(57)【要約】【課題】隔膜の提供。【解決手段】本発明は、水の存在下における少なくとも２種の前駆体の反応により得られる細胞遮蔽膜に関する。第一の前駆体Ａは、核と各々の鎖が共役不飽和基又共役不飽和結合を有するｎ個の鎖を含み、及び第二の前駆体Ｂは、核と各々の鎖がチオール基を有するｍ個の鎖を含み、ここでｍは２よりも大きいか又は２に等しく、ｎは２よりも大きいか又は２に等しく、及び、ｍ＋ｎは５よりも大きいか又は５に等しい。反応は架橋点を有する３次元ネットワークを形成する。隣接した架橋点は６００個より少ない原子を有する鎖により結合されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水の存在下における少なくとも２種の前駆体の反応により得られる細胞遮蔽膜であって、
第一の前駆体Ａは、ｎ個の鎖（各々の鎖は該鎖の末端の２０原子の何れかに結合された共役不飽和基又は共役不飽和結合を有する。）を有する核を含み、及び
第二の前駆体Ｂは、ｍ個の鎖（各々の鎖は、該鎖の末端の２０原子の何れかに結合されたチオール基を有する。）を有する核を含み、
ｍは２よりも大きいか又は２に等しく、
ｎは２よりも大きいか又は２に等しく、
ｍ＋ｎは５よりも大きいか又は５に等しく、
前記反応は、架橋点で３次元ネットワークを形成するが、
ｍ及びｎが２より大きい場合、前記前駆体の各々の核は架橋点を形成し、ｍが２に等しい場合、対応する架橋点は隣接した第一の前駆体Ａの核に対応し、ｎが２に等しい場合、架橋点は隣接した第二の前駆体Ｂの核に対応し、及び隣接した架橋点は６００個より少ない原子を有する鎖により結合されていることを特徴とする細胞遮蔽膜。
【請求項２】
共役不飽和基又は共役不飽和結合が末端にあることを特徴とする請求項１記載の膜。
【請求項３】
チオール基が末端にあることを特徴とする請求項１又は請求項２記載の膜。
【請求項４】
第一の前駆体Ａが２ないし１０個の鎖を有することを特徴とする請求項１ないし３の何れか１項に記載の膜。
【請求項５】
第一の前駆体Ａが２ないし８個の、好ましくは４ないし８個の鎖を有することを特徴とする請求項４記載の膜。
【請求項６】
第二の前駆体Ｂが２ないし１０個の鎖を有することを特徴とする請求項１ないし５の何れか１項に記載の膜。
【請求項７】
第二の前駆体Ｂが２ないし８個の、好ましくは４ないし８個の鎖を有することを特徴とする請求項４記載の膜。
【請求項８】
隣接した架橋点が３３０個より少ない原子を有する鎖により結合される請求項１ないし７の何れか１項に記載の膜。
【請求項９】
隣接した架橋点が３０ないし１２０個の原子を有する鎖により結合される請求項１ないし８の何れか１項に記載の膜。
【請求項１０】
第一の前駆体Ａ又は第二の前駆体Ｂの鎖が直鎖状ポリマーである請求項１ないし９の何れか１項に記載の膜。
【請求項１１】
第一の前駆体及び／又は第二の前駆体Ｂのポリマーがポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（エチレン−コ−ビニルアルコール）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コ−アクリル酸）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレン−コ−ビニルピロリドン）、ポリ（マレイン酸）、ポリ（エチレン−コ−マレイン酸）、ポリ（アクリルアミド）及びポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマーからなる群より選択されることを特徴とする請求項１０記載の膜。
【請求項１２】
第一の前駆体及び／又は第二の前駆体Ｂの鎖がポリ（エチレングリコール）残基であることを特徴とする請求項１ないし１１の何れか１項に記載の膜。
【請求項１３】
第一の前駆体Ａの共役不飽和基又は共役不飽和結合が、アクリレート、アクリルアミド、キニン、２−若しくは４−ビニルピリジニウム又はイタコン酸エステルであることを特徴とする請求項１ないし１２の何れか１項に記載の膜。
【請求項１４】
第一の前駆体Ａが
【化１】
2008502388.tif 000026
【化２】
2008502388.tif 000027
からなる群より選択されることを特徴とする請求項１ないし１３の何れか１項に記載の膜。
【請求項１５】
第二の前駆体Ｂが
【化３】
2008502388.tif 000028
【化４】
2008502388.tif 000029
からなる群より選択されることを特徴とする請求項１ないし１４の何れか１項に記載の膜。
【請求項１６】
請求項１で定義される第一の前駆体Ａと請求項１で定義される第二の前駆体Ｂを水の存在下で混合することにより細胞遮蔽膜を形成する請求項１記載の細胞遮蔽膜の製造方法。
【請求項１７】
前記水が緩衝された水性溶液であることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
細胞遮蔽膜を製造するためのキットであって、
ｎ個の鎖（各々の鎖は該鎖末端の２０原子の何れかに結合された共役不飽和基又は共役不飽和結合を有する。）を有する核を含む第一の前駆体Ａ、及び
ｍ個の鎖（各々の鎖は、該鎖末端の２０原子の何れかに結合されたチオール基を有する。）を有する核を含む第二の前駆体Ｂからなり、ここで
ｍは２よりも大きいか又は２に等しく、
ｎは２よりも大きいか又は２に等しく、
ｍ＋ｎは５よりも大きいか又は５に等しく、
ｍ及びｎが２より大きい場合、前記前駆体の各々の核は架橋点を形成し、ｍが２に等しい場合、対応する架橋点は隣接した第一の前駆体Ａの核に対応し、ｎが２に等しい場合、架橋点は隣接した第二の前駆体Ｂの核に対応し、及び隣接した架橋点は６００個より少ない原子を有する鎖により結合されており、
前記第一の前駆体Ａと前記第二の前駆体Ｂが互いに分離されていることを特徴とするキット。
【請求項１９】
更に緩衝された水性溶液及び／又は粘度調整剤を含む請求項１８記載のキット。
【請求項２０】
以下に示す化合物。
【化５】
2008502388.tif 000030
【請求項２１】
以下に示す化合物。
【化６】
2008502388.tif 000031
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水の存在下における少なくとも２種の前駆体の反応により得られる細胞遮蔽膜及び該膜の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨中に挿入するために使用されるインプラント、例えば、入れ歯の取り付けのために顎中に設置されるチタンネジが知られている。そのようなインプラントの機能は、移植の部位において不十分な骨体積や骨の欠陥により障害され得る。移植部位において骨形成を促進するためにしばしば適用される措置が骨誘導再生（ＧＢＲ）である。この処置において、骨形成が要求される部位は、非骨原性の軟組織細胞の前記部位への侵入を妨げる隔膜により、周囲の軟組織から分離され、それにより、骨髄からの細胞が該部位を骨で満たすことを可能とする。加えて、骨誘導性の骨充填材が膜を保護するために使用し得る。
【０００３】
骨誘導再生又は組織再生の分野において一般的に使用される細胞遮蔽膜の幾つかのタイプが存在する。市販で入手可能な細胞遮蔽膜は、その系性に従い、異なった種の個々から誘導された異種膜材料及び合成的に製造された膜材料に分類され得る。
【０００４】
異種材料は常に感染の危険性を抱えている。殆どの膜材料はシートとして販売され、外科医により一定サイズにするために切断される必要があるが、それは時間を浪費する。更にこの処置は、結果として形状適合による困難性を生じる。異種材料の例としては、生分解性で親水性のコラーゲンが挙げられる。
【０００５】
合成材料の例としては、ＰＴＦＥ（テフロン：登録商標）が挙げられる。ＰＴＦＥ膜は疎水性であり、そのため生物組織にうまく付着せず、そして、しばしばピン又はネジを用いて付着しなければならない。更に加えて、該材料は生分解性でなく、そのため治癒過程の後に、第二のの侵襲的手技において取り除かなければならない。
【０００６】
生分解性材料はこの技術分野において既知である。国際公開第０１／９２５８４号パンフレットにおいて、共役不飽和基への求核付加反応により形成されるマトリックス材料が開示されている。この生物材料に医薬活性成分が共有結合で結合されるが、それはその後、体内へ放出される。該生分解性材料は、生理的な条件下で一ヶ月以内に分解される。
【０００７】
国際公開第００／４４８０８号パンフレットもまた、共役不飽和基への求核付加反応により形成されるポリマー性の生物材料を開示する。得られたヒドロゲルは、例えば、接着剤又は封止剤として及び組織工学用途及び創傷治癒用途のための足場として使用され得る。前記ヒドロゲルもまた、生理的な条件下で迅速に分解される。
【０００８】
米国特許第５，８７４，５００号明細書は、複数の親電子基を含む第二の合成ポリマーに共有結合で結合した２個以上のアミノ基を含む第一の合成ポリマーと生物学的活性成分からなる、架橋ポリマー組成物を開示する。前記組成物は、第一表面と第二表面間の接着を達成するために、組織増強を達成するために、外科的接着の形成を避けるために及び合成インプラントの表面を被覆するために使用され得る。
【０００９】
ここで使用する用語“重合”及び“架橋”は異なった前駆体がそれぞれ互いに結合し、結果として実質的な分子量の増加が生じることを示すために使用される。“架橋”は更に、典型的にはポリマーネットワークを生じる分岐を示す。
【００１０】
“自己選択的”とは、反応の第一の前駆体Ａが、反応部位において混合物中に存在する他の化合物とよりも迅速に第二の前駆体Ｂと反応し、そして反応の第二の前駆体Ｂが、反応部位において混合物中に存在する他の化合物とよりも迅速に第一の前駆体Ａと反応することを意味する。前記混合物は、他の生物学的材料、例えば、薬剤、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、細胞、細胞集合体及び組織を含み得る。
【００１１】
“共役不飽和結合”は炭素−炭素、炭素−ヘテロ原子又はヘテロ原子−ヘテロ原子の多重結合と単結合が交互となることを意味する。そのような結合は付加反応を受け得る。
【００１２】
“共役不飽和基”とは、炭素−炭素、炭素−ヘテロ原子又はヘテロ原子−ヘテロ原子の多重結合と単結合が交互となることを含む分子又は分子の一領域であって、付加反応を受け得る多重結合を有するものを意味する。共役不飽和基の例としては、これに限定されるものではないが、アクリレート、アクリルアミド、キニン及びビニルピリジニウム、例えば、２−又は４−ビニルピリジニウムを含む。
【特許文献１】国際公開第０１／９２５８４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第００／４４８０８号パンフレット
【特許文献３】米国特許第５，８７４，５００号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、周囲の軟組織の保護される部位との相互作用を妨げる、感染の危険性を生じない生分解性膜を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記課題は請求項１に記載の隔膜により解決される。更に好ましい態様は請求項２ないし１７の対象である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明に従う膜は２種以上の前駆体の反応により得ることができる。前駆体の特性の組合せ、即ち、前駆体の鎖の数、並びに隣接した架橋点が６００個より少ない原子を有する鎖により結合されているという事実により、結果として膜は細胞遮蔽性となる。本発明に従う膜は、周囲の軟組織の保護される部位との相互作用を妨げる。このことは骨欠陥において迅速な骨再生を可能とする。
【００１６】
膜が非動物由来であるという事実により、炎症及び動物病原体の感染の危険性が低減される。更に、該膜は、第二の外科処置を回避する生分解性である。しかしながらそれは、インプラント土台の欠陥における効果的な骨再生のための完全な治療期間中、隔離機能の維持を確実にするのに十分安定であり、それは外科医にとって重要な予見できる治療成果が存在することを意味する。膜は約６ヶ月以内に分解され得る。分解性生物は容易に排泄され、非毒性である。
【００１７】
本発明に従う膜は、要時調製により適用され得るが、それは、外科医及び患者により必要とされる、迅速な適用が可能であることを意味する。適用の様式により、膜は支持構造をなす表面の形状をとり、それにより、最適な適合と保持を確実にする。そのような膜の固定は必要ではない。つまり、口腔外部の調整が回避されるため取扱いが容易である。完璧な適合のため、望ましくない顆粒移動の危険性が顕著に低減される。
【００１８】
第一の前駆体Ａは、鎖末端の２０原子の何れかに結合された共役不飽和基又は共役不飽和結合を有するｎ個の鎖を有する核を含む。好ましい態様において、前記共役不飽和基又共役不飽和結合は末端に存在する。核は炭素原子又は窒素原子のような単原子又はエチレ
ンオキシド単位、糖、ペンタエリトリトールのような多機能アルコール、ヘキサグリセロールのようなグリセリン若しくはオリゴグリセリンのような小分子であり得る。鎖は、所望によりヘテロ原子、アミド基又はエステル基を含む、直鎖ポリマー又は直鎖若しくは分岐のアルキル鎖である。鎖以外に核は更に共役不飽和基又は結合を有さない直鎖又は分岐のアルキル残基又はポリマーで置換され得る。好ましい態様において、第一の前駆体Ａは２ないし１０個の鎖、最も好ましくは４ないし８個の鎖を有する。共役不飽和結合は、好ましくは、アクリレート、アクリルアミド、キニン、２−又は４−ビニルピリジニウム、及び式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）
【化１】
2008502388.tif 000002
（式中、Ｒ1及びＲ2は独立して、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基又はブチル基を表し、Ｒ3は直鎖又は分岐した炭素原子数１ないし１０の炭化水素鎖、好ましくは、
メチル基、エチル基、プロピル基又はブチル基を表す。）で表されるイタコン酸エステルである。
【００１９】
第二の前駆体Ｂは、各々が鎖末端の２０原子の何れかに結合されたチオール基を有するｍ個の鎖を有する核を含む。例えば、システイン残基が鎖中に組み込まれ得る。好ましくは、チオール基は末端である。核は炭素原子又は窒素原子のような単原子又はエチレンオキシド単位、糖、ペンタエリトリトールのような多機能アルコール、ヘキサグリセロールのようなグリセリン若しくはオリゴグリセリンのような小分子であり得る。鎖は、所望によりヘテロ原子、エステル基又はアミド基を含む、直鎖ポリマー又は直鎖若しくは分岐のアルキル鎖である。好ましい態様において、第二の前駆体Ｂは２ないし１０個の鎖、最も好ましくは４ないし８個の鎖を有する。
【００２０】
第一の前駆体Ａ化合物はｎ個の鎖を有するが、ここでｎは２以上であり、第二の前駆体Ｂ化合物はｍ個の鎖を有するが、ここでｍは２以上である。第一の前駆体Ａ及び／又は第二の前駆体Ｂは、官能化されていない更なる鎖を含み得る。第一の前駆体Ａの及び第二の前駆体Ｂの鎖の合計は、それはｍ＋ｎを意味するが、５以上である。密度の高い三次元ネットワークを得るために、好ましくは、ｍ＋ｎは８以上である。
【００２１】
前駆体の各々の核は、ｍとｎの両方が２よりも大きい場合、架橋点を形成する。ｍが２を表す場合、つまり、第二の前駆体Ｂが直鎖状である場合、対応する架橋点は、隣接する第一の前駆体Ａの核に対応する。ｎが２を表す場合、つまり、第一の前駆体Ａが直鎖状である場合、対応する架橋点は、隣接する第二の前駆体Ｂの核に対応する。前記隣接する架橋点は、６００個より少ない原子を有する鎖により結合される。前記６００個の原子は単に鎖の骨格における原子のみを表し、つまり、置換基やＨ原子は計数されない。好ましくは、２つの隣接する架橋点間の原子の数は約３３０個の原子より少なく、より好ましくは、３０ないし１２０個の原子である。それにより、結果として得られる３次元ネットワークの網の目は、細胞の大きさ（細胞の大きさは、１ないし１００μｍである。）よりもけた違いに小さくなるが、それは結果として細胞遮蔽膜となる。
【化２】
2008502388.tif 000003
第一の前駆体Ａと第二の前駆体Ｂの鎖の数（ｎ＋ｍ）は少なくとも５であり、第一の前駆体Ａの核と第二の前駆体Ｂの核の間の距離は小さいため、ネットワークにおける含水率が減少し、結果としてインビボの安定性がより長期となる。水の存在は小分子の輸送を保証するが、それは、廃棄物が細胞から離れて輸送でき、栄養素が細胞内に入れることを意味する。
【００２２】
第一の前駆体Ａと第二の前駆体Ｂの反応は、好ましくは、塩基で触媒される第一の前駆体Ａの共役不飽和基又は共役不飽和結合と第二の前駆体Ｂのチオール基間のマイケル型の付加に基づく：
【化３】
2008502388.tif 000004
結果として得られた連鎖は水との接触で加水分解される。加水分解反応の速度は、温度と殆どの組織において７．４であるｐＨ値に依存する。幾つかの結合の加水分解の後、不安定な連鎖の加水分解のため、架橋ネットワークは分解又は崩壊する。
【化４】
2008502388.tif 000005
【００２３】
好ましい態様において、第一の前駆体Ａの鎖及び／又は第二の前駆体Ｂの鎖は、直鎖状ポリマーである。
前記ポリマーは、好ましくは、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（エチレン−コ−ビニルアルコール）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コ−ビニルピロリドン）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレン−コ−ビニルピロリドン）、ポリ（マレイン酸）、ポリ（エチレン−コ−マレイン酸）、ポリ（アクリルアミド）又はポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマーからなる群より選択される。前記ポリマーはまた、コポリマー、ブロックコポリマー、グラフトコポリマー又はランダムコポリマーであり得る。親水性ポリマーの末端で重合されたブロックは、例えば、乳酸、グリコール酸、ε−カプロラクトン、ラクティック−コ−グリコール酸オリゴマー、トリメチレンカーボネート、アンヒドリド及びアミノ酸からなり得る。
【００２４】
好ましい態様において、前駆体分子の鎖は、ポリ（エチレングリコール）分子（ＰＥＧ
）である。ＰＥＧは、水溶性が高く、高品質で入手可能であり、多くの異なった構造のものがある。更に、非毒性であり、ヒトへの経口投与及び局所投与並びに注射が米国食品医薬局により認可されている。
【００２５】
最も好ましい態様において、第一の前駆体Ａは、８個の鎖を有するＰＥＧ−アクリレートであり、おおよその分子量は、２ｋ（ｋｇ／ｍｏｌ＝ｋＤａ）である。分子量は約±２０％で変化し得、そのためｖの値は単なるおおよその値である。
【化５】
2008502388.tif 000006
第二の前駆体Ｂは、４個の鎖を有するＰＥＧ−チオールであり、おおよその分子量は、２ｋ（ｋｇ／ｍｏｌ＝ｋＤａ）である。
【化６】
2008502388.tif 000007
【００２６】
本発明の更なる態様において、液体がゲル化する以前に逃れることを防止するために粘度改善剤が前駆体に添加され得る。使用可能な粘度改善剤は、例えば、ＣＭＣ又はキサンタンである。
【００２７】
更なる好ましい態様において、第一の前駆体Ａの自己重合を避けるために安定剤を添加し得る。使用可能な安定剤は、良好な安定化を保証するメチレンブルーである。
【００２８】
本発明に従って膜を得るために、前駆体は水、好ましくは生理的なｐＨ又は殆ど生理的なｐＨで緩衝された水の存在下で一緒に混合される。モノマーは水に完全に溶解性であることを必要としない。一般に、架橋は比較的短時間内に完結する（即ち、１０秒ないし１５分）。そのため手術部位は、外科手術が完結すれば比較的すぐに閉じ得る。
【００２９】
本発明に従う膜を形成するための混合は幾つかの手段により行うことができる。好ましい態様において、第一の前駆体Ａは第一の緩衝液と混合され、第二の前駆体Ｂは第二の緩衝液と混合される。適用において前記２種の混合物は、２つの注射器を備えた静的ミキサ
ーの手段により更に混合され、結果として得られる混合物は、要時調製で適用される。
【００３０】
混合はまた、エアースプレーにおける２種の前駆体溶液のそれぞれの微小液滴の間でも起こし得る。一つの溶液を両方の前駆体から調製し得るが、しかし、例えば、反応が進行できないか又は緩徐でのみ進行するようなｐＨにおいてである。前記混合された前駆体溶液の配置の後、例えば、酸若しくは塩基を混合することにより或いは酸若しくは塩基を作るための化学反応又は酸若しくは塩基の拡散により、ｐＨを調節することができ、結果として、化学反応が進行するために好適な、最終前駆体溶液における最終条件となる。別のアプローチは、反応の活性化エネルギー又は温度に敏感な性質を有する緩衝物の何れかに関連するか或いは両方に関連して、反応が進行できないか又は緩徐でのみ進行するような温度において最終前駆体溶液を調製することであり得る。最終適用温度（例えば、注射後の体温）への加熱又は冷却（殆どの場合、加熱が有効）することにより最終前駆体溶液の条件は化学反応が進行するために適当となり得る。
【００３１】
第一の前駆体Ａ及び第二の前駆体Ｂは互いに独立して販売され得る。好ましい態様において、それらは、第一の前駆体Ａと第二の前駆体Ｂを含むキットの形態で一緒に販売されるが、該キットにおいて前記前駆体は互いに分離されている。これは、例えば、２個の注射器、２つの区画を有する容器又は２個の別の容器により行われ得る。前記キットは更に緩衝水溶液を含み得る。緩衝溶液は、第一の前駆体Ａ及び第二の前駆体Ｂから分離されていることもまた可能である。
【実施例】
【００３２】
実施例１：ＰＥＧ−テトラチオール  ２ｋ
Ａ．）ＰＥＧ−テトラアリルエーテル  ２ｋ
【化７】
2008502388.tif 000008
４−アームＰＥＧ  ２ｋ（Ｍn＝２３２３ｇ／ｍｏｌ、３５．７ｍｅｑ  ＯＨ）２０．
３ｇをＡｒ雰囲気下で無水テトラヒドロフラン２００ｍＬに溶解した。含水量が２００ｐｐｍより低く落ちるまで、モレキュラシーブス上で溶媒を還流することにより溶液を乾燥した。その後、室温まで冷却し、鉱油中の６０％ＮａＨ懸濁物２．６９ｇ（６７ｍｍｏｌ）を添加し、１５分間反応させ、その後、アリルブロミド８．７５ｇ（７３．３ｍｍｏｌ）を添加した。懸濁物を還流させ１晩撹拌した。冷却後、約１ｃｍのセライト５４５を通してろ過し、淡黄色の透明溶液を得た。溶媒と過剰のアリルブロミドをロータリーエバポレーターで除去し、残った油状物を水２００ｍＬ中に再溶解した。結果として得られた乳濁液をジエチルエーテル５０ｍＬで３回洗浄し、得られた透明な淡黄色溶液に、ＮａＣｌ
２０ｇを溶解した。生成物をジクロロメタン５０ｍＬで３回抽出し、合わせた有機層をＭｇＳＯ4で乾燥し、ろ過した。ロータリーエバポレーターで溶媒を除去し、淡黄色油状
物２１．３ｇ（９８％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲは生成物の構造を裏付けた。
【００３３】
Ｂ．）ＰＥＧ−テトラ（チオアセテート）  ２ｋ
【化８】
2008502388.tif 000009
ＰＥＧ−テトラアリルエーテル  ２ｋ（Ｍn＝２４８３ｇ／ｍｏｌ、３１．７ｍｅｑ  
アリル）１９．７ｇ及びＡＩＢＮ  １．７０ｇ（１０．４ｍｍｏｌ）を安定剤が入っていないテトラヒドロフラン１５０ｍＬ中に溶解し、溶液を排気とＡｒパージを４サイクル行うことにより脱気した。溶液を２０時間還流した。テトラヒドロフラン２１ｍＬ中のチオ酢酸９．０ｍＬ（１３５ｍｍｏｌ）の脱気溶液を１０ｍＬづつ３回に分けて添加した。最後の添加の前に、ＡＩＢＮ０．５３ｇ（３．３ｍｍｏｌ）を添加した。還流下で更に４時間撹拌した後、生成物をＡ．）で記載したようにして単離し、淡黄色油状物２２．２ｇ（１００％）を得た。生成物の構造とアリル基の完全な変換は1Ｈ  ＮＭＲにより裏付けた
が、約９５％の官能化の程度を示した。
【００３４】
Ｃ．）ＰＥＧ−テトラチオール  ２ｋ
【化９】
2008502388.tif 000010
ＰＥＧ−テトラ（チオアセテート）  ２ｋ（Ｍn＝２７８７ｇ／ｍｏｌ、１５．７ｍｅ
ｑ  チオアセテート）１０．９ｇを水１００ｍＬ中に溶解し、排気とＡｒパージを４サイクル行うことにより脱気した。その後、脱気した０．４Ｍ  ＮａＯＨ水溶液１００ｍＬを添加し、結果として得られた溶液を再び脱気した。室温で２時間撹拌した後、２．００Ｍ
ＫＨＳＯ4水溶液１２．７ｍＬを添加し、ｐＨ６．５の溶液を得た。生成物をＡ．）で
記載したようにして、しかし工程の間中Ａｒ雰囲気下を維持して単離し、黄色油状物１０．１ｇ（９８％）を得た。ＩＲスペクトルによりカルボニル基（１６９０ｃｍ-1におけるシグナル）は検出することができず、1Ｈ  ＮＭＲは生成物の構造を裏付けた。
【００３５】
実施例２：直鎖状ＰＥＧ−ジチオール  ３．４ｋ
Ａ．）α，ω−ビスアリル−ＰＥＧ
【化１０】
2008502388.tif 000011
α，ω−ビスヒドロキシ−ＰＥＧ（Ｍn＝３３９１ｇ／ｍｏｌ、２０．１ｍｅｑ  ＯＨ
）３４．０ｇをＡｒ雰囲気下で無水テトラヒドロフラン２５０ｍＬに溶解した。含水量が１００ｐｐｍより低く落ちるまで、モレキュラシーブス上で溶媒を還流することにより溶液を乾燥した。その後、約５０℃まで冷却し、鉱油中の６０％ＮａＨ懸濁物１．６８ｇ（４２ｍｍｏｌ）を添加し、１５分間反応させ、その後、アリルブロミド４．０ｍＬ（４７ｍｍｏｌ）を添加した。懸濁物を還流させ１晩撹拌した。冷却後、約１ｃｍのセライト５４５を通してろ過し、淡黄色の透明溶液を得た。溶媒と過剰のアリルブロミドをロータリーエバポレーターで除去し、結果として得られた固体を水２００ｍＬ中に再溶解した。結果として得られた乳濁液をジエチルエーテル５０ｍＬで２回洗浄し、得られた透明な淡黄色溶液に、ＮａＣｌ  ２０ｇを溶解した。生成物をクロロホルム５０ｍＬで３回抽出し、
合わせたクロロホルム層をＭｇＳＯ4で乾燥、ろ過し、ロータリーエバポレーターで約８
０ｍＬまで濃縮した。冷ジエチルエーテル１．２Ｌ中で沈殿させ、その後、ろ過し、真空オーブン中６０℃で乾燥し、白色粉末３３．３ｇ（９６％）を得た。生成物の構造は1Ｈ
ＮＭＲにより裏付けたが、約９７％の官能化の程度を示した。
【００３６】
Ｂ．）α，ω−ビス（３−チオアセチルプロピル）−ＰＥＧ
【化１１】
2008502388.tif 000012
α，ω−ビスアリル−ＰＥＧ（Ｍn＝３４７１ｇ／ｍｏｌ、１８．３ｍｅｑ  アリル）
３１．７ｇ及びＡＩＢＮ  １．０２ｇ（１０．４ｍｍｏｌ）を安定剤が入っていないテトラヒドロフラン２００ｍＬ中に溶解し、溶液を排気とＡｒパージを４サイクル行うことにより脱気した。溶液を２１時間還流した。テトラヒドロフラン２５ｍＬ中のチオ酢酸５．２ｍＬ（７３ｍｍｏｌ）の脱気溶液を１０ｍＬづつ３回に分けて添加した。最後の添加の前に、ＡＩＢＮ０．２６ｇ（１．６ｍｍｏｌ）を添加した。還流下で更に５時間撹拌した後、生成物をＡ．）で記載したようにして単離し、殆ど白色の粉末３０．８ｇ（９３％）を得た。生成物の構造とアリル基の完全な変換は1Ｈ  ＮＭＲにより裏付けたが、約９７
％の官能化の程度を示した。
【００３７】
Ｃ．）α，ω−ビス（３−メルカプトプロピル）−ＰＥＧ  ３．４ｋ
【化１２】
2008502388.tif 000013
α，ω−ビス（３−チオアセチルプロピル）−ＰＥＧ（Ｍn＝３６２３ｇ／ｍｏｌ、４
．７ｍｅｑ  チオアセテート）８．５ｇを、脱気した０．２０Ｍ  ＮａＯＨ水溶液７０ｍＬに溶解し、Ａｒ雰囲気下室温で２時間撹拌した。その後、２．００Ｍ  ＫＨＳＯ4水溶
液を溶液がｐＨ６になるまで添加した。生成物をＡ．）で記載したようにして、しかし工程の間中Ａｒ雰囲気下を維持して単離し、白色粉末６．４ｇ（７６％）を得た。ＩＲスペクトルによりカルボニル基（１６９０ｃｍ-1におけるシグナル）は検出することができず、生成物の構造は1Ｈ  ＮＭＲにより裏付けた。
【００３８】
実施例３：ＰＥＧ−テトラアクリレート  ２ｋ
【化１３】
2008502388.tif 000014
４−アームＰＥＧ  ２ｋ（Ｍn＝２３２３ｇ／ｍｏｌ、２１．９ｍｅｑ  ＯＨ）１２．
７ｇをＡｒ雰囲気下で無水テトラヒドロフラン２５０ｍＬに溶解した。含水量が１００ｐｐｍより低く落ちるまで、モレキュラシーブス上で溶媒を還流することにより溶液を乾燥し、その後、室温まで冷却した。トリエチルアミン２．８１ｇ（２７．８ｍｍｏｌ）を添加し、無水ジクロロメタン２５ｍＬ中のアクリル酸クロリド２．５１ｇ（２７．７ｍｍｏｌ）の溶液を反応混合物の温度が３０℃以下を維持するような速度で滴下した。結果とし
て得られた懸濁物を約１．５ｃｍのセライト５４５を通してろ過し、淡黄色の透明溶液を得、ＭＥＨＱ  ４４ｍｇを添加した。ロータリーエバポレーターで溶媒を除去し、残った油状物を水１５０ｍＬ中に再溶解し、ＮａＨＣＯ3をｐＨ８になるまで添加した。水溶液
をジエチルエーテル５０ｍＬで３回洗浄し、ＮａＣｌ  １５ｇを添加し、生成物をジクロロメタン５０ｍＬで５回抽出した。合わせた有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、ろ過した。ロータリーエバポレーターで溶媒を除去し、黄色油状物１２．９ｇ（９３％）を得た。1Ｈ
ＮＭＲは生成物の構造を支持した。淡黄色油状物２１．３ｇ（９８％）を得た。生成物の構造は1Ｈ  ＮＭＲにより裏付けたが、約９５％の官能化の程度を示した。
【００３９】
実施例４：ＰＥＧ−オクタアクリレート  ２ｋ
【化１４】
2008502388.tif 000015
８−アームＰＥＧ  ２ｋ（Ｍn＝１９８５ｇ／ｍｏｌ）から出発し、実施例３に記載さ
れた方法に従って、約９４％の官能化の程度であるＰＥＧ−オクタアクリレート  ２ｋを得た。
【００４０】
実施例５：ＰＥＧ−テトラアクリレート  １５ｋ
【化１５】
2008502388.tif 000016
４−アームＰＥＧ  １５ｋ（Ｍn＝１４８６１ｇ／ｍｏｌ、３．３ｍｅｑ  ＯＨ）１２
．０８ｇをＡｒ雰囲気下で無水テトラヒドロフラン１５０ｍＬ中に溶解した。含水量が１００ｐｐｍより低く落ちるまで、モレキュラシーブス上で溶媒を還流することにより溶液を乾燥し、その後、室温まで冷却した。トリエチルアミン０．７８ｇ（７．７ｍｍｏｌ）を添加し、無水ジクロロメタン２０ｍＬ中のアクリル酸クロリド０．６９ｇ（７．７ｍｍｏｌ）の溶液を反応混合物の温度が３０℃以下を維持するような速度で滴下した。結果として得られた懸濁物を約１ｃｍのセライト５４５を通してろ過し、淡黄色の透明溶液を得、ＭＥＨＱ  ４４ｍｇを添加した。ロータリーエバポレーターで溶媒を除去し、結果として得られた固体を水１５０ｍＬ中に再溶解し、ＮａＨＣＯ3をｐＨ８になるまで添加した
。水溶液をジエチルエーテル４０ｍＬで２回洗浄し、ＮａＣｌ  １０ｇを添加し、生成物をジクロロメタン５０ｍＬで４回抽出した。合わせた有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、ろ過した。結果として得られた淡黄色溶液へＭＥＨＱ  ３０ｍｇを添加し、約３５ｍＬになるまでロータリーエバポレーターで濃縮した。冷ジエチルエーテル０．８Ｌ中で沈殿させ、その後、ろ過し、真空オーブン中６０℃で乾燥し、白色粉末１１．５ｇ（９４％）を得た。生成物の構造は1Ｈ  ＮＭＲにより裏付けたが、約９７％の官能化の程度を示した。
【００４１】
実施例６：ＰＥＧ−オクタアクリレート  １０ｋ
【化１６】
2008502388.tif 000017
８−アームＰＥＧ  １０ｋ（Ｍn＝９４６８ｇ／ｍｏｌ）から出発し、実施例５に記載
された方法に従って、約９５％ないし１００％の間の官能化の程度であるＰＥＧ−オクタアクリレート  １０ｋを得た。
【００４２】
実施例７：ＰＥＧ−オクタアクリレート  ２０ｋ
【化１７】
2008502388.tif 000018
８−アームＰＥＧ  ２０ｋ（Ｍn＝１９７７０ｇ／ｍｏｌ）から出発し、実施例５に記
載された方法に従って、約９６％ないし１００％の間の官能化の程度であるＰＥＧ−オクタアクリレート  ２０ｋを得た。
【００４３】
実施例８：ＰＥＧ−トリスアクリレート  １５ｋ
【化１８】
2008502388.tif 000019
３−アームＰＥＧ  １５ｋ（Ｍn＝１４７６３ｇ／ｍｏｌ）から出発し、実施例５に記
載された方法に従って、約９７％の官能化の程度であるＰＥＧ−トリスアクリレート  １５ｋを得た。
【００４４】
実施例９：トリス（２−［４−メルカプトブチリルアミノ］エチル）アミン塩酸塩
【化１９】
2008502388.tif 000020
トリス（２−アミノエチル）アミン４．７ｇ（３２ｍｍｏｌ）及びγ−チオブチロラクトン１０．３ｇ（１０１ｍｍｏｌ）をＡｒ雰囲気下で無水クロロホルム１００ｍＬに溶解した。反応混合物を還流下２４時間撹拌し、室温まで冷却し、ジエチルエーテル中の２．０Ｍ  ＨＣｌ１６ｍＬの緩徐な添加により沈殿させた。沈殿物を静置した後、上澄みをデカントし、沈殿物をジクロロメタン中に再溶解し、ジエチルエーテル中で再沈殿させ、真空オーブン中で乾燥して、淡黄色ワックス状物質を得た。生成物の構造は1Ｈ  ＮＭＲと13Ｃ  ＮＭＲにより裏付けた。
【００４５】
実施例１０：トリス（２−［２−｛Ｎ−アセチルアミノ｝−４−メルカプトブチリルアミノ］エチル）アミン塩酸塩
【化２０】
2008502388.tif 000021
トリス（２−アミノエチル）アミン２．５１ｇ（１７．１ｍｍｏｌ）及びＮ−アセチルホモ−システイン  チオラクトン８．５４ｇ（５３．７ｍｍｏｌ）をＡｒ雰囲気下で無水クロロホルム５０ｍＬに溶解した。反応混合物を還流下２２時間撹拌し、室温まで冷却し、ジエチルエーテル中の２．０Ｍ  ＨＣｌ１０ｍＬの緩徐な添加により沈殿させた。沈殿物を静置した後、上澄みをデカントし、沈殿物をエタノール中に再溶解し、ジエチルエーテル中で再沈殿させ、真空オーブン中で乾燥して、白色粉末１０．２ｇ（９０％）を得た。生成物の構造は1Ｈ  ＮＭＲと13Ｃ  ＮＭＲにより裏付けた。
【００４６】
実施例１１：α，ω−ビス（４−メルカプトブチリルアミノ）−ＰＥＧ  ３．４ｋ
【化２１】
2008502388.tif 000022
α，ω−ビスアミノ−ＰＥＧ（Ｍn＝３４５７ｇ／ｍｏｌ、０．７２ｍｅｑ  アミン）
１．２７ｇ（３２ｍｍｏｌ）、γ−チオブチロラクトン０．２２ｇ（２．１ｍｍｏｌ）及び４−（ジメチルアミノ）−ピリジン２０ｍｇをＡｒ雰囲気下で無水ジクロロメタン１０ｍＬに溶解した。反応混合物を還流まで加熱し、３２時間撹拌し、その後、生成物を冷ジエチルエーテル中で２回沈殿させることにより単離し、真空オーブン中で乾燥して、白色粉末１．２３ｇ（９１％）を得た。生成物の構造は1Ｈ  ＮＭＲにより裏付けた。
【００４７】
ゲル化
実施例１２
実施例２からの生成物７．０ｍｇ（４．０μｅｑ  チオール）及び実施例８からの生成物２０．０ｍｇ（４．０μｅｑ  アクリレート）を各々ｐＨ８．０で水性の０．３０Ｍ  トリエタノールアミン／ＨＣｌ緩衝液の等量中に溶解した。両方の溶液を０℃まで冷却し、迅速に混合して並行板レオメータのプレートの間に置いた。プレートは３７℃を維持し、貯蔵（Ｇ´）係数及び損失（Ｇ´´）係数を１０Ｈｚの振動数で、時間に対応して測定した。Ｇ´とＧ´´の交差点として定義されるゲル点は、幾つかのＰＥＧ濃度において決定された（表１）。
【表１】
2008502388.tif 000023
【００４８】
実施例１３
実施例１からの生成物４１．９ｍｇ（６４．０μｅｑ  チオール）及び実施例３からの生成物４０．３ｍｇ（６３．５μｅｑ  アクリレート）を各々ｐＨ７．６で水性の０．０５０Ｍ  トリエタノールアミン／ＨＣｌ緩衝液の２３７ｍｇ中に溶解した。両方の溶液を０℃まで冷却し、迅速に混合して並行板レオメータのプレートの間に置いた。プレートは３７℃を維持し、貯蔵（Ｇ´）係数及び損失（Ｇ´´）係数を１０Ｈｚの振動数で、時間に対応して測定した。Ｇ´とＧ´´の交差点として定義されるゲル点が決定された（表２）。
【表２】
2008502388.tif 000024
【００４９】
インビトロ分解
実施例１４
実施例１からの生成物１５５．８ｍｇ（２３８μｅｑ  チオール）及び実施例３からの生成物１５０．６ｍｇ（２３７μｅｑ  アクリレート）を各々ｐＨ７．４で水性の０．０３０Ｍ  トリエタノールアミン／ＨＣｌ緩衝液の０．５９ｇ中に溶解した。両方の溶液を０℃まで冷却し、迅速に混合し、円筒状のゲル（７０μＬ）をテフロン（登録商標）の鋳型（直径６ｍｍ）中に投入した。ゲルを３７℃で１時間硬化し、３７℃で１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に置いた。エステル連鎖の加水分解による膨張を、定期的にゲルを秤量することにより測定した（図１：６つの試料の平均値；線は対数曲線適合を示す）。ゲルは約６４日後に完全に溶解した。
【００５０】
実施例１５
実施例１４に記載された方法に従い、チオール化合物とアクリレート化合物の幾つかの異なった組み合わせをゲル化した。ゲルが完全に溶解した時間を表３中に記載した。
【表３】
2008502388.tif 000025
【００５１】
実施例１６−細胞遮蔽性
方法
乾燥した、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）の高度に多孔質のスポンジを直径３ｍｍで高さ５ｍｍの円筒に切断し、膨張及びその後脱イオン水中で高圧蒸気殺菌することにより殺菌した。結果として得られた殺菌円筒状スポンジをその後、過剰な水を除去するために凍結乾燥し、更に必要になるまで殺菌保存した。
標準のフィブリン接着剤キットを、最終のフィブリノーゲン成分の濃度が、標準キットよりも４倍低くなり、トロンビン成分の最終濃度が標準キットよりも１２５倍低くなるように希釈した。フィブリノーゲン溶液とトロンビン溶液の等体積量を混合し、ＰＶＡスポンジ中に吸収させ、ＰＶＡの孔の間にフィブリンネットワークを構築した。
このようにして形成したフィブリン−ＰＶＡスポンジを動物における移植（陽性対照）又は膜物質における封入を行うまで殺菌ペトリ皿中で保存した。
等モル量の４−アームＰＥＧ−チオール  ２ｋと８−アームＰＥＧ−アクリレート  ２ｋ、並びに、粘度改善剤としてＣＭＣを含むトリエタノールアミン／ＨＣｌ緩衝液を含む膜キットを使用し、膜ＰＥＧゲルを殺菌条件下室温で、円筒のステンレス鋼鋳型（Φ７ｍｍ、高さ７ｍｍ）中に投入した。ゲル化を始める前に、フィブリンスポンジを各々の膜ゲルの中央に置いた。鋳型は覆われ、ゲルは約１時間硬化され、その後それらは殺菌された１０ｍＭ  ＰＢＳへ移動され、３７℃で1晩培養器中に保存された。
標準操作手段において、１４匹の成体のメスのラットはそれぞれ、４つの背面皮下ポケットにわたって無作為に分布された４つのインプラントを受けた。ポケットの３つにおいては膜インプラントを置き、４番目のポケットにおいては陽性対照としてフィブリンで充填された２つのスポンジを置いた。切開部は止め金で閉じられた。動物は手術後の幾つかの時点の後、解剖され、インプラントは４％  ＰＦＡ／ＰＢＳ中に固定された。一連の７０、９０及び１００％エタノールでの脱水が室温で緩徐に振動している間に達成された。各々の脱水工程は２４時間続けられたが、その間に溶液は一度交換された。脱水の後、移植片は新しく触媒されたヒストクリル（Ｈｉｓｔｏｃｒｙｌ）溶液により３６時間浸漬されたが、該溶液は浸漬の間に2回交換された。各試料はその後新しく触媒されたヒストク
リル（Ｈｉｓｔｏｃｒｙｌ）溶液と伴にゼラチンカプセル（ＥＭＳ、サイズ１３）中に埋め込まれた。埋め込まれた移植片はナイフ（ｄ加工  マイクロム社（ＭＩＣＲＯＭ））を備えたロータリーミクロトム（マイクロム社（ＭＩＣＲＯＭ））で区分化された。区分化物はメイヤーのヘマトキシリン（メルク社（Ｍｅｒｃｋ））と水性エオシン溶液（１％  シグマ社（Ｓｉｇｍａ））で染色され、Ｍｏｗｉｏｌ中に埋め込まれた。
フィブリンで充填されたＰＶＡスポンジへの細胞の侵入の程度は、自動画像解析による
組織移植片の３６ないし４５の組織切片（４μｍ厚）においてＤＡＰＩで染色された細胞核を集計することにより定量化された。
【００５２】
結果
１ヶ月後、ＰＥＧ遮蔽インプラントは基本的に細胞が存在しなかったが、一方、遮蔽されなかったインプラントにおいて、スポンジのフィブリン相は、高密度にパックされた細胞により完全に侵入されていた。統計分析は試料と陽性対照の間の高い有意差（Ｐ＝０．００００４）を示した。続く時点において、基本的に、陽性対照中に見られた細胞数に変化がないことが観察された。対照試料の平均値（±ＳＤ）はｍｍ3当り（１．３±０．３
）・１０6の細胞数である（ｎ＝１２）。
図２は対照試料における平均数のパーセンテージとしての各ＰＥＧ遮蔽スポンジ中に見られた細胞数を示す（白抜きの円）。各時点の平均パーセンテージ（±ＳＤ）は十字で示された。１ヶ月と４ヶ月の間、試料中に見られた細胞数は僅かに増加しただけだった。細胞侵入における明確な増加が６ヶ月後に観察されたものの、殆どのスポンジにおいて細胞数は依然として陽性対照におけるものの１％未満であった。７ヶ月後、ＰＥＧ膜は殆ど分解し、細胞数は陽性対照におけるものの（２．８±４．７）％まで増加した。この時点における個々の試料間の強い変化は、個々のＰＥＧ膜間の完全分解までの時間における僅かな変化により説明され得る。“細胞遮蔽性”が１％未満の細胞の侵入を許容することと定義される場合、膜が約６ヶ月の間細胞遮蔽性であることと結論され得る。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１：６つの試料の平均値；線は対数曲線適合を示す。
【図２】図２は対照試料における平均数のパーセンテージとしての各ＰＥＧ遮蔽スポンジ中に見られた細胞数を示す（白抜きの円）。各時点の平均パーセンテージ（±ＳＤ）は十字で示された。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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