(57)【要約】  本発明は、液体媒体中に懸濁された多孔性キトサン粒子を含む整形外科用組成物であって、液体媒体はさらに生体適合性ポリマーを含む、組成物に関する。本発明はまた、固体、または半固体の整形外科用材料を調製するための方法であって、整形外科用組成物を乾燥させることを含む、方法を提供する。得られた固体または半固体整形外科用材料は、骨代用材料、骨セメント、および組織足場として使用される。結晶性を誘発することが可能な孔形成剤を取り込むことによる、本発明に好適な多孔性キトサン粒子を調製するための方法も記載される。【選択図】図１
2008523870.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体媒体中に懸濁された多孔性キトサン粒子を含む整形外科用組成物であって、前記液体媒体がさらに生体適合性ポリマーを含む、組成物。
【請求項２】
前記粒子は、10μmから2 mmの粒径を持つことを特徴とする、請求項１に記載の整形外科用組成物。
【請求項３】
前記粒子は、キトサンと、キトサン誘導体、多糖、および／またはタンパクとの混合物から構成されることを特徴とする、請求項１または２に記載の整形外科用組成物。
【請求項４】
前記キトサン誘導体は、硫酸化キトサン、N-カルボキシメチルキトサン、O-カルボキシメチルキトサン、およびN,O-カルボキシメチルキトサンの中から選ばれることを特徴とする、請求項３に記載の整形外科用組成物。
【請求項５】
前記粒子が少なくとも50%のキトサンを含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の整形外科用組成物。
【請求項６】
前記粒子が50から90%のキトサンを含むことを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の整形外科用組成物。
【請求項７】
前記液体媒体が可塑剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載の整形外科用組成物。
【請求項８】
前記可塑剤がグリセロールであることを特徴とする、請求項７に記載の整形外科用組成物。
【請求項９】
前記生体適合性ポリマーが、多糖またはタンパクであることを特徴とする、請求項１から８のいずれかに記載の整形外科用組成物。
【請求項１０】
前記生体適合性ポリマーが荷電性ポリマーであることを特徴とする、請求項１から９のいずれかに記載の整形外科用組成物。
【請求項１１】
前記生体適合性ポリマーが陽イオン性ポリマーであることを特徴とする、請求項１０に記載の整形外科用組成物。
【請求項１２】
前記生体適合性ポリマーがキトサンであることを特徴とする、請求項１１に記載の整形外科用組成物。
【請求項１３】
前記生体適合性ポリマーは、前記液体媒体に溶解されていることを特徴とする、請求項１から１２のいずれかに記載の整形外科用組成物。
【請求項１４】
前記液体媒体が水性媒体であることを特徴とする、請求項１から１３のいずれかに記載の整形外科用組成物。
【請求項１５】
固体または半固体の整形外科用材料を調製するための方法であって、請求項１から１４のいずれかに記載の整形外科用組成物を乾燥させることを含む、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の固体または半固体の整形外科用材料を調製するための方法であって、乾燥が、凍結乾燥によって行われることを特徴とする、方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の固体または半固体の整形外科用材料を調製するための方法であって、乾燥が、液体媒体の蒸発によって行われることを特徴とする、方法。
【請求項１８】
請求項１５から１７のいずれかに記載の方法によって得ることができる、固体または半固体の整形外科用材料。
【請求項１９】
前記材料が、前記多孔性キトサン粒子の間に、50μmから1 cmの直径を持つ孔を含むことを特徴とする、請求項１８に記載の固体または半固体の整形外科用材料。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載の固体または半固体の整形外科用材料を、骨代用材料として用いる使用方法。
【請求項２１】
請求項１８または１９に記載の固体または半固体の整形外科用材料を、骨セメントとして用いる使用方法。
【請求項２２】
請求項１８または１９に記載の固体または半固体の整形外科用材料を、組織足場として用いる使用方法。
【請求項２３】
多孔性キトサン粒子を調製するための方法であって、キトサンおよび前記キトサンに対し結晶性を誘発することが可能な孔形成剤を含む溶液を調製すること、前記溶液を乾燥して固体残留物とすること、および、前記固体残留物を粉砕して前記多孔性キトサン粒子を生成すること、を含む方法。
【請求項２４】
前記溶液が、キトサンと、キトサン誘導体、多糖、および／またはタンパクとの混合物を含むことを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記誘導体は、硫酸化キトサン、N-カルボキシメチルキトサン、O-カルボキシメチルキトサン、およびN,O-カルボキシメチルキトサンの中から選ばれることを特徴とする、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記混合物が少なくとも50%のキトサンを含むことを特徴とする、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記混合物が50から90%のキトサンを含むことを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記孔形成剤は、生体適合性無機塩、および、少なくとも10 kDの分子量を持つポリエチレングリコールの中から選ばれることを特徴とする、請求項２３から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記孔形成剤は生体適合性無機塩であり、かつ、前記塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、および塩化マグネシウムの中から選ばれることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記塩が塩化ナトリウムであることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
キトサン、あるいは、キトサンと、キトサン誘導体、多糖、および／またはタンパクとの混合物と、孔形成剤との比が、1:1から1:10であることを特徴とする、請求項２３から３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記比が1:2から1:5であることを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項２３から３２のいずれかに記載の方法によって得ることができる、多孔性キトサン粒子。
【請求項３４】
前記多孔性キトサン粒子が、請求項３３に記載の多孔性キトサン粒子であることを特徴とする、請求項１から１４のいずれかに記載の整形外科用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はキトサン組成物、特に、整形外科用途のための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨代用品は、様々な適応症、例えば、骨折整復、インプラントの更新、腫瘍および嚢胞除去後および脊椎適応症における空洞の充填に使用される。高齢ではあるが依然として活動的な人々の集団が、骨代用品を必要とする手術処置の増加に大きく貢献している。数年前は、整形外科医は、大多数の移植手術において患者自身の骨（自己移植片）を用いていたが、今日では、専門家は、商業骨バンクから入手可能な、または病院で回収される、死体骨（同種移植片）によりいっそう依存するようになっている。同種移植片に依存することは二つの弱点を持つ。第一に、どんなに小さくともウィルス汚染の危険があることで、患者の安全を保証するためには高価な検査処置を行わなければならない。第二に、同種移植片に対する需要は供給を上回る。これらの因子が互いに組み合わさって骨代用合成材料への門戸が開らかれた。
【０００３】
もう一つの関連領域は骨折固定装置である。金属プレート、ねじ、釘、ワイヤー、ピン、ロッドが、骨の固定のために使用される。この固定は、骨折を治癒するためにはある程度剛直でなければならないが、剛直すぎる固定は、固定装置と骨の弾性の間に不整合があるため、治癒の完成を妨げる可能性がある。ステンレススチールおよびチタンで製造した固定装置は、骨に比べ、相当高いヤング率を持つ。通常、これらの金属インプラントは、治癒後も体内に滞留し続けることになるが、時に患者にとって痛みおよび不快の原因となることがあり、二次的手術処置において取り出さなければならないことがある。装置と骨の間における剛性の不整合を緩和するために、骨セメントのようなポリマーが使用される。これらの不整合をさらに均すために、いくつかの新規材料が設計されている。
【０００４】
新しく、より良い材料および治療処置が興味を持たれる第三の領域として、軟骨整復がある。莫大な数の対処法が試験されてきたが、これまでに成功を見たのはごく僅かである。生細胞、および、様々な材料に基づく新しい足場の移植が試験され、その研究は極めて激しいものがあった。軟骨整復において主な興味の細胞は軟骨細胞である。軟骨細胞は、そのまま、または、足場に納めて損傷領域に移植された。軟骨細胞の足場の例としては、例えば、ヒアルロン酸およびキトサンがある。
【０００５】
骨充填や骨固定、および軟骨整復の両分野において、広範な研究および材料開発が現在進められている。骨充填領域では、材料は主に三つのグループに分類される。すなわち、無機セラミック様材料、合成ポリマー、および、各種混合物であって、その内のあるものは自己移植片を含んでいるものである。例えば、US 6,376,573、US 6,458,375、US 6,696,073、US 6,767,369、US 6,793,369、US 6,793,725、US 6,372,257、WO 02/080992、US 2002/032488、KR 2001/103306、US 2003/124172、DE 19724869、WO 99/47186、US 6,378,527、US 5,624,463、WO 03/008007を参照されたい。キトサン足場上での、骨形成細胞すなわち骨芽細胞の培養が、WO 01/46266およびMacromol. Biosci. 2004, 4, 811-819に記載されている。WO 01/46266は、ゆるく結合したキトサンのネットワークの形を取るキトサンビーズを開示し、Macromol. Biosci.の論文はキトサン繊維を記載する。
【０００６】
ヒドロキシアパタイトは、様々な組成物に使用される。このものは、生体適合性、骨伝導性、非毒性であり、かつ、非免疫原性である。しかしながら、粒状のヒドロキシアパタイトは、患者の血液と混合されると不安定となり、周辺組織に移動することがある。リン酸カルシウムセメントは、腔の形状に一致し、組織内で硬化して固体のヒドロキシアパタイトを形成する。セラミックの多孔性インプラントによって得られる潜在的な利点は、その不活性と共に、骨がセラミックの孔の中に成長した場合に生じる、隆起状界面の力学的安定性である。ある種のサンゴの微小構造は、高度に調節された孔サイズを持つ構造を得るに当たってほぼ理想的な材料となる。サンゴは、脆く、引っ張り強度が不足すると考えられるので、力学的な要求が比較的重要ではない、いくつかの整形外科用途においては好適であることが判明している。
【０００７】
骨充填では、膨大な数の有機ポリマーが試験されている。天然の材料、例えば、コラーゲンのようなタンパクや、ヒアルロン酸、キトサン、キチンのような多糖類、および、ポリアクチドおよびポリグリコリドなどの合成ポリマーの両方が使用されている。
【０００８】
無機および有機材料の混合物も、多くの場合、無機質除去骨と組み合わせて、膨大な数の用途に使用されている。使用分野に応じて、材料には、硬度、生分解性、および多孔性に関して特異的性質が付与される。様々な増殖因子、骨形成をさらに刺激するための骨形成タンパク、および、抗菌剤のような添加剤も、これらの混合物では広く使用される。
【０００９】
力学的性質がもっとも重要である骨固定装置では、乳酸またはグリコール酸から成る生分解性ポリマーに基づく合成材料がもっとも頻繁に使用され、これらの材料からできたいくつかの製品も、現在市場で見られる。PLAおよびPGA、およびこれらのコポリマーは、他の、どの生分解性ポリマーよりもさらに広い用途のために研究されている。これらの材料に対する関心は、その優れた材料特性によるというよりは、主に、これらのポリマーが、既に、多数の承認済みの医用インプラントにおいて使われて成功を収め、ほとんど全ての先進国の規制当局によって安全で、生分解性で、非毒性であると見なされているという事実に基づく。従って、PLA、PGA、またはそのコポリマーから調製される体内埋め込み可能な装置は、新規のポリマーであって、その生分解性がまだ証明されていないポリマーから調製される類似の装置よりは、より短い時間で、より低いコストで市場に出回る可能性がある。現在市販される公認製品としては、縫合糸、歯科用GTR膜、骨ピン、および埋め込み可能な薬剤送達システムが挙げられる。これらのポリマーはまた、血管および泌尿器科ステントおよび皮膚代用品、および組織工学および組織再建用足場の設計において広く研究されている。これらの応用の多くにおいて、PLA、PGA、およびそれらのコポリマーは、中等度から高度の成功を収めてきた。しかしながら、依然として未解決の問題がある。第一に、組織培養実験において、大抵の細胞がPLAまたはPGA表面には付着せず、他の材料表面におけるほど活発に増殖しない。これは、これらのポリマーが、インビトロの細胞増殖において実際には基質として劣っていることを示している。第二に、PLAおよびPGAの分解産物は、比較的強い酸（乳酸およびグリコール酸）である。これらの分解産物が埋め込み部位に蓄積した場合、移植後数ヶ月から数年して遅延型炎症反応が観察されることがよくある。
【００１０】
装置が埋め込まれ、吸着および吸収過程が起こると、体液と接触するポリマー表面は直ちにタンパク様成分を吸着し、本体は、可溶性分、例えば、水、タンパク、および脂質を吸収し始める。次に、細胞要素が、該表面に付着し、化学的過程を開始する。生体適合性材料の場合、埋め込み部位における異物反応は、生体材料の表面の性質、インプラントの形、および生体材料の表面積とインプラントの容量との関係によって調整される。例えば、線維または多孔性材料のように、表面対容積比が高いインプラントでは、インプラント部位のマクロファージ、異物巨大細胞の比率がより高いのに対して、より滑らかな表面のインプラントでは、インプラント部位の重要成分として線維症（線維性嚢胞）をもたらす。一般に、生体材料またはインプラントの周囲には、その界面異物反応により線維症が生じ、インプラントおよび異物反応を局所の組織環境から隔離するので、その分解速度は実質的に低下する。最近の所見から、嚢胞化には、材料の物性係数が重要であることが示唆され、新規材料は、嚢胞層の厚みを最小とするためには、周辺組織に近い物性係数を持つべきであることが提案されている。
【００１１】
細胞へ栄養素を補給すること、および細胞から老廃物を排出すること、これらは、細胞の増殖能力にとって、かつ、第２の工程において、インビボでの人工的足場における増殖にとって決定的に重要である。軟骨細胞においては、これは拡散によって行われ、骨芽細胞および他の多くの細胞では、これは、新生血管の足場内部での増殖によって達成される。従って、骨再生のための物質は、血管形成を可能とする、開孔した多孔性構造を持たなければならない。
【００１２】
インプラントの孔径、物性係数、および表面特性を最適化することによって、細胞の内部増殖、血管形成を可能としながらも、同時に、手術処置の結果を損なう可能性のある強度の炎症反応を引き起こすことない材料を特別あつらえすることは可能であると考えられる。
【００１３】
ある整形外科学的見地からすると、材料を二つのセグメントに分けるのが好都合である。第一は、焦点が、新しい骨の増殖を刺激するが、物理的強度は必ずしも重要ではない材料にある場合である。第二は、焦点が、荷重担持能力および力学的強度にあり、移植された骨代用品の役割が、骨折または欠陥部を安定化し、できるだけ速やかに患者の運動を可能とすることにある場合である。
【００１４】
これまでいくつかの試みがなされてきたが、その成果は限られたものであった。合成材料は、硬すぎたり、脆すぎたりして、取り扱い性が悪いか、材料の変性の後で有害な副作用を招いたりする。これらの欠点は、骨代用材料に関する、米国の最近の市場の数字(2001)にも反映されている。全体市場規模は578百万米ドルで、その内の96%（552百万米ドル）は、同種移植片によるもので、残りの4%（26百万米ドル）が、合成の骨代用材料によるものである。従って、従来技術には、取り扱い性・安定性が改善された材料に対して依然として需要がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従って、本発明は、液体媒体中に懸濁された多孔性キトサン粒子を含む整形外科用組成物であって、液体媒体がさらに生体適合性ポリマーを含む組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、キトサン材料、および、それらの使用、例えば、整形外科用途に関連する問題点に対処する。本発明の新規キトサン材料は、高い負荷担持性、所望の弾性、優れた細胞接着性および細胞増殖性を可能にしている。これらの材料は、様々な孔特性を示すように製造することが可能で、かつ、少なくともその一部が固体材料の形で存在する過飽和キトサン混合物から製造することが可能である。この材料は、液体またはゲル処方で作製される基質中で互いに結合された固体粒子を含み、その後、得られたペーストを乾燥させて生成される最終材料として特徴づけることが可能である。
【００１７】
一つの実施態様では、固体粒子は、結合前に多孔性とし、このようにして二重、または多重多孔性材料を生成することも可能である。これは、例えば、粒子の中に一つのサイズ分布を持つ孔がある場合、および、粒子の間に異なるサイズ分布を持つ孔がある場合である。本特許出願に開示される方法を用いることによって、材料は、様々な用途、例えば、骨充填または骨固定装置としての設計に合わせて特別あつらえすることが可能である。骨充填のための材料は、比較的柔らかいが、それでもある程度の負荷担持能力を持ち、他方、固定のための材料は、さらに強く、かつ、一般的に使用される形状、例えば、プラグ、ねじ、プレート等に成形されることができる。粒子の強度をさらに上げるためには、イオン的、または共有的架橋結合を用いることができる。
【００１８】
本発明の一つの実施態様では、二重または多重多孔性材料を、例えば、ステンレススチール製またはチタン製などの医用装置のコーティング材料として使用してよい。本発明のもう一つの目的は、天然の骨または組織の物性、すなわち、負荷担持性および屈曲性に類似の物性を持つ材料を提供することである。本発明のもう一つの目的は、新生骨の増殖を促進し、支持する多孔性材料を提供することである。本発明のもう一つの目的は、最適化された特性、例えば、炎症、嚢胞形成、および他の生物反応のような生物学的特性、を実現するように、孔サイズの調節が可能な材料を提供することである。本発明のもう一つの目的は、粒子内部に孔を持つのみならず、粒子間の基質の中にも孔を持つ二重または多重多孔性材料を提供することである。本発明のもう一つの目的は、例えば、様々な程度のN-脱アセチル化を持つキトサン、または前記キトサンの混合物を用いて、調節された生分解性を持つ材料を提供することである。それとは別に、生分解性は、基質構造に含まれる添加成分によって、例えば、様々な分解速度を持つポリマーを加えることによって影響されてもよい。本発明のもう一つの目的は、非毒性の分解産物を生じる材料を提供することである。本発明のもう一つの目的は、他の生物学的活性分子、例えば、増殖因子、増殖因子刺激剤、抗菌剤、遺伝子断片、ビタミン、鎮痛剤等を取り込むことによって新たな性質が付与されうる材料を提供することである。本発明のもう一つの目的は、内在的に抗菌性を持つ材料を提供することである。本発明のもう一つの目的は、取り扱いの容易な材料を提供することである。本発明のもう一つの目的は、各種用途に適合する、魅力的な物理的形態および形状として製作されうる材料を提供することである。本発明のもう一つの目的は、病気を伝染しない材料を提供することである。本発明のもう一つの目的は、骨チップとして使用することが可能な材料を提供することである。本発明のもう一つの目的は、骨楔および骨プラグを作製するのに使用が可能な材料を提供することである。本発明のもう一つの目的は、軟骨整復のために使用が可能な材料を提供することである。本発明のもう一つの目的は、血管形成を可能とする材料を提供することである。本発明のもう一つの目的は、生細胞をあらかじめ植え付けることを可能とする材料を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
次に、本発明を、付属の図面を参照しながら説明する。  
本発明は一般に、例えば医学および獣医学における使用を意図した、キトサンから製造される材料に関する。さらに詳細には、本発明は、整形外科領域内の製品、特に、骨折治癒、軟骨組織および骨欠陥の治癒、または歯科手術のために使用される製品を目的とする。製品はまた、美容または形成外科において使用されてもよい。
【００２０】
キチンは、セルロースに次いで、地上でもっとも大量に存在する多糖類である。キチンは硬構造および強靭材料の中に認められ、それらの中で、キチンは、補強棒の機能を果たす。カルシウム塩類、いくつかのタンパクおよび脂質と共に、キチンは、甲殻類および節足動物のような海洋生物の外骨格を構成する。キチンはまた、ある種の細菌および海綿の細胞壁の中にも認められ、昆虫の硬い殻および羽を構成する。商業的には、キチンは、漁業の廃棄物として出される甲殻類の殻から単離される。キトサンは、1,4-ベータ結合D-グルコサミンおよびN-アセチル-D-グルコサミン残基から成る、直鎖状多糖である。キチンそれ自体は水溶性ではなく、このためその使用が極めて制限される。しかしながら、キチンを強アルカリで処理することによって、部分的に脱アセチル化された、水溶性誘導体キトサンが得られ、これは、数多くの異なる物理的形態として、例えば、フィルム、スポンジ、ビーズ、ヒドロゲル、膜状に加工することが可能である。キトサンは、その基本形においては、特に、高分子量のもの、および／または、高度のN-脱アセチル化を経たものは、事実上水に不溶であるが、一塩基酸によるその塩は水溶性となる傾向がある。グルコサミン残基の平均pKaは約6.8であり、例えば、HCl、酢酸、およびグリコール酸との水溶性塩がポリマーから形成される。
【００２１】
本発明で使用されるキトサンは、任意の脱アセチル化されたキトサンであってよい。しかしながら、キトサンの持つ脱アセチル化度は、好ましくは少なくとも33%であって、より好ましくは少なくとも40%、もっとも好ましくは少なくとも50%であり、かつ、好ましくは100%以下であって、より好ましくは95%以下、もっとも好ましくは90%以下である。一般に、脱アセチル化の程度が低ければ低いほど、キトサンは、体液に接触するとより急速に分解する。キトサンは、製薬等級、またはそれと等価な品質のもの、例えば、Carmeda AB（スウェーデン）によって市販されるChitech(登録商標)であってもよい。キトサンは、過剰レベルの重金属、タンパク、エンドトキシン、またはその他の毒性の危険性のある汚染物を含んではならない。多くの用途において、キトサンはそれらの汚染物を実質上含んではならない。多孔性キトサン粒子において、また、生分解性ポリマーとして使用されるキトサンは、様々な程度の脱アセチル化度を有していてよい。
【００２２】
キトサンは、分子量において特には制限されない。しかしながら、キトサンの持つ分子量は、好ましくは少なくとも5 kDであって、より好ましくは少なくとも10 kD、もっとも好ましくは少なくとも15 kDであり、また、好ましくは1500 kD以下、より好ましくは1000 kD以下、もっとも好ましくは500 kD以下である。多孔性キトサン粒子において、また、生分解性ポリマーとして使用されるキトサンは、様々な分子量を有していてよい。
【００２３】
キチン同様、キトサンは、極めて強靭なポリマーであり、また、いくつかの魅力的な生物学的性質も持つ。キトサンの生体内分解は、ポリマー鎖の酵素的切断によって起こる。ほとんど全ての体液の中に認められるリゾチームは、キトサン分解酵素の中でもっとも顕著なものである。リゾチーム切断のための必要条件は、多糖鎖にアセチル基が残っていることで、アセチル基が多ければ多いほど、分解速度は速くなる。キトサンは、非毒性成分に分解され、生組織に接着し、かつ、抗菌性を持つ。これらの性質は、医用製品を開発するに際しキトサンを極めて魅力あるものとした。キトサンは、例えば、ほんの二三の例を挙げるならば、薬品の調節放出用製品、細胞培養用基質、ワクチン担体、および外傷治癒用製品において使用される。キトサンの優れた生分解性は、いくつかのインビボ実験において証明されており、さらに、骨細胞、骨芽細胞も、キトサンで構成される基質の上で培養が可能であることが示されている。整形外科用途におけるキトサンの有用性は長い間想定され、その生物学的および物理学的性質は目覚しいものがあるが、現在に至るまで、誰も、骨格の代用、または骨固定装置の代用として使用できるほど十分に強い材料を作製することができなかった。
【００２４】
キトサンはまた、異なるN-脱アセチル化度を持つ複数のキトサンの混合物として使用してもよい。反復単位が生体適合性置換基によって置換されるキトサン誘導体も使用が可能である。キトサン誘導体の例としては、硫酸化キトサン、N-カルボキシメチルキトサン、O-カルボキシメチルキトサン、およびN,O-カルボキシメチルキトサンが挙げられる。
【００２５】
本発明の整形外科用組成物は、液体媒体に懸濁したキトサンを含む粒子から製造される。従って、液体媒体は、キトサン粒子を懸濁状態に維持するために、すなわち、キトサン粒子を沈着させないために十分なほど粘ちょうである。このような媒体は、従来技術では通常「ゲル」と呼ばれる。これは、生体適合性ポリマーを液体相に取り込むことによって実現される。この生体適合性ポリマーは、多糖またはタンパクであることが好ましい。例としては、キトサンおよびその誘導体、セルロースおよびその誘導体、ヒアルロン酸、デキストランコンドロイチン硫酸、ヘパリン、アルギン酸、コラーゲン、フィブリン、組織封止剤が挙げられる。生体適合性ポリマーは、荷電性（陽イオン性、または陰イオン性）ポリマーであっても、または非荷電性ポリマーであってもよい。さらに好ましくは、生体適合性ポリマーは、陽イオンポリマーであり、もっとも好ましくはキトサンまたはその誘導体である。生体適合性ポリマーは、液体媒体に溶解または懸濁されてもよく、通常ゲルを形成する。液体媒体は水であることが好ましい。
【００２６】
粘度は、組成物の性質に応じて異なるが、粘度は少なくとも50 mPasであることが好ましく、より好ましくは少なくとも100 mPas、より好ましくは少なくとも250 mPas、より好ましくは少なくとも500 mPas、より好ましくは少なくとも1000 mPas、もっとも好ましくは少なくとも1500 mPasである。粘度の上限は、組成物の取り扱い要求によってのみ限定される。
【００２７】
存在する生分解性ポリマーの量は、ポリマーの性質に依存する。なぜなら、ポリマーの性質が、液体媒体中の粘度上昇を決定するからである。要求される粘度もまた、キトサンの多孔性粒子のサイズと性質に依存する。なぜなら、粒子が溶液中に留まることを可能とするためには、異なる粒子は異なる粘度を必要とするからである。しかしながら、生体適合性ポリマーの量は、通常、液体媒体の全重量（すなわち、キトサンの多孔性粒子を含まない）に対する重量として、少なくとも0.1%で、より好ましくは少なくとも1%であり；また、20%以下で、より好ましくは15%以下、より好ましくは10%以下、もっとも好ましくは5%以下である。液体媒体は、生体適合性ポリマーによって過飽和されていることが好ましい。生体適合性ポリマーがキトサンであって、ゲルおよび水溶液を酸性環境で製造する場合、その特定のキトサンの可溶性によって実際的限界が設定される。キトサンの可溶性は、その分子量およびN-脱アセチル化の程度に依存する。しかしながら、水性媒体におけるキトサンの量は、通常、液体媒体の重量に対する重量として1-10%の範囲にあり、好ましくは1-5%である。その際、低分子量キトサンが使用される場合、量は、上記範囲の高い方の端に向かう傾向がある。
【００２８】
前記懸濁液またはペーストはそのまま用いることも可能であるが、多くの場合、所望の形に成形して乾燥させる。従って、本発明は、固体、または半固体の整形外科用材料の調製方法であって、本明細書に記載される整形外科用組成物を乾燥させることを含む調製方法を提供する。半固体とは、固体を形成するように完全には乾燥されていない材料を意味する。乾燥は、例えば、液体媒体の蒸発によって、例えば、空気乾燥、減圧乾燥、または凍結乾燥によって行って、所望の材料を得てもよい。本発明はまた、この方法によって得られる、固体、または半固体の整形外科用材料を提供する。乾燥条件は、その中では組成物の粒子同士が多かれ少なかれ接近して互いに結合しているペースト材料によって形成される基質に、大きな影響を及ぼす。空気乾燥は、小孔を持つより密な材料をもたらし、そのため、比較的機械的強度の高い材料が得られる。凍結乾燥は、個々の多孔性キトサン粒子の間の基質の中に比較的大きな孔を導入するので、強度は低くなるが、屈曲性はより大きくなり、例えば、細胞や血管の内部増殖にとっては好適な材料を与える。凍結乾燥によってもたらされる孔は、約50μmから数ミリメートル（最大約1 cm）までの直径を持ち、空気乾燥によってもたらされる孔は、約50ないし約200μmの直径を持つ。特に、これによって、ペースト中の多孔性キトサン粒子の多孔性に加えて、所望の基質多孔性を実現できる可能性が生じるので、乾燥された材料の性質を、特定の用途に合わせて調整することが可能となる。
【００２９】
さらに、材料の性質は、製薬組成物に一般的に使用される添加物、例えば、防腐剤、潤滑剤、または可塑剤、例えば、グリセロールを加えることによって変化させることが可能である。グリセロールなどの可塑剤は、乾燥材料の屈曲性を増す傾向があるので、骨欠陥部の充填のために使用が可能な、柔軟で、展性の高いペーストを実現するのに使用してもよい。
【００３０】
これらの乾燥材料はさらに、加工あるいは造形してもよく、例えば、ねじ溝を切っても、穴を掘削しても、または削って砕片としてもよい。このペーストはまた、他の材料、例えば、ステンレススチールまたはチタンの表面に塗布して、粗い、半固形の、抗菌保護が得られるようにしてもよい。これらの性質の内のいくつかは図において見ることができる。
【００３１】
図１は、ねじがその中にねじ込まれている状態の、プレートの形の乾燥材料を示す。本プレートは、下記の実施例１に記載されるように、空気乾燥によって、少量のグリセロールを添加した組成物から調製された。プレートの高密度の微細構造も顕微鏡写真から見て取ることができる。
【００３２】
図２も空気乾燥材料を示す。成形バーは、その外表面にねじ溝を含む。
【００３３】
図３および４は、凍結乾燥材料を示す。凍結乾燥過程で水を除去することによってマクロ孔が得られる。水が去ると、3次元構造が後に残り、強度は低いがより多孔性の材料が得られる。
【００３４】
図５ａおよび５ｂは、下記の実施例4:8および4:9に記載されるように、異なるやり方で乾燥された同じ材料を示す。図５ａのプラグは、凍結乾燥されたもので、12mmの直径、13mmの長さを持つ。図５ｂのプラグは、空気乾燥されたもので、7mmの直径、13mmの長さを持つ。
【００３５】
キトサンを含む粒子は様々なやり方で製造することが可能である。一つは、キトサン液の蒸発後に得られる固形残留物の粉砕によるものである。もう一つは、多くのキトサン製造方法の産物であるキトサン線維またはキトサン砕片を粉砕することである。多孔性キトサン粒子およびビーズは、ポリフォスフェートのような架橋剤を用いることによって、または、界面活性剤を含む溶液から調製することが可能である。キトサン材料中に孔を形成するもう一つの方法は、孔形成剤を使用することである。一般に、孔形成剤とは、ある材料の形成中に、該材料に添加されると、ある特異的構造を与えるが、その後、洗浄等によって除去することが可能な分子である。典型的な孔形成剤は、オリゴサッカリド、低分子ポリエチレングリコール、グリセロール等である。
【００３６】
キトサン材料に大きな孔を導入するもう一つの方法は、孔形成剤としてシリカ粒子のような粒子を用いることである。シリカ粒子は、第２の工程において、アルカリ液による洗浄によって除去される。
【００３７】
驚くべきことに、孔形成剤として、例えば、無機塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、および塩化マグネシウム、もっとも好ましくは、塩化ナトリウム、または、高分子量（例えば、分子量が、少なくとも10 kD、好ましくは20 kD）のポリエチレングリコールを用いると、蒸発後の残留物は、脆く、従って容易に粉砕されることが見出された。理論によって縛られることを望むものではないが、これは「塩効果」によるものと考えられる。この孔形成剤含有キトサンペーストに、たとえ他の分子、例えば、他のグリコサミノグリカン（GAG）、増殖因子、タンパクなどをある程度加えたとしても、液体の蒸発後、材料は依然として粉砕が可能である。キトサンと孔形成剤の比は、所望の多孔性に応じて、1:1から1:10の範囲であってよく、より好ましくは1:2から1:5の範囲である。これは、従来既知の材料、例えば、前述のWO 01/46266およびMacromol. Biosci. 2004, 4, 811-819に開示されるものと対照的である。すなわち、後者の材料は、凝集してキトサンが化学的に分解されるほど加熱されてしまい易いので、粉砕が不可能である。
【００３８】
従って、本発明はまた、多孔性キトサン材料を調製するための製造方法を提供する。該方法は、キトサンおよび、キトサンに結晶性を誘発することが可能な孔形成剤を含む溶液を調製すること、溶液を乾燥して固体残留物とすること、および、固体残留物を粉砕して多孔性キトサン粒子を生成することを含む。本発明はまた、この方法によって得ることが可能な多孔性キトサン粒子を提供する。この粒子は、本発明の整形外科用組成物に取り込むのに特に好適な粒子である。
【００３９】
次に、孔形成剤は、例えば、孔形成剤を含む粒子をアルカリ性バッファーで中和し、その後徹底的に洗浄することによって除去することが可能である。最後に、乾燥することによって多孔性粒子が得られる。要すれば、これらの粒子は、例えば篩にかけるなどの方法によってさらに分画し、様々なサイズの粒子、または、特定の用途に対して所望のサイズを持つ粒子を得るようにしてもよい。
【００４０】
本発明の多孔性キトサン粒子の多孔度は、孔形成剤の量の増加と共に増す。これは、粒子を電子顕微鏡で観察し、粒子の全断面積に対する、孔の容量パーセントを分析することによって見て取ることができる。キトサン対塩化ナトリウムの比が1:1であると、孔容量の計算値は44.7%となる。キトサン対塩の比が1:2、1:3、1:4、1:5、および1:10の場合の同様の計算値は、それぞれ、62%, 71%, 78%, 80%, および89%の孔容量を与える。多孔性キトサン粒子の持つ孔容量は、少なくとも40%であることが好ましく、より好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも65%、もっとも好ましくは少なくとも70%であり、また、95%以下であって、より好ましくは90%以下、より好ましくは85%以下、およびもっとも好ましくは80%以下である。
【００４１】
キトサン粒子は、ある程度のキトサンは必ず含んでいなければならないが、キトサンの外に他の物質を含んでもよい。粒子は、少なくとも50%のキトサンを含むのが好ましく、50から90%のキトサンを含むことがより好ましい。粒子の残りは、キトサン誘導体、および／または、他の多糖、および／またはタンパクを含んでもよい。キトサン粒子は、他の粒状材料と組み合わせて使用されてもよく、例えば、所望の化合物、例えば、抗生物質、抗炎症または鎮痛物質の、緩徐な、または調節的放出を可能とする薬剤含有粒状物、または細胞増殖刺激分子、例えば、増殖因子、または、増殖因子を安定化することが知られる分子を含む粒子などが挙げられる。粉砕された材料を骨チップとして使用する場合、該材料は、異種移植骨チップと任意の比率で混合されてよい。生きた骨形成細胞すなわち骨芽細胞が骨チップに加えられても良い。本発明による製品は、異なるサイズ、異なる孔サイズ、異なる組成、および／または、異なるキトサン品質、例えばキトサンの異なる脱アセチル化度、を持つようなキトサン粒子を含んでもよい。次に、この粒子、または粒子混合物は、ゲルまたは溶液に、該溶液が、キトサンに関して過飽和状態となる濃度において加えられる。これは、たとえ溶液が酸性にされても、キトサンが、少なくともある程度は、粒状状態に留まることを意味する。粒子を酸性処理すると、キトサンの表面がプロトン化され、ゲル様で粘着性となる。
【００４２】
粒子の製造を意図してキトサン液を調製する場合、キトサンを、酸性環境、すなわち、7未満のpHで溶解してもよい。好ましい酸は、酢酸、塩酸、およびアルファ-ヒドロキシ酸、例えば、グリコール酸である。
【００４３】
粒子を前述の液体媒体と混ぜることによって、材料を、所望の性質および形態となるように特別あつらえで調製することが可能である。これは、異なるサイズおよび／または異なる多孔度を持つ複数の粒子を用いることによって達成される。材料の性質に影響を及ぼす他のパラメータとしては、前述したように、ペーストに加えられる粒子の濃度、ペーストの乾燥法がある。驚くべきことに、前述のパラメータを変えることによって、骨様の材料を生産することが可能であることが見出された。
【００４４】
生物学的活性分子、例えば、増殖因子刺激剤、抗菌剤、遺伝子断片、ビタミン、鎮痛剤等を、単独で、または混合物として、粒子、液体媒体、またはその両方を調製する際に添加してもよい。このような生物学的活性分子の例としては、例えば、組み換えヒト骨形成タンパク-2(rhBMP-2)や組み換えヒト骨形成タンパク-7（rhBMP-7）などの骨形成タンパク、線維芽細胞増殖因子（FGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、トランスフォーミング増殖因子-b、成長ホルモンおよびインスリン様増殖因子、ゲンタマイシン、リファンピン、フルクロキサシリン、バンコマイシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、ペニシリン、セファロスポリン、グリセオフルビン、バシトラシン、ポリミキシンB、アンフォテリシンB、エリスロマイシン、ネオマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、サリチル酸塩、イブプロフェン、ナプロキセン、モルヒネ、メペリジン、プロポキシフェン、ジクロフェナック、ジフルニカル、エトドラック、フェノプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラック、メクロフェナム酸塩、メテナム酸、エコパン、オキサプロエイン、スリンダック、トルメチン、ビタミンA、ビタミンB、ビタミンC、ビタミンD、ビタミンE、ビタミンK、がある。
【００４５】
本発明による材料にはまた生細胞を加えてもよい。このような細胞の例は、骨芽細胞および軟骨細胞である。
【００４６】
本発明による材料は、任意の要求に応えるように調整することが可能である。粒子の孔径を変えることによって、物理的性質を調整してもよい。大きい孔は、より柔軟で弾性に富む材料を与え、一方、小さい孔は、より硬い材料を与える。多孔性粒子の中に、生物学的活性分子を取り込むことによって、材料が分解するにつれてこれらの分子の徐放を可能とするようにしてもよい。孔径はさらに、骨および軟骨形成細胞の培養に好適な基質を生成するように変えてもよい。キトサンそれ自体が、骨芽細胞および軟骨細胞の増殖を刺激するので、至適孔径を持つ粒子を生産することによって、本発明による材料は、細胞培養にとって最適な足場となる。ゲルは、さらに別の、例えば、N-脱アセチル化の程度のより低いキトサンを含むようにして、そのために、ゲルの分解速度の方が、粒子の分解速度よりも高くなるようにされてもよい。このような材料は、最初は強いが、一定期間の後分解して、内部増殖細胞が容易に接近することが可能な粒子のみを残すことになる。
【００４７】
本発明による製品の一つの例は、前述の、キトサン粒子含有ペーストである。このものは、局所的用途のために広げて、乾燥、または実質的に乾燥させて、所望の形の塊りとすることが可能である。製品のもう一つの例は、乾燥工程によって得られる乾燥材料である。
【００４８】
本発明による乾燥材料は、水溶液中で膨潤するが、膨潤の程度は、例えば、使用するキトサン（単数または複数）の脱アセチル化の程度を変えることによって、様々な用途における要件に応じるように調整することが可能である。
【００４９】
従って、本発明の、固体または半固体整形外科用材料は、骨代用材料、骨セメント、および組織足場としての用途が見いだされる。この固体整形外科材料はまた、骨合成用材料、例えば、ねじ、ピン、プレート、ペグ、リベット、コッタ、スパイク、ボルト、スタッド、留め金、ボス、クランプ、クリップ、だぼ、杭、フック、アンカー、結び目、バンド、襞、楔、プラグ、釘、ワイヤー、リング、リング固定器、およびワッシャーを形成するように製造することが可能である。
【００５０】
本発明は、下記の実施例によって具体的に説明されるが、いかなる点においてもこれらの実施例によって限定されない。
【実施例】
【００５１】
実施例では、下記の材料が、別様に言明しない限り、使用された。すなわち：
Primex（ノルウェー）製のキトサンで、145 kDでN-脱アセチル化度85％のもの。N-脱アセチル化度が低いキトサンは、Sannan T, Kurita K, Iwamura Y.「キチン研究1」("Studies on Chitin, 1"), Die Makromoleculare Chemie 1975;0:1191-5 、Sannan T, Kuriata K, Iwamura Y.「キチン研究2」("Studies on Chitin, 2"), Die Makromol. Chem. 1976;0:3589-600、Guo X, Kikuch, Matahira Y, Sakai K, Ogawa K.「脱アセチル化度の低い水溶性キチン」("Water soluble Chitin of low degree of deacetylation"), Journal of Carbohydrate chemistry 2002;21:149-61、およびWO 03011912号公報の中に概略される原理に事実上従って調製された。ヒラルロン酸はPharmaciaから、グリセロールはFluka（ドイツ）から、NaClはMerckから、MgCl2はMerckから、HClはMerckから、水はmilliporeから。
【００５２】
〔実施例１〕
4 gのキトサン（N-脱アセチル化度が85%、分子量が145 kD）を、pHを希釈HClにて4.5に調整することによって133 gの水に溶解した。次に、このキトサン溶液に、12 gのNaClを50 gの水に溶解して得た水溶液を攪拌して加えた。次に、このゲル様スラリーを平坦なプラスチックの表面に広げ空気乾燥し、得られた脆い残留物をさらに粉砕して粒子(250μm)とした。次いで、粒子をアルカリ性バッファー中で中和し、水で十分に洗浄したところ、塩を含まない多孔性キトサン基質が得られた。乾燥後、この多孔性粒子0.3 gを、4%キトサン（N-脱アセチル化度が85%、145 kD）pH 4.5および0.4 gグリセロールから成るゲル(1.2 g)に加えた。このペーストを、室温で2分膨潤させ、プラスチック表面に広げ、プレート(20 x 20 x 2 mm)に成形した。40℃で乾燥後、強度が高い、やや屈曲性を有するプレートが得られた。
【００５３】
〔実施例２〕
3 gのキトサン（N-脱アセチル化度が50%、分子量が200 kD）を、pHを希釈HClにて4.5に調整することによって134 gの水に溶解した。次に、このキトサン溶液に、12 gのNaClおよび0.3 gのヒアルロン酸を含む50 gの水溶液を攪拌して加えた。次に、このゲル様スラリーを、平坦なプラスチックの表面に広げ空気乾燥し、粉砕して粒子(250μm)とした。次いで、粒子を中和し、水で洗浄し、乾燥し、粉砕して粒子とした。次に、この乾燥多孔性粒子0.3 gを、1.2 gの4%キトサン液／ゲル（N-脱アセチル化度が50%、200 kD）pH 4.5に加えてペーストを得た。このペーストを、室温で2分膨潤させ、ペーストをチューブ中に流し込んでロッド状とした。充填されたチューブを凍結乾燥し、その後チューブを除去することにより、キトサン／ヒアルロン酸複合体を含む、強度が高い多孔性ロッドが得られた。
【００５４】
〔実施例３〕
4 gのキトサン（N-脱アセチル化度が85%、分子量が145 kD）を、pHを希釈HClにて4.5に調整することによって133 gの水に溶解した。次に、このキトサン溶液に、20 gのMgCl2を43 gの水に溶解した水溶液を加えた。このゲル様スラリーを平坦なプラスチックの表面に広げて空気乾燥し、粉砕して粒子(1 mm)とした。この粒子／砕片をアルカリ性バッファーで中和し、水で洗浄し、乾燥した。次に、この乾燥多孔性粒子0.3 gを、1.0 gの4%キトサン液／ゲル（N-脱アセチル化度が85%、145 kD）pH 4.5に加え、十分に混ぜ合わせペーストとし、これを、室温で2分膨潤させた。膨潤後、ペーストを短いチューブ（φ= 5 mm, h = 10 mm）の中に流し込んでプラグ状とした。チューブを凍結乾燥し、その後チューブを除去することにより、強度が高いキトサンプラグが得られた。
【００５５】
その他の材料も、粒子のサイズや濃度、および乾燥手順を変動させた、同様の製造手順に従って製造された。
【００５６】
〔実施例４〕
＜キトサン粒子の調製＞
18.31 gのキトサン（N-脱アセチル化度が85%、分子量が145 kD）を、pHを希釈HClにて4.5に調整することによって570 gの水に溶解した。重量を、水にて600 gに調整した。  
54 gのNaClを171 gの水に溶解した。
【００５７】
〔実施例4:1〕
＜キトサン粒子の調製＞
上記キトサン液150 gを、上記NaCl液37.5 gに加え、さらに37.5 gの水を加えた。この混合物を、均一になるまで攪拌した。混合物を平坦なプラスチックの表面に広げ、空気乾燥した。得られた乾燥砕片を、250μmのリング状篩を備えたRetsch ZM 200ミルにて14000 rpmで粉砕した。この粒子を、1N NaOH液で中和し、水で洗浄(5 x 300 ml)し、空気乾燥した。
【００５８】
〔実施例4:2〕
＜キトサン粒子の調製＞
上記キトサン液450 gを、上記NaCl液168.8 gに加えた。この混合物を、均一になるまで攪拌した。混合物を平坦なプラスチックの表面に広げ、空気乾燥した。得られた乾燥砕片を、80, 120, および250μmのリング状篩をそれぞれ備えたRetsch ZM 200ミルにて、14000 rpmで粉砕した。これらの粒子を、1N NaOH液で中和し、水で洗浄し、空気乾燥した。
【００５９】
〔実施例4:3〕
＜キトサン粒子の調製＞
上記キトサン液150 gを、上記NaCl液75.0 gに加え、さらに37.5 gの水を加えた。この混合物を、均一になるまで攪拌した。混合物を平坦なプラスチックの表面に広げ、空気乾燥した。得られた乾燥砕片を、250μmのリング状篩を備えたRetsch ZM 200ミルにて14000 rpmで粉砕した。この粒子を、1N NaOH液で中和し、水で洗浄し、空気乾燥した。
【００６０】
〔実施例4:4〕
＜キトサンゲルの調製＞
21.0 gのキトサン（N-脱アセチル化度が85%、分子量が145 kD）を650 gの水に溶解した。pHを4N HClにて3.5に調整した。重量を700 gに調整し、3%キトサン液を得た。
【００６１】
〔実施例4:5〕
＜キトサンゲルの調製＞
25.0 gのキトサン（N-脱アセチル化度が85%、分子量が145 kD）を450 gの水に溶解した。pHを4N HClにて5.1に調整した。重量を500 gに調整し、5%キトサン液を得た。
【００６２】
〔実施例4:6〕
＜キトサンプラグの調製＞
実施例4:2の80μmのキトサン粒子3 gを、実施例4:5の5%キトサンゲル15 gと混合した。形成されたペーストを、直径13 mmの円筒形金型に入れ、このサンプルを空気乾燥または凍結乾燥し、固体材料を得た。この材料をさらに機械的に加工して、その典型的サイズが表２および３に示す通りのキトサンプラグを得た。
【００６３】
〔実施例4:7〜4:22〕
前述の方法に従って、キトサンプラグを表１に概略されるように調製した。
〔表１〕
2008523870.tif 000003
【００６４】
〔実施例５〕
実施例４に従って調製したキトサンプラグについて、破断点および圧縮係数を試験した。凍結乾燥および空気乾燥プラグの圧縮データおよび破断点は、1 mm/分の圧縮速度で動作する10 kNロードセルを備えたSintech 20 D装置にて測定した。プラグサイズは表に示す。凍結乾燥プラグのデータは、表２および図６ａに示し、空気乾燥プラグのデータは表３および図６ｂに示す。図６ａは、サンプル4:7の圧縮分析をグラフで示し、図６ｂは、サンプル4:6の圧縮分析をグラフで示す。グリセロールを含む凍結乾燥プラグおよび空気乾燥プラグは破断点を持たず、従って、圧縮係数のデータしか示されていない。
【００６５】
〔表２〕
2008523870.tif 000004
【００６６】
サンプル4:7から4:21は、キトサン粒子を全く含まないサンプル4:22に比べて、より高い圧縮係数を持つ。実際、本発明の乾燥材料で得られた圧縮係数は、多孔性キトサン粒子を含まないという点を除けば、全ての点で同一な乾燥材料で得られた圧縮係数より、少なくとも100%高い。
【００６７】
〔表３〕
2008523870.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、本発明の組成物を空気乾燥することによって形成される材料を示す。
【図２】図２は、本発明の組成物を空気乾燥することによって形成される材料を示す。
【図３】図３は、凍結乾燥された材料を示す。
【図４】図４は、凍結乾燥された材料を示す。
【図５】図５ａおよび５ｂは、(a)凍結乾燥、および(b)空気乾燥によって乾燥した同じ材料を示す。
【図６ａ】図６ａは、凍結乾燥された材料の圧縮データを示す。
【図６ｂ】図６ｂは、空気乾燥された材料の圧縮データを示す。
【図１】
2008523870.tif 000006
【図２】
2008523870.tif 000007
【図３】
2008523870.tif 000008
【図４】
2008523870.tif 000009
【図５ａ】
2008523870.tif 000010
【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
2008523870.tif 000013
【国際調査報告】
2008523870.tif 000014
2008523870.tif 000015
2008523870.tif 000016