(57)【要約】本発明の材料は、水和した場合に凝血塊形成を促進する構造的な枠組みとして役立つ超分子架橋ネットワークの形態に凝集する反応性サブミクロンシリカ粒子の結合剤に基づく外的に使用される創傷シーラントの固有のファミリーである。血栓溶解カスケード促進剤を、凝固プロセスをさらに加速するために、任意でさらなる凝固因子と共に提供することができる。2008507362.tif 000004
2008507362.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面ヒドロキシル基を有する複数の反応性シリカ・ナノ粒子をさらに含む結合剤を含む、創傷シーラント組成物。
【請求項２】
シリカ・ナノ粒子が400M2/gを超える表面積を有する、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
シリカ・ナノ粒子が24M2/g〜500M2/gの表面積を有する、請求項1記載の組成物。
【請求項４】
シリカ・ナノ粒子が0.1ナノメートル〜100ナノメートルの平均直径を有する、請求項1記載の組成物。
【請求項５】
シリカ・ナノ粒子が1ナノメートル〜10ナノメートルの平均直径を有する、請求項1記載の組成物。
【請求項６】
出血創傷へ適用される場合に、シリカ粒子が二酸化ケイ素の水素結合鎖の超分子格子へと凝集する、請求項1記載の組成物。
【請求項７】
表面ヒドロキシル基および凝固剤を有する複数の滅菌シリカ・ナノ粒子をさらに含む結合剤を含む、創傷シーラント組成物。
【請求項８】
凝固剤が外因性因子である、請求項7記載の組成物。
【請求項９】
凝固剤が酵素である、請求項7記載の組成物。
【請求項１０】
凝固剤がトロンビンまたはその血栓溶解断片である、請求項7記載の組成物。
【請求項１１】
凝固剤が組換えヒト・トロンビンまたはその血栓溶解断片である、請求項10記載の組成物。
【請求項１２】
凝固剤がトロンボプラスチンまたはその血栓溶解断片である、請求項7記載の組成物。
【請求項１３】
凝固剤が組換えヒト・トロンボプラスチンまたはその血栓溶解断片である、請求項12記載の組成物。
【請求項１４】
10mgのシリカ・ナノ粒子当たり1マイクログラム〜1ミリグラムの凝固剤を有する、請求項7記載の組成物。
【請求項１５】
10mgのシリカ・ナノ粒子当たり10マイクログラム〜500マイクログラムの凝固剤を有する、請求項7記載の組成物。
【請求項１６】
10mgのシリカ・ナノ粒子当たり100マイクログラム〜250マイクログラムの凝固剤を有する、請求項7記載の組成物。
【請求項１７】
シリカ・ナノ粒子が400M2/gを超える表面積を有する、請求項7記載の組成物。
【請求項１８】
シリカ・ナノ粒子が25M2/g〜500M2/gの表面積を有する、請求項7記載の組成物。
【請求項１９】
シリカ・ナノ粒子が0.1ナノメートル〜100ナノメートルの平均直径を有する、請求項7記載の組成物。
【請求項２０】
シリカ・ナノ粒子が1ナノメートル〜10ナノメートルの平均直径を有する、請求項7記載の組成物。
【請求項２１】
出血創傷へ適用される場合に、シリカ粒子が二酸化ケイ素の水素結合鎖の超分子格子へと凝集する、請求項7記載の組成物。
【請求項２２】
出血創傷を有する哺乳動物に請求項1記載の組成物を適用する段階、それによって創傷からの出血を阻止する段階を含む、哺乳動物において出血を阻止する方法。
【請求項２３】
複数のシリカ・ナノ粒子を得る段階、シリカ・ナノ粒子をヒドロキシル化する段階、およびヒドロキシル化シリカ・ナノ粒子を滅菌する段階、それによって創傷シーラント組成物を得る段階を含む、創傷シーラント組成物を作製する方法。
【請求項２４】
以下からなる群より選択される第2の化合物と滅菌ヒドロキシル化シリカ・ナノ粒子とを混合する段階をさらに含む、請求項23記載の方法：
賦形剤、界面活性剤、樹脂、抗生物質、吸収剤、凝固経路に関与する酵素、抗真菌剤、防腐剤、多機能性短鎖分子、および媒染剤。
【請求項２５】
滅菌ヒドロキシル化シリカ・ナノ粒子に凝固剤を接合させる段階をさらに含む、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
凝固剤が外因性因子である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
凝固剤が酵素である、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
凝固剤がトロンビンまたはその血栓溶解断片である、請求項25記載の方法。
【請求項２９】
凝固剤が組換えヒト・トロンビンまたはその血栓溶解断片である、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
凝固剤がトロンボプラスチンまたはその血栓溶解断片である、請求項25記載の方法。
【請求項３１】
10mgのシリカ・ナノ粒子当たり1マイクログラム〜1ミリグラムの凝固剤を有する、請求項30記載の組成物。
【請求項３２】
10mgのシリカ・ナノ粒子当たり10マイクログラム〜500マイクログラムの凝固剤を有する、請求項30記載の組成物。
【請求項３３】
10mgのシリカ・ナノ粒子当たり100マイクログラム〜250マイクログラムの凝固剤を有する、請求項30記載の組成物。
【請求項３４】
出血創傷を有する哺乳動物に請求項7記載の組成物を適用する段階、それによって創傷からの出血を阻止する段階を含む、哺乳動物において出血を阻止する方法。
【請求項３５】
創傷シーラントが、創傷を有する対象の創傷部位に適用された場合に止血および凝固を促進するという点で対象における過剰な出血の処置に適している、請求項23、請求項24、または請求項25記載の創傷シーラント組成物を調製する段階を含む薬剤の製造法。
【請求項３６】
出血創傷を有する哺乳動物に請求項1記載の組成物を適用する段階、それによって創傷からの出血を阻止する段階を含む、哺乳動物において出血を阻止する方法。
【請求項３７】
複数のシリカ・ナノ粒子を得る段階、シリカ・ナノ粒子をヒドロキシル化する段階、およびヒドロキシル化シリカ・ナノ粒子を滅菌する段階、それによって創傷シーラント組成物を得る段階を含む、創傷シーラント組成物を作製する方法。
【請求項３８】
以下からなる群より選択される第2の化合物と滅菌ヒドロキシル化シリカ・ナノ粒子を混合する段階をさらに含む、請求項23記載の方法：
賦形剤、界面活性剤、樹脂、抗生物質、吸収剤、凝固経路に関与する酵素、抗真菌剤、防腐剤、多機能性短鎖分子、および媒染剤。
【請求項３９】
滅菌ヒドロキシル化シリカ・ナノ粒子に凝固剤を接合する段階をさらに含む、請求項23記載の方法。
【請求項４０】
凝固剤が外因性因子である、請求項25記載の方法。
【請求項４１】
凝固剤が酵素である、請求項25記載の方法。
【請求項４２】
凝固剤がトロンビンまたはその血栓溶解断片である、請求項25記載の方法。
【請求項４３】
凝固剤が組換えヒト・トロンビンまたはその血栓溶解断片である、請求項28記載の方法。
【請求項４４】
凝固剤がトロンボプラスチンまたはその血栓溶解断片である、請求項25記載の方法。
【請求項４５】
10mgのシリカ・ナノ粒子当たり1マイクログラム〜1ミリグラムの凝固剤を有する、請求項30記載の組成物。
【請求項４６】
10mgのシリカ・ナノ粒子当たり10マイクログラム〜500マイクログラムの凝固剤を有する、請求項30記載の組成物。
【請求項４７】
10mgのシリカ・ナノ粒子当たり100マイクログラム〜250マイクログラムの凝固剤を有する、請求項30記載の組成物。
【請求項４８】
出血創傷を有する哺乳動物に請求項7記載の組成物を適用する段階、それによって創傷からの出血を阻止する段階を含む、哺乳動物において出血を阻止する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般に、以下のいくつかの用途を有する創傷シーラントに関連する：単純な血管外側の出血用途; 出血を減少、制御、もしくは解消するかまたはさらなる出血を制御するための外側の深い創傷外傷部位用途; および内出血用途。
【背景技術】
【０００２】
背景
創傷シーラントは、様々な創傷の種類に対する適合性の程度を変化させながら、多くの形態で何年もの間使用されてきた。典型的には、止血制御のための創傷シーラントは、典型的に、使用前に混合されて適用前に準備することができる2つまたは3つの段階の多成分製剤である。ヒトまたは動物の血液または組織産物に由来する精製された材料の創傷シーラント製剤は、典型的に反応するのが遅く(>30 分)、圧力出血（pressure bleeding）または再発性出血（recurrent bleeding）に対して一般に効果がない。
【０００３】
当技術分野において公知の特定のタイプの創傷シーラントは、フィブリノーゲンおよびトロンボプラスチン(WO 97297972)、フィブリノーゲンおよびトロンビン(US 5,219,328)、フィブリン類似体(US 5,292,333)、フィブリノーゲン類似体およびトロンビン(US 5,645,849および5,643,596)、トロンビン単独（0277016Bl）、バイオ・シーラント接着剤（adhesive）/糊（glue）（ゼラチン/レゾルシノール/グルタルアルデヒド）（US 6,168,788）を有するトロンビンおよびトロンボプラスチンおよび因子 VII、IXおよびX、ならびに更にはメチルアクリレートのような接着剤単独（US 5,981,621、US 6,607,631、およびその他）の使用に依存する。FDAは、US 6,168,788において必要とされていた動物またはヒトの血漿に由来する材料の使用を終わらせ、1978年にヒトフィブリノーゲンの使用を認可しなかった。さらに、US 6,168,788に記載されている精製法は、アルブミン、免疫グロブリン、ウイルスなどのような望ましくない他の材料の同時精製に加えて、カスケードを時間とともにゆっくりと開始する可能性のある、混合物（他の血栓溶解カスケード因子）中に存在してはならない種々の他の血液因子の同時精製という結果をもたらすという点で、不十分である。ウイルスおよびプリオンを含有していることに加え、宿主レシピエントにおいて組織適合性障害を助長しうるという点で、動物に由来する材料もまた問題である。上記に引用された特許において、フィブリノーゲン成分は典型的に「糊」を供給し、トロンビンまたはトロンボプラスチン成分は凝固プロセスの「アクチベーター」を供給した。アクチベータとしてトロンボプラスチンのみを使用しているそれらの製剤は、プロトロンビンを提供して凝固カスケードを開始する適用部位に依存する。この酵素的な材料は、存在する場合、本来低濃度で生じ、容易に消耗し得る。トロンビンを使用するこれらの製剤は、適用部位により供給されるフィブリノーゲンと共に即時に凝固を開始することができるが、さらなる出血の場合にはさらなるプロトロンビンをトロンビンに変換する能力を欠いている。
【０００４】
他の多段階式の生物活性創傷シーラントは、以下を含んでいた：プラスミンインヒビターの添加（US 5,645,859）; ポリオール安定化剤の添加（EP0277096B1）; 不溶性陽イオン交換材料および親水性ポリマーに結合する酸素酸塩の添加（20020141964）; カルシウムの制御（US 5,318,524）; pHの制御（US 5,219,328）; 合成プロトロンビンコンバーターの使用（PAJl0052267）; またはトロンビン様プロテアーゼ（EPS708067A1）。
【０００５】
さらに、包帯剤として創傷部位に適用される可塑性網状物(webbing)に加えて、滅菌スパイダーウェブのようないくつかの繊維ベースの産物が凝固を補助するためのマトリクスとして使用され、アミノカプロン酸のような凝固加速剤の使用およびミョウバンのような様々な収斂薬の使用が、その部位で毛細血管を収縮させ凝固を補助するために使用されてきた。
【０００６】
二段階シアノアクリレート(Closure Medical)またはカルボキシメチルセルロースもしくはキトサン（2002141964）のような親水性ポリマーは、しばしば、創傷部位で体液の表面に適用され、すぐ下に位置する凝血塊上に被膜を形成する（通常、創傷と相互作用しない被覆として）。
【０００７】
US 6,060,461は、多孔質粒子を使用した創傷部位と相互作用的しない局所的粉末凝固材料を記載しており（エピクロヒドリン（epiclorhydrin）架橋アガロース、すなわち、ヒトのための使用に適しておらず、MSDSによって毒性であるとみなされる研究材料であるセファデックス（Pharmacia））; 使用するセファデックスは、親水性であるが多孔質であり（固形でない）、ゲルの再水和により（スパゲッティのように）液体の存在下で膨張する、50nmの粒子を含む。US 6,386,203は、10〜100nmのサイズのフュームドシリカを使用している皮膚の接着剤を記載しており; 使用される材料は、しかしながらメチル基を含有する疎水性物質であって、親水性でない。それは、皮膚の接着剤が創傷部位間隙に落ちることを事実上防止するためにシアノアクリレートに関連して使用され、その疎水性の特性に基づき、創傷上包帯剤の特徴を保つ。US 4,373,519は、主に吸収性粒子（多孔質粘土、キトサン）を使用する創傷包帯剤を記載する。従来の、化学的に不活性な、固体である、マクロ粒子の、非吸収性の、篩分けされたシリカが、充填剤以外に与えられる、官能性のない不活性充填剤として添加される。US 5,741,509は、製剤中の溶媒が蒸発して創傷の上に防水層を残す、溶媒ベースの、シリコンオイルグリースおよび疎水性ヒュームドシリカからなるUS 6,386,203に機能的に類似している、水不透過性の、創傷-体液非相互作用的な、局所的なグリース包帯剤を記載している。使用されるフュームドシリカは完全に疎水性であり、創傷部位で体液と相互作用せず、充填剤の目的をあらためて満たす。US 20020128336は、建築産業（コーキング）において使用されているような、非医用（非創傷）接着剤に言及しており; 浴室における使用のための、固体マクロ粒子シリカ、チタン、およびアルミナからなる防水性シリカコーキング接着剤（気泡様）を記載している。これは、10〜50nmの疎水性の、非相互作用的な非吸収性シリカを使用する。US 20030133990は、創傷部位を乾燥させるための吸収剤として作用する天然のカルシウム強化粘土（Zeolite）の多孔質の分子ふるいの使用を記載している。この乾燥化をさらに補助するために、従来のビーズ状（1mm）で多孔質のシリカゲル乾燥剤材料（湿気制御のために消費財において乾燥剤として日常的に見出される）が添加される。この追加的材料は多孔質のマクロビーズを含み、これがこの追加的材料を吸収剤として吸湿性にする。それには、乾燥剤として化学的に不活性なビーズ状のシリカゲルが含まれる。空隙率は、この吸湿性材料に吸収剤機能を与える。反応性界面化学は存在しない。
【０００８】
このように、合成バイオ・シーラントである従来の創傷シーラントに関する問題は、それらが初期の凝血塊を、焼き石膏のように硬化する傾向があるということである; さらに、一度硬化されると、シーラントは通常使用済みである（出血に対してもはや反応することができない）。従来の創傷シーラントは、圧力出血、重度の外傷、深い創傷部位、長期にわたる出血、再出血、血友病に起因する出血、血液希釈剤を使用している患者による出血、または単純な体の動きに起因する凝血塊の崩壊に対して通常効果的でない。
【０００９】
他の創傷シーラント法は、保管中に相互作用する可能性があるために、別々に創傷部位へと送達（複数送達）されなければならない複数の成分を含む。これらは、一段階製剤ではない。これらの技術が、それらが対処するために開発された特定の目的に適度に適し得るとはいえ、それらは通常、妥協案である。当技術分野には、改良された創傷シーラント組成物の必要性が残されている。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
従来の創傷シーラントの主な欠点は、外傷部位の必要に応じて、凝固速度、圧力出血状態下での有効性、および経時的に変化する凝血塊の最適化された組み合わせを示すことができないことである。例えば、典型的な創傷シーラントはまた、侵透力のある、相互作用的な、柔軟で、かつ再可鍛性の創傷包帯剤として機能しないが、むしろ、別々の創傷包帯剤と共に使用されるか、または上記で述べたように、創傷に上塗りするかもしくは創傷を封止する試みとして体液表面の上にかつ凝血塊自身から離れて適用される。
【００１１】
理想的な創傷シーラントは、以下の特性を与える：「真の」一段階製剤および送達; 事前の湿潤処理、混合、または活性化時間を必要としない; 増大、および自然な凝固プロセスの加速; 出血（断続的、再発性、圧力性）の量およびタイプに応じた、体によって提供される材料の創傷部位での利用; 凝固のための外因性カスケードの2つの主反応に由来する重要な「アクチベーター」の使用; 即時のおよび持続性の出血の制御; その反応性（相互作用的な）特性に基づく適用の後の、インサイチューでの格子ウェブ形成の提供する; 動的、柔軟、かつ可鍛性の創傷包帯剤として役立つ; ウイルスを含まない非動物起源の生物活性材料からなる; 即時のおよび持続性の出血の制御のために別々の機能を可能にするための、保管の間、長期にわたって、または適用後に互いに反応しない血栓溶解アクチベーターの使用; 体自体が供給を制限するか、または供給が初期の出血で消費される可能性がある場合の、凝固活性化因子の「過度の」供給; ならびに、長い有効期間を有する安定な製剤。
【００１２】
上記の点に関して、本発明の創傷シーラントは、従来の概念および先行技術のデザインとは実質的に異なる反応性シリカ・ナノ粒子および任意の組換え血栓溶解因子を含む凝固促進剤格子技術を使用し、かつ、そうすることにより創傷シーラントおよび凝固増強剤の性能を改善する材料を提供する。本発明において、組換えクローニングおよび活性ペプチドの発現による遺伝子的に操作したトロンビンおよびトロンボプラスチンの使用によって、他の血栓溶解因子および他の血液製剤、HIVのような血液が媒介する危険なウイルス、免疫グロブリン、サイトカインなどを含まない安定な生物活性標品が得られる。
【００１３】
基本的な凝固促進剤は非常に高密度で高反応性の親水性表面ヒドロキシル基を含有する非多孔質シリカ・ナノ粒子の短鎖からなり、創傷部位で体液と接触するとすぐに水中で水素結合によって架橋する。反応性シリカ・ナノ粒子は、それらの極めて小さいサイズの粒子（ウイルスと同じくらい小さい）およびそれらの極めて高い表面積に基づいた「ナノ」テクノロジーを使用する。
【００１４】
これは、機能的なヒドロキシル基を有さない化学的に不活性である従来の「マイクロ」テクノロジーシリカでない。従来のシリカは、大きさが約1,000倍大きい（マクロベースまたはミクロンベースのビーズ）。それはまた非親水性かつ非格子形成性である。反応性ナノ粒子は一方で、直接的にまたは媒介物としての極性水分子を介して容易に互いに水素結合して創傷部位に三次元構造迷路を作りだし、周囲の水性体液（血清）の揺変性（肥厚）をもたらして、インサイチューで格子を作り出す。粘性増加および揺変性の発達は共に、水素結合の結果としての三次元迷路形成の直接的な結果である。格子は、動的な再会合を生じる運動および剪断力に応答して剪断時に絶えず再形成し、従って、ヒドロキシシリカ・ナノ粒子の柔軟な創傷シーラントマトリクスを結果的にもたらす。
【００１５】
インサイチューで形成されるこのフィブリン非依存性格子は、自然な凝血塊形成のためのバックボーンとして役立つ。加えて、製剤は、外因性カスケードの2つの主反応の鍵アクチベーターである、血漿由来の（獣医学的適用にのみ有用）または好ましくは組換えによるヒト・トロンビンおよびトロンボプラスチンを含有してもよい。トロンビンはフィブリノーゲンと作用して最終的な凝血塊を形成し、「即時の」凝血塊形成を促進するが、トロンボプラスチンはプロトロンビンと作用して上記の反応を開始するかまたは持続性もしくは再発性の出血時に凝固するために反応を再び開始する。集合的に、これらの材料の組み合わせは公知の方法および物質に対する実質的な利点を提示し、かつこれらの欠陥を回避する。後により詳細に記載する本発明の全般的な目的は、凝固促進格子を形成する新規な創傷シーラント組成物を提供することであり、特定の態様において、これは即時のおよび持続性の出血を止血するために独立して凝固経路を調節する一つまたは複数の任意の組換え血栓溶解アクチベーターを含む。この組成物は、本明細書において言及される既存の創傷シーラントに勝る多くの利点を提供する。
【００１６】
本発明は、通常、様々な応急手当ておよびより深刻な医療用途に特異的な、多数の態様および産物処方を生みだす非限定的な局面について考察する。一つの局面において、本発明は、創傷部位に適用されると、重合して水素結合凝固促進剤格子を形成するヒドロキシル化シリカ・ナノ粒子の組成物を提供する。ヒドロキシル化シリカ・ナノ粒子はまた、結合剤として本明細書において言及され、調製物は単純な血管からの出血（切り傷および擦り傷）を止血するために創傷部位へ直接適用することができる。500M2/gと同じまたはそれ以上の（以下「ナノ粒子」）表面積を有するのに十分小さいシリカ（二酸化ケイ素）粒子は、結合剤として好ましい。表面積の範囲は、25〜500のM2/g、好ましくは175〜300M2/gの間であり得る。このようなナノ粒子は、調製物中に存在する最高0.02%の325のメッシュ残渣（44ミクロン）を有し、極めて小さい（直径約0.01ナノメートル〜約1マイクロメートル、より好ましくは、直径0.1〜100ナノメートル、および最も好ましくは直径1〜50ナノメートル）。小さなサイズは大きな表面積と相まって、過剰な数の反応性ヒドロキシル基が非常に極性の水環境中での架橋結合を促進するのを可能にする。
【００１７】
本発明に適しているシリカ・ナノ粒子は、1800℃以上への加熱を伴う一般の産業的な「フュームドシリカ」プロセスによって典型的に形成される。これらのシリカ・ナノ粒子はフューミングプロセスの直接的な結果としてヒドロキシル化され、結合剤として使用できる適当なヒドロキシ・シリカ・ナノ粒子はより大きい化学的に不活性のシリカ・マクロ粒子またはマイクロ粒子（直径1マイクロメートルを超える）と混同されず、粉砕および篩分けにより産生されて、抗固結防止(anticaking)目的のために食品産業において一般に使用される。従来のより大きいシリカ粒子は、粒子の表面上の必要な活性ヒドロキシル官能基を欠いている。
【００１８】
ヒドロキシル表面基を含有する親水性の高いシリカ・ナノ粒子がすぐに架橋して水素結合した格子を形成する場合、これらの結合剤は創傷部位での体液との接触時に迅速な凝血塊形成を促進する。結合剤は格子中で媒介物として、互いにまたは極性水分子と水素結合する。水分子は、隣接するヒドロキシ・シリカ・ナノ粒子間の結合反応に関与する。創傷部位での一次水和時に、結合剤は経時的に揺変性の状態であると仮定する。体液の揺変性および肥厚の程度は体液中のナノ粒子の密度に直接的に比例し、濃度および製剤組成物（pH、添加物）の両方は試料の粘性、肥厚、流量、および動きを最適化するように調整することができる。ここで水素結合格子として集合した結合剤は創傷の全体にわたって集積され、失血に対するバリアを形成するが、出血自体によって供給および活性化される対象の内因性凝固因子の機能を妨げない。
【００１９】
別の局面において、結合剤は、少なくとも一つおよび好ましくは二つの酵素またはその活性断片、例えば外因性経路の血栓溶解アクチベーターを含んでいる凝固剤を含む。本明細書における使用のために適した血栓溶解カスケード促進剤は、鍵となる外因性経路アクチベーターであるヒト・トロンビンおよびトロンボプラスチンを含む。トロンビンはフィブリノーゲンと結合して凝血塊を形成し、創傷部位において「即時の」凝血塊形成を促進するが、トロンボプラスチンはプロトロンビンと結合して上記の二次反応を開始するかまたは「持続性または再発性の」出血時に凝固を再び開始する。結合剤および凝固剤の組成物は、通常出血を止めるかまたは減少させるために圧迫を必要とする外傷のようなより重い外傷を処置するのに適している。都合のよいことに、結合剤および凝固剤の創傷シーラント組成物は出血に対する物理的バリアを提供し、出血部で創傷部位に見出される天然のフィブリノーゲンと作用して凝固経路のより迅速な活性化およびより迅速な凝血塊形成という結果をもたらす。
【００２０】
ヒドロキシル化シリカ・ナノ粒子調製物は、任意で一つまたは複数の凝固剤を有し、創傷部位への単回送達適用のための滅菌調製物として調製される。調製物は、パッケージング可能でありかつ次の4つの優先的な製剤中に供給される：乾燥粉末、乾燥接着剤コーティング、乾燥噴霧剤、または液体（非水性）。製剤は、創傷部位へ局所的に適用するか、またはより深い裂創の場合もしくは外科的手技の間、創傷部位の内部に導入することができる。様々な他の局面において、創傷シーラント製剤は凝固剤および結合剤を含み、従って、創傷部位へ血栓溶解カスケード促進剤を提供する。好ましくは、凝固剤および結合剤は、予め混合された製剤として供給される。様々な態様において、結合剤は、血栓溶解アクチベーターであるトロンビンおよびトロンボプラスチンを含む。好ましい態様はこれらの凝固剤の組換え型、特に組換えヒト・トロンビンおよびトロンボプラスチンを含み、より好ましい態様はその活性断片を含む。最も好ましくは、凝固剤は、乾燥または凍結乾燥された形態で提供され、フィブリノーゲンまたはフィブリン類似体を実質的に含まない。
【００２１】
さらに他の局面において、血栓溶解カスケード促進剤が、本明細書において記載されている製剤と共に直接的創傷部位の処置に対する補助剤として使用され、例えばヒドロキシ・シリカ・ナノ粒子調製物と同時に患者に対して全身的にまたは局所的に投与される。組換えポリペプチドは、それらがウイルスを含まず、許容可能な純度であって、安全かつ有効であることが証明されていることから精製天然物または動物性材料に対して好ましい。
【００２２】
本発明のさらなる特徴を以下に記載する。この点において、本発明の少なくとも一つの態様を詳細に説明する前に、本発明が解釈の細部および以下の説明に記載されるかまたは図面中に例示される成分の配置に対するその用途に限定されないことが理解されるである。本発明は他の態様が可能であり、または様々な方法で実践または実施することができる。同様に、本明細書において用いた句および用語は説明を目的としており、限定と解釈してはならないことが理解されるべきである。
【００２３】
本発明の第一の目的は、先行技術の材料および方法の能力を越えて全てが血液凝固プロセスを改善および加速するために、高表面積で親水性の高いシリカ・ナノ粒子（典型的にフュームドシリカに由来する）を活用して格子構造を作り、プロセスを活性化し、ならびに追加的機会を生み出す、創傷シーラントのファミリーを提供することである。
【００２４】
本発明の別の目的は、出血の水性成分によって水和した際に鎖へと凝集するシリカ・ナノ粒子を使用する一段階送達創傷シーラントを提供することであり、その結果の一つは創傷体液の揺変である。
【００２５】
別の目的は、赤血球および他の血液成分を捕捉し、ならびに創傷部位からのそれらの流出を妨げるために、水和するとインサイチューでシリカ・ナノ粒子の凝集鎖の構造を作る単一成分/単回送達の創傷シーラントを提供することである。
【００２６】
別の目的は、繊維由来の鎖が三次元格子となるナノメートル寸法の凝集シリカ・ナノ粒子によって、毛細血管レベルに対してであっても出血を即時に封止および止める一段階創傷シーラントを提供することである。
【００２７】
別の目的は、種々の単回送達様式および媒体（乾燥、液体、パッチ/絆創膏上のコーティング、泡、エアロゾル）に対して順応性があるシリカのナノ粒子を使用する一段階創傷シーラントを提供することであり、従って、事前の湿潤処理、予混合、または活性化時間の遅れを回避する。
【００２８】
別の目的は、単一成分/単回送達シーラントの全ての利点および特徴を有し、材料および物質を凝固を増強するために添加することができる、シリカ・ナノ粒子のネットワークからなる一段階創傷シーラントを提供することである。
【００２９】
別の目的は、深傷または内出血の場合の血栓溶解カスケードを加速するためのヒト組換えトロンビンおよびトロンボプラスチンを含んでいる一段階創傷シーラントを提供することである。
【００３０】
過剰な体液が放出される外出血の場合の別の目的は、より大きい粒子サイズの他の分子水分吸収剤に分散したまたはその上にコーティングされたシリカ・ナノ粒子からなる一段階創傷シーラントを提供することであり、それにより創傷部位での体液に対するナノ粒子の比率を格子形成、粘性、および肥厚程度に好都合な特定の比率内に維持する。このような吸収剤は、例えば、シリカ様の（silicaeous）真珠岩またはバーミキュライト、モレキュラーシーブ・アルミナもしくはアルミナシリケートミクロスフェア、またはアルミナ・ゲル、セラミックミクロスフェア、吸収剤としての多孔質の非活性化もしくは活性化炭素等の、高い水結合能力を有する不活性材料を含んでいてもよい。
【００３１】
別の目的は、凝固を増強し、かつ異なるタイプの創傷、患者、環境、および血液学的要求量に対して材料を最適化するために様々な他の凝固因子、カルシウム陽イオン、収斂剤、促進剤、繊維、吸収剤または吸着剤、抗菌物質、および他の成分を混合することができる、シリカ・ナノ粒子のネットワークからなる一段階創傷シーラントを提供することである。
【００３２】
別の目的は、製剤が保管される間、自己活性化または成分間相互作用に影響されない一段階複数成分創傷シーラント製剤を提供することである。別の目的は、有用な貯蔵寿命を有し、最小限の特別なパッケージングおよび/または保管条件を必要とする一段階複数成分創傷シーラントを提供することである。別の目的は、先行技術に記載されている方法の材料よりも優れた費用対効果を有する材料を使用する創傷シーラントを提供することである。
【００３３】
別の目的は、無機原料に由来する安価な材料を使用するシリカのナノ粒子の創傷シーラントを提供し、従ってコストを減らすことである。
【００３４】
別の目的は、適用された場合に、損傷を受けずに動きに反応する能力を有し、ほぼ任意のサイズの創傷の処置も可能にする、柔軟な創傷包帯剤を形成するシリカのナノ粒子に基本的に基づく創傷シーラントを提供することである。
【００３５】
別の目的は、材料を再形成する能力による適用部位での持続性の凝固を提供するシリカのナノ粒子を使用する創傷シーラントを提供し、持続性のまたは新たな出血の処理ができるようにすることである。
【００３６】
別の目的は、圧力（動脈の）出血を伴う深刻な外傷に対して効果的であるシリカのナノ粒子を使用する創傷シーラントを提供し、効果的に出血を止めるだけでなく、創傷部位に存在する体液に元々存在する凝固因子を適応させるおよび利用することである。
【００３７】
別の目的は、圧力出血の制御を促進するために必要に応じて組織シーラント製剤に組み込まれることができる血栓溶解カスケード促進剤および様々な凝固因子の効率的な輸送媒体である創傷シーラントを提供することである。
【００３８】
他の目的は、結合剤との混合物中の動物由来または組換え体由来である血栓溶解カスケード促進剤の効率的な輸送媒体である創傷シーラントを提供することである。
【００３９】
別の目的は、接触および製剤時の反応または交差反応に対する懸念なしで成分を製剤化することができるように、ならびにこのために接触および系の「発火」を恐れて成分を別々に保つ必要がないように、非相互作用的成分（血液凝固プロセスにおいて互いに直接的に反応性でない）で構成される血栓溶解カスケード促進剤を使用することである。
【００４０】
別の目的は、比較的高い濃度で見出されあらかじめ血清中で豊富である成分に対して凝固プロセスを制限または除去するよりむしろ加速するために、比較的低く律速の血清中濃度で見出される、血栓溶解カスケードの一部として元々体に存在するそれらの血栓溶解カスケード促進剤成分を供給することである。
【００４１】
別の目的は、凝血塊形成 対 それらの必須凝血塊形成依存性因子それ自身（すなわちプロトロンビンまたはフィブリノーゲン）の供給のための基礎的要素として体により既に供給されている、血漿成分の活性化に関与する重要コア血栓溶解カスケード促進剤前駆体成分を過剰に提供することである。
【００４２】
別の目的は、それらの血栓溶解カスケード促進剤前駆体成分が例えば触媒の酵素的なプロセスによって起こるような重要な律速段階でカスケードの「活性化」に関与することである。
【００４３】
別の目的は、生理的条件よりも多量に供給される血栓溶解カスケード促進剤を含む創傷シーラントを提供することである。
【００４４】
別の目的は、非水性液体製剤を含む、安定であるが液体形態で即時に生理活性状態となる血栓溶解カスケード促進剤試薬を有する創傷シーラントを提供することである。
【００４５】
これらのおよび他の目的を達成するために、本発明をここに要約する。一つの局面において、本発明は、表面ヒドロキシル基を有する複数の反応性シリカ・ナノ粒子を含む結合剤を有する創傷シーラント組成物を含む。シリカ粒子は、出血創傷へ適用した場合に、二酸化ケイ素の水素結合鎖の超分子格子へと凝集する。一つの態様において、シリカ・ナノ粒子は、約400M2/gを超える表面積を有する。別の態様において、シリカ・ナノ粒子は、約25M2/g〜約500のM2/gの表面積を有する。別の態様において、シリカ・ナノ粒子は、約0.1ナノメートル〜約100ナノメートルの平均直径を有する。別の態様において、シリカ・ナノ粒子は、約1ナノメートル〜約10ナノメートルの平均直径を有する。
【００４６】
別の局面において、本発明は、表面ヒドロキシル基を有する複数の滅菌シリカ・ナノ粒子をさらに有している結合剤、および凝固剤を少なくとも含む、二成分創傷シーラント組成物を提供する。シリカ粒子は、出血創傷へ適用した場合に、二酸化ケイ素の水素結合鎖の超分子格子へと凝集し、凝固剤が凝固カスケードを活性化することにより止血を加速する。一つの態様において、凝固剤は、外因性因子である。一つの態様において、凝固剤は酵素である。一つの態様において、凝固剤は、トロンビンまたはその血栓溶解断片である。
【００４７】
一つの態様において、凝固剤は、組換えヒト・トロンビンまたはその血栓溶解断片である。一つの態様において、凝固剤は、トロンボプラスチンまたはその血栓溶解断片である。一つの態様において、凝固剤は、組換えヒト・トロンボプラスチンまたはその血栓溶解断片である。一つの態様において、組成物は、約10mgのシリカ・ナノ粒子当たり約1マイクログラム〜約1ミリグラムの凝固剤を有する。一つの態様において、組成物は、約10mgのシリカ・ナノ粒子当たり約10マイクログラム〜約500マイクログラムの凝固剤を有する。一つの態様において、組成物は、約10mgのシリカ・ナノ粒子当たり約100マイクログラム〜約250マイクログラムの凝固剤を有する。一つの態様において、シリカ・ナノ粒子は、約400M2/gを超える表面積を有する。一つの態様において、シリカ・ナノ粒子は、約25M2/g〜約500のM2/gの表面積を有する。一つの態様において、シリカ・ナノ粒子は、約0.1ナノメートル〜約100ナノメートルの平均直径を有する。一つの態様において、シリカ・ナノ粒子は、約1ナノメートル〜約10ナノメートルの平均直径を有する。
【００４８】
別の局面において、本発明は、出血創傷を有する哺乳動物対象に有効量の記載された創傷シーラント組成物を適用する段階、それによって創傷からの出血を阻止する段階、および対象において止血を開始するために凝固カスケードを任意で誘導する段階を含む、哺乳動物において出血を阻止する方法を提供する。
【００４９】
別の局面において、本発明は、複数のシリカ・ナノ粒子を得る段階、シリカ・ナノ粒子をヒドロキシル化する段階、およびヒドロキシル化シリカ・ナノ粒子を滅菌する段階、それによって創傷シーラント組成物を得る段階を含む、創傷シーラント組成物を作製する方法を提供する。滅菌ヒドロキシル化シリカ・ナノ粒子を第2の化合物、例えば賦形剤、界面活性剤、樹脂、抗生物質、吸収剤、凝固経路に関与する酵素、抗真菌剤、防腐剤、多機能短鎖分子、および媒染剤と混合することにより、製剤の様々な態様が提供される。一つの態様において、本発明は、滅菌ヒドロキシル化シリカ・ナノ粒子に凝固剤を結合させる段階を含む。一つの態様において、凝固剤は外因性因子である。一つの態様において、凝固剤は酵素である。一つの態様において、凝固剤は、トロンビンまたはその血栓溶解断片である。一つの態様において、凝固剤は、組換えヒト・トロンビンまたはその血栓溶解断片である。一つの態様において、凝固剤は、トロンボプラスチンまたはその血栓溶解断片である。一つの態様において、組成物は、約10mgのシリカ・ナノ粒子当たり約1マイクログラム〜約1ミリグラムの凝固剤を有する。一つの態様において、組成物は、約10mgのシリカ・ナノ粒子当たり約10マイクログラム〜約500マイクログラムの凝固剤を含む。一つの態様において、本発明は、約10mgのシリカ・ナノ粒子当たり約100マイクログラム〜約250マイクログラムの凝固剤を含む。さらに別の局面において、本発明は、創傷シーラント組成物を調製する段階を含む薬剤を製造するための方法を提供し、本方法において、創傷シーラントは、創傷を有する対象の創傷部位へ適用した場合にそれが止血および凝固を促進するという点で対象における過剰な出血を処置するのに適している。
【００５０】
本明細書において記載されている創傷シーラント調製物は対象（好ましくはヒト）における創傷部位からの出血を回復させるかまたは減少させる用途を有するが、当業者は獣医学的用途が適用可能であることを理解すると考えられる。このように創傷シーラントは対象における止血を調節する様々な方法を提供する。様々な製剤により処置可能な創傷として、特に、局所的創傷、より深い創傷、および外科的切開が挙げられる。従って、創傷シーラントの様々な用途は、応急処置および死傷者分類用途、ならびに医療手法を含む。本発明の他の目的および利点は読者にとって明らかになると考えられ、これらの目的および利点は本発明の範囲内であることが意図されている。
【００５１】
上記のおよび関連する目的の達成のために、本発明は添付の図面中に例示した形態に具体化することができるが、しかしながら、図面が例示のみであるという事実に注意がうながされるべきである。
【００５２】
詳細な説明
外出血への適用のため、結合剤は、1グラム当たり約500平方メートルまでの個々の表面積を有し、好ましくは直径数ナノメートルの個々の粒子サイズを有する短鎖中に、滅菌フュームドシリカ・ナノ粒子を含む。このようなシリカ粒子はいくつかの方法により産生され、最も一般なものはCabotによる「フュームドシリカ」製造技術、Elkinによる「シリカフューム」製造技術、および他の会社に由来する類似の産物である。本明細書において言及したヒトへの使用のための医用グレードのフュームドシリカは、比較的珍しい（例えば、Cabotは、ヒトへの適用に適したCAB-O-SILグレードM5またはM5Pを販売する）。他の用途では、ヒトであるか獣医学的であるかに関わらず、医用グレード品質はそれほど重要ではなく、例えば、生命をおびやかす外傷または戦場状況では、Cabotグレードの使用はL-90、LM-130、LM-150、PTG、M-7D、MS-55、H-5、HS-5、またはEH-5が使用され得る。全てのグレードは、90〜380M2/gの平均表面積、0.02%未満の325メッシュ残渣（44ミクロン）、100ナノメートル未満のサイズの範囲内にはいり、適当な反応性界面化学を有する。
【００５３】
ナノ粒子を調製するために使用されるフューミングプロセスの間、多数の表面ヒドロキシル基が粒子の表面に産生される。これは、粒子を高親水性にし、親水性は、それを他の従来のシリカマイクロ粒子と対比させる別の特徴である。ヒュームド技術によって調製した場合に、2つのタイプのヒドロキシル基は通常、ナノ粒子の表面に産生される。フュームドシリカは、縮合時に表面ヒドロキシル基を有するナノ粒子を産生する二酸化ケイ素分子を結果として生じる、1800℃での水素酸素火炎中の四塩化ケイ素の加水分解によって産生される。IRによって観察されるのは、2つの2タイプのヒドロキシルである：高親水性である3750cm-1に吸収極大を有する単離されたヒドロキシル基; および同様に高親水性である水素結合ヒドロキシル基（3700〜3500cm-1）。後者は、隣接した表面ケイ素原子に付着したヒドロキシル基の存在に起因する。全てのケイ素原子が1つのヒドロキシルを有する場合、ヒドロキシル基の表面密度は理論的に平方ナノメートル当たり8までのヒドロキシル基と同じ程度であることができるが、平均は化学的および熱重量分析により平方ナノメートル当たり4つのヒドロキシルである傾向がある。
【００５４】
Langmuir 20:260-262, 2004, GoIe, JL et alで記載されるように、ナノ粒子の表面ヒドロキシル化を改良することが可能であり得る。メタロイド・イオン（metalloidions）/出発混合物中のメタロイド・イオン の比率によってSi/SiO2ナノ粒子における表面酸化状態を調整することが可能であり得る。例として、出発混合物中のSi4/SiOの比率の変動により、微調整が可能な平均表面酸化状態をもたらすフェノールのヒドロキシル化反応に対してより反応性の大きいナノ粒子を得ることができる。
【００５５】
本発明の好ましい態様の適用を促進するために、確かなその特性および機能が説明されなければならない。水和した場合、毛細血管レベルまでのあらゆるレベルの出血における有効性を可能にするために、1ミクロン未満の次元で凝血塊形成の三次元枠組みを提供する格子形態で、結合剤は二酸化ケイ素の架橋鎖の超分子ネットワークまたは織物へと直ちに凝集する。創傷部位の血中および血清に存在する水分は格子の作製に関与し、従って2つの目的に貢献する：血液細胞および凝固因子の捕捉ならびにフロー制御のための小さい孔サイズを生じる三次元格子形成; ならびに肥厚をもたらす水分の吸収（格子構造自体の一部としての水素結合による）。この格子は、絶対的な力が存在しない場合体液が揺変性ゲルとなる原因となり、それゆえに、絶対的な力および創傷部位でのさらなる体液の利用可能性に応答して絶えずそれ自体を再形成する柔軟な創傷包帯剤として役立つ。結合剤がそれ自体で有用な創傷シーラントであるにもかかわらず、それはまた凝固および創傷封止プロセスを増強するための他の成分の便利な非相互作用的担体である。
【００５６】
結合剤は従って、滅菌材料として調製したシリカ粒子を含む、独立型の、単一成分/単回送達シーラントである。これらの粒子は、直径数ナノメートルであり、適用部位で水素結合ができるヒドロキシルおよびシロキサンの表面基を有する。ヒドロキシル基は、凝固因子をその後放出することによって、創傷において血小板膜を刺激することが知られている。創傷中の遊離ヒドロキシル基は、苛性アルカリのために刺傷反応を生じる。この製剤においては、しかしながら、ヒドロキシル基がシリカ表面に高密度で見出され、血小板を引きつけて捕捉するのに役立つが、刺傷反応（20020141964）を相殺するために陽イオン交換材料の追加を必要とする特定の酸素酸調製物によって特に言及されるように、創傷部位で刺傷反応を生じない。これは、有益な特徴としてみなされる。体液による水性水和時に、結合剤は、凝固因子の放出による血小板の誘引に加えて、凝固のためのマトリクスを提供し、かつ流動を減少させるために血液の水性成分を揺変性にする、水素結合によって形成されるウェブを即時に作り出す。
【００５７】
シリカを、1グラム当たり25平方メートル〜1グラム当たりt500平方メートルまたはそれより大きい表面積の範囲にあるが、より好ましくは、1グラム当たり200平方メートルまでである凝集ナノ粒子の長鎖または短鎖として使用することができる。ネットワーク形成の程度は、製剤および調剤によって、または使用時の適用方法においてのいずれかで制御することができるいくつかの因子に依存する。明らかに、ナノ粒子の濃度およびグレードは三次元ネットワーク形成に影響する。本特許中に記載されているグレードおよび濃度が機能することが見出された。創傷部位におけるpHもまた重要である。2.3を超えて最高8までのpHが適しており、好ましくはpH5〜pH7の間である。ナノ・シリカの等電点は、それが電気的に中性である場合は約2.3である。大部分の血液試料は、pH4〜pH9の間のpHを有する。血液試料中の分散度もまた重要である。反応性シリカ・ナノ粒子の創傷部位における水分に対する高い親水性は、一度、皮膚に粉末として適用されると、混合物への水性体液の「引き込み」を通常保証する。これは、十分で迅速な分散を保証する。十分な分散を保証しながら、創傷部位上の皮膚表面から溶媒が蒸発するにしたがって、創傷からの水性体液が混合物に引き入れられるため、非水性ベースの液体製剤の使用もまた効果的である。
【００５８】
結合剤は、粉末もしくはコーティングとして適用することができるか、または0.1%未満から99.9%を超える任意の濃度で非水性低水素結合液体もしくは溶媒と混合される。これは、非水素結合材料、例えば創傷部位にすぐに用いることのできる、送達のために創傷シーラント処方中の他の添加物をナノ粒子に共吸着することができる脂肪族炭化水素（鉱油）と混合することもできる。創傷の体液中の高い極性の水分と接触させた際、ナノ粒子水素結合の水分子との交換において、共吸着された材料が体液相へと送達される。これは、例えば抗生物質、鎮痛剤、または他の薬品のような創傷シーラント添加物の分散の促進を助長すると考えられる。結合剤は、乾燥粉末としてまたは非水性液体担体に入れて送達することができる。それは非水性ゲルまたは粉末として包帯に添加することができる。結合剤は、例えばタルクまたは類似の材料のような乾燥不活性担体と混合することができるか、または任意の従来の創傷包帯剤材料上にコーティングされるかもしくは組み込まれる。
【００５９】
シリカ・ナノ粒子へ、様々な可溶性または不溶性の、合成または天然の短鎖モノマーまたはポリマーを乾燥形態で混合物へ添加することができる。格子形成のために必要とされるわけではないが、これらの材料は格子それ自体の中に捕捉することができ、架橋シリカ枠組み間の媒染剤（接合剤）として作用してインサイチューでさらにウェブ・ネットワークを強化する。本明細書に参照により組み入れられる材料は以下を含むが、これに限定されるものではない：架橋アニオン性もしくはカチオン性のポリアミンまたはポリアクリルアミド綿状材料（PAMS）; リグノスルファネート（lignosulfanate）; ヒアルロン酸; 合成ポリケチド; ポリ水酸化アルカノエート、植物材料の消化物であるクチンもしくはスベリン（天然のポリエステル）; ポリ（g-D-グルタメート）; 重合ヒト血清アルブミン（組換え型）; プラナン（pullanan）および真菌のポリマー・スクレログルカンのようなバイオプラスチック・ポリマー; ならびにデキストランのような天然の非食用多糖類など。コラーゲンおよびフィブリノーゲンを含むタンパク質ポリマーもまた有用である。
【００６０】
乾燥、綿状、中性、アニオン性もしくはカチオン性架橋ポリアミン、ポリDADMAC、またはポリアクリルアミド(Cytec, Inc., SUPERFLOC)を体液吸収のためにまたは媒染剤として補助するために使用することができ、異なる粘性の種々の分子量で利用可能である。リグノサルフェート（lignosulfate）は、様々なプロセスによって木材パルプから抽出される天然のGRAS (Generally Regarded As Safe)材料であり、動物飼料中におよび間接的食品添加物として使用される。それらは、消化の後にポリマー形態で生じ、親水性であり、接着剤、結合剤、および金属イオン封鎖剤として使用される。ヒアルロンは化粧品中に使用されるGRAS直鎖状多糖類である。
【００６１】
シリカ・ナノ粒子は、粒子質量から体液体積比の広範囲にわたる創傷試料の体液中に三次元格子ネットワークを形成する。深い創傷部位における過剰出血または過剰体液の場合には、格子形成の次の活性として水吸収剤として機能することができる他の材料とシリカ・ナノ粒子乾燥粉末を混合して創傷における体液の吸収を促進することによって試料の肥厚を補助し、成分の近さを増すことによって凝固を促進することが有利であり得るか、または、水分減少率を制御するために、創傷の水和（湿り）を意図的に維持する反対の目的を提供することができる。このような特性は、やけどの犠牲者において体液減少率を制御するために特に有用でありうる。その高い表面積のために、創傷体液吸収を促進するため様々な従来の大きな粒子の水吸着剤材料とシリカ・ナノ粒子粉末を多様な比率で混合することが有利でありうる。このような吸収剤として、超微細粉砕真珠岩（1600℃で加熱したシリカ様の火山岩; 200%〜600%の水吸収、重量%）; 粉砕加熱膨張バーミキュライト（220%〜325%の水吸収、重量%; 4-Superfineグレード; 密度90Kg/m3〜160Kg/m3）; 架橋アガロースゲル、例えばSephadex（登録商標）もしくはSepharose（登録商標）; 合成モレキュラーシーブ粉末、例えばPurmol（登録商標）; モレキュラーシーブ・アルミナ、もしくはアルミナ・ゲル、もしくは脱臭剤中に使用されるアルミナシリケートミクロスフェア（Lawrence Laboratories; UOP）; セラミックミクロスフェア、ゼオライト、および/または不活性もしくは活性化炭素もしくは木炭が挙げられる。全てのこれらの材料は、水によってそれらの重量が少なくとも倍加し、かつ結合剤と適合性である。
【００６２】
アルミナは、特定の流体力学的特性および吸収特性を有する合成酸化アルミニウムのビーズ状粉末のファミリーである。典型的な合成吸着剤、例えば、UOP InternationalのVersal Aluminum酸化物(A 1203)、いわゆるゲル・アルミナは、UOPのモレキュラーシーブ（MOLSIV粉末）に加えて例として挙げられる。
【００６３】
単一成分/単回送達系として、結合剤は、血液の水性成分に対するその揺変性効果による血流に対する即時の「冷結」効果、および血液細胞を捕捉するウェブ構造の作製、ならびに継続的な凝血塊形成を支持する合成創傷包帯剤からなる結果として生じる凝血塊を生じる。創傷の体液は、通常出血により提供される他の全ての凝固因子を含有している血液細胞および血漿と共に、架橋ウェブを満たす体に由来するフィブリノーゲンを含有し、一次凝血塊形成を共同で加速する。凝血塊は、創傷およびたとえ毛細血管からの出血路であってもその被覆および封止を維持しながら、必要に応じてあらゆるレベルで、1ミクロン未満の寸法にまで再形成する。
【００６４】
凝固剤を含有している態様において、同じ利点を有する同じ格子形成プロセスが生じる。しかしながら、凝固剤、例えばヒト組換え型凝固成分（トロンビン、トロンボプラスチン、または様々な他の因子、陽イオンなどの組み合わせ）の任意の添加は、血栓溶解カスケードを生化学的に加速し、凝血塊形成速度および創傷封止におけるさらなる改善を生じる。凝固剤は、結合剤と混合されるかまたは水素結合を介してナノ粒子の表面へと吸着される。創傷部位に由来するより極性の水との二次的な反応は、吸着された因子の単純な放出をもたらすと考えられ、すばやい溶解性および二次的な反応性を可能にする。
【００６５】
2部構成創傷シーラント調製物は、血栓溶解カスケード促進剤を含む凝固剤の任意の一つまたはいくつかの組み合わせを表す第2の成分が混合される同じシリカ・ナノ粒子調製物からなる。凝固剤は、天然由来のまたは好ましくは任意のいくつかの方法により調製される組換えトロンビンおよびトロンボプラスチンである。凝固剤は、粉砕可能なまたは分散可能な粉末を前もって形成するために乾燥または凍結乾燥することができ; 粉砕可能な粉末を形成するように、グリセロールのような定められた割合の非水素結合液体を含有している非水性製剤への添加後に乾燥または凍結乾燥することができ; 例えば特定のアルコールのような非水性の、非水素結合溶媒への添加の後に蒸発により乾燥させることができる。保管中、シリカ・ナノ粒子間の相互作用を防止するために非水素結合材料の使用が必要とされる。
【００６６】
選択された血栓溶解材料の原料はそれが使用される宿主によって決定されると考えられる。例えば、獣医学的製剤は動物由来の材料を使用してもよい。血栓溶解カスケード促進剤は、フィブリノーゲンまたはフィブリン類似体を含まず、創傷部位で見出される自然のフィブリノーゲンの切断を活性化するためにトロンボプラスチンおよびトロンビンからなり、従ってフィブリンを生じ、所望の血栓溶解カスケードにつながることが好ましい。トロンボプラスチンは、シンプラスチン（simplastin）、トロンボプラスチン試薬、脳トロンボプラスチン、英国比較トロンボプラスチン、トロンボレルS、カルシウム・トロンボプラスチン、ブタ脳トロンボプラスチン、ウシ脳トロンボプラスチン、イノビンR（Innovin R）、リコンビプラスチン（Recombiplastin）、および他の類似の特性のものを含む広範囲にわたる原料から選択される。好ましい材料は組換えヒト・トロンボプラスチンである。トロンビン（r-トロンビン）は、典型的に、ヒルディン（Hirudin）およびヒルディンベースのペプチド・セファロースクロマトグラフィーを使用したヒトCHO細胞に由来する活性化された組換えヒト・トロンボプラスチンに由来するか、または当技術分野において公知である組換え技術により産生される。
【００６７】
組換えヒト・トロンビンおよびトロンボプラスチンが利用可能であり、これらはヒトへの使用のための試薬の選択肢である。製剤は、ピークレベルでその比活性および生物反応性を依然として保持しかつ維持しながら、液体および乾燥形態の両方において安定であるように設計される。それはまた、2つの成分の間で相互作用を伴わない結合剤の存在下で完全な機能、または結合剤による水素結合ウェブ形成の阻害を維持するために製剤化される。凝固剤を有する創傷シーラントは非水素結合液体、例えば鉱油によって製剤化され、好ましくは凝固剤はヒドロキシ・シリカ・ナノ粒子に吸着される。あるいは、凝固剤は、トロンビンおよびトロンボプラスチンと組み合わされた非水性液体の形態で、低水素結合多機能性短鎖分子、例えばポリエチレングリコール3350、ポリオキシエチレン-6-ソルビトール、またはポリソルベート60のような非イオン性界面活性剤の混合物として導入することができる。
【００６８】
創傷部位において、多機能性短鎖分子または非イオン性界面活性剤へと共吸着される任意の弱く水素結合するトロンビンまたはトロンボプラスチン分子は、材料を即時に放出し、活性シリカ・ナノ粒子担体の初期の水和時に周囲の体液中で利用可能な高極性の水によって加水分解すると考えられる。これは、ウェブ形成の基礎としてのより極性の高い水分子への、二酸化ケイ素（結合剤）上のヒドロキシル基の優先的な結合をもたらすと考えられる。これは、凝固剤が早期の凝血塊形成のために体液に放出されるのを可能にし、従って、一段階、単回送達、液体混合剤組織シーラントの作製を可能にする。
【００６９】
凝固剤の断片は、完全なポリペプチドの使用の代替物として使用することができる。トロンビンは、単に適度に制限されたタンパク質分解能力を有するが特定の結合（例えばフィブリノーゲン中のAα切断部位）に関して非常に高い特異性を有する酵素であるだけでなく、細胞受容体相互作用を伴うホルモン様の活性を有するタンパク質である。このような活性は触媒として活性な酵素を必要としないが、ヒルジン（同様にアンチトロンビンIII）により遮断される。これらは、固有の挿入およびエキソン接合部での二次的なペプチド・セグメントに関与するように見える。一方、トロンビンの酵素機能は触媒部位それ自体に依存し、フィブリノペプチド側面中の隣接する非極性結合部位、および活性溝のフィブリン側面中の独立したアニオン結合部位から特異性を誘導する。凝固経路に関与し、本明細書において記載されているような結合剤への接合のために適したトロンビン・ペプチド断片である特異的トロンビン・ペプチド領域の考察のためには、Fenton, JW et al, Thrombin active-site regions. Semin Thromb Hemost. 1986 Jul;12(3): 200-8を参照されたい。凝固経路に関与し、本明細書において記載されているようなハイドロシリカ・ナノ粒子への接合のために適したトロンボプラスチン・ペプチド断片である特異的トロンボプラスチン・ペプチド領域の考察のためには、McCallum et al., J Biol Chem. 1996 Nov 8;271(45): 28168-75を参照されたい。
【００７０】
凝固製剤に含まれるさらなる凝固因子は、組織シーラントの一部として供給されてもよいか、またはそれらが有効性に対して重大でないにもかかわらず部位において体によって単に提供されてもよい。それらは未変性（ヒトまたは動物）でまたは組換え材料として精製されてもよい。トロンボプラスチンによって媒介される反応のために、因子V、VII、およびXを追加的に供給してもよい。これに加えて、またはそれ自体で代替的に、因子XIIIはトロンビン媒介凝固反応をもたらして追加的に供給されてもよい。同様に、当技術分野において公知の様々な方法または改善を、本明細書において開示される創傷シーラント調製物中に組み込むかまたは含めてもよい。例として、上記の製剤は、ポリオールまたは他の安定剤(EPS 0277 096B1)の使用、プラスミンインヒビター(US 5,645,859)の添加、または当技術分野において公知である他の血液凝固技術の包含を通じて、液体の安定なトロンビンを提供するために改変されてもよい。
【００７１】
凝固剤は、フィブリノーゲンのフィブリンへの切断を支持する典型的なトロンビン様プロテアーゼを刺激する。これらは、大量の出血、外傷時の使用への適用、および再発性出血への血友病の場合でさえの適用において、ならびに対象が血液希釈剤および抗凝固剤の用量を服用しているかもしれない場合にでさえ、創傷シーラントを使用できるようにする。凝血塊の2つの基本構造単位、すなわちプロトロンビンおよびフィブリノーゲンが比較的高いレベルで創傷部位において体により供給される。創傷シーラント調製物中の凝固剤は、凝固プロセスを加速しかつ触媒し、これらの自然に利用可能な凝固タンパク質を使用し、凝固効果は増強された止血のために血液細胞および血漿を捕捉するマトリクスまたは格子を提供する活性化された結合剤と平行にかつタンデムに機能する。
【００７２】
トロンビンおよびトロンボプラスチンの適当な濃度は、製剤が重篤なまたはより中程度の出血のために調製されるかどうかに明らかに依存すると考えられる。通常、液体二成分創傷シーラント製剤の用量当たりの酵素濃度は、0.01ナノモル〜10マイクロモルの凝固剤、好ましくは0.1〜1000ナノモルの濃度、より好ましくは1〜100ナノモルの濃度、および最も好ましくは約10〜50ナノモルの濃度の凝固剤の範囲に及ぶと考えられる。乾燥製剤においては、粉末/凍結乾燥二成分創傷シーラント製剤の用量当たりの酵素重量は、約1ナノグラム〜100mgの凝固剤、好ましくは10ナノグラム〜10ミリグラム、より好ましくは100ナノグラム〜1ミリグラムの凝固剤、および最も好ましくは約1マイクログラム〜100マイクログラムの凝固剤の範囲に及ぶと考えられる。各凝固剤の特定の濃度への調節は、多数の濃度での様々な凝固カスケード酵素の所与の公開された活性によって、当業者にとって明らかであると考えられる。Lo K, Diamond SL, Blood coagulation kinetics: high throughput method for real-time reaction monitoring., Thromb Haemost. 2004 Oct;92(4): 874-82を参照されたい。凝固剤はシリカ・ナノ粒子表面を飽和してはならない; 水素結合格子構造が望ましい。
【００７３】
創傷シーラントの適当な用量は、特定の傷害のタイプに主に依存すると考えられ、医療専門家によって評価することができる。さらに、凝固欠陥もしくは障害を有する対象、または血液希釈薬品を服用している個体はさらなる量の適当な製剤を必要とする可能性がある。非限定的な例として、小血管出血によって特徴づけられる2cmの裂傷を1mg〜100mgまたはそれ以上の粉末製剤を使用することにより処置することができる。例えば針またはランセット棒に由来する小さい刺創は、1mg〜10mgもしくはそれ以上の粉末製剤または1滴の液体製剤を使用することにより処置することができる。深傷はグラム量の滅菌乾燥粉末製剤で、または異なる重量の単一および二成分乾燥製剤で充填することができる。単一成分創傷シーラント調製物は基本的にシリカであり、通常、体内で不活性である。
【００７４】
実施例1：粉末包帯製剤
単純な血管の出血のための消費者が粉末を適用する外用適用のための乾燥粉末製剤は、2つの主な成分を用いる。適した混合容器中で、医療グレードの硫酸アルミニウム、Al2(SO4)3 粉末（Sigma）をwt/wtベースで1.0パーセントの終濃度までCAB-O-SILグレードのM5粉末（Cabot）と混合する。質量は重量測定的に決定することが好ましい。混合の結果生じる静電荷を最小化するために、床に静電気防止マットにより接地したスチール机上で、ステンレス鋼容器を用い、<40% RH、周囲室温で材料を混ぜ合わせることが好ましい。電荷は産物に不利な影響をもたらさないと考えられるが、シリカ材料が極めて軽いため、制御の欠如はGMP調剤を混乱させ得る。混合はまたゆっくりとしたものでなければならず、ここで硫酸アルミニウムが最初にシリカへと添加されなければならず、逆順序であってはならない。十分な混合に続いて、材料は市場のために適した容器に分配されかつ封止される。必要とされる場合、材料は、γ照射または他の医学的に許容される滅菌技術、例えばエチレン・ガスおよび高圧蒸気殺菌法により滅菌することができる。
【００７５】
凝固促進剤ならびにトロンビンおよびトロンボプラスチンの両方を含有している、深い出血のための外用適用のために粉末を調製するために、重量測定的にそれぞれ最高2%、好ましくは0.5% wt/wtの終濃度まで、乾燥（両方が粉末として乾燥または凍結乾燥されている）組換えトロンビンおよびトロンボプラスチン粉末を上記の混合物に添加する。硫酸アルミニウムは内用のために必要に応じてこの製剤から取り除くことができる。充填の後、材料はγ照射により滅菌することができる。好ましい乾燥二成分創傷シーラント製剤には、10mgのシリカ・ナノ粒子当たり1マイクログラム〜1ミリグラムの凝固剤を有する製剤、10mgのシリカ・ナノ粒子当たり10マイクログラム〜500マイクログラムの凝固剤、および最も好ましくは10mgのシリカ・ナノ粒子当たり100マイクログラム〜250マイクログラムの凝固剤を有する製剤が含まれるがこれらに限定されない。
【００７６】
実施例2：液体包帯製剤
液体包帯として単一製剤へと混合される、1つは液体であり1つは固体である二つの相が提供される。調製物は液体として保管される。固体成分は、0.1%〜99.9% wt/vol、または当量、好ましくは20% wt/volである反応性フュームドシリカ・ナノ粒子粉末、グレードM-5P (Cabot)を含む。固相は液相に混合される。液相はピロキシリンまたは他のポリマー材料の非水性蒸発溶媒ベースの溶液を含む。ピロキシリンは、エーテルおよびアルコールのような溶媒の混合物中に溶解した場合に膜を形成するセルロースナイトレート樹脂化合物の一般名である。撹拌による適当な混合の後に、混合物は消費者による使用のために適当な容器（蓋付きの）へと分配される。
【００７７】
創傷部位での適用の後、表面に薄膜を残して蒸発（急速な乾燥）が起こる。適用後、産物の蒸発を促進するために、溶媒には以下が含まれる; アセトン、エーテル、酢酸アミル（バナナ溶液）、アルコール（メタノールまたはエチルアルコール）など、および様々なそれらの組み合わせ。種々のポリマー材料を液相において使用することができる。
【００７８】
以下は使用することができる様々なセルロース性樹脂の非限定的な例である：セルロースナイトレート（ニトロセルロース）、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートプロプリオネート、セルロースアセテート、セルロースプロプリオネート、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース。
【００７９】
以下は使用することができる様々な非セルロース性樹脂の非限定的な例である：ポリマー・デキストラン、架橋ポリアミン、またはポリアクリルアミド凝集剤（PAMS）、ポリヒドロキシアルカノエート、植物材料のクチンまたはスベリン消化物（天然のポリエステル）、合成ポリケチド。
【００８０】
作用機構
使用される非水性液体溶媒はやや極性であり、創傷部位へ適用した場合に急速に蒸発する。シリカ二酸化物ナノ粒子上のヒドロキシル基はより極性の高い水分子およびそれ自身へ誘引され、乾燥時に格子枠組みを形成する。適用される材料は両方とも、透明プラスチック包帯のように、創傷部位に浸透し、および創傷部位と相互作用し、および創傷部位を覆う。これは、凝血塊形成のための格子枠組みのみでなく創傷部位で可塑性の絆創膏被覆を提供する。
【００８１】
二成分液体製剤中で、凝固剤はシリカ・ナノ粒子と混合される。それらは、結合剤に架橋することができるが、好ましくはそれらは、シリカ・ナノ粒子へ水素結合することが許容される。他の態様において、それらは任意で賦形剤に吸着され、結合剤と混合されて液体基剤となる。例えば、トロンビンまたはトロンボプラスチン分子は多機能性短鎖分子または非イオン性界面活性剤へと共吸着され、調製物は、創傷部位へ適用された場合に凝固剤を即時に放出し、活性シリカ・ナノ粒子または担体の初期の水和時に周囲の体液中で利用可能な極性の高い水によって加水分解すると考えられる。これは、シリカ・ナノ粒子間のウェブ形成の基礎としてのより極性の高い水分子に対する、二酸化ケイ素（結合剤）上のヒドロキシル基の優先的な結合をもたらすと考えられる。好ましい液体二成分創傷シーラント製剤には、10mg乾燥重量のシリカ・ナノ粒子当たり1マイクログラム〜1ミリグラムの凝固剤を有する製剤、10mg乾燥重量のシリカ・ナノ粒子当たり10マイクログラム〜500マイクログラムの凝固剤、および最も好ましくは10mg乾燥重量のシリカ・ナノ粒子当たり100マイクログラム〜250マイクログラムの凝固剤を有する製剤が含まれるがこれらに限定されない。
【００８２】
弾性ポリマーピロキシリン樹脂は数日間洗い流されないと考えられる。添加物を、例えば、8-ヒドロキシキノリン・アルコールおよびヨウ素などのような防腐剤、例えばポリスポリン（polysporin）、ネオスポリン（neosporin）、ペニシリン、メチシリン、セファロスポリン、エリスロマイシン、バンコマイシン、ゲンタマイシン、シプロフロキシン（ciprofloxicin）、および他の広域抗菌スペクトル抗菌剤のような抗生物質、テルビナフィンおよびアンフォテリシンのような抗真菌剤、ならびに他の吸収剤、ならびに上述の媒染剤に限定されない混合物に加えることができる。これらの添加物はまた、乾燥製剤中で良好に機能する。必要とされる場合、液体製剤は、γ照射またはその他の医学的に許容される液体の滅菌技術により滅菌することができる。
【００８３】
前述のものは本発明の原理の例示のみであるとみなされる。さらに、多数の改変および変更が当業者にとって容易に生じるため、示されかつ記載される厳密な構造および操作に本発明を制限することは望ましくなく、従って、全ての適当な改変および同等物を用いることができ、全て本発明の範囲内に含まれる。これは、引用とした様々な技術において記載されている様々な組成物および方法を含む様々な態様を含み、従って、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００８４】
実施例3：凝固試験
実施例1に記載されている製剤の有効性を決定するために、以下の成人ボランティア試験を行った。全ての参加者は出血障害の病歴がなく、血液希釈剤を常用していない明らかに健常な正常の成人である。個人の器用さに依存して、右または左の前腕またはふくらはぎのいずれかを使用した。2つの二つ組の点中にランセットを使用して小さい針穴を作り、穿刺時に生じると考えられる創傷部位で同一の軽微な出血を誘導するために穏やかにしぼり出すか、または、代わりに擦過時に生じると考えられる軽微な出血を誘導するために、粗いやすりを皮膚を横切って引きずり皮膚をすりむいた。
【００８５】
穿刺または擦過の直後に、いずれの場合にも、乾燥粉末（実施例1、血栓溶解因子なし）を2つの傷口部位のうちの1つの上へ十分に振りかけた。同等な大きさの傷口を生成するよう注意をはらった。過剰な粉末を45秒後に振り落とし、相対凝固時間、相対的な瘡蓋の堅さおよび24時間後の均一性、ならびに瘡蓋がはずれるまでの相対的な瘡蓋の継続時間を記録した。
【００８６】
以下の結果が観察された：
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スケール：1、ゆるやかな、断続的出血、不完全に形成; 2、軟らかく、容易に崩壊可能; 3、中程度に固まった凝血塊、血液はしぼり出すのが困難; 4、良好な凝血塊、均一、しぼり出すことができない、5、堅い、堅固な凝血塊、皮膚への強い固着; 6、極めて堅い、濃縮された凝血塊、皮膚に向かって縮む、しぼり出すかまたは取り除くために痛みを伴う。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】血液凝固カスケードを示す。内因性および外因性経路の両方を示す。
【図２】ヒドロキシル化シリカ・ナノ粒子（結合剤）の調製物を含む単一成分創傷シーラントの作用様式を示す。
【図３】ヒドロキシル化シリカ・ナノ粒子（結合剤）および様々な凝固剤の調製物を含む二成分創傷シーラントの作用様式を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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