(57)【要約】  本発明は、アプリケーションマトリックスに対する候補酵素のセットを、好ましくは、少なくとも中スループットレベルでスクリーニングし、アプリケーションマトリックスにおける機能性変化を生じるそれらの能力について酵素を選択することを含んでなる、目的の酵素を同定するための方法に関する。本発明のアプリケーションマトリックススクリーニング方法では、スクリーニング方法を適用する前にスクリーニングしようとする酵素活性を規定する必要がない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アプリケーションマトリックスに対する候補酵素のセットを、好ましくは、少なくとも中スループットレベルでスクリーニングし、アプリケーションマトリックスにおける機能性変化を生じるそれらの能力について酵素を選択することを含んでなる、目的の酵素を同定するための方法。
【請求項２】
ａ）候補酵素のセットを提供すること、
ｂ）アプリケーションマトリックスに対する候補酵素の前記セットを、好ましくは、少なくとも中スループットレベルでスクリーニングすること、
ｃ）アプリケーションマトリックスにおける機能性変化を生じる酵素のサブセットを選択すること、
ｄ）さらなるアプリケーション試験において、所望される活性を伴う酵素のサブセットから酵素を選択すること、
ｅ）選択された酵素の酵素活性を規定すること、
を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
特徴ｃ）の前記機能性変化は、前記アプリケーションマトリックスにおける包括的機能性変化である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
特徴ｃ）の前記機能性変化は、前記アプリケーションマトリックスにおける規定された機能性変化である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
特徴ｃ）の前記機能性変化は、超音波スペクトロスコピーを使用して測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
工程ｃ）を反復して、先に測定された特徴ｃ）の機能性変化よりもストリンジェントなアプリケーションマトリックスにおける機能性変化を生じる酵素のさらなるサブセットを選択することをさらに含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
候補酵素の前記セットは、適切な宿主生物体においてクローニングおよび発現される遺伝子のセット、即ち、発現ライブラリーによって提供される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記発現ライブラリーは、冗長なクローンを取り出すおよび／またはタンパク質過剰発現を全く有さないかもしくは有意なタンパク質過剰発現を有さないクローンを取り出すことによって純化される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記アプリケーションマトリックスは高脂肪乳、カード、チーズのスラリー、パン生地、穀粉懸濁液、穀物のミールのスラリーまたはダイズミールのスラリーである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵素の産生に役立つ条件下で前記酵素を発現することが可能な微生物を増殖させ、産生される酵素を取り出すことを含んでなる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法によって選択される酵素の産生のための方法。
【請求項１１】
前記微生物は、前記選択される酵素をコードする発現カセットを含有するポリヌクレオチドで形質転換された宿主生物体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
所望される酵素活性を選択するためのスクリーニングパラメータとしてのアプリケーションマトリックスにおける機能性変化の使用。
【請求項１３】
酵素活性のスクリーニングにおける超音波スペクトロスコピーの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
新たな酵素製品開発のための現在の戦略は、仮定を主導とするものである。先ず、特定のアプリケーションについて要求される酵素活性が規定され、続いて、スクリーニングツールとして、規定された酵素活性専用の酵素活性アッセイを使用する関連酵素の検索が行われる。検索は、典型的に、所望される酵素活性を発現し得る１つもしくはそれ以上の生物体のスクリーニングを含む。しばしば、これらの生物体は、細菌、酵母および真菌などの微生物である。
【０００２】
あるいは、関連酵素は、所望される酵素活性を有するタンパク質をコードするかまたはコードすることが予想される遺伝子の配列データベースを検索することによって、同定され得る。これらの検索は、コードされる遺伝子産物と既に公知の遺伝子産物との相同性（アノテーション）に基づく新たな遺伝子への機能の割り当てに依存する。目的の遺伝子が同定されている場合、当該分野において公知の技術を使用して、それをクローニングし、発現させることができ、産生されるタンパク質を所望される活性について試験することができる。
【０００３】
これらのアプローチは、最終的に、所望される活性を有する１つもしくはそれ以上の酵素の同定をもたらす。一旦、これらの酵素が同定されると、それらは、最終アプリケーションにおいて、適切な機能性について試験される。このアプローチ、具体的には、データベース検索を介する経路は、最新の配列決定プログラムから入手可能になるアノテーション付けされた遺伝子の多数およびなお増加しているプールから利益を得る。
【０００４】
しかし、仮定主導型アプローチはまた、いくらかの欠点を有する。例えば、最終アプリケーションシステムにおける関連酵素の試験は、スクリーニングの最終段階でしか行われず、大きなセットの微生物の培養を含むしばしば多大な労力を必要とする一連の行為の成功は、スクリーニングの終了時においてのみ確認されることを暗示する。しばしば、仮定していることが誤りであることが判明し、誤った酵素活性の検索がもたらされ、スクリーニングが徒労に帰する。
【０００５】
さらに、アプリケーションの理解不足のため、しばしば、特定の最終アプリケーションのための関連酵素活性を予め規定することができないことが生じる。そのような場合には、スクリーニングアッセイもまた規定することができず、関連酵素の検索は不可能である。
【０００６】
アノテーション付けされた遺伝子を供給源として使用して、新たな酵素を同定する場合、アノテーションの品質に対する強力な依存性が存在する。アノテーションが誤りであることも生じ得る。さらに、アノテーション付けされた遺伝子の使用は、完全に新たなかつ予想外の遺伝子産物の同定をもたらさない本来的に保守的なアプローチである。
【０００７】
現在、（あり得そうな）機能を多くの遺伝子に割り当てることが可能であるが、なお、アノテーション付けされ得ない相当な量の遺伝子が存在する。アノテーション付けされていない遺伝子の割合は生物体間でばらつきがあるが、２０〜７０％の範囲であり得る。このことは、相当数の遺伝子がデータベースアプローチにおける関連酵素の検索に含まれておらず、従って、仮定に基づくスクリーニングにおいて活用されないことを意味する。
【０００８】
仮定に基づくスクリーニングでは、酵素アッセイは、常に、関連酵素を同定することが要求される。アッセイの開発は複雑な問題であり、事実、しばしば、酵素スクリーニングにおいて隘路を形成する。アッセイの開発は、しばしば、関連酵素を同定するために使用することができる適切な基質の合成を含む。適切な基質の合成は、しばしば、アッセイの開発における主要な障害物である。あるいは、酵素の天然の基質は、それがスクリーニング目的のための適切な基質となるように、化学的または酵素的に修飾され得る（例えば、天然の基質への染料化合物の付着）。しかし、合成基質が天然の基質と同一でない場合、人工基質に対して活性を示す同定された酵素が、天然の基質に対して活性を示さないことがある。
【０００９】
仮定主導型アプローチの欠点を回避するために、本発明は、スクリーニングの補完形態：アプリケーションマトリックススクリーニングを提供する。
【００１０】
本発明によるアプリケーションマトリックススクリーニングでは、スクリーニングパラメータは、アプリケーションマトリックスにおける機能性変化である。
【００１１】
本発明によるアプリケーションマトリックススクリーニングでは、酵素活性を予め規定する必要はなく、即ち、スクリーニングプロセスの前に既知である必要はない。これは、マトリックス機能性における所望される規定された変化を生じるべき酵素活性が最初に規定される仮定に基づくスクリーニング（ここで、先に規定された酵素活性を検出することが可能である適切な基質が選択されるかまたは調製される）との根本的差異である。
【００１２】
国際出願国際公開第００／６７０２５号パンフレットは、そのような仮定に基づくアプローチの例を開示しており：それは、リパーゼのスクリーニングにおいて使用することができる合成的蛍光標識アシルグリセリド基質の調製について開示している。従って、これらの基質は、規定された酵素、即ち、リパーゼの活性のスクリーニングを目的として意図的に開発され、さらに、最終アプリケーション（ここで、リパーゼが使用されるべきである）と異なる。対照的に、本発明によるアプリケーションマトリックススクリーニングは、酵素活性の事前の規定を必要とするいずれの方法によっても制限されず、従って、仮定に基づくアプローチに関連するものとして同定されていない酵素の同定を可能にする。本発明によるアプローチは、実質的に、酵素スクリーニングのヒット率を増加する。
【００１３】
例えば、発現ライブラリーをアプリケーションマトリックスにおける特定の機能性変化（例えば、ダイズミールスラリーにおける粘度の減少）についてスクリーニングする場合、この機能性変化を達成することができる酵素をコードするすべてのクローンがスクリーニングプロセスにおいて同定される。対照的に、仮定に基づくスクリーニングでは、最初に、この変化を達成し得る酵素活性が規定され（例えば、プロテアーゼあるいは１つもしくは特定のグループの細胞壁を分解する酵素（またはその組み合わせ））、ここで、スクリーニングにおいてそのような酵素を見出すように指向された酵素アッセイが開発される。
【００１４】
従って、第１の態様では、本発明は、目的の酵素を同定するための方法を提供し、ここで、候補酵素のセットがアプリケーションマトリックスに対して、好ましくは、少なくとも中スループットレベルでスクリーニングされ、アプリケーションマトリックスにおける機能性変化を生じるそれらの能力について酵素が選択される。
【００１５】
本発明の文脈において、アプリケーションマトリックスにおける機能性変化は、任意の分析手段によって測定または検出することができる酵素反応から生じるアプリケーションマトリックスにおける任意の物理または化学的変化として定義される。そのような機能性変化の例には、凝集状態、色、水結合性、粘度、ゲル形成、風味付けプロファイル、におい形成などの変化がある。
【００１６】
関連酵素活性は、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、エステラーゼ、ヒドロラーゼ、カルボヒドラーゼ、モノオキシゲナーゼ、ジオキシゲナーゼによって発揮されるもののうちの少なくとも１つであり得るが、これらに限定されない。
【００１７】
詳細には、本発明の方法は以下の工程を含んでなる：
ａ）候補酵素のセットを提供すること、
ｂ）アプリケーションマトリックスに対する候補酵素の前記セットを、好ましくは、少なくとも中スループットレベルでスクリーニングすること、
ｃ）アプリケーションマトリックスにおける機能性変化を生じる酵素のサブセットを選択すること、
ｄ）さらなるアプリケーション試験において、所望される活性を伴う酵素のサブセットから酵素を選択すること、
ｅ）酵素の酵素活性を規定すること。
【００１８】
酵素の酵素活性を規定することは、本発明のプロセスの任意の段階で行われ得る。しかし、スクリーニングしようとする酵素活性の性質に関して、アプリケーションマトリックスの事前の適応の必要はない。
【００１９】
候補酵素のセットは、いくらかの方法で作製することができる。例えば、候補酵素のセットは、１つもしくはそれ以上の酵素の発現に役立つ条件下で培養される微生物のセットによって提供される。微生物のセットのメンバーは異なる微生物種であってもよく、および／または１つの特定の微生物種とは異なる株であってもよい。１つもしくはそれ以上の酵素は細胞内に蓄積してもよく、または培養培地に分泌されてもよい。
【００２０】
候補酵素を本発明によるスクリーニングに供するために、個々のクローン（発現ライブラリー内）は、所望されるバイオマス濃度または所望される細胞密度に達するまで、培養される。候補酵素が細胞内に産生されるかまたは培養培地に分泌されるかどうかに依存して、それぞれ、細胞抽出物または培養上清はスクリーニングのために調製される。
【００２１】
細胞内に蓄積する酵素のスクリーニングのために、本発明によるスクリーニングにおけるアプリケーションマトリックスとの相互作用ために細胞内酵素を放出するように細胞を処置する必要がある。典型的に、無細胞抽出物は、当業者に公知の方法に従って調製される。細胞外酵素のスクリーニングのために、細胞は、遠心分離によって培養液から取り出され、場合により、続いて、限外ろ過工程が行われ、ここで、培養上清はスクリーニングに供される。
【００２２】
好ましくは、候補酵素のセットは、適切な宿主生物体においてクローニングおよび発現される対応する遺伝子またはｃＤＮＡのセットによって提供され、即ち、発現ライブラリーによって提供される。候補酵素のセットをコードする遺伝子またはｃＤＮＡのセットの供給源および／または宿主生物体の選択は、なかでも、選択しようとする酵素の目的とするアプリケーションに依存する。
【００２３】
候補酵素のセットをコードする遺伝子またはｃＤＮＡのセットは、目的の任意の生物体、即ち、動物（ヒトを含む）または植物種または微生物由来であり得る。発現ライブラリーは、細菌（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、酵母（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クリュイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ））、糸状菌（例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ））、昆虫細胞または無細胞発現系などの当該分野において公知の他のタンパク質発現系などの多様な宿主生物体において作製することができる。
【００２４】
細菌由来の遺伝子もしくはｃＤＮＡのセットは、好ましくは、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）において発現され、酵母由来の遺伝子もしくはｃＤＮＡのセットは、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはクリュイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）において発現され、真菌由来の遺伝子もしくはｃＤＮＡのセットは、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）または麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）において発現され、動物または植物由来の遺伝子もしくはｃＤＮＡのセットは、適切な微生物宿主において発現される（宿主の選択は、例えば、コードされる酵素のサイズおよび性質に依存し得る）。
【００２５】
具体的には、大きなゲノムを伴う生物体、例えば、真核生物では、候補酵素のセットを提供するためにｃＤＮＡを使用することが好適である。異なる条件下で培養される生物体由来の異なるｃＤＮＡライブラリーを調製および組み合わせることも選択肢の１つである。
【００２６】
１つのヒットについてスクリーニングしようとするクローンの量は、なかでも、遺伝子のセットの生物体の供給源に依存する。
【００２７】
原核生物の場合、発現ライブラリーは、特定の環境下で得られるｍＲＮＡ集団から構築することができる。多様な培養条件下で細菌を増殖させ、多様な時間ポイントにおいてサンプリングすることによって、幾分完全なスペクトルのｍＲＮＡを得ることができる。これを行うための方法は、当該分野において周知である。あるいは、特異的エンドヌクレアーゼでゲノムＤＮＡを切断し、得られるＤＮＡフラグメントを適切なベクターにクローニングすることによって、ゲノム細菌（発現）ライブラリーを構築するための方法が記載されている。これらのアプローチは、細菌発現ライブラリーの構築をもたらす。
【００２８】
真核生物（糸状菌、酵母、植物など）の場合、発現ライブラリーは、通常、ｃＤＮＡライブラリーの形態で構築される。そのようなｃＤＮＡ発現ライブラリーを構築するための方法は、当該分野において公知である。真核生物の遺伝子の数（パン酵母の約６，０００〜植物の約３０，０００もしくはそれ以上の範囲）は、細菌（約２，５００〜約４，５００の範囲）よりもかなり多く、真核生物のゲノムの完全に提示するのに必要な増殖条件の数は、原核生物のそれよりもかなり多いため、真核生物のゲノムを完全に提示する発現ライブラリーのライブラリーサイズ（クローンの数）は、しばしば、原核生物について要求されるそれより１０〜１００倍大きい。結果として、特定の遺伝子を同定するためにスクリーニングする必要がある発現ライブラリー由来のクローンの数は、通常、真核生物の方が原核生物よりもかなり大きい。
【００２９】
ｃＤＮＡを介するライブラリー構築の方法は、本来的に、発現バンクにおける高い冗長性を暗示する：多くの遺伝子が１回を超えて提示される。この冗長性は、ライブラリーにおけるすべての遺伝子の提示が完全に近づく場合、かなり増加する。従って、本発明の一実施形態では、候補酵素のセット、例えば、発現ライブラリーを純化して、候補の数を減少することができ、候補酵素のスマートなセットとも呼ばれる候補酵素の純化されたセット、例えば、スマート発現ライブラリーが得られる。
【００３０】
純化プロセスは、ライブラリーにおいて１回を超えて提示されるクローンの大部分を取り出し得、即ち、冗長なクローンを取り出し得る。結果として、各クローンのただ１つまたは若干の代表が純化されたライブラリー、即ち、候補酵素の純化されたセットに残る。従って、候補酵素の順化されたセットは、スクリーニング目的に関連すると考えられる最小数のメンバーを含有する。戦略的理由のため、冗長性を発現ライブラリーに故意に再導入して、例えば、発現ライブラリー全体の培養中に特定のクローンの増殖の失敗を最小限にすることができる。
【００３１】
純化プロセスはまた、発現ライブラリーからタンパク質過剰発現を全く有さないかもしくは有意なタンパク質過剰発現を有さないクローンを取り出すことができる。結果として、本発明によるスクリーニングのために使用される純化された発現ライブラリーは、タンパク質の過剰産生体であるクローンにおいて富化される。タンパク質過剰産生体は、クローンのタンパク質発現プロファイルが、形質転換されていない発現宿主生物体のバックグランドのタンパク質発現プロファイルと識別可能であるようなレベルで、クローニングされた遺伝子からタンパク質を発現する形質転換されたクローンである。
【００３２】
本発明による純化プロセス、即ち、例えば、冗長性および／またはタンパク質過剰発現についての発現ライブラリーのメンバーのスクリーニングは、多様な方法で行うことができる。
【００３３】
タンパク質過剰発現は、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の１つもしくはそれ以上の過剰なバンドの出現として認識することができる。しかし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは労力を要し、９６ウェルＳＤＳ−ＰＡＧＥは解像度が低い。ラボ・オン・チップシステムなどのＳＤＳ−ＰＡＧＥアナログ、例えば、アギレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）から市販のものは、少なくとも中スループットスクリーニングにさらに適切である。
【００３４】
発現ライブラリーのメンバーの中またはさらになお高スループットスクリーニングに良好に適合されると思われるシステムは質量分析である。純化プロセスは、問題のライブラリーのクローンの例えば、タンパク質分解消化および質量分析後に得られる独特のフィンガープリントに基づいて行うことができる。そのような分析は、細胞外（分泌型）ならびに細胞内タンパク質に対して行うことができる。
【００３５】
細胞外タンパク質の分析のための典型的な手順は、以下のとおりである。まず、細胞は、遠心分離によって培養液から取り出され、場合により、続いて、限外ろ過工程ならびに／または副産物、例えば、炭水化物および塩を取り出すための適切なサンプル前処置が行われ、無細胞上清は、タンパク質分解消化の条件を最適化するために緩衝化される。サンプルは、適切なプロテアーゼ、例えば、トリプシンによって処置され、場合により、続いて、（クロマトグラフィーによる）脱塩が行われ、質量分析計に注入される。得られる質量スペクトルは、クローンのタンパク質組成に依存する分子量分布を伴うペプチドのプロファイルからなる。類似のクローンは類似のプロファイルを生じ、冗長なクローンの同定を可能にする。クローンが特定のタンパク質を過剰発現する場合、これは、過剰に発現されるタンパク質を含有しないクローンと比較して、質量スペクトルにおいて過剰なペプチドを生じる。過剰なペプチドの分子量は、それらのフラグメンテーションスペクトルと共に、過剰産生されるタンパク質の独特なフィンガープリントである。
【００３６】
細胞内タンパク質の分析では、無細胞抽出物は、当業者に公知の技術に従って調製することができる。好ましくは、抽出物は、以後のスクリーニング工程をできるだけ最小限に干渉する方法を使用して調製される。
【００３７】
イオン化方法論（例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ））および質量決定の方法（例えば、飛行時間（ＴＯＦ）、四重極（Ｑ）、トリプル四重極（ＴＱ）または四重極−飛行時間（ＱＴＯＦ）、イオンサイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）、（リニア）イオントラップなど）において異なる極めて多様な質量分析計が、現在利用可能である。好ましくは、高解像度およびデューディサイクルを伴う質量分析計が使用される。１つの設定において、好適な質量分析計は、イオン化技術としてのＭＡＬＤＩ、およびＴＯＦ、ＱＴＯＦ、ダブルもしくはトリプルＱまたは（リニア）イオントリップ質量分析器のいずれかと共に作動する。
【００３８】
上記の純化プロセスは、任意の発現ライブラリーに適用可能である。従って、本発明は、冗長性を取り出し、および／またはタンパク質過剰発現を全く有さないかもしくは有意なタンパク質過剰発現を有さないクローンを取り出すことによって、発現ライブラリーを純化するプロセスを提供する。
【００３９】
候補酵素の純化されていないかまたは好ましくは純化されたセットは、適切なアプリケーションマトリックスに対してスクリーニングされ、アプリケーションマトリックスにおいて機能性変化を生じる酵素のサブセットが選択される。機能性変化は、任意の分析手段によって測定または検出することができる酵素反応から生じるアプリケーションマトリックスにおける任意の物理または化学的変化であり得る。
【００４０】
本発明によるスクリーニングにおける使用のための適切なアプリケーションマトリックスは、原則的に、目的の特定の最終アプリケーションに類似する任意のマトリックスであり得る。従って、特定の予め規定された酵素活性をスクリーニングするためのアプリケーションマトリックスを意図的に適応する必要はない。好ましくは、目的の最終アプリケーションは食物および／または食物アプリケーションである。
【００４１】
従って、スクリーニングのために使用されるアプリケーションマトリックスの選択は、なかでも、所望される最終アプリケーションによって決定され、ここで、選択しようとする酵素は活性であるべきである。
【００４２】
好ましくは、アプリケーションマトリックスは、できるだけ最終（大きな規模）アプリケーションに近いものであるべきであり、即ち、最終アプリケーションの基質と実質的に同じ組成であるべきであり、および／または最終アプリケーションの少なくとも検認済みの代表物であるべきである。
【００４３】
当業者であれば、アプリケーションマトリックスが、例えば、対応する最終アプリケーションにおいて存在する量から若干偏向する例えば、タンパク質、炭水化物および／または脂質の量を、本発明の趣旨から逸脱することなく含有し得ることを理解するであろう。例えば、最終アプリケーションより高い水分含量を含有するアプリケーションマトリックスを使用する必要があり得る。あるいはまたはさらに、例えば、タンパク質、炭水化物および／または脂質含量または比に関するアプリケーションマトリックスの組成は、最終アプリケーションの組成とは若干異なり得る。
【００４４】
好ましくは、アプリケーションマトリックスの組成は、少なくとも７０重量％（アプリケーションマトリックスならびに最終アプリケーションの乾燥物質含量に基づく）、より好ましくは、少なくとも８０％、さらにより好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％の最終アプリケーションの組成に対応する。
【００４５】
アプリケーションマトリックスは、さらに好ましくは、時間を通じて再現可能に生成されるべきである。時間を通じて再現可能な生成とは、アプリケーションマトリックスの生成が、時間を通じて実質的に同じすべての組成を伴うマトリックスをもたらすべきであり、かつ／またはアプリケーションマトリックスの生成が適応され得ない季節変動に供されるべきでないことを意味する。アプリケーションマトリックスは、さらに好ましくは、少なくとも中スループットレベル（例えば、マイクロタイター形式）でのスクリーニングに適合性であるべきであり、好ましくは、ピペッティングおよびポンピング手順（例えば、大きな塊を含まない）に適合性であるべきである。アプリケーションマトリックスは、好ましくは、安定な物理状態を有するべきである。
【００４６】
例えば、パン製造では、アプリケーションマトリックスは、パンが製造される特定の生地であり得るか、あるいはパンが製造される生地由来の検認済みの代表物、例えば、小麦（または目的の他の穀物）粉懸濁液もしくはミールスラリーであり得；チーズ製造では、アプリケーションマトリックスは、高脂肪（牛）乳またはカードであり得；ダイズ減粘化では、アプリケーションマトリックスは濃縮されたダイズミールスラリーであり得る。
【００４７】
中スループットレベルでのスクリーニングは、典型的に、少なくとも一千、例えば、一千〜十万のサンプル（クローン）が１週間あたりにスクリーニングされることを意味する。もちろん、本発明によるスクリーニングはまた、低スループットレベルで、即ち、１週間あたり一千未満のサンプルに対して適切に行われ得る。
【００４８】
本発明は、目的のアプリケーションマトリックスに対する候補酵素のセットのスクリーニングおよびアプリケーションマトリックスにおいて機能性変化を生じる酵素のサブセットの以後の選択の多様な実施形態を想定している。
【００４９】
本発明の１つの実施形態では、アプリケーションマトリックスにおける包括的機能性変化を生じる酵素のサブセットを選択する。包括的機能性変化は、予め規定されず、特定の性質の変化に制限されない機能性変化である。それは、任意の分析手段によって測定または検出することができる酵素反応から生じるアプリケーションマトリックスにおける任意の物理または化学的変化であり得る。従って、選択しようとする酵素が目的のアプリケーションマトリックスにおいて機能性変化のどのタイプを行うかを規定する必要はない。
【００５０】
アプリケーションマトリックスにおいて包括的機能性変化を生じる酵素のサブセットの選択は、極めて包括的な検出方法論および／または技術、即ち、アプリケーションマトリックスにおいて生じる任意の機能性変化を検出することが可能である方法論および／または技術を必要とする。以下に記載のようないくらかの方法および／または技術が、この目的のために使用され得る。
【００５１】
本質的にすべての（化学的）反応は、熱生成（発熱的または吸熱的）の変化を伴うため、熱検出、例えば、マイクロ熱量分析は、原則的に、適合された技術である。熱検出技術の欠点は、それが常に十分な感度とは限らないことである。
【００５２】
アプリケーションマトリックスにおける包括的機能性変化を同定するために使用することができるもう１つのパラメータは、マトリックスの誘電率である。媒体、例えば、アプリケーションマトリックスの誘電率の変化を極めて高感度で測定する誘電体プローブが利用可能である。
【００５３】
エレクトリックノーズおよび／またはマウス（ｍｏｕｔｈ）などの半導体測定値に基づく技術は、小さな分子が作製される場合において特に適切である。
【００５４】
さらに適切な技術は、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）などの赤外（ＩＲ）およびＲＡＭＡＮ分光学に基づく技術である。これは、赤外ビームによって加えられた振動遷移を検出する技術である。スペクトルの吸収帯の周波数は、振動基底状態と励起された状態との間のエネルギーの差異に相関関係がある。これらの吸収帯は、特定のグループの原子に特徴的である。ＦＴＩＲによって発生したスペクトルは、アプリケーションマトリックスにおける包括的機能性変化により変化し得る。
【００５５】
アプリケーションマトリックスにおける包括的変化を測定するのに極めて適切な技術は、高分解能超音波スペクトロスコピー（ＨＲＵＳ）である。高分解能超音波スペクトロスコピー測定は、アプリケーションマトリックスを介して伝搬する高い超音波周波数での音波の速度および減衰の測定に基づく。ＨＲＵＳは、マトリックスの特性の広範なスペクトルの迅速な非破壊的分析を提供する。この技術の利点は、光学的に不透明なアプリケーションマトリックスを介して伝搬する超音波の能力である。ＨＲＵＳは、圧電振動子を使用する長手方向変形の超音波を発生する。これらの波の伝搬を決定する主な特徴は、超音波速度および超音波減衰係数である。超音波速度の値は、密度および長手方向変調の弾性モジュールの関数である。超音波の吸収および超音波散乱は、超音波減衰係数の値を決定する。
【００５６】
要約すると、ＨＲＵＳ技術は、それらがアプリケーションマトリックスを介して通過する時に超音波に生じる変化を測定することに基づく。従って、超音波測定値は、アプリケーションマトリックスにおける包括的機能性変化の検出に好適な技術を提示する。
【００５７】
従って、さらなる態様では、本発明は、酵素活性のスクリーニングにおける超音波スペクトロスコピー、好ましくは、ＨＲＵＳの使用を提供する。具体的には、上記の候補酵素のセットが、適切な基質に対してスクリーニングされ、酵素が、基質の機能性変化を生じるそれらの能力について選択され、ここで、機能性変化は、超音波スペクトロスコピー、好ましくは、ＨＲＵＳを使用して測定される。適切な基質は、基質に対する活性を伴う酵素を見出すことが所望される任意の基質であり得る。好ましくは、適切な基質は上記のアプリケーションマトリックスである。好ましくは、超音波スペクトロスコピーは、以下に記載のように動力学的に行われる。
【００５８】
好適な実施形態では、（包括的）機能性変化の検出は、いわゆる動力学解析、即ち、反応が経時的に追跡される分析を使用して行われる。反応が追跡される期間は、数分間、例えば、２もしくは５または１０分間から２、３時間、例えば、２もしくは４または８〜２４時間まで変動し得る。好ましくは、反応は、始まり、即ち、酵素がアプリケーションマトリックスに添加される瞬間（Ｔ＝０）から開始して、追跡される。動力学解析は、有利なことに、候補酵素のセットのメンバーおよび／またはアプリケーションマトリックス自体に本来的に存在し得る対バックグランド活性についてスクリーニングされる酵素活性の適切な決定を可能にする。
【００５９】
本発明の１つの実施形態では、上記のアプリケーションマトリックスにおける包括的機能性変化に対するスクリーニングおよび選択の結果は、事実上、候補酵素のセット、例えば、発現ライブラリーのマトリックス特異的サブセットである。そのようなマトリックス特異的発現ライブラリーは、有利なことに、特定のアプリケーションマトリックスに対する各生物体について１回作製するだけでよい。発現ライブラリーは、それらが新たなアプリケーションの問題が生じる場合において直接利用可能であるように、貯蔵することができる。
【００６０】
本発明の別の実施形態において、アプリケーションマトリックス、例えば、マトリックス特異的発現ライブラリーにおいて包括的機能性変化を提供するそれらの酵素を選択した後に得られる酵素のサブセットは、再度、アプリケーションマトリックスに対してスクリーニングされ、アプリケーションマトリックスにおいて規定された機能性変化、即ち、最終アプリケーションにおいて所望される機能性変化により類似および／または近似する機能性変化を生じる酵素のさらなるサブセットが選択される。
【００６１】
アプリケーションマトリックスにおける規定された機能性変化は、最終アプリケーションにおいて所望である機能性変化に依存して、予め規定される。それは、例えば、凝集状態、色、水結合性、粘度、ゲル形成、風味付けプロファイル、におい形成などの変化から選択される１つの機能性変化であり得る。
【００６２】
所望される機能性変化の検出のために使用される技術のタイプは、どの機能性変化が規定されるかに依存する。アプリケーションマトリックスにおける規定された機能性変化は、ｐＨ測定、多様な比色および分光技術、サーミスターの使用、誘電特性の測定、超音波測定、質量分析測定、誘電率決定、粘度測定、レオロジー測定などのようないくらかの測定および／またはそれらの組み合わせの使用によって検出され得る。
【００６３】
非処置マトリックスに関するこれらの変化の検出は、マトリックスまたはその抽出物を直接測定することによって生じ得る。マトリックスの直接測定は、例えば、レオロジー測定、反射または吸収測定、粘度測定などを介して行われ得る。
【００６４】
例えば、不溶性マトリックスからの低分子量成分の放出が測定される場合、間接的測定、即ち、マトリックス自体に対しては実施されない測定が、時々、要求され得る。そのような場合、低分子量成分をマトリックスから抽出して、定量化を可能にし得る。あるいは、間接的測定は、（例えば、ＧＣ−ＭＳを使用する）酵素処置時にマトリックスから放出される揮発性成分の組成の変化の決定を含み得る。
【００６５】
本発明の別の実施形態では、候補酵素のセットがアプリケーションマトリックスに対してスクリーニングされ、アプリケーションマトリックスにおいて規定された機能性変化を生じるそれらの能力について直接選択される。アプリケーションマトリックスにおける包括的機能性変化に対する最初のスクリーニングが省略される。
【００６６】
なお別の実施形態では、アプリケーションマトリックスにおいて規定された機能性変化を生じる能力についての候補酵素の（サブ）セットのスクリーニングが少なくとも１回反復される。本実施形態では、アプリケーションマトリックスにおける規定された変化に対する最初のスクリーニングは、さらなるスクリーニングよりも低いストリンジェントな変化に対してであってもよい。最初のスクリーニング時に、選択のための条件がそれほどストリンジェントではない粗い選択が行われる。次いで、この工程において選択される候補は、よりストリンジェントな選択基準でさらに選択される。そのような２段階選択はより高いスループットスクリーニングを生じ得、従って、所望され得る。このような２段階選択が関連し得るアプリケーションの例は、特定のアミノ酸を介するチーズにおける風味付けの作製である。第１の段階では、例えば、ニンヒドリン染色による検出を使用する遊離アミノ酸の増加レベルを生じる候補酵素のセットが選択される。次いで、選択された候補が、特定の遊離アミノ酸の作製のためのさらなるスクリーニングにおいて試験される。チーズアプリケーションでは、これらの特定のアミノ酸は、多くのチーズ多様性において重要な風味付け前駆体である例えば、メチオニンまたはフェニルアラニンであり得る。
【００６７】
本発明は、１つもしくはそれ以上の酵素分子に関連する酵素活性が、同定しようとする酵素活性の性質に関して、アプリケーションマトリックスの事前の適合を必要としない本発明のプロセスの任意の段階で規定されることを有利に可能にする。
【００６８】
酵素の酵素活性を規定することは、当業者に公知の多様な方法で行うことができる。例えば、（選択された）酵素の酵素活性の結果として、アプリケーションマトリックスにおいて、どの産物が形成されるかを確立することができる。選択された酵素がどの特定の（モデル）基質に対して活性を示すかを確立することもできる。選択された酵素のアミノ酸配列を決定し、既知の配列との相同性について配列を分析することも可能である。後者の可能性は、発現ライブラリーを純化する段階で既に行われ得る。
【００６９】
アプリケーションマトリックスのスクリーニングは、一般に、試験管規模（１００μｌ〜５ｍｌ）でマイクロタイタープレートにおいて行われる。サンプルのインキュベーションおよび輸送では、ピペッティングデバイスが、場合により、ロボットおよびフロースルーシステムとの組み合わせで使用することができる。サンプルの取り扱いの選択は、関与するアプリケーションマトリックスの物理パラメータによってかなり決定される。
【００７０】
アプリケーションマトリックスに対する候補酵素のセットのスクリーニング後に得られる酵素のサブセットまたはさらなるサブセットは、さらなるアプリケーション試験において、より大きな規模でスクリーニングされる。必ずしも全面的規模は必要ではないが、さらなるアプリケーションスクリーニングは、一般に、グラム規模もしくはそれ以下であるアプリケーションマトリックススクリーニングよりかなり大きな規模（数十〜数百グラム）にある。そのようなさらなるアプリケーション試験の例には、ミニチーズおよびおよび子犬用パンがある。このさらなるアプリケーションスクリーニングにおいてポジティブな性能を示す候補は、最終アプリケーションを提示する全面的規模のアプリケーション試験において選択および試験される。
【００７１】
一般に、本発明のプロセス全体にわたってスクリーニングが実施される規模は増加する。これに対し、運搬上および取り扱い上の理由のため、スループット能は、典型的に、規模の増加に伴い減少する。発現ライブラリーは、一般に、数〜数百もしくはマイクロリットルの量で培養され、同じ規模で分析される。このレベルでのスループットは、１週間あたり、少なくとも千、例えば、千〜十万のサンプル（クローン）のオーダーであり、中スループットである。本発明のプロセスに供される時、発現ライブラリーは、一般に、発現ライブラリーが調製される生物体のゲノムに存在する遺伝子の総数の推定で２０〜３０％にまでサイズが減少する。これは、関連候補の数が数百〜数千にまで減少することを暗示し、正確な数は問題の生物体に依存する。本発明の方法は、最大で数百の候補がさらなるアプリケーション試験においてスクリーニングに供されることを有利に可能にする。さらなるアプリケーション試験におけるスクリーニング後、最大で１０〜２０の候補が、全面的規模のアプリケーション試験のために一般に残される。全体で、これは、発現ライブラリーおよび全面的規模のアプリケーション試験間の有効な絞込み選択（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｕｎｎｅｌ）の確立をもたらし、ここで、タンパク質は、特定のアプリケーションにおいて有効性に対してのみ選択される。本発明の方法を使用して同定（選択）される酵素は、有利なことに、全面的規模のアプリケーションにおいて高い可能性で適切かつ有効な性能を有する。
【００７２】
全面的規模のアプリケーションでは、実質的な量の酵素および基質材料が、通常、要求される。また、この規模において関与する費用は、しばしば、かなりの程度であり、この相のスループットを制限する。本発明によるアプリケーションマトリックスに対する先のスクリーニングは、有利なことに、全面的規模のアプリケーションにおいて試験しようとする酵素の数を減少する。
【００７３】
本発明の方法は、有利なことに、仮定に基づくスクリーニング方法によって同定され得ない新規の酵素活性を同定するために使用される。
【００７４】
本発明の方法は、１つの酵素活性を選択または同定するが、さらに、２つもしくはそれ以上の酵素活性の混合物を選択または同定するために使用することができる。通常、酵素活性の混合物は、異なる酵素分子によって提供される。しかし、単一の酵素分子が異なるタイプの活性を提供することも可能である。
【００７５】
本発明は、アプリケーションマトリックスにおける機能性変化が、有利なことに、所望される酵素活性を選択するためのスクリーニングパラメータとして使用され得ることを示す。
【００７６】
第２の態様では、本発明は、第１の態様の方法によって選択される酵素の産生のためのプロセスに関する。プロセスは、前記酵素の産生に役立つ条件下で前記選択された酵素を発現することが可能な微生物を増殖させ、産生された酵素を回収することを含んでなる。酵素の回収は、無細胞培養上清を生成するための微生物細胞の分離、例えば、限外ろ過による無細胞上清の濃縮、適切な安定剤による液体培養上清もしくは限外ろ過物の安定化、液体培養上清もしくは限外ろ過物からの酵素のさらなる精製、顆粒化および／または乾燥技術による固体酵素組成物の調製のような工程を含み得る。好ましくは、前記選択された酵素を発現することが可能な微生物は、選択された酵素をコードする発現カセットを含有するポリヌクレオチドで形質転換される宿主生物体である。
【００７７】
実施例１
チーズカードマトリックスの調製
チーズカードマトリックスを調製するための代表的な方法は以下のとおりである。高脂肪牛乳（２５０グラム）を、遠心管において３０℃まで加熱した。この温度においておよび緩除な撹拌下で、１６５μｌのＣａＣｌ２を直接添加し、続いて、５４．４μｌのＭａｘｉｒｅｎ（登録商標）１８０（ＤＳＭ  Ｆｏｏｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ、蘭国）を添加した。次いで、撹拌を停止し、混合物を３０℃で６０分間、静置した。次いで、遠心管をＳｏｒｖａｌｌ  ＧＳ−３ローター（５５００ｒｐｍ、２５℃）において遠心分離し、上清を注意深く捨てた。フレームにおいて１ｃｍ間隔で隔てたストレッチワイヤのカッターを、ペレットの手動での切断のために使用した。ペレットの容積を測定し、等容積のＮａＣｌ／乳酸溶液（ＮａＣｌ９０ｇ／Ｌ、１２．７５ｍｌの乳酸／Ｌ）を添加した。Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘを使用して、混合物を均質化した。均質化中、下記のとおりに調製される６３μｌの細胞溶解物を添加した。全容積を測定し、均質化物を、この容積の３３％に等しい量のＮａＣｌ溶液（４．５％ｗ／ｖ）の添加によって希釈した。この時点で、チーズカードマトリックスは、アプリケーションスクリーニングにおける使用のための準備ができている。
【００７８】
細胞溶解物の調製：
細胞溶解物は次のように調製した；４５ｍｌの生理的食塩水溶液を５ｍｌのＤＥＬＶＯ−ＴＥＣ（登録商標）ＬＬ５５Ｄ（ＤＳＭ  Ｆｏｏｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ、蘭国より入手される）細胞懸濁液に添加し、遠心分離した（５０００ｒｐｍ、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＧＳ３、１０分間、２５℃）。上清を捨て、ペレットを５ｍｌの生理的食塩水溶液に再懸濁し、再遠心分離した。最後のサイクルを３回反復し、ペレットを最終的に５ｍｌの生理的食塩水溶液に再懸濁した。次に、６３０μｌのリゾチーム（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、蘭国より入手される）溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、混合物を３０℃で貯蔵し（１時間）、直ちに、続いて、室温でさらなるインキュベーション（１時間）を行った。最終溶液を遠心分離（４０００ｒｐｍ、１０分間）し；上清（＝細胞溶解物）を注意深く取り出し、−２０℃で貯蔵した。
【００７９】
実施例２
小麦粉マトリックスの調製
小麦粉マトリックスを調製するための代表的な方法は以下のとおりである。Ｋｏｌｉｂｒｉ小麦粉（ＭＥＮＥＢＡ、蘭国より入手される）を使用して、小麦粉懸濁液を調製した；ボルテックスで混合しながら、６．９ｇの小麦粉を１１ｇの脱イオン水に添加した。小麦粉懸濁液をＵｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘミキサーで均質化し、シヌソイドＣｏｕｌｔｅｒミキサー（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、英国より入手される）上に、１０〜３０分間、配置した。
【００８０】
その調製直後、小麦粉懸濁液は、水浴中、３０℃で、少なくとも３０分間、酵素を伴うまたは伴わずに、インキュベートしなければならない。次いで、サンプルを、超音波水浴（Ｓｏｎｉｃｏｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ、米国より入手）を使用して、脱気した。小麦粉マトリックスは、マトリックススクリーニングにおいて測定するための準備ができている。
【００８１】
実施例３
ダイズ由来水不溶性基質（ＷＵＳ）マトリックスの調製
ダイズ由来ＷＵＳマトリックスを調製するための代表的方法は以下のとおりである。５％ｗ／ｖダイズＷＵＳ調製物をＨ２Ｏにおいて作製した。連続撹拌下で、ダイズ−ＷＵＳを１晩、室温でインキュベートした。大きな粒子の沈殿後、上清を回収したところ、アプリケーションスクリーニングにおける使用のための準備ができている。
【００８２】
実施例４
超音波スペクトロスコピーを使用する乳汁マトリックスにおける酵素活性の測定
乳汁における３つの酵素の活性の超音波測定を、以下のとおりに実施した。製造者の指示（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、愛国）に従って、超音波スペクトロメーターＨＲ−ＵＳ１０２を操作し、設定した。
【００８３】
ＨＲ−ＵＳ１０２超音波スペクトロメーター（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、愛国）の１ｍｌの超音波セルに牛乳を充填し、３０℃で平衡化させた。温度平衡化後、酵素を添加し、反応経過を追跡した。多様な酵素を試験し、添加は以下のとおりであった：
Ａ．Ｍａｘｉｒｅｎ（登録商標）１８０を１：１００に希釈し、乳汁に添加した（２０μｌの酵素／１ｍｌの乳汁）。
Ｂ．Ｐｉｃｃａｎｔａｓｅ（登録商標）Ｒ８０００を１：１００に希釈し、乳汁に添加した（３０μｌの酵素／１ｍｌの乳汁）。
Ｃ．Ｍａｘｉｌａｃｔ（登録商標）２０００を１：１００に希釈し、乳汁に添加した（１０μｌの酵素／１ｍｌの乳汁）。
Ｄ．Ｍａｘｉｌａｃｔ（登録商標）２０００を１：１０００に希釈し、乳汁に添加した（１０μｌの酵素／１ｍｌの乳汁）。
すべての酵素は、ＤＳＭ  Ｆｏｏｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ、蘭国より入手した。
【００８４】
活性曲線を図１、グラフＡ〜Ｄに示す。
【００８５】
データは、超音波技術が１つのマトリックス（牛乳）においてプロテアーゼ（Ｍａｘｉｒｅｎ（登録商標）１８０）、リパーゼ（Ｐｉｃｃａｎｔａｓｅ（登録商標）Ｒ８０００）および（３−ラクターゼ（Ｍａｘｉｌａｃｔ（登録商標）２０００）のような極めて多様な酵素活性を測定することが可能であることを示す。従って、超音波スペクトロスコピー方法論は、本発明によるマトリックススクリーニングアプローチにおいて包括的検出方法論としてきわめて良好に適合される。また、シグナル変化の速度は、添加された酵素の量に依存し、２つのＭａｘｉｌａｃｔ（登録商標）曲線（高および低用量）によって明らかに示される。Ｍａｘｉｒｅｎ（登録商標）ならびにＰｉｃｃａｎｔａｓｅ（登録商標）Ｒ８０００についてのグラフＡおよびＢもまた、８分間の平衡化期間を示す。
【００８６】
実施例５
超音波スペクトロスコピーを使用するチーズカードマトリックスにおける酵素活性の測定
実施例１に従って調製したチーズカードにおける１つの酵素の活性の超音波測定を以下のとおりに実施した。製造者の指示（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、愛国）に従って、超音波スペクトロメーターＨＲ−ＵＳ１０２を操作し、設定した。
【００８７】
ＨＲ−ＵＳ１０２超音波スペクトロメーターのセル１にチーズカード＋Ｐｉｃｃａｎｔａｓｅ（登録商標）Ｒ８０００を充填し、ＨＲＵＳのセル２にチーズカード単独を充填し、両セルについて３０℃で反応の経過を追跡した。
【００８８】
図２は、超音波技術が、チーズカードマトリックスにおいてリパーゼ（Ｐｉｃｃａｎｔａｓｅ（登録商標）Ｒ８０００）のような酵素活性を測定することが可能であることを示す。
【００８９】
実施例６
超音波スペクトロスコピーを使用する小麦粉マトリックスにおける酵素活性の測定
小麦粉懸濁液における５つの酵素の活性の超音波測定を、以下のとおりに実施した。
【００９０】
実施例２に記載のとおりに小麦粉懸濁液を調製した。その後、小麦粉懸濁液は、水浴中、３０℃で、少なくとも３０分間、酵素を伴うまたは伴わずに、インキュベートした。サンプルを、超音波水浴（Ｓｏｎｉｃｏｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ、米国より入手）を使用して、脱気した。
【００９１】
製造者の指示（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、愛国）に従って、超音波スペクトロメーターＨＲ−ＵＳ１０２を操作し、設定した。ＨＲ−ＵＳ１０２のセル１に小麦粉懸濁液＋酵素を充填し、セル２に酵素を伴わない小麦粉懸濁液を充填した。サンプルの３０℃への平衡化後、サンプルの超音波速度を、製造者の指示に従って測定した。
【００９２】
多様な酵素を試験し、添加は以下のとおりであった：
Ａ．５００ｐｐｍ＊Ｂａｋｅｚｙｍｅ  ＧＯ１５００（登録商標）と共にインキュベートした小麦粉懸濁液
Ｂ．３００ｐｐｍ＊Ｂａｋｅｚｙｍｅ  ＨＳ２０００（登録商標）と共にインキュベートした小麦粉懸濁液
Ｃ．３８ｐｐｍ＊Ｂａｋｅｚｙｍｅ  Ｐ５００（登録商標）と共にインキュベートした小麦粉懸濁液
Ｄ．１７１ｐｐｍ＊Ｂａｋｅｚｙｍｅ  Ｂ５００（登録商標）と共にインキュベートした小麦粉懸濁液
Ｅ．６０ｐｐｍ＊Ｌｉｐｏｐａｎ−Ｆ（登録商標）と共にインキュベートした小麦粉懸濁液
注：＊ｐｐｍはｍｇ酵素／ｋｇ小麦粉である。
すべてのＢａｋｅｚｙｍｅ酵素は、ＤＳＭ  Ｂａｋｅｒｙ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ、蘭国から入手し、Ｌｉｐｏｐａｎ−Ｆ（登録商標）はＮｏｙｏｚｙｍｅｓ、丁国）から入手した。
【００９３】
活性曲線を図３、グラフＡ〜Ｅに示す。
【００９４】
データは、超音波技術が、小麦粉マトリックスにおいてグルコースオキシダーゼ（Ｂａｋｅｚｙｍｅ  ＧＯ１５００（登録商標））、キシラナーゼ（Ｂａｋｅｚｙｍｅ  ＨＳ２０００（登録商標））、アミラーゼ（Ｂａｋｅｚｙｍｅ  Ｐ５００（登録商標））、プロテアーゼ（Ｂａｋｅｚｙｍｅ  Ｂ５００（登録商標））およびリパーゼ＊（Ｌｉｐｏｐａｎ  Ｆ（登録商標））のような極めて多様な酵素活性を測定することが可能であることを示す。
【００９５】
実施例７
超音波スペクトロスコピーを使用するダイズ−ＷＵＳマトリックスにおける酵素活性の測定
実施例３に従って調製したダイズ−ＷＵＳにおける２つの酵素の活性の超音波測定を以下のとおりに実施した。製造者の指示（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、愛国）に従って、超音波スペクトロメーターＨＲ−ＵＳ１０２を操作し、設定した。
【００９６】
ＨＲ−ＵＳ１０２超音波スペクトロメーターのセル１にダイズ−ＷＵＳ＋酵素を充填し、ＨＲＵＳのセル２にダイズ−ＷＵＳ単独を充填し、３０℃での相対超音波速度測定によって、反応の経過を追跡した。
【００９７】
以下の酵素について試験した：
Ｐｅｃｔｉｎｅｘ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  ＳＰ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、丁国）希釈物１０μｌ／５００ｍｌのＷＵＳ
Ｒａｐｉｄａｓｅ（登録商標）Ｐｒｅｓｓ（ＤＳＭ  Ｆｏｏｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｉｅｓ、蘭国）希釈物５０μｌ／５００ｍｌ  ＷＵＳ。
【００９８】
図４は、超音波技術がダイズ−ＷＵＳマトリックスにおいてペクチナーゼ（Ｒａｐｉｄａｓｅ  Ｐｒｅｓｓ（登録商標）およびＰｅｃｔｉｎｅｘ  ｕｌｔｒａ  ＳＰ（登録商標））のような酵素活性を測定することが可能であることを示す。
【００９９】
実施例８
超音波スペクトロスコピーを使用する乳汁マトリックスにおいて上清および無細胞抽出物にスパイクされた酵素活性の測定
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）培養上清（Ａ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）無細胞抽出物（Ｂ）においてスパイクされた酵素の活性を超音波測定によって決定した。製造者の指示（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、愛国）に従って、超音波スペクトロメーターＨＲ−ＵＳ１０２を操作し、設定した。
【０１００】
ＨＲ−ＵＳ１０２超音波スペクトロメーターの１ｍｌ超音波セルに牛乳を充填し、３０℃で平衡化させた。温度平衡化後、標準的な４８時間の枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）発酵（Ａ）由来の１００μｌの上清または同じ４８時間の枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）発酵（Ｂ）由来の１００μｌの無細胞抽出物を添加し、反応経過を追跡した。両方の実験において、上清および無細胞抽出物を、ラクターゼによるスパイクを伴うまたは伴わずに分析した。スパイクのために、Ｍａｘｉｌａｃｔ（登録商標）２０００を、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）サンプルにおいて１：１０００に希釈した。
【０１０１】
データは、超音波技術が複雑なタンパク質調製物において酵素活性を測定することが可能であることを示す。
【０１０２】
上清および無細胞抽出物を以下のとおりに調製した：
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株を、凍結管から直接、１００ｍｌのＴＹブロス（１６グラムのトリプトファン／ｌ、１０グラムの酵母抽出物／ｌおよび５グラムのＮａＣｌ／リットル；ＮａＯＨでｐＨを７に調製した）に播種し、３７℃、２５０ｒｐｍで４８時間、インキュベートした。４８時間の発酵後、細胞を、５０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって回収した。上清を回収し、ディスポーザブル０．２２μｍステリフリップ減圧システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄ  ｆｏｒｄ、米国）を使用してろ過し、−２０℃で貯蔵した。
【０１０３】
細胞ペレットをリン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）に懸濁し、使用したＰＢＳの量を、４８時間培養の光学密度のために補正した。細胞懸濁液を、細胞破砕のためのガラス粒を含有する管中の１ｍｌアリコートに分けた。破砕を、供給者によって推奨されるＢｌｕｅマトリックスプロトコルを使用して、Ｆａｓｔｐｒｅｐ（登録商標）（Ｑ−Ｂｉｏｇｅｎ，Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、仏国）において実施した。破砕は、合間に氷上で前冷却および冷却しているサンプルで２回実施した。破砕後、細胞破砕物およびマトリックスを、１分間、１０，０００ｇでの遠心分離により取り出した。無細胞抽出物を−２０℃で貯蔵した。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】乳汁マトリックスにおける３つの酵素の活性の超音波測定を表す。
【図２】チーズカードマトリックスにおけるリパーゼの活性の超音波測定を表す。
【図３】小麦粉懸濁液における５つの酵素の活性の超音波測定を表す。
【図４】ダイズ−ＷＵＳマトリックスにおけるペクチナーゼの活性の超音波測定を表す。
【図５】培養上清および無細胞抽出物においてスパイクされた酵素活性の超音波測定を表す。
【図１】
2008504834.tif 000002
【図２】
2008504834.tif 000003
【図３】
2008504834.tif 000004
【図４】
2008504834.tif 000005
【図５】
2008504834.tif 000006
【国際調査報告】
2008504834.tif 000007
2008504834.tif 000008
2008504834.tif 000009
2008504834.tif 000010
2008504834.tif 000011