(57)【要約】  反応を行うのに必要とされる試薬溶液の量を最小限にしながら、マイクロプレートのウェルにおける濃縮されたｃＤＮＡの合成等の反応を行う方法が提示される。この方法において、物質を固定化しているマイクロプレートのウェルに内筒が挿入される。物質が固定化されるウェルの部分を覆うには不十分である一定量の試薬溶液がウェルに分注される。内筒の挿入によって試薬溶液が押し上げられ、物質を固定化していたウェルの部分と接触する溶液の表面積が増大する。
2008538928.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロプレートのウェル内で反応を行う方法であって、該マイクロプレートはそのウェルの一部分に固定化された該反応に関与する物質を有し、該方法は、
前記反応のために、前記物質が固定化されるウェルの前記部分を覆うには不十分な量の試薬溶液を前記ウェルに移す工程、
前記ウェルに内筒を挿入し、それにより前記試薬溶液が、前記物質を固定化するウェルの前記部分に接触する表面積を増大させる工程、及び
前記反応を行う工程
を含む方法。
【請求項２】
前記物質を固定化するウェルの前記部分が前記ウェルの表面の半分を超える部分に相当する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記物質を固定化するウェルの前記部分が、約８０μＬの試薬が該ウェルに移される場合に覆われる部分に相当する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試薬溶液の量が３０μＬ以下である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記物質がオリゴヌクレオチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドがオリゴｄ（Ｔ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記物質が抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記反応がｃＤＮＡ合成反応である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記試薬が界面活性剤を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記界面活性剤がＴｗｅｅｎ２０である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記反応が酵素免疫吸着測定法の一部である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記反応が固相化学合成反応である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ｃＤＮＡを合成する方法であって、
少なくとも一部分にオリゴｄ（Ｔ）が固定化されたマイクロプレートのウェルにｍＲＮＡ含有溶液を移す工程、
前記ｍＲＮＡを前記オリゴｄ（Ｔ）にハイブリダイズさせる工程、
未結合のｍＲＮＡを取り除くために前記ウェルを洗浄する工程、
ｃＤＮＡ合成のために、前記オリゴｄ（Ｔ）を固定化するウェルの前記部分を覆うには不十分な量の試薬溶液を前記ウェルに移す工程、
内筒を前記ウェルに挿入し、それにより前記試薬溶液が、前記オリゴｄ（Ｔ）を固定化する前記ウェルの前記部分に接触する表面積を増大させる工程、及び
ｃＤＮＡ合成反応を行う工程
を含む方法。
【請求項１４】
前記ハイブリダイズさせる工程が、前記ｍＲＮＡ含有溶液の、前記オリゴｄ（Ｔ）を固定化する前記ウェルの前記部分に接触する表面積を増大させるために、内筒を該ウェルに挿入する工程を包含する、請求項１３に記載のｃＤＮＡを合成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、反応を行うのに必要である試薬溶液の量を最小限にしながら、マイクロプレートのウェルにおける濃縮されたｃＤＮＡの合成等の反応を行う方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プラスチック製のマイクロプレートは、生物学的及び科学的な研究開発における必須のツールになっている。これらのマイクロプレートは、別々の反応を行うことができる複数のウェル（標準的なフォーマットでは１枚のマイクロプレート当たり９６個のウェルが存在する）を特徴とする。これらのマイクロプレートは、表面（各ウェルの壁）上での物質の固定化を要求するプロセス、その後の１つ又は複数の試薬による固定化された物質の反応、及びマイクロプレートの様々なウェルにおける結果の迅速な評価を行うのに特に有用である。マイクロプレートの組成に応じて、マイクロプレートウェルに固定化することができる様々な物質が存在する。これらには、例えば、長オリゴヌクレオチド及び長ｃＤＮＡ、アミノ修飾オリゴヌクレオチド、アミノ修飾ｃＤＮＡ、タンパク質、炭水化物、細胞、溶解物、組織並びに単量体等の化学的サブユニットが挙げられる。このような物質を固定化しているマイクロプレートを、いくつかある用途の中でも例えば遺伝子発現マイクロアレイ、ＳＮＰ検出マイクロアレイ及びタンパク質マイクロアレイに使用することができる。
【０００３】
これらのマイクロプレートのウェルには様々な形状があり、幾つかのものは平底であり、他のものは丸底であるか、又はＶ字型底であり、これは円錐型のウェルをもたらす。一般的なウェルの作動量は７５〜２５０μＬである。これらのウェルで反応を行うために、現在は物質が固定化すされたウェルの表面を覆うのに十分な量の試薬をウェルに移すことが必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、これらの試薬は非常に高価であることが多い（例えば逆転写酵素やＲＮＡｓｉｎ等のポリメラーゼ連鎖反応に使用される酵素は、従来必要とされる量での一反応当たりに７ドルもかかってしまう可能性がある。したがって、生物学的反応を行う際のこのような試薬の使用を節約することが望まれている。
【０００５】
さらに、より少量の試薬を使用しながら、標準的な量の反応生成物を生成することによって、反応生成物のより濃縮された溶液がもたらされ得る。より高い濃度の反応生成物がより強いシグナルをもたらすので、このことは、反応生成物を検出するために得られた溶液を（蛍光アッセイ等を介して）試験する場合に重要になり得る。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一実施の形態では、一部分に固定化される反応に関与する物質を有するマイクロプレートのウェル内で反応を行う方法が提供され、この方法は、反応のための、物質が固定化されたウェルの部分を覆うには不十分な量の試薬溶液をウェルに加える工程、ウェルに内筒（ペストル）を挿入し、それにより試薬溶液の、物質を固定化するウェルの部分に接触する表面積を増大させる工程、及び、反応を行う工程を含む。
【０００７】
さらなる態様では、物質を固定化するウェルの部分がウェルの表面の半分を超える部分に相当する。
【０００８】
さらなる態様では、物質を固定化するウェルの部分が、約８０μＬの試薬がウェルに移される場合に浸される部分に相当する。
【０００９】
さらなる態様では、試薬溶液の量が３０μＬ以下である。
【００１０】
さらなる態様では、物質がオリゴヌクレオチドである。
【００１１】
さらなる態様では、前記オリゴヌクレオチドがオリゴｄ（Ｔ）である。
【００１２】
さらなる態様では、物質が抗原である。
【００１３】
さらなる態様では、反応がｃＤＮＡ合成反応である。
【００１４】
さらなる態様では、試薬が界面活性剤を含む。
【００１５】
さらなる態様では、前記界面活性剤がＴｗｅｅｎ２０である。
【００１６】
さらなる態様では、反応が酵素免疫吸着測定法の一部である。
【００１７】
さらなる態様では、反応が固相化学合成反応である。
【００１８】
本発明の一実施の形態では、ｃＤＮＡを合成する方法が提供され、この方法は、少なくとも一部分にオリゴｄ（Ｔ）が固定化されたマイクロプレートのウェルにｍＲＮＡ含有溶液を移す工程、ｍＲＮＡをオリゴｄ（Ｔ）にハイブリダイズさせる工程、未結合のｍＲＮＡを取り除くためにウェルを洗浄する工程、ｃＤＮＡ合成のために、オリゴｄ（Ｔ）が固定化されたウェルの部分を覆うには不十分な量の試薬溶液をウェルに移す工程、内筒をウェルに挿入し、それにより試薬溶液が、オリゴｄ（Ｔ）が固定化されたウェルの部分に接触する表面積を増大させる工程、そしてｃＤＮＡ合成反応を行う工程を含む。
【００１９】
さらなる態様では、ハイブリダイズさせる工程が、ｍＲＮＡ含有溶液の、オリゴｄ（Ｔ）が固定化されたウェルの部分に接触する表面積を増大させるために、内筒をウェルに挿入する工程を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の方法は、物質を固定化しているマイクロプレートのウェルに挿入される内筒の使用に関する。物質が固定化されたウェルの部分を覆うには不十分な量の試薬溶液がウェルに導入される。内筒の挿入によって試薬溶液が押しのけられ、内筒が挿入されると、物質を固定化しているウェルの部分と接触する溶液の表面積を増大させる。好ましい一実施形態では、物質が液体８０μＬで浸されるウェルの領域（「８０μＬ領域」）に固定化され、用いられる試薬溶液の量は３０μＬ以下である。固定化される物質全体が試薬溶液に接触し、反応に関与することを可能にするようにウェル内に配置した内筒を用いて反応を行う。反応を終わらせた後、又は反応が完了した後、反応溶液を反応生成物の検出等のさらなる処理にかけることができる。
【００２１】
本発明の方法は、任意の固相反応で用いることができる。このような固相反応の例としては、例えば、ウェルに固定化されているオリゴｄ（Ｔ）分子によって捕捉されたｍＲＮＡを使用するポリメラーゼ連鎖反応を介するｃＤＮＡ合成；抗原をウェル表面に固定化し、それにより抗原と結合し得る抗体を含む溶液に曝す酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）；及び化学基質がマイクロプレートのウェルに結合された化学化合物のコンビナトリアル合成が挙げられる。
【００２２】
任意の一般的に利用される形状のウェルを有するマイクロプレートを用いることができる。内筒をウェルの形状に合わせる必要はないが、反応に関与する物質を固定化しているウェル表面が試薬溶液で浸されていることを確保するために、内筒が十分な量の試薬溶液を押しのけることが必要である。
【００２３】
内筒の使用によって、試薬溶液中に気泡が形成されないことが好ましい。この理由のために、内筒の表面が平滑であること、及び縁(edges)が粗いと気泡が形成される可能性があるので、あらゆる縁が鋭利であることが好ましい。
【００２４】
さらに、内筒は、ウェルで行われる反応に用いる試薬と相互作用しない物質で構成される必要がある。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質が反応に関与する場合、内筒はポリプロピレン、又はヌクレオチド及びポリペプチドの最小限の非特異的な吸着を示す同様の物質等で構成される必要がある。内筒は、使用中に曲がり、捩れ、変形等を示さず、精密なプラスチック成形に好適である比較的堅い物質で構成されることが好ましい。
【００２５】
さらに、内筒の品質は行われる反応及び用いられる試薬の特徴によって変化する。例えば、内筒をｃＤＮＡ合成反応に使用する場合、内筒を構成する物質は３７〜４５℃で安定であることが望ましいが、ｃＤＮＡ合成の後にポリメラーゼ連鎖反応を行う場合は、内筒は９５℃の温度まで安定であることが好ましい。いずれの場合であっても、内筒はＤＮＡｓｅ及びＲＮＡｓｅを含まない材料であることが好ましい。さらに、リアルタイムＰＣＲのように蛍光を伴うアッセイを行う場合、内筒は透明な物質で構成されることが好ましい。
【００２６】
最終的には、内筒に反応プロセス中に試薬溶液の蒸発を防ぐためにウェルの上端をカバーするように横方向に拡がる部分を設けることが好ましい。
【００２７】
次に、本方法を、好ましい実施形態を参照して説明する。これらは、本発明の方法の特定の応用形態を例示しているにすぎず、決して限定するように解釈されるものではない。
【実施例１】
【００２８】
合成ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ合成
液体８０μＬで浸され得る各ウェル領域（「８０μＬ領域」）に共有結合により固定化されているオリゴ（ｄＴ）を含む、ＧｅｎｅＰｌａｔｅ（登録商標）として知られているオリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレートを用いて、以下の様式で合成ｍＲＮＡからｃＤＮＡを生成した。１００μＬのポリＡ40配列を含む合成ＲＮＡ３４を溶解緩衝液で懸濁させた。このような溶解緩衝液は当該技術分野において既知であり、好ましい一実施形態では、溶解緩衝液には界面活性剤（例えば、０．５％Ｎ−ラウロイルサルコシン及び０．１％ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０）、塩（例えば、４×ＳＳＣ（０．６ＭのＮａＣｌ、６０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）））、キレート剤（例えば、０．１〜５ｍＭのＥＤＴＡ）、ｐＨ緩衝液（例えば、１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４））、１．７９１Ｍのチオシアン酸グアニジン、ＲＮＡｓｅ不活性剤（例えば、プロテイナーゼＫ又は２−メルカプトエタノール）、ｔＲＮＡ（血液由来のＤＮＡ及びＲＮＡのろ過プレートへの非特異的な吸着を阻害するために含まれる）、及び外来ＤＮＡ（例えば、血液由来のＤＮＡ及びＲＮＡのろ過プレートへの非特異的な吸着を阻害するために添加される１０ｍｇ／ｍｌの超音波処理したサケ精子ＤＮＡ）が含まれる。このような溶解緩衝液の使用は、本発明の実施形態等において合成ｍＲＮＡからｃＤＮＡを生成するのには必要ではないが、ｍＲＮＡが細胞溶解物から得られた場合に存在した条件と同じ条件を維持するために、溶解緩衝液を用いた。８０μＬ領域を覆うようにＧｅｎｅＰｌａｔｅの各ウェルにｍＲＮＡ溶液を添加した。
【００２９】
４℃で一晩のインキュベーション後、溶解緩衝液１００μＬで３回、その後洗浄緩衝液１５０μＬで３回各ウェルを洗浄することにより、ハイブリダイズしていないＲＮＡ３４を取り除いた。続いて、図１の概略図で示されるように、約３０μＬのｃＤＮＡ合成緩衝液を各ウェルに入れた後、内筒をウェルに挿入し、この量の溶液で、より大きい表面積（約８０μＬ領域）を浸した。図２は、実験に実際に使用された内筒及びＧｅｎｅＰｌａｔｅを示す。内筒をNalge Nunc International（製品番号７４９５２１−０５９０）から購入した。内筒を各ウェルに完全に適合させなかったが、溶液２５〜３０μＬでウェル表面全体を浸した。それから、各ウェルで３７℃で２時間、ｃＤＮＡを合成し、４μＬのｃＤＮＡ溶液をＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲに使用してＲＮＡ３４を定量した。図３のｙ軸は、全量のｃＤＮＡ溶液から回収された全ＲＮＡを示し、縦棒グラフ(column)及びバーはそれぞれ、三重測定の平均及び標準偏差を示す。３番目の縦棒グラフは、１００μＬのｃＤＮＡ溶液から回収された全ＲＮＡ３４を示す。２番目の縦棒グラフは、内筒を挿入した３０μＬのｃＤＮＡ溶液の結果を示す。ＲＮＡ及び酵素の内筒への非特異的な吸着を最小限にするために、ｃＤＮＡ合成溶液にＴｗｅｅｎ（トゥイーン）２０を包含させた。この実験の前に、Ｔｗｅｅｎ２０がｃＤＮＡ合成に影響を与えなかったことを確認した。興味深いことに、図３で示されるように、Ｔｗｅｅｎ２０を含まない溶液中で内筒を使用した結果は芳しくなかったが、Ｔｗｅｅｎ２０を含む溶液中で内筒を使用した３０μＬのｃＤＮＡ溶液から回収された全ＲＮＡ３４は、陽性対照のものと同程度であった（縦棒グラフ３）。
【００３０】
この実施例において通常要求されるｃＤＮＡ合成緩衝液８０μＬを用いるのではなく約３０μＬの溶液を用い全てのＲＮＡがｃＤＮＡに転写された。ｍＲＮＡハイブリダイズ工程にも内筒（ペストル）を使用することも可能であり、このことはわずか少量のｍＲＮＡ溶液しか得られない場合には特にこの反応で望ましい。
【実施例２】
【００３１】
コンビナトリアル化学合成
本発明の別の実施形態では、本方法を固相コンビナトリアル合成に適用することができる。このような方法は１９６０年代から知られている。この実施形態では、マイクロプレートが、合成の条件に対して不活性である架橋した不溶性の重合物質として機能する。固相はリンカーを介してそれに結合し、この例としては、メチルベンズヒドリルアミン等のカルボキサミドリンカー、テトラヒドロプロパニル保護基又はトリチル基に基づくもの等のアルコールリンカー、アミンリンカー又はシリルリンカー等のトレースレスリンカー(traceless linker)が挙げられる。オリゴマー分子の最初の単量体等の、各ウェルでマイクロプレートに結合した固相を、特異的な単量体溶液に連続してランダムに接触させ、マイクロプレートのウェルにおいて一組の独自のオリゴマー生成物を生成した。これらの試薬は高価であり得るので、反応プロセスを妨げない内筒の使用によって、少量の試薬溶液を各ウェルの大きい表面積に接触させることが可能になり、このようにして試薬が固定化固相と反応する機会を最大限にする。
【００３２】
一実施形態において、固相に加えられる試薬を含有する約３０μＬの溶液をウェルに導入し、このウェルの８０μＬ領域はこれに固定化される反応の固相を有している。その後、内筒がウェルに導入され、試薬溶液の表面積が固相を固定化するより大きなウェルの部分と接触するように、試薬溶液を押しのける。それにより反応を進めることができる。所望に応じてこのプロセスを繰り返すことによって、試薬溶液８０μＬを各反応に用いた場合に生成されるものと同量の多量体化学分子を生成することができるが、実際に用いられる試薬量は半分未満である。
【実施例３】
【００３３】
酵素免疫吸着測定法
本発明の別の実施形態では、本方法を酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）に適用することができる。これらのアッセイにおいて、対象の抗原を基質（一般的にはマイクロプレートのウェル）に固定化させる。次に、この抗原に対する抗体を含んでいると疑われる患者由来の血清等の液体をウェルに入れる。この液体がこのような抗体を含む場合、これらの抗体はプレート上で抗原と結合する。それから二次抗体（一般的には酵素と結合した抗ヒト免疫グロブリン）がウェルに導入される。一次抗体が存在する場合、この二次抗体は一次抗体と結合する。最後に、二次抗体と結合する酵素で切断すると色が変わる色原体又は基質を導入する。この色原体のシグナル強度は、シグナルを発生する反応に関与する固定化抗原をより多くすることで向上する。しかし、このアッセイで用いられる高価な試薬又は（患者の血清の場合）わずかな試料を節約することが望ましく、このような場合に本発明の実施形態の方法が利用される。反応プロセスを妨げない内筒の使用によって、少量の試薬溶液を各ウェルの表面により多く接触させることができ、このようにして試薬が固定化抗原と反応する機会を最大限にする。
【００３４】
一実施形態において、固定化抗原又は抗原−抗体複合体と反応する試薬を含有する約３０μＬの溶液をウェルに導入し、このウェルの８０μＬ領域はこれに固定化されている抗原を有している。その後、内筒がウェルに導入され、試薬溶液の表面積が抗原を固定化するより大きなウェルの部分と接触するように、試薬溶液を押し上げる。それにより反応を進めることができる。高価な試薬又はわずかな試薬を伴う各工程での内筒の使用によって、試薬溶液８０μＬを各反応に用いた場合に生成されるのと同じシグナル強度を発生することができるが、実際に用いられる試薬量は半分未満である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明の一実施形態による、内筒が挿入されているマイクロプレートのウェルの概略図である。
【図２】本発明の一実施形態での使用に適しているマイクロプレート及び内筒を示す図である。
【図３】本発明の一実施形態による、マイクロプレート上で捕捉されたＲＮＡ３４  ｍＲＮＡからのｃＤＮＡの生成の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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