(57)【要約】  本発明は、黄色ブドウ球菌の過剰産生株の製造方法に関する。この方法によれば、（ａ）黄色ブドウ球菌の株を培地Ｍ１、Ｍ２またはＭ３上で増殖させ、（ｂ）次いで、このようにして製造された株を培地から回収し得る。本発明はまた、多糖を製造するための株の使用に関する。
2008538702.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を包含する、過剰産生黄色ブドウ球菌株の製造方法：
（ａ）培地１ｌあたり以下：
・５〜１００ｇの植物ペプトン、
・０．５〜２０ｇの酵母エキス、
・１〜３０ｇの糖、
・１〜２００ｍｇの、ＦｅＣｌ３およびＦｅＳＯ４からなる群より選択される鉄塩、
・１〜７００ｍｇの、ＭｇＣｌ２およびＭｇＳＯ４からなる群より選択されるマグネシウム塩、
・０．１〜５００ｍｇのＣａＣｌ２、
・０〜５０ｍｇのＺｎＣｌ２、
・１０〜２５０ｇのＮａＣｌ、好ましくは５８．５ｇ／ｌを含み、そして
そのｐＨは６．２〜７．５の値の範囲内である培地Ｍ１上で黄色ブドウ球菌株を培養する工程、ならびに
（ｂ）このようにして製造された株を培地から回収してもよい工程。
【請求項２】
工程（ａ）の培地Ｍ１がコムギペプトンを含む、請求項１記載の過剰産生株の製造方法。
【請求項３】
培地Ｍ１が培地１ｌあたり以下：
・３０ｇのコムギペプトン、
・５ｇの酵母エキス、
・１ｇのＤ−グルコースＨ２Ｏ、
・１２０ｍｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、
・４００ｍｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、
・１０ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、
・５８．５ｇのＮａＣｌ、
・５ｍｇのＺｎＣｌ２、
・６．８ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、
・６ｇのＮＨ４Ｃｌを含み、そしてｐＨ＝６．５である、請求項１または２記載の過剰産生株の製造方法。
【請求項４】
培地Ｍ１が１ｌあたり以下：３０ｇのコムギペプトン、５ｇの酵母エキス、１ｇのＤ−グルコースＨ２Ｏ、１２０ｍｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、４００ｍｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、５８．５ｇのＮａＣｌ、５ｍｇのＺｎＣｌ２、６．８ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６ｇのＮＨ４Ｃｌからなり、そしてｐＨ＝６．５である、請求項４記載の製造方法。
【請求項５】
以下：
・３〜５０ｇの植物ペプトン、
・０．５〜２０ｇの酵母エキス、
・１〜３０ｇの糖、
・１〜２００ｍｇの、ＦｅＣｌ３およびＦｅＳＯ４からなる群より選択される鉄塩、
・１〜７００ｍｇの、ＭｇＣｌ２およびＭｇＳＯ４からなる群より選択されるマグネシウム塩、
・０．１〜５０ｍｇのＣａＣｌ２、
・０〜５０ｍｇのＺｎＣｌ２、
・２〜５０ｇのＮａＣｌ、好ましくは６ｇ／ｌを含み、そして
そのｐＨが６．２〜７．５の値の範囲内である培地Ｍ０上で前培養する工程を包含する、請求項１〜４のいずれか１項記載の過剰産生株の製造方法。
【請求項６】
前培養工程の培地Ｍ０が３．８７ｇまたは３０ｇのコムギペプトンを含む、請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
前培養工程の培地Ｍ０が以下：
・３．８７または３０ｇのコムギペプトン、および
・５ｇの酵母エキス、
・１ｇのＤ−グルコースＨ２Ｏ、
・１２０ｍｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、
・４００ｍｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、
・１０ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、
・６ｇのＮａＣｌ、
・５ｍｇのＺｎＣｌ２、
・６．８ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、
・６ｇのＮＨ４Ｃｌを含み、そしてｐＨ＝６．５である、請求項５または６記載の製造方法。
【請求項８】
以下の工程を包含する、過剰産生黄色ブドウ球菌株の製造方法：
（ａ）培地１ｌあたり以下：
・５２．５〜１００ｇの植物ペプトン、有利にはコムギペプトン、
・０〜８２．５ｇのＮａＣｌ、有利には５ｇ〜８２．５ｇ、特に４１ｇ／ｌのＮａＣｌ、
・０〜１５ｇ／ｌの、ＭｇＳＯ４およびＭｇＣｌ２からなる群より選択されるマグネシウム塩、有利には０．０１〜１５ｇ／ｌ、特に１５ｇ／ｌのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、および
・０〜７ｇ／ｌの糖、有利には０．２５〜７ｇ／ｌ、特に０．２５ｇ／ｌのＤ−グルコース・Ｈ２Ｏを含み、そのｐＨは６．３〜６．７の値の範囲内である培地Ｍ２上で黄色ブドウ球菌株を培養する工程、ならびに
（ｂ）このようにして製造された株を培地から回収してもよい工程。
【請求項９】
培地Ｍ２が９３ｇ／ｌのコムギペプトン、４１ｇ／ｌのＮａＣｌ、０．２５ｇ／ｌのＤ−グルコース・Ｈ２Ｏおよび１５ｇ／ｌのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏを含み、有利にはそれらからなり、そしてそのｐＨは６．３〜６．７の値の範囲内である、請求項８記載の過剰産生株の製造方法。
【請求項１０】
以下の工程を包含する、過剰産生黄色ブドウ球菌株の製造方法：
（ａ）培地１ｌあたり以下：
・６５〜８５ｇの酵母エキス、有利には７５ｇ、
・０〜８２．５ｇのＮａＣｌ、有利には５ｇ〜８２．５ｇ、特に４１ｇ／ｌのＮａＣｌ、
・０〜１５ｇ／ｌの、ＭｇＳＯ４およびＭｇＣｌ２からなる群より選択されるマグネシウム塩、有利には０．０１〜１５ｇ／ｌ、特に１５ｇ／ｌのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、および
・０〜７ｇ／ｌの糖、有利には０．２５〜７ｇ／ｌ、特に０．２５ｇ／ｌのＤ−グルコース・Ｈ２Ｏを含み、そのｐＨは６．３〜６．７の値の範囲内である培地Ｍ３上で黄色ブドウ球菌株を培養する工程、
（ｂ）このようにして製造された株を培地から回収してもよい工程。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項記載の、過剰産生黄色ブドウ球菌Ｔ５株の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項記載の、過剰産生黄色ブドウ球菌Ｔ８株の製造方法。
【請求項１３】
以下の工程を包含する、莢膜多糖の製造方法：
（ａ）請求項１〜４のいずれか１項記載の培地Ｍ１上、または請求項８または９記載の培地Ｍ２上、または請求項１０記載の培地Ｍ３上で黄色ブドウ球菌株を培養する工程、
（ｂ）このようにして製造された培養物を不活性化する工程、および
（ｃ）莢膜多糖を回収する工程。
【請求項１４】
培養工程の培地Ｍ１がコムギペプトンを含む、莢膜多糖の製造方法。
【請求項１５】
培養工程の培地Ｍ１が培地１ｌあたり以下：３０ｇのコムギペプトン、５ｇの酵母エキス、１ｇのＤ−グルコースＨ２Ｏ、１２０ｍｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、４００ｍｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、５８．５ｇのＮａＣｌ、５ｍｇのＺｎＣｌ２、６．８ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６ｇのＮＨ４Ｃｌを含み、そしてｐＨ＝６．５である、請求項１３または１４記載の莢膜多糖の製造方法。
【請求項１６】
培地Ｍ１が培地１ｌあたり以下：３０ｇのコムギペプトン、５ｇの酵母エキス、１ｇのＤ−グルコースＨ２Ｏ、１２０ｍｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、４００ｍｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、５８．５ｇのＮａＣｌ、５ｍｇのＺｎＣｌ２、６．８ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６ｇのＮＨ４Ｃｌからなり、そしてｐＨ＝６．５である、請求項１５記載の莢膜多糖の製造方法。
【請求項１７】
請求項５〜７のいずれか１項記載の前培養工程を包含する、請求項１３〜１６のいずれか１項記載の莢膜多糖の製造方法。
【請求項１８】
請求項１３〜１７のいずれか１項記載の方法によって得られる過剰産生黄色ブドウ球菌株。
【請求項１９】
請求項１８記載の過剰産生Ｒｅｙｎｏｌｄｓ株。
【請求項２０】
請求項１８記載の過剰産生Ｂｅｃｋｅｒ株。
【請求項２１】
請求項１８記載の過剰産生ＣＹＬ７７０株。
【請求項２２】
請求項１８記載の過剰産生ＣＹＬ１８９２株。
【請求項２３】
以下：
・３〜５０ｇの植物ペプトン、
・０．５〜２０ｇの酵母エキス、
・１〜３０ｇの糖、
・１〜２００ｍｇの、ＦｅＣｌ３およびＦｅＳＯ４からなる群より選択される鉄塩、
・１〜７００ｍｇの、ＭｇＣｌ２およびＭｇＳＯ４からなる群より選択されるマグネシウム塩、
・０．１〜５０ｍｇのＣａＣｌ２、
・０〜５０ｍｇのＺｎＣｌ２、
・２〜５０ｇのＮａＣｌ、好ましくは６ｇ／ｌを含み、そして
そのｐＨは６．２〜７．５の値の範囲内である、黄色ブドウ球菌の培養に適切な培地Ｍ０。
【請求項２４】
以下：
（ａ）３．８７または３０ｇのコムギペプトン、および
（ｂ）５ｇの酵母エキス、
（ｃ）１ｇのＤ−グルコースＨ２Ｏ、
（ｄ）１２０ｍｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、
（ｅ）４００ｍｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、
（ｆ）１０ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、
（ｇ）６ｇのＮａＣｌ、
（ｈ）５ｍｇのＺｎＣｌ２、
（ｉ）６．８ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、
（ｊ）６ｇのＮＨ４Ｃｌを含み、そしてｐＨ＝６．５である、請求項２３記載の培地Ｍ０。
【請求項２５】
以下：
・５〜１００ｇの植物ペプトン、
・０．５〜２０ｇの酵母エキス、
・１〜３０ｇの糖、
・１〜２００ｍｇの、ＦｅＣｌ３およびＦｅＳＯ４からなる群より選択される鉄塩、
・１〜７００ｍｇの、ＭｇＣｌ２およびＭｇＳＯ４からなる群より選択されるマグネシウム塩、
・０．１〜５００ｍｇのＣａＣｌ２、
・０〜５０ｍｇのＺｎＣｌ２、
・１０〜２５０ｇのＮａＣｌ、好ましくは５８．５ｇ／ｌを含み、そして
そのｐＨは６．２〜７．５の値の範囲内である、莢膜多糖の過剰産生に適切な培地Ｍ１。
【請求項２６】
以下：
・３０ｇのコムギペプトン、
・５ｇの酵母エキス、
・１ｇのＤ−グルコースＨ２Ｏ、
・１２０ｍｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、
・４００ｍｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、
・１０ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、
・５８．５ｇのＮａＣｌ、
・５ｍｇのＺｎＣｌ２、
・６．８ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、
・６ｇのＮＨ４Ｃｌを含み、そしてｐＨ＝６．５である、請求項２２記載の培地Ｍ１。
【請求項２７】
培地１ｌあたり以下：
・５２．５〜１００ｇの植物ペプトン、有利にはコムギペプトン、
・０〜８２．５ｇのＮａＣｌ、有利には５ｇの〜８２．５ｇ、特に４１ｇ／ｌのＮａＣｌ、
・０〜１５ｇ／ｌのマグネシウム塩、有利には０．０１〜１５ｇ／ｌ、特に１５ｇ／ｌのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、および
・０〜７ｇ／ｌの糖、有利には０．２５〜７ｇ／ｌ、特に０．２５ｇ／ｌのＤ−グルコースＨ２Ｏを含み、
そのｐＨは６．３〜６．７の値の範囲内である、莢膜多糖の過剰産生に適切な培地Ｍ２。
【請求項２８】
培地１ｌあたり以下：９３ｇ／ｌのコムギペプトン、４１ｇ／ｌのＮａＣｌ、０．２５ｇ／ｌのＤ−グルコースＨ２Ｏ、および１５ｇ／ｌのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏを含み、そのｐＨが６．３〜６．７の値の範囲内である、請求項２７記載の培地Ｍ２。
【請求項２９】
培地１ｌあたり以下：
・６５〜８５ｇの酵母エキス、有利には７５ｇの酵母エキス、
・０〜８２．５ｇのＮａＣｌ、有利には５ｇ〜８２．５ｇ、特に４１ｇ／ｌのＮａＣｌ、
・０〜１５ｇ／ｌのマグネシウム塩、有利には０．０１〜１５ｇ／ｌ、特に１５ｇ／ｌのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、および
・０〜７ｇ／ｌの糖、有利には０．２５〜７ｇ／ｌ、特に０．２５ｇ／ｌのＤ−グルコースＨ２Ｏを含み、
そのｐＨが６．３〜６．７の値の範囲内である、莢膜多糖の過剰産生に適切な培地Ｍ３。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、過剰産生黄色ブドウ球菌株の製造方法および莢膜多糖の製造方法におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
黄色ブドウ球菌莢膜多糖（特に、血清型５および８の多糖）は、黄色ブドウ球菌に起因する感染症に対する防御を目的とするワクチンを製造するための目的の成分として文献に記載されている。
【０００３】
Ｔ５およびＴ８株は微小莢膜化（microcapsulees）されており、それゆえ少量の目的の莢膜多糖を産生する。ワクチン中に含めなければならない莢膜多糖の量は、標的化される集団の免疫系欠損ゆえにかなりの量である（例えば、Ｆａｔｔｏｍ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ  （１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ  １３，  １２８８−１２９３を参照のこと）。
【０００４】
そのようなワクチンの工業的開発の場合、それゆえ、多量のＴ５およびＴ８莢膜多糖の製造が可能であることが重要である。
【０００５】
この観点をもって、本発明者らは黄色ブドウ球菌株が莢膜多糖を分泌する能力を実質的に増加させる新規の方法を示した。それゆえ、本発明者らは、多量に黄色ブドウ球菌莢膜多糖を得ることを可能にする製造方法を提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第１の態様によれば、本発明はそれゆえ、以下の工程を包含する、過剰産生黄色ブドウ球菌株の製造方法に関する：
（ａ）培地１ｌあたり以下：
・５〜１００ｇの植物ペプトン、
・０．５〜２０ｇの酵母エキス、
・１〜３０ｇの糖、
・１〜２００ｍｇの、ＦｅＣｌ３およびＦｅＳＯ４からなる群より選択される鉄塩、
・１〜７００ｍｇの、ＭｇＣｌ２およびＭｇＳＯ４からなる群より選択されるマグネシウム塩、
・０．１〜５００ｍｇのＣａＣｌ２、
・０〜５０ｍｇのＺｎＣｌ２、
・１０〜２５０ｇのＮａＣｌ、好ましくは５８．５ｇ／ｌを含み、そして
そのｐＨは６．２〜７．５の値の範囲内である培地Ｍ１上で黄色ブドウ球菌株を培養する工程、ならびに
（ｂ）株を培地から回収してもよい工程。
【０００７】
過剰産生株の製造方法の特定の実施態様によれば、工程（ａ）の培地Ｍ１はコムギペプトンを含む。
【０００８】
過剰産生株の製造方法の有利な実施態様によれば、培地Ｍ１は培地１ｌあたり以下：
・３０ｇのコムギペプトン、
・５ｇの酵母エキス、
・１ｇのグルコース、
・１２０ｍｇのＦｅＣｌ３塩、
・４００ｍｇのＭｇＣｌ２塩、
・１０ｍｇのＣａＣｌ２、
・５８．５ｇのＮａＣｌ、
・５ｍｇのＺｎＣｌ２、
・６．８ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、
・６ｇのＮＨ４Ｃｌを含み、そしてｐＨ＝６．５である。
【０００９】
別の有利な実施態様によれば、培地Ｍ１は１ｌあたり以下：３０ｇのコムギペプトン、５ｇの酵母エキス、１ｇのＤ−グルコースＨ２Ｏ、１２０ｍｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、４００ｍｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、５８．５ｇのＮａＣｌ、５ｍｇのＺｎＣｌ２、６．８ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４および６ｇのＮＨ４Ｃｌからなり、そしてｐＨ＝６．５である。
【００１０】
特定の実施態様によれば、過剰産生株の製造方法は以下：
・３〜５０ｇの植物ペプトン、
・０．５〜２０ｇの酵母エキス、
・１〜３０ｇの糖、
・１〜２００ｍｇの、ＦｅＣｌ３およびＦｅＳＯ４からなる群より選択される鉄塩、
・１〜７００ｍｇの、ＭｇＣｌ２およびＭｇＳＯ４からなる群より選択されるマグネシウム塩、
・０．１〜５０ｍｇのＣａＣｌ２、
・０〜５０ｍｇのＺｎＣｌ２、
・２〜５０ｇのＮａＣｌ、好ましくは６ｇ／ｌを含み、そして
そのｐＨは６．２〜７．５の値の範囲内である前培養培地Ｍ０上で前培養する工程を包含する。
【００１１】
過剰産生株の製造方法の特定の実施態様によれば、前培養工程は、１ｌあたり３．８７ｇのコムギペプトンを含む前培養培地Ｍ０を使用する。
【００１２】
過剰産生株の製造方法の別の実施態様によれば、前培養工程は、１ｌあたり３０ｇのコムギペプトンを含む前培養培地Ｍ０を使用する。
【００１３】
過剰産生株の製造方法の有利な実施態様によれば、前培養工程は、以下：３．８７ｇのコムギペプトン、５ｇの酵母エキス、１ｇのＤ−グルコースＨ２Ｏ、１２０ｍｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、４００ｍｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、６ｇのＮａＣｌ、５ｍｇのＺｎＣｌ２、６．８ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６ｇのＮＨ４Ｃｌ、１５ｇ／ｌの寒天を含み、そしてｐＨ＝６．５である寒天前培養培地Ｍ０を使用する。
【００１４】
過剰産生株の製造方法の別の有利な実施態様によれば、前培養工程は、以下：３０ｇのコムギペプトン、５ｇの酵母エキス、１ｇのＤ−グルコースＨ２Ｏ、１２０ｍｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、４００ｍｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、６ｇのＮａＣｌ、５ｍｇのＺｎＣｌ２、６．８ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６ｇのＮＨ４Ｃｌを含み、そしてｐＨ＝６．５である液体前培養培地Ｍ０を使用する。
【００１５】
１つの実施態様によれば、上記の方法は、黄色ブドウ球菌Ｔ５の過剰産生株の製造方法である。
【００１６】
別の実施態様によれば、上記の方法は、黄色ブドウ球菌Ｔ８の過剰産生株の製造方法である。
【００１７】
本発明はまた、上記の方法によって得られる過剰産生株、および莢膜多糖を製造するためのこの株の使用に関する。それゆえ、本発明は特に、上記の方法によって得られる過剰産生Ｒｅｙｎｏｌｄｓ株、過剰産生Ｂｅｃｋｅｒ株および過剰産生ＣＹＬ７７０株に関する。
【００１８】
別の態様によれば、本発明はそれゆえ、以下の工程を包含する、莢膜多糖の製造方法を提供する：
（ａ）上記の培地Ｍ１上で黄色ブドウ球菌株を培養する工程、
（ｂ）このようにして製造された培養物を不活性化する工程、および
（ｃ）莢膜多糖を回収する工程。
【００１９】
莢膜多糖の製造方法の１つの実施態様によれば、培養工程はコムギペプトンを含む培地Ｍ１を使用する。
【００２０】
１つの実施態様によれば、莢膜多糖の製造方法は、過剰産生株の製造方法に関連して記載する前培養工程を包含する。
【００２１】
本発明の主題はまた、以下：
・３〜５０ｇの植物ペプトン、
・０．５〜２０ｇの酵母エキス、
・１〜３０ｇの糖、
・１〜２００ｍｇの、ＦｅＣｌ３およびＦｅＳＯ４からなる群より選択される鉄塩、
・１〜７００ｍｇの、ＭｇＣｌ２およびＭｇＳＯ４からなる群より選択されるマグネシウム塩、
・０．１〜５０ｍｇのＣａＣｌ２、
・０〜５０ｍｇのＺｎＣｌ２、
・２〜５０ｇのＮａＣｌ、好ましくは６ｇ／ｌを含み、そして
そのｐＨは６．２〜７．５の値の範囲内である、黄色ブドウ球菌の培養に適切な培地Ｍ０であり、
そして、それは好ましくは、１ｌあたり以下：３．８７ｇまたは３０ｇのコムギペプトンおよび５ｇの酵母エキス、１ｇのＤ−グルコースＨ２Ｏ、１２０ｍｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、４００ｍｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、６ｇのＮａＣｌ、５ｍｇのＺｎＣｌ２、６．８ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６ｇのＮＨ４Ｃｌを含み、有利にはそれらからなり、そしてｐＨ＝６．５である寒天または液体培地Ｍ０に関する。
【００２２】
本発明の主題はまた、以下：
・５〜１００ｇの植物ペプトン、
・０．５〜２０ｇの酵母エキス、
・１〜３０ｇの糖、
・１〜２００ｍｇの、ＦｅＣｌ３およびＦｅＳＯ４からなる群より選択される鉄塩、
・１〜７００ｍｇの、ＭｇＣｌ２およびＭｇＳＯ４からなる群より選択されるマグネシウム塩、
・０．１〜５００ｍｇのＣａＣｌ２、
・０〜５０ｍｇのＺｎＣｌ２、
・１０〜２５０ｇのＮａＣｌ、好ましくは５８．５ｇ／ｌを含み、そして
そのｐＨは６．２〜７．５の値の範囲内である、黄色ブドウ球菌莢膜多糖の過剰産生に適切な培地Ｍ１であり、
そして、それは好ましくは、１ｌあたり以下：３０ｇのコムギペプトン、５ｇの酵母エキス、１ｇのＤ−グルコースＨ２Ｏ、１２０ｍｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、４００ｍｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、５８．５ｇのＮａＣｌ、５ｍｇのＺｎＣｌ２、６．８ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６ｇのＮＨ４Ｃｌを含み、有利にはそれらからなり、そしてｐＨ＝６．５である培地Ｍ１に関する。
【００２３】
本発明者らは、上記の培地Ｍ１が単純化培地Ｍ２によって有利に置換され得ることを示した。従って、本発明はまた、培地Ｍ１が下記の培地Ｍ２によって置換される、上記の過剰産生黄色ブドウ球菌株の製造方法および莢膜多糖の製造方法に関する。
【００２４】
従って、本発明の主題はまた、培地１ｌあたり以下：
・５２．５〜１００ｇの植物ペプトン、有利にはコムギペプトン、
・０〜８２．５ｇのＮａＣｌ、有利には５ｇの〜８２．５ｇ、特に４１ｇ／ｌのＮａＣｌ、
・０〜１５ｇ／ｌのマグネシウム塩、有利には０．０１〜１５ｇ／ｌ、特に１５ｇ／ｌのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、および
・０〜７ｇ／ｌの糖、有利には０．２５〜７ｇ／ｌ、特に０．２５ｇ／ｌのＤ−グルコースＨ２Ｏを含み、
そのｐＨは６．３〜６．７、有利には６．４〜６．６の値の範囲内である培地Ｍ２である。
【００２５】
特定の実施態様によれば、培地Ｍ２は以下：９３ｇ／ｌのコムギペプトン、４１ｇ／ｌのＮａＣｌ、０．２５ｇ／ｌのＤ−グルコース・Ｈ２Ｏおよび１５ｇ／ｌのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏを含み、有利にはそれから構成され、そのｐＨは６．３〜６．７の値の範囲内である。
【００２６】
本発明者らはまた、植物ペプトンが６５〜８５ｇ／ｌ、有利には７５ｇ／ｌの酵母エキスによって置換された培地Ｍ２に対応する培地Ｍ３が使用され得ることを示した。従って、本発明はまた、培地Ｍ１が下記の培地Ｍ３によって置換される、上記の過剰産生黄色ブドウ球菌株の製造方法および莢膜多糖の製造方法に関する。
【００２７】
従って、本発明の主題はまた、培地１ｌあたり以下：
・６５〜８５ｇの酵母エキス、有利には７５ｇ／ｌの酵母エキス、
・０〜８２．５ｇのＮａＣｌ、有利には５ｇ〜８２．５ｇの、特に４１ｇ／ｌのＮａＣｌ、
・０〜１５ｇ／ｌのマグネシウム塩、有利には０．０１〜１５ｇ／ｌ、特に１５ｇ／ｌのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、および
・０〜７ｇ／ｌの糖、有利には０．２５〜７ｇ／ｌ、特に０．２５ｇ／ｌのＤ−グルコースＨ２Ｏを含み、
そのｐＨは６．３〜６．７の値の範囲内である培地Ｍ３である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明を、多糖を回収するためのプロトコルの描写を提供する図１を参照して、以下の説明においてさらに詳細に説明する。
【００２９】
本発明者らは、驚くべきことに、培地Ｍ１、Ｍ２およびＭ３が、黄色ブドウ球菌株が莢膜多糖を分泌する能力の実質的な増加を誘導することを実証した。増加は、下記の実施例２．４に記載のＥＬＩＳＡ法によって、製造された莢膜多糖の量を測定することによって実証され得る。増加した分泌能力を示す黄色ブドウ球菌株は、本発明の関連において、過剰産生株と呼ばれる。
【００３０】
本発明の関連において、用語「過剰産生株」はそれゆえ、培地Ｍ１またはＭ２またはＭ３上で培養した後に、同じ培養条件下でポートレル（Poutrel）培地（培地の説明についてＰｏｕｔｒｅｌ，  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）．  Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２，  １６６−１７１、または下記の実施例１．１を参照のこと）上で同じ出発株を培養することによって産生されるものより少なくとも３倍、好ましくは５倍、そして有利には１０倍多い量の莢膜多糖（ｍｇ／ｍｌ）（実施例２．４に記載のＥＬＩＳＡ法によって決定される）を産生する黄色ブドウ球菌株を意味することが意図される。
【００３１】
組換え株の場合、用語「過剰産生株」は、培地Ｍ１またはＭ２またはＭ３上で培養した後に、同じ培養条件下でＴＳＢ培地（培地の説明について実施例１．５を参照のこと）上で同じ出発株を培養することによって産生されるものの少なくとも２倍量の莢膜多糖（ｍｇ／ｌ）（実施例２．４に記載のＥＬＩＳＡ法によって決定される）を産生する組換え黄色ブドウ球菌株を意味することが意図される。
【００３２】
本発明者らは、驚くべきことに、過剰産生株の製造方法が、黄色ブドウ球菌Ｔ５およびＴ８株に適用可能であることを実証した。本発明者らはまた、本発明による方法がまた、その莢膜多糖を過剰産生するように遺伝子改変された組換え株に適用可能であることを観察した。本発明者らは、Ｔ８莢膜多糖を多量に産生するように遺伝子改変されたＣＹＬ７７０株に本発明による方法を適用することによってこの態様を実証した。それが培地Ｍ１またはＭ２またはＭ３上で培養された後、下記の実施例において記載されるように、この株がＴ８莢膜多糖を分泌する能力は２の係数で増加する。
【００３３】
本発明の関連において、用語「黄色ブドウ球菌株」はそれゆえ、血清型Ｔ５および／またはＴ８の多糖を含む莢膜または微小莢膜（microcapsule）を発現する任意の黄色ブドウ球菌株を意味することが意図される。適切な株の非限定的な例として、Ｎｅｗｍａｎ（Ｔ５）、Ｒｅｙｎｏｌｄｓｓ（Ｔ５）、Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ（Ｔ５）、Ｂｅｃｋｅｒ（Ｔ８）、Ｗｒｉｇｈｔ（Ｔ８）、ＣＹＬ７７０（Ｔ８）およびＣＹＬ１８９２（Ｔ５）株に言及し得る。
【００３４】
これらの株は、種々の研究所からまたは種々の収集物において入手可能であり；特に以下に言及し得る：Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＩＰ）：Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ＣＩＰ  １０３３１３、Ｂｅｃｋｅｒ  ＣＩＰ１０３３１４、またはＡＴＣＣ：Ｗｒｉｇｈｔ  ＡＴＣＣ９５２５、Ｌｏｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  ＡＴＣＣ  ４９５２１。本発明の関連において、ＣＹＬ７７０（Ｔ８）およびＲｅｙｎｏｌｄｓ（Ｔ５）株が、好適に使用される。ＣＹＬ７７０株は、より多量のＴ８莢膜多糖を産生するように遺伝子改変されたＢｅｃｋｅｒ株である。この株は、本発明による過剰産生株の製造方法において、そしてまた本発明による多糖の製造方法において出発株として有利に使用され得る。ＣＹＬ７７０株の説明は、Ｌｕｏｎｇ，  Ｔ．ＴおよびＬｅｅ，  Ｃ．Ｙによる論文（２００２），  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．  ７０：  ３３８９−３３９５において与えられる。ＣＹＬ１８９２株は、以下の改変を有する、ＬｕｏｎｇおよびＬｅｅによって記載される方法（２００２  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ７０：  ３３８９−３３９５）に従ってｃａｐ５オペロンプロモーターが黄色ブドウ球菌のＭ株のｃａｐ１オペロンの強い構成性プロモーターと置換されたＲｅｙｎｏｌｄｓ株（ＣＩＰ１０３３１３）から得られた組換え黄色ブドウ球菌株を示す：相同配列がＲｅｙｎｏｌｄｓ株の等価な相同配列と置換されており、プラスミドｐＣＬ５２．２が、温度感受性複製起点を含みそしてｃａｔマーカー（クロラムフェニコールに対する耐性を与えるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）を含むプラスミドｐＣＬ１０と置換されている。簡潔に記載すると、Ｐｃａｐ１プロモーターを含む約２５０ｂｐのフラグメントに融合されたＲｅｙｎｏｌｄｓ株のｃａｐ５  ＯＲＦを含む約１ｋｂのＤＮＡフラグメントが、重複ＰＣＲ技術によって構築される。ｃａｐ５Ａ遺伝子の上流の配列を含む約１ｋｂのＤＮＡフラグメントが、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ株のゲノムからＰＣＲによって増幅される。続いて、２つのフラグメントが、Ｐｃａｐ５プロモーターがＰｃａｐ１プロモーターと置換されるように、温度感受性複製起点を保有しそしてｃａｔマーカーを含むプラスミドｐＣＬ１０中にクローン化される。続いて、このようにして構築されたプラスミドがＲＮ４２２０株中に電気穿孔され、次いでバクテリオファージ５２を使用する形質導入によってＲｅｙｎｏｌｄｓ株中へ導入される。プラスミドの複製起点の温度感受性は、続いて、その複製をブロックしつつ、同時にクロラムフェニコールでの選択を適用することによって相同組換えを促進することを可能にする。
【００３５】
本発明の関連において、用語「莢膜多糖」は、黄色ブドウ球菌株のＴ５および／またはＴ８莢膜多糖を意味し、それに由来するフラグメントも意味することが意図される。
【００３６】
本発明の関連において、用語「培地」は、動物起源のタンパク質を含まない培地を意味することが意図される。
【００３７】
表現「動物起源のタンパク質」は、動物起源の材料から得られたタンパク質およびそれに由来する任意の産物（例えば、動物タンパク質の化学的処理から生じた誘導体）を意味することが意図される。それはまた、これらの動物タンパク質の部分的または全体的加水分解の産物（例えば、それに由来するペプトン、ポリペプチド、ペプチド、もしくはアミノ酸）を意味することが意図される。
【００３８】
本発明による過剰産生株の製造方法は、（ａ）黄色ブドウ球菌株を培養する工程を包含する。１つの実施態様によれば、培養工程は、以下：
・５〜１００ｇの植物ペプトン、
・０．５〜２０ｇの酵母エキス、
・１〜３０ｇの糖、
・１〜２００ｍｇの、ＦｅＣｌ３およびＦｅＳＯ４からなる群より選択される鉄塩、
・１〜７００ｍｇの、ＭｇＣｌ２およびＭｇＳＯ４からなる群より選択されるマグネシウム塩、
・０．１〜５０ｍｇのＣａＣｌ２、
・０〜５０ｍｇのＺｎＣｌ２、
・１０〜２５０ｇのＮａＣｌ、好ましくは５８．５ｇ／ｌを含み、そして
そのｐＨは６．２〜７．５の値の範囲内である培地Ｍ１を使用する。
【００３９】
使用される培地Ｍ１中のタンパク質窒素供給源は、主に植物ペプトンによって提供される。
【００４０】
本発明の関連において、用語「植物ペプトン」は、以下からなる群より選択されるペプトンを意味することが意図される：コムギペプトンおよびエンドウマメペプトン。一般に植物ペプトンは、最高のタンパク質含量を含む植物の部分（例えば、コムギ麦芽）から一般に抽出されるタンパク質の酵素的または化学的処理によって得られる加水分解産物の形態である。好ましくは、化学的に修飾されていない植物が使用される。化学的処理の場合、タンパク質抽出物は、高温条件下および加圧下で塩酸の作用に供される。次いで、加水分解産物は、水酸化ナトリウムを用いて中和され、次いで、固体副生成物がそれから除去される。酵素処理の場合、タンパク質抽出物は、通常、パパインを用いて消化される。得られるペプトンは、主にアミノ酸、およびＭＷが≦１ＫＤである小ペプチドの混合物からなる。ＭＷが＞１ＫＤであるペプチドは、混合物の３０％未満を表す。Ｈｙ−Ｐｅａ  ７４０４（Ｑｕｅｓｔから  ｒｅｆ  ５７１０５６５）およびＰｅｐｔｏｎｅ  ｄｅ  ｂｌｅ  Ｅ１（Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅから  ｒｅｆ  １９５５９）の名称で参照される市販の調製物は、本発明の関連において使用され得る植物ペプトン加水分解産物の例である。
【００４１】
培地Ｍ１中で使用される植物ペプトンの濃度は、ペプトンのタンパク質窒素含量を考慮し、そして酵母エキスの濃度を考慮することによって選択される。この含量は、ケルダール法によって算出される。さらなる詳細について、例えば、Ｌｙｎｃｈ  Ｊ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔ．  （１９９９）  ８２  （６）：  １３８９−９８による論文が参照され得る。通常、選択された植物ペプトンのタンパク質窒素含量は、８％〜１５％（重量／重量）の間である。この値の範囲において、使用され得る植物ペプトンの濃度は、５〜１００ｇ／ｌ培地、好ましくは２０〜５０ｇ／ｌ、そして特に３０ｇ／ｌである。
【００４２】
使用される培地Ｍ１中のタンパク質窒素供給源はまた、酵母エキスによって提供される。酵母エキス中のタンパク質窒素含量は、一般に９〜１３％（重量／重量）である。酵母エキスは、０．５〜２０ｇ／ｌ培地の濃度、特に５ｇ／ｌの濃度で使用される。培地中のタンパク質窒素はまた、無機塩の形態で提供され得る；例として、アンモニウム塩（例えば、塩化物または硫酸塩）に言及し得る。この無機塩は、他の窒素供給源によって提供される量に従って調整される濃度で使用され得る。
【００４３】
タンパク質窒素供給源の濃度は、全タンパク質窒素含量が、培養の間の有毒な老廃物の蓄積の原因であり得る窒素異化亢進を生じないように調整される。さらに、酵母エキスによって提供されるビタミンの過剰に起因する実質的な阻害効果の出現を防止するために、後者は、タンパク質窒素の二次的な供給源としてのみ、好ましくは５ｇ／ｌの濃度で使用される。
【００４４】
有利な実施態様によれば、培地Ｍ１は、培地１ｌあたり３０ｇのペプトン（好ましくは、コムギペプトン）および５ｇの酵母エキスを含む。
【００４５】
培地はまた、糖供給源を含む。
【００４６】
本発明の関連において、用語「糖供給源」は、細菌によって代謝され得る非動物起源の糖の任意の供給源（例えば、フルクトース、リボース、キシロース、フコースまたはグルコース）を意味することが意図される。１〜３０ｇ／ｌ培地の桁の濃度が、使用され得る。例えば、グルコースについて、１ｇ／ｌの濃度が有利には使用される。
【００４７】
培地Ｍ１はまた、無機塩、特に鉄、マグネシウム、カルシウム、亜鉛およびナトリウム塩、好ましくは塩化物を以下の量で含む：
−  培地１ｌあたり、１〜２００ｍｇの、ＦｅＣｌ３およびＦｅＳＯ４からなる群より選択される鉄塩、特に１２０ｍｇのＦｅＣｌ３；
−  培地１ｌあたり、１〜７００ｍｇの、ＭｇＣｌ２およびＭｇＳＯ４からなる群より選択されるマグネシウム塩、特に４００ｍｇのＭｇＣｌ２；
−  培地１ｌあたり、０．５〜５０ｍｇのＣａＣｌ２、特に１０ｍｇのＣａＣｌ２；
−  培地１ｌあたり、０〜５０ｍｇのＺｎＣｌ２、特に５ｍｇのＺｎＣｌ２；および
−  培地１ｌあたり、１０〜２５０ｇのＮａＣｌ、好ましくは５８．５ｇ。
【００４８】
Ｆｅ、ＣａおよびＭｇの無機塩は、通常、水和形態で使用される。本発明の関連において、以下の水和塩が培地中で使用された：ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ。
【００４９】
培地Ｍ１は、６．２〜７．５の値の範囲内、好ましくは６．５の初期ｐＨを有し；これを行うために、その緩衝能力のために通常使用され、上記の値の範囲のｐＨを得ることを可能にする任意の無機塩が、必要に応じて使用され得る。ｐＨを決定するために、周囲温度においてｐＨメーターを使用して、それが測定される。
【００５０】
培地Ｍ１はまた、グリセロリン酸および／またはグリシンベタインのような浸透圧調節剤を、グリシンベタインについては１〜１０ｍＭ、およびグリセロリン酸については５０〜１００ｍＭの濃度で含み得、これはＮａＣｌ濃度が１Ｍ（５８ｇ／ｌ）超である場合に添加することが有利であり得る。
【００５１】
使用される培地Ｍ１は、液体培地に好適に対応する。しかし、それは固体形態であり得る。固体または寒天形態は、ゲル形成物質（通常、寒天）の液体培地への１０〜３０ｇ／ｌ培地の濃度での添加によって得られる。
【００５２】
有利な実施態様によれば、培地Ｍ１は、１ｌあたり以下：３０ｇのコムギペプトン、５ｇの酵母エキス、１ｇのＤ−グルコースＨ２Ｏ、１２０ｍｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、４００ｍｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、５８．５ｇのＮａＣｌ、５ｍｇのＺｎＣｌ２、６．８ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、および６ｇのＮＨ４Ｃｌを含み、好ましくはそれらからなり、そして６．５のｐＨを有する。
【００５３】
培養工程は、培地Ｍ１に接種物（例えば、０．２の初期ＯＤ６８０ｎｍを有する）を播種し、そして３７℃において、例えば約４８〜７２時間の期間、５〜１０％の濃度でＣＯ２を含み得る雰囲気中で（５型についてはＣＯ２なし、Ｂｅｃｋｅｒ株の使用の場合はＣＯ２あり）培養することによって実施され得る。培養容量は、必要に応じて変動し得る。４００ｍｌ〜２０ｌの容量またはより大きな容量（例えば、３０ｌ〜１００ｌ）が、使用され得る。培養容器の容量に対する培地の容量の比率２０％（Ｖ／Ｖ）が維持される。より大きな容量について、酸素負荷は、酸素圧を調整することおよび適切な撹拌によって培養の間に確認されそして調節される。
【００５４】
培養工程は、必要に応じて、バイオマスおよび製造される多糖の量を増加させるために、漸増容量中での連続培養を含み得る。
【００５５】
有利な実施態様によれば、過剰産生株の製造方法は、１ｌあたり以下：
・１〜３ｇの植物ペプトン、
・０．５〜２０ｇの酵母エキス、
・１〜３０ｇの糖、
・１〜２００ｍｇの、ＦｅＣｌ３およびＦｅＳＯ４からなる群より選択される鉄塩、
・１〜７００ｍｇの、ＭｇＣｌ２およびＭｇＳＯ４からなる群より選択されるマグネシウム塩、
・０．１〜５０ｍｇのＣａＣｌ２、
・０．１〜５０ｍｇのＺｎＣｌ２、
・０〜５０ｇのＮａＣｌ、好ましくは６ｇ／ｌを含み、そして
そのｐＨは６．２〜７．５の値の範囲内である前培養培地Ｍ０上で前培養する工程を包含する。
【００５６】
種々の構成物の定義については、培地Ｍ１に関連して上記に与えられる定義に言及し得る。
【００５７】
一方、前培養工程の場合、前培養培地１ｌあたり３．８７または３０ｇのペプトン、特にコムギペプトンが、好適に使用される。培地Ｍ０中のＮａＣｌの濃度は、好ましくは６ｇ／ｌである。前培養工程における前培養培地Ｍ０は、好ましくは、１ｌあたり３．８７ｇのコムギペプトンを含む寒天培地、または１ｌあたり３０ｇのコムギペプトンを含む液体培地のいずれかである。
【００５８】
有利な実施態様によれば、前培養工程は、１ｌあたり以下：３０ｇのコムギペプトン、５ｇの酵母エキス、１ｇのＤ−グルコースＨ２Ｏ、１２０ｍｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、４００ｍｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、６ｇのＮａＣｌ、５ｍｇのＺｎＣｌ２、６．８ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、および６ｇのＮＨ４Ｃｌを含み、好ましくはそれらからなり、そしてｐＨ＝６．５である前培養培地Ｍ０上で株を培養することによって実施される。
【００５９】
別の有利な実施態様によれば、前培養工程は、以下：３．８７ｇのコムギペプトン（または液体培地Ｍ０については３０ｇ／ｌ）、５ｇの酵母エキス、１ｇのＤ−グルコースＨ２Ｏ、１２０ｍｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、４００ｍｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、６ｇのＮａＣｌ、５ｍｇのＺｎＣｌ２、６．８ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、および６ｇのＮＨ４Ｃｌを含み、好ましくはそれらからなり、そしてｐＨ＝６．５である液体または寒天前培養培地Ｍ０上で株を培養することによって実施される。
【００６０】
前培養工程は、接種物を増幅することを可能にする。それは、前培養培地Ｍ０に黄色ブドウ球菌株（例えば、１×１０７ＣＦＵの割合で）を播種し、そして３７℃において、例えば５時間〜２０時間の範囲であり得る期間、５〜１０％（容量）のＣＯ２を含み得る雰囲気中で（Ｔ５についてはＣＯ２なし、Ｂｅｃｋｅｒ株が使用される場合はＣＯ２の存在下）インキュベートすることによって実施され得る。バイオマスを増加させるために、前培養工程は、培地Ｍ０の漸増容量中での連続前培養を含み得る。次いで、前培養物は、液体培地Ｍ１に播種するために使用される。これを行うために、初期ＯＤ６８０ｎｍが０．２であるような接種物の量が使用され得る。前培養工程における培養容量は、通常４００ｍｌ〜２０ｌで変動し得る。容器の容量に対する前培養培地の容量の比率２０％以下が、好ましくは維持される。
【００６１】
培養工程の後、このようにして製造された株は遠心分離によって回収され得、そして凍結乾燥産物、または２０％グリセロールの添加後の凍結産物の形態で保存され得るか、またはより大きな容量の培地に播種するために直接使用され得、そうでなければ本発明による莢膜多糖の製造方法において直接使用され得る。
【００６２】
有利な実施態様によれば、上記の製造方法は、過剰産生Ｒｅｙｎｏｌｄｓ株の製造方法に対応する。
【００６３】
別の有利な実施態様によれば、上記の製造方法は、過剰産生ＣＹＬ７７０株の製造方法に対応する。
【００６４】
本発明はまた、上記の方法によって製造された過剰産生黄色ブドウ球菌株（特に、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、ＢｅｃｋｅｒおよびＣＹＬ７７０株）に関する。
【００６５】
本発明者らは、培地Ｍ１が単純化され得、そして本発明による方法の関連において下記の培地Ｍ２と置換され得ることを示す実験計画を実施した。
【００６６】
別の実施態様によれば、工程（ａ）はそれゆえ、培地１ｌあたり以下：
・５２．５〜１００ｇの植物ペプトン、有利にはコムギペプトン、
・０〜８２．５ｇのＮａＣｌ、有利には５ｇ〜８２．５ｇ、特に４１ｇ／ｌのＮａＣｌ、
・０〜１５ｇ／ｌのマグネシウム塩、有利には０．０１〜１５ｇ／ｌ、特に１５ｇ／ｌのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、および
・０〜７ｇ／ｌの糖、有利には０．２５〜７ｇ／ｌ、特に０．２５ｇ／ｌのＤ−グルコース・Ｈ２Ｏを含み、
・そのｐＨは６．３〜６．７の値の範囲内である培地Ｍ２を使用する。
【００６７】
使用される用語の定義については、培地Ｍ１に関連して上記した定義が参照される。
【００６８】
実験計画の結果は、植物ペプトンが少なくとも５％の全糖含量を含む場合、培地Ｍ２に糖を添加する必要はないことを示す。後者は、糖の混合物（例えば、フルクトース、グルコース、マンノトリオース、ラフィノース、スクロースまたはスタキオース）を含み得る。そうでない場合、別の糖の供給源を培地に添加する必要がある。糖は０．２５ｇ／ｌ〜７ｇ／ｌの割合で添加され得る。
【００６９】
有利な実施態様によれば、培地Ｍ２は０．２５ｇ／ｌの糖、特にＤ−グルコース・Ｈ２Ｏを含む。
【００７０】
培地Ｍ２は、有利には、ＭｇＣｌ２およびＭｇＳＯ４からなる群より選択されるマグネシウム塩を含み得る。本発明者らは、マグネシウム塩の添加が培地の頑強性を増加させることを可能にすることを示した（構成物の変動範囲は、ＭｇＣｌ２の存在下で、実質的により狭い）。塩化マグネシウム、特にＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏは、それゆえ、０．０１ｇ／ｌ〜１５ｇ／ｌ培地の範囲で培地Ｍ２に有利に添加され得る。培地Ｍ２が１５ｇ／ｌのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏを含む場合、最も高い頑強性が観察される。より高い濃度のマグネシウム塩は、いずれのさらなる頑強性の増加ももたらさない。
【００７１】
本発明者らはまた、改善された多糖生産性が、ＮａＣｌ濃度の広い範囲内にある培地Ｍ２を用いて観察されることを示した。詳細には、ＮａＣｌは非存在であるか、または５ｇ／ｌ〜１００ｇ／ｌ、有利には５ｇ／ｌ〜８２．５ｇ／ｌ培地の濃度範囲内で使用されるかのいずれかであり得る。
【００７２】
さらに、実験計画は、ペプトンの濃度とＮａＣｌの濃度との間に強い相互作用が存在することを示すことを可能にした。従って、本発明による方法の関連において有利に使用され得る濃度範囲を定義することが可能となった。
【００７３】
特に有利な実施態様によれば、上記の培地Ｍ２は、５２．５〜７０ｇの植物ペプトン、有利にはコムギペプトン、および５〜３７ｇのＮａＣｌを含む。
【００７４】
別の特に有利な実施態様によれば、上記の培地Ｍ２は、６６〜８２．５ｇの植物ペプトン、有利にはコムギペプトン、および２２〜７４ｇのＮａＣｌを含む。
【００７５】
別の特に有利な実施態様によれば、上記の培地Ｍ２は、６０〜９０．５ｇの植物ペプトン、有利にはコムギペプトン、および３５〜６３．５ｇのＮａＣｌを含む。
【００７６】
別の特に有利な実施態様によれば、上記の培地Ｍ２は、７９〜９５ｇの植物ペプトン、有利にはコムギペプトン、および４６〜８２．５ｇのＮａＣｌを含む。
【００７７】
これらの４つの実施態様による培地Ｍ２は、有利には、０．２５ｇ／ｌのグルコース、特にＤ−グルコース、および１５ｇ／ｌのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏを含み得る。
【００７８】
特定の実施態様によれば、培地Ｍ２は、９３ｇ／ｌのコムギペプトン、４１ｇ／ｌのＮａＣｌ、０．２５ｇ／ｌのＤ−グルコース・Ｈ２Ｏおよび１５ｇ／ｌのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏを含み、有利にはそれらからなり、そのｐＨは６．３〜６．７の値の範囲内である。そのような培地は、例えば、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ株から４０ｍｇ／ｌの多糖Ｔ５の収量を生じる。
【００７９】
本発明者らはまた、実験計画によって、植物ペプトンが６５〜８５ｇ、有利には７５ｇ／ｌの酵母エキスで置換された上記の培地Ｍ２が本発明による方法において使用され得ることを示した。この培地は、培地Ｍ３と呼ばれる。それゆえ、本発明による培地Ｍ３は、培地１ｌあたり以下：
・６５ｇ／ｌ〜８５ｇ／ｌの酵母エキス、有利には７５ｇ／ｌの酵母エキス、
・０〜８２．５ｇのＮａＣｌ、有利には５ｇ〜８２．５ｇ、特に４１ｇ／ｌのＮａＣｌ、
・０〜１５ｇ／ｌのマグネシウム塩、有利には０．０１〜１５ｇ／ｌ、特に１５ｇ／ｌのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、および
・０〜７ｇ／ｌの糖、有利には０．２５〜７ｇ／ｌ、特に０．２５ｇ／ｌのＤ−グルコース・Ｈ２Ｏを含み、
・そのｐＨは６．３〜６．７の値の範囲内である。
【００８０】
さらなる実験は、植物ペプトン範囲（上記）が２００ｇ／ｌ培地の値まで拡張され得ることを示した。植物ペプトンを５２．５〜２００ｇ／ｌの割合で含む上記のＭ２およびＭ３培地は、それゆえ、本発明の範囲に含まれる。
【００８１】
それゆえ、本発明はまた、上記の培地Ｍ２またはＭ３中で使用される方法によって製造された過剰産生黄色ブドウ球菌株（特にＲｅｙｎｏｌｄｓ、Ｂｅｃｋｅｒ、ＣＹＬ７７０およびＣＹＬ１８９２株）に関する。
【００８２】
別の態様によれば、本発明はそれゆえ、以下の工程を包含する莢膜多糖の製造方法に関する：
（ａ）上記の培地Ｍ１またはＭ２またはＭ３上で、上記の黄色ブドウ球菌株を培養する工程、
（ｂ）このようにして製造された培養物を不活性化する工程、および
（ｃ）莢膜多糖を回収する工程。
【００８３】
莢膜多糖の製造方法の培養工程（ａ）は、過剰産生株の製造方法の工程（ａ）に関連して上記したものと同じ条件下で実施され得、そしてまた上記の前培養工程によって先行され得る。
【００８４】
工程（ａ）から得られた培養物は、次いで、不活性化工程に供される。
【００８５】
不活性化工程は、培養物を２％（容量、終濃度）の割合のフェノール／エタノール（Ｖ／Ｖ）混合物で処理し、次いで、例えばマグネチックバーによって周囲温度において６時間〜４８時間（処理されるべきバイオマスに依存する）撹拌することによって実施され得る。不活性化は、死亡率試験によって確認される。これを行うために、１００μｌの処理された培養物はＣｏｌｕｍｂｉａ  ａｇａｒ  ２％ＮａＣｌ上にプレーティングされ、同時に、１００μｌの処理された培養物が３０分の１のウマ血清を補充したｔｒｙｐｃａｓｅ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ中に播種される。培養物は、４８時間３７℃において静置位置において培養され、ブロスフラスコの栓はゆるめたままである。培養物の不活性化は、３７℃において１６〜１８時間振盪するＴＳＢ培地（血清の添加なし）中での増幅工程を包含する方法によって制御され得、次いで、Ｃｏｌｕｍｂｉａ  ａｇａｒ  ２％ＮａＣｌのペトリ皿に、１５０μｌのこのようにして増幅された培養物が接種される。ペトリ皿自体は３７℃において１６〜１８時間置かれ、次いで観察される。コロニーの欠如は、処理された培養物の不活性化の成功を証明する。生存細菌の欠如は、２４時間３７℃においてインキュベートした後の増殖の欠如によって反映される。一旦培養物の死亡率が確立されると、莢膜多糖が回収される。回収工程は、細胞から多糖を抽出することを含む。種々の抽出技術が文献に記載されており、本発明の関連において使用され得る。例えば、Ｌｅｅ  Ｊ．Ｃ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎｕ．  １９９３；  ６７：１８５３−１８５８；  Ｄａｓｓｙ  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９９１；  １３７：１１５５−１１６２による論文を参照し得る。１２１℃におけるオートクレーブによる抽出方法は、実施例２．３において説明される。リゾスタフィンを使用する抽出技術は、実施例２．５に記載される。
【００８６】
ＣＹＬ７７０株の場合、大部分の多糖は培養上清に分泌され、それゆえ直接後者から回収され得る。これを行うために、培養の終わりに、培地は遠心分離され、そして細胞ペレットは除去される。
【００８７】
次いで、必要に応じて、得られた莢膜多糖は精製され得る。種々の精製技術が文献に記載されており、そして本発明の関連において使用され得る。例えば、Ｌｅｅ  Ｊ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ  １９８７；  ５５：２１９１−２１９７；  Ｆａｔｔｏｍ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  １９９０；  ５８：２３６７−２３７４による論文を参照し得る。精製技術は、実施例２．５において説明される。
【００８８】
単糖のモル組成分析および５００ＭＨＺにおける陽子ＮＭＲ分析は、７０％より高いＯ−アセチル化の程度および少なくとも７０％の純度を有して、その構造が文献の記載に従う多糖が得られることを示す。残留物質が最終産物中に、約０．５〜３％（ｗ／ｗ）のタンパク質型の残留物質、ならびに０．１％（ｗ／ｗ）未満の残留核酸、ならびに５％（ｗ／ｗ）未満の残留リポテイコ酸および残留テイコ酸の比率で存在する。
【００８９】
得られた莢膜多糖の量は、実施例２．４に記載のようなＥＬＩＳＡ技術によって評価され得る。
【００９０】
本発明によるＰＳの製造方法は、それゆえＴ５多糖（好ましくはＲｅｙｎｏｌｄ株（例えば、ＣＩＰ１０３３１３）から）およびＴ８多糖（好ましくはＣＹＬ７７０株から）を製造するために有利に使用され得る。
【００９１】
別の態様によれば、本発明はそれゆえ、黄色ブドウ球菌の培養に適切な上記の培地Ｍ０に関する。
【００９２】
本発明の関連において、表現「黄色ブドウ球菌の培養に適切な培地」は、第１に６８０ｎｍにおける吸光度を測定することによって決定される少なくとも１０の係数でのバイオマスの増加、および第２にＯＤ／ＣＦＵ比率が少なくとも１  ＯＤユニット＝１０８  ＣＦＵ／ｍｌであるような生存率を得ることを可能にする培地を意味することが意図される。このＯＤ／ＣＦＵ比率を決定するために、細菌懸濁物（分光光度計を使用してその吸光度が測定されている）は、１０倍希釈を使用してＰＢＳ緩衝液中に希釈される。これらの希釈物中に含まれるＣＦＵの数は、栄養素培地（例えば、Ｃｏｌｏｍｂｉａ  ａｇａｒ）を含むペトリ皿上への後者の播種の後に評価される。２４時間の３７℃におけるインキュベーションの後、生存細菌が計数され、従って生存細菌数（コロニー形成単位（ＣＦＵ）として表される）と吸光度（ＯＤ）との間の対応が確立され得る。
【００９３】
別の態様によれば、本発明はまた、黄色ブドウ球菌莢膜多糖の過剰産生に適切な上記の培地Ｍ１、Ｍ２およびＭ３に関する。
【００９４】
本発明の関連において、表現「莢膜多糖の過剰産生に適切な培地」は、同じ培養条件下であるがポートレル培地上で同じ出発株を培養することによって産生されるものより、少なくとも３倍、好ましくは少なくとも５倍、特に少なくとも１０倍高い莢膜多糖の産生（実施例２．４において定義されるＥＬＩＳＡアッセイによって決定される）をもたらす、黄色ブドウ球菌株が莢膜多糖を分泌する能力の増加を生じる培地を意味することが意図される。
【００９５】
組換え株の場合、それが、同じ培養条件下であるがＴＳＢ培地上で同じ出発株を培養することによって産生されたものの少なくとも２倍の莢膜多糖の産生（実施例２．４に記載のＥＬＩＳＡアッセイによって決定される）をもたらす、組換え黄色ブドウ球菌株が莢膜多糖を分泌する能力の増加を生じる場合、培地は莢膜多糖の過剰産生に適切であると考えられる。
【００９６】
ここで、本発明は、以下の実施例においてより詳細に記載される。実施例は、純粋に本発明の説明として与えられるのであって、本発明の範囲の制限としては決して考慮され得ない。
【実施例】
【００９７】
実施例１：培地の調製
まず、各構成物のストック溶液を調製する。これを行うために、構成物を精密天秤上で秤量し、そして限外濾過水に溶解する（ほかに示さない場合）。次いで、このようにして得られた溶液を、０．２２μｍ  ｓｔｅｒｉｃｕｐを通して濾過し、＋４℃において暗所に保存する。コムギペプトン、酵母エキスおよびＦｅＣｌ３のストック溶液を用時調製する。
【００９８】
１．１  −  ポートレル培地
Ｐｏｕｔｒｅｌら（Ｐｏｕｔｒｅｌ，  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）．  Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２，  １６６−１７１）による論文において示されるように、種々のストック溶液を混合することによってポートレル培地を調製する。次いで、３０％ＮａＯＨを添加することによってｐＨを７に調整し、培地を、０．２２μｍを通して濾過する。
【００９９】
培地の最終組成（ｇ／ｌ）は以下のとおりある：Ｌ−シスチン：０．２４ｇ／ｌ／；Ｌ−アスパラギン酸：２．４  ｇ／ｌ；Ｌ−グルタミン酸：２．４ｇ／ｌ；Ｌ−プロリン：２．４ｇ／ｌ；Ｌ−アルギニン：０．３６ｇ／ｌ；Ｌ−グリシン：２．４ｇ／ｌ；Ｌ−ヒスチジン：０．４８ｇ／ｌ；Ｌ−リジンＨＣｌ：０．６ｇ／ｌ；Ｌ−セリン：２．４ｇ／ｌ；Ｌ−バリン：０．４８ｇ／ｌ；Ｌ−チロシン：０．１８ｇ／ｌ；Ｌ−スレオニン：２．４ｇ／ｌ；Ｌ−アラニン：２．４ｇ／ｌ；Ｌ−イソロイシン：０．６ｇ／ｌ；Ｌ−ロイシン：０．６ｇ／ｌ；Ｌ−フェニルアラニン：０．２ｇ／ｌ；Ｌ−トリプトファン：０．０６ｇ／ｌ；Ｌ−メチオニン：０．１８ｇ／ｌ；Ｄ−グルコース：１０ｇ／ｌ；ニコチン酸：１１．９４ｍｇ／ｌ；チアミンＨＣｌ：０．６ｍｇ／ｌ；硫酸アンモニウム：６．８４ｇ／ｌ；リン酸二水素カリウム：１．３４ｇ／ｌ；  二リン酸ナトリウム：１４．３８ｇ／ｌ；塩化カルシウム：５ｍｇ／ｌ；  塩化コバルト六水和物：２．４ｍｇ／ｌ；硫酸銅：０．５ｍｇ／ｌ；硫酸マンガン：５．６ｍｇ／ｌ；塩化ナトリウム：５．８ｍｇ／ｌ；塩化亜鉛：３．４ｍｇ／ｌ；塩化鉄：２７ｍｇ／ｌ；硫酸マグネシウム：２４７  ｍｇ／ｌ。
【０１００】
１．２  −  寒天培地Ｍ０、液体培地Ｍ０、Ｍ１培地
寒天培地Ｍ０について
まず、３ｇの寒天を１５０ｍｌの限外濾過Ｈ２Ｏに溶解することによって、１５０ｍｌの寒天ベースを調製する。寒天の粒子が消失するまで（約３０分間）、得られた組成物を沸騰水浴中に入れ、次いで１１６℃において３０分間オートクレーブ中で滅菌する。
【０１０１】
次いで、種々のストック溶液を混合し（下記の組成において示される順序で）、得られた混合物を０．２２μｍ  ｓｔｅｒｉｃｕｐを通して濾過し、そしてこのようにして得られた混合物（５０ｍｌ）を寒天ベースに添加して、以下（ｇ／ｌ）：
コムギペプトン：３．８７ｇ；酵母エキス：５ｇ；Ｄ−グルコースＨ２Ｏ：１ｇ；ＮａＣｌ：６ｇ；ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ：０．４ｇ；（ＮＨ４）２ＳＯ４：６．８ｇ；ＮＨ４Ｃｌ：６ｇ；ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ：１２０×１０−３ｇ；ＺｎＣｌ２：５×１０−３ｇ；ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ：１０×１０−３ｇを含む培地を得ることによって寒天培地Ｍ０を調製する。
【０１０２】
次いで、８つのペトリ皿に注ぐ。
【０１０３】
使用したコムギペプトンは、Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ（ｒｅｆ．１９５５９）からのコムギペプトンに対応する。使用した酵母エキスは、Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ｒｅｆ．２１２７５０）からのエキスに対応する：
【０１０４】
液体培地Ｍ０について：
種々のストック溶液を混合し（下記の組成において示される順序で）、そして得られた混合物を０．２２μｍ  ｓｔｅｒｉｃｕｐを通して濾過して、以下（ｇ／ｌ）：
コムギペプトン：３０ｇ；酵母エキス：５ｇ；Ｄ−グルコースＨ２Ｏ：１ｇ；ＮａＣｌ：６ｇ；ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ：０．４ｇ；（ＮＨ４）２ＳＯ４：６．８ｇ；ＮＨ４Ｃｌ：６ｇ；ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ：１２０×１０−３ｇ；ＺｎＣｌ２：５×１０−３ｇ；ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ：１０×１０−３ｇを含み、ｐＨ＝６．５である培地を得ることによって、液体培地Ｍ０を調製する。
【０１０５】
培地Ｍ１について
種々のストック溶液を混合し（下記の組成において示される順序で）、そして得られた混合物を０．２２μｍ  ｓｔｅｒｉｃｕｐを通して濾過して、以下（ｇ／ｌ）：
コムギペプトン：３０ｇ；酵母エキス：５ｇ；Ｄ−グルコースＨ２Ｏ：１ｇ；ＮａＣｌ：５８．５ｇ；ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ：０．４ｇ；（ＮＨ４）２ＳＯ４：６．８ｇ；ＮＨ４Ｃｌ：６ｇ；ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ：１２０×１０−３ｇ；ＺｎＣｌ２：５×１０−３ｇ；ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ：１０×１０−３ｇを含む培地を得ることによって、培地Ｍ１を調製する。
【０１０６】
１．３  −  Ｃｏｌｏｍｂｉａ  ａｇａｒ  ２％ＮａＣｌ
１ｌの培地について、４４ｇのＣｏｌｕｍｂｉａ「Ｂｌｏｏｄ  Ａｇａｒ  Ｂａｓｅ」（Ｄｉｆｃｏ  ｒｅｆ．  ２７９２４０）を秤量し、次いで５００ｍｌの滅菌限外濾過Ｈ２Ｏを添加する。得られた混合物を１００℃の水浴中で約３０分間（完全な溶解および透明な溶液が得られるまで）インキュベートする。次いで、５００ｍｌの滅菌限外濾過Ｈ２Ｏを添加する。溶液を２００ｍｌ  Ｓｃｈｏｔｔフラスコに分注し、次いで１１６℃において３０分間オートクレーブすることによって滅菌する。次いで、ペトリ皿に注ぐ（２５ｍｌ／ペトリ皿）前に、５５℃（水浴）において培地を保持する。ペトリ皿に注ぐ前に、２％（＝２ｇ／１００ｍｌ）の終濃度を得るように、２００ｍｌフラスコあたり１３．３ｍｌの３０％ＮａＣｌ（０．２２μｍを通して濾過した）を添加する。
【０１０７】
１．４  −  Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ａｇａｒ（ＧＴＳ）
１ｌの培地について、４０ｇの「Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ａｇａｒ」（Ｄｉｆｃｏ  ｒｅｆ．  ２３６９５０）を秤量し、次いで５００ｍｌの滅菌限外濾過Ｈ２Ｏを添加する。得られた混合物を１００℃の水浴中で約３０分間（完全な溶解および透明な溶液が得られるまで）インキュベートする。次いで、５００ｍｌの滅菌限外濾過Ｈ２Ｏを添加する。溶液を２００ｍｌ  Ｓｃｈｏｔｔフラスコに分注し、次いで１１６℃において３０分間オートクレーブすることによって滅菌する。次いで、ペトリ皿に注ぐ（２５ｍｌ／ペトリ皿）前に、５５℃（水浴）において培地を保持する。
【０１０８】
１．５  −  「Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ」Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）
１ｌの培地について、３０ｇの「Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ」（Ｄｉｆｃｏ  ｒｅｆ．  ２１１８２５）を秤量し、次いで５００ｍｌの滅菌限外濾過Ｈ２Ｏを添加する。得られた混合物を１００℃の水浴中で約３０分間（完全な溶解および透明な溶液が得られるまで）インキュベートする。次いで、５００ｍｌの滅菌限外濾過Ｈ２Ｏを添加する。溶液を２００ｍｌ  Ｓｃｈｏｔｔフラスコに分注し、次いで１１６℃において３０分間オートクレーブすることによって滅菌する。次いで、ペトリ皿に注ぐ（２５ｍｌ／ペトリ皿）前に、５５℃（水浴）において培地を保持する。
【０１０９】
実施例２：種々の培養条件下での５型莢膜多糖（ＣＰ５）製造の評価
２．１  −  Ｒｅｙｎｏｌｄｓ株の培養
動物起源の化合物を含まない条件下または標準的な条件下のいずれで操作することが所望されるかに依存して、２つの異なる方法で凍結材料を調製した。標準的な条件については、出発凍結乾燥材料をＣｏｌｏｍｂｉａ  ａｇａｒ＋２％ＮａＣｌ上に取り出す。後者を１８時間３７℃で、株に依存してＣＯ２有りまたは無しで培養する。対数増殖期の微生物を得るために、４時間３７℃において新たな寒天ペトリ皿上で培養物を再度継代培養する。次いで、培養物をｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ中に回収し、そこに２０％のグリセロールを添加する。動物起源の化合物を含まない条件が必要とされる場合、前培養を培地Ｍ０上で１８時間３７℃において実施し、次いで接種物を使用して液体培地Ｍ０を継代培養する。また、２０％グリセロール添加後、凍結を実施する。
【０１１０】
上記の第１の方法によって得られた１００μｌの凍結Ｒｅｙｎｏｌｄｓ材料を、９００μｌのＰＢＳ中に取り出す。
【０１１１】
２つの寒天培地Ｍ０のペトリ皿および２つのｃｏｌｕｍｂｉａ  ａｇａｒ  ２％ＮａＣｌのペトリ皿に、ペトリ皿あたり１５０μｌの細菌懸濁物の層を播種し、そして１８〜２０時間３７℃においてインキュベートする。
【０１１２】
層をかき取り、５ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁する。懸濁物のＯＤ６８０ｎｍを測定する。これはＯＤ６８０ｎｍ＝０．２で５０ｍｌ三角フラスコに播種するために必要な前培養物の容量を決定することを可能にする。
【０１１３】
Ｃｏｌｕｍｂｉａ  ａｇａｒ  ２％ＮａＣｌ上での前培養物を、ポートレル培地を含む三角フラスコに播種するために使用し、寒天Ｍ０上での前培養物（１８〜２０時間、３７℃において）を、液体培地Ｍ０を含む三角フラスコおよび培地Ｍ１を含む三角フラスコに播種するために使用する。容量はアッセイによって変動し得、そして最も一般的には５０ｍｌである。適正な酸素負荷を維持するために、培地の容量は三角フラスコの容量の２０％以下である。
【０１１４】
初期ＯＤ６８０ｎｍ値の確認後、３７℃において三角フラスコを振盪する（×１００ｒｐｍ）。
【０１１５】
６８０ｎｍにおけるＯＤをｔ０、ｔ８ｈ、ｔ２４ｈ、ｔ３２ｈ、ｔ４８ｈ、ｔ５６ｈ、およびｔ７２ｈにおいて測定することによって培養物をモニターし、ｐＨを最初および培養７２時間において測定する。５０ｍｌの培養物について得られた結果を、下記の表１および２において報告する。
【０１１６】
【表１】
2008538702.tif 000003
【０１１７】
【表２】
2008538702.tif 000004
【０１１８】
２．２  −  培養物の不活性化
７２時間において、培養物を各々７５０ｍｌの培養物を含む４つの１ｌ  Ｓｃｈｏｔｔフラスコに分注する。
【０１１９】
７５０ｍｌの培養物について１５ｍｌのフェノール／エタノール（ｖ／ｖ）（すなわち、２％の終濃度）を添加し、混合物をマグネチックバーを使用して周囲温度において約４８時間撹拌する。
【０１２０】
死亡率試験を以下の方法で実施する：
１００μｌの処理された培養物をＣｏｌｕｍｂｉａ  ２％ＮａＣｌ上にプレーティングし、そして１００μｌの処理された培養物をｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ＋３０分の１ウマ血清に播種し、次いで４８時間３７℃においてインキュベートする（ｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈのフラスコの栓はゆるめたままにする）。このようにして不活性化された培養物を使用して、多糖を抽出し、そして製造された量をＥＬＩＳＡによって評価する。
【０１２１】
２．３  −  製造された多糖の抽出
次いで、不活性化された７２時間培養物を、３０分間３５００ｒｐｍで＋４℃において遠心分離し、培養上清を分離し、そして＋４℃で保存する。ペレットを５ｍｌのＰＢＳ中に取り出し、６０分間１２１℃においてオートクレーブし、次いで３０分間２５０００ｇおよび＋４℃で遠心分離する。上清（抽出物１）を回収する。ペレットを５ｍｌのＰＢＳ中に取り出し、６０分間１２１℃においてオートクレーブし、３０分間２５０００ｇおよび＋４℃において遠心分離する。上清（抽出物２）を回収する。抽出物１および２を合し、そして５０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを用いて１時間３７℃において処理し、次いで２０分間７５℃においてタンパク質を不活性化する。
【０１２２】
２．４  −  ＥＬＩＳＡによる、製造された多糖の量の評価
Ｋａｒａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９８５  Ｓｅｐ；  ２２（３）：４４５−７に記載の方法によって、５型または８型莢膜に対するポリクローナル血清を製造した。使用するモノクローナルは、Ｈｏｃｈｋｅｐｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９８７  Ｍａｒ；  ２５（３）：５２６−３０に記載のプロトコルよって製造され、パスツール研究所によって本発明者らに供与された。
【０１２３】
製造された莢膜多糖の量をＥＬＩＳＡによって決定する。これを行うために、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ，  Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，  Ｄｅｎｍａｒｋ）上で実施する。第１の工程において、抗ＣＰ５モノクローナル抗体（０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ＝９．６（Ｓｉｇｍａ）中１μｇ／ｍｌ−１００ｎｇ／ウェル）をウェル中に入れ、そしてプレートを一晩４℃においてインキュベートする。次いで、プレートを４回１ウェルあたり３００μｌの、０．０５％のｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）を補充したＰＢＳ緩衝液（Ｅｕｒｏｂｉｏ）（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）を用いて洗浄し、次いで、１時間３７℃において１ウェルあたり２５０μｌの、１％（容量／重量）のＢＳＡ（Ｅｕｒｏｂｉｏ）を補充したＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−ＢＳＡ）を用いて飽和させる。次いで、プレートを３回ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液を用いて洗浄する。
【０１２４】
工程２．３由来の抽出物の段階２倍希釈物を、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ溶液を使用して調製し、１００μｌ／ウェルの割合で添加する。プレートを９０分間３７℃においてインキュベートし、次いで４回ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いて洗浄する。Ｋａｒａｋａｗａ（Ｋａｒａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９８５，  Ｓｅｐ；  ２２（３）：  ４４５−７）のプロトコルに従って製造された抗ＣＰ５ウサギポリクローナル抗体をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−ＢＳＡ中で希釈し（１／２０００）、次いで１００μｌ／ウェルの割合でウェルに添加し、そしてプレートを９０分間３７℃でインキュベートする。次いで、プレートを４回ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いて洗浄する。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−ＢＳＡ中で希釈した（１／６０００）抗ウサギヤギＩｇＧペルオキシダーゼ結合体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｉｏｔｅｃｈ）を、１００μｌ／ウェルの割合で添加し、そしてプレートを１時間３７℃においてインキュベートする。プレートを３００μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いて８回洗浄し、そして１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（ＴＥＢＵ）溶液を添加し、続いて暗所で１５分間周囲温度（約２２℃）においてインキュベートする。酵素反応を、１ウェルあたり１００μｌの１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４  １Ｍ（Ｓｉｇｍａ）を添加することによって停止させる。
【０１２５】
次いで、自動プレートリーダー（Ｖｅｒｓａｍａｘ）で４５０ｎｍにおける吸光度を測定する。コントロールの値を差し引き、そして標準曲線と比較することによって量を評価する。
【０１２６】
結果を、下記の表３において報告する。
【０１２７】
【表３】
2008538702.tif 000005
【０１２８】
２．５  −  多糖ＣＰ５の抽出および精製
Ｒｅｙｎｏｌｄｓ株を項目２．１に記載のように、寒天培地Ｍ０上での前培養および次いで三角フラスコ中の４００ｍｌの培地Ｍ１中での培養を含むプロトコルに従って培養する。培養物を合して、３ｌの培養物を得、そこから製造されたＴ５多糖を抽出および精製する。
【０１２９】
培養物全体をフェノール−エタノール（終濃度２％Ｖ／Ｖ）での処理によって不活性化し、次いで３０分間２５０００ｇにおいて遠心分離する。１ｌの培養物あたり約１０．９ｇの湿潤不活性化微生物のペレットを得る。
【０１３０】
微生物を、０．５ｇ／ｍｌ  ５０ｍＭトリス、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、ｐＨ７．５の割合で懸濁する。１００μｇ／ｍｌの終濃度を得るように、リゾスタフィン水溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を添加する。４時間３７℃におけるマグネチック撹拌を用いてのインキュベーションの後、ｂｅｎｚｏｎａｓｅ溶液（５Ｕ／ｍｌの終濃度）を添加し、そしてインキュベーションを２時間３７℃においてマグネチック撹拌を用いて実施する。
【０１３１】
遠心分離（２５０００ｇ、３０分）後、抽出上清を回収し、合し、そして限外濾過した。限外濾過システムに充分な容量を得るように、事前に上清をＨ２Ｏ中で１／４に希釈する。限外濾過を、以下の条件下で２ＵＦ  ５９ｋＤカセット上で実施する：Ｈ２Ｏ：１０倍容量；次いで５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０：３倍容量。限外濾過の間、保持物(retentat）の容量は一定のままである。保持物は、ＣＰ５抽出物と呼ばれるものを構成する。
【０１３２】
ＣＰ５抽出物を、３７℃においてＭｇＣｌ２（１ｍＭの終濃度）およびｂｅｎｚｏｎａｓｅ（５Ｕ／ｍｌの終濃度、すなわち、約４０Ｕ／ｇ処理湿潤微生物）の存在下で撹拌しながらインキュベートする。３時間のインキュベーション後、ｂｅｎｚｏｎａｓｅを５Ｕ／ｍｌの終濃度で添加し、そしてインキュベーションを３時間継続する。４Ｕ／ｍｌの終濃度（すなわち、約３０Ｕ／ｇ処理湿潤微生物）が得られるように、プロナーゼ水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、ＣａＣｌ２を１ｍＭの終濃度で補充する。次いで、混合物を１５時間３７℃においてインキュベートする。核酸およびタンパク質フラグメントを除去するために、２つのＵＦ  ５０Ｋｄカセット上で、以下の条件下、５０ｋＤ限外濾過を実施する：Ｈ２Ｏ：１０倍容量、次いで５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０：３倍容量。限外濾過の間、保持物の容量は一定のままである。上記で得られた保持物に、以下を添加し：ＭｇＣｌ２（１ｍＭの終濃度）、ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（０．１Ｕ／ｍｌの終濃度）、そしてマグネチック撹拌用いて混合物を３時間インキュベートする。
【０１３３】
ＣａＣｌ２を１ｍＭの終濃度で補充したプロナーゼ水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を０．１Ｕ／ｍｌの終濃度で添加し、次いで混合物を２時間３７℃においてインキュベートする。
【０１３４】
次いで、２つのＵＦ  ３０ＫＤカセット上での限外濾過を、以下の条件下で実施する：Ｈ２Ｏ：１０倍容量、次いで５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５：３倍容量。得られた保持物は、白っぽい沈殿物／濁りを示し、８０００ｇで３０分間遠心分離することによってそれを除去する。
【０１３５】
次いで、イオン交換クロマトグラフィー上での精製工程を実施する。
【０１３６】
それは、残留物質（特に、テイコ酸（ＴＡ）およびリポテイコ酸（ＬＴＡ））を除去することを可能にする。
【０１３７】
以下の条件を使用する：３つの５ｍｌ  Ｈｉ  Ｔｒａｐ  Ｑ  ＨＰカラムを直列に連結する（Ｒｅｆ：Ａｍｅｒｓｈａｍ  １７−１１５４−０１）；平衡緩衝液：２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５；流速：２ｍｌ／分；サンプルを平衡緩衝液中で注入。
【０１３８】
溶出：
−  ２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５：５倍カラム容量
−  ２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、０〜０．５Ｍ  ＮａＣｌの勾配：１０倍カラム容量
−  ２０ｍＭトリス、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５：５倍カラム容量
−  ２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、０．５〜１Ｍ  ＮａＣｌの勾配：５倍カラム容量
−  ２０ｍＭトリス、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５：５倍カラム容量
−  ２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５：５倍カラム容量
【０１３９】
２０６および２８０ｎｍにおける吸光度の測定によって、溶出をモニターする。ＣＺＥ分析は、クロマトグラフィーの間に溶出される種々の構成物を同定することを可能にする。
【０１４０】
ＣＰ５多糖を、０．２Ｍ〜０．３Ｍの間のＮａＣｌ濃度において溶出する。使用するクロマトグラフィー条件下で、多糖は残留物質（特に、０．３６Ｍ〜０．４８Ｍの間のＮａＣｌで溶出されるテイコ酸、および０．７４Ｍ〜０．８６Ｍの間のＮａＣｌで溶出されるリポテイコ酸）から明確に分離される。
【０１４１】
ＣＰ５を含む画分を合し、そして＋４℃において２０倍容量の０．５Ｍ  ＮａＣｌ水溶液（２〜３浴（bain））、次いで２０倍容量の限外濾過水（３〜４浴）に対して透析する。このようにして、トリスを除去する。
【０１４２】
精製産物を凍結乾燥し、−２０℃において保存する。
【０１４３】
３ｌの培養物から、精製の終わりに７４ｍｇのＴ５莢膜多糖が得られる。産物の特性を、下記の表４において報告する。
【０１４４】
【表４】
2008538702.tif 000006
【０１４５】
実施例３：種々の培養条件下での８型莢膜多糖（ＣＰ８）生産性の評価
評価を、ＢｅｃｋｅｒおよびＣＹＬ７７０株に対して実施する。
【０１４６】
３．１  −  Ｂｅｃｋｅｒ株の培養
動物起源の化合物を含まない条件下または標準的な条件下のいずれで操作することが所望されるかに依存して、２つの異なる方法で凍結材料を調製する。標準的な条件については、初期凍結乾燥材料を、Ｃｏｌｏｍｂｉａ  ａｇａｒ＋２％ＮａＣｌ上に取り出す。後者を、１８時間３７℃において株に依存してＣＯ２有りまたは無しで培養する。対数増殖期の微生物を得るために、培養物を新たな寒天ペトリ皿上で４時間３７℃において再度継代培養する。次いで、ｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ中に培養物を回収し、そこに２０％のグリセロールを添加する。動物起源の化合物を含まない条件が必要とされる場合、前培養を培地Ｍ０上で１８時間３７℃において実施し、次いで接種物を使用して液体培地Ｍ０を継代培養する。２０％グリセロール添加後、凍結をまた実施する。
【０１４７】
ｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ法によって調製されたＢｅｃｋｅｒ凍結材料１００μｌを、９００μｌのＰＢＳ中に取り出す。３つの寒天Ｍ０のペトリ皿、２つのｃｏｌｕｍｂｉａ  ａｇａｒ  ２％  ＮａＣｌのペトリ皿、および１つのＧＴＳペトリ皿に、ペトリ皿あたり１５０μｌの細菌懸濁液の層を播種する。ペトリ皿を、１８／２０時間３７℃＋５％ＣＯ２においてインキュベートする。
【０１４８】
層をかき取り、そして５ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁する。
【０１４９】
懸濁物のＯＤ６８０ｎｍを測定する。これはＯＤ６８０ｎｍ＝０．２で５０ｍｌ三角フラスコに播種するために必要とされる前培養物の容量を決定することを可能にする。
【０１５０】
ｃｏｌｕｍｂｉａ  ａｇａｒ  ２％ＮａＣｌ上の前培養物をポートレル培地を含む三角フラスコに播種するために使用し、ＧＴＳ上の前培養物をＴＳＢを含む三角フラスコに播種するために使用し、そして寒天培地Ｍ０上の前培養物を液体培地Ｍ０を含む三角フラスコおよび培地Ｍ１を含む三角フラスコに播種するために使用する。適正な酸素負荷を維持するために、培地の容量は三角フラスコの容量の２０％以下である。
【０１５１】
初期ＯＤ６８０ｎｍ値の確認後、三角フラスコを３７℃において振盪（１００ｒｐｍ）する。
【０１５２】
同様の実験を、４００ｍｌの培地を含む三角フラスコ中で実施する。
【０１５３】
３．２  −  ＣＹＬ７７０株の培養
組換えＣＹＬ７７０株について、凍結材料を調製する方法は、ＴＳＢ培地上または液体培地Ｍ０上での初期凍結材料の継代培養を使用する。培養を、５時間３７℃において振盪しながら実施する。培地に２０％グリセロールを添加後、凍結を実施する。
【０１５４】
このようにして得られた１つの凍結ＣＹＬ７７０材料１ｍｌを、１０ｍｌの液体培地Ｍ０を用いて取り出し、次いで５０ｍｌ三角フラスコ中に入れ、そして１８／２０時間３７℃において振盪しながら（１００ｒｐｍ）インキュベートする。第２の凍結ＣＹＬ７７０材料を、１０ｍｌのＴＳＢ培地中に取り出し、次いで振盪しながら、以前と同じ条件下に置く。
【０１５５】
液体前培養物のＯＤ６８０ｎｍを測定する。これはＯＤ６８０ｎｍ＝０．２で５０ｍｌ三角フラスコに播種するために必要とされる前培養物の容量を決定することを可能にする。
【０１５６】
ＴＳＢ中の前培養物は、ＴＳＢを含む三角フラスコに播種することを可能にし、そして液体Ｍ０中の前培養物は、培地Ｍ１を含む三角フラスコに播種することを可能にする。適正な酸素負荷を維持するために、培地の容量は三角フラスコの容量の２０％以下である。
【０１５７】
初期ＯＤ６８０ｎｍ値の確認後、三角フラスコを３７℃において振盪（１００ｒｐｍ）する。
【０１５８】
同様の実験を、４００ｍｌの培地を含む三角フラスコ中で実施する。
【０１５９】
３．３  −  培養物のモニター
６８０ｎｍにおけるＯＤをt0、t8h、t24h、t32h、t48h、t56hおよびt72hで測定することによって、培養物をモニターする。
【０１６０】
最初および培養７２時間においてｐＨを測定する。５０ｍｌの培養物の結果を、下記の表５において報告する。
【０１６１】
【表５】
2008538702.tif 000007
【０１６２】
３．４  −  培養物の不活性化
上記の項目２．２のものと同じプロトコルによって、培養物を不活性化する。上記の項目２．３のものと同じプロトコルによって、製造された多糖の抽出を実施する。
【０１６３】
３．５  −  ＥＬＩＳＡによる、製造された多糖の量の評価
使用される抗体が抗ＣＰ８抗体であり、そしてペレット抽出物および培養上清に対してアッセイを実施することを除いて上記の項目２．４のものと同じＥＬＩＳＡアッセイを使用して、製造された多糖の量の評価を実施する。２００００分の１に希釈したモノクローナルＫ８−２４を含む腹水を用いて吸着を実施し、そしてウサギポリクローナル抗体が１０００分の１に希釈した吸着血清である。
【０１６４】
下記の表６において、５０ｍｌおよび４００ｍｌの培養物について得られた結果を報告する。４００ｍｌの培養物について、５０ｍｌの培養物の単一サンプルに対して毎回分析を実施し、次いで総量を算出して、表６において報告する。
【０１６５】
【表６】
2008538702.tif 000008
【０１６６】
３．６  −  製造されたＰＳの回収および精製
Ｔ５多糖の取得について実施例２に記載した方法を使用して、培地Ｍ１中でのＢｅｃｋｅｒ株の４００ｍｌ三角フラスコ培養物から、Ｔ８多糖を回収した。
【０１６７】
また、培地Ｍ−１中のＣＹＬ７７０株の４００ｍｌ三角フラスコ培養物およびＴＳＢ培地上の培養物からＴ８多糖を精製した。これを行うために、上記の方法に従ってフェノール−エタノールでの処理によって、８００ｍｌの培養物を不活性化し、次いで３０分間２５０００ｇで遠心分離する。７２０ｍｌの上清を得た。
【０１６８】
４％の酢酸ナトリウムの終濃度が得られるような量の酢酸ナトリウムを、５００ｍｌのこの上清に添加する。３０分間周囲温度において懸濁物を撹拌する。次いで、５０％のエタノールの終濃度が得られるような量のエタノールを添加する。次いで、周囲温度において３０分間懸濁物を撹拌し、次いで撹拌せずに一晩＋４℃において保存する。
【０１６９】
１５０００ｇで３０分間の遠心分離の後、上清を回収する。４％の酢酸ナトリウムおよび８５％のエタノールの終濃度が得られるように、この上清に酢酸ナトリウムおよびエタノールを添加する。３０分間周囲温度において懸濁物を撹拌し、次いで撹拌せずに一晩４℃において保存する。１５０００ｇで３０分間の遠心分離の後、ペレットを回収する。
【０１７０】
このようにして得られたペレットを１００ｍｌの限外濾過水を用いて取り出す（遠心分離した培養上清の容量に関して５倍濃度）。ペレットが完全に溶解するまで周囲温度においてマグネチック撹拌した後、得られた懸濁物を２ｌの限外濾過水に対して、周囲温度におけるその日の間の３回の浴交換、およびそれに続く４℃における一晩の工程を行って透析する。次いで、５０ｍＭのトリスおよび１ｍＭのＭｇＣｌ２の終濃度が得られるように、トリスおよびＭｇＣｌ２をこのようにして得られた懸濁物に添加する。３７℃においてｂｅｎｚｏｎａｓｅの存在下（５Ｕ／ｍｌの終濃度）で撹拌しながら、この溶液をインキュベートする。３時間のインキュベーション後、ｂｅｎｚｏｎａｓｅを５Ｕ／ｍｌの終濃度で添加し、インキュベーションを３時間継続する。
【０１７１】
４Ｕ／ｍｌの終濃度が得られるようにプロナーゼ水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、ＣａＣｌ２（１ｍＭの終濃度）を補充する。次いで、１５時間３７℃においてこの工程をインキュベートする。可視の濁り／乳白色が出現する場合、８０００ｇで３０分間の遠心分離を実施する。
【０１７２】
以下の条件下で、タンパク質および核酸のフラグメントを除去するために、３０ｋＤａ限外濾過を実施する：Ｈ２Ｏ：１０倍容量；次いで２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５：３倍容量。
【０１７３】
保持物の容量は限外濾過の間一定のままであり、非常にわずかに着色した透明な溶液が得られる。
【０１７４】
得られた保持物が少しでも濁り／乳白色を示す場合、８０００ｇで３０分間の遠心分離によって後者を除去する。
【０１７５】
次いで、残留物質（特に、テイコ酸（ＴＡ）およびリポテイコ酸（ＬＴＡ））の除去を完了するために、以下の条件下で、イオン交換クロマトグラフィー工程を実施する：Ｑ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰゲル；２０ｍｌ  Ｈｉ  Ｔｒａｐ  Ｑ  ＨＰカラム；平衡緩衝液：２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５；流速：２ｍｌ／分；サンプルを平衡緩衝液中で注入。１２５ｍｌの培養上清／２０ｍｌゲルの等価物を注入する；溶出：
−  ２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５：５倍カラム容量
−  ２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、０〜０．５Ｍ  ＮａＣｌの勾配：２０倍カラム容量
−  ２０ｍＭトリス、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５：５倍カラム容量
−  ２０ｍＭトリス、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５：５倍カラム容量
−  ２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５：５倍カラム容量。
【０１７６】
２０６および２８０ｎｍにおける吸光度を測定することによって、溶出をモニターする。ＣＺＥ分析は、クロマトグラフィーの間に溶出される種々の構成物を同定することを可能にする。
【０１７７】
このようにして、本発明者らは、ＣＰ８多糖が０．２Ｍ〜０．３Ｍの間のＮａＣｌ濃度において溶出されることを決定することができた。使用されるクロマトグラフィー条件下で、このクロマトグラフィー工程の後、多糖は残留物質（その量はわずかである）から明確に分離される；特に０．３６Ｍ〜０．４８Ｍの間のＮａＣｌで溶出されるテイコ酸、および０．７４Ｍ〜０．８６Ｍの間のＮａＣｌで溶出されるリポテイコ酸。
【０１７８】
ＣＰ８を含む画分を合し、そして＋４℃において２０倍容量の０．５Ｍ  ＮａＣｌ水溶液（２〜３浴）、次いで２０倍容量の限外濾過水（３〜４浴）に対して透析する。高ＮａＣｌ濃度における工程は、トリスの効果的な除去を可能にする。
【０１７９】
このようにして精製された産物を凍結乾燥し、そして−２０℃において保存する。
【０１８０】
下記の表７において、得られた結果を報告する。
【０１８１】
【表７】
2008538702.tif 000009
【０１８２】
実施例４：３０ｌ発酵槽中での黄色ブドウ球菌Ｒｅｙｎｏｌｄｓ５型株の培養
４．１  −  ＢＴＳ培地＋ＮａＣｌ上の培養
項目２．１の第１の方法によって調製された凍結Ｒｅｙｎｏｌｄｓ株材料を、０．５％（重量）の割合で、ＮａＣｌ（５５ｇ／ｌ）を補充した２００ｍｌのｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈを各々が含む２つの２ｌバッフル三角フラスコ（Ｅ１およびＥ２）に接種する。３７℃において５±１時間（Ｅ１）または４８時間（Ｅ２）１７５ｒｐｍで振盪しながら、三角フラスコをインキュベートする。
【０１８３】
２０ｌの同じ培地を含む３０ｌ  Ｂｒａｕｎ発酵槽に、約１．３８×１０１１ＣＦＵであると見積られる前培養物（Ｅ１）（約５時間の培養、および三角フラスコ中の最終ＯＤ６００ｎｍ  ４付近）７０ｍｌを接種する。以下の条件下で培養を実施する：温度：３７℃；培養期間：４８±２時間；２５％ＮＨ４ＯＨおよび１０％Ｈ３ＰＯ４を用いて６．５０に調節されたｐＨ；３０％ＰＯ２（カスケードでの調節：撹拌２０〜８０％、空気２０（１ｖｖｍ）〜６０％（３ｖｖｍ）、酸素富化０〜１００％）；圧力：１００ｍｂａｒ；５０分の１  ｓｔｒｕｋｔｏｌを用いる消泡調節。
【０１８４】
６００ｎｍにおけるＯＤを確認するために、定期的なサンプルを取ることによって最初の数時間の間、そしてまた培養の２０±２時間、培養の２４±２時間、および培養の４２±２時間において培養物をモニターし；乾燥重量を決定し；生存率を決定し；形態を観察し；グルコースをアッセイし；酢酸をアッセイし、そして培養の４±２時間、１８±２時間、２４±３時間、４４±３時間および４８±２時間後に、ＯＤ＝５０のペレット６個についてのＥＬＩＳＡアッセイによって多糖生産性を決定する。
【０１８５】
培養の４８±２時間後に１ｌ遠心分離バケット中に細胞を回収し（１２バケット／２０ｌ培養物）、そして２０分間７０００ｇで４℃において遠心分離する。上清の除去後、湿重量を決定する。フェノール／エタノールを用いた微生物不活性化、次いで実施例２の方法によるＴ５多糖の回収および精製からなる工程まで、ペレットを≦−２０℃において保存する。
【０１８６】
培養の１０時間、２４時間および４８時間におけるＣＰ５莢膜の生産性を追跡するために４８時間にわたって第２の三角フラスコ（Ｅ２）をモニターする。
【０１８７】
４．２  −  ポートレル培地上での培養
項目２．１に記載の第１の方法によって調製された黄色ブドウ球菌Ｒｅｙｎｏｌｄｓ５型株の凍結材料を、１％（容量）の割合で、２００ｍｌのポートレル培地を各々含む２つの２ｌバッフル三角フラスコ（Ｅ１およびＥ２）に接種する。３７℃において１７５ｒｐｍで１６±２時間、三角フラスコをインキュベートする。前培養物をプールし、そして発酵槽に接種するために使用する。以下の条件下で、２０ｌのポートレル培地を含む３０ｌ  Ｂ．Ｂｒａｕｎ発酵槽中での培養を実施する：温度：３７℃；培養期間：４８±２時間；２５％ＮＨ４ＯＨおよび１０％Ｈ３ＰＯ４を用いて６．５０に調節されたｐＨ；３０％ＰＯ２（カスケードでの調節：２０〜８０％撹拌、空気２０（１ｖｖｍ）〜６０％（３ｖｖｍ）、酸素富化０〜１００％）；圧力：１００ｍｂａｒ；５０分の１  ｓｔｒｕｋｔｏｌを用いる消泡調節。
【０１８８】
最初の数時間の間、そしてまた培養の２４±２時間および培養の３０±２時間において、６００ｎｍにおけるＯＤを確認するためにサンプルを取ることによって培養物をモニターし；乾燥重量を決定し；生存率を決定し；形態を観察し；グルコースをアッセイし；酢酸をアッセイし、遊離アミノ酸をアッセイし、そしてＥＬＩＳＡアッセイによって多糖生産性を決定する。
【０１８９】
培養の４８±２時間後に細胞を回収する。
【０１９０】
２ｌの回収物を２ｌのＳｃｈｏｔｔフラスコ中に回収し、そして２％（ｖ／ｖ）の終濃度のフェノール／エタノール（ｖ／ｖ）で処理する。この混合物を、６時間±１時間２２℃±３℃において撹拌する。培養物の残りから上清を除去した後、細菌ペレットを最小容量のＰＢＳ緩衝液を用いて取り出し、次いで上記の実施例２に記載の方法によって多糖を不活性化および回収するためにオートクレーブする。
【０１９１】
培養物の残りを１ｌ遠心分離バケット中に回収し（１２バケット／１８ｌ培養物）、２０分間７０００ｇで４℃において遠心分離する。上清の除去後、湿重量を決定する。０．４５μｍ濾過および１２１℃における５５分間のオートクレーブの後、２ｌの上清を≦−２０℃において保存する。
【０１９２】
１２個のペレットを、ｕｌｔｒａｔｕｒａｘを使用して、最小容量のＰＢＳ緩衝液（約６５０ｍｌ）中に再懸濁する。懸濁物をプールし、ホモジナイズし、１２１℃において５５分間オートクレーブする前に３つの５００ｍｌ  Ｓｃｈｏｔｔフラスコに均等に分注する（約３００ｍｌ／Ｓｃｈｏｔｔフラスコ）。次いで、オートクレーブした懸濁物をプールし、そして上記の実施例２に記載のプロトコルによって多糖を回収する。
【０１９３】
４．３  −  Ｃｏｌｕｍｂｉａ  ｍｅｄｉｕｍ＋ＮａＣｌ上での培養
項目２．１の第１の方法によって調製された凍結黄色ブドウ球菌Ｒｅｙｎｏｌｄｓ５型材料を、１％（容量）の割合で、２００ｍｌのｃｏｌｕｍｂｉａ  ｍｅｄｉｕｍ＋２０ｇ／ｌのＮａＣｌ（Ｄｉｆｃｏ  ｒｅｆ．  ２９４４２０ｌ）を各々含む２つの２ｌバッフル三角フラスコに接種する。三角フラスコを、３７℃において２４±２時間１７５ｒｐｍで振盪しながらインキュベートする。２４±２時間後、前培養物をプールし、そして発酵槽に接種するために使用する。以下の条件下で、２０ｌの同じ培地を含む３０ｌ  Ｂ．Ｂｒａｕｎ発酵槽中での培養を実施する：温度：３７℃；培養期間：２４±２時間後；２５％ＮＨ４ＯＨおよび１０％Ｈ３ＰＯ４を用いて７．００に調節されたｐＨ；３０％ＰＯ２（カスケードでの調節：２０〜８０％撹拌、空気２０（１ｖｖｍ）〜６０％（３ｖｖｍ）、酸素富化０〜１００％）；圧力：１００ｍｂａｒ；５０分の１  ｓｔｒｕｋｔｏｌを用いる消泡調節。
【０１９４】
６００ｎｍにおけるＯＤを確認するために定期的なサンプルを取ることによって、定期的に培養物をモニターし；乾燥重量を決定し；生存率を決定し；形態を観察し；グルコースをアッセイし；酢酸をアッセイし、そしてＥＬＩＳＡアッセイによって多糖生産性を決定する。
【０１９５】
次いで、培養の２４±２時間において細胞を回収する。最終培養物を１ｌ遠心分離バケット中に移し（１２バケット／２０ｌ培養物）、２０分間７０００ｇで４℃において遠心分離する。上清の除去後、湿重量を決定する。遠心分離後、ｕｌｔｒａｔｕｒａｘを使用して１２個のペレットを１〜１．２ｌの間の最小容量のＰＢＳ緩衝液中に再懸濁する。懸濁物をプールし、ホモジナイズし、そして５００ｍｌ  Ｓｃｈｏｔｔフラスコ中に均等に分配し、次いで１２１℃において５５分間オートクレーブする。次いで、オートクレーブした懸濁物をプールし、そして上記の実施例２に記載のプロトコルによって多糖を回収する。
【０１９６】
４．４  −  培地Ｍ１上での培養
上記の項目２．１に記載の第１の方法によって調製された凍結黄色ブドウ球菌Ｒｅｙｎｏｌｄｓ５型材料を、１Ｃ  ＰＢＳ緩衝液中に９ｍｌの緩衝液あたり１ｍｌの凍結材料の割合で取り出して、寒天培地Ｍ０のペトリ皿約１０個に１５０μｌ／ペトリ皿の割合で播種する。
【０１９７】
ペトリ皿を３７℃において１５〜１８時間インキュベートする。１５〜１８時間３７℃においてインキュベートした後、各三角フラスコにおいて０．２付近の初期ＯＤ６００ｎｍを有するように同一組成の２つの三角フラスコ（２００ｍｌ／２ｌ  −  Ｅ１およびＥ２）に接種するために、培地Ｍ１中に再懸濁する前に、形成された層をかき取る。三角フラスコを、３７℃において１７５ｒｐｍで振盪しながら約５時間（対数増殖期の培養物、Ｅ１）または７２時間（Ｅ２）インキュベートする。
【０１９８】
Ｅ１培養物（３付近のＯＤ６００ｎｍ）の一部を、０．０２付近の初期ＯＤ６００ｎｍを有するように、２０ｌの培地Ｍ１を含む３０ｌ  Ｂ．Ｂｒａｕｎ発酵槽に接種するために使用する。以下の条件下で培養を実施する：温度：３７℃；培養期間：７２±４時間；２５％ＮＨ４ＯＨおよび１０％Ｈ３ＰＯ４を用いて６．５０に調節されたｐＨ；３０％ＰＯ２（カスケードでの調節：２０〜８０％撹拌、空気２０（１ｖｖｍ）〜６０％（３ｖｖｍ）、酸素富化０〜１００％）；圧力：１００ｍｂａｒ；５０分の１  ｓｔｒｕｋｔｏｌを用いる消泡調節。
【０１９９】
次いで、１ｌの培養物を遠心分離バケット中に回収し、そして上清の除去後に湿重量を決定するために２０分間７０００ｇで４℃において遠心分離する。
【０２００】
ペレットを≦−２０℃において保存する。
【０２０１】
培養物の残りを５０ｌ  Ｎａｌｇｅｎ中に回収し、そしてフェノール／エタノール（２％Ｖ／Ｖの終濃度）を用いて不活性化し、そして上記の実施例２に記載のプロトコルによって多糖を回収する。
【０２０２】
得られた全ての結果を、下記の表８において報告する。
【０２０３】
【表８】
2008538702.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【０２０４】
（原文に記載なし）
【図１】
2008538702.tif 000011
【国際調査報告】
2008538702.tif 000012
2008538702.tif 000013
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