(57)【要約】 成人幹細胞及び血小板を含む細胞サブセットの採取、収集、処理、及び移植のための、特に再生医療に組織修復のためのシステムであって、前もって接続されているか、又は無菌的にそれらを相互に接続するための無菌コネクタを含むか、或いは無菌的に接続するのに適合しているディスポーザブル液体移送要素のセットを含むシステム。前記セットは、通常は、セットの各相互接続可能なキットを収納するためのコンパートメントを一つ持ち、トレーのような支持体に載せられたブリスターパックに包装された３つのディスポーザブル無菌要素、即ち収集キット、処理キット、及び移植キットを含む。前記セットは、患者から骨髄又はその他の細胞サブセット供給源を採取するための、例えば骨穿刺又は静脈穿刺用の針を含む採取装置を含む。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
成人幹細胞及び血小板を含む細胞サブセットを、特に再生医療での臓器修復のために採取、処理、及び移植するためのシステムであって、前もって接続されているか、又はそれらを無菌的な様式で相互接続するための無菌的コネクタを備えているか、もしくはそれに適合しているディスポーザブル滅菌液体移送要素のセットを具備し、前記セットが：
−例えば、骨又は静脈穿刺用の針を含む、骨髄又はその他細胞サブセットの供給源を患者から採取するための採取装置と；
−採取装置によって患者から採取された細胞を捕獲するための採取装置に事前に接続されているか、もしくは接続可能な収集チャンバと；捕獲された細胞に処理及び移送作業を実施する処理装置と協同するのに適した処理チャンバと；処理された細胞を選別して患者に送り戻すための再注入チャンバとを含み；前記収集、処理、及び再注入チャンバは分離されかつ事前に連結されているか、もしくは相互に接続可能であるか、又は多目的処理チャンバが収集−処理チャンバ、処理−再注入チャンバ、もしくは収集−処理−再注入チャンバの機能をまとめて提供している、患者から採取された細胞サブセットを収集、処理、及び再注入するための少なくとも１つのチャンバと；
−処理された細胞を患者に送り戻すための再注入チャンバに事前に接続されているか、又は接続可能である移植装置と、を具備しているシステム。
【請求項２】
ディスポーザブル要素のセットがトレーのような支持体の上にブリスターパックに包装されており、前記ブリスターパックが相互接続した全セットを収納するための１つのコンパートメント、又はセットの別部分と接続するための無菌コネクタを含む、セットの一部分をそれぞれ収納する複数のコンパートメントを有する、請求項１記載のシステム。
【請求項３】
ディスポーザブル要素のセットが、ディスポーザブル要素の３キット、即ち収集キット、処理キット、及び移植キットを含む、請求項１又は２記載のシステム。
【請求項４】
収集キットが骨髄採取装置単独、又は：少なくとも１本のシリンジ；収集チャンバを形作っている移送バッグ、及び場合によって処理キットとの接続のための無菌コネクタと組み合わせて含んでいる、請求項３記載のシステム。
【請求項５】
収集キットがシリンジと移送バッグとを接続している、又は接続できるフィルタを更に含む、請求項４記載のシステム。
【請求項６】
処理キットが、処理チャンバ、及び処理チャンバとの液体の選択的移送を可能にする少なくとも１つのストップバルブ又はマルチポートバルブによって処理チャンバに接続されているディスポーザブル容器を少なくとも１つの含み、前記処理チャンバが収集キットと接続しているか、又は収集キットとの接続のための無菌コネクタを有するか、もしくは無菌的に接続するのに適しており、かつ前記処理チャンバは移植キットとも接続しているか、又は移植キットとの接続のための無菌コネクタを有するか、もしくは無菌的に接続するのに適合している、請求項３、４又は５記載のシステム。
【請求項７】
処理キットが、ストップコック又はマルチポートバルブに追加の容器を接続するためのコネクタを１つ以上備えたラインを更に含む、請求項６記載のシステム。
【請求項８】
移植キットが、少なくとも１つの移植装置、又は少なくとも１つの移植装置と少なくとも１つの収集バッグ；収集バイアル；及びシリンジとの組み合わせを含む、請求項３〜８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項９】
処理チャンバが、処理対象の細胞及び処理された細胞のための入口／出口を有する中空の遠心処理チャンバであり、前記処理チャンバが細胞を受けるための様々なサイズの分離空間を画定する移動可能部材を含み、前記部材が移動可能で前記入口から処理対象の選択量の細胞を分離チャンバ内に取り込み、かつ前記出口から分離チャンバから処理された細胞を外に出すことができる、請求項１〜８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１０】
遠心分離処理チャンバは概ね円筒であり、かつ円筒の軸の回りを回転でき、移動可能部材は遠心分離処理チャンバ内に液体密封式に運動可能に装着されたピストンである、請求項９記載のシステム。
【請求項１１】
−患者から骨髄又はその他の細胞サブセット供給源を採取するための装置であって、該装置により採取された幹細胞を処理チャンバに収集するために、処理チャンバに無菌接続によって接続できる装置；
−処理チャンバ及び／又はディスポーザブル容器との選択的な液体のやりとりを可能にする少なくとも１つのストップコックバルブ又はマルチポートバルブによって処理チャンバに接続されおり、前記処理チャンバが無菌コネクタによって前記ストップコック又はマルチポートバルブに接続可能である、少なくとも１つのディスポーザブル容器；並びに
−無菌接続によって処理チャンバに接続可能であり、前記処理チャンバがその中で処理された細胞を患者に送り込むための再注入チャンバとして働く、少なくとも１つの移植装置、を含む：
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１２】
処理チャンバが、特定の細胞サブセット（成人幹細胞及び血小板を含む）に富む生成物を生成するように配置されている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１３】
処理チャンバが、密度勾配に基づくプロセスとそれに続く細胞洗浄を利用して幹細胞を分離するように配置されている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１４】
モノクローナル抗体をコーティングしたマイクロビーズを用いて幹細胞を処理するように配置されている、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１５】
透明なチューブの中を通る細胞サブセットによる光の反射の違いを検出するための光学ラインセンサーを具備する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１６】
分離使用するための濃縮血小板を調製することへの請求項１〜１５のいずれか１項に記載のシステムの使用。
【請求項１７】
ヒトへの移植を目的として、特に再生医療分野における臓器修復を目的として、ヒトから採取された細胞サブセットを収集及び処理する方法であって、それを通して細胞、特に幹細胞を含む骨髄が採取される採取容器に接続されている収集チャンバに採取した細胞を収集する段階、細胞を収集チャンバと同一であるか、又は収集チャンバに接続している遠心分離処理チャンバ内で処理する段階を含み、並びに処理した細胞を処理チャンバと同一であるか、又は処理チャンバに接続している再注入チャンバに収集する段階とを含み、前記再注入チャンバが処理された細胞サブセットを患者に送り戻すための再注入チャンバに接続している移植装置に接続されている方法。
【請求項１８】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載のシステムを用いて実行される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
透明なチューブの中を通る細胞サブセットの吸収及び反射を測定できる、光学センサー。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、組織再生を目的とする、それら細胞を局所的に再注入するための骨髄、末梢血、臍帯血、又は脂肪組織に存在する細胞サブセットの採集、自動処理、及び移植に関する。細胞サブセットは、典型的には成人幹細胞又は血小板であるが、より一般的には赤血球及び白血球のような細胞の亜集団を含む。このような処置は、おそらくは細胞処理実験室を持たない病院環境又は医療施設で行われ、かつ専門外の技師によって実施されると思われる。発明は、透明なチューブを通過する細胞のサブセットをモニタリングする新規タイプの光学センサーを含む。
【発明の背景】
【０００２】
幹細胞は、クローン原性及び自己再生能力を有し、かつ複数の細胞系列に分化する細胞と定義されている。胚性幹細胞は胚盤胞期の哺乳動物胚に由来し、体内において最終的に分化した細胞を発生させる能力を持つのに対し、成人幹細胞は、それらが分化するものとして確約されている出生後生物組織に特異的な細胞の一部である。成人幹細胞は、胚性幹細胞を凌ぐ実際的な利点を提供する。後者と異なり、それらはいかなる倫理的な問題を起こさず、患者自身から採取できる。それらは大量に供給されており、人体の様々な組織に本来備わっているものである。成人幹細胞の最も扱いやすい供給源は、最近の研究が示すように骨髄、末梢血、臍帯血、及び場合によっては脂肪細胞である。これらの細胞は、生理学的な細胞回転又は傷害による組織損傷の結果として、それら自体に特異的な組織内の最終分化細胞を維持、発生、及び置換えることができる。細胞可塑性として知られているこのような能力は、障害臓器の生理学及び機能を回復させることを目的とする、欠損組織の再生を目標とした治療応用の開発をもたらしている。成人幹細胞は、数十年前から知られているように造血幹細胞を生ずることができるが、最近分かったように血管、筋肉、骨、軟骨、皮膚、ニューロン等も生ずることができる。このような細胞は、間葉性幹細胞として知られている。これに加えて、濃縮血小板として調製された血小板を用いて創傷の治癒を促進することができ、結果として骨、皮膚、又はその他組織のような組織の再構築を支援する再生医療においてある役割を果たすことができる。
【０００３】
造血幹細胞は主に、その造血回復を目的として化学療法を受けている患者に移植するために用いられている。当初は骨髄から採取されていたが、最近は末梢血又は臍帯血を供給源とするようになり、後者のものは最も高い増殖能力を有している。移植のための細胞は、細胞分離、続いて時に選別及び／又は拡大プロセスといった特殊な処理を必要とする。今日まで、このような移植は設備の整った細胞処理実験室内で、細胞生物学及び血液学を熟知した、高度な訓練を受けた者によって行われてきた。このような操作は、チューブ内の遠心分離、密度勾配分離を含む手間のかかる実験室の作業を必要とし、多くの場合、細菌等による汚染のリスクのある開放系で行われている。
【０００４】
再生医療分野での幹細胞によってもたらされた新しい局面は、これらの技術に一般的でない環境においてこれら細胞を扱うという実務的な問題に直面している。主要な問題の一つは、細胞を安全に処理できるクリーンルームが無いことである。一例を挙げれば、心臓学、整形外科学、及び神経学の分野は全て幹細胞に基づく治療を実験的に行っているが、適切に細胞を処理する設備は持っていない。このような理由から、患者のベッドサイドにオンライン細胞処理システムを提供するために、閉鎖系の中で迅速に成人幹細胞又は一般的に任意の細胞サブセットを自動的に処理できる簡便なシステムが求められている。
【発明の開示】
【０００５】
発明は、再生医療での組織修復を狙った細胞サブセットの採取、収集、処理、及び移植を可能にするシステムを提供する。このようなシステムは、手順を実施するための個別のキットが入ったトレーのような支持体に載せて提供できる。個別キットには、無菌的にそれらを相互接続する無菌コネクタがあらかじめ取付けられているか、又は取付けることができるか、或いは溶着して用いるＴｅｒｕｍｏのＳＣＤのような無菌接続装置を用いて接続できる。
【０００６】
本発明は、請求項１に記載するような、患者ベッドサイドでオンライン細胞処理システムを提供できる、閉鎖系で細胞サブセットを自動的に処理／濃縮するための簡便なシステムを提供する。本発明の態様は、従属クレームに記載する。
【０００７】
一つの態様では、患者から細胞サブセットを捕獲するのに用いられる収集容器は、分離チャンバとしても使用できるようにデザインできる。同様に、分離した細胞を収集するのに用いる貯蔵容器は、細胞を患者に送り戻す再注入容器としても役立つようにデザインできる。細胞の分離はバフィーコート収集を目的にでき、又は密度勾配に基づく分離プロセスを用い、続いてEP-B-912 250 (Claude Fell)及びPCT/IB99/020523 (Biosafe)に記載されているようなシステムに基づいて細胞を洗浄することで実施できる。細胞を処理する別の方法はWO03/009889 (CellGenix/Biosafe)に記載のようなモノクローナル抗体をコーティングしたマイクロビーズを使う方法である。
【０００８】
透明チューブに流入する細胞の吸収及び反射を測定できる光学検出器を併用すると、血小板のような特定の細胞サブセットを更に正確に収集して濃縮血小板を作ることができる。このような濃縮血小板は別の分離手順によって、又はある細胞サブセットを目的とする手順の副産物として得ることができる。発明はまた、記載のシステムを、別の目的で濃縮血小板を調製するために使用することも想定している。
【０００９】
かくして発明は、閉鎖系を用いることで汚染リスクを最小限にする、ベッドサイド介入のための完全統合システムを提供する。それは高レベルの自動化を提示し、いかなる特殊な細胞処理の専門技術にも依存しない。これはどのような細胞供給源（成人幹細胞、血小板のような）にも適しているが、自己又は同種異系条件での骨髄幹細胞の調製に特に適している。
【００１０】
発明を、例示の形で、添付の概略図を参照しながら更に記載する。
【詳細な説明】
【００１１】
本発明は、傷害又は欠損組織の修復又は再生を目的とする、細胞のサブセットの収集、それらの処理／濃縮、及び特定の細胞サブセットに富む生成物の再注入を可能にする統合システムに関する。
【００１２】
そのプロセスを自己由来の設定で記載するが、これは細胞を同一の患者から採取して再注入することを意味する。このような自己処理が一般的に好ましいが、それはドナーとレシーバの間に不適合性による免疫学的反応又は有害作用が無いからである。しかしながら、同種異系の設定においても原理は同じである。
【００１３】
幹細胞、より具体的には間葉性幹細胞は、現在の知識によれば骨髄中に存在しているが、研究は間葉性幹細胞が臍帯血、末梢血、又は脂肪組織にも存在していることを示唆している。原理はこれら様々な幹細胞供給源にも応用できるだろうが、本明細書に記載するプロセスは骨髄の処理に関するものである。
【００１４】
プロセスは、最初に局所麻酔下に骨盤帯域から骨髄を採取することからなる。例えばＴｙｃｏ型の骨髄採取器を用いて骨に穿孔をあける。前もって抗凝固剤、通常はヘパリン又はクエン酸／リン酸液を充填しておいた１本以上のシリンジを使って骨髄を吸引する。典型的には５０ｍｌの体積が集められるが、別の体積のこともある。吸引した骨髄は、一般的には、濾過され、又は濾過されずにＰＶＣ収集バックに移され、攪拌機にかけることができる。次にＰＶＣ収集バッグを、無菌的技術を用いて、好ましくはEP-B-912 250 及びPCT/IB99/02052に記載のシステムに接続し、次にそれに合う形で幹細胞の吸引及び能書区を行う。別の遠心分離処理チャンバ（例えば回転軸が円筒形の処理チャンバの軸と平行でないもの）、又は可撓性の容器を使うこともできる。
【００１５】
参照によってその内容がここに組み入れられているEP-B-0 912 250 (CFELL)は、分離対象の生物学的液体を受けるための１セットの容器、及び場合によっては追加の溶液のための１種類以上の追加容器を具備する、構成要素への生物学的液体の処理・分離のためのシステムを記載している。中空の遠心分離処理チャンバは、回転駆動ユニットに前記処理チャンバを嵌合させることによって、回転軸の回りを回転できる。処理チャンバは処理対象となる生物学的液体及び処理された生物学的液体の構成要素用に、軸方向に入口／出口を有している。この入口／出口は、生物学的液体の遠心分離処理が全て行われる体積可変性の分離空間につながっている。処理チャンバは、処理チャンバの端壁から伸びる概ね円筒形である壁を具備し、この概ね円筒形の壁は、回転軸と同軸の、中空開放型の円筒空間を占有する中空の処理チャンバをその中に画定しており、軸方向の入口／出口は、中空処理チャンバ内に開口して、概ね円筒形の壁と同軸に前記端壁内に設けられている。処理チャンバは概ね円筒形の壁の内側に、ピストンのような軸方向に移動可能な部材を含んでいる。体積可変式の分離空間は、概ね円筒形の壁と、処理チャンバの概ね円筒形の壁の内側に在る軸方向に移動可能な部材とによって処理チャンバの上部に画定されており、このとき移動可能部材の軸方向の運動が分離空間の体積を変え、移動可能部材は処理チャンバ内を軸方向に移動して、遠心処理前又は処理中に選択された量の処理対象の生物学的液体を入口から分離空間内に取り込み、かつ遠心分離処理中又は処理後に分離空間から処理済みの生物学的液体の構成要素を出口から出す。可動部材の位置をモニタリングし、それによって生物学的液体の取込み量及び分離された構成要素の排出量を制御する手段が提供される。システムは更に処理チャンバと選択された容器との選択的連絡を確立する、又は処理チャンバと容器の連絡を絶つための分配バルブ装置を具備する。
【００１６】
PCT/IB99/02052に記載によれば、このようなシステムは分離及び非分離移送モードで運転するように計画されており、これにより、造血幹細胞の分離及び一般実験室での処理といった従来想定されていない新規の応用を含めたシステム使用の可能性が大きく広げられる。かくしてシステムは、次のような運転が可能なように計画されている：
−分離モードでは、チャンバが回転又は静止しながら、液体を処理チャンバ内に取り込むことができ、チャンバに取り込まれた液体は遠心分離にかけられて構成要素に分離し、分離した構成要素はチャンバを回転させながら、又は場合によって最後の分離構成要素については、チャンバを静止した状態で外に出される。
−移送モードでは、処理チャンバは、チャンバを静止させた状態で液体を取り込み、液体を外に出す。バルブ稼働装置を作動させて、液体を構成要素に遠心分離又は分離することなく、部材を動かすことによって処理チャンバを介してある容器から別の容器に液体量を移すことができ、かつ移動可能部材の位置をモニタリングする手段が、移動した非分離液体の量を制御する。
【００１７】
本発明による新規応用では、EP-B-912 250 及びPCT/IB99/02052の分離チャンバを好都合に用い、分離の標的をバフィーコート収集に定め、特別な細胞サブセットターゲティングなしに最高の幹細胞回収を可能にする。その供給源が上記の供給源である初期生成物は、ピストンを下げることによって分離チャンバ内に導かれる。生成物が分離チャンバ内に取り込まれると−取り込まれたことは分離チャンバ入口近くに配置された光学ラインセンサーによって感知される−典型的には５〜１０分の沈降サイクルによって、血漿と赤血球層の間にバフィーコートが生成する。採取時には、ピストンを上に動かして最初に血漿が採取される。例えば図８を参照して記載されている光学ラインセンサーが、バフィーコートに属する細胞を感知し、各種パラメータ（採取時間、採取体積、遠心分離速度）を適応させて、所望する体積及びプロセス制約時間に応じて細胞回収を最適化する。バフィーコート細胞は、専用のバッグ又はバイアル（処理キットの構成に依存する）に取り出される。残った赤血球は専用のバッグに採取される、チャンバ内に残される（プロセス時間を節約するために）。バフィーコート採取期の間に最適化されたパラメータに応じて、上記したような連続的な沈降／採取サイクルを再始動できる。こうして、細胞生成物の最終用途に応じて、その特性を最適化するバフィーコートの採取容積を得る。
【００１８】
より特異的な細胞亜集団を選別する場合も、より特異的な細胞サブセットの反射及び吸収を感知する同型の光学ラインセンサーによって上記の原理（充填／沈降／採取）を利用できる。血漿採取中は、液体の吸収及び反射は極めて低い。チューブ内に細胞が流れ始めると、流出生成物の吸収及び反射の両方が増加する。反射は細胞のタイプ及びサイズにも依存する。この依存性によって特定の細胞サブセットを選別することができる。最終的に細胞の濃度が高くなると、吸収は最大レベルとなり、もはや反射は起こらない。これを利用して、血小板のようなサイズの異なる細胞サブセットを感知して、濃縮血小板を創り出することができる。
【００１９】
ある細胞サブセットを選別するために好ましい方法は、目的の細胞亜集団により特異的に狙いを定めることができる密度勾配媒体を用いる。これは、赤血球及びその他不要の細胞サブセットによる汚染を減らして生成物の純度を上げるだろう。密度勾配媒体は、標的とするサブセットに応じて選ばれる。例えば、単核球を標的とする場合は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）を基礎とする媒体を用いることができる。このような場合は、最初に密度勾配媒体を分離チャンバ内に入れる。次にピストンを、典型的には下げながら、典型的には５ｍｌ／分の速度で骨髄をゆっくりと入れて、密度勾配媒体層の上に細胞を沈積させる。赤血球及び顆粒球は密度勾配媒体層を通過する傾向があり、一方単核球及び血小板は層の前に留まるだろう。骨髄が全体積導入され、これを装置上部の光学ラインセンサー（図８）が感知すると、ピストンは停止し、例えば１０〜２０分の沈降段階が開始する。生成物の吸引が完了するとシステムによって追加の希釈が、システムに接続した等張液を利用して自動的に行われる。遠心分離速度を上げてこの沈降時間を短縮することができる。次にピストンを上に動かして収集を開始する。上清液は血漿のみを含んでいる。次に最初の細胞が続いて流出チューブを不透明にし、これを光学ラインセンサーが感知する。これが引き金となって、標的の幹細胞を含む単核球の収集が始動する。オペレータメニューによって前もって定めた体積に達するか、又は流出ラインが再び透明になったら細胞収集段階は停止し、分離チャンバ体積中の残留物は、チャンバが完全に空になるまで廃棄バック集められる。この段階で、等張溶液を使って分離チャンバから全ての残存赤血球を洗い流す。収集した細胞を分離チャンバに再び入れ、それに続いて、又は先行して食塩水のような洗浄溶液／アルブミン溶液（これに替わってリン酸緩衝化溶液もしくはその他のものも使用できる）を再度入れる。細胞と洗浄溶液を混合する。ピストンは所定の容積後又はチャンバが完全に満たされると停止する。次に新たな沈降段階が実施され、その間に沈降中に生成される上清を使って収集バッグを洗浄し、痕跡量残った密度勾配媒体を取り除くことができる。次に上清（洗浄溶液及び密度勾配媒体からなる）を外に出す。最初の細胞が流出ラインに再度現れたらプロセスを停止するか、又は洗浄効果を上げるためにプロセスを繰り返すこともできる。細胞は最終的に、収集した細胞のその後の使用を容易にするよう特別にデザインされた収集容器に集められる。必要に応じてチャンバを洗浄する。このような細胞は、患者の標的臓器への再導入に容易に利用できるか、又は選択又は拡大を目的として更に操作することができる。それができるように、システムは細胞を所望培地内に直接浮遊できてもよい。
【００２０】
密度勾配媒体を使用しないより洗練された分離は、骨髄をモノクローナル抗体でコーティングしたマイクロビーズの入った媒体中でインキュベーションするものである。このような方法は、公開WO03/009889 (CellGenix/Biosafe)に記載されている。その手順は次の通りである。特異的抗体に結合したマイクロビーズを含む生成物を関心対象の細胞を含む血液生成物に混ぜる。インキュベーション時間後、マイクロビーズは標的細胞の表面に付着してその密度を変化させる。次に混合物を分離チャンバに注ぎ入れると、先行特許に記載されているように浮上密度分離が開始する。沈降が完了したらチャンバから上清を廃棄バッグに採取し、次に赤血球も廃棄する。マイクロビーズで標識され、その結果最も高い密度を有する関心対象の細胞はチャンバに最後まで残るだろう。それらは適切な容器に収集でき、必要に応じて、続いて洗浄して抗体溶液を取り除いてもよい。
【００２１】
処理後直ちに再導入する場合は、収集した細胞を、それらを患者に移植可能にする装置に無菌的な技術を用いて接続できる。心臓学への応用では、このような装置は血管造影に用いられるようなバルーンカテーテルでよく、例えば急性心筋梗塞治療に関連してこれらの細胞を局所的に再注入できる。この場合、１０ｍｌの量の濃縮幹細胞を、一定間隔でバルーンを膨らませて３ｍｌずつ繰り返し注射し、幹細胞を展開させる。このような方法は、Ｚｅｉｈｅｒらによって科学文献(TOPCARE-2002年10月発行）に記載されている。
【００２２】
濃縮血小板の収集では、捕獲した血小板を単独で用いても、又は場合により患者の血漿から同時に得ることができるトロンビンと組み合わせて用い、創傷の治癒を促進する血小板ゲルを形成させてもよい。このような血小板ゲルは、それ単独又は幹細胞と共同して組織の修復を都合良く刺激できる成長因子を含んでいる。
【００２３】
図１に概略的に描かれているように全てのプロセスが患者のベッドサイドで実施でき、従ってオンラインプロセスと見なすことができる。これは安全、ロジスティック、及び対応時間に大きな利益を与え、かつ特別な細胞処理の専門技術に依存しない。
【００２４】
多様な標的細胞サブセットの収集を同一収集操作中に行うことができるが、細胞サブセットの使用目的に合わせて同一作業中の異なる時間間隔で行える。
【００２５】
発明は、収集、分離、及び移植それぞれを実施するための個別のディスポーザブル無菌セットが既に納められているシステム又は「カスタムパック」を提供する。このようなパックは、３つのコンパートメントを有する「ブリスターパック」に納めることができ、それぞれのコンパートメントにディスポーザブルセット又はキットが１つ入っている：骨髄採取用の１セット：骨髄分離用の１セット、好ましくはEP-B-912 250 及びPCT/IB99/020523に記載されているシステムに基づくタイプの１セット、並びに細胞を再注入するための１セットが入っている。各セットは様々に変形させることができ、最も広い用途を持つセットは移植用セットであるが、それは治療対象となる組織（例えば骨、筋肉、血管等）によって異なるからである。個々のセットの構成を図２〜７に描く。
【００２６】
これらのセットは、完全閉鎖システムの使用を望む場合、全てを事前に接続しても、又は３つの内の２つを事前に接続してもよい。事前に接続しない場合の実際的な解決法は、ＰＡＬＬから販売されているＭｅｄｌｏｃｋシステム（ACD参照）のような、並びに米国特許第3,650,093号、第5,868,433号、第6,536,805号、及び第6,655,655号に記載されている特別にデザインされた無菌的コネクタを用い、接続を確実に無菌的接続下で行い、それによって閉鎖システムの基準を満たすことからなる。別の可能性は、滅菌接続装置を用いてセットを接続することだろう。上記の構成−事前接続、又は無菌接続装置又は無菌接続装置を用いた接続−のいずれもが、機能的な閉鎖システムを提供するだろう。このような機能的閉鎖システムは、クリーンルーム又は層流システムを必要としないが、このことは、通常これらの必要条件を満たす設備を持たない作業室又は介入ユニットの環境にとって非常に重要な便益である。
【００２７】
発明の別の改良点は、第２段階で分離チャンバとして働く加工チャンバと呼ばれる骨髄吸引容器にある。そのデザインは、PCT/IB99/020523に記載されている分離チャンバに類似しており、骨盤骨に穿孔をあけるための特殊な針を取付けることができる。それには前もって抗凝固剤が満たされているか、又は収集開始前に抗凝固剤でプライミングできる。骨に穿孔をあけたならば直ちに、手動又は電気式の真空源を作動させて処理チャンバのピストンを下方に動かして骨髄を吸引する。次に処理チャンバを遠心分離機に入れて、チューブライン配列とバッグからなるセットをチャンバに接続する。次に上記のプロセスに従って、例えばバフィーコート遠心分離プロトコルを用いて、分離を開始することができる。発明の別の改良点は、分離した細胞を、細胞を患者に再注入して戻すシステムに容易に接続又は取付けることができる特別容器に採取することにある。このような容器は、１反が分離セットに接続しており、他端にはその後カテーテルを接続するためのルアーロックコネクタが装着されているＹ字コネクタが取付けられた目盛り付きシリンジでよい。
【００２８】
図３Ａは、フィルタ無しの収集キットを示しており、図３Ｂはフィルタ付き収集キットを示している。収集キットには、骨髄吸引の実施に必要な全てが組み入れられている：
ａ．投入点は、例えば骨髄採取器（例えばTYCOタイプのもの）であり、典型的には骨穿刺用の針、又は静脈穿刺用の針を具備している。投入点は、ストップコック又はその他のバルブを利用してその他のキットのその他構成要素に直接接続できる。
ｂ．必要に応じて、吸引を行うための１又は複数本のシリンジ（１．．．ｎ）。
ｃ．フィルタは、図３Ｂに描かれているように、収集後に骨髄を濾過するために収集キットに挿入できる。
ｄ．次に収集した骨髄（濾過済み又は未濾過）を、処理前に移送バッグに貯蔵する。
ｅ．該当する場合には、追加のシリンジを用いて骨髄に希釈生成物を追加、及び／又はフィルタを濯ぐことができる。
ｆ．無菌コネクタ（Pall ACD又は同等物）が使用できる。
【００２９】
収集キットは、例えば以下のような構成である：
Ｃ１１  処理キットに骨針ａが事前接続されている、フィルタｃなしの収集キット。Ｘ本のシリンジｂ。
Ｃ１２  処理キットに骨針ａが事前接続されていない、フィルタｃなしの収集キット。Ｘ本のシリンジｂ。
Ｃ２１  処理キットに骨針ａが事前接続されている、フィルタｃ付き収集キット。Ｘ本のシリンジｂ。
Ｃ２２  処理キットに骨針ａが事前接続されていない、フィルタｃ付き収集キット。Ｘ本のシリンジｂ。
【００３０】
これら全ての構成について、骨針は静脈針に交換できる。
【００３１】
図４は前記の収集キットに無菌的接続によって接続するのに適合している処理キットを示す。
ａ．無菌的接続は、無菌コネクタ（Pall CAD等のような）又は無菌条件下のスパイクコネクタを介して実施できるだろう。
ｂ．場合によって、ドリップチャンバを用いて処理経路内への気泡の侵入を防いでもよい。
ｃ．流路の方向は、本例では３方向活栓を装備したストップコックランプ、又は、例えばマルチポートバルブのような別のタイプのバルブによって選択できる。
ｄ．分離プロセスには、例えば、EP-B-912 250 及びPCT/IB99/02052に記載の分離チャンバを用いる。
ｅ．追加の生成物（等張液、培地等）は、１又は複数の接続（スパイクコネクタ、．．−１．．．ｎ）を備えたラインによって導き入れられる。
ｆ．廃棄された生成物及び密度勾配媒体投入には、サテライトバッグ又は廃棄物バッグが用いられる。
ｇ．場合によっては、中間バッグが取付けられた排出ラインが生成物を移植キットに導く。
ｈ．このラインには無菌コネクタ（Pall ACD又は同等物）を用いることができる。
【００３２】
処理キットの主な変形としては次のものが挙げられる：
Ｐ１  中間バッグのない処理キット
Ｐ２  中間バッグのある処理キット
【００３３】
図５Ａは、移植キットの考え得る個別要素を示し、図５Ｂは移植キットを作り上げている１つの、可能な組み合わせを示す。移植キットは、無菌的接続を介して上記初期キットに接続するのに適しており、移植のための最終生成物を含むだろう。無菌的接続は、無菌条件下に無菌コネクタ（Pall ACDもしくはその他のような）又はスパイクコネクタによって実行できるだろう。
【００３４】
移植キットは次のものを含むだろう：
Ｔ１  バッグ
Ｔ２  収集バイアル
Ｔ３  シリンジ
Ｔ４  移植体向け特殊装置（例えば心筋梗塞の場合のカテーテル）
Ｔ５  Ｔ１〜Ｔ４の組み合わせ
【００３５】
一般的に言えば、移植キットは最低限、他の構成要素の様々な組み合わせ、例えばバッグＴ１もしくは収集バイアルＴ２、及び／又はシリンジＴ３と組み合わせることができる移植体向け特殊装置Ｔ４を少なくとも１つ含む。
【００３６】
図６は、完成システムを作り上げるための様々な組み合わせを描いている。完成システムは、例えば上記の収集キット（C11〜C22）、処理キット（P1又はP2）及び移植キット（T1〜T4）の任意の組み合わせからできている。
【００３７】
図７は、例えばEP-B-912 250 及びPCT/IB99/020523に記載の回転可能な処理チャンバｂ３が分離シリンジであり、これが細胞の収集及び移植にも用いられる一体式骨髄処理セットの図である。収集キットａは、投入点、例えば処理チャンバｂ３と接続するための無菌コネクタが取付けられた骨髄採取器（例えばTYCO型のもの）からなる。処理キットｂは、洗浄バッグｂ２及び密度勾配媒体／廃棄物バッグｂ４に接続しているストップコックｂ１、並びに無菌コネクタを介してストップコックｂ１又は収集キットａ、又は移植キットｃに接続可能な分離／処理／移植体チャンバｂ３を含む。移植キットｃは、処理チャンバｂ３と接続するための無菌コネクタが取付けられた、移植体用特殊装置（例えば心筋梗塞用カテーテル）からなる。
【００３８】
図７Ａ、７Ｂ、及び７Ｃはそれぞれ、図７のセットの収集、処理、及び移植時の構成要素の稼働配置を示す。
【００３９】
図７Ａでは、収集／処理チャンバｂ３は、無菌コネクタによって収集システムａの投入ポイントに接続されており、処理チャンバは採取された幹細胞を収集する役割を果たす。幹細胞の取り込みは、処理チャンバｂ３のピストンの変位によって制御される。
【００４０】
図７Ｂでは、収集／処理チャンバｂ３は、その無菌コネクタによって、上記の処理運転に合わせて、それを洗浄バッグｂ２及び密度勾配媒体／廃棄物バッグｂ４に選択的に接続するストップコックｂ１に接続されており、運転終了時には処理された／濃縮された幹細胞は処理チャンバｂ３に戻される。その後、処理チャンバｂ３は再注入チャンバの役割を果たす。
【００４１】
図７Ｃは、処理キットのストップバルブｂ１から外された後に無菌コネクタによって移植キットｃの移植装置に接続された処理チャンバｂ３を示す。この配置では、患者への処理済み幹細胞の再注入は、処理／再注入チャンバｂ３のピストンの変位によって制御できる。
【００４２】
この態様は、収集、処理、及び再注入の作業を連続的に実施するために、無菌コネクタを用いて処理チャンバｂ３を収集キットａに、又はストップバルブｂ１を介して処理キットの残りの部分に、又は移植キットｃに接続することに拠っている。これによって、不使用の要素を含まず、都合良く使用できる特に小型のシステムができる。
【００４３】
図８Ａ、８Ｂ、及び８Ｃは、透明チューブを通した、細胞の吸収及び反射特性を利用する光学ラインセンサーＬＳによる細胞の検出の原理を示す。図８Ａは透明な液体の入ったチューブの配置であり、ここではＬＳからの光は反射されず光軸上にある前方検出器Ｒに向かって直進している。図８Ｂは、透明な液体中に浮遊する細胞を含むチューブの配置である；この場合は、細胞は光を無秩序方向に反射し、前方検出器Ｒ及び軸に対し約９０°の角度に配置された側方検出器Ｒの両方によって捕捉される。図８Ｃは、光を全く反射しない不透明液が入ったチューブの構成を示している。図８Ｄは、ＬＥＤ及びレシーバ装置が配置された光学ラインセンサーを上から見た図であり、特に前方青（Fblue）、側方青（Lblue）、前方赤（Fred）及び側方赤（Lred）の光の位置を示す。
【００４４】
図９は、光学ラインセンサーの典型的なシグナルを示しており、シグナルは「前方」及び「側方」センサーによって記録される。「側方」反射シグナルから得られた情報は、収集の開始又は終了の引き金として用いることができる。センサーの出力値（Y軸）は、最大レベルのパーセンテージで表したバフィーコート（BC）採取体積である。Ｘ軸は、チューブ内の通過する容積の情報（全体積のパーセンテージの情報も）を含んでいる。
【００４５】
本発明は、その精神又は本質的な特徴から逸脱することなしに複数の異なる形状で具体化できることを理解しなければならない。発明の範囲は、上記の具体的な既述ではなく添付の請求の範囲によって画定される。それゆえに、請求の範囲の意味及び均等の範囲内に入る全ての態様は、請求の範囲に包含されると解釈される。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、発明の骨髄処理キットの一般的な構成を描いた図である。
【図２】図２は、発明の例示的キットの各種構成要素を描くために図３〜７に使用した記号を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、フィルタユニットを持たない収集キットの態様を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、フィルタユニットを持つ収集キットの態様を示す図である。
【図４】図４は、図３Ａもしくは図３Ｂに示したような収集キット、又は図５Ａもしくは図５Ｂに示す移植キットに、無菌コネクタによって接続できる処理キットを示す図である。
【図５Ａ】図５Ａは移植キットの個別の要素を示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは移植キットを構成している要素の組み合わせを示す図である。
【図６】図６は、完全なシステムを構成するための、キットの様々な組み合わせを描いた図である。
【図７】図７は、回転可能処理チャンバが、細胞の収集及び移植にも用いられる分離シリンジを構成している、一体化された骨髄処理セットの図である。
【図７Ａ】図７Ａは図７のセットの、収集、処理、及び移植に合わせた構成要素の稼働配置を示す図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは図７のセットの、収集、処理、及び移植に合わせた構成要素の稼働配置を示す図である。
【図７Ｃ】図７Ｃは図７のセットの、収集、処理、及び移植に合わせた構成要素の稼働配置を示す図である。
【図８Ａ】図８Ａは、細胞の吸収及び反射特性を利用した光学ラインセンサーによる細胞検出の原理を示す図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、細胞の吸収及び反射特性を利用した光学ラインセンサーによる細胞検出の原理を示す図である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、細胞の吸収及び反射特性を利用した光学ラインセンサーによる細胞検出の原理を示す図である。
【図８Ｄ】図８Ｄは、ＬＥＤ及びレシーバ装置を備えた光学ラインセンサーを上から見た図である。
【図９】図９は図８の光学ラインセンサーの典型的な出力シグナルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【国際調査報告】
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