(57)【要約】本発明は、Ｐｏｌ  ＩＩＩα変異体、これを含む改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼ、種々の核酸複製反応のための改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼの使用方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数のモチーフＡおよびＢ中に少なくとも１つの変異を有するＰｏｌ  ＩＩＩα変異体であって、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩαが、前記少なくとも１つの変異を持たない非改変Ｐｏｌ  ＩＩＩαと比較して活性が変化している、Ｐｏｌ  ＩＩＩα変異体。
【請求項２】
前記Ｐｏｌ  ＩＩＩα変異体が、前記非改変Ｐｏｌ  ＩＩＩαと比較してｄＮＴＰ識別活性が変化している、請求項１に記載のＰｏｌ  ＩＩＩα変異体。
【請求項３】
前記Ｐｏｌ  ＩＩＩα変異体のｄｄＮＴＰに対する親和性が増加している、請求項２に記載のＰｏｌ  ＩＩＩα変異体。
【請求項４】
前記Ｐｏｌ  ＩＩＩα変異体が、モチーフＢ中に１つまたは複数の変異を含む、請求項２に記載のＰｏｌ  ＩＩＩα変異体。
【請求項５】
前記Ｐｏｌ  ＩＩＩα変異体の標識ヌクレオチドに対する親和性が増加している、請求項２に記載のＰｏｌ  ＩＩＩα変異体。
【請求項６】
前記Ｐｏｌ  ＩＩＩα変異体が、モチーフＡ中に１つまたは複数の変異を含む、請求項５に記載のＰｏｌ  ＩＩＩα変異体。
【請求項７】
前記Ｐｏｌ  ＩＩＩα変異体が、モチーフＢ中に１つまたは複数の変異を含む、請求項５に記載のＰｏｌ  ＩＩＩα変異体。
【請求項８】
前記Ｐｏｌ  ＩＩＩα変異体が、モチーフＡ中に１つまたは複数の変異およびモチーフＢ中に１つまたは複数の変異を含む、請求項５に記載のＰｏｌ  ＩＩＩα変異体。
【請求項９】
前記Ｐｏｌ  ＩＩＩα変異体が、前記非改変Ｐｏｌ  ＩＩＩαと比較してプライマー識別活性が変化している、請求項１に記載のＰｏｌ  ＩＩＩα変異体。
【請求項１０】
前記Ｐｏｌ  ＩＩＩα変異体のＲＮＡプライミングテンプレートに対する親和性が増加している、請求項９に記載のＰｏｌ  ＩＩＩα変異体。
【請求項１１】
前記Ｐｏｌ  ＩＩＩα変異体のＤＮＡプライミングテンプレートに対する親和性が減少している、請求項９に記載のＰｏｌ  ＩＩＩα変異体。
【請求項１２】
前記Ｐｏｌ  ＩＩＩα変異体のＤＮＡプライミングテンプレートに対する親和性が増加している、請求項９に記載のＰｏｌ  ＩＩＩα変異体。
【請求項１３】
前記Ｐｏｌ  ＩＩＩα変異体のＲＮＡプライミングテンプレートに対する親和性が減少している、請求項９に記載のＰｏｌ  ＩＩＩα変異体。
【請求項１４】
前記Ｐｏｌ  ＩＩＩα変異体が、モチーフＢ中に１つまたは複数の変異を含む、請求項９に記載のＰｏｌ  ＩＩＩα変異体。
【請求項１５】
請求項１〜請求項１４のいずれか１項に記載のＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を含む改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼ。
【請求項１６】
前記改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼがクランプローダーを欠く、請求項１５に記載の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼ。
【請求項１７】
前記改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼが、βスライディングクランプを含む、請求項１５に記載の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼ。
【請求項１８】
候補ポリペプチドを細菌ＤＮＡ  ＰｏｌＩＩＩαに分類する方法であって、前記候補ポリペプチド中の細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩαモチーフＡ、Ｂ、またはＣの少なくとも１つを同定する工程を含む、方法。
【請求項１９】
前記候補ポリペプチド中の細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩαモチーフＡおよびＢを同定する工程を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩαモチーフＡおよびＢの配置を決定する工程をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
細菌Ｐｏｌ  ＩＩＩαモチーフＡおよびＢのスペーシングを決定する工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記候補ポリペプチド中の細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩαモチーフＣを同定する工程をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩαモチーフＣおよびＡ、ＣおよびＢ、またはＣおよびＡおよびＢの配置を決定する工程をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細菌Ｐｏｌ  ＩＩＩαモチーフＣおよびＡ、ＣおよびＢ、またはＣおよびＡおよびＢのスペーシングを決定する工程をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩαモチーフが、グラム陽性細菌に対応する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記候補ポリペプチドが、ヒトサンプルに由来する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１に記載のＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を含む、核酸増幅キット。
【請求項２８】
請求項１に記載のＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を含む、核酸増幅反応管。
【請求項２９】
請求項１に記載のＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を含む、核酸増幅反応混合物。
【請求項３０】
核酸を複製する方法であって、請求項１に記載のＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を含む複製反応混合物中の前記核酸を複製反応に供する工程を含む、方法。
【請求項３１】
１つの反応混合物中の核酸を増幅および配列決定する方法であって、請求項１に記載のＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を含む反応混合物中の前記核酸を同時増幅および配列決定反応に供する工程を含む、方法。
【請求項３２】
患者の細菌感染を診断する方法であって、前記患者から得た候補ポリペプチド中の細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩαモチーフＡ、Ｂ、もしくはＣ、またはその組み合わせを同定する工程を含む、方法。
【請求項３３】
前記候補ポリペプチド中の少なくとも２つの前記細菌Ｐｏｌ  ＩＩＩαモチーフを同定する工程を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記候補ポリペプチド中の少なくとも２つの細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩαモチーフの配置を決定する工程をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記候補ポリペプチド中の少なくとも２つの細菌ＤＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩαモチーフのスペーシングを決定する工程をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩαモチーフが、グラム陽性細菌Ｐｏｌ  ＩＩＩコンセンサスモチーフである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
患者の細菌感染を診断する方法であって、前記患者からサンプルを得る工程と、前記サンプル中の１つまたは複数の細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩαモチーフＡ、Ｂ、およびＣをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列含む核酸を同定する工程を含む、方法。
【請求項３８】
前記核酸が、細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩαモチーフＡ、Ｂ、およびＣをコードするヌクレオチド配列の少なくとも２つを含む、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連の記述
本出願は、２００５年１月３日出願の米国特許仮出願番号６０／６４１，１８３号（特に、その全体が本明細書中で参考として援用される）の利益を主張する。
【０００２】
分野
本発明は、核酸分子の酵素合成、消化、複製、および改変に関する。本発明は、さらに、所望の特性が操作された細菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ酵素およびその変異形に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ＤＮＡポリメラーゼは、分子生物学の基本的過程で使用され、核酸配列決定、核酸ラベリング、核酸の定量（実時間ＰＣＲ、ＢＡＳＢＡ）、核酸増幅（ＰＣＲ、ＲＤＡ、ＳＤＡ）、およびＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写が含まれる。
【０００４】
ＤＮＡポリメラーゼは、種々の生物源から単離され、典型的には、少なくとも２つの異なる触媒活性を有する多機能酵素として特徴づけられている。例えば、レトロウイルス逆転写酵素は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮアーゼＨ型エンドヌクレアーゼ活性を有する。ＰＣＲおよび配列決定で使用される他のＤＮＡポリメラーゼ（熱安定性ＴａｑおよびＴｔｈＤＮＡポリメラーゼＩなど）は、その天然の形態で、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。別のＤＮＡポリメラーゼ群（大腸菌ＤＮＡポリメラーゼおよび配列決定酵素Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼが含まれる）は、２つの異なるエキソヌクレアーゼ活性（５’→３’および３’→５’）およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。分析方法における多機能性ＤＮＡポリメラーゼの使用には、ほとんどの場合、望ましくない非ポリメラーゼ活性の抑制または排除が必要である。活性が存在する完全なドメインを欠失させるか、変異誘発によって活性部位中の保存配列モチーフを変化させるタンパク質工学によってこれを行うことができる。両シナリオでは、酵素活性を決定する活性部位の位置および構造についての知識が必要である。
【０００５】
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素（「Ｐｏｌ  ＩＩＩ」）は、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．，１９８２  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｔｏ  ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ  １２２−１２５）（本明細書中で参考として援用される）によって最初に精製され、大腸菌染色体の主要なレプリカーゼであると決定された。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩの３つの機能的成分を、これら全てを連結させた１つのホロ酵素にアセンブリすることができる（ＭｃＨｅｎｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ．，２５２：６４７８−６４８４（１９７７）およびＭａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：６５５１−６５５９（１９８８）（本明細書中で参考として援用される）。
【０００６】
Ｐｏｌ  ＩＩＩの３つの機能的成分は、（ｉ）「コア」（すなわち、ポリメラーゼ）、β（すなわち、クランプ）、およびγ複合体（すなわち、クランプローダー）である。τサブユニットは、互いに２つのコアを保持してＰｏｌ  ＩＩＩ’サブアセンブリを形成し、これが１つのγ複合体に結合してＰｏｌ  ＩＩＩ*を形成する。τサブユニットおよびγサブユニットは、共にｄｎａＸによってコードされる。τは全長産物である一方で、γはτのＮ末端の約２／３であり、翻訳フレームシフトによって形成される（Ｔｓｕｃｈｉｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔｉｎｇ  Ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ｔｈｅ  γ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩＩ  Ｈｏｌｏｅｎｚｙｍｅ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，８７：２５１６−２５２０（１９９０）（本明細書中で参考として援用される））。
【０００７】
「コア」内に以下の３つのサブユニットが存在する。αサブユニット（ｄｎａＥによってコードされる）は、ＤＮＡポリメラーゼ活性を含み（Ｂｌａｎａｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：４６２２−４６２６（１９８４）（本明細書中で参考として援用される）、εサブユニット（ｄｎａＱ、ｍｕｔＤによってコードされる）はプルーフリーディング３’→５’エキソヌクレアーゼであり（Ｓｃｈｅｕｅｒｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：７７４７−７７５１（１９８５）およびＤｅＦｒａｎｃｅｓｃｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：５５６７−５５７３（１９８４）（本明細書中で参考として援用される）、θサブユニット（ｈｏｌＥによってコードされる）は、εを刺激する（Ｓｔｕｄｗｅｌｌ−Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，"ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩＩ  Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｖ．ｔｈｅｔａ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｈｏｌＥ*，"Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１１７８５−１１７９１（１９９３）（本明細書中で参考として援用される）。αサブユニットは、εと強固な１：１複合体を形成し（Ｍａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：１２９８７−１２９９２（１９８５）（本明細書中で参考として援用される）、θは、εと１：１複合体を形成する（Ｓｔｕｄｗｅｌｌ−Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，"ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩＩ  Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｖ．ｔｈｅｔａ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｈｏｌＥ*，"Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１１７８５−１１７９１（１９９３）（本明細書中で参考として援用される）。
【０００８】
大腸菌３成分ポリメラーゼは、ｓｓＤＮＡ結合タンパク質（「ＳＳＢ」）でコートされた固有にプライミングされたバクテリオファージ一本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）ゲノムを、５ｋｂの環状ＤＮＡから一度も分離することなく３０℃で少なくとも５００ヌクレオチド／秒の速度で非常に有効且つ完全に複製する（Ｆａｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６：９７６−９８３（１９８１）；Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：１２８８４−１２８８９（１９８５）；およびＭｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：１６６４４−１６６５４（１９８７）（本明細書中で参考として援用される））。
【０００９】
好熱性細菌では、最小機能的ＤＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩホロ酵素の組織化はあまり複雑ではない。ポリメラーゼコアは、εおよびθサブユニットを用いずに非常に有効に機能することができる。クランプローダー複合体は、機能的開始複合体にΨおよびχサブユニットが関与することなくアセンブリすることができる（例えば、Ｂｒｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：１７３３４−１７３４８，２００２；Ｂｕｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：１３４０１−１３４０８，２００２を参照のこと）。
【００１０】
古細菌では、ゲノムレプリカーゼホロ酵素は、同一の３つの機能的成分（クランプローダー（ＲＣＦ）、進化性クランプ（ＰＣＮＡ増殖細胞核抗原）、およびポリメラーゼコア）からアセンブリされるが、そのサブユニットの組織化は困難であり、これらのサブユニットは、細菌Ｐｏｌ  ＩＩＩサブユニットといかなる有意な配列相同性も共有しない。
【００１１】
以下に記載のように、本明細書中でモチーフＡ、Ｂ、およびＣと呼ばれる機能的モチーフは、Ｐｏｌ  Ｉ  ＤＮＡポリメラーゼ中で同定された。
【００１２】
「モチーフＡ」は、Ｐｏｌ  Ｉ酵素のパームドメイン中に存在してｄＮＴＰ結合ポケットの下部を形成し、ｄＮＴＰ結合およびデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの識別に関与する。モチーフＡは、プライミングテンプレート分子の結合にも関与する。常に不変のアスパラギン酸残基の後に、触媒的に重要なＭｇ2+カチオンと共にモチーフＡ複合体内の巨大な疎水性アミノ酸が続く。このＭｇ2+カチオンは、プライマーの３’末端の水酸基を活性化し、入ってくるｄＮＴＰのαホスホジエステル結合を攻撃する。
【００１３】
「モチーフＢ」は、フィンガードメイン中に存在してｄＮＴＰ結合ポケットの側面および頂点を形成し、ｄＮＴＰ結合ならびにデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの識別およびデオキシリボヌクレオチドとジデオキシリボヌクレオチドとの識別にも関与する。モチーフＢは、プライミングテンプレートの結合にも関与し、プライマーの３つの末端塩基のリン酸−糖骨格と相互作用する。モチーフＢ内に保存されたフェニルアラニンおよびチロシン残基は、π電子巣タッキング相互作用によって、入ってくるｄＮＴＰの塩基部分と相互作用する。モチーフＢのＮ末端の半分中の不変のリジン残基は、入ってくるｄＮＴＰのγおよびβオルソリン酸基と静電相互作用で結合する。
【００１４】
「モチーフＣ」は、パームドメイン中で隔離されており、ＤＮＡポリメラーゼの触媒活性部位を形成する。モチーフＣ内の２つの保存されたアスパラギン酸残基（時折、３つ）は、第２の触媒的に重要なＭｇ2+カチオンと配位結合し、ポリメラーゼと複合体化する。Ｍｇ2+カチオンは、入ってくるｄＮＴＰのαホスホジエステル結合を活性化する。
【００１５】
これらのモチーフの操作により、ヌクレオチド識別特性が変化し、テンプレート核酸特性が変化したポリメラーゼが得られた。
【００１６】
ＤＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩポリメラーゼは、一般に、異なる機構によって操作すると考えられている（例えば、Ｓｔｅｉｔｚ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：１７３９５−１７３９８，１９９９；Ｍａｒ  Ａｌｂａ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２：ｒｅｖｉｅｗｓ３００２．１−３００２．４，２００１を参照のこと）。しかし、Ｆｉｊａｌｋｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．は、配列アラインメントによるＰｏｌ  ＩＩＩα中の推定保存モチーフの同定を以前に報告しており（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５４：１０３９−１０４４，１９９３）、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌは、Ｐｏｌ  ＩＩＩα活性部位における２価カチオンの配位に関与すると推定される保存酸性残基の同定を報告している（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７９：６７２１−６７２８，１９９７）。
【００１７】
その報告では、Ｆｉｊａｌｋｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．は、Ｐｏｌ  Ｉ酵素のようにアミノ末端からカルボキシ末端への方向でＡ−Ｂ−Ｃとして配置した推定モチーフＡ、Ｂ、およびＣを同定した。しかし、配列アラインメントによって示唆される推定モチーフの機能を支持するデータは提供されておらず、Ｆｉｊａｌｋｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．によって試験された機能的Ｐｏｌ  ＩＩＩ変異は、その指定されたモチーフＡ、Ｂ、およびＣの外側をマッピングしていた。
【００１８】
Ｐｏｌ  Ｉポリメラーゼの活性部位を説明し直すために、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．は、アラインメントによってＰｏｌ  ＩＩＩ中に保存され、且つＰｏｌ  ＩＩＩ活性部位中での２価カチオンの配位に関与すると推定される２つのアスパラギン酸残基を同定した。さらに、彼らは、第３の保存された酸性残基の５つの候補位置を同定した。しかし、著者は、得られたデータはＰｏｌ  ＩＩＩ活性部位の位置に関して明確に結論づけるには不十分であることを認めていた。
【発明の開示】
【００１９】
発明の概要
細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニット中のＤＮＡポリメラーゼ機能的モチーフＡ、Ｂ、およびＣの同定、ならびにその得意な配置を本明細書中に開示する。これらのモチーフおよびその配置（そのスペーシングを含む）は、ＤＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩαサブユニット中で高度に保存されており、このことは、おそらく、触媒、プライマー選択性、およびヌクレオチド識別におけるその極めて重要な機能に起因する。Ｎ末端→Ｃ末端方向でＣ、Ａ、Ｂの順序のこれらのモチーフの配置は、以前の報告（Ｆｉｊａｌｋｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．前出）と矛盾し、全ての公知のポリメラーゼクラスで固有であり、細菌ゲノムＤＮＡレプリカーゼに特異的である。さらに、特に、グラム陰性細菌ＤｎａＥ、グラム陽性細菌ＤｎａＥ、グラム陽性細菌ＰｏｌＣ、およびラン藻ＤｎａＥのモチーフおよび配置を開示し、これを使用して、これらの異なるＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニット型を区別することができる。
【００２０】
１つの態様では、この発見から得られた配列ベースの分類および活性決定方法を本明細書中に開示する。本発明の分類および活性決定方法は、多数の適用（核酸分子の増幅および核酸分子の配列決定が含まれる）における以前に特徴づけられていないタンパク質および／または新規のタンパク質の潜在的有用性に関する情報が得られる都合の良い配列ベースの方法である。細菌感染を診断するための組成物および方法を本明細書中にさらに開示する。
【００２１】
グラム陰性細菌由来のＤｎａＥの活性部位のモチーフＡ、Ｂ、およびＣのコンセンサス配列は、それぞれ、Ｇ−［Ｌ／Ｍ］−［Ｌ／Ｖ／Ｉ］−Ｋ−Ｘ−Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−Ｘ−Ｘ−Ｌ−Ｔ、［Ｆ／Ｗ］−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｆ−Ｘ−Ｘ−Ｙ−［Ａ／Ｇ］−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｈ、およびＳ−Ｘ−Ｐ−Ｄ−［Ｆ／Ｉ］−Ｄ−Ｘ−Ｄ−［Ｆ／Ｉ］（式中、Ｘは、任意のアミノ酸である）である。モチーフの配置は、Ｎ末端からＣ末端への方向で、Ｃ−Ａ−Ｂであり、モチーフＣ−Ａ間のスペーシングは約１５３〜１５５アミノ酸であり、モチーフＡ−Ｂ間のスペーシングは約１９５〜２０１アミノ酸であり、それによるモチーフＣ−Ｂ間のスペーシングは３４８〜３５６アミノ酸である。この情報を、ポリペプチドがグラム陰性細菌由来のＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットであることについての配列ベースの決定方法に提供する。本方法は、候補ポリペプチドまたはそのセグメントのアミノ酸配列を決定する工程と、候補ポリペプチド中のグラム陰性ＤｎａＥに特徴的な配置を有するグラム陰性コンセンサスモチーフＡ、Ｂ、およびＣ、ＣおよびＡ、ＡおよびＢ、またはＣおよびＢのアミノ酸配列を同定する工程とを含む。別の実施形態では、本方法は、本質的に、ポリペプチドのアミノ酸配列またはその一部中のコンセンサスグラム陰性ＤｎａＥモチーフＡ、Ｂ、およびＣを同定する工程からなる。別の実施形態では、本方法は、本質的に、ポリペプチドのアミノ酸配列またはその一部中のコンセンサスグラム陰性ＤｎａＥモチーフＡ、Ｂ、またはＡおよびＢ、任意選択的にＣを同定する工程からなる。配列ベースの方法を、他の活性アッセイと組み合わせることができる。
【００２２】
ラン藻由来のＤｎａＥの活性部位のモチーフＡ、Ｂ、およびＣのコンセンサス配列は、それぞれ、Ｇ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｍ−Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−［Ｒ／Ｋ］−Ｎ−Ｌ−Ｔ、Ｆ−Ｄ−Ｑ−Ｍ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ａ−Ｅ−Ｙ−Ｃ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｈ、Ｐ−Ｄ−Ｉ−Ｄ−Ｔ−Ｄ−Ｆ−Ｃである。モチーフは、アミノ末端からカルボキシル末端への方向で、Ｃ−Ａ−Ｂの順序で配置されている。モチーフＣとＡとの間のスペーシングは約１００〜１６０アミノ酸である。モチーフＡとモチーフＢとの間のスペーシングは約１５０〜２１０アミノ酸である。モチーフＣからモチーフＢまでのスペーシングは２５０〜３７０アミノ酸である。この情報を、ポリペプチドがラン藻由来のＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットであることについての配列ベースの決定方法に提供する。本方法は、候補ポリペプチドまたはそのセグメントのアミノ酸配列を決定する工程と、候補ポリペプチド中のラン藻ＤｎａＥに特徴的な配置を有するラン藻コンセンサスモチーフＡ、Ｂ、およびＣ、ＣおよびＡ、ＡおよびＢ、またはＣおよびＢのアミノ酸を同定する工程とを含む。別の実施形態では、本方法は、本質的に、ポリペプチドのアミノ酸配列またはその一部中のコンセンサスラン藻ＤｎａＥモチーフＡ、Ｂ、およびＣを同定する工程からなる。別の実施形態では、本方法は、本質的に、ポリペプチドのアミノ酸配列またはその一部中のコンセンサスラン藻ＤｎａＥモチーフＡ、Ｂ、またはＡおよびＢ、任意選択的にＣを同定する工程からなる。配列ベースの方法を、他の活性アッセイと組み合わせることができる。
【００２３】
同様に、グラム陽性細菌由来のＤｎａＥの活性部位のモチーフＡ、Ｂ、およびＣのコンセンサス配列は、それぞれ、Ｇ−［Ｌ／Ｖ］−［Ｌ／Ｖ］−Ｋ−Ｘ−Ｄ−［Ｆ／Ｉ］−Ｌ−Ｇ−Ｌ−［Ｒ／Ｋ］−Ｘ−Ｌ−［Ｔ／Ｓ］、［Ｆ／Ｙ／Ｗ］−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−［Ｒ／Ｋ］−Ｆ−Ｘ−Ｘ−Ｙ−［Ａ／Ｇ］−Ｆ−Ｎ−［Ｒ／Ｋ］−Ｘ−Ｈ、およびＰ−Ｄ−Ｉ−Ｄ−［Ｌ／Ｉ／Ｖ］−Ｄ−［Ｆ／Ｌ／Ｖ］（式中、Ｘは、任意のアミノ酸である）である。モチーフの配置は、Ｎ末端からＣ末端への方向で、Ｃ−Ａ−Ｂであり、モチーフＣ−Ａ間のスペーシングは約１１２〜１５０アミノ酸であり、モチーフＡ−Ｂ間のスペーシングは約１６７〜１９０アミノ酸であり、それによるモチーフＣ−Ｂ間のスペーシングは２７９〜３４０アミノ酸である。この情報を、ポリペプチドがグラム陽性細菌由来のＤｎａＥ  Ｐｏｌ  ＩＩＩαサブユニットであることについての配列ベースの決定方法に提供する。本方法は、候補ポリペプチドまたはそのセグメントのアミノ酸配列を決定する工程と、候補ポリペプチド中のグラム陽性ＤｎａＥに特徴的な配置を有するグラム陽性コンセンサスモチーフＡ、Ｂ、およびＣ、ＣおよびＡ、ＡおよびＢ、またはＣおよびＢのアミノ酸配列を同定する工程とを含む。別の実施形態では、本方法は、本質的に、ポリペプチドのアミノ酸配列またはその一部中のコンセンサスグラム陽性ＤｎａＥモチーフＡ、Ｂ、およびＣを同定する工程からなる。別の実施形態では、本方法は、本質的に、ポリペプチドのアミノ酸配列またはその一部中のコンセンサスグラム陽性ＤｎａＥモチーフＡ、Ｂ、またはＡおよびＢ、任意選択的にＣを同定する工程からなる。配列ベースの方法を、他の活性アッセイと組み合わせることができる。
【００２４】
同様に、グラム陽性細菌由来のＤｎａＥの活性部位のモチーフＡ、Ｂ、およびＣのコンセンサス配列は、それぞれ、［Ｌ／Ｖ］−［Ｌ／Ｖ］−Ｋ−Ｘ−Ｄ−［Ａ／Ｉ］−Ｌ−Ｇ−Ｈ−Ｄ−Ｘ−Ｐ−Ｔ、［Ｆ／Ｙ］−Ｉ−Ｘ−Ｓ−Ｃ−Ｘ−［Ｒ／Ｋ］−Ｉ−Ｋ−Ｙ−［Ｍ／Ｌ］−Ｆ−Ｐ−Ｋ−Ａ−Ｈ、およびＰ−Ｄ−Ｉ−Ｄ−Ｌ−Ｄ−Ｆ−Ｓ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸である）である。モチーフの配置は、Ｎ末端からＣ末端への方向で、Ｃ−Ａ−Ｂであり、モチーフＣ−Ａ間のスペーシングは約１２４アミノ酸であり、モチーフＡ−Ｂ間のスペーシングは約１７３〜１７９アミノ酸であり、それによるモチーフＣ−Ｂ間のスペーシングは２９７〜３０３アミノ酸である。この情報を、ポリペプチドがグラム陽性細菌由来のＰｏｌＣであることについての配列ベースの決定方法に提供する。本方法は、候補ポリペプチドまたはそのセグメントのアミノ酸配列を決定する工程と、候補ポリペプチド中のグラム陽性ＰｏｌＣに特徴的な配置を有するグラム陽性ＰｏｌＣコンセンサスモチーフＡ、Ｂ、およびＣ、ＣおよびＡ、ＡおよびＢ、またはＣおよびＢのアミノ酸配列を同定する工程とを含む。別の実施形態では、本方法は、本質的に、ポリペプチドのアミノ酸配列またはその一部中のコンセンサスＰｏｌＣモチーフＡ、Ｂ、およびＣを同定する工程からなる。別の実施形態では、本方法は、本質的に、ポリペプチドのアミノ酸配列またはその一部中のコンセンサスＰｏｌＣモチーフＡ、Ｂ、またはＡおよびＢ、任意選択的にＣを同定する工程からなる。配列ベースの方法を、他の活性アッセイと組み合わせることができる。
【００２５】
１つの態様では、本発明は、宿主中の細菌の存在を検出するための組成物および方法を提供する。本方法は、宿主由来のサンプルをＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットの存在について分析する工程を含む。レプリカーゼが細菌の生存度に極めて重要であるので、Ｐｏｌ  ＩＩＩαサブユニットは、生存細菌の存在を示す極めて有用な診断マーカーである。
【００２６】
１つの態様では、本発明は、細菌ＤＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩα酵素の活性を調整し、好ましくは阻害する能力について、候補生体活性因子をスクリーニングするための組成物および方法を提供する。１つの実施形態では、本方法は、さらに、ヒトレプリカーゼ阻害能力がない候補生体活性因子のスクリーニングを含む。１つの実施形態では、本発明は、本明細書中に記載のスクリーニング法によって同定された生体活性因子を提供する。本明細書中に記載のスクリーニング法によって得られたこのような生体活性因子は、細菌が感染した患者の治療で使用される。
【００２７】
細菌Ｐｏｌ  ＩＩＩα活性部位の機能的モチーフの同定および説明に加えて、モチーフＡおよびＢ内の種々の位置でのアミノ酸置換による、細菌Ｐｏｌ  ＩＩＩαサブユニットおよびこれを含むＰｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼの機能性を変化させる方法を本明細書中に提供する。モチーフＡおよび／またはＢの変異により、１つまたは複数の変異を持たないＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットと区別される１つまたは複数の特徴がＰｏｌ  ＩＩＩα変異体に付与される。好ましい活性の変化には、プライマー識別の変化およびｄＮＴＰ識別の変化が含まれる。
【００２８】
したがって、本発明は、１つまたは複数のモチーフＡおよびＢ中に少なくとも１つの変異を有し、非改変Ｐｏｌ  ＩＩＩαサブユニットと異なる機能的特徴を有するＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。
【００２９】
１つの態様では、本発明は、ＲＮＡ／ＤＮＡプライマーを識別する能力が変化したＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。１つの実施形態では、ＲＮＡプライミングテンプレートを優先的に複製するＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、好ましくは、モチーフＢ中に１つまたは複数の変異を有する。別の実施形態では、ＤＮＡプライミングテンプレートを優先的に複製するＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、好ましくは、モチーフＢ中に１つまたは複数の変異を有する。
【００３０】
１つの態様では、本発明は、標識ヌクレオチドをプライマー伸長産物に組み込む能力が変化したＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。１つの実施形態では、標識ヌクレオチドをプライマー伸長産物に組み込む能力が増加したＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、好ましくは、モチーフＡ中に１つまたは複数の変異を有する。
【００３１】
１つの態様では、本発明は、ｄｄＮＴＰをプライマー伸長産物に組み込む能力が変化したＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。好ましい実施形態では、ｄｄＮＴＰをプライマー伸長産物に組み込む能力が増加したＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、好ましくは、モチーフＢ中に１つまたは複数の変異を有する。
【００３２】
１つを超える活性が変化したＰｏｌ  ＩＩＩα変異体も提供する。好ましい実施形態では、本発明は、ｄｄＮＴＰをプライマー伸長産物に組み込む能力が増加し、また、ＤＮＡプライミングテンプレートを優先的に複製する、Ｐｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。
【００３３】
Ｐｏｌ  ＩＩＩα変異体の産生方法も本明細書中に提供する。好ましい実施形態では、本方法は、少なくとも１つの変異を１つまたは複数の非改変Ｐｏｌ  ＩＩＩαのモチーフＡ、Ｂ、およびＣに導入する工程を含む。非改変Ｐｏｌ  ＩＩＩαサブユニットを、グラム陰性ＤｎａＥ、グラム陽性ＤｎａＥ、ラン藻ＤｎａＥ、およびグラム陽性ＰｏｌＣから選択することができる。本明細書中に開示のように、特定の細菌型に特徴的なスペーシングで、非改変Ｐｏｌ  ＩＩＩαサブユニットを、好ましくは、Ｎ末端からＣ末端の方向で、モチーフＣ、Ａ、Ｂを有することを特徴とする。
【００３４】
本明細書中に開示のＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を含む改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼをさらに提供する。改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、１つまたは複数の変異を持たないαサブユニットを含む非改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼと比較して活性が変化している。好ましい活性の変化には、ｄＮＴＰ識別の変化およびプライマー識別の変化が含まれる。
【００３５】
好ましい特徴を有するＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットイソ型をさらに提供する。これらのＰｏｌ  ＩＩＩαイソ型は、天然に存在するイソ型であり得る。本明細書中に開示のモチーフ配列と活性との結び付きに基づいて、これらのイソ型は、初めて、モチーフ配列に基づいて、所望のヌクレオチドおよびプライマー識別特性を有すると認識され、それにより、本明細書中に開示の同一の望ましい特徴を有する天然に存在しないＰｏｌ  ＩＩＩα変異体の代わりに、本明細書中に記載の特定の組成物および方法で有用となる。
【００３６】
本発明の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、１つ、２つ、３つ、またはそれを超える成分からなり得る。本発明の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼのうち、本明細書中に開示のＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を含むホロ酵素調製物が含まれる。好極限性細菌の非改変Ｐｏｌ  ＩＩＩαサブユニットに由来するＰｏｌ  ＩＩＩα変異体が本発明での使用に好ましい。
【００３７】
特に好ましい実施形態では、Ｐｏｌ  ＩＩＩα変異体は、好熱性細菌または好熱性ラン藻の非改変Ｐｏｌ  ＩＩＩαサブユニットに由来する。好ましい実施形態では、好熱性細菌は、テルムス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、アクイフェックス属（Ａｑｕｉｆｅｘ）、サーモトガ属（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、サーモクリディス属（Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｄｉｓ）、ヒドロゲノバクター属（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）、サーモシンケコッカス属（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｃｈｅｃｏｃｃｕｓ）、およびサーモアネロバクター属（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される。アクイフェックス・エアロリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ）、アクイフェックス・ピロゲン（Ａｑｕｉｆｅｘ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、テルムス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、テルムス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）、およびサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）が特に好ましい。
【００３８】
１つの態様では、本発明は、核酸複製のための組成物および方法（ＰＣＲなどのＤＮＡ増幅法およびＤＮＡ配列決定が含まれる）における改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼの使用に関する。
【００３９】
したがって、１つの態様では、本発明は、本明細書中に開示の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを含む複製反応混合物中の核酸分子を複製反応に供する工程を含む、核酸分子を複製する方法を提供する。１つの実施形態では、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、１成分Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼである。別の実施形態では、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、２成分Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼである。別の実施形態では、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、３成分またはそれを超えるＰｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを含む。１つの実施形態では、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼの組み合わせを、複製反応混合物中で使用する。１つの実施形態では、１成分または２成分のＰｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを、１つまたは複数の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼと組み合わせて使用する。１つの実施形態では、Ｉ型１サブユニット修復ＤＮＡポリメラーゼを、１つまたは複数の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼと組み合わせて使用する。
【００４０】
好ましい実施形態では、複製された核酸分子は、ＤＮＡ分子である。さらに好ましい実施形態では、ＤＮＡ分子は、二本鎖であえる。さらに好ましい実施形態では、二本鎖ＤＮＡ分子は、線状ＤＮＡ分子である。他の実施形態では、ＤＮＡ分子は、非線状（例えば、環状またはスーパーコイル）ＤＮＡである。
【００４１】
好ましい実施形態では、核酸分子の複製方法は、核酸分子、好ましくは、ＤＮＡの配列決定に有用な配列決定方法である。好ましい実施形態では、本方法は、配列決定反応混合物中の核酸分子を配列決定反応に供する工程を含む。配列決定反応混合物は、本明細書中に開示の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼ、好ましくは、１成分改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを含む。使用される改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、本明細書中に開示の変異Ｐｏｌ  ＩＩＩαを含み、プライマー伸長産物にｄｄＮＴＰを組み込む能力が増加している。好ましくは、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、配列決定反応混合物中に３’末端ｄｄＮＴＰを除去することができる３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。好ましい実施形態では、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくは、テルムス属またはアクイフェックス属、好ましくは、テルムス・サーモフィラス、テルムス・アクアティクス、またはアクイフェックス・エアロリカスの非改変ｄｎａＥαサブユニット由来のＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を含む。
【００４２】
別の好ましい実施形態では、核酸分子の複製方法は、核酸分子、好ましくは、ＤＮＡの増幅に有用な増幅方法である。好ましい実施形態では、本方法は、増幅反応混合物中の核酸分子を配増幅反応に供する工程を含む。増幅反応混合物は、本明細書中に開示の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを含む。使用される改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、本明細書中に開示の変異Ｐｏｌ  ＩＩＩαを含み、プライマー伸長産物に標識ｄＮＴＰを組み込む能力が増加している。改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくは、増幅反応混合物中に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
【００４３】
好ましい実施形態では、増幅方法は、温度サイクリングモードによる核酸分子、好ましくは、ＤＮＡ（好ましくは、二本鎖）の増幅に有用なサーモサイクリング増幅方法である。好ましい実施形態では、本方法は、サーモサイクリング増幅反応混合物中の核酸分子をサーモサイクリング配増幅反応に供する工程を含む。サーモサイクリング増幅反応混合物は、熱安定性改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましい実施形態では、熱安定性改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、サーモサイクリング増幅反応混合物中に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含む。好ましい実施形態では、熱安定性改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくは、テルムス属またはアクイフェックス属、好ましくは、テルムス・サーモフィラス、テルムス・アクアティクス、またはアクイフェックス・エアロリカスの非改変ｄｎａＥαサブユニット由来のＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を含む。好ましい実施形態では、本明細書中に開示のように、サーモサイクリング増幅反応混合物は、さらに、熱安定剤を含む。
【００４４】
好ましい実施形態では、サーモサイクリング増幅方法は、ＰＣＲによる核酸分子、好ましくは、ＤＮＡ（好ましくは、二本鎖）の増幅に有用なＰＣＲ法である。好ましい実施形態では、本方法は、ＰＣＲ反応混合物中の核酸分子をＰＣＲに供する工程を含む。ＰＣＲ反応混合物は、熱安定性改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを含む。
【００４５】
好ましい実施形態では、本発明は、ファストＰＣＲ法を提供する。好ましい実施形態では、本方法は、ファストＰＣＲ反応混合物中の核酸分子をファストＰＣＲに供する工程を含む。ファストＰＣＲ反応混合物は、熱安定性改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを含む。
【００４６】
好ましい実施形態では、本発明は、ロングレンジＰＣＲ法を提供する。好ましい実施形態では、本方法は、ロングレンジＰＣＲ反応混合物中の核酸分子をロングレンジＰＣＲに供する工程を含む。ロングレンジＰＣＲ反応混合物は、熱安定性改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを含む。
【００４７】
１つの態様では、本発明は、１つの均一反応混合物中のＤＮＡ分子を同時に配列決定および増幅する方法であって、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼおよび熱安定性Ｉ型単一サブユニット修復ＤＮＡポリメラーゼを含む配列決定／増幅反応混合物中のＤＮＡ分子を配列決定／増幅反応に供する工程を含む、方法を提供する。
【００４８】
好ましい実施形態では、１つまたは複数の高温変性工程を含む同時配列決定／増幅反応のために使用される配列決定／増幅反応混合物は、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼによって配列決定テンプレートの増幅を駆動するための２つのＲＮＡプライマー（順方向および逆方向）および修復型ＤＮＡポリメラーゼによって配列決定反応を駆動するための１つのＤＮＡプライマーを含む。修復型ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは、保存されたフェニルアラニン残基がチロシン残基に置換された変異モチーフＢ配列を有する。改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、ＲＮＡプライミングテンプレートの優先度が増加しており、好ましくは、モチーフＢ中に１つまたは複数の変異を含む。１つの実施形態では、混合物は、さらに、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼの熱安定性に寄与する安定剤を含む。
【００４９】
別の実施形態では、プライマー伸長産物にｄｄＮＴＰを組み込む能力が増加した第２の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを、同時配列決定／増幅反応中で修復型ＤＮＡポリメラーゼの代わりに使用する。第２の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくは、モチーフＢ中に１つまたは複数の変異を含む。好ましい実施形態では、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、ＤＮＡプライミングテンプレートの優先度が増加した。
【００５０】
別の実施形態では、増幅および配列決定反応は同時ではない。この実施形態では、ＲＮＡプライマーおよびＤＮＡプライマーならびに／または改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼおよび修復型ＤＮＡポリメラーゼ（または第２の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼ）を、同一の反応混合物に連続的に添加する。
【００５１】
１つの態様では、本発明は、混合物が本明細書中に開示の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを含む、核酸複製のための複製反応混合物を提供する。好ましい実施形態では、複製反応混合物は、ＤＮＡ複製に有用である。１つの実施形態では、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、１成分改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼである。別の実施形態では、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、２成分改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼである。別の実施形態では、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、３成分またはそれを超える成分を含む。別の実施形態では、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼの組み合わせを、複製反応混合物中で使用する。
【００５２】
好ましい実施形態では、複製反応混合物は、核酸分子、好ましくは、ＤＮＡの配列決定に有用な配列決定反応混合物である。配列決定反応混合物は、本明細書中に開示の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼ、好ましくは、１成分改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを含む。使用される改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、本明細書中に開示の変異Ｐｏｌ  ＩＩＩαを含み、プライマー伸長産物にｄｄＮＴＰを組み込む能力が増加している。好ましくは、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、配列決定反応混合物中に３’末端ｄｄＮＴＰを除去することができる３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。好ましい実施形態では、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくは、テルムス属またはアクイフェックス属、好ましくは、テルムス・サーモフィラス、テルムス・アクアティクス、またはアクイフェックス・エアロリカスの非改変ｄｎａＥαサブユニット由来のＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を含む。
【００５３】
別の好ましい実施形態では、複製反応混合物は、核酸増幅、好ましくは、ＤＮＡ増幅に有用な増幅反応混合物である。増幅反応混合物は、本明細書中に開示の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを含む。使用される改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、本明細書中に開示の変異Ｐｏｌ  ＩＩＩαを含み、プライマー伸長産物に標識ｄＮＴＰを組み込む能力が増加している。改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくは、増幅反応混合物中に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
【００５４】
好ましい実施形態では、増幅反応混合物は、温度サイクリングモードによる核酸、好ましくは、ＤＮＡ（好ましくは、二本鎖）の増幅に有用なサーモサイクリング増幅反応混合物である。サーモサイクリング増幅反応混合物は、熱安定性改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましい実施形態では、熱安定性改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、サーモサイクリング増幅反応混合物中に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含む。好ましい実施形態では、熱安定性改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくは、テルムス属またはアクイフェックス属、好ましくは、テルムス・サーモフィラス、テルムス・アクアティクス、またはアクイフェックス・エアロリカスの非改変ｄｎａＥαサブユニット由来のＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を含む。好ましい実施形態では、本明細書中に開示のように、サーモサイクリング増幅反応混合物は、さらに、熱安定剤を含む。
【００５５】
好ましい実施形態では、サーモサイクリング増幅混合物は、ＰＣＲによる核酸、好ましくは、ＤＮＡ（好ましくは、二本鎖）の増幅に有用なポリメラーゼ連鎖反応混合物（「ＰＣＲ混合物」）である。好ましくは、ＰＣＲ反応混合物は、熱安定性改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを含む。
【００５６】
好ましい実施形態では、本発明は、ファストＰＣＲ法に有用なファストＰＣＲ混合物である。好ましくは、ファストＰＣＲ混合物は、熱安定性改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを含む。
【００５７】
好ましい実施形態では、本発明は、ロングレンジＰＣＲ法に有用なロングレンジＰＣＲ混合物であるＰＣＲ混合物を提供する。好ましくは、ロングレンジＰＣＲ混合物は、熱安定性改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを含む。
【００５８】
１つの態様では、本発明は、本明細書中に開示の核酸複製反応混合物を含む核酸複製反応管を提供する。複製反応混合物を含む管は、反応混合物を含む管である。
【００５９】
好ましい実施形態では、核酸複製反応管は、本明細書中に開示の配列決定反応混合物を含む配列決定反応管である。
【００６０】
別の好ましい実施形態では、核酸複製反応管は、本明細書中に開示の複製反応混合物を含む複製反応管である。
【００６１】
好ましい実施形態では、核酸複製反応管は、本明細書中に開示のサーモサイクリング複製反応混合物を含むサーモサイクリング複製反応管である。
【００６２】
好ましい実施形態では、サーモサイクリング核酸複製反応管は、本明細書中に開示のＰＣＲ反応混合物を含むＰＣＲ管である。
【００６３】
好ましい実施形態では、本発明は、本明細書中に開示のファストＰＣＲ反応混合物を含むファストＰＣＲ管を提供する。
【００６４】
好ましい実施形態では、本発明は、本明細書中に開示のロングレンジＰＣＲ反応混合物を含むロングレンジＰＣＲ管であるＰＣＲ管を提供する。
【００６５】
１つの態様では、本発明は、本明細書中に開示の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを含む、核酸複製に有用な核酸複製キットを提供する。好ましい実施形態では、複製キットは、本明細書中に開示の複製反応混合物を含む。キットの複製反応混合物は、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを含まなくて良く、使用前に改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを添加する必要があり得る。
【００６６】
好ましい実施形態では、核酸複製キットは、核酸配列決定、好ましくは、ＤＮＡ配列決定に有用な配列決定キットである。
【００６７】
別の好ましい実施形態では、核酸複製キットは、核酸増幅、好ましくは、ＤＮＡ増幅に有用な増幅キットである。
【００６８】
好ましい実施形態では、増幅キットは、サーモサイクリングモードによる核酸、好ましくは、ＤＮＡ（好ましくは、二本鎖）の増幅に有用なサーモサイクリング増幅キットである。
【００６９】
好ましい実施形態では、サーモサイクリング増幅キットは、ＰＣＲによる核酸、好ましくは、ＤＮＡ（好ましくは、二本鎖）の増幅のためのＰＣＲキットである。
【００７０】
好ましい実施形態では、本発明は、ファストＰＣＲキットであるＰＣＲキットを提供する。
【００７１】
好ましい実施形態では、本発明は、ロングレンジＰＣＲキットであるＰＣＲキットを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７２】
発明の詳細な説明
本発明で使用される場合、「標識ヌクレオチド」は、ヌクレオチドに結合した標識を有するヌクレオチドをいう。標識および標識ヌクレオチドの例は、当該分野で周知である。標識は、典型的には、ヌクレオチドの塩基部分に頻繁に結合する疎水性部分である。標識により、典型的には、ヌクレオチドが検出されるか、その特徴が変化する。
【００７３】
本明細書中で使用される場合、「熱安定性」は、熱による不活化に耐性を示すＤＮＡポリメラーゼをいう。ＤＮＡポリメラーゼ（本明細書中に開示の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼが含まれる）は、５’→３’方向へのプライマー伸長によって一本鎖ＤＮＡテンプレートに相補的なＤＮＡ分子の形成を合成する。本明細書中で使用される場合、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、熱不安定性ＤＮＡポリメラーゼよりも熱不活化に対する耐性が高い。しかし、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、必ずしも熱不活化に完全に耐性を示すわけではなく、それにより、熱処理によってＤＮＡポリメラーゼ活性がいくらか減少し得る。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼはまた、典型的には、熱不安定性ＤＮＡポリメラーゼよりも合成機能を発揮するための至適温度が高い。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、典型的には、好熱性生物（例えば、好熱性細菌）から単離される。
【００７４】
本明細書中で使用される場合、「熱不安定性」は、熱による不活化に耐性を示さないＤＮＡポリメラーゼをいう。例えば、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼは、その活性が酵素の９０℃で３０分間の温度への曝露によって完全に不活化され、熱不安定ＤＮＡポリメラーゼと見なされる。本明細書中で使用される場合、熱不安定性ＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼよりも熱不活化に対する耐性が低い。熱不安定性ＤＮＡポリメラーゼはまた、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼよりも低い至適温度を有するようである。熱不安定性ＤＮＡポリメラーゼは、典型的には、中温性生物（例えば、中温性細菌または真核生物（一定の動物が含まれる））から単離される。
【００７５】
分類方法および活性の決定
１つの態様では、本発明は、タンパク質分類方法および活性決定方法を提供する。これらの方法は、細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニット中に保存されている以前に認識されなかったタンパク質モチーフＡ、Ｂ、およびＣ、ならびにその固有の配置に基づく。これらの特徴的アミノ酸配列モチーフおよびその配置（そのスペーシングが含まれる）は、ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩの機能に極めて重要であり、決定で使用することができる。
【００７６】
ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットのモチーフＡ、Ｂ、およびＣのアミノ酸配列は、グラム陰性細菌と、グラム陽性細菌と、ラン藻との間、および細菌Ｐｏｌ  ＩＩＩ酵素型の間（ＤｎａＥとＰｏｌＣとの間）でいくらか異なり、それにより、配列決定に基づいて区別することが可能である。さらに、ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットのモチーフＡ、Ｂ、およびＣの間のスペーシングは、グラム陰性細菌と、グラム陽性細菌と、ラン藻との間、およびＰｏｌ  ＩＩＩ酵素型の間で異なり、それにより、配列中のモチーフ配置に基づいて区別することが可能である。本明細書中に開示のように、非Ｐｏｌ  ＩＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ中で以前に同定されたモチーフと類似した機能的モチーフＡ、Ｂ、およびＣは、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、ラン藻のＤＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩαサブユニット中に存在する。明らかに、Ｐｏｌ  ＩＩＩαサブユニット中のこれらのモチーフの順序は、非Ｐｏｌ  ＩＩＩポリマー中のモチーフの順序と異なる。細菌Ｐｏｌ  ＩＩＩαサブユニットでは、モチーフは、Ｎ末端からＣ末端の方向で、Ｃ−Ａ−Ｂの順序である。
【００７７】
好ましい実施形態では、本発明は、ポリペプチドまたはその一部のアミノ酸配列を細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩモチーフＡ、Ｂ、およびＣのコンセンサスアミノ酸配列と比較する工程を含む、ＤＮＡポリメラーゼとしてポリペプチドを分類する方法を提供する。好ましい実施形態では、本方法は、ポリペプチド中の３つ全てのモチーフ（すなわち、Ａ、Ｂ、およびＣ）を同定する工程を含む。本方法は、さらに、ポリペプチド中の３つのモチーフの配置を決定する工程を含む。本方法は、さらに、３つのモチーフの間のアミノ酸スペーシングを決定する工程を含む。ポリペプチド中の３つ全てのモチーフを同定し、モチーフが、アミノ末端からカルボキシル末端の方向で、Ｃ−Ａ−Ｂの順序で配置され、３つのモチーフが、互いに細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩ中のコンセンサスモチーフに特徴的なスペーシング範囲内の距離で互いに間隔をあけている場合、ポリペプチドがＤＮＡポリメラーゼであると決定される。
【００７８】
別の実施形態では、本方法は、候補ポリペプチドのアミノ酸配列またはそのセグメントを決定する工程と、候補ポリペプチド中の細菌Ｐｏｌ  ＩＩＩに特徴的な配置を有する細菌Ｐｏｌ  ＩＩＩコンセンサスモチーフＣおよびＡ、ＡおよびＢ、またはＣおよびＢのアミノ酸配列を同定する工程とを含む。
【００７９】
別の実施形態では、本方法は、本質的に、ポリペプチドのアミノ酸配列またはその一部中でコンセンサス細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩモチーフＡ、Ｂ、およびＣを同定する工程からなる。別の実施形態では、本方法は、本質的に、ポリペプチドのアミノ酸配列またはその一部中でコンセンサス細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩモチーフＡ、Ｂ、およびＣ、任意選択的にＣを同定する工程からなる。さらなるアッセイを、配列ベースの方法と組み合わせることができる。
【００８０】
配列決定の代替法として、コンセンサス細菌ＤＮＡモチーフＡ、Ｂ、またはＣに相補的なプローブへの高ストリンジェンシーなハイブリッド形成を使用して、コンセンサス配列の存在を同定することができる。
【００８１】
１つの実施形態では、細菌Ｐｏｌ  ＩＩＩモチーフＡ、Ｂ、およびＣのコンセンサス配列は、それぞれ、［Ｌ／Ｖ／Ｍ］−［Ｌ／Ｖ／Ｉ］−Ｋ−Ｘ−Ｄ−［Ｆ／Ａ／Ｉ］−Ｌ−Ｇ−［Ｌ／Ｈ］−Ｘ−Ｘ−［Ｌ／Ｐ］−［Ｔ／Ｓ］、［Ｆ／Ｙ／Ｗ］−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−［Ｆ／Ｒ／Ｋ／］−Ｘ−Ｘ−Ｙ−［Ａ／Ｇ／Ｍ／Ｌ］−Ｆ−［Ｎ／Ｐ］−［Ｒ／Ｋ］−Ｘ−Ｈ、およびＰ−Ｄ−［Ｆ／Ｉ］−Ｄ−Ｘ−Ｄ−［Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｖ］（式中、Ｘは、任意のアミノ酸である）である。モチーフは、アミノ末端からカルボキシル末端への方向で、Ｃ−Ａ−Ｂの順序で配置されている。モチーフＣとＡとの間のスペーシングは約１１２〜１５５アミノ酸の範囲である。モチーフＡとモチーフＢとの間のスペーシングは約１６７〜２０１アミノ酸の範囲である。モチーフＣからモチーフＢまでのスペーシングは約２７０〜約３５６アミノ酸の範囲である。
【００８２】
好ましい実施形態では、本方法は、ポリペプチド配列を、モチーフＡ、Ｂ、およびＣの１つ、２つ、３つ、または４つのコンセンサス配列組を比較する工程と、コンセンサス配列組が、グラム陰性細菌ｄｎａＥ遺伝子産物のモチーフコンセンサス配列組、グラム陽性細菌ｄｎａＥ遺伝子産物のモチーフコンセンサス配列組、グラム陽性細菌ＰｏｌＣ遺伝子産物のコンセンサス配列組、およびラン藻ｄｎａＥ遺伝子産物のコンセンサス配列組から選択されることとを含む。好ましい実施形態では、本方法は、ポリペプチド中の特定のコンセンサスモチーフ組の３つ全てのモチーフ（すなわち、Ａ、Ｂ、およびＣ）を同定する工程を含む。本方法は、好ましくは、ポリペプチド中の３つのモチーフの配置を決定する工程をさらに含む。本方法は、好ましくは、３つのモチーフの間のアミノ酸スペーシングを決定する工程をさらに含む。ポリペプチド中の特定のコンセンサスモチーフ組の３つ全てのモチーフが同定され、モチーフが、アミノ末端からカルボキシル末端の方向で、Ｃ−Ａ−Ｂの順序で配置され、３つのモチーフが、互いに特定のコンセンサスモチーフ組に特徴的な範囲内の距離で互いに間隔をあけている場合、ポリペプチドが対応する型のＤＮＡポリメラーゼであると決定される。したがって、ポリペプチドを、本明細書中の組成物および方法で、Ｐｏｌ  ＩＩＩαサブユニットとして使用することができる。さらに、ポリペプチドを、好ましい特徴を有するＰｏｌ  ＩＩＩα変異体の誘導のための親分子として使用することができる。
【００８３】
別の実施形態では、本方法は、候補ポリペプチドのアミノ酸配列またはその一部を同定する工程と、候補ポリペプチド中の特定のコンセンサスモチーフ組に特徴的な配置を有する特定のコンセンサスモチーフ組由来の細菌Ｐｏｌ  ＩＩＩコンセンサスモチーフＣおよびＡ、ＡおよびＢ、またはＣおよびＢのアミノ酸配列を同定する工程とを含む。
【００８４】
別の実施形態では、本方法は、本質的に、ポリペプチドのアミノ酸配列またはその一部中で特定のコンセンサスモチーフ組由来の細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩモチーフＡ、Ｂ、およびＣを同定する工程からなる。別の実施形態では、本方法は、本質的に、ポリペプチドのアミノ酸配列またはその一部中で特定のコンセンサスモチーフ組由来の細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩモチーフＡ、Ｂ、またはＡおよびＢ、任意選択的にＣを同定する工程からなる。さらなるアッセイを、このような配列ベースの方法と組み合わせることができる。
【００８５】
好ましい実施形態では、グラム陰性細菌ｄｎａＥ遺伝子産物のモチーフＡ、Ｂ、およびＣのコンセンサス配列は、それぞれ、Ｇ−［Ｌ／Ｍ］−［Ｌ／Ｖ／Ｉ］−Ｋ−Ｘ−Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−Ｘ−Ｘ−Ｌ−Ｔ、［Ｆ／Ｗ］−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｆ−Ｘ−Ｘ−Ｙ−［Ａ／Ｇ］−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｈ、およびＳ−Ｘ−Ｐ−Ｄ−［Ｆ／Ｉ］−Ｄ−Ｘ−Ｄ−［Ｆ／Ｉ］（式中、Ｘは、任意のアミノ酸である）である。モチーフは、アミノ末端からカルボキシル末端への方向で、Ｃ−Ａ−Ｂの順序で配置されている。モチーフＣとＡとの間のスペーシングは約１５３〜約１５５アミノ酸の範囲である。モチーフＡとモチーフＢとの間のスペーシングは約１９５〜約２０１アミノ酸の範囲である。モチーフＣからモチーフＢまでのスペーシングは約３４８〜約３５５アミノ酸の範囲である。
【００８６】
好ましい実施形態では、グラム陽性細菌ｄｎａＥ遺伝子産物のモチーフＡ、Ｂ、およびＣのコンセンサス配列は、それぞれ、Ｇ−［Ｌ／Ｖ］−［Ｌ／Ｖ］−Ｋ−Ｘ−Ｄ−［Ｆ／Ｉ］−Ｌ−Ｇ−Ｌ−［Ｒ／Ｋ］−Ｘ−Ｌ−［Ｔ／Ｓ］、［Ｆ／Ｙ／Ｗ］−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−［Ｒ／Ｋ］−Ｆ−Ｘ−Ｘ−Ｙ−［Ａ／Ｇ］−Ｆ−Ｎ−［Ｒ／Ｋ］−Ｘ−Ｈ、およびＰ−Ｄ−Ｉ−Ｄ−［Ｌ／Ｉ／Ｖ］−Ｄ−［Ｆ／Ｌ／Ｖ］（式中、Ｘは、任意のアミノ酸である）である。モチーフは、アミノ末端からカルボキシル末端への方向で、Ｃ−Ａ−Ｂの順序で配置されている。モチーフＣとＡとの間のスペーシングは約１１２〜約１５０アミノ酸の範囲である。モチーフＡとモチーフＢとの間のスペーシングは約１６７〜約１９０アミノ酸の範囲である。モチーフＣからモチーフＢまでのスペーシングは約２７８〜約３３９アミノ酸の範囲である。
【００８７】
好ましい実施形態では、グラム陽性細菌ＰｏｌＣ遺伝子産物のモチーフＡ、Ｂ、およびＣのコンセンサス配列は、それぞれ、［Ｌ／Ｖ］−［Ｌ／Ｖ］−Ｋ−Ｘ−Ｄ−［Ａ／Ｉ］−Ｌ−Ｇ−Ｈ−Ｄ−Ｘ−Ｐ−Ｔ、［Ｆ／Ｙ］−Ｉ−Ｘ−Ｓ−Ｃ−Ｘ−［Ｒ／Ｋ］−Ｉ−Ｋ−Ｙ−［Ｍ／Ｌ］−Ｆ−Ｐ−Ｋ−Ａ−Ｈ、およびＰ−Ｄ−Ｉ−Ｄ−Ｌ−Ｄ−Ｆ−Ｓ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸である）である。モチーフは、アミノ末端からカルボキシル末端への方向で、Ｃ−Ａ−Ｂの順序で配置されている。モチーフＣとＡとの間のスペーシングは約１２４アミノ酸である。モチーフＡとモチーフＢとの間のスペーシングは約１７３〜約１７９アミノ酸の範囲である。モチーフＣからモチーフＢまでのスペーシングは約２９６〜約３０２アミノ酸の範囲である。
【００８８】
好ましい実施形態では、ラン藻ｄｎａＥ遺伝子産物のモチーフＡ、Ｂ、およびＣのコンセンサス配列は、それぞれ、Ｇ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｍ−Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−［Ｒ／Ｋ］−Ｎ−Ｌ−Ｔ、Ｆ−Ｄ−Ｑ−Ｍ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ａ−Ｅ−Ｙ−Ｃ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｈ、Ｐ−Ｄ−Ｉ−Ｄ−Ｔ−Ｄ−Ｆ−Ｃである。モチーフは、アミノ末端からカルボキシル末端への方向で、Ｃ−Ａ−Ｂの順序で配置されている。モチーフＣとＡとの間のスペーシングは約１００〜１６０アミノ酸である。モチーフＡとモチーフＢとの間のスペーシングは約１５０〜２１０アミノ酸である。モチーフＣからモチーフＢまでのスペーシングは約２５０〜３７０アミノ酸である。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本方法は、細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩモチーフの存在を検出するためのＰＣＲおよびオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む。使用プライマーは、細菌Ｐｏｌ  ＩＩＩモチーフＡ−Ｂ−Ｃを含む配列を増幅することができる。１つの実施形態では、本方法は、細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩモチーフＣをコードするヌクレオチド配列とハイブリッド形成する第１のＰＣＲプライマーおよび細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩモチーフＢをコードするヌクレオチド配列に対応する第２のＰＣＲプライマーの使用を含む。２つのプライマーを使用してＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を、細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩモチーフＢをコードするヌクレオチド配列またはその相補物とハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドプローブを使用して探索する。１つの実施形態では、ＰＣＲ産物を、細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩモチーフＡをコードするヌクレオチド配列またはその相補物とハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドプローブを含むマイクロアレイと組み合わせる。１つの実施形態では、本方法は、さらに、ＰＣＲ産物由来の細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩモチーフＣ、Ａ、およびＢのスペーシングを決定する工程を含む。別の実施形態では、ＰＣＲ産物のサイズを決定する。別の実施形態では、モチーフＣおよびＡまたはＡおよびＢに指向するプライマーを使用し、ＰＣＲ産物のサイズを決定する。あるいは、ＰＣＲ産物を配列決定することができる。
【００９０】
細菌Ｐｏｌ  ＩＩＩαサブユニット中の例示的モチーフスペーシングには、以下が含まれる。
【００９１】
【表１】
2008526215.tif 000003
2008526215.tif 000004
【００９２】
Ｐｏｌ  ＩＩＩα変異体
細菌Ｐｏｌ  ＩＩＩα活性部位の機能的モチーフの同定および説明に加えて、モチーフＡおよびＢ内の種々の位置でのアミノ酸置換による、細菌Ｐｏｌ  ＩＩＩαサブユニットおよびこれを含むＰｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを変化させる方法を本明細書中に提供する。モチーフＡおよび／またはＢの変異により、１つまたは複数の変異を持たないＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットと区別される１つまたは複数の特徴がＰｏｌ  ＩＩＩα変異体に付与される。好ましい活性の変化には、プライマー識別の変化およびｄＮＴＰ識別の変化が含まれる。
【００９３】
さらなる変異をＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットに導入して、さらなる好ましい特徴（βサブユニットに対する親和性の増加など）を有するαサブユニットを得ることができる。このようなさらなる望ましい変異の詳細な説明については、２００５年１１月２９日出願され、発明の名称が「βサブユニット結合モチーフが改変された２成分ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼおよびその使用」の米国特許仮出願番号６０／Ｘ号（特に、その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００９４】
１つの態様では、本発明は、グラム陰性細菌、ラン藻、およびグラム陽性細菌のＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。グラム陽性細菌のＰｏｌ  ＩＩＩα変異体には、ＤｎａＥおよびＰｏｌＣ変異体が含まれる。
【００９５】
本発明のＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、非改変Ｐｏｌ  ＩＩＩαサブユニットと比較して、１つまたは複数のモチーフＡおよびＢ中に少なくとも１つの変異を有する活性部位を有する改変された天然に存在しないＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットである。いくつかの場合、これらのＰｏｌ  ＩＩＩα変異形は、各細菌型のコンセンサス配列に分類されるモチーフＡまたはＢ配列を有するが、これらは、天然に存在せず、非改変Ｐｏｌ  ＩＩＩαサブユニットと異なる所望の機能的特徴を得るために活性部位内の１つまたは複数の特定の位置で改変されていること以外は、非改変Ｐｏｌ  ＩＩＩαサブユニットに対応する。先行技術で公知の天然に存在するＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットと同一のアミノ酸配列を有する変異体は、本発明のＰｏｌ  ＩＩＩα変異体から除外される。
【００９６】
（ｉ）グラム陰性細菌Ｐｏｌ  ＩＩＩ由来のＰｏｌ  ＩＩＩ変異体
グラム陰性細菌のコンセンサスモチーフＡを、Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｘ14（式中、Ｘ1はＧであり、Ｘ2は［Ｌ／Ｍ］であり、Ｘ3は［Ｌ／Ｖ／Ｉ］であり、Ｘ4はＫであり、Ｘ5は任意のアミノ酸配列であり、Ｘ6はＤであり、Ｘ7はＦであり、Ｘ8はＬであり、Ｘ9はＧであり、Ｘ10はＬであり、Ｘ11は任意のアミノ酸であり、Ｘ12任意のアミノ酸であり、Ｘ13はＬであり、Ｘ14はＴである）と示すことができる。
【００９７】
グラム陰性細菌由来の例示的モチーフＡ配列には、以下が含まれる。
【００９８】
【表２】
2008526215.tif 000005
2008526215.tif 000006
【００９９】
１つの態様では、本発明は、標識ｄＮＴＰに結合し、これをプライマー伸長産物に組み込む能力が増加したＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。
【０１００】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基１０のＬ（非改変形態）が、好ましくは、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｃ、Ｍ、Ｙ、Ｇ、およびＦから選択される（ＧおよびＡが特に好ましい）疎水性または芳香族アミノ酸に変異したモチーフＡを含む。
【０１０１】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基１１で、非改変Ｐｏｌ  ＩＩＩαサブユニット中に存在する残基が、好ましくは、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｐ、Ｒ、およびＨから選択される（ＲおよびＨが特に好ましい）正電荷のアミノ酸、芳香族アミノ酸、または小アミノ酸に変異したモチーフＡを含む。
【０１０２】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基１２で、非改変Ｐｏｌ  ＩＩＩαサブユニット中に存在する残基が、好ましくは、Ｎ、Ｓ、Ｑ、Ｐ、Ｍ、Ｃ、およびＬから選択される（Ｓが特に好ましい）極性アミノ酸または長鎖疎水性アミノ酸に変異したモチーフＡを含む。Ｘ11が小側鎖を有するアミノ酸ではない場合、Ｘ11はまた、好ましくは、小側鎖を有するアミノ酸を得るために変異させる。
【０１０３】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、２つまたはそれを超えるＸ10、Ｘ11、およびＸ12位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＡを含む。
【０１０４】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ10、Ｘ11、およびＸ12位にこれらの好ましいまたは特に好ましいアミノ酸の１つを有するモチーフＡを含み、さらに、好ましくは、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｃ、Ｍ、Ｆから選択される疎水性または芳香族アミノ酸であるＸ6アミノ酸を含む。
【０１０５】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ10、Ｘ11、およびＸ12位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＡを含み、さらに、好ましくは、Ａ、Ｐ、Ｓ、およびＴから選択される小アミノ酸であるＸ9アミノ酸を含む。特に好ましい実施形態は、Ｘ9はＰである。
【０１０６】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ10、Ｘ11、およびＸ12位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＡを含み、さらに、好ましくは、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｃ、およびＡから選択される疎水性アミノ酸であるＸ13アミノ酸を含む。特に好ましい実施形態は、Ｘ13はＡである。
【０１０７】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ10、Ｘ11、およびＸ12位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＡを含み、さらに、好ましくは、１つまたは複数のＸ8、Ｘ9、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を含む。
【０１０８】
保存的アミノ酸置換を、モチーフＡのＸ6以外の他の位置に組み込むこともできる。例えば、Ｘ1位にＰおよびＳが許容され、Ｘ2位にＶ、Ｉ、Ｆ、Ａ、Ｍ、Ｃ、およびＹが許容され、Ｘ3位にＬ、Ｉ、Ｆ、Ａ、Ｍ、Ｃ、およびＹが許容され、Ｘ4位にＲが許容され、Ｘ5位にＭ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、およびＹが許容され、Ｘ7位にＹ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｃ、およびＡが許容され、Ｘ14位にＳ、Ａ、およびＰが許容される。
【０１０９】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、（ｉ）モチーフＡ配列Ｇ−Ｌ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−［Ｒ／Ｋ］−Ｔ−Ｌ−Ｔ、モチーフＢ配列Ｆ−Ｄ−Ｌ−Ｍ−Ｅ−Ｋ−Ｆ−Ａ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｆ−Ｄ−Ｉ−Ｄ−Ｆ−Ｃを有するＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットと比較して、プライマー伸長産物に標識ヌクレオチドを組み込む能力が増加している。
【０１１０】
グラム陰性細菌のコンセンサスモチーフＢを、Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｘ14−Ｘ15−Ｘ16（式中、Ｘ1は［Ｆ／Ｗ］であり、Ｘ2は任意のアミノ酸であり、Ｘ3は任意のアミノ酸であり、Ｘ4は任意のアミノ酸であり、Ｘ5は任意のアミノ酸であり、Ｘ6は任意のアミノ酸であり、Ｘ7はＦであり、Ｘ8は任意のアミノ酸であり、Ｘ9は任意のアミノ酸であり、Ｘ10はＹであり、Ｘ11は［Ａ／Ｇ］であり、Ｘ12はＦであり、Ｘ13はＮであり、Ｘ14はＫであり、Ｘ15はＳであり、Ｘ16はＨである）と示すことができる。
【０１１１】
例示的グラム陰性モチーフＢ配列には、以下が含まれる。
【０１１２】
【表３】
2008526215.tif 000007
【０１１３】
１つの態様では、本発明は、標識ｄＮＴＰに結合し、これをプライマー伸長産物に組み込む能力が増加したＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。
【０１１４】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基６で、非改変Ｐｏｌ  ＩＩＩαサブユニット中に存在する残基が、好ましくは、Ｒ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｎ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、およびＰから選択される荷電アミノ酸、小側鎖を有するアミノ酸、または極性アミンを有するアミノ酸に変異したモチーフＢを含む。
【０１１５】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基７で、Ｆが非荷電芳香族アミノ酸、好ましくは、ＹまたはＷ（Ｙが特に好ましい）に変異したモチーフＢを含む。
【０１１６】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基１０で、Ｙが、好ましくは、Ｆ、Ｈ、Ｗ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、およびＩから選択される（Ｆ、Ｉ、およびＶが特に好ましい）別の芳香族または嵩高い疎水性アミノ酸に変異したモチーフＢを含む。
【０１１７】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、２つまたはそれを超えるＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含む。
【０１１８】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、Ｐ、Ｔ、またはＳ以外の任意のアミノ酸であるＸ5アミノ酸を含む。
【０１１９】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、小疎水性または嵩高い疎水性アミノ酸であるが、荷電または芳香族アミノ酸ではないＸ6アミノ酸を含む。Ｇ、Ｓ、Ｌ、Ｃ、Ｍ、Ｖ、およびＩが好ましく、Ｇが特に好ましい。
【０１２０】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、小アミノ酸、極性アミノ酸、または負電荷のアミノ酸であるＸ9アミノ酸を含む。Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、およびＤが好ましい。
【０１２１】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、小アミノ酸または非分岐疎水性アミノ酸であるが、芳香族アミノ酸ではないＸ11アミノ酸を含む。Ａ、Ｓ、Ｐ、Ｃ、Ｌ、およびＭが好ましい。
【０１２２】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、非荷電芳香族アミノ酸または嵩高い疎水性アミノ酸であるＸ12アミノ酸を含む。Ｙ、Ｗ、Ｌ、Ｍ、Ｃ、Ｖ、およびＩが好ましく、Ｙが特に好ましい。
【０１２３】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、極性アミノ酸であるＸ13アミノ酸を含む。Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、およびＧが好ましく、ＧおよびＳが特に好ましい。
【０１２４】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、正電荷のＸ14アミノ酸を含む。ＲおよびＨが好ましい。
【０１２５】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、極性アミノ酸であるＸ15アミノ酸を含む。Ｑ、Ｎ、Ｐ、Ｔ、Ｇ、およびＡが好ましく、Ｇが特に好ましい。
【０１２６】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、１つまたは複数のＸ5、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、およびＸ15位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を含む。
【０１２７】
保存的アミノ酸置換を、モチーフＢ中の１〜４位に組み込むこともできる。例えば、Ｘ1位にＷ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、およびＣが許容され、Ｘ2位にＥ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ａ、Ｇ、およびＬが許容され、Ｘ3位にＶ、Ｉ、Ｍ、Ｃ、およびＡが許容され、Ｘ4位にＬ、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｃ、Ｙ、およびＦが許容され、Ｘ16位にＲ、Ｋ、Ｙ、およびＦが許容される。
【０１２８】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、（ｉ）モチーフＡ配列Ｇ−Ｌ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−［Ｒ／Ｋ］−Ｔ−Ｌ−Ｔ、モチーフＢ配列Ｆ−Ｄ−Ｌ−Ｍ−Ｅ−Ｋ−Ｆ−Ａ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｆ−Ｄ−Ｉ−Ｄ−Ｆ−Ｃを有するＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットと比較して、プライマー伸長産物に標識ヌクレオチドを組み込む能力が増加している。
【０１２９】
１つの態様では、本発明は、ｄｄＮＴＰに結合し、これをプライマー伸長産物に組み込む能力が増加したＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。
【０１３０】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基６で、非改変Ｐｏｌ  ＩＩＩαサブユニット中に存在する残基が、好ましくは、Ｒ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｎ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、およびＰから選択される荷電アミノ酸、小側鎖を有するアミノ酸、または極性アミンを有するアミノ酸に変異したモチーフＢを含む。
【０１３１】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基７で、Ｆが非荷電芳香族アミノ酸、好ましくは、ＹまたはＷ（Ｙが特に好ましい）に変異したモチーフＢを含む。
【０１３２】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基１０で、Ｙが、好ましくは、Ｆ、Ｈ、Ｗ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、およびＩから選択される別の芳香族または嵩高い疎水性アミノ酸に変異したモチーフＢを含む。
【０１３３】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、２つまたはそれを超えるＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含む。
【０１３４】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、Ｐ、Ｔ、またはＳ以外の任意のアミノ酸であるＸ5アミノ酸を含む。
【０１３５】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、小疎水性または嵩高い疎水性アミノ酸であるが、荷電または芳香族アミノ酸ではないＸ6アミノ酸を含む。Ｇ、Ｓ、Ｌ、Ｃ、Ｍ、Ｖ、およびＩが好ましく、Ｇが特に好ましい。
【０１３６】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、小アミノ酸、極性アミノ酸、または負電荷のアミノ酸であるＸ9アミノ酸を含む。Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、およびＤが好ましい。
【０１３７】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、小アミノ酸または非分岐疎水性アミノ酸であるが、芳香族アミノ酸ではないＸ11アミノ酸を含む。Ａ、Ｓ、Ｐ、Ｃ、Ｌ、およびＭが好ましい。
【０１３８】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、非荷電芳香族アミノ酸または嵩高い疎水性アミノ酸であるＸ12アミノ酸を含む。Ｙ、Ｗ、Ｌ、Ｍ、Ｃ、Ｖ、およびＩが好ましく、Ｙが特に好ましい。
【０１３９】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、極性アミノ酸であるＸ13アミノ酸を含む。Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、およびＧが好ましい。
【０１４０】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、正電荷のアミノ酸であるＸ14アミノ酸を含む。Ｒ  およびＨが好ましい。
【０１４１】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、極性アミノ酸であるＸ15アミノ酸を含む。Ｑ、Ｎ、Ｐ、Ｔ、Ｇ、およびＡが好ましく、Ｇが特に好ましい。
【０１４２】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、１つまたは複数のＸ5、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、およびＸ15位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を含む。
【０１４３】
保存的アミノ酸置換を、モチーフＢ中の１〜４位に組み込むこともできる。例えば、Ｘ1位にＷ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、およびＣが許容され、Ｘ2位にＥ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ａ、Ｇ、およびＬが許容され、Ｘ3位にＶ、Ｉ、Ｍ、Ｃ、およびＡが許容され、Ｘ4位にＬ、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｃ、Ｙ、およびＦが許容され、Ｘ16位にＲ、Ｋ、Ｙ、およびＦが許容される。
【０１４４】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、（ｉ）モチーフＡ配列Ｇ−Ｌ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−［Ｒ／Ｋ］−Ｔ−Ｌ−Ｔ、モチーフＢ配列Ｆ−Ｄ−Ｌ−Ｍ−Ｅ−Ｋ−Ｆ−Ａ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｆ−Ｄ−Ｉ−Ｄ−Ｆ−Ｃを有するＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットと比較して、プライマー伸長産物にｄｄＮＴＰを組み込む能力が増加している。
【０１４５】
１つの態様では、本発明は、ＲＮＡプライマーとＤＮＡプライマーとのその識別が変化したＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。１つの実施形態では、ＲＮＡプライミングテンプレートを優先的に複製するＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、好ましくは、モチーフＢ中に１つまたは複数の変異を有する。これらの変異は、ＤＮＡプライマーを伸長する能力が減少している。
【０１４６】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基１１で、ＧがＭ、Ｃ、またはＬに変異したモチーフＢを含む。
【０１４７】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩαイソ型は、（ｉ）モチーフＡ配列Ｇ−Ｌ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−［Ｒ／Ｋ］−Ｔ−Ｌ−Ｔ、モチーフＢ配列Ｆ−Ｄ−Ｌ−Ｍ−Ｅ−Ｋ−Ｆ−Ａ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｆ−Ｄ−Ｉ−Ｄ−Ｆ−Ｃを有するＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットと比較して、ＲＮＡプライミングテンプレートに対する優先度が増加している。
【０１４８】
１つの実施形態では、ＤＮＡプライミングテンプレートを優先的に複製するＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変態は、好ましくは、モチーフＢ中に１つまたは複数の変異を有する。これらの変異体は、好ましくは、ＲＮＡプライマーを伸長する能力が減少している。
【０１４９】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基１２で、ＦがＹに変異し、好ましくは、残基１１で、ＧがＭ、Ｃ、またはＬに第２の変異をしたモチーフＢを含む。
【０１５０】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩαイソ型は、（ｉ）モチーフＡ配列Ｇ−Ｌ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−［Ｒ／Ｋ］−Ｔ−Ｌ−Ｔ、モチーフＢ配列Ｆ−Ｄ−Ｌ−Ｍ−Ｅ−Ｋ−Ｆ−Ａ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｆ−Ｄ−Ｉ−Ｄ−Ｆ−Ｃを有するＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットと比較して、ＤＮＡプライミングテンプレートに対する優先度が増加している。
【０１５１】
好ましい実施形態では、Ｐｏｌ  ＩＩＩα変異体は、モチーフＡおよびＢが上記のアミノ酸配列を含むモチーフＡおよびモチーフＢを含む。
【０１５２】
（ｉｉ）グラム陽性ＤｎａＥ由来のＰｏｌ  ＩＩＩ変異体
グラム陽性細菌ＤｎａＥのコンセンサスモチーフＢを、Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｘ14（式中、Ｘ1はＧであり、Ｘ2は［Ｌ／Ｖ］であり、Ｘ3は［Ｌ／Ｖ］であり、Ｘ4はＫであり、Ｘ5は任意のアミノ酸であり、Ｘ6はＤであり、Ｘ7［Ｆ／Ｉ］であり、Ｘ8はＬであり、Ｘ9はＧであり、Ｘ10はＬであり、Ｘ11は［Ｒ／Ｋ］であり、Ｘ12は任意のアミノ酸であり、Ｘ13はＬであり、Ｘ14は［Ｔ／Ｓ］である）と示すことができる。
【０１５３】
グラム陽性細菌由来の例示的ＤｎａＥモチーフＡ配列には、以下が含まれる。
【０１５４】
【表４】
2008526215.tif 000008
【０１５５】
１つの態様では、本発明は、標識ｄＮＴＰに結合し、これをプライマー伸長産物に組み込む能力が増加したＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。
【０１５６】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基Ｘ10で、Ｌ（非改変形態）が、好ましくは、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｃ、Ｍ、Ｙ、およびＦから選択される疎水性または芳香族アミノ酸に変異したモチーフＡを含む。
【０１５７】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基Ｘ11で、［Ｒ／Ｋ］が、正電荷のアミノ酸、芳香族アミノ酸、または小アミノ酸に変異したモチーフＡを含む。Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ｇ、Ｓ、Ａ、およびＰが好ましい。
【０１５８】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基Ｘ12で、非改変Ｐｏｌ  ＩＩＩαサブユニット中に存在する残基が、極性アミノ酸または長鎖疎水性アミノ酸に変異したモチーフＡを含む。Ｔ、Ｓ、Ｑ、Ｐ、Ｍ、Ｃ、およびＬが好ましい。変異体中のＸ12が極性または長鎖疎水性アミノ酸であり、Ｘ11が小側鎖を有するアミノ酸ではない場合、Ｘ11は小側鎖を有するアミノ酸に変異している。
【０１５９】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基Ｘ4で、Ｋが、正電荷のアミノ酸に変異したモチーフＡを含む。ＲおよびＨが好ましい。
【０１６０】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、２つまたはそれを超えるＸ10、Ｘ11、およびＸ12、ならびにＸ4位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＡを含む。
【０１６１】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ10、Ｘ11、Ｘ12、およびＸ4位にこれらの好ましいまたは特に好ましいアミノ酸の１つを有するモチーフＡを含み、さらに、好ましくは、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｃ、Ｍ、Ｆから選択される疎水性または芳香族であるＸ6アミノ酸を含む。
【０１６２】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ10、Ｘ11、Ｘ12、およびＸ4位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＡを含み、さらに、好ましくは、Ａ、Ｐ、Ｓ、およびＴから選択される小アミノ酸であるＸ9アミノ酸を含む。
【０１６３】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ10、Ｘ11、Ｘ12、およびＸ4位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＡを含み、さらに、好ましくは、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｃ、およびＡから選択される疎水性アミノ酸であるＸ13アミノ酸を含む。
【０１６４】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ10、Ｘ11、Ｘ12、およびＸ4位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＡを含み、さらに、好ましくは、１つまたは複数のＸ8、Ｘ9、およびＸ13位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を含む。
【０１６５】
さらなる保存的アミノ酸置換が許容される。明らかに、６位の置換は許容されない。例えば、Ｘ2位およびＸ3位にＶ、Ｉ、Ｆ、Ａ、Ｍ、Ｃ、およびＹが許容され、Ｘ5位にＦ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｃ、およびＹが許容され、Ｘ7位にＹ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｃ、およびＡが許容され、Ｘ14位にＰが許容される。
【０１６６】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩαイソ型は、モチーフＡ配列Ｇ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｍ−Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−［Ｒ／Ｋ］−Ｎ−Ｌ−［Ｔ／Ｓ］、モチーフＢ配列Ｙ−Ｄ−Ｌ−Ｉ−［Ｌ／Ｖ］−Ｋ−Ｆ−Ａ−Ｎ−Ｙ−Ｇ−Ｆ−Ｎ−Ｒ−Ｓ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｆ−Ｄ−Ｌ−Ｄ−Ｆ−Ｓを有するＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットと比較して、プライマー伸長産物に標識ヌクレオチドを組み込む能力が増加した。
【０１６７】
グラム陽性細菌ＤｎａＥのコンセンサスモチーフＢを、Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｘ14−Ｘ15−Ｘ16（式中、Ｘ1は［Ｆ／Ｙ／Ｗ］であり、Ｘ2は任意のアミノ酸であり、Ｘ3は任意のアミノ酸であり、Ｘ4は任意のアミノ酸であり、Ｘ5は任意のアミノ酸であり、Ｘ6は［Ｒ／Ｋ］であり、Ｘ7はＦであり、Ｘ8は任意のアミノ酸であり、Ｘ9は任意のアミノ酸であり、Ｘ10はＹであり、Ｘ11は［Ａ／Ｇ］であり、Ｘ12はＦであり、Ｘ13はＮであり、Ｘ14は［Ｒ／Ｋ］であり、Ｘ15は任意のアミノ酸であり、Ｘ16はＨである）と示すことができる。
【０１６８】
グラム陽性細菌由来の例示的ＤｎａＥモチーフＢ配列には、以下が含まれる。
【０１６９】
【表５】
2008526215.tif 000009
【０１７０】
１つの態様では、本発明は、標識ｄＮＴＰに結合し、これをプライマー伸長産物に組み込む能力が増加したＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。
【０１７１】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基Ｘ6で、［Ｒ／Ｋ］が、正電荷のアミノ酸、好ましくは、ＲまたはＨに変異したモチーフＢを含む。
【０１７２】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基Ｘ7で、Ｆが非荷電芳香族アミノ酸、好ましくは、ＹまたはＷに変異したモチーフＢを含む。
【０１７３】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基Ｘ10で、Ｙが、好ましくは、Ｆ、Ｈ、Ｗ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、およびＩから選択される別の芳香族または嵩高い疎水性アミノ酸に変異したモチーフＢを含む。
【０１７４】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、２つまたはそれを超えるＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含む。
【０１７５】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、疎水性または芳香族であるＸ5アミノ酸を含む。Ｌ、Ｉ、Ａ、Ｃ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、およびＹが好ましい。
【０１７６】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、小疎水性または嵩高い疎水性アミノ酸であるが、荷電または芳香族アミノ酸ではないＸ6アミノ酸を含む。Ｇ、Ｓ、Ｌ、Ｃ、Ｍ、Ｖ、およびＩが好ましい。
【０１７７】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、小アミノ酸、極性アミノ酸、または負電荷のアミノ酸であるＸ9アミノ酸を含む。Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、およびＤが好ましい。
【０１７８】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、小アミノ酸または非分岐疎水性アミノ酸であるが、芳香族アミノ酸ではないＸ11アミノ酸を含む。Ａ、Ｓ、Ｐ、Ｃ、Ｌ、およびＭが好ましい。
【０１７９】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、非荷電芳香族アミノ酸または嵩高い疎水性アミノ酸であるＸ12アミノ酸を含む。Ｙ、Ｗ、Ｌ、Ｍ、Ｃ、Ｖ、およびＩが好ましい。
【０１８０】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、極性アミノ酸であるＸ13アミノ酸を含む。Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、およびＧが好ましい。
【０１８１】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、正電荷のＸ14アミノ酸を含む。ＲおよびＨが好ましい。
【０１８２】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、極性アミノ酸であるＸ15アミノ酸を含む。Ｑ、Ｎ、Ｐ、Ｔ、Ｇ、およびＡが好ましい。
【０１８３】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、１つまたは複数のＸ5、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、およびＸ15位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を含む。
【０１８４】
さらなる保存的アミノ酸置換が許容される。明らかに、６位の置換は許容されない。例えば、Ｘ2位およびＸ3位にＶ、Ｉ、Ｆ、Ａ、Ｍ、Ｃ、およびＹが許容され、Ｘ5位にＦ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｃ、およびＹが許容され、Ｘ7位にＹ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｃ、およびＡが許容され、Ｘ14Ｐが許容される。
【０１８５】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩαイソ型は、モチーフＡ配列Ｇ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｍ−Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−［Ｒ／Ｋ］−Ｎ−Ｌ−［Ｔ／Ｓ］、モチーフＢ配列Ｙ−Ｄ−Ｌ−Ｉ−［Ｌ／Ｖ］−Ｋ−Ｆ−Ａ−Ｎ−Ｙ−Ｇ−Ｆ−Ｎ−Ｒ−Ｓ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｆ−Ｄ−Ｌ−Ｄ−Ｆ−Ｓを有するＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットと比較して、プライマー伸長産物に標識ヌクレオチドを組み込む能力が増加した。
【０１８６】
１つの態様では、本発明は、ｄｄＮＴＰに結合し、これをプライマー伸長産物に組み込む能力が増加したＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。
【０１８７】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基Ｘ6で、［Ｒ／Ｋ］が、正電荷のアミノ酸、好ましくは、ＲまたはＨに変異したモチーフＢを含む。
【０１８８】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基７で、Ｆが、非荷電芳香族アミノ酸、好ましくは、ＹまたはＷに変異したモチーフＢを含む。
【０１８９】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基１０で、Ｙが、好ましくは、Ｆ、Ｈ、Ｗ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、およびＩから選択される別の芳香族または嵩高い疎水性アミノ酸に変異したモチーフＢを含む。
【０１９０】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、２つまたはそれを超えるＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含む。
【０１９１】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、疎水性または芳香族であるＸ5アミノ酸を含む。Ｌ、Ｉ、Ａ、Ｃ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、およびＹが好ましい。
【０１９２】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、小疎水性または嵩高い疎水性アミノ酸であるが、荷電または芳香族アミノ酸ではないＸ6アミノ酸を含む。Ｇ、Ｓ、Ｌ、Ｃ、Ｍ、Ｖ、およびＩが好ましい。
【０１９３】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、小アミノ酸、極性アミノ酸、または負電荷のアミノ酸であるＸ9アミノ酸を含む。Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、およびＤが好ましい。
【０１９４】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、小アミノ酸または非分岐疎水性アミノ酸であるが、芳香族アミノ酸ではないＸ11アミノ酸を含む。Ａ、Ｓ、Ｐ、Ｃ、Ｌ、およびＭが好ましい。
【０１９５】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、非荷電芳香族アミノ酸または嵩高い疎水性アミノ酸であるＸ12アミノ酸を含む。Ｙ、Ｗ、Ｌ、Ｍ、Ｃ、Ｖ、およびＩが好ましい。
【０１９６】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、極性アミノ酸であるＸ13アミノ酸を含む。Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、およびＧが好ましい。
【０１９７】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、正電荷のＸ14アミノ酸を含む。ＲおよびＨが好ましい。
【０１９８】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、極性アミノ酸であるＸ15アミノ酸を含む。Ｑ、Ｎ、Ｐ、Ｔ、Ｇ、Ａが好ましい。
【０１９９】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、１つまたは複数のＸ5、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、およびＸ15位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を含む。
【０２００】
さらなる保存的アミノ酸置換が許容される。明らかに、６位の置換は許容されない。例えば、Ｘ2位およびＸ3位にＶ、Ｉ、Ｆ、Ａ、Ｍ、Ｃ、およびＹが許容され、Ｘ5位にＦ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｃ、およびＹが許容され、Ｘ7位にＹ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｃ、およびＡが許容され、Ｘ14位にＰが許容される。
【０２０１】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩαイソ型は、モチーフＡ配列Ｇ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｍ−Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−［Ｒ／Ｋ］−Ｎ−Ｌ−［Ｔ／Ｓ］、モチーフＢ配列Ｙ−Ｄ−Ｌ−Ｉ−［Ｌ／Ｖ］−Ｋ−Ｆ−Ａ−Ｎ−Ｙ−Ｇ−Ｆ−Ｎ−Ｒ−Ｓ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｆ−Ｄ−Ｌ−Ｄ−Ｆ−Ｓを有するＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットと比較して、プライマー伸長産物にｄｄＮＴＰを組み込む能力が増加した。
【０２０２】
１つの態様では、本発明は、ＲＮＡプライマーとＤＮＡプライマーとのその識別が変化したＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。１つの実施形態では、ＲＮＡプライミングテンプレートを優先的に複製するＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、好ましくは、モチーフＢ中に１つまたは複数の変異を有する。これらの変異は、ＤＮＡプライマーを伸長する能力が減少している。
【０２０３】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基１１で、［Ａ／Ｇ］がＭ、Ｃ、またはＬに変異したモチーフＢを含む。
【０２０４】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩαイソ型は、モチーフＡ配列Ｇ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｍ−Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−［Ｒ／Ｋ］−Ｎ−Ｌ−［Ｔ／Ｓ］、モチーフＢ配列Ｙ−Ｄ−Ｌ−Ｉ−［Ｌ／Ｖ］−Ｋ−Ｆ−Ａ−Ｎ−Ｙ−Ｇ−Ｆ−Ｎ−Ｒ−Ｓ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｆ−Ｄ−Ｌ−Ｄ−Ｆ−Ｓを有するＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットと比較して、ＲＮＡプライミングテンプレートに対する優先度が増加している。
【０２０５】
１つの実施形態では、ＤＮＡプライミングテンプレートを優先的に複製するＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変態は、好ましくは、モチーフＢ中に１つまたは複数の変異を有する。これらの変異体は、ＲＮＡプライマーを伸長する能力が減少している。
【０２０６】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基１２で、ＦがＹに変異し、好ましくは、残基１１で、［Ａ／Ｇ］がＭ、Ｃ、またはＬに第２の変異をしたモチーフＢを含む。
【０２０７】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩαイソ型は、モチーフＡ配列Ｇ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｍ−Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−［Ｒ／Ｋ］−Ｎ−Ｌ−［Ｔ／Ｓ］、モチーフＢ配列Ｙ−Ｄ−Ｌ−Ｉ−［Ｌ／Ｖ］−Ｋ−Ｆ−Ａ−Ｎ−Ｙ−Ｇ−Ｆ−Ｎ−Ｒ−Ｓ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｆ−Ｄ−Ｌ−Ｄ−Ｆ−Ｓを有するＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットと比較して、ＤＮＡプライミングテンプレートに対する優先度が増加している。
【０２０８】
好ましい実施形態では、Ｐｏｌ  ＩＩＩα変異体は、モチーフＡおよびＢが上記のアミノ酸配列を含むモチーフＡおよびモチーフＢを含む。
【０２０９】
（ｉｉｉ）グラム陽性ＰｏｌＣ由来のＰｏｌ  ＩＩＩ変異体
グラム陽性細菌ＰｏｌＣのコンセンサスモチーフＡを、Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13（式中、Ｘ1は［Ｌ／Ｖ］であり、Ｘ2は［Ｌ／Ｖ］であり、Ｘ3はＫであり、Ｘ4は任意のアミノ酸であり、Ｘ5はＤであり、Ｘ6は［Ａ／Ｉ］であり、Ｘ7はＬであり、Ｘ8はＧであり、Ｘ9はＨであり、Ｘ10はＤであり、Ｘ11は任意のアミノ酸であり、Ｘ12はＰであり、Ｘ13はＴである）と示すことができる。
【０２１０】
グラム陽性細菌由来の例示的ＰｏｌＣモチーフＡ配列には、以下が含まれる。
【０２１１】
【表６】
2008526215.tif 000010
【０２１２】
１つの態様では、本発明は、標識ｄＮＴＰに結合し、これをプライマー伸長産物に組み込む能力が増加したＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。
【０２１３】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基Ｘ9で、Ｈが、好ましくは、Ｙ、Ｆ、およびＷから選択される芳香族アミノ酸に変異したモチーフＡを含む。
【０２１４】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基Ｘ10で、Ｄが、好ましくは、Ｅ、Ｑ、およびＮから選択される正電荷のアミノ酸または極性アミンを有するアミノ酸に変異したモチーフＡを含む。
【０２１５】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基Ｘ11で、既存のアミノ酸が、好ましくは、Ｅ、Ｑ、およびＮから選択される正電荷のアミノ酸または極性アミンを有するアミノ酸に変異したモチーフＡを含む。
【０２１６】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基Ｘ3で、Ｋが、正電荷のアミノ酸、好ましくは、ＲまたはＨに変異したモチーフＡを含む。
【０２１７】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、２つまたはそれを超えるＸ9、Ｘ10、Ｘ11、およびＸ3位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＡを含む。
【０２１８】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ9、Ｘ10、Ｘ11、およびＸ3位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＡを含み、さらに、好ましくは、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｃ、Ｍ、Ｆから選択される疎水性または芳香族であるＸ7アミノ酸を含む。
【０２１９】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ9、Ｘ10、Ｘ11、およびＸ3位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＡを含み、さらに、好ましくは、Ａ、Ｐ、Ｓ、およびＴから選択される小アミノ酸であるＸ8アミノ酸を含む。
【０２２０】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ9、Ｘ10、Ｘ11、およびＸ3位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＡを含み、さらに、好ましくは、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｎ、およびＱから選択される小アミノ酸または極性アミノ酸であるＸ12アミノ酸を含む。
【０２２１】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ9、Ｘ10、Ｘ11、およびＸ3位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＡを含み、さらに、好ましくは、１つまたは複数のＸ7、Ｘ8、およびＸ12位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を含む。
【０２２２】
さらなる保存的アミノ酸置換が許容される。明らかに、６位の置換は許容されない。例えば、Ｘ2位およびＸ3位にＶ、Ｉ、Ｆ、Ａ、Ｍ、Ｃ、およびＹが許容され、Ｘ5位にＦ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、およびＹが許容され、Ｘ7位にＦ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｃ、Ａが許容され、Ｘ14位にＳ、Ａ、Ｐ、Ｇが許容される。
【０２２３】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩαイソ型は、モチーフＡ配列Ｎ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｄ−Ｉ−Ｌ−Ｇ−Ｈ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｔ、モチーフＢ配列Ｙ−Ｉ−Ｅ−Ｓ−Ｃ−Ｋ−Ｋ−Ｉ−Ｋ−Ｙ−Ｍ−Ｆ−Ｐ−Ｋ−Ａ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｉ−Ｄ−Ｌ−Ｎ−Ｆ−Ｓを有するＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットと比較して、プライマー伸長産物に標識ヌクレオチドを組み込む能力が増加した。
【０２２４】
グラム陽性細菌ＰｏｌＣのコンセンサスモチーフＢを、Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｘ14−Ｘ15−Ｘ16（式中、Ｘ1は［Ｆ／Ｙ］であり、Ｘ2はＩであり、Ｘ3は任意のアミノ酸であり、Ｘ4はＳであり、Ｘ5はＣであり、Ｘ6は任意のアミノ酸であり、Ｘ7は［Ｒ／Ｋ］であり、Ｘ8はＩであり、Ｘ9はＫであり、Ｘ10はＹであり、Ｘ11は［Ｍ／Ｌ］であり、Ｘ12はＦであり、Ｘ13はＰであり、Ｘ14はＫであり、Ｘ15はＡであり、Ｘ16はＨである）と示すことができる。
【０２２５】
グラム陽性細菌由来の例示的ＰｏｌＣモチーフＢ配列には、以下が含まれる。
【０２２６】
【表７】
2008526215.tif 000011
【０２２７】
１つの態様では、本発明は、標識ｄＮＴＰに結合し、これをプライマー伸長産物に組み込む能力が増加したＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。
【０２２８】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基Ｘ7で、［Ｒ／Ｋ］が、正電荷のアミノ酸、好ましくは、ＲまたはＨに変異したモチーフＢを含む。
【０２２９】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基Ｘ9で、Ｋが、正電荷のアミノ酸、好ましくは、ＲまたはＨに変異したモチーフＢを含む。
【０２３０】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基Ｘ10で、Ｙが、好ましくは、別の芳香族アミノ酸、好ましくは、Ｆ、Ｈ、またはＷ（ＦおよびＷが特に好ましい）に変異したモチーフＢを含む。
【０２３１】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、２つまたはそれを超えるＸ7、Ｘ9、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含む。
【０２３２】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ7、Ｘ9、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、疎水性または芳香族であるＸ5アミノ酸を含む。Ｌ、Ｉ、Ａ、Ｃ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、およびＹが好ましい。
【０２３３】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、小疎水性または嵩高い疎水性アミノ酸であるが、荷電または芳香族アミノ酸ではないＸ8アミノ酸を含む。Ｇ、Ｓ、Ｌ、Ｃ、Ｍ、Ｖ、およびＩが好ましく、Ｇ、Ｓ、およびＡが特に好ましい。
【０２３４】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、小疎水性または嵩高い疎水性アミノ酸であるが、荷電または芳香族アミノ酸ではないＸ9アミノ酸を含む。Ｇ、Ｓ、Ｌ、Ｃ、Ｍ、Ｖ、およびＩが好ましく、Ｒ、Ｓ、およびＧが特に好ましい。
【０２３５】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、小アミノ酸または非分岐疎水性アミノ酸であるが、芳香族アミノ酸ではないＸ11アミノ酸を含む。Ａ、Ｓ、Ｐ、Ｃ、Ｌ、およびＭが好ましく、ＡおよびＧが特に好ましい。
【０２３６】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、非荷電芳香族アミノ酸または嵩高い疎水性アミノ酸であるＸ12アミノ酸を含む。Ｙ、Ｗ、およびＩが好ましい。
【０２３７】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、極性アミノ酸であるＸ13アミノ酸を含む。Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、およびＧが好ましく、ＧおよびＳが特に好ましい。
【０２３８】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、正電荷のＸ14アミノ酸を含む。ＲおよびＨが好ましい。
【０２３９】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、極性アミノ酸であるＸ15アミノ酸を含む。Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｐ、Ｔ、Ｇ、およびＡが好ましく、ＧおよびＳが特に好ましい。
【０２４０】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、１つまたは複数のＸ5、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、およびＸ15位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を含む。
【０２４１】
さらなる保存的アミノ酸置換が許容される。例えば、Ｘ1位にＷ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、およびＣが許容され、およびＸ2位にＬ、Ｖ、Ｃ、Ｍ、Ｇ、Ａが許容され、Ｘ3位にＤ、Ｑ、Ｎが許容され、Ｘ4位にＴ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｄが許容される。
【０２４２】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩαイソ型は、モチーフＡ配列Ｎ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｄ−Ｉ−Ｌ−Ｇ−Ｈ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｔ、モチーフＢ配列Ｙ−Ｉ−Ｅ−Ｓ−Ｃ−Ｋ−Ｋ−Ｉ−Ｋ−Ｙ−Ｍ−Ｆ−Ｐ−Ｋ−Ａ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｉ−Ｄ−Ｌ−Ｎ−Ｆ−Ｓを有するＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットと比較して、プライマー伸長産物に標識ヌクレオチドを組み込む能力が増加した。
【０２４３】
１つの態様では、本発明は、ｄｄＮＴＰに結合し、これをプライマー伸長産物に組み込む能力が増加したＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。
【０２４４】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基Ｘ7で、［Ｒ／Ｋ］が、正電荷のアミノ酸、好ましくは、ＲまたはＨに変異したモチーフＢを含む。
【０２４５】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基Ｘ9で、Ｋが、正電荷のアミノ酸、好ましくは、ＲまたはＨに変異したモチーフＢを含む。
【０２４６】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基Ｘ10で、Ｙが、好ましくは、別の芳香族アミノ酸、好ましくは、Ｆ、Ｈ、またはＷ（ＦおよびＷが特に好ましい）に変異したモチーフＢを含む。
【０２４７】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、２つまたはそれを超えるＸ7、Ｘ9、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含む。
【０２４８】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ7、Ｘ9、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、疎水性または芳香族であるＸ5アミノ酸を含む。Ｌ、Ｉ、Ａ、Ｃ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、およびＹが好ましい。
【０２４９】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、小疎水性または嵩高い疎水性アミノ酸であるが、荷電または芳香族アミノ酸ではないＸ8アミノ酸を含む。Ｇ、Ｓ、Ｌ、Ｃ、Ｍ、Ｖ、およびＩが好ましく、Ａ、Ｌ、Ｇ、およびＳが特に好ましい。
【０２５０】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、小疎水性または嵩高い疎水性アミノ酸であるが、荷電または芳香族アミノ酸ではないＸ9アミノ酸を含む。Ｇ、Ｓ、Ｌ、Ｃ、Ｍ、Ｖ、およびＩが好ましく、Ｒ、Ｓ、およびＧが特に好ましい。
【０２５１】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、小アミノ酸または非分岐疎水性アミノ酸であるが、芳香族アミノ酸ではないＸ11アミノ酸を含む。Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｃ、およびＭが好ましく、Ａ、Ｇ、およびＬが特に好ましい。
【０２５２】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、非荷電芳香族アミノ酸または嵩高い疎水性アミノ酸であるＸ12アミノ酸を含む。Ｙ、Ｗ、Ｖ、およびＩが好ましく、Ｙが特に好ましい。
【０２５３】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、極性アミノ酸であるＸ13アミノ酸を含む。Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、およびＧが好ましく、ＧおよびＳが特に好ましい。
【０２５４】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、正電荷のＸ14アミノ酸を含む。ＲおよびＨが好ましい。
【０２５５】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、極性アミノ酸であるＸ15アミノ酸を含む。Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｐ、Ｔ、Ｇ、が好ましい。
【０２５６】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、１つまたは複数のＸ5、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、およびＸ15位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を含む。
【０２５７】
さらなる保存的アミノ酸置換が許容される。例えば、Ｘ1位にＷ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、およびＣが許容され、およびＸ2位にＬ、Ｖ、Ｃ、Ｍ、Ｇ、Ａが許容され、Ｘ3位にＤ、Ｑ、Ｎが許容され、Ｘ4位にＴ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｄが許容される。
【０２５８】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩαイソ型は、モチーフＡ配列Ｎ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｄ−Ｉ−Ｌ−Ｇ−Ｈ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｔ、モチーフＢ配列Ｙ−Ｉ−Ｅ−Ｓ−Ｃ−Ｋ−Ｋ−Ｉ−Ｋ−Ｙ−Ｍ−Ｆ−Ｐ−Ｋ−Ａ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｉ−Ｄ−Ｌ−Ｎ−Ｆ−Ｓを有するＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットと比較して、プライマー伸長産物にｄｄＮＴＰを組み込む能力が増加した。
【０２５９】
１つの態様では、本発明は、ＲＮＡプライマーとＤＮＡプライマーとのその識別が変化したＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。１つの実施形態では、ＲＮＡプライミングテンプレートを優先的に複製するＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、好ましくは、モチーフＢ中に１つまたは複数の変異を有する。これらの変異は、ＤＮＡプライマーを伸長する能力が減少している。
【０２６０】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基１１で、［Ｍ／Ｌ］が、Ｃに変異したモチーフＢを含む。
【０２６１】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩαイソ型は、モチーフＡ配列Ｎ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｄ−Ｉ−Ｌ−Ｇ−Ｈ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｔ、モチーフＢ配列Ｙ−Ｉ−Ｅ−Ｓ−Ｃ−Ｋ−Ｋ−Ｉ−Ｋ−Ｙ−Ｍ−Ｆ−Ｐ−Ｋ−Ａ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｉ−Ｄ−Ｌ−Ｎ−Ｆ−Ｓを有するＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットと比較して、ＲＮＡプライミングテンプレートに対する優先度が増加している。
【０２６２】
１つの実施形態では、ＤＮＡプライミングテンプレートを優先的に複製するＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変態は、好ましくは、モチーフＢ中に１つまたは複数の変異を有する。これらの変異体は、ＲＮＡプライマーを伸長する能力が減少している。
【０２６３】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基１２で、ＦがＹに変異し、任意選択的に、残基１１で、［Ｍ／Ｌ］が、Ｃに第２の変異をしたモチーフＢを含む。
【０２６４】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩαイソ型は、モチーフＡ配列Ｎ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｄ−Ｉ−Ｌ−Ｇ−Ｈ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｔ、モチーフＢ配列Ｙ−Ｉ−Ｅ−Ｓ−Ｃ−Ｋ−Ｋ−Ｉ−Ｋ−Ｙ−Ｍ−Ｆ−Ｐ−Ｋ−Ａ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｉ−Ｄ−Ｌ−Ｎ−Ｆ−Ｓを有するＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットと比較して、ＤＮＡプライミングテンプレートに対する優先度が増加している。
【０２６５】
好ましい実施形態では、Ｐｏｌ  ＩＩＩα変異体は、モチーフＡおよびＢが上記のアミノ酸配列を含むモチーフＡおよびモチーフＢを含む。
【０２６６】
（ｉｖ）ラン藻Ｐｏｌ  ＩＩＩ由来のＰｏｌ  ＩＩＩ変異体
ラン藻ＤｎａＥのコンセンサスモチーフＡを、Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｘ14（式中、Ｘ1はＧであり、Ｘ2はＬであり、Ｘ3はＬであり、Ｘ4はＫであり、Ｘ5はＭであり、Ｘ6はＤであり、Ｘ7はＦであり、Ｘ8はＬであり、Ｘ9はＧであり、Ｘ10はＬであり、Ｘ11は［Ｒ／Ｋ］であり、Ｘ12はＮであり、Ｘ13はＬであり、Ｘ14はＴ）と示すことができる。
【０２６７】
ラン藻由来の例示的モチーフＡ配列には、以下が含まれる。
【０２６８】
【表８】
2008526215.tif 000012
【０２６９】
１つの態様では、本発明は、標識ｄＮＴＰに結合し、これをプライマー伸長産物に組み込む能力が増加したＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。
【０２７０】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基Ｘ10で、Ｌが、好ましくは、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｃ、Ｍ、Ｙ、およびＦから選択される芳香族アミノ酸または疎水性アミノ酸に変異したモチーフＡを含む。
【０２７１】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基Ｘ11で、［Ｒ／Ｋ］が、好ましくは、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ｇ、Ｓ、Ａ、およびＰから選択される芳香族アミノ酸、小アミノ酸、または正電荷のアミノ酸に変異したモチーフＡを含む。
【０２７２】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基Ｘ12で、Ｎが、このましくは、Ｔ、Ｓ、Ｑ、Ｐ、Ｍ、Ｃ、およびＬから選択される極性アミノ酸または長鎖疎水性アミノ酸に変異したモチーフＡを含む。Ｘ11が小アミノ酸ではない場合、Ｘ11はまた、好ましくは、変異されて小アミノ酸が得られる。
【０２７３】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基Ｘ4で、Ｋが、正電荷のアミノ酸、好ましくは、ＲまたはＨに変異したモチーフＡを含む。
【０２７４】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、２つまたはそれを超えるＸ10、Ｘ11、およびＸ12、ならびにＸ4位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＡを含む。
【０２７５】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ10、Ｘ11、Ｘ12、およびＸ4位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＡを含み、さらに、好ましくは、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｃ、Ｍ、Ｆから選択される芳香族または疎水性アミノ差であるＸ8アミノ酸を含む。
【０２７６】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ10、Ｘ11、Ｘ12、およびＸ4位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＡを含み、さらに、好ましくは、Ａ、Ｐ、Ｓ、およびＴから選択される小アミノ酸であるＸ9アミノ酸を含む。
【０２７７】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ10、Ｘ11、Ｘ12、およびＸ4位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＡを含み、さらに、好ましくは、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｃ、およびＡから選択される疎水性アミノ酸であるＸ13アミノ酸を含む。
【０２７８】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ10、Ｘ11、Ｘ12、およびＸ4位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＡを含み、さらに、好ましくは、１つまたは複数のＸ8、Ｘ9、およびＸ13位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を含む。
【０２７９】
さらなる保存的アミノ酸置換が許容される。明らかに、６位の置換は許容されない。例えば、Ｘ2位およびＸ3位にＩ、Ｆ、Ａ、Ｍ、Ｃ、Ｙが許容され、Ｘ5位にＦ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｃ、Ｙが許容され、Ｘ7位にＹ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｃ、Ａが許容され、Ｘ14位にＳ、Ａ、Ｐが許容される。
【０２８０】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩαイソ型は、モチーフＡ配列Ｇ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｍ−Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−［Ｒ／Ｋ］−Ｎ−Ｌ−Ｔ、モチーフＢ配列Ｆ−Ｄ−Ｑ−Ｍ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ａ−Ｅ−Ｙ−Ｃ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｉ−Ｄ−Ｔ−Ｄ−Ｆ−Ｃを有するＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットと比較して、プライマー伸長産物に標識ヌクレオチドを組み込む能力が増加した。
【０２８１】
ラン藻ＤｎａＥのコンセンサスモチーフＢを、Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｘ14−Ｘ15−Ｘ16（式中、Ｘ1はＦであり、Ｘ2はＤであり、Ｘ3はＱであり、Ｘ4はＭであり、Ｘ5はＶであり、Ｘ6はＫであり、Ｘ7はＦであり、Ｘ8はＡであり、Ｘ9はＥであり、Ｘ10はＹであり、Ｘ11はＣであり、Ｘ12はＦであり、Ｘ13はＮであり、Ｘ14はＫであり、Ｘ15はＳであり、Ｘ16はＨである）と示すことができる。
【０２８２】
ラン藻由来の例示的モチーフＢ配列には、以下が含まれる。
【０２８３】
【表９】
2008526215.tif 000013
【０２８４】
１つの態様では、本発明は、標識ｄＮＴＰに結合し、これをプライマー伸長産物に組み込む能力が増加したＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。
【０２８５】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基Ｘ6で、Ｋが、好ましくは、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｎ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、およびＰから選択される小アミノ酸、荷電アミノ酸、または極性アミノ酸に変異したモチーフＢを含む。
【０２８６】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基Ｘ7で、Ｆが、非荷電芳香族アミノ酸、好ましくは、ＹまたはＷに変異したモチーフＢを含む。
【０２８７】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基Ｘ10で、Ｙが、好ましくは、Ｆ、Ｈ、Ｗ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、およびＩから選択される別の芳香族アミノ酸または嵩高い疎水性アミノ酸に変異したモチーフＢを含む。
【０２８８】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、２つまたはそれを超えるＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含む。
【０２８９】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、疎水性または芳香族であるＸ5アミノ酸を含む。Ｌ、Ｉ、Ａ、Ｃ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、およびＹが好ましい。
【０２９０】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、小疎水性または嵩高い疎水性アミノ酸であるが、荷電または芳香族アミノ酸ではないＸ6アミノ酸を含む。Ｇ、Ｓ、Ｌ、Ｃ、Ｍ、Ｖ、およびＩが好ましい。
【０２９１】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、小疎水性アミノ酸、極性アミノ酸、または負電荷のアミノ酸であるＸ9アミノ酸を含む。Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、およびＤが好ましい。
【０２９２】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、小アミノ酸または非分岐疎水性アミノ酸であるが、芳香族アミノ酸ではないＸ11アミノ酸を含む。Ａ、Ｓ、Ｐ、Ｃ、Ｌ、およびＭが好ましい。
【０２９３】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、非荷電芳香族アミノ酸または嵩高い疎水性アミノ酸であるＸ12アミノ酸を含む。Ｙ、Ｗ、Ｌ、Ｍ、Ｃ、Ｖ、およびＩが好ましい。
【０２９４】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、極性アミノ酸であるＸ13アミノ酸を含む。Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、およびＧが好ましい。
【０２９５】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、正電荷のＸ14アミノ酸を含む。ＲおよびＨが好ましい。
【０２９６】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、極性アミノ酸であるＸ15アミノ酸を含む。Ｑ、Ｎ、Ｐ、Ｔ、Ｇ、およびＡが好ましい。
【０２９７】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、１つまたは複数のＸ5、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、およびＸ15位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を含む。
【０２９８】
さらなる保存的アミノ酸置換が許容される。例えば、Ｘ1位にＷ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｃが許容され、Ｘ2位にＥ、Ｑ、Ｎが許容され、Ｘ3位にＤ、Ｅ、Ｎが許容され、Ｘ4位にＬ、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｆが許容される。
【０２９９】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩαイソ型は、モチーフＡ配列Ｇ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｍ−Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−［Ｒ／Ｋ］−Ｎ−Ｌ−Ｔ、モチーフＢ配列Ｆ−Ｄ−Ｑ−Ｍ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ａ−Ｅ−Ｙ−Ｃ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｉ−Ｄ−Ｔ−Ｄ−Ｆ−Ｃを有するＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットと比較して、プライマー伸長産物に標識ヌクレオチドを組み込む能力が増加した。
【０３００】
１つの態様では、本発明は、ｄｄＮＴＰに結合し、これをプライマー伸長産物に組み込む能力が増加したＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。
【０３０１】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基Ｘ6で、Ｋが、好ましくは、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｎ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、およびＰから選択される小アミノ酸、荷電アミノ酸、または極性アミノ酸に変異したモチーフＢを含む。
【０３０２】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基Ｘ7で、Ｆが、非荷電芳香族アミノ酸、好ましくは、ＹまたはＷに変異したモチーフＢを含む。
【０３０３】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基Ｘ10で、Ｙが、好ましくは、Ｆ、Ｈ、Ｗ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、およびＩから選択される別の芳香族アミノ酸または嵩高い疎水性アミノ酸に変異したモチーフＢを含む。
【０３０４】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、２つまたはそれを超えるＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含む。
【０３０５】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、疎水性または芳香族であるＸ6アミノ酸を含む。Ｌ、Ｉ、Ａ、Ｃ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、およびＹが好ましい。
【０３０６】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、小疎水性または嵩高い疎水性アミノ酸であるが、荷電または芳香族アミノ酸ではないＸ6アミノ酸を含む。Ｇ、Ｓ、Ｌ、Ｃ、Ｍ、Ｖ、およびＩが好ましい。
【０３０７】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、小疎水性アミノ酸、極性アミノ酸、または負電荷のアミノ酸であるＸ9アミノ酸を含む。Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、およびＤが好ましい。
【０３０８】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、小アミノ酸または非分岐疎水性アミノ酸であるが、芳香族アミノ酸ではないＸ11アミノ酸を含む。Ａ、Ｓ、Ｐ、Ｃ、Ｌ、およびＭが好ましい。
【０３０９】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、非荷電芳香族アミノ酸または嵩高い疎水性アミノ酸であるＸ12アミノ酸を含む。Ｙ、Ｗ、Ｌ、Ｍ、Ｃ、Ｖ、およびＩが好ましい。
【０３１０】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、極性アミノ酸であるＸ13アミノ酸を含む。Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、およびＧが好ましい。
【０３１１】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、正電荷のＸ14アミノ酸を含む。ＲおよびＨが好ましい。
【０３１２】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、極性アミノ酸であるＸ15アミノ酸を含む。Ｑ、Ｎ、Ｐ、Ｔ、Ｇ、およびＡが好ましい。
【０３１３】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、１つまたは複数のＸ6、Ｘ7、およびＸ10位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を有するモチーフＢを含み、さらに、１つまたは複数のＸ5、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、およびＸ15位に好ましいまたは特に好ましいアミノ酸を含む。
【０３１４】
さらなる保存的アミノ酸置換が許容される。例えば、Ｘ1位にＷ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｃが許容され、Ｘ2位にＥ、Ｑ、Ｎが許容され、Ｘ3位にＤ、Ｅ、Ｎが許容され、Ｘ4位にＬ、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｆが許容される。
【０３１５】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩαイソ型は、モチーフＡ配列Ｇ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｍ−Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−［Ｒ／Ｋ］−Ｎ−Ｌ−Ｔ、モチーフＢ配列Ｆ−Ｄ−Ｑ−Ｍ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ａ−Ｅ−Ｙ−Ｃ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｉ−Ｄ−Ｔ−Ｄ−Ｆ−Ｃを有するＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットと比較して、プライマー伸長産物にｄｄＮＴＰを組み込む能力が増加した。
【０３１６】
１つの態様では、本発明は、ＲＮＡプライマーとＤＮＡプライマーとのその識別が変化したＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。１つの実施形態では、ＲＮＡプライミングテンプレートを優先的に複製するＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、好ましくは、モチーフＢ中に１つまたは複数の変異を有する。これらの変異は、ＤＮＡプライマーを伸長する能力が減少している。
【０３１７】
１つの実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基１１で、Ｃが、［Ｍ／Ｌ］に変異したモチーフＢを含む。
【０３１８】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩαイソ型は、モチーフＡ配列Ｇ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｍ−Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−［Ｒ／Ｋ］−Ｎ−Ｌ−Ｔ、モチーフＢ配列Ｆ−Ｄ−Ｑ−Ｍ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ａ−Ｅ−Ｙ−Ｃ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｉ−Ｄ−Ｔ−Ｄ−Ｆ−Ｃを有するＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットと比較して、ＲＮＡプライミングテンプレートに対する優先度が増加している。
【０３１９】
１つの実施形態では、ＤＮＡプライミングテンプレートを優先的に複製するＰｏｌ  ＩＩＩα変異体を提供する。このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変態は、好ましくは、モチーフＢ中に１つまたは複数の変異を有する。これらの変異体は、ＲＮＡプライマーを伸長する能力が減少している。
【０３２０】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩα変異体は、残基１２で、ＦがＹに変異し、任意選択的に、残基１１で、Ｃが、［Ｍ／Ｌ］に第２の変異をしたモチーフＢを含む。
【０３２１】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩαイソ型は、モチーフＡ配列Ｇ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｍ−Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−［Ｒ／Ｋ］−Ｎ−Ｌ−Ｔ、モチーフＢ配列Ｆ−Ｄ−Ｑ−Ｍ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ａ−Ｅ−Ｙ−Ｃ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｉ−Ｄ−Ｔ−Ｄ−Ｆ−Ｃを有するＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットと比較して、ＤＮＡプライミングテンプレートに対する優先度が増加している。
【０３２２】
好ましい実施形態では、Ｐｏｌ  ＩＩＩα変異体は、モチーフＡおよびＢが上記のアミノ酸配列を含むモチーフＡおよびモチーフＢを含む。
【０３２３】
好ましい特徴を有するＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットイソ型
別の態様では、本発明は、好ましい特徴（好ましいプライマー識別活性または好ましいヌクレオチド識別活性など）を有するＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットイソ型を提供する。これらのＰｏｌ  ＩＩＩαイソ型は、天然に存在するイソ型またはＰｏｌ  ＩＩＩα変異体であり得る。これにかかわらず、本明細書中に開示のモチーフ配列と活性との結び付きに基づいて、これらのイソ型は、初めて、モチーフ配列に基づいて、ｄｄＮＴＰまたは標識ヌクレオチドに結合してこれをプライマー伸長産物に組み込む能力を有するか、好ましプライマー識別活性を有すると認識され、それにより、本明細書中に記載のように、Ｐｏｌ  ＩＩＩα変異体の代わりに、本明細書中に記載の特定の組成物および方法で有用となる。
【０３２４】
このようなＰｏｌ  ＩＩＩαイソ型中のモチーフＡ、Ｂ、およびＣのアミノ酸配列は、Ｐｏｌ  ＩＩＩα変異体の上記モチーフ配列の範囲に含まれる。
【０３２５】
好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩαイソ型は、（ｉ）モチーフＡ配列Ｇ−Ｌ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−［Ｒ／Ｋ］−Ｔ−Ｌ−Ｔ、モチーフＢ配列Ｆ−Ｄ−Ｌ−Ｍ−Ｅ−Ｋ−Ｆ−Ａ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｆ−Ｄ−Ｉ−Ｄ−Ｆ−Ｃ、（ｉｉ）モチーフＡ配列Ｇ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｍ−Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−［Ｒ／Ｋ］−Ｎ−Ｌ−Ｔ、モチーフＢ配列Ｆ−Ｄ−Ｑ−Ｍ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ａ−Ｅ−Ｙ−Ｃ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｉ−Ｄ−Ｔ−Ｄ−Ｆ−Ｃ；（ｉｉｉ）モチーフＡ配列Ｇ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｍ−Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−［Ｒ／Ｋ］−Ｎ−Ｌ−［Ｔ／Ｓ］、モチーフＢ配列Ｙ−Ｄ−Ｌ−Ｉ−［Ｌ／Ｖ］−Ｋ−Ｆ−Ａ−Ｎ−Ｙ−Ｇ−Ｆ−Ｎ−Ｒ−Ｓ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｆ−Ｄ−Ｌ−Ｄ−Ｆ−Ｓ；または（ｉｖ）モチーフＡ配列Ｎ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｄ−Ｉ−Ｌ−Ｇ−Ｈ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｔ、モチーフＢ配列Ｙ−Ｉ−Ｅ−Ｓ−Ｃ−Ｋ−Ｋ−Ｉ−Ｋ−Ｙ−Ｍ−Ｆ−Ｐ−Ｋ−Ａ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｉ−Ｄ−Ｌ−Ｎ−Ｆ−Ｓを有するＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットと比較して、プライマー伸長産物にｄｄＮＴＰまたは標識ヌクレオチドを組み込む能力が増加した。
【０３２６】
別の好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩαイソ型は、（ｉ）モチーフＡ配列Ｇ−Ｌ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−［Ｒ／Ｋ］−Ｔ−Ｌ−Ｔ、モチーフＢ配列Ｆ−Ｄ−Ｌ−Ｍ−Ｅ−Ｋ−Ｆ−Ａ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｆ−Ｄ−Ｉ−Ｄ−Ｆ−Ｃ、（ｉｉ）モチーフＡ配列Ｇ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｍ−Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−［Ｒ／Ｋ］−Ｎ−Ｌ−Ｔ、モチーフＢ配列Ｆ−Ｄ−Ｑ−Ｍ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ａ−Ｅ−Ｙ−Ｃ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｉ−Ｄ−Ｔ−Ｄ−Ｆ−Ｃ；（ｉｉｉ）モチーフＡ配列Ｇ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｍ−Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−［Ｒ／Ｋ］−Ｎ−Ｌ−［Ｔ／Ｓ］、モチーフＢ配列Ｙ−Ｄ−Ｌ−Ｉ−［Ｌ／Ｖ］−Ｋ−Ｆ−Ａ−Ｎ−Ｙ−Ｇ−Ｆ−Ｎ−Ｒ−Ｓ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｆ−Ｄ−Ｌ−Ｄ−Ｆ−Ｓ；または（ｉｖ）モチーフＡ配列Ｎ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｄ−Ｉ−Ｌ−Ｇ−Ｈ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｔ、モチーフＢ配列Ｙ−Ｉ−Ｅ−Ｓ−Ｃ−Ｋ−Ｋ−Ｉ−Ｋ−Ｙ−Ｍ−Ｆ−Ｐ−Ｋ−Ａ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｉ−Ｄ−Ｌ−Ｎ−Ｆ−Ｓを有するＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットと比較して、ＲＮＡプライミングテンプレートの優先度が増加した。
【０３２７】
別の好ましい実施形態では、このようなＰｏｌ  ＩＩＩαイソ型は、（ｉ）モチーフＡ配列Ｇ−Ｌ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−［Ｒ／Ｋ］−Ｔ−Ｌ−Ｔ、モチーフＢ配列Ｆ−Ｄ−Ｌ−Ｍ−Ｅ−Ｋ−Ｆ−Ａ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｆ−Ｄ−Ｉ−Ｄ−Ｆ−Ｃ、（ｉｉ）モチーフＡ配列Ｇ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｍ−Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−［Ｒ／Ｋ］−Ｎ−Ｌ−Ｔ、モチーフＢ配列Ｆ−Ｄ−Ｑ−Ｍ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ａ−Ｅ−Ｙ−Ｃ−Ｆ−Ｎ−Ｋ−Ｓ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｉ−Ｄ−Ｔ−Ｄ−Ｆ−Ｃ；（ｉｉｉ）モチーフＡ配列Ｇ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｍ−Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｇ−Ｌ−［Ｒ／Ｋ］−Ｎ−Ｌ−［Ｔ／Ｓ］、モチーフＢ配列Ｙ−Ｄ−Ｌ−Ｉ−［Ｌ／Ｖ］−Ｋ−Ｆ−Ａ−Ｎ−Ｙ−Ｇ−Ｆ−Ｎ−Ｒ−Ｓ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｆ−Ｄ−Ｌ−Ｄ−Ｆ−Ｓ；または（ｉｖ）モチーフＡ配列Ｎ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｄ−Ｉ−Ｌ−Ｇ−Ｈ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ｔ、モチーフＢ配列Ｙ−Ｉ−Ｅ−Ｓ−Ｃ−Ｋ−Ｋ−Ｉ−Ｋ−Ｙ−Ｍ−Ｆ−Ｐ−Ｋ−Ａ−Ｈ、およびモチーフＣ配列Ｐ−Ｄ−Ｉ−Ｄ−Ｌ−Ｎ−Ｆ−Ｓを有するＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットと比較して、ＤＮＡプライミングテンプレートの優先度が増加した。
【０３２８】
１成分および２成分のＰｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼ
１つの態様では、本発明は、１成分Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼであえる改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを提供する。別の態様では、本発明は、２成分Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼであえる改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを提供する。１成分および２成分のＰｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼの詳細な説明については、ＷＯ２００５／１１３８１０号、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１１９７８号（特に、その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。１成分および２成分のＰｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼの簡単な説明を以下に示す。
【０３２９】
以前の報告の所見と対照的に、細菌ｄｎａＥにコードされるαサブユニットおよびＰｏｌＣにコードされるαサブユニットは、適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下にて単独でおよび／または最小機能Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼとしてＰｏｌ  ＩＩＩの進化性クランプ成分と組み合わせて機能することができる。このような１成分および２成分のＰｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、Ｐｏｌ  ＩＩＩクランプローダーを欠く。
【０３３０】
さらに、グラム陰性細菌のｄｎａＥにコードされるαサブユニット、より詳細には、非中温性細菌のｄｎａＥにコードされるαサブユニットによって特徴づけられるいくつかのｄｎａＥにコードされるαサブユニットは、クランプローダーの非存在下で固有の亜鉛依存性３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および機能的Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼ活性を有する。また、グラム陽性細菌のＰｏｌＣにコードされるαサブユニット、より詳細には、非中温性細菌のＰｏｌＣにコードされるαサブユニットによって特徴づけられるＰｏｌＣにコードされるαサブユニットは、クランプローダーの非存在下で機能的Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼ活性を有する。このようなαサブユニットは、１成分および２成分のＰｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼで有用である。極限性細菌由来のαサブユニットの使用が好ましい。好熱菌由来のαサブユニットの使用が特に好ましい。
【０３３１】
驚いたことに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの１成分および２成分のＰｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼの適切な機能にクランプローダー成分機能が存在する必要はない。１成分および２成分のＰｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、クランプローダーによって形成された開始複合体を用いずにｓｓＤＮＡプライミングテンプレート分子をｉｎ  ｖｉｔｒｏで高速かつ進歩性に複製することができるという所見も驚きである。クランプローダーの非存在下にもかかわらず、１成分Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼの場合、進歩性クランプの非存在下で、本発明の最小機能的ＰｏｌＩＩＩ  レプリカーゼの伸長速度は、ＤＮＡ配列決定、増幅、定量、標識、および逆転写のために現在使用されているいかなるＡ型およびＢ型修復ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ａ型）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ（Ａ型）のＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａ型）、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ａ型）、φ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂ型）、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂ型）、Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂ型）、またはＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂ型）など）の伸長速度の少なくとも６〜８倍である。
【０３３２】
さらに、好熱性生物由来の１成分および２成分のＰｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、適切な条件下で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで二本鎖ＤＮＡ分子を増幅させる温度サイクリングモードで反復ＤＮＡ複製反応を維持するのに十分な熱安定性を示す。
【０３３３】
１成分Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、１つのサブユニットまたは複数のサブユニットからなり得る。１成分Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、本質的に、最小Ｐｏｌ  ＩＩＩの第１の成分からなり、この第１の成分は、αサブユニットを含み、クランプローダーを欠く。いくつかの好ましい実施形態では、第１の成分は、本質的に、αサブユニットからなる。他の好ましい実施形態では、第１の成分は、Ｐｏｌ  ＩＩＩのコアポリメラーゼ複合体の１つまたは複数のさらなるサブユニットを含む。したがって、本発明の１成分Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、αサブユニットを含み、γおよび／またはτサブユニットを欠く。種々のサブユニットを、本発明の１成分Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼで使用することができる。
【０３３４】
熱安定性１成分Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくは、好熱性細菌または好熱性ラン藻に由来する。好ましい実施形態では、好熱性細菌は、テルムス属、アクイフェックス属、サーモトガ属、サーモクリディス属、ディノコッカス属、メタノバクテリウム属、ヒドロゲノバクター属、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、サーモシンケコッカス属、およびサーモアネロバクター属からなる群から選択される。アクイフェックス・エアロリカス、アクイフェックス・ピロゲン、テルムス・サーモフィラス、テルムス・アクアティクス、サーモトガ・ネアポリタナ、およびサーモトガ・マリチマ由来の１成分および２成分のＰｏｌ  ＩＩＩが特に好ましい。
【０３３５】
本明細書中の最小機能的Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼのαサブユニットは、細菌ｐｏｌＣまたはｄｎａＥ遺伝子によってコードされ、ｄｎａＥにコードされるαサブユニットは、固有の亜鉛依存性３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
【０３３６】
特に好ましい実施形態では、細菌ｄｎａＥまたはｐｏｌＣにコードされるαサブユニットは、アクイフェックス・エアロリカス、テルムス・サーモフィラス、ディノコッカス・ラディウランス、テルムス・アクアチカス、サーモトガ・マリチマ、サーモアネロバクター属、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、テルムス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、テルムス・ルーバー（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ）、テルムス・ブロキアナス（Ｔｅｒｍｕｓ  ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）、サーモトガ・ネアポリタナおよびサーモトガ属の他の種、メタノバクテリウム・サーモアウトトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、サーモクリディス属由来の種、ヒドロゲノバクター属、サーモシンケコッカス属、ならびにこれらの種の変異体からなる群から選択される細菌またはラン藻に由来する。１つの実施形態では、１成分Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、θサブユニットおよび／またはεサブユニットを含み、これらのサブユニットは、好ましくは、１成分Ｐｏｌ  ＩＩＩのαサブユニットと同一の種に由来する。
【０３３７】
２成分ポリメラーゼ
本明細書中に開示の２成分Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、本質的に、第１の成分および第２の成分からなり、ここで、第１の成分は１成分Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼであり、第２の成分は進化性クランプを含む。好ましい実施形態では、第２の成分は、本質的に、進化性クランプからなる。好ましい実施形態では、進化性クランプは、Ｐｏｌ  ＩＩＩβサブユニットを含む。いくつかの好ましい実施形態では、進化性クランプは、本質的に、Ｐｏｌ  ＩＩＩβサブユニットからなる。本発明の２成分Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼはまた、クランプローダー成分を欠く。いくつかの実施形態では、２成分Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、１つを超える第１の成分を含み、これは、同一であっても異なっていても良い。
【０３３８】
好ましい実施形態では、２成分ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは、好熱性細菌の細菌ＤｎａＥまたはＰｏｌＣ遺伝子によってコードされるαサブユニットを含む。サブユニットの例を、例えば、２００１年５月２９日に付与された米国特許第６，２３８，９０５号、２０００年８月１８日出願の米国特許出願番号０９／６４２，２１８号、２０００年１１月２１日出願の米国特許出願番号０９／７１６，９６４号、１９９８年９月１１日出願の米国特許出願番号０９／１５１，８８８号、および２００１年３月２８日出願の米国特許出願番号０９／８１８，７８０号（それぞれ、特に、本明細書中で参考として援用される）に見出される。２成分ＤＮＡポリメラーゼの第１の成分は、任意選択的に、好ましくは、好熱性細菌由来の細菌ｄｎａＱ遺伝子によってコードされるεサブユニットを含む。εサブユニットの例は、例えば、２０００年８月１８日出願の米国特許出願番号０９／６４２，２１８号２０００年１１月２１日出願の米国特許出願番号０９／７１６，９６４号、１９９８年９月１１日出願の米国特許出願番号０９／１５１，８８８号、および２００１年３月２８日出願の米国特許出願番号０９／８１８，７８０号に見出される。さらに、２成分ＤＮＡポリメラーゼの第２の成分は、好ましくは、好熱性細菌の細菌ｄｎａＮ遺伝子によってコードされるβサブユニットを含む。βサブユニットの例は、例えば、２０００年８月１８日出願の米国特許出願番号０９／６４２，２１８号、２０００年１１月２１日出願の米国特許出願番号０９／７１６，９６４号、１９９８年９月１１日出願の米国特許出願番号０９／１５１，８８８号、および２００１年３月２８日出願の米国特許出願番号０９／８１８，７８０号に見出される。
【０３３９】
いくつかの好ましい実施形態では、２成分ポリメラーゼの第１の成分は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、いくつかの実施形態では、この活性はαサブユニットによって付与され、他の実施形態では、この活性はεサブユニットによって付与される。２成分ポリメラーゼに３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を付与する成分は、使用した反応緩衝液のｐＨおよびＺｎ2+濃度によって変化し得る。
【０３４０】
本発明の２成分ポリメラーゼは、例えば、アシネトバクター属、アグロバクテリウム属アクイフェックス・エアロリカス、ブデロビブリオ属、ボルデテラ属、ボレリア属、カンジダタス属、クラミジア属、クラミドフィラ属、クロロビウム属、クロストリジウム属、クロモバクテリウム属、高度好熱菌、コリネバクテリウム属、コクシエラ属、ディノコッカス・ラディウランス、デスルフォビブリオ属、テルムス・アクアチカス、大腸菌、エルウィニア属、ジオバクター属、ヘモフィルス・インフルエンカ、ピロリ菌、レプトスピラ属、メソリゾビウム・ロティ、マイコバクテリウム・ボビス、ライ菌、肺マイコプラズマ、ナイセリア属、ノカルジア・ファルシニカ、パスツレラ属、ピレルラ属、ポルフィロモナス、緑膿菌、ロドシュードモナス属、リケッチア属、サルモネラ属、シュワネラ属、赤痢菌属、トレポネーマ属、トロフェリマ属、ウォルバキア属、ウォリネラ属、キシレラナ属、サーモトガ・マリティマ、枯草菌、バチルス・リケニフォルミス、セレウス菌、フェカリス菌、化膿性レンサ球菌、ミュータンス菌、黄色ブドウ球菌、バチルス・ハロデュランス、クロストリジウム・アセトブチリカム、サーモアナエロバクター属、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、ピロコッカス・ウォーシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｏｓｉｉ）、ピロコッカス属の他の種、バチルス・ステアロサーモフィルス、スルフォロブス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、サーモプラズマ・アシドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、サームスフラバス属（Ｔｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓ）、テルムス・ルーバー（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ）、テルムス・ブロキアナス、サーモトガ・ネアポリタナおよびサーモトガ属の他の種、メタノバクテリウム・サーモアウトトロフィカムの細菌、およびこれらの種の変異体に由来し得る。
【０３４１】
いくつかの好ましい実施形態では、２成分ポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼである。
【０３４２】
好ましい実施形態では、２成分ポリメラーゼの第１および第２の成分は、好熱性細菌に由来する。好ましい実施形態では、好熱性細菌は、テルムス属、アクイフェックス属、サーモトガ属、サーモクリディス属、ヒドロゲノバクター属、サーモシンケコッカス属、およびサーモアネロバクター属からなる群から選択される属に由来する。アクイフェックス・エアロリカス、アクイフェックス・ピロゲン、テルムス・サーモフィラス、テルムス・アクアティクス、サーモトガ・ネアポリタナ、およびサーモトガ・マリチマ由来の２成分ポリメラーゼが特に好ましい。
【０３４３】
核酸の複製
１つの態様では、本発明は、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを含む複製反応混合物中の核酸を複製反応に供する工程を含む、核酸分子を複製する方法を提供する。
【０３４４】
「核酸の複製」は、テンプレート核酸分子の全部または一部が複製される過程である。したがって、核酸の複製反応産物は、複製されるテンプレート核酸分子と完全または部分的に相補的であり得る。５’−３’方向でのテンプレート核酸の伸長、伸長産物中の各位置でのテンプレート核酸の塩基に相補的なヌクレオチドの組み込みによって核酸が複製される。プライマーは、例えば、一本鎖ＤＮＡテンプレート領域とハイブリッド形成する合成オリゴヌクレオチドであり得る。プライマーはまた、例えば、一本鎖ＤＮＡテンプレートの第２の領域に相補的であり、且つ自己プライミングすることができる一本鎖ＤＮＡテンプレートの一部であり得る。等温複製反応、配列決定反応、増幅反応、サーモサイクリング増幅反応、ＰＣＲ、ファストＰＣＲ、およびロングレンジＰＣＲが核酸複製反応の範囲内に含まれる。
【０３４５】
核酸複製反応中で複製される核酸は、好ましくは、ＤＮＡであり、複製は、好ましくは、本明細書中に開示の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を含む。
【０３４６】
好ましい実施形態では、複製反応混合物は、両性イオン緩衝液（約ｐｋ７．０〜８．５の弱有機酸（例えば、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＡＰＳ、ＨＥＰＢＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＴＲＩＣＩＮＥ、ＰＯＰＳＯ、ＭＯＢＳ、ＴＡＰＳＯ、およびＴＥＳ）と約ｐｋ６．８〜８．５の弱有機塩基（例えば、トリス、ビス−トリス−プロバン、イミダゾール、ＴＭＮＯ、４−メチルイミダゾール、およびジエタノールアミン）との組み合わせを含む緩衝液を含み、緩衝液のｐＨを、約ｐＨ７．５〜８．９の有機塩基での滴定によって設定し、有機酸の濃度は、約１０〜４０ｍＭ、より好ましくは、約２０〜３０ｍＭである。
【０３４７】
特に好ましい実施形態では、複製反応混合物と改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼとの組み合わせは、以下の組み合わせから選択される：（ｉ）ＨＥＰＥＳ−ビス−トリス−プロパン（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）とテルムス属、好ましくはテルムス・サーモフィラス由来の改変ＤｎａＥにコードされるαサブユニットを含む改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼとの組み合わせ、および（ｉｉ）ＴＡＰＳ−Ｔｒｉｓ（２０ｍＭ、ｐＨ８．７）と、アクイフェックス属、好ましくは、アクイフェックス・エアロリカス由来の改変ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼとの組み合わせ。
【０３４８】
好ましい実施形態では、核酸複製反応混合物は、Ｚｎ2+、Ｍｇ2+、Ｋ+、およびＮＨ42+からなる群から選択される１つまたは複数のイオンを含み、これらのイオンは、反応混合物中の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼ活性を至適にするために含まれる。イオンを、好ましくは、予備アッセイで滴定して、反応混合物中での改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼの至適活性のための至適濃度を決定する。特に好ましい実施形態では、核酸複製反応混合物は、Ｃａ2+イオンを欠く。
【０３４９】
いくつかの好ましい実施形態では、核酸複製反応混合物は、カリウムイオンを含む。カリウムイオンを、好ましくは、最初に滴定して、使用される改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼのための至適濃度を決定する。一般に、複製反応混合物のＫ+濃度は、好ましくは、０と約１００ｍＭとの間、より好ましくは、約５〜２５ｍＭである。カリウムイオンを、好ましくは、ＫＣｌ、Ｋ2ＳＯ4、または酢酸カリウムの形態で準備する。Ｋ+と共に準備する特定の対陰イオンは、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼ活性に影響を与えることができ、対陰イオンが特定の複製反応のための特定の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼに最良に適合かどうかを判断するために予備アッセイを行うことが好ましい。一般に、硫酸または塩素対アニオンは、アクイフェックス・エアロリカス由来の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼと共に、好ましくは硫酸が塩素を超えて、使用されることが好ましい。また、カリウムイオンは、テルムス・サーモフィラス由来の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼとの複製反応混合物での使用に好ましくない。
【０３５０】
いくつかの好ましい実施形態では、核酸複製反応混合物は、アンモニウムイオンを含む。アンモニウムイオンを、好ましくは、最初に滴定して、使用される改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼのための至適濃度を決定する。一般に、複製反応混合物のＮＨ42+濃度は、好ましくは、０と約１５ｍＭとの間である。アンモニウムイオンを、好ましくは、硫酸アンモニウムの形態で準備する。アンモニウムイオンは、アクイフェックス・エアロリカス由来の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼとの複製反応混合物に含まれる。さらに、アンモニウムイオンは、テルムス・サーモフィラス由来の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼとの複製反応混合物での使用に好ましくない。
【０３５１】
いくつかの好ましい実施形態では、核酸複製反応混合物は、亜鉛イオンを含む。亜鉛イオンを、好ましくは、最初に滴定して、使用される改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼのための至適濃度を決定する。一般に、複製反応混合物のＺｎ2+濃度は、好ましくは、０と約５０ｍＭとの間、より好ましくは、約５〜１５μＭである。亜鉛イオンを、好ましくは、ＺｎＳＯ4、ＺｎＣｌ2、または酢酸亜鉛から選択される塩の形態で準備する。Ｚｎ2+と共に準備する特定の対陰イオンは、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼ活性に影響を与えることができ、対陰イオンが特定の複製反応のための特定の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼに最良に適合かどうかを判断するために予備アッセイを行うことが好ましい。一般に、塩化物または酢酸対イオンを、好ましくは、テルムス・サーモフィラス由来の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼとの複製反応混合物で使用し、硫酸対イオンを、好ましくは、アクイフェックス・エアロリカス由来の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼとの複製反応混合物で使用する。
【０３５２】
一般に、Ｚｎ2+は、多数のサブユニット（例えば、テルムス・サーモフィラス）の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が増加し得るので、配列決定反応混合物中での使用は好ましくない。任意の特定のＰｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に対するＺｎ2+の影響およびこれを使用した配列決定反応に対するその影響を、当該分野で周知の標準的なエキソヌクレアーゼアッセイアッセイを使用して評価することができる。
【０３５３】
いくつかの好ましい実施形態では、核酸複製反応混合物は、マグネシウムイオンを含む。マグネシウムイオンを、好ましくは、最初に滴定して、使用される改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼのための至適濃度を決定する。一般に、複製反応混合物のＭｇ2+濃度は、好ましくは、０と約１５ｍＭとの間、より好ましくは、約４〜１０ｍＭである。一般に、等温核酸複製反応（核酸配列決定反応が含まれる）は、好ましい濃度範囲の上限でのＭｇ2+濃度により適応する。マグネシウムイオンを、好ましくは、ＭｇＣｌ2、ＭｇＳＯ4、および酢酸マグネシウムから選択される塩の形態で準備する。Ｍｇ2+と共に準備する特定の対陰イオンは、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼ活性に影響を与えることができ、対イオンが特定の複製反応のための特定の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼに最良に適合かどうかを判断するために予備アッセイを行うことが好ましい。一般に、酢酸または塩化物対イオンを、好ましくは、テルムス・サーモフィラス由来の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼと使用するが、塩化物よりも酢酸塩が好ましい。さらに、硫酸対イオンを、好ましくは、アクイフェックス・エアロリカス由来の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼとの複製反応混合物で使用する。
【０３５４】
特に好ましい実施形態では、アクイフェックス・エアロリカス由来の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼと使用するための複製反応混合物は、ＴＡＰＳ−トリス（２０ｍＭ、ｐＨ８．７）、２５ｍＭ  Ｋ2ＳＯ4、１０ｍＭ  ＮＨ4（ＯＡｃ）2、および１０ｍＭ  ＭｇＳＯ4を含む。
【０３５５】
別の特に好ましい実施形態では、テルムス・サーモフィラス由来の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼと使用するための複製反応混合物は、ＨＥＰＥＳ−ビス−トリス−プロパン（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）、および１０ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）2を含む。
【０３５６】
１つの実施形態では、複製のための一本鎖核酸テンプレートを得るために必要な変性温度を低下させるために、複製反応物にヘリカーゼが含まれる。
【０３５７】
１つの実施形態では、本明細書中に提供する複製反応混合物は、ＡＴＰを欠く。
【０３５８】
１つの実施形態では、本明細書中に提供する複製反応混合物はＳＳＢを欠き、ここで、ＳＳＢは、複製反応混合物中に存在する場合、複製反応混合物中で使用した特定の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼのＤＮＡポリメラーゼ活性を減少させるであろう。好ましい実施形態では、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを含む複製反応混合物はＳＳＢを欠き、この改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、化膿性レンサ球菌ＰｏｌＣによってコードされるαサブユニットを含む。
【０３５９】
使用される改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼが好熱性細菌に由来する本明細書中の核酸複製反応では、反応混合物は、好ましくは、約ｐＨ７．２〜８．９である。いくつかの好ましい実施形態では、反応混合物のＺｎ2+濃度は、０と５０μＭとの間、より好ましくは約５〜１５μＭである。いくつかの好ましい実施形態では、反応混合物いくつかの好ましい実施形態では、複製反応混合物のＭｇ2+濃度は、０と約１５ｍＭとの間、より好ましくは、約４〜１０ｍＭである。複製反応混合物のＫ+濃度は、０と約１００ｍＭとの間、より好ましくは、約５〜２５ｍＭである。いくつかの好ましい実施形態では、ＮＨ42+濃度は、０と１２ｍＭとの間、より好ましくは、約５〜１２ｍＭである。いくつかの好ましい実施形態では、反応混合物は、その好ましい濃度範囲で、これらの陽イオンの混合物を有する。
【０３６０】
本明細書中の核酸複製反応では、プライマー伸長を行う温度は、好ましくは、約５５℃〜７２℃、より好ましくは約６０〜６８℃である。
【０３６１】
好ましい実施形態では、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長を行う温度は、好ましくは、約５５℃〜７２℃、より好ましくは約６０〜６８℃、より好ましくは、約６０〜６５℃であるが、至適温度を、プライマーの長さ、塩基含有量、テンプレートに対するプライマーの相補度、および当該分野で周知の他の要因によって決定される。
【０３６２】
好ましい実施形態では、サーモサイクリング増幅で変性を行う温度は、約８６℃〜９５℃、より好ましくは８７℃〜９３℃であり、本明細書中に開示のように、ＤＮＡ不安定化剤を含むサーモサイクリング増幅反応混合物と組み合わせて使用するには、温度範囲の下限の温度が好ましい。好ましいサーモサイクリング増幅方法には、約１０〜約１００サイクル、より好ましくは、約２５〜約５０サイクル、約８６℃〜９５℃、より好ましくは８７〜９３℃のピーク温度を含むポリメラーゼ連鎖反応が含まれるが、本明細書中に開示のように、ＤＮＡ不安定化剤を含むＰＣＲ反応混合物と組み合わせて使用するには、温度範囲の下限の温度が好ましい。
【０３６３】
核酸の増幅
１つの態様では、本発明は、本明細書中に開示の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを含む増幅反応混合物中の核酸分子を増幅反応に供する工程を含む、核酸分子を増幅する方法を提供する。好ましくは、本明細書中に記載の増幅反応管中で、増幅反応を行う。
【０３６４】
核酸分子を、任意の文献に記載の任意の手作業または自動化された増幅方法にしたがって増幅することができる。本明細書中で使用される場合、「増幅」は、所望のヌクレオチド配列のコピー数に増加させるための任意のｉｎ  ｖｉｔｒｏ法をいう。増幅される核酸は、好ましくは、ＤＮＡであり、増幅は、好ましくは、本明細書中に記載の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を含む。
【０３６５】
１つの実施形態では、核酸増幅により、ＤＮＡ分子またはプライマーにヌクレオチドが組み込まれ、それにより、核酸テンプレートに相補的な新規のＤＮＡ分子が形成される。形成されたＤＮＡ分子およびそのテンプレートをテンプレートとして使用して、さらなるＤＮＡ分子を合成することができる。本明細書中で使用される場合、１つの増幅反応は、多数のＤＮＡ複製ラウンドからなり得る。ＤＮＡ複製反応には、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）が含まれる。１つのＰＣＲ反応は、１０〜１００「サイクル」のＤＮＡ分子の変性および合成からなり得る。このような方法には、ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号（本明細書中で参考として援用される）に記載）、標準的な置換増幅（「ＳＤＡ」）（米国特許第５，４５５，１６６号（本明細書中で参考として援用される）に記載）、核酸配列ベースの増幅（「ＮＡＳＢＡ」）（米国特許第５，４０９，８１８号（本明細書中で参考として援用される）に記載）が含まれるが、これらに限定されない。例えば、低温でのＤＮＡ融解効率を高めるためにヘリカーゼでさえも使用することができるローリングサークル複製系によって増幅することができる（Ｙｕｚｈａｋｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８６：８７７−８８６（１９９６）およびＭｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１６５５８−１６５６５（１９８７）（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【０３６６】
好ましい実施形態では、サーモサイクリング増幅で変性を行う温度は、約８６℃〜９５℃、より好ましくは８７℃〜９３℃であり、本明細書中に開示のように、ＤＮＡ不安定化剤を含むサーモサイクリング増幅反応混合物と組み合わせて使用するには、温度範囲の下限の温度が好ましい。好ましいサーモサイクリング増幅方法には、約１０〜約１００サイクル、より好ましくは、約２５〜約５０サイクル、約８６℃〜９３℃、より好ましくは８７〜９３℃のピーク温度を含むポリメラーゼ連鎖反応が含まれるが、本明細書中に開示のように、ＤＮＡ不安定化剤を含むＰＣＲ反応混合物と組み合わせて使用するには、温度範囲の下限の温度が好ましい。特に好ましい実施形態では、熱安定性改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくは、テルムス属またはアクイフェックス属、好ましくは、テルムス・サーモフィラスまたはアクイフェックス・エアロリカスのｄｎａＥαサブユニットを含む。
【０３６７】
好ましい実施形態では、本明細書中により完全に記載および例示するように、１つまたは複数の高温変性工程を含む増幅反応で使用される増幅反応混合物は、さらに、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼの熱安定性に寄与する安定剤を含む。
【０３６８】
好ましい実施形態では、本明細書中に提供した増幅混合物はＳＳＢを欠き、ここで、ＳＳＢは、複製反応混合物中に存在する場合、複製反応混合物中で使用される特定の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼのＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害するであろう。
【０３６９】
好ましい実施形態では、適切な安定剤を含む改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを使用してＰＣＲ反応を行い、（ａ）ハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドプライマーを合成することができる標的配列の末端が十分に詳細に知られている場合、および（ｂ）少量の標的配列を鎖反応の開始に利用可能である場合、含まれる反応工程数に関して指数関数的な量で、少なくとも１つの標的核酸配列が産生される。鎖反応産物は、使用した特異的プライマーの末端に対応する末端を有する核酸二重鎖と異なる。
【０３７０】
所望の標的核酸配列を含むか含むと考えられる場合、精製形態または非精製形態の任意の核酸供給源を、出発核酸として使用することができる。したがって、本過程は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ（伝令ＲＮＡが含まれる）を使用することができ、ＤＮＡまたはＲＮＡは一本鎖または二本鎖であり得る。さらに、それぞれ各鎖を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを使用することができる。これらの核酸の任意の混合物も使用することができるか、同一または異なるプライマーを使用した以前の増幅反応から産生された核酸を使用することができる。増幅される核酸は、好ましくは、ＤＮＡである。増幅されるべき標的核酸配列は、より大きな分子の画分のみであり得るか、最初に個別の分子として存在することができ、それにより、標的配列は全核酸を構成する。増幅すべき標的配列が純粋な形態で存在する必要はなく、標的配列は、複雑な混合物の小さな画分（全ヒトＤＮＡ中に含まれるβ−グロブリン遺伝子の一部または生物が特定の生体サンプルの非常に小さな画分しか構成することができない特定の生物に起因する核酸配列の一部など）であり得る。出発核酸は、１つを超える所望の標的核酸配列を含むことができ、これは、同一であっても異なっていてもよい。したがって、本方法は、大量の１つの標的核酸配列の産生だけでなく、同一または異なる核酸分子上に存在する複数の標的核酸配列の同時増幅にも有用である。
【０３７１】
核酸を任意の供給源から得ることができ、供給源には、プラスミドおよびクローン化ＤＮＡまたはＲＮＡ、並びに任意の供給源（細菌、酵母、ウイルス、および高等生物（植物または動物など）が含まれる）由来のＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。ＤＮＡまたはＲＮＡを、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）ｐｐ  ２８０−２８１（１９８２）などに記載の種々の技術によって、例えば、血液もしくは他の流動物または組織材料（絨毛膜絨毛または羊膜細胞）から抽出することができる。
【０３７２】
任意の特異的（すなわち、標的）核酸配列を、本発明の方法によって産生することができる。標的配列の両末端の十分数の塩基を十分に詳細に知ることのみが必要であり、それにより、所望の配列の異なる鎖に、１つのプライマーから合成された伸長産物を、そのテンプレート（相補物）から分離された場合に、所定の長さの核酸への他のプライマーの伸長のためのテンプレートして使用することができるような配列に沿った相対的な位置でハイブリッド形成する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを調製することができる。配列の両末端の塩基についての知識が多いほど、標的核酸配列のためのプライマーの特異性が高くなり、それにより、過程の効率が高くなる。以後で使用されるワードプライマーは、特に、増幅すべきフラグメントの末端配列に関する情報がいくらか曖昧である場合、１つを超えるプライマーいうことができると理解される。例えば、核酸配列がタンパク質配列情報から推測される場合、遺伝コードの縮重に基づいて全ての可能なコドンの変動を示す配列を含むプライマー集団を各鎖のために使用することができる。この集団由来の１つのプライマーは、増幅すべき所望の配列の末端と相同であろう。
【０３７３】
いくつかの別の実施形態では、ランダムプライマー、好ましくは、六量体を使用して、テンプレート核酸分子を増幅することができる。このような実施形態では、増幅された正確な配列は、予め決定されない。
【０３７４】
さらに、１つのプライマーを使用した一方向増幅を行うことができることが当業者に認識される。
【０３７５】
オリゴヌクレオチドプライマーを、任意の適切な方法（例えば、ホスホトリエステル法およびホスホジエステル法またはその自動化実施形態）を使用して調製することができる。１つのこのような自動化実施形態では、出発物質としてジエチルホスホロアミダイトを使用し、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２：１８５９−１８６２（１９８１）（本明細書中で参考として援用される）に記載のように、合成することができる。修飾固体支持体上でのオリゴヌクレオチドの１つの合成方法は、米国特許第４，４５８，００６号（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。生物供給源（制限エンドヌクレアーゼ消化物など）から単離したプライマーを使用することも可能である。
【０３７６】
好ましいプライマーは、約１５〜１００塩基長、より好ましくは、約２０〜５０塩基長、最も好ましくは、約２０〜４０塩基長である。明白に、本明細書中で用いる好ましいプライマーは、Ｐｏｌ  Ｉポリメラーゼに好ましいプライマーより長い。
【０３７７】
標的核酸配列を、テンプレートとしてこの配列を含む核酸の使用によって増幅する。核酸が２つの鎖を含む場合、核酸の鎖を分離する必要があり、その後に、個別の工程としてかプライマー伸長産物の合成と同時にテンプレートして使用することができる。この鎖分離を、任意の適切な変性方法（物理的、化学的、または酵素的手段が含まれる）によって行うことができる。核酸鎖の１つの物理的分離方法は、完全に（９９％超）変性するまでの核酸の加熱を含む。典型的な熱変性は、約８０〜１０５℃、好ましくは、約９０℃〜約９８℃、さらにより好ましくは、９３℃〜９４℃の範囲の温度および約１〜１０分の範囲の時間を含み得る。ヘリカーゼ活性を有し、ＤＮＡを変性することが公知のヘリカーゼまたは酵素ＲｅｃＡとして公知の酵素クラス由来の酵素によって鎖分離を誘導することもできる。ヘリカーゼを使用した核酸鎖の分離に適切な反応条件は、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐｏｓｉａ  ｏｎ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．ＸＬＩＩＩ  "ＤＮＡ：Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ"（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９７８）に記載されており、ＲｅｃＡの使用技術は、Ｃ．Ｒａｄｄｉｎｇ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６：４０５−３７（１９８２）（本明細書中で参考として援用される）に概説されている。本発明で使用される好ましいヘリカーゼは、ｄｎａＢによってコードされる。
【０３７８】
増幅すべき配列を含む元の核酸は一本鎖であり、その相補物を、核酸へのオリゴヌクレオチドプライマーの添加によって合成する。適切な１つのプライマーを添加する場合、プライマー、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼ、および下記の４つのヌクレオチドの存在下でプライマー伸長産物が合成される。産物は、一本鎖核酸と部分的に相補的であり、核酸鎖とハイブリッド形成して長さが異なる鎖を形成し、次いで、上記のような一本鎖に分離して、２つの１つの分離相補鎖が産生される。
【０３７９】
元の核酸が増幅すべき配列を構成する場合、産生されたプライマー伸長産物は元の核酸鎖と完全に相補的であり、ハイブリッド形成して同一の長さの二本鎖を形成し、一本鎖分子に分離される。
【０３８０】
核酸の相補鎖を分離する場合、核酸が最初に二本鎖または一本鎖であることにかかわりなく、鎖を、さらなる核酸鎖の合成のためのテンプレートとして鎖が使用される状態にある。任意の適切な方法を使用して、この合成を行うことができる。一般に、合成は、緩衝液中で起こる。いくつかの好ましい実施形態では、緩衝液は、約ｐＨ８．５〜８．９であり、ＰｏｌＩ酵素の好ましいｐＨ範囲と明らかに異なる。好ましくは、モル過剰の（クローン化核酸については、通常、約１０００：１＝プライマー：テンプレート、ゲノム核酸については、通常、約１０6：１＝プライマー：テンプレート）２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、分離したテンプレート鎖を含む緩衝液に添加する。しかし、本明細書中の過程を診断のために使用する場合、相補鎖の量を知ることができないので、相補鎖の量に対するプライマーの量を確実に決定することができないと理解される。しかし、実用上の問題として、プライマーの添加量は、一般に、増幅すべき配列が複雑な長鎖核酸鎖の混合物中に含まれる場合、相補鎖（テンプレート）を超えるモル量であろう。過程の効率を改善するために、高いモル過剰量が好ましい。
【０３８１】
ヌクレオシド三リン酸、好ましくは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、および／またはｄＵＴＰも、適量で合成混合物に添加する。
【０３８２】
新規に合成した鎖およびその相補核酸鎖が二本鎖分子を形成し、これを、過程の次の工程で使用する。次の工程では、二本鎖分子の鎖を、上記の任意の手順を使用して分離し、一本鎖分子が得られる。
【０３８３】
新規の核酸を、一本鎖分子上に合成する。必要に応じて上記の条件下で反応を進行させるために、さらなるポリメラーゼ、ヌクレオチド、およびプライマーを添加することができる。また、オリゴヌクレオチドプライマーの一方の末端で合成を開始させ、テンプレートの一本鎖に沿って合成を進行させて、さらなる核酸を産生する。
【０３８４】
鎖の分離工程および伸長産物の合成工程を、必要な数だけ反復して、所望の量の特定の核酸配列を産生することができる。特定の核酸配列の産生量は、指数関数的様式で増加する。
【０３８５】
第１の核酸または核酸の混合物から１つを超える特定の核酸配列を産生することが望ましい場合、適切な数の異なるオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。例えば、２つの異なる特定の核酸配列を産生すべきである場合、４つのプライマーを使用する。プライマーのうちの２つは、一方の特定の核酸配列に特異的であり、他方の２つのプライマーは、第２の特定の核酸配列に特異的である。この様式では、それぞれ２つの異なる特定の配列を、この過程によって指数関数的に産生することができる。勿論、異なるテンプレート核酸配列の末端配列が同一である場合、プライマー配列は、互いに同一であり、テンプレート末端配列に相補的であろう。
【０３８６】
さらに、上記のように、別の実施形態では、ランダムプライマー、好ましくは、六量体を使用して、テンプレート核酸分子を増幅する。
【０３８７】
さらに、１つのプライマーを使用した一方向増幅を行うことができる。
【０３８８】
本発明を、各段階後に新規の試薬を添加する段階的様式か、最初の工程で全試薬を添加する同時か、所与の工程数の後に新たな試薬を添加する一部段階的および一部同時様式で行うことができる。必要に応じて、さらなる材料（例えば、安定剤）を添加することができる。適切な時間をおいて所望の量の特定の核酸配列を産生した後、任意の公知の様式での酵素の不活化または反応からの酵素の分離によって反応を停止させることができる。
【０３８９】
したがって、本発明の核酸分子の増幅では、核酸分子を、好ましくは、安定剤と共に適切な増幅反応混合物中に熱安定性改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを含む組成物と接触させる。
【０３９０】
１つの実施形態では、本発明は、一般に「ロングレンジＰＣＲ」と呼ばれる技術によって、巨大核酸分子を増幅する方法を提供する（Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：２２１６−２２２０（１９９４）（"Ｂａｒｎｅｓ"）；Ｃｈｅｎｇ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：５６９５−５６９９（１９９４）（本明細書中で参考として援用される））。約５〜６キロベースを超える核酸分子の増幅に有用な１つの方法では、標的核酸分子が接触する組成物は、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを含むだけでなく、約０．０００２〜２００単位／ミリリットル、好ましくは、約０．００２〜１００単位／ｍＬ、より好ましくは、約０．０２〜２０単位／ｍＬ、さらにより好ましくは、約０．００２〜２．０単位／ｍＬ、最も好ましくは、約０．４０単位／ｍＬの濃度で３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（「エキソ＋」ポリメラーゼ）を示す低濃度の第２のＤＮＡポリメラーゼ（好ましくは、熱安定性修復型ポリメラーゼまたはｐｏｌＣαサブユニット）を含む。本発明での使用に好ましいエキソ＋ポリメラーゼは、サーモトガ・マリチマＰｏｌＣ、Ｐｆｕ／ＤＥＥＰＶＥＮＴ、ｍたはＴｌｉ／ＮＥＮＴ（商標）（Ｂａｒｎｅｓに付与された米国特許第５，４３６，１４９号（本明細書中で参考として援用される））、サーモトガ属由来の熱安定性ポリメラーゼ（Ｔｍａ  Ｐｏｌ  Ｉなど）（米国特許第５，５１２，４６２号（本明細書中で参考として援用される）、ならびにサーモトガ・ネアポリタナから単離された一定の熱安定性ポリメラーゼおよびその変異体（Ｔｎｅ（３’ｅｘｏ+）など）である。テルムス・サーモフィラスのＰｏｌＣ産物も好ましい。本発明の方法での第２のポリメラーゼと組み合わせた改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼの使用により、少なくとも３５〜１００キロベース長のＤＮＡ配列を高濃度に増幅して、信頼性を有意に改善することができる。
【０３９１】
ロングレンジＰＣＲの考察については、例えば、Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００２；１８７：５１−５（特に、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０３９２】
好ましくは、本発明の増幅方法は、２つの改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを有する安定剤の使用を含む。安定剤を、好ましくは、増幅反応混合物中に含め、それにより、これらの反応混合物中の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼの熱安定性が増加する。
【０３９３】
本発明の増幅反応混合物は、２５％までの共溶媒（反応混合物に添加される全共溶媒量）、５％までの凝集剤（ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（反応混合物に添加される全凝集剤量）、および２Ｍまでの酸化物（反応混合物に添加される全酸化物量）を含み得る。
【０３９４】
特に好ましい実施形態では、アクイフェックス・エアロリカス由来の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼと使用するための増幅反応混合物は、ＴＡＰＳ−トリス（２０ｍＭ、ｐＨ８．７）、２５ｍＭ  Ｋ2ＳＯ4、１０ｍＭ  ＮＨ4（ＯＡｃ）2、１５μｍｏｌ  ＺｎＳＯ4、および４ｍＭ  ＭｇＳＯ4を含む。
【０３９５】
別の特に好ましい実施形態では、テルムス・サーモフィラス由来の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼと使用するための増幅反応混合物は、ＨＥＰＥＳ−ビス−トリス−プロパン（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）、０．５μｍｏｌ  ＺｎＣｌ2、および６ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）2を含む。
【０３９６】
１つの実施形態では、１つまたは複数の高温変性工程を８９℃未満で行う場合、サーモサイクリング増幅法は、サーモサイクリング増幅反応混合物中でのヘリカーゼの使用を含み、好ましくは、ヘリカーゼは、細菌ｄｎａＢ遺伝子によってコードされる。ヘリカーゼを、好ましくは、８９℃またはそれを超える温度での１つまたは複数の変性工程を含むサーモサイクリング増幅法で使用しない。
【０３９７】
１つの実施形態では、本明細書中の核酸複製方法は、ＡＴＰを欠く核酸複製混合物の使用を含む。
【０３９８】
１つの実施形態では、本明細書中の核酸複製方法は、ＳＳＢを欠く核酸複製混合物の使用を含み、ここで、ＳＳＢは、複製反応混合物中に存在する場合、複製反応混合物中で使用される特定の最小機能性改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼのＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害するであろう。
【０３９９】
核酸の配列決定
１つの態様では、本発明は、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを含む配列決定反応混合物中の核酸分子を配列決定反応に供する工程を含む、核酸分子、好ましくは、ＤＮＡを配列決定する方法を提供する。
【０４００】
好ましくは、使用される改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、配列決定反応混合物中に、３’末端ジデオキシヌクレオチドを除去することができる３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。
【０４０１】
したがって、ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットを含む改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、一般に、その高レベルの亜鉛依存性３’−５’エキソヌクレアーゼ活性のために配列決定反応での使用は好ましくない。
【０４０２】
好ましい実施形態では、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくは、テルムス属またはアクイフェックス属、好ましくは、テルムス・サーモフィラスまたはアクイフェックス・エアロリカスのＤｎａＥαサブユニットを含む。
【０４０３】
明らかに、本発明で使用されるｄｎａＥαサブユニットの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、一般に、３’末端ジデオキシヌクレオチドを除去することができる一方で、εサブユニットの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、一般に、このような末端ジデオキシヌクレオチドを除去することができない。したがって、配列決定反応混合物中のεサブユニットによって付与される３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、一般に、本明細書中の配列決定反応で有用である。さらに、望ましくないｄｎａＥαサブユニット３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を、好ましくは、化学的手段（すなわち、緩衝液の条件、より詳細には、Ｚｎ2+濃度およびｐＨ）によって減少させるか、完全に阻害する。
【０４０４】
明らかに、グラム陽性細菌由来のＤｎａＥは、３’末端ジデオキシヌクレオチドを除去することができる３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠き、それにより、グラム陽性ＤｎａＥが配列決定法での使用に特に望ましくなる。
【０４０５】
核酸分子を、任意の文献に記載の手作業または自動化された配列決定方法によって配列決定することができる。このような方法には、以下が含まれるが、これらに限定されない：ジデオキシ配列決定法（「サンガー配列決定」；Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９４：４４４−４４８（１９７５）；Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３−５４６７（１９７７）；米国特許第４，９６２，０２２号および同第５，４９８，５２３号（本明細書中で参考として援用される）ならびにＰＣＲベースの方法およびより複雑なＰＣＲベースの核酸フィンガープリンティング技術（ランダム増幅多形ＤＮＡ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ）（「ＲＡＰＤ」）分析（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ｇ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８（２２）：６５３１−６５３５，（１９９０）（本明細書中で参考として援用される））、任意プライミングＰＣＲ（Ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ  Ｐｒｉｍｅｄ  ＰＣＲ）（「ＡＰ−ＰＣＲ」）（Ｗｅｌｓｈ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８（２４）：７２１３−７２１８，（１９９０）（本明細書中で参考として援用される））、ＤＮＡ増幅フィンガープリンティング（ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ）（「ＤＡＦ」）（Ｃａｅｔａｎｏ−Ａｎｏｌｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：５５３−５５７，（１９９１）（本明細書中で参考として援用される））、マイクロサテライトＰＣＲまたはマイクロサテライト−領域ＤＮＡの有向増幅（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｎｉｓａｔｅｌｌｉｔｅ−ｒｅｇｉｏｎ  ＤＮＡ）（「ＤＡＭＤ」）（Ｈｅａｔｈ，Ｄ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１（２４）：５７８２−５７８５，（１９９３）（本明細書中で参考として援用される））、および増幅フラグメント長多型（「ＡＦＬＰ」）分析（Ｖｏｓ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３（２１）：４４０７−４４１４（１９９５）；Ｌｉｎ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＯＣＵＳ，１７（２）：６６−７０，（１９９５）（本明細書中で参考として援用される））など）。
【０４０６】
一旦配列決定すべき核酸分子が配列決定反応混合物中の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼと接触すると、上記開示のプロトコールまたは当該分野で公知の他のプロトコールにしたがって配列決定反応を進行させることができる。
【０４０７】
特に好ましい実施形態では、アクイフェックス・エアロリカス由来の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼと使用するための配列決定反応混合物は、ＴＡＰＳ−トリス（２０ｍＭ、ｐＨ８．７）、２５ｍＭ  Ｋ2ＳＯ4、１０ｍＭ  ＮＨ4（ＯＡｃ）2、および１０ｍＭ  ＭｇＳＯ4を含む。好ましくは、αサブユニットの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を制限するために、反応混合物は、亜鉛を欠く。
【０４０８】
別の特に好ましい実施形態では、テルムス・サーモフィラス由来の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼと使用するための配列決定反応混合物は、ＨＥＰＥＳ−ビス−トリス−プロパン（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）および１０ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）2を含む。好ましくは、αサブユニットの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を制限するために、反応混合物は、亜鉛を欠く。
【０４０９】
１つの態様では、本発明は、１つの均一反応混合物中のＤＮＡ分子を同時に配列決定および増幅する方法であって、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼおよび熱安定性Ｉ型単一サブユニット修復ＤＮＡポリメラーゼを含む配列決定／増幅反応混合物中のＤＮＡ分子を配列決定／増幅反応に供する工程を含む、方法を提供する。
【０４１０】
好ましい実施形態では、１つまたは複数の高温変性工程を含む同時配列決定／増幅反応のために使用される配列決定／増幅反応混合物は、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼによって配列決定テンプレートの増幅を駆動するための２つのＲＮＡプライマー（順方向および逆方向）および修復型ＤＮＡポリメラーゼによって配列決定反応を駆動するための１つのＤＮＡプライマーを含む。修復型ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは、保存されたフェニルアラニン残基がチロシン残基に置換された変異モチーフＢ配列を有する。改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、ＲＮＡプライミングテンプレートの優先度が増加しており、好ましくは、モチーフＢ中に１つまたは複数の変異を含む。１つの実施形態では、混合物は、さらに、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼの熱安定性に寄与する安定剤を含む。
【０４１１】
別の実施形態では、プライマー伸長産物にｄｄＮＴＰを組み込む能力が増加した第２の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼを、同時配列決定／増幅反応中で修復型ＤＮＡポリメラーゼの代わりに使用する。第２の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくは、モチーフＢ中に１つまたは複数の変異を含む。好ましい実施形態では、改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼは、ＤＮＡプライミングテンプレートの優先度が増加した。
【０４１２】
別の実施形態では、増幅および配列決定反応は同時ではない。この実施形態では、ＲＮＡプライマーおよびＤＮＡプライマーならびに／または改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼおよび修復型ＤＮＡポリメラーゼ（または第２の改変Ｐｏｌ  ＩＩＩレプリカーゼ）を、同一の反応混合物に連続的に添加する。
【０４１３】
キット
他の好ましい実施形態では、本発明は、本明細書中に開示の２成分ポリメラーゼを使用した核酸の増幅または配列決定で使用されるキットを提供する。
【０４１４】
本発明の核酸増幅キットは、２成分ポリメラーゼおよびｄＮＴＰを含む本発明のこの態様に含まれる複製キットは、さらに、標準的な核酸増幅プロトコールの実施に必要なさらなる試薬および化合物を含み得る（ＰＣＲによるＤＮＡ増幅方法に関する米国特許第４，６８３，１９５号および同第４４，６８３，２０２号を参照のこと）。
【０４１５】
同様に、本発明の核酸配列決定キットは、２成分ポリメラーゼおよびジデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む。配列決定キットは、さらに、標準的な核酸配列決定プロトコールの実施に必要なさらなる試薬および化合物（ピロホスファターゼ、配列決定ゲルの処方のためのアガロースまたはポリアクリルアミドゲル媒質、および配列決定された核酸の検出に必要な他の成分など）を含み得る（ＤＮＡ配列決定法に関する米国特許第４，９６２，０２０号および同第５，４９８，５２３号を参照のこと）。
【０４１６】
好ましい実施形態では、キットは、緩衝液および安定剤、または安定剤を有する緩衝液を含む。
【０４１７】
１つの実施形態では、キットはＡＴＰを欠き、ＡＴＰは、キットから得られる増幅反応や配列決定反応で使用されない。
【０４１８】
さらに好ましい実施形態では、本発明の増幅および配列決定キットは、さらに、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する第２のＤＮＡポリメラーゼを含み得る。Ｐｆｕ／ＤＥＥＰＶＥＮＴ、ＴｌｉＮＥＮＴ（商標）、Ｔｍａ、Ｔｎｅ（３’エキソ＋）、ならびにその変異体および誘導体が好ましい。テルムス・サーモフィラスのＰｏｌＣ産物も好ましい。
【０４１９】
安定剤
好ましくは、少なくとも２つ、より好ましくは、少なくとも３つの安定剤の組み合わせを、サーモサイクリング増幅反応混合物に含める。好ましい実施形態では、安定剤は、少なくとも１つの共溶媒（ポリオール（例えば、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、マルチトール）など）、少なくとも１つの凝集剤（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、フィコール、ポリビニルアルコール、またはポリプロピレングリコールなど）、糖、有機第四級アミン（ベタインなど）、ならびにその窒素酸化物および界面活性剤から選択される第３の成分を含む。特に好ましい実施形態では、安定剤には、共溶媒、凝集剤、および第四級アミンの窒素酸化物（トリメチルアミン−Ｎ−オキシド（ＴＭＮＯ）またはモルホリノ−Ｎ−オキシドなど）が含まれる。さらに好ましい実施形態では、反応混合物は、さらに、第４の安定剤、最も好ましくは、第２のポリオールを含む。他の好ましい第４の安定剤の組み合わせには、３つの異なる共溶媒および第四級アミンの窒素酸化物が含まれる。
【０４２０】
高温変性工程を使用した核酸複製反応は、反応混合物中の１つまたは複数の安定剤の封入によって利益を得ることができる。本発明で好ましい安定剤には、典型的には、１つまたは複数の酸化物、糖、界面活性剤、ベタイン、および／または糖と共に、共溶媒（ポリオール）および凝集剤（ポリエチレングリコール）を含む。上記成分の組み合わせが最も好ましい。
【０４２１】
本明細書中で使用される場合、「高分子凝集剤」または「凝集剤」は、タンパク質凝集を少なくとも一部模倣する高分子をいう。本発明で使用される例示的凝集剤には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＶＰ、フィコール、およびプロピレングリコールが含まれる。
【０４２２】
本明細書中で使用される場合、「界面活性剤」は、水の表面張力を低下させる任意の物質をいい、陰イオン性、陽イオン性、非イオン性、および両性イオン性の界面活性剤が含まれるが、これらに限定されない。本発明で使用される例示的界面活性剤には、Ｔｗｅｅｎ２０、ＮＰ−４０、およびＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１０が含まれる。
【０４２３】
本明細書中で使用される場合、「ポリオール」は、多価アルコール（すなわち、３つまたはそれを超える水酸基を含むアルコール）をいう。３つの水酸基（３価）を有するポリオールはグリセロールであり、３つを超えるポリオールは糖アルコールと呼ばれ、一般式はＣＨ2ＯＨ（ＣＨＯＨ）nＣＨ2ＯＨ（式中、ｎは、２〜５であり得る）である。
【０４２４】
【表１０】
2008526215.tif 000014
【０４２５】
【表１１】
2008526215.tif 000015
【０４２６】
本発明の実施形態は、一般に、温度ベースの核酸増幅を容易にするために、群Ｉ〜ＶＩＩ（表２を参照のこと）から選択される少なくとも２つ、より好ましくは、少なくとも３つの異なる安定剤の組み合わせを含む。本発明の好ましい実施形態は、増幅反応混合物内での群ＩＩ由来の少なくとも１つのメンバーと群ＩＩＩ由来のメンバーとの組み合わせを含む。特に、群ＩＩ由来のメンバーは、グリセロールおよび／またはソルビトールである。特に好ましい組み合わせには、群ＩＩＩ由来の１つのメンバーおよび群ＶＩ由来の１つのメンバーと組み合わせた群ＩＩの２つの異なるメンバーが含まれる。
【０４２７】
診断方法
１つの態様では、本発明は、細菌の存在を検出するための組成物および方法を提供する。本方法は、宿主由来のサンプルを、細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩ酵素の存在について分析する工程を含む。レプリカーゼが細菌の生存度に極めて重要であるので、Ｐｏｌ  ＩＩＩαサブユニットは、生存細菌の存在を示す極めて有用な診断マーカーである。
【０４２８】
１つの態様では、本発明は、宿主中の生存細胞の存在を検出するための組成物および方法を提供する。好ましい実施形態では、方法は、宿主由来のサンプルを、細菌Ｐｏｌ  ＩＩＩ酵素をコードするＲＮＡ転写物の存在について分析する工程を含む。
【０４２９】
宿主サンプルは、例えば、細菌感染が疑われる宿主由来の流動物サンプルであり得る。
【０４３０】
いくつかの実施形態では、本方法は、細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩ酵素を検出するためのＰＣＲの使用を含む。１つの実施形態では、本方法は、細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩモチーフＣをコードするヌクレオチド配列とハイブリッド形成する第１のＰＣＲプライマーおよび細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩモチーフＢをコードするヌクレオチド配列の相補物とハイブリッド形成する第２のＰＣＲプライマーを含む。２つのプライマーを使用してＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を、細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩモチーフＡをコードするヌクレオチド配列またはその相補物とハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドプローブを使用して探索する。１つの実施形態では、ＰＣＲ産物を、細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩモチーフＡをコードするヌクレオチド配列またはその相補物とハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドプローブを含むマイクロアレイと組み合わせる。１つの実施形態では、本方法は、さらに、ＰＣＲ産物由来の細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩモチーフＣ、Ａ、およびＢのスペーシングを決定する工程を含む。このようなプライマーを使用したＰＣＲ産物の形成により、ここで、この産物が内部細菌ＤＮＡＰｏｌＩＩＩモチーフＡを含むと判断され、細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩ酵素の存在および宿主中の細菌の存在が証明される。１つの実施形態では、方法は、ＰＣＲ産物由来の細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩモチーフＣ、Ａ、およびＢのスペーシングを決定する工程を含む。
【０４３１】
薬物のスクリーニング
１つの態様では、本発明は、細菌ＤＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩ酵素の活性を調整し、好ましくは阻害する能力について、候補生体活性因子をスクリーニングするための組成物および方法を提供する。本明細書中に記載のスクリーニング法によって得られた候補生体活性因子は、細菌が感染した患者の治療で使用される。
【０４３２】
好ましい実施形態では、本方法は、本明細書中に記載の分類方法によって同定された細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩ酵素への候補生体活性因子の結合をスクリーニングする工程を含む。
【０４３３】
別の好ましい実施形態では、本方法は、細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩ酵素由来の１つまたは複数の細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩモチーフＣ、Ａ、およびＢへの候補生体活性因子の結合をスクリーニングする工程を含む。好ましい実施形態では、本方法は、候補生体活性因子を使用した結合アッセイにおける１つまたは複数の細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩモチーフＣ、Ａ、およびＢを含む細菌ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩ酵素のフラグメントの使用を含む。好ましい実施形態では、本方法は、さらに、１つまたは複数のヒトレプリカーゼモチーフＡ、Ｂ、およびＣに結合する能力が無いことについて候補生体活性因子をスクリーニングする工程を含む。好ましくは、１つまたは複数のヒトレプリカーゼモチーフＡ、Ｂ、およびＣを含むヒトレプリカーゼのフラグメントを使用する。
【０４３４】
本明細書中で使用される場合、用語「候補生体活性因子」は、任意の分子（例えば、タンパク質、小有機分子、炭水化物（ポリサッカリドが含まれる）、ポリヌクレオチド、脂質など）を説明する。一般に、複数のアッセイ混合物を異なる因子と並行して反応させて、種々の濃度に対する差分応答を得る。典型的には、これらの濃度のうちの１つはネガティブコントロール（すなわち、ゼロ濃度または検出レベル未満）としての機能を果たす。
【０４３５】
候補因子は、多数の化学クラスを含むが、典型的には、候補因子は有機分子であり、好ましくは、分子量が、１００を超え且つ約２，５００未満、より好ましくは、１００ダルトンと２０００ダルトンとの間、より好ましくは、約１００ダルトンと約１２５０ダルトンとの間、より好ましくは、約１００ダルトンと約１０００ダルトンとの間、より好ましくは、約１００ダルトンと約７５０ダルトンとの間、より好ましくは、約２００ダルトンと約５００ダルトンとの間である小有機化合物である。候補因子は、タンパク質との構造的相互作用に必要な官能基を含み、典型的には、少なくとも１つのアミン基、カルボニル基、水酸基、またはカルボキシル基、好ましくは、少なくとも２つの化学官能基が含まれる。候補因子は、しばしば、１つまたは複数の上記官能基と置換された炭素環式構造または複素環式構造および／または芳香族構造もしくは多環芳香族構造を含む。候補因子はまた、生体分子（ペプチド、サッカリド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、その誘導体、構造アナログ、または組み合わせ）で見出される。
【０４３６】
候補因子は、広範な種々の供給源（合成または天然化合物のライブラリーが含まれる）から得られる。例えば、広範な種々の化合物生体分子の無作為および有向性の合成（無作為化オリゴヌクレオチドの発現が含まれる）に多数の手段が利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物、および動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが利用可能であり、容易に産生される。さらに、天然または合成によって産生されたライブラリーおよび化合物を、従来の化学的、物理的、および生化学的な手段によって容易に修飾される。公知の薬理学的因子を、直接または無作為な化学修飾（アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化など）に供して、構造アナログを産生することができる。
【０４３７】
好ましい実施形態では、候補生体活性因子は、有機化学部分または小分子化学成分であり、広範な種々のこれらを文献から利用可能である。
【０４３８】
「ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩαサブユニット」という名称の２００４年４月７日に出願された仮出願番号６０／５６０，７９３号は、明確に、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０４３９】
本明細書中の引例は、明確に、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【実施例１】
【０４４０】
実施例
実施例１：Ｔ．ｔｈαサブユニットおよびＴｔｈ  ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩホロ酵素によるプライマー発現
（図Ｘ）テルムス・サーモフィラス（Ｔ．ｔｈ）αサブユニットを、経時プライマー伸長アッセイで使用して、独立型ポリメラーゼとしてのその伸長速度を最小Ｔ．ｔｈ  ＤＮＡＰｏｌＩＩＩホロ酵素の伸長速度と比較した。１９．６μｌの反応混合物中に、３．７５ｐｍｏｌの３０量体オリゴデオキシヌクレオチドプライマーでプライミングした３５０ｎｇ（０．１５ｐｍｏｌ）のｓｓＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡを、２０ｍＭ  ＴＡＰＳ−トリス（ｐＨ７．５）、８ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）2、１４％グリセロール、４０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、および４０ｍＭソルビトール中、２μｇ（１５ｐｍｏｌ）のＴ．ｔｈαサブユニットの存在下にて６０℃で２分間インキュベートした。プライマー伸長／複製を、１０ｍＭ  ｄＡＴＰ、１０ｍＭ  ｄＧＴＰ、１０ｍＭ  ｄＴＴＰ、および１０ｍＭ  ｄＣＴＰ（それぞれの最終濃度が２００μｍｏｌになるまで）を含む０．４μｌのｄＮＴＰ混合物の添加によって開始した。プライマー伸長アッセイの表示の測定点で、２μｌの０．１Ｍ  ＥＤＴＡの添加およびその氷上への移動によって各反応を停止させた。複製産物を、０．７％  ＴＥＡＥ緩衝化アガロースゲルにおける電気泳動による分離およびその後の臭化エチジウム染色によって分析した。矢印は、全サイズ（７．２ｋｂ）の二本鎖複製産物が検出可能な最初の測定点を示す。αサブユニットのみで、２４０ｂ／秒の最大伸長速度でＤＮＡプライミング７．２ｋｂ  Ｍ１３テンプレートを複製することができる。これは、等価な条件下でのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（３０〜４０ｂ／秒）の伸長速度の約６〜８倍である。クランプローダーおよび進歩性クランプを有する最小ホロ酵素の伸長速度は、αのみの複製速度より約３倍速い（７２５ｂ／秒）。
【実施例２】
【０４４１】
実施例２：Ｔ．ｍａαサブユニット（ＰｏｌＣ）によるプライマー伸長
（図Ｘ）サーモトガ・マリチマ（「Ｔ．ｍａ」）αサブユニットを、経時プライマー伸長アッセイで使用して、独立型ポリメラーゼとしてのその伸長速度を試験した。１９．６μｌの反応混合物中に、０．３７５ｐｍｏｌの３０量体オリゴデオキシヌクレオチドプライマーでプライミングした３５０ｎｇ（０．１５ｐｍｏｌ）のｓｓＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡを、２０ｍＭ  ＴＡＰＳ−トリス（ｐＨ７．５）、２５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、８ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）2、１４％グリセロール、４０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、および４０ｍＭソルビトール中、１００ｎｇ（０．６４ｐｍｏｌ）のＴｍａ  ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニット（ｐｏｌＣ）の存在下にて６０℃で２分間インキュベートした。プライマー伸長／複製を、１０ｍＭ  ｄＡＴＰ、１０ｍＭ  ｄＧＴＰ、１０ｍＭ  ｄＴＴＰ、および１０ｍＭ  ｄＣＴＰ（それぞれの最終濃度が２００μｍｏｌになるまで）を含む０．４μｌのｄＮＴＰ混合物の添加によって開始した。プライマー伸長アッセイの表示の測定点で、２μｌの０．１Ｍ  ＥＤＴＡの添加およびその氷上への移動によって各反応を停止させた。複製産物を、０．７％  ＴＥＡＥ緩衝化アガロースゲルにおける電気泳動による分離およびその後の臭化エチジウム染色によって分析した。矢印は、全サイズ（７．２ｋｂ）の二本鎖複製産物が検出可能な最初の測定点を示す。Ｔ．ｍａαサブユニット（ｐｏｌＣ）は、７２０ｂ／秒の最大伸長速度で７．２ｋｂ  Ｍ１３テンプレートを複製した。
【実施例３】
【０４４２】
実施例３：デオキシリボヌクレオチド／リボヌクレオチドプライマーの識別
経時プライマー伸長アッセイでαサブユニット中の１つまたは複数のモチーフ中のアミノ酸が置換されたテルムス・サーモフィラスを、非変異テルムス・サーモフィラスと比較して、ＤＮＡプライマーとＲＮＡプライマーとを区別する能力を決定する。１９．６μｌの反応混合物中に、０．３７５ｐｍｏｌの３０量体プライマー（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）でプライミングした３５０ｎｇ（０．１５ｐｍｏｌ）のｓｓＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡを、２０ｍＭ  ＴＡＰＳ−トリス（ｐＨ７．５）、２５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、８ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）2、１４％グリセロール、４０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、および４０ｍＭソルビトール中、１００ｎｇ（０．６４ｐｍｏｌ）の変異または非変異Ｔｔｈ  ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットの存在下にて６０℃で２分間インキュベートする。プライマー伸長／複製を、１０ｍＭ  ｄＡＴＰ、１０ｍＭ  ｄＧＴＰ、１０ｍＭ  ｄＴＴＰ、および１０ｍＭ  ｄＣＴＰ（それぞれの最終濃度が２００μｍｏｌになるまで）を含む０．４μｌのｄＮＴＰ混合物の添加によって開始する。プライマー伸長アッセイの表示の測定点で、２μｌの０．１Ｍ  ＥＤＴＡの添加およびその氷上への移動によって各反応を停止させた。複製産物を、０．７％  ＴＥＡＥ緩衝化アガロースゲルにおける電気泳動による分離およびその後の臭化エチジウム染色によって分析する。各プライマー型について非変異Ｔｔｈ  ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットの伸長比を変異Ｔｔｈ  ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットの伸長比で割ることによって伸長時間の比を得た。比１は、変異Ｔｔｈおよび非変異Ｔｔｈは等しい効率で特定のプライマー型を使用することができることを示す。１より高い比は、Ｔｔｈ変異体が非変異Ｔｔｈよりも低い効率で特定の型を使用することを示す。１より低い比は、Ｔｔｈ変異体が非変異Ｔｔｈよりも高い効率で特定の型を使用することを示す。
【実施例４】
【０４４３】
実施例４：ジデオキシリボヌクレオチドの組み込み
以下のアッセイを使用して、プレプライミングヌクレオチド基質にジデオキシリボヌクレオチドを組み込む能力についてＤｎａＥ変異体およびＰｏｌＣ変異体を評価する。以下の部分的に二本鎖の基質を、アッセイのために準備する。
５’−ＸＸＸＡＣＧ
３’−ＸＸＸＴＧＣＧＴＡＣＴＣＣＴＡＴＣＡＴＣＴ
【０４４４】
プレプライミングヌクレオチド基質を、緩衝液（上記）、ＤｎａＥまたはＰｏｌＣ、デオキシリボヌクレオチド、およびＦＡＭ標識ジデオキシリボヌクレオチド（ｄｄＣＴＰ）を含む反応混合物に添加する。混合物を、６０〜７０℃で５分間インキュベートする。反応完了後、ＥＤＴＡの添加によって反応を停止させることができる。反応混合物を精製して、任意の残存標識および非標識ヌクレオチドを除去する。次いで、反応混合物を、マイクロタイタープレートに入れ、任意の組み込まれた蛍光を、標準的な分光光度計によって読む。非標識ブランクまたは標準を基準として使用して、５００〜５４０ｎｍ下で収集した蛍光の読み取り値と比較する。ｄｄＮＴＰＳを組み込むことができる任意のＤｎａＥ変異体またはＰｏｌＣ変異体から、標準またはブランクよりも高い蛍光が読み取られる。
【実施例５】
【０４４５】
実施例５：標識（巨大）ヌクレオチド組み込み／伸長
以下のアッセイを使用して、プレプライミングヌクレオチド基質にジデオキシリボヌクレオチドを組み込む能力についてＤｎａＥ変異体およびＰｏｌＣ変異体を評価する。以下の部分的に二本鎖の基質を、アッセイのために準備する。
５’−ＸＸＸＡＣＧ
３’−ＸＸＸＴＧＣＧＴＡＣＴＣＣＴＡＴＣＡＴＣＴ
【０４４６】
プレプライミングヌクレオチド基質を、緩衝液（上記）、ＤｎａＥまたはＰｏｌＣ、ｄＮＴＰ、ＦＡＭ標識ｄＣＴＰ、およびＰ32標識ｄＴＴＰを含む反応混合物に添加する。混合物を、６０〜７０℃で５分間インキュベートする。反応完了後、ＥＤＴＡの添加によって反応を停止させることができる。反応混合物を精製して、任意の残存標識および非標識ヌクレオチドを除去する。次いで、反応混合物を、マイクロタイタープレートに入れ、任意の組み込まれた蛍光を、標準的な分光光度計によって読む。非標識ブランクまたは標準を基準として使用して、５００〜５４０ｎｍ下で収集した蛍光の読み取り値と比較する。ｄＮＴＰＳを組み込むことができる任意のＤｎａＥ変異体またはＰｏｌＣ変異体から、標準またはブランクよりも高い蛍光が読み取られる。一旦分光光度計による読み取り値が得られると、サンプルをシンチレーションカウンターに入れて、Ｐ32の組み込みレベルを決定する。非ＦＡＭ標識ブランクまたは標準を、比較のために使用する。ｓａＦＡＭ標識ＣＴＰ後の基質伸長することができるサンプルは、ブランクまたは標準よりも高いＰ32組み込みレベルを有する。Ｐ32組み込みレベルが高くなるほどシンチレーションカウンターでのＣＰＭの読み取りが高くなり、これは、標識（巨大）ヌクレオチド組み込み後にテンプレート伸長が可能な変異体を示す。
【実施例６】
【０４４７】
実施例６：同時増幅および配列決定
任意のＤｎａＥαサブユニットがＤＮＡ合成のためにＲＮＡプライマーを使用し、且つｄｄＮＴＰ対ｄＮＴＰの組み込みを識別する能力ならびにＡｍｐｌｉＴａｑＦＳ配列決定ＤＮＡポリメラーゼまたはＴ７  ＤＮＡポリメラーゼがｄｄＮＴＰを有効に組み込むが、ＲＮＡプライマーの伸長を区別する能力に基づいて、テンプレート配列決定およびテンプレート増幅を、１つの均一の同質の反応で同時に行うことができる。
【０４４８】
本実験では２．９ｋｂの二本鎖線状ＤＮＡ基質を準備する。このＤＮＡ基質を、緩衝液、ｄＮＴＰ、標識ｄｄＮＴＰ、テンプレート増幅のための順方向および逆方向ＲＮＡプライマー、および配列決定反応を駆動するための１つのＤＮＡプライマー、ならびに２つの異なるＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩの野生型ＤｎａＥαサブユニットおよび変異ＡｍｐｌｉＴａｑＦＳ配列決定ポリメラーゼ）を含む反応混合物に添加する。この反応混合物を、以下のインキュベーション温度で少なくとも３０回サイクル運転を行う：９３℃で１５秒、５５℃で２分。ＤＮＡ配列決定プライマーを、テンプレート増幅のためのＲＮＡプライマーのアニーリング部位間にアニーリングするようにデザインする。テンプレート増幅反応を駆動するＤｎａＥαサブユニットはＲＮＡプライマーを使用することができるが、デオキシリボヌクレオチドを組み込むことができず、ＡｍｐｌｉＴａｑＦＳ配列決定ポリメラーゼはｄｄＮＴＰＳを組み込むことができるが、ＤＮＡ配列決定プライマーのみを伸長する。特定の場合、ＤｎａＥαサブユニットは、ＲＮＡプライマーを使用してｐＧＥＭ基質を増幅することができる。以下のＲＮＡ増幅プライマーを準備する。
ＲＮＡ順方向プライマー（５’−ＧＡＣＧＵＵＧＵＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＵ−３’）
ＲＮＡ逆方向プライマー（５’−ＧＵＧＡＣＵＧＧＧＡＡＡＡＣＣＣＵＧＧＣＧＵＵＡＣ−３’）
【０４４９】
ＡｍｐｌｉＴａｑＦＳ配列決定ポリメラーゼは、ＲＮＡプライマーを使用して基質を増幅する能力を欠くが、伸長のためにＤＮＡプライマーを使用しながらｄｄＮＴＰを組み込むことができる。この特定の場合、標準的なサンガー配列決定プロトコールで使用されるジデオキシリボヌクレオチド鎖ターミネーターを組み込む能力を有するので、ＡｍｐｌｉＴａｑＦＳ配列決定ポリメラーゼを配列決定酵素として使用する。ＡｍｐｌｉＴａｑＦＳ配列決定ポリメラーゼは、ＲＮＡ順方向増幅プライマーに対して内部の１つのＤＮＡ配列決定プライマーを使用する。以下のＤＮＡ配列決定プライマーを準備する。
ＤＮＡ配列決定プライマー（５’−ＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣＡＡＣＡＴＡＣＧＡＧＣＣＧＧ−３’）
【０４５０】
反応混合物に対して、複数回にわたり、５５〜９５℃で温度サイクリングを行う。サイクリング過程中、ＤｎａＥαサブユニットは、ｐＧＥＭ基質の増幅のためにＲＮＡプライマーを使用する一方で、ＡｍｐｌｉＴａｑＦＳ配列決定ポリメラーゼは、１つのＤＮＡ配列決定プライマーによって基質の一部の標識鎖終結コピーを同時に生成する。温度サイクリングの終了後、反応混合物を精製して、任意の残存した標識または非標識ヌクレオチドおよび残存塩を除去し、種々の配列決定法（すなわち、キャピラリー電気泳動）によって分析することができる。
【実施例７】
【０４５１】
実施例７：αサブユニット変異体の生成
ＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットをコードする遺伝子の部位特異的変異誘発を、製造者の説明書にしたがって市販のキットを使用した先行技術で公知の任意の部位特異的変異誘発法によって行うことができる。
【０４５２】
例えば、変異誘発のための所望のＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットをコードするｄｎａＥ遺伝子を有する線状の二本鎖プラスミドテンプレートを、逆ＰＣＲによって作製する。逆ＰＣＲのための順方向および逆方向プライマーを、ｄｎａＥコード配列中の変異原性部位で末端同士が（５’末端同士が）アニーリングするようにデザインする。プラスミドの完全な線状の二本鎖コピーを、以下のＰＣＲプログラムにて３５サイクル増幅させる：９３℃で２０秒、６５℃で５分。得られた増幅産物は、変異誘発のためにターゲティングされる部位で二本鎖が平滑に切断されている。リン酸化二本鎖変異原性コドンカセットを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでのライゲーションによって標的部位に挿入する。５’末端がリン酸化された２つのデオキシリボヌクレオチドのハイブリッド形成によって変異誘発カセットを形成する。
【０４５３】
各変異原性コドンカセットは、３つの塩基対の直接末端反復および制限エンドヌクレアーゼＳａｐＩ（その認識配列の外側を切断する酵素）の２つの末端同士の認識配列を含む。３塩基対反復の配列は、所望の変異コドンに類似している。次いで、変異原性カセットを含む介在分子を、ＳａｐＩで消化し、それにより、ほとんどの変異原性カセットを除去し、３塩基付着末端のみが遊離し、これをライゲーションして、最終的に挿入または置換変異を行う。この手順中に変異原性カセットを切り出し、所望の変異の組み込みのみによって標的が変化し、同一のカセットを使用して、全標的部位に特定のコドンを導入することができる。このアプローチにより、任意の部位に任意のＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニットの任意の所望の変異を生成することが可能である。同一のＤＮＡＰｏｌ  ＩＩＩαサブユニット中にいくつかの変異が望ましい場合、記載の過程を、逆ＰＣＲによって介在変異プラスミド分子を増幅するいくつかの変異原性カセットを使用して連続的に反復すべきである。次いで、得られた変異分子を、所望の宿主中に形質変換し、発現し、精製し、所望の効果についてアッセイすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０４５４】
【図１−１】図１は、種々のグラム陰性およびグラム陽性ＤＮＡポリメラーゼサブユニット、ならびにヒト、古細菌、およびバクテリオファージのＤＮＡポリメラーゼサブユニット中のモチーフＡ、Ｂ、およびＣの配置およびスペーシングを概略的に比較している。
【図１−２】図１は、種々のグラム陰性およびグラム陽性ＤＮＡポリメラーゼサブユニット、ならびにヒト、古細菌、およびバクテリオファージのＤＮＡポリメラーゼサブユニット中のモチーフＡ、Ｂ、およびＣの配置およびスペーシングを概略的に比較している。
【図１−３】図１は、種々のグラム陰性およびグラム陽性ＤＮＡポリメラーゼサブユニット、ならびにヒト、古細菌、およびバクテリオファージのＤＮＡポリメラーゼサブユニット中のモチーフＡ、Ｂ、およびＣの配置およびスペーシングを概略的に比較している。
【図２】図２は、グラム陰性ＤＮＡｅ  ｐｏｌ  ＩＩＩα中に異なる機能的特徴を得るためのモチーフＡ内の好ましい二次置換を提供する。
【図３】図３は、グラム陰性ＤＮＡｅ  ｐｏｌ  ＩＩＩα中に異なる機能的特徴を得るためのモチーフＢ内の好ましい二次置換を提供する。
【図４】図４は、グラム陽性ＤＮＡｅ  ｐｏｌ  ＩＩＩα中に異なる機能的特徴を得るためのモチーフＡ内の好ましい二次置換を提供する。
【図５】図５は、グラム陽性ＤＮＡｅ  ｐｏｌ  ＩＩＩα中に異なる機能的特徴を得るためのモチーフＢ内の好ましい二次置換を提供する。
【図６】図６は、グラム陽性ＰｏｌＣ  ｐｏｌ  ＩＩＩα中に異なる機能的特徴を得るためのモチーフＡ内の好ましい二次置換を提供する。
【図７】図７は、グラム陽性ＰｏｌＣ  ｐｏｌ  ＩＩＩα中に異なる機能的特徴を得るためのモチーフＢ内の好ましい二次置換を提供する。
【図８】図８は、ラン藻ＰｏｌＣ  ｐｏｌ  ＩＩＩα中に異なる機能的特徴を得るためのモチーフＡ内の好ましい二次置換を提供する。
【図９】図９は、ラン藻ＰｏｌＣ  ｐｏｌ  ＩＩＩα中に異なる機能的特徴を得るためのモチーフＢ内の好ましい二次置換を提供する。
【図１０】図１０は、テルムス・サーモフィラス（Ｔ．ｔｈ）αサブユニットを使用した経時プライマー伸長アッセイの結果を示す。
【図１１】図１１は、サーモトガ・マリチマαサブユニットを使用した経時プライマー伸長アッセイの結果を示す。
【図１２】図１２は、Ｔ．ｔｈ  ＤｎａＥ配列に基づいたＤＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩのＤｎａＥ型αサブユニットの提案された活性部位モデルを提供する。
【図１３】図１３は、Ｔ．マリチマ  ＰｏｌＣ配列に基づいたＤＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩのＰｏｌＣ型αサブユニットの提案された活性部位モデルを提供する。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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