(57)【要約】  本発明は、天然抽出物であるクロマメノキの抽出物を有効成分として含む皮膚状態改善用の組成物に関する。クロマメノキの抽出物は、皮膚に紫外線が照射されるに伴い皮膚組織内において生成される活性酸素を抑制及び消去させ、チロシナーゼ活性を有効に阻害してメラニン細胞におけるメラニンの生成を抑制させ、ケラチノサイトにおけるサイトカイン分泌を阻害させ、プロコラーゲンの生成を促進してコラーゲンの分解を抑制させるなどの作用を有することから、紫外線による皮膚の光老化の防止、皮膚美白状態及びシワ状態の改善に有効に使用可能である。また、本発明によるクロマメノキの抽出物は、皮膚に塗布したり飲用しても皮膚シワの改善効能が得られることから、化粧料、健康機能食品、薬剤の皮膚シワの改善のための成分として用いて好適である。【選択図】図１４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマメノキ（Vaccinium uliginosum）の抽出物を有効成分として含有し、紫外線に起因する活性酸素種を消去／抑制する皮膚美白及びシワを改善する皮膚状態改善用の組成物。
【請求項２】
前記クロマメノキの抽出物は、クロマメノキの実若しくは葉に抽出溶媒としての水若しくはアルコールを加えて抽出されたものであることを特徴とする請求項１に記載の皮膚状態改善用の組成物。
【請求項３】
前記クロマメノキの抽出物は、クロマメノキの実若しくは葉を４０〜１００℃の恒温水槽中において温湯して得られる熱水抽出物をろ過し、ろ過された熱水抽出物から上澄み液を分離した後、分離された上澄み液を減圧濃縮することにより得られるものであることを特徴とする請求項１に記載の皮膚状態改善用の組成物。
【請求項４】
前記クロマメノキの抽出物は、クロマメノキの実若しくは葉をアルコールに入れて２０〜９０℃の温度下で得られる抽出物をろ過し、前記ろ過された抽出物から上澄み液を分離した後、分離された上澄み液を減圧濃縮することにより得られるものであることを特徴とする請求項１に記載の皮膚状態改善用の組成物。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の皮膚状態改善用の組成物と化粧料添加剤成分を含み、皮膚美白及びシワを改善する皮膚状態改善用の化粧料組成物。
【請求項６】
前記クロマメノキの抽出物の含量は、前記化粧料組成物の全体の重量に対して乾燥重量換算で０．０００１〜１０重量％であることを特徴とする請求項５に記載の皮膚状態改善用の化粧料組成物。
【請求項７】
前記化粧料組成物は、アルブチン（arbutin）、コウジ酸（Kojic acid）、コウゾ抽出物、３−エトキシアスコルビン酸（3-ethoxyascorbicacid）、甘草抽出物及びこれらの混合物よりなる群から選ばれるいずれか１種以上の成分をさらに含有することを特徴とする請求項５に記載の皮膚状態改善用の化粧料組成物。
【請求項８】
請求項１から４のいずれかに記載の皮膚状態改善用の組成物と食品学的に許容される食品添加剤とをさらに含む食品学的組成物。
【請求項９】
請求項１から４のいずれかに記載の皮膚状態改善用の組成物と薬剤学的に許容される担体とをさらに含み、コラーゲンの合成を増進させると共にチロシナーゼ活性を抑制する薬学的組成物。
【請求項１０】
クロマメノキの実若しくは葉に溶媒としての水若しくはアルコールを加えてクロマメノキの抽出液を得る第１段階と、前記第１段階において得られたクロマメノキの抽出液をろ過して上澄み液を分離する第２段階と、前記第２段階において得られたクロマメノキの抽出液を濃縮させる第３段階と、を含む皮膚状態改善用のクロマメノキの抽出物の製造方法。
【請求項１１】
前記第３段階に後続して、濃縮されたクロマメノキの抽出物を少量の蒸留水に溶解した後、凍結乾燥あるいは粉末乾燥して粉体状のクロマメノキの抽出物を得る第４段階をさらに含むことを特徴とする請求項１０に記載の皮膚状態改善用のクロマメノキの抽出物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロマメノキ（Vaccinium uliginosum：黒豆の木）の抽出物を含有する皮膚状態改善用の組成物に係り、さらに詳しくは、皮膚のニキビ、そばかす、色素沈着などを予防・改善して皮膚美白に役立ち、皮膚シワを予防・改善するだけではなく、皮膚の弾力を増強可能な皮膚状態（皮膚の老化）改善用の組成物に関する。本発明による皮膚状態改善用の組成物は、抽出液若しくは乾燥された抽出粉体状に容易に製造することができ、皮膚状態の改善のための用途の化粧料、健康機能性食品及び薬剤などの一成分として使用可能である。
【背景技術】
【０００２】
近年、平均寿命の延長に伴う老人人口の増加とあいまって、医学、生化学、食品学分野において老化に関する研究が占める比重は次第に高まりつつある一方である。あらゆる生命体は、年を取るにつれて老化されるものであるが、老化とは、環境の変化に適応する生物体の能力が経時的に次第に低下することを言う。
【０００３】
皮膚も同様である。皮膚にシワができ、皮膚に色素沈着が起こり、しかも、弾力が低下するなど皮膚の状態が悪化することは皮膚老化による主たる現象であって、内外部の原因に起因する種々の因子により、様々な構造的な変化を通じて皮膚は老化過程を経ることになる。しかしながら、現代人は、皮膚をさらにきれいにし、かつ、美しく保つことを希望しており、皮膚状態を改善（皮膚老化を防止）する方法及び材料に関する様々な研究と実験も次第に活発化している。
【０００４】
皮膚状態を悪化させる主な現象である皮膚老化の原因は、大きく内因性老化と外因性老化とに分けられる。すなわち、年を取るにつれて発生することが内因性老化（intrinsic aging）であり、紫外線などの外部因子により発生する老化を外因性老化（extrinsic aging）という。特に、外因性老化は、主に紫外線により老化が進むことから、光老化（photo aging）と呼ばれる。
【０００５】
内因性の皮膚老化の過程においては、特定の臨床皮膚の所見によれば、微細なシワ、真皮の収縮、そして皮下脂肪層の減少などが見られる。外因性老化の最も大きな比重を占める太陽光線中の紫外線による光老化過程においては、紫外線により皮膚の表皮において活性酸素種（ＲＯＳ）が過度に生成されるが、このような活性酸素種は、メラニンの増大による色素沈着が観察され、皮膚組織におけるコラーゲンとエラスチンとの生合成を阻害して分解の促進を引き起こしてシワの形成が見られる。特に、本発明は、光老化過程を経る皮膚状態を改善（皮膚美白及びシワなど）することと関連する。
【０００６】
光老化の作用機序は明らかではないが、紫外線は核酸とたんぱく質などの変形及び脂質の酸化を引き起こして細胞の染色体変形と細胞膜損傷を引き起こしたり、あるいは、活性酸素種を介して細胞の変形を引き起こしたりするということは種々の研究により判明されている。また、太陽による紫外線照射は紅斑、浮腫などの炎症性反応と皮膚黒化、真皮細胞間物質の変性など様々な臨床的な変化を引き起こす。さらに、かような多くの反応のどれが皮膚のシワ、弾力性などと深い関連性があるかを明らかにするための研究が進行中である。
【０００７】
紫外線による光老化、自然老化などの理由で皮膚の状態が悪くなるに伴い生じうる代表的な現象としては、皮膚の色が黒みがかかってくるような現象がある。皮膚の色に預かる色素としては、メラニン、メラゾイド、カロチン、酸化型ヘモグロビン、還元型ヘモグロビンなどがあるが、これらのうち最も重要なのはメラニンである。メラニンは自己保護のための偽装手段として働き、紫外線を吸収したり散乱させることにより皮膚内の細胞や組織が紫外線により損なわれることを防ぐ。メラニンは格別な最大吸収波長がなく、全領域の光を吸収し、しかも、皮膚内において過酸化陰イオン、過酸化水素、ヒドロキシラジカル、一重項酸素などの活性酸素種を消去する機能に優れている。
【０００８】
しかしながら、皮膚組織中にメラニンが過剰に存在している場合、メラニンそのものが活性酸素を発生することもあり、メラニン構造内のカテコールやキノンにより他の物質を還元若しくは酸化させることもある。なお、メラニンそのものが自由ラジカルの性質を示して人体にニキビ、そばかすなどを形成して皮膚の色を黒くし、皮膚老化を促進し、しかも、皮膚癌の誘発に預かることが知られている。
【０００９】
メラニン生成経路としては、周知のごとく、チロシンからチロシナーゼによりドパ（ＤＯＰＡ）、ドパキノン（ＤＯＰＡ−ｑｕｉｎｏｎｅ）を経てメラニンが生成される化学的な経路、あるいは、メラニン細胞からケラチン細胞へと移動してメラニンを生成する経路などがある。
【００１０】
メラニン生成抑制を通じての皮膚美白の方法としては、紫外線を遮断する方法、チロシナーゼの活性のために必要となるコア炭水化物の合成を阻害する方法、メラニン形成と関連する酵素であるチロシナーゼの活性を抑える方法、メラニン細胞に特異的な毒性を有する物質を用いてメラニン細胞の分裂を妨げる方法、ビタミンＣ誘導体と胎盤抽出物を用いる方法などが知られている。
【００１１】
特開平０６−１９２０６２号には、美白物質としてヒドロキノンが開示されているが、ヒドロキノンの美白効果は抜群であるが、発癌物質であり、化粧料などの材料として用いるには不向きである。特開昭５６−７７１０号には美白物質としてコウジ酸が開示されているが、コウジ酸はチロシナーゼの阻害能に優れていて美白効果に優れているが、コウジ酸の毒性に関する問題がもたげられているため、化粧料、食品などの材料として用いるには不適切であるという不都合がある。特開平４−９３１５号には、美白物質として、天然植物であって高山地帯に棲息するコケモモから抽出したり合成したりして得られるアルブチンが開示されているが、皮膚刺激による問題点が指摘されている。また、昔から皮膚美白と関連して、ハトムギ、キュウリなどの天然物が皮膚美白の目的で使用されているが、かような天然物はメラニンの過剰生成とは無関係なものであった。
【００１２】
皮膚の色が黒みがかかってくる現象に加えて、皮膚表皮が損なわれ、且つシワができる現象は、光老化などにより皮膚状態が悪くなるに伴い発生する代表的な現象である。光老化においては、大体真皮の変化が目立つため、シワ発生も真皮の変化に起因することが知られている。特に、皮膚真皮層の顕著な変化は、外側の真皮に無定形の弾力組織が過度に蓄積されることと、真皮のコラーゲン繊維が減少することである。
【００１３】
シワの発生過程は現在のところ判明されてはいないが、真皮のコラーゲンの合成低下または分解活性の増加、表皮基底膜の損傷、表皮代謝活性の低下などシワ発生と関連する多数の結果が報告されている。また、皮膚シワの発生は紫外線に起因する様々な生化学的、臨床的な変化の総合的な影響によるものであると理解できる。
【００１４】
皮膚シワの問題を解決するために、従来には、コラーゲンを化粧品に配合して製品にした場合があったが、コラーゲンを化粧品にして皮膚の表面に塗布する場合、高分子となるコラーゲンの経皮吸収が困難になってその機能を十分に期待できないという不都合があった。また、皮膚の真皮に直接的にコラーゲンを注入する方法もあるが、この方法もまた副作用により皮膚シワを改善する解決策とはなっていない。
【００１５】
コラーゲン合成を促進する物質として、レチノ酸と、動物胎盤由来のたんぱく質（特開平８−２３１３７０号）などが知られている。レチノ酸は剤型技術が複雑であり、しかも、皮膚に刺激となるなど安全性の側面から使用に限界があり、動物胎盤由来のたんぱく質は狂牛病にかかったウシの摘出物を使用することがあるという致命的な短所があった。また、人体への効能が確認されているα−ヒドロキシ酸（alpha-hydroxy acid、ＡＨＡ）と各種のビタミンＡ誘導体（レチノイド類）が開発されて化粧品などに使用されている。しかしながら、これまで臨床的に確実な効能があると立証されたのは、前記の物質や紫外線遮断剤にとどまっている。既にヨーロッパにおいては、１９９０頃より化粧品にシワ改善効果を表記して広報しており、１９９３年頃にはセラミド、ＡＨＡ、レチノールなどの皮膚状態改善成分の化粧品の導入と機能性化粧品という用語が新たに造語されている。
【００１６】
ほとんどの化粧品会社は皮膚美白やシワを改善するための化粧品を開発してきたが、化粧品に限られており、摂取を通じて皮膚シワ改善の効果が得られないものであった。また、「塗布する化粧品」よりも「食べる化粧品」の方が早くきくということに鑑みてみるとき、「食べる皮膚状態改善用の化粧品」のみならず、「皮膚状態を改善する機能性食品」に関する研究開発も至急望まれるのが現状である。
【００１７】
摂取を通じて皮膚状態を改善する効能がある原料として学界に報告されているものとしては、ビタミンＣ、ビタミンＥ、グアバ抽出物などの皮膚美白原料があり、その種類が極めて少ない。塗布する化粧品原料についても、ヒドロキノンとこの前駆体として考えられるアルブチン、コウジ酸、ビタミンＣを安定化させた誘導体、天然物（メラニン合成と関連するサイトカインの調節）などに留まっている。塗布する化粧品の場合、このような化合物は種々の試験管内（in vitro）実験を経て効能が検証されているが、その他のシワ改善及び補湿製品に対して感じる満足よりも高い満足を与えられないことから、現在にも数多くの誘導体が合成されており、新規な天然物に対する皮膚状態の改善効能が検討されているが、経口投与などを通じての新製品の開発まではまだまだ遠いのが現状である。
【００１８】
一方、本発明において、皮膚シワの改善のための成分として最初に使用するクロマメノキは、大韓民国のハンラ山、グムガン山、ベクテゥ山などにおいて自生するツツジの花と落葉灌木植物であって、６〜７月に開花して８月に実を結ぶ植物である。クロマメノキの含有成分としては、糖分（８〜１１．８％）、果物酸（２〜２．２５％）、タンニン（０．１５〜０．２５％）、繊維素などが挙げられる。
【００１９】
これまで知られているクロマメノキの公知の薬理作用としては、血管保護、痢疾、抗潰瘍、抗癌、糖尿病性網膜疾患の治療、老人性疾患の予防、産後回復、精血作用、利尿作用、リウマチ関節炎の治療などが挙げられる。しかしながら、クロマメノキの皮膚シワ、皮膚美白改善効果と関連して知られていることはない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
［発明の詳細な説明］
［技術的課題］
本発明は、クロマメノキの抽出物を有効成分として含み、皮膚美白及びシワを改善する皮膚状態改善用の組成物とその製造方法を提供することを目的とする。
【００２１】
また、本発明は、クロマメノキの抽出物を含む皮膚美白及びシワ改善用の化粧料組成物、食品学的組成物及び薬学的組成物と共に、皮膚状態改善剤としての用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
［技術的解決方法］
本発明は、クロマメノキの抽出物が光老化の重要な原因となる活性酸素種（Reactive oxygen species）の生成を抑制若しくは除去する抗酸化効能を有するということに着目して完成されたものである。皮膚が紫外線にさらされる場合、ケラチノサイトにはスーパーオキシドラジカル、ヒドロキシルラジカル、過酸化水素、一重項酸素ラジカルなどの活性酸素種が高濃度にて生成されるが、本発明によるクロマメノキの抽出物を紫外線にされた皮膚組織に投与する場合、前記活性酸素種の生成量が有意的に低減することが確認されている。
【００２３】
また、本発明者らは、クロマメノキの抽出物がメラニン合成を媒介するチロシナーゼ活性を阻害することにより、実質的にメラニンの生成を抑制する作用を示すという点、及び皮膚繊維芽細胞におけるコラーゲンの合成を増加させるとともにコラーゲンの分解を抑制し、ケラチノサイトにおけるサイトカイン分泌を抑制するなどの作用を示すという点を新規に見出し、これらの点に着目して皮膚美白とシワを改善するクロマメノキの抽出物の新規な用途を提案するに至った。
【００２４】
本発明において、皮膚改善剤として採っている天然材料のクロマメノキの抽出物は、特に副作用がないことから、皮膚シワを防止・改善して皮膚の弾力を増強させるような用途として用いて好適である。さらに、クロマメノキの抽出物は、皮膚に塗布したり服用するだけで、皮膚美白とシワなどの皮膚の状態を改善する効能を得るに足りない。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によるクロマメノキの抽出物を含む皮膚美白及びシワ改善用の組成物は、皮膚に紫外線が照射されるに伴い、皮膚組織内において生成される活性酸素を抑制及び消去させ、チロシナーゼ活性を有効に阻害してメラニン細胞におけるメラニンの生成を抑制させ、ケラチノサイトにおけるサイトカイン分泌を阻害させ、プロコラーゲンの生成を促進してコラーゲンの分解を抑制するなどの作用を有するため、紫外線による皮膚の光老化防止、皮膚美白状態及びシワ状態の改善に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明による皮膚状態改善用の組成物及びその製造方法と、その具体的な使用態様について詳述する。
【００２７】
本発明による皮膚美白及びシワ改善用の組成物は、有効成分としてクロマメノキの抽出物を含有する。前記組成物は、クロマメノキの抽出物成分の他にも、必要な剤型に応じて、種々の添加剤、安定剤などをさらに含んでいてもよい。前記クロマメノキの抽出物は、クロマメノキの実、葉若しくは樹皮などから抽出されるものであって、抽出溶媒としては、水、アルコールなどが好適である。
【００２８】
本発明の主な成分であるクロマメノキの抽出物の製造方法に特に限定はないが、本発明に供されるクロマメノキの抽出物の好適な製造方法は、下記の通りである。
【００２９】
まず、クロマメノキの実、葉を洗浄した後、水を溶媒としてクロマメノキの抽出原液を得る（第１段階）。具体的に、クロマメノキの実１００ｇに対する水の量は８００〜１２００ｍｌであることが好ましく、４０〜１００℃の恒温水槽中において１０〜１５時間重湯させることが好ましい。
【００３０】
次いで、前記第１段階において得られたクロマメノキの抽出液をろ過して上澄み液をとる（第２段階）。例えば、複数重のガーゼで前記クロマメノキの抽出液をろ過させて異物の取られた上澄み液を得ることが好ましい。
【００３１】
前記第１段階若しくは第２段階において得られたクロマメノキの抽出液だけでも本発明による皮膚状態の改善効能を十分に得られるが、クロマメノキの抽出物をより効率よく用いるためには、下記のステップをさらに含むことが好ましい。
【００３２】
次いで、前記第２段階において得られた上澄み液に含まれている溶媒を蒸発させてクロマメノキの抽出液を濃縮させることにより、高濃縮されたクロマメノキの抽出物を得る（第３段階）。好ましくは、前記第１段階と第２段階を３回繰り返し行って得た上澄み液を取り合わせ、回転式エパポレータを用いて減圧下で水を完全に蒸発させることにより、クロマメノキの抽出物を濃縮させることが好ましい。
【００３３】
さらに、前記第３段階に続けて、濃縮されたクロマメノキの抽出物を少量の蒸留水に溶解させた後、凍結乾燥若しくは噴霧乾燥させることにより粉体状にしたクロマメノキの抽出物を用いてもよい。
【００３４】
前記第１段階において、クロマメノキから抽出物を抽出するための溶媒としては、水の他に、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノールなどのアルコールも採用してもよい。この場合、クロマメノキの実若しくは葉をアルコールに入れて２０〜９０℃の温度下で抽出しても、消音波処理しても、常温若しくは４℃の温度下で冷浸して抽出してもよい。
【００３５】
本発明によるクロマメノキの抽出物の具体的な使用態様としては、クロマメノキの抽出物を含有する皮膚美白及びシワ改善用の化粧料組成物、食品または健康機能食品、薬学的組成物があり、以下、これらを詳述する。
【００３６】
まず、本発明によるクロマメノキの抽出物は、既存の化粧料に皮膚美白とシワの改善剤として添加して用いることができ、化粧料の剤型に特に制限はない。クロマメノキの抽出物を用いて化粧料を製造する場合、クロマメノキの抽出物の他に化粧料に通常用いられる成分、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料、香料などの通常の補助剤と担体成分を併用してもよい。化粧料の剤型の例としては、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、含界面活性剤クレンジング、オイル、粉体パウンデーション、乳濁液パウンデーション及びスプレイなどがあり、通常の当業者であれば、剤型に応じた担体を容易に採択して用いることができる。
【００３７】
好ましくは、前記化粧料組成物は、アルブチン、コウジ酸、コウゾ抽出物、３−エトキシアスコルビン酸、甘草抽出物及びこれらの混合物よりなる群から選ばれるいずれか１種以上の成分をさらに含有することが、美白効果の側面からなお一層好ましい。さらに、添加剤としてレチノール、レチノールパルミテート、ポリエトキシル化レチンアミド、アデノシン、カイネチン、蚕繭抽出物、イソフラボン及びこれらの混合物よりなる群から選ばれるいずれか１以上の成分をさらに含めて用いてもよい。
【００３８】
クロマメノキの抽出物の（乾燥）含量は、化粧料組成物の総重量に対して０．０００１〜１０重量％であることが好ましいが、クロマメノキの抽出物の含量が０．０００１重量％未満である場合には、シワ改善の効果があまりなく、１０重量％を超える場合には、溶解し難いという不都合があり、クロマメノキの抽出物成分の追加によるチロシナーゼ活性を抑制させることや、コラーゲンの合成を増加させることなどにより促される効果が得られず、しかも、コスト上昇の面から好ましくないという不都合がある。
【００３９】
クロマメノキの抽出物の他の使用態様として、本発明は、クロマメノキの抽出物と食品添加剤を含む皮膚美白及びシワ改善用の食品を提供する。
【００４０】
本発明における前記皮膚美白及びシワ改善用の食品は、一般食品はもとより、「健康補助食品」または「健康機能食品」を含む概念として用いる。特に、「健康機能食品」は、人体に有用な機能性を有する原料や成分を用いて錠剤、カプセル、粉体、顆粒、液状、丸剤などの剤型に製造及び加工した食品（大韓民国法律第７４２８号の健康機能食品に関する法律の第３条第１号）を満たすものである。ここで、「機能性」とは、人体の構造及び機能に対して栄養素を調節したり、生理学的な作用などの保健用途に有用な効果を得たりすることを言う。すなわち、健常人または反健康人の保健用途に有効に使用可能なことを意味する。
【００４１】
含クロマメノキの抽出物食品を摂取したり皮膚に塗布するだけでも、十分に皮膚状態の改善の効能を得られるが、服用のし易さのために、錠剤、糖衣錠、カプセル、ドリンクなどの剤型を有する機能性食品として用いることが好ましい。
【００４２】
前記皮膚状態改善用の食品のさらなる態様としては、飲み物、酒、キムチ、ヨーグルト、牛乳、アイスクリーム、パン、餅及びそばなどがある。
【００４３】
前記「食品添加剤」とは、食品を製造、加工または保存するに際して、食品に添加、混合、浸潤などの方法により用いられる添加剤を意味する。
【００４４】
本発明のさらに他の一態様として、本発明は、クロマメノキの抽出物と薬剤学的に許容される担体をさらに含む皮膚美白及びシワ改善用の薬学組成物を提供する。クロマメノキの抽出物は、抗酸化機能を有し、プロコラーゲンの合成を促進させるとともにコラーゲンの分解を抑制させるなど紫外線による皮膚シワを改善し、チロシナーゼの活性を抑制する作用を有するということは後述する実施例から明らかになるであろう。
【００４５】
前記薬学的組成物の好適な剤型としては、錠剤、糖衣錠、軽質若しくは軟質のカプセル剤、溶液剤、懸濁剤、乳化液剤、注射剤、座薬剤などがあるが、これに限定されるものではない。担体の種類は、薬剤の剤型に応じて当業者が容易に選択することができ、希釈剤、香味剤、可溶化剤、潤滑剤、懸濁剤、バインダー、崩壊剤などとして働きうる成分を１またはそれ以上含んでいてもよい。
【００４６】
クロマメノキの抽出物を含有するコラーゲン合成促進用の薬剤の服用量は、患者が必要とする程度、患部の具合、そして、使用すべき化合物の種類によるが、過量を服用しても副作用の問題はない。通常、患者の体重１Ｋｇ当たりのクロマメノキの抽出物の含量は、乾燥粉体を基準として０．００１〜０．１０ｇを服用（１回分）することが好ましい。
【００４７】
以下、本発明において採用したクロマメノキの抽出物が有する皮膚状態の改善作用と関連して、まず、皮膚美白とシワが形成される過程についてそれぞれ述べた後、クロマメノキの抽出物を用いたときに皮膚シワと関連する因子にいかなる変化があるかについて後述する実施例と実験例を挙げて述べる。
【００４８】
皮膚老化の主な原因である太陽光線からの紫外線が皮膚に達すると、皮膚の表皮組織に活性酸素種（ＲＯＳ）ができる。こうしてできた活性酸素種は、表皮細胞に障害を与え、しかも、表皮組織にあるケラチノサイトを刺激してしまい、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６などのインターロイキンをはじめとして、コロニ刺激因子（colony stimulating factor）とＴＮＦ（tumor necrosis factor）−αなどのサイトカインの分泌が促され、このときに分泌されたインターロイキンやサイトカインは皮膚細胞に影響して複雑な炎症反応と免疫反応を引き起こす。そして、活性酸素種は、メラノサイトからケラチノサイトへのメラノソームの移送を増大させ、メラノサイトにおけるメラニン生成を増大させ、真皮において繊維芽細胞におけるコラーゲン合成を阻害するといった現象を引き起こすが、これは、光老化経路における極めて重要な現象である。
【００４９】
外部から紫外線などの刺激を受けたとき、ケラチノサイトは炎症性サイトカインなどを分泌してメラノサイトの増殖とメラニンとの生合成を促すことにより、メラノサイトの生長、形成及びメラニンの分泌と分化における種々の因子を調節する。また、皮膚組織内まで照射される紫外線は皮膚内のメラノサイトを刺激してＩＬ−１αを分泌させ、分泌されたＩＬ−１αはメラノサイトをさらに刺激してＥＴ（endothelin）−１を分泌させる。ＥＴ−１は、プロテインキナーゼ（protein kinase）Ｃとアデニラートシクラーゼ（adenylate cyclase）系を活性化させてメラノサイトを増殖させ、チロシナーゼの活性を促すことにより、結果として色素沈着が起こるのである。
【００５０】
さらに、ケラチノサイトから生産、分泌される上述のインターロイキンはマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）−１（コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−３（ストロメチシン-１）、ＭＭＰ−９（９２−ｋｄ  ゼラチナーゼ）などの基質分解酵素（matrix-degrading enzyme）の遺伝子発現を刺激してＭＭＰの生成量を増大させる作用をし、プロコラーゲン遺伝子発現を阻害するためにプロコラーゲンの生合成量を低減させる。ＭＭＰ−１は、コラーゲン分解酵素であって、タイプＩプロコラーゲンから変換されたコラーゲンの分解を促進する作用をする。すなわち、皮膚に紫外線が達すると、タイプＩプロコラーゲンの生成の減少と生成されたコラーゲンの分解が起こり、皮膚におけるコラーゲンの量が低減することになる。このような過程を経て皮膚にシワが形成されるのである。
【００５１】
上述した皮膚美白とシワにあずかる因子と関連して、クロマメノキの抽出物を投与することによる影響については、後述する実験例を挙げて述べる。
【００５２】
図１は、クロマメノキの抽出物のＤＰＰＨラジカル消去能を示すグラフである。
図２は、キサンチン−キサンチンオキシダーゼ系におけるスーパーオキシドラジカルに対して、クロマメノキの抽出物が有するスーパーオキシドラジカル消去能を示すグラフである。
図３は、ＮＡＤＨ／ＰＭＳ系におけるスーパーオキシドラジカルに対して、クロマメノキの抽出物が有するスーパーオキシドラジカル消去能を示すグラフである。
図４は、クロマメノキの抽出物のヒドロキシルラジカル消去能を示すグラフである。
図５は、クロマメノキの抽出物の一重項酸素消去能を示すグラフである。
図６は、ケラチノサイトにおけるスーパーオキシドラジカルに対して、クロマメノキの抽出物が有するスーパーオキシドラジカル生成阻害能を示すグラフである。
図７は、ケラチノサイトにおけるヒドロキシラジカルに対して、クロマメノキの抽出物が有するヒドロキシラジカル生成阻害能を示すグラフである。
図８は、ケラチノサイトにおける過酸化水素に対して、クロマメノキの抽出物が有する過酸化水素生成阻害能を示すグラフである。
図９は、ケラチノサイトにおける一重項酸素に対して、クロマメノキの抽出物が有する一重項酸素生成阻害能を示すグラフである。
図１０は、ケラチノサイトにおけるＩＬ−１βに対して、クロマメノキの抽出物が有するＩＬ−１β分泌抑制能を示すグラフである。
図１１は、ケラチノサイトにおけるＩＬ−６に対して、クロマメノキの抽出物が有する分泌抑制能を示すグラフである。
図１２は、ＩＬ−１βとクロマメノキの抽出物の濃度によるプロコラーゲン型Ｉの生成量を示すものである。
図１３は、ＩＬ−１βとクロマメノキの抽出物の濃度によるＭＭＰ−１の生成量を示すものである。
図１４は、無毛マウスの皮膚に紫外線を照射し、クロマメノキの抽出物を投与した場合における皮膚写真である。
図１５の（ａ）から（ｄ）は、無毛マウスの皮膚に紫外線を照射し、クロマメノキの抽出物を投与した場合における測定Ｈ＿Ｒ値を示すものである。
図１６は、クロマメノキの抽出物とコウジ酸を投与した場合における皮膚組織の単位細胞当たりのメラニンの量を示すものである。
図１７は、皮膚に紫外線を照射し、クロマメノキの抽出物とコウジ酸を投与した場合における皮膚組織の単位細胞当たりのメラニンの量を示すものである。
【実施例】
【００５３】
［発明を実施するための形態］
［製造例１：クロマメノキの抽出物の製造］
北朝鮮産のクロマメノキの実１００ｇを８０％水５００ｍｌと一緒に５０℃の恒温水槽中において１２時間をかけて温湯してクロマメノキの抽出液を得、前記クロマメノキの抽出液を複数種のガーゼでろ過して上澄み液を取った。このような抽出及びろ過過程を３回繰り返し行って得た上澄み液を取り合わせ、回転式エバポレータを用いて減圧下で水を完全に蒸発させ、濃縮されたクロマメノキ熱水抽出液を得た。
【００５４】
［製造例２：クロマメノキの抽出物粉体の製造］
前記濃縮されたクロマメノキの抽出物を蒸留水に溶解させた後、吹き付け乾燥して、粉状の最終的なクロマメノキの抽出物を製造した。
【００５５】
［製造例３：クロマメノキの抽出物の製造］
クロマメノキの実１００ｇを８０％メタノール（メタノール：水＝４：１）５００ｍｌに入れて、常温下で５時間ずつ４回超音波処理して抽出した後、ガーゼでろ過し、上澄み液を取った。前記上澄み液を取る過程を３回繰り返し行って得られる上澄み液を取り合わせ、回転式蒸発装置を用いて減圧下でメタノールを蒸発させ、次いで、これを少量の蒸留水に溶解させてクロマメノキアルコール抽出液を得た。
【００５６】
［実施例１：皮膚状態改善用の柔軟化粧水（スキンローション）の製造］
前記製造例１の方法に従い製造されたクロマメノキの抽出物（液状）を用いて、柔軟化粧水を通常の方法により製造した。柔軟化粧水の構成成分とその使用量は、下記の通りである。
【００５７】
【表１】
2008526956.tif 000003
【００５８】
［実施例２：皮膚状態改善用の栄養化粧水の製造］
前記製造例１の方法に従い製造されたクロマメノキの抽出物（液状）を用いて、柔軟化粧水を通常の方法により製造した。柔軟化粧水の構成成分と使用量は、下記の通りである。
【００５９】
【表２】
2008526956.tif 000004
【００６０】
［実施例３：皮膚状態改善用の機能性食品（錠剤）の製造］
前記製造例２の方法に従い製造されたクロマメノキの抽出物（粉体）５ｍｇ、ラクトースＢＰ１５０ｍｇ、澱粉ＢＰ３０ｍｇ及び全ゼラチン化トウモロコシ澱粉ＢＰ１５ｍｇと混合した後、精製水を適量添加して粉体に顆粒化させた。前記顆粒を乾燥させた後、ステアリン酸マグネシウム１ｍｇと混合し、圧着して錠剤を得た。
【００６１】
［実施例４：皮膚状態改善用の機能性食品（飲み物）の製造］
前記製造例１の方法に従い製造されたクロマメノキの抽出物２ｍｇ、食用色素５ｍｇ、オーレンジエッセンス５ｍｇ、果糖７００ｍｇ、クエン酸１０ｍｇ、ビタミン５ｍｇを含む機能性飲料ベースを添加した組成物を製造した後、精製水を添加して飲料水を製造した。
【００６２】
［実施例５：皮膚状態改善用の健康機能食品（シロップ剤）の製造］
精製水（５００ｍｌ）に白糖（６３７．５ｇ）を溶解させ、別の容器に別途にカルボキシメチルセルロースナトリウム（２．０ｇ）は精製水４００ｍｌに溶解させた後、前記白糖を溶解させた溶液と混合し、メチルパラベン（０．２８ｇ）とプロピルパラベン（０．１２ｇ）を加えて溶解させた後、エタノール（２０ｍｌ）を加え、精製水を全体溶液の容量が１０００ｍｌになるようにした。これを篩体にかけて得た製造例１のクロマメノキの抽出物を懸濁させてシロップ剤を得た。
【００６３】
［実施例６：軟膏剤の製造］
前記製造例１の方法に従い製造されたクロマメノキの抽出物５ｇ、セチルパルミテート２０ｇ、セタノール４０ｇ、ステアリルアルコール４０ｇ、ミリスタンイソプロピル８０ｇ、モノステアリン酸ソルビタン２０ｇ、ポリソルベート６０ｇ、パラオキシ安息香酸プロピル１ｇ、パラオキシ安息香酸メチル１ｇと精製水を適量添加して軟膏剤を製造した。
【００６４】
［実施例７：機能性酒の製造］
脱水精製された４０重量％のアルコールを蒸留水で希釈し、希釈されたアルコール蒸留水１００重量部に対して製造例３に従い得たクロマメノキの抽出物０．０５重量部添加し、残量のステビオサイド、高果糖、アミノ酸、クエン酸、塩を添加して含クロマメノキの抽出物の機能性酒を製造した。
【００６５】
［実験例１：活性酸素種（ＲＯＳ）の消去能］
１．ＤＰＰＨラジカル消去能の測定
エチルアルコールに溶かした１ｍＭのＤＰＰＨ（２、２−ジフェニルｌ−１−ピクリルヒドラジル）溶液０．８ｍｌと製造例１のクロマメノキの抽出物溶液０．２ｍＬを入れて３７℃の温度下で３０分間放置させた後、５１７ｎｍにおける吸光度を測定した。対照薬物としては、アスコルビン酸（ビタミンＣ）を使用し、その結果を未処理試料群に対する百分率にて示す。
【００６６】
実験の結果、図１に示すように、クロマメノキの抽出物のＤＰＰＨラジカル消去能は１０ｍｇ／ｍＬの濃度においてビタミンＣ１００μＭの３倍程度と高く、１ｍｇ／ｍＬの濃度においてビタミンＣ１００μＭの２倍程度高かった。 図１は、製造例１のクロマメノキの抽出物が有するＤＰＰＨラジカルスカベンジャー活性を示すグラフである。上部におけるアルファベット文字は、ダンカンの多重検定法（Duncan’s multiple range test）による場合、有意レベルｐ＜０．０５の範囲において有意に異なる値を示すものである。
【００６７】
２．スーパーオキシドラジカル消去能の測定
２−１．酵素系（Xanthine-Xanthine oxidase system）
２４ウェルプレートに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.５）６００μｌ、各濃度別に調製したクロマメノキの抽出物溶液５０μｌとキサンチン酸化酵素（０．０６８μｇ／ｍＬ）５０μｌを混合して２５℃の温度下で３０分間放置させた後、１ＭＨＣＬ１００μｌを加えて反応を止め、次いで、２９５ｎｍにおける吸光度を測定した。対照薬物としては、キサンチン酸化酵素抑制作用のある薬物として知られているアルプリノールを使用し、その結果を未処理試料群に対する百分率にて示す。図２を参照すると、酵素的なスーパーオキシドラジカル生成系であるキサンチン−キサンチンオキシダーゼ系におけるスーパーオキシド消去能は、クロマメノキの抽出物０．０１ｍｇ／ｍＬにおいてビタミンＡ１０μＭと同様であり、アルプリノール１μＭと１０μＭとの中間レベルの消去能を示している。
【００６８】
２−２．非酵素系（ＮＡＤＨ−ＰＭＳ system）
２４ウェルプレートに、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.４）溶液に ＮＡＤＨ、フェナジンメトサルファートとＮＢＴのそれぞれの濃度をそれぞれ７３μＭ、１５μＭ及び５０μＭ ＮＢＴになるように調節して１．８ｍＬの溶液を用意した。前記溶液に製造例１のクロマメノキの抽出物０．２ｍＬを濃度を異ならせて入れ、３７℃の温度下で２０分間放置させた後、５６０ｎｍにおける吸光度を測定した。対照薬物としては、アスコルビン酸（ｑビタミンＣ）を使用し、その結果は、未処理試料群に対する百分率にて示す。図３を参照すると、非酵素的なスーパーオキシドラジカル生成系であるＮＡＤＨ／ＰＭＳ系におけるスーパーオキシドラジカル消去能は、クロマメノキの抽出物０．１ｍｇ／ｍＬにおいてビタミンＣ１００μＭと同様であった。
【００６９】
３．ヒドロキシルラジカル消去能の測定
２４ウェルプレートに、２．５ｍＭβ−カロチンエタノール溶液０．２ｍＬに５．９４ｍＭのＨ２Ｏ２０．８ｍＬ及びＦｅＳＯ４２６．４ｍＭの濃度を有するエタノール溶液０．８ｍＬを混合し、ここに製造例１のクロマメノキの抽出物０．２ｍＬを添加した後、４３６ｎｍにおける吸光度を測定した。対照薬物としては、アスコルビン酸（ビタミンＣ）を使用し、その結果は、未処理試料群に対する百分率にて示す。実験の結果、クロマメノキの抽出物のヒドロキシルラジカル消去能は、クロマメノキの実抽出の濃度が０．０５ｍｇ／ｍＬであるときにビタミンＣ１００μＭとほぼ同様であった（図４参照）。
【００７０】
４．一重項酸素消去能の測定
４５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１）に１０ｍＭヒスチジン、１０ｍＭＮａＯＣｌ、１０ｍＭＨ２Ｏ２、５０ｍＭＮ、Ｎ−ジメチル−ｐ−ニトロソアニリンが混合された混合溶液１．９ｍＬに、クロマメノキの抽出物０．１ｍＬを濃度別に異ならせて添加し、３０℃の温度下で４０分間放置した後、４４０ｎｍにおける吸光度を測定した。対照薬物としては、α−トコフェロール（ビタミンＥ）を使用し、その結果は、未処理試料群に対する百分率にて示す。実験の結果、一重項酸素ラジカル消去能は、クロマメノキの抽出物０．１ｍｇ／ｍＬと０．０１ｍｇ／ｍＬにおいて大差なかったし、効能はビタミンＥ１００μＭと同様であった（図５参照）。
【００７１】
［実験例２：ケラチノサイトにおけるＲＯＳ生成抑制能］
ヒトケラチノサイトの培養
ヒトのケラチノサイトは、１３歳男子の皮膚組織から生検したものであり、修正されたＭＣＤＢ１５３培地成分が根幹となるケラチノサイト基礎培地に組換えヒト上皮細胞成長因子（１００ｎｇ／ｍＬ）、ウシ腦下垂体抽出物（７０ｍｇ／ｍＬ）、ヒドロコルチソーン（０．５ｍｇ／ｍＬ）、インシュリン（５ｍｇ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（０．３ｍｇ／ｍＬ）、アンフォテリシン−Ｂ（２．５ｍｇ／ｍＬ）を添加した培地において３７℃、５．０％ＣＯ２条件のＣＯ２インキュベーターにおいて培養させた。実験に供されたケラチノサイトは、３次継代培養した細胞であった。
【００７２】
ケラチノサイトにおけるラジカル生成阻害能の測定
皮膚が紫外線により刺激を受けたとき、ケラチノサイトにおいて生成されるＲＯＳを測定するために、ケラチノサイトを２４ウェルプレートに１０５セル／ウェルずつ接種して１７時間放置してセルの付着を確かめた後、培地を取り除き、各濃度別に培地に溶かして製造したクロマメノキの抽出物を各ウェルに２ｍＬずつ分注して２４時間放置した。放置が終わると、培地を取り除き、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）を４００μｌずつ分注した後、紫外線（ＵＶ）Ｂ照射光源により４５ｍＪ／ｃｍ２にて照射した後、６０分まで１０分おきに生成されるＲＯＳ量を測定した。
【００７３】
１．スーパーオキシドラジカル生成阻害能の測定
２４ウェルプレートに、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に７３μＭＮＡＤＨ、１５μＭフェナジンメトサルファート及び５０μＭＮＢＴを混合させた溶液１．８ｍＬを用意した後、製造例１のクロマメノキの抽出物を０．２ｍＬ入れた。そして、時間別に上澄み液を０．２ｍＬずつ取り除いた後、これを３７℃の温度下で２０分間放置させた後、５６０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００７４】
測定の結果、ケラチノサイトにおいて紫外線を照射した後に生成されるスーパーオキシドラジカルに対するクロマメノキの抽出物のラジカル生成量は、１０、２０、３０、４０、５０、６０分において、２ｍｇ／ｍＬ処理群において対照群に比べて３１、５５、４２、３７、４５、６５％の生成量を示し、０．２ｍｇ／ｍＬ処理群においては、７９、８６、８７、８９、９４、９４％の生成量を示している。１０分から４０分までは統計的な有意性があるように濃度依存的に減少し、その後の時間においては、クロマメノキの抽出物２ｍｇ／ｍＬを処理した群において有意性のある減少を示している（図６参照）。
【００７５】
２．ヒドロキシルラジカル生成阻害能の測定
２４ウェルプレートに、２．５ｍＭβ−ケラチンエタノール溶液０．２ｍＬに５．９４ｍＭＨ２Ｏ２０．８ｍＬと２６.４ｍＭＦｅＳＯ４の濃度になるように溶かしたエタノール溶液０．８ｍＬ、各時間別に取り除いた上澄み液０．２ｍＬを混ぜた後、４３６ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００７６】
測定の結果、ケラチノサイトにおいて紫外線Ｂを照射した後に生成されるヒドロキシルラジカルに対して１０分から５０分までクロマメノキの抽出物２ｍｇ／ｍＬを処理したケラチノサイトにおける生成量が低減されており、対照群に対する生成量の比率は１０、２０、３０、４０、５０分において４６、４６、４２、２４、３７％であった（図７参照）。
【００７７】
３．過酸化水素生成阻害能の測定
３×１０−６Ｍスコポレチン１ｍＬと１０−２Ｍアジト化ナトリウム４００μｌと各時間別に取り除いた上澄み液０．５ｍＬを混ぜて５分間放置した後、１５０Ｕ／ｍＬの濃度に調製されたＨＰＯ（西洋ワサビペルオキシダーゼ ）１００μｌ、ＫＲＰ（クレブスリンガーリン酸）緩衝液６００μｌを入れ、蛍光強度計を用いて励起３６０ｎｍ、放出４５０ｎｍ、１波長における蛍光度を測定した。図８を参照すると、ケラチノサイトにおいて紫外線を照射した後に生成される過酸化水素の生成量は、クロマメノキの抽出物（２ｍｇ／ｍＬ）を処理した場合、未処理対照群に比べて有意的な減少を示していたが、対照群に対する生成量の比率は、２０、３０、４０、５０分において６１、６１、３９、６２％であった。
【００７８】
４．一重項酸素生成阻害能の測定
４５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１）に１０ｍＭヒスチジン、１０ｍＭＮａＯＣｌ、１０ｍＭＨ２Ｏ２、５０ｍＭＮ、Ｎ−ジメチル−ｐ−ニトロソアニリンを溶かした溶液１．８ｍＬに各時間別に上澄み液を０．２ｍＬ混ぜて３０℃において４０分間放置した後、４４０ｎｍにおける吸光度を測定し、その結果を図９に示す。ケラチノサイトにおいて紫外線を照射した後に生成される一重項酸素ラジカルに対して２０分からそれ以降の時間帯においてクロマメノキの抽出物を処理したケラチノサイトにおいてラジカルの生成量が濃度依存的に減少している。対照群（ＵＶ−Ｃ）と比較してみるとき、２ｍｇ／ｍＬ処理群（Ｖ２）においては２０分において９８％、３０分において９６％、４０分から６０分までは９３％の生成量を示し、０．２ｍｇ／ｍＬ処理群（Ｖ０．２）においては９９％の生成量を示している。
【００７９】
［実験例３：ケラチノサイトにおけるサイトカイン分泌阻害能］
皮膚が紫外線により刺激を受けたとき、ケラチノサイトにおいて生成されるサイトカインを測定するために、ケラチノサイトを２４ウェル平板に１０５セル／ウェルずつ接種して１７時間放置した後、細胞の付着を確かめて培地を取り除き、次いで、各濃度別に培地に溶かして調製したクロマメノキの抽出物溶液を各ウェルに２ｍＬずつ分注した後、２４時間放置した。放置が終わると、培地を取り除き、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）を４００μｌずつ分注し、ＵＶＢ照射光源により４０ｍＪ／ｃｍ２にて照射した後、２４時間までそれぞれにおいて生成されたサイトカインの量を測定した。
【００８０】
１．ＩＬ−１β分泌阻害能の測定
ケラチノサイトにＵＶＢを４０ｍＪ／ｃｍ２にて照射し、０時間、３０分、１時間、３時間、６時間、２４時間後に上澄み液を取り除き、ＥＬＩＳＡアッセイキットを用いてＩＬ−１βの量を測定した。実験の結果、クロマメノキの抽出物２ｍｇ／ｍＬを処理したケラチノサイトにおけるＩＬ−１βの生成量は、対照群に比べて有意的な減少を示し、生成量の比率は、１、３、６、２４時間においてそれぞれ３７、２８、２９、２６％程度であり、０．２ｍｇ／ｍＬ処理群においては８５、８８、８９、７３％程度の比率を示している（図１０参照）。
【００８１】
２．ＩＬ−６分泌阻害能の測定
ケラチノサイトにＵＶＢを４０ｍＪ／ｃｍ２にて照射し、０時間、１時間、３時間、６時間、２４時間後に上澄み液を取り除き、ＩＬ−６の量をＩＬ−６ＥＬＩＳＡアッセイキットを用いて測定した。実験の結果、クロマメノキの抽出物２ｍｇ／ｍＬを処理したケラチノサイトにおけるＩＬ−６の生成量は、３時間後から有意的に減少され、対照群に対する生成量の比率は３、６、２４時間においてそれぞれ４３、６１、３３％であった。クロマメノキの抽出物０．２ｍｇ／ｍＬを処理した群においては、６時間において有意的な減少を示し、対照群に対する生成量の比率は８１％程度であった（図１１参照）。
【００８２】
［実験例４：シワ改善効果の実験］
ヒト繊維芽細胞の培養
ヒトの繊維芽細胞は、１３歳男子の皮膚組織において生検したものであり、１０％ウシ胎児血清とペニシリン（１００ＩＵ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＤＭＥＭ（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）溶液において３７℃、５．０％二酸化炭素インキュベーターにおいて培養した。
【００８３】
シワ改善効果の実験
ヒトの繊維芽細胞を２４ウェルに１ウェル当たりに１０４細胞ずつ接種し、１７時間後に細胞の付着を確かめた後、培地を取り除き、各濃度別に培地に溶かし、製造例１に従い製造したクロマメノキの抽出物を各ウェルにつき２ｍｌずつ分注した。４８時間中にＣＯ２培養器において培養した後、培地を取り除いて繊維芽細胞におけるシワ形成因子（タイプIプロコラゲン、ＭＭＰ−１））を測定した。
【００８４】
１．ヒトの繊維芽細胞におけるプロコラーゲンのタイプＩの生成促進
各濃度別にクロマメノキの抽出物溶液を処理した後に生成されるタイプＩプロコラーゲンの量を試料を処理してから４８時間後にクロマメノキの抽出物をフィブロブラストに処理し、４８時間後に上澄み液を救い上げた後、プロコラーゲンタイプＩＣ−ペプチド（ＰＩＰ）ＥＩＡキットを用いてヒト繊維芽細胞において生成されるタイプＩプロコラーゲンの量を測定した。
【００８５】
【表３】
2008526956.tif 000005
【００８６】
１）Ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．
前記実験の結果、薬物を投与しなかった対照群と比較したとき、対照群の生成量（１４９．６ｎｇ／ｍＬ）よりも０．００５ｍｇ／ｍＬにおいて１５５．１ｎｇ／ｍＬ（１０３％）、０．０１ｍｇ／ｍＬにおいて１７９．２ｎｇ／ｍＬ（１１９％）と濃度依存的に増加する傾向にあった。コラーゲン繊維は、繊維母細胞において前駆物質であるプロコラーゲンが合成されて細胞外に分泌されて酵素の作用、繊維形成及び交差連結などにより完成された。このため、クロマメノキの抽出物がコラーゲンの前駆物質であるプロコラーゲンの量を増加させることにより、皮膚弾力の増強及びシワ改善に効果が得られることが確認できた。
【００８７】
２．マトリックスメタロプロテナーゼ−１（ＭＭＰ−１）の活性抑制
ヒト繊維芽細胞に、下記表４に示すように、各濃度別にクロマメノキの抽出物溶液を処理した後、４８時間経過後に上澄み液を取り除き、ＭＭＰ−１ＥＩＡキットを用いて、繊維芽細胞において生成されるマトリックスメタロプロテナーゼ（ＭＭＰ）−１の量を測定した。
【００８８】
【表４】
2008526956.tif 000006
【００８９】
１）Ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．
前記実験の結果、試料を投与しなかった対照群の生合成量が３７．２ｍｇ／ｍＬであるのに対し、クロマメノキの抽出物の濃度０．０１ｍｇ／ｍＬにおいて２５．５ｎｇ／ｍＬ（６８％）と示されるなど、ＭＭＰ−１の合成量は濃度依存的に減少する傾向にあることが確認できた。ＭＭＰ−１は、紫外線の繰り返し露出により角質形成細胞と繊維母細胞において発現され、これは、コラーゲンを分解する酵素であることが知られている。このため、クロマメノキの抽出物は、ＭＭＰ−１の活性を抑制することにより、皮膚のコラーゲン分解を抑制させて皮膚弾力の増強及びシワ改善に効果が得られることが確認できた。
【００９０】
３．ヒトの繊維芽細胞にＩＬ−１βを加えるときにおけるプロコラーゲンタイプＩ生成量の変化
ヒトの繊維芽細胞にインターロイキン（ＩＬ）−１βを加えたときに生成されるプロコラーゲンタイプＩの量は、ＩＬ−１βを加えなかったときに生成される量よりも低く、特に、ＩＬ−１βに対して濃度依存的に減少する傾向にあることが分かる。しかしながら、クロマメノキの抽出物を添加する場合、クロマメノキの抽出物の添加濃度に依存してプロコラーゲンタイプＩの生成量が増加することが確認できた。図１２は、ヒトの繊維芽細胞における、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ）とクロマメノキの抽出物の濃度（０．２ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ）によるプロコラーゲンタイプＩの生成量を示すものである。
【００９１】
４．ヒトの繊維芽細胞にＩＬ−１βを加えた場合におけるＭＭＰ−１の生成量の変化
図１３を参照すると、ヒトの繊維芽細胞にインターロイキン（ＩＬ）−１βを加えたときに生成されるＭＭＰ−１の量は、ＩＬ−１βを加えなかったときに生成される量よりも高く、ＭＭＰ−１の量は、ＩＬ−１β濃度依存的に増加する傾向にあることが分かる。しかしながら、この場合にも、クロマメノキの抽出物を添加する場合、クロマメノキの抽出物の添加濃度に依存してＭＭＰ−１の濃度が減少することが確認できる。
【００９２】
［実験例５：インビボシワ形成抑制能の実験］
無毛マウス、紫外線照射及び試料の投与
６週齢のメス無毛マウス（Ｓｋｈ−１）を使用し、実験室に到着後３日間の適応期間を経た後に実験を始めた。餌と水は自律で食べるようにし、２４±２℃の温度に５０±１０％の湿度、１２時間おきの昼間／夜間サイクル条件下において飼育した。動物群は、「紫外線照射群」、「紫外線非照射群」、「紫外線照射＋試料投与群」に分け、「紫外線照射＋試料投与群」はクロマメノキの抽出物をそれぞれ１０、２０、４０ｍｇ／ｋｇと異ならせて投与した。
【００９３】
紫外線の照射は、最小紅斑量（ＭＥＤ）６０ｍＪ／ｃｍ２にして１週間に３回ずつマウスの背部に照射し、１週目には１ＭＥＤ（６０ｍＪ／ｃｍ２）、２週目と３週目には２ＭＥＤ（１２０ｍＪ／ｃｍ２）、４週目から６週目までは３ＭＥＤ（１８０ｍＪ／ｃｍ２）、７週目から４ＭＥＤ（２４０ｍＪ／ｃｍ２）に照射して合計で１８週に亘って照射した。試料としてのクロマメノキの抽出物は、１０、２０、４０ｍｇ／ｋｇの濃度になるようにクロマメノキの抽出物を蒸留水に溶かして毎日定まった時間に投与した。
【００９４】
皮膚模似板の製作
マウスの試料投与によるシワ改善の推移を測定するために、３週単位にペントバルビタル溶液５０ｍｇ／ｋｇにて腹腔注射して麻酔させ、口径８ｍｍの模似板枠を背部に貼り付けた。そして、Ｓｉｌｆｌｏの構成成分であるシリコン液、シーナー、触媒を適切に配合し、枠内によく塗布して乾くまで待った後、これを取り外して模似板を製作した。コンピュータ映像分析器を通じて前記模似板に光を一定の角度から照射し、これにより生成される陰影の面積からシワの深さや数を定量してシワの付き具合を測定した。
【００９５】
皮膚模似板分析の結果
紫外線照射後に目視にて観察したところ、正常群（Ｎ）に比べてＵＶ対照群（Ｃ）の皮膚シワの増加ははっきりと現れた。しかしながら、クロマメノキの抽出物を投与した皮膚の場合、９週目には太いシワが低減されていることがはっきりと現れた（図１４参照）。
【００９６】
投与後３週目にクロマメノキの抽出物が２０ｍｇ／ｋｇ（Ｖ２０）と４０ｍｇ／ｋｇ（Ｖ４０）である群においては、ＵＶ対照群（Ｃ）に比べてＨ＿Ｒ１、４、５値が有意的に減少していた。投与後６週目にはクロマメノキの抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群においてＨ＿Ｒ２、３値が減少する傾向を示す他、全ての投与群の全体値がＵＶ対照群に比べて有意的に減少していた。また、投与後９週目には、クロマメノキの抽出物の投与群においてＨ＿Ｒ値がいずれも有意的に減少していた。
【００９７】
図１５の（ａ）〜１５（ｄ）は、紫外線照射後０週目、３週目、６週目、９週目のＨ＿Ｒ値を示すものであり、ここで、Ｈは水平を意味し、Ｒ１は最も高い個所と最も低い個所との距離を示し、Ｒ２は、最大距離を有する５つの値のうち最大値を示し、Ｒ３は最大距離を有する５つのＲ１値の平均を示し、Ｒ４はスムードネス深さを示し、Ｒ５は、平均粗さを示す。図１５において、上部に書いてあるアルファベット文字は、ダンカンの多重検定法による場合、有意レベルｐ＜０．０５の範囲において有意に異なる値を示すものである。
【００９８】
［実験例６：チロシナーゼ活性抑制効果］
９６ウェルプレート（製造元：米国コーニング）に０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ６．５）２２０μｌと各濃度別に調製したクロマメノキの抽出物溶液２０μｌ、そして２、０００Ｕ／ｍＬチロシナーゼ溶液２０μｌをこの順に入れ、この溶液に１．５ｍＭチロシン溶液４０μｌを入れた後、３７℃において１０分間放置させ、次いで、酵素結合免疫吸収分析（ＥＬＩＳＡ）読取装置（製造元：米国バイオテック）を用いて４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。供試料液として０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ６．５）２０μｌを入れて実験を行い、対照群としてはコウジ酸を処理した群を使用した。チロシナーゼの活性阻害率を求める公式は、下記の通りである。
【００９９】
チロシナーゼ活性阻害率(%)=[100-{(b-b’)/(a-a’)}]×100
（ａ：供試料液の反応後の吸光度、ｂ：試料液の反応後の吸光度
ａ’、ｂ’：各試料液の反応において、チロシナーゼに代えて緩衝液を用いて測定した吸光度）。
【０１００】
実験の結果、クロマメノキの抽出物はチロシナーゼ活性に対してＩＣ５０が０．４１ｍｇ／ｍＬ程度であり、コウジ酸の場合には１０μＭ程度の濃度においてＩＣ５０を示していた。クロマメノキの抽出物は、１ｍｇ／ｍＬの濃度において７２．８％のチロシナーゼ活性に対して阻害をしており、これは、コウジ酸の１０μＭにおける５０．８％と１００μＭにおける８４．８％の阻害率との中間レベル程度の効果であると見られる。また、低濃度においては、クロマメノキの抽出物０．１ｍｇ／ｍＬにおける阻害率が１１．４％であり、コウジ酸１μＭの阻害率（１４．４％）とほぼ同じ阻害率を示している（表５参照）。
【０１０１】
【表５】
2008526956.tif 000007
【０１０２】
前記実験の結果、両物質の濃度が異なって比較はできないが、０．５ｍｇ／ｍｌのクロマメノキの抽出物は、コウジ酸１０μＭを処理した対照群よりも活性阻害率が高く、クロマメノキの抽出物がチロシナーゼの活性を格段に抑制することが分かる。チロシナーゼは、アミノ酸の一種であるチロシンを酸化させてメラニンを生成する役割を果たすが、クロマメノキの抽出物がチロシナーゼの活性を阻害する上記の実験を通じて、クロマメノキの抽出物成分は皮膚の美白状態を改善できることが確認できた。
【０１０３】
［実験例７：Ｂ１６メラノマＦ１０セルを用いたメラニン生成量の低下効果の実験］
Ｂ１６メラノマＦ１０の培養
Ｂ１６メラノマＦ１０細胞は、１０％ウシ胎児血清とペニシリン１００ＩＵ／ｍＬ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬを含有するＤＭＥＭ溶液において３７℃、５．０％ＣＯ２条件のＣＯ２インキュベーターにおいて培養した。
【０１０４】
メラニン生成抑制効果に対する実験
Ｂ１６メラノマＦ１０セルを２４ウェルに１ウェル当たりに１０４セルずつ培養した。１７時間後に細胞の付着を確かめた後、培地を取り除き、製造例１に従い製造されたクロマメノキの抽出物溶液を各濃度別に各ウェルに２ｍＬずつ分注した。７２時間中にＣＯ２培養器において培養した後、培地を取り除き、ＮａＯＨを１ウェル当たりに２ｍＬずつ入れ、６０℃において３０分間放置した後、セル破砕溶液に対する４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。メラニンの濃度は、メラニン標準曲線と対比して計算した。
【０１０５】
実験の結果、Ｂ１６メラノマＦ１０セルにクロマメノキの抽出物を処理したときのメラニン生成量の総量は０．０１ｍｇ／ｍＬから０．５ｍｇ／ｍＬの濃度まで濃度依存的に有意的な減少を示していた。また、クロマメノキの抽出物０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度においてメラニン生成量は１６．６６μＭ／ｍＬであり、コウジ酸１０μＭの生成量である１６．５４μｇ／ｍＬと比較したときにクロマメノキの抽出物０．０５ｍｇ／ｍＬにおけるメラニン生成抑制効果がコウジ酸１０μＭの効果と同様であった。さらに、クロマメノキの抽出物０．５ｍｇ／ｍＬにおけるメラニン生成量はコウジ酸１００μＭの生成量よりも少ない傾向にあった（図１６参照）。図１６において、Ｖはクロマメノキの抽出物が処理された実験群を意味し、Ｋは、コウジ酸が処理された実験群を意味するものである。
【０１０６】
紫外線照射時における総メラニン生成量低下効果に対する実験
紫外線照射により照射しなかった細胞に比べてメラニン生成量が有意的に増加していたＢ１６メラノマＦ１０セルに対して、クロマメノキの抽出物を０．２ｍｇ／ｍＬと２ｍｇ／ｍＬの濃度にて処理した群におけるメラニン生成量は、それぞれ２０．８０μｇ／ｍＬ、１７．４７μｇ／ｍＬであり、対照群（２７．９６μｇ／ｍＬ）に比べて少量であり、メラニンの生成量はクロマメノキの抽出物の濃度に依存して減少していた。なお、コウジ酸を処理した群と比較したとき、クロマメノキの抽出物０．２ｍｇ／ｍＬはコウジ酸０．２μＭ（２２．７２μｇ／ｍＬ）の場合よりもメラニン生成量がなお一層減少され、クロマメノキの抽出物２ｍｇ／ｍＬはコウジ酸２μＭ（１９．２２μｇ／ｍＬ）の場合よりも生成量が減少していた（図１７参照）。図１７において、Ｃは紫外線を照射しない実験群を意味し、ＵＶ−Ｃは紫外線が照射された対照群を意味し、ＶとＫはそれぞれクロマメノキの抽出物とコウジ酸が処理された実験群を意味する。
【０１０７】
前記実験の結果、メラニン量においては、試料を投与しなかった対照群と比較してみたとき、コウジ酸とクロマメノキの抽出物ともに減少する傾向を示していた。ニキビ、そばかすなど皮膚にできる色素沈着は表皮内におけるメラニン色素の異常増加に起因する。クロマメノキの抽出物とコウジ酸ともに有意的に減少していたが、コウジ酸は毒性が問題となるという点を考慮するとき、クロマメノキの抽出物はコウジ酸に代えうる物質として有用であることが確認できる。
【０１０８】
本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、上述の技術的な思想を逸脱しない範囲内における様々な変形が可能であるため、本発明の保護範囲が上述の実施例と実験例に限定されない。このように様々に変形された実施形態もまた、特許請求の範囲により定まる本発明の保護範囲に属するものとして理解すべきである。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明による皮膚状態改善用の組成物は、抽出液または乾燥された抽出粉体の形状に容易に製造することができ、皮膚美白の増進、シワの除去、シワ予防及び弾力増強のための用途として使用でき、天然抽出物を用いたものであって、産業上の活用範囲に特に制限はない。また、クロマメノキの抽出物を皮膚に塗布したり飲用しても、皮膚の状態を改善させる効能が得られるので、化粧料、食品、薬剤の皮膚シワ改善のための成分として用い易い。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】クロマメノキの抽出物のＤＰＰＨラジカル消去能を示すグラフである。
【図２】キサンチン−キサンチンオキシダーゼ系におけるスーパーオキシドラジカルに対して、クロマメノキの抽出物が有するスーパーオキシドラジカル消去能を示すグラフである。
【図３】ＮＡＤＨ／ＰＭＳ系におけるスーパーオキシドラジカルに対して、クロマメノキの抽出物が有するスーパーオキシドラジカル消去能を示すグラフである。
【図４】クロマメノキの抽出物のヒドロキシルラジカル消去能を示すグラフである。
【図５】クロマメノキの抽出物の一重項酸素消去能を示すグラフである。
【図６】ケラチノサイトにおけるスーパーオキシドラジカルに対して、クロマメノキの抽出物が有するスーパーオキシドラジカル生成阻害能を示すグラフである。
【図７】ケラチノサイトにおけるヒドロキシラジカルに対して、クロマメノキの抽出物が有するヒドロキシラジカル生成阻害能を示すグラフである。
【図８】ケラチノサイトにおける過酸化水素に対して、クロマメノキの抽出物が有する過酸化水素生成阻害能を示すグラフである。
【図９】ケラチノサイトにおける一重項酸素に対して、クロマメノキの抽出物が有する一重項酸素生成阻害能を示すグラフである。
【図１０】ケラチノサイトにおけるＩＬ−１βに対して、クロマメノキの抽出物が有するＩＬ−１β分泌抑制能を示すグラフである。
【図１１】ケラチノサイトにおけるＩＬ−６に対して、クロマメノキの抽出物が有する分泌抑制能を示すグラフである。
【図１２】ＩＬ−１βとクロマメノキの抽出物の濃度によるプロコラーゲン型Ｉの生成量を示すものである。
【図１３】ＩＬ−１βとクロマメノキの抽出物の濃度によるＭＭＰ−１の生成量を示すものである。
【図１４】無毛マウスの皮膚に紫外線を照射し、クロマメノキの抽出物を投与した場合における皮膚写真である。
【図１５】（ａ）から（ｄ）は、無毛マウスの皮膚に紫外線を照射し、クロマメノキの抽出物を投与した場合における測定Ｈ＿Ｒ値を示すものである。
【図１６】クロマメノキの抽出物とコウジ酸を投与した場合における皮膚組織の単位細胞当たりのメラニンの量を示すものである。
【図１７】皮膚に紫外線を照射し、クロマメノキの抽出物とコウジ酸を投与した場合における皮膚組織の単位細胞当たりのメラニンの量を示すものである。
【図１】
2008526956.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2008526956.tif 000017
【図１１】
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【図１２】
2008526956.tif 000019
【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年8月3日(2006.8.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマメノキ（Vaccinium uliginosum）の抽出物を有効成分として含有し、紫外線に起因する活性酸素種を消去／抑制する皮膚美白及びシワ改善用の組成物。
【請求項２】
前記クロマメノキの抽出物は、クロマメノキの実若しくは葉に抽出溶媒としての水若しくはアルコールを加えて抽出されたものであることを特徴とする請求項１に記載の皮膚美白及びシワ改善用の組成物。
【請求項３】
前記クロマメノキの抽出物は、クロマメノキの実若しくは葉を４０〜１００℃の恒温水槽中において温湯して得られる熱水抽出物をろ過し、ろ過された熱水抽出物から上澄み液を分離した後、分離された上澄み液を減圧濃縮することにより得られるものであることを特徴とする請求項１に記載の皮膚美白及びシワ改善用の組成物。
【請求項４】
前記クロマメノキの抽出物は、クロマメノキの実若しくは葉をアルコールに入れて２０〜９０℃の温度下で得られる抽出物をろ過し、前記ろ過された抽出物から上澄み液を分離した後、分離された上澄み液を減圧濃縮することにより得られるものであることを特徴とする請求項１に記載の皮膚美白及びシワ改善用の組成物。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の組成物と化粧料添加剤成分を含有することを特徴とする皮膚美白及びシワ改善用の化粧料組成物。
【請求項６】
前記クロマメノキの抽出物の含量は、前記化粧料組成物の全体の重量に対して乾燥重量換算で０．０００１〜１０重量％であることを特徴とする請求項５に記載の皮膚美白及びシワ改善用の化粧料組成物。
【請求項７】
前記化粧料組成物は、アルブチン（arbutin）、コウジ酸（Kojic acid）、コウゾ抽出物、３−エトキシアスコルビン酸（3-ethoxyascorbicacid）、甘草抽出物及びこれらの混合物よりなる群から選ばれるいずれか１種以上の成分をさらに含有することを特徴とする請求項５に記載の皮膚美白及びシワ改善用の化粧料組成物。
【請求項８】
請求項１から４のいずれかに記載の皮膚美白及びシワ改善用の組成物と食品学的に許容される食品添加剤とをさらに含む皮膚美白及びシワ改善用の食品学的組成物。
【請求項９】
請求項１から４のいずれかに記載の皮膚美白及びシワ改善用の組成物と薬剤学的に許容される担体とをさらに含み、コラーゲンの合成を増進させると共にチロシナーゼ活性を抑制する皮膚美白及びシワ改善用の薬学的組成物。
【請求項１０】
クロマメノキの実若しくは葉に溶媒としての水若しくはアルコールを加えてクロマメノキの抽出液を得るａステップと、前記ａステップにおいて得られたクロマメノキの抽出液をろ過して上澄み液を分離するｂステップと、前記ｂステップにおいて得られたクロマメノキの抽出液を濃縮させるｃステップと、を含み、紫外線に起因する活性酸素種を消去／抑制する皮膚美白及びシワ改善用のクロマメノキの抽出物の製造方法。
【請求項１１】
前記ｃステップに後続して、濃縮されたクロマメノキの抽出物を少量の蒸留水に溶解した後、凍結乾燥あるいは粉末乾燥して粉体状のクロマメノキの抽出物を得るｄステップをさらに含むことを特徴とする請求項１０に記載の皮膚美白及びシワ改善用のクロマメノキの抽出物の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロマメノキ（Vaccinium uliginosum：黒豆の木）の抽出物を含有する皮膚美白及びシワ状態改善用の組成物に係り、さらに詳しくは、皮膚のニキビ、そばかす、色素沈着などを予防・改善して皮膚美白に役立ち、皮膚シワを予防・改善するだけではなく、皮膚の弾力を増強可能な皮膚状態（皮膚の老化）改善用の組成物に関する。本発明による皮膚状態改善用の組成物は、抽出液若しくは乾燥された抽出粉体状に容易に製造することができ、皮膚状態の改善のための用途の化粧料、健康機能性食品及び薬剤などの一成分として使用可能である。
【背景技術】
【０００２】
近年、平均寿命の延長に伴う老人人口の増加とあいまって、医学、生化学、食品学分野において老化に関する研究が占める比重は次第に高まりつつある一方である。あらゆる生命体は、年を取るにつれて老化されるものであるが、老化とは、環境の変化に適応する生物体の能力が経時的に次第に低下することを言う。
【０００３】
皮膚も同様である。皮膚にシワができ、皮膚に色素沈着が起こり、しかも、弾力が低下するなど皮膚の状態が悪化することは皮膚老化による主たる現象であって、内外部の原因に起因する種々の因子により、様々な構造的な変化を通じて皮膚は老化過程を経ることになる。しかしながら、現代人は、皮膚をさらにきれいにし、かつ、美しく保つことを希望しており、皮膚状態を改善（皮膚老化を防止）する方法及び材料に関する様々な研究と実験も次第に活発化している。
【０００４】
皮膚状態を悪化させる主な現象である皮膚老化の原因は、大きく内因性老化と外因性老化とに分けられる。すなわち、年を取るにつれて発生することが内因性老化（intrinsic aging）であり、紫外線などの外部因子により発生する老化を外因性老化（extrinsic aging）という。特に、外因性老化は、主に紫外線により老化が進むことから、光老化（photo aging）と呼ばれる。
【０００５】
内因性の皮膚老化の過程においては、特定の臨床皮膚の所見によれば、微細なシワ、真皮の収縮、そして皮下脂肪層の減少などが見られる。外因性老化の最も大きな比重を占める太陽光線中の紫外線による光老化過程においては、紫外線により皮膚の表皮において活性酸素種（ＲＯＳ）が過度に生成されるが、このような活性酸素種は、メラニンの増大による色素沈着が観察され、皮膚組織におけるコラーゲンとエラスチンとの生合成を阻害して分解の促進を引き起こしてシワの形成が見られる。特に、本発明は、光老化過程を経る皮膚状態を改善（皮膚美白及びシワなど）することと関連する。
【０００６】
光老化の作用機序は明らかではないが、紫外線は核酸とたんぱく質などの変形及び脂質の酸化を引き起こして細胞の染色体変形と細胞膜損傷を引き起こしたり、あるいは、活性酸素種を介して細胞の変形を引き起こしたりするということは種々の研究により判明されている。また、太陽による紫外線照射は紅斑、浮腫などの炎症性反応と皮膚黒化、真皮細胞間物質の変性など様々な臨床的な変化を引き起こす。さらに、かような多くの反応のどれが皮膚のシワ、弾力性などと深い関連性があるかを明らかにするための研究が進行中である。
【０００７】
紫外線による光老化、自然老化などの理由で皮膚の状態が悪くなるに伴い生じうる代表的な現象としては、皮膚の色が黒みがかかってくるような現象がある。皮膚の色に預かる色素としては、メラニン、メラゾイド、カロチン、酸化型ヘモグロビン、還元型ヘモグロビンなどがあるが、これらのうち最も重要なのはメラニンである。メラニンは自己保護のための偽装手段として働き、紫外線を吸収したり散乱させることにより皮膚内の細胞や組織が紫外線により損なわれることを防ぐ。メラニンは格別な最大吸収波長がなく、全領域の光を吸収し、しかも、皮膚内において過酸化陰イオン、過酸化水素、ヒドロキシラジカル、一重項酸素などの活性酸素種を消去する機能に優れている。
【０００８】
しかしながら、皮膚組織中にメラニンが過剰に存在している場合、メラニンそのものが活性酸素を発生することもあり、メラニン構造内のカテコールやキノンにより他の物質を還元若しくは酸化させることもある。なお、メラニンそのものが自由ラジカルの性質を示して人体にニキビ、そばかすなどを形成して皮膚の色を黒くし、皮膚老化を促進し、しかも、皮膚癌の誘発に預かることが知られている。
【０００９】
メラニン生成経路としては、周知のごとく、チロシンからチロシナーゼによりドパ（ＤＯＰＡ）、ドパキノン（ＤＯＰＡ−ｑｕｉｎｏｎｅ）を経てメラニンが生成される化学的な経路、あるいは、メラニン細胞からケラチン細胞へと移動してメラニンを生成する経路などがある。
【００１０】
メラニン生成抑制を通じての皮膚美白の方法としては、紫外線を遮断する方法、チロシナーゼの活性のために必要となるコア炭水化物の合成を阻害する方法、メラニン形成と関連する酵素であるチロシナーゼの活性を抑える方法、メラニン細胞に特異的な毒性を有する物質を用いてメラニン細胞の分裂を妨げる方法、ビタミンＣ誘導体と胎盤抽出物を用いる方法などが知られている。
【００１１】
特開平０６−１９２０６２号には、美白物質としてヒドロキノンが開示されているが、ヒドロキノンの美白効果は抜群であるが、発癌物質であり、化粧料などの材料として用いるには不向きである。特開昭５６−７７１０号には美白物質としてコウジ酸が開示されているが、コウジ酸はチロシナーゼの阻害能に優れていて美白効果に優れているが、コウジ酸の毒性に関する問題がもたげられているため、化粧料、食品などの材料として用いるには不適切であるという不都合がある。特開平４−９３１５号には、美白物質として、天然植物であって高山地帯に棲息するコケモモから抽出したり合成したりして得られるアルブチンが開示されているが、皮膚刺激による問題点が指摘されている。また、昔から皮膚美白と関連して、ハトムギ、キュウリなどの天然物が皮膚美白の目的で使用されているが、かような天然物はメラニンの過剰生成とは無関係なものであった。
【００１２】
皮膚の色が黒みがかかってくる現象に加えて、皮膚表皮が損なわれ、且つシワができる現象は、光老化などにより皮膚状態が悪くなるに伴い発生する代表的な現象である。光老化においては、大体真皮の変化が目立つため、シワ発生も真皮の変化に起因することが知られている。特に、皮膚真皮層の顕著な変化は、外側の真皮に無定形の弾力組織が過度に蓄積されることと、真皮のコラーゲン繊維が減少することである。
【００１３】
シワの発生過程は現在のところ判明されてはいないが、真皮のコラーゲンの合成低下または分解活性の増加、表皮基底膜の損傷、表皮代謝活性の低下などシワ発生と関連する多数の結果が報告されている。また、皮膚シワの発生は紫外線に起因する様々な生化学的、臨床的な変化の総合的な影響によるものであると理解できる。
【００１４】
皮膚シワの問題を解決するために、従来には、コラーゲンを化粧品に配合して製品にした場合があったが、コラーゲンを化粧品にして皮膚の表面に塗布する場合、高分子となるコラーゲンの経皮吸収が困難になってその機能を十分に期待できないという不都合があった。また、皮膚の真皮に直接的にコラーゲンを注入する方法もあるが、この方法もまた副作用により皮膚シワを改善する解決策とはなっていない。
【００１５】
コラーゲン合成を促進する物質として、レチノ酸と、動物胎盤由来のたんぱく質（特開平８−２３１３７０号）などが知られている。レチノ酸は剤型技術が複雑であり、しかも、皮膚に刺激となるなど安全性の側面から使用に限界があり、動物胎盤由来のたんぱく質は狂牛病にかかったウシの摘出物を使用することがあるという致命的な短所があった。また、人体への効能が確認されているα−ヒドロキシ酸（alpha-hydroxy acid、ＡＨＡ）と各種のビタミンＡ誘導体（レチノイド類）が開発されて化粧品などに使用されている。しかしながら、これまで臨床的に確実な効能があると立証されたのは、前記の物質や紫外線遮断剤にとどまっている。既にヨーロッパにおいては、１９９０頃より化粧品にシワ改善効果を表記して広報しており、１９９３年頃にはセラミド、ＡＨＡ、レチノールなどの皮膚状態改善成分の化粧品の導入と機能性化粧品という用語が新たに造語されている。
【００１６】
ほとんどの化粧品会社は皮膚美白やシワを改善するための化粧品を開発してきたが、化粧品に限られており、摂取を通じて皮膚シワ改善の効果が得られないものであった。また、「塗布する化粧品」よりも「食べる化粧品」の方が早くきくということに鑑みてみるとき、「食べる皮膚状態改善用の化粧品」のみならず、「皮膚状態を改善する機能性食品」に関する研究開発も至急望まれるのが現状である。
【００１７】
摂取を通じて皮膚状態を改善する効能がある原料として学界に報告されているものとしては、ビタミンＣ、ビタミンＥ、グアバ抽出物などの皮膚美白原料があり、その種類が極めて少ない。塗布する化粧品原料についても、ヒドロキノンとこの前駆体として考えられるアルブチン、コウジ酸、ビタミンＣを安定化させた誘導体、天然物（メラニン合成と関連するサイトカインの調節）などに留まっている。塗布する化粧品の場合、このような化合物は種々の試験管内（in vitro）実験を経て効能が検証されているが、その他のシワ改善及び補湿製品に対して感じる満足よりも高い満足を与えられないことから、現在にも数多くの誘導体が合成されており、新規な天然物に対する皮膚状態の改善効能が検討されているが、経口投与などを通じての新製品の開発まではまだまだ遠いのが現状である。
【００１８】
一方、本発明において、皮膚シワの改善のための成分として最初に使用するクロマメノキは、大韓民国のハンラ山、グムガン山、ベクテゥ山などにおいて自生するツツジの花と落葉灌木植物であって、６〜７月に開花して８月に実を結ぶ植物である。クロマメノキの含有成分としては、糖分（８〜１１．８％）、果物酸（２〜２．２５％）、タンニン（０．１５〜０．２５％）、繊維素などが挙げられる。
【００１９】
これまで知られているクロマメノキの公知の薬理作用としては、血管保護、痢疾、抗潰瘍、抗癌、糖尿病性網膜疾患の治療、老人性疾患の予防、産後回復、精血作用、利尿作用、リウマチ関節炎の治療などが挙げられる。しかしながら、クロマメノキの皮膚シワ、皮膚美白改善効果と関連して知られていることはない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
［発明の詳細な説明］
［技術的課題］
本発明は、クロマメノキの抽出物を有効成分として含み、紫外線に起因する活性酸素種を消去／抑制する皮膚美白及びシワ改善用の組成物とその製造方法を提供することを目的とする。
【００２１】
また、本発明は、クロマメノキの抽出物を含む皮膚美白及びシワ改善用の化粧料組成物、食品学的組成物及び薬学的組成物と共に、皮膚の美白及びシワ改善剤としてのクロマメノキの抽出物の新規な用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
［技術的解決方法］
本発明は、クロマメノキの抽出物が光老化の重要な原因となる活性酸素種（Reactive oxygen species）の生成を抑制若しくは除去する抗酸化効能を有するということに着目して完成されたものである。皮膚が紫外線にさらされる場合、ケラチノサイトにはスーパーオキシドラジカル、ヒドロキシルラジカル、過酸化水素、一重項酸素ラジカルなどの活性酸素種が高濃度にて生成されるが、本発明によるクロマメノキの抽出物を紫外線にされた皮膚組織に投与する場合、前記活性酸素種の生成量が有意的に低減することが確認されている。
【００２３】
また、本発明者らは、クロマメノキの抽出物がメラニン合成を媒介するチロシナーゼ活性を阻害することにより、実質的にメラニンの生成を抑制する作用を示すという点、及び皮膚繊維芽細胞におけるコラーゲンの合成を増加させるとともにコラーゲンの分解を抑制し、ケラチノサイトにおけるサイトカイン分泌を抑制するなどの作用を示すという点を新規に見出し、これらの点に着目して皮膚美白とシワを改善するクロマメノキの抽出物の新規な用途を提案するに至った。
【００２４】
本発明において、皮膚美白及びシワ改善剤として採っている天然材料のクロマメノキの抽出物は、特に副作用がないことから、皮膚シワを防止・改善して皮膚の弾力を増強させるような用途として用いて好適である。さらに、クロマメノキの抽出物は、皮膚に塗布したり服用するだけで、皮膚美白とシワなどの皮膚の状態を改善する効能を得るに足りない。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によるクロマメノキの抽出物を含む皮膚美白及びシワ改善用の組成物は、皮膚に紫外線が照射されるに伴い、皮膚組織内において生成される活性酸素を抑制及び消去させ、チロシナーゼ活性を有効に阻害してメラニン細胞におけるメラニンの生成を抑制させ、ケラチノサイトにおけるサイトカイン分泌を阻害させ、プロコラーゲンの生成を促進してコラーゲンの分解を抑制するなどの作用を有するため、紫外線による皮膚の光老化防止、皮膚美白状態及びシワ状態の改善に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明による皮膚状態改善用の組成物及びその製造方法と、その具体的な使用態様について詳述する。
【００２７】
本発明による皮膚美白及びシワ改善用の組成物は、有効成分としてクロマメノキの抽出物を含有する。前記組成物は、クロマメノキの抽出物成分の他にも、必要な剤型に応じて、種々の添加剤、安定剤などをさらに含んでいてもよい。前記クロマメノキの抽出物は、クロマメノキの実、葉若しくは樹皮などから抽出されるものであって、抽出溶媒としては、水、アルコールなどが好適である。
【００２８】
本発明の主な成分であるクロマメノキの抽出物の製造方法に特に限定はないが、本発明に供されるクロマメノキの抽出物の好適な製造方法は、下記の通りである。
【００２９】
まず、クロマメノキの実、葉を洗浄した後、水を溶媒としてクロマメノキの抽出原液を得る（ａステップ）。具体的に、クロマメノキの実１００ｇに対する水の量は８００〜１２００ｍｌであることが好ましく、４０〜１００℃の恒温水槽中において１０〜１５時間重湯させることが好ましい。
【００３０】
次いで、前記ａステップにおいて得られたクロマメノキの抽出液をろ過して上澄み液をとる（ｂステップ）。例えば、複数重のガーゼで前記クロマメノキの抽出液をろ過させて異物の取られた上澄み液を得ることが好ましい。
【００３１】
前記ａステップ若しくはｂステップにおいて得られたクロマメノキの抽出液だけでも本発明による皮膚状態の改善効能を十分に得られるが、クロマメノキの抽出物をより効率よく用いるためには、下記のステップをさらに含むことが好ましい。
【００３２】
次いで、前記ｂステップにおいて得られた上澄み液に含まれている溶媒を蒸発させてクロマメノキの抽出液を濃縮させることにより、高濃縮されたクロマメノキの抽出物を得る（ｃステップ）。好ましくは、前記ａステップとｂステップを３回繰り返し行って得た上澄み液を取り合わせ、回転式エパポレータを用いて減圧下で水を完全に蒸発させることにより、クロマメノキの抽出物を濃縮させることが好ましい。
【００３３】
さらに、前記ｃステップに続けて、濃縮されたクロマメノキの抽出物を少量の蒸留水に溶解させた後、凍結乾燥若しくは噴霧乾燥させることにより粉体状にしたクロマメノキの抽出物を用いてもよい。
【００３４】
前記ａステップにおいて、クロマメノキから抽出物を抽出するための溶媒としては、水の他に、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノールなどのアルコールも採用してもよい。この場合、クロマメノキの実若しくは葉をアルコールに入れて２０〜９０℃の温度下で抽出しても、消音波処理しても、常温若しくは４℃の温度下で冷浸して抽出してもよい。
【００３５】
本発明によるクロマメノキの抽出物の具体的な使用態様としては、クロマメノキの抽出物を含有する皮膚美白及びシワ改善用の化粧料組成物、食品または健康機能食品、薬学的組成物があり、以下、これらを詳述する。
【００３６】
まず、本発明によるクロマメノキの抽出物は、既存の化粧料に皮膚美白とシワの改善剤として添加して用いることができ、化粧料の剤型に特に制限はない。クロマメノキの抽出物を用いて化粧料を製造する場合、クロマメノキの抽出物の他に化粧料に通常用いられる成分、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料、香料などの通常の補助剤と担体成分を併用してもよい。化粧料の剤型の例としては、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、含界面活性剤クレンジング、オイル、粉体パウンデーション、乳濁液パウンデーション及びスプレイなどがあり、通常の当業者であれば、剤型に応じた担体を容易に採択して用いることができる。
【００３７】
好ましくは、前記化粧料組成物は、アルブチン、コウジ酸、コウゾ抽出物、３−エトキシアスコルビン酸、甘草抽出物及びこれらの混合物よりなる群から選ばれるいずれか１種以上の成分をさらに含有することが、美白効果の側面からなお一層好ましい。さらに、添加剤としてレチノール、レチノールパルミテート、ポリエトキシル化レチンアミド、アデノシン、カイネチン、蚕繭抽出物、イソフラボン及びこれらの混合物よりなる群から選ばれるいずれか１以上の成分をさらに含めて用いてもよい。
【００３８】
クロマメノキの抽出物の（乾燥）含量は、化粧料組成物の総重量に対して０．０００１〜１０重量％であることが好ましいが、クロマメノキの抽出物の含量が０．０００１重量％未満である場合には、シワ改善の効果があまりなく、１０重量％を超える場合には、溶解し難いという不都合があり、クロマメノキの抽出物成分の追加によるチロシナーゼ活性を抑制させることや、コラーゲンの合成を増加させることなどにより促される効果が得られず、しかも、コスト上昇の面から好ましくないという不都合がある。
【００３９】
クロマメノキの抽出物の他の使用態様として、本発明は、クロマメノキの抽出物と食品添加剤を含む皮膚美白及びシワ改善用の食品を提供する。
【００４０】
本発明における前記皮膚美白及びシワ改善用の食品は、一般食品はもとより、「健康補助食品」または「健康機能食品」を含む概念として用いる。特に、「健康機能食品」は、人体に有用な機能性を有する原料や成分を用いて錠剤、カプセル、粉体、顆粒、液状、丸剤などの剤型に製造及び加工した食品（大韓民国法律第７４２８号の健康機能食品に関する法律の第３条第１号）を満たすものである。ここで、「機能性」とは、人体の構造及び機能に対して栄養素を調節したり、生理学的な作用などの保健用途に有用な効果を得たりすることを言う。すなわち、健常人または反健康人の保健用途に有効に使用可能なことを意味する。
【００４１】
含クロマメノキの抽出物食品を摂取したり皮膚に塗布するだけでも、十分に皮膚状態の改善の効能を得られるが、服用のし易さのために、錠剤、糖衣錠、カプセル、ドリンクなどの剤型を有する機能性食品として用いることが好ましい。
【００４２】
前記皮膚状態改善用の食品のさらなる態様としては、飲み物、酒、キムチ、ヨーグルト、牛乳、アイスクリーム、パン、餅及びそばなどがある。
【００４３】
前記「食品添加剤」とは、食品を製造、加工または保存するに際して、食品に添加、混合、浸潤などの方法により用いられる添加剤を意味する。
【００４４】
本発明のさらに他の一態様として、本発明は、クロマメノキの抽出物と薬剤学的に許容される担体をさらに含む皮膚美白及びシワ改善用の薬学組成物を提供する。クロマメノキの抽出物は、抗酸化機能を有し、プロコラーゲンの合成を促進させるとともにコラーゲンの分解を抑制させるなど紫外線による皮膚シワを改善し、チロシナーゼの活性を抑制する作用を有するということは後述する実施例から明らかになるであろう。
【００４５】
前記薬学的組成物の好適な剤型としては、錠剤、糖衣錠、軽質若しくは軟質のカプセル剤、溶液剤、懸濁剤、乳化液剤、注射剤、座薬剤などがあるが、これに限定されるものではない。担体の種類は、薬剤の剤型に応じて当業者が容易に選択することができ、希釈剤、香味剤、可溶化剤、潤滑剤、懸濁剤、バインダー、崩壊剤などとして働きうる成分を１またはそれ以上含んでいてもよい。
【００４６】
クロマメノキの抽出物を含有するコラーゲン合成促進用の薬剤の服用量は、患者が必要とする程度、患部の具合、そして、使用すべき化合物の種類によるが、過量を服用しても副作用の問題はない。通常、患者の体重１Ｋｇ当たりのクロマメノキの抽出物の含量は、乾燥粉体を基準として０．００１〜０．１０ｇを服用（１回分）することが好ましい。
【００４７】
以下、本発明において採用したクロマメノキの抽出物が有する皮膚状態の改善作用と関連して、まず、皮膚美白とシワが形成される過程についてそれぞれ述べた後、クロマメノキの抽出物を用いたときに皮膚シワと関連する因子にいかなる変化があるかについて後述する実施例と実験例を挙げて述べる。
【００４８】
皮膚老化の主な原因である太陽光線からの紫外線が皮膚に達すると、皮膚の表皮組織に活性酸素種（ＲＯＳ）ができる。こうしてできた活性酸素種は、表皮細胞に障害を与え、しかも、表皮組織にあるケラチノサイトを刺激してしまい、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６などのインターロイキンをはじめとして、コロニ刺激因子（colony stimulating factor）とＴＮＦ（tumor necrosis factor）−αなどのサイトカインの分泌が促され、このときに分泌されたインターロイキンやサイトカインは皮膚細胞に影響して複雑な炎症反応と免疫反応を引き起こす。そして、活性酸素種は、メラノサイトからケラチノサイトへのメラノソームの移送を増大させ、メラノサイトにおけるメラニン生成を増大させ、真皮において繊維芽細胞におけるコラーゲン合成を阻害するといった現象を引き起こすが、これは、光老化経路における極めて重要な現象である。
【００４９】
外部から紫外線などの刺激を受けたとき、ケラチノサイトは炎症性サイトカインなどを分泌してメラノサイトの増殖とメラニンとの生合成を促すことにより、メラノサイトの生長、形成及びメラニンの分泌と分化における種々の因子を調節する。また、皮膚組織内まで照射される紫外線は皮膚内のメラノサイトを刺激してＩＬ−１αを分泌させ、分泌されたＩＬ−１αはメラノサイトをさらに刺激してＥＴ（endothelin）−１を分泌させる。ＥＴ−１は、プロテインキナーゼ（protein kinase）Ｃとアデニラートシクラーゼ（adenylate cyclase）系を活性化させてメラノサイトを増殖させ、チロシナーゼの活性を促すことにより、結果として色素沈着が起こるのである。
【００５０】
さらに、ケラチノサイトから生産、分泌される上述のインターロイキンはマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）−１（コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−３（ストロメチシン-１）、ＭＭＰ−９（９２−ｋｄ  ゼラチナーゼ）などの基質分解酵素（matrix-degrading enzyme）の遺伝子発現を刺激してＭＭＰの生成量を増大させる作用をし、プロコラーゲン遺伝子発現を阻害するためにプロコラーゲンの生合成量を低減させる。ＭＭＰ−１は、コラーゲン分解酵素であって、タイプＩプロコラーゲンから変換されたコラーゲンの分解を促進する作用をする。すなわち、皮膚に紫外線が達すると、タイプＩプロコラーゲンの生成の減少と生成されたコラーゲンの分解が起こり、皮膚におけるコラーゲンの量が低減することになる。このような過程を経て皮膚にシワが形成されるのである。
【００５１】
上述した皮膚美白とシワにあずかる因子と関連して、クロマメノキの抽出物を投与することによる影響については、後述する実験例を挙げて述べる。
【００５２】
図１は、クロマメノキの抽出物のＤＰＰＨラジカル消去能を示すグラフである。
図２は、キサンチン−キサンチンオキシダーゼ系におけるスーパーオキシドラジカルに対して、クロマメノキの抽出物が有するスーパーオキシドラジカル消去能を示すグラフである。
図３は、ＮＡＤＨ／ＰＭＳ系におけるスーパーオキシドラジカルに対して、クロマメノキの抽出物が有するスーパーオキシドラジカル消去能を示すグラフである。
図４は、クロマメノキの抽出物のヒドロキシルラジカル消去能を示すグラフである。
図５は、クロマメノキの抽出物の一重項酸素消去能を示すグラフである。
図６は、ケラチノサイトにおけるスーパーオキシドラジカルに対して、クロマメノキの抽出物が有するスーパーオキシドラジカル生成阻害能を示すグラフである。
図７は、ケラチノサイトにおけるヒドロキシラジカルに対して、クロマメノキの抽出物が有するヒドロキシラジカル生成阻害能を示すグラフである。
図８は、ケラチノサイトにおける過酸化水素に対して、クロマメノキの抽出物が有する過酸化水素生成阻害能を示すグラフである。
図９は、ケラチノサイトにおける一重項酸素に対して、クロマメノキの抽出物が有する一重項酸素生成阻害能を示すグラフである。
図１０は、ケラチノサイトにおけるＩＬ−１βに対して、クロマメノキの抽出物が有するＩＬ−１β分泌抑制能を示すグラフである。
図１１は、ケラチノサイトにおけるＩＬ−６に対して、クロマメノキの抽出物が有する分泌抑制能を示すグラフである。
図１２は、ＩＬ−１βとクロマメノキの抽出物の濃度によるプロコラーゲン型Ｉの生成量を示すものである。
図１３は、ＩＬ−１βとクロマメノキの抽出物の濃度によるＭＭＰ−１の生成量を示すものである。
図１４は、無毛マウスの皮膚に紫外線を照射し、クロマメノキの抽出物を投与した場合における皮膚写真である。
図１５の（ａ）から（ｄ）は、無毛マウスの皮膚に紫外線を照射し、クロマメノキの抽出物を投与した場合における測定Ｈ＿Ｒ値を示すものである。
図１６は、クロマメノキの抽出物とコウジ酸を投与した場合における皮膚組織の単位細胞当たりのメラニンの量を示すものである。
図１７は、皮膚に紫外線を照射し、クロマメノキの抽出物とコウジ酸を投与した場合における皮膚組織の単位細胞当たりのメラニンの量を示すものである。
【実施例】
【００５３】
［発明を実施するための形態］
［製造例１：クロマメノキの抽出物の製造］
北朝鮮産のクロマメノキの実１００ｇを８０％水５００ｍｌと一緒に５０℃の恒温水槽中において１２時間をかけて温湯してクロマメノキの抽出液を得、前記クロマメノキの抽出液を複数種のガーゼでろ過して上澄み液を取った。このような抽出及びろ過過程を３回繰り返し行って得た上澄み液を取り合わせ、回転式エバポレータを用いて減圧下で水を完全に蒸発させ、濃縮されたクロマメノキ熱水抽出液を得た。
【００５４】
［製造例２：クロマメノキの抽出物粉体の製造］
前記濃縮されたクロマメノキの抽出物を蒸留水に溶解させた後、吹き付け乾燥して、粉状の最終的なクロマメノキの抽出物を製造した。
【００５５】
［製造例３：クロマメノキの抽出物の製造］
クロマメノキの実１００ｇを８０％メタノール（メタノール：水＝４：１）５００ｍｌに入れて、常温下で５時間ずつ４回超音波処理して抽出した後、ガーゼでろ過し、上澄み液を取った。前記上澄み液を取る過程を３回繰り返し行って得られる上澄み液を取り合わせ、回転式蒸発装置を用いて減圧下でメタノールを蒸発させ、次いで、これを少量の蒸留水に溶解させてクロマメノキアルコール抽出液を得た。
【００５６】
［実施例１：皮膚美白及びシワ改善用の柔軟化粧水（スキンローション）の製造］
前記製造例１の方法に従い製造されたクロマメノキの抽出物（液状）を用いて、柔軟化粧水を通常の方法により製造した。柔軟化粧水の構成成分とその使用量は、下記の通りである。
【００５７】
【表１】
2008526956.tif 000025
【００５８】
［実施例２：皮膚美白及びシワ改善用の栄養化粧水の製造］
前記製造例１の方法に従い製造されたクロマメノキの抽出物（液状）を用いて、柔軟化粧水を通常の方法により製造した。柔軟化粧水の構成成分と使用量は、下記の通りである。
【００５９】
【表２】
2008526956.tif 000026
【００６０】
［実施例３：皮膚美白及びシワ改善用の機能性食品（錠剤）の製造］
前記製造例２の方法に従い製造されたクロマメノキの抽出物（粉体）５ｍｇ、ラクトースＢＰ１５０ｍｇ、澱粉ＢＰ３０ｍｇ及び全ゼラチン化トウモロコシ澱粉ＢＰ１５ｍｇと混合した後、精製水を適量添加して粉体に顆粒化させた。前記顆粒を乾燥させた後、ステアリン酸マグネシウム１ｍｇと混合し、圧着して錠剤を得た。
【００６１】
［実施例４：皮膚美白及びシワ改善用の機能性食品（飲み物）の製造］
前記製造例１の方法に従い製造されたクロマメノキの抽出物２ｍｇ、食用色素５ｍｇ、オーレンジエッセンス５ｍｇ、果糖７００ｍｇ、クエン酸１０ｍｇ、ビタミン５ｍｇを含む機能性飲料ベースを添加した組成物を製造した後、精製水を添加して飲料水を製造した。
【００６２】
［実施例５：皮膚美白及びシワ改善用の健康機能食品（シロップ剤）の製造］
精製水（５００ｍｌ）に白糖（６３７．５ｇ）を溶解させ、別の容器に別途にカルボキシメチルセルロースナトリウム（２．０ｇ）は精製水４００ｍｌに溶解させた後、前記白糖を溶解させた溶液と混合し、メチルパラベン（０．２８ｇ）とプロピルパラベン（０．１２ｇ）を加えて溶解させた後、エタノール（２０ｍｌ）を加え、精製水を全体溶液の容量が１０００ｍｌになるようにした。これを篩体にかけて得た製造例１のクロマメノキの抽出物を懸濁させてシロップ剤を得た。
【００６３】
［実施例６：軟膏剤の製造］
前記製造例１の方法に従い製造されたクロマメノキの抽出物５ｇ、セチルパルミテート２０ｇ、セタノール４０ｇ、ステアリルアルコール４０ｇ、ミリスタンイソプロピル８０ｇ、モノステアリン酸ソルビタン２０ｇ、ポリソルベート６０ｇ、パラオキシ安息香酸プロピル１ｇ、パラオキシ安息香酸メチル１ｇと精製水を適量添加して軟膏剤を製造した。
【００６４】
［実施例７：機能性酒の製造］
脱水精製された４０重量％のアルコールを蒸留水で希釈し、希釈されたアルコール蒸留水１００重量部に対して製造例３に従い得たクロマメノキの抽出物０．０５重量部添加し、残量のステビオサイド、高果糖、アミノ酸、クエン酸、塩を添加して含クロマメノキの抽出物の機能性酒を製造した。
【００６５】
［実験例１：活性酸素種（ＲＯＳ）の消去能］
１．ＤＰＰＨラジカル消去能の測定
エチルアルコールに溶かした１ｍＭのＤＰＰＨ（２、２−ジフェニルｌ−１−ピクリルヒドラジル）溶液０．８ｍｌと製造例１のクロマメノキの抽出物溶液０．２ｍＬを入れて３７℃の温度下で３０分間放置させた後、５１７ｎｍにおける吸光度を測定した。対照薬物としては、アスコルビン酸（ビタミンＣ）を使用し、その結果を未処理試料群に対する百分率にて示す。
【００６６】
実験の結果、図１に示すように、クロマメノキの抽出物のＤＰＰＨラジカル消去能は１０ｍｇ／ｍＬの濃度においてビタミンＣ１００μＭの３倍程度と高く、１ｍｇ／ｍＬの濃度においてビタミンＣ１００μＭの２倍程度高かった。 図１は、製造例１のクロマメノキの抽出物が有するＤＰＰＨラジカルスカベンジャー活性を示すグラフである。上部におけるアルファベット文字は、ダンカンの多重検定法（Duncan’s multiple range test）による場合、有意レベルｐ＜０．０５の範囲において有意に異なる値を示すものである。
【００６７】
２．スーパーオキシドラジカル消去能の測定
２−１．酵素系（Xanthine-Xanthine oxidase system）
２４ウェルプレートに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.５）６００μｌ、各濃度別に調製したクロマメノキの抽出物溶液５０μｌとキサンチン酸化酵素（０．０６８μｇ／ｍＬ）５０μｌを混合して２５℃の温度下で３０分間放置させた後、１ＭＨＣＬ１００μｌを加えて反応を止め、次いで、２９５ｎｍにおける吸光度を測定した。対照薬物としては、キサンチン酸化酵素抑制作用のある薬物として知られているアルプリノールを使用し、その結果を未処理試料群に対する百分率にて示す。図２を参照すると、酵素的なスーパーオキシドラジカル生成系であるキサンチン−キサンチンオキシダーゼ系におけるスーパーオキシド消去能は、クロマメノキの抽出物０．０１ｍｇ／ｍＬにおいてビタミンＡ１０μＭと同様であり、アルプリノール１μＭと１０μＭとの中間レベルの消去能を示している。
【００６８】
２−２．非酵素系（ＮＡＤＨ−ＰＭＳ system）
２４ウェルプレートに、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.４）溶液に ＮＡＤＨ、フェナジンメトサルファートとＮＢＴのそれぞれの濃度をそれぞれ７３μＭ、１５μＭ及び５０μＭ ＮＢＴになるように調節して１．８ｍＬの溶液を用意した。前記溶液に製造例１のクロマメノキの抽出物０．２ｍＬを濃度を異ならせて入れ、３７℃の温度下で２０分間放置させた後、５６０ｎｍにおける吸光度を測定した。対照薬物としては、アスコルビン酸（ｑビタミンＣ）を使用し、その結果は、未処理試料群に対する百分率にて示す。図３を参照すると、非酵素的なスーパーオキシドラジカル生成系であるＮＡＤＨ／ＰＭＳ系におけるスーパーオキシドラジカル消去能は、クロマメノキの抽出物０．１ｍｇ／ｍＬにおいてビタミンＣ１００μＭと同様であった。
【００６９】
３．ヒドロキシルラジカル消去能の測定
２４ウェルプレートに、２．５ｍＭβ−カロチンエタノール溶液０．２ｍＬに５．９４ｍＭのＨ2Ｏ２０．８ｍＬ及びＦｅＳＯ4２６．４ｍＭの濃度を有するエタノール溶液０．８ｍＬを混合し、ここに製造例１のクロマメノキの抽出物０．２ｍＬを添加した後、４３６ｎｍにおける吸光度を測定した。対照薬物としては、アスコルビン酸（ビタミンＣ）を使用し、その結果は、未処理試料群に対する百分率にて示す。実験の結果、クロマメノキの抽出物のヒドロキシルラジカル消去能は、クロマメノキの実抽出の濃度が０．０５ｍｇ／ｍＬであるときにビタミンＣ１００μＭとほぼ同様であった（図４参照）。
【００７０】
４．一重項酸素消去能の測定
４５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１）に１０ｍＭヒスチジン、１０ｍＭＮａＯＣｌ、１０ｍＭＨ2Ｏ2、５０ｍＭＮ、Ｎ−ジメチル−ｐ−ニトロソアニリンが混合された混合溶液１．９ｍＬに、クロマメノキの抽出物０．１ｍＬを濃度別に異ならせて添加し、３０℃の温度下で４０分間放置した後、４４０ｎｍにおける吸光度を測定した。対照薬物としては、α−トコフェロール（ビタミンＥ）を使用し、その結果は、未処理試料群に対する百分率にて示す。実験の結果、一重項酸素ラジカル消去能は、クロマメノキの抽出物０．１ｍｇ／ｍＬと０．０１ｍｇ／ｍＬにおいて大差なかったし、効能はビタミンＥ１００μＭと同様であった（図５参照）。
【００７１】
［実験例２：ケラチノサイトにおけるＲＯＳ生成抑制能］
ヒトケラチノサイトの培養
ヒトのケラチノサイトは、１３歳男子の皮膚組織から生検したものであり、修正されたＭＣＤＢ１５３培地成分が根幹となるケラチノサイト基礎培地に組換えヒト上皮細胞成長因子（１００ｎｇ／ｍＬ）、ウシ腦下垂体抽出物（７０ｍｇ／ｍＬ）、ヒドロコルチソーン（０．５ｍｇ／ｍＬ）、インシュリン（５ｍｇ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（０．３ｍｇ／ｍＬ）、アンフォテリシン−Ｂ（２．５ｍｇ／ｍＬ）を添加した培地において３７℃、５．０％ＣＯ2条件のＣＯ2インキュベーターにおいて培養させた。実験に供されたケラチノサイトは、３次継代培養した細胞であった。
【００７２】
ケラチノサイトにおけるラジカル生成阻害能の測定
皮膚が紫外線により刺激を受けたとき、ケラチノサイトにおいて生成されるＲＯＳを測定するために、ケラチノサイトを２４ウェルプレートに１０５セル／ウェルずつ接種して１７時間放置してセルの付着を確かめた後、培地を取り除き、各濃度別に培地に溶かして製造したクロマメノキの抽出物を各ウェルに２ｍＬずつ分注して２４時間放置した。放置が終わると、培地を取り除き、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）を４００μｌずつ分注した後、紫外線（ＵＶ）Ｂ照射光源により４５ｍＪ／ｃｍ2にて照射した後、６０分まで１０分おきに生成されるＲＯＳ量を測定した。
【００７３】
１．スーパーオキシドラジカル生成阻害能の測定
２４ウェルプレートに、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に７３μＭＮＡＤＨ、１５μＭフェナジンメトサルファート及び５０μＭＮＢＴを混合させた溶液１．８ｍＬを用意した後、製造例１のクロマメノキの抽出物を０．２ｍＬ入れた。そして、時間別に上澄み液を０．２ｍＬずつ取り除いた後、これを３７℃の温度下で２０分間放置させた後、５６０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００７４】
測定の結果、ケラチノサイトにおいて紫外線を照射した後に生成されるスーパーオキシドラジカルに対するクロマメノキの抽出物のラジカル生成量は、１０、２０、３０、４０、５０、６０分において、２ｍｇ／ｍＬ処理群において対照群に比べて３１、５５、４２、３７、４５、６５％の生成量を示し、０．２ｍｇ／ｍＬ処理群においては、７９、８６、８７、８９、９４、９４％の生成量を示している。１０分から４０分までは統計的な有意性があるように濃度依存的に減少し、その後の時間においては、クロマメノキの抽出物２ｍｇ／ｍＬを処理した群において有意性のある減少を示している（図６参照）。
【００７５】
２．ヒドロキシルラジカル生成阻害能の測定
２４ウェルプレートに、２．５ｍＭβ−ケラチンエタノール溶液０．２ｍＬに５．９４ｍＭＨ2Ｏ2０．８ｍＬと２６.４ｍＭＦｅＳＯ4の濃度になるように溶かしたエタノール溶液０．８ｍＬ、各時間別に取り除いた上澄み液０．２ｍＬを混ぜた後、４３６ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００７６】
測定の結果、ケラチノサイトにおいて紫外線Ｂを照射した後に生成されるヒドロキシルラジカルに対して１０分から５０分までクロマメノキの抽出物２ｍｇ／ｍＬを処理したケラチノサイトにおける生成量が低減されており、対照群に対する生成量の比率は１０、２０、３０、４０、５０分において４６、４６、４２、２４、３７％であった（図７参照）。
【００７７】
３．過酸化水素生成阻害能の測定
３×１０-6Ｍスコポレチン１ｍＬと１０-2Ｍアジト化ナトリウム４００μｌと各時間別に取り除いた上澄み液０．５ｍＬを混ぜて５分間放置した後、１５０Ｕ／ｍＬの濃度に調製されたＨＰＯ（西洋ワサビペルオキシダーゼ ）１００μｌ、ＫＲＰ（クレブスリンガーリン酸）緩衝液６００μｌを入れ、蛍光強度計を用いて励起３６０ｎｍ、放出４５０ｎｍ、１波長における蛍光度を測定した。図８を参照すると、ケラチノサイトにおいて紫外線を照射した後に生成される過酸化水素の生成量は、クロマメノキの抽出物（２ｍｇ／ｍＬ）を処理した場合、未処理対照群に比べて有意的な減少を示していたが、対照群に対する生成量の比率は、２０、３０、４０、５０分において６１、６１、３９、６２％であった。
【００７８】
４．一重項酸素生成阻害能の測定
４５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１）に１０ｍＭヒスチジン、１０ｍＭＮａＯＣｌ、１０ｍＭＨ2Ｏ2、５０ｍＭＮ、Ｎ−ジメチル−ｐ−ニトロソアニリンを溶かした溶液１．８ｍＬに各時間別に上澄み液を０．２ｍＬ混ぜて３０℃において４０分間放置した後、４４０ｎｍにおける吸光度を測定し、その結果を図９に示す。ケラチノサイトにおいて紫外線を照射した後に生成される一重項酸素ラジカルに対して２０分からそれ以降の時間帯においてクロマメノキの抽出物を処理したケラチノサイトにおいてラジカルの生成量が濃度依存的に減少している。対照群（ＵＶ−Ｃ）と比較してみるとき、２ｍｇ／ｍＬ処理群（Ｖ２）においては２０分において９８％、３０分において９６％、４０分から６０分までは９３％の生成量を示し、０．２ｍｇ／ｍＬ処理群（Ｖ０．２）においては９９％の生成量を示している。
【００７９】
［実験例３：ケラチノサイトにおけるサイトカイン分泌阻害能］
皮膚が紫外線により刺激を受けたとき、ケラチノサイトにおいて生成されるサイトカインを測定するために、ケラチノサイトを２４ウェル平板に１０5セル／ウェルずつ接種して１７時間放置した後、細胞の付着を確かめて培地を取り除き、次いで、各濃度別に培地に溶かして調製したクロマメノキの抽出物溶液を各ウェルに２ｍＬずつ分注した後、２４時間放置した。放置が終わると、培地を取り除き、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）を４００μｌずつ分注し、ＵＶＢ照射光源により４０ｍＪ／ｃｍ2にて照射した後、２４時間までそれぞれにおいて生成されたサイトカインの量を測定した。
【００８０】
１．ＩＬ−１β分泌阻害能の測定
ケラチノサイトにＵＶＢを４０ｍＪ／ｃｍ2にて照射し、０時間、３０分、１時間、３時間、６時間、２４時間後に上澄み液を取り除き、ＥＬＩＳＡアッセイキットを用いてＩＬ−１βの量を測定した。実験の結果、クロマメノキの抽出物２ｍｇ／ｍＬを処理したケラチノサイトにおけるＩＬ−１βの生成量は、対照群に比べて有意的な減少を示し、生成量の比率は、１、３、６、２４時間においてそれぞれ３７、２８、２９、２６％程度であり、０．２ｍｇ／ｍＬ処理群においては８５、８８、８９、７３％程度の比率を示している（図１０参照）。
【００８１】
２．ＩＬ−６分泌阻害能の測定
ケラチノサイトにＵＶＢを４０ｍＪ／ｃｍ2にて照射し、０時間、１時間、３時間、６時間、２４時間後に上澄み液を取り除き、ＩＬ−６の量をＩＬ−６ＥＬＩＳＡアッセイキットを用いて測定した。実験の結果、クロマメノキの抽出物２ｍｇ／ｍＬを処理したケラチノサイトにおけるＩＬ−６の生成量は、３時間後から有意的に減少され、対照群に対する生成量の比率は３、６、２４時間においてそれぞれ４３、６１、３３％であった。クロマメノキの抽出物０．２ｍｇ／ｍＬを処理した群においては、６時間において有意的な減少を示し、対照群に対する生成量の比率は８１％程度であった（図１１参照）。
【００８２】
［実験例４：シワ改善効果の実験］
ヒト繊維芽細胞の培養
ヒトの繊維芽細胞は、１３歳男子の皮膚組織において生検したものであり、１０％ウシ胎児血清とペニシリン（１００ＩＵ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＤＭＥＭ（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）溶液において３７℃、５．０％二酸化炭素インキュベーターにおいて培養した。
【００８３】
シワ改善効果の実験
ヒトの繊維芽細胞を２４ウェルに１ウェル当たりに１０４細胞ずつ接種し、１７時間後に細胞の付着を確かめた後、培地を取り除き、各濃度別に培地に溶かし、製造例１に従い製造したクロマメノキの抽出物を各ウェルにつき２ｍｌずつ分注した。４８時間中にＣＯ2培養器において培養した後、培地を取り除いて繊維芽細胞におけるシワ形成因子（タイプIプロコラゲン、ＭＭＰ−１））を測定した。
【００８４】
１．ヒトの繊維芽細胞におけるプロコラーゲンのタイプＩの生成促進
各濃度別にクロマメノキの抽出物溶液を処理した後に生成されるタイプＩプロコラーゲンの量を試料を処理してから４８時間後にクロマメノキの抽出物をフィブロブラストに処理し、４８時間後に上澄み液を救い上げた後、プロコラーゲンタイプＩＣ−ペプチド（ＰＩＰ）ＥＩＡキットを用いてヒト繊維芽細胞において生成されるタイプＩプロコラーゲンの量を測定した。
【００８５】
【表３】
2008526956.tif 000027
【００８６】
１）Ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．
前記実験の結果、薬物を投与しなかった対照群と比較したとき、対照群の生成量（１４９．６ｎｇ／ｍＬ）よりも０．００５ｍｇ／ｍＬにおいて１５５．１ｎｇ／ｍＬ（１０３％）、０．０１ｍｇ／ｍＬにおいて１７９．２ｎｇ／ｍＬ（１１９％）と濃度依存的に増加する傾向にあった。コラーゲン繊維は、繊維母細胞において前駆物質であるプロコラーゲンが合成されて細胞外に分泌されて酵素の作用、繊維形成及び交差連結などにより完成された。このため、クロマメノキの抽出物がコラーゲンの前駆物質であるプロコラーゲンの量を増加させることにより、皮膚弾力の増強及びシワ改善に効果が得られることが確認できた。
【００８７】
２．マトリックスメタロプロテナーゼ−１（ＭＭＰ−１）の活性抑制
ヒト繊維芽細胞に、下記表４に示すように、各濃度別にクロマメノキの抽出物溶液を処理した後、４８時間経過後に上澄み液を取り除き、ＭＭＰ−１ＥＩＡキットを用いて、繊維芽細胞において生成されるマトリックスメタロプロテナーゼ（ＭＭＰ）−１の量を測定した。
【００８８】
【表４】
2008526956.tif 000028
【００８９】
１）Ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．
前記実験の結果、試料を投与しなかった対照群の生合成量が３７．２ｍｇ／ｍＬであるのに対し、クロマメノキの抽出物の濃度０．０１ｍｇ／ｍＬにおいて２５．５ｎｇ／ｍＬ（６８％）と示されるなど、ＭＭＰ−１の合成量は濃度依存的に減少する傾向にあることが確認できた。ＭＭＰ−１は、紫外線の繰り返し露出により角質形成細胞と繊維母細胞において発現され、これは、コラーゲンを分解する酵素であることが知られている。このため、クロマメノキの抽出物は、ＭＭＰ−１の活性を抑制することにより、皮膚のコラーゲン分解を抑制させて皮膚弾力の増強及びシワ改善に効果が得られることが確認できた。
【００９０】
３．ヒトの繊維芽細胞にＩＬ−１βを加えるときにおけるプロコラーゲンタイプＩ生成量の変化
ヒトの繊維芽細胞にインターロイキン（ＩＬ）−１βを加えたときに生成されるプロコラーゲンタイプＩの量は、ＩＬ−１βを加えなかったときに生成される量よりも低く、特に、ＩＬ−１βに対して濃度依存的に減少する傾向にあることが分かる。しかしながら、クロマメノキの抽出物を添加する場合、クロマメノキの抽出物の添加濃度に依存してプロコラーゲンタイプＩの生成量が増加することが確認できた。図１２は、ヒトの繊維芽細胞における、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ）とクロマメノキの抽出物の濃度（０．２ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ）によるプロコラーゲンタイプＩの生成量を示すものである。
【００９１】
４．ヒトの繊維芽細胞にＩＬ−１βを加えた場合におけるＭＭＰ−１の生成量の変化
図１３を参照すると、ヒトの繊維芽細胞にインターロイキン（ＩＬ）−１βを加えたときに生成されるＭＭＰ−１の量は、ＩＬ−１βを加えなかったときに生成される量よりも高く、ＭＭＰ−１の量は、ＩＬ−１β濃度依存的に増加する傾向にあることが分かる。しかしながら、この場合にも、クロマメノキの抽出物を添加する場合、クロマメノキの抽出物の添加濃度に依存してＭＭＰ−１の濃度が減少することが確認できる。
【００９２】
［実験例５：インビボシワ形成抑制能の実験］
無毛マウス、紫外線照射及び試料の投与
６週齢のメス無毛マウス（Ｓｋｈ−１）を使用し、実験室に到着後３日間の適応期間を経た後に実験を始めた。餌と水は自律で食べるようにし、２４±２℃の温度に５０±１０％の湿度、１２時間おきの昼間／夜間サイクル条件下において飼育した。動物群は、「紫外線照射群」、「紫外線非照射群」、「紫外線照射＋試料投与群」に分け、「紫外線照射＋試料投与群」はクロマメノキの抽出物をそれぞれ１０、２０、４０ｍｇ／ｋｇと異ならせて投与した。
【００９３】
紫外線の照射は、最小紅斑量（ＭＥＤ）６０ｍＪ／ｃｍ2にして１週間に３回ずつマウスの背部に照射し、１週目には１ＭＥＤ（６０ｍＪ／ｃｍ2）、２週目と３週目には２ＭＥＤ（１２０ｍＪ／ｃｍ2）、４週目から６週目までは３ＭＥＤ（１８０ｍＪ／ｃｍ2）、７週目から４ＭＥＤ（２４０ｍＪ／ｃｍ2）に照射して合計で１８週に亘って照射した。試料としてのクロマメノキの抽出物は、１０、２０、４０ｍｇ／ｋｇの濃度になるようにクロマメノキの抽出物を蒸留水に溶かして毎日定まった時間に投与した。
【００９４】
皮膚模似板の製作
マウスの試料投与によるシワ改善の推移を測定するために、３週単位にペントバルビタル溶液５０ｍｇ／ｋｇにて腹腔注射して麻酔させ、口径８ｍｍの模似板枠を背部に貼り付けた。そして、Ｓｉｌｆｌｏの構成成分であるシリコン液、シーナー、触媒を適切に配合し、枠内によく塗布して乾くまで待った後、これを取り外して模似板を製作した。コンピュータ映像分析器を通じて前記模似板に光を一定の角度から照射し、これにより生成される陰影の面積からシワの深さや数を定量してシワの付き具合を測定した。
【００９５】
皮膚模似板分析の結果
紫外線照射後に目視にて観察したところ、正常群（Ｎ）に比べてＵＶ対照群（Ｃ）の皮膚シワの増加ははっきりと現れた。しかしながら、クロマメノキの抽出物を投与した皮膚の場合、９週目には太いシワが低減されていることがはっきりと現れた（図１４参照）。
【００９６】
投与後３週目にクロマメノキの抽出物が２０ｍｇ／ｋｇ（Ｖ２０）と４０ｍｇ／ｋｇ（Ｖ４０）である群においては、ＵＶ対照群（Ｃ）に比べてＨ＿Ｒ１、４、５値が有意的に減少していた。投与後６週目にはクロマメノキの抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群においてＨ＿Ｒ２、３値が減少する傾向を示す他、全ての投与群の全体値がＵＶ対照群に比べて有意的に減少していた。また、投与後９週目には、クロマメノキの抽出物の投与群においてＨ＿Ｒ値がいずれも有意的に減少していた。
【００９７】
図１５の（ａ）〜１５（ｄ）は、紫外線照射後０週目、３週目、６週目、９週目のＨ＿Ｒ値を示すものであり、ここで、Ｈは水平を意味し、Ｒ１は最も高い個所と最も低い個所との距離を示し、Ｒ２は、最大距離を有する５つの値のうち最大値を示し、Ｒ３は最大距離を有する５つのＲ１値の平均を示し、Ｒ４はスムードネス深さを示し、Ｒ５は、平均粗さを示す。図１５において、上部に書いてあるアルファベット文字は、ダンカンの多重検定法による場合、有意レベルｐ＜０．０５の範囲において有意に異なる値を示すものである。
【００９８】
［実験例６：チロシナーゼ活性抑制効果］
９６ウェルプレート（製造元：米国コーニング）に０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ６．５）２２０μｌと各濃度別に調製したクロマメノキの抽出物溶液２０μｌ、そして２、０００Ｕ／ｍＬチロシナーゼ溶液２０μｌをこの順に入れ、この溶液に１．５ｍＭチロシン溶液４０μｌを入れた後、３７℃において１０分間放置させ、次いで、酵素結合免疫吸収分析（ＥＬＩＳＡ）読取装置（製造元：米国バイオテック）を用いて４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。供試料液として０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ６．５）２０μｌを入れて実験を行い、対照群としてはコウジ酸を処理した群を使用した。チロシナーゼの活性阻害率を求める公式は、下記の通りである。
【００９９】
チロシナーゼ活性阻害率(%)=[100-{(b-b’)/(a-a’)}]×100
（ａ：供試料液の反応後の吸光度、ｂ：試料液の反応後の吸光度
ａ’、ｂ’：各試料液の反応において、チロシナーゼに代えて緩衝液を用いて測定した吸光度）。
【０１００】
実験の結果、クロマメノキの抽出物はチロシナーゼ活性に対してＩＣ５０が０．４１ｍｇ／ｍＬ程度であり、コウジ酸の場合には１０μＭ程度の濃度においてＩＣ５０を示していた。クロマメノキの抽出物は、１ｍｇ／ｍＬの濃度において７２．８％のチロシナーゼ活性に対して阻害をしており、これは、コウジ酸の１０μＭにおける５０．８％と１００μＭにおける８４．８％の阻害率との中間レベル程度の効果であると見られる。また、低濃度においては、クロマメノキの抽出物０．１ｍｇ／ｍＬにおける阻害率が１１．４％であり、コウジ酸１μＭの阻害率（１４．４％）とほぼ同じ阻害率を示している（表５参照）。
【０１０１】
【表５】
2008526956.tif 000029
【０１０２】
前記実験の結果、両物質の濃度が異なって比較はできないが、０．５ｍｇ／ｍｌのクロマメノキの抽出物は、コウジ酸１０μＭを処理した対照群よりも活性阻害率が高く、クロマメノキの抽出物がチロシナーゼの活性を格段に抑制することが分かる。チロシナーゼは、アミノ酸の一種であるチロシンを酸化させてメラニンを生成する役割を果たすが、クロマメノキの抽出物がチロシナーゼの活性を阻害する上記の実験を通じて、クロマメノキの抽出物成分は皮膚の美白状態を改善できることが確認できた。
【０１０３】
［実験例７：Ｂ１６メラノマＦ１０セルを用いたメラニン生成量の低下効果の実験］
Ｂ１６メラノマＦ１０の培養
Ｂ１６メラノマＦ１０細胞は、１０％ウシ胎児血清とペニシリン１００ＩＵ／ｍＬ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬを含有するＤＭＥＭ溶液において３７℃、５．０％ＣＯ２条件のＣＯ2インキュベーターにおいて培養した。
【０１０４】
メラニン生成抑制効果に対する実験
Ｂ１６メラノマＦ１０セルを２４ウェルに１ウェル当たりに１０４セルずつ培養した。１７時間後に細胞の付着を確かめた後、培地を取り除き、製造例１に従い製造されたクロマメノキの抽出物溶液を各濃度別に各ウェルに２ｍＬずつ分注した。７２時間中にＣＯ2培養器において培養した後、培地を取り除き、ＮａＯＨを１ウェル当たりに２ｍＬずつ入れ、６０℃において３０分間放置した後、セル破砕溶液に対する４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。メラニンの濃度は、メラニン標準曲線と対比して計算した。
【０１０５】
実験の結果、Ｂ１６メラノマＦ１０セルにクロマメノキの抽出物を処理したときのメラニン生成量の総量は０．０１ｍｇ／ｍＬから０．５ｍｇ／ｍＬの濃度まで濃度依存的に有意的な減少を示していた。また、クロマメノキの抽出物０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度においてメラニン生成量は１６．６６μＭ／ｍＬであり、コウジ酸１０μＭの生成量である１６．５４μｇ／ｍＬと比較したときにクロマメノキの抽出物０．０５ｍｇ／ｍＬにおけるメラニン生成抑制効果がコウジ酸１０μＭの効果と同様であった。さらに、クロマメノキの抽出物０．５ｍｇ／ｍＬにおけるメラニン生成量はコウジ酸１００μＭの生成量よりも少ない傾向にあった（図１６参照）。図１６において、Ｖはクロマメノキの抽出物が処理された実験群を意味し、Ｋは、コウジ酸が処理された実験群を意味するものである。
【０１０６】
紫外線照射時における総メラニン生成量低下効果に対する実験
紫外線照射により照射しなかった細胞に比べてメラニン生成量が有意的に増加していたＢ１６メラノマＦ１０セルに対して、クロマメノキの抽出物を０．２ｍｇ／ｍＬと２ｍｇ／ｍＬの濃度にて処理した群におけるメラニン生成量は、それぞれ２０．８０μｇ／ｍＬ、１７．４７μｇ／ｍＬであり、対照群（２７．９６μｇ／ｍＬ）に比べて少量であり、メラニンの生成量はクロマメノキの抽出物の濃度に依存して減少していた。なお、コウジ酸を処理した群と比較したとき、クロマメノキの抽出物０．２ｍｇ／ｍＬはコウジ酸０．２μＭ（２２．７２μｇ／ｍＬ）の場合よりもメラニン生成量がなお一層減少され、クロマメノキの抽出物２ｍｇ／ｍＬはコウジ酸２μＭ（１９．２２μｇ／ｍＬ）の場合よりも生成量が減少していた（図１７参照）。図１７において、Ｃは紫外線を照射しない実験群を意味し、ＵＶ−Ｃは紫外線が照射された対照群を意味し、ＶとＫはそれぞれクロマメノキの抽出物とコウジ酸が処理された実験群を意味する。
【０１０７】
前記実験の結果、メラニン量においては、試料を投与しなかった対照群と比較してみたとき、コウジ酸とクロマメノキの抽出物ともに減少する傾向を示していた。ニキビ、そばかすなど皮膚にできる色素沈着は表皮内におけるメラニン色素の異常増加に起因する。クロマメノキの抽出物とコウジ酸ともに有意的に減少していたが、コウジ酸は毒性が問題となるという点を考慮するとき、クロマメノキの抽出物はコウジ酸に代えうる物質として有用であることが確認できる。
【０１０８】
本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、上述の技術的な思想を逸脱しない範囲内における様々な変形が可能であるため、本発明の保護範囲が上述の実施例と実験例に限定されない。このように様々に変形された実施形態もまた、特許請求の範囲により定まる本発明の保護範囲に属するものとして理解すべきである。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明による皮膚美白及びシワ改善用の組成物は、抽出液または乾燥された抽出粉体の形状に容易に製造することができ、皮膚美白の増進、シワの除去、シワ予防及び弾力増強のための用途として使用でき、天然抽出物を用いたものであって、産業上の活用範囲に特に制限はない。また、クロマメノキの抽出物を皮膚に塗布したり飲用しても、皮膚の状態を改善させる効能が得られるので、化粧料、食品、薬剤の皮膚シワ改善のための成分として用い易い。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】クロマメノキの抽出物のＤＰＰＨラジカル消去能を示すグラフである。
【図２】キサンチン−キサンチンオキシダーゼ系におけるスーパーオキシドラジカルに対して、クロマメノキの抽出物が有するスーパーオキシドラジカル消去能を示すグラフである。
【図３】ＮＡＤＨ／ＰＭＳ系におけるスーパーオキシドラジカルに対して、クロマメノキの抽出物が有するスーパーオキシドラジカル消去能を示すグラフである。
【図４】クロマメノキの抽出物のヒドロキシルラジカル消去能を示すグラフである。
【図５】クロマメノキの抽出物の一重項酸素消去能を示すグラフである。
【図６】ケラチノサイトにおけるスーパーオキシドラジカルに対して、クロマメノキの抽出物が有するスーパーオキシドラジカル生成阻害能を示すグラフである。
【図７】ケラチノサイトにおけるヒドロキシラジカルに対して、クロマメノキの抽出物が有するヒドロキシラジカル生成阻害能を示すグラフである。
【図８】ケラチノサイトにおける過酸化水素に対して、クロマメノキの抽出物が有する過酸化水素生成阻害能を示すグラフである。
【図９】ケラチノサイトにおける一重項酸素に対して、クロマメノキの抽出物が有する一重項酸素生成阻害能を示すグラフである。
【図１０】ケラチノサイトにおけるＩＬ−１βに対して、クロマメノキの抽出物が有するＩＬ−１β分泌抑制能を示すグラフである。
【図１１】ケラチノサイトにおけるＩＬ−６に対して、クロマメノキの抽出物が有する分泌抑制能を示すグラフである。
【図１２】ＩＬ−１βとクロマメノキの抽出物の濃度によるプロコラーゲン型Ｉの生成量を示すものである。
【図１３】ＩＬ−１βとクロマメノキの抽出物の濃度によるＭＭＰ−１の生成量を示すものである。
【図１４】無毛マウスの皮膚に紫外線を照射し、クロマメノキの抽出物を投与した場合における皮膚写真である。
【図１５】（ａ）から（ｄ）は、無毛マウスの皮膚に紫外線を照射し、クロマメノキの抽出物を投与した場合における測定Ｈ＿Ｒ値を示すものである。
【図１６】クロマメノキの抽出物とコウジ酸を投与した場合における皮膚組織の単位細胞当たりのメラニンの量を示すものである。
【図１７】皮膚に紫外線を照射し、クロマメノキの抽出物とコウジ酸を投与した場合における皮膚組織の単位細胞当たりのメラニンの量を示すものである。
【国際調査報告】
2008526956.tif 000030
2008526956.tif 000031