(57)【要約】  本発明は、ウイルスへの結合及び中和に有用である新規なアプタマ誘導体を提供する。また、このアプタマを具える薬学的処方物及びこのアプタマでの有用な化合物に対するスクリーニングでのこのアプタマの使用も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｉ
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に示されるような二次構造を形成する単鎖核酸分子において、
Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３が全てへリックスであり；
Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３が全てループ構造であり；
Ｌ２が配列ＣＡＣ又はＣＡＸＣを具え；
前記核酸分子が、表１に挙げられた核酸から選択された核酸を具えないことを条件として、Ｌ３が配列ＡＣＸＸ又はＡＸＸＸを具えることを特徴とする単鎖核酸分子であり；ここで、Ｘが任意のヌクレオチドであり、次のヌクレオチドがＨ３の一部を形成するＧであり；Ｈ２とＨ３の間の領域のＬ１が配列ＵＵＵＵを具えることを特徴とする単鎖核酸分子。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸分子において、当該核酸分子がウイルスを中和することができることを特徴とする核酸分子。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸分子において、当該核酸分子がＨＩＶ−１ウイルスを中和することができることを特徴とする単鎖核酸分子。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸分子において、当該核酸分子が糖タンパク質ｇｐ１２０を包むように結合することによって、ＨＩＶ−１ウイルスを中和することを特徴とする核酸分子。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載の核酸分子において、当該核酸分子が切断アプタマであることを特徴とする核酸分子。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載の核酸において、Ｈ１が４から１０の塩基対から成ることを特徴とする核酸。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸において、配列；
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を具えることを特徴とする核酸。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載の核酸分子において、前記核酸分子が、修飾ヌクレオチドを具えることを特徴とする核酸分子。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸分子において、前記修飾塩基が、以下の手段：
（ｉ）    Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、ＣＨ３でのピリミジン６位又は８位、又はプリン５修飾；
（ｉｉ）  ＮＨ３でのピリミジン２位修飾；
（ｉｉｉ）ピリミジン修飾Ｏ６−ＣＨ３、Ｎ６−ＣＨ３、及びＮ２−ＣＨ３；
（ｉｖ）  ２’糖修飾；
（ｖ）    ３’及び／又は５’キャッピング
の１又はそれ以上によって修飾されることを特徴とする核酸分子。
【請求項１０】
請求項１から７のいずれか１項に記載の配列と補完することを特徴とする核酸。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか１項に記載の核酸分子と前記核酸分子の結合部位を具える生体分子との間の相互作用を阻害又は強化する化合物を同定するインビトロ法において：
（ａ）請求項１から１０のいずれか１項に記載の１又はそれ以上の核酸分子と、前記生体分子と、候補化合物を具える混合物を形成するステップと；
選択的に、
（ｂ）前記候補化合物の不在下で、前記生体分子に対する前記核酸分子の特異的結合を許容する条件下で、前記混合物をインキュベートするステップと；
（ｃ）前記生体分子に対する前記核酸分子の結合への前記候補化合物の効果を測定するステップと；
を具えることを特徴とするインビトロ法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において、前記方法が、マイクロ流体デバイスを使用することを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１１又は請求項１２に記載の方法において、前記方法が、高スループットスクリーニングを具えることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１１から１３に記載の方法において、前記方法が、拮抗阻害を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１１から１４に記載の方法において、前記方法がｇｐ１２０を用いることを特徴とする方法。
【請求項１６】
薬学的組成物において、選択的に、１又はそれ以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤と共に、請求項１から１０のいずれか１項に記載の少なくとも１つの核酸分子を具えることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項１７】
ＨＩＶ感染症の治療用の請求項１から１０のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１８】
ＨＩＶ感染症の治療用の薬剤の製造における、請求項１から１０のいずれか１項に記載の核酸分子の使用。
【請求項１９】
ＨＩＶ感染症の治療方法において、これらを必要とする被験者に対して、請求項１から１０のいずれか１項に記載の少なくとも１つの有効量の核酸分子、又は請求項１６に記載の薬学的処方物を投与するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項２０】
表１に示される配列を有することを特徴とする核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二次構造を有し、従ってウイルスの表面に結合することが可能な所定の核酸分子、具体的には、ＨＩＶの糖タンパク質ｇｐ１２０を有する核酸分子に関する。
【０００２】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２）は、後天性不免疫症候群（ＡＩＤＳ）（２−４）の病原因子であり、年間、約３百万人の死亡原因となっている。臨界ウイルス酵素の強力な阻害剤の開発及び複合治療アプローチにも関わらず、ＨＩＶ感染症の根絶のゴールは、異常な系統間の多様性によって、分かりにくいままである（５）。従って、新規な抗レトロウイルス剤を開発する強い動機付けがある。古くから、抗レトロウイルス剤は、ウイルス酵素をターゲットとしてきたが、最近の研究は、宿主細胞内へのウイルスの侵入の阻害を対象とした薬剤が、代替戦略を提供することを示している（６）。ＨＩＶ−１は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）と、一次細胞レセプタ（ＣＤ４）及びコレセプタ（ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４）の間の分子相互作用の連鎖によってＣＤ４＋  Ｔ細胞に侵入する（８−１０）。表面糖タンパク質、ｇｐ１２０は、先ずＣＤ４に結合し、コレセプタの結合を促進する立体構造変化を受けるように誘発される（１１）。これは、膜貫通糖タンパク質（ｇｐ４１）の更なる立体構造変化を誘発し、標的細胞膜へのＮ−末端融合ペプチドの挿入、及び宿主サイトプラズムへのウイルスゲノムの最終放出につながる（１２）。このため、ウイルス侵入は、ウイルス（ｇｐ１２０及びｇｐ４１）と、宿主標的細胞（ＣＤ４及びケモカインコレセプタ）の双方への治療攻撃用の多数のターゲットを示す。ウイルスが、免疫学的監視を逃れるために用いる多数の回避戦略を促進する抗体（〜１５０ｋＤａ）によって課せられた選択的圧力を考慮して、アプタマ（２０−３８ｋＤａ）等のより小さなリガンドが、エンベロープ糖タンパク質上の凹型保存領域に結合し、ウイルスの侵入を阻害することができると仮定した。
【０００３】
アプタマは、一般的に２０から１２０の核酸を具える核酸リガンドであり、タンパク質の表面上の機能性保存部位を規定するのに用いることができる。これらは、ＳＥＬＥＸと呼ばれるインビトロ進化プロセスによって、複合組み合わせライブラリから取り出すことができる（１３、１４）。この方法を用いて、ＣＣＲ５−依存性ＨＩＶ−１株Ｂａ−Ｌのｇｐ１２０に結合する一連の高親和性単鎖ＲＮＡアプタマを単離した（１）。ＢＩＡｃｏｒｅを用いる５回の選択後、高親和性を有するｇｐ１２０を結合した抗−ｇｐ１２０（Ｂａ−Ｌ）アプタマの２５の異なる配列ファミリを単離した（１）。これらのアプタマは、１，０００倍以上のヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌの感染性を中和した。重要なことは、これらは、試験された中和モノクローナル抗体よりも効果的に、様々な臨床分離株を中和し、８０％又はそれ以上の度合でＨＩＶ−１感染症を阻害した（１）。これらのアプタマを表１に挙げる。
【０００４】
一般的な二次構造モチーフは、現在アプタマ−ｇｐ１２０相互作用に重要である最小ｇｐ１２０−結合領域内で同定される。これは、言い換えれば、修飾／切断アプタマを提供し、これは、更に、（１）に記載されたフルサイズのアプタマ構造の中和効果を提供する。
【０００５】
従って、第１の態様では、本発明は、Ｉ
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で示されるような二次構造を形成する単鎖核酸分子を提供し、ここで、
Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３は、全てへリックスであり；
Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は、全てループ構造であり；
Ｌ２は、配列ＣＡＣ又はＣＡＸＣを具え；
前記核酸分子が、表１に上げられたものから選択された核酸を具えない場合に、Ｌ３は、配列ＡＣＸＸ又はＡＸＸＸを具え；ここで、Ｘは、任意のヌクレオチドであり、次のヌクレオチドはＨ３の一部を形成するＧであり；
Ｈ２とＨ３の間の領域で、Ｌ１は配列ＵＵＵＵを具える。
【０００６】
単鎖核酸分子の２つの部分間に、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対が形成される場合、へリックスを形成する。これは、通常、回分配列がある場合に起こる。しかし、「ウォブル」の度合、例えば、Ｇ−Ｕ塩基対合が可能である。へリックスを形成する配列の２つの部分間の配列は、ループを形成する。従って、図１ｃを見て、ここに示されるアプタマ構造を考える場合、様々な長さの塩基−対合の３つの領域が明らかに見える。これらは、図において１、２、及び３に分類されている。Ｈ３が、２つの塩基対のみから成ることが分かるが、本発明の目的のためには、このような短い対を成す配列が、更にへリックスとして規定される。本発明によれば、塩基対合を形成しない配列の他の部分は、ループ構造を構成する。
【０００７】
本発明の核酸分子は、好ましくは、ウイルスを中和することができなければならない。好ましい実施例では、中和は、エンベロープタンパク質、例えば、ＨＩＶウイルスのｇｐ１２０タンパク質に結合することによって達成される。
【０００８】
本明細書では、用語「中和」は、好ましくは、少なくとも１桁、より好ましくは数桁、エンベロープウイルスの感染力を中和／還元することをいう。
【０００９】
核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかであり、単鎖又は二重鎖のいずれかである。一般的に、核酸分子は、長さ２０−１２０ヌクレオチドである。核酸を形成するヌクレオチドは、化学的に修飾されて、分子の安定性を増し、その生物学的利用能を強化し、又は、更なる活性を与えることができる。例えば、ピリミジン塩基は、６又は８位で修飾され、プリン塩基は、ＣＨ３、又はＩ、Ｂｒ、又はＣｌ等のハロゲンを用いて、５位で修飾することができる。また、ピリミジン塩基の修飾は、２ＮＨ３、Ｏ６−ＣＨ３、Ｎ６−ＣＨ３、及びＮ２−ＣＨ３を含む。２’位での修飾は、糖修飾であり、典型的に、ＮＨ２、Ｆ、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、Ｏ−ブチル、又はあらゆるＯ−アルキル基を含む。また、修飾は、キャッピング等の３’及び５’修飾を含むことができる。また、リボース部分に対する修飾は、構造中に組み込むことができる。
【００１０】
代替的に、モルホリノヌクレオチド、固定核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）及びペプチド核酸（ＰＮＡ）等の修飾ヌクレオチドを用いることができる。モルホリノオリゴヌクレオチドは、様々なモルホリノサブユニットからアッセンブルされ、それぞれは、６−員モルホリン環に結合した４つの遺伝的塩基（アデニン、サイトシン、グアニン、及びチミン）のうちの１つを含む。これらのサブユニットは、非イオン性ホスホロジアミダートサブユニット間結合によって結合し、モルホリノオリゴヌクレオチドを与える。ＬＮＡモノマは、フラノース環構造が、４’−Ｃ位に２’−Ｏ位を結合するメチレンリンカによって制限される点で特徴付けられる。ＰＮＡは、骨格が糖よりもむしろ擬ペプチドであるＤＮＡの類似体である。
【００１１】
本発明の実施例では、Ｈ１は、４−１０塩基対から成り、加えて、Ａ：Ａミスマッチ対合も具えることができる。代替的に、Ｈ１は、３塩基対未満、又は実に１０塩基対を超えるものから成るものでもよい。
【００１２】
我々は、Ｈ１の長さを短縮することは、アプタマの構造の安定性の減少させる、言い換えれば、結合を少なくすることを示した。これは、恐らく、Ｈ１によってＬ１の安定性が失われることに起因する。従って、Ｈ１の長さが短くなるにつれて、Ｌ１は、修飾の導入、例えば、架橋修飾、又はＨ１又は実にＬ１の塩基対を増やすものによって、安定化されるべきである。従って、例えば、Ｈ１を除去することが可能であるべきであるが、これは、Ｌ１を安定化する架橋又は塩基対修飾によってＬ１ループの「閉鎖」を必要とするであろう。
【００１３】
結合等においてＨ１の長さを変更する効果を、図９−１１に見ることができる。
【００１４】
アプタマは、当業者に公知の方法、例えば、固相合成（Ｏｇｉｌｖｉｅ，Ｋ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ８５（１６）ｐ５７６４−８；Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．Ａ（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３１７  ｐ３−１８）、又は、インビトロ転写（Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ，Ｏ．，Ｗ．Ｐｅｉｋｅｎ  ａｎｄ  Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（１９９３）Ｆａｓｅｂ  Ｊ．７（１）ｐ９０−６）によって調製することができる。
【００１５】
別の実施例では、アプタマは、切断アプタマ、即ち、除去した核酸残渣を少なくとも１つ有する全長アプタマ核酸分子である。ここで議論されているように、このような分子の重要な特徴は、ここに記載されている二次構造を形成する能力を保持することである。本発明者は、このようなアプタマ分子が中和のために効果的である最小構造を規定した。
【００１６】
第２の態様では、本発明は、本発明のアプタマを用いて潜在的治療ターゲットをスクリーニングする方法を提供する。上記のように、ウイルスは、抗体による検出から自身を守るように適応する。抗体可変領域よりも小さい分子に基づいた薬剤は、これらの適応デバイス中を通ることができるべきである。ウイルス感染を防ぐように働く薬剤はほとんどない（「ロスマン（Ｒｏｓｓｍａｎ）」結合開裂抗−ピコルナウイルス剤は、明らかな例外である）。これは、抗ウイルス治療の道具の有意なギャップとして同定される。アプタマウイルス結合の効果が、細胞の感染を防ぐので、ウイルス結合用アプタマと競合する小さな分子を同定することが可能である。これらの分子は、ウイルスの同じ機能が保存されている部位に結合し、ウイルス感染を抑制するので、抗−ウイルス治療の開発に有益である。
【００１７】
ウイルス中和アッセイは、細胞培養システム、拡張インキュベーション時間、及び複合読み出しシステムの要求（ｃｈａｌｌｅｎｇｉｎｇ）に依存するので、高スループットスクリーニングアプローチの影響を受けにくい。アプタマは、Ｇｒｅｅｎ及びＪａｎｊｉｃ（２００１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ３０  １０９４−６，１０９８，１１００の各所に記載されているように、高スループットスクリーニングに用いることができる。従って、１の好ましい実施例では、本発明のアプタマを高スループットスクリーニング法で用いている。このような方法は、ウイルスタンパク質、具体的には、エンベロープ糖タンパク質、例えばｇｐ１２０の使用を含む。
【００１８】
本発明の第３の態様では、本発明のアプタマと該アプタマの結合部位を具える生体分子間の相互作用をブロックする又は強化する化合物を同定するインビトロ方法を提供し、この方法は：
（ａ）本発明の１又はそれ以上のアプタマ、前記生体分子、及び候補化合物を具える混合物を形成するステップと；選択的に、
（ｂ）候補化合物のない状態で、前記生体分子に対するアプタマの特異的結合を許容する条件下で、前記混合物をインキュベートするステップと；
（ｃ）前記生体分子に対する前記アプタマの結合の候補化合物の効果を測定するステップと；
を具える。
【００１９】
アプタマ結合部位に対する本発明のアプタマの結合を阻害又は刺激する化合物が、疾病の治療における潜在的な薬理活性、又はこの結合部位に対するアプタマの結合モチーフに媒介される状態を有するとして同定される。
【００２０】
ここで用いられるとき、用語「特異的結合」は、アプタマが、生体分子のその他の領域、又はアッセイが実施される容器の表面に非特異的に結合することと逆に、結合モチーフに結合することを意味する。
【００２１】
生体分子は、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸、又は例えば、ペプチド核酸等のこれらの組み合わせであってよい。１の好ましい実施例では、生体成分は、ＨＩＶ−１のエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０のアプタマ結合モチーフを具える。より好ましくは、この生体分子は、ＨＩＶ−１のエンベロープ糖タンパク質である。
【００２２】
１の好ましい実施例では、アプタマ及び／又は生体分子が標識されて、検出シグナルを提供する。この成分は、直接又は間接的に検出できる標識、例えば、３５Ｓ、１２５Ｉ、３２Ｐ、及び／又は３Ｈ等の放射性標識、蛍光又は発光標識、タンパク質成分の一つ又は他の特異的検出を促進する酵素又はエピトープタグで標識されてよい。このアッセイ混合物の他の成分は、最適なタンパク質−タンパク質結合を強化し、反応成分のバックグラウンド又は非特異的相互作用を低減する塩、緩衝剤成分等を必要に応じてを含む。
【００２３】
ウイルスタンパク質は、Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｐ．，Ｊ．Ａ．ＭｃＫｅａｔｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｐｌ２０  ａｎｄ  ｇｐｌ６０  ｆｒｏｍ  ＨＩＶ−Ｉ：ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ＣＤ４”Ａｉｄｓ４（４）：３０７−１５に記載されている９６ウエルプレート等の反応容器に結合する。例えば、組み合わせライブラリからの化合物を、固定したウイルスタンパク質でインキュベートする。標識した中和アプタマを加える。この標識は、放射性、又は、例えば、ストレプトアビジン等のタンパク質であってよい。あらゆる非結合アプタマを洗い落として、結合アプタマの濃度を測定する。結合アプタマの量が対照よりもかなり少ない（試験化合物を除去した）容器が、潜在的にウイルス感染を阻害する試験化合物に相当する。次いで、同定された化合物は、最も低いＩＣ５０でこれらを同定するために様々な濃度で、更なるスクリーニング試験に用いることができる（アプタマ−タンパク質結合を５０％阻害する濃度）。また、超高スループット法も用いることができる。
【００２４】
これらのスクリーニング法は、マイクロ流体技術、及び「ラボオンチップ（ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）」ベースの技術を用いて実施することができる。これらの方法では、一般的に、直径１ｍｍよりも小さいチャネルのデバイスを用いる。これらの方法で用いられる通常ナノリットルの小さな体積、必要な試薬の量を低減し、これによって、特に、高価な試薬が必要とされる場合に、コストを削減する。また、等化を起こすのに必要な時間を低減して、プロセスを促進する。これらのデバイスの製造は比較的安価であり、複数のデバイスを大量生産することが可能である。また、マイクロ流体技術は、いくつかの異なる機能を同じチップ上で実施することが可能である。マイクロ流体技術を用いる高スループットスクリーニング法は、当業者に公知であり、例えば、国際公開番号第ＷＯ９８／００２３１号、ＵＳ５９４２４４３号及びＵＳ２００２／０３１８２１号に記載されている。また、これらの方法で用いる方法及びデバイスは、ＵＳ６４９５３６９号に記載されている。
【００２５】
本発明の核酸は、薬学的組成物に用いることができる。従って、第４の態様では、本発明は、選択的に１又はそれ以上の薬学的に許容できる賦形剤、担体又は希釈剤を有するここで規定されているような１又はそれ以上の核酸を具える薬学的組成物を提供する。
【００２６】
本発明の組成物は、あらゆる適切な経路、例えば、経口（口腔又は舌下を含む）、経腸、経鼻、局所（口腔、舌下、又は経皮を含む）、経腟又は非経口（皮下、筋肉内、静脈、脊髄内、眼球、又は皮内を含む）経路による投与に適応される。このような処方は、例えば、担体又は賦形剤を有する活性成分に関する医薬の技術分野で公知のあらゆる方法によって調製される。
【００２７】
経口投与に適合した薬学的処方は、カプセル又はタブレット；パウダー又は顆粒；水性又は非水性液体の溶液又は懸濁液；可食性の泡又はホイップ；又は水中油型液体エマルジョン又は油中水型液体エマルジョン等の個々の単位として存在してよい。
【００２８】
経皮投与に適合した薬学的処方は、受け手の表皮へ長期間の密接な接触を維持する目的で個々のパッチとして存在してよい。例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３（６），３１８（１９８６）に一般的に記載されているように、イオン導入によってパッチから有効成分が導入される。
【００２９】
局所投与に適合した薬学的処方は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、パウダー、溶液、ジェル、スプレィ、エアロゾル、又は油として処方されてよい。
【００３０】
眼又はその他の外部組織、例えば口又は皮膚への塗布のためには、処方が、好ましくは局所軟膏又はクリームとして適用されてよい。軟膏で処方される場合、有効成分は、パラフィン又は水混和性軟膏ベースと共に用いることができる。代替的に、有効成分を、水中油型クリームベース又は油中水型ベースを有するクリームと共に処方してもよい。
【００３１】
眼への局所投与に適合した薬学的処方は、点眼を含み、有効成分は、好適な担体、特に水性溶剤中に溶解又は懸濁される。
【００３２】
口内の局所投与に適合した薬学的処方は、ドロップ（ｌｏｚｅｎｇｅｓ）、トローチ（ｐａｓｔｉｌｌｅｓ）及び洗口液を含む。
【００３３】
経腸投与に適合した薬学的処方は、座薬又は浣腸剤として存在してよい。
【００３４】
経鼻投与に適合した薬学的処方であって、担体が固体である薬学的処方は、例えば、嗅ぎ薬で摂取される方法で、即ち、鼻に近づけたパウダァの容器から鼻腔を通って急速に吸入することによって投与される２０から５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗粉末を含む。経鼻スプレィとして、又は経鼻ドロップとして投与用の担体が液体である好適な処方は、有効成分の水性又は油性溶液を含む。
【００３５】
吸入による投与に適合した薬学的処方は、様々なタイプの定量噴霧圧力エアロゾル、噴霧器又は吸入器によって発生する微粉末又は霧を含む。
【００３６】
経腟投与に適合した薬学的処方は、ペッサリィ、タンポン、クリーム、ジェル、ペースト、泡、又はスプレィ処方として存在してよい。
【００３７】
非経口投与に適合した薬学的処方は、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、対象とするレシピエントの血液と等張な製剤にする溶質を含む水性及び非水性無菌注射液；懸濁剤及び増粘剤を含む水性及び非水性無菌懸濁液を含む。この処方は、例えば、密封したアンプル及びバイアル等の単位投与容器、又は反復投与容器に入れてあり、使用直前に、例えば、注射用水等無菌液体担体の添加のみを必要とするフリーズ−ドライした（凍結乾燥した）状態で貯蔵することもできる。即時注射液及び懸濁液は、無菌パウダー、顆粒及びタブレットから調製されてよい。
【００３８】
本発明の組成物は、所定量の１投与当たりの各有効成分を含む単位投与形態で与えることができる。このような単位は、５−１００ｍｇ／日の化合物、好ましくは５−１５ｍｇ／日、１０−３０ｍｇ／日、２５−５０ｍｇ／日、４０−８０ｍｇ／日、又は６０−１００ｍｇ／日を提供するようにしてもよい。式Ｉの化合物については、１００−１０００ｍｇ／日の範囲、好ましくは１００／４００ｍｇ／日。３００−６００ｍｇ／日、又は５００−１０００ｍｇ／日の範囲で提供することができる。このような投与は、単回投与で、又は多数の分散投与として提供することができる。もちろん、最終的な投与は、治療の状態、投与経路、患者の年齢、体重及び状態に依存し、医師の裁量である。
【００３９】
好ましい単位投与処方は、有効成分の上記のような１日の投与量、サブ−ドーズ（ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）、又はこれらの最適な分画を含む処方である。
【００４０】
特に上記の成分に加えて、処方は、問題の処方のタイプに関するこの分野の従来の他の薬剤も含んでもよく、例えば、経口投与に好適な薬剤は、香料添加剤を含んでもよいことが理解されるであろう。
【００４１】
更なる態様では、本発明は：
（ｉ）  ＨＩＶ感染の治療用の医薬の製造における本発明の少なくとも１の核酸分子の使用と；
（ｉｉ）対象に対する本発明の少なくとも１の核酸分子の有効量を投与するステップを具えるＨＩＶ感染の治療方法と；
を提供する。
【００４２】
ここで、本発明を、以下に記載されている図に言及する次の非限定例を参照して、より詳細に記載する。
【００４３】
例
材料及び方法
【００４４】
細胞
ヨトウガ（ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９ｓ細胞は、Ｊｏｈｎ  Ｓｉｎｃｌａｉｒ（英国所在のオックスフォード大学Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）によって親切にも提供された。ヒト白血球は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓを通してＢｒｉｓｔｏｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓによって供給された軟膜画分から得た。
【００４５】
ウイルスストック
本試験に用いたＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌ株は、米国メリーランド州ベテスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）所在のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈによるＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｃａｔａｌｏｇ  ｎｕｍｂｅｒ  ５１０）を通して得た。
【００４６】
オリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチド１及び２を各アプタマのＴ７転写用のテンプレートとして用いた（５’→３’に記載されている）。５’及び３’プライマを列挙し、Ｔ７プロモータに下線を付している。
【００４７】
１．アプタマＢ４０（１−１１７）−
2008529517.tif 000003
５’プライマ（Ｔ３  ＳＥＬＥＸ）−
2008529517.tif 000004
３’プライマ（Ｔ７  ＳＥＬＥＸ）−
2008529517.tif 000005
【００４８】
２．アプタマＢ４０ｔ７７（１−７４ＣＣＣ）−
2008529517.tif 000006
2008529517.tif 000007
2008529517.tif 000008
【００４９】
ＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌｇｐ１２０の発現
１×１０６細胞／ｍｌ以下の浮遊培地中のＳＦ９００ＩＩ血清−フリー昆虫培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）中で、Ｓｆ９ｓ細胞を２８℃で培養した。次の標準的方法で、Ｓｆ９ｓ細胞をＨＩＶ−１Ｂａ−ＬＳＵ糖タンパク質（ｇｐ１２０）及び線形化ｐＡｃＢＡＫ６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をコードする５００ｎｇのｐ２ＢａＣ−ｇｐ１２０（２８）の混合物でトランスフェクトして、組み換えウイルスを産生した（２９）。細胞を５のｍ．ｏ．ｉで感染させ、２８℃で４日間インキュベートした。この時間で、培地内へのｇｐ１２０の分泌が最適であった。抗−ＦＬＡＧ  Ｍ２（Ｓｉｇｍａ社製）親和性クロマトグラフィを用いてｇｐ１２０を精澄培地上澄みから精製し、画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びウエスタンブロットによって評価した。製造者の指示に従って、タンパク質を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ  １０／３０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いてＦＰＬＣゲルろ過によって更に精製して、高次凝集体を取り除き、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（英国チェスター所在のＰｉｅｒｃｅ社製）を用いて定量化した。
【００５０】
インビトロトランスクリプション
２２５ｐｍｏｌのＤＮＡテンプレート全量を、４０ｍＭ  トリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ２’Ｆ  ＵＴＰ、１ｍＭ  ２’Ｆ  ＣＴＰ（Ｔｒｉｌｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、１ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＧＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭ  スペルミジン、及び１，５００ＵのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）から成る最終５００μｌの転写反応混合物に加え、３７℃で１６時間インキュベートした。１μｇのＤＮＡテンプレートについて、１ＵのＲＮａｓｅ−フリーＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｓｉｇｍａ社製）の添加によって転写を終了し、この反応混合物を３７℃で２０分間インキュベートした後、フェノール−クロロフォルムを抽出した。ＲＮＡをエタノールで沈殿させ、水に再溶解し（Ｓｉｇｍａ社製）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ５０ニックスピンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）で低−Ｍｒ汚染物質から分離し、Ａ２６０の決定によって定量化した。３分間水中で９５℃に加熱することによって、ＲＮＡをリフォールディングして、次いで、５分間室温に徐冷し、１×ｃＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．７ｍＭ  ＫＣｌ）に調製し、更に室温で１０分間インキュベートした。
【００５１】
ＲＮＡの３２Ｐ５’−末端標識
５’−末端標識について、微生物アルカリホスファターゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて末端５’ホスファートの脱リン酸を実施し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰからγ−ホスファートで置換した。次いで、標識ＲＮＡを１２％の変性（８Ｍ尿素）ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させ、オートラジオグラフィによって可視化し、受動的溶離によってゲルスライスから回収した。
【００５２】
酵素プロービング及びフットプリント
３２Ｐ５’−末端標識ＲＮＡは、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ｔ１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製；５×１０−３Ｕ）、ヌクレアーゼＶ１（Ｐｉｅｒｃｅ社製；５×１０−３Ｕ）、又はＳ１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製；０．０５Ｕ）で、２０℃で５分間、担体ＲＮＡ（１μｇのｔＲＮＡ）の存在下で１×ｃＨＢＳ緩衝液の酵素消化に曝された。この反応を停止し、ＲＮＡは、フェノール／クロロフォルム抽出に曝され、エタノール沈殿し、ホルムアミド緩衝液に溶解した。フットプリントを、２５℃で１時間ＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌｇｐ１２０の様々な濃度で同様に標識されたアプタマをインキュベートすることによって達成し、適切なヌクレアーゼ消化をした。消化をフェノール抽出によって終了し、エタノールで沈殿させ、ホルムアルデヒド緩衝液に再溶解した。次いで、ＲＮＡフラグメントを１８％変性（８Ｍ尿素）ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させることによって大きさ順に並べ、次いで、オートラジオグラフィした。フラグメントのサイズの決定を、部分アルカリ加水分解ラダーと（５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．２で標識したＲＮＡを、９５℃で１０分間加熱することによって達成した）、ＲＮａｓｅ  Ｔ１−消化ラダー（１０μｌの２０ｍＭクエン酸ナトリウム中５５℃でＲＮＡを変性させた５０，０００ｃ．ｐ．ｍ（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ社製）の消化によって生成した、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、７Ｍ尿素、ｐＨ４．６）を流すことによって促進し、Ｇ残渣の位置を示した。
【００５３】
化学プロービング
ジメチルサルファート（ＤＭＳ；Ｆｌｕｋａ社製）及び１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド  メト−ｐ−トルエンスルホナート（ＣＭＣＴ；Ｓｉｇｍａ社製）を用いて上記（１５−１７）のように化学プロービングを実施した。２μｇ  ｔＲＮＡの存在下にゲル精製及びリフォールディングした０．１μｇのアプタマＢ４０（１−１１７）のＤＭＳ（Ｎ１−Ａ及びＮ３−Ｃを修飾）及びＣＭＣＴ（Ｎ３−Ｕ、Ｎ１−Ｇを修飾）修飾を、２０μｌ反応液中で実施した。ＤＭＳについては、緩衝液は、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び１５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含むが、ＣＭＣＴについては、緩衝液は、５０ｍＭ  ホウ酸−ＮａＯＨ  ｐＨ８．０、５ｍＭ  Ｍｇ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２・Ｈ２Ｏ、１５０ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＫ、及び５ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含んでいた。セミ−変性緩衝液は、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含んでいた。３０μｍｏｌ及び６０μｍｏｌのＤＭＳの存在下で、５分間、１０μｍｏｌ及び２０μｍｏｌのＣＭＣＴの存在下で２０分間、２０℃で反応を実施した。エタノールで沈殿させた後、修飾ＲＮＡを水に溶解させた。対照、即ち未修飾アプタマＢ４０を同時に処理した。
【００５４】
プライマ伸長
プライマ伸長（１８）を実施して、修飾残基を検出した。プローブされた対照（未修飾）ＲＮＡを、５’−３２Ｐ−標識ＤＮＡプライマ（５’ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣ３’）にハイブリダイズした。これは、標的配列の３’−末端に相補であり、このプライマは、ＡＭＶ逆転写酵素（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ社製；４Ｕ）を用いて伸長した。プローブされた（対照の）ＲＮＡのプライマ伸長によって生成したｃＤＮＡパターンを、８％変性（８Ｍ尿素）ポリアクリルアミドゲル上で分析し、オートラジオグラィを実施した。ジデオキシヌクレオチド及び未処理ＲＮＡを用いた配列反応（１９）を実施して、修飾残基の同定を促進するように平行に進めた。プライマ伸長プロセス中の逆転写酵素の自然の切れ目を検出するために、未修飾ＲＮＡの伸長対照も平行に進めた。
【００５５】
Ｂ４０アプタマの二次構造予測
アプタマＢ４０及びＢ４０ｔ７７の二次構造モデルを、ｍｆｏｌｄ折り畳みアルゴリズム（２０）及びＳＴＡＲソフトウエアパッケージ（２１、２２）を用いて推定した。この予測を、酵素及び化学プロービング実験からのデータを用いて限定した。
【００５６】
ゲル移動度のシフトアッセイ（Ｇｅｌ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｈｉｆｔ  ａｓｓａｙ）
天然ゲルシフトアッセイを用いて、ｇｐ１２０に結合するＢ４０及びＢ４０ｔ７７アプタマの解離定数を定量化した。典型的な結合アッセイでは、１×ｃＨＢＳ緩衝液及び１μｇのｔＲＮＡ中の５’−末端標識アプタマ（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ社製５０００ｃ．ｐ．ｍ．）を、室温で１時間、増量したｇｐ１２０の存在下でインキュベートした。インキュベートを完了後、７０％（ｖ／ｖ）グリセロール及び０．０２５％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルーを含む３μｌのローディング溶液を各反応液に加えた。
【００５７】
次いで、サンプルを１％のアガロースゲルに再溶解させた。電気泳動後、ゲルに再溶解したサンプルを、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に移した。結合及び未結合画分中のアプタマの量を、リン貯蔵オートラジオグラフィ及びＳＴＯＲＭリン撮像装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社製）を用いて得た。Ｂ４０及びＢ４０ｔ７７アプタマの解離定数は、式：結合画分＝Ｂｍａｘ（ｇｐ１２０）／（（ｇｐ１２０）＋Ｋｄ）へのフィットから誘導される。ここで、Ｂｍａｘは、観察されたアプタマ結合の最大画分であり、（ｇｐ１２０）は、タンパク質濃度、Ｋｄは、解離定数である。ゲル上のアプタマ−ｇｐ１２０複合体の拡散によって、ｇｐ１２０に結合したアプタマの画分を、フリー（未結合）アプタマの画分から推測した（レーン１、図Ａ及びＢ）。
【００５８】
ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）表面プラズモン共鳴
ＢＩＡｃｏｒｅ２０００を用いて、全ての結合アッセイを実施した。リサーチグレードＣＭ５センサチップ、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）／ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド）カップリング試薬、エタノールアミン及びグリシン−ＨＣｌは、ＢＩＡｃｏｒｅ社製（瑞国ウプサラ県所在）であった。１×ｃＨＢＳ緩衝液を１時間脱気して、流入緩衝液として用いた。流速を５μｌ／分に設定した。アミン結合化学物質を用いて、ｇｐ１２０をＣＭ５センサチップ上に固定した。フローセルを、ＥＤＣ（０．２Ｍ）とＮＨＳ（０．０５Ｍ）の混合物で１０分間活性化した。
【００５９】
ｇｐ１２０は、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２で交換した緩衝液であり、５００μｇ／ｍｌの濃度で注入された。投与量依存性結合アッセイについて、１００００ＲＵ、５０００ＲＵ及び１０００ＲＵを、３つの異なるフローセル上に固定し、第４のフローセルを、モック固定化ブランク対照（ｍｏｃｋ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ，ｂｌａｎｋ  ｃｏｎｔｒｏｌ）として用いた。ＲＮＡの２’−フルオロ−ピリミジン修飾の役割を研究する結合アッセイでは、２５００ＲＵを固定化した。固定化に続いて、エタノールアミン（１Ｍ、ｐＨ８．５）を１０分間注入し、残りの活性基を阻害した。次いで、グリシン−ＨＣｌ（１０ｍＭ、ｐＨ２．５）を用いて、あらゆる非特異的結合リガンドを洗い流した。このアプタマを結合緩衝液（上記のような）中でリフォールディングし、５μｌ／分でフローセル全体に注入した（３５μｌ又は１５μｌ）。注入の間に、これらの表面を、５μｌの１０ｍＭ  ＮａＯＨを２回注入することによって再生し、次いで、流入緩衝液で１０分間洗浄した。屈折率の変化、及び機器のノイズを補正するために、対照表面からの反応データを、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．２を用いて反応表面から得られた反応から差し引いた。
【００６０】
ヒトＰＢＭＣの培養
ヒトＰＢＭＣを、標準のＨＩＶ−陰性ドナーのヘパリン化軟膜から、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）密度勾配遠心分離法によって単離した。希釈自己プラズマを保存して、加熱不活化し、浄化して、白血球培養用自己血清（ＡＳ）添加剤を調製した。ＰＢＭＣを４℃のＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ社製）で６回洗浄し、実質的に血小板及び顆粒球がなくした。ＨＩＶ−１中和を研究するために、マイトジェンの活性化とインターロイキン−２（ＩＬ−２）なしで培養したＰＢＭＣ培地を用いた。細胞を２％のＡＳを含むＸ−ＶＩＶＯ−１０（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社製）で７日間維持した。マイトジェン及びＩＬ−２のないシステムは、マイトジェン処理した、サイトカイン添加培地よりもより高いレベルのウイルス分離体のレプリカを、思いのままにサポートするリンパ球やマクロファージの遅増殖型混合培地を生成する。これに続いて、細胞培地を用いて、９６ウエルプレートで感染及び中和アッセイを実施した。
【００６１】
中和アッセイ
１０５細胞／ウエルで播種した７日目のＰＢＭＣを、室温で３０分間、５０μｌの逐次希釈（反対数希釈）抗−ｇｐ１２０モノクローナルアプタマ又は対照アプタマ、ＳＡ１９、又は可溶性ヒトＣＤ４で前インキュベートした培養液中で、ＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌの１０３感染単位／ｍｌを用いて感染させた。アプタマＳＡ１９は、Ｂ４０として同じＳＥＬＥＸライブラリからＴａｈｉｒｉ−Ａｌａｏｕｉ  ｅｔ．ａｌ（２３）によってストレプトアビジンに対して選択された。３つの複製を各希釈液で用いた。感染後１６時間で、培地含有ウイルス接種材料及びアプタマを新しい培地と交換して、この培養液を更に３日間維持した。ウイルス複製の範囲を、上記のように上澄みから細胞外ｐ２４−抗原成分を測定することによって決定した（２４、２５）。
【００６２】
突然変異Ｂ４０ｔ７７アプタマのＲＮＡ突然変異生成及びＢＩＡｃｏｒｅ結合分析。
【００６３】
突然変異生成研究用に、先ず、ＲＮＡ突然変異体を、ｍｆｏｌｄを用いたインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）で試験して、３方向ジャンクション構造を保持するようにした。これによって、この研究で用いられる突然変異アプタマは、特に言及しない限り、前記二次構造を保持する。これらの突然変異体（置換体又は欠失体の双方）をＤＮＡテンプレート中に導入し、突然変異オリゴはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から得た。Ｂ４０ｔ７７−特異５’−及び３’−プライマを用いてＰＣＲ増幅を実施した。インビトロ転写を（上記のように）実施して、突然変異Ｂ４０ｔ７７アプタマを得て、Ａ２６０の決定によって収量を定量化した。ＢＩＡｃｏｒｅ２０００を用いて、結合アッセイを実施した。上記のようにリサーチグレードＣＭ５センサチップを用いて活性化した。２５００ＲＵのｇｐ１２０を、アミン結合を介して１のフローセル上に固定する一方で、モック固定化ブランクフローセル（ｍｏｃｋ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ，ｂｌａｎｋ  ｆｌｏｗ  ｃｅｌｌ）を対照として用いた。これらのアプタマを結合緩衝液（上記のような）中でリフォールディングして、１５μｌを５μｌ／分でフローセル全体に渡って注入した。これらの注入の間、この表面を上記のように再生した。３つの独立した実験を実施して、各場合についてサンプルをランダムな順で注入した。突然変異体の相対結合度（対照チャネルから反応を引いた後の）を記録し（Ｔ＝１８０ｓで）、このデータをその時点の反応の平均±標準偏差として表す（図５）。
【００６４】
結果
アプタマＢ４０の二次構造の解明
いくつかのアルゴリズムを用いるＢ４０についてのＲＮＡ二次構造のインシリコ予測は、少数の予測された安定した折り畳みを導いた。これらの推測した構造のいずれか一方が実験的に確かめられるかどうかを決めるために、酵素（Ｓ１、Ｖ１又はＴ１）プロービング法と化学プロービング法の双方を用いた。酵素プロービング（図１）に見られる感受性及び保護のパターンを見つけて、ｍｆｏｌｄを含むいくつかのアルゴリズム（バージョン３．１）を用いて予測されるように最も安定な折り畳みを確かめる。この推定二次構造は２つのドメインに分割することができる。ドメインＩは、ヌクレオチド１から７６から成り、ステムループ１、２、及び３を含み、ドメインＩＩは、ヌクレオチド７７から１１７から成り、ステムループ４を含む。
【００６５】
また、化学プロービングデータもこの予測を強力に支持した−これらのデータの説明できない特徴は、へリックス間の領域に位置するいくつかのヌクレオチドの反応性欠如である。例えば、Ａ−３９、５８、８０、及びＣ−２１、３３、５４及び５５は、ＤＭＳに対して反応性を示さなかった（図１Ｅ及び補充データＳ２）。同様に、Ｇ−２５、７７、８４、及びＵ−２０、２４、４８及び４９は、ＣＭＣＴに対して反応しなかった（図１Ｂ及び１Ｅ）。これらの相違は、ＤＭＳ及びＣＭＣＴを用いた反応性に影響するアプタマ内の３次相互作用によって、又は代替配座異性体の存在によって生じうる。様々なへリックスドメインの安定度を確立するために、セミ−変性条件下（即ち、ＥＤＴＡの存在下）で、ＤＭＳ及びＣＭＣＴを用いた同様の反応を実施した。自然の条件下ではＣＭＣＴと反応しなかったＵ−６８、６９、７４、８１、８７及びＧ−８２が、セミ−変性条件下で融解し、同じプローブに対して反応性を示した（図１Ｂ及び１Ｅ）。従って、我々は、これらの残基が、恐らく、このような条件下で変性するヘリックス内でのより弱い相互作用に含まれることを提案する。
【００６６】
アプタマＢ４０分子の集団を、ここに示す集団に対して代替的に折り畳まれるｇｐ１２０結合型を少ない割合で含む可能性が、以下の欠失突然変異のコンテキストにおいて、遺伝的に調べる。
【００６７】
アプタマ上のｇｐ１２０結合部位及び結合親和性の決定
アプタマＢ４０上のｇｐ１２０のフットプリントを決定するために、タンパク質の存在下及び不存在下でのヌクレオチドの開裂位置を比較した。フットプリントデータは、ｇｐ１２０の結合が、濃度依存法のドメインＩ（図１Ａ及び１Ｄ）の様々な度合に対して保護を誘発することを示した。主要な保護は、ドメインＩのヌクレオチド２１−５７を含む領域を含み、１１７マー親アプタマ上の１次ｇｐ１２０結合部位が、このドメインで本質的に存在することを示している。また、タンパク質結合後のリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ｖ１及びＳ１に対する感受性の変化も観察した（図１Ａ及び１Ｄ）、これはアプタマのタンパク質誘発構造変化を暗示している。これらの２つのドメインの内のドメインＩＩは、ｇｐ１２０結合に関与しなかった。ドメインＩのヘリックス１は、ステムループ２及び３の配置を安定化するように思えた。これらをもとに、このデータは、ドメインＩのみを具えるアプタマは、ｇｐ１２０結合活性を保持するであろうと仮定された。従って、アプタマ、即ちＢ４０ｔ７７（１−７４ＣＣＣ）を構成した。このアプタマは、３’−末端で２つに２つもサイトカインを有するドメインＩのヌクレオチド１−７４を保持して、３ｂｐ５’−３’ＧＣ−クランプを完成した（図ＩＣ）。この７７−ヌクレオチド切頭アプタマ（以下単にＢ４０ｔ７７という）は、酵素プロービング及びｍｆｏｌｄを用いた二次構造予測によって推定されるように、その配座異性体（親アプタマのドメインＩのように）を保持した（図１Ｃ及び補完データＳ１）。切頭アプタマのフットプリントパターンは、親アプタマＢ４０に類似しているが、より強いタンパク質誘発構造変化（アンフォールディング）が、前者（図ＩＣ及びＳ１）、特に、ドメインＩのヘリックスステム１で観察された。これは、ドメインＩＩが、タンパク質の不存在下での親分子のドメインＩのこの領域を安定化する役割を果たす場合に、理にかなっている。
【００６８】
親アプタマ及び切頭アプタマの結合親和性を決定するために、天然ゲル移動度シフトアッセイを実施した。全長アプタマＢ４０（図２Ａ＆Ｂ）と、切頭アプタマＢ４０ｔ７７（図２Ｄ＆Ｅ）を有するｇｐ１２０のインキュベートは、フリーＲＮＡと比較して〜５０ｎＭタンパク質濃度での、電気泳動移動度がより遅い複合体を得た。実験を３回別個に繰り返して、親アプタマについて２１±２ｎＭ（図１０  ２Ｂ）、及び切頭アプタマについての３１±２ｎＭ（図２Ｅ）の解離定数（ＫＤ）の推定値を得た。これから、切頭アプタマは、親アプタマの結合エネルギィの〜９０％を保持し、従って、生成結合に必要とされる要素の主要部分を含んでいなければならないといえる。
【００６９】
また、アプタマＢ４０（図２Ｃ）とＢ４０ｔ７７（図２Ｆ）との結合を調べて、ＢＩＡｃｏｒｅＳＰＲ技術を用いて、リアルタイムでＣＭ５センサチップ上にｇｐ１２０を固定した。明確な投与依存性反応が観察された。しかし、このデータは、１：１ラングミュア結合又はその他の単純なモデルを用いて適合しなかった。これは、恐らく、リアルタイム結合が敏感であるアプタマの低レベルでの立体配座の不均質に起因すると思われる。
【００７０】
親アプタマ及び切頭アプタマによるＨＩＶ−１のＲ５株（Ｂａ−Ｌ）の中和
初期の研究は、Ｂ４０を含むアプタマ（２７の内の２５）で導かれるＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌｇｐ１２０の主要部分は、ＰＢＭＣの相同ＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌを中和することができることを示した（Ｋｈａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。従って、この研究で、切頭アプタマが標的細胞中のこのＨＩＶ−１株の感染を防止又は制限することができるかどうかも決定することを望んだ。終点希釈及びｐ２４−抗原ＥＬＩＳＡを用いて、切頭アプタマが、ヒトＰＢＭＣ中の相同ＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌを中和する点で、親アプタマと同様に強力であることが分かった（図３）。３００ｎＭで、双方のアプタマは、アプタマのない、及び無関係のアプタマ対照とは逆にＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌエントリをバックグラウンドレベルに中和した。これは、ウイルス感染に効果が無かった。また、可溶性ヒトＣＤ４は、ＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌを３００ｎＭ濃度でバックグラウンドレベル近くへ中和した。一連の様々な濃度を研究して、ＩＣ５０を取り出した（５０％のウイルス感染を阻害するアプタマの効果的濃度）。これは、Ｂ４０アプタマ双方について、ほぼ２ｎＭであることが分かった。ＫＤとＩＣ５０の間の１０倍の差は、定数を決定するのに用いられるアッセイの全く異なる性質を単純に反映するが、ウイルス上に存在する実質的に５０％未満のｇｐ１２０部位が、アプタマによって結合する場合に、ウイルス中和を達成することを暗示するように解釈してもよい。各スパイクトリマ中のｇｐ１２０単位のみが、相当するｇｐ４１トリマの６量体融合促進複合体の形成を阻害するために、阻害することが必要であるということは説得力がある。また、全部には満たないスパイクトリマは、阻害すべきウイルスエンベロープ及びプラズマメンブレンの間の融合のためにこの方法で機能的に阻害される必要があるように思われる。しかしながら、我々のデータでは、エントリに必要とされるトリマの最小比率の正確な計算をすることができない。
【００７１】
リガンド結合（ｔｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ）中のアプタマの修飾２’フルオロ−ピリミジンの役割
ｇｐ１２０−結合中のフルオロ−ピリミジンの潜在的役割を調べるために、２’フルオロ−サイトカイン又は２’フルオロ−ウラシルのどちらか、又は双方を、２’ＯＨ相当物と置換するアプタマのｇｐ１２０結合能力を分析した（図４）。２−Ｆウリジンを２’−ＯＨウリジンと置換するが、２’Ｆサイトカインは保持するアプタマが、ｇｐ１２０結合能力を保持することが分かった。これは、フットプリント領域内で比較的よく見られるウリジン中の２’Ｆ基のいずれも、結合ｇｐ１２０中に直接含まれないことを示している。一方、２’Ｆ−サイトカイン中のウリジンは、２’ＯＨ−サイトカインと置換されるが、２’Ｆ−ウリジンを保持するものは、結合能力を失った。これは、明らかに、１又はそれ以上の２’フルオロ−サイトカインがｇｐ１２０との相互作用に必要とされるが、必須である２’修飾がヘリックス（例えば、ヘリックス２）又はループ（例えば、ループ２）にあるかどうかを示すものではないことを表している。当然、２’Ｆピリミジンの双方が相当する２’ＯＨピリミジンと置換されると、結合が消滅した。
【００７２】
フットプリント領域内での配列の必要条件の分析
ｇｐ１２０に結合することによってヌクレアーゼから保護されたアプタマＢ４０の部分内のヌクレオチドのサブセットのみが、タンパク質−核酸相互作用に必要とされることが可能である。これを調べるために、この領域の突然変異生成分析に取り組んだ。１５０を上回る個々の点突然変異体（及び＞１０２４多重突然変異体）は、フットプリント領域内で理論的にあり得るが、実行可能な結果を得るために、上で同定した二次構造を変更しないことが予想されるサブセットを先ず研究することを選択した。この型の主要な突然変異は、単鎖ループ及びジャンクション領域にあり、あり得る突然変異の包括的なインシリコ分析の後に同定した。ジャンクション１の残基の突然変異によってｇｐ１２０結合の有意な欠失を得た。これは、ｇｐ１２０との相互作用を必要とすることを示した。ｇｐ１２０結合に何らかの有意な差を示さないこの領域の突然変異のみが、Ｃ２１Ａの置換である（図５）。これは、この配列の５’ヌクレオチドが、Ｂ４０ｔ７７アプタマのｇｐ１２０結合の自由エネルギィ変化にほとんど寄与しない場合に可能である。ヘアピンループ１及び２の突然変異体は全て、結合のほぼ完全な欠失を示し、フットプリントデータから分かるように、これらの残基もｇｐ１２０認識及び結合に必要である。また、領域Ｕ４０−Ｕ４３（ジャンクション１＊）の全突然変異によって、ｇｐ１２０に対する結合の有意な欠失を得た（図５Ｂ）。一般的に、この領域の複数の置換（ＵＵＵＵ→ＣＣＣＣ）は、点突然変異（例えば、Ｕ４０Ａ）よりもより極端な効果を有した。興味深いことに、２’Ｆ  Ｕが、活性を無くすことなく２’ＯＨ  Ｕで置換することができることを示したが、これらの４つのウラシル（２’リボース置換基に関わりなく）は必須であるように思われる。加えて、自然の二次構造を保存するように設計されたヘリックス３の二重及び四重突然変異体を分析した。全突然変異体は、野生型Ｂ４０ｔ７７アプタマと比較して結合に有意な欠失を示した（図５）。全体として、これらの結果は、二次構造が維持されるが、フットプリント領域（ジャンクション１及び１＊、ループＩ及び２及びヘリックス３）内のほとんどのヌクレオチドの変化によって、ｇｐ１２０結合が欠失する。
【００７３】
ｇｐ１２０結合の二次構造の必要条件の分析
二次構造モデリングは、アプタマＢ４０ｔ７７は、原則として、実験的証拠によって支持される分枝構造に加えて、線形二次構造をとることができるべきであることを示唆している（図６Ａ参照）。これらの２つの代替構造は、互いに同様の安定性を有し、一般的に、いくつかの構造上の特徴を共有することが推測される。結果として、少数のアプタマ集団が、線形を適用し、生物化学的検出を逃れ、更に、ｇｐ１２０結合活性に関与することがあり得る。この可能性を調べるために、再び遺伝的分析を行った。これは、二次構造の潜在的に識別力のある領域が、ｇｐ１２０フットプリント内にあり、その結果、主要な配列効果が、二次構造効果と混同するという事実によって複雑になった。
【００７４】
例えば、分枝構造を分断するヘリックス３の点突然変異（Ｇ６４Ｃ及びＣ４７Ｇ）では結合は欠失しているが（図６Ｂ参照）、構造を修復した代償性突然変異が、結合を修復するのに失敗している（図５、上記参照）。この結果、この領域の配列又は二次構造、又は双方のどちらかが機能するのに必要であるかどうかを見分けることは不可能である。
【００７５】
その完全性（Ｇ１８Ｃ＋Ｃ６１Ｇ、Ａ１４Ｇ＋Ｕ６５Ｃ、Ｃ７Ｕ＋Ｇ７１Ａ、及びΔＡ９）を維持するヘリックス１の突然変異は、ｇｐ１２０結合を維持した（図６Ｃ参照）。しかし、これらの突然変異は、線形及び分枝形の双方と全て一致し、そのため、この２つの形状間を区別できなかった。
【００７６】
分枝構造及び線形構造双方の構造（ΔＧ１８）を失ったヘリックス１の突然変異は、結合を有意に喪失した。この突然変異体は、ヘリックス３、ループ２、及び上部ヘリックスＩを、実質的に歪む異常な、分枝構造を構成するように予測される（図６Ｄ参照）。また、正常な分枝及び線形形状を復元する代償性欠失（ΔＧ１８＋ΔＣ６１）も、ｇｐ１２０結合を復元した。これは、明らかに、アプタマＢ４０ｔ７７の二次構造の維持がｇｐ１２０に必要であることを示すが、結合形態が、分枝構造、線形構造、又はその双方かどうかを明確にするものではない。
【００７７】
最終的に、この２つの二次構造間を明確に区別するように設計されているヘリックス２の突然変異を調べた。この分枝構造の形成を防止するが、線形構造（Ｇ２７Ｃ）と一致するヘリックス２の突然変異は、ｇｐ１２０に対するアプタマの結合を実質的になくした（図６Ｅ）。分枝構造を復元するが、線形構造（Ｇ２７Ｃ＋Ｃ３７Ｇ）をなくす代償性突然変異は、完全野生型レベルに対してではないが、ｇｐ１２０結合（Ｐ＝０．００１５、ｔ試験）を有意に復元した。この結果は、アプタマの３方向分枝構造が、機能的形状であるとの仮説を強力に支持するものであり、実際、Ｂ４０ｔ７７集団の分枝形状と共存する場合は、線形代替異性体は、ｇｐ１２０に対するリガンドではない。しかし、二重突然変異体の分枝形状の復元後のｇｐ１２０結合の完全な復元の失敗は、残基２７及び／又は３７が、全構造を安定化する役割に加えて、僅かに結合にも寄与していることを示す。
【００７８】
議論
アプタマによるＨＩＶ−１の様々な組織培養研究室適合（ＴＣＬＡ）及び臨床ＣＣＲ５−指向性（Ｒ５）分離株の感染の中和が、ＨＩＶ−１  Ｒ５株のｇｐ１２０に対して明らかに生じた旨を報告した。ここで、１つのこのような中和アプタマ、Ｂ４０の必須の構造上の特徴を述べる。親アプタマの二次構造及び完全ｇｐ１２０結合に必須の最小領域を決定することによって、アプタマをより小さなサイズに切る一方で、その結合及び中和特性を保存することができた。ここで、ＨＩＶ  ｇｐ１２０結合アプタマのより広い接触、及び結果的により高い親和性が、標的タンパク質のより大きいサイズを反映している。切頭アプタマＢ４０ｔ７７は、〜２３ｋＤａの分子量：ＩｇＧ分子の６分の１未満のサイズ、及び抗体の抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）の約２分の１のサイズを有する。従って、より大きなエントリ阻害剤が、立体障害によってアクセスできない「コア」糖タンパク質の深い保存領域に容易にアクセスできると考える。これは、この発生は、Ａ．Ｆ．Ｌａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）による最近の発見によって更に支持されるＣＤ４ｉ−特異的中和剤のサイズが、その能力と逆に関係し、主要なＨＩＶ−１分離株を中和することを明確に示した。高親和性及び特異性を有する標的結合することに加えて、核酸ベースの治療剤及び診断剤は、ヌクレアーゼ耐性があり、及び安定した非生物学的流体である必要がある。ＲＮＡの２’フルオロ及び２’アミノ修飾は、アルカリ性加水分解物及びリボヌクレアーゼ分解に対する耐性を与える（Ｐｉｅｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。ｇｐ１２０に対する２’フルオロ修飾及び未修飾アプタマのＳＰＲ結合分析の結果（図４）は、２’位での修飾が、リガンド−標的相互作用に有意に作用することを示している。２’フルオロ−ピリミジンのピリミジンの２’ＯＨ基での置換は、ｇｐ１２０に対するアプタマの結合の完全な欠失をもたらした。これは、熱力学的により安定であり、未修飾ＲＮＡよりも剛性構造を形成する実質的により強力な分子内ヘリックスを形成する２’Ｆ  ＲＮＡの能力に起因し（Ｐａｇｒａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、より高い親和性で標的に結合する。２’Ｆ−シチジンのリボヌクレオシド類似体での置換は、同様の結合を欠失し、これは、リガンド結合中の１又はそれ以上のシチジンの２’位のフッ素原子の所定の役割に寄与する。更に、２’位の置換基も、その能力の差を発現して水素結合を形成し、結合で観察される差の主な原因となる。ＲＮＡの２’ＯＨ基は、水素結合受容体及び供与体として作用する一方で、２’Ｆ基は、恐らく弱い水素結合受容体としてのみ機能することができる（Ａｕｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。しかし、各場合で、この置換によって誘発されるオリゴヌクレオチドの局所的異性体変化の寄与は、アプタマのリガンド結合特性の欠失又は保存の重要な要因である。従って、様々な２’−部分を有する核酸ライブラリで実施される選択が、同じ標的又は異なる標的に対する様々な結合特性を有するアプタマの明らかに異なるファミリを生じる。
【００７９】
親アプタマと切頭アプタマのナノモル親和性、及びその強力な中和能力を考慮すると、アプタマは、必須の供与体結合部位を占めることによって、又はｇｐ１２０中に非生産的異性体変化を誘発することによって、その中和効果を与えることが可能である。従って、このアプタマは、ｇｐ１２０と標的細胞上のその受容体間の分子間相互作用のよりよい理解を可能にするツールとして働く。
【００８０】
突然変異生成研究及びＳＰＲ結合分析の結果は、上記のＲＮＡフットプリントデータ及び二次構造モデルを強力に支持している。切頭アプタマのフットプリント領域内でのほとんどの突然変異は、ｇｐ１２０結合を有意に抑止する。フットプリント領域外では、ＲＮＡステム内で塩基対を特異的に分離するよう設計した突然変異が、ｇｐ１２０結合を抑止する一方で、構造を回復する代償性突然変異、又は構造を分離しない突然変異が、ｇｐ１２０結合を維持する。より重要なことは、提案された分枝構造を分離する一方で線形代替配座異性体を安定化するフットプリントヘリックス２内の突然変異は、結合を阻止するが、分枝構造を回復し、線形代替配座異性体を阻止する二次代償性突然変異はｇｐ１２０結合を有意に回復した。これは、ｇｐ１２０結合についての小さな配列特異的モチーフを提供するために特異的３次元アプタマ構造が必要であるという仮定を強力に支持する。注目すべきは、この構造の結合部分の配列が、ｇｐ１２０に対する結合後のＶＩヌクレアーゼに対してより敏感になり、この相互作用がアプタマ構造の変化を指数化する可能性を示している。
【００８１】
興味深いことに、ＨＩＶ−ＩＢａＬｇｐ１２０に対して上げられ、ウイルス感染を中和することが分かったアプタマＢ４及びＢ１１６は、アプタマＢ４０に系統発生学的に無関係であることが明らかであり、主要な配列レベルに関して統計学的に有意な関係を示さないが、アプタマＢ４０についてここに記載した構造モチーフを共有することが可能である。構造分析は、これらが２つのヘアピンループ及び終端ヘリックスの３方向ジャンクションを具えることも示している（データは示さず）。更に、これらは、ループ１（Ｂ４、Ｂ１１６及びＢ４０のＣＡＣと比較したＣＡｇＣ及びＣＡａＣ）、及び恐らくループ２（モチーフＡＮＮＹＧ）の断片的な主配列を共有している。この証拠は、確証的ではないが、３つ全てのアプタマが、ｇｐ１２０に対する中和結合を可能にする基礎的な構造モチーフを共有すると考える。アプタマ−ｇｐ１２０複合体の高分解能構造が、この問題に更に取り組み、全ｇｐ１２０認識事象を形作る多重相互作用を明らかになるであろう。
【００８２】
参考文献
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２３．Ｔａｈｉｒｉ−Ａｌａｏｕｉ，Ｆｒｉｇｏｔｔｏ，Ｌ．，Ｍａｎｖｉｌｌｅ，Ｎ．，Ｉｂｒａｈｉｍ，Ｊ．，Ｒｏｍｂｙ，Ｐ．ａｎｄ  Ｊａｍｅｓ，Ｗ．（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，３０，ｅ４５．１５
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２８．Ｐａｇｒａｔｉｓ，Ｎ．Ｃ，Ｂｅｌｌ，Ｃ，Ｃｈａｎｇ，Ｙ．Ｆ．，Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｓ．，Ｆｉｔｚｗａｔｅｒ，Ｔ．，Ｊｅｌｌｉｎｅｋ，Ｄ．ａｎｄ  Ｄａｎｇ，Ｃ（１９９７）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１５，６８−７３．
２９．Ａｕｒｕｐ，Ｈ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１，９６３６−９６４１．
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【００８３】
表１
2008529517.tif 000009
【００８４】
合成Ｂ４０アプタマ誘導体
原理
インビトロ転写（通常、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて）によって、又は固相化学合成（オリゴヌクレオチドとして）によって、アプタマを作成することができる。前者のアプローチは、ＳＥＬＥＸプロセスによるアプタマの発見、及び初期の構造及び機能分析に必要である。化学合成は、化学療法、化学的予防及び結晶学等の用途の、大規模で費用効果の高いアプタマの製造に欠かせないが、６０ｎｔの長さよりもずっと長い配列には実施できない。有効転写が可能なＢ４０の最も短い誘導体は、７７ｎｔの長さであり、３１ｎｔのこの誘導体はヘリックス１を具え、結合要素の必須成分を具えるというより、アプタマ構造の安定性のためにのみが必要であると推測した。従って、アプタマＢ４０のコアの想定される機能構造を維持するであろう化学合成用の一連のアプタマを設計する一方で、多くのヘリックス１を除去した。表２−４にこれらの合成アプタマの配列を、図１２−１４に予測される構造を、図１５にｇｐ１２０結合能力を示す。
【００８５】
２４７．２及び２４７．１
これらのアプタマは、親Ｂ４０及びＢ４０ｔ７７、即ち、３方向ジャンクションから離れた４塩基対に見られるＡ：Ａミスマッチを保持する。Ｂ４０ｔ７７のように、これらのアプタマは、分枝及び線形形状を導入することができる。Ｂ４０ｔ７７は、Ａ：Ａミスマッチ１５ｂｐヘリックス１を有し、２４７．２は、Ａ：Ａミスマッチ１０ｂｐヘリックス１を有し、２４７．１は、Ａ：Ａミスマッチ７ｂｐヘリックス１を有する。ヘリックス１の短縮は、Ｂ４０ｔ７７＞２４７．２＞２４７．１の順にアプタマの熱力学的安定性の予測された低減に関連する。ｇｐ１２０に対するアプタマの結合ポテンシャルは、７ｂｐに対するミスマッチヘリックス１の低減が、機能的アプタマ構造の小さいが有意な欠失をもたらすことを示している。その結果、Ａ：Ａミスマッチが、除去されて、安定性を損なうことなくヘリックス１の更なる低減が可能になるかを調べた。
【００８６】
２４７．５、２４７．３、及び２４７．４
これらのアプタマは、それぞれ７ｂｐ、６ｂｐ、及び４ｂｐの長さのヘリックス１を有するＡ：Ａミスマッチ（上記）の欠失を含んでいた。ミスマッチの除去は、等価物であるミスマッチ２４７．１と比較して、２４７．５及び２４７．３の熱力学的安定性を改善したが、４ｂｐに対する低減は、４つの代替配座の生成をもたらした。２４７．５が、完全なｇｐ１２０結合能力を保持する一方で、２４７．３は、いくつかの結合能力を失い、２４７．４では、大幅に低下した。この結果、代替異性体の生成を阻害する更なる突然変異が、短縮アプタマの結合能力を改善する可能性を調べた。
【００８７】
２４７．６
このアプタマは、２４７．４のように４ｂｐヘリックス１を有するが、結合領域内に後者と関連する代替配座と不適合である突然変異を追加で有している。予測と一致して、２４７．６は、完全ｇｐ１２０結合活性を保持した。
【００８８】
二次構造を安定化するための疎水性置換基の使用（２６５シリーズ）
前に述べたように、リボースの２’位にある疎水性置換基が、ヘリックスの安定性に影響することがある。１つの鎖のみに存在する場合に、これらの効果は、ヘリックスを不安定にする。対照的に、３’方向に１ｎｔだけオフセットされている反対の鎖に存在する場合、これらはヘリックスを安定化するように相互作用する。アプタマ２６５．１は、６ｂｐヘリックス１を有し、ヘリックス１の３つの塩基対が、ジメチル−アリル対によって安定化されることを除いて、２４７．３に対する配列と同一である。２４７．３よりも熱力学的安定性が全体的に大きいことが望まれるが、分枝及び線形構造双方に適合することが依然として可能である。予測されるように、２６５．１は、２４７．３よりもｇｐ１２０によく結合した。実際、この修飾は、対照であるＢ４０ｔ７７と比較して、結合の有意な増加をもたらす。
【００８９】
分枝構造を安定化する試みで、２４７．３の更に３つの誘導体を合成し（２６５．２、２６５．３、及び２６５．４）、ジメチル−アリル対を、ヘリックス２の３つの位置の内の１つに導入した。２６５．３は、２４７．３を超える結合（野生型レベルには達しないが）の改善を示したが、２６５．２（示さず）及び２６５．４は、改善を示さなかった。
【００９０】
突然変異及び疎水性相互作用の組み合わせ（２９９．２、２９９．３及び２９９．１）
ジメチル−アリル置換は、短い形状のヘリックス１をよく安定化させることができ、分枝形状は結合領域又はヘリックス２の突然変異によって線形形状を犠牲にして安定化することができることが、上記に示されている。いずれかのアプローチの多数の変形例が、有益に用いられ、多数の潜在的に有益な方法で組み合わされることは明らかである。これを例示するために、３つのあり得る変形例を示す。アプタマ２９９．２は、２６５．１のようなｄｍａ安定化６ｂｐヘリックス１アプタマであるが、加えて、付加Ｃ：Ｇ塩基対によって安定化したヘリックス１を有する。この修飾は、線形異性体を除去し、２６５．１によって示されるものよりもより高次の結合をｇｐ１２０にもたらす。アプタマ２９９．３は、結合突然変異を付加的に有することを除いて、２９９．２と同様である（２４７．６に前もって有益に導入されている）。この更なる変化は、ｇｐ１２０結合に追加の効果が生じない。アプタマ２９９．１は、ヘリックス１の２’Ｏ−ブチル置換を具え（ジメチル−アリルの代わりに）、２４７．６に導入された結合突然変異を追加で有する。このアプタマの結合は、Ｂ４０ｔ７７と区別することができず、そのため、ブチル置換は、ジメチル−アリルよりも安定性が低い。
【００９１】
２９９．４
この短いアプタマは４ｂｐヘリックス１、及び安定化結合突然変異を有する点で２４７．６と似ているが、加えて、ヘリックス２の塩基で突然変異し、潜在的により安定性があるＣ：Ｇ標準対（ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｐａｉｒ）でＵ：Ｇウォッブル塩基対を置換した。２４７．６よりも構造的に安定であると予測されるが、ｇｐ１２０に対して僅かな結合能力しかなく、ヘリックス２の塩基におけるウォッブル塩基対のいくつかの特徴が活性に重要であることを示している。
【００９２】
２９９．５
この短いアプタマは、５’末端でのビオチン化ウラシルの付加を除いて、２４７．６と同一であり、アプタマ及びｇｐ１２０のキャプチャ、及び欠失を促進する。ｇｐ１２０に対するこのアプタマの結合特性は、２４７．６の結合特性と区別することができない（データは示さず）。
【００９３】
（２）９３
これは、この研究で述べた組成物と同様の組成物のアプタマであるが、未関連のタンパク質であるＰｒＰに対して上げた（Ｓａｙｅｒ，Ｃｕｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。
【００９４】
表２
合成Ｂ４０アプタマ誘導体の配列
Ｔ７ポリメラーゼ−転写Ｂ４０ｔ７７を比較のために挙げる。より低い場合、即ち「ｃ」及び「ｇ」は、２’Ｏ−ブチル（２９９．１）又は２’ジメチル−アリルを表し（２６５．１、２６５．２、２６５．３、２６５．４、２９９．２及び２９９．３）、「ｂＵ」は、ビオチン化ウラシルを表す（２９９．５）。
2008529517.tif 000010
【００９５】
表３
合成Ｂ４０アプタマの整列。「〜」は、配列目的のみで導入した埋め込み文字である。共有結合修飾は示さず。
2008529517.tif 000011
【００９６】
表４
合成Ｂ４０アプタマの配置；グラフバージョン
表２に示されているが、カラーコードした残渣と「．」で示されるＢ４０ｔ７７と相同の位置を有する。
2008529517.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は、アプタマＢ４０及びＢ４０ｔ７７の酵素プロービング、ＲＮＡフットプリンティング及び溶液構造を示す図である。（Ａ）ＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌｇｐ１２０の不存在（０）及び存在（５，２５ｎＭ）下で、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ｔ１、ヌクレアーゼＶ１及びＳ１を有する５’−末端標識Ｂ４０の消化生成物を示す１８％のポリアクリルアミド（８Ｍ尿素）ゲルのオートラジオグラム。部分アルカリ加水分解物（ＯＨ−）及びリボヌクレアーゼ（ＲＮＡｓｅ）Ｔ１消化（Ｇ残渣）ラダーが、公知の配列への配置を促進するべく側部を走る。縦軸は、主なｇｐ１２０−保護領域を示す。対照（Ｃ）は、ｇｐ１２０の存在下ではあるが、ヌクレアーゼの不存在下でインキュベートした５’−末端標識Ｂ４０（１−１１７）アプタマに相当する。アルカリ加水分解物（ＯＨ−）ラダー中のギャップは、２’−フルオロピリミジンを示す。ゲル頂点のウェッジは、ｇｐ１２０の濃度（０、５、２５ｎＭ）の増加を示している。（Ｂ）ＣＭＣＴを用いたアプタマＢ４０の二次構造分析。アプタマＢ４０は、ＣＭＣＴで修飾され、５’−末端標識３’−プライマ、及びＡＭＶ逆転写酵素を用いて、逆転写された。ｃＤＮＡ産物を、ＰＡＧＥを変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）することによって可視化した。バンド（矢印で示す）は、野生型アプタマ構造で対になっていない残渣における、ＤＭＳ修飾の位置を示す。未修飾（Ｃｏｎ）アプタマＢ４０は、化学的修飾によって特に導入した停止と、安定二次構造の存在に起因する停止と、ＡＭＶ逆転写酵素の誤停止との間を区別するように平行になっている。Ｎ−修飾は自然の条件下で成され；ＳＤ−修飾はセミ−変性（ｓｅｍｉ−ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）条件（１ｍＭ  ＥＤＴＡ）下で成される。レーンＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕは、ジデオキシＲＴ配列ラダーを示す。ゲル頂点のウェッジは、ＣＭＣＴの濃度（１０μｍｏｌ及び２０μｍｏｌ）の増加を示す。（Ｃ及びＤ）ｍｆｏｌｄ予測アルゴリズムを制限するために用いた酵素プロービングデータからそれぞれ推測されるようなアプタマＢ４０ｔ７７及びＢ４０の提案の二次構造。リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ｖ１（緑）、ヌクレアーゼＳ１（赤）によって目標とされた残渣、及びｇｐ１２０上のヌクレアーゼＶ１（緑の矢印）又はＳ１（赤の矢印）に対してより敏感な残渣が強調されている。ｇｐ１２０に対する結合のヌクレアーゼ保護を示す残渣の概略、ラインの厚みは、保護の度合を示す。ワトソン−クリック塩基対は・によって示され、ウォッブル（Ｗｏｂｂｌｅ）Ｇ−Ｕは☆によって示される。（Ｅ）ＤＭＳ（Ｎ１−Ａ及びＮ３−Ｃ）及びＣＭＣＴ（Ｎ１−Ｇ及びＮ３−Ｕ）に対するアプタマＢ４０のワトソン−クリック位の反応性。自然（及びセミ−変性）条件下での反応：ＤＭＳ（□□）及びＣＭＣＴ（Ｏ）；自然条件下では未反応であるが、セミ−変性条件下では反応：（Ｏ＊）。ワトソン−クリック塩基対は・によって示され、ウォッブル（Ｗｏｂｂｌｅ）Ｇ−Ｕは☆によって示される。
【図２】図２は、アプタマＢ４０及びＢ４０ｔ７７の結合親和性のゲル移動度シフトアッセイを示す。（Ａ及びＤ）１％のアガロースゲル上で分析したタンパク質濃度（２５から４００ｎＭ）の増加範囲をそれぞれに用いたアプタマＢ４０及びＢ４０ｔ７７の結合親和性を分析する代表的なゲルのオートラジオグラム。（Ｂ及びＥ）タンパク質濃度を関数としたｇｐ１２０によって結合したアプタマの割合の代表的なプロットを示す。このデータは、グラフ−パッドプリズム（Ｇｒａｐｈ−Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ）の非線形曲線フィット法の双曲線関数に合致した。この滴定で、アプタマＢ４０及びＢ４０ｔ７７それぞれについて、２１±２ｎＭ及び３１±２ｎＭの平行解離定数（Ｋｄ）を得た。（Ｃ及びＦ）ＢＩＡｃｏｒｅ社製表面プラズモン共鳴測定装置を用いてＣＭ５センサチップ（１００００ＲＵ）上にｇｐ１２０を固定化するためのアプタマＢ４０（Ｃ）及びＢ４０ｔ７７（Ｆ）投与依存性結合。このバーは、アプタマがチップ表面を横切って流れた時間を示している。
【図３】図３は、アプタマＢ４０及びＢ４０ｔ７７によるヒトＰＢＭＣ中のＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌの中和を示す。ウイルスｐ２４抗原の出力を用いて、ｐ２４抗原ＥＬＩＳＡを用いてアプタマの効果を測定する。ウイルス複製の範囲は、阻害剤の不存在下で生成したｐ２４抗原の割合として示される。可溶性ヒトＣＤ４（ｓｈＣＤ４）を、陽性対照として用い、一方で、ストレプトアビジン（２３）に対するアプタマＳＡ１９を陰性対照として用いる。この実験を３回中２回実施する。エラーバーは、この手段の標準的なエラーを示す。
【図４】図４は、リガンド結合中のアプタマの修飾２’−フルオロピリミジンの役割を分析するためのＢＩＡｃｏｒｅ社製結合アッセイを示す。（Ａ）ＢＩＡｃｏｒｅ社製表面プラズモン技術（ＳＰＲ）によって分析したときに、固定化ｇｐ１２０（２５００ＲＵ）に対するアプタマ２’−フルオロピリミジン置換Ｂ４０及びＢ４０ｔ７７、２’−フルオロサイトカイン置換Ｂ４０ｔ７７、２’−フルオロウラシル置換Ｂ４０ｔ７７及び未置換（リボヌクレオチドを含む）ｍＢ４０ｔ７７アプタマ（〜１００ｎＭ）の相対結合スコア（ＲＵ）。３つの別々の実験の平均±ＳＤがプロットされている。相対結合（ＲＵ）スコアは、ｔ＝１８０ｓで結合値である。２’−フルオロピリミジン置換アプタマＢ４０及びＢ４０ｔ７７は、予想通りにｇｐ１２０に結合するが、２’−フルオロサイトカイン置換Ｂ４０ｔ７７アプタマは、ｇｐ１２０への結合能力を残しており、一方で２’−フルオロウラシル置換Ｂ４０ｔ７７アプタマ及び未置換Ｂ４０ｔ７７アプタマが固定化ｇｐ１２０に結合しない。（Ｂ）前記アプタマの代表的結合を示すための対照補正ＳＰＲ曲線のオーバーレイ（１セットの結合曲線のみ）を示す。太いバーは、アプタマがチップ表面を横切って流れた時間を示す。
【図５】図５は、アプタマＢ４０ｔ７７のｇｐ１２０−フットプリント領域内の配列要件の分析を示す。切頭Ｂ４０の配列を、二次構造実験によって明らかになった分枝中に示す。ｇｐ１２０に結合することによって、ヌクレアーゼ介在開裂から保護されるように思われる構造の５つの部分を太線で示し、ｇｐ１２０結合への関与を示す最も明瞭な証拠が存在する残渣に下線が付加されている。ＢＩＡｃｏｒｅ社製ＳＰＲ技術を用いて、ｇｐ１２０−結合への影響についての５つの領域の突然変異を研究した。野生型Ｂ４０ｔ７７配列の相対結合と比較して、ｔ＝１８０ｓでの全突然変異体の相対結合を、ＧｒａｐｈＰａｄプリズムを用いて記録し、この相対結合を平均±ＳＤとして示す。この相対結合は、３つの別々の実験から得た結果である。相対結合（ＲＵ）スコアは、ｔ＝１８０ｓでの結合値である。この野生型の突然変異体から統計的に区別することができなかった値には、ｎ／ｓを付している。野生型配列との有意な差は、＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）、又は＊＊＊（ｐ＜０．００１）で示されている。
【図６】図６は、ｇｐ１２０結合の二次構造要件の分析である。Ａ．Ｂ４０ｔ７７の２つの潜在的代替配座異性体のグラフ表示を示す。フットプリント分析及び突然変異生成によるｇｐ１２０−結合に重要であると認識される領域を標識し、厚い領域として示し、代替構造の表示を示す。Ｂ−Ｅ．図５に関する説明文に記載されているように、ＢＩＡｃｏｒｅ社製ＳＰＲ分析によるｇｐ１２０結合の突然変異の効果の分析を示す。各ケースで、各突然変異体に関して予測される配座異性体は、予測される異常分枝構造が完全に示されているパネルＤ、突然変異体ΔＧ１８、を除いて、関連するデータバーのすぐ上のカートゥーンによって示されている。
【図７】図７は、アプタマＢ４０ｔ７７のＲＮＡフットプリント及び溶液構造を示す。ＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌｇｐ１２０の不存在（０）及び存在（５、２５ｎｍ）下で、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ｔ１、ヌクレアーゼＶ１及びＳ１を有する５’−末端標識Ｂ４０の消化生成物を示す１８％ポリアクリルアミド（８Ｍ尿素）ゲルのオートラジオグラム。部分アルカリ加水分解物（ＯＨ−）及びリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ｔ１消化（Ｇ残渣）ラダー（Ｔ１Ｄ）が、公知の配列への整列を促進する側に走っている。縦線は、主要なｇｐ１２−保護領域を示す。対照（Ｃ）は、ｇｐ１２０は存在するがヌクレアーゼの不存在下でインキュベートされた５’−末端標識Ｂ４０アプタマに相当する。ゲル頂点のウェッジは、ｇｐ１２０の濃度（０、５、２５ｎｍ）の増加を示す。
【図８】図８は、ＤＭＳを用いるアプタマＢ４０の化学プロービングを示す。アプタマＢ４０の化学修飾は、ＤＭＳを用いて成され、５’−末端標識３’−プライマを用いて逆転写した。ｃＤＮＡ生成物を、１８％変性（８Ｍ尿素）ＰＡＧＥによって視覚化した。矢印は、相当するＤＮＡラダーの距離に足りない距離１ヌクレオチドで移動する処理されたＲＮＡの化学修飾塩基を表すプライマ延長中の転写停止を示す。Ｃｏｎ−Ａｈは未修飾ＲＮＡ対照であり；Ｎ−修飾は自然条件下で成され；ＳＤ−修飾はセミ−変性条件（１ｍＭ  ＥＤＴＡ）下で成された。レーンＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕは、ジデオキシＲＴ配列ラダーを表す。ゲル頂点のウェッジは、ＤＭＳの濃度（３０μｍｏｌ及び６０μｍｏｌ）が増加することを示す。左：長距離移動、右：短距離移動。
【図９】図９は、種々のアプタマ構造について予測される最小エネルギィ構造であり、Ｈ１の長さは様々である。
【図１０】図１０は、図９に示す最小構造のｇｐ１２０への結合を示す。
【図１１】図１１は、最小構造の結合と構造安定性との関係の分析を示す。
【図１２】図１２は、合成Ｂ４０アプタマ誘導体の２４７シリーズの予測される構造及び熱力学的特性を示す。
【図１３】図１３は、合成Ｂ４０アプタマ誘導体の２６５シリーズの予測される構造及び熱力学的特性を示す。
【図１４】図１４は、合成Ｂ４０アプタマ誘導体の２９９シリーズの予測される構造及び熱力学的特性を示す。
【図１５】図１５は、組み換えｇｐ１２０に対するセルチン（ｃｅｒｔｓｉｎ）Ｂ４０−誘導アプタマの結合試験の結果を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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