(57)【要約】  本発明は、生来のコドンが同義コドンと交換されている（前記同義コドンは生来のコドンと同じアミノ酸をコードし、表１において規定されるコドン使用頻度において生来のコドンより高い頻度を有する）ような最適化されたコドン頻度を伴う同義ヌクレオチドコード配列を含んでなるヌクレオチド配列であって；場合により、前記ヌクレオチド配列は：次のリストの配列：2008527985.tif 000042から選択される５’から３’方向へ配向された１つの翻訳終結配列、および／またはヌクレオチドの多義コード：ｖ（Ａ／Ｃ／Ｇ）；ｎ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）を使用して、次のリストの配列：ｇｃｔｎｃｃｙｙｃから選択される５’から３’方向へ配向された１つの翻訳イニシエータコード配列、好ましくは、５’−ＧＣＴ  ＴＣＣ  ＴＴＣ−３’のような制御配列を含んでなる。本発明はさらに、コンセンサス翻訳イニシエータ配列：５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡｍｖ−３’に関し、好ましくは、翻訳イニシエータ配列は：５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＡ−３’、５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＣＡ−３’、および５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＧ−３’からなるリストから選択される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
・生来のコドンが同義コドンと交換されている（前記同義コドンは生来のコドンと同じアミノ酸をコードし、表１において規定されるコドン使用頻度において生来のコドンより高い頻度を有する）ような最適化されたコドン頻度を伴う同義ヌクレオチドコード配列を含んでなるヌクレオチド配列であって；場合により：
・次のリストの配列：
【化１】
2008527985.tif 000036
から選択される５’から３’方向へ配向された１つの翻訳終結配列、および／または
次のリストの配列：
【化２】
2008527985.tif 000037
から選択される５’から３’方向へ配向された１つの翻訳イニシエータコード配列、
を含んでなる、ヌクレオチド配列。
【表１】
2008527985.tif 000038
【請求項２】
最適化されたコドン頻度は、少なくとも１つの生来のコドン、好ましくは少なくとも２つの生来のコドン、より好ましくは少なくとも３つの生来のコドン、より好ましくは少なくとも４つの生来のコドン、より好ましくは少なくとも５つの生来のコドン、より好ましくは少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の生来のコドンが同義コドンと交換されているようなものであり、前記同義コドンは生来のコドンと同じアミノ酸をコードし、表１において規定されるコドン使用頻度において生来のコドンより高い頻度を有する、請求項１に記載のヌクレオチド配列。
【請求項３】
最適化されたコドン頻度は、少なくとも１つの生来のコドン、好ましくは少なくとも２つの生来のコドン、より好ましくは少なくとも３つの生来のコドン、より好ましくは少なくとも４つの生来のコドン、より好ましくは少なくとも５つの生来のコドン、より好ましくは少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の生来のコドンが同義コドンと交換されているようなものであり、同義コドンは、次のリストの最適百分率：ＴＧＣ（１００％）によるシステイン；ＴＴＣ（１００％）によるフェニルアラニン；ＣＡＣ（１００％）によるヒスチジン；ＡＡＧ（１００％）によるリジン；ＡＡＣ（１００％）によるアスパラギン；ＣＡＧ（１００％）によるグルタミン；ＴＡＣ（１００％）によるチロシン；アラニンはＧＣＴ（３８％）、ＧＣＣ（５１％）、もしくはＧＣＧ（１１％）によりコードされる；ＧＡＣ（６４％）によるアスパラギン酸；ＧＡＧ（７４％）によるグルタミン酸；ＧＧＴ（４９％）、ＧＧＣ（３５％）、ＧＧＡ（１６％）によるグリシン；ＡＴＴ（２７％）、ＡＴＣ（７３％）によるイソロイシン；ＴＴＧ（１３％）、ＣＴＴ（１７％）、ＣＴＣ（３８％）、ＣＴＧ（３２％）によるロイシン；ＣＣＴ（３６％）、ＣＣＣ（６４％）によるプロリン；ＣＧＴ（４９％）、ＣＧＣ（５１％）によるアルギニン；ＴＣＴ（２１％）、ＴＣＣ（４４％）、ＴＣＧ（１４％）、ＡＧＣ（２１％）によるセリン；ＡＣＴ（３０％）、ＡＣＣ（７０％）によるスレオニンおよび／またはＧＴＴ（２７％）、ＧＴＣ（５４％）、ＧＴＧ（１９％）によるバリンを適用する、前記頻度における前記同義コドンの百分率と列挙された最適百分率との間の差分絶対値が修飾後により小さくなるようにコドン頻度を変更する、請求項１または２に記載のヌクレオチド配列。
【請求項４】
最適化されたコドン頻度を伴う同義ヌクレオチドコード配列のコドン適応度は、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、好ましくは、９６％、９７％、９８％、最も好ましくは、＞９８％である適応値を有し、ここで、コドン適応度は、以下の関数：
【数１】
2008527985.tif 000039
［ここで、ｇはヌクレオチドコード配列、｜ｇ｜はその長さ、ｇ（ｋ）はそのｋ番目のコドンを表し、
【数２】
2008527985.tif 000040
は、コドンｃ（ｋ）の所望される割合、
【数３】
2008527985.tif 000041
はヌクレオチドコード配列ｇにおける実際の割合である］
によって算出される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項５】
アミノ酸配列から逆行分析される、請求項４に記載のコドン適応度を伴う同義ヌクレオチドコード配列。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の同義ヌクレオチドコード配列を含んでなるヌクレオチド配列であって、
同義ヌクレオチドコード配列はシグナル配列を含んでなる、ヌクレオチド配列。
【請求項７】
少なくとも１つのイントロンおよび請求項１〜６のいずれか一項に記載の同義ヌクレオチドコード配列を含んでなるヌクレオチド配列。
【請求項８】
好ましくは、翻訳イニシエータ配列を含んでなる請求項１〜７のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列であって、
前記翻訳イニシエータ配列は、ヌクレオチドの多義コード：ｍ（Ａ／Ｃ）；ｒ（Ａ／Ｇ）；ｗ（Ａ／Ｔ）；ｓ（Ｃ／Ｇ）；ｙ（Ｃ／Ｔ）；ｋ（Ｇ／Ｔ）；ｖ（Ａ／Ｃ／Ｇ）；ｈ（Ａ／Ｃ／Ｔ）；ｄ（Ａ／Ｇ／Ｔ）；ｂ（Ｃ／Ｇ／Ｔ）；ｎ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）を使用して、コンセンサス翻訳イニシエータ配列：５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡｍｖ−３’（即ち、配列番号１６）によって規定される核酸配列を含んでなり、好ましくは、コンセンサス翻訳イニシエータ配列は、次のリスト：５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＡ−３’（即ち、配列番号１７）、５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＣＡ−３’（即ち、配列番号１８）、および５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＧ−３’（即ち、配列番号１９）から選択されるものである、ヌクレオチド配列。
【請求項９】
翻訳イニシエータ配列は５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ−３’（即ち、配列番号２２）または５’−ＣＧＣＡＧＴＣＡＡＧ−３’（即ち、配列番号２３）である、請求項８に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を含んでなる核酸構築物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸構築物の少なくとも１つのコピーを含んでなる糸状菌宿主細胞。
【請求項１２】
核酸構築物に存在するコード配列および／または制御配列は、請求項１〜９のいずれか一項に記載のコード配列および／または制御配列の改変前は宿主細胞に対し生来である、請求項１１に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項１３】
核酸構築物に存在するコード配列および／または制御配列は、請求項１〜９のいずれか一項に記載のコード配列および／または制御配列の改変前は宿主細胞に対し異種である、請求項１１に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１０に記載の核酸構築物の所定のコピー数を含んでなる請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の糸状菌宿主細胞であって、
ここで、前記核酸構築物によってコードされる産物の発現は、対応する生来のヌクレオチド配列を含んでなる対応する核酸構築物によってコードされる同じ産物の産生と比較して増強され、前記対応する核酸構築物は、対応する糸状菌宿主細胞において同じコピー数で存在する、糸状菌宿主細胞。
【請求項１５】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、クリスポルム（Ｃｈｒｙｓｐｏｒｕｍ）またはペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種である、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項１６】
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、またはトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、またはクリソスポルム・ラクナウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、またはペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）である、請求項１５に記載のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、クリソスポルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｕｍ）またはペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の糸状菌宿主細胞を使用することによって、目的の化合物を産生させ、場合により、それを精製するための方法であって：
・目的の化合物の産生に適する栄養培地において、前記糸状菌宿主細胞を培養すること；および
・糸状菌宿主細胞の栄養培地から目的の化合物を回収すること、
を含んでなる、方法。
【請求項１８】
請求項１０に記載の核酸構築物の所定のコピー数を含んでなる本発明の糸状菌宿主細胞によって産生される目的の化合物の収量は、対応する生来のヌクレオチド配列を含んでなる対応する核酸構築物を含んでなる対応する糸状菌宿主細胞によって産生される同じ目的の化合物の産生と比較して、少なくとも１％、５％、１０％、２５％、５０％、１００％、２００％、３００％、４００％、より好ましくは少なくとも５００％、増加し、前記対応する核酸構築物は、対応する糸状菌宿主細胞において同じコピー数で存在する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１５または１６に記載の糸状菌細胞における目的の化合物の産生は、１リットルあたり０．１ｇ、０．２ｇ、０．３ｇ、０．４ｇ、より好ましくは０．５ｇ、最も好ましくは、１リットルあたり０．５ｇを超える目的の化合物の産生を生じる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
目的の化合物を産生させるための方法における請求項１〜９のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列のいずれか１つの使用。
【請求項２１】
目的の化合物を産生させるための方法における請求項１０に記載の核酸構築物の使用。
【請求項２２】
目的の化合物を産生させるための方法における請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の糸状菌宿主細胞のいずれか１つの使用。
【請求項２３】
ヌクレオチド配列を産生させるための方法であって、以下の工程：
・請求項１〜７に記載の最適化されたコドン頻度を伴う同義ヌクレオチドコード配列を提供すること、および場合により、
・前記同義ヌクレオチドコード配列を、請求項１に記載の制御配列に操作可能に連結すること、
を含んでなる、方法。
【請求項２４】
請求項８または９に記載のヌクレオチド配列を産生させるための方法。
【請求項２５】
請求項２３または２４に記載のヌクレオチド配列を産生させるための方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、糸状菌細胞において目的の化合物を産生させるための方法であって、ここで、目的の化合物をコードするヌクレオチド配列および／またはそれに操作可能に会合した制御ヌクレオチド配列は、目的の化合物をコードするヌクレオチド配列の改善された発現および／または目的の化合物の改善された産生が得られるように改変されている、方法に関する。
【０００２】
［背景技術］
本発明は、目的の化合物を産生させるための改善された方法に関する。タンパク質過剰発現および／または産生のための株を作製することにおいて、今までに多数のアプローチが適用されている。これは、目的の化合物をコードするマルチコピーの遺伝子を伴う株を作製すること、および強力なプロモーター配列を適用することを含むが、これらに限定されない。
【０００３】
それぞれの特定のアミノ酸は、最小で１つのコドンおよび最大で６つのコドンによってコードされる。先の研究は、細胞のポリペプチドをコードする遺伝子におけるコドン使用頻度が、種間で偏りがあることを示している（カナヤ，Ｓ（Ｋａｎａｙａ，Ｓ）、Ｙ．ヤマダ（Ｙ．Ｙａｍａｄａ）、Ｙ．クドウ（Ｙ．Ｋｕｄｏ）およびＴ．イケムラ（Ｔ．ｌｋｅｍｕｒａ）（１９９９年）「Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ａｎｄ  ｔＲＮＡ  ｇｅｎｅｓ  ａｔ  １８  ｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｔＲＮＡｓ：ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｅｖｅｌ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ」Ｇｅｎｅ  ２３８：１４３−１５５）。先の刊行物は、ポリペプチド産生を改善するための所定の宿主細胞におけるコドン使用の最適化を開示している（例えば、国際公開第９７／１１０８６号パンフレットを参照のこと）。より具体的には、国際公開第０３／７０９５７号パンフレットは、植物ポリペプチドを産生するための糸状菌における最適化されたコドン使用を説明している。「古典的」コドン最適化のこれらのすべての場合において、生来のコドンは、参照の組の遺伝子由来の最も頻度の高いコドンによって置換されている一方、各アミノ酸に対するコドン翻訳の割合が高くなるように設計される（最適化される）。しかし、この「古典的」コドン最適化は、ｔＲＮＡがなお利用可能である他のコドンを無視する。
【０００４】
最近、国際公開第０３／８５１１４号パンフレットにおいて、遺伝子において最適および非最適コドンの分布を生じるコドン使用の調和について記載され、これらはタンパク質フォールディングを生じることが想定された。遺伝子に対するコドン使用の調和のこの方法を使用することは、宿主生物体における良好（不良）なものによるドナー生物体における良好（不良）なコドンの置換を生じる。それらはより最適なものによって置き換えられないため、しかし、コドン調和（国際公開第０３／０８５１１４号パンフレット）のこの方法は、非最適コドンを無視する。さらに、該方法は相同遺伝子に適用することができない。
【０００５】
別の刊行物は、改善されたコンセンサス翻訳イニシエータ配列（米国特許第６，４６１，８３７Ｂ１号明細書）；コンセンサス配列５’−ｎｙＣｎｎｈＣＡＣＣ（ＡＴＧ）−３’を使用することによって、宿主細胞におけるポリペプチド産生を改善するためのさらなる方法を説明している。
【０００６】
糸状菌細胞においてポリペプチドを産生させるための改善された方法が依然として必要とされている。
【０００７】
［発明の詳細な説明］
糸状菌細胞における目的の化合物の産生を改善するための新規のアプローチは、タンパク質をコードする配列またはタンパク質コード配列の改変および場合により、翻訳効率および／または目的の化合物の産生の効率に影響を及ぼし得る関連する「非コード」配列または制御配列に基づいて提唱される。
【０００８】
ヌクレオチド配列
本発明の第１の態様に従えば、以下を含んでなるヌクレオチド配列が提供される：
・生来のコドンが同義コドンと交換されている（前記同義コドンは生来のコドンと同じアミノ酸をコードし、表１において規定されるコドン使用頻度において生来のコドンより高い頻度を有する）ような最適化されたコドン頻度を伴う同義ヌクレオチドコード配列；場合により、前記ヌクレオチド配列は、以下のような制御配列を含んでなる：
・次のリストの配列：
【化１】
2008527985.tif 000002
から選択される５’から３’方向へ配向された１つの翻訳終結配列、および／または
次のリストの配列：
【化２】
2008527985.tif 000003
から選択される５’から３’方向へ配向された１つの翻訳イニシエータコード配列。
【０００９】
【表１】
2008527985.tif 000004
【００１０】
好適な実施態様に従えば、前記ヌクレオチド配列は、前記ヌクレオチド配列に含まれる前記同義ヌクレオチドコード配列の最適化されたコドン頻度が、少なくとも１つの生来のコドン、好ましくは少なくとも２つの生来のコドン、より好ましくは少なくとも３つの生来のコドン、より好ましくは少なくとも４つの生来のコドン、より好ましくは少なくとも５つの生来のコドン、より好ましくは少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の生来のコドンが同義コドンと交換されているようなものであり、前記同義コドンは生来のコドンと同じアミノ酸をコードし、表１において規定されるコドン使用頻度において生来のコドンより高い頻度を有する、配列である。
【００１１】
より好適な実施態様に従えば、前記ヌクレオチド配列は、最適化されたコドン頻度が、少なくとも１つの生来のコドン、好ましくは少なくとも２つの生来のコドン、より好ましくは少なくとも３つの生来のコドン、より好ましくは少なくとも４つの生来のコドン、より好ましくは少なくとも５つの生来のコドン、より好ましくは少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の生来のコドンが同義コドンと交換されているようなものであり、同義コドンは、次のリストの至適百分率：ＴＧＣ（１００％）によるシステイン；ＴＴＣ（１００％）によるフェニルアラニン；ＣＡＣ（１００％）によるヒスチジン；ＡＡＧ（１００％）によるリジン；ＡＡＣ（１００％）によるアスパラギン；ＣＡＧ（１００％）によるグルタミン；ＴＡＣ（１００％）によるチロシン；アラニンはＧＣＴ（３８％）、ＧＣＣ（５１％）、もしくはＧＣＧ（１１％）によりコードされる；ＧＡＣ（６４％）によるアスパラギン酸；ＧＡＧ（７４％）によるグルタミン酸；ＧＧＴ（４９％）、ＧＧＣ（３５％）、ＧＧＡ（１６％）によるグリシン；ＡＴＴ（２７％）、ＡＴＣ（７３％）によるイソロイシン；ＴＴＧ（１３％）、ＣＴＴ（１７％）、ＣＴＣ（３８％）、ＣＴＧ（３２％）によるロイシン；ＣＣＴ（３６％）、ＣＣＣ（６４％）によるプロリン；ＣＧＴ（４９％）、ＣＧＣ（５１％）によるアルギニン；ＴＣＴ（２１％）、ＴＣＣ（４４％）、ＴＣＧ（１４％）、ＡＧＣ（２１％）によるセリン；ＡＣＴ（３０％）、ＡＣＣ（７０％）によるスレオニンおよび／またはＧＴＴ（２７％）、ＧＴＣ（５４％）、ＧＴＧ（１９％）によるバリンを適用する、前記頻度における前記同義コドンの百分率と列挙された至適百分率との間の差分絶対値が修飾後により小さくなるようにコドン頻度を変更する、配列である。
【００１２】
さらにより好適な実施態様に従えば、前記ヌクレオチド配列は、前記ヌクレオチド配列に含まれる最適化されたコドン頻度を伴う前記同義ヌクレオチドコード配列のコドン適応度が、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、好ましくは、９６％、９７％、９８％、最も好ましくは、＞９８％である適応値を有し、ここで、コドン適応度は、以下の関数：
【数１】
2008527985.tif 000005
［ここで、ｇはヌクレオチドコード配列、｜ｇ｜はその長さ、ｇ（ｋ）はそのｋ番目のコドンを表し、
【数２】
2008527985.tif 000006
は、コドンｃ（ｋ）の所望される割合、
【数３】
2008527985.tif 000007
はヌクレオチドコード配列ｇにおける実際の割合である］
によって算出される、配列である。
【００１３】
本発明に関して、ヌクレオチドコード配列および制御配列の両方は、本発明の方法が適用される前のこれらの配列について言及する場合、本明細書において生来または野生型である。一旦、本発明によって修飾されると、それらは、改変型または同義配列と命名される。その結果、同義配列は、一般的に、組換え配列として認識される。因みに、天然に存在する配列は、同義配列と同一であり得る。
【００１４】
本発明に関して、ヌクレオチドコード配列および同義ヌクレオチドコード配列は、産生させようとする目的の化合物を直接コードしてもよい。目的の化合物という用語は、後に「目的の化合物の産生」のセクションにおいて規定される。（同義）ヌクレオチドコード配列によって直接コードされる目的の化合物の例は、ポリペプチドであり、好ましくは、ポリペプチドは、酵素、より好ましくは、細胞外に分泌される酵素である。あるいは、（同義）ヌクレオチドコード配列によってコードされる化合物は、目的の化合物自体でなくてもよいが、特に、目的の化合物の産生に関与し得る。この場合、（同義）ヌクレオチドコード配列によってコードされる化合物は、代謝物の産生に関与する細胞内酵素、トランスポーター、転写因子、構造タンパク質、シャペロンまたはハウスキーピング遺伝子の産物であり得るが、これらに限定されない。
【００１５】
本発明に関して、用語「コドン」は、一般的に、アミノ酸をコードするヌクレオチドトリプレットを指す。本明細書において使用する「同義コドン」は、同一なヌクレオチド配列を有さないが、同一のアミノ酸（ＡＡ）をコードするコドンを指す。用語「コドン頻度」、「コドンバイアス」、または「コドン使用頻度」は、異なる対応するコドンがコード配列において使用される頻度として規定される。コドン使用頻度は、コード配列におけるいくらかのコドンが同じアミノ酸をコードするが、前記アミノ酸をコードする異なるコドンの頻度が多様なコード配列間で変動し得るという事実に基づく。
【００１６】
産生のために使用される宿主細胞に相同または異種である（ポリペプチドをコードする）ヌクレオチドコード配列は、例えば、ウイルス、原核細胞、真菌、糸状菌、他の真核生物ならびに哺乳動物、ヒトおよび植物のような高等な真核生物に由来し得る。このような（生来の）ヌクレオチドコード配列は、表１において記載されている（および「表１を使用する「最適化されたコドン頻度」または「最適化されたコドン使用頻度」の算出」の段落においてさらに開示されている）ように、最適コドン頻度に従って改変され、同義ヌクレオチド配列を生じる。生来のコード配列は、以下の群から選択することができる：
・予め決定されたアミノ酸配列をコードする野生型ヌクレオチド配列、
・コドンに対する無作為選択を使用する天然に存在するアミノ酸配列の逆翻訳、
・既知のアミノ酸配列に対して相同性を示す天然に存在しないアミノ酸配列、例えば、シャッフルした配列、
・例えば、融合配列において使用されるべき上記の配列の一部。
【００１７】
最適化されたコドン使用頻度を伴う同義ヌクレオチドコード配列は、好ましくは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、クリソスポルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｕｍ）またはペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）宿主細胞において発現される。より好ましくは、同義ヌクレオチドコード配列は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポルム・ラクナウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）またはペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）宿主細胞において発現される。最も好適なアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主細胞は、ＣＢＳ５１３．８８またはその誘導体である。好ましくは、存在する同義コード配列によってコードされる産物の発現は、対応する生来のコード配列の産生と比較して増強され、前記対応する核酸構築物は、対応する糸状菌宿主細胞において同じコピー数で存在する。好ましくは、ヌクレオチドコード配列の改変（本発明の同義ヌクレオチドコード配列を生じる）は、対応する糸状菌宿主細胞において同じコピー数で存在する生来のヌクレオチドコード配列の産生と比較して、所定のコピー数の同義ヌクレオチドコード配列を含んでなる本発明の糸状菌宿主細胞によって産生される目的の化合物の収量の少なくとも１％、５％、１０％、２５％、５０％、１００％、２００％、３００％、４００％、より好ましくは少なくとも５００％の増加を生じる。
【００１８】
産生させようとする目的の化合物の収量の増加は、本発明の糸状菌宿主細胞によって産生される化合物の量を測定し、それを、対応する糸状菌宿主細胞によって産生される目的の化合物と比較することによって決定され得る。産生される目的の化合物の収量を決定することは、特に、（同義）ヌクレオチドコード配列から転写されるｍＲＮＡの量、ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドの量、または同義ヌクレオチドコード配列によってコードされるポリペプチドの産生に関与する化合物（例えば、代謝物）の量を測定することによって、達成され得る。ｍＲＮＡの量を決定するための当業者に既知の方法の例として、ノーザンブロット、定量ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、およびマイクロアレイ分析が挙げられるが、これらに限定されない。ポリペプチドの量は、特に、当業者に既知のタンパク質測定アッセイを使用して決定することができる。ポリペプチドが酵素である場合、ポリペプチドの量は、関係する酵素に特異的な活性アッセイを使用して測定することができる。当業者は、特定の酵素についてどのアッセイを選択するかを知っている。産生させようとする目的の化合物の量を決定するための好適なアッセイは、関係する酵素に特異的な活性アッセイである。
【００１９】
表１において規定される最適コドン使用頻度および生物体の遺伝子間のコドンバイアスを考慮すると、相同なポリペプチドをコードする生来のコードヌクレオチド配列もまた、コドン最適化に供され、相同ポリペプチドについて同じ宿主における生来のヌクレオチド配列の発現よりも多い収量を提供すると考えられる。
【００２０】
本発明に関して、ヌクレオチドコード配列またはコード配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列として規定される。ヌクレオチドコード配列の境界は、一般的に、ｍＲＮＡの５’末端におけるオープンリーディングフレームの開始部に位置するＡＴＧ開始コドン、およびｍＲＮＡの３’末端におけるオープンリーディングフレームの直ぐ下流に位置する終止コドンによって決定される。ヌクレオチドコード配列としては、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、および組換え核酸配列（ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ）配列を挙げることができるが、これらに限定されない。コード配列が真核細胞における発現を目的とする場合、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常、コード配列の３’側に位置する。ヌクレオチドコード配列は、翻訳イニシエータコード配列、および場合により、シグナル配列を含んでなる。
【００２１】
ヌクレオチドコード配列の発現を達成するために、ヌクレオチドコード配列は、好ましくは、制御配列と組み合わされる。本発明に関して、制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現に必要または有利なヌクレオチド配列として規定される。ともに存在する場合、制御配列は、ヌクレオチドコード配列に操作可能に会合される。用語「制御配列」は、ヌクレオチドコード配列の発現に必要または有利なすべての遺伝子エレメントを含む。それぞれの制御配列は、ヌクレオチドコード配列に対して生来であってもまたは外来性であってもよい。制御配列として、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、翻訳イニシエータ配列、翻訳イニシエータコード配列、翻訳転写ターミネーターおよび転写ターミネーター配列が挙げられるが、これらに限定されない。制御配列は、例えば、制御配列とポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード領域との連結を容易にする特定の制限部位を導入する目的のためのリンカーを伴って提供され得る。
【００２２】
用語「操作可能に会合」は、本明細書において、制御配列が、（同義）ヌクレオチドコード配列の発現を指令するような（同義）ヌクレオチドコード配列に対する位置に、制御配列が適切に配置される配置形態として規定される。
【００２３】
本発明に関して、用語「翻訳イニシエータコード配列」は、ＤＮＡコード配列のオープンリーディングフレームのイニシエータまたは開始コドンのすぐ下流の９個のヌクレオチドとして規定される。イニシエータまたは開始コドンは、ＡＡメチオニンをコードする。イニシエータコドンは、典型的に、ＡＴＧであるが、また、ＧＴＧのような任意の機能的開始コドンであってもよい。用語「コンセンサス翻訳イニシエータコード配列」は、ＤＮＡコード配列のオープンリーディングフレームのイニシエータコドンのすぐ下流の９個のヌクレオチドとして規定され、次のＤＮＡ配列：５’−ＧＣＴｎＣＣｙｙＣ−３’（即ち、配列番号２０）（ヌクレオチドの多義コードｙ（Ｃ／Ｔ）およびｎ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）を使用している）を有する。これは、次の翻訳イニシエータコード配列の１６種の変種をもたらす：
【化３】
2008527985.tif 000008
好ましくは、翻訳イニシエータコード配列は、核酸配列：５’−ＧＣＴ  ＴＣＣ  ＴＴＣ−３’（即ち、配列番号２１）を有する。
【００２４】
コンセンサス翻訳イニシエータコード配列を使用して、記載のＡＡ位置において、次のＡＡが許容される：コードされるポリペプチドにおける＋２位のアラニン、＋３位のアラニン、セリン、プロリン、またはスレオニン、および＋４位のフェニルアラニン、セリン、ロイシンまたはプロリン。本発明において、コンセンサス翻訳イニシエータコード配列は、産生させようとするポリペプチドをコードする核酸配列に対して外来性であってもよい。あるいは、コンセンサス翻訳イニシエータは、真菌宿主細胞に対して生来であってもよい。
【００２５】
本発明に関して、用語「翻訳終結配列」は、オープンリーディングフレームまたはヌクレオチドコード配列の３’末端において翻訳終止コドンから開始し、５’から３’の方向で配向された４個のヌクレオチドとして規定される。好ましくは、翻訳終結配列は、次のリストの配列：５’−ＴＡＡＧ−３’、５’−ＴＡＧＡ−３’および５’−ＴＡＡＡ−３’から選択される。より好ましくは、翻訳終結配列は５’−ＴＡＡＡ−３’である。
【００２６】
本明細書において使用される用語「最適化されたコドン頻度」または「最適化されたコドン使用頻度」は、表１において記載されている（および「表１を使用する「最適化されたコドン頻度」または「最適化されたコドン使用頻度」の算出」の段落においてさらに開示されている）ように、コドン使用頻度に従って同義ヌクレオチドコード配列を付与するように全体的もしくは部分的に改変されている生来のヌクレオチドコード配列を指す。コドン頻度を最適化することは、宿主細胞としての任意の糸状菌種において産生させようとする任意の所定のポリペプチドについて任意のコード配列を改善するために使用することができる。好ましくは、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、クリソスポルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｕｍ）またはペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）宿主細胞である。より好ましくは、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポルム・ラクナウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）またはペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）宿主細胞である。最も好適なアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主細胞は、ＣＢＳ５１３．８８またはその誘導体である。好適な宿主細胞のより網羅的なリストは、「宿主細胞」のセクションにおいて認められる。
【００２７】
ポリペプチド配列のアミノ酸配列が決定されている場合、宿主細胞における発現のための最適化されたコドン頻度を伴うポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または同義ヌクレオチドコード配列を合成することができ、ここで、１つもしくはそれ以上の生来のコドンが、同じアミノ酸をコードする同義コドンと交換されており、前記同義コドンは、表１において記載されている（および「表１を使用する「最適化されたコドン頻度」または「最適化されたコドン使用頻度」の算出」の段落においてさらに開示されている）ように、コドン使用頻度においてより高い頻度を有する。
【００２８】
少なくとも１つの生来のコドン、少なくとも２つの生来のコドン、少なくとも３つの生来のコドン、少なくとも４つの生来のコドン、少なくとも５つの生来のコドン、または少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは、好ましくは少なくとも９５％の生来のコドンが同義コドンと交換されており、同義コドンは生来のコドンと同じアミノ酸をコードし、表１において規定されるコドン使用頻度において生来のコドンより高い頻度を有する場合、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列あるいは同義コード配列は、最適化されたコドン頻度を有するとみなされる。
【００２９】
少なくとも１つの生来のコドン、少なくとも２つの生来のコドン、少なくとも３つの生来のコドン、少なくとも４つの生来のコドン、少なくとも５つの生来のコドン、または少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは好ましくは少なくとも９５％の生来のコドンが同義コドンと交換されており、同義コドンは、次のリストの最適百分率：ＴＧＣ（１００％）によるシステイン；ＴＴＣ（１００％）によるフェニルアラニン；ＣＡＣ（１００％）によるヒスチジン；ＡＡＧ（１００％）によるリジン；ＡＡＣ（１００％）によるアスパラギン；ＣＡＧ（１００％）によるグルタミン；ＴＡＣ（１００％）によるチロシン；アラニンはＧＣＴ（３８％）、ＧＣＣ（５１％）、もしくはＧＣＧ（１１％）によりコードされる；ＧＡＣ（６４％）によるアスパラギン酸；ＧＡＧ（７４％）によるグルタミン酸；ＧＧＴ（４９％）、ＧＧＣ（３５％）、ＧＧＡ（１６％）によるグリシン；ＡＴＴ（２７％）、ＡＴＣ（７３％）によるイソロイシン；ＴＴＧ（１３％）、ＣＴＴ（１７％）、ＣＴＣ（３８％）、ＣＴＧ（３２％）によるロイシン；ＣＣＴ（３６％）、ＣＣＣ（６４％）によるプロリン；ＣＧＴ（４９％）、ＣＧＣ（５１％）によるアルギニン；ＴＣＴ（２１％）、ＴＣＣ（４４％）、ＴＣＧ（１４％）、ＡＧＣ（２１％）によるセリン；ＡＣＴ（３０％）、ＡＣＣ（７０％）によるスレオニンおよび／またはＧＴＴ（２７％）、ＧＴＣ（５４％）、ＧＴＧ（１９％）によるバリンを適用する、前記頻度における前記コドンの百分率と列挙された最適百分率との間の差分絶対値が修飾後により小さくなるようにコドン頻度を変更する場合、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列あるいは同義コード配列は、最適化されたコドン頻度を有するとみなされる。
【００３０】
コドン適応度は、すべてのコドンの出現数について正規化された遺伝子における実際のコドンの割合と標的コドンの割合との差異であると規定される。
【数４】
2008527985.tif 000009
を、コドンｃｋの所望される割合（または頻度）、および
【数５】
2008527985.tif 000010
を先と同様に遺伝子ｇにおける実際の割合とし、次いで、単一のコドン適応度は以下のように規定される：
【数６】
2008527985.tif 000011
【００３１】
従って、コドン適応度｛ｆｉｔｃ（ｇ）｝は、０〜１００％の間の値に到達することができ、最適配列は１００％に近づく。その結果、同義コード配列のコドン適応値が少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、好ましくは、９６％、９７％、９８％、最も好ましくは、＞９８％である場合、同義ヌクレオチドコード配列は、最適化されたコドン頻度を有するとみなされる。
【００３２】
本発明のヌクレオチド配列は、合成ヌクレオチド配列であってもよい。本明細書において使用する用語「合成」遺伝子、ＤＮＡ構築物、核酸、ポリヌクレオチド、プライマーなどは、天然において見出されないヌクレオチド配列；言い換えれば、単に、特定の生物体に対して異種の配列だけではなく、それが研究室において設計および／または作製されており、それがその天然に存在する供給源、テンプレートまたは相同物の１つに対して同一のヌクレオチド（もしくはおそらくＡＡ）配列を有さないような何らかの方法で変更されているという意味で、異種であるものを意味する。本明細書において使用される合成核酸またはＡＡ配列は、理論的配列または明らかに物理的に作製された実施態様を指すことができる。本発明に従う合成ペプチドは、任意の形態、例えば、紙もしくはコンピュータ読み取り可能なおよび物理的に作製された核酸配列、タンパク質、ペプチド、融合ペプチドまたはマルチペプチドで本発明に含まれることが意図される。
【００３３】
代替的に、天然に存在するヌクレオチド配列は、本発明の特徴を示し得る。そのような配列の使用も本発明に包含されるとみなされる。
【００３４】
用語「合成ヌクレオチド構築物」または「合成核酸」として、天然に存在する配列と比較して、単一もしくは複数のヌクレオチドの変更を伴う全体的に人工のアミノ酸配列または核酸配列から誘導あるいは設計される核酸を挙げることができる。これらの「合成ＤＮＡ構築物」は、無作為もしくは指向性変異誘発、ＤＮＡシャフリング方法、ＤＮＡ再集成方法、遺伝子合成によって、または当業者に公知の任意の手段（例えば、ヤング（Ｙｏｕｎｇ）およびドン（Ｄｏｎｇ）（２００４年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２、（７）電子アクセスｈｔｔｐ：／／ｎａｒ．ｏｕｐｉｏｕｒｎａｌｓ．Ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｒｅｐｒｉｎｔ／３２／７／ｅ５９またはガプタ（Ｇｕｐｔａ）ら（１９６８年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，６０：１３３８−１３４４；スカルプラ（Ｓｃａｒｐｕｌｌａ）ら（１９８２年）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２１：３５６−３６５；ステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）ら、（１９９５年）、Ｇｅｎｅ  １６４：４９−５３を参照のこと）によって作製することができる。
【００３５】
あるいは、合成ヌクレオチド配列をアミノ酸配列から設計してもよい（実施例２を参照のこと）。この逆操作方法を使用すれば、利用され得ない天然に存在するヌクレオチド配列の必要性はなくなる。逆翻訳は、最初に、コドンに対する無作為選択を使用して実施し得る。続いて、得られるヌクレオチド配列を、コドン使用頻度について最適化することができる。
【００３６】
別の好適な実施態様に従えば、本発明に従う最適化されたコドン頻度を伴う同義ヌクレオチドコード配列は、逆に操作されたヌクレオチドコード配列であり、ここで、最適化されたコドン頻度は、少なくとも１つのコドン、少なくとも２つのコドン、少なくとも３つのコドン、少なくとも４つのコドン、少なくとも５つのコドンもしくは少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または好ましくは少なくとも９５％のコドンが、表１において規定されるコドン使用頻度において、算術平均によって推定されるコドン使用頻度（即ち、１コドンの場合１００％、２コドンの場合５０％、３コドンの場合３３．３％、４コドンの場合２５％、および６コドンの場合１６．７％）より高い頻度を有するようなものである。
【００３７】
より好適な実施態様に従えば、最適化されたコドン頻度を伴う前記同義ヌクレオチドコード配列は、逆に操作されたヌクレオチドコード配列であり、ここで、ヌクレオチドコード配列のコドン適応度が、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、好ましくは、９６％、９７％、９８％、最も好ましくは、＞９８％である適応値を有し、ここで、コドン適応度は、以下の関数によって算出される：
【数７】
2008527985.tif 000012
［ここで、ｇはヌクレオチドコード配列、｜ｇ｜はその長さ、ｇ（ｋ）はそのｋ番目のコドンを表し、
【数８】
2008527985.tif 000013
は、コドンｃ（ｋ）の所望される割合、
【数９】
2008527985.tif 000014
はヌクレオチドコード配列ｇにおける算出された割合である］。
【００３８】
本発明のヌクレオチド配列に存在し得る制御配列に加えて、ヌクレオチドコード配列は、シグナル配列、またはシグナルペプチドコード領域を含んでなり得る。
【００３９】
シグナル配列は、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードし、発現されたポリペプチドを細胞の分泌経路へ指向することができる。ヌクレオチド配列のコード配列の５’末端は、分泌される目的のポリペプチドをコードするコード領域のセグメントを伴う翻訳リーディングフレームにおいて天然に連結されるシグナルペプチドコード領域を本来的に含有し得る。その場合、翻訳イニシエータコード配列はシグナル配列の部分である。あるいは、コード配列の５’末端は、分泌されるタンパク質をコードするコード配列の一部に対して外来性であるシグナルペプチドコード領域を含有してもよい。外来性のシグナルペプチドコード領域は、コード配列がシグナルペプチドコード領域を天然には含有しない場合に要求され得る。あるいは、コード配列と正常に会合された天然のシグナルペプチドコード領域に関連するタンパク質の増強された分泌を得るために、外来性のシグナルペプチドコード領域は、単純に天然のシグナルペプチドコード領域を置き換えてもよい。シグナルペプチドコード領域は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種由来のグルコアミラーゼもしくはアミラーゼ遺伝子、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）種由来のリパーゼもしくはプロテイナーゼ遺伝子、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のα−因子の遺伝子、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来のアミラーゼもしくはプロテアーゼ遺伝子、または仔ウシプレプロキモシン遺伝子から得られる。しかし、発現されるタンパク質を好適な宿主細胞の分泌経路に指向することが可能ないずれのシグナルペプチドコード領域も本発明において使用することができる。糸状菌宿主細胞に好適なシグナルペプチドコード領域は、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ遺伝子（ＥＰ２３８０２３号明細書）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性アミラーゼ遺伝子、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子、フミコーラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）セルラーゼ遺伝子、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼ、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）クチナーゼ、カンジダ・アンタクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｃｔｉｃａ）リパーゼＢ遺伝子またはリゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ遺伝子ならびにその変異、短縮型、およびハイブリッドシグナル配列から得られるシグナルペプチドコード領域である。
【００４０】
好適な別の実施態様では、本発明の最適化されたコード頻度を伴う同義ヌクレオチドコード配列は、シグナル配列を含んでなる。より好適な実施態様に従って、本発明のシグナル配列は、最適化されたコドン頻度を伴うシグナル配列であって、ここで、少なくとも１つの生来のコドン、または少なくとも１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは好ましくは少なくとも９５％の生来のコドンが同義コドンと交換されており、前記同義コドンは、生来のコドンと同じアミノ酸を有し、表１において規定され、「表１を使用する「最適化されたコドン頻度」または「最適化されたコドン使用頻度」の算出」の段落においてさらに開示されるように、コドン使用頻度において、生来のコドンより高い頻度を有する。より好ましくは、本発明のシグナル配列は、次のコンセンサスＤＮＡ配列：５’−ＧＣＴｎＣＧｙｙＧ−３’（即ち、配列番号２０）を有する翻訳イニシエータコード配列または、さらにより好ましくは、核酸配列：５’−ＧＣＴ  ＴＣＣ  ＴＴＣ−３’（即ち、配列番号２１）を伴う翻訳イニシエータコード配列を含んでなる。
【００４１】
ヌクレオチドコード配列は、本発明の修飾が適用される前は、タンパク質配列においてアミノ酸をコードしないヌクレオチドを含有する１つもしくはそれ以上のイントロンを含有してもよい。コード配列の発現を最適化する工程の１つは、イントロンを伴わない同義コード配列を使用し得る。実施例２では、生来のヌクレオチド配列に存在するイントロンは、改変型構築物において置き換えられなかった。
【００４２】
あるいはおよび本発明の別の好適な実施態様に従えば、本発明の同義ヌクレオチドコード配列を含んでなるヌクレオチド配列（ここで、改変されていないヌクレオチドコード配列は、本来、１つもしくはそれ以上のイントロンを含んでなった）では、少なくとも１つのイントロンが、ヌクレオチドコード配列において、好ましくは、（必ずしも必要ではないが）本来の位置で、再導入されている。実施例１では、麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ｐｌａ１ＤＮＡ配列の部分であるイントロンが、発現のために使用されたコドン最適化（同義）ＤＮＡ配列において置き換えられた。
【００４３】
翻訳イニシエータ配列
第２の態様では、本発明は、翻訳イニシエータ配列に関する。翻訳イニシエータ配列は、タンパク質の開始部をコードする核酸領域であり、翻訳イニシエータ配列の生物学的活性は、アミノ酸配列がｍＲＮＡのヌクレオチド配列によって特定されるポリペプチドのリボソーム仲介産生を開始すべきである。真核生物では、ＡＴＧの前の翻訳イニシエータコンセンサス配列（６−１２ヌクレオチド）は、この論題に対する最初の研究（コザック，Ｍ．（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．）（１９８７年）：「ａｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ５’−ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ６９９  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡｓ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５（２０）：８１２５−４７）により、しばしば、コザックコンセンサス配列と呼ばれる。コザック（Ｋｏｚａｋ）によって誘導される＋４ヌクレオチドを含む本来のコザックコンセンサス配列ＣＣＣＧＣＣＧＣＣｒＣＣ（ＡＴＧ）Ｇは、高等真核生物における翻訳の開始と関連する。本発明に関して、用語「翻訳イニシエータ配列」は、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のオープンリーディングフレームのイニシエータまたは開始コドンのすぐ上流の１０個のヌクレオチドとして規定される。イニシエータまたは開始コドンは、ＡＡメチオニンをコードする。イニシエータコドンは、典型的に、ＡＴＧであるが、また、ＧＴＧのような任意の機能的開始コドンであってもよい。ウラシル、Ｕが、ＲＮＡでは、デオキシヌクレオチドのチミン、Ｔに取って代わることは当該分野において周知である。
【００４４】
転写イニシエータ配列の生物学的活性は、転写イニシエータ配列のすぐ下流のオープンリーディングフレームの転写された遺伝子産物の量を測定し、この量と、対照転写イニシエータ配列によって制御される同じオープンリーディングフレームから測定される量とを比較することによる定量的方法で決定することができる。遺伝子産物の量は、ｍＲＮＡの量またはｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドの量のいずれかを測定することによって、決定され得る。ｍＲＮＡの量を決定するための当業者に既知の方法の例として、ノーザンブロット、定量ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、およびマイクロアレイ分析が挙げられるが、これらに限定されない。転写イニシエータ配列のすぐ下流のオープンリーディングフレームによってコードされるポリペプチドの量は、特に、当業者に既知のタンパク質測定アッセイを使用して、決定することができる。転写イニシエータ配列のすぐ下流のオープンリーディングフレームによってコードされるポリペプチドが酵素である場合、ポリペプチドの量は、関係する酵素に特異的な活性アッセイを使用して、測定することができる。当業者は、特定の酵素についてどのアッセイを選択するかを知っている。転写イニシエータ配列の生物学的活性を決定するための好適なアッセイは、関係する酵素に特異的な活性アッセイである。
【００４５】
好適な実施態様に従えば、ヌクレオチド配列、好ましくは、本発明の第１の態様のヌクレオチド配列は、翻訳イニシエータ配列を含んでなり、前記翻訳イニシエータ配列は、ヌクレオチドの多義コード：ｍ（Ａ／Ｃ）；ｒ（Ａ／Ｇ）；ｗ（Ａ／Ｔ）；ｓ（Ｃ／Ｇ）；ｙ（Ｃ／Ｔ）；ｋ（Ｇ／Ｔ）；ｖ（Ａ／Ｃ／Ｇ）；ｈ（Ａ／Ｃ／Ｔ）；ｄ（Ａ／Ｇ／Ｔ）；ｂ（Ｃ／Ｇ／Ｔ）；ｎ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）を使用するコンセンサス翻訳イニシエータ配列：５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡｍｖ−３’（即ち、配列番号１６）によって規定される核酸配列を含んでなる。より好ましくは、コンセンサス翻訳イニシエータ配列は、以下のリスト：５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＡ−３’（即ち、配列番号１７）；５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＣＡ−３’（即ち、配列番号１８）または５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＧ−３’（即ち、配列番号１９）から選択されるものである。これらのより好適な配列は、次の配列のいずれか１つに対応する：
【化４】
2008527985.tif 000015
【００４６】
より好適な実施態様に従えば、翻訳イニシエータ（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｒ）配列は、５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ−３’（即ち、配列番号２２）または５’−ＣＧＣＡＧＴＣＡＡＧ−３’（即ち、配列番号２３）である。
【００４７】
本発明は、単離された翻訳イニシエータ配列、単離された翻訳イニシエータ配列と同じ生物学的活性をなお有するその変種およびサブ配列をさらに包含する。
【００４８】
本発明のコンセンサス翻訳イニシエータ配列は、好ましくは、本発明の第１の態様のヌクレオチド配列に含まれる。あるいは、本発明のコンセンサス翻訳イニシエータ配列は、目的の化合物をコードするヌクレオチドコード配列を含んでなる任意のヌクレオチド配列に含まれ得る。ヌクレオチドコード配列は、いずれのコード配列であってもよい。好ましくは、ヌクレオチドコード配列は、先に規定されるような同義コード配列である。
【００４９】
さらに、本発明の別の態様に従えば、「核酸構築物」のセクションにおいて規定される核酸構築物または発現ベクターが提供され、前記核酸構築物または発現ベクターは、本発明のコンセンサス翻訳イニシエータ配列を含んでなる。
【００５０】
本発明のコンセンサス翻訳イニシエータ配列は、前記細胞において産生させようとする任意の化合物をコードする任意の核酸配列を発現させるために、任意の糸状菌細胞において使用することができる。糸状菌細胞は、「宿主細胞」のセクションにおいて規定される。
【００５１】
本発明において、コンセンサス翻訳イニシエータ配列は、好ましくは、産生させよとするポリペプチドをコードする核酸配列に対して外来性であるが、コンセンサス翻訳イニシエータ配列は、真菌宿主細胞に対して生来であってもよい。
【００５２】
当業者は、本発明が、個別または組み合わせで使用することができるいくらかの異なる実施態様に関することを理解するであろう：
・最適コドン頻度および／または以下のような制御配列の改変を使用することによる同義ヌクレオチドコード配列：
・次のリストの配列：
【化５】
2008527985.tif 000016
から選択される５’から３’方向へ配向された翻訳終結配列、および／または
・次のリストの配列：
【化６】
2008527985.tif 000017
から選択される５’から３’方向へ配向された翻訳イニシエータコード配列、および／または
翻訳イニシエータ配列であって、前記翻訳イニシエータ配列は、ヌクレオチドの多義コード：ｍ（Ａ／Ｃ）；ｒ（Ａ／Ｇ）；ｗ（Ａ／Ｔ）；ｓ（Ｃ／Ｇ）；ｙ（Ｃ／Ｔ）；ｋ（Ｇ／Ｔ）；ｖ（Ａ／Ｃ／Ｇ）；ｈ（Ａ／Ｃ／Ｔ）；ｄ（Ａ／Ｇ／Ｔ）；ｂ（Ｃ／Ｇ／Ｔ）；ｎ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）を使用するコンセンサス翻訳イニシエータ配列：５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡｍｖ−３’によって規定される核酸配列を含んでなり、好ましくは、翻訳イニシエータ配列は、次のリスト：５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＡ−３’、５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＣＡ−３’、および５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＧ−３’から選択されるものであり、より好ましくは、翻訳イニシエータ配列は、５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ−３’または５’−ＣＧＣＡＧＴＣＡＡＧ−３’である。
【００５３】
当業者は、本発明が、個別または多様な異なる組み合わせ（これらの組み合わせのいくらかを下記に記載する）で使用することができるいくらかの異なる実施態様に関することを理解するであろう。
【００５４】
好ましくは、本発明のヌクレオチド配列は、本明細書において開示される本発明に従う最適化されたコドン頻度を有する同義コード配列を含んでなる。
【００５５】
さらに好適な実施態様に従えば、本発明のヌクレオチド配列は、本明細書において開示されるような本発明に従う最適化されたコドン頻度を有する同義コード配列を含んでなり、前記同義コード配列は、次のリスト：５’−ＴＡＡＧ−３’、５’−ＴＡＧＡ−３’、および５’−ＴＡＡＡ−３’から選択される５’から３’方向へ配向された１つの翻訳終結配列を含んでなる制御配列と会合する。より好ましくは、本発明のヌクレオチド配列は、本明細書において開示されるような本発明に従う最適化されたコドン頻度を有する同義コード配列を含んでなり、前記同義コード配列は、次の翻訳終結配列５’−ＴＡＡＡ−３’を含んでなる制御配列と会合する。
【００５６】
なおさらに好適な実施態様に従えば、本発明のヌクレオチド配列は、本明細書において開示されるような本発明に従う最適化されたコドン頻度を有する同義コード配列を含んでなり、前記同義コード配列は、次のリスト：５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＡ−３’、５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＣＡ−３’、および５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＧ−３’（ｍ，ｗの多義コードについては既に先に開示されている）から選択される１つの翻訳イニシエータ配列を含んでなる制御配列と会合する。より好ましくは、ヌクレオチド配列は、本明細書において開示されるような本発明に従う最適化されたコドン頻度を有する同義コード配列を含んでなり、前記同義コード配列は、次のリスト：５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ−３’および５’−ＣＧＣＡＧＴＣＡＡＧ−３’から選択される１つの翻訳イニシエータ配列を含んでなる制御配列と会合する。なおより好ましくは、ヌクレオチド配列は、本明細書において開示されるような本発明に従う最適化されたコドン頻度を有する同義コード配列を含んでなり、前記同義コード配列は、次の翻訳イニシエータ配列５’−ＣＧＣＡＧＴＣＡＡＧ−３’と会合する。最も好ましくは、ヌクレオチド配列は、本明細書において開示されるような本発明に従う最適化されたコドン頻度を有する同義コード配列を含んでなり、前記同義コード配列は、次の翻訳イニシエータ配列５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ−３’と会合する。
【００５７】
なおさらに好適な実施態様に従えば、ヌクレオチド配列は、本明細書において開示されるような本発明に従う最適化されたコドン頻度を有する同義コード配列を含んでなり、前記同義コード配列は、次のリスト：５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＡ−３’、５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＣＡ−３’、および５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＧ−３’（ｍ，ｗの多義コードについては既に先に開示されている）から選択される１つの翻訳イニシエータ配列ならびに／あるいは次のリスト：５’−ＴＡＡＧ−３’、５’−ＴＡＧＡ−３’および５’−ＴＡＡＡ−３’から選択される５’から３’方向へ配向された１つの翻訳終結配列を含んでなる制御配列と会合する。より好ましくは、ヌクレオチド配列は、本明細書において開示されるような本発明に従う最適化されたコドン頻度を有する同義コード配列を含んでなり、前記同義コード配列は、次のリスト：５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＡ−３’および５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＣＡ−３’および５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＧ−３’（ｍ，ｗの多義コードについては既に先に開示されている）から選択される１つの翻訳イニシエータ配列ならびに／あるいは次の翻訳終結配列５’−ＴＡＡＡ−３’を含んでなる制御配列と会合する。さらにより好ましくは、ヌクレオチド配列は、本明細書において開示されるような本発明に従う最適化されたコドン頻度を有する同義コード配列を含んでなり、前記同義コード配列は、次のリスト：５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ−３’および５’−ＣＧＣＡＧＴＣＡＡＧ−３’から選択される１つの翻訳イニシエータ配列ならびに／あるいは次のリスト：５’−ＴＡＡＧ−３’、５’−ＴＡＧＡ−３’および５’−ＴＡＡＡ−３’から選択される５’から３’方向へ配向された１つの翻訳終結配列を含んでなる制御配列と会合する。その上さらにより好ましくは、ヌクレオチド配列は、本明細書において開示されるような本発明に従う最適化されたコドン頻度を有する同義コード配列を含んでなり、前記同義コード配列は、次のリスト：５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ−３’および５’−ＣＧＣＡＧＴＣＡＡＧ−３’から選択される１つの翻訳イニシエータ配列ならびに／あるいは次の翻訳終結配列５’−ＴＡＡＡ−３’を含んでなる制御配列と会合する。その上さらにより好ましくは、ヌクレオチド配列は、本明細書において開示されるような本発明に従う最適化されたコドン頻度を有する同義コード配列を含んでなり；前記同義コード配列は、次の翻訳イニシエータ配列５’−ＣＧＣＡＧＴＣＡＡＧ−３’および／または次の翻訳終結配列５’−ＴＡＡＡ−３’と会合する。最も好ましくは、ヌクレオチド配列は、本明細書において開示されるような本発明に従う最適化されたコドン頻度を有する同義コード配列を含んでなり；前記同義コード配列は、次の翻訳イニシエータ配列５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ−３’および／または次の翻訳終結配列５’−ＴＡＡＡ−３’と会合する。
【００５８】
最も好適な実施態様に従えば、本発明のヌクレオチド配列は、本明細書において開示されるような本発明に従う最適化されたコドン頻度を有する同義コード配列を含んでなり、ならびに／あるいは次の翻訳イニシエータコード配列５’−ＧＣＴＴＣＣＴＴＣ−３’を含んでなり；前記同義コード配列は、次のリスト：５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＡ−３’、５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＣＡ−３’、および５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＧ−３’（ｍ，ｗの多義コードについては既に先に開示されている）から選択される１つの翻訳イニシエータ配列ならびに／あるいは次のリスト：５’−ＴＡＡＧ−３’、５’−ＴＡＧＡ−３’、および５’−ＴＡＡＡ−３’から選択される５’から３’方向へ配向された１つの翻訳終結配列を含んでなる制御配列と会合する。より好ましくは、ヌクレオチド配列は、本明細書において開示されるような本発明に従う最適化されたコドン頻度を有する同義コード配列を含んでなり、ならびに／あるいは次の翻訳イニシエータコード配列５’−ＧＣＴＴＣＣＴＴＣ−３’を含んでなり；前記同義コード配列は、次のリスト：５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＡ−３’および５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＣＡ−３’、および５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＧ−３’（ｍ，ｗの多義コードについては既に先に開示されている）から選択される１つの翻訳イニシエータ配列ならびに／あるいは次の翻訳終結配列５’−ＴＡＡＡ−３’を含んでなる制御配列と会合する。さらにより好ましくは、ヌクレオチド配列は、本明細書において開示されるような本発明に従う最適化されたコドン頻度を有する同義コード配列を含んでなり、ならびに／あるいは次の翻訳イニシエータコード配列５’−ＧＣＴＴＣＣＴＴＣ−３’を含んでなり；前記同義コード配列は、次のリスト：５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ−３’および５’−ＣＧＣＡＧＴＣＡＡＧ−３’から選択される１つの翻訳イニシエータ配列ならびに／あるいは次のリスト：５’−ＴＡＡＧ−３’、５’−ＴＡＧＡ−３’および５’−ＴＡＡＡ−３’から選択される５’から３’方向へ配向された１つの翻訳終結配列を含んでなる制御配列と会合する。その上さらにより好ましくは、ヌクレオチド配列は、本明細書において開示されるような本発明に従う最適化されたコドン頻度を有する同義コード配列を含んでなり、ならびに／あるいは次の翻訳イニシエータコード配列５’−ＧＣＴＴＣＣＴＴＣ−３’を含んでなり；前記同義コード配列は、次のリスト：５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ−３’および５’−ＣＧＣＡＧＴＣＡＡＧ−３’から選択される翻訳イニシエータ配列ならびに／あるいは次の翻訳終結配列５’−ＴＡＡＡ−３’を含んでなる制御配列と会合する。その上さらにより好ましくは、ヌクレオチド配列は、本明細書において開示されるような本発明に従う最適化されたコドン頻度を有する同義コード配列を含んでなり、ならびに／あるいは次の翻訳イニシエータコード配列５’−ＧＣＴＴＣＣＴＴＣ−３’を含んでなり；前記同義コード配列は、次の翻訳イニシエータ配列５’−ＣＧＣＡＧＴＣＡＡＧ−３’ならびに／あるいは次の翻訳終結配列５’−ＴＡＡＡ−３’と会合する。最も好ましくは、ヌクレオチド配列は、本明細書において開示されるような本発明に従う最適化されたコドン頻度を有する同義コード配列を含んでなり、ならびに／あるいは次の翻訳イニシエータコード配列５’−ＧＣＴＴＣＣＴＴＣ−３’を含んでなり；前記同義コード配列は、次の翻訳イニシエータ配列５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ−３’ならびに／あるいは次の翻訳終結配列５’−ＴＡＡＡ−３’と会合する。
【００５９】
あるいはおよび本発明の別の好適な実施態様に従えば、本発明のヌクレオチド配列は、コード配列を含んでなり、前記コード配列は、次のリスト：５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＡ−３’、５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＣＡ−３’、および５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＧ−３’（ｍ，ｗの多義コードについては既に先に開示されている）から選択される１つの翻訳イニシエータ配列を含んでなる制御配列と会合する。より好ましくは、ヌクレオチド配列はコード配列を含んでなり、前記コード配列は、次のリスト：５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ−３’および５’−ＣＧＣＡＧＴＣＡＡＧ−３’から選択される翻訳イニシエータ配列を含んでなる制御配列と会合する。さらにより好ましくは、ヌクレオチド配列はコード配列を含んでなり、前記コード配列は、翻訳イニシエータ配列５’−ＣＧＣＡＧＴＣＡＡＧ−３’を含んでなる制御配列と会合する。最も好ましくは、ヌクレオチド配列はコード配列を含んでなり、前記コード配列は、翻訳イニシエータ配列５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ−３’を含んでなる制御配列と会合する。
【００６０】
あるいはおよび本発明の別のさらに好適な実施態様に従えば、ヌクレオチド配列は、コード配列を含んでなり、ならびに／あるいは次の翻訳イニシエータコード配列５’−ＧＣＴＴＣＣＴＴＣ−３’を含んでなり、前記コード配列は、次のリスト：５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＡ−３’、５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＣＡ−３’、および５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＧ−３’（ｍ，ｗの多義コードについては既に先に開示されている）から選択される１つの翻訳イニシエータ配列を含んでなる制御配列と会合する。より好ましくは、ヌクレオチド配列はコード配列を含んでなり、および／または次の翻訳イニシエータコード配列５’−ＧＣＴＴＣＣＴＴＣ−３’を含んでなり、前記コード配列は、次のリスト：５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ−３’および５’−ＣＧＣＡＧＴＣＡＡＧ−３’から選択される１つの翻訳イニシエータ配列を含んでなる制御配列と会合する。さらにより好ましくは、ヌクレオチド配列はコード配列を含んでなり、および／または次の翻訳イニシエータコード配列５’−ＧＣＴＴＣＣＴＴＣ−３’を含んでなり、前記コード配列は、翻訳イニシエータ配列５’−ＣＧＣＡＧＴＣＡＡＧ−３’を含んでなる制御配列と会合する。最も好ましくは、ヌクレオチド配列はコード配列を含んでなり、および／または次の翻訳イニシエータコード配列５’−ＧＣＴＴＣＣＴＴＣ−３’を含んでなり、前記コード配列は、翻訳イニシエータ配列５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ−３’を含んでなる制御配列と会合する。
【００６１】
あるいはおよび本発明の別のさらに好適な実施態様に従えば、ヌクレオチド配列は、コード配列を含んでなり、前記同義コード配列は、次のリスト：５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＡ−３’、５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＣＡ−３’、および５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＧ−３’（ｍ，ｗの多義コードについては既に先に開示されている）から選択される翻訳イニシエータ配列ならびに／あるいは次のリスト：５’−ＴＡＡＧ−３’、５’−ＴＡＧＡ−３’および５’−ＴＡＡＡ−３’から選択される５’から３’方向へ配向された１つの翻訳終結配列を含んでなる制御配列と会合する。より好ましくは、ヌクレオチド配列はコード配列を含んでなり、前記同義コード配列は、次のリスト：５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＡ−３’および５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＣＡ−３’および５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＧ−３’（ｍ，ｗの多義コードについては既に先に開示されている）から選択される１つの翻訳イニシエータ配列ならびに／あるいは次の翻訳終結配列５’−ＴＡＡＡ−３’を含んでなる制御配列と会合する。さらにより好ましくは、ヌクレオチド配列はコード配列を含んでなり、前記コード配列は、次のリスト：５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ−３’および５’−ＣＧＣＡＧＴＣＡＡＧ−３’から選択される翻訳イニシエータ配列ならびに／あるいは次のリスト：５’−ＴＡＡＧ−３’、５’−ＴＡＧＡ−３’および５’−ＴＡＡＡ−３’から選択される５’から３’方向へ配向された１つの翻訳終結配列を含んでなる制御配列と会合する。その上さらにより好ましくは、ヌクレオチド配列はコード配列を含んでなり、前記コード配列は、次のリスト：５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ−３’および５’−ＣＧＣＡＧＴＣＡＡＧ−３’から選択される翻訳イニシエータ配列ならびに／あるいは次の翻訳終結配列５’−ＴＡＡＡ−３’を含んでなる制御配列と会合する。その上さらにより好ましくは、ヌクレオチド配列はコード配列を含んでなり、前記コード配列は、翻訳イニシエータ配列５’−ＣＧＣＡＧＴＣＡＡＧ−３’ならびに／あるいは次のリスト：５’−ＴＡＡＧ−３’、５’−ＴＡＧＡ−３’および５’−ＴＡＡＡ−３’から選択される５’から３’方向へ配向された１つの翻訳終結配列と会合する。その上さらにより好ましくは、ヌクレオチド配列はコード配列を含んでなり、前記コード配列は、翻訳イニシエータ配列５’−ＣＧＣＡＧＴＣＡＡＧ−３’および／または次の翻訳終結配列５’−ＴＡＡＡ−３’と会合する。その上さらにより好ましくは、ヌクレオチド配列はコード配列を含んでなり、前記コード配列は、翻訳イニシエータ配列５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ−３’ならびに／あるいは次のリスト：５’−ＴＡＡＧ−３’、５’−ＴＡＧＡ−３’および５’−ＴＡＡＡ−３’から選択される５’から３’方向へ配向された１つの翻訳終結配列と会合する。最も好ましくは、ヌクレオチド配列はコード配列を含んでなり、前記コード配列は、翻訳イニシエータ配列５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ−３’および／または次の翻訳終結配列５’−ＴＡＡＡ−３’と会合する。
【００６２】
あるいはおよび本発明の最も好適な実施態様に従えば、ヌクレオチド配列はコード配列を含んでなり、ならびに／あるいは次の翻訳イニシエータコード配列５’−ＧＣＴＴＣＣＴＴＣ−３’を含んでなり、前記同義コード配列は、次のリスト：５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＡ−３’、５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＣＡ−３’、および５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＧ−３’（ｍ，ｗの多義コードについては既に先に開示されている）から選択される１つの翻訳イニシエータ配列ならびに／あるいは次のリスト：５’−ＴＡＡＧ−３’、５’−ＴＡＧＡ−３’および５’−ＴＡＡＡ−３’から選択される５’から３’方向へ配向された１つの翻訳終結配列を含んでなる制御配列と会合する。より好ましくは、ヌクレオチド配列は、コード配列を含んでなり、ならびに／あるいは次の翻訳イニシエータコード配列５’−ＧＣＴＴＣＣＴＴＣ−３’を含んでなり、前記コード配列は、次のリスト：５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＡ−３’、５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＣＡ−３’、および５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＧ−３’（ｍ，ｗの多義コードについては既に先に開示されている）から選択される１つの翻訳イニシエータ配列ならびに・あるいは次の翻訳終結配列５’−ＴＡＡＡ−３’を含んでなる制御配列と会合する。さらにより好ましくは、ヌクレオチド配列はコード配列を含んでなり、ならびに／あるいは次の翻訳イニシエータコード配列５’−ＧＣＴＴＣＣＴＴＣ−３’を含んでなり、前記コード配列は、次のリスト：５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ−３’および５’−ＣＧＣＡＧＴＣＡＡＧ−３’から選択される１つの翻訳イニシエータ配列ならびに／あるいは次のリスト：５’−ＴＡＡＧ−３’、５’−ＴＡＧＡ−３’および５’−ＴＡＡＡ−３’から選択される５’から３’方向へ配向された１つの翻訳終結配列を含んでなる制御配列と会合する。その上さらにより好ましくは、ヌクレオチド配列はコード配列を含んでなり、ならびに／あるいは次の翻訳イニシエータコード配列５’−ＧＣＴＴＣＣＴＴＣ−３’を含んでなり、前記コード配列は、次のリスト：５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ−３’および５’−ＣＧＣＡＧＴＣＡＡＧ−３’から選択される翻訳イニシエータ配列ならびに／あるいは次の翻訳終結配列５’−ＴＡＡＡ−３’を含んでなる制御配列と会合する。その上さらにより好ましくは、ヌクレオチド配列はコード配列を含んでなり、ならびに／あるいは次の翻訳イニシエータコード配列５’−ＧＣＴＴＣＣＴＴＣ−３’を含んでなり、前記コード配列は、翻訳イニシエータ配列５’−ＣＧＣＡＧＴＣＡＡＧ−３’ならびに／あるいは次のリスト：５’−ＴＡＡＧ−３’、５’−ＴＡＧＡ−３’および５’−ＴＡＡＡ−３’から選択される５’から３’方向へ配向された１つの翻訳終結配列と会合する。その上さらにより好ましくは、ヌクレオチド配列はコード配列を含んでなり、および／または次の翻訳イニシエータコード配列５’−ＧＣＴＴＣＣＴＴＣ−３’を含んでなり、前記コード配列は、翻訳イニシエータ配列５’−ＣＧＣＡＧＴＣＡＡＧ−３’および／または次の翻訳終結配列５’−ＴＡＡＡ−３’と会合する。最も好ましくは、ヌクレオチド配列はコード配列を含んでなり、および／または次の翻訳イニシエータコード配列５’−ＧＣＴＴＣＣＴＴＣ−３’を含んでなり、前記コード配列は、翻訳イニシエータ配列５’−ＣＧＣＡＧＴＣＡＡＧ−３’および／または次の翻訳終結配列５’−ＴＡＡＡ−３’と会合する。
【００６３】
あるいはおよび本発明の別の好適な実施態様に従えば、本発明のヌクレオチド配列はコード配列を含んでなり、前記コード配列は、次のリスト：５’−ＴＡＡＧ−３’、５’−ＴＡＧＡ−３’、および５’−ＴＡＡＡ−３’から選択される５’から３’方向へ配向された１つの翻訳終結配列を含んでなる制御配列と会合する。より好ましくは、本発明のヌクレオチド配列はコード配列を含んでなり、前記コード配列は次の翻訳終結配列５’−ＴＡＡＡ−３’と会合する。
【００６４】
あるいはおよび本発明の別の好適な実施態様に従えば、本発明のヌクレオチド配列はコード配列を含んでなり、ならびに／あるいは次の翻訳イニシエータコード配列５’−ＧＣＴＴＣＣＴＴＣ−３’を含んでなり、前記コード配列は、次のリスト：５’−ＴＡＡＧ−３’、５’−ＴＡＧＡ−３’および５’−ＴＡＡＡ−３’から選択される５’から３’方向へ配向された１つの翻訳終結配列を含んでなる制御配列と会合する。より好ましくは、ヌクレオチド配列はコード配列を含んでなり、および／または次の翻訳イニシエータコード配列５’−ＧＣＴＴＣＣＴＴＣ−３’を含んでなり、前記コード配列は、次の翻訳終結配列５’−ＴＡＡＡ−３’と会合する。
【００６５】
本発明の第１の態様において規定される制御配列に加えて、他の制御配列を使用してもよい。他のそのような制御配列は、適切なプロモーター配列、核酸配列の発現のために宿主細胞によって認識されるヌクレオチド配列であってもよい。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を仲介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、変異、短縮型、およびハイブリッドプロモーターを含む細胞において転写活性を示す任意の核酸配列であってもよく、細胞に対して同種または異種のいずれかの細胞外もしくは細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得てもよい。
【００６６】
制御配列はまた、適切な転写ターミネーター配列、転写を終結するために細胞によって認識される配列であってもよい。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端と操作可能に連結される。細胞において機能的であるいずれのターミネーターも本発明において使用することができる。
【００６７】
糸状菌細胞のための好適なターミネーターは、麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ａ．ニダランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、ｔｒｐＣ遺伝子、およびフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子から得られる。
【００６８】
制御配列はまた、適切なリーダー配列、細胞による翻訳に重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域であってもよい。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端と操作可能に連結される。細胞において機能的であるいずれのリーダー配列も本発明において使用することができる。
【００６９】
糸状菌細胞のための好適なリーダーは、麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼおよびＡ．ニダランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）トリオースリン酸イソメラーゼおよびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ｇｌａＡをコードする遺伝子から得られる。
【００７０】
他の制御配列は、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）ＩＰＮＳ遺伝子、またはｐｃｂＣ遺伝子、β−チューブリン遺伝子から単離され得る。国際公開第０１／２１７７９号パンフレットにおいて引用されるすべての制御配列は、本明細書において参考として援用される。
【００７１】
制御配列はまた、ポリアデニル化配列、核酸配列の３’末端と操作可能に連結され、転写される場合、転写されるｍＲＮＡにポリアデノシン残基を添加するためのシグナルとして細胞に認識される配列であってもよい。細胞において機能的であるいずれのポリアデニル化配列も本発明において使用することができる。
【００７２】
糸状菌細胞のための好適なポリアデニル化配列は、麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）グルコアミラーゼ、Ａ．ニダランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ、およびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼをコードする遺伝子から得られる。
【００７３】
本発明のヌクレオチド配列は、核酸構築物または発現ベクターに含まれ得る。
【００７４】
核酸構築物
第３の態様に従えば、本発明は、先のセクションにおいて規定される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含んでなる核酸構築物または発現ベクターに関する：
・最適コドン頻度および場合により、以下のような制御配列の改変を使用することによる同義ヌクレオチドコード配列：
・次のリストの配列：
【化７】
2008527985.tif 000018
から選択される５’から３’方向へ配向された１つの翻訳終結配列、および／または
次のリストの配列：
【化８】
2008527985.tif 000019
から選択される５’から３’方向へ配向された１つの翻訳イニシエータコード配列、および／または
翻訳イニシエータ配列、前記翻訳イニシエータ配列は、ヌクレオチドの多義コード：ｍ（Ａ／Ｃ）；ｒ（Ａ／Ｇ）；ｗ（Ａ／Ｔ）；ｓ（Ｃ／Ｇ）；ｙ（Ｃ／Ｔ）；ｋ（Ｇ／Ｔ）；ｖ（Ａ／Ｃ／Ｇ）；ｈ（Ａ／Ｃ／Ｔ）；ｄ（Ａ／Ｇ／Ｔ）；ｂ（Ｃ／Ｇ／Ｔ）；ｎ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）を使用して、コンセンサス翻訳イニシエータ配列：５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡｍｖ−３’によって規定される核酸配列を含んでなり、
好ましくは、翻訳イニシエータ配列は、次のリスト：５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＡ−３’、５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＣＡ−３’および５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＧ−３’から選択されるものである。これらの好適な配列は、次の配列のいずれか１つに対応する：
【化９】
2008527985.tif 000020
より好ましくは、翻訳イニシエータ配列は、５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ−３’または５’−ＣＧＣＡＧＴＣＡＡＧ−３’である。
【００７５】
別の好適な実施態様に従えば、核酸構築物または発現ベクターは翻訳イニシエータ配列を含んでなり、前記翻訳イニシエータ配列は、ヌクレオチドの多義コード：ｍ（Ａ／Ｃ）；ｒ（Ａ／Ｇ）；ｗ（Ａ／Ｔ）；ｓ（Ｃ／Ｇ）；ｙ（Ｃ／Ｔ）；ｋ（Ｇ／Ｔ）；ｖ（Ａ／Ｃ／Ｇ）；ｈ（Ａ／Ｃ／Ｔ）；ｄ（Ａ／Ｇ／Ｔ）；ｂ（Ｃ／Ｇ／Ｔ）；ｎ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）を使用して、コンセンサス翻訳イニシエータ配列：５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡｍｖ−３’によって規定される核酸配列を含んでなり、好ましくは、翻訳イニシエータ配列は：５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＡ−３’、５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＣＡ−３’、および５’−ｍｗＣｈｋｙＣＡＡＧ−３’からなる群の間で選択される。これらの好適な配列は、次の配列のいずれか１つに対応する：
【化１０】
2008527985.tif 000021
より好ましくは、翻訳イニシエータ配列は、５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ−３’または５’−ＣＧＣＡＧＴＣＡＡＧ−３’である。
【００７６】
「核酸構築物」は、本明細書において、天然に存在する遺伝子から単離されるかまたは天然には存在しない様式で組み合わされ、並置される核酸のセグメントを含有するように修飾されている一本鎖もしくは二本鎖のいずれかの核酸分子として規定される。核酸構築物がコード配列の発現のために要求されるすべての制御配列を含有する場合、核酸構築物という用語は、発現カセットまたは発現ベクターという用語と同義である。
【００７７】
核酸構築物または発現ベクターへのその挿入の前のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の操作は、核酸構築物または発現ベクターに依存して、所望もしくは必要とされ得る。クローニング方法を利用して核酸配列を改変するための技術は、当該分野において周知である。
【００７８】
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列、プロモーター、ならびに転写および翻訳終止シグナルを含んでなる組換え発現ベクターに関する。上記の多様な核酸および制御配列を共に接続して、１つもしくはそれ以上の簡便な制限部位を含んで、そのような部位における、ポリペプチドをコードする核酸配列の挿入もしくは置換を可能にし得る組換え発現ベクターを産生させてもよい。
【００７９】
あるいは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列を含んでなるヌクレオチド配列または核酸構築物を、発現のための適切なベクターに挿入することによって発現され得る。発現ベクターの作製では、コード配列は、コード配列が、発現、および随意の分泌に適切な制御配列と操作可能に化合するような様式で、ベクターに位置する。
【００８０】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に簡便に供され得、ポリペプチドをコードする核酸配列の発現をもたらし得る任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であってもよい。ベクターの選択は、典型的に、ベクターと、ベクターを導入しようとする糸状菌細胞との適合可能性に依存する。ベクターは、線状であってもまたは閉環状プラスミドであってもよい。ベクターは、自律的複製型ベクター、即ち、その複製が染色体複製とは独立する細胞外染色体実体として存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体であってもよい。自律的に維持されるクローニングベクターは、ＡＭＡ１配列を含んでなり得る（例えば、アレクセンコ（Ａｌｅｋｓｅｎｋｏ）およびクラッターバック（Ｃｌｕｔｔｅｒｂｕｃｋ）（１９９７年，Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．２１：３７３−３９７を参照のこと）。
【００８１】
あるいは、ベクターは、真菌細胞に導入される場合、ゲノムに組込まれ、それが組込まれている染色体と共に複製するものであってもよい。組込みクローニングベクターは、真菌宿主細胞の染色体の無作為または予め決定された標的遺伝子座に組込み得る。本発明の好適な実施態様では、組込みクローニングベクターは、この予め決定された座位へのクローニングベクターの組込みを標的化するための真菌宿主細胞のゲノムにおける予め決定された標的遺伝子座のＤＮＡ配列に相同であるＤＮＡフラグメントを含んでなる。標的化組込みを促進するために、クローニングベクターは、好ましくは、宿主細胞の形質転換の前に線状化される。線状化は、好ましくは、少なくとも１つ、但し、好ましくは、クローニングベクターのいずれか一方の末端が標的遺伝子座に相同な配列によって隣接されるように、実施される。標的遺伝子座に隣接する相同配列の長さは、好ましくは少なくとも３０ｂｐ、好ましくは少なくとも５０ｂｐ、好ましくは少なくとも０．１ｋｂ、なお好ましくは少なくとも０．２ｋｂ、より好ましくは少なくとも０．５ｋｂ、さらにより好ましくは少なくとも１ｋｂ、最も好ましくは少なくとも２ｋｂである。好ましくは、標的遺伝子座に相同であるクローニングベクターにおけるＤＮＡ配列が、高度に発現される遺伝子座から誘導され、これは、それが、糸状菌宿主細胞において高い発現レベルが可能である遺伝子から誘導されることを意味する。高い発現レベルが可能な遺伝子、即ち、高度に発現される遺伝子は、本明細書において、例えば、誘導条件下で、そのｍＲＮＡが少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）の全細胞ｍＲＮＡを構成し得る遺伝子、あるいは、その遺伝子産物が少なくとも１％（ｗ／ｗ）の全細胞性タンパク質を構成し得るか、または、分泌される遺伝子産物の場合、少なくとも０．１ｇ／ｌのレベルまで分泌され得る遺伝子として規定される（ＥＰ３５７１２７Ｂ１号明細書に記載される）。多くの好適な高度に発現される真菌遺伝子は、次の例によって示される：アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ）またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）由来のアミラーゼ、グルコアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、キシラナーゼ、グリセルアルデヒド−リン酸デヒドロゲナーゼもしくはセロビオヒドロラーゼ（ｃｂｈ）遺伝子。これらの目的のために最も好適な高度に発現される遺伝子は、グルコアミラーゼ遺伝子であり、好ましくは、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ遺伝子、麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡ−アミラーゼ遺伝子、Ａ．ニダランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｇｐｄＡ遺伝子、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ遺伝子、好ましくは、ｃｂｈ１である。ポリペプチドをコードする１コピーを超える核酸配列を宿主細胞に挿入して、遺伝子産物の産生を増加させてもよい。これは、好ましくは、ＤＮＡ配列のそのゲノムコピーへの組込みによって、より好ましくは、先の段落において規定した１つの高度に発現される遺伝子座におけるＤＮＡ配列の組込みを標的化することによって、行うことができる。あるいは、これは、核酸配列を伴う増幅可能な選択マーカー遺伝子を含むことによって行うことができ、こ���で、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピー、およびそれによる核酸配列のさらなるコピーを含有する細胞を、適切な選択可能因子の存在下で細胞を培養することによって、選択することができる。過剰発現させようとするＤＮＡ配列のコピー数をさらにより増加するために、国際公開第９８／４６７７２号パンフレットに記載の遺伝子変換技術を使用してもよい。
【００８２】
ベクターシステムは、糸状菌細胞のゲノムに導入しようとする全ＤＮＡを共に含有する単一のベクターまたはプラスミドあるいは２つもしくはそれ以上のベクターまたはプラスミド、あるいはトランスポゾンであってもよい。
【００８３】
ベクターは、好ましくは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする１つもしくはそれ以上の選択マーカーを含有する。選択マーカーは、その産物が殺生物剤耐性またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に栄養非要求性、などを提供する遺伝子である。糸状菌細胞において使用される選択マーカーは、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｂｌｅＡ（フレオマイシン結合性）、ｈｙｇＢ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびに他の種由来の等価物を含むがこれらに限定されない群から選択され得る。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）細胞における使用には、Ａ．ニダランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）または麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）のａｍｄＳ（ＥＰ６３５５７４Ｂ１号明細書、国際公開第９７／０６２６１号パンフレット）およびｐｙｒＧ遺伝子ならびにストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）のｂａｒ遺伝子が好適である。より好ましくは、ａｍｄＳ遺伝子、さらにより好ましくは、Ａ．ニダランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のａｍｄＳ遺伝子が使用される。最も好適な選択マーカー遺伝子は、Ａ．ニダランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｇｐｄＡプロモーターに融合されたＡ．ニダランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳコード配列である（ＥＰ６３５５７４Ｂ１号明細書を参照のこと）。他の糸状菌由来のＡｍｄＳ遺伝子を使用してもよい（国際公開第９７／０６２６１号パンフレット）。
【００８４】
上記のエレメントを連結して、本発明の組換え発現ベクターを構築するために使用される手順は、当業者に周知である（例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年、上掲を参照のこと）。
【００８５】
宿主細胞
第４の態様に従えば、本発明は糸状菌宿主細胞に関する。本発明の糸状菌宿主細胞は、当業者に既知の任意の糸状菌宿主細胞宿主細胞であり得る。
【００８６】
「糸状菌」は、亜門の真菌門（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）および卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）のすべての糸状形態を含む（ホークスワース（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ）ら、１９９５年、上掲により規定される）。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複雑な多糖からなる菌糸体の壁によって特徴付けられる。栄養生長は菌糸伸長により、炭素の異化は偏性好気性である。糸状菌株として、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、オーレオバシディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クリソスポルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｕｍ）フィリバシディウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロマイセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、スエヒロタケ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、シーラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トイポクラディウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびその完全世代の株は、米国菌株保存機関（ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、ならびにＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）のような多くの培養コレクションにおいて、一般に、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ５１３．８８、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＡＴＣＣ２０４２３、ＩＦＯ４１７７、ＡＴＣＣ１０１１、ＡＴＣＣ９５７６、ＡＴＣＣ１４４８８−１４４９１、ＡＴＣＣ１１６０１、ＡＴＣＣ１２８９２、Ｐ．クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＣＢＳ４５５．９５、ペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）ＡＴＣＣ３８０６５、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）Ｐ２、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＡＴＣＣ３６２２５またはＡＴＣＣ４８２７２、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＡＴＣＣ２６９２１またはＡＴＣＣ５６７６５またはＡＴＣＣ２６９２１、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）ＡＴＣＣ１１９０６、クリソスポリウム・ラクナウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）ＡＴＣＣ４４００６およびそれらの誘導体に容易にアクセスされる。
【００８８】
好ましくは、本発明の糸状菌宿主細胞は、本発明の第３の態様の少なくとも１コピーの核酸構築物を含んでなる。
【００８９】
好適な実施態様に従えば、核酸構築物に存在するコード配列および／または制御配列は、本発明の第１および第２の態様に従うコード配列および／または制御配列の修飾前の糸状菌宿主細胞に対して生来である。
【００９０】
別の好適な実施態様に従えば、核酸構築物に存在するコード配列および／または制御配列は、本発明の第１および第２の態様に従うコード配列および／または制御配列の修飾前の糸状菌宿主細胞に対して異種である。
【００９１】
より好適な実施態様に従えば、本発明の第３の態様の核酸構築物の所定のコピー数を含んでなる本発明の糸状菌宿主細胞は、前記核酸構築物によってコードされる産物の発現が、対応する生来のヌクレオチド配列を含んでなる対応する核酸構築物によってコードされる同じ産物の産生と比較して増強され、前記対応する核酸構築物は、対応する糸状菌宿主細胞において同じコピー数で存在する、糸状菌細胞である。好ましくは、本発明の第３の態様の核酸構築物または発現ベクターに存在するヌクレオチド配列の改変は、対応する生来のヌクレオチド配列を含んでなる対応する核酸構築物の産生と比較して、本発明の第３の態様の核酸構築物の所定のコピー数を含んでなる本発明の糸状菌宿主細胞によって産生される目的の化合物の収量の少なくとも１％、５％、１０％、２５％、５０％、１００％、２００％、３００％、４００％、より好ましくは少なくとも５００％の増加を生じ、前記対応する核酸構築物は、対応する糸状菌宿主細胞において同じコピー数で存在する。
【００９２】
産生させようとする目的の化合物の収量の増加は、本発明の糸状菌宿主細胞によって産生される化合物の量を測定し、それを、対応する糸状菌宿主細胞によって産生される目的の化合物と比較することによって決定され得る。産生される目的の化合物の収量を決定することは、特に、（同義）ヌクレオチドコード配列から転写されるｍＲＮＡの量、ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドの量、または同義ヌクレオチドコード配列によってコードされるポリペプチドの産生に関与する化合物（例えば、代謝物）の量を測定することによって、達成され得る。ｍＲＮＡの量を決定するための当業者に既知の方法の例として、ノーザンブロット、定量ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、およびマイクロアレイ分析が挙げられるが、これらに限定されない。ポリペプチドの量は、特に、当業者に既知のタンパク質測定アッセイを使用して決定することができる。ポリペプチドが酵素である場合、ポリペプチドの量は、関係する酵素に特異的な活性アッセイを使用して測定することができる。当業者は、特定の酵素についてどのアッセイを選択するかを知っている。産生させようとする目的の化合物の量を決定するための好適なアッセイは、関係する酵素に特異的な活性アッセイである。
【００９３】
より好適な実施態様に従えば、本発明の宿主細胞は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、クリソスポルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｕｍ）またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種からなる群から選択される種、最も好ましくは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、クリソスポルム・ラクナウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）またはペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）からなる群から選択される種に属する細胞である。最も好適なアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主細胞は、ＣＢＳ５１３．８８またはその誘導体である。
【００９４】
宿主細胞は、野生型糸状菌宿主細胞または変種、変異体もしくは遺伝的に改変された糸状菌宿主細胞であってもよい。本発明の好適な実施態様では、宿主細胞は、プロテアーゼ欠損またはプロテアーゼ欠乏株である。これは、「ａｌｐ」と命名されるアルカリプロテアーゼ遺伝子を欠失しているプロテアーゼ欠損株の麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＪａＬ１２５（国際公開第９７／３５９５６号パンフレットもしくはＥＰ４２９４９０号明細書において記載されている）、または国際公開第９６／１４４０４号パンフレットにおいて開示されているＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のトリペプチジルアミノペプチダーゼ（ＴＰＡＰ）欠損株であり得る。さらに、国際公開第０１／６８８６４号明細書に記載の転写アクチベーター（ｐｒｔＴ）の産生の減少を伴う宿主細胞もまた、本発明に従って考慮される。別の特に考慮される宿主株は麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＢＥＣｈ２であり、ここで、親株ＩＦ０４１７７に存在する３つのＴＡＫＡアミラーゼ遺伝子は不活化されている。さらに、２種のプロテアーゼ、アルカリプロテアーゼおよび中性メタロプロテアーゼ１１は、遺伝子破壊によって破壊されている。代謝物シクロピアゾン酸およびコウジ酸を形成する能力が、変異によって破壊されている。ＢＥＣｈ２は国際公開第００／３９３２２号パンフレットに記載されており、ＪａＬ２２８（国際公開第９８／１２３００号パンフレットに開示されている）から誘導され、またさらに、Ａ１５６０として米国特許第５，７６６，９１２号明細書において開示されるＩＦ０４１７７の変異体であった。
【００９５】
場合により、糸状菌宿主細胞は、野生型細胞と比較して上昇したアンフォールドタンパク質応答（ＵＰＲ）を含んでなり、目的のポリペプチドの産生能を増強する。ＵＰＲは、米国特許出願公開第２００４／０１８６０７０Ａ１号明細書および／または米国特許出願公開第２００１／００３４０４５Ａ１号明細書ならびに／あるいは国際公開第０１／７２７８３Ａ２号パンフレットおよび／または国際公開第２００５／１２３７６３号パンフレットにおいて記載の技術によって増加され得る。より具体的には、ＨＡＣ１および／またはＩＲＥ１および／またはＰＴＣ２のタンパク質レベルがモジュレートされ、ならびに／あるいはＳＥＣ６１タンパク質は、上昇したＵＰＲを有する宿主細胞を得るために操作されている。
【００９６】
あるいは、または上昇したＵＰＲと組み合わせて、宿主細胞は、目的のポリペプチドの産生能を増強するために野生型細胞と比較して、より低いプロテアーゼ発現および／またはプロテアーゼ分泌を示す表現型を得るように遺伝的に改変される。そのような表現型は、プロテアーゼの発現の転写調節因子の欠失および／または改変および／または不活化によって得ることができる。そのような転写調節因子は、例えば、ｐｒｔＴである。ｐｒｔＴのモジュレーションによってプロテアーゼの発現を低下させることは、米国特許出願公開第２００４／０１９１８６４Ａ１号明細書に記載の技術によって達成され得る。
【００９７】
あるいは、または上昇したＵＰＲならびに／またはより低いプロテアーゼ発現および／もしくはプロテアーゼ分泌を示す表現型と組み合わせて、目的のポリペプチドの産生の収量を増強するために、宿主細胞は、シュウ酸欠損表現型を示す。シュウ酸欠損表現型は、国際公開第２００４／０７００２２Ａ２号パンフレットに記載の技術によって得ることができる。
【００９８】
あるいは、または上昇したＵＰＲならびに／またはより低いプロテアーゼ発現および／もしくはプロテアーゼ分泌および／もしくはシュウ酸欠損を示す表現型と組み合わせて、目的のポリペプチドの産生の収量を増強するために、宿主細胞は、野生型細胞と比較して表現型の差異の組み合わせを示す。これらの差異は、グルコアミラーゼおよび／または中性α−アミラーゼＡおよび／または中性α−アミラーゼＢ、α−１、６トランスグルコシダーゼ、プロテアーゼ、およびシュウ酸ヒドロラーゼの低下した発現を含み得るが、これらに限定されない。宿主細胞によって示される前記表現型の差異は、米国特許出願公開第２００４／０１９１８６４Ａ１号明細書に記載の技術に従う遺伝的改変によって得ることができる。
【００９９】
あるいは、または上記の表現型と組み合わせて、相同組換えによる宿主細胞のゲノムへの核酸構築物の標的化された組込み、即ち、予め決定された遺伝子座における組込みの効率は、好ましくは、宿主細胞の増大した相同組換え能によって増加する。細胞のそのような表現型は、好ましくは、国際公開第２００５／０９５６２４号パンフレットに記載の欠損ｈｄｆＡまたはｈｄｆＢ遺伝子に関与する。国際公開第２００５／０９５６２４号パンフレットは、上昇した効率の標的化された組み込みを含んでなる糸状菌細胞を得るための好適な方法を開示する。
【０１００】
発現ベクターまたは核酸構築物の糸状菌細胞への導入は、それ自体既知の様式でのプロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、および細胞壁の再生からなるプロセスに関与し得る。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞の形質転換に適切な手順については、ＥＰ２３８０２３号明細書およびエルトン（Ｙｅｌｔｏｎ）ら、１９８４年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ８１：１４７０−１４７４に記載されている。フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種を形質転換するための適切な方法については、メーラディール（Ｍａｌａｒｄｉｅｒ）ら、１９８９年、Ｇｅｎｅ７８：１４７１５６または国際公開第９６／００７８７号パンフレットにより記載されている。使用することができる発現ベクターまたは核酸構築物については、対応するセクションで既に説明した。
【０１０１】
目的の化合物の産生
本発明は、目的の化合物を産生させるために使用され得る。目的の化合物は、好ましくは、ポリペプチドである。あるいは、目的の化合物は代謝物であってもよい。この場合、代謝物の合成に関与する酵素をコードするヌクレオチド配列が、本発明に従って改変される。用語「代謝物」は一次および二次代謝物の両方を包含し；代謝物はいずれの代謝物であってもよい。好適な代謝物はクエン酸である。別の好適な代謝物はカロテノイドである。代謝物は、例えば、生合成または代謝経路において、１つもしくはそれ以上の遺伝子によってコードされ得る。一次代謝物は、エネルギー代謝、増殖、および構造に関係する細胞の一次または全体的代謝の産物である。二次代謝物は、二次代謝の産物である（例えば、Ｒ．Ｂ．ハーバード（Ｒ．Ｂ．Ｈｅｒｂｅｒｔ）、「Ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ」チャップマン（Ｃｈａｐｍａｎ）およびホール（Ｈａｌｌ）、ニューヨーク、１９８１年を参照のこと）。一次代謝物として、アミノ酸、脂肪酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、糖、トリグリセリド、またはビタミンがあり得るが、これらに限定されない。二次代謝物として、アルカロイド、クマリン、フラボノイド、ポリケチド、キニーネ、ステロイド、ペプチド、またはテルペンがあり得るが、これらに限定されない。二次代謝物は、抗生物質、摂食阻害剤、アトラクタント、殺菌剤（ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｄｅ）、殺真菌剤、ホルモン、殺虫剤、または殺鼠剤であってもよい。好適な抗生物質は、セファロスポリン系薬剤およびβ−ラクタム系薬剤である。
【０１０２】
あるいは、目的の化合物はまた、選択マーカー遺伝子の産物であってもよい。選択マーカー遺伝子は、その産物が殺生物剤耐性またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求株への原栄養性などを提供する遺伝子である。この場合、選択マーカー遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、本発明に従って改変される。選択マーカーとして、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｙｇＢ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、ｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ｂｌｅ（フレオマイシン耐性タンパク質）、ならびにそれらの等価物が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１０３】
目的の化合物がポリペプチドである場合、ポリペプチドは、細胞に対して生来であろうとまたは異種（もしくは非生来）であろうといずれのポリペプチドであってもよい。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列およびそれに操作可能に会合する制御ＤＮＡ配列が既知であれば直ちに、これらの生来または非生来のＤＮＡ配列は、本発明に従って改変され（ＤＮＡ配列のセクションを参照のこと）、適切なＤＮＡ構築物または発現ベクターにクローニングされ、選択された宿主に形質転換される。異種ポリペプチドをコードする核酸配列は、任意の原核生物、真核生物、植物または他の供給源から得ることができる。本発明の目的のために、所定の供給源に関して本明細書において使用する用語「から得る」は、ポリペプチドが、供給源または供給源由来の遺伝子が挿入されている細胞によって産生されることを意味すべきである。
【０１０４】
用語「異種ポリペプチド」は、本明細書においては、野生型細胞によって産生されない（非生来）ポリペプチドとして規定される。用語「ポリペプチド」は、本明細書においては、特定の長さのコードされた産物を指すことを意図するのではなく、従って、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質を包含する。ポリペプチドはまた、細胞に対して生来であるポリペプチドである、例えば、最適化された核酸配列によってコードされる、およびポリペプチドの産生に関与する核酸配列に対して外来性である１つもしくはそれ以上の制御配列をさらに含んでなり得る組換えポリペプチドであってもよい。ポリペプチドは、野生型ポリペプチドであってもよく、またはその変種であってもよい。ポリペプチドはまた、少なくとも２つの異なるポリペプチド（ここで、１つもしくはそれ以上のポリペプチドは、細胞に対して異種であり得る）から得られる部分的もしくは完全なポリペプチド配列の組み合わせを含有するハイブリッドポリペプチドであってもよい。ポリペプチドは、上記のポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子および操作された変体をさらに含む。
【０１０５】
好ましくは、ポリペプチドは糸状菌宿主細胞の外側に分泌される。好適な実施態様では、ポリペプチドは、抗体もしくはその一部、抗原、凝固因子、酵素、ホルモンもしくはホルモン変種、受容体もしくはその一部、調節タンパク質、構造タンパク質、レポーター、または輸送タンパク質、細胞内タンパク質、分泌プロセスに関与するタンパク質、フォールディングプロセスに関与するタンパク質、シャペロン、ペプチドアミノ酸トランスポーター、グリコシル化因子、転写因子である。好適な実施態様では、ポリペプチドは細胞外環境に分泌される。
【０１０６】
より好適な実施態様では、酵素は、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、デキストラナーゼ、エステラーゼである。
【０１０７】
さらにより好適な実施態様では、ポリペプチドは、カルボヒドラーゼ、例えば、セルラーゼ、例えば、エンドグルカナーゼ、β−グルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼまたはβ−グルコシダーゼ、ヘミセルラーゼまたはペクチン分解酵素、例えば、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、ガラクトシダーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチン酸リアーゼ、エンドポリガラクツロナーゼ、エキソポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、アラバナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アラビノキシランヒドロラーゼ、ガラクツロナーゼ、リアーゼ、またはデンプン分解酵素；ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、またはリガーゼ、ホスファターゼ、例えば、フィターゼ、エステラーゼ、例えば、リパーゼ、タンパク質分解酵素、酸化還元酵素、例えば、オキシダーゼ、トランスフェラーゼ、またはイソメラーゼである。より好ましくは、所望される遺伝子はフィターゼをコードする。さらにより好適な実施態様では、ポリペプチドは、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、エンドプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼカタラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはグルコースオキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼである。
【０１０８】
別のさらにより好適な実施態様では、ポリペプチドは、ヒトインスリンまたはそのアナログ、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）またはインスリノトロピンである。
【０１０９】
ポリペプチドはまた、例えば、シャペロン、プロテアーゼもしくは転写因子のような細胞内タンパク質または酵素であってもよい。この例は、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８年１０月；５０（４）：４４７−５４（「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｂｉｐＡ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｂｌａｃｋ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ．」プント  ＰＪ（Ｐｕｎｔ  ＰＪ）、バンゲメレン  ＩＡ（ｖａｎ  Ｇｅｍｅｒｅｎ  ＩＡ）、ドリント−クイジュヴェンホヴェン  Ｊ（Ｄｒｉｎｔ−Ｋｕｉｊｖｅｎｈｏｖｅｎ  Ｊ）、ヘッシング  ＪＧ（Ｈｅｓｓｉｎｇ  ＪＧ）、バンムイジュゥ−ハートベルト  ＧＭ（ｖａｎ  Ｍｕｉｊｌｗｉｊｋ−Ｈａｒｔｅｖｅｌｄ  ＧＭ）、ベイジェルスベルゲン  Ａ（Ｂｅｉｊｅｒｓｂｅｒｇｅｎ  Ａ）、ヴェリップス  ＣＴ（Ｖｅｒｒｉｐｓ  ＣＴ）、バンデンホンデル  ＣＡ（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ  ＣＡ））に記載されている。チャペロン、プロテアーゼまたは転写因子のようなこのポリペプチドが、タンパク質産生の制限要因であることが公知であった場合、これを使用して、例えば、タンパク質生産者としての宿主細胞の効率を改善することができる。
【０１１０】
あるいは、細胞内ポリペプチドは、カロテノイドのような所定の二次代謝物または抗生物質（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃａ）の産生に関与する酵素である。
【０１１１】
本発明はまた、細胞に対して生来であるポリペプチドの組換え産生のために使用してもよい。対応する先のセクションにおいて規定されるコードヌクレオチド配列および／または制御ヌクレオチド配列を改変する場合、生来のポリペプチドは組換え産生され得る。例えば、コード配列は、生来または天然に存在するヌクレオチド配列の発現レベルを改善するように、任意のアミノ酸をコードするために先に規定されるような最適化されたコドン頻度を使用することによって改変される。場合により、得られる同義コード配列を、異なるプロモーターの制御下に配置して、ポリペプチドの発現を増強し、本発明のシグナル配列の使用によって細胞の外側への目的の生来のポリペプチドの輸出を促進し、細胞によって正常に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を増加することができる。本発明はまた、用語「異種ポリペプチド」の範囲内で、そのような発現が細胞に対して生来でない遺伝子エレメントの使用、または糸状菌細胞において天然には存在しない様式で機能するように操作されている生来のエレメントの使用に関与するような程度で、細胞に対して生来のポリペプチドのそのような組換え産生を包含する。異種ポリペプチドをコードする核酸配列を単離またはクローニングするために使用される技術は当該分野において公知であり、ゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製、またはそれらの組み合わせを含む。
【０１１２】
本発明の方法では、異種ポリペプチドもまた、別のポリペプチドがポリペプチドまたはそのフラグメントのＮ末端もしくはＣ末端で融合される融合あるいはハイブリッドポリペプチドを含み得る。融合ポリペプチドは、１つのポリペプチドをコードする核酸配列（またはその一部）を別のポリペプチドをコードする核酸配列（またはその一部）に融合させることによって、産生される。
【０１１３】
融合ポリペプチドを産生させるための技術は当該分野において公知であり、ポリペプチドをコードするコード配列を、それらがフレーム内にあって、融合されたポリペプチドの発現が同じプロモーターおよびターミネーターの制御下にあるように連結することを含む。ハイブリッドポリペプチドは、少なくとも２つの異なるポリペプチドから得られる部分的または完全なポリペプチド配列の組み合わせを含んでなり得、ここで、１つもしくはそれ以上は、変異真菌細胞に対して異種であってもよい。目的の異種ポリペプチドをコードする単離された核酸配列は、ポリペプチドの発現を提供するための様々な方法で操作され得る。発現は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、および分泌を含むがこれらに限定されないポリペプチドの産生に関与する任意の工程を含むことが理解される。ベクターへのその挿入前のポリペプチドをコードする核酸配列の操作は、発現ベクターに依存して所望または必要であり得る。クローニング方法を利用して核酸配列を改変するための技術は、当該分野において周知である。
【０１１４】
上記のセクションに記載の目的の化合物は、本発明によって提供される糸状菌宿主細胞において提供され得る。
【０１１５】
従って、別の態様に従えば、本発明は、本発明の糸状菌宿主細胞において目的の化合物を産生させる方法に関し、以下を含んでなる：
（ａ）目的の化合物の産生に適する栄養培地において、糸状菌宿主細胞を培養すること；および
（ｂ）糸状菌宿主細胞の栄養培地から目的の化合物を回収すること。
【０１１６】
本発明の糸状菌宿主細胞は、当該分野において既知の方法を使用する目的の化合物の産生に適切な栄養培地において培養される。例えば、細胞は、適切な培地において、ならびに目的の化合物を発現させるおよび／または単離することが可能な条件下で実施される実験室あるいは産業発酵槽における振盪フラスコ培養、小規模または大規模発酵（連続、バッチ、流加、もしくは固体発酵を含む）によって、培養することができる。培養は、炭素および窒素源および無機塩を含んでなる適切な栄養培地において、当該分野において既知の手順（例えば、ベネット，Ｊ．Ｗ．（Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｗ．）およびラシュア，Ｌ．（ＬａＳｕｒｅ，Ｌ．）編、「Ｍｏｒｅ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｇｉ」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州、１９９１年を参照のこと）を使用して行われる。適切な培地は販売者から入手可能であり、または（例えば、米国菌株保存機関（ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のカタログにおいて）公開された組成物を使用して、調製してもよい。目的の化合物が栄養培地に分泌される場合、ポリペプチドは、培地から直接回収することができる。目的の化合物が分泌されない場合、それは、細胞溶解物から回収される。
【０１１７】
得られる目的の化合物は、当該分野において既知の方法によって単離することができる。例えば、ポリペプチドは、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、エバポレーション、または沈殿を含むがこれらに限定されない従来の手順によって、栄養培地から単離することができる。次いで、単離された目的の化合物は、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、電気泳動手順（例えば、分取等電点電気泳動、差分溶解性（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、または抽出（例えば、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、編者：Ｊ．−Ｃ．ヤンソン（Ｊ．−Ｃ．Ｊａｎｓｏｎ）およびラーズ・ライデン（Ｌａｒｓ  Ｒｙｄｅｎ）、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ニューヨーク、１９８９年を参照のこと）を含むが、これらに限定されない様々な既知の手順によって、さらに精製することができる。
【０１１８】
目的の化合物は、ポリペプチドに特異的である当該分野において既知の方法を使用して、検出することができる。これらの検出方法は、特異的抗体の使用、酵素生成物の形成、酵素基質の消失、またはＳＤＳ  ＰＡＧＥを含み得る。例えば、目的の化合物が酵素である場合、酵素アッセイを使用して、活性を決定することができる。酵素活性を決定するための手順は、多くの酵素について当該分野において公知である。
【０１１９】
本発明の方法では、本発明の第３の態様の核酸構築物の所定のコピー数を含んでなる本発明の糸状菌宿主によって産生される目的の化合物の収量は、好ましくは、対応する生来のヌクレオチド配列を含んでなる対応する核酸構築物の産生と比較して、少なくとも１％、５％、１０％、２５％、５０％、１００％、２００％、３００％、４００％、より好ましくは少なくとも５００％、増加し、前記対応する核酸構築物は、対応する糸状菌宿主細胞において同じコピー数で存在する。好ましくは、本発明の糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、クリソスポルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｕｍ）またはペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）宿主細胞である。より好ましくは、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポルム・ラクナウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）またはペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）宿主細胞である。最も好適なアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主細胞は、ＣＢＳ５１３．８８またはその誘導体である。
【０１２０】
好適な別の実施態様では、本発明の第３の態様の核酸構築物の所定のコピー数を含んでなる本発明の糸状菌宿主によって産生される目的の化合物の収量は、好ましくは、１リットルあたり０．１ｇ、０．２ｇ、０．３ｇ、０．４ｇ、より好ましくは、０．５ｇおよびなお最も好ましくは、１リットルあたり０．５ｇを超える目的の化合物である。目的の化合物の産生は、特異的アッセイによって決定することができる。好ましくは、本発明の糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、クリソスポルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｕｍ）またはペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）宿主細胞である。より好ましくは、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、クリソスポルム・ラクナウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）またはペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）宿主細胞である。最も好適なアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主細胞は、ＣＢＳ５１３．８８またはその誘導体である。
【０１２１】
あるいは、および別の好適な実施態様に従えば、ポリペプチドが、（β−ラクタム）抗生物質またはカロテノイドのような所定の代謝物の産生に関与する酵素である場合、本発明の糸状菌宿主細胞は、所定の代謝物の産生のために使用される。
【０１２２】
本発明のさらなる態様に従えば、目的の化合物を産生させるための方法の対応するセクションにおいて規定されるヌクレオチド配列のいずれか１つの使用、目的の化合物を産生させるための方法の対応するセクションにおいて規定される核酸構築物または発現ベクターの使用および目的の化合物を産生させるための方法の対応するセクションにおいて規定される糸状菌宿主細胞のいずれか１つの使用が提供される。
【０１２３】
ヌクレオチド配列を産生させるための方法；最適化されたコドン頻度の算出
本発明のさらなる態様に従えば、本発明の第１の態様のヌクレオチド配列を産生させるための方法が提供され、以下の工程を含んでなる：
・本発明の第１の態様において規定される最適化されたコドン頻度を伴う同義ヌクレオチドコード配列を提供すること、および場合により、
・場合により、前記同義ヌクレオチドコード配列を、本発明の第１の態様で規定される制御配列に連結させること。
【０１２４】
最適化されたコード頻度を伴う同義ヌクレオチドコード配列を提供するために、最適化されたコード頻度を、本発明によって提供される方法によって算出することができる。この方法については、以下において概要を述べる。
【０１２５】
以後、グループ１アミノ酸（ＡＡ）と呼ばれるアミノ酸については、ただ１つの可能性が存在する。グループ１は、常にＡＴＧによってコードされるメチオニンおよび常にＴＧＧによってコードされるトリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｅ）からなる。
【０１２６】
以後、グループ２  ＡＡと呼ばれるアミノ酸は、０％または１００％の極端な頻度に従う最適化に供され、ストラテジーは明白である。グループ２  ＡＡに対するすべてのコドンは、以下に列挙されるコドンに特異的に変更される。より具体的には：
・システインは、常にＴＧＣによって；
・フェニルアラニンはＴＴＣによって；
・ヒスチジンはＣＡＣによって；
・リジンはＡＡＧによって；
・アスパラギンはＡＡＣによって；
・グルタミンはＣＡＧによって；
・チロシンはＴＡＣによってコードされる。
【０１２７】
以後、グループ３  ＡＡと呼ばれる他のすべてのＡＡは、表１において規定されるいくらかのコドンによってコードされ得；各コドンは好適なコドン頻度で存在する：
・アラニンはＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、またはＧＣＧによって；
・アスパラギン酸はＧＡＴ、ＧＡＣによって；
・グルタミン酸はＧＡＡ、ＧＡＧによって；
・グリシンはＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ、ＧＧＧによって；
・イソロイシンはＡＴＴ、ＡＴＣ、ＡＴＡによって；
・ロイシンはＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧによって；
・プロリンはＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＡ、ＣＣＧによって；
・アルギニンはＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、ＡＧＧによって；
・セリンはＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、ＡＧＣによって；
・スレオニンはＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、ＡＣＧによって；
・バリンはＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡ、ＧＴＧによってコードされる。
【０１２８】
以下の規則が、所定のコード配列におけるグループ３  ＡＡに対して最適化されたコドン頻度の算出に適用される：
グループ３  ＡＡおよびそれらの異なる対応するコドンについて、所定のコード配列内のそれぞれの可能なコドンの最適な発生の算出は、好ましくは、以下の方法論に従って実施される：
ｉ．それぞれのグループ３  ＡＡのそれぞれについて、所定の配列においてコードされる残基の総数を合計する、
ｉｉ．それぞれのＡＡおよび該ＡＡをコードするコドンについて、該ＡＡについての総数に、表１における最適コドン分布を乗じ、一般的に１０進数を含有し得る生のコドン分布を求める、
ｉｉｉ．数字を取り出すことによって、生のコドン分布（ｉｉ）の値を丸め、丸められたコドン分布を求める、
ｉｖ．ＡＡのそれぞれについて、丸められたコドン分布（ｉｉｉ）において示されるＡＡの総数を合計する、
ｖ．所定の配列（ｉ）においてコードされる残基の総数を、丸められたコドン分布（ｉｖ）において示されるＡＡの総数で引くことによって、丸められたコドン分布におけるそれぞれのＡＡのそれぞれについての残基の失われた総数を算出する、
ｖｉ．それぞれのコドンについて、減法によって、生のコドン分布（ｉｉ）と丸められたコドン分布（ｉｉｉ）との間の１０進数の差異を算出する、
ｖｉｉ．それぞれのコドンについて、１０進数の差異（ｖｉ）および表１における最適コドン分布を乗じ、それぞれのコドンに対するウェイト値を得る、
ｖｉｉｉ．それぞれのＡＡのそれぞれについて、失われた残基の量（ｖ）、最も高いウェイト値を有するコドンのそれぞれの量（ｖｉｉ）を選択する、
ｉｘ．ポリペプチドをコードする所定の配列内の最終最適コドン分布の算出は、丸められたコドン分布（ｉｉｉ）およびそれぞれのコドンについて失われた残基（ｖｉｉｉ）の選択された量を合計することによって、算出される。
【０１２９】
続いて、所定の配列における総数が、算出される最終最適コドン分布より高いコドンでは、算出される異なる対応するコドンへの置換のために、選択が行われる。また、頻度において増加すべきコドンでは、頻度において減少すべき他の異なる対応するコドン候補から選択が行われる（実施例１を参照のこと）。別の好適な方法では、所定のヌクレオチド配列におけるコドン置換えの選択および算出のためのコンピュータアルゴリズムを使用することが考慮され得る。好適な別の実施態様では、コドン置換えの選択および算出は、算出されるコドン頻度および二次構造の基準ならびに所定のＲＮＡ−タグまたは制限部位の封入のような他の特徴に従って行われ得、所定のヌクレオチド配列が回避される。「二次構造」は、一本鎖である場合、二本鎖ヘアピン構造またはループを形成する傾向を有する核酸配列の領域を指す。そのような構造は、転写および翻訳を妨げ得る。国際公開第０１／５５３４２号パンフレットでは、二次構造を形成するそれらの可能性について核酸を評価する仕方の可能な方法が提供される。いくらかのソフトウェアプログラムが二次構造を推定することができる。好適な実施態様では、二次構造は最短距離法によって決定される。この方法の説明については、フライヤー（Ｆｒｅｉｅｒ）ら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８６年、８３，９３７３−９３７７）により記載されており、ＲＮＡ：ＲＮＡ二次構造を指すエネルギーパラメータを使用する。この方法の適用は、Ｃｌｏｎｅ  Ｍａｎａｇｅｒ  ７プログラム（Ｓｃｉ．Ｅｄ．Ｃｅｎｔｒａｌ：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＆Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  ｓｏｆｔｗａｒｅ、バージョン７．０２）において行われ得る。
【０１３０】
別の好適な方法に従えば、表１に従う最適化されたコドン頻度が、コード配列の特定の部分のみに適用される。本発明のより好適な実施態様では、所定のヌクレオチド配列におけるコドンの置換は、置換えのための候補の無作為選択、および新規の対応するコドン候補の無作為選択を行った後、最終最適コドン分布に従って実施される。
【０１３１】
別の好適な方法に従えば、アミノ酸配列のみに基づいて、算出された最適コドン分布が適用される。アミノ酸配列は、最適化されたコドン頻度を伴う改変型コード配列への算出された最適コドン分布に従って、コドンの適切な選択によって、ヌクレオチド配列に逆翻訳される（実施例２）。改変型コード配列の設計後、それは、二次構造特徴、ＡＴリッチストレッチおよび所望されない制限部位について、確認され得る。そのような態様が観察される場合、当業者は、コードされたポリペプチドを変更することなく特定の問題を回避するために、改変型コード配列の特定のコドンを交換または置き換える仕方を知っている。好適な実施態様では、これは、二次構造のための特定の基準を考慮するコンピュータアルゴリズム、ＡＴリッチ領域を回避すること、ＧＣリッチ領域を回避すること、制限部位の導入などによって行うことができる。別の実施態様では、逆翻訳は、ヌクレオチド配列において配置するのに必要なそれぞれのコドンの位置の無作為選択によって行われる。
【０１３２】
所望される改変を伴うヌクレオチド配列を提供するために、一般的な分子生物学的方法を適用することができる。これらのクローニング方法を利用してヌクレオチド配列を改変するための技術は、当該分野において周知である。そのような方法として、例えば、無作為もしくは指向性変異誘発、ＤＮＡシャフリング方法、ＤＮＡ再集成方法、遺伝子合成、および当業者に公知の他の手段（例えば、ヤング（Ｙｏｕｎｇ）およびドン（Ｄｏｎｇ）（２００４年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２、（７）電子アクセスｈｔｔｐ：／／ｎａｒ．ｏｕｐｉｏｕｒｎａｌｓ．Ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｒｅｐｒｉｎｔ／３２／７／ｅ５９またはガプタ（Ｇｕｐｔａ）ら（１９６８年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，６０：１３３８−１３４４；スカルプラ（Ｓｃａｒｐｕｌｌａ）ら（１９８２年）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２１：３５６−３６５；ステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）ら、（１９９５年）、Ｇｅｎｅ  １６４：４９−５３を参照のこと）が挙げられる。
【０１３３】
なお別の好適な実施態様に従えば、本発明の第２の態様に従う翻訳イニシエータ配列を伴うヌクレオチド配列を提供することによって、本発明の第２の態様のヌクレオチド配列を産生させる方法が提供される。クローニング方法を利用して核酸配列を改変するための技術は、当該分野において周知である。
【０１３４】
なお別の実施態様に従えば、以下による本発明の第１および第２の態様の組み合わされた特徴を示す同義ヌクレオチドコード配列を含んでなるヌクレオチド配列を産生させるための方法が提供され：
・上記の方法を使用する本発明の第１の態様において規定される最適化されたコドン頻度を伴う同義ヌクレオチドコード配列を提供すること、
・上記の方法を使用して、本発明の第２の態様に従って、翻訳イニシエータ配列を伴うヌクレオチド配列を提供すること、および場合により
・場合により、前記同義ヌクレオチドコード配列を、本発明の第１の態様で規定される制御配列に連結させること。
【０１３５】
以下の実施例によって本発明についてさらに説明するが、これは、本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。
【実施例】
【０１３６】
実験の情報
株
ＷＴ１：このＡ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）株を野生型株として使用する。この株は、寄託番号ＣＢＳ５１３．８８でＣＢＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに寄託される。
【０１３７】
ＷＴ２：このＡ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）株は、グルコアミラーゼをコードする遺伝子（ｇｌａＡ）の欠失を含んでなるＷＴ１株である。ＷＴ２は、ＥＰ０６３５５７４Ｂ１号明細書に記載のように、「マーカー遺伝子を含まない（ＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ  ＦＲＥＥ）」アプローチを使用して、構築した。本特許では、ＣＢＳ５１３．８８のゲノムにおけるｇｌａＡ特異的ＤＮＡ配列を欠失する仕方について、広範に説明する。該手順により、最終的に外来性のＤＮＡ配列を全く有さない、マーカー遺伝子を含まない（ＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ  ＦＲＥＥ）（？）ｇｌａＡ組換えＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ５１３．８８株が得られた。
【０１３８】
ＷＴ３：このＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株は、シュウ酸欠損Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株を生じる変異を含んでなるＷＴ２株である。ＷＴ３は、ＥＰ１５９０４４４号明細書に記載の方法を使用することによって構築した。本特許出願では、シュウ酸欠損Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株をスクリーニングする仕方について広範に説明する。株ＷＴ３は、ＥＰ１５９０４４４号明細書の実施例１および２の方法に従って構築したが、株ＷＴ３は、ＥＰ１５９０４４４号明細書の変異株２２（ＥＰ１５９０４４４号明細書でＦＩＮＡＬと呼ばれる）である。
【０１３９】
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）振盪フラスコ発酵
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株を、国際公開第９９／３２６１７号パンフレットの実施例：「Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）振盪フラスコ発酵」に記載のように、２０ｍｌ前培養培地において前培養した。１晩増殖後、１０ｍｌのこの培養物を、α−アミラーゼ発酵のために、発酵培地１（ＦＭ１）およびホスホリパーゼＡ１発酵のために発酵培地２（ＦＭ２）のに移した。発酵は、全体的に国際公開第９９／３２６１７号パンフレットに記載のように、１００ｍｌ発酵ブロスを伴うバッフル付５００ｍｌフラスコにおいて、３４℃および１７０ｒｐｍで、示された日数の間、実施される。
【０１４０】
このＦＭ１培地は、１リットルあたり：７０ｇのグルコース、２５ｇのカゼイン加水分解物、１２．５ｇの酵母抽出物、１ｇのＫＨ２ＰＯ４、２ｇのＫ２ＳＯ４、０．５ｇのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．０３ｇのＺｎＣｌ２、０．０２ｇのＣａＣｌ２、０．０１ｇのＭｎＳＯ４．４Ｈ２Ｏ、０．３ｇのＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、１０ｍｌのＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０３７８−０１６）を含有し、４Ｎ  Ｈ２ＳＯ４でｐＨ５．６に調整される。
【０１４１】
ＦＭ２培地は、１リットルあたり：８２．５ｇのグルコース１Ｈ２Ｏ、２５ｇのＭａｌｄｅｘ１５（Ｂｏｏｍ  Ｍｅｐｐｅｌ、オランダ）、２ｇのクエン酸、４．５ｇのＮａＨ２ＰＯ４．１Ｈ２Ｏ、９ｇのＫＨ２ＰＯ４、１５ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０２ｇのＺｎＣｌ２、０．１ｇのＭｎＳＯ４．１Ｈ２Ｏ、０．０１５ｇのＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ、０．０１５ｇのＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、１ｇのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．１ｇのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．３ｇのＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、３０ｇのＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸）、ｐＨ＝６を含有する。
【０１４２】
ＰＬＡ１ホスホリパーゼ活性
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）培養ブロスにおけるホスホリパーゼＰＬＡ１活性（ｐｌａ１）を分光学的に決定するために、人工基質：１，２−ジチオジオクタノイルホスファチジルコリン（ｄｉＣ８、基質）を使用する。ｐｌａ１は、Ａ１位でスルフィド結合を加水分解し、チオ−オクタン酸を解離させる。チオ−オクタン酸は、４，４ジチオピリジン（発色試薬、４−ＤＴＤＰ）と反応し、４−チオピリドンを形成する。４−チオピリドンは、４−メルカプトピリジンと互変異性平衡であり、３３４ｎｍの波長を有する照射を吸収する。該波長での消光変化を測定する。１単位は、３７℃およびｐＨ４．０で１分間あたり１，２−ジチオジオクタノイルホスファチジルコリンから１ｎｍｏｌチオ−オクタン酸を遊離させる酵素の量である。
【０１４３】
基質溶液は、６６ｍｌエタノールあたり１ｇのｄｉＣ８結晶を溶解し、２６４ｍｌ酢酸緩衝液を添加することによって、調製する。酢酸緩衝液は、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含有する０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ３．８５を含んでなる。発色試薬は、１１ｍＭ  ４，４−ジチオジピリジン溶液である。それは、２ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆサンプルカップに５．０ｍｇの４，４−ジチオジピリジン秤量し、１．００ｍｌエタノールに溶解することによって調製した。１．００ｍｌのミリＱ水を添加した。
【０１４４】
真菌α−アミラーゼ活性
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）培養ブロスにおけるα−アミラーゼ活性を決定するために、供給者のプロトコルに従って、Ｍｅｇａｚｙｍｅ  ｃｅｒｅａｌ  ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ  ｋｉｔ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ，ＣＥＲＡＬＰＨＡ  ａｌｐｈａ  ａｍｙｌａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ、カタログ参照Ｋ−ＣＥＲＡ、２０００−２００１年）を使用する。測定される活性は、過剰のグルコアミラーゼおよびα−グルコシダーゼの存在下で、非還元末端をブロックしたｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシドの加水分解に基づく。形成されるｐ−ニトロフェノールの量は、サンプル中に存在するα−アミラーゼ活性に対する測定値である。
【０１４５】
実施例１．麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ホスホリパーゼＡ１をコードするｐｌａ１遺伝子およびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）α−アミラーゼをコードするａｍｙＡ遺伝子のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）発現構築物の構築
ホスホリパーゼＡ１タンパク質をコードするｐｌａ１遺伝子のＤＮＡ配列は、特開平１０−１５５４９３−Ａ／１号公報において開示され、また、受託番号Ｅ１６３１４下でＥＭＢＬ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｌ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）から回収することができる。生来の麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ｐｌａ１遺伝子のゲノム配列を配列番号１として示す。ｐｌａ１の対応するコード配列を配列番号２として示す。配列番号２の翻訳された配列は、配列番号３として割り当てられ、麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ホスホリパーゼＡ１を表す。
【０１４６】
α−アミラーゼタンパク質をコードするａｍｙＡ遺伝子のＤＮＡ配列は、Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．１９９０年３月、１７（３）：２０３−２１２（コールマン  ＤＲ（Ｋｏｒｍａｎ  ＤＲ）、ベイリス  ＦＴ（Ｂａｙｌｉｓｓ  ＦＴ）、バーネット  ＣＣ（Ｂａｒｎｅｔｔ  ＣＣ）、カルモナ  ＣＬ（Ｃａｒｍｏｎａ  ＣＬ）、コダマ  ＫＨ（Ｋｏｄａｍａ  ＫＨ）、ロイヤー  ＴＪ（Ｒｏｙｅｒ  ＴＪ）、トンプソン  ＳＡ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＳＡ）、ウォード  Ｍ（Ｗａｒｄ  Ｍ）、ウィルソン  ＬＪ（Ｗｉｌｓｏｎ  ＬＪ）、バーカ  ＲＭ（Ｂｅｒｋａ  ＲＭ）によるアスペルギルス・ニガー変種アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｖａｒ．ａｗａｍｏｒｉ）由来の２種のα−アミラーゼ遺伝子のクローニング、特徴付け、および発現）において開示され、また受託番号ＡＢ１０９４５２下でＥＭＢＬ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｌ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）から回収することができる。生来のＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ａｍｙＡ遺伝子のゲノム配列を配列番号２８として示す。ａｍｙＡの対応するコード配列を配列番号２９として示す。配列番号２９の翻訳された配列は、配列番号３０として割り当てられ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）α−アミラーゼタンパク質を表す。
【０１４７】
ｐｌａ１構築物のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種における発現解析のために、ゲノムｐｌａ１遺伝子とＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼプロモーターとの融合を、クローニング部位の導入を伴う翻訳開始部位において行った。そのようにするために、ゲノムｐｌａ１遺伝子の増幅のためのＰＣＲを、配列番号４および配列番号５として同定されるオリゴヌクレオチド、ならびにテンプレートとして、国際公開０４／０７００２２号パンフレットにおいて記載のｐＧＢＦＩＮ１１においてクローニングされるｐｌａ１遺伝子構築物を使用して実施し、フラグメントＡとして同定される１．１ｋｂフラグメントを作製した。さらに、ＳｎａＢＩクローニング部位を導入した。第２のＰＣＲを、配列番号６および配列番号７として同定されるオリゴヌクレオチドならびにテンプレートとしてｐＧＢＦＩＮ−２３ベクター（国際公開第９９／３２６１７号パンフレットに記載されている）を使用して実施し、フラグメントＢとして同定される０．４ｋｂのｇｌａＡプロモーターフラグメントを作製した。得られるフラグメントＡおよびＢの両方を、ＰＣＲ、配列番号５および配列番号６として同定されるオリゴヌクレオチド、ならびに上記のフラグメントＡおよびＢを使用する配列重複伸長（Ｇｅｎｅ．１９８９年４月、１５；７７（１）：５１−９、ホ  ＳＮ（Ｈｏ  ＳＮ）、ハント  ＨＤ（Ｈｕｎｔ  ＨＤ）、ホートン  ＲＭ（Ｈｏｒｔｏｎ  ＲＭ）、プーレン  ＪＫ（Ｐｕｌｌｅｎ  ＪＫ）、ピーズ  ＬＲ（Ｐｅａｓｅ  ＬＲ）「Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ」に記載のＳＯＥ−ＰＣＲ）によって融合し；１．４ｋｂのフラグメントＣを作製した。ゲノムｐｌａ１遺伝子およびｇｌａＡプロモーターの部分を含んでなるこのフラグメントＣを、ＳｆｉＩおよびＳｎａＢＩで消化し、ＳｆｉＩおよびＮｒｕＩ消化ｐＧＢＦＩＮ−３０ベクター（図１）に導入し、ｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ａ（図２）を作製した。導入および消化されたＰＣＲフラグメントＣの配列を配列解析によって確認し、その配列を配列番号８に示す。Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ａｍｙＡ構築物のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種における発現解析のために、ゲノムａｍｙＡプロモーターおよびａｍｙＡ  ｃＤＮＡ配列を含有するフラグメントを、上記と同様なストラテジーにおけるＰＣＲを使用して増幅および融合した。適切な制限部位を両末端に導入し、発現ベクターにおけるクローニングを可能にした。５’末端にＸｈｏＩ部位を導入し、３’末端にＰａｃＩ部位を導入した。α−アミラーゼプロモーターおよびｃＤＮＡ配列を含んでなるこのフラグメントを、ＸｈｏＩおよびＰａｃＩで消化し、ＸｈｏＩおよびＰａｃＩ消化ｐＧＢＦＩＮ−１２ベクター（国際公開第９９／３２６１７号パンフレットに記載の構築およびレイアウト）に導入し、ｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−１（図４）を作製した。導入されたＰＣＲフラグメントの配列を配列解析によって確認し、その配列を配列番号３１に提示する。
【０１４８】
実施例２：Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）における麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）のホスホリパーゼＡ１酵素の産生を改善するための改善されたＤＮＡ配列の構築のための本発明の方法の使用
２．１．Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）における発現のための麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ホスホリパーゼＡ１コード配列のコドン頻度またはコドン使用頻度の改善
本発明の方法を、麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）のＰＬＡ１遺伝子のコドン使用の改善に、以後適用した。この方法は、任意のヌクレオチド配列のコドン使用の改善のための同じ様式で適用することができる。ｐｌａ１のヌクレオチドコード配列を配列番号２として示す。
【０１４９】
ＰＬＡ１をコードする生来の麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）遺伝子のコドン使用および合成の最適化された変種を以下の表２に示す。生来および最適化された合成ｐｌａ１遺伝子では、それぞれのコドンの正確な数ならびにアミノ酸あたりの分布が与えられる。さらに、第３のカラムは、最適化のための標的である提唱される最適分布を提供する。
【０１５０】
グループ１アミノ酸では、ただ１つの可能性が存在する。グループ１は、常にＡＴＧによってコードされるメチオニンおよび常にＴＧＧによってコードされるトリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｅ）からなる。
【０１５１】
グループ２アミノ酸は、０％または１００％の極端な頻度に従う最適化に供され、ストラテジーは明白である。グループ２ＡＡのすべてのコドンは、２つの可能なコドンの最適変種へ特異的に変更される。より具体的には、システインでは、コドンＴＧＴがＴＧＣによって；フェニルアラニンでは、ＴＴＴがＴＴＣによって；ヒスチジンでは、ＣＡＴがＣＡＣによって；リジンでは、ＡＡＡがＡＡＧによって；アスパラギンでは、ＡＡＴがＡＡＣによって；グルタミンでは、ＣＡＡがＣＡＧによって；チロシンでは、ＴＡＴがＴＡＣによって置き換えられる。
【０１５２】
グループ３アミノ酸は、表１において示されるいくらかのコドンによってコードされ得；各コドンは好適なコドン頻度で存在し：アラニンではＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、ＧＣＧ；アスパラギン酸ではＧＡＴ、ＧＡＣ；グルタミン酸ではＧＡＡ、ＧＡＧ；グリシンではＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ、ＧＧＧ；イソロイシンではＡＴＴ、ＡＴＣ、ＡＴＡ；ロイシンではＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ；プロリンではＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＡ、ＣＣＧ；アルギニンではＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、ＡＧＧ；セリンではＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、ＡＧＣ；スレオニンではＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、ＡＣＧ；バリンではＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡ、ＧＴＧが以下の方法論に従って最適化される。
【０１５３】
グループ３アミノ酸（ＡＡ）およびそれらのコードするコドンについて、所定のコード配列内のそれぞれの可能なコドンの最適な発生の算出は、以下の方法論に従って実施される：
ｉ．それぞれのグループ３  ＡＡのそれぞれについて、所定の配列においてコードされる残基の総数を合計する、カラムＡ１（表３）を参照のこと、
ｉｉ．それぞれのＡＡおよび該ＡＡをコードするコドンについて、該ＡＡについての総数に、表１における最適コドン分布を乗じ、一般的に１０進数を含有し得る生のコドン分布を求める、カラムＡ２（表４）を参照のこと、
ｉｉｉ．数字を取り出すことによって、生のコドン分布（ｉｉ）の値を丸め、丸められたコドン分布を求める、カラムＡ３（表４）を参照のこと、
ｉｖ．ＡＡのそれぞれについて、丸められたコドン分布（ｉｉｉ）において示されるＡＡの総数を合計する、カラムＡ４（表３）を参照のこと、
ｖ．所定の配列（ｉ）においてコードされる残基の総数を、丸められたコドン分布（ｉｖ）において示されるＡＡの総数で引くことによって、丸められたコドン分布におけるそれぞれのＡＡのそれぞれについての残基の失われた総数を算出する、カラムＡ５（表３）を参照のこと、
ｖｉ．それぞれのコドンについて、減法によって、生のコドン分布（ｉｉ）と丸められたコドン分布（ｉｉｉ）との間の１０進数の差異を算出する、カラムＡ６（表４）を参照のこと、
ｖｉｉ．それぞれのコドンについて、１０進数の差異（ｖｉ）および表１における最適コドン分布を乗じ、それぞれのコドンに対するウェイト値を得る、カラムＡ７（表４）を参照のこと、
ｖｉｉｉ．それぞれのＡＡのそれぞれについて、失われた残基の量（ｖ）、最も高いウェイト値を有するコドンのそれぞれの量（ｖｉｉ）を選択する、カラムＡ８（表４）を参照のこと、
ｉｘ．ポリペプチドをコードする所定の配列内の最終最適コドン分布の算出は、丸められたコドン分布（ｉｉｉ）およびそれぞれのコドンについて失われた残基（ｖｉｉｉ）の選択された量を合計することによって、算出される、カラムＡ９（表４）を参照のこと。
【０１５４】
【表２】
2008527985.tif 000022
【０１５５】
【表３】
2008527985.tif 000023
【０１５６】
【表４】
2008527985.tif 000024
【０１５７】
【表５】
2008527985.tif 000025
【０１５８】
【表６】
2008527985.tif 000026
【０１５９】
【表７】
2008527985.tif 000027
【０１６０】
続いて、ｐｌａ１コード配列における総数が、算出される最終コドン分布より高かったコドンでは、算出される異なる対応するコドンへの置換のために、無作為選択を行った。また、ｐｌａ１コード配列において増加すべきであるコドンについて、頻度において減少すべきである他の異なる対応するコドン候補から無作為選択を行った。
【０１６１】
これにより、表２に示される改変型コード配列（または同義コード配列もしくは最適化された合成配列）が生じる。上記のプロセスから生じる最適化された合成ｐｌａ１配列を図６に示す。ここで、本発明の改変型コード配列と生来およびゲノムｐｌａ１配列のアラインメントを見出すことができる。この改変型コード配列では、生来の配列の３つのイントロンを、それらの本来の位置（配列番号１に示される）に配置し、配列番号１１に示されるような最適化された合成配列を生じた。改変型コード配列における二次構造を、有害な二次構造の可能な発生についてのＣｌｏｎｅ  Ｍａｎａｇｅｒ  ７プログラム（Ｓｃｉ．Ｅｄ．Ｃｅｎｔｒａｌ：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＆Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  ｓｏｆｔｗａｒｅ、バージョン７．０２）を使用して、確認した。
【０１６２】
２．２：改変された翻訳終結配列の選択
麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ホスホリパーゼＡ１をコードする生来のｐｌａ１遺伝子は、「ＴＡＧ」終止コドン、続いて、導入されるＳｎａＢＩ制限部位のＴＡＣＧＴＡを含有する。多くの合成構築物では、５’−ＴＡＧＴ−３’翻訳終結配列は、ＴＡＡＡに続いてＳｎａＢＩ制限部位の同じＴＡＣＧＴＡによって置き換えられる。この置き換えは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号３５の配列において行われている。この結果として、発現構築物ｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ｄ、ｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ｅ、ｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ｆ、ｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ｇおよびｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ｈは、本発明に従う改変型翻訳終結配列を有する。
【０１６３】
２．３：改変型翻訳開始配列の選択
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）における酵素の過剰発現のために、ｐＧＢＦＩＮ発現構築物を使用して、強力なｇｌａＡプロモーターが適用される。ＰｇｌａＡのＡＴＧ開始コドンを含む翻訳開始配列は、５’−ＣＡＣＣＴＣＡＧＣＡ  ＡＴＧ−３’である。ＰｇｌａＡの翻訳開始配列は、５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ−３’または５’−ＣＧＣＡＧＴＣＡＡＧ−３’に改変されている。これにより、ＥｃｏＲＩ部位の下流にそれぞれ配列番号２５および２６において同定され得るようなグルコアミラーゼプロモーター配列を生じる。この置き換えは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４の配列において実施した。この結果として、発現構築物ｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ｂ、ｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ｃ、ｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ｅ、ｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ｆおよびｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ｇは、本発明に従う改変型翻訳終結配列を有する。米国特許第６，４６１，８３７Ｂ１号明細書に記載の翻訳イニシエータ配列は、発現構築物ｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ｈを生じる配列番号３５の配列において試験されている。
【０１６４】
２．４：改変型翻訳開始コード配列の選択
翻訳開始コード配列の改変は、コドン最適化および／または翻訳開始コード配列の改善と組み合わせることができる。ただ１つのコドンが最適であり、即ち、コドンはアラニンをコードするＧＣＴによって置き換えられるため、コード配列における第２のコドンの置換は明白である。第３のコドンは、４つの選択肢：それぞれセリン、プロリン、スレオニン、およびアルギニンをコードするＴＣＣ；ＣＣＣ；ＡＣＣ；ＧＣＣを有する。ＴＴＣを選択した。第４のコドンは、フェニルアラニンに対するＴＴＣ、セリンに対するＴＴＣ、ロイシンに対するＣＴＣ、またはプロリンに対するＣＣＣのいずれかであり得る。ＴＣＣを選択した。これは、開始コドンを含む改変型翻訳開始コード配列として５’−ＡＴＧＧＣＴＴＣＣＴＴＣ−３’をもたらす。これにより、ＥｃｏＲＩ部位の下流かつ翻訳開始コード配列を伴う配列番号２７において同定され得るようなグルコアミラーゼプロモーター配列を生じる。この改変型配列は、配列番号１４において使用される。この結果として、発現構築物ｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ｇは、本発明に従う改変型翻訳開始コード配列を有する。
【０１６５】
２．５：２．１〜２．４において作製される少なくとも１つの改変の組み合わせ
産生させようとするポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現は、コドン使用頻度、ならびに／あるいはコンセンサス翻訳イニシエータコード配列ならびに／あるいはコンセンサス翻訳イニシエータ配列および／または最適翻訳終結配列を含んでなる制御ＤＮＡ配列を最適化することによって、改善され得る。一連の８つの構築物（表５）を分析して、本発明の多くの実施態様を試験した。
【０１６６】
【表８】
2008527985.tif 000028
【０１６７】
実施例３：Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）におけるα−アミラーゼ酵素の産生を改善するための改善されたＤＮＡ配列の構築のための本発明の方法の使用
３．１．Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）における発現のためのα−アミラーゼコード配列ａｍｙＡのコドン頻度またはコドン使用頻度の改善
本発明の方法を、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のａｍｙＡ遺伝子のコドン使用の改善に、以後適用した。この方法は、任意のヌクレオチド配列のコドン使用の改善のための同じ様式で適用することができる。生来のａｍｙＡのヌクレオチドコード配列を配列番号２９として示す。
【０１６８】
ｘ．Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）の生来のａｍｙＡ遺伝子のコドン使用および合成の最適化された変種を以下の表６に示す。生来および最適化された合成ａｍｙＡ遺伝子では、それぞれのコドンの正確な数ならびにアミノ酸あたりの分布が与えられる。さらに、第３のカラムは、最適化のための標的である提唱される最適分布を提供する。
【０１６９】
【表９】
2008527985.tif 000029
【０１７０】
【表１０】
2008527985.tif 000030
【０１７１】
【表１１】
2008527985.tif 000031
【０１７２】
続いて、完全に新規のヌクレオチドコード配列が、本来のａｍｙＡペプチドにおけるそれぞれのアミノ酸についての提唱される数の同義コドン（表６）の無作為分布によって作製される。
【０１７３】
生来のａｍｙＡ遺伝子は「ＴＧＡ」終止コドンを含有する。作製されるすべてのａｍｙＡ構築物において、５’−ＴＧＡ−３’翻訳終結配列を、５’−ＴＡＡＡ−３’に続いてＰａｃＩ制限部位の５’−ＴＴＡＡＴＴＡＡ−３’によって置き換えた。
【０１７４】
これにより、表６に示される改変型コード配列（または同義コード配列もしくは最適化された合成配列）が生じる。上記のプロセスから生じる最適化された合成ａｍｙＡ配列を配列番号３２に示す。改変型コード配列における二次構造を、有害な二次構造の可能な発生についてのＣｌｏｎｅ  Ｍａｎａｇｅｒ  ７プログラム（Ｓｃｉ．Ｅｄ．Ｃｅｎｔｒａｌ：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＆Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  ｓｏｆｔｗａｒｅ、バージョン７．０２）を使用して、確認した。
【０１７５】
３．２：改変型翻訳開始配列の選択
本実施例では、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）におけるαアミラーゼ酵素の過剰発現のために、ｐＧＢＦＩＮに基づく発現構築物を使用して、強力なａｍｙＡプロモーターが適用される。ＰａｍｙＡのＡＴＧ開始コドンを含む翻訳開始配列は、５’−ＧＧＣＡＴＴＴＡＴＧ  ＡＴＧ−３’または５’−ＧＡＡＧＧＣＡＴＴＴ  ＡＴＧ−３’であり、どのＡＴＧが開始コドンとして選択されるかに依存する。ＰａｍｙＡの翻訳開始配列は、５’−ＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡＡＴＧ−３’に改変されている。この置き換えは、配列番号３３および配列番号３４の配列において行われている。この結果として、発現構築物ｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−２およびｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−３は、本発明に従う改変型翻訳開始配列を有する。
【０１７６】
３．３：３．１および３．２において作製される少なくとも１つの改変の組み合わせ
発現させようとするポリペプチドをコードする配列の発現は、コドン使用頻度ならびに／あるいはコンセンサス翻訳イニシエータ配列および／または最適翻訳終結配列を含んでなる制御ＤＮＡ配列を最適化することによって、改善され得る。一連の３つの構築物（表７）を構築して、本発明の多くの実施態様を試験した。
【０１７７】
【表１２】
2008527985.tif 000032
【０１７８】
実施例４．改変型発現ベクターの構築およびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）におけるそれらの試験
４．１．実施例２．１〜２．５に従う麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ホスホリパーゼＡ１を発現する改変型ｐｌａ１発現ベクターの構築
ｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ａのクローニングされたＥｃｏＲＩ−ＳｎａＢＩフラグメントのＤＮＡ配列を、配列番号８として示す。グルコアミラーゼプロモーターの翻訳開始配列の変種を含んでなるＥｃｏＲＩフラグメントのＤＮＡ配列を、配列番号９および配列番号１０として示す。これらの改変型遺伝子フラグメントを完全に合成し、配列解析によって配列を確認した。
【０１７９】
発現ベクターにおけるこれらの改変型配列変種をクローニングするために、すべての合成遺伝子フラグメントをＥｃｏＲＩで消化し、ＥｃｏＲＩ消化ｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ａベクター（図２）の大きなフラグメントに導入して、ｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ａの変種発現ベクターを作製した。ＥｃｏＲＩフラグメントの適切な配向を確認した後、変種発現構築物を、表８において以下に記載のようにｐＧＢＦＩＮＰＬＡ１ｂおよびｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ｃと命名した。図３はまた、プラスミドｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ｂおよびｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ｃの代表的マップを提供している。
【０１８０】
グルコアミラーゼプロモーターの部分、ｐｌａ１シグナル配列、ホスホリパーゼＡ１の成熟ペプチドおよび終止コドンの周りの翻訳終結配列を含んでなる他の５つの合成配列変種のＤＮＡ配列を、配列番号１１〜配列番号１４および配列番号３５として示す。これらの５つの改変型遺伝子フラグメントを、重複ポリヌクレオチドの設計および合成ならびに多くの重複ポリヌクレオチド由来の二本鎖配列の以後の集成によって、完全に合成した。配列を、配列解析によって確認した。
【０１８１】
発現ベクターにおけるこれらの改変型配列変種をクローニングするために、すべての合成遺伝子フラグメントをＥｃｏＲＩおよびＳｎａＢＩで消化し、ＥｃｏＲＩおよびＮｒｕＩ消化ｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ａベクター（図２）の大きなフラグメントに導入して、以下の表８に示される変種発現ベクターｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ｄからｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ｈを作製した。プラスミドｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ｄからｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ｈの代表的マップを図３に提供する。
【０１８２】
【表１３】
2008527985.tif 000033
【０１８３】
プラスミドｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ａからｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ｆおよびｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ｈのｐｌａ１コード配列の翻訳された配列は、配列番号３において同定されるアミノ酸配列に従い、野生型麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ホスホリパーゼＡ１を表す。プラスミドｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ｇのｐｌａ１コード配列の翻訳された配列は、配列番号１５において同定されるアミノ酸配列に従い、改変型シグナル配列を伴う麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ホスホリパーゼＡ１を表す。
【０１８４】
４．２．実施例３．１〜３．３に従うＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）α−アミラーゼを発現する改変型ａｍｙＡ発現ベクターの構築
ｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−１（図４）のＸｈｏＩ−ＰａｃＩフラグメントのＤＮＡ配列を、配列番号３１として示し、野生型ａｍｙＡプロモーターおよび野生型ａｍｙＡ  ｃＤＮＡ配列を含んでなり、改変型翻訳終止配列（ＴＡＡＡ）を伴う。α−アミラーゼプロモーターの翻訳開始配列の変種を含んでなるＤＮＡ配列を、配列番号３３として示す。α−アミラーゼエンコーディングａｍｙＡ遺伝子に対するコドン最適化コード配列と組み合わされたα−アミラーゼプロモーターの翻訳開始配列の変種を含んでなるＤＮＡ配列を、配列番号３４として示す。これらの改変型遺伝子フラグメントをインビトロで完全に合成し、配列解析によって配列を確認した。
【０１８５】
発現ベクターにおけるこれらの改変型配列変種をクローニングするために、すべての合成遺伝子フラグメントをＸｈｏＩおよびＰａｃＩで消化し、ＸｈｏＩおよびＰａｃＩ消化ｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−１ベクター（図４）の大きなフラグメントに導入して、変種発現ベクターを作製した。正確なフラグメントの組込みを確認した後、変種発現構築物を、表９において以下に記載のように、ｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−２およびｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−３と命名した。
【０１８６】
【表１４】
2008527985.tif 000034
【０１８７】
プラスミドｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−１からｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−３のａｍｙＡコード配列の翻訳された配列は、配列番号３０において示されるようなアミノ酸配列に従い、野生型Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）α−アミラーゼを表す。
【０１８８】
４．３．ｐＧＢＦＩＮＰＬＡベクターを使用する麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ホスホリパーゼＡ１およびｐＧＢＦＩＮＦＵＡベクターを使用するＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）α−アミラーゼの野生型および改変型発現構築物のＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）における発現
先の段落において調製したｐＧＢＦＩＮＰＬＡおよびｐＧＢＦＩＮＦＵＡ発現構築物を、以下に記載のような形質転換および図５に示されるストラテジーに従って、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）に導入した。
【０１８９】
ＷＴ２において８つのｐＧＢＦＩＮＰＬＡベクター（表８）およびＷＴ３において３つのｐＧＢＦＩＮＦＵＡベクター（表９）を導入するために、形質転換および形質転換体の以後の選択を、国際公開第９８／４６７７２号パンフレットおよび国際公開第９９／３２６１７号パンフレットに記載のように行った。簡単に説明すると、ｐＧＢＦＩＮ構築物の線状ＤＮＡを単離し、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）を形質転換するために使用した。形質転換体をアセトアミド培地上で選択し、標準的手順に従ってコロニーを精製した。コロニーを、ｇｌａＡ遺伝子座における組込みおよびＰＣＲを使用するコピー数について診断した。より小さな予想されるコピー数（低コピー：１〜２）を伴うそれぞれのｐＧＢＦＩＮ構築物の５〜１０個の独立した形質転換体を選択し、例えば、それぞれＰＬＡ−１ａ−１、ＰＬＡ−１ｂ−２およびＦＵＡ−１−１、ＦＵＡ−３−１のような形質転換プラスミドの番号を使用して、命名した。
【０１９０】
選択されたＰＬＡおよびＦＵＡ株ならびにＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＷＴ２およびＷＴ３を使用して、タンパク質産物のそれぞれについての上記のような１００ｍｌの培地中、３４℃および１７０ｒｐｍで、５００ｍｌバッフル付振盪フラスコを使用するインキュベーターシェーカーにおいて、振盪フラスコ実験を実施した。２、３、４、５および／または６日間の発酵後、サンプルを採取した。第１の工程では、ｐｌａ１およびａｍｙＡ過剰発現を、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＷＴ２およびＷＴ３の形質転換体ならびにＷＴ２およびＷＴ３自体のノーザンブロット解析によって測定した。回収した菌糸体を、ＲＮＡの単離（国際公開第９９／３２６１７号パンフレットに記載されている）およびノーザンブロット解析の標準的手順（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年）に従うノーザンブロット解析に使用した。野生型ｐｌａ１遺伝子のすべての形質転換体について（但し、ＷＴ２自体についてではない）、強力かつ比較可能なハイブリダイゼーションシグナルが、ｐｌａ１  ｍＲＮＡレベルについて検出された（データ示さず）。これは、ｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ａからｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ｃのすべての形質転換された株においてグルコアミラーゼプロモーターによるｐｌａ１遺伝子の転写制御が無傷（ｉｎｔａｃｔ）であり、野生型ｇｌａＡプロモーターと比較して変化していないことを示す。さらに、ｐｌａ１改変型構築物のｐｌａ１過剰発現を、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＷＴ２の関係するＰＬＡ形質転換体およびＷＴ２自体のノーザンブロット解析によって測定した。改変型合成ｐｌａ１遺伝子のすべての形質転換体について（但し、ＷＴ２自体についてではない）、強力かつ比較可能なハイブリダイゼーションシグナルが、検出された（データ示さず）。これは、ｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ｄからｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ｈのすべての形質転換された株におけるグルコアミラーゼプロモーターによる最適化されたｐｌａ１遺伝子の転写制御が無傷（ｉｎｔａｃｔ）であり、合成ｐｌａ１遺伝子が発現されたことを示す。
【０１９１】
同様の方法において、生来および改変型構築物のａｍｙＡ過剰発現を、すべての３つの発現構築物において使用されるグルコアミラーゼターミネーターの３’−非翻訳領域に位置する（ユニバーサル）プローブを使用して、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＷＴ３の関係するＦＵＡ形質転換体およびＷＴ３自体のノーザンブロット解析によって測定した。ａｍｙＡ構築物のすべての形質転換体について、強力かつ比較可能なハイブリダイゼーションシグナルを検出した（データ示さず）。これは、ｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−１からｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−３のすべての形質転換された株におけるα−アミラーゼプロモーターによる最適化されたａｍｙＡ遺伝子の転写制御が無傷（ｉｎｔａｃｔ）であり、合成ａｍｙＡ遺伝子が発現されたことを示す。
【０１９２】
ホスホリパーゼＡ１ポリペプチドの産生を、すべてのＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＰＬＡ形質転換体において測定した。図７において認められるように、ホスホリパーゼ産生に対する改変型翻訳開始部位（変種１および変種２）の使用のポジティブな効果は、グルコアミラーゼプロモーターを使用して、観察することができる。同様に、ホスホリパーゼ産生に対するコドン使用頻度および翻訳終止配列の改変のポジティブな効果が観察された。結果の概要を以下の表１０に示す。これは、どのようにして、本発明の単一の改変または改変の組み合わせ、例えば、変種１、２もしくは米国特許第６，４６１，８３７Ｂ１号明細書に記載の変種のような改変型翻訳開始配列、および／または改変されたコドン使用頻度および／または改変された翻訳終止配列を使用して、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）におけるホスホリパーゼＡ１の産生の収量を改善することができるかを明白に示す。
【０１９３】
【表１５】
2008527985.tif 000035
【０１９４】
図８から認められ得るように、マルチコピー（２）状態においても、明らかに改善が認められ得る。これは、どのようにして、本発明の単一の改変または改変の組み合わせ、例えば、改変型翻訳開始配列および／または改変型コドン使用頻度および／または改変型翻訳終止配列を、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）におけるホスホリパーゼＡ１の改善された産生に使用することができるかを明白に示した。
【０１９５】
α−アミラーゼの産生を、すべての３種の異なるＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＦＵＡ形質転換体において測定した。図９において認められるように、α−アミラーゼ産生に対する改変型翻訳開始部位（変種１）の使用のポジティブな効果は、α−アミラーゼプロモーターを使用して、観察することができる。さらに、改善されたα−アミラーゼ産生に対する改変型翻訳開始部位（変種１）と改変型コドン使用頻度および改変型翻訳終止配列の組み合わせのポジティブおよび相乗効果が観察された。これらの結果は、ホスホリパーゼ産生およびα−アミラーゼ産生の両方が本発明の方法を使用して改善され得るため、改変の普遍的効果を明白に示す。さらに、複数のプロモーターが、本発明の改変型翻訳開始部位を使用して、改善され得る。明らかに、これらの実施例は、どのようにして、本発明の単一または組み合わせの改変、例えば、改変型翻訳開始配列、改変型コドン使用頻度および／または改変型翻訳終止配列を、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）におけるα−アミラーゼもしくは糸状菌における他の任意のタンパク質の改善された産生に使用することができるかを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１９６】
【図１】発現ベクターｐＧＢＦＩＮ−３０のプラスミドマップを示す。グルコアミラーゼプロモーターにおいて独特なＳｆｉＩおよびＥｃｏＲＩクローニング部位、続いて、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｒｕＩクローニング部位を伴うｇｌａＡプロモーターに関連するｇｌａＡフランキング領域が示される。ｐＧＢＦＩＮ−３０ベクターは、ＡｓｃＩ−ＸｈｏＩ部位が単一のＮｒｕＩ制限部位によって置き換えられているｐＧＢＦＩＮ−２３（構築は国際公開第９９／３２６１７号パンフレットに記載されている）に由来する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡは、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株の形質転換前に、制限酵素ＮｏｔＩによる消化によって取り出すことができる。
【図２】発現ベクターｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ａのプラスミドマップを示す。図２はまた、プラスミドｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ｂおよびｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ｃの代表的マップを提供する。ｇｌａＡプロモーターに関連するｇｌａＡフランキング領域およびホスホリパーゼＡ１をコードする麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ゲノムｐｌａ１遺伝子が示される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡは、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株の形質転換前に、制限酵素ＮｏｔＩによる消化によって取り出すことができる。
【図３】発現ベクターｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ｄからｐＧＢＦＩＮＰＬＡ１ｈのプラスミドマップを示す。ｇｌａＡプロモーターの変種配列に関連するｇｌａＡフランキング領域およびホスホリパーゼＡ１をコードする麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ゲノムｐｌａ１遺伝子が示される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡは、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株の形質転換前に、制限酵素ＮｏｔＩによる消化によって取り出すことができる。
【図４】発現ベクターｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−１のプラスミドマップを示す。図４はまた、プラスミドｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−２およびｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−３の代表的マップを提供する。すべてのクローンは、ｐＧＢＦＩＮ−１２（国際公開第９９／３２６１７号パンフレットにおいて記載される）発現ベクターに由来する。ａｍｙＡプロモーターの変種配列に関連するｇｌａＡフランキング領域およびα−アミラーゼをコードするＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ａｍｙＡ  ｃＤＮＡ配列が示される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡは、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株の形質転換前に、制限酵素ＮｏｔＩによる消化によって取り出すことができる。
【図５】単一の相同組換えを介する組み込みの略図を表す。発現ベクターは、選択可能なａｍｄＳマーカー、およびｐｌａ１遺伝子に接続されたｇｌａＡプロモーターを含んでなる。これらの特徴は、ゲノムｇｌａＡ遺伝子座において組込みを指令するために、ｇｌａＡ遺伝子座の相同領域（それぞれ、３’ｇｌａＡおよび３’’ｇｌａＡ）によって隣接される。
【図６−１】生来のｐｌａ１コード配列、生来のｐｌａ１ゲノム配列および合成の最適化されたｐｌａ１コード配列のアラインメントを示す。ゲノム配列中のイントロンがｐｌａ１ゲノム配列において示される。改変型ｐｌａ１コード配列において変更されているコドンを枠で示す。改変されているヌクレオチドを灰色で示す。
【図６−２】生来のｐｌａ１コード配列、生来のｐｌａ１ゲノム配列および合成の最適化されたｐｌａ１コード配列のアラインメントを示す。ゲノム配列中のイントロンがｐｌａ１ゲノム配列において示される。改変型ｐｌａ１コード配列において変更されているコドンを枠で示す。改変されているヌクレオチドを灰色で示す。
【図７】８つの異なる構築物（ｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ａ−ｈ）を発現するＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株の培養ブロスにおけるホスホリパーゼＡ１活性を示す。生来（ｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ａ）または改変型ｐｌａ１構築物（ｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ｂ−ｈ）を発現するＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株の培養ブロスにおける平均ホスホリパーゼＡ１活性が示され、ここで、翻訳開始配列および／または翻訳終結配列および／またはコドン使用頻度が本発明の方法に従って改変されている。ホスホリパーゼ活性は任意単位［ＡＵ］で示され、少なくとも５つの独立して単離および培養される形質転換体の平均であり、示されるように命名され（表６）、示される培養時間後に測定される。
【図８】３つの異なる構築物を発現するＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株の培養ブロスにおけるホスホリパーゼＡ１活性を示す。生来（ｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ａ）または改変型ｐｌａ１構築物を発現する３つのＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株の培養ブロスにおけるホスホリパーゼＡ１活性が示され、ここで、翻訳開始配列および翻訳終結配列（ｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ｂ）ならびに翻訳開始配列、翻訳終結配列およびコドン使用頻度（ｐＧＢＦＩＮＰＬＡ−１ｅ）が本発明の方法に従って改変されている。ホスホリパーゼは２コピーｐｌａ１形質転換体について任意単位［ＡＵ］で示され、示されるように命名され（表６）、示される培養時間後に測定される。
【図９】３つの異なる構築物を発現するＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株の培養ブロスにおけるα−アミラーゼ活性を示す。生来（ｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−１）または改変型ａｍｙＡ構築物を発現するＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株の培養ブロスにおけるα−アミラーゼ活性が示され、ここで、本発明に従って、翻訳開始配列および翻訳終結配列が改変され（ｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−２）、翻訳開始配列、翻訳終結配列およびコドン使用頻度が改変型（ｐＧＢＦＩＮＦＵＡ−３）。α−アミラーゼ活性は相対単位［ＡＵ］で示され、４日目における１０株のＦＵＡ１グループのうち、７つの１コピー株の平均を１００％と設定する。示される１グループあたり１０個の形質転換体は、独立して単離および培養された形質転換体であり、表９において示されるように命名され、示されるような培養時間において測定される。
【図１】
2008527985.tif 000043
【図２】
2008527985.tif 000044
【図３】
2008527985.tif 000045
【図４】
2008527985.tif 000046
【図５】
2008527985.tif 000047
【図６−１】
2008527985.tif 000048
【図６−２】
2008527985.tif 000049
【図７】
2008527985.tif 000050
【図８】
2008527985.tif 000051
【図９】
2008527985.tif 000052
【配列表】
2008527985000001.app
【国際調査報告】
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2008527985.tif 000054
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