(57)【要約】  ４−キナゾリンアミンとＨＥＲ−２／ｎｅｕ分子を標的とするワクチンとを投与するステップを含む、癌を治療する方法、ならびに４−キナゾリンアミンとＨＥＲ−２／ｎｅｕ分子を標的とするワクチンとを含んでなる医薬配合物を記載する。【選択図】図１２Ｅ
2008523017.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において癌を治療する方法であって、
（ａ）式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩもしくはＩＶの化合物、および／またはその塩、溶媒和物もしくは生理的に機能しうる誘導体であって、Ｒ１がＣｌまたはＢｒであり；ＸがＣＨ、ＮまたはＣＦであり；かつＨｅｔがチアゾールまたはフランであるもの；ならびに
（ｂ）ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質に由来する少なくとも１つのエピトープを含む単離されたタンパク質、または当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなる免疫原性組成物
を治療上有効量で該哺乳動物に投与するステップを含む、上記方法。
【請求項２】
Ｒ１がＣｌであり；ＸがＣＨであり；かつＨｅｔがフランである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ１がＢｒであり；ＸがＣＨであり；かつＨｅｔがフランである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ１がＣｌであり；ＸがＣＨであり；かつＨｅｔがチアゾールである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
成分（ａ）が式ＩＩの化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
成分（ａ）と成分（ｂ）とを同時に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
成分（ａ）と成分（ｂ）とを逐次的に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
以下のもの：
（ａ）式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩもしくはＩＶの化合物、および／またはその塩、溶媒和物もしくは生理的に機能しうる誘導体であって、Ｒ１がＣｌまたはＢｒであり；ＸがＣＨ、ＮまたはＣＦであり；かつＨｅｔがチアゾールまたはフランであるもの；ならびに
（ｂ）ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質に由来する少なくとも１つのエピトープを含んでなる単離されたタンパク質、または当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなる免疫原性組成物
を治療上有効量で含んでなる、医薬配合物。
【請求項９】
請求項８に記載の配合物を含んでなる、医薬組成物。
【請求項１０】
治療での使用のための、請求項８に記載の医薬配合物または請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
癌の治療のための医薬の製造における、請求項８に記載の医薬配合物または請求項９に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１２】
個体での癌の治療のための医薬の製造における、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩもしくはＩＶの化合物、および／またはその塩、溶媒和物もしくは生理的に機能しうる誘導体を治療上有効量で含んでなる医薬配合物の使用であって、該個体はＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質に由来する少なくとも１つのエピトープ、または当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなる免疫原性組成物の投与を受けた個体である、上記使用。
【請求項１３】
前記免疫原性組成物が、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ細胞外ドメインとそれに融合したＨＥＲ−２／ｎｅｕリン酸化ドメインとを含む融合タンパク質を含んでなる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法、配合物、組成物または使用。
【請求項１４】
前記免疫原性組成物が、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ細胞外ドメインとそれに融合したＨＥＲ−２／ｎｅｕ細胞内ドメインとを含む融合タンパク質を含んでなる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法、配合物、組成物または使用。
【請求項１５】
前記免疫原性組成物がアジュバントを含んでなる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法、配合物、組成物または使用。
【請求項１６】
前記アジュバントが、コレステロール；水中油型エマルジョン；低量水中油型エマルジョン；トコフェロール；リポソーム；サポニン；３Ｄ−ＭＰＬ、および免疫刺激性オリゴヌクレオチドのうち１以上を含んでなる、請求項１５に記載の方法、配合物、組成物または使用。
【請求項１７】
前記アジュバントが、サポニンと、免疫刺激性オリゴヌクレオチドとを含んでなる、請求項１６に記載の方法、配合物、組成物または使用。
【請求項１８】
リポ多糖をさらに含んでなる、請求項１６に記載の方法、配合物、組成物または使用。
【請求項１９】
前記サポニンがＱＳ２１である、請求項１７または１８に記載の方法、配合物、組成物または使用。
【請求項２０】
前記リポ多糖が、
（ｉ）モノホスホリル脂質Ａ
（ｉｉ）３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ
（ｉｉｉ）ジホスホリル脂質Ａ
からなる群より選択される、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法、配合物、組成物または使用。
【請求項２１】
前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが少なくとも２つのＣｐＧモチーフを含有する、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、以下のもの：
2008523017.tif 000012
からなる群より選択される、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
前記サポニンが、ＩＳＣＯＭまたはリポソームを形成するように製剤化されている、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記サポニンが、水中油型エマルジョン中に存在している、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
少なくとも１つのエピトープがＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質の細胞外領域に由来するものである、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法、配合物、組成物または使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する分野
本発明は、（ａ）チロシンキナーゼであるヒト上皮細胞増殖因子受容体２（ＨＥＲ−２／ｎｅｕまたはｃ−ｅｒｂＢ２としても知られる）および上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲまたはｃ−ｅｒｂＢ１としても知られる）のインヒビターであるキナゾリン誘導体および（ｂ）ＨＥＲ−２分子を標的とする免疫原性組成物の配合物に関する。該配合物を癌の治療において使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
タンパク質チロシンキナーゼは、細胞増殖および分化の調節に関与する種々のタンパク質中の特定のチロシン残基のリン酸化を触媒する。ＨＥＲ−２／ｎｅｕおよびＥＧＦＲはタンパク質チロシンキナーゼの例である。特定のタンパク質チロシンキナーゼのインヒビターについての例は、例えば、ＷＯ９９／３５１４６（ＵＳ２００２ １７７５６７）（参照により本明細書中に組み入れられる）に挙げられている。
【０００３】
ＥＧＦＲは１７０ｋＤａの単一鎖の膜貫通型糖タンパク質であり、チロシンキナーゼ活性を有する細胞内触媒ドメイン、アンカー膜貫通ドメインおよび細胞外リガンド結合領域からなる。
【０００４】
ＨＥＲ−２／ｎｅｕは、チロシンキナーゼ受容体のファミリーである上皮細胞成長因子受容体ファミリーのメンバーである。該ＨＥＲ−２／ｎｅｕ分子を標的にするワクチンまたは免疫原性組成物の例は、例えばＷＯ００／４４８９９（ＵＳ２００２ １７７５６７）（参照により本明細書中に組み入れられる）に記載されている。
【０００５】
ＨＥＲ−２／ｎｅｕは膜貫通タンパク質であり、推定の相対分子量は１８５ｋＤであり、長さは約１２５５アミノ酸である。ＨＥＲ−２／ｎｅｕは、約６４５アミノ酸の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、非常に疎水性の高い膜貫通ドメイン、および約５８０アミノ酸のカルボキシ末端細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を有する。用語「ＰＤ」とは、細胞内ドメイン内の「リン酸化ドメイン」（すなわちリン酸化されるドメイン）を表し、「ΔＰＤ」とは、該リン酸化ドメイン内のリン酸化ドメインの特定の断片（配列番号１６で示されるものなど）を表し、「ＫＤ」とは、細胞内ドメイン内のキナーゼドメインを表す。ＨＥＲ−２／ｎｅｕのＰＤは２６８アミノ酸長であり、細胞内にあり、タンパク質チロシンキナーゼによってリン酸化することができる。
【０００６】
約３０％の乳癌患者では、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子が増幅され、該タンパク質が過剰発現されている。ＨＥＲ−２／ｎｅｕの過剰発現は、種々の異なる悪性腫瘍において報告されている。該悪性腫瘍には、乳房、卵巣、腎細胞、前立腺、膵臓、結腸、非小細胞肺、胃、唾液腺、膀胱および口腔扁平細胞の悪性腫瘍が含まれる。乳癌患者では、ＨＥＲ−２／ｎｅｕの過剰発現は予後が悪いことを示す因子であり、一部の化学療法剤に対する耐性の予想材料であると思われる。
【０００７】
ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＤＮＡおよびＨｅｒ２ペプチドに基づくＨＥＲ−２／ｎｅｕワクチンは、動物モデルおよびヒトワクチン試験においてＨＥＲ−２／ｎｅｕに対するＴ細胞免疫を誘発することが示されている。さらにまた、ＨＥＲ−２／ｎｅｕに対するヒト化モノクローナル抗体であるトラスツズマブ（Trastuzumab）（ハーセプチン（Herceptin）（登録商標））は、転移性乳癌の治療に有効であることがわかった。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の第１の態様では、哺乳動物において癌を治療する方法であって、
（ａ）本明細書中に記載の式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの化合物、および／またはその塩、溶媒和物もしくは生理的に機能しうる誘導体であって、Ｒ１がＣｌまたはＢｒであり；ＸがＣＨ、Ｎ、またはＣＦであり；かつＨｅｔがチアゾールまたはフランであるもの；ならびに
（ｂ）ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質に由来する少なくとも１つのエピトープを含む単離されたタンパク質、または当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなる免疫原性組成物
を治療上有効量で該哺乳動物に投与するステップを含む方法を提供する。
【０００９】
本発明の第２の態様では、以下のものを治療上有効量で含んでなる医薬配合物を提供する：
（ａ）本明細書中に記載の式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの化合物、および／またはその塩、溶媒和物もしくは生理的に機能しうる誘導体であって、Ｒ１がＣｌまたはＢｒであり；ＸがＣＨ、Ｎ、またはＣＦであり；かつＨｅｔがチアゾールまたはフランであるもの；ならびに
（ｂ）ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質に由来する少なくとも１つのエピトープを含む単離されたタンパク質、または当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなる免疫原性組成物。
【００１０】
本発明の第３の態様では、癌の治療のための医薬の製造における、本明細書中に記載の医薬配合物の使用を提供する。
【００１１】
本発明の第４の態様では、個体での癌の治療のための医薬の製造における、本明細書中に記載の式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの化合物および／またはその塩、溶媒和物もしくは生理的に機能しうる誘導体を治療上有効量で含んでなる医薬配合物の使用であって、該個体は、本明細書中に記載の、ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質に由来する少なくとも１つのエピトープ、または当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなる免疫原性組成物の投与を受けた個体である使用を提供する。
【００１２】
驚くべきことに、本発明の免疫原性組成物（ｂ）での免疫化にしたがって得られる血清の投与とともに、本発明の成分（ａ）を組み合わせると、乳癌細胞の増殖が阻害されることを発明者らは発見した。この２成分の相乗効果は、単一薬剤での処理で示される阻害よりずっと顕著であった。
【００１３】
図面の簡単な説明
図１は、ヒトＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質の完全長アミノ酸配列（配列番号１２）を示す。  
図２は、ラットＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質の完全長アミノ酸配列（配列番号１３）を示す。キナーゼドメインはアミノ酸７２１〜アミノ酸９９８の領域（両端を含む）にわたる。  
図３は、細胞外ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。  
図４は、ヒトＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質のリン酸化ドメイン（ＰＤ）のアミノ酸配列（配列番号１５）を示す。  
図５は、ヒトＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質のリン酸化ドメインの一部分（ΔＰＤ）のアミノ酸配列の一例（配列番号１６）を示す。  
図６は、ヒトＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）およびリン酸化ドメイン（ＰＤ）を含む融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１７）を示す。  
図７は、ヒトＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）およびリン酸化ドメインの代表的な部分（ΔＰＤ）を含む融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１８）を示す。  
図８は、ラットＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のアミノ酸配列（配列番号１９）を示す。  
図９は、ヒトＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質をコードするＤＮＡ分子の完全長ヌクレオチド配列（配列番号２０）を示す。該完全長ヌクレオチド配列はＷＯ９６／３０５１４（ＵＳ ５，７２６，０２３）に記載されており、該融合タンパク質はＷＯ００／４４８９９（ＵＳ２００２／０１７７５６７）に記載されている。これらの文献の開示内容は参照によりその全体が本明細書中に組み入れられる。  
図１０は、ラットＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質をコードするＤＮＡ分子の完全長ヌクレオチド配列（配列番号２１）を示す。この完全長ヌクレオチド配列はBargmann et al. (1986) Nature, 319:226-30、およびＧＥＮＢＡＮＫ／Ｘ０３３６２に記載されている。該文献およびデータベースの開示内容は参照によりその全体が本明細書中に組み入れられる。  
図１１Ａは、ＢＴ４７４ヒト乳癌細胞の増殖に対する、ラパチニブ（Lapatinib）との併用での抗ＨＥＲ２／ｎｅｕポリクローナル抗体の抗増殖効果を示す。  
図１１Ｂは、ＳＫＢＲ３ヒト乳癌細胞の増殖に対する、ラパチニブとの併用での抗ＨＥＲ２／ｎｅｕポリクローナル抗体の抗増殖効果を示す。  
図１２Ａ（上段パネル）は、指数増殖中のＢＴ４７４細胞を以下のもので処理した結果を示す：（ｉ）ＤＭＳＯ単独（ラパチニブに関する陰性対照）、（ｉｉ）ラパチニブ（０．１μＭ）、（ｉｉｉ）ｐＡｂ（１００μｇ／ｍＬ）、（ｉｖ）ラパチニブ（０．１μＭ）およびｐＡｂ（１００μｇ／ｍＬ）、（ｖ）ＴＡ２０２１（１００μｇ／ｍＬ）、（ｖｉ）ラパチニブ（０．１μＭ）およびＴＡ２０２１（１００μｇ／ｍＬ）、（ｖｉｉ）トラスツズマブ（１０μｇ／ｍＬ）、または（ｖｉｉｉ）ラパチニブ（０．１μＭ）およびトラスツズマブ（１０μｇ／ｍＬ）。７２時間後、アネキシンＶ染色およびフローサイトメトリーを使用してアポトーシスを評価した。  
図１２Ｅは、図１２Ａと同様の結果を示す。  
７２時間後に、ウエスタンブロットを使用して、活性化型ホスホＥｒｂＢ２（ｐ−ＥｒｂＢ２）、トータルＥｒｂＢ２、およびＳｕｒｖｉｖｉｎの定常状態タンパク質レベルも評価した（下段パネル（図中、レーン１はＤＭＳＯ単独であり；レーン２はラパチニブ（０．１μＭ）であり；レーン３はｐＡｂ（１００μｇ／ｍＬ）であり；レーン４はラパチニブ（０．１μＭ）およびｐＡｂ（１００μｇ／ｍＬ）であり；レーン５はＴＡ２０２１（１００μｇ／ｍＬ）であり；レーン６はラパチニブ（０．１μＭ）およびＴＡ２０２１（１００μｇ／ｍＬ）であり；レーン７はトラスツズマブ（１０μｇ／ｍＬ）であり；かつレーン８はラパチニブ（０．１μＭ）およびトラスツズマブ（１０μｇ／ｍＬ）である））。アクチンの定常状態タンパク質レベルは、等しいタンパク質ロード量に関する対照として用いた。ビヒクル（ＤＭＳＯ）またはＴＡ２０２１で処理されたＢＴ４７４細胞は、それぞれラパチニブおよびｐＡｂに関する対照として用いた。  
図１２Ｂは、位相差顕微鏡検査を使用して、ＢＴ４７４細胞増殖に対する図中に示した処理条件の効果（７２時間後）を示す。処理条件には、図１２Ａに関して記載される条件、およびそれに加えて、ゲフィチニブ（gefitinib）（イレッサ（Iressa））（０．１μＭ）；ゲフィチニブ（０．１μＭ）およびｐＡＢ（１００μｇ／ｍＬ）；ゲフィチニブ（０．１μＭ）およびＴＡ２０２１（１００μｇ／ｍＬ）；およびゲフィチニブ０．１μＭおよびトラスツズマブ（１０μｇ／ｍＬ）を含めた。  
図１２Ｃは、アネキシンＶ染色およびフローサイトメトリーを使用して、ＢＴ４７４細胞のアポトーシスに対する、単独またはラパチニブ（１００ｎＭ）との併用での漸増濃度のｐＡｂの効果を示す。  
図１２Ｄは、単独またはラパチニブ（１００ｎＭ）との併用での漸増量のｐＡｂに応答してのトータルＥｒｂＢ２およびｐ−ＥｒｂＢ２の定常状態タンパク質レベルを示す。そのレベルはウエスタンブロットによって評価されたものである。アクチンの定常状態タンパク質レベルは、等しいタンパク質ロード量に関する対照として用いた。  
図１２Ｅは、図１２Ａと同様の結果を示す。  
図１３は、Ｅｒｋ１／２およびＡｋｔの活性化状態がラパチニブおよびワクチン誘発抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗体（ｐＡｂ）に応答してモジュレートされることを示す。指数増殖中のＢＴ４７４細胞を、記載の処理条件下で７２時間培養した。トータルＥｒｋ１／２、活性化型ホスホＥｒｋ１／２、トータルＡｋｔ、および活性化型ホスホＡｋｔの定常状態タンパク質レベルをウエスタンブロットによって評価した。ビヒクル（ＤＭＳＯ）またはＴＡ２０２１単独で処理された細胞は対照として用いた。  
図１４は、ＥｒｂＢ３の活性化状態に対する、ラパチニブおよびワクチン誘発抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗体（ｐＡｂ）の効果を示す。図のように、ＢＴ４７４細胞を種々の処理条件下で培養した。７２時間後、細胞ライセートを回収し、トータルＥｒｂＢ３および活性化型ホスホＥｒｂＢ３の定常状態タンパク質レベルをウエスタンブロットによって評価した。  
図１５Ａは、ＢＴ４７４細胞のアポトーシスに対する、図中に示した処理条件の効果を示す。アネキシンＶ染色およびフローサイトメトリーを使用してアポトーシスを評価した。  
図１５Ｂは、図中に示した定処理条件下で培養されたＢＴ４７４細胞における、７２時間後の、トータルＥｒｂＢ２、ｐ−ＥｒｂＢ２、およびＳｕｒｖｉｖｉｎの定常状態タンパク質レベルのウエスタンブロット解析を示す。  
図１５Ｃは、トータルＥｒｋ１／２、ｐ−Ｅｒｋ１／２、トータルＡｋｔ、およびｐ−Ａｋｔの定常状態タンパク質レベルに対する、図中に示した処理条件の効果を示す。その効果は、処理の７２時間後にウエスタンブロットによって評価されたものである。  
図１６は、ＳＫＢＲ３細胞を以下のもので処理した場合のアポトーシス効果を示す：（ｉ）ＤＭＳＯ単独（ラパチニブに関する陰性対照）、（ｉｉ）ラパチニブ（０．１μＭ）、（ｉｉｉ）ｐＡｂ（１００μｇ／ｍＬ）、（ｉｖ）ラパチニブ（０．１μＭ）およびｐＡｂ（１００μｇ／ｍＬ）、（ｖ）ＴＡ２０２１（１００μｇ／ｍＬ）、（ｖｉ）ラパチニブ（０．１μＭ）およびＴＡ２０２１（１００μｇ／ｍＬ）、（ｖｉｉ）トラスツズマブ（１０μｇ／ｍＬ）、または（ｖｉｉｉ）ラパチニブ（０．１μＭ）およびトラスツズマブ（１０μｇ／ｍＬ）。７２時間後、アネキシンＶ染色およびフローサイトメトリーを使用してアポトーシスを評価した。  
図１７は、ＳＫＢＲ３細胞を以下のもので７２時間処理した場合の、Ｓｕｒｖｉｖｉｎタンパク質に対する効果を示す：（ｉ）ＤＭＳＯ単独（ラパチニブに関する陰性対照）、（ｉｉ）ラパチニブ（０．１μＭ）、（ｉｉｉ）ｐＡｂ（１００μｇ／ｍＬ）、（ｉｖ）ラパチニブ（０．１μＭ）およびｐＡｂ（１００μｇ／ｍＬ）、（ｖ）ＴＡ２０２１（１００μｇ／ｍＬ）、（ｖｉ）ラパチニブ（０．１μＭ）およびＴＡ２０２１（１００μｇ／ｍＬ）、（ｖｉｉ）トラスツズマブ（１０μｇ／ｍＬ）、または（ｖｉｉｉ）ラパチニブ（０．１μＭ）およびトラスツズマブ（１０μｇ／ｍＬ）。  
図１８は、図中に示されたＳｋｂＲ３細胞のｐＴｙｒ／ＥｒｂＢ１２および下流バイオマーカーに対する、ラパチニブおよび抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体の効果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
本明細書を通して、文脈によって特に要求されない限り、用語「含む（comprise）」および「含む（包含する）（include）」または「comprising」、「comprises」、「including」、「includes」、等の変化形は、包括的に解釈されるものとし、すなわち、これらの用語が使用される場合、具体的に列挙されていない整数または要素を含む可能性を含意する。
【００１５】
留意すべきは、本明細書の全体を通して参照されるすべての参考文献および刊行物は参照により本明細書中に組み入れられることである。
【００１６】
さらに、本明細書中では、用語「タンパク質」は「ポリペプチド」または「ペプチド」と交換可能に使用される。
【００１７】
成分（ａ）
以下の構造式は式Ｉの化合物を表す：
【化１】
2008523017.tif 000003
【００１８】
式中、Ｒ１はＣｌまたはＢｒであり；ＸはＣＨ、Ｎ、またはＣＦであり；かつＨｅｔはチアゾールまたはフランである。
【００１９】
一実施形態では、Ｒ１はＣｌであり；ＸはＣＨであり；かつＨｅｔはフランであり、成分（ａ）は式ＩＩの化合物および／またはその塩、溶媒和物もしくは生理的に機能しうる誘導体であってよい。
【化２】
2008523017.tif 000004
【００２０】
式ＩＩの化合物は、Ｎ−｛３−クロロ−４−［（３−フルオロベンジル）オキシ］フェニル｝−６−［５−（｛［２−（メタンスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フリル］−４−キナゾリンアミンという化学名を有する。
【００２１】
別の実施形態では、Ｒ１はＣｌであり；ＸはＣＨであり；かつＨｅｔはチアゾールであり、成分（ａ）は式ＩＩＩの化合物および／またはその塩、溶媒和物もしくは生理的に機能しうる誘導体であってよい。
【化３】
2008523017.tif 000005
【００２２】
式ＩＩＩの化合物は、（４−（３−フルオロ−ベンジルオキシ）−３−クロロフェニル）−（６−（２−（（２−メタンスルホニル−エチルアミノ）−メチル）−チアゾール−４−イル）キナゾリン−４−イル）−アミンである。
【００２３】
別の実施形態では、Ｒ１はＢｒであり；ＸはＣＨであり；かつＨｅｔはフランであり、成分（ａ）は式ＩＶの化合物および／またはその塩、溶媒和物もしくは生理的に機能しうる誘導体であってよい。
【化４】
2008523017.tif 000006
【００２４】
式ＩＶの化合物は、（４−（３−フルオロ−ベンジルオキシ）−３−ブロモフェニル）−（６−（５−（（２−メタンスルホニル−エチルアミノ）−メチル）−フラン−２−イル）キナゾリン−４−イル）−アミンである。
【００２５】
本明細書中で使用される用語「有効量」とは、例えば研究者または臨床医が求める組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を誘発する、薬物または医薬物質の量を意味する。さらにまた、用語「治療上有効量」とは、任意の量であって、その量を投与されなかった対応する被験体と比較して、疾患、障害、もしくは副作用の改善された治療、治癒、予防、もしくは軽減または疾患もしくは障害の進行率の減少を生じさせる量を意味する。該用語には、その範囲内に、正常な生理的機能を増強するために有効な量も含まれる。好適には、有効量および／または治療上有効量で成分（ａ）を投与する。
【００２６】
本明細書中で使用される用語「生理的に機能しうる誘導体」とは、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶの化合物の、任意の製薬上許容しうる誘導体、例えばエステルまたはアミドであって、哺乳動物への投与時に、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、もしくはＩＶの化合物またはその活性代謝産物を（直接または間接的に）提供可能な誘導体を表す。そのような誘導体は、過度の実験を行うことなく、Burger's Medicinal Chemistry And Drug Discovery, 5th Edition, Vol 1: Principles and Practiceの教示内容を参照して当業者に自明である。該文献は、それが生理的に機能しうる誘導体を教示する範囲で、参照により本明細書中に組み入れられる。
【００２７】
本明細書中で使用される用語「溶媒和物」とは、溶質（本発明では、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、もしくはＩＶの化合物またはその塩もしくは生理的に機能しうる誘導体）および溶媒によって形成される種々の化学量論の複合体を表す。そのような溶媒は、本発明の目的のために、該溶質の生物学的活性を妨害してはならない。好適な溶媒の例には、非限定的に、水、メタノール、エタノールおよび酢酸が含まれる。使用される溶媒は製薬上許容しうる溶媒でありうる。好適な製薬上許容しうる溶媒の例には、水、エタノールおよび酢酸が含まれる。一実施形態では、使用される溶媒は水である。
【００２８】
式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶの化合物（ａ）は、１種以上の形態で結晶化する能力を有し、それは多形性として公知の特徴であり、該多形性の形態（「多形」）は式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶの範囲内であることが理解される。多形性は、一般に、温度もしくは圧力または両者の変化に対する応答として生じうるものであり、結晶化プロセスにおける変動にも由来しうる。多形は、当技術分野において公知の種々の物理的特性、例えばＸ線回折パターン、溶解度、および融点によって識別しうる。
【００２９】
典型的に、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶの化合物の塩は製薬上許容しうる塩である。用語「製薬上許容しうる塩」の範囲内に包含される塩とは、本発明の化合物の無毒の塩を表す。式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶの化合物の塩には、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶの化合物中の置換基上の窒素に由来する酸付加塩が含まれるであろう。代表的な塩には、以下の塩が含まれる：酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、ホウ酸塩、臭化物、カルシウムエデト酸塩（calcium edetate）、カンシル酸塩（camsylate）、炭酸塩、塩化物、クラブラン酸塩（clavulanate）、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシラート（edisylate）、エストラート（estolate）、エシラート（esylate）、フマル酸塩、グルセプタート（gluceptate）、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニラート（glycollylarsanilate）、ヘキシルレゾルシナート（hexylresorcinate）、ヒドラバミン（hydrabamine）、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシラート、メチルブロミド、メチル硝酸塩（methylnitrate）、メチル硫酸塩（methylsulfate）、一カリウムマレイン酸塩（monopotassium maleate）、粘液酸塩、ナプシラート（napsylate）、硝酸塩、Ｎ−メチルグルカミン、シュウ酸塩、パモ酸塩（エンボナート）（pamoate（embonate））、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、カリウム、サリチル酸塩、ナトリウム、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩（teoclate）、トシラートおよびジトシラート、トリエチオダイド（triethiodide）、トリメチルアンモニウムおよび吉草酸塩。製薬上許容されない他の塩は、本発明の化合物の製造において有用である可能性があり、これらは本発明の別の態様を形成する。さらにまた、該塩は無水形態または水和形態であってよい。一実施形態では、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、または
ＩＶの化合物は塩酸塩またはジトシラート塩、例えばジトシラート塩、例えばジトシラート塩の一水和物である。
【００３０】
式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶの化合物の側鎖ＣＨ３ＳＯ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２はＨｅｔ基の任意の好適な位置に連結されていてよい。同様に、キナゾリン核のフェニル基はＨｅｔ基の任意の好適な位置に連結されていてよい。
【００３１】
本発明の一実施形態では、成分（ａ）は、無水または水和形態のラパチニブジトシラート（GSK572016; Lapatinib）（GSK）、例えば該ジトシラート塩の一水和物であってよい。
【００３２】
成分（ｂ）
本明細書中で使用される用語「免疫原性組成物」は、好適な哺乳動物被験体に投与された場合に、該被験体においてＨＥＲ−２／Ｎｅｕの少なくとも１つの部分に対する免疫応答を誘発する能力を有する、任意の組成物を包含する。本明細書中で使用される用語「免疫原」とは、ＨＥＲ−２／Ｎｅｕの少なくとも１つの部分に対する免疫応答を誘発する能力を有する、組成物の成分を表す。
【００３３】
成分（ｂ）は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質に由来する少なくとも１つのエピトープを含む単離されたタンパク質、または当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。本発明の一実施形態では、該少なくとも１つのエピトープは９個以上のアミノ酸長を有する。
【００３４】
本明細書中に記載のＨＥＲ−２／ｎｅｕ分子は、ラット、マウス、非ヒト霊長類、ヒト由来またはそれらのハイブリッドであってよい。一実施形態では、本明細書中に記載のＨＥＲ−２／ｎｅｕ分子はタンパク質全体、またはそのハイブリッドであってよい。本発明の一実施形態では、ＨＥＲ−２／ｎｅｕはヒト由来である。
【００３５】
本発明の一実施形態では、本明細書中に記載の成分（ｂ）は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ細胞外ドメインに由来する少なくとも１つのエピトープを含む単離されたタンパク質、または当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。本発明の一実施形態では、該少なくとも１つのエピトープは９個以上のアミノ酸長を有する。
【００３６】
本発明の一実施形態では、成分（ｂ）は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ細胞外ドメインを含むか、もしくはそれからなる単離されたタンパク質、または当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００３７】
本発明の一実施形態では、本明細書中に記載の成分（ｂ）は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ細胞内ドメインに由来する少なくとも１つのエピトープを含む単離されたタンパク質、または当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。本発明の一実施形態では、該少なくとも１つのエピトープは９個以上のアミノ酸長を有する。
【００３８】
代替の実施形態では、成分（ｂ）は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ細胞内ドメインを含むか、もしくはそれからなる単離されたタンパク質、または当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００３９】
本発明の別の実施形態では、成分（ｂ）は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質、例えばその細胞外ドメインに由来する少なくとも１つのエピトープを含む融合タンパク質、または当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。本発明において使用することができる融合タンパク質の例は、ＷＯ００／４４８９９（ＵＳ２００２ １７７５６７）に記載されている。該文献は参照により本明細書中に組み入れられる。
【００４０】
用語「融合タンパク質」とは、少なくとも２種のペプチドまたはポリペプチドを含むタンパク質を表す。融合タンパク質の一実施形態では、一方のペプチドまたはポリペプチドは１種のタンパク質配列またはドメインに由来し、他方のペプチドまたはポリペプチドは別のタンパク質配列またはドメインに由来する。該ペプチドまたはポリペプチドは、例えば共有結合性リンカー、例えばアミノ酸リンカー、例えばポリグリシンリンカー、または別のタイプの化学リンカー、例えば炭水化物リンカー、脂質リンカー、脂肪酸リンカー、ポリエーテルリンカー、例えばＰＥＧ、等を介して共有結合によって連結されていてよい（例えばHermanson, Bioconjugate techniques（1996）を参照のこと）。
【００４１】
本発明の別の実施形態では、成分（ｂ）は、（例えば、化学コンジュゲーション技術を使用して）担体分子にコンジュゲートされているか、あるいは、担体分子に融合されている（例えば、Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質および／またはそのエピトープおよび担体を含む組換え融合タンパク質を形成している）、本明細書中に記載のＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質および／またはそのエピトープを含んでよい。該担体は、該ＨＥＲ−２／ｎｅｕ分子に対する免疫応答を発生させるためのＴ細胞の支援を提供するものでもよい。
【００４２】
本発明において使用することができる担体の非網羅的なリストには、以下のものが含まれる：キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、例えばウシまたはヒト血清アルブミン（ＢＳＡまたはＨＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、不活性化型細菌毒素、例えば破傷風トキソイド（ＴＴ）またはジフテリアトキソイド（ＤＴ）、またはその組換え断片（例えば、ＴＴの断片Ｃのドメイン１、またはＤＴの転位ドメイン）、ツベルクリンの精製済みタンパク質誘導体（ＰＰＤ）。担体タンパク質が動物起源、例えばＫＬＨまたは血清アルブミンである本発明の実施形態では、該担体タンパク質は組換えによって生成されたものであってよい。
【００４３】
本発明の一実施形態では、該担体はインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）由来のタンパク質Ｄであってよい（参照により本明細書中に組み入れられるＥＰ０５９４６１０Ｂ１）。タンパク質Ｄはインフルエンザ菌由来のＩｇＤ結合性タンパク質であり、Forsgrenによって特許が取得されている（参照により本明細書中に組み入れられるＷＯ９１／１８９２６、権利化されているＥＰ ０ ５９４ ６１０ Ｂ１）。何らかの環境、例えば組換え免疫原の発現系では、タンパク質Ｄの断片、例えばタンパク質Ｄ １／３（1/3rd）（タンパク質ＤのＮ末端の１００〜１１０アミノ酸を含む（参照により本明細書中に組み入れられるＧＢ ９７１７９５３．５（ＵＳ６，３４２，２２４））を使用することが望ましいであろう。
【００４４】
本発明の一実施形態では、該担体は「Ｔ細胞ヘルパー（Ｔｈ）エピトープ」または「Ｔヘルパーエピトープ」であってよく、それは、ＭＨＣ分子に結合し、動物種においてＴ細胞を刺激することができるペプチドである。Ｔヘルパーエピトープは外来性または非自己エピトープであってよい。Ｔ細胞エピトープは、不特定エピトープ（promiscuous epitopes）、すなわち、動物種または集団においてＭＨＣクラスＩＩ分子の大部分に結合するエピトープであってよい（Panina-Bordignon et al, EJI. 1989, 19:2237-2242; Reece et al, JI 1993, 151:6175-6184（これらの文献は参照により本明細書中に組み入れられる））。
【００４５】
不特定のＴｈエピトープは、動物およびヒト集団において、広く多岐にわたるＭＨＣタイプと高度かつ広範に反応性である（Partidos et al. (1991) "Immune Responses in Mice Following Immunisation with chimaeric Synthetic Peptides Representing B and T Cell Epitopes of Measles Virus Proteins" J. of Gen. Virol. 72:1293-1299; ＵＳ ５，７５９，５５１（これらの文献は参照により本明細書中に組み入れられる））。本発明にしたがって使用することができるＴｈドメインは約１０〜約５０アミノ酸、例えば約１０〜約３０アミノ酸を有する。複数のＴｈエピトープが存在する場合、これらはすべて同一である（すなわち該エピトープは同種性（homologous）である）か、あるいは２種以上のタイプのエピトープの組み合わせを使用してよい（すなわち該エピトープは異種性（heterogeneous）である）。
【００４６】
Ｔｈエピトープには、例として、病原体由来のエピトープ、例えば肝炎ウイルス表面またはコア（ペプチド５０〜６９、Ferrari et al., J.Clin.Invest, 1991, 88, 214-222）抗原Ｔｈエピトープ、百日咳毒素Ｔｈエピトープ、破傷風毒素Ｔｈエピトープ（例えばＰ２（参照により本明細書中に組み入れられるＥＰ ０ ３７８ ８８１ Ｂ１）およびＰ３０（参照により本明細書中に組み入れられるＷＯ９６／３４８８８、ＷＯ９５／３１４８０、ＷＯ９５／２６３６５））、麻疹ウイルスＦタンパク質Ｔｈエピトープ、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）大外膜タンパク質Ｔｈエピトープ（例えばＰ１１、Stagg et al., Immunology, 1993, 79, 1-9）、エルシニア（Yersinia）のインベジン（invasin）、ジフテリアトキソイド、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素（haemagluttinin）（ＨＡ）、および熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）のＣＳ抗原が含まれる。
【００４７】
他のＴｈエピトープは、以下のものをはじめとする文献に記載されている：ＷＯ９８／２３６３５; Southwood et al., 1998, J. Immunol., 160: 3363-3373; Sinigaglia et al., 1988, Nature, 336: 778-780; Rammensee et al., 1995, Immunogenetics, 41: 4, 178-228; Chicz et al., 1993, J. Exp. Med., 178:27-47; Hammer et al., 1993, Cell 74:197-203; およびFalk et al., 1994, Immunogenetics, 39: 230-242, ＵＳ５，７５９，５５１; Cease et al., 1987, PNAS 84, 4249-4253; Partidos et al., J.Gen.Virol, 1991, 72, 1293-1299; ＷＯ９５／２６３６５およびＥＰ ０ ７５２ ８８６ Ｂ。Ｔ細胞エピトープは人工配列、例えばＰａｎ Ｄ−Ｒペプチド「ＰＡＤＲＥ」であってもよい（参照により本明細書中に組み入れられるＷＯ９５／０７７０７（ＵＳ６，６７５，４２８））。本発明の一実施形態では、使用される担体はＰＡＤＲＥである。
【００４８】
Ｔ細胞エピトープは、ヒトにおいて２種以上のＭＨＣ ＩＩ分子を発現するいくつかの個体に結合するエピトープの群から選択してよい。例えば、特に意図されるエピトープはＴＴ由来のＰ２およびＰ３０エピトープである（Panina-Bordignon Eur. J. Immunol 1989 19 (12) 2237）。一実施形態では、異種性Ｔ細胞エピトープはＴＴ由来のＰ２またはＰ３０である。
【００４９】
Ｐ２エピトープは配列ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ（配列番号１）を有し、破傷風毒素のアミノ酸８３０−８４３に相当する。
【００５０】
Ｐ３０エピトープ（破傷風毒素の残基９４７−９６７）は配列ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（配列番号２）を有し；場合により、ＦＮＮＦＴＶ配列を欠失させてよい。
【００５１】
他の汎用Ｔエピトープは熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）由来のスポロゾイト周囲タンパク質、特に配列ＤＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮＳ（配列番号３）を有する領域３７８−３９８に由来する（Alexander J, (1994) Immunity 1 (9), p 751-761）。
【００５２】
使用することができる別のエピトープは、麻疹ウイルス融合タンパク質の、配列ＬＳＥＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶ（配列番号４）を有する残基２８８−３０２から誘導される（Partidos CD, 1990, J. Gen. Virol 71(9) 2099-2105）。
【００５３】
使用することができるさらに別のエピトープは、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の、特に、配列ＦＦＬＬＴＲＩＬＴＩＰＱＳＬＤ（配列番号５）を有するアミノ酸から誘導される。
【００５４】
使用することができる別のセットのエピトープはジフテリア毒素に由来する。これらのペプチドのうちの４種（アミノ酸２７１−２９０、３２１−３４０、３３１−３５０、３５１−３７０）は、該毒素の断片ＢのＴドメイン内に位置し、残りの２種はそのＲドメイン中に位置する（４１１−４３０、４３１−４５０）：
2008523017.tif 000007
【００５５】
（Raju R., Navaneetham D., Okita D., Diethelm-Okita B., McCormick D., Conti-Fine B. M. (1995) Eur. J. Immunol. 25: 3207-14.）。
【００５６】
したがって、本発明の免疫原性組成物は、本明細書中に記載のＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質および／またはそのエピトープ、ならびに本明細書中に記載の担体および／またはＴｈエピトープを、化学コンジュゲートまたは純粋な合成ペプチド構築物として含んでよい。免疫原は、該免疫原のＮ末端またはＣ末端でスペーサー（例えばＧｌｙ−Ｇｌｙ）を介してＴｈエピトープに取り付けることができる。
【００５７】
１種以上の担体（群）および／または不特定のＴｈエピトープ（群）を含ませてよい。一実施形態では、免疫原性組成物は２〜５種の範囲の担体および／またはＴｈエピトープを含んでよい。
【００５８】
一実施形態では、免疫原をリポソーム担体に直接コンジュゲートしてよく、リポソーム担体はＴ細胞の支援を提供可能な免疫原をさらに含んでよい。
【００５９】
コンジュゲーションまたは融合タンパク質
当技術分野において周知のコンジュゲーションの方法を使用して、担体またはＴｈエピトープをカップリングすることができる。ゆえに、例えば、直接の共有結合によるカップリングに関して、共通の市販のヘテロ二機能性リンカー、例えばＣＤＡＰおよびＳＰＤＰを（製造元の指示を用いて）利用して、カルボジイミド、グルタールアルデヒドまたは（Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステルを利用することが可能である。カップリング反応後、透析法、ゲル濾過法、分画法等を用いて、コンジュゲートを容易に単離および精製することができる。本発明では、グルタールアルデヒド（gluteraldehyde）またはマレイミド化学の使用によって形成されるコンジュゲートを使用することができる。一実施形態では、マレイミド化学を使用することができる。
【００６０】
あるいは、本明細書中に記載のＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質もしくはエピトープに担体またはＴｈエピトープを融合することができる。例えば、ＥＰ０４２１６３５Ｂ（参照により本明細書中に組み入れられる）では、ウイルス様粒子中で外来ペプチド配列を提示するためのキメラヘパドナウイルスコア抗原粒子の使用が記載されている。そのように、融合分子は、例えばＢ型肝炎コア抗原からなるキメラ粒子中で提示される本発明の免疫原を含むことができる。あるいは、組換え融合タンパク質はインフルエンザウイルスの免疫原およびＮＳ１を含むことができる。
【００６１】
本発明の成分（ｂ）の一部分を形成する任意の組換え発現タンパク質に関して、該タンパク質をコードする核酸もまた、本発明の一態様を形成する。
【００６２】
本発明の一実施形態では、融合タンパク質は、場合によりリンカー配列を介した、遺伝子改変融合パートナーの発現体であってよい。
【００６３】
融合タンパク質を形成するポリペプチドはＣ末端とＮ末端を連結することができる。あるいは、Ｃ末端とＣ末端、Ｎ末端とＮ末端、またはＮ末端とＣ末端でそれらを連結してよい。融合タンパク質のポリペプチドは任意の順序であってよい。用語「ポリペプチド」および「融合タンパク質」とは、該ポリペプチドの保存的に改変された変異体、多型変異体、対立遺伝子、突然変異体、部分配列および種間ホモログ、または融合タンパク質を構成するポリペプチドを表してもよい。
【００６４】
１種のタンパク質配列由来のアミノ酸の鎖を別のタンパク質配列由来のアミノ酸の鎖に共有結合で連結することによって融合タンパク質を作製することができ、例えば、該融合タンパク質を連続してコードする組換えポリヌクレオチドを調製することによって融合タンパク質を作製する。融合タンパク質は、同種または異種由来の２つ、３つ、４つまたはそれ以上の異なるアミノ酸鎖を含むことができる。融合タンパク質中の異なるアミノ酸鎖は直接つなぎ合わせることができ、あるいは化学連結基またはアミノ酸連結基を介して間接的につなぎ合わせてよい。融合タンパク質は、場合により、本明細書中でさらに詳細に記載される他の成分を含んでよい。
【００６５】
コンジュゲートまたは融合タンパク質は、実質的に、生物学的に不活性であってよい。
【００６６】
一実施形態では、本明細書中に記載のＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質またはエピトープを組換えＧＭ−ＣＳＦ、例えばヒトＧＭ−ＣＳＦに連結または融合する。別の実施形態では、本明細書中に記載のＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質またはエピトープを含む組成物はＧＭ−ＣＳＦをさらに含む。
【００６７】
本明細書中で使用される用語「ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質」は、本明細書中で「ＥＣＤ−ＩＣＤ」または「ＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質」とも称され、該用語は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質の（ｉ）細胞外ドメインまたはその断片を含むか、あるいはそれからなるアミノ酸配列；および（ｉｉ）細胞内ドメインまたはその断片を含むか、あるいはそれからなるアミノ酸配列を含む融合タンパク質またはその断片を表す。
【００６８】
本明細書中で使用される用語「ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質」は、「ＥＣＤ−ＰＤ」または「ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質」とも称され、該用語は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質の（ｉ）細胞外ドメインまたはその断片を含むか、あるいはそれからなるアミノ酸配列；および（ｉｉ）リン酸化ドメインまたはその断片を含むか、あるいはそれからなるアミノ酸配列を含む融合タンパク質またはその断片を表す。
【００６９】
本明細書中で使用される用語「ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ΔＰＤ融合タンパク質」は、「ＥＣＤ−ΔＰＤ」または「ＥＣＤ−ΔＰＤ融合タンパク質」とも称され、該用語は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質の（ｉ）細胞外ドメインまたはその断片を含むか、あるいはそれからなるアミノ酸配列；および（ｉｉ）ΔＰＤドメインまたはその断片を含むか、あるいはそれからなるアミノ酸配列を含む融合タンパク質またはその断片を表す。
【００７０】
一実施形態では、成分（ｂ）は、融合タンパク質「ＥＣＤ−ＩＣＤ」、または該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはそれからなる免疫原性組成物を含む。
【００７１】
別の実施形態では、成分（ｂ）は、融合タンパク質「ＥＣＤ−ＰＤ」、または該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはそれからなる免疫原性組成物を含む。
【００７２】
さらに別の実施形態では、成分（ｂ）は、融合タンパク質「ＥＣＤ−ΔＰＤ」、または該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはそれからなる免疫原性組成物を含む。
【００７３】
本発明の一実施形態では、融合タンパク質はＨＥＲ−２／ｎｅｕ膜貫通ドメインの大部分を含まない。別の実施形態では、融合タンパク質はいずれのＨＥＲ−２／ｎｅｕ膜貫通ドメインをも含まない。
【００７４】
本発明のＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質およびＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質は、可溶性で、分泌型で、培地中で安定であることができる。
【００７５】
本明細書中に記載のＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質は、その断片、そのホモログおよびその機能的等価物（包括的に「変異体」と称される）、例えば、１個以上のアミノ酸が挿入、欠失または、他のアミノ酸（群）または非アミノ酸（群）で置換されているものを含むと理解され、本発明のいくつかの実施形態では、変異体は（ｉ）ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質と比較して、免疫応答の誘発または増強を高めるか、あるいは（ｉｉ）ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質と比較して、免疫応答の誘発または増強に実質的に影響しない（例えば、変異体はヘルパーＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞による応答を刺激するか、あるいは抗体の生産を刺激する）。
【００７６】
ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質およびＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質の典型的な断片、ホモログおよび機能的等価物を含む変異体の例は、ＷＯ００／４４８９９（ＵＳ２００２／０１７７５６７）にさらに詳細に記載されている。該文献は参照により本明細書中に組み入れられる。変異体はネイティブのポリペプチド成分を含む融合タンパク質と「実質的に同一」または「実質的に類似」であってよく、免疫応答を刺激する能力を保持する。使用することができる変異体およびそのような変異体を決定する方法の例は、ＷＯ００／４４８９９（ＵＳ２００２／０１７７５６７）に記載されている。該文献は参照により本明細書中に組み入れられる。
【００７７】
本発明の一部分を形成しうるＩＣＤはヒト、ラットまたはマウス起源のＩＣＤであってよい。ヒトＩＣＤ（図１；配列番号１２）はＬｙｓ６７６〜Ｖａｌ１２５５の領域にわたる（両端を含む）。ラットＩＣＤは図２および配列番号１３に記載され、Ｌｙｓ６７７〜Ｖａｌ１２５６の領域にわたる（両端を含む）。
【００７８】
本発明の一部分を形成しうるＰＤはヒト、ラットまたはマウス起源のＩＣＤであってよい。ヒトＰＤは図４に記載される（配列番号１５のアミノ酸配列１−２６６（ＨＥＲ−２／ｎｅｕのアミノ酸配列９９０−１２５５に相当する））。ヒトＰＤは図１５に示されるヒトΔＰＤであってよい（配列番号１６のアミノ酸配列１−５９（ＨＥＲ−２／ｎｅｕのアミノ酸配列９９０−１０５０に相当する））。ラットＰＤは図２および配列番号１３に示され、Ｇｌｎ９９１〜Ｖａｌ１２５６の領域にわたる（両端を含む）。ラットＰＤは図２および配列番号１３に示されるラットΔＰＤであってよく、Ｇｌｎ９９１〜Ａｒｇ１０４９の領域にわたる（両端を含む）。
【００７９】
一実施形態では、ヒトＥＣＤを、（ｉ）ヒトＩＣＤもしくはラットＩＣＤ、あるいは（ｉｉ）ヒトＰＤもしくはΔＰＤ、またはラットＰＤもしくはΔＰＤと融合することができる。別の実施形態では、ラットＥＣＤを、（ｉ）ヒトＩＣＤもしくはラットＩＣＤ、あるいは（ｉｉ）ヒトＰＤもしくはΔＰＤ、またはラットＰＤもしくはΔＰＤと融合することができる。
【００８０】
本発明の一部分を形成しうる融合タンパク質は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕリン酸化ドメインに融合されたＨＥＲ−２／ｎｅｕ細胞外ドメインを含んでよい。該タンパク質は、配列番号１７の配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列、または配列番号１５の配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列に融合された、配列番号１４の配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列を有してよい。あるいは、該タンパク質は、配列番号１３のＧｌｎ９９１〜Ｖａｌ１２５６を含む配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一のアミノ酸配列に直接融合された、配列番号３の配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列、または配列番号１３のＧｌｎ９９１〜Ｖａｌ１２５６を含む配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一のアミノ酸配列に融合された、配列番号３（１７）の配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列を含んでよい。あるいは、該タンパク質は、配列番号１５の配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列に直接融合された、配列番号１９の配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列、または配列番号１５の配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列に融合された、配列番号１９の配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列を含んでよい。あるいは、該タンパク質は、配列番号１３のＧｌｎ９９１〜Ｖａｌ１２５６を含むアミノ酸配列に直接融合された、配列番号１９の配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列、または配列番号１３のＧｌｎ９９１〜Ｖａｌ１２５６を含むアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列に融合された、配列番号１９の配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列を含んでよい。
【００８１】
別の実施形態では、融合タンパク質は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕリン酸化ドメインの断片に融合されたＨＥＲ−２／ｎｅｕ細胞外ドメインを含んでよい。一実施形態では、該タンパク質は、配列番号１８の配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列、または配列番号１６の配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列に融合された、配列番号１４の配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列を有してよい。あるいは、該タンパク質は、配列番号２のＧｌｎ９９１〜Ａｒｇ１０４９を含むアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列に直接融合された、配列番号１４の配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列、または配列番号１３のＧｌｎ９９１〜Ａｒｇ１０４９を含むアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列に融合された、配列番号１４の配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列を含んでよい。あるいは、該タンパク質は、配列番号１６の配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列に直接融合された、配列番号１９の配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列、または配列番号１６の配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列に融合された、配列番号１９の配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列を含んでよい。あるいは、該タンパク質は、配列番号１３のＧｌｎ９９１〜Ａｒｇ１０４９を含むアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列に直接融合された、配列番号１９の配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列、または配列番号１３のＧｌｎ９９１〜Ａｒｇ１０４９を含むアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列に融合された、配列番号１９の配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列を含んでよい。
【００８２】
別の実施形態では、融合タンパク質は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ細胞内ドメインに融合されたＨＥＲ−２／ｎｅｕ細胞外ドメインを含んでよい。あるいは、該タンパク質は、配列番号１２のＬｙｓ６７６〜Ｖａｌ１２５５を含むアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列に直接融合された、配列番号１４の配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列、または配列番号１２のＬｙｓ６７６〜Ｖａｌ１２５５を含むアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列に、少なくとも１つの化学連結基またはアミノ酸連結基を介して融合された、配列番号１４の配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列を含んでよい。あるいは、該タンパク質は、配列番号１３のＬｙｓ６７７〜Ｖａｌ１２５６を含むアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列に直接融合された、配列番号１４の配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列を含んでよく、あるいは、その場合、該タンパク質は、配列番号２のＬｙｓ６７７〜Ｖａｌ１２５６を含むアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列に、少なくとも１つの化学連結基またはアミノ酸連結基を介して融合された、配列番号１４の配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列を含む。あるいは、該タンパク質は、配列番号１２のＬｙｓ６７６〜Ｖａｌ１２５５を含むアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列に直接融合された、配列番号１９の配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列、または配列番号１２のＬｙｓ６７６〜Ｖａｌ１２５５を含むアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列に、少なくとも１つの化学連結基またはアミノ酸連結基を介して融合された、配列番号１９の配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列を含んでよい。あるいは、該タンパク質は、配列番号１３のＬｙｓ６７７〜Ｖａｌ１２５６を含むアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列に直接融合された、配列番号１９の配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列、または配列番号１３のＬｙｓ６７７〜Ｖａｌ１２５６を含むアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列に、少なくとも１つの化学連結基またはアミノ酸連結基を介して融合された、配列番号１９の配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列を含んでよい。
【００８３】
本発明において使用することができるＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質は、変異体を含むと理解され、ヒトおよび非ヒトポリペプチド間の任意の可能な組み合わせを含む。非ヒトポリペプチドには、任意の哺乳動物、例えばラット、マウス、モルモット、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、等由来のポリペプチドが含まれる。一実施形態では、ＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質としては以下のものが挙げられる：
（ｉ）ヒトＥＣＤ−ヒトＩＣＤ融合タンパク質、例えば、図３（配列番号１４）のヒトＥＣＤを、図１（配列番号１２）に示されるＬｙｓ６７６〜Ｖａｌ１２５５にわたるアミノ酸配列（両端を含む）であるヒトＩＣＤと、化学連結基および／またはアミノ酸連結基を用いて、あるいは用いずに、連結することによって形成されるもの、およびその変異体；
（ｉｉ）（ｉｉ）ラットＥＣＤ−ラットＩＣＤ融合タンパク質、例えば、図８（配列番号１９）のラットＥＣＤを、図２（配列番号１３）に示されるＬｙｓ６７７〜Ｖａｌ１２５６にわたるアミノ酸配列（両端を含む）であるラットＩＣＤと、化学連結基および／またはアミノ酸連結基を用いて、あるいは用いずに、連結することによって形成されるもの、およびその変異体；
（ｉｉｉ）ヒトＥＣＤ−ラットＩＣＤ融合タンパク質、例えば、図３（配列番号１４）に示されるヒトＥＣＤを、図２（配列番号１３）に示されるＬｙｓ６７７〜Ｖａｌ１２５６にわたるアミノ酸配列（両端を含む）であるラットＩＣＤと、化学連結基および／またはアミノ酸連結基を用いて、あるいは用いずに、連結することによって形成されるもの、およびその変異体；および
（ｉｖ）ラットＥＣＤ−ヒトＩＣＤ融合タンパク質、例えば、図８（配列番号１９）に示されるラットＥＣＤを、図１（配列番号１２）に示されるＬｙｓ６７６〜Ｖａｌ１２５５にわたるアミノ酸配列（両端を含む）であるヒトＩＣＤと、化学連結基および／またはアミノ酸連結基を用いて、あるいは用いずに、連結することによって形成されるもの、およびその変異体。
【００８４】
本明細書中に記載のＥＣＤ−ＩＣＤ融合タンパク質の任意の変異体は、本発明の融合タンパク質として包含される。一実施形態では、そのような変異体はネイティブのＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤタンパク質と実質的に同一または実質的に類似であり、免疫応答を刺激する能力を保持する。
【００８５】
ＥＣＤタンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列は、例えば図９（配列番号２０）に示され、ヌクレオチド１〜ヌクレオチド１９５９にわたる（両端を含む）。ＩＣＤタンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列は、例えば図９（配列番号２０）に示され、ヌクレオチド２０２６〜ヌクレオチド３７６５にわたる（両端を含む）。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤタンパク質が免疫応答を生じさせる能力に対する、任意の配列改変の影響は、例えば、突然変異型ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤタンパク質がＴ細胞応答を誘発する能力を、例えば本明細書中に記載の方法を使用して分析することによって、あるいは突然変異型ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＩＣＤタンパク質が抗体を産生させる能力を分析することによって、容易に決定されるであろう。
【００８６】
本発明において使用することができるＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質は、変異体を含むと理解され、ヒトおよび非ヒトポリペプチド間の任意の可能な組み合わせを含む。非ヒトポリペプチドには、例えばラット、マウス、モルモット、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、等由来のものが含まれる。一実施形態では、ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質としては以下のものが挙げられる：
（ｉ）ヒトＥＣＤ−ヒトＰＤ融合タンパク質、例えば図６（配列番号１７）に示されるものおよびその変異体、例えば、図３（配列番号１４）のヒトＥＣＤを図４（配列番号１５）のヒトＰＤと、化学連結基および／またはアミノ酸連結基を用いて、あるいは用いずに、連結することによって形成される融合タンパク質およびその変異体；
（ｉｉ）ラットＥＣＤ−ラットＰＤ融合タンパク質、例えば、図８（配列番号１９）のラットＥＣＤを、図２（配列番号１３）に示されるＧｌｎ９９１〜Ｖａｌ１２５６にわたるアミノ酸配列（両端を含む）であるラットＰＤと、化学連結基および／またはアミノ酸連結基を用いて、あるいは用いずに、連結することによって形成されるもの、およびその変異体；
（ｉｉｉ）ヒトＥＣＤ−ラットＰＤ融合タンパク質、例えば、図３（配列番号１４）に示されるヒトＥＣＤを、図２（配列番号１３）に示されるＧｌｎ９９１〜Ｖａｌ１２５６にわたるアミノ酸配列（両端を含む）であるラットＰＤと、化学連結基および／またはアミノ酸連結基を用いて、あるいは用いずに、連結することによって形成されるもの、およびその変異体；および
（ｉｖ）ラットＥＣＤ−ヒトＰＤ融合タンパク質、例えば、図８（配列番号１９）に示されるラットＥＣＤを、図４（配列番号１５）に示されるヒトＰＤと、化学連結基および／またはアミノ酸連結基を用いて、あるいは用いずに、連結することによって形成されるもの、およびその変異体。
【００８７】
ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質の任意の変異体は、本発明の実施形態として包含される。一実施形態では、そのような変異体はネイティブのＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＰＤタンパク質と実質的に同一または実質的に類似であり、免疫応答を刺激する能力を保持する。ＥＣＤタンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列は、例えば図９（配列番号２０）に示され、ヌクレオチド１〜ヌクレオチド１９５９にわたる（両端を含む）。ＰＤタンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列は、例えば図９（配列番号２０）に示され、ヌクレオチド２９６８〜ヌクレオチド３７６５にわたる（両端を含む）。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＰＤタンパク質が免疫応答を生じさせる能力に対する、任意の配列改変の影響は、例えば、突然変異型ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＰＤタンパク質がＴ細胞応答を誘発する能力を、例えば本明細書中に記載の方法を使用して分析することによって、あるいは突然変異型ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ＰＤタンパク質が抗体を産生させる能力を分析することによって、容易に決定されるであろう。
【００８８】
別の実施形態では、ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質は本発明のＥＣＤ−ΔＰＤ融合タンパク質であり、それは変異体を含むと理解され、ヒトおよび非ヒトポリペプチド間の任意の可能な組み合わせを含む。非ヒトポリペプチドには、例えばラット、マウス、モルモット、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、等由来のものが含まれる。一実施形態では、ＥＣＤ−ΔＰＤ融合タンパク質としては以下のものが挙げられる：
（ｉ）ヒトＥＣＤ−ヒトΔＰＤ融合タンパク質、例えば図７（配列番号１８）に示されるものおよびその変異体、例えば、図３（配列番号１４）のヒトＥＣＤを図５（配列番号１６）のヒトΔＰＤと、化学連結基および／またはアミノ酸連結基を用いて、あるいは用いずに、連結することによって形成される融合タンパク質およびその変異体；
（ｉｉ）ラットＥＣＤ−ラットΔＰＤ融合タンパク質、例えば、図８（配列番号１９）のラットＥＣＤを、図２（配列番号１３）に示されるＧｌｎ９９１〜Ａｒｇ１０４９にわたるアミノ酸配列（両端を含む）であるラットΔＰＤと、化学連結基および／またはアミノ酸連結基を用いて、あるいは用いずに、連結することによって形成されるもの、およびその変異体；
（ｉｉｉ）ヒトＥＣＤ−ラットΔＰＤ融合タンパク質、例えば、図３（配列番号１４）に示されるヒトＥＣＤを、図２（配列番号１３）に示されるＧｌｎ９９１〜Ａｒｇ１０４９にわたるアミノ酸配列（両端を含む）であるラットΔＰＤと、化学連結基および／またはアミノ酸連結基を用いて、あるいは用いずに、連結することによって形成されるもの、およびその変異体；および
（ｉｖ）ラットＥＣＤ−ヒトΔＰＤ融合タンパク質、例えば、図８（配列番号１９）に示されるラットＥＣＤを、図５（配列番号１６）に示されるヒトΔＰＤと、化学連結基および／またはアミノ酸連結基を用いて、あるいは用いずに、連結することによって形成されるもの、およびその変異体。
【００８９】
ＥＣＤ−ΔＰＤ融合タンパク質の任意の変異体は、本発明の実施形態として包含される。一実施形態では、そのような変異体はネイティブのＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ΔＰＤタンパク質と実質的に同一または実質的に類似であり、免疫応答を刺激する能力を保持する。ＥＣＤタンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列は、例えば図９（配列番号２０）に示され、ヌクレオチド１〜ヌクレオチド１９５９にわたる（両端を含む）。配列番号１６のΔＰＤタンパク質をコードするヒトＤＮＡ配列は、例えば図９（配列番号２０）に示され、ヌクレオチド２９６８〜ヌクレオチド３１４４にわたる（両端を含む）。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ΔＰＤタンパク質が免疫応答を生じさせる能力に対する、任意の配列改変の影響は、例えば、突然変異型ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ΔＰＤタンパク質がＴ細胞応答を誘発する能力を、例えば本明細書中に記載の方法を使用して分析することによって、あるいは突然変異型ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−ΔＰＤタンパク質が抗体を産生させる能力を分析することによって、容易に決定されるであろう。
【００９０】
一実施形態では、免疫原性成分（ｂ）は、ＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質または当該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００９１】
成分（ｂ）がタンパク質である本発明の実施形態では、成分（ｂ）はアジュバントまたは免疫刺激剤、例えば、非限定的に、ＴＨ１型応答を刺激可能なものをさらに含んでよい。本発明の一実施形態では、成分（ｂ）はＴＨ１型応答を刺激可能なアジュバントを含む。
【００９２】
タンパク質製剤に好適なアジュバント
腸内細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）が免疫系の強力な刺激因子であることが長い間知られているが、アジュバントにおけるその使用はその有毒な影響によって抑制されてきた。ＬＰＳの無毒の誘導体であるモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）は、コアの炭水化物基および還元末端グルコサミン由来のリン酸基を除去することによって製造される。ＭＰＬはRibi et al（1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407-419）によって報告され、以下の構造を有する：
【化５】
2008523017.tif 000008
【００９３】
さらに無毒化された型のＭＰＬは、二糖主鎖の３位からアシル鎖を除去することによって得られ、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）と称される。それはＧＢ ２１２２２０４Ｂにおいて教示される方法によって精製および製造することができ、該参考文献は、ジホスホリル脂質Ａ、およびその３−Ｏ−脱アシル化変種の製造をさらに開示している。一実施形態では、免疫原性組成物は３Ｄ−ＭＰＬを含む。
【００９４】
一実施形態では、使用することができる３Ｄ−ＭＰＬの形態は、直径が０．２μｍ未満の小さい粒子サイズを有するエマルジョンの形態であり、その製造方法はＷＯ９４／２１２９２に開示されている。該文献は参照により本明細書中に組み入れられる。モノホスホリル脂質Ａおよび界面活性剤を含む水性製剤はＷＯ９８４３６７０に記載されている。該文献は参照により本明細書中に組み入れられる。
【００９５】
本発明の組成物中に製剤化される対象の細菌性リポ多糖由来のアジュバントは細菌供給源から精製および加工することができ、あるいはそれらは合成されたものでもよい。例えば、精製モノホスホリル脂質Ａは、Ribi et al 1986（上掲）に記載され、サルモネラ属の種（Salmonella sp.）由来の３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルまたはジホスホリル脂質ＡはＧＢ ２２２０２１１およびＵＳ ４９１２０９４に記載されている。他の精製および合成リポ多糖が報告されている（Hilgers et al., 1986, Int.Arch.Allergy.Immunol., 79(4):392-6; Hilgers et al., 1987, Immunology, 60(1):141-6; およびＥＰ ０ ５４９ ０７４ Ｂ１）。一実施形態では、細菌性リポ多糖アジュバントは３Ｄ−ＭＰＬである。
【００９６】
したがって、本発明において使用することができるＬＰＳ誘導体は、ＬＰＳまたはＭＰＬまたは３Ｄ−ＭＰＬと構造が類似している免疫刺激剤である。本発明の別の態様では、ＬＰＳ誘導体はアシル化単糖であってよく、それは上記ＭＰＬ構造の一部分である。
【００９７】
３Ｄ−ＭＰＬはＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ−４）のアゴニストである。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物に１種以上のＴＬＲ−４アゴニスト（群）を含ませてよい。ＴＬＲ−４アゴニストには以下のものが含まれる：グラム陰性菌由来のリポ多糖（ＬＰＳ）またはその断片；熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）１０、６０、６５、７０、７５または９０；界面活性タンパク質Ａ、ヒアルロナンオリゴ糖、ヘパラン硫酸断片、フィブロネクチン断片、フィブリノゲンペプチドおよびｂ−デフェンシン−２およびＭＰＬ、例えば３Ｄ−ＭＰＬ。
【００９８】
サポニンは以下の文献に教示されている：Lacaille-Dubois, M and Wagner H.（1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386）。サポニンは植物および海洋動物界で広く分布しているステロイドまたはトリテルペングリコシドである。サポニンは、振とう時に泡立つコロイド水溶液を形成させること、およびコレステロールを沈殿させることに関して有名である。サポニンが細胞膜の付近に存在すると、それらは膜中に細孔様構造を創出し、該膜を破裂させる。赤血球の溶血はこの現象の例であり、これはすべてではないが特定のサポニンの特性である。
【００９９】
サポニンは全身投与用ワクチンにおけるアジュバントとして知られる。個々のサポニンのアジュバントおよび溶血活性は当技術分野において広範に研究されている（Lacaille-Dubois and Wagner, 上掲）。例えば、ＵＳ ５，０５７，５４０および"Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55; およびＥＰ ０ ３６２ ２７９ Ｂ１には、Ｑｕｉｌ Ａ（南米のキラヤ（Quillaja Saponaria Molina）の木の皮由来）およびそのフラクションが記載されている。Ｑｕｉｌ Ａのフラクションを含む、免疫刺激性複合体（ＩＳＣＯＭ）と称される微粒子構造は溶血性であり、ワクチンの製造に使用されている（Morein, B., ＥＰ ０ １０９ ９４２ Ｂ１; ＷＯ９６／１１７１１; ＷＯ９６／３３７３９（これらの文献は参照により本明細書中に組み入れられる））。溶血性サポニンＱＳ２１およびＱＳ１７（Ｑｕｉｌ ＡのＨＰＬＣ精製フラクション）は強力な全身性アジュバントとして報告されており、その生産方法は米国特許第５，０５７，５４０号およびＥＰ ０ ３６２ ２７９ Ｂ１に開示されている。全身性ワクチン接種研究において使用されている他のサポニンには、他の植物種、例えばカスミソウ（Gypsophila）およびサポンソウ（Saponaria）由来のものが含まれる（Bomford et al., Vaccine, 10(9):572-577, 1992）。
【０１００】
本発明において使用することができる１つのアジュバント系は、無毒の脂質Ａ誘導体およびサポニン誘導体を含む。使用することができる特定のアジュバント系は、例えばＷＯ９４／００１５３に開示されているように３Ｄ−ＭＰＬおよびＱＳ２１を含む。該文献は参照により本明細書中に組み入れられる。使用することができる別の系は、例えばＷＯ９６／３３７３９に開示されているように３Ｄ−ＭＰＬおよびＱＳ２１を含み、その場合、該ＱＳ２１はコレステロールでクエンチされる。該文献は参照により本明細書中に組み入れられる。
【０１０１】
本発明の別の実施形態では、成分（ｂ）は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドとともにサポニンを含むアジュバント組成物をさらに含む。例えば、該アジュバント組成物は免疫調節性オリゴヌクレオチド、例えばメチル化されていないＣＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチド（ＣｐＧオリゴヌクレオチド）とともにＱＳ２１を含んでよい。
【０１０２】
本発明の一実施形態では、アジュバント中に包含することができる免疫刺激性オリゴヌクレオチドは以下の群から選択される：
2008523017.tif 000009
【０１０３】
本発明の別の実施形態では、成分（ｂ）は、例えばＥＰ ３８２ ２７１に記載の水中油型エマルジョンを含むアジュバント組成物をさらに含む。該文献は参照により本明細書中に組み入れられる。
【０１０４】
別の実施形態では、成分（ｂ）は、例えばＷＯ０２／３２４５０に記載のリポソームまたは水中油型エマルジョン担体とともに３Ｄ−ＭＰＬ、ＱＳ２１およびＣｐＧオリゴヌクレオチドを用いて製剤化されたアジュバント組成物をさらに含む。該文献は参照により本明細書中に組み入れられる。そのような製剤は体液性応答および細胞性応答の両者を生じさせるであろう。ＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬのみを含むアジュバント製剤と比較して、本発明の製剤は、マウスにおいて強いＴＨ１応答を好都合に示すであろう。
【０１０５】
本発明のさらに別の実施形態では、アジュバントは、水中油型エマルジョンおよびサポニンを含むアジュバントであるＳＢ６２’ｃであり、その場合、油は代謝可能な油であり、代謝可能な油：サポニンの比（ｗ／ｗ）は１：１〜２００：１（低量水中油型エマルジョン）の範囲である。それはＷＯ９９／１１２４１に記載され、該文献の全教示内容は参照により本明細書中に組み入れられる。一実施形態では、代謝可能な油：サポニンの比（ｗ／ｗ）は実質的に４８：１である。サポニンはＱｕｉｌＡ、例えばＱＳ２１であってよい。一例では、代謝可能な油はスクアレンである。該ＳＢ６２’ｃアジュバント組成物はステロール、例えばコレステロールをさらに含んでよい。該ＳＢ６２’ｃアジュバント組成物は、１種以上の免疫調節物質、例えば：３Ｄ−ＭＰＬおよび／またはα−トコフェロールを追加的にまたは代替でさらに含んでよい。３Ｄ−ＭＰＬを含むＳＢ６２’ｃの実施形態では、ＱＳ２１：３Ｄ−ＭＰＬの比（ｗ／ｗ）は１：１０〜１０：１、例えば１：１〜１：２．５、または１：１〜１：２０であってよい。
【０１０６】
ゆえに、該アジュバントＳＢ６２’ｃの一実施形態では、代謝可能な油：サポニンの比（ｗ／ｗ）は１：１〜２００：１の範囲であるか、あるいは実質的に４８：１であり、該サポニンはＱＳ２１であり、かつ、該アジュバントは３Ｄ−ＭＰＬをさらに含む（低量水中油型エマルジョン、ＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ）。
【０１０７】
本発明の別の実施形態では、アジュバントは、例えばＥＰ０３８２２７１に記載されるトコール（tocol）を含む水中油型エマルジョンからなる。該文献は参照により本明細書中に組み入れられる。別の実施形態では、使用することができる水中油型エマルジョンはα−トコフェロールを含む。
【０１０８】
一実施形態では、アジュバントは、例えばＥＰ８２２８３１に記載されているものなどのリポソーム中で提供される本明細書中に記載のアジュバント組成物である。該文献は参照により本明細書中に組み入れられる。別の実施形態では、アジュバントはモンタニド（montanide）ＩＳＡ５１を含んでよい。
【０１０９】
ワクチン
本発明は、本明細書中に記載の免疫原性組成物を、製薬上許容しうる賦形剤、アジュバントまたはビヒクルとともに含むワクチンをさらに提供する。本発明は、ワクチン組成物を製造する方法であって、本明細書中に記載の免疫原性組成物を製薬上許容しうる適切なビヒクル、アジュバントまたは賦形剤と混合するステップを含む方法をさらに提供する。適切なビヒクルおよび賦形剤は当技術分野において周知であり、例えば水またはバッファーが挙げられる。ワクチン製造は、Vaccine Design（"The subunit and adjuvant approach"（Powell M.F. & Newman M.J.編）（1995）Plenum Press New York）に全般的に記載されている。
【０１１０】
ポリヌクレオチド
本発明の一実施形態では、成分（ｂ）は、本明細書中に記載の本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【０１１１】
別の実施形態では、該ポリヌクレオチド配列は、該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものでありうる。本明細書中で使用される用語「ストリンジェントな条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、配列間に少なくとも９５％および好ましくは少なくとも９７％の同一性が存在する場合にのみハイブリダイゼーションが生じることを意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の具体例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト液、１０％硫酸デキストラン、および２０マイクログラム／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩インキュベーションした後、０．１×ＳＳＣ中で約６５℃で該ハイブリダイゼーション支持体を洗浄することである。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)、特にそのChapter 11で例示されている。
【０１１２】
したがって、該融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列としては、保存的に改変された変異体、多型変異体、対立遺伝子、突然変異体、部分配列、および種間ホモログが挙げられる。成分（ｂ）がポリヌクレオチドを含む実施形態では、成分（ｂ）はアジュバントをさらに含み、あるいはアジュバントまたは免疫刺激性物質と同時にまたは連続して投与してよい。
【０１１３】
前記ポリヌクレオチドは当業者に公知の任意の種々の送達系内で提供してよく、それには核酸発現系、細菌およびウイルス発現系が含まれる。多数の遺伝子送達技術が当技術分野において周知であり、例えばRolland (1998) Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198およびその引用文献に記載されている技術である。適切な核酸発現系は、患者体内での発現に必要なＤＮＡ配列（例えば好適なプロモーターおよび終結シグナル）を含有する。細菌送達系には、該融合タンパク質の免疫原性部分をその細胞表面で発現するか、あるいはそのようなエピトープを分泌する細菌（例えばカルメット・ゲラン菌（Bacillus Calmette-Guerin））の投与が含まれる。一実施形態では、ウイルス発現系またはベクター（例えばワクシニアウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルス）を使用してＤＮＡを導入することができ、それは非病原性（欠損型）で複製能を有するウイルスの使用を含む。好適な系は、例えばFisher-Hoch et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321; Flexner et al. (1989) Ann. N.Y. Acad. Sci. 569:86-103; Flexner et al. (1990) Vaccine 8:17-21; 米国特許第４，６０３，１１２号, 同第４，７６９，３３０号, 同第４，７７７，１２７号および同第５，０１７，４８７号; ＷＯ８９／０１９７３; ＧＢ ２，２００，６５１; ＥＰ ０，３４５，２４２; ＷＯ９１／０２８０５; Berkner (1988) Biotechniques 6:616-627; Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431-434; Kolls et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219; Kass-Eisler et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11498-11502; Guzman et al. (1993) Circulation 88:2838-2848; およびGuzman et al. (1993) Cir. Res. 73:1202-1207に開示されている。そのような発現系にＤＮＡを組込む技術は当業者に周知である。該ＤＮＡは「裸の」ＤＮＡであってもよく、それは例えばUlmer et al. (1993) Science 259:1745-1749に記載され、Cohen (1993) Science 259:1691-1692に総説として示されている。ＤＮＡを生分解性ビーズ上にコーティングすることによって裸のＤＮＡの取り込みを高めることができ、この場合、該ビーズは細胞内に効率的に輸送されるものである。
【０１１４】
本発明のワクチンまたは免疫原性組成物はポリヌクレオチドおよびポリペプチド成分の両者を含んでよいことが明らかである。そのようなワクチンまたは免疫原性組成物は増強された免疫応答を提供するであろう。
【０１１５】
ポリヌクレオチド配列とともに使用することができる免疫刺激性物質には、合成イミダゾキノリン、例えばイミキモド（imiquimod）［S-26308, R-837］または、Ｔｏｌｌ様受容体７を刺激することが知られている任意の他の分子、（Harrison, et al. 'Reduction of recurrent HSV disease using imiquimod alone or combined with a glycoprotein vaccine', Vaccine 19: 1820-1826, (2001)）；およびレシキモド（resiquimod）［S-28463, R-848］（Vasilakos, et al. 'Adjuvant activites of immune response modifier R-848: Comparison with CpG ODN', Cellular immunology 204: 64-74 (2000).）、抗原提示細胞およびＴ細胞表面で構成的に発現されるカルボニルおよびアミンのシッフ塩基、例えばツカレソール（tucaresol）（Rhodes, J. et al. 'Therapeutic potentiation of the immune system by costimulatory Schiff-base-forming drugs', Nature 377: 71-75 (1995)）、以下のものが含まれるであろう、タンパク質またはペプチドであるサイトカイン、ケモカインおよび共刺激分子：炎症誘発性サイトカイン（例えばインターフェロン、特にインターフェロンおよびＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、Ｔｈ１誘導物質（例えばインターフェロンγ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１）、Ｔｈ２誘発物質（例えばＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３）および他のケモカインおよび共刺激遺伝子（例えばＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＣＡ−３、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０Ｌ）、他の免疫刺激性ターゲティングリガンド（例えばＣＴＬＡ−４およびＬ−セレクチン）、アポトーシス刺激性タンパク質およびペプチド（例えばＦａｓ、（４９））、合成脂質ベースのアジュバント（例えばバックスフェクチン（vaxfectin）（Reyes et al., 'Vaxfectin enhances antigen specific antibody titres and maintains Th1 type immune responses to plasmid DNA immunization', Vaccine 19: 3778-3786）、スクアレン、α−トコフェロール、ポリソルベート８０、ＤＯＰＣおよびコレステロール）、内毒素、［ＬＰＳ］（Beutler, B., 'Endotoxin, 'Toll-like receptor 4, and the afferent limb of innate immunity', Current Opinion in Microbiology 3: 23-30 (2000)）；ＣｐＧオリゴおよびジヌクレオチド（Sato, Y. et al., 'Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective intradermal gene immunization', Science 273 (5273): 352-354 (1996). Hemmi, H. et al., 'A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA', Nature 408: 740-745, (2000)）、およびＴｏｌｌ受容体を作動させてＴｈ１誘発性サイトカインを産生させる他の潜在的なリガンド（例えば合成のマイコバクテリアリポタンパク質、マイコバクテリアタンパク質ｐ１９、ペプチドグリカン、タイコ酸および脂質Ａ）。他の細菌由来免疫刺激性タンパク質には、コレラ毒素、大腸菌毒素およびその突然変異型トキソイドが含まれる。主にＴｈ１型応答を誘発するためのアジュバントの例としては、例えば、脂質Ａ誘導体、例えばモノホスホリル脂質Ａ、または３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａが挙げられる。ＭＰＬ（登録商標）アジュバントはCorixa Corporation（Seattle, WA; 例えば米国特許第４，４３６，７２７号；同第４，８７７，６１１号；同第４，８６６，０３４号および同第４，９１２，０９４号を参照のこと）から入手可能である。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されていない）もまた、主にＴｈ１応答を誘発���る。そのようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えばＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８および米国特許第６，００８，２００号および同第５，８５６，４６２号に記載されている。免疫刺激性ＤＮＡ配列は、例えばSato et al., Science 273:352, 1996にさらに記載されている。使用することができる別のアジュバントはサポニン、例えばＱｕｉｌ Ａ、またはその誘導体を含み、それにはＱＳ２１およびＱＳ７（Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA）；エスシン（Escin）；ジギトニン（Digitonin）；またはカスミソウ（Gypsophila）またはキノア（Chenopodium quinoa）サポニンが含まれる。
【０１１６】
本発明の一実施形態では、アジュバント中に包含することができる免疫刺激性オリゴヌクレオチドは以下の群から選択される：
2008523017.tif 000010
【０１１７】
組み合わせ
任意の治療上適切な組み合わせにおいて、成分（ａ）および成分（ｂ）を同時にまたは逐次的に組み合わせて使用することができる。
【０１１８】
本発明にしたがって、成分（ａ）および（ｂ）の同時投与によって該組み合わせを使用することができる。同時投与は、例えば（１）両成分を含む単位医薬組成物を投与するか、あるいは（２）各々が一方の成分を含む別個の医薬組成物を被験体に同時投与することによる。
【０１１９】
成分（ａ）および（ｂ）が別々に投与される実施形態では、該組み合わせを同時にまたは逐次的様式で投与してよい。該逐次様式では、一方が最初に投与され、次に他方が投与されるか、あるいはその逆である。
【０１２０】
本明細書中で使用される逐次的投与とは、生物学的に関連する期間以内の成分（ａ）および（ｂ）の両者の投与を表す。逐次的投与の例には、例えば、第一の成分の投与が完了した直後の第二の成分の投与；または被験体が第一投与成分の生物学的効果を経験している時点で第二の成分を投与することが含まれる。ゆえに、最初に成分（ｂ）が投与される場合、成分（ａ）は、成分（ｂ）によって誘発される免疫応答、例えば抗体および／またはＴ細胞応答の期間中に投与されることが明らかである。成分（ｂ）が初回免疫・追加免疫処方で投与される本発明の一実施形態では、成分（ａ）は成分（ｂ）の「追加免疫」投与と同時に投与してよい。
【０１２１】
最初に成分（ａ）が投与される場合、成分（ｂ）は成分（ａ）が被験体の体内に存在する期間中に投与される。該成分は１：１様式以外の様式で投与してよく、例えば成分（ａ）の投与前に成分（ｂ）を２回以上投与してよく；成分（ｂ）の投与に続いて、生物学的に関連する期間以内に成分（ａ）を複数回投与してよいこと、等が当業者には明らかである。
【０１２２】
一実施形態では、成分（ｂ）の前に成分（ａ）が投与される。成分（ｂ）の前に成分（ａ）を１回以上投与してよい。
【０１２３】
別の実施形態では、成分（ａ）の前に成分（ｂ）が投与される。成分（ａ）の前に成分（ｂ）を１回以上投与してよい。一実施形態では、免疫原性組成物（ｂ）を以前に投与されている個体に成分（ａ）を投与してよい。
【０１２４】
成分（ｂ）が２回以上投与される場合、１回以上の投与がタンパク質であってよく、１回以上の投与がＤＮＡであってよいことが理解される。
【０１２５】
本発明は、本発明の組み合わせと任意の治療上適切な組み合わせにおいて、同時または逐次的に組み合わせて、少なくとも１つの追加の癌治療法の実施を含んでもよい。該追加の癌治療法には、放射線療法、外科治療および／または、少なくとも１種の追加の抗新生物剤を投与することを含む少なくとも１つの追加の化学療法による治療が含まれるであろう。
【０１２６】
成分（ａ）の前に成分（ｂ）が投与される本発明の実施形態では、免疫応答、例えばポリクローナル抗体応答の発生を許容するために、成分（ａ）より十分に前の時点で成分（ｂ）を投与する。本発明の一実施形態では、成分（ｂ）に対して発生した免疫応答のピークの時点で成分（ａ）を投与してよい。一実施形態では、既往性（記憶）応答のピークの時点で成分（ａ）を投与してよい。
【０１２７】
成分（ａ）の投与
治療における使用に関して、成分（ａ）の式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶの化合物ならびにその塩、溶媒和物および生理的に機能しうる誘導体を未製剤の化学物質として投与することが可能であるが、医薬組成物として該有効成分を提供することが可能である。したがって、一実施形態では、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよび／またはＩＶの化合物、およびその塩、溶媒和物、および生理的に機能しうる誘導体、ならびに１種以上の製薬上許容しうる担体、希釈剤、または賦形剤を含んでなる医薬組成物として本発明の成分（ａ）を提供する。
【０１２８】
担体（群）、希釈剤（群）または賦形剤（群）は、製剤の他の成分と適合性であり、そのレシピエントに対して有害でないという意味で許容しうるものである必要がある。
【０１２９】
本発明の別の態様にしたがえば、成分（ａ）の医薬製剤の製造方法であって、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよび／もしくはＩＶの化合物、および／またはその塩、溶媒和物、および／もしくは生理的に機能しうる誘導体を、１種以上の製薬上許容しうる担体、希釈剤または賦形剤と混合するステップを含む方法がさらに提供され、そのような医薬製剤は本発明の成分（ｂ）と組み合わせて提供される。
【０１３０】
本発明の成分（ａ）の医薬組成物の成分は、任意の経路による投与用に製剤化することができ、適切な経路は治療対象の具体的な癌ならびに治療対象の被験体に依存する。好適な医薬製剤には、経口、経直腸、鼻腔、局所（例えば頬側、舌下、および経皮）、経膣または非経口（例えば筋肉内、皮下、静脈内、および患部組織内への直接）の投与のための製剤または吸入もしくは吹送による投与に好適な形式の製剤が含まれる。適切であれば、該製剤を別個の用量単位で都合よく提供してよく、製薬分野で周知の任意の方法によって製造してよい。
【０１３１】
経口投与用に製造される医薬製剤は、分離した単位、例えばカプセル剤または錠剤；散剤または顆粒剤；水性もしくは非水性液体中の溶液剤または懸濁液剤；食用フォームまたはホイップ；あるいは水中油型乳濁液剤または油中水型乳濁液剤として提供してよい。
【０１３２】
例えば、錠剤またはカプセル剤の剤形での経口投与に関して、有効薬物成分を、経口の無毒の製薬上許容しうる不活性担体、例えばエタノール、グリセロール、水等と組み合わせることができる。散剤は、化合物を粉砕して好適な微細サイズにし、同様に粉砕された医薬用担体、例えば食用炭水化物、例えばデンプンまたはマンニトールと混合することによって製造される。香味物質、保存料、分散剤および着色剤を加えることもできる。
【０１３３】
カプセル剤は、上記粉末混合物を製造し、有形ゼラチンの入れ物に充填することによって作成される。流動促進剤および滑沢剤、例えばコロイド状シリカ、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムまたは固形ポリエチレングリコールを、充填操作前に該粉末混合物に加えることができる。崩壊剤または可溶化剤、例えば寒天、炭酸カルシウムまたは炭酸ナトリウムを加えて、カプセル摂取時の該医薬の有効性を改善することもできる。
【０１３４】
さらに、所望または必要である場合、好適な結合剤、滑沢剤、崩壊剤および着色剤を該混合物に組み込むこともできる。適切な結合剤には、デンプン、ゼラチン、天然糖類、例えばグルコースまたはβ−ラクトース、トウモロコシ甘味料、天然ガムおよび合成ガム、例えばアカシア、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックス等が含まれる。これらの剤形中で使用される滑沢剤には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等が含まれる。崩壊剤には、非限定的に、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム等が含まれる。錠剤は、例えば粉末混合物を製造し、顆粒化またはスラグ化し、滑沢剤および崩壊剤を加え、圧縮して錠剤にすることによって製剤化される。粉末混合物は、好適に粉砕された化合物を上記希釈剤または基剤および、場合により、結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギナート（aliginate）、ゼラチン、またはポリビニルピロリドン、溶解遅延剤（例えばパラフィン）、再吸収促進剤（例えば四級塩）および／または吸収剤（例えばベントナイト、カオリンまたは第二リン酸カルシウム）と混合することによって製造される。該粉末混合物は、結合剤、例えばシロップ、デンプンペースト、アカディアガムのり（acadia mucilage）またはセルロース系もしくはポリマー材料の溶液で湿潤させ、スクリーンに押し通すことによって顆粒化することができる。顆粒化の代替として、該粉末混合物を打錠機に通すことができ、その結果、不完全に形成されたスラグが崩壊して顆粒になる。ステアリン酸、ステアリン酸塩、タルクまたは鉱油を加えることによって該顆粒を潤滑にして、錠剤形成鋳型に対する固着を防ぐことができる。次いで、該潤滑化混合物を圧縮して錠剤にする。本発明の化合物を自由流動性不活性担体と混合し、顆粒化またはスラグ化ステップを経由せずに直接圧縮して錠剤にすることもできる。シェラックの密封コート、糖またはポリマー材料のコーティングおよびワックスの光沢コーティングからなる透明または不透明の保護性コーティングを提供することができる。これらのコーティングに色素を加えて、種々の単位用量を識別することができる。
【０１３５】
経口用の液体、例えば溶液剤、シロップ剤およびエリキシル剤を単位投与剤形で製造して、所定量があらかじめ決められた量の該化合物を含有するようにすることができる。好適に香味を付けた水性溶液に該化合物を溶解することによって、シロップ剤を製造することができ、一方、エリキシル剤は無毒のアルコール性ビヒクルの使用によって製造される。無毒のビヒクルに該化合物を分散させることによって、懸濁液剤を製剤化することができる。可溶化剤および乳化剤、例えばエトキシル化イソステアリルアルコールおよびポリオキシエチレンソルビトールエーテル、保存料、香味添加物、例えばペパーミント油または天然甘味料またはサッカリンまたは他の人工甘味料、等を加えることもできる。
【０１３６】
適切な場合、経口投与用の単位投与製剤をマイクロカプセル化することができる。例えばポリマー、ワックス等の中に微粒子材料をコーティングまたは包埋することによって該製剤を製造し、放出を延長または持続させることもできる。
【０１３７】
本発明の医薬組成物の成分は、リポソーム送達系、例えば小型単層小胞、大型単層小胞および多重膜小胞の形態で投与することもできる。種々のリン脂質、例えばコレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンからリポソームを形成させることができる。
【０１３８】
本発明の医薬組成物の成分は、化合物分子がカップリングされる対象の個別の担体としてモノクローナル抗体を使用することによって送達してもよい。ターゲティング可能な薬物担体としての可溶性ポリマーと該化合物をカップリングしてもよい。そのようなポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドフェノール（polyhydroxyethylaspartamidephenol）、またはポリエチレンオキシドポリリシン（パルミトイル残基で置換されている）が挙げられる。さらにまた、薬物の制御放出を達成するのに有用な生分解性ポリマーのクラス、例えばポリ乳酸、ポリイプシロン（polepsilon）カプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリラートおよびヒドロゲルの架橋型または両親媒性ブロックコポリマーに該化合物をカップリングしてよい。
【０１３９】
経皮投与用に製造される医薬製剤は、レシピエントの表皮と密接に接触した状態を長期間保つための個別のパッチとして提供することができる。例えば、イオン泳動によって該パッチから有効成分を送達させてよい。それはPharmaceutical Research, 3(6), 318 (1986)に全般的に記載されている。
【０１４０】
局所投与用に製造される医薬製剤は、軟膏剤、クリーム剤、懸濁液剤、ローション剤、散剤、溶液剤、ペースト剤、ゲル剤、スプレー剤、エアロゾル剤または油剤として製剤化することができる。
【０１４１】
眼または他の外側組織、例えば口腔および皮膚の治療に関して、局所軟膏剤またはクリーム剤として製剤を投与してよい。軟膏中に製剤化される場合、パラフィン系または水混和性軟膏基剤とともに該有効成分を使用する。あるいは、水中油型クリーム基剤または油中水型基剤を伴うクリーム中で該有効成分を製剤化してよい。
【０１４２】
眼に対する局所投与用に製造される医薬製剤には点眼剤が含まれ、その場合、好適な担体、特に水性溶媒に該有効成分が溶解または懸濁される。
【０１４３】
口腔での局所投与に合わせて製造される医薬製剤には、ロゼンジ剤、トローチ剤および口腔洗浄剤が含まれる。
【０１４４】
経直腸投与用に製造される医薬製剤は坐剤または浣腸剤として提供することができる。
【０１４５】
担体が固形である場合に鼻腔投与用に製造される医薬製剤には、例えば２０〜５００ミクロンの範囲の粒子サイズを有する粗末が含まれ、該粗末は、嗅薬が摂取される様式で、すなわち鼻に近接して保持される該粉末の容器から鼻腔を通過する高速吸入によって投与される。担体が液体である場合の鼻内スプレーまたは点鼻剤としての投与に好適な製剤としては、該有効成分の水性または油性溶液が挙げられる。
【０１４６】
吸入による投与用に製造される医薬製剤には微粒子ダストまたはミストが含まれ、それらは種々のタイプの定量式加圧エアロゾル、噴霧器または空気吸入器を用いて生成することができる。
【０１４７】
経膣投与用に製造される医薬製剤は、膣坐剤、タンポン剤、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、フォーム剤またはスプレー製剤として提供することができる。
【０１４８】
非経口投与用に製造される医薬製剤としては、水性および非水性滅菌注射溶液剤（抗酸化剤、バッファー、静菌剤および、該製剤を目的のレシピエントの血液と等張にする溶質を含有してよい）；および水性および非水性滅菌懸濁液剤（懸濁化剤および増粘剤を含んでよい）が挙げられる。該製剤は、単位用量または複数用量の容器、例えば密封アンプルおよびバイアル中で提供することができ、使用直前に滅菌液状担体、例えば注射用の水を加えるだけでよい凍結乾燥（lyophilized）条件で保存してよい。滅菌粉末、顆粒および錠剤から即席注射溶液および懸濁液を製造してよい。
【０１４９】
上で具体的に記載される成分に加えて、該製剤は、対象となっている製剤のタイプを考慮して当技術分野において慣用の他の物質を含んでよく、例えば経口投与に好適な製剤には香味物質を含ませてよいことが理解されるべきであろう。
【０１５０】
本発明の医薬組成物の成分（ａ）についての治療上有効量はいくつかの要因に依存し、その要因には、非限定的に、哺乳動物の年齢および体重、治療を必要とする厳密な障害およびその重症度、製剤の性質、および投与経路が含まれ、最終的には、担当医師または獣医師の判断にしたがう。典型的に、本発明の医薬組成物の成分は、治療に関して、１日あたりレシピエント（哺乳動物）の体重１ｋｇあたり０．１〜１００ｍｇの範囲で投与され、より一般的には、１日あたり体重１ｋｇあたり１〜１０ｍｇの範囲で投与される。許容しうる１日量は、約０．１〜約１０００ｍｇ／日、例えば約０．１〜約１００ｍｇ／日であってよい。
【０１５１】
成分（ｂ）の投与
本明細書中に記載の成分（ｂ）についての投与の経路および頻度ならびに投与量は個体ごとに異なり、それは標準的技術を使用して容易に設定することができる。一般に、免疫原性組成物および／またはワクチンは、注射（例えば皮内、筋肉内、静脈内または皮下）によって、鼻腔内に（例えば吸引によって）、または経口で投与することができる。一実施形態では、５２週間にわたって１〜１０用量の範囲で投与する。１か月の間隔で６用量を投与してもよく、その後、定期的に追加免疫用ワクチン接種を行ってよい。代替のプロトコルは個別の患者に適切なものであってよい。好適な用量は、上記のように投与される場合に、抗腫瘍免疫応答を促進可能な化合物の量であり、それは基底（すなわち治療していない）レベルを少なくとも１０〜５０％上回る。ワクチンに関して、そのような応答は、患者中の抗腫瘍抗体を測定することによって、あるいは患者の腫瘍細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで死滅させることが可能な細胞溶解性エフェクター細胞のワクチン依存的発生に基づいてモニターすることができる。そのようなワクチンは、ワクチン非接種患者と比較して、ワクチン接種患者において改善された臨床転帰（例えば、寛解がより起りやすい、完全なもしくは部分的なまたは長期の無疾患生存）をもたらす免疫応答を引き起こすことがさらに可能であろう。
【０１５２】
一般に、免疫原性組成物およびワクチンに関して、１用量中に存在する各免疫原の量は、宿主体重１ｋｇあたり約１μｇ〜５ｍｇ、例えば１００μｇ〜５ｍｇ、または例えば５μｇ〜２５０μｇの範囲である。好適な用量サイズは患者のサイズにともなって変動するが、典型的には、約０．１ｍＬ〜約５ｍＬの範囲である。
【０１５３】
一実施形態では、最初のまたは初期免疫化は、本明細書中に記載のＨＥＲ−２／ｎｅｕ免疫原性組成物、例えば、少なくとも１つのＥＣＤおよび／またはＩＣＤまたはＰＤを例えば有するＨＥＲ−２／ｎｅｕ融合タンパク質を用いて施され、以後の免疫化または追加免疫化がさらに施される。免疫化に好適なＥＣＤ−ＩＣＤおよび／またはＥＣＤ−ＰＤ融合タンパク質には、本明細書中に記載のものが含まれる。当業者には理解されるように、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ免疫原性組成物が融合タンパク質である場合、本発明は、インタクトなＨＥＲ−２／ｎｅｕ融合タンパク質ならびに該Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ融合タンパク質を複数のペプチドに分割したものの使用を意図する。
【０１５４】
一般に、適切な投与量および治療方式では、治療的および／または予防的利益を提供するために十分な量の活性化合物（群）が提供される。そのような応答は、治療していない患者と比較して、治療した患者において改善された臨床転帰（例えば、より頻繁な寛解、完全なもしくは部分的な、または長期の無疾患生存）が確立されることに基づいてモニターすることができる。ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質または融合タンパク質に対する免疫応答の発生またはそれに対する既存の免疫応答の増加によっても、成分（ｂ）の十分な量の使用が示されるであろう。既存の免疫応答の増加は臨床転帰の改善と相関するであろう。そのような免疫応答は、一般に、標準的な増殖アッセイ、細胞傷害性アッセイまたはサイトカインアッセイを使用して評価することができ、それは治療前後に患者から取得されたサンプルを使用して実施することができる。
【０１５５】
Ｔ細胞
本発明の成分（ｂ）は、本明細書中に記載のポリペプチドもしくは融合タンパク質に特異的なＴ細胞を、さらに、または代替的に含んでよい。そのような細胞は、一般に、標準的手順を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで調製してよい。例えば、市販の細胞分離系を使用して、患者の骨髄、末梢血または骨髄もしくは末梢血のフラクションからＴ細胞を単離してよい（米国特許第５，２４０，８５６号および同第５，２１５，９２６号; ＷＯ８９／０６２８０; ＷＯ９１／１６１１６およびＷＯ９２／０７２４３をさらに参照のこと）。あるいは、血縁関係があるか、もしくはないヒト、非ヒト哺乳動物、細胞株または培養からＴ細胞を取得してよい。
【０１５６】
ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび／または該ポリペプチドを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）でＴ細胞を刺激することができる。そのような刺激は、該融合ポリペプチドに特異的なＴ細胞の生成を可能にするために十分な条件下かつ時間で実施される。該ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、特異的なＴ細胞の生成を促進するために、送達ビヒクル、例えばミクロスフェア内で提供することができる。
【０１５７】
Ｔ細胞がＨＥＲ−２／ｎｅｕ融合ポリペプチドに特異的であると見なされるのは、該Ｔ細胞が、該融合ポリペプチドでコーティングされた標的細胞または該融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する標的細胞を死滅させる場合である。Ｔ細胞の特異性は種々の標準的技術のいずれかを使用して評価することができる。例えば、クロム放出アッセイまたは増殖アッセイでは、溶解および／または増殖が陰性対照と比較して２倍以上に増大していることを示す刺激指数によってＴ細胞の特異性が示される。そのようなアッセイは、例えばChen et al. (1994) Cancer Res. 54:1065-1070に記載のように実施してよい。あるいは、種々の公知技術によってＴ細胞増殖の検出を達成することができる。例えば、ＤＮＡ合成の割合の増加を測定することによって（例えばトリチウム化チミジンを用いてＴ細胞をパルス標識培養し、ＤＮＡに取り込まれたトリチウム化チミジンの量を測定することによって）、Ｔ細胞増殖を検出することができる。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ融合ポリペプチド（１００ｎｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ、例えば２００ｎｇ／ｍＬ〜２５μｇ／ｍＬ）と３〜７日間接触させると、その結果、Ｔ細胞の増殖が少なくとも２倍増加するはずである。２〜３時間の上記接触の結果、Ｔ細胞が活性化されるはずであり、これは標準的サイトカインアッセイを使用して測定される。その場合、サイトカイン放出（例えばＴＮＦまたはＩＦＮγ）のレベルの２倍の増大がＴ細胞の活性化を示す（Coligan et al., Current Protocols in Immunology, vol. 1, Wiley Interscience (Greene 1998)を参照のこと）。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ融合ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは融合ポリペプチド発現ＡＰＣに応答して活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋であってよい。標準的技術を使用してＨＥＲ−２／ｎｅｕ特異的Ｔ細胞を増殖させることができる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は患者から取得されるか、あるいは血縁関係があるかまたはないドナーから取得され、刺激および増殖後に該患者に投与される。
【０１５８】
治療目的では、ＨＥＲ−２／ｎｅｕポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはＡＰＣに応答して増殖するＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞の数をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで増大させることができる。そのようなＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖は種々の様式で達成することができる。例えば、Ｔ細胞をＨＥＲ−２／ｎｅｕポリペプチドに再曝露することができ、その場合、Ｔ細胞成長因子、例えばインターロイキン−２、および／または、ＨＥＲ−２／ｎｅｕポリペプチドを合成する刺激細胞（stimulator cell）を加えるか、あるいは加えない。あるいは、ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質の存在下で増殖する１種以上のＴ細胞の数をクローニングによって増大させることができる。細胞をクローニングするための方法は当技術分野において周知であり、それには限界希釈が含まれる。増殖後、例えばChang et al. (1996) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 22:213に記載のように、該細胞を該患者に投与して戻してよい。
【０１５９】
樹状細胞
本発明の成分（ｂ）は、本明細書中に記載のポリペプチドまたは融合タンパク質に特異的な樹状細胞（ＤＣ）を、さらに、あるいは代替的に含んでよい。そのような細胞は、一般に、標準的手順を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで調製することができる。使用することができる方法の例はＷＯ０１／７４８５５に記載されている。該文献は参照により本明細書中に組み入れられる。
【０１６０】
一実施形態では、本発明の方法および使用における哺乳動物はヒトである。
【０１６１】
成分（ａ）の製造方法の例
式（Ｉ）の化合物の遊離塩基、ＨＣｌ塩、およびジトシラート塩は、以下の文献の手順にしたがって、ならびに以下に列挙される適切な実施例にしたがって調製することができる：１９９９年１月８日に出願され、１９９９年７月１５日にＷＯ９９／３５１４６として公開された上記参照の国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９９／０００４８号および２００１年６月２８日に出願され、２００２年１月１０日にＷＯ０２／０２５５２として公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／２０７０６号。式（Ｉ）の化合物のジトシラート塩を調製するための該手順の１つを以下のスキーム１に提供する。
【０１６２】
スキーム１
【化６】
2008523017.tif 000011
【０１６３】
スキーム１では、式（ＩＩＩ）の化合物のジトシラート塩の調製は４ステージで進行する：ステージ１：上記の二環式化合物およびアミンを反応させて、上記のヨウ化キナゾリン誘導体を得るステージ；ステージ２：対応するアルデヒド塩を調製するステージ；ステージ３：キナゾリンジトシラート塩を調製するステージ；およびステージ４：一水和物のジトシラート塩を調製するステージ。
【０１６４】
成分（ｂ）の融合タンパク質についての製造方法の例はＷＯ００／４４８９９（ＵＳ２００２／０１７７５６７）に記載されている。
【０１６５】
本発明の方法、使用、配合物および組成物は、癌、例えば乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌または前立腺癌に罹患している患者に対する投与に有用であろう。一実施形態では、癌はｅｒｂＢ２過剰発現癌、例えばｅｒｂＢ２過剰発現乳癌である。本明細書中で使用される「癌を治療する」とは、被験体が治癒することを必要としない。当業者には明らかであるように、癌が治療される場合の臨床転帰の成功には、生存期間の延長、疾患進行までの期間延長、部分的応答、ならびに癌の寛解が含まれる。
【０１６６】
バイオマーカーとしてのＳｕｒｖｉｖｉｎの使用
本明細書中で提供される結果は、併用療法（二重ＥＧＦＲ／ｅｒｂＢ２インヒビター、例えばラパチニブおよびワクチン誘発抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体を使用）後の、ｅｒｂＢ２過剰発現癌細胞における腫瘍細胞のアポトーシスの増加が、ＭＡＰＫ−Ｅｒｋ１／２またはＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路のダウンレギュレーションよりもＳｕｒｖｉｖｉｎタンパク質のダウンレギュレーションに密接に関連していたことを示す。この結果は、該併用療法の使用および該併用療法の効力に関するバイオマーカーとしてのＳｕｒｖｉｖｉｎレベルの使用に関する生物学的な理論的根拠を提供する。
【０１６７】
Ｓｕｒｖｉｖｉｎはアポトーシスファミリーのタンパク質のインヒビター（ＩＡＰ）のメンバーである。Ｓｕｒｖｉｖｉｎタンパク質の発現は、ラパチニブ単独で処理されたＢＴ４７４細胞において阻害され（図１２Ａ、下段）；対照的に、ｐＡｂまたはトラスツズマブはＳｕｒｖｉｖｉｎに対してほとんど効果を有しなかった（図１２Ａ、下段）。ラパチニブとｐＡｂまたはトラスツズマブを併用すると、ＢＴ４７４細胞において高い程度（図１２Ａ、下段）にＳｕｒｖｉｖｉｎが阻害された。同様に、ラパチニブ単独と比較して、併用のラパチニブおよびｐＡｂまたはトラスツズマブで処理されたＢＴ４７４細胞においてアポトーシスが増加した（図１２Ａ、上段）。本明細書中で提供される、ＳＫＢＲ３細胞を使用した結果では、ＢＴ４７４細胞においてよりは低い程度にではあるが、併用療法後のＳｕｒｖｉｖｉｎの阻害とアポトーシスの増加の間の同様の関連性が示される（図１６および図１７）。
【０１６８】
ゆえに、本結果は、ラパチニブおよび抗ＥｒｂＢ２抗体の組み合わせに応答するＳｕｒｖｉｖｉｎのダウンレギュレーションが（ｐＥｒｋ１／２またはｐＡｋｔのダウンレギュレーションと比較して）アポトーシスの増加と相関していることを示す。本実施例では、Ｓｕｒｖｉｖｉｎタンパク質が最も阻害された処理条件（ｐＡｂまたはトラスツズマブと併用のラパチニブ）で顕著な腫瘍細胞のアポトーシスが生じた。
【０１６９】
ゆえに、本発明の別の実施形態は、二重ＥＧＦＲ／ｅｒｂＢ２キナーゼインヒビター、例えば本明細書中に記載の成分（ａ）の化合物での癌の治療におけるバイオマーカーとしてのＳｕｒｖｉｖｉｎの使用に関する。
【０１７０】
二重ＥＧＦＲ／ｅｒｂＢ２チロシンキナーゼインヒビターでの治療に応答する腫瘍組織における種々の具体的なタンパク質のレベルの変化は、患者の腫瘍が該治療に応答しているかどうかを評価する際に有用であると示唆されている。例えばＷＯ２００５／０１７４９３；ＷＯ２００４／００００９４を参照のこと。本結果は、ｅｒｂＢ２過剰発現腫瘍細胞または組織におけるＳｕｒｖｉｖｉｎレベルを使用して、該腫瘍を有する患者が、本明細書中に記載の二重ＥＧＦＲ／ｅｒｂＢ２チロシンキナーゼインヒビターでの治療または本明細書中に記載の成分（ａ）および（ｂ）の組み合わせでの治療に好都合に反応する可能性を予測することができることを示す。初期の治療後に腫瘍細胞が低下レベル（治療前レベルと比較して低下している）のＳｕｒｖｉｖｉｎを有する被験体は、初期の治療後に腫瘍細胞中に不変または増加レベルのＳｕｒｖｉｖｉｎを有する被験体より、該治療に対して好都合な臨床応答を有する可能性が高い。対照的に、初期の治療後に不変または増加レベルのＳｕｒｖｉｖｉｎを有する被験体は好都合な臨床応答を有する可能性が低く、代替の治療から恩恵を受けるかもしれない。
【０１７１】
Ｓｕｒｖｉｖｉｎは、当技術分野において公知であるように任意の好適な手段によって測定してよい。本明細書中で使用される被験体または患者とは、ｅｒｂＢ２を過剰発現する固形腫瘍を患う哺乳動物を表し、それにはヒトが含まれる。本明細書中で使用される、治療に対する「好都合な臨床応答」とは、いかなる治療も存在しない条件下で生じる腫瘍成長と比較して、腫瘍成長の割合の低下を示すことが当業者によって認識される生物学的または身体的応答を表し；それは治癒を示すことを意図するものではない。治療前の生物学的に関連する期間内にＳｕｒｖｉｖｉｎの治療前レベルが評価される。それは、好ましくは治療前の１か月、２週間、１０日、または１週間以内である。初期治療期間が経過した後、該腫瘍組織におけるＳｕｒｖｉｖｉｎレベルが再評価される。
【実施例】
【０１７２】
以後、以下の非限定的な実施例を参照して、本発明をさらに説明する。
【０１７３】
実施例１
導入
以下の実施例によって示されるように、組換えｄＨＥＲ２タンパク質を用いて動物にワクチン接種すると、該ＨＥＲ２／ｎｅｕ分子に特異的なポリクローナル抗体応答が誘発された。
【０１７４】
本明細書中に記載の実験では、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいて該ポリクローナル抗体がＨＥＲ２過剰発現細胞の増殖を阻害することが示されている。
【０１７５】
本明細書中で提供される実施例では、ＨＥＲ２／ｎｅｕ分子を過剰発現しているヒト乳癌細胞（ＢＴ４７４およびＳＫＢＲ３）に対する、ＨＥＲ２／ｎｅｕ分子およびＥＧＦＲ分子の両者に特異的なチロシンキナーゼインヒビターであるラパチニブとの併用での、前記ワクチンによって生成された抗ＨＥＲ２ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）の抗増殖性効果を評価した。
【０１７６】
実施例２
方法および材料
ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質をコードする発現プラスミドの構築
組換えＨｅｒ２／ｎｅｕ糖タンパク質を産生する安定なＣＨＯ−Ｋ１細胞株が樹立されている。該タンパク質は細胞培養培地中に分泌され、次いで、該培地からそれを精製する。
【０１７７】
簡潔に言えば、乳房腫瘍サンプルから調製されたｍＲＮＡから出発して、ＨＥＲ２／ｎｅｕ分子の細胞外ドメイン（ＥＣＤ：ＡＡ１−６５３）に相当するｃＤＮＡおよび細胞内ドメイン（ＩＣＤ：ＡＡ９９１−１２５５）のリン酸化領域（ＰＤ）に相当するｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ（Clontech）によって増幅した。次いで該２種のｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１ハイグロマイシンベクター中にライゲーションしてクローニングし、ＨｉｎｄＩＩ−ＸｂａＩ制限断片（２７８２ｂｐ長）をＣＨＯ  Ｋ１グルタミンシンターゼ発現ベクター（ｐＥＥ１４ Ｉ Celltech）中にクローニングした。このプラスミドをｐＥＥ１４−ＥＣＤ−ＰＤ＃１３と称し、またはｐＲＩＴ１５０５０と称し、従来のＣａＰＯ４共沈法を使用したＣＨＯ−Ｋ１細胞（Lonza's MCB 024M由来）の安定なトランスフェクションに使用した。グルタミンを含まず、５％ウシ胎児血清（New Zealand）、グルタミン酸、アスパラギン、ヌクレオシドおよび３０μＭ ＭＳＸ（選択的試薬として）を添加したＧＭＥＭ（Glasgow最少イーグル培地）中で、トランスフェクトしたクローンを選択した。１クローン（＃１３００２）をその発現レベルに基づいて選択した。組換え発現タンパク質は、トランケート型のＨＥＲ２／ｎｅｕ増殖因子受容体であり、それは細胞外ドメイン（ＥＣＤ）および細胞内ドメイン（ＩＣＤ）のＣ末端リン酸化部分（ＰＤ）の融合物からなり、該受容体の膜貫通部分およびホスホキナーゼ部分は排除されている。この組換えｄＨＥＲ２タンパク質はＣＨＯＫ１細胞から効率的に分泌され、それを細胞培養上清から精製する。
【０１７８】
実施例３
ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質の精製（ｄＨＥＲ２）
該培養回収物をアニオン交換Q Sepharose FFカラム（Amersham）でのクロマトグラフィーによる分離に付した。該カラムは１５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含有する２０ｍＭビス−トリスプロパンバッファーｐＨ６．５中で平衡化した。同平衡化バッファー中のＮａＣｌの濃度を増加させることによって該カラムから抗原を溶出させた。リン酸を加えた後、抗原陽性の溶出物を２連続のアフィニティーカラムに通した。該カラムは、４０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０中で平衡化された１本のMacro-Prep Ceramic Hydroxyapatite type I カラム（Bio-Rad）、それに続く、１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０で平衡化された１本のBlue Trisacryl plus LS カラム（Biosepra）であった。硫酸アンモニウム（ＡＭＳ）を加え、ｐＨを調整（７．０）した後、該抗原を含有するBlue Trisacrylフロースルーを、１．２Ｍ ＡＭＳを含有する１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０中で平衡化された疎水性Ether Toyopearl 650 M カラム（TosoHaas）に注入した。同リン酸バッファー中のＡＭＳの濃度を低下させることによって該カラムから抗原を溶出させた。抗原陽性の溶出物を濃縮し、次いでBiomax 10 kDaメンブレン（Millipore）で５ｍＭリン酸最終バッファーｐＨ７．０に対してダイアフィルトレーションした。限外濾過の残留物をナノフィルトレーションステップ（Planova 15 Nメンブレン, Asahi）に付し、次いで得られた透過物を０．２２μｍ Duraporeメンブレン（Millipore）に通して滅菌濾過した。精製済み材料を−２０℃で保存した。
【０１７９】
実施例４
ワクチンまたは免疫原性組成物
本実施例で使用される免疫原性組成物は、５００μｇ ＣｐＧオリゴヌクレオチド2006（ODN 7909としても知られる）（Coley Pharmaceutical）と混合された５０μｇ ３Ｄ−ＭＰＬ（Corixa, Seattle, WA, USA）、５０μｇ ＱＳ２１（Antigenics, New York, NY, USA）のリポソーム製剤を含むGSK Bioの専売アジュバント系を用いて、即席で、あるいは注射の前日に製剤化したＥＣＤ−ＰＤ（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの「欠失」構築物、または「ｄＨＥＲ２」として知られる）タンパク質を含むものであった。
【０１８０】
実施例５
細胞株および試薬
ＢＴ４７４およびＳＫＢＲ３細胞をAmerican Type Culture Collection（Manassas, VA, USA）から入手し、１０％ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ中で培養した。
【０１８１】
抗ヒトＳｕｒｖｉｖｉｎ抗体はRD System（Minneapolis, MN, USA）から入手した。抗マウスＩｇＧはRockland（Gilbertsville, PA, USA）から入手した。ホスホチロシンおよびアクチンに対する抗体はSigma-Aldrich（St Louis, MO, USA）から購入した。抗ＥｒｂＢ１（Ab-12）および抗ＥｒｂＢ２（Ab-11）抗体はNeo Markers（Union City, CA, USA）から入手した。抗ホスホＡＫＴ（Ser 437）はCell Signaling Technology, Inc.（Beverly, MA, USA）から入手した。抗Ａｋｔ１／２、抗ホスホＥｒｋ１／２、抗Ｅｒｋ１および抗Ｅｒｋ２抗体はSanta Cruz Biotechnology, Inc.（Santa Cruz, CA USA）から購入した。トラスツズマブはGenentech Inc.（South San Francisco, CA, USA）から購入した。Guava PCA 96 NesinキットはGuava Technologies Inc.（Hayward, CA, USA）から購入した。SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity SubstrateはPierce（Rockford, IL, USA）から入手した。プロテインＧアガロースはBoehringer Mannheim（Germany）から購入した。GW572016（ラパチニブ）は、報告されているように合成した（Cockerill et al.,Bioorg Med. Chem. Lett, 11:1401-1405 (2001)）。細胞培養実験用のラパチニブはＤＭＳＯに溶解させた（Xia et al., Oncogene 21:6255-63 (2002)）。
【０１８２】
実施例６
動物
アジュバント中のｄＨＥＲ２タンパク質を用いてワクチン接種されたメスのニュージーランド系統白色ウサギを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖阻害実験用の血清の供給源として使用した。簡潔に言えば、実施例４に記載のようにリポソームアジュバント系中に製剤化された１００μｇのｄＨＥＲ２タンパク質を用いて、３週間間隔で該ウサギの筋肉内にワクチン接種した。１６１日目に追加免疫注射を行い、１４日後に血清を採取した。プロテインＡセファロースで血清のＩｇＧフラクションを精製し、１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
【０１８３】
ＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ３と比べてのＥｒｂＢ２に関するｐＡｂの選択性を、ＢＴ４７４細胞における免疫沈降およびウエスタンブロット解析によって実証した（データは示していない）。トラスツズマブ等のモノクローナル抗体と比較して、ポリクローナル抗体は、標的免疫原の複数のエピトープに対する結合親和性のスペクトルによって特徴付けられる。
【０１８４】
実施例７
アポトーシスの評価：アネキシンＶ染色およびフローサイトメトリー
アネキシンＶ染色およびフローサイトメトリーを使用して評価される対象の細胞を、６ウェルプレート中で、図１２Ａ、図１２Ｃ、図１５Ａおよび図１６の説明に記載された濃度のＤＭＳＯ、ラパチニブ、ｐＡｂ、あらかじめ免疫化されたウサギ由来の血清（本明細書中で「ｐＡＢプレ免疫」またはＴＡ２０２１と称される）、トラスツズマブ、および／またはゲフィチニブで処理した。トリプシン−ＥＤＴＡを用いて細胞を回収した後、５０μＬ中の５０００細胞を９６ウェルマイクロプレート上にサンプリングした。該マイクロプレート中で、２００μＬの最終反応容量中の１×ネキシンバッファー中のアネキシンＶ−ＰＥおよびネキシン７−ＡＡＤを用いて、該細胞を直接的に染色した。室温で２０分間インキュベートした後、該反応サンプルはGuava PCA-96システム（Guava Technology, Inc., Hayward, CA USA）においてデータ取得できるものとなった。
【０１８５】
７−ＡＡＤは、後期アポトーシスにおいて細胞膜が崩壊した後に細胞の核物質に結合する。アネキシンＶ染色では、細胞膜の完全性の喪失に先行する初期のアポトーシス変化が示される。ゆえに７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）と併用のアネキシンＶの使用により、初期および後期のアポトーシス細胞の両者を特定することができる。
【０１８６】
フローサイトメトリーの結果をドットプロットの結果（データは示していない）としてグラフで示した。その場合、アネキシンＶをＸ軸にとり、７−ＡＡＤをＹ軸にとった。低アネキシンＶおよび低７−ＡＡＤは生存細胞を表し；低アネキシンＶおよび高７−ＡＡＤは核の細片を示し；高アネキシンＶ染色を伴う細胞はアポトーシス細胞を示した。図１２Ａ、図１２Ｃ、図１５Ａ、および図１６において提供されるグラフは、細胞全体と比較したアポトーシス細胞（高アネキシンＶ）のパーセンテージを示す。
【０１８７】
実施例８
細胞のタンパク質レベル：ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析
細胞中の種々のタンパク質のレベルを評価するために、細胞をペトリ皿からかき取り、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で該細胞ペレットを２回洗浄し、次いで２倍の細胞容量（two-packed-cell volumes）のＲＩＰＡバッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．２５％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸、１％ ＮＰ−４０、５ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、２ｍＭフッ化ナトリウム、およびプロテアーゼインヒビターカクテル）に該ペレットを再懸濁することによって、全細胞抽出物を調製した。Bradford法の変法（Bio-Rad Laboratory）を使用してタンパク質濃度を測定した。該細胞ライセートを遠心分離によって清澄化し；３μｇの抗ＥｒｂＢ１（Ab-13, NeoMarkers）、抗ＥｒｂＢ２（Ab-11, NeoMarkers）、抗ＥｒｂＢ３（C-17, Santa Cruz Biotechnology）抗体、または５μｇのｐＡｂおよび２０μＬのプロテインＡ＋Ｇセファロースを用いて、２００μｇの該ライセートからＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３を別々に免疫沈降した。４〜１５％勾配のＳＤＳ−ポリアクリルアミドアガロースゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって該免疫沈降物を分離し、抗ＥｒｂＢ受容体抗体を用いたウエスタンブロットによってＥｒｂＢ受容体を検出した。
【０１８８】
Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、トータルＥｒｂＢ２、リン酸化ＥｒｂＢ２（ｐＥｒｂＢ２またはｐＴｙｒ）、トータルＥｒｋ１／２、活性化型Ｅｒｋ１／２（ｐ−Ｅｒｋ）、トータルｐＥｒｂＢ３、活性化型ｐＥｒｂＢ３（ｐＥｒｂＢ３）、トータルＡＫＴタンパク質および活性化型Ａｋｔ（ｐ−Ａｋｔ）タンパク質の定常状態レベルをウエスタンブロットによって評価した。複数のチロシンがリン酸化された型のＥｒｂＢ２に結合する抗体（すなわち該抗体はリン酸化部位特異的でない）を使用してｐＥｒｂＢ２のレベルを評価した。アクチン定常状態タンパク質レベルは、等しいタンパク質ロード量に関する対照として用いた。
【０１８９】
ウエスタンブロットでは、７．５％または４〜１５％勾配のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって還元条件下で等量のタンパク質を分離させた。タンパク質をImmobilon-Pまたはニトロセルロースメンブレンにトランスファーした。効率およびタンパク質の等しいロード量をポンソーＳ染色によって評価した。４％（ｗ／ｖ）低脂肪乳または３％ ＢＳＡ（ｗ／ｖ）を含有するＴＢＳ（２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ）中で１時間、メンブレンをブロッキングした。次いで、標的タンパク質を認識する特異的抗体を用いてメンブレンをプローブし、SuperSignal West Femto Maximum 感度基質キット（Pierce）またはOdyssey Infrared Imaging System（LI-COR, Lincoln, NE USA）を用いてそれを可視化した。
【０１９０】
実施例９
ｉｎ ｖｉｔｒｏ成長阻害アッセイ（抗増殖）
ラパチニブとの併用でのワクチン誘発抗ＨＥＲ２ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）の抗増殖性効果を、［３Ｈ］チミジン取り込み法を使用して、該ＨＥＲ２／ｎｅｕ分子を過剰発現しているヒト乳癌細胞（ＢＴ４７４およびＳＫＢＲ３細胞）で評価した。簡潔に言えば、９６ウェルプレートにおいて、２００μＬ中に１０ｅ４細胞を３通りで播種し、以下の培地中で３７℃で７２時間インキュベートした：
１）培地；
２）ラパチニブ単独（０．０１μＭ）を含有する培地；
３）ｐＡｂ単独（５０μｇ／ｍＬ）を含有する培地；
４）プレ免疫ｐＡｂ（ＴＡ２０２１）（５０μｇ／ｍＬ）を含有する培地；
５）（２）ラパチニブ（０．０１μＭ）および（３）ｐＡｂ（５０μｇ／ｍＬ）の組み合わせ；または
６）（２）ラパチニブ（０．０１μＭ）および（４）プレ免疫ｐＡｂ（ＴＡ２０２１）（５０μｇ／ｍＬ）の組み合わせ。
【０１９１】
次の２４時間、１μＣｉの［３Ｈ］チミジン（５Ｃｉ／ｍｍｏｌ; Amersham）を加え、その後、トリプシン処理によってフィルタープレート上に細胞を回収し、取り込まれた放射能をβ線カウンター（beta counter）でカウントした。結果をｃｐｍで表し、該培地に関して増殖阻害のパーセンテージを算出した。
【０１９２】
ラパチニブおよびｐＡｂの両者に関して用量範囲曲線を作成した（データは示していない）。考えられる相加効果または相乗効果を調べることができるように、１０〜３０％の増殖阻害しか誘発しない各成分の最適以下の用量を選択した。
【０１９３】
非ワクチン接種ウサギから精製されたＩｇＧ（ｐＡｂ ｐｒｅ−ｉｍｍ）を前記アッセイの陰性対照として使用した。
【０１９４】
本実験を独立して少なくとも３回実施し、代表的な１回の実験の３通りのウェルに関するデータをまとめて、図１１Ａおよび図１１Ｂに提供する。
【０１９５】
実施例１０
結果：抗増殖効果
強力なアジュバント中に製剤化された組換えｄＨＥＲ２タンパク質を用いてウサギにワクチン接種すると、ＨＥＲ２／ｎｅｕ分子に特異的なポリクローナル抗体応答が誘発された。
【０１９６】
ＨＥＲ２／ｎｅｕ分子を過剰発現しているヒト乳癌細胞（ＢＴ４７４およびＳＫＢＲ３）に対する、ＨＥＲ２／ｎｅｕ分子およびＥＧＦＲ分子の両者に特異的なチロシンキナーゼインヒビターであるラパチニブとの併用での、前記抗ＨＥＲ２ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）の抗増殖性効果を評価した。データを図１１Ａおよび図１１Ｂに示す。
【０１９７】
実施例１１
結果（アポトーシスおよびタンパク質レベル）
図１２Ａ、図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１３、図１４、図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ、図１６および図１７に示されるすべての結果は少なくとも３回の独立の実験を代表するものである。
【０１９８】
図１２Ａ、ＢおよびＣに見られるように、ラパチニブおよびワクチン誘発抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗体（ｐＡｂ）は協働してＥｒｂＢ２（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ）過剰発現ＢＴ４７４細胞のアポトーシスを誘発する。
【０１９９】
図１２Ａは、指数増殖中のＢＴ４７４を以下のもので処理した場合の結果を示す：（ｉ）ＤＭＳＯ単独（ラパチニブに関する陰性対照）、（ｉｉ）ラパチニブ（０．１μＭ）、（ｉｉｉ）ｐＡｂ（１００μｇ／ｍＬ）、（ｉｖ）ラパチニブおよびｐＡｂ、（ｖ）ＴＡ２０２１（１００μｇ／ｍＬ）、（ｖｉ）ラパチニブおよびＴＡ２０２１、（ｖｉｉ）トラスツズマブ（１０μｇ／ｍＬ）、または（ｖｉｉｉ）ラパチニブおよびトラスツズマブ。７２時間後、アネキシンＶ染色およびフローサイトメトリーを使用してアポトーシスを評価した。７２時間後、ウエスタンブロットを使用して、活性化型ホスホＥｒｂＢ２（ｐ−ＥｒｂＢ２）、トータルＥｒｂＢ２、およびＳｕｒｖｉｖｉｎの定常状態タンパク質レベルをさらに評価した（図１２Ａ、下段パネル）。アクチン定常状態タンパク質レベルは、等しいタンパク質ロード量に関する対照として用いた。ビヒクル（ＤＭＳＯ）またはＴＡ２０２１で処理されたＢＴ４７４細胞は、それぞれラパチニブおよびｐＡｂに関する対照として用いた。
【０２００】
図１２Ｂは、位相差顕微鏡検査を使用して、ＢＴ４７４細胞増殖に対する種々の処理条件の効果（７２時間後）を示す。処理条件には、図１２Ａに関して記載される条件、およびそれに加えて、ゲフィチニブ（イレッサ）（０．１μＭ）；ゲフィチニブ（０．１μＭ）およびｐＡＢ（１００μｇ／ｍＬ）；ゲフィチニブ（０．１μＭ）とＴＡ２０２１（１００μｇ／ｍＬ）；およびゲフィチニブ０．１μＭとトラスツズマブ（１０μｇ／ｍＬ）が含まれた。
【０２０１】
図１２Ｃは、アネキシンＶ染色およびフローサイトメトリーを使用して、ＢＴ４７４細胞のアポトーシスに対する、単独またはラパチニブ（１００ｎＭ）との併用での漸増濃度のｐＡｂの効果を示す。
【０２０２】
図１２Ｄは、単独またはラパチニブ（１００ｎＭ）との併用での漸増量のｐＡｂという条件で処理された細胞における、トータルＥｒｂＢ２およびｐ−ＥｒｂＢ２の定常状態タンパク質レベルを示す。そのレベルはウエスタンブロットによって評価されたものである。アクチンの定常状態タンパク質レベルは、等しいタンパク質ロード量に関する対照として用いた。
【０２０３】
図１３は、Ｅｒｋ１／２およびＡｋｔの活性化状態がラパチニブおよびワクチン誘発抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗体（ｐＡｂ）に応答してモジュレートされることを示す。指数増殖中のＢＴ４７４細胞を、記載の処理条件下で７２時間培養した。トータルＥｒｋ１／２、活性化型ホスホＥｒｋ１／２、トータルＡｋｔ、および活性化型ホスホＡｋｔの定常状態タンパク質レベルをウエスタンブロットによって評価した。ビヒクル（ＤＭＳＯ）またはＴＡ２０２１単独で処理された細胞は対照として用いた。
【０２０４】
図１４は、ＥｒｂＢ３の活性化状態に対する、ラパチニブおよびワクチン誘発抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗体（ｐＡｂ）の効果を示す。ＢＴ４７４細胞を図中に示された種々の処理条件下で培養した。７２時間後、細胞ライセートを回収し、トータルＥｒｂＢ３および活性化型ホスホＥｒｂＢ３の定常状態タンパク質レベルをウエスタンブロットによって評価した。
【０２０５】
図１５は、ワクチン誘発抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗体（ｐＡｂ）と協働してＢＴ４７４細胞のアポトーシスを誘発し、かつＳｕｒｖｉｖｉｎをモジュレートするその能力に関する、ラパチニブとゲフィチニブとの間の差異を示す。ゲフィチニブ（イレッサまたはｚｄ１８３９）はＥＧＦＲタンパク質チロシンキナーゼのインヒビターである。
【０２０６】
図１５Ａは、図中に示された処理条件下で７２時間培養された、指数増殖期のＢＴ４７４細胞を使用した結果を示す。アネキシンＶ染色およびフローサイトメトリーを使用してアポトーシスを評価した。
【０２０７】
図１５Ｂは、図中に示された処理条件下で培養されたＢＴ４７４細胞における、７２時間後の、トータルＥｒｂＢ２、ｐ−ＥｒｂＢ２、およびＳｕｒｖｉｖｉｎの定常状態タンパク質レベルのウエスタンブロット解析の結果を示す。
【０２０８】
図１５Ｃは、ＢＴ４７４細胞における、トータルＥｒｋ１／２、ｐ−Ｅｒｋ１／２、トータルＡｋｔ、およびｐ−Ａｋｔの定常状態タンパク質レベルに対する、図中に示された処理条件の効果を示す。その効果は、処理の７２時間後にウエスタンブロットによって評価されたものである。
【０２０９】
図１６は、ＳＫＢＲ３細胞に対する図中に示された処理条件の効果を示す。７２時間後、アネキシンＶ染色およびフローサイトメトリーを使用してアポトーシスを評価した。
【０２１０】
図１７は、ＳＫＢＲ３細胞でのＳｕｒｖｉｖｉｎに対する図中に示された処理条件の処理７２時間後の効果を示す。
【０２１１】
図１８は、図中に示されたＳｋｂＲ３細胞のｐＴｙｒ／ＥｒｂＢ１２および下流バイオマーカーに対する、ラパチニブおよび抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体の効果を示す。
【０２１２】
上で記載した図において示されるように、ラパチニブ、ｐＡｂ、またはトラスツズマブでの単独療法としての処理は、対照（ＤＭＳＯ、ＴＡ２０２１）と比較してアポトーシスのわずかな増加しか生じなかった（図１２Ａ上段パネル）。ラパチニブをｐＡｂまたはトラスツズマブと組み合わせると、いずれの単独処理と比較しても腫瘍細胞のアポトーシスが増加した（図１２Ａ、上段パネル）。単独でｐＡｂの濃度を増加させても、アポトーシスに対してほとんど影響はなかった（図１２Ｃ）。固定濃度のラパチニブと組み合わせると、ｐＡｂの濃度を増加させることによってＢ４７４細胞のアポトーシスが増加した（図１２Ｃ）。同様に、ラパチニブをｐＡｂと組み合わせると、別のＥｒｂＢ２過剰発現乳癌細胞株であるＳＫＢＲ３細胞でもアポトーシスが増加したが、ＢＴ４７４細胞において観察される程度よりは低い程度であった（図１６）。
【０２１３】
上で記載した図において同様に示されるように、活性化型のリン酸化ＥｒｂＢ２タンパク質（ｐＥｒｂＢ２）の定常状態レベルがラパチニブ単独によって阻害され、トータルＥｒｂＢ２タンパク質には影響しなかった（図１２Ａ、下段パネル）。ラパチニブは、また、ｐＥｒｋ１／２およびｐＡｋｔの定常状態レベルを低下させた（図１３）。対照的に、ｐＡｂはトータルＥｒｂＢ２タンパク質を顕著に阻害し、リン酸化（活性化型）ＥｒｂＢ２には影響しなかった（図１２Ａ、下段パネル）。ホスホＥｒｋ１／２およびｐＡｋｔもまた、ｐＡｂによって顕著に阻害された（図１３）。本研究では、トラスツズマブは、ｐＡｂと比較して、トータルＥｒｂＢ２に対する低い効果しか有さなかったが、ｐＥｒｂＢ２をわずかに阻害した（図１２Ａ、下段パネル）。さらに、ｐＥｒｋ１／２およびｐＡｋｔもまた、トラスツズマブによって阻害されたが、ｐＡｂを用いて観察された阻害より低い程度であった（図１３）。ラパチニブをｐＡｂと組み合わせると、ラパチニブ単独と比較してｐＥｒｂＢ２がさらに阻害された（図１２Ａ、下段パネル）。ラパチニブとトラスツズマブの組み合わせは、ｐＥｒｂＢ２の定常状態タンパク質レベルを完全に阻害し（図１２Ａ、下段パネル）、さらにｐＥｒｋ１／２およびｐＡｋｔを阻害した。ｐＡｂの濃度を２０から１００〜２００μｇ／ｍＬに増加させても、トータルＥｒｂＢ２タンパク質の阻害は増加しなかったが、ｐＥｒｂＢ２の阻害は、特に高濃度のｐＡｂでは増加した。
【０２１４】
結論
図１１ＡおよびＢで示されるように、それぞれ５０μｇ／ｍＬのワクチン誘発抗ＨＥＲ２／ｎｅｕポリクローナル血清および０．０１μＭのラパチニブを使用しても、両細胞株に対する中程度の増殖阻害しか観察されなかった。
【０２１５】
ワクチン誘発抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体（ｐＡｂ）とラパチニブとを組み合わせると、単一薬剤での処理より顕著な増殖阻害がみられた。この組み合わせは、ＢＴ４７４およびＳＫＢＲ３ Ｈｅｒ２／ｎｅｕ過剰発現細胞株の両者に対する相乗的な（相加的を超える）増殖阻害効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【０２１６】
【図１−１】ヒトＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質の完全長アミノ酸配列（配列番号１２）を示す。
【図１−２】ヒトＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質の完全長アミノ酸配列（配列番号１２）を示す。
【図１−３】ヒトＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質の完全長アミノ酸配列（配列番号１２）を示す。
【図２−１】ラットＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質の完全長アミノ酸配列（配列番号１３）を示す。キナーゼドメインはアミノ酸７２１〜アミノ酸９９８の領域（両端を含む）にわたる。
【図２−２】ラットＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質の完全長アミノ酸配列（配列番号１３）を示す。キナーゼドメインはアミノ酸７２１〜アミノ酸９９８の領域（両端を含む）にわたる。
【図２−３】ラットＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質の完全長アミノ酸配列（配列番号１３）を示す。キナーゼドメインはアミノ酸７２１〜アミノ酸９９８の領域（両端を含む）にわたる。
【図３−１】細胞外ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。
【図３−２】細胞外ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。
【図４】ヒトＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質のリン酸化ドメイン（ＰＤ）のアミノ酸配列（配列番号１５）を示す。
【図５】ヒトＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質のリン酸化ドメインの部分（ΔＰＤ）のアミノ酸配列の例（配列番号１６）を示す。
【図６−１】ヒトＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）およびリン酸化ドメイン（ＰＤ）を含む融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１７）を示す。
【図６−２】ヒトＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）およびリン酸化ドメイン（ＰＤ）を含む融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１７）を示す。
【図７−１】ヒトＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）およびリン酸化ドメインの代表的な部分（ΔＰＤ）を含む融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１８）を示す。
【図７−２】ヒトＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）およびリン酸化ドメインの代表的な部分（ΔＰＤ）を含む融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１８）を示す。
【図８−１】ラットＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のアミノ酸配列（配列番号１９）を示す。
【図８−２】ラットＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のアミノ酸配列（配列番号１９）を示す。
【図９】ヒトＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質をコードするＤＮＡ分子の完全長ヌクレオチド配列（配列番号２０）を示す。
【図１０】ラットＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質をコードするＤＮＡ分子の完全長ヌクレオチド配列（配列番号２１）を示す。
【図１１Ａ】ＢＴ４７４ヒト乳癌細胞の増殖に対する、ラパチニブ（Lapatinib）と併用の抗ＨＥＲ２／ｎｅｕポリクローナル抗体の抗増殖効果を示す。
【図１１Ｂ】ＳＫＢＲ３ヒト乳癌細胞の増殖に対する、ラパチニブと併用の抗ＨＥＲ２／ｎｅｕポリクローナル抗体の抗増殖効果を示す。
【図１２Ａ】上段パネルは、指数増殖中のＢＴ４７４細胞をラパチニブ等で処理した結果を示す。下段パネルは、７２時間後に、ウエスタンブロットを使用して、活性化型ホスホＥｒｂＢ２（ｐ−ＥｒｂＢ２）、トータルＥｒｂＢ２、およびＳｕｒｖｉｖｉｎの定常状態タンパク質レベルをさらに評価した結果を示す。
【図１２Ｂ】位相差顕微鏡検査を使用して、ＢＴ４７４細胞増殖に対する図中に示された処理条件の効果（７２時間後）を示す。
【図１２Ｃ】アネキシンＶ染色およびフローサイトメトリーを使用して、ＢＴ４７４細胞のアポトーシスに対する、単独またはラパチニブ（１００ｎＭ）との併用での漸増濃度のｐＡｂの効果を示す。
【図１２Ｄ】単独またはラパチニブ（１００ｎＭ）との併用での漸増量のｐＡｂに応答する、トータルＥｒｂＢ２およびｐ−ＥｒｂＢ２の定常状態タンパク質レベルを示す。
【図１２Ｅ】図１２Ａと同様の結果を示す。
【図１３】Ｅｒｋ１／２およびＡｋｔの活性化状態がラパチニブおよびワクチン誘発抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗体（ｐＡｂ）に応答してモジュレートされることを示す。
【図１４】ＥｒｂＢ３の活性化状態に対する、ラパチニブおよびワクチン誘発抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗体（ｐＡｂ）の効果を示す。
【図１５Ａ】ＢＴ４７４細胞のアポトーシスに対する、図中に示された処理条件の効果を示す。
【図１５Ｂ】指定処理条件下で培養されたＢＴ４７４細胞における、７２時間後の、トータルＥｒｂＢ２、ｐ−ＥｒｂＢ２、およびＳｕｒｖｉｖｉｎの定常状態タンパク質レベルのウエスタンブロット解析を示す。
【図１５Ｃ】トータルＥｒｋ１／２、ｐ−Ｅｒｋ１／２、トータルＡｋｔ、およびｐ−Ａｋｔの定常状態タンパク質レベルに対する、図中に示された処理条件の効果を示す。
【図１６】ＳＫＢＲ３細胞をラパチニブ等で処理した場合のアポトーシス効果を示す。
【図１７】ＳＫＢＲ３細胞をラパチニブ等で７２時間処理した場合の、Ｓｕｒｖｉｖｉｎタンパク質に対する効果を示す。
【図１８】図中に示されたＳｋｂＲ３細胞のｐＴｙｒ／ＥｒｂＢ１２および下流バイオマーカーに対する、ラパチニブおよび抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体の効果を示す。
【図１−１】
2008523017.tif 000013
【図１−２】
2008523017.tif 000014
【図１−３】
2008523017.tif 000015
【図２−１】
2008523017.tif 000016
【図２−２】
2008523017.tif 000017
【図２−３】
2008523017.tif 000018
【図３−１】
2008523017.tif 000019
【図３−２】
2008523017.tif 000020
【図４】
2008523017.tif 000021
【図５】
2008523017.tif 000022
【図６−１】
2008523017.tif 000023
【図６−２】
2008523017.tif 000024
【図７−１】
2008523017.tif 000025
【図７−２】
2008523017.tif 000026
【図８−１】
2008523017.tif 000027
【図８−２】
2008523017.tif 000028
【図９】
2008523017.tif 000029
【図１０】
2008523017.tif 000030
【図１１Ａ】
2008523017.tif 000031
【図１１Ｂ】
2008523017.tif 000032
【図１２Ａ】
2008523017.tif 000033
【図１２Ｂ】
2008523017.tif 000034
【図１２Ｃ】
2008523017.tif 000035
【図１２Ｄ】
2008523017.tif 000036
【図１２Ｅ】
2008523017.tif 000037
【図１３】
2008523017.tif 000038
【図１４】
2008523017.tif 000039
【図１５Ａ】
2008523017.tif 000040
【図１５Ｂ】
2008523017.tif 000041
【図１５Ｃ】
2008523017.tif 000042
【図１６】
2008523017.tif 000043
【図１７】
2008523017.tif 000044
【図１８】
2008523017.tif 000045
【国際調査報告】
2008523017.tif 000046
2008523017.tif 000047
2008523017.tif 000048
2008523017.tif 000049
2008523017.tif 000050