(57)【要約】  出願人は、ヘパリン結合ドメインがアラニンスキャンニング、部位特異的変異誘発によって不活性化されたＶＥＧＦ１６４タンパク質変異体を用いて、血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ１６４（１６５）タンパク質分子の炎症誘発性ドメインを明確にした。本発明は、修飾ヘパリン結合ドメインを有する新規ＶＥＧＦ変種を提供する。ＶＥＧＦ変種は、受容体結合機能を維持しながら、天然ＶＥＧＦに匹敵するヘパリン結合機能を改変した。本発明は、血管新生及び炎症に関係する障害を治療する組成物及び方法を提供する。
2008538927.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然ＶＥＧＦポリペプチド配列の１つ以上の変化を有する、炎症誘発活性の低いＶＥＧＦポリペプチド配列変種を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
天然ＶＥＧＦポリペプチド配列の変化が、ＶＥＧＲ−２（ＦＬＫ−１／ＫＤＲ）に対する親和性を実質的に維持しながら、ヘパリン結合親和性を低下させる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
天然ＶＥＧＦポリペプチド配列の変化が、ＶＥＧＲ−２（ＦＬＫ−１／ＫＤＲ）に対する親和性を実質的に維持しながら、ニューロピリン−１受容体結合親和性を低下させる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
天然ＶＥＧＦポリペプチド配列の変化が、ＶＥＧＲ−２（ＦＬＫ−１／ＫＤＲ）に対する親和性を実質的に維持しながら、ヘパリン結合親和性を低下させる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
天然ＶＥＧＦポリペプチド配列の変化が、ＶＥＧＲ−２（ＦＬＫ−１／ＫＤＲ）に対する親和性を実質的に維持しながら、Ｆｌｔ−１結合親和性を低下させる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
天然ＶＥＧＦポリペプチド配列の変化が、血管新生促進機能を実質的に維持しながら、白血球動員を減少させる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
天然ＶＥＧＦポリペプチド配列の変化が、血管新生促進機能を実質的に維持しながら、血管透過性を低下させる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
天然ＶＥＧＦポリペプチド配列の変化が、神経保護促進機能を実質的に維持しながら、白血球動員を減少させる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
天然ＶＥＧＦポリペプチド配列の変化が、神経保護促進機能を実質的に維持しながら、血管透過性を低下させる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
天然ＶＥＧＦポリペプチド配列が、ヒト、マウス、ラット、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ及びウサギからなる群から選択されるほ乳動物のＶＥＧＦアイソフォームである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
天然ＶＥＧＦポリペプチド配列が、ＶＥＧＦ１６４、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９及びＶＥＧＦ２０６からなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
天然ＶＥＧＦポリペプチド配列が、ＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号１）である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
ＶＥＧＦポリペプチド配列変種が、配列：ＰＣＳＥ  Ｘ１Ｘ２Ｘ３  Ｘ４ＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＸ５ＣＳ  ＣＸ６ＮＴＤＳ  Ｘ７Ｃ  Ｘ８Ａ  Ｘ９ＱＬＥＬＮＥ  Ｘ１０ＴＣ  Ｘ１１ＣＤＸ１２Ｐ  Ｘ１３Ｘ１４（配列番号２）（式中、Ｘ１−Ｘ１４の少なくとも１個は、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列：ＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号１）の非塩基性アミノ酸置換、非塩基性アミノ酸挿入、アミノ酸欠失又はこれらの組合せである。）を有する、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
Ｘ１−Ｘ１４の少なくとも１個が非塩基性アミノ酸置換である、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
Ｘ１、Ｘ２及びＸ５−Ｘ１１の少なくとも１個が非塩基性アミノ酸置換である、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
非塩基性アミノ酸が、Ａ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ及びＶからなる群から選択される、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
非塩基性アミノ酸がアラニンである、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
ＶＥＧＦポリペプチド配列変種が、配列：ＰＣＳＥＸ１Ｘ２ＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  Ｘ３ＣＤＫＰＲＲ（配列番号２８）（式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３の少なくとも１個は非塩基性アミノ酸である。）を有する、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
非塩基性アミノ酸が、Ａ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ及びＶからなる群から選択される、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
非塩基性アミノ酸がアラニンである、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
ＶＥＧＦ変種が、ＰＣＳＥＲＡＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＡＣＤＫＰＲＲ（配列番号３）、ＰＣＳＥＡＡＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＡＣＤＫＰＲＲ（配列番号４）、ＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＡＮＴＤＳＡＣＫＡ  ＡＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号５）、ＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＡＣＫＡ  ＡＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号６）、ＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＡＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号７）、ＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＡＮＴＤＳＡＣＫＡ  ＡＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＡＣＤＫＰＲＲ（配列番号８）、ＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＡＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号９）、ＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＡＴＣ  ＡＣＤＫＰＲＲ（配列番号１０）、ＰＣＳＥＡＡＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号１１）及びＰＣＳＥＡＡＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＡＴＣ  ＡＣＤＫＰＲＲ（配列番号１２）からなる群から選択される配列を有する、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
ＶＥＧＦ変種が、ＡＲＱＥＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＡＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＡＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号１３）、ＡＲＱＥＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＡＡＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＡＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号１４）、ＡＲＱＥＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＡ  ＮＴＤＳＡＣＫＡＡＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号１５）、ＡＲＱＥＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＡＣＫＡＡＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号１６）、ＡＲＱＥＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＡ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号１７）、ＡＲＱＥＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＡ  ＮＴＤＳＡＣＫＡＡＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＡＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号１８）、ＡＲＱＥＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＡ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号１９）、ＡＲＱＥＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＡＴＣＡＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２０）、ＡＲＱＥＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＡＡＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２１）及びＡＲＱＥＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＡＡＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＡＴＣＡＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２２）からなる群から選択される配列を有する、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
ＶＥＧＦ変種が、以下の配列からなる群から選択される配列を有する、請求項１８に記載のポリペプチド：
ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＡＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＡＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２３）、
ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＡＡＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＡＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２４）、
ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＡＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２５）、
ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＡＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２６）、及び
ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＡＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２７）。
【請求項２４】
Ｘ１−Ｘ１４の少なくとも１個がアミノ酸欠失である、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
Ｘ１、Ｘ２及びＸ５−Ｘ１１の少なくとも１個がアミノ酸欠失である、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
ＶＥＧＦ変種が、以下の配列からなる群から選択される配列を有する、請求項２５に記載のポリペプチド：
ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２９）、
ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号３０）、
ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号３１）、及び
ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号３２）。
【請求項２７】
Ｘ１−Ｘ１４の少なくとも１個が非塩基性アミノ酸挿入である、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
Ｘ１、Ｘ２及びＸ５−Ｘ１１の少なくとも１個が非塩基性アミノ酸挿入である、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
ＶＥＧＦ変種が、以下の配列からなる群から選択される配列を有する、請求項２８に記載のポリペプチド：
ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＡＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＡＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号３３）、
ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＡＲＡＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＡＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号３４）、
ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＡＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号３５）、
ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＡＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号３６）、及び
ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＡＲＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号３７）。
【請求項３０】
ポリペプチドが、ほ乳動物の天然ＶＥＧＦ  ｃＤＮＡをコードする核酸と厳密な条件下でハイブリッド形成する核酸によってコードされる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
ほ乳動物の天然ＶＥＧＦ  ｃＤＮＡが、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３７６のヒトＶＥＧＦ  ｃＤＮＡである、請求項３０に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
請求項１に記載のポリペプチドを投与することを含む、炎症性副作用の少ないＶＥＧＦポリペプチド配列変種を用いて疾患又は障害を治療する方法。
【請求項３３】
ＶＥＧＦポリペプチド配列変種が、虚血性心疾患において側副血管の形成を増加させる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
疾患又は障害が創傷治癒である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
疾患又は障害が循環器疾患である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
疾患又は症状が虚血である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
ＶＥＧＦポリペプチド配列変種が神経保護を強化する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
疾患又は障害が、神経の疾患又は障害である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
疾患又は障害が、眼球神経の疾患又は障害である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
疾患又は障害が緑内障である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
（ａ）試験化合物の存在下でヘパリン／ＶＥＧＦ相互作用レベルを検出すること、及び
（ｂ）試験化合物の存在下におけるヘパリン／ＶＥＧＦ相互作用レベルを試験化合物の非存在下におけるヘパリン／ＶＥＧＦ相互作用レベルと比較すること
を含み、
試験化合物の存在下におけるヘパリン／ＶＥＧＦ相互作用レベルが試験化合物の非存在下におけるヘパリン／ＶＥＧＦ相互作用レベルよりも低い場合に、試験化合物がヘパリン／ＶＥＧＦ相互作用阻害剤である、
ヘパリン／ＶＥＧＦ相互作用阻害剤を特定する方法。
【請求項４２】
（ｃ）ＶＥＧＦ受容体とのＶＥＧＦ相互作用レベルを試験化合物の存在下で検出することによって、ＶＥＧＦ血管形成促進効果を妨げない特定のＶＥＧＦ炎症誘発作用阻害剤を特定すること、及び
（ｄ）試験化合物の存在下におけるＶＥＧＦ受容体とのＶＥＧＦ相互作用レベルを、試験化合物の非存在下におけるＶＥＧＦ受容体とのＶＥＧＦ相互作用レベルと比較すること
をさらに含み、
試験化合物の存在下におけるＶＥＧＦ受容体とのＶＥＧＦ相互作用レベルが、試験化合物の非存在下におけるＶＥＧＦ受容体とのＶＥＧＦ相互作用レベルと実質的に同じ、又はそれよりも高い場合に、試験化合物が特定のＶＥＧＦ炎症誘発作用阻害剤であり、試験化合物がヘパリン／ＶＥＧＦ相互作用阻害剤である、
請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＶＥＧＦ受容体がＶＥＧＦＲ−２（ＦＬＫ−１／ＫＤＲ）である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ＶＥＧＦ受容体がＶＥＧＦＲ−１である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
試験化合物がアプタマーである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
試験化合物がペプチド又はペプチド模倣物である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
試験化合物が小分子である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
ＶＥＧＦポリペプチドとＶＥＧＦ血管形成促進効果を妨げない特定のＶＥＧＦ炎症誘発作用阻害剤とを、ほ乳動物対象に同時投与して、ＶＥＧＦ炎症誘発作用を抑制しながら血管新生を刺激するすることをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
（ａ）天然ＶＥＧＦポリペプチド配列の変種を含むポリペプチドを用意すること、及び
（ｂ）変種を含むポリペプチドのヘパリン結合レベルを、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列を含むポリペプチドのヘパリン結合レベルと比較すること
を含み、
変種を含むポリペプチドのヘパリン結合レベルが、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列を含むポリペプチドのヘパリン結合レベルよりも低い場合に、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種が、ヘパリンに対する親和性の低いＶＥＧＦポリペプチド配列変種である、
ヘパリンに対する親和性の低いＶＥＧＦポリペプチド配列変種を単離する方法。
【請求項５０】
（ａ）ＶＥＧＦヘパリン結合ドメイン機能を担う部位の原子座標を用意し、それによってＶＥＧＦヘパリン結合性を担う部位の３次元構造を定義する段階と、
（ｂ）ＶＥＧＦヘパリン結合ドメインの３次元構造を使用して、調節物質候補をコンピュータモデリングによって設計又は選択する段階と、
（ｃ）調節物質候補を用意する段階と、
（ｄ）前記調節物質候補のＶＥＧＦヘパリン結合ドメイン活性調節能力を求めるために、調節物質候補をＶＥＧＦヘパリン結合ドメインと物理的に接触させる段階と
を含み、
ＶＥＧＦヘパリン結合ドメイン活性の調節物質が特定される、
ＶＥＧＦヘパリン結合ドメイン活性の調節物質候補を特定する方法。
【請求項５１】
請求項１に記載のポリペプチドを含むＶＥＧＦ変種をコードする配列を含む単離核酸分子。
【請求項５２】
ａ）ＶＥＧＦ変種をコードするポリヌクレオチドと、
ｂ）前記ＶＥＧＦ変種をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、宿主細胞中で機能する転写制御配列及び翻訳制御配列と、
ｃ）選択マーカーと
を含む、請求項１に記載のポリペプチドを含むＶＥＧＦ変種を宿主細胞中で産生するための発現ベクター。
【請求項５３】
宿主細胞中でＶＥＧＦ変種が発現されるように、請求項１に記載のポリペプチドを含むＶＥＧＦ変種をコードするポリヌクレオチドで安定に形質転換された宿主細胞、及び該ポリヌクレオチドを安定に形質移入された宿主細胞。
【請求項５４】
可溶性ヘパリン結合ドメインを投与する段階を含む、ＶＥＧＦ１６４によって誘導される白血球停滞を阻止する方法。
【請求項５５】
可溶性ヘパリン結合ドメインが、ＡＲＱＥＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号３８）の配列を有するポリペプチドを含む、請求項５４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品に関する。より具体的には、本発明は、血管新生及び新血管新生に関し、より詳細には、本発明は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の変種に関する。本明細書に開示する組成物及び方法は、血管新生及び炎症に関係する障害の治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
血管新生又は新血管新生は、新しい血管が既存の内皮から発生するプロセスである。正常な血管新生は、胚発生、創傷治癒、及び女性の性機能の幾つかの構成要素を含めて、種々のプロセスにおいて重要な役割を果たすが、血管新生は、ある種の病的症状とも関連がある。望ましくない、又は病的な血管新生は、増殖性網膜症、リウマチ様関節炎、乾せん及び癌を含めて、ある種の病態を伴う（Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｓｃｉ．  １６：５７及びＦｏｌｋｍａｎ  （１９９５）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １：２７参照）。実際、腫よう組織における血管量は、乳癌（Ｗｅｉｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ８４：１８７５−１８８７）、前立腺癌（Ｗｅｉｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １４３：４０１−４０９）、脳腫よう（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｌａｎｃｅｔ  ３４４：８２−８６）及び黒色腫（Ｆｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５６：２９００−２９０３）において、極めてネガティブな予後の指標である。また、血管透過性の変化は、正常及び異常な生理的プロセスにおいてある役割を果たすと考えられる（Ｃｕｌｌｉｎａｎ−Ｂｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １３３：８２９；  Ｓｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １２：３０３）。
【０００３】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、発生、成体の生理及び病理中の主要な血管形成分子として確認されている。ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２並びにニューロピリン−１（Ｎｒｐ−１）及びＮｒｐ−２と結合する。Ｎｒｐ−１及びＮｒｐ−２は、ニューロン成長中の軸索のガイダンスに関与する分子であるセマフォリンの受容体である（Ｋｏｌｏｄｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｃｅｌｌ，  ９０：７５３−６２；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎｅｕｒｏｎ，  １９：５４７−５９）。ＶＥＧＦは、内皮細胞（ＥＣ）の増殖、出芽、遊走及び管形成を誘導する（Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．，  ９：６６９−７６）。ＶＥＧＦは、生理的血管新生及び腫よう血管新生中のＥＣの強力な生存因子でもあり、ＥＣにおいて抗アポトーシスタンパク質の発現を誘導することが判明した（Ｂｅｎｊａｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ９４：８７６１−６；  Ｇｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７３：１３３１３−６）。ＶＥＧＦは、細胞間隙、嚢血管（ｖｅｓｉｃｏ−ｖａｓｃｕｌａｒ）細胞小器官、空胞及び開窓を形成することによって内皮の透過性を増大させるので、透過性因子として当初記述された（Ｂａｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ．  Ａｎａｔ．，  ２００：５８１−９７）。ＶＥＧＦは、内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）を誘導し、続いて、一酸化窒素の生成を増加させることによって、血管拡張も起こす（Ｈｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ２７４：Ｈ１０５４−８；  Ｋｒｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ２６５：６３６−９９）。
【０００４】
ＶＥＧＦは主にＥＣに作用するが、造血幹細胞（ＨＳＣ）、単球、骨芽細胞及びニューロン上のＶＥＧＦ受容体に結合することも示された（Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．，  ９：６６９−７６）。血管新生に加えて、ＶＥＧＦは、骨髄からのＨＳＣの動員、単球の化学遊走、骨芽細胞によって媒介される骨形成、及びニューロンの保護を引き起こす（Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．，  ９：６６９−７６）（Ｓｔｏｒｋｅｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，  ２６：９４３−５４）。また、ＶＥＧＦは、炎症細胞の動員を刺激し、血管新生における細胞周囲のマトリックス分解に関与するプロテアーゼの発現を促進する（Ｐｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  １８１：９０２−６；  Ｕｎｅｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  １５３：５５７−６２；  Ｍａｎｄｒｉｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７０：９７０９−１６）。血小板由来増殖因子、上皮成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子及びトランスフォーミング成長因子を含めて、多数のサイトカインは、細胞中でＶＥＧＦの発現を誘導する（Ｆｅｒｒａｒａ，  Ｎ．  （２００４）  Ｅｎｄｏｃｒ．  Ｒｅｖ．，  ２５：５８１−６１１）。
【０００５】
ＶＥＧＦは、軸索の成長を刺激し、上頚及び後根（ｄｏｒｓａｌ  ｒｏｕｔｅ）神経節ニューロンの生存を改善し、器官型移植片培養における中脳ニューロンの生存を促進する（Ｓｏｎｄｅｌｌ，  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  （１９９９）  １９：５７３１−５７４０；  Ｓｏｎｄｅｌｌ，  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １２：４２４３−４２５４）。このことは、ＶＥＧＦの保護作用を示している。また、ＶＥＧＦは、血清除去によって誘発されるアポトーシスからＨＮ３３海馬細胞を救済することができる（Ｊｉｎ，  ＫＬ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ９７（１８）：１０２４２−７）。ＶＥＧＦレベルが低いと運動ニューロンが変性する恐れがあり、ＶＥＧＦの局所送達は、運動ニューロンを保護し、その生存を延長し得る（Ｏｏｓｔｈｕｙｓｅ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．  ２８（２）：１３１−８；  Ｓｔｏｒｋｅｂａｕｍ  Ｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ８（１）：８５−９２）。ＶＥＧＦは、ＮＭＤＡによって誘導される毒性（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１），  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  １５（７）：１２１８−２０）又は虚血性傷害に対して、ある種の神経細胞に直接の保護作用も有する。
【０００６】
アミノ酸数が異なる少なくとも６種類のＶＥＧＦアイソフォームが選択的スプライシングによって産生される：ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８３、ＶＥＧＦ１８９及びＶＥＧＦ２０６（表１）（Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．，  ９：６６９−７６）。ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５及びＶＥＧＦ１８９は、大部分の細胞タイプによって分泌される主要な形態である（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｓｃｉ．，  １１４：８５３−６５）。分泌後、ＶＥＧＦ１２１は、組織中で比較的自由に拡散し得るが、分泌されたＶＥＧＦ１６５のほぼ半数は、細胞表面のヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）と結合する。ＶＥＧＦ１８９は、細胞外基質中でＨＳＰＧによってほぼ完全に隔離されたままであり、それによって、ＨＳＰＧは、タンパク質分解によって動員され得るＶＥＧＦの貯蔵所になっている（Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．，  ９：６６９−７６）。
【０００７】
ＶＥＧＦは、まずマウス胚の前部において主に発現され、胚組織中で、ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２陽性細胞の遊走を誘導する（Ｈｉｒａｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２５：３５５−６３）。一般に、ＶＥＧＦ発現は、胚中の活性血管形成及び血管新生部位においてより強力である（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，  ＢＭ  （１９９９）  Ｄｅｖ．  Ｄｙｎ．，  ２１５：２−１１）。同型接合的ＶＥＧＦノックアウトマウスは、血島形成、ＥＣ発生及び血管形成の欠陥によってＥ８−Ｅ９で死亡する（Ｆｅｒｒａｒａ，  Ｎ．  （２００４）  Ｅｎｄｏｃｒ．  Ｒｅｖ．，  ２５：５８１−６１１）。単一のＶＥＧＦ対立遺伝子でも欠損したマウスはＥ１１−Ｅ１２で死亡し、初期血管発生における欠陥を示しているので、発生中のＶＥＧＦタンパク質レベルは重大であると考えられる（Ｆｅｒｒａｒａ，  Ｎ．  （２００４）  Ｅｎｄｏｃｒ．  Ｒｅｖ．，  ２５：５８１−６１１）。ＶＥＧＦアイソフォームの異なる生物学的機能は、アイソフォーム特異的ＶＥＧＦのノックアウトマウスについての研究によって説明された。ＶＥＧＦ１２０（ヒトＶＥＧＦ１２１の相同体）しか発現しないマウスは誕生後すぐに死亡し、生存したマウスは虚血性心筋症及び多臓器不全によって死亡する（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．，  ５：４９５−５０２）。ＶＥＧＦ１８８（ヒトＶＥＧＦ１８９）しか発現しないマウスは、細動脈の成長が損なわれ、約半数が誕生時に死亡する（Ｓｔａｌｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  １０９：３２７−３６）。ＶＥＧＦ１６４（ヒトＶＥＧＦ１６５）しか発現しないマウスは、生存可能であり、健康である（Ｓｔａｌｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  １０９：３２７−３６）。これらの研究は、中間の拡散及びマトリックス結合特性とともに、ＶＥＧＦ作用の主要なエフェクターとしてのＶＥＧＦ１６５の重要性を強調するものである。
【０００８】
ＶＥＧＦは、低酸素誘導性因子（ＨＩＦ）によって調節されるＶＥＧＦ遺伝子成分によって、低酸素状態で強力に誘導される（Ｐｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．，  ９：６７７−８４）。低酸素誘導性因子（ＨＩＦ）−１αの恒常的な分解は、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼの酸素要求と、それに続くＨＩＦ−１α、及びアリール炭化水素核移行因子（ＡＲＮＴ）とも称されるＨＩＦ−１βのそのヘテロ２量体化の安定化のために、低酸素では遮断される。次いで、これらの複合体は、低酸素誘導性遺伝子のプロモーター中の低酸素応答性要素（ＨＲＥ）と結合し、グルコース輸送、解糖及び血管新生に関与する遺伝子を含めて、１００遺伝子を超えるセットの転写を惹起する（Ｐｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．，  ９：６７７−８４；  Ｌｕｔｔｕｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ２９５：４２８−３４）。興味深いことに、ネコひっかき熱の病原体であるバルトネラ  ヘンセレ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ）は、細胞内酸素消費機序によって低酸素症を引き起こし、ＶＥＧＦ誘導及び血管腫をもたらし得る（Ｋｅｍｐｆ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．，  ３：６２３−３２）。低酸素によって調節される別の遺伝子の例としては、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）、ＭＭＰ−２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ−１などが挙げられる（Ｐｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．，  ９：６７７−８４）。マウスＶＥＧＦ遺伝子プロモーター由来のＨＲＥが欠損すると、恐らくは神経組織の不十分な血管潅流及びＶＥＧＦ誘導の減少による運動ニューロン生存の減少のために、進行性運動ニューロン変性が生じる（Ｏｏｓｔｈｕｙｓｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２８：１３１−８）。
【０００９】
皮膚は、インビボでのＶＥＧＦ作用の研究用モデルとして広く用いられている。例えば、皮膚中でＶＥＧＦを過剰発現するトランスジェニックマウスは、多量の皮膚の血管新生、及び乾せんに似た炎症性皮膚症状を示す（Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｂｌｏｏｄ，  １０２：１６１−８）。マウス皮膚におけるＶＥＧＦの過剰発現は、実験的腫よう成長も加速する（Ｌａｒｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  １７：３０３−１１）。これに対し、表皮中で目標のＶＥＧＦが欠損したマウスは、創傷治癒が遅延する一方で、化学的に誘導された皮膚乳頭腫の発生頻度が減少した（Ｒｏｓｓｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ６４：３５０８−１６）。ＶＥＧＦ阻止モノクローナル抗体又はＶＥＧＦ受容体阻害は、マウス及びヒトにおける実験的腫ようの成長を抑制した（Ｆｅｒｒａｒａ，  Ｎ  （２００４）  Ｅｎｄｏｃｒ．  Ｒｅｖ．，  ２５：５８１−６１１；  Ｓｅｐｐ−Ｌｏｒｅｎｚｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ６４：７５１−６；  Ｋａｂｂｉｎａｖａｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．，  ２１：６０−５）。ヒトにおいては、ＶＥＧＦは、実質的に全試験固形腫ようにおいて、また、一部の血液悪性腫ようにおいて発現する（Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．，  ９：６６９−７６）。実際に、ＶＥＧＦ発現レベル、疾患進行及び生存には相関が見出された（Ｆｅｒｒａｒａ，  Ｎ．  （２００２）  Ｓｅｍｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．，  ２９：１０−４）。
【００１０】
リンパ性脈管構造に対するＶＥＧＦの効果も最近研究された。皮膚中でのネズミＶＥＧＦ１６４のアデノウイルスによる過剰発現は巨大リンパ管の形成を引き起こしたが（Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １９６：１４９７−５０６）、ヒトＶＥＧＦ１６５アイソフォームを用いた別の研究は、皮膚のリンパ管の拡張しか報告していない（図３Ａ）（Ｓａａｒｉｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，  １６：１０４１−９）。しかし、ＶＥＧＦは、幾つかの別の組織タイプにおいては、リンパ血管新生を誘導しなかった（Ｋｕｂｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ９９：８８６８−７３；  Ｒｉｓｓａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．，  ９２：１０９８−１０６；  Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．，  ９４：６６４−７０；  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．，  １０：１０９５−１０３）。ＶＥＧＦのリンパ血管形成効果は、ＶＥＧＦＲ−１を発現し、リンパ血管形成因子を分泌する、マクロファージなどの炎症細胞の動員と関連し得る（Ｃｌａｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７１：１７６２９−３４；  Ｒａｆｉｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ９９６：４９−６０；  Ｃｕｒｓｉｅｆｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  １１３：１０４０−５０）。少なくとも妊娠中期マウス胚においては、ＶＥＧＦではなくＶＥＧＦ−Ｃが、リンパ性内皮系列に関係づけられた内皮細胞の遊走を誘発する能力を有した（Ｋａｒｋｋａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ５：７４−８０）。
【００１１】
ＶＥＧＦは、眼球の健康状態及び疾患にも重要な役割を果たし、網膜脈管構造の生理的及び病理的発生の大きな原因である（Ａ．Ｐ．  Ａｄａｍｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｒｅｔｉｎａ，  ２５：１１１−１１８；  Ｙ．−Ｓ．  Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．  ３１２：５２７−５３７；  Ｅ．Ｗ．Ｍ．  Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．  ５：１２３−１３２）。ＶＥＧＦは、単一の遺伝子から生じるｍＲＮＡの選択的スプライシングによって生成する少なくとも５種類のアイソフォームを有する。網膜における２つの主要な一般的アイソフォームは、ＶＥＧＦ１２１（１２０）及びＶＥＧＦ１６５（１６４）である。ヒトタンパク質は、ネズミ相同体よりも１残基長い。
【００１２】
白血球は、正常発生中に網膜脈管構造を取り除くので、眼球の健康状態に有益であることが判明した。しかし、Ｓ．  Ｉｓｈｉｄａ等は、白血球が疾患における網膜脈管構造を消失させることを示した（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  （２００３）  ９：７８１−７８８）。広範な白血球接着が、生理的ではなく、病理的な新血管新生の立ち上がりにおいて認められた。研究によれば、虚血により誘導される網膜血管新生は、局所的炎症反応によってある程度引き起こされる。病理的新血管新生中のＶＥＧＦ１６４（１６５）の絶対的及び相対的発現レベルは、生理的新血管新生中よりも増加した。ＶＥＧＦ１６４（１６５）は、白血球動員及び炎症の誘発において他のＶＥＧＦアイソフォームよりもかなり強力であることが判明した炎症誘発性アイソフォームとして確認された。ＶＥＧＦ１６４（１６５）は、ＶＥＧＦＲ−１によって媒介される効果である、単球の化学走性の誘発においてより強力であることも判明した。不死化ヒト白血球細胞系においては、ＶＥＧＦ１６４（１６５）は、ＶＥＧＦＲ−１のチロシンリン酸化をより効率的に誘発することが判明した。（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００４）  ４５：３６８−３７４を参照されたい。）
【００１３】
白血球、非内皮細胞タイプは、ＶＥＧＦによって誘導される血管透過性に寄与することも示された。ラットモデルを用いて、病態生理学的濃度のＶＥＧＦに網膜が浸漬されるような硝子体内注射によって、血管透過性増加、毛細血管非潅流などの血管変化と一致する広範な網膜白血球静止（白血球停滞）が突然引き起こされることが判明した。実験的糖尿病においては、網膜循環における静的な白血球の増加は、血管透過性の増加と相関がある。白血球停滞及び血管透過性の変化は、網膜の細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の増加と一致する。ＩＣＡＭ−１の生理活性が抗体によって阻止されると、網膜の白血球停滞及び血管透過性の増加は、それぞれ４９％及び８６％減少する。（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  （２０００）  １５６：１７３３−１７３９を参照されたい。）
【００１４】
黄斑浮腫は、糖尿病における失明の最大原因の一つであり、糖尿病性網膜症の過程においていつでも出現し得る。糖尿病性網膜症は、血液網膜関門（ＢＲＢ）の破壊の直接的結果である病態である。網膜の白血球停滞及び漏出は、糖尿病の期間と密接に相関し、それとともに増加した。初期の糖尿病の眼においては、網膜のＶＥＧＦ１６４の発現は、ＶＥＧＦ１２０の１１倍である。ＶＥＧＦによって誘導されるＢＲＢの破壊は、ＩＣＡＭ−１に依存した網膜白血球停滞によってある程度媒介される。インビトロ及びインビボでのデータによっても、ＶＥＧＦ１６５は内皮ＩＣＡＭ−１発現並びに白血球接着及び遊走をより強力に誘発することが示された。等モル基準で、ＶＥＧＦ１６４は、インビボにおいて、ＩＣＡＭ−１レベルの増加並びにＩＣＡＭ−１によって媒介される網膜白血球停滞及びＢＲＢ破壊の誘発が、ＶＥＧＦ１２０の少なくとも２倍強力である。Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標）（ペガプタニブナトリウム）による内因性ＶＥＧＦ１６４のアイソフォーム特異的遮断によって、初期と慢性の両方の糖尿病において、網膜の白血球停滞及びＢＲＢ破壊がかなり抑制された。Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標）は、白血球接着及び病理的新血管新生を強力に抑制したが、生理的新血管新生に対してはほとんど、又は全く影響を及ぼさなかった。（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２００３）  ４４：２１５５−２１６２を参照されたい。）。同様に、遺伝子改変ＶＥＧＦ１６４欠損（ＶＥＧＦ１２０／１８８）マウスは、野生型（ＶＥＧＦ＋／＋）対照と比較して、生理的新血管新生に差がなかった。（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  （２００３）  １９８：４８３−４８９を参照されたい。）
【００１５】
ＶＥＧＦの構造解明が報告された。ＶＥＧＦの最初の結晶構造は、Ｙ．Ａ．  Ｍｕｌｌｅｒ等（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  （１９９７）  ５：１３２５−１３３８）によって報告された。その後間もなく、Ｃ．  Ｗｉｅｓｍａｎｎ等は、Ｆｌｔ−１受容体のドメイン２と複合化したＶＥＧＦの分解能１．７Åにおける結晶構造を報告した（Ｃｅｌｌ  （１９９７）  ９１：６９５−７０４）。Ｍ．Ａ．  ＭｃＴｉｇｕｅ等は、ＶＥＧＦのキナーゼドメインの結晶構造を報告した（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  （１９９９）  ７：３１９−３３０）。Ｍｅｌｉｓｓａ  Ｅ．  Ｓｔａｕｆｆｅｒ等は、ＶＥＧＦヘパリン結合ドメインの溶液構造を解明した（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ  （２００２）  ２３：５７−６１）。
【００１６】
完全長ＶＥＧＦ１６４とＶＥＧＦ１６４のヘパリン結合ドメインとの分子相互作用を比較した研究が報告された。ＮＭＲ分光法によって、単離ＨＢＤ−アプタマー複合体が完全長ＶＥＧ１６４−アプタマー複合体と比較された（その内容を参照によりその全体を本明細書に組み込むＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＮＡＳ，（２００５）Ｖｏｌ．１０２，  １８９０２−１８９０７）。
【００１７】
ＶＥＧＦ変種は報告されている。Ｔ．  Ｚｉｏｎｃｈｅｃｋ他は、切断型ヘパリン結合ドメインを含むＶＥＧＦ変種を記述している（米国特許第６，４８５，９４２号及び米国特許出願公開第２００３／００３２１４５号）。Ｎ．Ｓ．  Ｐｏｌｌｉｔｔ他は、他のアミノ酸残基をシステインアミノ酸残基で置換することを含むＶＥＧＦ変種を記述している（米国特許第６，４７５，７９６号）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
発生、創傷治癒及び腫よう形成に付随する約血管新生及び白血球動員については多くの知見がある。しかし、ＶＥＧＦ、血管新生及び白血球動員の関連性は、捕らえどころがないままである。血管内皮増殖因子の炎症誘発性ドメインは不明であった。したがって、新血管新生に付随する分子現象の理解は進んだが、この理解を利用して、白血球停滞、及び加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）と一緒に起こる眼球血管新生疾患などの眼球血管新生疾患を含めて、血管新生障害を治療するさらなる方法及び処方を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
発明の要旨
本発明は、ＶＥＧＦのヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）が白血球動員及び血管透過性と関連があるという知見に一部基づく。別の態様においては、本発明は、ニューロピリン（Ｎｐ−１）が、ＶＥＧＦによって媒介される炎症誘発作用と関連があるという知見に一部基づく。別の態様においては、本発明は、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）が、ＶＥＧＦによって媒介される炎症誘発作用と関連があるという知見に一部基づく。出願人は、ヘパリン結合ドメインがアラニンスキャンニング、部位特異的変異誘発によって不活性化されたＶＥＧＦ１６４タンパク質変異体を用いて、血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ１６４／１６５タンパク質分子の炎症誘発性ドメインを明確にした。
【００２０】
一態様においては、本発明は、新規ＶＥＧＦ変種を提供する。このＶＥＧＦ変種は、修飾ヘパリン結合ドメインを有するポリペプチドを含む。一実施形態においては、ヘパリン結合ドメインは、塩基性アミノ酸残基を中性アミノ酸残基又は酸性アミノ酸残基で置換することによって修飾される。別の実施形態においては、ヘパリン結合ドメインは、塩基性アミノ酸に隣接する非塩基性アミノ酸を挿入することによって修飾される。別の実施形態においては、ヘパリン結合ドメインは、塩基性アミノ酸を除去することによって修飾される。
【００２１】
特に有用である態様においては、本発明は、ＶＥＧＲ−２（ＦＬＫ−１／ＫＤＲ）に対する親和性を実質的に維持しながら、ヘパリン結合親和性を低下させる、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列の１つ以上の変化を有し、炎症誘発活性の低いＶＥＧＦポリペプチド配列変種を含む、ポリペプチドを提供する。ある実施形態においては、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列はヒトＶＥＧＦ１６５である。別の実施形態においては、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列はヒトＶＥＧＦ１８９である。さらなる実施形態においては、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列はヒトＶＥＧＦ２０６である。さらに別の実施形態においては、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列はマウスＶＥＧＦ１６４である。さらなる実施形態においては、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列は、ヒト、マウス、ラット、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギなどのほ乳動物のＶＥＧＦアイソフォームである。
【００２２】
さらに別の態様においては、本発明は、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列ＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号１）の１つ以上のアミノ酸置換、アミノ酸挿入及び／又はアミノ酸欠失を有するＶＥＧＦポリペプチド配列変種を含むポリペプチドを提供する。ある実施形態においては、ポリペプチドは、非塩基性アミノ酸による天然ＶＥＧＦポリペプチド配列の塩基性アミノ酸の１個以上の置換を含む。別の実施形態においては、ポリペプチドは、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列の塩基性アミノ酸の１個以上の欠失を含む。別の実施形態においては、ポリペプチドは、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列の塩基性アミノ酸に隣接する非塩基性アミノ酸の１個以上の挿入を含む。別の実施形態においては、ポリペプチドは、置換、挿入及び／又は欠失の組合せを含む。
【００２３】
別の有用である態様においては、本発明は、一般化配列ＰＣＳＥ  Ｘ１Ｘ２Ｘ３  Ｘ４ＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＸ５ＣＳ  ＣＸ６ＮＴＤＳ  Ｘ７Ｃ  Ｘ８Ａ  Ｘ９ＱＬＥＬＮＥ  Ｘ１０ＴＣ  Ｘ１１ＣＤＸ１２Ｐ  Ｘ１３Ｘ１４（配列番号２）（式中、Ｘ１−Ｘ１４の少なくとも１個は、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列ＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号１）の非塩基性アミノ酸置換の位置、アミノ酸欠失の位置、又はアミノ酸挿入の位置に対応する。）を有するＶＥＧＦポリペプチド配列変種を含む、ポリペプチドを提供する。
【００２４】
さらに別の実施形態においては、本発明は、受容体結合機能を維持しながら、天然ＶＥＧＦに匹敵する修飾ヘパリン結合機能を有する、ＶＥＧＦ変種を提供する。別の実施形態においては、ＶＥＧＦ変種は、白血球動員又は血管透過性を増大させずに、血管新生を促進する。別の実施形態においては、ＶＥＧＦ変種は、改変されたＦｌｔ−１結合機能及び正常なＫＤＲ結合機能を含む。別の実施形態においては、ＶＥＧＦ変種は、改変されたＮｐ−１結合機能及び正常なＫＤＲ結合機能を含む。
【００２５】
本発明の態様は、ＶＥＧＦ変種をコードする核酸も提供する。
【００２６】
別の態様においては、本発明は、ＶＥＧＦのヘパリン結合ドメインの機能を阻害する方法を提供する。本発明は、Ｆｌｔ−１及び／又はＮｐ−１の機能を阻害する方法も提供する。一実施形態においては、ＶＥＧＦの受容体結合ドメインの機能を妨害せずに、ＶＥＧＦのヘパリン結合ドメインの機能を阻害する。別の実施形態においては、ＫＤＲの機能を維持しながら、Ｆｌｔ−１の機能を阻害する。別の実施形態においては、ＫＤＲの機能を維持しながら、Ｎｐ−１の機能を阻害する。
【００２７】
本発明のＶＥＧＦ変種は、白血球動員又は血管透過性を増大させずに血管新生を促進するのに有用である。本発明のＶＥＧＦ変種は、創傷治癒、骨修復及び骨成長の促進にも有用である。ヘパリン結合ドメインと結合可能な化合物は、白血球動員を阻止することができ、血管透過性を抑制することができる。これらの化合物は、抗炎症剤、抗血管透過剤、免疫抑制剤及び抗高血圧剤として有用であり得る。
【００２８】
別の態様においては、本発明は、血管新生、血管透過性及び炎症に付随した障害を治療する方法を提供する。本発明は、血管内皮細胞の増殖を必要とする個体を治療する方法も提供する。
【００２９】
別の態様においては、本発明は、白血球動員を促進せずに、血管新生を促進する能力について、候補化合物をスクリーニングする方法を提供する。一実施形態においては、方法は、受容体結合ドメインの機能を阻害せずに、ヘパリン結合ドメインの機能を阻害する化合物をスクリーニングする。一実施形態においては、ＫＤＲの機能を阻害せずに、Ｆｌｔ−１の機能を阻害する化合物をスクリーニングする。別の実施形態においては、ＫＤＲの機能を阻害せずに、Ｎｐ−１の機能を阻害する化合物をスクリーニングする。
【００３０】
別の態様においては、本発明は、ヘパリン結合ドメインと結合可能な化合物を設計する方法を提供する。一実施形態においては、化合物は、ＳＥＬＥＸを用いて設計される。別の実施形態においては、化合物は、分子モデリングを用いて設計される。
【００３１】
別の態様においては、本発明は、ＶＥＧＦ受容体結合ドメインの機能を維持しながら、ヘパリン結合ドメインと結合可能な化合物、及び／又はその機能を改変可能な化合物を提供する。
【００３２】
別の態様においては、本発明は、ＶＥＧＦ１６４によって誘導される白血球停滞を阻害する方法を提供する。一実施形態においては、ＶＥＧＦ１６４によって誘導される白血球停滞を阻害する方法は、可溶性ヘパリン結合ドメインの投与を含む。特定の一実施形態においては、可溶性ヘパリン結合ドメインは、ＶＥＧＦ５５の配列を有するポリペプチドを含む。
【００３３】
発明の詳細な説明
出願人は、ＶＥＧＦ１６４の機能的ヘパリン結合ドメインが病理的新血管新生及びその炎症誘発活性に必要であることを発見した。以前の研究によれば、虚血により誘導される網膜血管新生は、局所的炎症反応によってある程度引き起こされる。ＶＥＧＦ１６４アイソフォームは、炎症誘発性事象を誘発する能力が高いので、出願人は、ＶＥＧＦ１６４欠損（ＶＥＧＦ１２０／１８８）マウスを用いて、炎症及び病理的新血管新生におけるその役割を特徴づけた。ヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）が点特異的（ｐｏｉｎｔ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）変異誘発によって不活性化されたＶＥＧＦ１６４タンパク質変異体を用いて、ＶＥＧＦ１６４タンパク質分子の炎症誘発性ドメインを明確にした。
【００３４】
その結果によれば、正常な発生条件下では、ＶＥＧＦ１２０／１８８マウスの網膜脈管構造は正常に発生し、同齢の野生型同腹仔の網膜脈管構造と類似していた。結果は、ＶＥＧＦ１６４タンパク質が網膜における正常な血管発生に不要であり、ＶＥＧＦ１２０とＶＥＧＦ１８８アイソフォームの組合せが生理学的網膜血管成長の進行に十分であることも示した。
【００３５】
酸素過剰５日後の未熟児網膜症（ＲＯＰ）モデルにおいては、ＶＥＧＦ１２０／１８８と野生型マウスでは血管の損失に差がない。このデータは、これらのＶＥＧＦ１６４欠損マウスの網膜脈管構造が、網膜中の局所的ＶＥＧＦレベルの低下による血管の退化に影響されやすいことを示している。正常酸素圧状態（相対的に低酸素）に戻した後の病理的新血管新生は、野生型同腹仔と比較してＶＥＧＦ１２０／１８８マウスにおいて９０％を超えて抑制された。これに対し、ＲＯＰモデルにおけるＶＥＧＦ１２０／１８８網膜では、生理学的血管再生は抑制されなかった。また、ＶＥＧＦ１６４タンパク質が欠損すると、ＲＯＰモデルにおけるＶＥＧＦ１２０／１８８網膜脈管構造中の炎症反応がかなり減少した。
【００３６】
さらに、皮膚遅延型過敏（ＤＴＨ）モデルを用いて、ＶＥＧＦ１６４タンパク質の欠損は、ＶＥＧＦ１２０／１８８マウスにおける炎症もかなり低下する。これは、ＶＥＧＦ１６４タンパク質が病的血管新生と関連し、その炎症誘発性が眼と皮膚の両方で確認されることを示唆している。したがって、ＶＥＧＦ１６４タンパク質アイソフォームは全組織タイプにおいて炎症誘発性である可能性が高いことを発見した。ＶＥＧＦ１６４タンパク質アイソフォームの炎症誘発性は、そのヘパリン結合ドメインによって与えられる。というのは、ＶＥＧＦ１２０タンパク質アイソフォームは、炎症誘発性事象と関連がないことが判明したからである。
【００３７】
ヘパリン結合ドメインのアルギニン残基１３、１４及び４９に点変異を含む非ヘパリン結合性ＶＥＧＦ１６４タンパク質変異体をラットの硝子体に投与しても白血球は動員されなかったが、野生型ＶＥＧＦ１６４タンパク質注射によってかなりの白血球停滞が誘導された。このデータによれば、機能的ヘパリン結合ドメインは、ＶＥＧＦ１６４タンパク質アイソフォームの炎症誘発性及び病的性質に必要である。したがって、ＶＥＧＦ１６４のヘパリン結合ドメインは、異なるＶＥＧＦアイソフォーム間のその独特な生物活性及び病的性質に必要である。これらの結果は、独特な生物学的機能をＶＥＧＦに付与し得る、ＶＥＧＦ−ヘパリン相互作用における静電成分及びタンパク質配列特異的成分を示唆している。
【００３８】
本発明のＶＥＧＦ変種組成物及び方法は、治療上の新血管新生を必要とする循環器疾患又は症状の治療に有用である。かかる循環器疾患又は症状としては、心筋虚血、冠動脈疾患及び末梢動脈疾患が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００３９】
本発明のＶＥＧＦ変種組成物及び方法は、正常な胚発生（血管形成）、創傷治癒、女性の性機能、骨髄からの造血幹細胞（ＨＳＣ）の動員、単球の化学遊走、及び骨芽細胞によって媒介される骨形成を促進するのにも有用である。
【００４０】
本発明のＶＥＧＦ変種組成物及び方法は、ニューロン障害の治療に有用である。特に、本発明のＶＥＧＦ変種組成物及び方法は、神経保護の促進に有用である。
【００４１】
本発明のＶＥＧＦ変種組成物及び方法は、ニューロンへの不完全なＶＥＧＦ生存シグナルを特徴とする、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルー  ゲーリッグ病）、ＡＬＳ様疾患などの障害の治療に有用である。
【００４２】
本発明のＶＥＧＦ変種組成物及び方法は、特に虚血性眼疾患における低酸素中の、網膜における神経細胞の保護にも有用である。
【００４３】
本発明のＶＥＧＦ変種組成物及び方法は、運動ニューロンの保護、運動ニューロン変性の防止、及び運動ニューロンの延命にも有用である。
【００４４】
本発明のＶＥＧＦ変種組成物及び方法は、神経幹細胞の刺激にも有用である。
【００４５】
ＶＥＧＦ１６５は、例えば、軸索の退縮及びニューロン死に関与するセマフォリン（ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎｇ）３Ａと結合することが知られている受容体であるニューロピリン−１並びにＶＥＧＦ受容体−２と結合することによって、ニューロンの生存を刺激し、又はニューロンの死を阻止する（参照によりその全体を本明細書に組み込むＣａｒｍｅｌｅｉｔ他、国際公開第０１／７６６２０号）。ＶＥＧＦは、軸索の成長を刺激し、上頚及び後根（ｄｏｒｓａｌ  ｒｏｕｔｅ）神経節ニューロンの生存を改善し、中脳ニューロンの生存を促進する。ＶＥＧＦは、ＨＮ３３海馬細胞をアポトーシスから救済し得る。
【００４６】
本発明のＶＥＧＦ変種組成物及び方法は、炎症又は血管透過性の負の効果なしに、血管新生又は治療上の新血管新生を促進するのにも有用である。本発明のＶＥＧＦ変種組成物及び方法は、既存の内皮からの新しい血管の発生を必要とするあらゆる対象の治療に有用である。新しい血管は、例えば低酸素組織、虚血性組織など、血流が不十分なあらゆる組織で必要となり得る。
【００４７】
一態様においては、本発明は、新規ＶＥＧＦ変種を提供する。これらのＶＥＧＦ変種は、修飾ヘパリン結合ドメインを有するポリペプチドを含む。一実施形態においては、ヘパリン結合ドメインは、塩基性アミノ酸残基を中性アミノ酸残基又は酸性アミノ酸残基で置換されることによって修飾される。別の実施形態においては、ヘパリン結合ドメインは、塩基性アミノ酸に隣接する非塩基性アミノ酸が挿入されることによって修飾される。別の実施形態においては、ヘパリン結合ドメインは、塩基性アミノ酸を除去することによって修飾される。本発明は、ＶＥＧＦ変種をコードする核酸も提供する。
【００４８】
一実施形態においては、ＶＥＧＦ変種は、受容体結合機能を維持しながら、天然ＶＥＧＦに匹敵する修飾ヘパリン結合機能を有する。別の実施形態においては、ＶＥＧＦ変種は、白血球動員又は血管透過性を増大させずに、血管新生を促進する。別の実施形態においては、ＶＥＧＦ変種は、改変されたＦｌｔ−１結合機能及び正常なＫＤＲ結合機能を含む。別の実施形態においては、ＶＥＧＦ変種は、改変されたＮｐ−１結合機能及び正常なＫＤＲ結合機能を含む。
【００４９】
さらに別の実施形態においては、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列は、ＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号１）である。さらなる実施形態においては、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種は、配列ＰＣＳＥＸ１Ｘ２ＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  Ｘ３ＣＤＫＰＲＲ（配列番号２８）を有し、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はＲ又は非塩基性アミノ酸であるが、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３の少なくとも１個は非塩基性アミノ酸である。ある特に有用である実施形態においては、非塩基性アミノ酸はアラニンである。別の実施形態においては、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種は、配列ＰＣＳＥＲＡＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＡＣＤＫＰＲＲ（配列番号３）を有する。さらに別の実施形態においては、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種は、配列ＰＣＳＥＡＡＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＡＣＤＫＰＲＲ（配列番号４）を有する。さらなる実施形態においては、ポリペプチドは、配列ＰＣＳＥＸ１Ｘ２ＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  Ｘ３ＣＤＫＰＲＲ（配列番号２８）を有し、Ｘ１及びＸ２はＲであり、Ｘ３は非塩基性アミノ酸である。特定の実施形態においては、置換された非塩基性アミノ酸は、Ａ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ又はＶである。特定の実施形態においては、Ｘ１及びＸ２はＲであり、Ｘ３はＡである。別の特定の実施形態においては、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はＡである。
【００５０】
さらに別の実施形態においては、ポリペプチドは、配列ＰＣＳＥＸ１Ｘ２ＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  Ｘ３ＣＤＫＰＲＲ（配列番号２８）を有し、Ｘ１及びＸ３はＲであり、Ｘ２は非塩基性アミノ酸である。特定の実施形態においては、置換された非塩基性アミノ酸は、Ａ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ又はＶである。ある実施形態においては、Ｘ１及びＸ２はＲであり、Ｘ３はＡである。さらなる実施形態においては、Ｘ２及びＸ３はＲであり、Ｘ１は非塩基性アミノ酸である。特定の実施形態においては、置換された非塩基性アミノ酸は、Ａ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ又はＶである。特定の実施形態においては、Ｘ２及びＸ３はＲであり、Ｘ１はＡである。別の特定の実施形態においては、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はＡである。
【００５１】
特定の実施形態においては、ＶＥＧＦ変種は、ＰＣＳＥＲＡＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＡＣＤＫＰＲＲ（配列番号３）、ＰＣＳＥＡＡＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＡＣＤＫＰＲＲ（配列番号４）、ＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＡＮＴＤＳＡＣＫＡ  ＡＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号５）、ＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＡＣＫＡ  ＡＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号６）、ＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＡＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号７）、ＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＡＮＴＤＳＡＣＫＡ  ＡＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＡＣＤＫＰＲＲ（配列番号８）、ＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＡＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号９）、ＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＡＴＣ  ＡＣＤＫＰＲＲ（配列番号１０）、ＰＣＳＥＡＡＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号１１）及びＰＣＳＥＡＡＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＡＴＣ  ＡＣＤＫＰＲＲ（配列番号１２）からなる群から選択される配列を有するポリペプチドを含む。
【００５２】
別の特定の実施形態においては、ＶＥＧＦ変種は、ＡＲＱＥＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＡＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＡＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号１３）、ＡＲＱＥＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＡＡＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＡＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号１４）、ＡＲＱＥＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＡ  ＮＴＤＳＡＣＫＡＡＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号１５）、ＡＲＱＥＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＡＣＫＡＡＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号１６）、ＡＲＱＥＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＡ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号１７）、ＡＲＱＥＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＡ  ＮＴＤＳＡＣＫＡＡＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＡＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号１８）、ＡＲＱＥＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＡ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号１９）、ＡＲＱＥＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＡＴＣＡＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２０）、ＡＲＱＥＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＡＡＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２１）及びＡＲＱＥＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＡＡＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＡＴＣＡＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２２）からなる群から選択される配列を有するポリペプチドを含む。
【００５３】
ある実施形態においては、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種を含むポリペプチドは、配列ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＡＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＡＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２３）を有する。別の実施形態においては、ポリペプチドは、配列ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＡＡＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＡＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２４）を有する。さらに別の実施形態においては、ポリペプチドは、配列ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＡＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２５）を有する。さらなる実施形態においては、ポリペプチドは、配列ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＡＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２６）を有する。さらなる実施形態においては、ポリペプチドは、配列：ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＡＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２７）を有する。
【００５４】
さらに特に有用である実施形態においては、炎症誘発活性の低いＶＥＧＦポリペプチド配列変種は、網膜に投与したときに、対応する天然ＶＥＧＦポリペプチド配列よりも白血球停滞を誘導しない。
【００５５】
別の態様においては、本発明は、ＶＥＧＲ−２（ＦＬＫ−１／ＫＤＲ）に対する親和性を実質的に維持しながら、ニューロピリン−１受容体結合活性を低下させる、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列の変化を含むポリペプチドを提供する。ある実施形態においては、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列はヒトＶＥＧＦ１６５である。別の実施形態においては、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列はヒトＶＥＧＦ１８９である。さらなる実施形態においては、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列はヒトＶＥＧＦ２０６である。さらに別の実施形態においては、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列はマウスＶＥＧＦ１６４である。さらなる実施形態においては、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列は、ヒト、マウス、ラット、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギなどのほ乳動物のＶＥＧＦアイソフォームである。
【００５６】
さらに別の実施形態においては、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列は、ＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号１）である。さらなる実施形態においては、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種は、配列ＰＣＳＥＸ１Ｘ２ＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  Ｘ３ＣＤＫＰＲＲ（配列番号２８）を有し、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はＲ又は非塩基性アミノ酸であるが、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３の少なくとも１個は非塩基性アミノ酸である。ある特に有用である実施形態においては、非塩基性アミノ酸はアラニンである。別の実施形態においては、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種は、配列ＰＣＳＥＲＡＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＡＣＤＫＰＲＲ（配列番号３）を有する。さらに別の実施形態においては、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種は、配列ＰＣＳＥＡＡＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＡＣＤＫＰＲＲ（配列番号４）を有する。さらなる実施形態においては、ポリペプチドは、配列ＰＣＳＥＸ１Ｘ２ＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  Ｘ３ＣＤＫＰＲＲ（配列番号２８）を有し、Ｘ１及びＸ２はＲであり、Ｘ３は非塩基性アミノ酸である。特定の実施形態においては、置換された非塩基性アミノ酸は、Ａ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ又はＶである。特定の実施形態においては、Ｘ１及びＸ２はＲであり、Ｘ３はＡである。別の特定の実施形態においては、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はＡである。
【００５７】
さらに別の実施形態においては、ポリペプチドは、配列ＰＣＳＥＸ１Ｘ２ＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  Ｘ３ＣＤＫＰＲＲ（配列番号２８）を有し、Ｘ１及びＸ３はＲであり、Ｘ２は非塩基性アミノ酸である。特定の実施形態においては、置換された非塩基性アミノ酸は、Ａ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ又はＶである。ある実施形態においては、Ｘ１及びＸ２はＲであり、Ｘ３はＡである。さらなる実施形態においては、Ｘ２及びＸ３はＲであり、Ｘ１は非塩基性アミノ酸である。特定の実施形態においては、置換された非塩基性アミノ酸は、Ａ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ又はＶである。特定の実施形態においては、Ｘ２及びＸ３はＲであり、Ｘ１はＡである。別の特定の実施形態においては、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はＡである。
【００５８】
あるさらなる実施形態においては、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種を含むポリペプチドは、配列ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＡＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＡＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２３）を有する。別の実施形態においては、ポリペプチドは、配列ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＡＡＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＡＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２４）を有する。さらに別の実施形態においては、ポリペプチドは、配列ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＡＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２５）を有する。さらなる実施形態においては、ポリペプチドは、配列ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＡＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２６）を有する。さらなる実施形態においては、ポリペプチドは、配列：ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＡＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２７）を有する。
【００５９】
さらに特に有用である実施形態においては、炎症誘発活性の低いＶＥＧＦポリペプチド配列変種は、網膜に投与したときに、対応する天然ＶＥＧＦポリペプチド配列よりも白血球停滞を誘導しない。
【００６０】
特に有用である態様においては、本発明は、ＶＥＧＦポリペプチド変種が天然ＶＥＧＦポリペプチド配列の１つ以上の変化を有する、炎症誘発活性の低いＶＥＧＦポリペプチド配列変種を含む、ポリペプチドを提供する。特に有用である実施形態においては、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列は、ＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号１）であり、変化は１つ以上のアミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失又はこれらの組合せである。
【００６１】
さらに別の態様においては、本発明は、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列ＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号１）の１つ以上のアミノ酸置換、アミノ酸挿入及び／又はアミノ酸欠失を有するＶＥＧＦポリペプチド配列変種を含むポリペプチドを提供する。ある実施形態においては、ポリペプチドは、非塩基性アミノ酸による天然ＶＥＧＦポリペプチド配列の塩基性アミノ酸の１個以上の置換を含む。別の実施形態においては、ポリペプチドは、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列の塩基性アミノ酸の１個以上の欠失を含む。別の実施形態においては、ポリペプチドは、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列の塩基性アミノ酸に隣接する非塩基性アミノ酸の１個以上の挿入を含む。別の実施形態においては、ポリペプチドは、置換、挿入及び／又は欠失の組合せを含む。
【００６２】
別の有用である態様においては、本発明は、一般化配列ＰＣＳＥ  Ｘ１Ｘ２Ｘ３  Ｘ４ＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＸ５ＣＳ  ＣＸ６ＮＴＤＳ  Ｘ７Ｃ  Ｘ８Ａ  Ｘ９ＱＬＥＬＮＥ  Ｘ１０ＴＣ  Ｘ１１ＣＤＸ１２Ｐ  Ｘ１３Ｘ１４（配列番号２）（式中、Ｘ１−Ｘ１４の少なくとも１個は、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列ＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号１）の非塩基性アミノ酸置換である。）を有するＶＥＧＦポリペプチド配列変種を含む、ポリペプチドを提供する。
【００６３】
有用であるさらなる態様においては、本発明は、一般化配列ＰＣＳＥ  Ｘ１Ｘ２Ｘ３  Ｘ４ＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＸ５ＣＳ  ＣＸ６ＮＴＤＳ  Ｘ７Ｃ  Ｘ８Ａ  Ｘ９ＱＬＥＬＮＥ  Ｘ１０ＴＣ  Ｘ１１ＣＤＸ１２Ｐ  Ｘ１３Ｘ１４（配列番号２）（式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ５−Ｘ１１の少なくとも１個は、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列ＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号１）の非塩基性アミノ酸置換である。）を有するＶＥＧＦポリペプチド配列変種を含む、ポリペプチドを提供する。ある実施形態においては、非塩基性アミノ酸置換は、Ａ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｖなどのアミノによる。特に有用である一実施形態においては、非塩基性アミノ酸置換はＡである。
【００６４】
特定の実施形態においては、ポリペプチドは、配列ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＡＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＡＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２３）を有する。別の実施形態においては、ポリペプチドは、配列ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＡＡＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＡＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２４）を有する。さらに別の実施形態においては、ポリペプチドは、配列ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＡＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２５）を有する。さらに別の実施形態においては、ポリペプチドは、配列ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＡＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２６）を有する。さらなる実施形態においては、ポリペプチドは、配列ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＡＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２７）を有する。
【００６５】
さらなる態様においては、本発明は、配列ＰＣＳＥ  Ｘ１Ｘ２Ｘ３  Ｘ４ＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＸ５ＣＳ  ＣＸ６ＮＴＤＳ  Ｘ７Ｃ  Ｘ８Ａ  Ｘ９ＱＬＥＬＮＥ  Ｘ１０ＴＣ  Ｘ１１ＣＤＸ１２Ｐ  Ｘ１３Ｘ１４（配列番号２）（式中、Ｘ１−Ｘ１４の少なくとも１個は、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列ＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号１）のアミノ酸欠失位置に対応する。）を含む、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種を提供する。
【００６６】
さらに別の有用である態様においては、本発明は、配列ＰＣＳＥ  Ｘ１Ｘ２Ｘ３  Ｘ４ＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＸ５ＣＳ  ＣＸ６ＮＴＤＳ  Ｘ７Ｃ  Ｘ８Ａ  Ｘ９ＱＬＥＬＮＥ  Ｘ１０ＴＣ  Ｘ１１ＣＤＸ１２Ｐ  Ｘ１３Ｘ１４（配列番号２）（式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ５−Ｘ１１の少なくとも１個は、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列ＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号１）のアミノ酸欠失位置に対応する。）を含む、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種を提供する。この態様のある実施形態においては、ポリペプチドは、配列：ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２９）を有する。別の実施形態においては、本発明は、配列ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号３０）を有するポリペプチドを提供する。さらに別の実施形態においては、本発明は、配列ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号３１）を有するポリペプチドを提供する。さらなる実施形態においては、ポリペプチドは、配列ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号３２）を有する。
【００６７】
さらなる態様においては、本発明は、一般化配列ＰＣＳＥ  Ｘ１Ｘ２Ｘ３  Ｘ４ＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＸ５ＣＳ  ＣＸ６ＮＴＤＳ  Ｘ７Ｃ  Ｘ８Ａ  Ｘ９ＱＬＥＬＮＥ  Ｘ１０ＴＣ  Ｘ１１ＣＤＸ１２Ｐ  Ｘ１３Ｘ１４（配列番号２）（式中、Ｘ１−Ｘ１４の少なくとも１個は、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列ＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号１）のアミノ酸挿入位置に対応する。）を有するＶＥＧＦポリペプチド配列変種を含む、ポリペプチドを提供する。
【００６８】
特に有用である別の態様においては、本発明は、一般配列ＰＣＳＥ  Ｘ１Ｘ２Ｘ３  Ｘ４ＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＸ５ＣＳ  ＣＸ６ＮＴＤＳ  Ｘ７Ｃ  Ｘ８Ａ  Ｘ９ＱＬＥＬＮＥ  Ｘ１０ＴＣ  Ｘ１１ＣＤＸ１２Ｐ  Ｘ１３Ｘ１４（配列番号２）（式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ５−Ｘ１１の少なくとも１個は、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列ＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号１）のアミノ酸挿入位置に対応する。）を有するＶＥＧＦポリペプチド配列変種を含む、ポリペプチドを提供する。挿入は、天然アミノ酸のどちらかの側に隣接してなされ得る。
【００６９】
ある実施形態においては、ポリペプチドは、配列ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＡＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＡＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号３３）を有する。別の実施形態においては、ポリペプチドは、配列ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＡＲＡＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＡＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号３４）を有する。さらに別の実施形態においては、ポリペプチドは、配列ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＡＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号３５）を有する。さらなる実施形態においては、ポリペプチドは、配列ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＡＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号３６）を有する。さらに別の実施形態においては、ポリペプチドは、配列ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＡＲＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号３７）を有する。
【００７０】
本発明の上記態様のいずれかのある特に有用である実施形態においては、ポリペプチドは、ほ乳動物の天然ＶＥＧＦ  ｃＤＮＡをコードする核酸と厳密な条件下でハイブリッド形成する核酸によってコードされるＶＥＧＦポリペプチド（ｐｏｌｙｅｐｔｉｄｅ）配列変種を含む。ある実施形態においては、変種をコードする核酸がハイブリッド形成する、ほ乳動物の天然ＶＥＧＦ  ｃＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３７６のヒトＶＥＧＦ  ｃＤＮＡである（図１６参照）。
【００７１】
別の態様においては、本発明は、本発明の上記態様のポリペプチドのいずれかを投与することによって、炎症性副作用の少ないＶＥＧＦポリペプチドを用いて疾患又は障害を治療する方法を提供する。
【００７２】
特に有用である態様においては、本発明は、ＶＥＧＲ−２（ＦＬＫ−１／ＫＤＲ）に対する親和性を実質的に維持しながら、ヘパリン結合親和性を低下させる、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列の１つ以上の変化を有するＶＥＧＦポリペプチド配列変種を投与することによって、炎症性副作用の少ないＶＥＧＦポリペプチドを用いて、疾患又は症状を治療する方法を提供する。
【００７３】
本発明によるこの方法のある実施形態においては、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種は、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列ＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号１）の塩基性アミノ酸残基の１つ以上のアミノ酸置換を有する。ある実施形態においては、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種は、配列ＰＣＳＥＸ１Ｘ２ＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  Ｘ３ＣＤＫＰＲＲ（配列番号２８）を有し、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はＲ又は非塩基性アミノ酸であるが、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３の少なくとも１個は非塩基性アミノ酸である。
【００７４】
本発明によるこの方法の幾つかの有用である実施形態においては、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種は、配列ＰＣＳＥＲＡＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＡＣＤＫＰＲＲ（配列番号３）を有する。別の有用である実施形態においては、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種は、配列ＰＣＳＥＡＡＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＡＣＤＫＰＲＲ（配列番号４）を有する。
【００７５】
本発明のこの態様の幾つかの特に有用である実施形態においては、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種は、配列ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＡＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＡＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２３）を有する。さらに別の有用である実施形態においては、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種は、配列ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＡＡＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＡＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２４）を有する。
【００７６】
ある実施形態においては、本発明のこの態様において治療される疾患又は症状は、冠動脈疾患に付随する虚血である。特定の実施形態においては、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種は、虚血性心疾患において側副血管の形成を増加させる。別の実施形態においては、疾患又は症状は、下肢の糖尿病性神経障害である。さらなる実施形態においては、疾患又は症状は創傷治癒である。別の実施形態においては、疾患又は症状は循環器疾患である。さらなる実施形態においては、疾患又は症状は虚血である。
【００７７】
ある特に有用である実施形態においては、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種は、対応する天然ＶＥＧＦポリペプチド配列よりも低レベルの白血球停滞を起こす。
【００７８】
さらなる態様においては、本発明は、ＶＥＧＲ−２（ＦＬＫ−１／ＫＤＲ）に対する親和性を実質的に維持しながら、ニューロピリン−１受容体結合活性を低下させる、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列の１つ以上の変化を有する、炎症誘発活性の低いＶＥＧＦポリペプチド変種を含むポリペプチドを投与することによって、炎症性副作用の少ないＶＥＧＦポリペプチドを用いて疾患又は障害を治療する方法を提供する。
【００７９】
ある実施形態においては、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種は、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列ＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号１）の塩基性アミノ酸残基の１つ以上のアミノ酸置換を有する。さらなる実施形態においては、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種は、配列ＰＣＳＥＸ１Ｘ２ＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  Ｘ３ＣＤＫＰＲＲ（配列番号２８）を含み、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はＲ又は非塩基性アミノ酸であるが、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３の少なくとも１個は非塩基性アミノ酸である。ある特に有用である実施形態においては、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種は、配列ＰＣＳＥＲＡＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＡＣＤＫＰＲＲ（配列番号３）を有する。別の有用である特に有用である実施形態においては、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種は、配列ＰＣＳＥＡＡＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＡＣＤＫＰＲＲ（配列番号４）を有する。
【００８０】
本発明のこの態様のある実施形態においては、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種は、配列ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＡＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＡＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２３）を有する。別の実施形態においては、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種は、配列ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＡＡＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＡＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２４）を有する。
【００８１】
さらなる実施形態においては、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種は、虚血性心疾患において側副血管の形成を増加させる。特定の実施形態においては、治療される疾患又は症状は、下肢の糖尿病性神経障害である。ある実施形態においては、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種は、対応する天然ＶＥＧＦポリペプチド配列よりも白血球停滞を誘導しない。さらなる実施形態においては、治療される疾患又は症状は、創傷治癒である。別の実施形態においては、治療される疾患又は症状は、循環器疾患である。特定の実施形態においては、疾患又は症状は虚血である。
【００８２】
別の態様においては、本発明は、試験化合物の存在下でヘパリン／ＶＥＧＦ相互作用レベルを検出すること、及び試験化合物の存在下におけるヘパリン／ＶＥＧＦ相互作用レベルを試験化合物の非存在下におけるヘパリン／ＶＥＧＦ相互作用レベルと比較することによって、ヘパリン／ＶＥＧＦ相互作用阻害剤を特定する方法を提供する。一般に、試験化合物の存在下におけるヘパリン／ＶＥＧＦ相互作用レベルが試験化合物の非存在下におけるヘパリン／ＶＥＧＦ相互作用レベルよりも低い場合に、試験化合物はヘパリン／ＶＥＧＦ相互作用阻害剤である。
【００８３】
ある実施形態においては、この方法は、さらに、ＶＥＧＦ血管形成促進効果を妨げない特定のＶＥＧＦ炎症誘発作用阻害剤を特定する段階を含む。一般に、かかる特定のＶＥＧＦ炎症誘発作用阻害剤は、試験化合物の存在下でＶＥＧＦ受容体とのＶＥＧＦ相互作用レベルを検出すること、及び試験化合物の存在下におけるＶＥＧＦ受容体とのＶＥＧＦ相互作用レベルを試験化合物の非存在下におけるＶＥＧＦ受容体とのＶＥＧＦ相互作用レベルと比較することによって特定される。一般に、試験化合物の存在下におけるＶＥＧＦ受容体とのＶＥＧＦ相互作用レベルが、試験化合物の非存在下におけるＶＥＧＦ受容体とのＶＥＧＦ相互作用レベルと実質的に同じ、又はそれよりも高い場合に、試験化合物は、特定のＶＥＧＦ炎症誘発作用阻害剤である（また、試験化合物は、上記のように、ヘパリン／ＶＥＧＦ相互作用阻害剤である。）。ある実施形態においては、ＶＥＧＦ受容体はＶＥＧＦＲ−２（ＦＬＫ−１／ＫＤＲ）である。別の実施形態においては、ＶＥＧＦ受容体はＶＥＧＦＲ−１である。
【００８４】
特定の実施形態においては、試験化合物はアプタマーである。別の実施形態においては、試験化合物は、ペプチド又はペプチド模倣物である。
【００８５】
ある有用である実施形態においては、本発明によるこの方法は、さらに、ＶＥＧＦ炎症誘発作用を抑制しながら血管新生を刺激するために、ＶＥＧＦポリペプチドと、例えば上で特定された、ＶＥＧＦ血管形成促進効果を妨げない特定のＶＥＧＦ炎症誘発作用阻害剤とを、ほ乳動物対象に同時投与することを規定する。
【００８６】
さらに別の態様においては、本発明は、ヘパリンに対する親和性の低いＶＥＧＦポリペプチド配列変種を単離する方法を提供する。この方法は、一般に、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列の変種を含むポリペプチドを用意する段階、及び変種を含むポリペプチドのヘパリン結合レベルを天然ＶＥＧＦポリペプチド配列を含むポリペプチドのヘパリン結合レベルと比較する段階を含む。一般に、変種を含むポリペプチドのヘパリン結合レベルが、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列を含むポリペプチドのヘパリン結合レベルよりも低い場合に、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種は、ヘパリンに対する親和性の低いＶＥＧＦポリペプチド配列変種である。
【００８７】
本発明のこの態様のある特に有用である実施形態においては、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種は、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列ＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦ  ＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳ  ＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡ  ＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣ  ＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号１）の変種である。本発明のこの態様のある別の特に有用である実施形態においては、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種は、天然ＶＥＧＦポリペプチド配列ＡＲＱＥＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＲＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号３８；ＶＥＧＦ５５）の変種である。
【００８８】
特定の実施形態においては、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種は、塩基性アミノ酸の置換である。別の実施形態においては、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種は、塩基性アミノ酸の欠失である。さらに別の有用である実施形態においては、ＶＥＧＦポリペプチド配列変種は、塩基性アミノ酸に隣接する挿入である。
【００８９】
本発明の態様は、修飾ヘパリン結合ドメインを含むＶＥＧＦ変種をコードする配列を含む単離核酸分子も提供する。ここで、修飾ヘパリン結合ドメインは、天然ヘパリン結合ドメインの塩基性アミノ酸残基が中性アミノ酸残基又は酸性アミノ酸残基で置換されるような変異を含むことによって、天然ヘパリン結合ドメインとは異なる。ＶＥＧＦ変種は、受容体結合機能を維持しながら、天然ＶＥＧＦよりも低い親和性でヘパリンと結合する。
【００９０】
本発明は、一つには、宿主細胞中でＶＥＧＦ変種を産生する発現ベクターも提供する。このベクターは、ａ）ＶＥＧＦ変種をコードするポリヌクレオチド、ｂ）ＶＥＧＦ変種をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結され、宿主細胞中で機能する転写制御配列及び翻訳制御配列、並びにｃ）選択マーカーを含む。
【００９１】
本発明は、一つには、宿主細胞中でのＶＥＧＦ変種の発現を可能にするように、ＶＥＧＦ変種をコードするポリヌクレオチドで安定に形質転換された宿主細胞、及び該ポリヌクレオチドを安定に形質移入された宿主細胞も提供する。
【００９２】
本発明は、一つには、ｐ１２０又はｐ１００に対する、ＶＥＧＦによって誘発されたリン酸化効果を可視化する方法も提供する。Ｊ．Ｍ．  Ｓｔａｄｄｏｎ他（その内容を参照によりその全体を本明細書に組み込む欧州特許第１１３７９４６号Ｂ１）は、ｐ１２０又はｐ１００のセリン又はトレオニンリン酸化状態に影響を及ぼし得る物質をスクリーニングする方法を提供している。
【００９３】
本発明は、一つには、ＶＥＧＦ１６５のアイソフォーム特異的認識におけるＨＢＤの役割を特徴づける方法も提供する。Ｆ．  Ｊｕｃｋｅｒ等は、ＮＭＲ分光法によって、単離ＨＢＤ−アプタマー複合体を完全長ＶＥＧ１６４−アプタマー複合体と比較した（この内容を参照により全体を本明細書に組み込むＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＮＡＳ，（２００５）Ｖｏｌ．１０２，  １８９０２−１８９０７）。
【００９４】
本発明は、一つには、眼球血管新生障害、（加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症及び未熟児網膜症）、乾せん、リウマチ様関節炎、ぜん息、炎症性腸疾患（例えば、クローン病）  多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性鼻炎（枯草熱）、循環器疾患を含めて、ただしこれらだけに限定されない、血管新生疾患又は血管新生若しくは炎症に関係する疾患を治療するための治療化合物候補を設計し、スクリーニングする方法もさらに提供する。
【００９５】
本発明は、一つには、ＶＥＧＦのヘパリン結合ドメインをコンピュータによってモデル化する方法も提供する。かかるモデルは、このドメインと相互作用する化合物の設計に有用である。この方法は、本明細書に記載のＶＥＧＦヘパリン結合ドメインの変異誘発データ、並びにＸ線及び溶液構造から作製されたデータを、ＶＥＧＦのヘパリン結合ドメインの３次元モデル、及びポリペプチドに対する作動物質又は拮抗物質として作用する分子の設計に使用するのに適切な結合部位の３次元モデルを作製することができるコンピュータアルゴリズムに適用することを含む。Ｘ線結晶学的座標及び溶液構造は開示されている（Ｙ．Ａ．  Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：１３２５−１３３８；  Ｃ．  Ｗｉｅｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｃｅｌｌ  ９１：６９５−７０４；  Ｍ．Ａ．  ＭｃＴｉｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ７：３１９−３３０及びＭｅｌｉｓｓａ  Ｅ．  Ｓｔａｕｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ，  ２３：５７−６１参照）。本明細書に開示するＶＥＧＦヘパリン結合ドメインの機能的部位を示す変異誘発データによって、ＶＥＧＦヘパリン結合ドメインの機能的部位の３次元モデルを作製することができる。
【００９６】
本発明の態様は、ＶＥＧＦヘパリン結合ドメイン官能基に結合し、それを阻害する新規薬物候補分子、又はその効力を改善する新規薬物候補分子を新規に設計することによって、ＶＥＧＦヘパリン結合ドメインの調節物質候補を特定する方法も提供する。新規設計は、基質類似体構造に無関係に、立体的及び静電的に相補的に基づく部位に断片又は原子を構築及び連結するコンピュータプログラムを使用して分子を作製することを含む。薬物設計プロセスは、ＶＥＧＦヘパリン結合ドメイン構造を解析し、ヘパリン結合機能を担う領域を決定した後に始まる。次いで、コンピュータによって作製されたモデルを用いて、反復プロセスを種々の分子構造に適用して、ＶＥＧＦヘパリン結合ドメインの作動物質又は拮抗物質の候補を特定する。ＶＥＧＦヘパリン結合ドメインの拮抗物質及び作動物質は、血管新生及び炎症に付随する疾患又は障害の治療のための治療化合物候補の設計用リード化合物として役立つ。
【００９７】
一実施形態においては、ａ）ＶＥＧＦヘパリン結合ドメイン機能を担う部位の原子座標を用意し、それによってＶＥＧＦヘパリン結合性を担う部位の３次元構造を定義する段階と、ｂ）ＶＥＧＦヘパリン結合ドメインの３次元構造を使用して、調節物質候補をコンピュータモデリングによって設計又は選択する段階と、ｃ）調節物質候補を用意する段階と、ｄ）前記調節物質候補のＶＥＧＦヘパリン結合ドメイン活性調節能力を求めるために、調節物質候補をＶＥＧＦヘパリン結合ドメインと物理的に接触させる段階とを含み、ＶＥＧＦヘパリン結合ドメイン活性の調節物質が特定される、ＶＥＧＦヘパリン結合ドメイン活性の調節物質候補を特定する方法。別の実施形態においては、調節物質候補を新規に設計する。本発明のある実施形態においては、調節物質候補を公知調節物質から設計する。別の実施形態においては、調節物質候補をＭａｃｕｇｅｎ（登録商標）から設計する。
【００９８】
本発明の態様は、本明細書に記載のＶＥＧＦヘパリン結合ドメインの変異誘発データ並びにＶＥＧＦのＸ線及び溶液構造から作製されたデータを用いて作製された、ＶＥＧＦヘパリン結合ドメインのコンピュータモデルを用いて、候補化合物をスクリーニングする方法も提供する。
【００９９】
本発明によって提供されるＶＥＧＦ調節化合物は、抗炎症剤、抗血管透過剤、免疫抑制剤、抗高血圧剤として使用することができる。
【０１００】
本発明は、一つには、インビトロ又はインビボでのアッセイによってＶＥＧＦ変種をスクリーニングする方法も提供する。
【０１０１】
本発明は、一つには、インビトロ又はインビボでのアッセイによってＶＥＧＦ拮抗物質をスクリーニングする方法も提供する。
【０１０２】
一実施形態においては、本発明は、ＶＥＧＦ受容体結合ドメインの機能を維持しつつ、候補化合物のＶＥＧＦヘパリン結合ドメイン機能阻害能力を評価する方法を提供する。この方法は、（ａ）候補化合物のヘパリン結合阻害能力を評価すること、（ｂ）候補化合物の受容体結合阻害能力を評価すること、及び（ｃ）候補化合物が、受容体結合機能を維持しながら、ヘパリン結合を阻害する能力を求めることを含む。当分野で公知の任意の適切なアッセイを使用することができる。適切なアッセイとしては、下記実施例２−５に示すアッセイが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０１０３】
別の態様においては、本発明は、ＶＥＧＦ１６４によって誘導される白血球停滞を阻害する方法を提供する。一実施形態においては、ＶＥＧＦ１６４によって誘導される白血球停滞を阻害する方法は、可溶性ヘパリン結合ドメインの投与を含む。特定の一実施形態においては、可溶性ヘパリン結合ドメインは、ＶＥＧＦ５５の配列を有するポリペプチドを含む。
【０１０４】
本明細書で参照する特許及び科学文献は、当業者に利用可能である知識を確立するものである。本明細書で引用する、発行された米国特許、受理された出願、外国出願公報、及びＧｅｎＢａｎｋデータベース配列を含めた参考文献を、各々を具体的かつ個々に参照によりその全体を組み込むように指定した場合と同じ程度に参照により本明細書に組み込む。
【０１０５】
定義
本明細書では、以下の用語及び句は以下の意味を有するものとする。特に断らない限り、本明細書で使用する全技術用語及び全科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。
【０１０６】
本明細書では句「天然ＶＥＧＦポリペプチド配列の１つ以上の変化」などの「変化」という用語は、アミノ酸置換、アミノ酸欠失及びアミノ酸挿入を指すが、タンパク質切断（例えば、終止コドンの挿入、タンパク質Ｃ末端部分のタンパク質分解除去などによって起こるＣ末端タンパク質切断）を意味しない。
【０１０７】
「拮抗物質」とは、標的分子の活性又は産生をある程度、又は完全に、阻害する薬剤を意味する。特に、本明細書で選択的に使用する「拮抗物質」という用語は、ＶＥＧＦレベル、ＶＥＧＦＲタンパク質レベル又はタンパク質活性を低下させ得る薬剤を意味する。拮抗物質の例示的形態としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、（環式ペプチドなどの）ペプチド、抗体又は抗体断片、ペプチド模倣物、核酸分子、アンチセンス分子、リボザイム、アプタマー、ＲＮＡｉ分子及び小有機分子が挙げられる。ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲリガンド／受容体標的の拮抗物質阻害の例示的非限定的機序としては、（例えば、リガンド遺伝子／核酸を標的にしたアンチセンス、リボザイム又はＲＮＡｉ組成物を用いた）リガンドの合成及び／又は安定性の抑制、（例えば、抗リガンドアプタマー、抗体、又は可溶なおとり同族受容体を用いた）リガンドとその同族受容体との結合の阻止、（例えば、リガンド受容体遺伝子／核酸を標的にしたアンチセンス、リボザイム又はＲＮＡｉ組成物を用いた）受容体の合成及び／又は安定性の抑制、（例えば、受容体抗体を用いた）受容体とその同族受容体との結合の阻止、並びに（例えば、受容体チロシンキナーゼ阻害剤を用いた）同族リガンドによる受容体の活性化の阻止が挙げられる。また、拮抗物質は、標的分子を直接的又は間接的に阻害し得る。
【０１０８】
本明細書では「抗体」という用語は、例えば、任意のアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥなど）の抗体全体を含むものとし、脊椎動物（例えば、ほ乳動物）のタンパク質、炭水化物などを認識し、それと特異的に反応もする、その断片を含む。抗体は、従来技術によって断片化することができ、断片は、抗体全体について上述したのと同様に、有用性についてスクリーニングすることができる。したがって、「抗体」という用語は、ある種のタンパク質と選択的に反応し得る、抗体分子のタンパク質分解的に切断された、又は組み換え調製された部分のセグメントを含む。かかるタンパク質分解断片及び／又は組み換え断片の非限定的例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、並びにペプチドリンカーによって連結されたＶ［Ｌ］及び／又はＶ［Ｈ］ドメインを含む単鎖抗体（ｓｃＦｖ）が挙げられる。ｓｃＦｖは、共有結合的又は非共有結合的に結合して、２個以上の結合部位を有する抗体を形成し得る。本発明は、ポリクローナル、モノクローナル、又は抗体及び組み換え抗体の他の精製調製物を含む。
【０１０９】
「核酸リガンド」という用語と本明細書では区別なく使用する「アプタマー」という用語は、特定の３次元立体配座をとり得ることによって、標的に結合し、標的に対して拮抗（すなわち、抑制）効果を有する核酸を意味する。本発明の標的はＶＥＧＦ（又はその同族受容体ＶＥＧＦＲの１種類）であり、したがって、ＶＥＧＦアプタマー又は核酸リガンド（又はＶＥＧＦＲアプタマー若しくは核酸リガンド）という用語を使用する。アプタマーによる標的の阻害は、標的の結合によって、標的を触媒作用的に変化させることによって、標的又は標的の機能的活性を改変／変化させるように標的と反応することによって、自殺阻害因子のように標的と共有結合することによって、標的と別の分子の反応を促進することによって、起こり得る。アプタマーは、複数のリボヌクレオチド単位、デオキシリボヌクレオチド単位、又はヌクレオチド残基の両方のタイプの混合物を含み得る。アプタマーは、本明細書にさらに詳細に記載するように、１個以上の修飾塩基、糖又はリン酸骨格単位をさらに含み得る。
【０１１０】
「抗体拮抗物質」とは、標的ＶＥＧＦの１つ以上の活性を阻止し得る、又はかなり抑制し得る、本明細書に定義する抗体分子を意味する。例えば、ＶＥＧＦ阻害抗体は、ＶＥＧＦの血管新生刺激能力を阻害又は抑制し得る。
【０１１１】
ヌクレオチド配列は、２個の配列の塩基の各々が一致する場合、すなわち、ワトソン・クリック塩基対を形成し得る場合に、別のヌクレオチド配列と「相補的」である。「相補鎖」という用語は、本明細書では「相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）」という用語と区別なく使用される。核酸鎖の相補体は、コーディング鎖の相補体でも、非コーディング鎖の相補体でもよい。
【０１１２】
「保存された残基」又は「保存的アミノ酸置換」という句は、ある共通の性質に基づいてアミノ酸を分類することを指す。個々のアミノ酸間の共通の性質を定義する機能的方法は、共通の祖先に由来する生物の対応するタンパク質間のアミノ酸変化の正規化頻度を分析することである。かかる分析によれば、アミノ酸のグループは、グループ内のアミノ酸が優先的に交換し合い、したがって全体のタンパク質構造に対するその影響が互いに最も類似している場合に定義することができる（Ｓｃｈｕｌｚ，  Ｇ．Ｅ．  ａｎｄ  Ｒ．Ｈ．  Ｓｃｈｉｒｍｅｒ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。このようにして定義されるアミノ酸グループの例としては
（ｉ）Ｇｌｕ及びＡｓｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓからなる荷電グループ、
（ｉｉ）Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓ（すなわち、Ｋ、Ｒ及びＨ）からなる正荷電グループ（すなわち、塩基性アミノ酸）、
（ｉｉｉ）Ｇｌｕ及びＡｓｐ（すなわち、Ｅ及びＤ）からなる負荷電グループ（すなわち、酸性アミノ酸）、
（ｉｖ）Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐからなる芳香族グループ、
（ｖ）Ｈｉｓ及びＴｒｐからなる窒素環グループ、
（ｖｉ）Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅからなる大きい脂肪族非極性グループ、
（ｖｉｉ）Ｍｅｔ及びＣｙｓからなる微極性グループ、
（ｖｉｉｉ）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ及びＰｒｏからなる小さい残基グループ、
（ｉｘ）Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ及びＣｙｓからなる脂肪族グループ、並びに
（ｘ）Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる小さいヒドロキシルグループ
が挙げられる。
【０１１３】
上記グループに加えて、各アミノ酸残基はそれ自体のグループを形成し得る。個々のアミノ酸によって形成されるグループは、当分野で一般に使用されるアミノ酸の１文字及び／又は３文字の略語によって簡単に記述することができる。
【０１１４】
本明細書では「相互作用する」という用語は、タンパク質−タンパク質、タンパク質−核酸、核酸−核酸、及びタンパク質−小分子又は核酸−天然小分子の相互作用など、分子間の検出可能な関係又は会合（例えば、生化学的相互作用）を含むものとする。
【０１１５】
「相互作用タンパク質」という用語は、例えばＶＥＧＦタンパク質、その対応する同族受容体などの目的タンパク質と相互作用、結合及び／又は会合し得るタンパク質を指す。
【０１１６】
本明細書では、ペプチドは、同族の細胞物質、化学前駆体又は他の化学物質を実質的に含まないときに、「単離された」又は「精製された」と言われる。本発明のペプチドは、均一に、又は他の純度に、精製することができる。精製レベルは、意図する用途に基づく。
【０１１７】
ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸に関して、本明細書では「単離された」という用語は、巨大分子の自然源中に存在する、それぞれ他のＤＮＡ又はＲＮＡから分離された分子を指す。同様に、ポリペプチドに関して、本明細書では「単離された」という用語は、ポリペプチド源中に存在する他のタンパク質から分離されたタンパク質分子を指す。本明細書では単離されたという用語は、組み換えＤＮＡ技術によって製造されたときには、細胞物質、ウイルス性物質若しくは培地を実質的に含まない核酸若しくはペプチドも指し、又は化学合成されたときには、化学物質前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まない核酸若しくはペプチドも指す。
【０１１８】
「単離核酸」とは、天然には断片として存在せず、天然状態では存在しない、核酸断片を含むものとする。「単離された」という用語は、本明細書では、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドを指すのにも使用し、精製ポリペプチドと組み換えポリペプチドの両方を包含するものとする。
【０１１９】
本明細書では「細胞物質を実質的に含まない」という用語は、（乾燥重量で）約３０％未満の他のタンパク質（すなわち、汚染タンパク質）、約２０％未満の他のタンパク質、約１０％未満の他のタンパク質、又は約５％未満の他のタンパク質を含むペプチド調製物を含む。ペプチドを組み換えによって製造するときには、ペプチドは、培地を実質的に含まないこともあり得る。すなわち、培地は、タンパク質調製物の体積の約２０％未満である。
【０１２０】
本明細書では「化学物質前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない」という用語は、その合成に関与する化学物質前駆体又は他の化学物質から分離されたペプチドの調製物を含む。ある実施形態においては、「化学物質前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない」という言葉は、（乾燥重量で）約３０％未満の化学物質前駆体又は他の化学物質を含むＶＥＧＦペプチド調製物を含むが、本発明は、約２０％未満の化学物質前駆体若しくは他の化学物質、約１０％未満の化学物質前駆体若しくは他の化学物質、又は約５％未満の化学物質前駆体若しくは他の化学物質を含む実施形態も含む。
【０１２１】
「細胞中の遺伝子の発現レベル」とは、細胞中の遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ並びにｐｒｅ−ｍＲＮＡ新生転写物、転写物プロセシング中間体、成熟ｍＲＮＡ及び分解産物のレベル、並びに該遺伝子から翻訳されるタンパク質のレベルを指す。
【０１２２】
本明細書では「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）などのポリヌクレオチドを指し、必要に応じてリボ核酸（ＲＮＡ）を指す。この用語は、等価物として、ヌクレオチド類似体から作製されるＲＮＡ又はＤＮＡの類似体を含むと理解すべきでもある。また、記載した実施形態に該当する場合には、一本鎖（センス又はアンチセンス）及び二本鎖ポリヌクレオチド、ＥＳＴ、染色体、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びｒＲＮＡは、核酸と称し得る分子の代表例である。
【０１２３】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然の塩基、糖及び糖間（骨格）結合からなるヌクレオチド又はヌクレオシドモノマーのオリゴマー又はポリマーを指す。この用語は、非天然モノマー、又は同様に機能するその一部を含む、改変又は置換オリゴマーも含む。置換オリゴマーの組入れは、細胞内取り込みの促進、又はヌクレアーゼ耐性の増大を含めた要因に基づき、当分野で公知の通り選択される。オリゴヌクレオチド全体又はその一部のみは、置換オリゴマーを含み得る。
【０１２４】
オリゴヌクレオチドは、（１９８８年５月４日に発行された欧州特許公報第２６６，０３２号に記載のものなどの固相技術を用いて、又はＦｒｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６），  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４：５３９９−５４０７に記載のデオキシヌクレオシドＨ−ホスホナート中間体を介して、リン酸トリエステル、亜リン酸エステル又はホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｉｔｅ）化学反応などの）公知の方法によって化学合成される。次いで、オリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲルによって精製することができる。
【０１２５】
「パーセント同一」という用語は、２個のアミノ酸配列間又は２個のヌクレオチド配列間の配列同一性を指す。同一性は、比較目的で整列させることができる各配列の位置を比較することによって各々決定することができる。比較配列中の対応する位置が同じ塩基又はアミノ酸によって占有されるときには、分子は該位置において同一である。対応する部位が同じ又は類似の（例えば、立体的及び／又は電子的性質が類似した）アミノ酸残基によって占有されるときには、分子は、該位置において相同（類似）であると表すことができる。相同性、類似度又は同一性の割合としての表現は、比較配列によって共有される位置における同一又は類似のアミノ酸の数の関数を指す。Ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  Ｍｏｄｅｌ（ＨＭＭ）、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴを含めて、種々のアラインメントアルゴリズム及び／又はプログラムを使用することができる。ＨＮｉＭ、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．及びＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＥＢＩから入手可能である。一実施形態においては、これらのＧＣＧプログラムによってギャップ重み付け（ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ）１で求めることができる２個の配列の同一性パーセント、例えば、各アミノ酸ギャップは、２個の配列間の単一のアミノ酸又はヌクレオチドのミスマッチであるごとく重み付けされる。別のアラインメント技術は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．  ２６６：  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  （１９９６），  ｅｄ．  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ａ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  ＆  Ｃｏ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  ＵＳＡに記載されている。望ましい場合には、配列中のギャップを許容するアラインメントプログラムを利用して、配列を整列させる。Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列アラインメント中のギャップを許容するアルゴリズムの１タイプである（（１９９７）  Ｍｅｔｈ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ７０：１７３−１８７参照）。また、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈアラインメント法を用いたＧＡＰプログラムを利用して、配列を整列させることができる。ＨＭＭの使用を含むさらなる技術及びアルゴリズムは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ａｎｄ  Ｄａｔａｂａｎｋｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （２０００），  ｅｄ．  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ及びＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｄａｔａｂａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （１９９９）  ｅｄ．  Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓに記載されている。代替の探索戦略は、ＭＡＳＰＡＲコンピュータ上で実行されるＭＰＳＲＣＨソフトウェアを使用する。ＭＰＳＲＣＨは、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍｎａｎアルゴリズムを使用して、超並列計算機によって配列を評価する。この手法は、遠隔で関係する一致（ｄｉｓｔａｎｔｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｔｃｈ）を検出する能力を改善し、特に小さなギャップ及びヌクレオチド配列の誤りを許容する。核酸によってコードされるアミノ酸配列は、タンパク質とＤＮＡの両方のデータベースを検索するのに使用することができる。個々の配列を含むデータベースは、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ｅｄ．  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、同上に記載されている。データベースとしては、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＮＡ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）などが挙げられる。
【０１２６】
異常な、例えば、腫よう細胞の生物学的状態の「プロファイル」とは、病態に応じて変わる、細胞の種々の構成要素のレベルを指す。細胞の構成要素としては、ＲＮＡレベル、タンパク質存在レベル又はタンパク質活性レベルを含む。
【０１２７】
「タンパク質」という用語は、本明細書では「ペプチド」及び「ポリペプチド」という用語と区別なく使用される。「組み換えタンパク質」という用語は、組み換えＤＮＡ技術によって製造される本発明のタンパク質を指す。組み換えＤＮＡ技術では、一般に、発現タンパク質をコードするＤＮＡ、又はＲＮＡを適切な発現ベクターに挿入し、その発現ベクターを使用して宿主細胞を形質転換し、異種タンパク質又はＲＮＡを産生する。さらに、組み換えタンパク質をコードする組み換え遺伝子に関して「由来する」という句は、未変性タンパク質のアミノ酸配列、又は天然タンパク質の置換及び欠失を含めた変異によって生成される、未変性タンパク質のアミノ酸配列に類似したアミノ酸配列を有するタンパク質を「組み換えタンパク質」の意味の中に含むものとする。
【０１２８】
本明細書では「導入遺伝子」という用語は、細胞に導入された（例えば、標的核酸の１種類、又はそれに対するアンチセンス転写物をコードする）核酸配列を意味する。導入遺伝子は、導入遺伝子が導入されるトランスジェニック動物若しくは細胞とある程度若しくは完全に異種、すなわち、外来とすることができ、又は導入遺伝子が導入されるが、導入遺伝子が挿入される細胞のゲノムを変えるように、動物のゲノムに挿入されるように設計された、若しくは挿入された、トランスジェニック動物若しくは細胞の内因性遺伝子と相同である（例えば、導入遺伝子は、自然の遺伝子の位置とは異なる位置に挿入され、又は導入遺伝子の挿入がノックアウトをもたらす。）。導入遺伝子は、細胞中にエピソームの形でも存在し得る。導入遺伝子は、１個以上の転写調節配列、及び選択した核酸の最適な発現に必要となり得る、イントロンなどの任意の別の核酸を含み得る。
【０１２９】
「血管新生障害」とは、発癌性又は悪性形質転換、すなわち、癌に付随する血管新生以外の、変化した、又は未制御の血管新生を特徴とする障害を意味する。血管新生障害の例としては、乾せん、リウマチ様関節炎並びに糖尿病性網膜症及び加齢黄斑変性症を含めた眼球血管新生障害が挙げられる。
【０１３０】
本明細書では「新血管新生」及び「血管新生」という用語は、区別なく使用される。新血管新生及び血管新生とは、細胞、組織又は器官中への新しい血管の生成を指す。血管新生の制御は、典型的には、ある病態において変化し、多くの場合において、疾患に付随する病理学的損傷は、変化した、未制御の、又は抑制されない血管新生に関係する。持続的な未制御の血管新生は、内皮細胞による異常成長を特徴とする病態を含めて多数の病態で起こり、漏出及び血管の透過性を含めて、これらの症状において見られる病理学的損傷を支持する。
【０１３１】
「眼球血管新生障害」とは、患者の眼における変化した、又は未制御の血管新生を特徴とする障害を意味する。例示的非限定的な眼球血管新生障害としては、視神経乳頭新血管新生、虹彩新血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、角膜新血管新生、硝子体新血管新生、緑内障、パンヌス、翼状片、黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、血管性網膜症、網膜変性、ブドウ膜炎、網膜の炎症性疾患、及び増殖性硝子体網膜症が挙げられる。
【０１３２】
「炎症性障害」とは、変化した、又は未制御の白血球動員を特徴とする障害を意味する。炎症性障害の例としては、リウマチ様関節炎、ぜん息、炎症性腸疾患（例えば、クローン病）  多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性鼻炎（枯草熱）、循環器疾患が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０１３３】
「ニューロン障害」とは、生理学的機能不全又はニューロン死を特徴とする障害を意味する。ニューロンは、中枢神経系又は末梢神経系中に存在し得る。かかる障害の非限定的リストは、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルー  ゲーリッグ病）、シャイ・ドレーガー症候群、進行性核上性麻ひ、レビー小体病、神経細胞障害及び運動ニューロン障害及び他の変性ニューロン障害を含む。
【０１３４】
他のニューロン障害としては、認知症、前頭側頭葉型認知症、虚血性障害（例えば、大脳又は脊髄の梗塞及び虚血、慢性虚血性脳疾患並びに脳卒中）、（例えば、身体的傷害又は手術及び圧迫傷害によって引き起こされる）コーマ（ｋａｕｍａ）、情動障害（例えば、ストレス、抑うつ及び外傷後の抑うつ）、神経精神障害（例えば、統合失調症、多発性硬化症及びてんかん）、学習及び記憶障害、並びに眼球ニューロン障害が挙げられるが、これらだけに限定されない。ニューロン障害としては、例えばセマフォリン３Ａによって誘発されるニューロン死を特徴とするニューロン障害も挙げられる。
【０１３５】
「眼球ニューロン障害」としては、網膜又は視神経視神経障害、視神経損傷及び視神経症、視神経又は視覚伝導路の障害、中毒性弱視、視神経萎縮、高次視覚伝導路（ｈｉｇｈｅｒ  ｖｉｓｕａｌ  ｐａｔｈｗａｙ）の病変、眼球運動障害、第三脳神経麻ひ、第四脳神経麻ひ、第六脳神経麻ひ、核間性眼筋麻ひ、注視麻ひ並びにフリーラジカル誘発性眼疾患が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０１３６】
視神経症としては、虚血性視神経症、視神経の炎症、視神経の細菌感染、視神経炎、視神経症、及びうっ血乳頭（乳頭浮腫（ｃｈｏｋｅｄ  ｄｉｓｋ））、乳頭炎（視神経炎）、球後視神経炎、視神経炎（ＯＮ）、前部虚血性視神経症（ＡＩＯＮ）、網膜振とう症、緑内障、黄斑変性症、網膜色素変性症、網膜剥離、網膜裂傷又は裂孔、糖尿病性網膜症及び医原性網膜症が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０１３７】
１つの特定の眼球ニューロン障害は、緑内障である。緑内障のタイプとしては、原発緑内障、慢性開放隅角緑内障、急性又は慢性閉塞隅角緑内障、先天性（乳児性）緑内障、続発緑内障及び絶対緑内障が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０１３８】
対象における血管新生疾患を「治療する」、又は血管新生疾患を有する対象を「治療する」という用語は、対象を薬学的手順、例えば薬物投与に供して、血管新生疾患の少なくとも１つの症候を軽減させることを指す。したがって、本明細書では「治療する」という用語は、新生血管の症状又は疾患の少なくとも１つの症候の治癒及び寛解を包含するものとする。したがって、本明細書では「治療する」は、眼球血管新生障害の治療又は予防のための薬剤組成物の投与又は処方を含む。
【０１３９】
「患者」とは任意の動物を意味する。「動物」という用語は、ヒト及び他の霊長目を含めて、ただしこれらだけに限定されないほ乳動物を含む。この用語は、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコなどの飼い慣らされた動物も含む。
【０１４０】
「ＶＥＧＦ」又は「血管内皮増殖因子」とは、血管新生又は血管形成のプロセスに影響を及ぼす、ほ乳動物の血管内皮増殖因子を意味する。本明細書では「ＶＥＧＦ」という用語は、（例えば、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５及びＶＥＧＦ１８９を含めたＶＥＧＦ−Ａ／ＶＰＦ遺伝子の選択的スプライシングによって生じる（血管透過性因子（ＶＰＦ）及びＶＥＧＦ−Ａとしても知られる）ＶＥＧＦの種々のサブタイプを含む。また、本明細書では「ＶＥＧＦ」という用語は、同族ＶＥＦＧ受容体を介して、血管新生又は血管形成のプロセスを刺激するように作用するＰＩＧＦ（胎盤成長因子）、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−ＥなどのＶＥＧＦ関連血管形成因子を指す。特に、「ＶＥＧＦ」という用語は、（ｉ）ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）、ＶＥＧＦＲ−３（ＦＬＴ−４）などのＶＥＧＦ受容体に結合し、（ｉｉ）ＶＥＧＦ受容体に関連するチロシンキナーゼ活性を活性化し、（ｉｉｉ）それによって血管新生又は血管形成のプロセスに影響を及ぼす、増殖因子のクラスの任意のメンバーを意味する。「ＶＥＧＦ」という用語は、「ＶＥＧＦ」ポリペプチド、及びその対応する「ＶＥＧＦ」をコードする遺伝子又は核酸を含むものとする。
【０１４１】
「ＶＥＧＦ調節物質」とは、ＶＥＧＦの活性又は産生をある程度、又は完全に、抑制、阻害、増加又は活性化する薬剤を意味する。ＶＥＧＦ調節物質は、ＶＥＧＦ拮抗物質又はＶＥＧＦ作動物質であり得る。
【０１４２】
「ＶＥＧＦ拮抗物質」とは、ＶＥＧＦの活性又は産生をある程度、又は完全に、抑制又は阻害する薬剤を意味する。ＶＥＧＦ拮抗物質は、ＶＥＧＦ１６５などの特定のＶＥＧＦを直接的又は間接的に抑制又は阻害し得る。ＶＥＧＦ拮抗物質は、ＶＥＧＦの特定の機能を直接的又は間接的に阻害し得る。例えば、ＶＥＧＦ拮抗物質は、ヘパリン結合ドメインの機能を阻害し得るが、受容体結合ドメインの機能を阻害しない。また、「拮抗物質」の上記定義と一貫した「ＶＥＧＦ拮抗物質」は、ＶＥＧＦ関連受容体シグナルを抑制又は阻害するようにＶＥＧＦリガンド又はその同族受容体に作用する薬剤を含み得る。したがって、かかる「ＶＥＧＦ拮抗物質」の例としては、例えば、ＶＥＧＦ核酸を標的にした、アンチセンス、リボザイム又はＲＮＡｉ組成物；ＶＥＧＦとその同族受容体との結合を阻止する、抗ＶＥＧＦアプタマー、抗ＶＥＧＦ抗体又は可溶性ＶＥＧＦ受容体デコイ；同族ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）核酸を標的にした、アンチセンス、リボザイム又はＲＮＡｉ組成物；同族ＶＥＧＦＲ受容体に結合する、抗ＶＥＧＦＲアプタマー又は抗ＶＥＧＦＲ抗体、及びＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が挙げられる。
【０１４３】
「ＶＥＧＦ作動物質」とは、ＶＥＧＦの活性又は産生をある程度、又は十分に、増大又は活性化する薬剤を意味する。
【０１４４】
「血管新生障害を抑制するのに十分な量」とは、血管新生障害又はその症候を治療又は予防するのに必要な拮抗物質の有効量を意味する。血管新生障害によって引き起こされる症状、又は血管新生障害の一因となる症状の治療処置のために、本発明の実施に用いられる活性な拮抗物質の「有効量」は、投与方法、血管新生障害の解剖学的位置、患者の年齢、体重及び全般的健康状態に応じて変わる。最終的に、医師又は獣医師が、適切な量及び投与計画を決定する。かかる量は、血管新生障害を抑制するのに十分な量と称される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  （２０ｔｈ  ｅｄ．）  ｅｄ．  Ａ．Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，  ２０００，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ．を参照されたい。）。
【０１４５】
本発明の他の特徴及び効果は、以下の詳細な説明、及び特許請求の範囲から明らかである。
【０１４６】
ポリペプチドＸの「変種」は、１個以上のアミノ酸残基が変化した、ペプチドＸのアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。変種は「保存的」変化を有し得るものであって、置換アミノ酸は類似の構造的又は化学的性質を有する（例えば、イソロイシンによるロイシンの置換）。変種は「非保存的」変化を有し得る（例えば、アラニンによるアルギニンの置換）。変種は、二次又は三次構造が変わる変化を有し得る。変種は、非二次構造が変わる、又は非三次構造が変わる変化を有し得る。変異は、アミノ酸欠失若しくは挿入又はその両方も含み得る。生物学的又は免疫学的活性を失わずに、置換、挿入又は欠失し得るアミノ酸残基を決定するガイダンスは、当分野で周知のコンピュータプログラム、例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて見出すことができる。
【０１４７】
「変種」という用語は、ポリヌクレオチド配列に関連して使用するときには、遺伝子のポリヌクレオチド配列又はそのコード配列に関係するポリヌクレオチド配列を包含する。この定義は、例えば、「対立遺伝子」、「スプライス」、「種」又は「多形性」変種も含み得る。スプライス変種は、基準分子とかなりの同一性を有するが、一般に、ｍＲＮＡプロセシング中のエキソンの選択的スプライシングのために、ポリヌクレオチド数がより多い、又はより少ない。対応するポリペプチドは、追加の機能的ドメインを有し、又はドメインが欠如している場合がある。種変種は、種ごとに変動するポリヌクレオチド配列である。生成したポリペプチドは、一般に、互いにかなりのアミノ酸同一性を有する。多形性変種は、所与の種の個体間の特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列の変異である。
【０１４８】
「ＶＥＧＦ変種」という用語は、ヘパリン結合ドメインの機能の改変をもたらす修飾、又はヘパリンに対して天然物質よりも低い親和性を有する修飾を、ヘパリン結合ドメイン中に含むＶＥＧＦ分子を指す。かかる修飾は、得られる変種の高次構造に影響を及ぼし、したがって、かかる「修飾」に関する「構造上の変化」という用語の使用に影響を及ぼし得る。これらの修飾は、天然物質中に存在するアミノ酸とは異なるアミノ酸を有する分子を生成するためのＤＮＡ変異誘発の結果であり得る。特に、ヘパリン結合ドメインは比較的多数の正荷電アミノ酸を含むので、該ドメインとヘパリンの結合はイオン相互作用に基づき得る。したがって、ある実施形態は、正荷電アミノ酸を負又は中性荷電アミノ酸で置換される。したがって、本発明の態様は、修飾ヘパリン結合ドメイン機能を有する分子、又はヘパリンに対してより低い親和性を有する分子をもたらす、ＶＥＧＦヘパリン結合ドメインの任意の修飾を対象とする。
【０１４９】
「ベクター」という用語は、それに結合した別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。有用なベクターの１タイプは、エピソーム、すなわち、染色体外複製可能な核酸である。有用なベクターは、自己複製可能なベクター、及び／又はそれに結合した核酸の発現が可能なベクターである。ベクターに作用可能に連結した遺伝子の発現を誘導可能なベクターを本明細書では「発現ベクター」と称する。一般に、組み換えＤＮＡ技術に有用である発現ベクターは、「プラスミド」の形であることが多い。プラスミドは、一般に、ベクターの形では染色体に結合していない環状二本鎖ＤＮＡループを指す。本明細書においては、プラスミドが最も一般に使用されるベクターの形であるので、「プラスミド」と「ベクター」を区別なく使用する。しかし、本発明は、等価な機能を果たす発現ベクター、及び当分野でその後公知になる発現ベクターの他の形態も含むものとする。
【０１５０】
「形質移入」とは、任意のコード配列が実際に発現されても、されなくても、宿主細胞による核酸、例えば、発現ベクターの取り込みを指す。多数の形質移入方法、例えば、ＣａＰＯ４及び電気穿孔法が当業者には公知である。形質移入の成功は、一般に、このベクターが作用している徴候が宿主細胞内に存在することによって確認される。
【０１５１】
「形質転換」とは、染色体外要素として、又は染色体組み込み体によって、ＤＮＡが複製可能であるように、ＤＮＡを生物に導入することを意味する。形質転換は、使用する宿主細胞に応じて、かかる細胞に適切な標準技術を用いて実施される。Ｃｏｈｅｎ，  Ｓ．Ｎ．  （１９７２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ），  ６９：２１１０及びＭａｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５３：１５４に記載のように、塩化カルシウムを用いたカルシウム処理は、一般に、原核生物、又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に使用される。かかる細胞壁のないほ乳動物細胞の場合、Ｇｒａｈａｍ，  Ｆ．  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，  Ａ．，  （１９７８）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ５２：４５６−４５７のリン酸カルシウム沈殿法は特に有用である。ほ乳動物細胞宿主系の形質転換の一般的態様は、１９８３年８月１６日に発行されたＡｘｅｌの米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母への形質転換は、典型的には、Ｖａｎ  Ｓｏｌｉｎｇｅｎ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９７７）  Ｊ．  Ｂａｃｔ．，  １３０：９４６及びＨｓｉａｏ，  Ｃ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９７９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）  ７６：３８２９の方法によって実施される。しかし、核注入、原形質体融合などによってＤＮＡを細胞に導入する他の方法も使用することができる。
【０１５２】
「部位特異的変異誘発」は、当分野では標準の技術であり、所望の変異に相当する限定されたミスマッチ以外は、変異誘発しようとする一本鎖ファージＤＮＡに相補的である合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて実施される。手短に述べると、合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、ファージに相補的である鎖の合成を誘導し、生成した二本鎖ＤＮＡをファージを支持する宿主細菌に形質転換する。形質転換細菌の培養物を上層寒天に蒔き、ファージを宿す単細胞からプラークを形成させる。理論的には、新しいプラークの５０％は一本鎖として変異型を有するファージを含み、５０％は元の配列を有する。プラークは、完全一致のハイブリダイゼーションを可能にする温度であるが、元の鎖とのミスマッチがハイブリダイゼーションの阻止に十分である温度で、キナーゼ処理された（ｋｉｎａｓｅｄ）合成プライマーとハイブリッド形成する。次いで、プローブとハイブリッド形成したプラークを選択し、培養し、ＤＮＡを回収する。
【０１５３】
「作動可能に連結された」とは、成分の正常な機能を果たすことができるような近位を指す。したがって、制御配列に「作動可能に連結された」コード配列とは、コード配列を制御配列の制御下で発現することができ、連結されたＤＮＡ配列が隣接し、分泌リーダーの場合には、隣接し、かつ読み取り相（ｒｅａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）中に存在する、配置を指す。例えば、プレ配列又は分泌リーダー用のＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与する前タンパク質として発現される場合には、ポリペプチド用のＤＮＡに作動可能に連結される。また、プロモーター又はエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合には、コード配列に作動可能に連結される。或いは、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように位置する場合には、コード配列に作動可能に連結される。連結は、好都合な制限酵素切断部位におけるライゲーションによって行われる。かかる部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを慣例的実務に添って使用する。
【０１５４】
「制御配列」とは、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適切である制御配列は、例えば、プロモーターを含み、場合によってはオペレーター配列、リボソーム結合部位を含んでいてもよく、ことによっては今のところまだ十分に理解されていない他の配列を含んでいてもよい。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【０１５５】
「発現系」とは、所望のコード配列と、作動可能に連結された制御配列とを含むＤＮＡ配列を指す。その結果、これらの配列で形質転換された宿主は、コードされたタンパク質を産生することができる。形質転換を行うために、発現系をベクターに含めることができる。しかし、次いで、関連するＤＮＡを宿主染色体に組み込むこともできる。
【０１５６】
本明細書では「細胞」、「細胞系」及び「細胞培養物」を区別なく使用する。すべてのかかる名称は子孫を含む。したがって、「形質転換体」又は「形質転換細胞」は、転換の数に無関係に、最初の対象細胞及びそれから誘導される培養物を含む。全子孫は、故意又は偶然の変異のために、ＤＮＡ含量が正確に同一でなくてもよいことも理解されたい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能を有する変異体子孫が含まれる。異なる名称が意図される場合は、状況から明白なはずである。
【０１５７】
「プラスミド」は、前に大文字及び／又は数字がある小文字「ｐ」、及び／又は後ろに大文字及び／又は数字がある小文字「ｐ」によって命名される。本明細書の出発プラスミドは、市販されており、無制限で公的に利用可能であり、又は公表された手順に従ってかかる利用可能なプラスミドから構築することができる。また、他の等価なプラスミドは当分野で公知であり、当業者には明らかである。
【０１５８】
ＤＮＡの「消化」とは、ＤＮＡ中のある位置でのみ作用する酵素を用いたＤＮＡの触媒作用的な切断を指す。かかる酵素を制限酵素と称し、各々が特異的である部位を制限酵素切断部位と称する。本明細書で使用する種々の制限酵素は市販されており、酵素供給業者によって確立されたその反応条件、補因子及び他の要件を使用する。制限酵素は、一般に、各制限酵素が最初に得られた微生物を表す大文字とそれに続く他の文字、次いで特定の酵素を示す数字で構成される略語によって命名される。一般に、プラスミド又はＤＮＡ断片約１ｍｇを、酵素約１−２単位と一緒に緩衝液約２０ｍｌ中で使用する。特定の制限酵素に適切な緩衝剤及び基質の量は製造者によって指定されている。約３７℃で約１時間のインキュベーションを通常使用するが、供給者の指示に応じて変わり得る。インキュベーション後、タンパク質をフェノール及びクロロホルムで抽出して除去し、消化された核酸を水溶液画分からエタノール沈殿によって回収する。制限酵素による消化は、ＤＮＡ断片の２個の制限酵素切断末端が「環状化」するのを防止するために、又は制限酵素切断部位において別のＤＮＡ断片の挿入を妨害する閉じたループが形成されるのを防止するために、まれに、５’末端リン酸の細菌的なアルカリホスファターゼ加水分解がその後に続く。別段の記載がない限り、プラスミドの消化の後に、５’末端の脱リン酸が続くことはない。脱リン酸の手順及び試薬は従来通りである（Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９８２，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  １９８２）  ｐｐ．  １３３−１３４）。
【０１５９】
制限酵素消化物からの所与のＤＮＡ断片の「回収」又は「単離」とは、ポリアクリルアミド又はアガロースゲル上での電気泳動による消化物の分離、目的断片の移動度と分子量既知のマーカーＤＮＡ断片の移動度との比較による目的断片の同定、所望の断片を含むゲル区画の取り出し、及びＤＮＡからのゲルの分離を意味する。この手順は、当分野では一般に知られている。例えば、Ｒ．  Ｌａｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８１）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ９：６１０３−６１１４及びＤ．  Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８０）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ８：４０５７を参照されたい。
【０１６０】
「サザン分析」は、消化物又はＤＮＡ含有組成物中のＤＮＡ配列の存在を公知の標識オリゴヌクレオチド又はＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーションによって確認する方法である。本明細書では、特に示さない限り、サザン分析とは、１パーセントアガロース上での消化物の分離、変性、及びＥ．  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，  （１９７５）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ９８：５０３−５１７の方法によるニトロセルロースへの転写、及びＴ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９７８）  Ｃｅｌｌ  １５：６８７−７０１によって記述されたハイブリダイゼーションを意味するものとする。
【０１６１】
「ライゲーション」とは、２個の二本鎖核酸断片間のリン酸ジエステル結合を形成するプロセスを指す（Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９８２，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  １９８２）  ｐｐ．  １３３−１３４）。特に示さない限り、ライゲーションは、公知の緩衝剤及び条件を用い、連結しようとするＤＮＡ断片のほぼ等モル量０．５ｍｇ当たりＴ４  ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）１０単位を用いて実施することができる。
【０１６２】
形質転換体からのＤＮＡの「調製」とは、微生物培養物からプラスミドＤＮＡを単離することを意味する。特に示さない限り、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９８２、同上、ｐ．  ９０のアルカリ／ＳＤＳ法を使用することができる。
【０１６３】
ＶＥＧＦタンパク質は、体全体、特に眼における新しい血管の成長に重要な刺激である。ＶＥＧＦ生物活性の阻害を目的とした療法は、血管新生障害の治療又は予防方法を提供するものである。したがって、本発明は、ＶＥＧＦ調節物質組成物並びに血管新生障害を抑制する方法及び組成物を特徴とする。
【０１６４】
本発明によるＶＥＧＦ調節物質組成物及び方法は、眼球新血管新生の発生によって特徴づけられる、あらゆる眼科の（ｏｐｈｔｈａｍａｌｏｇｉｃａｌ）疾患及び障害の治療に特に有用である。かかる疾患及び障害としては、視神経乳頭新血管新生、虹彩新血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、角膜新血管新生、硝子体新血管新生、緑内障、パンヌス、翼状片、黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、血管性網膜症、網膜変性、黄斑変性症、ブドウ膜炎、網膜の炎症性疾患、及び増殖性硝子体網膜症が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０１６５】
本発明による療法は、単独で、又は別の療法と併せて実施することができ、家、医院、診療所、病院外来又は病院で施すことができる。治療は、一般に、医師が療法の効果を綿密に観察し、必要な調節をすることができるように病院で開始される。療法の期間は、治療する血管新生障害のタイプ、患者の年齢及び症状、患者の疾患の段階及びタイプ、並びに患者が治療に応答する仕方に応じて決まる。さらに、血管新生障害を起こすリスクが高い人（例えば、糖尿病患者）は、症候の開始を阻止又は遅延する治療を受けることができる。
【０１６６】
本発明は幾つかの利点を有する。本発明のＶＥＧＦ変種は、炎症を促進せずに、血管新生を促進する。本発明のＶＥＧＦ拮抗物質は、血管新生を防止又は減少せずに、白血球停滞を防止又は減少させる。本発明によって提供される化合物及び方法の重要な利点は、血管新生障害治療に対するその特異性である。かかる特異性によって、低用量の投与が可能になり、毒性及び副作用が軽減される。
【０１６７】
併用療法に使用する場合、組合せの各成分の投与量及び投与頻度を独立に調節することができる。例えば、１成分を１日３回投与することができ、第２の成分を１日１回投与することができる。併用療法は、今のところまだ予測できない副作用から患者の体が回復する機会を得られるように、休止期間を含む断続的なサイクルで行うことができる。各成分は、１回の投与で両方の成分が与えられるように、一緒に処方することもできる。
【０１６８】
ＶＥＧＦは、内皮細胞を選択的に刺激して、増殖させ、遊走させ、マトリックス分解酵素を産生させる、分泌ジスルフィド連結ホモ２量体である（Ｃｏｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ）  ８７：１３２３−１３２７）；  Ｆｅｒｒａｒａ  ａｎｄ  Ｈｅｎｚｅｌ  （１９８９）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．１６１：  ８５１−８５８）；  Ｐｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １８１：９０２−９０６；  Ｕｎｅｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １５３：５５７−５６２）。これらはすべて新しい血管の形成に必要なプロセスである。ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ遺伝子の選択的スプライシングの結果として４つの形態（ＶＥＧＦ−１２１、ＶＥＧＦ−１６５、ＶＥＧＦ−１８９、ＶＥＧＦ−２０６）で存在する（Ｈｏｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ５：１８０６−１８１４；  Ｔｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６：１１９４７−１１９５４）。２つの小さい形態は拡散性であるのに対して、大きい２つの形態はヘパリンに対する高い親和性の結果として細胞膜に主に局在したままである。ＶＥＧＦ−１６５もヘパリンに結合し、最も豊富な形態である。ヘパリンに結合しない唯一の形態であるＶＥＧＦ−１２１は、ＶＥＧＦ受容体に対してより低い親和性を有し（Ｇｉｔａｙ−Ｇｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１：５５１９−５５２３）、より低い分裂促進能を有すると考えられる（Ｋｅｙｔ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１：７７８８−７７９５）。ＶＥＧＦの生物学的効果は、その発現が内皮起源の細胞に高度に制限された２種類のチロシンキナーゼ受容体（Ｆｌｔ−１及びＦｌｋ−１／ＫＤＲ）によって媒介される（ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：９８９−９９１；  Ｍｉｌｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７２：８３５−８４６；  Ｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ６：５１９−５２４）。両方の機能的受容体の発現には高親和性結合が必要であるが、内皮細胞における走化性シグナル伝達及び分裂促進的シグナル伝達は、主にＫＤＲ受容体を介して生じると考えられる（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：２５６４６−２５６５４；  Ｓｅｅｔｈａｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １０：１３５−１４７；  Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９８８−２６９９５）。血管発生に対するＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ受容体の重要性は、最近、ＶＥＧＦ遺伝子の単一の対立遺伝子（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：４３５−４３９；  Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：４３９−４４２）又はＦｌｔ−１の両方の対立遺伝子（Ｆｏｎｇ  ｅｔ  ���ｌ．，  （１９９５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３７６：６６−７０）又はＦｌｋ−１遺伝子（Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３７６：６２−６６）を欠くマウスにおいて実証された。各場合において、胚致死をもたらす、血管形成の明確な異常が認められた。
【０１６９】
組織低酸素によって誘発される代償性血管新生は、ＶＥＧＦによって媒介されることが現在知られている（Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４６−２７５３）；  Ｓｈｗｅｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５９：８４３−８４５）。ヒトにおける研究によれば、高濃度のＶＥＧＦが血管原性の網膜障害において硝子体中に存在するが、不活性な病態又は非新血管新生の病態においては存在しない。実験的黄斑下手術後に切除されたヒト脈絡膜組織も、高いＶＥＧＦレベルを示した。
【０１７０】
唯一知られている内皮細胞特異的分裂促進因子に加えて、ＶＥＧＦは、巨大分子に対する血管透過性の過渡的増大の誘導能力において血管新生増殖因子の中でも独特である（したがって、その独自の別名、血管透過性因子、ＶＰＦ）（Ｄｖｏｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９７９）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２２：１６６−１７４；  Ｓｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１９：９８３−９８５；  Ｓｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８６）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４６：５６２９−５６３２参照）。血管透過性の増大と、その結果生じる、血管外空間における血しょうタンパク質の沈着は、内皮細胞の遊走に対して暫定的マトリックスを提供することによって新しい血管形成を助ける（Ｄｖｏｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １４６：１０２９−１０３９）。透過性亢進は、実際、腫ように付随する血管を含めて、新しい血管の特徴である。
【０１７１】
本発明の態様は、血管新生又は治療上の新血管新生が必要な治療を要する対象の療法に使用するＶＥＧＦ変種及びＶＥＧＦ作動物質（すなわち、プロモーター）を提供する。心筋虚血、末期冠動脈疾患及び慢性末梢動脈疾患の療法を含めて、心臓における、増殖因子によって誘導される治療上の血管新生の総説は、Ｊ．Ｅ．  Ｍａｒｋｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （２００５）  ６５：６５６−６６４；  Ｂ．Ｈ．  Ａｎｎｅｘ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （２００５）  ６５：６４９−６５５；  Ｙ．  Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （２００５）  ６５：６３９−６４８；  Ｋ．  Ａｓｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｒｚ．  （２０００）  ２５：６１１−６２２及びＬ．  Ｂａｒａｎｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｎ．  Ｖａｓｃ．  Ｓｕｒｇ．  （２００４）  １８：７５８−７６５（各々の内容を参照によりその全体を本明細書に組み込む。）にある。
【０１７２】
血管形成が望まれる適応症の治療に対するＶＥＧＦの使用は、米国特許第６，４８５，９４２号及び同６，３９５，７０７号並びに米国特許出願公開第２００３／００３２１４５号に記載されている。血管新生及び骨修復に対するＶＥＧＦを用いた治療は、Ｒ．Ａ．Ｄ．  Ｃａｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  （２００３）  ８：９８０−９８９及びＳ．  Ｂｕｎｔｉｎｇ他、米国特許出願公開第２００４／００３３９４９号に記載されている（各々の内容を参照によりその全体を本明細書に組み込む。）。
【０１７３】
本発明の別の態様は、血管新生障害の療法に使用する、ＶＥＧＦの拮抗物質（すなわち、阻害剤）を提供する。特定のＶＥＧＦ拮抗物質が当分野で公知であり、以下の項で手短に述べる。当業者に現在利用可能な、又は利用可能になった、さらに別のＶＥＧＦ拮抗物質としては、さらに提供する以下の項を含めて、本明細書の教示及びガイダンスと併せて、当分野で定常的である実務によって特定し、製造することができる、抗体、アプタマー、アンチセンスオリゴマー、リボザイム、ＲＮＡｉ組成物などが挙げられる。
【０１７４】
ＶＥＧＦ拮抗物質
ＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ１６５）の阻害は、種々の方法で実施される。例えば、アプタマー、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ＲＮＡｉ分子などの核酸分子及びＶＥＧＦ抗体を含めて、ＶＥＧＦの活性又は産生を阻害する種々のＶＥＧＦ拮抗物質が利用可能であり、本発明の方法に使用することができる。例示的なＶＥＧＦ拮抗物質としては、下記物質などのＶＥＧＦの核酸リガンド又はアプタマーが挙げられる。特に有用であるＶＥＧＦ１６５拮抗物質は、主要な可溶性ヒトＶＥＧＦアイソフォームに高い特異的な親和性で結合する改変ＰＥＧ化アプタマーであるＭａｃｕｇｅｎ（登録商標）（ペガプタニブナトリウム；以前はＥＹＥ００１及びＮＸ１８３８と称された。）である（米国特許第６，０１１，０２０号、同６，０５１，６９８号及び同６，１４７，２０４号参照。）アプタマーは、ＶＥＧＦに対する高親和性抗体と同様に、ＶＥＧＦに結合し、ＶＥＧＦを不活性化する。別の有用であるＶＥＧＦアプタマーは、非ＰＥＧ化型のＥＹＥ００１である。或いは、ＶＥＧＦ拮抗物質は、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体又は抗体断片であり得る。したがって、ＶＥＧＦ分子は、受容体との結合を阻害することによって不活性化される。また、ＶＥＧＦ発現又はＲＮＡ安定性を核酸レベルで阻害する、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ＲＮＡｉ分子などの核酸分子は、本発明の方法及び組成物における有用な拮抗物質である。他のＶＥＧＦ拮抗物質としては、ペプチド、タンパク質、環式ペプチド、小有機化合物などが挙げられる。例えば、シグナル伝達活性を伴わずにＶＥＧＦ受容体と結合するＶＥＧＦの可溶性切断型も拮抗物質として役立つ。また、ＶＥＧＦのシグナル伝達活性は、以下に詳述するように、例えばＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ活性の小分子阻害剤を含めた幾つかの拮抗物質を用いて、その下流のシグナル伝達を中断させることによって阻害され得る。
【０１７５】
化合物又は薬剤がＶＥＧＦ拮抗物質として役立つかどうかは、当分野で周知の任意の数の標準方法によって決定することができる。例えば、ＶＥＧＦの生物活性の１つは、血管内皮細胞上の受容体との特異的結合による血管透過性の増大である。その相互作用によって、堅固な内皮の接合部が緩み、それに続いて血液の漏出が起こる。ＶＥＧＦによって誘発される血管漏洩は、ＶＥＧＦの皮内注射の結果として、モルモットの脈管構造からのエバンスブルー色素の漏出を追跡することによって、インビボで測定することができる（Ｄｖｏｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  Ｆａｃｔｏｒ／Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ，  Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｈｙｐｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ，  ａｎｄ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ；  （１９９５）  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １４６：  １０２９）。同様に、アッセイは、ＶＥＧＦのこの生物活性を遮断する拮抗物質の能力を測定するのに使用することができる。
【０１７６】
血管透過性アッセイの有用な一例においては、ＶＥＧＦ１６５（２０ｎＭ−３０ｎＭ）をＭａｃｕｇｅｎ（登録商標）（３０ｎＭから１μＭ）又はＶＥＧＦ拮抗物質候補と生体外で予混合し、続いてモルモットの背側の剪毛した皮膚に皮内注射によって投与する。注射から３０分後、注射部位周囲のエバンスブルー色素の漏出を、コンピュータ処理形態計測解析システムを用いて標準方法によって定量する。ＶＥＧＦによって誘導された、脈管構造からの指示薬色素の漏出を阻止する化合物は、本発明の方法及び組成物における有用な拮抗物質と考えられる。
【０１７７】
化合物がＶＥＧＦ拮抗物質であるかどうかを決定する別のアッセイは、いわゆる角膜血管新生アッセイである。このアッセイでは、ＶＥＧＦ１６５（３ｐｍｏｌ）を含むメタクリラート（ｍｅｔｈａｃｙｒａｔｅ）ポリマーペレットをラットの角膜支質に移植して、通常は血管のない角膜に血管成長を起こさせる。次いで、ＶＥＧＦ拮抗物質候補をラットに用量１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇで１回又は２回／日で５日間静脈内投与する。治療期間の最後に、個々の角膜全部の顕微鏡写真を撮る。次いで、新しい血管が角膜組織中に発生する程度、及び候補化合物によるその阻害を、顕微鏡写真の標準化形態計測解析によって定量する。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）による処理と比較して角膜中のＶＥＧＦ依存性血管新生を阻害する化合物は、本発明の方法及び組成物において有用な拮抗物質と考えられる。
【０１７８】
ＶＥＧＦ拮抗物質候補は、未熟児網膜症（ＲＯＰ）のマウスモデルを用いても特定される。有用な一例においては、それぞれ９、８、８、７及び７匹のマウスの同腹仔を室内気中に放置し、又は過酸素とし、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）又はＶＥＧＦ拮抗物質候補を（例えば、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ／日で）用いて腹腔内処理する。次いで、アッセイのエンドポイント、すなわち、網膜の内境界膜を介した硝子体液への新しい毛細血管の成長を、微視的同定、並びに処理及び対照マウスの全部から得られた各眼の２０個の組織切片中の新生血管芽の計数によって評価する。無処置対照よりも処理マウスの網膜新生脈管構造が減少すれば、有用なＶＥＧＦ拮抗物質が特定されたと考えられる。
【０１７９】
さらに別の例示的なスクリーニングアッセイにおいては、ＶＥＧＦ拮抗物質候補を、インビボでのヒト腫よう異種移植片アッセイによって特定する。このスクリーニングアッセイにおいては、ＶＥＧＦ拮抗物質候補のインビボでの効力を、ヌードマウスに移植したヒト腫よう異種移植片（Ａ６７３横紋筋肉腫及びウィルムス腫よう）において試験する。次いで、マウスをＶＥＧＦ拮抗物質候補で処理する（例えば、定着腫よう（２００ｍｇ）の発生後、１０ｍｇ／ｋｇを１日１回腹腔内投与）。対照群を対照薬剤で処理する。対照と比較してＡ６７３横紋筋肉腫の成長及びウィルムス腫ようを阻害すると確認された候補化合物は、本発明の方法及び組成物において有用な拮抗物質と考えられる。
【０１８０】
ＶＥＧＦ拮抗物質活性を評価するさらに別の方法も当分野で公知であり、以下でさらに詳述する。
【０１８１】
本発明の態様は、さらに、当分野で公知のＶＥＧＦ拮抗物質、並びに以下で裏付けられるＶＥＧＦ拮抗物質、通常の作製技術の範囲内にある、任意の等価物及びすべての等価物を含む。例えば、ＶＥＧＦに対する阻害抗体は当分野で公知であり、例えば、その内容を参照によりその全体を組み込む米国特許第６，５２４，５８３号、同６，４５１，７６４号（ＶＲＰ抗体）、同６，４４８，０７７号、同６，４１６，７５８号、同６，４０３，０８８号（ＶＥＧＦ−Ｃに対する）、同６，３８３，４８４号（ＶＥＧＦ−Ｄに対する）、同６，３４２，２２１号（抗ＶＥＧＦ抗体）、同６，３４２，２１９号、同６，３３１，３０１号（ＶＥＧＦ−Ｂ抗体）及び同５，７３０，９７７号、並びに国際公開第９６／３００４６号、同９７／４４４５３号及び同９８／４５３３１号に記載されている。
【０１８２】
例えば、その内容を参照によりその全体を組み込む米国特許第５，８４０，３０１号、同５，８７４，５４２号、同５，９５５，３１１号及び同６，３６５，１５７号並びに国際公開第０４／００３２１１号に記載の抗体など、ＶＥＧＦ受容体に対する抗体も当分野で公知である。
【０１８３】
例えばＶＥＧＦＲ関連チロシンキナーゼ活性を阻害することによって、ＶＥＧＦの作用を遮断する小分子は当分野で公知であり、例えば、その各々の内容を参照によりその全体を組み込む米国特許第６，５１４，９７１号、同６，４４８，２７７号、同６，４１４，１４８号、同６，３６２，３３６号、同６，２９１，４５５号、同６，２８４，７５１号、同６，１７７，４０１号、同６０７１，９２１号及び同６００１，８８５号（ＶＥＧＦ発現のレチノイド阻害剤）に記載されている。
【０１８４】
ＶＥＧＦの作用を遮断するタンパク質及びポリペプチドは当分野で公知であり、例えば、その各々の内容を参照によりその全体を組み込む米国特許第６，５７６，６０８号、同６，５５９，１２６号、同６，５４１，００８号、同６，５１５，１０５号、同６，３８３，４８６号（ＶＥＧＦおとり受容体）、同６，３７５，９２９号（ＶＥＧＦおとり受容体）、同６，３６１，９４６同（ＶＥＦＧペプチド類似体阻害剤）、同６，３４８，３３３号（ＶＥＧＦおとり受容体）、同６，５５９，１２６号（ＶＥＧＦと結合し、ＶＥＧＦＲとの結合を阻止するポリペプチド）、同６，１００，０７１号（ＶＥＧＦおとり受容体）及び同５，９５２，１９９号に記載されている。
【０１８５】
ＶＥＧＦ及び／又はＶＥＧＦＲ遺伝子の発現及び／又は活性に対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介可能である、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は当分野で公知であり、例えば、その内容を参照によりその全体を組み込む国際公開第０３／０７０９１０号に開示されている。
【０１８６】
ＶＥＧＦを阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドは当分野で公知であり、例えば、その各々の内容を参照によりその全体を組み込む米国特許第５，６１１，１３５号、同５，８１４，６２０号、同６，３９９，５８６号、同６，４１０，３２２号及び同６，２９１，６６７号に記載されている。
【０１８７】
ＶＥＧＦを阻害する（核酸リガンドとしても知られている）アプタマーは当分野で公知であり、例えば、その各々の内容を参照によりその全体を組み込む米国特許第６，７６２，２９０号、同６，４２６，３３５号、同６，１６８，７７８号、同６，０５１，６９８号及び同５，８５９，２２８号に記載されている。
【０１８８】
抗体拮抗物質
本発明は、一つには、ＶＥＧＦ及びその同族受容体ＶＥＧＦＲに対する拮抗物質抗体を含む。本発明の抗体拮抗物質は、リガンドとその同族受容体の結合を阻止する。
【０１８９】
本発明の拮抗物質抗体は、阻害モノクローナル抗体を含む。モノクローナル抗体又はその断片は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡなどの全免疫グロブリンクラス、ＩｇＧサブクラスなどのそのサブクラス、又はこれらの混合物を包含する。ＩｇＧ及びＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧＭなどのそのサブクラスは有用である。ＩｇＧサブタイプＩｇＧ１／ｋａｐｐａ及びＩｇＧ２ｂ／ｋａｐｐは有用な実施形態として含まれる。挙げることができる断片は、抗体に対応する結合部位であって、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２断片などの軽鎖及び重鎖又は一本鎖断片によって形成される結合部位を有する抗体の一部など、ほ乳動物のＰＤＧＦ又はＶＥＧＦ（又はその同族受容体）に対して高い結合活性及び中和活性を示す、１又は２個の抗原相補的結合部位を有するすべての切断型又は改変型抗体断片である。Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２などの切断型二本鎖断片は特に有用である。これらの断片は、例えば、パパイン、ペプシンなどの酵素を用いて抗体のＦｃ部分を除去することによる酵素的手段によって、化学酸化によって、又は抗体遺伝子の遺伝子操作によって、得ることができる。遺伝子操作された非切断型断片を使用することも可能であり、有利である。抗ＶＥＧＦ抗体又はその断片は、単独で、又は混合物として、使用することができる。
【０１９０】
新規の抗体、抗体断片、その混合物又は誘導体は、有利には、１×１０−７Ｍから１×１０−１２Ｍ、又は１×１０−８Ｍから１×１０−１１Ｍ、又は１×１０−９Ｍから５×１０−１０Ｍの範囲のＶＥＧＦ（又はその同族受容体）に対して結合親和性を有する。
【０１９１】
遺伝子操作用の抗体遺伝子は、例えばハイブリドーマ細胞から、当業者に公知の方法で単離することができる。このために、抗体産生細胞を培養し、細胞の光学濃度が十分であるときには、細胞をチオシアン酸グアニジンによって溶解し、酢酸ナトリウムで酸性化し、フェノール、クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、イソプロパノールを用いて沈殿させ、エタノールで洗浄することによって、公知の方法で細胞からｍＲＮＡを単離する。次いで、逆転写酵素を用いてｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡは、適切な動物、真菌、細菌又はウイルスのベクターに、直接挿入することができ、又は、例えば、部位特異的変異誘発、挿入、反転、欠失又は塩基交換の導入による、遺伝子操作後に挿入することができ、適切な宿主生物において発現させることができる。有用である非限定的な細菌又は酵母ベクターは、遺伝子のクローニング、及びＥ．コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）などの細菌又はサッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母における発現のための、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８／１９、ｐＡＣＹＣ１８４、ラムダ又は酵母ｍｕベクターである。
【０１９２】
また、本発明の態様は、ＶＥＧＦ抗体を合成する細胞に関係する。この細胞としては、上記形質転換後の、動物、真菌、細菌細胞又は酵母細胞が挙げられる。これらの細胞は、有利にはハイブリドーマ細胞又はトリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）細胞であり、典型的にはハイブリドーマ細胞である。これらのハイブリドーマ細胞は、例えば、ＶＥＧＦ（又はその同族受容体）で免疫された動物から、その抗体産生Ｂ細胞を単離し、これらの細胞をＶＥＧＦ結合性抗体のために選択し、続いてこれらの細胞を、例えば、ヒト又は動物、例えば、マウス骨髄腫細胞、ヒトリンパ芽球状細胞又はヘテロハイブリドーマ細胞と融合させ（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９７５）  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：  ４９６を参照されたい。）、又はこれらの細胞を適切なウイルスに感染させて不死化細胞系を産生することによって、公知の方法で、産生することができる。融合によって産生されるハイブリドーマ細胞系は有用であり、マウスハイブリドーマ細胞系は特に有用である。本発明のハイブリドーマ細胞系は、ＩｇＧタイプの有用な抗体を分泌する。本発明のｍＡｂ抗体の結合は、高親和性で結合し、ＶＥＧＦの生物学的（例えば、血管形成）活性を低下させる、又は中和する。
【０１９３】
本発明は、さらに、そのＶＥＧＦ阻害活性を維持しつつ、薬剤としてのその使用に関係する１つ以上の他の性質、例えば、血清安定性又は産生効率を変える、これらの抗ＶＥＧＦ抗体の誘導体を含む。かかる抗ＶＥＧＦ抗体誘導体の例としては、ペプチド、抗体の抗原結合領域から誘導されるペプチド模倣物、及びポリエチレングリコール、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンなどの合成高分子、セルロース、セファロース、アガロースなどの天然ポリマーなどの固体若しくは液体担体に結合した抗体、抗体断片若しくはペプチド、又は酵素、毒素、３Ｈ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、３６Ｃｌ、５７Ｃｏ、５５Ｆｅ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、７５Ｓｅなどの放射性若しくは非放射性マーカーとの複合体、又はローダミン、フルオレセイン、イソチオシアナート、フィコエリトリン、フィコシアニン、フルオレサミン、金属キレート、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチンなどの蛍光／化学発光標識と共有結合した抗体、断片若しくはペプチドが挙げられる。
【０１９４】
新規の抗体、抗体断片、混合物、及びその誘導体は、直接使用することができ、乾燥後に、例えば凍結乾燥後に、上記担体との結合後に、又は薬剤を製造するための薬剤として活性な他の補助的物質と処方後に、使用することができる。活性な補助的物質の非限定的例としては、他の抗体、抗生物質全般、スルホンアミドなどの殺菌作用若しくは静菌作用を有する抗菌活性物質、制癌剤、水、緩衝剤、食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、不活性ビヒクル、又はアミノ酸、増粘剤、糖などの非経口生成物に通例の他の物質が挙げられる。これらの薬剤は、疾患の抑制に使用され、眼球新生血管障害並びにＡＭＤ及び糖尿病性網膜症を含めた疾患の抑制に有用である。
【０１９５】
新規の抗体、抗体断片、その混合物又は誘導体は、療法若しくは診断に直接使用することができ、又は固体担体、液体担体、酵素、毒素、放射能標識、非放射能標識若しくは上記蛍光／化学発光標識とカップリング後に療法に使用することができる。
【０１９６】
本発明のヒトＶＥＧＦモノクローナル抗体は、当分野で公知の任意の手段によって得ることができる。例えば、ほ乳動物をヒトＶＥＧＦ（又はその同族受容体）で免疫する。精製ヒトＶＥＧＦは、（例えば、Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｏｒｗｏｏｄ、ＭＡ及び他の商業的な供給業者から）市販されている。或いは、ヒトＶＥＧＦ（又はその同族受容体）は、ヒト胎盤組織から容易に精製することができる。抗ヒトＶＥＧＦ抗体産生用のほ乳動物は、限定されず、霊長類、（マウス、ラット、ウサギなどの）げっ歯類、ウシ、ヒツジ、ヤギ又はイヌとすることができる。
【０１９７】
次に、ひ臓細胞などの抗体産生細胞を免疫動物から取り出し、骨髄腫細胞と融合させる。骨髄腫細胞は当分野で周知である（例えば、ｐ３ｘ６３−Ａｇ８−６５３、ＮＳ−０、ＮＳ−１又はＰ３Ｕ１細胞を使用することができる。）。細胞融合操作は、当分野で公知である任意の従来法によって実施することができる。
【０１９８】
細胞融合操作に供した後、次いで、ハイブリドーマを選択するためにＨＡＴ選択培地で細胞を培養する。次いで、抗ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする。このスクリーニングは、例えば、産生されたモノクローナル抗体が、ヒトＶＥＧＦ（又はその同族受容体）が固定されたウェルに結合する、サンドイッチ酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などによって、実施することができる。この場合、二次抗体として、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼなどの酵素で標識された、免疫動物の免疫グロブリンに特異的な抗体を使用することができる。標識は、標識酵素をその基質と反応させ、生じる色を測定することによって検出することができる。基質として、３，３−ジアミノベンジジン、２，２−ジアミノビス−ｏ−ジアニシジン、４−クロロナフトール、４−アミノアンチピリン、ｏ−フェニレンジアミンなどが生成し得る。
【０１９９】
上記操作によって、抗ヒトＶＥＧＦ抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。次いで、選択されたハイブリドーマを従来の限界希釈法又は軟寒天法によってクローン化する。必要に応じて、クローン化ハイブリドーマを血清含有培地若しくは血清非含有培地によって大規模に培養することができ、又はマウスの腹腔に接種し、腹水から回収することができ、それによって、多数のクローン化ハイブリドーマを得ることができる。
【０２００】
次いで、選択した抗ヒトＶＥＧＦモノクローナル抗体のうちから、（例えば、細胞を用いたＶＥＧＦアッセイシステム（上記参照）において）対応するリガンド／受容体対の結合及び活性化を阻害し得る抗ヒトＶＥＧＦモノクローナル抗体を、さらなる分析及び操作のために選択する。抗体が受容体／リガンドの結合及び／又は活性化を阻害する場合、それは、試験モノクローナル抗体がヒトＶＥＧＦのＶＥＧＦ活性を低下させる、又は中和する能力を有することを意味する。すなわち、モノクローナル抗体は、ヒトＶＥＧＦ（又はその同族受容体）の重要な結合部位を特異的に認識し、及び／又は妨害する。
【０２０１】
本明細書のモノクローナル抗体は、さらに、所望の生物活性を示す限り、抗ＰＤＧＦ若しくはＶＥＧＦ抗体の（超可変を含む）可変ドメインを定常ドメイン（例えば、「ヒト化」抗体）と、又は軽鎖を重鎖と、又はある種の鎖を別の種の鎖と継ぎ合わせることによって、又は異種タンパク質（起源の種又は免疫グロブリンクラス若しくはサブクラス名称にかかわらない。）及び抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２及びＦｖ）との融合によって、産生されるハイブリッド及び組み換え抗体を含む。（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号及びＭａｇｅ  ＆  Ｌａｍｏｙｉ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ｐｐ．７９−９７（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．），  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）を参照されたい。）。
【０２０２】
したがって、「モノクローナル」という用語は、得られる抗体の特性が実質的に均一な抗体集団に由来し、特定の方法による抗体の産生を要すると解釈すべきではないことを示している。例えば、本発明によって使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記述されたハイブリドーマ方法によって作製することができ、又は組み換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製することができる。「モノクローナル抗体」は、例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載の技術によって作製されたファージライブラリーから単離することもできる。
【０２０３】
非ヒト（例えば、ネズミ）抗体の「ヒト化」体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む、特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又は（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、抗体の他の抗原結合性部分配列などの）その断片である。大部分は、ヒト化抗体は、レシピエント抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、ウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基で置換された、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ヒト免疫グロブリンのＦｖ枠組み領域（ＦＲ）の残基が、対応する非ヒトＦＲの残基で置換される場合もある。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にも、移入されたＣＤＲ又はＦＲ配列中にも存在しない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに改良し、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１個、典型的には２個の可変ドメインの実質的に全部を含み、ＣＤＲ領域の全部又は実質的に全部は、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ残基の全部又は実質的に全部は、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ残基である。ヒト化抗体は、免疫グロブリン（ｉｎｕｎｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域も含むことが最適である。
【０２０４】
非ヒト抗体のヒト化方法は当分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである出所からヒト化抗体中に導入された１個以上のアミノ酸残基を含む。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入」残基と称されることが多く、典型的には「移入」可変ドメインから取り込まれる。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒと共同研究者（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８６）  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：  ５２２−５２５；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：  ３２３−３２７及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：  １５３４−１５３６）の方法に従って、げっ歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって、本質的に実施することができる。したがって、かかる「ヒト化」抗体は、実質的に不完全なヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応する配列で置換された、キメラ抗体である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、幾つかのＣＤＲ残基及びことによると幾つかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体中の類似の部位由来の残基で置換されたヒト抗体である。
【０２０５】
ヒト化抗体の作製に使用されるヒト可変ドメインの選択は、軽鎖と重鎖のどちらも、抗原性の低下に極めて重要である。いわゆる「最良適合」法に従って、げっ歯類抗体の可変ドメイン配列を、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体についてスクリーニングする。次いで、げっ歯類の可変ドメイン配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体に対するヒト枠組み（ＦＲ）として受け入れる（Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５１：２２９６及びＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  （１９８７）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９６：９０１）。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定の枠組みを使用する。同じ枠組みを、幾つかの異なるヒト化抗体に使用することができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），  ８９：  ４２８５及びＰｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｊ．  Ｉｍｍｎｏｌ．，  １５１：２６２３）。
【０２０６】
抗体は、抗原に対する高い親和性、及び他の好都合な生物学的諸性質を保持しながらヒト化される。この目標を達成するために、有用である一方法によれば、ヒト化抗体は、親配列及びヒト化配列の３次元モデルを用いた、親配列及び種々の概念的ヒト化生成物の解析プロセスによって調製される。３次元免疫グロブリンモデルは、一般に利用可能であり、当業者によく知られている。選択した免疫グロブリン配列候補の可能な３次元高次構造を図示し、表示するコンピュータプログラムを利用することができる。これらの表示を詳しく調べることによって、免疫グロブリン配列候補の機能における残基の可能な役割を分析することができ、すなわち、免疫グロブリン候補がその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基を分析することができる。このようにして、ＦＲ残基をコンセンサスから選択し、組み合わせ、標的抗原に対する親和性の増大などの所望の抗体特性が得られるように配列を移入することができる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合への作用に直接的かつ最も実質的に関与する。
【０２０７】
ＶＥＧＦに対するヒトモノクローナル抗体も本発明に含まれる。かかる抗体は、ハイブリドーマ法によって作製される。ヒトモノクローナル抗体産生用のヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系は、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  （１９８４）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３３，  ３００１；  Ｂｒｏｄｅｕｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ｐｐ．５１−６３  （Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８７）及びＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４７：８６−９５に記載されている。
【０２０８】
内因性免疫グロブリン産生の非存在下で、免疫化によってヒト抗体の全レパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することができる。例えば、キメラの生殖細胞系列変異マウスにおける抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合型欠失は、内因性抗体産生を完全に阻害することが記述されている。かかる生殖細胞系列変異マウスにおいてヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイが移行することによって、抗原曝露後にヒト抗体が産生される（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），  ９０：  ２５５１；  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｎａｔｕｒｅ，  ３６２：２５５−２５８及びＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，  ７：３３を参照されたい。）。
【０２０９】
或いは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４８：  ５５２−５５３）を用いて、非免疫ドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからインビトロでヒト抗体及び抗体断片を産生することができる（総説として、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ３：５６４−５７１を参照されたい。）。幾つかのＶ遺伝子セグメント源をファージディスプレイに使用することができる。例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ等（（１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５２：  ６２４−６２８）は、免疫マウスのひ臓に由来するＶ遺伝子の小さな無作為コンビナトリアルライブラリーから抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。非免疫ヒトドナー由来のＶ遺伝子レパートリーを構築することができ、（自己抗原を含めた）抗原の多様なアレイに対する抗体を、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （（１９９１）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２２：５８１−５９７又はＧｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １２：７２５−７３４）によって記述された技術に本質的に従って単離することができる。
【０２１０】
自然な免疫応答においては、抗体遺伝子は、変異を高速で蓄積する（体細胞超変異）。導入された変化の一部はより高い親和性を与え、それに続く抗原曝露中に、高親和性表面免疫グロブリンを示すＢ細胞が優先的に複製され、分化する。この自然プロセスは、「鎖シャフリング」として知られる技術を使用することによって模倣することができる（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｂｉｏ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，  １０：７７９−７８３参照）。この方法では、ファージディスプレイによって得られる「一次」ヒト抗体の親和性は、重鎖及び軽鎖のＶ領域遺伝子を、非免疫ドナーから得られたＶドメイン遺伝子の天然変種（レパートリー）のレパートリーで逐次置換することによって改善することができる。この技術によって、ｎＭ範囲の親和性を有する抗体及び抗体断片を作製することができる。極めて大きなファージ抗体レパートリーを作製する戦略は、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ等（（１９９３）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２１：２２６５−２２６６）によって記述されている。
【０２１１】
遺伝子シャフリングによって、げっ歯類抗体からヒト抗体を誘導することもできる。ヒト抗体は、出発げっ歯類抗体と類似した親和性及び特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも称されるこの方法によれば、ファージディスプレイ技術によって得られるげっ歯類抗体の重鎖又は軽鎖Ｖドメイン遺伝子は、ヒトＶドメイン遺伝子レパートリーで置換され、げっ歯類ヒトキメラが生成する。抗原の選択によって、機能的抗原結合部位を回復することができるヒト可変が単離される。すなわち、エピトープは、パートナーの選択を決定する（インプリントする）。残りのげっ歯類Ｖドメインを置換するためにプロセスを繰り返すと、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日に公開された国際公開第９３／０６２１３号参照）。この技術によって、げっ歯類起源の枠組み又はＣＤＲ残基を持たない完全ヒト抗体が得られる。
【０２１２】
アプタマー拮抗物質
本発明は、一つには、ＶＥＧＦ（又はその同族受容体）に対するアプタマー拮抗物質を提供する。核酸リガンドとしても知られるアプタマーは、あらかじめ選択した標的に結合し、一般に拮抗する（すなわち、阻害する）非天然核酸である。
【０２１３】
アプタマーは、オリゴマー又はオリゴヌクレオチドを製造する任意の公知の方法によって作製することができる。多数の合成方法が当分野で公知である。例えば、残留プリンリボヌクレオチドを含み、３’−エキソヌクレアーゼによる偶発的分解を防止するために、３’末端に反転チミジン残基（Ｏｒｔｉｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２：１２９−１４６（１９９２））、２個のホスホロチオアート結合などの適切な３’末端を有する２’−Ｏ−アリル変性オリゴマーは、固相ベータ−シアノエチルホスホルアミダイト化学反応（Ｓｉｎｈａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １２：４５３９−４５５７（１９８４））によって、任意の市販ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて合成することができる。１つの方法は、リボヌクレオチド用の２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）保護戦略（Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １０９：７８４５−７８５４（１９８７））であり、必要なすべての３’−Ｏ−ホスホルアミダイトが市販されている。また、アミノメチルポリスチレンをその有利な諸性質のために支持材料として使用することができる（ＭｃＣｏｌｌｕｍ  ａｎｄ  Ａｎｄｒｕｓ  （１９９１）  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ３２：４０６９−４０７２）。フルオレセインは、市販フルオレセインホスホルアミダイトを用いた合成中に、基質ＲＮＡの５’末端に付加させることができる。一般に、アプタマーオリゴマーは、標準ＲＮＡサイクルによって合成することができる。構築終了後、塩基に不安定な全保護基を、密封バイアル中で濃アンモニア水／エタノール（３：１ｖ／ｖ）と一緒に５５℃で８時間処理することによって除去する。エタノールは、生成したリボヌクレオチド位置において脱保護の塩基性条件下でかなりの鎖切断をさもなければもたらす、２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ基の中途での除去を抑制する（Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８７）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １０９：７８４５−７８５４）。凍結乾燥後、ＴＢＤＭＳで保護されたオリゴマーをトリエチルアミン三フッ化水素酸塩／トリエチルアミン／Ｎ−メチルピロリジノンの混合物で６０℃で２時間処理して、中性条件下でシリル保護基を迅速かつ効率的に除去する（Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２３：２６７７−２６８４）。次いで、完全に脱保護されたオリゴマーを、Ｃａｔｈａｌａ及びＢｒｕｎｅｌ（（１９９０）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １８：２０１）の手順に従って、ブタノールを用いて沈殿させることができる。精製は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、又はイオン交換ＨＰＬＣ（Ｓｐｒｏａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．  １４：２５５−２７３）と逆相ＨＰＬＣの組合せによって、実施することができる。細胞中で使用するために、合成オリゴマーを過塩素酸ナトリウムのアセトン溶液で沈殿させて、そのナトリウム塩に転化する。次いで、微量の残留塩を市販の小さな使い捨てゲルろ過カラムに���って除去することができる。最終段階として、単離オリゴマーの確実性（ａｕｔｈｅｎｔｉｃｉｔｙ）をマトリックス支援レーザー脱離質量分析法（Ｐｉｅｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２１：３１９１−３１９６）及びヌクレオシド塩基組成分析によって調べることができる。
【０２１４】
開示したアプタマーは、ヌクレオチドサブユニットが酵素操作に利用可能であるときには、酵素的方法によって製造することもできる。例えば、ＲＮＡ分子をインビトロでのＲＮＡポリメラーゼＴ７反応によって作製することができる。ＲＮＡ分子は、Ｔ７を発現する細菌系統又は細胞系によって作製し、次いでこれらの細胞から単離することもできる。以下に考察するように、開示したアプタマーは、ベクター及びプロモーターを用いて細胞中で直接発現させることもできる。
【０２１５】
アプタマーは、本発明の他の核酸分子と同様に、さらに化学修飾ヌクレオチドを含み得る。核酸の診断又は治療上の使用において取り組むべき一問題は、体液中のリン酸ジエステル型のオリゴヌクレオチドが、所望の効果が現れる前に、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼなどの細胞内酵素及び細胞外酵素によって急速に分解し得ることである。核酸リガンドのある種の化学修飾によって、核酸リガンドのインビボでの安定性を増大させることができ、又は核酸リガンドの送達を促進若しくは媒介することができる（例えば、参照により本明細書に具体的に組み込む米国特許第５，６６０，９８５号、「Ｈｉｇｈ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」参照）。
【０２１６】
本発明で企図する核酸リガンドの修飾としては、核酸リガンド塩基又は核酸リガンド全体に追加の電荷、分極率、疎水性、水素結合、静電相互作用及びフラクショナリティーを組み込む他の化学基を与える修飾が挙げられるが、これだけに限定されない。かかる修飾としては、２’位の糖修飾、５位のピリミジン修飾、８位のプリン修飾、環外アミンにおける修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモ又は５−ヨード−ウラシルの置換；骨格修飾、ホスホロチオアート又はリン酸アルキル修飾、メチル化、イソ塩基（ｉｓｏｂａｓｅ）イソシチジン、イソグアニジンなど異常な塩基対組合せが挙げられるが、これらだけに限定されない。修飾としては、キャッピングなどの３’及び５’修飾、又は糖部分を用いた修飾も挙げることができる。本発明の一部の実施形態においては、核酸リガンドは、ピリミジン残基の糖部分が２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾されたＲＮＡ分子である。
【０２１７】
アプタマーの安定性は、かかる修飾の導入によって、また、ＲＮＡのリン酸骨格に沿った修飾及び置換によって、大きく増大し得る。また、分解を阻害し、所望のヌクレオチド相互作用を増大させることができる、又は望ましくないヌクレオチド相互作用を減少させることができる、種々の修飾を核酸塩基自体に行うことができる。したがって、アプタマーの配列が判明した後には、修飾又は置換を下記合成手順によって、又は当業者に公知の手順によって、実施することができる。
【０２１８】
他の非限定的修飾としては、リボ核酸（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＵ）及びデオキシリボ核酸（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴ）中に存在する、標準塩基の変形である修飾塩基（又は修飾ヌクレオシド又は修飾ヌクレオチド）、糖及び／又はリン酸骨格化学構造の組入れが挙げられる。この範囲に含まれるのは、例えば、Ｇｍ（２’−メトキシグアニル酸）、Ａｍ（２’−メトキシアデニル酸）、Ｃｆ（２’−フルオロシチジル酸）、Ｕｆ（２’−フルオロウリジル酸）、Ａｒ（リボアデニル酸）である。アプタマーとしては、５−メチルシトシン、４−アセチルシトシン、３−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、２−チオシトシン、５−ハロシトシン（例えば、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、５−クロロシトシン及び５−ヨードシトシン）、５−プロピニルシトシン、６−アゾシトシン、５−トリフルオロメチルシトシン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、フェノキサジンシチジン、フェノチアジンシチジン、カルバゾールシチジン又はピリドインドールシチジンを含めた、シトシン又は任意のシトシン関連塩基も挙げられる。アプタマーとしては、さらに、６−メチルグアニン、１−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルグアニン、７−メチルグアニン、２−プロピルグアニン、６−プロピルグアニン、８−ハログアニン（例えば、８−フルオログアニン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン及び８−ヨードグアニン）、８−アミノグアニン、８−スルフヒドリルグアニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニン、７−メチルグアニン、８−アザグアニン、７−デアザグアニン又は３−デアザグアニンを含めた、グアニン又は任意のグアニン関連塩基も挙げられる。アプタマーとしては、さらに、６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン、１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、８−ハロアデニン（例えば、８−フルオロアデニン、８−ブロモアデニン、８−クロロアデニン及び８−ヨードアデニン）、８−アミノアデニン、８−スルフヒドリルアデニン、８−チオアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニン、７−メチルアデニン、２−ハロアデニン（例えば、２−フルオロアデニン、２−ブロモアデニン、２−クロロアデニン及び２−ヨードアデニン）、２−アミノアデニン、８−アザアデニン、７−デアザアデニン又は３−デアザアデニンを含めた、アデニン又は任意のアデニン関連塩基も挙げられる。５−ハロウラシル（例えば、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル）、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、１−メチルシュードウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、５−メチルアミノメチルウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アゾウラシル又は４−チオウラシルを含めた、ウラシル又は任意のウラシル関連塩基も含まれる。
【０２１９】
当分野で公知の他の修飾塩基変種の非限定的例としては、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２（ｐ）（１）に記載のもの、例えば、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウリジン、２’−メトキシシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、２’−Ｏ−メチルシュードウリジン、ｂ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、１−メチルアデノシン、１−メチルシュードウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、ｂ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ−（（９−ｂ−Ｄ−リボフラノシル−２−メチルチオプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン、Ｎ−（（９−ｂ−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）Ｎ−メチル−カルバモイル）トレオニン、ウリジン（ｕｒｄｉｎｅ）−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウリジン、キューオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、Ｎ−（（９−ｂ−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、ワイブトシン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジンが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０２２０】
米国特許第３，６８７，８０８号、同３，６８７，８０８号、同４，８４５，２０５号、同５，１３０，３０２号、同５，１３４，０６６号、同５，１７５，２７３号、同５，３６７，０６６号、同５，４３２，２７２号、同５，４５７，１８７号、同５，４５９，２５５号、同５，４８４，９０８号、同５，５０２，１７７号、同５，５２５，７１１号、同５，５５２，５４０号、同５，５８７，４６９号、同５，５９４，１２１号、同５，５９６，０９１号、同５，６１４，６１７号、同５，６４５，９８５号、同５，８３０，６５３号、同５，７６３，５８８号、同６，００５，０９６号及び同５，６８１，９４１号に記載の修飾核酸塩基も含まれる。当分野で公知である修飾ヌクレオシド及びヌクレオチド糖骨格変種の例としては、例えば、Ｆ、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２、ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２、ＯＣＨ２ＯＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、Ｏ（Ｃ１−１０アルキル）、Ｏ（Ｃ２−１０アルケニル）、Ｏ（Ｃ２−１０アルキニル）、Ｓ（Ｃ１−１０アルキル）、Ｓ（Ｃ２−１０アルケニル）、Ｓ（Ｃ２−１０アルキニル）、ＮＨ（Ｃ１−１０アルキル）、ＮＨ（Ｃ２−１０アルケニル）、ＮＨ（Ｃ２−１０アルキニル）及びＯ−アルキル−Ｏ−アルキルなどの２’リボシル置換基を有するものが挙げられるが、これらだけに限定されない。望ましい２’リボシル置換基としては、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）などが挙げられる。２’−置換基は、ａｒａｂｉｎｏ（上）位でもｒｉｂｏ（下）位でもよい。
【０２２１】
本発明のアプタマーは、上記のものなどのヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体、又は両方の組合せで構成され得るものであり、又はオリゴヌクレオチド類似体である。本発明のアプタマーは、ＶＥＧＦ（又はその同族受容体）に結合するオリゴマーの機能に影響を及ぼさない位置にヌクレオチド類似体を含み得る。
【０２２２】
特定の標的分子に結合した核酸リガンドの改良若しくは強化、又は追加のアプタマーの選択に適合し得る幾つかの技術がある。一般に「インビトロ遺伝学（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」と称される１つの技術（Ｓｚｏｓｔａｋ  （１９９２）  ＴＩＢＳ，  １９：８９参照）は、無作為配列のプールからの選択によるアプタマー拮抗物質の単離を含む。開示するアプタマーを単離することができる核酸分子のプールは、約２０から４０ヌクレオチドの可変配列に隣接する不変配列を含み得る。この方法は、Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）と称される。本発明のアプタマー拮抗物質をＳＥＬＥＸ及び関係する方法によって生成するための組成物及び方法は当分野で公知であり、例えば、その各々を参照によりその全体を本明細書に具体的に組み込む米国特許第５，４７５，０９６号「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」及び米国特許第５，２７０，１６３号「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」に教示されている。ＳＥＬＥＸプロセス全般、特にＶＥＧＦアプタマー及び処方は、例えば、その各々の内容を参照により本明細書に具体的に組み込む米国特許第５，６６８，２６４号、同５，６９６，２４９号、同５，６７０，６３７号、同５，６７４，６８５号、同５，７２３，５９４号、同５，７５６，２９１号、同５，８１１，５３３号、同５，８１７，７８５号、同５，９５８，６９１号、同６，０１１，０２０号、同６，０５１，６９８号、同６，１４７，２０４号、同６，１６８，７７８号、同６，２０７，８１６号、同６，２２９，００２号、同６，４２６，３３５号及び同６，５８２，９１８号にさらに記載されている。
【０２２３】
手短に述べると、ＳＥＬＥＸ法は、結合親和性及び選択性の任意の所望の判定基準を実質的に達成するために、オリゴヌクレオチド候補の混合物からの選択と、同じ一般的選択スキームを用いた、選択標的との結合、分離及び増幅の段階的反復とを含む。無作為化配列のセグメントを典型的には含む核酸混合物から出発して、ＳＥＬＥＸ法は、結合に好都合な条件下で混合物を標的と接触させる段階、標的分子に特異的に結合した核酸から非結合性核酸を分離する段階、核酸−標的複合体を解離させる段階、核酸−標的複合体から解離された核酸を増幅して、リガンドに富む核酸混合物を得る段階、次いで結合、分離、解離及び増幅の各段階を所望の回数反復して、標的分子に対して極めて特異的な高親和性核酸リガンドを得る段階を含む。
【０２２４】
基本的なＳＥＬＥＸ法を改変して、幾つかの具体的目的が達成された。例えば、米国特許第５，７０７，７９６号「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」は、ＳＥＬＥＸプロセスをゲル電気泳動と併用して、ベントＤＮＡなど、特定の構造特性を有する核酸分子を選択することを記載している。米国特許第５，７６３，１７７号「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＳＥＬＥＸ」は、標的分子と結合及び／又は光架橋可能である、及び／又は標的分子を光不活性化可能である、光反応性基を含む核酸リガンドを選択する、ＳＥＬＥＸに基づく方法を記載している。米国特許第５，５８０，７３７号「Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｔｈａｔ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅ  ａｎｄ  Ｃａｆｆｅｉｎｅ」は、非ペプチド性であり得る、密接に関連した分子を識別することができる極めて特異的な核酸リガンドを特定する、Ｃｏｕｎｔｅｒ−ＳＥＬＥＸと称する方法を記載している。米国特許第５，５６７，５８８号「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＳＥＬＥＸ」は、標的分子に対して高親和性と低親和性を有するオリゴヌクレオチドを効率良く分離する、ＳＥＬＥＸに基づく方法を記載している。
【０２２５】
ＳＥＬＥＸ法は、インビボでの安定性の改善、送達特性の改善などの改善された特性をリガンドに付与する修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンドの特定を包含する。かかる修飾の非限定的例としては、リボース及び／又はリン酸及び／又は塩基位置における化学置換が挙げられる。ＳＥＬＥＸプロセスによって特定された修飾ヌクレオチド含有核酸リガンドは、ピリミジンの５及び２’位が化学修飾されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドを記載している米国特許第５，６６０，９８５号「Ｈｉｇｈ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」に記載されている。上記米国特許第５，５８０，７３７号は、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）及び／又は２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された１個以上のヌクレオチドを含む極めて特異的な核酸リガンドを記載している。１９９４年６月２２日に出願され、放棄された、米国特許出願第０８／２６４，０２９号「Ｎｏｖｅｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｋｎｏｗｎ  ａｎｄ  Ｎｏｖｅｌ  ２’  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｂｙ  Ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｉｃ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ」は、種々の２’修飾ピリミジンを含むオリゴヌクレオチドを記載している。
【０２２６】
ＳＥＬＥＸ法は、米国特許第５，６３７，４５９号「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ＳＥＬＥＸ」及び米国特許第５，６８３，８６７号「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  Ｂｌｅｎｄｅｄ  ＳＥＬＥＸ」にそれぞれ記載のように、選択オリゴヌクレオチドを他の選択オリゴヌクレオチド及び非オリゴヌクレオチド機能単位と組み合わせることを包含する。これらの特許は、オリゴヌクレオチドの広範な形状及び他の諸性質並びに効率的増幅及び複製特性と、他の分子の望ましい諸性質との組合せを考慮している。
【０２２７】
ＳＥＬＥＸ法は、さらに、参照により本明細書にその全体を具体的に組み込む米国特許第６，０１１，０２０号「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ」に記載のように、診断又は治療用複合体において、選択核酸リガンドと親油性化合物又は非免疫原性高分子量化合物を組み合わせることを包含する。
【０２２８】
アプタマー拮抗物質は、コンピュータモデリング技術を用いて改良することもできる。分子モデリングシステムの例は、ＣＨＡＲＭｍ及びＱＵＡＮＴＡプログラム、Ｐｏｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ．）である。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化及び分子動力学機能を果たす。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の構築、グラフィックモデリング及び分析を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子相互の挙動の双方向的な構築、改変、可視化及び分析を可能にする。これらのアプリケーションは、ＲＮＡ及びＤＮＡ分子の二次構造を規定し、表示するように改造することができる。
【０２２９】
次いで、これらの種々の修飾を有するアプタマーの機能を、ＶＥＧＦ細胞を用いた増殖活性アッセイなど、目的ＶＥＧＦ機能に適切な任意のアッセイによって試験することができる。
【０２３０】
修飾は、ＳＥＬＥＸプロセス前の修飾でも、ＳＥＬＥＸプロセス後の修飾でもよい。ＳＥＬＥＸプロセス前修飾は、ＳＥＬＥＸ標的に対する特異性を有し、インビボでの安定性が改善された、核酸リガンドを与える。２’−ＯＨ核酸リガンドに対してなされたＳＥＬＥＸプロセス後修飾は、核酸リガンドの結合能に悪影響を及ぼさずに、インビボでの安定性を改善することができる。
【０２３１】
本発明のアプタマーの製造に有用である他の修飾は、当業者に公知である。かかる修飾は、ＳＥＬＥＸプロセス後に行うことができ（前もって特定された非修飾リガンドの修飾）、又はＳＥＬＥＸプロセスに組み入れることによって行うことができる。
【０２３２】
一般にアプタマー又は核酸リガンド、特にＶＥＧＦアプタマーは、エキソヌクレアーゼに対する感受性を低下させ、全体の安定性を増大させるように、５’キャッピング及び３’キャッピングされたときに、最も安定であり、したがって効果的であることが認められた。（参照によりその全体を組み込むＡｄａｍｉｓ，  Ａ．Ｐ．他、国際公開第２００５／０１４８１４号を参照されたい。）。したがって、本発明は、一つには、一実施形態において、５’末端の５’−５’反転ヌクレオシドキャップ構造及び３’末端の３’−３’反転ヌクレオシドキャップ構造を有する、一般にアプタマー、特に抗ＶＥＧＦアプタマーのキャッピングに基づく。したがって、本発明は、一つには、５’末端が５’−５反転ヌクレオシドキャップでキャッピングされ、３’末端が３’−３’反転ヌクレオシドキャップでキャッピングされた抗ＶＥＧＦ及び／又は抗ＰＤＧＦアプタマー、すなわち、核酸リガンドを提供する。
【０２３３】
ある特に有用である本発明のアプタマーは、その末端に５’−５’と３’−３’反転ヌクレオチドキャップ構造を有する抗ＶＥＧＦアプタマー組成物を含めて、ただしこれだけに限定されない抗ＶＥＧＦアプタマー組成物である。かかる抗ＶＥＧＦキャップドアプタマーは、ＲＮＡアプタマー、ＤＮＡアプタマー、又は混合（すなわち、ＲＮＡとＤＮＡ）組成を有するアプタマーであり得る。本発明の適切な抗ＶＥＧＦアプタマー配列としては、ヌクレオチド配列ＧＡＡＧＡＡＵＵＧＧ（配列番号３４）、ヌクレオチド配列ＵＵＧＧＡＣＧＣ（配列番号３５）、ヌクレオチド配列ＧＵＧＡＡＵＧＣ（配列番号３６）などが挙げられる。以下の配列を有する本発明のキャップド抗ＶＥＧＦアプタマーは特に有用である。
Ｘ−５’−５’−ＣＧＧＡＡＵＣＡＧＵＧＡＡＵＧＣＵＵＡＵＡＣＡＵＣＣＧ−３’−３’−Ｘ（配列番号３７）
ここで、各Ｃ、Ｇ、Ａ及びＵは、それぞれ、天然ヌクレオチドのシチジン、グアニジン、アデニン及びウリジン、又はそれに対応する修飾ヌクレオチドであり、Ｘ−５’−５’はアプタマーの５’末端をキャッピングする反転ヌクレオチドであり、３’−３’−Ｘはアプタマーの３’末端をキャッピングする反転ヌクレオチドであり、残りのヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドは、５’−３’リン酸ジエステル結合を介して逐次連結される。一部の実施形態においては、キャップド抗ＶＥＧＦアプタマーのヌクレオチドの各々は、（リボ核酸（ＲＮＡ）に標準的である）−ＯＨ、（デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に標準的である）−Ｈなどの２’リボシル置換を個々に有する。別の実施形態においては、２’リボシル位置は、Ｏ（Ｃ１−１０アルキル）、Ｏ（Ｃ１−１０アルケニル）、Ｆ、Ｎ３又はＮＨ２置換基で置換されている。
【０２３４】
さらに特定の非限定的例においては、５’−５’キャップド抗ＶＥＧＦアプタマーは、以下の構造を有し得る。
Ｔｄ−５’−５’−ＣｆＧｍＧｍＡｒＡｒＵｆＣｆＡｍＧｍＵｆＧｍＡｍＡｍＵｆＧｍＣｆＵｆＵｆＡｍＵｆＡｍＣｆＡｍＵｆＣｆＣｆＧｍ  ３’−３’−Ｔｄ（配列番号３８）
ここで、「Ｇｍ」は２’−メトキシグアニル酸であり、「Ａｍ」は２’−メトキシアデニル酸であり、「Ｃｆ」は２’−フルオロシチジル酸であり、「Ｕｆ」は２’−フルオロウリジル酸であり、「Ａｒ」はリボアデニル酸であり、「Ｔｄ」はデオキシリボチミジル酸である。
【０２３５】
ＶＥＧＦＲを阻害又は活性化するさらに別の関係する化合物は、新規化合物を目的受容体チロシンキナーゼ活性に対するその効果について従来のアッセイによってスクリーニングすることによって入手可能である。ＶＥＧＦＲ小分子有機阻害剤又は活性化物質候補による有効な阻害又は活性化は、細胞を用いたアッセイシステム、及び当分野で公知の他のアッセイシステムによってモニターすることができる。
【０２３６】
例えば、ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼに対する活性の一試験は以下の通りである。試験は、Ｆｌｔ−１  ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼを用いて実施される。詳細な手順は以下の通りである。キナーゼ溶液３０μｌ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５中のＦｌｔ−１のキナーゼドメイン１０ｎｇ（Ｓｈｉｂｕｙａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  ５：  ５１９−２４参照）、３ｍＭ二塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、３ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、１０μＭバナジン酸ナトリウム、０．２５ｍｇ／ｍｌポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２００００、１ｍＭジチオスレイトール及び３ｕｇ／μｌポリ（Ｇｌｕ、Ｔｙｒ）４：１（Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、８ｕＭ［３３Ｐ］−ＡＴＰ（０．２ｕＣｉ）、１％ジメチルスルホキシド及び０から１００μＭ試験化合物を一緒に室温で１０分間インキュベートする。次いで、０．２５Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）ｐＨ７  １０μｌを添加して、反応を停止する。多チャネル分注器（ＬＡＢ  ＳＹＳＴＥＭＳ、ＵＳＡ）を用いて、２０μｌ一定分量をマイクロタイターフィルターマニフォールドを介してＰＶＤＦ（＝ポリフッ化ビニリデン（ｐｏｌｙ  ｖｉｎｙｌ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ））Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）に塗布し、真空に接続する。液体を完全に除去した後、膜を０．５％リン酸（Ｈ３ＰＯ４）を含む浴中で４回連続洗浄し、エタノールで１回洗浄し、毎回振とうしながら１０分間インキュベートし、次いでＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ＴｏｐＣｏｕｎｔ  Ｍａｎｉｆｏｌｄに装着し、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ．ＲＴＭ．（ベータ−シンチレーションカウンター液）１０μｌを添加後、放射能を測定する。ＩＣ５０値を３つの濃度（通常、０．０１μｍｏｌ、０．１μｍｏｌ及び１μｍｏｌ）の各化合物の阻害割合の線形回帰分析によって求める。活性チロシン阻害剤化合物のＩＣ５０値は、０．０１μＭから１００μＭの範囲であり得る。
【０２３７】
また、ＶＥＧＦによって誘導されたＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ／自己リン酸化活性の阻害又は活性化は、細胞に対するさらなる実験で確認することができる。手短に述べると、ヒトＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ／ＫＤＲ）を恒久的に発現する、形質移入されたＣＨＯ細胞を、６ウェル細胞培養プレート中の（１０％ウシ胎児（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｌ）血清（ＦＣＳ）を含む完全培地に蒔き、約８０％コンフルエントになるまで５％ＣＯ２下で３７℃でインキュベートする。次いで、試験化合物を（ＦＣＳを含まず、０．１％ウシ血清アルブミンを含む）培地で希釈し、細胞に添加する。（対照は、試験化合物を含まない培地を含む）。３７℃で２時間インキュベーション後、組み換えＶＥＧＦを添加し、最終ＶＥＧＦ濃度は２０ｎｇ／ｍｌである。）。３７℃でさらに５分間インキュベーション後、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し）、溶解緩衝剤１００μｌ／ウェルですぐに溶解させる。次いで、溶解物を遠心分離して細胞核を除去し、上清のタンパク質濃度を市販タンパク質アッセイ（ＢＩＯＲＡＤ）によって測定する。次いで、溶解物をすぐに使用することができ、又は必要に応じて−２００℃で保存することができる。
【０２３８】
次いで、サンドイッチＥＬＩＳＡを実施して、ＫＤＲ−受容体リン酸化を測定する。ＫＤＲに対するモノクローナル抗体を黒色ＥＬＩＳＡプレート（Ｐａｃｋａｒｄ製ＯｐｔｉＰｌａｔｅ（商標）、ＨＴＲＦ−９６）に固定する。次いで、プレートを洗浄し、残りの空いたタンパク質結合部位を１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液で飽和させる。次いで、細胞溶解物（タンパク質２０μｇ／ウェル）を、アルカリホスファターゼと結合した抗ホスホチロシン抗体（例えば、Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＫＹ製ＰＹ２０：ＡＰ）と一緒にこれらのプレート中で４℃で終夜インキュベートする。プレートを再度洗浄し、次いで、抗ホスホチロシン抗体と捕捉リン酸化受容体との結合を発光ＡＰ基質（ＣＤＰ−Ｓｔａｒ、ｒｅａｄｙ  ｔｏ  ｕｓｅ、ｗｉｔｈ  Ｅｍｅｒａｌｄ  ＩＩ；Ａｐｐｌｉｅｄ−Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＴＲＯＰＩＸ  Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いて証明する。発光を、例えば、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒで測定する。（ＶＥＧＦによって刺激された）正の対照のシグナルと（ＶＥＧＦによって刺激されていない）負の対照のシグナルの差は、ＶＥＧＦによって誘導されたＫＤＲ受容体リン酸化（＝１００％）に対応する。試験物質の活性は、ＶＥＧＦによって誘導されたＫＤＲ受容体リン酸化の阻害割合として計算される。最大阻害の半分を誘導する物質の濃度をＥＤ５０（５０％阻害に対する有効量）と定義する。活性チロシン阻害剤化合物は、０．００１μＭから６μＭ又は０．００５μＭから０．５μＭの範囲のＥＤ５０値を有する。
【０２３９】
薬剤及び治療投与
本発明のＶＥＧＦ拮抗物質組成物は、乾せん、リウマチ様関節炎及び眼球血管新生障害を含めて、血管新生障害の治療に有用である。特に興味深いのは、黄斑変性症、糖尿病性網膜症などの眼球血管新生障害を抑制するＶＥＧＦ拮抗物質を用いた療法である。したがって、患者は、血管新生障害を発症する、又は有する、リスクがあると診断された後、ＶＥＧＦの負の効果をそれぞれ遮断し、それによって血管新生障害の発生を抑制し、新血管新生に付随する有害作用を軽減するために、ＶＥＧＦ拮抗物質の投与による治療を受ける。本発明による方法の実施は、角膜の浮腫をもたらさない。上で考察したように、多種多様なＶＥＧＦ拮抗物質を本発明に使用することができる。
【０２４０】
本発明の組成物の投与は、血管新生障害の治療に有効である濃度が得られる任意の適切な手段によって投与することができる。例えば、各組成物は、適切な担体物質と混合することができ、一般に組成物の総重量の１−９５重量％の量で存在する。組成物は、眼、経口、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、皮下）、直腸、経皮、経鼻又は吸入薬投与に適切である剤形で提供することができる。したがって、組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、懸濁液剤、乳濁液剤、溶液剤、ヒドロゲル剤を含めたゲル剤、ペースト剤、軟膏剤、クリーム剤、硬膏剤、送達装置、坐剤、かん腸剤、注射剤、インプラント、噴霧剤又はエアゾール剤とすることができる。単一の拮抗物質又は２種類以上の拮抗物質を含む薬剤組成物を従来の製薬実務に従って調剤することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  （２０ｔｈ  ｅｄ．）  ｅｄ．  Ａ．Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，  ２０００，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ．及びＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ｅｄｓ．，  Ｊ．  Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．  Ｂｏｙｌａｎ，  １９８８−２００２，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。
【０２４１】
本発明の組成物は、有用である一態様においては、非経口（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、眼内、硝子体内、眼球後、結膜下、テノン嚢下又は皮下の注射又は移植）又は全身投与される。非経口又は全身投与用製剤としては、無菌水溶液、非水溶液、懸濁液、乳濁液などが挙げられる。種々の水系担体、例えば、水、緩衝水、食塩水などを使用することができる。他の適切なビヒクルの非限定的例としては、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、ゼラチン、ヒドロゲル、水素化ナフタレン（ｎａｐｈａｌｅｎｅ）、及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。かかる製剤は、保存剤、湿潤剤、緩衝剤、乳化剤及び／又は分散剤などの補助物質を含むこともできる。生体適合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、又はポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーを、活性成分の放出を制御するのに使用することができる。
【０２４２】
或いは、本発明の組成物を経口摂取によって投与することができる。経口用組成物は、薬剤組成物製造分野で公知である任意の方法によって、固体又は液体の形態で調製することができる。
【０２４３】
経口投与用固体剤形としては、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤などが挙げられる。一般に、これらの薬剤は、薬剤として許容される無毒の賦形剤と混合された活性成分を含む。薬剤として許容される無毒の賦形剤としては、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、セルロース、デンプン、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウム、カオリンなどの不活性希釈剤が挙げられる。結合剤、緩衝剤及び／又は潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）も使用することができる。さらに、錠剤及び丸剤は、腸溶コーティングによって調製することもできる。組成物は、より口当たりの良い調製物を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤、芳香剤及び保存剤を含んでいてもよい。
【０２４４】
本発明の組成物は、眼の硝子体内注射並びに結膜下及びテノン嚢下注射によって眼内投与することができる。他の投与経路としては、経強膜（ｔｒａｎｓｃｌｅｒａｌ）、眼球後、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｏｔｅｎｅａｌ）、筋肉内、静脈内などが挙げられる。或いは、組成物を薬物送達装置又は眼内インプラントによって送達することができる（下記参照）。
【０２４５】
経口投与用液体剤形としては、薬剤として許容される乳濁液剤、溶液剤、懸濁液剤、シロップ剤、軟ゼラチンカプセル剤などが挙げられる。これらの剤形は、水、油媒体など、ただしこれらだけに限定されない、当分野で一般に使用される不活性希釈剤を含み、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤などのアジュバントも含むこともできる。
【０２４６】
ある場合には、本発明の組成物は、例えば、貼剤によって、又は表皮、若しくは眼球障害に罹患しやすい、若しくは発症しやすい眼などの領域に直接適用することによって、又はイオントフォレーシスによって局所投与することもできる。
【０２４７】
眼用製剤としては、薬剤として許容される無毒の賦形剤との混合物として活性成分を含む錠剤などが挙げられる。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤又は充填剤（例えば、スクロース及びソルビトール）、潤滑剤、流動化剤及び癒着防止剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、硬化植物油又はタルク）であり得る。
【０２４８】
一般に、各製剤は、障害の有害作用又は症候を抑制、軽減又は排除するのに十分な量で投与される。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせる活性成分の量は、治療を受ける対象及び特定の投与方法に応じて変わる。
【０２４９】
各製剤の投与量は、症状の重症度、症状を治療又は防止すべきかどうか、並びに治療を受ける人の年齢、体重及び健康状態を含めて、幾つかの要因に応じて決まる。さらに、特定の患者についての薬理ゲノミクス（治療用物質の薬物動態学的プロファイル、薬力学的プロファイル又は効力プロファイルに対する遺伝子型の効果）情報は、使用投与量に影響し得る。また、当業者は、正確な個々の投与量が、投与する具体的組成物、投与時間、投与経路、製剤の性質、排出速度、治療する特定の血管新生障害、障害の重症度、及び血管新生障害の解剖学的場所（例えば、眼対体腔）を含めて、種々の要因に応じてある程度調節し得ることを理解されたい。必要な投与量は、多様な投与経路の効率が異なることを考慮すると、大きく変動すると予想される。例えば、経口投与は、一般に、静脈内又は硝子体内注射による投与よりも高い投与量レベルが必要であると予想される。これらの投与量レベルの変動は、当分野で周知である標準の経験的最適化ルーチンによって調節することができる。正確な治療有効投与量レベル及びパターンは、典型的には、上記要因を考慮して眼科医などの主治医が決定する。
【０２５０】
一般に、ヒトに経口投与するときには、本発明の組成物の投与量は、通常、約０．００１ｍｇから約２００ｍｇ／日、約１ｍｇから１００ｍｇ／日、又は約５ｍｇから約５０ｍｇ／日である。約２００ｍｇ／日までの投与量が必要であり得る。注射投与の場合、投与量は、通常、約０．１ｍｇから約２５０ｍｇ／日、約１ｍｇから約２０ｍｇ／日、又は約３ｍｇから約５ｍｇ／日である。注射は、約４回／日まで行うことができる。一般に、ヒトに非経口又は全身投与するときには、投与量は、通常、約０．１ｍｇから約１５００ｍｇ／日、約０．５ｍｇから約１０ｍｇ／日、又は約０．５ｍｇから約５ｍｇ／日である。約３０００ｍｇ／日までの投与量が必要であり得る。
【０２５１】
ヒトの眼に投与するときには、投与量は、通常、約０．１５ｍｇから約３．０ｍｇ／日、約０．３ｍｇから約３．０ｍｇ／日、又は約０．１ｍｇから１．０ｍｇ／日である。
【０２５２】
薬物投与は、独立に、１日から１年間１から４回／日とすることができ、さらには患者の一生とすることができる。慢性の長期投与が多くの場合に必要である。投与量は、単一用量として投与することができ、又は複数回投与に分割することができる。一般に、所望の投与量を設定間隔で長期間、通常少なくとも数週間投与すべきであるが、数か月以上のより長期の投与が必要な場合もある。
【０２５３】
既存の障害の治療に加えて、ＶＥＧＦ拮抗物質を含む療法を、これらの障害を防止するため、又はその発症を遅延させるために、予防投与することができる。予防の際には、ＶＥＧＦ拮抗物質を、特定の血管新生障害に罹患しやすい患者、又は特定の血管新生障害のリスクがある患者に投与する。正確な投与タイミング及び投与量は、患者の健康状態、体重などの多様な要因に応じて決まる。
【０２５４】
本発明による薬剤組成物は、本発明の組成物を実質的に投与直後に、又は制御放出剤形を用いて、投与後の任意の所定の時間に、放出するように処方することができる。例えば、本発明の少なくとも１種類の組成物を含む薬剤組成物を徐放性組成物として提供することができる。即時放出組成物又は徐放性組成物の使用は、治療する症状の性質に応じて決まる。症状が急性又は超急性（ｏｖｅｒ−ａｃｕｔｅ）障害からなる場合には、徐放性組成物よりも即時放出型の治療が典型的には利用される。ある種の予防治療又は長期治療の場合には、徐放性組成物も適切であり得る。
【０２５５】
制御放出剤形の組成物の投与は、組成物が、単独で、又は組み合わせて、（ｉ）狭い治療指数（例えば、有害な副作用又は有毒な反応をもたらす血しょう中濃度と、治療効果が少ない血しょう中濃度との差。一般に、治療指数ＴＩは、半致死量（ＬＤ５０）と半有効量（ＥＤ５０）の比として定義される。）、（ｉｉ）胃腸管における狭い吸収窓、又は（ｉｉｉ）短い生物学的半減期（その結果、血しょう中濃度を治療レベルに維持するために、１日に頻繁な投薬が必要である。）を有する場合に有用である。
【０２５６】
治療用物質の放出速度が分解又は代謝速度よりも大きい制御放出を得るために、多数の戦略を追求することができる。例えば、制御放出は、例えば、適切な制御放出組成物及びコーティングを含めて、製剤パラメータ及び成分を適切に選択することによって得ることができる。例としては、単一又は複数の単位錠剤又はカプセル剤組成物、油剤、懸濁液剤、乳濁液剤、マイクロカプセル、ミクロスフェア、ナノ粒子、貼剤及びリポソームが挙げられる。かかる徐放性製剤又は制御放出製剤を調製する方法は当分野で周知である。
【０２５７】
本発明の組成物を含む薬剤組成物は、インプラントなどの薬物送達装置を用いて送達することもできる。かかるインプラントは、生分解性及び／又は生体適合性インプラントとすることができ、又は非生分解性インプラントとすることができる。インプラントは、活性薬剤に対して透過性でも不透過性でもよい。
【０２５８】
眼の薬物送達装置は、前眼房、後眼房などの眼房に挿入することができ、又は強膜（ｓｃｅｌｒａ）、脈絡膜空間、若しくは硝子体外部の無血管（ａｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ）領域の中若しくは上に移植することができる。一実施形態においては、インプラントは、強膜などの無血管領域上に位置し、所望の治療部位、例えば、眼内空間及び眼の黄斑に薬物を経強膜拡散させることができる。また、経強膜拡散部位は、黄斑の近位にある部位などの新血管新生部位の近くにあり得る。
【０２５９】
本発明は、別々の薬剤組成物を薬剤パック中で組み合わせることに場合によっては関係する。したがって、本発明の組合せを薬剤パックの成分として提供してもよい。これらの成分は、一緒に、又は別々に、個々の投与量で、処方することができる。
【０２６０】
本発明の組成物は、塩として処方するときにも有用である。
【０２６１】
有効性
血管新生障害の抑制を、血管新生が遅延されるか、又は減少するかどうかを測定する任意の許容される方法によって評価する。この方法は、直接観察、及び自覚症状又は客観的な生理学的指標の評価などの間接的評価を含む。例えば、治療効力は、新血管新生、微小血管障害、血管漏洩若しくは血管浮腫又はこれらの任意の組合せの予防又は反転に基づいて評価することができる。眼球血管新生障害の抑制を評価する治療効力は、視力の安定化又は向上の観点から規定することもできる。
【０２６２】
眼球血管新生障害の治療又は予防における特定の療法の有効性を求めるには、注射後数日及び少なくとも１ヵ月後、次の注射の直前に眼科医が患者を臨床的に評価することもできる。ＥＴＤＲＳ視力、コダクローム写真及びフルオレセイン血管造影法も、最初の４ヵ月間毎月、必要に応じて、眼科医によって実施される。
【０２６３】
例えば、眼球新血管新生を治療するＶＥＧＦ拮抗物質療法の有効性を評価するために、ＶＥＧＦ−Ａアプタマー（例えば、ＥＹＥ００１のＰＥＧ化体）の単一又は複数の硝子体内注射の投与を含む試験を、加齢黄斑変性症に続発する中心窩下脈絡膜血管新生に罹患した患者において、眼科分野において周知である標準方法に従って実施する。実用的な一試験においては、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）に続発する中心窩下脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）の患者は、ＶＥＧＦ変種又はＶＥＧＦアプタマーの単一の硝子体内注射を受ける。組成物の有効性は、例えば、眼の評価によってモニターされる。治療後３ヵ月に安定した、又は改善した視力を示す患者、例えば、ＥＴＤＲＳチャートによる視力で３ライン以上の改善を示す患者は、眼球血管新生障害を抑制するＶＥＧＦ変種又はＶＥＧＦアプタマーの有効投与量を受けたと解釈される。
【０２６４】
実施例
以下の実施例は、ある有用な実施形態、及び本発明の態様を説明するものであって、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。代替の材料及び方法を利用しても、類似した結果を得ることができる。
【実施例１】
【０２６５】
部位特異的変異誘発
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いたＰＣＲによって、アラニン置換を完全長ＶＥＧＦ１６４のエキソン７（Ｐｒｏ１１６−Ｃｙｓ１６０）に導入した。
【０２６６】
非修飾ヌクレオチド配列に隣接する所望の変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、ＨＰＬＣ及びエタノール沈殿によって精製した。オリゴヌクレオチドプライマーを、テンプレートプラスミドの同じ鎖上の隣接配列又は別々の領域に結合するように設計した。プライマーは、通常、長さ３２−４３ｂｐであり、変異誘発効率を改善するために５’−リン酸化された。プライマーは、最小ＧＣ含量４０％、融解温度（Ｔｍ）≧７５℃であり、３’末端が１個以上のＣ又はＧ塩基で終結する。各プライマー１００ｎｇ、二本鎖ＤＮＡテンプレート５０ｎｇ、ｄＮＴＰミックス１μＬ及びＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素ブレンド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）１μＬを用いて適切な緩衝剤２５μＬ中で反応を実施した。
【０２６７】
以下のＰＣＲ条件を用いた。
セグメント１    １サイクル  ９５℃で１分間変性
セグメント２  ３０サイクル  ９５℃で１分間変性
５５℃で１分間アニーリング
６５℃でプラスミド長１ｋｂ当たり２分間伸長
【０２６８】
反応物（ｒｅａｃｔｉｏｎ）を氷上に２分間置いた後、ＤｐｎＩ制限酵素１０Ｕを３７°で１時間添加して、親（非変異）ＤＮＡテンプレートを消化した。ＤｐｎＩ処理ＤＮＡ  １．５μｌを４２℃で３０秒間インキュベートして、ＸＬ１０−Ｇｏｌｄウルトラコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。ＳＯＣ培地を添加し、次いで管を３７でインキュベートし、反応物を３７℃で１時間インキュベートした。適切な体積の各形質転換反応物を、２５μｇ／ｍＬ  Ｚｅｏｃｉｎを含む低塩ＬＢ寒天板に蒔いた。対照プラスミドの変異誘発効率を各実験において正の対照として求めた。
【０２６９】
以下の変異体オリゴヌクレオチドを、ＶＥＧＦ１６４ヘパリン結合ドメイン変異体の作製用プライマーとして用いた。
【０２７０】
【化１】
2008538927.tif 000003
太字のヌクレオチドは変異を示す。
【０２７１】
全変異をＤＮＡ塩基配列決定法によって確認した。
【０２７２】
ｐＰＩＣＺαＣ−ＶＥＧＦ１６４発現プラスミドをテンプレートとして使用して、三重変異体（Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ）を一段階で作製した。二重変異体（Ｒ１４／Ｒ４９Ａ）を、三重変異体に関連して、Ｒ１３→Ａ１３変異を反転させることによって作製した。
【０２７３】
二重変異体（Ｒ１４／Ｒ４９Ａ）：ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＲＡＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＡＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２３）。
【０２７４】
三重変異体（Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ）：ＡＰＭＡ  ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶ  ＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳ  ＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤ  ＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥ  ＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬ  ＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥ  ＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳ  ＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫ  ＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ  ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣ  ＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥ  ＮＰＣＧＰＣ  ＳＥＡＡＫＨＬＦＶＱ  ＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫ  ＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱ  ＬＥＬＮＥＲＴＣＡＣ  ＤＫＰＲＲ（配列番号２４）。
【０２７５】
考察
出願人は、アラニンスキャンニング変異誘発を使用して、ヘパリン結合タンパク質とヘパリンの相互作用を規定することに成功したことを述べた。また、出願人は、インビトロでのヘパリン結合アッセイによって、ＶＥＧＦ１６４とヘパリンの相互作用の一因となる残基を特定した。
【０２７６】
ＶＥＧＦ１６４（ＶＥＧＦ５５）のヘパリン結合ドメイン断片についてのＮＭＲ構造データが利用可能であることによって、設計に役立ち、ＶＥＧＦ１６４とヘパリンの相互作用に関与する重要な残基を明確にしようとする変異誘発戦略が合理化された（その内容を参照によりその全体を本明細書に組み込むＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＮＡＳ，  （２００５）  Ｖｏｌ．１０２，  １８９０２−１８９０７）。Ｆａｉｒｂｒｏｔｈｅｒ，  Ｗ．Ｊ．等は、カルボキシ末端サブドメイン及びアミノ末端ループ領域の一面にある塩基性アミノ酸側鎖のクラスターが、ヘパリン結合性部位であり得ることを示唆している（その内容を参照によりその全体を本明細書に組み込むＦａｉｒｂｒｏｔｈｅｒ，  Ｗ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  １９９８．  ６（５）：ｐ．６３７−４８）。この仮説を検定するために、エキソン７コード領域に属する８個の塩基残基を選択し、部位特異的変異誘発によって個々に、又は組み合わせて、アラニンに変えた。１０種類のＶＥＧＦ１６４変異体タンパク質がメチロトローフ酵母ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）中で産生され、それを均一に精製した。細菌発現系と異なり、この生物中で産生されたタンパク質は再折り畳みが不要である。また、タンパク質プロセシング及び翻訳後修飾は、高等真核生物のそれにより近似している。組み換え変異体の各々は、分泌、収率、及びジスルフィド連結ホモ２量体形成能に関して、野生型ＶＥＧＦ１６４に類似していることが判明した。さらに、各変異体の生物活性は、内皮細胞を用いたアッセイで評価して、天然ＶＥＧＦ１６４と同等に高いことが確認された。これらの知見によれば、タンパク質は折り畳まれており、変異は、タンパク質構造の完全性を損なう効果を持たなかった。これは、全置換残基が溶媒に曝され、したがって変異が構造的に許容される可能性が高い領域を構成するということと一致する。相対ヘパリン結合親和性は、ヘパリン−セファロースカラムへの結合能、及び溶出に必要な塩化ナトリウム濃度によって示されるように、全変異体タンパク質において多様な影響を受けた。結合性の減少度は、置換数に関係し、したがって全陽電荷の減少に関係すると考えられた。
【０２７７】
変異体Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａは、分析アフィニティークロマトグラフィーとフィルタートラッピングアッセイの両方におけるヘパリン結合親和性の顕著な減少に反映される一貫したヘパリン結合特性を示した。Ａｒｇ１４がＡｒｇ４９と組み合わせて標的であるときには、生成した変異体Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａは、ヘパリンカラムに結合し、同じ塩濃度（０．５２Ｍ  ＮａＣｌ）で溶出した。しかし、Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａと異なり、塩濃度０．１５ＭにおけるＲ１４Ａ／Ｒ４９Ａと可溶性ヘパリンの結合性は、Ｋｄ値が測定不可能なほどに低下した（Ｋｄ値＞１０μＭ）。
【０２７８】
三重変異体Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａは、２つの独立したインビトロでのヘパリン結合アッセイにおいて、生理学的塩濃度ではヘパリンと結合しなかった。低塩濃度（０．１Ｍ  ＮａＣｌ）におけるこの変異体とヘパリンカラムの結合性、及び０．５２Ｍにおけるその溶出は、高濃度ヘパリン−セファロースとの低イオン強度における低親和性静電相互作用によって説明することができる。高イオン強度におけるタンパク質の結合性は、これらの部位の飽和又は遮蔽によって阻止される。まとめると、これらのデータは、ヘパリンの結合性への大きな寄与が、３個のアルギニンのクラスターから生じることを示しており、Ａｒｇ１４及びＡｒｇ４９が最小結合部位である、Ａｒｇ１３、Ａｒｇ１４、Ａｒｇ４９及びＡｒｇ４６からなる主要なヘパリン結合性部位の存在を示唆している。これらの重要なヘパリン結合性残基は、明確に規定されたアミノ末端及びカルボキシ末端サブドメインの界面に沿って存在し、配列が隣接していない。このモデルは、最近公表された微細なＮＭＲ溶液構造、及びアミノ末端とカルボキシ末端サブドメインの相互配向の大きく改善された定義によって支持されている。最初の構造に対して、改良によって、２個のサブドメインのヘパリン結合性残基（Ａｒｇ１３、Ａｒｇ１４、Ａｒｇ４９）が互いに近接し、それによって連続結合面を形成することが判明した（Ｓｔａｕｆｆｅｒ，  Ｍ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  ＮＭＲ，  ２００２．  ２３（１）：ｐ．５７−６１）。変異残基Ａｒｇ１３、Ａｒｇ１４及びＡｒｇ４９は、ＨＢＤ一次配列の両端に位置するが、三次構造において連続結合面を形成する。
【０２７９】
ニューロピリン−１結合性に対するＶＥＧＦ１６４ヘパリン結合ドメイン変異の効果を、競合結合測定法においてヘパリンの非存在下で全ＶＥＧＦ１６４変異体のＩＣ５０を測定することによって調べた。放射性標識ＶＥＧＦ１６５とラットニューロピリン−１（０．１２８ｎＭ）の結合を阻害するのに必要な野生型ＶＥＧＦ１６４の最大濃度の半分は、高親和性相互作用を表す。ＶＥＧＦがニューロピリン−１に効率的に結合するにはヘパリンが必要と考えられることから、これは予想されなかった（Ｓｏｋｅｒ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  １９９６．  ２７１（１０）：ｐ．５７６１−７）。低いＩＣ５０は、表面プラズモン共鳴技術による結合試験から得られたデータとも全く対照的であった。表面プラズモン共鳴技術では、マウスニューロピリン−１に対するＶＥＧＦ１６５結合のＫｄは１１３ｎＭと計算された（Ｆｕｈ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２０００．  ２７５（３５）：ｐ．２６６９０−５）。後者の不一致は、ヒトＶＥＧＦに対するマウス及びラットニューロピリン−１の親和性がそのヒト対応物よりも低いことによって簡単に説明され得るが、これは確認されていない。これらのデータに照らして、この手法によって得られるＩＣ５０値は、絶対値ではなく相対値とみなすべきである。固定化ニューロピリン−１に対する全変異体ＶＥＧＦタンパク質の結合親和性は、ＶＥＧＦ１６４の１／２．５倍（Ｋ２６Ａ）から１／１１５倍（Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４６Ａ／Ｒ４９Ａ）に減少した。しかし、全変異体はかなりの結合活性を保持し、ＶＥＧＦ１６４上のニューロピリン−１結合エピトープとヘパリン結合エピトープが同一ではないことを示唆している。ヘパリン結合性欠損ＶＥＧＦ変異体の残留ニューロピリン−１結合活性は、ＶＥＧＦ１２０よりも強力に組織因子遺伝子発現を誘導する能力の原因であり得る。
【実施例２】
【０２８０】
ヘパリン／ＶＥＧＦタンパク質フィルター結合アッセイ
目的：
ＶＥＧＦ１６４及び変異体ＶＥＧＦ１６４変種に対するヘパリンの結合特異性を求めること。
【０２８１】
試薬：
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｅｙｅｔｅｃｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＭＡのピキア組み換えタンパク質産生システムを用いて産生された）ＶＥＧＦ１６４及びＶＥＧＦ１６４ヘパリン結合ドメイン変異体変種
［３Ｈ］−ヘパリン（Ｃａｔ  ＃  ＮＥＴ４７６、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  Ｉｎｃ．）
シンチレーション流体（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  Ｉｎｃ．）
ＴＲＩＳ塩基、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ，  Ｉｎｃ．）
材料：
非粘着１．５ｍＬ微量遠心管（Ａｍｂｉｏｎ，  Ｉｎｃ．）
ハイブリダイゼーションオーブン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｙｂａｉｄ，  Ｉｎｃ．）
Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  ＴｒｉＬｕｘシンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  Ｉｎｃ．）
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ真空マニフォールド及びＨＡＴＦ  ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌａｒフィルター（直径２．５ｃｍ、孔径０．４５ミクロン）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｔ＃  ＨＡＴＦ０２５００）
Ｐｉｐｅｔｍａｎ  Ｐ２０、Ｐ２００及びＰ１０００（Ｒａｉｎｉｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ，  Ｉｎｃ．）
Ｐｉｐｅｔ−Ａｉｄ（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．，  Ｉｎｃ．）
無菌ピペット（５ｍＬ、１０ｍＬ及び２５ｍＬ）（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．）
【０２８２】
ニトロセルロース結合アッセイ
ヘパリンとＶＥＧＦの結合性を溶液中で評価した。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ１６４）変異体の段階希釈物を結合緩衝剤（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．５）を用いて５μＭから０．４８８ｎＭの範囲で調製し、０．０５μＭ  ３Ｈ標識ヘパリンと一緒に微量遠心管中で最終体積１００μＬでインキュベートした（１時間、３７℃）。溶液（１００μＬ）をニトロセルロースフィルター（孔径０．４５μＭ）上に移し、次いで、タンパク質に結合した３Ｈ−ヘパリンを真空マニフォールドを用いた減圧ろ過によって捕捉した。フィルターを洗浄緩衝剤（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）１ｍＬで３回リンスし、ワットマン紙に移して乾燥させた。タンパク質／ヘパリン複合体を、Ｍｉｃｒｏ−Ｂｅｔａシンチレーションカウンターによってシンチレーション計数して定量した。
【０２８３】
飽和結合曲線及び結合親和性（Ｋｄ）をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０プログラムを用いて非線形回帰分析（１部位結合）によって計算した。
【０２８４】
分析的ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー
ＶＥＧＦ変種のヘパリン結合親和性を求めるために、タンパク質５０μｇを含むヘパリン結合緩衝剤（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）２００μｌを、あらかじめ平衡にした１ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にＡＫＴＡ  ＦＰＬＣ（商標）システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて流量０．２５ｍｌ／ｍｉｎで充填した。結合緩衝剤１カラム体積で洗浄して、結合していない物質を除去した。次いで、タンパク質を１００ｍＭから１Ｍ塩化ナトリウムの線形塩勾配によって９カラム体積で流量０．５ｍｌ／ｍｉｎで溶出させ、０．５ｍｌ画分を収集した。カラムを結合緩衝剤で洗浄して再構成し、次いで２０％エタノール中で保存した。伝導率、ｐＨ及びＵＶ吸光度（２８０ｎｍ）を４℃で測定した。各タンパク質の溶出のための塩濃度を、収集画分の伝導率に基づいて計算した。全画分をトリクロロ酢酸沈殿に供した。乾燥ペレットをＳＤＳ試料緩衝剤で希釈し、沸騰させ、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分離し、クーマシー染色によって分析した。方法プログラミング並びに測定の分析及び評価を、Ｕｎｉｃｏｒｎ  ４．１ソフトウェア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって実施した。
【０２８５】
ヘパリン／ＶＥＧＦフィルター結合アッセイ
５μＭから４．８８ｎＭの範囲のＶＥＧＦタンパク質の４倍段階希釈物６個（管＃１から＃６）のセットを、０．０５μＭ  ３Ｈ標識ヘパリンの結合緩衝剤（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、ＰＨ７．５）溶液と非粘着１．５ｍＬ微量遠心管中で合計１００μＬの最終体積で各々混合する。０．０５μＭ  ３Ｈ標識ヘパリンの１００μＬ結合緩衝剤溶液のみを含む別の管（＃７）を、セットのバックグラウンド対照として用いる。結合反応物を３７℃で１時間インキュベートして、平衡結合を起こさせる。７個のＨＡＴＦニトロセルロースフィルターを洗浄緩衝剤（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ＰＨ７．５）でリンスし、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ真空マニフォールド上に置き、低真空（Ｈｇ  ２．５インチ（６．４ｃｍ））下で洗浄緩衝剤５ｍＬであらかじめ湿らせる。洗浄したフィルターを低真空下に維持しながら、各結合反応物及びバックグラウンド対照１００μＬ全量を、対応する個々のフィルターにかけ、通過させる。フィルターを同じ低真空下で洗浄緩衝剤１ｍＬですぐに３回リンスする。フィルターをマニフォールドから取り出し、ろ紙で吸い取って簡単に乾かし、個々のシンチレーションバイアルに移す。シンチレーション流体約３ｍＬを各バイアルに添加し、各フィルターの放射能をシンチレーション計数によって測定する。
【０２８６】
結合親和性の測定
カウント／分（ｃｐｍ）単位の結合量を、フィルター（＃１から＃６）上に保持されたカウント数−バックグラウンド（フィルター＃７）として計算する。各標的タンパク質（ＶＥＧＦ１６４及び変種）希釈物から得られたｃｐｍ単位の補正済み結合値、及び対応する標的タンパク質濃度を、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭプログラム（１部位結合）を用いた非線形回帰によって解析し、生成した曲線を使用してＶＥＧＦ１６４及び異なるＶＥＧＦ１６４変異体変種に対するヘパリンの結合親和性（ＫＤ）を求める。
【０２８７】
ＶＥＧＦ１６４（野生型、ＷＴ）及びＶＥＧＦ１６４変異体変種のヘパリン結合親和性を、この直接的ヘパリン結合アッセイに基づいて分析した。結果を図４に示す。
【０２８８】
図４は、直接的ヘパリン結合アッセイに基づくＶＥＧＦ１６４（野生型、ＷＴ）及びＶＥＧＦ１６４変異体変種のヘパリン結合親和性を示すグラフである。結合３Ｈ標識ヘパリンの量をシンチレーション計数によって測定し、カウント／分（ＣＰＭ、Ｙ軸）として表し、対応するＶＥＧＦタンパク質濃度をナノモル（ｎＭ、Ｘ軸）で表す。この結果によれば、ＷＴ  ＶＥＧＦ１６４はヘパリンに対して高親和性特異的飽和結合を示したのに対して、変異体Ｒ１４／Ｒ４９Ａ及びＲ１３／Ｒ１４／Ｒ４９Ａはヘパリンに対して特異的結合を示さない。したがって、結果は、塩基性アミノ酸残基Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ４９が、ＶＥＧＦ１６４ヘパリン結合ドメインのヘパリン結合活性に重要であることを示唆している。
【実施例３】
【０２８９】
ニューロピリン−１、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）及びＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ−１）に対するＶＥＧＦ結合性を評価するインビトロ受容体結合アッセイ（競合結合アッセイ）
目的：
３種類の高親和性細胞表面受容体ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２及びニューロピリン−１に対するインビトロでの１２５Ｉ−ＶＥＧＦ１６５の結合を阻害するＶＥＧＦ１６４及びＶＥＧＦ１６４変異体変種の効力（ＩＣ５０）を求めること。
試薬：
抗ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片特異的抗体（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ，  Ｉｎｃ．）
ヒトＶＥＧＦＲ−１／Ｆｃキメラ、ヒトＶＥＧＦＲ−２／Ｆｃキメラ、ヒトニューロピリン−１／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．）
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びＴｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ，  Ｉｎｃ．）
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．）
Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋブロッキング緩衝剤のＰＢＳ溶液（ＰＩＥＲＣＥ，  Ｉｎｃ．）
Ｉ１２５ＶＥＧＦ１６５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．）
材料：
Ｉｓｏｐｌａｔｅ  Ｈｉｇｈ−Ｂｉｎｄｉｎｇ（ＨＢ）９６ウェル（Ｃａｔ＃  １４５０−５１８、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  Ｉｎｃ．）
非粘着１．５ｍＬ微量遠心管（Ａｍｂｉｏｎ，  Ｉｎｃ．）
ハイブリダイゼーションオーブン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｙｂａｉｄ，  Ｉｎｃ．）
Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  ＴｒｉＬｕｘシンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  Ｉｎｃ．）
Ｒｅｐｅａｔｅｒ  Ｐｌｕｓ  Ｐｉｐｅｔｔｏｒ及び１０ｍＬ  Ｃｏｍｂｉｔｉｐｓ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｉｎｃ．）
Ｐｉｐｅｔｍａｎ  Ｐ２０、Ｐ２００及びＰ１０００（Ｒａｉｎｉｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ，  Ｉｎｃ．）
Ｐｉｐｅｔ−Ａｉｄ（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．，  Ｉｎｃ．）
無菌ピペット（５ｍＬ、１０ｍＬ及び２５ｍＬ）（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．）
手順：
受容体の固定化
ニューロピリン−１、ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２結合性の場合、９６ウェルＩｓｏｐｌａｔｅプレートを、最初に、抗ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片特異的抗体の１００μｌ  ＰＢＳ溶液（１３８ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４）５００ｎｇ（３．３３ｐｍｏｌ）、２５０ｎｇ（１．６７ｐｍｏｌ）及び５００ｎｇ（３．３３ｐｍｏｌ）でそれぞれ終夜４℃で被覆する。プレートをＳｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋブロッキング緩衝剤３００μｌで室温で各５分間３回洗浄して、非特異的結合部位をブロックした。残留ブロッキング緩衝剤を結合緩衝剤（ＰＢＳ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）３００μｌで洗い流した。続いて、ラットニューロピリン−１／Ｆｃ  ０．３５ｐｍｏｌ（８４ｎｇ）、マウスＶＥＧＦＲ−１／Ｆｃ  ０．０４ｐｍｏｌ（８．８ｎｇ）及びマウスＶＥＧＦＲ−２／Ｆｃキメラ受容体０．２ｐｍｏｌ（４４ｎｇ）の１００μｌ結合緩衝剤溶液を対応するプレートに室温で２時間固定した。ウェルを結合緩衝剤３００μｌで２回洗浄して、結合していない受容体を除去した。
【０２９０】
結合性混合物の調製及び競合結合アッセイ
ニューロピリン−１及びＶＥＧＦＲ−２結合に対して４００ｎＭから０．０２ｐＭ、及びＶＥＧＦＲ−１結合に対して３００ｎＭから０．０３ｐＭの範囲の、ＶＥＧＦ１６４及びＶＥＧＦ１６４変種の一連の５倍段階希釈物を結合緩衝剤を用いて調製し、１２５Ｉ−ＶＥＧＦ１６５  ０．０２μＣｉと微量遠心管中で最終体積１００μｌで混合した。過剰量の非放射性ＶＥＧＦ１６４（ニューロピリン−１及びＶＥＧＦＲ−２の場合４００ｎＭ、及びＶＥＧＦＲ−１の場合３００ｎＭ）をバックグラウンド対照として用いて、１２５Ｉ−ＶＥＧＦの非特異的結合を求め、競合物質の非存在下で最大結合を求めた。結合性試料を９６ウェルプレートの対応するウェルに移し、固定化受容体との結合を平衡化した（ニューロピリン−１の場合室温で２時間、ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２の場合３７℃で２時間）。プレートを総体積９００μｌの洗浄緩衝剤（ＰＢＳ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）で３回洗浄し、シンチレーション流体２００μｌを各ウェルに添加し、１２５Ｉ−ＶＥＧＦの結合を液体シンチレーションカウンターによって定量した。
【０２９１】
受容体結合を５０％阻害する有効濃度（ＩＣ５０値）の測定
３つの独立した実験の各々から得られたＣＰＭ値を平均し、受容体に対する１２５Ｉ−ＶＥＧＦの特異的結合を以下の通り計算した。
【０２９２】
【化２】
2008538927.tif 000004
Ｘ＝非放射性競合物質の各濃度に対する平均ＣＰＭ値
ＮＳＢ＝非特異的結合（過剰量の非放射性競合物質の存在）に対する平均ＣＰＭ値
１００％Ｂ＝非放射性競合物質の非存在下での１２５Ｉ−ＶＥＧＦの最大結合
【０２９３】
ＶＥＧＦ１６４及び異なるＶＥＧＦ１６４変異体変種の競合結合曲線及びＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０プログラムを用いた非線形回帰分析（１部位競合）によって計算した。
【０２９４】
ニューロピリン−１（Ｎｐ−１）、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）及びＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ−１）とのＶＥＧＦ結合性をインビトロ受容体結合アッセイによって分析した。これらのインビトロ受容体結合アッセイの結果を図９から１２に示す。
【０２９５】
図９は、ＶＥＧＦアイソフォーム及びＶＥＧＦ１６４変異体変種に対するインビトロＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ受容体−２（ＫＤＲ）競合プレート結合アッセイの結果を示すグラフである。漸増量の異なる非放射性競合物質（ＶＥＧＦ１２０、ＶＥＧＦ１６４、変異体Ｒ１４／Ｒ４９Ａ及び変異体Ｒ１３／Ｒ１４／Ｒ４９Ａ）（Ｘ軸）を用いて、ＫＤＲ受容体との結合について１２５Ｉ標識ＶＥＧＦ１６５と競合させた。非放射性競合物質の漸増濃度における１２５Ｉ標識ＶＥＧＦ１６５による特異的結合レベルをＹ軸上の結合割合として表す。グラフは、ＶＥＧＦ１２０、ＶＥＧＦ１６４及びＶＥＧＦ１６４ヘパリン結合ドメイン変異体変種（Ｒ１４／Ｒ４９Ａ及びＲ１３／Ｒ１４／Ｒ４９Ａ）によるＶＥＧＦ１６５／ＫＤＲ受容体結合の阻害効力が類似していることを示している。したがって、野生型ＶＥＧＦ１６４と変異体変種は、ＫＤＲ受容体に対して類似の結合親和性を有する。これらの結果によって、ヘパリン結合ドメイン残基Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ４９における変異誘発が、ＶＥＧＦ１６４のＫＤＲ受容体結合部位に影響を及ぼさないことが確認された。
【０２９６】
図１０は、ＶＥＧＦアイソフォーム及びＶＥＧＦ１６４変異体変種に対するインビトロＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ受容体−１（Ｆｌｔ−１）競合プレート結合アッセイの結果を示すグラフである。漸増量の異なる非放射性競合物質（ＶＥＧＦ１２０、ＶＥＧＦ１６４、変異体Ｒ１４／Ｒ４９Ａ及び変異体Ｒ１３／Ｒ１４／Ｒ４９Ａ）（Ｘ軸）を用いて、Ｆｌｔ−１受容体との結合について１２５Ｉ標識ＶＥＧＦ１６５と競合させた。非放射性競合物質の漸増濃度における１２５Ｉ標識ＶＥＧＦ１６５による特異的結合レベルをＹ軸上の結合割合として表す。グラフによれば、ＶＥＧＦ１６５／Ｆｌｔ−１結合阻害効力が低下し、したがって野生型（ＷＴ）ＶＥＧＦ１６４と比較して、ＶＥＧＦ１６４ヘパリン結合ドメイン変異体変種（Ｒ１４／Ｒ４９Ａ及びＲ１３／Ｒ１４／Ｒ４９Ａ）によるＦｌｔ−１受容体結合親和性が低下している。また、ヘパリン結合ドメインを欠くＶＥＧＦ１２０も、ＷＴ  ＶＥＧＦ１６４よりも低いＶＥＧＦ１６５／Ｆｌｔ−１結合阻害効力を示した。これらの結果は、ヘパリン結合ドメイン、具体的には、ヘパリン結合ドメインの残基Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ４９が、ＶＥＧＦ１６４によるＦｌｔ−１受容体の高親和性結合に重要であることを示唆している。
【０２９７】
図１１は、野生型（ＷＴ）ＶＥＧＦ１６４及び異なる変異体変種（変異体Ｋ２６Ａ、Ｒ１４／Ｒ４９Ａ及びＲ１３／Ｒ１４／Ｒ４９Ａ）のインビトロＶＥＧＦ／ニューロピリン−１（Ｎｐ−１）受容体競合プレート結合アッセイの結果を示すグラフである。漸増量の異なる非放射性競合物質（ＶＥＧＦ１６４、変異体Ｋ２６Ａ、Ｒ１４／Ｒ４９Ａ及び変異体Ｒ１３／Ｒ１４／Ｒ４９Ａ）（Ｘ軸）を用いて、Ｎｐ−１受容体との結合について１２５Ｉ標識ＶＥＧＦ１６５と競合させた。非放射性競合物質の漸増濃度における１２５Ｉ標識ＶＥＧＦ１６５による特異的結合レベルをＹ軸上の結合割合として表す。グラフによれば、ＶＥＧＦ１６５／Ｎｐ−１結合阻害効力が低下し、したがってＷＴ  ＶＥＧＦ１６４と比較して、全ＶＥＧＦ１６４ヘパリン結合ドメイン変異体変種Ｋ２６Ａ、Ｒ１４／Ｒ４９Ａ及びＲ１３／Ｒ１４／Ｒ４９ＡによるＮｐ−１受容体結合親和性が低下している。また、変異体Ｋ２６Ａは、変異体Ｒ１４／Ｒ４９Ａ及びＲ１３／Ｒ１４／Ｒ４９Ａよりも高いヘパリン結合活性をある程度保持しているので、変異体変種のヘパリン結合活性は、Ｎｐ−１に対するその結合親和性と正の相関を示す。これらの結果は、ヘパリン結合ドメイン、特に残基Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ４９がＶＥＧＦ１６４によるＮｐ−１受容体の高親和性結合に関与し、ヘパリン結合活性がＮｐ−１受容体に対するＶＥＧＦ１６４の結合親和性と正の相関を有することを示唆しているこれらの結果は、ヘパリンとＮｐ−１の各結合部位が部分的に重複していることも示唆している。
【０２９８】
図１２は、野生型（ＷＴ）ＶＥＧＦ１６４及び異なる変異体変種（変異体Ｋ２６Ａ、Ｒ１４／Ｒ４９Ａ及びＲ１３／Ｒ１４／Ｒ４９Ａ）のインビトロＶＥＧＦ／ニューロピリン−１（Ｎｐ−１）受容体競合プレート結合アッセイの定量結果を示す図である。ＶＥＧＦ１６４及び変種によるＶＥＧＦ１６５／Ｎｐ−１結合の阻害効力をＹ軸上のＩＣ５０として表す。図は、ＶＥＧＦ１６４ヘパリン結合ドメイン変異体変種Ｋ２６Ａ、Ｒ１４／Ｒ４９Ａ及びＲ１３／Ｒ１４／Ｒ４９ＡによるＶＥＧＦ１６５／Ｎｐ−１結合の阻害効力が野生型ＶＥＧＦ１６４よりも低下（ＩＣ５０値の増加）したことを示している。また、ヘパリン結合活性の大部分を保持する変異体（変異体Ｋ２６Ａ）は、ＶＥＧＦ１６５／Ｎｐ−１結合阻害効力の低下も最小（変種間で最低のＩＣ５０）であり、ＶＥＧＦ１６４によるヘパリン結合活性とＮｐ−１結合に対する親和性に正の相関があることを示唆している。
【実施例４】
【０２９９】
ＶＥＧＦの硝子体内注射、及びアクリジンオレンジ白血球蛍光光度分析
ＶＥＧＦヘパリン結合ドメインは、この向上効果の一因である。組み換えＶＥＧＦ１６４変異体が網膜内皮との白血球接着を誘発する効力について試験した。
【０３００】
等モル濃度の精製滅菌ＶＥＧＦ変種をラットに硝子体内投与し、網膜中の白血球蓄積を１、２又は３日後にインビボでの白血球蛍光光度分析によって分析した。図５．６Ａに示すように、網膜微小血管系においてＶＥＧＦ１６４によって誘導された白血球停滞は、注射後４８時間でピークに達し（５２．６±８．３白血球／ｍｍ２網膜表面積）、ＶＥＧＦ１２０によって誘導される白血球停滞（１７．７±２．７白血球／ｍｍ２）の約３倍であった。ＶＥＧＦ１６４対照と比較して、これらの知見は、白血球動員が特異的であり、活性ＶＥＧＦによって直接引き起こされたことを示している。これらのデータは、ＶＥＧＦ１６４がＶＥＧＦ１２０の１．９倍の白血球停滞を誘導した以前の試験結果に類似している。
【０３０１】
不活性化ＶＥＧＦ１６４、ＶＥＧＦ１６４、ＶＥＧＦ１２０及び種々のＶＥＧＦ１６４変異体変種の５μＬ  ＰＢＳ溶液２ｐｍｏｌ又は２０ｐｍｏｌの硝子体内注射を、３３ゲージ針を麻酔下のラットの硝子体に挿入することによって１回実施した。投与量は、ＶＥＧＦ１６５の硝子体内注射後の網膜脈管構造における白血球停滞を記載した既報に基づいて決定した。体重２００−２２５ｇのオスのロングエバンスラットをこの実験に使用した。挿入及び注入を、手術用顕微鏡下で網膜を直接観察しながら実施した。硝子体注射の２４、４８及び７２時間後に、網膜中の白血球動力学をアクリジンオレンジデジタル蛍光光度分析（ＡＯＤＦ）によって試験した。（角膜、水晶体、硝子体及び網膜からなる）中間透光体は、極めて透明なので、網膜の微小循環をＡＯＤＦを用いて非侵襲的に観察することができる。アクリジンオレンジの静脈内注射によって、白血球及び内皮細胞は、分子と二本鎖核酸の非共有結合による蛍光を発する。走査レーザー検眼鏡（ＳＬＯ：Ｒｏｄｅｎｓｔｏｃｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いると、血管内の網膜白血球をインビボで可視化することができる。各白血球は、網膜血管中を移動する単一の蛍光性ドットとして認識される。毛細血管中の個々の白血球の空間的及び時間的動力学を解析することができた。生理条件においては、一部の白血球は、毛細血管を通過し、過渡的に詰まる。同じ位置に数分間留まる白血球は、白血球−内皮相互作用の結果として内皮に粘着し得る。注射後から３０分後に、体内に注射したアクリジンオレンジが洗い出され、毛細血管床中に静止した白血球が、もし存在すれば、白色の静止したドットとして観測され得る。
【０３０２】
各時点及びＡＯＤＦの直前において、各ラットに再度麻酔をかけ、瞳孔を１％トロピカミドによって拡張させて、白血球の動力学を観察した。アクリジンオレンジ（Ｓｉｇｍａ，  Ｉｎｃ．）を無菌食塩水（１．０ｍｇ／ｍＬ）に溶解させ、３ｍｇ／ｋｇを尾静脈カテーテルを介して１ｍＬ／分の速度で注射した。アルゴン青色レーザーを照明源として用い、標準フルオレセイン血管造影フィルターを用いたＳＬＯによって４０度視野設定で眼底を１分間観察した。３０分後、眼底を再度観察して、網膜白血球停滞を評価した。画像をデジタルビデオテープに３０フレーム／秒の速度で記録した。ビデオ画像を実時間（３０フレーム／秒）で６４０×４８０ピクセルに２５６段階の強度分解能で取り込んだコンピュータによって、記録画像を解析した。網膜白血球停滞を評価するために、半径５ディスク径（ｄｉｓｋ  ｄｉａｍｅｔｅｒ）の視神経円板周囲の観察域を、隣接する主要な網膜血管が境界を成す多角形を描くことによって明確にした。面積をピクセル単位で測定し、蛍光性ドットとして認識された静的な白血球の数を観察領域の面積で除算することによって、捕捉された白血球の密度を計算した。白血球は、その位置が３分間変化しない場合に、静的とみなした。白血球密度を８つの乳頭周囲観察域において計算し、８個の密度値を平均して平均密度を得た。
【０３０３】
統計解析
全部の値を平均＋／−ＳＥで表した。２つの群を比較するときには独立スチューデントｔ検定を統計解析に使用した。３つ以上の群を比較するときには事後の（ｐｏｓｔ  ｈｏｃ）比較検定によってデータを解析した。差は、Ｐ値が＜０．０５であるときに統計的に有意とみなした。
【０３０４】
ＶＥＧＦの硝子体内注射、及びアクリジンオレンジ白血球蛍光光度分析
ＶＥＧＦそのアイソフォーム及び変種の白血球動員活性を上記アクリジンオレンジ白血球蛍光光度分析によって分析した。白血球停滞に対するＶＥＧＦ変種の効果の結果を図１３及び１４に示す。
【０３０５】
図１３は、白血球停滞及びアクリジンオレンジを誘導するＶＥＧＦ注射後のラット網膜の走査レーザー検眼鏡（ＳＬＯ）画像である。ＶＥＧＦ１６４、不活性化ＶＥＧＦ１６４、ＶＥＧＦ１２０、変異体Ｒ１４／Ｒ４９Ａ及び変異体Ｒ１３／Ｒ１４／Ｒ４９Ａの画像を含めて５つの画像を図１３に示す。画像上の明るいドットが白血球である。野生型ＶＥＧＦ１６４は多数のドットを示すが、変異体Ｒ１４／Ｒ４９Ａ及び変異体Ｒ１３／Ｒ１４／Ｒ４９Ａははるかに少ない。画像によれば、ＶＥＧＦ１６４のヘパリン結合ドメイン変異体は、網膜における白血球停滞を誘発する活性が大きく低下した。
【０３０６】
図１４は、ＶＥＧＦ１６４及びその変異体による白血球停滞の調節の定量結果を示す図である。縦軸は、ＳＬＯ画像からピクセル単位で測定した面積に換算した白血球密度によって測定した白血球停滞である。各ＶＥＧＦアイソフォーム及び変種のＳＬＯ画像を２４、４８及び７２時間に測定した。グラフによれば、ヘパリン結合ドメイン変異体は、網膜における白血球停滞の誘導能力がかなり低い。
【０３０７】
図１３及び１４は、ＶＥＧＦ野生型及び変異体変種の硝子体内注射後のラット網膜脈管構造への白血球動員を示す。（Ａ）精製ピキア由来タンパク質２ｐｍｏｌの硝子体内注射後の白血球動力学の時間的経過。投与量は、ＶＥＧＦ注射後の網膜における白血球停滞を記載した既報に基づいて決定した（Ｍｉｙａｍｏｔｏ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，．  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ，  （２０００）．  １５６（５）：ｐ．１７３３−９）。ＶＥＧＦ１６４を１０分間煮沸して不活性化し、対照とした。走査レーザー検眼鏡法（ＳＬＯ）の３０分前にアクリジンオレンジを静脈内に注射して白血球を標識した。網膜白血球停滞を評価するために、視神経乳頭の縁部から５ディスク径の距離の８つの区域（各２００２ピクセル２）内の蛍光性ドット数を数えた。これらの数値を、１ピクセル２＝３．２２μｍ２の式を用いて、白血球／ｍｍ２に変換した。少なくとも６個の眼を各時点及びタンパク質（Ｎ≧６）について数えた。（Ｂ−Ｌ）ＶＥＧＦ  ２ｐｍｏｌ（Ｂ−Ｆ）及び２０ｐｍｏｌ（Ｇ−Ｋ）の硝子体内注射から４８時間の眼底の代表的なアクリジンオレンジ白血球蛍光光度分析（ＡＯＬＦ）画像。接着白血球は白色ドット（矢印）として現れる。２０ｐｍｏｌと２ｐｍｏｌを注射した眼では白血球停滞の増加は認められなかった。スケールバー（Ｋ）：５００μｍ。
【０３０８】
これに対し、ＶＥＧＦ１６４変異体Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ及びＲ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａは、網膜毛細血管床への白血球動員を引き起こすのに、ＶＥＧＦ１６４よりも徐々に有効でなくなった。二重変異体及び三重変異体の注射から４８時間後には、それぞれわずか３１．９±５．１白血球／ｍｍ２及び１３．１±１．６白血球／ｍｍ２しか計数されなかった（図１３、Ｅ及びＦ）。
【０３０９】
出願人は、白血球停滞に関する２種類の変異体の効力の減少が、ヘパリン結合性に関与する領域の変化と特異的に関連しているかどうかを検討した。したがって、結合試験によればリジン２６はヘパリン結合部位の一部ではないので、単一の変異体Ｋ２６Ａを対照として使用した。Ｋ２６Ａは、野生型の効力を２ｐｍｏｌ（５１±７．９白血球／ｍｍ２）の注射後４８時間保持した。これは、アルギニン１３、１４及び４９がＶＥＧＦ１６４の炎症誘発活性を媒介するのに重要な残基を構成していることを示唆している。眼底の定性分析によれば、タンパク質２０ｐｍｏｌを注射後の白血球浸潤は、２ｐｍｏｌよりも増加しなかったので、白血球停滞を誘導する変異体の能力が低下したことは、低投与量に起因するものではなかった（図１３Ｊ及びＫ）。
【０３１０】
網膜脈管構造に浸潤した血球を同定するために、体重の同じマウスにＶＥＧＦ１６４を硝子体内注射した後、ＦＩＴＣ標識コンカナバリンＡレクチン（ＣｏｎＡ）を２４時間潅流し、網膜脈管構造及び白血球を画像化した。
【０３１１】
この結果によれば、ヘパリン結合ドメインは、ＶＥＧＦ１６４の炎症誘発活性を与え、本明細書に記載のＶＥＧＦヘパリン結合ドメインの修飾は、ＶＥＧＦの白血球動員能力を低下させ、それによって炎症を抑制する。
【実施例５】
【０３１２】
ＨＵＶＥＣ細胞におけるＶＥＧＦ媒介性組織因子誘導アッセイ：
１．  細胞培養及びＲＮＡ単離
継代３以下のＨＵＶＥＣ細胞（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ、ｃａｔ＃  Ｃ−０１５−１０Ｃ）を１２ウェルプレート中の完全培地（Ｌｏｗ  Ｓｅｒｕｍ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｃａｔ＃  Ｓ−００３−１０を補充したＭｅｄｉｕｍ  ２００  Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ  ｃａｔ＃  ２００−５００）に密度３．０×１０５細胞／ウェルで蒔く。細胞を、加湿した組織培養インキュベーター中で３７℃及び５％ＣＯ２で終夜付着させる。翌朝、細胞を最少培地（Ｇｉｂｃｏ製１％ウシ胎児血清、ｃａｔ＃  １６０００−０３６を補充したＭｅｄｉｕｍ  ２００）で１回洗浄し、ＶＥＧＦで処理する前に、３７℃及び５％ＣＯ２の加湿した組織培養インキュベーター中でこの最少培地中で４時間培養する。
【０３１３】
組織培養フード中で無菌技術を用いて、管を標識し、ＶＥＧＦ１６４  １２．５ｎｇ／ｍＬ及び（Ｅｙｅｔｅｃｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＭＡで製造された）異なるＶＥＧＦ１６４変異体変種を含む種々の最少培地試料を調製する。各実験条件を、培地１ｍＬ／ウェル／処理を用いて３つ組（３個のウェル）で実施する。ＶＥＧＦを添加しない最少培地を負の対照として使用する。
【０３１４】
最少培地中での４時間のインキュベーションの最後に、ＨＵＶＥＣ細胞を、３７℃及び５％ＣＯ２の加湿した組織培養インキュベーター中で、ＶＥＧＦを含む最少培地で１時間処理する。次いで、細胞を移動させずにＰＢＳ  １ｍＬで軽く洗浄し、Ｑｉａｇｅｎ製ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット（ｃａｔ＃  ７４１０４）の溶解緩衝剤ＲＬＴ  ３５０μＬを細胞に添加する。細胞溶解物を、ヌクレアーゼを含まない清浄な微量遠心管に収集し、すぐに氷上に置き、製造プロトコルに従ってＲＮＡ単離に使用する。
【０３１５】
２．  組織因子発現の実時間ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）分析
ＨＵＶＥＣから単離したＲＮＡ試料を、製造者の手順に従って、ＤＮＡ−ｆｒｅｅ（商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ｃａｔ＃  １９０６）を用いてＤＮａｓｅで処理して、汚染ゲノムＤＮＡを除去する。生成した、ＤＮＡを含まないＲＮＡ  ３００ｎｇを、オリゴｄ（Ｔ）１６及び無作為プライマーと一緒にＴａｑＭａｎ逆転写試薬（ＡＢＩ、Ｃａｔ＃Ｎ８０８０２３４）を用いたｃＤＮＡ合成に総体積６０μＬで、製造者の手順に従って使用する。生成したｃＤＮＡと一緒に、２μＬを特異的プライマー及びＴａｑＭａｎ組織因子用プローブを用いた各ＴａｑＭａｎ分析に使用する。特異的プライマー及びＴａｑＭａｎＧＡＰＤＨ用プローブを用いた別個の反応を内部正規化対照として使用する。各ｃＤＮＡ試料を２つ組のＴａｑＭａｎ分析に供し、２つの結果の平均をその後の計算に使用する。ＴａｑＭａｎ分析の結果を、無処置（ＶＥＧＦ無し）ＨＵＶＥＣ  ＲＮＡ試料に対する組織因子発現の誘導倍率（ｆｏｌｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）として表す。
【０３１６】
ＨＵＶＥＣ（ヒトさい静脈内皮細胞）を用いた細胞系アッセイにおける組織因子（ＴＦ）遺伝子発現の誘導をモニタリングすることによって、ＶＥＧＦ及びその変種の活性を分析した。ＶＥＧＦは、その高親和性受容体ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２を介して、ＨＵＶＥＣにおいてＴＦ遺伝子の発現を誘導する。組織因子遺伝子は、第ＶＩＩ因子との結合による凝固カスケードの細胞開始剤（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｉｔｉａｔｏｒ）である。ＨＵＶＥＣ組織因子アッセイの結果を図７に示す。図７において、縦軸は、横軸に示したＶＥＧＦアイソフォーム及びＶＥＧＦ変種に起因する、ＨＵＶＥＣにおける組織因子遺伝子発現の誘導倍率である。組織因子発現の誘導倍率は、ＶＥＧＦアイソフォーム及びＶＥＧＦ変種の機能性と相関する。図７によれば、全ＶＥＧＦ変異体は、ＨＵＶＥＣ組織因子アッセイにおいて、十分機能的であり、野生型ＶＥＧＦ１６４に類似している。これらの結果は、本明細書に記載のヘパリン結合ドメインの修飾が、内皮細胞中でＴＦ発現を誘導する際に正常なＶＥＧＦの機能に影響しないことを示唆している。
【実施例６】
【０３１７】
インビトロ血管新生モデルにおけるＶＥＧＦ１６４エキソン７変異体の特性
ＶＥＧＦ１６４変異体が血管新生をインビトロで誘導する能力をラット大動脈輪器官培養モデルにおいて評価した。ラット大動脈輪は、微小血管を成長させ、分岐内皮管腔で構成されるネットワークを形成する。このアッセイは、血管新生が起こる環境を他のインビトロアッセイよりも正確に再現することが知られている。また、培養物を、外因の評価を可能にする明確な無血清増殖培地中に維持することができる。
【０３１８】
大動脈輪モデルにおいて血管新生に対するＶＥＧＦエキソン７変異体の効果を試験するために、大動脈の切片をコラーゲンに包埋し、ＶＥＧＦ１２０、ＶＥＧＦ１６４、Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ又はＲ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａの存在下又は非存在下で、無血清培地と一緒にインキュベートした。図１８及び１９は、ラット大動脈輪モデルにおける組み換えＶＥＧＦ１６４エキソン７変異体及び野生型アイソフォームの効力を示す。培養７日後、各群の輪は、主に輪の縁部から広がる分岐微小血管を生じ、細長い線維芽細胞様細胞によって包囲された（図１８）。血管のイソレクチンＢ染色によって、ＰＢＳ処理対照輪は、内因性増殖因子の放出によって誘導される、形のよい血管芽をほとんど生成しないことが判明した（図１８、左パネル）。等モル濃度のＶＥＧＦ１２０又はＶＥＧＦ１６４で処理すると、微小血管の全長がバックグラウンドレベルの３．５倍（ＶＥＧＦ１２０）及び４倍（ＶＥＧＦ１６４）に増加した（図１９）。同様に、Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ及びＲ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａは、高レベルの出芽を一貫して刺激した。総血管長を定量すると、ＰＢＳ処理輪の６倍（Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ）及び５．５倍（Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ）であった（図１９）。異なる群の輪を比較すると、出芽形態の差は肉眼では認められなかった。これらのデータは、ＶＥＧＦ１６４のヘパリン結合ドメインに導入した変異が大動脈輪アッセイにおいて微小血管の成長にネガティブな影響を及ぼさなかったことを示している。
【実施例７】
【０３１９】
変異体のヘパリン結合活性の測定（インビトロでの活性）
出願人は、ＶＥＧＦ変異体のヘパリン結合親和性を試験するスクリーニング方法としてヘパリン−セファロースクロマトグラフィーを使用した。ヘパリン−セファロースカラムに精製タンパク質２量体を充填し、洗浄し、結合したタンパク質を線形塩化ナトリウム勾配で溶出させた。次いで、タンパク質をカラムから溶出させるのに必要な塩の量を決定することによって、ヘパリンに対する相対親和性を評価した。
【０３２０】
ＶＥＧＦ１６４は、０．１Ｍ  ＮａＣｌの存在下でヘパリンカラムと完全に結合した（図２０）。ＶＥＧＦとヘパリンの結合は、そのヘパリン結合ドメインに位置する結合決定因子を介して起こった。というのは、この領域を欠くＶＥＧＦ１２０は、カラムに結合せず、通過画分及び洗浄画分中に存在したからである。また、ＶＥＧＦ５５は、ＶＥＧＦ１６４と類似したヘパリン結合挙動を示し、類似した溶出プロファイルが得られた。（これらのデータによって、ＶＥＧＦ１６４のヘパリン結合活性の全部がそのヘパリン結合ドメインによって媒介されることが確認される。）。ＶＥＧＦ１６４は、広範囲な塩勾配（０．５２Ｍ−０．９４Ｍ  ＮａＣｌ）にわたってカラムから溶出した。カラムからタンパク質の５０％を移動させるのに必要な溶出緩衝剤中の塩化ナトリウム濃度を、ヘパリン結合親和性の指標として用いた。
【０３２１】
図２０は、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む結合緩衝剤中のヘパリン−セファロースアフィニティーカラムにかけた精製タンパク質２量体（１０μｇ）を示す。流下物（ｆａｌｌ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を収集後、カラムを結合緩衝剤で洗浄した。結合タンパク質を１．５Ｍ塩化ナトリウム−ｔｒｉｓ緩衝剤までの線形塩勾配で１０ｍｌで溶出させ、画分１ｍｌを収集した。画分をトリクロロ酢酸で沈殿させ、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離させた。モノクローナルＶＥＧＦ抗体を用いてウエスタンブロット法を実施し、免疫陽性バンドを化学発光系によって可視化した。
【０３２２】
理論に拘泥するものではないが、カルボキシ末端ドメイン中の塩基性アミノ酸Ｌｙｓ３０、Ａｒｇ３５、Ａｒｇ３９及びＡｒｇ４９は、互いに近接して位置し、したがってＧＡＧ鎖のドッキング部位として潜在的に作用し得る。四重変異体Ｋ３０Ａ／Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａ／Ｒ４９Ａと三重変異体Ｋ３０Ａ／Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａは、類似した溶出プロファイルを示した。両方の場合において、かなりの量のタンパク質が、洗浄及び初期溶出画分中に存在し、第２の画分はカラムにより堅固に結合し、約０．４６Ｍで溶出した（図２０）。このばらつきは、タンパク質が部分的に分解したこと、及びこの領域における変異がタンパク質を分解又は誤った折り畳みに対してより感受性にし得ることを示唆している。
【０３２３】
二重及び三重変異体で観察されたヘパリン結合挙動に対する単一変異体の相対寄与度を求めるために、単一変異体Ｋ３０Ａの結合を検討した。この変異体と野生型ＶＥＧＦ１６４の間で、溶出特性に有意差は認められなかった。
【０３２４】
Ａｒｇ４６及びＡｒｇ４９は、カルボキシ末端ドメインにおける二本鎖逆平行β−シート構造の一部である塩基性クラスターを形成する。これらの残基のターゲティングによって、図２０に示すように、タンパク質の結合能がわずかに減少した。この変異体の５０％をヘパリンカラムから移動させるのに必要なＮａＣｌ濃度は約０．６４Ｍであった。ヘパリン結合性は、さらに、二重変異体Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａでも損なわれた（０．５２Ｍ  ＮａＣｌ）。Ａｒｇ１３及びＡｒｇ１４は、Ａｒｇ４６、Ａｒｇ４９及びこれらの２種類の変異体の組合せ（Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４６Ａ／Ｒ４９Ａ）に隣接する乱雑で不明確なループ領域を形成し、ヘパリン結合性をほぼ完全に破壊する。両方の変種は、カラムに結合し、ＶＥＧＦ１６４（０．７６Ｍ）よりもかなり低い比較的狭い範囲の塩濃度にわたって溶出した。二重変異体Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａは０．５２Ｍに明確に減少し、三重変異体Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａではより大きな減少が観察された（０．４Ｍ）。これらの結果は、Ａｒｇ１３、Ａｒｇ１４、Ａｒｇ４６及びＡｒｇ４９を含む領域にヘパリン結合性部位が存在することを示している。
【０３２５】
これらの観察結果をさらに検討するために、ＶＥＧＦ１６４及び変異体Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ及びＲ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａを同じアッセイにおいてわずかに異なる実験条件下で、結合緩衝剤中の塩濃度（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）及び１画分当たりのＮａＣｌ濃度増分を増加させて、再度試験した。これらの条件下で、ＶＥＧＦ１６４はカラムに結合し、約０．８２Ｍ  ＮａＣｌで溶出し（図２２）、以前の実験と一致した。
【０３２６】
図２１は、ＶＥＧＦ１６４野生型及び選択変異体の生理学的塩濃度におけるヘパリン結合挙動を示す。精製タンパク質２量体（１０μｇ）を、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む結合緩衝剤中のヘパリン−セファロースアフィニティーカラムにかけた。流下物を収集後、カラムを結合緩衝剤で洗浄した。結合タンパク質を１．５Ｍ塩化ナトリウム−ｔｒｉｓ緩衝剤までの線形塩勾配で１０ｍｌで溶出させ、画分１ｍｌを収集した。画分をトリクロロ酢酸で沈殿させ、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離させた。モノクローナルＶＥＧＦ抗体を用いてウエスタンブロット法を実施し、免疫陽性バンドを化学発光系によって可視化した。
【０３２７】
変異体Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａは、生理学的塩濃度においてヘパリン−セファロースカラムに結合する能力を失った。これは、以前の実験で認められた結合活性が、相互作用への非特異的静電気的寄与のためであり得ることを示唆している。二重変異体Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａの分析によれば、ヘパリン結合性が損なわれ、タンパク質の大多数が通過画分及び洗浄画分中に存在した。しかし、タンパク質の一部はカラムに結合し、０．１５Ｍから０．６Ｍで徐々に溶出した。
【実施例８】
【０３２８】
可溶性ヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）は、ＶＥＧＦ１６４によって誘導された白血球停滞を阻害する。
【０３２９】
ＶＥＧＦ  Ｃ末端ドメインは、ＶＥＧＦ１６４の炎症誘発活性を直接的又は間接的に媒介し得る。この領域自体がこの効果を誘導し得るかどうかを調べるために、ＶＥＧＦ１６４のヘパリン結合ドメインを酵母細胞中で組み換え断片（ＨＢＤ）として発現させ、ラットに注射した。図２２Ａに示すように、精製ペプチド２、１０又は５０ｐｍｏｌの硝子体内注射によって、白血球停滞は、対照レベルよりもさほど増加しなかった（７．６±２．１白血球／ｍｍ２）。これらの結果は、ＶＥＧＦヘパリン結合ドメインが、その炎症誘発能力をＮ末端受容体結合ドメインと無関係に発揮することができず、完全長タンパク質の形でのみ発揮し得ることを示唆している。
【０３３０】
可溶性ＨＢＤは、ＶＥＧＦ１６４で認められた白血球停滞を誘導する能力を欠くので（白血球停滞表現型を生じない。）、ＶＥＧＦによって誘導された網膜白血球停滞を阻止し得るかもしれない。この可能性を検討するために、組み換えＨＢＤ  ２、１０及び５０ｐｍｏｌを、２回の注射の間に針を抜く必要がない注射遅延技術によって、ＶＥＧＦ１６４の２分前に硝子体内注射した。
【０３３１】
ＨＢＤは、ＶＥＧＦによって誘導される、網膜微小血管系への白血球接着を用量依存的に強力に阻害することが判明した（図２２Ａ及びＣ−Ｅ）。ＶＥＧＦ２量体（２ｐｍｏｌ）の２５倍モル過剰のＨＢＤモノマー（５０ｐｍｏｌ）は、ＶＥＧＦによって誘導される白血球停滞を顕著に減少させた（８．８±２．１３白血球／ｍｍ２）。このレベルは、不活性化ＶＥＧＦ１６４注射後の観測レベル（７．６±２．１白血球／ｍｍ２）に匹敵した。したがって、一実施形態においては、ＶＥＧＦヘパリン結合ドメインは、眼におけるＶＥＧＦ１６４活性を妨害することによってインビボで抗炎症薬として作用する。
【０３３２】
出願人は、可溶性ＨＢＤがＶＥＧＦ１６４によって誘導される白血球動員を阻止する機序を検討した。硝子体内注射後に、ＨＢＤは、ＶＥＧＦ同様、硝子体液及び神経細胞外顆粒層（ＯＮＬ）層に拡散し、網膜血管に達する。ＨＢＤが硝子体中でＶＥＧＦに非特異的に会合し、それによってＶＥＧＦが受容体と相互作用することができなくなる可能性を排除することはできない。理論に拘泥するものではないが、出願人は、ヘパラン硫酸プロテオグリカン及び／又はニューロピリン−１との結合に対してＨＢＤとＶＥＧＦ１６４が競合して妨害が生じ、それによって網膜内皮細胞上のＶＥＧＦの潜在的ドッキング部位がブロックされたと考えている。
【０３３３】
出願人は、インビトロ競合結合アッセイにおいて固定化ニューロピリン−１並びにＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２に対する結合を１２５Ｉ−ＶＥＧＦ１６５と競合するＨＢＤの能力を求めた。ＶＥＧＦのニューロピリン−１結合活性は、ヘパリン結合ドメインによって付与される。実際、ＨＢＤは、固定化ニューロピリン−１から１２５Ｉ−ＶＥＧＦ１６５を完全に移動させることができ、最大抑制濃度の半分（ＩＣ５０）は２８．５６±４．５ｎＭであった（図２４、上部パネル）。ニューロピリン−１に対する２量体ＶＥＧＦ１６４の競合結合は約２３０倍強力であった。
【０３３４】
ＨＢＤは、１μＭもの高濃度でもＶＥＧＦＲ−１にさほど結合しなかった（図２４、中間パネル）。ＨＢＤは、極めて高濃度においてＶＥＧＦＲ−２との結合についてＶＥＧＦと競合することができた（図２４、下部パネル）。ＨＢＤが示す競合的挙動は、同じ結合部位に対する競合ではなく、受容体との非特異的会合によるものと考えられる。このインビトロ分析によれば、組み換えＨＢＤは、インビボで使用される濃度においては、ニューロピリン−１との結合に対してＶＥＧＦ１６４と競合するが、ＶＥＧＦＲ−１又はＶＥＧＦＲ−２とは競合しない。
【０３３５】
出願人は、組み換えＨＢＤが、眼において低酸素によって誘導されるＶＥＧＦ１６４アイソフォーム発現の増加によって引き起こされる白血球動員を抑制することができるかどうかに関して、マウスＯＩＲモデルにおける白血球停滞に対するＨＢＤの効果を検討した（Ｉｓｈｉｄａ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，  ２００３．  １９８（３）：ｐ．４８３−９）。Ｐ１４における白血球接着は、野生型マウスでは増加したが、酸素誘導性網膜症（ＯＩＲ）モデルのＶＥＧＦ１２０／１８８マウスにおいては増加しなかった。このモデルにおいて白血球停滞に対する可溶性ＨＢＤの効果を試験するために、野生型マウスの子をＰ１２に酸素チャンバから取り出し、ペプチド２ｎｍｏｌをＰ１２及びＰ１３日（低酸素期）に腹腔内注射した。また、２つの対照群に、抗ＶＥＧＦ中和抗体５ｍｇ／ｋｇ又はヤギＩｇＧ対照５ｍｇ／ｋｇをＰ１２及びＰ１３に投与した。全マウスの網膜血管内側の接着白血球を可視化し、最初の注射後４８時間のＰ１４において計数した。
【０３３６】
図２３に要約したように、非ＯＩＲ対照群のＰ１４マウスは、網膜において低レベルの白血球停滞を示した。白血球数は、ヤギ抗ＶＥＧＦ中和抗体に対して、非免疫ヤギから得られたＩｇＧを注射したＯＩＲマウスにおいてアイソタイプ対照として４．５倍増加した。これらのレベルは、注射していないＯＩＲマウスから得られたレベルと類似しており、対照抗体が白血球挙動に影響を及ぼさないことを示している。ＯＩＲマウスに組み換えＨＢＤを注射し、４８時間後に分析すると、ＯＩＲ対照よりも白血球接着が減少した。中和抗体を注射することによって、全ＶＥＧＦアイソフォームが遮断され、白血球動員がさらに阻害された。
【０３３７】
これらのデータは、虚血によって誘導されたＶＥＧＦ発現が、ＯＩＲマウスの眼において観察される炎症反応の原因であることを示唆している。また、これらのデータは、ＶＥＧＦヘパリン結合ドメインが、この新血管新生動物モデルにおける炎症反応にかなり寄与している間接的な証拠である。白血球停滞及びそれに続く病理学的血管成長は、ＶＥＧＦ１２０／１８８マウスでは認められなかったので、ＨＢＤによる白血球停滞の抑制が、病理的新血管新生（網膜前の血管叢（ｔｕｆｔ）形成）も減少させるかどうかを検討することは興味深い。
【実施例９】
【０３３８】
ＶＥＧＦ１６４変種による生物学的基質との類似の結合
出願人は、生物学的基質とのＨＢＤ変異体の結合能力を、細胞膜と一体化したプロテオヘパラン硫酸（ＨＳＰＧ）を用いて調べた。ヘパリンではなくＨＳＰＧは、インビボでの細胞表面及び細胞外基質上のＶＥＧＦの天然の結合パートナーである。
【０３３９】
ＶＥＧＦ変種と細胞表面の結合及び眼の断面：ブタの大動脈内皮（ＰＡＥ）細胞を１２ウェル皿に３．０×１０５細胞／ウェルで蒔き、２４時間培養した。細胞を結合緩衝剤（０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２Ｋ培地、ｐＨ７．５、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、ＣＡ）で１回洗浄した。精製マウスＶＥＧＦ変種（７．１４ｎＭ）と細胞表面及び基質との結合を、結合緩衝剤中で３７℃及び５％ＣＯ２で３０分間実施した。結合時間後、結合していないＶＥＧＦを除去し、細胞を結合緩衝剤で３回洗浄した後、結合したＶＥＧＦを細胞表面及び基質上のヘパラン硫酸プロテオグリカンから酵素的に分離させた。そのために、ヘパリナーゼＩ及びＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）を、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＣａＣｌ２及び０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解させることによって、各実験の直前に調製した。次いで、ヘパリナーゼ混合物を細胞に最終濃度０．５μ／ｍｌで添加し、細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。各ウェルの培地をピペットによって収集し、細胞を結合緩衝剤で１回洗浄した。ヘパリナーゼ処理及び最終洗浄後の培地中のＶＥＧＦ濃度を、マウスＶＥＧＦ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）を用いて製造者の指示に従って求めた。統計解析に十分なデータを得るために、各条件を２つ組の試料を用いて試験し、実験を３回繰り返した。
【０３４０】
ＶＥＧＦ変種とマウスの眼の切片との結合：２ヵ月齢Ｃ５７ｂｌ／６メスマウスの眼（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭＡ）を収集し、４％ＰＦＡ中の揺動機（ｒｏｃｋｅｒ）に４０℃で終夜固定した。次いで、眼をＰＢＳで３時間洗浄し、１０％スクロースのＰＢＳ溶液中に４時間置いた。次いで、眼を３０％スクロース溶液中に４０℃で終夜置いた。翌日、眼をＯＣＴ包埋化合物中に置き、ドライアイスで凍結させ、切断するまで−８００℃で保存した。スライドを解凍し、切片にパップペンで円を描き、１×ＰＢＳで５分間再水和した。次いで、切片をＶＥＧＦ１６４、ＶＥＧＦ１２０、Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ又はＲ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａの１０μＭ中で４０℃で終夜インキュベートした。試料をＰＢＳで１回５分間洗浄した後、ブロッキング溶液（１０％ヤギ血清、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の１×ＰＢＳ溶液）中で１５分間インキュベートした。次いで、試料をヤギ抗ＶＥＧＦ抗体（１：１００、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ）中で１時間インキュベートし、１×ＰＢＳで３回各５分間洗浄した。次いで、試料をロバ抗ヤギＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ６３３二次（１：５００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ＣＡ）で４５分間プローブし、１×ＰＢＳで３回各５分間洗浄した。切片を、ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ）を用いてマウントし、カバーガラスをかけ、マニキュア液（ｎａｉｌ  ｐｏｌｉｓｈ）で密封した。次いで、切片をデジタルＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｔｓｕ、Ｊａｐａｎ）を備えた落射蛍光顕微鏡（ＤＭＲＡ２、Ｌｅｉｃａ、Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって画像化した。全画像を同じ露出時間で収集した。各ＶＥＧＦ変種と眼の切片との結合を各々２個の別々の切片を用いて２回繰り返した。
【０３４１】
図２５は、ＶＥＧＦ１２０、ＶＥＧＦ１６４及びＨＢＤ変異体とＰＡＥ細胞の結合を比較したものである。細胞表面ＶＥＧＦ受容体がない、ブタの大動脈内皮細胞（３×１０５細胞）をＶＥＧＦ変種（７．１４ｎＭ）と一緒にインキュベートし、結合したＶＥＧＦを細胞表面及び基質からヘパリナーゼ消化によって遊離させた（ヘパリナーゼＩ／ＩＩＩ消化物）。両方の消化物及び洗浄画分中のＶＥＧＦ量を、マウスＶＥＧＦ特異的ＥＬＩＳＡによって測定した。ＶＥＧＦ１２０又はヘパリン結合性欠損変異体Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ及びＲ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａよりもかなり多いＶＥＧＦ１６４が、ＰＡＥ細胞と結合した（＊Ｐ＜０．０５）。データは３つの独立した実験の平均＋ＳＤである。
【０３４２】
図２６は、ＶＥＧＦ変種とマウスの眼の生物学的基質の結合を比較したものである。ＶＥＧＦ１６４は、網膜中のブルッフ膜と内境界膜（矢印）の両方と結合可能であった。網膜色素上皮層（ＲＰＥ）、脈絡膜及び強膜もＶＥＧＦ１６４による結合を示した（これらの層は、ＶＥＧＦ対照において検出された幾らかの内因性ＶＥＧＦを含むことに注意されたい。）。ＲＰＥ及びＲＧＣ細胞では低レベルの内因性ＶＥＧＦ発現しか検出されなかったが、ＶＥＧＦ１２０で処理した切片においては、ブルッフ膜も内境界膜（アステリスク）も標識されなかった。変異体Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ又はＲ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａで処理した切片は、ブルッフ膜とも内境界膜とも結合しなかった。内因性ＶＥＧＦを検出するための抗ＶＥＧＦ抗体のみによる眼の切片の染色は、ＲＰＥ及びＲＧＣ層を染色するが、二次抗体のみによる眼の切片の染色では免疫反応性を示さない。画像化目的に適切な網膜層を決定するために、核のＤＡＰＩ染色をすべての場合においてマーカーとして使用した。スケールバーは１０μｍである。
【０３４３】
ヘパリナーゼを用いてＰＡＥ細胞の表面から結合ＶＥＧＦを遊離させることによって、出願人は、ＶＥＧＦ１６４と細胞の結合がＶＥＧＦ１２０よりもかなり多いことを認め、ＶＥＧＦ１６４と細胞表面及び基質上のＨＳＰＧの結合を確認した（図２５参照）。Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ及びＲ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａは、ＶＥＧＦ１２０と類似した細胞結合性を示し、これらのヘパリン結合性欠損変異体がヘパラン硫酸に対する結合親和性を失ったことが示唆された。ＨＢＤ変異体と生物学的基質の結合性をマウスの眼の断面においてさらに評価した。細胞結合実験と同様に、ＶＥＧＦ１２０ではなくＶＥＧＦ１６４が、眼のヘパラン硫酸が豊富なブルッフ膜及び内境界膜（ＩＬＭ）と顕著な結合性を示した（図２６参照）。Ｒ１４Ａ／Ｒ４９ＡとＲ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａはどちらもこれらの領域との結合性を示さず、ＶＥＧＦ１６４のヘパリン結合ドメイン内の変異アルギニン残基が、生物学的基質中に存在するヘパラン硫酸との結合に重要であることを確認した。
【０３４４】
参照による組み込み
本明細書に参照した特許及び科学文献は、当業者に利用可能である知識を確立するものである。本明細書で引用する、発行された全特許、特許出願、外国出願公報、及びＧｅｎＢａｎｋデータベース配列を含めて刊行された参考文献を、各々を具体的かつ個々に参照によりその全体を組み込むように指定した場合と同じ程度に参照により本明細書に組み込む。
【０３４５】
均等物
当業者は、本明細書に具体的に記載した具体的実施形態の多数の均等物をせいぜい定常的な実験法によって認識し、又は確認することができる。かかる均等物は以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０３４６】
【図１】ＶＥＧＦ１６５のヘパリン結合ドメインの溶液構造の画像である。アミノ酸残基Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ４９を淡灰色で示す。これらのアミノ酸残基は、本発明者らの変異誘発分析によって定義して、最適ヘパリン結合活性に重要である。
【図２Ａ】ＶＥＧＦ１６５のヘパリン結合ドメインの溶液構造の２つの画像である。全塩基性アミノ酸残基を淡灰色で示す。図２（Ｂ）は、ＶＥＧＦ１６５のヘパリン結合ドメインが１８０度回転した図２（Ａ）の図である。
【図２Ｂ】ＶＥＧＦ１６５のヘパリン結合ドメインの溶液構造の２つの画像である。全塩基性アミノ酸残基を淡灰色で示す。図２（Ｂ）は、ＶＥＧＦ１６５のヘパリン結合ドメインが１８０度回転した図２（Ａ）の図である。
【図３Ａ】ＶＥＧＦ１６５ヘパリン結合ドメイン断片（ＶＥＧＦ５５）及びその変種の構造図を示すイメージである。図３（Ａ）は、ＶＥＧＦ１６５ヘパリン結合ドメインの一次アミノ酸配列（残基１−５５）である。
【図３Ｂ】図３（Ｂ）は、天然ＶＥＧＦ５５のリボンダイアグラム（左）、表面トポロジーモデル（中央）、及び垂直軸回りに１８０度回転させた（中央）の表面図（右）である。
【図３Ｃ】図３（Ｃ−Ｌ）は、ヘパリン結合ドメイン断片のリボンダイアグラム（左）及び表面トポロジーモデル（右）である。変異誘発について選択されたリジン及びアルギニン残基を標識し、強調表示し（暗い領域）、リボンダイアグラムにおけるその側鎖を描いた。アミノ酸の付番は、（Ａ）に示した一次配列に基づく。個々の断片を文字標識した。個々の断片は、以下のＶＥＧＦ１６４変異体：（Ｃ）Ｋ３０Ａ、（Ｄ）Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａ、（Ｅ）Ｋ３０Ａ／Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａ、（Ｆ）Ｋ３０Ａ／Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａ／Ｒ４９Ａ、（Ｇ）Ｋ２６Ａ、（Ｈ）Ｒ４６Ａ／Ｒ４９Ａ、（Ｉ）Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ、（Ｊ）Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ、（Ｋ）Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ、Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４６Ａ／Ｒ４９Ａに対応する。各図は、Ｐｙｍｏｌ（ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＮＭＲ溶液構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋコード：１ＫＭＸ）から作製された。
【図３Ｄ】図３（Ｃ−Ｌ）は、ヘパリン結合ドメイン断片のリボンダイアグラム（左）及び表面トポロジーモデル（右）である。変異誘発について選択されたリジン及びアルギニン残基を標識し、強調表示し（暗い領域）、リボンダイアグラムにおけるその側鎖を描いた。アミノ酸の付番は、（Ａ）に示した一次配列に基づく。個々の断片を文字標識した。個々の断片は、以下のＶＥＧＦ１６４変異体：（Ｃ）Ｋ３０Ａ、（Ｄ）Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａ、（Ｅ）Ｋ３０Ａ／Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａ、（Ｆ）Ｋ３０Ａ／Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａ／Ｒ４９Ａ、（Ｇ）Ｋ２６Ａ、（Ｈ）Ｒ４６Ａ／Ｒ４９Ａ、（Ｉ）Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ、（Ｊ）Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ、（Ｋ）Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ、Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４６Ａ／Ｒ４９Ａに対応する。各図は、Ｐｙｍｏｌ（ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＮＭＲ溶液構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋコード：１ＫＭＸ）から作製された。
【図３Ｅ】図３（Ｃ−Ｌ）は、ヘパリン結合ドメイン断片のリボンダイアグラム（左）及び表面トポロジーモデル（右）である。変異誘発について選択されたリジン及びアルギニン残基を標識し、強調表示し（暗い領域）、リボンダイアグラムにおけるその側鎖を描いた。アミノ酸の付番は、（Ａ）に示した一次配列に基づく。個々の断片を文字標識した。個々の断片は、以下のＶＥＧＦ１６４変異体：（Ｃ）Ｋ３０Ａ、（Ｄ）Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａ、（Ｅ）Ｋ３０Ａ／Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａ、（Ｆ）Ｋ３０Ａ／Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａ／Ｒ４９Ａ、（Ｇ）Ｋ２６Ａ、（Ｈ）Ｒ４６Ａ／Ｒ４９Ａ、（Ｉ）Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ、（Ｊ）Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ、（Ｋ）Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ、Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４６Ａ／Ｒ４９Ａに対応する。各図は、Ｐｙｍｏｌ（ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＮＭＲ溶液構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋコード：１ＫＭＸ）から作製された。
【図３Ｆ】図３（Ｃ−Ｌ）は、ヘパリン結合ドメイン断片のリボンダイアグラム（左）及び表面トポロジーモデル（右）である。変異誘発について選択されたリジン及びアルギニン残基を標識し、強調表示し（暗い領域）、リボンダイアグラムにおけるその側鎖を描いた。アミノ酸の付番は、（Ａ）に示した一次配列に基づく。個々の断片を文字標識した。個々の断片は、以下のＶＥＧＦ１６４変異体：（Ｃ）Ｋ３０Ａ、（Ｄ）Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａ、（Ｅ）Ｋ３０Ａ／Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａ、（Ｆ）Ｋ３０Ａ／Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａ／Ｒ４９Ａ、（Ｇ）Ｋ２６Ａ、（Ｈ）Ｒ４６Ａ／Ｒ４９Ａ、（Ｉ）Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ、（Ｊ）Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ、（Ｋ）Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ、Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４６Ａ／Ｒ４９Ａに対応する。各図は、Ｐｙｍｏｌ（ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＮＭＲ溶液構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋコード：１ＫＭＸ）から作製された。
【図３Ｇ】図３（Ｃ−Ｌ）は、ヘパリン結合ドメイン断片のリボンダイアグラム（左）及び表面トポロジーモデル（右）である。変異誘発について選択されたリジン及びアルギニン残基を標識し、強調表示し（暗い領域）、リボンダイアグラムにおけるその側鎖を描いた。アミノ酸の付番は、（Ａ）に示した一次配列に基づく。個々の断片を文字標識した。個々の断片は、以下のＶＥＧＦ１６４変異体：（Ｃ）Ｋ３０Ａ、（Ｄ）Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａ、（Ｅ）Ｋ３０Ａ／Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａ、（Ｆ）Ｋ３０Ａ／Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａ／Ｒ４９Ａ、（Ｇ）Ｋ２６Ａ、（Ｈ）Ｒ４６Ａ／Ｒ４９Ａ、（Ｉ）Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ、（Ｊ）Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ、（Ｋ）Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ、Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４６Ａ／Ｒ４９Ａに対応する。各図は、Ｐｙｍｏｌ（ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＮＭＲ溶液構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋコード：１ＫＭＸ）から作製された。
【図３Ｈ】図３（Ｃ−Ｌ）は、ヘパリン結合ドメイン断片のリボンダイアグラム（左）及び表面トポロジーモデル（右）である。変異誘発について選択されたリジン及びアルギニン残基を標識し、強調表示し（暗い領域）、リボンダイアグラムにおけるその側鎖を描いた。アミノ酸の付番は、（Ａ）に示した一次配列に基づく。個々の断片を文字標識した。個々の断片は、以下のＶＥＧＦ１６４変異体：（Ｃ）Ｋ３０Ａ、（Ｄ）Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａ、（Ｅ）Ｋ３０Ａ／Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａ、（Ｆ）Ｋ３０Ａ／Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａ／Ｒ４９Ａ、（Ｇ）Ｋ２６Ａ、（Ｈ）Ｒ４６Ａ／Ｒ４９Ａ、（Ｉ）Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ、（Ｊ）Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ、（Ｋ）Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ、Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４６Ａ／Ｒ４９Ａに対応する。各図は、Ｐｙｍｏｌ（ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＮＭＲ溶液構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋコード：１ＫＭＸ）から作製された。
【図３Ｉ】図３（Ｃ−Ｌ）は、ヘパリン結合ドメイン断片のリボンダイアグラム（左）及び表面トポロジーモデル（右）である。変異誘発について選択されたリジン及びアルギニン残基を標識し、強調表示し（暗い領域）、リボンダイアグラムにおけるその側鎖を描いた。アミノ酸の付番は、（Ａ）に示した一次配列に基づく。個々の断片を文字標識した。個々の断片は、以下のＶＥＧＦ１６４変異体：（Ｃ）Ｋ３０Ａ、（Ｄ）Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａ、（Ｅ）Ｋ３０Ａ／Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａ、（Ｆ）Ｋ３０Ａ／Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａ／Ｒ４９Ａ、（Ｇ）Ｋ２６Ａ、（Ｈ）Ｒ４６Ａ／Ｒ４９Ａ、（Ｉ）Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ、（Ｊ）Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ、（Ｋ）Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ、Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４６Ａ／Ｒ４９Ａに対応する。各図は、Ｐｙｍｏｌ（ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＮＭＲ溶液構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋコード：１ＫＭＸ）から作製された。
【図３Ｊ】図３（Ｃ−Ｌ）は、ヘパリン結合ドメイン断片のリボンダイアグラム（左）及び表面トポロジーモデル（右）である。変異誘発について選択されたリジン及びアルギニン残基を標識し、強調表示し（暗い領域）、リボンダイアグラムにおけるその側鎖を描いた。アミノ酸の付番は、（Ａ）に示した一次配列に基づく。個々の断片を文字標識した。個々の断片は、以下のＶＥＧＦ１６４変異体：（Ｃ）Ｋ３０Ａ、（Ｄ）Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａ、（Ｅ）Ｋ３０Ａ／Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａ、（Ｆ）Ｋ３０Ａ／Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａ／Ｒ４９Ａ、（Ｇ）Ｋ２６Ａ、（Ｈ）Ｒ４６Ａ／Ｒ４９Ａ、（Ｉ）Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ、（Ｊ）Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ、（Ｋ）Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ、Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４６Ａ／Ｒ４９Ａに対応する。各図は、Ｐｙｍｏｌ（ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＮＭＲ溶液構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋコード：１ＫＭＸ）から作製された。
【図３Ｋ】図３（Ｃ−Ｌ）は、ヘパリン結合ドメイン断片のリボンダイアグラム（左）及び表面トポロジーモデル（右）である。変異誘発について選択されたリジン及びアルギニン残基を標識し、強調表示し（暗い領域）、リボンダイアグラムにおけるその側鎖を描いた。アミノ酸の付番は、（Ａ）に示した一次配列に基づく。個々の断片を文字標識した。個々の断片は、以下のＶＥＧＦ１６４変異体：（Ｃ）Ｋ３０Ａ、（Ｄ）Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａ、（Ｅ）Ｋ３０Ａ／Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａ、（Ｆ）Ｋ３０Ａ／Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａ／Ｒ４９Ａ、（Ｇ）Ｋ２６Ａ、（Ｈ）Ｒ４６Ａ／Ｒ４９Ａ、（Ｉ）Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ、（Ｊ）Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ、（Ｋ）Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ、Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４６Ａ／Ｒ４９Ａに対応する。各図は、Ｐｙｍｏｌ（ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＮＭＲ溶液構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋコード：１ＫＭＸ）から作製された。
【図３Ｌ】図３（Ｃ−Ｌ）は、ヘパリン結合ドメイン断片のリボンダイアグラム（左）及び表面トポロジーモデル（右）である。変異誘発について選択されたリジン及びアルギニン残基を標識し、強調表示し（暗い領域）、リボンダイアグラムにおけるその側鎖を描いた。アミノ酸の付番は、（Ａ）に示した一次配列に基づく。個々の断片を文字標識した。個々の断片は、以下のＶＥＧＦ１６４変異体：（Ｃ）Ｋ３０Ａ、（Ｄ）Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａ、（Ｅ）Ｋ３０Ａ／Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａ、（Ｆ）Ｋ３０Ａ／Ｒ３５Ａ／Ｒ３９Ａ／Ｒ４９Ａ、（Ｇ）Ｋ２６Ａ、（Ｈ）Ｒ４６Ａ／Ｒ４９Ａ、（Ｉ）Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ、（Ｊ）Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ、（Ｋ）Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ、Ｒ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４６Ａ／Ｒ４９Ａに対応する。各図は、Ｐｙｍｏｌ（ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＮＭＲ溶液構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋコード：１ＫＭＸ）から作製された。
【図４】直接的ヘパリン結合アッセイに基づくＶＥＧＦ変種のヘパリン結合親和性を示すグラフである。結果は、アミノ酸残基Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ４９が、ＶＥＧＦ１６４ヘパリン結合ドメインのヘパリン結合活性に重要であることを示している。
【図５】種々のＶＥＧＦ変種によるＨＵＶＥ細胞における組織因子（ＴＦ）ｍＲＮＡの上方制御のＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ（登録商標）；Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．）分析の結果を示すグラフである。グラフによれば、変異ＶＥＧＦ変種は、機能的に活性であり、ＴＦ発現の誘導において野生型ＶＥＧＦ１６４に匹敵する。
【図６】精製ＶＥＧＦ１６４変異体タンパク質が、質量、グリコシル化及びオリゴマー形成能力に関して、野生型ＶＥＧＦ１６４に類似していることを示す、タンパク質ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）の画像である。このＰＡＧＥ分析によって、全精製ＶＥＧＦ変異体変種（ｍｕｔａｎｔ  ｖａｒｉａｎｔ）が完全長ペプチドとして産生され、野生型ＶＥＧＦ１６４として処理されることが確認される。
【図７】ＨＵＶＥＣ組織因子アッセイの結果を示すグラフである。グラフによれば、全ＶＥＧＦ変異体は、ＨＵＶＥＣ組織因子アッセイにおいて十分機能し、野生型ＶＥＧＦ１６４に類似している。
【図８Ａ】野生型ＶＥＧＦ１６４並びに変異体Ｒ１４／Ｒ４９Ａ及びＲ１３／Ｒ１４／Ｒ４９Ａの円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルの２つの比較結果を示すグラフである。図８（Ａ）は、ＷＴ  ＶＥＧＦ１６４（実線）と変異体Ｒ１４／Ｒ４９Ａ（破線）のＣＤスペクトルである。図８（Ｂ）は、ＷＴ  ＶＥＧＦ１６４（実線）と変異体Ｒ１３／Ｒ１４／Ｒ４９Ａ（破線）のＣＤスペクトルである。ＶＥＧＦ変種のＣＤ分析によれば、ＶＥＧＦ変種の変異は、その二次構造にさほど影響を及ぼさず、天然ＶＥＧＦ１６４の二次構造に類似していた。
【図８Ｂ】野生型ＶＥＧＦ１６４並びに変異体Ｒ１４／Ｒ４９Ａ及びＲ１３／Ｒ１４／Ｒ４９Ａの円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルの２つの比較結果を示すグラフである。図８（Ａ）は、ＷＴ  ＶＥＧＦ１６４（実線）と変異体Ｒ１４／Ｒ４９Ａ（破線）のＣＤスペクトルである。図８（Ｂ）は、ＷＴ  ＶＥＧＦ１６４（実線）と変異体Ｒ１３／Ｒ１４／Ｒ４９Ａ（破線）のＣＤスペクトルである。ＶＥＧＦ変種のＣＤ分析によれば、ＶＥＧＦ変種の変異は、その二次構造にさほど影響を及ぼさず、天然ＶＥＧＦ１６４の二次構造に類似していた。
【図９】インビトロでのＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ受容体−２（ＫＤＲ）プレート結合アッセイの結果を示すグラフである。グラフによれば、ＶＥＧＦ１６４ヘパリン結合ドメイン変異体と野生型ＶＥＧＦ１６４によるＶＥＧＦ１６４／ＫＤＲ受容体結合の阻害効力は類似しており、したがって野生型ＶＥＧＦと変異ＶＥＧＦはＫＤＲ受容体に対して類似した結合親和性を有する。これによって、ヘパリン結合ドメインにおける変異誘発が、ＶＥＧＦ１６４のＫＤＲ結合部位に影響を及ぼさないことが確認された。
【図１０】インビトロでのＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ受容体−１（Ｆｌｔ−１）プレート結合アッセイの結果を示すグラフである。グラフによれば、ＶＥＧＦ１６４／Ｆｌｔ−１結合阻害能が低下し、したがって野生型ＶＥＧＦ１６４と比較して、ＶＥＧＦ１６４ヘパリン結合ドメイン変異体Ｒ１４／Ｒ４９Ａ及びＲ１３／Ｒ１４／Ｒ４９ＡによるＦｌｔ−１受容体結合親和性が低下している。この結果は、ヘパリン結合ドメインがＶＥＧＦ１６４によるＦｌｔ−１受容体の高親和性結合に関与していることを示唆している。
【図１１】インビトロでのＶＥＧＦ／ニューロピリン−１（Ｎｐ−１）受容体プレート結合アッセイの結果を示すグラフである。グラフによれば、ＶＥＧＦ１６４／Ｎｐ−１結合阻害効力が低下し、したがって全ＶＥＧＦ１６４ヘパリン結合ドメイン変異体変種によってＮｐ−１受容体との結合親和性が低下した。また、変異体Ｋ２６Ａは、ヘパリン結合活性の大部分を変異体Ｒ１４／Ｒ４９Ａ及び変異体Ｒ１３／Ｒ１４／Ｒ４９Ａよりも保持しているので、変異体変種のヘパリン結合活性は、Ｆｌｔ−１に対するその結合親和性と正の相関を示す。この結果は、ヘパリン結合ドメインがＶＥＧＦ１６４によるＮｐ−１受容体の高親和性結合に関与していることを示唆している。
【図１２】野生型と比較して、ＶＥＧＦ１６４ヘパリン結合ドメイン変異体によってＶＥＧＦ１６４／Ｎｐ−１結合阻害効力が低下（ＩＣ５０値の増加）したことを示すグラフである。
【図１３】白血球停滞を誘発するＶＥＧＦ注射後のラット網膜の走査レーザー検眼鏡（ＳＬＯ）画像である。画像によれば、ＶＥＧＦ１６４のヘパリン結合ドメイン変異体は、網膜における白血球停滞を誘発する活性が大きく低下した。この結果は、ヘパリン結合ドメインが、ＶＥＧＦ１６４の炎症誘発活性を与えることを示唆している。
【図１４】ＶＥＧＦ１６４及びその変異体による白血球停滞の調節の定量結果を示すグラフである。グラフによれば、ヘパリン結合ドメイン変異体は、網膜における白血球停滞の誘導能力がかなり低い。この結果は、ヘパリン結合ドメインが、網膜におけるＶＥＧＦ１６４の炎症誘発活性に重要であることを示唆している。
【図１５】選択的にスプライスされたＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ転写物に起因する種々のＶＥＧＦアイソフォームを示す図である。
【図１６Ａ】ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００３３６７（配列番号４７）に対応するヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のポリペプチド配列の概略図である。プロセス分泌（ｐｒｏｃｅｓｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）シグナル配列を、下線を引いたイタリックで示す。変異誘発されたヘパリン結合ドメイン配列を、下線を引いた太字（ｂｏｌｄｅｄ  ｔｙｐｅｆａｃｅ）で示す。
【図１６Ｂ】ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３７６（配列番号４８）に対応する、ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）をコードする核酸配列のヌクレオチド配列の概略図である。
【図１７】ＶＥＧＦエキソン７−８及びアラニン置換変異１−１４の概略図である。
【図１８】落射蛍光顕微鏡法（原倍率、１０×）によって記録された大動脈外植片の画像である（左パネル）。イソレクチンＢ−免疫蛍光によって、ＰＢＳ、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）由来のＶＥＧＦ１２０、ＶＥＧＦ１６４、Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ又はＲ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ（各４．４ｎＭ）に７日間曝露後のコラーゲン包埋大動脈輪から伸びる毛細血管様微小血管が確認される（右パネル）。
【図１９】大動脈外植片の微小血管成長の定量化を示すグラフである。調査した血管の全長を、７日目に得られた画像から求めた（ｎ＝４匹の動物から得られた輪の総数、＊Ｐ＜０．００１）。バーは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．；ポストホックボンフェローニ検定によるＡＮＯＶＡを表す。
【図２０】ＶＥＧＦ野生型及び変異体タンパク質のヘパリン結合特性を示す、タンパク質ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）の画像である。
【図２１】生理的食塩水濃度におけるＶＥＧＦ１６４野生型及び選択変異体のヘパリン結合挙動を示す、タンパク質ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）の画像である。
【図２２Ａ】可溶性ＨＢＤによる、ＶＥＧＦ１６４によって誘導された白血球停滞の阻害を示すグラフである。精製ＨＢＤを単体で、又はＶＥＧＦ１６４（２ｐｍｏｌ）注射の２分前に、総体積５μｌでラットに硝子体内注射した。白血球停滞をアクリジンオレンジ白血球蛍光光度分析及び走査レーザー検眼鏡法（ＳＬＯ）によって４８時間後に評価した。棒内の数字は、分析した眼の数（ｎ）である。独立スチューデントｔ検定を統計解析に使用した。差は、Ｐ＜０．０５の場合に統計的に有意とみなす。
【図２２Ｂ】網膜微小血管系上の接着白血球を白色ドットとして示した眼底のフルオレセイン血管造影画像である。スケールバー＝５００μｍ。
【図２２Ｃ】網膜微小血管系上の接着白血球を白色ドットとして示した眼底のフルオレセイン血管造影画像である。スケールバー＝５００μｍ。
【図２２Ｄ】網膜微小血管系上の接着白血球を白色ドットとして示した眼底のフルオレセイン血管造影画像である。スケールバー＝５００μｍ。
【図２２Ｅ】網膜微小血管系上の接着白血球を白色ドットとして示した眼底のフルオレセイン血管造影画像である。スケールバー＝５００μｍ。
【図２３】酸素誘導性網膜症マウスにおける組み換えＨＢＤによる網膜白血球停滞の抑制を示すグラフである。マウスをＰ７からＰ１２までまず７５％酸素に曝露し、次いでＰ１４まで通常の空気に曝露することによって、酸素誘導性網膜症（ＯＩＲ）を引き起こした。Ｐ１２及びＰ１３に静脈内注射を施した：全ヤギＩｇＧ対照（５ｍｇ／ｋｇ）、ヤギ抗マウスＶＥＧＦ中和抗体（５ｍｇ／ｋｇ）及び精製ＨＢＤ（２ｎｍｏｌ≒１３．３μｇ）。網膜血管内側の接着白血球を、Ｐ１４のマウスの子にＣｏｎ−Ａレクチンを潅流させて可視化し、顕微鏡で定量した。円柱内の数字は、分析した眼の数である。ＯＩＲマウスにおける網膜血管の総数は、高酸素期（ｈｙｐｅｒｏｘｉｃ  ｐｈａｓｅ）中に血管が退化するので、非ＯＩＲマウスよりも少ない。非ＯＩＲ対照群のＰ１４マウスは、網膜において低レベルの白血球停滞を示した。
【図２４】固定化ＶＥＧＦ受容体に対するＨＢＤとＶＥＧＦ１６４の競合的結合を示すグラフである。１２５Ｉ−ＶＥＧＦ１６５と固定化ラットニューロピリン−１／Ｆｃ（上部パネル）、マウスＶＥＧＦＲ−１／Ｆｃ（中間パネル）及びマウスＶＥＧＦＲ−２／Ｆｃ（下部パネル）との結合を、示した濃度の組み換えＨＢＤ又はＶＥＧＦ１６４の存在下で実施した。１部位（ｏｎｅ−ｓｉｔｅ）競合モデルを用いた結合パラメータのカーブフィッティング及び分析を、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを用いて実施した。特異的結合を、未処理のシグナル値からバックグラウンドシグナル（４００ｎＭ  ＶＥＧＦ１６４の存在下で得られた非特異的シグナル）を減算することによって求めた。データポイント（平均±ＳＥＭ）は３つ組であり、３つの独立した実験の代表値である。
【図２５】ＰＡＥ細胞に対するＶＥＧＦ１２０、ＶＥＧＦ１６４及びＨＢＤ変異体の結合の比較を示すグラフである。図によれば、ＶＥＧＦ１２０又はヘパリン結合性欠損変異体Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａ及びＲ１３Ａ／Ｒ１４Ａ／Ｒ４９Ａよりもかなり多いＶＥＧＦ１６４が、ＰＡＥ細胞と結合した（＊Ｐ＜０．０５）。データは３つの独立した実験の平均＋ＳＤである。
【図２６】デジタルＣＣＤカメラを備えた落射蛍光顕微鏡による、眼のヘパラン硫酸が豊富なブルッフ膜及び内境界膜（ＩＬＭ）との結合を示す画像である。ＶＥＧＦ１６４は、網膜中のブルッフ膜と内境界膜（矢印）の両方と結合可能であった。ＶＥＧＦ１２０で処置した部分ではブルッフ膜も内境界膜（アステリスク）も標識されなかった。スケールバーは１０μｍである。
【図１】
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【図２Ａ】
2008538927.tif 000006
【図２Ｂ】
2008538927.tif 000007
【図３Ａ】
2008538927.tif 000008
【図３Ｂ】
2008538927.tif 000009
【図３Ｃ】
2008538927.tif 000010
【図３Ｄ】
2008538927.tif 000011
【図３Ｅ】
2008538927.tif 000012
【図３Ｆ】
2008538927.tif 000013
【図３Ｇ】
2008538927.tif 000014
【図３Ｈ】
2008538927.tif 000015
【図３Ｉ】
2008538927.tif 000016
【図３Ｊ】
2008538927.tif 000017
【図３Ｋ】
2008538927.tif 000018
【図３Ｌ】
2008538927.tif 000019
【図４】
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【図５】
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【図６】
2008538927.tif 000022
【図７】
2008538927.tif 000023
【図８Ａ】
2008538927.tif 000024
【図８Ｂ】
2008538927.tif 000025
【図９】
2008538927.tif 000026
【図１０】
2008538927.tif 000027
【図１１】
2008538927.tif 000028
【図１２】
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【図１３】
2008538927.tif 000030
【図１４】
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【図１５】
2008538927.tif 000032
【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
2008538927.tif 000034
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2008538927.tif 000038
【図２１】
2008538927.tif 000039
【図２２Ａ】
2008538927.tif 000040
【図２２Ｂ】
2008538927.tif 000041
【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
2008538927.tif 000043
【図２２Ｅ】
2008538927.tif 000044
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際調査報告】
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