(57)【要約】  確固とした核酸アレイおよび格子が、稜が核酸多重交差ドメインから構成される多角形単位の二重交差接着に基づいて組み立てられる。
2008504846.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結合された核酸多重交差ドメインを稜として有する多角形単位を含むポリ核酸構造物であって、前記稜の各々は、２本の並行ヘリックスを有する少なくとも１つの自由端を有し、前記２本の並行ヘリックスの各々が接着性末端で終り、前記少なくとも１つの自由端に二重接着性末端を提供する、ポリ核酸構造物。
【請求項２】
前記核酸多重交差ドメインが二重交差ドメインである、請求項１記載のポリ核酸構造物。
【請求項３】
前記核酸多重交差ドメインが三重交差ドメインである、請求項１記載のポリ核酸構造物。
【請求項４】
前記多角形単位が三角形である、請求項１記載のポリ核酸構造物。
【請求項５】
前記多角形単位が平行四辺形である、請求項１記載のポリ核酸構造物。
【請求項６】
前記稜の各々は、２本の並行ヘリックスを有する単一の自由端を有し、前記２本の並行ヘリックスの各々が接着性末端で終り、前記自由端において二重接着性末端を提供する、請求項１記載のポリ核酸構造物。
【請求項７】
前記稜は、各々が２本の並行ヘリックスを有する２つの自由端を有し、前記自由端の２本の並行ヘリックスの各々が接着性末端で終り、前記自由端において二重接着性末端を提供する、請求項１記載のポリ核酸構造物。
【請求項８】
前記２本の並行ヘリックス上の接着性末端が異なる、請求項１記載のポリ核酸構造物。
【請求項９】
前記多角形単位が、結合された核酸二重交差ドメインを稜として有する三角形であり；
前記稜の各々は２本の平行ヘリックスを有する単一の自由端を有し；および
前記２本の平行ヘリックスの各々が接着性末端で終り、前記自由端において二重接着性末端を提供する、
請求項１記載のポリ核酸構造物。
【請求項１０】
前記多角形単位が、結合された核酸三重交差ドメインを稜として有する三角形であり；
前記稜の各々はそれぞれ２本の平行ヘリックスを有する２つの自由端を有し；および
前記２本の平行ヘリックスの各々が接着性末端で終り、前記自由端において二重接着性末端を提供する、
請求項１記載のポリ核酸構造物。
【請求項１１】
前記多角形単位が、核酸二重交差ドメインを稜として有する平行四辺形であり；
前記稜の各々はそれぞれ２本の平行ヘリックスを有する２つの自由端を有し；および
前記２本の平行ヘリックスの各々が接着性末端で終り、前記自由端において二重接着性末端を提供する、
請求項１記載のポリ核酸構造物。
【請求項１２】
相補的な二重接着性末端によって互いに連結された多角形単位のアレイである、請求項１記載のポリ核酸構造物。
【請求項１３】
前記アレイが、相補的な二重接着性末端で互いに連結されて三角形格子を形成する三角形単位のアレイである、請求項１２記載のポリ核酸構造物。
【請求項１４】
相補的な二重接着性末端で互いに連結されて三角形格子を形成する２つの異なる三角形単位のアレイである、請求項１２記載のポリ核酸構造物。
【請求項１５】
前記アレイが、相補的な二重接着性末端で互いに連結された平行四辺形単位のアレイである、請求項１２記載のポリ核酸構造物。
【請求項１６】
各々が、自己相補的であるように、および／または別の一本鎖ポリヌクレオチドと相補的であるように設計されていて、多角形単位への自己アニーリングが可能である一本鎖ポリヌクレオチドを合成する工程；
一本鎖ポリヌクレオチドを混合してポリヌクレオチド混合物を形成し、混合物を熱変性させる工程；および
一本鎖ポリヌクレオチドの熱変性された混合物をアニーリングして、自己集合により多角形単位を形成する工程、
を含む、請求項１記載のポリ核酸構造物を生産するための方法。
【請求項１７】
アニーリングされた多角形単位を熱して、接着性末端を確実に露出させる工程；および
複数のアニーリングされた多角形単位の露出した相補的接着性末端をアニーリングして、多角形単位のアレイを形成する工程、
をさらに含む請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
請求項１６記載の方法であって、２つの異なる多角形単位が別々に形成され、またさらに：
２つの異なるアニーリングされた多角形単位を熱し、接着性末端を確実に露出させる工程；および
露出した相補的な接着性末端をアニーリングして、２つの異なる多角形単位のアレイを形成する工程、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の実施権
本出願において報告する実験は、一部分：国立一般医学研究所、助成番号ＧＭ−２９５５４；海軍研究局、助成番号Ｎ０００１４−９８−１−００９３；国立科学財団、助成番号ＤＭＩ−０２１０８４４、ＥＩＡ−００８６０１５、ＤＭＲ−０１１３８７９０およびＣＴＳ−０１０３００２；ならびにＤＡＲＰＡ／ＡＦＳＯＲ、助成番号Ｆ３０６０２−０１−２−０５６１、の援助を受けた。米国政府は、本発明について、一括払い実施権、および限定的状況下で、上記の助成金の条件によって提供される適切な条件で実施権を他者に付与するよう特許権者に要求する権利を有する。
【０００２】
本発明は、ポリ核酸ナノ構造および格子に関する。
【０００３】
背景技術
関連技術の概要
極微細スケールの物質の構造を制御するためには、強固な分子内モチーフおよび確固とした分子間相互作用の両方について良好な設計が要求される。２次元結晶アレイの設計に用いられた以前のモチーフには、二重交叉（ＤＸ）(Fu et al., 1993 ; Winfree et al., 1998)、三重交叉（ＴＸ）(LaBean et al., 2000)、ＤＮＡ平行四辺形（(Mao et al, 1999)、および４×４構造（Yan et al., 2003）が含まれていた。これらのモチーフは、対称性を欠くまたは２回対称の２次元結晶アレイを生成するために用いられてきた（Seeman, 2003)。対照的に、三角形または六角形アレイを生成する以前の試みは、すべて失敗するかまたは非常に小さな構造しか生成されなかった。三角形の固有の剛性、自然における三角形モチーフの重要性(Kappraff et al.,1990)を考慮すれば、三角形がこの問題を解決する鍵である。三腕接合の柔軟性が、六角形格子を組み立てるための最初の試みにおいて発見された（Ma et al., 1986）。予期していたであろう六量体からだけではなく、突き出た３腕接合（Liu et al., 1994）から組み立てられた三角形が、三量体およびそれ以上による循環式閉環ができることを実証した（Qi et al., 1996）。ＤＸ分子に由来する同一平面上のヘリックスが稜に接している三角形が、同様の振舞いをした（Yang et al., 1998）。
【０００４】
Brun et al.(2004) は、四重交叉体および三角形という、２つの新しい複合体についての実験的証拠を報告し、その中では、原子間力顕微鏡画像（ＡＦＭ）が、三角形が平面を６角形状に覆うことができることを示している。しかし、Brunらによって六角形の格子を形成するために用いられた三角形単位は、その稜が単一の核酸ヘリックスであり、これは確固としたものではないことが、形成された格子のＡＦＭ画像が、いくつかの五角形および正方形が格子中に存在することを示すように見えることからわかる。
【０００５】
本明細書中のいかなる文献の引用も、その文献が、本出願の任意の請求項の特許要件に対する適切な先行技術または検討すべき資料であることを承認する意図を有するものではない。任意の文献の内容または日付に関するいかなる記述も、出願者の出願時において利用可能な情報に基づいており、その記述の正しさについて承認を与えるものではない。
【０００６】
発明の開示
本発明は、１以上の多角形単位からなるポリ核酸構造物を提供する。多角形単位はそれぞれ、その稜として、結合された核酸多重交叉ドメインを有する。多角形単位の各稜は、二重接着性（粘着性）末端で終る２つの平行した核酸ヘリックスを有する少なくとも１つの自由端（稜の延長）を有する。
【０００７】
本発明はまた、本発明によるポリ核酸構造物を生成する方法であって：自己アニーリングして多角形単位を形成できるように、自己相補的に、および／または別の一本鎖ポリヌクレオチドに相補的に設計された一本鎖ポリヌクレオチドを混合する工程；および混合物を熱変性の後にアニーリングして多角形単位を形成する工程、を含む方法を提供する。この方法にはさらに、多角形単位上の相補的な露出した接着性末端のアニーリングによる多角形単位アレイの自己集合が含まれてもよい。
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明のポリ核酸構造物は、少なくとも部分的には多重交差分子から構成された反復単位からなる分岐した多量体を形成するように、本発明の方法に従って組み立てられるポリ核酸である。
【０００９】
核酸三角形などの確固とした核酸モチーフの基本単位を形成する複数の多重交叉分子が、一本鎖オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドから組み立てられ、本発明のポリ核酸単位分子が生成される。同様に、対称的な（並進対称の）分子間接触を持つ二次元または三次元周期格子を有する本発明のより複雑なポリ核酸構造物が、連結された多重交叉分子の基本単位から組み立てられる。
【００１０】
本明細書で使用される用語「確固とした」とは、設計された構造のみを排他的に生成し、他は生成しないことを意味する。これはモチーフだけではなくアレイおよび格子のような構造にも当てはまる。例えば、ＤＸ三角形が設計される場合には、その構成要素の鎖は、設計されたＤＸ三角形モチーフ／構造のみに自己集合することになる。
【００１１】
ヘリクッスドメイン間に２つの交差部位を有するＤＮＡ分子が、二重鎖切断を含む組み替え過程における中間生成物として広汎に示唆されてきた。従って、「二重交差分子」は、二重ヘリックスの腕の２つをライゲーションすることにより互いに連結された２つの分岐した接合部（交差部位に対応するホリデイ接合部）を含む核酸分子である。分岐した接合部とは、３つ以上のヘリックス（腕）が伸び出している点を意味する。
【００１２】
二重交差分子には５つの異性体が存在し(Fu et al., 1993)、それらはヘリックス軸の相対的な配向、平行（ＤＰ）または逆平行（ＤＡ）、により、２つの広い分子のクラスに分けられる。二重交差分子の並行二重ヘリックス分子は通常うまく動作しないので、逆平行異性体が、本発明中で用いられる予定である好ましい基本構成成分である。しかし、並行二重ヘリックス分子も同様に好ましい可能性がある。
【００１３】
本発明者らは、ここで三角形アレイを形成することができる新しいモチーフ、ＤＸ三角形、を開発した。このモチーフは、ＤＸモチーフ（図１Ａ）と突き出た三角形モチーフ（図１Ｂ）を組み合わせることにより、導出される。その結果のモチーフを図１Ｃに示す。ＤＸ分子は、従来の直鎖状二重鎖ＤＮＡの２倍硬いことが示された(Li et al., 2002; Sa-Ardyen et al., 2003)。したがって、この太さが２倍の三角形は、単純な突き出た接合部を持つ三角形より硬いと予期することができよう。さらに、ＤＸ三角形は、２重の分子間相互作用をすることができ、これはねじれ誤差に敏感でないので、以前に使用された単一ヘリックス相互作用より確固としている可能性がある。このモチーフからなる三角形アレイの自己集合を、以下に実施例１で示す。実施例１は、分子間接点の改善または安定が、ＤＸ三角形モチーフが三角形アレイを構成することを可能にする重要な特性であることを実証する。
【００１４】
上に記述し以下に実施例１で開示する、ＤＸ三角形およびこのモチーフから形成される三角形アレイまたは格子は、本発明のポリ核酸構造物の好ましい実施態様である。本発明のポリ核酸構造物は、ＤＸ三角形モチーフおよびそれから形成される三角形アレイ／格子だけでなく、以下に実施例２で開示する、歪んだＴＸ−ＤＸ三角形およびＤＸ平行四辺形などの（しかしこれらに限られない）他の多重交差モチーフ、ならびにそれらから形成されるアレイ／格子もまた包含するものとする。
【００１５】
本発明のポリ核酸構造物は、１以上の多角形単位から構成される。単一の多角形のみが存在する場合、その多角形ポリ核酸構造物がアレイおよび格子を形成するための単位構成要素である。しかし一方で、複数の連結された多角形単位が、アレイまたは格子となることができ、あるいはアレイまたは格子を二次元もしくは三次元にさらに拡張するために用いることができる。
【００１６】
各多角形単位は、その稜として、結合された核酸多重交差ドメインを有する。用語「稜」を、多角形などの幾何学的な構造を参照する場合には、用語「辺」と同義的に用いる。本明細書に用いる多角形は、３以上の稜または辺を有する、閉じた幾何学的構造である。多角形は一般には平面に限定されると思われるが、本発明の目的のために、図５、１０Ｃ、および１１に示す三次元のＤＸ三角形および歪んだＴＸ−ＤＸ三角形（上から見た場合は多角形）のようなモチーフを含むものとする。
【００１７】
当業者が認識し理解するであろうように、各多角形単位の稜は１以上の核酸多重交差分子によって形成されていると表現されるかもしれないが、個々の核酸多重交差分子の個別の範囲を同定することはできない可能性があり；むしろ、多角形単位の稜を形成している結合された核酸多重交差ドメインを考える方がより適切であろう。これは、個々の核酸鎖が配列相補性に基づいて自己集合し、多角形単位を形成するという、本発明によるポリ核酸構造物を生成する方式とよりよく一致している。従って稜は、互いに連結されるべき個々の分子として形成されるのではなく、むしろ自己集合して全体として多角形単位になる。
【００１８】
多角形単位の各稜または辺は、２本の並行したヘリックスを有する少なくとも１つの自由端を有する。「自由端」とは、多角形単位の１つの稜が別の稜に結合する頂点を越えた稜の延長を意味するものとする。各自由端は、少なくとも２本の並行した核酸の二重ヘリックスを有し、並行したヘリックスの少なくとも２つが各々接着性のまたは粘着性の末端で終る。自由端が２本の並行ヘリックスのみを有する場合は、その自由端は、別の相補的な二重接着性末端に接着できる二重接着性末端を有する。二重接着性末端は、同じかまたは異なる接着性末端でよい。あるいは各稜は、その終端の両方を自由端として持つことができる。別の実施態様としては、多角形単位は、１つの自由端を有する稜、２つの自由端を有する稜、自由端のない稜、またはそれらの組合せを持つことができる。
【００１９】
核酸の多重交差ドメインは、好ましくは、以下に実施例２に示す歪んだＴＸ−ＤＸ三角形によって例示されるような、二重または三重交差ドメイン、またはそれらの組合せであり得る。
【００２０】
多角形単位は、その稜の２つ以上から適当に延長されて他の多角形単位と接続し、アレイもしくは格子を形成することができる任意の多角形でよい。好ましくは、多角形単位は三角形または平行四辺形であるが、しかしそれらに限定されない。
【００２１】
本発明のポリ核酸構造物の好ましい実施態様は、相補的な二重接着性末端によって、三角形アレイを形成するように互いに連結された、三角形単位のアレイである。より好ましくは、アレイは、２つの異なる三角形単位の三角形アレイである。別の好ましい実施態様は、相補的な二重接着性末端によって連結された平行四辺形単位のアレイである。
【００２２】
本発明はさらに、本発明によるポリ核酸構造物を生成する方法を提供する。この方法には、一本鎖ポリヌクレオチドを合成する工程（その各々は、多角形単位へ自己アニーリングができるように、自己に相補的、および／または別の一本鎖ポリヌクレオチドに相補的であるように設計されている）；一本鎖ポリヌクレオチドを混合してポリヌクレオチドの混合物を形成する工程；混合物を熱変性させる工程；および、一本鎖ポリヌクレオチドの熱変性された混合物をアニーリングさせて、多角形単位を形成する工程、が含まれる。
【００２３】
一本鎖ポリペプチドを一緒に混合し、相補鎖の融解温度または変性温度より上の温度、例えば９０℃、で加熱し、混合物中に存在するはじめの二次構造をすべて消滅させ、次にゆっくり冷却して、鎖を配列相補性に基づいてアニーリングさせることができる。
【００２４】
一旦多角形単位が自己集合すれば、集合した多角形単位は、多角形単位上の二重接着性末端の接続に基づいてアレイおよび格子を形成することができる。まず自己集合した多角形単位を加熱して、確実に二重接着性末端を露出させ、次に、露出した相補的な二重接着性末端をアニーリングさせて、多角形単位のアレイを形成する。種々の多角形単位などの１以上の多角形単位を混合して、種々の多角形単位のアレイを形成させることができる。
【００２５】
さらに位相幾何学的に閉じた核酸構造を形成するための一本鎖オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを合成する場合には、配列の選択は、ヘアピンを形成するように、または互いに反対向きであるように意図された鎖が相補的であるならば、実質的に任意であると理解するべきである。配列を最適化して、所望の特徴を組込み、一方で望まないクロスハイブリダイゼーションまたは分枝点移動を回避するためには、以前に記述された対称最小化アルゴリズム（Seeman, 1990 ; Seeman, 1981 and 1982）を用いることが好ましい。
【００２６】
用語「核酸」とは、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方ならびに２者のハイブリッドを指すことを理解するべきである。構造は、理論上自然物から作ることができる何かに似ている必要はない。特定のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド鎖は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、およびウラシル、の標準の５つ以外の塩基を採用してもよい。誘導体化された（例えば、メチル化された）塩基、および、イソグアニン、イソシトシン、アミノアデニン、Ｋ、Ｘ、π（Piccirilli et al., 1990）イノシンなどの他の珍しい塩基、ならびにプリンおよびピリミジンの他の誘導体を用いてもよい。塩基の選択における好ましい特徴は、それらが相対する塩基と相互作用して、特異的な対の吸引力を形成することができるということである。自然のＤＮＡおよびＲＮＡでは、水素結合がこの相互作用を形成する。しかし、反対イオン電荷、疎水的相互作用、およびファンデルワールス力もまた、相互作用の許される形である。これらの相互作用が自然に存在する塩基を越えて選択の幅を広げ、さらに種々様々の物理的性質を与える。
【００２７】
ある特定の鎖の中では、複素環塩基が、糖部分から完全に欠落している可能性がある。これは、鎖が曲がったり、接合部を形成したりする場所、またはより少数の力が鎖を互いに保持することを望む場所には、特に望ましいであろう。
【００２８】
ある特定の鎖には、単一の連続するリボースリン酸またはデオキシリボースリン酸骨格が存在する必要はない。それは、ペプチド骨格を有するペプチド核酸でもよい。ポリヌクレオチド区分の間に、単純な無機または有機部分、あるいはポリマースペーサーを用いてもよい。ポリエチレン、ポリビニルポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、ポリペプチド（酵素、抗体など）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、多糖（デンプン、セルロースなど）、シリコン、シラン、およびコポリマーその他のスペーサーを使用してもよい。そのようなハイブリッド構造の一例は、一端にホスホルアミダイトを有するドデカジオールである。この構造を４個のＴヌクレオチドの代わりに共有結合で挿入し、それによって置換されるヌクレオチドと似た様式でヘアピンループを形成させた。Mitchel J. Doktycz, Ph.D. Thesis (1991), University of Illinois, Chicago を参照のこと。用語「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、これらの構造すべてを包含するものと考える。
【００２９】
自然界および分子生物学の分野では、二重鎖ＤＮＡは、一般にＢ形で存在する。しかしながら、本発明の目的のためには、ＤＮＡまたは他の二重鎖ポリヌクレオチドが、Ａ、Ｃ、Ｄ、またはＺ形で存在することが、望ましいであろう。様々な塩基、誘導体、および修飾物を用いて、Ａ、Ｃ、Ｄ、またはＺ形の構造を同様に安定させることができる。
【００３０】
三次元ポリ核酸構造物は、特に足場用媒体としての使用に適している。その理由は、それらは硬い分子であり、相互作用のないより小さい分子をそれに繋留しても著しく乱される可能性が少ないからである。この構造の別の応用には、鎖状高分子ポリマーの形成がある。
【００３１】
その構造はまた、酵素および他の触媒を固定するための適当な材料を生成する。オープンデザインを構造に使用することにより、１つ以上の酵素を構造へ結合することができ、なおかつ酵素へのおよび酵素からの基質および生成物の自由な移動が可能になる。酵素を構造に直接結合させる代わりに、構造が、酵素を封入するかごを形成してもよい。この技術は、酵素を修飾しないという追加の長所を有する。
【００３２】
従来の酵素固定技術はランダムな付着に依存し、したがって形成された固相の粒子は、活性かまたは構造のいずれかが均一でない。対照的に、予め定められた数の酵素を、一定の数および配向の酵素を有する構造を形成するように、ポリヌクレオチド鎖へ付着させることができる。
【００３３】
構造を、メッシュまたはスクリーン状の材料を作り出すように形成することができる。この材料を、極めて正確な多孔性を有するフィルターとして用いることができる。強度を追加するために、複数のメッシュ層を互いに連結させても、または層を他の従来の基質へ結合させてもよい。
【００３４】
本発明の構造および本発明により生成された構造は、多数の二次元および三次元構造上の用途を有する。構造の微細な大きさのために、それらはナノテクノロジー分野で応用できる。
【００３５】
現在のより一般的な使用には、化学物質用の、特に医薬品用の溶解剤または安定剤としての使用が含まれる。例えば、薬剤を、三次元ポリ核酸構造物の内部へ結合させることができる。ＤＮＡは酸性条件で分解され、ＲＮＡはアルカリ性条件で分解されるので、薬を消化器系の所望の任意の部分で放出されるようにすることができる。
【００３６】
ここで一般的に本発明について記述したが、次の実施例を参照することによって、より容易に同じ理解が得られることになろう。それらは説明のために提供されるものであって、本発明を制限することを意図するものではない。
【００３７】
実施例１
二重交差接着に基づいた三角形二次元ＤＮＡ結晶
二次元擬似六角形の三角形アレイが、ＤＮＡの自己集合によって構成された。用いるモチーフは、稜および延長部が、従来のＤＮＡ二重ヘリックスではなく、ＤＮＡ二重交差（ＤＸ）分子である、突き出た接合部のＤＮＡ三角形である。この実施例における下記の実験を、このシステムの成功が、ＤＸ分子の追加の硬度によるのか、あるいは各稜の終端における２つの粘着性末端の存在によるのかを確証するために、行なった。１つの粘着性末端の除去が格子形成を妨げる。これは、格子形成を可能にする主要な因子が二重粘着性末端であることを示唆している。
【００３８】
材料および方法
鎖を、従来のホスホルアミダイト法により合成し（Caruthers, 1985）、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により精製した。各三角形用の鎖の化学量論的混合物（ＯＤ260により推定する）を、別々に０.５μM濃度に、４０mMトリス-ＨＣｌ、pH８.０、２０mM酢酸、２mMＥＤＴＡ、および１２.５mM酢酸マグネシウムを含む溶液中で調製した。各混合物を、９０℃から室温まで、５００ml水浴中で４８時間かけて冷却した。アレイを形成するために、２つの複合体、ＤＴＸ−Ａ（図２Ａ）およびＤＴＸ−Ｂ（図２Ｂ）を化学量論的な量で混合し、４５℃に温め、室温まで５００mlの水浴を含む魔法瓶中で２４時間かけてゆっくり冷却し；ある場合は試料を、さらに２４時間１６℃に冷却した。原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）撮像を、５〜７μLの試料を新たに切断された雲母上に置き、それを３分間放置して表面へ吸着させて、行なった。緩衝液の塩を除去するために、５〜１０滴の再留水を雲母に置き、水滴を振落とし、試料を圧縮空気で乾燥させた。撮像は、接触モードで、ＮａｎｏＳｃｏｐｅ  ＩＶ（Digital Instruments）装置の流体セル中の２-プロパノール下で、Ｓｉ3Ｎ4の先端を有する市販のカンチレバー（DI）を用いて行なった。
【００３９】
結果
２つの三角形を、組み合わせたとき三角格子配置を生成するように設計した。三角形の配列（配列番号１〜１９）を図２Ａおよび２Ｂに示す。経済的な目的のために、いくつかの鎖を両方の三角形の中で用いた。三角形の稜は、それらのＤＸヘリックスの各々に、６５ヌクレオチド対を含み、またそれらは長さ６ヌクレオチドの５'粘着性末端で終る。各三角形内で、１つの稜あたり４回転が存在する。三角形は、互いに接着して長さで二重ヘリックス１３回転（〜４６nm）の連続的なＤＸ構造を生成するように設計されている。図１Ｄは、１個の六角形の側面に位置する６個の三角形群、各三角形種３個ずつ、を図示する。三角形１つを除いた六角形の稜は長さで９回転（〜３０nm）であり；中心間距離は〜３４nmとなる筈である。図１Ｅは、２種のＤＸ三角形を、擬似六角形の三角形二次元アレイへと集合させるように設計する方法を示す。図１Ｅに示す三角形格子は、図１Ｄに図示された６個の三角形複合体の精巧な合成物を示す。
【００４０】
三角形は、非変性ゲル上で、単一のバンドとして移動する（データ示さず）。図３Ａおよび３Ｆは、三角形の自己集合によって生成されたアレイの原子間力顕微鏡写真を示す。
【００４１】
配置中のハニカム構造が図３Ａ〜３Ｆで示される画像から明らかである。格子の質は図３Ａ〜３Ｃに示す画像で明らかである。図３Ｄに示されるように、格子には互いに重畳しようとする一定の傾向が存在する；上部左のアレイは、上のアレイがその下のアレイのおよそ半分の大きさにすぎないので、この点を明白に示している。空洞が層間で連続して見えるように、アレイが互いの上に積み重なって見えることに、注意されたい。図３Ｅ〜３Ｆに示されるズーム画像が、アレイの六角形の特性を明白に実証しており；図３Ｆの中心間の作る六角形は、予期される長さによく一致して、〜３８nmの稜を有する。
【００４２】
以前は、一様な六角形アレイどころか、いかなる六角形アレイの形成にも失敗していたことを考えると、現行のシステムおよび以前のシステム間の差異であるＤＸのより大きな硬度か、あるいは二重粘着性末端の接着のいずれが鍵となる変化であったかを確定することは、中心的な重要性を有する。この問題を解決するために、本発明者らの研究室は、各三角形のヘリックスのうちの１つから粘着性（接着性）末端を除去して、これらの実験を繰り返した。これらの修飾された分子を、二重粘着性末端の三角形で行われたものと同じプロトコルで処理したとき、図３Ａ〜３Ｆに示される種類の格子を生成することができなかった。したがって、差異は二重粘着性（接着性）末端の使用である。
【００４３】
本発明者らは、以前の失敗が、単一のヘリックスに沿った、理想のおよび実際のねじれの間の差異のためなのではないか；一方２本のヘリックスは明らかにＤＸの稜の２本のヘリックス軸によって定義される平面の向きを維持しながら、成功裡に結合することができるのではないか、と推測する。しかし、単一ヘリックス結合の柔軟性が、それらの分子がハニカムアレイを形成できない一因である可能性を除外することはできない。
【００４４】
このように、二重ヘリックス腕にＤＸ腕を置き換えることが、二次元の強固な自己集合をもたらす。もしこの結論が正しければ、二次元アレイの構成成分として単一ヘリックスの粘着性末端によって結合されて用いられたときには、無効または困難であったと分かった他のモチーフに、この手法を用いることができるに違いない。本発明者らは、多くのシステムでこの考え方をテストし、それが正しいことを見出した。本発明者らは、下の実施例２に記述するように、小さな三次元三角形のＤＸ版（Liu et al., 2004）、６本のヘリックスの束（Mathieu et al., 2001）、大きくて扱いにくいＤＮＡ平行四辺形（Mao et al., 1999）、および以前に報告されたことのない三次元ＴＸモチーフを用いて、成功裡に確固とした二次元アレイを構築した。本発明者らは、二重粘着性（接着性）末端によるこの形の接着の使用が、二次元での応用および三次元の集合体の両方に価値あるものであることが分かるであろう、と期待する。
【００４５】
実施例２
ＤＸ分子からの新しいシステム
これらの新しいシステムの最初の３つは、３次元空間に跨るモチーフである。それらの相補的な粘着性末端対の方向（すべてが、本質的にＤＸ単位を結合する）によって定義される３つのベクターに沿ってそれらを組み合わせれば、三次元立体が生じることになる。３つのモチーフはすべて、非変性ゲル上で良好に振る舞い、単一のバンドとして移動する。
【００４６】
三次元ＤＸ三角形
図１Ｃおよび図２Ａ〜２ＢのＤＸ三角形と異なるＤＸ三角形を、図４に図示する。稜の自由端（延長部）に二重接着性末端を有する三次元ＤＸ三角形の模式図を、図５に示す。三次元システムの幾何学的実現可能性についての良好なスクリーニングは、そのシステムから１対の接着性末端を除去し、次に、それが良好な二次元アレイを形成するかどうかを、ＡＦＭにより分析して確かめることである。システムの３つの二次元断面すべてが良好ならば、それは幾何学的設計問題が解決されたことを示している。図６Ａ〜６Ｃに示すように、本発明者らは、三次元ＤＸ三角形のこの点に関して著しく成功した。
【００４７】
いくつかのチューブ形成がこれらの画像に見られ、このチューブ形成は、選択されたＤＸモチーフ（交差の間に偶数個の半回転を有するＤＡＥ；Fuand Seeman, 1993）が内部屈曲を有する傾向があるために起こった可能性が高く；この問題が無い別のモチーフ（奇数個の半回転を有するＤＡＯ；Fu and Seeman, 1993）も開発されている。成長方向の１つが除かれたので、二次元アレイは三角形ではなく、菱形であることに注意されたい。
【００４８】
６本ヘリックス束
ＤＮＡの一巻き１０.５塩基のヘリックス構造（Wang, 1979 ; および Rhodes and Klug, 1980）は、交差などの特徴の間の７および１４ヌクレオチドの隔たりが特徴を１２０°だけ回転させることを意味する。この特徴を利用して、図７Ａおよび７Ｂに図示するＤＮＡの６本ヘリックス束（Mathieu et al., 2001）を、図８に示す配列番号２０〜３１の設計された鎖配列を組み合わせることにより生成した。
【００４９】
本発明者らの研究室は、三次元ＤＸ三角形と同様に、３方向の各々にこのモチーフを有するアレイを作成した。前方の上の２つのヘリックスが後方の下の２つのヘリックスに結合する。また他の２つの組についても同様である。これらを図９Ａ〜９Ｃに示す。明確なパターンが見られる。しかし、アレイの全体的構造は多くの欠陥を含んでいることが明らかである。これらの格子、特に中央のものに見られる欠陥は、それらの末端近くのヘリックス間にあまりにもわずかの交差しかない結果であると考えられる。
【００５０】
歪んだＴＸ三角形
歪んだＴＸ三角形モチーフは、図１０Ａに示すような、ヘリックスが対で延長しているＴＸ分子から構成される。設計された、配列番号３２〜６４の鎖配列を組み合わせることにより、この分子の３つを、三次元空間に跨る歪んだ三角状に組み立てる（図１１）。このモチーフの３つの二次元断面を、図１２Ａ〜１２Ｃに示す。
【００５１】
ＤＸ平行四辺形
ＤＮＡ平行四辺形に基づいた二次元システム（Mao et al., 1999）も、単一のヘリックス（単一の粘着性／接着性末端）を用いたときは、手に負えないことが分かった。しかし二重粘着性／接着性末端を有するＤＸ分子を用いる場合は、見ることのできるアレイが得られた。最初の平行四辺形システムは、各交差点を越えてヘリックスの１回転が、また交差点の間にヘリックスの４回転が存在したシステムに基づいていた（Mao et al., 1999）。二重粘着性／接着性末端を有するＤＸ平行四辺形の２つのバージョンを設計した。ＤＸ分子は、それらのヘリックスの相対的な配向および接合点間のヘリックス半回転の数により特徴づけられる。ヘリックスの配向は両方の設計において逆平行であったが、しかし接合部間のヘリックス半回転の数は異なっていた。最初のバージョンは、接合部間にすべて偶数のヘリックス半回転の数を持つように設計した。したがって、この分子をＰＤＸ−Ｅ−Ｅと呼ぶ。この分子の周期性は４０nmであった。配列番号６５〜９６を、このＰＤＸ−Ｅ−Ｅ ＤＮＡ平行四辺形の鎖配列として設計した（図１４）。システムを２倍にして、頂点を越えてヘリックス２回転、および頂点の間をヘリックス８回転としたときは、格子が得られなかった。このモチーフを図１３に示す。図１５Ａおよび１５Ｂから、図１３および１４のモチーフから平行四辺形アレイを形成することができることが明らかである。それらは以前には不可能であった。この設計は、大規模で良く配列されたアレイを生成しなかったし、このモチーフの角度を正確に測定することはできなかった。第２のバージョンを、接合部間のヘリックス半回転の数が１つおきに奇数と偶数の繰り返しパターンを持つように設計した。したがって、この分子をＰＤＸ−Ｅ−Ｏと呼ぶ（図１６および１７）。この分子の全体の周期もまた４１nmと測定された。ＡＦＭ画像（図１８Ａ〜１８Ｄ）に図示されているように、分岐した接合部の腕の間のねじれ角は５２°と測定された。アレイには１４nmの小さな空洞および２７nmの大きな空洞がある。これらの新しい設計は、パターン構成に有用な、より大きなサイズの平行四辺形を提供する。
【００５２】
本発明について完全に記述したので、当業者は、本発明の精神および範囲から外れず、不必要な実験を行うことなしに、広範囲の、等価なパラメーター、濃度、および条件内で、同じことを行なうことができるのは当然であろう。
【００５３】
本発明について、その具体的な実施態様に関連して記述したが、それをさらに改変できることは理解されるであろう。本出願は、一般に本発明の原則に従う、また本発明が関係する技術分野内の既知のまたは慣行的実施の内に入るような、および上文および以下に添付される請求項の範囲に明らかにされている本質的な特徴に該当するような本開示からの逸脱を含む、本発明の任意の変更、使用、または適応を、包含することを意図する。
【００５４】
学術論文または要約、公表されたまたは対応する米国または外国の特許出願、発行された米国または外国の特許、または任意の他の参考文献を含む、本明細書に引用したすべての参照文献は、引用された参照文献に提示されたすべてのデータ、表、図、およびテキストを含めて、参照により完全に本明細書に組み入れられる。さらに、本明細書に引用された参照文献内に引用された参照文献の全内容もまた、参照により完全に組み入れられる。
【００５５】
既知の方法工程、従来の方法工程、既知の方法または従来の方法への言及は、決して、本発明の任意の局面、記述、または実施態様が、当該技術中に開示され、教示され、あるいは示唆されていることを承認するものではない。
【００５６】
先の具体的な実施態様の記述は、非常に完全に本発明の一般的特性を明らかにすることになるであろうから、他者が、当技術分野の知識（本明細書に引用された参照文献の内容を含む）を適用することにより、不必要な実験をせず、本発明の一般的な概念から外れることなく、様々な応用のためにそのような具体的な実施態様を容易に修飾および／または適応させることができる。したがって、そのような適応および修飾は、本明細書に提示された教示および指導に基づいて、開示された実施態様の等価物の意義および範囲内にあると考える。本明細書中の語法または用語は、記述のためであって制限のためではないと理解するべきである。よって本明細書の用語または語法は、当該技術分野の専門家が、本明細書に提示された教示および指導に照らし、当業者の知識と組み合わせて解釈するべきである。
【００５７】
したがって、上の明細書および／または以下の特許請求の範囲中に見出されるであろう表現、「---する手段」および「---のための手段」あるいは任意の方法工程の用語（それらに機能的記述が続く）は、現在または将来存在し、上記の明細書の中で開示された１または複数の実施態様と正確に等価かどうかにかかわらず、詳述された機能を実行する、構造的、物理的、化学的、電気的な要素または構造のすべて、あるいは方法工程のすべて、を定義し、および包含するように意図する。即ち、同じ機能を実行するために他の手段または工程を用いることができ；また、そのような表現がそれらの最も広い解釈を与えられるよう意図する。
【００５８】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｅは、次のモチーフを図示する：ＤＸモチーフ（図ＩＡ）。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｅは、次のモチーフを図示する：突き出た接合部を持つ三角形（図１Ｂ）。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｅは、次のモチーフを図示する：ＤＸ三角形（図１Ｃ）。
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｅは、次のモチーフを図示する：２つの異なる種の６つのＤＸ三角形の三角形配置（図１Ｄ）。
【図１Ｅ】図１Ａ〜１Ｅは、次のモチーフを図示する：図１Ｄに示す２つの三角形の模式的な三角形格子（図１Ｅ）。
【図２Ａ】図２Ａおよび２Ｂは、２つのＤＮＡ  ＤＸ三角形、ＤＴＸ−Ａ（図２Ａ；配列番号１〜１３）の配置およびヌクレオチド配列、を模式的に示す。
【図２Ｂ】図２Ａおよび２Ｂは、２つのＤＮＡ  ＤＸ三角形、ＤＴＸ−Ｂ（図２Ｂ；配列番号１〜２、４、６、９、１１、および１３〜１９）の配置およびヌクレオチド配列、を模式的に示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｆは、擬似六角形の三角形アレイの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像を提示する。画面の大きさを右上角に示す。図３Ａは１対の二次元アレイを示す。アレイのハニカム特性が明らかである。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｆは、擬似六角形の三角形アレイの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像を提示する。画面の大きさを右上角に示す。図３Ｂは、図３Ａの右側に示されているアレイのズーム（拡大）である。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｆは、擬似六角形の三角形アレイの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像を提示する。画面の大きさを右上角に示す。図３Ｃは、もう１つのアレイのズーム（拡大）である。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｆは、擬似六角形の三角形アレイの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像を提示する。画面の大きさを右上角に示す。図３Ｄは、下方右に事実上完全な、上方左に部分的な、２つの積層アレイを含む画像を示す。
【図３Ｅ】図３Ａ〜３Ｆは、擬似六角形の三角形アレイの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像を提示する。画面の大きさを右上角に示す。図３Ｅは、１５のＤＸ三角形を含むズーム（拡大）画像である。
【図３Ｆ】図３Ａ〜３Ｆは、擬似六角形の三角形アレイの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像を提示する。画面の大きさを右上角に示す。図３Ｆは図３Ｅのさらなるズーム（拡大）であって、図１Ｄの配置に類似する６つの完全な三角形を示しており、中心・中心間の六角形の輪郭を重ねて示してある。
【図４】図４はＤＸ三角形の三次元特性を示す図である。各稜はＤＸ分子（２本の融合したＤＮＡ二重ヘリックス）から成る。各稜は１つのＤＸの下に、かつもう１つのＤＸの上にあり；例えば、上部の水平の稜は、左側の斜めのＤＸの上に、また右側の斜めのＤＸの下に位置する。３つのＤＸ稜の中心軸は三次元空間に跨る。
【図５】図５は、模式的に三次元ＤＸ三角形（配列番号９７〜１１８）の配置およびヌクレオチド配列を示す。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｃは、各異なる方向から接着性末端を除去することに対応した、３つの異なる断面の二次元ＡＦＭ画像を示す。各断面の良好に形成されたアレイに（中央の断面（図５Ｂ）からのアレイが最良）に注目されたい。画像に付された寸法は、ミクロンである。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｃは、各異なる方向から接着性末端を除去することに対応した、３つの異なる断面の二次元ＡＦＭ画像を示す。各断面の良好に形成されたアレイに（中央の断面（図５Ｂ）からのアレイが最良）に注目されたい。画像に付された寸法は、ミクロンである。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｃは、各異なる方向から接着性末端を除去することに対応した、３つの異なる断面の二次元ＡＦＭ画像を示す。各断面の良好に形成されたアレイに（中央の断面（図５Ｂ）からのアレイが最良）に注目されたい。画像に付された寸法は、ミクロンである。
【図７Ａ】図７Ａおよび８Ｂは、その中心軸に垂直な（図７Ａ）、およびその側面に沿っての（図７Ｂ）６本のヘリックス束の図である。それは、まさに互いに１２０°で融合したＤＸ分子の組であることがわかる。
【図７Ｂ】図７Ａおよび８Ｂは、その中心軸に垂直な（図７Ａ）、およびその側面に沿っての（図７Ｂ）６本のヘリックス束の図である。それは、まさに互いに１２０°で融合したＤＸ分子の組であることがわかる。
【図８】図８は、模式的に図７Ａおよび７Ｂに提示された６本ヘリックス束（配列番号２０〜３１）の配置およびヌクレオチド配列を示す。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｃは、６本ヘリックス束の３組の二次元断面のＡＦＭ画像である。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｃは、６本ヘリックス束の３組の二次元断面のＡＦＭ画像である。
【図９Ｃ】図９Ａ〜９Ｃは、６本ヘリックス束の３組の二次元断面のＡＦＭ画像である。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｃは、歪んだＴＸ三角形を示す図である。図１０Ａに歪んだＴＸ三角形の１辺を示す。それは明らかに、中央でＴＸモチーフによって融合された１対のＤＸ末端で作られている。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｃは、歪んだＴＸ三角形を示す図である。図１０Ｂには、図１０Ａと同様の配向で１つの辺（読者に最も接近して）が有るが、側面から見た一辺を含めて、他の２辺が加えられている。このモチーフは三次元空間に跨ることが明白である。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜１０Ｃは、歪んだＴＸ三角形を示す図である。図１０Ｃは三角形モチーフの平面図である。
【図１１】図１１は、図１０Ａ〜１０Ｃに提示された歪んだＴＸ三角形の配置およびヌクレオチド配列（配列番号３２〜６４）を模式的に示す。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｃは、図１２Ａ〜１２Ｃに示された、歪んだＴＸ三角形の３つの二次元断面のＡＦＭ画像である。二次元パタ−ン構成は図１２Ｂに最も明白に示されている。一方、他の２つ（図１２Ａおよび１２Ｃ）は整ったアレイではない。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜１２Ｃは、図１２Ａ〜１２Ｃに示された、歪んだＴＸ三角形の３つの二次元断面のＡＦＭ画像である。二次元パタ−ン構成は図１２Ｂに最も明白に示されている。一方、他の２つ（図１２Ａおよび１２Ｃ）は整ったアレイではない。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜１２Ｃは、図１２Ａ〜１２Ｃに示された、歪んだＴＸ三角形の３つの二次元断面のＡＦＭ画像である。二次元パタ−ン構成は図１２Ｂに最も明白に示されている。一方、他の２つ（図１２Ａおよび１２Ｃ）は整ったアレイではない。
【図１３】図１３は、両方向に、頂点を越えて２回転、頂点間に８回転を有するＤＸ平行四辺形（ＰＤＸ−Ｅ−Ｅ）の図である。
【図１４】図１４は、図１３に提示されたＤＸ平行四辺形（ＰＤＸ−E−Ｅ）の配置およびヌクレオチド配列（配列番号６５〜９６）を模式的に示す。
【図１５Ａ】図１５Ａおよび１５Ｂは、図１３および１４に示したモチーフから形成された二次元格子の図（図１５Ａ）およびズーム（図１５Ｂ）のＡＦＭ画像である。
【図１５Ｂ】図１５Ａおよび１５Ｂは、図１３および１４に示したモチーフから形成された二次元格子の図（図１５Ａ）およびズーム（図１５Ｂ）のＡＦＭ画像である。
【図１６】図１６は、接合部間で、偶数および奇数交互のヘリックス半回転の繰り返しパターンを有するＤＸ平行四辺形（ＰＤＸ−E−Ｏ）の図である。
【図１７】図１７は、図１６に提示されたＤＸ平行四辺形（ＰＤＸ−Ｅ−Ｏ）の配置およびヌクレオチド配列（配列番号１１９〜１５２）を模式的に示す。
【図１８Ａ】図１８Ａ〜１８Ｄは、図１６および１７に示されているＰＤＸ−Ｅ−Ｏ平行四辺形モチーフから形成された二次元格子のＡＦＭ画像である。
【図１８Ｂ】図１８Ａ〜１８Ｄは、図１６および１７に示されているＰＤＸ−Ｅ−Ｏ平行四辺形モチーフから形成された二次元格子のＡＦＭ画像である。
【図１８Ｃ】図１８Ａ〜１８Ｄは、図１６および１７に示されているＰＤＸ−Ｅ−Ｏ平行四辺形モチーフから形成された二次元格子のＡＦＭ画像である。
【図１８Ｄ】図１８Ａ〜１８Ｄは、図１６および１７に示されているＰＤＸ−Ｅ−Ｏ平行四辺形モチーフから形成された二次元格子のＡＦＭ画像である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【配列表】
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