(57)【要約】本発明は、医療用インプラントの表面に対する改善されたコーティングを提供する。このコーティングは、少なくとも１つの界面バイオマテリアル（ＩＦＢＭ）を含み、それはインプラントまたはインプラント関連材料の表面に結合する少なくとも１つの結合モジュール（「インプラントモジュール」）、および標的分析物に選択的に結合するか、または望ましい効果を有するようデザインされた少なくとも１つの結合モジュール（「検体モジュール」）からなる。これらのモジュールはリンカーによって連結される。いくつかの実施形態において、ＩＦＢＭコーティングは、標的分析物のデバイス表面に対する認識および接着を促進するよう作用する。ＩＦＢＭコーティングは、例えばインプラントの骨同化を促進することによって、移植された医療デバイスの性能を改善する。
2008504850.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．少なくとも１つのインプラントモジュール；および
ｂ．少なくとも１つの検体モジュール
を含むＩＦＢＭであって、該インプラントモジュールは、配列番号１〜配列番号８、配列番号３９〜配列番号４３、配列番号９５〜配列番号９６、または配列番号９７〜配列番号５５８のいずれかに示される配列を含むペプチドを含む、ＩＦＢＭ。
【請求項２】
前記インプラントモジュールが、以下：
ａ．ポリマー；
ｂ．セラミック；
ｃ．プラスチック；および
ｄ．金属
からなる群より選択される材料から作製されたインプラントに結合する、請求項１に記載のＩＦＢＭ。
【請求項３】
前記インプラントモジュールが、ポリ乳酸であるポリマーから作製されたインプラントに結合する、請求項２に記載のＩＦＢＭ。
【請求項４】
前記インプラントモジュールが、コラーゲンであるポリマーから作製されたインプラントに結合する、請求項２に記載のＩＦＢＭ。
【請求項５】
前記インプラントモジュールが、ポリテトラフルオロエチレンであるプラスチックから作製されたインプラントに結合する、請求項２に記載のＩＦＢＭ。
【請求項６】
前記インプラントモジュールが、チタン合金である金属から作製されたインプラントに結合する、請求項２に記載のＩＦＢＭ。
【請求項７】
前記インプラントモジュールが、酸化ジルコニウムであるセラミック材料から作製されたインプラントに結合する、請求項２に記載のＩＦＢＭ。
【請求項８】
前記検体モジュールが、以下：
ａ．骨形成タンパク質；
ｂ．血管内皮増殖因子；
ｃ．血小板由来増殖因子；
ｄ．トランスフォーミング増殖因子−β；
ｅ．インスリン様増殖因子−１；
ｆ．インスリン様増殖因子−２；
ｇ．線維芽細胞増殖因子；
ｈ．神経成長因子；および
ｉ．胎盤増殖因子
からなる群より選択されるタンパク質に結合する、請求項１に記載のＩＦＢＭ。
【請求項９】
前記検体モジュールが骨形成タンパク質−２に結合する、請求項１に記載のＩＦＢＭ。
【請求項１０】
前記検体モジュールが細胞に結合する、請求項１に記載のＩＦＢＭ。
【請求項１１】
前記検体モジュールが骨芽細胞に結合する、請求項１０に記載のＩＦＢＭ。
【請求項１２】
前記検体モジュールが、配列番号１１〜配列番号２８、配列番号４４〜配列番号７４、または配列番号７７〜配列番号９４のいずれかに示される配列を含むペプチドを含む、請求項１に記載のＩＦＢＭ。
【請求項１３】
前記検体モジュールが、配列ＲＧＤを含むペプチドを含む、請求項１に記載のＩＦＢＭ。
【請求項１４】
前記検体モジュールが、配列ＹＩＧＳＲを含むペプチドを含む、請求項１に記載のＩＦＢＭ。
【請求項１５】
前記検体モジュールが、配列ＩＫＶＡＶを含むペプチドを含む、請求項１２に記載のＩＦＢＭ。
【請求項１６】
前記インプラントモジュールが、少なくとも２つの検体モジュールに連結される、請求項１に記載のＩＦＢＭ。
【請求項１７】
前記検体モジュールが、増殖因子に結合する少なくとも１つの検体モジュール、および細胞に結合する少なくとも１つの検体モジュールを含む、請求項１６に記載のＩＦＢＭ。
【請求項１８】
請求項１に記載の少なくとも２つのＩＦＢＭでコーティングされたインプラントであって、該少なくとも２つのＩＦＢＭのうちの少なくとも２つが互いに異なる、インプラント。
【請求項１９】
前記検体モジュールが、ＢＭＰＲＩおよびＢＭＰＲＩＩの各々に結合してＢＭＰ活性を有する、請求項１に記載のＩＦＢＭ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、デバイス表面に対する標的分析物の特異的な認識および接着を促進する界面バイオマテリアルを用いて医療デバイスの表面をコーティングするための、材料および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ヒトおよび動物において、様々な関節置換術のため、および骨修復を促進するために、整形インプラントが使用される。医療業界アナリストによると、現在米国において毎年８００，０００件以上の股関節置換術および膝関節置換術がヒト患者において行われている。それに加えて、何十万人ものヒト患者が、例えば様々な型の骨折を治療するために、または重症の腰痛を軽減するために整形インプラントが使用される、外科的処置を受けている。
【０００３】
これらの処置の全てにおいて、コントロールされた、指向性の、迅速な治癒の必要性が存在する。関節置換術を受けた個人は多くの場合、無併発性の治癒および機能の回復を経験する。残念ながら、「遅発性機能不全」が挙げられる、高率の合併症が存在する。ヒトの関節置換術の合計に関する修正手術率は１０％〜２０％の間で変化する（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。これら修正手術の大部分は、インプラント−骨界面における機能不全のために必要とされる。
【０００４】
整形インプラントは、比較的不活性な材料（「アロプラスト性」材料）、代表的には金属材料、セラミック材料、またはプラスチック材料から作製される。整形移植手術の結果を改善するための以前のアプローチは、主に骨形成の増加を引き起こす、インプラント表面に対する物理的変化に焦点を当てていた。これらのアプローチは、骨の内殖を促進するために多孔性金属表面を有するインプラントを使用すること、およびインプラントをヒドロキシアパタイトプラズマでスプレーすることを含む。歯科インプラントを使用するアプローチも、組織分布を増強したチタン表面の使用を含んでおり、ここで表面の粗さはグリットブラスト、酸エッチング、または酸化のような方法によって付与される。これらの技術は整形移植手術の結果を改善したが、依然としてさらなる改善の余地がかなり存在する。
【０００５】
アロプラスト性材料に対する組織の反応は、材料の表面に対する細胞の接着によって影響されることが公知であり、そして多くの研究がアロプラスト性材料に対する細胞接着を改善する方向に向けられた。インビボにおける細胞間の細胞接着は、主として、細胞外マトリックスの短い露出したタンパク質ドメインが細胞表面レセプターに結合することによってコントロールされることが公知である（非特許文献４；非特許文献５）。特に、インテグリンとして公知のレセプターのクラスが、インプラント表面に対する細胞接着に関係している。インテグリンおよびその標的リガンドは、骨芽細胞の接着および増殖ならびに骨形成を刺激することが示された（例えば、非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８を参照のこと）。インテグリンは、インプラントに対する細胞接着の標的化に有用であり得、そしてこの様式でインプラントが隣接する骨に同化することを改善し得る。
【０００６】
他の研究は、成長因子およびサイトカインの局所的発現が、アロプラスト性インプラント表面における組織反応を増強し得ることを示した。例えば、Ｃｏｌｅら（非特許文献９）は、成長因子がインプラントの隣接する骨への同化（「骨同化」）を促進し得ること、およびインプラント表面の隣の骨形成速度を増加させ得ることを示した。特許文献１も参照のこと。新規の骨産生を刺激する成長因子（「骨誘導タンパク質」）としては、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子１および２（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増成長因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、および関連するファミリーメンバーが挙げられるがこれらに限定されない。
【０００７】
最も有効な骨誘導タンパク質は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）である。ＢＭＰは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーであり、そのメンバーは、保存された１組のシステイン残基および全体的に高レベルの配列同一性を共有する。１５種以上の異なるＢＭＰが同定され、そしてほとんどのＢＭＰは新規の骨形成へと導く事象のカスケードを刺激する（特許文献２；特許文献３；特許文献４；および特許文献５を参照のこと；非特許文献１０；非特許文献１１；および非特許文献１２によっても概説されている）。新規の骨形成へと導くこの事象のカスケードとしては、間葉系幹細胞の遊走、骨伝導性（ｏｓｔｅｏｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ）マトリックスの沈着、骨芽前駆細胞の増殖、および前駆細胞の骨産生細胞への分化が挙げられる。多くの研究が、インプラントの骨同化を促進するために、インプラント上でかまたはインプラント付近でのＢＭＰの使用に向けられた（例えば、非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５を参照のこと）。しかし、未解決のまま残った重要な問題の１つは、活性なＢＭＰまたは他の活性な生体分子を、インプラントの表面へ移植または固定化する方法である。
【０００８】
ＢＭＰの提示がインプラントデバイスの隣で望ましい骨形成を生じるために重要であることが示された。インプラントを改善するためのアプローチは、骨形成の天然の過程を考慮して設計された。ヒト骨において、コラーゲンは骨形成の足場、およびＢＭＰの天然担体の両方として作用する。鉱質除去された骨が、骨移植材料として首尾よく使用されている；鉱質除去した骨の主な成分は、コラーゲンおよびＢＭＰである（特許文献６を参照のこと）。マトリックスが分解するにつれて成長因子および他の生物活性分子を安定に放出することによって骨形成を促進するよう設計された多くのマトリックスシステムが開発された。ポリマーマトリックスからのＢＭＰ放出効率は、ＢＭＰのマトリックスに対する親和性、吸収速度、密度、および孔径のような、マトリックスの特徴に依存する。そのようなマトリックスシステムにおいて使用される材料としては、不活性なモノマーへと体内で容易に加水分解される有機ポリマーが挙げられる。そのような有機ポリマーとしては、ポリ乳酸、ポリグリコリド、ポリ無水物、ポリオルトエステルが挙げられる（特許文献７；特許文献８；および特許文献９を参照のこと）。ＢＭＰを含むマトリックスにおいて有用であると記載された他の材料としては、ポリ乳酸とポリグリコール酸とのコポリマー、アルギン酸塩、ポリ（エチレングリコール）、ポリオキシエチレンオキシド、カルボキシビニルポリマー、およびポリ（ビニルアルコール）が挙げられる（特許文献１０を参照のこと）。ＢＭＰを骨領域に送達するために、天然マトリックスタンパク質も使用されている；これらの天然タンパク質としては、コラーゲン、グリコサミノグリカン、およびヒアルロン酸が挙げられ、これらは体内で酵素的に消化される（特許文献１１；特許文献１２；特許文献１３；特許文献１４；特許文献１５；および特許文献１６を参照のこと）。
【０００９】
修復部位にＢＭＰを保持するポリマーマトリックスの使用にも関わらず、成長因子のマトリックスからの迅速な拡散のために、治癒を促進するためには超生理学的レベルのＢＭＰが必要であることが見出された。例えば、コラーゲンスポンジ送達システムに関して、２日後にはスポンジに添加したＢＭＰの５０％しか保持されない（非特許文献１６）。必要な時間の間、生理学的レベルのＢＭＰを維持するために必要なＢＭＰの高い初期投与量は、ＢＭＰ治療をより高価なものにし、そして異所性の骨形成もしくはアレルギー反応、または中和抗体の形成のような、有害な副作用を引き起こし得る。
【００１０】
腱および靭帯置換術、皮膚置換術、血管プロテーゼ、心臓ペースメーカー、人工心臓弁、乳房インプラント、陰茎インプラント、ステント、カテーテル、シャント、神経成長ガイド、眼内レンズ、創傷包帯、および組織シーラントのような他のインプラントに関しても、同様の問題が存在する。整形インプラントと同様に、これらのインプラントに関与する手術は、多くの場合、遅い創傷の治癒、および所望される場合、インプラントの周囲組織への不適切な同化を含む、同様の問題を引き起こす。
【特許文献１】米国特許第５，３４４，６５４号明細書
【特許文献２】米国特許第５，０１３，６４９号明細書
【特許文献３】米国特許第５，６３５，３７３号明細書
【特許文献４】米国特許第５，６５２，１１８号
【特許文献５】米国特許第５，７１４，５８９号明細書
【特許文献６】米国特許第５，２３６，４５６号明細書
【特許文献７】米国特許第４，５６３，４８９号明細書
【特許文献８】米国特許第５，６２９，００９号明細書
【特許文献９】米国特許第４，５２６，９０９号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，５９７，８９７号明細書
【特許文献１１】米国特許第４，３９４，３２０号明細書
【特許文献１２】米国特許第４，４７２，８４０号明細書
【特許文献１３】米国特許第５，３６６，５０９号明細書
【特許文献１４】米国特許第５，６０６，０１９号明細書
【特許文献１５】米国特許第５，６４５，５９１号明細書
【特許文献１６】米国特許第５，６８３，４５９号明細書
【非特許文献１】Ｍａｌｃｈａｕら「Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｔｏｔａｌ  ｈｉｐ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ：Ｕｐｄａｔｅ  ｏｆ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ａｎｄ  ｒｉｓｋ−ｒａｔｉｏ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｒｅｖｉｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅ−ｒｅｖｉｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｉｐ  Ａｒｔｈｒｏｐｌａｓｔｙ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ，１９７９−２０００」（２００２）第６９回  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  Ｓｕｒｇｅｏｎｓ、Ｄａｌｌａｓ、Ｔｅｘａｓ、２００２年２月１３〜１７日における科学展示会
【非特許文献２】ＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋらＨｅａｌｔｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｓｓｅｓｓ．（１９９８）２：１−６４
【非特許文献３】ＭａｈｏｍｅｄらＪ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．Ａｍ．（２００３）８５−Ａ：２７−３２
【非特許文献４】ＬｅＢａｒｏｎおよびＡｔｈａｎａｓｉｏｕ、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．（２０００）６：８５−１０３
【非特許文献５】Ｙａｍａｄａ、Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ．（１９９７）１６：１３７−１４１
【非特許文献６】Ｋａｎｔｌｅｈｎｅｒら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ（２０００）１：１０７−１１４
【非特許文献７】Ｓａｒｍｅｎｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．（２００４）６９Ａ：３５１−３５８
【非特許文献８】Ｈａｙａｓｈｉｂａｒａら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓ．（２００４）１９：４５５−４６２
【非特許文献９】Ｃｏｌｅら、Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．（１９９７）３４５：２１９−２２８
【非特許文献１０】ＲｅｄｄｉおよびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．（１９９３）８  追補２：Ｓ４９９−Ｓ５０２
【非特許文献１１】ＩｓｓａｃｋおよびＤｉＣｅｓａｒｅ、Ａｍ．Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．（２００３）３２：４２９−４３６
【非特許文献１２】ＳｙｋａｒａｓおよびＯｐｐｅｒｍａｎ、Ｊ．Ｏｒａｌ  Ｓｃｉ．（２００３）４５：５７−７３
【非特許文献１３】Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．Ａｍ．（２００１）８３−Ａ  追補１（Ｐｔ．２）：Ｓ１５１−５８
【非特許文献１４】Ｅｉｎｈｏｒｎ、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．Ａｍ．（２００３）８５−Ａ  追補３：８２−８８
【非特許文献１５】Ｂｕｒｋｕｓら、Ｊ．Ｓｐｉｎａｌ  Ｄｉｓｏｒｄ．Ｔｅｃｈ．（２００２）１５（５）：３３７−４９
【非特許文献１６】Ｇｅｉｇｅｒら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．（２００３）５５：１６１３−１６２９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、術後の治癒、そして望ましい場合にはインプラントの、例えば隣接する骨のような周囲組織への統合を促進するために、インプラントとして、またはインプラントと組み合わせて使用される材料の表面に活性な生体分子を移植するための、費用効果の高い方法を開発する必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（本発明の概要）
本発明は、医療用インプラントの表面の改善されたコーティングを提供する。そのコーティングは、少なくとも１つの界面バイオマテリアル（ＩＦＢＭ）を含み、それはインプラントまたはインプラント関連材料の表面に結合する少なくとも１つの結合モジュール（「インプラントモジュール」）、および標的分析物に結合するか、または望ましい効果を有するよう設計された少なくとも１つの結合モジュール（「検体モジュール」）からなる。モジュールはリンカーによって連結される。いくつかの実施形態において、ＩＦＢＭコーティングは、デバイス表面に対する標的分析物の認識および接着を促進するよう作用する。ＩＦＢＭコーティングは、インプラントの骨同化を促進すること、治癒を加速すること、および／または移植部位における炎症を抑制することによって、移植された医療デバイスの性能を改善する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ペプチド、タンパク質、薬剤、または細胞のデバイスへの接着を促進するために、医療用デバイスの表面に対して改善されたコーティングを提供する。そのコーティングは、連結した複数の結合モジュールを含む界面バイオマテリアル（ＩＦＢＭ）である。ＩＦＢＭは、インプラントの表面に結合する少なくとも１つの結合モジュール（「インプラントモジュール」）、および標的分析物に結合するか、または望ましい効果を有する少なくとも１つの結合モジュール（「検体モジュール」）を含む。代表的な結合モジュールは、例えば配列表において提供されたペプチド配列（配列番号１−７４および７７−５５８）を含む。これらのモジュールはリンカーによって連結される。いくつかの実施形態において、ＩＦＢＭの結合モジュールのインプラント表面に対する結合は、非共有結合である。同様に、いくつかの実施形態において、検体モジュールの標的分析物に対する結合は、非共有結合である。１つの実施形態によって、インプラントモジュールおよび検体モジュールは、インプラントモジュールがインプラント材料に結合し、そして検体モジュールが成長因子または細胞に特異的に結合するように、２つの別々のペプチド分子を含む。いくつかの実施形態において、インプラントモジュールおよび検体モジュールを、中央の高分子によって連結する。これらの結合モジュールは、代表的にはそれぞれインプラント材料または標的分析物に非共有結合する。検体モジュールが標的分析物に結合せず、むしろ望ましい効果を有する実施形態において、その検体モジュールは、例えば細胞をインプラントの位置に呼び寄せる（リクルートする）よう作用することによって、成長因子の作用を刺激し得る。ＩＦＢＭの選択方法および構造は、２００２年１１月２０日に提出され、そして公開番号２００３０１８５８７０として２００３年１０月２日に公開された、米国特許出願第１０／３００，６９４において記載され、それは本明細書中で参考文献に組み込まれる。
【００１４】
「特異的に結合する」または「特異的結合」によって、そのインプラントモジュールまたは検体モジュールが、選択されたインプラント材料または選択された分析物に結合することを意図する。いくつかの実施形態において、特定のインプラント材料または分析物に特異的に結合するモジュールは、そのモジュールが例えば移植に使用される異なる材料、移植に使用されない材料、またはウシ血清アルブミンのようなそのような目的のために代表的に使用されるタンパク質のような、適切なコントロールに結合するよりも、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはより高いパーセンテージでその材料または分析物に結合する。「分析物」によって、移植手術の後に、インプラントの骨同化を改善するかまたは周囲の組織の治癒を促進または加速させる、あらゆる物質または成分を意図する。検体モジュールの結合標的である適切な分析物は、骨形成タンパク質（例えばＢＭＰ−７およびＢＭＰ−２のようなＢＭＰ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、インスリン成長因子−１（ＩＧＦ−１）、インスリン成長因子−２（ＩＧＦ−２）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）および胎盤成長因子のような成長因子が挙げられるがこれに限らない。適切な分析物はまた、ホルモン、酵素、サイトカイン、および本発明の目的を達成するのに；すなわち移植手術後にインプラントの骨同化を促進するために、および／または周囲組織の治癒を改善するために有用な、他の生物活性物質または成分も含む。適切な分析物としてはまた、細胞、例えば骨芽細胞、軟骨細胞、幹細胞、前駆細胞、血小板、および骨同化および治癒に役割を果たす他の細胞も挙げられる。いくつかの実施形態において、検体モジュールは、例えば当該分野において特定の生物学的活性を有することが公知であるペプチド配列ＲＧＤ、ＹＩＧＳＲ、およびＩＫＶＡＶのような、細胞に結合するか、または細胞またはレセプターに対する結合によって生物活性を有するペプチド配列を含み得る。例えばＨｅｒｓｅｌら（２００３）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２４：４３８５−４４１５；Ｇｒａｎｔら（１９９０）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５８８：６１−７２；Ｈｏｓｏｋａｗａら（１９９９）Ｄｅｖ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．４１：２０７−２１６を参照のこと。いくつかの実施形態において、検体モジュールは、配列番号１１−２８、配列番号４４−７４、または配列番号７７−９４において述べた例示的な配列のような、ＢＭＰ−２に結合するペプチド配列および／またはその効果を模倣するペプチド配列を含む。細胞に結合する検体モジュールは、多くの異なる細胞型に結合する一般的な細胞結合配列を含むペプチドを含み得るか、またはその分析モジュールは、骨芽細胞、軟骨細胞、骨芽前駆細胞、または幹細胞のような特定の細胞型に結合するペプチドを含み得る。
【００１５】
「インプラント」という用語は一般的に、損傷した組織の機能を回復するために、または新しい機能を提供するために、ヒトまたは動物の体内に導入される構造を指す。インプラントデバイスは、あらゆる生体適合性の材料を用いて作製され得、それに対して結合薬剤が本明細書中で開示されたように特異的に結合し得る。代表的なインプラントとしては、股関節内部人工器官、人工関節、顎または顔面インプラント、腱および靭帯置換術、皮膚置換術、骨置換術および人工骨スクリュー、骨移植デバイス、血管プロテーゼ、心臓ペースメーカー、人工心臓弁、乳房インプラント、陰茎インプラント、ステント、カテーテル、シャント、神経成長ガイド、眼内レンズ、創傷包帯、および組織シーラントが挙げられるがこれに限らない。インプラントは、様々な材料から作られ、それら材料は当該分野で公知であり、そして例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸コポリマー、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリスチレン、ポリカーボネート、ナイロン、ＰＶＣ、コラーゲン（例えば架橋コラーゲンのような加工コラーゲンを含む）、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、アルギン酸塩、シルク、フィブリン、セルロース、およびゴムを含む、ポリマーまたはポリマーの混合物；ポリエチレン（例えば高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）を含む）、ＰＥＥＫ（ポリエーテルエーテルケトン）、およびポリテトラフルオロエチレンのようなプラスチック；チタン、チタン合金、ステンレス鋼、およびコバルトクロム合金のような金属；金属酸化物；非金属酸化物；シリコン；生体活性ガラス；例えば酸化アルミニウム、酸化ジルコニウム、およびリン酸カルシウムのようなセラミック材料；鉱質除去した骨マトリックスのような他の適切な材料；ならびにそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限らない。本明細書中で使用される「ポリマー」という用語は、何百万もの反復する連結した、それぞれは比較的単純な分子であるユニットから成る、通常高分子量の多くの天然および合成化合物の任意のものを指す。本明細書中で使用される「インプラント」という用語は、インプラントと会合し、そしてまたインプラントと組み合わせてヒトまたは動物の体内へ導入される、インプラント関連材料を含む。
【００１６】
本発明の１つの実施形態において、ＩＦＢＭは、成長因子のインプラント表面に対する接着を媒介する結合界面を作る。いくつかの実施形態において、本発明の方法によって調製されたインプラントは、インプラント表面に特異的に接着した成長因子を有する；移植部位からの成長因子の拡散率は、問題の成長因子に対する検体モジュールの親和性に依存して変化し得、これによって異なる拡散速率の成長因子を用いてインプラントを調製し得る。成長因子のインプラント表面に対する接着を含む実施形態において、成長因子は、例えば治癒過程の加速、治癒に必要な成長因子の量の低減、および超生理的用量の成長因子を使用することによって引き起こされる副作用を最小限にすることのような、正の効果を有する。検体モジュール、または検体モジュールに結合する因子のいずれかとして特に興味のある成長因子としては、例えばＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、およびＴＧＦβが挙げられる。
【００１７】
従って、本発明は、患者に外科的に置かれるインプラントを調製する方法を提供し、ここでそのデバイスは少なくとも１つのＩＦＢＭを含む層でコーティングされる。いくつかの実施形態において、その方法は：（ａ）ＩＦＢＭコーティングをインプラントに適用する工程、ここでＩＦＢＭはインプラントに特異的に結合するインプラントモジュールおよび成長因子に特異的に結合する検体モジュールを含む；（ｂ）成長因子を含む溶液をインプラントに浸漬するか、スプレーするか、またはブラシで塗ること（ｂｒｕｓｈｉｎｇ）によって、成長因子をインプラント表面に適用する工程；（ｃ）当業者に公知の適切な外科的技術を用いて、インプラントを患者に置く工程を含む。
【００１８】
あるいは、移植されたデバイスが成長因子の接着を促進するようにインプラントをコーティングする方法は：（ａ）ＩＦＢＭコーティングをインプラントに適用する工程、ここでＩＦＢＭは、インプラントに特異的に結合するインプラントモジュールと、移植部位において成長因子に特異的に結合する検体モジュールとを含む；ならびに（ｂ）インプラントを患者の移植部位に置く工程を含み、これによって宿主によって産生された成長因子がＩＦＢＭによってインプラントに結合する。移植部位において成長因子の存在の増強は、隣接する組織の治癒および隣接する組織へのインプラントの同化を増強する。
【００１９】
本発明の１つの実施形態において、ＩＦＢＭはインプラント表面に対する細胞の接着を媒介する。細胞接着および組織同化を増強することによって、本発明のＩＦＢＭは治癒を加速し、そして移植されたデバイスの機能を改善し得る。従って、本発明によって、患者に外科的に置かれるインプラントを調製する方法は：（ａ）ＩＦＢＭコーティングをインプラントに適用する工程、ここでＩＦＢＭはインプラントに特異的に結合する少なくとも１つのインプラントモジュール、および少なくとも１つの型の細胞に特異的に結合する少なくとも１つの検体モジュールを含む；ならびに（ｂ）インプラントを患者の移植部位に配置する工程を含み得、これによって細胞がインプラント上のＩＦＢＭコーティングに結合する。
【００２０】
いくつかの実施形態において、インプラントを調製する方法は：（ａ）ＩＦＢＭコーティングをインプラントに適用する工程、ここでＩＦＢＭは、インプラントに特異的に結合する少なくとも１つのインプラントモジュール、および少なくとも１つの型の細胞に特異的に結合する少なくとも１つの検体モジュールを含む；ならびに（ｂ）例えば細胞を含む溶液にインプラントを浸漬するか、または細胞を含む溶液をインプラント上にブラシで塗ることによって、インプラント表面に細胞を適用する工程を含む。次いで、このインプラントを患者（すなわち、ヒト患者または動物患者）に配置し得る。本明細書中で使用される「患者」によって、ヒト患者または動物患者のいずれかが意図される。
【００２１】
本発明の別の実施形態において、複数の機能性を有するコーティングを提供するために、インプラントを１つより多くの型のＩＦＢＭでコーティングする。例えば、インプラントコーティングは、細胞に結合する検体モジュールを有する第１のＩＦＢＭ、および成長因子に結合する検体モジュールを有する第２のＩＦＢＭを含み得る。これらのＩＦＢＭを含むコーティングは、インプラント表面に細胞および成長因子をどちらも結合する。いくつかの実施形態において、これらのＩＦＢＭをコーティングで混ぜて、結合した成長因子が結合した細胞と近くになるようにする。１つの実施形態において、コーティングは、間葉系幹細胞に結合するＩＦＢＭと成長因子ＢＭＰ−２に結合するＩＦＢＭとを含む；ＢＭＰ−２は幹細胞の骨芽細胞への分化を惹起する。別の実施形態において、インプラントコーティングは、そのインプラントモジュールおよびその検体モジュールのいずれかまたは両方で異なる、少なくとも２つの異なるＩＦＢＭの混合物を含み得る。別の実施形態において、コーティングは、１つは細胞に結合し、そして１つは成長因子に結合する２つの検体モジュールを有する多機能ＩＦＢＭを含む。
【００２２】
結合モジュール（すなわち、インプラントモジュールおよび／または検体モジュール）は、ペプチド、抗体または抗体フラグメント、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、これらのいずれかを含む複合体、あるいは様々な分子および／または化合物であり得る。ペプチドである結合モジュールは、２００２年１１月２０日に出願され、そして公開番号２００３０１８５８７０として２００３年１０月２日に公開された、係属中の米国特許出願第１０／３００，６９４号において記載されたように識別され得る。いくつかの実施形態において、結合モジュールは、チタン、ステンレス鋼、コバルト−クロム合金、ポリウレタン、ポリエチレンまたはシリコーンのような生体適合性の材料（すなわち「バイオマテリアル」）を含む材料に対する結合に関して、ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって同定され得る。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態において、検体モジュールは生物活性ペプチドであるか、または生物活性ペプチドに結合する。これらの生物活性ペプチドは、当該分野で周知であるように、天然タンパク質の生物学的効果を保持する、天然タンパク質の断片であり得る。例えば、ＴＰ５０８は、ヒトトロンビンのアミノ酸１８３−２００を示すトロンビン由来の合成ペプチドであり、そして骨折の治癒を加速することが示された（例えば、Ｗａｎｇら（２００２）Ｔｒａｎｓ  ＯＲＳ  ２７：２３４を参照のこと）。ＴＰ５０８の機能は、細胞表面に存在するインテグリンに結合する、ペプチド中のＲＧＤ配列によって媒介されると考えられる（例えば、Ｔｓｏｐａｎｏｇｌｏｕら（２００４）Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．９２（４）：８４６−５７を参照のこと）。同様に、Ｐ−１５は、コラーゲンの細胞結合ドメインを示すＩ型コラーゲン由来の１５アミノ酸のペプチドである（例えば、Ｙａｎｇら（２００４）Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．１０（７−８）：１１４８−５９を参照のこと）。Ｐ−１５は、新規の骨形成を増強することが示された（例えば、Ｓｃａｒａｎｏら（２００３）Ｉｍｐｌａｎｔ  Ｄｅｎｔ．１２（４）：３１８−２４を参照のこと）。生物活性ペプチドはまた、成長因子の断片であり得る。例えば、Ｓａｉｔｏら（Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ａ．２００５  ７２Ａ（１）：７７−８２）は、ＢＭＰ−２のアミノ酸７３−９２を示す合成ペプチドが、ＢＭＰ−２レセプターへの結合、遺伝子発現の活性化および異所性の骨形成の誘導を含むＢＭＰ−２の生物学的活性を保持することを示した。
【００２４】
望ましい活性が提供される限り、すなわちＩＦＢＭが適切なインプラントに特異的に結合し、そして検体モジュールによって与えられる適切な効果、すなわちＢＭＰ−２に結合する能力を有する限り、あらゆるインプラントモジュールを、あらゆる検体モジュールと組み合わせて、本発明のＩＦＢＭを作製し得る。当業者は、様々な型および様々な数のインプラントモジュールを、様々な型および様々な数の検体モジュールと組み合わせて、本発明のＩＦＢＭを作製し得ることを認識する。従って、例えば１つまたはそれ以上のインプラントモジュールを１つまたはそれ以上の検体モジュールと連結してＩＦＢＭを作り得る。当業者は、インプラントが作られる材料および検体モジュールによって与えられる望ましい活性に依存して、適切なインプラントモジュールと検体モジュールとを選択し得る。
【００２５】
本明細書中で使用される「抗体」という用語は、単鎖抗体を含む。従って、結合モジュールとして有用な抗体は、単鎖可変フラグメント抗体（ｓｃＦｖ）であり得る。単鎖抗体は、一続きのポリペプチドを形成するよう、直接的にかまたはペプチドリンカーによって一緒に結合された可変重鎖および可変軽鎖を含む抗体である。本明細書中で使用される「１本鎖抗体」という用語は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ハイブリッド抗体、突然変異誘発抗体、ヒト化抗体、および抗原結合部位を含む抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ抗体フラグメントおよびＦｖ抗体フラグメント）を含むがこれに限らない、免疫グロブリンタンパク質またはその機能的部分を含む。
【００２６】
ファージディスプレイ技術は当該分野で周知である。ファージディスプレイを用いて、多様なペプチドのライブラリーを標的基質に提示し得、そして基質に特異的に結合するペプチドを、結合モジュールとして使用するために選択し得る。「パニング」と呼ばれる複数の連続したラウンドのセレクションを使用し得る。当該分野で公知であるように、様々なライブラリーおよびパニング方法のいずれか１つを採用して、本発明の方法において有用な結合モジュールを同定し得る。例えば、抗体または抗体フラグメントのライブラリーを使用して、特定の細胞集団またはウイルスに結合する抗体または断片を同定し得る（例えば、米国特許第６，１７４，７０８；同第６，０５７，０９８号；同第５，９２２，２５４号；同第５，８４０，４７９号；同第５，７８０，２２５号；同第５，７０２，８９２号）；および同第５，６６７，９８８号を参照のこと）。パニング方法は、例えば、溶液相スクリーニング、固相スクリーニング、または細胞に基づくスクリーニングが挙げられ得る。候補結合モジュールが同定されたら、配列の指向性突然変異誘発または無作為の突然変異誘発を使用して、結合モジュールの結合性質を最適化し得る。「バクテリオファージ」および「ファージ」という用語は同義であり、そして本明細書中で交換可能に使用される。
【００２７】
ライブラリーは、分子の無作為のコレクションを含み得る。あるいは、ライブラリーは特定の配列、構造、またはコンフォメーションに対する偏りを有する分子のコレクションを含み得る。例えば、米国特許第５，２６４，５６３号および同第５，８２４，４８３号を参照のこと。様々な型の分子の多様な集団を含むライブラリーを調製する方法は、当該分野で公知であり、そして多数のライブラリーが市販でも入手可能である。ファージライブラリーを調製する方法は、例えば、Ｋａｙら（１９９６）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｂａｒｂａｓ（２００１）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）において見出し得る。
【００２８】
ペプチドである結合モジュール（すなわち、インプラントモジュールまたは検体モジュール）は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、または３００までのアミノ酸を含むペプチドである。結合モジュールとして有用なペプチドは、直線、分枝、または環状であり得、そして非ペプチド成分を含み得る。「ペプチド」という用語は、天然に存在するアミノ酸、合成アミノ酸、遺伝的にコードされたアミノ酸、遺伝的にコードされていないアミノ酸、およびその組み合わせを含むアミノ酸鎖を広く指す。ペプチドは、Ｌ型およびＤ型のアミノ酸をどちらも含み得る。
【００２９】
結合モジュールとして有用なペプチドは、様々な変化、置換、挿入、および欠失を受け得、ここでこのような変化は、その使用におけるある利点を提供する。従って、「ペプチド」という用語は、例えばアミド、タンパク質との結合物、環状化（ｃｙｃｌｏｎｅ）ペプチド、ポリマー化ペプチド、保存的置換変異体、アナログ、断片、化学修飾されたペプチド、およびペプチド模倣物を含む、様々な形式のペプチド誘導体のいずれも含む。望ましい結合特徴を有するあらゆるペプチドを、本発明の実施において使用し得る。
【００３０】
遺伝的にコードされていない代表的なアミノ酸としては、２−アミノアジピン酸；３−アミノアジピン酸；β−アミノプロピオン酸；２−アミノ酪酸；４−アミノ酪酸（ピペリジン酸）；６−アミノカプロン酸；２−アミノヘプタン酸；２−アミノイソ酪酸；３−アミノイソ酪酸；２−アミノピメリン酸；２，４−ジアミノ酪酸；デスモシン；２，２’−ジアミノピメリン酸；２，３−ジアミノプロピオン酸；Ｎ−エチルグリシン；Ｎ−エチルアスパラギン；ヒドロキシリシン；アロ−ヒドロキシリシン；３−ヒドロキシプロリン；４−ヒドロキシプロリン；イソデスモシン；アロ−イソロイシン；Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）；Ｎ−メチルイソロイシン；Ｎ−メチルバリン；ノルバリン；ノルロイシン；およびオルニチンが挙げられるがこれに限らない。
【００３１】
代表的な誘導体化アミノ酸は、例えば遊離のアミノ基が、塩酸アミン、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成するよう誘導体化された分子が挙げられる。遊離のカルボキシル基を、塩、メチルエステルおよびエチルエステルもしくは他の型のエステル、またはヒドラジドを形成するよう誘導体化し得る。遊離のヒドロキシル基を、Ｏ−アシル誘導体またはＯ−アルキル誘導体を形成するよう誘導体化し得る。ヒスチジンのイミダゾール窒素をＮ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成するよう誘導体化し得る。
【００３２】
「保存的置換改変体」という用語は、参照ペプチドの配列と実質的に同じアミノ酸残基配列を有するペプチドを指し、ここで１つまたはそれ以上の残基が機能的に同様の残基で保存的置換されており、その結果、「保存的置換改変体」はその親と実質的に同じ親和性で同じ結合パートナーと結合し、そしてその親の結合を阻止する。１つの実施形態において、保存的置換改変体は、参照ペプチドと比較した場合に同様の結合特異性を示す。「保存的置換改変体」という語句はまた、残基が化学的に誘導体化された残基で置換されたペプチドも含む。
【００３３】
保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような非極性（疎水性）残基の１つと別のものの置換；トリプトファン、チロシン、またはフェニルアラニンのような１つの芳香族残基と別のものの置換；アルギニンおよびリシン間、グルタミンおよびアスパラギン間、グリシン、アラニン、スレオニン、およびセリン間のような、１つの極性（親水性）残基と別のものの置換；リシン、アルギニン、またはヒスチジンのような１つの塩基性残基と別のものの置換；またはアスパラギン酸またはグルタミン酸のような１つの酸性残基と別のものの置換が挙げられる。
【００３４】
本発明のＩＦＢＭで結合モジュールとして使用するための代表的なペプチド配列（例えば、配列表における配列番号１−７４および配列番号７７−５５８）が本明細書中で開示されるが、当業者は、それらの配列によって与えられた結合または他の性質が、その配列により構成されるアミノ酸のいくつかのみに起因し得ることを認識する。本発明の結合モジュールであるペプチドはまた、結合モジュールの望ましい結合性質が保持される限り、本明細書中で開示されたような典型的なペプチド配列の配列と比較して、１つまたはそれ以上の残基の置換、追加、および／または欠失を有するペプチドを含む。従って、本発明の結合モジュールは、本明細書中で開示された典型的な配列から約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸異なるが、特定の材料へ結合する、または検体モジュールとして作用する、対応する典型的配列の能力を保持するペプチドを含む。本明細書中で開示された典型的配列と異なる本発明の結合モジュールは、適切なアッセイを用いて測定した場合、本明細書中で開示された典型的配列全体を含む結合モジュールの、少なくとも２５％、５０％、７５％、または１００％の活性を保持する。
【００３５】
すなわち、本発明の結合モジュールは、本明細書中で開示された典型的配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性、またはそれ以上の配列同一性を共有するペプチドを含む。配列同一性を、手作業で計算し得るか、または数学的アルゴリズムのコンピューターによる実行、例えばＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｖｅｒｓｉｏｎ１０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、９２１２１、ＵＳＡから入手可能）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡを用いて計算し得る。Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅのＶｅｒｓｉｏｎ１０で使用されるスコア付けマトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２である（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照のこと）。これらのプログラムを用い、デフォルトパラメーターを用いて整列を行い得る。
【００３６】
例えば末端ＮＨ２アシル化（例えば、アセチル化、またはチオグリコール酸アミド化）によって、または末端カルボキシルアミド化（例えば、アンモニアまたはメチルアミンを用る）によってペプチドを改変し得る。末端の改変は、タンパク質分解酵素消化による感受性を抑制するために有用であり、従って溶液中、特にプロテアーゼが存在し得る生物学的液体中のペプチドの半減期を延長するために有用である。
【００３７】
環化によって形成される安定な構造のために、およびそのような環状ペプチドで観察される生物学的活性を考慮して、ペプチドの環化も有用な改変である。ペプチドを環化する方法が、例えば、ＳｃｈｎｅｉｄｅｒおよびＥｂｅｒｌｅ（１９９３）Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．１９９２：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｗｅｎｔｙ−Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、１９９２年９月１３−１９日、Ｉｎｔｅｒｌａｋｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｅｓｃｏｍ、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓによって記載される。
【００３８】
必要に応じて、結合性モジュールペプチドは、リンカー分子への連結を促進するために、フッ素、臭素、またはヨウ素のような１つまたはそれ以上のハロゲンを含むよう改変された、１つ以上のアミノ酸を含み得る。本明細書中で使用される場合、「ペプチド」という用語はまた、１つまたはそれ以上のペプチド結合が、偽ペプチド結合（ｐｓｅｕｄｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｏｎｄ）によって置き換えられたペプチドを含み、この結合としては、炭素（ｃａｒｂａ）結合（ＣＨ２−ＣＨ２）、デプシ結合（ＣＯ−Ｏ）、ヒドロキシエチレン結合（ＣＨＯＨ−ＣＨ２）、ケトメチレン結合（ＣＯ−ＣＨ２）、メチレン−オキシ結合（ＣＨ２−Ｏ）、還元結合（ＣＨ２−ＮＨ）、チオメチレン結合（ＣＨ２−Ｓ）、Ｎ−修飾結合（−ＮＲＣＯ−）、およびチオペプチド結合（ＣＳ−ＮＨ）が挙げられるがこれに限らない。例えば、Ｇａｒｂａｙ−Ｊａｕｒｅｇｕｉｂｅｒｒｙら（１９９２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３９：５２３−５２７；Ｔｕｎｇら（１９９２）Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．５：１１５−１１８；Ｕｒｇｅら（１９９２）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２３５：８３−９３；Ｃｏｒｒｉｎｇｅｒら（１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１６６−１７２；Ｐａｖｏｎｅら（１９９３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４１：１５−２０を参照のこと。
【００３９】
目的の表面（チタン、ステンレス鋼、コラーゲン、およびポリグリコール酸（ＰＧＡ）が挙げられる）に特異的に結合し、そして従って本発明のＩＦＢＭにおいて結合モジュールとして使用するために適切である代表的なペプチドが、配列表に述べられ、そして本明細書中の下記でさらに記載される。典型的なペプチド配列が本明細書中で開示されるが、当業者は、それらの配列によって与えられる結合性質は、その配列によって含まれるアミノ酸のいくつかにのみに起因し得ることを認識する。従って、本明細書中で開示された代表的配列の一部のみを含む配列が、全長の典型的な配列と実質的に同じ結合性質を有し得る。従って、特定の典型的な配列の３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、または１２個のアミノ酸のみを含む配列も、結合モジュールとして有用であり、そしてそのようなアミノ酸は典型的な配列中で連続的または非連続的であり得る。そのようなアミノ酸は、典型的なペプチドのアミノ末端に集中し得る（例えば、ペプチドの最初の５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、または１２個のアミノ酸中、４個のアミノ酸に集まり得る）、またはそれらは典型的なペプチド全体に分散し得るが、それにもかかわらずペプチドの結合特性を担い得る。例えば、ＢＭＰ−２に特異的に結合するペプチドは、実施例３で記載されたような、および配列番号２７または２８において述べられたような配列モチーフの全てまたは一部を含み得る。従って、ＢＭＰ−２に特異的に結合するペプチドは、配列番号２７または２８で述べられたような配列モチーフのそれぞれの必要条件に一致する配列を有し得るか、またはそのペプチドは配列モチーフの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の必要条件に一致する配列を有し得る。配列番号２７で述べられた配列モチーフを、位置１、４、６、および７において存在するアミノ酸を制限する４つの「必要条件」を有するとして記載し得る。ＢＭＰ−２に特異的に結合するペプチドは、それらの必要条件のうち４つ全てに一致する配列番号１１で述べられた配列を有し得るか、またはそれはそれらの４つの必要条件のうち３つに一致する配列番号２１で述べられた配列を有し得る。これらの型の配列はどちらも、本発明によって提供される。
【００４０】
いくつかの実施形態において、ＩＦＢＭはタンパク質成長因子の生物学的効果を模倣するように構築された。これらの実施形態において、検体モジュールは、ＢＭＰレセプターＢＭＰＲＩに結合するアミノ酸配列を含み、そしてＢＭＰレセプターＢＭＰＲＩＩに結合するアミノ酸配列も含むペプチドを含む（例えば実施例６を参照のこと）。これらのレセプターは、当該分野で周知であり、そして市販でも入手可能である（例えばＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＣ、カタログ番号３１５−ＢＲおよび８１１−ＢＲ）。これらの実施形態において、検体モジュールは、例えば当該分野で公知であり、そして実施例６で記載される技術によって測定されるようなＢＭＰ活性を有する。本発明は、いかなる特定の操作のメカニズムにも拘束されないが、ＢＭＰＲＩおよびＢＭＰＲＩＩのそれぞれに結合することによって、検体モジュールはこれらのレセプターのヘテロダイマー化を促進し、それによってＢＭＰ−ＳＭＡＤ経路によるシグナル伝達を惹起すると考えられる。この方式において、ＢＭＰそれ自身を加えることなくＢＭＰ−ＳＭＡＤ経路によるシグナル伝達を惹起するように、ＩＦＢＭを構築し、そしてインプラントの表面をコートするために使用し得る。一般的に、天然のＢＭＰ−ＳＭＡＤ経路において、ＢＭＰＩ型レセプターおよびＢＭＰＩＩ型レセプターのヘテロダイマー化が、シグナル伝達に必要である（例えば、Ｃｈｅｎら（２００４）Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ２２：２３３−２４１を参照のこと）。ダイマー化は、Ｉ型およびＩＩ型レセプターの細胞質ドメインを近付け、構成的に活性なＩＩ型レセプターキナーゼがＩ型レセプターをリン酸化することを可能にする。Ｉ型レセプターの細胞質ドメインのリン酸化は、その潜在性のキナーゼ活性を活性化し、それが今度はＳｍａｄタンパク質を活性化する。レセプターから放出された後、リン酸化Ｓｍａｄタンパク質は、Ｓｍａｄ４と結合し、そしてこの複合体は核に移動して、他のタンパク質と共に転写因子として機能し、そして応答性遺伝子を調節する（Ｃｈｅｎら（２００４）Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ２２：２３３−２４１）。まとめると、このことは、下流のＳｍａｄまたはＢＭＰ−ＳＭＡＤのシグナル伝達経路、およびそれによって活性化される遺伝子と呼ぶことができる。ＳｍａｄまたはＢＭＰ−ＳＭＡＤ経路の活性化の結果として産生されるタンパク質を、Ｓｍａｄ活性化下流タンパク質産物と呼ぶことができる。
【００４１】
ペプチドである本発明の結合モジュールを、ペプチド合成の当業者に公知であるあらゆる技術によって合成し得る。代表的な技術を、例えばＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ（１９６９）Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６９）Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：２２１−２９６；ＦｉｅｌｄｓおよびＮｏｂｌｅ（１９９０）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３５：１６１−２１４；およびＢｏｄａｎｓｚｋｙ（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２改訂版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ）において見出し得る。代表的な固相合成技術を、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎら（２０００）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ５５：２２７−２５０、そこで引用された参考文献、および米国特許第６，０１５，５６１号；同第６，０１５，８８１号；同第６，０３１，０７１号；および同第４，２４４，９４６号において見出し得る。溶液中のペプチド合成が、ＳｃｈｒｏｄｅｒおよびＬｕｂｋｅ（１９６５）Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）において記載されている。ペプチド合成に有用な、適切な保護基が、上記のテキストおよびＭｃＯｍｉｅ（１９７３）Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）において記載されている。遺伝的にコードされていないアミノ酸を含むペプチドを含むペプチドをまた、Ｓｈｉｍｉｚｕら（２００１）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：７５１−７５５によって記載された系のような、無細胞翻訳系において産生し得る。それに加えて、明記されたアミノ酸配列を有するペプチドを、市販の供給源（例えば、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＢｉｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏ．，ＬＬＣ、およびＬｉｖｅｒｍｏｒｅ、ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＰｅｐｔｉｄｏＧｅｎｉｃｓ）から購入し得る。
【００４２】
結合モジュールを、少なくとも１つのリンカーで連結して本発明のＩＦＢＭを形成する。いくつかの実施形態において、ペプチドである結合モジュールから成るＩＦＢＭを、単一の連続的なペプチドとして合成する；これらの実施形態において、リンカーは単にペプチド中の結合の１つである。本発明の他の実施形態において、リンカーは、合成ポリマーまたは天然ポリマーを含むポリマーを含み得る。リンカーとして有用な、代表的な合成ポリマーとしては、ポリエーテル（例えば、ポリエチレングリコール；ＰＥＧ）、ポリエステル（例えば、ポリ乳酸（ＰＬＡ）およびポリグリコール酸（ＰＧＡ））、ポリアミド（例えば、ナイロン）、ポリアミン、ポリアクリル酸、ポリウレタン、ポリスチレン、および約２００ダルトンから約１０００キロダルトンの分子量を有する他の合成ポリマーが挙げられるがこれに限らない。リンカーとして有用な、代表的な天然ポリマーとしては、ヒアルロン酸、アルギン酸塩、コンドロイチン硫酸、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、アルブミン、コラーゲン、および約２００ダルトンから約２０，０００キロダルトンの分子量を有する他の天然ポリマーが挙げられるがこれに限らない。ポリマー性リンカーは、ジブロックポリマー、マルチブロックコポリマー、櫛型ポリマー、星型ポリマー、樹状ポリマー、ハイブリッド直鎖状−樹状ポリマー、またはランダムコポリマーを含み得る。
【００４３】
リンカーはまた、メルカプト（アミド）カルボン酸、アクリルアミドカルボン酸、アクリルアミド−アミドトリエチレングリコール酸、およびその誘導体を含み得る。例えば、米国特許第６，２８０，７６０号を参照のこと。リンカーがペプチドを含む場合、そのペプチドは、ＹＧＤおよびＧＳＲのような、特定の生物学的機能を有することが公知である配列を含み得る。
【００４４】
リンカー分子を結合ドメインに連結する方法は、各分子に存在する反応基によって変化する。反応基および分子を用いて連結するプロトコールは、当業者に公知である。例えば、Ｇｏｌｄｍａｎら（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：１４４７−１４５１；Ｃｈｅｎｇ（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：２７５−２８２；Ｎｅｒｉら（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：９５８−９６１；Ｎａｂｅｌ（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ、ＣＤ−ＲＯＭの巻（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｐａｒｋら（１９９７）Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０：３９９−４３５；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５４２−５４６；ＢａｕｍｉｎｇｅｒおよびＷｉｌｃｈｅｋ（１９８０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７０：１５１−１５９；米国特許第６，２８０，７６０号および同６，０７１，８９０号；および欧州特許第０４３９０９５号および同０７１２６２１号を参照のこと。
【００４５】
医療用デバイスの表面を、例えばＩＦＢＭをデバイスに浸漬するか、スプレーするか、またはブラシで塗ることによって、あらゆる適切な方法によってコーティングする。例えば空気乾燥または凍結乾燥によって、コーティングを安定化し得る。しかし、これらの処理は独占的ではなく、そして他のコーティングおよび安定化方法を採用し得る。適切な方法は当該分野で公知である。例えばＨａｒｒｉｓら（２００４）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２５：４１３５−４１４８および２００３年８月１９日に出願され、そして公開番号第２００４００８７５０５で２００４年５月６日に公開された、米国特許出願第１０／６４４，７０３号を参照のこと。
【００４６】
明細書中で言及された全ての出版物および特許出願は、本発明が属する当業者のレベルを示す。全ての出版物および特許出願は、個々の出版物または特許出願がそれぞれ明確におよび個々に参考文献に組み込まれると示されたのと同じ程度、本明細書中で参考文献に組み込まれる。
【００４７】
前述の説明および付随する図において示された教示の利点を有する、本明細書中で述べられた本発明の多くの変更および他の実施形態が、これらの発明が属する当業者に考えられる。従って、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されないこと、および変更および他の実施形態が、添付の請求の範囲内に含まれるよう意図されることが理解される。特定の用語が本明細書中で採用されるが、それらは一般的および説明的な意味でのみ使用され、制限の目的のためではない。
【実施例】
【００４８】
（実験）
（実施例１：チタンに結合するペプチドの単離）
１０個の異なるファージディスプレイライブラリーを、チタンビーズへの結合に関してスクリーニングした。直径約５／３２インチのチタン（Ｔｉ６Ａｌ４Ｖ）ビーズを、７０％エタノール、４０％硝酸、蒸留水、７０％エタノールおよびアセトンで洗浄して、あらゆる表面の混入物を除去した。９６穴ポリプロピレンプレート（Ｎｕｎｃ）の１つのウェルあたり１つのチタンビーズを置いた。
【００４９】
チタンおよびポリプロピレンの表面の非特異的結合部位を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、カタログ番号Ｐ−３８１３）中１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした。プレートを５０ｒｐｍで振とうしながら、室温で１時間インキュベートした。次いでウェルを３００μｌのＰＢＳで５回洗浄した。各ライブラリーをＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中で希釈し、そして２５０μｌの最終容量で、１０１０ｐｆｕ／ｍｌの濃度で加えた。室温で３時間および５０ｒｐｍで振とうしながらインキュベートした後、結合していないファージを、３００μｌのリン酸緩衝化生理食塩水−ＴｗｅｅｎＴＭ２０（ＰＢＳ−Ｔ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、カタログ番号Ｐ−３５６３）で３回洗浄することによって除去した。チタンビーズに結合したファージを回収するために、５０ｍＭのグリシン、ｐＨ２で１０分間処理し、その後１００ｍＭのエタノールアミン、ｐＨ１２で１０分間処理することによって、結合したファージを放出した。溶出されたファージをプールし、２００μｌの２００ｍＭ  ＮａＰＯ４  ｐＨ７で中和化した。溶出したファージおよびビーズを、２×ＹＴ培地中のＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αＦ’細胞に直接加えた。その混合物を３７℃、２１０ｒｐｍの振とう器で一晩インキュベートした。次いで８５００×ｇで１０分間遠心した後ファージ上清を回収した。２００μｌのＰＢＳ＋１％ＢＳＡで希釈したインプットとして、前の回からの増幅したファージの５０μｌを用いて、２回目および３回目のセレクションを、１回目と同様の方法で行った。４回目のセレクションを同様の方式で行った；しかし、洗浄を変更した。４時間の結合反応の後、ビーズをＰＢＳ−Ｔ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、カタログ番号Ｐ−３５６３）で５回洗浄し、ビーズを２ｍｌのウェルを有する清潔なポリプロピレンプレートに移し、１ｍｌのＰＢＳ＋１％ＢＳＡを各ウェルに加え、そして洗浄液を５０ｒｐｍで振とうしながら室温で一晩インキュベートした。次の朝、ファージを溶出し、そして１−３回目で記載した同じ方法で増幅した。次いで個々のクローンファージを単離し、そしてファージのプールの希釈液をプレートする（ｐｌａｔｉｎｇ  ｏｕｔ）ことによって試験して単一のプラークを得た。
【００５０】
チタンに特異的に結合するファージを検出するために、ＨＲＰに結合した抗Ｍ１３ファージ抗体を用いて、続いて色素生産性薬剤ＡＢＴＳを加えて、通常のＥＬＩＳＡを行った。ファージの相対的結合力を、ＥＬＩＳＡにおいて、チタンに対する結合に関してファージの系列希釈を試験することによって決定した。
【００５１】
チタンに特異的に結合するペプチドをコードするＤＮＡ配列を決定した。ペプチド挿入断片をコードする配列は、ファージゲノムに位置し、そして翻訳されてファージ表面に提示された対応するアミノ酸配列を生じた。
【００５２】
チタンに特異的に結合する代表的なペプチドを表１に列挙し、そして配列番号第１−８番として述べる。これらのペプチドを提示するファージのチタンビーズに対する結合を図１に示す。
【００５３】
【表１】
2008504850.tif 000003
次いで提示されたペプチドを、Ｃ末端ビオチン残基と共に合成し、そしてチタンに対する結合に関して試験した。結果を図２に示す。簡単には、粉末を１００％ＤＭＳＯに溶解して１ｍＭのペプチド溶液を作成することによって、ペプチドストック溶液を作製した。ＰＢＳ−Ｔでペプチドの系列希釈を作製した。ＰＢＳ中１％の脱脂粉乳でブロックしたチタンビーズを、様々な濃度のペプチドと、振とうしながら室温で１時間インキュベートした。ビーズをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ＵＳＢのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ＳＡ−ＡＰ）（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、カタログ番号１１６８７）を加え（ＰＢＳ−Ｔ中１：１０００）、そして振とうしながら室温で１時間インキュベートした。ビーズをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、そしてＰＮＰＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．、ＳｉｇｍａＦａｓｔタブレット、カタログ番号Ｎ１８９１）を加え、そして約１０分間発色させることによって、ペプチド：ＳＡ−ＡＰの量を決定した。溶液を透明なマイクロタイタープレートに移し、そしてＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒで４０５ｎｍにおける吸光度を読み取ることによって、定量を行った。ペプチド「９００３」は当該分野で公知である。このペプチドを酵素ヘキソキナーゼに結合したファージディスプレイによって同定した；これはこの実験のネガティブコントロールとして役立つ（例えば、Ｈｙｄｅ−ＤｅＲｕｙｓｃｈｅｒら（２０００）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７：１７−２５を参照のこと）。
【００５４】
（実施例２：チタン結合ペプチド６００７におけるシステイン残基の役割）
ペプチド６００７のチタンに対する結合における、システイン残基およびジスルフィド形成の役割を探索するために、ペプチドＡＦＦ６０１０を合成し（表２）、ここでチタン結合ペプチドＡＦＦ６００７において存在するシステイン残基をセリン残基に変化させた。ペプチドＡＦＦ６０１０の配列（ＳＳＳＤＫＳＨＫＨＷＹＳＹＥＳＫＹＧＧＳＧＳＳＧＫ）は配列番号９に示され、一方ペプチドＡＦＦ６００７の配列（ＳＳＳＤＫＣＨＫＨＷＹＣＹＥＳＫＹＧＧＳＧＳＳＧＫ）は配列番号１０に示される。次いで、これらのペプチドＡＦＦ６００７およびＡＦＦ６０１０をビオチンに結合させ、そして以下のようにチタンビーズに対する結合に関して比較した。
【００５５】
チタンビーズをＰＢＳ中１％のＢＳＡで、室温で３０分間ブロックした。ペプチドＡＦＦ６００７およびＡＦＦ６０１０のストック溶液を、１−２ｍｇのペプチドを水に溶解することによって調製した。各ペプチドの最終濃度を、２８０ｎｍにおける吸光度および各ペプチドの吸光係数を用いて決定した。ＡＦＦ６００７およびＡＦＦ６０１０を２００μＭで調製した。次いで系列希釈を、各ペプチドサンプルに関して調製した。各ペプチドを、ＰＢＳ中１％のＢＳＡ中で３倍希釈させた。
【００５６】
これらのペプチドをチタンビーズと室温で１時間インキュベートした。次いでビーズをＰＢＳ／ＴｗｅｅｎＴＭ２０で２回洗浄した。次いでストレプトアビジン−アルカリホスファターゼを、１：５００で、室温で３０分間ビーズに加えた。ビーズをＰＢＳ／ＴｗｅｅｎＴＭ２０で２回洗浄した。アッセイを発色させるためにＰＮＰＰを使用し、そして４０５ｎｍにおける吸光度を記録した。
【００５７】
図３に示す結果は、ペプチドＡＦＦ６００７およびＡＦＦ６０１０はどちらもチタンに結合することを示す。ペプチドのチタンに対する相対的親和性の推定を、最大シグナルの１／２を示すペプチド濃度を決定することによって行い得る（表２）。ＡＦＦ６００７におけるシステイン残基の完全な除去は、ペプチドのチタンに対する親和性を約１０倍減少させるが、それを無くすことはない（表２）。従って、システイン残基は、チタンに対する結合に必要ではないが、ペプチドのチタンに対する親和性を増加させる。
【００５８】
【表２】
2008504850.tif 000004
（実施例３：骨形成タンパク質２（「ＢＭＰ−２」）に特異的に結合するペプチド）
（ペプチドの単離および分析）
１０個の異なるファージディスプレイライブラリーを、ＢＭＰ−２に対する結合に関してスクリーニングした。ＢＭＰ−２（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ）をＮＨＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）でビオチン化して、タンパク質分子あたり平均１つのビオチンを有する標識タンパク質を作製した。このタンパク質をストレプトアビジン（ＳＡ）でコーティングしたプレートに固定化し、そしてファージディスプレイの標的として使用した。タンパク質を提示する第２の方法として、ＢＭＰ−２をまた、製造業者の指示に従って、ＮＨＳ−スクシニミド化学反応を用いてセファロースビーズに連結し（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ、参照番号１８−１０２２−２９、表題「Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ａｍｉｎｅ  ｏｆ  ａ  Ｌｉｇａｎｄ  ｔｏ  ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ」、１０５−１０８頁）、そしてそのビーズを固相として使用して未結合のファージからの遊離のものを分離した。３回のセレクションの後、各フォーマットからの個々のクローンを、ＨＲＰに結合した抗Ｍ１３ファージ抗体を用い、従来のＥＬＩＳＡを利用し、続いて発色剤ＡＢＴＳを加えることによって、ＳＡでコートしたプレート上でＢＭＰ−２に対する結合に関して試験した。
【００５９】
ＢＭＰ−２に特異的に結合するペプチドをコードするＤＮＡ配列を決定した。ペプチド挿入断片をコードする配列は、ファージゲノム中に位置し、そして翻訳されてファージ表面に提示される対応するアミノ酸配列を生成した。ＢＭＰ−２に特異的に結合する代表的なペプチドを表３に列挙し、そして配列番号１１−２６として記載する。いくつかの実施形態において、本発明の代表的な結合モジュールは、大文字で示された配列の部分のみを含む。
【００６０】
【表３】
2008504850.tif 000005
同定されたペプチドは、２つの異なる「配列クラスター」に分かれる。各配列クラスターは、共通の配列モチーフを含む。ＢＭＰ−結合ペプチドの第一の配列クラスターに関して、共通のモチーフ（「モチーフ１」と呼ばれ、そして配列番号２７に記載される）は、芳香族のもの−Ｘ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ｘ−「小さいもの」−Ｌｅｕ（芳香族のもの＝Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、またはＴｙｒ；Ｘ＝任意のアミノ酸；「小さいもの」＝Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＧｌｙ）である。モチーフ１は、上記の表３において示されるように、配列番号１１−２４において少なくとも部分的に見出される。第二の配列クラスターモチーフ（また、配列番号２８に記載される）は、配列（ＬｅｕまたはＶａｌ）−Ｘ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−（ＬｙｓまたはＡｒｇ）−Ｇｌｙを含む。モチーフ２と呼ばれるこのモチーフは、上記の表３において示されるように、配列番号２５および２６において見出される。代表的な結合モジュールはまた、本明細書中で同定されるこの配列モチーフまたは他の配列モチーフの必要条件を満たす配列を含む（すなわち、それらモジュールはこれらのモチーフ内に含まれる配列を含む）。
【００６１】
ＢＭＰ−２に結合する配列のさらなる特徴を決定するために、さらなる実験を行った。具体的には、これらのモチーフを囲むさらなる好ましいアミノ酸が存在するかどうかを決定するために、さらなるスクリーニングを行った。下記でさらに議論するように、集束ライブラリー（ｆｏｃｕｓｅｄ  ｌｉｂｒａｒｙ）を設計し、そしてｍＡＥＫファージディスプレイベクターにクローニングし、そして得られたファージを、ＢＭＰ−２に対する結合に関してスクリーニングした。以下の配列を含むペプチドを発現するよう、モチーフ１の集束ライブラリーを設計した：Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｗ／Ｌ／Ｃ／Ｙ／Ｆ／Ｓ）−Ｘ−Ｘ−（Ｗ／Ｌ／Ｃ／Ｙ／Ｆ／Ｓ）−Ｘ−（Ａ／Ｇ／Ｎ／Ｓ／Ｔ）−（Ｌ／Ｆ／Ｉ／Ｍ／Ｖ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ、ここでＸは２０個の天然に存在するアミノ酸のいずれかを示し、そしてカッコ内の位置はカッコ内に列挙されたアミノ酸に限定する。これらのペプチドは、配列：
【００６２】
【化１】
2008504850.tif 000006
（ここで「Ｎ」は４つのヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、またはＴのいずれかである；「Ｋ」はＧまたはＴである；「Ｒ」はＡまたはＧである；「Ｓ」はＣまたはＧである；「Ｂ」はＣ、Ｇ、またはＴである；および「Ｙ」はＣまたはＴである）を含むオリゴヌクレオチドによってコードされた。モチーフ２の集束ライブラリーを、以下の配列を含むペプチドを発現するよう設計した：Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｌ／Ｆ／Ｉ／Ｍ／Ｖ）−Ｘ−（Ｗ／Ｌ／Ｃ／Ｙ／Ｆ／Ｓ）−（Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ａ）−（Ｌ／Ｆ／Ｉ／Ｍ／Ｖ）−（Ｉ／Ｍ／Ｔ／Ｎ／Ｋ／Ｓ／Ｒ）−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ。これらのペプチドは、配列：
【００６３】
【化２】
2008504850.tif 000007
を含むオリゴヌクレオチドによってコードされた。
【００６４】
モチーフ１集束ライブラリーの代表的なライブラリー構築スキームとして、以下を提供する。当業者によって認識されるように、他のライブラリーに関して、同様の戦略を使用し得る。モチーフ１の集束ライブラリーを作製するため、適切な制限酵素部位にはさまれた上記の配列を含むオリゴヌクレオチドを合成した。このオリゴヌクレオチドは、配列：
【００６５】
【化３】
2008504850.tif 000008
を含んでいた。この配列において、下線を引いた配列ＣＴＣＧＡＧおよびＴＣＴＡＧＡは、ライブラリーをファージベクターにクローニングするために使用する、ＸｈｏＩ制限酵素部位およびＸｂａＩ制限酵素部位を示す。短いプライマーをオリゴヌクレオチドにアニーリングさせ、そしてＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖を合成する。得られた２本鎖ＤＮＡ分子を、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩで消化し、そしてファージディスプレイベクターにクローニングする。ライゲーションしたＤＮＡを適切な細菌宿主へ形質転換し、そして増幅してファージライブラリーを形成する。
【００６６】
モチーフ１およびモチーフ２の集束ライブラリーを、上記で記載されたように、ストレプトアビジンをコートしたプレートに固定化されたビオチン化ＢＭＰ−２を用いて、ＢＭＰ−２に対する結合に関してスクリーニングした。ＢＭＰ−２に対する２回のセレクションの後、ＢＭＰ−２に結合するペプチドを提示するファージについてライブラリーを富化した。富化したファージのプールを、細菌細胞の菌叢にプレートし、個々のファージを単離した。個々のファージクローンを、ＥＬＩＳＡ型のアッセイおよびＨＲＰに結合した抗Ｍ１３ファージ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃２７−９４２１−０１）を用いて、続いて発色剤ＡＢＴＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、カタログ番号Ａ３２１９）を加えて、ＢＭＰ−２に対する結合に関して試験した。
【００６７】
ＢＭＰ−２に特異的に結合するペプチドをコードするＤＮＡ配列を決定した。ペプチド挿入断片をコードする配列は、ファージゲノムに位置し、そして翻訳されてファージ表面に提示された対応するアミノ酸配列を生成した。
【００６８】
ＢＭＰ−２に特異的に結合するモチーフに基づく集束ライブラリー由来の代表的なペプチドを、表４および５に列挙し、そして配列番号４４−７１および配列番号７７−９２として記載する。いくつかの実施形態において、本発明の代表的な結合モジュールは、大文字で示された配列の一部のみを含むか、またはこれらの配列に基づいて同定されたモチーフまたはコンセンサス配列内に含まれる配列のみを含む（すなわち、モチーフ１、モチーフ１ａ、またはモチーフ２の範囲内に含まれる配列を含むか、または配列番号７２、７４、または９３に識別されるコンセンサス配列を含む）。
【００６９】
【表４】
2008504850.tif 000009
ＢＭＰ−２に結合し、そしてモチーフ１を含む、表３および６由来の全てのペプチド配列の分析の結果を作成し、そして図７に示す。モチーフ１を含む４０個のＢＭＰ結合配列の整列から、コンセンサス配列を得ることができ（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ；配列番号７２）、それは全てのペプチドを整列させた後に各位置において見出される優勢なアミノ酸を示す。４０個の配列のうち、最も保存されたアミノ酸が、コア結合モチーフを形成し、それはモチーフ１を含む全ての配列のサブセットを示す。「モチーフ１ａ」と呼ばれるこのモチーフは、配列Ｔｒｐ−Ｘ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ｘ−Ｘ−Ｌｅｕ（配列番号７３）を有する。本発明はいかなる特定の作用メカニズムに拘束されないが、このモチーフにおいて、ペプチドのＴｒｐ、Ｐｈｅ、およびＬｅｕ残基がＢＭＰ−２タンパク質との特異的相互作用に関与し、それがペプチドのＢＭＰに対する結合の原因であると考えられる。これに基づいて、このコア結合モチーフを含む他のペプチドも、ＢＭＰに結合するという仮説を立てた。
【００７０】
この考えを試験するために、ペプチド配列の並びの中にこのコア結合モチーフ１ａを含むペプチドを発現するオリゴヌクレオチドカセットを設計した。この配列はまた、その配列中に同定された他の位置に対するコンセンサス残基（これもまたコア結合モチーフをはさむ）を含んでいた（図８；配列番号７４を参照のこと）。偶発的に、ファージディスプレイによって以前に単離されたＢＭＰ結合ペプチドのどれも、実際この正確な配列を含まない（例えば表４を参照のこと）。このオリゴヌクレオチドカセットを、ｍＡＥＫファージディスプレイベクターにクローニングし、そして得られたファージ（ＡＰ０２−６１と呼ばれる）をＢＭＰ−２への結合に関して試験し、そして他のファージディスプレイＢＭＰ結合ペプチドと比較した（いくつかのファージの結果を図９に示す）。少なくとも１つの試験したファージ（ＡＰ０２−３７と呼ばれる）が、ディスプレイベクターｍＡＥＫのものと同等またはそれより下のレベルで結合を示した。いくつかの実施形態において、本発明の代表的な結合モジュールは、大文字で示された配列の部分のみを含む。
【００７１】
【表５】
2008504850.tif 000010
モチーフ２を含む、表３および７由来のペプチドの整列から、コンセンサス配列を得ることができ（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｌａ；配列番号９３；図１０を参照のこと）、それは全てのペプチドを整列させた後に各位置において見出される優勢なアミノ酸を示す。試験した配列のうち、最も保存されたアミノ酸は、「モチーフ２ａ」と呼ばれるコア結合モチーフを形成し、それは配列Ｌｅｕ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号９４）を有する。
【００７２】
モチーフ２は、モチーフ１よりも配列においてより制限されているようであり、ここでモチーフ２は６つの位置において必要条件を課すが、一方モチーフ１は３つの位置においてのみ必要条件を課す。全てのモチーフ２を含むＢＭＰ結合ペプチドがコア結合モチーフにおいて見出されるＰｒｏ残基およびＧｌｙ残基を含むので、モチーフ２のＰｒｏ残基およびＧｌｙ残基は、結合に必要なようである。モチーフ２のコンセンサス配列情報を用いて、モチーフ２コア結合モチーフをペプチド配列に組み込むことによって、ＢＭＰ結合ペプチドを設計し得る。
【００７３】
（合成ペプチドの作製およびＢＭＰ−２結合アッセイ）
次いで、提示されるペプチドの代表的なセットを、Ｃ末端ビオチン残基と共に合成し、そしてＢＭＰ−２に対する結合に関して試験した。結果を図４に示す。簡単には、粉末を１００％のＤＭＳＯに溶解して１０ｍＭのペプチド溶液を作製することによってペプチドストック溶液を作製し、次いで１０％のＤＭＳＯ中１ｍＭのペプチドの最終ストック濃度に水を加えた。ペプチドの系列希釈をＰＢＳ−Ｔで作製した。１００ｎｍから０．１ｎｍまでの範囲の濃度を有するＢＭＰ−２の希釈系列を、マイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶｉｒｇｉｎｉａのＩｍｍｕｌｏｎ−４（登録商標）ＨＢＸ）のウェルに固定化し、そして１％のＢＳＡでブロックした。これらのプレートを様々な濃度のペプチドと共に、振とうしながら室温で１時間インキュベートした。ビーズをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ＵＳＢのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ＳＡ−ＡＰ）（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、カタログ番号１１６８７）を加え（ＰＢＳ−Ｔ中１：１０００）、そして振とうしながら室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、そしてペプチド：ＳＡ−ＡＰの量を、ＰＮＰＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．、ＳｉｇｍａＦａｓｔタブレット、カタログ番号Ｎ１８９１）を加えて、そして約１０分間発色させることによって決定した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒにおいて、４０５ｎｍにおける吸光度を読むことによって、定量を行った。結果を図４にまとめる。
【００７４】
これらのＢＭＰ結合結果を確認するために、ペプチドを第２のアッセイ形式においても試験し、ここでペプチドおよびＢＭＰ２を溶液中で結合させ、そして次いでアッセイした。簡単には、ペプチドのＣ末端におけるリシン残基のεアミノ基に結合したビオチン基を有するペプチドを合成した。ビオチン化ペプチド（０−１２ｐｍｏｌ）を、溶液中でＢＭＰ−２（０−２５ｐｍｏｌ）と混合し、そしてポリプロピレンプレートにおいて３７℃で３０分間インキュベートさせた。この溶液をストレプトアビジンでコーティングしたプレートに移し、そして３７℃で１時間インキュベートしてビオチン化ペプチドを捕獲した。プレートをＴＢＳ−ＴｗｅｅｎＴＭ２０で洗浄し、そして次いで抗ＢＭＰ抗体（１：１０００希釈；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）と室温で１時間インキュベートした。洗浄の後、次いでアルカリホスファターゼで標識した２次抗体をプレートに加え、そして室温で３０分間インキュベートした。プレートをＴＢＳ−ＴｗｅｅｎＴＭ２０で洗浄し、そして色素生産性ＡＰ基質ｐＮＰＰを用いて抗体の結合を検出した。代表的な結果を図１１に示す。このデータから、各ＢＭＰ結合ペプチドのＢＭＰ−２に対する親和性を計算した（表６）。
【００７５】
【表６】
2008504850.tif 000011
（ＢＭＰ−２結合ペプチドは、他のＢＭＰタンパク質に結合する）
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、ＢＭＰ、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）および成長／分化因子（ＧＤＦ）を含むＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーである。ＴＧＦ−βスーパーファミリーのタンパク質は、構造的に非常に類似している。タンパク質骨格の折り畳まれた構造は、ファミリーの全てのメンバーの間でほとんど同一である。ＢＭＰ間の構造における類似性に基づいて、本発明者らは、いくつかのＢＭＰ−２結合ペプチドがＢＭＰ−４およびＢＭＰ−７に結合する能力を試験した。ビオチン化ペプチド２００７および２０１１を、上記で記載したように、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、およびＢＭＰ−７に対する結合に関して試験した。２００７および２０１１はどちらも、３つのＢＭＰ全てに結合し、一方無関係な標的に結合するペプチド（ＡＦＦ−９００１）は、どのＢＭＰにも結合しなかった（図１２）。
【００７６】
（実施例４：ＢＭＰ−２をコラーゲン上に固定化するＩＦＢＭの作製）
コラーゲン結合特性およびＢＭＰ−２結合特性を有する分子を設計するために、コラーゲンに結合するペプチドおよびＢＭＰ−２に結合するペプチドを含むＩＦＢＭを作製した。この「ハイブリッドペプチド」ＩＦＢＭの例を、表７に示す。
【００７７】
【表７】
2008504850.tif 000012
表７で示すように、各ＩＦＢＭは短いリンカー配列が続くＡＦＦ００１６由来のコラーゲン結合ドメインを含み、それは次いで「ハイブリッドペプチド」において上記の実施例由来のＢＭＰ結合配列に連結される。これらの分子を両方の方向で合成して、ＩＦＢＭがコラーゲンまたはＢＭＰ−２に結合する能力に対するＮ末端位置またはＣ末端位置の効果を評価した。
【００７８】
これらのＩＦＢＭがコラーゲンスポンジによって保持されるＢＭＰの量を増加させたかどうかを決定するために、本発明者らは、ＩＦＢＭとＢＭＰを混合し、この混合物をスポンジに加え、１．５時間それらを結合させ、スポンジを洗浄し、そして抗ＢＭＰ抗体を用いて結合したＢＭＰを検出した。簡単には、１−２ｍｇのペプチドを量り、そして水に溶解することによって、ストックＩＦＢＭ溶液を調製した。２８０ｎｍにおけるペプチドの吸光度および吸光係数を分析することによって、最終ペプチド濃度を決定した。各列に関して、２０μＬのペプチドを、ポリプロピレンマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。次いでＢＭＰを、３２μＭのＢＭＰから始まる３倍の希釈系列でこれらのウェルのそれぞれに加えた。ＩＦＢＭおよびＢＭＰを室温で３０分間混合させた。
【００７９】
各ウェルに、直径２／１６”のコラーゲンスポンジ（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ）を加えた。このコラーゲンとペプチドとの溶液を、室温で１．５時間インキュベートさせた。次いでスポンジを２００μＬのＭｅｄｔｒｏｎｉｃ緩衝液で、２２００ｒｐｍで１分間、３回すすいだ。各スポンジに対して、ＢＭＰに対する１次抗体（１：１０００に希釈；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ＃ＭＡＢ３５５２）を、室温で１時間加えた。次いでアルカリホスファターゼに結合した２次抗体（１：５０００）を、その系において室温で０．５時間インキュベートした。その系を発色させるためにＰＮＰＰを使用し、４０５ｎｍにおける吸光度を読み取った。結果を図５に示す。
【００８０】
図５に示した結果は、ＩＦＢＭ  ＡＦＦ７０１０が、ＩＦＢＭなしのスポンジより、多くのＢＭＰをスポンジに保持することを示す。ＩＦＢＭ  ＡＦＦ７００８およびＡＦＦ７０１７は、ＩＦＢＭなしと比較した場合にスポンジにおけるＢＭＰの量を増加させるが、ＡＦＦ７０１０より少ない程度である。ＢＭＰのスポンジへの保持の増加は、コラーゲン結合配列を含まないＢＭＰ結合ペプチドであるＡＦＦ２００６の添加によっては認められない。
【００８１】
この効果が、スポンジに加えたＢＭＰの量だけでなく、存在するＩＦＢＭの量に対しても用量依存性であることを示すために、ＩＦＢＭおよびＢＭＰ両方の濃度が変動させて、一連の２次元用量反応性曲線を得た。これらの結果を図６Ａ−６Ｄで示し、そしてＢＭＰのコラーゲンスポンジに対する結合は、ＢＭＰ濃度およびＩＦＢＭ濃度の両方に依存性であることを示す。ＩＦＢＭ（ＡＦＦ７００５、ＡＦＦ７００６、ＡＦＦ７００９、またはＡＦＦ７０１０）の濃度を増加させることは、より多くの量のＢＭＰ−２がコラーゲンに保持されることを引き起こす。
【００８２】
（実施例５：ステンレス鋼に結合するペプチド）
チタンビーズの代わりに５／３２インチのステンレス鋼ビーズを使用した以外は、チタン結合ペプチドに関して上記で記載されたように、ステンレス鋼結合ペプチドのセレクションを行った。単離されたステンレス鋼結合ペプチドを表８に示す。いくつかの実施形態において、本発明の代表的な結合モジュールは、大文字で示された配列部分のみを含む。
【００８３】
【表８】
2008504850.tif 000013
（実施例６：テフロン（登録商標）に結合するペプチド）
チタンビーズの代わりにＧｏｒｅＴｅｘ布の断片を使用した以外は、チタン結合ペプチドに関して上記で記載されたように、テフロン（登録商標）（ＧｏｒｅＴｅｘ（登録商標）；ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ））結合ペプチドのセレクションを行った。単離されたテフロン（登録商標）結合ペプチドを表９に示す。いくつかの実施形態において、本発明の代表的な結合モジュールは、大文字で示された配列部分のみを含む。
【００８４】
【表９】
2008504850.tif 000014
（実施例７：ＢＭＰＲＩおよび／またはＢＭＰＲＩＩに特異的に結合するペプチドの単離）
ＢＭＰＲＩおよび／またはＢＭＰＲＩＩに結合するペプチドの同定：骨形成タンパク質レセプターＩ（ＢＭＰＲＩＡ）および／または骨形成タンパク質レセプターＩＩ（「ＢＭＰＲＩＩ」）に特異的に結合するペプチドを同定するために、ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングして、各レセプターの細胞外ドメインに結合するペプチドをコードするファージを同定する。これらのレセプターの細胞外ドメインは当該分野で公知である（Ｒｏｓｅｎｗｅｉｇら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７６３２−７６３６；Ｔｅｎ  Ｄｉｊｋｅら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１６９８５−１６９８８）。様々なファージライブラリーをスクリーニングする。適切な場合、特定のアミノ酸モチーフを中心として設計された、または特定のアミノ酸に偏って作製されたファージライブラリーをセレクションし得る。ＢＭＰＲＩＡおよびＢＭＰＲＩＩ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３１５−ＢＲ／ＣＦおよび８１１−ＢＲ）を、炭酸塩コーティング緩衝液（１００ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）に溶解し；１００μｌのこの溶液を、９６穴Ｉｍｍｕｌｏｎ（登録商標）−４マイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）のウェルに加える。プレートを４℃で一晩インキュベートし、そして次いでポリスチレン表面の非特異的結合部位を、炭酸塩コーティング緩衝液中１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックする。次いでプレートを、５０ｒｐｍで振とうしながら、室温で１時間インキュベートする。次いでウェルを３００μｌのＰＢＳ−Ｔ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、カタログ番号Ｐ−３５６３）で５回洗浄する。各ライブラリーをＰＢＳ−Ｔで希釈し、そして１００μｌの全量で、１０１０ｐｆｕ／ｍｌの濃度で加える。次いでプレートを５０ｒｐｍで振とうしながら室温で３時間インキュベートする；次いで結合しなかったファージをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄して除去する。０．１Ｍのグリシン緩衝液ｐＨ２．２で変性することによって、結合したファージを回収する（Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、１９９６、Ｋａｙら編（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を参照のこと）。溶出したファージを、リン酸緩衝液で中和化し、そして次いで２×ＹＴ培地中のＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α細胞に加える。この混合物を、２１０ｒｐｍの振とう機で、３７℃で一晩インキュベートする。８５００×ｇで１０分間遠心分離することによって、ファージの上清を回収する。２回目および３回目のセレクションを、インプットファージとして前の回のセレクション由来のファージを使用して、１回目のセレクションと同様に行う。ファージディスプレイ技術は、例えばＰｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｋａｙら編（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）中のＳｐａｒｋｓら（１９９６）「Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｐｈ��ｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｒａｎｄｏｍ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、２２７−２５３頁において記載されるように、当該分野で周知である。
【００８５】
ＢＭＰＲＩＡまたはＢＭＰＲＩＩに特異的に結合するファージを同定するために、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合した抗Ｍ１３ファージ抗体を用いて、続いて色素生産性薬剤ＡＢＴＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、カタログ番号Ａ３２１９）を加えて、通常のＥＬＩＳＡを行う。ファージの相対的結合強度を、ＥＬＩＳＡにおいて、ＢＭＰレセプターへの結合に関して、ファージ段階希釈を試験することによって決定する。選択されたペプチドそれぞれをコードするＤＮＡを単離し、そして配列決定して選択されたペプチドのアミノ酸配列を決定する。
【００８６】
次いでこれらのペプチドを共に連結して検体モジュールを作成し、それがＢＭＰＲＩおよびＢＭＰＲＩＩのそれぞれに結合して、シグナル伝達を誘導するようにこれら２つのレセプターのヘテロダイマーを形成する。候補ペプチドを合成およびビオチン化し、そしてそのＢＭＰレセプターへの結合を確認する。簡単には、ビオチン化ペプチドを、ＢＭＰレセプター結合配列および結合したビオチン部分の間のリンカーと共に合成した。このリンカーは、アミノ酸配列ＧＳＳＧＫを有し、それはビオチン部分をペプチドのレセプター結合部分から分離するよう作用し、そしてそれは柔軟性がある。標準的なＦｍｏｃ化学を用いて、Ｒａｉｎｉｎ  Ｓｙｍｐｈｏｎｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｒａｉｎｉｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で、固相ペプチド合成技術を用いてペプチドを合成する。Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−アミノ酸（直交性側鎖保護基）を、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａｕｆｅｌｆｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入し得る。全ての残基が結合した後、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）カクテルの処理によって、切断および側鎖の脱保護を同時に達成する。粗製ペプチドを、冷ジエチルエーテルで沈殿させ、そしてＶｙｄａｃ  Ｃ１８シリカカラム（分取用  １０μｍ、２５０ｍｍ×２２ｍｍ；Ｇｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ  Ｃｏ．、Ｈｅｓｐｅｒｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ／Ｓｅｍｉ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ＨＰＬＣユニットにおける高速液体クロマトグラフィーによって、０．１％のＴＦＡを含む直線的な水／アセトニトリルの勾配を用いて精製する。合成ペプチドの均一性を、分析的ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８シリカカラム、１０μｍ、２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）によって評価し、そして例えばＵＮＣ−ＣＨ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで商業的に行われるように、ペプチドの正体をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで確認する。
【００８７】
ＢＭＰＲＩおよび／またはＢＭＰＲＩＩに高親和性で結合するペプチドの作製：ＢＭＰＲＩおよび／またはＢＭＰＲＩＩに結合するとして最初に同定されたペプチドは、例えば中程度〜低いμＭの範囲の低い結合親和性を有し得、一方ＩＦＢＭにおいて使用するためのペプチドは、例えばｎＭの範囲のより高い結合親和性を有することが好ましくあり得る。そのようなペプチドを同定するために、最初に同定されたペプチドの改変体ライブラリーを構築し、そしてＢＭＰＲＩおよび／またはＢＭＰＲＩＩに対する親和性セレクションによってスクリーニングする。
【００８８】
結合親和性の決定を、当該分野で公知の手順を用いて評価する。例えば、ＢＭＰＲＩ、ＢＭＰＲＩＩ、および適切なコントロールタンパク質を、炭酸塩コーティング緩衝液（１００ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）に溶解し、そして９６穴ポリプロピレンプレートのウェルに加える。４℃で一晩インキュベートした後、ウェルをＰＢＳ−Ｔ中１％のＢＳＡでブロックする。各レセプターおよびコントロールを、滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の０μＭ〜２００μＭのペプチド濃度の範囲にわたって、結合に関して試験する。次いでウェルを洗浄して結合していないペプチドを除去し、そしてＵＳＢのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合溶液（ＳＡ−ＡＰ）（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ＃１１６８７）を各ウェルに加えて、結合したペプチドの量を定量する。発色試薬ｐ−ニトロフェニルリン酸塩試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．、ＳｉｇｍａＦａｓｔタブレット、カタログ番号Ｎ１８９１）を用いて、そして４０５ｎｍにおける吸光度を測定して、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ活性を測定する。結合曲線およびおよそのＫＤを決定するために、吸光度を各ペプチドの濃度の関数としてプロットする。例えばｐＨ、温度、塩濃度、緩衝液の構成成分、およびインキュベーション時間のような、結合に対する他の因子の影響を評価し得る。
【００８９】
ＢＭＰＲＩおよび／またはＢＭＰＲＩＩに高親和性で結合するペプチドを作製および同定するために、ＢＭＰＲＩおよび／またはＢＭＰＲＩＩに結合するとして単離された最初のペプチドの中で同定されたアミノ酸モチーフに基づいてファージライブラリーを作製し、そして改善した結合性質を有するペプチドに関してさらにスクリーニングする。そのような技術は、当該分野で公知である（例えば、Ｈｙｄｅ−ＤｅＲｕｙｓｃｈｅｒら（２０００）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７：１７−２５；Ｄａｌｂｙら（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．９：２３６６−２３７６を参照のこと）。
【００９０】
ＢＭＰＲＩ結合ペプチドおよびＢＭＰＲＩＩ結合ペプチドを含むハイブリッドペプチドのアゴニスト活性の特徴づけ：柔軟なリンカー（例えば、配列ＧＳＳＧＳＳＧを有するリンカー）に連結したＢＭＰＲＩ結合ペプチドおよびＢＭＰＲＩＩ結合ペプチドの両方を含む合成ペプチドを、化学合成する。あるいは、２つのレセプター結合ペプチドを、リシンのαアミノ基とεアミノ基とで連結し得る（例えば、Ｃｗｉｒｌａら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：１６９６−１６９９またはＷｒｉｇｈｔｏｎら（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１２６１−１２６５のとおり）。これらのペプチドは、長さが約４０アミノ酸であり、そして容易に合成および精製される。
【００９１】
次いでこれらのペプチドを、当該分野で公知であるように、そして例えばＣｈｅｎｇら（２００３）Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．Ａｍ．８５−Ａ：１５４４−１５５２およびＲｕｐｐｅｒｔら（１９９６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３７：２９５−３０２によって記載されているように、例えばマウス間葉系Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞におけるアルカリホスファターゼ活性の誘導のような、ＢＭＰ活性に関してアッセイする。簡単には、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を、１０％ＦＢＳおよび適切な抗生物質および抗真菌剤を含むＧｉｂｃｏ（登録商標）ＭＥＭ／ＥＢＳＳ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、カタログ番号１１０９５−０８０）中で、９６穴プレートに加える（容量２００μｌ中、ウェルあたり３×１０４個の細胞）。細胞を、５％のＣＯ２雰囲気中で、３７℃でインキュベートすることによって、少なくとも３時間プレートに接着させる。次いで培地を無菌的に吸引し、そしてＢＭＰ−２またはペプチドを、高グルコースＧｉｂｃｏ（登録商標）ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、カタログ番号１１９６５−０９２）＋２％ＦＢＳ中に種々の濃度で加える。細胞を試験する化合物と３日間インキュベートし、その時に培地を吸引し、そして細胞を３００μｌのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）ＰＢＳ、カタログ番号１４１９０−１４４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で３回洗浄する。Ｈ２Ｏ中１００μｌのｐＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルリン酸塩、Ｓｉｇｍａ  Ｆａｓｔ  Ｔａｂｌｅｔ  Ｓｅｔ  カタログ番号Ｎ−１８９１）を各ウェルに加え、そして３７℃で１８時間まで色素を発色させ、その後、４０５ｎｍにおける吸光度を読み取る。
【００９２】
次いで当該分野で公知の方法を用いて、ＥＣ５０値を決定する。このアッセイのＢＭＰ−２に関する代表的なＥＣ５０値は、１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌの間の範囲である（例えば、Ｗｉｅｍａｎｎら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．６２：１１９−１２７を参照のこと）。異なる供給源から単離されたＢＭＰ−２は、異なるレベルの活性を示し得ることが当該分野で公知であり、そして当業者は、望ましい結果を達成するために、これらの違いを考慮してそのように手順を調整し得る。例えば、ＣＨＯ細胞を用いて調製された組み換えヒトＢＭＰ−２（「ｒｈＢＭＰ−２」）は、Ｅ．ｃｏｌｉを用いて調製された組み換えヒトＢＭＰ−２の活性とは５〜１０倍異なる活性を有することが、当該分野で公知である（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｔ．Ｓ．Ｌｉｎｄｈｏｌｍ編における、ＺｈａｏおよびＣｈｅｎ（２００２）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｈＢＭＰ−２  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｂｏｎｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ」を参照のこと）。
【００９３】
ハイブリッドペプチドのコラーゲンへの固定化：ＢＭＰ活性を示すハイブリッドペプチドを、コラーゲンに結合するペプチドに合成的に連結する。簡単には、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨのような、モジュール間のリンカーのアミノ酸に直交性の保護基を有する、コラーゲン結合モジュールおよびＢＭＰＲＩ結合モジュールを含むペプチドを合成する。リシン側鎖のεアミノ基のＤｄｅ保護基を、選択的に除去し得、そしてＢＭＰＲＩＩ結合ペプチドを、εアミノ基に結合させる。あるいは、コラーゲン結合モジュール、ＢＭＰＲＩ結合モジュール、およびＢＭＰＲＩＩ結合モジュールを含む、直線状のペプチドを合成し得る。
【００９４】
次いでコラーゲンに結合したハイブリッドペプチドを、そのＢＭＰ活性に関して試験する。例えばこのハイブリッドペプチドがコラーゲンマトリックスに結合している間のマウス間葉系Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞におけるアルカリホスファターゼ活性を誘導することについてアッセイすることによる。簡単には、５ｍｍのコラーゲンのディスクをＰＢＳで洗浄し、これを細胞に基づいたＢＭＰ活性アッセイに加える。
【００９５】
（実施例８：ＩＦＢＭでコーティングした表面の滅菌）
ＩＦＢＭでコーティングした表面を、電子ビーム滅菌手順およびγ線滅菌手順で処理した。コーティングした表面の結合性能を、滅菌手順の前および後に評価した。アッセイを、ポリスチレン表面およびチタン表面に対して行った。ポリスチレンアッセイに関して、結合モジュール（「ＡＦＦ−０００２−ＰＳ」）をビオチン化し、そして結合モジュールをストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼに曝すことによって、相対的結合を評価した。この結果は、ポリスチレン表面に結合したビオチン化ペプチドの量が、滅菌手順の前および後で実質的に同一であったことを示した。チタンに対する結合モジュール（「ＡＦＦ−０００６−Ｔｉ」）のアッセイに関して同様の結果を得た；このアッセイにおいて、滅菌前のコーティングした表面の性能は、滅菌後のその性能とおよそ同じであった。
【００９６】
（実施例９：予備的な毒性試験）
ペグ化ポリスチレン結合ペプチドを、様々なポリスチレン表面上にコーティングし、そして細胞毒性、溶血、および凝固を含む副作用に関して、以下のように試験した。この手順を、Ａｌｂｉｎｏ  Ｓｗｉｓｓ  Ｍｉｃｅ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）において実施した。下記でさらに議論するように、試験したＩＦＢＭのいずれも、毒性の徴候を全く示さなかった。
【００９７】
急性全身性毒性をアッセイするために、ポリスチレンの四角形（各四角４×４ｃｍ；全部で６０ｃｍ２）を、２０ｍＬの２つの媒体：０．９％のＵＳＰ通常生理食塩水または綿実油（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ）のうち１つにおいて、３７℃で７０〜７４時間インキュベートした。５匹のマウスにそれぞれ、ビヒクルまたはビヒクル−抽出物のいずれかを、体重１ｋｇあたり５０ｍＬの抽出物の投与割合で全身性に注射した。注射直後、および注射の４、２４、４８、および７２時間後に、マウスを毒性の徴候に関して観察した。ビヒクル−抽出物を注射された動物のうち、ビヒクル単独を投与されたものより大きな生物学的反応を示したものはなかった。
【００９８】
コーティングされた表面を、ＩＳＯ手順１０９９３−４（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に従って、部分的トロンボプラスチン時間（ｐａｒｔｉａｌ  ｔｈｒｏｍｂｏｂｌａｓｔｉｎ  ｔｉｍｅ）に関してアッセイした。簡単には、新鮮なヒト全血を、クエン酸ナトリウムを含むバキュテーナー（ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）チューブに取り、そして遠心沈殿して血漿を単離し、それを使用まで氷上に保存した。次いでコーティングしたポリスチレンの四角形（上記で記載したとおり）を、ポリプロピレンチューブにおいて、その血漿中で、１ｍＬあたり４ｃｍ２の割合で、３７℃で１５分間インキュベートし、そして６０ｒｐｍで攪拌した。次いで血漿抽出物を分離し、氷上に置き、そしてＣａｓｃａｄｅ（登録商標）Ｍ−４手動止血分析器（Ｈｅｌｅｎａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｅａｕｍｏｎｔ、Ｔｅｘａｓ）で試験した。凝固時間は、純粋血漿または標準的な参照コントロールで観察されるものと有意に異なっていなかった。
【００９９】
ＩＳＯ１０９９３−５で明細に述べられたように、Ｌ−９２９マウス線維芽細胞において細胞毒性をアッセイした。簡単には、６０．８ｃｍ２のポリスチレンコーティング四角形を、２０．３ｍＬのイーグル最小必須培地＋５％のＦＢＳ中で、３７℃で２４時間抽出した。陽性、陰性および中間の細胞株試験ディッシュを、加湿した５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃でインキュベートした。培養物を、２４時間、４８時間、および７２時間の時点で、顕微鏡による観察によって細胞毒性効果に関して評価した。ポジティブコントロールは、強力な細胞毒性反応スコアの「４」を示し、一方試験細胞は全ての時点にわたって健康な（「０」スコア）の様相を維持した（「０」のスコア）。中間のコントロール細胞は、全ての時点にわたって「２」のスコアであった。
【０１００】
溶血試験は、材料または材料抽出物が赤血球の破壊を引き起こす能力を測定する。行った試験は、ＡＳＴＭ  Ｆ−７５６  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｃｏｎｔａｃｔ  Ｍｅｔｈｏｄであった。浸出性物質を抽出するために生理食塩水を使用した。コーティングしたポリスチレン表面を抽出し、そして次いでクエン酸添加ウサギ血液（３．２％、ＰＢＳで希釈して１０ｍｇ／ｍｌの血中総ヘモグロビン濃度を得る）に加えた。０．４％のスコアが観察され、それは０〜２％の透過分類（ｐａｓｓｉｎｇ  ｃａｔｅｇｏｒｙ）に含まれる。ネガティブコントロールは０．１％のスコアを返し、そしてポジティブコントロールは１２．２％のスコアを返した。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】図１は、代表的なチタン結合性ペプチドを提示するファージの、チタンビーズに対する結合の比較を示す（実施例１を参照のこと）。チタンビーズに対する結合に関するアッセイのシグナル（縦軸）を、様々なファージ（横軸）に対して示す。
【図２】図２は、Ｃ−末端ビオチン残基を有するペプチドのチタンに対する結合の比較を示す（実施例１を参照のこと）。吸光度（縦軸）を、ペプチド濃度（μＭ、横軸）の関数として示す。
【図３】図３は、２つのペプチドのチタンへの結合の比較を示す（実施例２を参照のこと）。Ａ４０５ｎｍのシグナル（縦軸）を、ペプチド濃度（μＭ、横軸）の関数として示す。グラフで示した線は、上から下へ、それぞれペプチドＡＦＦ６００７およびＡＦＦ６０１０のデータ点を結ぶ。
【図４】図４は、様々なペプチドのＢＭＰ−２に対する結合の比較を示す（実施例３を参照のこと）。シグナル（ＡＰ比）を、様々なペプチド（横軸で識別される）に関して示す。
【図５】図５は、コラーゲンスポンジへのＩＦＢＭの結合に対するＢＭＰの効果を示す（実施例４を参照のこと）。シグナル（縦軸）を、ｎＭのＢＭＰ濃度（横軸）の関数として示す。
【図６】図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、および６Ｄは、実施例４で記載した実験の結果を示し、それはＩＦＢＭを介したコラーゲンへのＢＭＰの結合は、スポンジに加えたＢＭＰの量、および存在するＩＦＢＭの量にも依存することを示す。吸光度（縦軸）を、ＢＭＰ濃度（横軸）の関数として示す。
【図７】図７は、ＢＭＰ−２に結合し、そしてモチーフ１を含む、表３および表４由来のペプチド配列全ての分析結果を示す（実施例３を参照のこと）。この図は、分析したペプチド配列において、分析した位置のそれぞれに関して、各アミノ酸がその位置で見出された回数を示す；例えば、位置１における「Ｇ２」は、その位置でグリシンが２回見出されたことを意味する。
【図８】図８は、ペプチド配列に関してコア結合モチーフ１ａを含むペプチド（配列番号７４）を発現するよう設計されたオリゴヌクレオチドカセットを示し、それはまたその配列中の他の位置で同定されたコンセンサス残基も含んでいた（実施例３を参照のこと）。図に示したヌクレオチド配列はまた、配列番号７５および配列番号７６においても記載される。
【図９】図９は、ＢＭＰ結合ペプチドの相対的親和性を評価するために行った、通常のＥＬＩＳＡの結果を示す（実施例３を参照のこと）。ＥＬＩＳＡからのシグナル（Ａ４０５ｎｍでの読み取り）を、横軸におけるファージのマイクロリットルの関数として縦軸に示す。０．１０マイクロリットルのファージに対応するデータポイントにおいて、グラフで示す線は上から下へ、それぞれＡＰＯ２−６１、ＡＰＯ２−４０、ＡＰＯ２−４１、ＡＰＯ２−２６、ＡＰＯ２−３５、ＡＰＯ２−５９、ＡＰＯ２−４４、ｍＡＥＫ、およびファージなしのコントロールのデータポイントを結ぶ。
【図１０】図１０は、ＢＭＰ−２に結合し、そしてモチーフ２を含む表３および５のペプチド配列全ての分析結果を示す。この図は、分析したペプチド配列において、分析した位置のそれぞれに関して、各アミノ酸がその位置で見出された回数を示す；例えば、位置１における「Ｇ７」は、その位置でグリシンが７回見出されたことを意味する。モチーフ２を含む表３および７のペプチドの整列から導かれたコンセンサス配列も示す（配列番号９３）。この配列は、全てのペプチドを整列させた後に、各位置において見出される主なアミノ酸を示す。調査した配列の中で、最も保存されたアミノ酸は、「モチーフ２ａ」と呼ばれるコア結合モチーフを形成する（配列番号９４）。
【図１１】図１１は、ＢＭＰ結合活性に関する代替のアッセイの代表的な結果を示し、ここで結合は溶液相で起こる（実施例３を参照のこと）。４０５ｎｍにおける吸光度（縦軸）を、ＢＭＰのピコモルの関数として示す（横軸）。これらの結果を使用して、各ＢＭＰ結合ペプチドのＢＭＰ−２に対する親和性を計算した（表６を参照のこと）。１ピコモルのＢＭＰに対応するデータポイントにおいて、グラフで示された線は上から下へ、それぞれ２００６、２００７、２００８、２００９、２０１１、および２０１２のデータ点を結ぶ。
【図１２】図１２は、いくつかのペプチドを、それらがＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、およびＢＭＰ−７に結合する能力に関して試験したアッセイからの結果を示す（実施例３を参照のこと）。２００７ペプチドおよび２０１１ペプチドは、もともとＢＭＰ−２結合ペプチドとして同定され、一方９００１ペプチドはもともと無関係の標的に結合すると同定された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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