(57)【要約】  蛍光の励起および検出のためのシステムおよび方法であって、別個の光学経路を有しているシステムおよび方法が開示される。蛍光を検出するためのシステムが、励起光（４８）を照明チューブ（４４）へと発する光源（４０）、蛍光を収集するため、照明チューブの開口（４７）の周囲に配置された複数の収集光学系（３９）、および蛍光の量を割り出すための検出器（５３）を有している。蛍光を検出するための方法が、励起光（４８）を光源（４０）から照明チューブ（４４）へと発すること、励起光を励起フィルタ（６２）へと導くこと、サンプルを励起光（４８）で照明して、放射光を生成させること、および照明チューブ（４４）の周囲に位置する複数の収集光学系（３９）を使用して、放射光の光学的特徴を検出することを含んでいる。【選択図】図１
2008544254.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光を検出するためのシステムであって、
励起光を照明チューブへと発する光源と、
蛍光を収集するため、照明チューブの開口の周囲に配置された複数の収集光学系と、
蛍光の量を割り出すための検出器と、
を備えるシステム。
【請求項２】
前記照明チューブ内に励起フィルタをさらに備える請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記複数の収集光学系が、前記照明チューブの周囲で円錐形の形状を形成している請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記複数の収集光学系が、前記照明チューブの外側に配置されている請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記複数の収集光学系が、光ファイバーである請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記複数の収集光学系が、光パイプである請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記複数の収集光学系が、流体で満たされたファイバーである請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記光源が、発光ダイオードである請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記光源が、レーザ・ダイオードである請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記光源が、白熱光源である請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記検出器が、フォトダイオードである請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
前記検出器が、アバランシェ・フォトダイオードである請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記検出器が、光電子増倍管である請求項１に記載のシステム。
【請求項１４】
前記検出器が、電荷結合素子である請求項１に記載のシステム。
【請求項１５】
複数のサンプルからの蛍光を検出するための検出システムであって、
発光ダイオードからの励起光を受け取るための照明チューブと、
蛍光を収集するため、照明チューブの開口の周囲に配置された複数の収集光学系と、
蛍光の量を検出するためのフォトダイオードと、
を備えるシステム。
【請求項１６】
前記複数の収集光学系が、前記照明チューブの周囲で円錐形の形状を形成している請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
前記複数の収集光学系が、前記照明チューブの外側に配置されている請求項１５に記載のシステム。
【請求項１８】
前記複数の収集光学系が、光ファイバーである請求項１５に記載のシステム。
【請求項１９】
前記複数の収集光学系が、光パイプである請求項１５に記載のシステム。
【請求項２０】
前記複数の収集光学系が、流体で満たされたファイバーである請求項１５に記載のシステム。
【請求項２１】
蛍光を検出するためのシステムであって、
蛍光を収集するためのチューブと、
チューブの開口の周囲に配置された複数の光学系へと励起光を放射する光源と、
蛍光の量を検出するためのフォトダイオードと、
を備えるシステム。
【請求項２２】
蛍光を検出するための方法であって、
励起光を光源から照明チューブへと発することと、
励起光を励起フィルタへと導くことと、
サンプルを励起光で照明して、放射光を生成させることと、
照明チューブの周囲に位置する複数の収集光学系を使用して、放射光の光学的特徴を検出することと、
を含む方法。
【請求項２３】
前記複数の収集光学系が、前記照明チューブの周囲で円錐形の形状を形成している請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記複数の収集光学系が、前記照明チューブの外側に位置している請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００５年６月１３日付の米国特許仮出願第６０／６８９，９０３号の利益を主張し、この米国特許仮出願の全体が、そこでの教示に関して、ここでの言及によって本明細書に取り入れられたものとする。
【０００２】
分野
本明細書に開示される実施形態は、蛍光の励起および検出に関し、さらに詳しくは、別個の光学経路を有している蛍光の励起および検出のためのシステムおよび方法に関する。
【０００３】
背景
ＤＮＡサンプルの熱サイクルのための技法が、この技術分野において知られている。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行することによって、ＤＮＡの増幅を行うことができる。特別に構成された液体生物学的反応混合物について特定の継続時間および温度範囲のサイクルを加えることが、液体反応混合物中でＤＮＡを成功裏に増幅させるために望まれる。熱サイクルは、ＤＮＡを分解し、得られた１本鎖へと短いプライマーをアニーリングし、それらプライマーを延ばして２本鎖ＤＮＡの新たな複製を製作するプロセスである。液体反応混合物に対して、この高温での分解ならびに低温でのアニーリングおよび引き伸ばしというプロセスが繰り返し行われる。
【０００４】
典型的な熱サイクル装置においては、ＤＮＡを含んでいる生物学的反応混合物が、熱ブロック・アセンブリ上の多数のサンプル穴に用意される。定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、ＤＮＡを検出するために蛍光プローブを使用する。ｑＰＣＲ用として設計される器具は、小さな体積のサンプル（例えば、約２５μｌ）において約１ｎＭのこれらのプローブを検出できなければならない。検出方法が、ｑＰＣＲに必要とされる熱サイクルに適合していなければならない。また、検出方法が、同じサンプル内の複数の蛍光プローブを識別できなくてはならない。
【０００５】
ｑＰＣＲの器具または方法の蛍光検出の感度を向上させることができれば、より速やかに、すなわちより少ない熱サイクルでＤＮＡの検出が可能になることで、そのような器具または方法の有用性が向上する。
【０００６】
従来技術のシステムは、励起および検出のために、同じ光の経路を使用している。そのようなシステムにおいては、励起光が、典型的には励起光の約半分をサンプルへと伝達するビーム・スプリッタへと導かれる。サンプルからの放射光の一部が、ビーム・スプリッタへと戻り、その光の一部（典型的には、約半分）が、検出器へと導かれる。ビーム・スプリッタを使用することで、光のうちのわずかに約２分の１が反射および伝達され、すなわち信号のうちのわずかに約４分の１が測定されるだけである。
【０００７】
Ｂｒｕｎｏらの米国特許第５，７５７，０１４号が、化学物質の分析的測定のための光検出装置を開示している。Ｂｒｕｎｏらの装置は、同じ光学的光経路を共有する励起光ガイドおよび放射光ガイドを備えている。Ｏｌｄｈａｍらの米国特許第６，５６３，５８１号は、サンプル・トレイ内の複数のサンプルから発せられる蛍光を検出するためのシステムを開示している。Ｏｌｄｈａｍらの装置は、複数のレンズ、アクチュエータ、光源、光検出機構、および光学検出システムを備えている。Ｗｏｕｄｅｎｂｅｒｇらの米国特許第６，０１５，６７４号は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの核酸増幅プロセスからのポリヌクレオチド生成物をリアルタイムで測定するためのシステムを開示している。Ｗｏｕｄｅｎｂｅｒｇらの装置は、サンプル・ホルダ、光学インターフェイス、レンズ、ならびに励起ビームをサンプルへと届け、サンプルによって発せられる光を受け取るための光ファイバー・ケーブルを備えている。
【０００８】
他の従来技術の方法は、サンプルへと励起光を届け、サンプルからの蛍光を収集するために、光ファイバーを使用している。これらの方法は、それぞれのサンプルのために別個独立の光ファイバーを使用し、あるいは同じ光ファイバーをすべてのサンプルについて走査している。いくつかの方法は、サンプルの集合の全体を同時に照明し、大面積の検出器によって蛍光を検出している。
【０００９】
概要
蛍光の励起および検出のためのシステムおよび方法であって、別個の光学経路を有しているシステムおよび方法が開示される。本明細書に示される態様によれば、蛍光を検出するためのシステムであって、励起光を照明チューブへと発する光源、蛍光を収集するため、照明チューブの開口の周囲に配置された複数の収集光学系、および蛍光の量を割り出すための検出器を有するシステムが提供される。
【００１０】
本明細書に示される態様によれば、複数のサンプルからの蛍光を検出するための検出システムであって、発光ダイオードからの励起光を受け取るための照明チューブ、蛍光を収集するため、照明チューブの開口の周囲に配置された複数の収集光学系、および蛍光の量を検出するためのフォトダイオードを有するシステムが提供される。
【００１１】
本明細書に示される態様によれば、蛍光を検出するためのシステムであって、蛍光を収集するためのチューブ、チューブの開口の周囲に配置された複数の光学系へと励起光を放射する光源、および蛍光の量を検出するためのフォトダイオードを有するシステムが提供される。
【００１２】
本明細書に示される態様によれば、蛍光を検出するための方法であって、励起光を光源から照明チューブへと発すること、励起光を励起フィルタへと導くこと、サンプルを励起光で照明して、放射光を生成させること、および照明チューブの周囲に位置する複数の収集光学系を使用して、放射光の光学的特徴を検出することを含んでいる方法が提供される。
【００１３】
現時点において開示される実施形態を、添付の図面を参照しつつさらに説明する。添付の図面において、同様の構造は、複数の図面において同様の参照番号によって指し示されている。図面は、必ずしも比例尺ではなく、むしろ通常は、現時点において開示される実施形態の原理を説明することに重点が置かれている。
【００１４】
上記の図面は、現時点において開示される実施形態を説明しているが、検討において記されるように、他の実施形態も考えることが可能である。この開示は、例示の実施形態を代表的に提示するものであり、本発明を限定するものではない。現時点において開示される実施形態の原理の技術的範囲および技術的思想に包含される他の多数の変更および実施形態を、当業者であれば考え出すことが可能である。
【００１５】
詳細な説明
別個の光学経路を有している蛍光の励起および検出のためのシステムおよび方法が開示される。別個の光学経路を有する蛍光の励起および検出のためのシステムが、図１に広く参照番号３０で示されている。このシステムは、照明（励起）のための１つの光学光経路と、蛍光の検出のための別の光学光経路とを有している。励起光のための光学経路は、収集光学系を持たない自由空間光学系である。放射される蛍光の検出のための光学経路は、光を検出器へと案内する収集光学系を含んでいる。検出のための光学経路が、励起のための光学経路の外側かつ周囲にある。
【００１６】
光源が、中央の照明チューブを通じてサンプルを励起光で照らす。中央の照明チューブを通しての照明によって、小型な設計およびサンプルへの光の集中が可能になり、散乱光の量を最小限にできる。これにより、サンプルが蛍光を放射し、これが照明チューブの周囲に位置する複数の収集光学系によって検出される。放射光を照明チューブの周囲の位置で集めることで、ビーム・スプリッタが不要になり、設計の複雑さが軽減され、ビーム・スプリッタに起因する損失がなくなり、設計のサイズが小さくなる。システムが小型であり、検出される光が、質（散乱光の量が少ない）および量（ビーム・スプリッタに起因する損失がない）ともに優れている。
【００１７】
システムがｑＰＣＲへと適用される場合、使用されるＰＣＲ増幅の仕組みは重要ではないが、一般に、ｑＰＣＲは、エクソヌクレアーゼ活性を有する拡散ポリメラーゼまたは監視対象のＰＣＲの経過において増加する２本鎖ＤＮＡの集団の使用を必要とする。ｑＰＣＲにおいて使用される熱サイクル器は、典型的には、ＰＣＲのサイクルを構成する温度依存の各段階（テンプレートの変性、プライマーのアニーリング、およびプライマーの伸張）においてサンプルの温度を制御および維持するプログラム可能な加熱ブロックである。これらの温度が、ＤＮＡターゲットの増幅を達成するために、最大で４０回以上も繰り返される。熱サイクル器は、温度の変化を達成するために、これらに限られるわけではないが、ペルチェ加熱および冷却、抵抗加熱、ならびに空気または水による受動的な加熱など、種々の技法を使用している。
【００１８】
本明細書において使用されるとき、「光学モジュール」は、これらに限られるわけではないが、モジュール式の光学系、非モジュール式の光学系、および任意の他の適切な光学系など、この技術分野において公知の熱サイクルのための光学系を指す。光学モジュールを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を達成するためのＤＮＡの熱サイクルの後、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を達成するためのＤＮＡの熱サイクルの最中、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を達成するための逆転写反応の後のＤＮＡの熱サイクルの後、または逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）を達成するための逆転写反応の後のＤＮＡの熱サイクルの最中に、生物学的材料の複数のサンプルを走査するため、あるいは他の核酸増幅形式の実験の最中の蛍光の検出のために、使用することが可能である。光学モジュールが、照明光および蛍光の検出を制御する。
【００１９】
図１は、複数のサンプル・チューブ９０のうちの１つの上方の照明チューブの周囲に位置した収集光学系を有する実例としての光学モジュール３０を示している。光学モジュール３０は、複数のサンプル・チューブ９０の複数のサンプル９４からの蛍光を検出するために使用される。光学モジュール３０は、少なくとも１つの光学系ハウジング３５、複数の収集光学系３９、検出器ハウジング５０、および検出器５３を含んでいる。複数の収集光学系３９は、光学系ハウジング３５の内部を下方に延びており、照明チューブ４４の周囲に位置している（図３に示されている）。光学モジュール３０は、中央の照明チューブ４４を通って励起光を導いて内側から照明を行い、照明チューブ４４の周囲の外側から蛍光を収集する。複数の収集光学系３９は、検出器ハウジング５０へと延びている。複数のリード５４が検出器ハウジング５０から延び、検出器５３を電子機器へと接続している。電子機器は、光源への電力の供給ならびに検出器ハウジング５０の検出器５３からの信号の検出の両者を行う。電子機器を、光学モジュール３０に対して遠方に取り付けることができる。電子機器は、コンピュータ制御であってよい。光学モジュール３０は、単一の部品であっても、複数の部品の集合で構成されてもよい。
【００２０】
図２は、収集光学系を照明チューブの周囲に位置させて有している光学モジュール３０の正面図である。光学モジュール３０は、小型であり、光学モジュール３０が測定するサンプル９４を保持するサンプル・ホルダ９０に見合うサイズである。光学モジュール３０のサイズが小さいため、装置の全体としてのサイズおよびコストを低く保つ少数かつ小さな光学系を使用することができる。すべてのサンプルについて同じ光学モジュール３０を使用することで、複数のサンプルについて同時に照明および検出を行う光学系など、別個のサンプルについて別個の光学系を使用する場合に比べ、個々のサンプルごとの測定のばらつきが小さくなる。
【００２１】
図３は、収集光学系を照明チューブの周囲に配置して有する光学モジュール３０について、図２の線Ａ‐Ａに沿って得た断面斜視図である。光学モジュール３０が、照明チューブ４４を中心として同心のアレイに配置された複数の収集光学系３９を通じて、サンプルからの蛍光を収集する。複数の収集光学系３９は、光ファイバーの束または照明チューブ４４を囲む複数の光ファイバーの束であってよい。あるいは、複数の収集光学系３９は、融着光ファイバー、光パイプ、または照明チューブ４４を囲む別個独立の光ファイバーであってよい。あるいは、複数の収集光学系３９は、これらに限られるわけではないが、流体で満たされたファイバーまたは成型プラスチックなど、任意の種類の１つ以上の光ガイドであってよい。当業者であれば、この技術分野において知られている他の種類の固体の光学系が、ここに開示される実施形態の技術的範囲および技術的思想の範囲に包含されることを、理解できるであろう。
【００２２】
別個独立の光ファイバーを、それら別個独立の光ファイバーを照明チューブ４４の周囲に、それぞれの光ファイバーの一端が照明チューブ４４の開口４７と同一面になるように集めることによって、照明チューブ４４の周囲の収集光学系３９の同心リングとして、光を集めるために使用することができる。個々の光ファイバーの他端を、収集端から集めた光の出力を検出モジュール５０へと導く口金５２へと束ねることができる。照明チューブの周囲の同心リングからの光を集めるために、他の方法も使用可能であるが、個々の光ファイバーからなる特殊なリングの配置構成を製作することは、困難かつ高価につくと考えられ、ファイバーが破損する可能性もある。
【００２３】
別個独立の光ファイバーではなく、光ファイバーの束を使用することで、製造および取り扱いの懸念の一部を軽減することができる。リングを個々の光ファイバーから形成する代わりに、個々の光ファイバーを、照明チューブ４４の開口４７の周囲に並べられる円柱形のファイバー束へと集めることができる。光ファイバーを束ねることで、強度および安定性をもたらし、取り扱い時の損傷を最小限にすることができる。
【００２４】
融着光ファイバーからなる集合体も、別個独立の光ファイバーからなる集合体に比べ、照明チューブの周囲の収集光学系を使用する器具を製造するとき、信頼性が高く取り扱いが容易であると考えられる。融着光ファイバーは、個々の光ファイバーまたは光チューブを剛かつ丈夫なモノリシックな部品を形成すべく一体に接合して構成されている。ファイバーまたはチューブが全長にわたって一体に接合されているため、融着光ファイバーの取り扱いの際に、個々のファイバーが外れて破損する可能性がない。さらに、融着光ファイバーの光出力は、融着ファイバーを別個独立のファイバーよりも密に集めることができ、したがって収集光学系３９において実際に光を集める領域の割合を高めることができるため、別個独立の光ファイバーまたは光ファイバー束の光出力よりも大きい。
【００２５】
成型光パイプも、蛍光を集めるために使用することができる。光パイプは、光学的に透明な材料からなる単一の中実な部品である。光パイプは、バルク材料、例えばプラスチックから成型可能であるため、いずれも多数の部品からの集合体を必要とする別個独立の光ファイバー、光ファイバー束、または融着光ファイバーよりも製造が簡単である。光パイプにおいては、構造の全体が光を伝達するため、光パイプにおいて実際に光を集める収集領域の割合は、ほぼ１００％であって、融着光ファイバーと比べてもさらに高い割合である。光パイプは、基本的にただ１つの部品で構成されるため、別個独立の光ファイバー、光ファイバー束、または融着光ファイバーよりも信頼性が高いと考えられる。
【００２６】
励起光は、取り付け板３４に取り付けられた光源４０によって生成される。複数の励起光線が、光源４０から照明チューブ４４へと発せられる。図３において、光源４０からの励起は下向きである。光源４０からの光が、レンズ７２および励起フィルタ６２を通過して進み、次いでサンプル・チューブ９０に向かって進む。光は、サンプル・チューブ９０の内側へと集中させられるが、光源４０からの光のサンプル・チューブ９０のキャップ９２への照準および集中が有効である。照明チューブのために、光ファイバーではなく自由空間光学系を使用することで、励起光を光ファイバーに結合させるための光学系、および励起光を励起フィルタに達する前に平行にするための光学系が不要になるため、より小型な設計が可能になる。さらに、自由空間の設計においては、励起光を、光ファイバーからの励起光のように発散するのではなく、サンプルへと集束させることができるため、バックグラウンドの増大を引き起こして感度を低下させることになる散乱光を少なくするうえで、役に立つ。
【００２７】
レンズ７２および／または照明チューブ４４が、励起光を、専らサンプル・チューブ９０へと結合される細いビームへと閉じ込める。励起光が、サンプル・チューブ９０およびサンプル９４へと集中させられているため、光学系の残りの部分の全体において反射される迷光は最小限であり、これがバックグラウンドを低く保ち、感度を高く保つうえで役に立つ。
【００２８】
複数の収集光学系３９が、照明チューブを囲んでおり、サンプル・チューブ９０の開口の残りの領域を覆うことができる。複数の収集光学系３９は、サンプル９４から発せられる光の収集を最大化するように設計されている。複数の収集光学系３９を照明チューブ４４の周囲に一体化させることで、小さな光源によってサンプルを励起し、発せられる光の大きな面積を検出する効率的な２つの光学系がもたらされる。複数の収集光学系３９を照明チューブ４４の周囲に配置して備えることで、発せられる光について大きな検出面積が可能になる。
【００２９】
複数の収集光学系３９の中央に照明チューブ４４が位置することで、励起光の散乱が最小限になる。可能な限り多くの光がサンプル・チューブ９０へと進入するように保証することによって、サンプル・キャップ９２の角および縁から反射される励起光が少なくなる。結果として、励起光の大部分がサンプル・チューブ９０へと結合し、サンプル・チューブ９０へと進入せずに大気へと反射されて無駄になる励起光の量は、わずかである。より多くの光がサンプルへと結合されることにより、サンプルからの信号が大きくなることで、モジュールの感度が向上する。光のより多くの部分をサンプルへと結合させることで、信号の増大によってモジュールの感度が向上すると同時に、感度を制限しているバックグラウンドが小さくなる。
【００３０】
光は、キャップ９２を通ってサンプル・チューブ９０へと進み、サンプル・チューブ９０において、サンプル・チューブ９０内のサンプル９４に含まれるｑＰＣＲにおいて典型的に使用される蛍光プローブを励起し、サンプル９４の蛍光を生じさせる。各熱サイクルにおいてＤＮＡストランドが複製されるときに発せられる蛍光の量が、サンプル内のＤＮＡの量に関係するよう、生物学的プローブをそれぞれのＤＮＡサンプルに配置することができる。
【００３１】
サンプル９４から発せられた蛍光は、キャップ９２を通過し、複数の収集光学系３９によって集められる。蛍光が、照明チューブ４４の周囲の複数の収集光学系３９を通って移動する。複数の収集光学系３９が、照明チューブ４４の周囲を引き上げられ、収束して検出器ハウジング５０へと入るように、束３８にまとめられている。収集光学系３９の束３８が、検出器ハウジング５０への取り付けのための口金５２に取り付けられている。収集光学系３９によって集められた光は、口金５２において収集光学系３９の束を出て、もっぱら信号光を伝達して収集光学系３９によって集められた散乱光を阻止する放射光フィルタ６４を通過する。収集光学系３９によって集められた光を、放射光フィルタ６４によって伝達された後に、適切な光学系（この場合には、レンズ８４）によって検出器５３へと集光することができる。収集光学系からの光を集光するために、反射光学系を使用することも可能である。検出器５３が、光の強さを、光の強さの関数である電圧に変換する。検出器５３のための検出および制御用電子機器が、リード５４によって検出器５３へと接続されている。発せられた発光の量を検出することによって、この検出システムは、生み出されたＤＮＡの量を測定する。データを、それぞれのサンプル・チューブ９０から集めて、コンピュータによって分析することができる。
【００３２】
他の実施形態においては、反射器が、放射光フィルタ６４を出る光を集め、検出器５３へと反射させる。この実施形態においては、反射器が、レンズ８４の代わりに使用される。レンズ８４を反射器で置き換えることによって、検出器５３を、放射光フィルタ６４のより近くに移すことができ、より小型な検出器ハウジング５０がもたらされる。反射器は、円錐形、ドーナツ型、または光を集めて反射させるこの技術分野において公知の他の形状であってよい。
【００３３】
図４は、複数の収集光学系３９を照明チューブ４４の周囲に配置して有する光学モジュール３０について、図２の線Ａ‐Ａに沿って得た断面図であり、サンプル９４への励起光４８による照明の領域、およびサンプル９４から発せられた光の収集光学系３９の収集の円錐５８が示されている。光源４０が、照明チューブ４４のための励起光４８を供給する。励起光４８は、励起光４８を集中させて平行にするレンズ７２を通って進む。次いで、励起光４８は、サンプル９４の励起のために光の波長を選択する励起フィルタを通過する。励起光４８は、照明チューブ４４をさらに通過し、開口４７を通って照明チューブ４４から出て、複数のサンプル９４に向かって進む。
【００３４】
サンプル・チューブ９０のキャップ９２によって伝達される光の一部が、サンプル９４によって吸収されて、サンプル内の蛍光プローブを励起し、蛍光によって光が再び放射される。サンプル・チューブ９０を上方へと進む再放射の光（蛍光）は、キャップ９２を通って出て、照明チューブ４４の周囲に同心に配置された複数の収集光学系３９の収集の円錐の範囲に包含される。複数の収集光学系３９は、サンプルからの蛍光を集めた後に、この光を放射光フィルタ６４へと伝達し、その後にこの光が、レンズ８４または他の適切な光学系によって検出器５３へと集められる。
【００３５】
図４は、複数の収集光学系３９へと受け入れられる放射光の範囲を示している。複数の収集光学系３９は、或る角度範囲から入射する光を、そのような光が複数の収集光学系３９へと向かう方向に進む限りにおいて受け入れることができる。複数の収集光学系３９のそれぞれが、図４の収集の円錐５８によって定められる角度範囲から入射する光を受け入れることができる。複数の収集光学系３９は、照明チューブ４４の周囲に位置しているため、サンプル９４からの蛍光を集めるための収集の円錐５８を形成している。複数の収集光学系３９を、照明チューブ４４の周囲に３６０°にわたって配置することができる。
【００３６】
一実施形態においては、複数の収集光学系３９が、照明チューブ４４の開口４７を部分的に囲んでいる。複数の収集光学系３９を、放射光の収集を最大にするために、照明チューブ４４の開口４７の周囲の個別の位置に配置することができる。この実施形態においては、複数の収集光学系３９が、照明チューブ４４の開口４７を完全には囲んでおらず、隣り合う収集光学系の間にすき間が存在できる。例えば、収集光学系を、励起光の開口の周囲において９０度ごとに配置でき、４５度ごとに配置でき、あるいは１つのすき間を除いて連続的に配置することができる。隣り合う収集光学系の間の離間は、均一であってよく、さまざまであってよく、あるいは無作為であってよい。当業者であれば、任意の数の収集光学系および隣り合う収集光学系の間の任意の間隔が、ここに開示される実施形態の技術的思想および技術的範囲に含まれることを、理解できるであろう。
【００３７】
図３および図４に最もよく示されているように、光学系ハウジング３５が、複数の収集光学系３９の一部分を囲み、複数の収集光学系３９を照明チューブ４４の周囲に位置させている。複数の収集光学系３９は、好ましくは、照明チューブ４４の周囲に円形の様相で配置された別個独立の光ファイバーである。複数の収集光学系３９が、光学系ハウジング３５の内側に円形の様相で配置され、照明チューブ４４の周囲を包んでいる。光学系ハウジング３５の内側の係合面３７が、複数の収集光学系３９に係合している。光学系ハウジング３５の内部形状が、収集光学系３９を照明チューブ４４の外表面４２上の層として配置および固定すべく、複数の収集光学系３９を位置決めしている。光学系ハウジング３５の係合面３７は、照明チューブ４４の周囲に複数の収集光学系３９の円錐形状を生み出すために、傾けられている。光学系ハウジング３５が、複数の収集光学系３９が照明チューブ４４を囲むように保証し、照明チューブ４４の周囲の複数の収集光学系３９の円錐配向を維持している。
【００３８】
照明チューブ４４は、取り付け板３４へと取り付けられた光源４０によって閉じられた上端４５を有している。照明チューブ４４は、上端４５において下端４６よりも太い直径を有しており、照明用の光学系（光源４０、励起フィルタ６２、およびレンズ７２）を収集光学系３９の内側に収容できるようにするとともに、収集光学系の収集の効率を高めるために、収集光学系の端部を照明チューブ４４の中心に可能な限り近付けることができるようにしている。照明チューブ４４は、複数の収集光学系が照明チューブ４４の中心に近接するよう、テーパとして機能する。この円錐の設計において、照明チューブ４４の直径は、光源４０から開口４７へと減少している。開口４７が、励起光が照明チューブ４４を出て複数のサンプル・チューブ９０に向かって流れることができるようにしている。
【００３９】
図３に示されているように、複数の収集光学系が、照明チューブ４４の外表面４２に係合して、照明チューブ４４の周囲のほぼ円錐形の形状を形成している。複数の収集光学系３９の直径は、光源４０に向かってより大きく、照明チューブ４４の開口４７に向かってより小さい。照明チューブ４４の周囲の複数の収集光学系３９の円錐形の設計ゆえ、複数の収集光学系３９を、開口４７において照明チューブ４４へと近付け、小型な光学モジュール３０を生み出すことができる。小型ではなく、サンプルからの光の収集において効率的でないかもしれないが、円柱形の照明チューブも可能である。
【００４０】
光源４０は、１つ以上の取り付け穴３６を含んでいる取り付け板３４の下面に取り付けられる。取り付け板３４は、回路基板であってよい。
【００４１】
光源４０は、広帯域であっても、あるいは狭帯域であってもよいが、例えばｑＰＣＲなどの反応において使用されるプローブの濃度を光学モジュール３０によって検出できるよう、充分に明るくなければならない。
【００４２】
発光ダイオード（ＬＥＤ）または複数のＬＥＤが、光源４０として特に適している。なぜならば、ＬＥＤは、速やかに安定し、サイズが小型であり、種々の波長にて入手可能であるからである。ＬＥＤは、エレクトロルミネセンスによって光を発する半導体装置である。ＬＥＤは、特別な種類の半導体ダイオードである。通常のダイオードと同様、ＬＥＤは、ｐｎ接合と呼ばれる構造を生成すべく不純物の含浸またはドープを行った半導体材料のチップで構成されている。電荷担体（電子および正孔）が、接合を通過する電流によって生成される。電子が正孔に出会うとき、電子がより低いエネルギー・レベルへと落ち込み、エネルギーを光の形態で放出する。
【００４３】
ＬＥＤは、順方向に電気的にバイアスされるとき、インコヒーレントな準単色光を発する。発せられる光の色は、使用される半導体材料に依存して決まり、近紫外、可視、または赤外とすることができる。発せられる光の波長、すなわち色は、ｐｎ接合を形成している材料のバンドギャップ・エネルギーに依存して決まる。典型的にはケイ素またはゲルマニウムで作られる通常のダイオードは、不可視の遠赤外の光を発するが、ＬＥＤに使用される材料は、近赤外、可視、または近紫外の光に対応するバンドギャップ・エネルギーを有している。
【００４４】
他の光源として、これらに限られるわけではないが、１つまたは複数のレーザ・ダイオード、レーザ、フラッシュ・ランプ、白熱光源、タングステン・ハロゲン・ライト、またはアーク光源が挙げられる。他の光源を使用する場合には、種々の因子のなかでもとりわけ、サイズ、熱の放散、および電力の限界を考慮しなければならない。
【００４５】
レーザ・ダイオードとは、一般に、実際にレーザ発振を行う半導体チップと監視フォトダイオード・チップ（出力のフィードバック制御に使用される）とをパッケージに収容してなる組み合わせを指す。ダイオード・レーザは、きわめて小さなパッケージにおいてコヒーレント光を生成するためにガリウム‐ヒ素または他の珍しい半導体のほとんど微視的なチップを使用する。これらの半導体における伝導帯および価電子帯の電子の間のエネルギー・レベルの相違が、レーザ動作のための機構をもたらしている。レーザ・ダイオードは、小型であり（能動素子が、ほぼ砂粒のサイズである）、必要とする電力および電圧が低く、効率が高く（特に、ガス・レーザと比べ）、信頼性に富み、適切な処理によれば寿命が長い、などといった望ましい特徴を有している。
【００４６】
ＬＥＤと異なり、レーザ・ダイオードは、駆動用の電子機器においてはるかに大きな注意を必要とし、さもなければすぐに動作を停止してしまう。たとえマイクロ秒であっても超えてはならない最大電流が存在し、この最大電流は、特定の装置および接合部の温度に依存して決まる。
【００４７】
光源４０を、本出願の譲受人の出願であって、本出願と同時に係属中であり、その開示の全体がここでの言及によって本明細書に取り入れられたものとする２００５年５月４日付の出願第６０／６７７，７４７号および２００６年５月２日付の出願第１１／４１６，８８６号に開示されているように、パルス状とすることができる。
【００４８】
レンズ７２が、光をサンプル・チューブ９０に集中させる。光学的な設計においては、光源４０、レンズ７２、開口４７およびサンプル・チューブ９０の位置およびサイズを考慮に入れなければならない。例えば、開口４７が大きいほど、より多くの光をサンプル・チューブ９０へと結合させることができるが、開口がより大きいと言うことは、収集光学系３９が照明チューブ４４の光軸から遠く離れることを意味し、すなわち集められる放射光が少なくなることを意味する。さらに、励起フィルタ６２は、光がほぼ平行に入射するときに最もよく機能する。したがって、励起フィルタ６２は、レンズに対して、より光線が平行に近い側に配置されるべきである。
【００４９】
使用される場合、フィルタ６２、６４は、好ましくは、特定の帯域の上下の周波数を減衰させる狭帯域通過フィルタである。フィルタは、好ましくは、励起フィルタ６２および放射光フィルタ６４で構成されるマッチしたフィルタ・ペアである。励起フィルタ６２が、対象とする特定の蛍光プローブを励起する光を伝達し、他のプローブを励起させる光、あるいは蛍光プローブによって発せられる蛍光と同じまたはほぼ同じ波長の光を、効果的に阻止する。放射光フィルタ６４は、この励起された蛍光プローブからの光を効率的に伝達するが、他のプローブからの光および励起光を効果的に阻止する。フィルタの仕様は、光源に依存して決まる。例えば、白熱光源は、ＬＥＤ光源よりも幅広いスペクトルを有しているため、白熱光源と一緒に使用されるフィルタは、ＬＥＤ光源と一緒に使用されるフィルタよりも幅広い範囲の波長を減衰させる必要がある。
【００５０】
放射光フィルタ６４によって検出のための正しい波長の光を選択するために、光は、放射光フィルタ６４への進入にあたって、平行でなければならず、あるいは少なくとも約２０°の半角を超えて発散していてはならない。収集光学系３９を出る光の発散は、光学系の開口数（ＮＡ）によって決定される。ＮＡが小さいほど、光の発散も小さくなる。収集光学系３９が光ファイバーで構成される場合、それらの光ファイバーを、低いＮＡを有するように選択できる。あるいは、例えばレンズなどといった他の光学系によって、収集光学系３９からの光の発散を、光が放射光フィルタ６４へと達する前に小さくすることができる。
【００５１】
放射光フィルタ６４を通過した後の光を、レンズ８４が検出器５３へと集める。バックグラウンド光に対する信号光の比が、主としてフィルタ６２および６４のペアによって決定されるため、ひとたびサンプルによって発せられた光が放射光フィルタ６４によって伝達されたならば、その可能な限り多くが、検出器５３によって検出されなければならない。レンズ８４または他の集光用の光学系を、画像の品質にこだわらず、検出器５３へと到達する光を最大にするように選択しなければならない。
【００５２】
検出器５３は、サンプル中の蛍光プローブからの蛍光を、電悦へと変換することによって測定することができる。検出器５３は、好ましくは、蛍光を検出するためのフォトダイオードを有している。フォトダイオードは、最小かつ最も安価な検出方法となる傾向にある。フォトダイオード検出器は、感光性のシリコン・ダイオードであってよい。幅広い範囲にわたり、フォトダイオード検出器へと導かれた光の量が、そのフォトダイオード検出器が発する電流に直接比例する。この電流を、フォトダイオードへと取り付けた電子機器によって、アナログ‐デジタル変換器への入力のための電圧へと変換することができ、アナログ‐デジタル変換器が、検出器からの信号を、ヒトまたはコンピュータによる読み取りが可能な数へと変換する。
【００５３】
光源、光学系、および電子機器を注意深く設計することで、フォトダイオードを光学モジュール３０において使用することができる。光学モジュール３０は、回路の設計、ケーブルの引き回しおよび遮蔽、フォトダイオードからの信号における電子機器による大きな利得の使用、光学モジュール３０のサイズの制約に合致する利用可能な最大出力のＬＥＤの選択、ならびに可能な限り多くの光をサンプルへと導き、可能な限り多くの光をサンプルから集めると同時に、サンプルに関係しない散乱光を最小限にする光学系の設計によって、電子ノイズを最小限にする。
【００５４】
他の実施形態においては、これらに限られるわけではないが、アバランシェ・フォトダイオード（ＡＰＤ）、光電子増倍管（ＰＭＴ）、電荷結合素子（ＣＣＤ）、または同様の光検出器など、この技術分野において公知の他の検出器も使用可能である。アバランシェ・フォトダイオードは、典型的には、信号に対する応答がフォトダイオードよりも高速であるが、動作により高い電圧を必要とし、より高価である。光電子増倍管は、典型的には、最も高感度であるが最も高価であり、最も高い電圧の電源を必要とする。電荷結合素子は、フォトダイオードに比肩する感度を有し、検出される光について空間分解能を提供するが、フォトダイオードよりも高価である。
【００５５】
光学モジュール３０の電子機器は、モジュールの感度を制限するノイズへの寄与が可能な限り小さくなるように、最適化されなければならない。この目標に達するうえで役に立つ設計の指標として、プリアンプを検出器の可能な限り近くに配置すること、光学モジュールを電磁干渉から遮蔽すること、電子機器の全体としての利得を大きくすること、および信号をＲＣフィルタで処理することが挙げられる。
【００５６】
電子機器の最適化は、光源の最適化と協調して行われるべきである。光源は、可能な限り安定した照明を生み出さなければならない。
【００５７】
電子機器および光源によって生じるノイズを可能な限り少なくしたならば、光源の強さを最適化しなければならない。光のレベルが低いと、検出および電子機器のノイズによって感度が制限される。このノイズは光の強さと無関係であり、光学モジュール３０からの信号は、光の強さを増すほどに大きくなるため、光の強さを増すことで、光学モジュール３０の感度が向上する。しかしながら、或る光の強さのレベルにおいては、光学ノイズ（光の生成および検出につきものである）が、電子機器のノイズよりも大きくなり、ひとたびそのような強さに達したならば、さらに光を強めても光学モジュール３０の感度は向上しない。光の強さを、モジュールの感度がそれ以上向上しなくなるまで、可能な限り高めるべきである。光の強さをどこまで高めることができるかについての限界は、光源の物理的特性および利用可能な空間によって決定される。なぜならば、より強力な光源は、より大型であり、熱の放散のためにより大きな容積を必要とし、より大きな電力の供給を必要とするからである。理論モデルが、ノイズ源および信号源の理解に役立つが、最適な光の強さは、最も多くの場合、経験的に決定される。
【００５８】
光学モジュール３０は、照明チューブ４４の周囲を完全または部分的に巡って複数の収集光学系３９を有している。複数の収集光学系３９が、それら複数の収集光学系３９の中心に位置する照明チューブ４４の開口４７を囲んでいる。複数の収集光学系３９は、蛍光の収集および検出のために、円形のパターンにて照明チューブ４４の周囲に連続的または不連続に位置しており、信号を、検出器５３を有する検出器ハウジング５０へと案内する。
【００５９】
図５に示されているように、光学モジュール３０を、キャップを通してサンプルへの光学的なアクセスを可能にする９６穴（８×１２のアレイ）の熱サイクル器の上方を走査するために使用することができる。図５は、サンプルのアレイの上方で光学モジュールを走査するための蛇行法を示している。光学モジュール３０が、コンピュータによって制御することができる二軸の運動システム８０に取り付けられて示されている。光学モジュール３０の移動経路８２を、ブラインド・ステッピング（軸を所定の時間期間にわたって駆動する）によって定めることができる。あるいは、経路８２を、１つ以上のセンサ（図示されていない）からのフィードバックによって定めることができる。そのようなセンサは、例えば、光学モジュール３０の絶対位置を測定するために使用される目盛りであってよく、あるいは光学モジュール３０が特定の行または列の上方または端部に位置したことを検出するように設定されたリミット・スイッチであってよい。経路８２は蛇行しており、光学モジュール３０を、行の最も左側のサンプルの左側へと出発して、１行おきの最も右側のサンプルの右側へと終わり、サンプルの各行に沿って移動させる。次いで、運動システム８０は、光学モジュール３０を、光学モジュール３０が先の行と反対方向に走査を行う前に、次の行へと移動させる。図５は、９６穴の熱サイクル器の上方における光学モジュールの経路を示しているが、当業者であれば、４８穴、３８４穴、１５３６穴、および他の複数穴の熱サイクル器が、ここに開示した実施形態の技術的思想および技術的範囲に包含されることを、理解できるであろう。
【００６０】
一実施形態においては、複数の光学モジュール３０が、多重化（同じサンプルから別個の蛍光プローブを検出する）においてサンプルを走査するために単一のユニットへと一体に集められる。それぞれの光学モジュール３０が、異なる蛍光プローブのための別個の光学チャネルを呈することができる。複数の光学モジュール３０を備えるユニットが複数のサンプルを横切って移動するとき、個々の光学モジュール３０のそれぞれが、サンプルを順に走査して、いくつかの読み取りを生成する。照明チューブを複数の収集光学系の周囲に配置して有しているため、或る１つの光学モジュール３０から他の光学モジュールへの光の散乱が最小限であり、一方が他方の放射波長に近い励起波長または他方の放射波長と同じ励起波長を有している蛍光プローブのペアなど、最適な性能を得ることができる蛍光プローブの組み合わせが増加する。複数の光学モジュール３０を、サンプルの二次元のアレイを横切って移動させるために、二軸の運動システム（図５に示されている）へと接続することができる。２つ、３つ、４つ、または５つ以上の光学モジュール３０を、個々のサンプルを調査するために単一のユニットとして一体に集めることができる。複数の光学モジュールを、互いに前後に直線状に配置でき、正方形に配置でき、平行四辺形に配置でき、ダイアモンド型に配置でき、あるいは他のパターンに配置でき、ここに開示される実施形態の技術的思想および技術的範囲に包含されうる。
【００６１】
一実施形態においては、光源４０および検出器５３の位置を、サンプルからの蛍光が照明チューブ４４に沿って光学モジュール３０の中央に集められ、励起光が収集光学系からサンプルへと達するように、切り替えることができる。この実施形態においては、励起光が外側からサンプルへと導かれ、サンプルから発せられる蛍光が、光軸に沿って内側において検出される。主としてチューブの光軸に沿って収集が行われることで、サンプルからの蛍光を他からの散乱光よりも優先的に選択でき、感度を向上させることができる。励起光を外側から導くと、励起光の一部がサンプルへと導かれずに逃げ、サンプル・キャップの角または縁から反射される可能性がある。中央のチューブを囲むように励起光を配置することで、サンプルを励起させるためにより多くの励起光を使用する必要が生じる可能性がある。
【００６２】
収集光学系を照明チューブの周囲に配置して有する光学モジュールを、種々の製造者および型式のｑＰＣＲ器具と一緒に使用することができ、図１〜５に例示したような光学モジュールにおける使用に限定されない。ｑＰＣＲ反応からの蛍光を検出する他のｑＰＣＲ器具、システム、および方法も、収集光学系を照明チューブの周囲に配置して有する光学モジュールから利益を得ることができる。例えば、収集光学系を照明チューブの周囲に配置して有する光学モジュールを、本出願の譲受人の米国特許第６，６５７，１６９号（この特許の全体が、ここでの言及によって本明細書に取り入れられたものとする）に記載されている生物学的材料のサンプルの熱サイクルのための装置と一緒に使用することができる。さらに、収集光学系を照明チューブの周囲に配置して有する光学モジュールを、各サンプルを順次に調査するタングステン・ハロゲン球を使用し、光電子増倍管によって蛍光を検出するＭｘ３０００Ｐ  Ｒｅａｌ‐Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ＳｙｓｔｅｍおよびＭｘ４０００  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｑｕａｎｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（カリフォルニア州Ｌａ  ＪｏｌｌａのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから市販されている）と一緒に使用することができる。また、収集光学系を照明チューブの周囲に配置して有する光学モジュールを、以下のいずれかまたはすべて、すなわち各サンプルを順次に調査するタングステン・ハロゲン球、走査を行う光学モジュール、静止のサンプル、光源、および検出器、回転しているサンプルを順次に調査する静止のＬＥＤおよび検出器、ならびにこの技術分野において公知の他のｑＰＣＲ器具、のいずれかまたはすべてを取り入れているｑＰＣＲ器具と一緒に使用することができる。
【００６３】
生物学的材料のサンプルは、典型的には、複数のサンプル・チューブに収容されている。サンプル・チューブは、単一のチューブ、８つのチューブを互いに取り付けてなるストリップ、および９６個のサンプル・チューブが取り付けられたチューブ・トレイという３つの一般的な形態にて入手可能である。光学モジュール３０は、好ましくは、これら３つの設計のいずれにも適合するように設計される。
【００６４】
また、それぞれのサンプル・チューブは、生物学的反応混合物をサンプル・チューブ内に保つために、対応するキャップを有することができる。キャップは、典型的には、サンプル・チューブの上部の円筒形の表面の内側に挿入される。キャップは、キャップを通して光を伝達できるよう、比較的透明である。サンプル・チューブと同様に、キャップは、典型的には成型ポリプロピレンで製作されるが、他の適切な材料も容認できる。それぞれのキャップが、キャップの上面に薄くて平坦な光学窓を有している。それぞれのキャップの光学窓が、サイクルの最中に、励起光などの放射をサンプル内の蛍光プローブへと伝達できるようにし、サンプル内の蛍光プローブから発せられる蛍光を光学検出システムへと伝達できるようにしている。
【００６５】
スライド、仕切り、ビーズ、チャネル、反応チャンバ、容器、表面、などといった他のサンプル保持構造、あるいはサンプルの保持のための他の任意の適切な装置を、ここに開示した実施形態において使用することができる。サンプル保持構造に配置されるべきサンプルは、生物学的反応混合物に限定されない。サンプルとして、任意の種類の細胞、組織、微生物、または非生物学的な物質を挙げることができる。
【００６６】
収集光学系を照明チューブの周囲に配置して有する光学モジュールを、これらに限られるわけではないが、緑色蛍光たんぱく質、ＤＮＡマイクロアレイ・チップ、たんぱく質マイクロアレイ・チップ、フロー・サイトメトリー、および当業者にとって公知の同様の反応など、他の生物学的用途において蛍光を検出するために使用することができる。
【００６７】
本明細書において言及されたすべての特許、特許出願、および刊行物は、その全体がここでの言及によって本明細書に取り入れられたものとする。さまざまな上記開示の特徴および機能ならびに他の特徴および機能、あるいはそれらの代案を、他の多数の種々のシステムまたは用途へと望ましく組み合わせることができることを、理解できるであろう。現時点では予測または予期できないさまざまな代案、変更、変形、またはそれらの改善を、当業者であれば後に行うことができると考えられるが、それらも以下の特許請求の範囲に包含される。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】収集光学系を照明チューブの周囲に配置して有する光学モジュールの斜視図である。
【図２】収集光学系を照明チューブの周囲に配置して有する光学モジュールの正面図である。
【図３】収集光学系を照明チューブの周囲に配置して有する光学モジュールについて、図２の線Ａ‐Ａに沿って得た断面斜視図である。
【図４】収集光学系を照明チューブの周囲に配置して有する光学モジュールについて、図２の線Ａ‐Ａに沿って得た断面図であり、光の経路の痕跡を示している。
【図５】収集光学系を照明チューブの周囲に配置して有する光学モジュールの斜視図であり、アセンブリへと取り付けられており、光学モジュールが複数のサンプル・チューブ上を走査するときの経路が示されている。
【図１】
2008544254.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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