(57)【要約】改変ＨＣＶ非構造タンパク質が、記載される。このタンパク質は、ＮＳ３分子のタンパク分解活性が阻害されるような、改変ＮＳ３ドメインを含む。この改変タンパク質は、高次構造エピトープを保持する。改変ＮＳ３分子を含むＨＣＶイムノアッセイもまた、記載される。１つの実施形態において、本発明は、改変ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼドメインを含むポリペプチドを含むイムノアッセイ固体支持体に関し、この改変ＮＳ３ポリペプチドのプロテアーゼ活性は、改変を有さない対応するＨＣＶ  ＮＳ３ポリペプチドのプロテアーゼ活性と比較して阻害されている。このポリペプチドは、ＮＳ３高次構造エピトープを含み、かつＨＣＶ感染個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体に特異的に反応する。
2008511326.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イムノアッセイ固体支持体であって、該固体支持体は、改変Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＮＳ３プロテアーゼドメインを含むポリペプチドを含み、該改変ＮＳ３ポリペプチドのプロテアーゼ活性は、該改変を有さない対応するＨＣＶ  ＮＳ３ポリペプチドのプロテアーゼ活性と比較して阻害されており、ここで、該ポリペプチドは、ＮＳ３高次構造エピトープを含み、かつＨＣＶ感染個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体に特異的に反応する、固体支持体。
【請求項２】
請求項１に記載のイムノアッセイ固体支持体であって、該改変は、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けられた、Ｈｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含む、固体支持体。
【請求項３】
請求項２に記載のイムノアッセイ固体支持体であって、該改変は、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けられた、Ｓｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸に対するＡｌａの置換を含む、固体支持体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のイムノアッセイ固体支持体であって、該ポリペプチドは、Ｔｈｒ−１４２８に対応するアミノ酸に対するＰｒｏの置換、およびＳｅｒ−１４２９に対応するアミノ酸に対するＩｌｅの置換をさらに含む、固体支持体。
【請求項５】
請求項１に記載のイムノアッセイ固体支持体であって、該ポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、固体支持体。
【請求項６】
請求項５に記載のイムノアッセイ固体支持体であって、該ポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる、固体支持体。
【請求項７】
請求項１に記載のイムノアッセイ固体支持体であって、該ポリペプチドは、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む、固体支持体。
【請求項８】
請求項７に記載のイムノアッセイ固体支持体であって、該ポリペプチドは、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる、固体支持体。
【請求項９】
請求項１に記載のイムノアッセイ固体支持体であって、該ポリペプチドは、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む、固体支持体。
【請求項１０】
請求項９に記載のイムノアッセイ固体支持体であって、該ポリペプチドは、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる、固体支持体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のイムノアッセイ固体支持体であって、該固体支持体は、該支持体に結合した多エピトープ融合抗原をさらに含み、ここで、前記ポリペプチドおよび／または該多エピトープ融合抗原は、ＨＣＶ感染個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応する、固体支持体。
【請求項１２】
請求項１１に記載のイムノアッセイ固体支持体であって、前記多エピトープ融合抗原は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列、または該配列に対する少なくとも８０％の配列同一性を有しかつＨＣＶ感染個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応するアミノ酸配列を含む、固体支持体。
【請求項１３】
請求項１１に記載のイムノアッセイ固体支持体であって、前記多エピトープ融合抗原は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列、または該配列に対する少なくとも９０％の配列同一性を有しかつＨＣＶ感染個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応するアミノ酸配列を含む、固体支持体。
【請求項１４】
請求項１１に記載のイムノアッセイ固体支持体であって、前記多エピトープ融合抗原は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列、または該配列に対する少なくとも９８％の配列同一性を有しかつＨＣＶ感染個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応するアミノ酸配列を含む、固体支持体。
【請求項１５】
請求項１１に記載のイムノアッセイ固体支持体であって、該多エピトープ融合抗原は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなる、固体支持体。
【請求項１６】
生物学的サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を検出する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項１〜１５のいずれか１項に記載のイムノアッセイ固体支持体を提供する工程；
（ｂ）生物学的サンプルと該固体支持体とを、該生物学的サンプル中にＨＣＶ抗体が存在する場合に該ＨＣＶ抗体が前記ポリペプチドおよび／または前記多エピトープ融合抗原に結合可能である条件下で混合し、第１免疫複合体を形成する工程；
（ｃ）工程（ｂ）からの該固体支持体に、複合体形成条件下で検出可能に標識された抗体を加える工程であって、ここで、該標識された抗体は、該免疫複合体に反応性である工程；
（ｄ）該検出可能に標識された抗体と該第１免疫複合体との間に形成された第２免疫複合体が存在する場合、該第２免疫複合体を、該生物学的サンプル中のＨＣＶ感染の指標として検出する工程、
を包含する方法。
【請求項１７】
請求項１〜請求項１５のいずれか１項に記載のイムノアッセイ固体支持体、および免疫診断試験を実施するための指示書を含む、免疫診断試験キット。
【請求項１８】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、ＮＳ３高次構造エピトープを含む、ポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１８に記載の単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、ＮＳ３高次構造エピトープを含む、ポリペプチド。
【請求項２１】
請求項２０に記載の単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、ＮＳ３高次構造エピトープを含む、ポリペプチド。
【請求項２３】
請求項２２に記載の単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
【請求項２４】
請求項１８〜請求項２３のいずれか１項に記載のポリペプチドのコード配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２５】
組換えベクターであって、以下：
（ａ）請求項２４に記載のポリヌクレオチド；および
（ｂ）該ポリヌクレオチドに作動可能に連結される制御エレメントであって、それによって前記コード配列が宿主細胞中で転写され得、かつ翻訳され得る、制御エレメント、
を含む組換えベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載の組換えベクターによって形質転換された、宿主細胞。
【請求項２７】
組換えポリペプチドを産生する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項２６に記載の宿主細胞の集団を産生する工程；および
（ｂ）該細胞の集団を、前記組換えベクター中の前記コード配列によってコードされるポリペプチドが発現される条件下で培養する工程、
を包含する方法。
【請求項２８】
イムノアッセイ固体支持体を作製する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）固体支持体を提供する工程；および
（ｂ）該固体支持体に、請求項１８〜請求項２３のいずれか１項に記載の少なくとも１種のポリペプチドを結合させる工程
を包含する方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、前記固体支持体に、多エピトープ融合抗原を別個の位置で結合させる工程を、さらに包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般に、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）構築物およびこれを使用する方法に関する。より詳細には、本発明は、ＮＳ３分子のタンパク分解活性が阻害されるような改変ＮＳ３プロテアーゼドメインを有する、免疫原性かつ免疫反応性であるＨＣＶタンパク質に関する。この改変タンパク質は、高次構造エピトープを保持し、従って、ＨＣＶ感染を診断するためのイムノアッセイにおいて有用であり、かつ、ＨＣＶに対する免疫応答を刺激するために有用である。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、ほとんど輸血および体液交換を介して伝染する、非経口的な非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）の主要な原因である。このウイルスは、米国内の一般住民の０．４〜２．０％に存在する。感染の約５０％において慢性肝炎が発症し、そして、感染個体の約２０％が肝硬変を発症する。肝硬変は時々、肝細胞癌をもたらす。従って、この疾患の研究および制御は、医学的に重要である。
【０００３】
ＨＣＶは、最初に、ＨｏｕｇｈｔｅｎらによってＮＡＮＢＨの原因として同定され、そして性質決定された。ＨＣＶのウイルスゲノム配列は、この配列を得るための方法と同様に公知である。例えば、特許文献１、特許文献２および特許文献３を参照のこと。ＨＣＶは、９．５ｋｂの＋（センス）鎖の、一本鎖ＲＮＡゲノムを有し、そしてフラビウイルス科のウイルスのメンバーである。少なくとも６つの、異なるが関連したＨＣＶの遺伝子型が、系統発生分析に基づいて同定されている（非特許文献１）。このウイルスは、３０００を超えるアミノ酸残基を有する単一のポリタンパク質をコードする（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。このポリタンパク質は、翻訳と同時におよび翻訳後に、構造タンパク質ならびに非構造（ＮＳ）タンパク質の両方にプロセシングされる。
【０００４】
特に、図１に示されるように、いくつかのタンパク質は、ＨＣＶゲノムによってコードされる。ＨＣＶポリタンパク質の切断産物の順序および名称は、以下のようなものである：ＮＨ２−Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−Ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４ａ−ＮＳ４ｂ−ＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ−ＣＯＯＨ。このポリタンパク質の最初の切断は、宿主のプロテアーゼによって触媒され、３つの構造タンパク質（Ｎ末端ヌクレオカプシドタンパク質（「コア（ｃｏｒｅ）」と称される）および２つのエンベロープ糖タンパク質（「Ｅ１」（Ｅとしても公知である）および「Ｅ２」（Ｅ２／ＮＳ１としても公知である））、ならびにウイルス酵素を含む非構造（ＮＳ）タンパク質を生じさせる。これらのＮＳ領域は、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａおよびＮＳ５ｂと称される。ＮＳ２は、タンパク分解活性を有する内在性膜タンパク質である。ＮＳ２は、単独もしくはＮＳ３との組み合わせのいずれかにおいて、ＮＳ２−ＮＳ３シスル（ｓｉｓｓｌｅ）結合を切断し、次にＮＳ３のＮ末端を生成し、そしてセリンプロテアーゼおよびＲＮＡヘリカーゼ活性の両方を含む大きなポリタンパク質を生じる。このＮＳ３プロテアーゼが機能して、残りのポリタンパク質をプロセシングする。詳細には、ＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質は、３つの機能的ドメインを含む、６３０アミノ酸のタンパク質である。セリン様プロテアーゼドメインは、アミノ末端内に位置し、一方、ヘリカーゼ活性およびＮＴＰａｓｅ活性は、カルボキシ末端内に存在する。ＮＳ３のセリンプロテアーゼは、ＮＳ３／４ａ、ＮＳ４ａ／ｂ、ＮＳ４ｂ／５ａおよびＮＳ５ａ／ｂの接合部の切断を担っている。
【０００５】
ＨＣＶについての免疫学的試薬および診断試薬として有用である、（ＨＣＶポリタンパク質に由来する）多くの一般的なポリペプチドおよび特定のポリペプチドが、記載されている。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎらの特許文献４および特許文献５、非特許文献２、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、Ｃｈｉｅｎらの特許文献６、Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．の特許文献７を参照されたい。これらの刊行物は、一般に、ＨＣＶに対し、そしてＨＣＶポリペプチド免疫学的試薬の製造および使用に対し、広範囲な背景を提供する。それにより、簡潔さのために、これらの刊行物の開示は、本明細書中で参考として援用される。
【０００６】
ＨＣＶのキャリアならびにＨＣＶ汚染された血液および血液製剤をスクリーニングしそして同定するための高感度かつ特異的な方法は、医薬における重要な進歩を提供する。輸血後肝炎（ＰＴＨ）は、輸血を受けた患者の約１０％で起こり、そしてＨＣＶは、これらの症例の９０％以下の原因となっている。患者の看護、ならびに血液および血液製剤によるかまたは親密な個人的接触によるＨＣＶの伝染の予防は、信頼性のある診断ツールおよび予後診断ツールを必要とする。従って、ＨＣＶ感染の血清診断のための幾つかのアッセイが、開発されている。例えば、非特許文献２、非特許文献５、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．の特許文献７、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａらの特許文献８、Ｋａｓｈｉｗａｋｕｍａらの特許文献９を参照されたい。
【０００７】
特許文献１０（その全体が本明細書中で参考として援用される）は、ＮＳ３／４ａ高次構造エピトープを多エピトープ融合抗原（ＭＥＦＡ）と組み合わせて用いるイムノアッセイを記載する。このアッセイは、初期ＨＣＶセロコンバージョンを検出するための感度が高くかつ信頼性のある方法を提供する。特許文献１０に記載されるように、酵母において発現されそして非還元条件下で精製されたＮＳ３／４ａは、プロテアーゼ機能およびヘリカーゼ機能の両方を含む。何故なら、この様式で精製されたＮＳ３／４ａは、天然の高次構造を保存しているからである。この様式で精製されたＮＳ３／４ａは、初期セロコンバージョン抗体検出において、ｃ２００抗原もしくはｃ３３ｃ抗原よりも感度が高いことが見出されている。ＮＳ３／４ａおよびＭＥＦＡ  ７．１を抗原として用いる抗体アッセイにおいて、セロコンバージョン抗体は、現在市販されているＨＣＶアッセイよりも２〜１４日間早く検出された。しかし、ＮＳ３／４タンパク質は、自己加水分解を受け、そしてＮＳ３プロテアーゼ活性に起因して、ＭＥＦＡ  ７．１を切断する。
【０００８】
特許文献１１および特許文献１２は、低下したタンパク分解活性を有する変異ＮＳ３プロテアーゼドメインを含むＨＣＶタンパク質を記載する。しかし、十分な患者の看護を提供し、そして血液および血液製剤によるかまたは親密な個人的接触によるＨＣＶの伝染を予防するための、感度の高い、正確な診断ツールおよび予後診断ツールの需要が存在し続けている。
【特許文献１】国際公開第８９／０４６６９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９０／１１０８９号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９０／１４４３６号パンフレット
【特許文献４】欧州特許出願公開第３１８，２１６号明細書
【特許文献５】欧州特許出願公開第３８８，２３２号明細書
【特許文献６】国際公開第９３／００３６５号パンフレット
【特許文献７】国際公開第９４／０１７７８号パンフレット
【特許文献８】国際公開第９７／４４４６９号パンフレット
【特許文献９】米国特許第５，８７１，９０４号明細書
【特許文献１０】米国特許第６，６３２，６０１号明細書
【特許文献１１】国際公開第０４／００５４７号パンフレット
【特許文献１２】国際公開第０１／３８３６０号パンフレット
【非特許文献１】Ｓｉｍｍｏｎｄｓら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９３年，第７４巻，ｐ．２３９１−２３９９
【非特許文献２】Ｃｈｏｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９年，第２４４巻，ｐ．３５９−３６２
【非特許文献３】Ｃｈｏｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９１年，第８８巻，ｐ．２４５１−２４５５
【非特許文献４】Ｈａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９１年，第８８巻，ｐ．１７１１−１７１５
【非特許文献５】Ｋｕｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９年，第２４４巻，ｐ．３６２−３６４
【非特許文献６】Ｈｏｕｇｈｔｏｎら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１９９１年，第１４巻，ｐ．３８１−３８８
【非特許文献７】Ｃｈｉｅｎら，Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２年，第８９巻，ｐ．１００１１−１００１５
【非特許文献８】Ｃｈｉｅｎら，Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．，１９９３年，第８巻，ｐ．Ｓ３３−３９
【非特許文献９】Ｃｈｏｏら，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．，１９９０年，第４６巻，ｐ．４２３−４４１
【非特許文献１０】Ｅｂｅｌｉｎｇら，Ｌａｎｃｅｔ，１９９０年，第３３５巻，ｐ．９８２−９８３
【非特許文献１１】ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｅｌら，Ｌａｎｃｅｔ，１９９０年，第３３５巻，ｐ．５５８−５６０
【非特許文献１２】ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｅｌら，Ｌａｎｃｅｔ，１９９１年，第３３７巻，ｐ．３１７−３１９
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、改変プロテアーゼドメインを有するＨＣＶ  ＮＳ３ポリペプチドの使用は、ＨＣＶ感染を検出するための優れた試薬を提供するという知見に一部基づく。この改変ＮＳ３ポリペプチドは、高次構造エピトープを保持する（従って、免疫反応性を保持する）一方で、プロテアーゼ活性を除去されている。何故なら、このＮＳ３ポリペプチドは、プロテアーゼ活性をプロテアーゼ活性を除去するように改変されているからであり、これらは、ＮＳ３タンパク分解性切断部位を保持する他のＨＣＶポリペプチドに関して、そしてさもなければ機能的ＮＳ３プロテアーゼによってタンパク分解的に切断される他のＨＣＶポリペプチドに関して、特に有用である。従って、この改変ＮＳ３ポリペプチドは、ＨＣＶ感染の存在の正確かつ効率的な検出のために、単独で使用されてもよく、または他のＨＣＶ試薬（とりわけ、多エピトープ融合抗原（ＭＥＦＡ））と組み合わせて使用されてもよい。ＭＥＦＡの使用は、基質の単位面積あたりより多い数のエピトープを与えることにより、マスキング（ｍａｓｋｉｎｇ）問題の低減、抗体検出についての選択性の改善および感度の改善の、さらなる利益を提供する。本明細書中で記載されるアッセイは、ＨＣＶの６種の公知の遺伝子型のいずれかによって引き起こされるＨＣＶ感染を検出するために使用され得る。
【００１０】
従って、１つの実施形態において、本発明は、イムノアッセイ固体支持体に関し、この固体支持体は、改変Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＮＳ３プロテアーゼドメインを含むポリペプチドを含み、この改変ＮＳ３ポリペプチドのプロテアーゼ活性は、改変を有さない対応するＨＣＶ  ＮＳ３ポリペプチドのプロテアーゼ活性と比較して阻害されている。このポリペプチドは、ＮＳ３高次構造エピトープを含み、かつＨＣＶ感染個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体に特異的に反応する。特定の実施形態において、この改変は、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けられた、Ｈｉｓ−１０８３、Ａｓｐ−１１０５および／またはＳｅｒ−１１６５に対応するアミノ酸の置換を含む。
【００１１】
さらなる実施形態において、この免疫アッセイ固体支持体上のこのポリペプチドは、Ｔｈｒ−１４２８に対応するアミノ酸に対するＰｒｏの置換、およびＳｅｒ−１４２９に対応するアミノ酸に対するＩｌｅの置換をさらに含む。
【００１２】
さらなる実施形態において、この免疫アッセイ固体支持体上のこのポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、このポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列からなる。
【００１３】
なおさらなる実施形態において、この免疫アッセイ固体支持体上のこのポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、このポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列からなる。
【００１４】
さらなる実施形態において、この免疫アッセイ固体支持体上のこのポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、このポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列からなる。
【００１５】
なおさらなる実施形態において、この固体支持体は、この支持体に結合した多エピトープ融合抗原をさらに含み、ここで、上記ポリペプチドおよび／またはこの多エピトープ融合抗原は、ＨＣＶ感染個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応する。
【００１６】
特定の実施形態において、この多エピトープ融合抗原は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列、またはこの配列に対する少なくとも８０％（例えば、少なくとも９０％もしくは少なくとも９８％）の配列同一性を有しかつＨＣＶ感染個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応するアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、この多エピトープ融合抗原は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなる
さらなる実施形態において、本発明は、生物学的サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を検出する方法に関する。この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）上述のイムノアッセイ固体支持体を提供する工程；
（ｂ）生物学的サンプルとこの固体支持体とを、生物学的サンプル中にＨＣＶ抗体が存在する場合にＨＣＶ抗体が上記ポリペプチドおよび／または上記多エピトープ融合抗原に結合可能である条件下で混合し、第１免疫複合体を形成する工程；
（ｃ）工程（ｂ）からの固体支持体に、複合体形成条件下で検出可能に標識された抗体を加える工程であって、ここで、この標識された抗体は、上記免疫複合体に反応性である工程；
（ｄ）この検出可能に標識された抗体と第１免疫複合体との間に形成された第２免疫複合体が存在する場合、第２免疫複合体を、生物学的サンプル中のＨＣＶ感染の指標として検出する工程。
【００１７】
なおさらなる実施形態において、本発明は、上述のイムノアッセイ固体支持体、および免疫診断試験を実施するための指示書を含む、免疫診断試験キットに関する。
【００１８】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに関し、このポリペプチドは、ＮＳ３高次構造エピトープを含む。特定の実施形態において、このポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列からなる。
【００１９】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに関し、このポリペプチドは、ＮＳ３高次構造エピトープを含む。特定の実施形態において、このポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列からなる。
【００２０】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号６のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに関し、このポリペプチドは、ＮＳ３高次構造エピトープを含む。特定の実施形態において、このポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列からなる。
【００２１】
なおさらなる実施形態において、本発明は、上述のポリペプチドのうちいずれか１種についてのコード配列を含むポリヌクレオチド、ならびにこのポリヌクレオチドとこのポリヌクレオチドに作動可能に連結される制御エレメント（それによって上記コード配列が宿主細胞中で転写され得、かつ翻訳され得る）とを含む組換えベクターに関する。さらなる実施形態において、本発明は、この組換えベクターによって形質転換された宿主細胞に関する。なおさらなる実施形態において、本発明は、組換えポリペプチドを産生する方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）上述の宿主細胞の集団を産生する工程；および
（ｂ）この細胞の集団を、上記組換えベクター中の上記コード配列によってコードされるポリペプチドが発現される条件下で培養する工程。
【００２２】
さらなる実施形態において、本発明は、イムノアッセイ固体支持体を作製する方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）固体支持体を提供する工程；および
（ｂ）この固体支持体に、上述の少なくとも１種のポリペプチドを結合させる工程。
特定の実施形態において、この方法は、上記固体支持体に多エピトープ融合抗原を別個の位置で結合させる工程を、さらに包含する。
【００２３】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照することにより明らかになる。さらに、特定の手順もしくは組成物をより詳細に説明する種々の参考文献が、本明細書中で示され、それにより、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、特に明記されない限り、当業者の技術の範囲内の従来の化学的方法、生物化学的方法、組換えＤＮＡ技術による方法および免疫学的方法を使用する。このような技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ巻〜第ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，最新版）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照のこと。
【００２５】
本明細書中に記載される全ての刊行物、特許および特許出願は、前出および後出を問わず、本明細書によってその全体が参考として援用される。
【００２６】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈中で明らかに別のものを示さない限り、複数形が含まれることに留意しなければならない。したがって、例えば、「抗原（ａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）」という言及には、２種以上のこのような抗原の混合物が含まれる、などである。
【００２７】
以下のアミノ酸の略語は、本明細書を通して使用される：
アラニン：Ａｌａ（Ａ）        アルギニン：Ａｒｇ（Ｒ）
アスパラギン：Ａｓｎ（Ｎ）    アスパラギン酸：Ａｓｐ（Ｄ）
システイン：Ｃｙｓ（Ｃ）      グルタミン：Ｇｌｎ（Ｑ）
グルタミン酸：Ｇｌｕ（Ｅ）    グリシン：Ｇｌｙ（Ｇ）
ヒスチジン：Ｈｉｓ（Ｈ）      イソロイシン：Ｉｌｅ（Ｉ）
ロイシン：Ｌｅｕ（Ｌ）        リジン：Ｌｙｓ（Ｋ）
メチオニン：Ｍｅｔ（Ｍ）      フェニルアラニン：Ｐｈｅ（Ｆ）
プロリン：Ｐｒｏ（Ｐ）        セリン：Ｓｅｒ（Ｓ）
トレオニン：Ｔｈｒ（Ｔ）      トリプトファン：Ｔｒｐ（Ｗ）
チロシン：Ｔｙｒ（Ｙ）        バリン：Ｖａｌ（Ｖ）。
【００２８】
（Ｉ．定義）
本発明の記載において、以下の用語が使用され、そして以下で示すように定義されることが意図される。
【００２９】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーをいい、産物の長さの下限に制限されない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、および多量体などは、この定義の範囲内に含まれる。全長タンパク質およびそのフラグメントの両方は、この定義に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、およびリン酸化など）を含む。さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」とは、タンパク質が所望の活性を保持する限り、天然の配列の改変（例えば、欠失、付加、および置換（一般に、本質的に保存的である））を含むタンパク質をいう。これらの改変は部位特異的変異誘発による意図的なものであっても、タンパク質を産生する宿主の変異またはＰＣＲ増幅に起因するエラーなどによる偶発的なものであってもよい。
【００３０】
ＨＣＶポリペプチドは、ＨＣＶポリタンパク質に由来する、上に定義されるようなポリペプチドである。このポリペプチドは、物理的にＨＣＶに由来することを必要とせず、合成的または組換え的に産生され得る。さらに、このポリペプチドは、種々のＨＣＶ株および単離物（例えば、ＨＣＶの株１、株２、株３、株４、株５もしくは株６に由来する単離物のいずれかであるが、これらに限定されない）のいずれかに由来し得る。これらの株の間の多くの保存領域および可変領域が公知であり、そして一般的に、これらの領域に由来するエピトープのアミノ酸配列は、２つの配列が並列された場合に、高度の配列相同性（例えば、３０％を超える（好ましくは、４０％を超える）アミノ酸配列相同性）を有する。従って、例えば、用語「ＮＳ３／４ａ」ポリペプチドとは、種々のＨＣＶ株のいずれかに由来する天然のＮＳ３／４ａ、ならびに以下でさらに定義されるようなＮＳ３／４ａアナログ、ＮＳ３／４ａムテインおよびＮＳ３／４ａ免疫原性フラグメントをいう。これらの株の多くの完全な遺伝子型は、公知である。例えば、米国特許第６，１５０，０８７号およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ２３８８００および同ＡＪ２３８７９９を参照されたい。
【００３１】
ＨＣＶポリタンパク質に「由来する」ポリペプチドは、参照ＨＣＶポリタンパク質の１つ以上の領域もしくは領域の部分の配列を含むポリペプチドを意図する。代表的には、ポリペプチドは、エピトープを含む領域もしくは領域の部分からなり、一般に、以下で規定する参照ポリペプチドに実質的に相同なアミノ酸配列を有する。従って、用語「由来する」は、分子の元来の供給源を同定するために使用されるが、この分子が作製される方法（例えば、化学合成による方法もしくは組換え手段による方法であり得る）を限定することを意味しない。
【００３２】
用語「アナログ」および「ムテイン」とは、所望の活性（例えば、本明細書中で記載されるアッセイにおける免疫反応性）を保持する、参照分子の生物学的に活性な誘導体、またはこのような誘導体のフラグメントをいう。一般的に、用語「アナログ」とは、天然の分子に対する１個以上のアミノ酸の付加、置換（一般的に本質的に保存的であるか、または改変ＮＳ３の場合においては活性なタンパク分解部位において本質的に非保存的である）および／または欠失を（これらの改変が免疫原性活性を破壊しない限り）含む、天然のポリペプチド配列および構造を有する化合物をいう。用語「ムテイン」とは、１種以上のアミノ酸様分子（アミノ分子および／またはイミノ分子のみを含む化合物、１種以上のアミノ酸アナログ（例えば、非天然アミノ酸などが挙げられる）を含むポリペプチド、置換された連結を有するポリペプチド、ならびに当該分野で公知の他の改変（環状分子および分枝状分子などの、天然に存在する分子および天然に存在しない（例えば合成の）分子の両方）が挙げられるが、これらに限定されない）を有するポリペプチドをいう。この用語はまた、１種以上のＮ置換グリシン残基（「ペプトイド」）および他の合成アミノ酸もしくは合成ペプチドを含む分子をも含む。（例えば、ペプトイドの記載について、米国特許第５，８３１，００５号；同第５，８７７，２７８号；および同第５，９７７，３０１号；Ｎｇｕｙｅｎら，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．（２０００）７：４６３−４７３；ならびにＳｉｍｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：９３６７−９３７１を参照されたい。）好ましくは、アナログまたはムテインは、少なくとも天然の分子と同一の免疫活性を有する。ポリペプチドアナログおよびムテインを作製するための方法は、当該分野で公知であり、そして以下にさらに記載される。
【００３３】
上記で説明される通り、アナログは、一般的に、天然において保存的な置換（すなわち、その側鎖において関連するアミノ酸のファミリー内で起こる置換）を含む。具体的には、アミノ酸は、一般的に、以下の４つのファミリーに分類される：（１）酸性−−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性−−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性−−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンは、ときとして、芳香族アミノ酸として分類される。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンとの単独置換、アスパラギン酸のグルタミン酸との単独置換、トレオニンのセリンとの単独置換、または同様の、構造的に関連するアミノ酸によるアミノ酸の保存的置換は、生物学的活性に大きな影響を与えないことが容易に予想される。例えば、目的のポリペプチドは、この分子の所望の機能がインタクトなままである限り、約５〜１０個までの保存的アミノ酸置換もしくは非保存的アミノ酸置換、またはさらに約１５〜２５個までの保存的アミノ酸置換もしくは非保存的アミノ酸置換、または５〜２５の間の任意の整数の保存的アミノ酸置換もしくは非保存的アミノ酸置換を含み得る。当業者は、当該分野で周知のＨｏｐｐ／ＷｏｏｄｓプロットおよびＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプロットを参照することにより、目的の分子の変化を許容し得る領域を容易に決定し得る。
【００３４】
「改変ＮＳ３」は、ＮＳ３ポリペプチドのプロテアーゼ活性が破壊されるような改変を有するＮＳ３ポリペプチドを意味する。従って、この改変ＮＳ３ポリペプチドは、非改変親ＮＳ３ポリペプチドと比較した場合に、より低いプロテアーゼ活性を示す。この改変は、天然の分子に対する１個以上のアミノ酸の付加、置換（一般的に、本質的に非保存的である）および／または欠失を含み得、この改変において、ＮＳ３ポリペプチドのプロテアーゼ活性は、破壊される。プロテアーゼ活性を測定する方法は、以下でさらに議論される。
【００３５】
「フラグメント」は、インタクトな全長ポリペプチド配列および構造の、一部のみからなるポリペプチドを意図する。フラグメントは、天然のポリペプチドのＣ末端の欠失、および／またはＮ末端の欠失を含み得る。特定のＨＣＶタンパク質の「免疫原性フラグメント」は、一般的に、エピトープを定義する全長分子の少なくとも約５〜１０個の連続するアミノ酸残基、好ましくは全長分子の少なくとも約１５〜２５個の連続するアミノ酸残基、最も好ましくは全長分子の少なくとも約２０〜５０個またはそれより多くの連続したアミノ酸残基、あるいは５個のアミノ酸と全長配列との間の任意の整数の連続したアミノ酸残基を含むが、但しここで、目的のフラグメントは、本明細書中に記載されるアッセイにおいて免疫反応性を保持することが条件である。例えば、好ましい免疫原性フラグメントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：例えば、ＨＣＶコアポリタンパク質の１０〜４５、１０〜５３、６７〜８８および１２０〜１３０のアミノ酸を含むＨＣＶコアのフラグメント、エピトープ５−１−１（ウイルスゲノムのＮＳ４ａ／ＮＳ４ｂ領域内）、ならびに図１で示されるポリタンパク質の任意の領域（例えば、ＨＣＶポリタンパク質のＥ１領域、Ｅ２領域、ＮＳ３領域（例えばＮＳ３領域由来のｃ３３ｃポリペプチド）、ＮＳ４領域（例えばＮＳ３／ＮＳ４領域由来のｃ１００ポリペプチド）、ＮＳ３／４ａ領域およびＮＳ５領域であるが、これらに限定されない）に由来する規定のエピトープ、ならびにＨＣＶポリタンパク質から同定された任意の種々の他のエピトープ。例えば、Ｃｈｉｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら，Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら，国際出願公開第９３／００３６５号；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際出願公開第９４／０１７７８号；米国特許第６，１５０，０８７号および同第６，１２１，０２０号（これら全ては、本明細書中でその全体が参考として援用される）を参照されたい。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ」とは、少なくとも約３〜５個、好ましくは約５〜１０個または１５個、および約１，０００個以下（またはその間の任意の整数）のアミノ酸の配列であって、それ自体の配列またはより大きな配列の一部を定義し、このような配列に対する応答において産生される抗体に結合する配列をいう。フラグメントの長さの上限は存在せず、このフラグメントは、タンパク質配列のほぼ全長を含んでもよく、ＨＣＶポリタンパク質由来の２種以上のエピトープを含む融合タンパク質ですら含んでもよい。本発明で使用するためのエピトープは、由来する親タンパク質の一部の正確な配列を有するポリペプチドに限定されない。実際、ウイルスゲノムは、常に不安定な状態であり、単離物の間で比較的高い可変性を示す、いくつかの可変ドメインを含む。したがって、用語「エピトープ」は、天然の配列と同一の配列、ならびに欠失、付加、および置換（一般的に、本質的に保存的である）のような天然の配列に対する改変配列を包含する。
【００３７】
エピトープを含む所与のポリペプチドの領域は、当該分野で周知の任意の数のエピトープマッピング技術を使用して同定することができる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻（Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，編、１９９６）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙを参照のこと。例えば、一次エピトープは、例えば、固体支持体上で多数のペプチド（タンパク質分子の一部に対応するペプチド）を同時に合成し、そしてこれらのペプチドがなお支持体に結合している間に、これらのペプチドと抗体とを反応させることによって決定され得る。このような技術は当該分野で公知であり、そして例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎら、（１９８４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８−４００２；Ｇｅｙｓｅｎら、（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１７８−１８２；Ｇｅｙｓｅｎら、（１９８６）、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９−７１５（これら全ては、本明細書中でその全体が参考として援用される）に記載される。このような技術を使用して、多くのＨＣＶのエピトープが、同定されている。例えば、Ｃｈｉｅｎら、Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ（１９９４）ｐｐ．３２０−３２４、および以下をさらに参照されたい。同様に、高次構造エピトープは、例えば、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴によるようなアミノ酸の空間的高次構造の決定によって容易に同定される。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、前出を参照のこと。タンパク質の抗原性領域はまた、標準的な抗原性プロットおよびハイドロパシープロット（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐから利用可能なＯｍｉｇａバージョン１．０ソフトウェアプログラムを使用して計算したもの）を使用して同定され得る。このコンピュータプログラムは、抗原性プロフィールを決定するためにＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ法（Ｈｏｐｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８１）、７８：３８２４−３８２８）を使用し、そしてハイドロパシープロットを決定するためにＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ技術（Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８２）、１５７：１０５−１３２）を使用する。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、「高次構造エピトープ」とは、全長天然タンパク質内のエピトープをコードするアミノ酸配列に対して天然のままである構造的特徴を有する、全長タンパク質の一部分、またはこれらのアナログもしくはムテインをいう。天然の構造的特徴としては、グリコシル化および三次元構造が挙げられるが、これらに限定されない。エピトープ規定配列の長さは、３つのエピトープが抗原の三次元形状（例えば、折りたたみ）によって形成されると考えられるので、広範な変動に供され得る。従って、エピトープを規定するアミノ酸は、比較的少ない数であり得るが、分子の長さに沿って広範に散在し、折りたたみを介して正確なエピトープ高次構造となる。エピトープを規定する残基の間の抗原の部分は、エピトープの高次構造の構成に重要ではない場合がある。例えば、これらの介在性配列の欠失もしくは置換は、エピトープの高次構造に重要な配列（例えば、ジスルフィド結合に関与するシステイン、グリコシル化部位など）が維持されている場合、高次構造エピトープに影響を及ぼさない場合がある。
【００３９】
ＮＳ３／４ａ領域内に存在する高次構造エピトープは、上述の方法を使用して容易に同定される。さらに、所与のポリペプチドにおける高次構造エピトープの存在もしくは非存在は、抗体（この高次構造エピトープに対するポリクローナル血清もしくはモノクローナル抗体）による目的の抗原のスクリーニング、ならびにその反応性をこの抗原の変性型（存在する場合でも、一次エピトープしか有さない）に対する反応性と比較する工程を介して、容易に決定され得る。ポリクローナル抗体を使用するこのようなスクリーニングにおいて、ポリクローナル血清を最初に変性抗原で吸収させ、そして目的の抗原に対する抗体を有するか否かを調べることは、有利であり得る。
【００４０】
好ましくは、高次構造エピトープは、組換え的に産生され、そしてエピトープの所望の構造特徴を保存する条件下で（例えば、エピトープの変性を伴わずに）エピトープを抽出可能である細胞において発現される。そのような細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞が挙げられる。ＨＣＶポリタンパク質に由来する組換え高次構造エピトープの発現および単離は、例えば、国際出願公開第９６／０４３０１号、同第９４／０１７７８号、同第９５／３３０５３号、同第９２／０８７３４号（これらの出願は、本明細書中でその全体が参考として援用される）に記載される。あるいは、抗原を発現し、そしてこのタンパク質を回収後さらに復元することが可能である。また、化学的合成は、天然の抗原の高次構造エピトープと交差反応可能である高次構造抗原ミミトープ（ｍｉｍｉｔｏｐｅ）を提供し得ることもまた、理解される。
【００４１】
用語「多エピトープ融合抗原」もしくは「ＭＥＦＡ」は、本明細書中で使用される場合、多数のウイルス抗原が、天然で存在しない、１つの連続したアミノ酸の鎖として編成されているポリペプチドを意図する。本明細書中で使用される場合、ＭＥＦＡは、ＨＣＶ抗原に限定される。ＨＣＶ抗原は、ペプチド結合によって互いに直接接続してもよく、または介在するアミノ酸配列によって分離されてもよい。融合抗原はまた、ＨＣＶポリタンパク質に対して外因性である配列をも含み得る。さらに、存在するＨＣＶ配列は、多数のＨＣＶの遺伝子型および／または多数のＨＣＶの単離物に由来し得る。本発明のイムノアッセイにおける使用のための特定のＭＥＦＡの例は、例えば、国際出願公開第９７／４４４６９号、米国特許第６，５１４，７３１号、同第６，４２８，７９２号および同第６，６３２，６０１号（これらの全てはその全体が本明細書中で参考として援用される）において詳述されており、さらに以下で説明される。
【００４２】
「抗体」は、抗原に存在する目的のエピトープに特異的に結合する分子を意図する。「特異的に結合する」は、抗体が、エピトープを認識し、そして「鍵と鍵穴（ｌｏｃｋ  ａｎｄ  ｋｅｙ）」型の相互作用においてエピトープと相互作用し、抗原と抗体との間に複合体を形成することを意味する。これは、抗体と例えば試験基質との間に生じ得る非特異的結合とは対照的である。従って、例えば、ＨＣＶコア抗体は、ＨＣＶコアタンパク質に特異的に結合する分子である。用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、ポリクローナル調製物およびモノクローナル調製物の両方から得られる抗体、ならびに以下を包含する：ハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９；および米国特許第４，８１６，５６７号を参照）；Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ａｂ）フラグメント；Ｆｖ分子（非共有結合性ヘテロダイマー、例えば、Ｉｎｂａｒら（１９７２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６９：２６５９−２６６２；およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９：４０９１−４０９６を参照）；単鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照）；二量体抗体フラグメント構築物および三量体抗体フラグメント構築物；ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）（例えば、Ｐａｃｋら（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３１：１５７９−１５８４；Ｃｕｍｂｅｒら（１９９２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４９Ｂ：１２０−１２６を参照）；ヒト化抗体分子（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６；および英国特許出願公開第２，２７６，１６９号（１９９４年９月２１日公開）を参照）；ならびに、このような分子から得られた、親抗体分子の免疫学的結合特性を保持している任意の機能的フラグメント。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」は、均一な抗体集団を有する抗体組成物をいう。この用語は、抗体の種もしくは供給源に関して限定されず、作製された様式によっても限定されない。従って、この用語は、マウスハイブリドーマから得られた抗体、ならびにマウスハイブリドーマではなくヒトハイブリドーマを用いて得られたヒトモノクローナル抗体を、包含する。例えば、Ｃｏｔｅら，Ｍｏｎｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，１９８５，ｐ．７７を参照されたい。
【００４４】
ポリペプチドに関する場合、「単離された」により、指定の分子が、この分子が天然において見出される生物全体から分離されて独立しているか、または他の同種の生物学的高分子の実質的に非存在下で存在していることが、意味される。ポリヌクレオチドに関する用語「単離された」は、通常天然で伴っている配列全体または一部を有さない核酸分子であるか、または天然に存在する通りの配列であるがそれと結合する異種配列を有する配列であるか、あるいは染色体から分離された分子である。
【００４５】
「等価な抗原決定基」は、ＨＣＶの株１、株２、株３のような異なるＨＣＶの亜種または株に由来する抗原決定基を意味する。より具体的には、エピトープは、公知であり（例えば、ＨＣＶ−１ポリタンパク質配列に対して番号付けられたおよそ１６９４〜１７３５位に存在する「５−１−１」）、そしてこのようなエピトープは、株１と、株２と、株３との間で変動する。従って、３つの異なる株に由来するエピトープ５−１−１は、等価な抗原決定基であり、従って、その配列が同一でなくとも、「コピー」である。一般に、等価な抗原決定基のアミノ酸配列は、２つの配列が並列される場合、高度な（例えば、３０％より大きく、好ましくは４０％より大きい）配列相同性を有する。
【００４６】
「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド部分または２つのポリペプチド部分の間の類似性の％をいう。２つのＤＮＡ配列または２つのポリペプチド配列は、定義した分子の長さにわたって、これらの配列が少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０〜８５％、好ましくは少なくとも約９０％、および最も好ましくは少なくとも約９５％〜９８％の配列類似性を示す場合、互いに「実質的に相同」である。本明細書中で使用される場合、「実質的に相同」とはまた、特定のＤＮＡ配列またはポリペプチド配列に対する完全な同一性を示す配列をもいう。
【００４７】
一般的に、「同一性」とは、それぞれ、２つのポリヌクレオチド配列または２つのポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応をいう。％同一性は、配列を並列することによって２つの分子（参照配列と参照配列に対する％同一性が未知である配列と）の間の配列情報を直接比較する工程、並列された２つの配列間の正確な適合の数を計数する工程、参照配列の長さで除算する工程、およびこの結果に１００を掛ける工程によって決定され得る。
【００４８】
すぐに利用可能なコンピュータープログラム（例えば、ペプチド分析用のＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズム（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９，１９８１）に適合させたＡＬＩＧＮ（Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、第５補遺，３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ））が、相同性および同一性の分析を補助するために使用され得る。ヌクレオチド配列の相同性を決定するためのプログラムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから利用可能）で利用可能である（例えば、やはりＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムに依存するＢＥＳＴＦＩＴプログラム、ＦＡＳＴＡプログラム、およびＧＡＰプログラム）。これらのプログラムは、製造者によって推奨され、かつ上記で言及したＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅに記載される初期設定のパラメータを使用して容易に利用される。例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の％相同性は、初期設定のスコアリング表およびヌクレオチド上の６つの位置でのギャップペナルティを使用したＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを使用して決定され得る。
【００４９】
本発明に関連して％相同性を確立する別の方法は、エディンバラ大学が著作権を有し、Ｊｏｌｍ  Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ  Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、そしてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から販売されているＭＰＳＲＣＨプログラムパッケージを使用することである。このパッケージ一式から、スコアリング表のために初期設定のパラメータ（例えば、１２のギャップオープンペナルティ、１のギャップ伸長ペナルティ、および６のギャップ）を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが、使用され得る。作成されたデータからの「適合」値は、「配列相同性」を反映する。配列間の同一性または類似性の％を計算するための他の適切なプログラムは、一般的に、当該分野で公知であり、例えば、別のアラインメントプログラムは、初期設定のパラメータを使用したＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下の初期設定のパラメータを使用して使用され得る：遺伝コード＝標準；フィルタ＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝５０配列；分類＝ハイスコア；データベース＝非重複、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳物＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、すぐに利用できる。
【００５０】
あるいは、相同性は、相同領域間で安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、その後の一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化、および消化フラグメントのサイズ決定によって決定され得る。実質的に相同なＤＮＡ配列は、例えば、特定の系について規定したストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験で同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は、当業者の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、前出を参照のこと。
【００５１】
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配列の制御下においた場合に、インビトロまたはインビボで転写（ＤＮＡの場合）され、そしてポリペプチドに翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。転写終結配列は、コード配列に対して３’側に配置され得る。
【００５２】
「作動可能に連結された」とは、そのように記載される構成要素がその所望の機能を発揮するように構成されるエレメントの配置をいう。したがって、コード配列に作動可能に連結された所与のプロモーターは、適切な転写因子などが存在する場合に、コード配列の発現を達成し得る。プロモーターは、その発現を指向するように機能する限り、コード配列に隣接する必要はない。したがって、例えば、翻訳されないが転写される介在配列は、転写されたイントロンがそうであるように、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得るので、プロモーター配列は、なおコード配列に「作動可能に連結された」と見なされ得る。
【００５３】
核酸分子を記載するために本明細書中で使用される場合、「組換え体」は、ゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、ウイルス起源、半合成起源、または合成起源のポリヌクレオチドを意味し、このポリヌクレオチドは、その起源または操作ゆえに、天然において結合するポリヌクレオチドの全体または一部と結合しない。タンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、用語「組換え体」は、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されたポリペプチドを意味する。一般的に、目的の遺伝子は、クローニングされ、次いで、以下でさらに記載されるように、形質転換された生物中で発現される。宿主生物は、発現条件下で外来遺伝子を発現して、タンパク質を産生する。
【００５４】
「制御エレメント」とは、それが連結されるコード配列の発現を補助するポリヌクレオチド配列をいう。この用語は、プロモーター、転写終結配列、上流調節ドメイン、ポリアデニル化シグナル、非翻訳領域（５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲ、ならびに、適切な場合、リーダー配列およびエンハンサーが含まれる）を包含し、これらは、宿主細胞におけるコード配列の転写および翻訳を共同して提供する。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、「プロモーター」は、宿主細胞中でＲＮＡポリメラーゼに結合し、そしてそこに作動可能に連結された下流（３’方向）コード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。本発明の目的のために、プロモーター配列は、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで目的の遺伝子の転写を開始するために必要な、最小数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列内に、転写開始部位およびＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（共通配列）が存在する。真核生物プロモーターは、しばしば「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含むが、常にこれらを含むわけではない。
【００５６】
ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合し、そしてコード配列をｍＲＮＡに転写する場合、制御配列は、細胞中のコード配列の「転写を指示し」、その後、このｍＲＮＡは、コード配列によってコードされたポリペプチドに翻訳される。
【００５７】
「発現カセット」または「発現構築物」とは、目的の配列または遺伝子の発現を指向し得る集合をいう。発現カセットは、上に記載されるような制御エレメント（例えば、目的の配列または遺伝子に（これらの転写を指示するように）作動可能に連結されたプロモーター）を含み、多くの場合、またポリアデニル化配列をも含む。本発明の特定の実施形態では、本明細書中に記載される発現カセットは、プラスミド構築物内に含まれ得る。発現カセットの構成要素に加えて、プラスミド構築物はまた、１つ以上の選択可能マーカー、プラスミド構築物を一本鎖ＤＮＡとして存在させるシグナル（例えば、Ｍ１３複製起点）、少なくとも１つのマルチクローニングサイト、および「哺乳動物」の複製起点（例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルスの複製起点）を含み得る。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、「形質転換」とは、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの挿入をいい、挿入のために使用した方法（例えば、直接取り込み、トランスフェクション、および感染などによる形質転換）を問わない。特定のトランスフェクション法については、以下をさらに参照のこと。外因性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター（例えば、エピソーム）として維持され得るか、または宿主ゲノム内に組み込まれ得る。
【００５９】
「宿主細胞」は、外因性ＤＮＡ配列によって、形質転換されている細胞であるか、または形質転換可能な細胞である。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、「生物学的サンプル」は、被験体から単離された組織もしくは液体のサンプルをいい、通常、被験体によって産生された抗体を含む。このような抗体を含む代表的なサンプルは、当該分野で公知であり、血液、血漿、血清、糞便、尿、骨髄、胆汁、脊髄液、リンパ液、皮膚のサンプル、皮膚、気道、腸および生殖器官の分泌物、涙、唾液、乳汁、血球、器官、生検ならびにまたインビトロ細胞培養構成物（培養培地中の細胞および組織の増殖から得られた調製培地（例えば組換え細胞および細胞構成要素）が挙げられるが、これらに限定されない）のサンプルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
「共通の固体支持体」は、本発明のイムノアッセイにおいて使用されるＨＣＶポリペプチドが、共有結合的に結合するか、または非共有結合的手段（例えば、疎水性吸着）によって結合する、１つの固体マトリックスを意図する。
【００６２】
「免疫学的に反応性である」または「免疫反応性である」は、目的の抗原が、ＨＣＶ感染個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体に特異的に反応することを意味する。
【００６３】
「免疫原性」とは、目的の抗原が、個体に投与された場合に免疫応答を誘発することを意図する。
【００６４】
「免疫複合体」とは、抗体が抗原上のエピトープに結合する場合に形成される結合物を意図する。
【００６５】
本明細書中で使用される場合、用語「標識」および「検出可能な標識」とは、検出の可能な分子をいい、放射性同位体、蛍光剤（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）、化学発光剤（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、発色団、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、発色団、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）、もしくはハプテン）などが挙げられるが、これらに限定されない。用語「蛍光剤」とは、検出可能な範囲の蛍光を示すことの可能な基質もしくはその部分をいう。本発明の下で使用され得る標識の特定の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ）、テキサスレッド、ルミノール、ＮＡＤＰＨおよびα−β−ガラクトシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６６】
（ＩＩ．発明を実施する形態）
本発明を詳細に説明する前に、本発明は特定の処方物または処理パラメータに制限されず、当然に変更可能であることが理解されるべきである。本明細書中で使用される専門用語は、本発明の特定の実施形態を記載することのみを目的とし、本発明を制限することを意図しないことがまた、理解されるべきである。
【００６７】
本明細書中に記載のものに類似するか、またはそれらと等価な多数の組成物および方法が、本発明の実施に使用され得るが、好ましい材料および方法は、本明細書中に記載される。
【００６８】
上述のように、本発明は、（例えば、ＮＳ３プロテアーゼのタンパク分解活性が阻害されるような）改変ＮＳ３ドメインを有するＨＣＶポリペプチド変異体は、高次構造エピトープを保有し得、したがって、ＨＣＶ感染の存在を検出するためのイムノアッセイにおいて有用であることの知見に基づく。ＮＳ３変異体は、初期ＨＣＶ感染を正確に検出するための診断方法において特に有用である。この方法は、ＨＣＶセロコンバージョンの初期段階の間にＨＣＶ感染を検出するために使用され得、それによって、検出精度を上昇させ、そして間違った結果の発生率を低下させる。
【００６９】
特に、本明細書中で記載されるイムノアッセイは、タンパク分解活性を破壊するが高次構造エピトープを保持する変異を有する、ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａ領域に由来する高度に免疫活性であるエピトープを用いる。この改変ＮＳ３ポリペプチドは、イムノアッセイにおいて単独で使用されてもよく、または他のＨＣＶ抗原と組み合わせて使用されてもよい。この他のＨＣＶ抗原は、例えば、同じかもしくは異なるＨＣＶ遺伝子型および単離物のいずれかに由来する種々のＨＣＶポリペプチドを含む、多エピトープ融合抗原であり、これらのＨＣＶポリペプチドは、例えば、多数の免疫優性エピトープであり、例えば、ＨＣＶ  ｃｏｒｅ配列、Ｅｌ配列、Ｅ２配列、ＮＳ３配列、５−１−１配列、ｃ１００−３配列およびＮＳ５配列の主な一次エピトープである。この方法は、好都合にも、以下で記載されるいくつかのアッセイ形式のいずれかを用いる１回のアッセイにおいて実施され得、これらのアッセイ形式は、例えば、ＨＣＶ抗原が結合する固体支持体を用いるアッセイ形式であるが、これらに限定されない。
【００７０】
本発明のさらなる理解のために、改変ＮＳ３ポリペプチドおよびＨＣＶ融合体（すなわち、ＭＥＦＡ）、ならびにタンパク質の産生およびこのタンパク質を使用する方法に関してより詳細な議論が以下で提供される。
【００７１】
（ＨＣＶタンパク質）
ＨＣＶ株のゲノムは、約９，０００〜１２，０００ヌクレオチドの単一のオープンリーディングフレームを含み、これは、ポリタンパク質に転写される。図１および表１に示されるように、切断の際、ＨＣＶポリタンパク質は、ＮＨ２−Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４ａ−ＮＳ４ｂ−ＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ−ＣＯＯＨの順序で、少なくとも１０個の異なる生成物を生成する。ｃｏｒｅポリペプチドは、ＨＣＶ−１に対して番号付けされた１位〜１９１位に存在する（ＨＣＶ−１ゲノムについては、Ｃｈｏｏら、（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２４５１−２４５５を参照のこと）。このポリペプチドはさらにプロセシングされて、ほぼアミノ酸１〜１７３を含むＨＣＶポリペプチドを生じる。エンベロープポリペプチドであるＥ１およびＥ２は、それぞれ、ほぼ１９２位〜３８３位および３８４位〜７４６位に存在する。Ｐ７ドメインは、ほぼ７４７位〜８０９位に見出される。ＮＳ２は、タンパク分解活性を有する内在性膜タンパク質であり、そしてこのポリタンパク質のほぼ８１０位〜１０２６位に見出される。ＮＳ３（ほぼ１０２７位〜１６５７位に見出される）との組み合わせにおいて、ＮＳ２は、ＮＳ２−ＮＳ３シスル結合を切断し、次にＮＳ３のＮ末端を生成し、そしてセリンプロテアーゼおよびＲＮＡヘリカーゼ活性の両方を含む大きなポリタンパク質を放出する。ＮＳ３プロテアーゼ（ほぼ１０２７位〜１２０７位に見出される）が機能して、残りのポリタンパク質をプロセシングする。このヘリカーゼ活性は、ほぼ１１９３位〜１６５７位に見出される。ＮＳ３は、ＮＳ３補因子（ほぼ１６５８位〜１７１１位に見出されるＮＳ４ａ）、２つのタンパク質（ほぼ１７１２位〜１９７２位に見出されるＮＳ４ｂ、およびほぼ１９７３位〜２４２０位に見出されるＮＳ５ａ）、ならびにＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ほぼ２４２１位〜３０１１位に見出されるＮＳ５ｂ）を遊離させる。ポリタンパク質の成熟の完了は、ＮＳ３セリンプロテアーゼによって触媒される、ＮＳ３−ＮＳ４ａ連結における自己触媒的な切断によって開始される。
【００７２】
【表１】
2008511326.tif 000003
＊ＨＣＶ−１に対して番号付けされた。Ｃｈｏｏら、（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２４５１〜２４５５を参照のこと。
【００７３】
本発明の改変ＮＳ３ポリペプチドは、プロテアーゼ活性を阻害するように変異され、それによって、改変ＮＳ３ドメイン（例えば、ＮＳ３／４ａポリペプチド）を含むポリペプチドのさらなる切断、および改変ＮＳ３ポリペプチドと組み合わせて使用されるさらなるＨＣＶタンパク質の触媒性切断が、阻害される。ＭＳ３ポリペプチドは、ＮＳ３プロテアーゼドメインの全てもしくは一部分の欠失によって改変され得る。あるいは、タンパク分解活性は、プロテアーゼドメインの活性領域内のアミノ酸の置換によって阻害され得る。最後に、触媒部位が改変されるようなこのドメインの活性領域に対するアミノ酸の付加もまた、タンパク分解活性を阻害するために寄与する。好ましくは、プロテアーゼ活性を低下させるかもしくは消失させる改変は、天然のＮＳ３タンパク質もしくはＮＳ３／４ａタンパク質における高次構造エピトープを破壊しない。
【００７４】
上で説明されたように、プロテアーゼ活性は、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされた（Ｃｈｏｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：２４５１−２４５５を参照）アミノ酸のおよそ１０２７位〜１２０７位（図３の２位〜１８２位）において見出されるＮＳ３プロテアーゼおよび活性部位の構造は、公知である。例えば、Ｄｅ  Ｆｒａｎｃｅｓｃｏら，Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｔｈｅｒ．（１９９８）３：９９−１０９；Ｋｏｃｈら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１）４０：６３１−６４０を参照のこと。したがって、天然の配列に対する欠失もしくは改変は、代表的に、分子の活性部位もしくはその近位に存在する。特に、図３の１〜１８２もしくは２〜１８２、好ましくは１〜１７０もしくは２〜１７０、または１〜１５５もしくは２〜１５５において存在する１つ以上のアミノ酸を改変するか、またはこれに対して欠失を起こすことが望ましい。好ましい改変は、プロテアーゼの活性部位における触媒性三連構造（すなわち、Ｈ残基、Ｄ残基もしくはＳ残基）に対する、プロテアーゼ不活性化のための改変である。これらの残基は、それぞれ、全長ＨＣＶポリタンパク質に対して番号付けられた１０８３位、１１０５位および１１６５位（それぞれ図３の５８位、８０位および１４０位）に存在する。このような改変は、ＮＳ３プロテアーゼのタンパク分解性切断活性を抑制し、その一方で、免疫反応性を維持する。特に好ましい置換は、天然において非保存的な置換であり、例えば、通常プロテアーゼドメインの１０８３位、１１０５位および１１６５位において見出されるアミノ酸残基の１つ以上に対するＡｌａの置換である。当業者は、活性を破壊するために欠失させるためのＮＳ３プロテーゼの位置を、容易に決定し得る。
【００７５】
さらに、これらの部位における他の適切なアミノ酸改変は、例えば、Ｄｅ  Ｆｒａｎｃｅｓｃｏら，Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｔｈｅｒ．（１９９８）３（第３補遺）：９９−１０９：ならびにＳｃｈｅｃｈｔｅｒおよびＢｅｒｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９６７）２７：１５７−１６２に記載されるようなＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの公知の構造および機能に基づき、当業者によって容易に決定され得る。特に、ＮＳ３プロテアーゼはセリンプロテアーゼであり、そしてタンパク分解メカニズムは、セリンによる標的したペプチド結合の求核攻撃に基づく。多くの場合、基の求核特性は、アスパラギン酸によって「タンパク質アクセプター状態」に拘束されたヒスチジンの存在によって改善される。セリン、ヒスチジンおよびアスパラギン酸の並列した側鎖は、ほとんどのセリンプロテアーゼに共通する触媒性三連構造を構築する。セリンプロテアーゼの活性部位は、ポリペプチド基質が結合する間隙として形成される。ＳｃｈｅｃｈｔｅｒおよびＢｅｒｇｅｒ（ＳｃｈｅｃｈｔｅｒおよびＢｅｒｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９６７）２７：１５７−１６２）は、ポリペプチド基質（Ｐｉ、・・・、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’・・・、Ｐｊ）およびその対応する結合基質（Ｓｉ、・・・、Ｓ３、Ｓ２、Ｓ１、Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’・・・、Ｓｊ）のＮ末端からＣ末端までのアミノ酸残基を標識し、そしてこの切断は、Ｐ１とＰ１’との間で触媒されることを見出した。ＮＳ３キモトリプシン様折りたたみを採用し、そして非常に長い、溶媒に曝露された基質結合部位を含み、このことは、非常に長いペプチド基質（Ｐ６−Ｐ４’）を要求することと一貫する。ＮＳ３プロテアーゼは、基質のＰ１位におけるシステイン残基を優先する傾向を有する。したがって、上および当該分野で記載されるような公知の構造および機能に基づき、当業者は、ＮＳ３プロテアーゼのタンパク分解活性を破壊するために寄与する他のアミノ酸置換、付加および欠失を容易に決定し得る。
【００７６】
ＮＳ３タンパク分解活性の存在もしくは非存在は、当業者に公知の方法を用いて容易に決定され得る。例えば、プロテアーゼ活性もしくはその欠損は、以下の実施例に記載される手順を用いて、ならびに当該分野で周知のアッセイを用いて、決定され得る。例えば、Ｔａｋｅｓｈｉｔａら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）２４７：２４２−２４６；Ｋａｋｉｕｃｈｉら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）１２２：７４９−７５５；Ｓａｌｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９８）３７：３３９２−３４０１；Ｃｈｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．（１９９８）７２：１０９−１１５；Ｃｅｒｒｅｔａｎｉら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９）２６６：１９２−１９７；Ｚｈａｎｇら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９）２７０：２６８−２７５；Ｋａｋｉｕｃｈｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．（１９９９）８０：７７−８４；Ｆｏｗｌｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．（２０００）５：１５３−１５８；およびＫｉｍら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０００）２８４：４２−４８を参照されたい。
【００７７】
また、さらなる変異が、ＮＳ３分子内に存在してもよいが、存在する必要はない。これらの変異は、例えば、ヘリカーゼドメインにおける変異（例えば、１４２８位および１４２９位において見出されるアミノ酸残基のうちの１つもしくは両方の置換、例えば、通常１４２８位に存在するＴｈｒからＰｒｏへの置換、および通常１４２９位に存在するＳｅｒからＩｌｅへの置換）である。これらの変異は、本明細書中で「ＰＩ」変異体と呼ばれる。図４Ｂは、代表的な改変ＮＳ３構築物を示す。このタンパク質は、Ｎ末端ＭｅｔおよびＮＳ３のアミノ酸１０２７〜１６５７を含み、したがって、ＨＣＶポリタンパク質の全長ＮＳ３ドメインを含む。通常１１６５位に存在するＳｅｒは、Ａｌａと置換される。さらに、この変異体は、上述のＰＩ置換を含む。この構築物のＤＮＡおよびアミノ酸配列は、図６Ａ〜図６Ｃに示される。
【００７８】
本発明の改変ＮＳ３ポリペプチドはまた、改変ＮＳ３プロテアーゼドメインに加えて、ＮＳ３ヘリカーゼドメイン（すなわち、ＮＳ３ポリペプチド全体および／またはＨＣＶポリタンパク質の１つ以上の他の領域からの１つ以上のポリペプチド）をも含み得る。好ましくは、改変ＮＳ３ポリペプチドは、ＮＳ４ａポリペプチドもしくはそのフラグメントを含む。実際、ＨＣＶポリタンパク質の領域の全ては、このような融合体中に存在し得る。これらのポリペプチドは、ＮＳ３ポリペプチドと同一のＨＣＶ単離物に由来し得るか、または異なる株に由来し得、そして単離物は、種々のＨＣＶ遺伝子型のいずれかを有し、広範な範囲のＨＣＶ遺伝子型に対して増大した保護を提供する単離物を含む。さらに、ポリペプチドは、免疫診断が使用される特異的な遺伝子型領域において固有である、特定のウイルスクレードに基づいて選択される。この改変ＨＣＶタンパク質が、広範な種々の状況において、ＨＣＶ感染を診断する有効な手段を提供することは、容易に理解される。
【００７９】
多くのＨＣＶ株および単離物の核酸配列ならびにアミノ酸配列は、ＨＣＶポリタンパク質の種々の領域の核酸配列およびアミノ酸配列（決定されているＣｏｒｅ、ＮＳ２、ｐ７、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、ＮＳ５ｂの遺伝子およびポリペプチドが挙げられる）を含む。例えば、単離物ＨＣＶ  Ｊ１．１は、Ｋｕｂｏら（１９８９）Ｊａｐａｎ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：１０３６７−１０３７２；Ｔａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｇｅｎｅ  ９１：２８７−２９１；Ｔａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３０２７−３０３３；およびＴａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：４６２６において記載される。２つの別個の単離物であるＨＣＶ−ＪおよびＢＫの完全なコード配列は、Ｋａｔｏら，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：９５２４−９５２８およびＴａｋａｍｉｚａｗａら，（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１１０５−１１１３にそれぞれ記載される。
【００８０】
ＨＣＶ−１単離物を記載する刊行物としては、Ｃｈｏｏら（１９９０）Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．４６：４２３−４４１；Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２４５１−２４５５およびＨａｎら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１７１１−１７１５が挙げられる。ＨＣＶ単離物であるＨＣ−Ｊ１およびＨＣ−Ｊ４は、Ｏｋａｍｏｔｏら（１９９１）Ｊａｐａｎ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６０：１６７−１７７において記載される。ＨＣＶ単離物であるＨＣＴ  １８〜、ＨＣＴ  ２３、Ｔｈ、ＨＣＴ  ２７、ＥＣ１およびＥＣ１０は、Ｗｅｉｎｅｒら（１９９１）Ｖｉｒｏｌ．１８０：８４２−８４８において記載される。ＨＣＶ単離物Ｐｔ−１、ＨＣＶ−Ｋ１およびＨＣＶ−Ｋ２は、Ｅｎｏｍｏｔｏら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ  １７０：１０２１−１０２５において記載される。ＨＣＶ単離物Ａ、Ｃ、ＤおよびＥは、Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａら（１９９１）Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ５：２４３−２５４において記載される。
【００８１】
融合タンパク質の各成分は、同じＨＣＶ株もしくは単離物から得られても、異なるＨＣＶ株もしくは単離物から得られてもよい。例えば、改変ＮＳ３ポリペプチドは、ＨＣＶの第１の株に由来し得、そして存在する他のＨＣＶポリペプチドは、ＨＣＶの第２の株に由来し得る。あるいは、他のＨＣＶポリペプチドの１種以上（例えば、ＮＳ２、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、Ｃｏｒｅ、ｐ７、Ｅ１および／またはＥ２）が存在する場合、これはＨＣＶの第１の株に由来し得、そして残りのＨＣＶポリペプチドは、ＨＣＶの第２の株に由来し得る。さらに、存在するＨＣＶポリペプチドの各々が、異なるＨＣＶ株に由来し得る。
【００８２】
特定の実施形態において、改変ＮＳ３タンパク質はまた、ＮＳ４ａドメインもしくはその一部分（例えば、ＮＳ４ａおよび／またはＮＳ４ｂドメイン）またはそのフラグメントを含む。改変ＮＳ３タンパク質（ＮＳ４ａドメインを含むかもしくは含まない）はまた、他のＨＣＶ領域（例えば、ＮＳ５ａドメイン、ＨＣＶのコアポリペプチドなど）と融合され得る。これらの領域は、これらが天然のＨＣＶポリタンパク質中で天然に存在する順番である必要はない。したがって、例えば、存在する場合、ＮＳ４ａポリペプチドは、ＮＳ３ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に融合させられ得る。
【００８３】
図４Ａおよび図４Ｃは、代表的な改変ＮＳ３ポリペプチドを示す。この図において、通常１１６５位に存在するＳｅｒは、Ａｌａと置換される。さらに、この変異体は、上記のＰＩ置換（すなわち、通常１４２８位に存在するＴｈｒからＰｒｏへの置換、および通常１４２９位に存在するＳｅｒのＩｌｅへの置換）を含む。図４Ａにおいて、このタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の方向で、Ｎ末端ＭｅｔおよびＮＳ３のアミノ酸１０２７〜１６５７およびＮＳ４ａのアミノ酸１６５８〜１７１１を含む。この融合体は、したがって、ＨＣＶポリタンパク質の全長ＮＳ３ドメインおよびＮＳ４ａドメインを含む。このタンパク質のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列は、図５Ａ〜図５Ｃに示される。図４Ｃにおいて、このタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端への方向で、Ｎ末端ＭｅｔおよびＮＳ４ａのアミノ酸１６７８〜１６９０、その後のアミノ酸配列ＳＧＳ、次いで、ＮＳ３のアミノ酸１０２９〜１６５７を含む。したがって、この融合体は、ＮＳ４ａドメインの１３個のアミノ酸、その後の三ペプチド可撓性（ｆｌｅｘｉｂｌｅ）リンカー配列（「ｔｕｒｎ」配列と呼ばれる）、次いでＮＳ３ドメインのほぼ全体（Ｎ末端の最初の２つのアミノ酸を除く）を含む。このｔｕｒｎ配列は、ＮＳ４ａがプロテアーゼのポケットに折りたたまれることを可能にする。このタンパク質のこのヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列は、図７Ａ〜７Ｃに示される。本明細書中の番号付けは、ＨＣＶ血清型が容易に決定できるように、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質および等価な領域を参照している。
【００８４】
上で記載される改変ＮＳ３ポリペプチドは、多エピトープ融合抗原（「ＭＥＦＡ」と呼ばれる；国際公開第９７／４４４６９号ならびに米国特許第６，５１４，７３１号および同第６，４２８，７９２号において記載され、これらの開示は本明細書中でその全体が参考として援用される）と共にイムノアッセイにおいて使用され得る。このようなＭＥＦＡは、図１および表１に示し、上で詳細に記載したようなＨＣＶポリタンパク質の２つ以上の種々のウイルス領域に由来する多数のエピトープを含む。このような改変ＮＳ３ポリペプチドのＭＥＦＡと一緒の使用は、ＭＥＦＡのＮＳ３タンパク分解性切断は起こらず、したがって、ＨＣＶイムノアッセイにおける使用のためによりよい試薬を提供する。
【００８５】
多数のＨＣＶ抗原は、天然に存在しない、１つの連続する鎖のアミノ酸として並列される。したがって、エピトープの線形順序は、これらが存在するゲノムにおける線形順序とは異なる。本明細書中の使用のためのＭＥＦＡの配列の線形順序は、好ましくは、最適な抗原性で並列される。好ましくは、このエピトープは、１種より多いＨＣＶ株に由来し、それによって、１回のアッセイにおいてＨＣＶの多数の株を検出するさらなる能力を提供する。したがって、本明細書中の使用のためのＭＥＦＡは、上記のポリタンパク質に由来する種々の免疫原性領域を含み得る。しかし、このポリタンパク質のコア領域におけるフレームシフトから生じるタンパク質（例えば、国際公開第９９／６３９４１号において記載される）は、ＭＥＦＡもしくは上記の改変ＮＳ３を有する融合体において使用され得る。所望される場合、ＨＣＶポリタンパク質に由来する１種以上のエピトープの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０またはそれ以上が、この融合タンパク質中に存在し得る。
【００８６】
ＭＥＦＡにおける使用のためのさらなるＨＣＶエピトープとしては、Ｅ２の超過片領域に由来するエピトープ（例えば、アミノ酸３８４〜４１４もしくは３９０〜４１０におよぶ領域）、またはＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ（配列番号１１）の領域からの共通配列（ＨＣＶ１型へ飲むのアミノ酸３９０〜４１０についての共通配列を表す）が挙げられる。本発明のＭＥＦＡ中に存在する代表的なＥ２エピトープは、アミノ酸３８４〜４１４におよぶハイブリッドエピトープを含み得る。このようなハイブリッドＥ２エピトープは、第２の株からの共通配列に融合するアミノ酸３９０〜４１０を表す共通配列を含み得る。あるいは、存在するＥ２エピトープは、アミノ酸３９０〜４４４におよぶハイブリッドエピトープを含み得る。このようなハイブリッドＥ２エピトープは、上で詳述するようなアミノ酸３９０〜４１０を表す共通配列を含み得、これは、例えば、ＨＣＶ  Ｅ２のアミノ酸４１１〜４４４の天然のアミノ酸配列に融合する。
【００８７】
さらに、この抗原は、種々のＨＣＶ株に由来し得る。ＨＣＶの多数のウイルス株が公知であり、そしてこれらの株のいずれかに由来するエピトープは、融合タンパク質において使用され得る。有機体の任意の所定の種は、個々の個体間で互いに異なっており、さらに所定の有機体（例えばウイルス）は、多くの異なる株を有し得ることが、周知である。例えば、上で説明したように、ＨＣＶは、少なくとも６種の遺伝子型を含む。これらの遺伝子型の各々は、等価な抗原性決定基を含む。より具体的には、各株は、ウイルスの全ての株において存在するが、ウイルス株間で互いにわずかに異なっている、多くの抗原性決定基を含む。例えば、ＨＣＶは、５−１−１として公知である抗原性決定基を含む（図１参照）。この５−１−１エピトープは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク配列に対して番号付けられた、およそ１６９４位〜１７３５位で見出される。この特定の抗原性決定基は、ＨＣＶ−１、ＨＣＶ−２およびＨＣＶ−３において３つの異なる形態で現れる。したがって、本発明の好ましい実施形態において、５−１−１のこれらの形態の３つ全ては、本発明のイムノアッセイにおいて使用される多エピトープ融合抗原上に現れる。同様に、異なるＨＣＶ株のコア領域からの等価な抗原決定基もまた、存在し得る。一般に、等価な抗原決定基は、アミノ酸配列に関して高度な相同性を有し、この相同性の程度は、並列させた場合、一般に、３０％以上であり、好ましくは４０％以上である。また、本発明の多数のコピーのエピトープは、同じエピトープの正確なコピーである多数のコピーをも含み得る。
【００８８】
図８および図１１Ａ〜図１１Ｃは、ＨＣＶに由来する、本発明における使用のための代表的なＭＥＦＡを示す。しかし、ＨＣＶゲノムに由来する他のエピトープもまた、本発明のアッセイにおいて用途を見出すことが理解される。
【００８９】
代表的な多エピトープ融合抗原であるＭＥＦＡ  ７．１のＤＮＡ配列および対応するアミノ酸配列は、図９Ａ〜図９Ｆに示される。このＭＥＦＡはまた、米国特許第６，６３２，６０１号においても記載され、本明細書中で参考としてその全体が援用される。ＭＥＦＡ  ７．１についての一般構造式は、図８において示され、そして、以下の通りである：ｈＳＯＤ−Ｅ１（１型）−Ｅ２ＨＶＲ共通（１ａ型）−Ｅ２ＨＶＲ共通（１型および２型）−ヘリカーゼ（１型）−５−１−１（１型）−５−１−１（３型）−５−１−１（２型）−ｃ１００（１型）−ＮＳ５（１型）−ＮＳ５（１型）−ｃｏｒｅ（１＋２型）−ｃｏｒｅ（１＋２型）。この多数のコピーのエピトープは、ＨＣＶ−１に対して番号付けされた（以下に示すアミノ酸の番号付けは、Ｃｈｏｏ，ら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２４５１−２４５５において提供される指定番号付け（ここで、アミノ酸番号１は、ｃｏｒｅ領域のコード配列によってコードされる第１メチオニンである）にしたがう）、以下のアミノ酸配列を含む：スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ、このタンパク質の組換え体発現を増大するために使用される）のアミノ酸１〜１５６；Ｅ１領域からのポリタンパク質のアミノ酸３０３〜３２０；このポリタンパク質のアミノ酸３９０〜４１０（ＨＣＶ−１ａ  Ｅ２の超可変領域の共通配列を表す）；Ｅ２領域からのポリタンパク質のアミノ酸３８４〜４１４（ＨＣＶ−１およびＨＣＶ−２のＥ２超可変領域の共通配列を表す）；ＨＣＶ−１ポリタンパク質のアミノ酸１１９３〜１６５８（ヘリカーゼを規定する）；５−１−１アミノ酸１６８９〜１７３５由来のエピトープの３つのコピー（２つはＨＣＶ−１由来、１つはＨＣＶ−３由来そして１つはＨＣＶ−２由来、これらのコピーはＨＣＶの３つの異なる株に由来する等価な抗原決定基である）；ＨＣＶ−１のＨＣＶポリペプチドＣ１００、ポリタンパク質のアミノ酸１９０１〜１９３６；ＨＣＶ−１のＮＳ５領域由来のエピトープの２つの正確なコピー（各々、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２２７８〜２３１３を有する）；ならびにコア領域由来のエピトープの２つのコピー（１つはＨＣＶ−１由来でありそして１つはＨＣＶ−２由来であって、これらのコピーは、ＨＣＶ−１の９〜３２、３９〜４２および６４〜８８およびＨＣＶ−２の６７〜８４のアミノ酸によって表される等価な公言決定基である）。
【００９０】
表２は、本明細書中で図９Ａ〜９Ｆに関連する種々のエピトープのアミノ酸位置を示す。
【００９１】
【表２】
2008511326.tif 000004
本発明の１つの実施形態（図２に示す）において、急速培養リガンドイムノアッセイ（ｒａｐｉｄ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が、改変ＮＳ３ポリペプチド、もしくは改変ＮＳ３ポリペプチドを含む融合体、および１つ以上の多エピトープ融合抗原（例えばＭＥＦＡ  ７．１）を用いて実施される。サンプルは、抗原と混合され、以下でさらに記載されるように、この抗原は、固体支持体上に存在してもよい。サンプルがＨＣＶに感染している場合、固体支持体上に存在するこれらのエピトープに対するＨＣＶ抗体は、固体支持体成分に結合する。検出は、検出可能マーカー（例えば、図２で示すように西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））の抗原／抗体複合体への結合による。結合は、共有結合性手段によってもよく、もしくは次の検出可能標識化抗体（例えば、標準的サンドイッチアッセイ）の結合によってもよく、または酵素反応（この反応の産物が検出可能である）によってもよい。この検出可能マーカーとしては、発色団、抗体、抗原、酵素、酵素反応性化合物（その切断産物が検出可能である）、ローダミンもしくはローダミン誘導体、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）、蛍光化合物、化学発光化合物（例えば、ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ））、これらのマーカーの誘導体および／または組み合わせが挙げられ得るが、これらに限定されない。存在するヒトＩｇＧ分子を検出可能である、検出可能標識化抗ヒト抗体が、都合よく使用され得る。
【００９２】
（ＨＣＶ抗原の産生）
上で説明したように、本発明の分子は、一般に、組換え的に産生される。したがって、本発明による使用のためのＨＣＶ抗原をコードするポリヌクレオチドは、分子生物学の標準的技術を使用して作製され得る。例えば、上記の分子をコードするポリヌクレオチド配列は、組換え的方法を用いて（例えば、この遺伝子を発現する細胞由来のｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーのスクリーニングによって、またはこの遺伝子を含むことが公知であるベクターからこの遺伝子を誘導することによって）得られ得る。さらに、所望される遺伝子は、当該分野で記載される技術（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら，米国特許第５，３５０，６７１号）を用いて、ウイルス核酸分子から直接単離され得る。目的の遺伝子はまた、クローニングされるのではなく合成的に産生され得る。この分子は、特定の配列についての適切なコドンによって設計され得る。次いで、完全な配列は、標準的方法によって調製される重複するオリゴヌクレオチドから集められ、そして完全なコード配列に集合される。例えば、Ｅｄｇｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９；およびＪａｙら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１を参照のこと。
【００９３】
したがって、特定のヌクレオチド配列は、所望の配列を有するベクターから得られてもよく、または適切な場合、完全に合成されてもよく、もしくは部分的に当該分野で公知の種々のオリゴヌクレオチド合成技術（例えば、部位特異的変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術）を用いて合成されてもよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，前出を参照。特に、所望の配列をコードするヌクレオチド配列を得るひとつの方法は、従来的な自動化ポリヌクレオチド合成機において産生された重複する合成オリゴヌクレオチドの相補的な組をアニーリングする工程、その後、適切なＤＮＡリガーゼによるライゲーション、およびＰＣＲを介するリガンドヌクレオチド配列の増幅を行うことによる方法である。例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４０８４−４０８８を参照。さらに、オリゴヌクレオチド指向型合成（Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ５４：７５−８２）、既に存在しているヌクレオチド領域のオリゴヌクレオチド指向型突然変異誘発（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６）、ならびにＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いるギャップのあるポリヌクレオチドの酵素的埋め合わせ（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）（Ｑｕｅｅｎら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３）は、改変されたかもしくは増強された抗原結合能力および／または低下された免疫原性を有する分子を提供するために、本発明の下で使用され得る。
【００９４】
所望のヌクレオチド配列（たとえばＮＳ３もしくは他のＨＣＶ抗原）の変異体もしくはアナログを産生するための方法が、周知である。例えば、Ｄａｓｍａｈａｐａｔｒａら，米国特許第５，８４３，７５２号およびＺｈａｎｇら，米国特許第５，９９０，２７６号を参照のこと。イムノアッセイにおける使用のためのＮＳ３もしくは他のＨＣＶ抗原の変異体もしくはアナログは、目的のポリペプチドをコードする配列の一部分の欠失、配列の挿入および／または配列内の１つ以上のヌクレオチドの置換によって調製され得る。ヌクレオチド配列を改変するための技術（例えば、部位特異的変異誘発など）は、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：４４８；Ｇｅｉｓｓｅｌｓｏｄｅｒら（１９８７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ５：７８６；ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８；Ｄａｌｂｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ  ７９：６４０９を参照のこと。
【００９５】
一旦、コード配列が調製されるかもしくは単離されると、このような配列は、任意の適切なベクターもしくはレプリコン内にクローニングされ得る。多くのクローニングベクターが、当業者に公知であり、そして適切なクローニングベクターの選択は、選択できる問題である。適切なベクターとしては、適切なコントロールエレメントと結合した場合に複製可能である、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、もしくはウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。
【００９６】
次いで、コード配列は、発現のために使用される系に依存して、適切な制御エレメントの制御下に置かれる。したがって、コード配列は、プロモーター、リボソーム結合部位（細菌発現のため）、および、必要に応じて、オペレーター、の制御下に置かれ得、それによって目的のＤＮＡ配列は、適切な形質転換体によってＲＮＡへ転写される。コード配列は、宿主の翻訳後プロセシングによって後に除去され得るシグナルペプチドもしくはリーダー配列を含んでも、含まなくてもよい。例えば、米国特許第４，４３１，７３９号；同第４，４２５，４３７号；同第４，３３８，３９７号を参照。
【００９７】
制御配列に加えて、宿主細胞の成長に関連して配列の発現を調節可能である調節配列を付加することが所望され得る。調節配列は、当業者に公知であり、そして例としては、化学的刺激もしくは物理的刺激（調節性化合物の存在を含む）に応答して遺伝子発現のオンオフを引き起こすものが挙げられる。他の型の調節エレメントもまた、ベクター中に存在し得る。例えば、エンハンサーエレメントは、本明細書中で、構築物の発現レベルを上昇させるために使用され得る。例としては、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー（Ｄｉｊｋｅｍａら（１９８５）ＥＭＢＯＪ．４：７６１）、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）エンハンサー／プロモーター（Ｇｏｒｍａｎら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ  １９：６１１１）およびヒトＣＭＶに由来するエレメント（Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４１：５２１）（例えば、ＣＭＶイントロンＡ配列に含まれるエレメント（米国特許第５，６８８，６８８号））が挙げられる。発現カセットは、さらに、適切な宿主細胞における自己複製のための複製起点、１つ以上の選択可能マーカー、１つ以上の制限部位、大きなコピー数のための能力および強力なプロモーターを含み得る。
【００９８】
発現ベクターは、特定のコード配列が適切な調節配列と共に配置されるように構築され、制御配列に対するコード配列の位置および方向は、コード配列が制御配列の「制御」下で転写されるような位置および方向である（すなわち、制御配列においてＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼが、コード配列を転写する）。目的の分子をコードする配列の改変は、この目的を達成することが所望され得る。例えば、いくつかの場合、配列を改変し、それによってこの配列が適切な方向で制御配列に結合し得る（すなわち、リーディングフレームを維持する）ようにする必要がある場合がある。制御配列および他の調節配列は、ベクターへの挿入前に、コード配列とライゲーションされ得る。あるいは、コード配列は、既に制御配列および適切な制限部位を含む発現ベクター内に直接クローニングされてもよい。
【００９９】
この分子は、広範な種々の系において発現され得、この系としては、昆虫発現系、哺乳動物発現系、細菌発現系、ウイルス発現系および酵母発現系が挙げられ、これらは全て、当該分野で周知である。例えば、昆虫細胞発現系（例えば、バキュロウイルス系）は、当業者に公知であり、そして例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ第１５５５号（１９８７）において記載される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系についての材料および方法は、キット形態で、特にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡから（「ＭａｘＢａｃ」キット）市販されている。同様に、細菌細胞発現系および哺乳動物発現系は、当該分野で周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出に記載されている。酵母発現系もまた、当該分野で公知であり、例えば、Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂａｒｒら，編，１９８９）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｌｏｎｄｏｎに記載されている。
【０１００】
上記の系と共に使用するための多くの適切な宿主細胞もまた、公知である。例えば、哺乳動物細胞株は、当該分野で公知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能である不死化細胞株を含む。これらの不死化細胞株は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、新生仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト胎性腎細胞、ヒト肝細胞癌腫細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓（「ＭＤＢＫ」）細胞、などであるが、これらに限定されない。同様に、細菌宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．は、本発明の発現構築物と共の用途を見出す。本発明における酵母宿主としては、特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。バキュロウイルス発現ベクターと共に使用するための昆虫細胞としては、特に、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉが挙げられる。
【０１０１】
目的のヌクレオチド配列を含む核酸分子は、当該分野で周知の種々の遺伝子送達技術を用いて、宿主細胞ゲノム内に安定的に組み込まれてもよく、または適切な宿主細胞において安定なエピソームエレメント上で維持されてもよい。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと。
【０１０２】
選択された発現系および宿主に依存して、分子は、上述の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞によって、タンパク質が発現される条件下で産生される。発現されたタンパク質は、次いで、宿主細胞から単離され、そして精製される。発現系が増殖培地中にタンパク質を分泌する場合、産物は、培地から直接精製され得る。分泌されない場合、このタンパク質は、細胞溶解物から単離され得る。適切な増殖条件および回収方法の選択は、当業者の範囲内である。
【０１０３】
種々のＨＣＶ抗原（上述の種々の融合体において使用される抗原を含む）の組換え体産生は、記載されている。例えば、国際公開第９４／０１７７８号、同第９３／００３６５号、同第０４／００５４７号および同第０１／３８３６０号；米国特許第５，３５０，６７１号、同第５，６８３，８６４号、同第６，３４６，３７５号、同第６，１５０，０８７号、同第６，５１４，７３１号、同第６，４２８，７９２号および同第６，６３２，６０１号；Ｃｈｉｅｎら，Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際公開第９４／０１７７８号；Ｃｈｉｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５を参照されたい。これらの全ての開示は、本明細書中でその全体が参考として援用される。改変ＮＳ３ポリペプチドを産生する好ましい方法は、実施例１において記載される。
【０１０４】
（免疫診断アッセイ）
一旦産生されると、ＨＣＶ抗原は、抗体を検出するために既知の抗原を使用する実質的に任意のアッセイ形式において使用され得る。これらの全てのアッセイに共通する特徴は、抗原が、ＨＣＶ抗体を含むことが疑われる身体の成分と、この抗原がこの成分中に存在する任意のこのような抗体に結合することを可能にする条件下で、接触させられることである。このような条件は、代表的に、生理学的な温度、ｐＨおよびイオン強度であり、過剰な抗原を用いる。この抗原と標本とのインキュベーションの次に、抗原からなる免疫複合体の検出が行われる。
【０１０５】
イムノアッセイの設計は、大きく変動し得、そして多くの形式が、当該分野で公知である。例えば、プロトコールは、固体支持体を使用してもよく、または免疫沈降を使用してもよい。ほとんどのアッセイは、標識化抗体もしくは標識化ポリペプチドの使用を包含する；例えば、標識は、上で詳しく考察した通り、酵素分子、蛍光分子、化学発光分子、放射活性分子もしくは色素分子であり得る。免疫複合体からのシグナルを増幅するアッセイもまた、公知である。これらの例は、ビオチンおよびアビジンを使用するアッセイ、ならびに酵素標識化イムノアッセイおよび酵素媒介型イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ）である。
【０１０６】
このイムノアッセイは、限定されないが、異種形式でも同種形式でもよく、そして標準型でも競合型でもよい。異種形式において、ポリペプチドは、代表的に、固体マトリックスもしくは固体支持体に結合し、インキュベーション後に、このポリペプチドからサンプルを分離することを容易にする。本発明の目的のために、固体支持体は、可溶性マトリックスである任意の材料であり得、そして剛性もしくは半剛性の表面を有し得る。例示的な固体支持体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ニトロセルロースのような基質（例えば、膜もしくはマイクロタイターウェル形態）；塩化ポリビニル（例えば、シートもしくはマイクロタイターウェル）；ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズもしくはマイクロタイターウェル）；フッ化ポリビニリジン；ジアゾ化紙；ナイロン膜；活性型ビーズ、磁気応答ビーズなど。特定の支持体としては、プレート、ペレット、ディスク、キャピラリー、中空ファイバー、針、ピン、固体ファイバー、セルロースビーズ、穴あきガラス（ｐｏｒｅ−ｇｌａｓｓ）ビーズ、シリカゲル、必要に応じてジビニルベンゼンに架橋したポリスチレンビーズ、グラフト共重合ビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、ラテックスビーズ、必要に応じてＮ−Ｎ’−ビス−アクリロイルエチレンジアミンに架橋したジメチルアクリルアミドビーズ、および疎水性ポリマーでコーティングしたガラス粒子が挙げられる。
【０１０７】
所望される場合、固体支持体に添加されるべき分子は、スチレン部分もしくはアクリレート部分を作製するように容易に官能性付与され得、どれによって、この分子のポリスチレン、ポリアクリレートもしくは他のポリマー（例えば、ポリイミド、ポリアクリルアミド、ポリエチレン、ポリビニル、ポリジアセチレン、ポリフェニレン−ビニレン、ポリペプチド、多糖類、ポリスルホン、ポリピロール、ポリイミダゾール、ポリチオフェン、ポリエーテル、エポキシ、石英ガラス、シリカゲル、シロキサン、ポリリン酸塩、ヒドロゲル、アガロース、セルロースなどへの組み込みを可能にする。
【０１０８】
１種より多くのＨＣＶ抗原（例えば、改変ＮＳ３ポリペプチドおよびＭＥＦＡもしくは別のＨＣＶ抗原）がアッセイにおいて使用される場合、これらの抗原は、同じ固体支持体上もしくはこのアッセイにおいて合わせられ得る異なる固体支持体上で提供され得る。したがって、例えば、これらの抗原は、別個の実態として、例えば、１枚のプレート上に存在してもよく、または、例えば、目的のアッセイにおける使用のために混合される個々の微小ビーズ上に存在してもよい。
【０１０９】
１つの状況において、図２で示すように、固体支持体は、最初に、改変ＮＳ３ポリペプチド（例えば、ＮＳ３ａＰＩ．１１６５，  ＮＳ３ＰＩ．１１６５もしくはｄ．４ａ．ｔ．ＮＳ３ＰＩ．１１６５）およびＭＥＦＡ（例えばＭＥＦＡ７．１）のようなＨＣＶ抗原（本明細書中で、集合的に「固相成分」と呼ぶ）と、この分子が十分に固体支持体に固定化されるような適切な結合条件下で反応させられる。時々、支持体への固定化は、抗原のより良い固相結合特性を有するタンパク質への最初のカップリングによって増強され得る。適切なカップリングタンパク質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、および当業者に公知の他のアルブミン。分子を支持体に結合するために使用され得る他の試薬としては、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマーなどが挙げられる。そのような分子およびこれらの分子の抗原へのカップリングの方法は、当業者に周知である。例えば、Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，Ｍ．Ａ．（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：２−１３；Ｈａｓｈｉｄａら（１９８４）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６：５６−６３；ならびにＡｎｊａｎｅｙｕｌｕおよびＳｔａｒｏｓ（１９８７）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３０：１１７−１２４を参照されたい。
【０１１０】
固体支持体を固相成分と反応させた後、任意の非固定化固相成分は、洗浄によって支持体から除去され、次いで、この支持体に結合した成分は、ＨＣＶ抗体（本明細書中で集合的に「リガンド分子」と呼ぶ）を含むことが疑われる生物学的サンプルと、適切な結合条件下で接触させられる。ＨＣＶ抗体が、サンプル中に存在する場合、これらは、ＨＣＶ抗原と複合体を形成する。任意の非結合リガンド分子を除去するための洗浄の後、検出可能に標識化された抗体（例えば、抗ＨＣＶ抗体上のエピトープを認識する抗外因性抗体（例えば、抗ヒト抗体））が、添加される。これらの抗体は、複合体形成に起因して結合する。
【０１１１】
別のアッセイ形式が、図１２に示される。このアッセイ形式は、当該分野で周知であり、ビオチン標識化抗体（改変ＮＳ３および、必要な場合ＭＥＦＡ（例えば、ＭＥＦＡ  ７．１）と結合する）と反応させられるストレプトアビジンコーティングされた固体支持体を用いる。このサンプルは、適切な結合条件下で加えられる。ＨＣＶ抗体がサンプル中に存在する場合、これらは、ＨＣＶ抗原と複合体を形成する。任意の非結合リガンド分子を除去するための洗浄の後、上述のように、検出可能に標識化された抗体が添加される。
【０１１２】
同種形式において、試験サンプルは、溶液中の抗原の組み合わせと共にインキュベートされる。例えば、これは、形成された任意の抗原−抗体複合体を沈殿する条件下であり得る。同種アッセイについての標準形式および競合形式の両方が、当該分野で公知である。
【０１１３】
標準形式において、抗体−抗原複合体を形成するＨＣＶ抗体の量が、直接モニタリングされる。これは、抗ＨＣＶ抗体上のエピトープを認識する標識化外因性抗体（例えば、抗ヒト抗体）が、複合体形成に起因して結合するか否かを決定することによって、達成され得る。競合形式において、サンプル中のＨＣＶ抗体の量は、複合体中の既知の量の標識化抗体（または他の競合性リガンド）の結合における競合作用をモニタリングすることによって推定される。
【０１１４】
より詳細には、抗ＨＣＶ抗体（または、競合アッセイにおいては、競合性抗体の量）を含んで形成される複合体が、その形式に依存して、多くの公知の技術のいずれかによって検出される。例えば、複合対中の未標識化ＨＣＶ抗体は、標識（例えば、酵素標識）と複合体化した抗外因性Ｉｇの結合体を用いて検出され得る。免疫沈降アッセイ形式もしくは凝集アッセイ形式において、ＨＣＶ抗原と抗体との間の反応は、ネットワークを形成し、このネットワークは、溶液もしくは懸濁液から沈殿し、そして沈殿物の可視の層もしくは薄膜を形成する。抗ＨＣＶ抗体が試験標本中に存在しない場合、可視の沈殿物は形成されない。上述のアッセイ試薬（結合した抗体および抗原を有するイムノアッセイ固体支持体、ならびに捕獲したサンプルと反応させられる抗体および抗原を含む）は、上述のイムノアッセイを実施するために、適切な指示書および他の必要な試薬と共にキット中で提供され得る。このキットは、抗原の組み合わせ（既に固体マトリックスに結合していても、またはマトリックスに結合するための試薬と別個でもよい）、コントロール抗体処方物（ポジティブおよび／またはネガティブ）、標識がシグナルを直接産生しない場合にアッセイ形式が同一のシグナル発生試薬（例えば酵素基質）を必要とする場合は標識化抗体を、通常、別個の容器で、含む。アッセイを実施するための指示書（例えば、書類、テープ、ＶＣＲ、ＣＤ−ＲＯＭなど）が、キット中に含まれる。このキットはまた、使用される特定のイムノアッセイに依存して、他の梱包された試薬および材料（すなわち、洗浄緩衝液など）を含んでもよい。上述のもののような標準的イムノアッセイが、これらのキットを用いて実施され得る。
【実施例】
【０１１５】
（ＩＩＩ．実施例）
以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の例である。これらの例は、例示のみの目的で提供され、そして本発明の範囲を限定することをいかなるようにも意図しない。
【０１１６】
使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確さを期するために努力がなされているが、無論、ある程度の実験誤差および偏差は許容される。
【０１１７】
（実施例１）
（改変ＮＳ３タンパク質の産生）
（Ｉ．ＮＳ３４ａＰＩ）
ＮＳ３ヘリカーゼドメインに対する変異を有するがプロテアーゼドメインに対しては変異を有さない、ＮＳ３４ａＰＩを、以下のような酵母発現ベクターｐＢＳ２４．１による発現のために産生した。ＮＳ３４ａＰＩは、ＨＣＶ−１全長配列に対して番号付けされたアミノ酸Ｔｈｒ−１４２８およびＳｅｒ−１４２９がそれぞれＰｒｏおよびＩｌｅに変異されていることを除き、天然のＮＳ３／４ａポリペプチドについてのアミノ酸配列を含む。この酵母発現ベクターｐＢＳ２４．１は、酵母における自己複製のために２μ配列を含み、そして選択可能マーカーとして酵母遺伝子であるｌｅｕ２−ｄおよびＵＲＡ３を含む。β−ラクタマーゼ遺伝子およびＣｏｌＥ１複製起点（細菌におけるプラスミド複製のために必要である）もまた、この発現ベクター中に存在する。ＮＳ３４ａＰＩをコードするプラスミドｐｄ．ｈｃｖ１ａ．ｎｓ３ｎｓ４ａＰＩを、以下のように産生した。２工程の手順を使用した。第１に、以下のＤＮＡ断片を、ライゲーションして一緒にした：（ａ）５’ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位を提供する合成オリゴヌクレオチド、およびその後に続く配列ＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡ（配列番号１２）、開始ＡＴＧ、ならびにＨＣＶ１ａについてのコドン（アミノ酸１０２７で始まり、アミノ酸１０４６におけるＢＧｌＩ部位まで続く）；（ｂ）ｐＡｃＨＬＴｎｓ３ｎｓ４ａＰＩ由来の６８３ｂｐのＢｇｌＩ−ＣｌａＩ制限フラグメント（コードするアミノ酸は１０４６〜１２７４）；ならびに（ｃ）ＨｉｎｄＩＩＩおよびＣｌａＩで切断し、脱リン酸化し、そしてゲル精製したｐＳＰ７２ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ登録番号Ｘ６５３３２）。プラスミドｐＡｃＨＬＴｎｓ３ｎｓ４ａＰＩは、ｐＡｃＨＬＴ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から市販されている場急路ウイルス発現ベクター）に由来した。詳細には、ｐＡｃＨＬＴ  ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩベクターおおび以下のフラグメントを調製した：ＥｃｏＲＩ−ＡｌｗｎＩ、９３５ｂｐ、ＨＣＶ−１ゲノムのアミノ酸１０２７〜１３３６に対応する；ＡｌｗｎＩ−ＳａｃＩＩ、２４７ｂｐ、ＨＣＶ−１ゲノムのアミノ酸１３３６〜１４１９に対応する；ＨｉｎｆＩ−ＢｇｌＩ、１７５ｂｐ、ＨＣＶ−１ゲノムのアミノ酸１４４９〜１５０９に対応する；ＢｇｌＩ−ＰｓｔＩ、６１９ｂｐ、ＨＣＶ−１ゲノムのアミノ酸１５１０〜１７１１に対応する、および転写終止コドン。合成的に産生した９１ｂｐのフラグメントであるＳａｃＩＩ−ＨｉｎｆＩ（ＨＣＶ−１ゲノムのアミノ酸１４２０〜１４４８に対応し、かつＰＩ変異（Ｔｈｒ−１４２８からＰｒｏへの変異、Ｓｅｒ−１４２９からＩｌｅへの変異）を有する）を、上述の１７５ｂｐのＨｉｎｆＩ−ＢｇｌＩフラグメントおよび６１９ｂｐのＢｇｌＩ−ＰｓｔＩフラグメントとライゲーションし、そしてＳａｃＩＩおよびＰｓｔＩで消化したｐＧＥＭ−５Ｚｆ（＋）ベクター内にサブクローニングした。ｐＧＥＭ−５Ｚｆ（＋）は、市販のＥ．ｃｏｌｉベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ登録番号Ｘ６５３０８）である。コンピテントＨＢ１０１細胞の形質転換後、個々のクローンのミ��スクリーン分析および配列評価を行い、ｐＧＥＭ５．ＰＩクローン２からの８８５ｂｐのＳａｃＩＩ−ＰｓｔＩフラグメントを、ゲル精製した。このフラグメントを、ＥｃｏＲＩ−ＡｌｗｎＩの９３５ｂｐフラグメント、ＡｌｗｎＩ−ＳａｃＩＩの２４７ｂｐフラグメントおよび上述のｐＡｃＨＬＴ  ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩベクターとライゲーションした。得られた構築物を、ｐＡｃＨＬＴｎｓ３ｎｓ４ａＰＩと名づけた。
【０１１８】
上記のライゲーション混合物を、ＨＢ１０１コンピテント細胞内に形質転換し、そして１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬｕｒｉａ寒天プレート上でプレート培養した。個々のクローンのミニプレップ分析から、推定される陽性を同定し、これらのうちの２つを増幅した。ｐＳＰ７２  １ａＨＣについてのプラスミドＤＮＡ（クローン番号１および２）を、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉｐｒｅｐキットで精製し、そして配列決定した。
【０１１９】
次に、以下のフラグメントを、ライゲーションして一緒にした：（ａ）ｐＳＰ７２１ａＨＣ＃１からの７６１ｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＣｌａＩフラグメント（ｐＳＰ７２．１ａＨＣを、以下をライゲーションして一緒にすることによって産生した：ＨｉｎｄＩＩＩおよびＣｌａＩによって切断したｐＳＰ７２、５＝ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位を提供する合成オリゴヌクレオチド、その後に続く配列ＡＣ  ＡＡＡＡＣＡＡＡ（配列番号１２）、開始コドンＡＴＧ、およびＨＣＶ１ａについてのコドン（アミノ酸１０２７で始まり、アミノ酸１０４６におけるＢｇｌＩＩ部位まで続く）、ならびにｐＡｃＨＬＴｎｓ３ｎｓ４ａＰＩからの６８３ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＣｌａＩ制限フラグメント（コードするアミノ酸は１０４６〜１２７４である））；（ｂ）酵母ハイブリッドプロモーターＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨについての１３５３ｂｐのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント；（ｃ）ｐＡｃＨＬＴｎｓ３ｎｓ４ａＰＩからの１３２０ｂｐのＣｌａＩ−ＳａｌＩフラグメント（Ｔｈｒ  １４２８からＰｒｏへの変異およびＳｅｒ  １４２９からＩｌｅへの変異を有する、ＨＣＶ１ａアミノ酸１０４６〜１７１１をコードする）；ならびに（ｄ）ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断し、脱リン酸化し、そしてゲル精製したｐＢＳ２４．１酵母発現ベクター。このライゲーション混合物を、コンピテントＨＢ１０１内に形質転換し、そして１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有のＬｉｒｉａ寒天プレート上にプレート培養した。個々のコロニーのミニプレップ分析から、３４４６ｂｐ  ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ挿入物（ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター、開始コドンＡＴＧおよびＴｈｒ  １４２８からＰｒｏへの変異およびＳｅｒ  １４２９からＩｌｅへの変異を有するＨＣＶ１ａ  ＮＳ３４ａのアミノ酸１０２７〜１７１１からなる）を有することが予測されるコロニーを同定した。この構築物を、ｐｄ．ＨＣＶ１ａ．ｎｓ３ｎｓ４ａＰＩと名付けた。
【０１２０】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＡＤ３を、ｐｄ．ＨＣＶ１ａ．ｎｓ３ｎｓ４ａＰＩによって形質転換し、そして１つの形質転換体を、培地中のグルコースの枯渇後に発現について確認した。組換えタンパク質は、酵母において高レベルで発現した。このことは、クーマシーブルー染色によって検出され、そしてＮＳ３のヘリカーゼドメインに対するポリクローナル抗体を用いるイムノブロットによって確認した。
【０１２１】
ＮＳ３／４ａタンパク質を、以下のように精製した。上記のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞（ＮＳ３４ａＰＩタンパク質を発現する）を収集し、そして細胞を、溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．１μＭペプスタチン、１μＭロイペプシン）中に浮遊させ、そしてこれを、Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ（Ｗａｂ  Ｗｉｌｌｙ  Ａ．Ｂａｃｈｏｆｏｎ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）もしくは等価の装置において、１：１：１の細胞：緩衝液：０．５ｍｍガラスビーズの比でガラスビーズを用いて使用して、溶解した。この溶解物を、３０１００×ｇで３０分間４℃で遠心分離し、そして不溶性タンパク質画分を含むペレットに洗浄緩衝液（出発細胞ペレット重量１ｇあたり６ｍｌ）を加え、室温で１５分間振とうした。この洗浄緩衝液は、５０ｍＭ  ＮａＰＯ４（ｐＨ８．０）、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１０％グリセロール、０．０５％オクチルグルコシド、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．１μＭペプスタチン、１μＭロイペプチンからなる。細胞屑を、３０１００×ｇで３０分間４℃の遠心分離によって除去した。上清を捨て、ペレットを残した。
【０１２２】
タンパク質を、以下のようにペレットから抽出した。６ｍｌ／ｇ抽出緩衝液を添加し、そして室温で１５分間振とうした。この抽出緩衝液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１０％グリセロール、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．１μＭペプスタチン、１μＭロイペプチンからなっていた。これを、３０１００×ｇで３０分間４℃で遠心分離した。この上清を保持し、そして硫酸アンモニウムを、以下の式を用いて１７．５％まで添加した：上清の容量（ｍｌ）×ｘ％硫酸アンモニウム／（１−ｘ％硫酸アンモニウム）＝上清に添加した４．１Ｍ飽和硫酸アンモニウムの量（ｍｌ）。硫酸アンモニウムを氷上で撹拌しながら滴下し、そしてこの溶液を氷上で１０分間撹拌した。この溶液を、１７７００×ｇで３０分間４℃で遠心分離し、そしてペレットを得て、２℃〜８℃で４８時間まで保存した。
【０１２３】
このペレットを再懸濁し、そしてポリＵカラム（ポリＵセファロース４Ｂ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に４℃で以下のようにかけた。ペレットを、ペレット１ｇあたり６ｍｌのポリＵ平衡化緩衝液中に再懸濁した。平衡化緩衝液は、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ（新鮮に添加した）、１０％グリセロール、１．２オクチルグリコシドから構成されていた。この溶液を、４℃で１５分間振とうし、そして３１０００×ｇで３０分間４℃で遠心分離した。
【０１２４】
ポリＵカラム（出発ペレット重量１ｇあたり１ｍｌの樹脂）を、調製した。線形流速は、６０ｃｍ／時間であり、そしてパッキング流速は、１３３％の６０ｃｍ／時間であった。カラムを、平衡化緩衝液で平衡化し、そして再懸濁した硫酸アンモニウムペレットの上清を、平衡化カラム上にロードした。このカラムを、平衡化緩衝液で基線まで洗浄し、そしてタンパク質を、以下のポリＵ溶出緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ（新鮮に加えた）、１０％グリセロール、１．２オクチルグルコシド）中で、溶出工程で溶出した。カラム溶出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）にかけ、そしてアリコートを、凍結させそして−８０℃で保存した。ＮＳ３４ａＰＩタンパク質の存在を、ＮＳ３プロテアーゼドメインに対して指向するポリクローナル抗体および５−１−１−エピトープ（ＨＣＶ  ４ａ）に対するモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロットによって確認した。
【０１２５】
さらに、プロテアーゼ酵素活性を、精製の間以下のようにモニタリングした。ＮＳ４ａペプチド（ＫＫＧＳＶＶＩＶＧＲＩＶＬＳＧＫＰＡＩＩＰＫＫ、配列番号）およびＮＳ３４ａＰＩタンパク質を含有するサンプルを、９０μｌの反応緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．０５  ｎ−ドデシルＢ−Ｄ−マルトシド、５ｍＭ  ＤＴＴ）中で希釈し、そして３０分間室温で混合させた。９０μｌの混合物を、マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に添加し、そして１０μｌのＨＣＶ基質（ＡｎａＳｐｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ  ＣＡ）を添加した。このプレートを混合し、そしてＦｌｕｏｓｔａｒプレートリーダー上で読み取った。結果を、１分間あたりの相対蛍光単位（ＲＦＵ）として表した。
【０１２６】
これらの方法（１Ｍ  ＮａＣｌ抽出の産物は３．７ＲＦＵ／分の活性を含んだ）を用い、この硫酸アンモニウム沈殿は、７．５ＲＦＵ／分の活性を有し、そしてポリＵ精製の産物は、１８．５ＲＦＵ／分の活性を有した。
【０１２７】
（ＩＩ．プロテアーゼドメインに変異を有する改変ＮＳ３抗原）
ＮＳ３プロテアーゼドメインに対する変異を有する改変ＮＳ３抗原を、上記のＮＳ３４ａＰＩ配列の部位特異的変異誘発を用いて産生した。詳細には、プロテアーゼ触媒性三連構造中のＳｅｒ−１１６５についてのコドンを、Ａｌａコドンに変異させた。１１６５位のＳｅｒからＡｌａへの置換を含むＮＳ３４ａＰＩ構築物の図を、図４Ａに示す。この構築物のヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列を、図５Ａ〜図５Ｃに示す。この構築物を、「ＮＳ３４ａＰＩ．１１６５」と呼んだ。
【０１２８】
さらに、図４Ｃに示した改変ＮＳ３タンパク質を、産生した。上記のタンパク質と同様に、改変ＮＳ３もまた、ヘリカーゼドメインにＰＩ変異を含んだ。このタンパク質は、ＮＳ４ａのアミノ酸１６７８〜１６９０、およびその後にアミノ酸配列ＳＧＳ、次いでＮＳ３のアミノ酸１０２９〜１６５７を含んだ。ＳＧＳ配列は、ＮＳ４ａポリペプチドをプロテアーゼポケットに折りたたんで酵素的に活性な分子を作製する、可撓性のリンカー配列を提供する。このタンパク質のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を、図７Ａ〜図７Ｃに示す。この構築物を、「ｄ．４ａ．ｔ．ＮＳ３ＰＩ．１１６５」と呼んだ。
【０１２９】
最後に、アミノ酸１１６５におけるＡｌａ置換およびヘリカーゼドメインにおけるＰＩ置換を含む改変ＮＳ３タンパク質（図４Ｂに示す）を、以下のように産生した。このタンパク質のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を、図６Ａ〜図６Ｃに示す。この構築物を、「ＮＳ３ＰＩ．１１６５」と呼んだ。
【０１３０】
ＮＳ３ＰＩ．１１６５酵母発現ベクターを構築するために、以下の工程を行った。最初に、プラスミドｐＳＰ７２ＮＳ３ＮＳ４ａ．ＰＩ．ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｃｌａｉ＃９を、ＢｇｌＩ／ＣＩａＩフラグメント（上述のように、ｐＡｃＨＬＴ  ＮＳ３ＮＳ４ａＰＩから単離した）と９７ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｇｌＩ合成オリゴヌクレオチド（下記）とのライゲーションによって作製し、次いで、ＨＢ１０１内に形質転換した。
【０１３１】
【数１】
2008511326.tif 000005
ミニスクリーンおよび配列確認の後、プラスミドｐＳＰ７２ＮＳ３ＮＳ４ａ．ＰＩＨｉｎｄＩＩＩ／Ｃｌａｉ＃９を（ＤＡＭ−メチル化した）ＳＣＳ１１０  Ｅ．ｃｏｌｉコンピテント細胞内に再形質転換した。次いで、このプラスミドを、ムターゼ（部位特異的変異誘発（ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）を用いた、ＨＣＶ１ａＮＳ３プロテアーゼ触媒性三連構造のセリン１１６５からアラニンへの変異）に対するテンプレートとして使用して、以下のＰＣＲプライマーを使用した：
【０１３２】
【数２】
2008511326.tif 000006
ミニスクリーン分析および配列評価の後、正しい配列を有するクローンを、ｐＳＰ７２ＮＳ３ＮＳ４ａＰＩｍｕｔ１１６５＃３２と名付けた。次に、このプラスミドを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｖｒＩＩ（ＢｌｎＩ）で消化して、下のＨＣＶ１ａ  ＮＳ３ドメイン由来のＮ末端の１４アミノ酸をコードする５８塩基対の合成オリゴヌクレオチド（酵母の好むコドンを用いる）とのライゲーションのためのベクターを調製した。
【０１３３】
【数３】
2008511326.tif 000007
ＨＢ１０１形質転換、ミニスクリーン分析および配列評価の後、正しい配列を有する新規なプラスミドを、ｐＳＰ７２Ｈ３／ＣｌａＩＮＳ３ｍｕｔ１１６５＃１５と名付けた。ＨＣＶ１ａ  ＮＳ３ドメインのＣｌａＩ部位はメチル化されているので、ＳＣＳ１１０  Ｅ．ｃｏｌｉコンピテント細胞を、ｐＳＰ７２Ｈ３／ＣｌａＩＮＳ３ｍｕｔ１１６５＃１５サブクローンを形質転換するために使用した。次に、このプラスミドを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＣｌａＩで消化し、７６１ｂｐのフラグメントを調製した。
【０１３４】
第２に、１１２９ｂｐのＣｌａＩ／ＥａｇＩフラグメントを、バキュロウイルス発現プラスミドｐＡｃＨＬＴｎｓ３ｎｓ４ａＰＩから単離した。このＣｌａＩ／ＥａｇＩフラグメントを、ＮＳ３ドメインのＣ末端およびＮＳ４ａペプチドをコードする１９５ｂｐの合成オリゴヌクレオチドと共にｐＳＰ７２  ＣｌａＩ／ＳａｌＩベクター内にライゲーションして、サブクローンｐＳＰ７２ＮＳ３ＮＳ４ａＰＩ  Ｃｌａ／Ｓａｌ＃３０を作製した。このサブクローンを、ＳＣＳ１１０コンピテント細胞内に形質転換し、ここで、ＣｌａＩ部位は、ＨＢ１０１においてのようにメチル化されなかった。
【０１３５】
【数４】
2008511326.tif 000008
このプラスミドから、制限酵素であるＡｖａ３およびＳａｌＩで消化することによってベクターを調製し、それによって、ＮＳ４ａドメインを削除した。このベクター内に、３７ｂｐの合成オリゴヌクレオチドをライゲーションし、そしてＨＢ１０１内に形質転換した。
【０１３６】
【数５】
2008511326.tif 000009
ミニスクリーン分析および配列評価の後、ｐＳＰ７２  ＣｌａＩＳａｌＩ  ＮＳ３ＰＩサブクローン＃１０１を作製した。このプラスミドを、前に記載したように、１３２０ｂｐのＣｌａＩ／ＳａｌＩフラグメントを単離するために、再びＳＣＳ１１０内に再形質転換した。
【０１３７】
最後に、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＣｌａＩ  ７６１ｂｐフラグメントおよびＣｌａＩ／ＳａｌＩ  １３２０ｂｐフラグメントを、ｐＢＳ２４．１  ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ酵母発現ベクター内にライゲーションし、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＨＢ１０１コンピテント細胞を用いて形質転換した。個々のコロニーのミニプレップ分析から、３２８４ｂｐと予測したフラグメントを有するクローンを同定した。この構築物を、ｐｄ．ＮＳ３ＰＩ．１１６５＃２１と名付けた。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＤ３株の酵母における発現を、ｐｄ．ＨＣＶ１ａ．ｎｓ３ｎｓ４ａＰＩについて、上述のように確認した。
【０１３８】
ｄ．４ａ．ｔ．ＮＳ３ＰＩ．１１６５酵母発現プラスミドを、以下のように産生した。ＮＳ４ａペプチドおよびその後のアミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＳｅｒならびにＮＳ３ドメインのアミノ酸１０２９〜１０３９をコードする１００ｂｐの合成オリゴヌクレオチドを、ベクターｐＳＰ７２ＮＳ３ＮＳ４ａＰＩｍｕｔ１１６５＃３２  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｖｒＩＩ（上記）内にライゲーションし、そしてＨＢ１０１内に形質転換した。
【０１３９】
【数６】
2008511326.tif 000010
ミニスクリーンおよび配列評価の後、ｐＳＰ７２４ａ−ｔ−ＮＳ３ＰＩ．１１６５＃１４を作製した。得られたプラスミドを、次いで、上記の理由でＳＣＳ１１０内に形質転換し、そして８０３ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＣｌａＩフラグメントを、単離した。ｄ．４ａ．ｔ．ＮＳ３ＰＩ．１１６５酵母発現プラスミドを作製するため、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨ  ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩプロモーターを、８０３ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＣｌａＩフラグメントおよびＮＳ３ＰＩ領域の３’末端をコードする１１５８ｂｐのＣｌａＩ／ＳａｌＩフラグメントと共にｐＡＢ２４  ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ酵母発現ベクター内にライゲーションした。ｐｄ．４ａ−ｔ−ｎｓ３．１１６５＃４を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＤ３酵母株内に形質転換し、そして１つの形質転換体を、上述のように、ｐｄ．ＨＣＶ１ａ．ｎｓ３ｎｓ４ａＰＩの発現について確認した。
【０１４０】
タンパク質を、上のように精製した。変異体タンパク質の全ては、酵母においてＮＳ３４ａＰＩの発現レベルと同等の発現レベルを有し、そして、これをＮＳ３４ａＰＩの純度（９０％を超える純度）と同等の純度で精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットは、改変ＮＳ３ポリペプチドのタンパク分解活性の欠損を確認した。詳細には、ＮＳ３４ａＰＩ．１１６５は、未切断の全長タンパク質であり、そしてＮＳ３ＰＩ．１１６５およびＮＳ３４ａＰＩ．１１６５は、ＭＥＦＡ  ７．１を切断しないことを示した。したがって、この改変タンパク質は、タンパク分解活性を欠損していた。
【０１４１】
（実施例２）
（変異ＨＣＶ抗原を用いるイムノアッセイ）
ＨＣＶ抗原および、特定されるいくつかの場合、ＭＥＦＡ  ７．１抗原を、以下のように、イムノアッセイのためにプレート上にコーティングした。ＭＥＦＡ  ７．１を、米国特許第６，６３２，６０１号（本明細書中でその全体が参考として援用される）において記載されるように産生した。ＭＥＦＡ  ７．１は、ＮＳ３プロテアーゼに対する天然の基質である。ＨＣＶコーティング緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＰＯ４（ｐＨ７．０）、２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１％クロロアセトアミド）を、０．２２μフィルターユニットを通して濾過した。次いで、以下の試薬を、ＨＣＶコーティング緩衝液に順次添加し、そして各添加の後で撹拌した：２μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ−スルフヒドリル改変（１０ｍｇ／ｍｌ溶液から）（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐ．Ｐｅｎｔｅｘ，Ｋａｎｋａｋｅｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）；５ｍＭ  ＤＴＴ（１Ｍ溶液から）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；０．４５μｇ／ｍｌ  ＮＳ３／４ａ（０．３ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度）；０．３７５μｇ／ｍｌ  ＭＥＦＡ  ７．１（１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度）。最終溶液を、室温で１５分間撹拌した。
【０１４２】
２００μｌの上記溶液を、Ｃｏｓｔａｒ  ｈｉｇｈ  ｂｉｎｄｉｎｇ平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）の各ウェルに添加し、そしてこのプレートを、湿潤チャンバ内で一晩インキュベートした。次いでこのプレートを、洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、０．１％  ＴＷＥＥＮ−２０）で洗浄し、タッピング乾燥（Ｔａｐｐｅｄ  ｄｒｙ）し、そして２８５μｌのＯｒｔｈｏ  Ｐｏｓｔ−Ｃｏａｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、１％  ＢＳＡ、３％スクロース）を添加した。このプレートを、少なくとも１時間インキュベートし、タッピングしそして一晩２〜８℃で乾燥させた。このプレートを、将来の使用のために、乾燥剤と共に袋に入れた。
【０１４３】
ＮＳ３４ａＰＩ（タンパク分解ドメインの変異を有さない）と比較した改変ＮＳ３抗原の性能を、研究した。ＨＣＶ感染している市販のヒト血液サンプルのパネルを使用した。以下の表で示すＰＨＶパネルを、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ  Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＭＡ（ＢＢＩ）から購入した。
【０１４４】
ＨＣＶアッセイを、以下のように実施した。２００μｌの標本希釈緩衝液（１ｇ／ｌカゼイン、１００ｍｇ／ｌ組換えヒトＳＯＤ、１ｇ／ｌクロロアセトアミド、１０ｇ／ｌ  ＢＳＡ、５００ｍｇ／ｌ酵母抽出物、０．３６６ｇ／ｌ  ＥＤＴＡ、１．１６２ｇ／ｌ  ＫＰＯ４、５ｍｌ／ｌ  Ｔｗｅｅｎ−２０、２９．２２ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、１．６２７ｇ／ｌ  ＮａＰＯ４、１％  ＳＤＳ）を、コーティングしたプレートに添加した。これを、３７℃で１時間インキュベートした。このプレートを、洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で洗浄した。２００μｌの結合体溶液（マウス抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ、例えば、ＯＲＴＨＯ  ＨＣＶ  ３．０  ＥＬＩＳＡ  Ｔｅｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍ中で増強したＳＡＶｅバルク結合体希釈液（Ｏｒｔｈｏ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒａｒｉｔａｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）により１：２２で希釈したマウス抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰを添加し、そして６０分間３７℃でインキュベートした。これを、上述のように洗浄し、そして２００μｌの基質溶液（１個のＯＰＤ錠剤／１０ｍｌ）を添加した。このＯＰＤ錠剤は、西洋ワサビペルオキシダーゼ反応発色のためにｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリドおよび過酸化水素を含有する。これを、室温で３０分間暗所でインキュベートした。この反応を、５０μｌの４Ｎ  Ｈ２ＳＯ４の添加によって停止させ、そしてこのプレートを、４９２ｎｍで読み取っり、コントロールとしての６９０ｎｍにおける吸光度と比較する。
【０１４５】
結果を、表３〜表６に示す。詳細には、表３は、ＮＳ３ＰＩ．１１６５およびＮＳ３４ａＰＩ．１１６５対ＮＳ３４ａＰＩのイムノアッセイ性能の比較の結果を示す。表３に示されるように、プロテアーゼ欠損変異体の両方とも、免疫反応性であり、２倍の量でコーティングした場合、タンパク分解活性を有するＮＳ３４ａＰＩコントロール分子の約８０〜９０％の反応性を保持する。表６は、ｄ．４ａ．ｔ．ＮＳ３ＰＩ．１１６５、ＮＳ３ＰＩ．１１６５およびＮＳ３４ａＰＩ．１１６５対ＮＳ３４ａＰＩのイムノアッセイ性能の比較の結果を示す。表６で示すように、適切なレベルでコーティングした場合、ｄ．４ａ．ｔ．ＮＳ３ＰＩ．１１６５、ＮＳ３ＰＩ．１１６５およびＮＳ３４ａＰＬ１１６５は、ＮＳ３４ａＰＩの免疫反応性と同等の免疫反応性を示し、ｄ．４ａ．ｔ．ＮＳ３ＰＩ．１１６５は、ＮＳ３４ａＰＩの免疫反応性と最も近い免疫反応性を示す。
【０１４６】
表４および表７から理解され得るように、また、ＮＳ３ＰＩ．１１６５、ＮＳ３４ａＰＩ．１１６５およびｄ．４ａ．ｔ．ＮＳ３ＰＩ．１１６５は、ＭＥＦＡ  ７．１と組み合わせて使用した場合、ＮＳ３４ａＰＩの反応性と非常に類似した反応性を達成した。
【０１４７】
表５は、ＭＥＦＡ  ７．１と組み合わせたアッセイ、もしくはＭＥＦＡ  ７．１と組み合わせないアッセイのどちらかにおける、ＮＳ３ＰＩ．１１６５およびｄ．４ａ．ｔ．ＮＳ３ＰＩ．１１６５対ＮＳ３４ａＰＩのイムノアッセイ性能の比較の結果を示す。理解され得るように、単独もしくはＭＥＦＡ  ７．１との組み合わせのどちらも、天然ＮＳ３４ａＰＩの免疫反応性と非常に類似した免疫反応性を達成した。したがって、試験した改変ＮＳ３タンパク質の３種全てが、免疫反応性を有した。
【０１４８】
これらの３種の改変ＮＳ３タンパク質は、ヘリカーゼ活性を有した（データは示さず）が、プロテアーゼ活性は有さなかった。さらに、図１３および図１４で示すように、改変ＭＳ３変異体タンパク質は、ＮＳ３プロテアーゼの天然の基質であるＭＥＦＡ  ７．１を切断しなかった。
【０１４９】
発明者らの知識の限り、これはＮＳ３の免疫反応性およびプロテアーゼ活性が分離でき、かつセリンプロテアーゼ活性の削除は、このタンパク質の抗体認識部位に影響しないことの最初の実証である。
【０１５０】
（実施例３）
（初期セロコンバージョン検出および市販のアッセイとの比較）
（市販のアッセイ）
Ｃ３３ｃ抗原およびＣ２００抗原は、非常に免疫反応性であり、そしてこれらの高原に対する抗体は、初期セロコンバージョンパネルにおいて見出される。したがって、イムノアッセイにおけるｄ．４ａ．ｔ．ＮＳ３ＰＩ．１１６５およびＭＥＦＡ  ７．１、またはＮＳ３４ａＰＩおよびＭＥＦＡ  ７．１の性能を、よく性質決定された、ＨＣＶ感染ヒト血液サンプルの市販のｃ３３ｃパネルおよびｃ２００パネルを用いて研究して、セロコンバージョン感受性を評価し、そしてこれらの結果を、市販の抗ＨＣＶ  ＥＬＩＳＡキットにおいて得られる結果と比較した。特に、Ａｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＥＬ）は、市販されており、そして抗体ベースの検出アッセイである。このアッセイを、製造業者の指示書を用いて実施した。ＯＲＴＨＯ  ＨＣＶ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０  ＥＬＩＳＡ  Ｔｅｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＨＣＶ  ３．０）（Ｏｒｔｈｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒａｒｉｔａｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）は、抗体ベースの検出アッセイである。このアッセイを、製造業者の指示書を用いて実施した。
【０１５１】
結果を、表７に示す。試験するパネルについて、ＮＳ３４ａＰＩおよびＭＥＦＡ  ７．１、ならびにｄ．４ａ．ｔ．ＮＳ３ＰＩ．１１６５およびＭＥＦＡ  ７．１は、初期セロコンバージョンパネルにおいて、ｃ３３ｃ型抗体およびｃ２００型抗体を検出した。この検出は、Ｏｒｔｈｏ  ＨＣＶ  ３．０およびＡｂｂｏｔｔ  Ｐｒｉｓｍアッセイより２〜１２日間早かった。
【０１５２】
（表３：ＭＥＦＡ  ７．１なしで単独でコーティングしたＮＳ３変異体タンパク質の免疫反応性）
【０１５３】
【表３】
2008511326.tif 000011
（表４：ＭＥＦＡ  ７．１と共にコーティングしたＮＳ３変異体タンパク質の免疫反応性）
【０１５４】
【表４】
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（表５：ＭＥＦＡ  ７．１と共に（左のパネル）もしくはＭＥＦＡ  ７．１なしで（右のパネル）コーティングしたＮＳ３変異体タンパク質の免疫反応性）
【０１５５】
【表５】
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（表６：単独でコーティングしたＮＳ３／４ａＰＩのアッセイ性能）
【０１５６】
【表６】
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（表７：アッセイ性能：より初期のセロコンバージョン検出）
【０１５７】
【表７】
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（表８：アッセイ性能：遺伝子型希釈感受性）
【０１５８】
【表８】
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したがって、検出アッセイにおける改変ＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質およびその使用を、開示した。上記から、本発明の特定の実施形態が例示の目的で本明細書中に記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の改変がなされ得ることが、理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】図１は、本発明のアッセイ試薬（タンパク質および抗体）が由来するポリタンパク質の種々の領域を示す、ＨＣＶゲノムの図示である。
【図２】図２は、本発明に従う改変ＮＳ３ポリペプチドを用いる代表的なイムノアッセイの概略図である。ここで、ＨＣＶ抗原は、固体支持体上に固定化されている。
【図３】図３（配列番号７および配列番号８）は、代表的な天然の非改変ＮＳ３タンパク質ドメインのＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。
【図４】図４Ａ〜図４Ｃは、本発明に従う変異体ＮＳ３タンパク質の概略図である。図４Ａ〜図４Ｃにおいて、通常１１６５位に存在するＳｅｒは、Ａｌａと置換されている。さらに、図４Ａ〜図４Ｃにおいて示される全ての変異体は、通常１４２８位に存在するＴｈｒに対するＰｒｏの置換、および通常１４２９位に存在するＳｅｒに対するＩｌｅの置換を含む。図４Ａにおいて、このタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端への方向で、Ｎ末端Ｍｅｔ、ＮＳ３の１０２７〜１６５７のアミノ酸およびＮＳ４ａの１６５８〜１７１１のアミノ酸を含み、従って、ＨＣＶポリタンパク質の全長のＮＳ３ドメインおよびＮＳ４ａドメインを含む。図４Ｂにおいて、このタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端への方向で、Ｎ末端Ｍｅｔ、およびＮＳ３の１０２７〜１６５７のアミノ酸を含み、従って、ＨＣＶポリタンパク質の全長のＮＳ３ドメインを含む。図４Ｃにおいて、このタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端への方向で、Ｎ末端Ｍｅｔ、ＮＳ４ａの１６７８〜１６９０のアミノ酸、その後に配列Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、次いでＮＳ３の１０２９〜１６５７のアミノ酸を含む。
【図５】図５Ａ〜図５Ｃ（配列番号１および配列番号２）は、図４Ａからのタンパク質（「ＮＳ３４ａＰＩ．１１６５」と呼ばれる）のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を示す。
【図６】図６Ａ〜図６Ｃ（配列番号３および配列番号４）は、図４Ｂからのタンパク質（「ＮＳ３ＰＩ．１１６５」と呼ばれる）のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を示す。
【図７】図７Ａ〜図７Ｃ（配列番号５および配列番号６）は、図４Ｃからのタンパク質（「ｄ．４ａ．ｔ．ＮＳ３ＰＩ．１１６５」と呼ばれる）のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を示す。
【図８】図８は、ＭＥＦＡ  ７．１の概略図である。
【図９】図９Ａ〜図９Ｆ（配列番号９および配列番号１０）は、ＭＥＦＡ  ７．１のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。
【図１０】図１０は、ｐｄ．ＨＣＶ１ａ．ｎｓ３ｎｓ４ａＰＩの構造の図である。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｃは、本発明の医務のアッセイでの使用のための代表的なＭＥＦＡを示す。図１１Ａは、ＭＥＦＡ  ３の概略図である。図１１Ｂは、ＭＥＦＡ  ５の概略図である。図１１Ｃは、ＭＥＦＡ  ６の概略図である。
【図１２】図１２は、改変ＮＳ３ポリペプチドおよびストレプトアビジンコーティングした固体支持体を用いる、代表的なイムノアッセイ形式の概略図である。
【図１３】図１３は、ＮＳ３変異体タンパク質は自己加水分解を受けず、ＭＥＦＡ  ７．１を切断しないことを示す、クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの図である。レーン１：ＮＳ３４ａＰＩ；レーン２：ＮＳ３４ａＰＩ．１１６５；レーン３：ＮＳ３ＰＩ．１１６５；レーン４：ＮＳ３４ａＰＩ＋ＭＥＦＡ  ７．１、時間＝０；レーン５：ＮＳ３４ａＰＩ＋ＭＥＦＡ  ７．１、時間＝４０分間；レーン６：ＮＳ３４ａＰＩ＋ＭＥＦＡ  ７．１、時間＝２時間；レーン７：ＮＳ３４ａＰＩ．１１６５＋ＭＥＦＡ  ７．１、時間＝０；レーン８：ＮＳ３４ａＰＩ．１１６５＋ＭＥＦＡ  ７．１、時間＝４０分間；レーン９：ＮＳ３４ａＰＩ．１１６５＋ＭＥＦＡ  ７．１、時間＝２時間；レーン１０：ＮＳ３ＰＩ．１１６５＋ＭＥＦＡ  ７．１、時間＝０；レーン１１：ＮＳ３ＰＩ．１１６５＋ＭＥＦＡ  ７．１、時間＝４０分間；レーン１２：ＮＳ３ＰＩ．１１６５＋ＭＥＦＡ  ７．１、時間＝２時間；レーン１３：ＭＥＦＡ  ７．１。
【図１４】図１４は、ＭＥＦＡ  ７．１に対する一次抗体として抗ＳＯＤを用い、そして二次抗体として抗マウス−ＨＲＰを用いたウエスタンブロットの図であり、ＮＳ３タンパク質は、自己加水分解を受けず、ＭＥＦＡ  ７．１を切断しないことを示す。レーン１：ＮＳ３４ａＰＩ；レーン２：ＮＳ３４ａＰＩ．１１６５；レーン３：ＮＳ３ＰＩ．１１６５；レーン４：ＮＳ３４ａＰＩ＋ＭＥＦＡ  ７．１、時間＝０；レーン５：ＮＳ３４ａＰＩ＋ＭＥＦＡ  ７．１、時間＝４０分；レーン６：ＮＳ３４ａＰＩ＋ＭＥＦＡ  ７．１、時間＝２時間；レーン７：ＮＳ３４ａＰＩ．１１６５＋ＭＥＦＡ  ７．１、時間＝０；レーン８：ＮＳ３４ａＰＩ．１１６５＋ＭＥＦＡ  ７．１、時間＝４０分；レーン９：ＮＳ３４ａＰＩ．１１６５＋ＭＥＦＡ  ７．１、時間＝２時間；レーン１０：ＮＳ３ＰＩ．１１６５＋ＭＥＦＡ  ７．１、時間＝０；レーン１１：ＮＳ３ＰＩ．１１６５＋ＭＥＦＡ  ７．１、時間＝４０分；レーン１２：ＮＳ３ＰＩ．１１６５＋ＭＥＦＡ  ７．１、時間＝２時間；レーン１３：ＭＥＦＡ  ７．１。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
2008511326.tif 000021
【図５Ｂ】
2008511326.tif 000022
【図５Ｃ】
2008511326.tif 000023
【図６Ａ】
2008511326.tif 000024
【図６Ｂ】
2008511326.tif 000025
【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
2008511326.tif 000027
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
2008511326.tif 000029
【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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