(57)【要約】  本発明は、試料溶液における全リポタンパクの濃度を決定する方法に関する。本方法は、試料中のリポタンパクに結合し、そのように結合した場合に適切な励起下で蛍光を発するプローブ物質、K-37を、試料のアリコートに添加する工程を含む。その後、試料中の全リポタンパクの濃度が蛍光分析を用いて決定される。本方法は、使用者がリポタンパクを区別することができるように、リポタンパクのクラス又はサブクラスに特異的である第二プローブ物質を使うことができる。本発明は、さらに、本発明の方法を行うために用いることができる装置に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料溶液中の全リポタンパクの濃度を決定する方法であって、
(i)プローブ物質が試料中のリポタンパクに結合し、そのように結合した場合に適切な励起下で蛍光を発する0.2mM〜1.0mMのプローブ物質、K-37(本明細書に定義された)を、試料の第一アリコートに添加する工程; 及び
(ii)試料中の全リポタンパクの濃度を蛍光分析を用いて決定する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
第一アリコートに添加されるK-37の濃度が、約0.5-0.85mMである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記方法が、リポタンパク又はHDLの濃度が決定される前に、プローブ物質のヒト血清アルブミンについて疎水性結合ドメインへの結合を実質的に阻害するように適合されるリガンド結合阻害剤を第一アリコートに添加することを含む、請求項1又は2記載の方法。
【請求項４】
リガンド結合阻害剤が、脂肪酸又はその官能性誘導体を含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
リガンド結合阻害剤が、オクタン酸(C8)又はその誘導体、例えば、オクタノエートを含む、請求項3又は4記載の方法。
【請求項６】
各工程について、400nm-650nmの励起波長で第一アリコートを励起させることによって蛍光が誘発され、得られた蛍光が約540nm-700nmの発光波長で測定される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、さらに、リポタンパクの具体的なクラス又はサブクラスの濃度を決定する工程を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
第二プローブ物質が試料の第二アリコートに添加され; 第二プローブがリポタンパクの特定のクラス又はサブクラスに結合して、それに結合した場合に適切な励起下で蛍光収量が変わり; この蛍光が特定のクラス又はサブクラスのリポタンパクの濃度を表す、請求項7記載の方法。
【請求項９】
リポタンパクのクラス又はサブクラスがHDLである、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
第二プローブ物質がナイルレッドである、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
試料に添加されるプローブ物質ナイルレッドの濃度が約0.1-0.9mMである、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
請求項5〜7のいずれか1項に記載のリガンド結合阻害剤が、第二アリコートに添加される、請求項8〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
HSAの薬剤結合ドメインを遮断する物質が、HDL濃度が決定される前に、第二アリコートに添加される、請求項8〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
前記物質が、安息香酸又はその塩又は誘導体である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
400nm-650nmの励起波長で第二アリコートを励起させ、得られた蛍光を約540nm-700nmの発光波長で測定することによって、蛍光が誘発される、請求項10〜14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
第一アリコートを400nm-500nmの励起波長で励起させ; 第二アリコートを約600nmの励起波長で励起させ; 各アリコートから得られた蛍光を約620nmの発光波長で測定することによって、蛍光が誘発される、請求項10〜15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
試料が、生体液である、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
試料が、血漿又は血清、又はリンパを含む、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項1〜18のいずれか1項に記載のリポタンパク分析を行うための装置であって、反応リザーバー; 請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法に必要とされる試薬を含有するように適合された密封手段; 試料を励起させて蛍光を発するように作用可能な励起手段、及び試料によって放出される蛍光を検出するように作用可能な検出手段を備えている、前記装置。
【請求項２０】
装置がリーダーとカートリッジを備え、カートリッジが反応リザーバーと、密封手段を備えている、請求項19記載の装置。
【請求項２１】
励起手段が、約460nmで試料を照射するように作用可能な照明光源を備え、また、600nmで試料を照射してもよいように作用可能な照明光源を備えている、請求項19又は20記載の装置。
【請求項２２】
検出手段が、約500nm-700nmで試料が放出する蛍光を検出する、請求項19〜21のいずれか１項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は試料混合物において異なる種類の脂質分子を区別する分析システムに関する。特に、本発明は、血漿又は血清において特定のリポタンパクの濃度を決定する方法に関する。本発明は、さらに、前記方法を行う装置に関する。
脂質は、生物に存在する異種類の有機化合物である。それらは、水に不溶であるが、有機溶媒に可溶である。脂質は、概して2種類: (i)複合脂質と(ii)単純脂質に分類される。複合脂質は、長鎖脂肪酸のエステルであり、グリセリド、糖脂質、リン脂質、コレステロール、ワックスが挙げられる。単純脂質は、脂肪酸を含有せず、ステロイド(例えば、コレステロール)、テルペンが挙げられる。
脂質は、タンパク質と組合わせて、コレステロールやトリグリセリドのような脂質が血液やリンパ中で運搬される形であるリポタンパクを形成することができる。血漿に見られるリポタンパクは、3つの主な分類: (i)高密度リポタンパク(HDL)、(ii)低密度リポタンパク(LDL)、(iii)超低密度リポタンパク(VLDL)に、中間型リポタンパク(IDL)と共に分かれる。簡潔のために、“血清”という用語が本明細書に用いられるが、“血清”について述べることは、血漿又は血清について述べることと解釈されなければならない。
血漿中の種々のリポタンパクの濃度とアテローム性動脈硬化症のリスク、即ち、心臓発作となり得る、血管壁に有害なプラークの発生との間に強力な関係があることは十分に実証されている。異なる種類のリポタンパク(HDL、LDL、VLDL)が各々アテローム性動脈硬化症において異なる役割を果たすことも知られている。例えば、HDLは抗アテローム生成的であるとみなされるが、LDLは非常にアテローム生成的であることが知られる(アテローム性動脈硬化症発症と密接に相関して担持されるコレステロール)。
それ故、血液中の種々の脂質成分の各々の相対濃度の知識(即ち、リポタンパク)は、これらの脂質の血中濃度が不適当である患者を治療する際に臨床医を援助するので有利である。患者の脂質プロファイルの知識を有することにより、臨床医に最も有利になることが理解される。
【０００２】
血液中の脂質成分の一部の濃度を決定するための分析が開発された。このような分析は、通常、まず最初に患者から血液試料を採取することを必要とし、その後、分析のために臨床検査室に送られる。このような分析は、費用のかかる装置を用いて行われなければならず且つ実際業務の理由のために結果を作成するためにかなりの時間がかかる。このことにより、治療が遅延する。さらにまた、試験を必要とし、それ故、費用がかかる。さらに、ラボにおいて用いられる装置は、容易な携帯用でないので、GP、又は看護婦よって用いることができず、往診、又は家庭用の試験キットとしてさえ行うことができない。“治療時点”でラボ分析を再現することを試みるデバイスが最近開発されたが、これらは、費用がかかり且つ作動させるために専門の使用者を必要とすることがわかった。従って、血清中のリポタンパクプロファイルを分析するための改善された方法を提供することが求められている。
血清は、種々のタンパク質の複合混合物であり、異なる種類のリポタンパクの濃度を分離し直接測定するための方法は既知であるが、このような方法は、複雑で費用がかかる。血清のリポタンパク濃度を決定するための分析の一例は、国際出願公開第01/53829A1号に開示されている。この引例は、蛍光プローブとしての特定の有機発光団、4-ジメチルアミノ-4'-ジフルオロメチルスルホニルベンジリデンアセトフェノン(DMSBA)の使用に関する。K-37として確認されるプローブの式を以下に示す。
【０００３】
【化１】
2008523379.tif 000003
【０００４】
プローブK-37は、水中で発光しないが、リポタンパク水溶液、例えば、血清中で強く発光する。特に、蛍光の強度は血清のリポタンパク含量に非常に依存し、従って、K-37は、存在することができるリポタンパクの濃度を測定するために蛍光プローブとして用いることができる。即ち、K-37は、リポタンパクの脂質と結合したときに蛍光を発し、適切な放射線波長で励起される。従って、リポタンパク混合物の時間分解蛍光減衰の測定は、その混合物に有する異なるリポタンパク(LDLとVLDL)の相対濃度に関して直接の情報を示すために用いることができる。
しかしながら、K-37時間分解蛍光減衰を用いることによる問題は、その測定が複雑であり且つ費用のかかる装置を必要とすることである。さらにまた、得られたデータの高度に技術的なコンピュータ解析を必要とし、正しく説明するために時間がかかってしまう。従って、血液中の脂質成分の濃度を決定するためのK-37時間分解蛍光減衰の使用は、時間分解蛍光減衰を用いてリポタンパク分析を得る時間をかけるよりはむしろ治療の過程を速やかに判断したい場合の臨床医にとって重大な制限を有する。
それ故、プローブK-37による時間分解蛍光分析を用いることにより、試料中の個々のリポタンパクの濃度を決定するのに利用できる方法があったとしても、この方法が多くの制限を有することが理解される。
それ故、本発明の実施態様の目標は、従来技術による問題を取り除くか又は改善するとともに、試料中のリポタンパクの濃度を決定する改善された方法を提供することである。目標は、さらに、前記方法を行う装置を提供することである。
本発明者らは、生体分子におけるリポタンパクを測定するためのK-37の使用に基づいて簡単にした分析を開発した。K-37蛍光測定を用いて血液試料中の全リポタンパク(即ち、HDL、LDL、及びVLDL)の濃度を決定するために、本発明者らは、種々の種類のリポタンパクに結合したプローブ物質からの蛍光応答が、その組成(即ち、試料中のHDL:LDL:IDL:VLDLの比)に関係なく、或る全リポタンパク濃度、即ち、全リポタンパク濃度として実質的に同じはずであることが好ましいと考えた。従って、本発明者らは、プローブ物質から蛍光強度の応答が、臨床検査において直面する試料から予想されるリポタンパク分子の濃度の範囲全体に実質的に直線的でなければならないことが好ましいと考えた。
【０００５】
本発明者らはいかなる仮説によっても縛られたくないが、プローブ物質からの蛍光強度は、試料中の具体的なリポタンパク分子(HDL、LDL、IDL又はVLDL)に対する親和性、そのリポタンパク分子複合体の範囲内の環境による蛍光量子収率、また、一緒に密接に装填されるプローブ分子間のエネルギー転移による蛍光消光の程度に左右されると考えられる。つまり、本発明者らは、簡単な蛍光測定によって全リポタンパクの正確な測定をするために用いることができるプローブ物質の適切な濃度を選ぶことが可能なものであると結論した。本発明者らは、さらに、このようなプローブ濃度が、好ましくは、HDLに対してより高い親和性を有するVLDLとLDLに比較して、HDLにおけるK-37のより高い量子収率、それ故、HDL内のより高程度の消光と釣り合い、全てのリポタンパク粒子に対して一定の蛍光シグナル応答を生じると考えた。
それ故、本発明者らは、真の血清試料において直面するリポタンパク濃度の範囲全体に、プローブ物質、K-37の蛍光と各リポタンパク粒子型(HDL、LDLとVLDL)のリポタンパク濃度との間に直線的で等しい関係を得ることが可能か調べるために一連の実験(実施例1に記載される)を行った。驚いたことに、K-37の蛍光とリポタンパク濃度との間に直線関係があるK-37の所定の濃度があることがわかった。
つまり、本発明の第一態様によれば、試料溶液中の全リポタンパクの濃度を決定する方法であって、
(i)試料の第一アリコートに、プローブ物質が試料中のリポタンパクに結合し、そのように結合した場合に適切な励起下で蛍光を発する、0.1mM-1.0mMのK-37を添加する工程;
(ii)試料中の全リポタンパクの濃度を蛍光分析を用いて決定する工程
を含む、前記方法が提供される。
“全リポタンパク”という用語は、試料中のVLDL、HDL、LDL、IDL、及びカイロミクロンの総体的な濃度を意味する。
有利には0.1-1.0mMのK-37の濃度で、方法の工程(ii)の蛍光測定分析から得られるシグナルの歪みが驚くほどかなり少ないので、全リポタンパクの濃度のより正確な分析が可能である。
【０００６】
試料に添加されるK-37の濃度は、適切には約0.2-1.0mM、より適切には約0.3-0.9mM、さらにより適切には約0.5-0.8mMであるのがよい。試料に添加されるK-37の濃度は、好ましくは約0.65-0.75mMである。0.65mMのK-37が好ましい濃度であり、特に好ましい濃度は約0.7mMのK-37である。
つまり、好ましい実施態様においては、本発明の方法の工程(i)における試料に約0.7mMのプローブ物質、K-37を添加して、本発明の方法の工程(ii)を行う。
本発明者らは、タンパク質を含有する生体試料が分析される場合、多くの実験条件において0.65mMのK-37が有用であるが、0.7mMがこのプローブの好ましい濃度であることがわかった。
第一態様の方法は、好ましくは約400nm-500nm、より好ましくは約420nm-480nm、さらにより好ましくは約440nm-470nmの励起波長で試料を励起することを必要とする。約450-470nmのいかなる波長の励起も特に好ましいが、約450nmの特に好ましい励起波長を用いるのがよい。
本方法は、好ましくは約500-650nm、より好ましくは約520nm-620nmの発光波長で蛍光を観測することを含む。約540nm(又はそれ以上)の特に好ましい発光波長を用いるのがよく、全リポタンパク濃度(即ち、HDL、IDL、LDL及びVLDLの濃度、存在する場合にはカイロミクロンも)を決定するのに最も正確な読み取りが観測されるのがよい。
“蛍光分析”という用語は、まず蛍光を発するように試料を励起させ、その後、蛍光を観測することによる、リポタンパク分析の生成物の蛍光の測定を意味する。
試料は、その中の全リポタンパク濃度の知識が必要とされる食品でもよい。好ましくは、試料は、試験される被検者から得ることができる生体試料である。試料は、あらゆる生体液、例えば、血漿又は血清、又はリンパを含むことができる。試料が血清又は血漿を含むことが特に好ましい。
本発明者らは、試験される試料中の種々のリポタンパクを区別することができれば、本発明の方法を用いて作成することができるリポタンパクプロファイルをさらに改善することができ、さらに詳述することができると考えた。それ故、本発明者らは、種々のリポタンパク分子を区別することが可能であるかを見るためにK-37以外のプローブ物質の使用を調べた。驚いたことに、リポタンパクに結合し且つ結合した具体的なリポタンパクに依存する異なった蛍光応答を示す多くの染料が利用できることがわかった。これらの染料による蛍光測定は、試料中に有するリポタンパクの種類を区別することを可能にする。このことは、リポタンパク混合物におけるリポタンパクの1つの種類によって増強又は減少した蛍光と、検定曲線とK-37分析によって示される全リポタンパク含量の既知の値から決定されるその他のリポタンパク(特異的な特性のリポタンパクの不在下で)から予想される蛍光とを比較することによって行われる。例えば、蛍光色素、ナイルレッドは、HDLがLDLやVLDLのようなその他のリポタンパクより著しく強い蛍光を示した。それ故、本発明者らは、第二プローブ物質(例えば、ナイルレッド、又は具体的なリポタンパクに対して特異性、又は蛍光増強又は減少を示す他のあらゆる親油性プローブ)を、試料中のリポタンパクのクラス又はサブクラスを区別するために用いることができると考えた。このことは、全脂質濃度が決定された後に可能である。
【０００７】
従って、本発明の方法は、さらに、第二プローブを用いてそのリポタンパクに特異的な染料の蛍光応答のずれによって、リポタンパクの具体的なクラス又はサブクラスの濃度を決定することを含むことができる。第二プローブ物質を試料の第二アリコートに添加することができ、プローブがリポタンパクの特定のクラス又はサブクラスに結合し、それに結合した場合に、適切な励起下で蛍光収量を変え、リポタンパクの特定のクラス又はサブクラスの濃度を表す。
この工程は、さらに、方法の工程(i)の後に試料の個別のアリコートにプローブナイルレッドを添加して、試料中のHDLを分析することを含むことが好ましい。このことは、実施例3に詳述される。
好ましくは、ナイルレッドを用いて試料中のHDL濃度を決定するために、計算は、HDLの存在によりナイルレッドからの過剰の蛍光でできていなければならない。第一に、全リポタンパク濃度(測定“A”)が、K-37蛍光とリポタンパク濃度との直線相互関係によって測定される(工程(ii)によって決定される)。
第二に、その後、ナイルレッド蛍光がLDL(及び/又は濃度応答に対する蛍光が本質的に同じでなければならないVLDL)によって種々の濃度で検定されて、勾配“X”と切片“Y”を有する検定曲線を得る。当業者は、LDL(及び/又はVLDL)の濃度の範囲をどのように調製し、各濃度についてそれぞれの蛍光をどのように決定するかを知っている。
第三に、その後、一連の濃度のHDLとLDLの一定の濃度について追加の検定曲線が構成されて、勾配“Z”を得る。第四に、K-37測定“A”から全リポタンパク濃度と未知試料“B”の過剰のナイルレッド蛍光を知ることにより、未知試料中のHDL“C”の濃度は、次式によって決定することができる。
C = (B - (AX - Y))/Z
本発明の実施においてその予め調製された又は標準の検定曲線を用いることができることは理解される。さらに、脂質プロファイル(下記を参照のこと)を作成するために開発されたデバイスは、使用者関与のないHDLレベルの自動計算を可能にする内部標準を有し及び/又は処理手段を有してもよい。
【０００８】
それ故、本発明の方法は、さらに、蛍光分析を用いて試料中のHDL濃度を決定することを含むことができる。本方法は、さらに、プローブ物質ナイルレッドを試料の第三アリコートに添加し、そのプローブがHDLと他のリポタンパクに結合する工程(工程(iii))を含む。適切な励起下で、ナイルレッドは試料中のHDL濃度に比例してますます強く蛍光を発する。この追加工程が本発明の方法において行われる場合、臨床医に非常に有用である、全リポタンパク濃度、及びHDL濃度からなる、試料のさらにより詳細なリポタンパクプロファイルを作成することができる。
本発明者らは、試料中のHDLの定量の正確さと、必要とされたかなりの本発明の努力を改善するために、試料に添加されなければならないナイルレッドの最適濃度を決定するために一連の実験を行った。試料に添加されるプローブ物質ナイルレッドの濃度は、約0.1-1mMであるのがよい。有利には、ナイルレッドのこの濃度で、HDL濃度の濃度のより正確な定量が可能である。
試料に添加されるナイルレッドの濃度は、適切には約0.1-0.9mM、より適切には約0.2-0.7mM、さらにより適切には約0.3-0.6mMであるのがよい。ナイルレッドを試料に約0.4mMの最終濃度まで添加することが特に好ましい。
ナイルレッドの蛍光は、好ましくは、試料を約400nm-650nmの励起波長で励起することによって誘発される。
励起波長は、400nm-650nm、好ましくは約420nm-620nm、さらにより好ましくは約590nm-610nmであることが好ましい。約600nmの励起波長が、その他のリポタンパクと比較した場合にHDLにおいてナイルレッドからの蛍光応答の最大区別(5×)を示すナイルレッドと関連して用いることができる。これらの励起波長が使われる場合、下でより詳述されるヒト血清アルブミン(HSA)について“脂肪酸及び薬剤結合ドメイン”を遮断する物質を用いることが好ましい。
ナイルレッドから得られた蛍光は、その後、約540-700nm、より好ましくは約570-650nmの発光波長で観測され測定される。約620nmの好ましい発光波長を用いるのがよく、HDLの濃度を決定するのに最も正確な読み取りが観測されるのがよい。
【０００９】
本発明者らは、本発明の方法に用いられる個々の分析の正確さをさらに改善することが可能かを調べ、そのように約30-50mg/mlの濃度を有する血清の主成分であるヒト血清アルブミン(HSA)に対する注意にした。
HSAは、種々のリガンドを結合することができる少なくとも2種類の結合部位を有することが知られる。第一の種類は、本明細書では“疎水性ドメイン”と呼び、ドメインの第二の種類は、本明細書では“薬剤結合ドメイン”と呼ぶ。これらのドメインは、当業者に既知であり、Nature Structural Biology (V5 p827 (1998))における論文では互いに区別されている。この論文は、脂肪酸が結合することができるものとして疎水性ドメインを同定し、薬剤結合ドメインはHSAと会合することができる多くの薬剤を結合することができる。
それらの実験から、本発明者らは、驚くべきことに、プローブ物質K-37とナイルレッド双方が、HSAの疎水性結合部位/ドメインに個々に結合することができることを確立した。つまり、K-37とナイルレッドは、共にHSAのリガンドである。さらに、驚くべきことに、本発明者らは、HSAに結合した場合、K-37とナイルレッドが蛍光を発することがわかった。それ故、本発明者らはいかなる仮説にも縛られたくないが、本発明者らは、K-37のこの追加の蛍光が、HSAに結合した場合に、実質的な背景シグナルを生じるものであり、本発明の方法の工程(ii)における全リポタンパクの濃度の定量において歪ませて有意な誤差になるものと考える。同様に、本発明者らは、ナイルレッドのこの追加の蛍光が、HSAに結合した場合に、実質的な背景シグナルを生じるものであり、この追加の工程が本発明の方法に用いられる場合に全リポタンパクの濃度の定量において歪ませて有意な誤差になるものと考える。
結果として、本発明者らは、HSAによる、リガンドK-37、及びリガンドナイルレッドの結合を阻害する作用を調べた。特に、プローブK-37やナイルレッドが結合し蛍光を発するHSAの疎水性結合部位を遮断することを試みた。この実験は、実施例3と実施例4に記載される。本発明者らはいかなる仮説によっても縛られたくないが、驚いたことに、リガンドK-37と疎水性結合部位との結合を阻害することにより、リガンド結合阻害剤が添加されなかった場合より試料中の全リポタンパクの濃度のより正確な基準であるリポタンパク分子(HDL、LDL、VLDL)に結合した場合のプローブ物質の蛍光が得られることがわかった。本発明者らは、また、リガンドナイルレッドのHSAへの結合を阻害することによりHDL定量の正確さが改善されることがわかった。
【００１０】
従って、本発明の方法は、試料に、プローブ物質(K-37及び/又はナイルレッド)のHSA、好ましくはその疎水性結合部位への結合を実質的に阻害するように適合されるリガンド結合阻害剤を添加することを含むことが好ましい。工程(i)の前に又は工程(i)と同時にリガンド結合阻害剤が試料に添加されることが特に好ましい。HDL分析を行うために、ナイルレッドが添加される別個のアリコートに阻害剤を添加することも好ましい。
リガンド結合阻害剤は、疎水性であってもよい。阻害剤は、両親媒性であってもよい。リガンド結合阻害剤は、脂肪酸又はその官能性誘導体、また、他の疎水性分子を含んでもよい。HSAの疎水性結合部位を遮断することができる脂肪酸の適切な誘導体の例は、脂肪酸、そのエステル、アシルハライド、カルボン酸無水物、又はアミド等を含むことができる。好ましい脂肪酸誘導体は、脂肪酸エステルである。
脂肪酸又はその誘導体は、C1-C20脂肪酸又はその誘導体を含むことができる。脂肪酸又はその誘導体は、好ましくはC3-C18脂肪酸又はその誘導体、より好ましくはC5-C14脂肪酸又はその誘導体、さらにより好ましくはそのC7-C9脂肪酸又は誘導体を含むことができる。
リガンド結合阻害剤は、オクタン酸(C8)又はその誘導体、例えば、オクタン酸塩を含むことが特に好ましい。好ましくは、リガンド結合阻害剤は、アルカリ金属オクタン酸塩、好ましくはI族アルカリ金属オクタン酸塩、例えば、オクタン酸ナトリウム又はカリウムとして添加される。
好ましくは約10-400mM、より好ましくは約20-200mM、さらにより好ましくは約50-150mMのリガンド結合阻害剤が、本方法の工程(i)を行う前に試料に添加される。約100mMの阻害剤が添加されることが特に好ましい。つまり、本方法の好ましい実施態様において、約100mMのオクタン酸ナトリウムは、工程(i)を行う前に又は工程(i)を行うと同時に試料に添加することができる。
本発明の方法が工程(iii)におけるナイルレッドの使用に達する場合、好ましくは約10-400mMのリガンド結合阻害剤が試料に添加され、より好ましくは約20-200mM、さらにより好ましくは約50-150mMが添加される。約100mMの阻害剤が用いられることが最も好ましい。つまり、本方法の好ましい実施態様において、約100mMのオクタン酸ナトリウムが、ナイルレッドを添加し、本方法のHDL分析を行う前に試料の第三アリコートに添加される。
【００１１】
本発明の好ましい実施態様において、リガンド結合阻害剤、例えば、約100mMのオクタン酸ナトリウムは、まず、本方法の工程(i)において全リポタンパク濃度の蛍光測定を行う前に、約0.7mMのK-37プローブを有する、試料から取った第一アリコートに添加される。他の実施態様において、リガンド結合阻害剤、例えば、約100mMのオクタン酸ナトリウムは、まず、本方法においてHDL濃度の蛍光測定を行う前に、約0.4mMのナイルレッドプローブを有する、第三アリコートに添加される。
有利には、K-37プローブの所定の濃度と組合わせたリガンド結合阻害剤により、全リポタンパク(及びナイルレッドプローブが添加される場合HDL濃度)の非常に正確な測定が得られる。
実施例1及び実施例3は、染料K37の蛍光測定が試料中の全リポタンパクの濃度を決定するためにどのように用いることができるか、また、ナイルレッドの蛍光測定が試料中のHDLの濃度を決定するためにどのように用いることができるかを示すものである。いずれの染料も450nmの波長で励起することができ、染料の発光は540nm以上の波長で測定することができる。実施例には、リガンド結合阻害剤によりHSAを遮断して、K-37やナイルレッド蛍光によって得られる結果の正確さを改善することが記載される。それ故、本発明者らは、リポタンパク組成物を分析するための単一の平行法を作成することが可能であると考えた。
つまり、好ましい方法は2つの分析(全リポタンパクとHDL)からなり、ほとんど同時に結果が得られる。臨床医は、ある治療の過程を判断するためにこの情報を用いることができる。
本発明者らは、さらに、ナイルレッドが上で述べたHSAについての薬剤結合ドメインと相互作用することがわかった。この薬剤結合ドメイン用のリガンドとしては、チロキシン、イブプロフェン、ジアゼパム、ステロイドホルモン及びそれらの誘導体(薬剤)、ヘム、ビリルビン、親油性プロドラッグ、ワルファリン、クマリンベースの薬剤、麻酔薬、ジアゼパム、イブプロフェン及び抗うつ剤(例えば、チオキサンチン)のような薬剤分子が挙げられる。
【００１２】
本発明者らは、この薬剤結合ドメインを遮断するために物質を用いることができ、且つこれによりナイルレッドによる分析結果の改善がさらに得られることがわかった。上記の薬剤、又はこのドメインに対して親和性を有する他のいかなる分子も、HSAの薬剤結合ドメインを遮断するための物質として用いることができる。しかしながら、安息香酸又はその誘導体(例えば、トリクロロ安息香酸又はトリヨード安息香酸)が、薬剤結合ドメインを遮断するために用いられることが最も好ましい。
それ故、本発明の最も好ましい実施態様は、患者から血液試料を採取すること、その後、血液細胞から血清を分離することを含むのがよい。このことは、既知の技術、例えば、ろ過又は遠心分離によって達成することができる。その後、血漿を3つのアリコートに分離することができ、それぞれが蛍光分析にかけられて脂質成分の濃度が決定される。第一アリコートは、試料中の全リポタンパクの濃度を決定するために用いることができ; 第二アリコートは、試料中の全リポタンパクの濃度を知っている試料中のHDL濃度を決定するために用いることができる。
第一アリコートに、HSAリガンド結合阻害剤、例えば、オクタン酸ナトリウムを添加することができる。工程(i)における第一アリコートにプローブK37を、好ましくは約0.7mMの最終濃度まで添加されることが好ましい。その後、第一アリコートは、プローブが蛍光を発するように約450nmで励起させることができる。その後、540nm以上の発光波長で蛍光を測定することができる。その後、この値から、試料中の全リポタンパク(HDL、LDL、IDL及びVLDL及び存在する場合にはカイロミクロン)の濃度を決定することが可能である。
第二アリコートに、HSAリガンド結合阻害剤、例えば、オクタン酸ナトリウムを約100mMの最終濃度まで添加することができる。安息香酸のようなHSAの薬剤結合ドメインに結合する物質を、1-10mM又はより詳しくは約5mMの濃度まで添加されることもできる。その後、プローブナイルレッドを約0.4mMの最終濃度まで添加することができる。その後、この試料を、プローブが蛍光を発するように約600nmで励起させることができる。蛍光は、約620nmの発光波長で測定することができ、その後、この値から、実施例3に記載されるように、試料中のHDL濃度を決定することが可能である。
【００１３】
本発明の最も好ましい実施態様において、本発明は、
(A)生体試料から採取された第一アリコートに100mMのオクタン酸ナトリウム(リガンド結合阻害剤)を約0.7mMのK-37プローブと共に添加し; 約450nmで励起し; 約540nmの発光波長で、本方法の工程(i)における全リポタンパク濃度の蛍光測定を行う工程; 及び
(B)試料から採取された第二アリコートに100mMのオクタン酸ナトリウム(リガンド結合阻害剤)と5mMの安息香酸ナトリウム(HSAの薬剤結合ドメインを遮断する物質)を約0.4mMのナイルレッドと共に添加し; 約600nmで励起させ; 約620nmの放出波長で蛍光測定を行ってHDL濃度を決定する工程; 及び
(C)本発明の方法の工程(ii)の全リポタンパク濃度と、HDL濃度を算出する工程
を含むことができる。
第一態様の方法を開発することに加えて、本発明者らは、また、本方法を行う装置を開発した。
つまり、本発明の第二態様によれば、試料中の全リポタンパク濃度を決定する装置であって、リポタンパク分析を行うための反応リザーバー; 第一態様の方法に必要とされる試薬を含有するように適合された密封手段; 蛍光を発するように試料を励起させるのに作用可能な手段; 及び試料によって放出される蛍光を検出するのに作用可能な検出手段を備えている、前記装置が提供される。
好ましくは、装置は、反応リザーバーにおいて試料と試薬を混合するための手段を備えている。
好ましくは、装置は、多くのタイプのリザーバーを備えている。
第一タイプのリザーバーは、試料を含有するためのものであり、本明細書では試料リザーバーと呼ばれる。
反応リザーバーは、第二タイプのリザーバーであってもよく、試料アリコート中のリポタンパク濃度を決定する分析を行うことができる(試料と試薬の導入後)。装置は、単一反応リザーバーを備えてもよく、異なる試料アリコートによる反応の間に洗い流すことができる。或いは、複数の(例えば、単一使用)反応リザーバーを励起手段と接触させることもできる。
【００１４】
密封手段は、K-37染料と全リポタンパク分析(例えば、リガンド結合阻害剤)のための他の試薬を含有する第三リザーバー(第一試薬リーザバ)を備えることができる。HDLが決定される(例えば、ナイルレッドを用いて)場合、密封手段は、ナイルレッド染料とHDLを決定するための他の試薬(例えば、リガンド結合阻害剤、HSAの薬剤結合ドメインを遮断するための物質)を含有する第四試薬リザーバー(第二試薬リザーバーを備えることができる。或いは、K-37試薬とナイルレッド試薬は、個別の密封手段に含まれてもよい。従って、K-37分析のための試薬は、第一密封手段における第一試薬リザーバーの中にあってもよく、ナイルレッド分析のための試薬は、第二密封手段における第二試薬リザーバーの中にあってもよい。
励起手段と光学接触させることができるように反応リザーバーが配置されることが好ましい。分析から得られる蛍光が検出手段によって検出することができるように反応リザーバーが配置されることが好ましい。
ある実施形態において、試料が反応リザーバーに直接導入することができるようにデバイスを設計することができることが理解される。これにより、第一リザーバー又は試料リザーバーが取り除かれる。
好ましい実施態様において、第一試薬リザーバは、適切な希釈剤中のプローブ物質、K-37を含有し、HSAリガンド結合阻害剤、例えば、オクタン酸ナトリウムをさらに含有することができる。
第二試薬リザーバは、プローブ物質ナイルレッドを含んでもよく、また、HSAリガンド結合阻害剤、例えば、オクタン酸ナトリウムを含でもよく、また、HSAについての薬剤結合ドメインを遮断するための物質、例えば、安息香酸を含んでもよい。
装置は、リーダー及び、好ましくは、それとともに機能的に連通して配置されるように適合されたカートリッジを備えてもよい。好ましくは、カートリッジは、リーダーに挿入されるか、又は取り付けられてもよい。リーダーは、カートリッジが挿入されるドッキング手段を備えることができる。ドッキング手段は、スロットであってもよい。つまり、好ましくは、カートリッジはリーダーから取り外し可能である。
【００１５】
カートリッジは、密封手段及び反応と試料のリザーバー(存在する場合)を備えるか、又は各々備えてもよい。つまり、検定用試薬を担持するカートリッジは、一旦試薬が使い尽くされると、リーダーから取り出すことができ、新規な検定用試薬を含有する新規なカートリッジと取り替えられる。自己充足的なカートリッジ(全てのリザーバーを備える)は、使い捨ての反応カートリッジとして容易に用いることができることは理解される。カートリッジは、リーダーから簡単に除去され、試薬を含む新規なカートリッジと取り替えることができ、試料アリコートは、反応リザーバー又はカートリッジ内のリザーバーに配置されてもよい。
リーダーは、励起手段、好ましくは、検出手段を備えてもよい。
好ましくは、装置は、検出された蛍光に基づき試料中のコレステロールと全リポタンパクの濃度を決定するように適合された処理手段を備えている。好ましい実施態様において、処理手段は、また、蛍光分析に基づき試料中のHDLの濃度を決定するのに適合されている。処理手段は、全リポタンパク、及びHDLの濃度に基づき試料中のLDL、VLDL及びIDLの濃度を算出するように適合されていてもよい。
装置は、全リポタンパクの濃度、好ましくは、試料中のHDLの濃度を示すための表示手段を、好ましくは読み出しとして備えてもよい。例えば、表示手段は、LCD画面を備えることができ、又は電力を供給及び/又はコンピュータ計算のためのコンピュータ及び/又はディスプレイに依存してもよい。
好ましくは、装置は、携帯用であり、患者から試料を採取し、その後、試料が採取される部位で分析を行うことにより、患者の脂質プロファイルを作成するために用いることができる。試料は、あらゆる生体液、例えば、血液、血清、リンパ等であってもよい。
好ましくは、励起手段は、約400nm-500nm(K-37分析の場合)で、ナイルレッド分析の好ましい実施態様の場合、約600nmで、試料を照射するように作用可能な照明光源を備えている。従って、光源は、好ましくは約400nm-600nmで試料を照射することができる。照明光源は、電球又は1以上のLEDを備えることができ、励起波長は、450nmの干渉フィルタ及び600nmの干渉フィルタを用いて変えることができる。励起手段は、照明光源によって得られる光を偏光させるように作用可能な偏光手段を備えることができる。励起手段は、試料に光を集中させるように適合された集光手段を備えることができる。集光手段は、レンズを備えることができる。
【００１６】
好ましくは、検出手段は黄-赤感光性であるフォトダイオード又はフォトマルチプライヤを備えている。試料によって放出される蛍光は、K-37について、好ましくは約500nm-650nm、より好ましくは540nm以上の長い波長で検出される。検出手段は、ナイルレッドを含む分析の場合、620nmで放出される蛍光を検出することができなければならない。蛍光は、第二レンズによって集めることができ、偏光板を通過させることができる。散在する励起光は、遮断フィルタによって除去することができる。蛍光強度の測定のために、フォトダイオードから電流又はフォトマルチプライヤからカウント速度は、電流計、電圧計又は計数率計モジュールから読み取ることができる。
一実施態様において、装置は、2つ(以上)カートリッジを受容するように適合されているリーダーを備えることができる。このようなリーダーは、各反応リザーバーと整列させ得る2つ(又はそれ以上)の励起手段を備えることができる。さらに、装置は、各反応リザーバーのための検出手段を備えることができる。
装置は、また、光源の変動を考慮することができるように励起修正システムを備えることができる。装置は、リポタンパクの濃度を決定する前の調整に用いられる少なくとも1つの蛍光標準を備えることができる。標準は、内部標準であるのがよい。
従って、装置は、同時に又はカートリッジがリーダーに入るにつれて又はその後のある時点で、各分析の蛍光強度を検出し測定し、それによって全リポタンパク濃度、及びHDL濃度からなるリポタンパクプロファイルを作成するように構成される。
有利には、第二態様の装置は、迅速且つ容易な分析を行うために用いることができ、生体液から脂質プロファイルを作成するために同時に行うことができる。コレステロール、リポタンパク、及びHDL濃度の知識をもつ臨床医は、治療の有効過程を判断することができる。さらに、装置は、携帯用であり、GP、又は家庭訪問を行う看護士によって、又は家庭用の試験キットとしてさえ用いることができる。
本明細書に記載される特徴の全て(添付のあらゆる請求の範囲、要約及び図面を含む)、及び/又はそのように開示されるあらゆる方法又はプロセスの工程の全ては、このような特徴及び/又は工程の少なくとも一部が互いに排除する組合わせを除いて、上記の態様のいずれかとあらゆる組合わせで組合わせることができる。
本発明のより良好な理解のために、また、本発明の実施態様がどのように実施することができるかを示すために、ここで、一例として、添付の図面を参照する。
本発明者らは、蛍光プローブの使用を調べて試料中の全リポタンパクとHDLの濃度を決定して、患者のためのリポタンパクプロファイルを作成するために一連の実験を行った。患者のためのリポタンパクプロファイルの知識は、臨床医が治療の具体的な過程を判断するのを援助するのに有利である。以下の実施例に記載されるこれらの実験の結果は、その後、本発明の方法及び装置を開発するために用いた。
【実施例】
【００１７】
実施例1-全リポタンパク濃度の測定
本発明者らは、一連の試料において全リポタンパク(全ての脂質がリポタンパクに結合する考えられるので、全トリグリセリドとコレステロールとコレステロールエステル類に等しくなる)の濃度を検出するために蛍光色素K-37の使用を調べた。染料K-37は、当業者に既知であり、容易に利用できる。染料を、まず、所定の波長で励起させ、その後、後述するように他の所定の波長で蛍光を測定する。蛍光強度を用いて、試料中の全リポタンパクの濃度を算出する(即ち、本発明の方法の工程(ii))。
方法
ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解した染料、K-37を、リン酸緩衝食塩水に溶解したHDL、LDL、及びVLDLの濃度系に種々の濃度の範囲で添加した。実験の目的は、実在の血漿又は血清試料において直面するリポタンパク濃度の範囲全体に、各粒子タイプ(HDL、LDL、及びVLDL)に対する蛍光とリポタンパク濃度との間の直線的及び同等の関係を得ることであった。蛍光強度は、パーキン・エルマーLS50蛍光計にて450nmの励起波長と540nmの発光波長で測定した。
結果
図1〜図3は、リン酸緩衝食塩水中のHDL、LDL、及びVLDLにおいて、3つの濃度、即ち、0.4mM、0.65mM、及び0.9mMのK-37について蛍光強度と全リポタンパク濃度を示すグラフである。各々の系(上の0.4mM、中の0.65mM、下の0.9mM)に対して直線の一致のR2値を示す。同じデータを、図4〜図6においてプロットし、K-37濃度によって分類する。
【００１８】
実験からの結論は、以下のことである。
1) 3つのリポタンパク粒子の種類(HDL、LDL、及びVLDL)全てについて、R2は、0.65mMのK-37濃度において全リポタンパク濃度と蛍光強度との間に良好な直線関係があることを示す。良好な直線関係は、LDLとVLDLにおいて0.9mMのK-37にも見られるが、HDLにおける0.9mMのK-37の直線性は少し不十分である。直線性は、0.4mMのK-37よる全てのリポタンパクについて不十分である。直線性が不十分である濃度でもなお作用するが、より正確でないことは、注目に値する。しかしながら、非直線性は、多項式フィッティングを用いて処理することができる。
2) 2つの因子が直線性に影響を及ぼすと考えられる。低染料濃度において、高い全リポタンパク濃度で応答から平坦になる。本発明者らはいかなる仮説によっても縛られたくないが、充分にリポタンパク粒子を充分に占有するのに利用できる染料が不十分であることからこのことが起こると考えられる。高染料濃度において、低い全リポタンパク濃度による応答は平坦である。このことは、染料が非常に密接に粒子に詰まる場合の蛍光の自己消光による。
3) 0.65mMのK-37濃度は、リン酸緩衝食塩水中で測定した場合の適切な範囲全体に全てのリポタンパク粒子の種類について直線的で非常に類似した蛍光応答を示す。
従って、その後、0.65mMのK-37を一連のHDL/LDL/VLDL混合物に添加し、上記の通りに蛍光強度を測定した。データを図7に示す。見ることができるように、全リポタンパク濃度は、蛍光強度(R2 = 0.9983)と極めて相関し、K-37(0.65mM)のこの濃度は、全リポタンパク濃度の非常に正確な測定に適していることが確認される。患者からの生体試料にこれを適用する場合、発明者らは、高脂質濃度である曲率を見た。その結果として、0.7mMのK-37の濃度は、血清又は血漿に用いられる最適K-37濃度として選ばれた。つまり、この濃度は本発明の方法に最も適した濃度として選ばれた。
【００１９】
実施例2-HSAの遮断 
その後、本発明者らは、本発明の方法を最適化するためにさらに研究を行った。このために、HSAが疎水性結合部位を有し、それにK-37が結合し蛍光を発すると考えた。HSAに結合した場合にK-37のこの追加の蛍光は、実質的な背景シグナルを生じ、歪ませ、それによってリポタンパク分子、即ち、HDL、LDL及びVLDLの測定において有意な誤差が生じる。それ故、追加の蛍光が最小にし得るかを見るために、リガンド結合阻害剤、例えば、オクタン酸ナトリウムでHSA上の疎水性結合部位を遮断することを決めた。このようにしてK37とHSAとの結合を阻害すると、K37蛍光測定を用いて得られる結果の正確さが改善されることが想定された。
方法
染料K37を、50mg/mlのHSAの存在下と不在下で5mMの全脂質濃度のLDLに0.5mMの濃度で添加した。リガンド結合阻害剤として作用する、0.1Mオクタン酸ナトリウムを添加して、また、添加せずに測定を行った。
結果
蛍光強度を全ての試料について測定し、下記の表1にまとめる。
【００２０】
表1
2008523379.tif 000004
【００２１】
結果は、LDLのみにおけるK-37の蛍光強度が213500単位であることを示している。オクタン酸塩がLDLに添加される場合のK-37の蛍光強度は、209700単位(即ち、オクタン酸塩を含まない場合とほぼ同じ)であり、オクタン酸塩の存在がそれ自体でLDL結合したK-37の蛍光強度に関与しないことが示される。HSAに結合したK-37の蛍光強度は79300単位であるが、HSAとオクタン酸塩の存在下のK-37は3600である。これにより、HSAがK-37蛍光に関与し、それ故、妨害シグナルであることが示される。オクタン酸塩を添加すると、妨害が著しく低下し、それによりHSAの破壊的な作用が取り除かれる。それ故、結果は、LDLにおいてオクタン酸塩の存在下にHSAとのK-37について蛍光強度の大きな抑制を示しているが、K37蛍光に対してほとんど作用しないことを示している。これにより、オクタン酸塩は、HSA上のK-37結合部位を遮断することで著しく成功し、K-37蛍光が全リポタンパク濃度の真の基準になることが示された。
従って、本発明者らは、HSAの疎水性結合部位を結合するオクタン酸塩のようなリガンド結合阻害剤を、K-37の蛍光を測定する前に血液試料に添加して、全リポタンパク濃度の正確さを改善することができると考える。さらに、本発明者らによって、この技術が、他のリガンドのHSAの疎水性結合部位への結合を遮断するとともにそれにすでに結合しているものであり且つオクタン酸塩よりHSAに対する親和性が低いリガンドを置き換えるために用いることもできることも示される。この研究に続いて本発明者らは、0.7mMのK37と100mMのオクタン酸が最適であることがわかった。
【００２２】
実施例3-HDLの測定
本発明者らは、その後、血液試料中に有するリポタンパクの異なる種類を区別することが可能であるかを調べた。つまり、リポタンパクの種類が識別可能かを見るために、K-37以外の蛍光プローブ、例えば、ナイルレッドを用いることの効力を試験した。驚いたことに、K-37の代わりにナイルレッドを用いることにより、血液試料中のHDLの濃度を決定することが可能であることがわかった。
方法
測定の原理は、プローブナイルレッドが、LDL、及びVLDLよりHDLがさらに蛍光性であることであり、後者は濃度による蛍光応答が非常に類似しているが同一でない。ナイルレッドの構造を図8に示す。測定は、計算がHDLにおけるナイルレッドからの過剰蛍光でなされるにちがいなく、単に全てのリポタンパクの全体の蛍光でないので、全リポタンパクについてのK37測定よりさらに複雑である。手順は、以下の通りである。
1) 検定
ジメチルホルムアミドに溶解した0.5mMナイルレッドを通常4〜10mMの種々の全リポタンパク濃度のLDLと混合した(典型的には50マイクロリットルの染料を、50マイクロリットルのリポタンパク及び1mlのリン酸緩衝食塩水と混合する)。試料を分光蛍光計に入れ、蛍光強度を測定した(励起波長450nm、発光波長600nm)。蛍光強度をLDL全脂室濃度に対してプロットし、図9に示されるように勾配“X”と切片“Y”を有する直線検定ラインを得た。
その後、手順を、LDLとHDLの混合物について繰り返した。HDLを0〜3.0mMの濃度で添加し、LDLを全ての試料について6mMの全リポタンパク濃度を保持するように添加した(しかし、3-12mMが限度である)。その後、これらの試料についての蛍光強度を測定した。その後、図10に示されるように、プロットをHDLの存在による過剰蛍光で行い、“勾配”Zを有する直線検定ラインを得た。
2) 未知の測定
ジメチルホルムアミドに溶解した0.5mMのナイルレッドを、検査によって試料と混合した。試料を蛍光計に入れ、上記検定と同じ条件下で蛍光強度を測定した。
【００２３】
3) HDL濃度の計算
HDLの計算には、K37の蛍光強度から、例えば、測定され得るがそれに限らない、全リポタンパク濃度“A”の知識が必要である。具体的な試料について、試料がHDLを含まない場合に予想される蛍光強度は、図10に示される検定ラインから得られる。(測定された蛍光強度)-(この算出蛍光強度)は、HDLが試料中に存在することによる過剰蛍光である。
その後、未知試料におけるHDL濃度“C”は、図15に示される検定ラインと次式を用いて得ることができる。
C = (B - (AX - Y))/Z
実在の臨床試料において予想される濃度の範囲をカバーするように意図されるHDL/LDL/VLDL混合物の濃度の範囲を調製した。上記検定データを用いて混合物からHDL濃度を算出した。図11は、実際のHDL濃度とナイルレッド蛍光から決定されるHDL濃度との間の誤差を示すグラフであり、わずかに約0.15mMの最大誤差が示されている。本発明者らは、さらに、0.4mMである血清の試料に用いられる濃度のナイルレッドを精製した。
これらのデータの結果として、本発明者らは、試料中に存在するリポタンパクの種類を区別するとともに染料ナイルレッドを用いてHDL濃度を決定することが可能であることを示した。
実施例2に記載される知見に従って、HSAの疎水性結合部位を遮断するオクタン酸塩の添加に関して、本発明者らは、その後、ナイルレッドも、HSAに結合し、蛍光を発することを見出した。HSAに結合した場合のナイルレッドこの追加の蛍光も実質的な背景シグナルを引き起こし、歪ませ、それによってHDL測定において有意な誤差が生じる。それ故、K-37遮断と同じリガンド結合阻害剤、即ち、オクタン酸ナトリウムでHSAにおける疎水性結合部位を遮断すると決めた。ナイルレッドとHSAで行われる実験は、実施例2に記載されるものに基づき、すべて0.5mMのナイルレッドを用いた。
【００２４】
表2:
2008523379.tif 000005
【００２５】
表2に示される結果は、LDL単独におけるナイルレッドの蛍光強度が187.532単位であることを示している。オクタン酸塩がLDLに添加される場合のナイルレッドの蛍光強度は、183.786単位(即ち、オクタン酸を含まない場合とほぼ同じ)であり、オクタン酸塩の存在が、それ自体でLDL結合したK-37の蛍光強度に関与しないことが示される。HSAに結合したナイルレッドの蛍光強度は、58.905単位であるが、HSAとオクタン酸塩の存在下のナイルレッドは、9.118である。これにより、HSAがナイルレッド蛍光に関与し、それ故妨害シグナルであることが示される。オクタン酸塩を添加するとこの妨害がかなり低下し、それによって試料におけるHSAの破壊的な作用が取り除かれる。それ故、結果は、LDLにおいてオクタン酸塩の存在下にナイルレッドとHSAについて蛍光強度の大きな抑制を示しているが、ナイルレッド蛍光に対してほとんど作用しないことを示している。
これにより、オクタン酸塩は、HSA上のナイルレッド結合部位を遮断することで著しく成功し、ナイルレッド蛍光がリポタンパク濃度の真の基準になることが示された。従って、本発明者らは、HSAの疎水性結合部位に一致することができるオクタン酸塩のようなリガンド結合阻害剤を、ナイルレッドの蛍光を測定する前に血液試料に添加して、リポタンパク(HDL)濃度の正確さを改善することができると考える。この研究に続いて本発明者らは、0.4mMのナイルレッドと50mM、又はより好ましくは100mMのオクタン酸塩が血清試料の分析に最適であることがわかった。
実施例6は、さらに、HSAの薬剤結合ドメインに結合する物質(例えば、安息香酸)の添加によってナイルレッドによる蛍光測定をさらに改善することができることによる開発研究を記載する。
【００２６】
実施例4−リポタンパクプロファイルを作成する同時分析
実施例1及び3は、染料K37の蛍光測定が試料中の全リポタンパクの濃度を決定するためにどのように用いることができるか、また、ナイルレッドの蛍光測定が試料中のHDLの濃度を決定するためにどのように用いることができるかを示すものである。実施例2は、K-37蛍光によって得られる結果の正確さを改善するためにHSAを遮断することを記載するものである。
それ故、本発明者らは、患者の血液試料の脂質組成を分析してその患者のためのリポタンパクプロファイルを作成するための単一の平行法を作ることが可能であると考えた。好ましい方法は2つの分析からなり、そのいずれもが非常に類似した条件下で行うことができ、つまり、非常に急速に結果を得ることができる。臨床医は、治療の過程を判断するためにこの情報を用いることができる。
方法
血液試料を、まず最初に患者から採取し、その後、確立した従来の技術を用いて遠心分離し、血清を分離する。その後、血清を2つの1mlアリコート(a & b)に分け、それぞれを生化学分析にかけ、脂質成分の濃度を決定する。後述するように、アリコート(a)を、全リポタンパクの濃度を決定するために用い、アリコート(b)を、HDLの濃度を決定するために用いる。
アリコート(a) - HSAリガンド結合阻害剤、オクタン酸ナトリウムを、上の実施例2に記載されるように、100mMの濃度まで1mlの血清に添加する。その後、ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解したプローブK-37を試料に0.7mMの最終濃度に撹拌しながら徐々に添加した。その後、プローブが蛍光を発するように試料を450nmで励起させた。蛍光を520nm又は540nmの発光波長で測定し、この値から、上記実施例1のように、試料中の全リポタンパク(HDL、LDL、及びVLDL)の濃度を決定することは可能であった。
アリコート(b) - HSAリガンド結合阻害剤、オクタン酸ナトリウムを、上の実施例3に記載されるように、50mM又は100mMの濃度に1mlの血清に添加する。さらに、安息香酸を、5mMの濃度に血清に添加してもよい。その後、プローブナイルレッドを、0.4mMの最終濃度に試料に撹拌しながら徐々に添加した。その後、プローブが蛍光を発するように試料を600nmで励起させた。蛍光を620nmの発光波長で測定し、この値から、上記実施例3のように、試料中のHDL濃度を決定することは可能であった。
【００２７】
実施例5-リポタンパク質プロファイルを作成するためのデバイス
図12-14を参照すると、本発明者らによって開発される携帯用のデバイスが示され、患者の脂質プロファイルを作成するために用いることができる。デバイスは、図12に詳細に示されるカートリッジ1及び図13と図14に詳細に示されるリーダー50からなる。
カートリッジ1は、本発明の分析を行うために流体を流すことができる一連の相互接続リザーバーを有する。カートリッジ1は、カートリッジ1で行われるこれらの分析の各々について蛍光強度を検出し測定するためにスロット52によってリーダー50に接続する。
図12を参照すると、カートリッジ1は、試料リザーバー2を有し、血液のような患者から採取された生体液が含まれている。フィルタ18は、血液から血液細胞を除去するために設けられ、分析が行われる血漿又は血清又は他の体液が残る。流体を、2つのアリコート(実施例4に記載されるようにaとb)に分け、チャネルに沿ってそれぞれ反応リザーバー4、6、8に押し付ける。
K-37とオクタン酸ナトリウムを含有する2つの試薬リザーバー10、12は、それぞれ、リザーバー4(アリコート(a))に接続される。染料とオクタン酸をリーザバー4に押し付け、全リポタンパク分析を開始する。
2つ試薬リーザバー16、17は、ナイルレッドを含有し、オクタン酸ナトリウム+任意の安息香酸をそれぞれ反応リザーバー8(アリコート(b))に接続する。ナイルレッドとオクタン酸塩をリザーバー8に押し付け、流体と混合し、HDL分析を開始する。
ナイルレッド; 及びHSA遮断剤(例えば、オクタン酸ナトリウムと安息香酸-実施例8を参照のこと)を含有する2つの試薬リザーバー16、17は、それぞれ、反応リザーバー8(HDLを決定するために)に接続される。ナイルレッドとHSA遮断剤をレザバー8に押し付け、流体と混合し、HDL分析を開始する。2つのリザーバ、12、17の代わりにオクタン酸ナトリウムを含有するために1つだけの試薬リザーバを有することが可能なものであること、また、オクタン酸が必要に応じて反応リザーバ4、8にこの1つのリザーバから供給することができることが理解される。カートリッジは、また、リーダー50を調整するために用いることができる蛍光標準20、24を含むことができる。
【００２８】
装置(即ち、カートリッジ1とリーダー50)の一実施態様において、反応リザーバー4、8において2つの分析が行われる。カートリッジ1は、図13に示されるように、リーダー50の前面のスロット52に接続する。カートリッジ1をリーダー50に入れると、リーダー内に有する、2つの反応リザーバー4、8が各々対応する励起源(光源30、34)と対応する検出手段(フォトダイオード36、40)と整列する。他の一実施態様において、リーダー50は、各リザーバー4、8について別個のLEDの代わりに、唯一の光源又はLEDを有する。
LED(又はLEDからのガイド) 30、34は、各々対応する分析に各々の分析生成物が蛍光を発するように必要とされる蛍光励起照明を備えている。LED 30、34の各々からの光の波長は約450-470nmであり、分析のある実施態様については約600nmであってもよい。光は、適切な反応リザーバー4、8に進む前に、450nm又は600nm干渉フィルタ（図示せず）を通過することができる。リーダー50は、励起修正システム46を有してもよい。つまり、2つの分析(a、及びb)の蛍光は、レンズ又は同様の収集光学系によって集められ、分析aについて偏光板を540nmの波長で(全リポタンパク)、また、分析bについて約600nm又は620nmの波長で通過することができる。或いは、共通の偏光板は、いずれの分析にも用いることができる。蛍光強度の測定のためには、フォトダイオード36、40の電流出力が増幅され、電流又は電圧として読み取られる。
従って、リーダー50は、カートリッジ1を保持して3つの分析の各々の蛍光強度を検出し測定して、それによって全リポタンパク濃度及びHDL濃度を決定するように構成される。一実施態様においては、装置は、LCD読み出し表示42を有し、血液成分の各々の濃度が示される。他の実施態様においては、リーダー50は、PC、ラップトップ、PDA又は携帯電話26のUSBポートで出力することができ、それらを通って送られた読み出しを有し、リポタンパクの濃度についての情報を臨床医が読み出すことが可能になる。或はまた、装置は、カートリッジと測定機器の双方の態様を具体化することができ、脂質成分それ自体の各々の濃度を算出することができるマイクロプロセッサ44を備えている。
カートリッジ1とリーダー装置50の利点は、迅速且つ容易な分析システムにあり、生体液から脂質プロファイルを作成するために同時に行うことができる。その後、臨床医は、治療の有効な過程を判断することができる。カートリッジ1は、使い捨て商品であり、安くすることができ、双方の分析についての試薬と調製されている。
【００２９】
実施例6: 本発明の方法のその後の最適化
本発明の方法に従ってHDLレベルを表す蛍光を誘発するための最適励起波長を調べるためにヒト血清試料についてさらに試験を行った。
本発明者らは、多くの波長を試験し、ナイルレッドを用いた場合に、600nmの励起波長と620nmの発光波長が最適結果を示す(図15を参照のこと)ことが確立された。驚いたことに、この励起波長がスペクトルの非常に長い波長端であることから最適であった。
ある試料について、本発明者は、460nmの励起波長と620nmの発光波長によるよりノイズの多いプロットを見出した(図16を参照のこと)。
本発明者らは、ナイルレッドがわずか約2倍蛍光性である460nmの励起とは反対に600nmで励起される場合にVLDL及びLDLよりHDLにおいて約5倍蛍光性であると考える。これにより、LDLとVLDLの曲線を標準から差し引くとノイズに対して良好なシグナルが得られる。
本発明ら者はいかなる仮説によっても縛られたくないが、460nmで励起される血清試料中に見られる“ノイズ”がシグナル対ノイズの作用であると考える。本発明者らは、ナイルレッドがHSA、特に低脂質濃度で結合することに留意した。それ故、460nmと600nmの双方の励起波長でHDL(+オクタン酸塩)又はHSA(+オクタン酸塩)の存在下にナイルレッド蛍光の分光分析を行った(図24を参照のこと)。本発明者らが考える予想外のスペクトル挙動を生じるこれらの実験は、ナイルレッドが厳密には極性の環境(HSA上の結合部位)にあり且つ励起と発光をより長い波長に移動するナイルレッドがゆがんだ分子内電荷移動を示す(TICT) (Journal of Photochem and Photobiol A:Chemistry 93 (1996) 57-64)事実によって説明することができる。この励起状態における分子は、異なる双極子モーメントを有し、従って、異なる化学種のようにふるまう。600nmで励起する際に、他のリポタンパクと比較してHDLにおけるナイルレッド間のシグナルのより大きな差によるより良好なシグナル対ノイズは、TICT蛍光が620nm発光波長設定によって除外されることからTICT状態の励起を補償する。言い換えれば、我々が600nmでより最適にHSA/ナイルレッドを励起させる間、その蛍光は機器によって拒絶される。
これにより、本発明者らはHDL/ナイルレッド分析が追加の遮断薬を用いることによりさらに改善することができると考えるようになった。HSAの薬剤結合ドメインを遮断物質を試みた。驚いたことに、安息香酸、及びそのトリクロロ及びトリヨード誘導体のような物質が全て約5mMでリポタンパク蛍光に影響を及ぼさずにHSAからナイルレッドを置き換えるために作用したことがわかった。安息香酸によって、約20％だけの水溶液でナイルレッド残留蛍光の消光が付け加えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】実施例1に記載されるようにHDL中の3つの濃度(0.4mM、0.65mM、及び0.9mM)におけるK-37についての全脂質濃度に対する蛍光強度を示すグラフである。
【図２】実施例1に記載されるようにLDL中の3つの濃度(0.4mM、0.65mM、及び0.9mM)におけるK-37についての全脂質濃度に対する蛍光強度を示すグラフである。
【図３】実施例1に記載されるようにVLDL中の3つの濃度(0.4mM、0.65mM、及び0.9mM)におけるK-37についての全脂質濃度に対する蛍光強度を示すグラフである。
【図４】実施例1に記載されるようにHDL、LDL、及びVLDL中の0.4mMのK-37についての全脂質濃度に対する蛍光強度を示すグラフである。
【図５】実施例1に記載されるようにHDL、LDL、及びVLDL中の0.65mMのK-37についての全脂質濃度に対する蛍光強度を示すグラフである。
【図６】実施例1に記載されるようにHDL、LDL、及びVLDL中の0.9mMのK-37についての全脂質濃度に対する蛍光強度を示すグラフである。
【図７】実施例1に記載されるように一連のHDL、LDL、及びVLDL混合物中の0.65mMのK-37についての全脂質濃度に対する蛍光強度を示すグラフである。
【図８】実施例3に記載されるようにリーベルマン・バーチャード反応を示すスキームである。
【図９】実施例3に記載されるように蛍光強度に対するLDL濃度の検定曲線である;
【図１０】実施例3に記載されるようにHDL濃度に対する過剰蛍光の検定曲線である。
【図１１】実施例3に記載されるようにHDL濃度に対する誤差を示すグラフである。
【図１２】実施例5に記載されるように本発明のカートリッジの実施態様を示す概略図である。
【図１３】実施例5に記載されるように本発明のリーダーの実施態様を示す斜視図である。
【図１４】実施例5に記載されるようにリーダーに挿入されるカートリッジを示す正面図である。
【図１５】実施例6に記載されるようにHDL濃度に対するナイルレッド蛍光(ex460nnm、em620nm)を示すグラフである。
【図１６】実施例6に記載されるようにHDL濃度に対するナイルレッド蛍光(ex600nnm、em620nm)を示すグラフである。
【図１７】HDL(+オクタン酸塩)又はHSA(+オクタン酸塩)の存在下で460nmと600nmの励起波長におけるナイルレッド蛍光の分光分析を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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