(57)【要約】  本発明は、ＤＮＡにおけるメチル化パターンの分析および疾患組織における異常にメチル化された遺伝子の同定のための方法を提供する。本発明はまた、治療的介入のための新規標的および疾患マーカーの同定のための方法を提供する。新規癌標的を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸フラグメントのサンプル中のメチル化核酸フラグメントを富化する方法であって：
(ａ)核酸フラグメントのサンプルとメチル化ヌクレオシドに特異的な抗体を、該抗体のメチル化ヌクレオシドへの結合に適した条件下接触させ；
(ｂ)メチル化ヌクレオシドに特異的な抗体に結合した核酸フラグメントを選択する
工程を含む、方法。
【請求項２】
工程(ａ)の前に：
サンプル中の二本鎖核酸フラグメントの鎖を分ける
工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
(ｃ)１個以上のメチル化核酸フラグメントを特徴付けするさらなる工程をさらに含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
核酸フラグメントのサンプル中の異なってメチル化された対立遺伝子の検出のための、請求項１から３のいずれかに記載の方法の使用。
【請求項５】
核酸フラグメントのサンプル中のまたはそこから取り出したときのメチル化核酸フラグメントの割合が、工程(ａ)と(ｂ)の間で少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍または少なくとも１００倍増加する、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
核酸フラグメントがＤＮＡフラグメントである、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
メチル化ヌクレオシドがメチルシチジンである、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
メチル化ヌクレオシドが５−メチルシチジンである、請求項８記載の方法。
【請求項９】
抗体に結合する核酸フラグメントの選択が、抗体の固体支持体への接着または結合、そしてこの固体支持体のサンプル液相からの分離により行う、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
固体支持体がメチル化ヌクレオシドに特異的な抗体に特異的に結合する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
固体支持体がメチル化ヌクレオシドに特異的な抗体に特異的な第二抗体を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
固体支持体がビーズの形である、請求項９から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
固体支持体が磁性物質である、請求項９から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
さらにメチル化ヌクレオシドに特異的な抗体からメチル化核酸フラグメントを脱離させる工程を含む、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
メチル化ヌクレオシドに特異的な抗体からメチル化核酸フラグメントを脱離させる工程が、第一抗体に結合した核酸フラグメントとプロテイナーゼのインキュベーションを含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ゲノムＤＮＡサンプルのメチル化状態を特徴付けする方法であって：
(ｉ)ゲノムＤＮＡサンプルをフラグメント化して、核酸フラグメントのサンプルを得て、そして
(ii)(ｉ)で得た核酸フラグメントのサンプルに対して請求項３から１５のいずれかに記載の方法を行う
工程を含む、方法。
【請求項１７】
少なくとも２個の核酸フラグメントのサンプルのメチル化状態を比較する方法であって：
(ｉ)各核酸フラグメントのサンプルに対して請求項３から１５のいずれかに記載の方法を行い、そして
(ii)一個の核酸サンプルと少なくとも１個の他の核酸サンプルから(ｉ)で得た結果を比較する
工程を含む、方法。
【請求項１８】
個体における特異的核酸フラグメントのメチル化と関連する疾患を診断または予後診断する方法であって：
(ｉ)個体からの核酸フラグメントのサンプルに対して請求項３から１５のいずれかに記載の方法を行い；
(ii)(ｉ)で得た結果と、個体の疾患状態を相関させる
工程を含む、方法。
【請求項１９】
患者における核酸メチル化の経時的変化を検出する方法であって：
(ｉ)患者から組織標本をある時点に得て；
(ii)工程(ｉ)を少なくとも１回別の時点で繰り返し；
(iii)各時点の核酸サンプルを得るために各組織標本から核酸を抽出し、そして
(iv)核酸配列がメチル化されているかいないか、および／またはどの程度されているかを特徴付けするために、各時点の各核酸サンプルに対して請求項３から１５のいずれかに記載の方法を行う
工程を含む、方法。
【請求項２０】
核酸メチル化の変化と疾患の臨床症状を相関させる方法であって、請求項１９に記載の工程と：
(ａ)各時点で患者において観察された疾患の臨床症状を記録し、そして
(ｂ)各時点で記録された臨床症状と工程(iv)において観察された結果を相関させる
工程をさらに含む、方法。
【請求項２１】
各組織標本を貯蔵し、そして工程(ii)を複数の標本で同時に行う工程をさらに含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
疾患が癌である、請求項１８から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
ＫＩＡＡ０７８９、ＦＯＸＦ１、ＡＤＡＭ１２、ＭＧＣ４８６２５、ＳＨＨ、ＰＡＸ６、ＦＬＪ２５４３９、ＴＡＺ、ＧＡＴＡ３、ＴＧＦｂ２、ＺＮＦ５６６、ＡＬＸ４、ＬＯＣ２８３５１４およびＤＡＰの一種以上の活性または発現の調整を含む、癌の処置法。
【請求項２４】
ＫＩＡＡ０７８９、ＦＯＸＦ１、ＡＤＡＭ１２、ＭＧＣ４８６２５、ＳＨＨ、ＰＡＸ６、ＦＬＪ２５４３９、ＴＡＺ、ＧＡＴＡ３、ＴＧＦｂ２、ＺＮＦ５６６、ＡＬＸ４、ＬＯＣ２８３５１４およびＤＡＰのいずれか１種の、癌の処置のためのそれらのモジュレーターを同定するためのアッセイにおける使用。
【請求項２５】
ヒト組織が腫瘍性形質転換する素因があるか否かを決定する方法であって、該組織由来の細胞においてＫＩＡＡ０７８９、ＦＯＸＦ１、ＡＤＡＭ１２、ＭＧＣ４８６２５、ＳＨＨ、ＰＡＸ６、ＦＬＪ２５４３９、ＴＡＺ、ＧＡＴＡ３、ＴＧＦｂ２、ＺＮＦ５６６、ＡＬＸ４、ＬＯＣ２８３５１４およびＤＡＰから成る群から選択される核酸分子が存在しないか、変異体で存在するかまたは後成的な機構を介して下方制御されているかどうかの決定を含む、方法。
【請求項２６】
処置を必要とする患者における癌を処置または阻害する方法であって、該患者にＫＩＡＡ０７８９受託番号ＸＭ＿０３３１３３−、ＦＯＸＦ１、ＡＤＡＭ１２、ＭＧＣ４８６２５、ＳＨＨ、ＰＡＸ６、ＦＬＪ２５４３９受託番号ＮＭ＿１４４７２５−、ＴＡＺ、ＧＡＴＡ３、ＴＧＦｂ２、ＺＮＦ５６６受託番号ＮＭ＿０３２８３８−、ＡＬＸ４受託番号ＮＭ＿０２１９２６−、ＬＯＣ２８３５１４およびＤＡＰから成る群から選択される遺伝子を発現できるベクターを投与する工程を含む、方法。
【請求項２７】
ＫＩＡＡ０７８９、ＦＯＸＦ１、ＡＤＡＭ１２、ＭＧＣ４８６２５、ＳＨＨ、ＰＡＸ６、ＦＬＪ２５４３９、ＴＡＺ、ＧＡＴＡ３、ＴＧＦｂ２、ＺＮＦ５６６、ＡＬＸ４、ＬＯＣ２８３５１４およびＤＡＰ、それらの活性フラグメント、それらの発現産物およびそれらの発現産物に対する抗体から成る群から選択されるいずれか１個またはそれ以上の遺伝子、および不活性担体を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般にメチル化ＤＮＡの富化および分析において使用するための方法および材料ならびに疾患における異常にメチル化された部位の同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
メチル化ヌクレオチド塩基は原核生物および真核生物の両方で発見されている(Achwal et al., 1983)。真核生物で発見されているものはＤＮＡで５−メチルシトシン、６−メチルアデニンおよび７−メチルグアニン(Achwal et al., 1983)ならびにＲＮＡで５−メチルシトシン(Hernandez-Blazquez et al., 2000)および７−メチルグアノシン(Tebib et al., 1997)である。通常ＣｐＧジヌクレオチドでの、シトシンの可逆性メチル化は、植物および動物を含む高等真核生物で一般的なＤＮＡ修飾である。
【０００３】
ＤＮＡメチル化は転写抑制に至り得て、故にインスリン増殖因子およびその受容体、およびＸｉｓｔ遺伝子についてのような、哺乳動物遺伝子の遺伝子制御およびインプリンティングに関与する。ＤＮＡメチル化は、この修飾がＤＮＡ配列を変えないが、細胞分裂を通して遺伝されるため、後成的レギュレーターである。
【０００４】
異常ＤＮＡメチル化は疾患をもたらし得る。特に、異常ＤＮＡメチル化はプロトオンコジーンの増加した発現または腫瘍抑制遺伝子の減少した発現をもたらし得る。故に、ＤＮＡメチル化の誤制御は、多くのヒト癌で顕著な表現型である(Jones and Baylin, 2002)。新しい像は、不活性腫瘍抑制遺伝子と関連していることもあるプロモーターのサブセットの過剰メチル化と同時のメチル化シトシンの量の全体的減少である。しかしながら、この低メチル化の遺伝子位置は、異常プロモーターメチル化の頻度および特異性と同様未知である。
【０００５】
正常および異常細胞機能に関するＤＮＡメチル化の関連およびその腫瘍学における薬剤標的および診断ツールとしての可能性を考慮して、ＤＮＡメチル化を同定するための技術的アプローチは非常に望まれている(Fazzari and Greally, 2004)。
【０００６】
メチル化ＤＮＡの検出に現在利用可能なプロトコールは、しばしば、修飾感受性制限エンドヌクレアーゼ(ＭＳＲＥ)または化学物質、例えばビスルファイト、ヒドラジンまたはペルマンガネートを使用した差次的塩基修飾(Rein et al., 1998)、続くＤＮＡ配列分析を必要とする。差次的塩基修飾法は、メチル化塩基を、一続きのＤＮＡ中の正確なヌクレオチド位置に位置づけできるが、これらの方法は大規模(ゲノム全体)分析に適用するには面倒すぎる。メチル化感受性制限酵素の使用は、ゲノム全体の分析に使用できるが、試験できる部位の数は、核酸中の適当な制限部位の数により制限される。これは、染色体上への修飾塩基の位置を、あまり正確に位置づけできないことを意味する。さらに、現在の化学的および酵素的検出法は、相対的に高品質のＤＮＡでしか行うことができない。
【０００７】
故に、メチル化核酸の富化または検出ならびに疾患における異常にメチル化されたＤＮＡの同定のための新規な方法が、この分野に貢献するであろうことを見ることができる。
【発明の開示】
【０００８】
本発明者らは、メチル化ヌクレオシドに特異的な抗体は、核酸フラグメントのサンプル中の特異的メチル化核酸の効率的な富化および同定に使用できることを証明した。この新規なアプローチを使用して、本発明者らは、実時間ＰＣＲにより検出して、メチル化配列の、非メチル化コントロールの１２０倍までの富化を観察している。本方法は、核酸フラグメントの配列に無関係であり、高品質の核酸を必要とせず、そして大規模ゲノム分析に、例えば慣用のＤＮＡ配列検出法と組み合わせたときに、容易に適合できる(susceptible)。サンプル中のどの配列がメチル化されているかの決定を可能にすることに加えて、本発明者らはまた本発明の免疫沈降ベースの方法による富化が用量依存的であり、故に配列のメチル化の程度の定量に使用できることも証明している。
【０００９】
修飾塩基に特異的な抗体は、以前に、修飾塩基の全体的な量および一般的位置の検出に使用されている。例えば、５−メチルシチジン(ｍ５Ｃ)に特異的な抗体は、ニトロセルロース紙に結合した哺乳動物ＤＮＡ中のｍ５Ｃと反応することが示されている(Achwal et al., 1983; Achwal & Chandra, 1982)。免疫蛍光も、高頻度のｍ５Ｃの染色体領域の決定に使用されている(Barbin et al., 1994)。５−メチルシチジンに対するマウスモノクローナル抗体はまた、以前に、癌患者によるヌクレオシドの尿排泄変化の検出に(Tebib et al., 1997)ならびに正常および悪性細胞における哺乳動物染色体に沿ったメチル化配列の分布を可視化するために(Hernandez-Blazquez et al., 2000; Mayer et al., 2000)使用されている。しかしながらこのような抗体は、核酸サンプル中のメチル化核酸の富化について以前に教示も示唆もされていない。
【００１０】
故に、第一の局面において、本発明は、核酸フラグメントのサンプル中のメチル化核酸フラグメントを富化する方法であって：
(ａ)核酸フラグメントのサンプルとメチル化ヌクレオシドに特異的な抗体を、該抗体のメチル化ヌクレオシドへの結合に適した条件下接触させ；
(ｂ)メチル化ヌクレオシドに特異的な抗体に結合した核酸フラグメントを選択する
工程を含む、方法を提供する。
【００１１】
メチル化ヌクレオシドに特異的な抗体に結合した核酸フラグメントの選択前に、メチル化および非メチル化フラグメントを、抗体へのメチル化フラグメントの結合に基づいて分離してよい。
【００１２】
本発明は、一本鎖核酸フラグメントのサンプルとメチル化ヌクレオシドに特異的な抗体を接触させる前に、一本鎖核酸フラグメントのサンプルを形成させるためにサンプル中の何らかの二本鎖核酸フラグメントの鎖を分離する工程をさらに含み得る。
【００１３】
好ましい態様において、本発明は、核酸フラグメントのサンプルからのメチル化核酸フラグメントを特徴付けまたは同定する方法を提供し、該方法は：
(ｃ)１個以上のメチル化核酸フラグメントを特徴付けする
工程をさらに含む。
【００１４】
“富化”は、核酸フラグメントのサンプル中のまたはそこからの特定のカテゴリーの核酸フラグメントの比率の増加を意味する。好ましくは、本富化は少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍、または１００倍である。
【００１５】
他の局面において、本発明は、疾患におけるＤＮＡメチル化の分布を提供し、それにより治療的介入の標的、ならびに癌および他の疾患との戦いに有用な診断、予後診断および代用マーカーを提供する。
【００１６】
いくつかの好ましい態様をここで記載する。
【００１７】
核酸の性質
上記の方法は、全てのタイプの核酸のサンプルに適用できるが、好ましくは本核酸はＤＮＡである。
【００１８】
メチル化ヌクレオシドの例は、メチル化シチジン(例えば５−メチルシチジン)、メチル化アデノシン(例えば６−メチルアデノシン)およびメチル化グアノシン(７−メチルグアノシン)を含む。好ましい態様において、本メチル化ヌクレオシドは、メチルシチジンである。さらに特に好ましくは、本メチル化ヌクレオシドは５−メチルシチジンである。
【００１９】
サンプルの性質
サンプルは分析を望む全てのものであり得る。
【００２０】
試験すべき核酸の品質に対する要求が少ないため、このプロトコールは、その核酸がホルマリンのために一部変性しているホルマリンで固定された標本の試験に適する。下記の通り、本方法は、核酸メチル化の変化を病歴と相関するために使用できる。
【００２１】
当業者は、核酸フラグメントのサンプルを産生するためにどのように核酸をフラグメント化するか容易に決定できる。例えば、ゲノムＤＮＡは、剪断(例えば音波処理)を使用して、またはＡｌｕＩのような制限酵素での消化を使用して、フラグメント化できる。
【００２２】
それを得たら、核酸フラグメントのサンプルを、好ましくは液体(例えば抗体結合に適した緩衝液)に懸濁する。
【００２３】
核酸の変性
ヌクレオチド修飾に対する抗体の特異性は、核酸が一本鎖であるとき、高い。故に、メチル化ヌクレオチドの富化および検出の能力は、サンプル中の核酸分子が一本鎖であるとき、高くなる。故に、サンプル鎖中に存在する全ての二本鎖核酸分子の鎖を分離することが望まれる。
【００２４】
変性(二本鎖分子の鎖の分離)は、最も容易には核酸の加熱により行う。当業者は、興味のある核酸の変性に適した加熱の温度および長さを容易に決定できる。９５℃で１０分の加熱は、本発明において使用するためのＤＮＡに有効であることが判明した。
【００２５】
抗体の性質
多くのメチル化塩基に特異的な抗体は市販されている。例えばｍ５Ｃに対するマウスモノクローナル抗体はEurogentec S.A. (Belgium)から入手可能であり、ウサギポリクローナル血清はMegabase Research Products(USA)から入手可能である。他のメチル化塩基(６−メチルアデノシンおよび７−メチルグアノシン)に対するポリクローナルウサギ抗血清は入手可能である(Megabase Research Products, USA)。
【００２６】
あるいは、メチル化塩基に特異的な抗体は、慣用の技術を使用して製造できる(例えばRoitt et al. in “Immunology 5th edition” - Pub. 1997 by Moseby International Ltd, London参照)。
【００２７】
ここで使用する用語“抗体”は、必須の特異性の結合ドメインを有する、全ての特異的に結合する物質をカバーすると解釈すべきである。故に、この用語は、天然であれ合成であれ、免疫グロブリン結合ドメインを含む全てのポリペプチドを含む、抗体フラグメント、抗体の誘導体、機能的等価体および相同体をカバーする。他のポリペプチドに融合した、免疫グロブリン結合ドメイン、または等価体を含むキメラ分子は、故に包含される。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、ＥＰ−Ａ−０１２０６９４およびＥＰ−Ａ−０１２５０２３に記載されている。
【００２８】
例えば、全抗体のフラグメントが、結合抗原の機能を実行できることが示されている。結合フラグメントの例は、(ｉ)ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから成るＦａｂフラグメント；(ii)ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄフラグメント；(iii)単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖフラグメント；(iv)ＶＨドメインから成るｄＡｂフラグメント(Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546, 1989)；(ｖ)単離ＣＤＲ領域；(vi)Ｆ(ａｂ’)２個の連結したＦａｂフラグメントから成る２フラグメント、二価フラグメント(vii)ＶＨドメインおよびＶＬドメインが２個のドメインが抗原結合部位を形成するために会合することを可能にするペプチドリンカーにより連結されている、一本鎖Ｆｖ分子(ｓｃＦｖ)(Bird et al., Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al., PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988)；(viii)二特異的一本鎖Ｆｖ二量体(ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５)および(ix)遺伝子融合により構築された“二重特異性抗体(diabody)”、多価または多特異的フラグメント(WO94/13804; Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993)である。
【００２９】
二重特異性抗体はポリペプチドの多量体であり、各ポリペプチドは免疫グロブリン軽鎖の結合領域を含む第一ドメインおよび免疫グロブリン重鎖の結合領域を含む第二ドメインを含み、この２個のドメインは連結している(例えばペプチドリンカー)が、互いに会合して抗原結合部位を形成することはできない：抗原結合部位は、多量体内の１個のポリペプチドの第一ドメインと、多量体内の他のポリペプチドの第二ドメインの会合により形成される(WO94/13804)。
【００３０】
好ましくは、本抗体はメチルシチジンに特異的である。より好ましくは、５−メチルシチジンである。
【００３１】
メチル化ヌクレオシドに特異的な抗体の結合に適した条件
当業者は、液相中での第一抗体のメチル化ヌクレオシドへの結合に適した条件を容易に決定できる。特に、抗体がメチル化ヌクレオシドに効果的に結合できるように、サンプル中の適当なイオンバランスを維持することが重要である。例えば、サンプルのｐＨは、リン酸ナトリウムのような適当な緩衝剤の添加により制御でき、これは、ｐＨを約７.０に維持する。塩化ナトリウムのような塩もまた緩衝液および／またはサンプルに添加できる。
【００３２】
サンプルを、それを核酸と接触させる間、約１〜５℃に維持することが好ましいかもしれない。
【００３３】
メチル化核酸の第一抗体への結合は、メチル化核酸を‘標識’する。この‘標識化’は、メチル化核酸を非メチル化核酸から分離することを可能にする。
【００３４】
分離工程の性質
好ましくは、選択工程前に、メチル化および非メチル化核酸フラグメントを、第一抗体のメチル化ヌクレオシドへの結合に基づき分離する。これは、当業者に既知の任意の方法で行い得る。
【００３５】
好ましい態様において、本分離は抗体の固相または支持体(この用語は交換可能に使用される)への接着または結合、そしてこの固相からのサンプル液相の分離により行う。故に、第一抗体に特異的に結合する固体支持体の添加は、メチル化核酸の非メチル化核酸からの分離を容易にする。固体支持体の第一抗体への特異的結合は、第一抗体に特異的な第二抗体を含む固体支持体の使用により達成できる。例えば、第一抗体(すなわちメチル化ヌクレオシドに特異的な抗体)がマウス抗ｍ５Ｃ抗体であるとき、ヤギ抗マウス抗体が適するであろう。
【００３６】
ビーズの形の固体支持体が、その上で結合が起こり得る大きな表面を提供するため、特に有用である。Dynabeads(Dynal Biotech)のような磁性ビーズは、ビーズ(および故にそれに結合している核酸)をサンプルから磁石を使用して容易に除去できるため、メチル化および非メチル化核酸の分離を簡単にする。あるいは、本固体支持体を非結合核酸から、遠心分離および／または濾過のような技術を使用して分離できる。当業者は、使用している固体支持体の非結合(すなわち非メチル化)核酸からの分離に適する方法を容易に決定できる。
【００３７】
メチル化核酸の特徴付け
メチル化核酸フラグメントの特徴付け前に、メチル化核酸を第一抗体(および使用しているならば固体支持体)から脱離させることが望まれる。当業者は、核酸が脱離工程中に変性しない、このような脱離法を容易に決定できる。
【００３８】
例えば、核酸フラグメントを、抗体から、抗体の消化により脱離できる。これは、第一抗体に結合した核酸フラグメントと、プロテイナーゼＫのようなプロテイナーゼのインキュベーションにより達成できる。
【００３９】
第一抗体に結合している核酸周辺のｐＨをわずかに変えることが、抗体とメチル化核酸の間の結合を弱めることができ、さらに脱離を容易にする。これは、適当な緩衝剤(例えば５０mM  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８.０)をメチル化核酸およびそれに結合している抗体に添加することにより達成できる。当業者は、これを行うための他の適当な方法を容易に決定できる。ＥＤＴＡ(エチレンジアミンテトラ酢酸)およびＳＤＳ(ドデシル硫酸ナトリウム)もまた緩衝液に添加できる。
【００４０】
第一抗体および固体支持体から脱離したら、本メチル化核酸を  −  例えば存在量、メチル化フラグメントの全部または一部の配列および／または本メチル化部位の配列または位置を決定するために  −  さらに分析できる。
【００４１】
この工程は、核酸のさらなる処理の後であり得る。例えば、メチル化核酸がＤＮＡであるとき、それを抽出し(例えばフェノールおよびクロロホルム中)、続いて沈殿させ得る(例えばエタノールで)。
【００４２】
慣用の核酸分析技術を次いで本メチル化核酸に適用する。例えば、メチル化核酸中の目的の配列の存在を、当業者に既知のようなＰＣＲ、スロット・ブロット、マイクロアレイなどの技術を使用して決定できる。
【００４３】
例えば分析は、ガラス支持体上にオリゴヌクレオチドまたは長いＤＮＡ配列のマイクロアレイを含む、マイクロチップ系を用いうる。サンプル核酸(例えば蛍光標識した)を、オリゴヌクレオチドアレイとハイブリダイズさせ、配列特異的ハイブリダイゼーションを、走査共焦点顕微鏡により検出し、自動的に分析できる(Marshall & Hodgson, Nature Biotechnology 16: 27-31, 1998; also Nature Cell Biology August 2001 volume 3 issue 8 pp E190 - E195 “Navigating gene expression using microarrays − a technology review” Almut Schulze and Julian Downward参照)。マイクロアレイ・アセンブリーおよびＤＮＡ検出に現在使用されている技術の一覧は、本“DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual”, eds. Bowtell and Sambrook, CSHL 2002に見ることができる。
【００４４】
本発明のいくつかの他の局面を、ここで記載する。
【００４５】
ゲノム分析
上記の本方法に使用する核酸フラグメント単離を、標準ＰＣＲまたはスロット・ブロットハイブリダイゼーションのいずれかにより分析できるため、この方法はマイクロアレイを使用した大規模(ゲノム全体)分析に適用できる。
【００４６】
故に本発明は、(例えば生物ゲノムからの)ＤＮＡサンプルのメチル化状態を特徴付けする方法であって：
(ｉ)ゲノムをフラグメント化し、
(ii)上記の通りの本発明の方法を行う
工程を含む、方法を提供する。
【００４７】
“メチル化状態”は、核酸配列がメチル化されているかいないか、および／またはどの程度されているかを意味する。メチル化の程度は、配列中のどのヌクレオチドがメチル化されているかおよび／または配列中のメチル化されているヌクレオチドの割合として測定できる。
【００４８】
核酸のメチル化の比較法
上記の通り、本発明の方法において、富化は用量依存的である(すなわち富化はメチル化ヌクレオシドの数に比例する)(実施例２および図２Ｂ参照)。これは、本発明が、遺伝子がメチル化されているか否かの決定に使用できるだけでなく、それらの遺伝子のメチル化の程度の定量または比較にも使用できることを意味する。
【００４９】
故に本発明は、異なる、対応する、核酸または核酸サンプルのメチル化を比較する方法であって：
(ｉ)各核酸またはサンプルに対して上記の通りの本発明の方法を行い、
(ii)工程(ｄ)の結果を比較する
工程を含む方法を提供する。
【００５０】
本方法は別々に、または多重で実施できる(ただし、核酸またはサンプルは識別可能である)。典型的に核酸は、配列マーカーまたはラベルにより識別可能である。
【００５１】
一つの態様において、本発明は  −  例えばインプリントされた遺伝子の  −  サンプル中の、異なってメチル化された対立遺伝子検出に使用できる。
【００５２】
“インプリントされた遺伝子”は、それらが、雄性または雌性親のいずれから遺伝されたかに依存して、その対立遺伝子が異なった発現度または浸透度を有する遺伝子である。インプリンティングは、発育段階特異的または組織特異的のいずれかであり得る。遺伝子の母性および父性対立遺伝子が異なってメチル化されるとき、それらは、本発明の方法に付される核酸サンプルにおいて、異なる程度まで富化される。
【００５３】
それらの対立遺伝子が異なってメチル化されるインプリントされた遺伝子の例は、マウスのＨ１９  ＩＣＲである(実施例３および図２Ｃ参照)。この座位はＣｐＧ島を含む。ＣｐＧ島は、１kb長前後の一続きの配列であり、しばしば遺伝子の５’末端に発生し、それは高密度のＣｐＧジヌクレオチドを含む。このＣｐＧ島は、母性対立遺伝子ではメチル化されないが、父性対立遺伝子ではメチル化される(実施例３および図２Ｃ参照)。マウスゲノムＤＮＡのフラグメントのサンプルに適用したとき、本発明の方法は父性対立遺伝子を富化するが、母性対立遺伝子はしない。当業者は、母性または父性対立遺伝子のいずれがサンプル中で富化されたかを決定する適当な技術を容易に決定できる。母性または父性対立遺伝子のいずれかのための‘マーカー’が特に有用である。例えば、Mus spretusからのＨ１９  ＩＣＲ対立遺伝子は、Mus musculus domesticus  Ｈ１９  ＩＣＲ対立遺伝子に存在しない多型ＳａｃＩ制限部位を含む。故に、domesticus×spretusハイブリッドは、ＳａｃＩ制限部位を有する１個の対立遺伝子と有さない１個を含む。Ｈ１９  ＩＣＲのプライマーを使用したＰＣＲ増幅、続くＰＣＲ産物のＳａｃＩでの処理は、domesticus対立遺伝子については１個の２００bpフラグメントおよびspretus対立遺伝子については２個の１００bpフラグメントをもたらす。‘富化’サンプルから得たフラグメントのサイズは、故に母性、父性または両方の対立遺伝子が富化されているかどうかを示す。
【００５４】
診断または予後診断
上記の通り、異常ＤＮＡメチル化は疾患をもたらし得る。特に、異常ＤＮＡメチル化はプロトオンコジーンの増加した発現または腫瘍抑制遺伝子の減少した発現をもたらし、多くのヒト癌腫と関連する。
【００５５】
本発明の方法を、疾患状態と関連する異常核酸メチル化部位のスクリーニングおよび同定に、または、例えば癌における疾患もしくは疾患進行の診断もしくは予後診断に使用できる。
【００５６】
疾患状態と関連する新規異常核酸メチル化部位を、本発明の方法を、病気のおよび病気ではない個体からの核酸サンプルに対して行い、結果を比較することにより同定できる。
【００５７】
本発明は、さらに、個体における特異的核酸配列のメチル化と関連する疾患の診断の方法であって：
(ｉ)該個体由来の核酸サンプルに対して上記の通りの本発明の方法を行い、特異的核酸配列がメチル化されているか否かを特徴付けし、そして
(ii)その結果と個体の疾患状態を相関させる
工程を含む方法を提供する。
【００５８】
本発明は、さらに、核酸メチル化の経時的変化の検出のために提供される(例えばこれを病歴と、故に、核酸配列におけるメチル化の変化と関連する疾患の診断または予後診断と相関させるため)。
【００５９】
このような方法は：
(ｉ)患者から核酸フラグメントのサンプルを少なくとも２回の時点で得て、
(ii)本発明の方法を、各時点の各核酸フラグメントのサンプルに対して行い、核酸配列がメチル化されているかいないか、および／またはどの程度されているかの特徴付けをする
工程を含み得る。
【００６０】
好ましくは核酸フラグメントのサンプルは、患者から下記プロトコールを使用して得る：
(ａ)患者から組織標本を得て；
(ｂ)核酸を各組織標本から抽出して核酸サンプルを提供し；
(ｃ)核酸サンプルをフラグメント化して、核酸フラグメントのサンプルを得る。
【００６１】
核酸メチル化の経時的変化の検出のための本方法は
(iii)各時点で患者において観察された疾患の臨床症状を記録し、そして
(iv)各時点で記録された臨床症状と、各時点の目的の核酸配列のメチル化状態を比較する
工程をさらに含み得る。
【００６２】
核酸メチル化の変化の検出のための本方法は、任意の適当な順番で行い得る。例えば、抽出および分析工程を、各時点に、またはその直後に行い得る。あるいは、標本またはサンプルを貯蔵し、核酸の抽出および／または記録した臨床症状とメチル化状態の比較を、複数サンプルで一緒に行い得る。例えば組織標本は、貯蔵のために凍結またはホルマリンで固定されていてよい。
【００６３】
好ましくは特異的核酸配列のメチル化または核酸配列のメチル化の変化と関連する疾患は、癌である。
【００６４】
本発明を、ここで、下記の非限定的図面および実施例を参照してさらに記載する。本発明の他の態様を、これらに照らして、当業者は考えるであろう。
【００６５】
ここに引用する全ての引用文献の開示を、それが当業者が本発明を実施する際に使用できる程度に、ここに相互参照により特に包含する。
【００６６】
モジュレーターのスクリーニングおよび処置法
標的遺伝子が同定されたら、それを可能性のある抗癌剤を同定するための調査目的の薬剤スクリーニングに使用できる。このようなスクリーニングは、標的遺伝子によりコードされるタンパク質の発現、および化学薬品とそのタンパク質の、該化学薬品が該タンパク質活性に対して何か効果を有するか否かを各員するための接触を含み得る。
【００６７】
既知の機能のタンパク質活性のアッセイは当分野で既知である。一般にこのようなアッセイは機能的アッセイと呼ばれ、無細胞でインビトロで、または細胞ベースの系で行い得る。機能的アッセイが利用可能である場合、リガンド結合アッセイが好ましい。
【００６８】
未知の機能のタンパク質のアッセイは、典型的にリガンド結合のみの評価に依存するが、化学物質レベルの異常(disturbance)に基づく他のアッセイは、当業者に既知である。
【００６９】
本発明において使用するための候補化学物質の供給は、当業者に既知である。例えば化合物のライブラリーを容易に合成し、試験できる。これは、例えば：Applications of combinatorial technologies to drug discovery, 2. Combinatorial organic synthesis, library screening techniques, and future direction, J. Med. Chem., 1994, 37, 1385-1401に詳細に記載されている。
【００７０】
未知の機能のタンパク質について、ここに概略のリガンド結合アッセイはまた候補化学物質の一群を定義する。しかしながら、この群は、結合が、タンパク質の表面に暴露されている多くの異なる部位で起こり、かつ結合単独ではタンパク質の活性と結合するリガンドの効果を予測できないため、大きすぎる傾向がある。候補化学物質の中から、最大の親和性を有するものの厳密な選択は、試験するのに充分に小さい化学物質のセットを定義する。
【００７１】
それとは別のまたはそれに付加される方法は、カルシウムイオン、サイクリックＡＭＰまたは細胞シグナル伝達経路の他の成分のセンサーを含むように遺伝子操作されている細胞中でのタンパク質標的の発現である。例えば、任意の適当な起源の永久細胞系をトランスフェクトし、そして該タンパク質を永久的に発現する系を選択する。多くの場合、未知のタンパク質の発現は、細胞シグナル伝達成分のレベルのシフトをもたらし、それはセンサーにより検出され、例えば、蛍光または発光シグナルとして読み取ることができる。タンパク質発現細胞とコントロール細胞の差異が、本アッセイの基礎となる。タンパク質発現系とコントロール系の差異に対する化学物質の効果を評価する。
【００７２】
本発明のポリペプチドをコードする核酸も、遺伝子治療に使用できる。遺伝子治療適用において、遺伝子を、治療的に有効な、例えば欠損遺伝子の置換のための、遺伝子産物のインビボ合成を達成するために細胞に挿入する。遺伝子治療は、一回処置により永続する効果が達成される慣用の遺伝子治療、および、治療的に有効なＤＮＡまたはｍＲＮＡの１回または反復投与を含む遺伝子治療剤の投与の両方を含む。アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡは、インビボである遺伝子の発現を遮断するための治療剤として使用できる。短アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞が移入され、その場所でそれが、細胞膜により限定された取り込みが原因の低細胞内濃度にもかかわらず、阻害剤として作用できることが既に示されている。(Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 4143-4146, 1986)。オリゴヌクレオチドは、取り込みを促進するために、例えば、それらの負荷電ホスホジエステル基を非荷電基で置換することにより、修飾できる。
【００７３】
核酸を生存可能細胞に挿入するために利用できる種々の技術がある。本技術は、核酸を培養細胞にインビトロで移植するか、または意図される宿主内の細胞にインビボで移植するかに依存して異なる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移植するのに適する技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などの使用を含む。現在好ましいインビボ遺伝子移植技術は、ウイルス(典型的にレトロウイルス)ベクターでのトランスフェクションおよびウイルスコートタンパク質−リポソーム介在トランスフェクションを含む(Dzau et al., Trends in Biotechnology, 11: 205-20, 1993)。ある状況において、細胞表面膜タンパク質または標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上の受容体のリガンドなどのような、標的細胞が標的とする薬剤と共に核酸源を提供することが望ましい。リポソームを用いるとき、エンドサイトーシスと関連する細胞表面膜タンパク質と結合するタンパク質を、例えば、特定の細胞型を指向する(tropic)キャプシッドタンパク質またはそのフラグメント、サイクリングにおける内部移行に付されているタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし、細胞内半減期を延長するタンパク質の、ターゲティングおよび／または取り込みを促進するために使用できる。受容体介在エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wu et al., J. Biol. Chem., 262: 4429-4432, 1987; Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414, 1990)により記載されている。遺伝子製造および遺伝子治療プロトコールのレビューについて、Anderson et al., Science, 256: 808-813, 1992参照。
【００７４】
図面の記載
図１：本発明の好ましい態様および続く特徴付け工程の模式図である。望む平均長のゲノムＤＮＡ(制限酵素での消化または剪断のいずれかにより産生)を変性させ、メチル化ＤＮＡを５−メチルシチジンに対する抗体とのインキュベートにより単離する。５−メチルシチジンに対する抗体はメチル化配列に結合する。これらを非メチル化配列から分離し、次いでＰＣＲまたはマイクロアレイのような標準ＤＮＡ検出法で検出できる。
【００７５】
図２ａ：マウスゲノム中のメチル化配列の検出。非メチル化ＣｐＧ島(ActinbおよびＡＰＲＴプロモーター)およびＣｐＧ(ＣｐＧａおよびＣｐＧｂ)を含まないコントロール配列と比較してメチル化配列が富化される(IAP Long Terminal Repeat, Xist promoter, H19 ICR)。値は、本発明の方法に付した、ＡｌｕＩ消化した雌ｇＤＮＡ(左)および雄音波処理ｇＤＮＡ(右)からのＤＮＡの実時間ＰＣＲにより計算した。ＩＡＰ＝大槽内Ａ粒子。ＩＣＲ＝インプリンティングコントロール領域。ＡＰＲＴ＝アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ。
【００７６】
図２ｂ：Ｈ１９  ＩＣＲ配列における４個のＡｌｕＩ制限フラグメントの富化とメチル化シトシンの数の正の相関。
【００７７】
図２ｃ：インプリントされたＨ１９  ＩＣＲのメチル化父性対立遺伝子の特異的検出。本アッセイは、ハイブリッドマウスｇＤＮＡ(Mus musculus domesticus×spretus)で行い、ＩＣＲの親の対立遺伝子を、spretus対立遺伝子に特異的な多型ＳａｃＩ制限部位を使用したＰＣＲにより同定した。黒および白印は、各々メチル化および非メチル化ＣｐＧｓを示す。ＩＣＲ＝インプリンティングコントロール領域。ＩＰ＝‘富化’サンプル。ＩＮ＝非‘富化’サンプル。
【００７８】
図３：結腸癌における異常メチル化のための新規標的の確認。Ａ. ＰＣＲ用プライマーを、ＳＷ４８細胞において過剰メチル化であるとマイクロアレイ分析で同定された陽性クローンのために設計した。ＤＮＡメチル化は、上記の本方法に従い、ＷＩ３８原発性線維芽細胞およびＳＷ４８結腸癌細胞から調製した富化メチル化サンプルに対する単一遺伝子ＰＣＲにより制御された。ＩＮ＝インプットゲノムＤＮＡ、Ｍ＝富化メチル化ＤＮＡ。別のコントロールとして、本発明者らは、３名の患者からの適合させた正常結腸(Ｎ)および結腸腫瘍(Ｔ)から調製したサンプルを分析した。ＭＬＨ１およびＲＡＳＳＦ１Ａは、ＳＷ４８細胞およびある結腸腫瘍において異常にメチル化されると以前に記載されている。インプリントされたＨ１９  ＩＣＲ配列は、メチル化のポジティブコントロールとして働く。Ｂ. メチル化感受性制限によるメチル化状態の制御。ゲノムＤＮＡは、メチル化感受性ＨｐａＩＩ酵素で消化するか、または未消化のいずれかであり、無作為に選択された３個の陽性クローン(最上列)および陰性クローン(最下列)にわたるＨｐａＩＩ含有ＰＣＲフラグメントをプライマーとＰＣＲ鋳型として使用した。ＰＣＲ単位複製配列内のＨｐａＩＩ部位の数を括弧内に示す。ＨｐａＩＩ消化後のＰＣＲ産物の存在は、サンプル中のＤＮＡメチル化を反映し、いずれの場合も、上記富化分析を確認する。Ｃ. ５−アザ−ｄＣ処理による、ＳＷ４８細胞における沈黙遺伝子の再活性化。ＲＴ−ＰＣＲを、５μm  ５−アザ−ｄＣで４日間処理した(＋)またはしていない(−)ＷＩ３８線維芽細胞およびＳＷ４８細胞からのｃＤＮＡ調製物に対して行った。ベータ−アクチン(beta-acting)遺伝子をコントロールとして使用した。
【実施例】
【００７９】
実施例１
サンプル調製
雄マウス(Mus musculus domesticus)ゲノムＤＮＡを、Bransonデジタルソニファイアーを使用した音波処理によりフラグメント化し、雌マウス(Mus musculus domesticus)ゲノムＤＮＡを、製造者が推薦する条件を使用したＡｌｕＩ(NEW ENGLAND BIOLABS, USA)での消化によりフラグメント化。
【００８０】
富化
４μg  ＡｌｕＩ消化または音波処理マウスゲノムＤＮＡを４５０μL  ＴＥ(１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７.５、１mM  ＥＤＴＡ)で希釈してＤＮＡ懸濁液を製造し、９５℃で１０分加熱してＤＮＡを変性させた。
【００８１】
５１μLの１０×ＩＰ緩衝液(１００mM  リン酸ＮａｐＨ７.０、１.４Ｍ  ＮａＣｌ、０.５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００)および１０μLの５−メチルシチジンに対するマウスモノクローナル抗体(EUROGENTEC, #MMS-900P-B)を懸濁液に添加した。本懸濁液を次いで２時間、４℃でオーバーヘッド振盪(overhead shaking)しながらインキュベートした。
【００８２】
３０μLのDynabeads  Ｍ−２８０ヒツジ抗マウスＩｇＧ(DYNAL BIOTECH, #112.01)をＰＢＳ−ＢＳＡ  ０.１％(リン酸緩衝化食塩水−ウシ血清アルブミン)で予洗し、懸濁液に添加した。本懸濁液をさらに２時間、４℃でオーバーヘッド振盪しながらインキュベートした。
【００８３】
ビーズを３回７００μLの１×ＩＰ緩衝液(１０mM  リン酸ＮａｐＨ７.０、０.１４Ｍ  ＮａＣｌ、０.０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００)で洗浄し、２５０μL  消化緩衝液(５０mM  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８.０、１０mM  ＥＤＴＡ、０.５％ＳＤＳ)に再懸濁した。
【００８４】
７μLのプロテイナーゼＫ(１０mg／ml)をビーズ懸濁液に添加し、ビーズ懸濁液を５０℃で３時間、水平に振盪させながらインキュベートした。
【００８５】
ＤＮＡをビーズ懸濁液からの有機抽出と、その後のエタノール沈殿により抽出した。これは下記の通り行った：
１. １容量のフェノールでの抽出。
２. １容量のクロロホルムでの抽出。
３. 残りの水相を３００mM  ＮａＣｌに調整し、２容量のエタノールを添加した。
４. 沈殿を室温で１４.０００rpmの遠心分離により行った。
５. 得られたＤＮＡペレットを２００μlの７０％エタノールで洗浄し、その後５０μL  ＴＥに溶解した。
【００８６】
メチル化配列の発生量の検出
非メチル化ＣｐＧ島(ActinbおよびＡＰＲＴプロモーター)およびＣｐＧ(ＣｐＧａおよびＣｐＧｂ)を含まないコントロール配列に対するメチル化配列の発生量(IAP Long Terminal Repeat, Xist promoter, H19 ICR)を、実時間ＰＣＲを使用して分析した。
【００８７】
雌マウスＡｌｕＩ消化したゲノムＤＮＡの結果(左)または音波処理雄マウスゲノムＤＮＡの結果(右)を図２Ａに示す。この新規なアプローチを使用して、メチル化配列の、非メチル化コントロールの１２０倍までの富化が観察された。
【００８８】
実施例２
マウス(Mus musculus domesticus)ゲノムＤＮＡを、ＡｌｕＩでの消化によりフラグメント化した。４μgの本フラグメント化ＤＮＡを、実施例１に記載の通りの富化に付した。
【００８９】
種々の量のメチル化ＣｐＧを含むＨ１９  ＩＣＲの４個の制限フラグメントの発生量を、ＣｐＧを含まないネガティブコントロールに対して、実時間ＰＣＲにより計算した。
【００９０】
図２Ｂの結果が、富化と、制限フラグメント中のメチル化ＣｐＧの量の間の正の直線的相関を示す。
【００９１】
実施例３
ハイブリッドマウス(Mus musculus domesticus×Mus spretus)ゲノムＤＮＡを、音波処理によりフラグメント化した。
【００９２】
４μgの本フラグメント化ＤＮＡを４５０μL  ＴＥ(１０mM  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ  ｐＨ７.５、１mM  ＥＤＴＡ)で希釈してＤＮＡ懸濁液を製造し、９５℃で１０分加熱してＤＮＡを変性させた。
【００９３】
本懸濁液を２個のサンプルに分けた(ＩＮおよびＩＰ)。サンプルＩＰは、実施例１に記載の通りの富化に付した。サンプルＩＮは富化に付さなかった。
【００９４】
母性および父性対立遺伝子の検出
ＩＮおよびＩＰサンプルの両方を、Ｈ１９  ＩＣＲ対立遺伝子のプライマーを使用したＰＣＲで増幅させ、これは２００bp  ＰＣＲ産物をもたらした。Mus spretus由来のＨ１９  ＩＣＲ対立遺伝子は、Mus musculus domesticus  Ｈ１９  ＩＣＲ対立遺伝子には存在しない多型ＳａｃＩ制限部位を含む。domesticus対立遺伝子からのＰＣＲ産物のＳａｃＩでの処理は２００bpフラグメントを未切断のまま残すが、spretus対立遺伝子からのＰＣＲ産物のＳａｃＩでの処理は、２個の１００bpフラグメントをもたらした。
【００９５】
ＩＮおよびＩＰ  ＰＣＲ産物を、各２個の小サンプルに分けた。４個の小サンプルを、ＩＮ−、ＩＮ＋、ＩＰ−、ＩＰ＋と名付けた。ＩＮ＋およびＩＰ＋を、ＰＣＲ後ＳａｃＩで処理した。ＩＮ−およびＩＰ−はＳａｃＩで処理しなかった。
【００９６】
図２Ｃは、各小サンプルにおいて見られるＤＮＡフラグメントを示す、臭化エチジウムアガロースゲルの図である。富化前は、父性(spretus)対立遺伝子および母性(domesticus)対立遺伝子の両方がサンプルに存在する。富化後、父性対立遺伝子のみが存在する。こでは、父性(spretus)対立遺伝子のみが、この方法で富化されることを証明する。父性Ｈ１９  ＩＣＲ対立遺伝子のみがメチル化されているため、使用した富化法は、メチル化ＤＮＡに特異的である。
【００９７】
実施例４
結腸癌における異常メチル化の新規標的の同定
結腸癌細胞系ＳＷ４８(ATTC, Rockville, MD)を、上記の通りのメチル化ＤＮＡの富化に付し、得られたサンプルを、製造者が記載の通り約１２０００個のＣｐＧ島プローブ(UHN Microarray Centre, Ontario)を表すマイクロアレイに、ハイブリダイゼーションし、ヒト肺線維芽細胞ＨＦＬ−１(ATTC, Rockville, MD)およびＷＩ−３８(ATTC, Rockville, MD)と比較した。ＣｐＧ島アレイハイブリダイゼーションのために、２μgの音波処理インプットＤＮＡをＣｙ５−ｄＣＴＰで標識し、１回の富化アッセイの産物をＣｙ３−ｄＣＴＰで標識した。標識は、Bioprime標識化キット(Invitrogen)、１２０μMの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、６０μM  ｄＣＴＰおよび６０μM  Ｃｙ５−ｄＣＴＰまたはＣｙ３−ｄＣＴＰを使用した無作為プライミングにより行った。この方法により、本発明者らは、結腸癌細胞に排他的なＤＮＡ過剰メチル化領域を同定した。この１９３クローンの群のうち、１０８個は、配列アノテーションに基づき不明瞭ではないと同定できた。この中で、３１個のみが独特の配列に対応し、一方７７個はリボソームＤＮＡを示した。このようなリボソームＤＮＡの過剰メチル化は加齢および腫瘍形成と関連して以前に記載報告されているが、その生理学的役割はまだ不明なままである。独特な配列のうち、３個のクローンが遺伝子間ＣｐＧ島を示すが、残りの２８個は、２６種の異なる遺伝子に位置づけされた。２個の遺伝子以外、全てプロモーター領域に位置する。
【００９８】
メチル化ＤＮＡの単一遺伝子ＰＣＲによるマイクロアレイ結果を確認するために、我々は、これらの候補遺伝子の２２個に特異的なプライマーを設計した。これらのコントロールは、全遺伝子の７０％におけるＳＷ４８−特異的メチル化を確認した。メチル化感受性制限酵素を別々の独立したアプローチとして使用して、３個の無作為に選択した遺伝子上の差次的メチル化を確認した。最後に、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、本発明者らは、これらの遺伝子のサブセットのＳＷ４８細胞における転写下方制御および脱メチル化剤５−アザ−ｄＣでの処理による抑制解除を証明した。この再反応化は、検出されたメチル化が、連結する遺伝子の活性を直接抑制することを示唆する。故に、本発明の方法とＣｐＧ島マイクロアレイでのハイブリダイゼーションは、癌細胞における後成的に沈黙した遺伝子の同定を可能にする。
【００９９】
５−アザ−ｄＣ処理およびＲＴ−ＰＣＲ
ＳＷ４８細胞(１×１０６)を培養培地に播き、２４時間維持して、その後処理した。細胞を次いで５μM  ５−アザ−ｄＣ(Sigma)で４日間処置した。５−アザ−ｄＣ含有培地を処置開始２４時間後に交換した。コントロール細胞を、５−アザ−ｄＣ添加無しで同じ方法で処理した。総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニ・キット(Quiagen)を使用して調製し、ｃＤＮＡ合成を２μgの総ＲＮＡ上で、Superscipt第一鎖合成系(Invitrogen)およびオリゴ−ｄＴプライマーを使用して行った。ＰＣＲ反応を、ｃＤＮＡ調製物の１／２０で行った。ＲＴ酵素なしのコントロールは全て陰性であった。
【０１００】
ＭｅＤＩＰサンプル上のＰＣＲ用プライマー(ｓ＝センス；ａｓ＝アンチセンス)
ＫＩＡＡ０７８９  ｓ  ＡＴＴＣＡＡＧＧＣＧＣＡＣＡＣＴＡＴＣＣＣ
ＫＩＡＡ０７８９  ａｓ  ＴＧＣＴＧＣＡＧＴＧＧＣＴＴＴＡＡＧＧＡＡ
ＦＯＸＦ１  ｓ  ＴＧＣＡＴＴＴＣＧＧＡＡＧＣＣＡＣＴＧＴ
ＦＯＸＦ１  ａｓ  ＡＡＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＧＡＡＧ
ＡＤＡＭ１２  ｓ  ＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＴＣＡＣＡＧＧＣＣＴ
ＡＤＡＭ１２  ａｓ  ＡＡＡＡＧＴＴＴＣＣＣＣＣＣＧＴＧＴＧＴ
ＭＧＣ４８６２５  ｓ  ＣＣＴＴＴＣＣＣＡＴＣＴＴＡＡＧＣＴＣＣＧ
ＭＧＣ４８６２５  ａｓ  ＧＣＧＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＴＴＴＴＴＴ
ＳＨＨ  ｓ  ＴＡＣＣＴＴＴＧＡＧＧＣＣＡＣＡＧＡＧＣＣ
ＳＨＨ  ａｓ  ＧＣＧＧＴＴＧＧＴＴＣＴＴＡＡＧＣＣＣＴＡ
ＰＡＸ６  ｓ  ＡＡＣＡＡＴＴＣＧＧＣＧＣＴＴＴＴＣＧＴ
ＰＡＸ６  ａｓ  ＴＴＣＴＴＡＡＡＴＴＣＴＣＣＣＣＧＧＣＣ
ＦＬＪ２５４３９  ｓ  ＧＣＴＴＡＣＡＧＡＣＴＴＧＣＣＧＣＡＧＡＡ
ＦＬＪ２５４３９  ａｓ  ＴＣＴＧＡＴＣＴＣＴＣＡＡＡＣＴＣＣＣＧＧＡ
ＴＡＺ  ｓ  ＣＡＡＧＣＣＣＣＧＡＧＴＧＣＡＧＴＴＡＴＴ
ＴＡＺ  ａｓ  ＡＴＡＡＴＴＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＡＧＡ
【０１０１】
ＨｐａＩＩ消化
２μgのゲノムＤＮＡをＸｂａＩとＨｐａＩＩまたはＸｂａＩのみのいずれかで消化した。ＰＣＲ反応を、数個のＨｐａＩＩ制限部位を含むフラグメントにわたるプライマーを使用して、２５ngの消化したＤＮＡ上で行った。プライマー配列およびＰＣＲ条件は請求に応じて入手可能である。
【０１０２】
結腸癌における異常メチル化の新規標的：
ＣｐＧ島アレイを使用して同定した標的遺伝子の中で、ホメオボックス遺伝子ＰＡＸ６−受託番号ＮＭ＿０００２８０−のみが、ＳＷ４８細胞においてメチル化されると既に報告されている。ＧＡＴＡ３遺伝子は、以前は結腸癌では試験されていないが、乳癌細胞において異常にメチル化されると報告されていた。残りの遺伝子は、癌における異常過剰メチル化の新規標的を示す。
【０１０３】
これらの遺伝子は、転写制御(ＦＯＸＦ１−受託番号ＮＭ＿００１４５１−、ＰＡＸ６、ＴＡＺ−受託番号ＮＭ＿０１５４７２−、ＧＡＴＡ３−受託番号ＮＭ＿００１００２２９５−)、細胞周期進行(ＴＧＦＢ２−受託番号ＮＭ＿００３２３８−)、細胞−マトリックス相互作用(ＡＤＡＭ１２−受託番号ＮＭ＿００３４７４−)およびアポトーシス(ＤＡＰ−受託番号ＮＭ＿００４３９４−)を含む、広範囲の生物学的機能に関与する。これらのいくつかは、ＲＡＳＬ１１Ａ−受託番号ＮＭ＿２０６８２７−、ＦＯＸＦ１、ＴＧＦＢ２およびＳＨＨ−受託番号ＮＭ＿０００１９３−である。
【０１０４】
癌生物学における我々の発見の妥当性を評価するために、我々は、３名の患者からの、原発性腺癌および適合させた正常結腸組織の遺伝子のセットのメチル化状態を決定した(図３Ａ)。遺伝子の１個のみ(ＡＸＬ４)が全３個の正常結腸組織である程度メチル化されており、結腸特異的メチル化の可能性を示唆する。残りの遺伝子の全てについて、ＳＷ４８細胞におけるメチル化は、それらが、正常結腸においてメチル化されていないか、またはサンプルの１個(ＭＧＣ４８６２５−受託番号ＮＭ＿１８２６０９−)または２個(ＬＯＣ２８３５１４受託番号−ＮＭ＿１９８８４９−)のみにおいてメチル化されているため、組織特異的メチル化を反映しない。興味深いことに、これらの後者の遺伝子のメチル化は、正常結腸で均一ではない。このようなメチル化の年齢による差次的蓄積は、他の遺伝子に関しても観察されており、癌形成の素因であるはずである。要約すると、ＳＷ４８細胞系においてメチル化されたと同定された遺伝子の半分以上が、また少なくとも１個の腫瘍でメチル化されており、我々が、インビボでの異常過剰メチル化の新規標的を同定したことを証明する。
【０１０５】
引用文献
1. Hernandez-Blazquez, F. J., Habib, M., Dumollard, J. M., Barthelemy, C., Benchaib, M., de Capoa, A., and Niveleau, A. (2000). Evaluation of global DNA hypomethylation in human colon cancer tissues by immunohistochemistry and image analysis. Gut 47, 689-693.
2. Mayer, W., Niveleau, A., Walter, J., Fundele, R., and Haaf, T. (2000). Demethylation of the zygotic paternal genome. Nature 403, 501-502.
3. Tebib, J. G., Reynaud, C., Cedoz, J. P., Letroublon, M. C., and Niveleau, A. (1997). Relationship between urinary excretion of modified nucleosides and rheumatoid arthritis process. Br J Rheumatol 36, 990-995.
4. Achwal, C. W., Iyer, C. A. and Chandra, H. S. (1983) FEBS Lett. 158, 353-358
5. Achwal, C. W. and Chandra, H. S. (1982) FEBS Lett. 150, 469-472
6. Barbin, A., Montpellier, C., Kokalj, V. N., Gibaud, A., Niveleau, A., Malfoy, B., Dutrillaux, B. and Bourgeois, C. A. (1994) Hum. Genet. 94, 684-692
7. Rein, T., DePamphilis, M. L. and Zorbas, H. (1998). Nucleic Acids Research. 26, 2255-2264.
8. Jones, P. A. and Baylin, S. B. (2002). Nat Rev Genet 3, 415-428.
9. Fazzari, M. J. and Greally, J. M. (2004). Nat Rev Genet 5, 446-455.
10. Bowtell and Sambrook (eds.) (2002). DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual. CSHL.
11. Roitt et al. (1997)in ‘Immunology’ 5th Edition. Moseby International Ltd., London
12. Hollinger, P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 644-648.
13. WO94/13804 (CAMBRIDGE ANTIBODY TECH and HOLLIGER, K. P.). Published: 1994-06-23.
14. Marshall & Hodgson (1998) Nature Biotechnology 16: 27-31.
15. Schulze, A. and Downward, J. (2001). Nature Cell Biology August 2001, volume 3, issue 8, pp E190 - E195 “Navigating gene expression using microarrays − a technology review”.
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】本発明の好ましい態様および続く特徴付け工程の模式図である。望む平均長のゲノムＤＮＡ(制限酵素での消化または剪断のいずれかにより産生)を変性させ、メチル化ＤＮＡを５−メチルシチジンに対する抗体とのインキュベートにより単離する。５−メチルシチジンに対する抗体はメチル化配列に結合する。これらを非メチル化配列から分離し、次いでＰＣＲまたはマイクロアレイのような標準ＤＮＡ検出法で検出できる。
【０１０７】
【図２ａ】マウスゲノム中のメチル化配列の検出。非メチル化ＣｐＧ島(ActinbおよびＡＰＲＴプロモーター)およびＣｐＧ(ＣｐＧａおよびＣｐＧｂ)を含まないコントロール配列と比較してメチル化配列が富化される(IAP Long Terminal Repeat, Xist promoter, H19 ICR)。値は、本発明の方法に付した、ＡｌｕＩ消化した雌ｇＤＮＡ(左)および雄音波処理ｇＤＮＡ(右)からのＤＮＡの実時間ＰＣＲにより計算した。ＩＡＰ＝大槽内Ａ粒子。ＩＣＲ＝インプリンティングコントロール領域。ＡＰＲＴ＝アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ。
【０１０８】
【図２ｂ】Ｈ１９  ＩＣＲ配列における４個のＡｌｕＩ制限フラグメントの富化とメチル化シトシンの数の正の相関。
【０１０９】
【図２ｃ】インプリントされたＨ１９  ＩＣＲのメチル化父性対立遺伝子の特異的検出。本アッセイは、ハイブリッドマウスｇＤＮＡ(Mus musculus domesticus×spretus)で行い、ＩＣＲの親の対立遺伝子を、spretus対立遺伝子に特異的な多型ＳａｃＩ制限部位を使用したＰＣＲにより同定した。黒および白印は、各々メチル化および非メチル化ＣｐＧｓを示す。ＩＣＲ＝インプリンティングコントロール領域。ＩＰ＝‘富化’サンプル。ＩＮ＝非‘富化’サンプル。
【０１１０】
【図３】結腸癌における異常メチル化のための新規標的の確認。Ａ. ＰＣＲ用プライマーを、ＳＷ４８細胞において過剰メチル化であるとマイクロアレイ分析で同定された陽性クローンのために設計した。ＤＮＡメチル化は、上記の本方法に従い、ＷＩ３８原発性線維芽細胞およびＳＷ４８結腸癌細胞から調製した富化メチル化サンプルに対する単一遺伝子ＰＣＲにより制御された。ＩＮ＝インプットゲノムＤＮＡ、Ｍ＝富化メチル化ＤＮＡ。別のコントロールとして、本発明者らは、３名の患者からの適合させた正常結腸(Ｎ)および結腸腫瘍(Ｔ)から調製したサンプルを分析した。ＭＬＨ１およびＲＡＳＳＦ１Ａは、ＳＷ４８細胞およびある結腸腫瘍において異常にメチル化されると以前に記載されている。インプリントされたＨ１９  ＩＣＲ配列は、メチル化のポジティブコントロールとして働く。Ｂ. メチル化感受性制限によるメチル化状態の制御。ゲノムＤＮＡは、メチル化感受性ＨｐａＩＩ酵素で消化するか、または未消化のいずれかであり、無作為に選択された３個の陽性クローン(最上列)および陰性クローン(最下列)にわたるＨｐａＩＩ含有ＰＣＲフラグメントをプライマーとＰＣＲ鋳型として使用した。ＰＣＲ単位複製配列内のＨｐａＩＩ部位の数を括弧内に示す。ＨｐａＩＩ消化後のＰＣＲ産物の存在は、サンプル中のＤＮＡメチル化を反映し、いずれの場合も、上記富化分析を確認する。Ｃ. ５−アザ−ｄＣ処理による、ＳＷ４８細胞における沈黙遺伝子の再活性化。ＲＴ−ＰＣＲを、５μm  ５−アザ−ｄＣで４日間処理した(＋)またはしていない(−)ＷＩ３８線維芽細胞およびＳＷ４８細胞からのｃＤＮＡ調製物に対して行った。ベータ−アクチン遺伝子をコントロールとして使用した。
【図１】
2008502332.tif 000002
【図２ａ】
2008502332.tif 000003
【図２ｂ】
2008502332.tif 000004
【図２ｃ】
2008502332.tif 000005
【図３】
2008502332.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成19年2月14日(2007.2.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008502332000001.app
【国際調査報告】
2008502332.tif 000007
2008502332.tif 000008
2008502332.tif 000009
2008502332.tif 000010
2008502332.tif 000011