(57)【要約】  本発明は、特にヘプシンによるプロＨＧＦ活性を制御することによって、ヘプシン活性及びＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路を調節するための方法及び組成物を提供する。
2008507295.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＧＦのヘプシン活性化を阻害する候補インヒビター物質の同定方法であって、(ａ)候補物質をヘプシンとプロＨＧＦ物質を含有する第一試料と反応させ、(ｂ)該試料中のプロＨＧＦ物質の活性量を、第一試料と同じ量のヘプシンとプロＨＧＦ物質を含有するが該候補物質と反応させていない対照試料中のプロＨＧＦ物質の活性量と比較し、対照試料中のプロＨＧＦ物質の活性量と比較して第一試料中のプロＨＧＦ物質の活性量が少ない場合に、該候補物質が短鎖ＨＧＦ(プロＨＧＦ)のヘプシン活性を阻害することができることを示す方法。
【請求項２】
前記試料中のヘプシンが前記プロＨＧＦを活性するために有効な量である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロＨＧＦが、Ｒ４９４-Ｖ４９５ペプチド連鎖の野生型を含有するＨＧＦ又はその断片を含んでなるポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
プロＨＧＦがプロテアーゼのコンセンサス切断部位に一致するヒトＨＧＦの切断部位を含んでなり、該切断部位が位置Ｐ１に塩基性残基と、位置Ｐ１'及びＰ２'に２つの疎水性アミノ酸残基を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ヘプシン及び肝細胞成長因子の相互作用を阻害するアンタゴニスト分子。
【請求項６】
前記分子が抗体又はその断片を含んでなる、請求項５に記載のアンタゴニスト分子。
【請求項７】
前記分子がｋｕｎｉｔｚドメイン１配列を含有するポリペプチドを含んでなる、請求項５に記載のアンタゴニスト分子。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国特許法規則１．５３(ｂ)(１)に基づき出願した非仮出願であり、米国特許法１１９条(ｅ)に基づき、２００４年７月２６日出願の米国特許仮出願番号６０／５９１３３９号の優先権を主張するものであり、その全体の開示が出典明記によりそのままここに組み込まれる。
【０００２】
（技術分野）
一般的に本発明は分子生検及び成長因子制御の分野に関する。より具体的には、本発明はＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路のモジュレータ、及び該モジュレータの使用に関する。
【０００３】
（背景）
ヘプシン(Hepsin)(別名ＴＭＲＰＲＳＳ１)は細胞表面発現型キモトリプシン様セリンプロテアーゼであり、マトリプターゼ(matriptase)(別名ＭＴ-ＳＰ１)およびエンテロペプチダーゼ(１)も含むタイプＩＩ膜貫通型セリンプロテアーゼ(ＴＴＳＰ)のファミリのメンバーである。第１９染色体のｑ１１-１３．２に位置する(２)ヒトヘプシン遺伝子は、スカベンジャーレセプターシステイン-豊富な(ＳＲＣＲ)、プロテアーゼドメインから成る細胞外ドメイン(Ａｒｇ４５-Ｌｅｕ４１７)、膜貫通領域及び短いＮ末端細胞質尾部を含んでなる４１７のアミノ酸ポリペプチド(３)をコードする。
ヘプシン酵素前駆体は、Ａｒｇ１６２-Ｉｌｅ１６３ (４)の切断によって、自己触媒的に活性化され、ＳＲＣＲドメインにジスルフィド結合されたプロテアーゼドメイン(Ｃｙｓ１５３-Ｃｙｓ２７７)によって、ヘテロ二量体の酵素を形成する。共有結合性Ｃｙｓ-Ｃｙｓ結合に加えて、ヘプシンの最近決定された結晶構造により、ＳＲＣＲとプロテアーゼドメインは、およそ１２００Å２を覆い隠す各々のドメインである広い作用領域を共有していることが明らかとなった(５)。この作用領域がＳＲＣＲドメインの膜貫通の近位残基の近くに位置するので、ヘプシンプロテアーゼドメインおよび活性部位は細胞表面の近くに位置しうる(５)。これは、活性部位が膜表面のはるか上流(６０−８０Å)に位置する、凝固因子VIIａ(FVIIａ)１、IXａ及びXａなどの他の細胞表面集積性セリンプロテアーゼと基本的に異なる(６-８)。
【０００４】
ヘプシンの生理機能は理解しがたいものであった。凝固因子VIIを除いて、高分子基質は知られておらず、生理的に関連するインヒビターは同定されなかった。血液凝固におけるヘプシンの役割はKazama 等 (1995) (９)により提唱され、ヘプシン形質移入細胞が凝固因子ＶＩＩを活性化できることが示された。しかしながら、ヘプシン欠陥マウスは生存可能であり、血液凝固障害を示さない(１０、１１)ことから、正常な止血におけるヘプシンの重要性に疑問が投じられた。しかしながら、血液凝固、組織因子(１３、１４)の一次イニシエータが存在しない病理学的状態、例えば腎臓細胞上皮癌(１２)において、ヘプシンがフィブリン形成に関与しうる可能性がある。さらに、他の研究では、ヘプシンと細胞性成長との機能的な関連を示唆している。腫瘍細胞株および使用する実験条件によって、ヘプシンは、成長促進活性(１５)又は成長抑制活性(１６)を有することが報告されている。なかでも、ヘプシンに関する付加的情報は、ＰＣＴ公開番号国際公報２００４／００９８０３、米国特許第６,４８２,６３０号、米国特許第６,４２３,５４３号、米国特許第５,９８１,８３０号、米特許出願公開番号２００４／０００９９１１Ａ１、米特許出願公開番号２００４／０００１８０１Ａ、米特許出願公開番号２００３／０２２３９７３Ａ１、米特許出願公開番号２００３／０１７５７３６Ａ１、米特許出願公開番号２００３／００１３０９７Ａ１(また、国際公報０２／０５９３７３)、米特許出願公開番号２００３／００４９６４５(また、国際公報０２／０６４８３９)、及び、米国特許出願公開番号２００４／０１３２１５６にみられる。
【０００５】
近年の遺伝子発現実験によって、前立腺癌において、最も上方制御される遺伝子の一つとしてヘプシンが同定された(１７−２２)。インサイツ染色法により、前立腺分泌腺の上皮細胞において、ヘプシン発現が示された(１９)。ヘプシンの発現は悪性形質転換と相関しており(１９)、進行した疾患患者の腫瘍において、最も高く、良性過形成において、最も低い(１８、２２)。対照的に、ヘプシンタンパク質の発現の低さはグリースンスコアの高さと大きな腫瘍に相関することが示された(２０)。この見かけの矛盾は用いられた方法、すなわち免疫組織化学(２０)とＲＮＡ定量化(１８、２２)に関連があるかどうかは明らかでない。さらにまた、ヘプシンは、主に上皮細胞型に関する卵巣がん(２３)及び、腎臓細胞上皮癌において、強く上方制御される(１２)。
【０００６】
上皮細胞表面では、ヘプシンは、典型的には、細胞外基質および他の膜関連タンパク質の成分と相互作用するように位置する。ヘプシンに構造的に関連があるＴＴＳＰマトリプターゼ(matriptase)(同義語ＭＴ-ＳＰ１)(２４、２５)を含む、キモトリプシン様セリンプロテアーゼは、線維素溶解酵素、基質メタロプロテアーゼ及び肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)などの成長因子の潜在型を活性化することが知られている。ＨＧＦは、レセプターチロシンキナーゼＭｅｔ((２６、２７)において、概説される)を活性化することによって、細胞増殖、移動、血管新生、生存および形態形成を促進する。正常な生理機能におけるその重要性に加えて、ＨＧＦ／Ｍｅｔ経路は、侵襲性腫瘍成長および腫瘍転移に関係している(２６)。ＨＧＦは、セリンプロテアーゼプラスミノーゲンに高い類似性があり、キモトリプシン様プロテアーゼに相同性を有するβ鎖及び４つのクリングルドメイン及びＮドメインを含有するα鎖からなる。それは、不活性な一本鎖前駆体(プロＨＧＦ)として細胞外基質に分泌され、Ａｒｇ４９４-Ｖａｌ４９５での活性化切断を要して、生物学的に適正なジスルフィド結合されたα／βヘテロ二量体を形成する(２８−３１)。この工程は、プロＨＧＦ転換セリンプロテアーゼ、例えば肝細胞増殖因子活性化因子(ＨＧＦＡ)(３２)、マトリプターゼ(３３、３４)、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子(ｕ-ＰＡ)(３５)、第ＸＩＩａ因子(３６)、第ＸＩａ因子および血漿カリクレイン(３４)により媒介される。ＨＧＦＡおよびマトリプターゼは、細胞表面発現型Ｋｕｎｉｔｚ型インヒビター、例えば２つの肝細胞増殖因子活性因子インヒビタースプライシング変異体ＨＡＩ-１(３７、３８)およびＨＡＩ-1Ｂ(３４)によって、及びＨＡＩ-２(３９)により阻害される。ＨＡＩ-２(別名胎盤ｂｉｋｕｎｉｎ)(４０)はまた、第ＸＩａ因子および血漿カリクレイン(４１)を強力に阻害するのに対して、ＨＡＩ-1Ｂはほとんどないしは全く阻害活性を有しない(３４)。したがって、細胞外基質のプロＨＧＦプールの生物学的有効性は、プロＨＧＦ転換酵素およびそのインヒビターの活性により制御される。
【０００７】
その機能不全が発癌の元となりうる他の成長因子のレギュレータとして機能する潜在能力とともに、上記の癌組織でのヘプシン発現の分布から、その物質とヘプシンとの相互作用の調節が効果的な治療的アプローチとなりうることが示唆される。この点に関して、ヘプシンの生理的基質及び／又はその生理的モジュレータ(一又は複数)を同定する必要性が明らかに存在する。本発明はこの必要性を果たして、他の利点を提供するものである。
特許出願および刊行物を含む、本願明細書中のすべての引例は出典明記によりその全体が組み込まれる。
【０００８】
（発明の開示）
本願明細書において、記述されるように、複数の癌において、非常に過剰発現する細胞-表面タンパク質であるヘプシンの生理的基質は、それ自体が癌発生の多くの態様において、重要な役割を果たすことが知られている肝細胞増殖因子である。ヘプシンは、強力な生理学的プロＨＧＦ転換酵素であるＨＧＦＡ(肝細胞増殖因子活性化因子)と同等の活性を有するプロＨＧＦを切断することが本明細書において、示されている。ヘプシンにより生成される２鎖(活性化型) ＨＧＦは、Ｍｅｔチロシンリン酸化の誘導、細胞増殖の刺激及び細胞移動の刺激などの正常な生物活性を表す。加えて、２つのクーニッツ(Kunitz)ドメインインヒビターであるＨＡＩ-１ＢおよびＨＡＩ-２は、ヘプシン酵素活性の生理学的調節因子として、本願明細書において、特定される。本発明は、これらの所見の少なくとも一部をベースとした、さらに詳細に後述される方法および組成物を提供する。ヘプシンおよびＨＧＦ及び／又はその生理学的インヒビターとの相互作用は固有のものであり、ＨＧＦ／Ｍｅｔ(「ｃ-ｍｅｔ」とも称される)経路の異常又は不必要なシグナル伝達と関係する病的状態に対する予防的方法及び／又は治療的方法を設定する際の重大な微調整のための有益な標的となりうることを示す。ゆえに、本発明は、ＨＧＦ活性化の調節に伴う生理学的相互作用分子の制御を介してＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ経路を制御できる物質を同定するための、及び該物質を使用するための方法、組成物、キット及び製造品を提供する。
【０００９】
したがって、一態様では、本発明は、ＨＧＦのヘプシン活性を阻害する候補インヒビター(すなわちアンタゴニスト)物質のスクリーニング(又は同定)方法であって、(ａ) 候補物質をヘプシンとプロＨＧＦ物質を含有する第一試料と反応させ、(ｂ) 該試料中のプロＨＧＦ物質の活性量を、第一試料と同じ量のヘプシンとプロＨＧＦ物質を含有するが該候補物質と反応させていない対照試料中のプロＨＧＦ物質の活性量と比較し、対照試料中のプロＨＧＦ物質の活性量と比較して第一試料中のプロＨＧＦ物質の活性量が少ない場合に、該候補物質が短鎖ＨＧＦ(プロＨＧＦ)のヘプシン活性を阻害できることを示す方法を提供する。一実施態様では、試料中のヘプシンは、前記プロＨＧＦを活性化するために有効な量である。プロＨＧＦ上のヘプシン切断部位の特徴を擬態する限り、これらの方法への使用に好適なプロＨＧＦ基質は多くの形態であってよい。プロＨＧＦ基質の例として、Ｒ４９４-Ｖ４９５ペプチド結合の野生型を含有する完全長一本鎖ＨＧＦ、およびこのペプチド結合を含有するＨＧＦの任意の断片が含まれるが、これに限定されるものではない。このような断片は任意の長さであり、例えば少なくとも(およそ)５、７、１０、１５、２０、２５アミノ酸の長さ、又は、両者間に、(およそ)４と２５、５と２０、７と１５アミノ酸の間の長さであってもよい。一般にそして好ましくは、プロＨＧＦ基質は、野生型ヘプシンにより切断されうるＲ４９４-Ｖ４９５ペプチド結合を含んでなる。一実施態様では、プロＨＧＦ基質は、プロテアーゼのコンセンサス切断部位に一致するヒトＨＧＦの切断部位を含んでなる(すなわち位置Ｐ１の塩基性残基と位置Ｐ１'およびＰ２'の２つの疎水性アミノ酸残基 ― Ｐ１Ｒ４９４、Ｐ１'Ｖ４９５、Ｐ２'Ｖ４９６)。
【００１０】
他の態様では、本発明は、ヘプシンによって、プロＨＧＦ活性化をブロックする物質のスクリーニング方法であって、(好ましくは、必然的ではないが、特異的に)ヘプシン又はプロＨＧＦに結合して、ヘプシンとプロＨＧＦとの特異的な相互作用をブロックする物質のスクリーニングを含む方法を提供する。いくつかの実施態様では、物質はＨＧＦへの結合についてヘプシンと競合する。いくつかの実施態様では、物質はヘプシンへの結合についてプロＨＧＦと競合する。一実施態様では、前記の物質は、少なくともおよそ６０％、７０％、８０％、９０％、９５％で、９９％の配列類似性又は(例えばヒトの)プロＨＧＦと同一性を有するアミノ酸配列を含有する、これらからなる、ないしはこれらから基本的になるもの、例えば、アミノ酸残基４９５(Ｖａｌ)に結合したアミノ酸残基４９４(Ａｒｇ)を含有するヒトＨＧＦの断片である。物質がそのようなアミノ酸配列を含有する、これらからなる、ないしはこれらから基本的になる実施態様では、断片は変異されるか、少なくとも一部のＨＧＦβ鎖を欠いて、該断片は野生型ＨＧＦと比較してｃ-ｍｅｔ活性化活性を減じている。
【００１１】
当業者に明らかであるように、上記したそれらと一致したスクリーニングアッセイはまた、候補調節物質の第一群を得るためにヘプシン-ＨＧＦ複合体形成の情報に基づくスクリーニングの第一工程の後、ＨＧＦの活性化及び／又はＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ経路を活性化できる形態へのＨＧＦの変換を調節するために候補調節物質の第一群の能力に基づくスクリーニングの第二工程を含んでもよい。適切な情報は、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路と関係する酵素‐基質複合体形成及び／又は生物学的活性の認識に基づいて、当業者に明らかな任意のものでよい。酵素‐基質複合体形成は、例えば、慣例的な生化学アッセイ(例えばゲル電気泳動、クロマトグラフィ、ＮＭＲなど)を使用して測定されてもよい。ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ生物学的活性には、Ｃ-ｍｅｔリン酸化、Ｃ-ｍｅｔキナーゼの基質である細胞性分子のリン酸化、細胞性成長(増殖、生存など)、血管新生、細胞移動、細胞形態形成などがあるが、これに限定されるものではない。
一態様では、本発明は、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路を崩壊させるＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔアンタゴニストを提供する。例えば、本発明は、プロＨＧＦのヘプシン切断(例えばＲ４９４-Ｖ４９５位置での切断)を阻害する分子を提供する。分子は、限定するものではないが、プロＨＧＦのヘプシン切断が阻害されるヘプシン又はプロＨＧＦ何れかへの結合、プロＨＧＦの切断が阻害されるヘプシン-プロＨＧＦ複合体への結合、および／またはヘプシンによるＨＧＦ切断の効果が阻害される(例えばヘプシンによる切断に続くＨＧＦの放出の阻害)プロＨＧＦ又はヘプシンへの結合など、任意の方法でその阻害性機能を発揮してもよい。一実施態様では、本発明のアンタゴニスト分子は、ｃ-ｍｅｔへのＨＧＦ結合を阻害しない。例えば、一実施態様では、アメリカ培養細胞系統保存機関寄託番号ＡＴＣＣ  ＨＢ-１１８９４(ハイブリドーマ１Ａ３.３.１３)又はＨＢ-１１８９５(ハイブリドーマ５Ｄ５.１１.６)の下に寄託されるハイブリドーマ細胞株により産生される抗体と、本発明のアンタゴニスト分子は同種の抑制性及び／又は結合能力を有する抗体又はその断片でない。一実施態様では、本発明のアンタゴニスト分子は、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ活性化と関係する生物学的活性を阻害する。
【００１２】
一態様では、本発明のアンタゴニストは、肝細胞成長因子インヒビター(ＨＡＩ-１、ＨＡＩ-１Ｂ、ＨＡＩ-２)がプロＨＧＦのヘプシン活性化の強力なインヒビターであるという本明細書中の発見に由来する。一実施態様では、本発明はヘプシンによるプロＨＧＦ活性化のアンタゴニストを提供するものであり、該アンタゴニストはヒトＨＡＩ-１、ＨＡＩ-1Ｂ又はＨＡＩ-２の少なくとも一部(全てを含む)を含んでなる。一実施態様では、前記部分は、ヘプシンによるプロＨＧＦ活性化を阻害することが可能なクーニッツ(Kunitz)ドメイン(ＫＤ)配列を含有する。一実施態様では、前記クーニッツドメイン配列は、ＨＡＩ-１又はＨＡＩ-１Ｂのクーニッツドメイン１(ＫＤ１)である。一実施態様では、本発明のアンタゴニストは、ヒトＨＡＩ-１の野生型ＫＤ１と少なくともおよそ７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する変異形ＫＤ1配列を含有し、該変異形配列はヒトプロＨＧＦのヘプシン切断を阻害する野生型ＫＤ1に少なくとも匹敵する能力を有する。一実施態様では、本発明のアンタゴニストは、ヒトＨＡＩ-１の野生型ＫＤ１とおよそ７０％から９９％の間、およそ７５％から９８％の間、およそ８０％から９７％、８５％から９５％の配列同一性を有する変異形ＫＤ１配列を含有するものであり、該配列はヒトプロＨＧＦのヘプシン切断を阻害する野生型ＫＤ1に少なくとも匹敵する能力を有する。一実施態様では、前記クーニッツドメイン配列は、ＨＡＩ-２のクーニッツドメインの一または両方である。一実施態様では、本発明のアンタゴニストは、野生型ヒトＨＡＩ-２の対応するクーニッツドメイン(一又は複数)と少なくともおよそ７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する変異形ＨＡＩ-２クーニッツドメイン配列を含有するものであり、該変異形配列はヒトプロＨＧＦのヘプシン切断を阻害する野生型ＨＡＩ-２に少なくとも匹敵する能力を有する。一実施態様では、本発明のアンタゴニストは、野生型ヒトＨＡＩ-２の対応するクーニッツドメイン(一又は複数)とおよそ７０％から９９％の間、およそ７５％から９８％の間、およそ８０％から９７％、８５％から９５％の配列同一性を有する変異形ＨＡＩ-２クーニッツドメイン配列を含有するものであり、該配列はヒトプロＨＧＦのヘプシン切断を阻害する野生型ＨＡＩ-２に少なくとも匹敵する能力を有する。
【００１３】
いくつかの実施態様では、本発明のアンタゴニストは、小分子、ペプチド、抗体、抗体断片、アプタマー又はそれらの組合せを含んでなる。本明細書中に記載のアンタゴニストは、本明細書に記載のようにヘプシン、肝細胞増殖因子インヒビターおよびプロＨＧＦの相互作用の発見に基づいて、当分野で公知の技術(以下に詳述するものも含む)を用いて慣例的に得ることができる。例えば、いくつかの実施態様では、本発明のアンタゴニストは、ＨＧＦへの結合についてヘプシンと競合するが、ヘプシン切断部位でプロＨＧＦを切断する能力を有しない。いくつかの実施態様では、本発明のアンタゴニストは、ヘプシンへの結合についてプロＨＧＦと競合する。例えば、一実施態様では、前記アンタゴニストは、プロＨＧＦ(例えばヒト)と少なくともおよそ６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％の配列類似性又は同一性を有するアミノ酸配列を含有するか、これらから成るか、又は基本的にこれらからなるものであり、実質的にヘプシンに結合できるが、ヘプシン切断部位(例えば野生型ヒトＨＧＦ  Ｒ４９４-Ｖ４９５ペプチド結合を含有するＰ１部位)を欠いている、及び／又はｃ-ｍｅｔを活性化する能力を欠いている(例えば、該ＨＧＦβ鎖は変異している、ＨＧＦβ鎖又はその一部などが欠けている)。一実施態様では、本発明のアンタゴニストは、ヘプシンに結合可能なＨＧＦ断片を含有するか、これらから成るか、又は基本的にこれらからなるものであり、該断片が野生型ＨＧＦと比較してｃ-ｍｅｔを活性化する活性を減弱するように、ＨＧＦβ鎖の少なくとも一部が欠けている。
【００１４】
ゆえに、本発明は、実質的にヘプシンに結合できるが野生型ＨＧＦと比較してＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ調節活性が減弱しているＨＧＦ突然変異体、例えばＨＧＦ生物学的活性(例えば細胞成長刺激活性)を有しているが減弱しているＨＧＦ変異体又はＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ活性のアンタゴニストを提供する。一実施態様では、本発明のアンタゴニストは、野生型(インビボ) ＨＧＦの生物活性(このような生物活性には、細胞増殖の刺激、細胞生存の促進、血管新生の促進、細胞移動の誘導／促進を含むが、これに限定されるものではない)を阻害することが可能である。一実施態様では、本発明のアンタゴニストは、減弱した細胞成長(細胞増殖、細胞生存、血管形成、細胞移動を含むがこれらに限定するものではない)促進活性を提供する。
いくつかの実施態様では、本発明のアンタゴニストは本明細書に記載の発明のスクリーニング方法又は同定方法によって、得られる。
一態様では、本発明のアンタゴニスト分子は、細胞障害性剤などの毒素に結合される。これらの分子／物質は、添加物／促進剤、例えば放射線及び／又は化学療法剤と組み合わせて製剤されるか、投与されてもよい。
【００１５】
一態様では、本発明はヘプシンによるプロＨＧＦ切断を亢進できる分子を提供する。該分子はヘプシンとのＨＡＩ-１、ＨＡＩ-１Ｂ及び／又はＨＡＩ-２相互作用を阻害できる。いくつかの実施態様では、本発明のエンハンサー分子は小分子、ペプチド、抗体、抗体断片、アプタマー又はそれらの組合せであるか、これらを含んでなる。例えば、本発明のエンハンサー分子は、ＨＡＩ-１、ＨＡＩ-１Ｂ及び／又はＨＡＩ-２の断片又はその変異体を含有するか、これらから成るか、又は基本的にこれらからなるものであり、該断片はヘプシンに結合できるが、プロＨＧＦのヘプシン切断を実質的に阻害しない。一実施態様では、前記分子は、野生型ＨＡＩ-１、ＨＡＩ-１Ｂ及び／又はＨＡＩ-２のヘプシンへの結合を競合して阻害できる。一実施態様では、本発明のエンハンサー分子は、ヘプシンおよびＨＡＩ-１、ＨＡＩ-１Ｂ及び／又はＨＡＩ-２を含有する複合体の形成を阻害する抗体である。一実施態様では、本発明のエンハンサー分子はヘプシン又はその変異体(後に定義されるものを含む)であり、ヘプシン又はその変異体はＲ４９４-Ｖ４９５部位でのプロＨＧＦ切断をもたらすことが可能である。
また、本発明は、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達中枢の調節不全と関係する疾患状態を調整するために有用な方法および組成物を提供する。ゆえに、一態様では、本発明は、被検体のｃ-ｍｅｔ活性化の調節方法であって、被検体に本発明のＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔモジュレータ分子(例えば、本願明細書において、記述されるような、プロＨＧＦのヘプシン切断を阻害するアンタゴニスト分子)が投与されることを含み、それによって、ｃ-ｍｅｔ活性化が調整される方法を提供する。一実施態様では、前記分子は、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ活性を阻害するＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔアンタゴニストである。一実施態様では、前記分子は、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ活性を増やすエンハンサー分子である。一態様では、本発明は、被検体のｃ-ｍｅｔの活性化に関する病的状態の治療方法であって、被検体に本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト(例えば本明細書に記載のヘプシンによるプロＨＧＦ切断の任意のアンタゴニスト)が投与されることを含み、それによって、ｃ-ｍｅｔ活性化が阻害される方法を提供する。
【００１６】
ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路は、細胞成長促進(例えば細胞増殖、細胞生存、細胞移動、細胞形態形成)および血管新生などの複数の生物学的及び生理的機能に関与する。ゆえに、他の態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔ活性化細胞成長(例えば増殖及び／又は生存)を阻害する方法であって、細胞又は組織と本発明のアンタゴニストとを反応させることを含み、それによって、ｃ-ｍｅｔ活性化と関係する細胞増殖が阻害される方法を提供する。さらに他の態様では、本発明は、血管新生野阻害方法であって、異常な血管新生と関係する病態を有する細胞、組織及び／又は被検体に本発明のアンタゴニストが投与されることを含み、それによって、血管新生が阻害される方法を提供する。さらに他の態様では、本発明は、血管新生を亢進する方法であって、血管新生の増加により利を得る症状及び／又は標準以下の量の血管新生に関係する症状を有する細胞、組織及び／又は被検体に本発明のエンハンサー分子が投与されることを含み、それによって、血管新生が亢進される方法を提供する。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫性(例えば自己免疫性)疾患及び／又は血管新生関連疾患などの疾患の治療的処置及び／又は予防的処置をするための医薬の製造における本発明のアンタゴニストの使用を提供する。アンタゴニストは、抗体、抗体断片、小分子(例えば有機分子)、ポリペプチド(例えばオリゴペプチド)、核酸(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は干渉ＲＮＡなどのオリゴヌクレオチド)、アプタマー、又はそれらの組合せを含む本願明細書に記述される任意の形態のものであってもよい。
【００１７】
一態様では、本発明は、創傷治癒(例えば、糖尿病、外傷、などと関係している損傷)などの疾患の治療的処置及び／又は予防的処置をするための医薬の製造における本発明のエンハンサー分子の使用を提供する。エンハンサー分子は、抗体、抗体断片、小分子(例えば有機分子)、ポリペプチド(例えばオリゴペプチド)、核酸(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は干渉ＲＮＡなどのオリゴヌクレオチド)、アプタマー、又はそれらの組合せを含む本願明細書に記述される任意の形態のものであってもよい。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫性(例えば自己免疫性)疾患及び／又は血管新生関連疾患(例えば創傷治癒)などの疾患の治療的処置及び／又は予防的処置をするための医薬の製造における本発明の核酸の使用を提供する。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫性(例えば自己免疫性)疾患及び／又は血管新生関連疾患(例えば創傷治癒)などの疾患の治療的処置及び／又は予防的処置をするための医薬の製造における本発明のベクターの使用を提供する。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫性(例えば自己免疫性)疾患及び／又は血管新生関連疾患(例えば創傷治癒)などの疾患の治療的処置及び／又は予防的処置をするための医薬の製造における本発明の宿主細胞の使用を提供する。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫性(例えば自己免疫性)疾患及び／又は血管新生関連疾患(創傷治癒)などの疾患の治療的処置及び／又は予防的処置をするための医薬の製造における本発明の製造品の使用を提供する。
【００１８】
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫性(例えば自己免疫性)疾患及び／又は血管新生関連疾患(創傷治癒)などの疾患の治療的処置及び／又は予防的処置をするための医薬の製造における本発明のキットの使用を提供する。
一態様では、本発明はｃ-ｍｅｔ活性化細胞増殖を阻害する方法であって、細胞又は組織と有効量の本発明のアンタゴニストとを反応させることを含み、それによって、ｃ-ｍｅｔ活性化に関係する細胞増殖が阻害される方法を提供する。
一態様では、本発明は被検体のｃ-ｍｅｔ活性化の調節不全に関与する病理的症状を治療する方法であって、被検体に有効量の本発明のアンタゴニストが投与されることを含み、それによって、該症状が治療される方法を提供する。
一態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又はその両方を発現する細胞の成長を阻害する方法であって、該細胞と本発明のアンタゴニストとを反応させ、それによって、該細胞の成長が阻害されることを含む方法を提供する。一実施態様では、前記細胞は、異なる細胞により発現されるＨＧＦと(例えば、パラ分泌を介して)反応する。
一態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又はその両方を発現する細胞を含有する癌性腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置する方法であって、該哺乳動物に有効量の本発明のアンタゴニストが投与されることを含み、それによって、該哺乳動物が有効に治療される方法を提供する。一実施態様では、前記細胞は、異なる細胞により発現されるＨＧＦと(例えば、パラ分泌を介して)反応する。
【００１９】
一態様では、本発明は、ヘプシン、ｃ-ｍｅｔ及び／又は肝細胞増殖因子の発現又はその活性の亢進が関与する細胞増殖性疾患を治療する又は予防する方法であって、そのような処置を必要とする被検体に有効量の本発明のアンタゴニストが投与されることを含み、それによって、該細胞増殖性疾患が有効に治療ないしは予防される方法を提供する。一実施態様では、前記増殖性疾患は癌である。
一態様では、本発明は、細胞の成長がヘプシン、ｃ-ｍｅｔ及び／又は肝細胞増殖因子の成長促進効果に少なくともある程度依存している細胞の成長を阻害する方法であって、該細胞と有効量の本発明のアンタゴニストとを反応させることを含み、それによって、該細胞の成長が阻害される方法を提供する。一実施態様では、前記細胞は、異なる細胞により発現されるＨＧＦと(例えば、パラ分泌を介して)反応する。
一態様では、本発明は、腫瘍の成長がヘプシン、ｃ-ｍｅｔ及び／又は肝細胞増殖因子の成長促進効果に少なくともある程度依存している哺乳動物の腫瘍を治療的に処置する方法であって、該細胞と有効量の本発明のアンタゴニストとを反応させることを含み、それによって、該腫瘍が有効に治療される方法を提供する。一実施態様では、前記細胞は、異なる細胞により発現されるＨＧＦと(例えば、パラ分泌を介して)反応する。
【００２０】
本発明の方法は、任意の好適な病理学的状態、例えばヘプシン及び／又はＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路の調節不全にかかわる細胞及び／又は組織に効果を示すために用いられうる。一実施態様では、本発明の方法で標的とされる細胞は癌細胞である。例えば、癌細胞は、乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、乳頭カルシノーマ細胞(例えば、甲状腺の癌細胞)、大腸癌細胞、膵臓癌細胞、卵巣癌細胞、頸部癌細胞、中枢神経系癌細胞、前立腺癌細胞、骨原性肉種細胞、腎臓カルシノーマ細胞、肝細胞癌細胞、膀胱癌細胞、胃カルシノーマ細胞、頭頸部扁平上皮癌細胞、メラノーマ細胞および白血病細胞からなる群から選択されるものでありうる。一実施態様では、本発明の方法で標的とされる細胞は過剰増殖性細胞及び／又は過形成細胞である。一実施態様では、本発明の方法で標的とされる細胞は形成異常細胞である。さらに他の実施態様では、本発明の方法で標的とされる細胞は転移性細胞である。
本発明の方法は、さらに後処理工程を含んでもよい。例えば、一実施態様では、方法は、標的とされる細胞及び／又は組織(例えば癌細胞)が放射線治療又は化学療法剤にさらされる工程を更に含む。
本願明細書において、記述されるように、ｃ-ｍｅｔ活性化は、その調節不全によって、数多くの病的状態が引き起こされる、重要な生物学的工程である。したがって、本発明の方法の一実施態様では、標的とされる細胞(例えば癌細胞)は、同じ組織起源の正常細胞と比較してｃ-ｍｅｔの活性が亢進されているものである。一実施態様では、本発明の方法によって、標的とされる細胞の死が引き起こされる。例えば、本発明のアンタゴニストと反応すると、細胞死となるｃ-ｍｅｔ経路を介するシグナルに対して細胞が不活性となりうる。
【００２１】
例えば、ＨＧＦ(ｃ-ｍｅｔの同系リガンド)及び／又はｃ-ｍｅｔ自体の過剰発現を含め、多くの細胞性変化からｃ-ｍｅｔ活性化の調節不全が生じうる。したがって、いくつかの実施態様では、本発明の方法は、ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又はその両方が同じ組織起源の正常細胞と比較して、前記細胞(例えば癌細胞)によって、より多く発現される細胞を標的とすることを含んでなる。ｃ-ｍｅｔ発現細胞は、様々な起源からのＨＧＦによって、すなわち自己分泌又はパラ分泌の方法で調節されうる。例えば、本発明の方法の一実施態様では、標的とされる細胞は、異なる細胞において、発現される肝細胞増殖因子と(例えば、パラ分泌効果を介して)反応する／結合する。前記異なる細胞は、同じ又は異なる組織起源のものであってもよい。一実施態様では、標的とされる細胞は、標的細胞自体により発現されるＨＧＦと(例えば、自己分泌効果／ループを介して)反応する／結合している。
一態様では、本発明は、被検体に本発明のエンハンサー分子を投与することを含んでなる方法を提供する。この方法により治療される症状には、被検体のＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ活性が関与する血管新生の異常／望ましくない低生理的レベルと関係する任意の病的状態が、含まれる。このような症状の例として、創傷治癒、心肥大、心筋梗塞、肢乏血、末梢性動脈系疾患などがあるが、これに限定されるものではない。一態様では、本発明は、本発明の一つ以上のアンタゴニスト又はエンハンサーと担体を含有する組成物を提供する。一実施態様では、担体は薬学的に受容可能である。
【００２２】
一態様では、本発明は、本発明のアンタゴニスト又はエンハンサー分子をコードする核酸を提供する。一実施態様では、本発明の核酸は、ポリペプチド(例えばオリゴペプチド)であるか、ないしはこれを含んでなるアンタゴニスト又はエンハンサー分子をコードする。一実施態様では、本発明の核酸は、抗体又はその断片であるか、ないしはこれを含んでなるアンタゴニスト又はエンハンサー分子をコードする。
一態様では、本発明は、本発明の核酸を含んでなるベクターを提供する。
一態様では、本発明は、本発明の核酸又はベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。ベクターは、例えば発現ベクターなどの組換えベクターなど任意の種類のものでよい。任意の様々な宿主細胞が用いられうる。一実施態様では、宿主細胞は原核細胞、例えば大腸菌である。一実施態様では、宿主細胞は、真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞などの哺乳類の細胞である。
一態様では、本発明は、本発明のアンタゴニスト又はエンハンサー分子の作製方法を提供する。例えば、本発明は、抗体(又はその断片)であるか、ないしは抗体(又はその断片)を含有するアンタゴニストの作製方法であって、該抗体(又はその断片)をコードする本発明の組み換えベクターを好適な宿主細胞で発現させ、該抗体を回収することを含む方法を提供する。他の例では、本発明は、ポリペプチド(例えばオリゴペプチド)であるか、ないしはポリペプチド(例えばオリゴペプチド)を含有するアンタゴニスト又はエンハンサー分子の作製方法であって、該ポリペプチド(例えばオリゴペプチド)をコードする本発明の組み換えベクターを好適な宿主細胞で発現させ、該ポリペプチド(例えばオリゴペプチド)を回収することを含む方法を提供する。
【００２３】
一態様では、本発明は、容器と、容器に具備される組成物を含んでなる製造品であって、該組成物が本発明の一つ以上のアンタゴニスト又はエンハンサー分子を含有するものである製造品を提供する。一実施態様では、組成物は本発明の核酸を含有する。一実施態様では、アンタゴニスト又はエンハンサー分子を含有してなる組成物は、いくつかの実施態様では、薬学的に受容可能である担体をさらに含有する。一実施態様では、本発明の製造品は、被検体に組成物(例えばアンタゴニスト又はエンハンサー分子)を投与するための指示書を更に含む。
一態様では、本発明は、本発明の一つ以上のアンタゴニスト又はエンハンサー分子を含有する組成物を具備する第一容器と、バッファを具備する第二容器を含むキットを提供する。一実施態様では、バッファは薬学的に受容可能である。一実施態様では、アンタゴニスト又はエンハンサー分子を含有する組成物は、いくつかの実施態様では、薬学的に受容可能である担体をさらに含有する。一実施態様では、キットは、被検体に組成物(例えばアンタゴニスト又はエンハンサー分子)を投与するための指示書を更に含む。
【００２４】
（発明の実施の形態）
本発明は、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路のモジュレータを含む方法、組成物、キット及び製造品、並びにそのモジュレータの使用方法を提供するものである。
これら方法、組成物、キット及び製造品の詳細は本明細書中に示される。
【００２５】
典型的技術
本発明の実施は、特に明記しない限り、当業者の技術範囲内の分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技術を使用して行う。このような技術は、例えば以下のような文献に完全に明記されている。「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, 第２版(Sambrookら, 1989)；「Oligonucleotide Synthesis」(M. J. Gait, 編, 1984)；「Animal Cell Culture」(R. I. Freshney, 編, 1987)；「Methods in Enzymology」(Academic Press, Inc.)；「Current Protocols in Molecular Biology」(F. M. Ausubelら, 編., 1987, and periodic updates)；「PCR: The Polymerase Chain Reaction」, (Mullisら, 編, 1994)；「A Practical Guide to Molecular Cloning」(Perbal Bernard V., 1988)；「Phage Display: A Laboratory Manual」(Barbas 等, 2001)。
【００２６】
定義
本明細書にて用いる「ヘプシン」なる用語は、天然配列のポリペプチド、天然配列のポリペプチドのポリペプチド変異体及びその断片、及び野生型ヘプシンと類似の様式でプロＨＧＦを切断することができるポリペプチド変異体(本明細書中でさらに定義される)を包含する。本明細書中で記載のヘプシンは、ヒト組織種類ないしは他の供給源などの様々な供給源から単離するか、組み換え法ないしは合成法によって調整されたものでもよい。また、「ヘプシン」、「ヘプシンポリペプチド」、「ヘプシン酵素」及び「ヘプシンタンパク質」なる用語は、本明細書中で記載のようなヘプシンポリペプチドの変異体を含む。
「天然配列ヘプシンポリペプチド」には、天然由来のヘプシンポリペプチドに対応する同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。一実施形態では、天然配列ヘプシンポリペプチドは、配列番号１（図７参照）のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、天然配列ヘプシンポリペプチドは、配列番号２（図８参照）のアミノ酸配列を含む。このような天然配列ヘプシンポリペプチドは、天然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生成することもできる。「天然配列ヘプシンポリペプチド」という用語には、特に、特定のヘプシンポリペプチドの天然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、天然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びそのポリペプチドの天然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。
【００２７】
「ヘプシンポリペプチド変異体」又はその変異体とは、ヘプシンポリペプチド、一般的には、ここに開示するような天然配列のヘプシンポリペプチド配列のいずれかと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するここで定義するような活性なヘプシンポリペプチドを意味する。このようなヘプシンポリペプチド変異体には、例えば、天然アミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたヘプシンポリペプチドが含まれる。通常、ヘプシンポリペプチド変異体は、ここに開示する天然配列ヘプシンポリペプチド配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有している。通常、ヘプシン変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、あるいは少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００アミノ酸長、又はそれ以上である。場合によっては、ヘプシン変異体ポリペプチドは、天然ヘプシンポリペプチド配列に比較して一つ以下の保存的アミノ酸置換、あるいは天然のヘプシンポリペプチド配列に比較して２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０以下の同類アミノ酸置換を有するにすぎない。
【００２８】
ペプチド又はポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、特定のペプチド又はポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、米国特許第６８２８１４６号に記載のような配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られる。
ここで使用される「ベクター」という用語は、それが結合している他の核酸を輸送することのできる核酸分子を意味するものである。一つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは付加的なＤＮＡセグメントが結合されうる円形の二重鎖ＤＮＡループを意味する。他の型のベクターはファージベクターである。他の型のベクターはウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムへ結合させうる。所定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内において自己複製することができる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターとエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、宿主ゲノムと共に複製する。更に、所定のベクターは、それらが作用可能に結合している遺伝子の発現を指令し得る。このようなベクターはここでは「組換え発現ベクター」（又は単に「組換えベクター」）と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形をとる。本明細書では、プラスミドが最も広く使用されているベクターの形態であるので、「プラスミド」と「ベクター」を相互交換可能に使用する場合が多い。
【００２９】
ここで交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体(アナログ)、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより、もしくは合成反応によりポリマー中に取り込み可能な任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前又は後になされ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは合成後に、例えば標識との結合により、さらに修飾されてもよい。他のタイプの修飾には、例えば「キャップ(caps)」、類似体との自然に生じたヌクレオチドの一又は複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結(例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等)及び荷電連結(ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等)を有するもの、ペンダント部分、例えばタンパク質(例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ply-L-リジン等)を含むもの、インターカレータ(intercalators)を有するもの(例えばアクリジン、ソラレン等)、キレート剤を含むもの(例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属等)、アルキル化剤を含むもの、修飾された連結を含むもの(例えばアルファアノマー核酸等)、並びにポリヌクレオチド(類)の未修飾形態が含まれる。さらに、糖類中に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えばホスホナート基、ホスファート基で置き換えられてもよく、標準的な保護基で保護されてもよく、又は付加的なヌクレオチドへのさらなる連結を調製するように活性化されてもよく、もしくは固体又は半固体支持体に結合していてもよい。５'及び３'末端のＯＨはホスホリル化可能であり、又は１〜２０の炭素原子を有するアミン又は有機キャップ基部分で置換することもできる。また他のヒドロキシルは標準的な保護基に誘導体化されてもよい。さらにポリヌクレオチドは当該分野で一般的に知られているリボース又はデオキシリボース糖類の類似形態のものをさらに含み、これらには例えば２'-Ｏ-メチル-、２'-Ｏ-アリル、２'-フルオロ又は２'-アジド-リボース、炭素環式糖の類似体、アルファ-アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース類又はリキソース類、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、及び非塩基性ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。一又は複数のホスホジエステル連結は代替の連結基で置き換えてもよい。これらの代替の連結基には、限定されるものではないが、ホスファートがＰ(Ｏ)Ｓ(「チオアート」)、Ｐ(Ｓ)Ｓ(「ジチオアート」)、「(Ｏ)ＮＲ２(「アミダート」)、Ｐ(Ｏ)Ｒ、Ｐ(Ｏ)ＯＲ'、ＣＯ又はＣＨ２(「ホルムアセタール」)と置き換えられた実施態様のものが含まれ、ここでそれぞれのＲ及びＲ'は独立して、Ｈ又は、エーテル(-Ｏ-)結合を含んでいてもよい置換もしくは未置換のアルキル(１-２０Ｃ)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケ��ル又はアラルジル(araldyl)である。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。先の記述は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含むここで引用される全てのポリヌクレオチドに適用される。
【００３０】
ここで使用される場合、「オリゴヌクレオチド」とは、短く、一般的に一本鎖であり、また必ずしもそうではないが、一般的に約２００未満のヌクレオチド長さの、一般的に合成のポリヌクレオチドを意味する。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」なる用語は、相互に排他的なものではない。ポリヌクレオチドについての上述した記載はオリゴヌクレオチドと等しく、十分に適用可能である。
本願明細書において用いられるように、「肝細胞増殖因子」又は「ＨＧＦ」なる用語は、特別に又は文脈上別途示されない限り、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達過程を生じる条件下においてこの経路を活性化しうる任意の（天然／天然に生じるもの又は合成のもののいずれにせよ）天然の又は変異形のＨＧＦポリペプチドを指す。「野生型ＨＧＦ」なる用語は、一般に、天然に生じるＨＧＦタンパク質のアミノ酸配列を含有してなるポリペプチドを指す。「野生型ＨＧＦ配列」なる用語は、一般に、天然に生じるＨＧＦにおいてみられるアミノ酸配列を指す。
「抗体」及び「免疫グロブリン」なる用語は互換性をもって広義な意味で使われ、モノクローナル抗体（例えば完全長又は無傷のモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、単価抗体、多価抗体、多特異性抗体（例えば所望の生物学的活性を示す限りの二重特異性抗体）及び本明細書で記載される抗体断片が含まれる。抗体はヒト、ヒト化及び／又は親和性成熟したものであり得る。
【００３１】
「抗体断片」は、無傷の抗体の部分のみを含有するものであり、該部分は完全な抗体中に存在する場合、その部分に通常伴う機能の少なくとも一、好ましくはほとんど又はすべてを保持する。一実施態様では、抗体断片は完全な抗体の抗原結合部位を含有しているために抗原への結合能を保持する。他の実施態様では、抗体断片、例えばＦｃ領域を含有するものは、ＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合などの、完全抗体に存在する場合のＦｃ領域に通常関する、少なくとも一の生物学的機能を保持する。一実施態様では、抗体断片は、完全な抗体に実質的に類似のインビボ半減期を有する一価抗体である。例えばそのような抗体断片は、該断片にインビボ安定性を与えることができるＦｃ配列を結合した抗原結合アームを含んでなる。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原に対している。さらに、典型的に異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
【００３２】
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種由来の抗体、あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同性があり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体、あるいは他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同である「キメラ」抗体、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りこのような抗体の断片を特に含む(米国特許第４８１６５６７号;及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984))。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト免疫グロブリンから得られた最小配列を含むキメラ抗体である。多くの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、状況に応じて免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。また、以下の概説文献及びここに挙げる引用文献も参照のこと：Vaswani及びHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)。
【００３３】
「ヒト抗体」は、ヒトにより生成される抗体のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を有するもの、及び／又は本明細書中に開示したヒト抗体をつくるためのいずれかの技術を使用して、つくられたものである。この定義におけるヒト抗体は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特別に除く。
「親和性成熟」抗体は、その1つ以上のCDRに1つ以上の変更を有する抗体であって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性を向上させる。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks他は、Bio/Technology, 10:779-783(1992年)において、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas他、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994)；Schier他、Gene, 169:147-155 (1995)；Yelton他、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)；Jackson他, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995)；およびHawkins他, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
【００３４】
「ブロッキング抗体」又は「アンタゴニスト」抗体は、結合する抗原の生物学的活性を阻害するか、減弱するものである。好適なブロッキング抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的にないしは完全に阻害する。
本明細書中で用いられる「アゴニスト抗体」は、対象のポリペプチドの機能的な活性の少なくとも一を擬態する抗体である。
「疾病」は、本発明の物質／分子又は方法を用いた治療によって利益を得る任意の症状である。これには、問題とする疾患に哺乳動物がかかりやすくなる病理学的症状を含む慢性及び急性の疾病又は疾患を含む。限定的なものではなく、ここで治療する疾患の例には、悪性及び良性の腫瘍；非白血病性及びリンパ球性悪性腫瘍；神経系、神経膠系、星状性、視床下部系及び他の腺性、マクロファージ性、上皮性、間質性及び胚盤胞性疾患；及び炎症性、免疫性及び他の血管形成性関連疾患が含まれる。
「細胞増殖性疾患」及び「増殖性疾患」なる用語は、異常な細胞増殖にある程度関連している疾患を意味する。一実施態様では、細胞増殖性疾患は癌である。
【００３５】
本明細書中の「腫瘍」とは、悪性か良性かにかかわらず、すべての腫瘍性細胞成長及び増殖と、すべての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。「癌」」「癌性」「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」なる用語は、本明細書に参照されるように相互に限定的なものでない。
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平細胞癌(squamous cell cancer)、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平癌腫(squamous carcinoma)、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸管癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝臓性癌、並びに様々な頭頸部の癌が含まれる。
【００３６】
ここで使用されるところの「治療」は、治療されている個体又は細胞の天然の過程を改変するための臨床的介入を意味し、予防のため又は臨床的病理の過程中に実施することができる。治療の望ましい効果には、疾病の発生又は再発の防止、症状の寛解、疾病の任意の直接的又は間接的病理的結果の低減、転移の防止、疾病の進行速度の低減、疾病状態の回復又は緩和、及び寛解又は改善された予後が含まれる。ある実施態様では、本発明の抗体は疾患又は疾病の進行を遅らせるために用いられる。
「有効量」とは所望の治療又は予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。
本発明の物質／分子の「治療的有効量」は、例えば個体の疾病ステージ、年齢、性別、及び個体の体重、並びに個体に所望の応答を誘発する物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの能力のような因子に従って変わりうる。また、治療的有効量は物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの任意の毒性又は有害な効果よりも治療的に恩恵のある効果が上回るものである。「予防的有効量」とは所望の予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。典型的には、予防的用量は疾患の初期ステージ又はその前の患者に用いるので、予防的有効量は治療的有効量よりも少ないであろう。
【００３７】
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体）、化学治療薬、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロランブシル、ダウノルビシン又はその他インターカレート剤、酵素及びその断片、例えば核溶解性酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、そして下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含むように意図されている。他の細胞障害性薬が下記に記載されている。殺腫瘍性剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
【００３８】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカナビノール（ドロナビノール、MARINOL（登録商標）；βラパチョーネ；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン（合成アナログトポテカン（HYCAMTIN（登録商標）、CPT-11（イリノテカン、CAMPTOSAR（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン(scopolectin)及び９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１（例えばAgnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186(1994)参照）；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)ドキソルビシン(モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィ��マイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシノイド(maytansinoid)類、例えばメイタンシン(maytansine)及びアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖複合体（JHS Natural Products, Eugene, OR）；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類(特にＴ-２毒素、ベラクリン(verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａ及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン（ELDISINE（登録商標）、FILDESIN（登録商標））；ダカーバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ａｒａ-Ｃ」）；チオテパ；タキソイド類、例えばＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）、ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭパクリタキセルのクレモフォー無添加アルブミン操作ナノ粒子製剤（American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois）、及びＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドキセタキセル（Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；ゲムシタビン(gemcitabine) （ＧＥＭＺＡＲ(登録商標)）；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナアナログ、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン（VELBAN（登録商標））；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン（ONCOVIN（登録��標））；オキサリプラチン；ロイコボビン(leucovovin)；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(登録商標)）；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸のようなレチノイド；カペシタビン(capecitabine)（XELODA（登録商標）；上述したもののいずれかの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体：並びに上記のうち２以上の組み合わせ、例えば、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニソロン併用療法の略称であるＣＨＯＰ、及び5-FU及びロイコボビン(leucovovin)とオキサリプラチン（ELOXATINTM）を組み合わせた治療法の略称であるFOLFOXが含まれる。
【００３９】
またこの定義に含まれるものには、癌の成長を助けるホルモンの作用を調節、低減、遮断又は阻害するように働き、多くの場合全身処置の形態で使用される抗ホルモン剤がある。それらはそれ自体がホルモンであってもよい。それらは例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節物質（ＳＥＲＭ）を含み、例えば、タモキシフェン（NOLVADEX(登録商標)タモキシフェンを含む）、EVISTA（登録商標）ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェン；抗プロゲステロン；エストロゲンレセプター下方調節剤（ERD）；卵巣を抑止又は停止させる機能がある作用剤、例えばLUPRON（登録商標）及びELIGARD（登録商標）酢酸ロイプロリド等の黄体形成ホルモン放出ホルモン（LHRH）アゴニスト、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン及びトリプテレリン(tripterelin)；その他抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド；並びに副腎のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４(５)-イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ(登録商標)酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ(登録商標)エキセメスタン、フォルメスタニー(formestanie)、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ(登録商標)ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ(登録商標)レトロゾール、及びＡＲＩＭＩＤＥＸ(登録商標)アナストロゾールである。加えて、このような化学療法剤の定義には、クロドロネート（例えばBONEFOS（登録商標）又はOSTAC（登録商標））、DIDROCAL（登録商標）エチドロン酸、NE-58095、ZOMETA（登録商標）ゾレドロン酸／ゾレドロネート、FOSAMAX（登録商標）アレンドロネート、AREDIA（登録商標）パミドロン酸、SKELID（登録商標）チルドロン酸、又はACTONEL（登録商標）リセドロン酸、並びにトロキサシタビン(troxacitabine)（１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に接着細胞の増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、及びＨ-Ｒａｓ、及び上皮成長因子レセプター（EGF-R）；THERATOPE（登録商標）ワクチン及び遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、及びＶＡＸＩＤ(登録商標)ワクチン；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ(登録商標)トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ(登録商標)ｒｍＲＨ；ラパチニブ（lapatinib ditosylate）（GW572016としても知られるErbB-2及びEGFR二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤）及び上記のもののいずれかの製薬的に許容される塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００４０】
ここで用いられる際の「成長阻害剤」は、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ活性化に依存する細胞の成長をインビトロ又はインビボの何れかで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、成長阻害剤は、Ｓ期でＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ依存性の細胞の割合を有意に減少させるものである。成長阻害剤の例は、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン類、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。タキサン類（パクリタキセル及びドセタキセル）は、共にイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（TAXOTERE（登録商標）、ローン・プーラン ローラー）は、パクリタキセル（TAXOL（登録商標）、ブリストル-マイヤー スクウィブ）の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸分裂を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化にする。
「ドキソルビシン」はアントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの完全な化学名は、(８Ｓ-シス)-１０-[(３-アミノ-２，３，６-トリデオキシ-α-Ｌ-リキソ-ヘキサピラノシル)オキシ]-７，８，９，１０-テトラヒドロ-６，８，１１-トリヒドロキシ-８-(ヒドロキシアセチル)-１-メトキシ-５，１２-ナフタセンジオンである。
【００４１】
ＩＩ．本発明の組成物及び方法
Ａ．抗体
一実施形態では、本発明は、ここで治療及び／又は診断薬としての用途が見出され得る抗体を提供する。例示的な抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。
１．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射することにより、動物に産生される。それは、免疫化されるべき種において免疫原性であるタンパク質へ、関連する抗原（特に、合成ペプチドが用いられる場合）を結合させるために有用である。例えば、この抗原を、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターへ、二重官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する抱合)、グルタルアルデヒド、及び無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲ及びＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを用いて結合させることができる。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ（それぞれウサギ又はマウスの場合）を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。コンジュゲートはまた、タンパク融合として組換え細胞培養中で調製することができる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【００４２】
２．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作成することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。免疫化の後、リンパ球を単離し、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞（融合のパートナーとも呼ばれる）の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
【００４３】
好ましい融合のパートナーである骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支援し、融合しない親細胞に対して選択する選択培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫ライン、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡより入手し得るＭＯＰＣ-２１およびＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及び、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニア、ＵＳＡより入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されるものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている（Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁、(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
【００４４】
例えば、モノクローナル抗体の結合親和性は、Munson等, Anal. Biochem., 107:220(1980)のスキャッチャード分析によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、そのクローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地は、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地を包含する。また、このハイブリドーマ細胞は、動物の腹水症腫瘍として、例えばマウスへの細胞の腹腔内注射によって、インビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばアフィニティークロマトグラフィー（例えばプロテインＡ又はプロテインＧ-セファロースを用いる）又はイオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析等のような常套的な抗体精製法によって、培地、腹水、又は血清から上手く分離される。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に分離されて、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外では抗体タンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌での組み換え発現に関する概説論文には、Skerra等, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPluckthun, Immunol. Revs. 130: 151-188(1992)が含まれる。
【００４５】
更なる実施形態では、抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリーから分離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリーを使用したマウス及びヒト抗体の分離を記述している。続く刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生成(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783[1992])、並びに非常に大きなファージライブラリーを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266[1993])を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
抗体をコードするＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン（ＣＨ及びＣＬ）の配列を、相同的マウス配列に代えて置換することによって(米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison等, Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチド（異種ポリペプチド）のコード配列の全部又は一部を共有結合させることによって修飾してキメラ又は融合抗体ポリペプチドを生成することができる。非免疫グロブリンポリペプチド配列は、抗体の定常ドメインと置き代わることができるか、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインが置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【００４６】
３．ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的にウィンター(Winter)及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４，８１６，５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【００４７】
抗体がヒトの治療用途を意図している場合、抗原性及びＨＡＭＡ反応(ヒト抗-マウス抗体)を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方のヒト可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒトＶドメイン配列を同定し、その中のヒトフレームワーク（ＦＲ）をヒト化抗体のために受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623(1993))。
更に、抗体を、抗原に対する高結合親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【００４８】
ヒト化抗体の種々の形態が考えられる。例えばヒト化抗体は、免疫結合体を生成するために、状況に応じて一又は複数の細胞傷害剤(類)と結合していてもよい抗体断片、例えばＦａｂであってもよい。また、ヒト化抗体は無傷抗体、例えば無傷ＩｇＧ１抗体であってもよい。
ヒト化の別法として、ヒト抗体を生成することができる。例えば、現在では、免疫化することで、内因性免疫グロブリンの産生がなく、ヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子のホモ接合体欠失によって、結果として内因性抗体産生の完全な阻害が起こることが説明されてきた。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列の、このような生殖細胞系突然変異体マウスへの転移によって、結果として抗原投与時にヒト抗体の産生がおこる。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993); Bruggeman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０６号、同５５６９８２５号、同５５９１６６９号（全てジェンファーム(GenPharm)）；同５５４５８０７号；及び国際公開第９７／１７８５２号を参照されたい。
【００４９】
別法として、ファージディスプレイ技術(McCafferty等, Nature 348：552-553[1990])を使用して、非免疫化ドナーの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させることができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、フレーム単位で、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄの大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子のどちらかでクローンし、ファージ粒子の表面で機能的抗体断片として表示させる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択に基づいても、結果としてこれらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択が成される。よって、このファージはＢ細胞のいくつかの特性を模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照せよ。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージディスプレイのために使用できる。Clackson等, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化したマウス脾臓由来のＶ遺伝子の小さいランダムなコンビナトリアルライブラリーから、多様で多くの抗-オキサゾロン抗体を単離した。非免疫化ヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーが構成可能であり、多様で多くの抗原(自己抗原を含む)に対する抗体は、Marks等, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術にそのまま従うことで単離することができる。また、米国特許第５５６５３３２号及び同５５７３９０５号を参照のこと。
上述したように、ヒト抗体はインビトロで活性化したＢ細胞により産生することができる(米国特許第５５６７６１０号及び同５２２９２７５号)。
【００５０】
４．抗体断片
ある状況下では、抗体全体よりも、抗体断片を用いることに利点がある。より小さな大きさの断片によって迅速なクリアランスが可能となり、固形腫瘍への接近の改良につながり得る。
抗体断片を産生するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化によって誘導された(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接産生することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片は、すべて大腸菌で発現させ分泌させることができ、従って、大量のこれら断片の産生が容易となった。抗体断片は、上で論じた抗体ファージライブラリーから単離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。インビボ半減期が増した、サルベージレセプター結合性エピトープ残基を含むＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２が、米国特許第５８６９０４６号に記載されている。抗体断片を生成するのための他の方法は、当業者には明らかであろう。他の実施形態では、選択する抗体は一本鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)である。国際公開９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域を欠く無傷の連結部位を有する唯一の種である；従って、インビボで使用している間の減少した非特異的結合に適している。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ又はカルボキシ末端のどちらかで、エフェクタータンパク質の融合体が生成されるように構成されてもよい。上掲のAntibody Engineering, Borrebaeck編を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。そのような直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってもよい。
【００５１】
５．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、本明細書に記載のヘプシン、ＨＧＦ及び／又はヘプシン：ＨＧＦ複合体の２つの異なるエピトープに結合しうる。他のこのような抗体では他のポリペプチドに対する結合部位とそのものの結合部位とが結合しうる。あるいは、抗体は、ヘプシン及び／又はＨＧＦを発現する細胞及び／又はヘプシン及び／又はＨＧＦに結合する細胞に細胞防御メカニズムを集中させ局在させるように、ＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)及びＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃγＲ)に対するＦｃレセプター、又はＴ細胞レセプター分子(例えばＣＤ３)等の白血球上のトリガー分子に結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体はヘプシン、ＨＧＦ及び／又はヘプシン：ＨＧＦ複合体を発現する及び／又はヘプシン、ＨＧＦ及び／又はヘプシン：ＨＧＦ複合体に結合する細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はポリペプチド結合アーム及び細胞障害剤(例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
国際公開第９６／１６６７３号には、二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／抗-ＦｃγＲＩＩＩ抗体が記載されており、米国特許第５８３７２３４号には、二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／抗-ＦｃγＲＩ抗体が開示されている。二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体は国際公開第９８／０２４６３号に示されている。米国特許第５８２１３３７号は、二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／抗-ＣＤ３抗体を教示するものである。
【００５２】
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker等、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原-抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＩｇ重鎖定常ドメインである。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、組立に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が所望の二重特異性抗体の最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が所望の鎖の結合にあまり影響がないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【００５３】
この手法の好ましい実施形態では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology,１−７:210 (1986)を参照されたい。
米国特許第５７３１１６８号に記載された他の手法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面はＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【００５４】
二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロコンジュゲート」抗体もまた含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方はアビジンに結合され、他方はビオチンに結合され得る。そのような抗体は、例えば、不要の細胞に対する免疫系細胞をターゲティングするため(米国特許第４６７６９８０号）、及びＨＩＶ感染の治療のために提案された（国際公開第９１／００３６０号、同９２／２００３７３号、及び欧州特許第０３０８９号)。ヘテロコンジュゲート抗体は、あらゆる簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当該分野において良く知られており、幾つかの架橋技術と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に変換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再変換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【００５５】
最近の進歩により、大腸菌からのＦａｂ'-ＳＨ断片の直接の回収が容易になり、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞、及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生成されている。Kostelny等, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生成に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーによりＶＬにＶＨを結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、よって２つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
【００５６】
６．ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第４６７６９８０号］及びＨＩＶ感染の治療のために［国際公開第９１／００３６０；国際公開第９２／２００３７３；欧州特許第０３０８９号］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することによって、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチルイミダート、及び例えば米国特許第４６７６９８０号に開示されたものが含まれる。
【００５７】
７．多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び／又は異化)されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は３ないし８、好ましくは４の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖(好ましくは２つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はＶＤ１-(Ｘ１)ｎ-ＶＤ２-(Ｘ２)ｎ-Ｆｃを有し、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の一つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は：ＶＨ-ＣＨ１-柔軟なリンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも２つ(好ましくは４つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約２〜約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはＣＬドメインを更に有する。
【００５８】
８．エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば抗体の抗原-依存細胞媒介細胞障害性（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存細胞障害性（ＣＤＣ）を向上させることは望ましい。これは、抗体のＦｃ領域で一又は複数のアミノ酸置換を誘導することによりなされうる。あるいは又はさらに、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上したインターナリゼーション能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存細胞性細胞障害性（ＡＤＣＣ）を有する可能性がある。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes,  B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolff等, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。抗体の血清半減期を増大させるために、例えば米国特許第５７３９２７７号に記載のように、抗体(特に抗体断片)へサルベージレセプター結合エピトープを導入してもよい。ここで使用される場合の「サルベージレセプター結合エピトープ」なる用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加させる原因であるＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを意味する。
【００５９】
９．免疫コンジュゲート
また、本発明は、化学治療薬、薬剤、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片）などの細胞障害性剤、あるいは放射性同位体（即ち、放射性コンジュゲート）と抱合している抗体を含む免疫コンジュゲート、又は抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）に関する。
細胞障害性又は細胞分裂停止性の薬剤、すなわち癌治療における腫瘍細胞を殺す又は阻害するための薬剤の局部運搬に抗体−薬剤コンジュゲートを用いると(Syrigos及びEpenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172；米国特許第4,975,278号)、論理的に腫瘍への薬剤成分の標的とする運搬とそこでの細胞内集積が可能となるものであり、この非コンジュゲート薬物作用剤の全身性投与により正常細胞並びに除去しようとする腫瘍細胞への毒性が容認できないレベルとなりうる(Baldwinら., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,」 in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pincheraら. (ed.s), pp. 475-506)。これによって、最小限の毒性で最大限の効果を求める。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体はこの方策に有用であるとして報告されている(Rowlandら., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87)。この方法に用いる薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキサート及びビンデジンが含まれる(Rowlandら., (1986)、上掲)。抗体−毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、ゲルダナマイシン(Mandlerら(2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581；Mandlerら(2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028；Mandlerら(2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、メイタンシノイド(EP 1391213；Liuら., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)、及びカリケアマイシン(Lodeら (1998) Cancer Res. 58:2928；Hinmanら (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)などのリシン、小分子毒素などの植物毒が含まれる。該毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合又はトポイソメラーゼ阻害を含む機能によりその細胞障害性及び細胞分裂停止性の効果に影響しうる。ある種の細胞障害性剤は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした場合に、不活性又は活性が低減する傾向がある。
【００６０】
ゼバリン(ZEVALIN)（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン(ibritumomab tiuxetan), Biogen/Idec）は正常及び悪性のＢリンパ球の細胞表面上にみられるＣＤ２０抗原に対するマウスＩｇＧ１κモノクローナル抗体と111In又は90Y放射性同位体とがチオウレアリンカーキレート剤にて結合した抗体−放射性同位体コンジュゲートである(Wisemanら (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77；Wisemanら (2002) Blood 99(12):4336-42；Witzigら (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63；Witzigら (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69)。ゼバリンはＢ細胞非ホジキン性リンパ球（ＮＨＬ）に対して活性を有するが、投与によってほとんどの患者に重症で長期の血球減少を引き起こす。カリケアマイシンに連結したｈｕＣＤ３３抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるマイロターグ(MYLOTARG)（登録商標）（ゲムツズマブオゾガミシン(gemtuzumab ozogamicin), Wyeth Pharmaceuticals）は、急性骨髄性白血病の治療用注射剤として２０００年に認可された(Drugs of the Future (2000) 25(7):686；米国特許第4970198号；同第5079233号；同第5585089号；同第5606040号；同第5693762号；同第5739116号；同第5767285号；同第5773001号)。ジスルフィドリンカーＳＰＰを介してメイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結しているｈｕＣ２４２抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるカンツズマブメルタンシン(Cantuzumab mertansine)(Immunogen, Inc.)は、ＣａｎＡｇを発現する癌、例として大腸、膵臓、胃などの治療用に第ＩＩ相試験へと進んでいる。メイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結している抗前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）モノクローナル抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるＭＬＮ−２７０４(Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.)は、前立腺癌の潜在的治療の開発段階にある。アウリスタチン(auristatin)ペプチド、アウリスタチンＥ（ＡＥ）及びモノメチルアウリスタチン（ＭＭＡＥ）、ドラスタチン(dolastatin)の合成類似体は、キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６（癌細胞上のルイスＹに特異的）及びｃＡＣ１０（血液系悪性腫瘍上のＣＤ３０に特異的）(Doroninaら (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784)にコンジュゲートしており、治療的開発段階にある。
【００６１】
このような免疫コンジュゲート（免疫コンジュゲート）の生成に有用な化学治療薬を上に記載した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（PAPI、PAPII、及びPAP-S）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。抗体及び細胞障害性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ-ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。国際公開９４／１１０２６参照。
抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、トリコセン(trichothene)及びＣＣ１０６５、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体が、ここで考察される。
【００６２】
メイタンシン及びメイタンシノイド
一実施態様では、本発明の抗体(完全長又は断片)は一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４１３７２３０号；同４２４８８７０号；同４２５６７４６号；同４２６０６０８号；同４２６５８１４号；同４２９４７５７号；同４３０７０１６号；同４３０８２６８号；同４３０８２６９号；同４３０９４２８号；同４３１３９４６号；同４３１５９２９号；同４３１７８２１号；同４３２２３４８号；同４３３１５９８号；同４３６１６５０号；同４３６４８６６号；同４４２４２１９号；同４４５０２５４号；同４３６２６６３号；及び同４３７１５３３号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。
【００６３】
メイタンシノイド-抗体コンジュゲート
治療指標を改善する試みにおいて、メイタンシン及びメイタンシノイドは、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体と結合している。メイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第５，２０８，０２０号、同５，４１６，０６４号、欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞障害性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ.１に結合している免疫コンジュゲートが記載されている。ＴＡ.１-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞障害性はヒト乳癌株化細胞ＳＫ-ＢＲ-３におけるインビトロで試験され、細胞当たり３×１０５ＨＥＲ-２表面抗原が発現した。薬剤コンジュゲートにより、遊離のメイタンシノイド剤に類似した細胞障害度が達成され、該細胞障害度は、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることにより増加する。Ａ７-メイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいては低い全身性細胞障害性を示した。
【００６４】
抗体-メイタンシノイドコンジュゲート(免疫コンジュゲート)
抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に抗体を化学的に結合させることにより調製される。１分子の毒素／抗体は、裸抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３-４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５２０８０２０号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
例えば、米国特許第５２０８０２０号又は欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号、及びChari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)に開示されているもの等を含む、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。
【００６５】
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合により提供されるＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)及びＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。好ましい実施形態において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。
【００６６】
カリケアマイシン
対象の他の免疫コンジュゲートには、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した抗体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
【００６７】
他の細胞障害剤
本発明の抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５-フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同５７７０７１０号に記載されており、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第５８７７２９６号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ)との間に形成される免疫コンジュゲートをさらに考察する。
【００６８】
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗体を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが検出に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、mriとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
【００６９】
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号)。
本発明の化合物は、限定するものではないが、架橋剤：市販されている(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、及びスルホ-SMPB、及びSVSB (succinimidyl-(4-ビニルスルホン)安息香酸塩)にて調製したＡＤＣが特に考えられる。2003-2004 Applications Handbook and Catalogの４６７−４９８頁を参照。
【００７０】
抗体薬剤コンジュゲートの調製
本発明の抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）において、抗体（Ａｂ）を、リンカー（Ｌ）を介して、一つ以上の薬剤部分（Ｄ）、例えば抗体につき約１〜約２０の薬剤部分にコンジュゲートする。式ＩのＡＤＣはいくつかの手段、当業者に公知の有機化学反応、状態および試薬を用いて調製されうる：(１)共有結合の後に薬剤部分Ｄと反応してＡｂ-Ｌを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた抗体の求核基の反応；及び(２)共有結合の後に抗体の求核基と反応してＤ-Ｌを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた薬剤部分の求核基の反応、が含まれる。
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ            Ｉ
抗体上の求核基には、限定するものでなく、以下のものを含む：（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリシン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、および（ｉｖ）抗体がグリコシル化される糖水酸基又はアミノ基。アミン、チオールおよび水酸基は、求核であり、反応して、リンカー部分上の求電子性の群およびリンカー試薬により共有結合を形成することができる：（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸および酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキルおよびベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド群、が含まれる。特定の抗体は、還元しうる鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、還元剤、例えばＤＴＴ（ジチオトレイトール）による処置によって、リンカー試薬を用いたコンジュゲート反応を行ってもよい。ゆえに、各々のシステイン架橋は、理論的には、２の反応性のチオール求核基を形成する。チオールにアミンを転換させる２-イミノチオラン（トラウトの試薬）を用いてリシンを反応させることによって抗体に付加的な求核基を導入することができる。
【００７１】
また、本発明の抗体薬剤コンジュゲートは、抗体を修飾して求電子性の部分を導入する（リンカー試薬又は薬剤上の求核置換基を用いて反応させることができる）ことによって生成してもよい。グリコシル化された抗体の糖質を、例えば過ヨウ素酸塩酸化剤を用いて酸化して、リンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応するアルデヒド又はケトン基を形成させてもよい。生じたイミンシッフ塩基群が安定結合を形成するか、又は例えば安定アミン結合を形成させるホウ化水素試薬によって、還元してもよい。一実施態様では、ガラクトースオキシダーゼ又はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩の何れかによるグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により、薬剤(Hermanson, Bioconjugate Techniques)上の適当な基と反応することができるタンパク質のカルボニル（アルデヒドおよびケトン）基が生じうる。他の実施態様では、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含んでいるタンパク質はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩と反応して、第一のアミノ酸の代わりにアルデヒドを生成する(Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146；US 5362852)。このようなアルデヒドは、薬剤部分又はリンカー求核基と反応することができる。
同様に、薬剤部分上の求核基には、限定するものではないが、以下のものを含む：反応して、リンカー部分およびリンカー試薬上の求電子性の基と共有結合することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸エステルおよびアリールヒドラジド基：(ｉ)活性エステル（例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸および酸ハロゲン化物）；(ｉｉ)アルキルおよびベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；(ｉｉｉ)アルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド基、が含まれる。
【００７２】
別法として、抗体及び細胞障害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から非結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【００７３】
１０．免疫リポソーム
ここで開示されている抗体は、免疫リポソームとして処方することもできる。「リポソーム」は、哺乳動物への薬物輸送に有用な、脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤を含む種々のタイプの小胞体である。リポソームの成分は、通常は生物膜の脂質配向に類似した２層構造に配列される。抗体を含有するリポソームは、例えばEpstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688(1985)；Hwang等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030(1980)；及び米国特許第４４８５０４５号及び同４５４４５４５号；及び１９９７年１０月２３日に公開の国際公開９７／３８７３１に記載されているように、当該分野において既知の方法により調製される。循環時間が増したリポソームは米国特許第５０１３５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含有する脂質組成物を用いた逆相蒸発法により作製することができる。リポソームは孔径が定められたフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ'断片は、ジスルフィド交換反応を介して、Martin等, J. Biol. Chem. 257:286-288(1982)に記載されているようにしてリポソームにコンジュゲートすることができる。場合によっては、化学療法剤はリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19)1484(1989)を参照されたい。
【００７４】
Ｂ．結合オリゴペプチド
本発明の結合オリゴペプチドはここで記載される様なヘプシン、ＨＧＦ及び／又はヘプシン：ＨＧＦ複合体に、好ましくは特異的に、結合するオリゴペプチドである。結合オリゴペプチドは、既知のオリゴペプチド合成法を用いて化学的に合成することができ、あるいは組換え技術を用いて調製及び生成することができる。結合オリゴペプチドは通常、少なくとも約５のアミノ酸長であり、或いは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００のアミノ酸長以上であり、このようなオリゴペプチドはここに記載される様なポリペプチドに対して好ましくは特異的に結合する能力がある。結合オリゴペプチドは、よく知られた技術を用いて過度の実験をすることなしに同定することができる。この点において、ポリペプチド標的に特異的に結合する能力のあるオリゴペプチドのオリゴペプチドライブラリーを検索する技術は当分野でよく知られていることを注記する（例えば、米国特許第５５５６７６２号、同第５７５０３７３号、同第４７０８８７１号、同第４８３３０９２号、同第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６８９号、同第５６６３１４３号；ＰＣＴ公開第ＷＯ８４／０３５０６号、及びＷＯ８４／０３５６４号；Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984)；Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985)；Geysen等, in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)；Geysen等, J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987)；Schoofs等, J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla,S.E.等(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378；Lowman,H.B.等 (1991) Biochemistry, 30:10832；Clackson,T.等 (1991) Nature, 352:624；Marks,J.D.等 (1991) J. Mol. Biol., 222:581；Kang,A.S.等 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363、及びSmith, G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668参照）。
【００７５】
この点において、バクテリオファージ（ファージ）ディスプレイは、大きなオリゴペプチドライブラリーを検索して、ポリペプチド標的に特異的に結合する能力のあるこれらライブラリーのメンバーを同定することを可能にするよく知られた技術の一つである。ファージディスプレイは、様々なポリペプチドがバクテリオファージ粒子の表面上のコートタンパク質に融合タンパク質として表示されることによる技術である（Scott,J.K.及びSmith G. P. (1990) Science 249:386)。ファージディスプレイの有用性は、選択的にランダム化されたタンパク質変異体（又はランダムクローンｃＤＮＡ）の大きなライブラリーを標的分子に高い親和性で結合するこれらの配列について素早く効果的に分類することができる点にある。ファージでのペプチド（Cwirla,S.E.等 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378）又はタンパク質（Lowman,H.B.ら (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson,T.ら (1991) Nature, 352: 624; Marks,J.D.等 (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang,A.S.等 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363）ライブラーリのディスプレイは、特異的に結合する特性を有するものについて無数のポリペプチド又はオリゴペプチドをスクリーニングするために使用されている（Smith, G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668）。ランダム突然変異体のファージライブラリーの分類は、多数の変異体を構築して増殖させる方法、標的レセプターを用いた親和性精製の方法、及び結合増強の結果を評価する手段を必要とする。米国特許第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６８９号、及び同第５６６３１４３号。
【００７６】
ほとんどのファージディスプレイ法は繊維状ファージを使用していたが、λファージディスプレイシステム（ＷＯ９５／３４６８３；米国特許第５６２７０２４号）、Ｔ４ファージディスプレイシステム（Ren等 Gene, 215:439 (1998); Zhu等Cancer Research, 58(15): 3209-3214 (1998); Jiang等, Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997); Ren等, Gene, 195(2):303-311 (1997); Ren, Protein Sci., 5:1833 (1996); Efimov等, Virus Genes, 10:173 (1995)及びＴ７ファージディスプレイシステム（Smith及びScott, Methods in Enzymology, 217, 228-257 (1993); 米国特許第５７６６９０５号）も知られている。
【００７７】
現在、基礎的なファージディスプレイ構想の多くの他の改良及び変形が開発されている。これらの改良は、選択された標的分子への結合についてペプチドライブラリーをスクリーニングするための、及びこれらのタンパク質が所望の特性をスクリーニングする潜在能力で機能性タンパク質をディスプレイするためのディスプレイシステムの能力を増強する。ファージディスプレイ反応のための組み換え反応手段について記載があり（ＷＯ９８／１４２７７）及びファージディスプレイライブラリーは二分子相互作用（ＷＯ９８／２０１６９；ＷＯ９８／２０１５９）及び拘束性へリックスペプチドの特性（ＷＯ９８／２００３６）を分析及び制御するために使用されている。ＷＯ９７／３５１９６は、リガンドが標的分子に結合しうる第一の溶液、及び親和性リガンドが標的分子に結合しない第二の溶液とファージディスプレイライブラリーを接触させて結合リガンドを選択的に単離する、親和性リガンドの単離方法を記載する。ＷＯ９７／４６２５１は、親和性精製抗体でランダムファージディスプレイライブラリーをバイオパニングし、次いで結合ファージを単離し、続いてマイクロプレートのウェルでマイクロパニングして高親和性結合ファージを単離する方法を記載する。黄色ブドウ球菌（Staphlylococcus aureus）タンパク質Ａの親和性タグとしての使用も報告されている（Li等, (1998) Mol Biotech., 9:187）。ＷＯ９７／４７３１４は、ファージディスプレイライブラリーでもよいコンビナトリアルライブラリーを用いて酵素特異性を識別するための基質サブトラクションライブラリーの使用を記載している。ファージディスプレイに用いる洗浄剤における使用に適した酵素を選択する方法は国際公開公報９７／０９４４６に記載される。特異的に結合するタンパク質を選択する更なる方法は、米国特許第５４９８５３８号、同第５４３２０１８号、及び国際公開公報９８／１５８３３に記載されている。
ペプチドライブラリーの作製及びこれらのライブラリーのスクリーニングの方法は、米国特許第５７２３２８６号、同第５４３２０１８号、同第５５８０７１７号、同第５４２７９０８号、同第５４９８５３０号、同第５７７０４３４号、同第５７３４０１８号、同第５６９８４２６号、同第５７６３１９２号、及び同第５７２３３２３号に記載される。
【００７８】
Ｃ．結合小分子
結合小分子とは、好ましくは、ヘプシン、ＨＧＦ及び／又はヘプシン：ＨＧＦ複合体に、好ましくは特異的に結合する、ここに定義されるようなオリゴペプチド又は抗体以外の有機分子である。結合有機小分子は既知の方法（例えばＰＣＴ公開第ＷＯ００／００８２３及びＷＯ００／３９５８５号参照）を用いて同定され、化学的に合成されうる。結合有機小分子は通常、約２０００ダルトンの大きさ未満であり、あるいは約１５００、７５０、５００、２５０又は２００ダルトンの大きさであり、ここに記載される様なヘプシン、ＨＧＦ及び／又はヘプシン：ＨＧＦ複合体に、好ましくは特異的に結合する能力のあるこのような有機小分子は、よく知られた技術を用いて過度の実験をすることなしに同定されうる。この点において、ポリペプチド標的に結合する能力のある分子の有機小分子ライブラリーを検索する技術は当分野でよく知られていることを注記する（例えばＰＣＴ公開第ＷＯ００／００８２３及びＷＯ００／３９５８５号参照）。結合有機小分子は、例えばアルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、Ｎ置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバミン酸塩、炭酸塩、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、ハロゲン化アリール、アリールスルホン酸、ハロゲン化アルキル、アルキルスルホン酸、芳香族化合物、複素環化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアン酸塩、塩化スルホニル、ジアゾ化合物、酸塩化物等であり得る。
【００７９】
Ｄ．所望の特性を有する抗体、結合オリゴペプチド及び結合小分子のスクリーニング
抗体、オリゴペプチド及び小分子を生成する技術を、上記にて記載した。所望するような、所定の生物学的特性を有する抗体、オリゴペプチド又は他の小分子をさらに選択することができる。
本発明の抗体、オリゴペプチド又は他の小分子の成長阻害効果を、例えば、内因的又はそれぞれの遺伝子によるトランスフェクション後のいずれかでヘプシン及び／又はプロＨＧＦを発現する細胞を用いる当該分野で周知の方法によって評価することができる。例えば、適切な腫瘍細胞株、及びヘプシン及び／又はＨＧＦポリペプチド形質移入細胞は、数日間（例えば、２−７）、種々の濃度の本発明のモノクローナル抗体、オリゴペプチド又は他の小分子で処理し、クリスタル・バイオレット又はＭＴＴで染色、又は幾つかの他の比色アッセイによって分析し得る。増殖を測定するその他の方法は、本発明の抗体、結合オリゴペプチド又は結合小分子の存在又は非存在下で処理した細胞の３Ｈ-チミジン取り込みを比較することによる。処理の後、細胞を収集し、ＤＮＡへ取り込まれた放射能をシンチレーションカウンターで定量化した。適切なポジティブコントロールには、細胞株の成長を阻害することが知られている成長阻害抗体でその選択した細胞株を処理することが含まれる。インビボでの腫瘍細胞の成長阻害は、当該分野で知られている種々の方法で確かめることができる。腫瘍細胞は、ヘプシン及び／又はプロＨＧＦポリペプチドを過剰発現するものとすることができる。抗体、結合オリゴペプチド又は結合有機小分子は、ある実施形態では約０．５から３０μｇ／ｍｌの抗体濃度で、未処理腫瘍細胞と比べて約２５−１００％、より好ましくは約３０−１００％、そしてさらにより好ましくは約５０−１００％又は７０−１００％のヘプシン及び／又はプロＨＧＦを発現する腫瘍細胞の増殖をインビトロ又はインビボで阻害する。成長阻害は、細胞培養で、約０．５から３０μｇ／ｍｌ又は０．５ｎＭから２００ｎＭの抗体濃度で測定することができ、その成長阻害は、抗体への腫瘍細胞の曝露後１−１０日で確かめられる。約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重での抗体の投与が、抗体の最初の投与から約５日から３ヶ月、好ましくは約５から３０日以内に腫瘍の大きさの減少又は腫瘍細胞増殖の減少を引き起こすならば、抗体はインビボで成長阻害作用がある。
【００８０】
細胞死を誘発する抗体、結合オリゴペプチド又は結合有機小分子を選択するために、例えばヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー又は７ＡＡＤの取込みにより示される膜インテグリティの損失度合いを対照と比較して求める。ＰＩ取込みアッセイは、補体及び免疫エフェクター細胞の不在下で行われる。ヘプシン及び／又はプロＨＧＦ発現細胞腫瘍細胞を、培地のみ、又は適切な抗体（例えば約１０μｇ／ｍｌ）、結合オリゴペプチド又は結合有機小分子を含有する培地でインキュベートする。細胞を３日間インキュベートする。各処理に続いて、細胞を洗浄し、細胞凝塊除去のために３５ｍｍのストレーナキャップ付き１２×７５チューブ(チューブ当たり１ｍｌ、処理グループ当り３チューブ)に等分する。次いで、チューブへＰＩ（１０μｇ／ｍｌ）を与える。サンプルをＦＡＣＳＣＡＮ(登録商標）フローサイトメータとＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ(登録商標）セルクエスト(CellQuest)ソフトウエア(Becton Dickinson)を使用して分析してもよい。ＰＩ取込みによって測定されるような、統計的に有意なレベルの細胞死を誘発する抗体、結合オリゴペプチド又は結合有機小分子は、細胞死誘発性抗体、結合オリゴペプチド又は結合有機小分子として選択することができる。
関心のある抗体が結合したポリペプチド上のエピトープに結合する抗体、オリゴペプチド又は他の有機小分子をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow及びDavid Lane編(1988)に記載されているような通常の交差ブロッキングアッセイを実施することができる。既知の抗体のように、試験抗体、オリゴペプチド又は他の有機小分子が同じ部位又はエピトープと結合するならば、このアッセイを確定するために用いることができる。あるいは、又は付加的に、エピトープマッピングを、当該分野で周知の方法によって行うことができる。例えば、接触残基を同定するために、例えばアラニンスキャンニングによって抗体配列を変異させることができる。この変異体抗体は、適切なフォールディングを確かめるために、最初にポリクローナル抗体との結合について試験される。異なる方法では、ポリペプチドの異なる領域と一致するペプチドを、試験抗体群又は試験抗体及び特徴付けられた又は既知のエピトープを有する抗体による競合アッセイで用いることができる。
【００８１】
Ｅ．抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ治療法(ＡＤＥＰＴ)
また、本発明の抗体は、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、国際公開８１／０１１４５を参照)を活性な抗癌剤へ変換するプロドラッグ活性化酵素へ抗体をコンジュゲートすることによって、ＡＤＥＰＴにおいて使用することができる。例えば国際公開８８／０７３７８及び米国特許第４９７５２７８号を参照されたい。
ＡＤＥＰＴに有用な免疫コンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形態に変換するようにプロドラッグへ作用し得る任意の酵素が含まれる。
限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗癌剤５-フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(例えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なもの；Ｄ-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの変換に有用なＤ-アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なノイラミニダーゼ及びβガラクトシダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に変換させるのに有用なβラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に変換するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」としてもまた公知の酵素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを変換させるために使用することもできる(例えば、Massey, Nature 328:457-458(1987)を参照)。抗体-アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。
この発明の酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えば上で検討したヘテロ二官能性架橋試薬を使用することにより、抗体に共有的に結合させることができる。あるいは、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質を、当該技術においてよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができる(Neuberger等, Nature 312:604-608[1984])。
【００８２】
Ｆ．抗体変異体
ここに記載した抗体に加えて、抗体変異体も調製できると考えられる。抗体変異体は、コード化ＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することによって、及び／又は所望の抗体を合成することによって調製できる。当業者は、アミノ酸変化がグリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などの抗体の翻訳後プロセスを変え得るのを理解するであろう。
ここに記載した抗体の変異は、例えば、米国特許第５３６４９３４号に示す保存的及び非保存的変異に関する技術及び指針のいずれかを用いて作成することができる。変異は、結果として天然配列抗体又はポリペプチドと比較してアミノ酸配列の変化を生じる、抗体をコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってもよい。場合によっては、変異は、抗体の一つ又は複数のドメインにおける、少なくとも一つのアミノ酸の他の任意のアミノ酸との置換による。どのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失され得るかを確かめる指針は、抗体の配列を既知の相同タンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内で生じたアミノ酸配列変化の数を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸を類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸で置換すること、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果であるとすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内であり得る。許容され得る変異は、配列にアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、生じた変異体を、親配列によって示される活性に関して試験することによって確かめられる。
【００８３】
抗体及びポリペプチド断片がここで提供されている。そのような断片は、例えば完全長天然抗体又はタンパク質と比較した時に、Ｎ末端又はＣ末端で切断しているか、又は内部残基を欠いている可能性がある。ある断片は、抗体又はポリペプチドの所望される生物学的活性にとって必修ではないアミノ酸残基を欠く。
抗体及びポリペプチド断片は、多くの従来技術のいずれかによって調製してもよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法には、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基で確定した部位でタンパク質を切断することが知られた酵素によってタンパク質を処理することで、又は適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによって抗体又はポリペプチド断片を生成することが含まれる。さらにその他の好適な技術には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、所望の抗体又はポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することが含まれる。ＤＮＡ断片の所望の末端を確定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマーで用いられる。好ましくは、抗体及びポリペプチド断片は、ここに開示した天然抗体又はポリペプチドと少なくとも１つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
【００８４】
特定の実施形態では、対象とする保存的置換を、好ましい置換の項目でこの表に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、この表に例示的置換と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より実質的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
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【００８５】
抗体又はポリペプチドの機能又は免疫学的同一性の実質的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の電荷又は分子疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において有意に異なる置換基を選択することにより達成される。アミノ酸は、それらの側鎖特性の類似性に従ってグループ分けすることができる（A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp.73-75, Worth Publisher, New York (1975)）：
（１) 無極性：  Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
（２）無電荷極性：  Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
（３）酸性：  Asp (D), Glu (E)
（４）塩基性：  Lys (K), Arg (R), His(H)
或いは、共通の側鎖特性に基づいて天然に発生する残基をグループ分けすることができる：
（１）疎水性：  ノルロイシン、Met, Ala, Val, Leu, Ile;
（２）中性親水性：  Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
（３）酸性：  Asp, Glu;
（４）塩基性：  His, Lys, Arg;
（５）鎖の方向に影響する残基：  Gly, Pro;
（６）芳香性：  Trp, Tyr, Phe
【００８６】
非保存的置換は、これらの分類の１つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、又はより好ましくは、残された（非保存）部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができる。部位特異的突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wells等, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］又は他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施して、抗体又はポリペプチド変異体ＤＮＡを作成することもできる。
【００８７】
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Cunningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman ＆ Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
抗体又はポリペプチドの適切なコンフォメーションを維持することに関与していない任意のシステイン残基も、分子の酸化的安定性を向上させ、異常な架橋を防ぐために、概してセリンと置換され得る。逆に、抗体又はポリペプチドの安定性（特に、抗体がＦｖ断片のような抗体断片）を向上させるために、それにシステイン結合（複数でも）を加えてもよい。
【００８８】
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的に、更なる開発のために得られた変異体は、それらが生成された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を生成する簡便な方法には、ファージディスプレイを使用する親和性成熟がふくまれる。簡潔に言えば、高頻度可変領域部位（例えば、６−７部位）を変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された抗体変異体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として一価形態で表示される。ファージ表示変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。改変の候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。あるいは、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体と抗原ポリペプチドとの接点を同定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここで詳しく記述した技術による置換の候補である。そのような変異体が生成されたら、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択することができる。
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該分野で周知の種々の方法によって調製される。これらの方法には、限定されるものではないが、オリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、そして抗体の早期に調製した変異体又は非変異体形のカセット突然変異誘発による、天然ソースからの単離（天然発生アミノ酸配列変異体の場合）又は調製が含まれる。
【００８９】
Ｇ．抗体及びポリペプチドの修飾
抗体及びポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型には、抗体又はポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、抗体又はポリペプチドの選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることが含まれる。二官能性試薬による誘導体化は、例えば抗体又はポリペプチドを、抗体の精製方法で用いる水不溶性支持体マトリクス又は表面と架橋させるために有用であり、その逆も同じである。通常用いられる架橋剤には、例えば、１,１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸を有するエステル、３,３'-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１,８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ］プロピオイミダート等の試薬が含まれる。
他の修飾には、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman ＆ Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【００９０】
本発明の範囲内に含まれる抗体又はポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、抗体又はポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。ここで意図される「天然グリコシル化パターンの変更」とは、天然配列抗体又はポリペプチドに見られる一又は複数の炭水化物部分を欠失させること（内在するグリコシル化部位を取り除くことによって、又は化学及び／又は酵素的手法でグリコシル化を欠失させることのいずれか）、及び／又は天然配列抗体又はポリペプチドに存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。更には、この語句には、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的な変化が含まれる。
抗体及び他のポリペプチドのグリコシル化とは、典型的にはＮ-結合又はＯ-結合のいずれかである。Ｎ-結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付与を指す。トリペプチドは、Ｘがプロリンを除く任意のアミノ酸である、アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニンの配列であり、アスパラギン側鎖への炭水化物部分が酵素的に付与される認識部位である。従って、ポリペプチドのこれらトリペプチド配列のいずれかの存在によって、潜在的なグリコシル化部位が作り出される。Ｏ-結合グリコシル化とは、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンも用いられるが、殆どの場合にはセリン又はスレオニンへＮ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースのうちの一つの糖をヒドロキシアミノ酸へ付与することを指す。
抗体又はポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を改変して、それが上記に記載のトリペプチド配列（Ｎ-結合グリコシル化部位について）の一つ又は複数を含むようにすることによって簡便に完遂できる。この改変は、また、最初の抗体又はポリペプチドの配列へ一つ又は複数のセリン又はスレオニン残基を付加、又は置換することによって生成される（Ｏ-結合グリコシル化部位について）。抗体又はポリペプチドアミノ酸配列は、ＤＮＡレベルでの変化を通して、特に、コドンが所望するアミノ酸へ翻訳される、あらかじめ選択した塩基での抗体又はポリペプチドをコードするＤＮＡを変異させることによって、場合によっては改変され得る。
【００９１】
抗体又はポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。そのような方法は、この技術分野において、例えば、１９８７年９月１１日に発行された国際公開８７／０５３３０、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
抗体又はポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)によって、そしてEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)によって記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
抗体又はポリペプチド共有結合的修飾の他の型は、抗体又はポリペプチドを種々の非タンパク質様ポリマーの１つ、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンへ、米国特許第４６４０８３５号；第４４９６６８９号；第４３０１１４４号；第４６７０４１７号；第４７９１１９２号又は第４１７９３３７号に記載された方法で結合させることをを含む。また、抗体又はポリペプチドは、例えばコアセルベーション法によって又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセル）に、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションで捕捉することができる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, １６版, A. Oslo編(1980)に開示されている。
また、本発明の抗体又はポリペプチドは、その他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列と融合した抗体又はポリペプチドを含むキメラ分子が形成される方法で修飾されてもよい。
【００９２】
一実施形態では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドと抗体又はポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的には抗体又はポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このような抗体又はポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によって抗体又はポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（ポリ-His）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。
それに換わる実施形態では、キメラ分子は抗体又はポリペプチドの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも１つの可変領域に換えて抗体又はポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施形態では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第５４２８１３０号を参照のこと。
【００９３】
Ｈ．抗体及びポリペプチドの調製
以下の説明は、主として、抗体及びポリペプチドコード化核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することにより抗体及びポリペプチドを産生させる方法に関する。勿論、当該分野においてよく知られている他の方法を用いて抗体及びポリペプチドを調製することができると考えられている。例えば、適切なアミノ酸配列、又はその一部分を、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生成してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., サン フランシスコ, カリフォルニア(1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動を使用することによってインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（フォスター  シティー, カリフォルニア）を用いて、製造者の指示によって実施してもよい。抗体又はポリペプチドの種々の部分を別々に化学的に合成し、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて所望する抗体又はポリペプチドを生成させてもよい。
【００９４】
１．抗体又はポリペプチドをコードするＤＮＡの単離
抗体又はポリペプチドをコードするＤＮＡは、抗体又はポリペプチドｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。従って、ヒト抗体又はポリペプチドＤＮＡは、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に得ることができる。また抗体又はポリペプチド-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから又は公知の合成方法（例えば、自動核酸合成）により得ることもできる。
ライブラリーは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(少なくとも約２０-８０塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。抗体又はポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法は、ＰＣＲ法を使用するものである［Sambrook等,上掲；Dieffenbach等, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【００９５】
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための技術は、当該分野で良く知られている。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、疑陽性が最小化されるよう十分な長さであり、十分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリー内のＤＮＡとのハイブリダイゼーション時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識ＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用を含む。中程度のストリンジェンシー及び高度のストリンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件は、上掲のSambrookら，に示されている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、GenBankらの公共データベース又は他の個人の配列データベースに寄託され利用可能となっている他の周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内の又は完全長配列に渡っての（アミノ酸又はヌクレオチドレベルのいずれかでの）配列同一性は、当該分野で知られた、及びここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されていないｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用して、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。
【００９６】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載した抗体又はポリペプチド生成のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及び上掲のSambrook等に見出すことができる。
真核生物細胞形質移入及び原核生物細胞形質転換の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315(1983)及び１９８９年６月２９日公開の国際公開８９／０５８５９に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が用いられる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【００９７】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物には、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性微生物、例えば大腸菌のような腸内細菌科が含まれる。種々の大腸菌株が公に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３６３５）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌属、例えば大腸菌（E. coli）、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えばネズミチフス菌(Salmonella Typhimurium）、セラチア、例えばセラチア・マルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバチルス・スブチルス(B. subtilis)及びバチルス・リチェニフォルミス(B. licheniformis)（例えば、１９８９年４月１２日発行のＤＤ２６６７１０に記載されたバチルス・リチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生成物発酵のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０を、宿主にとって内因性のタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子変異をもたらすように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  （ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ  ５５，２４４）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７  ｉｌｖＧ  ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日発行の米国特許第４９４６７８３号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
【００９８】
完全長抗体、抗体断片、及び抗体融合タンパク質は、治療用の抗体が細胞傷害剤（例えば、毒素）と結合し、その免疫コンジュゲートそのものが腫瘍細胞の破壊において有効性を示す場合など、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合に、細菌で産生させることができる。完全長抗体は、血液循環でより長い半減期を有する。大腸菌での産生が、より迅速でより費用効率的である。細菌での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号（Carter等）、米国特許第５７８９１９９号（Joly等）、及び翻訳開始部位（ＴＩＲ）及び発現と分泌を最適化するシグナル配列を記載している米国特許第５８４０５２３号（Simmons等）を参照のこと。これら特許は、ここに参考文献として取り入れられている。発現の後、抗体は、大腸菌細胞ペーストから可溶性分画へ分離し、例えば、アイソタイプによってプロテインＡ又はＧカラムを介して精製することができる。最終精製は、例えば、ＣＨＯ細胞で発現させた抗体を精製するための工程と同じようにして行うことができる。
【００９９】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、抗体又はポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)（Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; １９８５年５月２日公開の欧州特許第１３９３８３号）；クリュイベロミセス宿主(Kluyveromyces hosts)（米国特許第４９４３５２９号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)）、例えばクリュイベロミセスラクチス(K. lactis)（MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol., 154(2): 737-742 [1983]）、クリュイベロミセス・フラギリス(K. fragilis)（ＡＴＣＣ１２４２４）、クリュイベロミセス・ブルガリクス(K. bulgaricus)（ＡＴＣＣ１６０４５）、クリュイベロミセス・ウィケラミイ(K. wickeramii)（ＡＴＣＣ２４１７８）、クリュイベロミセス・ワルチイ(K. waltii)（ＡＴＣＣ５６５００）、クリュイベロミセス・ドロソフィラルム(K. drosophilarum)（ＡＴＣＣ３６９０６； Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990)）、クリュイベロミセス・テモトレランス(K. thermotolerans)及びクリュイベロミセス・マルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)（欧州特許第４０２２２６号）；ピシア・パストリス(Pichia pastoris)（欧州特許第１８３０７０号； Sreekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]）；カンジダ；トリコデルマ・レーシア(Trichoderma reesia)（欧州特許第２４４２３４号）；アカパンカビ（Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]）；シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)（１９９０年１０月３１日公開の欧州特許第３９４５３８号）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)（１９９１年１月１０日公開の国際公開９１／００３５７）；及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルス・ニダランス（Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn等, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]）及びアスペルギルス・ニガー（Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]）が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(Ｃ１化合物資化性、Methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピシア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されたメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
【０１００】
グリコシル化抗体又はポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物から由来のものである。非脊椎動物細胞の例には、植物細胞、例えば綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト及びタバコの細胞培養と同様に、ショウジョウバエＳ２及びヨトウ(spodoptera)Ｓｆ９等の昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルス株及び変異体、及びヨトウガ(Spodoptera frugiperda)(幼虫(caterpillar))、ネッタイシマカ(蚊)、ヒトスジシマカ(蚊)、キイロショウジョウバエ(ショウジョウバエ)、及びカイコ等の宿主に対応する許容性昆虫宿主細胞が同定されている。種々のトランスフェクション用のウィルス株、例えばオートグラファ・カルフォルニカ(Autographa californica)ＮＰＶのＬ−１変異株、カイコＮＰＶのＢｍ-５株が公に入手でき、このようなウィルスは、本発明に係るウィルスとして、特に、ヨトウガ細胞のトランスフェクションのために使用してもよい。
しかし、最大の関心は脊椎動物細胞に向けられ、培養(組織培養)した脊椎動物細胞の増殖がルーチン作業となった。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０(ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１)で形質転換させたサル腎ＣＶ１細胞株；ヒト胚芽腎細胞株(２９３又は懸濁培養で成長するようにサブクローン化された２９３細胞，Graham等,J.Gen Virol.,36:59 (1977))；ベビーハムスター腎細胞(ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チヤイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ，Urlaub等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216 (1980));マウスセルトリ細胞(ＴＭ４，Mather,Biol.Reprod.,23：243-251 (1980))；サル腎細胞(ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザル腎細胞(ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト頚管腫瘍細胞(ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞(ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞(ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞(Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞(ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝臓癌細胞（ＨｅｐＧ２）である。
宿主細胞は、抗体又はポリペプチド生成のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘発し、形質転換体を選出し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に修正した通常の栄養培地で培養される。
【０１０１】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
抗体又はポリペプチドをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
ポリペプチドは直接的に組換え手法によって生成されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生成される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入される抗体又はポリペプチド-コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクリュイベロミセス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(１９９０年４月４日発行の欧州特許第３６２１７９号)、又は１９９０年１１月１５日に公開された国際公開９０／１３６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【０１０２】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードしており、例えばバシリのＤ-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子がある。
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、抗体又はポリペプチド-コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)；Kingsman等, Gene, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファンで成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
【０１０３】
発現及びクローニングベクターは、通常、抗体又はポリペプチド-コード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を方向付けるプロモーターを含む。種々の有能な宿主細胞により認識されるプロモーターが知られている。原核生物宿主との使用に適したプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Chang等, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); 欧州特許第３６，７７６号］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモーターもまた抗体又はポリペプチドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
酵母宿主との使用に適したプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1978)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモーターは欧州特許第７３６５７号に更に記載されている。
【０１０４】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗体又はポリペプチド転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(１９８９年７月５日公開の英国特許第２２１１５０４号)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
より高等の真核生物による抗体又はポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、抗体又はポリペプチドコード化配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、抗体又はポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養での抗体又はポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); 欧州特許第１１７０６０号；及び欧州特許第１１７０５８号に記載されている。
【０１０５】
４．宿主細胞の培養
本発明の抗体又はポリペプチドを生成するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((MEM),シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((DMEM),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国特許再発行第３０９８５号に記載された任意の培地も宿主細胞に対する培養培地として使用できる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン（商品名）薬)、微量元素(マイクロモル範囲の最終濃度で通常は存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０１０６】
５．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリダイゼーションによって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果、表面での二本鎖の形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量化する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はポリペプチドＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【０１０７】
６．抗体及びポリペプチドの精製
抗体及びポリペプチドの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)を用いて又は酵素的切断により膜から引き離すことができる。抗体及びポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
抗体及びポリペプチドは、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及び抗体及びポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生成方法及び特に生成される特定の抗体又はポリペプチドの性質に依存する。
【０１０８】
組換え技術を使用する場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔内に生成されるか、又は培地に直接分泌され得る。抗体が細胞内に生成される場合、第１工程として、粒状屑、宿主細胞又は溶菌断片を、例えば遠心分離又は超遠心分離にかけて取り除く。Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992)は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順について記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを酢酸ナトリウム(ｐＨ３．５)、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフロリド(ＰＭＳＦ)の存在下で、３０分以上かけて解凍する。細胞屑は遠心分離により除去することができる。抗体が培地へ分泌されている場合、そのような発現系からの上清は、一般的には、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmicon又はMillipore Pelliconの限外濾過ユニットを用いて最初に濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めてタンパク質分解を阻害してもよく、抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティリガンドとしてのプロテインＡの適合性は抗体に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる（Lindmark等, J. Immunol. Meth. 62: 1-13 [1983]）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Guss等, EMBO J. 5: 15671575 [1986]）。アフィニティリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Bakerbond ABX(商標)樹脂（J.T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラム）上でのヘパリンSEPHAROSE(商品名)クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿などの他のタンパク質精製技術も、回収される抗体に応じて利用可能である。
任意の予備精製工程に続いて、対象とする抗体と汚染物とを含む混合物に、約２．５−４．５のｐＨでの溶離バッファーを用いて、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーを施してもよく、好ましくは低い塩濃度（例えば、約０−０．２５Ｍ塩）で実施される。
【０１０９】
Ｉ．製薬製剤
本発明に係る抗体、結合オリゴペプチド、結合有機又は無機小分子及び／又は本発明で用いられるポリペプチドの治療的製剤は、所望される程度の純度を持つ抗体、ポリペプチド、オリゴペプチド又は有機／無機小分子を凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で、最適な製薬上許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製され保存される（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th 版, Osol, A. 編. [1980]）。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、酢酸、Ｔｒｉｓ、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムクロライド、ベンズエトニウムクロライド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；トレハロース及び塩化ナトリウムなどのトニシファイヤー；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ポリソルベート等の界面活性剤；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体）；及び／又はトゥイーン(TWEEN)（登録商標）、プルロニクス(PLURONICS)（登録商標）、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。抗体は、好ましくは５−２００ｍｇ／ｍｌの間、好ましくは１０−１００ｍｇ／ｍｌの間の濃度の抗体で構成される。
【０１１０】
ここでの製剤は、また、治療すべき特定の徴候の必要に応じて一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。例えば、抗体、結合オリゴペプチド又は結合有機又は無機小分子に加えて、１つの製剤に、例えば、同じポリペプチド上の異なるエピトープと結合する第二抗体、又は特定の癌の成長に影響を与える成長因子のような何らかの他の標的に対する抗体を含めることは望ましい。あるいは、又はさらに、この組成物は、更に化学療法剤、細胞障害性剤、サイトカイン、成長阻害剤、抗-ホルモン剤、及び／又は心臓保護剤を含んでもよい。このような分子は、意図する目的にとって有効な量の組み合わせで適切に存在する。
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ-グルタミン酸及びγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(登録商標)（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ポリ-(Ｄ)-（-）-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
【０１１１】
Ｊ．抗体、結合オリゴペプチド及び結合有機／無機小分子を用いる治療
癌におけるポリペプチド(ヘプシン及び／又はＨＧＦ)発現を定量するために、種々の検出アッセイが利用可能である。一実施形態では、ポリペプチド過剰発現は、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって分析される。腫瘍生検からのパラフィン包埋組織切片をＩＨＣアッセイへ供してもよいし、次のようなポリペプチド染色強度基準と合致させてもよい：
スコア０ - 染色が観察されないか、又は膜染色が腫瘍細胞の１０％未満で観察される。
スコア１＋ - わずかに／弱く認知できる程度の膜染色が腫瘍細胞の１０％を越えて検出される。細胞はそれらの膜の一部のみが染色される。
スコア２＋ - 弱いないしは中程度の完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％を越えて観察される。
スコア３＋ - 中程度から強い完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％を越えて観察される。
ポリペプチド発現に関して０又は１＋スコアの腫瘍は、ポリペプチドが過剰発現していないことを特徴としうるものであるのに対し、２＋又は３＋スコアの腫瘍はポリペプチドが過剰発現していることを特徴としうる。
【０１１２】
別に、又は付加的に、ＦＩＳＨアッセイ、例えばＩＮＦＯＲＭ（登録商標）(Ventana, Arizonaから販売)又はＰＡＴＨＶＩＳＩＯＮ（登録商標）(Vysis, Illinois)を、ホルマリン固定、パラフィン包埋された腫瘍組織で実施して、腫瘍におけるポリペプチド過剰発現の程度(生じているならば)を測定してもよい。
ポリペプチド過剰発現又は増幅は、インビボ検出アッセイを使用して評価することができ、例えば検出される分子に結合し、検出可能な標識(例えば、放射性同位体又は蛍光標識)が付けられた分子(例えば抗体、オリゴペプチド又は有機小分子)を投与し、標識の局在化について患者を外部スキャニングする。
上に記載したように、本発明の抗体、オリゴペプチド又は有機小分子には、種々の非治療的用途がある。本発明の抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子は、ポリペプチドを発現している癌の染色にとって有用である（例えば、ラジオイメージングで）。他の細胞の精製の工程として、混合細胞の集団からポリペプチド発現細胞を死滅させて除去するために、この抗体、オリゴペプチド又は有機小分子は、また、例えば、ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットにおいて、インビトロでポリペプチドの検出及び定量化のために、細胞からポリペプチドを精製又は免疫沈降するのに有用である。
【０１１３】
現在、癌の段階に応じて、癌の治療には、次の治療：外科手術による癌組織の除去、放射線治療、及び化学治療の一つ、又はそれらを組合せたものが含まれる。抗体、オリゴペプチド又は有機小分子による治療は、特に、化学治療における副作用や毒素に対する耐性がない老年の患者、及び放射線治療の有用性に限界がある転移性疾患において所望されている。本発明の腫瘍標的化抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子は、疾患の初期診断時及び再発中におけるポリペプチド発現癌の緩和に有用である。治療用途に関しては、抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子は、単独で、あるいは例えば、ホルモン、抗血管形成、又は放射標識された化合物と共に、又は外科手術、寒冷療法、及び／又は放射線治療と組み合わせてもよく、使用してもよい。抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子による治療は、従来的治療の前又は後のいすれかに連続させて、他の形態の従来的治療と共に実施することができる。化学療法剤、例えばタキソテレ(登録商標)(ドセタキセル)、タキソール(登録商標)(パリクタキセル)、エストラムスチン及びミトキサントロンは、癌、特に危険性の少ない患者の癌治療に使用される。癌を治療又は緩和するための本発明の方法において、上述した一又は複数の化学療法剤による治療と組合せて、癌患者に抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子を投与することができる。特に、パリクタキセル及び改変誘導体との組合せ治療が考えられる(例えば、欧州特許第０６００５１７号を参照のこと)。抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子は治療的有効量の化学療法剤と共に投与されるであろう。他の実施形態では、抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子は化学療法剤、例えばパクリタキセルの活性及び効力を高めるための化学治療と組合せて投与される。医師用卓上参考書(ＰＤＲ)には、種々の癌治療に使用されるこれらの薬剤の用量が開示されている。治療的に有効な上述の化学療法剤の投薬計画及び用量は、治療される特定の癌、疾患の程度、及び当該技術分野の医師によく知られている他の因子に依存し、医師が決定することができる。
【０１１４】
特定の一実施形態では、細胞障害剤に結合した抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子を含有する毒素コンジュゲートを患者に投与する。好ましくは、タンパク質に結合した免疫コンジュゲートは細胞によりインターナリゼーションし、結果として、それが結合した癌細胞の殺傷性における免疫コンジュゲートの治療的効果が向上する。好ましい実施形態では、細胞障害剤は、癌細胞内の核酸を標的とするか、又はこれに干渉する。このような細胞障害剤の例は、上述されており、メイタンシノイド、カリケアマイシン、リボヌクレアーゼ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む。
抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子又はその免疫コンジュゲートは、公知の方法、例えばボーラス、もしくは一定時間にわたる連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液包内、くも膜下腔内、経口、局所的、又は吸入経路により、ヒトの患者に投与される。抗体、オリゴペプチド又は有機小分子の静脈内又は皮下投与が好ましい。
他の治療計画を抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子の投与と組合せてもよい。組合せ投与には、別々の製剤又は単一の医薬製剤を使用する同時投与、及び好ましくは両方(又は全ての)活性剤が同時にその生物学的活性を働かせる時間があるいずれかの順での連続投与が含まれる。このような組合せ治療により、結果として相乗的治療効果が生じることが好ましい。
【０１１５】
また、特定の癌に関連した他の腫瘍抗原に対する抗体の投与と共に、抗体又は抗体類、オリゴペプチド又は有機／無機小分子の投与を組合せることが望ましい。
他の実施形態では、本発明の治療方法は、異なる化学療法剤の混合物の同時投与を含む、抗体(一又は複数)、オリゴペプチド又は有機／無機小分子と一又は複数の化学療法剤又は成長阻害剤との組合せ投与を含む。化学療法剤には、リン酸エストラムスチン、プレドニムスチン、シスプラチン、５-フルオロウラシル、メルファラン、シクロホスファミド、ヒドロキシ尿素及びヒドロキシ尿素タキサン類(hydroxyureataxanes)(例えばパクリタキセル及びドキセタキセル)及び／又はアントラサイクリン抗生物質が含まれる。このような化学療法剤の調製及び投与スケジュールは製造者の注意書きに従い使用されるか、又は熟練した実務者により経験的に決定される。このような化学療法の調製及び投与スケジュールは、Chemotherapy Service編 M.C.Perry, Williams ＆ Wilkins, Baltimore, MD(1992)にも記載されている。
抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子は、抗ホルモン化合物；例えばタモキシフェン等の抗-エストロゲン化合物；抗-プロゲステロン、例えばオナプリストン(onapristone)(欧州特許第６１６８１２号を参照)；又は抗アンドロゲン、例えばフルタミドを、このような分子に対して既知の用量で組合せてもよい。治療される癌がアンドロゲン非依存性癌である場合、患者は予め抗アンドロゲン治療を受け、癌がアンドロゲン非依存性になった後、抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子(及び場合によってはここに記載した他の薬剤)を患者に投与してもよい。
【０１１６】
しばしば、心臓保護剤(治療に関連する心筋の機能不全を防止又は低減するため)又は一又は複数のサイトカインを患者に同時投与することも有益なことである。上述した治療摂生に加えて、抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子治療の前、同時又は治療後に、外科的に癌細胞を取り除くか、及び／又は放射線治療を施してもよい。上述した任意の同時投与される薬剤の適切な用量は現在使用されている量であり、抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子と薬剤の組合せ作用(相乗作用)に応じてより少なくしてもよい。
疾患の予防又は治療のための投与量及び方式は、公知の基準に従い、医師により選択されるであろう。抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子の適切な用量は、上記のような治療される疾患の種類、疾患の重症度及び過程、抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子を予防目的で投与するのか治療目的で投与するのか、過去の治療、患者の臨床歴及び抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子の応答性、手当てをする医師の裁量に依存するであろう。抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子は一度に又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。好ましくは、抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子は静脈注入又は皮下注射により投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一又は複数の別個の投与又は連続注入のいずれであれ、体重１ｋｇ当たり約１μｇないし５０ｍｇ(例えば０．１−１５ｍｇ／ｋｇ／用量)の抗体を患者への最初の投与量の候補とすることができる。投薬計画は、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷量、続いて１週間に約２ｍｇ／ｋｇの維持用量の抗体を投与することからなってよい。しかしながら、他の投薬計画も有効であろう。上述した因子に応じて、典型的な一日の投与量は約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇあるいはそれ以上の範囲である。数日間又はそれ以上の繰り返し投与の場合、状態によっては、疾患の徴候の望ましい抑制が生じるまで処置を維持する。この治療の進行状態は、医師又は他の当業者に公知の基準をベースにした通常の方法やアッセイで容易にモニターされる。
【０１１７】
抗体タンパク質の患者への投与の他に、本出願は遺伝子治療による抗体の投与を考察する。抗体をコードする核酸の投与は「抗体を治療的有効量で投与する」という表現に含まれる。例えば、遺伝子治療を用いた細胞内抗体の産生に関する、１９９６年３月１４日に公開された国際公開第９６／０７３２１号を参照のこと。
核酸（場合によってはベクター内に含まれたもの）を患者の細胞に入れるために：インビボ及びエキソビボという２つの主要な方法がある。インビボ送達では、核酸は、通常は抗体が必要とされている部位に直接注入される。エキソビボ処理では、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、修飾された細胞を患者に、直接、又は例えば患者に埋め込まれる多孔性膜にカプセル化して投与する（米国特許第４８９２５３８号及び第５２８３１８７号参照）。核酸を生細胞に導入するために利用可能な種々の技術がある。これらの技術は、核酸が培養された細胞にインビトロで移入されるか、又は対象とする宿主にインビボで移入されるかによって異なる。哺乳動物細胞にインビトロで核酸を移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などの使用を含む。遺伝子のエキソビボ送達に通常用いられるベクターはレトロウイルスベクターである。
【０１１８】
現在好まれているインビボ核酸移入技術は、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルス）、及び脂質ベースの系（例えば、遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ-Ｃｈｏｌである）での形質移入を含む。現在知られている遺伝子マーキング及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Anderson等, Science, 256:808-813 (1992)を参照のこと。また、国際公開第９３／２５６７３号及びそこに引用された参考文献も参照。
本発明の抗体は、ここでの「抗体」の定義により包含される様々な形態であってよい。よって、抗体には、完全長又は無傷抗体、抗体断片、天然配列抗体又はアミノ酸変異体、ヒト化、キメラ又は融合抗体、免疫コンジュゲート、及びそれらの機能的断片が含まれる。融合抗体において、抗体配列は異種ポリペプチド配列に融合している。抗体はＦｃ領域が修飾されて、所望のエフェクター機能を提供することができる。以下の段落に詳細に記載されるように、適切なＦｃ領域と共に、細胞表面に結合したそのままの抗体は、例えば抗体-依存性細胞障害(ＡＤＣＣ)を介して又は補体依存性細胞障害において補体を補充することにより、又は他のいくつかのメカニズムにより、細胞障害性を誘発し得る。また、副作用及び治療による合併症を最小にするようにエフェクター機能を除去又は低減することが望ましい場合には、所定の他のＦｃ領域が使用される。
一実施形態では、抗体は、本発明の抗体と同じエピトープとの結合に関して競合するか、又はこれに実質的に結合する。また、本発明の該抗体の生物学的特徴を有する抗体、特にインビボ腫瘍ターゲティング及び任意の細胞増殖阻害又は細胞障害特性を含むものが考察される。
上述した抗体の産生方法をここで詳細に記載する。
【０１１９】
本抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子は、哺乳動物におけるヘプシン及び／又はＨＧＦを発現する癌の治療、或いは一又は複数の癌の徴候の緩和に有用である。本発明の方法では、癌に関連する転移性の腫瘍の徴候を治療及び／又は緩和するのにアンタゴニストを用いる。抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子アンタゴニストは、哺乳動物において該ポリペプチドを発現している癌細胞の少なくとも一部に結合可能である。一実施形態では、抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子は、インビボ又はインビトロでポリペプチドに結合し、ポリペプチドを発現するか及び／又は、ポリペプチドに応答する腫瘍細胞を破壊又は死滅させるか、又はこのような腫瘍細胞の成長を阻害するのに効果的である。このような抗体には、裸の抗体(いかなる薬剤にも結合していない)が含まれる。細胞傷害性又は細胞成長阻害特性を有する裸の抗体は、細胞障害剤と併用すると、より強く腫瘍細胞を破壊することが可能である。例えば細胞障害剤と抗体とを結合させ、以下に記載するような免疫コンジュゲートを形成させることによって、細胞障害特性を抗体に付与することができる。一部の実施形態では、この細胞障害剤又は成長阻害剤は、小分子である。一部の実施形態では、毒素、例えばカリケアマイシン又はメイタンシノイド、及びそれらの類似物又は誘導体が使用される。
【０１２０】
本発明は、本発明の抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子と担体を含有する組成物を提供する。癌の治療のために、組成物はその治療の必要性に応じて患者に投与することができ、ここで組成物は免疫コンジュゲート又は裸の抗体として存在する一又は複数の抗体を含有し得る。さらなる実施形態においては、組成物は、他の療法剤、例えば化学療法剤を含む成長阻害剤又は細胞障害剤とこれらの抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子を組合せて含有することもできる。また本発明は、本発明の抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子と担体を含有する製剤も提供する。一実施形態では、製剤は製薬的に許容可能な担体を含有する治療用製剤である。
本発明の他の態様は、抗体をコードする単離された核酸分子である。Ｈ及びＬ鎖、特に高頻度可変領域残基をコードする核酸、天然配列抗体及び変異体をコードする鎖、該抗体の修飾体及びヒト化形態を含む。
本発明は、抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子を治療的有効量、哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における癌の治療又は癌の一又は複数の徴候を緩和するのに有用な方法を提供する。抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子治療組成物は、医師の指示通りに、短い期間(急性)又は慢性的に、又は間欠的に投与することができる。また、ポリペプチド(ヘプシン及び／又はＨＧＦ)を発現する細胞及び／又はポリペプチド(ヘプシン及び／又はＨＧＦ)に応答する細胞の成長を阻害し、該細胞を殺傷する方法も提供される。
本発明は少なくとも一つの抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子を含有するキット又は製造品も提供する。抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子を含有するキットは、例えば細胞殺傷アッセイ、細胞からのポリペプチドの精製又は免疫沈降における用途が見出されている。例えば、ポリペプチドの単離及び精製のためには、キットはビーズ(例えばセファロースビース)に結合した抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子を含有することができる。インビトロにおけるポリペプチドの検出及び定量化、例えばＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットにおける抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子を含有するキットを提供することもできる。検出に有用なこのような抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子は、蛍光又は放射標識などの標識が付されて提供され得る。
【０１２１】
Ｋ．製造品及びキット
本発明の他の実施形態は、非ホジキンリンパ腫等のポリペプチド(ヘプシン及び／又はＨＧＦ)発現癌の治療に有用な物質を含有する製造品である。この製造品は容器と容器に付与又は添付されるラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの多様な材料から形成されてよい。容器は、癌の状態の治療に有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明の抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が癌の治療のために使用されることを示す。ラベル又はパッケージ挿入物は、癌患者に抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子組成物を投与する際の注意書きをさらに含む。製造品はさらに、製薬的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第２の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
種々の目的、例えばポリペプチド発現又は細胞殺傷アッセイ、細胞からのポリペプチドの精製又は免疫沈降に有用なキットも提供される。ポリペプチドの単離及び精製において、キットはビーズ(例えばセファロースビーズ)に結合した抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子を含むことが可能である。インビトロにおけるポリペプチドの検出及び定量化、例えばＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットのための抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子を含むキットを提供することもできる。製造品と同様、キットも容器と容器に付与又は添付されるラベル又は能書を含んでなる。容器には少なくとも１つの本発明の抗体、オリゴペプチド又は有機／無機小分子を含有する組成物が収容されている。希釈液及びバッファー、コントロール抗体等を収容する付加的な容器を具備していてもよい。ラベル又は能書は、組成物についての記載、並びに意図するインビトロ又は診断での使用に関する注意書きを提供するものである。
【０１２２】
Ｌ．ポリペプチド及びポリペプチドコード核酸−特定の形態及び用途
ポリペプチドをコードする核酸配列（又はそれらの相補鎖）は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡプローブの生成において種々の用途を有している。また、ポリペプチドコード化核酸は、ここに記載される組換え技術によるポリペプチドの調製に有用であり、これらポリペプチドは、例えば、ここで記載の抗体の調製において用途を見出し得る。
完全長天然配列ポリペプチド遺伝子又はその一部は、ここに開示した天然ポリペプチド配列に対して所望の配列同一性を持つ他のｃＤＮＡ（例えば、天然に生じる変異体又は他の種からのポリペプチドをコードするもの）の単離のために、ｃＤＮＡライブラリ用のハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。場合によっては、プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。このハイブリダイゼーションプローブは、少なくとも部分的に完全長天然ヌクレオチド配列の新規な領域から誘導してもよく、それらの領域は、過度の実験をすることなく、天然配列ポリペプチドのプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から判定され得る。例えば、スクリーニング法は、ポリペプチド遺伝子のコード化領域を周知のＤＮＡ配列を用いて単離して約４０塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリダイゼーションプローブは、３２Ｐ又は３５Ｓ等の放射性ヌクレオチド、又はアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識され得る。本発明のポリペプチド遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリーの何れのメンバーにプローブがハイブッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブリダイゼーション技術を、以下の実施例において更に詳細に記載する。本出願に開示されている任意のＥＳＴ配列は、ここに開示している方法を利用して、同じようにプローブとして用い得る。
【０１２３】
ポリペプチドコード核酸の他の有用な断片には、標的ポリペプチドｍＲＮＡ（センス）又はポリペプチドＤＮＡ（アンチセンス）配列と結合できる一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明によると、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書中に記載のヘプシン、プロＨＧＦ又は結合断片をコードするＤＮＡのコード化領域の断片を含む。そのような断片は、一般的には少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４から３０ヌクレオチドを含む。与えられたタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいて、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを得る能力は、例えば、Stein及びCohen（Cancer Res. 48:2659, 1988）及び van der Krol等（BioTechniques 6:958, 1988）に記載されている。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は二重鎖の形成をもたらし、それは、二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の未熟終止を含む幾つかの方法の一つ、又は他の方法により、標的配列の転写又は翻訳を阻止する。そのような方法は、本発明に含まれている。よって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質の発現を阻止するのに用いられ、それらタンパク質は、哺乳動物での癌の誘導を担い得る。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖−ホスホジエステル骨格（又は他の糖結合、国際公開９１／０６６２９に記載のもの等）を有するオリゴヌクレオチドを更に含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼ耐性である。そのような耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、インビボで安定であるが（つまり、酵素分解に耐えうるが）、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性は保持している。
【０１２４】
アンチセンス結合の好適な遺伝子内部位には、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始／開始コドン（５'-ＡＵＧ／５'-ＡＴＧ）又は終結／停止コドン（５'-ＵＡＡ、５'-ＵＡＧ及び５-ＵＧＡ／５'-ＴＡＡ、５'-ＴＡＧ及び５'-ＴＧＡ）を含む領域が含まれる。これらの領域は翻訳開始又は終結コドンから何れかの方向（つまり５'又は３'）に約２５から約５０の近接ヌクレオチドを包含するｍＲＮＡ又は遺伝子の一部を意味する。アンチセンス結合のための他の好適な領域には、イントロン；エキソン；イントロン-エキソン接合部；翻訳開始コドンと翻訳終結コドンの間の領域であるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）又は「コード領域」；５'-５'トリホスフェート結合を介してｍＲＮＡの５'−最末端残基に結合したＮ７-メチル化グアノシン残基を含み、５'キャップ構造自体と同様にキャップに隣接する最初の５０ヌクレオチドを含むｍＲＮＡの５'キャップ；翻訳開始コドンから５'方向のｍＲＮＡの部分で、ｍＲＮＡ又は遺伝子上の対応するヌクレオチドの翻訳開始コドンと５'キャップ部位の間のヌクレオチドを含む５'の未翻訳領域（５'ＵＴＲ）；及び翻訳終結コドンから３'方向のｍＲＮＡの部分で、ｍＲＮＡ又は遺伝子上の対応するヌクレオチドの３'末端と翻訳停止コドンの間のヌクレオチドを含む、３'未翻訳領域（３'ＵＴＲ）が含まれる。
【０１２５】
ポリペプチドの発現を阻害するのに有用な好適なアンチセンス化合物の特定の例には、修飾骨格又は非天然ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドには骨格にリン原子を保持しているものと骨格にリン原子を有していないものが含まれる。この明細書の目的のために、また当該分野でしばしば引用されるように、そのヌクレオシド間骨格にリン原子を持たない修飾オリゴヌクレオチドはまたオリゴヌクレオシドであると考えることができる。好適な修飾オリゴヌクレオチド骨格には、例えばホスホロチオネート、キラルホスホロチオネート、ホスホロジチオネート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネートで、３'-アルキレンホスホネート、５'-アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むもの、ホスフィネート、ホスホルアミデートで、３'-アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデートを含むもの、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート及びボラノ-ホスフェートで通常の３'-５'結合を持つもの、これらの２'-５'結合類似体、及び一又は複数のヌクレオチド間結合が３'から３'、５'から５'又は２'から２'結合である逆転された極性を持つものが含まれる。逆転した極性を持つ好適なオリゴヌクレオチドは単一の３'から３'結合を最も３'側のヌクレオチド間結合、つまり、非塩基性(abasic)でありうる単一の逆転ヌクレオシド残基（核酸塩基がないか、又はその代わりにヒドロキシル基を有する）を含む。様々な塩、混合された塩及び遊離の酸形態がまた含まれる。リン含有結合の調製を教唆する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許３６８７８０８；４４６９８６３；４４７６３０１；５０２３２４３；５１７７１９６；５１８８８９７；５２６４４２３；５２７６０１９；５２７８３０２；５２８６７１７；５３２１１３１；５３９９６７６；５４０５９３９；５４５３４９６；５４５５２３３；５４６６６７７；５４７６９２５；５５１９１２６；５５３６８２１；５５４１３０６；５５５０１１１；５５６３２５３；５５７１７９９；５５８７３６１；５１９４５９９；５５６５５５５；５５２７８９９；５７２１２１８；５６７２６９７及び５６２５０５０が含まれ、その各々は出典明示によりここに取り込まれる。
【０１２６】
リン原子をそこに含まない好適な修飾オリゴヌクレオチド骨格は短鎖アルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は一又は複数の短鎖ヘテロ原子又は複素環ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）を有するもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；及び混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分部分を有する他のものが含まれる。このようなオリゴヌクレオチドの調製を教唆する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許５０３４５０６；５１６６３１５；５１８５４４４；５２１４１３４；５２１６１４１；５２３５０３３；５２６４５６２；５２６４５６４；５４０５９３８；５４３４２５７；５４６６６７７；５４７０９６７；５４８９６７７；５５４１３０７；５５６１２２５；５５９６０８６；５６０２２４０；５６１０２８９；５６０２２４０；５６０８０４６；５６１０２８９；５６１８７０４；５６２３０７０；５６６３３１２；５６３３３６０；５６７７４３７；５７９２６０８；５６４６２６９及び５６７７４３９が含まれ、その各々は出典明示によりここに取り込まれる。
【０１２７】
他の好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドでは、糖とヌクレオシド間結合の双方、つまりヌクレオチド単位の骨格が新規な基と置換される。ベース単位は適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。一つのそのようなオリゴマー化合物である、優れたハイブリダイゼーション特性を持つことが示されているオリゴヌクレオチド擬態体はペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格はアミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格と置き換えられている。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を教唆する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許５５３９０８２；５７１４３３１；及び５７１９２６２が含まれ、その各々は出典明示によりここに取り込まれる。ＰＮＡ化合物の更なる教示はNielsen等, Science, 1991, 254, 1497-1500に見出すことができる。
好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドはホスホロチオネート骨格及び／又はヘテロ原子骨格、特に-ＣＨ２-ＮＨ-Ｏ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-Ｎ(ＣＨ３)-Ｏ-ＣＨ２-［メチレン(メチルイミノ)又はＭＭＩ骨格として知られる］、-ＣＨ２-Ｏ-Ｎ(ＣＨ３)-ＣＨ２-、-ＣＨ２-Ｎ(ＣＨ３)-Ｎ(ＣＨ３)-ＣＨ２-、及び上で参照した米国特許第５４８９６７７号に記載された-Ｏ-Ｎ(ＣＨ３)-ＣＨ２-ＣＨ２-［ここで天然ホスホジエステル骨格は-Ｏ-Ｐ-Ｏ-ＣＨ２-と表される］及び上で参照された米国特許第５６０２２４０号のアミド骨格を含む。また好ましいものは上で参照した米国特許第５０３４５０６号のモルホリノ骨格構造を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０１２８】
修飾オリゴヌクレオチドはまた一又は複数の置換糖部分を含みうる。好適なオリゴヌクレオチドは２'位に次のものの一つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ-アルキル、Ｓ-アルキル、又はＮ-アルキル；Ｏ-アルケニル、Ｓ-アルケニル又はＮ-アルケニル；Ｏ-アルキニル、Ｓ-アルキニル又はＮ-アルキニル；又はＯ-アルキル-Ｏ-アルキルを含み、ここでアルキル、アルケニル及びアルキニルは置換又は非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルでありうる。特に好ましいものはＯ[(ＣＨ２)ｎＯ]ｍＣＨ３、Ｏ(ＣＨ２)ｎＯＣＨ３、Ｏ(ＣＨ２)ｎＮＨ２、Ｏ(ＣＨ２)ｎＣＨ３、Ｏ(ＣＨ２)ｎＯＮＨ２、及びＯ(ＣＨ２)ｎＯＮ[(ＣＨ２)ｎＣＨ３]２であり、ここでｎ及びｍは１から約１０である。他の好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは２'位に次のものの一つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ-アルカリル又はＯ-アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善する基、オリゴヌクレオチドの薬理的性質を改善する基、及び同様な性質を持つ他の置換基。好適な修飾は２'-メトキシエトキシ(２'-Ｏ-(２-メトキシエチル)又は２'-ＭＯＥとしても知られている２'-Ｏ-ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３)（Martin等, Helv. Chim. Acta., 1995, 78, 486-504）、つまりアルコキシアルコキシ基を含む。更に好適な修飾は、以下の実施例に記載されているように２'-ジメチルアミノオキシエトキシ、つまり２'-ＤＭＡＯＥとしても知られているＯ(ＣＨ２)２ＯＮ(ＣＨ３)２基、及び２'-ジメチルアミノエトキシエトキシ（２'-Ｏ-ジメチルアミノエトキシエチル又は２'-ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）、つまり２'-Ｏ-ＣＨ２-Ｏ-ＣＨ２-Ｎ(ＣＨ２)を含む。
【０１２９】
更に好適な修飾は、２'-ヒドロキシル基が糖環の３'又は４'炭素原子に結合され二環糖部分を形成する固定核酸(Locked Nucleic Acids: ＬＮＡｓ)を含む。結合は好ましくはｎが１又は２である２'酸素原子と４'炭素原子を架橋するメチレン（-ＣＨ２-）ｎ基である。ＬＮＡｓ及びその製造方法は国際公開９８／３９３５２及び国際公開９９／１４２２６に記載されている。
他の好適な修飾は２'-メトキシ(２'-Ｏ-ＣＨ３)、２'-アミノプロポキシ(２'-ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２)、２'-アリル(２'-ＣＨ２-ＣＨ=ＣＨ２)、２'-Ｏ-アリル(２'-Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ=ＣＨ２)及び２'-フルオロ(２'-Ｆ)を含む。２'-修飾はアラビノ（上）位置又はリボ（下）位置においてでありうる。好適な２'-アラビノ修飾は２'-Ｆである。同様の修飾はまたオリゴヌクレオチドの他の位置、特に３'末端ヌクレオチドの糖の３'位又は２'−５'結合オリゴヌクレオチド及び５'末端ヌクレオチドの５'位になすことができる。オリゴヌクレオチドはまたペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖擬態体を有しうる。そのような修飾糖構造の調製を教唆する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許４９８１９５７；５１１８８００；５３１９０８０；５３５９０４４；５３９３８７８；５４４６１３７；５４６６７８６；５５１４７８５；５５１９１３４；５５６７８１１；５５７６４２７；５５９１７２２；５５９７９０９；５６１０３００；５６２７０５３；５６３９８７３；５６４６２６５；５６５８８７３；５６７０６３３；５７９２７４７；及び５７００９２０が含まれ、その各々は出典明示により全体がここに取り込まれる。
【０１３０】
オリゴヌクレオチドにはまた核酸塩基（当該分野ではしばしば単に「塩基」と称される）の修飾又は置換が含まれうる。ここで使用される場合、「未修飾の」又は「天然の」核酸塩基にはプリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）及びピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核酸塩基には、他の合成及び天然核酸塩基、例えば５-メチルシトシン（５-me-Ｃ）、５-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２-アミノアデニン、６-メチル及び他のアデニン及びグアニンのアルキル誘導体、２-プロピル及び他のアデニン及びグアニンのアルキル誘導体、２-チオウラシル、２-チオチミン及び２-チオシトシン、５-ハロウラシル及びシトシン、５-プロポニル（-Ｃ≡Ｃ-ＣＨ３又はＣＨ２-Ｃ≡ＣＨ）ウラシル及びシトシン及び他のピリミジン塩基のアルキル誘導体、６-アゾウラシル、シトシン及びチミン、５-ウラシル（プソイドウラシル）、４-チオウラシル、８-ハロ、８-アミノ、８-チオール、８-チオアルキル、８-ヒドロキシル及び他の８-置換アデニン類及びグアニン類、５-ハロ、特に５-ブロモ、５-トリフルオロメチル及び他の５-置換ウラシル類及びシトシン類、７-メチルグアニン及び７-メチルアデニン、２-Ｆ-アデニン、２-アミノ-アデニン、８-アザグアニン及び８-アザアデニン、７-デアザグアニン及び７-デアザアデニン及び３-デアザグアニン及び３-デアザアデニンが含まれる。更なる修飾核酸塩基には、三環系ピリミジン類、例えばフェノキサジンシチジン(１Ｈ-ピリミド[５,４-ｂ][１,４]ベンゾキサジン-２(３Ｈ)-オン)、フェノチアジンシチジン(１Ｈ-ピリミド[５,４-ｂ][１,４]ベンゾチアジン-２(３Ｈ)-オン)、Ｇ-クランプ、例えば置換フェノキサジンシチジン（例えば９-(２-アミノエトキシ)-Ｈ-ピリミド[５,４-ｂ][１,４]ベンゾキサジン-２(３Ｈ)-オン）、カルバゾールシチジン(２Ｈ-ピリミド[４,５-ｂ]インドール-２-オン)、ピリドインドールシチジン(Ｈ-ピリド[３',２'：４,５]ピロロ[２,３-ｄ]ピリミジン-２-オン)が含まれる。修飾核酸塩基にはまたプリン又はピリミジン塩基が他の複素環で置き換えられているもの、例えば７-デアザ-アデニン、７-デアザグアノシン、２-アミノピリジン及び２-ピリドンが含まれうる。更なる核酸塩基には米国特許第３６８７８０８号に開示されているもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, ８５８-８５９頁, Kroschwitz, J.I.編 John Wiley ＆ Sons, 1990に開示されているもの、及びEnglisch等, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30,613に開示されているものが含まれる。これらの核酸塩基のある種のものは本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるのに特に有用である。これらには、５-置換ピリミジン、６-アザピリミジン及びＮ-２、Ｎ-６及びＯ-６置換プリンで、２-アミノプロピルアデニン、５-プロピニルウラシル及び５-プロピニルシトシンを含むものが含まれる。５-メチルシトシン置換は０．６−１．２℃だけ核酸二重安定性を増大させることが知られており（Sanghvi等, Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp.276-278）、より詳細には２'-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合には、好適な塩基置換である。修飾核酸塩基の製造を教唆する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国��許３６８７８０８；並びに米国特許４８４５２０５；５１３０３０２；５１３４０６６；５１７５２７３；５３６７０６６；５４３２２７２；５４５７１８７；５４５９２５５；５４８４９０８；５５０２１７７；５５２５７１１；５５５２５４０；５５８７４６９；５５９４１２１；５５９６０９１；５６１４６１７；５６４５９８５；５８３０６５３；５７６３５８８；６００５０９６；５６８１９４１及び５７５０６９２が含まれ、その各々は出典明示によりここに取り込まれる。
【０１３１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの他の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布又は細胞取り込みを亢進する一又は複数の部分又はコンジュゲートをオリゴヌクレオチドに化学的に結合させることを含む。本発明の化合物は第１級又は第２級ヒドロキシル基のような官能基に共有結合したコンジュゲート基を含む。本発明のコンジュゲート基には、介入物（インターカレーター）、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬理的性質を増強する基、及びオリゴマーの薬物動態学的性質を増強する基が含まれる。典型的なコンジュゲート基には、コレステロール、脂質、カチオン脂質、リン脂質、カチオン性リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び染料が含まれる。この発明の文脈における薬理学的性質を増強する基には、オリゴマー取り込みを改善し、分解に対するオリゴマーの耐性を亢進し、及び／又はＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーションを補強する基が含まれる。この発明の文脈における薬物動態学的性質を増強する基には、オリゴマー取り込み、分散、代謝又は排出を改善する基が含まれる。コンジュゲート部分には限定されるものではないが、脂質分子、例えばコレステロール部分（Letsinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556)、コール酸（Manoharan等, Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1063）、チオエーテル、例えばヘキシル-S-トリチルチオール（Manoharan等, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660-306-309; Manoharan等, Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770）、チオコレステロール（Oberhauser等, Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538）、脂肪族鎖、例えばドデカンジオール又はウンデシル残基（Saison-Behmoaras等, EMBOJ., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov等, FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk等, Biochimie, 1993, 75, 49-54）、リン脂質、例えばジ-ヘキサデシル-rac-グリセロール又はトリエチル-アンモニウム１,２-ジ-Ｏ-ヘキサデシル-rac-グリセロ-３-Ｈ-ホスホナート（Manoharan等, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea等, Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783)、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Manoharan等, Nucleosides ＆ Nucleotides, 1995, 14, 969-973）、又はアダマンタン酢酸（Manoharan等、Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654）、パルミチル部分（Mishra等, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237）、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分が含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドはまた活性な薬物物質、例えばアスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、(Ｓ)-(＋)-プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２,３,５-トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメチシン、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗菌剤又は抗生物質にコンジュゲートすることができる。オリゴヌクレオチド-薬剤コンジュゲート及びその製造方法は米国特許出願第０９／３３４１３０号（１９９９年６月１５日出願）及び米国特許４８２８９７９；４９４８８８２；５２１８１０５；５５２５４６５；５５４１３１３；５５４５７３０；５��５２５３８；５５７８７１７；５５８０７３１；５５８０７３１；５５９１５８４；５１０９１２４；５１１８８０２；５１３８０４５；５４１４０７７；５４８６６０３；５５１２４３９；５５７８７１８；５６０８０４６；４５８７０４４；４６０５７３５；４６６７０２５；４７６２７７９；４７８９７３７；４８２４９４１；４８３５２６３；４８７６３３５；４９０４５８２；４９５８０１３；５０８２８３０；５１１２９６３；５２４１１３６；５０８２８３０；５１１２９６３；５２１４１３６；５２４５０２２；５２５４４６９；５２５８５０６；５２６２５３６；５２７２２５０；５２９２８７３；５３１７０９８；５３７１２４１；５３９１７２３；５４１６２０３；５４５１４６３；５５１０４７５；５５１２６６７；５５１４７８５；５５６５５５２；５５６７８１０；５５７４１４２；５５８５４８１；５５８７３７１；５５９５７２６；５５９７６９６；５５９９９２３；５５９９９２８及び５６８８９４１に記載され、その各々は出典明示によりここに取り込まれる。
【０１３２】
与えられた化合物の全ての位置を一様に修飾する必要はなく、実際、一を超える上述の修飾を単一化合物中に又はオリゴヌクレオチド内の単一ヌクレオシドにさえ導入することができる。本発明はまたキメラ化合物であるアンチセンス化合物を含む。本発明の文脈における「キメラ」アンチセンス化合物又は「キメラ」は、それぞれが少なくとも一のモノマー単位、つまりオリゴヌクレオチド化合物の場合にはヌクレオチドからなる２以上の化学的に区別される領域を含むアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは典型的にはオリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ分解に対する増大した耐性、増大した細胞性取り込み、及び／又は標的核酸に対する増大した結合親和性を付与するようにオリゴヌクレオチドが修飾されている少なくとも一の領域を含む。オリゴヌクレオチドの更なる領域はＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブロッドを切断可能な酵素の基質となりうる。例を挙げると、ＲＮアーゼＨはＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。故に、ＲＮアーゼＨの活性化はＲＮＡ標的の開裂を生じ、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効果を大きく向上させる。従って、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオネートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、キメラオリゴヌクレオチドが使用される場合、より短いオリゴヌクレオチドで同等の結果をしばしば得ることができる。本発明のキメラアンチセンス化合物は上述の二以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド及び／又はオリゴヌクレオチド擬態体の複合構造体として形成されてもよい。好適なキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ耐性を付与するために３'末端に少なくとも一の２'修飾糖（好ましくは２'-Ｏ-(ＣＨ２)２-Ｏ-ＣＨ３）とＲＮアーゼＨ活性を付与するために少なくとも４の隣接した２'-Ｈ糖を持つ領域を含む。このような化合物はまた当該分野においてハイブリッド又はギャプマー(gapmers)とも呼ばれている。好適なギャプマーは少なくとも４の隣接した２'-H糖を持つ少なくとも一の領域で分離した３'末端と５'末端２'修飾糖（好ましくは２'-Ｏ-(ＣＨ２)２-Ｏ-ＣＨ３）の領域を持ち、好ましくはホスホロチオネート骨格結合を含む。このようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許第５０１３８３０；５１４９７９７；５２２０００７；５２５６７７５；５３６６８７８；５４０３７１１；５４９１１３３；５５６５３５０；５６２３０６５；５６５２３５５；５６５２３５６；及び５７００９２２が含まれ、これらのそれぞれが出典明示によりここに取り込まれる。
【０１３３】
本発明において使用されるアンチセンス化合物は固相合成のよく知られた技術によって簡便かつ常套的に製造することができる。そのような合成のための装置は、例えばApplied Biosystems (Foster City, Calif.)を含む幾つかのメーカーによって販売されている。当該分野で知られているそのような合成のための任意の他の手段を付加的に又は別に使用してもよい。オリゴヌクレオチド、例えばホスホロチオネート及びアルキル化誘導体を調製するために類似の技術を使用することはよく知られている。本発明の化合物は、また、取り込み、分散及び／又は吸収を補助するための他の分子、分子構造又は化合物混合物、例えばリポソーム、レセプター標的分子、経口、直腸、局所適用又は他の製剤と、混合、カプセル化、コンジュゲート又はその他、組み合わされてもよい。そのような取り込み、分散及び／又は吸収を補助する製剤の調製を教示する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許第５１０８９２１；５３５４８４４；５４１６０１６；５４５９１２７；５５２１２９１；５５４３１５８；５５４７９３２；５５８３０２０；５５９１７２１；４４２６３３０；４５３４８９９；５０１３５５６；５１０８９２１；５２１３８０４；５２２７１７０；５２６４２２１；５３５６６３３；５３９５６１９；５４１６０１６；５４１７９７８；５４６２８５４；５４６９８５４；５５１２２９５；５５２７５２８；５５３４２５９；５５４３１５２；５５５６９４８；５５８０５７５；及び５５９５７５６が含まれ、これらのそれぞれが出典明示によりここに取り込まれる。
【０１３４】
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、国際公開９０／１００４８に記載されているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への親和性を向上させる他の部分、例えばポリ-(Ｌ-リジン)に共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。さらにまた、エリプチシン等の挿入剤及びアルキル化剤又は金属錯体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変してもよい。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ４-媒介ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子転換方法により、又はエプスタイン-バーウイルスなどの遺伝子転換ベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入される。好ましい方法では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含む細胞は、インビボ又はエキソビボで組換えレトロウイルスベクターに接触させる。好適なレトロウイルスベクターは、これらに限られないが、マウスレトロウイルスＭ-ＭｕＬＶから誘導されるもの、Ｎ２（Ｍ-ＭｕＬＶから誘導されたレトロウイルス）、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと命名されたダブルコピーベクター（国際公開９０／１３６４１参照）を含む。
【０１３５】
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開９１／０４７５３に記載されているように、リガンド結合分子との複合体の形成により標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子は、これらに限られないが、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドを含む。好ましくは、リガンド結合分子の複合体形成は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する、あるいはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合体の細胞への侵入を阻止する能力を実質的に阻害しない。
あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開９０／１０４４８に記載されたように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で分解される。
【０１３６】
アンチセンス又はセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、通常は少なくとも約５ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、又は１０００ヌクレオチド長であり、この文脈の「約」という用語は、参照ヌクレオチド配列長にその参照長の１０％を加えるか又は減じたものを意味する。
また、プローブをＰＣＲ技術に用いて、密接に関連したポリペプチドコード化配列の同定のための配列のプールを作成することができる。
また、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、そのポリペプチドをコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリダイゼーションプローブの作成にも用いることができる。ここに提供されるヌクレオチド配列は、インサイツハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対する連鎖分析、及びライブラリーでのハイブリダイゼーションスクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。
【０１３７】
ポリペプチドをアッセイに使用して、ポリペプチドとの結合性相互作用に関与する他のタンパク質又は分子を同定することができる。このような方法により、レセプター／リガンド結合性相互作用の阻害剤を同定することができる。また、このような結合性相互作用に含まれるタンパク質は、結合性相互作用のペプチド又は小分子阻害剤のスクリーニングに用いることができる。スクリーニングアッセイは、天然ポリペプチド又はポリペプチドのレセプターの生物学的活性を模倣するリード化合物を見出すために設計することができる。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングを施すことができるアッセイを含み、それらアッセイを特に小分子薬剤候補を同定することに適したものにする。考慮される小分子は、合成有機化合物又は無機化合物を含む。アッセイは、この分野で良く特徴付けられているタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。
また、ポリペプチド又はその修飾型をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物のいずれかを産生することに使用でき、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えばマウス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施形態では、ポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を作製するために使用するゲノム配列及び確立された技術に基づいて、ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができる。トランスジェニック動物、特にマウス又はラット等を産生する方法は、当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第４７３６８６６号や第４８７０００９号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのポリペプチド導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたポリペプチドをコードする導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物はポリペプチドをコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理学的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。本発明のこの態様においては、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病理学的状態の発症率が低ければ、病理学的状態に対する治療上の処置の可能性が示される。
【０１３８】
あるいは、ポリペプチドの非ヒト相同体は、動物の胚性細胞に導入されたポリペプチドをコードする変更ゲノムＤＮＡと、ポリペプチドをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、ポリペプチドをコードする欠陥又は変更遺伝子を有する遺伝子「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、ポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失させたり、組み込みをモニターしたりするために使用する選択性マーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ(５’と３’末端の両方)を数キロベース含む［例えば、相同組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと］。ベクターを胚幹細胞株に(例えばエレクトロポレーションによって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する［例えば、Li等, Cell, 69:915(1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson編 (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照のこと］。その後、キメラ胚を適切な偽妊娠の雌性乳母動物に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物を作り出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ポリペプチドの欠乏によるある種の病理的状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付けられる。
また、ポリペプチドをコードする核酸は遺伝子治療にも使用できる。遺伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的に有効な遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が細胞内に導入される。「遺伝子治療」とは、１回の処理により継続的効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの１回又は繰り返し投与を含む遺伝子治療薬の投与の両方を含む。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取り込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それが阻害剤として作用する細胞中に移入できることは既に示されている（Zamecnik等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 [1986]）。オリゴヌクレオチドは、それらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによって取り込みを促進するように修飾してもよい。
【０１３９】
生細胞に核酸を導入するための種々の技術が存在する。これらの技術は、核酸が培養細胞にインビトロで、あるいは意図する宿主の細胞においてインビボで移入されるかに応じて変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などを含む。現在好ましいインビボ遺伝子移入技術は、ウイルス（典型的にはレトロウイルス）ベクターでのトランスフェクション及びウイルス被覆タンパク質-リポソーム媒介トランスフェクションである（Dzau等, Trends  in Biotechnology 11, 205-210(1993)）。幾つかの状況では、核酸供給源を、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の標的細胞を標的化する薬剤とともに提供するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク質又はその断片、サイクルにおいてインターナリゼーションを受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が、標的化及び／又は取り込みの促進のために用いられる。レセプター媒介エンドサイトーシス技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); 及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)によって記述されている。遺伝子作成及び遺伝子治療のプロトコールの概説については、Anderson等, Science 256, 808-813 (1992)を参照のこと。
ここに記載したポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子は、染色体の同定に有用である。この点において、実際の配列データに基づく染色体マーキング試薬は殆ど利用可能ではないため、目下のところ新規な染色体マーカーの同定の必要である。本発明の各核酸分子は染色体マーカーとして使用できる。
本発明のポリペプチド及び核酸分子は組織タイピングの診断に使用でき、ポリペプチドは、その他の組織と比較して１つの組織において、好ましくは同じ組織型の正常組織に比較して疾患性組織において特異的に発現する。核酸分子には、ＰＣＲ、ノーザン分析、サザン分析及びウェスタン分析のプローブ生成のための用途が見出されるであろう。
【０１４０】
この発明は、ポリペプチド（アンタゴニスト）の効果を防ぐものを同定するための化合物をスクリーニングする方法を含む。アンタゴニスト薬候補に関するスクリーニングアッセイは、ここで同定された遺伝子によってコードされたポリペプチドと結合又は複合化する、さもなければコードされているポリペプチドと他の細胞タンパク質の相互作用を妨害する化合物、例えば、細胞からのポリペプチドの発現を阻害するものを含む化合物を同定するように設計されている。そのようなスクリーニングアッセイには、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングを施すことができるアッセイが含まれ、それらアッセイを特に小分子薬剤候補の同定に適したものにする。
このアッセイは、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、免疫アッセイ、そして細胞ベースアッセイを含む、当該分野で良く特徴付けられている種々の形式で行うことができる。
アンタゴニストに関する全てのアッセイは、薬候補をここで同定された核酸によってコードされているポリペプチドと、これら両成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間にわたって接触させることを必要とする点で共通である。
【０１４１】
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施形態では、ポリペプチド又は薬候補が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化すべきポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体の使用によって検出できる。
【０１４２】
候補化合物が相互作用するがポリペプチドに結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィーのカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質-タンパク質相互作用は、Chevray及びNathans Proc.Natl. Acad. Sci. USA,89:5789-5793 (1991)に開示されているようにして、Fields及び共同研究者等［Fiels及びSong, Nature(London),340,:245-246(1989)；Chien等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)］に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより監視することができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系（一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（MATCHMAKER(商品名)）は、Clontechから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
【０１４３】
ここで同定されたポリペプチドをコードする遺伝子と他の細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験できる：通常は反応混合物は、遺伝子産物と細胞内又は細胞外成分を、それら２つの生成物が相互作用及び結合する条件下及び時間で調製される。候補化合物の結合阻害能力を試験するために、反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される。さらに、プラシーボを第３の反応混合物に添加してポジティブコントロールを提供してもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合（複合体形成）は上記のように監視される。試験化合物を含有する反応混合物ではなくコントロール反応における複合体の形成は、試験化合物が試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を阻害することを示す。
アンタゴニストを検定するために、ポリペプチドを、特定の活性についてスクリーニングされる化合物とともに細胞に添加してもよく、ポリペプチド存在下で対象とする活性を阻害する当該化合物の能力が、当該化合物がポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。あるいは、アンタゴニストは、ポリペプチド及び潜在的アンタゴニストを、膜結合ポリペプチドレセプター又はコード化されたレセプターと、競合的阻害アッセイに適した条件下で結合させることにより検出してもよい。ポリペプチドは、放射活性等で標識でき、レセプターに結合したポリペプチド分子の数を潜在的アンタゴニストの有効性を決定するのに使用できる。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパニング及びＦＡＣＳソーティングにより同定できる。Coligan等, Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991)。好ましくは発現クローニングが用いられ、そこではポリアデニル化ＲＮＡがポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このＲＮＡから生成されたｃＤＮＡライブラリがプールに分配され、ＣＯＳ細胞又は他のポリペプチドに反応性でない細胞の形質移入に使用される。スライドガラスで成長させた形質移入細胞を、標識したポリペプチドへ曝露する。ポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の包含を含む種々の手段で標識できる。固定及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフ分析を施す。ポジティブプールを同定し、対話型サブプール化及び再スクリーニング法を用いてサブプールを調製して再形質移入し、最終的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生成する。
【０１４４】
レセプター同定の代替的方法として、標識したポリペプチドをレセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調製物に光親和性結合させることができる。架橋材料をＰＡＧＥで分離し、Ｘ線フィルムに曝す。レセプターを含む標識複合体を励起し、ペプチド断片に分離し、タンパク質マイクロシークエンシングを施してよい。マイクロシークエンシングから得たアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするディジェネレートオリゴヌクレオチドプローブの組の設計に用いられる。
アンタゴニストの他の検定では、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物を、候補化合物の存在下で標識ポリペプチドとともにインキュベートする。次いで、この相互作用を促進又は阻止する化合物の能力を測定する。
潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限られないが、ポリ-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、レセプターを認識するが効果を与えず、よってポリペプチドの作用を競合的に阻害するポリペプチドの変異形態であってもよい。
【０１４５】
他の潜在的なアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ作成物であり、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリダイゼーションしてタンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、三重螺旋形成又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法はともに、ポリヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡへの結合に基づく。例えば、ここでの成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５'コード化部分は、約１０から４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計に使用することができる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計され（三重螺旋−Lee等, Nucl, Acid Res., 6: 3073 (1979); Cooney等, Science, 241: 456 (1988); Dervan等, Science, 251: 1360 (1991)参照）、それによりポリペプチドの転写及び生成を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリダイゼーションしてｍＲＮＡ分子のポリペプチドへの翻訳を阻止する（アンチセンス−Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)）。また上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に輸送され、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡをインビボで発現させて、ポリペプチドの産生を阻害することもできる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０１４６】
潜在的アンタゴニストは、ポリペプチドの活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりポリペプチドの正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチド有機又は無機化合物を含む。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーション、次いでヌクレオチド鎖切断的開裂により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994)及びＰＣＴ公報、国際公開 ９７／３３５５１（１９９７年９月１８日公開）を参照。
転写阻害に用いられる三重螺旋形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスティン(Hoogsteen)塩基対則を介する三重螺旋形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのかなり大きな伸張を必要とする。さらなる詳細は、例えば、上掲のＰＣＴ公報、国際公開９７／３３５５１を参照。
これらの小分子は、上記で議論したスクリーニングアッセイの一又は複数の任意のものにより及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
【０１４７】
単離されたポリペプチド-コード化核酸は、ここに記載されているような当該分野で良く知られている技術を用いて、組み換え的にポリペプチドを生成するために用いることが可能である。次に、生成されたポリペプチドは、ここに記載されているような当該分野で良く知られている技術を用いて、抗体を生成するために用いることが可能である。
ここで同定されるポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイによって同定された他の分子は、種々の疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
ポリペプチドが細胞内にあり、全抗体が阻害剤として用いられる場合、取り込める抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームも抗体、又は抗体断片を細胞に搬送するために使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)参照。
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞障害性薬、サイトカイン、化学療法剤、又は成長阻害剤のようなその機能を高める薬剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
【０１４８】
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【実施例】
【０１４９】
試薬
色素生産性基質Ｓ２３６６はDiaPharma Group, Inc. (West Chester, OH)、Ｌｙｓ-プラスミノーゲンはHaematologic Technologies Inc. (Essex Junction, VT)から、および組織型プラスミノーゲン活性化因子(ｔ-ＰＡ)はGenentech, Inc. (South San Francisco, CA)から入手した。血清がない条件下でチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞において、発現され、ＨｉＴｒａｐセファロースＳＰクロマトグラフィにより精製されたプロＨＧＦは、David Kahn (Genentech)により入手した。記述される(３４)ように、残基Ｖａｌ３７３−Ａｒｇ４０７を含有するＨＧＦＡはバキュロウイルス発現系において、発現され、精製された。ヒトの２９３細胞において、発現される、精製されたヒト組換えＦＶＩＩは、Mark O'Connell (Genentech)から贈与されたものであり、最近記述されている(４２)。記述される(４３)ように、基本的に、ジオレイル1,2-ジアシル-ｓｎ-グリセロ-3-(ホスホ-Ｌ-セリン)(ＰＳ)およびオレオイル1,2-ジアシル-ｓｎ-グリセロ-3-ホスホコリン(ＰＣ)(Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, AL)は、ＰＣＰＳベシクル(７:３モル比)を生産するために用いた。分子量マーカーは、ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２およびＭｕｌｔｉＭａｒｋ標準物質(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いた。
【０１５０】
ヘプシンの発現及び精製
I.M.A.G.E. consortium (ATCC, Manassas, VA)から入手の完全長ヘプシンのｃＤＮＡは、限定エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ (New England Biolabs Inc. Beverly, MA)によって、消化し、真核生物発現ベクターｐＲＫ５Ｅに挿入した。分泌されたＨｉｓタグ付加ヘプシンｃＤＮＡは、ヒトヘプシンの細胞外ドメイン(Ａｒｇ４５−Ｌｅｕ４１７：番号付けシステムSomoza 等, 2003(５)に従う)をコードするｃＤＮＡとヒトＨＧＦ(アミノ酸Ｍｅｔ１−Ｇｌｙ３１)のシグナル配列をコードするｃＤＮＡを融合することによって、構築した。加えて、真核生物発現ベクターｐＣＭＶ.ＰＤ５に挿入された最終的なｃＤＮＡコンストラクトとＬｅｕ４１７の後のＣ末端にＨｉｓ８タグを付加した。基本的に、野生型ｓＨＡＩ-１Ｂの産生について記述される(３４)ように、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞一時的発現システムでヘプシンを発現させ、ニッケル-ニトリロトリ酢酸(Ｎｉ-ＮＴＡ)親和性クロマトグラフィによって精製した。
【０１５１】
ｓＨＡＩ-1Ｂ、ｓＨＡＩ-1Ｂ突然変異体およびｓＨＡＩ-２の発現および精製
既に記述される(３４)ように、全ての細胞外ドメインを含有するＨＡＩ-１Ｂの可溶型(ｓＨＡＩ-１Ｂ)はＣＨＯ細胞一時的発現システムで生産して、精製した。部位特異的突然変異を用いて、ＫＤ１(Ａｒｇ２６０)およびＫＤ２(Ｌｙｓ４０１)のＰ１残基をＡｌａにそれぞれ変異させ、結果として生じるタンパク質、ｓＨＡＩ-１Ｂ(Ｒ２６０Ａ)およびｓＨＡＩ-１Ｂ(Ｋ４０１Ａ)を、記述される(３４)ように、発現させて、精製した。
完全長ＨＡＩ-２は、オリゴｄＴ／ＮｏｔＩ部位をプライマーおよび二本目の鎖のＳａｌＩ部位を有するアダプターとして用いて、ヒト胎児肺ＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリ (BD Biosciences Clontech, Palto Alto, CA)から入手した。ｃＤＮＡはＳａｌＩおよびＮｏｔＩによって消化し、２．８ｋｂより大きいｃＤＮＡはｐＲＫ５Ｄに挿入した。ヒト肺ｃＤＮＡ／ｐＲＫ５Ｄライブラリの一本鎖ＤＮＡは、標準物質分子生物学的方法を用いて生成した。リバースプライマ(５'-ＴＴＴＣＴＴＧＡＧＧＣＡＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧ-３')は、一本鎖ｃＤＮＡプールにアニールし、Ｔ７又はＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸展させた。大腸菌に合成された二本鎖ＤＮＡを形質移入し、コロニーを標準的なフィルタハイブリダイゼーション法を使用してスクリーニングした。挿入サイズは、ＰＣＲおよび制限エンドヌクレアーゼ消化（ＸｂａＩ）によって分析した。ＨＡＩ-２完全長クローンを同定して、ＤＮＡ塩基配列決定によって確認した。ＨＡＩ-２の可溶型(ｓＨＡＩ-２)は、ＨＡＩ-２の細胞外ドメイン(Ａｌａ２８−Ｌｙｓ１９７、番号付けシステムKawaguchi 等, 1997(３９)に従う)をコードするｃＤＮＡを構築して、Ｇｌｙスペーサを有するＣ末端Ｈｉｓ８タグを付加することによって産生した。次いで、得られたｃＤＮＡを、ｐＶＬ１３９３ (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)から得られるバキュロウイルス発現ベクターに挿入した。基本的に、ＨＧＦβ鎖の産生について記述される(４４)ように、ｓＨＡＩ-２は、バキュロウイルス発現系において、発現させ、Ｎｉ-ＮＴＡ親和性クロマトグラフィによって精製した。タンパク質濃度は定量的アミノ酸分析で測定した。
【０１５２】
ＦＶＩＩおよびプラスミノーゲン活性化アッセイ
０．１１ｍｇ／ｍｌ濃度のＦＶＩＩを、２３０ｎＭのヘプシンを含有する３０ｍＭ トリス-ＨＣｌ、ｐＨ８．４、３０ｍＭ イミダゾール、０．５ｍＭ ＰＣＰＳ溶媒存在下での２００ｍＭ ＮａＣｌ(トリス緩衝液)および５ｍＭ ＣａＣｌ２によって、３７℃で活性化した。異なる時間点で採取した反応分割量を、４−２０％の勾配ゲル(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いてＳＤＳ-ＰＡＧＥ(還元条件)によって分析した。ゲルはＳｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎ(Invitrogen)にて染色した。
０．１２ｍｇ／ｍｌのプラスミノーゲンを、４０ｎＭのヘプシン又は４０ｎＭのｔ-ＰＡ(ポジティブコントロール)を含有する２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ(Ｈｅｐｅｓバッファ)にて、３７℃でインキュベートした。ＦＶＩＩ活性化アッセイについて記述されるように、異なる時間点で採取した反応分割量をＳＤＳ-ＰＡＧＥによって、分析した。
【０１５３】
ヘプシンおよびＨＧＦＡによるプロＨＧＦ活性化
プロＨＧＦ(０．３ｍｇ／ｍｌ)を、４０ｎＭのヘプシンを有するＨｅｐｅｓバッファ又は４０ｎＭのＨＧＦＡを有するＨｅｐｅｓバッファ中で３７℃で４時間インキュベートし、後の使用まで−２０℃で保存した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥによる消化された材料、ＨＧＦｈｅｐｓｉｎおよびＨＧＦＨＧＦＡの分析により、９５％より多くのプロＨＧＦが２-鎖ＨＧＦに転換したことが示された。
記述される(３４、４５)ように、プロＨＧＦ活性化アッセイおよびプロＨＧＦの１２５Ｉ-標識を行った。簡潔には、０．０５ｍｇ／ｍｌの１２５Ｉ標識プロＨＧＦを含有するＨｅｐｅｓバッファを、漸増濃度(０．１６−４０ｎＭ)のヘプシン又はＨＧＦＡとともに３７℃でインキュベートした。４時間後、分割量を採取し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ( ４−２０％の勾配ゲル) (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)によって分析した。阻害研究のために、ヘプシン(１５ｎＭ)を１μＭのｓＨＡＩ-１Ｂ、ｓＨＡＩ-１Ｂ(Ｋ４０１Ａ)、ｓＨＡＩ-１Ｂ(Ｒ２６０Ａ)又はｓＨＡＩ-２とともにＨｅｐｅｓバッファ中で３７℃でインキュベートした。４時間後、試料をＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分析し、Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎ(Invitrogen)によって染色した。
【０１５４】
酵素阻害アッセイ
アッセイ条件は、色素生産性基質Ｓ２３６６(Ｌ-ピログルタミル-Ｌ-プロイル-Ｌ-アルギニン-ｐ-ニトロアニリンヒドロクロライド)を用いたSomoza 等 2003(５)により記述されるものと類似である。ヘプシン(終濃度０．４ｎＭ)を、漸増濃度のインヒビターとともにトリスバッファ中で室温で３０分間インキュベートした。基質Ｓ２３６６を添加し、４０５ｎｍの吸光度の変化を動態学的マイクロプレート読み取り機(Molecular Devices, Sunnyvale CA)にて測定した。この最終反応混合物中のヘプシン及びＳ２３６６の濃度はそれぞれ、０．４ｎＭおよび０．２ｍＭ(Ｋｍ＝０．２ｍＭを測定)であった。阻害活性は、阻害されない酵素活性の部分的活性(ｖｉ／ｖ０)として表した。５０％阻害(ＩＣ５０)を示すインヒビター濃度は、４つのパラメータ回帰曲線適合プログラム(Kaleidagraph, Synergy Software, Reading, PA)にデータを合わせることによって算出した。それぞれのインヒビターについて少なくとも３回の独立した実験を行った。
【０１５５】
細胞増殖および移動アッセイ
増殖アッセイは、European Collection of Cell Cultures (CAMR, Centre for Applied Microbiology and Research, Salisbury, Wiltshire, UKから入手したヒト膵臓腺癌細胞株ＢｘＰＣ３を用いて行った。細胞は、１０％ ＦＣＳ (Sigma, St. Louis, MO)、１０ｍＭ ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ グルタミン、ペニシリン-ストレプトマイシン(Invitrogen, Carlsbad, CA)および２５０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８(Invitrogen)を含有しているＲＰＭＩ培養液中で生育した。集密的な細胞層をＰＢＳで洗浄した後、１０ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳにて洗浄し、トリプシンにてインキュベーションの後に取り出した。細胞を、細胞増殖培養液中に再懸濁して、９６ウェル白底のＭＴプレート(Cultur PlateTM, Packard/PerkinElmer, Boston, MA)に播種した(１０，０００−１５，０００細胞／ウェル)。２４時間後、細胞増殖培養液をＲＰＭＩ-０．１％ＢＳＡと置き換えた。さらに２４時間後、培養液を除去し、ＲＰＭＩ-０．１％ＢＳＡ中に様々な濃度のＨＧＦｈｅｐｓｉｎ及びＨＧＦＨＧＦＡを添加し、細胞を７２時間生育させた。次いで、製造業者の指示に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔキット(Promega, Madison, WI)を用いて細胞増殖を定量化した。Ｔｒｏｐｉｘ  ＴＲ７１７マイクロプレート照度計(Berthold 75323, Bad Wildbad, Germany)にて発光を測定した。バックグラウンドの値(ＨＧＦの非存在下での増殖量)を減算した後、ＨＧＦｈｅｐｓｉｎおよびＨＧＦＨＧＦＡの活性を、１００ｎｇ／ｍｌのＨＧＦコントロール調製物(Dr. Ralph Schwall, Genentechから入手)に対するＢｘＰＣ３増殖の割合として表した。
記述される(４４)ように、乳癌細胞株ＭＤＡ-ＭＢ４３５ (ＨＴＢ-１２９, ATCC, Manassas, VA)を用いて細胞移動アッセイを行った。簡単に言うと、無血清培地に懸濁した０．２ｍｌの細胞(０．６−０．８×１０６細胞／ｍｌ)を、１０μｇ／ｍｌのラット尾部コラーゲンタイプＩ (Upstate, Lake Placid, NY)でプレコーティングした２４ウェルトランスウェルプレート(８μｍ細孔径) (HTS MultiwellTM Insert System, Falcon, Franklin Lakes, NJ)の上部チャンバに添加した。ＨＧＦ調製物を、無血清培地中の下部チャンバに添加した。１３−１４時間インキュベーションした後、膜の先端面上の細胞を除去し、基礎側に移動したものを４％パラホルムアルデヒドに固定して、０．５％クリスタルバイオレット溶液にて染色した。細胞を１０％酢酸で溶解し、Ａ５６０をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓマイクロプレート読み取り機にて測定した。ＨＧＦ突然変異体のプロ移動性活性を、ＨＧＦの非存在下での基礎移動を減算した後の、ＨＧＦコントロール調製物に対する割合として表した。
【０１５６】
Ｍｅｔレセプターリン酸化アッセイ
記述される(４４)ように、キナーゼレセプター活性化アッセイ(KIRA)を行った。簡単に言うと、肺上皮癌Ａ５４９細胞(ＣＣＬ-１８５、ＡＴＣＣ、Manassas, VA)を１ウェルにつき５０，０００細胞の密度で、９６ウェルプレートに播いた。３７℃で一晩インキュベーションした後、細胞増殖培養液を除去し、細胞を０．１％ＦＢＳを含有する培養液中で３０〜６０分間おいて、血清欠乏状態にした。０．１％ＦＢＳを含有する培養液中に漸増濃度のＨＧＦｈｅｐｓｉｎ及びＨＧＦＨＧＦＡを添加した。対照として、我々は、切断部位が変異した(Ａｒｇ４９４Ｇｌｕ) ＨＧＦの非切断一本鎖型(ｓｃＨＧＦ)を用いた(４４)。３７℃で１０分インキュベーションした後、培養液を除去し、細胞をプロテアーゼインヒビター反応混液を添加した溶解バッファ(Cell Signaling Technologies, Beverly, MA)にて溶解した。ＢＶ-ＴＡＧ標識４Ｇ１０抗体およびビオチン化抗Ｍｅｔ抗体を細胞溶解物に加えた。１．５〜２時間インキュベーションした後、ストレプトアビジン磁気ビーズ(Dynabeads, Bio Veris)を添加して、４５分間インキュベートした。結合した材料(抗Ｍｅｔ抗体／Ｍｅｔ／抗ホスホチロシン抗体)を有するビーズを、外部から磁石にあてることによって、捕獲した。洗浄工程の後、光源により生成される化学発光シグナルを、Ｂｉｏ  Ｖｅｒｉｓ計測器にて相対的な発光の単位として測定した。各々の実験について、ＨＧＦｈｅｐｓｉｎ、ＨＧＦＨＧＦＡ又はｓｃＨＧＦによるＭｅｔリン酸化を、ＨＧＦコントロール調整物で得られた最大シグナルに対する割合として表した。
【０１５７】
結果
ヘプシンによるプロＨＧＦのタンパク分解処理
全ての細胞外ドメインを含有するヘプシンの可溶型(Ａｒｇ４５−Ｌｅｕ４１７、番号付けシステムSomoza 等, 2003(５)に従う)と、Ｃ末端Ｈｉｓ８タグを、ＣＨＯ細胞において、発現させた。精製工程の間、ヘプシン酵素前駆体は、おそらく自己活性化によって、自然発生的にその２-鎖型に変換した(図１Ａ)(４)。３０ｋＤａ以下のプロテアーゼドメイン(１６３ＩＶＧＧＲＤＴＳＬＧＲ１７３)のＮ末端配列決定によって、予想されたＡｒｇ１６２-Ｉｌｅ１６３ペプチド結合での切断が活性な酵素を生じることが確認された。ヘプシンが、能動的にＦＶＩＩ酵素前駆体を２-鎖ＦＶＩＩａに変換することは(図１Ｂ)、ＦＶＩＩ活性を決定するための細胞表面発現ヘプシンを用いたKazama 等, 1995(９)により報告された実験と一致した。プロＨＧＦに対するヘプシン活性は、１２５Ｉ標識プロＨＧＦの２-鎖ＨＧＦへの変換を測定することによって、調べられた。結果は、プロＨＧＦが濃度依存的な様式でヘプシンにより切断されることが示された(図２Ａ)。ヘプシン活性はＨＧＦＡのものと同等であり(図２Ｂ)、両方の酵素は４ −１３ｎＭ濃度のプロＨＧＦを完全に変換した。同じアッセイシステムにおいて、プロＨＧＦ活性化第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子および血漿カリクレインは、完全にプロＨＧＦを変換するためにはおよそ５−６倍の濃度が必要である(４５)。３６ｋＤａ以下および３９ｋＤａ以下のＨＧＦβ鎖のＮ末端配列決定によって、ヘプシンが予想されたＡｒｇ４９４-Ｖａｌ４９５ペプチド結合でプロＨＧＦをプロセシングしたことを示す、同一の配列(４９５ＶＶＮＧＩＰＴＲＴＮＩＧ５０６)が明らかとなった。第ＸＩａ因子および血漿カリクレインとは異なり、さらに長時間反応させた後であっても、ヘプシンは、(Ａｒｇ４２４-Ｈｉｓ４２５間の切断によって)ＨＧＦα２-鎖断片を生成しなかった(４５)。さらに、ヘプシン(４０ｎＭ)は、５時間の反応の間、プラスミノーゲンを活性化する能力を完全に欠いていた(図２Ｃ)。相対的に、およそ５０％の酵素前駆体によって、ｔ-ＰＡに効率的に処理されたプラスミノーゲンは、０．５時間後には既に切断した(図２Ｃ)。
【０１５８】
ヘプシン消化により生成されるＨＧＦの生物活性
非標識プロＨＧＦ(０．３ｍｇ／ｍｌ)を、ＨＧＦｈｅｐｓｉｎおよびＨＧＦＨＧＦＡそれぞれを求めるために、４０ｎＭのヘプシン又は４０ｎＭのＨＧＦＡにてＨＧＦに完全に(＞９５％)変換させた(図３Ａ)。Ａ５４９肺カルシノーマ細胞を用いたキナーゼレセプターアッセイ(ＫＩＲＡ)では、両方のＨＧＦ調製物は同じように濃度依存的にＭｅｔリン酸化を誘導し、２５０ｎｇ／ｍｌで最大活性となった(図３Ｂ)。既に示されている(４４)ように、変更した切断部位(Ｒ４９４Ｅ)により切断されなかったＨＧＦの一本鎖型(ｓｃＨＧＦ)は、活性を示さなかった(図３Ｂ)。対照実験では、ヘプシン又はＨＧＦＡ単独は無効であったことが示された(データは示さない)。さらに、ＨＧＦｈｅｐｓｉｎは、ＢｘＰＣ３膵癌細胞の増殖を効率的に促進した。活性は、５−１００ｎｇ／ｍｌの範囲で試験したＨＧＦＨＧＦＡの活性と比較した(図４Ａ)。コラーゲンコートトランスウェル移動システムを用いたＭＤＡ-ＭＢ４３５細胞による細胞移動アッセイでは同様の結果が得られた。細胞増殖アッセイでみられるように、ＨＧＦｈｅｐｓｉｎのプロ遊走性の効果は濃度依存性であり、ＨＧＦＨＧＦＡの活性と区別がつかなかった(図４Ｂ)。
【０１５９】
ｓＨＡＩ-１ＢおよびｓＨＡＩ-２によるヘプシン酵素活性の阻害
２６個の市販の色素生産性基質の最初のスクリーニングでは、Somoza 等, 2003(５)により報告される基質であるＳ２３６６が最も高い割合でヘプシンにより加水分解されたことが示された(データは示さない)。基質としてＳ２３６６を使用して、野生型ＨＡＩ-１Ｂ(ｓＨＡＩ-１Ｂ)及びＨＡＩ-２(ｓＨＡＩ-２)の高度に精製された、可溶性型の阻害活性を測定した。加えて、我々は、２つのｓＨＡＩ-１Ｂ突然変異体ｓＨＡＩ-１Ｂ(Ｒ２６０Ａ)及びｓＨＡＩ-1Ｂ(Ｋ４０１Ａ)を生産した。この突然変異体はそれぞれのクーニッツドメインがＰ１残基(ＫＤ１のＡｒｇ２６０およびＫＤ２のＬｙｓ４０１)をアラニンに置換されることによって、不活性である(３４)。ｓＨＡＩ-１Ｂ及びｓＨＡＩ-２の両方が、それぞれＩＣ５０値２１．１± ２．７ｎＭ及び１．３±０．３ｎＭで、ヘプシン酵素活性を強力に阻害したことを示した(図５)。さらに、機能しないＫＤ２を含有する変異体ｓＨＡＩ-１Ｂ(Ｋ４０１Ａ)は野生型ｓＨＡＩ-1Ｂと同等の効力であるが、一方ｓＨＡＩ-１Ｂ(Ｒ２６０Ａ)は活性が４７分の１より小さくなった(図５)。得られたＩＣ５０値を表１にまとめる。
【０１６０】
表１  クーニッツドメインインヒビターによるヘプシンの阻害
2008507295.tif 000004
【０１６１】
ヘプシン媒介性プロＨＧＦ活性化の阻害
高分子基質処理を妨げるｓＨＡＩ-１Ｂ及びｓＨＡＩ-２の能力を、１２５Ｉ-プロＨＧＦ活性化アッセイにおいて、測定した。得られた結果は、アミノリシスアッセイにおいて、測定されるそれらの阻害力と完全に一致した。１μＭ濃度のｓＨＡＩ-２、野生型ｓＨＡＩ-1Ｂ及びｓＨＡＩ-１Ｂ(Ｋ４０１Ａ)では、プロＨＧＦの切断が完全に阻害された(図６)。対照的に、１μＭのｓＨＡＩ-１Ｂ(Ｒ２６０Ａ)は阻害を示さず、プロＨＧＦ活性化により完全に転換した(図６)。
【０１６２】
考察
ＨＧＦ／Ｍｅｔシグナル伝達経路は、腫瘍浸潤及び転移を含むヒト生理機能及び病理学において、重要な役割を果たす。活性なＨＧＦの局所の有効性は、細胞外環境における不活性なプロＨＧＦの処理を制御する、キモトリプシン様セリンプロテアーゼおよびその同族インヒビターにより制御される。したがって、癌におけるこの「上流の」プロＨＧＦ転換酵素経路の混乱は、プロＨＧＦプロセシングを促進することによって、腫瘍成長を促進しうる。ここで、我々は、前立腺癌及び卵巣癌において、高度に上方制御されるセリンプロテアーゼであるヘプシンは、プロＨＧＦの強力な活性化因子である。ゆえに、ヘプシンはおそらく、前立腺癌(４６−４８)並びに卵巣がん(４９、５０)に関係している、ＨＧＦ／Ｍｅｔシグナル伝達経路を活性化することによって、腫瘍成長をもたらすことにおいて、重要な役割を果たす。
ヘプシンは、第ＸＩａ因子および血漿カリクレインにより認識される部位であるクリングルドメイン４のＡｒｇ４２４-Ｈｉｓ４２５でいかなる付加的な切断をすることなく、Ａｒｇ４９４−Ｖａｌ４９５ペプチド結合でプロＨＧＦを蛋白質加水分解的に切断する(４５)。ヘプシンにより生成される２-鎖ＨＧＦは十分に機能的であり、Ｍｅｔレセプターリン酸化を誘発して、ＨＧＦＡにより生成されるＨＧＦと同等の活性で細胞増殖および移動を促進した。不活性なプロＨＧＦの活性な成長因子へのヘプシン媒介性変換の基本となる分子メカニズムは、キモトリプシン様セリンプロテアーゼの酵素変換に対するタンパク分解性酵素前駆体と類似している。このことはプロＨＧＦ活性化の構造的結果についての近年の研究に裏付けられており、Ａｒｇ４９４−Ｖａｌ４９５で切断されると、プロテアーゼ様ＨＧＦβ鎖での立体配置的変化とＭｅｔレセプター結合部位の完全な成熟が引き起こされることが示されている(４４、５１)。この、ＨＧＦの「活性部位領域」及び「活性化ドメイン」に集中しているＭｅｔ結合部位は、セリンプロテアーゼの基質処理領域と著しく似ている(４４、５１)。ゆえに、ヘプシンによるプロＨＧＦ切断により、ＨＧＦβ上の構造再配置が起こり、生産的なＨＧＦ／Ｍｅｔシグナル伝達複合体の形成を可能にする。プロＨＧＦの非常に近い構造的ホモログであるプラスミノーゲンを切断しなかったので、プロＨＧＦに対するヘプシンのタンパク分解性活性は非常に特異的であるようである。ヘプシンは、他のセリンプロテアーゼ基質、例えばプロトロンビン、プロテインＣ、第Ｘ因子および第ＩＸ因子に対するタンパク分解性活性を有しなかった(９)。
【０１６３】
ＨＧＦヌルマウスを用いた研究では、ＨＧＦ／Ｍｅｔ経路が正常な胚発生及び生存に必須であることが示された(５２、５３)。対照的に、ヘプシン遺伝子に欠陥のあるマウスが正常に発生することは、胚発生の間ではヘプシンが主要なＨＧＦ活性化因子でないようであることを示唆する。ヘプシンと同様に、他の公知のプロＨＧＦ変換酵素マトリプターゼ(５４)、第ＸＩ因子(５５)、カリクレイン前駆体(５６)及びｕ-ＰＡ(５７)の欠損は胚性致死でない。胚発生及び出産後の生理機能におけるその重要性のために、ＨＧＦ活性は、複数のプロＨＧＦ転換酵素システムによって、協調して制御されうる。その場合、プロＨＧＦ転換酵素遺伝子欠損が混在すると、ＨＧＦヌルマウスと類似の発生の欠損が生じうる。二者択一的に、胚発生の間にＨＧＦプロセシングを制御しているプロＨＧＦ転換酵素は、まだ特定されていない。
ＨＡＩ-１Ｂ、ＨＡＩ-１及びＨＡＩ-２は、上皮細胞表面インヒビターであって、多くの正常組織及び腫瘍において、発現される(３４、５８−６３)。このように、それらは、上皮細胞発現型ＴＴＳＰ及びおそらく他の細胞表面関連セリンプロテアーゼの酵素活性を制御するために、理想的に位置する。実際、ＨＡＩ-１スプライシング変異体ＨＡＩ-１及びＨＡＩ-１Ｂは、強力にＴＴＳＰマトリプターゼ(ＭＴ-ＳＰ１)を阻害し、マトリプターゼとのＨＡＩ-１の複合体はヒト母乳において、みられた(３８)。ここで、我々はｓＨＡＩ-1Ｂ及びｓＨＡＩ-２の両方がヘプシン酵素活性の強力なインヒビターでもあることを示した。さらに、Ｐ１残基-定方向突然変異実験では、変異体ｓＨＡＩ-１Ｂ(Ｒ２６０Ａ)がプロＨＧＦアッセイにおいては不活性であり、アミド溶解性アッセイにおいては野生型及びＫＤ２変異体活性の１％未満であったので、ヘプシンの阻害はｓＨＡＩ-ＢのＫＤ１に完全に媒介されることが示された。
【０１６４】
ゆえに、ヘプシン、マトリプターゼ及びＨＧＦＡはかなりのプロＨＧＦ変換活性を有しているだけでなく(３４)、ＫＤ1特異的様式での等しい作用強度(１６−３０ｎＭ)でｓＨＡＩ-1Ｂにより阻害される(３４、６４)。スプライシング変異体ＨＡＩ-１及びＨＡＩ-1Ｂは、ＫＤ１に対するＣ末端に位置する１６アミノ酸の有無に違いがあるだけである。前立腺癌及び卵巣癌を含む組織における発現パターンは同一であり、従来、効力と標的プロテアーゼパターンにおいて、有意な差がみられなかった。したがって、我々は２つのスプライシング変異体のインビボ機能は同等であると考慮する。ＨＡＩ-２クーニッツドメインの役割は、我々の研究では特に言及しなかった。大部分の標的酵素について、ＨＡＩ-２は、Ｎ-及びＣ-末端クーニッツドメインの両方を利用する(４１、６５)。
【０１６５】
インビトロでのＨＡＩ-１Ｂ及びＨＡＩ-２とのヘプシンの機能的な作用と、インビボ上皮細胞表面への局在化とは、それらが生理的に関連する酵素-インヒビターシステムを構成しうることを示唆する。例えば、２つのＨＡＩ-１スプライシング変異体及びＨＡＩ-２は、正常な前立腺及び前立腺癌細胞株(３４、５９、６１)において、発現され、ＨＡＩ-１抗原は前立腺腺上皮の分泌細胞層に局所化していた(５９)。興味深いことに、前立腺腫瘍でのヘプシン発現が同じ上皮の区画に局在化していることから、ＨＡＩ-１及びおそらくＨＡＩ-２がインビボでヘプシンと作用すると言える(１９、２０)。ヘプシン発現が前立腺癌において、強く上方制御される一方(１７−２２)、Welsh 等, 2001(１７)により報告される遺伝子発現結果によるとＨＡＩ-１及びＨＡＩ-２はわずかに増加するだけである(およそ１．５倍)。結果として、腫瘍のヘプシン酵素活性は、不十分に制御されてもよく、プロＨＧＦプロセシングと腫瘍発達の亢進を引き起こしうる。卵巣がんのマトリプターゼ／ＨＡＩ-１(６２、６３)、結腸直腸癌のＨＧＦＡ／ＨＡＩ-１(６６、６７)及び腎臓細胞上皮癌のＨＧＦＡ／ＨＡＩ-１(６８)に関して、プロＨＧＦ転換酵素／インヒビターシステムにおける同様な不均衡が記述されている。これらの癌にはヘプシンの上方制御された発現が、ある転換酵素／インヒビターシステムに複数の酵素が含まれており、そのために酵素／インヒビター比率が増加し、悪性腫瘍を引き起こす可能性を高めうることが示唆されるものもある。
結論として、示された結果により、ヘプシンが効率的にプロＨＧＦを活性化することが示され、したがって、腫瘍上皮表面のヘプシンと不活性成長因子前駆体を含有する細胞外基質との機能的な関連が明らかとなった。ＨＡＩ-１Ｂ及びＨＡＩ-２が、前立腺癌や卵巣癌で上方制御されるヘプシンの強力なインヒビターであるという発見により、癌治療のための新規な方法が提供される。例えば、ＨＡＩ-１Ｂ又はＨＡＩ-２の機能的なクーニッツドメインはファージディスプレイ技術を用いてより特異的及び／又はより強力な酵素インヒビターを生成するための足場として役立ちうる。その技術は他のクーニッツドメイン足場にうまく応用されている(６９、７０)。
【０１６６】
脚注／省略語
１第ＶＩＩａ因子、第ＦＶＩＩａ因子；Ｈｅｐｅｓバッファ、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；トリス緩衝液、３０ｍＭ トリス-ＨＣｌ、ｐＨ８．４、３０ｍＭ イミダゾール、２００ｍＭ ＮａＣｌ；プロＨＧＦ、一本鎖肝細胞増殖因子、ＨＧＦ、２-鎖肝細胞増殖因子；ＨＧＦＡ肝細胞増殖因子活性化因子；ＨＡＩ-１、肝細胞増殖因子活性化因子インヒビター-１；ＨＡＩ-１Ｂ、肝細胞増殖因子活性化因子インヒビター-１のスプライシング変異体；ＨＡＩ-２、肝細胞増殖因子活性化因子インヒビター-２；ＫＤ１及びＫＤ２、ＨＡＩ-１ＢのＮ-及びＣ-末端クーニッツドメイン；ｓＨＡＩ-１Ｂ、細胞外ドメインを包含するＨＡＩ-１Ｂの可溶型；ｓＨＡＩ-２、細胞外ドメインを包含するＨＡＩ-２の可溶型；ＨＧＦｈｅｐｓｉｎ、ヘプシンによるプロＨＧＦの活性化により生産されるＨＧＦ；ＨＧＦＨＧＦＡ、ＨＧＦＡによるプロＨＧＦの活性化により生産されるＨＧＦ；ｓｃＨＧＦ、変異した切断部位(Ａｒｇ４９４Ｇｌｕ)により切断されない一本鎖ＨＧＦ；ｕ-ＰＡ、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子；ｔ-ＰＡ、組織型プラスミノーゲン活性化因子。Ｎｉ-ＮＴＡ、ニッケル-ニトリロトリ酢酸。
【０１６７】
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【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】ヘプシン純度と第VII因子に対する活性。(Ａ)ＣＨＯ細胞発現型可溶性ヘプシンは、全ての細胞外ドメイン(Ａｒｇ４５−Ｌｅｕ４１７)およびＣ末端Ｈｉｓ８タグを含有する。精製されたヘプシンの染色ゲル(還元状態)によって、ヘプシンがＡｒｇ１６３−Ｉｌｅ１６３(Ｎ末端配列決定により検査される)で切断されて自然に２つの鎖に変換されていることを示す。(Ｂ)ＰＣＰＳ溶媒とＣａＣｌ２中のヘプシン(４０ｎＭ)、３７℃で２時間による第VII因子酵素前駆体の活性。ＦＶＩＩ酵素前駆体、並びにＦＶＩＩａの軽鎖(ｌ.ｃ.)およびプロテアーゼドメイン(ｈ.ｃ.)の位置を示す。分子量マーカーをＭｒ×１０−３で示す。
【図２】ヘプシンによるプロＨＧＦの特異的活性化。１２５Ｉ-標識プロＨＧＦ(０．０５ｍｇ／ｍｌ)を２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ, ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ(Ｈｅｐｅｓバッファ)にて、レーン２の４０ｎＭからレーン７の０．１６ｎＭまで、酵素を３倍希釈させた漸減濃度のヘプシン及びＨＧＦＡとともにインキュベートした。(Ａ) ヘプシンおよび(Ｂ) ＨＧＦＡ。３７℃で４時間の後、試料を、還元下のＳＤＳ-ＰＡＧＥの後にＸ線用フィルムへ曝露させて分析した。プロＨＧＦ、ＨＧＦα鎖およびＨＧＦβ鎖(二重線)の位置を下線で示した。レーン１は反応の開始直後の分割量である。(Ｃ) ｔ-ＰＡおよびヘプシンによるプラスミノーゲンの活性化。プラスミノーゲン(０．１２ｍｇ／ｍｌ)を、Ｈｅｐｅｓバッファ中で、ｔ-ＰＡ(４０ｎＭ)、ヘプシン(４０ｎＭ)又はバッファ(対照)とともにインキュベートした。異なる時間点で採取した分割量を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ(還元条件)の後にＳｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎで染色することによって、分析した。レーン１、０．５時間時のバッファ；レーン２、０．５時間時のｔ-ＰＡ；レーン３、０．５時間時のヘプシン；レーン４、５時間時のバッファ；レーン５、５時間時のｔ-ＰＡ；レーン６、５時間時のヘプシン。プラスミノーゲン(Ｐｌｇ)およびプラスミン重鎖(ｈ.ｃ)の位置を下線で示す。
【図３】ヘプシンおよびＨＧＦＡによって、活性化されるプロＨＧＦによるＭｅｔのリン酸化。(Ａ) 非標識プロＨＧＦ(０．３ｍｇ／ｍｌ)を、９５％より大きく変換されるように４０ｎＭのヘプシン又は４０ｎＭのＨＧＦＡによって、切断した。ヘプシン切断(ＨＧＦｈｅｐｓｉｎ)によって、及び、ＨＧＦＡ切断(ＨＧＦＨＧＦＡ)により生産されるＨＧＦを、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ(還元条件)の後に、Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎで染色して分析した。(Ｂ) Ｍｅｔレセプターのリン酸化を、漸増濃度のＨＧＦｈｅｐｓｉｎ(○)、ＨＧＦＨＧＦＡ(□)、又はＨＧＦの非切断短鎖形態であるｓｃＨＧＦ(◇)にＡ５４９細胞を曝すことによるＫＩＲＡアッセイにおいて、測定した。活性は、ＨＧＦ対照調製物で得られた最大のシグナルの割合をして表した。値は、３回の実験の平均±ＳＤである。
【図４】ヘプシン(ＨＧＦｈｅｐｓｉｎ)およびＨＧＦＡ(ＨＧＦＨＧＦＡ)によって、活性化されたプロＨＧＦによる細胞増殖および移動。(Ａ) ＨＧＦｈｅｐｓｉｎ(黒色棒)およびＨＧＦＨＧＦＡ(白色棒)の漸増濃度下におけるＢｘＰＣ３細胞の細胞増殖。値は、２回の実験の平均である。(Ｂ) トランスウェル細胞移動システムの下部チャンバに添加したＨＧＦｈｅｐｓｉｎ(黒色棒)およびＨＧＦＨＧＦＡ(白色棒)の濃度増大により刺激される細胞移動の数量。値は、３回の実験の平均±ＳＤである。増殖および移動アッセイの活性は、それぞれの実験で用いられる１００ｎｇ／ｍｌの対照のＨＧＦ調整物に曝した対照細胞の割合として表した。
【図５】アミノリシスアッセイにおけるヘプシン酵素活性の阻害。ヘプシン(０．４ｎＭ)を、インヒビターとともに室温で３０分間インキュベートし、Ｓ２３６６(０．２ｍＭ〜Ｋｍ)に対する酵素活性を動態学的マイクロプレート読み取り機にて測定した。(■)ｓＨＡＩ-１Ｂ、(▼)ｓＨＡＩ-１Ｂ(Ｒ２６０Ａ)、(●)ｓＨＡＩ-２、(●)ｓＨＡＩ-１Ｂ(Ｋ４０１Ａ)。
【図６】ｓＨＡＩ-１Ｂの変異体及びｓＨＡＩ-２によるプロＨＧＦ活性化の阻害。１２５Ｉ標識プロＨＧＦ(０．０５ｍｇ／ｍｌ)を、ヘプシン(１５ｎＭ)およびインヒビターとともに３７℃で４時間インキュベートした。反応液分割量は、図１にて説明したように分析した。１５ｎＭのヘプシンを各々の試料に加えた。インヒビターは１μＭであった。レーン１、ｔ＝０の分割量；レーン２、インヒビターなし；レーン３、ｓＨＡＩ-１Ｂ；レーン４、ｓＨＡＩ-１Ｂ(Ｒ２６０Ａ)；レーン５、ｓＨＡＩ-１Ｂ(Ｋ４０１Ａ)；レーン６、ｓＨＡＩ-２。プロＨＧＦ、ＨＧＦα鎖およびＨＧＦβ鎖(二重線)の位置を下線で示した。
【図７】天然のヒトヘプシンのアミノ酸配列の一実施態様。
【図８】天然のヒトヘプシンのアミノ酸配列の他の実施態様。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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