(57)【要約】  本発明は、ベータセルリンを含むErbBリガンドの治療的使用に関する。治療的使用には、ErbBリガンドファミリー化合物を単独でまたは他の作用物質と一緒に、血糖レベルの減少、I型およびII型糖尿病、肥満、筋肉消耗疾患および心毒性の治療のために使用する方法が含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体での疾患の治療のためのErbBリガンドファミリーのポリペプチドおよび製薬上許容される担体を含む医薬組成物であって、被験体で筋細胞へのグルコースおよび/もしくはアミノ酸の取り込みを刺激し、筋細胞の生存を促進するかもしくは筋細胞のアポトーシスを抑制し、HbA1cを低減し、ユートロフィン発現を誘導し、基礎血糖レベルを低減し、または血糖レベルを急減させるのに少なくとも十分な量の前記ポリペプチドを含み、前記ポリペプチド量は従来技術の量とは異なる、前記組成物。
【請求項２】
前記量が0.25ml中100μg/ml、4ml中0.5mg/ml、2ml中1.0mg/ml、4ml中2.5mg/ml、2ml中5.0mg/ml、1リットル中0.5gまたは1リットル中2.5g以外である、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記ポリペプチドがベータセルリンを含む、請求項2に記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリペプチドがニューレグリン1である、請求項1に記載の組成物。
【請求項５】
被験体での疾患の治療のためのErbBリガンドファミリーのポリペプチドおよび製薬上許容される担体を含む医薬組成物であって、前記ポリペプチドが従来技術の量とは異なる量で存在する、前記組成物。
【請求項６】
前記ポリペプチドがベータセルリンを含む、請求項5に記載の組成物。
【請求項７】
前記量が0.25ml中100μg/ml、4ml中0.5mg/ml、2ml中1.0mg/ml、4ml中2.5mg/ml、2ml中5.0mg/ml、1リットル中0.5gまたは1リットル中2.5g以外である、請求項6に記載の組成物。
【請求項８】
前記ポリペプチドがニューレグリン1を含む、請求項5に記載の組成物。
【請求項９】
前記ポリペプチドがベータセルリン、ニューレグリン1(NRG1)、HB-EGF、EGF、TGF-アルファ(TGF-α)、エピレグリン、エピゲン、アンフィレグリン、またはこれらのいずれかの活性変異体もしくは断片を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが配列番号4〜6、11、13、18〜24、27〜81のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項9に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ポリペプチドがベータセルリンまたはその活性変異体もしくは断片を含む、請求項9に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ポリペプチドがニューレグリン1-アルファ(NRG1-アルファ)またはその活性変異体もしくは断片を含む、請求項9に記載の組成物。
【請求項１３】
前記筋細胞が骨格筋細胞または心筋細胞を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項１４】
前記疾患が急性高血糖症、糖尿病性ケトアシドーシス、糖尿病性昏睡または初期の糖尿病性ケトアシドーシスのいずれか1つまたは複数と関連する、請求項1に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ポリペプチドの量が低血糖症を誘導することなく被験体で血糖レベルを急減させるのに十分である、請求項1に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ポリペプチドの量が被験体で基礎グルコースレベルを低下させるのに十分である、請求項1に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ポリペプチドの量が被験体でHbA1cレベルを低下させるのに十分である、請求項1に記載の組成物。
【請求項１８】
被験体が急性病の状況である、請求項1に記載の組成物。
【請求項１９】
前記急性病の状況が緊急状況、集中治療状況、呼吸不全、腎不全または他の生命にかかわる病態のいずれか1つまたは複数を含む、請求項18に記載の組成物。
【請求項２０】
前記疾患が糖尿病を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項２１】
前記疾患がI型および/またはII型糖尿病を含む、請求項20に記載の組成物。
【請求項２２】
被験体に食事の前、間または後に投与される場合、前記ポリペプチドの量が血中グルコースを低下させるのに十分である、請求項1に記載の組成物。
【請求項２３】
前記疾患が筋障害を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項２４】
前記筋障害がジストロフィー、筋肉消耗、筋萎縮症またはサルコペニアを含む、請求項23に記載の組成物。
【請求項２５】
前記疾患が心血管障害を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項２６】
前記心血管障害が虚血性心疾患、うっ血性心不全、心筋梗塞または誘導心毒性を含む、請求項25に記載の組成物。
【請求項２７】
前記誘導心毒性がウイルス誘導心毒性または治療誘導心毒性を含む、請求項26に記載の組成物。
【請求項２８】
前記疾患が肥満症を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ポリペプチドの量が、被験体に投与すると該被験体でユートロフィン発現を誘導するのに十分である、請求項1に記載の組成物。
【請求項３０】
被験体で延長された半減期を与えるように修飾されたErbBリガンドポリペプチドを含む、持続性ErbBリガンドポリペプチド。
【請求項３１】
前記修飾がErbBリガンドを融合パートナーに連結することを含む、請求項30に記載の持続性ErbBリガンドポリペプチド。
【請求項３２】
前記融合パートナーが免疫グロブリンのフラグメントである、請求項31に記載の持続性ErbBリガンドポリペプチド。
【請求項３３】
前記免疫グロブリンのフラグメントがFcフラグメントを含む、請求項32に記載の持続性ErbBリガンドポリペプチド。
【請求項３４】
前記延長された半減期がErbBリガンドポリペプチド単独の半減期よりも少なくとも0.5時間、または1時間、または2時間、または3時間、または4時間、または5時間長いことを含む、請求項30に記載の持続性ErbBリガンドポリペプチド。
【請求項３５】
前記修飾がErbBリガンドをポリマー、他のポリペプチド、スクシニル基、アルブミン分子、オリゴマー化ドメインまたはこれらのいずれかの活性変異体もしくは断片と連結することを含む、請求項30に記載の持続性ErbBリガンドポリペプチド。
【請求項３６】
前記ポリマーがポリエチレングリコール(PEG)部分を含み、該PEGは恒久的にまたは可逆的にErbBリガンドと共有結合で結合する、請求項35に記載の持続性ポリペプチド。
【請求項３７】
前記ErbBリガンドがベータセルリン、ニューレグリン1(NRG1)、HB-EGF、EGF、TGF-アルファ(TGF-α)、エピレグリン、エピゲン、アンフィレグリン、またはこれらのいずれかの活性変異体もしくは断片を含む、請求項30に記載の持続性ポリペプチド。
【請求項３８】
前記ErbBリガンドがベータセルリンまたはその活性変異体もしくは断片を含む、請求項37に記載の持続性ポリペプチド。
【請求項３９】
ヒトまたは非ヒト動物への投与のための請求項1〜12、15〜17、22もしくは29のいずれか1項に記載の組成物、または請求項30〜38のいずれか1項に記載の持続性ポリペプチド、および説明書を含むキット。
【請求項４０】
組成物を保持するためのバイアルまたはカートリッジをさらに含む、請求項39に記載のキット。
【請求項４１】
前記バイアルまたはカートリッジが前記ポリペプチドを少なくとも約0.1mg〜少なくとも約400mg、任意選択で少なくとも約0.5mg〜少なくとも約300mg、さらに任意選択で少なくとも約1mg〜少なくとも約200mg、さらに任意選択で少なくとも約10mg〜少なくとも約100mgで含む、請求項40に記載のキット。
【請求項４２】
前記バイアルまたはカートリッジが少なくとも約1ml、任意選択で約2ml、さらに任意選択で約3ml、さらに任意選択で約4mlの量を含む、請求項40に記載のキット。
【請求項４３】
前記説明書が疾患の治療のために被験体で上昇した血糖レベルを急減させるための説明書を含む、請求項39に記載のキット。
【請求項４４】
少なくとも1つの第2の作用物質をさらに含み、該第2の作用物質は抗糖尿病薬である、請求項39に記載のキット。
【請求項４５】
前記説明書が疾患の治療のために被験体で筋肉消耗を抑制するかまたは筋肉質量を増加させるための説明書を含む、請求項39に記載のキット。
【請求項４６】
前記説明書が心臓病の治療のために被験体の心臓におけるグルコースまたはアミノ酸の取り込みを増加させるための説明書を含む、請求項39に記載のキット。
【請求項４７】
前記説明書が急性病の状況にある被験体を治療するための説明書を含む、請求項39に記載のキット。
【請求項４８】
前記説明書が肥満について被験体を治療するための説明書を含む、請求項39に記載のキット。
【請求項４９】
被験体での疾患の治療方法であって、該疾患には、被験体での筋細胞へのグルコースもしくはアミノ酸の取り込みの刺激、筋細胞のアポトーシスの促進もしくは抑制、ユートロフィン発現の誘導、筋肉消耗の抑制もしくは筋肉質量の増加、HbA1cの減少、インスリン投与と関連する低血糖症の減少、基礎血糖レベルの低下、または上昇した血糖レベルの急減が有益であり、
(a)請求項1〜12、15〜17、22、29のいずれか1項に記載の組成物、または請求項30〜33のいずれか1項に記載の組成物を含むキット、または請求項34〜42のいずれか1項に記載の持続性ポリペプチドを提供することと、
(b)前記有益を得るために被験体に前記組成物または持続性ポリペプチドの単回または多回の用量を投与することと、
を含む、前記方法。
【請求項５０】
前記組成物または持続性ポリペプチドを経口的に、皮下に、静脈内に、経皮的に、腹腔内に、吸入もしくは移植により、皮内に、筋肉内に、心臓内に、鼻腔内に、および/または直腸座剤により投与することを含む、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
前記各用量が少なくとも約0.01mg/kg〜少なくとも約5mg/kgの範囲、任意選択で少なくとも約0.1mg/kg〜少なくとも約2mg/kgの範囲、さらに任意選択で少なくとも0.2mg/kg〜少なくとも約1mg/kgの範囲、さらに任意選択で少なくとも約0.3mg/kg〜少なくとも約0.9mg/kgの範囲、さらに任意選択で少なくとも約0.4mg/kg〜少なくとも約0.8mg/kgの範囲、さらに任意選択で少なくとも約0.5mg/kg〜少なくとも約0.7mg/kgの範囲の量の前記ポリペプチドを含む、請求項49に記載の方法。
【請求項５２】
前記用量が皮下に投与される、請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
前記各用量が少なくとも約0.83μg/kg〜少なくとも約0.83mg/kgの範囲、任意選択で少なくとも約0.1mg/kg〜少なくとも約3mg/kgの範囲、さらに任意選択で少なくとも約8.3μg/kg〜少なくとも約0.25mg/kgの範囲の量の前記ポリペプチドを含む、請求項49に記載の方法。
【請求項５４】
前記用量が少なくとも約8.3μg/kg〜少なくとも約0.25mg/kgの範囲の量の前記ポリペプチドを含む、請求項53に記載の方法。
【請求項５５】
前記用量が全身に投与される、請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
前記用量が1mg/kgを超える前記ポリペプチドを含まない、請求項49に記載の方法。
【請求項５７】
前記疾患が上昇した血糖レベルを含む、請求項49に記載の方法。
【請求項５８】
前記疾患がI型またはII型糖尿病を含む、請求項57に記載の方法。
【請求項５９】
前記組成物または持続性ポリペプチドの1用量が食事時間に、またはおよそその時間に投与される、請求項57に記載の方法。
【請求項６０】
前記組成物または持続性ポリペプチドが少なくとも1日1回、または少なくとも1日2回、または少なくとも1日3回投与される、請求項57に記載の方法。
【請求項６１】
前記組成物または持続性ポリペプチドを投与する段階が食事の前もしくは後約120分、または約90分、または約60分、または約30分、または約15分、または約5分以内に、あるいは食事の間に該組成物を投与することを含む、請求項49に記載の方法。
【請求項６２】
前記有益が上昇した血糖レベルの急減を含む、請求項49に記載の方法。
【請求項６３】
前記急減は、約1分〜約120分以内に、任意選択で約2分〜約90分以内に、さらに任意選択で約3分〜約60分以内に、さらに任意選択で約4分〜約30分以内に、さらに任意選択で約5分〜約15分以内に達成される、請求項62に記載の方法。
【請求項６４】
(c)少なくとも1つの第2の作用物質を投与すること、
をさらに含み、該第2の作用物質は他の治療剤である、請求項49に記載の方法。
【請求項６５】
前記第2の作用物質が抗糖尿病薬を含む、請求項64に記載の方法。
【請求項６６】
前記組成物またはポリペプチドが血中グルコースの正常血糖レベルを生じさせるのに十分な用量で投与される、請求項57に記載の方法。
【請求項６７】
前記第2の作用物質が、経口的に、皮下に、静脈内に、経皮的に、腹腔内に、吸入により、移植により、皮内に、筋肉内に、心臓内に、鼻腔内に、および/または直腸座剤により投与される、請求項64または65に記載の方法。
【請求項６８】
前記第2の作用物質が前記組成物またはポリペプチドの前に、後に、またはそれと同時に投与される、請求項64または65に記載の方法。
【請求項６９】
前記第2の作用物質がメトホルミン、インスリン分泌促進物質、グルコシダーゼ阻害剤またはPPARアルファアゴニストを含む、請求項68に記載の方法。
【請求項７０】
前記インスリン分泌促進物質がスルホニル尿素またはメグリチニドを含む、請求項69に記載の方法。
【請求項７１】
前記第2の作用物質がインスリン、インスリン類似体、同時分泌因子、プラムリンチドまたはDPP4アンタゴニストを含む、請求項68に記載の方法。
【請求項７２】
前記第2の作用物質がグルカゴン様ペプチドを含む、請求項69に記載の方法。
【請求項７３】
前記グルカゴン様ペプチドがエキセナチドを含む、請求項65に記載の方法。
【請求項７４】
前記疾患が糖尿病性筋萎縮症もしくは他の代謝ミオパシーと関連する筋肉消耗、悪液質、AIDS性消耗、非活動性萎縮、サルコペニアまたは筋ジストロフィーを含む、請求項49に記載の方法。
【請求項７５】
心臓病の治療のために被験体の心臓におけるグルコースまたはアミノ酸の取り込みを増加させることを含む、請求項49に記載の方法。
【請求項７６】
前記心臓病が虚血、うっ血性心不全または誘導心臓病を含む、請求項75に記載の方法。
【請求項７７】
前記誘導心臓病が療法と関連する誘導された悪影響を含む、請求項76に記載の方法。
【請求項７８】
前記療法が化学療法を含む、請求項77に記載の方法。
【請求項７９】
前記誘導心臓病が誘導心毒性を含む、請求項77に記載の方法。
【請求項８０】
前記心臓病がウイルス誘導心毒性を含む、請求項76に記載の方法。
【請求項８１】
前記組成物がコラーゲンまたはゲルをさらに含む、請求項75に記載の方法。
【請求項８２】
前記単回または多回の用量が少なくとも約400ng〜少なくとも約50μg、任意選択で少なくとも約33ng〜少なくとも約4.2μgの範囲の用量の前記ポリペプチドを含む、請求項75に記載の方法。
【請求項８３】
前記単回または多回の用量が少なくとも約800ng〜約8μg、任意選択で少なくとも約67ng〜約667ngの範囲の用量の前記ポリペプチドを含む、請求項75に記載の方法。
【請求項８４】
少なくとも約1nM〜少なくとも約10nM、任意選択で少なくとも約10ng/ml〜少なくとも約100ng/mlの範囲の血中濃度を被験体で生じさせるのに十分な用量で前記ポリペプチドが投与される、請求項49に記載の方法。
【請求項８５】
前記疾患が急性病の状況を含む、請求項49に記載の方法。
【請求項８６】
前記急性病の状況が緊急状況、集中治療状況、呼吸不全、腎不全または他の生命にかかわる病態のいずれか1つまたは複数を含む、請求項85に記載の方法。
【請求項８７】
前記疾患が肥満症を含む、請求項49に記載の方法。
【請求項８８】
前記組成物または持続性ポリペプチドがベータセルリンまたはその活性変異体もしくは断片を含む、請求項49に記載の方法。
【請求項８９】
ErbBリガンドポリペプチドを作製する方法であって、
(a)配列番号1〜配列番号89のいずれか1つをコードするポリヌクレオチド配列を含むDNA構築物をトランスフェクトした宿主細胞を提供することと、
(b)ポリペプチドを産生するために、前記トランスフェクトした宿主細胞を培養することと、
(c)前記細胞培養物からポリペプチドを1エンドトキシン単位未満を含むものに、または97%以上の純度を含むものに精製することと、
を含む、前記方法。
【請求項９０】
前記ErbBリガンドポリペプチドがベータセルリンまたはその活性変異体もしくは断片を含む、請求項89に記載の方法。
【請求項９１】
因子に対する細胞集団の応答に及ぼすタンパク質の影響を測定する方法であって、該タンパク質は分泌タンパク質もしくはその活性断片、または膜貫通タンパク質の細胞外断片を含み、
(a)前記タンパク質と接触した後の細胞のインピーダンスを測定することと、
(b)前記タンパク質と前記因子とに接触した後の細胞のインピーダンスを測定することと、
(c)前記因子に対する細胞の応答に及ぼす前記タンパク質の影響があればそれを測定することと、
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、米国特許商標庁に出願された以下の出願:2005年5月27日に出願の米国特許仮出願60/685,702、2005年7月22日に出願の米国特許仮出願60/701,490、2005年7月22日に出願の米国特許仮出願60/701,964、2005年7月22日に出願の米国特許仮出願60/702,065、2005年11月7日に出願の米国特許仮出願60/733,791、2005年11月16日に出願の米国特許仮出願60/736,866、2006年2月27日に出願の米国特許仮出願60/778,169、2006年5月16日に出願の米国特許仮出願60/800,443および2006年5月30日に出願の「筋細胞へのグルコース取り込みを刺激する方法および組成物ならびに疾患を治療する方法および組成物」と題された米国特許出願、の権益を主張し、その全ての開示は完全に本明細書で参照により組み込まれる。
【０００２】
本発明の技術分野
本発明は、上皮成長因子(EGF)としても知られる、ErbBリガンドファミリータンパク質の治療的使用に関する。治療的な使用には、血糖管理、筋細胞へのグルコース取り込みの刺激および疾患治療のために、ErbBリガンド化合物を単独で、他の作用物質との組み合わせおよび/または併用により用いる方法が含まれる。
【背景技術】
【０００３】
グルコースは、腸管から吸収される食物由来の炭水化物が人体の細胞に供給される、主要な形態である。グルコースは哺乳動物内のいくつかの専門化細胞(例えば白色筋細胞)によって意味のある程度に用いられる唯一の燃料であり、それは脳によって用いられる主要な燃料である。実際、例えばグリコーゲン分解(すなわち肝臓および骨格筋内のグリコーゲンの分解)および糖新生(例えばアミノ酸からの合成)の過程を通してグルコースを貯蔵および/または合成する能力は、ヒトの生存のために重要である。さらに、グルコースはこれらの専門化細胞および脳にとって非常に重要であるので、体の主要な組織(すなわち筋肉、肝臓、脂肪および腎臓)のいくつかは、協力してこの必須の細胞基質の連続的供給を確保する。
【０００４】
最も一般的な代謝疾患のうちの2つである肥満および糖尿病は、グルコース供給連鎖における急性または持続性の故障と関連づけられている。しばしば、これらの疾患は、主にインスリンおよびグルカゴンによって調節される過程である、グルコースを感知し、かつ/または取り込む細胞の能力の障害のために起こる。しかし、肥満および糖尿病は、糖代謝の調節障害の結果起こることもある。次に、肥満および糖尿病は、アテローム性動脈硬化症、心不全、高血圧、小血管疾患、腎不全、手足切断および盲目を含む主要な医学的問題の発症の寄与因子である。様々な治験は、これらの合併症の長期に及ぶリスクは、血圧、食事および身体活動の厳格な管理と一緒に、最適な血糖管理を通して減少させることができることを示す。
【０００５】
高血糖症、すなわちヒトでは約130md/dLを超える血糖レベルの上昇は、有害予後と関連する、普通に見られる重度の病気である。それは、脳卒中、心筋梗塞、血管および心臓手術からの合併症の危険因子であり、非常に重篤な患者および外傷患者では、死亡率の上昇と関連する。他方、厳密なグルコース管理は、例えば心臓手術、心筋梗塞および集中治療室での処置の予後を改善する(Van der Berghe他、NEJM、354:449〜461、(2006))。
【０００６】
しばしば、高血糖症は糖尿病との関連で存在する。しかし、糖尿病が存在しない場合の高血糖症(例えばストレス高血糖症)も記載されており、一般的にヒトでは、約200md/dL(約11.1mmol/リットル)より上の血漿グルコースレベルを指す。ストレス高血糖症の機構のいくつかは、公知である。例えば、急性疾患の間の反調節ホルモン類(例えばエピネフリン、グルカゴン、コルチゾール、成長ホルモン)およびサイトカイン(TNFα、遊走阻止因子/MIF)の過剰は、しばしばインスリン抵抗性を引き起こす。さらに、多くの入院患者は、様々な他の理由のために、例えば慢性腎臓疾患、急性生理学的ストレス、膵臓炎、低体温および低酸素血症のために、インスリン欠乏症である。特に完全静脈栄養または経腸栄養補助を受ける患者においては、過剰なブドウ糖注入も、しばしば見落される高血糖症の寄与因子である。ストレス高血糖症は心筋感染の後の、死、うっ血性心不全および心原性ショックのリスクを増加させ、虚血性ショックの後の院内死亡率を増加させる(Hirsch, I.B.、J Clin Endocrinol Metab. 87:975〜977(2002)で記載されている)。
【０００７】
最近の治験において、外科集中治療室(ICU)で治療を受けた患者のグルコースレベルを厳密に管理すると、罹患率および死亡率はかなり低下した。医学的な合併症、例えば重度の感染および臓器不全症も減少した。免疫機能不全の予防、全身の炎症の減少ならびに内皮およびミトコンドリアの構造および機能の保護を含む、厳密なグルコース管理の利点を説明するために、いくつかの可能な機構が提案された(Van den Berghe他、NEJM、345:1359〜1367(2001); Van der Berghe他、NEJM、354:449〜461、(2006)で議論される)。外科ICUにおける2001年の最初の試験(Van den Berghe他、NEJM、345:1359〜1367(2001))以来、非常に重篤な患者における血中グルコースの上昇、すなわち以前は無視されるか適応性であると記載されたマーカーは、主要な治療目標となった。
【０００８】
伝えられるところでは、改善された血糖管理は、米国だけで1820万人が居住する糖尿病患者で、初期の微小血管合併症、例えば網膜症、腎症および神経障害のリスクも低減させる。それでも、年に約320万人の死亡(毎分6人が死亡する)は、高血糖症および/またはI型およびII型糖尿病を含む糖尿病、ならびにメタボリックシンドロームの合併症にまだ起因する。近年、世界保健機構(WHO)は糖尿病の流行が進行中であると宣言した(SmythおよびHeron、Nature Medicine 12:75〜80(2006); WHO Report「Preventing Chronic Diseases:a Vital Investment」(2005))。1985年に、世界全体で、概算で3000万人が糖尿病であった。しかし、1995年までに、この数字は1億3500万人に増加した。2005年に、世界全体でおおよそ2億1700万人が糖尿病を患い、WHOは、2030年までに、この数字が増加して3億6600万人を超えると予測する。
【０００９】
この世界的な糖尿病危機の2大懸念は、(i)糖尿病関連の罹患率、死亡率および経済的負担の増加の多くは(Yach, D.他、Nature Medicine 12:62〜66(2006))、人口増加、老化、不健康な食事、肥満および坐位のライフスタイルのために、インドおよび中国のような開発途上国で起こること、および(ii)II型糖尿病(総症例の約90%を占める)の発生率の増加がより若い年齢で見られることである。米国、日本および他の先進国では、糖尿病患者のほとんどは退職年齢より上である。他方、開発途上国においては、罹患する頻度の最も高い人々は、35歳から64歳の間の、生涯のうちで中年の生産的な年齢である。全体的に、糖尿病の健康管理の直接費用は、地域の糖尿病有病率および利用できる治療の洗練度に従い、年間の保健予算の2.5%から15%である。生産の損失高は、ラテンアメリカの25カ国からのWHOの推定によると、直接的健康管理費の5倍になることもある。
【００１０】
したがって、糖尿病は、公衆衛生上の大きな脅威となる、緊急性の多因子疾患である。II型糖尿病は、インスリン欠乏症およびインスリン抵抗性の組み合わせに、一般に起因する。実際、この疾患を有する者は、慢性高血糖症ならびにインスリン促進グルコース輸送を有する組織(インスリンの標的組織)である筋肉、肝臓および脂肪組織におけるインスリン抵抗性の増加を含む、一群の臨床症状を共有する。インスリン抵抗性は、疾患の進行および糖尿病の合併症、例えば糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、メタボリックシンドロームおよび筋肉消耗への、主要な寄与因子である。
【００１１】
インスリン抵抗性は、標的組織(例えば筋肉、脂肪および肝臓)における、ある量のインスリンの損傷作用と定義されているようである。インスリン抵抗性の主要な結果は、炭水化物代謝の変化である。筋肉においては、インスリン促進グルコース輸送および糖代謝の第1段階(炭素6におけるグルコースのリン酸化)は、両方とも損なわれる。グリコーゲン合成速度も低下することがある。脂肪においては、インスリン抵抗性はグルコース取り込みの障害として現れるが、脂肪分解抑制の障害としても出現する。肝臓では、グルコース産生を抑制するために、通常より高いインスリン濃度が必要となる。身体不活動性、高エネルギーおよび高脂肪の食事、喫煙およびストレスなどの環境因子は、遺伝性素因と強く相互作用して糖尿病の発症を促進する。しかし、インスリン抵抗性の発達の原因である一次要因は、わかっていない。
【００１２】
最近まで、支配的な考えは、インスリン抵抗性は、主にインスリン標的細胞内の一次欠陥に起因するというものであった。しかし、現在、全身の神経内分泌の調節不全も、インスリン抵抗性の発達で主要な役割をすると思われる(BurenおよびEriksson、Diabetes Metab Res Rev 21:487〜494(2005); Pocai, A.他、Nature 434:1026〜1031(2005); SeeleyおよびTschop、Nature Medicine 12:47〜49(2006))。世界的な肥満および糖尿病の流行および、入手可能な薬剤でこれらの疾患に十分に対処することができないことを考えると、両疾患の治療のために、グルコースの取り込みおよび代謝に影響を及ぼすことができる他の作用物質を特定する、まだ満たされていない必要性がある。
【発明の開示】
【００１３】
本発明は、被験体で筋細胞へのグルコースまたはアミノ酸の取り込みを刺激すること、細胞の生存を促進するかもしくは筋細胞のアポトーシスを抑制すること、ユートロフィン(utrophin)の発現を誘導すること、筋肉消耗を抑制するかもしくは筋肉質量を増加させること、HbA1cを低下させること、インスリン投与と関連する低血糖を低減すること、基礎血糖レベルを低下させること、および/または上昇した血糖レベルを急減させることから利益を受ける被験体を治療するために用いることができる組成物、キットおよび方法を提供する。
【００１４】
本発明は、低血糖を誘導することなく被験体で血糖レベルを急減させるのに十分な濃度のベータセルリン(betacellulin)またはその活性変異体もしくは断片、および製薬上許容される担体を含む医薬組成物を目的とする。
【００１５】
本発明の一部の実施形態では、組成物はベータセルリンポリペプチドおよび融合パートナーまたはその活性変異体もしくは断片を含む持続性のベータセルリン融合タンパク質を含み、ベータセルリン融合タンパク質は、ベータセルリンポリペプチド単独と比較して、被験体で延長された半減期を有する。例えば、持続性のベータセルリン融合タンパク質は、ベータセルリンポリペプチド単独の半減期よりも少なくとも0.5時間、少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも3時間、少なくとも4時間または少なくとも5時間長い半減期を有することができる。
【００１６】
持続性のベータセルリン融合タンパク質中の融合パートナーのそれには限定されない例は、ポリマー、ポリペプチド、スクシニル基またはこれらのいずれかの活性変異体もしくは断片でよい。例えば、ポリマーは、ベータセルリンポリペプチドに永久にまたは可逆的に共有結合で結合している、ポリエチレングリコール部分を含む。例えば融合パートナーポリペプチドは、免疫グロブリンフラグメント、アルブミンまたはオリゴマー化ドメインを含むことができる。一実施形態では、免疫グロブリンフラグメントはFcフラグメントを含む。
【００１７】
医薬組成物は、キットで提供することができる。本発明で提供されるキットのそれには限定されない例は、(a)ErbBリガンドファミリーのポリペプチドまたはその活性変異体もしくは断片、あるいはErbBリガンドファミリーのポリペプチドまたはその活性変異体もしくは断片および融合パートナーを含む持続性の融合タンパク質を含む医薬組成物であって、融合タンパク質はErbBリガンドポリペプチド単独と比較して被験体での半減期が長く、ならびに製薬上許容される担体を含む医薬組成物、ならびに(b)そのような組成物を必要とする被験体への投与のための説明書を含むものである。
【００１８】
キットは、その中に含まれる組成物の1つまたは複数の使用を記載する説明書を含むことができる。例えば、被験体で上昇した血糖レベルを急減させるための、筋肉消耗を抑制するかもしくは筋肉質量を増加させるための、被験体の心筋へのグルコースもしくはアミノ酸の取り込みを増加させるための、肥満症治療のための、および/または緊急時に被験体を治療するための組成物の使用の説明書があってもよい。
【００１９】
キットは、バイアルまたはカートリッジをさらに含むことができる。バイアルまたはカートリッジは、約50μg/ミリリットルから約100μg/ミリリットルのErbBリガンドポリペプチドを含むことができる。任意選択で、バイアルまたはカートリッジは、約100μg/ミリリットルから約1ミリグラム/ミリリットルのErbBリガンドポリペプチドを含む。他の実施形態では、バイアルまたはカートリッジは、約1ミリグラム/ミリリットルから約5ミリグラム/ミリリットルのErbBリガンドポリペプチドを、または約5ミリグラム/ミリリットルから約500ミリグラム/ミリリットルのErbBリガンドポリペプチドを、または約100ミリグラム/ミリリットルから約400ミリグラム/ミリリットルのErbBリガンドポリペプチドを、または約200ミリグラム/ミリリットルから約300ミリグラム/ミリリットルのErbBリガンドポリペプチドさえも含む。
【００２０】
一実施形態では、バイアルまたはカートリッジは、約0.5ミリリットル、約1.0ミリリットルまたは約1.5ミリリットルの量を含む、ErbBリガンドポリペプチドの単一用量を含む。一実施形態では、バイアルまたはカートリッジは単一用量、二回用量または三回用量のErbBリガンドポリペプチドを含み、各用量は約0.5ミリリットル、約1.0ミリリットルまたは約1.5ミリリットルの量を含む。バイアルまたはカートリッジは、固体の状態、例えば、それには限定されないが、フリーズドライされたポリペプチドのErbBリガンドを含むこともできる。
【００２１】
本発明は、少なくとも1つの第2の作用物質をさらに含むキットも提供し、この第2の作用物質は抗糖尿病薬である。
【００２２】
本発明は、疾患を治療するためのいくつかの方法を提供する。一実施形態において、本発明は、被験体で疾患を治療する方法であって、(a)ErbBリガンドファミリーのポリペプチドを提供すること、および(b)ポリペプチドを被験体に投与することを含み、被験体は正常な膵臓機能および/または正常なインスリンレベルを有し、被験体で筋細胞へのグルコースまたはアミノ酸の取り込みを刺激すること、細胞の生存を促進するかもしくは筋細胞のアポトーシスを抑制すること、ユートロフィンの発現を誘導すること、筋肉消耗を抑制するかもしくは筋肉質量を増加させること、HbA1cを低下させること、インスリン投与と関連する低血糖を低減すること、基礎血糖レベルを低下させること、および/または上昇した血糖レベルを急減させることから利益を受ける方法を提供する。任意選択で、本発明は、(c)少なくとも1つの第2の作用物質を投与することをさらに含み、第2の作用物質は他の治療剤である治療方法も提供する。
【００２３】
一実施形態では、ErbBリガンドファミリーのポリペプチドは、ベータセルリンまたはその活性変異体もしくは断片を含む。あるいは、ErbBリガンドファミリーのポリペプチドは、ErbBリガンドファミリーのポリペプチドまたはその活性変異体もしくは断片および融合パートナーを含む持続性のErbBリガンド融合タンパク質を含み、ErbBリガンド融合タンパク質は、ErbBリガンドポリペプチド単独と比較して被験体での半減期が長い。
【００２４】
疾患は、血糖レベルの上昇、肥満、I型またはII型糖尿病、ならびに急性高血糖症、初期の糖尿病性ケトアシドーシス、糖尿病性ケトアシドーシスおよび糖尿病性昏睡から選択される病態を含むことができる。疾患は、糖尿病性筋萎縮症または他の代謝ミオパシー、悪液質、AIDS性消耗、非活動性萎縮、サルコペニア、横紋筋融解、筋炎、筋疾患による横隔膜虚弱、および筋ジストロフィーと関連する筋肉消耗から選択することもできる。ポリペプチドの影響を受ける筋細胞は、骨格、心臓および平滑筋の筋細胞でよい。
【００２５】
ポリペプチドの投与は、少なくとも1日1回、少なくとも1日2回、または少なくとも1日3回でよい。一実施形態では、ポリペプチドは、血中グルコースの正常血糖レベルを生じさせるのに十分な用量で投与される。一実施形態では、ポリペプチドは被験体で空腹時血糖を低下させ、かつ/またはHbA1cレベルを低下させるのに十分な量で投与される。
【００２６】
一実施形態では、その量は心臓病の治療のために被験体の心筋によるグルコースまたはアミノ酸の取り込みを増加させるのに十分であり、その心臓病は、虚血、うっ血性心不全、心筋梗塞および誘導心毒性から選択される。誘導心毒性は、化学療法によって誘導されるものおよびウイルスによって誘導されるものを含む。
【００２７】
被験体は、緊急状況で治療することができる。緊急状況としては、救急室、集中治療の状況、被験体が急性病である状況、ならびに被験体が呼吸不全、心不全、腎不全、糖尿病性ケトアシドーシスおよび他の生命にかかわる病態から選択される病態を患っている状況が挙げられる。
【００２８】
治療の方法は、ポリペプチドを、経口的に、皮下に、静脈内に、経皮的に、腹腔内に、吸入により、移植により、皮内に、筋肉内に、心臓内に、鼻腔内に、および/または直腸座剤により投与することを含むことができる。ポリペプチドは、コラーゲンまたはゲルを含む組成物として投与することができる。
【００２９】
ポリペプチドは、被験体において約1ナノモルから約10ナノモル、または約10ナノグラム/ミリリットルから約100ナノグラム/ミリリットルの範囲のポリペプチドの血中濃度を生じさせるのに十分な用量で投与される。
【００３０】
ポリペプチドの単回または多回の用量は、食事時間に、またはその時間帯に投与することができる。例えば、ポリペプチドは食事の前後約120分、約90分、約60分、約30分、約15分もしくは約5分以内に、または食事の間に投与することができる。
【００３１】
被験体が本発明の治療方法から引き出す利点としては、上昇した血糖レベルの急減を挙げることができる。急減は、約1分〜約120分以内に、約2分〜約90分以内に、約3分〜約60分以内に、約4分〜約30分以内に、または約5分〜約15分以内に起こることがある。
【００３２】
ポリペプチドは、約50μgを超える量から約2ミリグラム未満、約2ミリグラムを超える量から約10ミリグラム未満、および約10ミリグラムを超える量から約500ミリグラムを含む用量から選択される、単回または多回の用量で投与される。
【００３３】
一実施形態では、用量は約100ミリグラムから約400ミリグラムを含む。他の実施形態では、用量は約200ミリグラムから約300ミリグラムを含む。
【００３４】
一実施形態では、ポリペプチドは単回または多回の用量で投与される。被験体の重量はキログラムで測定され、各用量は約0.01ミリグラム/キログラムから約5ミリグラム/キログラムを含む。一実施形態では、用量は約0.1ミリグラム/キログラムから約2ミリグラム/キログラムを含む。他の実施形態では、用量は約0.2ミリグラム/キログラムから約1ミリグラム/キログラムである。他の実施形態では、用量は約0.3ミリグラム/キログラムから約0.9ミリグラム/キログラムである。用量は、約0.4ミリグラム/キログラムから約0.8ミリグラム/キログラム、または約0.5ミリグラム/キログラムから約0.7ミリグラム/キログラムでもよい。一実施形態では、用量は1ミリグラム/キログラムを超えて含まない。
【００３５】
ポリペプチドは、それぞれ約1μg/キログラムから約10ミリグラム/キログラムを含む、単回または多回の用量で投与することもできる。一実施形態では、ポリペプチドはそれぞれ約10μg/キログラムから約1ミリグラム/キログラムを含む、単回または多回の用量で投与される。
【００３６】
第2の作用物質は、抗糖尿病薬を含むことができる。第2の作用物質は、経口的に、皮下に、静脈内に、経皮的に、腹腔内に、吸入により、移植により、皮内に、筋肉内に、心臓内に、鼻腔内に、および/または直腸座剤により投与することができる。
【００３７】
さらに、第2の作用物質は、ポリペプチドの前に、後に、または同じ時間に投与することができる。第2の作用物質は、メトホルミン(メトフォルミン)、インスリン分泌促進物質、グルコシダーゼ阻害剤、PPARγアゴニストおよび二重のγ/α-PPARアゴニストから選択することができる。
【００３８】
一実施形態では、インスリン分泌促進物質は、スルホニル尿素およびメグリチニド(meglitinide)から選択される。一実施形態では、第2の作用物質は、インスリン、インスリン類似体、同時分泌剤、プラムリンチド(pramlintide)およびDPP4アンタゴニストから選択される。他の実施形態では、第2の作用物質は、グルカゴン様ペプチドを含む。グルカゴン様ペプチドは、例えば、エキセナチド(exenatide)を含むことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
A.定義
本明細書で定義されていなければ、本明細書で用いる用語はそれらの通常の意味を有し、さらには本明細書に沿って理解することができる。
【００４０】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は互換的に用いられてアミノ酸残基のポリマーを指すが、最小長に限定されない。ゆえに、生物学的に、組換えでまたは合成的に産生されるかどうかに関係なく、および天然または非天然のアミノ酸から構成されるかどうかに関係なく、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体などがこの定義に含まれる。完全長タンパク質およびその断片の両方が、定義に含まれる。この用語は、ポリペプチドの同時翻訳修飾(例えばシグナルペプチド切断)および翻訳後修飾、例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、タンパク分解性切断(例えばフリン(furin)またはメタロプロテアーゼによる切断)なども含む。さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」はそのタンパク質が所望の活性を維持する限り、本来の配列に対する、欠失、付加および置換などの修飾を含むタンパク質(当業者ならばわかるであろうが一般に性質は保存的である)を指す。これらの修飾は部位特異的突然変異誘発などを通して故意的であるか、タンパク質を産生する宿主の変異またはPCR増幅もしくは他の組換えDNA方法に起因する誤りを通して、偶然であってもよい。本明細書で核酸分子の記載で用いる「組換え」は、ゲノム、cDNA、ウイルス、半合成および/または合成由来のポリヌクレオチドを意味し、これは、その起源または操作のために、それが本来関連しているポリヌクレオチドの全てまたは一部と関連していない。タンパク質またはポリペプチドに関して用いられる用語「組換え」は、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。宿主細胞に関して用いられる用語「組換え」は、組換えポリヌクレオチドが導入された宿主細胞を意味する。
【００４１】
本明細書で用いるように、「ErbBリガンド」は、その分子の少なくとも一部がErbBリガンド(すなわち1つまたは複数のErbB受容体と結合するEGF様タンパク質ファミリーのメンバー)またはその断片を含む分子を指す。ErbBリガンドのそれには限定されない例は、ベータセルリン(BTC)、上皮成長因子(EGF)、エピゲン(Epigen)、アンフィレグリン(amphiregulin)(AR)、トランスフォーミング成長因子アルファ(TGF-α)、ヘパリン結合EGF(HB-EGF)、エピレグリン(epiregulin)(EPR)、ならびに複数のニューレグリン(neuregulin)アイソフォームおよびスプライス変異体(例えばNRG-1、NRG-2、NRG-3またはNRG-4)のいずれかである。受容体は、International Union of Pharmacology Committee on Receptor Nomenclature and Drug Classification(NC-IUPHAR)によって、タンパク質を調節して細胞事象を媒介することができる生理的に関連したリガンドを認識する、タンパク質またはタンパク質複合体と定義される。
【００４２】
「リガンド」は、他の分子、例えば、それらに限定されないが、受容体上の特定の部位と結合する任意の分子である。例えば、リガンドは、他の分子と結合すると、通常、シグナル伝達経路の活性化などの細胞応答を開始する、細胞外分子であってもよい。
【００４３】
「断片」は、対応するポリペプチドまたはポリヌクレオチド分子の任意の部分またはサブセットである。ゆえに、例えば、「アルブミンの断片」はアルブミンのポリペプチドサブセットを指し、「Fcの断片(フラグメント)」はFc分子のポリペプチドサブセットを指す。用語「断片」は、部分またはサブセットを、いかなる最小長または最大長にも制限するものではない。
【００４４】
ErbBリガンドの「変異体」は、構造および生物的活性が未変性のErbBリガンドまたはその断片に相当類似しているが、そのような分子またはその断片と同一ではないリガンドを指すものとする。変異体は必ずしも未変性の分子に由来するわけではなく、様々な類似したまたは異なる細胞系のいずれかから得ることができる。用語「変異体」は、遺伝子の対立遺伝子およびグリコシル化変異体も含むものとする。ゆえに、2つのErbBリガンドが類似した構造および生物的活性を有するならば、リガンドのうちの1つの組成または二次的、三次的、もしくは四次的構造が他のリガンドで見られるものと同一でない場合にもその用語は本明細書で用いられるので、それらは変異体とみなされる。
【００４５】
ErbBリガンドに関して「持続性の」は、対応するErbBリガンド単独の半減期よりも長い薬物動態学的半減期を有するErbBリガンドを指す。同様に、本明細書で使用される用語「延長された半減期」は、他の形態と比較して分子の1つの形態におけるより長い薬物動態学的半減期を指す、相対用語である。用語「薬物動態学的半減期」は、関心のErbBリガンドの投与の後に、血液、血漿または他の特定の組織中でErbBリガンドの濃度がその初期濃度(すなわち、投与直後の到達濃度)の半分に低下するのに要する時間の長さを指す。
【００４６】
「融合ポリペプチド」は、2種類以上のポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含むものである。例えば、「持続性のベータセルリン融合タンパク質」は、ベータセルリンポリペプチドまたはその活性変異体もしくは断片、および融合パートナーまたはその活性変異体もしくは断片を含む融合ポリペプチドである。したがって融合ポリペプチドは、「融合パートナー」と呼ばれる第2のポリペプチドと(例えば組換えで、または合成方法によって)結合した、関心のタンパク質を含む。一般的に用いられる融合パートナーの例としては、とりわけ、アルブミン、Fc分子、オリゴマー化ドメインを含むポリペプチド、および哺乳類の免疫グロブリンのH鎖またはL鎖の定常部の様々なドメインがある。
【００４７】
用語「アルブミン」および「アルブミン分子」は、水溶性であり、適度に濃縮された塩溶液であり、加熱によって凝固する性質のある一群のタンパク質の、いずれか1つを指す。適当なアルブミンは当業者には周知であろう。加えて、これらのタンパク質は、タンパク質分解、分子生物学的方法を用いる配列修飾、および脂質または炭水化物への結合によって修飾することができる。
【００４８】
本明細書で使用される用語「Fc分子」は、Fc領域のCHドメインのいずれかまたは全てを含む抗体のFc領域に由来する、未変性のおよび突然変異タンパク質形態のポリペプチドを含む。本明細書で定義されるように、エフェクター機能を欠くFc分子は、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性(ADCC)を誘導しないものである。抗体または免疫グロブリンは、特異抗原を認識して結合することができるタンパク質である。抗体は、免疫系により、合成によりまたは組換えで生成することができ、その例としてはポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製物、ならびに、ハイブリッド抗体、変化抗体、キメラ抗体、ハイブリッド抗体分子、F(ab')2およびF(ab)フラグメント;Fv分子(例えば、非共有結合性のヘテロダイマー)、二量体および三量体抗体断片構築物;ミニ体、ヒト抗体、ヒト化抗体分子、およびそのような分子から得られる任意の機能性フラグメントであって、そのようなフラグメントは特異的結合を保持するもの、を含む調製物などが挙げられる。抗体は、当技術分野においては公知である。抗体は、例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド抗原を認識することができる。この用語は、活性フラグメント、例えば、免疫グロブリンの抗原結合性フラグメント、H鎖の可変部および/または定常部、L鎖の可変部および/または定常部、相補性決定部(cdr)ならびにフレームワーク領域を含む。抗体CH3ドメインは、Fc分子のCH3部分を指す。二量体化を促進するヒンジ部を含むそのようなポリペプチドの切断型も、含まれる。
【００４９】
用語「ポリマー」は互いに共有結合で結合した2個以上のモノマー単位からなる任意の化合物を意味し、モノマー単位は同じであっても異なってもよいので、ポリマーはホモポリマーまたはヘテロポリマーであることができる。代表的なポリマーとしては、ペプチド、多糖類、核酸、などがあり、ポリマーは天然であっても合成されてもよい。
【００５０】
本明細書で使用される用語「スクシニル基」は、コハク酸または(1,4-ジオキソブチル)-1-カルボン酸に由来するアシル残基を指す。
【００５１】
用語「オリゴマー化ドメイン」は、オリゴマーを形成することができる融合パートナー部分を指し、すなわち、オリゴマー化を可能にする十分な構造がある。オリゴマーは、任意のサブユニット化学量でよく、例えば二量体化および四量体化ドメインでよい。オリゴマー化ドメインは、コイルドコイルドメイン(例えばテトラネクチン(tetranectin)コイルドコイルドメイン、軟骨オリゴマー基質タンパク質中のコイルドコイルドメイン、血管新生因子コイルドコイルドメインまたはロイシンジッパードメイン)、コラーゲンもしくはコラーゲン様ドメイン(例えばコラーゲン、マンノース結合レクチン、肺表面活性剤プロテインA、肺表面活性剤タンパク質D、アディポネクチン、フィコリン(ficolin)、コングルチニン、マクロファージスカベンジャー受容体もしくはエミリン(emilin))、または二量体免疫グロブリンドメイン(例えば抗体CH3ドメイン)を含むことができる。
【００５２】
本明細書で「組成物」または「医薬組成物」は、賦形剤、例えば当技術分野で常用され、治療、診断または予防の目的のために被験体に投与するのに適当である製薬上許容される担体を通常含む、組成物を指す。それは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが細胞および/または培地に存在する、細胞培養を含むことができる。さらに、当技術分野で公知のように、および本明細書で記載されているように、局所(例えば口腔粘膜、呼吸粘膜)および/または経口の投与のための組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤、経口用リンスまたは散剤の性状でよい。組成物は、安定剤および保存料を含むこともできる。担体、安定剤およびアジュバントの例については、University of the Sciences in Philadelphia(2005)Remington:The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons、第21版を参照。
【００５３】
本明細書で用いられるように、用語「製薬上許容される担体」は、標準的な薬用担体、例えばリン酸緩衝食塩水溶液、水および乳濁液、例えば油/水または水/油乳濁液、ならびに各種の湿展剤のいずれかを含む。
【００５４】
本明細書で使用されるように、用語「キット」は、一緒に用いるために包装されるかまたはマークされた成分を指す。例えば、キットはErbBリガンド(例えばベータセルリン)、他の抗糖尿病薬(例えば異なるErbBリガンド)および担体を含むことができ、これら3つの成分を3つの別個の容器に入れてもよい。別の例では、キットは任意の2つの成分を1つの容器に含むことができ、第3の成分および任意の更なる成分を1つまたは複数の別個の容器に含むことができる。任意選択で、被験体(例えば急性病の被験体、糖尿病の被験体、心臓病を患っている被験体)への投与に適当な組成物(例えば筋細胞へのグルコース取り込みおよび/またはアミノ酸取り込みを増加させる組成物)を処方するために、キットは成分の組み合わせおよび/または投与のための説明書をさらに含む。
【００５５】
用語「食事」は、一度に出されて食される食物を指す。この用語は、大体において固定された時間(例えば朝食、昼食、夕食)に慣行または習慣によって起こる食物を食べる機会のいずれかで食される「食事」、ならびに他のいかなる機会(例えば間食)に食される「食事」も含む。
【００５６】
「疾患」は、病的状態、例えば健康または正常な状態からそれていく症状または他の識別要素によって特定することができるものである。用語「疾患」は、障害、症候群、病態および傷害を含む。疾患としては、それらに限定されないが、増殖性、炎症性、免疫性、代謝性、感染性および虚血性の疾患がある。
【００５７】
用語「筋障害」または「筋疾患」は、筋肉消耗、悪液質、サルコペニア、横紋筋融解、横隔膜虚弱、などを含む、筋肉および神経筋の障害を含むこととする。一部の筋障害は、特定の細胞型の原形質膜の不安定化または不適当な構成を特徴とし、例としては、それには限定されないが、筋ジストロフィー(MD)がある。MDは、神経系が関与しない虚弱および筋萎縮を特徴とする、一群の遺伝的変性性のミオパシーである。MDの3つの主な型は、偽性肥大型(Duchenne、Becker)、肢帯型(LGMD)および顔面肩甲上腕型である。いくつかの筋ジストロフィーおよび筋萎縮症は筋細胞膜の破壊を特徴とし、すなわち、それらはジストロフィンの突然変異から生じる漏出性膜を特徴とするが、そのいくつかはユートロフィンの代償性の過剰発現によって治療することができる。用語「筋障害」は、さらにWelander末梢性ミオパシー(WDM)、遺伝性末梢性ミオパシー、良性先天性緊張低下、中心コア病、ネマリンミオパシー、および筋管(中心核)ミオパシー、ならびに筋肉消耗、サルコペニアおよび筋萎縮症を含む。筋萎縮症のそれには限定されない例は、AIDS関連の消耗、神経外傷による除神経(筋肉とその神経との接触の減少)から生じるもの;変性性、代謝性(例えば代謝ミオパシー、糖尿病性筋萎縮症)または炎症性神経障害(例えばGuillian Barre症候群)、末梢神経疾患および環境毒素または薬剤に起因する神経傷害から生じるもの;運動系神経細胞障害、例えば大人の運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症(ALSまたはLou Gehrig病)による除神経から生じる筋萎縮;幼児および青少年の脊髄筋肉萎縮症、および多病巣性の伝導ブロックによる自己免疫運動系神経障害;長期不使用、例えば病態、例えば、それらに限定されないが、脳卒中、脊髄損傷による麻痺、外傷(例えば骨折、捻挫もしくは脱臼)または長引くベッド療養による骨格の不動化から生じる慢性の非活動性萎縮から生じる筋萎縮;ならびに、代謝ストレスまたは栄養不足、例えば、それらに限定されないが癌および他の慢性疾患の悪液質、横紋筋融解、および内分泌障害、例えば、それらに限定されないが甲状腺の障害および糖尿病などから生じる筋萎縮である。
【００５８】
本明細書で用いられる用語「心血管障害」は、心臓血管系、例えば心臓、血管および/または血液に関係する疾患、障害または状態を含む。心血管障害は、動脈圧のアンバランス、心臓の機能不全、または、例えば血栓による、血管の閉塞に起因することがある。そのような障害の例としては、先天性の心臓の欠陥(例えば房室管欠陥)、高血圧、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈痙攣、冠状動脈疾患、弁膜疾患、虚血、虚血性再かん流損傷、再狭窄、動脈の炎症、血管壁リモデリング、心室のリモデリング、急速な心室ペーシング、冠状微小塞栓症、頻脈、徐脈、圧負荷、大動脈の屈曲、冠状動脈ライゲーション、血管心疾患、長QT症候群、うっ血性心不全、洞房結節機能不全、心房粗動、心筋梗塞、冠状動脈痙攣、不整脈および心筋症がある。
【００５９】
「心毒性」は、心臓および/または心臓血管系に対する臨床上の(例えば臨床的心不全)および無症状の(例えば診断技法で測定される異常)傷害を含む(例えば心筋障害)。「誘導された心毒性」は、とりわけ、ウイルス誘導性の心毒性、治療誘導性の心毒性、さもなければ治療的な薬剤、例えばウイルスベースの薬剤、癌の治療で用いられるアントラサイクリン/アントラサイクリン類似体(例えばドキソルビシン、アドリアマイシン)、環式の抗鬱薬、カルシウムチャンネル遮断薬、ベータブロッカー、経口避妊薬、抗不整脈薬およびジゴキシンの投与に起因する心臓の傷害を含む。
【００６０】
用語「被験体」、「個体」、「宿主」および「患者」は本明細書で互換的に用いられ、ヒトおよび非ヒト動物を含む、生きている動物を指す。被験体は、例えば、抗原性の刺激に応答することができる免疫細胞を有するか、または、細胞表面受容体結合を通して刺激性および抑制性のシグナル伝達に応答する細胞を有する生物体でよい。被験体は、哺乳動物、例えばヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラットおよびマウスでよい。用語「被験体」は疾患に関して完全に正常であるか、または全ての点で正常である個体を排除せず、糖尿病および非糖尿病の被験体を含む。
【００６１】
本明細書で使用される「治療」または「治療すること」は、ヒトを含む哺乳動物で疾患の治療手段のいかなる投与または適用も包含し、疾患を抑制することを含む。それは、例えば回帰を引き起こすか、または、失われたか、欠落しているか、欠陥のある機能を回復もしくは修理するか、または、非効率的もしくは休止中の過程を刺激することによって、疾患発症を阻止することおよび疾患を軽減することを含む。本明細書で、「治療」は、血糖レベルの急減、グルコースの基礎レベルの調節、または、被験体の筋細胞の生存、グルコース取り込み、アミノ酸取り込み、ユートロフィン発現もしくはグルコースレベルの増加、またはその筋肉質量の増加のうちの、1つまたは複数も含む。治療剤は、病態の治療のために用いられる任意の作用物質である。
【００６２】
「バイアル」は本明細書で広義に用いられ、カートリッジ、ブリスター、などと同義であり、少量(例えば単回投薬量または多回投薬量)の医薬組成物(すなわち薬剤)の無菌密封保管、輸送および取扱いのために設計されてそれに適当である、任意の薬剤包装装置を指す。
【００６３】
特に血中グルコースに関連する用語の定義は、以下に示す。
【００６４】
本明細書で使用される用語「長期的に有効な血清レベル」は、血中グルコースなどの血清成分を調節するのに十分な、ある物質の血清レベルの長期間の維持、例えば少なくとも1日、または1日、2日もしくは3日、または1週、または1カ月、または1年にわたる維持を指す。
【００６５】
用語「正常血糖レベル」は血糖正常レベルと同義であり、血糖レベルの正常レベル、すなわち約50〜約110mg/dLの範囲の血糖レベルを指す。
【００６６】
用語「低血糖症」は、大人のヒト被験体が約40〜60mg/dL未満(2.2mmol/l未満)の血糖レベルを示す臨床状態を指す。幼児の低血糖症は、CornblathおよびSchwartzによって満期産児では30mg/dL未満の総血中グルコースおよび早期産児では20mg/dLと記載された(Cornblath, M.およびSchwartz, R.、J. Pediatr. Endocrinol.、6:113〜129(1993)。血漿または血清中のグルコース濃度は、全血より10〜15%高いことがある(Schwartz R.P.、J. Pediatr.;131:171〜173(1997))。マウスでは、用語「低血糖症」は、約50mg/dL未満の血糖レベルを指す。
【００６７】
用語「高血糖症」は、大人のヒト被験体における約120mg/dL(7mmol/L)またはそれ以上の血糖レベルを指す。「急性高血糖症」は、被験体が少なくとも約10mmol/Lの血糖レベルを示す過渡状態を指す。当業者ならば認識するように他の動物、例えばマウスも、高血糖レベルを示す。
【００６８】
本明細書で使用される用語「糖尿病」は、慢性的に上昇する血糖レベル(高血糖症)の存在によって定義される疾患を指し、その用語は、例えば、I型およびII型糖尿病、ならびに様々な病気または医薬品に起因する他の様々なタイプの糖尿病(時々、二次的糖尿病と呼ばれる)などの、全ての既知の形態の糖尿病を含む。関係する一次過程(例えば膵臓β細胞の破壊または末梢のインスリン抵抗性の発達)に従い、これらの型の二次的糖尿病はI型またはII型糖尿病と同様にふるまう。最も一般的なものは、膵臓β細胞を破壊する膵臓の疾患(例えばヘモクロマトーシス、膵臓炎、嚢胞性線維症、膵臓癌)、インスリン分泌に干渉する(例えば褐色細胞腫)かまたは末梢のインスリン抵抗性を引き起こす(例えば先端巨大症、クッシング症候群、褐色細胞腫)ホルモン性症候群、および薬剤(例えばフェニトイン、グルココルチコイド、エストロゲン)によって誘導される糖尿病である。この用語は、メタボリックシンドロームおよび前糖尿病状態も含む。
【００６９】
用語「糖尿病性ケトアシドーシス」は、中間代謝で引き続いて起こる高血糖症、脱水およびアシドーシス産生性錯乱によって悪化する被験体における、絶対的または相対的なインスリン欠乏症の状態を指す。糖尿病性ケトアシドーシス(DKA)の最も一般的な原因は、根底にある感染、インスリン治療の崩壊および糖尿病の新規開始である。DKAは、一般的に300mg/dLを超える高血糖症、低濃度の重炭酸塩(<15mEq/L)、ならびにケトン血症およびケトン尿症を伴うアシドーシス(pH<7.30)を特徴とする。
【００７０】
用語「I型糖尿病」は、インスリン依存性糖尿病(IDM)、インスリン依存型糖尿病( IDDM)、成長発症糖尿病、1型糖尿病、DM、糖尿病、I型DM、小児期糖尿病、小児期糖尿病、小児期発症糖尿病、小児期発症糖尿病、小児期の糖尿病、小児期の糖尿病、若年発症糖尿病、若年発症糖尿病、ケトーシス型糖尿病、自己免疫性糖尿病、脆弱糖尿病、寝室用便器水腫、口渇疾患、糖疾患、糖病と同義である。I型糖尿病はいかなる年齢でも起こる可能性があり、一般的に、β細胞の自己免疫性破壊のために、インスリンを分泌する膵臓の能力の著しい低下を特徴とする。それは通常小児に起こり、かなり突然発症する。しかし、より新しい抗体検査により、成人の潜伏性自己免疫糖尿病(LADA)と呼ばれる、新しく発症した成人型のI型糖尿病を有する人々をより多く同定することが可能になった。I型糖尿病患者の識別特性は、患者のインスリンを引きあげると、ケトーシス、および最終的にケトアシドーシスが発症することである。したがって、これらの患者は外部からのインスリンに依存する。
【００７１】
用語「II型糖尿病」は、2型糖尿病、インスリン非依存型糖尿病(NIDDM)および成人発症糖尿病と同義である。現在では、小児の肥満および不活動性の蔓延のために、II型糖尿病はより若い年齢で起こっている。II型糖尿病は一般的に40歳より上の個体を侵すが、糖尿病の家族歴を有する2歳という若い小児で診断されたこともある。II型糖尿病は、様々な程度のインスリン分泌欠陥を伴う、末梢のインスリン抵抗性を特徴とする。II型糖尿病が発症するために、両方の欠陥が存在しなければならない。全ての過体重の個体はインスリン抵抗性を有するが、β細胞によるインスリン産生を増加させることができない個体だけが糖尿病を発症する。正常なグルコース耐性から異常なグルコース耐性への進行において、食後のグルコースレベルが最初に増加する。最終的には、肝臓の糖新生が増加して、空腹時高血糖症になる。II型糖尿病を発症する患者の約90%は、肥満体である。若年発症成人型糖尿病(MODY)は、II型糖尿病の1形態である。
【００７２】
用語「糖尿病性昏睡」は、血糖レベルがあまりに低いかまたはあまりに高いので、人が昏睡状態(意識不明)である医学非常事態を指す。昏睡は、通常、糖尿病の3つの急性合併症、すなわち、(i)重度の糖尿病性低血糖症、(ii)重度の高血糖症、脱水およびショックの組み合わせからくる無意識、および消耗をきたすのに十分進行した糖尿病性ケトアシドーシス、ならびに(iii)極端な高血糖症および脱水だけで無意識を起こすのに十分である高浸透圧非ケトン性昏睡、の1つの結果である。
【００７３】
「急性病の状況」の被験体は、とりわけ、うっ血性心不全、呼吸器疾患、感染性または炎症性疾患をもつ内科患者、ならびに、手術後、外傷、頭部外傷、火傷および医療集中治療室(ICU)の患者を含む。
【００７４】
本明細書で使用される「抗糖尿病薬(antidiabetic agent)」または「抗糖尿病薬(anti-diabetic agent)」は、血液中のグルコース(糖)のレベルの制御を可能にする(すなわち、血糖管理に役立つ)物質である。抗糖尿病薬の活性は当技術分野で標準の方法によって、例えば、血糖レベルおよび/またはヘモグロビンA1c(HbA1c)レベルに及ぼすその影響を測定することによって、in vitroおよびin vivoで評価することができる。抗糖尿病薬のそれには限定されない例としては、インスリン、インスリン模倣剤、インスリン類似体、ビグアナイド(例えばメトホルミン、フェンホルミン)、メグリチニド(meglitinide)(例えばレパグリニド)、ビグアナイド/グリブリド配合薬(例えばGlucovance(登録商標))、経口血糖降下薬(グルコースレベルを低下させる吸入薬を含む)、インスリン分泌促進物質、インクレチン、インスリン感作物質(例えばメトホルミン、グリタゾン(glitazone)およびチアゾリジンジオン)、α-糖分解酵素阻害薬(例えばアカルボースまたはミグリトール(miglitol))、スルホニル尿素(例えばグリメピリド(glimepiride)、グリブリド、グリクラジド、クロルプロパミドおよびグリピジド)、β細胞分泌促進物質、グルカゴン様ペプチド(GLP-1およびGLP-2)、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP-IV)阻害剤と併用したまたはしないGLP-1類似体(例えば、アシル化GLP-1、CJC-1131、LY307 161SR)、DPP-IV阻害剤、チアゾリジンジオン(例えばトログリタゾン、ロジグリタゾンおよびピオグリタゾン)、PPAR-αアゴニスト、PPAR-γアゴニスト、PPAR-α/γ二重アゴニスト、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤、脂肪酸結合タンパク質(aP2)の阻害剤、ナトリウムグルコース共輸送体2(SGLT2)阻害剤、ならびにグルコース誘導性のインスリン放出を強化する非ステロイド系消炎薬(例えばサリチル酸塩)がある。ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP-4)は、循環Tリンパ球(酵素はCD-26として知られる)上ならびに様々な組織(腸、肝臓、肺、腎臓)内に位置する、膜結合性非古典的セリンアミノジペプチダーゼである。それはある種の内因性ペプチド(GLP-1(7-36)、グルカゴン)のin vivoでの代謝切断を担い、様々な他のペプチド(GHRH、GIP、NPY、GLP-2、VIP)に対するタンパク分解性活性をin vitroで示した。
【００７５】
本明細書で使用される用語「被験体でインスリン投与と関連する低血糖症を減少させること」は、インスリン投与に起因する低血糖症に被験体をさらすことを防止、最小化または回避することを指し、そのような防止、低減または最小化は、例えば、その後被験体のインスリンに対する更なる必要/要求を低減または除去する非インスリン治療を被験体に提供することにより、達成することができる。
【００７６】
「正常なインスリンレベル」は、生理的に正常なインスリンレベル、ならびに、抗糖尿病薬による治療を含む、いかなる作用物質による治療によって達成された正常なインスリンレベルも含む。
【００７７】
本明細書で使用される用語「インスリン」は、それらに限定されないが以下の種、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ニワトリ、カモまたはクジラを含む、任意の種のインスリンを意味する。インスリンは天然、合成または遺伝子操作されたものでもよく、また、単量体および/またはポリマー(例えば六量体)、レンテ(lente)インスリンおよび/または中性プロタミンハーゲドーン(NPH)インスリンでもよい。
【００７８】
本明細書で使用される用語「インスリン類似体」は、1つまたは複数のアミノ酸が置換されているがインスリン活性の一部または全部が保持されているインスリンを意味する。それは、脂肪酸でアシル化されたインスリン、例えばGuthrie, R. Clinical Diabetes 19:66〜70(2001))で記載されているものも含む。当業者ならば理解するように、インスリン類似体は様々な手段で得ることができる。例えば、受容体、抗体の抗原結合性領域または基質分子上の結合部位などの構造とのインタラクティブ結合能をあまり低下させずに、インスリン構造中の他のアミノ酸をある種のアミノ酸で置換することができる。インスリンのインタラクティブ能力および性質がその生物学的機能活性を定義するので、アミノ酸配列内である種のアミノ酸配列の置換を実行することができ、結果として生じるタンパク質は類似した特性を有するポリペプチドのままである。インスリン類似体のそれには限定されない例としては、インスリングラルギン(glargine)、インスリンLys-Pro/リスプロ(lispro)(例えば、Humalog(登録商標);Eli Lilly and Company)、インスリンデテミール(detemir)、インスリンアスパルト(aspart)(例えば、NovoLog(登録商標);Novo Nordisk、Princeton、NJ)、NN304(ε-LysB29-ミリストイル(myristoyl)、デス[B30]ヒトインスリン)、および脂肪酸で修飾された[Ne-パルミトイルLys(B29)]-ヒトインスリンがある。
【００７９】
本明細書で使用される用語「インスリン模倣薬」または「インスリン模倣剤」は、インスリン受容体と反応(および、それによって、インスリン作用を模倣)して、血糖レベルの低下および/またはインスリン感受性の増加に導く分子を指し、そのいくつかは合成分子である。そのような化合物のそれらには限定されない例は、Srivastava AKおよびMehdi MZ.、Diabet Med. 22(1):2〜13(2005)で見ることができ、そのいくつかはセレニウム、スルホニル尿素(例えばAmaryl)またはバナジウムを含む。インスリン模倣薬は様々な薬物動態学的活性および生物学的利用能のプロフィールを有することができ、短時間作用性および持続性の化合物を含む。
【００８０】
「インスリン分泌促進物質」は、内因性のインスリン分泌を増加させる薬剤である。内因性のインスリン分泌は、例えば、その細胞発現の間のプロインスリン処理の生成物である、血液中の内因性循環インスリンC-ペプチドのレベルを測定することによって評価することができる。一部のインスリン分泌促進物質は、膵臓β細胞の表面のK/ATPチャンネルに働きかけることによって働く。それらは、可能性としてはグルコース濃度依存性などの多くの側面で異なり、また、短時間であるが迅速に作用するものがあればより緩効的であるがより長く作用するものもある。インスリン分泌促進物質としては、スルホニルウレア、メグリチニド(meglitinide)およびD-フェニルアラニン誘導体、迅速作用性インスリン分泌促進物質ナテグリニド(nateglinide)およびレパグリニド、などがある。
【００８１】
「同時分泌因子」は、他の分泌タンパク質または因子と同時に、またはほとんど同時に分泌される分子である。分泌されたタンパク質は、一般に、分泌先導体、シグナルペプチドまたはリーダー配列の結果として、小胞体(ER)、分泌小胞または細胞外空間に誘導することができる。それらがシグナル配列を含むかどうかに関係なく、それらを、例えばエキソサイトーシスまたはタンパク分解性切断によって、細胞外空間に放出することができる。分泌されたタンパク質は、ある状況では、処理を経て成熟ポリペプチドになることができる。分泌されたタンパク質は、ポリペプチドのアミノ末端に位置して切断部位に伸長しているアミノ酸残基のリーダー配列を含むことができ、それらは、タンパク分解性切断の後に、成熟タンパク質の形成をもたらす。リーダー配列は、それがその遺伝子によってコードされているのでそのタンパク質に内因性である配列でよく、または、それは、成熟タンパク質をコードする配列と作動可能的に結合した、他のタンパク質からのリーダー配列(すなわち異種シグナル/リーダー配列)でもよい。
【００８２】
本明細書の記載は、本発明の作製方法および使用方法の詳細を当業者に提供するために提示されるものであり、発明者が彼らの発明と考えるものの範囲を限定するものではなく、また、提示した実験が全てであること、および実施した唯一の実験であることを示すものでもない。
【００８３】
本発明はその具体的な実施形態に関して記載されているが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更を加えることおよび同等物で置換することができることは、当業者によって理解されるはずである。加えて、特定の状況、材料、物質組成物、方法、処理工程を本発明の目的、精神および範囲に適応させるために、多くの修正を加えることもできる。そのような修正の全ては、本明細書に付属する特許請求の範囲内であるものとする。
【００８４】
特に定義されていない場合、本明細書で用いる全ての専門用語および科学用語の意味は、本発明が属する技術分野の専門家が通常理解するものである。
【００８５】
値域に関しては、文脈上明らかに別の指示がない限り、本発明は下限の単位の少なくとも1/10まで、その範囲の上下限の間の各中間値を含む。さらに、本発明は明示された他のいかなる中間値も含む。さらに、明示された範囲から特に排除されない限り、本発明は範囲の上下限の一方または両方を含む範囲も包含する。
【００８６】
本明細書と添付の請求項で使われているように、単数形「a」、「or」および「the」は、文脈上明らかに別の指示がない限り、複数体を含むことに注意する必要がある。したがって、例えば「対象ポリペプチド」と言うときは、複数のそのようなポリペプチドを含み、「作用物質」と言うときは、当業者に公知の1つまたは複数の作用物質およびその同等物への言及も含み、その他同様である。
【００８７】
さらに、本明細書中で用いる成分の量、反応条件、純度百分率、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド長、その他を表す全ての数字は、特に明記しない限り用語「約」によって修飾される。したがって、本明細書および請求項で示す数的パラメータは、本発明の所望の特性によって変動する可能性のある近似値である。少なくとも、均等論の適用を制限しようとするものではないが、各数的パラメータは少なくとも報告されている有効数字の数字を考慮し、通常の四捨五入の手法を適用して解釈しなければならない。それにもかかわらず、具体的な実施例で示す数値は、できるだけ正確に報告されている。しかしいかなる数値も、その実験測定値の標準偏差からの一定の誤差を本質的に含む。
【００８８】
本明細書は引用文献に照らして最も完全に理解されるが、その全ては本明細書で参照により完全に組み込まれている。
【００８９】
B.グルコースの取り込み、処理および代謝の調節
B.1.インスリン応答性組織および細胞によるグルコースの取り込み
通常、骨格筋はインスリン促進状態の下でのグルコース取り込みの主要な部位であり、グルコース注入後のグルコース処理の約75%を占める。インスリン応答は、細胞表面でのインスリン受容体への結合およびその活性化を通して開始される。一旦活性化されると、インスリン受容体はインスリン受容体基質(IRS)を含むいくつかのシグナル伝達タンパク質をリン酸化する。
【００９０】
インスリン受容体の活性化の後に、多くの下流事象が起こる。究極的に、筋肉中のグルコース取り込みは細胞表面へのグルコース輸送物質(GLUT4)の転流によって達成されるが、それはIRSによるホスホイノシチド3-キナーゼ(PI3K)の活性化を含む。II型糖尿病患者において、骨格筋はインスリンに効果的に応答せず、インスリン抵抗性になる。報告によると、この抵抗性はインスリンシグナル伝達経路の欠陥に一部起因し、これらの欠陥のいくつかは可逆的のようである。ゆえに、II型糖尿病患者において、グルコース調節における重大欠陥の1つは、インスリン刺激後の骨格筋内のグルコース輸送レベルの低下である。
【００９１】
現在では、チアゾリジンジオンが、骨格筋へのグルコース取り込みを促進するインスリン感作物質の唯一の薬剤類である。しかし、チアゾリジンジオンは一部の患者で、肝毒性、体液貯留および心不全の憎悪の可能性を引き起こす。
【００９２】
B.2.細胞によるインスリン非依存性グルコース取り込み
インスリン媒介性グルコース取り込み(IMGU)に加えて、ヒトにおけるグルコースの取り込みおよび処理は、インスリン非媒介性グルコース取り込み(NIMGU)の結果としても起こる。正常な個体では、正常血糖条件下のグルコース処理の約75%は、NIMGUの結果として主に中枢神経系において、また、より低い程度で、内臓床、血液細胞、末梢神経および骨格筋などの他の組織において起こる(Meneilly他、Diabetes Care 24:1951〜1956(2001)、およびその中の参考文献を参照)。高血糖条件下では、骨格筋で起こるNIMGUの割合はかなり増加し、グルコース処理全体に対するNIMGUの量的重要性は、IMGUの量的重要性に類似する。インスリン抵抗性状態、例えば糖尿病では、食後のグルコース取り込みの約80%は、NIMGUの結果として起こる。しかし、インスリン非媒介性グルコース処理の機構は、ほとんど知られていない。
【００９３】
骨格筋では、インスリンシグナル伝達の欠如を補償することができる、グルコース取り込みの少なくとも2つの代替経路があるようであり、これにはIgf1r媒介性経路(Shefi-Friedman L他、Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 281:E16〜E24(2001))および収縮活性化シグナル伝達(Wojtaszewski JF他、J. Clin. Invest. 104:1257〜64(1999))が含まれる。GLUT4転位を調節して、インスリンとは独立して筋肉でのグルコースの取り込みおよび利用に導く、少なくとも2つの代替経路がある。収縮は、AMP活性化キナーゼの活性化を通してのGLUT4転位への、強力なトリガーである。筋肉内のIgf1rは、IRSタンパク質およびPI3-キナーゼを通して、Aktおよび他のイノシトール三リン酸(PIP3)依存性キナーゼ、例えばPKCアイソフォームの活性化を通したGLUT4転位を刺激するように、シグナル伝達する。
【００９４】
C.インスリンシグナル伝達経路に及ぼす影響のハイスループットスクリーニング
培養細胞は電気的に活性であり、それらの電気抵抗は、マイクロエレクトロニクスのセンサーを備えているアッセイウェルで細胞を成長させることで測定することができる。市販の細胞-電極インピーダンス測定系は、ACEA Bioscience, Inc.、(San Diego、CA)からのリアルタイム細胞電子システム(RT-CES(商標)システム)である。このシステムは、インピーダンスアナライザーに連結した集積マイクロエレクトロニクスセンサー付きの多重ウェル組織培養プレートを含み、それは次に、コンピュータに連結される。それは、米国特許出願公開US 2004/0152067 A1で記載されている。ウェル内の細胞または液体がセンサー内の電極に接続されると、インピーダンスアナライザーは電極上に加えられる交流電圧から生じるインピーダンスを測定する。ウェル内に接種された細胞は電極に付着して、電極間の抵抗を変化させる。例えば、その受容体へのリガンドの結合によるシグナル伝達経路の刺激によって引き起こされる細胞の電気抵抗の変化は、インピーダンスの変化として測定される(Abassi他、J. Immuno. Meth., 292:195〜205(2004);Giaever他、Proc. Nat'l. Acad. Sci., 81:3761〜3764(1984))。
【００９５】
細胞増殖、細胞毒性および受容体-リガンド相互作用を監視するために、インピーダンス測定システムが用いられた。RT-CESシステムは、微小電極に付着している細胞から生じるインピーダンスの標準化された変化を計算して、ベースライン読取値を提供する。リガンド添加後の細胞の電気的応答は、試験するリガンドを培養ウェルに加えることによって、リアルタイムで測定することができる(Abassi他、J. Immunol.、meth. 292:195〜205(2004))。ACEA Bioscience, Inc.(San Diego、CA)から市販されているリアルタイム細胞-電極インピーダンス測定システム(RT-CES(商標)システム)の全操作段階を、図1および図2で示す。
【００９６】
本発明は、RT-CES(商標)システムにより一般に用いられる方法の、更なる修飾によって得られた結果を提供する。一般には、因子を細胞に加えた後に細胞指数の変化だけを測定するのではなく、代わりに細胞を試験因子と一緒に24時間インキュベートし、その後インスリンを加え、応答について細胞指数を監視した(図2)。
【００９７】
D.インスリンシグナル伝達経路に及ぼす影響を評価するためのハイスループットスクリーニング法を用いることによるインスリンモジュレーターとしてのErbBリガンドの同定
「実施例」のセクションでさらに記載されるように、上述の変更されたインピーダンスアッセイを用いて、いくつかの化合物がインスリンシグナル伝達経路およびグルコース取り込みに影響を及ぼすと特定された。これらの化合物の1つは、ErbBリガンドファミリーのタンパク質である、ベータセルリンである。このように、本発明はErbBリガンドポリペプチド、ならびにグルコース輸送障害および/または代謝障害から(少なくとも一部)生じる高血糖症、糖尿病および疾患を治療するために、ErbBリガンドポリペプチドを用いる方法に関する。本発明は、従って、ErbBリガンドポリペプチドを含む組成物および組成物の医薬用配合物、ならびにグルコース取り込みを刺激するためのそのような組成物の使用方法を提供する。
【００９８】
D.1. ErbB受容体およびErbBリガンドタンパク質ファミリー
ErbB受容体のためのリガンドのファミリー(本明細書で「ErbBリガンドファミリー」と呼び、そのメンバーはErbBリガンドと呼ぶ)は、ウイルスのerb遺伝子の細胞相同体から名づけられているが、翻ってそれは、当初、赤芽球を転換する能力を有すると確認された7複製欠陥白血病ウイルス(DLV)株の最初の3つのRNAの1つである(名前erbはそれに由来する)(Roussel, M.他、Nature、281:452〜5(1979))。
【００９９】
上皮成長因子(EGF)は、ErbBリガンドファミリーの原型メンバーである。EGFは、ヒトEGF-受容体1(HER1/ErbB1/EGFR)チロシンキナーゼと結合する。構造的にHER1(ErbB1)に類似した受容体をコードする他の3つの哺乳動物遺伝子が同定され、HER2(またはErbB2)、HER3(またはErbB3)およびHER4(またはErbB4)と命名された。ErbBリガンドが共有するものはEGFドメインであり、3つの分子内ジスルフィド結合(C1からC3、C2からC4、およびC5からC6)を形成する、6つの空間的に保存されたシステイン(C)残基(CX7 CX4-5 CX10-13 CXCX8 C)のコンセンサス配列である。EGFは、EGFドメインの6つのコピーを含む。他のErbBリガンドファミリーメンバーは1つだけを含み、1EGFドメインがHER/ErbBへの結合およびその活性化に必要かつ十分である。創傷治癒を促進するそれらの能力に加えて、ヒトの遺伝子研究および動物モデルにおける標的突然変異は、EGF/HER複合ファミリーが他の複数の生物過程における重要なプレーヤーを含むことを示す。例えば、EGFは胚形成の間、ニューロンおよび上皮の系統の分化を決定し、一部の変異体は報告によると精神分裂症と関連するが、HERの持続的および不適切な自己活性化は、報告によると、上皮細胞の生存および増殖ならびにかなりの割合の肺および乳房の腫瘍における血管形成を促進するシグナル伝達経路を媒介する。
【０１００】
現在では、哺乳類のEGFリガンドファミリーは、3群のタンパク質を含む。第1群のメンバーは、HER1/ErbB1を単独発現する細胞を活性化することができる。これらは、EGF(Savage他、J. Biol. Chem.、247:7612〜7621(1972))、トランスフォーミング成長因子α(TGF-α)(Marquardt他、Science、223:1079〜1082(1984))、エピゲン(Epigen)(Strachan L.他、J Biol Chem. 276:18265〜18271(2001))、およびアンフィレグリン(amphiregulin)(Shoyab他、Science、243:1074〜1076(1989))である。第2群のメンバーはHER1/ErbB1またはHER4/ErbB4を単独発現する細胞を活性化することができ、例えば、ヘパリン結合EGF様成長因子(HB-EGF)(Higashiyama他、Science、251:936〜939(1991))、エピレグリン(epiregulin)(Toyoda他、J. Biol. Chem.、270:7495〜7500(1995))およびベータセルリン(BTC)(Shing他、Science、259:1604〜1607(1993))がある。第3群は最も大きく、そのメンバーはHER3/ErbB3またはHER4/ErbB4受容体を単独発現する細胞を活性化することができる。この群はニューレグリン(neuregulin)(NRG)サブファミリーを含み、ヒトにおいてそれは4つの遺伝子、すなわちNRG1(Marchionni他、Nature、362:312〜318(1993)、NRG2(Higashiyama他、J. Biochem. 122(3):675〜80(1997);Chang他、Nature、387:509〜512(1997);Carraway他、Nature、387:512〜515(1997))、NRG3(Zhang他、Proc. Natl. Acad. Sci.(USA)、94:9562〜9567(1997))およびNRG4(Harari他、Oncogene、18:2681〜2689(1999))の生成物である。直接的HER2/ErbB2リガンドは現在まで全く同定されていないが、HER2/ErbB2は、報告によると、他のHERファミリーメンバーとのヘテロ二量体化の後に、NRGおよびBTCによって間接的に活性化される(Harris, C.R.他、Exp. Cell Res.、284:2〜13(2003))。
【０１０１】
D.2.ベータセルリン
上記したように、ベータセルリンは、発明者らが細胞性インスリン応答のモジュレーターとして同定した、ErbBリガンドタンパク質の1例である。ベータセルリンは、膜貫通前駆体分子として翻訳され、タンパク質加水分解的に成熟した細胞外の可溶性形態に切断される、I型膜タンパク質である(詳細は、実施例41を参照)。プロテアーゼADAM10は、可溶性形態へのベータセルリンの脱皮を完遂させることができる(Sanderson M.P.他、J. Biol. Chem.、280:1826〜1837(2005))。ベータセルリンは、主にモノマーとして存在する。その分子は、Aループ、BループおよびCループを含む構造に折り畳まれる。Cループは、受容体結合に関係する。可溶性の成熟ベータセルリンは、80個のアミノ酸を含む。ヒトのベータセルリン遺伝子は、第4染色体上のバンド4q13-q21に位置する。
【０１０２】
ベータセルリンは1つのEGF様ドメインを含み、そのカルボキシル末端はトランスフォーミング成長因子アルファ(TGF-α)と約50%の相同性を有する。ベータセルリンは上皮成長因子受容体に作用するものの、腸の上皮細胞内でそれが作用する可能性のある正確な受容体は不明であるが、おそらくErbB1またはErbB4であろう(Jones, J.T.他、FEBS Letters、447:227〜231(1999))。類似した役割がニューレグリン1(別名、ヘレグリン(heregulin)ベータ1)について報告されており、それもErbBリガンドである(Uarez, E.他、J. Biol. Chem.、18257〜18264(2001))。
【０１０３】
本明細書で発明者らは、ベータセルリンが、グルコース取り込みを続けて促進する筋細胞(例えば骨格筋および心筋)、生存、アポトーシスの抑制、ユートロフィンの発現、筋肉質量の増加および他の同化活動に対する直接効果、ならびに/またはインスリンレベル、またはこれらの活動全ての組み合わせに対する直接効果を有することを見出し、その全てはそのようなタンパク質の、従来記載されているいかなる使用とも異なる。
【０１０４】
E.分子、組成物、それらの治療的適用および使用方法
E.1.血糖管理のためのならびにグルコース輸送および/またはグルコース代謝に関する疾患を治療するためのErbBリガンドの使用
健康な個体では、膵臓ランゲルハンス島のβ細胞がインスリンを産生し、それはグルコース代謝のために体が必要とし、血中グルコース濃度の増加(例えば、食後の増加、食後の期間とも称される)に応じて分泌される。インスリンは細胞によるグルコースの取り込みならびに流入グルコースの代謝を促進し、肝臓によるグルコースへのグリコーゲンおよび脂質の変換を一時的に停止することによって、体が食間の代謝活動を助けることを可能にする。しかし、I型糖尿病患者はβ細胞破壊(例えば自己免疫疾患)のためにインスリンを産生する能力が低下しているかまたは全くなく、したがって、毎日の多回の投与(例えば注射またはインスリンポンプ)を通してインスリンを補充する必要がある。II型糖尿病はI型糖尿病より普通に見られ、インスリン抵抗性および膵臓β細胞の進行性の機能障害を特徴とする。II型糖尿病患者はインスリンをまだ産生することができるが、インスリン補充療法を必要とすることもある。インスリン抵抗性は、疾患の進行および糖尿病の多くの合併症、例えば心疾患、筋肉消耗および神経障害への主要な寄与因子である。インスリン抵抗性は、少なくとも一部、インスリンシグナル伝達経路の機能不全のために起こる。
【０１０５】
II型糖尿病患者は、一般的に血糖レベルの増加に対して遅延された反応を示す。正常者が通常食物摂取後2〜3分以内にインスリンを放出するのに対して、II型糖尿病患者は摂取後数時間の間、内因性のインスリンを分泌することができない。その結果、内因性のグルコース産生は摂食後も継続し(Pfeiffer、Am. J. Med.、70:579〜88(1981))、患者は上昇した血糖レベルのために高血糖症になる。
【０１０６】
初期のII型糖尿病患者のほとんどは、現在、経口剤で治療されるが、結果はあまりよくない。インスリンの皮下注射も、インスリンをII型糖尿病患者へ提供するのに有効なことはまれであり、実際、作用開始の遅延、変動性および浅さのため、インスリン作用を悪化させることもある。しかし、インスリンが食事と静脈内投与されると、初期のII型糖尿病患者は肝臓のグルコース生成の所望の停止を経験し、生理的グルコース管理の向上を示すことがわかった。さらに、彼らの遊離脂肪酸レベルは、インスリン療法なしの場合よりも速く低下する。おそらくII型糖尿病を治療するのに有効であろうが、患者が毎食事に静脈内にインスリンを投与することは安全でも実行可能でもなく、インスリンの静脈内投与はおそらく無効な解決策である。
【０１０７】
インスリンは多角的な作用を有し、低血糖症を引き起こすことからだけでなく他の生物学的作用を通しても、有害な結果を誘導することがある。しかし、骨格筋グルコース取り込みを増加させることができる他のタンパク質治療薬は、現在までわずかしか特定されていない。ゆえに、本発明は、インスリン受容体に依存的におよび/または独立してグルコース取り込みを増加させることができる分子(例えばErbBリガンド)が、インスリンに抵抗性であるかまたはインスリン感受性の障害を有するII型糖尿病患者に有益となることができることを示す。I型糖尿病患者もそのような分子から恩恵を受けるが、その理由は、たとえ彼らの筋細胞がインスリンに応答性であるとしても、インスリンまたは他の糖尿病薬の副作用が望ましくなく、しばしば危険でさえあるからである。インスリンとは独立にグルコースの取り込みを増加させることによって、I型糖尿病患者は抗糖尿病薬(例えば血糖管理のための作用物質)の必要性を減少させ、したがって、それらの作用物質と関連する罹患率を低下させるであろう。
【０１０８】
糖尿病は、肥満とともに代謝障害であるからして、筋肉消耗を伴う可能性がある。さらに、糖尿病の末期腎臟病患者は筋肉消耗をより患いやすく、入院のリスクが高いと報告されている。糖尿病の存在は、腎臓補充療法における除脂肪体重減少の最も有意な独立予測因子である(Pupim、L.B.他、Kidney Int.、68:2368〜2374(2005))。ゆえに、彼らの血糖管理を改善し、かつ/または彼らの糖尿病を治療することによって、この患者集団で筋肉消耗を改善することが有利であろう。
【０１０９】
さらに、筋肉消耗は、癌患者、筋ジストロフィーまたはサルコペニアを患う患者など、老齢集団の他の被験体で起こる。悪液質は癌患者のほぼ半分に影響を及ぼし、食欲不振、筋肉消耗、体重減少、早期の満腹、疲労、および障害性の免疫応答の臨床症状を引き起こすと報告された。悪液質は報告によると食事摂取量の増加によって回復されず、単なるカロリー欠乏症より複雑な機構を意味する。この患者集団において筋肉消耗を予防または改善することができるならば、それは有利であろう(Esper, D.H.およびHarb, W.A.、Nutr. Clin. Pract.、20:369〜376(2005))。
【０１１０】
このように、本発明はポリペプチド配列を含むErbBリガンドを提供し、そのポリペプチドはベータセルリン(BTC)、上皮成長因子(EGF)、Epigen、アンフィレグリン(AR)、トランスフォーミング成長因子アルファ(TGF-α)、ヘパリン結合EGF(HB-EGF)、エピレグリン(EPR)またはニューレグリン(NRG-1、NRG-2、NRG-3もしくはNRG-4)、またはこれらのいずれかの活性変異体もしくは断片である。これらのポリペプチドのいくつかは、配列番号4〜6、11、13、18〜24、27〜89に記載されている配列を含むものである。
【０１１１】
一実施形態では、ErbBリガンドは、筋細胞(例えば骨格筋、心筋、平滑筋細胞)によるグルコース取り込みを強化し、すなわち、ErbBリガンドは、筋細胞(例えば骨格筋、心筋、平滑筋細胞)へのグルコース取り込みの増加を引き起こす。
【０１１２】
一実施形態によると、ErbBリガンドの活性は、細胞をインスリンに感作させること、換言すると、インスリンに対する細胞の感受性を増加させることを含むこともできる。ゆえに、例えば、インスリンに対する細胞の感受性は、ErbBリガンドへの曝露時/曝露後に増加することができ、その場合、所定量のインスリンへの細胞応答は同量のインスリンへの細胞応答の前の測定値と比較して増加する。
【０１１３】
一実施形態では、ErbBリガンドは治療した被験体でインスリンレベルを低下させ、被験体のインスリンの必要性を低減することができる。
【０１１４】
他の実施形態では、ErbBリガンドは筋細胞(例えば骨格筋、心筋、平滑筋細胞)によるアミノ酸取り込みを向上させる。
【０１１５】
一実施形態では、ErbBリガンドは、筋細胞(例えば骨格筋の、心筋、平滑筋細胞)でユートロフィン発現を上方制御する。
【０１１６】
一実施形態によると、ErbBリガンドは、(i)ErbBリガンドの活性を含む第1の分子、および(ii)被験体で第1の分子に延長された半減期を与える第2の分子を含む、持続性のErbBリガンドである。
【０１１７】
一実施形態によると、この持続性のErbBリガンドの第1の分子は、ErbB1またはErbB4受容体などのErbB受容体と相互作用する。相互作用とは、2つの分子が生理的条件下で相対的に安定である複合体を形成することを意味する。さらに、ErbB1受容体およびErbB4受容体などのErbB受容体は、1つまたは複数のErbBリガンドおよび/またはその断片と特異的に相互作用する受容体である。
【０１１８】
一実施形態では、持続性のErbBリガンドは、第1の分子の半減期よりも少なくとも0.5時間、または1時間、または2時間、または3時間、または4時間、または5時間長い、延長された半減期を被験体で有する。
【０１１９】
一実施形態では、持続性のErbBリガンドの第2の分子は、ポリマー、ポリペプチド、スクシニル基またはアルブミン分子を含む。
【０１２０】
一実施形態では、ポリペプチドはFc分子の一部を含む。
【０１２１】
一実施形態では、アルブミン分子は、アルブミン、アルブミンの1つまたは複数の断片、アルブミンと結合するペプチド、脂質とコンジュゲートする分子、またはアルブミンと結合する他の分子を含む。一実施形態では、結合するとは、2つ以上の分子が、生理的条件下で相対的に安定である複合体を形成することを意味する。言い換えると、分子は、生理的条件下で相対的に安定であるアルブミンとの複合体を形成する。コンジュゲート体は、共有結合または非共有結合により、他の分子に結合する分子を含むと定義される。一実施形態では、例えば、アルブミン分子は脂質分子に結合する。この文脈で用いられる表現「アルブミンと結合する他の分子」は、アルブミンと結合する、ペプチド以外の任意の分子を指す。
【０１２２】
一実施形態では、ポリマーはポリエチレングリコール部分(PEG)を含む。任意選択で、ポリエチレングリコール部分は、分岐鎖または直鎖のポリマーである。さらに、ポリマー(例えばPEG)が直接的または間接的に、ポリペプチドと共有結合で結合しているとしても、そのような共有結合は恒久的または一時的/可逆的であることができる。
【０１２３】
一実施形態では、被験体への持続性ErbBリガンドの投与時に、ポリマーはポリペプチド(すなわち薬剤)から放出される。そのような放出の動態および条件は、血漿、細胞および組織のpH、レドックス電位、などの生理的および病理学的パラメータによって変動する可能性がある。一時的または可逆的に薬剤を、例えばポリペプチドベースの薬剤をPEG化する方法のそれには限定されない例は、米国特許第4,935,465号(1990年6月19日に公布)および6,342,244号(2002年1月29日に公布)、ならびに米国特許出願公開US2006/0074024で提供される。当業者は、一般的に、PEGベースの試薬に関する更なる詳細を、例えば、国際出願公開2005047366、米国特許出願公開2005171328、およびNEKTAR PEG Reagent Catalog(登録商標)2005〜2006(Nektar Therapeutics、San Carlos、CA)に記載されているものの中で見つけるであろう。
【０１２４】
一実施形態では、持続性ErbBリガンドの第2の分子は、オリゴマー化ドメインを含む。一実施形態では、持続性ErbBリガンドの第2の分子は、リソソーム中に改善された受容体結合を有する分子を含む。改善された受容体結合とは、単独のErbBリガンドと比較して強化された受容体への結合(すなわち増加した親和性または親和力)を指す。
【０１２５】
ベータセルリン:発現および精製
一実施形態では、ErbBリガンドはベータセルリンである。一実施形態では、ベータセルリンは、修飾されているかまたは修飾されていない、単離されたヒトベータセルリン、任意選択でヒトベータセルリンの活性断片である。修飾としては、大腸菌などの原核生物の発現系での発現の促進のための、N末端メチオニン残基の付加を挙げることができる。当業者は、いくつかのベータセルリン産生方法に精通している。一実施形態では、Cooperative Research Centre for Tissue Growth and Repair、CSIRO Health Sciences and Nutrition、Adelaide、AustraliaのDunbarら(Dunbar, A.J.他、J. Mol. Endo. 27:239〜247(2001))によって、およびFolkmanおよびShingによって米国特許第5,328,986号で記載されているように、組換えラットベータセルリンを精製することができる。例えば、ラットのベータセルリンは、切断可能な融合タンパク質の手法を用いて大腸菌で発現させ、それから精製することができる。不溶性融合タンパク質は封入体として収集し、還元条件下で尿素で溶解し、再び折り畳み、ゲル濾過クロマトグラフィーおよびC4 RP-HPLCによって精製することができる。ベータセルリンの完全長および末端切断断片は、因子Xaで融合タンパク質をタンパク質加水分解的に切断することによって得ることができる。生物学上活性な断片は、ヘパリン-アフィニティークロマトグラフィーによって完全長ベータセルリンから分離することができる。
【０１２６】
一実施形態では、ベータセルリンは哺乳動物の細胞(例えばCHO細胞、293細胞、PerC6(登録商標)細胞(Crucell、Netherlands))で発現することもできる。他の実施形態では、ベータセルリンは哺乳動物の組織から単離することができる。ベータセルリンは膵臓、小腸、腎臓および肝臓組織を含むいくつかの組織型によって、ならびにマウスベータ腫瘍およびMCF-7細胞系を含む腫瘍細胞型によって合成されると報告された(Sasada, R.他、Biochem. Biophys. Res. Comm. 190:1173〜1179(1993))。高レベルの発現が、膵臓および小腸で観察された。
【０１２７】
DNA突然変異およびアミノ酸配列変異体
本発明はさらに、本発明のErbBリガンドの部分、類似体または誘導体をコードする、本発明の核酸分子の変異体に関する。
【０１２８】
ゆえに、本発明のErbBリガンドの断片、誘導体または類似体のそれには限定されない可能な例は、(i)アミノ酸残基の1つまたは複数が1つまたは複数の保存されたまたは保存されていないアミノ酸残基で置換され、そのような置換されたアミノ酸残基は遺伝子コードによってコードされたものであってもそうでなくてもよいもの、(ii)アミノ酸残基の1つまたは複数が置換基を含むもの、(iii)成熟したポリペプチドが他の化合物、例えばポリペプチドの半減期を延長させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)と融合されているもの、あるいは(iv)更なるアミノ酸が上記形態のポリペプチドに融合されているもの、例えばIgG Fc融合領域ペプチド、リーダーもしくは分泌配列、上記形態のポリペプチドの発現もしくは精製のために使用される配列、またはプロタンパク質配列である。そのような断片、誘導体および類似体は、本明細書の教示から当業者の守備範囲内であると考えられる。
【０１２９】
一実施形態では、ErbBリガンド変異体は天然のものでよく、それにはスプライス変異体(例えば、Ogata, T.他、Endocrinology 146:4673〜81.(2005);Dunbar AJおよびGoddard C.、Growth Factors 18:169〜75(2000)を参照)ならびに天然の対立遺伝子変異体が含まれる。対立遺伝子の変異体は、例えば、Genes II、Lewin, B.編、John Wiley & Sons、New York(1985)で記載されている、ある生物体の染色体上の与えられた遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替形態の1つ、および組み換え生成物を含む。一実施形態では、非天然の変異体は、当技術分野で公知である突然変異誘発技術を用いて産生することもできる。
【０１３０】
したがって、一実施形態では、対立遺伝子の変異体としては、ヌクレオチドの置換、欠失または付加によって産生されるものがある。置換、欠失または付加は、1つまたは複数のヌクレオチドを含むことができる。変異体は、コード領域、非コード領域または両方で変化させることができる。コード領域の変更は、保存的または非保存的なアミノ酸の置換(下記でより詳細に議論される)、欠失または付加を生じさせることができる。これらは、記載されているErbBリガンドまたはその部分の特性および活性を変化させない、サイレント置換、付加または欠失の形態をとることができる。
【０１３１】
一実施形態では、本発明は切断されたシグナルペプチドまたはリーダー配列を有するものを含む、成熟したErbBリガンドをコードする核酸分子を提供する。一実施形態は、本発明のErbBリガンド(例えばベータセルリン)の1つまたは複数、またはそのようなリガンドの1つまたは複数の生物学的に活性な断片と少なくとも70%同一、少なくとも80%同一、少なくとも90%同一、または少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を含む。
【０１３２】
一実施形態では、ErbBリガンドの生物学的に活性な断片は、天然分子の構造的、調節的もしくは生化学的な機能を、または、細胞の、代謝的な、もしくは生理的な過程に関係または関連する任意の機能を有するものである。生物学的に活性なポリヌクレオチド断片は、本発明のポリヌクレオチドの活性に類似しているが必ずしもそれと同一でない活性を示すものである。
【０１３３】
一実施形態では、生物学的に活性なポリペプチドまたはその断片は、生体反応、例えば、それらに限定されないが、1つまたは複数のErbB受容体の活性化に関与すること、筋細胞でヒト骨格筋細胞のインピーダンスを上昇させること、インスリンに対する細胞応答の調整、筋細胞によるグルコース取り込みおよび/またはアミノ酸取り込みの刺激、筋細胞でのユートロフィン発現の上方制御、筋細胞の生存の促進、筋細胞のアポトーシスの抑制、筋肉質量の増加、in vivo血糖管理、ヘモグロビンA1c血漿レベルの調節、または上記のいずれかの組み合わせに関与することができるものがある。他の実施形態では、生物学的に活性なポリペプチドは免疫応答、例えば抗体生成を刺激するエピトープもしくは免疫原の役目を果たすことができるもの、または、免疫応答の調整に関与することができるものがある。一実施形態では、生物的活性は所望の活性の改善または望ましくない活性の減少を含むことができる。
【０１３４】
さらに、他の実施形態において、ある実体は、それがハイブリダイゼーションなど他の分子との分子相互作用に関与するとき、それが病状の軽減で治療価値を有するとき、それが免疫応答の誘導で予防的価値を有するとき、それが、例えば、ポリヌクレオチド分子に特有であると検出することができるか、または、ポリメラーゼ連鎖反応でプライマーとして用いることができるポリヌクレオチドの生物学的に活性な断片などの分子の存在を判断する際に診断上のおよび/または予後の価値を有するとき、生物的活性を証明する。
【０１３５】
ErbBリガンドをコードする参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば、95%同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、そのヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の各100個のヌクレオチドにつき最大で5つの点突然変異を含むことができることを除いて、その参照配列と同一であるものである。言い換えると、少なくとも95%参照ヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のヌクレオチドの最高で5%が欠失するかもしくは他のヌクレオチドで置換されてもよく、または、参照配列中の総ヌクレオチドの5%までの数のヌクレオチドを参照配列に挿入することができる。参照配列のこれらの突然変異は、参照ヌクレオチド配列の5'もしくは3'の末端位置またはそれらの末端位置の間のどこかで、参照配列のヌクレオチドの間で個々に散在して、または参照配列内の1つまたは複数の連続した群として、存在することができる。
【０１３６】
一実施形態では、任意の特定の核酸分子がベータセルリンを含む本発明のErbBリガンドと少なくとも70%、80%、90%または95%同一であるかどうかは、Bestfitプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package、Unix（登録商標）版Version 8、Genetics Computer Group、Madison、WI)のような公知のコンピュータプログラムを用いて、常法により決定することができる。Bestfitは、2つの配列の間で相同性が最高の部分を発見するために、SmithおよびWaterman、Advances in Applied Mathematics 2:482〜489(1981)のローカルホモロジーアルゴリズムを用いる。特定の配列が、例えば、本発明による参照配列と95%同一であるかどうか判断するためにBestfitまたは他の任意の配列アラインメントプログラムを用いる場合、同一性割合が参照ヌクレオチド配列の完全長全体で計算され、参照配列中のヌクレオチドの総数の最高で5%の相同性ギャップが許容されるように、パラメータが設定される。
【０１３７】
一実施形態では、核酸分子の1つまたは複数は、それらが本明細書で記載されているErbBリガンド活性を有するポリペプチドをコードするかどうかにかかわりなく、ベータセルリンを含む本発明のErbBリガンドと少なくとも70%、80%、90%または95%同一である。特定の核酸分子が活性を有するポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者はその核酸分子を、例えばハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プライマーとして用いる方法を知るであろう。活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用としては、とりわけ、cDNAライブラリーで遺伝子またはその対立遺伝子変異体を単離すること、およびVerna他、Human Chromosomes:A Manual of Basic Techniques、Pergamon Press、New York(1988)、で記載されているようにErbBリガンド遺伝子の正確な染色体位置を提供するための中期染色体スプレッドへのin situハイブリダイゼーション(例えば、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH))、および特定の組織でのそれらのベータセルリンmRNAの発現を検出するためのノーザンブロット分析がある。
【０１３８】
他の実施形態では、1つまたは複数の核酸分子は、ErbBリガンド(例えばベータセルリン)の核酸配列と少なくとも70%、80%、90%または95%同一である配列を有し、ポリペプチド活性を有するポリペプチド、すなわち、上で定義されるように、本発明のErbBリガンドの活性に類似するが必ずしも同一でない活性を示すポリペプチドをコードする。一実施形態では、例えば、本発明のErbBリガンドは、筋細胞(例えば骨格筋、心筋、平滑筋細胞)によるグルコースおよび/またはアミノ酸の取り込み、ユートロフィンの発現、またはその両方を刺激することができる。
【０１３９】
他の実施形態では、遺伝子コードの縮重のために、本発明のErbBリガンドの1つまたは複数の核酸配列と少なくとも70%、80%、90%または95%同一である配列を有する多数の核酸分子が活性を有するポリペプチドをコードすることを、当業者は直ちに認めよう。実際、これらのヌクレオチド配列の複数の縮重変異体は同じポリペプチドをコードすることから、上記の比較アッセイを実施しなくても、このことは当業者に明白となる。縮重変異体でない相応な数の核酸分子も活性を有するポリペプチドをコードすることは、当技術分野でさらに認識される。ゆえに、さらに以下に記すように、当業者は、タンパク質機能に影響を及ぼす(例えば、第2の脂肪族アミノ酸で脂肪族アミノ酸を置換する)可能性が低いかまたはないであろうアミノ酸置換を熟知している。
【０１４０】
一実施形態では、本発明のErbBリガンドの特性を向上または変化させるために、タンパク質工学を用いることができる。当業者に公知である組換えDNA技術は、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加または融合タンパク質を含む、新規のタンパク質突然変異体または「突然変異タンパク質」を作製するために用いることができる。一実施形態では、そのような修飾されたポリペプチドは、強化された活性または増加した安定性などの望ましい特性を示すことができる。一実施形態では、そのような修飾されたポリペプチドはより高い収率で精製することができ、少なくともある精製および貯蔵条件の下では、対応する天然のポリペプチドよりも優れた溶解性を示す。一実施形態では、ベータセルリン突然変異タンパク質のそれには限定されない例は、米国特許第6,825,165号で与えられる(例えば、その中で参照される配列番号1、2および38)。
【０１４１】
一実施形態では、本発明は、膜関連タンパク質の細胞外ドメインまたはErbBリガンドのような分泌されたタンパク質の成熟形態を含む多くのタンパク質に関して、生物学的機能を実質的に損なうことなく、1つまたは複数のアミノ酸をN末端またはC末端から除去することができることを提示する。当業者はそのことを知っており、例えばRon他、J. Biol. Chem.、268:2984〜2988(1993)は、3、8または27個のアミノ末端アミノ酸残基が失われていてもヘパリン結合活性を有していた、修飾されたKGFタンパク質を報告した。同様に、生物学的に機能的なC末端欠失突然変異タンパク質の多くの例が知られている。例えば、インターフェロンγは、8〜10個のアミノ酸残基がタンパク質のカルボキシ末端から除去されても、10倍も活性が増加し、例えば、Dobeli他、J. Biotechnology、7:199〜216(1988)を参照。
【０１４２】
一実施形態では、たとえタンパク質のN末端またはC末端からの1つまたは複数のアミノ酸の欠失が、そのタンパク質の1つまたは複数の生物学的機能の変化または低下をもたらすとしても、他の生物的活性をなお保持することができる。ゆえに、短くなったタンパク質の、そのタンパク質の完全なまたは成熟した形態を認識する抗体を誘導し、かつ/またはそれに結合する能力は、完全なまたは成熟したタンパク質の大多数未満の残基がNまたはC末端から除去されても保持されよう。完全タンパク質のNまたはC末端の残基を欠く特定のポリペプチドがそのような免疫活性を保持するかどうかは、本明細書で記載されているか、さもなければ当技術分野で知られている常用の方法で判断することができる。したがって、一実施形態では、本発明は、本発明のErbBリガンドのアミノ酸配列のアミノ末端から1つまたは複数の残基が除去されたポリペプチドを、さらに提供する。
【０１４３】
一実施形態では、タンパク質の構造および機能にあまり影響を及ぼさずに、本発明のErbBリガンドポリペプチドの一部のアミノ酸配列を変化させることができることも、当業者は認めよう。そのような配列の差を企図するならば、タンパク質上に活性を決定する重要な領域があることを記憶しておかなければならない。
【０１４４】
一実施形態では、本発明は、本明細書で記載されている実質的なErbBリガンド活性を示すか、または、以下に記すタンパク質部分などのErbBリガンドの領域を含む、ErbBリガンドの変形形態を含む。そのような突然変異体は欠失、挿入、逆位、反復および型置換を含み、それらは、活性にほとんど影響を及ぼさないように、当技術分野で知られている一般規則によって選択される。例えば、表現型が潜伏性のアミノ酸置換を作製する方法に関するガイダンスは、Bowie, J.U.他、Science、247:1306〜1310(1990)で提供され、そこで著者らは、アミノ酸配列の変化に対する寛容を研究する2つの主な手法があることを示す。第1の方法は、突然変異が自然選択によって受け入れられるかまたは拒絶される、進化の過程に依存する。第2の手法は、クローン化遺伝子の特定の位置でアミノ酸の変化を導入するために遺伝子工学を用い、機能性を維持する配列を特定するために選択またはスクリーニングを用いる。
【０１４５】
タンパク質はアミノ酸置換に驚くほど寛容であると、これらの研究は報告している。著者らは、さらに、どのアミノ酸変化がタンパク質のある位置で許容性を有しそうであるかを示す。例えば、最も埋没したアミノ酸残基は無極性の側鎖を必要とするが、表面側鎖のわずかの機構しか一般に保存されない。他のそのような表現型が潜伏性の置換は、Bowie他、前掲、およびその中の引用文献で記載される。一般的に保存的置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ala、Val、LeuおよびIleの1つの他による置換、疎水性置換Leu、IsoおよびVal、ヒドロキシ残基SerおよびThrの相互交換、酸性残基AspおよびGluの交換、アミド残基AsnおよびGlnの間の置換、塩基性残基Lys、HisおよびArgの交換、芳香族残基Phe、TrpおよびTyrの間の置換、および小アミノ酸置換Ala、Ser、Thr、MetおよびGlyである。
【０１４６】
一実施形態では、ErbBリガンド機能に関係するアミノ酸は、当技術分野で公知である方法、例えば部位特異的突然変異誘発またはアラニン-スキャン突然変異誘発によって特定することができる(例えば、Cunningham, B.C.およびWells, J.A.、Science、244:1081〜1085(1989)を参照)。後者の手法は、単一のアラニン突然変異を導入する。一実施形態では、結果として生じる突然変異分子は、生物的活性、例えば、それらに限定されないが、受容体結合、または筋細胞(例えば骨格筋、心筋、平滑筋細胞)によるグルコース取り込みのin vitroまたはin vivoでの促進、および筋細胞内でのユートロフィン発現の上方制御について、次に試験される。
【０１４７】
一実施形態では、他の荷電または中性のアミノ酸による荷電アミノ酸の置換は、非常に望ましい改善された特性、例えばより少ない凝集性を有するタンパク質を産生することができる。例えば、凝集体は免疫原性である可能性があるので、医薬製剤を調製するとき、凝集は活性を損ねるだけでなく、問題となることもある。Pinckard、R.N.他、Clin. Exp. Immunol.、2:331〜340(1967);Robbins, D.C.他、Diabetes、36:838〜845(1987);Cleland, J.L.他、Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems、10:307〜377(1993)。
【０１４８】
一実施形態では、アミノ酸を置換することは、リガンドの細胞表面受容体への結合の選択性を変えることもできる。例えば、Van Ostade, X.他、Nature、361:266〜268(1993)は、TNF受容体の2つの既知の型の1つだけとのTNF-αの選択的な結合をもたらす、突然変異を記載する。一実施形態では、リガンド-受容体結合にとって重要である部位は、結晶化、核磁気共鳴または光親和性標識化などの構造解析で決定することもできる(例えば、Smith, L.J. et al., J. Mol. Biol., 224:899-904(1992)およびde Vos, A.M. et al., Science, 255:306-312(1992))。
【０１４９】
一実施形態では、これらの一般原理のいくつかをErbBリガンドベータセルリンへ適用して、配列が、アミノ酸位置No. 7、No. 28、No. 69、No. 77、No. 82、No. 93、No. 95およびNo. 104に位置する8つのシステイン残基を含むことに気づく。一実施形態では、本発明は、1つまたは複数のシステイン残基が、例えばセリン残基に突然変異させられた、突然変異ベータセルリン分子を提供する。一実施形態では、これらの構築物は当技術分野で公知の任意の発現に適当なベクター、例えばpTT5-Gベクターにクローニングすることができる。
【０１５０】
他の実施形態では、これらの突然変異タンパク質を分析することはベータセルリンのジスルフィド結合パターンの理解を提供し、例えば哺乳動物細胞からの改善された発現および分泌、精製されたタンパク質の凝集の減少、ならびに、大腸菌で発現させたときの、活性組換えベータセルリンを産生する能力などの、改善された特性を有するタンパク質を特定することができる。
【０１５１】
融合ポリペプチド
上記のように、発明者らはベータセルリンが筋細胞へのグルコースおよびアミノ酸の取り込みを増加させ、異なる疾患、例えばI型およびII型糖尿病の治療に適用できることを見出した。したがって、より持続するin vivo活性を生み出すためにin vivoでのベータセルリンの半減期を増加させることが望ましい。遺伝子操作技術は、望ましい薬物動態特性を与える融合パートナーと組み合わせた、組換えタンパク質治療薬の開発および使用を可能にした。融合分子を作製するために、いくつかの異なる融合パートナーを用いた。例えば、合成ヘムタンパク質と融合させた組換えヒト血清アルブミンは、可逆的に酸素を運ぶことが報告された(Chuang, V.T.他、Pharm Res.、19:569〜577(2002))。ヒト血清アルブミン(HSA)の長い半減期および安定性は、それを短寿命タンパク質治療薬との融合のための魅力的な候補にする(米国特許第6,686,179号)。このように、一実施形態では、融合パートナーはアルブミンを含む。アルブミンは、ヒト血清アルブミンまたは、アルブミンと結合する脂質もしくは他の分子と結合またはコンジュゲートするペプチドを、含むことができる。これらの融合パートナーは、それらの任意の変異体または任意の断片を含むことができる。
【０１５２】
ヒト免疫グロブリンGサブクラス1(IgG1)のFc受容体も、治療的分子のための融合パートナーとして用いられた。それは、2つの可溶性p75腫瘍壊死因子(TNF)受容体分子に、組換えで連結されている。この融合タンパク質は、単量体可溶性受容体よりも長い循環半減期を有し、関節リウマチ患者の関節でTNF-αによって誘導された炎症誘発活性を抑制することが報告された(Goldenberg, M.M. Clin Ther.、21:75〜87(1999))。この融合タンパク質は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎および強直性脊椎炎を治療するために、臨床的に用いられている(Nanda, S.およびBathon, J.M.、Expert Opin. Pharmacother.、5:1175〜1186(2004))。ゆえに、一実施形態では、融合パートナーは、Fcフラグメントを含むことができる。
【０１５３】
ヒトCD4ポリペプチドの最初の2つのドメイン、および哺乳動物免疫グロブリンのH鎖またはL鎖の定常部の様々なドメインを含んでいる融合パートナーも、産生された。例えば、EP A 394,827;Traunecker, A.他、Nature、331:84〜86(1988)を参照。IgG部分のためにジスルフィド結合二量体構造を有する融合分子も、他の分子と結合して中和することにおいて、例えば、単量体ErbBリガンドポリペプチドまたはポリペプチド断片単独よりも効率的となることができる。例えば、Fountoulakis, M.他、J. Biochem.、270:3958〜3964(1995)を参照。
【０１５４】
ゆえに、本発明はErbBリガンドのポリペプチド融合パートナーを提供する。一実施形態では、融合パートナーは複数の遺伝子の全てまたは部分を表す融合分子、例えばポリヌクレオチドまたはポリペプチドの部分であってもよい。このように、本発明は融合パートナーをコードする第2のヌクレオチド配列を有する、核酸分子を提供することができる。この第2のヌクレオチド配列は、第1のヌクレオチド配列に機能的に連結することができる。例えば、融合タンパク質は、組換えDNAの鎖をスプライスしてハイブリッド遺伝子を発現させることによって得られる生成物でよい。
【０１５５】
一実施形態では、融合分子は遺伝子工学によって、例えば、第1のタンパク質のDNA配列から終止コドンを除去し、次にインフレームの第2のタンパク質のDNA配列を追加することによって作製することができる。DNA配列は、次に細胞によって単一タンパク質として発現される。一実施形態では、これは、既存の遺伝子とインフレームである発現ベクター内へcDNAをクローニングすることによって達成される。本発明は、異種および同種のリーダー配列との融合タンパク質、異種アミノ酸配列との融合タンパク質、およびN末端メチオニン残基を有するか有さない融合タンパク質を提供する。本発明の融合パートナーは、N末端融合パートナーまたはC末端融合パートナーであることができる。
【０１５６】
一実施形態では、融合ポリペプチドは、タンパク質を分泌のために膜に導くリーダー配列の組込みによって、細胞から分泌させることができる。これらのリーダー配列は宿主細胞に特異的であることができ、当業者に公知であり、それらは、参考文献でも引用されている。ゆえに、本発明は適当なベクターに様々な融合ポリペプチドをクローニングするための、適当な制限酵素部位を含む。これらの融合タンパク質の分泌を促進することに加えて、本発明はそれらの産生を促進することを提供する。このことは、いくつかの方法、例えば複数のコピーを作製すること、強力なプロモーターを使用すること、および、それらの細胞内安定性を、例えば、β−ガラクトシダーゼとの融合によって増加させることによって達成することができる。
【０１５７】
一実施形態では、融合パートナーはリンカーを、すなわち遺伝子をスプライスするために用いることができる制限酵素認識部位を含む合成DNAの断片を含むことができる。これらはポリリンカーを含むことができ、それらはいくつかの制限酵素認識部位を含む。リンカーは、クローニングベクターの一部となることができる。それはタンパク質治療薬の上流または下流に位置してもよく、融合パートナーの上流または下流に位置してもよい。
【０１５８】
一実施形態では、当技術分野で知られているタンパク質発現系は、ErbBリガンドポリペプチドを組み込む融合タンパク質を産生することができる。一実施形態では、ErbBリガンドの未変性の形態は、与えられた治療的使用にとって望ましいものよりも短い半減期を有する。他の実施形態では、本発明は、ErbBリガンド活性を有する第1の分子および第1の分子に延長された半減期を与える第2の分子を含む、持続性のErbBリガンドを提供する。
【０１５９】
一実施形態では、第1の分子は任意のErbBリガンドファミリータンパク質またはその断片の1つもしくは複数を含むことができ、それはR&D System(Minneapolis、MN)のような供給元から購入することができる。一実施形態では、第1の分子は、例えば、実施例41の表1から4、または付録に記載する分子から選択されたものなど、ErbBリガンドまたはその断片であることができる。
【０１６０】
一実施形態では、第2の分子は、融合分子の産生、分泌および/または精製を促進することができる。一実施形態では、本発明のために適当な第2の分子としては、例えば、ポリマー、ポリペプチド、スクシニル基またはアルブミン分子がある。一実施形態では、第2の分子は、リソソーム内で改善された受容体結合性を有するオリゴマー化ドメインまたは分子を含むことができる。
【０１６１】
一実施形態では、本発明の持続性ErbBリガンドポリペプチドは、ErbBリガンドポリペプチドにポリペプチドまたは分岐点アミノ酸を結合することによって調製することができる。例えば、ポリペプチドは、ErbBリガンドポリペプチドの循環半減期を増加させる役目を果たす(すなわち、ErbBリガンド融合分子を通して達成される利点に加えて)担体タンパク質であってもよい。一実施形態では、そのようなポリペプチドは、中和抗原性応答および他の有害反応を起こさない。そのようなポリペプチドは、血清アルブミン(例えばヒト血清アルブミン)、追加の抗体もしくはその部分、例えばFc領域、または他のポリペプチド、例えばポリリジン残基から選択することができる。本明細書で記載されているように、ポリペプチドが給合する位置は、N末端、またはC末端、またはその間の他の場所でもよく、さらには化学リンカー部分によって選択されたErbBリガンドに連結されてもよい。
【０１６２】
そのような修飾されたポリペプチドは、例えば、強化された活性または高められた安定性を示すことができる。さらに、それらはより高い収率で精製することができ、少なくともある精製および貯蔵条件の下では、対応する天然のポリペプチドよりも優れた溶解性を示す。一実施形態では、ヒト血清アルブミン-ErbBリガンド融合分子は、本明細書で、さらに米国特許第6,686,179号で記載されているように調製することができる。
【０１６３】
一実施形態では、本発明は、これらの融合タンパク質の精製を促進することも提供する。選択可能なマーカーとの融合は、例えば、アフィニティークロマトグラフィーによる精製を促進することができる。例えば、選択可能なマーカーグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)との融合は、GSTに対する抗体で検出し、グルタチオンセファロース上でアフィニティークロマトグラフィーによって単離することができるポリペプチドを生成する。GSTマーカーは、次にトロンビン切断によって除去することができる。金属イオンへの結合を可能にするポリペプチドも、親和性精製に適当である。例えば、Hisnを組み込み、nは3から10の範囲、例えば6×His標識である融合タンパク質は、ニッケルリガンドを用いるアフィニティークロマトグラフィーによってタンパク質を単離するために用いることができる。
【０１６４】
他のポリマーベースの修飾、誘導体化、PEG化
一実施形態によると、ErbBリガンドのコンジュゲート体は、グリコシル化、非グリコシル化または脱グリコシルErbBリガンドおよびその断片または変異体を用いて調製することができる。ErbBリガンドおよびErbBリガンドの変異体の誘導体化のための適当な化学分子としては、例えば、ポリマー、例えば本明細書で記載される水溶性ポリマーがある。
【０１６５】
一実施形態では、それぞれのポリマーを結合させたポリペプチドは水性環境、例えば生理的環境では沈殿しないので、水溶性ポリマーを含むポリマーは本発明に役立つ。一実施形態では、本発明で使用されるポリマーは、治療的な製品または組成物の調製のために、製薬上許容される。当業者は、ポリマー/タンパク複合体が治療的に用いられるかどうか、ならびに、もしそうであれば所望の投薬量、循環時間およびタンパク質分解抵抗性などを考慮して、所望のポリマーを選択することができるようになる。
【０１６６】
一実施形態では、ポリマー(例えば水溶性ポリマー)は任意の分子量でよい。一実施形態では、ポリマーは分岐型または非分岐型でよい。一実施形態では、ポリマーはそれぞれ約2kDa〜約100kDaの範囲の平均分子量を有することができる。他の実施形態では、各ポリマーの平均分子量は、約5kDaおよび約50kDaの間である。他の実施形態では、各ポリマーの平均分子量は、約12kDaおよび約25kDaの間である。一般に、分子量が高いほどまたはより分岐しているほど、ポリマー:タンパク質比は高い。一実施形態では、所望の治療プロフィールにより、例えば徐放性の期間、もしあるならば生物的活性への影響、取扱い易さ、抗原性の程度または欠落、および本発明の修飾されたErbBリガンドに及ぼすポリマーの他の既知の影響により、他のサイズのものを用いることができる。
【０１６７】
一実施形態では、適当な、臨床的に許容される水溶性ポリマーとしては、それらに限定されないが、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、モノメトキシ-ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルピロリドン、ポリ1,3-ジオキソラン、ポリ1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリ(βアミノ酸)(ホモポリマーまたはランダム共重合体)、ポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー(PPG)および他のポリアルキレンオキシド、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(POG)(例えば、グリセリン)および他のポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトールまたはポリオキシエチル化グルコース、結腸酸または他の炭水化物ポリマー、フィコールまたはデキストラン、およびそれらの混合物がある。
【０１６８】
一実施形態では、ポリエチレングリコールは他のタンパク質を誘導体化するために用いられる形態のいずれか、例えばモノ(C1〜C10)アルコキシ-またはアリールオキシ-ポリエチレングリコールを含む。一実施形態では、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水中安定性のために、製造上の利点を有する可能性がある。
【０１６９】
一実施形態では、本発明で使用されるポリマーは、ポリペプチドの機能性または抗原性のドメインに及ぼす影響を考慮して、本発明のErbBリガンドに結合される。一実施形態では、化学誘導体化は、タンパク質を活性化されたポリマー分子と反応させるために用いられる、任意の適当な条件下で実施することができる。一実施形態では、ポリマーを活性部分に連結するために用いることができる活性基としては、以下の、スルホン、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフラート、トレシラート、アジジリン、オキシランおよび5-ピリジルがある。
【０１７０】
一実施形態では、1つの(または複数の)ポリマーが、アミノ酸のアルファ(α)またはイプシロン(ε)アミノ基の位置で本発明のErbBリガンドポリペプチドに結合される。一実施形態では、ポリマーは反応性チオール基に結合される。一実施形態では、ポリマーは、適当な反応条件下でポリマー基に結合するために十分に反応性である、タンパク質の任意の反応基に結合される。ゆえに、一実施形態では、ポリマーは、遊離のアミノ基またはカルボキシル基などの反応基を通して、本発明のErbBリガンドポリペプチドに共有結合で結合することができる。一実施形態では、遊離アミノ基を有するアミノ酸残基としては、リジン残基およびN末端アミノ酸残基を挙げることができる。一実施形態では、遊離のカルボキシル基を有するアミノ酸としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基およびC末端アミノ酸残基を挙げることができる。一実施形態では、反応性チオール基を有するアミノ酸としては、システイン残基がある。
【０１７１】
一実施形態では、本発明は、水溶性ポリマーなどのポリマーとコンジュゲートしたErbBリガンド融合分子を含む、ポリマーとコンジュゲートしたErbBリガンドを調製する方法であって、(a)タンパク質が1つまたは複数のポリマーに結合する条件下でタンパク質をポリマーと反応させること、および(b)反応生成物を得ることを含む方法を提供する。
【０１７２】
各コンジュゲーションのための反応条件は当業者に公知であり、当技術分野で公知のものまたはその後開発されたもののいずれかから選択することができるが、修飾するタンパク質を不活性化するような反応条件、例えば温度、溶媒およびpHレベルへの曝露を避けるかまたは制限するように選択しなければならない。一般に、反応のための最適反応条件は、既知のパラメータおよび所望の結果に基づいて個別に決定される。例えば、ポリマーとタンパクとの複合体の比がより大きいほど、コンジュゲーション生成物の割合はより大きい。最適な比率(未反応のタンパク質およびポリマーが過剰に存在しないという意味での反応効率に関して)は、所望の誘導体化の程度(例えば、モノ-、ジ-、トリ-、など)、選択されたポリマーの分子量、ポリマーが分岐型であるかまたは非分岐型であるか、および用いる反応条件などの因子によって決定することができる。一実施形態では、ポリマー(例えば、PEG)とErbBリガンドポリペプチドとの比は、1:1から100:1までの範囲内である。タンパク質の濃度次第では、活性化されたポリマーとタンパク質との2000:1のモル比を用いることもできる。
【０１７３】
一実施形態では、1つまたは複数の精製されたポリマーコンジュゲート体を標準的な精製技術によって、例えば、とりわけ透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび電気泳動によって、各混合物から調製することができる。
【０１７４】
一実施形態では、特に、N末端が化学修飾されたタンパク質を調製することができる。例えば、その分子量および/またはその分枝、反応混合物内でのポリマーとタンパク質(またはペプチド)分子との比率、実施する反応の型、ならびにN末端が化学修飾された選択されたタンパク質を得る方法によって、ポリマーを選択することができる。N末端が化学修飾されたタンパク質製剤を得る(すなわち、必要に応じてこの部分を他の一誘導体化部分から分離する)方法は、化学修飾されたタンパク質分子の集団からのN末端が化学修飾されたタンパク物質の精製によるものであってよい。
【０１７５】
一実施形態では、N末端の選択的化学修飾は、特定のタンパク質の誘導体化で利用できる異なる種類の第一アミノ基(リジン対N末端)の差別的反応性を活用する、還元アルキル化によって達成することができる。一実施形態では、本発明はモノ-またはポリ-(例えば、2〜4)PEG部分を含むように、化学的に誘導体化されたErbBリガンドポリペプチドを企図する。「PEG化」は、当技術分野で知られているPEG化反応のいずれかによって実行することができる。当業者が利用できる、いくつかのPEG給合方法がある。例えば、米国特許第4,935,465号(1990年6月19日公布)および6,342,244号(2002年1月29日公布)、米国特許出願公開2006/0074024、欧州特許第0 401 384号、Malik, F.他、Exp. Hematol.、20:1028〜1035(1992)、Francis、Focus on Growth Factors、3(2):4〜10(1992)、欧州特許第0 154 316号、欧州特許第0 401 384号、国際公開92/16221、国際公開95/34326、ならびに、本明細書で引用するPEG化に関する他の刊行物を参照。
【０１７６】
アシル化によるPEG化は、一般にポリエチレングリコールの活性エステル誘導体を本発明のErbBリガンドポリペプチドと反応させることを含む。一実施形態では、活性化されたPEGエステルは、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)にエステル化されたPEGである。一実施形態では、タンパク質治療薬とPEGなどのポリマーとの間の結合は、アミド、カルバメート、ウレタン、などである。例えば、Chamow, S.M. Bioconjugate Chem.、5(2):133〜140(1994)を参照。アシル化によるPEG化は、ポリPEG化されたタンパク質を一般に生成する。一実施形態では、生じる生成物は、実質的に(例えば、>95%)モノ、ジ-またはトリ-PEG化されるだけである。他の実施形態では、より高い程度のPEG化を有するいくつかの種を、用いる特定の反応条件に依存する量で形成することができる。
【０１７７】
アルキル化によるPEG化は、一般に、還元剤の存在下でPEGの末端のアルデヒド誘導体をタンパク質と反応させることを含む。還元性のアルキル化反応のために、選択されるポリマーは単一の反応性アルデヒド基を有しなければならない。例示的な反応性PEGアルデヒドは水安定性であるポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、または、そのモノC1〜C10アルコキシもしくはアリールオキシ誘導体であり、例えば、米国特許第5,252,714号を参照。
【０１７８】
組成物
一実施形態では、本発明は、疾患の治療のために筋細胞(例えば骨格筋、心筋、平滑筋細胞)へのグルコース取り込みを刺激する1つまたは複数のポリペプチド、および製薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供し、ポリペプチドの1つはベータセルリンである。
【０１７９】
一実施形態では、本発明は、疾患の治療のために筋細胞(例えば骨格筋、心筋、平滑筋細胞)へのグルコース取り込みを刺激する1つまたは複数のポリペプチド、および製薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供し、ポリペプチドの1つはErbBリガンドである。
【０１８０】
一実施形態では、本発明は、疾患の治療のために筋細胞(例えば骨格筋、心筋、平滑筋細胞)へのアミノ酸取り込みを刺激する1つのポリペプチド、および製薬上許容される担体またはビヒクルを含む医薬組成物を提供し、ポリペプチドはErbBリガンドである。
【０１８１】
一実施形態では、本発明は、疾患の治療のために筋細胞(例えば骨格筋、心筋、平滑筋細胞)内でのユートロフィン発現を刺激する1つのポリペプチド、および製薬上許容される担体またはビヒクルを含む医薬組成物を提供し、ポリペプチドはErbBリガンドである。
【０１８２】
一実施形態では、本発明は、被験体の筋細胞および/または筋組織で有意な同化作用を示し、それによって被験体の身体組成を変えるポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、被験体の身体組成は、骨格筋質量を増加させ、内臓脂肪を減少させることによって変化する。一実施形態では、そのような医薬組成物は、したがって、人的能力最適化薬剤として役立つことができる。一実施形態では、そのような医薬組成物は、しばしば糖尿病と関連する病態である、肥満の治療薬として用いることができる。
【０１８３】
一実施形態では、ErbBリガンドは、筋肉で同化作用を示すポリペプチドである。
【０１８４】
賦形剤および製剤
一部の実施形態では、組成物は製薬上許容される担体との製剤で提供され、多種多様の担体が当技術分野で公知である。Gennaro, A.R.(2003)Remington:The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons:DrugfactsPlus.第20版、Lippincott Williams & Williams;Ansel, H.C.ら編(2004)Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems第8版、Lippincott Williams & Wilkins;Kibbe, A.H.編(2000)Handbook of Pharmaceutical Excipients、第3版、Pharmaceutical Press。「製薬上許容される担体」、例えばビヒクル、アジュバント、賦形剤、カプセル化材、補助物質または希釈剤は、一般人が容易に入手できる。さらに、製薬上許容される補助物質、例えばpH調節および緩衝剤、等張化剤、安定剤、湿展剤なども、一般人が容易に入手できる。好適なビヒクルは、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。さらに、所望により、ビヒクルは、湿展剤または乳化剤またはpH緩衝剤などの補助物質の少量を含むことができる。
【０１８５】
米国のFood and Drug AdministrationのDepartment of Health and Human Servicesは、動物実験で得られた結果に基づいて初期治験に適用できる出発用量を推定するためのガイドラインを提供している。ゆえに、刊行物「Guidance for Industry and Reviewers:Estimating the Safe Starting Does in Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers」(2002年12月に発表)は、当業者が利用できる他のガイドラインに加えて、本発明で提供される組成物の濃度および投薬量を適切に設計するために用いることができる。
【０１８６】
医薬用の剤形では、本発明の組成物はそれらの製薬上許容される塩の形で投与することができ、または、それらは単独で、もしくは他の作用物質として活性な化合物と適当に結合させて、ならびに併用して用いることもできる。本発明の組成物は、可能な投与様式に従って製剤化される。作用物質の投与は、経口、口内、鼻腔内、直腸、経腸、腸管外、局所(例えば胃腸粘膜、口腔粘膜、目粘膜、呼吸粘膜)、腹腔内、皮内、経皮、筋肉内、皮下、静脈内、動脈内、心臓内、心室内、頭蓋内、気管内、クモ膜下の投与、などを含む様々な方法で、あるいはそうでなければ植え込みカテーテルもしくはポンプにより、または吸入により達成することができる。
【０１８７】
注射によって投与することができる作用物質とは、それを非経口的投与、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、クモ膜下、眼窩内、嚢内、髄腔内、内部胸骨内の注射のために、または、傷害、損傷もしくは障害の部位への局所注入のために適当なものにする、作用物質の製剤を指す。注射可能な作用物質は、作用物質の有効量に加えて、任意の製薬上かつ/または生理的に許容される溶液を、例えば当技術分野で公知の標準に従ってその症例を扱う医師が選択することができるリン酸緩衝食塩水を、含むことができる。ゆえに、本発明の組成物は、固体、半固体、液体またはガス状の製剤、例えば錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏、液剤、坐薬、注射剤、吸入薬およびエアゾールで製剤化することができる。
【０１８８】
経口投与のための作用物質(すなわち「経口作用物質」)は、液剤、懸濁液、錠剤、ピル、顆粒剤、カプセル剤、徐放性製剤、経口リンス液または散剤を形成することができる。経口用製剤のために、作用物質、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは単独で、または、適当な添加剤と組み合わせて、例えば、従来の添加剤、例えばラクトース、マンニトール、コーンスターチもしくはジャガイモ澱粉と、結合剤、例えば結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチもしくはゼラチンと、崩壊薬、例えばコーンスターチ、ジャガイモ澱粉もしくはカルボキシメチルセルロースナトリウムと、滑剤、例えばタルクもしくはステアリン酸マグネシウムと、ならびに、所望により、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存料および着香料と組み合わせて用いることができる。さらに、一実施形態において、組成物は吸入薬を用いて鼻腔内に投与することができる。この組成物は、肺組織への損傷を最小にしつつ、肺への薬剤有効量の投与を可能にするように製剤化される。
【０１８９】
一実施形態では、ベータセルリンおよびニューレグリンを含むErbBリガンドファミリータンパク質(上述の全てのそれらの変異体および修飾体を含む)は、徐放性の製剤(例えば脂質およびアミノ酸ベースのマイクロスフェアおよび微小粒子)または送達器具で送達することもできる。
【０１９０】
一実施形態では、送達器具は、筋細胞への局所送達、例えば、心筋への局所送達を可能にする。一実施形態では、筋細胞への局所送達は、カテーテルに基づく送達系を用いて達成される。一実施形態では、送達器具は、遠隔磁気操縦を含む。磁気操縦によって支援される送達器具のそれには限定されない例は、Stereotaxis Niobe(登録商標)磁気ナビゲーションシステム(Sterotaxis Inc.、Maple Grove、MN)、Noga XP(商標)Cardiacナビゲーションシステム、および磁気支援の注射カテーテルを含むシステムである。一実施形態では、送達システムは被験体の心室の1つに、組成物(例えば1つまたは複数のErbBリガンドを含む組成物)を直接送達する。
【０１９１】
一実施形態では、組成物としては、ゲルマトリックス、例えば当業者に公知であるヒドロゲルマトリックスの1つを含む組成物がある。ゲルマトリックスのそれには限定されない例としてはコラーゲンマトリックスがあり、それはポロキサマー(poloxamer)またはアルギン酸塩を含むことができる。
【０１９２】
一実施形態では、ErbBリガンド(例えばベータセルリン、持続性のベータセルリン融合タンパク質)は、経口送達のために製剤化される。ベータセルリンおよび/または他のErbBリガンドの送達のために用いることができる製剤のそれには限定されない例としては、吸入器ポンプまたは当業者に公知である散剤もしくはエアゾールの送達のための他の任意の器具を通した薬剤送達のために調製された製剤、例えば、米国特許第5740794号、同第5997848号、同第6051256号、同第6737045号、同第RE37872および同第RE38385で記載されている方法、または、米国特許第5352461号、同第5503852号、同第6071497号および同第6331318号で、および米国特許出願公開20040096403、同20060040953で記載されている方法に類似した方法によって調製された製剤があり、これらのそれぞれはジケトピペラジンおよびジケトピペラジンによって媒介される薬剤送達に関して教示しているものの、本明細書で完全に参照により組み込まれている。一実施形態では、ErbBリガンド(例えばベータセルリン)は、吸入器によって肺に送達される。一実施形態では、ErbBリガンド(例えばベータセルリン)は散剤として製剤され、吸入器によって肺に送達される。
【０１９３】
一実施形態では、ErBリガンドは経口送達のために、ピル、カプセルまたはその同等物として製剤化され、それらは胃腸の膜を通して吸収される。例えば、ErbBリガンド(例えばベータセルリン)は、経口送達のために、米国特許第7,005,141号、同第6,906,030号、同第6,663,898号で記載されている方法の1つを用いて製剤化される。
【０１９４】
一実施形態では、本発明は、キットのパーツとして提供する(例えば、販売、保存、製造、処方、など)目的のために製剤化されるErbBリガンドを提供する。キットは、一緒に用いるために包装またはマークされた構成要素を指す。一実施形態では、本発明は、ErbBリガンド(例えばベータセルリン)、任意選択で他の抗糖尿病薬(例えば異なるErbBリガンド)および担体を含むキットを提供し、これら2つまたは3つの構成要素は2つまたは3つの別個の容器に入っている。別の例では、キットは任意の2つの構成要素を1つの容器に含むことができ、第3の構成要素および任意の更なる構成要素を1つまたは複数の別個の容器に含むことができる。任意選択で、被験体(例えば急性病の被験体、糖尿病の被験体、心臓病を患っている被験体)への投与に適当な組成物(例えば筋細胞へのグルコース取り込みおよび/またはアミノ酸取り込みを増加させる組成物)を処方するために、キットは構成要素の組み合わせおよび/または投与のための説明書をさらに含む。
【０１９５】
以下の方法および賦形剤は単に例示するだけであり、決して限定するものではない。
【０１９６】
剤形を調製する実際の方法は当業者に公知であるか、または明らかとなる(Gennaro, A.R.(2003)Remington:The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons:DrugfactsPlus.第20版;University of the Sciences in Philadelphia(2005)Remington:The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons、第21版を参照)。投与される組成物または製剤は、いずれにしても、治療する被験体において所望の状態を達成するのに十分な作用物質の量を含む。
【０１９７】
一実施形態では、ベータセルリンおよび/または他の本発明のErbBリガンドを含む治療製剤は、所望の程度の純度を有するこれらのタンパク質を、凍結乾燥されたケーキ、乾燥粉末、懸濁液、水溶液、などの形で、任意選択の生理的に許容される担体、賦形剤または安定剤(Remington's Pharmaceutical Sciences、前掲)と混ぜることによって、保存のために調製することができる。一実施形態では、許容される担体、賦形剤または安定剤は使用される投薬量および濃度でレシピエント被験体に無毒性であり、その例としては、リン酸、クエン酸および他の有機酸などの緩衝液;アスコルビン酸を含む抗酸化剤;低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸;グルコース、ラクトース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖類、二糖類および他の炭水化物;EDTAなどのキレート化剤;マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール;ナトリウムなどの塩形成対イオン;ならびに/またはTween、Pluronicsまたはポリエチレングリコールなどの非イオン性界面活性剤がある。
【０１９８】
一実施形態では、本明細書で記載されるタンパク質(例えばベータセルリン)の1つまたは複数は、治療的投与のためにその循環半減期を延長するために、ポリマーと複合体を形成させるかそれと結合することができる。この目的に役立つポリエチレンポリオールおよびポリオキシエチレンポリオールのそれには限定されない例には、ポリオキシエチレングリセリン、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビトール、ポリオキシエチレングルコース、その他が含まれる。一実施形態では、ポリオキシエチレングリセリンのグリセリン骨格は、例えば、動物およびヒトで見られるモノ-、ジ-およびトリグリセリドと同じ骨格である。
【０１９９】
糖尿病、高血糖症または他の疾患の治療での使用方法
一実施形態では、本発明はErbBリガンドポリペプチドの使用によって糖尿病を治療する方法を提供する。ErbBリガンドファミリーは、ErbB受容体(例えばErbB1、ErbB2、ErbB3およびErbB4)を通してシグナルを送る。一実施形態では、ErbBリガンドファミリーはこの異なるシグナル伝達経路を用いてヒト筋細胞でグルコースの取り込みを刺激することができるので、ErbBリガンドポリペプチドは血糖管理のために用いることができる。詳細には、ErbBリガンドポリペプチドは、インスリン感受性が低下または消失する障害、例えばII型糖尿病を治療するために用いることができる。さらに、I型またはII型糖尿病患者へのベータセルリンなどのErbBリガンドポリペプチドの投与は、彼らが高インスリン血症(すなわち、高インスリン症で見られる一般的な空腹時インスリンレベルは20μU/mlを超え、抵抗性が高いときにはレベルは100μU/mlを超える可能性がある)、低インスリン血症(すなわち、正常なインスリンレベルより低い)または正常インスリン血(すなわち正常なインスリンレベル)であろうが、グルコース耐性を改善するはずである。例えば、ベータセルリンなどのErbBリガンドポリペプチドは、循環インスリンレベルが上昇しているがインスリン抵抗性のために内因性インスリンまたは外部から投与されたインスリンのレベルの上昇に十分に応答しない糖尿病患者において、グルコース耐性を改善し、それによって高血糖症を緩和する。この患者集団は、インスリン依存性で血糖が十分に管理されている患者、または、内因性もしくは外来性のインスリンのレベルを増加させることによって血糖を十分に管理することができる患者とは別で、互いに異なる。
【０２００】
異なるErbBリガンドファミリーメンバーは、グルコース取り込みの刺激において、異なる特性を有する。非常に高い受容体親和性を有するものがあれば、低い親和性を有するもののグルコース取り込みの最大刺激量が高いものもある。なかでも、それらの受容体選択性/特異性、生物学的利用能、動態、クリアランス速度も、変動する可能性がある。このように、このファミリーメンバーの異なる特性は、短期および長期の血糖管理(例えばI型およびII型糖尿病の治療)のための選択肢を増加させる。
【０２０１】
一実施形態では、本発明は、グルコースおよびアミノ酸の筋細胞への取り込みを刺激するが、脂肪細胞へのこれらの一方または両方の取り込みを増加させることのない、ベータセルリンを含む組成物を提供する。ゆえに、一実施形態では、インスリンまたはステロイドによる治療が時々そうするように、ベータセルリン治療が体脂肪の増加をもたらすことはない。
【０２０２】
全ての形態の糖尿病患者は、多くの場合経口血糖降下薬(例えば、スルホニル尿素もしくはPPARγアゴニスト)またはタンパク質(例えばインスリン、酢酸プラムリンチド(pramlintide)もしくはエキセナチド(exenatide))によって部分的に治療されるだけである、グルコース寛容減損を有する。一実施形態では、本発明は、さらにグルコース耐性を改善することによる、I型またはII型糖尿病の治療法を提供する。
【０２０３】
ゆえに、本発明は、ベータセルリン(BTC)、上皮成長因子(EGF)、Epigen、アンフィレグリン(AR)、トランスフォーミング成長因子アルファ(TGF-α)、ヘパリン結合EGF(HB-EGF)、エピレグリン(EPR)またはニューレグリン(NRG-1、NRG-2、NRG-3もしくはNRG-4)、またはその生物学的に活性な断片の1つまたは複数を含む組成物を提供し、および、長期的に有効な血清レベルを「成就」(すなわち、到達もしくは達成すること)するかまたは「維持」(すなわち、既存のレベルを保つか継続すること)するために2回以上被験体にその組成物の治療的有効量を投与することによって、被験体での血糖管理および/または糖尿病(I型かII型)治療の方法を提供する。
【０２０４】
一実施形態では、ErbBリガンドポリペプチドだけが投与され、単独療法を構成する。そのような組成物のそれには限定されない例は、ベータセルリン(BTC)、上皮成長因子(EGF)、Epigen、アンフィレグリン(AR)、トランスフォーミング成長因子アルファ(TGF-α)、ヘパリン結合EGF(HB-EGF)、エピレグリン(EPR)またはニューレグリン(NRG-1、NRG-2、NRG-3もしくはNRG-4)の1つまたは複数を含むものであり、これらのタンパク質の全ては融合パートナーの有無に関係なく存在することができる。
【０２０５】
本発明は、さらに、ErbBリガンドおよび製薬上許容される賦形剤を含む1つまたは複数の組成物の配合薬の投与を提供する。一実施形態では、配合薬のErbBリガンドは、ベータセルリン(BTC)、上皮成長因子(EGF)、Epigen、アンフィレグリン(AR)、トランスフォーミング成長因子アルファ(TGF-α)、ヘパリン結合EGF(HB-EGF)、エピレグリン(EPR)またはニューレグリン(例えばNRG-1、NRG-2、NRG-3もしくはNRG-4)、またはその任意の変異体断片である。一実施形態では、ErbBリガンドは、持続性のErbBリガンドである。一実施形態では、組成物の1つは他のグルコース取り込みを刺激する分子(第1の分子と異なる)、例えば、インスリンまたはグルコース取り込みを刺激する他の任意の分子をさらに含み、その組成物はグルコース取り込みを刺激する第1の分子を含む組成物と併用される(すなわち、第1の組成物と一緒に、またはその前に、後にもしくは同時に投与される)。
【０２０６】
一実施形態では、糖尿病治療方法は、インスリンに抵抗性である被験体を治療することができる。一実施形態では、治療はインスリンの必要性を低減するかもしくは遅らせ、抗糖尿病薬の必要性を低減し、かつ/またはグルコース恒常性を改善することもできる。作用物質の必要性を低減するとは、十分なグルコース恒常性を達成するのに必要な作用物質の投薬量を減少させることを指す。一実施形態では、投薬量は、例えば、一度に投与する薬量を減少させることを通して、投与の頻度を減少させることによって、またはその両方により減少させることができる。インスリンの必要性を遅らせるとは、十分なグルコース恒常性を達成するために必要とされるインスリンの頻度を減少させることを指す。一実施形態では、例えば、被験体がより長い時間の間、十分なグルコース恒常性を維持するので、インスリンの必要性を遅らせることができる。グルコース恒常性を改善するとは、生理的に正常なまたは正常に近いグルコースレベルを維持し、グルコースレベルの異常な変動(例えば、低血糖症および高血糖症)を最小にする被験体の能力を向上させることを指す。
【０２０７】
一実施形態では、本発明は、長期的に有効な血清レベルを達成しかつ/または血清グルコースレベルを急減させるために、小用量の頻繁な投与を通してグルコース恒常性を維持する方法を示す。一実施形態では、糖尿病患者(I型およびII型)は1日を通して正常なグルコースレベルを維持することができないので、小用量の頻繁な投与が望ましい。グルコースレベルは、食物摂取量、日常活動および運動などの因子に従い変動する。ゆえに、例えば、患者がカロリー摂取量を増加させるかまたは運動活動を増加させると予想される場合は、治療はそれに従って調節することができる。このように、糖尿病患者はしばしば、1日3〜4回、例えば、朝の起床時に、朝食の前に、昼食の前に、および夕食の前に、血中グルコースを検査する。一実施形態では、食事の前に、患者はどのくらいの量のグルコースを摂取するかを予想し、次にそれに従って治療を変更することができる。ゆえに、一実施形態は、グルコースレベルの、約15〜約90分以内の急速な減少によって、食後のグルコースを制御するための方法を提供する。これらの方法は、膵臓インスリン産生β細胞の再生を誘導するためにベータセルリンを投与することを開示する他の方法と対照をなし、さらに、そのような方法は異なる小用量の頻繁な投与を一般に必要としない。
【０２０８】
一実施形態では、1つまたは複数のErbBリガンド、例えばベータセルリンを含むグルコース低下組成物の用量は、第1のグルコース測定値に基づいて調整し、次に、例えば、グルコースレベルおよび/またはインスリンレベルの再測定に基づいて、1週以内(より好ましくは1日以内)に確認および/または、おそらく、再調整をすることができる。一実施形態では、投薬は1日に例えば少なくとも2、3回の多回でもよく、1日の様々な時間に測定されたグルコースレベルの変動に基づいて、投薬ごとに用量を変えることができた。ゆえに、用量は、食事から2時間以内の時間に、例えば、食事から約90分、60分、30分もしくは15分以内に、または食事時間中に投与することができた。
【０２０９】
一実施形態では、ErbBリガンド(単独または他のグルコース低下剤および/または抗糖尿病薬と併用)は、緊急または集中治療の状況下の患者の治療で用いることができる。一実施形態では、心筋梗塞、呼吸不全、うっ血性心不全または他の生命にかかわる病態を含む病態により深刻な病気である患者は、急性の重度の高血糖症をしばしば経験する(Van den Berghe他、2001;Van den Berghe他、2006;前掲)。これらの患者は彼らの高血糖症が積極的に治療されるとより良い予後を有するが、積極的なインスリン治療体系と関連する低血糖症のマイナスの結果がより危惧される。一実施形態では、これらの(または他の)急性病の状況で臨床上の予後を改善しつつ、インスリンの使用を減らすかまたは皆無にすることによってインスリンによって誘導される低血糖症の発生率を低下させるために、患者をベータセルリン(または他のErbBリガンド単独で、または併用療法)で治療することができる。この理由から、一実施形態では、ベータセルリンは、救護隊員が静脈内インスリンを投与するのはあまりに危険であり、通常のインスリンの皮下投与はあまりに緩慢であるような、救急車または他の病院外の状況で投与することができる。
【０２１０】
一実施形態では、組成物は急性のグルコース代償不全の状況で、治療および/または血糖管理において用いられる。例えば、重症の高血糖症を引き起こす患者、および糖尿病性ケトアシドーシス(DKA)の危険があるかまたはDKAを発症している患者は、低血糖症の危険を伴わずにより安全なグルコース範囲へ復帰させるために、作用開始の非常に速いErbBリガンド(例えば作用開始時間の短い、例えば約15〜90分のベータセルリン)を用いることができた。
【０２１１】
単独療法に加えて、本発明は、特に短時間作用様式(作用開始が15〜30分以内で、作用持続時間が30〜120分)で投与されるベータセルリンとの併用療法をさらに提供する。そのような急激な併用薬としては、血中グルコースを急激に制御するための、インスリン、インスリン突然変異タンパク質、例えばリスプロ(lispro)もしくはグラルギン(glargine)、またはGLP-1類似体、例えばエキセナチドまたはDPP IV阻害剤などの作用物質を挙げることができる。そのような急激な制御は、重症、急性の高血糖症、例えば糖尿病性ケトアシドーシス、糖尿病性昏睡または初期の糖尿病性ケトアシドーシスの重大な合併症を予防することができる。
【０２１２】
一実施形態では、ベータセルリンの用量は、ベータセルリンの各用量で得られた急性高血糖症の重大度に基づいて、または、より長期のグルコースレベルに基づいて調節することができる。後者には、例えば、血中グルコースの毎週の測定値および/またはヘモグロビンA1cの測定値を含めることができる。ヘモグロビンA1c検査(別名、H-b-A-1-c)は簡易実験室検査であり、その結果はそれ以前の3ヵ月間の平均血中グルコースの目安である。ヘモグロビンA1c検査は、ヒトの血糖が正常値に近いかまたは高すぎるかを示す。それは、基礎グルコースレベルの長期的管理を監視するために容認された検査である。
【０２１３】
一実施形態では、ErbBリガンド(例えばベータセルリン単独で、または他のグルコース低下薬と併用する)は、インスリンの使用から生じる合併症を軽減および/または低減するために用いることができる。例えば、ベータセルリンは、特に食後の状況において毎日の血糖の変動を減らすために、長時間または短時間作用型インスリンと同時投与することができる。ベータセルリンの限られた作用持続時間は、患者が食事時の短時間作用型インスリン用量を減らすことを可能にし、それによってインスリン関連の低血糖性事象の発生率を低下させる。食事時のインスリンを服用する患者は、食事時のインスリンの服用後に食事を抜いた場合に、低血糖症の危険がある。一実施形態では、ベータセルリン(単独または本明細書で記載される他の作用物質と併用)は、食事時のインスリンの代わりに用いることもできる。一実施形態では、正常血糖被験体(血中グルコースの正常血糖レベルが約50〜110である被験体)でのベータセルリンの低血糖症(血糖が<70mg/dL)との関連性がないことから、患者は、たとえベータセルリンを服用後に食事を抜いたとしても、ベータセルリン単独療法による低血糖症を経験しないであろうと予測される。
【０２１４】
一実施形態では、血糖管理の(例えば、糖尿病の治療における)方法は、ベータセルリン(BTC)などのErbBリガンドファミリーメンバーを含む組成物の治療的有効量を第2の作用物質と投与することを含む。「抗糖尿病薬」と呼んでもよいこれらの第2の作用物質は、糖尿病を治療するために第1の作用物質に加えて投与される物質を指し、その抗糖尿病薬は第1の作用物質と異なる分子である。異なる抗糖尿病薬としては、ホルモン、成長因子、サイトカインまたはケモカインを挙げることができる。一実施形態では、異なる抗糖尿病薬としては、インスリン、またはベータセルリン(BTC)、または上皮成長因子(EGF)、またはEpigen、またはアンフィレグリン(AR)、またはトランスフォーミング成長因子アルファ(TGF-α)、またはヘパリン結合EGF(HB-EGF)、またはエピレグリン(EPR)またはニューレグリン(NRG-1、NRG-2、NRG-3もしくはNRG-4)、またはその生物学的活性断片が含まれ、これらに融合パートナーが結合してもよい。一実施形態では、ベータセルリンを含む組成物をニューレグリン1と併用投与する場合は、ベータセルリンまたはニューレグリン1の少なくとも1つは融合パートナーを含む。
【０２１５】
一実施形態では、本発明は、ErbBリガンドの投与の前、後または同時の、1つまたは複数の抗糖尿病薬の経口投与をさらに含む、血糖管理の(例えば、糖尿病の治療における)方法を提供する。一実施形態では、これらの作用物質としては、例えば、「メトホルミン」(すなわちGlucophage(登録商標)、ビグアナイド系抗糖尿病薬)、インスリン分泌促進物質、グルコシダーゼ阻害剤またはPPARアルファアゴニストを挙げることができる。インスリン分泌促進物質は、膵臓β細胞によるインスリンの分泌を刺激する、その刺激に関与する、またはそれを強化する、任意の薬剤組成物である。インスリン分泌促進物質には、インスリン分泌剤およびインスリン分泌または放出の増強物質、例えば「スルホニル尿素」、「メグリチニド」および「グルカゴン様ペプチド」が含まれる。
【０２１６】
一実施形態では、本発明はErbBリガンドの前、後または同時の、1つまたは複数の第2の作用物質の注射による投与を含む。これらの注射可能な作用物質としては、インスリン、インスリン類似体、同時分泌剤、「プラムリンチド」(すなわちSymlin(登録商標)、合成ヒトアミリン)または「DPP4アンタゴニスト」(すなわちジペプチジルペプチダーゼIVプロテアーゼの阻害剤)がある。さらに、注射可能な作用物質は、「エキセナチド」などのグルカゴン様ペプチドと併用投与することができる。
【０２１７】
一実施形態では、本発明はErbBリガンドの前、後または同時の、第2の作用物質としての免疫調節剤の投与を含む。免疫調節剤は、本明細書で治療される被験体の免疫系を調節する働きをする、1つまたは複数の物質のいずれかである。免疫調節剤は、抗CD3抗体などの抗体、またはその活性変異体を含むことができる。抗CD3抗体は、Tリンパ球上のCD3と結合する任意の抗体である。抗体は、ダクリズマブ(daclizumab)などのヒト化モノクローナルインターロイキン(IL)2-R-アルファ抗体を含むこともできる。調節するとは、適当な対照と比較したときの、測定された活性の増加もしくは減少、刺激、抑制、干渉または妨害の直接的または間接的生成を指す。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのモジュレーターとは、適当な対照と比較したときの、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの測定された活性に影響を及ぼす(例えば、増加させる、減少させる、刺激する、抑制する、干渉する、または妨害する)物質を指す。
【０２１８】
一実施形態では、免疫調節剤は、小分子を含む。小分子は、とりわけ、ポリペプチドおよび核酸以外の、生物過程に作用して影響を及ぼすことができる、任意の化学部分または他の部分でよい。小分子としては、現在知られ、用いられている任意の数の治療剤、または、生物学的機能についてスクリーニングする目的でそのような分子のライブラリーで合成された小分子を挙げることができる。
【０２１９】
一実施形態では、小分子は、いくつかのリンフォカイン、特にIL-2の生成を抑制することによってT細胞増殖をin vitroで妨げる「FK506」(すなわちタクロリムス、フジマイシン(Fujimycin))、または、IL-2の刺激に応じて増殖するT細胞の能力を妨害する「ラパマイシン」(すなわちシロリムス、ラパムン(Rapamune))である。免疫調節剤は、シロリムスまたは「T-またはB細胞の活性または活性化のサプレッサー」(すなわち、T-またはB細胞の活性または活性化の活性を減少させる作用物質、例えばサイクロスポリン)を含むこともできる。
【０２２０】
次の一連の実施形態において、ErbBリガンドは、グルコース代謝に関係する他の障害、例えばメタボリックシンドローム、肥満、筋肉消耗および神経細胞傷害の治療で役立つ。
【０２２１】
一実施形態では、本発明は、被験体で筋肉質量を増加させる方法であって、修飾されていないかまたは持続性のErbBリガンドを含む組成物を得ること、および、筋肉質量を増加させ、それによって筋肉消耗を治療するために、被験体にその組成物の治療的有効量を投与することを含む方法を提供する。上述の治療方法と同様に、これらの方法は単独療法、および、1つまたは複数の作用物質を伴う療法(すなわち併用療法)を含むことができる。筋肉質量の増加とは、例えば筋細胞の増殖を通した、骨格筋の細胞および組織の増加を指す。筋肉消耗は糖尿病性筋萎縮症、または他の代謝性ミオパシー、悪液質、AIDS関連の消耗、サルコペニアなどの非活動性萎縮、または筋ジストロフィー、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィーを原因とすることがある。
【０２２２】
一実施形態では、本発明は、タンパク質ジストロフィンの機能障害または発現の減少に起因するジストロフィーを改善する方法であって、骨格筋細胞、例えばヒト筋原細胞でユートロフィンの発現を上方制御するために、あるErbBリガンド、例えばベータセルリンを得て、その治療的有効量を投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、ベータセルリンの投与は、同化機能を提供することによって、そのような治療が必要な被験体で筋肉質量を増加させる。一実施形態では、ベータセルリンの投与は、ユートロフィンの誘導によりジストロフィンの減少を補償することによって、そのような治療が必要な被験体で筋肉損傷を減少させる。一実施形態では、ベータセルリンの投与は、筋細胞へのグルコースおよび/またはアミノ酸の取り込みを増加させることによって、筋肉機能を改善する。
【０２２３】
一実施形態では、心筋細胞に対するベータセルリンの同化作用は、筋疾患と関連する心筋症を減らすことができる。
【０２２４】
他の実施形態では、本発明は、ストレスまたは有害な条件に曝された心筋の生存を促進し、かつ/または心筋のアポトーシスを抑制するために、ErbBリガンドを提供する。心筋細胞死をもたらすストレス/有害条件のそれには限定されない例は、栄養および酸素の欠乏、ならびに心毒性の薬剤への曝露である。心毒性の薬剤は心疾患の分野の当業者に公知であり、アントラサイクリンなどのいくつかの化学療法剤が含まれる。
【０２２５】
肥満は、本発明に従い、ErbBリガンドによって治療することができる、代謝異常の他の例である。一実施形態では、ErbBリガンドは筋細胞へのグルコース取り込みおよびアミノ酸取り込みを促進するが、脂肪の生成を増加させない(すなわち、脂質生合成を起こさない)。一実施形態では、筋細胞によるアミノ酸および/またはグルコースの取り込みの促進は被験体の代謝速度を刺激し、それによって脂肪組織の異化および/または分解を促進することができる。
【０２２６】
慢性高血糖症は血管壁および心筋内の、例えば基質タンパク質の非酵素的糖化ももたらし、高度糖化最終産物(AGE)および活性酸素種を生成する。AGEは隣接したコラーゲンポリマーの架橋を促進してコラーゲンの弾性を低下させ、その後血管、ならびに心臓の筋肉(心筋)のコンプライアンスを低減し、心不全を起こす。一実施形態では、グルコースレベルを低下させることにより、本発明は、例えば、グルコースによって誘導された組織マトリックス内へのコラーゲンの析出、間質性および血管周囲の線維症、左心室(LV)肉厚の増加およびLV質量の増加に起因する筋肉および血管への損傷を軽減することによって、心不全を改善する方法も提供する。
【０２２７】
一実施形態では、本発明は、被験体で神経細胞の完全性を再生または維持する方法であって、持続性のErbBリガンドを含む組成物を得ること、および、神経細胞の完全性を再生または維持するために、そのリガンド、例えばベータセルリンの治療有効量を被験体へ投与することを含む方法を提供する。ある量が投与後に望ましい結果を生じるならば、その量は治療的に有効であるとみなされる。これは、投与される投薬量および投与経路などの様々な因子によって異なる。さらに、細胞または細胞集団の完全性を維持するとは、例えば、細胞の傷害または死を予防することによって、細胞の状態を維持することを意味する。一実施形態では、その方法は脳脊髄疾患、例えば脳卒中、アルツハイマー病またはパーキンソン病を患っている被験体を治療する。上述の治療方法と同様に、これらの方法は単独療法、および、1つまたは複数の他の作用物質を伴う療法を含むことができる。
【０２２８】
単に本発明を例示するだけのものであり、したがって決して本発明を限定するものとみなされてはならない例も、上記の本発明の態様および実施形態を記載および詳述する。それらの例は、下記の実験が、実施された全てまたは唯一の実験であることを表すものではない。用いる数字(例えば、量および温度)に関して正確を期する努力を払ったが、多少の実験誤差および偏差は考慮されなければならない。別途示されない限り、部は重量による部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧、またはその近くである。実施例および参考文献は本発明をより詳細に例示するために下で示すが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されない。当業者が思いつく例示項目のいかなる変形形態も、本発明の範囲内であるものとする。実験は、他のErbBファミリーメンバーにより単独で、または、他の分子(例えば、とりわけ、インスリン、インスリン模倣薬、インクレチン)と組み合わせて行うことができる。そのような組み合わせの更なる例は明細書を通して見つけることができるが、本開示に照らして当業者が知ることにもなろう。
【実施例】
【０２２９】
実施例１：L6筋細胞における細胞指数はインスリンに応答して用量依存的に低下した
早期のインピーダンス実験(図1および図2に図式化)は、インスリンが、インピーダンスアッセイで測定したラットL6筋細胞における細胞指数を、用量依存的に低下させることを示した。すなわち、インスリン濃度が上昇するにつれて、細胞指数は低下した。インピーダンスアッセイは、RT-CES(商標)16Xシステム(カリフォルニア州サンディエゴ、ACEA Bioscience社)を用い、特に指示のない限りおおむね製造元の指示書に従って実施した。略述すると、各96ウェルプレートの各ウェルを0.1%ゼラチンでコーティングし、ラットL6筋細胞約104個(米国、バージニア州マナサス、American Type Culture Collection「ATCC」から入手)を、10%(v/v)ウシ胎仔血清、100ユニット/mlペニシリンG、100μg/mlストレプトマイシン、および0.25μg/mlアンフォテリシンBを含むアルファミニマムイーグル培地(以下、「増殖培地」)により、各ウェルにまいた。細胞は、37℃および5%CO2の細胞培養インキュベータにより、一晩インキュベートした。翌日、増殖培地を除去し、ウェル当たり135μlの無血清培地で置換した。さらに6時間細胞をインキュベートした。次いで、無血清培地(15μl)中のインスリン(ヒトインスリン、100ユニット/ml、インディアナ州インディアナポリス、Eli Lilly and Company社)を各ウェルに添加し、インスリン添加後すぐに細胞指数を測定した。用量約0.1pM、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM、100nM、1.0μMを含む、約0.1pM〜約1.0μMの範囲にあるインスリン濃度をトリプリケートで調べた。インピーダンス変化の指標である細胞指数は、RT-CES(商標)16Xシステムソフトウェアにより計算した。本実施例は、L6細胞へのインスリン添加後数分以内の早さで細胞指数が低下し、インピーダンスアッセイがインスリン濃度の変化に対する細胞応答を検出できることを示した。塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)(型番234-FSE/CF)(ミネソタ州ミネアポリス、R&D Systems社)も同様に(0.1pM〜1.0μMの濃度で)調べたが、影響は見られなかった。
【０２３０】
実施例２：インスリンシグナル伝達に影響する他の因子もL6細胞における細胞指数を低下させる
本実施例で示すように、該実験はさらに、インスリンシグナル伝達経路に影響する他の因子も、L6細胞における細胞指数(インピーダンスアッセイで測定)を低下させることを示した。実施例1に述べた手順で、RT-CES(商標)16XシステムのプレートにL6細胞をまいた。実施例1に述べた手順で、インスリンに代わり15μl無血清培地においてそれぞれ濃度約100nMの被験因子を、ウェル中の細胞に個別に添加した。無血清培地を対照として用いた。因子の添加後すぐに、細胞指数をトリプリケートで測定した。その後、120分間にわたり測定を継続した。図3に示す本試験の結果は、インスリン様成長因子I(型番291-G1)およびII(型番291-G2)(ミネソタ州ミネアポリス、R&D Systems社)は、インスリン(100nM)よりも大幅に細胞指数を低下させた。ヒトPDGF-BB(型番220-BB)(ミネソタ州ミネアポリス、R&D Systems社)も細胞指数を低下させたが、インスリン(インディアナ州インディアナポリス、Eli Lilly and Company社)よりは小幅であった。遺伝子組み換えマウスGDF-8(型番788-G8;ミネソタ州ミネアポリス、R&D Systems社)は、インスリンシグナル伝達経路には影響しないものの、細胞指数を上昇させた。GH(遺伝子組み換えヒト成長ホルモン、型番1067-GH)およびbFGF(ミネソタ州ミネアポリス、R&D Systems社)については、有意な影響が認められなかった。
【０２３１】
実施例３：インスリン、IGF-I、IGF-II、またはPDGF-BBによる細胞のプレインキュベーションはその後のL6細胞におけるインスリン誘導性の細胞指数応答を阻害する
実施例2では、インスリンシグナル伝達経路に関わるインスリンおよび他の因子が、L6細胞を対象とするインピーダンスアッセイにおいて細胞指数を低下させることを示した。そこで、インスリン、またはインスリンシグナル伝達経路を調節する他の因子によりL6細胞をプレインキュベートするとき、インスリンに対するその後の応答に与える効果を調べた。インスリン、または、IGF-I、IGF-II、GDF-8、bFGF、PDGF-BB、GH(ミネソタ州ミネアポリス、R&D Systems社)のそれぞれについて最終濃度を約100nMとする他は、実施例1に述べた手順で本試験を行った。無血清培地を対照として用いた。該因子により約24時間、細胞をインキュベートした。24時間のインキュベーション後、ベースラインの細胞指数を測定した。次いで、約100nMの最終濃度でインスリンを各ウェルに添加し、すぐにトリプリケートで細胞指数を測定した。結果は、前出においてインスリンへの曝露時にL6細胞が示した通常の細胞指数の低下が、インスリンシグナル伝達経路に影響する因子でL6細胞をプレインキュベートすると、観察されないか、または有意に僅少化することを示した。すなわち、インスリン、IGF-I、IGF-II、またはPDGF-BBによる前処置後のインスリン処置がいずれも、単独のインスリン処置より細胞指数を上昇させたことは、該因子で前処置したL6細胞におけるインスリン応答が阻害されたことを示す。他方、無血清培地、GH、bFGF、またはGDF-8で前処置したL6細胞では、こうした応答低下が見られなかった。こうして本試験により、上述のようにL6細胞をプレインキュベートすると、インピーダンスアッセイで測定するその後のインスリン刺激に対する該細胞の応答を阻害することがわかった。
【０２３２】
実施例４：L6細胞におけるインピーダンスアッセイによるインスリン、IGF-I、およびIGF-IIのEC50の測定
インスリン、IGF-I、およびIGF-IIの最大効果の50%を生じる有効濃度(EC50)をインピーダンスアッセイによる測定で調べ、3H-デオキシグルコース法[HS Hundal他:Biochem J. 297:269-295(1994)]によるEC50の公表データと比較したところ、ほぼ同様であることが分かった。本試験では、実施例1に述べた手順で、インピーダンスアッセイ用にラットL6筋細胞(ATCC社)を調製した。実施例2および3と同様に、それぞれ濃度が10-13M〜10-6Mで変化するインスリン(図4A)、IGF-I(図4B)、またはIGF-II(図4C)を、個別のウェルに添加した。該因子によるインキュベーションの30分後に、トリプリケートで細胞指数を測定した。インピーダンス測定は、インスリンのEC50が約41nM、IGF-IのEC50が約102pM、およびIGF-IIのEC50が約2.9nMであり、すべて公表値と一致することを示した。
【０２３３】
実施例５：インスリンはヒト初代筋細胞における細胞指数を上昇させる
次に、インピーダンスアッセイにより、別の細胞型、すなわち初代ヒト骨格筋細胞(ニュージャージー州イーストラザフォード、Cambrex社)のインスリン応答を調べた。インスリンは初代ヒト骨格筋細胞の細胞指数に用量依存的に影響するものの、L6細胞の場合とは異なり逆方向の影響であることがわかった。インスリン濃度が上昇するにつれて、細胞指数も上昇した。おおむね実施例1に述べた手順で細胞をインピーダンスアッセイ用に調製し、0.1%ゼラチンでコーティングしたRT-CES(商標)16Xシステムを用いて同様にインピーダンスを測定した。こうして、約3×104個の初代ヒト骨格筋細胞を、該細胞用の増殖培地(25mM HEPES、10%ウシ胎仔血清、2mMグルタミン、0.5%ニワトリ胚抽出物、100 U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、および0.25μg/mlアンフォテリシンB入りのDMEM:培地およびサプリメントともにCambrex社から入手)により、各ウェルにまいた。5%CO2中37℃で一晩、細胞をインキュベートした。翌日、増殖培地をウェル当たり135マイクロリットルの無血清培地で置換し、さらに6時間、細胞をインキュベートした。次いで、無血清培地(15マイクロリットル)中のインスリン(インディアナ州インディアナポリス、Eli Lilly and Company社)を各ウェルに添加し、インスリン添加後すぐに細胞指数を測定した。インスリン濃度は10-13M〜10-6Mにおいて10倍間隔で上昇させ、トリプリケートで測定した。
【０２３４】
本試験は、初代ヒト骨格筋細胞において、インスリンが、細胞指数を用量依存的に上昇させることを示した。観察された細胞指数最高値は、最高被験インスリン濃度、すなわち10-6Mにおいて得られた。最低3濃度では、細胞指数によって測定されるインスリン効果が、ほぼ同等であると思われた。
【０２３５】
実施例６：インピーダンスアッセイで測定した初代骨格筋細胞におけるインスリン、IGF-I、およびIGF-IIのEC50は報告値と一致
インピーダンスアッセイにより、初代ヒト骨格筋細胞(ニュージャージー州イーストラザフォード、Cambrex社)におけるインスリン、IGF-I、およびIGF-IIのEC50を測定した。実施例5に述べた手順で、細胞を調製した。インスリン(図5A)、IGF-I(図5B)、およびIGF-II(図5C)の用量依存曲線は、約0.1pM〜約1.0μMの範囲の濃度で作成した。それぞれ30分後にトリプリケートで測定した。インスリンのEC50が約8.3nM(図5参照)と判明したことは、ヒト初代骨格筋細胞が、培養L6細胞(実施例4および図4に示すようにEC50=41nM)よりもインスリン感受性が約5倍大きいことを示す。ヒト初代骨格筋細胞において、IGF-IのEC50は約270pM(L6細胞よりもIGF-I感受性が低い)であり、IGF-IIのEC50は約2.7nM(L6細胞とIGF-II感受性が同等)であった。
【０２３６】
実施例７：IGF-IIは初代骨格筋細胞におけるインスリン応答を阻害する
実施例3で論じたように、IGF-IIによるラットL6細胞のプレインキュベーションが、その後のインスリン応答を阻害したことを踏まえ、本実施例では、IGF-IIが初代ヒト骨格筋細胞に対して同様の効果を有することを示す。
【０２３７】
実施例5に述べた手順で、初代ヒト骨格筋細胞(ニュージャージー州イーストラザフォード、Cambrex社)をインピーダンスアッセイ用に調製した。約10-13M〜約10-6Mの範囲の濃度で、IGF-II(ミネソタ州ミネアポリス、R&D Systems社)を添加した。前述と同様、5%CO2中37℃で24時間、細胞をインキュベートした。24時間後、ベースラインの細胞指数を記録した。次いで、約100nMの最終濃度までインスリンを添加し、30分後に細胞指数をトリプリケートで測定した。本試験の結果は、IGF-IIのプレインキュベーション濃度が上昇するにつれ、細胞指数に対するインスリンの効果が低下することを示した。すなわち、IGF-IIによる前処置は、前出において、ヒト初代骨格筋細胞をインスリンのみに曝露したときには観察された細胞指数の上昇を損なった、すなわち細胞指数の上昇幅を減少させた。以上の結果は、インスリンシグナル伝達経路において役割を果たす因子であるIGF-IIによる初代骨格筋細胞のプレインキュベーションが、L6細胞細胞では見られた初代ヒト骨格筋細胞におけるインスリン応答を阻害することを示す。
【０２３８】
実施例８：インスリン応答モジュレーターのハイスループットスクリーニング
早期の実験が、インピーダンスアッセイでインスリンへの細胞応答に影響する因子の同定が可能であると示して以来、インスリンシグナル伝達経路に影響すると思われる他の因子を高速大量に同定する目的でインピーダンスアッセイを用いた。ただし第一には、ヒト初代骨格筋細胞における細胞インピーダンスに影響する因子についてスクリーニングを行った。次いで、単独で用いたときに細胞インピーダンスに効果を有する因子だけでなく、インスリン処置がもたらす細胞インピーダンス変化に影響を及ぼし得る因子(すなわち、インスリン応答のモジュレーター)についてもスクリーニングを行った。
【０２３９】
前出の実施例に述べた手順で、初代ヒト骨格筋細胞(ニュージャージー州イーストラザフォード、Cambrex社)をインピーダンスアッセイ用に調製した。前述と同様に、細胞をプレートに付着させ、プレートを一晩インキュベートした。後続の手順は、試験目的によって異なった。
【０２４０】
一連の作用物質を細胞インピーダンス/細胞指数への効果について調べるために、一晩のインキュベーション後にベースラインのインピーダンスを確立した。増殖培地を除去し、無血清培地を添加した。次いで、無血清培地によりさらに6時間、細胞をインキュベートした。4分間にわたり2分間隔でインピーダンスを測定して、ベースラインを確立した。ベースラインの確立後、各ウェルに1タンパク質ずつ、スクリーニング試験作用物質を含む40マイクロリットルの培地で無血清培地を置換した。計30分間にわたり、2分ごとに各ウェルのインピーダンスを測定した。30分間の測定結果を、図6Aに示す。濃度10nMのインスリン様成長因子I(IGF-I)を、陽性対照として用いた。列1〜12および行A〜Hは、96ウェルプレートのウェルグリッドを指す。ベータセルリン(矢印)は、ウェルG3に収容する。ウェルH4には、内部陽性対照であるインスリン様成長因子I(IGF-I)を収容する。ウェルD6には、インターロイキン4(IL-4)を収容する。ウェルH3には、線維芽細胞成長因子1(FGF-1)を収容する。ウェルD10には、セマフォリン3Fを収容する。ウェルH10には、PDGF-Cを収容する。ウェルD8には、エンドセリン3を収容する。ウェル12A〜Dには、外部陽性対照である10nM IGF-Iを収容する。ウェル1E〜Hおよび2A〜Dについては、データを示さない。以上の結果は、ベータセルリンが、インピーダンスアッセイで測定したヒト初代骨格筋細胞における細胞指数に、有意な変化を誘発したことを示す。
【０２４１】
一連の作用物質を、細胞インピーダンスにおけるインスリン媒介性の変化に対する効果について調べるため、以下のように細胞を処置した。一晩のインキュベーション後、増殖培地を除去し、無血清培地を添加した。次いで、無血清培地でさらに6時間細胞をインキュベートし、ベースラインのインピーダンス測定値を得た。ベースラインの測定後、各試験作用物質40マイクロリットルずつを各ウェルに添加し、細胞を一晩インキュベートした。翌日、新規のベースライン測定を行い、インスリン処置前ベースラインのインピーダンス値を確立した。次いで、各ウェルにインスリンを200nMの濃度まで添加し、計30分間にわたり2分ごとにインピーダンスを測定した。スクリーニングは、37℃および5%CO2の細胞培養インキュベータで行った。各ウェルの測定値は、インスリン処置前ベースラインで正規化した。早期の実験において、10nMの濃度で細胞の前処置に用いるとインスリン媒介性の細胞指数上昇幅を低減することがわかった、インスリン様成長因子I(IGF-I)を対照として用いた。本試験では、2通りのスクリーニング実験を行った。一つは、(内部cDNAライブラリーからの)各種タンパク質分泌のためのcDNA発現細胞でならした培地を用いる実験であり、今一つは、各種精製組み換えタンパク質による実験である。ならし培地による実験結果を図6Bに示す。各ウェルの測定値は、新規ベースラインの最後の測定値で正規化した。データは、96ウェルプレート配列により、30分後の単一時点においてプロットした。ベータセルリンは、ウェルG3に配置した。ウェルF3は、FGF18である。ウェルH4は、内部陽性対照であるIGF-Iである。ウェルH3は、FGF1である。ウェル12A〜Dは、外部陽性対照として用いた10nM IGF-Iである。ウェル1E〜Hおよび2A〜Dについてはデータがない。
【０２４２】
精製組み換えタンパク質(100nMの精製ヒト組み換えベータセルリン、R&D Systems社から購入;ミネソタ州ミネアポリス、型番261-CE)、または(ベータセルリンを含む)各種分泌タンパク質を含むならし培地による、2通りの実験結果はいずれも、ベータセルリンが、ヒト初代骨格筋細胞のインスリンに対する細胞指数/インピーダンス応答を上昇させることを示した。すなわち、ヒト初代骨格筋細胞においては、細胞をベータセルリンで前処置するとインスリンにより生じる細胞指数の上昇幅が増大した。組み換えベータセルリンは、R. Sasada他:BBRC, 190:1173(1993)を参照すると、大腸菌(E. coli)において発現した水溶性成熟ヒトベータセルリンのDNA配列で特徴付けられ、80アミノ酸残基および分子量9.5kDaを有する。
【０２４３】
実施例９：ベータセルリンが誘発するインピーダンス変化の時系列
初代ヒト骨格筋細胞のベータセルリンまたはインスリン処置により生じる、インピーダンスの時系列変化を比較した。初代ヒト骨格筋細胞は、前述の方法でインピーダンスアッセイ用に調製した。ベースラインのインピーダンスは、0、2、4分後に確立した。約1μMインスリン(インディアナ州インディアナポリス、Eli Lilly and Company社)、約100nMベータセルリン、およびモックコントロールを、該当する各ウェルに個別に添加し、2分間隔で約30分間インピーダンス測定を継続した。前出の通り、結果を、インスリンまたはベータセルリン添加前のベースライン値に正規化した正規化細胞指数として示す。
【０２４４】
図7に示す結果は、インスリン(1μM)処置が、最初の6〜10分間で細胞指数の上昇を誘発することを示した。その後、細胞指数は、約30分間にわたり高値を保ち、30分を過ぎてわずかに低下した。これに対して、ベータセルリン処置は、最初の10〜20分間でインスリンよりも高度の細胞指数上昇を誘発し、約10分でピークに達した。その後、ベータセルリン処置細胞の細胞指数は低下し、約17〜35分後にインスリン処置細胞よりも低下したが、それでも、すべての時点でベータセルリンおよびインスリン処置細胞よりも低い細胞指数を示した対照細胞よりは高値であった。以上の結果は、ベータセルリンが時系列的にインスリンとは異なる仕方でヒト筋細胞に影響すること、ベータセルリンがインスリンとは異なり、作用の開始が急速(約5〜10分以内)で活性の持続が短いことを示す。
【０２４５】
実施例１０：精製ベータセルリンによる骨格筋細胞のプレインキュベーションはインスリンへの筋細胞応答を上昇させる
精製ベータセルリン100nMによる初代ヒト筋細胞のプレインキュベーション効果の動態を、その後のインスリン曝露への応答能により調べた。この目的のために、35分間にわたり、ベータセルリン前処置をインスリン1μMによる前処置と比較した。ベータセルリンによる細胞のプレインキュベーション(24時間)が、インスリンによる刺激後10分までに、その後のインスリンへの応答を上昇させることがわかった。さらに、図8に示すように、この効果は実験の残り30分間にわたり持続した。インスリン前処置では逆の効果が観察された。
【０２４６】
本試験では、前述の方法で初代ヒト骨格筋細胞を調製し、インピーダンスアッセイを行った。ベースラインのインピーダンス測定は、ベータセルリンまたはインスリンによる前処置前に行った。インスリン(インディアナ州インディアナポリス、Eli Lilly and Company社)、ベータセルリン(ミネソタ州ミネアポリス、R&D Systems社)、またはモックコントロール(無血清培地)をそれぞれ該当するウェルに添加し、30分間にわたり2分につき1回の測定頻度でインピーダンス測定を行った。細胞は、被験物質により24時間インキュベートした。次いで、インスリン処置前ベースラインのインピーダンス測定を行った。次に、各ウェルにインスリンを約200nMの最終濃度まで添加し、30分間にわたり2分間隔でインピーダンス測定を行った。本測定の結果は、1μMインスリンによるプレインキュベーションが、その後の細胞のインスリンへの応答を阻害するのに対し、100nMベータセルリンによるプレインキュベーションは、細胞のインスリンへの応答を上昇させることを示した。本実験は、ベータセルリンが、前出の実験(実施例8参照)において後続のインスリン応答を阻害することを示したIGF-IIとは異なり、活性においてインスリンを補うらしいことを示す。
【０２４７】
実施例１１：ErbBリガンドファミリーメンバーは各様のインピーダンス変化を誘発する
ベータセルリンが、インスリンシグナル伝達経路に関わるインスリンおよび他の因子と同様、ヒト筋細胞のインピーダンス変化を誘発するという知見をもとに、ErbBリガンドファミリーの他のメンバーが同様の効果を有するかどうか調べることにした。本試験では、約35分間の試験時間中、初代ヒト骨格筋細胞(Cambrex社)において、ErbBリガンドファミリーメンバーの誘発するインピーダンス変化がファミリーメンバー間で異なる場合のあることがわかった。調べたErbBリガンドポリペプチドは、R&D Systems社(ミネソタ州ミネアポリス)から購入したもので、TGF-α(型番239-A)、NRG1-アルファ(NRG1-α)EGFドメイン(型番296-HR)、NRG1-ベータ(NRG1-β)EGFドメイン(型番396-HB)、HB-EGF(型番259-HE)、エピレグリン(型番1195-EP)、EGF(型番236-EG)、アンフィレグリン(型番262-AR)、ベータセルリン(型番261-CE)、およびエピゲン(型番1127-EP)であった。
【０２４８】
初代ヒト骨格筋細胞は、6時間のインキュベーション手順において無血清培地約135マイクロリットルの代わりに約90マイクロリットルを用いた以外は、前出と同様インピーダンスアッセイ用に調製した。インキュベーション後、2分ごとに3回(0、2、4分後)、ベースラインを測定した。ベースラインの測定後、各被験物質の濃度を約100pMとして、各被験物質約10マイクロリットルずつをトリプリケートウェルに添加し、計30分間にわたって2分ごとに各ウェルのインピーダンスを測定した。各ウェルの測定値は、最終のベースライン測定値で正規化した。インスリン約1μMを陽性対照に用い、無血清培地を陰性対照に用いた。結果を図9に示す。
【０２４９】
本試験の結果は、複数のErbBリガンドファミリーメンバーが、ベータセルリン(BTC)と同様に、初代ヒト骨格筋細胞における細胞インピーダンスの上昇を誘発し得ることを示す。被験ErbBリガンドポリペプチドのうち、EGF(黒三角)、BTC(×)、HB-EGF(-)、およびTGF-α(黒ダイヤモンド)のすべてが、対照の誘発するよりも大きなインピーダンスの時系列変化を示した。インスリンへの応答が、インピーダンス測定の開始約10分後にピークに達し、測定時間全体にわたりピークを維持するのに対し、EGF、BTC、HB-EGF、およびTGF-αへの応答は、急速に上昇し、約14分後、16分後、16分後、16分後にそれぞれピークに達し、その後やはり急速に低下した。残るErbBリガンドポリペプチドであるエピレグリン、アンフィレグリン、およびエピゲンは、陰性対照とほぼ同様のふるまいを示した。NRG1-αおよびNRG1-βが誘発するインピーダンス変化は、陰性対照をやや下回った。本実験は、被験ErbBリガンド濃度(100pM)において、EGFおよびベータセルリンが最大の細胞指数上昇効果を生じ、HB-EGF、およびTGF-アルファがこれに続くことを示した。他のErbBリガンドも同様の活性を有すると考えられる。
【０２５０】
実施例１２：インスリンおよびベータセルリンによる骨格筋細胞へのグルコース取り込みの刺激
ベータセルリンが、インスリンと同様に、初代ヒト骨格筋細胞におけるインピーダンス変化を誘発することを見出した後、ベータセルリンが、インスリンと同様に、グルコース取り込みを刺激するかどうか調べた。図10の結果は、ベータセルリンがインスリンよりも強力に、初代ヒト骨格筋細胞へのグルコース取り込みを刺激したことを示す。
【０２５１】
たとえばE. Suarez他:J. Biol. Chem., 275:18257-18264(2001)による測定法のように、最も頻用され、そのために「ゴールドスタンダード」と呼ばれる、グルコース取り込みの直接的な測定法では、放射性の非代謝性3Hデオキシグルコースを用いる。たとえば、グルコース取り込み率は、筋細胞への放射性3Hデオキシグルコースの取り込み率として測定する[G. Sweeney他:J. Biol. Chem., 274:10071-10078(1999)]。
【０２５２】
本試験では、初代ヒト骨格筋細胞(Cambrex社)を前述の方法で調製し、5時間にわたり血清飢餓培養した。次いで、濃度約10-11M〜約10-4Mのインスリン(インディアナ州インディアナポリス、Eli Lilly and Company社)、または濃度約10-13M〜10-6Mのベータセルリン(ミネソタ州ミネアポリス、R&D Systems社)により、細胞を20分間インキュベートした。対照細胞には、該成長因子の添加を行わなかった(すなわち、インスリン、ベータセルリンを含まない)。次いで培地を、標識なしのデオキシグルコース10μM溶液中に1μCi 3Hデオキシグルコースを含む50マイクロリットルグルコースフリー培地で置換した。放射性物質で標識したグルコースで細胞を15分間インキュベートし、次いで氷冷したリン酸バッファー(PBS)で3回洗浄した。次いで、0.05N水酸化ナトリウム(NaOH)1mlを用いた10分間にわたる一定の振とうにより細胞を溶解し、PerkinElmer TopCountマイクロプレートシンチレーションカウンター(マサチューセッツ州ウェルズリー、PerkinElmer Life and Analytical Sciences社)により放射能を測定した。結果は、無処置の対照細胞において測定したグルコース取り込みに対する相対値でプロットした。インスリンのEC50約27nMに対し、ベータセルリンのEC50は約43pMであったことは、初代ヒト骨格筋細胞においてはベータセルリンの方がインスリンよりもグルコース取り込みの刺激能が強力であることを示す。
【０２５３】
実施例１３：ヒト骨格筋細胞によるグルコース取り込みに対するインスリンおよびベータセルリンの併用効果
初代ヒト骨格筋細胞におけるグルコース取り込みに対するベータセルリンおよびインスリンの併用効果を調べ、加算的効果の有無を判定した。図11に示すように、本試験で、10pMの低濃度ベータセルリンおよび100pMの低濃度インスリンの配合剤が、ベータセルリン単剤またはインスリン単剤の場合と比べて、初代ヒト骨格筋細胞におけるグルコース取り込みを協同的に上昇させることがわかった。
【０２５４】
本試験では、放射性グルコースの取り込みを実施例12に述べた手順で測定した。100nMベータセルリンは、3Hデオキシグルコースの取り込みを、対照の約2150cpmから約2600cpmに上昇させた。10pMベータセルリンおよび100pMのインスリンは、対照とおおむね同様のふるまいを示した。これに対して、10pMベータセルリンおよび100pMのインスリンの配合剤は、初代ヒト骨格筋細胞におけるグルコースの取り込みを、約2500cpmと有意に上昇させた。
【０２５５】
実施例１４：ベータセルリンは骨格筋細胞におけるインスリン刺激性のグルコース取り込みを用量依存的に促進する
10pMベータセルリン(図12、上)ならびに1pMベータセルリン(図12、下)と、各濃度のインスリンとの併用について調べた。図12に示すように、結果は、ベータセルリンが、インスリン効果への加算的効果を有し、インスリン刺激性のグルコース取り込みを用量依存的に上昇させることを確認した。本実験では、実施例12に述べる手順でグルコース取り込みの測定を行った。ベータセルリンはインスリンのEC50を変化させないことがわかった。ただし、ベータセルリンは、1.0pMの濃度でも、インスリンが刺激する初代ヒト骨格筋細胞によるグルコース取り込みの大きさを増大させた。
【０２５６】
実施例１５：ErbBリガンドファミリータンパク質による骨格筋細胞へのグルコース取り込みの刺激
さらに、実施例12に述べた放射性グルコース取り込み法による測定法で、筋細胞へのグルコース取り込みの刺激能について、他のErbBリガンドファミリーメンバーを調べた。被験ErbBリガンドポリペプチドはいずれも、異なる度合いで筋細胞へのグルコース取り込みの上昇を刺激した。
【０２５７】
ErbBリガンドは、いずれもR&D Systems社(ミネソタ州ミネアポリス)から購入し、以下を含む:(1)ベータセルリン(BTC)(型番261-CE)は、R. Sasada 他:BBRC, 190:1173(1993)が述べる通り、水溶性の成熟ヒトベータセルリンタンパク質配列をコードするDNAから大腸菌(E. coli)により発現する80アミノ酸残基のタンパク質で、約9.5kDaの予測分子量を有する。(2)上皮成長因子(EGF)(型番236-EG)は、アクセッション番号P01133およびG.I. Bell他:Nucleic Acids Res. 14(21):8427-8446(1986)が述べる通り、成熟ヒトEGFタンパク質(Asn971〜Arg1023)をコードするDNA配列から大腸菌(E. coli)により発現する、成熟ヒトEGFタンパク質のN末端がメチオニン型で54アミノ酸残基からなるタンパク質で、約6kDaの予測分子量を有する。(3)ヘパリン結合EGF(HB-EGF)(型番259-HE)は、S. Higashiyama他:Science 251:936(1991)が述べる通り、バキュロウイルス発現系を用いるSf21昆虫細胞における、ヒトHB-EGF前駆体のN末端側148アミノ酸残基をコードするDNA配列の発現産物から、62アミノ酸残基のシグナルおよびプロペプチド配列を除去して産生する、86アミノ酸の成熟組み換えタンパク質で、約9.5kDaの予測分子量を有する。ただしこの組み換えタンパク質は、不均一反応によりO-グリコシル化することが知られており、SDS-PAGEでは約12kDaのタンパク質と定量される。(4)TGF-アルファ(TGF-α)(型番239-A)は、R. Derynck他:Cell 38:287-297(1984)が述べる通り、成熟ヒトTGF-αタンパク質配列をコードするDNA配列から大腸菌(E. coli)により発現する、50アミノ酸残基の組み換えタンパク質で、約0.6kDaの予測分子量を有する。(5)NRG1-アルファ(NRG1-α)(型番296-HR)は、W.E. Holmes他:Science 256:1205(1992)が述べる通り、アミノ酸残基177〜241であるヘレグリンアルファのEGFドメインをコードするDNA配列から大腸菌(E. coli)により発現する、65アミノ酸残基の組み換えタンパク質で、約7kDaの予測分子量を有する。(6)アンフィレグリン(AR)(型番262-AR)は、G.D. Plowman他:Mol. Cell. Biol. 10:1969(1990)が述べる通り、アミノ酸残基Ser101〜Lys198に対応する、98アミノ酸残基からなる成熟ヒトアンフィレグリンをコードするDNA配列から大腸菌(E. coli)により発現する、98アミノ酸残基の組み換えヒトタンパク質で、約11kDaの予測分子量を有する。(7)エピレグリン(EPR)(型番1195-EP)は、ヒトエピレグリンの成熟鎖Val63〜Leu108をコードするDNA配列から大腸菌(E. coli)により発現する、47アミノ酸残基からなるメチオニン型の組み換えヒトエピレグリン(アクセッション番号XP_003511)で、約5.4kDaの予測分子量を有する。(8)エピゲン(型番1127-EP)は、アミノ酸残基53〜103に対応する、マウスエピゲンの機能性内部ペプチドをコードするDNA配列から大腸菌(E. coli)により発現する、51アミノ酸残基からなる組み換えマウスエピゲンで、約5.9kDaの分子量を有する。(9)NRG1-ベータ(NRG1-β)(型番396-HB)は、W.E. Holmes他:Science 256:1205-1210(1992)が述べる通り、アミノ酸残基176〜246に対応する、ヘレグリンベータのEGFドメインをコードするDNA配列から大腸菌(E. coli)により発現する、71アミノ酸残基の組み換えタンパク質で、約8kDaの予測分子量を有する。
【０２５８】
本実験では、実施例12に述べた手順で、初代ヒト骨格筋細胞を処置した。細胞を5時間、血清飢餓培養した。次いで、対照細胞には培地のみを添加するのと別に、約10-13M〜約10-7Mで変化する各濃度のErbBリガンドポリペプチドを、それぞれ無血清培地による個別の細胞ウェルに添加する。次いで、細胞を37℃で20分間インキュベートした後、培地を完全に除去し、10μMデオキシグルコース中に3Hデオキシグルコース1μCiを含むグルコースフリー培地50マイクロリットルを各ウェルに添加した。細胞を放射性物質で15分間標識した後、標識培地を除去し、氷冷したリン酸バッファーで細胞を3回洗浄した。次いで、0.05N水酸化ナトリウム1mlを用いて10分間にわたる一定の振とうにより細胞を溶解し、PerkinElmer TopCountマイクロプレートシンチレーションカウンターにより放射能を測定した。結果は、対照と比較した相対値による3Hデオキシグルコース取り込み、および被験ErbBリガンドタンパク質濃度の関数としてプロットした。
【０２５９】
図13Aに示すように、ベータセルリン、EGF、HB-EGF、およびTGF-αは、約10pM〜約100pMのEC50でグルコース取り込みを刺激した。図13Bは、AR、EPRおよびエピゲンが、それぞれnM範囲のEC50でグルコース取り込みを刺激したことを示す。ベータセルリンおよびEGFのEC50は、それぞれ約46pMおよび60pMであり、図10で見た約27nMのインスリンよりもはるかに低値である。これに対して、エピレグリン(EPR)、アンフィレグリン(AR)、およびエピゲンのEC50は、それぞれ約4〜20nMであり、インスリンのEC50とほぼ同じ対数範囲に落ち着く。したがって、ErbBリガンドファミリーのうち、ベータセルリン、EGF、HB-EGF、およびTGF-α、エピレグリン、アンフィレグリン、およびエピゲンは、いずれも初代ヒト骨格筋細胞におけるグルコース取り込みを有意に誘発し、インスリンと同等またはそれ以上であった。NRG1-α(アルファ)およびNRG1-β(ベータ)は、本測定で有意にグルコース取り込みを刺激しなかったが、これら分子に対して該細胞系の感受性が低い可能性がある。後出の実験(実施例36、図34)で示すように、NRG1-β1は、ラット新生仔心筋細胞によるグルコース取り込みを確かに誘発した。
【０２６０】
実施例１６：組み換えヒトベータセルリンの産生
組み換えヒトベータセルリンのcDNAは、米国特許第5,886,141号などが述べる方法を用いれば、真核細胞または原核細胞を問わず、常套的ないくつかの各種発現系で発現し、組み換えタンパク質を産生すると考えられる。
【０２６１】
in vivoでの測定用により多量のベータセルリンを得るために、大腸菌(E. coli)のpET24/BTC発現ベクターの発現による常套的手法を用いて、組み換えヒトベータセルリンを産生した(以下、「大腸菌(E. coli)発現から内在的に産生したBTC」と呼ぶ)。まず、Hisタグ(サブクローニング中に除去)なしで、ベクターpET24(+)(カリフォルニア州サンディエゴ、EMD Biosciences社、Novagen)内にBTC構築物を作製し、これが、先頭のメチオニン(Met)残基を上流に有し、アミノ酸残基Asp32〜Tyr111に対応する、活性な組み換えヒトベータセルリン断片をコードした。ベクターは、常套的手法に従い、大腸菌(E. coli)Rosetta(商標)(DE3)細胞(Novagen)に導入した。個々のトランスフォーマントを単離し、pET24ベクター製造元の指示書(pET System Manual, 10th and 11th Editions, Novagen)に従って培養した。次いで、ToyoPearl AF-Blue樹脂によるアフィニティークロマトグラフィーおよびPhenyl-Sepharose 6 Fast Flow(high sub)による疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて、菌体溶解液中の封入体からBTCを精製した。手順の詳細は、以下に示す。標準化学物質はすべて、Sigma-Aldrich Chemical社(ミズーリ州セントルイス)から入手した。
【０２６２】
最初の発酵段階では、Rosetta(商標)(DE3)細胞を、標準的な菌体発酵槽内37℃のルリア(LB)培地(カナマイシン50μg/mlおよびクロランフェニコール34μg/mlを追加)で振とう培養し、波長約600nMにおける光学濃度が約5となるようにした。次いで、1mMイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド(ミズーリ州セントルイス、Sigma Chemical社)存在下で、rhBTCタンパク質の発現を4時間にわたり誘発した。
【０２６３】
BTCタンパク質を得るための、封入体の収集および可溶化プロセスは、以下の通りであった。菌体内における不溶性の封入体として産生されるBTCは、以下の方法で精製した。細胞を遠心分離により収集し、最初の培地の0.1容量に等しい容量中に10mM EDTAおよび1% Triton X-100を含むpH8.0の20mMトリス塩酸バッファー中に、細胞ペレットを再懸濁させる。その後、(Microfluidizerを用いる)高圧ホモジナイゼーションにより細胞を溶解し、4℃、20000×gで15分間の遠心分離により封入体(IB)を回収した。IBペレットは、同体積に10mM EDTAおよび1% Triton X-100を含むpH8.0の20mMトリス塩酸バッファーで2回洗浄し、可溶化バッファー(7M塩酸グアジニンおよび5mMジチオスレイトールを含有するpH8.0の100mMトリス塩酸バッファー)ml当たりペレット3mgで再懸濁させた。BTCタンパク質は、振とうせず平均1時間、4℃のインキュベーションにより、IBから抽出した。
【０２６４】
次の段階は、組み換えBTCのリフォールディングをともない、以下の手順に従った。抽出後、可溶化タンパク質濃度を2.5mg/mlに調節し、リフォールディングバッファー(2M尿素、0.5mM酸化型グルタチオン、1mM還元型グルタチオン、および0.1Mアルギニンを含有するpH8.0の50mMトリス塩酸バッファー)でさらに25倍に希釈した後、4℃で約20時間インキュベートすると、この間にBTCが再生またはリフォールディングした。リフォールディングは、濃縮型3M酢酸ナトリウム(pH4.75)でpHを5.0に調節することにより終了した。リフォールディングしたBTCタンパク質は、精製水で1:3に希釈したリン酸バッファー(PBS)(カルシウムおよびマグネシウムを含まない)により透析した。リフォールディングしたBTCを含む透析液は、5000×gの遠心分離で透明化した。
【０２６５】
次に、BTCをクロマトグラフィーで精製した。リフォールディングしたBTCは、50mM NaClを含有するpH7.0の10mMリン酸カリウムバッファー(バッファーA)で平衡化した、Toyopearl AF-Blue HC-650カラム(1.6cm×20cm)(ペンシルベニア州モンゴメリービル、Tosoh Bioscience LLC社)に注入した。タンパク質は、カラム容積の20倍量にわたり確立した、バッファーAからバッファーB(1.5M NaClを含むpH7.0の10mMリン酸カリウムバッファー)への連続的濃度勾配(すなわち、0〜1.5M NaClの直線濃度勾配)により、流量3ml/分で溶出した。目的のBTC含有分画を収集し、プールした。1.5M NH4SO4を含有するpH7.0の10mMリン酸カリウムバッファー(バッファーC)で平衡化したPhenyl-Sepharose(商標)6FF/high sub(1.6cm×20cm)(ニュージャージー州ピスケイタウェイ、GE Healthcare社)を用いる、疎水性相互作用クロマトグラフィーによるさらなる精製のため、硫酸アンモニウムを加えて最終濃度1.3Mとした。BTCタンパク質は、カラム容積の25倍量にわたり確立した、バッファーCからバッファーD(50mM NaClを含むpH7.0の10mMリン酸カリウムバッファー)への連続的濃度勾配により、流量3ml/分で溶出した。精製BTCタンパク質含有分画(SDS-PAGEおよびクーマシーブルー/銀染色の常套的なタンパク質可視化法により定量)は、タンジェンシャルフロー濾過により濃縮し、濃縮液をPBS(Ca2+/Mg2+を含まない)で透析した。
【０２６６】
エンドトキシンの除去は、製造元の指示書に従い、セルファイン(商標)ETクリーン(日本国、東京、チッソ株式会社)クロマトグラフィーを用いたさらなる精製[M. Sakata他:American Biotechnol. Lab. 20:36(2002)]により達成した。略述すると、透析したBTCを、PBSで平衡化したセルファイン(商標)ETクリーンカラム(10×0.9cm[内径]、9.6ml)に注入し、流量0.5ml/分のフロースルーで回収した。リムルス(LAL)試験(メリーランド州ウォーカーズビル、Cambrex社)による評価では、最終BTC溶液(Ca2+/Mg2+を含まないPBSによる)のエンドトキシン含有量は、通例通り2E.U./mg未満であった。
【０２６７】
実施例１７：正常マウスによるベータセルリンのクリアランス
正常マウスにベータセルリンを静脈内注射し、約60分間にわたり血漿ベータセルリン値を観察した。ワイルドタイプ正常C57BL/6Jマウス(マサチューセッツ州、Charles River Laboratories社から入手した9週齢、雄)に、マウス体重kg当たり0.5mg(すなわち、0.5mg/kg)の単回静脈内投与により、ベータセルリン(ミネソタ州ミネアポリス、R&D Systems社)を投与した。ベータセルリンの血清濃度は、各時点(ベータセルリン投与の5〜60分後)の尾静脈から採取した血液をもとに、酵素免疫測定(ELISA)法(ミネソタ州ミネアポリス、R&D Systems社から入手)によりモニタリングした。注射した組み換えベータセルリンはヒト起源の組み換えタンパク質であり、使用したELISA法はマウスベータセルリン(製造元によれば、交叉反応性は0.125%未満)を検出しない。こうして、注射したヒトベータセルリンのクリアランス率のみを測定することができた。時間(分)の関数としてマウス血漿中のベータセルリン値nMをプロットした結果(図14参照)は、ベータセルリンが、投与5分後に約180nMで検出可能となり、約15分後に150nMをやや超える値まで低下した後、約30分後に約100〜120nM、約60分後に約50nMとなり、マウスにおける半減期は約32分間であることを示す。本実験は、正常C57BL/6Jマウスにおけるヒト組み換えベータセルリンの循環半減期が約32分間であることを示した。各データ点は、マウス3匹による測定の平均値を示す。
【０２６８】
実施例１８：ベータセルリンの皮下投与は静脈内投与よりもバイオアベイラビリティを延長する
正常C57BL/6Jマウスにおける静脈内注射時ベータセルリンの滞留時間を、皮下注射時と比較した。図15Aおよび15Bに示すように、in vivoにおけるベータセルリンの皮下投与は、静脈内投与と比べて、バイオアベイラビリティの持続時間を飛躍的に延長させることがわかった。
【０２６９】
本測定では、ワイルドタイプの正常C57BL/6Jマウス(マサチューセッツ州、Charles River Laboratories社から入手した、9週齢、雄)に、単回投与量0.05mg/kgのベータセルリン(ミネソタ州ミネアポリス、R&D Systems社から入手)を、皮下(s.c.)または経尾静脈内(i.v.)注射した。血液試料は、約2、5、15、30、60、120分後の時点に、各マウスの尾静脈から採取した。結果(図15A)は、ベータセルリンの皮下投与が、投与約2分後に約150nMで検出可能な血漿値を生じ、約5分後に約440pM、約15分後には500pMをやや超える値まで上昇した後、約30分後に約575pMで最高値に達したことを示す。血漿ベータセルリン値は、約60分後に約440pM、約120分後には約320pMに低下した。
【０２７０】
これに対し、0.05mg/kgの投与量でベータセルリンを静脈内注射されたマウス(図15B)は、投与約5分後に約620pMの血漿値を示した。ベータセルリンは、マウスの血漿中から約15分間でクリアランスされ、この時点でベータセルリンは検出不能となった。こうして、ベータセルリンのバイオアベイラビリティ持続時間は、静脈内投与と比較して皮下注射により飛躍的に延長した。ただし、ベータセルリンの血中値は、皮下(s.c.)注射したマウスよりも、i.v.注射したマウスの方がはるかに早く高値を示した。各データ点は、マウス3匹による測定の平均値を示す。
【０２７１】
実施例１９：皮下投与後におけるベータセルリンの最高血漿濃度およびクリアランス率は投与量依存的であった
正常C57BL/6Jマウスに2種類の投与量で皮下注射したときの、ベータセルリンの血漿値を検討した。結果を図16に示す。ヒト組み換えベータセルリンのin vivo循環濃度は、投与量0.8mg/kgの皮下(s.c.)投与後のマウスにおいて120nMまで上昇し、120分間またはそれ以上にわたり維持され得ることがわかった。本試験では、ワイルドタイプの正常C57BL/6Jマウスに、単回投与量0.05mg/kgまたは0.8mg/kgのベータセルリンを皮下(s.c.)注射した。血液試料は、注射後約2、5、15、30、60、120分の時点に尾静脈から採取し、前出と同様のELISA法によりベータセルリン値を解析した。ベータセルリンの皮下投与後、ベータセルリンの血漿値は、投与量0.8mg/kgで注射したマウスの場合、投与後約60〜約120分に約120nMの最高値に達した。0.05mg/kgのs.c.投与の場合、ベータセルリンは、投与後約30分に約0.6nMの最高値に達した。ちなみに、健康ヒト血漿中におけるベータセルリン循環値は、約3pMである。各データ点は、マウス3匹による測定の平均値を示す。
【０２７２】
実施例２０：ベータセルリンは正常マウスにおける血中グルコースを投与量依存的に低下させる
絶食後に各投与量のベータセルリンを投与した正常C57BL/6Jマウスの血中グルコースレベルを検討した。結果を図17に示す。ベータセルリンが、絶食マウスにおける血中グルコースレベルを、投与量に応じた迅速な動態により低下させることがわかった。本試験では、時点0においてワイルドタイプの正常C57BL/6Jマウスに餌を与えず絶食させ、30分後に単回投与で生理食塩水、または0.005mg/kg、または0.05mg/kg、または0.5mg/kgのベータセルリンを皮下注射した。血液試料は、ベータセルリンまたは生理食塩水注射前の時点0分(絶食前)、30分後(絶食後)、および該注射の30分後(t=60分)の各時点に、各マウスの尾静脈から採取した。血液試料は、ベータセルリン値(ELISA法による)および自動グルコースモニター(米国カリフォルニア州ミリピタス、Lifescan社、One Touch II)による総血中グルコースレベルの双方について解析した。図17Aは、約123mg/dLの絶食前グルコースレベルおよび約142mg/dLの絶食後グルコースレベルを示す。t=60分の時点で、生理食塩水を投与したマウスの血中グルコースレベルは平均約145mg/dL、ベータセルリン0.5mg/kgを投与したマウスの血中グルコースレベルは平均約115mg/dL、ベータセルリン0.05mg/kgを投与したマウスの血中グルコースレベルは平均約127mg/dL、ベータセルリン0.005mg/kgを投与したマウスの血中グルコースレベルは平均約146mg/dLであった。
【０２７３】
血漿ベータセルリン値は、グルコース測定の2分後に測定した。結果を図17Bに示す。ベータセルリンの投与量が0.5μg/g(すなわち、0.5mg/kg)のときの血漿ベータセルリン値は約47.2nM、ベータセルリンの投与量が0.05μg/g(すなわち、0.05mg/kg)のときの血漿ベータセルリン値は約1.19nM、ベータセルリンの投与量が0.005μg/g(すなわち、0.005mg/kg)のときの血漿ベータセルリン値は約0.0661nMであった。こうして、ベータセルリンは、絶食後の正常マウスにおける血中グルコースレベルを、投与量依存的かつ迅速な動態により低下させた。各データ点は、マウス6例による測定の平均値を示す。
【０２７４】
実施例２１：摂食後におけるベータセルリンのグルコース低減効果
前出の一連の実験(実施例12から14、図10〜12)では、ベータセルリンおよび他のErbBリガンドファミリー各メンバーが、in vitroにおいて骨格筋へのグルコース取り込みを刺激することを示した。以上の試験は、ベータセルリン効果が投与量依存的であること、ベータセルリンの方がインスリンよりも初代ヒト骨格筋培養細胞によるグルコース取り込みをより強力に推進することを示した。in vivoにおける血中グルコースレベルに対するベータセルリンの効果を理解するために、糖尿病(db)および正常マウスを対象とするグルコース耐性試験(GTT試験)を用いた。
【０２７５】
糖尿病のモデルとしてdbマウス(Mouse Genome Informatics(MGI)accession number 1856009)[KP Hummel他:Science 153(740):1127(1966)が述べる]、非糖尿病正常対照系統として正常C57BL/6Jマウスを用いた。dbマウスは、ヒト糖尿病のモデルとして長く被験対象となってきた[CE Hunt他:Fed Proc. 35(5):1206-17(1976)]。Harlan Laboratories社から7〜8週齢の雄dbマウス(C57BL/Ks系統のII型糖尿病マウスである、C57BL/KsOlaHsd-Leprdbマウス;インディアナ州、Harlan Laboratories社)を入手し、Jackson Laboratories社から7〜8週齢のC57BL/6Jマウス(C57BL/6J、系統番号000664、メーン州バーハーバー、The Jackson Laboratories社)を入手した。すべてのマウスに、試験開始前1週間の順応期間を与えた。ベータセルリンは、大腸菌(E. coli)における発現から内在的に調製した。各ロットにおけるベータセルリン活性は、インピーダンスアッセイまたはErbB受容体の酸化法(実施例35に述べる)により確認した。
【０２７６】
試験日において、マウスは午前7時から5時間にわたり絶食した。ベースライン(絶食時)の血中グルコースレベルは、5時間絶食時点(すなわち、時刻0分)において測定した。各系統につき、マウスを絶食時グルコースレベルに基づく6投与群ずつに振り分けた。マウスは、各系統の投与群当たり8例ずつであった。マウスを投与群に振り分けてすぐ、ベータセルリン(BTC)0.25mlまたは生理食塩水を皮下注射により投与し、直後にグルコース0.25mlの腹腔内注射を行った。C57BL/6Jマウスおよびdbマウスに、それぞれ4g/kgおよび0.75g/kgのグルコースを投与した。dbマウスおよびC57BL/6Jマウスのいずれにも同等な6つの投与群は以下の通りであった:生理食塩水群、0.01mg/kg BTC群、0.1mg/kg BTC群、1.0mg/kg BTC群、3.0mg/kg BTC群、および10.0mg/kg BTC群。グルコース投与後4時間までの複数時点において、尾静脈から血中グルコースレベルを測定した。血中グルコースレベルは、Bayer社製Ascensia血糖測定器により測定した。試験結果を図18に示す。各データ点は、マウス8匹の平均値を示す。
【０２７７】
C57BL/6Jマウス(図18A)についての結果は、生理食塩水、0.01mg/kg BTC、0.1mg/kg BTC、1.0mg/kg BTC、3.0mg/kg BTC、および10mg/kg BTC各群の血中グルコースレベルが、ベースライン時(時刻0)に約115mg/dL、30分後に約410mg/dL、60分後に約280mg/dL、90分後に約190mg/dLであったことを示す。C57BL/6Jマウスでは、生理食塩水およびBTC投与群間に有意差(t検定で判定)は見られなかった。
【０２７８】
dbマウス(図18B)についての結果は、すべてのBTC投与群で、ベースライン時の血中グルコースレベルが約220mg/dLであったことを示す。生理食塩水投与群の血中グルコースレベルは、30分後に約500mg/dLに上昇した後、60分後に約390mg/dLに減少し、90分後に約310mg/dL、120分後に約250mg/dL、240分後に約170mg/dLとなった。0.01mg/kg BTC投与群の血中グルコースレベルは、30分後に約380mg/dLに上昇して後、60分後に約300mg/dLに減少し、90分後に約230mg/dL、120分後に約210mg/dL、240分後に約170mg/dLとなった。0.1mg/kg BTC投与群の血中グルコースレベルは、30分後に約380mg/dLに上昇した後、60分後に約220mg/dLに減少し、90分後に約200mg/dL、120分後に約190mg/dL、240分後に約100mg/dLとなった。1.0mg/kg BTC投与群の血中グルコースレベルは、30分後に約280mg/dLとなった後、60分後に約200mg/dLに減少し、90分および120分後に約190mg/dL、240分後に約100mg/dLとなった。3.0mg/kg BTC投与群の血中グルコースレベルは、30分後に約205mg/dLとなった後、60分後に約170mg/dLに減少し、90分後に約190mg/dL、120分後に約170mg/dL、240分後に約100mg/dLとなった。10.0mg/kg投与群の血中グルコースレベルは、30分後に約205mg/dLとなった後、60分および90分後に約220mg/dL、120分後に約170mg/dL、240分後に約100mg/dLとなった。BTC投与群におけるマウスのグルコースレベルは、生理食塩水投与群におけるマウスとの間で有意差(t検定で判定)を示した。
【０２７９】
本試験は、GTTが示すグルコースバースト後の糖尿病dbマウスにおいてはベータセルリンにより有意なグルコース低減効果が生じるが、正常C57BL/6Jマウスにおいてはベータセルリンによる有意なグルコース低減効果は生じないことを示した。グルコース低減効果は、0.01mg/kg〜10mg/kgの範囲で投与量依存的であった。本実験の結果は、ベータセルリン投与が、食後などのグルコース変動後における急速かつ有意な血糖制御を達成するために考慮すべき因子であることを示す。dbマウスがヒト糖尿病の有用なモデルであると報告されているので、本実験はさらに、ベータセルリンが、インスリン耐性患者の治療に有効であろうことをも示す。
【０２８０】
実施例２２：ベータセルリンの慢性投与はヘモグロビンA1cおよびインスリンを低下させる
本実験では、in vivoにおける、ベータセルリンへのマウスの慢性曝露の効果を調べた。スタンフォード大学Mark Kay博士の研究室(Stanford, CA 94305)から入手したベクターを、Kay研究室がHum. Gene Ther. 16(1):126-31(2005)、Hum. Gene Ther. 16(5):558-70(2005)、およびWO 04/02065に述べる方法で用いて、ベータセルリン遺伝子を導入した。ベータセルリンをコードするcDNAを目的遺伝子として、ヒト第IX因子イントロンの下流に挿入して上記ベクターを修飾した。本ベクターは、図19に図解した構造を有する。修飾ベクターは、F. Liu他:Gene Therapy 6:1258-1266(1999)および米国特許第6,627,616号が報告する動水力学的尾静脈注射法を用いて、尾静脈からマウスに注射(詳細は以下に述べる)した。
【０２８１】
前出の実験(実施例21、図18)では、ベータセルリンのボーラス注射投与後のGTT試験が示すように、糖尿病(db)マウスへのベータセルリンの急性投与が、摂食後の血糖抑制を急速に改善することを示した。米国糖尿病学会では、糖尿病患者の長期ケアモニタリング法として、年に数回のヘモグロビンA1c(HbA1c)測定を推奨している[D.E. Goldstein他:Diabetes Care 27:1761-1773(2004)を参照]。HbA1cは、ヘモグロビンAoの糖化により形成され、数週間分の血中グルコースレベルに比例する。したがってHbA1cの測定は、糖尿病治療法の長期的治療価値を理解するために有用である。
【０２８２】
上述の方法で作製したヒトベータセルリンのcDNA発現ベクター(「DNA構築物」)を、尾静脈注射によりdbマウス(対照マウス10例およびベータセルリン投与マウス18例)に導入し、3週間にわたり複数の血糖パラメータをモニタリングした。Harlan Laboratories社から7〜8週齢のdbマウスを入手し、約3週間の施設環境への順応期間の後に調べた。ベータセルリンのcDNA発現ベクターは、構築物#CLN00908052と名づけた。血中グルコースレベルの測定はすべて、Bayer社Ascensia血糖測定器により行った。HbA1cは、Bayer社DCA 2000試薬キットおよびリーダーにより、dbマウス尾静脈血を用いて全血液から測定した。インスリンは、Crystal Chem社製のELISA法キット(型番90060、イリノイ州ダウナーズグローブ)を用いて血漿から測定した。ベータセルリンは、R&D Systems社製のELISA法キット(型番DY261)を用いて血漿から測定した。
【０２８３】
ベータセルリン群には、0日目に、DNA構築物100μgを含むリンゲル液4.2mlの注射によりベータセルリンを投与した。対照または生理食塩水群には、0日目に、リンゲル液を注射した。5日目および18日目に、ベータセルリンの発現を測定した。0日目、7日目、14日目、21日目に、絶食時血中グルコースレベル(絶食4時間後)を測定した。0日目、7日目、14日目、21日目には、HbA1cも測定した。インスリン値は、11日目に測定した。
【０２８４】
実験結果を図20に示す。図20Aは、5日目までに、dbマウス16例中13例において、100pM〜約10,000pMの範囲にある著明量のベータセルリンが観察されたが、該16例中3例では検知可能な発現が見られなかったことを示す。しかし18日目までには、dbマウス16例中16例が、約100pMでベータセルリンを発現した。結果は、dbマウスが、少なくとも18日間は持続する高値で、ヒトベータセルリンを有効に発現し得ることを示した。
【０２８５】
図20Bは、試験開始時(0日目)において、ベータセルリン群および対照群のいずれも、絶食時グルコースレベル(4時間後)が約350mg/dLであることを示す。対照群マウスは絶食時血中グルコースレベルが高く、7日目までに約500mg/dLに達し、14日目および21日目まで高値を維持して試験を中止した。これに対しベータセルリン群のマウスは、7日目、14日目、21日目まで約350mg/dL〜400mg/dLの絶食時血中グルコースレベルをおおむね維持した。ベータセルリン群と対照群との血中グルコースレベルの差は、統計学的に有意(p<0.05)であった。こうしてベータセルリン投与は、生理食塩水対照と比べて、試験期間中にわたる絶食時グルコースレベルの上昇を防止した。
【０２８６】
図20Cは、試験開始時(0日目)の両群マウスいずれにおいても、比較的高いHbA1c値、すなわち約9%を示す。7日目までに、ベータセルリン群におけるマウスのHbA1c値は、有意に低下した(9%に対して約7.5%)。この影響は、試験期間中全体にわたり持続した。14日目までに、ベータセルリン群のHbA1c値は約6.5%となったのに対し、対照群では約8%であった。21日目まで、ベータセルリン群のHbA1c値は約6.5%を維持したのに対し、対照群では約7.5%であった。試験期間中、両群間におけるHbA1c値の差は統計学的に有意であった。本測定は、長期投与法における慢性ベータセルリン投与が、dbマウスにおける絶食時血中グルコースレベルの抑制に有効であることを示した。HbA1c値は経時的なグルコース積算値に相当し、絶食時血中グルコースレベルは基礎的なグルコース抑制を反映するので、以上の結果は、ベータセルリンが、糖尿病マウスにおける基礎的なグルコースレベルを抑制できることを示す。以上の結果は、皮下注射などによってin vivoにおける血中ベータセルリン値を高く保つことで、次第に糖尿病被験体における血中グルコースレベルの持続的な低減を達成できることも示す。
【０２８７】
図20Dは、11日目に測定した対照群におけるdbマウスのインスリン値を、ベータセルリン群と比較して示す。前者の約4ng/mlに対して後者が約3ng/mlであることは、ベータセルリン投与が、統計学的に有意な差(p<0.005、t検定)となる血漿インスリン値の低下をもたらしたことを示す。ベータセルリン群のdbマウスでインスリン値が低いことは、インスリン感受性の増大可能性または「インスリン節約効果」[G Slama:Diabete Metab. 17(1 Pt 2):241-3(1991)が論じる]を示す。インスリンの節約は、ベータセルリンからの補償により生じると考えられる。このデータは、ベータセルリンへの長期の持続的な曝露がHbA1c値を低下させることを示し、長期的な血糖抑制の改善を示している。
【０２８８】
本試験結果は、図38に結果を示す別の試験においてさらに確認された。前出(実施例21、図40)において、dbマウスへのベータセルリン(BTC)cDNAの動水力学的トランスフェクションが、絶食時グルコースレベルおよびHbA1c値を、対照と比べて改善することを示した。数日間にわたるBTCタンパク質の頻回投与法が、絶食時グルコースレベルおよびHbA1c値を改善するかどうかを調べるため、14日間にわたり、複数の投与濃度でdbマウスに投与した。投与時刻は後述の通り夜間であり、マウスの通常の摂食時刻と一致するように計画した。Harlan Laboratories社から約7〜8週齢の雄dbマウスを入手し、3週間の施設環境への順応期間の後に調べた。ベータセルリンは、大腸菌(E. coli)における発現から内在的に調製した。試験の開始日を0日目と名づけた。0日目においてマウスは10週齢であり、HbA1c値に基づき10例ずつの同等な7群に振り分けた。以下の表に投与群を示す。
【０２８９】
2008545715.tif 000002
【０２９０】
マウス各例には、0日目の午後7時から14日目の午前7時まで、同じ投与計画で毎日継続して午後7時、午前0時、および午前7時の1日3回投与した。0日目、7日目および14日目の午前7時に始める5時間の絶食後、マウス全例から絶食時グルコースレベルおよびHbA1c値を測定した。血中グルコースレベルの測定はすべて、Bayer社Ascensia血糖測定器により行った。HbA1cは、Bayer社DCA 2000試薬キットおよびリーダーにより、全血液から測定した。
【０２９１】
HbA1cグラフ(図38A)は、生理食塩水群の百分率HbA1c値が、0日目に約5.2、7日目に約6.0、および14日目に約6.2であったことを示す。0.01mg/kg投与群の百分率HbA1c値は、0日目に約5.2、7日目に約5.6、および14日目に約5.9であった。0.03mg/kg投与群の百分率HbA1c値は、0日目に約5.2、7日目に約5.6、および14日目に約5.4であった。0.1mg/kg投与群の百分率HbA1c値は、0日目に約5.2、7日目に約6.2、および14日目に約6.1であった。0.3mg/kg投与群の百分率HbA1c値は、0日目に約5.2、7日目に約5.8、および14日目に約5.5であった。1.0mg/kg投与群の百分率HbA1c値は、0日目に約5.2、7日目に約5.5、および14日目に約5.2であった。3.0mg/kg投与群の百分率HbA1c値は、0日目に約5.2、7日目に約5.4、および14日目に約5.2であった。
【０２９２】
絶食時グルコースグラフ(図38B)は、生理食塩水群の絶食時グルコースレベルが、0日目に約260mg/dL、7日目に約355mg/dL、および14日目に約375mg/dLであったことを示す。0.01mg/kg投与群の絶食時グルコースレベルは、0日目に約250mg/dL、7日目に約230mg/dL、および14日目に約250mg/dLであった。0.03mg/kg投与群の絶食時グルコースレベルは、0日目に約225mg/dL、7日目に約220mg/dL、および14日目に約200mg/dLであった。0.1mg/kg投与群の絶食時グルコースレベルは、0日目に約275mg/dL、7日目に約285mg/dL、および14日目に約230mg/dLであった。0.3mg/kg投与群の絶食時グルコースレベルは、0日目に約275mg/dL、7日目に約230mg/dL、および14日目に約150mg/dLであった。1.0mg/kg投与群の絶食時グルコースレベルは、0日目に約250mg/dL、7日目に約170mg/dL、および14日目に約100mg/dLであった。3.0mg/kg投与群の絶食時グルコースレベルは、0日目に約265mg/dL、7日目に約190mg/dL、および14日目に約180mg/dLであった。こうして、(14日目までの)中間解析結果は、HbA1c値および絶食時グルコースレベルによる測定で、長期的な血糖抑制に対するベータセルリンの投与量依存的で有益な効果が存在することを確認した。
【０２９３】
実施例２３：ベータセルリン以外の他のEGFファミリーメンバーも血中グルコースレベルを低下させた
ベータセルリンはタンパク質のEGFファミリーメンバーであるので、EGF受容体結合プロファイルの異なる複数のEGF/ErbBファミリーメンバーを比較し、同様にグルコース低減効果を有するかどうかを評価した。この可能性を調べるため、試験タンパク質投与後の複数の時点において、絶食dbマウスにおける血中グルコースレベルを測定した。Harlan Laboratories社から約7〜8週齢の雄dbマウスを入手し、試験開始前に施設順応期間を1週間与えた。血中グルコースレベルの測定はすべて、尾の傷により得る滴下血液から、Bayer社Ascensia血糖測定器により行った。ベータセルリンは、ロット番号RF17-20から内在的に調製した。他のEGFファミリーメンバーは、R&D Systems社(ミネソタ州ミネアポリス)から入手した:(i)NRG1-α/HRG1-αEGFドメイン(型番296-HR/CF)、ロット番号KC045051。0.1% BSAを添加した10mM酢酸中で再構成した。(ii)HB-EGF(型番259-HE/CF)、ロット番号JI165091。0.1% BSAを添加したPBS中で再構成した。および(iii)EGF(型番236-EG)、ロット番号HLM135031。0.1% BSAを添加したPBS中で再構成した。
【０２９４】
マウスは、4時間にわたる絶食後、時刻0分において血中グルコースレベルを測定し、絶食後ベースライン時の血中グルコースレベルを定めた。次いで、ベースラインの測定値に基づき、マウスを等しく6群に振り分けた。6群は以下の通りであった:EGF群、HB-EGF群、NRG-1群、BTC群、生理食塩水群、および酢酸対照群。各群は、マウス5例よりなる酢酸対照群を除き、マウス8例ずつで構成した。投与はすべて、容量0.25ml中に1mg/kgを皮下投与した。試験化合物の投与30分後、60分後、90分後に、血中グルコースレベルを測定した。本試験では、グルコース投与は行わなかった。試験結果を図21に示す。各データ点は、当該投与群におけるマウス全例の平均値を示す。
【０２９５】
図21は、ベースラインの時刻0分時に、全投与群におけるマウスの血中グルコースレベルが約204mg/dLであったことを示す。生理食塩水投与マウス(白ダイヤモンド)の血中グルコースレベルは、30分後に平均約225mg/dL、60分後に約195mg/dL、および90分後に約185mg/dLであった。酢酸投与対照マウス(黒三角)の血中グルコースレベルは、30分後に平均約235mg/dL、60分後に約210mg/dL、および90分後に約190mg/dLであった。EGF投与マウス(黒四角)の血中グルコースレベルは、30分後に平均約145mg/dL、60分後に約130mg/dL、および90分後に約115mg/dLであった。HB-EGF投与マウス(白四角)の血中グルコースレベルは、30分後に平均約215mg/dL、60分後に約175mg/dL、および90分後に約135mg/dLであった。NRG-1投与マウス(黒ダイヤモンド)の血中グルコースレベルは、30分後に平均約205mg/dL、60分後に約140mg/dL、および90分後に約105mg/dLであった。BTC投与マウス(黒丸)の血中グルコースレベルは、30分後に平均約115mg/dL、60分後に約115mg/dL、および90分後に約145mg/dLであった。まとめると、本試験は、BTC、EGF、HB-EGF、NRG-1のいずれも、生理食塩水および溶媒(酢酸)対照と比べ、dbマウスにおける絶食時血中グルコースレベルを有意に低下させることができることを示した。
【０２９６】
実施例２４：ベータセルリンのグルコースレベル低減効果は投与時に依存する
前出の実験で、絶食およびグルコース投与後のdbマウスにベータセルリンを投与すると、対照と比べ、血中グルコースレベルが有意に低下することを示した(実施例21、図18)。本発明者らは、この効果(すなわち、グルコース低減効果)が、即時のグルコース取り込みを生じる急速な応答によるものか、または応答が長期投与に依存するものかを判定したいと考えた。この目的のために、雄dbマウスにおいて、グルコース投与以前または同時の0.3mg/kgベータセルリン投与効果を比較する試験を行った。
【０２９７】
前出の実施例と同様に、BTCは本発明者らの施設で作製した。Harlan Laboratories社から約7〜8週齢のdbマウスを入手し、1週間の施設順応期間後に調べた。マウスは、3投与群に振り分けた。各群には、午前4時からの6時間ごとに、各投与につき0.25mlずつのベータセルリンまたは生理食塩水を3回ずつ皮下投与した。また、午前4時から残りの試験期間中、摂食を制限した。6時間後の午前10時、マウスにベータセルリンまたは生理食塩水の2回目の投与を行った後、0.75g/kgグルコースの腹腔内注射により、グルコース耐性試験(「GTT#1」)を実施した。この後2時間の複数時点において、血中グルコースレベルを測定した。さらに6時間後の午後4時、マウスにベータセルリンまたは生理食塩水の3回目の投与を行って後、グルコース耐性試験(「GTT#2」)を実施した。血液はすべて尾に傷をつけて採取し、グルコースレベルの測定はBayer社Ascensia血糖測定器により行った。結果を図22に示す。各データ点は、マウス10例の平均値を示す。
【０２９８】
マウスの3群は以下の通りであった:群Aマウスには、3回の投与とも生理食塩水を投与した。群Bマウスには、用量1では生理食塩水、2および3では各投与に付き0.3mg/kgずつのベータセルリンを投与した。群Cマウスには、1および2では各投与につき0.3mg/kgずつのベータセルリン、3では生理食塩水を投与した。
【０２９９】
PK研究(後述)から、投与量0.3mg/kgのベータセルリンは、6時間の時間域内で循環からクリアランスされることがわかった。したがって、Cのマウスでは、2回目のGTT試験時に循環に残存するベータセルリン値はさほど高くないと予測された。図22Aは、群Aマウス(黒四角)の血中グルコースレベルが、GTT#1開始直前におけるベースラインの時刻0に平均約110mg/dL、GTT#1開始の約30分後に約375mg/dLで最高値に達し、60分後に徐々に低下して約350mg/dLとなり、90分後に約300mg/dL、120分後に約250mg/dLとなったことを示す。群BおよびCのマウスは当初同様のふるまいを示し、血中グルコースレベルがGTT#1開始後の時刻0にそれぞれ平均約120mg/dLおよび75mg/dL、約30分後にそれぞれ約325mg/dLおよび300mg/dLで最高値に達し、60分後にいずれも約200mg/dLに低下し、90分後に約185mg/dL、120分後に約165mg/dLとなった。こうして、用量2におけるベータセルリン単回投与の群Bマウス(黒ダイヤモンド)または用量1および2におけるベータセルリン二回投与の群C(黒三角)のいずれも、GTT#1の時刻0におけるグルコース投与に対する血中グルコース低下に、同様の有効性を示した。
【０３００】
GTT#1開始の8時間後で2回目のグルコース耐性試験(GTT#2)直前である、時刻480分において、群Aマウス(生理食塩水対照)の血中グルコースレベルは平均約140mg/dL、群Bマウスはの血中グルコースレベル平均約100mg/dL、および群Cマウスの血中グルコースレベル平均約75mg/dLであった。GTT#2の開始後約30分(時刻510分)以内に、群Aマウスの血中グルコースレベルは約350mg/dLで最高値に達し、群Bおよび群Cマウスでは約280mg/dLで最高値に達した。その後、GTT#2の開始後60分(時刻540分)から、群Bおよび群Cマウスの間で差が見られるようになる。540分後の血中グルコースレベルは、群Aマウスが平均約275mg/dL、群Bマウスが約150mg/dLおよび群Cマウスが約250mg/dLであった。GTT#2の開始後90分であるGTT#1後570分において、群Aマウスの血中グルコースレベルは平均約250mg/dL、群Bマウスが平均約140mg/dL、および群Cマウスが平均約200mg/dLであった。600分後、またはGTT#2の開始後120分において、群Aマウスの血中グルコースレベルは平均約225mg/dLにとどまり、群Bマウスが平均約145mg/dLおよびGroup Cマウスが平均約190mg/dLであった。こうして結果は、群Cマウスが、2回目のGTT試験中におけるグルコースのクリアランスでは、群Bマウスに比べ有効でないものの、生理食塩水投与の群Aマウスに比べると、グルコースのクリアランスでまだわずかに有効であったことを示す。
【０３０１】
図22Bは群Bおよび群Cの間では、GTT#1の総曲線下面積(AUC1)にさほどの差がなかったものの、群Bおよび群Cの各々と群Aとの間では、GTT#1のAUC1に有意な差があったことを示す。さらに、群Bの2回目GTT(GTT#2)の曲線下面積(AUC2)は、群Aまたは群Cと比べて低値であった。また、14時間の試験期間中、群Bおよび群Cマウスには等しい総投与量のベータセルリンを投与したにもかかわらず、群Cマウスは、2回目のGTT期間中に同等のグルコース低減効果を達成しないことがわかった。
【０３０２】
本実験は、グルコース変動と同時のベータセルリン投与が、血中グルコースの急速な低減に最高のベネフィットをもたらすのに対し、試験同日のグルコース変動以前に投与すると、累積投与量の等しいベータセルリンであっても、最大グルコース低減効果を達成するのに十分でなかったことを示す。本試験結果は、摂食後に適用する場合、ベータセルリン投与および炭水化物負荷の増大を時間的に近接させることで、予測される摂食後のグルコース変動時にベータセルリンが血中治療濃度で存在するようにすべきことを予見した。したがって、摂食後に適用する場合、ベータセルリンは、食事中または前後における投与が最適であると考えられる。この急速に始まり比較的短命なベータセルリンの血糖低減効果は、膵島細胞新生または膵島ベータ細胞集塊における別種の増殖では説明できない異なる薬理効果を示す。
【０３０３】
実施例２５：ラットにおけるベータセルリンの薬物動態パラメータ
前出の実験(実施例24、図22)において、絶食およびグルコース投与後におけるdbマウスへのベータセルリン投与が、対照と比べて有意に血中グルコースを低下させることを示した。試験は、グルコース低減効果がグルコースおよびBTCの同時投与と関連し、ベータセルリンの無作為投与とは関連しないことを示した。投与時の関係をよりよく理解するため、Sprague Danleyラットによる薬物動態学的(PK)試験を、ベータセルリンについて実施した。PK試験のin vivo的側面については、Northview Pacific Laboratories社(カリフォルニア州ハーキュリーズ)に委託した。ラットは、雄で約250〜300gの体重であった。ベータセルリンは、大腸菌(E. coli)から内在的に調製した。
【０３０４】
ベータセルリン(BTC)、またはビヒクルを、以下に示す表に従い投与した:
2008545715.tif 000003
【０３０５】
表に示した時点において、血液(約0.5 mL)をEDTA入り真空採血管に採取した。採取後の試料は、2〜8℃中約2800rpm(1000×g)で約15分間遠心分離した。血漿は採取後-20℃で凍結した。試料は、血漿中ベータセルリン量測定のため、本発明者らのもとへ送付された。ベータセルリン(BTC)は、R&D Systems社製のELISA法キット、型番DY261(ミネソタ州ミネアポリス)を用いて血漿から測定した。結果を図23A(静脈内投与)および図23B(皮下投与、sq)および以下の表に示す。各データ点は、ラット4例の平均値を示す。
【０３０６】
皮下投与については、以下の結果を得た。0.01mg/kg、0.1mg/kg、1.0mg/kgおよび10mg/kgのベータセルリン各投与量に対して、それぞれ約18分後、32分後、39分後、および42分後にTmaxに達し、それぞれ約657pg/ml、3.7ng/ml、166ng/ml、2.1μg/mlでCmaxに達し、ベータセルリンの半減期はそれぞれ約26分間、75分間、33分間、61分間であり、ベータセルリンの血漿濃度は、それぞれ120分後、240分後、480分後、および1440分後に100pg/mlを下回った。
【０３０７】
静脈内投与については、以下の結果を得た。0.01mg/kg、0.1mg/kg、1.0mg/kgおよび10mg/kgの各投与量に対して、注射後2分におけるベータセルリンの血漿濃度は、それぞれ3.3ng/ml、109ng/ml、2.7μg/ml、および25μg/mlであり、ベータセルリンの半減期はそれぞれ約1分間、2分間、15分間、および31分間であり、ベータセルリンの血漿濃度は、それぞれ15分後、30分後、480分後、および960分後に10pg/mlを下回った。
【０３０８】
以下に示す1組目の表は、ラットに対するベータセルリン皮下投与のPK結果を示す。ベータセルリンの検出限界は、≧10pMであった。UDとは、検出限界未満を意味する。Kとは、当該値1000単位を意味する。
【０３０９】
2008545715.tif 000004
2008545715.tif 000005
【０３１０】
次の2組目の表は、ラットに対するベータセルリン静脈内投与のPK結果を示す。ベータセルリンの検出限界は、≧10pMであった。UDとは、0.1pMの検出限界未満を意味する。Kとは、当該値1000単位を意味する。NAとは、該当なしを意味する。
【０３１１】
2008545715.tif 000006
2008545715.tif 000007
【０３１２】
以上まとめると、PK試験は、ベータセルリンが、正常ラットの血中から急速にクリアランスされ、投与経路により約1時間または1時間未満の循環半減期を有することを示した。ベータセルリンの急速なクリアランスは、血中グルコース変動に対して非同期的にベータセルリンをマウスに投与した場合にグルコース低減効果が見られなかった(前出の実施例を参照)理由についての1つの説明となり得る。以上の結果は、摂食後の適用例のように、有意かつ急速なグルコース低減効果を得るためには、グルコースレベルが上昇する時点にベータセルリンが薬理学的濃度で存在するのが望ましいことを示す。
【０３１３】
実施例２６：ベータセルリンおよびGLP1のグルコース低減作用は少なくとも加算的であった
グルカゴン様ペプチド1(GLP1)[JJ. Holst:Diabetologia, 49(2):253-60(2006)が総括]およびexendin-4 [C TriplittおよびE. Chiquette:J. Am Pharm Assoc(Wash DC), 46(1):44-52(2006)が総括]は、インスリン分泌の強力な刺激因子であり、その結果グルコース代謝の制御に有意な効果を有する。Exendin-4は、アメリカドクトカゲ(Gila monster)から分離されたペプチドで、強力なGLP1受容体作用薬である。他の研究者によるin vitroおよびin vivo試験は、両分子ともに、GLP1受容体を介する経路に依存するグルコース低減効果を示唆した。両分子ともに、げっ歯類モデルにおける血中グルコース低減に有効であることが報告された。実施例22(図20D)で、ベータセルリン投与が、血漿インスリン値を低減することを示した。したがって、ベータセルリンが、GLP1受容体を介する経路とは異なる機構により、GLP1受容体作用薬の血中グルコース低減効果を促進する証拠を得た。
【０３１４】
ベータセルリンがGLP1受容体に作用する薬剤の効果を促進することを示すため、0.2mg/kg GLP1単剤、またはベータセルリン単剤または両者の配合剤を投与する、雄dbマウスにおけるグルコース耐性試験(GTT)を実施した。0.3mg/kgベータセルリンを本試験の投与に用いた。Harlan Laboratories社から約7〜8週齢のdbマウスを入手し、約1週間の施設順応期間後に調べた。ベータセルリン(BTC)は、大腸菌(E. coli)宿主による発現から、本発明者らの施設で調製した。GLP1は、Sigma-Aldrich社(型番G9416)から購入した。血中グルコースレベルの測定はすべて、尾静脈の傷から、Bayer社Ascensia血糖測定器により行った。
【０３１５】
まず、5時間の絶食後、時刻0におけるベースラインのグルコースレベルを得た。次いで、絶食時のグルコースレベルに基づき、マウスを4群に振り分けた。群構成は以下の通りであった:群1マウス7例には、生理食塩水(◆/ダイヤモンド)を注射した。群2マウス8例には、GLP1単剤(黒塗りの丸/丸)を注射した。群3マウス8例には、ベータセルリン単剤(▲/三角)を注射し、群4マウス7例には、GLP1+BTCの配合剤(■/四角)を注射した。GTTの開始時、グルコース0.75mg/kgの腹腔内投与の直前、マウスに指定薬剤を皮下注射した。その後の2時間にわたり、グルコースレベルを測定した。各データ点は、各群マウス全例の平均値を示す。本試験結果を図24に示す。
【０３１６】
図24Aは、生理食塩水を投与した群1の血中グルコースレベルが、時刻0における約175mg/dLのベースライン値から30分後に約450mg/dLの最高値となった後、60分後に約400mg/dL、90分後に約325mg/dLに低下し、1080分(すなわち、18時間)後に再度約390mg/dLに増加したことを示す。GLP1を投与した群2マウスの血中グルコースレベルは、30分後、60分後、90分後、および120分後に200〜230mg/dLでほぼ同一値を維持して後、1080分後に約325mg/dLに増加した。ベータセルリンを投与した群3マウスの血中グルコースレベルは、時刻0における約175mg/dLから30分後に約400mg/dLの最高値に増加して後、60分後に急速に低下して約210mg/dL、90分後に約190mg/dL、120分後に約150mg/dLとなったが、1080分後に約325mg/dLに上昇した。GLP1およびベータセルリンを投与した群4マウスの血中グルコースレベルは、時刻0に約160mg/dL、30分後、60分後、90分後、および120分後に約150〜125mg/dLの低値を維持して後、1080分後に約310mg/dLに上昇した。
【０３１７】
図24Bは、グルコース投与後120分間の累積曲線下面積(AUC)を示す。GLP1投与の群2と生理食塩水投与の対照の群1との差、GLP1投与の群2とGLP1およびベータセルリン投与の群4との差、ならびにベータセルリン投与の群3と対照の群1との差、ベータセルリン投与の群3とGLP1およびベータセルリン投与の群4との差は、いずれも統計学的に有意(t検定で判定)であった。
【０３１８】
以上の結果は、糖尿病モデル動物としてのdbマウスに、GLP1およびベータセルリンの併用投与が奏効することを示した。ベータセルリンおよびGLP1の配合剤が、いずれか単剤よりも血中グルコースを大幅に低下させたことは、とくにこれら薬剤を摂食後のグルコース変動と同時に投与した場合の、加算的なグルコース低減効果を示す。これは、ベータセルリンのグルコース低減効果が、GLP1受容体媒介性のシグナル伝達経路が媒介する該効果に対して少なくとも加算的であり、ベータセルリン投与が、インスリン分泌促進薬の作用を促進はしても阻害はしなかったことを示す。
【０３１９】
実施例２７：ベータセルリンおよびメトフォルミンのグルコース低減効果はすくなくとも加算的であった
CJ Bailey:Diabetes Care 15(6):755-772(1992)が述べる通り、メトフォルミンは、II型糖尿病の治療に用いられる血糖降下剤である。添付文書によれば、「メトフォルミンは、肝によるグルコース産生を低下させ、腸によるグルコース吸収を低下させ、末梢組織によるグルコースの取り込みおよび利用を増大させることでインスリン感受性を改善する。」メトフォルミンのグルコース低減効果は、インスリン分泌の刺激なしに生じ、インスリンの存在を必要とする。受容体後レベルにおけるインスリン作用の促進は、メトフォルミンがインスリン媒介性のグルコース取り込みおよび酸化による代謝を増大させる、筋肉などの末梢組織において生じる。
【０３２０】
本発明者らは、ベータセルリンが、糖尿病患者におけるメトフォルミンの血中グルコース低減効果を促進するのではないかと考え、この効果を示すことにした。本試験では、雄dbマウスを用い、投与量1.0mg/kgのベータセルリン単剤投与またはメトフォルミン250mg/kgとの併用投与で、効果を比較した。Harlan Laboratories社から約7〜8週齢のdbマウスを入手し、1週間の施設順応期間後に用いた。ベータセルリンは、本発明者らの施設で調製した。メトフォルミンは、Sigma-Aldrich社(型番D5035)から購入した。血中グルコースレベルの測定はすべて、尾静脈の傷から、Bayer社Ascensia血糖測定器により行った。注射はすべて、0.25ml容量で行った。
【０３２１】
まず、絶食時のグルコースレベルに基づき、マウスを2群に振り分けた。マウスは、組み分けのために5時間にわたり1回目の絶食を行った3日後、GTT試験のために2回目の絶食を行った。マウス20例による「メトフォルミン群」には、3日間にわたり1日1回午前8時に250mg/kgメトフォルミンを腹腔内投与し、マウス10例による「生理食塩水群」には、同期間にわたり生理食塩水を投与した。3日目の投与直後、マウスは5時間の絶食を受け、その後(すなわち、時刻0分に)GTTを実施した。GTT開始時に、メトフォルミンおよび生理食塩水投与の各マウスグループを、さらに2つのサブグループに分割し、グルコース0.75mg/kgを腹腔内投与する直前に、ベータセルリン(1mg/kgのBTC)、または生理食塩水の皮下注射を行った。以下の通りに群を構成した:(i)メトフォルミン-BTC群(◆)、(ii)生理食塩水-BTC群(▲)、(iii)メトフォルミン-生理食塩水群(黒塗りの丸)、(iv)生理食塩水-生理食塩水群(■)。GTTは、最終メトフォルミン投与の5時間後である、午後1時頃に開始した。
【０３２２】
試験結果を図25に示す。図25Aは、投与3日後に、メタフォルミン群におけるdbマウス20例の絶食時血中グルコースレベルが平均約250mg/dLであり、生理食塩水群におけるdbマウス20例の平均約375mg/dLを有意に下回ったことを示す。
【０３２３】
図25Bは、生理食塩水-生理食塩水群におけるdbマウス5例の平均血中グルコースレベルがGTT中最高で、時刻0の約400mg/dLから、30分後に約550mg/dLに上昇して後、60分後に約500mg/dLに低下し、90分後に約475mg/dL、および120分後に約500mg/dLとなったことを示す。生理食塩水-BTC群におけるdbマウス5例の平均血中グルコースレベルは、時刻0に約350mg/dLから、30分後に約450mg/dLに上昇した後、60分後に約325mg/dLに低下し、90分後に約275mg/dL、および120分後に約290mg/dLとなった。メトフォルミン-生理食塩水群におけるdbマウス10例の平均血中グルコースレベルは、時刻0における約250mg/dLの低値から始まり、30分後に約500mg/dLに上昇し、60分後に約450mg/dLに低下し、90分後に約410mg/dL、120分後に約400mg/dLとなった。メトフォルミン-BTC群におけるdbマウス8例の成績が最もよく、平均血中グルコースレベルは、時刻0の約250mg/dLから、30分後に(最)高値の約370mg/dLに上昇し、60分後に約280mg/dLに低下し、90分後に約290mg/dL、120分後に約315mg/dLとなった。
【０３２４】
図25Cは、異なる4投与群の総AUCを示す。メトフォルミン-生理食塩水群とメトフォルミン-BTC群との差は、統計学的に有意(p<0.05)であった。メトフォルミン-生理食塩水群と生理食塩水-生理食塩水群との差も、統計学的に有意(p<0.05、t検定)であった。
【０３２５】
本試験は、糖尿病マウスへのメトフォルミン単剤投与が、絶食時の血糖を低下させるものの、該投与dbマウスの血中グルコースレベルが120分間の観察時間にわたり高値(400〜500mg/dLの範囲)を維持するので、メトフォルミンはグルコース変動(すなわち、GTT)後における血中グルコースの急速な低減の媒介にはあまり有効でないことを示した。ベータセルリン単剤投与は、グルコース変動後の急速な時間経過(グルコースのボーラス投与後約60分以内)において、血中グルコースの急速な低下を媒介するのに有効であった。ベータセルリンのメトフォルミンとの併用投与は、摂食後のグルコース変動と同時にベータセルリンを投与する場合とくに、グルコースのボーラス投与後約60分以内に急速な血中グルコースレベルの低下を達成するので、各単剤と比べて急速なグルコース低減効果において少なくとも加算的であった。以上のデータは、肝臓によるグルコース新生を阻害し末梢組織によるグルコースの取り込みおよび利用を促進する薬剤とベータセルリンとの併用は、各単剤よりも良好な摂食後グルコース抑制を達成することを示した。
【０３２６】
実施例２８：ベータセルリンおよびインスリンのグルコース低減効果は加算的である
前出の試験(実施例22、図20)で、dbマウスへのベータセルリン投与が、投与マウスの血漿インスリン値を低下させることがわかった。本発明者らは、ベータセルリンが、インスリン受容体媒介性の経路に対して補完的な機構により作用するのではないかと考えた。まさにその通りであることを示すために、インスリン2 U/kg単剤、またはベータセルリン単剤、またはインスリンおよびベータセルリン配合剤のいずれかを投与する雄dbマウスにおいて、グルコース耐性試験(GTT)を行った。本試験では、注射用に0.3 mg/kgのベータセルリンを用いた。
【０３２７】
Harlan Laboratories社から約7〜8週齢のdbマウスを入手し、約1週間の施設順応期間後に調べた。ベータセルリンは、大腸菌(E. coli)宿主による発現から、本発明者らの施設で調製した。インスリン(インディアナ州インディアナポリス、Eli Lilly社、Humilin(登録商標))は、地元の薬局から購入した。血中グルコースレベルの測定はすべて、尾静脈の傷から採取した血液(約2マイクロリットル)により、Bayer社Ascensia血糖測定器を用いて行った。
【０３２８】
本試験結果を図26に示す。5時間の絶食後、時刻0におけるベースラインのグルコースレベルを得た。次いで、絶食時のグルコースレベルに基づき、マウスを10例ずつの等しく4群に振り分けた。群構成は以下の通りであった:群1マウスには、生理食塩水(■/四角)を注射した。群2マウスには、インスリン単剤(▲/三角)を注射した。群3マウスには、ベータセルリン(BTC)単剤(◆/ダイヤモンド)を注射し、群4マウス7例には、インスリン+BTCの配合剤(黒塗りの丸/丸)を注射した。GTTの開始時である、グルコース0.75mg/kgの腹腔内投与の直前、マウスに指定薬剤250マイクロリットルを皮下注射した。その後の2時間にわたり、グルコースレベルを測定した。各データ点は、各dbマウス10例の平均値を示す。
【０３２９】
図26は、生理食塩水を投与した群1の血中グルコースレベルが、時刻0における約230mg/dLのベースライン値から30分後に約400mg/dLの最高値となって後、60分後に約360mg/dL、90分後に約320mg/dLに低下し、120分後に275mg/dLとなったことを示す。インスリンを投与した群2マウスの血中グルコースレベルは、時刻0における約230mg/dLのベースライン値から30分後に約400mg/dLの最高値となった後、60分後に約360mg/dL、90分後に約280mg/dLに低下し、120分後に275mg/dLとなった。ベータセルリンを投与した群3マウスの血中グルコースレベルは、時刻0における約230mg/dLのベースライン値から30分後に約375mg/dLの最高値となった後、60分後に約300mg/dLに低下し、90分後に約250mg/dL、120分後に220mg/dLとなった。インスリンおよびベータセルリンの両者を投与した群4マウスの血中グルコースレベルは、時刻0における約230mg/dLのベースライン値から30分後に約320mg/dLの最高値となった後、60分後に約175mg/dLに低下し、90分後に約160mg/dL、120分後に175mg/dLとなった。配合剤投与群(群4)とインスリン投与群(群2)との差、ならびに配合剤投与群(群4)とベータセルリン投与群(群1)との差は、いずれも統計学的に有意であった。
【０３３０】
以上の結果は、dbマウスの血中グルコースレベルが、グルコースのボーラス投与後120分間の観察時間にわたり比較的高値(約275〜400mg/dLの間)を維持し、生理食塩水投与の対照と比べてインスリン単剤投与の効果が有意な差を示さないという意味で、糖尿病の動物モデルであるdbマウスがインスリン抵抗性動物として振舞ったことを示す。ベータセルリン投与群のマウスでは、約60分で血中グルコースレベルの有意な低減を達成し、グルコース投与後約90分以内にGTT以前の値に復帰するので、該投与はより急速に奏効した。インスリンおよびベータセルリン配合剤を投与したマウスでは、グルコース投与後約60分以内に基礎値を下回る血中グルコースレベルを達成し、その後60分間の観察時間にわたり同じ値を維持するので、最も有意に奏効した。
【０３３１】
こうして、ベータセルリンおよびインスリンの配合剤は、各薬剤単剤よりも大幅に血中グルコースを低下させ、特に摂食後のグルコース変動と同時に両剤を投与する場合、少なくとも加算的または協同的なグルコース低減効果を示した。以上の結果は、ベータセルリンのグルコース低減効果が、インスリンおよび/またはインスリン受容体媒介性経路による効果を促進はしても阻害はしないことを示した。
【０３３２】
実施例２９：ベータセルリンおよびグラルギンのグルコース低減効果は少なくとも加算的であった
膵ベータ細胞によるインスリン分泌の正常な生理学的パターンは、1日を通じた持続的な基礎インスリン値に、食後2〜3時間で減衰する血中インスリンの比較的大規模なバースト(すなわち、ボーラスインスリン)を重ね合わせることで成立する。長時間作用性のインスリン剤による基礎的なグルコース抑制は、糖尿病患者に対するグルコース管理の重要な構成要素である。インスリングラルギンといった長時間作用性の薬剤は、高い安定性および信頼性で基礎インスリンをカバーし、基礎ボーラス投与戦略の有益な部分をなすことについては、M.A. BethelおよびM.N. Feinglos:J. Am.Board Fam. Pract. 18(3):199-204(2005)が述べる通りである。インスリングラルギンは、ヒトインスリンの組み換えDNA修飾により創出された長期作用性インスリンアナログであることについては、R.K. Campbell他:Clin. Ther. 23(12):1938-57(2001)が述べている。インスリン分子の変性が等電位点を上昇させ、インスリングラルギンを注射部位に停滞させることで、吸収を緩徐化する。インスリングラルギンの薬理学的プロファイルは、著明な最高値の欠如および約24時間の作用時間を特徴とする。
【０３３３】
本発明者らは、グラルギンおよびベータセルリンを併用すれば、加算的なグルコース低減作用が得られるであろうと考えた。ベータセルリンと併用した場合のグラルギンによるグルコース低減効果を示すため、雄dbマウスにおける試験を行った。1.0mg/kgベータセルリンを単剤またはグラルギンとの併用で投与した場合の効果を比較した。Harlan Laboratories社から約7〜8週齢のdbマウスを入手し、1週間の施設順応期間後に調べた。ベータセルリンは、大腸菌(E. coli)宿主による発現から、本発明者らの施設で調製した。グラルギンは、Aventis Pharmaceuticals社製で、地元の薬局から購入した。血中グルコースレベルの測定はすべて、尾静脈の傷から採取した血液を用い、Bayer社Ascensia血糖測定器により行った。
【０３３４】
まず、絶食時のグルコースレベルに基づき、マウスを2群に振り分けた。一方のグラルギン群には、最初の3日間は1ユニット/kgのグラルギン250マイクロリットルを1日1回腹腔内投与した後、次の3日間は3ユニット/kgで1日1回投与した。他方の生理食塩水群には、6日間毎日250マイクロリットルを注射した。6日目の投与直後、マウスに5時間の絶食を課し、その終了時(すなわち、時刻0)に、ベータセルリンまたは生理食塩水投与と同時にボーラスGTTを実施した。GTT開始時のグルコース0.75mg/kgの腹腔内投与直前に、グラルギンおよび生理食塩水の各マウス投与群をさらに、1mg/kgのベータセルリン250マイクロリットルまたは生理食塩水250マイクロリットルを皮下投与するマウス10例ずつのサブグループに分割し、以下の4群を構成した:グラルギン-ベータセルリン群(黒塗りの丸)、生理食塩水-ベータセルリン群(◆)、グラルギン-生理食塩水群(▲)、および生理食塩水-生理食塩水群(■)。GTTは、マウス各例にグルコース0.75mg/kgを腹腔内注射して実施した。GTTは、最終グラルギン投与の5時間後(および絶食の5時間後)である、午後1時頃に開始した。試験結果を図27に示す。
【０３３５】
図27Aは、グラルギン投与6日後に、グラルギン群におけるdbマウスの絶食時血中グルコースレベルが平均約165mg/dLであり、生理食塩水群における絶食時血中グルコースレベル約215mg/dLを有意に下回ったことを示す。図27Bは、GTT中2時間にわたりモニタリングしたマウス4群の血中グルコースレベルを示す。生理食塩水-生理食塩水群におけるマウスの平均血中グルコースレベルは、時刻0の約215mg/dLから、30分後に約465mg/dLに上昇し、60分後に約390mg/dLに低下し、および90分後に約325mg/dL、また120分後に約255mg/dLとなった。グラルギン-生理食塩水群におけるマウスの血中グルコースレベルは、時刻0に約165mg/dLの低値から始まり、30分後に約400mg/dLに上昇して後、60分後に約340mg/dLに低下し、および90分後に約250mg/dL、また120分後に約250mg/dLとなった。生理食塩水-ベータセルリン群におけるマウスの平均血中グルコースレベルは、時刻0に約230mg/dLの高値から始まり約350mg/dLに上昇して後、60分後に約200mg/dLに低下し、および90分後に約195mg/dL、また120分後に約215mg/dLとなった。グラルギン-ベータセルリン群におけるマウスの平均血中グルコースレベルは、時刻0において約165mg/dLであった。30分後に約265mg/dLに上昇し、60分後に約165mg/dLに低下し、90分後は約165mg/dLを維持し、120分後は約180mg/dLでやや高値となった。
【０３３６】
膵臓からのインスリン基礎分泌が、絶食状態における血中グルコースレベルを抑制する。内因性基礎グルコース抑制を刺激する、長時間作用性インスリンまたはその他の作用物質は、第一に絶食時血糖を低下させ、食後短時間で生じる急速な炭水化物負荷においては比較的微弱な効果を与えると予測される。糖尿病マウスへの、長時間作用性「基礎作用型」インスリンであるグラルギン投与が、絶食時血糖を低下させることを示した本実験により、上記効果が立証された。グルコースのボーラス投与後における血中グルコースレベルの急速な低減に関して、グラルギン投与マウスは、GTTにおける血中グルコースレベルの軽微な低下を示すにとどまった。前出の知見と符合するが、グルコース投与後60分以内の速さで、グルコースボーラス後の血中グルコースをグルコース投与前の値に急速に低減する場合は、ベータセルリン単剤が有効であった。グラルギンおよびベータセルリンの併用は、単剤での両剤の有益な効果を併合し、グルコースボーラス後の血中グルコースの急速な低減、および基礎血中グルコースレベルの低値維持をいずれも達成した。以上のデータは、全般的または部分的に絶食時血糖を低減する薬剤とベータセルリンを併用すると、いずれかの薬剤単剤よりも良好に摂食後のグルコースを抑制することを示す。
【０３３７】
実施例３０：ベータセルリンは単離したラット足底筋へのグルコース取り込みを促進した
ベータセルリンおよびEGFファミリーの他のメンバーが、初代ヒト骨格筋細胞へのグルコース取り込みを刺激したという知見を踏まえ、他の筋細胞へのベータセルリン効果を調べた。図28に示すように、ベータセルリンは、ベータセルリンなしのインスリンが誘発するよりも、ラット足底筋におけるin situの筋によるグルコース取り込みの有効性を増大させた。本実験では、Charles River Laboratories社(マサチューセッツ州ウィルミントン)から入手した、雄Sprague-Dawleyラット(9週齢)を用いた。J.J. Wilkes他:Diabetes 52:1904-1909(2003)などが述べる公知の方法により、腱を付着させたままのラット足底筋を、ハインドクォータから単離した。単離した筋を半分に分割した。分割した筋は、32mmol/lマンニトール、8mmol/l D-グルコース、および0.1% BSAを含有するクレブス−ヘンゼライトバッファー(KHB)溶液に入れた。ストリップは、12nMインスリンもしくは5nMベータセルリンの添加なし(対照)または添加ありの両者について、37℃で50分間インキュベートした。グルコース輸送測定の前に、38mmol/lマンニトールおよび2mmol/lピルビン酸を含む、グルコースフリーKHBにより筋を一度洗浄することで、 D-グルコースを除去した。2-デオキシグルコース(2-DOG)取り込み測定のため、筋を(4.5μCi/ml)2-デオキシ-D-[3H]グルコース(1mmol/l)および(1μCi)14C-マンニトール(37mmol/l)により20分間インキュベートした。筋を速やかに取り出し、ブロットし、ドライアイスでスナップ凍結した。筋は、水1ml中で10分間煮沸し、14Cおよび3Hについて解析した。グルコース取り込み率は、P.A. Hansen:J. Appl. Physiol. 76(2):979-985(1994)が述べる方法で計算した。結果は、濃度約5nMのベータセルリンが、約2μmol/ml/20分で放射性グルコースの取り込みを刺激することを示した。以上の結果は、ベータセルリンが、足底筋へのグルコース取り込みの刺激に有効であり、インスリンよりも低濃度で可能であることから、インスリンよりも強力であることを示した。
【０３３８】
実施例３１：ベータセルリンは骨格筋細胞によるアミノ酸取り込みを促進した
ベータセルリンが各種筋細胞へのグルコース取り込みを刺激するという知見を踏まえ、ベータセルリンが他の同化活性を有するかどうかを判定することにした。骨格筋によるアミノ酸取り込みが、糖尿病および筋喪失疾患などの各種異化状態において低下すると報告されているので、ベータセルリンによる筋細胞へのアミノ酸取り込み刺激能を調べた。図29に示すように、ベータセルリンが培養初代ヒト骨格筋細胞(ニュージャージー州イーストラザフォード、Cambrex社)によるアミノ酸取り込みを大幅に促進することが、本試験でわかった。
【０３３９】
本実験では、前出と同じく、増殖培地中にウェル当たり3×104個の密度で、96ウェルプレートに初代ヒト骨格筋細胞をまいた。細胞は、37℃および5%CO2の細胞培養インキュベータで一晩接着させた。翌日、増殖培地を除去し、無血清培地を加え、5時間飢餓培養した。その後、培地をHEPESバッファー(HBS)で1時間置換し、細胞からアミノ酸を枯渇させた。培地中約10-11M〜10-6Mの各濃度のインスリン、または約10-13M〜10-8Mのヒト組換えベータセルリン(ミネソタ州ミネアポリス、R&D Systems社)を各ウェルに添加し、37℃および5%CO2の細胞培養インキュベータで20分間インキュベートした。対照細胞は、培地のみで処置した。インキュベーション後、ウェル当たり0.1μCiと等価な14Cで標識した代謝不能型アラニン同族体2-(メチルアミノ)イソブチル酸[2-(methylamino)isobutyric(MeAIB)acid]の10μM HBS溶液50マイクロリットルで培地を置換し、細胞を37℃および5%CO2の細胞培養インキュベータに15分間戻した。次いで培地を除去し、氷冷したPBSで3回洗浄し、0.05N NaOHで溶解した。PerkinElmer TopCountを用いる溶解液の放射能測定により14Cで標識したアミノ酸MeAIBの取り込みを評価し、陰性対照細胞との比較により正規化した値をプロットした。
【０３４０】
各測定は、トリプリケートウェルで行った。図29に示す結果は、インスリンおよびベータセルリンの全試験濃度で、ベータセルリンはインスリンよりも強力に筋細胞へのアミノ酸取り込みを刺激することを一貫して示した。
【０３４１】
実施例３２：ベータセルリンは筋細胞におけるユートロフィン発現のアップレギュレーションを媒介した
ベータセルリンおよび他のErbBリガンド(EGF)ファミリーが、筋細胞へのグルコースおよびアミノ酸取り込みを刺激することができるという知見を踏まえ、本発明者らは、ベータセルリンおよび他のErbBファミリーメンバーが、糖尿病以外に、筋ジストロフィー、筋肉減少症、筋萎縮、神経筋障害など、筋に関連する他の疾患の治療にも有用なのではないかと考えるに至った。そこで、ベータセルリンおよび他のErbBリガンドファミリーメンバーを、筋ジストロフィーにおいて重要な役割を果たすタンパク質であるユートロフィンの発現刺激能について調べた。図30に示す結果は、被験濃度におけるベータセルリン、ならびにEGFおよびNRG1-アルファ(NRG1-α)といった他のErbBリガンド/EGFファミリーメンバーに、インスリンと同様、初代ヒト骨格筋細胞(ニュージャージー州イーストラザフォード、Cambrex社)におけるユートロフィンmRNAの発現をアップレギュレートすることが可能なことを示した。
【０３４２】
本実験では、前出の実施例と同様、増殖培地中にウェル当たり3×104個の密度で、96ウェルプレートに初代ヒト骨格筋細胞をまき、37℃および5%CO2の細胞培養インキュベータで一晩接着させた。翌日、増殖培地を除去し、無血清培地で置換した。無血清培地中にそれぞれ10nMで最終濃度が同一の、ヒト組み換えベータセルリン、EGF、NRG1-α、インスリンまたはIGF-I(すべて、ミネソタ州、R&D Systems社から入手)を、各ウェル中の細胞に個別に添加し、細胞を48時間インキュベートした。対照細胞は、無血清培地のみで処置した。インキュベーション後、Qiagen社(カリフォルニア州バレンシア)製のRNeasy 96キットを用いて、細胞から総細胞RNAを回収した。Qiagen社製QuantiTect SYBR Green RT-PCRシステムにより、回収細胞中のユートロフィンmRNA量を定量した。ユートロフィン発現量は、各処置条件について同様に測定した宿主遺伝子GusBの発現量で正規化した。A.O. Gramolini他:Proc. Natl. Acad. Sci., 96:3223-3227(1999)が述べる方法で、NRG1-アルファ(NRG1-α)を陽性対照として用いた。試験濃度において、ベータセルリン、EGFおよびNRG1-αは、インスリンと同じく、上記細胞におけるユートロフィン発現の刺激において対照培地よりも活性であった。インスリンが最も高活性で、対照の約1.5倍であった。IGF-Iが最も低活性で、対照の約1.25倍であった。各発現量はトリプリケートウェルで測定し、図30に示すように平均をプロットした。こうして、EGFR/ErbBリガンドファミリーメンバーは、初代ヒト骨格筋細胞におけるユートロフィン発現の刺激において有効であった。
【０３４３】
実施例３３：EGFファミリーメンバーによるユートロフィン発現の調節は投与量依存性の過程である
各種EGF/ErbBファミリーメンバーを対象に、初代ヒト骨格筋細胞(ニュージャージー州イーストラザフォード、Cambrex社)におけるユートロフィン発現刺激能の相対的強度を調べた。図31に示すように、用量100pMで、ベータセルリンおよびTGF-アルファ(TGF-α)は最もユートロフィン発現を強力に刺激することがわかった。EGF、HB-EGFおよびエピレグリンがこれに次いで強力であった。
【０３４４】
本実験では、前出と同様、増殖培地中にウェル当たり3×104個の密度で、96ウェルプレートに初代ヒト骨格筋細胞をまき、37℃および5%CO2の細胞培養インキュベータで一晩接着させた。翌日、増殖培地を除去し、無血清培地で置換した。各ウェル中の細胞は、無血清培地中0.1pM、1pM、10pM、100pM、1000pM、および10,000pMの濃度のヒト組み換えベータセルリン(「BTC」)または他のErbBリガンドファミリーメンバーにより、各濃度各タンパク質につき4ウェルずつ、個別に48時間処置した。試験ErbBリガンドファミリーメンバーは、以下の通りであった:ベータセルリン、HB-EGF、HB-EGF、TGF-アルファ(TGF-α)、アンフィレグリン(「AR」)、ニューレグリン1-ベータ(NRG1-β)、エピレグリン(「EPR」)およびエピゲン(「EPG」)。タンパク質はすべて、R&D Systems社(ミネソタ州ミネアポリス)から購入した。対照細胞は、無血清培地のみで処置した。細胞RNAは、前出の方法で回収した(実施例32)。Qiagen社製QuantiTect SYBR Green RT-PCRシステムにより、48時間の処置後に回収した細胞中のユートロフィンmRNA量を定量した。ユートロフィン発現量は、各処置条件について同様に測定した宿主遺伝子GusBの発現量で正規化し、相対値によるユートロフィンの発現とした。各発現量は、4レプリケートウェルで測定した。図31は、各タンパク質について平均した濃度100pMでの測定値のみを示す。
【０３４５】
本試験結果は、ベータセルリン、HB-EGF、およびTGF-α(アルファ)といったErbBリガンドファミリーメンバーが、無血清培地のみの存在下におけるユートロフィン値を少なくとも約40%は上回って、初代ヒト骨格筋細胞におけるユートロフィン発現の増大を刺激することを示した。以上3種のタンパク質、または該ポリペプチド断片は、それぞれ約100pM、1.0nM、および10nM以上の濃度において、初代ヒト骨格筋細胞に対する最大効果を生じた。EGFがユートロフィン発現に対して示した効果は、これよりも小さかった。AR、NRG1-ベータ、およびEPGは、初代ヒト骨格筋細胞におけるユートロフィン発現にほとんどまたはまったく影響を及ぼさなかった。
【０３４６】
実施例３４：ベータセルリンは初代ラット脂肪細胞における脂肪新生を刺激しなかった
ベータセルリンおよび他のErbB/EGFリガンドファミリーメンバーが、筋細胞へのグルコースおよびアミノ酸取り込みを刺激したという知見を踏まえ、ベータセルリンに脂肪新生活性があるかどうかを判定することにした。これは、脂肪酸への3H-グルコース取り込みを定量することにより測定した。脂肪新生活性は、細胞抽出液の有機相(脂肪含有相)における、3H活性を定量することにより評価した。図32の結果は、ベータセルリンが試験濃度において脂肪新生活性を有さないことを示した。
【０３４７】
本実験では、Charles River Laboratories社(マサチューセッツ州ウィルミントン)から雄Sprague-Dawleyラット(9週齢)を入手した。当技術分野の標準的方法[たとえば、M. Moldes他:Biochem J. 344:873-880(1999)]を用いて、ラットから脂肪細胞を単離し、1% BSA入りのDMEMで2時間インキュベートした。次いで、細胞を3nMインスリン(陽性対照)、または1% BSA入りのDMEM中で約0.01nM〜100nMの範囲における各濃度のベータセルリン、または1% BSA入りのDMEMを含有する対照培地で処置した。ベータセルリンが脂肪新生活性を刺激したとすれば、3H-グルコースが、少なくとも部分的には、脂肪酸に転換されると考えられる。結果は、高度の脂肪新生活性を示したインスリンと異なり、ベータセルリンが、0.01nM、0.1nM、1nM、10nM、または100nMのいずれの濃度でも、単離した脂肪細胞の脂肪新生活性を刺激しないことを示した。同様の実験は、ATCC社から入手した3T3 L1脂肪細胞などの脂肪細胞系統によっても実施可能である。
【０３４８】
実施例３５：ベータセルリンはHeLa細胞におけるEGF受容体のリン酸化を活性化した
ベータセルリン活性を調べるため、ベータセルリンによるErbB受容体のリン酸化を測定した。10%胎仔ウシ血清を含むMEM培地100マイクロリットル中のHeLa細胞約3×104個(ATCC社から入手)を、96ウェルプレートの各ウェルに接種した。細胞は一晩接着させた。翌日、培地を除去し、無血清培地90マイクロリットルで6時間、飢餓培養した。次いで、37℃の無血清培地中における、10-13M〜10-8Mの範囲における各濃度のベータセルリン10マイクロリットルで、細胞を15分間処置した。その後、細胞を溶解し、リン酸化した受容体(pY1068)をELISA法(カマリロ、Biosource International社)によって定量した。図33は、ErbB1受容体のリン酸化に対するベータセルリンの効果を示す。ベータセルリンは、ErbB1受容体のリン酸化を、用量依存的に誘発できることがわかった。結果は、HeLa細胞におけるErbB1リン酸化法が、ベータセルリン活性を検出するための便法となることを示した。
【０３４９】
実施例３６：ベータセルリンはラット新生仔心筋細胞への3Hデオキシグルコース取り込みを刺激した
前出の実験で、ベータセルリンが、他のEGFファミリーメンバーと同様に、初代ヒト骨格筋細胞およびラット足底筋細胞へのグルコース取り込みを刺激することを示した。さらに、別種の筋細胞、すなわち心筋細胞が同様に応答するかどうかを調べた。
【０３５０】
ラット新生仔心筋細胞の単離
ラット心筋細胞は、製造元の示すプロトコールに従い、Cellutron Life Technologies社(型番nc-60631、ニュージャージー州ハイランドパーク)から購入した新生仔ラット/マウス心筋細胞単離キットを用いて単離した。まず、組織消化用の実験溶液(D1、D2、およびD3実験溶液)を調製した。個別にみると、D1原液5mlおよび滅菌水45mlにより、D1実験溶液を調製した。D2実験溶液は、2例調製した。各D2実験溶液は、D2原液20ml、滅菌水28ml、およびEC(酵素コラゲナーゼ)用バッファー2mlを含有した。成分を混合し、0.22μmフィルターでD2実験溶液をろ過した。D3実験溶液も、2例調製した。各D3実験溶液は、NS(新生仔播種)培地25ml、D3原液1瓶(15ml)を含有するので、最終容量は40mlとなった。新生仔ラット(Sprague Dawley系統、Charles River Laboratories社)を70%エタノールで滅菌し、開胸して、心臓を取り出し、冷やしたD1実験溶液に入れる。やはり冷やしたD1実験溶液を入れた別の培養皿内で、大血管、心房および結合組織を取り去り、心室を残す。
【０３５１】
次いで、切り取った心室を、D2実験溶液12ml(新生仔心臓約70〜80例につき溶液約12ml)の入った滅菌済み30mlフラスコに移し、37℃インキュベータまたはオーブン内の攪拌プレート上、攪拌速度#2〜3(約300〜600rpm)(Fisher Scientific、テキサス州ヒューストン、型番1150049S)で組織を12分間攪拌し、心室組織から細胞を放出させた。溶液中の組織をピペットで吸出して後、上清(放出された細胞を含有)を15ml滅菌丸底プラスティック製試験管に移し、遠心分離(ドイツ、Kendro社、型番75004377)にかけた。上清を室温、1200rpmで2分間遠心分離し、細胞ペレットを得た。細胞ペレットは、D3実験溶液5〜10ml中に再懸濁させ、単離手順が済むまで室温中に放置した。D2およびD3実験溶液による上述の手順をさらに5〜11回、加工した心室組織がすべて細胞に消化されるまで繰り返した。心室全体から回収した細胞をプールし、キットが提供するセルストレイナー/フィルターでろ過し、フィルター表面をピペットで周回してフィルター上部から細胞を回収した。
【０３５２】
次いで、細胞(心室約70例から回収した)を、コーティングしない100mm Corning細胞培養皿(ニューヨーク州コーニング、Corning社、型番430167)にまいて5%CO2中37℃で約1.5時間インキュベートし、線維芽細胞を除去した(この条件では、線維芽細胞のみがプレートに接着するのに対し、心筋細胞は上清中に残る)。この後、新生仔心筋細胞を含有する培地を回収し、細胞を数えた。細胞純度を確保するため、新生仔ラット/マウス心筋細胞単離キットの指示書に従い、単離細胞プールの一定量を対象に、心筋アルファアクチンのための免疫組織化学的染色法を行った。心筋アルファアクチンは心筋細胞のマーカーであり、心線維芽細胞には存在しない。
【０３５３】
次いで1日目において、NS培地(ニュージャージー州ハイランドパーク、Cellutron Life Technologies社、型番M-8031)100マイクロリットル中にウェル当たり3×104個の密度で、96ウェル無色/透明底組織培養プレート(マサチューセッツ州ベッドフォード、BD Biosciences社、型番353947)にラット新生仔心筋細胞をまいた。プレートを組織培養フード内に30分間放置し、エッジ効果を最小化した。次いで、5%CO2中37℃のインキュベータ内に、プレートを一晩放置した。
【０３５４】
翌日の2日目に培地を除去し、低濃度グルコース(5mM)DMEM中に1% BSAを含有する栄養飢餓培地90マイクロリットルを各ウェルに添加した。細胞を、6時間飢餓培養した。次いで、陰性対照としての培地10マイクロリットル、または陽性対照としてのインスリン、または試験タンパク質(BTC、またはニューレグリン1-ベータ1[「NRG1-β1」])を各ウェルに添加した。20分間のインキュベーション後、培地を除去し、3Hで標識した培地50マイクロリットルを各ウェルに分注した。標識培地には、50マイクロリットル標識培地中に放射能1μCiを含む3H-デオキシグルコース溶液(型番NET-331A;マサチューセッツ州ウェルズリー、PerkinElmer Life and Analytical Sciences社)、1% BSA、およびグルコースフリーDMEM培地中の冷やした10μMデオキシグルコース(ドイツ、シュタインハイム、Sigma社、型番:D-3179)を含む。プレートは、15分間インキュベートした。次いで標識培地を除去し、細胞をカルシウムおよびマグネシウムを含む氷冷PBSで3回洗浄した。洗浄後PBSを除去し、0.05N NaOH 50マイクロリットルを各ウェルに分注した後、ピペットの吸入吐出により細胞を溶解した。次いで、マイクロシンチ40(型番D-6013641;マサチューセッツ州ウェルズリー、PerkinElmer Life and Analytical Sciences社)150マイクロリットルをきわめて緩徐に、溶液添加の際にチップを振動させて各ウェルに添加した。プレート上部をシーリングテープ(型番6005185;マサチューセッツ州ウェルズリー、PerkinElmer Life and Analytical Sciences社)でシールし、プレート下部は、白色バッキングテープ(マサチューセッツ州ウェルズリー、PerkinElmer Life and Analytical Sciences社、型番:6005199)で覆った。シグナルは、Windows XP(登録商標)上で作動するソフトウェアが付属するTopCount NXT(マサチューセッツ州ウェルズリー、PerkinElmer Life and Analytical Sciences社)によりカウントした。
【０３５５】
結果を図34に示す。各バーは、処置当たりウェル4以上の平均を示す。バーの高さ(y軸)は、各タンパク質のグルコース取り込み率を対照1で除した、相対値によるグルコース取り込みを示す。3種類の試験タンパク質(ベータセルリン、NRG1-β1(ベータ1)およびインスリン)すべてが、対照よりも約1.2〜1.5倍ラット新生仔心筋細胞へのグルコース取り込みを刺激した。各試験タンパク質および対照の間の差は、統計学的に有意(p<0.01)であった。
【０３５６】
実施例３７：ベータセルリンはAktおよびERKのリン酸化を刺激し、ラット新生仔心筋細胞の生存を促進した
ベータセルリンはラット新生仔心筋細胞におけるAktおよびERK のリン酸化を促進したがSTAT3のリン酸化は促進しなかった
実施例36に述べた手順で回収した新生仔心筋細胞は、NS(新生仔播種)培地(ニュージャージー州ハイランドパーク、Cellutron Life Technologies社、型番M-8031)および0.1ミリモル(mM)ブロモデオキシウリジン(BrdU)溶液(ドイツ、シュタインハイム、Sigma社、型番B-5002-250mg)で6×105個/mlに希釈した。次いで、1日目に、希釈した細胞懸濁液を、100マイクロリットル/ウェルの容量で96ウェルPrimaria(商標)プレート(ニュージャージー州フランクリンレークス、Becton Dickinson社、型番:353872)に接種し、5%CO2中37℃で一晩インキュベートした。
【０３５７】
翌日(2日目)、培地を、150マイクロリットル/ウェルに0.1mM BrdUを含有する新鮮なNS培地と交換し、細胞を5%CO2中37℃で一晩インキュベートした。3日目に、培地を150マイクロリットル/ウェルの栄養飢餓培地に交換し、細胞を5%CO2中37℃で一晩インキュベートした。栄養飢餓培地は以下を含有した:DMEM-glc-pry+10mM HEPES+0.1% BSA+1×ペニシリン-ストレプトマイシン。DMEM-glc-pryは、グルコースおよびピルビン酸なしのDMEM(ニューヨーク州グランドアイランド、Gibco/Invitrogen社、型番11966-025)を含有した。HEPESは、Mediatech社(バーモント州ハーンドン、型番25-060-CI, 1M)から購入した。Bovine Albumin Fr. V Fatty Acid Free(BSA)は、Serologicals Protein社(イリノイ州カンカキー、型番:82-002-4)から購入し、ペニシリン-ストレプトマイシンは、Mediatech社(バーモント州ハーンドン、型番30-002-CI, 100X)から購入した。
【０３５８】
一晩のインキュベーション後である4日目には、プレートの96ウェルを吸引し、新鮮な栄養飢餓培地150マイクロリットル/ウェルで洗浄し、さらに各ウェルに新鮮な栄養飢餓培地50マイクロリットルを添加した。次いで、タンパク質ならし培地50マイクロリットルを添加して、96ウェルプレートの列2〜11にある細胞を処置した。rhIGF1 300ng/mLの陽性対照を列1のウェルA〜Dに添加し、rhLIF 20ng/mLの陽性対照を列12のウェルA〜Hに添加し、陰性対照(ベクターのみのならし培地)を列1のウェルE〜Hに添加した。
【０３５９】
次いでプレートを、5%CO2中37℃で15分間インキュベートした。各種試験作用物質(組み替えタンパク質)によるインキュベーション後、ウェル中の溶液を吸引により除去した。次いで、氷冷した1×PBS 150マイクロリットル/ウェルでウェルを洗浄し、1mMpMSF(ドイツ、シュタインハイム、Sigma社、型番P7626)を含む氷冷したLysis Buffer(Cell Signaling Technology社、マサチューセッツ州ビバリー、型番9803)40マイクロリットルを各ウェルに添加した。プレートを氷上に10分間置いた。こうして、細胞溶解液入りのプレートでは、ルミネックスリン酸化タンパク質検出アッセイの準備が整った。
【０３６０】
ルミネックスリン酸化タンパク質検出アッセイ
96ウェルのアッセイフィルタープレート(フランス、モルサン、Millipore社、型番MSBVN1250)を、アッセイバッファー約100マイクロリットルで洗浄した後、バッファーを真空吸引した。アッセイバッファーは、カルシウムおよびマグネシウムなしのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)(バーモント州ハーンドン、Mediatech社、型番21-031-CV)および0.2% BSA(イリノイ州カンカキー、Serologicals Protein社、型番82-002-4)を含有した。
【０３６１】
抗リン酸化Akt(αpAkt)ビーズ(ニューヨーク州レークプラシッド、UpState社、型番46-601)、抗リン酸化ERK(αpERK)ビーズ(UpState社、型番46-602)、および抗リン酸化STAT3(αp STAT3)ビーズ(UpState社、型番46-623)の懸濁液を、アッセイバッファーでαpAktビーズについては1:40の希釈率、αpERKビーズおよびαp STAT3ビーズについては1:50の希釈率で希釈した。3種ビーズの混合懸濁液約25マイクロリットル(αpAkt、αpERK、およびαp STAT3の各種ビーズ懸濁液を等量に含む)を、アッセイフィルタープレートの各ウェルに添加した。さらに、細胞溶解液(上述の方法で調製)25マイクロリットルをアッセイフィルタープレートの各ウェルに添加した。次いで、黒色の覆いによる暗所内、4℃の振とう器上でプレートを一晩インキュベートした。
【０３６２】
インキュベーション後、ウェル中の液体を真空吸引して後、アッセイバッファー200マイクロリットルで各ウェルを2回ずつ洗浄した。αpAkt(ニューヨーク州レークプラシッド、UpState社、型番:46-601)、αpERK(UpState社、型番:46-602)、αp STAT3(UpState社、型番:46-623)用のビオチニル化レポーターを、アッセイバッファーで以下のように希釈した。αpAktビオチニル化レポーターは1:40の希釈率、αpERKおよびαp STAT3ビオチニル化レポーターはいずれも1:50の希釈率。調製したビオチニル化レポーターを混合し、洗浄手順用のアッセイバッファーを吸引した後、容量25マイクロリットルの混合レポーターを各ウェルに添加した。次いで、暗所内、室温の振とう器上で90分間、プレートをインキュベートした。90分後、ウェルから液体を吸引し、アッセイバッファー約200マイクロリットルで各ウェルを2回ずつ洗浄した。次いでアッセイバッファーにより、1:200の希釈率でストレプトアビジン-PE(BD PharMingen、カリフォルニア州サンディエゴ、型番554061)を調製し、ストレプトアビジン-PE希釈液約25マイクロリットルを各ウェルに添加した。次いで、暗所内、室温の振とう器上で15分間、プレートをインキュベートした。アッセイバッファー(1:1)でエンハンサー溶液(ニューヨーク州レークプラシッド、UpState社、型番:43-024)を調製し、25マイクロリットルを各ウェルに添加した。暗所内、室温の振とう器上で30分間、プレートをインキュベートした。液体を吸引し、アッセイバッファー200マイクロリットルで各ウェルを1回ずつ洗浄した。最後に、各ウェルにアッセイバッファー100マイクロリットルを添加してビーズを懸濁させ、暗所内で室温の振とう器上に10分間プレートを置いた。次いで、「pAkt、pERK、p STAT3」プログラムを用い、ルミネックスリーダーでプレートを解読した。
【０３６３】
図35A1および図35A2は、各用量の組み替えタンパク質(前出の実施例で述べたようにR&D Systems社から入手)で処置した、ラット新生仔心筋細胞におけるpAktおよびpERKアッセイの結果を示す。図35A1および図35A2のいずれにおいても、各組み換えタンパク質につきバー4本ずつの各組が各タンパク質につき4種類ずつの用量を示し、各バーは3つのレプリケート平均を表す。用量は、左から1本目のバーが100ng/ml、2本目のバーが33ng/ml、3本目のバーが11ng/ml、4本目のバーが0ng/mlである。バーの高さ(y軸)は、蛍光シグナルの測定値を示す。図35A1の結果は、ベータセルリンおよびNRG1-ベータ1のいずれもが、HB-EGF およびNRG1-アルファよりも大幅にpAkt値(pAkt発現量と呼ぶ)を上昇させたことを示す。図35A2の結果は、エピレグリン、ベータセルリン、およびNRG1-ベータ1がpERK値を著明に上昇させるのに対し、TGF-アルファ、HB-EGF、NRG1-アルファ、およびEGFはpERK値をごくわずかしか上昇させないことを示した。以上の条件下において調べた被験タンパク質のいずれもが、pSTAT3活性に対する効果を示さなかった。図35A3の結果は、ラット新生仔心筋細胞において、ベータセルリン(BTC)およびNRG1-ベータ1のpAktおよびpERK値(pAktおよびpERK発現量と呼ぶ)に対する効果が、用量依存的であることを示す。以上の条件下で、ベータセルリンのEC50は、pAktおよびpERK発現量に対して、それぞれ約77pMおよび約11pMであった。一方NRG1-b1のEC50は、pAktおよびpERK発現量に対して、それぞれ約123pMおよび約3pMであった。
【０３６４】
ベータセルリンは栄養飢餓状態に曝露したラット新生仔心筋細胞の生存を促進した
製造元の指示書に従ってCellTiter-Gloアッセイ(ウィスコンシン州マディソン、Promega社、型番G7573)を用い、栄養剥奪(栄養飢餓)状態下における複数の作用物質による心筋細胞生存に対する効果を調べた。1日目において、0.1ミリモル(mM)ブロモデオキシウリジン(BrdU)溶液(ドイツ、シュタインハイム、Sigma社、型番B-5002)入りのNS培地(ニュージャージー州ハイランドパーク、Cellutron Life Technologies社、型番M-8031)100マイクロリットル中にウェル当たり2×104個の密度で、96ウェルPrimaria組織培養プレート(ニュージャージー州フランクリンレークス、Becton Dickinson社、型番353872)にラット新生仔心筋細胞をまいた。Breathe Easy Sealing Tape(カリフォルニア州クララ、E&K Scientific社、型番1796200)により、プレートをシーリングした。細胞を5%CO2中37℃で一晩インキュベートした。翌日(2日目)、培地を0.1mM BrdU入りの新鮮なNS培地150マイクロリットルと交換した。シーリングテープでプレートをシーリングした。細胞をさらに24〜48時間インキュベートした。その後、DMEM-glc-pry培地に10mM HEPES、0.1% BSA、および1×ペニシリン-ストレプトマイシンを含む栄養飢餓培地100マイクロリットル中で、各種組み換えタンパク質により細胞を処置した。DMEM-glc-pryは、グルコースおよびピルビン酸なしのDMEM(ニューヨーク州グランドアイランド、Gibco/Invitrogen社、型番11966-025)を含有した。HEPESは、Mediatech社(バーモント州ハーンドン、型番25-060-CI, 1M)から購入した。Bovine Albumin Fr. V Fatty Acid Free(BSA)は、Serologicals Protein社(イリノイ州カンカキー、型番:82-002-4)から購入し、ペニシリン-ストレプトマイシンは、Mediatech社(バーモント州ハーンドン、型番30-002-CI, 100X)から購入した。約40時間のインキュベーション後、ウェル当たり約100マイクロリットルのCellTiter-Gloアッセイバッファー(ウィスコンシン州マディソン、Promega社、型番G7573)を培地に添加し、暗所内室温で10分間振とうした。ウェル当たり合計100マイクロリットルの混合液を96ウェルハーフエリアアッセイプレート(ニューヨーク州コーニング、Corning社、型番3688)に移し、蛍光プレートリーダーLmax(カリフォルニア州サニーベールMolecular Devices社)により蛍光シグナルを測定した。
【０３６５】
本アッセイの結果を図35B1に示す。各バーは各試験作用物質を表し、各試験作用物質は6つのレプリケートで測定した。対照の細胞生存率を100%に設定した。バーの高さ(y軸)は、対照に対する細胞生存百分率を示す。一方、生存百分率は、各タンパク質の平均ATP蛍光シグナルを対照で除することにより計算した。星印(*)を付したタンパク質、すなわちBTC、NRG1-b1、エピレグリン、TNF-アルファ、HB-EGF、およびEGFはすべて、対照で処置した細胞と比べ、栄養飢餓状態下の細胞生存を統計学的に有意に(p<0.01)上昇させた。
【０３６６】
ベータセルリンは虚血状態に曝露したラット新生仔心筋細胞の生存を促進した
複数の作用物質による、酸素剥奪(すなわち、虚血状態)に曝露した心筋細胞に対する生存効果を試験するため、1日目において、0.1ミリモル(mM)ブロモデオキシウリジン(BrdU)溶液(ドイツ、シュタインハイム、Sigma社、型番B-5002)入りのNS培地(ニュージャージー州ハイランドパーク、Cellutron Life Technologies社、型番M-8031)100μl中にウェル当たり2×104個の密度で、96ウェルPrimaria組織培養プレート(ニュージャージー州フランクリンレークス、Becton Dickinson社、型番353872)にラット新生仔心筋細胞をまいた。Breathe Easy Sealing Tape(カリフォルニア州クララ、E&K Scientific社、型番1796200)により、プレートをシーリングした。細胞を5%CO2中37℃で一晩インキュベートした。翌日(2日目)、培地を0.1mM BrdU入りの新鮮なNS培地150マイクロリットルと交換した。シーリングテープでプレートをシーリングした。3日目、すなわち、5%CO2中37℃でさらに一晩のインキュベーション後、培地をウェル当たり150マイクロリットルの栄養飢餓培地に交換した。シーリングテープでプレートをシーリングした。次いで、細胞を5%CO2中37℃で一晩インキュベートした。4日目に、137mM NaCl、12mM KCl、0.9mM CaCl2・2H2O、4mM HEPES、10mMデオキシグルコース、20mM乳酸ナトリウム、および0.49mM MgCl2を含み、H2O中においてpH6.7のEsumi虚血バッファー100マイクロリットル中で、各種組み換えタンパク質により細胞を処置した。細胞の対照群には、組み換えタンパク質を与えなかった。虚血状態下における3時間のインキュベーション後、ウェル当たり約100マイクロリットルのCellTiter-Gloアッセイバッファー(ウィスコンシン州マディソン、Promega社、型番G7573)を培地に添加し、暗所内室温で10分間振とうした。ウェル当たり合計100マイクロリットルの混合液を96ウェルハーフエリアアッセイプレート(ニューヨーク州コーニング、Corning社、型番3688)に移し、蛍光プレートリーダーLmaxにより蛍光シグナルを測定した。
【０３６７】
図35B2に示す本試験の結果は、虚血状態に曝露したラット新生児心筋細胞の生存率または生存に対する、組み換えヒトベータセルリンおよびNRG1-ベータ1の効果を示した。組み換えヒトIGF-1を陽性対照として用いた。各バーは各試験作用物質による処置を表し、各処置は24のレプリケートをともなった。バーの高さ(y軸)は、ATP蛍光シグナルで表される相対値による細胞生存率(生存細胞の指標)を示す。星印(*)を付したタンパク質、すなわちBTC、NRG1-b1、およびIGF-1はすべて、対照で処置した細胞と比べ、細胞生存を統計学的に有意に(p<0.001)増加させた。
【０３６８】
ベータセルリンは心毒性作用物質に曝露した心筋細胞の生存を促進した
ベータセルリンが、栄養飢餓または虚血状態に曝露した新生仔心筋細胞の生存を促進させることを確認したので、さらにベータセルリンが、たとえば、癌または他種の治療における化学療法剤として用いられる、心毒性の副作用を有する薬剤(例えば、ドキソルビシン)などの毒性物質に対して、心筋細胞を保護する可能性を有するか試験することにした。
【０３６９】
本試験では、1日目において、0.1ミリモル(mM)ブロモデオキシウリジン(BrdU)溶液(ドイツ、シュタインハイム、Sigma社、型番B-5002)入りのNS培地(ニュージャージー州ハイランドパーク、Cellutron Life Technologies社、型番M-8031)100マイクロリットル中にウェル当たり2×104個の密度で、96ウェルPrimaria組織培養プレート(ニュージャージー州フランクリンレークス、Becton Dickinson社、型番353872)にラット新生仔心筋細胞をまいた。Breathe Easy Sealing Tape(カリフォルニア州クララ、E&K Scientific社、型番1796200)により、プレートをシーリングした。細胞を5%CO2中37℃で一晩インキュベートした。翌日の2日目に、培地を0.1mM BrdU入りの新鮮なNS培地150マイクロリットルと交換した。シーリングテープでプレートを再度シーリングした。一晩のインキュベーション後、培地をウェル当たり約150マイクロリットルの栄養飢餓培地(実施例36と同様)に交換した。シーリングテープでプレートを再度シーリングし、再度細胞を一晩インキュベートした。翌日の4日目に、2μMドキソルビシンSigma-Aldrich Chemical社(ミズーリ州セントルイス、型番44583)50マイクロリットルおよびベータセルリンなしの対照培地50マイクロリットル、または最終濃度が1μMドキソルビシンおよび0nM、0.1nM、1nM、10nM、もしくは100nM各濃度のベータセルリン(ミネソタ州、R&D Systems社)となるように、ベータセルリン濃度を0.2nM、2nM、20nM、もしくは200nMと変化させる栄養飢餓培地50マイクロリットルのいずれかで細胞を処置した。約24時間のインキュベーション後、ウェル当たり約100マイクロリットル のCellTiter-Gloアッセイバッファー(ウィスコンシン州マディソン、Promega社、型番G7573)を各ウェルに添加し、暗所内室温で約10分間振とうした。ウェル当たり合計100マイクロリットルの混合液を96ウェルハーフエリアアッセイプレート(ニューヨーク州コーニング、Corning社、型番3688)に移し、蛍光プレートリーダーLmax(カリフォルニア州サニーベール、Molecular Devices社)により蛍光シグナルを測定した。
【０３７０】
図35に示す結果は、心毒性作用物質存在下における、ラット新生仔心筋細胞の生存率に対する組み換えベータセルリン(BTC)の効果を示した。図35は、ベータセルリンの各試験濃度に対するATP蛍光シグナルにより測定した、対照比百分率としての細胞生存率を示す。各バーは、3レプリケートの平均値を表す。ベータセルリンは、すべての濃度で、対照細胞と比べ統計学的に有意な保護効果(p<0.001)を示した。対照は、生存率100%に設定した。100nMベータセルリンは、対照の約210%の細胞生存率により、最高の保護効果を示した。10nMベータセルリンは、対照の約175%の生存率を示した。1nMおよび0.01nMのベータセルリンは、それぞれ対照の約160%の生存率を示した。本実験は、ベータセルリンが、心毒性作用物質に曝露した心筋細胞の生存を促進できたことを示した。
【０３７１】
実施例３８：ベータセルリンのスプライス変異体はインピーダンスアッセイで不活性であった
BTCが、初代ヒト骨格筋細胞の細胞指数の上昇、およびインスリンに応答した細胞指数の上昇(インピーダンスアッセイにより測定)のいずれにおいても活性であるという(前出の実施例における)知見を踏まえ、ベータセルリンスプライス変異体(「BTC SV」)の活性を調べた。本変異体は、ワイルドタイプのベータセルリン分子とC末端が異なっていた(PTC出願WO 06/012707で述べた)。BTCおよびBTC SVのcDNA [pTT5ベクターでクローン、Y. Durocher他:Nucleic Acids Res 30(2):E9(2002)]は、それぞれ293T細胞(ATCC(登録商標)番号CRL-11268(商標))で発現させ、4日間の培養後におけるこれら細胞培養液の上清を、インピーダンスアッセイのタンパク質源として用いた。ACEAから入手し前出の方法でインピーダンスアッセイ用に調製したインピーダンスプレートの各ウェルに、約3×104個の初代ヒト骨格筋細胞(ニュージャージー州イーストラザフォード、Cambrex社)を接種した。細胞を、無血清培地120マイクロリットルで6時間飢餓培養した。次いで、BTCを発現する293T細胞、またはBTC SVを発現する293T細胞、またはベクター対照をトランスフェクトした293T細胞からの上清40マイクロリットルずつを、各ウェルに添加した。前出の実施例に述べた手順により、ACEA製のRT-CES(商標)を用いてインピーダンス変化を測定した。図36の結果は、時間に対する細胞指数(ベースラインに対して正規化)のプロットを示す。本実験は、BTCならし培地が、正規化した細胞指数を急速に上昇させることを示した。一方で、BTC SVならし培地は、このような効果を示さず、ベクター対照をトランスフェクトした293T細胞からの上清と同様に低値の応答を示すに過ぎなかった。本試験は、ベータセルリンスプライス変異体が、ワイルドタイプベータセルリンの刺激活性を欠いていることを示す。
【０３７２】
実施例３９：BTCスプライス変異体は初代ヒト骨格筋細胞におけるグルコース取り込みを刺激しなかった
WO 06/012707で公表したベータセルリンスプライス変異体が初代ヒト骨格筋細胞における細胞指数を上昇させなかったという知見を踏まえ、グルコース取り込み刺激能について該ベータセルリンスプライス変異体を調べた。本実験では、ワイルドタイプBTCおよびBTC SVのいずれも、293T細胞で発現させた。Cambrex社製の初代ヒト骨格筋細胞約3×104個を、前出の方法で96ウェルプレートの各ウェルに接種し、インピーダンスアッセイ用に調製した。初代ヒト骨格筋細胞を、無血清培地120マイクロリットルで6時間飢餓培養した。次いで、BTCスプライス変異体を発現する293T細胞(BTCならし培地、発現の4日後に回収)、またはベクター対照をトランスフェクトした293T細胞(対照ならし培地、モック/空ベクター対照発現の4日後に回収)からの上清40マイクロリットルずつを、各ウェルに添加し、37℃で20分間放置した。
【０３７３】
次いで、細胞を1μCi 3Hデオキシグルコースで標識し、37℃で20分間放置した。標識後、氷冷したPBSで細胞を3回洗浄し、0.05N NaOHで溶解した。TopCount(マサチューセッツ州ウェルズリー、PerkinElmer社)により放射能を測定した。図37の結果は、陽性対照として用いたμMインスリンが、ヒト骨格筋細胞におけるグルコース取り込みを誘発したことを示す。一方で、BTCスプライス変異体を含むならし培地は、取り込みを誘発しなかった。本実験は、ベータセルリンスプライス変異体が、前出の同じ条件下におけるワイルドタイプのベータセルリンでは見られた特性である、筋細胞へのグルコース取り込み刺激能を欠いていたことを示す。ベータセルリンが、細胞指数上昇の刺激能および筋細胞へのグルコース取り込み刺激能のいずれをも有し、ベータセルリンスプライス変異体が以上のいずれをも有さないことから、本実験は、両刺激能の間に良好な相関関係が存在することをも示す。
【０３７４】
実施例４０：筋ジストロフィーなどの筋疾患を有する被験体における筋機能改善のためのベータセルリンの使用
筋ジストロフィーモデルとしてのジストロフィン欠損mdxマウス
ジストロフィン欠損mdxマウスは、ジストロフィン遺伝子に変異があり、筋ジストロフィーのモデルとして広く用いられている[総括については、J.V. Chakkalakal他:FASEB J. 19:880-891(2005)を参照]。ジストロフィンは通常、骨格筋および心筋で発現する。ジストロフィンがなければ、骨格筋および心筋の細胞膜と周囲の基底膜との結合が緩み、筋ジストロフィーおよび心筋症の発症と関連する病態の原因となる。そこで、本発明は、mdxマウスを用いて、ベータセルリン投与が、筋喪失もしくは筋ジストロフィーを有する被験体における、筋機能喪失予防、筋機能改善、筋機能回復または以上のすべてに与える効果を測定するための試験を提示する。同類の実験は、他のErbBファミリーメンバー単剤または他の分子との配合剤により実施可能である。こうした配合剤の一部の実施例については、明細書の各箇所を参照のこと。
【０３７５】
本稿ではmdxマウスと呼ぶ、ジストロフィン欠損C57b1/10ScSn-Dmdmdx/Jマウス、およびC57b1/10ScSn対照マウスは、The Jackson Laboratories社(米国、メーン州バーハーバー)から入手できる。ある研究では、ベータセルリンが、筋ジストロフィーを改善できるかどうかを判定するため、4週齢の雄mdxマウスに、担体溶液中で各種投与法により皮下投与するベータセルリン投与、または担体溶液のみの投与を行う。また別の研究では、ベータセルリンが筋ジストロフィーを予防できるかどうかを判定するため、mdxマウスモデルにおける筋損傷が顕在化する以前の、たとえば生後1週間といった幼齢において、ベータセルリン投与を開始することができる[J. Tinsley他:Nat. Med. 4:1441-1444(1998)]。前出の実施例に述べた手順で、マウスにベータセルリンもしくは他のErbBリガンドポリペプチド、または対照物質を注射することができる。投与を受けた筋肉の生理学的(力学的、生化学的および組織学的)評価は、たとえば、T.O.B. Krag他:Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 101:13856-13860(2004)、またはJ.M. Gillis他:Acta Neurol. Belg., 100:146-150(2000)が述べる方法で実施できる。本発明の実施例の一部を以下に提示するが、当業者なら、投与を受ける被験体の筋肉に対するベータセルリンの効果の度合いを判定するための適切な方法およびパラメータの選定法のみならず、被験体の全般的な余命および生活の質(運動能力、食物摂取)を改善するために適切な投与量および投与回数についてもご存知であろう。
【０３７６】
グルコース取り込み、グルコース耐性、アミノ酸取り込みおよびユートロフィン発現に対するベータセルリンの効果についても、筋ジストロフィーのmdxモデルにより調べることができる。該解析のための実験に関する詳細は、実施例17から32で述べている。注目すべきは、ジストロフィン欠損mdxマウスにおいては、筋における内因性ユートロフィン値が、正常マウスと比べて、生後すぐは上昇を維持することである。筋線維壊死の第1の徴候は、内因性ユートロフィン値が成体値まで低下した後(生後約1週齢)に検出されるに過ぎない。
【０３７７】
収縮特性試験による筋機能回復の評価:等尺性筋力産生および遠心性収縮の定量
ベータセルリンまたはその他のErbBリガンドファミリー(以後、すなわち、実施例40のこれ以後、まとめて「ベータセルリン」と呼ぶ)が与え得る有益性の度合いを判定するために用いることのできる、筋機能回復評価の標準的評価法の1つは、力学的筋損傷感受性試験である。この試験は、長趾伸(ELD)筋に対してよく実施されるが、足底筋、腓腹筋、前脛骨筋、横隔膜筋、および四頭筋に対しても実施できる。mdxマウスは、長期にわたるベータセルリン投与が可能である。望ましいベータセルリン投与期間の終了時に、触覚刺激に対する反応を防止するための必要に応じた補充投与を含め、ペントバルビトンナトリウムによりマウスに深く麻酔をかける。たとえばEDLなど、切除したばかりの筋を計量し、フォーストランスデューサに移し、実験時間中25℃酸化リンゲル液(pH7.4)により平衡化する。まず、EDL筋をフォーストランスデューサのいずれかの端部に固定した後、スティミュレータに接続したプラチナ製電場電極で刺激した。これにより、筋は、遠心性収縮(ECC)と呼ばれる、外力による伸張をともなう一連の収縮を受ける。コンバータおよび適切なソフトウェアにより、データを数値化して収集し、標準的なECCプロトコール[T.O.B. Krag他:Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 101:13856-13860(2004)]による1回目および10回目強縮時の等尺性筋力産生の差を用いて、遠心性収縮力の低下を計算する。
【０３７８】
in situの力学的試験の完了後、EDL筋は、さらなる解析のために加工することができる。たとえば、細胞膜損傷を測定するためには、酸化リンゲル液(HEPESによりpH7.4に緩衝)中の0.5%プロシオンオレンジ(Procion Orange)染料(米国、ミズーリ州セントルイス、Sigma-Aldrich社)に筋を5分間浸漬(浸漬槽は、95% O2および5%CO2の混合気体により継続的に酸化し、25℃に保つ)した後、イソペンタン液でフラッシュ凍結した。凍結断面は、クリオスタットを用いて-20℃の各組織から長さ方向の中央部で切り出し、細胞質中、プロシオンオレンジで染色された筋線維の百分率を定量する。この低分子量染料の筋線維への取り込みが、細胞膜への損傷の直接的な指標となる。
【０３７９】
別の方法は、たとえば、Tissue-Tek(登録商標)OCT化合物(カリフォルニア州トランス、Sakura Finetek USA社、TissueTek)もしくは他の包埋媒質で包埋、および/または、たとえば液体窒素で事前冷却したイソペンタン中でフラッシュ冷却後、筋を組織学的分析のために加工することである。伸張性収縮時におけるmdx EDLの損傷感受性については、一連のECC後に十分な筋力産生能を損なう特性がよく知られている[S. Bogdanovich他:FASEB J., 19:543-549(2005)]。この機能障害は通常、ECC後における筋力産生の低下である、「筋力低下」を計算することにより定量する。筋力低下の絶対値の減少、またはベータセルリン処置後のEDLにより産生されるECC後等尺性筋力の改善がある場合は、ベータセルリンが処置筋に対する機能改善をもたらすということができる。
【０３８０】
ベータセルリンの有益性は、たとえばG.S. Lynch他:Am. J. Physiol., 272:C2063-C2068(1997)、およびP. Gregorevic他:Am. J. Pathol., 161:2263-2271(2002)が述べるように、横隔膜筋を用いても示すことができる。横隔膜筋は、mdxマウスで最も損傷を受ける筋であり、通常16週間後までに、EDLに先立ち変性および線維症を示すことが多いと報告されている[H.H. Stedman他:Nature, 352:536-539(1991)]。ベータセルリンおよび対照による処置の完了時に、たとえば、中央部腱膜から肋骨の短い区間に向けて放射状に切り出すことで麻酔下mdxマウスから横隔膜の細片を切除して後、両端をフォーストランスデューサに取り付けた。各筋標本の長さは、最大等尺性筋力を得るように調整する。正規化した筋力(単位断面積あたりの筋力)を計算し、mN/mm2単位で表す[J. Tinsley他(1998)、H.H. Stedman他:Nature, 352:536-539(1991)]。
【０３８１】
全身張力(WBT)
ベータセルリン投与マウスおよび対照マウス筋系全体の筋力は、尾をフォーストランスデューサに取り付けたマウスが、尾のピンチングから逃れるときに出す筋力を記録する、非侵襲的な「エスケープ試験」中の筋力変化によってもモニタリングすることができる。試験後、筋力最高値、または全身張力(WBT1)、および一定時間(分単位)内の多回のピンチング反復後における、5つの最高値の平均を計算する。結果は、被験体の体重で正規化してmN/gで表し、この比はWBTである[J. Tinsley他:Nat. Med., 4:1441-1444(1998)]。
【０３８２】
クレアチンキナーゼ試験による筋機能回復の生化学的評価
筋疾患では、クレアチンキナーゼ値(CK)といった、筋細胞膜への損傷(筋線維膜の損傷)時に放出される細胞質酵素の血中値が上昇し、筋ジストロフィーでは非常に高値となり得る[G. Bulfield他:Proc. Natl. Acad. Sci., 81:1189-1192(1984)、S. Bogdanovich他:Nature, 420:418-421(2002)]。実際、血中CK値は、筋ジストロフィーの診断検査に用いられる。したがって、ベータセルリンの有益な効果は、マウスにベータセルリンを投与し、ベータセルリン投与期間中の各時点において尾静脈からの血液試料を遠心分離して血清を採取することによっても示すことができる。血清CK値は、間接法によるSigma Diagnostics Creatine Phosphokinaseキットおよび添付の基準(米国、ミズーリ州セントルイス、Sigma-Aldrich社)により測定する。ベータセルリン投与マウスのCK値が低値であれば、筋損傷に対するベータセルリンの保護効果を示すことになる。
【０３８３】
ベータセルリン投与後の形態的な筋評価
中心核線維の比率
中心核線維の比率は、筋変性/再生サイクルの指標として受容されており、mdxマウスにおける遺伝子治療試験の有効性をモニタリングするための指標として用いられている[J.M. Gillis他:Acta Neurol. Belg., 100:146-150(2000)、S. Bogdanovich他:FASEB J., 19:543-549(2005)]。mdx筋は、慢性炎症および筋損傷に応答して常に再生するので、正常マウスに比べてはるかに大きな比率で中心核線維(CNF)を有する[J.W. CarnwathおよびD.M. Shotton:J. Neurol. Sci., 80:39-54(1987)]。そこで、目的のベータセルリン投与完了後、マウスに麻酔をかけ、筋(たとえば、横隔膜筋またはEDL筋)を切除して液体窒素で冷却したイソペンタンによりフラッシュ冷却する。凍結断面は、クリオスタットを用いて-20℃の各筋から長さ方向の中央部/筋腹中央部で切り出し、氷冷した100%メタノールを用いて短時間(5分間)固定し、すぐに解析するか、またはヘマトキシリンおよびエオシン染色の標準的プロトコールに従い加工するまで-80℃の密閉容器で保存する。断面は、光学顕微鏡で観察し、筋線維総数のほか、中心核を含む筋線維数を評価する。デジタル画像の形態学的測定に、画像加工フリーウェアNIH Imageを用いることもできる。mdxマウスの病態改善におけるベータセルリンの有益な効果は、ベータセルリン投与mdxマウスにおけるCNF比率が、対照mdxマウスと比べて有意に低下することによって示すことができる。
【０３８４】
ロータロッド上の運動持続時間
回転するロッド(「ロータロッド」)上の運動持続時間(endurance time)は、全身筋力の評価法として詳しく記述されており、mdxマウスは、該器械において重力に抗した把持および懸垂能が損なわれると報告されている[F. Muntoni他:J. Neurol. Sci., 120:71-77(1993)]。投与期間中の各時点でマウスに対するベータセルリンの有益な効果を示すことができ、各速度で(たとえば、5rpmおよび10rpm)マウスの運動持続能(endurance)を評価することができる。たとえば、マウスを直径3.8cmのロッド上に載せることができる(ロータロッド試験、CR-1 Rotamex System、Columbus Instruments社)。ロッドは5rpm/minの速度で回転し、10rpm/minまで加速することができる。マウスが、回転し加速するロッドから脱落するまでの時間を測定する(平均±SE)。落下したらすぐに、マウスに電気ショックを与える(0.2 mAで1秒間)。各マウスには、60分間以内に1日当たり5回の試験を受けさせる。ベータセルリンの有益な効果の度合いは、ベータセルリン投与マウスが落下までにロッド上に乗っていられる時間の延長により観察することができる。
【０３８５】
体重の変化
ジストロフィンの欠如したmdxマウスは通常、何週間もの間、体重が有意に増加せず、齢数によっては減量する場合もある。体重に対するベータセルリンの効果を判定するため、ベータセルリン投与前および投与中の各時点(たとえば、0〜14週間の毎週)にマウスをケージから取り出し、体重計に載せて体重を測定する。
【０３８６】
筋病態の組織形態学的評価:筋組織、筋長、筋量ならびに筋線維サイズおよび数
筋量の増加を定量するため、マウスを安楽死させ、長趾伸筋、足底筋、腓腹筋、前脛骨筋、横隔膜筋、および四頭筋などの筋を切除して計量する。筋量増減の度合いを、対照およびベータセルリン投与マウスで比較する。筋量変化が肥大(細胞サイズの増大)、過形成(細胞数の増加)、またはその両方のいずれによるかを判定するため、組織断面にさらなる形態計量学的検討を加える。凍結断面は、クリオスタットを用いて-20℃の各筋から長さ方向の中央部/筋腹中央部で切り出し、氷冷した100%メタノールを用いて短時間(5分間)固定し、すぐに解析するか、またはヘマトキシリンおよびエオシン染色の標準的プロトコールに従い加工するまで-80℃の密閉容器で保存する。断面は、光学顕微鏡で観察し、たとえば、筋線維数および断面積、中心核総数、中心核/線維数、炎症細胞浸潤および線維症について評価する。総筋断面積(CSA)および単線維断面積の測定も、EDL筋について行われることがきわめて多い。ベータセルリン投与および対照マウスについて、単線維断面積(um2)に沿って筋線維数分布を示す度数分布グラフを作成することができる[S. Bogdanovich他:Nature, 420:418-421(2002)]。
【０３８７】
ベータセルリン投与後におけるマウス病態の生化学的および分子的評価
筋細胞病態に対するベータセルリンの有益な効果を細胞レベルで評価するためには、ErbB受容体(たとえば、投与中および投与後における、各受容体の活性化およびリン酸化状態の同定)、ならびにグルコース代謝(たとえば、ホスホGskベータ/アルファ、ホスホグリコーゲン合成酵素、リン酸化IRS)、細胞生存およびストレスへの細胞応答(たとえば、ホスホAkt [Ser473]、ホスホp70S6キナーゼ、ホスホS6リボゾームタンパク質、ホスホFKHR、リン酸化PI3K[同化および調節に関わるサブユニット])、細胞死(たとえば、カスパーゼ3活性化、ホスファチジルセリン曝露)の代理マーカーのほか、細胞増殖(たとえば、ホスホヒストンH3 [Ser10、分裂期マーカー]、増殖細胞核抗原)および細胞周期(たとえば、p27およびサイクリンD1)マーカーとして機能する分子の一部を含む、複数の分子を対象とする免疫組織化学的および免疫細胞化学的解析(たとえば、免疫蛍光法、免疫沈降法、キナーゼ解析)により、骨格筋試料を調べることになる。同様の実験は、本明細書の各箇所で詳細に述べた、他のErbBファミリーメンバー、変異体、および配合剤によっても実施可能である。
【０３８８】
筋ユートロフィン発現に対するベータセルリン効果の評価は、切除した筋をユートロフィンに対する第一抗体で免疫染色することにより、in situでも実施可能である。筋線維におけるユートロフィン発現を他の細胞型と対比して評価することなど、ユートロフィンシグナルの可視化も、第二抗体の使用によるブライトフィールドまたは蛍光顕微鏡など、当業者にはよく知られた方法によって実施可能である。後者の方法は、ブライトフィールド顕微鏡で可視化される色原性基質に作用する、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼといった酵素、またはCy5(米国、ペンシルベニア州ウェストグローブ、Jackson Immunoresearch社)またはAlexa Fluor 488(米国、カリフォルニア州カールスバード、Invitrogen社)といった蛍光標識との組み合わせが可能である。
【０３８９】
脂肪組織へのグルコース取り込み
対照またはベータセルリン投与群(たとえば、mdxマウスまたはミオスタチンを投与したC57BL/6Jマウス)からの雄マウスを一晩絶食させて後、適切な場合はインスリンを添加した生理食塩水中、マウス体重に対して250uCi/kgの濃度の、ここでは2-[3H]DGと呼ぶ2-デオキシ-D-[1,2-[3H](N)]グルコース(米国、ミズーリ州セントルイス、Sigma-Aldrich社)を、尾静脈から静脈内ボーラス注射する。マウスには麻酔をかけ、注射後30分で急速に安楽死させる。次いで、両投与群のマウスから一定の間隔で、副睾丸脂肪組織をすばやく切除し、洗浄し、ブロットを乾燥し、計量し、60℃の1M NaOHで溶解する。取り込まれた放射能は、シンチレーションカウンター(カリフォルニア州フラートンBeckman社、LS3801)でカウントする。2-[3H]DGの取り込みは、1分当たりのカウント数をタンパク質含有量で除した値で表す。
【０３９０】
横隔膜筋の弛緩および収縮によるグルコース取り込みに対するベータセルリンの効果
当業者なら、横隔膜筋の外植片におけるグルコース取り込みのための公知の評価法[たとえば、A.A. Evans他:J. Endocrin., 155:387-392(1997)参照]については、よくご存知であろう。
【０３９１】
4〜12週齢(または各投与終了時)の成体雄マウス(たとえば、雄mdxマウスおよび該対照、またはミオスタチンプラスミドを注射したC57BL/6Jマウス)に麻酔をかけ、頚椎脱臼で安楽死させる。横隔神経とともに横隔膜を切除し、中心腱に沿って2葉の半横隔膜に分割し、改変型クレブス-ヘンゼライト液(118mM NaCl、4.7mM KCl、8.7mM CaCl2.2H2O、1.17mM MgSO4.7H2O、1.2mM KH2PO4、25mM NaHCO3、2%(w/v)ウシ血清アルブミン、2mMリン酸ナトリウム)5〜10mlを含むSylgardでコートした組織培養プレート(ドイツ、ヴィースバーデン、Dow-Corning社)に固定する。37℃に保った恒温庫内の培養筋には、95%O2/5%CO2の混合気体を持続的に供給する。本明細書で2-[3H]DGと呼ぶ2-デオキシ-D-[1,2-[3H](N)]グルコースを、1mM(0.1 mCi/mmol)の最終濃度で含有する。インスリン、ベータセルリン、または両タンパク質の配合剤(または本明細書の各所で述べる他の配合剤)を、目的の最終濃度で添加する。目的のインキュベーション時間終了時に、筋を恒温庫から取り出し、すすぎ、ブロットし、液体窒素でスナップ凍結する。次いで、90℃の1M NaOH 0.5ml中で10分間、筋を加熱処理し、温浸後の筋抽出液中の3H含有量について、上清を解析する。
【０３９２】
筋収縮時のグルコース取り込みに対する、インスリンおよびベータセルリンの併用効果を評価するため、各濃度のインスリンもしくはベータセルリン、またはインスリンおよびベータセルリンの配合剤を含むKHB培地(2-[3H]DG入り)でインキュベートした腹部筋細片のテタニー性収縮を、EDL筋について前述したプラチナ電極、または他に述べられた方法[P.A. Hansen他:J. Appl. Physiol., 76:979-985(1994)]により刺激することができる。収縮筋外植片によるグルコース取り込みは、前出の段落に述べた手順で評価することができる。
【０３９３】
心筋細胞へのベータセルリンの効果
マウス心筋細胞の単離
インスリン、ミオスタチン、ベータセルリンまたは以上すべての配合剤による投与前または後のmdxマウスまたはC57BL/6Jマウスから、公知の方法[たとえば、D.D. Belke他:J Clin Invest., 109:629-39(2002)]に従って、成体心室の心筋細胞を単離する。略述すると、雄マウス(12週齢または目的のin vivo投与終了時)にヘパリン100Uを腹腔内投与してから30分後に、ペントバルビタールナトリウム(250mg/kg)の腹腔内投与により麻酔をかけ、頚椎脱臼で安楽死させる。心臓を速やかに切除し、氷冷したバッファーA(120mM NaCl、5.4mM KCl、1.2mM MgSO4、1.2mM NaH2PO4、5.6mMグルコース、20mM NaHCO3、0.6mM CaCl2、10mM 2.3-ブタンジオンモノキシム、および5mMタウリン、pH7.5)中で停止させる。次いで、大動脈にカニューレを挿入し、まず95%O2/5%CO2を供給するバッファーAにより4分間、次いで25μM CaCl2および59U/ml II型コラーゲン(米国、ニュージャージー州フリーホールドのWorthington Biochemical社)により10〜14分間、37℃で心臓を逆向きに灌流する。冠動脈における流量を、2.5ml/分に設定する。次いで、右室自由壁を除去し、コラゲナーゼ、50μM CaCl2、および1%(w/v)脂肪酸フリーウシ血清アルブミンの存在下で、さらに37℃で5〜10分間温浸する。次いで、滅菌したカミソリの刃で心臓をみじん切りにし、含有カルシウム濃度を1mMの最終濃度に達するまで段階的に上昇させるバッファーAでの一連の洗浄により、心筋細胞を分離する。
【０３９４】
孔径85マイクロメートルのナイロンメッシュ(ニューヨーク州ブライアークリフメナー、Tekto社)で分散した心筋細胞をろ過し、40×gで2分間の遠心分離によりペレット化し、100μM CaCl2および0.6%(w/v)脂肪酸フリーウシ血清アルブミン入りのバッファーAで再懸濁させる。次いで、単離したての細胞を、グルコース取り込み、アミノ酸取り込み、細胞生存、およびユートロフィン発現の各試験に用いる。
【０３９５】
単離したての成体心筋細胞によるグルコース取り込み
単離したマウス心筋細胞によるグルコース取り込みに対する、明細書の各箇所で記述する各種製剤および配合剤の効果についての試験は、ラミニンコーティング(BD Biocoat)した12ウェル(ウェル径22mm)組織培養プレート(米国、マサチューセッツ州ベッドフォード、BD Biosciences社)によりトリプリケートで実施する。グルコースフリーDMEM 1mlで、ラミニンプレートに接種した単離済み心筋細胞を2回洗浄する。次いで、各濃度のベータセルリンを配合したインスリン(たとえば、1nM)入りグルコースフリーDMEM 1mlのほか、1mMピルビン酸および0.1%BSAを添加する。細胞をインキュベータに戻し、37℃および5%CO2で静置する。40分後、グルコースフリーDMEM 130μl、100mM 2-デオキシグルコース液15μl、および、ここでは2-[3H]DGと呼ぶ1μCi/μl 2-デオキシ-D-[1,2-[3H](N)]グルコース5μlを含む、2-デオキシグルコース混合培地10μlを添加する。30分後、培地を除去し、冷却したPBS 1mlで細胞を2回洗浄する。37℃で20分間、1M NaOH 500μlにより細胞を溶解する。Micro BCA Protein Assay Kit(米国、イリノイ州ロックフォード、Pierce Chemical社)による溶解液中総タンパク質含有量の測定には、細胞溶解液40μlずつを用いた。2-[3H]DGの特異活性の測定には、細胞溶解液400μlずつをカウントする。こうして、タンパク質ミリグラム当たり1分当たりのピコモル数としてグルコース取り込みを表す。
【０３９６】
単離したての成体心筋細胞によるアミノ酸取り込み
無血清ダルベッコ改変イーグル培地中で、心筋細胞を培養する。細胞回収の2時間前に、1マイクロCi/ml [3H]フェニルアラニンを培地に添加する。氷冷したPBSですばやく細胞をすすぎ、20%トリクロロ酢酸1mlにより、氷上で20分間インキュベートする。液体シンチレーションカウンティングにより、各培養皿中の総放射能を測定する。実施例31に詳細を記した手順によっても、アミノ酸取り込み試験を行った。
【０３９７】
統計学的解析
熟練した2人以上の統計解析担当者が、結果の不偏解析を行った。結果は、各試料集団の平均±SEMとして表し、P<0.05で統計学的に有意と考えた。対応のない群間の比較には、場合に応じて、Studentのt検定またはMann-Whitney検定を用いた。
【０３９８】
実施例４１：ベータセルリンおよび他のErbBリガンドの特性:タンパク質配列、ヌクレオチド配列、およびタンパク質ドメイン
表１「タンパク質およびヌクレオチド配列の同定」で、本発明が対象とするベータセルリンおよび他のErbBリガンドのサブセットについて、付加的特性のいくつかを提示する。第1列に示す内部参照番号(FP I)により、各ポリペプチドを識別する。核酸配列のオープンリーディングフレームに対応するヌクレオチド配列番号(N1)を、第2列に示す。ポリペプチド配列のアミノ酸配列番号(P1)を、第3列に示す。UTRを含む核酸配列全体のヌクレオチド配列番号(N0)を、第4列に示す。第5列は、クローン内部参照番号(クローンID)を示す。第6列は、タンパク質の一部についての注記を収載する。
【表１】
2008545715.tif 000008
2008545715.tif 000009
2008545715.tif 000010
【０３９９】
Pfamシステムとは、保存されたタンパク質ドメインに基づく、タンパク質配列の分類および解析システムである。本発明者らは、ベータセルリンおよび他のErbBリガンドのPfam解析を行い、その構造および活性可能性についてのさらなる情報を収集した。Pfamシステムは、複数の方法による一般アクセスが可能である[一般アクセスの可能なウェブサイトに関する総括およびリンクについては、R.D. Finn他:Nucleic acids Res. 34:D247-D251(2006)を参照]。タンパク質ドメインは、三次構造を有し、酵素活性または結合活性を有することもあるタンパク質の部分である。タンパク質内部の柔軟なポリペプチド領域によって、複数のドメインが結合可能である。Pfamドメインは、タンパク質のN末端またはC末端を含むか、または中間の任意の点に位置するかいずれも可能である。Pfamシステムは、これらドメインに基いてタンパク質ファミリーを同定し、タンパク質をファミリーに分類する注記つきの検索可能なデータベースを提示する。
【０４００】
表２「ベータセルリンおよび他のErbBリガンド配列のPfamタンパク質座標および注記」では、第1列にタンパク質のFP ID(FP ID)を示す。第2列は、ソースIDを示す。第3列には、各ポリペプチドのPfamドメイン(Pfam)名を示す。第4列には、全ポリペプチドのN末端を「1」としてアミノ酸残基を順に数える、各Pfamドメインの座標を収載する。第5列には、公開データベースからの注記を収載する。
【表２】
2008545715.tif 000011
2008545715.tif 000012
【０４０１】
表３「ベータセルリンおよび他のErbBリガンドの膜貫通ドメイン座標」に、明細書の各箇所で述べるタンパク質サブセットの物理的特性の一部を提示する。第1列には、タンパク質のFP IDを記載する。第2列は、クラスターIDを示す。第3列は、ベータセルリンを1型1回膜貫通ドメイン(STM)膜タンパク質として分類する。第4列は、アミノ酸残基数として表される、各ポリペプチドの予測長を示す。第5列は、ポリペプチドが分泌される確率が高い場合を「1」、低い場合を「0」として、ある配列が分泌されるかどうかを予測する内部開発アルゴリズム(Tree Vote)の結果を明らかにする。第6列は、膜貫通領域(TM)の数を記載する。第7列は、膜貫通ドメインのアミノ酸座標を記載する。
【表３】
2008545715.tif 000013
【０４０２】
表４「ベータセルリンおよび他のErbBリガンドのシグナルペプチドおよび非膜貫通ドメイン座標」に、これらタンパク質のその他の物理的特徴の一部を提示する。第1列は、タンパク質のFP IDを収載する。第2列は、非膜貫通領域座標(非TM座標)を収載する。第3列は、始点および終点アミノ酸残基の位置に基づく、各ポリペプチドのシグナルペプチド(または分泌リーダー)の位置(シグナルペプチド座標)を収載する。第4列は、各ポリペプチドのシグナルペプチド(または分泌リーダー)配列切断後における成熟ポリペプチドのアミノ酸残基である、対応の成熟タンパク質座標(成熟タンパク質座標)を収載する。第5列および第6列は、それぞれ代替可能なシグナルペプチドおよび成熟タンパク質座標を収載する。
【表４】
2008545715.tif 000014
【０４０３】
実施例４２：ベータセルリン融合タンパク質は半減期を延長させた
本試験において、ポリエチレングリコール(PEG)によるベータセルリンのコンジュゲートまたは免疫グロブリンFc領域へのベータセルリンの融合により、ベータセルリンの薬物動態学的特性を改善し得ることを示した。
【０４０４】
パートA:ベータセルリンのPEG化
前述の手順(実施例16参照)により、大腸菌(E. coli)で発現させ生成したヒトベータセルリンを、以下の手順でPEG化した。最高収量の活性モノPEG化ベータセルリンを得る条件を同定するため、2種類のPEG試薬、すなわちmPEG-SMB-20KおよびmPEG-ButyrALD-20K(Nektar Therapeutics、アラバマ州ハンツビル)について、複数の試験反応条件を調べた。mPEG-SMB-20Kについては、ベータセルリン濃度(1または2.5mg/mL)、ベータセルリン:PEGのモル比(1:1、1:2、1:5)、バッファー(リン酸カリウムpH7.0、リン酸カリウムpH7.5、またはホウ酸カリウムpH9.0)を変化させて、下記の表に示す手順で18種類の反応を実施した。反応進行をモニタリングするため、30分後、1時間後、4時間後、24時間後に試料を採取した。
【０４０５】
2008545715.tif 000015
【０４０６】
標準的な方法に従い、SDS-PAGE(4〜12%ビストリス)による各時点における各反応試料の分離、およびクーマシーブルーによるタンパク質の染色により、PEG化反応の進行をモニタリングした。PEG添加は、ゲル中のタンパク質泳動の低下として観察された。未反応BTCは、染料フロントのやや上方まで泳動し、モノPEG化BTCは約51kDaの分子量マーカー付近まで泳動し、マルチアームでPEG化したBTCは、約64kDa〜191kDaのマーカー間まで泳動した。反応は速やかに進行し、30分後には有意な生成物が観察された。24時間後には、各種のマルチアームでPEG化したBTCが観察された。
【０４０７】
試薬mPEG-ButyrALD-20Kを用いたベータセルリンのPEG化については、ベータセルリン濃度(1または2.5mg/mL)、ベータセルリン:PEGのモル比(1:1、1:2、1:5)、バッファー(リン酸カリウムpH7.0、リン酸カリウムpH6.0、または酢酸塩pH5.0)を変化させて、18種類の反応を実施した。いずれの場合も、5倍モル過剰(対ベータセルリン)のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いた。反応進行をモニタリングするため、30分後、1時間後、4時間後、24時間後に試料を採取した。
【０４０８】
2008545715.tif 000016
【０４０９】
同様にクーマシーブルーで染色したSDS-PAGE(4〜12%ビストリス)により、反応の進行をモニタリングした。ベータセルリンへのPEG添加は、ゲル中の泳動低下として観察された。反応はより緩徐に進行し、約24時間後に完了に近づいた。予測した通り、本試薬からはほとんどの場合モノPEG化BTCが生成し、約51kDaの分子量マーカー付近まで泳動した。24時間後、過剰グリシンの添加により、すべてのPEG化反応を停止させた。mPEG-SMB-20KおよびmPEG-ButyrALD-20K反応はプールし、S75およびS200カラム(ニュージャージー州ピスケイタウェイ、Amersham Pharmacia Biotech社、GE Healthcare Bio-Sciences社)を用いるサイズ除外クロマトグラフィーにより分画した。PEG化ベータセルリンに対応するピークをプールし、40μM(280nMにおける吸光度に基づく)まで希釈し、活性について調べた。
【０４１０】
製造元の指示書に従うin vitroでのHeLa 229(ATCC番号CCL2.1)細胞に基づく結合アッセイおよびリン酸化EGFR pY1068に基づくELISA法(カリフォルニア州カマリロ、BioSource International社、型番:KHR9081)を用い、実施例35に述べた手順でベータセルリン活性を測定した。以上の反応およびアッセイ条件下で、mPEG-SMB-20K試薬を用いて生成されるPEG化ベータセルリンの活性は、未反応ベータセルリンの活性よりも約3倍低かったのに対し、mPEG-ButyrALD-20K試薬を用いて生成されるPEG化ベータセルリン活性の低下幅は50%未満であった。
【０４１１】
2008545715.tif 000017
【０４１２】
パートB:ベータセルリン-Fc融合タンパク質
マウスベータセルリン(全長タンパク質のアミノ酸残基1〜111を含む)を、ヒト免疫グロブリンIgG1のFc部分に融合した。pIRESpuro3発現ベクター(カリフォルニア州マウンテンビュー、Clonetech Laboratories社、型番6986-1)で、融合構築物をサブクローニングした。標準的なトランスフェクション法を用いてベクターをCHO-S細胞へ安定的にトランスフェクトし、10 L Wave発酵器(ニュージャージー州サマセット、Biotech社、型番BASE2050EH)およびCD-CHO培地(カリフォルニア州カールスバード、Invitrogen社、型番10743-029)を用いてタンパク質を産生した。上述の条件下における8日間の培養後、細胞上清を回収した。製造元の推奨に従い、Protein A Sepharose 4 Fast Flow樹脂(ニュージャージー州ピスケイタウェイ、GE Healthcare社、型番17-5280-02)を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより、融合タンパク質マウスBTC-ヒトFcを精製し、PBSで透析した。上述および実施例35に述べたリン酸化ErbB受容体アッセイにより、精製したマウスBTC-ヒトFc融合タンパク質(ベータセルリン-Fc融合物)の活性も調べた。
【０４１３】
パートC:PEG化およびFc融合ベータセルリンの薬物動態アッセイ
PEG化またはFc融合がベータセルリンの薬物動態学的特性に影響するかどうかを判定するため、未反応ベータセルリン、ベータセルリン-Fc融合物、およびPEG化ベータセルリンを調製し、マウスに投与し、血流からの消失についてモニタリングした。
【０４１４】
本試験で用いたベータセルリンタンパク質のPEG化反応条件は、以下の通りであった:2.5mg/mLベータセルリン、5倍モル過剰のmPEG-ButyrALD-20Kおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウム、リン酸カリウムpH7.0バッファー、および24時間後の過剰グリシンpH7.0による反応停止。2×PBSによる一晩の透析により、反応生成物を注射用に調製した。反応の成功は、前出のパートBおよびCに述べた手順で、クーマシー染色したSDS-PAGEゲルにより確認した。本試験に用いるPEG-BTC、BTC-Fc(パートCに述べた手順で調製)およびBTC(実施例16に述べた手順で調製)タンパク質溶液の濃度は、Bradford法で測定した。各ベータセルリンタンパク質溶液を0.1%BSA(ミズーリ州セントルイス、Sigma社、型番A3059)入りのPBS中で0.125mg/ｍLまで希釈して、注射用の試料を調製した。
【０４１５】
1mg/kg BTCの投与量で、BTC、PEG-BTC、またはBTC-Fc 200マイクロリットルを、8週齢のC57BL/6Jマウスに静脈内注射し、血液試料を2、30、120、1440分後に採取した。各試験ベータセルリン型につき、マウス6例ずつに試験物質を注射した。次いで2分後に、マウス6例中3例の後眼窩洞から採血し、120分後には心穿孔により再度採血した。他のマウス3例については、30分後に後眼窩洞から採血し、1140分後に心穿孔により採血した。血液試料はすべて、Becton Dickinson社製のEDTA入り血漿収集用「Microtainer」チューブ(型番365973、ニュージャージー州フランクリンレークス)に収集し、次いで直接スピンに供し、血漿を得た。
【０４１６】
ELISA法により、BTCおよびPEG-BTC血漿試料中のヒトベータセルリン濃度およびBTC-Fc血漿試料中のマウスベータセルリン濃度を測定した。0.34〜250pMのマウスおよびヒトベータセルリンにより、標準曲線を作成した。血漿試料は、10% FCS/PBS溶液で10、100、および5000倍に希釈して、標準曲線の直線領域内にシグナルが収まるようにした。注射後2、30、120、1180分における各血漿試料について測定したELISA濃度を、以下のように計算した。
【０４１７】
2008545715.tif 000018
【０４１８】
ウェスタンブロット用の試料を調製するため、各時点において、同一群の各マウスから血漿3.25マイクロリットルずつをプールした。トリストリシン非還元ゲル(10〜20%)で一定量ずつの血漿を分離し、タンパク質を標準ウェスタンブロット解析により可視化した。結果を図41に示す。R&D Systems社(ミネソタ州ミネアポリス)製抗体#261によりヒトベータセルリンを検出し、HRPで標識した抗ヒトFc抗体(米国ペンシルベニア州ウェストグローブ、Jackson ImmunoResearch社、型番209-035-088)にECL検出システム(ニュージャージー州ピスケイタウェイ、GE Healthcare社)を併用してBTC-Fcを検出した。PEG-BTCは約45kDaまで泳動し、未反応BTCは約10kDaまで泳動し、BTC-Fcの位置は図41の左側に示す通りである。
【０４１９】
ELISA法およびウェスタンブロット法両者の結果から、未修飾ベータセルリンよりもPEG-BTCおよびBTC-Fcの方が、マウス血漿から有意に遅くクリアランスされるので薬物動態学的半減期が延長されると判定した。
【０４２０】
配列表
本願出願人は、電子フォーマットおよび紙フォーマットで提示する配列表および配列表への付記を併載する。「配列表」は、本明細書および実施例部分で論じた各ベータセルリンFP ID(詳細には、実施例41、配列番号1-89参照)の核酸配列およびアミノ酸配列(配列番号1〜91)のほか、明細書の各箇所で述べる他のErbBリガンドの配列を提示する。
【産業上の利用可能性】
【０４２１】
本発明は、第1のポリペプチドおよび製薬上許容される担体を含む医薬組成物および医薬用配合物を提供し、この第1のポリペプチドは、被験体での疾患の治療のために、筋細胞へのグルコース取り込みおよび/またはアミノ酸取り込みを刺激し、かつインスリンまたはインスリン模倣剤以外であり、この治療は、被験体における血中グルコースレベルの急減、基礎グルコースレベルの調節、ユートロフィン発現の増進、血中HbA1c値の低減、細胞生存の増加ならびに/または神経細胞および/もしくは筋細胞のグルコースレベルの上昇のうちの1つまたは複数と関連する。
【図面の簡単な説明】
【０４２２】
【図１】既知および未知の物質を、該物質への細胞応答の指標である細胞インピーダンスに対する有意な効果についてスクリーニングするために用いる、ハイスループット法の流れ図である。
【図２】試験物質(たとえば、分泌タンパク質のcDNAライブラリーからのcDNAをトランスフェクトした細胞のならし培地に存在する分泌タンパク質、および組み換えタンパク質など)を特徴付けしたホルモン応答に対する効果についてスクリーニングするために用いる、ハイスループット法の流れ図である。
【図３】インスリンシグナル伝達経路に作用する作用物質が、L6細胞における細胞指数を低下させたことを示すグラフである。インスリン、インスリン様成長因子I(IGF-I)、インスリン様成長因子II(IGF-II)、および血小板由来成長因子BB(PDGF-BB)はそれぞれ、120分間にわたる濃度100nMで細胞指数を低下させた。一方、成長分化因子-8(GDF-8)、成長ホルモン(GH)、および塩基性線維芽細胞成長因子(bFGFまたはFGF-2)は、L6細胞における細胞指数に作用しなかった。
【図４】RT-CES(商標)システムで測定したL6細胞におけるインスリン(図4A)、IGF-I(図4B)、およびIGF-II(図4C)のEC50が、測定法として3H-デオキシグルコースの取り込みを用いて得た公知のEC50値と同様であることを示すグラフである。実施例4に述べた細胞指数/インピーダンスアッセイにより定量したインスリンのEC50は約41nM、IGF-Iは約102pM、またIGF-IIは約2.9nMであった。
【図５】RT-CES(商標)システムによる、初代ヒト骨格筋細胞におけるインスリン(図5A)、IGF-I(図5B)、およびIGF-II(図5C)のEC50を示すグラフである。インスリンのEC50は約8.3nMであり、初代骨格筋細胞のインスリン感受性が、L6細胞株よりも約5倍強いことを示す。実施例6で詳しく述べるように、IGF-IのEC50は約270pM、IGF-IIのEC50は約2.7nMであった。
【図６】実施例8で詳しく述べるように、パネルAおよびBは、インピーダンスを上昇させる作用物質の分泌因子による、ヒト骨格筋細胞のハイスループットスクリーニングの結果を示すグラフである。図6Aは、ヒト初代骨格筋細胞のインピーダンスに作用する試験作用物質についてのインピーダンスアッセイの結果を示す。結果は、作用物質で処理してから30分後に測定した、単一時点(30分後)における正規化した細胞指数としてプロットした。列1〜12および行A〜Hは、96ウェルプレートのウェルグリッドを指す。ベータセルリン(矢印)は、ウェルG3に収容し、細胞指数の上昇をもたらす。ウェルH4には、内部陽性対照であるインスリン様成長因子I(IGF-I)を収容する。ウェルD6には、インターロイキン4(IL-4)を収容する。ウェルH3には、線維芽細胞成長因子1(FGF-1)を収容する。ウェルD10には、セマフォリン3Fを収容する。ウェルH10には、PDGF-Cを収容する。ウェルD8には、エンドセリン3を収容する。ウェル12A〜Dには、外部陽性対照である10nM IGF-Iを収容する。ウェル1E〜Hおよび2A〜Dについては、データを示さない。実施例8で詳しく述べるように、図6Bは、細胞によるインスリンへのインピーダンス応答を変化させる作用物質の分泌因子による、ヒト骨格筋細胞のスクリーニング結果を示す。データは、96ウェルプレート配置により、インスリン添加の30分後における単一時点でプロットした。ベータセルリン(ウェルG3)、線維芽細胞成長因子-18(FGF18)およびFGF1を、インスリンへのインピーダンス応答を上昇させる作用物質として同定した。ウェルH4には内部陽性対照であるIGF-Iを収容し、ウェル12A〜Dには外部陽性対照である10nM IGF-Iを収容する。
【図７】実施例9で詳しく述べるように、ベータセルリン(100nM)またはインスリン(1μM)に曝露した初代ヒト骨格筋細胞における、時系列的な細胞指数変化を示すグラフである。細胞指数に対する効果を正規化し、インスリンまたはベータセルリンのいずれも不在下で24時間インキュベートした細胞の値(対照)と比較した。
【図８】実施例10で詳しく述べるように、精製したベータセルリン(100nM)またはインスリン(1μM)のいずれかでプレインキュベートした後、インスリンで処置した初代ヒト骨格筋細胞における細胞指数変化を示すグラフである。細胞指数に対する効果を正規化し、インスリンまたはベータセルリンのいずれも不在下で24時間インキュベートした後、インスリンで処置した細胞の値(対照)と比較した。
【図９】実施例11で詳しく述べるように、ErbBリガンドポリペプチドが誘発する細胞インピーダンス変化を示すグラフである。1μMインスリンおよび各100pMの上皮成長因子(EGF)、ベータセルリン(BTC)、エピゲン、トランスフォーミング成長因子-アルファ(TGF-α)、アンフィレグリン(AR)、エピレグリン(EPR)、ヘパリン結合EGF(HB-EGF)、ニューレグリン1-アルファ(NRG1-a)、およびニューレグリン1-ベータ(NRG1-b)を調べた。これら試験物質中で、EGFおよびベータセルリンが、インスリンとほぼ同様の最も大きな細胞指数上昇を生じ、しかもインスリン(1μM)より数桁低い用量(100pM)であった。
【図１０】実施例12で詳しく述べるように、初代ヒト骨格筋細胞において、ベータセルリンがグルコース取り込みを刺激したことを示すグラフである。インスリンおよびベータセルリンのいずれも、用量依存的にグルコース取り込みを上昇させた。インスリンよりも低濃度でグルコース取り込みを上昇させたので、ベータセルリンの方が強力であった。インスリンのEC50が約27nMと測定されたのに対し、ベータセルリンのEC50は約43pMと測定された。
【図１１】実施例13で詳しく述べる、3H-デオキシグルコース取り込み法で測定するグルコース取り込みへの効果が示すように、初代ヒト骨格筋細胞へのインスリン作用に対するベータセルリンの強化効果を示すグラフである。100nMベータセルリン、10pMベータセルリン、100pMインスリン、または100pMインスリンおよび10pMベータセルリン配合剤により、細胞を処置した。配合剤は、100pMインスリンまたは10pMベータセルリンのいずれか単剤よりも大幅にグルコース取り込みを誘発した。
【図１２】実施例14で詳しく述べるように、ベータセルリンが、初代ヒト骨格筋細胞によるインスリン刺激性のグルコース取り込みを用量依存的に増大させたことを示すグラフである。10pM(上)または1pM(下)いずれの濃度のベータセルリンも、グルコース取り込みを増大させた。
【図１３】実施例15で詳しく述べるように、図13Aおよび13Bは、ErbBリガンドポリペプチドがグルコース取り込みを刺激したことを示すグラフである。図13Aが、BTC、EGF、HB-EGF、TGF-アルファが刺激した相対値によるグルコース取り込みを示し、図13Bは、AR、EPR、エピゲン、NRG1-アルファ(NRG1-a)、およびNRG1-ベータ(NRG1-b)が刺激した相対値によるグルコース取り込みを示す。
【図１４】実施例17で詳しく述べるように、ワイルドタイプ正常C57BL/6Jマウスの尾静脈へ、体重kgあたり0.5mgのベータセルリンを静脈内注射した後における、マウス血漿からのベータセルリンのクリアランス率を示すグラフである。上記の条件下において、ベータセルリンのin vivo半減期は約32分間である。
【図１５】実施例18で詳しく述べるように、図15Aおよび15Bは、ワイルドタイプ正常C57BL/6Jマウスへ、0.05mg/kgのベータセルリンを皮下注射した後(図15A)および静脈内注射した後(図15B)における、ベータセルリンの血漿クリアランス率を対比して示すグラフである。皮下注射後には、静脈内投与後に比べ、ベータセルリンのバイオアベイラビリティ持続時間の延長が認められた。
【図１６】実施例19で詳しく述べるように、C57BL/6Jマウスへの、体重比それぞれ0.8mg/kgおよび0.05mg/kgの皮下投与後における、ベータセルリンの血漿値およびクリアランス率を示すグラフである。結果は、0.8mg/kg投与時の血漿ベータセルリン値は投与後約120分で最高値約120nMに達し、0.05mg/kg投与時のベータセルリン値は投与後約30分で最高値約0.6nMに達した。
【図１７】実施例20で詳しく述べるように、図17Aおよび17Bは、絶食条件下の正常ワイルドタイプC57BL/6Jマウスにおける、血中グルコースレベル(図17A)および血漿ベータセルリン値(図17B)に対する、ベータセルリンの皮下投与効果を示すグラフである。ベータセルリンは、急速な動態変化により、投与量依存的に血中グルコースレベルを低下させた。
【図１８】実施例21で詳しく述べるように、図18A(ワイルドタイプ正常マウス)および18B(糖尿病の動物モデルであるdbマウス)は、ベータセルリンの摂食後における血漿グルコースレベルに対する効果を示すグラフである。db(糖尿病)マウスのみがベータセルリン処置において摂食後グルコースレベルの有意な低下を示したので、結果は、該条件下においてdbマウスの方が正常マウスよりもベータセルリンに対してより感受性であることを示す。
【図１９】ベータセルリンcDNAの動水力学的な経尾静脈トランスフェクションにより、マウスにおける組み換えヒトベータセルリンの長期的な発現に用いたベクターの構造を示す図である。ベクターは以下の部分を含む:apoEエンハンサーを含むアルファ1アンチトリプシンプロモーターに対応するアルファアンチトリプシンPro、ヒト因子IX遺伝子のイントロン1に対応するヒトFIX、ヒトベータセルリンのcDNAを表すBT、ウシpolyAテールを表すpoly。
【図２０】実施例22で詳しく述べるように、パネルA、B、C、およびDは、dbマウスにおける絶食時グルコースレベル(図20B)、HbA1c値(図20C)、および血漿インスリン値(図20D)に対する、長期的なベータセルリン発現の効果(すなわち、循環における血漿ベータセルリン値上昇の延長(図20A))を示すグラフである。循環中のベータセルリン値は、cDNAの注射後18日間にわたり正常よりも有意に高値であり、試験期間中における絶食時グルコースレベルの上昇を予防する結果となった。この「慢性的な」ベータセルリン上昇は、HbA1c値およびインスリン値の低下をもともなった。
【図２１】実施例23で詳しく述べるように、糖尿病(db)マウスにおける血中グルコースレベルに対するErbBリガンド(ベータセルリン、EGF、HB-EGF、NRG-1)皮下投与の相対値による効果を示すグラフである。2種類の対照は、生理食塩水および希酢酸(生理食塩水で溶解したベータセルリンを除き、ErbBリガンドの溶解に用いた)であった。上記の条件下において、ベータセルリンが血中グルコースレベルの低減に最も強力な効果を示し、しかも最も急速な動態変化をともなった。
【図２２】実施例24で詳しく述べるように、ベータセルリンの投与量および投与時の変化が、摂食後グルコースレベルの低減能に対して及ぼす効果を示すグラフである。結果は、摂食後グルコースレベルに対するベータセルリンの効果が、ベータセルリンの総累積投与量よりも、投与時(グルコース/糖類の摂取時と関連)に依存することを示す。
【図２３】実施例25で詳しく述べるように、図23Aおよび23Bは、静脈内(図23A)および皮下(図23B)投与後のラットにおけるベータセルリンの薬物動態プロファイルを示すグラフである。結果は、投与経路に応じて、ベータセルリンが、約60分間の半減期で血中から急速にクリアランスされることを示す。
【図２４】実施例26で詳しく述べるように、図24Aおよび24Bは、ベータセルリンのGLP1との併用(すなわち、インスリン分泌促進薬との併用療法を模倣)による加算的効果を示すグラフである。結果は、GLP1およびインスリンが、摂食後グルコースレベルの低減に加算的な効果を有することを示す。
【図２５】実施例27で詳しく説明するように、パネルA、BおよびCは、ベータセルリンのメトフォルミンとの併用(すなわち、肝臓による糖新生を阻害し、末梢組織によるグルコースの取り込みおよび利用を促進する、血糖降下剤との併用療法を模倣)による加算的効果を示すグラフである。結果は、メトフォルミンまたはベータセルリン単剤よりも配合剤の方が、摂食後グルコースレベルの低減に有効であることを示す。
【図２６】実施例28で詳しく説明するように、ベータセルリンおよびインスリンの配合剤が摂食後の血中グルコースレベルに及ぼす治療効果を模倣する、両剤併用の加算的効果を示すグラフである。結果は、ベータセルリンが、インスリン受容体に直接作用する薬剤(すなわち、インスリン)の効果を促進し、摂食後血中グルコースレベルの低減に加算的に作用することを示す。
【図２７】実施例29で詳しく説明するように、図27Aおよび27Bは、ベータセルリンの長時間作用性インスリンアナログ(すなわち、グラルギン)との併用による加算的効果を示すグラフである。結果は、該配合剤が、より有効な摂食後制御をもたらし、いずれか単剤の場合よりも、急速に作用すると同時に基礎グルコースレベルの低値維持にも良好に作用することを示す。
【図２８】実施例30で詳しく述べるように、インスリンまたはベータセルリン投与に応答する、単離したラット足底筋によるin situにおけるグルコース取り込みの比較を示すグラフである。結果は、12nMインスリンと比べ5nMベータセルリンが、in situでのグルコース取り込みを改善することを示す。
【図２９】実施例31で詳しく述べるように、インスリンおよびベータセルリンで処置した、初代ヒト骨格筋細胞によるアミノ酸取り込みの比較を示すグラフである。結果は、10-11M〜10-8Mの処置濃度において、インスリンと比べベータセルリンが、14Cで標識したアラニンアナログの取り込みを改善したことを示す。
【図３０】初代ヒト骨格筋細胞によるin vitroにおけるユートロフィン発現のアップレギュレート能に対する、複数のErbBリガンドファミリーメンバー(10nM)による効果を示すグラフである。実施例32で詳しく述べるように、当該グラフは、ベータセルリン(BTC)、EGF、およびNRG-1アルファ(NRG1-a)のすべてが、無血清培地中で維持した対照細胞と比べ、初代ヒト骨格筋細胞におけるユートロフィン発現をアップレギュレートしたことを示す。
【図３１】実施例33で詳しく述べるように、初代ヒト骨格筋細胞によるin vitroにおけるユートロフィン発現に対する、各種ErbBリガンドファミリーメンバー(100pM)による効果を示すグラフである。結果は、該濃度において、BTCおよびTGF-アルファが、最高度のユートロフィン発現を誘発したことを示す。HB-EGF、EGF、およびエピレグリン(EPR)も、対照で処置した細胞と比べ、高度のユートロフィン発現を誘発した。
【図３２】初代ラット脂肪細胞によるin vitroでの脂肪新生に対する、ベータセルリンおよびインスリンの効果を示すグラフである。実施例34で詳しく述べるように、ベータセルリンは、単離した脂肪細胞における脂肪新生を刺激しない。
【図３３】ErbB/EGF受容体リン酸化に対する、ベータセルリン効果を示すグラフである。実施例35で詳しく述べるように、ベータセルリンの生物学的活性(OD450)は、用量依存的にEGF受容体活性化と関連する。
【図３４】実施例36で詳しく述べるように、ヒト骨格筋細胞で観察したのと同様に、ベータセルリンが心筋細胞へのグルコース取り込みを刺激することを示すグラフである。
【図３５Ａ】実施例37で詳しく述べるように、図35Aは、各用量の各種組み換えタンパク質で処置したラット新生仔心筋細胞に対する、リン酸化Akt(pAkt)アッセイ(図35A.1および図35A.3左側パネル)およびリン酸化ERK(pERK)アッセイ(図35A.2および図35A.3右側パネル)の結果を示すグラフである。各種組み換えヒトタンパク質で15分間、ラット新生仔心筋細胞を処置した後、luminexによるpAkt、pERK、およびpSTAT3の検出を行った。図示した用量は以下の通りである:各図の左側から1本目のバーが100ng/ml、2本目のバーが33ng/ml、3本目のバーが11ng/ml、4本目のバーが0ng/ml(すなわち、組み換えタンパク質を添加しない対照処置)である。バーの高さ(y軸)は、蛍光シグナルの測定値を示す。BTCおよびNRG1-ベータ1のいずれもがpAkt値を大幅に上昇させた(図35A.1および図35A.3左側パネル)のに対し、HB-EGF およびNRG1-アルファはpAkt値をさほど上昇させなかった。エピレグリン、BTC、およびNRG1-ベータ1がpERK値を上昇させ(図35A.2および図35A.3右側パネル)、TGF-アルファ、HB-EGF、NRG1-アルファ、およびEGFもpERK値を上昇させたが、さほどではなかった。本実験の試験タンパク質は、pSTATの活性化には効果を示さなかった。図35A.3は、BTCおよびNRG1-ベータ1の用量を増加させながら新生仔心筋細胞を処置した後における、これらタンパク質によるpAkt(図35A.3左側パネル)およびpERK(図35A.3右側パネル)値(発現量として表した)に対する用量依存的な効果を示すグラフである。
【図３５Ｂ】実施例37で詳しく述べるように、図35Bは、栄養飢餓(図35B.1)、虚血(図35B.2)、または心毒性薬剤(図35B.3)に曝露した新生仔心筋細胞の生存に対する各種組み換えタンパク質の効果を示すグラフである。ベータセルリンは、栄養剥奪(栄養飢餓)または酸素剥奪(虚血)のいずれかに曝露した細胞の生存または生存率を延長または増大させた。実施例37で詳しく述べるように、図35B.3は、ベータセルリン存在下で、心毒性薬剤ドキソルビシンに曝露した心筋細胞に対する、細胞生存率アッセイの結果を示すグラフである。結果は、ベータセルリンが、ドキソルビシン存在下における心筋細胞の生存を、用量依存的に延長したことを示す。
【図３６】実施例38で詳しく説明するように、ベータセルリンスプライス変異体(BTC SV)を刺激作用物質として用いる、ヒト初代骨格筋細胞に対するインピーダンスアッセイの結果を示すグラフである。結果は、成熟ベータセルリンと異なり、C末端ドメイン部分を欠くベータセルリンスプライス変異体は、インピーダンスアッセイで測定する細胞指数の増減を刺激できないことを示す。
【図３７】実施例39で詳しく説明するように、ヒト初代骨格筋細胞によるグルコース取り込みに対するBTC SVの効果を示すグラフである。結果は、C末端ドメインを欠くベータセルリンスプライス変異体は、該条件下におけるグルコース取り込みを刺激できないことを示す。
【図３８】実施例22で詳しく説明するように、図38Aおよび38Bは、dbマウスにおける毎日のベータセルリン注射の効果に関する中間解析の結果を示すグラフである。結果は、HbA1cおよび絶食時血中グルコースにより測定する、長期的な血糖制御に対する投与量依存的で良好な効果を確認する。
【図３９】ベータセルリンCLN00902377_expressed_Met(Met残基を上流に有し、残基32〜111に対応する、成熟ヒトベータセルリン)、ベータセルリンNP_001720_NM_001729、米国特許第5,886,141号からの配列番号3、14、17、および18、ならびに米国特許第6,232,288号からの配列番号1および2のアミノ酸アラインメントを示す図である。アラインメントは、フリーウェアCLUSTAL FORMAT for T-COFFEE Version_1.37、CPU=0.00 sec、SCORE=75、Nseq=8、Len=178により実施した。
【図４０】ベータセルリン22218788_33871113、ベータセルリンNP_001720_NM_001729、およびベータセルリン15079597_15079596のアミノ酸アラインメントを示す図である。アラインメントは、CLUSTAL FORMAT for T-COFFEE Version_1.37、CPU=0.00 sec、SCORE=76、Nseq=3、Len=178により実施した。
【図４１】ベータセルリン-Fc融合タンパク質(BTC-Fc)、PEG化ベータセルリン(PEG-BTC)、および未修飾のベータセルリン(BTC)の注射2分後、30分後、2時間後、および18時間後における、血漿中ベータセルリンのウェスタンブロット法による解析結果を示す図である。未修飾のベータセルリンよりもPEG-BTCおよびBTC-Fcの方が、有意に遅くマウス血漿中よりクリアランスされた。
【図１】
2008545715.tif 000019
【図２】
2008545715.tif 000020
【図３】
2008545715.tif 000021
【図４】
2008545715.tif 000022
【図５】
2008545715.tif 000023
【図６】
2008545715.tif 000024
【図７】
2008545715.tif 000025
【図８】
2008545715.tif 000026
【図９】
2008545715.tif 000027
【図１０】
2008545715.tif 000028
【図１１】
2008545715.tif 000029
【図１２】
2008545715.tif 000030
【図１３】
2008545715.tif 000031
【図１４】
2008545715.tif 000032
【図１５】
2008545715.tif 000033
【図１６】
2008545715.tif 000034
【図１７】
2008545715.tif 000035
【図１８】
2008545715.tif 000036
【図１９】
2008545715.tif 000037
【図２０】
2008545715.tif 000038
【図２１】
2008545715.tif 000039
【図２２】
2008545715.tif 000040
【図２３】
2008545715.tif 000041
【図２４】
2008545715.tif 000042
【図２５】
2008545715.tif 000043
【図２６】
2008545715.tif 000044
【図２７】
2008545715.tif 000045
【図２８】
2008545715.tif 000046
【図２９】
2008545715.tif 000047
【図３０】
2008545715.tif 000048
【図３１】
2008545715.tif 000049
【図３２】
2008545715.tif 000050
【図３３】
2008545715.tif 000051
【図３４】
2008545715.tif 000052
【図３５Ａ】
2008545715.tif 000053
【図３５Ｂ】
2008545715.tif 000054
【図３６】
2008545715.tif 000055
【図３７】
2008545715.tif 000056
【図３８】
2008545715.tif 000057
【図３９】
2008545715.tif 000058
【図４０】
2008545715.tif 000059
【図４１】
2008545715.tif 000060
【配列表】
2008545715000001.app
【国際調査報告】
2008545715.tif 000061
2008545715.tif 000062
2008545715.tif 000063
2008545715.tif 000064
2008545715.tif 000065
2008545715.tif 000066
2008545715.tif 000067