(57)【要約】  所定の態様では、本発明は、理論的蛋白質デザインに関する方法及び組成物を提供する。
2008526259.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の特性を有する蛋白質の作製方法であって、
（ｉ）所定のアルゴリズムを蛋白質骨格に適用して複数の可能な変異体を生成し、
（ii）該複数の変異体をコンピュータ内でスクリーニングして変異体の序列付きリストを作成し、
（iii）該変異体のうち少なくとも１０種をコードする既定配列を有する核酸分子を生成し、ここで、該核酸分子は：
（ａ）該変異体をコードする該核酸分子のそれぞれの配列を規定する部分重複配列を有するオリゴヌクレオチドのプールを準備し、
（ｂ）該オリゴヌクレオチドのプールをハイブリダイゼーション条件下及び次の条件:（１）連結反応条件、（２）鎖延長条件又は（３）鎖延長及び連結反応条件のうちの少なくとも一つの条件の下でインキュベートし、それによって核酸構築物を形成させ、
（ｃ）該既定配列を有する構築物を該既定配列を有しない構築物から分離し、それによって該変異体をコードする核酸分子を形成させること
を含む方法によって作成されたものであり、
（iv）該核酸分子を発現させて該蛋白質変異体を生成させ、
（ｖ）該変異体をスクリーニングして所望の特性を有する変異体を同定すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記変異体の少なくとも１０００種をコードする核酸を生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記変異体の少なくとも１００００種をコードする核酸を生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記変異体をコードする核酸が少なくとも１０００塩基の長さである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記変異体をコードする核酸が少なくとも５０００塩基の長さである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記変異体を試験管内で生成させる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記変異体をコードする核酸分子を単一のプールで調製する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
１種以上の核酸の配列の少なくとも一部分が、少なくとも１種の他の核酸との相同性を減少させるようにコドン再配列された、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドをアレイ上で合成させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記アレイが固体支持材と、該固体支持材に不随した複数の別個の機構とを備え、ここで、それぞれの機構が、規定されたコンセンサス配列を一括して有するオリゴヌクレオチド集団を独立して含むが、ただし、該機構の該オリゴヌクレオチドの１０％以下が同一の配列を有するにすぎない、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
核酸分子を作製するための方法がエラー低減プロセスをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記変異体をコードする核酸分子が粘着末端を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸分子の配列を規定するオリゴヌクレオチドの１種以上は、所望の配列を有する核酸構築物の配列を規定するオリゴヌクレオチドのセットが、不正確な産物の配列を規定するオリゴヌクレオチドのセットと比較して、配列タグという区別できる補足物を有するように配列タグをさらに有し、しかも、所望の配列を有する核酸構築物をサイズ又は電気泳動の移動度に基づいて不正確なクロスオーバー産物から分離する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
所望の配列を有する核酸構築物の配列を規定するオリゴヌクレオチドのセットが、正確に形成された産物の環状化を可能にする粘着末端を形成し、しかも、正確に形成された環状化産物を不正確に形成された直鎖状産物から分離する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記環状化産物を、前記直鎖状産物をエキソヌクレアーゼで消化することによって該直鎖状産物から分離する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記変異体をコードする核酸分子が、ベクター配列と、環状化発現プラスミドを生じさせるように該核酸分子の環状化を可能にする粘着末端とを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
所定の特性又は特性のセットを有する種を選択又はスクリーニングできる複数の候補蛋白質をコードする複数の合成ＤＮＡを含む生合成ライブラリーであって、該ライブラリーが配列相同性のある領域を有する複数のＤＮＡを含み且つ化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築された、生合成ライブラリー。
【請求項１８】
所定の特性又は特性のセットを有する種を選択又はスクリーニングできる複数の候補蛋白質をコードする複数の合成ＤＮＡを含む生合成ライブラリーであって、該ライブラリーが、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから化学的に合成又は構築された複数のＤＮＡを含み、且つ、複数のリーディングフレームであって、そのＤＮＡが、選択された発現系において同様の発現レベルを増進させるように、一貫したコドン使用パターンを利用するものを有する、前記生合成ライブラリー。
【請求項１９】
前記化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを平行して合成する、請求項１８に記載のライブラリー。
【請求項２０】
前記ＤＮＡを、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから平行して構築する、請求項１８に記載のライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００５年１月１３日に出願した米国仮出願第６０／６４３，８１３号に対する優先権の利益を主張する。この出願は、参照によってここに援用するものとする。
【０００２】
本発明は、蛋白質デザインのための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
定方向分子進化を使用して新規な機能及び特性を有する酵素のような蛋白質を創り出すことができる。既知の天然蛋白質から出発して、数ラウンドの突然変異誘発、機能的スクリーニング及び正常な配列の生長反応が実行される。このプロセスの利点は、これを使用して任意の蛋白質をその構造に関する情報がなくても迅速に進化させることができることである。変異性ＰＣＲによる点突然変異誘発、カセット突然変異誘発及びＤＮＡシャフリングを含めて、いくつかの異なる突然変異誘発ストラテジーが存在する。これらの技術は、多くの成功を収めてきた；しかしながら、これらは、すべて、極少量の見込まれる変化以上を生じさせることができないという不利益がある。例えば、ほぼ５００アミノ酸長の平均的蛋白質については２０500のアミノ酸変化が可能である。明らかに、これほどたくさんの突然変異体の突然変異誘発と機能的スクリーニングは不可能である；定方向進化は、見込まれる配列のサンプリングが非常に僅かであるため、見込まれる変性蛋白質の小さな部分、主として点突然変異体又は既存配列の組換え体しか検査しない。見込まれる配列の膨大な数から無作為にサンプリングすることによって、定方向進化は、公平性を保ち且つ幅広い適用可能性を有するが、本質的に効率が悪い。というのは、定方向進化は、蛋白質に関する構造的知識及び生物物理学的知識を全て無視しているからである。
【０００４】
対照的に、計算法は、定方向分子進化のような実験的ライブラリースクリーニング法の重要な制限を克服する莫大な配列ライブラリー（１回の計算で１０80個まで）をスクリーニングするために使用できる。配列を生成し評価するために知られている様々な方法が存在する。これらには、配列プロファイリング（Ｂｏｗｉｅ及びＥｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３（５０１６）：１６４−７０、（１９９１））、回転異性体ライブラリー選択法（Ｄａｈｉｙａｔ及びＭａｙｏ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ５（５）：８９５−９０３（１９９６）；Ｄａｈｉｙａｔ及びＭａｙｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８（５３３５）：８２−７（１９９７）；Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ及びＨａｎｄｅｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４：２００６−２０１８（１９９５）；Ｈａｒｂｕｒｙ外，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９２（１８）：８４０８−８４１２（１９９５）；Ｋｏｎｏ外,ＰｒｏｔｅｉｎｓＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９：２４４−２５５（１９９４）；Ｈｅｌｌｉｎｇａ及びＲｉｃｈａｒｄｓ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９１：５８０３−５８０７（１９９４））；及び残基ペアポテンシャル（Ｊｏｎｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３：５６７−５７４、（１９９４））があるが、これらに限定されない。
【０００５】
計算法は、所望の特性を有し得る潜在的な蛋白質変異体を同定するための最初の段階としては強力な方法である。しかしながら、多くの変異体、通常は非常に多くの変異体を実験的に分析してこれらのものが実際に予想される特徴又は特性を有するのかどうかを決定することがなお必要である。今のところ、意図的に異なる多数の分子種を得るための方法論では、当業者がコンピュータ方法を使用して同定された多数の変異体をスクリーニングすることはできていない。コンピュータによる予測を高い処理能力で実験的に確認することを可能にする新規な組成物及び方法に対する強い要望が存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
さらに、必要に応じて自身がさらに突然変異を誘発できる本当の意味での多様な候補構造体を作製するための技術は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び蛋白質の構造空間を探求するために非常に有効な方法であろう。このような技術は、「理論的多様性」を具体化するデザインファミリーを作製することを可能にし、例えば、選択、スクリーニング又は無作為な組み合わせの突然変異誘発、さらには理論的な突然変異誘発に適合する進化的に独立した複数のデザインアプローチを具体化する１０万又は１００万以上の異なる構築物を与えることを可能にするであろう。これは、進化によっては得られそうにないＤＮＡ、蛋白質及び細胞構築物の発見を可能にし、また蛋白質技術者が凸凹した適応度空間を詳しく検討し且つ調査することを可能にする。別の言い方をすれば、このような技術が利用可能となることによって、「ダーウィンのブラックボックス」、つまり、全ての中間体の先行する状態が進化的に不利益を被ったり、致死的であったり、又はほとんど起こりそうにない生化学的性質若しくは構造の同時変化を必要とする特定の生物学的状態に進化を通じて到達するという論理的な困難さを回避することが可能になる。計算法を使用して特定される多数の変異体を作製し且つ実験的に評価するためのハイスループット方法を含め、理論的な蛋白質デザインのための方法を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概略
本発明は、所望の特性を有する蛋白質をデザインするための組成物及び方法を提供する。
【０００８】
一態様では、本発明は、計画された既知の配列（ランダム化されたものではない）の複数の合成ＤＮＡを含む生合成ライブラリーを提供する。これらのものは、所定の特性若しくは特性のセットを有する種について選択若しくはスクリーニングできる複数の候補蛋白質をコードするか、又はそれら自体を特定の機能的若しくは構造的特性、例えばリボソーム活性を有するポリヌクレオチドを選択又はスクリーニングできる。該ライブラリーにおけるポリヌクレオチドは、好ましくは、化学的に合成されるか、又は化学的に合成されたオリゴヌクレオチドからここで示すような技術を使用して構築される。これらが含有するこの複数のＤＮＡは、かなりの配列相同性のある領域を有し得る。その代わりに又はそれに加えて、該ライブラリーの構成要素は、選択された細胞発現系又は細胞フリー発現系、例えば、リボソーム発現系、ファージ発現系又はＥ．ｃｏｌｉ発現系において同様の発現レベルを増進させるように、一貫したコドン使用パターンを活用するリーディングフレームを有する。好ましくは、該オリゴヌクレオチドは、並行して合成される。化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから該遺伝子を並行して作製することが好ましい。
【０００９】
別の態様では、本発明は、所望の特性を有する蛋白質の作製方法であって、
（ｉ）所定のアルゴリズムを蛋白質骨格に適用して見込まれる複数の変異体を生成し、
（ii）該複数の変異体をコンピュータ内でスクリーニングして変異体の序列付きリストを作成し、
（iii）該変異体のうち少なくとも１０種をコードする既定配列を有する核酸分子を生成し、ここで、該核酸分子は、
（Ａ）該変異体をコードする該核酸分子のそれぞれの配列を規定する部分重複配列を有するオリゴヌクレオチドのプールを準備し、
（Ｂ）該オリゴヌクレオチドのプールをハイブリダイゼーション条件下及び次の条件のうちの少なくとも一つ:（１）連結反応条件、（２）鎖延長条件又は（３）鎖延長及び連結反応条件の下でインキュベートし、それによって核酸構築物を形成させ、
（Ｃ）該既定配列を有する構築物を該既定配列を有しない構築物から分離し、それによって該変異体をコードする核酸分子を形成させること
を含む方法によって作成されたものであり；
（iv）該核酸分子を発現させて該蛋白質変異体を生成し、
（ｖ）該変異体をスクリーニングして所望の特性を有する変異体を同定すること
を含む、前記方法を提供する。
【００１０】
所定の実施形態では、該方法を使用して該変異体の少なくとも１００、１０００、１００００種以上をコードする核酸を生成させることができる。
【００１１】
所定の実施形態では、変異体をコードする核酸は、それぞれ、少なくとも１０００、５０００以上の塩基長である。
【００１２】
所定の実施形態では、該方法は、該変異体をコードする核酸を、例えば、発現プラスミドのようなプラスミドに挿入することをさらに含むことができる。該方法は、該変異体をコードする核酸又は該変異体をコードする核酸を含むプラスミドを細胞に導入することをさらに含むことができる。所定の実施形態では、該変異体を、例えば、細菌細胞のような細胞内で産生させることができる。他の実施形態では、該変異体を試験管内で産生させることができる。所定の実施形態では、該変異体をコードする核酸分子は、例えば、プロモーター又はエンハンサーのような調節配列を有することができる。
【００１３】
所定の実施形態では、該変異体をコードする核酸分子の少なくとも一部分は、単一のプールで調製される。他の実施形態では、該変異体をコードする核酸分子の全て又は大部分は、単一のプールで調製される。
【００１４】
所定の実施形態では、該変異体をコードする１種以上の核酸の配列の少なくとも一部分は、少なくとも１種の他の核酸との相同性を減少させるようにコドンが再配置されている。
【００１５】
所定の実施形態では、変異体をスクリーニングして次の特性の少なくとも一つ：酵素活性、構造的特徴、標的分子に対する結合親和性、安定性の改善、免疫原性の低下、良好な生物学的利用率、発現の増加又は溶解度の増加を有する変異体を同定することができる。
【００１６】
所定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、アレイ上で合成される。このような所定の実施形態では、該アレイは、固体支持材と、該固体支持材に不随した複数の別個の機構とを備えることができ、ここで、それぞれの機構は、規定されたコンセンサス配列を一括して有するオリゴヌクレオチド集団を独立して含むが、ただし、該機構の該オリゴヌクレオチドの１０％以下が同一の配列を有するに過ぎない。所定の実施形態では、該核酸分子を生成させるための方法は、エラー低減プロセスをさらに含む。
【００１７】
所定の実施形態では、該変異体をコードする核酸分子は、粘着末端を有する。
【００１８】
所定の実施形態では、該核酸分子の配列を規定するオリゴヌクレオチドの一つ以上は、所望の配列を有する核酸構築物の配列を規定するオリゴヌクレオチドのセットが、不正確な産物の配列を規定するオリゴヌクレオチドのセットと比較して、配列タグという区別できる補足物を有するように配列タグをさらに有し、ここで、該所望の配列を有する核酸構築物は、サイズ又は電気泳動の移動度に基づき、不正確なクロスオーバー産物から分離される。
【００１９】
所定の実施形態では、所望の配列を有する核酸構築物の配列を規定するオリゴヌクレオチドのセットは、正確に形成された産物の環状化を可能にする粘着末端を形成し、そして、この場合に、正確に形成された環状化産物は、不正確に形成された直鎖状産物から分離される。このような実施形態では、該環状化産物は、該直鎖状産物をエキソヌクレアーゼで消化することによって又は例えばゲル電気泳動を使用したサイズ分離によって分離できる。
【００２０】
所定の実施形態では、該変異体をコードする核酸分子は、ベクター配列と、該核酸分子を環状化して環状化発現プラスミドを形成させるのを可能にする粘着末端とを有する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、所定の特性又は特性のセットを有する種について選択又はスクリーニングできる複数の候補蛋白質をコードする複数の合成ＤＮＡを含む生合成ライブラリーを提供し、ここで、該ライブラリーは、配列相同性のある領域を有する複数のＤＮＡを有し且つ化学的に合成されたヌクレオチドから構築される。所定の実施形態では、該化学的に合成されたオリゴヌクレオチドは、並行して合成される。所定の実施形態では、該ＤＮＡは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから並行して構築される。
【００２２】
別の態様では、本発明は、所定の特性又は特性のセットを有する種について選択又はスクリーニングできる複数の候補蛋白質をコードする複数の合成ＤＮＡを含む生合成ライブラリーであって、該ライブラリーが化学的に合成されたヌクレオチドから化学的に合成又は構築された複数のＤＮＡと、複数のリーディングフレームであって、そのＤＮＡが、選択された発現系において同様の発現レベルを増進させるように一貫したコドン使用パターンを利用するものとを有する、前記ライブラリーを提供する。所定の実施形態では、該化学的に合成されたオリゴヌクレオチドは、並行して合成される。所定の実施形態では、該ＤＮＡは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから並行して構築される。
【００２３】
別の態様では、本発明は、化学的に合成されたヌクレオチドから化学的に合成又は構築された、意図的に生成され予め特定された配列であって所定の特性又は特性のセットを有する種について選択又はスクリーニングできる複数の候補蛋白質をコードするもののうち少なくとも１０種のＤＮＡを含む生合成ライブラリーを提供する。所定の実施形態では、該化学的に合成されたオリゴヌクレオチドは、並行して合成される。所定の実施形態では、該ＤＮＡは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから並行して構築される。
【００２４】
別の態様では、本発明は、所望の特徴又は特性を有する蛋白質の作製方法であって、見込まれる複数の蛋白質変異体についての配列データを生成し；複数のオリゴヌクレオチドを並行して生成し、そしてこれらを構築して該蛋白質変異体の配列のうち少なくとも１０種をコードする核酸分子を生じさせ；該核酸分子を発現させて該蛋白質変異体を生成し；そして該変異体を選択し又はスクリーニングして該所望の特徴を有する蛋白質を同定することを含む方法を提供する。所定の実施形態では、該方法は、相補的なオリゴヌクレオチド配列のハイブリダイゼーション、続いてリガーゼ及び／又はポリメラーゼ処理によってオリゴヌクレオチドを構築することを伴い、また該蛋白質変異体の配列を少なくとも２０、５０、１００、１０3、１０4、１０5又は１０6個生成する。
【００２５】
所定の実施形態では、ここで提供する方法は、特に関心のある変異体配列を同定するために序列付けできる骨格蛋白質変異体のライブラリーを生成することを包含し得る。次いで、多数の該蛋白質変異体を発現させ、そして実験的に検査して所望の特徴を示す変異体を同定することができる。該方法は、相補的な重複オリゴヌクレオチドの段階的構築を使用して忠実度の高い大きな核酸分子を構成することを包含する。実験的な実施形態では、少なくとも１０個、１００個、１０００個、１００００個、１０００００個又はそれを超える蛋白質変異体が実験的に検査される。
【００２６】
本発明を実施するにあたっては、特に断らない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の慣用技術を採用できる。これらは技術常識である。このような技術は、所定の文献において完全に説明されている。例えば、「Molecular Cloning A Laboratory manual」，第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ著（コールドスプリングハーバーラボラトリープレス：１９８９）；「DNA Cloning」，第Ｉ巻及び第II巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ著，１９８５）；「Oligonucleotide Synthesis」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ著，１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓ外，米国特許第：４,６８３,１９５；「Nucleic Acid Hybridization」（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ及びＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ共著.１９８４）；「Transcription And Translation」（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ及びＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ共著.１９８４）；「Culture Of Animal Cells」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ社，１９８７）；「Immobilized Cells And Enzimes」（ＩＲＬプレス，１９８６）；Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ，「A Practical Guide To Molecular Cloning」（１９８４）；学術論文，Method In Enzymology（アカデミックプレス社，Ｎ．Ｙ．）；「Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells」（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ及びＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ共著,１９８７,コールドスプリングハーバーラボラトリー）；「Method In Enzymology」，第１５４及び１５５巻（Ｗｕ外共著），「Immunochemical Method In Cell And Molecular Biology」（Ｍａｙｅｒ及びＷａｌｋｅｒ共著，アカデミックプレス，ロンドン、１９８７）；「Handbook Of 実験 免疫logy」，第Ｉ〜IV巻（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ及びＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ共著，１９８６）；「Manipulating the Mouse Embryo」，（コールドスプリングハーバーラボラトリープレス,コールドスプリングハーバー、Ｎ．Ｙ．，１９８６）を参照されたい。
【００２７】
本発明の他の特徴及び利点は次の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかであろう。ここで与えた特許請求の範囲は、参照によってこの部で援用するものとする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
図面の簡単な説明
図１は、（Ａ）連結、（Ｂ）鎖延長及び（Ｃ）鎖延長と連結を含む、構成オリゴヌクレオチドを部分構築物及び／又はポリヌクレオチド構成物に構築するための３つの実験方法を示す。
【００２９】
図２は、合成される例示のＤＮＡ分子を簡単に示している。
【００３０】
図３は、図１の代表的なＤＮＡ分子の合成に使用したマイクロアレイを示している。
【００３１】
図４は、内部相同領域を有するポリヌクレオチド構築物の多重構築を実施するときに生じ得る、考えられるクロスオーバー産物を示す。
【００３２】
図５は、内部相同領域を有するポリヌクレオチド構築物の多重構築を実施するときに生じ得るクロスオーバー重合を示す。
【００３３】
図６は、相同領域を有するポリヌクレオチド構築物の多重構築のための環選択方法の一実施形態を示す。
【００３４】
図７は、相同領域を有するポリヌクレオチド構築物の多重構築のための環選択方法の別の実施形態を示す。
【００３５】
図８は、相同領域を有するポリヌクレオチド構築物の多重構築のためのサイズ選択方法の一実施形態を示す。
【００３６】
図９は、相同領域を有するポリヌクレオチド構築物の多重構築のためのサイズ選択方法の別の実施形態を示す。
【００３７】
図１０は、ミスマッチ結合蛋白質を使用したエラー配列の除去方法を示す。
【００３８】
図１１は、ミスマッチ認識蛋白質によるエラー配列の無効化方法を示す。
【００３９】
図１２は、ストランド特異的エラーの訂正方法を示す。 
【００４０】
図１３は、両ストランド上のミスマッチ部位のＤＮＡを局部的に除去するための一スキームを示す。
【００４１】
図１４は、両ストランド上のミスマッチ部位のＤＮＡを局部的に除去するための別のスキームである。
【００４２】
図１５は、２個のＤＮＡ二本鎖であってそれぞれが一塩基（ミスマッチ）エラーを有するものに適用された図１３（言い換えれば図１４）の方法の効果を要約するものである。
【００４３】
図１６は、ミスマッチ含有セグメントの半選択的除去の例を示している。
【００４４】
図１７は、合成されたＤＮＡにおいて相関エラーを減少させるための手順を示している。
【００４５】
発明の詳細な説明
１．定義
用語「アミノ酸」とは、天然型アミノ酸及び合成アミノ酸並びに天然型アミノ酸と類似する態様で機能するアミノ酸アナログ及びアミノ酸模倣物をいう。天然型アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるもの並びに後で修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート及びＯ−ホスホセリンである。アミノ酸アナログとは、天然型アミノ酸と同一の基本化学構造、即ち、水素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基に結合したα−炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムをいう。このようなアナログは、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するものの、天然型アミノ酸と同一の基本化学構造を保持している。「アミノ酸模倣物」とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するものの、天然型アミノ酸に類似する態様で機能する化学化合物をいう。
【００４６】
用語「増幅」とは、核酸フラグメントのコピー数を増加させることを意味する。
【００４７】
本明細書において蛋白質又は蛋白質変異体について使用するときに、用語「特徴」とは、所定の蛋白質の生化学的及び／又は生物物理学的特性をいう。生物物理学的特性の例としては、例えば、熱安定性、溶解性、等電点、ｐＨ安定性、結晶化性、結晶化条件、凝集状態、熱容量、化学変性に対する抵抗性、蛋白質分解抵抗性、アミド水素交換データ、クロマトグラフィー充填材上での挙動、電気泳動移動度、質量分析中の分解に対する抵抗性及び核磁気共鳴、Ｘ線結晶学法、円偏光二色性、光散乱、原子吸着、蛍光、蛍光消光、質量分析、赤外分光法、電子顕微鏡法及び／又は原子間力顕微鏡法から得られた結果が挙げられる。生化学的特性の例としては、例えば、発現能力、蛋白質の収量、小分子結合、亜細胞局在性、薬物標的としての有用性、蛋白質−蛋白質相互作用及び蛋白質−リガンド相互作用が挙げられる。
【００４８】
ここで使用するときに、用語「開裂」とは、２個のヌクレオチド間の結合、例えばホスホジエステル結合の切断をいう。
【００４９】
用語「保存残基」とは、共通する所定の特性を有するアミノ酸よりなる群の一員であるアミノ酸をいう。用語「保存的アミノ酸置換」とは、このような一群からのアミノ酸を同一の群からの異なるアミノ酸で置換すること（概念的であるか非概念的であるかは別にして）をいう。個々のアミノ酸間での共通する特性を定義するための有効な方法は、同種生物の対応する蛋白質間でのアミノ酸変化の正規化頻度を分析することである（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．及びＲ．Ｈ．Ｓｃｈｉｒｍｅｒ．，蛋白質構造の原理，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。このような分析に従ってアミノ酸の群を定義することができ、この場合、所定の群内のアミノ酸は優先的に互いに交換するため、蛋白質構造全体に及ぼすそれらの影響の点で最も互いに類似する（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．及びＲ．Ｈ．Ｓｃｈｉｒｍｅｒ，蛋白質構造の原理，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。この態様で定義されるアミノ酸群のセットの一例としては、（ｉ）ＧＩｕ及びＡｓｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ並びにＨｉｓからなる荷電した群、（ii）Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓからなる、正に荷電した群、（iii）ＧＩｕ及びＡｓｐからなる、負に荷電した群、（iv）Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐからなる芳香族群、（v）Ｈｉｓ及びＴｒｐからなる窒素環群、（vi）ＶａＩ、Ｌｅｕ及びＨｅからなる、大きな脂肪族非極性群、（vii）Ｍｅｔ及びＣｙｓかなる僅かに極性の群、（viii）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧＩｙ、Ａｌａ、ＧＩｕ、ＧＩｎ及びＰｒｏからなる小さな残基の群、（ix）ＶａＩ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ及びＣｙｓからなる脂肪族群並びに（ｘ）Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる小さなヒドロキシルの群が挙げられる。
【００５０】
「ドメイン」とは、ポリペプチド部分配列、完全なポリペプチド配列又は複数のポリペプチド配列を含む蛋白質又は蛋白質複合体の単位であって、該単位が確定した機能を有するものをいう。この機能は幅広く定義されるものとし、またリガンド結合、触媒活性であることができ、又は該蛋白質の構造に安定化効果を及ぼすことができる。
【００５１】
用語「遺伝子」とは、エキソン配列及び随意にイントロン配列を有するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する核酸をいう。用語「イントロン」とは、蛋白質には翻訳されず且つ概してエキソン間に見出される、所定の遺伝子に存在するＤＮＡ配列をいう。
【００５２】
キメラポリヌクレオチドの文脈において使用するときに、用語「異種」とは、セグメント、ドメイン又は遺伝要素を含む配列であって、その正確な組み合わせ及び配列が自然界には見出されないものをいう。
【００５３】
用語「リガーゼ」とは、所定の酵素類をいい、また、同一のオリゴヌクレオチドにアニーリングする隣接オリゴヌクレオチドにホスホジエステル結合を形成させる際のそれらの機能をいう。特に効率的な連結反応は、第１オリゴヌクレオチドの末端燐酸基と、隣接する第２オリゴヌクレオチドの末端ヒドロキシル基とが、二重らせん内でそれらの相補配列が互いに向かい合ってアニーリングする場合、即ち、連結プロセスによって連結可能なニック部位にある「切れ目」が連結し、そして相補的な二本鎖が創り出される場合に生じる（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｍ．及びＧａｉｔ，Ｍ．（１９９６）「Nucleic acid in Chemistry and Biology」，オックスフォード大学プレス，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．１３２−３３，４８１−２）。この隣接オリゴヌクレオチド間の部位は、「連結可能ニック部位」、「ニック部位」又は「切れ目」と呼ばれており、そのため、ホスホジエステル結合は存在していないか、又は開裂している。
【００５４】
用語「連結させる」とは、隣接オリゴヌクレオチドをヌクレオチド間結合の形成によって共有結合させる反応をいう。
【００５５】
用語「モチーフ」とは、特定の構造又は機能の蛋白質中に共通して見出されるアミノ酸配列をいう。通常、コンセンサス配列は、特定のモチーフを表すように定義される。該コンセンサス配列を厳密に定義する必要はないが、これは、変異性の位置、縮重、長さの変化などを含むことができる。このコンセンサス配列は、データベースを検索して、そのアミノ酸配列内に該モチーフが存在するため同様の構造又は機能を有し得る他の蛋白質を同定するために使用できる。例えば、オンラインデータベースを、特定のモチーフを有する他の蛋白質を同定するために、所定のコンセンサス配列で検索できる。ＦＡＳＴＡ、ブラースト又はＥＮＴＲＥＺを含め、様々な検索アルゴリズム及び／又はプログラムが使用できる。ＦＡＳＴＡ及びブラーストは、ＧＣＧ配列分析パッケージ（ウィスコンシン大学，ウィスコンシン州マディソン）の一部分として入手できる。ＥＮＴＲＥＺは、全米バイオテクノロジー情報センター、米国国立医学図書館、米国国立衛生研究所（米国ミッドランド州ベセスダ）を通じて入手できる。
【００５６】
用語「突然変異」とは、野生型核酸配列の配列が変化すること又は野生型ポリペプチド配列の配列が変化することを意味する。このような突然変異は、塩基置換又はトランスバージョンのような点突然変異であることができる。該突然変異は、欠失、挿入又は重複であることができる。
【００５７】
本明細書において、ある対象に適用するときに、用語「天然型」とは、所定の対象が自然界において見出され得るという事実をいう。例えば、自然界の源泉から単離できる生物（ウイルスを含む）内に存在し且つ研究室において人間により意図的に修飾されていないポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、天然型である。
【００５８】
用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）及び一本鎖又は二本鎖のいずれかの形態にあるそれらの重合体をいう。特に限定しない限り、この用語は、基準の核酸と同様の結合特性を有し且つ天然型ヌクレオチドと同様の態様で代謝される、天然ヌクレオチドの既知のアナログを含有する核酸を包含する。特に断らない限り、特定の核酸配列は、また、保存的に修飾されたそれらの変異体（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ及び相補的な配列並びに明示的に示された配列をも暗黙的に包含する。特に、縮重コドン置換は、１個以上の選択された（又は全ての）コドンの第３の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を生成させることによって達成できる（Ｂａｔｚｅｒ外，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ外，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ外，MoI．Cell．Probes ８：９１−９８（１９９４））。用語「核酸」は、遺伝子、ｃＤＮＡ及び所定の遺伝子によってコードされるｍＲＮＡについて区別なく使用する。
【００５９】
ここで使用するときに、用語「作動可能に結合」とは、ポリヌクレオチドが機能的な関係で結合することをいう。核酸は、他の核酸配列と機能的な関係に置かれたときに「作動可能に結合」する。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合には、該コード配列に作動可能に結合している。作動可能に結合とは、結合するＤＮＡ配列が通常隣接しており、また、２個の蛋白質コード領域を結合させる必要がある場合には、隣接し且つリーディングフレーム中にあることを意味する。
【００６０】
本明細書において、「ポリペプチド」及び「ペプチド」は、アミノ酸残基の重合体をいうために区別なく使用する；これに対して、「蛋白質」は、通常、１個又は複数のポリペプチド鎖を有する。３つの全ての用語は、１個以上のアミノ酸残基が対応する天然型アミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸重合体並びに天然型アミノ酸重合体及び非天然型アミノ酸重合体にも当てはまる。ここで使用するときに、これらの用語は、全長蛋白質を含めて任意の長さのアミノ酸鎖であって、それらのアミノ酸残基が共有ペプチド結合によって結合したものを包含する。ポリヌクレオチド又はポリペプチドに関連するときに、用語「残基」とは、ポリヌクレオチドについてはプリン若しくはピリミジンヌクレオチド又はポリペプチドについてはアミノ酸のいずれかをいう。
【００６１】
ポリペプチドに関して使用するときに、用語「構造モチーフ」とは、異なるアミノ酸配列を有し得るが、同様の構造を生じさせ得るポリペプチドをいい、ここで、構造とは、該モチーフが一般に同一の三次構造を形成すること、或いは該モチーフ又はそれらの骨格若しくは側鎖（これは、該側鎖のＣα原子を包含しても包含しなくてもよい）内の所定のアミノ酸残基が該モチーフにおいて互いに同様の関係で位置することを意味する。
【００６２】
用語「野生型」とは、その核酸フラグメントがいかなる突然変異も有しないことを意味する。「野生型」蛋白質とは、該蛋白質が自然界において見出される活性と同等のレベルで活性であり、且つ、通常、自然界において見出されるアミノ酸配列を含むことを意味する。本発明の所定の態様において、用語「野生型」又は「親配列」は、該配列の操作前の出発配列又は基準配列を示すことができる。
【００６３】
２．理論的多様性を使用した蛋白質工学
デノボ蛋白質デザイン方法論は、過去１０年の間に極めて強力になった。今や、コンピュータ内で＞１０100個の蛋白質配列のライブラリーを、それぞれのものをコンピュータでチェックせずに、むしろ所定のアルゴリズムを利用して配列スペースの領域を除去することによってスクリーニングすることが可能である。「原子レベルの正確さで折りたたまれた新規な球状蛋白質」，Ｋｕｈｌｍａｎ外，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖ２０３，ｐ．１３４４，２００３を参照されたい。これらのライブラリーのサイズは実験方法と比較して驚異的であり、最高約１０12〜１０15のライブラリーサイズに達する。
【００６４】
コンピュータ内方法の注意点は、蛋白質機能の経験上のモデルに大きく依拠しているため、今のところ完璧な正確さにはほど遠いということにある。モデルの不正確さを補うためには、コンピュータ内モデルのアウトプットは、一般に、それぞれのデザインに得点が割り当てられる、見込まれるデザインの序列付きリストである。そのときに、この序列付きリストの頂点では「大いにあり得る解」というリストになるが、そのうちのいくつかのサブセットを野生型配列から合成させ又は変異させ、そして試験することができる。さらに、このアプローチは、近年、いくつかの注目に値する成功を収めた。例えば、新規な２７アミノ酸配列の既定骨格を有するαββモチーフがデザインされ（Ｄａｈｉｙａｔ及びＭａｙｏ  １９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：８２−８７）、新規な超酸化鉄ジスムターゼがデザインされ（Ｐｉｎｔｏ外  １９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：５５６２−５５６７）、自然界には見出されない新規な９３アミノ酸蛋白質の折り畳み「Ｔｏｐ７」がデザインされ（Ｋｕｈｌｍａｎ外  ２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０２：１３６４−１３６８）、酵素活性（トリオース燐酸イソメラーゼ）の非酵素骨格（リボース結合蛋白質）への付与が蛋白質デザインによって達成され（Ｄｗｙｅｒ外  ２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４：１９６７−１９７１）、新規なセンサー蛋白質がデザインされ（Ｌｏｏｇｅｒ外  ２００３，Ｎａｔｕｒｅ  ４２３：１８５−１９０）、そして治療用蛋白質変異体（優性阻害ＴＮＦ−α変異体）がデザインされた（Ｓｔｅｅｄ外，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：１８９５−１８９８）。
【００６５】
この分野に携わる人々は、それぞれのデザインを得点するために使用する経験上のモデルが、最善の１０又は２０のデザインを他のものから区別するのに十分に良好ではないかもしれないということにますます気付き始めている。このことは、いくつかのモデルを、それらの最適な形から遠く離れた予測をたてるためにどのように使用するのかを指摘する近年の論文で強調された（Ｊａｒａｍｉｌｌｏ及びＷｏｄａｋ  ２００５，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．８８：１５６−１７１）。当業者は、それらのコンピュータ内デザインの〜１０以上、もしかしたら１００〜１０００又はそれどころかさらに１００００種の蛋白質を合成しそして試験しても、該モデル内におけるほんの僅かなエラーのため当該デザインの問題に対する可能な解決手段が見つからないという事態を回避したいという要望がある。
【００６６】
本出願人は、多数のＤＮＡ配列を低コストで合成するための新規な方法を開発した。これは、蛋白質デザイナーが、適切な費用で且つ合理的な時間内に、それらの高得点デザインの大部分又は全て、恐らくは１０4個以上の特定配列を構築することを可能にするであろう。これは、モデルの正確さが完璧ではなく、且つ、「適切な答え」が実際には予め試験できたもの（〜１０個のデザイン）と試験することが可能なもの（〜１００００個以上のデザイン）との間の序列付きリストの中のどこかにある状況において解決策を生み出す可能性を有する。
【００６７】
従って、コンピュータ内デザインを作成して、良好な候補のために試験又は選択できるプール又は複数の別個の種として機能したり、他の意図的なデザイン反復のための又はランダム突然変異誘発を利用する進化技術のための出発点として機能したりすることができる構築物のライブラリーを作製することができる。スクリーニング又は選択は、該プールに適用でき、また必要なら、このプロセス（デザイン又は別のライブラリーの拡大から始まる）を繰り返すことができる。ここでは、この一般的なストラテジーを「理論的多様性」といい、そしてこれは、初期ライブラリーデザインにおけるメカニズムモデル（「理論的」）の重要性を強調するものである。
【００６８】
デザインは、突然変異又は進化によっては行うことができないもの（又は合理的な時間内には行うことができないもの）のために必要である。本来、これは、コンピュータによるスクリーニングと実験によるスクリーニングとのライブラリーサイズの相違によって生じる。天然の生物学的進化及び定方向進化のような派生的な実験室技術は、２つの重要な制約がある。第１は、中間体が生存できなければならないこと（又は機能できなければならないこと）である。生存できないと（機能できないと）、連鎖が破壊される。第２は、進化時期が配列スペースを徹底的にサーチするには十分でないことである。しかしながら、合成蛋白質デザインは、ダーウィンの説では進化しないため、成功した別のデザインの系統である必要はないから、これは、蛋白質デザインについての可能性を大きく発展させる。
【００６９】
ワシントン大学のＢａｋｅｒのグループによるロゼッタデザインは、蛋白質デザインソフトウェアをどのようにして働かせるのかについてのモデルケースである。これは、機能がどのようにデザインされ又は設計されるのかに関わらず、蛋白質の骨格コンフォメーションがどのように関連するのかといういくつかの理解（例えば、このものがどのようにして適切に折りたたまれた構造、結合ポケット、触媒部位などを形成するのか又は形成しないのか）から始まる。このプログラムは、入力として所望の蛋白質骨格の空間位置を取得する。次いで、これは、全ての可能なアミノ酸配列を検索して所定の骨格コンフォメーションについて最小のエネルギーを有するものを探し出す。このエネルギーモデルは、半経験的（Ｌｅｎｎａｒｄ−Ｊｏｎｅｓ）モデルと全経験的（間接的溶媒和）モデルとの組み合わせである。ロゼッタデザインの現在のバージョンは、全ての可能な配列を検索できるだけでなく、それぞれの配列が標的コンフォメーションにおいて安定であるかどうかを決定することができ、そうでない配列を切り捨てることができる（Ｋｕｈｌｍａｎ外  ２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０２：１３６４−１３６８）。
【００７０】
一般に、本発明は、様々な分野及び有用な生物学的構築物を製造するための様々な状況で使用できるポリヌクレオチド、蛋白質及びライブラリー作製技術を提供する。蛋白質デザインの代表的な用途としては、例えば、生化学的及び／又は生物物理学的特性を含む新規な特徴を有する蛋白質のデザインが挙げられる。別の例は、新規な触媒ＲＮＡのデザインである。一実施形態では、ここで説明する方法を使用して、例えば、活性部位残基の周辺の骨格をデザインし、そして残基をコンピュータ内で変異させてさらに高い結合親和性、安定性の改善、免疫原性の低下、良好な生物学的利用率又は機能性を維持しながら容易な製造のような所望の特徴を有する変異体を生じさせることによって、改善されたヒトの治療法を開発することができる。別の実施形態では、ここで説明する方法を使用して、例えば、活性部位をデザインして所望の化学的形質転換を実施し、次いで骨格の足場をデザインして新規な活性部位を活性なコンフォメーション内に収容することによって新規な産業用酵素を開発することができる。産業用酵素の代表的な用途としては、化学合成、パルプ及び紙の漂白、バイオマスのエネルギー変換などが挙げられる。別の実施形態では、ここに開示する方法は、二機能性又は多機能性蛋白質を開発するために使用できる。例えば、多価の高親和性結合因子は、リンカーをデザインして、例えば、見込まれる親和性が最も高い構築物又は速度が遅い構築物を生じさせる結合ドメインに最適に結合させることによって開発できる。さらに、ここで説明する方法は、最適な触媒効率を生じさせる結合ドメイン、リンカー及び触媒ドメインの組み合わせを開発するために使用できる。さらに別の実施形態では、ここで説明する方法は、「最小蛋白質」を開発するために使用できる。例えば、蛋白質の機能領域の骨格を固定することができ、そしてこの領域の鎖を、安定な単一分子を生じさせる最も小さな適当な骨格と結合させることができる。該ポリペプチドの配列をさらに最適化して該骨格構造を保持することができる。このような最小蛋白質は、蛋白質の製造を促進させ、また、安定性がさらに大きい又は拡散速度がさらに高い蛋白質を生じさせることができる。
【００７１】
代表的な実施形態では、多数の蛋白質デザイン変異体を発現させ、そしてスクリーニングしたり、好ましくは選択プロセスに付したりして、所望の特徴を示す変異体を同定することができる。様々な実施形態では、少なくとも１０、１００、１０００、１００００又は１０００００種以上の変異体を所望の特徴についてスクリーニングできる。このような変異体は、随意に、見込まれる変異体の大きなライブラリーの分析から得られた変異体の序列付きリストを作成するコンピュータ内での予備スクリーニングに基づいて選択できる。
【００７２】
３．変異体ライブラリーの作製
非常に大きな突然変異体（変異体）ライブラリーをコンピュータでスクリーニングすることによって、蛋白質配列のさらに大きな多様性をスクリーニングすることができる（即ち、配列スペースのさらに大きなサンプリング）が、これは、蛋白質機能のさらに大きな改善をもたらす。さらに、所定のライブラリーのサイズをスクリーニングするために数種の突然変異体を実験によって検査し、蛋白質工学のコストと困難さを低減させることが必要になるかもしれない。計算法を使用して蛋白質ライブラリーを予備スクリーニングすることによって、速度及び効率というコンピュータの特徴と、適当なコンピュータモデルと構造−機能との関係が不明確な蛋白質において新たな活性を創り出すことができる実験ライブラリースクリーニングの能力とを組み合わせることができる。
【００７３】
さらに、以下に詳しく概説するように、該ライブラリーに様々な方法でバイアスをかけることができるが、これは、それらの着目点において異なるライブラリーの作製を可能にする；例えば、ドメイン、個々の残基、表面残基、残基のサブセット、活性部位又は結合部位などを全て変更してもよく、又は望み通りに一定に維持してもよい。
【００７４】
従って、本発明は、骨格蛋白質変異体の二次ライブラリーを作製するための方法を提供する。ここで使用するときに、蛋白質とは、ペプチド結合によって互いに結合した少なくとも２個のアミノ酸を包含することを意味するものとし、これには、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド及び様々に誘導体化されたポリペプチド、例えば、燐酸化又はグリコシル化蛋白質が含まれる。このペプチジル基は、天然型アミノ酸及びペプチド結合又は合成ペプチド模倣物構造、即ちペプトイドのような「アナログ」を含むことができる（Ｓｉｍｏｎ外，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９（２０）：９３６７（１９９２））。該アミノ酸は、天然型であるか又は非天然型であるかのいずれかであることができる；当業者であれば明らかなように、一連の回転異性体が知られており又は作製できるいかなる構造体もアミノ酸として使用できる。該側鎖は、（Ｒ）又は（Ｓ）配置のいずれかであることができる。好ましい実施形態では、該アミノ酸は（Ｓ）又はＬ−配置である。
【００７５】
骨格蛋白質はどのような蛋白質であってもよいが、好ましい蛋白質は、三次元構造が知られているか又は作製できるものである；即ち、該蛋白質の各原子について三次元配位が存在するものである。一般に、これは、Ｘ線結晶技術、ＮＭＲ技術、デノボモデリング、相同性モデリングなどを使用して決定できる。一般的に、Ｘ線構造を使用する場合には、２Åの分解能又はそれよりも良好な分解能の構造が好ましいが、必要なわけではない。
【００７６】
該骨格蛋白質は、原核生物及び真核生物を含めた任意の生物由来のものであることができ、酵素は、細菌、菌類、古細菌のような好極限性生物、昆虫、魚類、動物（特にほ乳類、特にヒト）及び鳥類由来のものであれば全て可能である。ここで、本明細書において「骨格蛋白質」とは、変異体のライブラリーが望まれている蛋白質を意味する。当業者であれば明らかなように、あらゆる数の骨格蛋白質が本発明で使用できる。具体的に「蛋白質」の定義に含まれるものは、酵素ドメイン、結合ドメインなどのような機能的ドメイン及び回転、ループなどのようなさらに小さなフラグメントを含め、既知の蛋白質のフラグメント及びドメインである。即ち、蛋白質の部分を同様に使用することができる。さらに、ここで使用するときに、「蛋白質」には、蛋白質、オリゴペプチド及びペプチドが含まれる。さらに、蛋白質変異体、即ち非天然型蛋白質アナログ構造を使用することができる。好適な蛋白質としては、リガンド、細胞表面受容体、抗原、抗体、サイトカイン、ホルモン、転写因子、シグナル伝達モジュール、細胞骨格蛋白質及び酵素を含めて、産業用及び医薬用蛋白質が挙げられるが、これらに限定されない。酵素の好適な部類としては、ヒドラーゼ、例えば、プロテアーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ；イソメラーゼ、例えば、ラセマーゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼ又はムターゼ；トランスフェラーゼ、キナーゼ、オキシドレダクターゼ及びホスファターゼが挙げられるが、これらに限定されない。好適な酵素は、スイスプロット酵素データベースに列挙されている。好適な蛋白質骨格としては、構造バイオインフォマティクス研究共同体（ＲＣＳＢ。以前はブルックヘブン国立研究所）が編集しサービスを提供している蛋白質データベースに見出されるものの全てが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
特に、好ましい骨格蛋白質としては、サイトカイン（ＩＬ−Ｉｒａ（＋受容体複合体）、ＩＬ−1（受容体単独）、ＩＬ−Ｉａ、ＩＬ−Ｉｂ（変異体及び／又は受容体複合体を含む）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−β、ＩＮＦ−γ、ＩＦＮ−α−２ａ；ＩＦＮ−α−２Ｂ、ＴＮＦ−α；ＣＤ４０リガンド（ｃｈｋ）、ヒト肥満蛋白質レプチン、顆粒球コロニー刺激因子、骨形成蛋白質−７、毛様体神経栄養因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、単球走化性蛋白質１、マクロファージ遊走阻止因子、ヒトグリコシル化阻害因子、ヒトランテス、ヒトマクロファージ炎症性蛋白質１β、ヒト成長ホルモン、白血病抑制因子、ヒトメラノーマ成長刺激活性、好中球活性化ペプチド−２、ＣＣケモカインＭｃｐ−３、血小板因子Ｍ２、好中球活性化ペプチド２、エオタキシン、ストローマ細胞由来因子−１、インスリン、インスリン様成長因子Ｉ、インスリン様成長因子II、形質転換成長因子Ｂ１、形質転換成長因子Ｂ２、形質転換成長因子Ｂ３、形質転換成長因子Ａ、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、内皮細胞増殖因子、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、血小板由来成長因子、ヒト肝細胞成長因子、グリア細胞由来神経栄養因子（並びにＰＤＢ中少なくとも５５種のサイトカイン）；エリスロポエチン；限定されないが、ソニック・ヘッジホッグ、デザート・ヘッジホッグ、インディアン・ヘッジホッグ（ｈＣＧ）を含めて、他の細胞外シグナル伝達部分；限定されないが、ＴＰＡ及び因子VIIａを含めて凝固因子；限定されないが、ｐ５３、ｐ５３四量体化ドメイン、Ｚｎフィンガー（このうち１２種以上の構造が知られている）、ホメオドメイン（このうち８種の構造が知られている）、ロイシンジッパー（このうち４種の構造が知られている）を含めて、転写因子；限定されないが、ｃＦｖを含めた抗体；限定されないが、ヘマグルチニン三量体化ドメイン及びｈｉｖ  Ｇｐ４１細胞外ドメイン（融合ドメイン）を含めてウイルス蛋白質；限定されないが、ＳＨ２ドメイン（このうち８種の構造が知られている）、ＳＨ３ドメイン（このうち１１種の構造が知られている）及びプレクストリン相同ドメインを含めて細胞内シグナル伝達モジュール；限定されないが、ヒト組織因子サイトカインの細胞外領域−Ｇｐｌ３０の結合領域、Ｇ−ＣＳＦ受容体、エリスロポエチン受容体、線維芽細胞成長因子受容体、ＴＮＦ受容体、ＩＬ−１受容体、ＩＬ−１受容体／ＩＬ−ｌｒａ複合体、ＩＬ−４受容体、ＩＮＦ−γ受容体α鎖、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、Ｔ細胞受容体、インスリン受容体、インスリン受容体チロシンキナーゼ及びヒト成長ホルモン受容体を含めて受容体など、既知の構造を有するもの（変異体を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
骨格蛋白質を選択したら、通常、既知の又は開発されたコンピュータ処理技術を使用してライブラリーを生成させることができる。一般的に言えば、いくつかの実施形態では、コンピュータ処理の目的は、最適化された一連の蛋白質配列を決定することである。ここで、「最適化された蛋白質配列」とは、コンピュータ処理の数学方程式を最良に適合させる配列を意味する。当業者であれば明らかなように、大域的最適化配列は、これらの方程式を最良に適合させる１個の配列である（例えば、蛋白質デザインオートメーション（ＰＤＡ）を使用する場合に、該大域的最適化配列は、以下の方程式１を最良に適合させる配列である）；即ち、あらゆる可能な配列のうち最もエネルギーが低い配列である。しかしながら、大域的最小点ではないにしてもエネルギーの低い配列はいくらでも存在する。
【００７９】
これらのライブラリーは、様々な方法で作成できる。要するに、測定可能な安定性パラメーターに基づく適当な蛋白質配列の相対的なランキングか又は好適な配列のリストのいずれかをもたらすことができる任意の方法を使用することができる。当業者であれば明らかなように、ここで説明する方法又は当該技術分野において知られているどのような方法も単独で又は他の方法と組み合わせて使用することができる。
【００８０】
一般に、ライブラリーを作成することができる様々な計算法がある。好ましい実施形態では、配列を基礎とした方法を使用する。或いは、構造を基礎とした方法、例えば、以下に詳述する蛋白質デザインオートメーション（ＰＤＡ）を使用する。
【００８１】
好ましい実施形態では、骨格蛋白質は酵素であり、しかも、非常に正確な静電モデルを酵素活性部位残基の採点のために使用して酵素活性部位ライブラリーを改善させることができる（Ｗａｒｓｈｅｌ，「Computer Modeling of Chemical Reactions in Enzymes and Solutions」，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ニューヨーク（１９９１）を参照。参照によって援用するものとする。）。これらの正確なモデルは、高い正確さで配列の相対エネルギーを評価することができるが、コンピュータに負担がかかる。
【００８２】
同様に、分子動力学的な計算を使用して、突然変異体配列の得点を個々に算出し、そして序列付きリストをコンパイルすることによってコンピュータによりスクリーニングすることができる。
【００８３】
好ましい実施形態では、残基ペアポテンシャルを使用して、コンピュータスクリーニング中に配列を採点することができる（Ｍｉｙａｚａｗａ外，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １８（３）：５３４−５５２（１９８５）（明示的に援用））。
【００８４】
好ましい実施形態では、配列プロファイルの得点（Ｂｏｗｉｅ外，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３（５０１６）：１６４−７０（１９９１）、参照により援用）及び／又は平均力ポテンシャル（Ｈｅｎｄｌｉｃｈ外，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１６（ｌ）：１６７−１８０（１９９０）、参照により援用）を算出して配列を採点することもできる。これらの方法は、所定の配列と３Ｄ蛋白質構造との突き合わせを評価するため、該蛋白質構造に対する忠実度をスクリーニングするように機能する。異なる採点機能を使用して配列を序列（ランク）付けすることにより、配列スペースの異なる領域をコンピュータスクリーニングでサンプリングすることができる。
【００８５】
さらに、採点機能を使用して、蛋白質中に金属又は補因子結合部位を創り出すであろう配列をスクリーニングすることができる（Ｈｅｌｌｉｎｇａ，Ｆｏｌｄ  Ｄｅｓ．３（ｌ）：Ｒｌ−８（１９９８）、参照によって援用するものとする。）。同様に、採点機能を使用して、蛋白質中にジスルフィド結合を創り出すであろう配列をスクリーニングすることができる。これらのポテンシャルは、新たな構造モチーフを導入するために蛋白質構造を特異的に修飾しようとする。
【００８６】
好ましい実施形態では、配列及び／又は構造アラインメントプログラムを使用してライブラリーを作成することができる。当該分野において知られているように、配列を基礎とする多数のアラインメントプログラムが存在する；例えば、スミス−ウォーターマン探索、ニードルマン−ブンシュ、ダブルアフィンスミス−ウォーターマン、フレーム探索、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ／ＧＣＧプロファイル探索、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ／ＧＣＧプロファイルスキャン、プロファイルフレーム探索、Ｂｕｃｈｅｒ一般化プロファイル、隠れマルコフモデル、Ｈフレーム、二重フレーム、ブラースト、Ｐｓｉ-ブラースト、Ｃｌｕｓｔａｌ及びＧｅｎｅＷｉｓｅが挙げられる。
【００８７】
配列のソースは、幅広く変更でき、且つ、限定されないがＳＣＯＰ（Ｈｕｂｂａｒｄ外，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  ２７（ｌ）：２５４−２５６（１９９９））；ＰＦＡＭ（Ｂａｔｅｍａｎ外，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  ２７（１）：２６０−２６２（１９９９））；ＶＡＳＴ（Ｇｉｂｒａｔ外，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ６（３）：３７７−３８５（１９９６））；ＣＡＴＨ（Ｏｒｅｎｇｏ外，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５（８）：１０９３−１１０８（１９９７））；ＰｈＤ  Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ（ワールドワイドウェブembl-heidelberg.de/predictprotein/predictprotein.html）；Ｐｒｏｓｉｔｅ（Ｈｏｆｍａｎｎ外，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  ２７（１）：２１５−２１９．（１９９９））；ＰＩＲ（ワールドワイドウェブmips.biochem.mpg.de/proj/protseqdb/）；ＧｅｎＢａｎｋ（ワールドワイドウェブncbi.nlm.nih.gov/）；ＰＤＢ（ワールドワイドウェブrcsb.org）及びＢＩＮＤ（Ｂａｄｅｒ外，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  ２９（１）：２４２−２４５（２００１））を含めた既知のデータベースのうちの一つ以上から配列を得ることを包含する。
【００８８】
さらに、これらのデータベースからの配列を連続分析又は遺伝子予測に付すことができる；Ｗｈｅｅｌｅｒ外，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  ２８（１）：１０−１４（２０００）並びにＢｕｒｇｅ及びＫａｒｌｉｎ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６８（ｌ）：７８−９４（１９９７）を参照されたい。
【００８９】
当該分野において知られているように、使用できる多数の配列アラインメント方法が存在する。例えば、配列相同性をベースとするアラインメント方法を使用して標的構造に関する蛋白質の配列アラインメントを作成ができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ外，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３（１９９０）、参照により援用）。次いで、これらの配列アラインメントを試験して、観測された配列のバリエーションを決定する。これらの配列バリエーションを作表して一次ライブラリーを定義する。さらに、以下でさらに概説するように、これらの方法を使用して二次ライブラリーを作成することもできる。
【００９０】
配列をベースとするアラインメントは、様々な方法で使用できる。例えば、関連のある多数の蛋白質を、当該分野において知られているように整列させることができ、そして「可変」及び「保存」残基 を定義する；即ち、ファミリーメンバー間で変化し又は同一性を保持する残基を定義することができる。これらの結果を使用して確率テーブルを作成することができる。或いは、許容配列バリエーションを使用して、コンピュータスクリーニング中にそれぞれの位置での考えられるアミノ酸を定義することができる。別のバリエーションは、該配列アラインメントで行ったアミノ酸についての得点にバイアスをかけ、それによって、これらのものがコンピュータスクリーニング中に見出されるが、ただしさらに他のアミノ酸を考慮することができる可能性を増大させることである。このバイアスは、一次ライブラリーに焦点を合わせることになろうが、ただし、検討材料から該アラインメントには見出されないアミノ酸を除去しないであろう。さらに、他のタイプの多数のバイアスを導入することができる。例えば、多様性を強制させることができる；即ち、「保存」残基を選択し、そしてこれをその蛋白質に多様化を強制させるように改変させ、その上でその配列スペースの大部分をサンプリングする。或いは、ファミリーメンバー間で変異性が高い部分（即ち、低い保存性）を、アミノ酸の全て又はサブセットを使用してランダム化できる。同様に、アウトライアー残基、即ち、位置のアウトライアー又は側鎖のアウトライアーのいずれかを除去することができる。
【００９１】
同様に、構造的に関連がある蛋白質の構造アラインメントを行って配列アラインメントを作成することができる。このような構造アラインメントプログラムが多数知られている。例えば、ＮＣＢＩからのＶＡＳＴ（ワールドワイドウェブncbi.nlm.nih.gov:80/StructureNAST/vast.shtml）；ＳＳＡＰ（Ｏｒｅｎｇｏ及びＴａｙｌｏｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２６６（６１７−６３５（１９９６））ＳＡＲＦ２（Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ９（９）：７２７−７３２（１９９６））ＣＥ（Ｓｈｉｎｄｙａｌｏｖ及びＢｏｕｒｎｅ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １１（９）：７３９−７４７（１９９８））；（Ｏｒｅｎｇｏ外，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ５（８）：１０９３−１０８（１９９７）；ＤａＩｉ（Ｈｏｌｍ外，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２６（ｌ）：３１６−９（１９９８）、これらの全てを参照により援用する）を参照されたい。次いで、これらの構造的に生成された配列アラインメントを試験して観測される配列バリエーションを決定することができる。
【００９２】
所定の実施形態では、ライブラリーは、配列から二次構造を予想し、次いでこの予想二次配列と適合性のある配列を選択することによって作成できる。スレッディング（Ｂｒｙａｎｔ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ５（２）：２３６−２４４（１９９５））、プロファイル３Ｄ（Ｂｏｗｉｅ外，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２６６（５９８−６１６（１９９６）；ＭＯＮＳＳＴＥＲ（Ｓｋｏｌｎｉｃｋ外，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６５（２）：２１７−２４１（１９９７）；ロゼッタ（Ｓｉｍｏｎｓ外，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ３７（Ｓ３）：１７１−１７６（１９９９）；ＰＳＩ−ブラースト（Ａｌｔｓｃｈｕｌ及びＫｏｏｎｉｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ２３（１１）：４４４−４４７（１９９８））；インパラ（Ｓｃｈａｆｆｅｒ外，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １５（１２）：１０００−１０１１（１９９９））；ＨＭＭＥＲ（ＭｃＣｌｕｒｅ外，Ｐｒｏｃ  Ｉｎｔ  Ｃｏｎｆ  Ｉｎｔｅｌｌ  Ｓｙｓｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４（１５５−１６４（１９９６））；Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ（ワールドワイドウェブebi.ac.uk/clustalw/）；ブラースト（Ａｌｔｓｃｈｕｌ外，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５（３）：４０３−４１０．（１９９０））、ヘリックス−コイル塩基置換理論（Ｍｕｎｏｚ及びＳｅｒｒａｎｏ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ  ４１：４９５，１９９７）、ナチュラルネットワーク、局所的構造アラインメントなど（例えば、Ｓｅｌｂｉｇ外，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １５：１０３９，１９９９参照）を含めて、多数の二次構造予測方法が存在するが、これらに限定されない。
【００９３】
同様に、上で概説したとおり、配列プロファイリング（Ｂｏｗｉｅ及びＥｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３（５０１６）：１６４−７０、（１９９１））、回転異性体ライブラリー選択法（Ｄａｈｉｙａｔ及びＭａｙｏ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ５（５）：８９５−９０３（１９９６）；Ｄａｈｉｙａｔ及びＭａｙｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８（５３３５）：８２−７（１９９７）；Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ及びＨａｎｄｅｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４：２００６−２０１８（１９９５）；Ｈａｒｂｕｒｙ外，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９２（１８）：８４０８−８４１２（１９９５）；Ｋｏｎｏ外，Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９：２４４−２５５（１９９４）；Ｈｅｌｌｉｎｇａ及びＲｉｃｈａｒｄｓ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９１：５８０３−５８０７（１９９４））；並びに残基ペアポテンシャル（Ｊｏｎｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３：５６７−５７４，（１９９４）；ＰＲＯＳＡ（Ｈｅｉｎｄｌｉｃｈ外，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１６：１６７−１８０（１９９０）；ＴＨＲＥＡＤＥＲ（Ｊｏｎｅｓ外，Ｎａｔｕｒｅ  ３５８：８６−８９（１９９２）並びに他の逆折り畳み方法、例えば、Ｓｉｍｏｎｓ外（Ｐｒｏｔｅｉｎ，３４：５３５−５４３，１９９９）、Ｌｅｖｉｔｔ及びＧｅｒｓｔｅｉｎ（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９５：５９１３−５９２０，１９９８）、Ｇｏｄｚｉｋ外，ＰＮＡＳ，Ｖ８９，ＰＰ１２０９８−１０２；Ｇｏｄｚｉｋ及びＳｋｏｌｎｉｃｋ（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８９：１２０９８−１０２，１９９２）、Ｇｏｄｚｉｋ外（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：２２７−３８，１９９２）に記載されたもの、並びに２プロファイル方法（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ外  ＰＮＡＳ  ８４：４３５５−４３５８（１９８７）、Ｆｉｓｃｈｅｒ及びＥｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．５：９４７−９５５（１９９６）、Ｒｉｃｅ及びＥｉｓｅｎｂｅｒｇ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６７：１０２６−１０３８（１９９７））を含めて、他の計算法も知られているが、これらに限定されない。これらの論文の全てを参照により明示的に援用するものとする。さらに、Ｋｏｅｈｌ及びＬｅｖｉｔｔ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：１１６１−１１８１（１９９９）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：１１８３−１１９３（１９９９）；参照により明示的に援用）に記載さるような他の計算法を使用して、改善された特性及び機能のための蛋白質配列ライブラリーを作成することができる。
【００９４】
さらに、ＳＣＭＦのような力場演算に基づく計算法（ＳＣＭＦにも同様に使用できる）が存在する。Ｄｅｌａｒｕｅ外，Ｐａｃ．Ｓｙｍｐ．Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ．１０９−２１（１９９７）、Ｋｏｅｈｌ外，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３９：２４９（１９９４）；Ｋｏｅｈｌ外，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．２：１６３（１９９５）；Ｋｏｅｈｌ外，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：２２２（１９９６）；Ｋｏｅｈｌ外，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２９３：１１８３（１９９９）；Ｋｏｅｈｌ外，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：１１６１（１９９９）；Ｌｅｅ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３６：９１８（１９９４）；及びＶａｓｑｕｅｚ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ  ３６：５３−７０（１９９５）を参照されたい；これらの全ては参照により明示的に援用するものとする。所定の計算法において配列のコンフォメーションを最適化するため又はここで概説したようにデノボ最適化配列を作製するために使用できる他の力場演算としては、ＯＰＬＳ−ＡＡ（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ外，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ（１９９６），ｖ１１８，ｐｐ．１１２２５−１１２３６；Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，Ｗ．Ｌ．；ＢＯＳＳ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１；エール大学：Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，Ｃｏｎｎ．（１９９９））；ＯＰＬＳ（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ外，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８８），ｖ１１０，ｐｐ．１６５７ｆｆ；Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ外，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９０），ｖ１１２，ｐｐ．４７６８ｆｆ）；ＵＮＲＥＳ（「Ｕｎｉｔｅｄ  Ｒｅｓｉｄｕｅ  Ｆｏｒｃｅｆｉｅｌｄ」；Ｌｉｗｏ外，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３），ｖ２，ｐｐｌ６９７−１７１４；Ｌｉｗｏ外，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３），ｖ２，ｐｐｌ７１５−１７３１；Ｌｉｗｏ外，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．（１９９７），ｖ１８，ｐｐ８４９−８７３；Ｌｉｗｏ外，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．（１９９７），ｖ１８，ｐｐ８７４−８８４；Ｌｉｗｏ外，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．（１９９８），ｖ１９，ｐｐ２５９−２７６；「蛋白質構造予測のための力場」（Ｌｉｗｏ外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９），ｖ９６，ｐｐ５４８２−５４８５）；ＥＣＥＰＰ／３（Ｌｉｗｏ外，Ｊ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ  １９９４  Ｍａｙ；１３（４）：３７５−８０）；ＡＭＢＥＲ１．１力場（Ｗｅｉｎｅｒ外，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．ｖ１０６，ｐｐ７６５−７８４）；ＡＭＢＥＲ  ３．０力場（Ｕ．Ｃ．Ｓｉｎｇｈ外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２：７５５−７５９）；ＣＨＡＲＭＭ及びＣＨＡＲＭＭ２２（Ｂｒｏｏｋｓ外，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．ｖ４，ｐｐ１８７−２１７）；ｃｖｆβ．Ｏ（Ｄａｕｂｅｒ−Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ外，（１９８８）  Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｖ４，ｐｐ３１−４７）；ｃｆｆＰｌ（Ｍａｐｌｅ外，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．ｖｌ５，１６２−１８２）が挙げられ；また、ＤＩＳＣＯＶＥＲ（ｃｖｆｆ及びｃｆｆ９１）及びＡＭＢＥＲ力場もＩＮＳＩＧＨＴ分子モデリングパッケージに使用され（Ｂｉｏｓｙｍ／ＭＳＩ，カリフォルニア州サンディエゴ）、ＨＡＲＭＭがＱＵＡＮＴＡ分子モデリングパッケージに使用されている（Ｂｉｏｓｙｍ／ＭＳＩ，カリフォルニア州サンディエゴ）がこれらに限定されない。これらの全ては参照により明示的に援用するものとする。
【００９５】
好ましい実施形態では、一次ライブラリーを作成するために使用される計算法は、米国特許第６，２６９，３１２号及び国際公開第９８／４７０８９号パンフレットに記載されるような蛋白質デザインオートメーション（ＰＤＡ）である。これらの両方は、参照によってここに明示的に援用するものとする。簡単に言うと、ＰＤＡは次のように説明できる。既知の蛋白質構造を出発点として使用する。次いで、最適化しようとする残基を同定するが、これは、これは全配列であってもそのサブセットであってもよい。続いて、改変されるべき任意の位置の側鎖を除去する。該蛋白質骨格及び残りの側鎖からなる得られた構造を鋳型と呼ぶ。次いで、それぞれの可変残基の位置を、好ましくはコア残基、表面残基又は境界残基と分類する；それぞれの分類は、この位置についての見込まれるアミノ酸残基のサブセットを定義する（例えば、コア残基は、一般に、疎水性残基のセットから選択され、表面残基は、一般に、親水性残基から選択され、境界残基はいずれでもよい）。それぞれのアミノ酸を、それぞれの側鎖の全ての可能な配座異性体（回転異性体と呼ばれる）の離散集合によって表すことができる。従って、所定の骨格について最適な配列に到達するためには、回転異性体の可能な全ての配列をスクリーニングしなければならず、この場合に、それぞれの骨格位置は、可能な全ての回転異性体状態にあるそれぞれのアミノ酸又はアミノ酸のサブセット、しかして回転異性体のサブセットが占めることができる。
【００９６】
次いで、二セットの相互作用をそれぞれの回転異性体について位置毎に算出する：回転異性体の側鎖と骨格の全て又は一部との相互作用（「シングルス」エネルギー。回転異性体／鋳型エネルギー又は回転異性体／骨格エネルギーともいう。）及び回転異性体の側鎖と他の全ての位置又は他の位置のサブセット毎の他の全ての可能な回転異性体との相互作用（「ダブルス」エネルギー。回転異性体／回転異性体エネルギーともいう）。これらの相互作用のそれぞれのエネルギーを様々な採点機能を使用することによって算出するが、これには、ファン・デル・ワールス力のエネルギー、水素結合のエネルギー、二次構造傾向性のエネルギー、表面積溶媒和のエネルギー及び静電エネルギーが含まれる。従って、骨格及び他の回転異性体の両方との各回転異性体相互作用の全エネルギーを算出し、そして行列形式で保存する。
【００９７】
回転異性体セットの離散的性質は、試験すべき回転異性体配列の数の簡単な推定を可能にする。位置当たりｍ個の見込まれる回転異性体を有する長さｎの骨格は、ｍn個の見込まれる回転異性体配列を有するであろうが、これは、配列の長さと共に指数関数的に増え、そしてリアルタイムで算出するのを非現実的にするか又は不可能にする数である。従って、このコンビナトリアル探索の問題を解決するためには、「Ｄead End Elimination」（ＤＥＥ）計算法を実行する。このＤＥＥ計算は、第１異性体の最悪の全相互作用が第２回転異性体の最良の全相互作用よりもなお良好であるならば、該第２回転異性体は大域的最適解の一部であることができないという事実に基づくものである。全ての回転異性体のエネルギーは既に算出されているので、このＤＥＥ手法は、回転異性体を試験し且つ削除するために配列の長さにわたる和しか必要とせず、計算を大幅にスピードアップする。ＤＥＥは、回転異性体のペア又は回転異性体の組み合わせを比較して再実行できるが、これは、最終的に大域的最適エネルギーを示す単一配列の決定に至るであろう。
【００９８】
大域的解が見出されたら、モンテカルロ探索を実行してＤＥＥ解の近辺にある配列の序列付きリストを作成することができる。ＤＥＥ解で始めて、ランダムな位置を他の回転異性体に変更し、そして新たな配列エネルギーを計算する。この新たな配列が容認基準を満たしている場合には、これを別のジャンプのための出発点として使用する。所定数のジャンプの後、配列の序列付きリストを作成する。モンテカルロ探索は、大域的最小点の周囲の配列スペースを探索したり、又は配列スペース内において隔たった新規な極小点を発見するためのサンプリング技術である。以下でさらに概説するように、ボルツマンサンプリング、遺伝学的アルゴリズム技術及びシミュレーテッドアニーリングを含め、使用できる他のサンプリング技術が存在する。さらに、全てのサンプリング技術について、可能なジャンプの種類を変更することができる（例えば、ランダムジャンプをランダムランダム残基に、バイアスジャンプ（を例えば野生型に又は野生型から遠ざける）、ジャンプをバイアス残基に（例えば、同様の残基に又は同様の残基から遠ざける）など）。同様に、全てのサンプリング技術について、サンプリングジャンプが受け入れられるかどうかの許容基準を変更することができる。
【００９９】
米国特許第６，２６９，３１２号に概説されるように、蛋白質骨格（（天然型蛋白質について）窒素、カルボニル炭素、α−炭素及びカルボニル酸素を、α−炭素からβ−炭素へのベクトル方向で含む）を、コンピュータ分析の前に、スーパー二次構造パラメーターと呼ばれる一連のパラメーターを変化させることによって変更することができる。
【０１００】
蛋白質構造の骨格を作成し（上で概説したように変更を行って）、そしてコンピュータにインプットしたら、明示的水素を該構造内に含まれていない場合に付加する（例えば、該構造がＸ線結晶学によって作成された場合には、複数の水素を付加しなければならない）。水素の付加後に、該構造のエネルギー最小化を実施して、水素並びに他の原子、結合角及び結合の長さを緩める。好ましい実施形態では、これを、原子座標位置の多数の共役勾配最小化ステップを行うことによって実行（Ｍａｙｏ外，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．９４：８８９７（１９９０））して、静電気を有しない Dreiding Force Field を最小化する。一般に、約１０〜約２５０ステップが好ましく、約５０ステップが最も好ましい。
【０１０１】
蛋白質の骨格構造は、少なくとも１個の可変残基位置を含有する。当該分野において知られているように、蛋白質の残基又はアミノ酸は、一般に、蛋白質のＮ末端から始めて連続的に番号付けされている。従って、そのＮ末端にメチオニンを有する蛋白質は、残基又はアミノ酸位置１にメチオニンを有すると言われており、次の残基は２、３、４などと呼ばれている。それぞれの位置で、野生型（即ち天然型）の蛋白質は、あらゆる回転異性体において、少なくとも２０種のアミノ酸のうちの１種を有することができる。ここで、「可変残基位置」とは、デザインされる蛋白質のアミノ酸の位置であって、特定の残基又は回転異性体、一般に、野生型残基又は野生型回転異性体として該デザイン方法では固定されないものを意味する。
【０１０２】
好ましい実施形態では、蛋白質の残基位置の全てが変更できる。即ち、全てのアミノ酸側鎖を本発明の方法で変更できる。これは、特に、より小さな蛋白質にとって望ましいが、この方法は、さらに大きな蛋白質のデザインも同様に可能にする。この方法でデザインできる蛋白質の長さに理論的な制限はないが、実際にはコンピュータ上の制限がある。
【０１０３】
別の好ましい実施形態では、蛋白質の残基位置のほんの一部を変更することができ、そして残りを「固定」する。即ち、これらは、固定されたコンフォメーションにあるときに、その三次元構造で同定される。いくつかの実施形態では、固定位置は、その元のコンフォメーションの状態のままである（これは、使用される回転異性体ライブラリーの特定の回転異性体に相関があってもなくてもよい）。或いは、残基は非野生型残基として固定できる；例えば、既知の部位特異的突然変異誘発技術によって特定の残基が望ましい（例えば、蛋白質分解部位を削除するため又は酵素の基質特異性を改変させるために）ことが示された場合に、該残基は、特定のアミノ酸として固定できる。或いは、本発明の方法は、以下で議論するように、新たな突然変異を評価するために使用できる。別の好ましい実施形態では、固定位置を「浮動」させることができる；この位置でアミノ酸を固定するが、該アミノ酸の異なる回転異性体を試験する。この実施形態では、この可変残基は、少なくとも１個であることができ、又は該残基の総数の０．１％〜９９．９％のどこであってもよい。従って、例えば、数個（又は１個）の残基のみを変更することや該残基のほとんどを変更することも可能であり、その中間の全てが可能である。
【０１０４】
好ましい実施形態では、固定できる残基としては、構造的又は生物学的機能を有する残基が挙げられるが、これらに限定されない。或いは、生物学的機能を有する残基は、特に固定しなくてもよい。例えば、生物活性のために重要であることが知られている残基、例えば、酵素の活性部位、酵素の基質結合部位、結合相手に対する結合部位（リガンド／受容体、抗原／抗体など）、生物学的機能に極めて重要な燐酸化若しくはグリコシル化部位を形成する残基、又は構造的に重要な残基、例えば、ジスルフィド架橋、金属結合部位、重要な水素結合残基、プロリン若しくはグリシンのような骨格コンフォメーションに重要な残基、詰め込み相互作用に重要な残基などを全てコンフォメーションに又は単一の回転異性体として固定してもよいし、「浮動」させてもよい。
【０１０５】
同様に、可変残基として選択できる残基は、望ましくない生物学的特質、例えば、蛋白質分解に対する感受性、二量体化部位又は集合部位、免疫応答に至り得るグリコシル化部位、不必要な結合活性、不必要なアロステリック効果、望ましくない酵素活性（ただし、結合は保存されている）などを与えるものであることができる。
【０１０６】
好ましい実施形態では、それぞれの可変位置は、コア残基位置か、表面残基位置か、境界残基位置かのいずれかとして分類されるが、場合によっては、以下で説明するように、該可変位置をグリシンに設定して骨格の歪みを最小化させることができる。さらに、ここで概説した通り、残基を分類する必要はなく、これらのものは変数として選択でき、そして任意のアミノ酸を使用することができる。コア位置、表面位置及び境界位置の任意の組み合わせを使用できる：コア残基、表面残基及び境界残基；コア残基及び表面残基；コア残基と境界残基及び表面残基と境界残基並びにコア残基単独、表面残基単独又は境界残基単独。
【０１０７】
コア、表面又は境界としての残基位置の分類は、当業者にはは明らかなように、いくつかの方法で行うことができる。好ましい実施形態では、該分類は、側鎖を含めた元の蛋白質骨格構造の視覚的走査によって及び蛋白質モデリングの技術分野において通常の知識を有する者の個人的な評価に基づく分類の割り当てによって行われる。或いは、好ましい実施形態は、米国特許第６，２６９，３１２号及び国際公開第９８／４７０８９号に概説されるように、鋳型Ｃα原子のみを使用して計算された、溶媒接触可能表面に対するＣα−Ｃβベクトル方向の評価を利用する。或いは、表面積計算を行うことができる。
【０１０８】
それぞれの可変位置をコア、表面又は境界のいずれかとして分類したら、一連のアミノ酸側鎖、しかして一連の回転異性体をそれぞれの位置に割り当てる。即ち、プログラムによって任意の特定位置で認識されることを可能にする適当なアミノ酸側鎖のセットを選択する。その後、適当なアミノ酸側鎖を選択したら、特定の位置で評価されることになる回転異性体のセットを決定することができる。従って、コア残基は、一般に、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン及びメチオニンよりなる疎水性残基の群から選択され（いくつかの実施形態では、ファン・デル・ワールス採点機能の倍率が、以下に説明するように低い場合には、メチオニンをこのセットから除去する）、また、それぞれのコア位置についての回転異性体セットは、これら８種のアミノ酸側鎖についての回転異性体を含むかもしれない（骨格に依存しないライブラリーを使用する場合には回転異性体の全て及び回転異性体に依存する骨格を使用する場合にはサブセット）。同様に、表面位置は、アラニン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リシン及びヒスチジンよりなる親水性残基の群から一般に選択される。そのため、それぞれの表面位置についての回転異性体セットは、これら１０残基についての回転異性体を包含する。最後に、境界位置は、一般に、アラニン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リシン、ヒスチジン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン及びメチオニンから選択される。そのため、それぞれの境界位置についての回転異性体セットは、場合によっては、これら１７残基についての回転異性体の全てを包含するかもしれない（システイン、グリシン及びプロリンを使用しないと仮定した場合。とはいえ、これらのものは存在し得る。）。さらに、いくつかの好ましい実施形態では、１８種の天然型アミノ酸（全て、システイン及びプロリンを除くものとする。これらは特に破壊的であることが知られている。）を使用する。
【０１０９】
従って、当業者であれば明らかなように、該残基位置を分類することにはコンピュータ上の利益がある。これは、計算数を減少させるからである。また、コア残基、境界残基及び表面残基を上記のものから変更する状況もあり得ることにも留意すべきである；例えば、ある状況下では、１種以上のアミノ酸を加えるか、又は可能なアミノ酸のセットから取り去る。例えば、二量体化若しくは多量体化する又はリガンド結合部位を有するいくつかの蛋白質は、疎水性表面残基などを含むことができる。さらに、ヘリックスを「キャッピング」させない又はα−ヘリックス双極子との好都合な相互作用を可能にしない残基を、可能な残基のセットから取り去ることができる。このアミノ酸基の改変は、残基上で残基に基づき行う。
【０１１０】
好ましい実施形態では、プロリン、システイン及びグリシンは、可能なアミノ酸側鎖のリストには含まれないため、これらの側鎖についての回転異性体は使用されない。しかしながら、好ましい実施形態では、該可変残基位置が０°を超えるφ角（即ち、（１）先のアミノ酸のカルボニル炭素；（２）現在の残基の窒素原子；（３）現在の残基のα−炭素；及び（４）現在の残基のカルボニル炭素によって決まる二面角）を有する場合に、この位置をグリシンに設定して骨格の歪みを最小化させる。
【０１１１】
見込まれる回転異性体の群をそれぞれの可変残基位置に対して割り当てたら、米国特許第６，２６９，３１２号及び国際公開第９８／４７０８９号に概説されるように処理を続行する。この処理ステップは、回転異性体同士の相互作用及び回転異性体と蛋白質骨格との相互作用を分析して最適化された蛋白質配列を作成することを必然的に伴う。非常に簡単にいうと、この処理は、始めに、骨格自体又は他の回転異性体に対する当該回転異性体の相互作用エネルギーを計算するための多数の採点機能を使用することを含む。好ましいＰＤＡ採点機能としては、ファン・デル・ワールスポテンシャル採点機能、水素結合ポテンシャル採点機能、原子溶媒和採点機能、二次構造傾向性採点機能及び静電気採点機能が挙げられるが、これらに限定されない。以下でさらに説明するように、少なくとも１種の採点機能を使用してそれぞれの位置を採点するが、該採点機能は、位置分類又はα−ヘリックス双極子との有利な相互作用のような他の考慮事項に応じて異なってもよい。以下で概説するように、これらの計算において使用される全エネルギーは、特定の位置で使用される各採点機能のエネルギーの和であり、一般に、式１:
Ｅtotal＝ｎＥvdw＋ｎＥas＋ｎＥh−結合＋ｎＥss＋ｎＥelec     式 1
で示される。
【０１１２】
式１において、全エネルギーは、ファン・デル・ワールスポテンシャルエネルギー（ＥVdw）、原子溶媒和エネルギー（Ｅas）、水素結合エネルギー（Ｅh−結合）、二次構造エネルギー（Ｅss）及び静電相互作用エネルギー（Ｅelec）の和である。用語ｎは、該用語が特定の残基位置について考慮されるべきかどうかに依存して、０又は１である。
【０１１３】
米国特許第６，２６９，３１２号及び国際公開第９８／４７０８９号に概説されるように、これらの採点機能単独又は二種以上の任意の組み合わせを使用することができる。使用すべき採点機能をそれぞれの可変位置について特定したら、このコンピュータ分析における好ましい第１ステップは、それぞれの回転異性体と該蛋白質の残余の全て又は一部との相互作用を決定することを含む。即ち、それぞれの可変残基位置における適当な各特定回転異性体と骨格又は他の回転異性体との相互作用エネルギー（該採点機能の一つ以上で測定される）を計算する。好ましい実施形態では、各回転異性体と該蛋白質の残余全部、即ち全ての鋳型と全ての他の回転異性体との相互作用を行う。しかしながら、上で概説したとおり、蛋白質の一部分、例えば、より大きな蛋白質のドメインのみの原型を作ることも可能であるため、場合によっては、該蛋白質の全てを考慮する必要はない。ある蛋白質に関してここで使用するときに、用語「部分」とは、この蛋白質のフラグメントをいう。このフラグメントは、サイズが１０アミノ酸残基〜全アミノ酸配列マイナス１個のアミノ酸を範囲とする。従って、本明細書において、ある核酸に関して使用するときに、用語「部分」とは、この核酸のフラグメントをいう。このフラグメントは、サイズが１０ヌクレオチド〜全核酸配列−１個のヌクレオチドを範囲とする。
【０１１４】
好ましい実施形態では、コンピュータ処理の第１ステップは、各回転異性体について位置毎に２セットの相互作用：回転異性体の側鎖と鋳型又は骨格との相互作用（「シングルス」エネルギー）及び回転異性体の側鎖と他の全ての可能な回転異性体との他の位置毎での相互作用（「ダブルス」エネルギー）を、該位置が変更されるか又は浮動されるかにかかわらず計算することによって行う。該骨格は、この場合には、蛋白質構造骨格の原子並びに任意の固定残基の原子を含み、ここで、この固定残基は、所定のアミノ酸の特定のコンフォメーションと定義されることを理解すべきである。
【０１１５】
従って、「シングルス」（回転異性体／鋳型）エネルギーは、可変残基位置毎の全ての可能な回転異性体と骨格との相互作用について、該採点機能のいくつか又は全てを使用して計算される。従って、水素結合採点機能については、回転異性体の全ての水素結合原子及び骨格の全ての水素結合原子を評価し、ＥHBを、それぞれの予想回転異性体について可変位置毎に計算する。同様に、ファン・デル・ワールス採点機能については、回転異性体の全ての原子を鋳型の全ての原子と比較し（一般に、その自身の残基の骨格原子を除く）、そしてＥVdw を、それぞれの予想回転異性体について可変残基位置毎に計算する。さらに、一般に、該原子が３つ以下の結合によって結合している場合には、ファン・デル・ワールスエネルギーは計算しない。原子溶媒和採点機能については、回転異性体の表面積を鋳型の表面積に対して測定し、そして、それぞれの可能回転異性体について全可変残基位置毎にＥaSを計算する。また、二次構造傾向性採点機能は、シングルスエネルギーともみなされるため、全シングルスエネルギーはＥss項を含むことができる。当業者であれば明らかなように、これらのエネルギー項の多くは、回転異性体と鋳型位置との間の物理的距離によってはゼロに近い；即ち、この２つの部分が離れるほど、エネルギーは小さい。
【０１１６】
「ダブルス」エネルギー（回転異性体／回転異性体）の計算については、予想される各回転異性体の相互作用エネルギーを、全ての他の可変残基位置での予想される全ての回転異性体と比較する。従って、「ダブルス」エネルギーは、可変残基位置毎の予想される全ての回転異性体と、他の可変残基位置毎の予想される全ての回転異性体との相互作用について該採点機能のいくつか又は全てを使用して計算される。そのため、水素結合採点機能については、第１回転異性体の全ての水素結合原子と、予想される全ての第２回転異性体の全ての水素結合原子とが評価され、そしてＥHBは、任意の２つの可変部位に対する各予想回転異性体ペアに対して計算される。同様に、ファン・デル・ワールス採点機能については、第１回転異性体の全ての原子と、予想される全ての第２回転異性体の全ての原子とを比較し、そしてＥVdWを、予想される各回転異性体ペアについて２つの可変残基位置毎に計算する。原子溶媒和採点機能については、第１回転異性体の表面積を、予想される全ての第２回転異性体の表面に対して測定し、そして、予想される各回転異性体ペアについて２つの可変残基位置毎にＥ3Sを計算する。二次構造傾向性採点機能を「ダブルス」エネルギーとして実行する必要はない。これは、「シングルス」エネルギーの構成要素とみなされるからである。当業者であれば明らかなように、これらのダブルスエネルギー項の多くは、第１回転異性体と第２回転異性体との物理的距離によっては、ゼロに近い；即ち、これら２つの部分が離れていれば、エネルギーも低い。
【０１１７】
さらに、当業者であれば明らかなように、以下のものを含めて、ＰＣＡで使用できる様々な力場が使用できる：Ｄｒｅｉｄｉｎｇ  Ｉ及びＤｒｅｉｄｉｎｇ  II（Ｍａｙｏ外，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．９４８８９７（１９９０））、ＡＭＢＥＲ（Ｗｅｉｎｅｒ外，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：７６５（１９８４）及びＷｅｉｎｅｒ外，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．１０６：２３０（１９８６））、ＭＭ２（Ａｌｌｉｎｇｅｒ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９９：８１２７（１９７７）、Ｌｉｌｊｅｆｏｒｓ外，Ｊ．Ｃｏｒｎ．Ｃｈｅｍ．８：１０５１（１９８７））；ＭＭＰ２（Ｓｐｒａｇｕｅ外，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．８：５８１（１９８７））；ＣＨＡＲＭＭ（Ｂｒｏｏｋｓ外，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．１０６：１８７（１９８３））；ＧＲＯＭＯＳ；及びＭＭ３（Ａｌｌｉｎｇｅｒ外，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：８５５１（１９８９））、ＯＰＬＳ−Ｍ（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ外，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９６），ｖ１１８，ｐｐ１１２２５−１１２３６；Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，Ｗ．Ｌ．；ＢＯＳＳ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１；エール大学：Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，Ｃｏｎｎ．（１９９９））；ＯＰＬＳ（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，外，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８８），ｖ１１０，ｐｐ１６５７ｆｆ；Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ外，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９０），ｖ１１２，ｐｐ４７６８ｆｆ）；ＵＮＲＥＳ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｒｅｓｉｄｕｅ  ＦｏｒｃｅＦｉｅｌｄ；Ｌｉｗｏ外，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）、ｖ２，ｐｐｌ６９７−１７１４；Ｌｉｗｏ外，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）、ｖ２，ｐｐｌ７１５−１７３１；Ｌｉｗｏ外，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．（１９９７），ｖ１８，ｐｐ８４９−８７３；Ｌｉｗｏ外，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．（１９９７），ｖ１８，ｐｐ８７４−８８４；Ｌｉｗｏ外，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．（１９９８），ｖ１９，ｐｐ２５９−２７６；蛋白質構造予測のための力場（Ｌｉｗｏ外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９），ｖ９６，ｐｐ５４８２−５４８５）；ＥＣＥＰＰ／３（Ｌｉｗｏ外，Ｊ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ  １９９４  Ｍａｙ；１３（４）：３７５−３８０）；ＡＭＢＥＲ  １．１力場（Ｗｅｉｎｅｒ外，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．ｖｌ０６，ｐｐ７６５−７８４）；ＡＭＢＥＲ  ３．０力場（Ｕ．Ｃ．Ｓｉｎｇｈ外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２：７５５−７５９）；ＣＨＡＲＭＭ及びＣＨＡＲＭＭ２２（Ｂｒｏｏｋｓ外，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．ｖ４，ｐｐ１８７−２１７）；ｃｖｆｆ３．０（Ｄａｕｂｅｒ−Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ外，（１９８８）Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｖ４，ｐｐ３１−４７）；ｃｆｆ９１（Ｍａｐｌｅ外，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．ｖｌ５，１６２−１８２）；また、ＤＩＳＣＯＶＥＲ（ｃｖｆｆ及びｃｆｆ９１）と、ＡＭＢＥＲ力場がＩＮＳＩＧＨＴ分子モデリングパッケージ（Ｂｉｏｓｙｍ／ＭＳＩ，カリフォルニア州サンディエゴ）で使用されており、、ＨＡＲＭＭがＱＵＡＮＴＡ分子モデリングパッケージ（Ｂｉｏｓｙｍ���ＭＳＩ，カリフォルニア州サンディエゴ）で使用されている。これらの全ては、参照によって明示的に援用するものとする。
【０１１８】
シングルスエネルギー及びダブルスエネルギーを計算し保存したら、次のコンピュータ処理ステップを行うことができる。米国特許第６，２６９，３１２号及び国際公開第９８／４７０８９号に概説されるように、好ましい実施形態は、「Ｄｅａｄ  Ｅｎｄ  Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ」（ＤＥＥ）ステップ、好ましくはモンテカルロステップを利用する。
【０１１９】
ＰＤＡは、概観すると、出力を改変させるように変更できる３種の構成要素を有する（例えばライブラリー）：この処理で使用される採点機能；フィルタリング技術及びサンプリング技術。
【０１２０】
好ましい実施形態では、採点機能を変更することができる。好ましい実施形態では、上で概説した採点機能に様々な方法でバイアスをかけたり重みをかけたりすることができる。例えば、基準配列若しくは配列のファミリーに向かうバイアス又はそれらから離れるバイアスを実行できる；例えば、野生型残基又はホモログ残基の方に向かうバイアスを使用できる。同様に、その蛋白質全体又はフラグメントにバイアスをかけることができる；例えば、活性部位に野生型残基の方に向けてバイアスをかけることができ、又はドメイン残基を特定の所望の物性に向けたバイアスを行うことができる。さらに、エネルギーの増加に向かう又はそれに対するバイアスを生じさせることができる。追加の採点機能のバイアスとしては、静電ポテンシャル勾配若しくは疎水性勾配を適用すること、該計算に基質若しくは結合の相手を加えること又は所望の荷電又は疎水性に向けてバイアスをかけることが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２１】
さらに、他の実施形態では、使用できる様々な追加の採点機能が存在する。追加の採点機能としては、ねじれポテンシャル若しくは残基ペアポテンシャル又は残基エントロピーポテンシャルが挙げられるが、これらに限定されない。このような追加の採点機能は、単独で使用でき、又は最初に採点した後のライブラリーを処理するための機能として使用できる。例えば、ペプチドのＭＨＣ（主要組織適合複合体）への結合に基づくデータから得られる様々な機能を使用して、場合によってはＭＨＣに結合できる配列、即ち場合によっては免疫原性の配列を含有する蛋白質を除去するためにライブラリーを再度採点することができる。
【０１２２】
好ましい実施形態では、ＤＥＥ及びその関連する対応部分（これらに限定されない）を含めて、様々なフィルタリング技術を行うことができる。追加のフィルタリング技術としては、最適な配列を見出すための分岐限界法（Ｇｏｒｄｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｊｏ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｆｏｌｄ．Ｄｅｓ．７：１０８９−９８，１９９９）及び配列の網羅的列挙が挙げられるが、これらに限定されない。しかしながら、いくつかの技術は、どのようなフィルタリング技術も使用することなく行うこともできることに留意すべきである；例えば、サンプリング技術を、フィルタリングの存在なしに使用して良好な配列を見出すことができる。
【０１２３】
当業者であれば明らかなように、最適化された配列又は一連の配列を作成したら（あるいはまた、これらを最適化又は順序づけする必要はない）、様々な配列スペースサンプリング方法を、好ましいモンテカルロ方法に加えて又はモンテカルロ探索の代わりに行うことができる。即ち、いったん配列又は一連の配列が作成されると、この好ましい方法は、サンプリング技術を利用して試験用の追加の関連する配列を作成することを可能にする。
【０１２４】
これらのサンプリング方法は、アミノ酸の置換、挿入若しくは欠失又は１個以上の配列の組換えの使用を包含することができる。ここで概説した通り、好ましい実施形態は、一連のバイアスをかけた、系統的な又はランダムなジャンプであるモンテカルロ探索を利用する。しかしながら、ボルツマンサンプリング、遺伝学的アルゴリズム技術及びシミュレーテッドアニーリングを含めて、使用できる他のサンプリング技術が存在する。さらに、全てのサンプリング技術について、可能なジャンプの種類を変更することができる（例えば、ランダムジャンプからランダム残基、バイアスをかけたジャンプ（例えば、野生型の方に又は野生型から離れて）、ジャンプからバイアス残基（例えば、同様の残基の方に又は同様の残基から離れて）など）。多数の残基位置を結合させる場合のジャンプ（２個の残基は、常に共に変化し、又は決して共に変化しない）、全ての残基が他の配列に変化する場合のジャンプ（例えば、組換え）がある。同様に、全てのサンプリング技術について、サンプリングジャンプが許容されるかどうかの許容基準を変更して、高温での広い探索及び低温で局所最適に近い狭い探索を可能にすることができる。Ｍｅｔｒｏｐｏｌｉｓ外，Ｊ．Ｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓ  ｖ２１，ｐｐ１０８７，１９５３を参照されたい。これは参照によって援用するものとする。
【０１２５】
好ましい実施形態では、特に、長い蛋白質又は長いサンプルが望まれる蛋白質については、ライブラリー配列を使用してそのメンバー配列をコードするＤＮＡのような核酸を作製し、続いて、所望ならば、これを宿主細胞にクローン化し、発現させ、そしてアッセイすることができる。従って、以下で説明する方法を使用して、それぞれのメンバー蛋白質配列をコードする核酸、特にＤＮＡを作製することができる。コドン、好適な発現ベクター及び好適な宿主細胞の選択は、多数の因子によって変化し、且つ、必要に応じて容易に最適化できる。
【０１２６】
４．ポリヌクレオチドの構築 
ここで説明する理論的多様性ライブラリーは、任意の所望のポリヌクレオチドを比較的安価に、迅速で且つ高い忠実度で本質的に構築することを可能にする、当業者であればここでの開示に基づいて利用可能な様々な方法によって作製できる。例えば、一実施形態では、多様性ライブラリーは、例えば、重複した相補オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションをベースとしたオリゴヌクレオチド構築によって構成できる（例えば、Ｚｈｏｕ外，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３２：５４０９−５４１７（２００４）；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ外，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３２：５０１１−５０１８（２００４）；Ｔｉａｎ外  Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１０５０−１０５４（２００４）；及びＣａｒｒ外，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３２：ｅｌ６２（２００４））を参照されたい。例えば、相補的な重複配列を有するオリゴヌクレオチドをチップ上で合成し、次いで流出させることができる。続いて、このオリゴヌクレオチドは、相補的な領域のハイブリダイゼーションに基づいて自己構築する。この技術は、忠実度の高いＤＮＡの長い分子を生じさせるのを可能にする。
【０１２７】
他の実施形態では、理論的多様性ライブラリーは、ＰＣＲをベースとする構築方法（ＰＡＭ又はポリメラーゼ構築多重化を含む）及び連結反応をベースとする構築方法（例えば、付着末端又は平滑末端を有する核酸セグメントの連結）を使用して作製できる。代表的な実施形態では、理論的多様性ライブラリーの全て又は一部分を形成する複数のポリヌクレオチド構築物は、単一の反応混合物中で構築できる。ここで説明する、核酸プールを伴う組成物及び方法は、支持体に結合した核酸と結合していない核酸の両方並びにそれらの組み合わせを包含することを意味することを理解すべきである。
【０１２８】
構築（アセンブリ）ＰＣＲを実行するための方法は、、例えば、Ｋｏｄｕｍａｌ外（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｔ  Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１５５７３；Ｓｔｅｍｍｅｒ外（１９９５）Ｇｅｎｅ １６４：４９；Ｄｉｌｌｏｎ外（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２９８；Ｈａｙａｓｈｉ外（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１７：３１０；Ｃｈｅｎ外（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：８７９９；Ｐｒｏｄｒｏｍｏｕ外（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．５：８２７；米国特許第５，９２８，９０５号及び５，８３４，２５２号；並びに米国特許出願公開第２００３／００６８６４３号及び２００３／０１８６２２６号に記載されている。
【０１２９】
代表的な実施形態では、ポリメラーゼ構築多重化（ＰＡＭ）を使用してここで説明する理論的多様性ライブラリーを作製することができる（例えば、Ｔｉａｎ外（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１０５０；Ｚｈｏｕ外（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：５４０９；及びＲｉｃｈｍｏｎｄ外（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：５０１１）を参照されたい。ポリメラーゼ構築多重化は、重複オリゴヌクレオチドのセット及び／又は増幅プライマーを、配列特異的ハイブリダイゼーション及びハイブリダイズ用ストランドを鋳型として使用したポリメラーゼによる鎖延長に有利な条件下で混合させることを伴う。この二本鎖延長産物を、随意に変性させ、そして所望のポリヌクレオチド構成物が合成されるまでさらなる構築ラウンドにわたり使用する。
【０１３０】
所定の実施形態では、理論的多様性ライブラリーの１種以上の構成要素は、形成したいポリヌクレオチド構成物の配列を部分的に又は完全に含む相補的な重複領域を有する複数の短鎖オリゴヌクレオチドを一緒に混合することによって構築できる。例えば、図１Ｂ及び１Ｃに示すように、該短鎖オリゴヌクレオチドは、鎖延長又は鎖延長と連結反応の組み合わせを使用してポリヌクレオチド構成物に構築される部分的に二本鎖の核酸を形成させて該短鎖オリゴヌクレオチド間に残されたギャップを埋めることができる。或いは、図１Ａに示されるように、該短鎖オリゴヌクレオチドは、構築時にこれらが互いに隣接し且つポリヌクレオチド構成物を形成するために該短鎖オリゴヌクレオチド間の連結反応しか必要としない該産物を形成するようにデザインできる（例えば、該構築プロセス中に該短鎖オリゴヌクレオチド間にあるギャップを埋める必要はない）。
【０１３１】
一実施形態では、理論的多様性ライブラリーの構築に好適なポリヌクレオチドは、例えば、任意の所望の配列及び不定の長さのＤＮＡ又は他の核酸分子を直接作製するための核酸アレイを使用して作製できる。所望の核酸分子の部分又はセグメントは、例えば、アレイ合成装置を使用した平行核酸合成プロセスによって、アレイ上で作製される。該セグメントの合成後に、該セグメントを組み立てて所望の分子を作る。基本的に、この技術は、どのような目的であっても、単純且つ迅速な合成プロセスで迅速で容易且つ直接的な核酸分子合成を可能にする。
【０１３２】
比較的単純なＤＮＡ分子の直接作製に関する実例を図１に記載する。図２において、１０で、既知の配列の二本鎖ＤＮＡ分子を示している。この分子は、図２Ａではよく見掛ける二重らせん形状で、並びに図２Ｂではねじれていない二本鎖直線形状で示されている。これを例示する目的として、該ＤＮＡ分子が、図２Ｃの符号１２〜１９によって示される、重複した小さな一連の一本鎖ＤＮＡセグメントに分割されたと仮定してほしい。偶数番号のセグメントは該ＤＮＡ分子ののうち一方のストランド上にあるが、奇数番号のセグメントは、該ＤＮＡ分子の反対の相補ストランドをなしている。この一本鎖分子セグメントは、任意の適当な長さのものであることができるが、この例の目的上、全て、１００塩基対の長さであってよい同一の長さのものであることが便利である。図２ＡのＤＮＡ分子１０の配列は既知のため、この小さなＤＮＡセグメント１２〜１９の配列は、それよりも大きな配列をそれぞれ例えば７５〜１００塩基対の重複配列に単純に切断することによって規定できる。
【０１３３】
次いで、セグメント１２〜１９の配列についての情報を使用して、完全に作製された新たなＤＮＡ分子を構成する。この方法は、共通の基材上で一本鎖ＤＮＡセグメントのマイクロアレイを構成することによって開始される。この方法を図３に示す。該一本鎖セグメント１２〜１９のそれぞれを、２０で示されるＤＮＡマイクロアレイの単一のセル又は機構中で構築する。該ＤＮＡセグメントのそれぞれは、符号２２〜２９によって示される対応する機構中においてその場で作製される。このようなマイクロアレイは、好ましくは、例えば、国際公開９９／４２８１３号パンフレット及び対応米国特許第６，３７５，９０３（これらのそれぞれの開示は、参照により援用するものとする）に記載されたタイプのマスクレスアレイ合成器（ＭＡＳ）を使用して構築される。アレイにおけるこれらの機構のそれぞれが所望の配列の一本鎖ＤＮＡ分子を有する慣用型ＤＮＡマイクロアレイを製造することができるマスクレス装置の他の例が知られている。この好ましいタイプの装置は、米国特許第６，３７５，９０３号の図５に示された、反射光学系の使用に基づくタイプのものである。これは、一本鎖ＤＮＡセグメントのＤＮＡ配列の選択が完全にソフトウェア制御下にあるという点で、このタイプのマスクレスアレイ合成器の望ましい有用な利点である。このマイクロアレイ合成の全プロセスは僅か数時間で達成でき、しかも、好適なソフトウェアによって所望のＤＮＡ配列を自由自在に改変することが可能であるため、この部類の装置は、１個の装置で毎日又はさらに一日当たり複数回、異なる配列のＤＮＡセグメントを含むマイクロアレイを製造することを可能にする。また、このマイクロアレイにおけるＤＮＡセグメントのＤＮＡ配列の相違は、僅かであっても又は著しくてもよく、この方法にはどちらでもよい。このようなマイクロアレイの通常の用途は、生物学的試料についてハイブリダイゼーション試験を実行して該生物学的試料中に規定の核酸が存在するか又はしないかについて試験することである。ここで、該マイクロアレイとはかなり異なる用途が予期される。
【０１３４】
該ＭＡＳ装置は、通常はハイブリダイゼーション実験用のマイクロアレイを作製するために使用されるであろう形態で、ただし、この用途に特に適した特徴を有するように適合されていてもよい形態で使用できる。例えば、上記米国特許第６，３７５，９０３号の図５に示された光源の代わりに、コヒーレント光源、即ちレーザーを使用することが望ましいかもしれない。レーザーを光源として使用する場合には、ビーム拡大及び散乱板をレーザーの後部に使用して、マスクレスアレイ合成器で使用したマイクロミラーアレイに照射させるために該レーザーからの狭い光線をそれよりも広い光源に変換させることができる。また、該マイクロアレイが合成されるフローセルに変化を生じさせることができることも考えられる。特に、該フローセルは、アレイ要素の直線列が共通する流路によって互いに流体連通した状態で細分化できることが考えられるが、ただし、それぞれの流路は、アレイ要素の隣接列と関連する隣接流路からは分離されているものとする。マイクロアレイの合成中に、該流路は、全て、同時に同一の流体を受け入れる。ＤＮＡセグメントを基材から分離した後に、これらの流路は、該アレイ要素の列からのＤＮＡセグメントを互いに集めるように機能し、そしてハイブリダイゼーションにより自己構築し始める。また、この別法は以下でさらに議論することとする。
【０１３５】
ＤＮＡマイクロアレイの製造が完了したら、続いて、該マイクロアレイ上の一本鎖ＤＮＡ分子セグメントを、これらのものが構成された基材から開放し又は溶離させる。一本鎖ＤＮＡセグメントを開放させるために使用される特定の方法は臨界的ではなく、いくつかの技術が可能である。ここで、ＤＮＡセグメントの分離方法は、最も好ましくは、セーフティーキャッチ方法と呼ばれる方法である。このセーフティーキャッチ手法の下では、マイクロアレイでのＤＮＡストランドの構築用の初期出発原料は、ＭＡＳ装置の条件でＤＮＡストランドを合成するために必要な条件下では安定であるが、好適な化学処理によって不安定になり得るリンカーを使用して基材に取り付けられる。アレイ合成後に、まず、このリンカーを不安定化させ、次いで開裂させて一本鎖ＤＮＡセグメントを開放させる。この手法のための好ましい分離方法は、光不安定化結合基の光分解による開裂である。
【０１３６】
この一本鎖ＤＮＡ分子は、一本鎖ＤＮＡストランドを二本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるのに有利な条件下で溶液に懸濁される。これらの条件下では、一本鎖ＤＮＡセグメントは、所望の大きな完全ＤＮＡ配列を自動的に構築し始めるであろう。これは、例えば、ＤＮＡセグメント１２の３’側の半分が優先的に又は独占的にＤＮＡセグメント１３のこれと相補的な半分にハイブリダイズするために生じる。これは、該セグメント１２の３’側の半分についての配列と、該セグメント１３の５’側の半分についての配列との相補的な性質のためである。続いて、該セグメント１２にハイブリダイズしなかったセグメント１３の半分が、次々にセグメント１４の３’側の半分にハイブリダイズするであろう。このプロセスは、マイクロアレイ基材から開放されるセグメントの全てについて自発的に続行するであろう。このプロセスによって、図２Ｃに示したのと同様のＤＮＡ構築物が作製される。整列した一本鎖ＤＮＡ分子を互いに結合させることによって（ＤＮＡリガーゼで行うことができる）、図２ＡのＤＮＡ分子１０が完成する。作製された分子のコピー数は、マイクロアレイ２０内の機構のそれぞれにおいて合成された同一のセグメントの数に比例するであろう。また、多数のタイプの副構築反応のうちの一つを実行して、完成ＤＮＡ分子の構築を補助することが望ましいかもしれない。このような反応についてのいくつかの選択肢を以下で説明する。
【０１３７】
ポリメラーゼ構築多重化（ＰＡＭ）を実施するときに、相同オリゴヌクレオチドは、全長産物（図４及び５）の混合物に至るクロスオーバー点として作用し得るかもしれない。用途によっては、これは、有用な多様性源となり得るし、所望の産物のみを得るための追加の分離ステップを必要とする面倒な問題ともなり得る。本出願人は、クロスオーバー産物の混合物からの所望の配列の選択的分離を達成するための２つの戦略:（１）中間体環状化による選択及び（２）サイズによる選択を見出した。両者は、一以上の内部相同領域を有するポリヌクレオチド構成物のＰＡＭにも適用される。
【０１３８】
ＰＡＭ（Ｔｉａｎ外，Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１０５０−１０５４（２００４））では、オリゴヌクレオチド出発物質を組み立ててポリヌクレオチド構築物を形成させる順序は、該オリゴヌクレオチドの５’及び３’相互相補性によって決まる（Ｍｕｌｌｉｓ外，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１  ｐｔ１：２６３−２７３）。それぞれのオリゴの末端はもう一つのオリゴ（遊離末端を有する、完成遺伝子の末端のオリゴヌクレオチドを除く）に正確にアニーリングできる。このアニーリングの特異性は、所望の全長遺伝子配列のみを構築することを保証する。
【０１３９】
しかしながら、多重化形式で合成される遺伝子のなかで相同性が高くて十分に長い領域が存在しない場合には、この特異性は失われ得る。例えば、単一のプールにおいて相同性の高い（又はさらに同一の）領域Ｘを含む２種以上のポリヌクレオチド構築物を合成しようと試みる場合に、この共通の相同領域は、対象のポリヌクレオチド構築物のほかに、様々な構築産物をもたらし得るであろう（図４参照）。この状況は、相同領域Ｘが少なくとも構成オリゴヌクレオチドと同程度に長いときに生じ得る。これは、例えば、共通のドメインを共有する近縁の蛋白質変異体又は蛋白質をコードするポリヌクレオチド構築物を合成するときに生じる。例えば、図４に示すように、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＸは、非相同構成オリゴヌクレオチドを表す。意図的に、Ｘの５’末端は、Ｃ及びＧの両方とハイブリダイズでき、また、Ｘの３’末端は、ＤとＨの両方にハイブリダイズできる。これは、２セットのオリゴヌクレオチドを互いに接触させない場合に厄介な問題をもたらさない（例えば、これらのものは、別個のプール中に存在する）。しかしながら、合成が単一のウェル中で実行される場合には、４種の別個の全長産物が形成されるであろう（トップストランドのみで特定する）：ＡＸＢ、ＡＸＦ、ＥＸＢ及びＥＸＦ（図４Ｄ参照）。従って、相同領域を処理するときに、形成され得る異なる産物の数はｓx+1であり、ここでｓは相同配列の数であり、ｘは内部クロスオーバー点の数である。
【０１４０】
内部相同領域（例えば、相同性の高い又は一致する同じ配列内に含まれる２つの領域）は特殊なケースである。というのは、これらは、ＰＡＭでは重合に至る可能性があるからである。図５に示すように、ＡＸＢＸＣ核酸（トップストランドのみで示す）を構築すると、ＡＸ（ＢＸ）nＣ（ここで、ｎは、任意の負でない整数である）によって表される産物のファミリーが生じ得る。この構築によって作製された産物遺伝子の数は、理論的に無限大である。
【０１４１】
所定の実施形態では、このタイプの組み合わせ的複雑さを生じさせることが望ましいかもしれない。例えば、このＰＡＭのクロスオーバーの特徴を利用して、蛋白質デザイン用のドメインシャフリングのような用途、ＲＮＡｉ分子ライブラリーの作製、アプタマーライブラリーの作製、Ｆａｂポリペプチドライブラリーの作製などのための大きな組み合わせライブラリーを迅速且つ安価に作製することができる。
【０１４２】
他の実施形態では、組み合わせ的複雑さを最小化又はなくし、そして相同配列の規定セットを合成することが望ましい。これは、例えば、クロスオーバー産物を避けるために規則正しい態様で互いに混合される別個のプールを使用して、相同領域を含む遺伝子を別々に合成する（クロスオーバーを避けるために）ことによって達成できる。或いは、相同領域を有する様々な遺伝子は、単一のプール中で合成でき、そして、望ましくない産物は、以下で説明する分離技術を使用して除去できる。
【０１４３】
一実施形態では、望ましくないクロスオーバー産物は、環選択方法を使用して合成遺伝子の混合物から除去できる。該環選択方法の一実施形態を図６に示す。この環選択方法は、環状一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡがエキソヌクレアーゼ耐性であるという事実をうまく利用するものである。図６Ａは、単一のプールで構築されることが望ましい２種のポリヌクレオチド構築物を示している（例示の目的で一本鎖として表されている）。図６Ｂに示すように、末端の構成オリゴヌクレオチドは、正確なポリヌクレオチド構成産物を環状化させることを可能にする一本鎖オーバーハング（これは、好適なリンカー配列を得るように構成オリゴヌクレオチドをデザインすることによって形成してもよい）を形成させるようにデザインされる。例えば、相補的なＡ／Ｃオリゴヌクレオチドは、相補的なオリゴヌクレオチドＢ／Ｄ（波線で示す）によって形成される一本鎖オーバーハングに相補的である一本鎖オーバーハングを形成するが、Ｆ／Ｈオリゴ対（点線で示す）などによって形成される一本鎖オーバーハングには相補的でない。従って、正確な産物のみが環状化できる一方で、正確でないクロスオーバー産物（例えば、Ｂ−ＡＸＦ−Ｅ及びＦ−ＥＸＢ−Ａ）は、直鎖状のままであり、且つ、エキソヌクレアーゼで分解（環状のものは完全なままである）され得る（図６Ｄ−Ｆ）。フランキング領域と環状化セグメントとが構築され、続いて、相同リンカーＸがこの混合物に添加される。次いで、この所望の配列は、環状体を形成する（図６Ｄ及び６Ｅ）が、クロスオーバー産物は、直鎖状配列（図６Ｆ）を形成する。これらのクロスオーバー産物は、エキソヌクレアーゼを使用して選択的に分解できる。続いて、適切な酵素（例えば、制限酵素又はウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ））を添加してこの環状体を直鎖にし及び／又は所望の産物、例えば、ＡＸＢ及びＥＸＦ（トップストランドのみで表す）のみを残して環状化セグメント（リンカー）を除去することができる。図６Ｄ及び６Ｅに示すように、該環状化産物は部分的に二本鎖（図６Ｄ）であっても、或いは完全に二本鎖（図６Ｅ）であってもいずれでもよい。また、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰを使用して、部分的に二本鎖の環状体を完全に二本鎖の環状体に変換することも可能である。
【０１４４】
環選択方法の別の実施形態を図７に示す。図７Ａは、単位のプール中で合成されるべきポリヌクレオチド構成物を示している。図７Ｂは、ポリヌクレオチド構成物を規定する構成オリゴヌクレオチドを示している。同一のストランド上の５’及び３’最末端構成オリゴヌクレオチドは、適切な順序で構築されたポリヌクレオチド構成物の環状化を可能にするフランキング配列を含む（例えば、波線で示されるオリゴヌクレオチドＡ及びＢ、点線で示されるＥ及びＦ）。ポリヌクレオチド構成物のプールをハイブリダイゼーション条件にさらした後に、末端構成オリゴヌクレオチドのフランキング配列に相補的な直鎖状配列を加える。例えば、図７Ｃ及び７Ｄに示されるように、アダプターＹＹは、ＡＸＢ構成物の環状化を可能にする（例えば、相補的なＹ’領域への結合によって）一方で、ＺＺアダプターは、ＥＸＦ構成物の環状化を可能にする（例えば、相補的なＺ’領域への結合によって）。しかしながら、不正確なクロスオーバー産物（例えば、Ｂ−ＡＸＦ−Ｅ及びＦ−ＥＸＢ−Ａ）は、Ｙ’及びＺ’相補領域の組み合わせを有する場合があるため、ＹＹ又はＺＺアダプターオリゴヌクレオチドにさらされても環状化しないであろう。次いで、この構築構成物を連結させて共有結合的に閉じた部分一本鎖環状体及び不正確な直鎖状クロスオーバー産物（図７Ｅ）を形成させることができる。次いで、該構成物を変性させ、そして直鎖状核酸ストランドから環状体を分離するための方法に付すことができる（図７Ｅ−７Ｆ）。これは、例えば、サイズ分離方法（例えば、環状体は、ＰＡＧＥゲルを通して直鎖状産物よりも早く移動するであろう）又は該環状体を完全な状態に保持しつつ直鎖状ストランドを消化させるための一本鎖エキソヌクレアーゼを使用して達成できる。続いて、環状産物の適切な領域を、ＡＸＢ及びＥＸＦ産物に隣接する領域に結合するプライマーを使用して増幅させることによって正確な構築産物が作製できる（図７Ｇ）。単なる例示の目的で該アダプターオリゴヌクレオチドをＹＹ及びＺＺで表していることを理解すべきである。該アダプターオリゴヌクレオチドは、構成オリゴヌクレオチドの適切な対に相補的な配列の任意の組み合わせであることができる（例えば、５’構成オリゴヌクレオチドに相補的な配列は、３’構成オリゴヌクレオチドの領域に相補的な配列と同一である必要はない）。
【０１４５】
別の実施形態では、望ましくないクロスオーバー産物は、図８及び９に示すサイズ選択を使用して合成ポリヌクレオチド構成物の混合物から除去できる。サイズ選択方法は、二本鎖ＤＮＡの移動度がそのサイズの関数であるため、異なる長さのＤＮＡが、例えば、ゲル又はカラムクロマトグラフィーによって分離できるという事実をうまく利用するものである。この実施形態では、初期のポリヌクレオチド構成物は、所望の産物がクロスオーバー産物の全てとは異なる長さを有するようにデザインされる（例えば、図８Ａ及び９Ａ）。例えば、一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、所望の産物の全てがほぼ同一のサイズであり、しかも任意のクロスオーバー産物が有意に異なるサイズであるようにデザインされる。これは、構成オリゴヌクレオチドを、クロスオーバー点が標的配列のそれぞれにおいて異なる位置にあるようにデザインすることによって達成できる。例えば、図８に示すように、仮に、所望の配列がＡＸＢ、ＣＸＤ及びＥＸＦであり、しかもＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＸが全てほぼ同一の長さである場合に、該配列を「埋めて」（例えば、破線で示される余分な塩基又は余分な一連の塩基の追加）（図８Ｂ）同一の長さを有する所望の産物、例えば、−−ＡＸＢ、−ＣＸＤ−及びＥＸＦ−−と、異なる長さを有する望ましくないクロスオーバー産物、例えば、−−ＡＸＦ−−、−−ＡＸＤ−、−ＣＸＦ−−、−ＣＸＢ、ＥＸＤ−又はＥＸＢ（図８Ｃ）とを生じさせることができる。このポリヌクレオチド構成物は、多重化形式で構築でき、そして所望の産物は、サイズ選択によってクロスオーバー産物から分離できる。次いで、この埋め込み単位を、制限酵素又はＵＤＧを使用して除去することができる。所定の実施形態では、このようなサイズ選択技術は、オリゴヌクレオチドを埋め込む必要なく構成オリゴヌクレオチドを単に注意深くデザインすることによって達成できる。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＸはもともと異なるサイズであるため、正確な産物と不正確な産物との区別が可能であろう。
【０１４６】
該産物を区別するために必要な長さの相違の程度は、使用される分離方法に基づいて決まり得る。例えば、サイズ分離をゲル電気泳動によって行う場合には、全長核酸配列の約＋／−５〜１０％という分離分解能及び寸法差が妥当である。
【０１４７】
別の実施形態では、既知のマーカー付きＤＮＡの内部領域を選択的に削除することができる場合には、相同性がある一以上の領域を有する配列について単一のサイズ選択を使用することができる。この実施形態を、例えば、図９Ｂに示した構成オリゴヌクレオチドを使用して−ＡＸＢＹＣ−及びＤＸＥ−−ＹＦ（図９Ａ）として単一のプール中で合成できる産物ＡＸＢＹＣ及びＤＸＥＹＦについて図９に示す。予想される８種の産物（図９Ｃ）のうち、２種の所望の産物は、それぞれ２個の埋め込み単位を含む（「−」）が、６種のクロスオーバー産物は、Ｘ又はＹに０、１、３又は４個の埋め込み単位を含む（図９Ｃ）。次いで、この内部埋め込み領域は、例えば、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、IIＳ型制限エンドヌクレアーゼ）を使用して削除できる。次いで、そのフラグメントをハイブリダイゼーション及び連結反応条件にさらして、埋め込みされていない正確な構成物を形成させることができる。
【０１４８】
別の実施形態では、多数の内部相同領域が存在するときに、それぞれの相同領域について別個の構築及び分離段階を実行することができる。このときに得られた遺伝子フラグメントは、ユニークであり、且つ、ＰＡＭで構築できる。これは、相同領域の数としての複雑さを調整する「直鎖状戦略」である。該分子の長さは増大するので、エラー低減の慣用方法は、極めて扱いにくくなり、しかもコストがかかる。以下に示すのは、大規模遺伝子合成において劇的にエラーを低減させるためのツールである。
【０１４９】
他の実施形態では、相同領域を含む配列の多重合成は、構成オリゴヌクレオチドの慎重なデザインによって達成できる。例えば、該構成オリゴヌクレオチドのコドンを再配置して相同性レベルを減少させると共に、該核酸によってコードされる任意のポリペプチド配列をなお保持し又は最低限に変化させる。さらに、２種以上の構成オリゴヌクレオチド間での相補性の領域を慎重に選択して望ましくないハイブリダイゼーション領域における相同性のレベルを減少させることができる（例えば、国際公開第００／４３９４２パンフレット参照）。オリゴヌクレオチドデザイン及びコドン再配置の方法は、例えば、ＤＮＡＷｏｒｋｓ（前出）、Ｇｅｎｅ２Ｏｌｉｇｏ（前出）又は以下でさらに議論する実施方法及びシステムを使用したコンピュータデザインの助けを借りて容易にすることができる。
【０１５０】
別の実施形態では、理論的多様性ライブラリーの作製方法であって、該ライブラリーの構成要素が自己相同性のある２種以上の領域を有するものを提供する。該方法は、自己相同性領域内では終結しない構成オリゴヌクレオチドを利用することを伴う。例えば、１個以上の構成オリゴヌクレオチドは、１個以上の自己相同性領域に及ぶ。ポリヌクレオチド構成物が大きな自己相同性領域（例えば、約１００以上、２００、５００以上の塩基対を有する自己相同性領域）を有する場合に、この構築手順は、別個のプールにおいてポリヌクレオチド構築物の異なる部分を構築することを含むことができる。例えば、第一自己相同性領域を有するポリヌクレオチド構成物の第一部分は、プールＡにおいて構築でき、第二自己相同性領域を有するポリオリゴヌクレオチド構成物の第二部分は、プールＢにおいて構築できる。該第一及び第二自己相同性領域は、互いに相同性を共有するが、同一のプールにおいて構築されるべきポリヌクレオチド構成物の他の部分とはいかなる相当の相同性も共有しない。該ポリヌクレオチド構成物の第一及び第二部分を別々のプールで構築した後に、これらのプールを混合して、例えば、連結、鎖延長又はそれらの組み合わせにより全長産物を形成させることができる。該ポリヌクレオチド構成物が該ポリヌクレオチド構成物の一方の末端又は両末端で自己相同性領域を含む場合には、非相同フランキング配列を該配列の末端に付加することができるため、結果として、自己相同性領域内では終結しない構成オリゴヌクレオチドをデザインすることができる。該フランキング配列は、該構成オリゴヌクレオチドをデザインする前に、該ポリヌクレオチド構成物の一方の末端又は両末端上に仮定的に付加してもよいし、又は必要に応じてポリヌクレオチド構成物の末端に相当する１個以上の構成オリゴヌクレオチドの末端に付加してもよい。
【０１５１】
代表的な実施形態では、ここで説明する生合成理論的多様性ライブラリーは、コドン再配置されたオリゴヌクレオチドから構築できる。用語「コドン再配置」とは、核酸配列のコドン含有量を、該核酸によってコードされるポリペプチド配列を改変させることなく改変することをいう。所定の実施形態では、該用語は、該核酸配列のコドン含有量が特定の細胞型での発現を向上させるように改変された「コドン最適化」を包含するものとする。他の実施形態では、該用語は、２種以上の核酸配列のコドン含量が該配列間におけるコドン使用の相違により生じ得る蛋白質発現の予想されるいかなる差も最小化するように改変される「コドン標準化」を包含するものとする。さらに他の実施形態では、該用語は、蛋白質の発現レベルを調節するための手段として核酸配列のコドン含量を変更することを包含するものとする（例えば、発現レベルの増加又は減少のいずれか）。コドン再配置は、「野生型配列」中の少なくとも１個のコドンを、所定の細胞型においてさらに高い又は低い頻度で使用される同一のアミノ酸をコードする異なるコドンで置き換えることによって達成できる。この実施形態について、「野生型」とは、これらのものが真の野生型配列であるか又はここで説明する方法を使用してデザインされた変異体配列であるかを問わず、コドン再配置されていない配列を包含するものとする。
【０１５２】
代表的な実施形態では、本発明は、コドン標準化及び／又はコドン最適化された生合成ライブラリーにおける複数の核酸分子に関するものである。コドン標準化核酸のライブラリーは、コドンバイアスによるポリペプチド発現レベルの変化から生じる実験上の相違（例えば、酵素活性、結合親和性などの相違）を最小化することによって所望の蛋白質変異体のスクリーニング及び／又は選択を容易にするであろう。コドン最適化核酸のライブラリーは、所定の宿主細胞内での発現を最適化させることによって所望の蛋白質変異体のスクリーニング及び／又は選択を容易にするであろう。代表的な実施形態では、ライブラリーは、コドン標準化された核酸及びコドン最適化された核酸の両方を含むことができる。
【０１５３】
任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを有するヌクレオチド配列の偏差によって、遺伝子をコードする配列の変化が可能になる。それぞれのコドンは３つのヌクレオチドからなり、ＤＮＡを含むヌクレオチドは４種の特定の塩基に限られるため、６４通りのヌクレオチドの組み合わせが可能であり、そのうちの６１通りがアミノ酸をコードする（残り３つのコドンは、翻訳を終結させるシグナルをコードする）。結果として、多くのアミノ酸が１種以上のコドンによってデザインされる。例えば、アミノ酸のアラニン及びプロリンは、４種のトリプレットがコードし、セリン及びアルギニンは６種がコードするが、これらに対してトリプトファン及びメチオニンは、たった１種のトリプレットがコードする。この縮重は、ＤＮＡ塩基の組成を、該ＤＮＡによってコードされる蛋白質のアミノ酸配列を変化させることなく広範囲にわたって変更することを可能にする。
【０１５４】
多くの生物が、成長しつつあるペプチド鎖への特定のアミノ酸の挿入をコードするために特定のコドンの使用への偏りを示す。コドン優先又はコドンバイアス、即ち、生物間におけるコドン使用の相違は、遺伝暗号の縮重によって与えられ、多くの生物においてよく記録されている。コドンバイアスは、多くの場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の効率的な翻訳と相関するが、これは、言い換えれば、とりわけ、翻訳されるコドンの特性と特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の有効性とに依存するものと考えられる。細胞内における選択されたｔＲＮＡの優位性は、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンが反映されたものである。従って、核酸配列は、所定の生物における最適な発現のためにコドン最適化に基づいて調節できる。
【０１５５】
様々な動物、植物及び微生物種にわたって利用可能な遺伝子配列が非常に多数あることを考えると、コドン使用の相対頻度を計算することが可能である。コドン使用頻度表は、例えば、ワールドワイドウェブkazusa.orjp/codon/で入手できる「コドン使用データベース」で容易に入手でき、また、これらの表は、多数の方法で適合できる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．外「Codon usage tabulated from the international DNA sequence database：status for the year 2000」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。これらの表はＲＮＡ命名法を使用しているため、ＤＮＡに見出されるチミン（Ｔ）の代わりに、この表はＲＮＡに見出されるウラシル（Ｕ）を使用している。この表は、６４個のコドンの全てについてではなく、それぞれのアミノ酸について頻度が計算されるように対応している。
【０１５６】
これらの又は同様の表を利用することによって、当業者は、該頻度を任意の所定のポリペプチド配列に適用し、そして同一のポリペプチドをコードするが、所定の種にとって多かれ少なかれ最適なコドンを利用するコドン再配置コード領域の核酸フラグメントを作製することができる。コドン再配置コード領域は、様々な異なる方法によってデザインできる。例えば、コドン最適化は、コドン使用頻度表を使用して任意の所定のアミノ酸に対して使用される最も高頻度の１個のコドンを見出し、しかも該コドンを、この特定のアミノ酸がポリペプチド配列に出現する度に使用する「均一最適化」と呼ばれる方法を使用して実施できる。例えば、ヒトにおいて、最も高頻度のロイシンコドンはＣＵＧであり、４１％の頻度で使用される。従って、コドン最適化は、このコドンＣＵＧを全てのロイシン残基に対して所定のアミノ酸で割り当てることによって実施できる。
【０１５７】
「完全最適化」と呼ばれる別の方法では、コドンの実際の頻度は、コード領域全体にわたってランダムに分布する。従って、最適化のためにこの方法を使用して、仮定上のポリペプチド配列が１００個のロイシン残基を有し且つヒト細胞内での発現について最適化したいと考えた場合には、ロイシンコドンの約７又は７％がＵＵＡであり、ロイシンコドンの約１３又は１３％がＵＵＧであり、ロイシンコドンの約１３又は１３％がＣＵＵであり、ロイシンコドンの約２０又は２０％がＣＵＣであり、ロイシンコドンの約７又は７％がＣＵＡであり、ロイシンコドンの約４１又は４１％がＣＵＧであったであろう。これらの頻度は、仮定上のポリペプチドをコードするコード領域内のロイシンコドン全体にわたってランダムに分布していよう。当業者であれば理解するであろうが、該配列中のコドン分布は、この方法を使用して有意に変更できるが、しかしながら、該配列は、常に同一のポリペプチドをコードする。このような方法は、コドン標準化を含めて他のコドン再配置技術に対しても同様に適合できる。
【０１５８】
所定のポリペプチド配列をコードするためにコドンを最適化された頻度でランダムに割り当てることは、それぞれのアミノ酸についてのコドン頻度を手作業で計算し、次いで、該コドンを該ポリペプチド配列にランダムに割り当てることによって行うことができる。さらに、様々なアルゴリズム及びコンピュータソフトウェアプログラムは、当業者であれば容易に入手できる。例えば、ＤＮＡｓｔａｒ社（米国ウィスコンシン州マジソン）から入手できるレーザージーンパッケージにおける「ＥｄｉｔＳｅｑ」機能、ＩｎｆｏｒＭａｘ社（米国ミッドランド州ベテスダ）から入手できるベクターＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅにおける逆翻訳機能、及びＡｃｃｅｌｒｙｓ社（米国カリフォルニア州サンディエゴ）から入手できるＧＣＧ−−ウィスコンシンパッケージに「ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｅ（逆翻訳）」機能である。さらに、コード領域配列をコドン最適化するための様々な資源が公的に入手可能である。例えば、ワールドワイドウェブ上のentelechon.com/eng/backtranslation.htmlで入手できる「逆翻訳」機能、ワールドワイドウェブ上のbioinfo.pbi.nrc.ca:- 8090/EMBOSS/index.htmlで入手できる「ｂａｃｋｔｒａｎｓｅｑ」機能がある。また、当業者であれば、所定の頻度に基づいてコドンを割り当てるために基本的なアルゴリズムを構築することも基本的な数学関数により容易に達成できる。
【０１５９】
他の実施形態では、理論的多様性ライブラリーの作製方法は、一以上のエラー低減手順を包含することができる。エラー低減手順は、チップ上での合成、ＰＣＲ増幅、ＰＣＲ構築などを含めて構築プロセス中の様々な段階で核酸分子に導入されたエラーの除去又は訂正を可能にし、且つ、所望のライブラリー構成要素の高い忠実度の合成を確実にするのを助成する。このようなエラー低減手順は、低純度アレイ、例えば、任意の所定の核酸配列に対して１０パーセント未満の純度という特徴を有するアレイを使用することを可能にする。配列エラーを訂正できる能力は、このような低純度アレイを使用して高い忠実度のライブラリー産物を作製することを可能にする。
【０１６０】
様々な実施形態では、ミスマッチ結合蛋白質を使用してオリゴヌクレオチド合成、遺伝子構築及び異なるサイズの核酸の構築中に生じたエラーを制御することができる（生体系は、ＤＮＡを合成するときにこの機能を使用するが、鋳型ストランドの存在を必要とする。この技術によって採用されるようなデノボ合成については、鋳型を使用せずに定義によって開始する。）。
【０１６１】
所望のＤＮＡ分子を作製しようとするときに、多くの場合、いくつかは該配列の正確なコピーを有し、いくつかは一以上のエラーを有する混合物が生じる。しかし、合成オリゴヌクレオチドをＤＮＡの相補ストランドにアニーリングさせる場合には（また、合成させる場合）、一方のストランド上の該配列位置での単一エラーによって塩基ミスマッチが生じ、これがＤＮＡ二本鎖の歪みの原因となる。これらの歪みは、ミスマッチ結合蛋白質によって認識され得る（このような蛋白質の一例は、細菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＭｕｔＳである）。いったんエラーが認識され後には、所望の最終ＤＮＡ配列に該エラーをいかにして存在させないようにするかについて様々な可能性が存在する。
【０１６２】
エラー認識のために相補的ＤＮＡストランドの対を使用すると、該対におけるそれぞれのストランドは、ある頻度でエラーを有し得るが、該ストランドを共にアニーリングさせると、両ストランド上の相関位置でエラーが生じる機会が非常に小さくなり、さらに機会が小さくなると、このような相関関係によって正確にマッチしたワトソン・クリック塩基対（例えばＡ−Ｔ、Ｇ−Ｃ）が生じるであろう。例えば、１％の塩基当たりエラー率を有する５０塩基長オリゴヌクレオチドのプールでは、該プールのおよそ６０％（０．９９５０）が正確な配列を有し、残り４０パーセントがランダムな位置に一以上のエラー（主としてオリゴヌクレオチド当たり１個のエラー）を有するであろう。同じことが相補的な５０塩基長から構成されるプールについても当てはまる。これら２つのプールをアニーリングした後に、該ＤＮＡ二本鎖のおよそ３６％（０．６２）が両ストランド上で正確な配列を有し、４８％（２×０．４×０．６）が一方のストランド上に１個のエラーを有し、そして１６％（０．４２）が両ストランドにおいて複数のエラーを有するであろう。この最後のカテゴリーのうち、エラーが同一の位置に存在する機会は、わずか２％（１／５０）に過ぎず、これらのエラーがワトソン・クリック塩基対を形成する機会はさらに少ない（１／３×１／５０）。検出されずにいるこれらの相関ミスマッチは、そのときに、全ＤＮＡ二本鎖プールの０．１１％（１６×１／３×１／５０）を占める。そのため、検出可能なミスマッチ含有配列を全て除去することによって、エラーのない配列のために該プールがほぼ２００倍富化（即ち、エラー含有配列の割合が減少）するであろう（一本鎖について元々０．６／０．４に対して、ミスマッチ検出及び除去後に０．３６／０．００１１）。さらに、次いで残りのオリゴヌクレオチドを解離させ、そして再度アニーリングさせることができるが、これは、該エラー含有ストランドを該プールにおける異なる相補ストランドと組み合わせ、異なるミスマッチ二本鎖を生じさせることを可能にする。また、これらは、上記のように検出及び除去でき、エラーのない二本鎖をさらに濃縮することを可能にする。このプロセスの多重サイクルは、原理上、エラーを検出できないレベルにまで低減させることができる。また、エラー調節のそれぞれのサイクルは、エラーのない配列のいくつかをも除去し得る（これと同時に、エラーのない配列についてのプールをさらに比例的に濃縮する）ので、エラー調節とＤＮＡ増幅とのサイクルを交互に使用して大きな分子プールを維持することができる。
【０１６３】
一実施形態では、エラーの検出数及び訂正数を、エラー訂正の前にＤＮＡ二本鎖のプールを融解及び再アニーリングさせることによって増加させることができる。例えば、問題のＤＮＡ二本鎖がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような技術によって増幅された場合には、新たな（完璧に）相補的なストランドの合成は、これらのエラーがＤＮＡミスマッチとして直ちには検出可能にしないことを意味しよう。しかしながら、これらの二本鎖を融解させ、そしてそのストランドを新たな（及びランダムな）相補対に再度会合させると、上記のように、ほとんどのエラーがミスマッチとして明らかであろう二本鎖が生じるであろう。
【０１６４】
以下で説明する方法の多くは、長鎖核酸分子を生じさせるための方法に沿って多数のポイントでエラー低減ステップを適用することと共に使用できる。エラー低減を、生じた第１オリゴヌクレオチド二本鎖に適用し、次いで、例えば、中間体５００塩基長又は１０００塩基長に適用し、続いて１０，０００塩基長以上というさらに長い全長核酸配列に適用することができる。代表的な実施形態では、ここで説明する方法を使用して、配列の一以上の所望の位置に特定の修飾を随意に導入した生物の全ゲノムを作製することができる。
【０１６５】
図１０は、ミスマッチ結合蛋白質を使用して配列エラーを除去するための代表的な方法を示している。ＤＮＡの一本鎖における所定のエラーは、ＤＮＡ二本鎖におけるミスマッチの原因となる。ＭｕｔＳ二量体のようなミスマッチ認識蛋白質（ＭＭＢＰ）は、該ＤＮＡ上のこの部位に結合する。図１０Ａに示すように、ＤＮＡ二本鎖のプールは、ミスマッチを有する二本鎖（左）と、エラーのないもの（右）を有する。それぞれのＤＮＡストランドの３’末端は、矢印で示している。ミスマッチを生じさせるエラーは、左上のストランド上の上に突き出た三角として示している。図１０Ｂに示すように、ＭＭＢＰを添加し、これをミスマッチの部位に選択的に結合させることができる。次いで、このＭＭＢＰ結合ＤＮＡ二本鎖を除去し、エラーのない二本鎖について劇的に濃縮されたプールを残すことができる（図１０Ｃ）。一実施形態では、このＤＮＡ結合蛋白質は、エラー含有ＤＮＡをエラーのないコピーから分離する手段を与える（図１０Ｄ）。該蛋白質−ＤＮＡ複合体は、例えば、特定の抗体、固定化ニッケルイオン（蛋白質がｈｉｓタグ融合体として生成される）、ストレプタビジン（蛋白質は、ビオチンの共有結合的付加によって修飾されている）又は蛋白質精製の技術分野に共通する他の当該機構で官能化された固体支持材に対する該蛋白質の親和性によって捕捉できる。或いは、該蛋白質−ＤＮＡ複合体は、エラーのないＤＮＡ配列のプールから、移動度の差によって、例えば、サイズ排除カラムクロマトグラフィーを使用して又は電気泳動（図１０Ｅ）によって分離される。この例では、ゲルにおける電気泳動移動度はＭＭＢＰ結合により変化する：ＭＭＢＰが存在しないと、全ての二本鎖は一緒に移動するが、ＭＭＢＰが存在すると、ミスマッチ二本鎖が遅れる（上のバンド）。次いで、ミスマッチのないバンド（それよりも下）を切り出し、そして抽出する。
【０１６６】
図１１は、ミスマッチ認識蛋白質を使用して配列エラーを無効にするための代表的な方法を示している。この実施形態では、エラー含有ＤＮＡ配列は、ＤＮＡ産物のプールからは除去されない。むしろ、これは、化学架橋剤（例えば、スベルイミノ酸ジメチルＤＭＳ）又は他の蛋白質（例えばＭｕｔＬ）の作用によってミスマッチ認識蛋白質との不可逆的複合体になる。次いで、このＤＮＡ配列のプールを増幅させる（例えばポリメラーゼ連鎖反応、即ちＰＣＲによって）が、エラーを含むものは増幅から遮断され、且つ、増加しつつあるエラーのない配列よりもすぐに劣勢になる。図１１Ａは、ミスマッチを有する二本鎖（左）と、エラーのないもの（右）とを有するＤＮＡ二本鎖の代表的なプールを示している。ミスマッチを含むＤＮＡ二本鎖に選択的に結合するようにＭＭＢＰを使用することができる（図１１Ｂ）。該ＭＭＢＰは、架橋剤の適用により該ミスマッチの部位に不可逆的に結合できる（図１１Ｃ）。共有結合したＭＭＢＰの存在下でこのＤＮＡ二本鎖プールを増幅させると、エラーのない二本鎖（図１１Ｄ）のコピーがそれよりも多く生じる。このＭＭＢＰ−ミスマッチＤＮＡ複合体は、増幅に関与することができない。というのは、この結合蛋白質は、二本鎖の２つのストランドが解離しないようにするからである。長鎖ＤＮＡ二本鎖については、ＭＭＢＰ結合部位の外側にある領域は、部分的に解離し、且つ、それら（エラーのない）領域の部分的な増幅に関与できるかもしれない。
【０１６７】
さらに長いＤＮＡ配列が生じるにつれて、完全にエラーのない配列の画分が減る。かなり長ければ、完全に正確な配列を含有するプール全体にはいかなる分子も存在しなくなると思われる。従って、極めて長いＤＮＡセグメントの作製のためには、まず上記のエラー調節アプローチに付すことができる小さな単位を作製することが有用であり得る。次いで、これらのセグメントを組み合わせてさらに長い全長産物を生じさせる。しかしながら、これらの極めて長い配列内のエラーを、この長いＤＮＡ二本鎖全体を除去又は無効にすることなく局所的に訂正できるならば、さらに複雑な段階的構築プロセスを回避することができる。
【０１６８】
多くの生物学的ＤＮＡ修復機構は、突然変異（エラー）の部位を認識し、次いで鋳型ストランド（ほとんどエラーがないと思われる）を使用してこの不正確な配列を置き換えることに依存している。ＤＮＡ配列のデノボ作製では、このプロセスは、どちらのストランドがエラーを有するのか及びどちらを鋳型として使用すべきかを決定するという難しさを伴う。本発明では、この問題の解決策は、他の配列のプールを混合物で使用して訂正用の鋳型を与えることに依存する。これらの方法は非常に強力であり得る：たとえ、ＤＮＡの全てのストランドが一以上のエラーを有していたとしても、該ストランドの大部分がそれぞれの位置で正確な配列を有している（これは、エラーの位置が一般にストランド間では相関しないため、予期される）限り、所定のエラーが正確な配列で置き換わるであろう高い可能性がある。図１２、１３、１４及び１５は、この局所的エラー訂正のソートを実行するための代表的な手順を与えている。
【０１６９】
図１２は、ストランド特異的エラー訂正を実施するための代表的な方法を示している。生物が複製する際には、多くの場合、酵素仲介ＤＮＡメチル化を使用してこの鋳型（親）ＤＮＡストランドを同定する。新たに合成された（娘）ストランドは、初めはメチル化されていない。ミスマッチが検出されたときに、二本鎖ＤＮＡのこのヘミメチル化状態を使用して、該ミスマッチ修復システムに娘ストランドのみに対して訂正を行うよう命令する。しかしながら、相補ＤＮＡストランドのデノボ合成においては、両方のストランドがメチル化されておらず、しかも、この修復システムは、どちらのストランドを訂正するのかという固有の選択基準を有していない。この本発明の態様では、メチル化及び部位特異的脱メチル化を使用して、選択的にヘミメチル化されるＤＮＡストランドを生じさせる。Ｅ．ｃｏｌｉのＤａｍメチラーゼのようなメチラーゼを使用してそれぞれのストランド上にあると考えられる全ての標的部位を均質にメチル化する。次いで、このＤＮＡストランドを解離させ、そして、新たな対ストランドと再アニーリングさせる。ミスマッチ結合蛋白質（ＭＭＢＰ）とデメチラーゼとの融合体である新規な蛋白質が適用される。この融合蛋白質は、ミスマッチにしか結合せず、しかも、該デメチラーゼの接近によって、いずれかのストランドからメチル基（ただし、ミスマッチの部位の近くにあるもののみ）が除去される。解離及びアニーリングというその後のサイクルによって、該（脱メチル化）エラーを含むストランドと、その配列のこの領域においてエラーのない（メチル化）ストランドとを会合させることが可能になる（これは、相補ストランド上のエラー位置が相関しないため、該ストランドの大部分についても当てはまるであろう）。ここで、該ヘミメチル化ＤＮＡ二本鎖は、全て、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡミスマッチ修復システムのような修復システム（これは、この目的でＭｕｔＳ、ＭｕｔＬ、ＭｕｔＨ及びＤＮＡポリメラーゼ蛋白質を使用する）の構成要素を使用してエラーの修復を指示するために必要な情報を含む。このプロセスは、全てのエラーを訂正するのを確実にするために、複数回反復することができる。
【０１７０】
図１２Ａは、左上のストランドにおける、ミスマッチを生じさせる１塩基エラーを除いて同一である２つのＤＮＡ二本鎖を示している。右手の二本鎖のストランドは、太線で示されている。次いで、メチラーゼ（Ｍ）を使用してそれぞれのＤＮＡストランド上の全ての可能な部位を均一にメチル化させる（図１２Ｂ）。次いで、メチラーゼを除去し、ミスマッチ結合蛋白質（ＭＭＢＰ）及びデメチラーゼ（Ｄ）の両方を含む融合蛋白質を適用する（図１２Ｃ）。該融合蛋白質のＭＭＢＰ部分は該ミスマッチの部分に結合するため、該融合蛋白質は該ミスマッチ部位に局在化する。次いで、該融合蛋白質のデメチラーゼ部分は、該ミスマッチの近傍において両ストランドからメチル基を特異的に除去するように作用し得る（図１２Ｄ）。続いて、このＭＭＢＰ−Ｄ蛋白質融合体を除去することができ、そして、該ＤＮＡ二本鎖を解離させ、新たな対ストランドと再会合させることが可能である（図１２Ｅ）。該エラー含有ストランドは、（ａ）該部位に相補的なエラーを含まない相補ストランド；及び（ｂ）該ミスマッチ部位の近傍でメチル化された相補ストランドと最も再会合しやすいだろう。ここで、この新たな二本鎖は、ＤＮＡミスマッチ修復システムに対して天然基質を模倣する。次いで、ミスマッチ修復システムの構成要素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのＭｕｔＳ、ＭｕｔＬ、ＭｕｔＨ及びＤＮＡポリメラーゼ）を使用してエラー含有ストランド中の塩基（エラーを含む）を除去することができ、そして反対側の（エラーのない）ストランドを該置換物の合成用の鋳型として使用し、修正されたストランドを残す（図１２Ｆ）。
【０１７１】
図１３は、両ストランドのミスマッチ部位にあるＤＮＡを局部的に除去するための代表的な方法を示している。様々な蛋白質を使用して、エラーの近傍にある両ＤＮＡストランドの切断を生じさせることができる。例えば、非特異的ヌクレアーゼ（例えばＤＮアーゼＩ）に融合したＭＭＢＰによって、該ヌクレアーゼ（Ｎ）をミスマッチ部位に作用させ、両ストランドを開裂させることができる。いったん切断が生じたら、他のストランド（その大部分は、この部位にエラーを有しない）を、削除されたＤＮＡを置換するための鋳型として使用するように、相同組換えを用いることができる。例えば、ＲｅｃＡ蛋白質を使用してシングルストランドインベーション及び相同組換えの初期段階を促進させることができる。或いは、ポリメラーゼを使用して、切断されたストランドを新たな全長対ストランドと再会合させ、新たなＤＮＡを合成させて該エラーを置換することを可能にする。例えば、図１３Ａは、図１３Ａに示すような１塩基エラーを有することを除いて同一の２つのＤＮＡ二本鎖を示している。一実施形態では、ＭＭＢＰとヌクレアーゼ（Ｎ）との融合体のような蛋白質を添加することができ、そしてこれは該ミスマッチ部位に結合する（図１３Ｂ）。或いは、一本鎖ＤＮＡに対して特異性を有するヌクレアーゼを、該ＤＮＡ二本鎖を該ミスマッチ部位で局所的に融解させることが有利である程度に高い温度を使用しつつ用いることができる（ミスマッチの非存在下では、完璧なＤＮＡ二本鎖は、融解する可能性が高くないであろう）。エンドヌクレアーゼ、例えば、ＭＭＢＰ−Ｎ融合体のエンドヌクレアーゼを使用して該ミスマッチ部位近傍での二本鎖の切断を生じさせることができる（図１３Ｃ）。次いで、該ＭＭＢＰ−Ｎ複合体を、該ミスマッチ周辺のＤＮＡ二本鎖の短い結合領域と共に除去する（図１３Ｄ）。融解及び対ストランドの再アニーリングによって、いくつかの二本鎖に一本鎖ギャップが生じる。次いで、ＤＮＡポリメラーゼを使用してこれらのギャップを埋め、元のエラーを有しないＤＮＡ二本鎖を生じさせることができる（図１３Ｅ）。
【０１７２】
図１４は、図１３に類似するプロセスを示しているが、この実施形態では、ＤＮＡ二本鎖における二本鎖ギャップは、組換え修復経路の蛋白質構成要素を使用して修復される（この場合には、全体的なＤＮＡストランドの融解及び再アニーリングは全く必要ないことに留意されたい。これはゲノムＤＮＡのような特に大きなＤＮＡ分子を取り扱うときに好ましい。）。例えば、図１４Ａは、１塩基ミスマッチを含むことを除き同一である２つのＤＮＡ二本鎖（図１３Ａと同様）を示している。図１３Ｂと同様に、ＭＭＢＰとヌクレアーゼ（Ｎ）との融合体のような蛋白質を添加し、これが該ミスマッチ部位に結合する（図１４Ｂ）。図１３Ｃと同様に、エンドヌクレアーゼ、例えば、ＭＭＢＰ−Ｎ融合体のエンドヌクレアーゼを使用して該ミスマッチ部位周辺で二本鎖の切断を生じさせることができる（図１４Ｃ）。次いで、ＲｅｃＢＣＤ複合体のようなＤＮＡ修復経路の蛋白質構成要素を使用して、３’重複配列を残して該二本鎖中断の露出末端をさらに消化することができる（図１４Ｄ）。その後、ＲｅｃＡ蛋白質のようなＤＮＡ修復経路の蛋白質構成要素を使用して、無傷のＤＮＡ二本鎖のシングルストランドインベーションを促進させ、ホリデイジャンクションを形成させる（図１４Ｅ）。次いで、ＤＮＡポリメラーゼを使用して新たなＤＮＡを合成し、一本鎖ギャップを埋めることができる（図１４Ｆ）。最後に、ＲｕｖＣ蛋白質のようなＤＮＡ修復経路の蛋白質構成要素を使用して該ホリデイジャンクションを回復させることができる（図１４Ｇ）。得られた二つのＤＮＡ二本鎖は、元のエラーを含まない。分岐点の移動によって、このようなジャンクションを回復させる一以上の方法が存在し得ることに留意されたい。
【０１７３】
ここで説明する方法は、たとえ初期のＤＮＡ産物のいずれもがエラーのないものでなかったしても、エラーのない長いＤＮＡ配列を作製することができることを明らかにすることが重要である。図１５は、それぞれ１塩基（ミスマッチ）エラーを有する２つのＤＮＡ二本鎖に適用された図１３の方法（即ち、図１４）の影響をまとめている。例えば、図１５Ａは、該ＤＮＡ配列内の異なる位置にそれぞれ１塩基ミスマッチがあることを除き同一である２つのＤＮＡ二本鎖を示している。次いで、ミスマッチの結合及び局在化ヌクレアーゼ活性を使用して、該エラーを削除する二本鎖破壊を生じさせる（図１５Ｂ）。組換え修復（図１４のような）又は融解及び再構築（図１３のような）を使用して、各削除エラー配列を、鋳型として他のＤＮＡ二本鎖（（同じ位置にエラーを有するとは思われない）をそれぞれ使用して、新たに合成された配列で置き換えたＤＮＡ二本鎖を作製する（図１５Ｃ）。該ＤＮＡ二本鎖の完全な解離及び再アニーリングは、必ずしもエラーのない産物を生じさせないことに留意されたい（図１４に示した方法を使用する場合）。
【０１７４】
長いＤＮＡ分子におけるエラーを減少させる単純な方法は、ＤＮＡ骨格の両ストランドを多数の部位で、例えば、開裂部位に短い一本鎖オーバーハングを生じさせる部位特異的エンドヌクレアーゼにより開裂させることである。得られたセグメントのうち、いくつかはミスマッチを有することが予期される。これらは、図１０に記載されるように、ミスマッチ結合蛋白質の作用及びその後の除去によって除去できる。セグメントの残りのプールを再度連結させて全長配列にすることができる。図１４のアプローチと同様に、このアプローチはいくつかの利点を有する。（１）エラーを除去するために全長ＤＮＡ二本鎖の全てを除去する必要がないこと；（２）ＤＮＡ二本鎖の全体的な解離及び再アニーリングの必要がないこと；（３）エラーのないＤＮＡ分子を、どの構成要素もエラーのないＤＮＡ分子ではない出発プールから構築できることである。
【０１７５】
最も一般的なタイプの制限エンドヌクレアーゼをこのアプローチについて使用した場合には、全てＤＮＡ開裂部位は、同一のオーバーハングを生じさせたであろう。そのため、該セグメントはランダムな順序で会合し、そして連結したであろう。しかしながら、部位特異的「外側カッター」エンドヌクレアーゼ（Ｈｇａｌ、Ｆｏｋｌ又はＢｓｐＭＩのような）を使用すると、（非重複）ＤＮＡ認識部位の近くに開裂部位が生じる。そのため、それぞれのオーバーハングは、他部位のその部分とは異なる、該ＤＮＡのその部分に特異的な配列を有していよう。次いで、これらの特に相補的な付着末端の再会合によって、該セグメントは適切な順序で一体になるであろう。生じた付着末端は、５塩基長までであることができるが、これは４5＝１０２４までの異なる組み合わせを可能にする。おそらく、この多くの異なる制限部位を使用することができると考えられるが、該付着末端間における略一致を回避する必要から、この数は減少し得るであろう。この必要な制限部位を、特に、該配列のデザインに含めることができ、又は所望の配列内での制限部位のランダムな分布を利用することができる（それぞれのエンドヌクレアーゼの認識配列は、生成されるフラグメントの典型的な分布の予測を可能にする）。また、標的配列は、エンドヌクレアーゼのどちらを選択することによって最も理想的なフラグメントのセットが生じるかについて分析できる。
【０１７６】
図１６は、ミスマッチ含有セグメントの半選択的除去の例を示している。例えば、図１６Ａは、それぞれがミスマッチに至る１個のエラーを有する３つのＤＮＡ二本鎖を示している。このＤＮＡは、隣接するセグメントに相補的な付着末端を有する二本鎖フラグメントを残して、部位特異的エンドヌクレアーゼで切断される（図１６Ｂ）。次いで、ＭＭＢＰを適用し、これがミスマッチを有するそれぞれのフラグメントに結合する（図１６Ｃ）。図１０に記載されるように、ＭＭＢＰに結合したフラグメントを該プールから除去する（図１６Ｄ）。それぞれのフラグメントの付着末端によって、それぞれのＤＮＡ二本鎖が正確な配列に特異的な近傍のフラグメントと会合することが可能になる（図１６Ｅ）。リガーゼ（例えばＴ４ＤＮＡリガーゼ）を使用して付着末端を結合させ、全長ＤＮＡ配列を作製する（図１６Ｆ）。これらのＤＮＡ配列は、元のＤＮＡ二本鎖のいずれもエラーを有しないものではなかったにも関わらず、エラーを有しないことができる。不完全な連結反応によって、全長に満たないいくつかの配列が残るが、これは、サイズに基づき精製除去することができる。
【０１７７】
上記のアプローチは、まずエラーを発見するための配列決定を使用し、次いでエンドヌクレアーゼとリガーゼで「カット・アンド・ペースト」するために特定のエラーのない部分配列を選択することに依存する、エラーを除去する慣用方法の一つを超える大きな利益を与える。この実施形態では、エラーを除去するために、配列決定や使用者の選択は全く必要ない。
【０１７８】
相補的なＤＮＡストランドを合成し且つアニーリングさせるときに、両ストランドはエラーを有し得るが、両配列における同一の塩基位置でエラーが生じる見込みは、上記のように極めて小さい。上記方法は、ＤＮＡミスマッチとして検出できる相関のないエラーという大多数のケースを排除するために有用である。両ストランド上の同一の位置での相補的なエラー生じるという希なケース（ミスマッチ結合蛋白質では検出不能）では、その後の二本鎖の解離及び異なる相補的なストランド（異なるエラー位置分布を有する）とのランダムな再アニーリングサイクルによって、この問題が改善する。しかし、いくつかの用途では、例えば、ゲノム長ＤＮＡストランドの場合には、該ＤＮＡ二本鎖を融解及び再アニーリングさせないことが望ましい。このような実施形態では、相関エラーを、異なる方法を使用して除去することができる。例えば、相関エラーの初期母集団は少ないことが予期されるものの、所定のプールにおいてＤＮＡ配列を増幅させたり、その他複製させたりすることによって、それぞれのエラーがコピーされて相補的なエラーを含む完全に相補的なストランドが生じることが確実になるであろう。本発明によれば、このアプローチは、ＤＮＡストランドの全体的な解離及び再アニーリングを必要としない。基本的に、ＤＮＡ損傷及び組換えの様々な形態を使用して長いＤＮＡ二本鎖の一本鎖部分を異なる二本鎖に再度組み合わせることが可能になる。
【０１７９】
図１７は、合成されたＤＮＡにおいて相関エラーを減少させるための手順を示している。図１７Ａは、一方のストランドに単一のエラーがあることを除いて同一である２つのＤＮＡ二本鎖を示している。非特異的ヌクレアーゼを使用して、該プールにおけるＤＮＡ二本鎖内のランダムな位置に短い一本鎖ギャップを生じさせることができる（図１７Ｂ）。ここに示しているのは、相関位置のうちの一つの位置で生じたこれらのギャップの一つの結果である。ＲｅｃＡ及びＲｕｖＢのような組換え特異的蛋白質を使用して四重鎖ホリデイジャンクションの形成を仲介する（図１７Ｃ）。ＤＮＡポリメラーゼを使用して該複合体の下部分において示されるギャップを埋める（図１７Ｄ）。ＲｕｖＣのような他の組換え及び／又は修復蛋白質の作用を用いてこのホリデイジャンクションを開裂させ、それらの前駆体のハイブリッドであるいくつかの配列を有する２つの新たなＤＮＡ二本鎖を生じさせる（図１７Ｅ）。示した例においては、エラー含有領域のうちの一つは除去されている。しかしながら、この方法において使用されるストランドの切断、再配列及び置換は、ランダムであることが意図されるため、該配列中のエラーの総数は実際には変化せず、単に該エラーは異なるストランドにリアソート（再集合）されることが予期される。従って、一つの二本鎖において相関するエラーの対は、それぞれ単一のエラーを有する別個の二本鎖に入れ替えられるであろう。このランダムなストランド再集合によって、上で詳述したミスマッチ修復蛋白質を使用して修復できるミスマッチを有する新たな二本鎖が生じるであろう。本発明のこの実施形態のユニークなところは、相関エラーを異なるＤＮＡ二本鎖に分けるために組換えを使用する点にある。
【０１８０】
上記の方法は、任意の所望の配列のＤＮＡを直接作製することを可能にする。もはや、試験管内組換えＤＮＡの技術によって構成要素部品から発現ベクターを構築する必要はない。その代わりに、任意の所望のＤＮＡ構築物は、セグメントにおいて合成を指令することによって直接合成され、その後自発的に集合して完成分子になることができる。構成されたＤＮＡ分子は、これまでに存在していたものである必要はなく、特定の目的に合わせて全体的に新規な構成物であることができる。そのため、今や当業者がコンピュータで所望のＤＮＡ配列又はベクターを完全にデザインし、次いでＤＮＡベクターを単一の操作で人工的に直接合成することが可能になった。
【０１８１】
ここで想定される直接ＤＮＡ合成方法は、使用者が構築したい標的配列を表現するコンピュータファイルの形態にある所望の標的ＤＮＡ配列から始まることが考えられる。所定のコンピュータソフトウェアプログラムを使用して、所望のＤＮＡ構築物を、大きな標的配列を組み立てるために使用できるさらに小さなＤＮＡに細分するための最適な方法を決定する。該ソフトウェアは、この目的のために最適化されよう。例えば、標的ＤＮＡ構築物は、それぞれのセグメントのうちハイブリダイズしつつある半分が、対応する半セグメントにはよくハイブリダイズするが、他のいかなる半セグメントにもハイブリダイズしないような態様でセグメントに細分化されるであろう。もし必要なら、該ＤＮＡの最終的な機能に影響を及ぼさない配列に変化させることが、場合によってはユニークなセグメントを保証するために必要になるかもしれない。この最適化のソートは、この目的のために設計されたコンピュータシステムによって行うことが好ましい。
【０１８２】
ＤＮＡセグメントをマイクロアレイの基材上で構築した後に、該ＤＮＡセグメントを該マイクロアレイ基材から分離させなければならない。これは、最初に該ＤＮＡセグメントを該基材に結合させるために使用した技術に応じて、多数の技術のうち任意のものによって行うことができる。以下で説明するのは、ガラス粒子上でオリゴヌクレオチドを作製するために使用される技術を改変した、不安定化学に基づく一技術であるが、ただし、これは、いくつかの可能性のうちの一例に過ぎない。要するに、必要なのは、該ＤＮＡセグメントの基材への結合を、ＤＮＡ分子自体を破壊しない技術によって開裂させることだけである。
【０１８３】
この方法は、特定の用途のために必要に応じて直接合成されたＤＮＡを十分な量にしてもよいし十分な量にしなくてもよい。多コピーの合成ＤＮＡは、他のＤＮＡ構築物がクローニングされ又は多量に複製されるいくつかの方法のうち任意のものによって作製できることが想定される。複製起点を環状ＤＮＡに作ることができ、これは、細菌宿主内で構築ＤＮＡのコピーを迅速に増幅させることを可能にするであろう。直鎖状ＤＮＡは、それぞれの末端の規定ＤＮＡプライマーにより構築でき、次いで、これは、ＰＣＲ方法によって該ＤＮＡ構築物のコピーをたくさん増幅させるために使用できる。
【０１８４】
５．蛋白質変異体のスクリーニング／選択
実験的な実施形態では、変異体ライブラリーから選択される様々な蛋白質変異体を発現させ、そしてさらにスクリーニングして、一以上の所望の特徴を示す変異体を同定することができる。選択プロトコールは、処理量が非常に効率的であるため、スクリーニングプロトコール以上に好ましいが、両方の技術は、適切な状況で使用できる。スクリーニングは、所定の構築物を興味のある一以上の特性について評価することを伴う；選択は、特定の特性を有する多種ライブラリーの種をその特性に基づいて回収又は単離すること、例えば、ファージ又はリボソームディスプレイにおいて使用されるようなパニングを伴う。一実施形態では、該変異体を、試験管内転写及び／又は翻訳系を使用して発現させることができる。別の実施形態では、該変異体をコードする核酸を発現ベクターに挿入し、そして蛋白質発現及びスクリーニング又は選択のために細胞に導入することができる。変異体の生化学的特徴に対してスクリーニング及び選択するための好適な方法としては、例えば、酵素活性又は結合相互作用（蛋白質／蛋白質、蛋白質／小分子などを含む）についての試験管内又は生体内アッセイ法が挙げられる。
【０１８５】
一実施形態では、ライブラリーの構成要素をコードする本発明の核酸を使用して、様々な発現ベクターを作製する。該発現ベクターは、自己複製性染色体外ベクターか、又は宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであることができる。一般に、これらの発現ベクターは、ライブラリー蛋白質をコードする核酸に作動可能に結合した転写調節核酸及び翻訳調節核酸を有する。用語「調節配列」とは、作動可能に結合したコード配列が特定の宿主生物内で発現するために必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物に好適な調節配列としては、例えば、プロモーター、随意にオペレーター配列及びリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【０１８６】
ある核酸は、他の核酸配列と機能的な関係に置かれる場合には「作動可能に結合」する。例えば、プレ配列又は分泌リーダーについてのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与する蛋白質前駆体として発現する場合には、該ポリペプチドについてのＤＮＡに作動可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合には、コード配列に作動可能に結合している；又は、リボソーム結合部位は、翻訳を促進させるように位置している場合には、コード配列に作動可能に結合している。一般に、「作動可能に結合」とは、結合されるＤＮＡ配列が隣接していること、また、分泌リーダーの場合には隣接し且つリーディング段階にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、隣接している必要はない。結合は、都合の良い制限部位での連結によって達成される。このような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドのアダプター又はリンカーを慣用方法に従って使用する。該転写及び翻訳調節核酸は、当業者であれば明らかなように、一般に、ライブラリー蛋白質を発現させるために使用される宿主細胞に適切であろう；例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓからの転写及び翻訳調節核酸配列は、好ましくは、ライブラリー蛋白質をＢａｃｉｌｌｕｓ内で発現させるために使用される。様々な宿主細胞のために適切な発現ベクター及び好適な調節配列の多数のタイプが当該技術分野において知られている。
【０１８７】
一般的に、転写及び翻訳調節配列としては、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始配列及び転写終止配列、翻訳開始配列及び翻訳終止配列並びにエンハンサー又はアクティベーター配列を挙げることができるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、該調節配列は、プロモーター、転写開始配列及び転写終止配列を有する。
【０１８８】
プロモーター配列としては、構成的プロモータ配列及び誘導性プロモーター配列が挙げられる。該プロモーターは、天然型プロモーター、複合又は合成プロモーターであることができる。また、一以上のプロモーター要素を組み合わせた複合プロモーターも当該技術分野において知られており、本発明に有用である。
【０１８９】
さらに、該発現ベクターは、追加の要素を含むことができる。例えば、該発現ベクターは２個の複製系を有することができ、それによって２種の生物、例えば、発現用のほ乳類又は昆虫細胞と、クローニング及び増幅用の真核生物宿主とにおいて該ベクターを保持することが可能になる。さらに、組込型発現ベクターについて、該発現ベクターは、宿主ゲノムに相同的な少なくとも１種の配列と、好ましくは発現構築物に隣接する２種の相同配列とを有する。該組込型ベクターは、該ベクター内に含まれるものとしてこの適切な相同配列を選択することにより、該宿主細胞内の特定部位に向けることができる。組込型ベクターの構築並びに適切な選択及びスクリーニングプロトコールは当業者に周知であり、例えば、Ｍａｎｓｏｕｒ外，Ｃｅｌｌ，５１：５０３（１９８８）及びＭｕｒｒａｙ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７（Ｃｌｉｆｔｏｎ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１）に記載されている。
【０１９０】
さらに、好ましい実施形態では、該発現ベクターは、該発現ベクターを含有する形質転換宿主細胞の選択を可能にするように選択遺伝子を有し、特にほ乳類細胞の場合には、該ベクターを含まない細胞は一般に死滅するため、該ベクターの安定性は確実に保証される。選択遺伝子は当該技術分野では周知であり、使用される宿主細胞によって変わってくるであろう。ここで、「選択遺伝子」とは、選択薬剤に対する耐性を与える遺伝子産物をコードする任意の遺伝子を意味する。好適な選択薬剤としては、ネオマイシン（又はそのアナログＧ４１８）、ブラストサイジンＳ、ヒスチニドールＤ、ブレオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシンＢ及び他の薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９１】
好ましい実施形態では、該発現ベクターは、遺伝子発現レベルを増大させるために、発現する遺伝子の上流又は下流にＲＮＡスプライシング配列を有する。Ｂａｒｒｅｔ外，Nucleic Acid Res.１９９１；Ｇｒｏｏｓ外，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９８７；及びＢｕｄｉｍａｎ外，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９８８を参照されたい。
【０１９２】
好ましい発現ベクター系は、レトロウイルスベクター系である。これは、例えば、Ｍａｎｎ外，Ｃｅｌｌ，３３：１５３−９（１９９３）；Ｐｅａｒ外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０（１８）：８３９２−６（１９９３）；Ｋｉｔａｍｕｒａ外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９２：９１４６−５０（１９９５）；Ｋｉｎｓｅｌｌａ外，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，７：１４０５−１３；Ｈｏｆｍａｎｎ外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９３：５１８５−９０；Ｃｈｏａｔｅ外，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，７：２２４７（１９９６）；ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０１９号及びＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０４８号並びにそこで引用された文献に一般的に記載されている。これら全ては、参照によって援用するものとする。
【０１９３】
本発明のライブラリー蛋白質は、ライブラリー蛋白質をコードする核酸を有する核酸、好ましくは発現ベクターで形質転換された宿主細胞を適切な条件下で培養して該ライブラリー蛋白質の発現を誘導させるか又は生じさせることによって生成される。ライブラリー蛋白質の発現に適切な条件は、発現ベクター及び宿主細胞の選択によって変化し、当業者であれば日常的な実験を通して容易に確認されるであろう。例えば、発現ベクターに構成的プロモーターを使用するには、宿主細胞の成長と増殖を最適化させることが必要であるのに対し、誘導性プロモーターの使用には、誘導のための適切な成長条件が必要である。さらに、いくつかの実施形態では、収集のタイミングが重要である。例えば、昆虫細胞の発現に使用されるバキュウロウイルス系は溶菌性ウイルスであるため、収集時間の選択が産物の収量にとって極めて重要になり得る。
【０１９４】
当業者であれば明らかなように、本発明で使用される細胞型は広く変更できる。基本的に、酵母、細菌、古細菌、菌類並びに昆虫細胞及びほ乳類細胞を含めた動物細胞を含め、非常に広範囲にわたる適切な宿主細胞を使用することができる。特に興味のあるものは、ドロソフィラ・メラノガスター（Drosophila melanogaster）細胞、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae） 及び他の酵母、大腸菌（E. coli）、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、ＳＦ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、アカパンカビ、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳ及びＨｅＬａ細胞、線維芽細胞、シュワン細胞株、不死化ほ乳類骨髄性及びリンパ球系細胞株、ジャーカット細胞、マスト細胞、他の内分泌性及び外分泌性細胞並びに神経細胞である。ＡＴＣＣ培養細胞株カタログを参照されたい。これは参照によって援用するものとする。さらに、当該技術分野において周知であるようなファージディスプレイ系での二次ライブラリーの発現は、該二次ライブラリーがランダムペプチドを含む場合には特に好ましい。一実施形態では、該細胞は、例えば、標的分子を含むように、遺伝子改変がなされていてもよい。即ち、外来性の核酸を含有してもよい。
【０１９５】
好ましい実施形態では、このライブラリー蛋白質をほ乳類細胞内で発現させる。任意のほ乳類細胞が使用でき、なかでもマウス、ラット、霊長目及びヒトの細胞が特に好ましいものの、当業者であれば明らかであるように、シュードタイピングによる該系の改変によって、全ての真核細胞、好ましくは高等真核生物を使用することが可能である。以下においてさらに完全に説明するが、該細胞がランダムライブラリー構成要素の存在下で選択可能な表現型を示すようにスクリーンを設定できる。以下においてさらに完全に説明するが、細胞内にライブラリー構成要素が存在する結果として表現型の変化を示した細胞を選択することが可能となるように好適なスクリーンを設計するならば、様々な病状に関わる細胞型が特に有用である。
【０１９６】
従って、好適なほ乳類細胞型としては、全タイプの腫瘍細胞（特にメラノーマ、骨髄性白血病、肺、乳房、卵巣、結腸、腎臓、前立腺、膵臓及び睾丸の癌腫）、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、リンパ細胞（Ｔ細胞及びＢ細胞）、マスト細胞、好酸球細胞、血管内膜細胞、肝細胞、単核白血球細胞を含めて白血球細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、肺幹細胞、腎臓幹細胞、肝臓幹細胞及び筋細胞幹細胞のような幹細胞（分化因子及び脱分化因子に対するスクリーニングに使用するための）、破骨細胞、軟骨細胞及び他の結合組織細胞、ケラチン生成細胞、メラニン形成細胞、肝臓細胞、腎臓細胞及び脂肪細胞が挙げられるが、これらに限定されない。また、好適な細胞として、ジャーカットＴ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＨＯ、Ｃｏｓなど（これらに限定されない）を含め、既知の研究細胞も挙げられる。ＡＴＣＣ培養細胞株カタログを参照されたい。これは参照によって援用するものとする。
【０１９７】
ほ乳類発現系もまた当該技術分野において知られており、これにはレトロウイルス系がある。ほ乳類プロモーターは、ほ乳類ＲＮＡポリメラーゼを結合することができ且つライブラリー蛋白質コード配列のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始させることができる任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常コード配列の５’末端の近傍に位置する転写開始領域と、該転写開始部位の上流にある２５〜３０塩基対のＴＡＴＡボックスとを有するであろう。このＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡ合成を正確な部位で開始させるようにＲＮＡポリメラーゼIIを導くものと思われる。また、ほ乳類プロモーターは、通常ＴＡＴＡボックスの上流１００〜２００塩基対内に位置した上流プロモーター要素（エンハンサー要素）も有するであろう。上流プロモーター要素は、転写を開始させる速度を決め、且つ、いずれかの方向で働き得る。ほ乳類プロモーターとして特に使用されるのは、ほ乳類ウイルス遺伝子由来のプロモーターである。というのは、該ウイルス遺伝子は、多くの場合、高発現であり、且つ、幅広い宿主範囲を有するからである。例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主後期プロモーター、ヘルペスシンプレックスウイルスプロモーター及びＣＭＶプロモーターが挙げられる。
【０１９８】
通常、ほ乳類細胞によって認識される転写終結配列及びポリアデニル化配列は、翻訳終止コドンに対して３’側に位置し、プロモータ要素と共にコード配列に隣接する調節領域である。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位特異的翻訳後開裂及びポリアデニル化によって形成される。転写終結シグナル及びポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０から誘導されるものが挙げられる。
【０１９９】
外来性核酸をほ乳類宿主並びに他の宿主に導入する方法は当該技術分野では周知であり、使用される宿主細胞によって変わる。デキストラン仲介トランスフェクション法、燐酸カルシウム沈降法、ポリブレン仲介トランスフェクション法、プロトプラスト融合法、電気穿孔法、ウイルス感染法、ポリヌクレオチドのリポソーム内へのカプセル化及びＤＮＡの核への直接マイクロインジェクション法などの技術が挙げられる。
【０２００】
好ましい実施形態では、ライブラリー蛋白質を細菌系で発現させる。細菌発現系は当該技術分野において周知である。
【０２０１】
好適な細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼを結合することができ且つライブラリー蛋白質コード配列のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始させることができる任意の核酸配列である。細菌プロモーターは、通常コード配列の５’末端の近傍に位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と転写開始部位とを有する。代謝経路酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を与える。例としては、ガラクトース、ラクトース及びマルトースのような糖代謝酵素に由来するプロモーター配列及びトリプトファンのような生合成酵素に由来する配列が挙げられる。また、バクテリオファージ由来のプロモーターも使用することができ、これは当該技術分野に知られている。さらに、合成プロモーター及びハイブリッドプロモーターも有用である；例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーター配列とｌａｃプロモーター配列とのハイブリッドである。さらに、細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼを結合させ且つ転写を開始させる能力を有する非細菌起源の天然型プロモーターを包含できる。
【０２０２】
機能性プロモーター配列のほかに、効率的にリボソームに結合する部位が望ましい。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、該リボソーム結合部位は、シャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列と呼ばれており、開始コドンと、該開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流に位置した３〜９ヌクレオチド長の配列とを有する。
【０２０３】
また、発現ベクターは、細菌内でのライブラリー蛋白質の分泌を与えるシグナルペプチド配列も有することができる。該シグナル配列は、当該技術分野において周知のように、通常、該細胞からの蛋白質の分泌を指令する疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドをコードする。この蛋白質は、培養基に分泌されるか（グラム陽性細菌）、又は細胞の内膜と外膜との間に位置した細胞膜周辺腔に分泌されるか（グラム陰性細菌）のいずれかである。
【０２０４】
また、該細菌発現ベクターは、形質転換した細菌株の選択を可能にするための選択可能なマーカー遺伝子を有することもできる。好適な選択遺伝子としては、該細菌をアンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンのような薬剤に対して耐性にする遺伝子が挙げられる。また、選択可能マーカーとして、ヒスチジン、トリプトファン及びロイシン生合成経路における生合成遺伝子のようなものも挙げられる。
【０２０５】
これらの構成要素は発現ベクターに構築される。細菌用の発現ベクターは当該技術分野において周知であり、これらのなかでは、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、大腸菌（E. coli）、ストレプトコッカス・セレモリス（Streptococcus cremoris）及びストレプトコッカス・リビダンス（Streptococcus lividans）用のベクターが挙げられる。
【０２０６】
該細菌発現ベクターは、塩化カルシウム処理、電気穿孔法などのような当該技術分野において周知の技術を使用して細菌宿主細胞に形質転換される。
【０２０７】
一実施形態では、ライブラリー蛋白質は、昆虫細胞内で産生される。昆虫細胞の形質転換用発現ベクター、特に、バキュウロウイルス系発現ベクターは当該技術分野において周知であり、例えば、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ外，「バキュウロウイルス発現ベクター」：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（ニューヨーク：オックスフォード大学プレス，１９９４）に記載されている。
【０２０８】
好ましい実施形態では、ライブラリー蛋白質は酵母細胞内で産生される。酵母発現系は当該技術分野において周知であり、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）及びカンジダ・マルトーサ（C. maltosa）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、クリベロミセス・フラギリス（Kluyveromyces fragilis）及びクリベロミセス・ラクチス（K. lactis）、ピキア・ギレリモンディ（Pichia guillerimondii）及びピキア・パストリス（P. pastoris）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）及びヤロウイア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）用の発現ベクターがある。酵母内発現用の好ましいプロモーター配列としては、誘導型ＧＡＬｌ，１０プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−燐酸イソメラーゼ、グリセロアルデヒド−３−燐酸−デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ及び酸性ホスファターゼ遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。酵母選択可能マーカーとしては、ツニカマイシン耐性を与える、ＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰｌ及びＡＬＧ７；Ｇ４１８耐性を与えるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子；及び酵母を銅イオンの存在下で成長させることを可能にするＣＵＰｌ遺伝子が挙げられる。
【０２０９】
また、ライブラリー蛋白質は、当該技術分野において周知の技術を使用して、融合蛋白質としても作製できる。従って、例えば、モノクローナル抗体の作製に関して、所望のエピトープが小さい場合には、ライブラリー蛋白質を担体蛋白質に融合させて免疫原を形成させることができる。或いは、該ライブラリー蛋白質は、発現を増加させるために又は他の目的のために融合蛋白質として作製できる。例えば、該ライブラリー蛋白質がライブラリーペプチドである場合には、該ペプチドをコードする核酸を発現目的で他の核酸に結合させることができる。同様に、ライブラリー構成要素を亜細胞又は細胞の細胞外区画に局在させることを可能にするターゲッティング配列、レスキュー配列又はライブラリー蛋白質若しくはこれらをコードする核酸の精製若しくは単離を可能にする精製タグ；ライブラリー蛋白質やこれをコードする核酸に安定性若しくは分解からの保護（例えば蛋白質分解抵抗性）又はそれらの組み合わせを与える安定性配列並びに必要に応じてリンカー配列のような他の融合相手を使用できる。
【０２１０】
従って、好適なターゲッティング配列としては、発現産物の生物活性を保持しつつ該発現産物を所定の分子又は分子類に結合させることができる（例えば、該当する酵素類を標的にするために酵素阻害剤又は基質配列を使用することによって）結合配列；単独又は共結合蛋白質の選択的分解を情報伝達する配列；及び候補発現産物を、（ａ）ゴルジ、小胞体、核、核小体、核膜、ミトコンドリア、葉緑体、分泌小胞、リソソーム及び細胞膜のような亜細胞の位置；及び（ｂ）細胞外の位置を含む所定の細胞の場所に分泌シグナルによって構成的に局在化させることができるシグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましいのは、分泌によって亜細胞の位置又は細胞の外部に局在化させることである。
【０２１１】
好ましい実施形態では、該ライブラリーの構成要素は、レスキュー配列を含む。レスキュー配列とは、候補因子又はこれをコードする核酸を精製又は単離するために使用できる配列である。従って、例えば、ペプチドレスキュー配列としては、Ｎｉアフィニティーカラムで使用するＨｉＳ6タグ及び検出、免疫沈降法又はＦＡＣＳ（蛍光標識細胞分取）用のエピトープタグのような精製配列が挙げられる。好適なエピトープタグとしては、ｍｙｃ（市販の９Ｅ１０抗体と共に使用）、細菌酵素ＢｉｒＡのＢＳＰビオチニル化標的配列、ｆｌｕタグ、ｌａｃＺ及びＧＳＴが挙げられる。或いは、レスキュー配列は、ＰＣＲ、関連技術又はハイブリダイゼーションによって、レトロウイルス構成物を迅速且つ容易に単離するこを可能にするためのプローブ標的部位として機能するユニークなオリゴヌクレオチド配列であることができる。
【０２１２】
好ましい実施形態では、融合の相手は、ライブラリー構成要素又はそれをコードする核酸に安定性を付与する安定性配列である。従って、例えば、ペプチドは、ワルシャフスキーのＮ末端規則通りに該ペプチドをユビキチン化から保護するために、開始メチオニン（ＭＧ又はＭＧＧ０）の後にグリシンを導入することによって安定化でき、それによって細胞質内での長い半減期を与えることができる。同様に、Ｃ末端の２個のプロリンは、カルボキシペプチダーゼの作用に対する耐性が大きいペプチドを与える。プロリンの前に２個のグリシンが存在することにより柔軟性が与えられ、またジプロリンにおける構造起因事象が候補ペプチド構造に伝わるのが防止される。従って、好ましい安定性配列は次の通りである：ＭＧ（Ｘ）nＧＧＰＰ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは少なくとも４の整数である。）。
【０２１３】
一実施形態では、本発明のライブラリーの核酸、蛋白質及び抗体は標識される。ここで、「標識」とは、本発明の核酸、蛋白質及び抗体が本発明の核酸、蛋白質及び抗体の検出を可能にするように結合した少なくとも１種の要素、同位体又は化学化合物を有することを意味する。一般的に、標識は３つの部類に分類される：（ａ）放射性又は重元素同位体であることができる同位体標識；（ｂ）抗体又は抗原であることができる免疫標識；及び（ｃ）着色又は蛍光染料。該標識を化合物に任意の位置で取り入れることができる。
【０２１４】
好ましい実施形態では、ライブラリー蛋白質は、発現後に精製又は単離される。ライブラリー蛋白質は、当業者に知られている様々な方法で、ほかにどのような構成要素が試料に存在しているかに応じて単離又は精製できる。標準的な精製方法としては、電気泳動法、分子技術、免疫学的技術及びイオン交換、疎水性、アフィニティー及び逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを含めてクロマトグラフィー技術並びにクロマト画分法が挙げられる。例えば、ライブラリー蛋白質は、標準的な抗ライブラリー抗体カラムを使用して精製できる。また、限外ろ過及びダイアフィルトレーション技術（同時に蛋白質を濃縮する）も有用である。好適な精製技術における一般的な手引については、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ（１９８２）を参照されたい。必要な精製度は、ライブラリー蛋白質の使用によって変わってくるであろう。場合によっては、精製は必要ないであろう。
【０２１５】
いったん発現及び必要に応じて精製したら、ライブラリーの蛋白質及び核酸は、多数の用途に有用である。一般的に、ライブラリーは、生物活性に対してスクリーニングされる。これらのスクリーニングは、当該分野においては周知であるように、選択された骨格蛋白質に基づくであろう。従って、既知の結合構成要素への結合（例えば、酵素である場合にはその基質）、活性プロファイル、安定性プロファイル（ｐＨ、熱、緩衝液の条件）、基質特異性、免疫原性、毒性などを含め、あらゆる蛋白質の活性又は属性を試験することができる。
【０２１６】
ランダムペプチドを作製する場合には、これらのものは、活性に対してスクリーニングするためにを様々な方法で使用できる。好ましい実施形態では、第一の複数細胞をスクリーニングする。即ち、ライブラリー構成要素の核酸が導入される細胞を、表現型の変化に対してスクリーニングする。従って、この実施形態では、ライブラリー構成要素の効果は、このものが作られる同一の細胞内で観察される；即ち、自己分泌効果。
【０２１７】
従って、一実施形態では、本発明の方法は、ライブラリー構成要素のうち分子ライブラリーを複数の細胞、即ち細胞ライブラリーに導入することを含む。次いで、以下にさらに完全に概説するように、該複数の細胞を、表現型の変化を示す細胞に対してスクリーニングする。この表現型の変化は、ライブラリー構成要素の存在によるものである。
【０２１８】
ここで、「表現型の変化」若しくは「生理機能の変化」又は同様の用語は、細胞の表現型が何らかの方法で、好ましくは何らかの検出可能な及び／又は測定可能な方法で変化することを意味する。当業者には明らかであろうが、本発明の強みは、本方法を使用して試験できる細胞型及び見込まれる表現型の変化が広範囲にわたることである。従って、観察、検出及び測定ができるいかなる表現型変化もここでのスクリーニング方法の基礎となることができる。好適な表現型変化としては、全体的な物理的変化、例えば、細胞形態、細胞増殖、細胞生存率、基質又は他の細胞への結合及び細胞密度の変化；１種以上のＲＮＡ、蛋白質、脂質、ホルモン、サイトカイン又は他の分子の発現の変化；平衡状態（即ち半減期）又は１種以上のＲＮＡ、蛋白質、脂質、ホルモン、サイトカイン又は他の分子の変化；１種以上のＲＮＡ、蛋白質、脂質、ホルモン、サイトカイン又は他の分子の局在の変化；１種以上のＲＮＡ、蛋白質、脂質、ホルモン、サイトカイン、受容体又は他の分子の生物活性又は特定の活性の変化；燐酸化の変化；イオン、サイトカイン、ホルモン、成長因子又は他の分子の分泌の変化；細胞膜の電位、極性化、完全性又は輸送の変化；ウイルス及び細菌病原体の感染性、感受性、潜在性、接着性及び取り込みの変化などが挙げられるが、これらに限定されない。ここで、「表現型を変化させることができる」とは、ライブラリー構成要素が細胞の表現型を何らかの検出可能な及び／又は測定可能な方法で変化させることができることを意味する。
【０２１９】
表現型の変化は様々な方法で検出でき、そして一般的には、変化する表現型に依存及び相当する。一般に、表現型の変化は、例えば、細胞形態の顕微鏡分析；標準的な細胞生存率アッセイ法（細胞死亡率の増加及び細胞生存率の増加の両方、例えば、ウイルス、細菌又は細菌毒素若しくは合成毒素による細胞死滅に対して耐性となった細胞を含む）；特定の細胞又は分子の存在又はレベルに対する蛍光定量的指標アッセイ法（ＦＡＣＳ又は他の染料染色技術を含む）のような標準的な標識アッセイ法；細胞を死滅させた後の標的化合物発現の生化学的検出などを使用して検出される。場合によっては、ここでさらに完全に説明した通り、表現型の変化は、ランダム化された核酸を導入した細胞内で検出される；他の実施形態では、表現型の変化は、第一細胞からのいくつかの分子シグナルに応答する第二細胞内で検出される。
【０２２０】
従って、好ましい実施形態では、本発明は、変異体蛋白質のライブラリー備えるバイオチップを提供し、ここで該ライブラリーは、少なくとも約１００種の異なる変異体を有する。少なくとも約５００種の異なる変異体が好ましく、約１０００種の異なる変異体が特に好ましいく、約５０００〜１０，０００が特に好ましい。
【０２２１】
一実施形態では、候補ライブラリーは、完全にランダム化されているが、ここで、任意の位置の配列が優先され又は一定であることはない。好ましい実施形態では、候補ライブラリーにバイアスがかけられる。即ち、該配列のいくつかの位置は、一定に保持されるか、又は可能性が限られたものから選択されるかのいずれかである。例えば、好ましい実施形態では、ヌクレオチド又はアミノ酸残基は、例えば、疎水性アミノ酸残基、親水性残基、架橋のためにシステインの生成、ＳＨ−３ドメインのためにプロリンの生成、燐酸化部位のためにセリン、トレオニン、チロシン又はヒスチジンの生成など又はプリンに向けて立体的にバイアスがかけられた（小さな又は大きな）残基などのうち既定の部類内でランダム化される。
【０２２２】
好ましい実施形態では、該バイアスは、既知の分子の部類と相互作用するペプチド又は核酸に向けてかけられる。例えば、候補生理活性因子がペプチドである場合には、細胞内シグナル伝達の多くが、小さなペプチドドメインを介して他のポリペプチドと相互作用するポリペプチドの短い領域によって行われることが知られている。例えば、これまでに、ＨＩＶ−Ｉエンベロープ細胞質ドメインからの短い領域は、細胞性カルモジュリンの作用をブロックすることが示されている。スズメバチのマストパラン毒素に対する相同性を示すＦａｓ細胞質ドメインの領域は、細胞死誘導性アポトーシス機能又はＧ蛋白質誘導機能を有する短いペプチド領域に限定できる。ゼノプス由来の天然ペプチドであるマゲイニンは、強力な抗腫瘍活性及び抗微生物活性を有し得る。蛋白質キナーゼＣアイソザイム（βＰＫＣ）の短いペプチドフラグメントは、刺激後にゼノプス卵母細胞内でのβＰＫＣの核転位をブロックすることが示された。また、短いＳＨ−３標的ペプチドは、ＳＨ−３蛋白質に特異的に結合する偽基質として使用されてきた。これは、勿論、生物活性を有する利用可能なペプチドのショートリストである。この分野には多数の文献が存在するからである。従って、小さなペプチドが細胞内シグナル伝達カスケードに活性を及ぼすことが可能であるという多くの先例が存在する。さらに、あらゆる数の分子のアゴニスト及びアンタゴニストも、同様に候補生理活性因子のバイアスランダム化の基礎として使用できる。
【０２２３】
従って、多数の分子又は蛋白質ドメインは、バイアスをかけてランダム化された候補生理活性因子を作製するための出発点として好適である。共通する機能、構造又は親和性を与える多数の小分子ドメインが知られている。さらに、当該技術分野では明らかなように、アミノ酸の相同性が弱い領域は、強力な構造的相同性を有し得る。ＳＨ−２ドメイン、ＳＨ−３ドメイン、プレクストリン、デスドメイン、プロテアーゼ開裂／認識部位、酵素阻害剤、酵素基質、Ｔｒａｆなどを含め、多数のこれらの分子、ドメイン及び／又は対応するコンセンサス配列が知られているが、これらに限定されない。同様に、本発明で使用するのに好適なドメインを含む多数の既知の核酸結合蛋白質が存在する。例えば、ロイシンジッパーコンセンサス配列が知られている。
【０２２４】
参照による援用
本明細書で引用した全ての特許、特許出願、刊行物及び配列データベース登録は、参照により援用するものとする。また、参照により援用するものは、米国特許出願公開第：２００４／０２５９１４６号；２００４／０２４１７０１号；２００３／００９６３０７号；２００４／００４３４３０号；２００３／００３６８５４号；２００４／０１５２８７２号；及び２００２／０１７７６９１号である。
【０２２５】
均等
当業者であれば、日常的な実験を使用して、ここに記載した本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し又は確認することができるであろう。このような均等物は、添付した特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２２６】
【図１】（Ａ）連結、（Ｂ）鎖延長及び（Ｃ）鎖延長と連結を含む、構成オリゴヌクレオチドを部分構築物及び／又はポリヌクレオチド構成物に構築するための３つの実験方法を示す図である。
【図２】合成されるＤＮＡ分子を示す図である。
【図３】図１の代表的なＤＮＡ分子の合成に使用したマイクロアレイを示す図である。
【図４】内部相同領域を有するポリヌクレオチド構築物の多重構築を実施するときに生じ得る、考えられるクロスオーバー産物を示す図である。
【図５】内部相同領域を有するポリヌクレオチド構築物の多重構築を実施するときに生じ得るクロスオーバー重合を示す図である。
【図６】相同領域を有するポリヌクレオチド構築物の多重構築のための環選択方法の一実施形態を示す図である。
【図７−１】相同領域を有するポリヌクレオチド構築物の多重構築のための環選択方法の別の実施形態を示す図である。
【図７−２】相同領域を有するポリヌクレオチド構築物の多重構築のための環選択方法の別の実施形態を示す図である。
【図８】相同領域を有するポリヌクレオチド構築物の多重構築のためのサイズ選択方法の一実施形態を示す図である。
【図９】相同領域を有するポリヌクレオチド構築物の多重構築のためのサイズ選択方法の別の実施形態を示す図である。
【図１０】ミスマッチ結合蛋白質を使用したエラー配列の除去方法を示す図である。
【図１１】ミスマッチ認識蛋白質によるエラー配列の無効化方法を示す図である。
【図１２】ストランド特異的エラーの訂正方法を示す図である。
【図１３】両ストランドのミスマッチ部位にあるＤＮＡを局部的に除去するための一スキームを示す図である。
【図１４−１】両ストランドのミスマッチ部位にあるＤＮＡを局部的に除去するための別のスキームである。
【図１４−２】両ストランドのミスマッチ部位にあるＤＮＡを局部的に除去するための別のスキームである。
【図１５】２個のＤＮＡ二本鎖であってそれぞれが単一塩基（ミスマッチ）エラーを有するものに適用された図１３（言い換えれば図１４）の方法の効果を要約する図である。
【図１６−１】ミスマッチ含有セグメントの半選択的除去の例を示す図である。
【図１６−２】ミスマッチ含有セグメントの半選択的除去の例を示す図である。
【図１７】合成されたＤＮＡにおいて相関エラーを減少させるための手順を示す図である。
【符号の説明】
【０２２７】
１０  二本鎖ＤＮＡ分子
１２  ＤＮＡセグメント
２０  マイクロアレイ
２２  機構
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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