１、７６．９、７６．３、７５．９、７５．６、７５．４、７５．３、７４．４、７３．８、７２．９、７２．７、７１．６、７０．９、７０．３、７０．０、６９．９、６８．８、６８．６、６７．６、６２．２、６１．８、６１．１、５２．４、５１．９、５０．５、２９．１、２８．５、２３．４、２２．８、１６．１。ＨＲＭＳ：Ｃ４３Ｈ７４Ｎ４Ｏ３０Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値：１１４９．４２８０  実測値：１１４９．４２１５。
化合物２０３ｂ：１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．５Ｈｚ）、４．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ）、４．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）、４．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）、４．０９（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝６．５４Ｈｚ）、４．０５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．２２Ｈｚ）、３．９６（ｓ，１Ｈ）、３．８７〜３．７３（ｍ，５Ｈ）、３．７１〜３．５４（ｍ，１２Ｈ）、３．５３〜３．４７（ｍ，３Ｈ）、３．４１〜３．３６（ｍ，１Ｈ）、３．２０（ｄｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．０２Ｈｚ，６．１２Ｈｚ）、１．９０（ｓ，３Ｈ）、１．５８〜１．４７（ｍ，４Ｈ）、１．３７〜１．２８（ｍ，２Ｈ）、１．０８（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）。１３Ｃ−ＡＰＴ  ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ１７５．１、１０４．６、１０２．７、１００．０、９９．１、７９．４、７７．１、７６．８、７５．８、７５．３、７４．２、７２．９、７２．５、７１．１、７０．２０、７０．１９、６９．８、６９．２、６８．６、６８．３、６７．５、６１．８、６１．７、５２．４、５１．７、２８．８、２８．５、２３．４、２２．９、１６．０。ＨＲＭＳ：Ｃ３１Ｈ５４Ｎ４Ｏ２０Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値：８２５．３２２３  実測値：８２５．３２３２。
化合物２０２ｂ：１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ５．１０（ｄ，１Ｈ  Ｊ＝３．４８Ｈｚ）、４．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４４Ｈｚ）、４．１８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８６Ｈｚ）、４．１０（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）、３．９７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．７４Ｈｚ）、３．８７〜３．７３（ｍ，４Ｈ）、３．７２〜３．５５（ｍ，８Ｈ）、３．５４〜３．４７（ｍ，３Ｈ）、３．４２〜３．３７（ｍ，１Ｈ）、３．２３〜３．１５（ｍ，２Ｈ）、１．９１（ｓ，３Ｈ）、１．５０〜１．３９（ｍ，４Ｈ）、１．２８〜１．１９（ｍ，２Ｈ）、１．０８（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）。１３Ｃ−ＡＰＴ  ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ１７４．３、１０３．４、１０２．８、９９．８、７７．４、７６．６、７５．７、７５．５、７４．２、７２．５、７０．７、７０．２、６９．８、６９．２、６８．７、６７．５、６１．７、６１．６、５２．１、４０．０、２８．８、２７．０、２２．９、２２．８、１５．９。ＨＲＭＳ：Ｃ２５Ｈ４４Ｎ４Ｏ１５Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値：６６３．２６９５  実測値：６６３．２６８９。
化合物２０１ｂ：１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ５．１２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６５Ｈｚ）、４．３５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ）、４．２１（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）、３．８２〜３．５１（ｍ，１０Ｈ）、３．４５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５５Ｈｚ，８．０５Ｈｚ）、３．２０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．７５Ｈｚ）、１．５８〜１．４５（ｍ，４Ｈ）、１．３５〜１．２４（ｍ，２Ｈ）、１．０８（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）。１３Ｃ−ＡＰＴＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ１０２．１、１００．０、７７．２、７５．６、７４．５、７２．５、７０．９、７０．２、６９．６、６９．０、６７．４、６１．６、５１．７、２９．２、２８．５、２３．３、１６．１。ＨＲＭＳ：Ｃ１７Ｈ３１Ｎ３Ｏ１０Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値：４６０．１９０２  実測値：４６０．１８９９。
【０２５５】
２０１〜２０４ａのＧｌｏｂｏ  Ｈ誘導体のマイクロアレイ分析：
ＮＨＳがコーティングされたスライドガラスに、各グリッド内に水平方向に置かれている１０個の複製物と合わせて下から上へ５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０及び１００μＭの濃度で糖２０１〜２０４ａのメタノール溶液をスポットした。この結合手順を図１２に説明する。スライドをＰＢＳ緩衝液で１分間洗浄した。
【０２５６】
次に、マウス由来のＭＢｒ１抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈモノクローナル抗体（ＩｇＭ）（Alexis Bichemicals社製）の７０μｇ／ｍＬ溶液１００μＬを０．０５％ツイーン２０／ＰＢＳ緩衝液中で作製した。この溶液を、糖のプリントされたグリッドの下に添加し、次いで、カバーグラスの装着により広げた。ガラス加湿チャンバー中のインキュベーションを、１時間振盪しながら行った。この後、スライドを、０．０５％ツイーン２０／ＰＢＳ緩衝液で５回、ＰＢＳ緩衝液で５回及び水で５回洗浄した。次に、ＦＩＴＣタグ付きヤギ抗マウス抗体（Cal Biochem社製）の７０μｇ／ｍＬ溶液２００μＬを作製し、前のようにスライドに添加した。振盪しながら、加湿チャンバーインキュベーションをホイルの下で１時間行った。この後、スライドを、もう一度０．０５％ツイーン２０／ＰＢＳ緩衝液で５回、ＰＢＳ緩衝液で５回及び水で５回洗浄し、次いで、窒素で乾燥した。次いで、蛍光スキャンをスライド上で行った。得られた画像を、グリッド内のすべてのスポットの蛍光の場所を見つけて定量するためのプログラムImageneを用いて分析した。このデータを、糖をプリントするのに使用した溶液の濃度に対してプロットし、炭水化物−抗体結合曲線を得た。
【０２５７】
ジスルフィドリンカー固定化（タイプ２１７の）：ジスルフィドリンカー２１５のＢＯＣで保護された誘導体（３．９ｍｇ、１３．５μｍｏｌ）をジクロロメタン１ｍＬに溶かし、トリフルオロ酢酸１ｍＬを加えた。反応物を１時間攪拌し、次いで、ロータリー蒸発による溶媒除去を介して反応を停止させた。次いで、残りのトリフルオロ酢酸を、メタノール及びベンゼンと２回共沸させることにより除去した。脱保護されたリンカー（２１５）の１ｍＭ溶液を調製した。アジドで修飾された糖のサンプルを秤量し（２０１ｂの場合は１ｍｇ）、１当量の２つの出発材料が存在するように、リンカー溶液を各糖（２１０ｂの場合は２．２９ｍＬ）に加えた。スパチュラ先端のヨウ化銅を加え、反応物を一夜攪拌した。翌日、メタノールを除去し、水を添加することにより１ｍＭ保存溶液を作製した。これらの溶液を固体表面上にスポットし、２１０〜２０４ａと平行して分析した。この反応を図１２に示す。
【０２５８】
結果
切断型のＧｌｏｂｏ  Ｈ類縁体２０１〜２０４を、マイクロアレイ分析を用いてＭＢｒ１との結合を評価することができるように、オリゴ糖合成のためのワンポットのプログラム可能なプロトコルを用いて調製した。これらの類縁体は、順に切り取られた糖を有する天然糖脂質の糖ドメインを含む。さらに、ペンタミン又はペンタジド（pentazide）リンカーを、ＮＨＳがコーティングされたグラススライドとの共有結合を介し、固定化のための還元末端に含めた。発明者は、以前にＧｌｏｂｏ  Ｈのワンポットのプログラム可能な合成を報告している。Burkhart et al. (2001) Angew. Chem. Int. Ed. 40, 1274-+。上記に記載されているように、この研究には新たな合成戦略を用いた。２つのワンポット反応を用いる代わりに、新規な［１＋２＋３］アプローチを用いる単一のワンポット反応で全六糖を構築した。最も困難なα１−４−ガラクトース−ガラクトース結合の形成は、ワンポット反応の収率を前方に改善した（以前の戦略の６２％に対して８３％）。三糖ビルディングブロックも、すべてのＧｌｏｂｏファミリーオリゴ糖の合成において役立つ。
【０２５９】
四糖、三糖、及び二糖類縁体の合成は、完全なＧｌｏｂｏ  Ｈ六量体と同じビルディングブロックを使用した。三糖２１０のガラクトースビルディングブロック２０９又はリンカーＮ−Ｃｂｚ−５−ヒドロキシルペンタミンとのカップリングは、上記に記載したように、それぞれ四糖２１１又は三糖２１２を与えた。ガラクトースビルディングブロック２１３及びフコースビルディングブロック２０５のカップリングは、上記に記載したような二糖２１４を与えた。Ｇｌｏｂｏ  Ｈ六糖２０８、四糖２１１、及び三糖２１２の脱保護は、活性化Ｚｎ粒子及び酢酸を用いるＴｒｏｃ基の除去から始まった。その後に、無水酢酸及びピリジンによるアミン基のアセチル化が続く。ベンゾエート基は、メタノール中のナトリウムメトキシドで除去した。ベンジルエーテル、ベンジリデンアセタール及びＮ−Ｃｂｚ基の最後の脱保護は、１気圧水素中で５％ギ酸／メタノール中のＰｄ黒を用いて行った。これは、完全に脱保護されたＧｌｏｂｏ  Ｈ六糖２０４ａ、四糖２０３ａ及び三糖２０２ａを与えた。上記に記載したようなメタノール中の５％ギ酸中のＰｄ黒による処理を介する二糖２１４の脱保護は、化合物２０１ｂを与えた。ジアゾ転移反応（硫酸銅触媒と一緒のアジ化トリフリル）を用い、脱保護されたオリゴ糖、２０４ａ、２０３ａ、２０２ａ、２０１ａのアミン基を、それぞれ対応するアジド糖２０４、２０３、２０２、２０１に変換した。
【０２６０】
それらの合成後、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ類縁体２０１〜２０４の抗体結合能力を、マイクロアレイプラットフォーム内で検討した。アミノ官能基付きＧｌｏｂｏ  Ｈ類縁体２０１〜２０４ｂを、ＮＨＳがコーティングされたスライドガラス上に直接固定化した。アジド類縁体２０１〜２０４ｂの場合、ジスルフィドリンカー戦略を表面結合について行った。２０１ｂ（図１２）などのアジドは、１，３−双極子環化付加反応と、続く２１７へ固定化するためのＮＨＳマイクロプレート（２１６）上へのスポッティングを介し、ジスルフィドリンカー２１５と組み合わせた。抗体結合曲線作製を可能にするため、糖を一連の濃度でスポットした。アッセイは、最初にモノクローナルマウスＩｇＭ抗体ＭＢｒ１で処理し、続いて、検出のために、フルオレセインタグ付き二次抗体、ヤギ抗マウスＩｇＭと共にインキュベートするものであった。蛍光についてスライドをスキャンすると、図１３に示すような画像が得られ、プリントされたオリゴ糖スポットとの抗体の結合を直接観察することができた。スライドは、上列の左から右へ２０１ａ〜２０４ａ及び下列には２０１ｂ〜２０４ｂがプリントされたグリッド中の糖を含んでいた。初期の視覚分析は、より短いオリゴ糖が、プレート表面への抗体の弱い動員を示すことを示した。
【０２６１】
次いで、図１３に示すような画像を、プログラムImageneを用いて処理すると、各スポットの蛍光を取り囲んで定量することができた。得られたデータを、スポットする間に各位置が受ける糖の濃度に対してプロットした。これにより、２０１ａ〜２０４ａについて図１４に示すような様々な炭水化物−抗体相互作用についての結合曲線が得られた。アミノで誘導体化されたオリゴ糖類縁体２０１ａ〜２０４ａは、ジスルフィドリンカーを介して固定化されたアジド含有部分（２０１ｂ〜２０４ｂ）よりも高い抗体動員特性を与えた。これは、リンカー含有糖の不十分な溶解性、リンカー結合における完全な変換の欠如、又は、単に、より短いリンカーが結合により適していることに起因している可能性がある。アッセイ結果は、抗体結合が、通常、オリゴ糖構造の複雑性とともに増加することを示した。二糖Ｇｌｏｂｏ  Ｈ誘導体２０１ａ及び２０１ｂは、表面への抗体の動員を生じなかった。三糖２０２ａ及び２０２ｂは、完全な天然六糖２０４ａ及び２０４ｂと競合する程ではないが、抗体と結合した。しかしながら、四糖２０３ａ及び２０３ｂは、完全な天然６量体と同様な表面への結合を示し、以下の四糖コア構造が、抗体と結合するのに有効であることを示した。
【０２６２】
【化３７】
2008504531.tif 000051
【０２６３】
式中、Ｒ１は、水素、グリカン又はリンカーである。一部の実施形態において、リンカーは、固体支持体であるか、或いは、固体支持体に結合しうる。
【０２６４】
Ｇｌｏｂｏ  Ｈオリゴ糖エピトープのさらなる特徴付けにおいて、構造確認の目的で分析的配列決定を用いた。この目的で、蛍光タグを含むＧｌｏｂｏ  Ｈ誘導体を調製した。次いで、これを、エンドグリコシダーゼ（図１５Ａ）、α−フコシダーゼ（ウシ腎臓、Sigma社製）、ｂ−１，３−ガラクトシダーゼ（大腸菌（E. coli）からの組換え体、Calbiochem社製）、ｂ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（肺炎連鎖球菌（Streptococcus pseuoniaeからの組換え体）、Prozyme社製）、及びｂ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（タチナタマメ由来、Prozyme社製）による様々な消化にかけた。次に、得られた消化物を蛍光検出によるＨＰＬＣ分析にかけた（図１５Ｂ）。消化から得られたグリカン断片は、予想通りであり、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗原の構造を裏付けた。
【０２６５】
したがって、この研究は、重要な生物学的プロセスに関与している天然リガンドに関する構造情報を得るためのこのアプローチの有効性を示している。
【０２６６】
また、これらの研究は、重要なスフィンゴ糖脂質Ｇｌｏｂｏ  Ｈ上に見出されるオリゴ糖エピトープ及びそのＭＢｒ１抗体との相互作用に関する理解を拡大する。したがって、それらは、抗癌ワクチン開発の進展を支援するはずである。この探究の一態様には、患者において先天性免疫応答をもたらすため、多価表示のための骨格上にＧｌｏｂｏ  Ｈを提示することが必要であった。この目的には、製造のコスト及び効率が、それぞれ減少及び増加するように、免疫原の合成を容易にすることが有利である。
【０２６７】
単純化したＧｌｏｂｏ  Ｈ四糖２０３は、多価フォーマットで２０４と同様の結合親和性を示したが、この化合物の合成経路はより短い。結果として、この誘導体は、抗癌ワクチンの効率的開発及び診断法として前途有望である。癌療法の進歩は、疾患を理解及び治療するためのツールの集積を必要とするはずである。このことは、癌幹細胞の最近の報告並びにこの分野によって示された展望及び挑戦のため、より重要になっている。本明細書に示した配列決定及びマイクロアレイ技法は、分子レベルにおける癌発生に関するプロセスを迅速に特徴付けるための有効な方法を示している。
【実施例１０】
【０２６８】
予備的研究は、２Ｇ１２抗ＨＩＶ抗体が、Ｍａｎ８グリカンと優先的に結合することを示す
この実施例は、２Ｇ１２抗ＨＩＶ抗体が結合するグリカンには、Ｍａｎ８グリカンが含まれることを示す予備的実験について説明する。２Ｇ１２抗体は、（Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２）と結合することが初めて観察された幅広い中和抗体である（Calarese et al. Science 2003, 300, 2065-2071を参照）。
【０２６９】
材料及び方法：
分析に使用する天然の高マンノース型Ｎ−グリカンは、Ｄｉｏｎｅｘ上で、プロナーゼ処理したウシリボヌクレアーゼＢから精製した。各調製物は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより決定されるような単一の分子量種であった。
【０２７０】
スライドガラス上にプリントされたグリカンアレイの構築：炭水化物構造のライブラリーは、上記に記載したような化学合成及び化学酵素合成、並びに天然源により入手した。この化合物ライブラリーは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）反応性の一級アミノ基を含み、マイクロアレイ遺伝子プリンター（ＴＳＲＩ）を用いて市販のＮＨＳ−活性化ガラス表面（Accelr8 Technology Corporation、Denver、ＣＯ）上にプリントされた。
【０２７１】
各グリカンタイプを、様々な濃度（１０〜１００μＭ）でプリントし（約０．５ｎＬ／スポット）、各濃度は６個の複製とした。スライドを、エタノールアミン緩衝液と共にさらにインキュベートし、残ったＮＨＳ官能基を不活性化した。
【０２７２】
マイクロタイタープレート中の切断可能なリンカーグリカンアレイ：図１１に示すような実施例７に記載した切断可能なトリアゾールリンカーを有するマイクロタイターウェル内に固定化されたグリカンを用い、さらに実験を行った。
【０２７３】
２Ｇ１２結合：ＱＨ２Ｏで洗浄した後、ウェルを、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５／０．１％ツイーン−２０を含有する１５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液（２００μＬ）で４℃にて１時間にわたりブロックした。次いで、緩衝液を取り除き、２Ｇ１２（１７μｇ／ｍＬ  ＰＢＳ緩衝液；２００μＬ）を、４℃にて１時間にわたり、ウェル中でインキュベートした。次いで、ウェルを、ＰＢＳ緩衝液（３×；２００μＬ）で洗浄し、フルオレセイン結合のヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（１４μｇ／ｍＬ  ＰＢＳ緩衝液；２００μＬ）を、暗所で４℃にて１時間にわたり、ウェル中でインキュベートした。次いで、ウェルを、ＰＢＳ緩衝液（３×；２００μＬ）で洗浄し、蛍光を、励起波長４８５ｎｍ及び発光波長５３５ｎｍで測定した。
【０２７４】
結果：
２Ｇ１２抗体は、グリカンアレイへの適用前に、二次ヒト抗ＩｇＧ−ＦＩＴＣ（２：１、２０μｇ／ｍＬ）と予め複合体を形成させた（１０分間）。２Ｇ１２抗体とのインキュベーション後、アレイを、緩衝液及び水の中にスライドを浸漬することにより洗浄した。
【０２７５】
結合は、いくつかの合成マンノース含有オリゴ糖及び単離精製したＭａｎ−８  Ｎ−グリカンに対する初期の実験で観察された。２Ｇ１２抗体が結合するグリカンは、以下のどのグリカン構造も有するか、或いはそれらの組合せであった
【０２７６】
【化３８】
2008504531.tif 000052
【０２７７】
式中、各黒丸（●）は、マンノース残基を示す。
【０２７８】
より小レベルの結合が、２Ｇ１２抗体とＭａｎ−９−Ｎ−グリカンの間に観察された。表７に示すように、より簡単な合成グリカンが、Ｍａｎ８グリカンと同様に２Ｇ１２と結合する。しかしながら、ｇｐ１２０の高マンノースグリカンとは違い、より簡単な化合物は、免疫原に対して抗体を生じる免疫応答を引き起こす可能性が高い。また、天然構造は、望ましくない免疫応答を生じる可能性が高くない。実際、酵母マンナンは、マンノースのポリマーであり、ヒトにおける強力な免疫原であり、酵母において組換え治療用糖タンパク質を生産する際の大きな障害になる。
【０２７９】
【表７】
2008504531.tif 000053
【０２８０】
これらの結果は、８個のマンノース残基を有するグリカンが、２Ｇ１２抗ＨＩＶ中和抗体と結合する優れた抗原であることを示している。
【０２８１】
２Ｇ１２抗ＨＩＶ抗体が結合するマンノース含有グリカンのタイプを明らかにするため、切断可能なリンカーアレイを用いてさらに研究を行った。これらの切断可能なリンカー研究は、Ｍａｎα１、２Ｍａｎα１、２Ｍａｎα１、３Ｍａｎ及び／又はＭａｎα１、２Ｍａｎα１、３Ｍａｎα１、２Ｍａｎα１、６Ｍａｎを含むグリカンが、２Ｇ１２に対するマイクロモル親和性の最適なエピトープであることを立証した。一定量の２Ｇ１２抗体と共に漸増量の標識されたＭａｎα１、２Ｍａｎα１、３Ｍａｎα１、２Ｍａｎα１、６Ｍａｎグリカンを用いる結合研究の結果を図１６に示す。構造的に関連するマンノース含有グリカンの２Ｇ１２抗体との結合についてのＫｄ値は、以下のように観察された。
Ｍａｎα１、２Ｍａｎα１、３Ｍａｎα１、２Ｍａｎα１、６Ｍａｎ：Ｋｄ＝０．１μＭ。
Ｍａｎα１、２Ｍａｎα１、２Ｍａｎα１、３Ｍａｎ：Ｋｄ＝０．１μＭ。
Ｍａｎα１、２Ｍａｎα１、２Ｍａｎα１、３（Ｍａｎα１、２Ｍａｎ１、２Ｍａｎ１．６）Ｍａｎ：Ｋｄ＝０．７μＭ。
Ｍａｎα１、２Ｍａｎα１、２Ｍａｎα１、３（Ｍａｎα１、２Ｍａｎ１、３（Ｍａｎα１、２Ｍａｎα１．２Ｍａｎα１．６））Ｍａｎ：Ｋｄ＝１．０μＭ。
【０２８２】
これらの研究は、グリカンＭａｎα１、２Ｍａｎα１、２Ｍａｎα１、３Ｍａｎ及びＭａｎα１、２Ｍａｎα１、３Ｍａｎα１、２Ｍａｎα１、６Ｍａｎを、２Ｇ１２に対するマイクロモル親和性の最適なエピトープであると断定した。さらに、この結果は、本発明の糖アレイの有用性を示している。
【実施例１１】
【０２８３】
２Ｇ１２抗体の炭水化物特異性の分析
新規な抗原、オリゴマンノース７、８及び９（以下及び図１７に示す）を合成し、これらのオリゴマンノースの（ｉ）溶液相ＥＬＩＳＡアッセイ（４）においてｇｐ１２０との２Ｇ１２の結合を阻害する能力及び（ii）マイクロタイタープレートをベースとしたアッセイ又はスライドガラスアッセイにおいて２Ｇ１２と結合する能力を研究することにより探索した。
【０２８４】
【化３９】
2008504531.tif 000054
【０２８５】
さらに、これらの合成オリゴマンノースのうちの４個（４、５、７、及び８、図１７）と結合しているＦａｂ  ２Ｇ１２の結晶構造を決定した。これらの生物化学的、生物物理学的、及び結晶学的結果は、Ｆａｂ  ２Ｇ１２が、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２のＤ１腕とＤ３腕双方の末端Ｍａｎα１−２Ｍａｎを認識できることを示している。これらのデータは、２Ｇ１２が、末端Ｍａｎα１−２Ｍａｎに対して極めて特異的であることを裏付けているが、オリゴマンノース部分の第三位との先に考えられたよりも幅広い結合範囲との関連において、これは、ＨＩＶ−１ワクチンに寄与すると思われる炭水化物をベースとした免疫原の開発を促進する可能性がある。
【０２８６】
材料及び方法：
オリゴマンノース合成：すべての化学物質は、Aldrich社から購入し、さらに精製することなく使用した。ビルディングブロック１０及び１３は、Lee et al. (2004) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43:1000-1003に記載されているように合成した。重要なチオグリコシドビルディングブロック（１２、１６及び１９）、保護されたＭａｎ７１４、Ｍａｎ８１７及びＭａｎ９２０、保護されていないＭａｎ７７、Ｍａｎ８８及びＭａｎ９９、残りの反応中間体１１、１５及び１８の合成についての実験の詳細、並びに７〜９、１１、１２及び１４〜２５についてのすべての特徴付けデータを以下に記載するように示す。
【０２８７】
酵素結合免疫吸着アッセイ。マイクロタイタープレートウェル（平底、Ｃｏｓｔａｒ型３６９０；Corning Inc.社製）を、５０ｎｇ／ウェルのｇｐ１２０ＪＲ−ＣＳＦで４℃にて一夜コーティングした。続くすべての工程は、室温にて行った。次いで、ウェルを、３％（ｍａｓｓ／ｖｏｌ）ＢＳＡで１時間ブロックする前に、マイクロプレートウォッシャー（Skan Wash 400、Molecular Devices社製）を用いてＰＢＳ／０．０５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ツイーン２０（Sigma社製）で４回洗浄した。次いで、１％（ｍａｓｓ／ｖｏｌ）ＢＳＡ／０．０２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ツイーン２０／ＰＢＳ（ＰＢＳ−ＢＴ）で０．５μｇ／ｍＬ（２５ｎｇ／ウェル）まで希釈したＩｇＧ  ２Ｇ１２を、２ｍＭから開始して段階希釈したオリゴマンノースの存在下で、抗原がコーティングされたウェルに２時間で加えた。
【０２８８】
結合していない抗体を、上記に記載したように、４回洗浄することにより除去した。結合している２Ｇ１２は、ＰＢＳ−ＢＴで１：１０００に希釈したアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２抗体（Pierce社製）で検出した。１時間後、ウェルを４回洗浄し、結合している抗体を、ｐ−ニトロフェノールホスフェート基質（Sigma社製）で可視化し、４０５ｎｍでモニターした。
【０２８９】
炭水化物マイクロアレイ分析。９６ウェルのＮＨＳがコーティングされたマイクロタイタープレート（NoAb Biodiscoveries社製）を、５％ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を含有するアミノ官能基付きジスルフィド及びアルキン含有リンカー（スキームＶ）の１ｍＭメタノール溶液２００μＬで処理し、４℃にて一夜インキュベートした。次いで、マイクロタイタープレートを、メタノール２×２００μＬ及び水２×２００μＬで洗浄した。次に、５％ＤＩＥＡ／メタノール中の０〜５００μＭの様々な濃度で、アジド官能基付きオリゴマンノース誘導体２１〜２５の溶液２００μＬを導入した。少量のヨウ化銅（Ｉ）を加え、内容物を４℃にて一夜反応させた。翌日、内容物を取り出し、プレートを、メタノール２×２００μＬ及び水２×２００μＬで洗浄した。次いで、プレートを、ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．５中の０．１％ツイーン２０溶液で４℃にて１時間ブロックし、次いで、ＨＥＰＥＳ緩衝液３×２００μＬで洗浄した。次に、０．１％ツイーン２０／ＰＢＳ緩衝液中の２Ｇ１２抗体の１μｇ／ｍＬ溶液２００μＬを、４℃における１時間のインキュベーションのためにウェルに加え、ＰＢＳ緩衝液２×２００μＬで洗浄した。この時点で、ＦＩＴＣタグ付きヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍＬ、Cal Biochem社製）２００μＬを４℃にて１時間で加え、次いで、ウェルを、ＰＢＳ緩衝液２×２００μＬで洗浄した。ＦＩＴＣタグ付き二次抗体の検出は、蛍光プレートリーダーを用い、水２００μＬ中で行った。得られたデータは、オリゴマンノース−２Ｇ１２結合等温線を与え、解離定数の決定にはスキャッチャードプロット解析を行った。Adams et al. (2004) Chem. Biol. 11:875-81。
【０２９０】
２Ｇ１２の精製、結晶化、構造決定、及び解析。ヒトモノクローナル抗体２Ｇ１２（ＩｇＧ１、κ）は、チャイニーズハムスター卵巣細胞における組換え発現により産生させた。Ｆａｂ断片は、パパインによる免疫グロブリンの消化と、続く、タンパク質Ａ及びタンパク質Ｇカラム上の精製により作製し、次いで、約３０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。各複合体（Ｍａｎ４、Ｍａｎ５、Ｍａｎ７、及びＭａｎ８）については、固体糖リガンドを、飽和までＦａｂ溶液に加えた。結晶化のため、タンパク質＋糖０．６μＬを等容積のリザーバ溶液と混ぜた。すべての結晶は、１ｍＬのリザーバ容積によるシッティングドロップ蒸気拡散法により成長させた。Ｆａｂ  ２Ｇ１２＋Ｍａｎ４結晶は、２７％ＰＥＧ４０００及び０．０５Ｍ酢酸ナトリウムのリザーバ溶液で成長させ、Ｍａｎ５共結晶は１．６Ｍ  リン酸Ｎａ／リン酸Ｋ、ｐＨ６．８で、Ｍａｎ７共結晶は２０％ＰＥＧ４０００及び０．２Ｍ酢酸ナトリウムで、Ｍａｎ８共結晶は２０％ＰＥＧ４０００及び０．２Ｍイミダゾールリンゴ酸ｐＨ７．０で成長させた。すべての結晶は、２５％グリセロールで凍結防止した。データは、Advanced Light Source（ＡＬＳ）ビームライン８．２．２及びStanford Synchrotron Radiation Laboratory（ＳＳＲＬ）ビームライン９−２及び１１−１で１００Ｋにて集めた。すべてのデータを指数付けし、取り込み、−３．０σを超えるすべての観測結果を用い、ＨＫＬ２０００（２５）でスケールした。
【０２９１】
構造は、Ｐｈａｓｅｒのための出発モデルとしてＦａｂ  ２Ｇ１２の１．７５Å構造（ＰＤＢコード：１ＯＰ３）を用い、分子置換により決定した。Li & Wang (2004) Org. Biomol. Chem. 2:483-88；Storoni e al. (2004) Acta Cryst. D60: 432-38。非対称単位のＭａｔｔｈｅｗｓ係数は、Ｆａｂ  ２Ｇ１２＋Ｍａｎ４データが単一Ｆａｂ＋糖複合体を含むことを示唆したが、他の複合体の非対称単位は、２つのＦａｂ＋糖複合体からなっていた。モデル構築は、ＴＯＭ／ＦＲＯＤＯ（Jones (1985) Methods Enzymol. 115: 157-71）を用いて行い、ＣＮＳバージョン１．１（Brunger et al. (1998) Acta Cryst. D54: 905-21）及びＴＬＳ精密化を用いるＲＥＦＭＡＣ（CCPA Acta Cryst. D50: 760-763）により、すべての測定データを用いて精密化した（Ｆ＞０．０σで）。当初は、厳格な非結晶学的対称（ＮＣＳ）拘束をかけたが、精密化中に徐々に解除した。精密化を通じてＲｆｒｅｅテストセット（５％）を維持した。データ収集及び精密化結果を表８に要約する。
【０２９２】
【表８】
2008504531.tif 000055
【０２９３】
Ｍａｎ４との複合体におけるＦａｂ  ２Ｇ１２の回折データは、２．０Åの回折限界にもかかわらず極度の異方性が生じた。我々は、２．０Å（２．０５〜２．００Åの最も高い分解能シェルにおいてＩ／σ＞２．０及び８８％の完全性）まで観察された測定データを報告するが、異方性回折は、２．７５Åを著しく超え、低いＲ値につながる。しかしながら、電子密度は、極めて明確で、この分解能において容易に解釈可能である。２．７５Åの低い分解能におけるＦａｂ  ２Ｇ１２＋Ｍａｎ４構造の精密化は、それぞれ２１．９％及び２８．２％というわずかに良好なＲｃｒｙｓ及びＲｆｒｅｅ値を与えるが、定性的電子密度図は著しく不十分である。したがって、より高い分解能構造を報告する。
【０２９４】
可能性のある水素結合及びファンデルワールス接触は、プログラムＣＯＮＴＡＣＳＹＭ（Sheriff et al. (1987) J. Mol. Biol. 197: 273-96）を用いて評価した。埋もれた分子表面積は、プログラムＭＳ（Connolly (1993) J. Mol. Graphics 11: 139-141）を用いて測定した。
【０２９５】
結果及び考察
Ｍａｎ７７、Ｍａｎ８８及びＭａｎ９９の合成。
Ｍａｎ７７を製造するための合成工程を以下のスキームＶに示す。合成工程は、文献手順（Schmidt et al. (1990) Synletters 694-96）に従って行った。スキームＶ
【０２９６】
【化４０】
2008504531.tif 000056
【０２９７】
スキームＶに用いた試薬及び条件：工程ａ：（ｉ）ＮＢＳ、アセトン、０℃、３０分；（ii）、ＣＣｌ３ＣＮ、ＤＢＵ、ＣＨ２Ｃｌ２、０℃、８時間；（iii）、１１、ＴＢＤＭＳＯＴｆ、Ｅｔ２Ｏ、−４０℃、４時間、３工程で７５％；工程ｂ：１３  ＮＩＳ／ＴｆＯＨ、ＭＳ、ＣＨ２Ｃｌ２、−４５℃、２時間、８５％：工程ｃ：（ｉ）ＴＢＡＦ／ＡｃＯＨ、ＴＨＦ、室温、２時間；（ii）ＮａＯＭｅ、ＭｅＯＨ、室温、４８時間；（iii）Ｐｄ黒、ＨＣＯＯＨ／ＭｅＯＨ（２０：１ｖ／ｖ）、Ｈ２、室温、２４時間、３工程で６０％。
【０２９８】
チオグリコシド二糖ビルディングブロック１０を、そのトリクロロアセトイミデート誘導体に変換し、ビルディングブロック１１によるグリコシル化のためにＴＢＤＭＳＯＴｆで活性化すると、好収率（３工程で７５％）で三糖ビルディングブロック１２が得られた。好収率（８５％）でのＭａｎ７７の収束合成は、−２５℃における無水ＣＨ２Ｃｌ２中のＮＩＳ／ＴｆＯＨ促進システムを用いる四糖受容体１３の三糖供与体１２によるグリコシル化により行った。優れたＭａｎα１−６Ｍａｎ選択性は、三糖供与体１２の２位におけるＴＢＤＭＳ基の存在により制御した。保護されたＭａｎ７１４の全体的な脱保護は、ＴＢＡＦ／ＡｃＯＨ緩衝液（Geng et al. (2004) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43: 2562-65）による脱シリル化、脱アセチル化、及び水素化分解により円滑に行われ、保護されていないＭａｎ７７（３工程で６０％）が得られた。
【０２９９】
類似の戦略を用い、スキームVIに示すようにＭａｎ８８及びＭａｎ９９の合成を行った。
【０３００】
【化４１】
2008504531.tif 000057
【０３０１】
スキームVIに用いた試薬及び条件：工程ａ：（ｉ）ＮＢＳ、アセトン、０℃、３０分；（ii）、ＣＣｌ３ＣＮ、ＤＢＵ、ＣＨ２Ｃｌ２、０℃、８時間；（iii）、１４又は１８、ＴＢＤＭＳＯＴｆ、Ｅｔ２Ｏ、−６０℃、４時間；工程ｂ：（ｉ）ＮＢＳ、アセトン、０℃、３０分；（ii）、ＣＣｌ３ＣＮ、ＤＢＵ、ＣＨ２Ｃｌ２、０℃、８時間；（iii）、１３、ＴＢＤＭＳＯＴｆ、Ｅｔ２Ｏ、−４０℃、４時間；ｃ、（ｉ）ＮａＯＭｅ、ＭｅＯＨ、室温、４８時間；（ii）Ｐｄ黒、ＨＣＯＯＨ／ＭｅＯＨ（２０：１ｖ／ｖ）、Ｈ２、２４時間。
【０３０２】
チオグリコシド二糖ビルディングブロック１０を、そのトリクロロアセトイミデート誘導体に変換し、−５０℃にて無水Ｅｔ２Ｏ中でＴＢＤＭＳＯＴｆにより活性化し、ビルディングブロック１５（１．１当量）又は１８（０．４５当量）を用いてグリコシル化すると、四糖ビルディングブロック１６（３工程で７５％）及び五糖ビルディングブロック１９（３工程で６５％）が好収率で得られた。Ｍａｎ８８及びＭａｎ９９の収束合成において、Ｍａｎα１−６Ｍａｎ選択性の制御は、チオグリコシド四糖供与体１６及び五糖供与体１９の２位に立体的にかさばる基、又は隣接関与基がないことから問題であった。最終的に、Ｍａｎα１−６Ｍａｎ選択性は、Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒのプロトコル（Ratner et al. (2002) Eur. J. Org. Chem. 5: 826-33）を実施することにより制御した。チオグリコシド四糖１６及び五糖１９を、対応するトリクロロイミデートに変換し、−４０℃にて無水Ｅｔ２Ｏ中のＴＢＤＭＳＯＴｆを用いて四糖１３とカップリングさせると、保護されたＭａｎ８１７（３工程で７５％）及びＭａｎ９２０（３工程で７５％）が好収率で得られた。保護されたＭａｎ８１７及びＭａｎ９２０の全体的な脱保護を、脱アセチル化及び水素化分解により行うと、保護されていないＭａｎ８８（２工程で６０％）及びＭａｎ９９（２工程で６０％）が得られた。
【０３０３】
２Ｇ１２結合のオリゴマンノース１〜８阻害の溶液相ＥＬＩＳＡアッセイ分析。
Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２１及び脱保護されたオリゴマンノース２〜６及び７〜９（図１７を参照）を、溶液相酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）における２Ｇ１２とｇｐ１２０の間の相互作用を阻害するそれらの能力について評価した。これらの結果（図１８）は、末端Ｍａｎα１−２Ｍａｎが、結合にとって重要であることを裏付けた。Ｍａｎα１−２Ｍａｎα１−２Ｍａｎモチーフ（図１７に示すＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２のＤ１腕に対応する）を含むオリゴマンノースはすべて、インタクトなＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２部分と同様のレベルで２Ｇ１２結合を阻害することができる。しかしながら、オリゴマンノース３が、低濃度で効率的に阻害しない（０．５ｍＭで１５．８％）ことから、２Ｇ１２は、Ｍａｎα１−２Ｍａｎα１−３Ｍａｎを容易には認識しない。オリゴマンノース３と類似しているがＭａｎα１−２Ｍａｎα１−６Ｍａｎモチーフを含むオリゴマンノース５は、阻害能力を有する（０．５ｍＭで３７．７％）。これらの結果は、２Ｇ１２が、Ｄ１腕（Ｍａｎα１−２Ｍａｎα１−２Ｍａｎ）又はＤ３腕（Ｍａｎα１−２Ｍａｎα１−６Ｍａｎ）との関連でＭａｎα１−２Ｍａｎを認識するが、Ｄ２腕（Ｍａｎα１−２Ｍａｎα１−３Ｍａｎ）は認識しないことを示唆している。
【０３０４】
全体的に見て、多くのオリゴマンノース誘導体は、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２の結合に競合することができ、したがって、２Ｇ１２様抗体を誘発するための潜在的免疫原のためのビルディングブロックとして役立つ可能性がある。
【０３０５】
炭水化物マイクロアレイ分析。２Ｇ１２との相互作用のための炭水化物エピトープの一団を有する共有結合性マイクロタイタープレートを用いる発明者による以前の研究は、アミン含有オリゴマンノース４、５、７、８及び９を、対応するアジド誘導体２１、２２、２３、２４及び２５に変換するものであった。次いで、これらの誘導体を、Ｃｕ（Ｉ）が触媒する１，３−双極子環化付加反応を介し、マイクロプレートに固定化された切断可能なリンカーに共有結合させた（図１１Ｂ）、２Ｇ１２のオリゴマンノース４、５、７、８、９との相互作用のＫｄ値（表９）は、蛍光性二次抗体を介する検出によるマイクロタイターをベースとしたアッセイを用いて決定した（Bryan et al. (2004) J. Am. Chem. Soc. 126, 8640-41を参照）。
【０３０６】
【表９】
2008504531.tif 000058
【０３０７】
これらの結果は、オリゴマンノース４及びオリゴマンノース５が、最も高い親和性で２Ｇ１２抗体と結合することを示している。これらのオリゴマンノースグリカンの構造を以下に示す。
【０３０８】
【化４２】
2008504531.tif 000059
【０３０９】
マイクロタイタープレートアレイ上の結合分析の結果は、スライドガラスアレイ上の結果と一致している。予想通り、表面上のエピトープの特異的な空間的配向は、２Ｇ１２抗体との結合にとって重要であった。マイクロアレイ研究におけるこれらの化合物の結合親和性の著しい増強は、ｇｐ１２０の表面上のオリゴマンノースのクラスターを模倣するオリゴマンノースの２Ｇ１２との多価相互作用により説明されるかもしれない。特に、より小さなオリゴマンノース誘導体は、多価提示から恩恵を受ける。したがって、このシステムは、ウイルスの表面などの表面上に提示される炭水化物が関わる結合事象を研究するための有効なモデルとなる可能性がある。
【０３１０】
全体的に言うと、２Ｇ１２の炭水化物特異性は、初期の研究が示したよりも制限的でない。Calarese et al. (2003) Science 300, 2065-71。合わせた生物化学的、生物物理的、及び結晶学的証拠は、２Ｇ１２が、オリゴマンノース糖のＤ１腕とＤ３腕双方の末端においてＭａｎα１−２Ｍａｎと結合することができることを明白に示している。Ｍａｎ４、Ｍａｎ７、及びＭａｎ８結晶構造において、２Ｇ１２は、Ｄ１腕と相互作用し、一方、Ｍａｎ５及びＭａｎ８結晶構造において、Ｄ３腕も結合部位で結合する。したがって、２Ｇ１２は、ｇｐ１２０上の２つの異なるＮ結合型オリゴマンノース由来のＤ１腕ばかりでなく、ｇｐ１２０上のオリゴマンノース群内の様々な糖由来のＤ１腕とＤ３腕の双方と結合することができる。この認識様式は、一群のオリゴマンノース部分との結合を増強し、抗体の多価結合部位に関するオリゴマンノース部分の完全な一致という制約を緩和するであろう。しかしながら、この多価相互作用の能力増加にもかかわらず、「自己」のタンパク質に対する有意な結合が観察されていないことから、２Ｇ１２は、ｇｐ１２０上のオリゴマンノースクラスター結合に極めて制限される。
【０３１１】
２Ｇ１２抗体は、広範囲なＨＩＶ−１分離株を中和することができる。ここに示した結果は、この抗体の炭水化物特異性をより正確に示している。免疫化治験のために多価オリゴマンノース提示を設計するのに必要とされるマンノースビルディングブロックの性質が解明されていることから、今や、２Ｇ１２−オリゴマンノース相互作用に関するこのより深い理解を、炭水化物をベースとした免疫原設計に応用することができる。
【０３１２】
参考文献：
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Vallee, F., Karaveg, K., Herscovics, A., Moremen, K. W., and Howell, P. L. (2000). Structural basis for catalysis and inhibition of N-glycan processing class I alpha 1,2-mannosidases. J Biol Chem 275, 41287-41298.
【０３１３】
本明細書で参照又は言及されているすべての特許及び刊行物は、本発明が関係する当業者の技能レベルを示し、各々のそのような参照された特許又は刊行物は、あたかも、個々に全体として参照により援用されているか、或いは全体として本明細書に示されていたかのように、同じ程度に参照により本明細書に援用されるものとする。出願人は、任意のそのような引用された特許又は刊行物からのありとあらゆる材料及び情報を本明細書に物理的に組み込む権利を留保する。
【０３１４】
本明細書に記載されている具体的な方法及び組成物は、好ましい実施形態を代表するものであり且つ例示的であり、本発明の範囲に対する制限のつもりではない。他の目的、態様、及び実施形態は、本明細書の検討の結果として当業者に思い当たるはずであり、特許請求の範囲により定義される本発明の精神内に包含される。当業者には当然のことながら、本発明の範囲及び精神を逸脱することなく、本明細書に開示されている発明に対して様々な置換及び改変を行うことができる。本明細書に例示的に記載されている本発明は、本明細書で不可欠として具体的に開示されていないいかなる１つ又は複数の要素、或いは１つ又は複数の制限もなしに適当に実施することができる。本明細書に例示的に記載されている方法及びプロセスは、異なる工程順で実施することができ、本明細書又は特許請求の範囲に示した工程順に必ずしも制限されない。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する単数形「a」、「an」、及び「the」には、文脈が他に明示していない限り、複数の参照が含まれる。即ち、例えば、「an antibody」への言及には、複数の（例えば、抗体の溶液又は一連の抗体調製物）のそのような抗体などが含まれる。いかなる場合も、本特許は、本明細書に具体的に開示されている具体的な例又は実施例又は方法に限定されると解釈されることはない。いかなる場合も、本特許は、そのような陳述が、出願人による答弁書に具体的且つ無資格又は無条件で明確に採用されていない限り、特許商標局のいかなる審査官又は他の当局者若しくは従業員によって作製されたいかなる陳述によっても制限されると解釈されることはない。
【０３１５】
用いられている用語及び表現は、説明の用語として使用され、限定されるものではなく、そのような用語及び表現の使用には、示され記載されている特徴のいかなる等価体又はそれらの部分も除外する意図はなく、当然のことながら、様々な改変が、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲内で可能である。したがって、当然のことながら、本発明を好ましい実施形態及び任意選択の特徴により具体的に開示してきたが、本明細書に開示されている概念の改変及び変形を当業者は行使することができ、そのような改変及び変形は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内にあると見なされる。
【０３１６】
本明細書において、本発明を幅広く且つ一般的に説明してきた。一般的開示に含まれるより狭い種及び亜属集団の各々も、本発明の一部を形成する。これには、削除された材料が本明細書で具体的に挙げられているか否かに関係なく、その属由来の対象物を除くという条件又は消極的な限定で本発明の一般的説明が含まれる。
【０３１７】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内にある。さらに、本発明の特徴又は態様がマーカッシュグループの用語で記載されている場合、当業者には当然のことながら、本発明は、マーカッシュグループの個々のメンバー又は下位グループのメンバーの用語でも記載される。
【図面の簡単な説明】
【０３１８】
【図１】ガラスマイクロアレイのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で誘導体化された表面とのアミノ官能基付きグリカンライブラリーの共有結合を示す図である。
【図２】グリカン濃度及びグリカンプリント時間を変えることによりマイクロアレイ上のグリカンの密度を最適化するための一連の実験の結果をグラフで示す図である。
【図３Ａ−Ｂ】植物レクチンＣｏｎＡが、プリントされたグリカンアレイ上の高マンノースグリカンと結合することを示す図である。図３Ａは、リガンド（グリカン）１〜１０４についての結果を提供し、一方、図３Ｂは、リガンド（グリカン）１０５〜２００についての結果を提供する。この実験は、プリントされたグリカンアレイ上の高マンノースグリカンの濃度又は密度が予想通りであり、選択されたグリカン（例えば、８残基マンノース、即ちＭａｎ８、グリカン）との抗体の結合が、Ｍａｎ８グリカンの異常なローディングのためではないことを立証する助けとなる対照として行った。
【図４Ａ−Ｂ】グリカンアレイとの、蛍光標識された植物レクチン、エリスリナ・クリスタガリ（Erythrina cristagalli）（ＥＣＡ）レクチンの結合を示す図である。図４Ａは、リガンド（グリカン）１〜１０４についての結果を提供し、一方、図４Ｂは、リガンド（グリカン）１０５〜２００についての結果を提供する。
【図５Ａ】蛍光標識された抗ＩｇＧ二次抗体による検出でグリカンアレイとのＥ−セレクチン−Ｆｃキメラの結合を示す図である。
【図５Ｂ】蛍光標識された抗ＩｇＧ二次抗体による検出でグリカンアレイとのヒトＣＤ２２−Ｆｃキメラの結合を示す図である。
【図６Ａ−Ｂ】グリカンアレイとの、蛍光標識されたヒト抗グリカン抗体ＣＤ１５の結合を示す図である。図６Ａは、リガンド（グリカン）１〜１０４についての結果を提供し、一方、図６Ｂは、リガンド（グリカン）１０５〜２００についての結果を提供する。
【図７Ａ−Ｂ】グリカンアレイとの、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンＨ１（１９１８）の結合を示す図である。図７Ａは、リガンド（グリカン）１〜１０４についての結果を提供し、一方、図７Ｂは、リガンド（グリカン）１０５〜２００についての結果を提供する。
【図８】本発明の一部のアミン及びアジド切断可能なリンカーの合成を示す図である。
【図９】本発明の一部のアミン及びアジド切断可能なリンカーの合成を示す図である。
【図１０】アルキン官能基付き表面を有するアレイを提供するための、ＮＨＳかアミンのどちらかがコーティングされた表面、例えば、マイクロタイタープレートへの切断可能なリンカー１及び２の結合を図式的に示す図である。
【図１１Ａ】固定化されたグリカンを形成するための、アルキン官能基付き固体表面（例えば、マイクロタイターウェル）へのグリカン−アジドの結合を図式的に示す図である。アジドとアルキンの反応により形成されるトリアゾールをＤＴＴにより切断し、例えば、質量分析により、グリカン構造の分析を可能にすることができる。
【図１１Ｂ】固定化されたオリゴマンノースを形成するための、アルキン官能基付き固体表面（例えば、マイクロタイターウェル）へのマンノース含有グリカンの結合を示す図である。オリゴマンノース４、５、６、７、８及び９の構造を図１７に示す。アジドとアルキンの反応により形成されるトリアゾールをＤＴＴにより切断し、例えば、質量分析により、グリカン構造の分析を可能にすることができる。  使用した試薬及び条件、ステップａ：ＴｆＮ３、ＣｕＳＯ４、Ｅｔ３Ｎ、Ｈ２Ｏ／ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（１：１：１、ｖ／ｖ）、室温、４８時間；ステップｂ：ＣｕＩ、５％ＤＩＥＡ／ＭｅＯＨ、室温、１２時間。
【図１２】オリゴ糖２０１〜２０４ｂをスライドガラス上に固定化することができる方法を示す図である。
【図１３】抗体インキュベーションアッセイ後の蛍光レベルを示すスライドの走査像を示す図である。点は、左から右に上列にプリントされた糖２０１〜２０４ａ及び下列の２０１〜２０４ｂを含む。
【図１４】Ｇｌｏｂｏ−Ｈ類縁体２０１ａ、２０２ａ、２０３ａ及び２０４ａ（それぞれ、１ａ、２ａ、３ａ及び４ａで識別される）についての炭水化物−抗体結合曲線を示す図である。
【図１５Ａ−Ｂ】分析的配列解析によるＧｌｏｂｏ  Ｈの構造確認を示す図である。図１５Ａは、蛍光標識されたデキストラン標準品に対するグルコースユニット（ＧＵ）値とともに、指示された酵素によるエキソグリコシダーゼ切断によって得られるグリカンを示す表である。図１５Ｂは、配列解析中に得られたグリカンを強調表示する蛍光検出（励起＝３３０ｎｍ、発光＝４２０ｎｍ）による順相ＨＰＬＣからのサンプルクロマトグラムである。
【図１６】一定量の２Ｇ１２抗体との、漸増量の標識されたＭａｎα１、２Ｍａｎα１、３Ｍａｎα１、２Ｍａｎα１、６Ｍａｎグリカンの結合をグラフで示す図である。この試験は、抗ＨＩＶ  ２Ｇ１２中和抗体とのオリゴマンノースの結合についてのＫｄ値の決定を可能にした。
【図１７】Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２１及びオリゴマンノース２〜９についての化学構造を示す図である。Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２のマンノース残基は、原文では赤で表示した。構造説明並びに分岐、腕及びマンノース残基への言及を容易にするため、オリゴマンノース２〜９のすべてのマンノース残基を表示し、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２上のそれらの構造等価体と対応させ、腕Ｄ１、Ｄ２及びＤ３を、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２１グリカン上で識別する。
【図１８】ｇｐ１２０との２Ｇ１２の結合のオリゴマンノース阻害（％）を示す図である。黒と灰色のバーは、それぞれ０．５及び２．０ｎＭのオリゴマンノース濃度における阻害のレベルを示す。
【図１】
2008504531.tif 000074
【図２】
2008504531.tif 000075
【図３Ａ−Ｂ】
2008504531.tif 000076
【図４Ａ−Ｂ】
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【図５Ａ】
2008504531.tif 000078
【図５Ｂ】
2008504531.tif 000079
【図６Ａ−Ｂ】
2008504531.tif 000080
【図７Ａ−Ｂ】
2008504531.tif 000081
【図８】
2008504531.tif 000082
【図９】
2008504531.tif 000083
【図１０】
2008504531.tif 000084
【図１１Ａ】
2008504531.tif 000085
【図１１Ｂ】
2008504531.tif 000086
【図１２】
2008504531.tif 000087
【図１３】
2008504531.tif 000088
【図１４】
2008504531.tif 000089
【図１５Ａ−Ｂ】
2008504531.tif 000090
【図１６】
2008504531.tif 000091
【図１７】
2008504531.tif 000092
【図１８】
2008504531.tif 000093
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月1日(2007.6.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体のＨＩＶ感染を検出する方法であって、（ａ）被験体からの試験サンプルを、マンノース含有グリカンのアレイと接触させること、及び（ｂ）試験サンプル中の抗体が、グリカンの第一（α１−３）枝上にＭａｎα１−２Ｍａｎを含むグリカン、グリカンの第三（α１−６）枝上にＭａｎα１−２Ｍａｎを含むグリカン、又はそれらの組合せと結合するか否かを判定することを含む方法。
【請求項２】
グリカンが、切断可能なリンカーによってアレイに結合している請求項１に記載の方法。
【請求項３】
マンノース含有グリカンが、以下のグリカンのうちの少なくとも１つ、又はそれらの組合せを含む請求項２に記載の方法。
【化１】
2008504531.tif 000094
【請求項４】
薬学的に許容できる担体を含み、且つ、ＨＩＶ ｇｐ１２０ペプチドに連結しているグリカンの第一（α１−３）腕上にＭａｎα１−２Ｍａｎ、ＨＩＶｇｐ１２０ペプチドに連結しているグリカンの第三（α１−６）腕上にＭａｎα１−２Ｍａｎ、又はそれらの組合せを含むグリカン−ＨＩＶ ｇｐ１２０ペプチド連結体を有効量含む医薬組成物。
【請求項５】
薬学的に許容できる担体を含み、且つ、ＨＩＶ ｇｐ１２０ペプチドに連結している以下のオリゴマンノースグリカンのうちのいずれか１つ、又はそれらの組合せを含むグリカン−ＨＩＶｇｐ１２０ペプチド連結体を有効量含む医薬組成物。
【化２】
2008504531.tif 000095
【請求項６】
薬学的に許容できる担体を含み、
且つ、ＨＩＶ ｇｐ１２０ペプチドに連結しているグリカンの第一（α１−３）腕上にＭａｎα１−２Ｍａｎ、ＨＩＶｇｐ１２０ペプチドに連結しているグリカンの第三（α１−６）腕上にＭａｎα１−２Ｍａｎ、又はそれらの組合せを含むＨＩＶ ｇｐ１２０ペプチドに連結体と、
以下のグリカンのうちのいずれか１つを含むグリカンとを
有効量含む医薬組成物。
【化３】
2008504531.tif 000096
【国際調査報告】
2008504531.tif 000097
2008504531.tif 000098
2008504531.tif 000099
2008504531.tif 000100
2008504531.tif 000101