(57)【要約】  本発明は、生物活性生成物であって、乳タンパク質（特に、カゼイン）から誘導される生物活性乳製品の製造用乳タンパク質から誘導される生物活性生成物の製造に関する。１６種の新規なペプチドは、これらを含有するタンパク質の化学的処理、生物工学的処理又は酵素的処理によって得ることができ、これらのペプチドは、抗菌活性、生体外でのアンギオテンシン変換酵素抑制活性及び／又は抗高血圧活性及び／又は抗酸化活性を有するペプチドをもたらす。この種の栄養と薬効のある生成物は、水解物又は生物活性ペプチドの形態で食品工業と薬品工業において使用するために適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の特性ａ）〜ｃ）によって特徴付けられる生物活性ペプチド：
ａ）抗菌活性及び／又は生体外でのＡＣＥ-抑制活性及び／又は生体内での抗高血圧活性及び／又は抗酸化活性を有する。
ｂ）ペプシン-加水分解化ラクターゼカゼイン酵素水解物の状態で存在する。
ｃ）次のアミノ酸配列を有する：ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．２、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．３、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．４、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．５、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．６、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．７、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．８、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．９、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１０、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１２、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１３、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１４。
【請求項２】
アミノ酸配列ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．２、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．５、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．６、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．７、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．８、又はＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１０を有する請求項１記載の生物活性ペプチドであって、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．７を含むこと及びαｓ２-カゼインから誘導されることによって特徴付けられる該生物活性ペプチド。
【請求項３】
請求項２記載の生物活性ペプチドから誘導される生物活性ペプチドであって、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．７の模擬胃腸内消化後に得られる末端単位及びＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１５によって特徴付けられる該生物活性ペプチド。
【請求項４】
アミノ酸配列ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．３、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．４、又はＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．９を有する請求項１記載の生物活性ペプチドであって、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１を含むこと及びαｓ２-カゼインから誘導されることによって特徴付けられる該生物活性ペプチド。
【請求項５】
アミノ酸配列ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１２、又はＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１３を有する請求項１記載の生物活性ペプチドであって、αｓ１-カゼインから誘導されることによって特徴付けられる該生物活性ペプチド。
【請求項６】
アミノ酸配列ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１４を有する請求項１記載の生物活性ペプチドであって、β-カゼインから誘導されることによって特徴付けられる該生物活性ペプチド。
【請求項７】
請求項２記載の生物活性ペプチドから誘導される生物活性ペプチドであって、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１４の模擬胃腸内消化のシミュレーション後に得られる末端単位並びにＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１６及びＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１７によって特徴付けられる該生物活性ペプチド。
【請求項８】
グラム陽性菌に対して抗菌活性を示すことによって特徴付けられる請求項１から３いずれかに記載の生物活性ペプチド。
【請求項９】
アミノ酸配列ＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．３及び大腸菌のようなグラム陰性菌に対して抗菌活性を示すことによって特徴付けられる請求項１から３いずれかに記載の生物活性ペプチド。
【請求項１０】
アミノ酸配列ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．７、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１２、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１３、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１４、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１５、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１６及びＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１７、及び生体外においてＡＣＥ-抑制活性を示すことによって特徴付けられ請求項１から７いずれかに記載の生物活性ペプチド。
【請求項１１】
アミノ酸配列ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．７、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１２、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１３、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１４、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１５、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１６及びＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１７、及び抗高血圧活性を示すことによって特徴付けられ請求項１から７いずれかに記載の生物活性ペプチド。
【請求項１２】
アミノ酸配列ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．７及び酸素ラジカルのキレート化によって抗酸化活性を示すことによって特徴付けられ請求項１から３いずれかに記載の生物活性ペプチド。
【請求項１３】
化学的若しくは酵素的な合成法又は組換え法によって得られる請求項１から１２いずれかに記載の生物活性ペプチド。
【請求項１４】
αｓ１-カゼイン、αｓ２-カゼイン、β-カゼイン、全カゼイン、含有成分の異なる乳、副乳製品又は発酵乳製品の酵素加水分解法によって得られる請求項１３記載の生物活性ペプチド。
【請求項１５】
下記の工程ａ）〜ｄ）を含む請求項１から１４いずれかに記載の生物活性ペプチドの製造方法：
ａ）動物又は植物を起源とする１種又は複数種のタンパク質又はペプチドを含有するいずれかの適当な基質である出発原料又は微生物に由来する出発原料（好ましくはカゼイン又は全乳）であって、請求項１記載のいずれかの生物活性ペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する出発原料を加水分解によって入手し、
ｂ）該出発原料を、タンパク質分解酵素が作用するために適当なｐＨ条件下の水中又は緩衝溶液中へ適当な濃度で溶解させるか、又は分散させ、
ｃ）出発物質中に存在するタンパク質を切断して所望のペプチドをもたらすタンパク質分解酵素（好ましくは、ｐＨ３．０の条件下でのペプシン）又は基質の発酵をおこなうタンパク質分解性微生物を該溶液又は分散液中へ添加し、次いで
ｄ）反応を１０分間〜２４時間（好ましくは３０分間〜３時間）おこなう。
【請求項１６】
下記の工程ａ）〜ｄ）を含む請求項３、７、１０、１１、１３又は１４いずれかに記載の生物活性ペプチドの製造方法：
ａ）動物又は植物を起源とする１種又は複数種のタンパク質又はペプチドを含有するいずれかの適当な基質である出発原料又は微生物に由来する出発原料（好ましくはカゼイン又は全乳）であって、請求項３及び７記載のいずれかの生物活性ペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する出発原料を加水分解によって入手し、
ｂ）該出発原料を、タンパク質分解酵素が作用するために適当なｐＨ条件下の水中又は緩衝溶液中へ適当な濃度で溶解させるか、又は分散させ、
ｃ）出発物質中に存在するタンパク質を切断して所望のペプチドをもたらすタンパク質分解酵素を該溶液又は分散液中へ添加するか（この場合、好ましくは、ペプシンをｐＨが３．０で、酵素／基質比が３．７／１００（ｐ／ｐ）となる条件下で使用して加水分解を３７℃でおこなうか、又はコロラーゼＰＰをｐＨが７〜８で酵素／基質比が１／２５（ｐ／ｐ）となる条件下で使用して加水分解を３７℃でおこなう）、又は基質の発酵をおこなうタンパク質分解性微生物を該溶液又は分散液中へ添加し、次いで
ｄ）反応を１０分間〜２４時間おこなう（この場合、好ましい反応時間は、ププシンの場合は３０分間であり、コロラーゼＰＰの場合は約２．５時間であり、また、反応は、反応系を水浴中において９５℃で１０分間加熱することによって停止させる）。
【請求項１７】
請求項１から５いずれかに記載の生物活性ペプチドであって、請求項１５記載の方法を使用することによって製造される該生物活性ペプチド。
【請求項１８】
請求項３から７いずれかに記載の生物活性ペプチドであって、請求項１６記載の方法を使用することによって製造される該生物活性ペプチド。
【請求項１９】
請求項１から７いずれかに記載のペプチドであって、固有の酵素的水解物、該水解物のフラクション又は精製物から得られる該ペプチドを少なくとも１種含有することによって特徴付けられる生物活性生成物。
【請求項２０】
請求項１から１４、１７、１８及び１９のいずれかに記載の生物活性生成物の薬学的誘導体若しくはその塩又は混合物である生物活性ペプチド。
【請求項２１】
請求項１から１４及び１７から２０のいずれかに記載の生物活性生成物であって、抗菌活性及び／又は生体外でのＡＥＣ-抑制活性及び／又は生体内での抗高血圧活性及び／又は抗酸化活性を有する該生物活性生成物を少なくとも１種含有する薬剤組成物。
【請求項２２】
請求項１から１４及び１７から２０のいずれかに記載の生物活性生成物であって、抗菌活性、生体外でのＡＥＣ-抑制活性及び／又は生体内での抗高血圧活性及び／又は抗酸化活性を有する該生物活性生成物を少なくとも１種含有する機能性食品の添加剤、成分又は栄養剤。
【請求項２３】
請求項１から１４、１７から２０及び２２のいずれかに記載の生物活性生成物であって、抗菌活性、生体外でのＡＥＣ-抑制活性及び／又は生体内での抗高血圧活性及び／又は抗酸化活性を有する該生物活性生成物を少なくとも１種含有する機能性食品。
【請求項２４】
請求項２１記載の薬剤組成物の使用であって、微生物感染症の予防及び／又は処置のための薬剤の製造における該使用。
【請求項２５】
請求項２１記載の薬剤組成物の使用であって、高血圧症の予防及び／又は処置のための薬剤の製造における該使用。
【請求項２６】
請求項２２記載の機能性食品の添加剤又は成分の使用であって、微生物感染症の予防に適した機能性食品の製造における該使用。
【請求項２７】
請求項２２記載の機能性食品の添加剤又は成分の使用であって、高血圧症の軽減に適した機能性食品の製造における該使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、乳タンパク質から誘導される生物活性生成物（bioactive products）の製造に関する。この種のタンパク質を酵素的処理に付すことによって、抗菌活性及び／又は生体外でのアンギオテンシン変換インヒビター活性（ＡＥＣ-抑制活性）及び／又は抗高血圧活性及び／又は抗酸化活性を有するペプチドがもたらされる。この種のペプチドは食品工業及び製薬工業における使用原料として適している。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの栄養素としての乳の役割は出生時から重要であり、また、乳は高い栄養価と機能的価値を有する食品である。最近の新たな生物工学的分離技術の発達により、乳の異なる成分の分別が可能となり、このような乳成分は新規な食品の原料として使用されるだけでなく、乳成分の消費の増大に寄与する非食品的目的や新たな用途における原料としても使用されている。このため、乳成分からの単離タンパク質の製造に携わる多くの企業の関心事は、乳成分の一部の成分（例えば、カゼインや乳漿タンパク質等）の用途の拡大と多様化である。このことは、ラクトフェリンの製造に含まれる産業が該当する。ラクトフェリンは抗菌剤として使用されており、また、ベビーフード、ヨーグルト、栄養剤、特殊配合物、歯科用製品及び皮膚科用製品においても既に使用されている。さらに、ラクトフェリンは、その抗菌活性に起因して、新鮮なミルクの保存寿命を延長させるための添加剤としても使用されている。
【０００３】
近年、機能性食品が食品産業に参入するようになっているが、これはダイエットと健康との間の関連性に対する消費者の高い意識に起因するものである。食品に配合された場合に、単なる栄養学的役割を越える特別な生物学的活性を発揮する成分として定義される機能性成分の中でも、多様性と多機能性に起因して卓越した地位を占めている成分のうちの１種は生物活性ペプチドである。この種のペプチドは、前駆体タンパク質中においては不活性なフラグメントであるが、生体内及び／又は生体外における加水分解過程によって放出されると、体内において種々の生理学的機能を発揮する。
【０００４】
この種のペプチドが１９７９年に発見されて以来、種々の生物学的活性（例えば、抗菌活性、抗高血圧活性、免疫調節活性、抗血栓症活性、オピオイド活性及び抗酸化活性等）を有する食物タンパク質から誘導されるペプチドが知られている。このようなペプチドは食品及び／又は薬剤の分野において潜在的な用途を有しており、また、該ペプチドは種々の方法によって供給してもよいが、現在最も多く利用されている方法は、酵素的加水分解法と微生物的発酵法である。
【０００５】
特に注目に値する生物活性ペプチドは抗菌特性を発揮するペプチドである（Ｒ．フロリス、Ｉ．レシオ、Ｂ．バークフート及びＳ．ビッセル、「乳タンパク質及びその誘導体の抗菌／抗ウイルス効果」、カレント・ファーマシューティカル・デザイン、２００３年、第９巻、第１２５７頁〜第１２７５頁参照）。乳の抗菌活性は長年に亘って研究されてきており、該活性は、一般的には乳中に存在する抗菌活性を有する種々のタンパク質（例えば、イムノグロブリン、ラクトフェリン、ラクトペルオキシダーゼ及びリゾチーム等）に起因するとされている。しかしながら、最近になって、乳タンパク質から誘導されるペプチドの抗菌活性も証明されている。現在までのところ、乳タンパク質から誘導される抗菌性ペプチドの作用機構に関する決定的な研究はなされていないが、予備的な研究報文には、これらのペプチドの生物活性配列の一部がバクテリアの膜と相互作用してこれを平滑化する機能を有しているということが記載されている（Ｄ．チャップル、Ｄ．Ｊ．マソン、Ｃ．Ｌ．ジョアノウ、Ｅ．Ｗ．オデル、Ｖ．グラント、Ｒ．Ｗ．エバンス、「大腸菌の血清型０１１１に対するヒトのラクトフェリン上の螺旋表面領域に対する抗菌性合成ペプチド相同体の機能と構造との関連性」、インフェクション・アンド・イミュニティー、１９９８年、第６６巻、第２４３４頁〜第２４４０頁参照）。ウシを入手源とするカゼインの酵素による水解物から得られる抗菌活性を有するペプチドが特許文献に記載されている。例えば、αｓ２-カゼインはＥＰ１１１４０６０公報（発明の名称：生物学的流体からのカチオン性ペプチドの製造法）に記載されており、また、β-カゼインとκ- カゼインはＷＯ９９／２６９７１公報（発明の名称：抗菌性ペプチド）に記載されている。類似の加水分解法により、乳漿タンパク質から誘導される抗菌特性を有するペプチドが単離されて同定されている。例えば、ラクトフェリンはＷＯ２００４／０８９９８６公報（発明の名称：トランスフェリン族からの抗菌性ペプチド）に記載されている。
【０００６】
特に重要な別の生物活性ペプチド群は、先進諸国における高血圧に関連する冠動脈疾患の発生率が高いということを考慮するならば、抗高血圧活性を有するペプチド群である。この種のペプチドの多くのものは、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の抑制によるレンニン-アンギオテンシン系の調節によって作用する（Ｔ．タカノ、「乳誘導ペプチドと高血圧の低下」、インターナショナル・デイリー・ジャーナル、１９９８年、第８巻、第３７５頁〜第３８１頁参照）。但し、この種のペプチドの効果が別の機構によってもたらされるという可能性を除外するものではない。
【０００７】
ＡＣＥ-抑制活性（ＡＣＥＩａ）を有する種々のペプチドが発見されている。例えば、この種のペプチドは、カゼインの酵素による水解物から得られており（米国特許第６５１４９４１号明細書参照；発明の名称：抗高血圧性ペプチドに富むカゼイン水解物の製造法）、また、乳漿からも得られている（ＷＯ０１／８５９８４公報；発明の名称：抗高血圧性ペプチドを製造するための乳漿タンパク質の酵素的処理、得られる生成物、及びほ乳類における高血圧症の処置）。抗高血圧性活性を有するペプチドの構造と活性との関連性に関する研究により、該活性がもたらされる過程における特定の疎水性アミノ酸の基本的な役割が明らかにされている（Ｈ．Ｓ．チョン、Ｆ．Ｌ．ワン、Ｍ．Ａ．オンデッチ、Ｅ．Ｆ．サボ及びＤ．Ｗ．クッシュマン、「アンギオテンシン変換酵素の抑制剤とペプチド基質との結合；ＣＯＯＨ-末端ジペプチド配列の重要性」、ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー、１９８０年、第２５５巻、第４０１頁〜第４０７頁参照）。
【０００８】
一部のこの種のアミノ酸の存在は、抗酸化活性を発揮させるためには必須であると考えられており、また、最近になって、該活性の重要性が増している（Ｈ．Ｍ．チェン、Ｋ．ムラモト、Ｆ．ヤマウチ、Ｋ．フジモト及びＫ．ノキハラ、「大豆タンパク質の消化物中に存在するペプチドフラグメントから構築されるヒスチジン含有ペプチドの抗酸化性特性」、ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・フードケミストリー、１９９８年、第４６巻、第４９頁〜第５３頁参照）。種々の変性疾患、例えば、癌、アルツハイマー疾患、白内障又は老化自体は細胞成分、脂質、タンパク質又はＤＮＡの酸化に関連している。このような疾患は、生物体の抗酸化系と酸化剤との間の不均衡の結果として発現する。このような理由から、規定食中への抗酸化性化合物の配合は、このようなタイプの疾患の予防において有用である。さらに、商品中に存在するこのような抗酸化性化合物は、このような食品の腐敗及び該食品への不快な匂いと味の付与の原因となる脂肪の酸化過程を遅延させる。
【０００９】
最近の研究によれば、種々の乳タンパク質とこれらの誘導体が異なる作用機構によって抗酸化活性を発揮する機能を有することが明らかにされている。このため、水解カゼイン（Ｋ．スエツナ、Ｈ．ウケダ及びＨ．オチ、「カゼインから誘導されるペプチドの単離及び遊離ラジカル捕獲活性の特性化」、ジャーナル・オブ・ニュートリショナルバイオケミストリー、２０００年、第１１巻、第１２８頁〜第１３１頁；ＥＰ１１８８７６７公報、発明の名称：カゼインから単離された抗酸化性ペプチド並びに該ペプチドの調製法、単離法及び同定法）又は乳漿タンパク質（Ｂ．ヘルナンデス-レデスマ、Ａ．ダバロス、Ｂ．ボルトロメ及びＬ．アミゴ、「α-ラクトアルブミンとβ-ラクトグロブリンからの酵素による抗酸化性水解物の調製；ＨＰＬＣ-ＭＳ／ＭＳによる活性ペプチドの同定」、ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・フードケミストリー、２００５年、第５３巻、第５８８頁〜第５９３頁）からの遊離ラジカルとキレート化する機能を有するペプチドが関連文献に記載されている。さらに、カゼインは、脂肪の酸化過程を触媒する酵素に対して抑制活性を示すペプチドの主要な原料となっている（Ｓ．Ｇ．リバル、Ｓ．ホルナロリ、Ｃ．Ｇ．ベリュ及びＨ．Ｊ．ウィケルス、「カゼインとカゼイン水解物Ｉ；リポオキシゲナーゼ抑制性ペプチド」、ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・フードケミストリー、２００１年、第４９巻、第２８７頁〜第２９４頁）。
【００１０】
今日まで行われている大部分の研究はウシのカゼインから誘導されるペプチドの生物学的活性を中心に展開されている。しかしながら、ウシ以外のカゼイン、例えば、ヒツジのカゼインやヤギのカゼイン等から誘導されるペプチドによって発揮される生物学的活性に関するデータはほとんど公表されていない。Ｊ．Ａ．ゴメス-ルイス、Ｉ．レシオ及びＡ．ピラントは、大腸菌ＪＭ１０３の代謝活性に対して投与量依存性の強力な抑制効果がβ-カゼインの水解物によってもたらされることを報告している（「ヒツジカゼイン水解物の抗菌活性；予備研究」、ミルヒビッセンシャフト-ミルクサイエンス・インターナショナル、２００５年、第６０巻、第４１頁〜第４５頁参照）。しかしながら、この研究においては、該抑制効果をもたらすペプチドの同定はおこなわれていない。
【００１１】
これに対して、マンチェゴチーズの製造において特徴的な発酵／熟成過程中にヒツジのカゼインから放出されるいくつかの配列（一部の配列はＡＣＥ-抑制活性を発揮している）は実際に同定されている（Ｊ．Ａ．ゴメス-ルイス、Ｍ．ラモス及びＩ．レシオ、「高性能液体クロマトグラフィー-タンデム型マススペクトロメトリーによるマンチェゴチーズにおけるアンギオテンシン-変換酵素抑制性ペプチドの同定と調製」、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー  Ａ、２００４年、第１０５４巻、第２６９頁〜第２７７頁）。これらの配列のＣＩ５０値（酵素活性を５０％抑制する濃度）は２４．１〜１２７５．４μＭである。この研究においては、最も大きなＡＣＥ-抑制活性を示すペプチドは、配列ＶＲＹＬ（ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１１）のαｓ１-カゼインフラグメントｆ（２０５-２０８）のペプチドであり、該ペプチドのＣＩ５０値は２４．１μＭである（Ｊ．Ａ．ゴメス-ルイス、Ｍ．ラモス及びＩ．レシオ、「マンチェゴチーズから単離されたペプチドのアンギオテンシン変換酵素抑制活性；シミュレート化胃腸消化条件下での安定性」、Int. デイリー・ジャーナル、２００４年、第１０７５頁〜第１０８０頁）。
【００１２】
しかしながら、この種のペプチドの腸管障壁の透過能及び生体内での抗高血圧効果の発揮能に関するデータは公表されていない。生体外でＡＣＥ抑制活性を示す多くのペプチドは、生体内で試験する場合には該活性を全て失うか、又は部分的に失うということに留意すべきであり、また、生体外で重要なＡＣＥ-抑制活性を示さないペプチドであっても、生体内においては消化酵素の作用に起因して該活性を示すことがあることに留意すべきである（Ｍ．マエノ、Ｎ．ヤマモト及びＴ．タカノ、「ラクトバシルス・ヘルベチカス（Lactobacillus helveticus）ＣＰ７９０からのタンパク質分解酵素によって生産されるカゼイン水解物から得られる抗高血圧性ペプチドの同定」、ジャーナル・オブ・デイリー・サイエンス、１９９６年、第７９巻、第１３１６頁〜第１３２１頁）。さらに、種々の生物学的活性（例えば、抗高血圧活性、抗菌活性及び／又は抗酸化活性等）を発揮する種々のタイプのカゼインから放出されるペプチドの多機能性の耐性に関する研究は行われていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
食物タンパク質の配列内には、加水分解によって放出されると、生物学的活性を示す領域がある。生物活性ペプチドとして知られているこの種のフラグメントは、胃腸酵素の作用によるタンパク質の加水分解中に生体内で生成され、また、生体外においても、特定の酵素の作用に起因して生成されることがあり、あるいは、特定の食品の調製時に生成されることがある。乳タンパク質の高い生物学的品質を考慮するならば、規定食の一部として摂取されたときに、基礎的な栄養学的機能を発揮すると共に健康の保持と病気の予防に有用な代謝的効果又は生理学的効果を発揮する生物活性ペプチドを乳タンパク質から得ることは特に重要である。乳タンパク質からの生物活性ペプチドの製造は、常套の栄養学的価値を超えてこの栄養素の新たな用途（例えば、薬剤及び栄養と薬効のある製品の製造等）の開発を可能にする。また、この種のペプチドの製造は、健康的で安全な高品質食品であって、乳製品の提供の目的とより高い価値の最大限の利用に貢献する高品質食品の開発に寄与すると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この発明は、乳タンパク質から誘導される生成物であって、抗菌活性及び／又は生体外でのＡＣＥ-抑制活性及び／又は抗高血圧活性及び／又は抗酸化活性を有する生物活性ペプチドを含有する該生成物を、カゼインフラクションの酵素的加水分解によって製造することからなる。
【００１５】
生物活性ペプチドは、該ペプチドの放出に適した部位でのタンパク質鎖の切断を可能にする加水分解条件下でタンパク質分解酵素（好ましくは、ペプシン及び適用可能な「コロラーゼ（Corolase）ＰＰ」（登録商標））を使用することにより、１種又は複数種のタンパク質、ペプチド又はこれらのフラグメントの加水分解によって製造される。両方の酵素を使用して模擬胃腸消化をおこなう場合には、胃腸的に同化される条件にあって血流中へ流入する最小限の機能的ペプチドユニットが得られる。この特性は、これらのペプチドを経口投与以外の他の投与形態で使用することを可能とし、また、これらのペプチドの吸収速度を増大させる。この種のペプチドは化学的合成法又は組換え法等によって製造してもよい。これらのペプチドはペプチド自体として摂取してもよく、あるいは粗製水解物、低分子量濃縮物、又はサイズに基づく分離法若しくはクロマトグラフィー法によって得られるその他の活性サブフラクションから摂取してもよい。
【００１６】
これらの水解物、これらのフラクション又はペプチドは、食物の防腐剤又は摂取されたときに身体の自然な防御機能の増進させる成分として食品の成分を構成してもよく、あるいは、病気の処置用薬剤、特に血圧及び／又は細菌性感染症を抑制するための薬剤の調製用成分として使用してもよい。本発明は、乳タンパク質の有する全ての特性を最大限に利用すると共に該タンパク質の価値をより高めることによって、乳タンパク質の用途を拡大する。
【００１７】
本発明は、乳カゼインから生物活性ペプチドを製造する方法を提供する。この種の生物活性ペプチドは、下記のアミノ酸配列を有することが確認されたペプチドである：
：ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．２、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．３、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．４、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．５、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．６、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．７、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．８、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．９、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１０、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１２、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１３、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１４、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１５、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１６及びＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１７（後記の表１参照）。
これらのペプチドの内の一部のペプチドは抗菌活性及び／又は生体外でのＡＣＥ-抑制活性及び／又は抗高血圧活性及び／又は抗酸化活性を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の出発原料は、動物又は植物を起源とする１種又は複数種のタンパク質又はペプチドを含有するいずれかの適当な基質、又は微生物に由来するいずれかの適当な基質であって、関連する生物活性ペプチドのアミノ酸配列を有する該基質であってもよい。αｓ２-カゼイン配列（ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．２、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．３、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．４、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．５、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．６、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．７、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．８、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．９、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１０；後記の表１参照）に関連する基質、異なるタイプのαｓ２-カゼインを含有する調製物、これらのフラクション、ペプチド又はこれらのあらゆるサイズを有するフラグメントは明らかに使用することができ、これらは単独で使用してもよく、あるいは他のタンパク質と併用してもよい。
【００１９】
αｓ１-カゼイン配列（ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１２、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１３）に関連する基質、異なるタイプのαｓ１-カゼイン、これらのフラクション、ペプチド又はこれらの所望のサイズを有するフラグメントを含有する調製物も明らかに使用することができ、これらは単独で使用してもよく、あるいは他のタンパク質と併用してもよい。β-カゼイン配列（ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１２、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１３）に関連する基質、異なるタイプのβ-カゼイン、これらのフラクション、ペプチド又はこれらの所望のサイズを有するフラグメントを含有する調製物も明らかに使用することができ、これらは単独で使用してもよく、あるいは他のタンパク質と併用してもよい。
【００２０】
従って、所望の１種又は複数種のペプチドに応じて、純粋なαｓ１-カゼイン、純粋なαｓ２-カゼイン、純粋なβ-カゼイン、全カゼイン、カゼイン塩、含有成分の異なる乳、発酵乳製品、乳タンパク質水解物、副乳製品及び動物飼料用乳誘導体等を使用することが可能である。
【００２１】
上記の出発原料は水中又は緩衝溶液中へ適当な濃度で溶解又は分散させる。この場合、ｐＨは、タンパク質分解酵素が作用するために適当な値に調整する。タンパク質分解酵素としては、出発原料中に存在するタンパク質を分解して関連するペプチドをもたらす酵素であれば、いずれの酵素を使用してもよいが、好ましくは、ｐＨ２．０〜３．０の条件下においてペプシンを使用する。基質の発酵とタンパク質の加水分解をもたらすタンパク質分解性微生物を使用してもよい。
【００２２】
加水分解の条件（ｐＨ、温度、酵素−基質比、反応の中断等）は、最も活性な水解物が選択的に得られるように最適化される。１つの特定の実施態様においては、生物活性ペプチドは、次の条件下で加水分解をおこなうことによって製造される。
酵素：ペプシン、
ｐＨ：３．０、
酵素−基質比：３．７／１００（ｐ／ｐ）、
加水分解温度：３７℃、及び
加水分解時間：１０分間〜２４時間（好ましくは３０分未満）。
【００２３】
ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１５及びＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１７（表１参照）として同定され、生体外でのＡＣＥ-抑制活性及び／又は抗高血圧活性を有する生物活性ペプチドは、これらの構造と胃腸酵素に対する耐性に起因して、最小の機能性ペプチドユニットとなる。該ペプチドユニットは、胃腸内で消化された後では、胃腸内で同化され得る状態にあり、血流中へ流入する。出発原料は、動物又は植物を起源とする１種又は複数種のタンパク質又はペプチドを含有するいずれかの適当な基質、又は関連する生物活性ペプチドのアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１５及びＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１７；表１参照）を含む微生物に由来するいずれかの適当な基質であってもよく、好ましくは、αｓ２-カゼイン及びβ-カゼインである。異なるタイプのαｓ２-カゼイン又はβ-カゼインを含有するいずれかの調製物、又はペプチド又はいずれかのサイズを有するこれらのフラグメントは明らかに使用することができ、これらは単独で使用してもよく、あるいはその他のタンパク質と併用してもよい。例えば、純粋なαｓ２-カゼイン、純粋なβ-カゼイン、全カゼイン、カゼイン塩、含有成分の異なる乳、発酵乳製品、乳タンパク質水解物、副乳製品及び動物の飼料用乳誘導体等を使用することが可能である。
【００２４】
加水分解の条件（ｐＨ、温度、酵素−基質比、反応の中断等）は、最も活性な水解物が選択的に得られるように最適化される。１つの特定の実施態様においては、この最適化は、ペプシンで加水分解されたカゼイン、該カゼインの３０００Ｄａ未満のフラクション、又は特定の配列（ＰＶＹＲＹＬ  ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．７及びＨＬＰＬＰＬＬ  ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１３）を含む合成ペプチドの加水分解を、酵素として「コロラーゼＰＰ」を使用し、ｐＨが７〜８で、酵素−基質比が１：２５（ｐ／ｐ）で、温度が３７℃の条件下において約２．５時間おこなうことによって達成される。この反応は、水浴中において反応系を９５℃で１０分間加熱することによって中断させる。コロラーゼＰＰは、タンパク質分解性のブタの膵臓酵素の調製品であって、トリプシンとケモトリプシンのほかにアミノペプチダーゼとカルボキシペプチダーゼを含有する。
【００２５】
次いで、生物活性ペプチドの濃縮が望まれる場合、及び抗菌活性を有するペプチドがカチオン性である場合には、生物活性ペプチドを含有するフラクションの分離をカチオン交換クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によっておこなう。より高いカチオン性フラクションからは、カチオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等、又は好ましくは逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ-ＨＰＬＣ）を使用して活性なサブフラクションを単離することができる。あるいは、生物活性ペプチドは、例えば、限外濾過、透析、適当な孔径を有する膜を用いる電気透析、又はゲル−フィルタークロマトグラフィー等を使用することによって水解物から濃縮させることができる。
【００２６】
完全水解物とそのフラクションのほかに、後記の表１に示す次のペプチドは生物活性特性（主として、抗菌活性及び／又はＡＣＥ−抑制活性及び／又は抗高血圧活性及び／又は抗酸化活性）を発揮し、この種のペプチドも本発明の対象である：ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．２、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．３、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．４、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．５、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．６、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．７、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．８、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．９、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１０、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１２、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１３、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１４。特に、次の配列によって同定されるペプチドはグラム陽性バクテリアに対して抗菌活性を発揮し、また、少なくともＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．３の配列で同定されるペプチドは大腸菌に対して強力な抗菌活性をさらに発揮する：ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．２、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．３、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．４、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．５、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．６、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．７、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．８、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．９、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１０。
【００２７】
さらに、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１及びＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．７の配列によって同定されるペプチドは強力な生体外でのＡＣＥ−抑制活性を発揮し、また、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．７の配列によって同定されるペプチドは、自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）へ経口投与されたときに抗高血圧活性を発揮する。このほかに、少なくともＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．７の配列によって同定されるペプチドは、酸素ラジカル-キレート化機構によってかなり高い抗酸化活性を示す。同様に、補正書においてＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１４の配列によって同定されるβカゼインから得られたペプチドは高いＡＣＥ−抑制活性も発揮する。ペプシン又はコロラーゼＰＰで加水分解されたカゼインのほかに、表１においてＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１５及びＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１７の配列によって同定されるペプチドも、自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）において抗高血圧活性を発揮し、これらのペプチドも本発明の対象である。この種のペプチドが、副作用がほとんどなくて良好な耐性が期待される幅広く消費されている生成物から調製される天然ペプチドであるという事実に特に注目すべきである。
【００２８】
ペプシンによる水解物中で同定された下記の配列で規定される生物活性ペプチド及びコロラーゼＰＰによって得られたペプチド（ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１５、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１６及びＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１７；表１参照）に関しては、これらの配列を考慮した上で、現在利用できる技術を利用することにより、化学的なペプチド合成法及び／又は酵素的ペプチド合成法あるいは組換え法に従って、この種のペプチドを得ることが可能である：ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．２、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．３、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．４、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．５、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．６、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．７、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．８、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．９、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１０、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１２、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１３、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１４。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
ウシ起源のαｓ２-カゼインタンパク質は知られていたが（ＥＰ１１１４０６０公報；生物学的流体からのカチオン性ペプチドの製造法）、ペプシンで加水分解されたヒツジのαｓ２-カゼインから生物活性ペプチドを製造する方法は先行技術文献には記載されていない。マンチェゴチーズに含まれるウシのαｓ２-カゼインとその他のヒツジカゼインから誘導だれるＡＣＥ-抑制活性を有するペプチドは従来から同定されているが（Ｊ．Ａ．ゴメス-ルイス、Ｍ．ラモス及びＩ．レシオ、「高速液体クロマトグラフィーを連結したマススペクトロメトリーによるマンチェゴチーズ中のアンギオテンシン変換酵素抑制性ペプチドの同定と生成」、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィーＡ、２００４年、第１０５４巻、第２６９頁〜第２７７頁）、この種のペプチドの生体内での抗高血圧活性に関する研究はなされていない。従来から同定されているＡＣＥ-抑制活性を有するペプチドの１種は、配列ＶＲＹＬ（ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１１）を有するヒツジのαｓ２-カゼインの２０５〜２０８フラグメントである（ＣＩ５０：２４．１μＭ）。
【００３１】
しかしながら、本発明による配列ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７（ＰＹＶＲＹＬ）（ＣＩ５０：１．９４μＭ）は、従来から知られている該フラグメントに比べて１２倍高いＡＣＥ-抑制活性を有しており、このことは、かなり高い抗高血圧活性及び／又は抗酸化活性及び／又は抗菌活性を発揮させるためには、本発明において見出された該配列全体が必要であることを示す。抗高血圧活性及び／又は抗酸化活性及び／又は抗菌活性を発揮させるためには、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７の配列全体も必要である。さらに、本発明によるＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７配列の模擬胃腸内消化後において、最小の活性フラグメントはＰＹＶ  ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１５配列のフラグメントであることも示される。
【００３２】
一方、この方法によれば、酵素製剤と模擬胃腸内消化条件を採用することによって、特定の生物活性ペプチド（ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１５、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１６、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１７；表１参照）を得ることが可能となる。従って、得られるフラグメントは、加水分解の最終生成物であって、胃腸管内に吸収されて抗高血圧作用の直接的な原因となる物質である可能性がある。しかしながら、血漿ペプチダーゼによるさらなる加水分解は除外されない。小さな活性フラグメントの製造は有利である。何故ならば、この種のフラアグメントは種々の経路によって容易に投与することができ、経口投与されると迅速に作用するからである。
【００３３】
全乳、乳成分、カゼイン及びカゼイン塩等の乳製品は、抗菌活性及び／又はＡＣＥ-抑制活性及び／又は抗高血圧活性及び／又は抗酸化活性を有する生物活性ペプチドを調製するための基質であって、容易に入手しうる安価な基質である。この種の乳製品は、機能性食品、添加剤、食品成分、又は動物及び主としてヒトにおけるあらゆるタイプの感染症及び／又は動脈性高血圧症の治療用及び／又は予防用薬剤として使用に供するためには、熱処理（例えば、低温殺菌処理等）に付すか、又は乾燥処理若しくは凍結乾燥処理に付される。
【００３４】
水解物、低分子量フラクション、ペプチド、これらの誘導体若しくは薬学的に許容される塩又はこれらの任意の混合物の使用量、又はいずれかの疾患を処置するためのこれらの投与量は種々の要因（例えば、年齢、病気又は疾患の程度、投与経路及び投与頻度等）によって左右される。これらの化合物は、いずれかの投与形態（固体状又は液体状）で投与してもよく、また、いずれかの適当な投与経路によって投与してもよいが（例えば、経口投与、気管支投与、直腸投与又は局所投与等）、特に固体状又は液体状の形態で経口投与するように調製される。
【００３５】
一般的には、この種の生成物（即ち、完全水解物、これらのフラクション及びこれらを構成するペプチド）の製造法は、可能な限り多量の生物活性ペプチドが得られるように調整するか、又は一般的には中分子量若しくは低分子量を有する高濃度の疎水性ペプチドに起因する苦味を許容できる程度に調整するよって最適化することができる。
【００３６】
分析方法
１．抗菌活性の測定
抗菌活性は、次の文献に記載の方法に従って測定した：Ａ．ペレグリニ、Ｃ．デルチング、Ｕ．トーマス、Ｐ．フンチカー、「ウシのβ-ラクトグロブリンにおける４つの殺菌性領域の単離と特性化」、ビオキミカ・エ・ビオフィジカ・アクタ、２００１年、第１５２６巻、第１３１頁〜第１４０頁。この場合、微生物としては次の微生物を使用した：
i）大腸菌（Escherichia coli）[アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、ロックヴィル、メリーランド、米国］ＡＴＣＣ  ２５９２２、
ii）リステリア・イノキュア（Listeria innocua）[コレクシオーン・エスパニョーラ・デ・クルチボス・チポ（ＣＥＣＴ）、ヴァレンシア、スペイン］ＣＥＣＴ  ９１０Ｔ、
iii）表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）ＣＥＣＴ  ２３１、
iv）エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis ）ＣＥＣＴ  ７９５、
v) セラチア・マルケセンス（Serratia marcescens ）ＣＥＣＴ  ８５４、及び
vi）スタフィロコッカス・カルノサス（Staphylococcus carnosus ）ＣＥＣＴ  ４４９１Ｔ。
【００３７】
これらの微生物の懸濁液を１％の濃度でブロス（broth）中へ接種した。即ち、大腸菌、セラチア・マルケセンス及びスタフィロコッカス属の菌株はトルプトーゼ・ソイ・ブロス（Tryptose Soy Broth；ＴＳＢ）中へ接種し、エンテロコッカス・フェカーリス及びリステリア・イノキュアは脳-心臓浸出物（ＢＨＩ）ブロス中へ接種した。インキュベーションは、セラチア・マルケセンスの場合は３０℃でおこない、その他の微生物の場合は３７℃でおこなった。
【００３８】
測定を開始するための微生物の接種物は、ＴＳＢ-寒天又はＢＨＩ-寒天中で増殖したコロニーを１０ｍｌのＴＳＢ又はＢＨＩ中において、３７℃又は３０℃で一夜インキュベートした後で得た。微生物の懸濁液（１ｍｌ）は対応する培養液を用いて１／５０に希釈し、次いで各菌株に対して適当な温度において、個体群密度が１〜４×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌになるまでインキュベートした。培養物を２０００×ｇでの遠心分離処理に１０分間付し、沈降した微生物を１５ｍｌの燐酸塩緩衝液（ｐＨ：７．４）を用いて２回洗浄し、個体群密度を１０６ＣＦＵ／ｍｌに調整した。複数のウェルを備えた無菌プレート（グライナー・ラボルテヒニーク社（フリッケンハウゼン、ドイツ）製）上において、微生物の懸濁液５０μｌ、被検物資５０μｌ及び燐酸塩緩衝液１００μｌを、各場合において適当な２％培養液と混合し、得られた混合物を３７℃又は３０℃において２時間インキュベートした。次いで、混合物を１０−５に希釈し、各希釈液１００μｌをＴＳＢ-寒天プレート又はＢＨＩ-寒天プレート上へ添加し、これらのプレートを２４時間インキュベートした後、コロニー数をカウントした。
【００３９】
抗菌活性は次式によって計算した：
抗菌活性＝log （Ｎ０／Ｎｆ）
式中、Ｎ０は試験開始時のコロニーの数（ＣＦＵ／ｍｌ）を示し、Ｎｆは最終的なコロニーの数（ＣＦＵ／ｍｌ）を示す。
【００４０】
２．アンギオテンシン変換酵素抑制活性（ＡＣＥＩａ）の測定
ＡＣＥ-抑制活性は、下記の文献i）に記載の方法を修正した文献ii）に記載されている方法に従って生体外で測定した：
i）Ｄ．Ｗ．クッシュマン及びＨ．Ｓ．チョン、「ウサキの肺中のアンギオテンシン-変換酵素の特性と分光光度的アッセイ」、バイオケミカル・ファーマコロジー、１９７１年、第２０巻、第１６３７頁〜第１６４８頁、及び
ii）Ｙ．Ｋ．キム、Ｓ．ヨーン、Ｄ．Ｙ．ユー、Ｂ．レンネルダール及びＢ．Ｈ．チュン、「大腸菌内で発現された組換えヒトαｓ１-カゼインから誘導された新規なアンギオテンシン-Ｉ-変換酵素抑制性ペプチド」、ジャーナル・オブ・デイリー・リサーチ、１９９９年、第６６巻、第４３１頁〜第４３９頁。
【００４１】
基質としては、シグマ・ケミカル社（セントルイス、ミズリー、米国）製の「ヒプリル・ヒスチジル・ロイシン（hipuril histidil leucine；ＨＨＬ）」を使用した。０．３ＭのＮａＣｌを含有する０．１Ｍ硼酸塩緩衝液（ｐＨ：８．３）に該基質を溶解させることによって、最終濃度が５ｍＭの基質溶液を調製した。ＡＣＥ-抑制活性がアッセイされるべき各試料４０μｌを基質溶液１００μｌ中へ添加した。シグマ社製のＡＣＥ酵素「ＣＥ3.4.5.1」を５０％グリセロールに溶解させた後、試験の実施時に、再蒸留水を用いて該溶液を１／１０に希釈した。反応は、水浴中において３７℃で３０分間おこなった。１ＮのＨＣｌ（１５０μｌ）を用いて反応系のｐＨを低下させることによって酵素を不活性化させた。生成する馬尿酸を酢酸エチル（１０００μｌ）で抽出した。渦状の撹拌処理を２０秒間おこなった後、周囲温度での遠心分離処理（３０００×ｇ）に１０分間付した。有機相から７５０μｌの試料を採取し、該試料を９８℃での加熱蒸発処理に１０分間付した。馬尿酸残渣を再蒸留水（８００μｌ）中へ再溶解させ、該溶液を撹拌処理に２０秒間付した後、２２８ｎｍでの吸光度を測定した。吸光度の測定には、ベックマン・インスツルメント社（ヒュラトン、米国）製のデュア-７０分光光度計を使用した。
【００４２】
下記の式を用いてＡＣＥ-抑制活性の百分率を計算した：
ＡＣＥ-抑制活性（％）＝[（Ａ対照−Ａ試料）／（Ａ対照−Ａブランク）］ ×１００
バックグラウンド吸光度を補正するためにブランクを使用した。ブランクには基質、酵素、及び試料の代わりの再蒸留水（２０μｌ）を含有させ、このときの反応は時間が０の時に停止させた。対照にはインヒビターの不存在下での基質上での酵素作用の１００％が課され、該対照は試料の代わりに水を２０μｌ含有し、そのインキュベーション時間は試料の場合と同様である。
【００４３】
結果はＣＩ５０（μＭ）又は酵素の活性が５０％抑制される濃度で示す。タンパク質の濃度は、パターン（pattern）としてウシ血清アルブミンを使用するビシンコニニン酸（bicinchoninic acid）試験法（ピース-ロッコード社；イリノイ、米国）を利用して決定した。
【００４４】
３．抗酸化活性の測定
酸素ラジカル吸収能（oxygen radical absorption capacity；ＯＲＡＣ ）は、下記の文献の研究者によって開発された方法によって測定した：
Ｂ．Ｘ．オウ、Ｍ．ハンプシュ-ウッディル、Ｒ．Ｌ．プリオー、「蛍光プローブとしてフルオレセインを用いる改良された酸素ラジカル吸収能アッセイの開発と有効性」、２００１年、第４９巻、第４６１９頁〜第４６２６頁。
この方法は、２，２’アゾ-ビス-２-アミジノプロパンジヒドロクロリドの熱分解によってその場で生成されるペルオキシラジカルによるフルオレセインの酸化に基づく方法である（λｅｘｏ ＝ ４９３ｎｍ及びλｃｍ＝ ５１５ｎｍ）。抗酸化剤の存在により、フルオレセインの分解は防止されるか、又は遅延される。
【００４５】
フルオレセインの作用溶液（６０ｎＭ）は、７５ｎＭ燐酸塩緩衝液（ｐＨ：７．５）を溶媒とするフルオレセイン母液（１００μＭ）から日毎に調製した。対照抗酸化剤としては、６-ヒドロキシ-２，５，７，８-テトラメチルクロマン-２-カルボン酸（トロロックス（Trolox））を使用した。この抗酸化剤は、燐酸塩緩衝液を溶媒として濃度が２０ｎＭの溶液（母液）として調製し、−２０℃で保存した。濃度が１２．５μＭ、２５μＭ、４０μＭ、５０μＭ及び１００μＭのパターン溶液を前記の母液から調製し、これらのパターン溶液を分析することによって、トロロックスの検量線を作成した。ＡＡＰＨを燐酸塩緩衝液に溶解させることによって調製した溶液（最終濃度：１４３ｍＭ）は、分解を抑制するために低温で保存した。
【００４６】
アッセイを実施するために、３７５μｌの試料を３７５μｌのＡＡＰＨ溶液と２．２２５ｍｌのフルオレセイン溶液と混合し、得られた混合物を３７℃でインキュベートした。ＲＦ-１５０１型蛍光計（シマズ社製）を用いて５分間毎に蛍光を測定した（λｅｘｏ ＝ ４９３ｎｍ及びλｃｍ＝ ５１５ｎｍ）。蛍光の安定性が実験中に確保されているかどうかを確認するためのフルオレセインと燐酸塩緩衝液を含有するブランク、及びフルオレセイン、ＡＡＰＨ及び燐酸塩緩衝液を含有する正の最大酸化対照から成るアッセイについて対照試験をおこなった。最大抗酸化活性の対照として、４０μＭのトロロックス溶液を各組の被検試料中へ添加した。全ての試料の分析は３回おこなった。
【００４７】
抗酸化活性は、フルオレセインの蛍光低下曲線の「曲線下の面積（area under curve；ＡＵＣ）」を測定することによって定量化し、トロロックス当量（trolox equivalent）（ＯＲＡＣ値）で表示した。ＡＵＣは次式を用いて計算される：
ＡＵＣ＝（０．５＋ｆ５／ｆ０＋ｆ１０／ｆ０＋ｆ１５／ｆ０＋.....＋ｆ３０／ｆ０）
式中、ｆ０は時間が０のときの蛍光を示し、ｆ５等は時間が５分等のときの蛍光を示す。
【００４８】
ペプチドに対する相対的なＯＲＡＣ値は次式を用いて決定される：
ＯＲＡＣ＝［(ＡＵＣ試料-ＡＵＣブランク)／(ＡＵＣトロロックス-ＡＵＣブランク)］×
[(トロロックスの容量モル濃度)／(試料の容量モル濃度)］
【００４９】
４．イオン交換クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によるペプチドフラクションの単離
カチオン型ペプチドフラクションの単離は、下記の文献に記載の方法によっておこなった。但し、ＦＰＬＣ系において「ハイロード（HiLoad）」（登録商標）２６／１０ＳＰセファローズ高速カチオン交換カラム[ファイーマシア社（ウプサラ、スウェーデン）製］を使用することによって該方法の一部を改変した。
Ｉ．レシオ、Ｓ．ヴィッセル、「ウシのαｓ２-カゼインの配列内の２種の抗菌性領域の同定」、ビオキミカ・エ・ビオフィジカ・アクタ、１９９９年、第１４２８巻、第３１４頁〜第３２６頁。
【００５０】
Ａ相及びＢ相はそれぞれ１０ｎＭのＮＨ４ＨＣＯ３（ＨＣＯＯＨを用いてｐＨを７．０に調整した）及び１．５ＭのＮＨ３を含有した。濃度を５ｍｇ／ｍｌに調整した試料をＡ相に溶解させた後、その５ｍｌをファーマシア製の「スーパーループ（Superloop）」（登録商標）を用いて注入した。水解物は５ｍｌ／分の流速で溶離した。１００％の溶剤Ａを２０分間適用した後、溶剤Ａ中の溶剤Ｂの濃度が０〜５０％になる濃度勾配を６０分間適用し、次いで５０％の溶剤Ｂを２０分間適用した。検出は２１４ｎｍの吸光度でおこなった。カラムと移動相の温度は９℃に設定した。フラクションはクロマトグラフィー分析を数回行った後に捕集した。
【００５１】
５．逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＦ-ＨＰＬＣ）を用いる半予備的スケールでのペプチドフラクションの単離
ウォーターズ社（ミルフォード、マサチューセッツ、米国）製のシステムであって、２台のプログラム制御ポンプ「ウォーターズ・デルタ６００型」、９６６型ダイオードアレイ（diode array）検出器、７１７型プラス自動注入器、及びフラクションの自動捕集器からなるシステム使用した。カラムガードとしてＣ１８カートリッジ（ウォーターズ社製）を備えた「Ｃ１８プレプ・ノバ・パック（登録商標）ＨＲカラム（７．８×３００ｍｍ；孔径６μｍ）」を使用した。分析は３０℃でおこない、検出は２１４ｎｍと２８０ｎｍでおこなった。データの取得は、ウォーターズ社製の「ミレニウム・ソフトウェア（ヴァージョン３．２）」を用いておこなった。
【００５２】
αｓ２-カゼイン試料は２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で調製し、注入に先立って遠心分離処理（１６０００×ｇ）に１０分間付した。試料を溶離させるために、０．１％及び０．０８％のトリフルオロ酢酸を含有する２成分のミリＱ（登録商標）水勾配（相Ａ）及びアセトニトリル（相Ｂ）をそれぞれ使用した（流速：４ｍｌ／分）。相Ｂの勾配は０〜４０％（５０分間）及び４０〜７０％（５分間）に設定し、カラムは７０％のＢを用いて５分間洗浄した後、出発状態にするための再状態調整処理に２５分間付した。３００μｌの試料を注入した。全カゼイン試料は１００ｍｇ／ｍｌの濃度に調整し、注入に先立って、０．４５μｍの孔径を有するフィルターを通過させた。試料を溶離させるために、０．１％及び０．０８％のトリフルオロ酢酸を含有する２成分のミリＱ（登録商標）水勾配（相Ａ）及びアセトニトリル（相Ｂ）をそれぞれ使用した（流速：４ｍｌ／分）。相Ｂの勾配は０〜３５％（７０分間）及び３５〜７０％（５分間）に設定し、カラムは７０％のＢを用いて５分間洗浄した後、出発状態にするための再状態調整処理に２０分間付した。５０μｌの試料を注入した。
【００５３】
６．タンデム型マススペクトロメトリーによる分析（オフライン）
この分析には、「エスクワイア（Esquire）３０００イオントラップ（ion trap）システム」[ブルッカー・ダルトニーク社（ブレーメン、ドイツ）製］を使用した。試料溶液は、蟻酸を０．０１％（ｖ／ｖ）含有する水／アセトニトリル５０％（ｖ／ｖ）溶液を溶媒として２ｍｇ／ｍｌの濃度で調製した。この試料溶液は、「２２型シリンジポンプ」［ハーバード・アパレイタス社（サウスネイチック、マサチューセッツ、米国）製］を使用して電気噴霧ネブライザー内へ４μｌ／分の流速で注入した。このシステムにおいては、噴霧／乾燥ガスとして窒素ガスを使用し、５×１０−３bar のヘリウム圧条件下で作動させた。マススペクトルは、１００〜２０００ｍ／ｚの間隔で、１３０００Ｄａ／秒の速度によって得た。ペプチド配列を同定するためのタンデム型マススペクトルの解析は「バイオツールズ２．１プログラム」［ブルッカー・ダルトニーク社（ブレーメン、ドイツ）製］を使用しておこなった。
【００５４】
７．タンデム型マススペクトロメトリーへオンラインで接続したＲＰ−ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）による分析
この分析には、「エスクワイア−ＬＣシステム」[ブルッカー・ダルトニーク社（ベレーメン、ドイツ）製］を使用した。ＨＰＬＣ（１１００シリーズ）システムは四元ポンプ、自動インジェクター、溶離液の脱気系、及び波長可変型紫外線検出器［アジレント・テクノロジーズ社（ヴァルトブロン、ドイツ）］を具備する。該紫外線検出器は「エスクワイア３０００イオントラップ型マススペクトロスコピー」（ブルッカー・ダルトニーク社製）へオンラインで接続させた。カラムとしては、長さが２５０ｍｍで、内径が４．６ｍｍで、充填粒子の粒径が５μｍである「ハイポア（Hi-Pore）Ｃ１８カラム」［バイオ−ラード・ラボラトリーズ社（リッチモンド、カリホルニア、米国）］を使用した。溶剤Ａとしては、水とトリフルオロ酢酸との混合物（混合比；１０００：０．３７）を使用し、溶剤Ｂとしては、アセトニトリルとトリフルオロ酢酸との混合物（混合比；１０００：０．２７）を使用した。４．５ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した試料溶液（５０μｌ）を注入した。流速は０．８ｍｌ／分とし、６０分間における溶剤Ａ中の溶剤Ｂの一次勾配は０％〜５０％とした。溶離液は、直前のセクションに記載の条件と同じ条件下において、質量−吸光分光分析法によって２１４ｎｍで監視した。但し、この場合には、ネブライザーを通過する試料溶液の注入速度は２７５μｌ／分とした。
【００５５】
８．自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）における抗高血圧活性に関する試験
同定された数種のペプチドの自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）の血圧に対する効果を検討した。この試験に使用したペプチドは化学的に合成した。この試験においては、生後１７〜２０週間のオスのＳＨＲ（体重：３００〜３５０ｇ）を使用した。これらのラットはチャールズ・リヴァー・ラボラトリーズ・エスパーニャ社から入手した。１ケージあたり５匹の割合で複数のケージ内に収容した。これらのケージは定温（２５℃）で１２時間の明暗サイクル条件下に保持し、ラットには好きなときに水と餌を与えた。収縮期血圧（ＳＢＰ）と拡張期血圧（ＤＢＰ）を測定した。この測定においては、尾部-カフ（tail-cuff）法を使用した。この方法に関しては、次の文献を参照されたい：Ｒ．Ｄ．ブニャーク、「覚醒時のラットにおける収縮期血圧を測定するための尾部-カフ法の検証」、J. Appl. Physiol. 、１９７３年、第３４巻、第２７９頁〜第２８２頁。
【００５６】
レチカ社製の装置「Ｌｅ５００１」を使用することによって、ＳＢＰ値及びＤＢＰ値をディジタル形式で自動的に得た。この装置を使用することによって、被検動物の心拍数の記録と増進が可能となる。尾部-カフと変換器をラットの尾部へ装着させる前に、ラットを３７℃付近の温度条件下に曝すことによって尾動脈の拡張を促進させた。さらに、測定の信頼性を保証するために、当該試験を実施する前に、ラットを２週間にわたって試験手順に慣らさせた。ＳＢＰ値及びＤＢＰ値は、これらの２種の測定値の各々について連続的に測定を３回行った後の平均値を計算することによって決定した。上記の試験に使用した自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）は、１９０〜２２０ｍｍＨｇのＳＢＰ値及び１３０〜１８０ｍｍＨｇのＤＢＰ値を示した。
【００５７】
被験生成物は、午前９時〜午前１０時の時間内において胃内カテーテルを用いて投与した。この場合、被験投与物は１ｍｌの蒸留水に溶解させた状態で投与した。ＳＢＰ値とＤＢＰ値は投与の前に読み取り、また、投与後のこれらの値は２時間毎に読み取り、投与から８時間経過するまで測定した。さらに、ＳＢＰ値とＤＢＰ値は、被験生成物を投与してから２４時間経過後にも測定した。カテーテルを挿入したラットにおけるＳＢＰとＤＢＰの概日性変化（circadian variation）を評価するための負対照として、胃内カテーテルを用いて１ｍｌの水を投与したラットを用いた同様の試験において得られたＳＢＰとＤＢＰの測定値を用いた。正対照として、カプトプリル（プロトタイプのＡＣＥ-抑制剤）を５０ｍｇ／ｋｇ投与したラットを用いた同様の試験において得られたＳＢＰとＤＢＰの測定値を用いた。この投与量のカプトプリルは、蒸留水１ｍｌに溶解させた状態で各々のラットへ投与した。
【００５８】
得られた結果を分類し、少なくとも６回の均等試験における測定値の標準誤差（ＳＥＭ）の±平均値を計算した。これらを比較するために、分散の一元分析（one-way analysis）をおこなった後、ボンフェロニ試験（Bonferroni test）をおこなった。ｐ＜０．０５の値差は有意なものとした。
【００５９】
次に添付図面について簡単に説明する。
図１は、ペプシンを用いる加水分解処理に３０分間付したヒツジのαｓ２-カゼインをカチオン交換クロマトグラフィーに付して得られたクロマトグラムを示す。この場合、５種のフラクション（ＦＡ〜ＦＥ）を選択し、これらのフラクションを手動で捕集し、Ｘ軸に時間（分）をプロットした。
【００６０】
図２Ａは、ペプシンを用いる加水分解処理に３０分間付したヒツジのαｓ２-カゼインから捕集されたＦＣフラクションを半予備的規模での逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ-ＨＰＬＣ）に付して得られたクロマトグラムを示す。この場合、４種のサブフラクション（ＦＣ１〜ＦＣ４）を選択し、これらのサブフラクションを手動で捕集し、Ｘ軸に時間（分）をプロットした。
【００６１】
図２Ｂは、ペプシンを用いる加水分解処理に３０分間付したヒツジのαｓ２-カゼインから捕集されたＦＤフラクションを半予備的規模での逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ-ＨＰＬＣ）に付して得られたクロマトグラムを示す。この場合、２種のサブフラクション（ＦＤ１〜ＦＤ２）を選択し、これらのサブフラクションを手動で捕集し、Ｘ軸に時間（分）をプロットした。
【００６２】
図３は、半予備的規模でのＲＰ-ＨＰＬＣによるＦＣフラクションとＦＤフラクションから得られた種々のサブフラクションの抗菌活性を示す。
【００６３】
図４は、自然発症高血圧ラットにおける収縮期血圧（ＳＢＰ）の低下及び拡張期血圧（ＤＢＰ）の低下が、１ｍｌの水（○）、５０ｍｇ／ｋｇのカプトプリル（□）、３ｍｇ／ｋｇのＰＹＶＲＹＬ（▲）及び３ｍｇ／ｋｇのＬＫＫＩＳＱ（◆）を胃内カテーテルでこれらのラットへ投与することによってもたらされたことを示す。「Ｔ（ｈ）」は水等の投与後の経過時間（時）を示す。これらのデータは、少なくとも６匹のラットにおけるＳＥＭの±平均値を示しており、水の場合はａＰ＜０．０５であり、カプトプリルの場合はｂＰ＜０．０５であり、また、ＰＹＶＲＹＬの場合はｃＰ＜０．０５である。
【００６４】
図５は、自然発症高血圧ラットにおける収縮期血圧（ＳＢＰ）の低下及び拡張期血圧（ＤＢＰ）の低下が、１ｍｌの水（○）、５０ｍｇ／ｋｇのカプトプリル（□）、４００ｍｇ／ｋｇのカゼイン（◆）、４００ｍｇ／ｋｇのカゼイン水解物（▲）及び２００ｍｇ／ｋｇのカゼイン水解物（Ｆ＜３０００Ｄａ）（■）を胃内カテーテルでこれらのラットへ投与することによってもたらされたことを示す。「Ｔ（ｈ）」は水等の投与後の経過時間（時）を示す。これらのデータは、少なくとも４匹のラットにおけるＳＥＭの±平均値を示しており、水の場合はａＰ＜０．０５であり、カプトプリルの場合はｂＰ＜０．０５であり、また、カゼイン（４００ｍｇ／ｋｇ）の場合はｃＰ＜０．０５である。
【００６５】
図６のＡは、ペプシンを用いる加水分解処理に３時間付したカゼインから得られた３０００Ｄａの少量のフラクションを半予備的規模での逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ-ＨＰＬＣ）に付して得られたクロマトグラムを示す。この場合、Ｘ軸における時間（分）に対して、２１４ｎｍにおける吸光度をＹ軸にプロットした。
図６のＢは、ＲＰ-ＨＰＬＣによって得られた図６のＡに対応するクロマトグラフィーフラクションのアンギオテンシン-変換酵素抑制活性を示す。この場合、強いＡＣＥ-抑制活性を有する３種のフラクション（Ｆ３、Ｆ５及びＦ６）を自動的に捕集した。
【００６６】
図７は、ペプシンと「コロラーゼＰＰ」を用いる連続的な加水分解処理に付した前後における合成ペプチドＰＹＶＲＹＬ  ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７のＲＰ-ＨＰＬＣによるクロマトグラムを示す。この場合、Ｘ軸の時間（分）に対して、２１４ｎｍにおける吸光度をＹ軸にプロットした。
【００６７】
図８は、自然発症高血圧ラットにおける収縮期血圧（ＳＢＰ）の低下及び拡張期血圧（ＤＢＰ）の低下が、１ｍｌの水（○）、５０ｍｇ／ｋｇのカプトプリル（□）、３ｍｇ／ｋｇのＰＹＶＲＹＬ（◆）及び２ｍｇ／ｋｇのＰＹＶ（■）を胃内カテーテルでこれらのラットへ投与することによってもたらされたことを示す。「Ｔ（ｈ）」は水等の投与後の経過時間（時）を示す。これらのデータは、少なくとも４匹のラットにおけるＳＥＭの±平均値を示しており、水の場合はａＰ＜０．０５であり、カプトプリルの場合はｂＰ＜０．０５であり、また、３ｍｇ／ｋｇのＰＹＶＲＹＬの場合はｃＰ＜０．０５である。
【００６８】
図９は、ペプシンと「コロラーゼＰＰ」を用いる連続的な加水分解処理に付した前後における合成ペプチドＨＬＰＬＰＬＬ  ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１４のＲＰ-ＨＰＬＣによるクロマトグラムを示す。この場合、Ｘ軸の時間（分）に対して、２１４ｎｍにおける吸光度をＹ軸にプロットした。
【００６９】
図１０は、自然発症高血圧ラットにおける収縮期血圧（ＳＢＰ）の低下及び拡張期血圧（ＤＢＰ）の低下が、１ｍｌの水（○）、５０ｍｇ／ｋｇのカプトプリル（□）、及び７ｍｇ／ｋｇのＨＬＰＬＰ（●）を胃内カテーテルでこれらのラットへ投与することによってもたらされたことを示す。「Ｔ（ｈ）」は水等の投与後の経過時間（時）を示す。これらのデータは、少なくとも４匹のラットにおけるＳＥＭの±平均値を示しており、水の場合はａＰ＜０．０５であり、カプトプリルの場合はｂＰ＜０．０５である。
【実施例】
【００７０】
以下に説明する実施例は、本発明を例示的に説明するものであって、本発明の範囲を制限するものではない。
実施例１
抗菌活性、ＡＣＥ-抑制活性、抗高血圧活性及び抗酸化活性を有する生物活性ペプチドを、ペプシンで加水分解されたヒツジのαｓ２-カゼインから製造する方法
次の文献に記載の方法に従ってヒツジのカゼイン残屑（rest）から得られたαｓ２-カゼインを基質として使用することによって水解物を得た：Ｈ．Ｊ．ヴレーマン、Ｊ．Ａ．Ｍ．ファン・リール、「ウシのカゼインからのαｓ２-カゼインの大規模単離」、ネザーランズ・ミルク・アンド・デイリー・ジャーナル、１９９０年、第４４巻、第４３頁〜第４８頁。酵素としては、シグマ・ケミカル社（セントルイス、米国）から入手したブタの胃から採取したブタペプシン（Ｅ．Ｃ．3.4.23.1.570 Ｕ／ｍｇタンパク質）を使用した。ヒツジのαｓ２-カゼインの０．５％水溶液を調製し、該水溶液のｐＨは１ＭのＨＣｌを用いて３．０に調整した後、ペプシンを添加した［酵素／基質比：３．７／１００（ｐ／ｐ）］。加水分解を３７℃で３０分間おこなった。反応系を８０℃で１５分間加熱することによってペプシンを不活性化させた後、該系のｐＨを１ＭのＮａＯＨで７．０に調整した。水解物を５℃で１６０００×ｇの条件下での遠心分離処理に１５分間付した後で捕集した上澄み液をＦＰＬＣによる分析処理に付し（図１参照）、分離された５種のフラクション（ＦＡ〜ＦＥ）を手動で捕集した後、凍結乾燥した。
【００７１】
これらの５種のフラクションの２．５ｍｇ／ｍｌ濃度における抗菌活性を測定した。対照としては大腸菌（５．９×１０３ＣＦＵ／ｍｌ）を使用した。得られた結果によれば、ＦＣフラクション及びＦＤフラクションが抗菌活性を示し、それぞれ２．５４及び０．６のオーダーで微生物数を低減させた。
【００７２】
抗菌活性をもたらすペプチドを同定するために、ＦＣフラクションとＦＤフラクションを半予備的規模でのＲＰ-ＨＰＬＣによる分析処理に付した。図２はＦＣフラクションのクロマトグラフィー図形（図２Ａ）とＦＤフラクションのクロマトグラフィー図形（図２Ｂ）を示す。ＦＣフラクションからは４種のサブフラクション（ＦＣ１〜ＦＣ４）が分離され、ＦＤフラクションからは２種のサブフラクション（ＦＤ１〜ＦＤ２）が分離された。これらのフラクションの各々のフラクションは、分離後にアセトニトリルを蒸発させ、次いで凍結乾燥させた。これらのサブフラクションの大腸菌（６．２×１０６ＣＦＵ／ｍｌ）に対する抗菌活性は、２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で測定した。
【００７３】
図３は、大腸菌に対するこれらのサブフラクションの抗菌活性の値を示す。これらのサブセクションの内で特にＦＣ１に注目すべきである。即ち、該サブフラクションは、試験した濃度［log （Ｎｆ／Ｎ０）＞６］において殺菌効果を示したと考えられるので、比較的大きな抗菌活性を示したことになる。ＦＣ４サブフラクション、ＦＤ１サブフラクション及びＦＤ２サブフラクションは穏やかな抗菌活性を示し、微生物の減少値はそれぞれ１．２４、１．３１及び１．６４のオーダーである。
【００７４】
ＦＣ１サブフラクション、ＦＣ４サブフラクション、ＦＤ１サブフラクション及びＦＤ２サブフラクションは、先に説明した方法に従って、イオントラップ分析器を用いるマススペクトロメトリーによって分析した。同定されたペプチドを以下の表２に示す。
【００７５】
【表２】
2008545774.tif 000003
【００７６】
実施例２
抗菌活性を有する化学的に合成されたペプチド
ペプシンを用いる加水分解処理に３０分間付したヒツジのαｓ２-カゼインから得られたサブフラクション中に一般的に存在するペプチド（ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．２、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．３及びＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７）を化学的に合成した。即ち、これらのペプチドはフモック固相法（Fmoc solid-phase method ）に従って合成し、該ペプチドの純度はＲＰ-ＨＰＬＣ-ＭＳ／ＭＳによって確認した。
【００７７】
次の微生物に対するこれらの合成ペプチドの抗菌活性は０．０５ｍＭの濃度で測定した：大腸菌、セラチア・マルケセンス、スタフィロコッカス・カルノサス、スタフィロコッカス・エピデルミジス、エンテロコッカス・フェカーリス及びリステリア・イノキュア。これらの合成ペプチドの抗菌活性を以下の表３に示す。
【００７８】
【表３】
2008545774.tif 000004
【００７９】
これらのペプチドはグラム陽性細菌、特に試験に供したスタフィロコッカス属の菌株に対して高い抗菌活性を示す。これらのペプチドの内の３種（ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．２、及びＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．３）はスタフィロコッカス・カルノサスに対して抗菌活性を示す。しかしながら、グラム陰性細菌（大腸菌及びセラチア・マルケセンス）は全てのこれらのペプチドの作用に対して高い耐性を示す。但し、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．３として同定されたペプチドが大腸菌に対して高い抗菌活性を示すという事実には特に注目すべきである。
【００８０】
実施例３
ＡＣＥ-抑制活性と抗高血圧活性を有する化学的に合成されたペプチド
化学的に合成されたペプチドの内の２種のペプチド（特に、実施例１において言及した配列ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１及びＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７）のＡＣＥ-抑制活性を測定した。ＣＩ５０値又は酵素活性を５０％抑制するために必要なタンパク質の濃度で表示される活性の結果を以下の表４に示す。これらの２種のペプチドは強力なＡＣＥ−抑制活性を示す。
【００８１】
【表４】
2008545774.tif 000005
【００８２】
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１及びＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７の抗高血圧活性に関する試験をおこなった。この試験は、これらのペプチド３ｍｇ／ｋｇの濃度で自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）へ投与することによっておこなった。これらのペプチドは蒸留水に溶解させ、得られた溶液１ｍｌに含まれる相当する量のペプチドを各々のラットへ投与した。
【００８３】
図４は、３ｍｇ／ｋｇのＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１ペプチド及びＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７ペプチドを自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）へ投与した後の種々の時点において測定した該ラットにおけるＳＢＰとＤＢＰの低下度を示す。ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７ペプチドの投与によって、これらの被検動物におけるＳＢＰ及びＤＢＰを著しく低下させることができる。これらの変数の低下は、該ペプチドの投与から４時間経過後にピークに達する。この低下現象は、抗高血圧活性を示すことが証明されているカプトプリルの投与によってもたらされるＳＢＰとＤＢＰの低下現象の経時変化と類似の経時変化を示す。これらの結果は、配列ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７によって同定されたペプチドが、急性の被検体（acute basis）へ経口投与されたときに、明確で顕著な抗高血圧効果をもたらすことを示す。
【００８４】
実施例４
抗酸化活性を有する化学的に合成されたペプチド
実施例１において言及したＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７配列の抗酸化活性を測定した。ペルオキシルラジカルのキレート化活性は次の通りである：
ＯＲＡＣＰＹＶＲＹＬ＝１．８２μmol トロロックス当量／μmol ペプチド
これらの結果は、ＰＹＶＲＹＬ（ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７）が１μmol のトロロックスよりも１．８２倍高い抗酸化活性を発揮することを示す。
【００８５】
実施例５
ＡＣＥ-抑制活性を有する生物活性ペプチドを、ペプシンを用いてウシカゼインから製造する方法
原料牛乳の等電沈殿によって得られたウシカゼイン基質を用いて加水分解をおこなった。酵素としては、シグマ・ケミカル社（セントルイス、米国）から入手したブタの胃から採取したブタペプシン（Ｅ．Ｃ．3.4.23.1.570 Ｕ／ｍｇタンパク質）を使用した。ウシのカゼインの０．５％水溶液を調製し、該水溶液のｐＨは１ＭのＨＣｌを用いて２．０に調整した後、ペプシンを添加した［酵素／基質比：３．７／１００（ｐ／ｐ）］。加水分解を３７℃で３時間おこなった。反応系を８０℃で２０分間加熱することによってペプシンを不活性化させた後、該系のｐＨを１ＭのＮａＯＨで７．０に調整した。水解物を５℃で１６０００×ｇの条件下での遠心分離処理に１５分間付した後で捕集した上澄み液を、孔径が３０００Ｄａの親水性膜（「セントリペップ（Centripep）」；アミコン社（ビバリー、マサチューセッツ、米国）製）を用いる限外濾過処理に付した。
【００８６】
全水解物と透過液（３０００Ｄａ未満の分子量を有する水解物のフラクション）のＡＣＥ-抑制活性と抗高血圧活性を、前記の分析法に従ってＳＨＲにおいて決定した。ＣＩ５０値又は酵素活性を５０％抑制するために必要なタンパク質の濃度で表示されるＡＣＥ-抑制活性、及びケルダール法によって測定したタンパク質の含有量を以下の表５に示す。
【００８７】
【表５】
2008545774.tif 000006
【００８８】
図５は、カゼイン水解物の投与後及びカゼイン水解物フラクション（分子量：３０００Ｄａ未満）の投与後から種々の時点でのＳＨＲにおけるＳＢＰとＤＢＰの低下を示す。図５から明らかなように、カゼイン水解物の投与によって、これらのラットにおけるＳＢＰとＤＢＰの著しい低下がもたらされる。また、３０００Ｄａ未満の分子量を有するカゼイン水解物フラクションを投与する場合にもたらされるＳＨＲにおけるＳＢＰとＤＢＰの低下度は、カゼイン水解物の投与後にもたらされる対応する低下度と類似する。これらの値の低下は、これらの被験物の投与から２時間後にピークに達する。非加水分解カゼインを投与する場合には、ＳＨＲにおけるＳＢＰの著しい改善はみられず、また、ＤＢＰの低下度も前記の被験物を投与した場合に比べて非常に小さい。これらの結果は、カゼイン水解物及びカゼイン水解物フラクション（分子量：３０００Ｄａ未満）を急性の被検体へ経口投与する場合には、明確な抗高血圧効果がもたらされることを示す。
【００８９】
ＡＣＥ-抑制活性と抗高血圧活性をもたらすペプチドを同定するために、限外濾過後の透過液を半予備的規模でのＲＰ-ＨＰＬＣによる分離処理に付すことによって８種のフラクションを捕集した。アセトニトリル溶媒を蒸発させた後、クロマトグラフィーのフラクションを凍結乾燥させ、次いでＡＣＥ-抑制活性とタンパク質含有量をビシンコニニン酸（bicinchoninic acid）法によって決定した。図６は、クロマトグラム、得られたフラクション、及び各々のフラクションに関するＡＣＥ-抑制活性（ＣＩ５０値）を示す。図６に示すフラクション（Ｆ３、Ｆ５及びＦ６）は大きなＡＣＥ-抑制活性（即ち、小さなＣＩ５０値）を示す。前述の方法により、タンデム型マススペクトロメトリーへオンラインで接続したＲＰ-ＨＰＬＣ（ＲＰ-ＨＰＬＣ-ＭＳ／ＭＳ）を使用してこれらのフラクションを分析した。同定された主要なペプチドを以下の表６に示す。
【００９０】
【表６】
2008545774.tif 000007
【００９１】
これらのクロマトグラフィーフラクションから得られた主要なペプチドを固体相フモック（Ｆｍｏｃ法によって化学的に合成し、これらの純度をＲＰ-ＨＰＬＣ-ＭＳ／ＭＳによって確認した。化学的に合成したペプチド、特に配列ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１２、ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１３及びＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１４で示されるペプチドのＡＣＥ-抑制活性を測定した。ＣＩ５０値又はＡＣＥ活性を５０％抑制するために必要なタンパク質の濃度で表示される測定結果を以下の表７に示す。同定された３種の主要なペプチドの内の少なくとも２種のペプチドは強いＡＣＥ-抑制活性を示した。
【００９２】
【表７】
2008545774.tif 000008
【００９３】
実施例６
αｓ２-カゼインＰＹＶＲＹＬ  ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．７の加水分解によって得られたフラグメントを模擬胃腸内消化処理に付した後のペプチドのＡＣＥ-抑制活性と抗高血圧活性
αｓ２-カゼイン水解物中において先に同定されたＰＹＶＲＹＬ  ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．７ペプチドを化学的に合成し、次の文献に記載の模擬的胃腸内消化を発現する２段階の加水分解処理に付した：Ａ．Ｃ．アルティング、Ｒ．Ｊ．Ｇ．Ｍ．マイイェル、Ｅ．Ｃ．Ｈ．ファン・ベレスタイン、「幼児の模擬胃腸内条件下におけるウシ血清アルブミンのＡＢＢＯＳエピトープの不完全除去」、ダイアベーテス・ケア、１９９７年、第２０巻、第８７５頁〜第８８０頁。この目的のために、合成ペプチドの水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を、最初に、シウグマ社から入手したペプシン（Ｅ．Ｃ．3.4.4.1、５７０Ｕ／ｍｇタンパク質）を用いる３７℃での加水分解処理に９０分間付し（ｐＨ２．０；酵素-基質比１：５０（ｐ／ｐ））、次いで、レーム社（ダルムシュタット、独国）製の「コロラーゼＰＰ」を用いる３７℃での加水分解処理に２．５時間付した（ｐＨ７〜８；酵素-基質比１：２５（ｐ／ｐ））。該反応溶液を水浴中において９５℃で１０分間加熱することによって反応を中断させた。
【００９４】
図７は、ＰＹＶＲＹＬペプチドＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．７がペプシンとコロラーゼＰＰを用いるインキュベーション処理に付した後では完全に加水分解することを示す。ＲＰ-ＨＰＬＣ-ＭＳ／ＭＳによって同定された主要なフラグメントはトリペプチドＰＶＹ  ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１５である。このペプチドを化学的に合成し、そのＡＣＥ-抑制活性（ＣＩ５０値）を測定したところ、７４１．３μＭであった。この値は、該ペプチドのＡＣＥ-抑制活性が出発ペプチドの対応する値の１／３７０であることを示す。このトリペプチドＰＶＹ  ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１５の抗高血圧活性は、該トリペプチドをＳＨＲへ投与することによって測定した。このトリペプチドを蒸留水に溶解させ、所定濃度の水溶液１ｍｌを投与した。
【００９５】
図８は、ＰＹＶ  ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１５を２ｍｇ／ｋｇ投与した後及びＰＹＶＲＹＬペプチドＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．７を３ｍｇ／ｋｇ投与した後の種々の時点でのＳＨＲにおけるＳＢＰとＤＢＰの低下を示す。図８から明らかなように、これらのラットにおいては、いずれのペプチドを投与してもＳＢＰとＤＢＰの著しい低下がもたらされる。ＰＹＶ  ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１５によるＳＢＰに関するピーク効果は、該ペプチドの投与後２時間で発生するが、ＰＹＶＲＹＬペプチドＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．７によるピーク効果は、該ペプチドの投与後４時間経過するまで発生しない。ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１５を投与する場合の抗高血圧効果のより速い発生は、次の事実に起因すると考えられる。即ち、この配列のペプチドが投与されると、生体内では発生しなければならない酵素的消化過程が回避される。これらの結果はＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１５の抗高血圧活性を例証する。もっとも、原則的には、この抗高血圧活性はＡＣＥ-抑制活性に起因しない。ＰＹＶペプチドＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１５の強力な抗高血圧活性は現在までのところ知られていなかったという点に注目することが重要である。
【００９６】
実施例７
完全カゼインＨＬＰＬＰＬＬ  ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１４の加水分解によって得られたフラグメントを模擬胃腸内消化処理に付した後のペプチドのＡＣＥ-抑制活性と抗高血圧活性
全カゼイン水解物のフラクション（分子量：３０００Ｄａ未満）中において予め同定されたＨＬＰＬＰＬＬペプチドＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１４を化学的に合成し、次の文献に記載の模擬的胃腸内消化を発現する２段階の加水分解処理に付した：Ａ．Ｃ．アルティング、Ｒ．Ｊ．Ｇ．Ｍ．マイイェル、Ｅ．Ｃ．Ｈ．ファン・ベレスタイン、「幼児の模擬胃腸内条件下におけるウシ血清アルブミンのＡＢＢＯＳエピトープの不完全除去」、ダイアベーテス・ケア、１９９７年、第２０巻、第８７５頁〜第８８０頁。この目的のために、合成ペプチドの水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を、最初に、シウグマ社から入手したペプシン（Ｅ．Ｃ．3.4.4.1、５７０Ｕ／ｍｇタンパク質）を用いる３７℃での加水分解処理に９０分間付し（ｐＨ２．０；酵素-基質比１：５０（ｐ／ｐ））、次いで、レーム社（ダルムシュタット、独国）製の「コロラーゼＰＰ」を用いる３７℃での加水分解処理に２．５時間付した（ｐＨ７〜８；酵素-基質比１：２５（ｐ／ｐ））。該反応溶液を水浴中において９５℃で１０分間加熱することによって反応を中断させた。
【００９７】
図９は、ＲＰ-ＨＰＬＣ-ＭＳ／ＭＳによって同定されたＨＬＰＬＰＬＬペプチドＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１４の加水分解によって得られたペプチドを示す。これらのペプチドはＨＬＰＬＰＬヘキサペプチドＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１６及びＨＬＰＬＰペンタペプチドＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１７に相当する。ＨＬＰＬＰＬ  ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１６は中間フラグメントであるが、ペンタペプチドＨＬＰＬＰ  ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１７は胃腸内酵素の作用に対して耐性を示すので、ＨＬＰＬＰＬＬペプチドＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１４の最終的なタンパク質加水分解生成物であると考えられる。ＨＬＰＬＰペンタペプチドＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１７のＡＣＥ-抑制活性（ＣＩ５０値）を測定したところ、２１μＭであった。同様にして、加水分解によって得られた最終的なペプチドＨＬＰＬＰ  ＳＥＱ．ＩＤ  Ｎｏ．１７をＳＨＲへ７ｍｇ／ｋｇ投与したときの抗高血圧活性を測定した。ＳＢＰとＤＢＰの低下現象を図１０に示す。これらのラットにおいてはＳＢＰとＤＢＰの著しい低下現象がみられたが、この場合には、抗高血圧効果は少なくとも部分的にはＡＣＥ-抑制活性に起因する。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】図１は、ペプシンを用いる加水分解処理に３０分間付したヒツジのαｓ２-カゼインをカチオン交換クロマトグラフィーに付して得られたクロマトグラムを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ペプシンを用いる加水分解処理に３０分間付したヒツジのαｓ２-カゼインから捕集されたＦＣフラクションを半予備的規模での逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ-ＨＰＬＣ）に付して得られたクロマトグラムを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ペプシンを用いる加水分解処理に３０分間付したヒツジのαｓ２-カゼインから捕集されたＦＤフラクションを半予備的規模での逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ-ＨＰＬＣ）に付して得られたクロマトグラムを示す。
【図３】図３は、半予備的規模でのＲＰ-ＨＰＬＣによるＦＣフラクションとＦＤフラクションから得られた種々のサブフラクションの抗菌活性を示す。
【図４】図４は、自然発症高血圧ラットにおける収縮期血圧（ＳＢＰ）の低下及び拡張期血圧（ＤＢＰ）の低下が、１ｍｌの水（○）、５０ｍｇ／ｋｇのカプトプリル（□）、３ｍｇ／ｋｇのＰＹＶＲＹＬ（▲）及び３ｍｇ／ｋｇのＬＫＫＩＳＱ（◆）を胃内カテーテルでこれらのラットへ投与することによってもたらされたことを示す。
【図５】図５は、自然発症高血圧ラットにおける収縮期血圧（ＳＢＰ）の低下及び拡張期血圧（ＤＢＰ）の低下が、１ｍｌの水（○）、５０ｍｇ／ｋｇのカプトプリル（□）、４００ｍｇ／ｋｇのカゼイン（◆）、４００ｍｇ／ｋｇのカゼイン水解物（▲）及び２００ｍｇ／ｋｇのカゼイン水解物（Ｆ＜３０００Ｄａ）（■）を胃内カテーテルでこれらのラットへ投与することによってもたらされたことを示す。
【図６】図６Ａは、ペプシンを用いる加水分解処理に３時間付したカゼインから得られた３０００Ｄａの少量のフラクションを半予備的規模での逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ-ＨＰＬＣ）に付して得られたクロマトグラムを示し、図６Ｂは、ＲＰ-ＨＰＬＣによって得られた図６のＡに対応するクロマトグラフィーフラクションのアンギオテンシン-変換酵素抑制活性を示す。
【図７】図７は、ペプシンと「コロラーゼＰＰ」を用いる連続的な加水分解処理に付した前後における合成ペプチドＰＹＶＲＹＬ  ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７のＲＰ-ＨＰＬＣによるクロマトグラムを示す。
【図８】図８は、自然発症高血圧ラットにおける収縮期血圧（ＳＢＰ）の低下及び拡張期血圧（ＤＢＰ）の低下が、１ｍｌの水（○）、５０ｍｇ／ｋｇのカプトプリル（□）、３ｍｇ／ｋｇのＰＹＶＲＹＬ（◆）及び２ｍｇ／ｋｇのＰＹＶ（■）を胃内カテーテルでこれらのラットへ投与することによってもたらされたことを示す。
【図９】図９は、ペプシンと「コロラーゼＰＰ」を用いる連続的な加水分解処理に付した前後における合成ペプチドＨＬＰＬＰＬＬ  ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１４のＲＰ-ＨＰＬＣによるクロマトグラムを示す。
【図１０】図１０は、自然発症高血圧ラットにおける収縮期血圧（ＳＢＰ）の低下及び拡張期血圧（ＤＢＰ）の低下が、１ｍｌの水（○）、５０ｍｇ／ｋｇのカプトプリル（□）、及び７ｍｇ／ｋｇのＨＬＰＬＰ（●）を胃内カテーテルでこれらのラットへ投与することによってもたらされたことを示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年2月7日(2008.2.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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