(57)【要約】本発明は、中間配列によって隔てられる、二重かつ連結されたＤＮＡ配列である相補性デュプリコンを含むＤＮＡ配列の遺伝子分析方法に関する。さらに、本発明は、単一のプライマーを使用する相補性デュプリコンの双方向増幅（ＢＡＣＤ）に関する。相補性デュプリコンの増幅は、種々の目的に使用され得、例えば、ゲノムＤＮＡを含むサンプルが由来する種を決定すること、または関心の形質に対するマーカーとして使用することであるが、これらに限定されない。また、本発明の遺伝子分析方法に有用なプライマーを識別するため、使用され得る巨大なデータ集合を分析するための手段が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子分析方法であって、該方法は個体由来のサンプル中のゲノムＤＮＡにおける相補性デュプリコンを増幅する工程および該増幅産物のプロファイルを作成する工程を包含し、ここで該プロファイルは前記ゲノムの特徴である、方法。
【請求項２】
前記プロファイルが前記個体の種を決定するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロファイルが前記個体の育種、系統または品種を決定するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記プロファイルは前記個体が特定の形質を保有するかどうかを決定するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記形質が疾患であるかまたは該疾患に対する罹病性である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
遺伝子分析方法であって、該方法は、以下：
ｉ）個体由来のサンプル中のゲノムＤＮＡにおける相補性デュプリコンの増幅に由来する第一核酸配列プロファイルを得る工程、
ｉｉ）より公知の種のうちの１つ由来の相補性デュプリコンの増幅によって得られる１つ以上の参照核酸配列プロファイルと、前記第一核酸配列プロファイルとを比較する工程、ならびに
ｉｉｉ）前記参照核酸配列プロファイルと比較した場合の第一核酸配列プロファイルの類似性に基づき、前記サンプルが由来する種を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項７】
前記個体が２つの種のハイブリッドであり、そして前記方法がハイブリッドの親種を決定する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
サンプル中の混入しているＤＮＡの存在を検出するため、および／または該混入しているＤＮＡの程度を定量するための方法であって、該方法は、以下：
ｉ）サンプル中のゲノムＤＮＡにおける相補性デュプリコンの増幅に由来する第一核酸配列プロファイルを得る工程
ｉｉ）より公知の種のうちの１つ由来の相補性デュプリコンの増幅によって得られる１つ以上の参照核酸配列プロファイルと、前記第一核酸配列プロファイルとを比較する工程
ｉｉｉ）前記参照核酸配列プロファイルと比較した場合の第一核酸配列プロファイルの類似性に基づき、前記サンプルが単一種由来であるかどうかを決定する工程
ｉｖ）前記サンプルが少なくとも２つの異種由来のＤＮＡを含む場合、前記参照核酸配列プロファイルと比較する場合の第一核酸配列プロファイルの類似性に基づき、前記サンプルが由来する２つ以上の種を決定する工程、ならびに
ｖ）必要に応じて前記サンプル中の２つ以上の異種由来のＤＮＡの相対濃度を定量する工程
を包含する、方法。
【請求項９】
２つの異なる種、育種、品種または系統の間の分岐年代を評価する方法であって、該方法は、以下：
ｉ）各々の種、育種、品種または系統の個体由来のサンプル中のゲノムＤＮＡにおける相補性デュプリコンの増幅に由来する核酸配列プロファイルを得る工程、
ｉｉ）増幅産物のサイズ範囲を比較して、２つの種、育種、品種または系統の進化上の関係を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項１０】
前記相補性デュプリコンが散在性トランスポゾンである、請求項１〜９のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記散在性トランスポゾンがレトロウイルス様トランスポゾンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記レトロウイルス様トランスポゾンがＡｌｕエレメントである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記増幅が単一のプライマーを使用して実施される、請求項１〜１２のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記増幅がポリメラーゼ連鎖反応を使用して実施される、請求項１〜１３のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記増幅産物がサイズ排除クロマトグラフィーによって分離される、請求項１〜１４のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記サイズ排除クロマトグラフィーがアガロースゲル電気泳動またはポリアクリルアミドゲル電気泳動のいずれかである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記サイズ排除クロマトグラフィーがポリアクリルアミドゲル電気泳動である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記サンプルが真核細胞生物由来のゲノムＤＮＡを含む、請求項１〜１７のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記真核細胞生物が動物である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記動物がヒトである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ゲノムＤＮＡにおける配列を比較する方法であって、以下の工程：
各々の配列がビットの列であるように、各々の配列中の各々の塩基を二進法形式で表す工程；
各々の配列中に指定位置において二進数で各々の配列部分を除算して、二進数の剰余を得る工程；
それぞれの配列の指定位置における各々の剰余を保管する工程；および
前記剰余を比較して前記配列の間の複製を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項２２】
コンピューターを制御してゲノムＤＮＡ中の配列を比較するコンピュータープログラムであって、該コンピュータープログラムは、該コンピューターを制御して、以下：
各々の配列がビットの列であるように、各々の配列中の各々の塩基を二進法形式で表す工程；
各々の配列中の指定位置において二進数で各々の配列部分を除算して、二進数の剰余を得る工程；
それぞれの配列の指定位置における各々の剰余を保管する工程；および
前記剰余を比較して前記配列間の複製を決定する工程
を作動可能にする、コンピュータープログラム。
【請求項２３】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載される方法における使用のためのプライマーまたはプライマーセットを識別する方法であって、該方法は、以下：
請求項２１または請求項２２に記載の方法を実施する工程；
複製について得られた情報を使用して、増幅のためのプライマーまたはプライマーセットを設計する工程；
ＤＮＡについての増幅反応において、またはゲノム配列についてのインシリコにおいて前記プライマーまたはプライマーセットを試験して、前記プライマーまたはプライマーセットが前記ゲノムの特徴であるプロファイルを生成するかどうかを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項２４】
相補性デュプリコンの増幅における使用のためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、該プライマーは、動物のゲノムの特徴である増幅産物プロファイルを作成するために使用され得る、オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項２５】
請求項２４に記載のオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下
ａ）  ＡＴＧＡＧＣＴＴＧＴＣＴＡＣＡＣＣＴ（配列番号１）、ＧＧＣＡＣＡＡＴＣＧＧＴＣＣＴＡＣＣＡＧＡＧＣＴＡ（配列番号２）、ＧＡＧＡＴＣＧＡＧＡＣＣＡＴＣＣＴＧＧＣＴＡＡＣＡＡ（配列番号３）、およびＣＣＧＴＧＴＴＡＧＣＣＡＧＧＡＴＧＧＴＣＴＣＧＡＴ（配列番号８）からなる群より選択される配列を含む、オリゴヌクレオチド：
ｂ）  ａ）に提供される任意のオリゴヌクレオチドの逆方向相補体である配列を含むオリゴヌクレオチド、ならびに
ｃ）  ａ）またはｂ）と同じ相補性デュプリコンに対する増幅条件下でハイブリダイズするａ）またはｂ）の改変体
からなる群より選択される、オリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
請求項２４または請求項２５に記載のオリゴヌクレオチド、および受容可能なキャリアを含む、組成物。
【請求項２７】
相補性デュプリコンを増幅するためのキットであって、該キットが相補性デュプリコンにハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーを備える、キット。
【請求項２８】
反応混合物、ヌクレオチド前駆体またはＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される少なくとも１つの他の成分を備える、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
成分のうちの少なくとも１つの集合において、成分の１つ以上の部分集合を識別して、該１つ以上の部分集合を所定の一致レベルで関心の部分集合（ＳＯＩ）と一致させる方法であって、該方法は、以下の工程：
成分のＮ次元行列を形成する工程であって、前記１つ以上の部分集合うちの１部分集合の変換が前記行列の次元によって表される工程；
前記行列中の各々の位置において識別子を保管する工程であって、各々の識別子が１つの部分集合の変換を表す工程；および
前記行列中に少なくとも一対の適合する識別子を見出す工程；
を包含する、方法。
【請求項３０】
識別子の一致した対を連結して、前記１つ以上の部分集合の変換と前記ＳＯＩの変換との間の一致を所定の一致レベルで提供する工程をさらに包含する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記１つ以上の部分集合の変換と、前記ＳＯＩの変換との間の適合を、該ＳＯＩの最大のサイズで見出す工程をさらに包含する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
保管された各々の識別子が多項式の剰余である、請求項１〜３１のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
各々の多項式の剰余が、
前記ＳＯＩ中の成分数をべき数とする多項式表現へと該ＳＯＩを変換する工程、および
固定順序の共通の多項式除数によって前記多項式表現を除算する工程、
によって導かれる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記成分の１つ以上の部分集合の識別がリレーショナルデータベース機能を使用し、前記行列が１つ以上のデータベースにおける表の１集合によって形成される、請求項２９〜３３のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記成分がヌクレオチドであり、そして前記成分の少なくとも１つの集合がＤＮＡ配列である、請求項２９〜３４のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記部分集合の変換が、順方向配列、逆方向配列、順方向相補配列または逆方向相補配列のうちのいずれか１つを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記Ｎ次元行列のうちのｎ番目の次元が前記変換のうちの任意の１つを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
成分の少なくとも１つの集合中に成分の１つ以上の部分集合を識別して、該１つ以上の部分集合を所定の一致レベルで関心の部分集合（ＳＯＩ）と一致させる使用のための、成分のＮ次元行列であって、該行列は、以下：
前記行列における各々の位置における識別子であって、各々の識別子が部分集合の変換を表す識別子を含み、
ここで前記１つ以上の部分集合のうちの１部分集合の変換が前記行列の次元によって表され、そして前記行列中に一致する識別子の少なくとも１つの対が見出される、Ｎ次元行列。
【請求項３９】
識別子の一致する対が連結されて前記１つ以上の部分集合の変換と前記ＳＯＩの変換との間の一致を所定の一致レベルで提供する、請求項３８に記載のＮ次元行列。
【請求項４０】
前記１つ以上の部分集合の変換と前記ＳＯＩの変換の間で、一致が該ＳＯＩの最大のサイズで位置付けられる、請求項３９に記載のＮ次元行列。
【請求項４１】
各々の保管された識別子が多項式の剰余である、請求項３８〜４０のうちのいずれか１項に記載のＮ次元行列。
【請求項４２】
各々の多項式の剰余が、
前記ＳＯＩ中の成分数をべき数とする多項式表現へと該ＳＯＩの長さを変換する工程、および
固定順序の共通の多項式除数によって前記多項式表現を除算する工程、
によって導かれる、請求項４１に記載のＮ次元行列。
【請求項４３】
前記成分の１つ以上の部分集合の識別がリレーショナルデータベース機能を使用し、前記行列が１つ以上のデータベースにおける表の１集合によって形成される、請求項３８〜４２のうちのいずれか１項に記載のＮ次元行列。
【請求項４４】
前記成分がヌクレオチドであり、そして前記成分の少なくとも１集合がＤＮＡ配列である、請求項３８〜４３のうちのいずれか１項に記載のＮ次元行列。
【請求項４５】
前記部分集合の変換が、順方向配列、逆方向配列、順方向相補配列または逆方向相補配列のうちのいずれか１つを含む、請求項４４に記載のＮ次元行列。
【請求項４６】
前記Ｎ次元行列のｎ番目の次元が前記変換のいずれか１つを含む、請求項４５に記載のＮ次元行列。
【請求項４７】
成分の少なくとも１つの集合において成分の１つ以上の部分集合を識別して、その結果該１つ以上の部分集合を所定の一致レベルまで関心の部分集合（ＳＯＩ）に一致させるためのコンピュータープログラムであって、該コンピュータープログラムは、請求項２９〜３７のうちのいずれか１項に記載の前記方法の工程または特徴を実施するようにプロセッサに指示する、コンピュータープログラム。
【請求項４８】
１つ以上の部分集合を識別する方法であって、各々の部分集合は関心の部分集合（ＳＯＩ）における成分に実質的に一致する成分を有し、前記各々の部分集合は成分の１集合または成分の複数集合の一部を形成し、前記方法は、以下の工程：
行列を形成する工程であって、該行列は、前記集合または複数集合における各々の成分のリストまたは部分的リストと、各々の成分の前記集合または複数集合における位置と、前記集合または複数集合中の同じ成分の別の位置を示す少なくとも１つのオフセットとを含む工程；
前記ＳＯＩにおける成分の位置を選択する工程；
前記選択されるＳＯＩ中で、選択される成分に対して、そして選択される成分の隣接成分に対して、１つ以上のオフセットを識別する工程；
前記オフセットに基づき前記選択されるＳＯＩ中の成分に対して、成分の集合または複数集合の中で一致する成分を見出す工程；
を包含する、方法。
【請求項４９】
可能性ある最大のオフセットを使用して一致する成分を見出す工程をさらに包含する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記成分がヌクレオチドであり、そして前記成分の集合または複数集合がＤＮＡ配列である、請求項４８または請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記部分集合は、順方向配列、逆方向配列、順方向相補配列または逆方向相補配列のうちのいずれか１つを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
１つ以上の部分集合を識別する使用のための行列であって、各々の部分集合は関心の部分集合（ＳＯＩ）における成分に実質的に一致する成分を有し、前記各々の部分集合は成分の１集合または成分の複数集合の一部を形成し、前記行列は、以下：
前記集合または複数集合の中の各々の成分のリストまたは部分的リスト；
前記各々の成分の集合または複数集合の中の位置；
前記集合または複数集合の中の同一成分の別の位置を示す、少なくとも１つのオフセット；
を含み、
ここで前記ＳＯＩの中の成分の位置が選択され、選択されるＳＯＩの中で、選択される成分に対して、そして選択される成分の隣接成分に対して１つ以上のオフセットが識別され、その後、前記行列を使用して、前記オフセットに基づき選択されるＳＯＩにおける成分に対して、成分の集合または複数集合の中の一致する成分を見出す、
行列。
【請求項５３】
前記最大のオフセットが一致する成分を見出すために使用される、請求項５２に記載の行列。
【請求項５４】
前記成分がヌクレオチドであり、そして前記成分の集合または複数集合がＤＮＡ配列である、請求項５２または請求項５３に記載の行列。
【請求項５５】
前記部分集合が、順方向配列、逆方向配列、順方向相補配列または逆方向相補配列のうちのいずれか１つを含む、請求項５４に記載の行列。
【請求項５６】
１つ以上の部分集合を識別するためのコンピュータープログラムであって、該各々の部分集合は関心の部分集合（ＳＯＩ）中の成分と実質的に一致する成分を有し、前記各々の部分集合は、成分の１集合または成分の複数集合の一部を形成し、前記コンピュータープログラムは、請求項４８〜５１のうちのいずれか１項に記載の方法の工程を実施するかまたは特徴を有するようにプロセッサに指示する、コンピュータープログラム。
【請求項５７】
成分の１つ以上の部分集合を識別して、該成分の１つ以上の部分集合中の少なくとも１つの成分を、選択される関心の部分集合（ＳＯＩ）中に位置付ける方法であって、前記成分の１つ以上の部分集合および選択されるＳＯＩの各々は少なくとも成分の１集合の一部を形成するものであり、前記方法は、以下：
前記ＳＯＩに対して識別子を決定する工程；
前記成分の１つ以上の部分集合の各々に対して識別子を決定する工程；および
前記ＳＯＩの識別子に対して１つ以上の部分集合の各々の識別子を比較して、１つ以上の部分集合のいずれかの中で成分を見出す工程であって、前記１つ以上の部分集合のいずれかは、比較される識別子が同一である場合に生じるＳＯＩの中にもまた存在する、方法。
【請求項５８】
前記識別子が多項式の剰余である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
各々の多項式の剰余は、
前記ＳＯＩ中の成分数をべき数とする多項式表現へと該ＳＯＩを変換する工程、および
固定順序の共通の多項式表現によって該多項式表現を除算する工程、
によって導かれる、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＳＯＩの多項式の表現の係数および前記１つ以上の部分集合の各々が二進数により表される、請求項５８または請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記二進数は、前記ＳＯＩおよび前記１つ以上の部分集合の各々における成分を表す、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記成分は各々４つのビットによって表され、そして前記ＳＯＩおよび前記１つ以上の部分集合は一続きの４つのビットの列である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記成分は各々３つのビットによって表され、そして前記ＳＯＩおよび前記１つ以上の部分集合が一続きの３つのビットの列である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記成分は各々２つのビットによって表され、そして前記ＳＯＩおよび前記１つ以上の部分集合が一続きの２つのビットの列である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
読み取りまたは処理を必要としない成分の１部分集合に対してマスクされた識別子を割り当てる工程をさらに包含し、該マスクされた識別子は、該マスクされた識別子に続いていくつの数の成分が読み取られないままであり得るかを示す、請求項５７〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記成分がヌクレオチドであり、かつ前記成分の１つ以上の集合がＤＮＡ配列である、請求項５７〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
成分の１つ以上の部分集合を識別して、該成分の１つ以上の部分集合中の少なくとも１つの成分が選択される関心の部分集合（ＳＯＩ）中に位置付けられるコンピュータープログラムであって、該成分の１つ以上の部分集合および選択されるＳＯＩの各々が成分の少なくとも１つの集合の一部を形成し、該コンピュータープログラムが、請求項５７〜６６のいずれか１項に記載の特徴の方法工程のうちのいずれか１つ以上を実行するようにプロセッサに指示する、コンピュータープログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、分子生物学および遺伝学の分野に広く関係する。より具体的には、本発明は相補性デュプリコンを含むＤＮＡ配列（すなわち、中間配列によって隔てられる重複かつ繋がったＤＮＡ配列）の遺伝子分析のための方法に関する。さらに、本発明は、単一のプライマーを使用する、相補性デュプリコンの双方向増幅（Ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｄｕｐｌｉｃｏｎｓ：ＢＡＣＤ）、およびそのために有用な単一プライマーを識別する方法に関する。相補性デュプリコンの増幅は、種々の目的（例えば、ゲノムＤＮＡを含むサンプルが由来する種を決定するものであるが、これに限定されない）のために使用され得るか、または目的の形質に対するマーカーとして使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
新規配列を獲得すること、および既存の配列を再配置すること／変異導入することの両方によって、ゲノムは進化する。
【０００３】
ゲノムの再配置は、ゲノムの内部への処理によって支援される。１つの原因は、相同性組換えに対する細胞のシステムによって誤った対形成（ｍｉｓ−ｐａｉｒｉｎｇ）から生じる不均一な組換えである。非相互性組換えは、遺伝子座の重複または再配置を生じる。ゲノム内での配列の重複は、新規配列の主要な供給源をもたらす。一方のコピーの配列はその元の機能を保持することができ、一方、他方のコピーは新規機能を発達させ得る。さらに、個々のゲノムの間の重要な差異が、組換えにより引き起こされた形態学的改変のため、分子レベルで見出される。
【０００４】
改変の別の重要な原因は、入れ換え可能なエレメントまたはトランスポゾンによりもたらされる。これらは、ゲノム内の移動可能である離散性配列である。すなわち、これらはゲノム内で他の位置へと自身を移動させ得る。トランスポゾンの印は、そのトランスポゾンがゲノム中の１つの位置から別の位置まで直接動くことである。ゲノム再構築に関与する大部分の他のプロセスとは異なり、転位はドナー部位における配列とレシピエント部位における配列との間の関係には全く依存しない。トランスポゾンはゲノムにおける突然変異の主要な供給源をもたらし得る。
【０００５】
トランスポゾンは２つの一般的なクラスに帰結する。第一のクラスとしては、ＤＮＡを直接操作してゲノム内で自身を増加させ得るタンパク質をコードするＤＮＡ配列として存在するトランスポゾンが挙げられる。トランスポゾンの第二のクラスはレトロウイルスに関係し、そのトランスポゾンの移動性の供給源は、それらウイルスのＲＮＡ転写物がＤＮＡコピーを作製する能力である；次いで、ＤＮＡコピーはそのゲノム中の新規部位に組み込まれるようになる。これらのトランスポゾンは、しばしばレトロポゾン、レトロトランスポゾンまたはレトロウイルス様エレメント（ＲＬＥ）といわれる。
【０００６】
移動性エレメントは、ヒトゲノムのうちの４５％以上を構成する。これらのエレメントは増幅し続け、それらの転位の負の結果として、それらのエレメントは多くのヒトの疾患に寄与する（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。すべての真核細胞生物のゲノムは移動性エレメントを含むが、エレメントのクラスの割合および活動性は、一般的にゲノム間で広く変動すると考えられる。これらエレメントは、重複、発現および増幅において広範な細胞性資源を使用する。それらエレメントが宿主ゲノムを攻撃して細胞性資源を搾取する、そもそも細胞内の災いであるかどうか、またはそれらエレメントがゲノムの進化における偶発的な正の影響のために許容されるかどうかに関しては、考慮すべき議論が存在する。
【０００７】
転位可能なエレメントは、ゲノムの再配置を直接的または間接的に促進し得る。転位の事象自体は、欠失または逆位を生じ得るか、または新規位置への宿主配列の移動を導き得る。さらにトランスポゾンは、「相同性のポータブルな領域」として機能することによって細胞の組換えシステムに対する基質として役立つ；異なる位置における２コピーのトランスポゾンは、（例え異なる染色体上であっても）相互的組換えのための部位を提供し得る。このような交換は、欠失、挿入、逆位または転座を生じる。
【０００８】
本発明者らの初期の出願（米国特許第６，３８３，７４７号（特許文献１）として登録された）は、祖先のハプロタイプを分析する方法を記載する。祖先のハプロタイプは、ヒト主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）等の複数遺伝子の複合体由来のＤＮＡ配列であり、免疫系において重要な役割を果たして多様な機能および疾患に影響する染色体ＤＮＡのうちの１領域である。このＭＨＣは、複数の多型かつ重複した遺伝子を含む（非特許文献４）。この方法はとりわけ、不完全である重複の存在に依存する。祖先のハプロタイプのＭＨＣは、ＨＬＡ  ＢからＨＬＡ  ＤＲまで広がり、そして一まとめとして保存されている。それらのうちのいずれか２つの間のこれらの祖先のハプロタイプおよび組換え体は、白人集団における祖先のハプロタイプのうちの約７３％の原因である。祖先のハプロタイプを含む他の複数遺伝子の複合体としては、リポタンパク質遺伝子複合体およびＲＣＡ複合体が挙げられる。
【０００９】
種の識別における最も一般的なアプローチは、ミトコンドリアのゲノム、ＤループおよびシトクロムＢ（Ｃｙｔ−Ｂ）遺伝子のうちの２つの領域に注目する（非特許文献５）。ミトコンドリアＤＮＡの突然変異率に起因して、このミトコンドリアＤＮＡは種の差異を検査するために一般的に使用される。そのため、Ｃｙｔ−Ｂ研究は、広範なアレイの種に対して首尾よいことを実証しているが、いくつかの場合において、変動性の増幅効率および密接に関係する種の間を区別するのが不可能であるような問題が観察されている。一般的にこのアプローチは、配列決定すること、および続いてサンプルの起源を識別するために利用可能な遺伝子データベースに対して配列を比較することに依存する。他の方法としては、βアクチン遺伝子、２８ｓＲＮＡ遺伝子およびＴＰ５３遺伝子等の核内標的の分析、ならびに多型ＤＮＡの短い縦列反復配列および急速増幅（Ｓｈｏｒｔ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｒｅｐｅａｔｓ  ａｎｄ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ）の使用が挙げられる。それにもかかわらず、遺伝子分析を使用した種の識別のための効果的な方法についての必要性が存在する。
【００１０】
巨大なデータ集合は、大気学、民族生態学、法医学、素粒子物理学、流体力学、遺伝学およびプロテオミクスと同じくらい多様な分野において作成されている。そのサイズに起因して、巨大なデータベース内の内部構造およびパターンの分析は、実質的にコンピューターの力を必要とする。例えば、進化ゲノム学において、異なる種の間で構造的パターンが比較され、データの列は２〜３ギガベースのオーダーのＤＮＡ配列であり、従って、小さな配列集合のみを比較している、可能性ある順列の数は莫大であり、そして巨大な配列集合を比較することは、世界で最も能力の高いコンピューターの能力をほとんど超える。分析の実行時間を減らすため、開発されている選択肢としては、大規模な並列アレイ等のより巨大なコンピューター、または巨大なクラスタ中のより小さなプロセッサを構築することが挙げられ、このことはコストを嵩ませ、ハードウエアの量を増加させる。
【特許文献１】米国特許第６，３８３，７４７号明細書
【非特許文献１】Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ，Ｐ．Ｌ．およびＢａｔｚｅｒ，Ｍ．Ａ．（１９９９）  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．６７：１８３−１９３
【非特許文献２】Ｒｉｃｃｉ，Ｖ．ら（２００３）  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１１２：４１９−４２５
【非特許文献３】Ｓｏｒｅｋ，Ｒ．ら（２００２）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１２：１０６０−１０６７
【非特許文献４】Ｚｈａｎｇ，Ｗ．Ｊ．ら（１９９０）  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：２１０１−２１１４
【非特許文献５】Ｂｒａｎｉｃｋｉ  Ｗ．ら（２００３）  Ｊ．Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉ．４８：８３−８７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
試験サンプル中のゲノムＤＮＡに関する情報を提供するプロファイルを生成するために使用され得る遺伝子分析のさらなる方法のための必要性が存在する。ここで、本発明者らは、相補性デュプリコンの増幅に依存する遺伝子分析の具体的な形態を記載する。本発明はまた、これまで実施されるものよりも単純かつコストに効果的な様式で、比較される配列の部分の間の重複を確認するため、巨大なデータ集合（例えば、ゲノムＤＮＡ配列）を比較する方法を提供することを追求する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、祖先のハプロタイプに対応するＤＮＡの特徴付けに由来する。特定の重複した配列の核酸増幅から生じる主要産物の分析は、重複した配列の横にある中間配列がゲノムに関する価値ある情報を提供することを見出した。より具体的には、増幅は明確なプロファイルを生じた。これらのプロファイルは、試験サンプルについての情報を作成するため、ゲノムＤＮＡの遺伝子分析の方法において使用され得る。
【００１３】
従って、第一の局面において、本発明は遺伝子分析方法を提供し、この方法は、個体由来のサンプル中のゲノムＤＮＡにおける相補性デュプリコンを増幅する工程、およびその増幅産物のプロファイルを作成する工程を包含し、ここでそのプロファイルはそのゲノムの特徴である。
【００１４】
この増幅産物は、機能に関連する配列を有し、そしてまた組込み、挿入、欠失、重複、ならびにＤＮＡの構造および内容に対する他の変化の経歴的記録を提供する。本発明の第一の局面に従う方法を使用して、例えば、そのサンプルが由来する生物体の種を決定するため、種もしくはその個体のゲノムに対する過去の変化を検査するため、または疾患に対する将来の罹病性を予想するために使用され得るプロファイルを作成し得る。
【００１５】
予測しなかったことに、多くの場合、これらのプロファイルが大部分は種特異的であることが見出された。さらに、相補性デュプリコンの増幅産物は、ゲノムＤＮＡを含むサンプルが由来する、わずかな程度でのみ異なる傾向にある種を決定することに関して、既知の代替物よりも情報性がある。本発明の方法のこの利点は、増幅される相補性デュプリコン産物が、長さおよび内容において異なる配列の増幅に起因する混合物であり、プライマー接合する（ｐｒｉｍｉｎｇ）配列の間の僅かな差異と、アンプリコン間の競合と、コンカテマーを含む産物の間の相互作用とに起因した示差的なプライマー接合であるという事実によって、部分的に説明され得る。
【００１６】
明らかに、米国特許第６，３８３，７４７号の産物ならびに個体の識別および移植適合についての他のマーカーとは対照的に、種間の実質的な差異は、種内での多型には関係していない。例えば、ＭＨＣ配列は多型性である。すなわち、種内で対立遺伝子とハプロタイプとの間で異なっているが、一方多くの増幅された相補性デュプリコン産物は、種内で実質的にまたは完全に単一形である。混乱を避けるため、本発明者らは、種内での差異を指すために用語多型を使用し続け、いくつかの対立遺伝子およびハプロタイプが種を超えて存在し得ること、すなわち密接に関係する（祖先の）種において見出され得ることを認識する。対照的に、増幅される相補性デュプリコン産物の多くは単一形であるが種内特異的（ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ）であり、このことは本発明者らに種内特異的な単一形（ＩＳＭ）等の差異を参照させる。
【００１７】
従って、第一の局面の好ましい実施形態において、このプロファイルは、個体の種を決定するために使用される。
【００１８】
さらに、第二の局面において、本発明は遺伝子分析方法を提供し、この方法は、以下：
ｉ）個体由来のサンプル中のゲノムＤＮＡにおける相補性デュプリコンの増幅に由来する第一核酸配列プロファイルを得る工程、
ｉｉ）より公知の種のうちの１つ由来の相補性デュプリコンの増幅によって得られる１つ以上の参照核酸配列プロファイルと、その第一核酸配列プロファイルとを比較する工程、および、
ｉｉｉ）参照核酸配列プロファイルと比較した場合の第一核酸配列プロファイルの類似性に基づき、そのサンプルが由来する種を決定する工程、
を包含する。
【００１９】
従って、ゲノムＤＮＡを含むサンプルは、個体から単離され得るか、または未知の供給源（例えば、毛胞または血液）から得ることができ、次いで種の認定のため上に詳述したような特徴付けに供され得る。
【００２０】
図４に示され得るように、増幅手順を使用して作成したプロファイルは、４つの異なるヒト集団、すなわちアジア人、黒人、オーストラリア原住民および白人の間で概ね同一である。さらに、図６は、（ａ）ヒト、（ｂ）チンパンジーおよび（ｃ）オラウータン由来の、同じ増幅手順を使用して作成されたプロファイルの各々が種特異的であることを示す（図６（ｄ）もまた参照のこと）。従って、ヒトは、他の霊長類種の同程度に明確なプロファイルとは異なる、明確なプロファイルを有していた。
【００２１】
増幅産物は、遺伝子分析の種々の方法において使用され得る、種特異的マーカーとみなすことができる。第一の局面の方法および第二の局面の方法のこのような使用としては、以下に挙げられるが、これらに限定されない：
（ａ）参照サンプルのライブラリーとこのプロファイルとを比較することによって、未知サンプルのＤＮＡの種を決定する方法（例えば、食物の認証において）；
（ｂ）混入しているＤＮＡの存在の検出、および程度の定量のための方法；
（ｃ）野生における混合集団の種（例えば、魚）を定義する方法；
（ｄ）ハイブリッドを含む子孫の分類のための方法；
（ｅ）未知または未確定である場合に種間の分岐年代を評価するための方法；
（ｆ）精液、卵子、幹細胞、クローンなどを含む細胞種の決定の方法；
（ｇ）異なる集団、群および種において見出されるＲＬＥおよび他の相補性デュプリコンの比較の方法；
（ｈ）育種の継承のための能力を評価する方法；
（ｉ）低い受胎または生存に対する説明を評価するための方法；
（ｊ）ＩＶＦの成功および失敗を調査する方法。
【００２２】
１実施形態において、個体は２種のハイブリッドであり、この方法はそのハイブリッドの親の種を決定する。
【００２３】
さらなる局面において、本発明はサンプル中に混入するＤＮＡの存在を検出するため、および／またはその程度を定量するための方法を提供し、この方法は、以下：
ｉ）サンプル中のゲノムＤＮＡにおける相補性デュプリコンの増幅に由来する第一核酸配列プロファイルを得る工程、
ｉｉ）より公知の種のうちの１つ由来の相補性デュプリコンの増幅によって得られる１つ以上の参照核酸配列プロファイルと、その第一核酸配列プロファイルとを比較する工程、
ｉｉｉ）参照核酸配列プロファイルと比較した場合の第一核酸配列プロファイルの類似性に基づき、そのサンプルが単一種由来であるかどうかを決定する工程、
ｉｖ）そのサンプルが少なくとも２つの異なる種由来のＤＮＡを含む場合、参照核酸配列プロファイルと比較する場合の第一核酸配列プロファイルの類似性に基づき、そのサンプルが由来する２つ以上の種を決定する工程、ならびに、
ｖ）必要に応じてそのサンプル中の２つ以上の異種由来のＤＮＡの相対濃度を定量する工程、
を包含する。
【００２４】
種の間のプロファイルの差異の大きさは定量され得、既知の分離（分岐）年代と比較され得る。より具体的には、この方法は、種の間の進化上の関係の尺度を提供する。従って、さらなる局面において、本発明は、２つの異なる種、育種、品種または系統の間の分岐年代を評価する方法を提供し、この方法は、以下：
ｉ）各々の種、育種、品種または系統の個体由来のサンプル中のゲノムＤＮＡにおける相補性デュプリコンの増幅に由来する核酸配列プロファイルを得る工程、
ｉｉ）増幅産物のサイズの範囲を比較して、その２つの種、育種、品種または系統の進化上の関係を決定する工程、
を包含する。
【００２５】
例えば、分岐年代は、同じプライマーを使用する場合の２つの異種から得られるプロファイルにおける差異の数を分析することによって決定し得る。プロファイルにおける差異が大きいほど、それら２つの種の間の分岐年代はより大きい。好ましくは、分岐年代は、種々の相補性デュプリコンを標的化する種々のプライマーを使用して得られる多くのプロファイルを分析することによって、決定される。この方法は特に、密接に関係する種の分岐年代を分析するのに有用であるが、これに限定されない。この方法は、分岐年代を評価して分析されている種の進化上の関係のよりよい理解を得るため、他の公知の手順と組み合わせることができると考えられる。
【００２６】
当業者が気付くとおり、相補性デュプリコンは特定の種内で驚くほど保存されていることが見出されているが、いくつかの場合、（例えば）相補性デュプリコンの横側にある中間配列のサイズを変化させる突然変異、または移動性エレメントの転位は、個体と少なくともいくつかの他の種のメンバーとの間の僅かに異なっているプロファイルを生じる。ある程度の多型が推定または実際の種または集団に存在する場合、本発明者らは、種内特異的なオリゴ多型（ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｌｉｇｏｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＩＳＯ）の名称を使用する。
【００２７】
相補性なデュプリコンをある程度の種内特異的なオリゴ多型と共に使用して、個体の育種、系統または品種を決定するために有用なプロファイルを作成し得る。
【００２８】
さらに、相補性なデュプリコンをある程度の種内特異的なオリゴ多型と共に使用して、その個体が特定の形質を有するかどうかを決定するのに有用なプロファイルを作成し得る。好ましくは、この形質は、疾患またはその疾患に対する罹患性である。
【００２９】
Ｍｉｒｉａｍｉら（２００３）は、いくつかのイントロンの中の相補性デュプリコンの存在を記載し、そしてこれらが選択的スプライシングされるイントロンに関係し得ることを提案している。このことは、本発明の第一の局面の方法に従って見出される相補性デュプリコンの横側にあるいくつかの配列が選択的スプライシングされるタンパク質に関係し得ることにおいて、本発明といくらかの関係を部分的に有し得る。
【００３０】
別の例において、いくつかのＭＨＣハプロタイプは、散在性のレトロウイルス様エレメント（ＲＬＥ）の数および位置において差異を有する。これらのハプロタイプは、疾患またはその疾患に対する罹患性と結び付けることができ、このことは本発明の方法を使用して検出し得る。
【００３１】
上に記載したように、遺伝子の特徴付けおよび関係は、中間配列によって分離される、重複および連結されたヌクレオチド配列を識別することによって規定され得る。デュプリコンが相補性であり逆向きである場合、単一のプライマーを本発明の方法のために使用し得ることが決定された。この現象は最初、祖先のハプロタイプの重複された配列を増幅するように意図された５’プライマーおよび３’プライマーの対を試験する場合に観察された。例えば、プライマーＡＴＧＡＧＣＴＴＧＴＣＴＡＣＡＣＣＴ（配列番号１）が低いアニーリング温度を含む特定の条件下で使用された場合、これは単一のプライマーとして単独でヒトＤＮＡを増幅し、増幅産物の複雑な混合物を生成した。
【００３２】
ＤＮＡ増幅の原理は、１対のプライマー（１つは順方向であり１つは逆方向）に基づき、これらは一緒に各々の配列とその介在配列との指数関数的増幅を可能にする。さらに、ＡＴＧＡＧＣＴＴＧＴＣＴＡＣＡＣＣＴ（配列番号１）を用いて使用されるアニーリング温度はとても低いため、特異性は期待できず、他の要因（例えば、三重構造物）が結合に寄与することを包含する。最後に、増幅は１つかまたはせいぜい２〜３つの産物を生じるべきであることが一般的に教示される。しかしながら、ここでは本発明者らは大量の異なる産物を生成する。これらの要因を考慮して、単一のプライマーを使用する結果が実施毎に高度に変動性であることが予想されている。実際、これらの結果は再現性が高い。従って、この結果は、従来技術から予想され得ない。
【００３３】
従って、本発明の特定の好ましい実施形態において、増幅は単一のプライマーを使用して実施される。さらにこの方法は、ＤＮＡの同じ鎖上に逆方向相補配列を有する相補性デュプリコンを含むゲノム領域を増幅することが好ましい（この配列は、配列のバリエーションを有しても有さなくてもよいが、反復として認識され得ないほど多いバリエーションは有さない）（本明細書中で相補性デュプリコンの双方向増幅（ＢＡＣＤ）といわれる）。
【００３４】
さらに、本発明のさらなる局面は、相補性デュプリコンを含むＤＮＡを増幅するための方法を提供し、この方法は、増幅に適切な条件下で相補性デュプリコンにハイブリダイズし得る単一のプライマーと、このＤＮＡとを接触させる工程を包含する。
【００３５】
本発明の方法に有用な単一のプライマーの例としては、ＡＴＧＡＧＣＴＴＧＴＣＴＡＣＡＣＣＴ（配列番号１）、ＧＧＣＡＣＡＡＴＣＧＧＴＣＣＴＡＣＣＡＧＡＧＣＴＡ（配列番号２）、ＧＡＧＡＴＣＧＡＧＡＣＣＡＴＣＣＴＧＧＣＴＡＡＣＡＡ（配列番号３）、およびＣＣＧＴＧＴＴＡＧＣＣＡＧＧＡＴＧＧＴＣＴＣＧＡＴ（配列番号８）、これらのいずれか１つの逆方向相補性である配列を含むプライマー、または増幅条件下で同じ相補性デュプリコンにハイブリダイズするこれらのうちのいずれか１つの改変体が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、プライマーはＡＴＧＡＧＣＴＴＧＴＣＴＡＣＡＣＣＴ（配列番号１）、その逆方向相補体を含むプライマー、または同じ相補性デュプリコンに増幅条件下でハイブリダイズするそのプライマーの改変体である。
【００３６】
好ましい実施形態において、相補性デュプリコンは散在性トランスポゾンである。好ましくは、これらの散在性トランスポゾンはレトロウイルス様トランスポゾンである。さらなる好ましい実施形態において、このレトロウイルス様トランスポゾンは、Ａｌｕエレメントである。
【００３７】
増幅は、特定の条件下での増幅プライマーの使用を含む。増幅に使用されるプライマーは、ゲノム内で重複される配列に実質的に相補性であるように設計される。これらは、ゲノム内に存在する相補性デュプリコンの横側にある特定の配列を探し当て、そしてその配列を特徴付けるように設計される。
【００３８】
増幅は、プライマー結合部位の間に見られる配列の増幅を生じるいずれかの方法に従って実行され得る。好ましい方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、およびその方法に由来する、単一のプライマーのみを必要とする方法である。
【００３９】
増幅工程は、好ましくは、低度から中度にストリンジェントな条件下、すなわち４０℃〜４６℃、好ましくは約４３℃により特徴付けられるアニーリング温度を使用して、実行される。増幅条件は、アニーリングおよびプライマー伸長を可能にするように設計され、結果として増幅が起こり、とりわけプライマーの配列および長さ、ならびにＤＮＡサンプルに依存する。
【００４０】
好ましくは、増幅産物はサイズ排除クロマトグラフィーによって分離される。より好ましくは、サイズ排除クロマトグラフィーはアガロースゲル電気泳動またはポリアクリルアミドゲル電気泳動のいずれかである。さらにより好ましくは、サイズ排除クロマトグラフィーはポリアクリルアミドゲル電気泳動である。
【００４１】
当業者に理解されるように、増幅される相補性デュプリコンはさらにＤＮＡ配列決定によって特徴付けられ得る。
【００４２】
本発明は、動物（例えば、哺乳動物および昆虫）および植物等の真核細胞生物のゲノムの遺伝子分析に関する。好ましい昆虫は蚊である。好ましい哺乳動物はヒト、家畜動物、コンパニオンアニマルおよび野生動物である。より好ましくは、哺乳動物は霊長類であり、より好ましくはヒトである。
【００４３】
別の好ましい実施形態において、真核細胞生物は植物ではない。
【００４４】
本発明はまた、本発明の方法において有用なプライマーを識別するため、使用され得るゲノムＤＮＡ中の配列を比較する手段を提供する。
【００４５】
本発明のさらなる局面に従って、成分の少なくとも１つの集合において成分の１つ以上の部分集合を識別して、その１つ以上の部分集合を所定の一致レベルまで関心の部分集合（ＳＯＩ）と一致させる方法が、提供される。この方法は、以下の工程：
成分のＮ次元行列を形成する工程であって、その１つ以上の部分集合のうちの１部分集合の変換が行列の次元によって表される工程；
その行列中の各々の位置において識別子を保管する工程であって、各々の識別子が１つの部分集合の変換を表す工程；および
その行列中に少なくとも一対の一致する識別子を見出す工程；
を包含する。
【００４６】
別の局面において、本発明は、成分の少なくとも１つの集合において成分の１つ以上の部分集合を識別して、その１つ以上の部分集合を所定の一致レベルまで関心の部分集合（ＳＯＩ）と一致させる使用のための、成分のＮ次元行列を提供し、この行列は、
その行列中の各々の位置における識別子であって、各々の識別子が部分集合の変換を表す識別子を含み、
ここで、１つ以上の部分集合のうちの１つの部分集合の変換は行列の次元によって表され、そして行列中の一致する識別子の少なくとも一対が見出される。
【００４７】
別の局面において、本発明は１つ以上の部分集合を識別する方法を提供し、各々の部分集合は関心の部分集合（ＳＯＩ）中の成分と実質的に一致する成分を有し、各々の部分集合は成分の１集合または成分の複数集合の一部を形成し、この方法は以下の工程：
行列を形成する工程であって、この行列は、その集合またはその複数集合中の各々の成分のリストまたは部分的リストを含み、各々の成分および少なくとも１つのオフセットの集合または複数集合における位置が、その集合またはその複数集合中の同じ成分の別の位置を示す工程；
そのＳＯＩにおける成分の位置を選択する工程；
選択されるＳＯＩ中で、選択される成分に対して、そして選択される成分の隣接成分に対して、１つ以上のオフセットを識別する工程；
それらオフセットに基づき、その選択されるＳＯＩ中の成分に対して、それら成分の集合または複数集合の中で一致する成分を見出す工程；
を包含する。
【００４８】
本発明の別の局面に従って、１つ以上の部分集合を識別する場合の使用のための行列が提供され、各々の部分集合は関心の部分集合（ＳＯＩ）の中の成分に実質的に一致する成分を有し、各々の部分集合は成分の１集合または成分の複数集合の一部を形成し、この行列は、以下：
その集合または複数集合の中の各々の成分のリストまたは部分的リスト；
各々の成分の集合または複数集合の中の位置；および
集合または複数集合の中の同じ成分の別の位置を示す、少なくとも１つのオフセット；
を含み；
ここでＳＯＩの中の成分の位置が選択され、選択されるＳＯＩの中で選択される成分、およびその選択される成分の隣接成分に対して１つ以上のオフセットが識別され、その後、この行列を使用して、それらのオフセットに基づき、選択されるＳＯＩの中の成分に対して、成分の集合または複数集合の中の一致する成分を見出す。
【００４９】
本発明の別の局面において、成分の１つ以上の部分集合を識別して、成分の１つ以上の部分集合の中の少なくとも１つの成分を、選択される関心の部分集合（ＳＯＩ）の中で位置付ける方法が提供され、成分の１つ以上の部分集合および選択されるＳＯＩの各々は、成分の少なくとも１つの集合の一部を形成し、この方法は、以下の工程：
ＳＯＩに対して識別子を決定する工程；
成分の１つ以上の部分集合の各々に対して識別子を決定する工程；および
ＳＯＩの識別子と１つ以上の部分集合の各々の識別子とを比較して、比較される識別子が同一である場合に生じるＳＯＩの中にもまた存在する、１つ以上の部分集合のいずれかの中の成分を見出す工程、
を包含する。
【００５０】
本発明の方法を使用する相補性複製配列の識別の際、プライマーまたは１組のプライマーは相補性デュプリコンを増幅するように設計され得る。これらのプライマーは、ゲノムＤＮＡ上で試験され得るかまたはインシリコでの分析を実施することができ、本明細書中に記載される遺伝子分析の方法においてそのプライマーが有用であるかどうかを決定する。
【００５１】
さらなる局面において、本発明は相補性デュプリコンを増幅するのに使用するためのオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。
【００５２】
また、本発明の方法を使用して生成されるオリゴヌクレオチドプライマーが提供され、ここでこのプライマーを使用して、動物のゲノムの特徴である増幅産物のプロファイルを作成し得る。
【００５３】
好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーは、以下からなる群より選択される：
ａ）  ＡＴＧＡＧＣＴＴＧＴＣＴＡＣＡＣＣＴ（配列番号１）、ＧＧＣＡＣＡＡＴＣＧＧＴＣＣＴＡＣＣＡＧＡＧＣＴＡ（配列番号２）、ＧＡＧＡＴＣＧＡＧＡＣＣＡＴＣＣＴＧＧＣＴＡＡＣＡＡ（配列番号３）およびＣＣＧＴＧＴＴＡＧＣＣＡＧＧＡＴＧＧＴＣＴＣＧＡＴ（配列番号８）からなる群より選択される配列を含むオリゴヌクレオチド、
ｂ）  ａ）において提供されるいずれかのオリゴヌクレオチドの逆方向相補体である配列を含むオリゴヌクレオチド、ならびに
ｃ）  増幅条件下でａ）またはｂ）と同じ相補性デュプリコンにハイブリダイズするａ）またはｂ）の改変体。
【００５４】
別の局面において、本発明は、相補性デュプリコンを増幅するためのキットを提供し、このキットは、相補性デュプリコンにハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーを備える。
【００５５】
キットは、相補性デュプリコンの増幅のためおよび／または増幅産物の分析のために必要とされる、任意の他の成分を備え得る。１つの実施形態において、キットは、反応混合物、ヌクレオチド前駆体またはＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される、少なくとも１つの他の成分をさらに備える。
【００５６】
明らかであるように、本発明の１つの局面の好ましい様相および特徴は、本発明の多くの他の局面に適用可能である。
【００５７】
本明細書全体を通して、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」またはその変形（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記述される要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしく工程の群の包含を意味するが、任意の他の要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群の除外を意味しないように理解される。
【００５８】
本発明は以後、以下の非限定的な実施例によって、添付の図面を参照しながら記載される。
【００５９】
（配列表のキー）
配列番号１〜８、１７〜２７および３５：相補性デュプリコンを増幅するのに有用なプライマー
配列番号９〜１１：Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号第ＡＣ０８９９９９の一部を形成するヒトゲノムの部分（図２を参照のこと）
配列番号１２：ヒトＡｌｕＳｘ反復の部分（図７を参照のこと）
配列番号１３：ヒトＡｌｕＹｃ１反復（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号第ＡＹ５２０１４４）
配列番号１４：ゴリラＡｌｕＹｃ１反復の部分（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号第ＡＹ５２０１３９）
配列番号１５：ヒトＡｌｕＳｘ反復（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号第ＡＦ１３４７２６）
配列番号１６：ヒトＬＩＮＥ（Ｌ１．２）反復（Ｓａｎｔｏｓら、２０００）
配列番号２８〜３４：Ｎｅｌｓｏｎら（１９８９）により記載されるプライマー。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６０】
（本発明の詳細な説明）
（一般的な技術と定義）
他に特に定義されない限り、本明細書中に使用される全ての技術用語および科学用語は、当該分野（例えば、分子遺伝学）の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有するようにとられる。
【００６１】
他に示されない限り、本発明において利用される組換え核酸技術は標準的手順であり、当業者に周知である。このような技術は、以下のような情報源において文献全体に記載され説明され、そして本明細書において参考として援用される：Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９８４），Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９），Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（編者），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，１巻および２巻，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１），Ｄ．Ｍ．ＧｌｏｖｅｒおよびＢ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（編者），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，１〜４巻，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５および１９９６）、ならびにＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編者），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８，現在までの全ての最新情報を含む），Ｅｄ  ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（編者）。
【００６２】
本明細書において使用される場合、用語「相補性デュプリコンを増幅すること」または関連する用語は、その増幅産物が２つの関連するデュプリコンの一部および中間配列を代表的に含むことを意味する。より具体的には、本発明の方法において使用されるプライマーは、ゲノムＤＮＡの同じ鎖上の２つの関連配列とハイブリダイズし、そして介在配列の増幅を生じる。結果として、増幅産物は、その中間配列の横側にある５’末端および３’末端において、重複した配列の部分を含む可能性が非常に高い（例外は、反復単位の正しく末端においてプライマーがハイブリダイズする場合である）。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、「中間配列」は、相補性デュプリコンの横側にあるゲノムの領域である。好ましくは、中間配列は約５ｋｂ未満であり、より好ましくは約３ｋｂ未満であり、さらにより好ましくは１．５ｋｂ未満であり、相補性デュプリコンの増幅産物が、例えばゲル電気泳動によって分析されることを可能にする（ここで、この増幅産物は中間配列を含む）。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、「サンプル」は、ゲノムＤＮＡを含む任意の物質であり得る。試験され得るサンプルの型は、そのサンプルが由来する生物体に依存して変化する。例えば、生物体が哺乳動物である場合、サンプルは、血液、血漿、唾液、皮膚細胞の頬の擦取物または毛包であり得るが、これらに限定されない。生物体が植物である場合、サンプルは、種子、葉、根または花粉であり得るが、これらに限定されない。生物体が昆虫である場合、サンプルは脚、卵または幼虫もしくは成虫由来の全ＤＮＡ抽出物であり得るが、これらに限定されない。いくつかの場合、サンプル中のＤＮＡは、当該分野で周知の技術を使用して少なくとも部分的に精製され得る。しかしながら、当業者が気付くように、少なくともいくつかの場合、例えば血液サンプルの場合、増幅手順を実施する前にＤＮＡを精製することは必須ではない。
【００６５】
用語「プロファイル」は、本発明の増幅工程から得られる産物に関係する情報の提示を指す。この「プロファイル」は、２つの異なる個体から得られる増幅産物を比較することを可能にする任意の形態であり得る。代表的に、「プロファイル」は、図示的な表示形態であり得、一方の軸はその産物のサイズについての指標を提供し、他方の軸は所定のサイズの増幅産物の定量の指標を提供する。このようなプロファイルの例は、図３〜６および図８〜１８のものに示されるが、これらに限定されない。
【００６６】
本明細書中で記載される場合、種々の相補性デュプリコンの増幅より得られるプロファイルは、種特異的であるように示されている。このことは、「参照核酸配列プロファイル」のパネルが広範な種々の生物体より提供されることを可能にする。未知の発生源のサンプルが本発明の方法に供される場合、得られるプロファイルは、参照パネルに対して比較することができ、そのサンプルが由来する種を決定し得る。
【００６７】
いくつかの場合、種内特異的なオリゴ形態に起因して、プライマーは、個体の育種、系統または品種に関係する情報を提供する相補性デュプリコンを増幅するために使用し得るものを選択することができる。用語「育種、系統または品種」は、本明細書において広く使用され、共通の祖先を有し、かつ１つの亜群（時折、亜種ともいわれる）を他の亜群と区別する特徴を有する生物体の種の任意の亜群を指す。例えば、植物の異なる品種（例えば、小麦）は周知である。さらに、多くの動物の異なる育種（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジおよびウシ）もまた周知である。
【００６８】
他のいくつかの場合、種内特異的なオリゴ形態に起因して、プライマーは、種のいくつかのメンバーによって共有される特定の形質に関係する情報を提供する相補性デュプリコンを増幅するために使用し得るものを、選択することができる。その形質が規定される遺伝的根拠を有する限り、相補性デュプリコンの分析によって検出し得る形質の可能性ある型について、制限は存在しない。
【００６９】
いくつかの場合、相補性デュプリコンは、形質と直接関与し得る。このことに関して、Ａｌｕ反復は、いくつかのヒト疾患またはそれに対する罹患性に関与することがこれまでに示されている（ＤｅｉｎｉｎｇｅｒおよびＢａｔｚｅｒ，１９９９；Ｒｉｃｃｉら，２００３；Ｓｏｒｅｋら，２００２）。他の場合、相補性デュプリコンは、関心の形質に「繋がる」とみなされ得るように、その形質を担うゲノム領域に近接して位置付けられ得ることがほとんどない。「繋がる」（また、当該分野では「遺伝子的に繋がる」ともいう）ことによって、相補性デュプリコンを含むマーカー遺伝子座および第二の遺伝子座が染色体上で十分近いので、これらが減数分裂の５０％超で（例えば、ランダムではなく）一緒に遺伝することが、意味される。従って、遺伝子座の間で観察される世代あたりの組換え率（センチモルガン（ｃＭ））は、５０未満である。本発明の特定の実施形態において、遺伝子的に繋がった遺伝子座は、染色体上で４５ｃＭ、３５ｃＭ、２５ｃＭ、１５ｃＭ、１０ｃＭ、５ｃＭ、４ｃＭ、３ｃＭ、２ｃＭ、もしくは１ｃＭまたはそれ未満だけ離れ得る。好ましくは、それらのマーカーは５ｃＭ離れており、そして最も好ましくは約０ｃＭ離れている。
【００７０】
「形質」は、定義される遺伝的素因を有する生物体の任意の特徴であり得る。特に、形質は、疾患またはそれに対する罹患性であり得る。このような疾患としては、癌および自己免疫疾患が挙げられるが、これらに限定されない。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、または肉腫（例えば、卵巣癌、結腸癌、乳癌、膵臓癌、肺癌、前立腺癌、尿路癌、膀胱癌、急性リンパ性白血病、ホジキン病、肺の小胞癌腫、黒色腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、および軟組織肉腫）が挙げられる。別の実施形態において、形質は、運動能力と関連付けられ得る。形質はまた、生産能力、例えば、ヒツジにおける羊毛生産量、乳牛におけるミルク生産量、肉牛における肉の品質、ウマにおけるスタミナ、農作物における疾患耐性、農作物における塩耐性、または小麦における種子のデンプン含量、と繋がり得る。
【００７１】
本明細書中で使用される場合、「トランスポゾン」（当該分野において「移動性遺伝子エレメント」ともいわれる）とは、生物体のゲノムの１領域から別のゲノム領域へと移動し得る任意の遺伝子エレメントである。トランスポゾンは自律性であり得、すなわちトランスポゾンは、転座（例えば、ヒトゲノムの多くのＬＩＮＥ）を生じるのに必要な全ての機構を含むか、あるいはトランスポゾンは、移動のための反復単位によって含まれもコードもされない要因（例えば、Ａｌｕ反復）に依存する非自律性であり得る。
【００７２】
本明細書中で使用される場合、「レトロウイルス様」トランスポゾン（「レトロトランスポゾン」、「レトロウイルス様エレメント」および「レトロポゾン」ともいわれる）は、逆転写酵素（自律性レトロウイルス様トランスポゾンの場合、反復単位は逆転写酵素をコードする）の作用によって生成されるＲＮＡ中間物を介して移動する、遺伝子エレメントである。
【００７３】
本明細書中で使用される場合、用語「介在する」は、反復単位が代表的に、タンデムに反復されるのではなく単一の単位としてゲノムの多くの部位において一般的に見出されることを意味する。
【００７４】
（相補性デュプリコンおよび相補性デュプリコンの双方向増幅）
遺伝子の特徴付けおよび関係は、中間配列によって分離される、複製かつ連結されるヌクレオチド配列を識別することによって定義され得る。これらの複製かつ連結されるヌクレオチド配列は、相補性デュプリコンと称される。
【００７５】
相補性デュプリコン配列の増幅より生じた主要産物の配列決定の後、意外なことに、相補性デュプリコンの間のヌクレオチド配列が多様であることが発見された。このことは、デュプリコンはゲノム内で近位に繋がるが、複数かつ全く異なる部位において存在することを意味する。所内およびその他で利用可能なデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｂｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／、およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋが挙げられる）との比較によって、相補性デュプリコンの間の種々の配列が分析されると、いくつかの配列は特定の特性を有することが見出された。いくつかの例は、レトロウイルス様エレメント（ＲＬＥ）として分類され得る。Ａｌｕ反復等の種特異的ＲＬＥは、増幅標的を提供する。しかしながら、他の配列は、ＲＬＥとしては分類されず、この方法では説明できなかった。表１は、魚、マウスおよびヒトのゲノムＤＮＡにおける相補性デュプリコンを増幅した後に観察される、産物（すなわち、増幅産物より選択され配列決定された特異的バンド）を示す。
【００７６】
（表１）
【００７７】
【表１−１】
2008529538.tif 000002
【００７８】
【表１−２】
2008529538.tif 000003
【００７９】
相補性デュプリコンは、正確な反復である必要はないが、反復として認識可能であるように単に実質的に反復されなければならない。例えば、図１に示されるように、プライマーＡＴＧＡＧＣＴＴＧＴＣＴＡＣＡＣＣＴ（配列番号１）は、実施例１に記載される増幅条件下でヒトゲノムの多くの部分にハイブリダイズし得ることを決定された。いくつかの場合、このプライマーは、１ｋｂ未満のサイズで多くの増幅産物を生じるように十分に間隔を空けて、ヒトゲノムＤＮＡの両方の鎖にハイブリダイズし得る。図１に強調されるゲノム領域は反復であるかまたはより巨大なそれぞれの単位の一部を形成するという証拠を本発明者らは見出していないものの、これらの強調される配列は、相補性デュプリコンとみなし得る。
【００８０】
反復は、目視によるか、または特定のコンピュータープログラム（例えば、「Ｒｅｐｅａｔ  ｍａｓｔｅｒ」（商標）、（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅｐｅａｔｍａｓｔｅｒ．ｏｒｇを参照のこと）または「Ｂｌａｓｔ」（商標）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴを参照のこと）を使用して、判定し得る。
【００８１】
好ましい実施形態において、反復配列として定義される相補性デュプリコンは、ゲノム全体にわたって散在した。しかしながら、相補性デュプリコンは代表的にゲノム中でタンデムには反復されない。なぜならこの場合には、その増幅産物は単回の（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ）反復単位を含み、中間配列を含む産物が（例えあるにせよ）ほとんどないからである。
【００８２】
ヒトゲノムに関して、好ましい相補性デュプリコンはＡｌｕ反復である。Ａｌｕ反復は、一般的に霊長類に限定されると考えられる、ヒトゲノムにおける相対的に最近の獲得物である。しかしながら驚くべきことに、本発明者らは、ヒトＡｌｕ反復に結合するプライマーを、非霊長類種において相補性デュプリコンを増幅するためにもまた使用し得ることを見出した。霊長類のゲノム中に約１×１０６コピーのＡｌｕ反復が存在し、ここでＡｌｕ反復の挿入物の起伏は、主要な進化上の分岐と関係することを示唆している。Ａｌｕ反復は、種々の方向（逆方向相補体が挙げられる）に挿入され、そして遺伝子発現（例えば、位置依存性の配列、翻訳、転写、選択的スプライシング、組換え、重複）に影響することが示されている（ＤｅｉｎｉｎｇｅｒおよびＢａｔｚｅｒ，１９９９；Ｒｉｃｃｉら，２００３；Ｓｏｒｅｋら，２００２）。
【００８３】
さらに、Ａｌｕ反復はサブファミリーに分類され得る（ＢａｔｚｅｒおよびＤｅｉｎｉｎｇｅｒ，２００２；ＫａｐｉｔｏｎｏｖおよびＪｕｒｋａ，１９９６；Ａｎｔｕｎｅｚ−ｄｅ−Ｍａｙｏｌｏら，２００２；Ｂａｔｚｅｒら，１９９６ａ；Ｂａｔｚｅｒら，１９９６ｂ）。これらのサブファミリーは、米国特許第６，３８３，７４７号に記載される祖先のハプロタイプに類似の様式で、種内での祖先に関する情報を提供する可能性が高い。さらに、所定のサブファミリーの特異的Ａｌｕ反復についての相補性デュプリコンの増幅は、本発明の方法に従って作成されるプロファイルと形質（例えば、疾患形質）との間の繋がりを識別し得る。
【００８４】
Ｎｅｌｓｏｎら（１９８９）は、ヒトゲノムを分析するためＡｌｕ反復より設計された単一プライマーを使用することを企図したが、増幅産物の情報性のないスメアがゲル電気泳動上で得られたのみであった。従って、Ｎｅｌｓｏｎら（１９８９）は、ゲノムの特徴ある増幅産物プロファイルを提供することができなかった。対照的に、本発明者らは、ヒトＡｌｕ反復より設計された単一プライマーがヒトおよび他の動物種のゲノム分析に有用であり得ることを示した。Ｎｅｌｓｏｎら（１９８９）の実験の失敗は、莫大なＡｌｕ反復にハイブリダイズするプライマーを使用して非常に莫大な増幅産物を生じたことに繋がるようである。結果として、本発明の方法は、本方法がＡｌｕ反復に結合するプライマーと関係するので、ゲノムのＡｌｕ反復の部分集合のみに結合することが予想されるプライマーを利用することが好ましい。さらに好ましい実施形態において、本発明の方法において使用されるプライマーは、ＡＡＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＧＣＡＧＴＧＡＧＣＣＧＡＧＡＴ（配列番号２８）、ＣＧＡＣＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＹＲＧＣＴＣＡＣＴＧＣＡＡ（配列番号２９）、ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＴＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＧ（配列番号３０）、ＡＣＴＣＧＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧ（配列番号３１）、ＣＴＣＧＧＣＴＣＡＣＴＧＣＡＡＡＣＴＣＣ（配列番号３２）、ＡＴＣＧＣＡＴＧＡＡＣＣＣＧＧＧＡＧＧＣ（配列番号３３）、ＧＣＡＴＣＧＡＴＡＧＡＴＹＲＹＲＣＣＡＹＴＧＣＡＣＴ（配列番号３４）でも、これらの逆方向相補体でもない。
【００８５】
１実施形態において、増幅される反復単位（例えば、Ａｌｕ反復のサブタイプ）は、ゲノムの約５％未満を示す。別の実施形態において、増幅される反復単位は、ゲノムの約３％未満を示す。別の実施形態において、増幅される反復単位は、ゲノムの約２％未満を示す。
【００８６】
配列番号２および配列番号３に表されるオリゴヌクレオチドは、ヒトゲノムの約１．５％を表す、ヒトＡｌｕ反復のうちのＡｌｕＹサブファミリーを少なくとも増幅することが決定された（Ｓｔｅｎｇｅｒら、２００１）。従って、別の実施形態において、増幅される反復単位は、ゲノムの約１．５％を示す。さらに、別の実施形態において、本方法はヒトゲノムのＡｌｕＹ反復を少なくとも増幅し得る。
【００８７】
代表的に、本発明の方法を使用して生成される情報性のあるプロファイルは、１００ｂｐ〜２，０００ｂｐの間の長さに１個〜約５０個の間のピークを有する。この特徴が本発明の好ましい実施形態である。別の実施形態において、本発明の方法を使用して生成されるプロファイルは、１００ｂｐ〜２，０００ｂｐの間の長さに約５個〜約５０個のピークを有する。さらなる実施形態において、本発明の方法を使用して生成されるプロファイルは、１００ｂｐ〜２，０００ｂｐの間の長さに約１０個〜約５０個のピークを有する。
【００８８】
さらに、上に概説したように、いくつかのＭＨＣハプロタイプは、散在するレトロウイルス様エレメント（ＲＬＥ）の数および位置に差異を有する（例えば、Ｋｕｌｓｋｉら、２００１を参照のこと）。これらのハプロタイプは、疾患またはその疾患に対する罹患性に繋がり得る。これらは、本発明の方法を使用して検出され得る。好ましい実施形態において、この疾患は、宿主対移植片疾患、または移植片対宿主疾患である。例えば、特定のハプロタイプの特徴であるプロファイルが識別される場合、本発明の方法は、骨髄移植のためのドナーとレシピエントとの対を適合させるために使用することができる。
【００８９】
いくつかの場合、本発明の方法において標的化される「相補性デュプリコン」は、ＤＮＡの同一鎖上で同一向きで存在する。この場合、２つのプライマーが増幅手順に必要とされる可能性が非常に高い。しかしながら、他の例において、デュプリコンは相補性であり逆方向である。この実施形態において、増幅手順は、相補性デュプリコンの双方向増幅（ＢＡＣＤ）と称される。ＢＡＣＤは、単一のプライマーまたは１対のプライマーを使用して実施し得る。後者の場合、これらのプライマーは、中間配列が増幅されそして反復配列の部分のみが増幅されないように設計される。
【００９０】
特定の好ましい実施形態において、単一のプライマーはＢＡＣＤに使用される。単一のプライマーがいくつかの種由来のゲノムＤＮＡにおけるＢＡＣＤを増幅するために使用され、そしてその結果を他のいくつかの種のマーカーが試験される場合に得られる結果と比較した場合、ＢＡＣＤ産物は、寡少な程度でのみ異なる傾向にある既知の代替物よりも、ずっと多様性があり、かつ情報性があることが、直ちに明白になった。ＢＡＣＤのこの利点は、以下に起因してＢＡＣＤ産物が混合物であるという事実によって部分的に説明し得る：
１．長さおよび内容において異なる配列の増幅；
２．プライマー接合する配列の間の寡少な差異およびアンプリコン間の競合に起因する示差的なプライマー接合；ならびに
３．コンカテマーを含む産物の間の相互作用。
これらの点に関して、作成されるプロファイルは、米国特許第６，３８３，７４７号に記載されるものと同様である。
【００９１】
（相補性デュプリコンの増幅のためのプライマーの設計）
本明細書中のプライマーは、特定の標的ＤＮＡ配列に対して、「実質的に」相補性であるように選択される。このことは、プライマーがそれぞれの鎖にアニーリングするのに十分に相補性でなければならないことを意味する。従って、プライマー配列は、鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補性（すなわち、制限部位を含んでいる）ヌクレオチドフラグメントは、プライマーの５’末端に結合することができ、その残りの部分のプライマー配列は、鎖に相補性であり得る。あるいは、非相補性塩基またはより長い配列をプライマー内に散在することができ、プライマー配列が配列と十分な相補性を有して、その配列とアニーリングして伸長産物の合成のための鋳型を形成することがもたらされる。
【００９２】
相補性デュプリコンは、目視によるか、または特定のコンピュータープログラム、例えば、「Ｒｅｐｅａｔ  ｍａｓｔｅｒ」（商標）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅｐｅａｔｍａｓｔｅｒ．ｏｒｇを参照のこと）、「Ｂｌａｓｔ」（商標）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴを参照のこと）を使用して、または本明細書中に記載される他の方法により判断し得る。他の適切なコンピュータープログラムの例としては、Ｂｅｄｅｌｌら（２０００）により記載されるもの、Ｃｌｏｕｇｈら（１９９６）により記載されるもの、およびＪｕｒｋａら（１９９６）により記載されるものが挙げられる。いくつかの場合、プライマーは、Ａｌｕ反復等の既知の散在性反復単位から設計される。他の場合、既知のゲノム配列を走査するコンピュータープログラムを使用して、本発明の方法に適切なプライマーを識別し得る。
【００９３】
本発明の方法に有用なプライマーの例としては、ＡＴＧＡＧＣＴＴＧＴＣＴＡＣＡＣＣＴ（配列番号１）、ＧＧＣＡＣＡＡＴＣＧＧＴＣＣＴＡＣＣＡＧＡＧＣＴＡ（配列番号２）、ＧＡＧＡＴＣＧＡＧＡＣＣＡＴＣＣＴＧＧＣＴＡＡＣＡＡ（配列番号３）、およびＣＣＧＴＧＴＴＡＧＣＣＡＧＧＡＴＧＧＴＣＴＣＧＡＴ（配列番号８）が挙げられるが、これらに限定されない。後者の２つは、ヒトＡｌｕ反復（図７）に由来し、本明細書中でそれぞれＰ３およびＰ１と称される。上に概説したように、これらプライマーの配列は、本発明の方法におけるそれらプライマーの有用性に影響せずに僅かに変更することができ、例えば、５’末端における伸長または１つもしくは２つのヌクレオチドの変更である。さらに、本発明がＡｌｕ反復の既知配列（例えば、図７、配列番号１３〜１５、ならびにＢａｔｚｅｒおよびＤｅｉｎｉｎｇｅｒ（２００２）、ＫａｐｉｔｏｎｏｖおよびＪｕｒｋａ（１９９６）、Ａｎｔｕｎｅｚ−ｄｅ−Ｍａｙｏｌｏら（２００２）、Ｂａｔｚｅｒら（１９９６ａ）、Ｂａｔｚｅｒら（１９９６ｂ）に提供されるＡｌｕ配列）に基づく場合、他のプライマーが、本方法における使用のために容易に設計され得る。本発明の方法において使用し得るＡｌｕ反復にハイブリダイズするプライマーのさらなる例としては、ＣＴＣＡＣＧＣＣＴＧＴＡＡＴＣＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧ（配列番号４）、ＧＧＡＴＣＡＣＧＡＧＧＴＣＡＧＧＡＧＡＴＣＧＡＧＡ（配列番号５）、ＧＣＣＧＡＧＡＴＣＧＣＧＣＣＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧ（配列番号６）、ＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡＴＧＧＣＧＴＧＡ（配列番号７）およびこれらの逆方向相補物が挙げられるが、これらに限定されない。当業者が気付くように、配列番号１３〜１５は、相補性デュプリコンの増幅のためのプライマーを設計するため使用し得るＡｌｕ反復の２〜３の例として単に提供されている。他の多くの既知Ａｌｕ反復が使用され得る。
【００９４】
Ａｌｕ反復と同様に、本開示を考慮して、（全てではないにせよ）大部分の生物体のゲノム中に他の多くの既知の散在反復単位が存在し、これらは本発明の方法における使用のためのプライマー設計のため、容易に標的化され得る。例としては、霊長類のＬＩＮＥ反復（例えば、配列番号１６およびＳｍｉｔら、１９９５を参照のこと）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）等の昆虫由来の転位可能なエレメント（Ｂａｒｔｏｌｏｍｅら、２００２；Ｌｏｚｏｖｓｋａｙａら、１９９５；Ｐｅｒｅｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚら、２００３；Ｖｉｅｉｒａら、２００２）、植物のレトロトランスポゾン（例えば、Ｔｙ１コピア）（Ｆｌａｖｅｌｌら、１９９２；ＳａｎＭｉｇｕｅｌ、ら、１９９８；Ｗａｎｇら、１９９９）、げっ歯類のＩＤ  ＳＩＮＥ（Ｋａｓｓら、１９９６）、げっ歯類のＭｙｓレトロトランスポゾン（Ｌｅｅら、１９９６）、げっ歯類のＢ１  ＳＩＮＥ（ＺｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚおよびＬａｂｕｄａ、１９９６）、および霊長類のＴｉｇｇｅｒトランスポゾン（ＳｍｉｔおよびＲｉｇｇｓ、１９９６）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
本発明の方法において使用し得る、霊長類のＬＩＮＥ反復より設計されたプライマーの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＡＧＡＧＣＡＧＡＡＣＴＧＡＡＧＧＡＡＡＴＡＧＡＧＡＣ（配列番号１７）、ＣＣＡＡＧＣＡＧＡＣＣＴＡＡＴＡＧＡＣＡＴＣＴＡＣＡ（配列番号１８）、ＡＴＡＧＴＴＧＧＡＡＧＴＡＡＡＧＣＴＣＴＣＣＴＣＡＧ（配列番号１９）、ＴＣＣＴＣＡＧＴＧＡＣＣＴＡＣＡＡＡＧＡＧＡＣＴＴＡ（配列番号２０）、ＡＴＡＣＡＴＴＣＣＴＣＧＡＣＡＣＡＴＡＣＡＣＴＣＴＣ（配列番号２１）、ＴＣＣＴＧＡＡＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＴＡＣＡＴＡＡＣ（配列番号２２）、ＣＴＡＣＡＡＧＧＣＴＡＣＡＧＴＡＡＣＣＡＡＡＡＣＡＧ（配列番号２３）、ＣＣＴＡＡＴＧＣＴＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＴＴＡＧＴＧＧ（配列番号２４）、ＣＴＡＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＡＧＧＡＣＡＴＣＴＡＣＡＣ（配列番号２５）、ＣＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＡＡＡＣＣＡＣＴ（配列番号２６）、ＡＴＡＣＡＧＡＧＡＡＧＴＧＣＴＴＡＡＡＧＧＡＧＣＴＧ（配列番号２７）、ＣＴＴＴＴＣＴＣＣＡＣＡＴＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＡＴＴ（配列番号３５）、およびこれらの逆方向相補物。他のプライマーは、多くの既知ＬＩＮＥ関連反復の配列を考慮して、容易に設計され得る（例えば、Ｓｍｉｔら、１９９５を参照のこと）。
【００９６】
当業者が気付くように、本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドプライマーの配列は、本発明の方法のための有用性に影響しない程度にいくらか変更することができる。本明細書中に具体的に開示されるプライマーの「改変体」は、提供される正確な配列と比較する場合、挿入、欠失または突然変異を有する任意のプライマーを含む。好ましくは、任意の改変体は、その５’末端および／または３’末端がより長いかまたはより短い。このような改変体は、本明細書中に開示される特定のプライマーと同じ相補性デュプリコンに増幅条件下でハイブリダイズし、等価な増幅産物を生成するために必要とされる。
【００９７】
用語「プライマー」は、本明細書中に定義される場合、鋳型依存性プロセスで初期核酸の合成を開始（ｐｒｉｍｉｎｇ）し得る任意の核酸を包含するように意味される。プライマーは、二重鎖形態または単鎖形態で提供され得るが、単鎖形態が好ましい。プライマー設計方法は、当該分野で周知であり、標準的なワトソンクリック塩基対形成から得られる相補性配列の設計（すなわち、アデニン対チミンまたはウラシルの結合、およびグアニン対シトシンの結合）に基づく。標的の相補性デュプリコンに関して適切な情報と共に提供される場合の、増幅プライマーの選択および設計のためにコンピューター処理されるプログラムは、当業者に周知の民間の供給源および／または公的な供給源から利用可能である。
【００９８】
相補性デュプリコン配列にアニーリングする、本発明の方法において使用されるプライマーは、好ましくは少なくとも連続する約１５ヌクレオチドの配列、より好ましくは少なくとも約１８ヌクレオチドの配列からなる。
【００９９】
本発明の方法において使用されるプライマーは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを有し得る。多くの修飾ヌクレオチド（ヌクレオチドアナログ）が公知であり、オリゴヌクレオチドにおいて使用され得る。ヌクレオチドアナログは、塩基部分、糖部分またはリン酸エステル部分のいずれかに対して何らかの型の修飾を含むヌクレオチドである。塩基部分の修飾としては、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ／Ｕの天然修飾および合成修飾、ならびに異なるプリン塩基またはピリミジン塩基が挙げられる。このような修飾は、当該分野で周知である。
【０１００】
キメラプライマーもまた使用し得る。キメラプライマーは、少なくとも２つの型のヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの両方、リボヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドの両方、２つ以上の型の修飾ヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよび２つ以上の異なる型の修飾ヌクレオチドの両方、リボヌクレオチドおよび２つ以上の異なる型の修飾ヌクレオチドの両方、または、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび２つ以上の異なる型の修飾ヌクレオチド）を有するプライマーである。１つの型のキメラプライマーは、ペプチド核酸／核酸のプライマーである。例えば、５’−ＰＮＡ−ＤＮＡ−３’プライマーまたは５’−ＰＮＡ−ＲＮＡ−３’プライマーは、より効率的な鎖進入および重合進入のために使用することができる。他の方のキメラプライマーは、例えば、５’−（２’−Ｏ−メチル）ＲＮＡ−ＲＮＡ−３’または５’−（２’−Ｏ−メチル）ＲＮＡ−ＤＮＡ−３’である。
【０１０１】
プライマーは、当該分野で周知の方法によって化学合成され得る。化学合成法は、蛍光標識、放射線標識などの検出可能な標識の配置が、その配列内の任意の場所に実際に配置されることを可能にする。当業者に公知な固相方法およびオリゴヌクレオチド合成またはポリヌクレオチド合成の他の方法は、本開示に関係して使用され得る。
【０１０２】
（配列（集合）を比較する方法）
１実施形態において、本発明は、情報（メタデータ）についての情報の作成を提供し、次いで、このメタデータを使用して今日まで可能ではない膨大なコンピューター処理業務を可能にする。今日まで、公開された文献は、Ｎ分木（Ｎ−ａｒｙ  ｔｒｅｅ）構造および精密化（例えば、これらの主題における接尾辞木、接頭辞木、およびバリエーション）を使用する。
【０１０３】
従って、２より大きい成分の数を有する、成分（列挙されたものおよび列挙されていないものの両方）の巨大なデータ集合についてのメタデータは、Ｎ次元行列中に保管することができ、これによってそのデータ集合（集合および部分集合）内およびそのデータ集合間の両方の構造および関係が見出され得る。任意の変換がメタデータの作成前および作成後の両方で、それらのデータ集合に適用され得る。
【０１０４】
１実施形態は、多項式代数を使用して、リレーショナルデータベース技術を使用して編成し、保管し、読み出し、そして問い合わされる成分の巨大な連続した任意の部分集合に、特有の整数識別子を割り当てる。一般的な多項式および一般的な最大の多項式のべき数の使用は、同じ型のデータ成分を有するデータ集合の間の互換性を生み出す。
【０１０５】
さらなる実施形態において、本発明は、非常に巨大なデータ集合のうちの任意の巨大な部分集合に対して特有の識別子を割り当て、次いで構造を問い合わせて定義するためのリレーショナルデータベースの新規の使用のための方法である。１つの長い整数は、１００万（または１０億）ヌクレオチドを表し得る。２００万塩基の配列が同一であるかどうかを決定することが必要とされる場合、２つの整数（各々の配列を表す）が、１００万の比較を行うことよりもむしろ同等性を確認するために、比較される。このことは、使用される木において、全ての節点に対して特有の識別子の割り当て、全ての可能性ある変換を記述することに類似である。ゲノムのセンスにおいて、関心は、各々の節点からの全ての可能性ある直鎖の双方向配列上で、順方向複製物および逆方向複製物、ならびに順方向相補物および逆方向相補物に存在し、次いでそのメタデータをネットワーク接続された位相幾何学の図表に入れて、同等性を明らかにさせる。
【０１０６】
本発明の実施に対する縮小の例は、ＤＮＡ配列内の特定の配列について、順方向複製物、逆方向複製物、順方向相補物および逆方向相補物を検索する適用である。逆方向相補物を使用して、ＢＡＣＤプロセスのための可能性あるプライマー位置を決定する。
【０１０７】
保管されたデータの性質およびこれにより任意に変換される能力はまた、遺伝子多型の純理論的な反復性リバースエンジニアリングが進化の実践の理解を改善することを可能にする。
【０１０８】
１実施形態に従い、成分の巨大な集合の分析のための新規アプローチが開示され、これは、整数、数または文字（α数字を含む）を含み得るが、これらに限定されない。これは多項式代数を使用する。また、任意の変換を有するデータ部分集合を選択して部分集合間の関係を定義する新規アプローチが開示される。この実施形態は、ＤＮＡ配列中のヌクレオチドの同一または類似の部分集合（部分配列）を見出すのに利用を有する。他の利用は全ての巨大なデータ集合において見出され、熱動態学、集団分析および画像認識（例えば、ピクセルのアレイを使用して番号プレート上に情報を検出すること）における集合が挙げられる。
【０１０９】
用語「成分の集合」、「成分の部分集合」または「成分の関心の部分集合」は、概して成分の集合または群を表すために使用され、用語「成分の配列」および「成分の部分配列」は、例えばゲノムＤＮＡに関して、その成分の相対位置が定義される集合を示すが、それ以外にも用語「成分の集合」または「成分の部分集合」と相互に交換可能に使用され得る。
【０１１０】
関心の部分集合（ＳＯＩ）は、ゲノムの意味において、任意に定義される変換の対象である配列（例えば、逆方向相補物または複製物）である。このアプローチは、ＳＯＩとみなすのに必要な長さおよび適合程度について、決定が任意になされることを必要とする。ゲノムＤＮＡにおいて、このことは、図１９に示されるように、複製物またはゲノム中への多重挿入物を含む。このアプローチは、同一方向のＳＯＩ、逆方向におけるＳＯＩ、ならびに順方向および逆方向について任意に規定される変換におけるＳＯＩを見出す能力を含む。ゲノムに関して、このことは、両方のＤＮＡ鎖に対する相補性ＤＮＡ配列を含む。
【０１１１】
このアプローチを使用して、成分の１つ以上の集合または配列におけるＳＯＩの存在および位置を決定し得る。ゲノムに関して、成分の配列は、異なる種のゲノムであってもよく、この場合、この方法は、異なる種に渡って相同性および配列保存を検索することを可能にする。図２０を参照すると、両方の配列に渡る２つの同一のＳＯＩを有する２つのヌクレオチド配列（一方から他方のオフセット）が示される。
【０１１２】
完全に同一のＳＯＩを見出すため、これをなす方法は、関心の集合内で（Ｎ−Ｄ）部分配列を作成することであり、ここでＮは集合のサイズであり、Ｄは調査される部分集合中の成分の数（デュプリコンの長さ）である。次いで、個々の識別子が各々の部分集合に対して割り当てられ（Ｄの関数に基づく）、次いで整頓され得る。特有の数字−整数識別子は、本来の順番を有するので、理想的である。この第一の方法は、多項式代数の４ビット表現を使用する。
【０１１３】
ＳＯＩを見出し比較するために以下のアルゴリズムを使用する場合、位置ｎにおける集合成分（Ｎ）は、二進数字または２ビットのＳビットニブルに素数を割り当てられる。Ｓは離散型の値の数の関数であり、その集合の成分は：
Ｑ≧２Ｓ≧Ｐ
を取り得、そのように定義される。ここで、Ｐは、仕上げられた表の集合（the enumeration set rounded）中の成分の各々に対して素数を割り当てるのに十分な最小の素数であり、Ｑは順番の素数の集合中の、次の素数である。ゲノムに関して、Ｓは４であり、Ａは二進数００１１（１０進数３）であり、Ｃは二進数０１０１（１０進数５）であり、Ｇは二進数０１１１（１０進数７）であり、Ｔは二進数１０１１（１０進数１１）であり、Ｘは二進数１１０１（１０進数１３）である。素数を使用して、集合間または部分集合間の特定の成分の変化の決定を可能にする。ゲノムに関して、このことは、特定のヌクレオチドの置換、欠失または挿入についての識別を可能にする。
【０１１４】
ビットの集合は、各々のビット集合に対して特有の識別子（例えば、多項式の剰余）を計算し、次いでそれらの識別子を比較することによって、確率統計的に比較される。多項式の剰余が異なる場合、それらの部分配列は異なる。多項式の剰余が一致する場合、それらの部分配列が実際に異なっている機会は小さい。この確率は、任意性をより小さく、共通の多項式の除数をより大きくさせ得る。
【０１１５】
任意長のビット配列に対して特有の識別子を割り当てるシステムは、モジュロ２多項式算術である。この方法は、大きさＤの各々のＳＯＩに対して、多項式の剰余（少なくともＳ＋１次の予め定義した多項式に対する）として計算する、増分シフト型の「ウィンドウ」を使用する。モジュロ２算術から生じる唯一の確実な整数は０および１であり得るので、多項式は、０または１のいずれかの係数を用いて作成され、これは位置ｎ（ｎ＜Ｄ−Ｎ）における成分の存在または不在を決定する。
【０１１６】
このプロセスを説明する最も単純な方法は、Ｎビットの任意の列のうちのｎ番目のビットを、多項式の表現においてＮ−１乗の虚数変数ｘの係数として割り当てることである。例えば、ビット集合が０１１０１０１１０１０１である場合、このことは、多項式：
０ｘ０＋ｘ１＋ｘ２＋０ｘ３＋ｘ４＋０ｘ５＋ｘ６＋ｘ７＋０ｘ８＋ｘ９＋０ｘ１０＋ｘ１１
すなわち、ｘ＋ｘ２＋ｘ４＋ｘ６＋ｘ７＋ｘ９＋ｘ１１
として解釈される。
【０１１７】
各々の多項式（可能性あるＳＯＩ）が（次数ｋの）共通の多項式表現により除算され、次いでその多項式の除数が、生じた（次数ｋ−１の）多項式剰余に加算される場合、特有でない多項式を誤って生じる確率が１／（２ｋ）であるような、元の多項式に対して特有である多項式を生じる。３２ビット除数多項式を使用する場合、エラーの確率は、１０億分の１未満である。ＩＥＥＥにより公開された多くの除数が存在し、これらは、ビット集合の性質に依存して、可能性あるエラーレベルを最小にする。
【０１１８】
従って、上記の方法は、成分の１つ以上の部分集合を識別して、その成分の１つ以上の部分集合中の少なくとも１つの成分が、選択される関心の部分集合（ＳＯＩ）中に位置付けられる。成分の１つ以上の部分集合および選択されるＳＯＩの各々は、成分の少なくとも１つの部分集合の一部を形成する。この方法は、以下の工程：
（１）  ＳＯＩに対する識別子を決定する工程；
（２）  成分の１つ以上の部分集合の各々に対して識別子を決定する工程；および
（３）  その１以上の部分集合についての各々の識別子をＳＯＩ識別子と比較して、比較された識別子が同一の場合、発生するＳＯＩ中にもまた存在する成分を１つ以上の部分集合のいずれかの中に見出す工程、
を包含する。
【０１１９】
コンピュータープログラムを使用して、成分の１つ以上の部分集合を識別するようにプロセッサに指示して、その成分の１つ以上の部分集合中の少なくとも１つの成分が、選択される関心の部分集合（ＳＯＩ）中に位置付けられる。成分の１つ以上の部分集合、および選択されるＳＯＩの各々は、成分の少なくとも１集合の一部を形成する。このプログラムは、本方法の少なくとも工程（１）、（２）および（３）ならびに任意の他の工程を実施するようにプロセッサに指示する。
【０１２０】
これらのアルゴリズムの有用性は、２つの事実に基づく：
１）  モジュロ２算術（元の表現の係数を除数多項式の係数で除算すること）は、単純な排他的論理和（ＸＯＲ）として実行され、これは、ハードウェアにおける単純なＸＯＲゲートを使用する、本来の機械命令である。
２）  ビットの配列（関心の集合の成分を表す）に沿って「ウィンドウ」またはフレームをずらすことは、単純な本来のシフト−レフト（ｓｈｉｆｔ−ｌｅｆｔ）機械命令である。このことは、計算（およびそれによる時間）が最小に保たれることを意味する。このことはまた、ワンパス操作（ｏｎｅ  ｐａｓｓ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）であることの利点を有する。
【０１２１】
多くの多項式の除数が存在し、これらは特定の配列バリエーション（例えば、補足されている単一のビット）、複数の成分の「バースト（ｂｕｒｓｔ）変化」（例えば、特定の多型割合（ｆ｛多型頻度｝）に関係しているヌクレオチド）、および現れる種々のより難解な条件）をくみ取るように調整される。
【０１２２】
特有の識別子（多項式の剰余）が行列形式で位置識別子（配列中の位置）に対して保管される場合、長さＤの全ての複製物が非常に迅速に識別され得る。
【０１２３】
完全に同一のプロセスが、ゲノム学において、関心の他の情報（例えば、順方向配列、相補性配列、逆方向配列および逆方向相補物）に適用され得る。
【０１２４】
第二の方法は、多項式代数２ビット表現を使用して、「全て適格にされた完全な」ＳＯＩに適用することができ、そしてゲノムに関して、Ａは二進数００（１０進数０）、Ｃは二進数０１（１０進数１）、Ｇは二進数１０（１０進数２）、そしてＴは二進数１１（１０進数３）である。従って、ＳＯＩはＷ／２個のヌクレオチドに縮小され、ここでＷは使用されるコンピューターの本来のワードサイズである。平均的なデスクトップＰＣおよび代表的な開発環境の本来のワードサイズは、常に２の倍数である。最近の設計のＣＰＵを複数備えるデスクトップワークステーションに対して公表されるアーキテクチャーは、１２８ビット以上のバス幅および並列ＮＰＵ（４以上の数）を有し、１２８ヌクレオチドが１０１２／１０２（すなわち１０１０）の速度で処理されることを可能にする。メモリ転送速度が十分に速いままカーネルイベントを制御するために別々のＣＰＵを使用して、特有の識別子の集合は、ヒトゲノムに対して僅か１秒未満で計算され得る（部分集合サイズＮは、所要時間における要因ではない）。現在使用されるＰＣ技術は、約４×１０１９の配列についての情報（すなわち、ヒトＤＮＡの鎖のすべてのヌクレオチドから展開する約１０１０個の部分集合の情報）が１集合のデータから記憶されることを可能にする。
【０１２５】
実際、この処理は、第三の方法において、特定の分析において関心のない反復性配列を除去すること（マスクすること）によって、さらに単純化し得る。マスクされた配列（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｍまたは等価物）を使用する場合、Ａ＝０１０（１０進数２）、Ｃ＝０１１（１０進数３）、Ｇ＝１０１（１０進数５）、Ｔ＝１１１（１０進数７）の素数、およびマスクされた記号Ｍ＝０００を割り当て、１０個の成分の３２ビットワードへの圧縮を可能にする。このことは、僅かに小さな圧縮率を生じるが、このワードが全て処理される必要があるかどうかの指標としての最上位ビット（ＭＳＢ）の使用を可能にし、非常に重要な処理時間の利益を生じる。大部分のマスク化は、全配列内でＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭ（Ａ、Ｃ、Ｔ、又はＧに置換される）の非常に大きな集合を生じ、従ってこれらのワード中で処理せずにスキップ（またはシフトレフト）するワードがいくつかをも含めることを可能にする。すなわち、ＭＳＢ＝０は、多項式の剰余に対してこのワードを処理せず、その代わりスキップするビット数についての情報を含む整数としてこれを読み取ることを意味する。ＭＳＢ＝１は、このワードを処理することを意味する。ヌクレオチドを表す素数を使用することはまた、シングルパスの一部としてのハミング距離の計算を、ずっとより単純にさせる。
【０１２６】
ハミング距離はまた、前進エラー訂正（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｅｒｒｏｒ  Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）に基づくパリティ（ｐａｒｉｔｙ）の方法としてデータ通信において使用されるが、このハミング距離は、１部分集合を別のものへと変えるために変更される必要のあるビット数として、解釈し得る。特定の生成プログラム（ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）行列を選択することによって、不正確な部分集合の一致を検索する場合、ハミング距離の使用によって、１つのＳＯＩと別のものとの適合の近さ（すなわち、１つのＳＯＩが同じ配列文字（または数）を有する程度）を定義することが可能である。このことは、適合度についての良好な概算である。
【０１２７】
２つの二進数の列の間で異なるビットの数は、より形式的には、２つの文字列ＡとＢとの間の距離であり、そしてΣ｜Ａｉ−Ｂｉ｜として表される。
【０１２８】
上記３つの方法のいずれかを使用することは、指標付きの表４＋Ｃ列の作成を可能にし、ここで、Ｃは元の部分集合に適用される、方向非関連性の（ｎｏｎ−ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ  ｒｅｌａｔｅｄ）変換の数である。ゲノムに関して、Ｃは６に等しくあり得、列は以下を表す：
配列中のヌクレオチドオフセット；
ヌクレオチドの型（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔまたは未知の場合にはＮ）；
位置ｎにおける順方向配列と関係する特有の識別子；
位置ｎにおける逆方向配列と関係する特有の識別子；
その地点における順方向配列の相補体と関係する特有の識別子；および
その地点における逆方向配列の相補体と関係する特有の識別子。
【０１２９】
このことは、両方のＤＮＡ鎖の表現を可能にする。
【０１３０】
二分木を使用して、多項式の剰余を順序付け（ｏｒｄｅｒ）そして指標付け、比較および探求を速やかにさせる。ＳＯＩが識別された後、配列中のそれらの位置またはオフセットは行列に保管されて、構造に関係するメタデータが分析され得る。このような行列の例は、図２１に示される。この図は、スライド型ウィンドウサイズ２５を使用して２つの別の配列間の関係を示す。
【０１３１】
ゲノム学にこの方法論を適用する場合、関心の４つの基礎関係が存在する（しかし、これらの４つの基礎関係の多くの集合が存在する）が、それらのデータ集合が存在する行列の次元数の増加が存在するので（例えば、ＤＮＡ配列はべき数（Ｐ）＝１の線形行列である）、ストラテジーのべき数は増加する（図２２を参照のこと）。例えば、同じ数の基礎関係を有する情報の２Ｄアレイ（例えば、複数のＤＮＡ配列）は、１地点において３２個のデータ集合を提供する。３Ｄアレイは、（例えば、第三次元において、異なる種由来の配列および各々の種由来のファミリー）は、１地点において１２８個の部分集合を提供し、４Ｄ集合（例えば、時間で変化するタンパク質）は、１０２４の部分集合をもたらす。
【０１３２】
行列は、Ｎ次元のアレイまで拡大することができ、ここでＮは可能性ある最も大きな数（例えば２５６次元）である。行列は、データベースにおける表の集合であり得る。行列は、関心の部分集合の異なる長さに位置付けられる成分を含み得、各々の成分の位置はその行列内に定義される。識別子（例えば、ＳＯＩの長さから導かれ、そして多項式算術を使用する多項式の剰余）は、行列中で各々の位置および各々のＳＯＩの長さで保管される。この識別子は、各々のＳＯＩについての情報またはメタデータを表す。行列の次元は、例えば、線形の、任意の数の逆方向相補体であり得る。
【０１３３】
行列中の成分の１つ以上の連続する集合から、成分の非同一性部分集合を識別する場合、ＳＯＩ長さにおける各々の集合中の一致する１対の識別子を見出すことができ、その後、一致する識別子のさらなる対が、同じＳＯＩ長または異なるＳＯＩ長において見出され得る。この例は、図２４および２５を参照しながら説明される。
【０１３４】
Ｎ次元行列中の１点における、識別可能なデータ部分集合の数は：
（ｆ｛Ｆ（Ｎ＾Ｎ）｝＊（その点における関心の基礎関係の数）＊（異なる部分集合サイズの関係の数））。
【０１３５】
部分的に適格にされたＳＯＩ（すなわち、複製物のサイズより低い適合完全性を有するＳＯＩ）に関して、連結されたリストおよび表のデータベース（行列）と関係して構築され使用される２つのアルゴリズムが存在する。これらのアルゴリズムは、任意のフィールドにおける集合中に部分集合を見出すことに関して使用でき、そのフィールドでは、それら集合は任意の記載の成分を有する一続きであるように表すことができ、そして識別子または多項式の剰余を計算することができる。
【０１３６】
第一の場合、その成分の位置を初期節点識別子とする連結されたリストが、構築される。各々の初期節点から外れて第二のリストの第一の節点は、成分識別子を含む。ゲノムのセンスにおいて、この成分は識別子（Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ、Ｘ）を有するヌクレオチドである。全ての初期節点に関して、第二の連結されたリストは、オフセットがＳＯＩサイズまたはデュプリコンサイズより大きくなるまで、その成分（ヌクレオチド）の次の存在へのオフセットを含む。このような連結されたリストは、図２３に示される。第一列は、第二列におけるヌクレオチドの特定の配列における位置の数を列挙する。第三列は、第二列におけるヌクレオチドのそれぞれの相補体を列挙する。残りの列は、配列中の特定のヌクレオチドのオフセットの次の８つの位置を列挙する。従って例えば、ヌクレオチドＴの位置３において、Ｔの配列における次の存在は、第一のオフセット列中の４つの位置に列挙されており、これによって配列中の位置７に現れる。
【０１３７】
適合誤り（ｍｉｓｆｉｔ）の確率は、ＳＯＩの長さに直接比例し、その結果、可能性あるＳＯＩの「最も離れた」成分を確認することおよびその可能性あるＳＯＩにおいて最も近い成分へと戻って作業することによって、大部分の配列を非常に迅速に差し引くことを可能にする。ゲノムに関して、この方法はまた、可能性あるプライマー適合がどこで結合を最大にするのに（例えば、最初の５個のヌクレオチドにおいて）最良でなければならないか、およびプライマーの結合を最大にするために適合誤りヌクレオチドが互いからどれほど近くに存在すればよいかについての判定を、可能にする。
【０１３８】
図２３の行列を参照すると、反復を検索されている部分配列が、配列中の位置１〜５までＡＣＴＧＡである場合、位置５における最も離れた成分Ａに着目し、そして次のＡに対するオフセットに注意する。次のオフセットは、位置５から５つの位置、すなわち位置１０において存在する。位置１０から位置９、８その他に戻す作業はＧＧを生じ、これは同じ部分配列ではない。従って、次の存在へと移動するか、または２つのオフセットが位置５から９つの位置、すなわち位置１４に存在する。位置１４から位置１３、１２その他に戻って作業することはＧＴＣＡを生じ、これはＡＣＴＧＡと同じ配列である。このようにして、位置１０〜１４における次の同一配列が位置付けられた。他の反復配列は、図２３の右側における垂線によって識別される。
【０１３９】
図２３の実施形態は、関心の部分集合（ＳＯＩ）中の成分に実質的に一致する成分を各々が有する、１つ以上の部分集合を識別するより広範な方法の例である。部分集合の各々は、成分の１集合または成分の複数集合の一部を形成する。この方法は、以下の工程：
（ｉ）  集合または複数集合中の各々の成分のリストまたは部分リストを含む行列を形成する工程であって、各々の成分および少なくとも１つのオフセットの集合または複数集合中の位置が、その集合または複数集合中の同じ成分の別の位置を示す工程；
（ｉｉ）  ＳＯＩ中に、成分位置を選択する工程；
（ｉｉｉ）  その選択されたＳＯＩ中で選択された成分に対して、およびその選択された成分に隣接する成分に対して、１つ以上のオフセットを識別する工程；
（ｉｖ）  それらのオフセットに基づき、選択されたＳＯＩ中の成分と、成分の集合または複数集合中の成分とが一致することを見出す工程；
を包含する。
【０１４０】
最大の可能性あるオフセットを使用して、一致する成分を見出し得る。
【０１４１】
コンピュータープログラムを使用して、関心の部分集合（ＳＯＩ）中の成分と実質的に一致する成分を各々が有する１つ以上の部分集合を識別するように、プロセッサに指示し得る。各々の部分集合は、成分の１集合または成分の複数集合の一部を形成する。このプログラムは、少なくとも上記の工程（ｉ）〜（ｉｖ）、および図２３の実施形態に関して開示される任意の他の工程を実行するように、プロセッサに指示する。
【０１４２】
第二の場合において、モジュロ２多項式算術（多項式代数４ビット表現を使用すること）を使用して、特有の識別子の行列を構築する。単一の表よりもむしろ、前述の第一の方法における行列と同じ行列のデータベースが構築されるが、デュプリコンのサイズ（Ｄ）は最小のＳＯＩから最大のＳＯＩまで広がる。データベース中の表の集合であり得る前述のＮ次元行列もまた構築され得る。ゲノム環境における実施のために減少する際、次いでこのデータベースは、同一でないが種内の複数または種に渡る複数のいずれかに由来するＤＮＡ配列に渡って最良に適合する最も可能性ある配列の作成を可能にする、配列の識別を可能にする。プライマーは、一致７、不一致１、一致６、不一致１、および一致６、または任意の他の組み合わせから作製され得る。同じ程度の不一致を有する異なる配列は、不一致の性質および位置に起因して、能力の異なるプライマーを示し得る。
【０１４３】
図２４を参照して、リレーショナルデータベースを形成する行列が示され、このデータベースは、本質的に二次元の行列であり、順方向配列Ｓ１および逆方向相補配列Ｓ２における位置番号ｎ〜ｎ＋３０についての行、ならびにＳ１およびＳ２両方に対するデュプリコンサイズＤ＝５〜Ｄ＝１０までの列を示す。行列中の全ての成分（数）は、特定のデュプリコンサイズのＳＯＩに対する位置において計算される識別子を表す。従って例えば、位置１におけるＳ１、Ｄ＝１０から開始すると、２４６の剰余が存在する。２４６の対応する剰余は、相補体Ｓ２において位置ｎ＋９において存在し、ＳＯＩの長さＤ＝１０を規定する。なぜなら、この同じ剰余に関してＳ１とＳ２との間に１０の位置の隔たりが存在するからである。対応する剰余２４６に対して可能性ある最大の隔たりは、逆方向相補配列Ｓ２について検索され、これは、位置ｎ＋１５において位置付けられる。このような任意の対形成は、最大のデュプリコンサイズ（例えば、Ｄ＝１０）において検索される。剰余２４６は、位置ｎ〜ｎ＋９における成分／ヌクレオチドの二進数表現を多項式表現に変換し、これを共通の多項式除数によって除算し、多項式の剰余を形成した後、計算される。多項式の剰余の係数は、数字形式へと、次いで１０進数形式へと変換され、２４６を生じる。
【０１４４】
Ｓ２、Ｄ＝１０における剰余２４６の位置は、次に最も高いＤの対形成がどこから検索され得るかを決定する。位置ｎ＋１０から進んで存在する対形成を有する次に最も高いＤのサイズは、Ｓ＝１、Ｄ＝５における位置ｎ＋１１に存在し、これは剰余７８９を有する。Ｄ＝５に関して、Ｓ２中の対応する７８９は、Ｓ２中の位置ｎ＋１５（この配列に沿った５の位置または成分）よりも上方に見出されなければならない。これは、逆方向相補体に関して、Ｓ２中の位置ｎ＋２１において存在する。
【０１４５】
次の対形成は、位置ｎ＋１６から検索され、最長のデュプリコンサイズ１０から出発し、そしてその配列中でサイズおよび位置を下げてゆき、次の対形成が見出されるまで系統的に作業を行う。これは、Ｄ＝７のＳ１およびＳ２において、それぞれ位置ｎ＋１７およびｎ＋２９に存在し、その剰余は２０である。
【０１４６】
従って、関心の順方向部分集合は、ｎ〜ｎ＋９、ｎ＋１１〜ｎ＋１５、およびｎ＋１７〜ｎ＋２３において識別された。
【０１４７】
逆方向相補体配列Ｓ２はまた、デュプリコンサイズＤから決定される。従って、Ｄ＝１０、５および７におけるＳ２中、対応する剰余は、逆方向相補配列を形成するように見出される。Ｄ＝７に関して、７の位置のギャップが、Ｓ２中の位置ｎ＋２９およびＳ１中の位置ｎ＋２３において、剰余２０を見出す。Ｄ＝５に関して、剰余７８９を有する５つの位置のギャップが、Ｓ２中の位置ｎ＋２１およびＳ１中の位置ｎ＋１７に位置付けられる。Ｄ＝１０に関して、剰余２４６を有する１０の位置のギャップが、Ｓ２中の位置ｎ＋１５およびＳ１中の位置ｎ＋６において位置付けられる。
【０１４８】
上記の順方向配列および逆方向相補配列は、同一の不一致を示す。
【０１４９】
図２５において、リレーショナルデータベースが示され、このデータベースは二次元の行列であり、特定の程度の適合を有する、順方向配列および異なる逆方向相補配列を示す。
【０１５０】
繰り返すと、行列中の全ての数は、特定のデュプリコンサイズのＳＯＩに関して、その位置において計算される剰余を表す。最も長いＤのサイズは、そのＤのサイズによって、その配列に沿った最長位置だけ隔てられる、類似の剰余の値について検索される。従ってＤ＝１０に関して、剰余２４６は、Ｓ１中の位置ｎおよびＳ２中の位置ｎ＋１０３０に位置付けられる。次の最長のデュプリコンサイズは、そのサイズ中で最大数の位置だけ隔てられる剰余の中で、Ｓ１中の位置ｎ＋１０から一致について検索される。検索は、Ｄ＝５に関して一致を明らかにし、Ｓ１に対する位置ｎ＋１１、およびＳ２に対する位置ｎ＋１０１９における剰余２８９である。順方向配列を続けると、次に最長のＤのサイズが、位置ｎ＋１６から検索される。このことは、Ｄ＝７に関して一致を明らかにし、Ｓ１中の位置ｎ＋１７およびＳ２中の位置ｎ＋２３における剰余２０であり、ｎ＋１７における最初の位置から配列中の前方に数えて７の位置である。
【０１５１】
従って、関心の順方向部分集合は、位置ｎ〜ｎ＋９、ｎ＋１１〜ｎ＋１５およびｎ＋１７〜ｎ＋２３において識別された。
【０１５２】
Ｓ２中の逆方向相補配列に関して、これは、順方向配列に完全には従わないが、特定の程度の適合を有する。Ｄ＝１０において、対応する剰余２４６は、Ｓ２中の位置ｎ＋１０３０に存在する。次いで、ｎ＋１０２０（ｎ＋１０３０とｎ＋１０２１との間に１０の位置が存在するからである）より小さい位置に対して、Ｄ＝５に関して検索が継続すると、剰余２８９が、Ｓ２中の位置ｎ＋１０１９に存在する。逆方向配列は、ある程度の不一致を有してこの場所から離れる。なぜなら、使用されているＤ＝７よりもむしろ、Ｄ＝８を使用して不一致である剰余を見出すからである。位置ｎ＋１０１５から上側（少ない側）に移動すると、剰余７０がＤ＝８、Ｓ２中の位置ｎ＋１０１４において見出される。このことは、Ｓ２中のＤ＝７の、位置ｎ＋１０１３における剰余２０と一致する代替である。存在する理由は、より大きなデュプリコンサイズを使用することである。
【０１５３】
図２４および２５の実施形態は、成分の少なくとも１つの集合中に成分の１つ以上の部分集合を識別して、検索されている１つ以上の部分集合が、所定の一致レベルまで関心の部分集合（ＳＯＩ）と一致する、より広範な方法の例である。この方法は、以下の工程：
（ａ）  成分のＮ次元行列を形成する工程であって、ここで１つ以上の部分集合のうちの１つの部分集合の変換は、行列の次元によって表される工程；
（ｂ）  行列中の各々の位置における識別子を保管する工程であって、各々の識別子が部分集合の変換を表す工程；
（ｃ）  その行列中で少なくとも１組の一致する識別子を見出す工程；
を包含する。
【０１５４】
コンピュータープログラムを使用して、成分の少なくとも１集合中に成分の１つ以上の部分集合を識別して、検索されている１つ以上の部分集合が所定の一致レベルまで関心の部分集合（ＳＯＩ）と一致するように、プロセッサに指示し得る。このプログラムは、少なくとも上記の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）、ならびに図２４および２５の実施形態に関して開示される任意の他の工程を実施するようにプロセッサに指示する。
【０１５５】
さらなる参照は、以下に提供される：
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｓｔ．ｇｏｖ／ｄａｄｓ／ＨＴＭＬ／ｃｙｃｌｉｃＲｅｄｕｎｄａｎｃｙＣｈｅｃｋ．ｈｔｍｌ
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｈｐａｇｅｓ．ｃｏｍ／ｈｏｍｅ／ｋｍａｔｈ４５８．ｈｔｍ
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｓｔ．ｇｏｖ／ｄａｄｓ／ＨＴＭＬ／ｈａｍｍｉｎｇｄｉｓｔ．ｈｔｍｌ。
【０１５６】
（プライマーの識別）
「整数フィールド−モジュロ２多項式算術」を実施例１のように使用して、特有の識別子の表の構築がなされるが、単一の表よりもむしろ複数の表のデータベースが、複製物サイズの範囲３〜４０で構築される。次いでこれは、種内の複数または種に渡る複数のいずれかに由来するＤＮＡ配列にわたって最良に適合するプライマーの作製を可能にする。これらのプライマーは、一致５、不一致１、一致７、不一致２および一致１０から作製され得る。１例は図１７に示され、順方向配列配列および逆方向配列を示す。
【０１５７】
（増幅手順）
増幅は、プライマー結合部位の間に見出される配列の増幅を生じる任意の方法に従って、実行され得る。適切な方法としては、単一プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および関連する増幅手順が挙げられる。
【０１５８】
ＰＣＲは、複製コピーが標的ポリヌクレオチドから作製される反応であり、「上流」および「下流」のプライマーからなる「プライマー対」または「プライマー組」、および重合触媒（例えば、ＤＮＡポリメラーゼおよび代表的には熱安定性のポリメラーゼ酵素）を代表的に使用する。ＰＣＲに関する方法は当該分野で公知であり、例えば、以下に教示される：「ＰＣＲ」（編者Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎおよびＳ．Ｇ  Ｍｏｌｌｅｒ（２０００）  ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｔｄ、Ｏｘｆｏｒｄ）。しかしながら、本明細書中で概説されるように、標準的なＰＣＲ方法は、単一プライマーのみを使用することによって相補性デュプリコンを増幅するため、特定の実施形態において改変し得る。
【０１５９】
増幅工程は、好ましくは、低度〜中程度のストリンジェンシー条件下、すなわち約４０℃〜約４６℃、好ましくは約４３℃により特徴付けられるアニーリング条件で実施される。この増幅条件は、アニーリングおよびプライマーの伸長を可能にするように設計されており、この結果増幅が生じ、この増幅はとりわけ、プライマーの配列および長さ、ならびにＤＮＡサンプルに依存する。
【０１６０】
好ましい増幅条件としては、約９０℃〜約９８℃の変性温度、約４０℃〜約４６℃のアニーリング温度、および約７０℃〜約７５℃の伸長温度が挙げられる。しかしながら、反応条件は、標的化される相補性デュプリコンの増幅にのみ適している必要がある。特定の相補性デュプリコンを標的化するプライマーを使用する場合の反応条件を最適化するための手順は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１６１】
増幅のために使用されるポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型に沿ったプライマーの伸長を形成し、ここでその伸長はそのＤＮＡ鋳型に対して相補性である。ヌクレオチドポリメラーゼは、鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼであり、ポリヌクレオチドの３’末端を伸長するための構築ブロックとしてヌクレオシド三リン酸を利用して、そのポリヌクレオチド鋳型に相補性な配列を提供する。通常、触媒はＤＮＡポリメラーゼ等の酵素であり、例えば、原核細胞生物のＤＮＡポリメラーゼ（Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩ）、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡ  ポリメラーゼ、クレノウフラグメント、逆転写酵素、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、などであり、細胞、細菌ような任意の供給源（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、植物、動物、ウイルス、好熱細菌、など）から導かれる。
【０１６２】
（分離方法）
増幅後、その増幅産物は、ゲノムのプロファイル特徴を作成するために分離される。当該分野で公知の任意の方法を使用して、その増幅産物を分離し、そして必要に応じて定量する。これら方法のいくつかを、以下にさらに詳細に説明する。
【０１６３】
（ゲル電気泳動）
ゲル電気泳動による分離は、電場中での分子のサイズおよびイオン電荷に従って、ゲルを通る示差的な移動に基づく。高い分解能技術は通常、流体相に対してゲル支持体を使用する。使用されるゲルの例は、デンプン、アクリルアミド、アガロースまたはアクリルアミドとアガロースとの混合物である。支持体により生じる摩擦抵抗は、電荷単独よりもむしろサイズが分離の主要な決定要素となることを引き起こす。より大きな負電荷を有するより小さな分子は、高電圧が印加される場合、ゲルを通って電極のアノード方向へとより速くより遠くへ移動する。類似の分子はゲル上で群を作る。これらは、染色することによって可視化することができ、得られる染色の比色濃度を連続的にモニタリングするデンシトメーターを使用して、相対的に定量し得る。電解液は、均一であっても（単一の緩衝液）不均一であってもよく、ここでサンプルは緩衝液の不均一性によって留められ、その後、移動（ｒｕｎｎｉｎｇ）ゲル／移動緩衝液に進入する。ゲルは、単一の濃度であっても、移動距離に伴って孔サイズが減少する勾配があってもよい。
【０１６４】
アガロースゲル電気泳動は、寒天の高精製形態からなるマトリクス中で、サイズに基づくＤＮＡの分離を容易にする。核酸は、電場の存在下で位置を端に向けられるようになる傾向がある。ゲルマトリクスを通る移動は、塩基対の数のｌｏｇ１０に対して反比例の速度で生じる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前述）。
【０１６５】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、分子が水和ゲル中でそれらの異なる電気泳動移動度によって分離される、分析かつ分離の技術である。ゲルは、流体相の対流混合を抑制し、このゲルを通って電気泳動が生じて分子篩いに寄与する。ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、アガロースゲル電気泳動を使用して同じ小さなフラグメントに対して成される分解能と比較した場合、比較的小さなサイズ（１，５００塩基対以下）の増幅産物を分解し得る。好ましくは、ゲルのポリアクリルアミドの濃度は約５％であるが、必要とされる分離を生じるために適切な任意の濃度を使用し得る。
【０１６６】
（マイクロ流体技術）
マイクロ流体技術としては、マイクロキャピラリー等のプラットフォーム上での分離が挙げられ、例としてはＡＣＬＡＲＡ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．により設計されるもの、またはＣａｌｉｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．によるＬａｂＣｈｉｐ（商標）が挙げられる。これらのマイクロ流体プラットフォームは、他の分離技術により必要とされるマイクロリットル容量とは対照的に、ナノリットル容量のみのサンプルを必要とする。遺伝子分析に関与するプロセスのいくつかを縮小することが、マイクロ流体デバイスを使用して達成されている。例えば、ＷＯ９４／０５４１４は、検体からの核酸の収集および増幅のため、統合マイクロＰＣＲ装置を報告する。米国特許第５，３０４，４８７号、同第５，２９６，３７５号および同第５，８５６，１７４号は、核酸分析に関与する種々の処理および分析操作を組み込んだ装置および方法を記載する。
【０１６７】
（キャピラリー電気泳動）
いくつかの実施形態において、増幅されたＤＮＡを分析するためのさらなる方法または代替方法を提供することが望ましくあり得る。これらの実施形態において、マイクロキャピラリーアレイは、この分析のために使用することを企図される。マイクロキャピラリーアレイ電気泳動は一般的に、薄いキャピラリーまたはチャネルの使用を含み、このキャピラリーまたはチャネルは、特定の分離媒体を充填されていてもされていなくてもよい。キャピラリーを通るサンプルの電気泳動は、サンプルに対する分離プロファイルに基づくサイズを提供する。マイクロキャピラリーアレイ電気泳動は一般的に、サイズに基づく配列決定、ＰＣＲ産物分析、および制限フラグメントのサイズ決定のための、迅速な方法を提供する。これらのキャピラリーの高い表面  対  容積比は、キャピラリーにわたって実質的な温度変動なしに、キャピラリーにわたってより高い電場の適用を可能にし、続いてより迅速な分離を可能にする。さらに、共焦点画像化方法と組み合わされる場合、これらの方法は、アトモル範囲での感度を提供し、これは、放射性配列決定方法の感度に匹敵する。マイクロキャピラリー電気泳動デバイスを含むマイクロ流体デバイスの微細組立ては、例えば、米国特許第５，９０４，８２４号に詳細に論じられている。代表的に、これらの方法は、シリカ、シリコンまたは他の結晶化基材もしくはチップの上でミクロン規模のチャネルの光リソグラフ処理エッチングを含み、そして本開示における使用に容易に適合し得る。
【０１６８】
多くのキャピラリー電気泳動方法において、キャピラリー（例えば、平板基材にエッチング、機械処理または成型処理された、溶融（ｆｕｓｅｄ）シリカキャピラリーまたはチャネル）は、適切な分離／篩い分けマトリクスに充填される。代表的に、当該分野で公知の種々の篩い分けマトリクスが、マイクロキャピラリーアレイにおいて使用され得る。このようなマトリクスの例としては、例えば、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリルアミド、アガロースなどが挙げられる。一般的に、特定のゲルマトリクス、移動緩衝液、および移動条件は、特定の適用の分離特徴（例えば、核酸フラグメントのサイズ、必要とされる分解能、および未変性の（native or undenatured）核酸分子の存在）を最大にするように選択される。例えば、移動緩衝液は、サンプル中の核酸を変性するため、変性剤、カオトロピック剤（例えば、尿素）を含み得る。
【０１６９】
（質量分析）
質量分析は、減圧下で分子をイオン化すること、および揮発によってそれらを「飛ばす」ことによって、個々の分子を「重量測定する」方法を提供する。電場と磁場との組み合わせの影響下で、イオンは、個々の質量（ｍ）および電荷（ｚ）に依存する軌道に従う。低分子量の分子に対して質量分析は、親分子イオンの質量の決定によって有機分子の分析および特徴づけのための、慣用的な物理学的有機的レパートリーの一部となっている。さらに、この親分子イオンと他の粒子（例えば、アルゴン原子）との衝突を整えておくことによって、いわゆる衝突誘導性解離（ＣＩＤ）によって、分子イオンは断片化され、二次的なイオンを形成する。断片化のパターン／経路は非常に頻繁に詳細な構造情報の誘導を可能にする。
【０１７０】
日本国の特許第５９−１３１９０９号において、電気泳動、液体クロマトグラフィーまたは高速ゲルろ過のいずれかによって分離された核酸フラグメントを検出する器械が記載される。質量スペクトル計の検出は、通常はＤＮＡ中に存在しない原子（例えば、Ｓ、Ｂｒ、Ｉ、Ａｇ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｏｓ、Ｈｇ）を核酸に組み込むことによって達成される。
【０１７１】
（識別方法）
増幅産物は、当該分野で公知の任意の方法を使用して可視化し得る。１つの代表的な可視化方法は、蛍光色素（例えば、臭化エチジウムまたはＶｉｓｔｒａ  Ｇｒｅｅｎ）を用いたゲルの染色およびＵＶ光下での可視化を含む。あるいは、増幅産物が放射性標識または蛍光測定標識されたヌクレオチドで内部に標識される場合、その増幅産物は、分離後、ｘ線フィルムに露光され得るかまたは適切な刺激スペクトルの下で可視化され得る。
【０１７２】
１実施形態において、可視化は核酸プローブを使用して間接的に達成される。例えば、増幅産物の分離後、標識された核酸プローブがその増幅産物と接触される。このようなプローブは、増幅プライマーがハイブリダイズする場所の下流に存在する標的相補性デュプリコンの領域から設計される。
【０１７３】
プローブは、好ましくは、発色団と結合体化されるが、放射性標識してもよい。別の実施形態において、プローブは、結合性パートナー（例えば、抗体またはビオチン）に結合体化され、ここで結合対の他方のメンバーが検出可能な部分を有する。他の実施形態において、プローブは蛍光色素または蛍光標識を組み込む。他の実施形態はまた、Ｔａｑｍａｎ（商標）プローブおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ（商標）プローブの使用を企図する。
【０１７４】
ＤＮＡ増幅産物に組み込まれる標識型は、分析に使用される方法により検出される。キャピラリー電気泳動、マイクロ流体電気泳動、ＨＰＬＣまたはＬＣ分離を使用する場合、組み込まれた蛍光標識色素または差し込まれた蛍光標識色素のいずれかを使用して、その増幅産物を標識および検出し得る。サンプルは動態学的に検出される。つまり標識された種が検出器を通り過ぎる場合に蛍光が定量される。分離のため任意の電気泳動方法、ＨＰＬＣまたはＬＣが使用される場合、生成物は、ＤＮＡに固有の特性であるＵＶ光の吸収によって検出することができ、これによって標識の追加を必要としない。ポリアクリルアミドゲルまたはスラブゲルの電気泳動が使用される場合、増幅反応のためのプライマーは、蛍光団、発色団もしくはラジオアイソトープにより、または結合性酵素の反応によって標識し得る。酵素検出は、ゲル上での増幅産物の分離後、プライマーに対する酵素の結合（例えば、ビオチン：アビジンの相互作用を介して）、次いで化学反応（例えば、ルミノールにより生成される化学発光）による検出を含む。蛍光シグナルは、動的にモニタリングされ得る。ラジオアイソトープまたは酵素反応を用いた検出は、ゲル電気泳動による初期の分離、続いて固体支持体へのＤＮＡ分子の移動（ブロット）、その後の分析を必要とする。ブロットが作製される場合、そのブロットは、プローブ結合（ｐｒｏｖｉｎｇ）、ブロットのストリッピング、次いで再プローブ結合によって１回よりも多く分析され得る。増幅産物が質量分析を使用して分離される場合、核酸は直接検出されるので、標識は必要とされない。
【０１７５】
ハイブリダイゼーションのオリゴヌクレオチドプローブを蛍光標識により標識することは、当該分野で周知の技術であり、プローブのハイブリダイゼーションの検出を容易にするための高感度で非放射性の方法である。ごく最近開発された検出方法は、プローブのハイブリダイゼーションの検出のため、蛍光強度の直接的な検出よりもむしろ蛍光エネルギー移動（ＦＥＴ）の過程を利用する。ＦＥＴは、一方（アクセプター）の吸収スペクトルが他方（ドナー）の放射スペクトルと重なり、かつそれら２つの色素が接近して存在する場合に、ドナー蛍光団とアクセプター色素（これは蛍光団であってもそうでなくてもよい）との間に生じる。これらの特性を有する色素は、ドナー／アクセプター色素対またはエネルギー移動色素対といわれる。ドナー蛍光団の励起状態のエネルギーは、共鳴双極子誘導性の双極子相互作用により、付近にあるアクセプターへと移動される。このことは、ドナー蛍光の消光を生じる。いくつかの場合、アクセプターもまた蛍光団である場合、その蛍光強度は増強され得る。エネルギー移動効率は、ドナーとアクセプターとの間の距離に高く依存し、これらの関係を予想する方程式が開発されている。エネルギー移動効率が５０％である場合のドナー色素とアクセプター色素との間の距離は、フォスター距離（Ｒｏ）といわれる。蛍光消光の他の機構もまた当該分野で公知であり、例えば、電荷移動および衝突消光が挙げられる。
【０１７６】
２つの色素が近位で相互作用して消光を生じることに依存するエネルギー移動および他の機構は、核酸配列を検出および同定するための魅力的な手段である。なぜならこのようなアッセイは、均一な形式で行われ得るからである。均一なアッセイ形式は、単一の蛍光標識の蛍光の検出に依存する従来のプローブハイブリダイゼーションアッセイとは異なる。なぜなら、均一なアッセイは一般的に遊離標識からハイブリダイズした標識を分けるためにさらなる工程を必要とするからである。ＦＥＴハイブリダイゼーションアッセイのためのいくつかの形式が、以下に概説される：Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，３１１−３５２ページ，１９９２。
【０１７７】
多くのドナー／アクセプター色素対が当該分野で公知であり、これら対は本開示において使用し得る。これら対としては：フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）／テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＡＬＩＣ）、ＦＩＴＣ／Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（商標）分子プローブ、ＦＩＴＣ／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｍｉｍｉｄｙｌ）１−ピレンブチラート（ＰＹＢ）、ＦＩＴＣ／エオシンイソチオシアネート（ＥＩＴＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル１−ピレンスルホネート（ＰＹＳ）／ＦＩＴＣ、ＦＩＴＣ／ローダミンＸ、ＦＩＴＣ／テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、などが挙げられるが、これらに限定されない。特定のドナー／アクセプター蛍光団対の選択は、重要ではない。エネルギー移動消光機構に関して、ドナー蛍光団の放射波長がアクセプターの励起波長と重なることが必要であるのみである。すなわち、効率的なエネルギー移動、電荷移動または蛍光消光を可能にするため、これら２つの色素の間の十分なスペクトルの重なりが存在しなければならない。Ｐ−（ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）は、非蛍光性アクセプター色素であり、隣接する蛍光団（例えば、フルオレセインまたは５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン（ＥＤＡＮＳ））からの蛍光を効果的に消光する。消光が起こる機構に関係なく、検出核酸において蛍光の消光を生じる任意の色素対が、本開示の方法における使用にふさわしい。末端および内部の標識化方法は両方とも当該分野で公知であり、検出核酸中のそれぞれの部位においてドナー色素とアクセプター色素とを繋ぐために慣用的に使用され得る。
【０１７８】
上記の分離プラットフォームの多くは、２つの異なる特性に基づき分離を達成するために結合され得る。例えば、アフィニティー捕捉を可能にする部分と結合されるＰＣＲプライマーもあれば、一方、未修飾のままのプライマーもある。修飾としては、糖（レクチンカラムへの結合のため）、疎水性基（逆相カラムへの結合のため）、ビオチン（ストレプトアビジンカラムへの結合のため）、または抗原（抗体カラムへの結合のため）を挙げることができる。サンプルは、アフィニティークロマトグラフィーカラムを通って移動される。フロースルー画分が収集され、結合性画分が（化学的開裂、塩溶出、などによって）溶出される。次いで、各々のサンプルは、個々の成分を識別するため、特性（例えば、質量）に基づきさらに分画される。
【０１７９】
（キット）
開示される増幅方法に必要とされる材料および試薬は、一緒にキット中に組み立てられる。本開示のキットは一般的に、特許請求される方法を実行するために必要な、少なくとも酵素およびヌクレオチド、ならびに少なくとも１つのプライマーを備える。好ましい実施形態において、キットは、単一のプライマーのみを備える。別の好ましい実施形態において、キットはまた、サンプルから相補性デュプリコンを増幅するための指示書を備える。キットはまた、増幅された核酸を検出するための手段を備え得る。
【０１８０】
ある実施形態において、核酸を検出するための手段は、標識（例えば、蛍光団、放射性標識、酵素タグなど）であり得、これは核酸プライマーまたは核酸自体に繋がれる。
【０１８１】
また、キットには、核酸を増幅するのに適切な酵素（種々のポリメラーゼ（Ｔａｑなど）が挙げられる）、デオキシヌクレオチドおよび緩衝液が備えられ、増幅のために必要な単一の反応混合物を提供し得る。
【０１８２】
各々の場合、キットは好ましくは、個々の試薬および酵素各々、ならびに各々のプライマーについて異なる容器を有する。各々の生物学的試薬は一般的に、それぞれの容器中に適切に小分けにされる。キットの容器手段としては、一般的に、少なくとも１つのバイアルまたは試験管が挙げられる。それらの試薬が配置され小分けにされるフラスコ、ボトルおよび他の容器手段もまた可能である。キットの個々の容器は好ましくは商用販売のため、閉鎖した系において維持される。
【実施例】
【０１８３】
（実施例１−魚ＺＰ３遺伝子から設計されたプライマーを使用する相補性デュプリコンの双方向増幅）
卵の周囲にある透明帯は、糖タンパク質を含み、そのうちの１つのＺＰ３は精子に対するレセプターであると報告されている。Ｃｒｏｓｓｔａｘａの精子結合は制限されており、とりわけＺＰ３における差異により制限されると予想される。魚の卵の認識および受精のプロセスは外部で起こり、従って、高度に発達して特異性を確実にする必要がある。
【０１８４】
ＺＰ３は高度に変動性であり、本発明者らはこれが不完全な重複を有する領域に存在することを予想する。異種の魚由来の遺伝子座および周辺配列を整列させて（ＣＬＵＳＴＡＬＷ）、保存領域および重複領域においてプライマーを設計した。これらの領域は、それぞれの配列を多く含むことを見出した。このことは、重複の証拠を提供するので有利であった。２０マー（これは、重要であるとはみなされなかった）辺りの好ましい長さを使用して、試験する多くのプライマーを選択した。２つのプライマーが、重複されたモチーフ、ＢＬＡＳＴおよび熱量分析の点から、最も高い見込みがあった。これらのうちの１つはまた、選択的スプライシング部位の配列に対して、そしてレトロエレメントを含む配列に対して配列相同性をいくらか示した。これは、複数の結合部位を示唆した（表１および図２を参照のこと）。興味深いことに、主要なアンプリコンがこのプライマー単独の産物であることを見出した（すなわち、順方向プライマーと逆方向プライマーとの両方と同様に操作すること：図１の理論上の例を参照のこと）。このプライマー（配列番号１）を、４ＡＯＨ細胞パネル（Ｃａｔｔｌｅｙら、２０００）由来の細胞株から抽出した多くのＤＮＡサンプル（ヒトおよび非ヒト霊長類）について、ＰＣＲにより試験した（以下に詳細に記載する条件を参照のこと）。ウマＤＮＡを獣医により収集された血液サンプルから抽出した。魚ＤＮＡをある場所の供給者から得られた新鮮な肝臓サンプルより調製した。本発明者らは、比較的低いアニーリング温度（４３℃〜５０℃）の多くを試験して、異種におけるプライマー結合配列中の予想される多型を考慮に入れた（例えば、米国特許第６，３８３，７４７号を参照のこと）。
【０１８５】
種々のＤＮＡサンプル（例として以下を挙げる：Ｒ８５／１５１８Ｂ−ヒト；Ｒ９２／１９４９Ｋ−チンパンジー；Ｒ９２／１２９７７Ｅ−オラウータン；Ｃ０２／４６５Ｈ−マウス；Ｃ０２／３６９Ｗ−ウマ；Ｃ０１／１６０７Ｎ−グローパー（Ｇｒｏｕｐｅｒ））およびプライマーＺＰ３  Ｅｘ２Ｆ（Ｔｍ＝４６℃）を使用した増幅産物の蛍光検出。これらの例において、複数のゲノムＤＮＡアンプリコンを、１個体のＤＮＡサンプルから１つのプライマーＺＰ３  Ｅｘ２Ｆ（配列番号１）を５０ｎｇ使用して１つの反応容器中で同時に増幅した。ＰＣＲ増幅は、１００ｎｇのＤＮＡ鋳型および１．４ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して、１×ＰＣＲ反応緩衝液（１６．６μＭ［ＮａＨ４］２．ＳＯ４、および６７μＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）（２５°Ｃにおいて））、０．４５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、３ｍＭｏｌｅｓ  ＭｇＣｌ２、ならびに５００μＭｏｌｅｓの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰからなる２０μｌの容量で、実施した。
【０１８６】
以下の増幅プロトコルを用いてサーマルサイクラー（Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｐａｌｍ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＴＭ、Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｍｏｒｔｌａｋｅ、ＮＳＷ）を使用した：９５℃  ２分間、次いで９４℃  ３０秒間、４３℃  ３０秒間および７２℃  ３０秒間を３５サイクル、続いて７２℃  ５分間および１５℃  １秒間を１サイクル。
【０１８７】
増幅産物を、９００ｖで９０分間、３０μｇ／ｌ  ＥｔＢｒを有する０．６  ＴＢＥ緩衝液中の１８．５ｃｍのゲル上で、５％のポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、その産物を蛍光スキャナ（Ｇｅｌ−Ｓｃａｎ  ２０００  ＴＭ、Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｍｏｒｔｌａｋｅ、ＮＳＷ）を使用する蛍光シグナルの検出によって可視化した。
【０１８８】
図３〜６に対して参照を作製した。これらの図は、異種の種々のサンプルに由来する増幅フラグメントのプロファイルを示す（ｘ軸上にサイズ、ｙ軸上に強度）。
【０１８９】
図４は、アジア人、黒人、オーストラリア原住民および白人のゲノムＤＮＡからの増幅による産物を作製するため、同じ系を使用して作成されるプロファイルを示す。図４に認められるように、各々の集団または群は、ほぼ同一のプロファイルを示す。
【０１９０】
図５は、ウマゲノムＤＮＡの２つのサンプルからの増幅による産物を作製するため同じ系を使用する、作成されるプロファイルを示す。
【０１９１】
図６は、（ａ）ヒト、（ｂ）チンパンジー、および（ｃ）オラウータンからの増幅による産物を作製するため、同じ系を使用して作製される各々のプロファイルを示し、そして（ｄ）全てのプロファイルの重ね合わせを示し、これはこれらのプロファイルが実際に種特異的であることを示す。種の間の差異の大きさを、既知の分離（分岐）年代に対して定量および比較し得る。従って、この方法は、種間の進化上の関係の尺度を提供する。
【０１９２】
ＺＰ３プライマー（配列番号１）を使用して首尾よくプロファイル付けされた他の種としては、以下が挙げられる：魚類−肺魚（Ｂａｒｒａｍｕｎｄｉ）（Ｌａｔｅｓ  ｃａｌｃａｒｉｆｅｒ）、タイ（Ｓｎａｐｐｅｒ）（Ｐａｇｒｕｓ  ａｕｒａｔｕｓ）およびグルーパー（Ｅｐｉｎｅｐｈｅｌｕｓ  ａｒｅｏｌａｔｕｓ）；有袋動物および他のオーストラリアの動物種−フクロネコ（Ｃｈｕｄｉｔｃｈ）（Ｄａｓｙｕｒｕｓ  ｇｅｏｆｆｒｏｉｉ）、キノボリカンガルー（Ｂｅｎｎｅｔｓ  Ｔｒｅｅ  Ｋａｎｇａｒｏｏ）（Ｄｅｎｄｒｏｌａｇｕｓ  ｂｅｎｎｅｔｔｉａｎｕｓ）、カオグロキノボリカンガルー（Ｌｕｍｈｏｌｔｚ  Ｔｒｅｅ  Ｋａｎｇａｒｏｏ）（Ｄｅｎｄｒｏｌａｇｕｓ  ｌｕｍｈｏｌｔｚｉ）、スナイロワラビー（Ａｇｉｌｅ  Ｗａｌｌａｂｙ）（Ｍａｃｒｏｐｕｓ  ａｇｉｌｉｓ）、ケナガワラルー（Ｗａｌｌａｒｏｏ／Ｅｕｒｏ）（Ｍａｃｒｏｐｕｓ  ｒｏｂｕｓｔｕｓ）、アカカンガルー（Ｒｅｄ  Ｋａｎｇａｒｏｏ）（Ｍａｃｏｐｕｓ  ｒｕｆｕｓ）、クロカンガルー（Ｇｒａｙ  Ｋａｎｇａｒｏｏ）（Ｍａｒｃｏｐｕｓ  ｆｕｌｉｇｉｎｏｕｓ）、ビルビー（Ｂｉｌｂｙ）（Ｍａｃｒｏｔｉｓ  ｌａｇｏｔｉｓ）、クオッカ（Ｑｕｏｋｋａ）（Ｓｅｎｔｏｎｉｘ  ｂｒａｃｈｙｕｒｕｓ）、タマー（Ｔａｍｍａｒ）（Ｍａｃｒｏｐｕｓ  ｅｕｇｅｎｉｉ）、ウエスタンペブルマウス（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｐｅｂｂｌｅ  Ｍｏｕｓｅ）（Ｐｓｅｕｄｏｍｙｓ  ｃｈａｍｐｍａｎｉ）、デリケートマウス（Ｄｅｌｉｃａｔｅ  Ｍｏｕｓｅ）（Ｐｓｅｕｄｏｍｙｓ  ｄｅｌｉｃａｔｕｌｕｓ）、砂漠ネズミ（Ｄｅｓｅｒｔ  Ｍｏｕｓｅ）（Ｐｄｅｕｄｏｍｙｓ  ｄｅｓｅｒｔｏｒ）、ノーザンペブルマウンドマウス（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｐｅｂｂｌｅ−ｍｏｕｎｄ  ｍｏｕｓｅ）（Ｐｓｅｕｄｏｍｙｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉ）、およびノースイースタンマウス（Ｎｏｒｔｈ  Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｍｏｕｓｅ）（Ｐｓｅｕｄｏｍｙｓ  ｐａｔｒｉｕｓ）、ならびに他の哺乳動物種−イヌ（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）、ネコ（Ｆｅｌｉｓ  ｃａｔｕｓ）、ウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）、ウマ（Ｅｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ）、ロバ（Ｅｑｕｕｓ  ａｓｉｎｕｓ）、ネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）およびウサギ（Ｏｒｃｙｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）（データは示さず）。
【０１９３】
（実施例２−ヒトＡｌｕ反復より設計されたプライマーを使用する相補性デュプリコンの双方向増幅）
ＢＡＣＤについて使用され得るプライマーに対して分析したヒトゲノムのＡｌｕ反復（図７）。Ｐ３（ＧＧＣＡＣＡＡＴＣＧＧＴＣＣＴＡＣＣＡＧＡＧＣＴＡ−配列番号２）およびＰ１（ＧＡＧＡＴＣＧＡＧＡＣＣＡＴＣＣＴＧＧＣＴＡＡＣＡＡ−配列番号３）と名付けた２つの重なるプライマーを選択した。
【０１９４】
種々のＤＮＡ産物（例としては、以下が挙げられる：Ｃ０２／００４７０Ｅ−ウマ２、Ｃ０２／００４７１Ｌ−ウマ３、Ｃ９９／０２３３４Ｖ  ウマＣＲ、Ｃ０２／００３９１Ｗ−ロバ  ポリー（Ｐｏｌｌｙ）；Ｃ０２／００３９３Ｊ−ロバ  ジャスパー（Ｊａｓｐｅｒ）；Ｃ０２／００３９５Ｘ−ロバ  ジュニア（Ｊｕｎｉｏｒ）；Ｃ０４／００４８５Ｑ−ヒツジＣ５０１、Ｃ０４／００４８６Ｘ  ヒツジＣ５０２；Ｃ０４／００４８７Ｄ−ヒツジＣ５０３；Ｃ０４／００４８８Ｋ−ヒツジＣ５０４、Ｃ０４／００４８９Ｒ−Ｃ５０５Ｃ９９／０２２５２Ｄ−雄ウシ  エミール（Ｅｍｉｒ）、Ｃ０４／００２１９Ｔ−雄ウシＲＤ３、Ｃ０４／００４２９Ｍ−ウシ０１６２、Ｃ０４／００２３９Ｄ−ウシ０１５７、Ｃ９９／０１９７２Ｋ−ウシ９８０４、Ｃ００／０４８７２Ｎ−ウシ００７０、Ｃ０３／０００３１Ｂ−ウシ９７６４、Ｃ０４／００２２７Ｙ−ウシ０４２８、Ｃ０４／００４９６Ｐ−グレートデーン１、イヌ  ジェンマ（Ｊｅｍｍａ）、Ｃ０４／００４９７Ｗ−グレートデーン２、Ｃ０４／００４７２Ｄ  レッドヒーラー（Ｒｅｄ  Ｈｅｅｌｅｒ））およびプライマーＰ３（配列番号２）を使用した増幅産物の蛍光検出。これらの例において、複数のゲノムＤＮＡアンプリコンを、１個体のＤＮＡサンプルから１つのプライマーＰ３（配列番号２）を１０．６ｎｇ使用して１つの反応容器中で同時に増幅した。ＰＣＲ増幅は、１００ｎｇのＤＮＡ鋳型および１．４ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して、１×ＰＣＲ反応緩衝液（Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＴＡＱ−３）、１．５ｍＭｏｌｅｓ  ＭｇＣｌ２ならびに２１２μＭｏｌｅｓの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰからなる２０μｌの容量で、実施した。以下の増幅プロトコルを用いてサーマルサイクラー（Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｐａｌｍ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＴＭ、Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｍｏｒｔｌａｋｅ、ＮＳＷ）を使用した：９５℃  ５分間、次いで９４℃  ３０秒間、４３℃  ３０秒間および７２℃  ３０秒間を３５サイクル、続いて７２℃  ５分間および１５℃  １秒間を１サイクル。
【０１９５】
増幅産物を、２０００ｖで１２０分間、１５μｇ／ｌ  ＥｔＢｒを有する０．６  ＴＢＥ緩衝液中の３２ｃｍのゲル上で、４％のポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、その産物を蛍光スキャナ（Ｇｅｌ−Ｓｃａｎ  ３０００  ＴＭ、Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｍｏｒｔｌａｋｅ、ＮＳＷ）を使用する蛍光シグナルの検出によって可視化した。
【０１９６】
ヒト、チンパンジーおよびウシのゲノムＤＮＡについての種々の増幅反応の結果を、図８〜１４に示す。図８ｄおよび図１２は、異なるヒトの間で高度に保存される、取得されたプロファイルを示す。しかしながら、ヒトより取得されたこれらのプロファイルは、チンパンジーより取得されたものと区別できる（例えば、図９ｂを参照のこと）。
【０１９７】
Ａｌｕ反復は一般的に霊長類に見出されるとみなされるが、驚くべきことに、Ｐ３プライマーおよびＰ１プライマーはまた、ウシゲノムＤＮＡ中の相補性デュプリコンを増幅した（図１０および１４）。図１０ｃから認めれるように、ヒトと比較した場合、ウシより取得されたプロファイルは、異なっている。
【０１９８】
（実施例３−非霊長類種の相補性デュプリコンの双方向増幅）
興味深いことに、プライマーＰ１およびプライマーＰ３はまた、ウシにおいて特異的かつ異なるバンドを増幅した。これらバンドは最初はネガティブコントロールとして含めていた（実施例２を参照のこと）。結果として、本発明者らはウマ、ロバ、ヒツジおよびイヌ由来のＤＮＡを分析した。使用された増幅手順は、上記の実施例２に提供されるものと同じであった。
【０１９９】
多様な種についてのさらなる分析は、より密接に関係する種に共有される類似のバンドと、種特異的バンドとを識別する（図１５〜１８）。さらに、Ｐ３は、ウシ、イヌおよびロバにおいて多型バンド（その種のうちのいくらかの個体には存在するが、他には存在しない）を識別した。
【０２００】
広範に記載されるように本発明の本質および範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示されるように、多くの改変および／または修飾が本発明になされ得ることが、当業者に理解される。従って、本発明の実施形態は、全ての点において例示であって限定ではないとみなされるべきである。
【０２０１】
上記に論じられる全ての刊行物は、本明細書中でその全体が援用される。
【０２０２】
本明細書中に包含されている文書、行為、物質、デバイス、物品などについてのいずれの考察も、単に、本発明の状況を提供する目的のためである。本発明は本出願の各特許請求の範囲の優先日より前に存在したことから、いかなる又は全てのこれらの事項も、従来技術の基礎の一部を形成すること、および本発明の関連分野における共通の一般的知識であったことの承認としてとられるべきでない。
【０２０３】
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【図面の簡単な説明】
【０２０４】
【図１−１】図１は、本発明の好ましい実施形態に従う、相補性デュプリコンに対するプライマー（配列番号１）のアニーリングを示す。
【図１−２】（図１−１の続き）
【図２】図２は、ゲノム配列のセグメントを示し、両方の相補鎖に潜在的に結合する単一プライマーを示す。示される配列は、単一のプライマーの例（ＡＴＧＡＧＣＴＴＧＴＣＴＡＣＡＣＣＴ：配列番号１）と、ゲノム配列の２４００ｂｐのセグメント（ＡＣ０８９９９９）であり、５６０ｂｐ離れて隔てられた両方の相補鎖に潜在的に結合する。アンプリコン（増幅産物）は反対向き（Ｃおよび＋と示される）に２つのＭＩＲセグメントを含み、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒ．ｏｒｇを使用して識別される反復配列のまとめの表に列挙されるとおりである。「．」はゲノム配列の連続を表す。ＲＬＥおよびプライマーが結合する塩基は、上付きで示される。示されるＡＣ０８９９９９の部分は、それぞれ配列番号９〜１１（５’−３’）に提供される。
【図３】図３は、本発明の実施形態に従う方法を使用するＤＮＡの増幅によって得られるヒトプロファイルを示す。
【図４】図４は、本発明の実施形態に従う方法を使用する、異なるヒト集団由来のＤＮＡの増幅によって得られるプロファイルを示す。
【図５】図５は、本発明の実施形態に従う方法を使用する、異なるウマサンプル由来のＤＮＡの増幅によって得られるプロファイルを示す。
【図６ａ】図６は、本発明の実施形態に従う方法を使用する、（ａ）ヒト、（ｂ）チンパンジー、（ｃ）オラウータン由来のＤＮＡの増幅によって得られるプロファイル、および（ｄ）（ａ）と（ｂ）と（ｃ）とのプロファイルの重ね合わせを示す。
【図６ｂ】図６は、本発明の実施形態に従う方法を使用する、（ａ）ヒト、（ｂ）チンパンジー、（ｃ）オラウータン由来のＤＮＡの増幅によって得られるプロファイル、および（ｄ）（ａ）と（ｂ）と（ｃ）とのプロファイルの重ね合わせを示す。
【図６ｃ】図６は、本発明の実施形態に従う方法を使用する、（ａ）ヒト、（ｂ）チンパンジー、（ｃ）オラウータン由来のＤＮＡの増幅によって得られるプロファイル、および（ｄ）（ａ）と（ｂ）と（ｃ）とのプロファイルの重ね合わせを示す。
【図６ｄ】図６は、本発明の実施形態に従う方法を使用する、（ａ）ヒト、（ｂ）チンパンジー、（ｃ）オラウータン由来のＤＮＡの増幅によって得られるプロファイル、および（ｄ）（ａ）と（ｂ）と（ｃ）とのプロファイルの重ね合わせを示す。
【図７】図７は、異なるＡｌｕ反復の領域の整列を提供する。プライマーＰ３（配列番号２）およびプライマーＰ１（配列番号３）の結合部位の位置が提供される。ＡｌｕＳｘ配列は、配列番号１２に示されている。
【図８ａ】図８ａ〜８ｃは、Ｐ３プライマーを使用する、異なるヒトサンプル由来のＤＮＡの増幅によって得られるプロファイルを示す。各々の場合、２つの別々の増幅反応の結果が提供される。図８ｄは、図８ａ〜８ｃにおけるプロファイルの重ね合わせを提供する。
【図８ｂ】図８ａ〜８ｃは、Ｐ３プライマーを使用する、異なるヒトサンプル由来のＤＮＡの増幅によって得られるプロファイルを示す。各々の場合、２つの別々の増幅反応の結果が提供される。図８ｄは、図８ａ〜８ｃにおけるプロファイルの重ね合わせを提供する。
【図８ｃ】図８ａ〜８ｃは、Ｐ３プライマーを使用する、異なるヒトサンプル由来のＤＮＡの増幅によって得られるプロファイルを示す。各々の場合、２つの別々の増幅反応の結果が提供される。図８ｄは、図８ａ〜８ｃにおけるプロファイルの重ね合わせを提供する。
【図８ｄ】図８ａ〜８ｃは、Ｐ３プライマーを使用する、異なるヒトサンプル由来のＤＮＡの増幅によって得られるプロファイルを示す。各々の場合、２つの別々の増幅反応の結果が提供される。図８ｄは、図８ａ〜８ｃにおけるプロファイルの重ね合わせを提供する。
【図９ａ】図９ａは、Ｐ３プライマーを使用する、チンパンジーサンプル由来のＤＮＡの増幅によって得られるプロファイルを示す。２つの別々の増幅反応の結果が提供される。図９ｂは、チンパンジー（図９ａ）およびヒト（図８ｃ）由来のプロファイルの比較を提供する。
【図９ｂ】図９ａは、Ｐ３プライマーを使用する、チンパンジーサンプル由来のＤＮＡの増幅によって得られるプロファイルを示す。２つの別々の増幅反応の結果が提供される。図９ｂは、チンパンジー（図９ａ）およびヒト（図８ｃ）由来のプロファイルの比較を提供する。
【図１０ａ】図１０ａは、Ｐ３プライマーを使用する、ウシサンプル由来のＤＮＡの増幅によって得られるプロファイルを示す。２つの別々の増幅反応の結果が提供される。図１０ｂは、Ｐ３プライマーを使用する、２つの異なるウシ由来のプロファイルの重ね合わせを提供する。図１０ｃは、ウシ（図１０ａ）およびヒト（図８ａ）由来のプロファイルの比較を提供する。
【図１０ｂ】図１０ａは、Ｐ３プライマーを使用する、ウシサンプル由来のＤＮＡの増幅によって得られるプロファイルを示す。２つの別々の増幅反応の結果が提供される。図１０ｂは、Ｐ３プライマーを使用する、２つの異なるウシ由来のプロファイルの重ね合わせを提供する。図１０ｃは、ウシ（図１０ａ）およびヒト（図８ａ）由来のプロファイルの比較を提供する。
【図１０ｃ】図１０ａは、Ｐ３プライマーを使用する、ウシサンプル由来のＤＮＡの増幅によって得られるプロファイルを示す。２つの別々の増幅反応の結果が提供される。図１０ｂは、Ｐ３プライマーを使用する、２つの異なるウシ由来のプロファイルの重ね合わせを提供する。図１０ｃは、ウシ（図１０ａ）およびヒト（図８ａ）由来のプロファイルの比較を提供する。
【図１１】図１１ａおよび図１１ｂは、Ｐ１プライマーを使用する、異なるヒトサンプル由来のＤＮＡの増幅によって得られるプロファイルを示す。各々の場合で、３つの別々の増幅反応の結果が提供される。
【図１２−１】図１２ａ〜１２ｆは、Ｐ１プライマーを使用する、種々のヒトサンプル由来のＤＮＡの増幅によって得られるプロファイルを比較する重ね合わせを提供する。
【図１２−２】図１２ａ〜１２ｆは、Ｐ１プライマーを使用する、種々のヒトサンプル由来のＤＮＡの増幅によって得られるプロファイルを比較する重ね合わせを提供する。
【図１２−３】図１２ａ〜１２ｆは、Ｐ１プライマーを使用する、種々のヒトサンプル由来のＤＮＡの増幅によって得られるプロファイルを比較する重ね合わせを提供する。
【図１３ａ】図１３ａは、Ｐ１プライマーを使用する、チンパンジーサンプル由来のＤＮＡの増幅によって得られるプロファイルを示す。３つの別々の増幅反応の結果が提供される。図１３ｂ〜１３ｅは、Ｐ１プライマーを使用する、種々のヒトサンプル由来のＤＮＡの増幅によって得られるプロファイルを、同じプライマーを使用する種々のチンパンジーサンプル由来のＤＮＡ増幅によって得られるプロファイルと比較する重ね合わせを提供する。
【図１３ｂ】図１３ａは、Ｐ１プライマーを使用する、チンパンジーサンプル由来のＤＮＡの増幅によって得られるプロファイルを示す。３つの別々の増幅反応の結果が提供される。図１３ｂ〜１３ｅは、Ｐ１プライマーを使用する、種々のヒトサンプル由来のＤＮＡの増幅によって得られるプロファイルを、同じプライマーを使用する種々のチンパンジーサンプル由来のＤＮＡ増幅によって得られるプロファイルと比較する重ね合わせを提供する。
【図１３ｃ】図１３ａは、Ｐ１プライマーを使用する、チンパンジーサンプル由来のＤＮＡの増幅によって得られるプロファイルを示す。３つの別々の増幅反応の結果が提供される。図１３ｂ〜１３ｅは、Ｐ１プライマーを使用する、種々のヒトサンプル由来のＤＮＡの増幅によって得られるプロファイルを、同じプライマーを使用する種々のチンパンジーサンプル由来のＤＮＡ増幅によって得られるプロファイルと比較する重ね合わせを提供する。
【図１３ｄ】図１３ａは、Ｐ１プライマーを使用する、チンパンジーサンプル由来のＤＮＡの増幅によって得られるプロファイルを示す。３つの別々の増幅反応の結果が提供される。図１３ｂ〜１３ｅは、Ｐ１プライマーを使用する、種々のヒトサンプル由来のＤＮＡの増幅によって得られるプロファイルを、同じプライマーを使用する種々のチンパンジーサンプル由来のＤＮＡ増幅によって得られるプロファイルと比較する重ね合わせを提供する。
【図１３ｅ】図１３ａは、Ｐ１プライマーを使用する、チンパンジーサンプル由来のＤＮＡの増幅によって得られるプロファイルを示す。３つの別々の増幅反応の結果が提供される。図１３ｂ〜１３ｅは、Ｐ１プライマーを使用する、種々のヒトサンプル由来のＤＮＡの増幅によって得られるプロファイルを、同じプライマーを使用する種々のチンパンジーサンプル由来のＤＮＡ増幅によって得られるプロファイルと比較する重ね合わせを提供する。
【図１４】図１４は、Ｐ１プライマーを使用するウシサンプル由来のＤＮＡ増幅によって得られるプロファイルを示す。３つの別々の増幅反応の結果が提供される。
【図１５−１】図１５は、Ｐ３プライマーを使用する、ウマサンプル、ロバサンプルおよびヒツジサンプル由来のＤＮＡの増幅により得られるプロファイルを示す。異なる個体由来のサンプルに対する別々の増幅反応の結果が、各々の種に対して提供される。
【図１５−２】（図１５−１の続き）
【図１６】図１６は、Ｐ３プライマーを使用する、ウシサンプル由来のＤＮＡの増幅によって得られるプロファイルを示す。上側のパネルは異なる個体間で単一形のプロファイルを示し、一方、下側のパネルは個体の間のいくつかの多形態プロファイルを提供する。
【図１７】図１７は、Ｐ３プライマーを使用する、イヌサンプル由来のＤＮＡの増幅によって得られるプロファイルを示す。上側のパネルは異なる個体（育種）間で単一形のプロファイルを示し、一方、下側のパネルは個体の間のいくつかの多形態プロファイルを提供する。
【図１８】図１８は、Ｐ３プライマーを使用する、ウシ、イヌ、ヒツジ、ウマおよびロバより得られるプロファイル間の比較を提供し、そして種特異的な増幅産物を強調する。
【図１９】図１９は、成分の１集合の開始からオフセットによって分離される、複製部分集合の成分を、ヌクレオチド形式で示す。
【図２０】図２０は、２集合にまたがる２対の複製部分集合の成分、および互いからのオフセットを、ヌクレオチド形式で示す。
【図２１】図２１は、各々の集合に沿った位置における２集合の成分のオフセット、およびその２集合の間の関係を示す行列である。
【図２２】図２２は、種々のサイズの集合についての剰余の例を示す。
【図２３】図２３は、特定されるヌクレオチド位置から特定のヌクレオチドの隣の存在に対するオフセットを示す行列である。
【図２４】図２４は、配列位置に対して５〜１０の複製のサイズに対する剰余の値を示す行列であり、順方向配列の剰余の値と逆方向相補配列の剰余の値との間の同一の不一致を強調する。
【図２５】図２５は、配列位置に対して５〜１０の複製物サイズに対する剰余の値を示す別の行列であり、順方向配列の剰余の値と逆方向相補配列の剰余の値との間の一致の程度を強調する。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１３ｄ】
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【図１３ｅ】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
2008529538000001.app
【国際調査報告】
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2008529538.tif 000049
2008529538.tif 000050
2008529538.tif 000051
2008529538.tif 000052