(57)【要約】  本発明はDNAのような生化学試料を連続的に反応させながら、その反応生成物をリアルタイムでモニタリングするための連続式定量反応のリアルタイムモニタリング装置に関する。 より詳しくは、本発明は生化学試料が移動する毛細管(100)と; 毛細管が順次的に数回巻かれていて、毛細管の内部に流れる試料を冷却又は加熱するため、互いに違う温度に維持される多数個の温度調節ブロックからなる熱伝逹ブロック(120)と、前記温度調節ブロックの温度を調節するための温度制御器; 毛細管の内部に流れる試料に光を照射するための光照射部(130);及び毛細管から発する蛍光を受光して測定する受光部(140)を含む、生化学試料の反応をリアルタイムモニタリングするための超小型装置に対することである。
2008511316.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
毛細管の内部に流れる試料を冷却又は加熱するため、互いに違う温度に維持される多数個の温度調節ブロックらからなる熱伝逹ブロック(120)と; 熱伝逹ブロック(120)に巻かれている生化学試料の流れる毛細管(100); 前記温度調節ブロックの温度を調節するための温度制御器; 毛細管の内部に流れる試料に線形光束を照射する光照射部(130);及び毛細管から発する蛍光を受光して測定する線形アレイ感知器を含む受光部(140)を含むことを特徴とする、生化学試料反応のリアルタイム連続モニタリング装置。
【請求項２】
生化学反応試料が前記熱伝逹ブロックに至る前に試料の前処理反応を進行させるための前処理ブロック(180)を追加で更に含むことを特徴とする、請求項1記載のリアルタイム連続モニタリング装置。
【請求項３】
熱伝逹ブロックに至る以前に反応試料をあらかじめ加熱するための加熱ブロック(170)を追加で更に含むことを特徴とする、請求項1記載のリアルタイム連続モニタリング装置。
【請求項４】
前記熱伝逹ブロック(120)が、変性ブロックとアニーリングブルロックの２つの温度ブロックと各温度ブロックを互いに結合させる断熱材(127)からなることなのを特徴とする、請求項1記載のリアルタイム連続モニタリング装置。
【請求項５】
前記熱伝逹ブロック(120)は変性ブロックと、アニーリングブルロックと、伸張ブロックの３つの温度ブロックからなることなのを特徴とする、請求項1記載のリアルタイム連続モニタリング装置。
【請求項６】
前記毛細管は熱伝逹ブロック(120)に10回ないし45回巻かれていることを特徴とする、請求項1記載のリアルタイム連続モニタリング装置。
【請求項７】
前記加熱ブロック(170)と前処理ブロック(180)の大きさと前記各ブロックに巻かれている毛細管の巻かれた回数によって、各ブロックでの反応時間が調節されることを特徴とする、請求項2又は請求項3記載のリアルタイム連続モニタリング装置。
【請求項８】
多様な種類の生化学反応試料を、毛細管を通じて、順次的に移送するための多重チャンネルバルブが追加で更に含むことを特徴とする、請求項1記載のリアルタイム連続モニタリング装置。
【請求項９】
前記受光部は多数の反応回数にあたる毛細管(100)束の蛍光を同時に測定するために線形固体撮像センサー(linear CCD)からなることなのを特徴とする、請求項1記載のリアルタイム連続モニタリング装置。
【請求項１０】
前記受光部は多数の反応回数にあたる毛細管(100)束の蛍光を同時に測定するために線形フォトダイオードアレイ(photo diode array)センサーからなることを特徴とする、請求項1記載のリアルタイム連続モニタリング装置。
【請求項１１】
試料が内部に流れて移動する毛細管(100)と; 毛細管が順次的に数回巻かれていて、試料を冷却及び加熱するため、互いに違う温度を維持する温度ブロックからなる熱伝逹ブロック(120)と、ここで試料の反応回数は熱伝逹ブロックに巻かれている毛細管の巻かれた回数によって調節され; 前記熱伝逹ブロックの温度を調節するための温度制御器; 及び毛細管内の反応試料に光を照射するための照射部(130)と毛細管から発する蛍光を受光するための受光部(140)からなる連続式定量反応モニタリング装置の毛細管の内部に一定時間の間隔で、多数の試料を自動的に供給する段階; 
前記試料を熱伝逹ブロックに巻かれている毛細管内を移動させ、互いに違う温度を通すようにして、反応を進行させる段階; そして
毛細管内の試料から発生される蛍光を測定する段階を含むことを特徴とする、一つの毛細管を利用して、多数の生花学的試料の反応を一定時間の間隔で、定量的にモニタリングするための方法。
【請求項１２】
試料が内部に流れて移動される毛細管(100)と; 毛細管が順次的に数回巻かれていて、試料の温度を冷却及び加熱するため、互いに違う温度を有する温度ブロックからなる熱伝逹ブロック(120)と、ここで試料の反応回数は熱伝逹ブロックに巻かれている毛細管の巻かれた回数によって調節され; 前記熱伝逹ブロックの温度を調節するための温度制御器; 及び毛細管内の反応試料に光を照射するための照射部(130)と毛細管から発する蛍光を受光するための受光部(140)からなる連続式定量反応モニタリング装置の毛細管の内部に一種類の試料を自動的に一定量供給する段階; 
前記試料を熱伝逹ブロック(120)に巻かれている毛細管内を移動させ、互いに違う温度を通すようにして、反応を進行させる段階; 
熱伝逹ブロックに巻かれている多数の毛細管束から各反応回数の反応程度を同時に測定する段階を含むことを特徴とする、生花学的試料反応の連続式定量モニタリング方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
[技術分野]
本発明はDNAのような生化学試料を連続的に反応させながら、その反応生成物をリアルタイムでモニタリングするための連続式定量反応のリアルタイムモニタリング装置に関する。より詳しくは、本発明は生化学試料の移動する毛細管(100)と；毛細管が順次的に数回巻かれていて、毛細管の内部に流れる試料を冷却又は加熱するため、互いに違う温度に維持される多数個の温度調節ブロックからなる熱伝達ブロック(120)と、前記温度調節ブロックの温度を調節するための温度制御器；毛細管の内部に流れる試料に光を照射するための光照射部(130)；及び毛細管から発する蛍光を受光して、測定する受光部(140)を含む、生化学試料の反応をリアルタイムモニタリングするための超小型装置に関する。
[背景技術] 
重合酵素連鎖反応(polymerase chain reaction, PCR)はDNAの一定部位を特異的に反復合成して、DNAを増幅させる方法で、非常に少ない量のDNAから複製して、同一のDNAを大量生成させる方法である。
【０００２】
このような重合酵素連鎖反応を通して、ゲノムDNAのように非常に大きいDNAから所望するDNA特定部分のみを選択的に増幅させることもできる。このような重合酵素連鎖反応は次の三つの段階に成り立つ。
1)DNAの変性(denaturation)
DNAを90℃〜96℃で加熱して、二本鎖DNA(ds DNA)を一本鎖DNA(ss DNA)に分離させる。高い温度で加熱するほど一本鎖DNA(ssDNA)に分離されるが、耐熱性重合酵素(Taq DNA polymerase)も温度が非常に高い状態では活性が低くなることもできるので、普通94℃で変性させるのが適合する。
2)プライマーの結合(annealing) 
一本鎖DNAに分離されたDNAがプライマーと結合する過程で、通常50℃〜65℃で進行される。非特異重合酵素連鎖反応産物が多く生成する恐れがある場合には、このような結合温度を上昇させて、非特異生成物を減らすことに役に立つこともある。
3)DNAの複製(polymerization, extension) 
複製反応は耐熱性重合酵素の作用によって、70℃〜74℃で行われる。増幅を必要とするDNAの大きさが大きいか、鋳型DNAの濃度が低い時には複製時間を延長させたほうが良い。耐熱性重合酵素(Taq DNA polymerase)は普通一分に2,000〜4,000塩基長さのDNAを合成することができるので、複製しようとするDNAの大きさの１kbごとに１分位の時間を配当すると複製反応が充分に発生することもできる。複製反応サイクルが繰り返しながら、酵素活性が減少するので、反応時間を少しずつ延長し、最終サイクルには反応時間を充分に(10分)付与して、酵素の活性が充分に発揮するようにする。前記の過程を繰り返して進行させると(普通25〜35回)必要とするDNA部位を増幅させる。
【０００３】
重合酵素連鎖反応と類似した反応である逆転写重合酵素連鎖反応(Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)はメッセンジャーリボ核酸(messenger ribonucleic acid, 以下mRNA)を増幅するための方法である。この反応はmRNAを利用して、相補(complimentary DNA, cDNA)に複製した後、これを、重合酵素連鎖反応を利用して増幅させることである。この方法はDNAでは検出が不可能で、RNAの増幅によってのみ検出可能な特定遺伝子を探すことに利用されている。
【０００４】
最近、リアルタイム重合酵素連鎖反応が一般に知られている。リアルタイム重合酵素連鎖反応とは、連鎖反応の結果物をゲルから分離せずに反応チューブの中で毎回の反応サイクルの進行を示す蛍光の強度を測定して、連鎖反応の進行と同時にリアルタイムで反応の進行をモニタリングすることができる技術である。ここに使われているリアルタイム重合酵素連鎖反応機器は重合酵素連鎖反応のための熱サイクラー(thermal cycler)と反応物の検出のための蛍光検出器(fluorometer)を合体した機器である。従来のリアルタイム(real-time)重合酵素連鎖反応機器の構成は熱電素子と試料が含まれている反応チューブに熱を伝えるための熱伝達ブロックとチューブ内部の試料に光を照射するための照射光源、そして試料から発生される蛍光を受光するための受光部で構成されている。前記重合酵素連鎖反応リアルタイムモニタリング技術原理はチューブの中の試料を反応させるため、熱電素子を利用して、冷却及び加熱サイクルを反復的に実行しながら、毎サイクルの終わる度に照射光源と受光部を利用して、試料に光を照射し、試料から発光する蛍光量を測定して、連鎖重合反応の進行の程度をリアルタイムで示すようにする。
【０００５】
しかし、今まで一般に知られている重合酵素連鎖反応リアルタイムモニタリング装置は多数の試料は処理することができるが、一定の時間の間隔にしたがって、試料を連続的に反応させるのは不可能で、装置に最初裝着された試料の反応が完了する前までは反応中に他の試料を反応チューブに装着するのはほとんど不可能であるという問題があった。また、従来のリアルタイムモニタリング装置は一つの反応サイクルが進行する度に反応チューブで表れる蛍光量を測定しなければならなかったし、試料の数が増加するようになると蛍光を測定するため所要される時間が増加するようになって、反応の進行程度測定時にはその正確度が落ちる。
【０００６】
このような従来技術の問題を克服するために、多様な形態の重合酵素連鎖反応リアルタイムモニタリング技術が挙げられている。それらの中で、本発明の装置と一番類似の形態のものを図４に示した。
【０００７】
図４は、毛細管を用いた従来(USP 6,033,880)技術による重合酵素連鎖反応装置に対する図面である。熱伝達ブロック(300)は４つの他の恒温ブロック(302、303、304など)で構成されており、毛細管(351)に溶液供給装置(350)を利用して、試料及び試薬を供給又は除去する。重合酵素連鎖反応を進行するため、熱伝達ブロックを回転しながら毛細管に伝われる温度を変化させ、重合酵素連鎖反応を行う。このような形態の構成を有する技術の一般の問題は重合酵素連鎖反応のため熱伝達ブロックを回転しなければならないし、回転時各毛細管がブロックとの接触程度に従って、重合酵素連鎖反応の差が発生するので、連鎖反応の再現性が足りなくなるという点である。
【０００８】
なお、このような形態の装置を使用する場合、時間の間隔をおいて、連続的に重合酵素連鎖反応を進行させるのは不可能である。さらに、重合酵素連鎖反応が完了した後のみ、反応の進行程度を測定することができる装置で構成されているので、反応が完了する前には進行程度が分からない問題がある。
【０００９】
このような先行技術の問題を画期的に改善する新しい方式の重合酵素連鎖反応リアルタイムモニタリング方法が紹介されたことがある。韓国の浦項工科大学校のJ. H. Hahn等は毛細管と円形の熱ブロックからなる連続式流れ式重合酵素連鎖反用温度循環装置を提案した(2004年2月4日付け、大韓民国特許出願第10-2004-0006740)。
【００１０】
この装置は変性(melting)、アニーリング(annealing)、延長(extension)温度区域に分かれた直径30mmの銅ブロックに長さ3.5mの毛細管を33回巻いて製作された。毛細管の内部に流れるPCR反応混合物は銅からなる熱ブロックを一度ずつ回転するのによって、PCR反応の各サイクルが行われる(Nokyoung Park, Suhyeon Kim and Jong Hoon Hahn, Cylindrical Compact Termal-Cycling Device for Continuous-Flow Polymerase Chain Reaction, Anal. Chem., 75, 6029-6033)。
【００１１】
Hahn等の方法では、重合酵素連鎖反応試料の流れる毛細管を加熱ブロックに巻き、スキャナーに装着された光照射装置を使って、加熱ブロックに巻かれた毛細管に光線を照射し、毛細管から発する蛍光量を測定するための手段として、蛍光検出器の装着されたスキャン装置を使って、毛細管をスキャニングするようになる。
【００１２】
この方法では加熱ブロックに巻かれた毛細管に光を照射するための光照射装置と毛細管から発する蛍光を測定するためのセンサーを移動装置(moving stage)に装着して、スキャナーを線形で駆動させ、スキャナーの移動によって毛細管に光を順次的に照射し、また、毛細管から発する蛍光をスキャナーの移動によって順次的に測定するようになる。
【００１３】
Hahn等の前記特許では、特定波長の光線を発生させるレーザー又はランプとPMT又はダイオードのような蛍光検出装置が毛細管の巻かれている加熱ブロックの上を一定速度で移動しながら、スキャニングする装備を記載している。このような光照射装置と蛍光検出センサーらがスキャナーに装着されたまま毛細管の巻かれた加熱ブロックの中心軸と平行する軸方向又はこれを横切る軸方向を沿って移動しながら、毛細管に光を照射したり、蛍光を測定する。
【００１４】
このように照射光源、蛍光測定部を移動式装置に装着し、一定速度で移動させながら発生する蛍光をスキャニングして、連続的に検出するためには必然的にステッピングモーターと線形移送手段のようにこれらを移送する移送装置、移送ガイド装置、移送装置に動力を提供する駆動手段等が具備されていなければならない。多数の光学レンズで構成されている光発生及び照射装置は対物レンズの如く高価のレンズを含むのみならず、光経路の正確な調整と調節変更のために、精巧な配置装置の使用が求められている。このような光発生及び光経路の統制と調節に使われる光学装置は値段が高いばかりでなく、相当な空間を占めていなければならない。このような駆動手段、動力伝達手段、移送装置などは酵素重合連鎖反応装備の嵩を非常に大きくしなければならないという問題を発生させる。これらの機械的装置とリニアーモーター装置は酵素反応連鎖反応リアルタイムモニタリング装置の大きさを大きくするばかりでなく、頻繁な故障と誤作動の原因になる。
【００１５】
なお、光源の移動に従って、相対的に位置の変わる毛細管に光線を照射するためには対物レンズを含んで高価の多数個の光学レンズを使うべきである。多数個の光学レンズの組合配置には光学レンズの値段が高いという問題以外にも、これらの設置固定も精巧な機械的処理を必要とするので、重合酵素連鎖反応装置の製作費用が幅広く増加してしまうという問題を起こす。
【００１６】
Hahn等の装置ではこのような移動式光源及び蛍光測定部、それから多数個の高価の光学レンズ装置を精巧に組立配置されたスキャナーを使って、多数の毛細管をスキャニングするによって、スキャニングする度に一度ずつ重合酵素連鎖反応をモニタリングするようになる。
【００１７】
このようなスキャニング方式で光を試料に照射して表れる蛍光を測定すると、スキャニングする瞬間、光が照射されたり、蛍光測定器が通る瞬間の毛細管の内部の反応のみがモニタリングされ、スキャナーの作用しない領域の毛細管で進む反応はモニタリングされないという問題を発生させる。
【００１８】
従って、当業界ではこのようなHahn等のリアルタイムモニタリング装置の常習的問題を克服し、より小さく、廉価で、リアルタイムモニタリングも連続的に行われる実用的ながらも、モニタリング効果の優秀な新しい形態の重合酵素連鎖反応リアルタイムモニタリング装備の開発に対する必要性が挙げられている。
[発明の詳細な説明] 
[技術的課題] 
本発明の目的は生化学試料を連続的に反応させながら、その反応の進行の程度をリアルタイムで測定するためのモニタリング装置として、非常に小型化になり、蛍光変化の測定が連続的で、制作費が低価で、故障や誤作動の可能性の低い新しい形態の重合酵素連鎖反応リアルタイムモニタリング装置を提供することである。
【００１９】
より詳しくは、本発明は生化学試料の移動する毛細管(100)と；毛細管が順次的に数回巻かれていて、毛細管の内部に流れる試料を冷却又は加熱するため、互いに違う温度に維持される多数個の温度調節ブロックからなる熱伝達ブロック(120)と、前記温度調節ブロックの温度を調節するための温度制御器；毛細管の内部に流れる試料に光を照射するための光照射部(130)；及び毛細管から発する蛍光を受光して測定する受光部(140)を含む装置において、前記毛細管に照射される光束の断面が線形として、多数個の毛細管に同時に光が照射することができるようにし、発生する蛍光を測定するセンサーが熱伝達ブロックと同軸上で線形に配置された、重合酵素連鎖反応のリアルタイムモニタリング装置を提供することを目的にする。
【００２０】
なお、本発明は多種の試料の連続的な反応の進行をモニタリングする時には各々の試料を分離して、連続的に毛細管の内部に通過させることによって、多種の試料に対して同時に反応進行程度を測定することのできる連続式リアルタイムモニタリング装置を提供することを目的にする。
[技術的解決方法] 
本発明者らは、毛細管に連続的に流れる試料に光を周期的に照射して発生する蛍光量を周期的に測定する方法である先行技術にひきかえ、試料に光を連続的に照射して、発生する蛍光を測定することにおいても、連続的に測定する新しい方式を着想して小型化になり、制作費が廉価で、故障の少ない重合酵素連鎖反応リアルタイムモニタリング装置の具体化が可能である事実を確認して、本発明を完成するように至った。
【００２１】
本発明の装置では、試料が熱伝達ブロック(120)で増幅される以前に試料前処理ブロック(180)を通すようにして、逆転写重合酵素連鎖反応に対するリアルタイムモニタリングもできるようにした。このような逆転写重合酵素連鎖反応のリアルタイムモニタリングのためには反応試薬(151)に逆転写反応用試薬を投与し、前処理ブロック(180)で一定時間の間、一定温度(普通42℃)に維持して、反応をさせると逆転写重合酵素連鎖反応が進まれる。本発明の装置を逆転写反応のモニタリングに使わない時には前処理ブロック(180)の温度を加熱ブロック(170)のように同一な温度(94℃)に設定して使用する。
【００２２】
より詳しくは、本発明の装置は、生化学試料の移動する毛細管(100)と；毛細管が順時的に数回巻かれていて、毛細管の内部に流れる試料を冷却又は加熱するため、互いに違う温度に維持される多数個の温度調節ブロックからなる熱伝達ブロック(120)と；前記温度調節ブロックの温度を調節するための温度制御器；毛細管の内部に流れる試料に光を照射するための光照射部(130)；及び毛細管から発する蛍光を受光して測定する受光部(140)を含む。
【００２３】
本発明の技術的特徴は、光照射部(130)として線光源(Linear-Facet Light Source)が使われたり、一般光源から発する光を線光源に変換させて使用するという点である。本発明の装置では先行技術らにひきかえ、光束の断面が円形ではなく、長い線形形態の断面を有する光を使って、円筒形像の長い熱伝達ブロックの中心軸に平行する軸方向と一致する線形光を密に巻かれた毛細管全部に同時に照射する。線形光の長さを毛細管が密に巻かれている円筒形像の熱伝達ブロックの長さと一致させると、一つの線形光を使って毛細管全部に光の照射することができるので、光照射装置をスキャナーに装着して移動させる必要がないようにする。即ち、本発明の装置は線形光束の長さを、光を照射しようとする毛細管が巻かれている熱伝達ブロックの長さと一致させ、各毛細管に同時に同一な光を照射することができるようにするという点を技術的特徴にする。
【００２４】
本発明の装置の別の特徴は蛍光検出装置もリニアーCCDのように直線形支持台に多数個の検出センサーが線形で配置された線形アレイ検出器を使用するという点である。線形アレイセンサーの長さを毛細管が密に巻かれている円筒形像の熱伝達ブロックの長さと一致させ、熱伝達ブロックの中心軸と平行する軸を沿って線形アレイセンサーを配置固定させると、蛍光検出センサーをスキャナーに装着してスキャニングしなくても、各毛細管から発する蛍光を同時に検出することができる。
【００２５】
本発明によると連続的に生物学的試料を、重合酵素連鎖反応をさせるため、図１に示すように、互いに相違な温度を有する温度ブロックからなる熱伝達ブロック(120)に毛細管を多数回巻き、定量ポンプを用いて一定時間の間隔で毛細管の中に反応試薬と試料を投入すると、試料は熱伝達ブロックに巻かれた毛細管を沿って、一方向へ進行するによって、互いに違う温度ブロック(121，122)を数回繰り返して通りながら、重合酵素連鎖反応を行うようになる。即ち、毛細管の中の試料は熱伝達ブロック(120)に巻かれている毛細管を一回り回ると、重合酵素連鎖反応が一サイクル行うようになる。
【００２６】
熱伝達ブロックに毛細管が多数回巻かれているようになると、反応サイクル(reaction cycle)は巻かれた回数ほど増えるようになる。毛細管を熱伝達ブロック(120)にコイル形態で巻いたため、毛細管自体の移動はなくなるようになるので、反応時熱伝達の差による反応誤差の発生はなくなる。
【００２７】
なお、本発明の装置では、重合酵素連鎖反応の始まる瞬間、反応がよくなるように94℃で試料を数分間加熱した後、反応が始まるが、本発明では加熱ブロック(170)を別途設置して、別途に反応させることなく、人の操作なしに自動で反応が効率的に進行されるようにし、逆転写反応など、特異な反応のために熱伝達ブロック(120)前端に別途に前処理ブロック(180)を置いて、重合酵素連鎖反応とは別に逆転写反応を行うことができるようにした。
本発明の装置で各加熱ブロック(170)、前処理ブロック(180)での試料の反応時間は各ブロックに巻かれた毛細管の回数とブロックの大きさによって決まる。
【００２８】
なお、本発明では照射部(130)及び受光部(140)を備えて、連続的に反応される試料から発する蛍光を反応と同時に測定して、重合酵素連鎖反応の反応程度をリアルタイムで、定量的に測定することができるようにした。
【００２９】
また、本発明は一つの毛細管を用いて、多数の生化学的試料の反応を同時に定量的にモニタリングするための方法であり、試料が内部へ流れて移動する毛細管(100)と；毛細管が順次的に数回巻かれていて、試料を冷却及び加熱するため、互いに違う温度を維持する温度ブロックからなる熱伝達ブロック(120)と、ここで試料の反応回数は熱伝達ブロックに巻かれている毛細管の巻かれた回数によって調節され；前記熱伝達ブロックの温度を調節するための温度制御器；及び毛細管内の反応試料に光を照射するための照射部(130)と毛細管から発する蛍光を受光するための受光部(140)からなる連続式定量反応モニタリング装置の毛細管の内部に一定時間の間隔で多数の試料を自動的に供給する段階；前記試料を熱伝達ブロックに巻かれている毛細管内を移動させ、互いに違う温度を通すようにして、反応を進行させる段階；毛細管内の試料から発生される蛍光を測定する段階からなる多数の生化学試料らの反応をリアルタイムで連続モニタリングする方法を提供する。
【００３０】
本発明は一つの毛細管を用いて、生化学的試料の反応を定量的にモニタリングするための方法であり、試料が内部へ流れて移動される毛細管(100)と；毛細管が順次的に数回巻かれていて、試料の温度を冷却及び加熱するため、互いに違う温度を有する温度ブロックからなる熱伝達ブロック(120)と、ここで試料の反応回数は熱伝達ブロックに巻かれている毛細管の巻かれた回数によって調節され；前記熱伝達ブロックの温度を調節するための温度制御器；及び毛細管内の反応試料に光を照射するための照射部(130)と毛細管から発する蛍光を受光するための受光部(140)からなる連続式定量反応モニタリング装置の毛細管の内部に一種類の試料を自動的に一定量供給する段階；前記試料を熱伝達ブロック(120)に巻かれている毛細管内を移動させ、互いに違う温度に通すようにして、反応を進行させる段階；熱伝達ブロックに巻かれている多数の毛細管束から各反応回数の反応程度を同時に測定する段階からなる生化学試料の連続式定量反応モニタリング方法を提供する。
[発明の効果] 
本発明による装置では試料を一定時間の間隔を置き、連続的に毛細管内を移動させて、各毛細管の蛍光を測定して、毎サイクルごとに反応程度を同時に測定できるようにした。
【００３１】
本発明は大気中の病原性微生物の検出、水質汚染モニタリング、生物学的テロの探知及び識別などのように連続的に一定時間の間隔で試料を採取して測定すべき分野で効果的に使われる装置である。一定時間の間隔で連続的に試料を反応させることが不可能であった従来技術を画期的に改善したので、前記の産業分野で効果的に使われる。
【００３２】
なお、本発明は毛細管の中に移送される反応試料の量が少なくて、反応に必要な時間を最大に短縮することができるし、毛細管を熱伝逹ブロック(120)に順次的に巻く形態を取って、既存装置の問題である熱伝逹ブロックと反応容器との接触程度によって、温度伝達の程度の差があるのが改善して、実験の再現性を高め、安全性を確保した。
【００３３】
なお、加熱ブロック(170)と前処理ブロック(180)を別に設置して、反応時間及び反応性の改善及び前処理反応など特殊な反応の具現も可能にさせ、直線型(linear)構造のセンサーを使って、多数の毛細管から発する蛍光を同時に測定することができるようになって、多数試料の反応程度を一度に測定することができ、多くの反応サイクルを一度に測定することができる。
【００３４】
なお、本発明の装置を使用して、多数の試料を測定する時には各試料を分離し、連続的に毛細管の内部に流すことによって、各試料に対して同時に反応程度を観察することができる。
[発明の実施のための最善の形態] 
以下、本発明の望ましい具体例を添付された図面とともに説明するが、本発明がここに限定されるのではない。
【００３５】
本発明の装置は生化学試料の反応をリアルタイム定量モニタリングする装置で、図1に図示すように、反応試薬、毛細管洗浄液及び試料反応に必要な溶液が入れられた貯蔵容器(151〜154)、分析する試料が入れられた貯蔵容器(155)、試料を移送するための定量ポンプ(110〜114)、さまざまな溶液を順次的に、反復的に毛細管に移送するための多重チャンネルバルブ(160)、試料を加熱及び冷却するため、互いに違う温度を維持する複数の温度ブロックからなる熱伝逹ブロック(120)、試料から蛍光が発するように励起光を照射する照射部(130)、試料から発生される蛍光を同時に測定するための受光部(140)、試料の前処理するため、加熱するための加熱ブロック(170)、選択的に試料を前処理反応させるための前処理ブロック(180)、反応の終わった試料が排出される廃液瓶(156)などで構成されている。
【００３６】
熱伝逹ブロック(120)はいくつかの他の温度を維持する個別的な温度ブロックで構成されていて、各個別ブロックは断熱材(127)により互いに結合されて、円形の棒の形態を成す。本発明の装置では一番代表的な実施態様として、90〜94℃、特に94℃を維持する(denaturation)ブロックと50〜65℃、特に55℃を維持する結合(annealing)ブロック(122)で構成されていて、反応試料の状態及び実験条件などによって、温度制御器(124、126)及びパイプヒーター(123、125)を利用し、各ブロックの温度を可変して設定することができる。
【００３７】
個別ブロックの個数は実験条件及び試料の状態によって、更に備えられるが、例えば、70？75℃を維持する伸長(extension)ブロックを更に具備することができる。また、各個別ブロックらは断熱材(127)により結合されて、最終的に熱伝逹ブロック(120)のような円形の形態が完成される。
【００３８】
図3は照射部及び受光部を更に詳らかに表現した図である。毛細管(100)の中の反応試料が蛍光を発するために必要なエネルギーを発生させるための光源を作るための発光ダイオードアレイ基板(133)とここから出た励起光を特定波長台の光のみを選択的に通過させるためのバンドパスフィルター(132)を通過させ、単色光で作った後、照射レンズ(131)を通じて集光し、毛細管(100)に入射させる。
【００３９】
毛細管の中の反応試料はエネルギーを受け、励起されて蛍光を発すると、その蛍光を効果的にセンサーに伝達するために受光レンズ(141)で集光した後、励起光は除去し、蛍光のみ選択的に透過させるバンドパスフィルター(142)を通過させ、受光センサー(143)に入射させて、蛍光量を測定する。ここで受光センサーは直線(linear)形センサーで、photodiode arrayやlinear CCDを使う。
[発明の実施のための形態] 
以下、実施例を通じて、本発明の構成及び作用、機能をより具体的に説明する。
(実施例 1) 
本発明の装置を使って、重合酵素連鎖反応を行う時、一種の試料に対して、毎サイクルごとに蛍光を測定しないで、反応の完了した後、一度に毎サイクルの反応程度を測定することができる構成及び作動原理を察すると次のようである。
【００４０】
まず、毛細管を洗浄するため、洗浄液(154)を定量ポンプ(113)を用いて、毛細管の中に移送させる。次の洗浄のため、蒸溜水(153)に繋がれた定量ポンプ(112)を可動させて、毛細管の中に蒸溜水を投入し、廃液瓶(156)に到達されるまで作動させると、毛細管の内部の洗浄が完了する。
【００４１】
次に、反応試薬(151)と反応試料(155)を定量ポンプ(110と114)を相互に作動させ、一定の量だけ毛細管の中に投入する。この時、その量は熱伝逹ブロック(120)に巻かれている毛細管中、受光部(140)の受光センサーが感知することができる毛細管束の個数ほどに限定する。その後、ミネラルオイル(152)を定量ポンプ(111)を利用して、毛細管の中にずっと投入すると、先に投入された試料及び試薬が熱伝逹ブロック(120)の変性(denaturation)ブロック(121)と結合(annealing)ブロック(122)の間を循環しながら、重合酵素連鎖反応が進行される。先に投入された試料は熱伝逹ブロック(120)をずっと回って、廃液瓶(156)直前まで来ると、反応が終わったのである。
【００４２】
図2は熱伝逹ブロック(120)の正面図及び平面図である。左側の正面図で、一番の下の毛細管が重合酵素連鎖反応がN回進行されたら、真上の毛細管は重合酵素連鎖反応がN-1回進行された状態である。したがって、受光部のセンサー(143)を用いて、蛍光を測定すると、N, N-1, N-2, N-3..など反応の毎サイクルの蛍光を同時に測定することができる。
【００４３】
図5は実施例1に対する蛍光量増加パターンである。グラフの形態は反応試料の状態や反応試薬の濃度によって、変わることができる。15反応回数(cycle)から微弱に蛍光が検出され、毎反応サイクルが進行される度に蛍光量は理論的には2n倍に増加しなければならないが、実際、約1.7n倍に増加する。また、反応が続いて毎サイクルごとに1.7倍ずつ増加するのではなく、一定サイクルになると反応試薬の限界で、これ以上増幅されないで、光量は飽和になる。図5では30サイクル位で飽和されて、これ以上光量が増加しない。
(実施例 2) 
次は本発明を利用して、多数の試料に対して時間差を置き、連続的に反応程度を測定することができる構成及び作動原理を察すると、次のようである。
【００４４】
毛細管を洗浄する方法は実施例1のようである。洗浄後、反応試薬(151)と反応試料(155)を定量ポンプ(110と114)を相互に作動させ、一定の量だけ毛細管の中に投入する。この時、投入量の範囲は最小受光部(140)の受光センサーが感知することができる領域以上、最大熱伝逹ブロック(120)に巻かれている毛細管の1回転分量以下にしてくれれば良い。残りはミネラルオイル(152)で満たして、熱伝逹ブロック(120)に巻かれている毛細管の1回転にあたる分量を作った後、反復的に他の試料を等しく前記のような方法で毛細管内に注入させ、満たして入れる。
【００４５】
リアルタイム重合酵素連鎖反応では、普通15サイクル以後から蛍光が測定される。したがって、受光センサーが熱伝逹ブロック(120)に巻かれた毛細管全体を感知する必要はなく、約15反応回数(cycle)以後から測定すれば良い。ここでは全体40回が巻かれていて、その中、受光センサーが15〜40回を感知する。
【００４６】
毛細管に満たされた試料が熱伝逹ブロック(120)に巻かれた毛細管を通じて、廃液瓶方へ流れながら、重合酵素連鎖反応サイクルが進行されて行く。この時、毎回転時ごとに受光部のセンサー(142)を利用して、蛍光を測定すると、40個の試料に対して、各々15回〜40回反応回数の重合酵素連鎖反応の毎サイクルにあたる定量測定データを連続的に得ることができる。
【００４７】
図6は実施例2に対する蛍光量増加パターンである。15回反応サイクルを進行させた後、蛍光を測定すると、一番目投入された試料の蛍光のみ出る。19回反応サイクルを進行させた後のグラフでは最初投入された試料は毛細管19番で一番強い光量で測定される。これは15回反応サイクルグラフで15番毛細管の中の試料で、反応が4回更に進行されて、19番目毛細管で観測されるのである。同じ図で19番毛細管は一番目に投入された試料、18番毛細管は二番目に投入された試料、17番毛細管は三番目に投入された試料であり、15番毛細管は五番目に投入された試料である。最後のグラフは30回重合酵素連鎖反応を行った後の光量価である。
【００４８】
最初投入された試料は30番毛細管で観測されるし、光量は飽和されている。15番毛細管から40番毛細管まで総16個の試料に対して、光量を同時に得ることができる。
[産業上利用可能性] 
本発明の連続式定量反応装置はPCR反応、シーケンシング反応、real-time PCR反応に使われるのに適合である。
[序列リストフリーテキスト] 
なし
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明の連続式リアルタイム定量モニタリング装置に関する全体構成図である。
【図２】本発明の連続式リアルタイム定量モニタリング装置で熱伝逹ブロックに関する詳細図(正面図及び平面図)である。
【図３】本発明の連続式リアルタイム定量モニタリング装置で図1の照射部と受光部に対する詳細図である。
【図４】従来技術による装置であり、多数の毛細管を用いた核酸増幅反応装置を示す図面である。
【図５】一種類の試料を数回反応させ、反応の完了した後、各反応回数別試料の蛍光量を表現したグラフである。
【図６−８】多数の試料を同時に反応させながら、各試料の各反応回数から発生される蛍光を反応回数別で表現したグラフである。[図面の主要部分に対する簡単な説明] 160: 多重チャンネルバルブ、110, 111, 112, 113, 114: 定量ポンプ、120: 熱伝逹ブロック、121: 変性ブロック、122: 結合ブロック、123, 125, 171, 181: パイプヒーター、124, 126, 172, 182: 温度制御器、127: 断熱材、140: 受光部、130: 照射部、170: 加熱ブロック、151: 反応試薬、152: ミネラルオイル、153: 蒸溜水、154: 洗浄液、155: 反応試料プレート、156: 廃液瓶、180: 前処理ブロック、143: 受光センサー、141: 受光レンズ、100: 毛細管束、131: 照射レンズ、132, 142: バンドパスフィルター、133: 発光ダイオードアレイ基板
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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