(57)【要約】化膿性感染に対する免疫を得るのに有用なＡ群レンサ球菌（ＧＡＳ）抗原。１つの局面において、本発明は、ａ）化膿性レンサ球菌（ＧＡＳ）タンパク質よりも少なくとも１アミノ酸短く、前記ＧＡＳタンパク質の表面露出ドメインを含む表面露出ＧＡＳ抗原であって、前記ＧＡＳタンパク質が、本明細書中に記載されるＧＡＳタンパク質、Ｍタンパク質、ＳａｇＡ、Ｓｆｂ１、およびＳｈｐからなる群から選択される、表面露出ＧＡＳ抗原と、ｂ）ＧＡＳ抗原をコードする核酸分子と、ｃ）ＧＡＳ抗原に特異的に結合する抗体と、からなる群から選択される少なくとも１つの活性因子を含む、組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）化膿性レンサ球菌（ＧＡＳ）タンパク質よりも少なくとも１アミノ酸短く、前記ＧＡＳタンパク質の表面露出ドメインを含む表面露出ＧＡＳ抗原であって、前記ＧＡＳタンパク質が、
（１）表２に列挙したＧＡＳタンパク質、
（２）表３に列挙したＧＡＳタンパク質、
（３）表４Ａ〜４Ｒからなる群から選択される表に列挙したＧＡＳタンパク質、
（４）表５に列挙したＧＡＳタンパク質、
（５）表６に列挙したＧＡＳタンパク質、
（６）表７に列挙したＧＡＳタンパク質、
（７）表８に列挙したＧＡＳタンパク質、
（８）表９に列挙したＧＡＳタンパク質、
（９）表１１に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１０）表１２に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１１）表１３に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１２）表１４に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１３）表１５に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１４）表１６に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１５）
【化１】
2008544949.tif 000128
（１６）
【化２】
2008544949.tif 000129
（１７）
【化３】
2008544949.tif 000130
（１８）
【化４】
2008544949.tif 000131
（１９）
【化５】
2008544949.tif 000132
（２０）
【化６】
2008544949.tif 000133
（２１）
【化７】
2008544949.tif 000134
および
（２２）
【化８】
2008544949.tif 000135
、Ｍタンパク質、ＳａｇＡ、Ｓｆｂ１、およびＳｈｐからなる群から選択される、表面露出ＧＡＳ抗原、
ｂ）ＧＡＳ抗原をコードする核酸分子、および
ｃ）ＧＡＳ抗原に特異的に結合する抗体
からなる群から選択される少なくとも１つの活性因子を含む、組成物。
【請求項２】
（ａ）少なくとも２つの表面露出化膿性レンサ球菌（ＧＡＳ）抗原であって、第１のＧＡＳ抗原が第１のＧＡＳ細菌の表面上に発現し、第２のＧＡＳ抗原が第２のＧＡＳ細菌の表面上に発現し、前記第１および第２のＧＡＳ細菌が異なるＭ型である、少なくとも２つの表面露出ＧＡＳ抗原、
（ｂ）前記少なくとも２つの表面露出ＧＡＳ抗原をコードする少なくとも１つの核酸分子、および
（ｃ）少なくとも２つの抗体であって、第１の抗体が前記第１のＧＡＳ抗原に特異的に結合し、第２の抗体が前記第２のＧＡＳ抗原に特異的に結合する、少なくとも２つの抗体
からなる群から選択される少なくとも２つの活性因子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第１および第２のＧＡＳ細菌のうちの１つが、Ｍ１、Ｍ３、Ｍ６、Ｍ１１、Ｍ１２、およびＭ２３からなる群から選択されるＭ型である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記第１および第２のＧＡＳ抗原のうちの１つが、少なくとも１０の異なるＧＡＳ株の表面上に発現する、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１つのＧＡＳ抗原が、
【化９】
2008544949.tif 000136
からなる群から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記第１および第２のＧＡＳ抗原のうちの少なくとも１つが、少なくとも７つの異なるＭ型細菌の表面上に発現する、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
前記少なくとも１つのＧＡＳ抗原が、
【化１０】
2008544949.tif 000137
からなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記第１および第２のＧＡＳ抗原のうちの少なくとも１つが、Ｍ１型ＧＡＳ細菌の表面上に発現する、請求項２に記載の組成物。
【請求項９】
前記少なくとも１つのＧＡＳ抗原が、
【化１１】
2008544949.tif 000138
からなる群から選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記第１および第２のＧＡＳ抗原のうちの少なくとも１つが、Ｍ３型ＧＡＳ細菌の表面上に発現する、請求項２に記載の組成物。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのＧＡＳ抗原が、
【化１２】
2008544949.tif 000139
からなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記第１および第２のＧＡＳ抗原のうちの少なくとも１つが、Ｍ６型ＧＡＳ細菌の表面上に発現する、請求項２に記載の組成物。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのＧＡＳ抗原が、
【化１３】
2008544949.tif 000140
からなる群から選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記第１および第２のＧＡＳ抗原のうちの少なくとも１つが、Ｍ１１型ＧＡＳ細菌の表面上に発現する、請求項２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのＧＡＳ抗原が、
【化１４】
2008544949.tif 000141
からなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記第１および第２のＧＡＳ抗原のうちの少なくとも１つが、Ｍ１２型ＧＡＳ細菌の表面上に発現する、請求項２に記載の組成物。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのＧＡＳ抗原が、
【化１５】
2008544949.tif 000142
からなる群から選択される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記第１および第２のＧＡＳ抗原のうちの少なくとも１つが、Ｍ２３型ＧＡＳ細菌の表面上に発現する、請求項２に記載の組成物。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのＧＡＳ抗原が、
【化１６】
2008544949.tif 000143
からなる群から選択される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ＧＡＳ抗原が、前記ＧＡＳタンパク質の少なくとも１つの膜貫通ドメインを欠く、請求項１〜請求項１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記第１のＧＡＳタンパク質が、前記第１のＧＡＳタンパク質の膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインを含まない、請求項１〜請求項２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
（１）表２に列挙したＧＡＳタンパク質、
（２）表３に列挙したＧＡＳタンパク質、
（３）表４Ａ〜４Ｒからなる群から選択される表に列挙したＧＡＳタンパク質、
（４）表５に列挙したＧＡＳタンパク質、
（５）表６に列挙したＧＡＳタンパク質、
（６）表７に列挙したＧＡＳタンパク質、
（７）表８に列挙したＧＡＳタンパク質、
（８）表９に列挙したＧＡＳタンパク質、
（９）表１１に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１０）表１２に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１１）表１３に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１２）表１４に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１３）表１５に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１４）表１６に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１５）
【化１７】
2008544949.tif 000144
（１６）
【化１８】
2008544949.tif 000145
（１７）
【化１９】
2008544949.tif 000146
（１８）
【化２０】
2008544949.tif 000147
（１９）
【化２１】
2008544949.tif 000148
（２０）
【化２２】
2008544949.tif 000149
（２１）
【化２３】
2008544949.tif 000150
および
（２２）
【化２４】
2008544949.tif 000151
、Ｍタンパク質、ＳａｇＡ、Ｓｆｂ１、およびＳｈｐ、
ｂ）ＧＡＳ抗原をコードする核酸分子、ならびに
ｃ）ＧＡＳ抗原に特異的に結合する抗体
からなる群から選択される第２の活性因子をさらに含む、請求項１〜請求項２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記少なくとも１つのＧＡＳ抗原が融合タンパク質成分である、請求項１〜請求項２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ＧＡＳタンパク質が、表１に示すアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜請求項２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ＧＡＳタンパク質が、表１に示すアミノ酸配列を含む、請求項１〜請求項２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
小児ワクチンで有用な抗原を含む、請求項１〜請求項２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
高齢または免疫不全状態の個体のためのワクチンで有用な抗原を含む、請求項１〜請求項２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
アジュバントをさらに含む、請求項１〜請求項２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ＧＡＳ抗原がポリペプチドであり、前記ポリペプチドがキャリアタンパク質にカップリングしている、請求項１〜請求項２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記キャリアタンパク質が、細菌毒素、細菌類毒素、髄膜炎菌外膜タンパク質、熱ショックタンパク質、百日咳タンパク質、インフルエンザ菌タンパク質Ｄ、サイトカイン、リンホカイン、ホルモン、成長因子、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂ、および鉄取り込みタンパク質からなる群から選択される、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
化膿性レンサ球菌に対する免疫の誘導のためのワクチンの作製方法であって、請求項１〜請求項３０のいずれか１項に記載の活性因子と薬学的に許容可能なキャリアとを組み合わせる工程を含む、方法。
【請求項３２】
前記活性因子がポリペプチドであり、前記ポリペプチドが、
（ａ）前記ポリペプチドをコードする発現ベクターを含む宿主細胞を培養する工程と、
（ｂ）前記ポリペプチドを回収する工程と
を含む方法によって作製される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
化膿性レンサ球菌感染に対する免疫を誘導するための薬物の製造における少なくとも２つの表面露出化膿性レンサ球菌（ＧＡＳ）抗原の使用であって、第１のＧＡＳ抗原が第１のＧＡＳ細菌の表面上に発現し、第２のＧＡＳ抗原が第２のＧＡＳ細菌の表面上に発現し、前記第１および第２のＧＡＳ細菌が異なるＭ型である、使用。
【請求項３４】
化膿性レンサ球菌感染に対する免疫を誘導するための薬物の製造における少なくとも２つの表面露出化膿性レンサ球菌（ＧＡＳ）抗原をコードする少なくとも１つの核酸分子の使用であって、第１のＧＡＳ抗原が第１のＧＡＳ細菌の表面上に発現し、第２のＧＡＳ抗原が第２のＧＡＳ細菌の表面上に発現し、前記第１および第２のＧＡＳ細菌が異なるＭ型である、使用。
【請求項３５】
化膿性レンサ球菌感染の治療のための薬物の製造における少なくとも２つの抗体の使用であって、第１の抗体が第１のＧＡＳ細菌の表面上に発現した第１の化膿性レンサ球菌（ＧＡＳ）抗原に特異的に結合し、第２の抗体が第２のＧＡＳ細菌の表面上に発現した第２のＧＡＳ抗原に特異的に結合し、前記第１および第２のＧＡＳ細菌が異なるＭ型である、使用。
【請求項３６】
化膿性レンサ球菌感染の治療のための薬物の製造における抗体の使用であって、前記抗体が第１のＧＡＳタンパク質よりも少なくとも１アミノ酸短く、前記第１のＧＡＳタンパク質の表面露出ドメインを含む表面露出ＧＡＳ抗原に特異的に結合し、前記第１のＧＡＳタンパク質がＧＡＳタンパク質からなる群から選択され、前記第１のＧＡＳタンパク質が、
（１）表２に列挙したＧＡＳタンパク質、
（２）表３に列挙したＧＡＳタンパク質、
（３）表４Ａ〜４Ｒからなる群から選択される表に列挙したＧＡＳタンパク質、
（４）表５に列挙したＧＡＳタンパク質、
（５）表６に列挙したＧＡＳタンパク質、
（６）表７に列挙したＧＡＳタンパク質、
（７）表８に列挙したＧＡＳタンパク質、
（８）表９に列挙したＧＡＳタンパク質、
（９）表１１に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１０）表１２に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１１）表１３に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１２）表１４に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１３）表１５に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１４）表１６に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１５）
【化２５】
2008544949.tif 000152
（１６）
【化２６】
2008544949.tif 000153
（１７）
【化２７】
2008544949.tif 000154
（１８）
【化２８】
2008544949.tif 000155
（１９）
【化２９】
2008544949.tif 000156
（２０）
【化３０】
2008544949.tif 000157
（２１）
【化３１】
2008544949.tif 000158
および
（２２）
【化３２】
2008544949.tif 000159
、Ｍタンパク質、ＳａｇＡ、Ｓｆｂ１、およびＳｈｐ、ならびに
（ｘ）表１に列挙したＧＡＳ抗原
からなる群から選択される、使用。
【請求項３７】
化膿性レンサ球菌に対する免疫を誘導する方法であって、個体に治療有効量の請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組成物のいずれかを投与する工程を包含し、ここで前記活性因子がポリペプチド分子または核酸分子である、方法。
【請求項３８】
化膿性レンサ球菌感染の治療方法であって、個体に治療有効量の請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組成物のいずれかを投与する工程を包含し、ここで前記活性因子が抗体である、方法。
【請求項３９】
キットであって、
請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組成物を含む容器と、
請求項３７に記載の方法の説明書と
を含む、キット。
【請求項４０】
キットであって、
請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組成物を含む容器と、
請求項３８に記載の方法の説明書と
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００４年１０月８日出願の同時係属仮出願番号６０／６１６，８５４号、２００５年２月１５日出願の同６０／６５２，７３６号、２００５年７月２１日出願の同６０／７０１，１２１号、および２００５年８月４日出願の同６０／７０５，２０９号の利益を主張し、参考として援用される。
【０００２】
本出願は、４つの各ＣＤ−ＲＯＭの内容が参考として援用され、それぞれ、「ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」とラベリングした本出願の配列表を含む同一の１．７５ＫＢのファイルを含む。ＣＤ−ＲＯＭを、２００５年１０月１１日に作製した。
【０００３】
発明の分野
本発明は、免疫学分野およびワクチン学分野に属する。詳細には、本発明は、化膿性レンサ球菌由来の抗原および免疫化におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
Ａ群連鎖球菌（「ＧＡＳ」、化膿性レンサ球菌）は、ヒト常在病原体であり、５〜１５％の正常個体に疾患の徴候を示さずに存在すると予測されている。しかし、宿主が易感染性である場合、生物がその病原性を発揮することができる場合、または生物が脆弱組織もしくは宿主に移入された場合に急性感染が起こる。関連疾患には、産褥熱、猩紅熱、丹毒、咽頭炎、膿痂疹、壊死性筋膜炎、筋炎、およびレンサ球菌毒素ショック症候群が含まれる。
【０００５】
ＧＡＳ細菌は、グラム陽性非胞子形成球状細菌であり、鎖状または細胞対として存在する。ＧＡＳ細菌は、Ｍタンパク質と呼ばれる巨大で非常に変化する細胞表面抗原に基づいた血清型別にしたがってさらに分類される。非特許文献１；非特許文献２。Ｍタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列決定は、ＧＡＳＭ型（ｅｍｍ配列型）の最も一般的な決定方法となっている。今日まで、１２４の異なるＭ型が同定されており、これらの型のうちの２２種は、１９９５年と１９９８年との間に同定された（非特許文献３）。Ｍｌ、Ｍ２８、Ｍ１２、Ｍ３、Ｍ１１、およびＭ６は、そのうちで世界的に最も一般的なＧＡＳ型である。非特許文献４；非特許文献５。
【０００６】
抗体を使用して化膿性レンサ球菌を処置することができるにもかかわらず、疾患の発症を防止するための予防ワクチンおよび化膿性レンサ球菌感染の治療のためのさらなる治療薬が当該分野で必要とされている。
【非特許文献１】Ｌａｎｃｅｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．４７，９−１０，１９２８
【非特許文献２】Ｌａｎｃｅｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９６２年、第８９巻，ｐｐ．３０７−１３
【非特許文献３】Ｆａｃｋｌａｍら，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．２００２年、Ｄｉｓ．３４巻，ｐｐ．２８−３８
【非特許文献４】Ｌｉら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２００３年、１８８巻，ｐｐ．１５８７−９２
【非特許文献５】Ｏ’Ｂｒｉｅｎら，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２００２年、３５巻，ｐｐ．２６８−７６
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の詳細な説明
本発明は、化膿性レンサ球菌感染の防止および／または治療のための組成物を提供する。これらの組成物は、ＧＡＳ細菌の表面上で発現するＧＡＳ抗原であり得る１つまたは複数の活性因子（ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）、ＧＡＳ抗原をコードする核酸分子、および／またはＧＡＳ抗原に選択的に結合する抗体を含む。
【０００８】
ＧＡＳ抗原
本発明の「ＧＡＳ抗原」には、（１）天然に存在するＧＡＳ細菌の免疫原性タンパク質、（２）このようなタンパク質の免疫原性部分、および（３）免疫原性を保持し、天然に存在するＧＡＳ免疫原性タンパク質またはその一部（ホモログ、オルソログ、対立遺伝子変異形、および変異体など）のアミノ酸配列と少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を有する操作タンパク質またはタンパク質の一部が含まれる。特定の配列にしたがって、配列同一度は、好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える）。典型的には、２ポリペプチド配列間の５０％またはそれを超える同一性は、機能的等価物の指標と見なされる。ポリペプチド間の同一性は、好ましくは、ギャップペナルティ＝１２およびギャップ伸長ペナルティ＝１のパラメーターを使用したアフィンギャップ検索を使用したＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）で実行されるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。
【０００９】
例えば、ＧＡＳタンパク質のアミノ酸配列ならびにこのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、表１で同定する。
【００１０】
好ましくは、ＧＡＳ抗原は、ＧＡＳタンパク質より少なくとも１アミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、７６、８０、８５、９０、９５、１００またはこれらを超えるアミノ酸）短い。より好ましくは、ＧＡＳ抗原は、膜貫通ドメインを欠く。さらにより好ましくは、ＧＡＳ抗原は、表面露出ドメインを含む。
【００１１】
本発明はまた、同定されたＧＡＳタンパク質の種々のポリペプチドフラグメント（免疫原性部分が含まれる）を含む。フラグメントの長さは、特定のＧＡＳ抗原のアミノ酸配列に依存して変化し得る。典型的には、ＧＡＳタンパク質のフラグメントは、少なくとも７つの連続するアミノ酸（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、２９、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、１７８、２００、２０３、２５０またはこれらを超える連続アミノ酸）を含む。
【００１２】
好ましくは、フラグメントは、１つまたは複数のエピトープを含む。フラグメントは、少なくとも１つの配列のＴ細胞、好ましくは、Ｂ細胞エピトープを含み得る。Ｔ細胞およびＢ細胞エピトープを、（例えば、ＰＥＰＳＣＡＮ（Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８１：３９９８−４００２；Ｃａｒｔｅｒ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６：２０７−２２３または類似の方法を使用して）経験的に同定するか、（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃインデックス（Ｊａｍｅｓｏｎ，ＢＡ  ｅｔ  ａｌ．１９８８，ＣＡＢＩＯＳ  ４（１）：１８１８−１８６）、行列ベースのアプローチ（Ｒａｄｄｒｉｚｚａｎｉ  ａｎｄ  Ｈａｍｍｅｒ（２０００）Ｂｒｉｅｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．１（２）：１７９−１８９）、ＴＥＰＩＴＯＰＥ（Ｄｅ  Ｌａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：１７２５−１７２９）、神経回路網（Ｂｒｕｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １４（２）：１２１−１３０）、ＯｐｔｉＭｅｒ  ＆  ＥｐｉＭｅｒ（Ｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ  １３（６）：５８１−５９１；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １２（７）：５９３−６１０）、ＡＤＥＰＴ（Ｍａｋｓｙｕｔｏｖ  ＆  Ｚａｇｒｅｂｅｌｎａｙａ（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．９（３）：２９１−２９７）、Ｔｓｉｔｅｓ（Ｆｅｌｌｅｒ  ＆  ｄｅ  ｌａ  Ｃｒｕｚ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９（６３１１）：７２０−７２１）、親水性（Ｈｏｐｐ（１９９３）Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：１８３−１９０）、抗原性指数（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｉｎｄｅｘ）（Ｗｅｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１８８：２１５−２１８）、またはＤａｖｅｎｐｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４２：３９２−２９７に開示の方法などを使用して）予想することができる。
【００１３】
他の好ましいフラグメントには、（１）それぞれ同定されたＧＡＳタンパク質のＮ末端シグナルペプチド、（２）そのＮ末端シグナルペプチドを含まない同定されたＧＡＳタンパク質、（３）１０個までのアミノ酸残基（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはこれらを超える）がＮ末端またはＣ末端から欠失したそれぞれ同定されたＧＡＳ、および（４）そのＮ末端アミノ酸残基を含まないＧＡＳポリペプチドが含まれる。いくつかのフラグメントは、１つまたは複数のタンパク質ドメインが省略されている（例えば、シグナルペプチド、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、および／または細胞外ドメイン）。
【００１４】
いくつかのＧＡＳ抗原は、本明細書中に開示の表面露出ドメインであり得るＧＡＳの免疫原性部分からなる。他のＧＡＳ抗原は、「ハイブリッドＧＡＳ抗原」であり、全長ＧＡＳタンパク質の１つまたは複数の免疫原性部分を含む。ハイブリッドＧＡＳ抗原（全長ＧＡＳ抗原も含まれ得る）を、以下に詳述する。他の融合単タンパク質は、例えば、１つまたは複数のさらなる抗原および／またはタグタンパク質（ポリヒスチジン（ＨＩＳ）またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）など）を含み得る。
【００１５】
好ましくは、ＧＡＳ抗原は、ＧＡＳ細菌の表面上、最も好ましくは、１つを超えるＭ型（例えば、２、３、４、５、６、７、８、または９を超えるＭ型）、詳細には、Ｍ１、Ｍ３、Ｍ６、Ｍ１１、Ｍ１２、および／またはＭ２３ＧＡＳ型の表面上に発現する。ＧＡＳ抗原はまた、好ましくは、少なくとも２つの異なる株（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４またはこれらを超える株）の表面上で見出される。好ましいＧＡＳ抗原は、複数のＭ型および／またはＭ型内の複数の株の間で高度に保存されている。全長ＧＡＳタンパク質およびこのタンパク質が発現されるＭ型を列挙した表２を参照のこと。表２のカラム３〜１３は、Ｍ型（例えば、Ｍ１、Ｍ２など）を列挙している。実施例１に説明するように、ＧＡＳタンパク質の存在は、これらのＭ型の種々の株の表面上に検出された。各型内で試験した株数を、カラム３〜１３の括弧内に示す。最後のカラムは、これらの各ＧＡＳ抗原を発現する全部で２０の試験株からの株数を列挙している。
【００１６】
表２に示すように、いくつかのＧＡＳ抗原は、多数の異なるＭ型の表面上およびこれらのいくつかのＭ型内の複数の株の表面上に発現する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、Ｍ１、Ｍ３、Ｍ６、Ｍ１１、Ｍ１２、および／またはＭ２３型の表面上に発現する１つまたは複数のＧＡＳ抗原を含む。このＧＡＳ型の好ましいＧＡＳ抗原：
【００１７】
【化３３】
2008544949.tif 000002
。さらにより好ましくは、ＧＡＳ抗原は、少なくとも１０のＭ型（例えば、ＧＡＳ５、２２、４０、５６、６７、７６、７７、９６、９９、１０３、１４２、１６６、１８８、および１９０）上に曝露されている。
【００１８】
本発明のＧＡＳ抗原には、以下のＧＡＳタンパク質：
【００１９】
【化３４】
2008544949.tif 000003
の表面露出ドメインも含まれる（表７を参照のこと）。
【００２０】
他のＧＡＳ抗原には、以下のＧＡＳタンパク質：
【００２１】
【化３５】
2008544949.tif 000004
の表面露出ドメインが含まれる（表８を参照のこと）。
【００２２】
さらに他には、以下のＧＡＳタンパク質：
【００２３】
【化３６】
2008544949.tif 000005
の表面露出ドメインが含まれる（表９を参照のこと）。
【００２４】
いくつかの表面露出ドメインを、配列番号５９１〜６４９に示す。他の表面露出ＧＡＳ抗原は、配列番号１〜１２８からなる群から選択される少なくとも７つの連続するアミノ酸（すなわち、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、５０、７５または１００あるいはこれらを超える）を含む。
【００２５】
ＧＡＳ抗原には、以下のＧＡＳタンパク質：
【００２６】
【化３７】
2008544949.tif 000006
の表面露出ドメインも含まれる。より好ましいＧＡＳ抗原は、
【００２７】
【化３８】
2008544949.tif 000007
の表面露出ドメインを含む。さらにより好ましい表面露出ＧＡＳ抗原は、ＧＡＳ４７２、ＧＡＳ４７３、またはＧＡＳ５５３の表面露出ドメインを含む。
【００２８】
他の有用なＧＡＳ抗原には、
【００２９】
【化３９】
2008544949.tif 000008
、ならびにＭタンパク質、ＧＡＳフィブロネクチン結合タンパク質、ＧＡＳレンサ球菌ヘム結合タンパク質、およびストレプトリジンＳ抗原が含まれる。
【００３０】
本発明のワクチンで使用する好ましいＧＡＳ抗原群には、
【００３１】
【化４０】
2008544949.tif 000009
が含まれる（表１６を参照のこと）。
【００３２】
ＧＡＳ６８０は、推定ＣｏＡ結合タンパク質と注釈がつけられ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：１３６２１４８１およびＧＩ：７１９０９９７４、Ｍ４９  ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：５６８０８５３４、Ｍｌ８  ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  ＧＩ：１９７４７４５４、Ｍ３  ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  ＧＩ：２８８９５０６２に対応し、
【００３３】
【化４１】
2008544949.tif 000010
ともいう。
【００３４】
本発明のＧＡＳワクチンには、好ましくは、ＧＡＳ５７および／またはＧＡＳ４０の全部または表面部分が含まれる。
【００３５】
ＧＡＳ４０抗原
ＧＡＳ４０タンパク質が多くのＭ型およびこれらのＭ型の複数の株で高度に保存されているので、ＧＡＳ４０抗原は本発明の組成物で特に有用である（図１を参照のこと）。ＧＡＳ４０タンパク質は、ＷＯ０５／０３２５８２号に詳述されている。図１５も参照のこと。ＧＡＳ４０は、常に、動物モデルを全身免疫化および攻撃誘発ならびに細菌抗体の誘導から防御する（以下の特定の実施例を参照のこと）。ＧＡＳ４０は、極めて高度に保存されたタンパク質であり、ほとんどのＭ血清型の表面上に曝露されているようである（これまで認められている唯一の例外はＭ３血清型である）。
【００３６】
種々のＭ株由来の多数のＧＡＳ４０タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号１７〜４３に示す。いくつかのＧＡＳタンパク質のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋにも含まれ、アクセッション番号ＧＩ：１３６２１５４５およびＧＩ１５６７４４４９（Ｍｌ）；アクセッション番号ＧＩ：２１９０９７３３（Ｍ３）、およびアクセッション番号ＧＩ：１９７４５４０２（Ｍｌ８）を有する。ＧＡＳ４０タンパク質は、「ＳｐｙＯ２６９」（Ｍｌ）、「ＳｐｙＭ３＿０１９７」（Ｍ３）、「ＳｐｙＭ１８＿０２５６」（Ｍｌ８）、および「ｐｒｇＡ」としても公知である。
【００３７】
ＧＡＳ４０タンパク質は、典型的には、リーダーペプチド配列（例えば、配列番号１７のアミノ酸１〜２６）、第１のコイルドコイル領域（例えば、配列番号１７のアミノ酸５８〜２６１）、第２のコイルドコイル領域（例えば、配列番号１７のアミノ酸５５６〜７３３）、ロイシンジッパー領域（例えば、配列番号１７のアミノ酸６７３〜７０１）、および膜貫通領域（例えば、配列番号１７のアミノ酸８５５〜８６６）を含む。
【００３８】
ＧＡＳ４０タンパク質の好ましいフラグメントは、Ｃ末端由来の１つまたは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはこれらを超える）および／またはＧＡＳ４０タンパク質のＮ末端由来の１つまたは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはこれらを超える）を欠く。１つの実施形態では、リーダー配列が除去されている。別の実施形態では、膜貫通領域が除去されている。他のフラグメントは、ＧＡＳ４０タンパク質の１つまたは複数の他のドメインを省くことができる。
【００３９】
ＧＡＳ４０のコイルドコイル領域は、二量体または三量体などのオリゴマーの形成に関与する可能性が高い。このようなオリゴマーは、ホモマー（相互にオリゴマー化した２つまたはこれを超えるＧＡＳ４０タンパク質を含む）またはヘテロマー（ＧＡＳ４０とオリゴマー化した１つまたは複数のさらなるＧＡＳタンパク質を含む）であり得る。あるいは、２つのコイルドコイル領域は、ＧＡＳ４０タンパク質内で相互作用して、第１および第２のコイルドコイル領域の間にオリゴマー反応物を形成することができる。したがって、いくつかの実施形態では、ＧＡＳ４０抗原は、オリゴマーの形態である。いくつかのオリゴマーは、２つを超えるＧＡＳ４０抗原を含む。他のオリゴマーは、第２のＧＡＳ抗原とオリゴマー化したＧＡＳ４０抗原を含む。
【００４０】
他の有用なＧＡＳ抗原には、ＧＡＳ４０およびＧＡＳ１１７を含む融合タンパク質が含まれる。「４０／１１７」は、ＧＡＳ４０タンパク質がＧＡＳ１１７タンパク質のＮ末端に存在し、且つＨＩＳタグがＧＡＳ１１７タンパク質のＣ末端に付加されたＧＡＳハイブリッド抗原である（配列番号２３４）。「１１７／４０」は、リンカー排列ＹＡＳＧＧＧＳ（配列番号２７８）によってＧＡＳ１１７がＧＡＳ４０に融合したＧＡＳハイブリッド抗原である。そのアミノ酸配列を、配列番号２３３に示す。
【００４１】
「ＧＡＳ４０ａ−ＨＩＳ」は、ＨＩＳタグを有するが、リーダー配列および疎水性配列を含まないＧＡＳ４０抗原である（配列番号２３５）。ＧＡＳ４０ａをコードするヌクレオチド配列を、配列番号８９２に示す（コドン８２４（野生型配列中のＡＧＡ）をＣＧＴに変異誘発した）。「ＧＡＳ４０ａＲＲ」は、コード配列中の２つのさらなるＡＧＡコドン（３３４および３３５）がＣＧＴに変異していること以外はＧＡＳ４０ａに類似している。
【００４２】
ハイブリッドＧＡＳ抗原
ＧＡＳ抗原は、それぞれ個別のポリペプチドとして本発明の組成物中に存在することができる。あるいは、上記のＧＡＳ抗原のいずれかの少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０）を、１つのポリペプチド鎖（すなわち、「ハイブリッドＧＡＳ抗原」）として発現することができる。ハイブリッドＧＡＳ抗原は、２つの主な利点を付与する。第１に、そのままでは不安定であり得るかあまり発現することができないポリペプチドを、適切なハイブリッドパートナーの付加によって補助し、問題を克服することができる。第２に、たった１つの発現および精製手順によって２つのポリペプチドが産生され、その両方が抗原的に有用であるので、市販の製品が簡素化される。
【００４３】
ハイブリッドＧＡＳ抗原は、ＧＡＳ抗原の１つまたは複数のアミノ酸配列および／または１つまたは複数の本発明の他のＧＡＳ抗原を含み得る。ハイブリッドは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個またはこれらを超えるＧＡＳ抗原由来のアミノ酸配列を含み得る。本発明の組成物では、ＧＡＳ抗原は、１つを超えるハイブリッドＧＡＳ抗原中に存在することができ、そして／または非ハイブリッドＧＡＳ抗原として存在することができる。
【００４４】
ハイブリッドＧＡＳ抗原は、１つのポリペプチド鎖として発現した少なくとも２つのＧＡＳ抗原（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０）を含む。好ましいハイブリッドＧＡＳ抗原は、少なくとも１つの表面露出ＧＡＳ抗原および／または表面結合ＧＡＳ抗原を含む。ハイブリッドＧＡＳ抗原は、２つの主な利点を付与する。第１に、そのままでは不安定であり得るかあまり発現することができないポリペプチドを、適切なハイブリッドパートナーの付加によって補助し、問題を克服することができる。第２に、たった１つの発現および精製手順によって２つのポリペプチドが産生され、その両方が抗原的に有用であるので、市販の製品が簡素化される。
【００４５】
ハイブリッドＧＡＳ抗原を、以下の式によって示すことができる：
ＮＨ２−Ａ−（−Ｘ−Ｌ−）ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨ
（式中、Ｘは表面露出ＧＡＳ抗原および／または表面結合ＧＡＳ抗原または二次ＧＡＳ抗原のアミノ酸配列であり、Ｌは任意選択的なリンカーアミノ酸配列であり、Ａは任意選択的なＮ末端アミノ酸配列であり、Ｂは任意選択的なＣ末端アミノ酸配列であり、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５である）。
【００４６】
−Ｘ−部分がその野生型形態のリーダーペプチド配列を有する場合、これを、ハイブリッド抗原中に含めても省いてもよい。いくつかの実施形態では、ハイブリッドタンパク質のＮ末端に存在するＸ部分のリーダーペプチド以外のリーダーペプチドを欠失する（すなわち、Ｘ１のリーダーペプチドを保持するが、Ｘ２．．．Ｘｎのリーダーペプチドが省かれる）。これは、全リーダーペプチドの欠失および部分−Ａ−としてのＸ１のリーダーペプチドの使用と等価である。
【００４７】
（−Ｘ−Ｌ−）の各ｎの例について、リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、存在していても存在しなくても良い。例えば、ｎ＝２の場合、ハイブリッドは、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨなどであり得る。リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、典型的には、短い（例えば、２０またはそれ未満のアミノ酸（すなわち、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１））。例には、クローニングを容易にする短いペプチド配列、ポリグリシンリンカー（Ｇｌｙｎ（式中、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、２０またはこれらを超える）、およびヒスチジンタグ（Ｈｉｓｎ（式中、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはこれらを超える）が含まれる。他の適切なリンカーアミノ酸配列は、当業者に明らかである。有用なリンカーは、Ｇｌｙ−ＳｅｒジペプチドがＢａｍＨＩ制限部位から形成されており、これがクローニングおよび操作を補助するＧＳＧＧＧＧ（配列番号２８０）であり、（Ｇｌｙ）４テトラペプチドは典型的なポリグリシンリンカーである。
【００４８】
−Ａ−は、任意選択的なＮ末端アミノ酸配列である。これは、典型的には、短い（例えば、４０またはそれ未満のアミノ酸（すなわち、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１））。例には、タンパク質輸送を指示するためのリーダー配列またはクローニングまたは精製を容易にする短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグＨｉｓｎ（式中、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０、またはこれらを超える）が含まれる。他の適切なＮ末端アミノ酸配列は、当業者に明らかである。Ｘ１がそれ自体のＮ末端メチオニンを欠く場合、−Ａ−は、好ましくは、Ｎ末端メチオニンを提供するオリゴペプチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８のアミノ酸を含む）である。
【００４９】
−Ｂ−は、任意選択的なＣ末端アミノ酸配列である。これは、典型的には、短い（例えば、４０またはそれ未満のアミノ酸（すなわち、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１））。例には、タンパク質輸送を指示するための配列またはクローニングまたは精製を容易にする短いペプチド配列（例えば、Ｈｉｓｎ（式中、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０、またはこれらを超える）、またはタンパク質安定性を増強する配列が含まれる。他の適切なＣ末端アミノ酸配列は、当業者に明らかである。
【００５０】
ハイブリッド内の各ＧＡＳ抗原（各−Ｘ−部分）は、１つまたは複数の株または１つまたは複数のＭ型に由来し得る。ｎ＝２の場合、例えば、Ｘ２はＸ１と同一の株もしくは型または異なる株または型に由来し得る。ｎ＝３の場合、株は、
【００５１】
【化４２】
2008544949.tif 000011
であり得る。
【００５２】
表面露出ＧＡＳ抗原の同定
表面露出ＧＡＳ抗原および／または表面結合ＧＡＳ抗原（ＧＡＳ「サーフォーム（ｓｕｒｆｏｍｅ）」）を、以下に概説のいくつかのプロテオミクスアプローチの任意の１つまたは組み合わせを使用して同定することができる。これらのプロテオミクスストラテジーは、逆ワクチン学（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ）などの他のストラテジーと比較した場合にワクチン発見に必要な時間が短縮される可能性が非常に高い。これらの方法によって同定された表面結合ＧＡＳ抗原および／または表面結合ＧＡＳ抗原を、化膿性レンサ球菌感染の防止および治療のための組成物中の活性因子として使用することができる。
【００５３】
１つの実施形態を、実施例１３に記載する。簡潔に述べれば、全ＧＡＳ細菌細胞の表面を、生理学的条件下でタンパク質を切断する試薬を使用してｉｎ  ｖｉｖｏで消化する。典型的には、試薬はプロテアーゼ（例えば、トリプシン、プロテアーゼＫ、パパイン）であるが、任意のタンパク質切断試薬を使用することができる。これらの試薬には、例えば、ギ酸、ヒドロキシルアミン、ＢＮＰＳ−スカトール（Ｔｒｐ残基で切断する３−ブロモ−３−メチル−２−（ｏ−ニトロフェニル−スルフェニル）−インドレニン）、臭化シアン（目地温残基のカルボキシル側のポリペプチドを切断する）、金属キレート試薬（Ｆｅ−ＥＤＴＡなど）などが含まれる。プロテアーゼは、遊離であっても繋留されていても良く、この後者の状態は、表面突出領域の同定に好ましい。１つを超えるタンパク質切断試薬の組み合わせを使用することができる。次いで、回収されたペプチドを、液体クロマトグラフィによって分離し、タンデム質量分析によって同定する。同定されたタンパク質の免疫系への実際の接近可能性を、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析によって評価することができる。このプロテオミクスアプローチにより、ソフトウェアベースのトポロジー予測を検証するかその逆が可能である。
【００５４】
別の実施形態を、実施例１４に記載する。このアプローチは、抗生物質処置後のＧＡＳ細菌からの膜脱制限構造の過剰産生を含む。Ｈａｋｅｎｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５５，１３７２−８１，１９８３（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。野生型ＧＡＳ細菌または変異ＧＡＳ細菌のいずれか（例えば、「漏出性」または脱安定化ペプチドグリカン細胞壁を有する細菌）を、本方法で使用することができる。ＧＡＳ細菌は、膜脱制限構造を天然に産生し、成長培地に放出する。細菌を細胞壁の合成を妨害する抗生物質（ペニシリン、セファロスポリン、グリコペプチド、およびシクロセリンなど）で処置した場合、これらの膜脱制限構造の産生が増加する。バンコマイシン（細胞壁合成およびソルターゼ（ｓｏｒｔａｓｅ）を阻害するグリコペプチド）は、ソルターゼによって触媒される表面タンパク質繋留を妨害し、これを使用して、膜脱制限構造の過剰産生をさらに増加させることができる。膜脱制限構造は、潜在的なワクチン候補であるＧＡＳタンパク質を含む。ＧＡＳタンパク質を、電気泳動によって分離し、質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を使用して同定することができる。あるいは、ＧＡＳタンパク質をプロテアーゼで消化し、得られたフラグメントを、液体クロマトグラフィによって分離し、タンデム質量分析を使用して同定することができる。
【００５５】
第３の実施形態を、実施例１５に記載する。この方法では、細胞壁および／または膜画分を、例えば、６Ｍグアニジウム、尿素、またはＳＤＳを使用した細菌細胞の化学的細胞分画によって生成する。細胞壁は、これらの試薬中で不溶性を示す。この特性により、細胞壁を単離し、繋留細胞壁タンパク質を同定することが可能である。これらの画分中のＧＡＳタンパク質を、上記のように分離し、同定することができる。
【００５６】
第４の実施形態は、細胞表面ＧＡＳタンパク質の標識（例えば、ビオチン化による）、細胞の溶解、およびアフィニティクロマトグラフィを使用した標識タンパク質の単離を含む。単離タンパク質を、電気泳動によって分離し、質量分析を使用して同定することができる。あるいは、単離タンパク質を、溶液中で消化し、その後に標識ペプチドをアフィニティクロマトグラフィによって単離し、標識ペプチドを液体クロマトグラフィによって分離し、標識ペプチドをタンデム質量分析を使用して同定することができる。これらの方法により、標識ペプチドが選択的に単離され、それにより、真に曝露されたドメインを同定可能である。この場合、２つのアフィニティクロマトグラフィ工程の使用により、クロマトグラフィカラムにロードされるサンプルの複雑さが軽減される。
【００５７】
全ての上記実施形態について、より豊富な公知の表面露出抗原（Ｍタンパク質およびＣ５ａペプチダーゼなど）の１つの遺伝子が欠失した変異体を使用することができる。これらの変異体により、以前に同定されていないあまり豊富でない表面タンパク質の確率が増加する。
【００５８】
細菌サーフォームの分析により、化膿性レンサ球菌に対するワクチンで有用な抗原の強力な同定方法が得られる。例えば、これらの技術を使用して、上記のように、本発明者らは、マウスにおいて高病原性Ｍ３（ＭＧＡＳ３１５）株に対する顕著な防御を付与するタンパク質Ｓｐｙ０４１６（ＧＡＳ５７）を同定した。Ｓｐｙ０４１６は、１６４７個のアミノ酸タンパク質であり、Ｃ末端ＬＰＸＴＧ様モチーフを保有し、Ｃ５ａペプチダーゼ前駆体と４８％類似している。配列番号１１８を参照のこと。このタンパク質は、タンパク質の最初の６００アミノ酸内にマッピングされるＣａ依存性セリンプロテアーゼ活性を有する（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｅｓｐｌａ，Ａｐｐ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０００）。ＳｐｙＯ４１６はＢ群レンサ球菌（ＧＢＳ）（ｃｓｐＡ）中にホモログを有し、このホモログは、オプソニン化食作用（ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ）による死滅から細菌を潜在的に防御することによってＧＢＳ病原性に関与すると提案されていた（Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｔ  ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｉｌｌ，６１−７０，２００３）。Ｌｅｉ  ａｎｄ  ｃｏ−ｗｏｒｋｅｒｓは、最近、Ｓｐｙ０４１６の３１ｋＤａＮ末端フラグメントがＧＡＳ培養物上清中に放出され、ＧＡＳ感染患者由来の血清によってタンパク質が十分に認識されることを見出した（Ｌｅｉ  ｅｔ  ａｔ，Ｉｎｆ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６８，６８０７−１８，２０００）。５つの利用可能な化膿性レンサ球菌ゲノム配列に基づいて、タンパク質は高度に保存されているようであり（９８％超）、２０の異なるＧＡＳ株パネル上の表面発現についての予備データは、Ｓｐｙ０４１６が７０％を超える循環株の主成分であることを示す。したがって、Ｓｐｙ０４１６は、単独または１つまたは複数の他のＧＡＳ抗原と組み合わせた免疫原性組成物での使用に好ましい抗原である。
【００５９】
核酸分子
配列表は、本明細書中に開示の表面露出ドメインおよび／または表面結合ドメインおよび全長タンパク質ならびにさらなる開示された二次ＧＡＳ抗原のコード配列を示す。しかし、下記のように、特定の抗原をコードする任意のヌクレオチド配列を、例えば、ＤＮＡワクチンとして本発明の組成物中で使用することができるか、組換えによってＧＡＳ抗原を産生するために使用することができる。少なくとも３つのＧＡＳ株の全ゲノム配列が光的に利用可能であり、これらを使用してＧＡＳ抗原のコード配列を得ることができる。Ｍ１  ＧＡＳ株のゲノム配列は、Ｆｅｒｒｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８，４６５８−６３，２００２で報告されている。Ｍ３  ＧＡＳ株のゲノム配列は、Ｂｅｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，１００７８−８３，２００２で報告されている。Ｍ１８  ＧＡＳ株のゲノム配列は、Ｓｍｏｏｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，４６６８−７３，２００２で報告されている。
【００６０】
本発明は、同定されたＧＡＳタンパク質およびタンパク質フラグメントをコードする核酸分子を含む。本発明はまた、このような分子と少なくとも５０％の配列が同一なヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。特定の配列に依存して、配列同一度は、好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれらを超える）。ヌクレオチド配列間の同一性を、好ましくは、パラメーター（ギャップオープンペナルティ＝１２およびギャップ伸長ペナルティ＝１）を使用したアフィンギャップ検索を使用してＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）で実行されるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定する。
【００６１】
本発明はまた、これらの分子とハイブリッド形成することができる核酸分子を提供する。ハイブリッド形成反応を、異なる「ストリンジェンシー」条件下で行うことができる。ハイブリッド形成反応のストリンジェンシーを増加させる条件は、当該分野で広く知られており、公開されている。例えば、ｐａｇｅ  ７．５２  ｏｆ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８９を参照のこと。関連条件の例には、以下が含まれる（ストリンジェンシーが増大する順序で）：２５℃、３７℃、５０℃、５５℃および６８℃のインキュベーション温度、１０×ＳＳＣ、６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、および０．１×ＳＳＣ（ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸緩衝液である）の緩衝液濃度、ならびに他の緩衝液系を使用したその等価物、０％、２５％、５０％、および７５％のホルムアルデヒド濃度、５分〜２４時間のインキュベーション時間、１回、２回、またはこれらを超える洗浄工程数、１、２、または１５分間の洗浄インキュベーション時間、６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ、または脱イオン水の洗浄液。ハイブリッド形成技術およびその至適化は、当該分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄ．，１９９９；米国特許第５，７０７，８２９号；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａ！．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０，１９８７を参照のこと。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は低ストリンジェンシー条件下で標的とハイブリッド形成し、他の実施形態では、本発明の核酸分子は中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成し、好ましい実施形態では、本発明の核酸分子は高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成する。低ストリンジェンシーハイブリッド形成条件の例は、５０℃および１０×ＳＳＣである。中程度のストリンジェンシーハイブリッド形成条件の例は、５５℃および１×ＳＳＣである。高ストリンジェンシーハイブリッド形成条件の例は、６８℃および０．１×ＳＳＣである。
【００６３】
これらの配列のフラグメントを含む核酸分子も本発明に含まれる。これらは、これらの配列のｎ個の連続するヌクレオチドを含み、特定の配列に依存して、ｎは１０またはこれを超える（例えば、１２、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００またはこれらを超える）。
【００６４】
本発明の核酸（およびポリペプチド）には、以下の配列が含まれ得る：
（ａ）配列表に開示された配列と同一の配列（すなわち、１００％同一）、
（ｂ）配列表に開示された配列と配列同一性を共有する配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列と比較して離れた位置に存在し得るか連続し得る、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の単一のヌクレオチドまたはアミノ酸が変化している配列、および
（ｄ）ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列表由来の特定の配列とアラインメントした場合、ｐ−ｘ＋１個のこのような窓が存在するｐモノマー（ｐ＞ｘの場合）まで伸長するアラインメントについて、各窓が少なくともｘ・ｙ個の同一のアラインメントしたモノマーを有し（ここで、ｘは、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００から選択され、ｙは０．５０、０．６０、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９から選択される）、ｘ・ｙが整数ではない場合、最も近い整数まで切り上げられるような開始（Ｎ末端または５’）から終止（Ｃ末端または３’）まで移動するｘモノマー（アミノ酸またはヌクレオチド）の窓の移動。好ましいペアワイズアラインメントアルゴリズムは、デフォルトパラメータ（例えば、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を使用したギャップオープンペナルティ＝１０．０およびギャップ伸長ペナルティ＝０．５）を使用したＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ全域アラインメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３）である。このアルゴリズムは、ＥＭＢＯＳＳパッケージ中のニードルツールで都合良く実行される（Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７］。
【００６５】
本発明の核酸およびポリペプチドは、さらに、これらの配列（ａ）〜（ｄ）のＮ末端／５’および／またはＣ末端／３’に対する配列をさらに有することができる。
【００６６】
抗体
本明細書中に開示の表面露出ＧＡＳ抗原および／または表面結合ＧＡＳ抗原または二次ＧＡＳまたは非ＧＡＳポリペプチド抗原に特異的に結合する抗体を生成することができる。用語「抗体」には、インタクトな免疫グロブリン分子ならびに抗原結合することができるそのフラグメントが含まれる。これらには、ハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えば、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４９，２９３−９９，１９９１；米国特許第４，８１６，５６７号）、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ａｂ）フラグメントならびにＦｖ分子、非共有結合性ヘテロ二量体（例えば、Ｉｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．６９，２６５９−６２，１９７２；Ｅｈｒｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９，４０９１−９６，１９８０）、単鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５，５８９７−８３，１９８８）、二量体および三量体の抗体フラグメント構築物、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）（例えば、Ｐａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３１，１５７９−８４，１９９２；Ｃｕｍｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４９Ｂ，１２０−２６，１９９２）、ヒト化抗体分子（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２，３２３−２７，１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９，１５３４−３６，１９８８；および１９９４年９月２１日公開の英国特許公開番号ＧＢ  ２，２７６，１６９号、このような分子から得た任意の機能的フラグメント、ならびにファージディスプレイなどの非従来的プロセスによって得た抗体が含まれる。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体を得る方法は、当該分野で周知である。
【００６７】
典型的には、エピトープの形成には、少なくとも６、７、８、１０、または１２個の連続したアミノ酸が必要である。しかし、非連続アミノ酸を含むエピトープは、より多くの（例えば、少なくとも１５、２５、または５０個の）アミノ酸を必要とし得る。種々の免疫アッセイ（例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、放射免疫アッセイ、免疫組織化学アッセイ、免疫沈降、または当該分野で公知の他の免疫化学アッセイ）を使用して、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。競合性結合または免疫放射定量アッセイのための多数のプロトコールが当該分野で周知である。このような免疫アッセイは、典型的には、免疫原と免疫原に特異的に結合する抗体との間の複合他形成の測定を含む。特定の抗原に特異的に結合する抗体の調製物により、免疫化学アッセイで使用した場合、他のタンパク質を使用して得た検出シグナルの少なくとも５、１０、または２０倍の検出シグナルが得られる。好ましくは、抗体は、免疫化学アッセイで他のタンパク質を検出せず、溶液から特定の抗原を免疫沈降することができる。
【００６８】
抗体の生成
ＧＡＳ抗原または非ＧＡＳポリペプチド抗原（下記）を使用して、哺乳動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、またはヒトなど）を免疫化してポリクローナル抗体を産生することができる。必要に応じて、抗原を、キャリアタンパク質（ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、およびキーホールリンペットヘモシアニンなど）に抱合することができる。宿主の種に依存して、種々のアジュバントを使用して、免疫応答を増大指せることができる。このようなアジュバントには、フロイントアジュバント、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、および界面活性剤（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノール）が含まれるが、これらに限定されない。ヒトで使用されるアジュバントのうち、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルバムが特に有用である。
【００６９】
抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を、連続継代細胞株によって抗体分子を産生する任意の技術を使用して調製することができる。これらの技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶハイブリドーマ技術が含まれるが、これらに限定されない（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５  ４９７，１９８５；Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８１，３１  ４２，１９８５；Ｃｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０，２０２６  ２０３０，１９８３；Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６２，１０９  １２０，１９８４）。
【００７０】
さらに、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（適切な抗原特異性および生物活性を有する分子を得るためのヒト抗体遺伝子に対するマウス抗体遺伝子のスプライシング）を使用することができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１，６８５１  ６８５５，１９８４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２，６０４  ６０８，１９８４；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４，４５２  ４５４，１９８５）。モノクローナル抗体および他の抗体を「ヒト化」して、治療で使用した場合に患者が抗体に対する免疫応答を生じるのを防止することができる。このような抗体は、治療で直接使用されるヒト抗体と配列が十分に類似し得るか、いくつかの重要残基の変化を必要とし得る。各残基の部位特異的範囲誘発または全相補性決定領域のグラフティングによるヒト配列と配列が異なる残基の置換によって、げっ歯類抗体とヒト配列との間の配列の相違を最小にすることができる。
【００７１】
あるいは、下記の組換え法を使用して、ヒト化抗体を産生することができる。米国特許第５，５６５，３３２号に開示のように、特定の抗原に特異的に結合する抗体は、部分的または完全にヒト化された抗原結合部位を含み得る。
【００７２】
あるいは、単鎖抗体の産生について記載した技術を当該分野で公知の方法を使用して、特定の抗原に特異的に結合する単鎖抗体を産生するように適合させることができる。関連する特異性を有するがイディオタイプ組成が異なる抗体を、鎖シャフリングによって無作為な組み合わせ免疫グロブリンライブラリーから生成することができる（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｃ．Ｓｃｉ．８８，１１１２０  ２３，１９９１）。
【００７３】
テンプレートとしてハイブリドーマｃＤＮＡを使用したＰＣＲなどのＤＮＡ増幅法を使用して、単鎖抗体を構築することもできる（Ｔｈｉｒｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ．５，５０７−１１）。単鎖抗体は、単一特異性または二重特異性を示し、２価または３価であり得る。４価の二重特異性単鎖抗体の構築は、例えば、Ｃｏｌｏｍａ  ＆  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９９７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５，１５９−６３に教示されている。２価の二重特異性単鎖抗体の構築は、Ｍａｌｌｅｎｄｅｒ  ＆  Ｖｏｓｓ，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１９９−２０６に教示されている。
【００７４】
下記のように、単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を、手作業または自動化されたヌクレオチド合成を使用して構築し、標準的な組換えＤＮＡ法を使用して発現構築物にクローン化し、コード配列を発現鎖させるための細胞に移入することができる。あるいは、単鎖抗体を、例えば、線状ファージテクノロジーを使用して直接産生することができる（Ｖｅｒｈａａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６１，４９７−５０１；Ｎｉｃｈｏｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６５，８１−９１）。
【００７５】
文献に開示のように、特定の抗原に特異的に結合する抗体を、リンパ球集団のｉｎ  ｖｉｖｏ産生の誘導または特異性の高い結合試薬の免疫グロブリンのライブラリーもしくはパネルのスクリーニングによって産生することもできる（Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，３８３３  ３８３７，１９８９；Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４９，２９３  ２９９，１９９１）。
【００７６】
ＷＯ９３／０３１５１号に開示のように、キメラ抗体を構築することができる。免疫グロブリンに由来し、且つ多価および多重特異性を示す結合タンパク質（ＷＯ９４／１３８０４号に記載の「ダイアボディ」など）を調製することもできる。
【００７７】
当該分野で周知の方法によって抗体を精製することができる。例えば、関連抗原が結合したカラムの通過によって、抗体を親和性精製することができる。次いで、結合した抗体を、高塩濃度の緩衝液を使用してカラムから溶離することができる。
【００７８】
ポリペプチド抗原の産生
ポリペプチドの組換え産生
特定の抗原をコードする任意のヌクレオチド配列を使用して、抗原を組換えによって産生することができる。必要に応じて、一旦そのアミノ酸配列がわかると、抗体を組換えによって産生することができる。
【００７９】
本発明のＧＡＳ抗原を産生するために使用することができる配列の例を、表１に分類する。表面露出ＧＡＳ抗原および／または表面結合ＧＡＳ抗原または二次ＧＡＳ抗原をコードする核酸分子を、標準的な核酸精製技術を使用して適切な化膿性レンサ球菌から単離するか、増幅技術（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）など）を使用するか、自動化合成機の使用によって合成することができる。核酸の単離方法は日常的であり、当該分野で公知である。任意のこのような核酸分子を得るための技術を使用して、特定の抗原をコードする核酸分子を得ることができる。特定の抗原または抗体をコードする配列の全体または一部を、当該分野で周知の化学的方法を使用して合成することができる（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２１５  ２２３，１９８０；Ｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２２５  ２３２，１９８０を参照のこと）。
【００８０】
テンプレートとしてｍＲＮＡを使用した標準的分子生物学技術を使用して、ｃＤＮＡ配列を作製することができる。その後、ｃＤＮＡ分子を、当該分野で周知の分子生物学技術を使用して複製することができる。テンプレートとしてゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれかを使用したＰＣＲなどの増幅技術を使用して、本発明のポリヌクレオチドのさらなるコピーを得ることができる。
【００８１】
必要に応じて、当該分野で一般的に公知の方法を使用してヌクレオチド配列を操作し、種々の理由のために抗原コード配列を変化させることができる（ポリペプチドまたはｍＲＮＡ産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を修飾する変化が含まれるが、これらに限定されない）。ランダム断片化によるＤＮＡシャフリングおよび遺伝子フラグメントのＰＣＲ再アセンブリ、および合成オリゴヌクレオチドを使用して、ヌクレオチド配列を操作することができる。例えば、部位特異的変異誘発を使用して、新規の制限部位を挿入し、グリコシル化パターンを変化させ、コドン使用頻度を変化させ、スプライスバリアントを産生し、変異を移入するなどを行うことができる。
【００８２】
配列修飾（精製タグ配列の付加またはコドン至適化など）を使用して、発現を容易にすることができる。例えば、Ｎ末端リーダー配列を、ポリヒスチジン（「ＨＩＳ」）またはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（「ＧＳＴ」）などのタグタンパク質をコードする配列と置換することができる。このようなタグタンパク質を使用して、精製、検出、および発現タンパク質の安定性を促進することができる。特定の原核生物宿主または真核生物宿主によって好まれるコドンを選択して、タンパク質発現率を増加させるか望ましい性質（天然に存在する配列から生成した転写物よりも長い半減期など）を有するＲＮＡ転写物を産生することができる。これらの方法は、当該分野で周知であり、ＷＯ０５／０３２５８２号に記載されている。
【００８３】
発現ベクター
抗原または抗体をコードする核酸分子を、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含む発現ベクターに挿入することができる。当業者に周知の方法を使用して、コード配列ならびに適切な転写および翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子組換えが含まれる。
【００８４】
宿主細胞
異種宿主は、原核生物宿主または真核生物宿主であり得る。大腸菌は、好ましい宿主細胞であるが、他の適切な宿主には、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトコッカス・クレモリス、枯草菌、コレラ菌、チフス菌、ネズミチフス菌、ナイセリア・ラクタミカ、ナイセリア・シネレア、マイコバクテリア（例えば、結核菌）、酵母などが含まれる。
【００８５】
宿主細胞株を、挿入配列の発現を調整するか所望の様式で発現ポリペプチドをプロセシングする能力について選択することができる。ポリペプチドのこのような修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアセチル化が含まれるが、これらに限定されない。ポリペプチドの「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングを使用して、正確な挿入、折り畳み、および／または機能を促進することもできる。翻訳後活性に特異的な細胞機構および特徴的な機構を有する異なる宿主細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９）から利用可能であり、外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にするために選択することができる。ＷＯ０１／９８３４０号を参照のこと。
【００８６】
発現構築物を、十分に確立されている技術（トランスフェリン−ポリカチオン媒介ＤＮＡ導入、裸の核酸または莢膜化された核酸でのトランスフェクション、リポソーム媒介細胞融合、ＤＮＡコーティングラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、エレクトロポレーション、「遺伝子銃」法、およびＤＥＡＥまたはリン酸カルシウム媒トランスフェクションが含まれるが、これらに限定されない）を使用して、宿主に移入することができる。
【００８７】
発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、発現および細胞培養物からのタンパク質の回収に適切な条件下で培養することができる。使用したヌクレオチド配列および／または発現ベクターに依存して、形質転換細胞によって産生されたタンパク質を分泌するか、細胞内に含めることができる。当業者は、原核細胞膜または真核細胞膜を介した可溶性抗原の分泌を指示するシグナル配列を含むように発現ベクターをデザインすることができると理解する。
【００８８】
精製
本発明で使用される抗原を、適切な化膿性レンサ球菌またはＧＡＳ抗原もしくは非ＧＡＳ抗原を産生するように操作された宿主細胞から単離することができる。当該分野で周知の方法を使用して、精製ポリペプチド抗原を、細胞中の他の成分（タンパク質、炭水化物、または脂質など）から分離する。このような方法には、サイズ排除クロマトグラフィ、硫酸アンモニウム分画、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、および分離ゲル電気泳動が含まれるが、これらに限定されない。精製ポリペプチド抗原の調製物の純度は、少なくとも８０％であり、好ましくは、調製物の純度は、９０％、９５％、または９９％である。調製物の純度は、既知のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法のような手法によって評価できる。必要に応じて、ポリペプチド抗原を、例えば、尿素を使用して可溶化することができる。
【００８９】
化学合成
本発明の組成物中で使用されるＧＡＳ抗原および他の抗原を、例えば、固相技術を使用して合成することができる。例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，２１４９  ５４，１９６３；Ｒｏｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９，２０２  ０４，１９９５を参照のこと。手作業の技術または自動化を使用してタンパク質合成を行うことができる。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａペプチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、自動化合成を行うことができる。任意選択的に、表面露出ＧＡＳ抗原および／または表面結合ＧＡＳ抗原のフラグメントを個別に合成し、化学的方法を使用して組み合わせて全長分子を産生することができる。
【００９０】
抗体またポリペプチド抗原をコードする核酸分子を、従来の方法（リン酸トリエステル法（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４），Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：１０５−１１１）など）または核酸の化学合成（Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９８１），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：ｒ４３−ｒ７４）によって合成することができる。
【００９１】
免疫原性組成物、診断組成物、および治療組成物
本発明はまた、薬物（例えば、免疫原性組成物またはワクチン）または宿主被験体中のＧＡＳ感染の検出のための診断試薬として使用するための組成物を提供する。本発明はまた、（ｉ）ＧＡＳ細菌による感染の治療または防止のための薬物、（ｉｉ）ＧＡＳ細菌もしくはＧＡＳ細菌に対して惹起される抗体の存在の検出のための診断試薬、および／または（ｉｉｉ）ＧＡＳ細菌に対する抗体を惹起することができる試薬の製造のための組成物の使用を提供する。
【００９２】
例えば、ＧＡＳ抗原またはこの抗原をコードする核酸を、ＧＡＳ感染の存在の検出もしくはＧＡＳ細菌に対して惹起される抗体の検出のための診断試薬の製造またはＧＡＳ細菌に対する抗体を惹起することができる試薬の製造で使用することができる。当該分野で公知のように、二重鎖を形成するハイブリッド形成条件下で核酸プローブと生体サンプルとを接触させ、二重鎖を検出することによって、ＧＡＳ抗原をコードする核酸を検出することができる。ＧＡＳ抗原に特異的に結合する抗体を使用して、ＧＡＳ抗原を検出することができる。同様に、ＧＡＳ抗原に対する抗体を使用して、抗体−抗原複合体の形成に適切な条件下で抗体サンプルを接触させ、形成された任意の複合体を検出することによってＧＡＳ抗原を検出することができる。本発明はまた、これらの方法の使用に適切な試薬を含むキットを提供する。
【００９３】
治療組成物
本発明の組成物は、化膿性レンサ球菌感染の防止および／または治療に有用である。ＧＡＳ抗原を含む組成物は、好ましくは、免疫原性組成物であり、より好ましくは、ワクチン組成物である。このような組成物のｐＨは、好ましくは、ｐＨ６とｐＨ８との間であり、好ましくは約ｐＨ７である。緩衝液の使用によってｐＨを維持することができる。組成物は、無菌および／または無発熱物質であり得る。組成物は、ヒトに関して等張であり得る。
【００９４】
本発明のワクチンを、予防または治療で使用することができるが、典型的には、予防的に使用される。したがって、本発明は、化膿性レンサ球菌感染の治療的処置方法または予防的処置方法を含む。動物は、好ましくは、哺乳動物、最も好ましくはヒトである。本方法は、動物に治療または予防量の本発明の免疫原性組成物を投与する工程を含む。
【００９５】
本発明のいくつかの組成物は、少なくとも２つの上記の表面露出ＧＡＳ抗原を含む。本発明の他の組成物は、２つの表面露出ＧＡＳ抗原をコードする少なくとも１つの核酸分子を含む。本発明のさらに他の組成物は、少なくとも２つの抗体を含み、それぞれが２つの表面露出ＧＡＳ抗原のうちの１つを特異的に結合する。本発明の好ましい組成物は、ＧＡＳ４０抗原である少なくとも１つの表面露出、任意の他のＧＡＳ抗原である他の抗原、２つの抗原をコードする少なくとも１つの核酸分子または２つの抗原に特異的に結合する少なくとも２つの抗体を含む。いくつかの組成物は、１つまたは複数のさらなるＧＡＳ抗原、さらなる抗原をコードする核酸分子、またはさらなる抗原に特異的に結合する抗体を含む。これらの抗原のうち、ＧＡＳ１１７が好ましい。
【００９６】
上記のように、本発明の組成物は、少なくとも２つのＧＡＳ抗原をコードする核酸分子および任意選択的に組成物中に含めることができる他の抗原を含む（以下を参照のこと）。例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＆  Ｔｏｒｒｅｓ（１９９７）Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９：２７１−２８３；Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａｎｎ．Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５：６１７−６４８；Ｓｃｏｔｔ−Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ（２０００）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  ９：４７１−４８０；Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ  ＆  Ｐｌｅｂａｎｓｋｉ（２０００）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２：４４１−４４７；Ｉｌａｎ（１９９９）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １：１１６−１２０；Ｄｕｂｅｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ６：７２３−７３２；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＆  Ｐｅｒｔｍｅｒ（２０００）Ａｄｖ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  ５５：１−７４；Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １６２（４  Ｐｔ  ２）：Ｓ１９０−１９３；Ｄａｖｉｓ（１９９９）Ｍｔ．Ｓｉｎａｉ  Ｊ．Ｍｅｄ．６６：８４−９０を参照のこと。典型的には、核酸分子は、ＤＮＡ分子（例えば、プラスミドの形態）である。
【００９７】
化膿性レンサ球菌感染の治療組成物は、ＧＡＳ抗原に特異的に結合する少なくとも１つの抗体および任意選択的に非ＧＡＳ抗原に特異的に結合する抗体を含む。本発明のいくつかの組成物は免疫原性を示し、且つ１つまたは複数のポリペプチド抗原を含む一方で、他の抗原性組成物は、表面露出ＧＡＳ抗原および／または表面結合ＧＡＳ抗原、ならびに任意選択的に二次ＧＡＳ抗原または非ＧＡＳ抗原をコードする核酸分子を含む。例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＆  Ｔｏｒｒｅｓ（１９９７）Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９：２７１−２８３；Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａｎｎ．Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５：６１７−６４８；Ｓｃｏｔｔ−Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ（２０００）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  ９：４７１−４８０；Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ  ＆  Ｐｌｅｂａｎｓｋｉ（２０００）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  ＭｏＩ  Ｔｈｅｒ  ２：４４１−４４７；Ｉｌａｎ（１９９９）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １：１１６−１２０；Ｄｕｂｅｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ６：７２３−７３２；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＆  Ｐｅｒｔｍｅｒ（２０００）Ａｄｖ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  ５５：１−７４；Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １６２（４  Ｐｔ  ２）：Ｓ１９０−１９３  Ｄａｖｉｓ（１９９９）Ｍｔ．Ｓｉｎａｉ  Ｊ．Ｍｅｄ．６６：８４−９０を参照のこと。典型的には、核酸分子は、ＤＮＡ分子（例えば、プラスミドの形態）である。
【００９８】
本発明の他の組成物は、少なくとも１つの活性因子を含む。化膿性レンサ球菌感染防止のための組成物は、活性因子として、本発明のＧＡＳ抗原を含むポリペプチドまたはこのポリペプチドをコードする核酸分子のいずれかを含み得る。
【００９９】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、１つまたは複数のさらなる活性因子を含み得る。このような薬剤には、（ａ）本発明の別のＧＡＳ抗原、好ましくは、表面露出ＧＡＳ抗原、（ｂ）小児ワクチンで有用なポリペプチド抗原、（ｃ）高齢または免疫不全状態の個体のためのワクチンで有用なポリペプチド抗原、（ｄ）（ａ）〜（ｃ）および（ａ）〜（ｃ）に特異的に結合する抗体をコードする核酸分子が含まれるが、これらに限定されない。
【０１００】
さらなる抗原
本発明の組成物を、本発明の治療方法、予防方法、または診断方法で使用される１つまたは複数の抗原と組み合わせて投与することができる。好ましい抗原には、下に列挙した抗原が含まれる。さらに、本発明の組成物を使用して、以下に列挙した病原体のいずれかに起因する感染症を治療または防止することができる。下記の抗原との組み合わせに加えて、本発明の組成物を、本明細書中に記載のアジュバントと組み合わせることもできる。
【０１０１】
本発明で使用される抗原には、下記の１つまたは複数の以下の抗原、下記の１つまたは複数の病原体由来の抗原が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０２】
Ａ．細菌抗原
本発明での使用に適切な細菌抗原には、細菌から単離、精製することができるか由来し得るタンパク質、ポリサッカリド、リポポリサッカリド、および外膜小胞が含まれる。さらに、細菌抗原には、細菌溶解物および不活化細菌処方物が含まれ得る。細菌抗原を、組換え発現によって産生することができる。細菌抗原には、好ましくは、その生活環の少なくとも１つの段階で細菌表面上に曝露されるエピトープが含まれる。細菌抗原は、好ましくは、複数の血清型で保存されている。細菌抗原には、下記の１つまたは複数の細菌に由来する抗原および以下で同定された特定の抗原例が含まれる。
【０１０３】
髄膜炎菌。髄膜炎抗原には、髄膜炎菌血清型（Ａ型、Ｃ型、Ｗ１３５型、Ｙ型、および／またはＢ型など）から精製されたか由来するタンパク質（引例１〜７で同定されたタンパク質など）、サッカリド（ポリサッカリド、オリゴサッカリド、またはリポポリサッカリドが含まれる）、外膜小胞（引例８、９、１０、１１）が含まれ得る。髄膜炎タンパク質抗原を、接着物、接着物、オートトランスポーター（ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、毒素、Ｆｅ捕捉タンパク質、および膜結合タンパク質（好ましくは、内在性外膜タンパク質）から選択することができる。
【０１０４】
肺炎球菌。肺炎球菌抗原には、肺炎球菌由来のサッカリド（ポリサッカリドまたはオリゴサッカリドが含まれる）および／またはタンパク質が含まれ得る。サッカリド抗原を、血清型１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆから選択することができる。タンパク質抗原を、ＷＯ９８／１８９３１号、ＷＯ９８／１８９３０号、米国特許第６，６９９，７０３号、同第６，８００，７４４号、ＷＯ９７／４３３０３号、およびＷＯ９７／３７０２６号で同定されたタンパク質から選択することができる。肺炎球菌タンパク質を、ポリヒスチジン三連構造ファミリー（ＰｈｔＸ）、コリン結合タンパク質ファミリー（ＣｂｐＸ）、ＣｂｐＸ短縮物、ＬｙｔＸファミリー、ＬｙｔＸ短縮物、ＣｂｐＸ短縮物−ＬｙｔＸ短縮物キメラタンパク質、ニューモリシン（Ｐｌｙ）、ＰｓｐＡ、ＰｓａＡ、Ｓｐｌ２８、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１３０、Ｓｐｌ２５、またはＳｐｌ３３から選択することができる。
【０１０５】
化膿性レンサ球菌（Ａ群レンサ球菌）。Ａ群レンサ球菌抗原には、ＷＯ０２／３４７７１号およびＷＯ２００５／０３２５８２号で同定されたタンパク質（ＧＡＳ４０が含まれる）、ＧＡＳ  Ｍタンパク質フラグメントの融合物（ＷＯ０２／０９４８５１号、Ｄａｌｅ，Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９９）１７：１９３−２００、およびＤａｌｅ，Ｖａｃｃｉｎｅ  １４（１０）：９４４−９４８に記載の融合物が含まれる）、フィブロネクチン結合タンパク質（Ｓｆｂｌ）、レンサ球菌ヘム結合タンパク質（Ｓｈｐ）、およびストレプトリジンＳ（ＳａｇＡ）が含まれ得る。
【０１０６】
カタル球菌。モラクセラ抗原には、ＷＯ０２／１８５９５およびＷＯ９９／５８５６２号で同定された抗原、外膜タンパク質抗原（ＨＭＶ−ＯＭＰ）、Ｃ−抗原、および／またはＬＰＳが含まれる。
【０１０７】
百日咳菌。百日咳抗原には、百日咳ホロ毒素（ＰＴ）および百日咳菌由来の繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）が含まれ、任意選択的に、パータクチンおよび／または凝集原２および３抗原との組み合わせも含む。
【０１０８】
黄色ブドウ球菌。黄色ブドウ球菌抗原には、任意選択的非毒性組換え緑膿菌外毒素Ａに抱合した黄色ブドウ球菌５型および８型莢膜ポリサッカリド（ＳｔａｐｈＶＡＸ（商標）など）、表面タンパク質由来の抗原、インベイシン（ロイコチジン、キナーゼ、ヒアルロニダーゼ）、食細胞の貪食を阻害する表面因子（莢膜、プロテインＡ）、カロテノイド、カタラーゼ産生、プロテインＡ、コアグラーゼ、凝集因子、および／または真核細胞膜を溶解する膜損傷毒素（任意選択的に解毒されている）（溶血素、ロイコトキシン、ロイコチジン）が含まれる。
【０１０９】
表皮ブドウ球菌。表皮ブドウ球菌抗原には、粘液関連抗原（ＳＡＡ）が含まれる。
【０１１０】
破傷風菌（テタヌス）。破傷風抗原には、好ましくは、本発明の組成物と抱合されたキャリアタンパク質として使用される破傷風トキソイド（ＴＴ）が含まれる。
【０１１１】
ジフテリア菌（ジフテリア）：ジフテリア  抗原には、好ましくは、解毒されているジフテリア毒素（ＣＲＭ１９７など）が含まれる。さらに、ＡＤＰリボシル化を調整、阻害するか、またはこれと関連することができる抗原は、本発明の組成物との組み合わせ／同時投与／抱合が意図される。ジフテリア毒素を、キャリアタンパク質として使用することができる。
【０１１２】
インフルエンザ菌Ｂ（Ｈｉｂ）。Ｈｉｂ抗原には、Ｈｉｂサッカリド抗原が含まれる。
【０１１３】
緑膿菌：シュードモナス抗原には、内毒素Ａ、Ｗｚｚ  タンパク質、緑膿菌ＬＰＳ、より詳細には、ＰＡＯ１（Ｏ５血清型）から単離したＬＰＳ、および／または外膜タンパク質（外膜タンパク質Ｆ（ＯｐｒＦ）（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００１  Ｍａｙ；６９（５）：３５１０−３５１５）が含まれる。
【０１１４】
レジオネラ・ニューモフィラ。細菌抗原は、レジオネラ・ニューモフィラに由来し得る。
【０１１５】
ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｂ群レンサ球菌）。Ｂ群レンサ球菌抗原には、ＷＯ０２／３４７７１号、ＷＯ０３／０９３３０６号、ＷＯ０４／０４１１５７号、またはＷＯ２００５／００２６１９号で同定されたタンパク質またはサッカリド抗原（タンパク質ＧＢＳ８０、ＧＢＳ１０４、ＧＢＳ２７６、およびＧＢＳ３２２が含まれ、血清型Ｉａ、Ｉｂ、Ｉａ／ｃ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、およびＶＩＩＩ由来のサッカリド抗原が含まれる）。
【０１１６】
淋菌。淋菌抗原には、Ｐｏｒ（すなわちポリン）タンパク質（ＰｏｒＢ（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００４）２２：６６０−６６９）など）、伝達（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）結合タンパク質（ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢなど（Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００４）７１（１）：２７７−２８３を参照のこと）、不透明（ｏｐａｃｉｔｙ）タンパク質（Ｏｐａなど）、還元改変可能（ｒｅｄｃｔｉｏｎ−ｍｏｄｉｆｉａｂｌｅ）タンパク質（Ｒｍｐ）、および外膜小胞（ＯＭＶ）調製物（Ｐｌａｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ（２０００）１８２：８４８−８５５を参照のこと）が含まれる。例えば、ＷＯ９９／２４５７８号、ＷＯ９９／３６５４４号、ＷＯ９９／５７２８０号、ＷＯ０２／０７９２４３号も参照のこと。
【０１１７】
トラコーマ病原体。トラコーマ病原体抗原には、血清型Ａ、Ｂ、Ｂａ、およびＣ（トラコーマ（失明の原因）の作用因子）、血清型Ｌｌ、Ｌ２、およびＬ３（性病性リンパ肉芽腫症に関連）、および血清型Ｄ〜Ｋに由来する抗原が含まれる。トラコーマ病原体抗原には、ＷＯ００／３７４９４号、ＷＯ０３／０４９７６２号、ＷＯ０３／０６８８１１号、またはＷＯ０５／００２６１９号で同定された抗原（
【０１１８】
【化４３】
2008544949.tif 000012
が含まれる）も含まれ得る。
【０１１９】
梅毒トレポネーマ（梅毒）：梅毒抗原には、ＴｍｐＡ抗原が含まれる。
【０１２０】
軟性下疳菌（軟性下疳を生じる）：軟性下疳抗原には、外膜タンパク質（ＤｓｒＡ）が含まれる。
【０１２１】
フェカリス菌またはエンテロコッカス・フェシウム。抗原には、米国特許第６，７５６，３６１号に示すトリサッカリド反復または他の腸球菌由来抗原が含まれる。
【０１２２】
ピロリ菌：ピロリ菌抗原には、Ｃａｇ、Ｖａｃ、Ｎａｐ、ＨｏｐＸ、ＨｏｐＹおよび／またはウレアーゼ抗原が含まれる。
【０１２３】
ストレプトコッカス・サプロフィチカス。抗原には、Ｓ．サプロフィチカスの１６０ｋＤａ血球凝集素が含まれる。
【０１２４】
エンテロコリチカ菌抗原には、ＬＰＳが含まれる（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００２  Ａｕｇｕｓｔ；７０（８）：４４１４）。
【０１２５】
大腸菌：大腸菌抗原は、腸内毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、腸管凝集性大腸菌（ＥＡｇｇＥＣ）、散在性接着大腸菌（ＤＡＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、および／または腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）に由来し得る。
【０１２６】
炭疽菌（炭疽病）。炭素菌抗原は、任意選択的に解毒されており、成分Ａ（致死因子（ＬＦ）および浮腫因子（ＥＦ））（防御抗原（ＰＡ）として公知の成分Ｂを共有することができる）から選択することができる。
【０１２７】
ペスト菌（疫病）。疫病抗原には、Ｆｌ莢膜抗原（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００３  Ｊａｎ；７１（１））：３７４−３８３）、ＬＰＳ（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．１９９９  Ｏｃｔ；６７（１０）：５３９５）、ペスト菌Ｖ抗原（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．１９９７  Ｎｏｖ；６５（１１）：４４７６−４４８２）が含まれる。
【０１２８】
結核菌。結核抗原には、リポタンパク質、ＬＰＳ、ＢＣＧ抗原、抗原８５Ｂの融合タンパク質（Ａｇ８５Ｂ）および／または任意選択的にカチオン性脂質小胞中に配合されたＥＳＡＴ−６（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００４  Ｏｃｔｏｂｅｒ；７２（１０）：６１４８）、結核菌（Ｍｔｂ）イソクエン酸デヒドロゲナーゼ関連抗原（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００４  Ａｕｇ  ２４；１０１（３４）：１２６５２）、および／またはＭＰＴ５１抗原（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００４  Ｊｕｌｙ；７２（７）：３８２９）が含まれる。
【０１２９】
リケッチア属。抗原には、外膜タンパク質（外膜プロテインＡおよび／またはＢ（ＯｍｐＢ）が含まれる）（Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２００４  Ｎｏｖ  ｌ；１７０２（２）：１４５）、ＬＰＳ、および表面タンパク質抗原（ＳＰＡ）（Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．１９８９  Ｊｕｎ；２  Ｓｕｐｐｌ：８１）が含まれる。
【０１３０】
リステリア菌。細菌抗原は、リステリア菌に由来し得る。
【０１３１】
肺炎クラミジア。抗原には、ＷＯ０２／０２６０６号で同定された抗原が含まれる。
【０１３２】
コレラ菌。抗原には、プロテイナーゼ抗原、ＬＰＳ、特に、コレラ菌ＩＩのリポポリサッカリド、Ｏ１  Ｉｎａｂａ  Ｏ−特異的ポリサッカリド、コレラ菌Ｏ１３９、ＩＥＭ１０８ワクチンの抗原（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００３  Ｏｃｔ；７１（１０）：５４９８−５０４）、および／または密着結合毒素（Ｚｏｔ）が含まれる。
【０１３３】
チフス菌（腸チフス熱）。抗原には、莢膜ポリサッカリド（好ましくは、抱合体）（Ｖｉ、すなわち、ｖａｘ−ＴｙＶｉ）が含まれる。
【０１３４】
ライム病菌（ライム病）。抗原には、リポタンパク質（ＯｓｐＡ、ＯｓｐＢ、ＯｓｐＣ、およびＯｓｐＤなど）、他の表面タンパク質（ＯｓｐＥ関連タンパク質（Ｅｒｐｓ）など）、デコリン結合タンパク質（ＤｂｐＡなど）、抗原変異ＶＩタンパク質（Ｐ３９およびＰ１３に関連する抗原（内在性膜タンパク質）など）（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００１  Ｍａｙ；６９（５）：３３２３−３３３４）、ＶＩｓＥ抗原変異タンパク質（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９  Ｄｅｃ；３７（１２）：３９９７）が含まれる。
【０１３５】
ジンジバリス菌。抗原には、ジンジバリス菌外膜タンパク質（ＯＭＰ）が含まれる。
【０１３６】
クレブシエラ属。抗原には、ＯＭＰ（ＯＭＰＡが含まれる）または任意選択的に破傷風トキソイドに抱合したポリサッカリドがふくまれる。
【０１３７】
本発明のさらなる細菌抗原は、上記のいずれかの莢膜抗原、ポリサッカリド抗原、またはタンパク質抗原であり得る。さらなる細菌抗原には、外膜小胞（ＯＭＶ）調製物も含まれ得る。さらに、抗原には、上記細菌のいずれかの生きた形態（ｖｅｒｓｉｏｎ）、弱毒化形態、および／または精製形態が含まれる。本発明の抗原は、グラム陰性細菌またはグラム陽性細菌に由来し得る。本発明の抗原は、好気性細菌または嫌気性細菌に由来し得る。
【０１３８】
さらに、上記の細菌由来サッカリド（ポリサッカリド、ＬＰＳ、ＬＯＳ、またはオリゴサッカリド）のいずれかを、別の作用因子または抗原（キャリアタンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７）など）と抱合することができる。このような抱合は、米国特許第５，３６０，８９７号およびＣａｎ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９８４  Ｍａｙ；６２（５）：２７０−５に示されるように、サッカリド上のカルボニル部分の還元的アミノ化によって行われるタンパク質上のアミノ基直接的抱合であり得る。あるいは、サッカリドを、スクシンアミドなどのリンカーまたはＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９６およびＣＲＣ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，１９９３に示されたリンカーによって抱合することができる。
【０１３９】
Ｂ．ウイルス抗原
本発明での使用に適切なウイルス抗原には、不活化（または死滅）ウイルス、弱毒化ウイルス、スプリットウイルス（ｓｐｌｉｔ  ｖｉｒｕｓ）処方物、精製サブユニット処方物、ウイルスから単離、精製、またはウイルスに由来するウイルスタンパク質、およびウイルス様粒子（ＶＬＰ）が含まれる。ウイルス抗原は、細胞培養物または他の基質上で増殖したウイルスに由来し得る。あるいは、ウイルス抗原を、組換えによって発現することができる。ウイルス抗原には、好ましくは、その生活環の少なくとも１つの段階でウイルス表面上に曝露されるエピトープが含まれる。ウイルス抗原は、好ましくは、複数の血清型または単離物を通して保存されている。ウイルス抗原には、１つまたは複数の下記のウイルスに由来する抗原および以下に同定された特定の抗原の例が含まれる。
【０１４０】
オルソミクソウイルス。ウイルス抗原は、オルソミクソウイルスに由来し得る（インフルエンザＡ、Ｂ、およびＣなど）。オルソミクソウイルス抗原を、１つまたは複数のウイルスタンパク質（血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、基質タンパク質（Ｍ１）、膜タンパク質（Ｍ２）、１つまたは複数の転写酵素成分（ＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡ）が含まれる）から選択することができる。好ましい抗原には、ＨＡおよびＮＡが含まれる。
【０１４１】
インフルエンザ抗原は、大流行の狭間の（ｉｎｔｅｒｐａｎｄｅｍｉｃ）（年間）インフルエンザ株に由来し得る。あるいは、インフルエンザ抗原は、汎流行発生を引き起こす可能性のある株（すなわち、現在循環している株中の血球凝集素と比較して新規の血球凝集素を有するインフルエンザ株またはトリ被験体で病原性を示し、且つヒト集団で水平伝播する可能性を有するインフルエンザ株、またはヒトに対して病原性を示すインフルエンザ株）に由来し得る。
【０１４２】
パラミクソウイルス科ウイルス。ウイルス抗原は、パラミクソウイルス科ウイルス（ニューモウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶ）、およびモルビリウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ）など）に由来し得る。
【０１４３】
ニューモウイルス。ウイルス抗原は、ニューモウイルス（呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、マウス肺炎ウイルス、およびシチメンチョウ鼻器官炎ウイルスなど）に由来し得る。好ましくは、ニューモウイルスはＲＳＶである。ニューモウイルス抗原は、１つまたは複数の以下のタンパク質（表面タンパク質融合物（Ｆ）、糖タンパク質（Ｇ）、疎水性低分子タンパク質（ＳＨ）、基質タンパク質ＭおよびＭ２、ヌクレオカプシドタンパク質Ｎ、Ｐ、およびＬ、ならびに構造タンパク質ＮＳ１およびＮＳ２が含まれる）から選択することができる。好ましいニューモウイルスタンパク質には、Ｆ、Ｇ、およびＭが含まれる。例えば、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．２００４  Ｎｏｖ；８５（Ｐｔ  １１）：３２２９を参照のこと。ニューモウイルス抗原を、キメラウイルス中に配合するか、これに由来し得る。例えば、キメラＲＳＶ／ＰＩＶウイルスは、ＲＳＶおよびＰＩＶの両方の成分を含み得る。
【０１４４】
パラミクソウイルス。ウイルス抗原は、パラミクソウイルス（パラインフルエンザウイルス１〜４型（ＰＩＶ）、ムンプスウイルス、センダイウイルス、サルウイルス５、ウシパラインフルエンザウイルス、およびニューカッスル病ウイルスなど）に由来し得る。好ましくは、パラミクソウイルスは、ＰＩＶまたはムンプスウイルスである。パラミクソウイルス抗原を、１つまたは複数の以下のタンパク質から選択することができる：血球凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）、融合タンパク質Ｆ１およびＦ２、核タンパク質（ＮＰ）、リンタンパク質（Ｐ）、巨大タンパク質（Ｌ）、基質タンパク質（Ｍ）。好ましいパラミクソウイルスタンパク質には、ＨＮ、Ｆ１、およびＦ２が含まれる。パラミクソウイルス抗原を、キメラウイルスに配合することもできるか、キメラウイルスにも由来し得る。例えば、キメラＲＳＶ／ＰＩＶウイルスは、ＲＳＶおよびＰＩＶの両方の成分を含み得る。市販のムンプスワクチンには、単価形態または麻疹ワクチンおよび風疹ワクチンと組み合わせた弱毒化生ムンプスウイルス（ＭＭＲ）が含まれる。
【０１４５】
モルビリウイルス。ウイルス抗原は、モルビリウイルス（麻疹など）に由来し得る。モルビリウイルス抗原を、１つまたは複数の以下のタンパク質から選択することができる：血球凝集素（Ｈ）、糖タンパク質（Ｇ）、融合因子（Ｆ）、巨大タンパク質（Ｌ）、核タンパク質（ＮＰ）、ポリメラーゼリンタンパク質（Ｐ）、および基質タンパク質（Ｍ）。市販の麻疹ワクチンには、典型的には、ムンプスおよび風疹ワクチンとの組み合わせた弱毒化生麻疹ウイルス（ＭＭＲ）が含まれる。
【０１４６】
ピコルナウイルス。ウイルス抗原は、ピコルナウイルスピコルナウイルス（エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパルナウイルス（Ｈｅｐａｒｎａｖｉｒｕｓ）、カルジオウイルス、およびアフトウイルスなど）に由来し得る。エンテロウイルス（ポリオウイルスなど）由来の抗原が好ましい。
【０１４７】
エンテロウイルス。ウイルス抗原は、エンテロウイルス（ポリオウイルス１、２、または３型、コクサッキーＡウイルス１〜２２および２４型、コクサッキーＢウイルス１〜６型、エコーウイルス（ＥＣＨＯ）ウイルス）１〜９、１１〜２７、および２９〜３４型、ならびにエンテロウイルス６８〜７１など）に由来し得る。好ましくは、エンテロウイルスはポリオウイルスである。エンテロウイルス抗原は、好ましくは、１つまたは複数の以下から選択される：カプシドタンパク質ＶＰｌ、ＶＰ２、ＶＰ３、およびＶＰ４。市販のポリオワクチンには、不活化されたポリオワクチン（ＩＰＶ）および経口ポリオワクチン（ＯＰＶ）が含まれる。
【０１４８】
ヘパルナウイルス。ウイルス抗原は、ヘパルナウイルス（Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）など）に由来し得る。市販のＨＡＶワクチンには、不活化ＨＡＶワクチンが含まれる。
【０１４９】
トガウイルス。ウイルス抗原は、トガウイルス（ルビウイルス属、アルファウイルス属、またはアルテリウイルスなど）に由来し得る。ルビウイルス属に由来する抗原（風疹ウイルスなど）が好ましい。トガウイルス抗原を、Ｅｌ、Ｅ２、Ｅ３、Ｃ、ＮＳＰ−Ｉ、ＮＳＰＯ−２、ＮＳＰ−３、またはＮＳＰ−４から選択することができる。トガウイルス抗原は、好ましくは、Ｅｌ、Ｅ２、またはＥ３から選択される。市販の風疹ワクチンには、典型的には、ムンプスおよび麻疹ワクチンと組み合わせたい低温馴化生ウイルス（ＭＭＲ）が含まれる。
【０１５０】
フラビウイルス。ウイルス抗原は、フラビウイルス（ダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）、デング１、２、３、または４型）、黄熱病、日本脳炎、ウエストナイル脳炎、セントルイス脳炎、ロシア春夏脳炎、ポワッサン脳炎など）に由来し得る。フラビウイルス抗原を、ＰｒＭ、Ｍ、Ｃ、Ｅ、ＮＳ−Ｉ、ＮＳ−２ａ、ＮＳ２ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、およびＮＳ５から選択することができる。フラビウイルス抗原は、好ましくは、ＰｒＭ、Ｍ、およびＥから選択される。市販のＴＢＥワクチンには、不活化ウイルスワクチンが含まれる。
【０１５１】
ペスチウイルス。ウイルス抗原は、ペスチウイルス（ウシのウイルス性下痢（ＢＶＤＶ）、ブタコレラ（ＣＳＦＶ）、またはボーダー病（ＢＤＶ）など）に由来し得る。
【０１５２】
ヘパドナウイルス。ウイルス抗原は、ヘパドナウイルス（Ｂ型肝炎ウイルスなど）に由来し得る。ヘパドナウイルス抗原を、表面抗原（Ｌ、Ｍ、およびＳ）、コア抗原（ＨＢｃ、ＨＢｅ）から選択することができる。市販のＢ型肝炎ウイルスワクチンには、表面抗原Ｓタンパク質を含むサブユニットワクチンが含まれる。
【０１５３】
Ｃ型肝炎ウイルス。ウイルス抗原は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に由来し得る。ＨＣＶ抗原を、１つまたは複数のＥｌ、Ｅ２、Ｅ１／Ｅ２、ＮＳ３４５ポリタンパク質、ＮＳ  ３４５−コアポリタンパク質、コア、および／または非構造領域由来のペプチドから選択することができる（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９１）１４：３８１）。
【０１５４】
ラブドウイルス。ウイルス抗原は、ラブドウイルス（リッサウイルス（狂犬病ウイルス）およびベシクロウイルス（ＶＳＶ）など）に由来し得る。ラブドウイルス抗原を、糖タンパク質（Ｇ）、核タンパク質（Ｎ）、巨大タンパク質（Ｌ）、非構造タンパク質（ＮＳ）から選択することができる。市販の狂犬病ウイルスワクチンは、ヒト二倍体細胞または胎児アカゲザルの肺細胞上で成長させた死滅ウイルスを卯組む。
【０１５５】
カリシウイルス科。ウイルス抗原は、カリシウイルス科（ノーウォークウイルス、ノーウォーク様ウイルス（ハワイウイルスおよびスノーマウンテンウイルスなど）など）に由来し得る。
【０１５６】
コロナウイルス。ウイルス抗原は、コロナウイルス、ＳＡＲＳ、ヒト呼吸器コロナウイルス、トリ伝染性気管支炎（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、およびブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）に由来し得る。コロナウイルス抗原を、スパイク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、マトリックス（Ｍ）、ヌクレオカプシド（Ｎ）、および赤血球凝集素−エステラーゼ糖タンパク質（ＨＥ）から選択することができる。好ましくは、コロナウイルス抗原は、ＳＡＲＳウイルスに由来する。ＳＡＲＳウイルス抗原は、ＷＯ０４／９２３６０号に記載されている。
【０１５７】
レトロウイルス。ウイルス抗原は、レトロウイルス（オンコウイルス、レンチウイルス、またはスプーマウイルスなど）に由来し得る。オンコウイルス抗原は、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、またはＨＴＬＶ−５に由来し得る。レンチウイルス抗原は、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に由来し得る。レトロウイルス抗原を、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｘ、ｔａｔ、ｒｅｘ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、およびｖｐｒから選択することができる。ＨＩＶ抗原を、ｇａｇ（ｐ２４ｇａｇおよびｐ５５ｇａｇ）、ｅｎｖ（ｇｐｌ６０およびｇｐ４１）、ｐｏｌ、ｔａｔ、ｎｅｆ、ｒｅｖ  ｖｐｕ、ミニタンパク質（好ましくは、ｐ５５  ｇａｇおよびｇｐｌ４０ｖ欠失）から選択することができる。ＨＩＶ抗原は、１つまたは複数の以下の株に由来し得る：ＨＩＶＩＩＩｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＩＶＬＡＶ、ＨＩＶＬＡＩ、ＨＩＶＭＮ、ＨＩＶ−１ＣＭ２３５、ＨＩＶ−１ＵＳ４。
【０１５８】
レオウイルス：ウイルス抗原は、レオウイルス（オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、またはコルティウイルスなど）に由来し得る。レオウイルスを、構造タンパク質（λｌ、λ２、λ３、μｌ、μ２、σｌ、σ２、またはσ３）または非構造タンパク質（σＮＳ、μＮＳ、またはσｌｓから選択することができる。好ましいレオウイルス抗原は、ロタウイルスに由来し得る。ロタウイルスを、ＶＰｌ、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４（またはＶＰ５およびＶＰ８の切断産物）、ＮＳＰ  １、ＶＰ６、ＮＳＰ３、ＮＳＰ２、ＶＰ７、ＮＳＰ４、またはＮＳＰ５から選択することができる。好ましいロタウイルス抗原には、ＶＰ４（またはＶＰ５およびＶＰ８の切断産物）およびＶＰ７が含まれる。
【０１５９】
パルボウイルス。ウイルス抗原は、パルボウイルス（パルボウイルスＢ１９など）に由来し得る。パルボウイルスを、ＶＰ−Ｉ、ＶＰ−２、ＶＰ−３、ＮＳ−Ｉ、およびＮＳ−２から選択することができる。好ましくは、パルボウイルス抗原は、カプシドタンパク質ＶＰ２である。
【０１６０】
Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）。ウイルス抗原は、ＨＤＶ、詳細には、ＨＤＶ由来のδ抗原に由来し得る（例えば、米国特許第５、３７８、８１４号を参照のこと）。
【０１６１】
Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）。ウイルス抗原は、ＨＥＶに由来し得る。
【０１６２】
Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）。ウイルス抗原は、ＨＧＶに由来し得る。
【０１６３】
ヒトヘルペスウイルス。ウイルス抗原は、ヒトヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）、およびヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）など）に由来し得る。ヒトヘルペスウイルス抗原を、最初期タンパク質（α）、初期タンパク質（β）、後期タンパク質（γ）から選択することができる。ＨＳＶ抗原は、ＨＳＶ−１株またはＨＳＶ−２株に由来し得る。ＨＳＶ抗原を、糖タンパク質（ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、およびｇＨ）、融合タンパク質（ｇＢ）、または免疫エスケープタンパク質（ｇＣ、ｇＥ、またはｇｌ）から選択することができる。ＶＺＶ抗原を、コア、ヌクレオカプシド、外被、またはエンベロープタンパクから選択することができる。弱毒化ＶＺＶ生ワクチンは市販されている。ＥＢＶ抗原を、初期抗原（ＥＡ）タンパク質、ウイルスカプシドタンパク質（ＶＣＡ）、および膜抗原の糖タンパク質（ＭＡ）から選択することができる。ＣＭＶ抗原を、カプシドタンパク質、エンベロープ糖タンパク質（ｇＢおよびｇＨなど）、および外被タンパク質から選択することができる。
【０１６４】
パポバウイルス。抗原は、パポバウイルス（乳頭腫ウイルスおよびポリオーマウイルスなど）に由来し得る。乳頭腫ウイルスには、ＨＰＶ血清型１、２、４、５、６、８、１１、１３、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４１、４２、４７、５１、５７、５８、６３、および６５が含まれる。好ましくは、ヒト乳頭腫ウイルス抗原は、血清型６、１１、１６、または１８から選択される。ＨＰＶ抗原を、カプシドタンパク質（Ｌｌ）および（Ｌ２）、Ｅｌ〜Ｅ７、またはこれらの融合物から選択することができる。ＨＰＶ抗原を、好ましくは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に配合する。ポリオーマウイルスには、ＢＫウイルスおよびＪＫウイルスが含まれる。ポリオーマウイルス抗原を、ＶＰｌ，ＶＰ２、またはＶＰ３から選択することができる。
【０１６５】
本発明の組成物と併せて、Ｖａｃｃｉｎｅｓ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｐｌｏｔｋｉｎ  ａｎｄ  Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｄ．２００４）；Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．２００２）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ  ｅｄ．１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ．１９９１）に含まれる抗原、組成物、方法、および微生物をさらに提供する。
【０１６６】
Ｃ．真菌抗原
本発明で使用される真菌抗原は、１つまたは複数の下記の真菌に由来し得る。
【０１６７】
真菌抗原は、皮膚糸状菌（エピデルモフィトン・フロカッサム（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ  ｆｌｏｃｃｕｓｕｍ）、ミクロスポラム・アウドウイニ（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ａｕｄｏｕｉｎｉ）、ミクロスポラム・カニス（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｃａｎｉｓ）、ミクロスポラム・ジストルタム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｄｉｓｔｏｒｔｕｍ）、ミクロスポラム・エクイナム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｅｑｕｉｎｕｍ）、ミクロスポラム・ギプサム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｇｙｐｓｕｍ）、ミクロスポラム・ナヌム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｎａｎｕｍ）、トリコフィトン・コンセントリクム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ）、トリコフィトン・エクイナム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｅｑｕｉｎｕｍ）、トリコフィトン・ガリナエ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｇａｌｌｉｎａｅ）、トリコフィトン・ギプセウム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｇｙｐｓｅｕｍ）、トリコフィトン・メグニニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｇｎｉｎｉ）、トリコフィトン・メンタグロフィテス（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）、トリコフィトン・キンケアナム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｑｕｉｎｃｋｅａｎｕｍ）、トリコフィトン・ルブルム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ）、トリコフィトン・スコエンレイニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎｉ）、トリコフィトン・トンスランス（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｔｏｎｓｕｒａｎｓ）、トリコフィトン・ベルコサム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ）、Ｔ．ベルコサム変種アルブム（Ｔ．ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ  ｖａｒ．ａｌｂｕｍ）、変種ジスコシデス（ｖａｒ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｓ）、変種オクラセウム（ｖａｒ．ｏｃｈｒａｃｅｕｍ）、トリコフィトン・バイオラセウム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、および／またはトリコフィトン・ファビホルメ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｆａｖｉｆｏｒｍｅ）が含まれる）に由来し得る。
【０１６８】
病原真菌は、アスペルギルス・フミガーツフ、黄色コウジ菌、クロカビ、偽巣性コウジ菌、アスペルギルス・テルレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・シドウィ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｙｄｏｗｉ）、アスペルギルス・フラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖａｔｕｓ）、アスペルギルス・グラウカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｇｌａｕｃｕｓ）、ブラストシゾマイセス・キャピタタス（Ｂｌａｓｔｏｓｃｈｉｚｏｍｙｃｅｓ  ｃａｐｉｔａｔｕｓ）、カンジダ・アルビカンス、カンジダ  エノラーゼ、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・パラプローシス、カンジダ・ステラトイデア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ）、カンジダ・クセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｕｓｅｉ）、カンジダ・パアクエセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｋｗｓｅｉ）、カンジダ・ルシタニエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、カンジダ・シュードトロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・グイリエルモンジ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉ）、クラドスポリウム・カリオニイ（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃａｒｒｉｏｎｉｉ）、コクシジオイデス・イミチス、ブラストミセス・デルマチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ゲオトリクム・クラバタム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｌａｖａｔｕｍ）、ヒストプラズマカプスラーツム、肺炎桿菌、南アメリカ分芽菌、ニューモシスチス・カリニ、ピチウム・インシジオサム（Ｐｙｔｈｉｕｍｎ  ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍ）、ピチロスポルム・オバレ（Ｐｉｔｙｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｏｖａｌｅ）、出芽酵母、サッカロマイセス・ブラウディ、サッカロマイセス・ポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、セドスポリウム・アピオステルム（Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ａｐｉｏｓｐｅｒｕｍ）、スポロトリクス・スケンキイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）、トリコスポロン・ベイゲリイ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｂｅｉｇｅｌｉｉ）、トキソプラズマ原虫、ペニシリウム・マルネフェイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍａｒｎｅｆｆｅｉ）、マラセジア亜種、フォンセカエア亜種（Ｆｏｎｓｅｃａｅａ  ｓｐｐ．）、ワンギエラ亜種（Ｗａｎｇｉｅｌｌａ  ｓｐｐ）、スポロトリクス亜種、バシジオボラス亜種（Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｓｐｐ．）、コニジオボラス亜種（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｓｐｐ．）、リゾプス亜種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐｐ）、ムコール亜種（Ｍｕｃｏｒ  ｓｐｐ）、アブシディア亜種、モルチエレラ亜種、クニンガメラ亜種（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｓｐｐ）、サクセナエア亜種（Ｓａｋｓｅｎａｅａ  ｓｐｐ．）、アルタナリア亜種、クルブラリア亜種（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｓｐｐ）、ヘルミントスポリウム亜種、フサリウム亜種、アスペルギルス亜種、ペニシリウム亜種、モノリニア亜種（Ｍｏｎｏｌｉｎｉａ  ｓｐｐ）、リゾクトニア亜種、ペシロマイセス亜種、ピトマイセス亜種（Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ）、およびクラドスポリウム亜種に由来し得る。
【０１６９】
真菌抗原の産生プロセスは、当該分野で周知である（米国特許第６，３３３，１６４号を参照のこと）。好ましい方法では、細胞壁が実質的に除去されているか少なくとも部分的に除去されている真菌細胞から得ることができる不溶性画分から抽出および分離された可溶化画分は、生きた真菌細胞を得る工程と、細胞壁が実質的に除去されているか少なくとも部分的に除去された真菌細胞を得る工程と、細胞壁が実質的に除去されているか少なくとも部分的に除去された真菌細胞をバーストさせる工程と、不溶性画分を得る工程と、不溶性画分から可溶化画分を抽出および分離する工程とを含むプロセスで特徴づけられる。
【０１７０】
Ｄ．ＳＴＤ抗原
本発明の組成物は、性感染症（ＳＴＤ）由来の１つまたは複数の抗原を含み得る。このような抗原により、クラミジア、性器ヘルペス、肝炎（ＨＣＶなど）、性器疣贅、淋病、梅毒、および／または軟性下疳などのＳＴＤの予防薬または治療薬を得ることができる（ＷＯ００／１５２５５号を参照のこと）。抗原は、１つまたは複数のウイルスまたは細菌のＳＴＤに由来し得る。本発明で使用されるウイルスＳＴＤは、例えば、ＨＩＶ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）、ヒト乳頭種ウイルス（ＨＰＶ）、および肝炎（ＨＣＶ）に由来し得る。本発明で使用される細菌ＳＴＤ抗原は、例えば、淋菌、トラコーマ病原体、梅毒トレポネーマ、軟性下疳菌、大腸菌、およびストレプトコッカス・アガラクチアに由来し得る。これらの病原体由来の特定の抗原の例は、上に記載している。
【０１７１】
Ｅ．呼吸器系抗原
本発明の組成物には、呼吸器系疾患を引き起こす病原体由来の１つまたは複数の抗原が含まれ得る。例えば、呼吸器系抗原は、オルソミクソウイルス（インフルエンザ）、ニューモウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶ）、モルビリウイルス（麻疹）、トガウイルス（風疹）、ＶＺＶ、およびコロナウイルス（ＳＡＲＳ）などの呼吸器系ウイルスに由来し得る。呼吸器系抗原は、呼吸器系疾患を引き起こす細菌（肺炎レンサ球菌、緑膿菌、百日咳菌、結核菌、肺炎マイコプラズマ、肺炎クラミジア、炭疽菌、およびカタル球菌など）に由来し得る。これらの病原体由来の特定の抗原の例は、上に記載している。
【０１７２】
Ｆ．小児ワクチン抗原
本発明の組成物には、小児被験体での使用に適切な１つまた複数の抗原が含まれ得る。小児被験体は、典型的には、約３歳未満、約２歳未満、または約１歳未満である。小児抗原を、６ヶ月、１年、２年、または３年にわたって複数回投与することができる。小児抗原は、小児集団をターゲティングすることができるウイルスおよび／または小児集団が感染に感受性を示すウイルスに由来し得る。小児ウイルス抗原には、１つまたは複数のオルソミクソウイルス（インフルエンザ）、ニューモウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶおよびムンプス）、モルビリウイルス（麻疹）、トガウイルス（風疹）、炎テロウイルス（ポリオ）、ＨＢＶ、コロナウイルス（ＳＡＲＳ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）に由来の抗原が含まれる。小児細菌抗原には、１つまたは複数の肺炎レンサ球菌、髄膜炎菌、化膿性レンサ球菌（Ａ群レンサ球菌）、カタル球菌、百日咳菌、黄色ブドウ球菌、破傷風菌（テタヌス）、ジフテリア菌（ジフテリア）、インフルエンザ菌Ｂ（Ｈｉｂ）、緑膿菌、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｂ群レンサ球菌）、および大腸菌由来の抗原が含まれる。これらの病原体由来の特定の抗原の例は、上に記載している。
【０１７３】
Ｇ．高齢または免疫不全状態の個体での使用に適切な抗原
本発明の組成物には、高齢または免疫不全状態の個体での使用に適切な１つまた複数の抗原が含まれ得る。このような個体は、ワクチン接種を、ターゲティングした抗原に対するその免疫応答を改善するために、より頻繁に、より高い用量で、またはアジュバント化（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）処方物と共に行うことが必要であり得る。高齢または免疫不全状態の個体での使用のためにターゲティングすることができる抗原には、１つまたは複数の以下の病原体由来の抗原が含まれる：髄膜炎菌、肺炎レンサ球菌、化膿性レンサ球菌（Ａ群レンサ球菌）カタル球菌、百日咳菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、破傷風菌（テタヌス）、ジフテリア菌（ジフテリア）、インフルエンザ菌Ｂ（Ｈｉｂ）、緑膿菌、在郷軍人病菌、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｂ群レンサ球菌）、フェカリス菌、ピロリ菌、肺炎クラミジア、オルソミクソウイルス（インフルエンザ）、ニューモウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶおよびムンプス）、モルビリウイルス（麻疹）、トガウイルス（風疹）、エンテロウイルス（ポリオ）、ＨＢＶ、コロナウイルス（ＳＡＲＳ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）。これらの病原体由来の特定の抗原の例は、上に記載している。
【０１７４】
Ｈ．青年期（ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔ）ワクチンでの使用に適切な抗原
本発明の組成物には、青年期被験体での使用に適切な１つまた複数の抗原が含まれ得る。青年期には、前に投与した小児抗原の追加免疫が必要であり得る。青年期での使用に適切であり得る小児抗原は、上に記載している。さらに、青年期は、性活動の開始前に予防的または治療的免疫を確実にするために、ＳＴＤ病原体由来の抗原が投与されるようにターゲティングすることができる。青年期での使用に適切であり得るＳＴＤ抗原は、上に記載している。
【０１７５】
Ｉ．抗原処方物
本発明の他の対応では、吸着抗原を有する微粒子の産生方法を提供する。本方法は、（ａ）（ｉ）水、（ｉｉ）界面活性剤、（ｉｉｉ）有機溶媒、および（ｉｖ）ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリアンヒドリド、およびポリシアノアクリレートからなる群から選択される生分解性ポリマーを含む混合物の分散によって乳濁液を準備する工程を含む。ポリマーは、典型的には、混合物中に有機溶媒に対して約１％〜約３０％の濃度で存在する一方で、界面活性剤は、典型的には、混合物中に界面活性剤とポリマーとの重量比が約０．００００１：１〜約０．１：１（より典型的には、約０．０００１：１〜約０．１：１、約０．００１：１〜約０．１：１、または約０．００５：１〜約０．１：１、）で存在し、（ｂ）乳濁液から有機溶媒を除去する工程と、（ｃ）微粒子表面上に抗原を吸着させる工程を含む。一定の実施形態では、生分解性ポリマーは、有機溶媒と比較して約３％〜約１０％の濃度で存在する。
【０１７６】
本明細書中で使用される微粒子を、滅菌可能であり、非毒性であり、且つ生分解性の材料から形成する。このような材料には、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリアンヒドリド、ＰＡＣＡ、およびポリシアノアクリレートが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明と共に使用される微粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、詳細には、ポリ（ラクチド）（「ＰＬＡ」）またはＤ，Ｌ−ラクチドとグリコリドまたはグリコール酸とのコポリマー（ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（「ＰＬＧ」または「ＰＬＧＡ」）など）、またはＤ，Ｌ−ラクチドとカプロラクトンとのコポリマーに由来する。微粒子は、種々の分子量、および、ＰＬＧなどのコポリマーの場合、種々のラクチド：グリコリド比を有する種々の重合出発材料のいずれかに由来することができ、その選択は、概して、同時投与した高分子に一部依存して、選択可能である。これらのパラメーターを、以下でより完全に考察する。
【０１７７】
さらなる抗原はまた、外膜小胞（ＯＭＶ）調製物が含まれ得る。
【０１７８】
さらなる配合方法および抗原（特に、腫瘍抗原）は、米国特許出願番号０９／５８１，７７２号に示されている。
【０１７９】
Ｊ．抗原に関する引例
以下の引例は、本発明の組成物との組み合わせに有用な抗原を含む。
【０１８０】
【化４４】
2008544949.tif 000013
【０１８１】
【化４５】
2008544949.tif 000014
上記で引用した全ての特許、特許出願、および学術論文の内容は、本明細書中で完全に記載されているかのように参考として援用される。
【０１８２】
サッカリド抗原または炭水化物抗原を使用する場合、免疫原性を増強するためにキャリアタンパク質と抱合することが好ましい。Ｒａｍｓａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｌａｎｃｅｔ  ３５７（９２５１）：１９５−１９６；Ｌｉｎｄｂｅｒｇ（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ  １７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ２８−３６；Ｂｕｔｔｅｒｙ  ＆  Ｍｏｘｏｎ（２０００）Ｊ  Ｒ  Ｃｏｌｌ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｌｏｎｄ  ３４：１６３−１６８；Ａｈｍａｄ  ＆  Ｃｈａｐｎｉｃｋ（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  １３：１１３−１３３，ｖｉｉ；Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ（１９９８）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４７：５６３−５６７；欧州特許第０  ４７７  ５０８号；米国特許第５，３０６，４９２号；ＷＯ９８／４２７２１号；Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ（ｅｄｓ．Ｃｒｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．）ＩＳＢＮ  ３８０５５４９３２６、特に、ｖｏｌ．１０：４８−１１４；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ＩＳＢＮ：０１２３４２３３６８または０１２３４２３３５Ｘを参照のこと。好ましいキャリアタンパク質は、細菌毒素または類毒素（ジフテリアまたは破傷風の類毒素）である。ＣＲＭ１９７ジフテリア類毒素が特に好ましい。
【０１８３】
他のキャリアタンパク質には、髄膜炎菌外膜タンパク質（ＥＰ−Ａ−０３７２５０１）、合成ペプチド（ＥＰ−Ａ−０３７８８８１およびＥＰ−Ａ  ０４２７３４７）、熱ショックタンパク質（ＷＯ９３／１７７１２号およびＷＯ９４／０３２０８号）、百日咳タンパク質（ＷＯ９８／５８６６８号およびＥＰ  Ａ  ０４７１１７７号）、インフルエンザ菌由来のプロテインＤ（ＷＯ００／５６３６０号）、サイトカイン（ＷＯ９１／０１１４６号）、リンホカイン、ホルモン、増殖因子、Ｃ．ディフィシル由来の毒素ＡまたはＢ（ＷＯ００／６１７６１号）、鉄取り込みタンパク質（ＷＯ０１／７２３３７号）などが含まれる。混合物がセリグラフ（ｓｅｒｉｇｒａｐｈ）ＡおよびＣの両方に由来する莢膜サッカリドを含む場合、ＭｅｎＡサッカリド：ＭｅｎＣサッカリドの比（ｗ／ｗ）が１より多い（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１、またはこれらを超える）ことが好ましいかもしれない。異なるサッカリドを、同一または異なるキャリアタンパク質型に抱合することができる。必要に応じて任意の適切なリンカーを使用して、任意の適切な抱合反応を使用することができる。
【０１８４】
必要に応じて、有毒タンパク質抗原を解毒することができる（例えば、化学的および／または遺伝的手段による百日咳毒素の解毒）。
【０１８５】
薬学的に許容可能なキャリア
本発明の組成物は、典型的には、上記の成分に加えて、１つまたは複数の「薬学的に許容可能なキャリア」を含む。これらには、キャリア自体が組成物を投与された個体に有害な抗体の産生を誘導しない任意のキャリアが含まれる。適切なキャリアは、典型的には、巨大なゆっくり代謝される高分子（タンパク質、ポリサッカリド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および脂質凝集体（油滴またはリポソームなど）など）である。このようなキャリアは、当業者に周知である。組成物はまた、希釈剤（水、生理食塩水、グリセロールなど）を含み得る。さらに、補助剤（湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤など）も存在し得る。薬学的に許容可能な成分の徹底的な考察は、Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ．２０ｔｈ  ｅｄ．，ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２で得られる。
【０１８６】
免疫調節薬
アジュバント
本発明のワクチンを、他の免疫調節薬と組み合わせて投与することができる。詳細には、組成物は、通常、アジュバントを含む。本発明と使用するためのアジュバントには、１つまたは複数の下記のアジュバントが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８７】
Ａ．ミネラル含有組成物
本発明でのアジュバントとしての使用に適切なミネラル含有組成物には、ミネラル塩（アルミニウム塩およびカルシウム塩など）が含まれる。本発明は、水酸化物（例えば、オキシヒドロキシド）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシリン酸塩、正リン酸塩）、硫酸塩（例えば、）などのミネラル塩（ｃｈａｐｔｅｒｓ  ８  ＆  ９  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ．．．（１９９５）ｅｄｓ．Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ．ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ．Ｐｌｅｎｕｍ．）、または異なるミネラル化合物の混合物（例えば、任意選択的に過剰なリン酸塩を含むリン酸塩と水酸化物アジュバントの混合物）を含み、任意の適切な形態を取る化合物（例えば、ゲル、結晶、無定形など）および塩に吸着した化合物が好ましい。ミネラル含有組成物を、金属塩粒子として配合することもできる（ＷＯ００／２３１０５号）。
【０１８８】
Ａｌ３＋の用量が、０．２ｍｇ／用量と１．０ｍｇ／用量との間であるようにアルミニウム塩を本発明のワクチンに含めることができる。
【０１８９】
１つの実施形態では、本発明で使用されるアルミニウムベースのアジュバントは、ミョウバン（硫酸アルミニウムカリウム（ＡｌＫ（ＳＯ４）２））またはミョウバン誘導体（抗原を含むリン酸緩衝液とミョウバンとの混合およびその後の水酸化アンモニウムまたは水酸化ナトリウムなどの塩基での滴定および沈殿によってｉｎ  ｓｉｔｕで形成されたミョウバン誘導体など）である。
【０１９０】
本発明のワクチン処方物で使用される別のアルミニウムベースのアジュバントは、水酸化アンモニウムアジュバント（Ａｌ（ＯＨ）３）または結晶オキシ水酸化アルミニウム（ＡｌＯＯＨ）であり、これは、優れた吸着剤であり、表面積が約５００ｍ２／ｇである。あるいは、水酸化アルミニウムアジュバントのいくつかまたは全ての水酸基の代わりにリン酸基を含むリン酸アルミニウムアジュバント（ＡｌＰＯ４）またはヒドロキシリン酸アルミニウムを提供する。本明細書中に提供された好ましいリン酸アルミニウムアジュバントは、無定形であり、酸性、塩基性、および中性の媒質に溶解する。
【０１９１】
別の実施形態では、本発明のアジュバントは、リン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムの両方を含む。そのさらに詳細な実施形態では、アジュバントは、水酸化アルミニウムよりも大量のリン酸アルミニウムを有する（２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、または９：１を超えるリン酸アルミニウムの水酸化アルミニウムに対する重量比など）。さらにより詳細には、ワクチン中のアンモニウム塩は、ワクチン投与あたり０．４〜１．０ｍｇ、ワクチン投与あたり０．４〜０．８ｍｇ、ワクチン投与あたり０．５〜０．７ｍｇ、またはワクチン投与あたり約０．６ｍｇで存在する。
【０１９２】
一般に、好ましいアルミニウムベースのアジュバントまたは複数のアルミニウムベースのアジュバントの比（リン酸アルミニウムの水酸化アルミニウムに対する比など）を、抗原が所望のｐＨでアジュバントと逆の電荷を有するような分子間の静電気引力の至適化によって選択する。例えば、リン酸アルミニウムアジュバント（等電点＝４）は、ｐＨ７．４でリゾチームを吸着するが、アルブミンを吸着しない。アルブミンが標的である場合、水酸化アルミニウムアジュバントが選択されるであろう（等電点１１．４）。あるいは、リン酸塩での水酸化アルミニウムの前処理によってその等電点を低下させ、より塩基性の抗原に好ましいアジュバントにする。
【０１９３】
Ｂ．油性乳濁液
本発明でのアジュバントとしての使用に適切な油性乳濁液組成物には、スクアレン−水乳濁液（ＭＦ５９（ミクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を使用してサブミクロン粒子に配合した５％スクアレン、０．５％ＴＷＥＥＮ（商標）８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５）など）が含まれる。ＷＯ９０／１４８３７号を参照のこと。Ｐｏｄｄａ，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００１）１９：２６７３−２６８０；Ｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）２１：４２３４−４２３７も参照のこと。ＭＦ５９を、ＦＬＵＡＤ（商標）インフルエンザウイルス３価サブユニットワクチンにおけるアジュバントとして使用する。
【０１９４】
組成物での使用に特に好ましいアジュバントは、サブミクロン水中油滴型乳濁液である。本明細書中での使用に好ましいサブミクロン水中油滴型乳濁液は、任意選択的に様々な量のＭＴＰ−ＰＥを含むスクアレン／水乳濁液（４〜５％ｗ／ｖスクアレン、０．２５〜１．０％ｗ／ｖ  ＴＷＥＥＮ（商標）８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、および／または０．２５〜１．０％ＳＰＡＮ８５（商標）（ソルビタントリオレエート）、および、任意選択的に、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグアトミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を含むサブミクロン水中油滴型乳濁液（例えば、「ＭＦ５９」として公知のサブミクロン水中油滴型乳濁液）など）である（国際公開番号ＷＯ９０／１４８３７号；米国特許第６，２９９，８８４号および同第６，４５１，３２５号、ならびにＯｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．ｅｄｓ．）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５，ｐｐ．２７７−２９６）。ＭＦ５９は、４〜５％  ｗ／ｖスクアレン（例えば、４．３％）、０．２５〜０．５％  ｗ／ｖ  ＴＷＥＥＮ（商標）８０、および０．５％  ｗ／ｖ  ＳＰＡＮ８５（商標）を含み、任意選択的に、種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含み、Ｍｏｄｅｌ  １１０Ｙミクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）などのミクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に配合する。例えば、ＭＴＰ−ＰＥは、投与あたり約０〜５００μｇ、より好ましくは、投与あたり約０〜２５０μｇ、最も好ましくは、投与あたり約０〜１００μｇの量で存在し得る。本明細書中で使用される、用語「ＭＦ５９−０」は、ＭＴＰ−ＰＥを欠く上記のサブミクロン水中油滴型乳濁液をいう一方で、用語「ＭＦ５９−ＭＴＰ」は、ＭＴＰ−ＰＥを含む処方物を示す。例えば、「ＭＦ５９−１００」は、投与あたり１００μｇのＭＴＰ−ＰＥを含むなどである。ＭＦ６９（本明細書中で使用される別のサブミクロン水中油滴型乳濁液）は、４．３％  ｗ／ｖスクアレン、０．２５％  ｗ／ｖ  ＴＷＥＥＮ（商標）８０、および０．７５％  ｗ／ｖ  ＳＰＡＮ  ８５（商標）、任意選択的に、ＭＴＰ−ＰＥを含む。さらに別のサブミクロン水中油滴型乳濁液は、ＭＦ７５であり、ＳＡＦとしても公知であり、１０％スクアレン、０．４％ＴＷＥＥＮ（商標）８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、サブミクロン乳濁液にもミクロ流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｄ）されている。ＭＦ７５−ＭＴＰは、投与あたり１００〜４００μｇなどのＭＴＰ−ＰＥを含むＭＦ７５処方物を示す。
【０１９５】
組成物で使用されるサブミクロン水中油滴型乳濁液、その作製方法、および免疫刺激薬（ムラミルペプチドなど）は、ＷＯ９０／１４８３７号、米国特許第６，２９９，８８４号、および同第６，４５１，３２５号に詳述されている。
【０１９６】
フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）を、本発明のアジュバントとして使用することもできる。
【０１９７】
Ｃ．サポニン処方物
サポニン処方物を、本発明でアジュバントとして使用することもできる。サポニンは、広範な植物種の樹皮、葉、幹、根、およびさらに花で見出されるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｒｏｕｐ）である。シャボンの木の樹皮から単離したサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。スミラックス・オルナタ（Ｓｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ）（サルサパリラ）、シュッコンカスミソウ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）（ブライダルベール）、およびサボンソウ（サボンソウ根）由来のサポニンを購入することもできる。サポニンアジュバント処方物には、精製処方物（ＱＳ２１など）および脂質処方物（ＩＳＣＯＭなど）が含まれる。
【０１９８】
サポニン組成物は、高速薄層クロマトグラフィ（ＨＰ−ＴＬＣ）および逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用して精製されている。これらの技術を使用した特定の精製画分が同定されており、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ、およびＱＨ−Ｃが含まれる。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の産生方法は、米国特許第５，０５７，５４０号に開示されている。サポニン処方物はまた、コレステロールなどのステロールを含み得る（ＷＯ９６／３３７３９号を参照のこと）。
【０１９９】
サポニンとコレステロールとの組み合わせを使用して、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる固有の粒子を形成することができる。ＩＳＣＯＭには、典型的には、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなどのリン脂質も含まれる。任意の公知のサポニンを、ＩＳＣＯＭで使用することができる。好ましくは、ＩＳＣＯＭには、１つまたは複数のＱｕｉｌ  Ａ、ＱＨＡ、およびＱＨＣが含まれる。ＩＳＣＯＭは、ＥＰ０１０９９４２号、ＷＯ９６／１１７１１、号およびＷＯ９６／３３７３９号にさらに記載されている。任意選択的にＩＳＣＯＭＳは、さらなる界面活性剤を欠き得る。ＷＯＯＯ／０７６２１を参照のこと。
【０２００】
サポニンベースのアジュバントの開発の概説を、Ｂａｒｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９８）３２：２４７−２７１で見出すことができる。Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９８）３２：３２１−３３８も参照のこと。
【０２０１】
Ｄ．ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）
ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）を、本発明でアジュバントとして使用することもできる。これらの構造物は、一般に、任意選択的にリン脂質と組み合わせているかリン脂質を配合したウイルス由来の１つまたは複数のタンパク質を含む。これらは、一般に、非病原性であり、複製せず、一般に、任意の天然のウイルスゲノムを含まない。ウイルスタンパク質を、組換えによって産生するか、全ウイルスから単離することができる。ビロソームまたはＶＬＰでの使用に適切なこれらのウイルスタンパク質には、インフルエンザウイルス（ＨＡまたはＮＡなど）、Ｂ型肝炎ウイルス（コアタンパク質またはカプシドタンパク質など）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡ−ファージ、Ｑβファージ（コートタンパク質など）、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐｌなど）が含まれる。ＶＬＰは、ＷＯ０３／０２４４８０号、ＷＯ０３／０２４４８１号、Ｎｉｉｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００２）２９３：２７３−２８０；Ｌｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００１）５２４６−５３５５；Ｐｉｎｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（２００３）１８８：３２７−３３８；およびＧｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００１）７５（１０）：４７５２−４７６０でさらに考察されている。ビロソームは、例えば、Ｇｌｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００２）２０：Ｂ１０  −Ｂ１６でさらに考察されている。免疫増強再構成インフルエンザビロソーム（ＩＲＩＶ）は、鼻腔内３価ＩＮＦＬＥＸＡＬ（商標）製品（Ｍｉｓｃｈｌｅｒ  ＆  Ｍｅｔｃａｌｆｅ（２００２）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０  Ｓｕｐｐｌ  ５：Ｂ  １７−２３）およびＩＮＦＬＵＶＡＣ  ＰＬＵＳ（商標）製品におけるサブユニット抗原送達系として使用される。
【０２０２】
Ｅ．細菌または微生物の誘導体
本発明での使用に適切なアジュバントには、以下などの細菌または微生物の誘導体が含まれる。
【０２０３】
（１）腸内細菌リポポリサッカリド（ＬＰＳ）の非毒性誘導体
このような誘導体には、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が含まれる。３ｄＭＰＬは、Ｏ脱アシル化モノホスホリル脂質Ａと４、５、または６アシル化鎖との混合物である。３脱Ｏアシル化モノホスホリル脂質Ａの好ましい「小粒子」形態は、欧州特許第０  ６８９  ４５４号に開示されている。３ｄＭＰＬのこのような「小粒子」は、０．２２ミクロン膜で濾過滅菌するのに十分に小さい（欧州特許第０  ６８９  ４５４号を参照のこと）。他の非毒性ＬＰＳ誘導体には、モノホスホリル脂質Ａ模倣物（リン酸アミノアルキルグルコサミニド誘導体（例えば、ＲＣ５２９）など）が含まれる。Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  ９：２２７３−２２７８を参照のこと。
【０２０４】
（２）脂質Ａ誘導体
脂質Ａ誘導体には、ＯＭ−１７４などの大腸菌由来の脂質Ａ誘導体が含まれる。ＯＭ−１７４は、例えば、Ｍｅｒａｌｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）２１：２４８５−２４９１；およびＰａｊａｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）２１：８３６−８４２に記載されている。
【０２０５】
（３）免疫刺激オリゴヌクレオチド
本発明でのアジュバントとしての使用に適切な免疫刺激オリゴヌクレオチドには、ＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列（非メチル化シトシンの後にグアノシンを含み、リン酸結合によって連結した配列）が含まれる。回文配列またはポリ（ｄＧ）配列を含む細菌二本鎖ＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドも免疫刺激性を示すことが示されている。
【０２０６】
ＣｐＧには、ホスホロチオエート修飾物などのヌクレオチド修飾物／アナログが含まれ、二本鎖または一本鎖であり得る。任意選択的に、グアノシンを、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンなどのアナログと置換することができる。可能なアナログ置換物の例については、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００３）３１（９）：２３９３−２４００；ＷＯ０２／２６７５７号、およびＷＯ９９／６２９２３おうを参照のこと。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、Ｋｒｉｅｇ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００３）９（７）：８３１−８３５；ＭｃＣｌｕｓｋｉｅ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）３２：１７９−１８５；ＷＯ９８／４０１００号；米国特許第６，２０７，６４６号；同第６，２３９，１１６号、および同第６，４２９，１９９号でさらに考察されている。
【０２０７】
ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９（モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴなど）に指向することができる。Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ（２００３）３１（ｐａｒｔ  ３）：６５４−６５８を参照のこと。ＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答（ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮ）の誘導に特異的であり得るか、Ｂ細胞応答（ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮなど）の誘導により特異的であり得る。ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００３）１７０（８）：４０６１−４０６８；Ｋｒｉｅｇ，ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００２）２３（２）：６４−６５およびＷＯ０１／９５９３５号で考察されている。好ましくは、ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮである。
【０２０８】
好ましくは、５’末端が受容体認識のために接近可能なようにＣｐＧオリゴヌクレオチドを構築する。任意選択的に、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を、その３’末端で結合させて、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成させることができる。例えば、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．，ＢＢＲＣ（２００３）３０６：９４８−９５３；Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ（２００３）３１（ｐａｒｔ  ３）：６６４−６５８；Ｂｈａｇａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＢＲＣ（２００３）３００：８５３−８６１、およびＷＯ０３／０３５８３６号を参照のこと。
【０２０９】
（４）ＡＤＰリボシル化毒素およびその解毒誘導体
ＡＤＰリボシル化毒素およびその解毒誘導体を、本発明でアジュバントとしての使用することができる。好ましくは、タンパク質は、大腸菌（すなわち、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ）、コレラ（「ＣＴ」））、または百日咳（「ＰＴ」）に由来する。粘膜アジュバントとしての解毒ＡＤＰリボシル化毒素の使用は、ＷＯ９５／１７２１１号に記載されており、非経口アジュバントとしては、ＷＯ９８／４２３７５号に記載されている。好ましくは、アジュバントは、解毒ＬＴ変異体（ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴＲｌ９２Ｇなど）である。アジュバントとしてのＡＤＰリボシル化毒素およびその解毒誘導体（詳細には、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２）の使用を、以下の引例で見出すことができる：Ｂｅｉｇｎｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００２）７０（６）：３０１２−３０１９；Ｐｉｚｚａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００１）１９：２５３４−２５４１；Ｐｉｚｚａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２０００）２９０（４−５）：４５５−４６１；Ｓｃｈａｒｔｏｎ−Ｋｅｒｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０００）６８（９）：５３０６−５３１３；Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９９）６７（１２）：６２７０−６２８０；Ｐａｒｔｉｄｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）６７（３）：２０９−２１６；Ｐｅｐｐｏｌｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２００３）２（２）：２８５−２９３；およびＰｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ（２００２）８５（ｌ−３）：２６３−２７０。アミノ酸置換のための多数の引例は、好ましくは、Ｄｏｍｅｎｉｇｈｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＭｏＩ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９５）１５（６）：１１６５−１１６７に記載のＡＤＰリボシル化毒素のＡおよびＢサブユニットのアラインメントに基づく。
【０２１０】
Ｆ．生体接着剤および粘膜接着剤
生体接着剤および粘膜接着剤を、本発明でアジュバントとして使用することもできる。適切な生体接着剤には、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｃｏｎｔ．ＲｅＩｅ．７０：２６７−２７６）または粘膜接着剤（ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリサッカリド、およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体など）が含まれる。キトサンまたはその誘導体を、本発明でアジュバントとして使用することもできる。ＷＯ９９／２７９６０号を参照のこと。
【０２１１】
Ｇ．微粒子
微粒子を、本発明でアジュバントとして使用することもできる。微粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは、直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、最も好ましくは、直径約５００ｎｍ〜約１０μｍ）は、生分解性であり、且つ非毒性の材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアンヒドリド、ポリカプロラクトンなど）から形成され、ポリ（ラクチドコグリコリド）が好ましく、任意選択的に、負電荷表面（例えば、ＳＤＳを使用）または正電荷表面（例えば、ＣＴＡＢなどのカチオン性界面活性剤）を有するように処理されている。
【０２１２】
Ｈ．リポソーム
アジュバントとしての使用に適切なリポソーム処方物の例は、米国特許第６，０９０，４０６号、同第５，９１６，５８８号、および欧州特許第０  ６２６  １６９号に記載されている。
【０２１３】
Ｉ．ポリオキシエチレンエーテル処方物およびポリオキシエチレンエステル処方物
本発明での使用に適切なアジュバントには、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが含まれる。ＷＯ９９／５２５４９号。このような処方物には、オクトキシノール（ＷＯＯ１／２１２０７号）と組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステルならびに数なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤（オクトキシノールなど）と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１１５２号）がさらに含まれる。
【０２１４】
好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ｌａｕｒｅｔｈ  ９）、ポリオキシエチレン−９−ステロイルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステロイルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【０２１５】
Ｊ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）
ＰＣＰＰ処方物は、例えば、Ａｎｄｒｉａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｂｙ  ｃｏａｃｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｏｐｈａｚｅｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ”，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（１９９８）１９（ｌ−３）：１０９−１１５およびＰａｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ  Ｍａｔｒｉｃｅｓ”，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗ（１９９８）３１（３）：１８５−１９６に記載されている。
【０２１６】
Ｋ．ムラミルペプチド
本発明での使用に適切なムラミルペプチドの例には、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−１−アラニル−ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−１−アラニル−ｄ−イソグルタミニル−１−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）が含まれる。
【０２１７】
Ｌ．イミダゾキノリン化合物
本発明でのアジュバントとしての使用に適切なイミダゾキノリンの例には、イミキモドおよびそのアナログが含まれ、Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ（２００２）２７（７）：５７１−５７７；Ｊｏｎｅｓ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ（２００３）４（２）：２１４−２１８；米国特許第４，６８９，３３８号、同第５，３８９，６４０号、同第５，２６８，３７６号、同第４，９２９，６２４号、同第５，２６６，５７５号、同第５，３５２，７８４号、同第５，４９４，９１６号、同第５，４８２，９３６号、同第５，３４６，９０５号、同第５，３９５，９３７号、同第５，２３８，９４４号、および同第５，５２５，６１２号にさらに記載されている。
【０２１８】
Ｍ．チオセミカルバゾン化合物
本発明でのアジュバントとしての使用に完全に適切なチオセミカルバゾン化合物ならびに化合物の配合、製造、およびスクリーニング方法には、ＷＯ０４／６０３０８号に記載のものが含まれる。チオセミカルバゾンは、サイトカイン（ＴＮＦ−αなど）の産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激で特に有効である。
【０２１９】
Ｎ．トリプタントリン化合物
本発明でのアジュバントとしての使用に完全に適切なトリプタントリン化合物ならびに化合物の配合、製造、およびスクリーニング方法には、ＷＯ０４／６４７５９号に記載のものが含まれる。トリプタントリン化合物は、サイトカイン（ＴＮＦ−αなど）の産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激で特に有効である。
【０２２０】
本発明はまた、上記で同定した１つまたは複数のアジュバントの態様の組み合わせを含み得る。例えば、以下のアジュバント組成物を、本発明で使用することができる。
【０２２１】
（１）サポニンおよび水中油滴型乳濁液（ＷＯ９９／１１２４１号）；
（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）（ＷＯ９４／００１５３号を参照のこと）；
（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；
（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ  １２（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ＋ａ  ｓｔｅｒｏｌ）（ＷＯ９８／５７６５９）；
（５）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油滴型乳濁液との組み合わせ（欧州特許出願番号０８３５３１８号、同第０７３５８９８号、および同第０７６１２３１号を参照のこと）；
（６）１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ  ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、サブミクロン乳濁液にミクロ流動化されているか、より大きな粒子サイズの乳濁液にボルテックスされたＳＡＦ；
（７）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ  ８０、およびモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（ＴＭ））からなる群から選択される１つまたは複数の細菌細胞壁成分を含むＲｉｂｉ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；
（８）１つまたは複数のミネラル塩（アルミニウム塩など）＋ＬＰＳの非毒性誘導体（３ｄＰＭＬなど）；
（９）１つまたは複数のミネラル塩（アルミニウム塩など）＋免疫刺激オリゴヌクレオチド（ＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列など）。
【０２２２】
Ｏ．ヒト免疫調節薬
本発明でのアジュバントとしての使用に適切なヒト免疫調節薬には、インターロイキン（例えば、ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、インターフェロンγ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子などのサイトカインが含まれる。
【０２２３】
アルミニウム塩およびＭＦ５９は、注射用インフルエンザワクチンとの使用のための好ましいアジュバントである。細菌毒素および生体接着剤は、粘膜送達ワクチン（経鼻ワクチンなど）との使用のための好ましいアジュバントである。
【０２２４】
上記引用の全ての特許、特許出願、および学術論文の内容が、本明細書中で完全に期さされているかのように参考として援用される。
【０２２５】
治療方法
本発明は、上記の組成物を使用したＧＡＳ抗原に対する免疫応答の誘導または増加方法を提供する。免疫応答は、好ましくは、防御免疫応答であり、抗体および／または細胞性免疫（全身免疫および粘膜免疫が含まれる）が含まれる。免疫応答には、追加免疫応答が含まれる。抗体を含む組成物を使用して、化膿性レンサ球菌感染を治療することができる。
【０２２６】
十代および児童（小児および乳児が含まれる）に予防用ワクチンを投与することができ、治療ワクチンを、典型的には、十代または成人に投与する。安全性、投薬量、免疫原性などを評価するために、児童溶ワクチンを、成人に投与することもできる。
【０２２７】
本発明にしたがって防止または治療することができる化膿性レンサ球菌によって引き起こされる疾患には、咽頭炎（レンサ球菌性咽頭炎など）、猩紅熱、膿痂疹、丹毒、蜂巣炎、敗血症、毒素性ショック症候群、壊死性筋膜炎、および続発症（リウマチ熱および急性糸球体腎炎など）が含まれるが、これらに限定されない。組成物はまた、他のレンサ球菌（例えば、ＧＢＳ）に対して有効であり得る。
【０２２８】
免疫応答の有効性を決定するための試験
治療上の処置の有効性を評価する１つの方法は、本発明の組成物の投与後にＧＡＳ感染をモニタリングする工程を含む。予防的処置の有効性を評価する１つの方法は、組成物の投与後に本発明の組成物中のＧＡＳ抗原に対する免疫応答をモニタリングする工程を含む。
【０２２９】
本発明の免疫原性組成物の成分タンパク質の免疫原性を評価する別の方法は、組換えによってタンパク質を発現し、免疫ブロットによって患者の血清または粘膜分泌物をスクリーニングすることである。タンパク質および患者の血清との間の陽性反応は、患者が既に問題のタンパク質に対する免疫応答を保持する（すなわち、タンパク質が免疫原である）ことを示す。この方法を使用して、免疫優性タンパク質および／またはエピトープを同定することもできる。
【０２３０】
治療上の処置の有効性をチェックする別の方法は、本発明の組成物の投与後にＧＡＳ感染をモニタリングする工程を含む。予防的処置の有効性をチェックする別の方法は、組成物の投与後に本発明の組成物中のＧＡＳ抗原に対する全身（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ産生レベルのモニタリングなど）および粘膜（ＩｇＡ産生レベルのモニタリングなど）の免疫応答をモニタリングする工程を含む。典型的には、ＧＡＳ血清特異的抗体応答を、免疫化後であるが攻撃誘発前に決定するのに対して、粘膜ＧＡＳ特異的抗体応答を、免疫化後且つ攻撃誘発後に決定する。
【０２３１】
本発明のワクチン組成物を、宿主（例えば、ヒト）への投与前にｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで評価することができる。特に有用なマウスモデルには、腹腔内免疫化後に腹腔内攻撃誘発または鼻腔内攻撃誘発を行うマウスモデルが含まれる。腹腔内免疫化を後に腹腔内攻撃誘発を行ったモデルを、図１３に示す。
【０２３２】
本発明の免疫原性組成物の有効性を、免疫原性組成物でのＧＡＳ感染の動物モデル（例えば、モルモットまたはマウス）の攻撃誘発によってｉｎ  ｖｉｖｏで決定することもできる。免疫原性組成物は、攻撃誘発血清型と同一の血清型に由来しても由来しなくても良い。好ましくは、免疫原性組成物は、攻撃誘発血清型と同一の血清型に由来する。より好ましくは、免疫原性組成物および／または攻撃誘発血清型は、Ｍ１、Ｍ３、Ｍ２３、および／またはこれらの組み合わせからなるＧＡＳ血清型群から誘導可能である。
【０２３３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性モデルには、以下が含まれるが、これらに限定されない：（ｉ）ヒトＧＡＳ血清型を使用したマウス感染モデル、（ｉｉ）マウス適合ＧＡＳ株（マウスで特に病原性を示すＭ２３株）を使用したマウスモデルであるマウス疾患モデル、および（ｉｉｉ）ヒトＧＡＳ単離物を使用した霊長類モデル。
【０２３４】
免疫応答は、ＴＨ１免疫応答およびＴＨ２応答の一方または両方であり得る。免疫応答は、改善されているか、増強されているか、変化した免疫応答であり得る。免疫応答は、全身および粘膜免疫応答の一方または両方であり得る。好ましくは、免疫応答は、増強された全身および／または粘膜応答である。
【０２３５】
全身および／または粘膜免疫の増強は、ＴＨ１および／またはＴＨ２免疫応答の増強を反映する。好ましくは、免疫応答の増強には、ＩｇＧ１および／またはＩｇＧ２ａおよび／またはＩｇＡの産生の増加が含まれる。
【０２３６】
好ましくは、粘膜免疫応答は、ＴＨ２免疫応答である。好ましくは、粘膜免疫応答には、ＩｇＡ産生の増加が含まれる。
【０２３７】
活性化ＴＨ２細胞は抗体産生を増強し、それにより、細胞外感染に対する応答で有益である。活性化ＴＨ２細胞は、１つまたは複数のＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０を分泌することができる。ＴＨ２免疫応答により、将来の防御のためのＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡ、および記憶Ｂ細胞を産生することができる。
【０２３８】
ＴＨ２免疫応答には、ＴＨ２免疫応答に関連する１つまたは複数のサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０など）の増加またはＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡ、および記憶Ｂ細胞の産生の増加の１つまたは複数が含まれ得る。好ましくは、ＴＨ２免疫応答の増強には、ＩｇＧ１産生の増加が含まれる。
【０２３９】
ＴＨ１免疫応答には、ＣＴＬの増加、ＴＨ１免疫応答に関連する１つまたは複数のサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮγ、およびＩＦＮβなど）の増加、活性化マクロファージの増加、ＮＫ活性の増加、またはＩｇＧ２ａ産生の増加の１つまたは複数が含まれ得る。好ましくは、ＴＨ１免疫応答の増強には、ＩｇＧ２ａ産生の増加が含まれる。
【０２４０】
本発明の免疫原性組成物、詳細には、本発明の１つまたは複数のＧＡＳ抗原を含む免疫原性組成物を、単独または任意選択的にＴｈ１および／またはＴｈ２応答を誘発することができる免疫調節薬と組み合わせて使用することができる。
【０２４１】
本発明はまた、１つまたは複数の免疫調節薬（アルミニウム塩などのミネラル塩など）およびＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを含む。最も好ましくは、免疫原性組成物は、アルミニウム塩およびＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドの両方を含む。あるいは、免疫原性組成物は、ＡＤＰリボシル化毒素（解毒ＡＤＰリボシル化毒素など）およびＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを含む。好ましくは、１つまたは複数の免疫調節薬には、アジュバントが含まれる。アジュバントを、以下でさらに考察したＴＨ１アジュバントおよびＴＨ２アジュバントからなる１つまたは複数の群から選択することができる。
【０２４２】
本発明の組成物は、好ましくは、ＧＡＳ感染に有効に対処するための細胞性免疫応答および体液性免疫応答の両方を誘発する。この免疫応答は、好ましくは、持続的（例えば、中和）抗体および１つまたは複数のＧＡＳ抗原への曝露の際に迅速に応答することができる細胞性免疫を誘導する。
【０２４３】
１つの特に好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、中和抗体応答を誘発する１つまたは複数のＧＡＳ抗原および細胞性免疫応答を誘発する１つまたは複数のＧＡＳ抗原を含む。このような方法で、中和抗体応答がＧＡＳ感染を防止または阻害する一方で、増強されたＴｈ１細胞応答を誘発することができる細胞性免疫応答はＧＡＳ感染のさらなる拡大を防止する。好ましくは、免疫原性組成物は、１つまたは複数のＧＡＳ表面抗原および１つまたは複数のＧＡＳ細胞質抗原を含む。好ましくは、免疫原性組成物は、１つまたは複数のＧＡＳ４０表面抗原などおよび１つまたは複数の他の抗原（Ｔｈ１細胞応答を誘発することができる細胞質抗原など）を含む。
【０２４４】
本発明の組成物を、一般に、患者に直接投与する。本発明の組成物を、単独または組成物の一部として種々の異なる経路で投与することができる。より有効な免疫応答（好ましくはＣＭＩ応答）が得られるか、副作用を誘導する可能性が低いか、投与がより容易になるように、一定の組成物に一定の経路を選択することができる。
【０２４５】
送達方法には、非経口注射（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、または間質への注射）、直腸、経口（例えば、錠剤、スプレー）、膣、局所、経皮（例えば、ＷＯ９９／２７９６１号を参照のこと）、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）（例えば、ＷＯ０２／０７４２４４号およびＷＯ０２／０６４１６６２号を参照のこと）、鼻腔内（ＷＯ０３／０２８７６０を参考のこと）、眼内、耳、および肺、または他の粘膜投与が含まれる。
【０２４６】
例として、本発明の組成物を、全身経路、粘膜経路、または経皮経路を介して投与するか、特定の組織に直接投与することができる。本明細書中で使用される、用語「全身投与」には、任意の非経口投与経路が含まれるが、これに限定されない。詳細には、非経口投与には、皮下、腹腔内、静脈内、動脈内、筋肉内、または間質への注射、静脈内、動脈内、または腎臓透析注入技術が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、全身、非経口投与は、筋肉内注射である。本明細書中で使用される、用語「粘膜投与」には、蛍光、動脈内、膣内、直腸内、気管内、腸内、および癌内投与が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４７】
投薬治療は、単回投与計画または複数回投与計画であり得る。複数回投与を、一次免疫化計画および／または追加免疫化計画で使用することができる。複数回投与計画では、同一または異なる経路（例えば、非経口での初回刺激（ｐｒｉｍｅ）および粘膜での追加免疫（ｂｏｏｓｔ）、粘膜の初回刺激および非経口の追加免疫など）によって種々の用量を投与することができる。
【０２４８】
本発明の組成物を、種々の形態で調製することができる。例えば、組成物を、注射可能な溶液または懸濁液のいずれかとして調製することができる。注射前に液体賦形剤で懸濁液または液体にするのに適切な固体形態を調製することもできる（例えば、凍結乾燥組成物）。経口投与のための組成物（錠剤もしくはカプセル、スプレー、またはシロップ（任意選択的に、風味づけする）など）を調製することができる。例えば、微粉またはスプレーを使用した吸入物（ｉｎｈａｌｅｒ）として、肺投与のための組成物を調製することができる。座剤またはペッサリーとして組成物を調製することができる。鼻内、耳内、または癌内投与のための組成物（例えば、点滴薬）を調製することができる。組成物は、組み合わせた組成物を患者への投与直前に再構成されるようにデザインされたキット形態であり得る。このようなキットは、液体形態の１つまたは複数のＧＡＳまたは他の抗原および１つまたは複数の凍結乾燥抗原を含み得る。
【０２４９】
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的有効量のＧＡＳ、他の抗原（または抗原をコードする核酸分子）、または抗体、および、必要に応じて、抗生物質などの任意の他の成分を含む。「免疫学的有効量」は、単回用量または一連の投与の一部として個体に投与した場合に測定可能な免疫応答が増加するか臨床症状が防止または軽減される量である。
【０２５０】
本発明の免疫原性組成物を、抗生物質治療計画と組み合わせて投与することができる。１つの実施形態では、抗生物質を、本発明の抗原または本発明の１つまたは複数のＧＡＳ抗原を含む組成物の投与前に投与する。
【０２５１】
別の実施形態では、抗生物質を、１つまたは複数の本発明の表面露出ＧＡＳ抗原および／または表面結合ＧＡＳ抗原または本発明の１つまたは複数の表面露出ＧＡＳ抗原および／または表面結合ＧＡＳ抗原を含む組成物の投与後に投与する。ＧＡＳ感染治療での使用に適切な抗生物質の例には、ペニシリンもしくはその誘導体またはクリンダマイシン、セファロスポリン、糖ペプチド（例えば、バンコマイシン）、およびシクロセリンが含まれるが、これらに限定されない。
【０２５２】
しかし、組成物中の活性因子の量は、治療される個体の健康状態および体調、年齢、治療される個体の分類群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望の防御の程度、ワクチンの処方、治療する医師の医療状況の評価、および他の関連要因によって変化する。量の範囲は比較的広く、日常的試験によって決定することができる。
【０２５３】
キット
本発明はまた、１つまたは複数の本発明の組成物の容器を含むキットを提供する。組成物は、液体形態であり得るか、個別の抗原として凍結乾燥することができる。組成物に適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が含まれる。容器を、種々の材料（ガラスまたはプラスチックが含まれる）から形成することができる。容器は、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって突き刺すことができるストッパーを有する静脈注射液のバッグまたはバイアルであり得る）。
【０２５４】
キットは、薬学的に許容可能な緩衝液（リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル液、またはデキストロース溶液など）をさらに含み得る。キットはまた、末端利用者に有用な他の材料（緩衝液、希釈液、フィルター、針、およびシリンジが含まれる）を含み得る。キットはまた、別の活性因子（例えば、抗生物質）を有する第２または第３の容器を含み得る。
【０２５５】
キットはまた、化膿性レンサ球菌に対する免疫誘導方法または化膿性レンサ球菌感染の治療について説明書を含む添付文書を含み得る。添付文書は、食品医薬品局（ＦＤＡ）または他の規制機関によって承認されていないドラフト（ｄｒａｆｔ）添付文書であり得るか、承認されている添付文書であり得る。
【０２５６】
本開示で引用された全ての特許、特許出願、および引例は、特に本明細書中で参考として援用される。上記開示は、一般に、本発明を説明している。以下の特定の実施例を参照してより完全に理解することができ、これらの実施例は本発明の例示を目的とし、本発明の範囲を制限することを意図しない。
【実施例】
【０２５７】
実施例１  表面露出ＧＡＳ抗原の同定
ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴａ、ＭＯＴＩＦＳ、ＦＩＮＤＰＡＴＴＥＲＮＳ、ＰＳＯＲＴ、ならびにＰｒｏＤｏｍ、Ｐｆａｍ、およびＢｌｏｃｋｓデータベース検索を使用して、７３組のタンパク質を、ＧＡＳＳＦ３７０株（Ｍ１）ゲノムの表面発現タンパク質としてｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで同定した。これらのプログラムを使用して、表面結合タンパク質に典型的な特徴（膜貫通ドメイン、リーダーペプチド、既知の表面タンパク質との相同性、リポタンパク質の署名配列（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）、外膜繋留モチーフ、およびＲＧＤなどの宿主−細胞結合ドメインなど）を予想した。結果を、表３に示す。
【０２５８】
市販の大腸菌発現ベクターｐＥＴおよびｐＧＥＸを使用して、ＨＩＳタグ化タンパク質またはＨＩＳ−ＧＳＴ融合物（すなわち、アミノ末端ヒスチジンタグおよびカルボキシ末端ＧＳＴ）のいずれかとしてＧＡＳ抗原を発現させた（どの「ＧＳＴ」が特定されなくとも、ＨＩＳタグ化抗原のみを発現した）。図４Ａおよび４Ｂを参照のこと。場合によっては、尿素を使用して抗原を可溶化した。簡潔に述べれば、ＰＣＲ反応を実施して、ＧＡＳ抗原コード配列を増幅し、次いで、増幅産物を一晩消化した。次いで、消化ＰＣＲ産物を精製し、ｐＥＴまたはｐＧＥＸベクターのいずれかで一晩ライゲーションした。大腸菌Ｂ２１株（ＤＥ３）およびＢＬ２１を、ｐＧＥＸおよびｐＥＴライゲーション産物でそれぞれ形質転換し、プレートし、３７℃でインキュベートした。各形質転換由来の２つのＰＣＲ陽性クローンをインキュベートし、一晩成長させた。これらのクローン中のタンパク質発現を、ＩＰＴＧで誘導し、大腸菌抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって評価した。次いで、ＧＡＳ抗原発現クローンのグリセロールバッチを調製した。
【０２５９】
２つの同定タンパク質（ＧＡＳ８７、１７１）は発現されなかった。マウスを、７０種の他のタンパク質で免疫化した。これらのマウスの血清を、天然の細菌細胞のＦＡＣＳ分析のために使用し、異なるＭ型の２０のＧＡＳ株に対して表面露出を試験した（表２を参照のこと）。細菌細胞表面上の各タンパク質の有無を、免疫血清を使用して得られたＦＡＣＳ値と免疫前血清を使用して得たＦＡＣＳ値との間の相違の計算（Δ平均（Ｄｅｌｔａ  Ｍｅａｎ））によって評価した。８０以上のΔ平均の任意のカットオフを使用して、タンパク質を「表面露出」として分類した。試験した抗原のうちの３つが、この閾値を満たさなかった（ＧＡＳ８８、２０８、および２１０）。試験した他のＧＡＳ抗原についての結果を、表４Ａ〜４Ｒおよび図２に示す。
【０２６０】
実施例２  異なるＧＡＳ株におけるＧＡＳ４０タンパク質の同一性
異なるＭ型のＧＡＳ株からゲノムＤＮＡを調製し、全長ＧＡＳ抗原の完全なタンパク質配列を得た。結果を図１および表５に示す。
【０２６１】
実施例３  ＧＡＳ４０タンパク質が表面露出されていることの証明
実施例１に記載のようにＦＡＣＳ分析を行い、ＧＡＳ４０タンパク質が表面露出されていることを証明した。結果を図２に示す。
【０２６２】
実施例４  種々のＧＡＳ４０抗原のＦＡＣＳ分析
マウスを、種々のＧＡＳ４０抗原で免疫化した。これらのマウスの血清を、種々の化膿性レンサ球菌株の天然の細菌細胞についてのＦＡＣＳ分析のために使用した。これらの抗血清が細菌細胞表面のＧＡＳ４０タンパク質を検出する能力を、免疫血清を使用して得られたＦＡＣＳ値と免疫前血清を使用して得たＦＡＣＳ値との間の相違の計算によって評価した。結果を、図３〜１１に示す。
【０２６３】
「天然の４０」（図３）は、配列番号１７に示すアミノ酸配列を有するＧＡＳ４０タンパク質であり、ＳＦ３７０株のゲノム配列由来のヌクレオチド配列によってコードされる。
【０２６４】
「ＧＳＴ４０」（図４Ａ〜４Ｂ）は、そのＮ末端のリーダー配列の代わりにグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを有するハイブリッドＧＡＳ４０抗原である。Ｎ末端アミノ酸ＬＶＰＲＧＳＨＭ（配列番号９６３）およびＣ末端アミノ酸ＡＡＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号９６４）は、ＧＳＴベクターｐＧＥＸＮＮＨに属する。
【０２６５】
「４０ａ」（図５Ａ〜５Ｂ）は、ＨＩＳタグを有するがリーダー配列および疎水性配列を持たないＧＡＳ４０抗原である（配列番号２３５）。配列番号８９２に示すヌクレオチド配列を、ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩ制限部位を使用してベクターｐＥＴ２１ｂ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローン化した。カルボキシル末端の１２アミノ酸を、ベクターに移入した。コドン８２４（野生型配列中のＡＧＡ）を、ＣＧＴに変異誘発した。
【０２６６】
「４０ａＣＨ」（図６Ａ〜６Ｂ）は、そのカルボキシル末端にＨＩＳタグを有し、そのＮ末端に２つのさらなるアミノ酸を有するＧＡＳ４０抗原である。そのコード配列ｐＳＭ２１４ｇＣＨシャトルベクターへのクローニングを使用して３つのヌクレオチドを変化させる（ヌクレオチド１９８、２２２、および１１１５）。１つのアミノ酸（アミノ酸３７２）を、ＰｈｅからＳｅｒに変化させた。
【０２６７】
「４０／１１７」（図７）は、ＧＡＳ４０タンパク質をＧＡＳ１１７タンパク質のＮ末端に配置し、ＨＩＳタグをＧＡＳ１１７タンパク質のＣ末端に付加したＧＡＳ４０ハイブリッド抗原である（配列番号２３４）。配列番号８９１は、この抗原をコードするヌクレオチド配列である。
【０２６８】
「１１７／４０」（図８）は、リンカー配列ＹＡＳＧＧＧＳ（配列番号２７８）によってＧＡＳ１１７をＧＡＳ４０に配置したＧＡＳ４０ハイブリッド抗原である。そのアミノ酸配列を配列番号２３３に示し、コード配列を配列番号８９０に示す。
【０２６９】
「４０ａＲＲ」（図９Ａ〜９Ｂ）は、コート配列中の２つのさらなるＡＧＡコドン（３３４および３３５）がＣＧＴに変異したこと以外は、「４０ａ」に類似している。
【０２７０】
「４０ａＮＨ」（図１０Ａ〜１０Ｂ）は、そのＮ末端にＨＩＳタグを有するＧＡＳ４０抗原である。そのコード配列を、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの代わりに構成性プロモーターを使用する大腸菌／枯草菌発現シャトルベクターｐＳＭ２１４ｇＮＨにクローン化した。アミノ末端の９アミノ酸を、クローニングを使用して移入する。これは、２つのヌクレオチドが変化し、この変化はＰＣＲ増幅中に生じる可能性が最も高く、それにより、アミノ酸は変化しない（ヌクレオチド３５６および１５４７）。
【０２７１】
「４０ａＲＲＮＨ」（図１１Ａ〜１１Ｂ）は、コドン１０３４および１０３５をＣＧＴに修飾したこと以外は「４０ａＮＨ」に類似する。
【０２７２】
実施例５  マウスの免疫化
６週齢と７週齢との間の１０匹のＣＤ１雌マウス群を、１００μｌの適切な溶液に懸濁した２つまたはそれを超える本発明のＧＡＳ抗原（２０μｇの各組換えＧＡＳ抗原）で免疫化する。０、２１、および４５日目に、各群に３回投与した。最初の投与については同体積のフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）を使用し、その後の２回の投与についてはフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）を使用したタンパク質の腹腔内注射によって免疫化を行った。各免疫化スキームでは、ネガティブコントロール群およびポジティブコントロール群を使用した。図１３を参照のこと。
【０２７３】
ネガティブコントロール群について、マウスを、いかなるＧＡＳ  ＯＲＦを含まないｐＥＴ２１ｂまたはｐＧＥＸ−ＮＮＨベクターのいずれかを含む（したがって、ＧＳＴのみを発現する）大腸菌株由来の全細菌抽出物の処理後に精製カラムから溶離した大腸菌タンパク質で免疫化した（この群を、それぞれＨｉｓＳｔｏｐまたはＧＳＴＳｔｏｐと示すことができる）。ポジティブコントロール群についてえ、マウスを、ＧＡＳ  ＳＦ３７０株またはＧＡＳ  ＤＳＭ  ２０７１株のいずれかからクローン化した精製ＧＡＳ  Ｍで免疫化した（この群を、それぞれ１９２ＳＦおよび１９２ＤＳＭと示した）。
【０２７４】
各群由来のプールした血清を最初の免疫化前および最後の免疫化から２週間後に回収した。約１週間後、マウスを、ＧＡＳに感染させた。
【０２７５】
免疫化マウスを、ＧＡＳ２０７１株（選択されたタンパク質のクローニングのために使用された異なる株）を使用して感染させた。（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，ＤＳＭＺ）。
【０２７６】
感染実験のために、ＤＳＭ２０７１を、ＯＤ６００が０．４になるまでＴＨＹブロス中にて３７℃で成長させた。遠心分離によって細菌をペレット化し、ＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳで懸濁し、希釈して、適切な濃度の細菌／ｍｌにし、腹腔内注射によってマウスに投与した。５つのＴＨＹプレート上の細菌懸濁液のアリコートのプレーティングによって決定したところ、５０と１００との間の細菌を各マウスに投与した。動物を毎日観察し、生存についてチェックした。腹腔内攻撃誘発後に得られた結果を、図２２および表６Ａに示す。鼻腔内攻撃誘発後に得られた結果を、表６Ｂに示す（生存率の増加に留意のこと）。
【０２７７】
実施例６
上記モデルを使用して、選択されたＧＡＳ抗原を試験し、これらのいくつかは、統計的に有意な防御率を示した（図１４）。これらのうち、ＧＡＳ４０は特に有望なようであり、異種ＧＡＳ株でのマウス攻撃誘発に対して５０％を超える防御率を示した。
【０２７８】
実施例７  ＦＡＣＳ分析
細菌を、ＴＨＹ中でＯＤ６００＝０．４まで成長させ、ＰＢＳで２回洗浄し、ＮＣＳ（新生仔牛血清、Ｓｉｇｍａ）に懸濁し、室温で２０分間インキュベートし、９６ウェルプレート（２０μｌ／ウェル）に分注した。ＰＢＳ−０．１％ＢＳＡで希釈した８０μｌの全免疫または免疫マウス血清を、最終的に希釈倍率が２００倍になるように細菌懸濁液に添加し、氷上で３０分間インキュベーションを行った。ＰＢＳ−０．１ＢＳＡでの２回の洗浄後、細菌を、最終的に１００倍希釈にした１０μｌのＦ（ａｂ’）２フラグメント特異的Ｒ−フィコエリトリンと抱合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を含むＰＢＳ−０．１％ＢＳＡ−２０％ＮＣＳ中にて氷上で３０分間インキュベートした。
【０２７９】
インキュベーション後、細菌を、ＰＢＳ−０．１％ＢＳＡで洗浄し、２００μｌＰＢＳに懸濁し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ  ＵＳＡ）およびＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ  ＵＳＡ）を使用して分析した。結果を、図１７に示す。
【０２８０】
実施例８  細菌表面上のＧＡＳ４０の分布
免疫金標識および電子顕微鏡法
ＧＡＳを、ＴＨＹＥ培地中で中対数期（ｍｉｄ−ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ）まで成長させ、ＰＢＳで洗浄し、再懸濁した。Ｆｏｒｍｖａｒ炭素コーティングニッケルグリッドを、ＧＡＳ懸濁液の液滴上に浮かせ、２％ＰＦＡ中で５分間固定し、ブロッキング溶液（１％ウサギ正常血清および１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）中に３０分間入れた。次いで、グリッドを、ブロッキング溶液で２０倍希釈した一次抗血清の液滴上に室温で３０分間浮かせ、洗浄し、１％ＢＳＡで１０倍希釈した１０ｎｍ金粒子に抱合した二次抗体上に３０分間浮かせた。
【０２８１】
グリッドをＰＢＳで洗浄し、水で希釈し、風乾し、ＴＥＭ  ＧＥＯＬ  １２００ＥＸ  ＩＩ透過型電子顕微鏡を使用して試験した。ネガティブコントロールとして、同一動物由来の免疫前血清を使用した。結果を、図１８に示す。
【０２８２】
実施例９  オプソニン化食作用および細菌成長阻害
細菌接種物の調製
細菌細胞を、中指数期（ｍｉｄｄｌｅ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｐｈａｓｅ）（ＯＤ６６０＝０．４）に到達するまでＴＨＹ培地中にて３７℃で成長させた。細菌を、冷却生理食塩水で２回洗浄し、ＭＥＭ培地に懸濁し、使用細菌量に応じて各株について体積を調製した。アッセイで使用するまで細菌細胞を氷中に保持した。
【０２８３】
末梢単核細胞（ＰＭＮ）の調製
ヘパリン処理血液のバフィコートからＰＭＮを調製した。バフィコートを、デキストラン、ＮａＣｌ、およびヘパリンを含む溶液中で（１：１の比）３０分間インキュベートした。上清のインキュベーション後、富化したハッケッキュウを除去し、清潔なチューブに移し、７００×ｇで２０分間遠心分離した。水で短時間洗浄して赤血球を破壊し、ＮａＣｌ溶液を添加して適切な塩濃度に戻した。この工程後に細胞を遠心分離し、洗浄し、適切な濃度のＭＥＭ中に懸濁した。
【０２８４】
オプソニン化食作用アッセイ
ＧＡＳ株を、熱不活化免疫マウス血清（またはコントロールとして免疫前）、ヒトＰＭＮ、および仔ウサギ補体と共に３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーションの直前または後に採取したサンプルを、ＴＨＹ血液寒天プレート上にプレートした。免疫前血清および免疫血清のコロニー数の相違を２回比較することによって食作用を評価した。データを、ｔ＝０での成長コロニー数の対数−ｔ＝６０での成長コロニー数の対数として報告した。図２０を参照のこと。
【０２８５】
細菌成長阻害
ＧＡＳ４０で免疫化したマウス由来の完全なヘパリン処理血液を、上記のように成長させた細菌細胞とインキュベートした。タンパク質緩衝液のみで免疫化したマウスの血液を、コントロールとして使用した。サンプルを、３７℃で３時間回転させた。反応物を、ＴＨＹ血液寒天プレート上にプレートし、ＣＦＵを計数した。サンプル中およびコントロール中のコロニー数の比較によって成長阻害を評価した。図１９を参照のこと。
【０２８６】
実施例１０  ＧＡＳ４０の発現
十分に保存されているようであるＧＡＳ４０遺伝子が実際の異なる株で発現されるかどうかを試験するために、異なるＧＡＳ株パネル由来の全細胞抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、組換えＧＡＳ４０に対して惹起された免疫血清で探索した。図１６に示すように、タンパク質は、試験した全株において検出可能なレベルで発現されるが、一定レベルのばらつきが認められた。
【０２８７】
細胞抽出物を、細胞を１０ｍｌのＴＨＹ中でＯＤ６０００．３２まで成長させることによって得た。細胞ペレットを、ＰＢＳで洗浄し、溶解緩衝液（４０％スクロース、０．１Ｍ  ＫＰＯ４（ｐＨ６．２）、ＭｇＣｌ２  １０ｍＭ、およびＲｏｃｈｅのＣＯＭＰＬＥＴＥ（商標）（無ＥＤＴＡ））に再懸濁し、４００Ｕのムタノリシン（ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ）および２ｍｇ／ｍｌリゾチームで３時間消化した。不溶性画分を遠心分離によって分離し、上清を分析した。
【０２８８】
実施例１１  ＧＡＳ４０ドメインのクローニング
ＧＡＳ４０のアミノ酸配列に基づいた計算機構造研究により、２つの潜在的なコイルドコイル領域（一方はＣ末端に存在し、他方はＮ末端に存在する）が同定された（ＷＯ０５／０３２５８２号を参照のこと）。この予想を使用して、２つの単離タンパク質ドメイン（一方は推定３０５（４０Ｎ）アミノ酸であり、他方は５６８アミノ酸（４０Ｃ）である）をクローン化および発現した。２組のプライマー（以下を参照のこと）（それぞれ推定コイルドコイルドメインの１つを含む）を使用して、ＰＣＲによって２つの異なるコード領域を増幅した。
【０２８９】
【化４６】
2008544949.tif 000015
次いで、ＤＮＡフラグメントを、ｐＥＴ２１ｂ＋およびｐＧＥＸベクターにクローン化し、大腸菌中で発現させた。Ｎ末端ドメインのみから推定されるサイズ（４０Ｎ）の産物が得られた。図２１を参照のこと。ＧＡＳ４０Ｎは、ＧＡＳ４０の２９２アミノ酸部分からなり、配列の最初にメチオニンを含み、末端にポリヒスチジンを含む。
【０２９０】
実施例１２  ＧＡＳ４０は、異なるＭ株を通して表面露出する
図２３は、ＧＡＳ４０が異なるＭ株を通して表面露出することを証明する。患者またはＧＡＳ感染から回復した患者由来の回復期の血清を使用してデータを得た。
【０２９１】
実施例１３  ＧＡＳ４０Ｎは、４つの抗ＧＡＳ４０モノクローナル抗原に反応しない
図２４は、ＧＡＳ４０に対する４つの異なるモノクローナル抗体（２８Ａ８、２９Ｇ２、２Ｅ４、および４Ｅ６）が分子のＧＡＳ４０Ｎ部分に反応しないことを証明する。
【０２９２】
「ＧＡＳ４０Ｎ」の見出しの下のブランク垂直型ゲルおよびＧＡＳタンパク質との反応性に留意のこと（「ＧＡＳ４０」カラムを参照のこと）。これらの結果は、これらのＧＡＳ４０モノクローナル抗体がＧＡＳ４０Ｎ特異的エピトープに対して惹起されなかったことを示す。
【０２９３】
図２４に示すＦＡＣＳグラフは、４つのＧＡＳ４０モノクローナル抗体がＭ２３株上のいかなる表面露出分子とも結合しないようであるのに対して、４つのＧＡＳ４０モノクローナル抗体のうちの少なくとも３つがＭ４株上の表面露出分子に結合するようであることを証明する。この結果を、Ｍ２３が莢膜を有する株であり、それにより、莢膜が表面露出ＧＡＳ４０分子を遮断するという事実によって説明することができる。
【０２９４】
実施例１３  表面分析：プロテアーゼ消化、液体クロマトグラフィ、およびタンデム質量分析法を使用したＧＡＳ表面タンパク質の同定
細菌株および培養。低莢膜化（ｈｙｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）Ｍ１野生型ＳＦ３７０株（Ｍ１血清型）（Ｆｅｒｒｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８，４６５８−６３，２００１）、ＣＤＣ  ＳＳ−９０株（Ｍ３血清型）、および２０７１株（Ｍ２３血清型）由来の化膿性レンサ球菌を、ＯＤ６００＝０．４に到達するまで（指数増殖期）、Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔブロス（ＴＨＢ）中にて３７℃、５％ＣＯ２で成長させた。培養後、細菌を、３，５００×ｇにて４℃で１０分間の遠心分離によって採取し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、下記の実験で使用した。Ｍ１のゲノムデータは、機能に関するバイオインフォマティクスによる推定結果と共にＴＩＧＲウェブサイト（ＵＲＬアドレス：ｈｔｔｐファイルタイプ、ｗｗｗホストサーバ、ドメイン名ｔｉｇｒ．ｏｒｇ）で利用可能である。
【０２９５】
細菌表面の消化。以下の２つの酵素を使用して細菌表面のプロテアーゼ消化を個別に行った：配列決定グレード修飾トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）およびプロテイナーゼＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）。１００ｍｌの初回培養物由来の培養物を、４０％スクロースを含む０．８ｍｌのリン酸ベースの緩衝液（２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３．７ｍＭ  ＮａＣｌ、８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４）に再懸濁した。
【０２９６】
２０μｇトリプシン（ｐＨ７．４）または１０μｇプロテイナーゼＫ（ｐＨ６．０）のいずれかを使用して５ｍＭ  ＤＴＴの存在下にて３７℃で３０分間消化した。消化混合物を、３，５００×ｇにて４℃で１０分間遠心分離した。消化ペプチドを含む上清を、孔サイズ０．２２μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターによって濾過した。プロテアーゼ反応を、１０％ｖ／ｖのギ酸の添加によって停止させた。分析前に、サンプル中の塩を、７分間の０．１％ギ酸溶液中の２％から８０％までのアセトニトリル（ＡＣＮ）勾配を使用したオフラインＨＰＬＣによって除去した。回収した画分をプールし、Ｓｐｅｅｄ−ｖａｃを使用して遠心分離した。上清を、さらなる分析まで−２０℃に保持した。
【０２９７】
多次元タンパク質同定テクノロジー（ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ＭｕｄＰＩＴ）。２つの異なるプラットフォームを、ペプチドのクロマトグラフ分離およびタンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）によるさらなる同定のために使用した。
【０２９８】
第１のプラットフォームでは、ペプチドを、二次元ナノ液体クロマトグラフィ（２−Ｄ  ＬＣ）によって分離し、ＭＡＬＤＩ標的に直接スポットし、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＴＯＦ（オフライン結合２−Ｄ  ＬＣ／ＭＡＬＤＩ  ＭＳ／ＭＳ）によって分析した。（Ｍｉｔｕｌｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２００４  Ｓｅｐ；４（９）：２５４５−５７）に記載のように、クロマトグラフィシステム（Ｄｉｏｎｅｘ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）は、ＦＡＭＯＳオートサンプラー、ＵＶ検出器を備えたＵｌｔｉＭａｔｅマイクロポンプ、およびＳｗｉｔｃｈｏｓカラム切り替えデバイスからなる。ＵｌｔｉＭａｔｅポンプを、流速３００ｎＬ／分で操作されるように設定した。サンプルをサンプルループから第１のカラムに運ぶために使用するＳｗｉｔｃｈｏｓローディングポンプの流速を、３０μＬ／分に設定した。
【０２９９】
簡潔に述べれば、以下のようにペプチド分離を行った。第１の局面では、ペプチドを、強陽イオン交換（ＳＣＸ）カラム（１０ｃｍ×３２０μｍ  ｉ．ｄ．）上にロードし、５つの漸増濃度のＮａＣｌ（０．０１、０．０５、０．１、０．５、および１  Ｍ）のアプライによって定組成溶離を行った。第２の局面では、ペプチドを、Ｃ１８トラップカラム（ＰＥＰＭＡＰ（商標）Ｃ１８μプレカラム、３００μｍ  ｉ．ｄ．×１  ｍｍ、Ｄｉｏｎｅｘ）を介した逆相Ｃ１８分析カラム（１５ｃｍ×７５μｍ  ｉ．ｄ．、Ｃｌ８  ＰＥＰＭＡＰ１００（商標）、３μｍ、１００  Ａ）によって分離した。ペプチドを、５％から５０％までの８０％ＡＣＮの０．１％ギ酸溶液の４５分間の勾配を使用し、流速３００ｎｌ／分で溶離した。
【０３００】
溶離液を、ＡＮＣＨＯＲ−ＣＨＩＰ（登録商標）ＭＡＬＤＩターゲット（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋｓ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上に、飽和α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸のアセトン溶液の薄層を使用して調製したＰｒｏｔｅｉｎｅｅｒ  ＦＣロボット（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋｓ）を使用して６０秒毎に連続してスポットした。スポッティング前に、標的を、飽和α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸のアセトン溶液の薄層を使用して調製した。画分の回収後、各スポットを、０．６μｌのエタノール／アセトン／０．１％トリフルオロ酢酸（６：３：１）を使用して手作業で再結晶させた。
【０３０１】
質量分析を、ＷＡＲＰ  ＬＣソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋｓ）の制御下でＵｌｔｒａｆｌｅｘ  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＴＯＦ装置を使用することによって自動で行った。第１に、ピーク選択のためにスポットした全画分のＭＳスペクトルを取り、選択したピークのＭＳ／ＭＳスペクトルを取った。ローカルデータベース中のＭＡＳＣＯＴのライセンスバージョンを使用して、バッチモードでペプチドの検索および同定を行った。ＭＡＳＣＯＴ検索パラメーターは以下であった：（１）種：化膿性レンサ球菌ＳＦ３７０株；（２）許容誤切断数（トリプシン消化についてのみ）：６；（３）可変翻訳後修飾：メチオニン酸化；（４）ペプチド許容度（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）：±３００  ｐｐｍ；（５）ＭＳ／ＭＳ許容度：±１．５Ｄａ、および（６）ペプチド負荷（ｃｈａｒｇｅ）：＋１。
【０３０２】
第２のプラットフォームでは、ペプチドを、ナノスプレー源（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）を備えたＱ−ＴｏＦ  Ｍｉｃｒｏ  ＥＳＩ質量分析器に接続したＣａｐＬＣ  ＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）でのナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分離した。サンプルを、５％（ｖ／ｖ）ＡＣＮ、０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸（溶媒Ａ）に再懸濁し、Ｃ１８トラップカラム（３００μｍ  ｉ．ｄ．×５  ｍｍ，ＬＣ  Ｐａｃｋｉｎｇｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）にロードした。３分後、流れを、Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｃ１８  ＮａｎｏＥａｓｅカラム（１００μｍ  ｉ．ｄ．×１００ｍｍ，Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）に切り替え、溶媒勾配を開始した。適用した流速は４μＬ／分であり、フロースプリッタを、分析カラムを介した４００ｎＬ／分のナノフローに仕向けるように設定した。
【０３０３】
溶媒Ｂ（９５％（ｖ／ｖ）ＡＣＮ、０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸）の５０分間で２％から６０％まで直線勾配を適用して、ペプチドを溶離した。溶離ペプチドを、ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して自動化データ依存プログラムに供し、ＭＳ調査スキャンを使用して、ＭＳ／ＭＳ断片化に供するべき多価ペプチドを選択した。３つまでの異なる成分を同時にＭＳ／ＭＳ断片化に供した。全サンプルについて、１価のペプチド種の断片化の選択のために第２のナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。
【０３０４】
全ての取得したＭＳ／ＭＳスペクトルを、ＰＫＬファイルフォーマットに変換し、ローカルデータベース上で実行するＭＡＳＣＯＴのライセンスバージョンを使用したデータベース検索によってタンパク質を同定した。適用した検索基準は以下であった：ペプチド許容度±５００ｐｐｍ、ＭＳ／ＭＳ許容度±０．３Ｄａ、誤切断６、ペプチド荷電状態１＋〜４＋。
【０３０５】
組換えタンパク質のクローニング、発現、および精製ならびに免疫前血清および免疫血清の調製を、Ｍａｉｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９，１４８−５０，２００５に記載のように行った。
【０３０６】
ＦＡＣＳ分析。以下のようにＦＡＣＳ分析を行った。約１０５種の細菌を、２００μｌのＰＢＳで洗浄し、３，５００×ｇにて４℃で１０分間遠心分離し、２０μｌのＰＢＳ−０．１％ＢＳＡに再懸濁した。ＰＢＳ−０．１％ＢＳＡで希釈した８０μｌの免疫前マウス血清または免疫マウス血清を、最終希釈倍率が１００倍、２５０倍、または５００倍となるように細菌懸濁液に添加し、氷上で３０分間インキュベートした。
【０３０７】
細菌を、１００μｌのＰＢＳ−０．１％ＢＳＡの添加によって１回洗浄し、３，５００×ｇにて４℃で１０分間遠心分離し、２００μｌのＰＢＳ−０．１％ＢＳＡに再懸濁し、再度遠心分離した。細菌を、１０μｌのフィコエリトリン抱合ヤギ抗マウスＩｇＧＦ（ａｂ’）２フラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を含むＰＢＳ−０．１％ＢＳＡに最終希釈倍率が１００倍となるように再懸濁し、氷上にて暗所で３０分間インキュベートした。次いで、細菌を、１８０μｌのＰＢＳ−０．１％ＢＳＡの添加によって洗浄し、３，５００×ｇにて４℃で１０分間遠心分離し、２００μｌのＰＢＳに再懸濁した。
【０３０８】
次いで、細菌懸濁液を、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ  ＵＳＡ）を使用して分析し、１０，０００の事象を得た。データを、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、細菌シグナルから形態学的ドットプロット（前方散乱および側方散乱パラメーターを使用）を引くことによって分析した。次いで、蛍光対数スケールのＦＬ２強度についてのヒストグラムプロットを作製した。
【０３０９】
実施例１４  ＳＦ３７０のサーフォーム（Ｍ１血清型）
上記アプローチによって全部で１７７種の典型的なペプチドから７２種のタンパク質を明確に同定し、プロテイナーゼＫ消化によって１０７種のペプチドを生成した。プロテイナーゼＫ由来ペプチドから１０種のタンパク質が同定され、トリプシンペプチドおよびプロテイナーゼＫペプチドの両方から１９種のタンパク質が同定された。表９は、ＥＳＩ−ｑ−ＴＯＦおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦテクノロジーに基づいた両方のＬＣ／ＭＳ／ＭＳプラットフォームの適用によって同定されたタンパク質のリストを示す。タンパク質リストは、各プロテアーゼについての３つの独立した表面消化実験の組み合わせデータの結果である。少なくとも２つのクロマトグラフィおよびその後のＭＳ／ＭＳ分析を、サンプルおよびプラットフォーム毎に行った。約５ｐｍｏｌのペプチドを、２−Ｄ  ＬＣ／ＭＡＬＤＩ  ＭＳ／ＭＳおよびＬＣ／ＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳシステムの両方にロードした。細胞内位置および特定のタンパク質の特徴を、ＰＳＯＲＴソフトウェアによって割り当てた。
【０３１０】
特定の細胞局在化を示す署名の存在についての各同定タンパク質配列のスキャニングにより、７２種のタンパク質を、以下の４つの主なファミリーに分類することができる：ＬＰＸＴＧ（配列番号９３１）様モチーフを含む（１２タンパク質）細胞壁繋留タンパク質ファミリー、リポタンパク質ファミリー（１１タンパク質）、１つまたは複数の膜貫通領域を含む膜貫通タンパク質ファミリー（３７タンパク質）、および分泌タンパク質ファミリー（８タンパク質）。ゲノムコンピュータ分析に基づいて、これらの各タンパク質ファミリーに起因し得るＧＡＳ  ＳＦ３７０タンパク質の総数は、それぞれ、１７、２８、４８９、および６７である。したがって、全ての推定細胞壁繋留タンパク質およびリポタンパク質の巨大集団が同定され、分泌細胞および膜貫通タンパク質の７％未満が、細胞表面の曝露していることが見出された。
【０３１１】
この矛盾は分泌タンパク質で予想され、そのほとんどが細胞外に放出され、一部のみが細胞壁に結合するという概念と一致する。これに反して、少数の同定膜貫通タンパク質はいくらか意外であり、これらのタンパク質の大部分が膜に深く包埋しているか、あまり発現されないか、その両方であることが示唆された。興味深いことに、４つのＰＳＯＲＴ推定細胞質タンパク質にみが細胞の外側に結合することが見出され（表９）、これらは全て、今まで分析された全部ではないがほとんどの細菌で膜貫通することが報告された細胞質タンパク質のカテゴリーに属する。これらは、他の細菌で膜貫通することが報告されている伸長因子Ｔｕ（Ｍａｒｑｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６，２６２５−３１，１９９８；Ｄａｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＭｏＩ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６，１０４１−５１，２００２）、２つのリボゾームタンパク質（Ｓｐｅｎｃｅ  ＆  Ｃｌａｒｋ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８，５００２−１０，２０００；Ｋｕｒａｒ  ＆  Ｓｐｌｉｔｔｅｒ，Ｖａｃｃｉｎｅ  １５，１８５１−５７，１９９７）、ならびにおそらく細胞壁局在化および側鎖形成に関与する価定常のタンパク質を含んでいた。
【０３１２】
表７および８ならびに図２８〜１０４も参照のこと。質量分析技術は定量的ではないが、Ｍタンパク質が最も豊富なようであり、トリプシン消化後にＭタンパク質ペプチドの１４のＭＳ／ＭＳスペクトルを同定した。
【０３１３】
トリプシン消化から生成されたペプチドからほとんどのタンパク質（６０）が同定された。プロテイナーゼＫは、３０種のタンパク質に対応するペプチドを放出し、１９種のタンパク質が両酵素によって同定された。プロテイナーゼＫは、トリプシン消化から同定されない多数の膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を有する膜タンパク質（例えば、７、１０、および４つのＴＭＤを有するＮＴ０１ＳＰ０４５４、ＮＴ０１ＳＰ０９０６、およびＮＴ０１ＳＰ１６６４）に対応するペプチドの回収に特に有用であった。タンパク質あたりのペプチドの同定数は、１から数十の範囲であった。
【０３１４】
図２５Ａ〜Ｂおよび図２６Ａ〜Ｂは、細胞壁タンパク質ＮＴ０ＩＳＰ１６５２（ＧＡＳ  １９０；配列番号１１７）の両プロテアーゼでの消化後に得られた高カバー率（ｃｏｖｅｒａｇｅ）を示す。ＧＡＳ１９０は、繋留配列ＬＰＸＴＧ（配列番号９３１）を含む。これは、以前に「ＯｒｆＸ」として記載されており、Ｍｇａ調節因子の調節下でのいくつかの細菌病原性因子の発現を組織化するｖｉｒレギュロン（ｖｉｒ  ｒｅｇｕｌｏｎ）に属する。ＧＡＳ１９０の機能は、今までのところ知られていないが、フィブロネクチン結合タンパク質であり得る。細胞壁結合領域は、約５０から１２５ものアミノ酸残基を対象とし得る。
【０３１５】
図２５Ａ（配列番号９３２〜９４９）および２５Ｂは、３５種のプロテイナーゼＫ生成ペプチドによるＧＡＳ１９０タンパク質配列のカバー率（５０．６％）を示す。トリプシンペプチドによるカバー率を欠く領域（図２５Ｂ中の矢印の間に示す）を、プロテイナーゼＫ消化下で広範に示したが、余剰の情報が多数得られた。同定されたほとんどのペプチドは、タンパク質の最も曝露された領域（すなわち、Ｎ末端配列の最初の半分）に対応した。
【０３１６】
１１種のトリプシン生成ペプチドおよびＧＡＳ１９０タンパク質配列に沿ったそのアラインメントを、図２６Ａ（配列番号９５０〜９６１）および２６Ｂに示し、カバー率は３４．６％である。トリプシン消化由来のペプチドは、ＧＡＳ１９０タンパク質中のＬＰＸＴＧ（配列番号９３１）から１３アミノ酸残基の近さで見出された。図２Ｂ中の２つの矢印の間にトリプシン消化部位（Ｋ／Ｒ）が存在せず、理論的に不可能な領域中にトリプシン種が生成されることに留意のこと。そのＮ末端の前にＫまたはＲを欠くたった１つのペプチドが同定され（ＶＤＧＩＰＰＩＳＬＴＱＫ、配列番号９６９）、これはＰＳＯＲＴ推定によるタンパク質の成熟形態の実際のＮ末端に対応する。１つを超えるトリプシン欠如切断部位を有するペプチド（１１のうち６つ）が比較的豊富であった。例えば、ペプチドＩＫＴＡＰＤＫＤＫＬＬＦＴＹＨＳＥＹＭＴＡＶＫ（配列番号９７０）は、トリプシンによってＣ切断されていない３つの内部リジンを含み、Ｍタンパク質のいくつかのペプチドについては、６つまでの切断部位が欠如していた。
【０３１７】
全ての同定されたタンパク質が、その各生成ペプチドによって広範に対象とされるわけではなかった。細胞壁繋留モチーフを含むタンパク質は、最も高いカバー率を示した。少なくとも１つの推定ＴＭＤを有するタンパク質（ＰＳＯＲＴ推定による）が、少数のペプチドから同定された（表９）。
【０３１８】
実施例１５  抗生物質処置後の膜脱制限（ｄｅｌｉｍｉｔｅｄ）構造の過剰発現後のＧＡＳ表面タンパク質の同定
細菌培養および抗生物質処置。化膿性レンサ球菌ＳＦ３７０細胞を、ＯＤ６００＝０．４（指数成長期）に到達するまで、ＴＨＢ中にて３７℃および５％ＣＯ２で成長させた。３，５００×ｇにて４℃で１０分間の遠心分離後に成長培地を採取した。細菌懸濁液を、抗生物質（０．７μｇ／ｍｌペニシリン；１０μｇ／ｍｌバンコマイシン、最終濃度）を含むＴＨＢの点かによって２倍希釈し、培養物を８０分間静置した。図１０７は、ペニシリン処置の際に産生した膜脱制限構造を示す電子顕微鏡写真である。
【０３１９】
膜脱制限構造の回収。上清を濾過し（０．２２μｍ）、膜脱制限構造を、２００，０００×ｇにて４℃で９０分間の遠心分離によって回収した。次いで、ペレットを、ＰＢＳ中で１回洗浄し、同一緩衝液に再懸濁した。
【０３２０】
膜脱制限構造のプロテオミクス分析。超遠心分離ペレットを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。このようにして分離されたバンドを、選別し、脱色し、トリプシン消化し、Ｚｉｐ−Ｔｉｐｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の使用によって脱塩し、Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋｓ）を使用したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析した。スペクトルの分析および同定のためにＭＡＳＣＯＴソフトウェアを使用した。
【０３２１】
この方法によって同定されたタンパク質を、表８に示す。同定タンパク質の大部分は、表面露出タンパク質（分泌タンパク質、膜貫通タンパク質、またはリポタンパク質）である。この画分中または膜脱制限構造中に細胞壁タンパク質は認められなかった。したがって、膜脱制限構造のタンパク質成分の大部分は、ワクチン開発に潜在的に有利である。
【０３２２】
実施例１６  化学的分画後のＧＡＳ表面タンパク質の同定（ＳＦ３７０血清型）
細菌ペレットの調製。細菌（ＧＡＳ  ＳＦ３７０）を、ＯＤ６００＝０．４に到達するまで（指数成長期）、２５０ｍｌのＴＨＢ中にて３７℃および５％ＣＯ２で成長させた。培養後、細菌を、３，５００×ｇにて４℃で１０分間遠心分離し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。細菌を、２０ｍｌの６Ｍグアニジウム（グアニジウムの代わりに尿素またはＳＤＳを代用することができる）、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌに再懸濁し、「ワンショットヘッド」を備えたＢａｓｉｃ  Ｚ  ０．７５Ｖ  Ｍｏｄｅｌ細胞破壊機（Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｌｔｄ，Ｎｏｒｔｈａｎｔｓ，Ｅｎｇｌａｎｄ）にて１．７ｋＢａｒで３サイクル破壊した。次いで、溶解物を、２０，０００×ｇにて４℃で２０分間遠心分離した。得られた上清を０．２２μｍの膜で濾過し、２０００，０００×ｇにて４℃で２時間の超遠心分離でスピンした。ペレットを、ＰＢＳで洗浄した（２００，０００×ｇにて４℃で３０分間）。
【０３２３】
全消化。１０μｇのトリプシンを含む５０ｍＭ重炭酸アンモニウム、５ｍＭ  ＤＴＴを含む３００μｌを、ペレットに添加した。３７℃で一晩消化を進行させた。
【０３２４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離。９μｇのムタノリシンを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含む３００μｌを、ペレットに添加した。３７℃で３時間消化を進行させ、タンパク質をゲルに侵入させた。タンパク質を、１２％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって分離した。
【０３２５】
ゲル内タンパク質消化および質量分析のためのサンプル調製。タンパク質スポットバンドを、ゲルから切り出し、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム／アセトニトリル５０／５０（Ｖ／Ｖ）で洗浄し、ＳｐｅｅｄＶａｃ遠心分離（Ｓａｖａｎｔ，Ｈｏｌｂｒｏｏｋ，ＮＹ）を使用して乾燥させた。乾燥スポットを、１２μｌの０．０１２μｇ／μｌの配列決定グレードの修飾トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を含む５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中にて３７℃で２時間消化させた。消化後、５μｌの０．１％トリフルオロ酢酸を添加し、ペプチドを脱塩し、ＺＩＰ−ＴＩＰｓ（Ｃ１８，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮した。
【０３２６】
２μｌの５ｇ／ｌ  ２，５−ジヒドロキシ安息香酸を含む５０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸を使用して、質量分析計Ａｎｃｈｏｒｃｈｉｐ  ３８４（４００μｍ，Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でペプチドを溶離し、室温で風乾し、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法によって分析した。Ｂｒｕｋｅｒ  ＵｌｔｒａＦｌｅｘ質量分析計にてマススペクトルを取得し、Ｂｒｕｋｅｒのペプチド較正スタンダード（１０００〜４０００Ｄａ）（品番２０６１９５）を使用して較正した。ペプチドの質量を、ＦｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓ（バージョン２．２，Ｂｒｕｋｅｒ）を使用して決定した。１０００〜３５００Ｄａの質量範囲のペプチドの実験的に生成したモノアイソトピック値とＭａｓｃｏｔソフトウェアを使用したコンピュータ生成フィンガープリントとの自動および手作業での比較によってタンパク質スポットを同定した。
【０３２７】
結果。ｍ／ｚ  １３７２．７、１２０２．６のペプチドの断片化によって、Ｃ５Ａペプチダーゼ前駆体（１５６７５７９６）が同定された。ｍ／ｚ  １７０６．８、１８８０．１のペプチドの断片化によって、Ｍタンパク質１型（１５６７５７９９）が同定された。
【０３２８】
実施例１７  高莢膜化（ｈｉｇｈｌｙ  ｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）Ｍ３株のサーフォーム分析
ＧＡＳは、ヒアルロン酸ベースの莢膜に取り囲まれており、その厚さは、株ごとに変化し得る。莢膜は、細菌の病原性で重要な役割を果たし、一般に、高莢膜化株が最も病原性の高い株である。接近可能な外部ドメインを有するタンパク質数は周囲の莢膜の厚さに依存すると予想される。これを検証するために、本発明者らは、高莢膜化Ｍ３株のサーフォームを特徴づけた。
【０３２９】
株を上記のように成長させ、莢膜含有率を、下記のように回収したヒアルロン酸量の測定によって決定した。これらの条件下で、Ｍ３は、ｃｆｕあたり５１ｆｇのヒアルロン酸を産生し、これは、ＳＦ３７０株の３倍にもなった。表１０および図１０８を参照のこと。次いで、Ｍ３細菌を、上記と同一のサーフォーム分析に供した。
【０３３０】
表１１に示すように、タンパク質分解および質量分析の際に１０種のタンパク質を検出することができ、１つ（伸長因子Ｔｕ）を除いた全てが表面結合すると予想された。これらは、５つのＬＰＸＴＧ（配列番号９３１）保有タンパク質、２つの膜タンパク質、および２つの分泌タンパク質を含む。興味深いことに、これらのタンパク質のうちの５つは、仮定／未知のタンパク質ファミリーに属する。さらに、Ｆ２様タンパク質を除いて、そのコード遺伝子はＳＦ３７０で認められず、推定ペニシリン結合タンパク質および仮定上のタンパク質ＳＰｓ１２７０を除いた全てのタンパク質もＳＦ３７０サーフォームに属する。
【０３３１】
要するに、全細胞のタンパク質分解の際に生成することができるペプチド数の減少によって判断されるように、莢膜の存在は、タンパク質の表面接近可能性を妨害する。
【０３３２】
実施例１８  サーフォームの検証
両サーフォームにおける細胞質タンパク質のほぼ完全な欠如により、本発明者らの手順が表面露出タンパク質同定に選択的であることが示唆された。この手順の信頼性をさらに確認するために、本発明者らは、２つの分析型を実施した。
【０３３３】
第１に、本発明者らは、３７種のＳＦ３７０サーフォームの膜貫通タンパク質を、ＰＳＯＲＴ（ＵＲＬアドレス：ｈｔｔｐファイルタイプ、ｗｗｗホストサーバ、ドメイン名ｎｉｂｂ．ａｃ．ｉｐ、フォームディレクトリ）を使用したトポロジー予測に供し、タンパク質分解によって生成され、正確にトポロジーが予測された場合に期待されるように、外部ドメイン内にＭＳ／ＭＳによって同定したペプチドが存在するかどうかを検索した。図１０６に示すように、３７種の膜タンパク質のうちの２６種について、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析および実験的ＭＳ／ＭＳデータは完全に一致した。これに反して、残りの１１種のタンパク質の対応する同定ペプチドを、ＰＳＯＲＴ推定細胞内ドメインにマッピングした。
【０３３４】
この矛盾により、これらの１１種の各タンパク質のトポロジーおよび機能についての注釈づけを手作業で調査しなければならなかた。本発明者らは、１１種のタンパク質のうちで少なくとも６種のタンパク質の推定膜貫通組織化を再訪問することが望ましいと結論づけた。詳細には、ＦｔｓＨタンパク質ファミリーに相同な推定細胞分割タンパク質ＮＴ０１ＳＰ００１４由来の２つのペプチドは、ＦｔｓＨタンパク質において細胞外であることが公知の十分に保存されたタンパク質ドメイン内に存在し（Ｔｏｍｏｙａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５，１３５２−５７，１９９３；Ａｋｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．２７１，２２３２６−３３，１９９８；Ａｍａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４４，１１９７−１２０３，１９９８）、これらのタンパク質において細胞外であることが公知の十分に保存されたタンパク質ドメインを保有することが見出された。
【０３３５】
ＮＴ０１ＳＰ１２５５の４つのペプチド（ＦｔｓＺに相同な第２の推定細胞分裂タンパク質）は、分子のＣ末端部分（バルトネラ・バシリホルミスが免疫原性であり、且つ表面に曝露されていることが見出された領域）に存在する（Ｐａｄｍａｌａｙａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９，４５４５−５２，１９９７）。
【０３３６】
２つの仮定上のタンパク質ＮＴ０１ＳＰ０２８９およびＮＴ０１ＳＰ１７８９は、ＰＳＯＲＴスコアが非常に低く、Ｃｙｓ残基の隣りにリーダーペプチド切断部位を有する膜貫通領域（ＴＭＲ）を保有し、内在性膜タンパク質よりもむしろリポタンパク質である可能性が高い。
【０３３７】
ＮＴ０１ＳＰ０９４７は２つのＴＭＲを有し、第２のＴＭＲは、ＰＳＯＲＴスコアが非常に低い（第１のＴＭＲの−８．１２とは対照的に−０．３２）。第２のＴＭＲが事実上真実でない場合、典型的なソルターゼ（ｓｏｒｔａｓｅ）ドメインを保有する分子のＣ末端部分が表面上に曝露されており、ソルターゼ作用機構と一致するであろう（Ｐａｔｅｒｓｏｎ  ＆  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２，８９−９５，２００４）。
【０３３８】
最後に、ＮＴ０１ＳＰ０１５４（推定グリシン−ベタイン結合パーミアーゼタンパク質）は、６つのＴＭＲを有すると予想され、そのうちの１つのスコアが低い。また、弱いＴＭＲを無視する場合、位相的組織化が変化し、２つのＭＳ／ＭＳ同定ペプチドが含まれるＣ末端領域ば表面露出するようなるであろう。実際、ＦＡＣＳによって試験した場合、このタンパク質のＣ末端ドメインに対するポリクローナル抗体は、ＧＡＳ  ＳＦ３７０全細胞に結合した。
【０３３９】
本発明者らが本発明者らのサーフォーム分析を立証するために使用した第２の研究は、タンパク質特異的抗体を使用したＦＡＣＳ分析に基づいた。ＳＦ３７０サーフォーム間で選択された５１種の組換えタンパク質に対するポリクローナル抗体を産生し、抗体を、全細菌に結合する能力について試験した。７種を除く全血清は、アッセイで陽性であり、各対応タンパク質が結合抗体に接近するのに十分に細菌表面上に曝露されていることを示した（表９も参照のこと）。同様に、Ｍ３サーフォームに属する１０種のタンパク質のうちの４種に対するポリクローナル抗体をＦＡＣＳによって試験し、これらのうちの３種は、Ｍ３細胞に結合することができた（図１０５、表９を参照のこと）。
【０３４０】
これらのデータから、本発明者らは、サーフォーム分析への本発明者らのアプローチは、タンパク質の全体または一部が細菌細胞表面に曝露するかどうかの決定で正確であると結論づけた。
【０３４１】
実施例１９  ワクチン開発へのサーフォーム分析の適用
髄膜炎菌ＢおよびＢ群レンサ球菌を使用した以前の経験から、本発明者らは、ワクチン候補である抗原が十分に発現し、細菌細胞の表面上に曝露することが望ましいことを理解している（Ｐｉｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７，１８１６−２０，２０００；Ｍａｉｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００５  Ｊｕｌ  ｌ；３０９（５７３１）：１４８−５０．）。サーフォームは、定義により、このタンパク質カテゴリーが含まれるので、サーフォーム分析は、新規のワクチン候補の同定に理想的なアプローチである。これの裏付けは、その遺伝子がＳＦ３７０中に存在する１０種の報告されたＧＡＳ推定抗原のうちの６種がＳＦ３７０の一部であるという所見である。表１２および本明細書中で引用された引例を参照のこと。
【０３４２】
いくつかのＳＦ３７０サーフォームタンパク質が防御についてまったく試験されていなかったので、本発明者らは、これらのうちのいくつかがマウスモデルにおいて防御応答を惹起することができるかどうかを調査した。不運なことに、ＳＦ３７０は、マウスで病原性を示さず、ＬＤ５０は、１０８ＣＦＵを超える。本発明者らは、タンパク質発現レベル、莢膜の厚さ、および遺伝子のばらつきによってＧＡＳサーフォームが株毎にいくらか変化すると予想しているので、異なる株に対する防御研究におけるＳＦ３７０サーフォームタンパク質の試験前に、本発明者らは、これらのうちのどのタンパク質が攻撃誘発株の表面上にも曝露されるかを調査した。
【０３４３】
このために、本発明者らは、ＧＡＳ株の１つがマウス攻撃誘発のために日常的に使用されているＭ２３  ＤＳＭ２０７１のサーフォームを定義した。Ｍ２３  ＤＳＭ２０７１のゲノム配列が利用可能でないので、ＳＦ３７０またはその配列が公的データベース（ＵＲＬアドレス：ｈｔｔｐファイルタイプ、ｗｗｗホストサーバ、ドメイン名ｔｉｇｒ．ｏｒｇおよびｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）で利用可能な他の６種のＧＡＳ株に共通の曝露タンパク質のみを同定するのに対して、Ｍ２３  ＤＳＭ２０７１特異的タンパク質は特徴づけられないままであった。
【０３４４】
表７に示すように、全部で以下の１７種のタンパク質が明白に同定された：５種の細胞壁繋留タンパク質、４種のリポタンパク質、５種の膜タンパク質、２種の分泌タンパク質、および１種の細胞質タンパク質。これらの全タンパク質は、ＳＦ３７０が類似しており、２種（推定亜鉛が乳アルコールデヒドロゲナーゼおよび推定ＲｏｆＡ関連調節タンパク質）を除く全てもＳＦ３７０サーフォーム中に含まれた（表９）。興味深いことに、ほとんどの（１７種のうちの１３種）同定タンパク質が、推定／仮定上のタンパク質ファミリーに属する。
【０３４５】
Ｍ２３  ＤＳＭ２０７１サーフォームに属する１７種のタンパク質のうち、１４種のタンパク質が、可溶性Ｈｉｓ融合物またはＧＳＴ融合物のいずれかとして大腸菌中に首尾よく発現された（表７）。タンパク質ＮＴ０１ＳＰ０９０８およびＮＴ０１ＳＰ０４８５は発現が認められず、このことは、これらがヒトタンパク質と有意な相同性を有するためである。５週齢のメスＣＤ１マウス（１０マウス／群）を、最初にフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびその後の２回にフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）と共に、０、２１、および３５日目に腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した２０μｇの組換えタンパク質で免疫化した。第１の免疫化前および第３の免疫化後に血液サンプルを回収した。免疫化マウスを、ＴＨＹブロス中でＯＤ６００＝０．４に成長させた１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＤＳＭ２０７１株にて鼻腔内（ｉ．ｎ．）で攻撃誘発した。感染用量のＣＦＵ力価を、５ＴＨＹブロス／血液プレートへのプレーティングによって検証した。マウスを、毎日モニタリングし、１０日後に最終生存率を計算した。
【０３４６】
表１４に示すように、以下の２種のタンパク質が本モデルで防御性を示した：Ｍタンパク質（生存率９０％）およびＮＴ０１ＳＰ０３３６（生存率７０％）。ＳＦ３７０血清型のＧＡＳ５７に対応するＮＴ０１ＳＰ０３３６は、典型的な細胞繋留ＬＰＸＴＧ（配列番号９３１）モチーフを保有する推定細胞莢膜プロテイナーゼである。
【０３４７】
興味深いことに、ＧＡＳ５７は、腹腔内免疫化後に腹腔内攻撃誘発を行ったマウスモデルで防御性をほとんど示さないか全く示さなかった。ＧＡＳ４０は、鼻腔内攻撃誘発モデルの生存率がより高いにもかかわらず、両モデルで防御性を示した。
【０３４８】
実施例２０  莢膜ヒアルロン酸含有量の決定
１０ｍｌ指数増殖期培養物（ＯＤ６００＝０．４）に由来する細胞を、水で２回洗浄し、次いで、５００μｌの水に再懸濁した。１ｍｌのクロロホルムを使用した震盪によって莢膜を放出させる。遠心分離によるサンプルの明澄化後、５０μｌの水相のヒアルロン酸含有量を、サンプルへの２０ｍｇのＳｔａｉｎｓ−Ａｌｌ製品（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）および６０μｌの氷酢酸を含む１００ｍｌの５０％ホルムアミドを含む１ｍｌの溶液の添加後に６４０ｎｍの吸光度を測定することによって決定する。吸光度を、既知濃度のヒアルロン酸を使用して作成した検量線と比較する。
【０３４９】
実施例２１  ＧＡＳ抗原の表面露出ドメインの同定
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ推定アルゴリズムにより、細菌表面に分泌または結合する可能性が高い産物をコードする６８４遺伝子が最初に同定された。Ｐｉｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７，１８１６−２０，２０００；Ｔｅｔｔｅｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，１２３９１−９６，２００２を参照のこと。これらのうち、２０７の遺伝子が、２つを超える膜貫通領域を含むと予想された。細胞表面上に存在すると予想される少なくとも５０種のアミノ酸の単離ドメインについてタンパク質配列を検索した（例えば、細胞外ループドメイン、アミノ末端ドメイン、またはカルボキシ末端ドメイン）。ＴＭｂａｓｅ（天然に存在する膜貫通タンパク質のデータベース）の統計分析に基づくアルゴリズムを使用して膜貫通領域およびその配向を予想することができるオンラインウェブサーバＴＭＰＲＥＤ（ＵＲＬアドレス：ｈｔｔｐファイルタイプ、ｗｗｗホストサーバ、ドメイン名．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ、ソフトウェア／ＴＭＰＲＥＤ＿ｆｏｒｍ．ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ）を使用して、表面露出を評価した。
【０３５０】
各同定ドメインを、６つのヒスチジン残基をコードするいずれかの配列を含む２つのベクターに並行してクローン化した。組換え産物を、首尾よく発現し、大腸菌から精製した。
【０３５１】
実施例２２  表面露出ＧＡＳ抗原での免疫化
１０匹またはそれを超える６週齢と７週齢との間のＣＤ１雌マウス群を、１００μｌの適切な溶液に懸濁した２０μｇの組換え産生表面露出ＧＡＳ抗原で免疫化した。０、２１、および４５日目に、各群のマウスに３回投与した。最初の投与については同体積のフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）を使用し、その後の２回の投与についてはフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）を使用したタンパク質の腹腔内注射によって免疫化を行った。各免疫化スキームで、ネガティブコントロール群およびポジティブコントロール群を使用した。
【０３５２】
ネガティブコントロール群のマウスを、いかなるクローン化ＧＡＳ  ＯＲＦも含まないｐＥＴ２１ｂまたはｐＧＥＸ−ＮＮＨベクター（したがって、ＧＳＴのみを発現する）（それぞれ、ＨｉｓＳｔｏｐまたはＧＳＴＳｔｏｐと示す）のいずれかを含む大腸菌株由来の全細菌抽出物のプロセシング後に精製カラムから溶離した大腸菌タンパク質で免疫化した。
【０３５３】
ポジティブコントロール群のマウスを、ＧＡＳ  ＳＦ３７０株またはＧＡＳ  ＤＳＭ２０７１株のいずれかからクローン化した精製ＧＡＳ  Ｍで免疫化した（それぞれ１９２ＳＦおよび１９２ＤＳＭと示した群）。
【０３５４】
各マウス由来の血清を、最初の免疫化前および最後の免疫化から２週間後に回収した。各グループのマウスの血清をプールした。最後の免疫化から約１週間後に、マウスに、ＧＡＳの２０７１株（Ｍ２３）、３３４８株（Ｍ１）、または２７２８株（Ｍ１２）うちの１つを感染させた。感染のために、ＯＤ６００＝０．４まで、ＧＡＳ株を、ＴＨＹブロス中にて３７℃で成長させた。細菌を、遠心分離によって回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳで懸濁し、希釈して、１ｍｌあたり適切な濃度の細菌を得て、これを複数内注射によってマウスに投与した。細菌懸濁液アリコートの５つのＴＨＹプレートへのプレーティングによって決定したところ、５０と１００との間の細菌を各マウスに投与した。動物を毎日観察し、生存についてチェックした。
【０３５５】
結果を、図１０９Ａ〜１１１Ｃに示し、表１５にまとめる。８０を超えるΔ平均は、試験ドメインが表面露出していることを示す。
【０３５６】
結果は、各試験ドメイン−−
【０３５７】
【化４７】
2008544949.tif 000016
−−が試験した３つのＧＡＳ株のうちの少なくとも１つの表面上に曝露されることを示す。いくつかの試験ドメインは、使用した株によってΔ平均（Ｍ１、Ｍ２３、およびＭ１２）が変化することを示し、このことは、おそらく、莢膜マスキングによるこれらのドメインの異なる「視認性（ｖｉｓｉｂｉｌｉｔｙ）」のためである（例えば、Ｍ２３は、高度に莢膜化された株である）。以下のドメイン：
【０３５８】
【化４８】
2008544949.tif 000017
は、試験した３つのＧＡＳ株のうちの少なくとも２つの表面上に曝露している。ドメインＧＡＳ４７２、ＧＡＳ４７３、およびＧＡＳ５５３は、３つ全ての試験したＧＡＳ株の表面に曝露している。
【０３５９】
実施例２３  タンパク質マイクロアレイ実験
タンパク質チップにより、ヒト血清中の病原性タンパク質の臨床的免疫原性罹患率を同定可能である。タンパク質チップの使用により、６人の健康なドナー由来の血清サンプルを試験し、そのうちの２人の咽頭炎がＧＡＳ感染に関連することが最近報告されている（ＳＣおよびＴＭ、図１１２を参照のこと）。
【０３６０】
図１１２は、一般的な免疫反応性抗原をマッピングし、６人の各ドナーについてシグナル強度および応答頻度によってまとめている。
【０３６１】
実験手順
１１２種のＧＡＳタンパク質（１９種のＧＳＴ融合物、９１種のＨｉｓタグ化タンパク質、および２種の天然のタンパク質）を精製し、ＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、３８４ウェルのポリプロピレンミクロプレートに分注した（各６μｌ）。タンパク質溶液の４つの複製物を、ＴｅｌｅＣｈｅｍクイルピン（ｑｕｉｌｌ  ｐｉｎ）（ＴｅｌｅＣｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を具備したＶＥＲＳＡＲＲＡＹ  ＣＨＩＰＷＲＩＴＥＲ（商標）Ｐｒｏ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を使用して、ニトロセルロースコーティングＦａｓｔ  Ｓｌｉｄｅｓチップ（Ｓｃｈｌｅｉｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）にスポットした。各タンパク質の最初のプリント後、ピンを、７回洗浄し（各６秒間）、超音波処理に供し（１秒間）、真空乾燥させた（２秒間）。各チップは、少なくとも１つの免疫グロブリンおよびＢＳＡ（Ｃｙ３およびＣｙ５標識、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｅｎｃｅｓ）検量線を含む。各印画工程後、各スライドをスキャニングして、Ｃｙ３およびＣｙ５標識ＢＳＡ曲線のシグナルをチェックした。
【０３６２】
スライドを、３％Ｔｏｐ  Ｂｌｏｃｋ（Ｆｌｕｋａ−ＢｉｏＣｈｅｍｉＫａ、カタログ番号３７７６６）および０．１％ＴＰＢＳ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ）中にて撹拌しながら４℃の暗所で一晩プレインキュベートした。次いで、スライドを、ヒト血清（最終的に１０００倍希釈）と共に暗所にて室温で１時間インキュベートし、０．１％ＴＰＢＳで３回（それぞれ５分間）洗浄した。Ｃｙ３またはＣｙ５抗ヒトＩｇＧ（８００倍）、ＩｇＡまたはＩｇＭ（１０００倍）を添加し、暗所にて室温で１時間インキュベーションを延長した。
【０３６３】
スライドを、ＴＰＢＳで２回洗浄し（各５分間）、ＰＢＳで１回洗浄し（１０分間）、ｍｉｌｌｉＱ滅菌水で１回洗浄し（３０秒間）、暗所にて３７℃で１０〜２０分間または窒素流を使用して乾燥させた。
【０３６４】
高解像度（１０μｍピクセルサイズ）のＳｃａｎＡｒｒａｙ  ５０００  Ｕｎｉｔ（Ｐａｃｋａｒｄ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して蛍光シグナルを検出し、ＩｍａＧｅｎｅ  ６．０ソフトウェア（Ｂｉｏｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｉｎｃ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して定量した。
【０３６５】
Ｓ字形曲線へのＩｇコントロールの最小２乗の挿入によってデータを正規化するソフトウェアを使用して、収集データを詳述した。各実験強度シグナルに対応する力価値について、このようなＳ字形曲線を参照し、スキャナの全ダイナミックレンジにわたって拡大した理論Ｓ字形曲線に正規化する。
【０３６６】
【表１−１】
2008544949.tif 000018
【０３６７】
【表１−２】
2008544949.tif 000019
【０３６８】
【表１−３】
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【０３６９】
【表１−４】
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【０３７０】
【表１−５】
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【０３７１】
【表１−６】
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【０３７２】
【表１−７】
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【０３７３】
【表１−８】
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【０３７４】
【表１−９】
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【０３７５】
【表１−１０】
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【０３７６】
【表１−１１】
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【０３７７】
【表１−１２】
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【０３７８】
【表１−１３】
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【０３７９】
【表１−１４】
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【０３８０】
【表１−１５】
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【０３８１】
【表１−１６】
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【０３８２】
【表１−１７】
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【０３８３】
【表１−１８】
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【０３８４】
【表１−１９】
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【０３８５】
【表１−２０】
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【０３８６】
【表１−２１】
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【０３８７】
【表２−１】
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【０３８８】
【表２−２】
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【０３８９】
【表２−３】
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【０３９０】
【表３−１】
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【０３９１】
【表３−２】
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【０３９２】
【表３−３】
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【０３９３】
【表３−４】
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【０３９４】
【表４Ａ−１】
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【０３９５】
【表４Ａ−２】
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【０３９６】
【表４Ａ−３】
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【０３９７】
【表４Ｂ−１】
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【０３９８】
【表４Ｂ−２】
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【０３９９】
【表４Ｂ−３】
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【０４００】
【表４Ｃ−１】
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【０４０１】
【表４Ｃ−２】
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【０４０２】
【表４Ｃ−３】
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【０４０３】
【表４Ｄ−１】
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【０４０４】
【表４Ｄ−２】
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【０４０５】
【表４Ｅ−１】
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【０４０６】
【表４Ｅ−２】
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【０４０７】
【表４Ｅ−３】
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【０４０８】
【表４Ｆ−１】
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【０４０９】
【表４Ｆ−２】
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【０４１０】
【表４Ｆ−３】
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【０４１１】
【表４Ｇ−１】
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【０４１２】
【表４Ｇ−２】
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【０４１３】
【表４Ｇ−３】
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【０４１４】
【表４Ｈ−１】
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【０４１５】
【表４Ｈ−２】
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【０４１６】
【表４Ｈ−３】
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【０４１７】
【表４Ｉ−１】
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【０４１８】
【表４Ｉ−２】
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【０４１９】
【表４Ｉ−３】
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【０４２０】
【表４Ｊ−１】
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【０４２１】
【表４Ｊ−２】
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【０４２２】
【表４Ｋ−１】
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【０４２３】
【表４Ｋ−２】
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【０４２４】
【表４Ｋ−３】
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【０４２５】
【表４Ｌ−１】
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【０４２６】
【表４Ｌ−３】
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【０４２７】
【表４Ｍ−１】
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【０４２８】
【表４Ｍ−２】
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【０４２９】
【表４Ｍ−３】
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【０４３０】
【表４Ｎ−１】
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【０４３１】
【表４Ｎ−２】
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【０４３２】
【表４Ｎ−３】
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【０４３３】
【表４Ｏ−１】
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【０４３４】
【表４Ｏ−２】
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【０４３５】
【表４Ｏ−３】
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【０４３６】
【表４Ｐ−１】
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【０４３７】
【表４Ｐ−２】
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【０４３８】
【表４Ｐ−３】
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【０４３９】
【表４Ｑ−１】
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【０４４０】
【表４Ｑ−２】
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【０４４１】
【表４Ｑ−３】
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【０４４２】
【表４Ｒ−１】
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【０４４３】
【表４Ｒ−２】
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【０４４４】
【表５】
2008544949.tif 000096
【０４４５】
【表６Ａ】
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【０４４６】
【表６Ｂ】
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【０４４７】
【表７−１】
2008544949.tif 000099
【０４４８】
【表７−２】
2008544949.tif 000100
【０４４９】
【表７−３】
2008544949.tif 000101
【０４５０】
【表７−４】
2008544949.tif 000102
【０４５１】
【表７−５】
2008544949.tif 000103
【０４５２】
【表７−６】
2008544949.tif 000104
【０４５３】
【表８−１】
2008544949.tif 000105
【０４５４】
【表８−２】
2008544949.tif 000106
【０４５５】
【表８−３】
2008544949.tif 000107
【０４５６】
【表８−４】
2008544949.tif 000108
【０４５７】
【表９−１】
2008544949.tif 000109
【０４５８】
【表９−２】
2008544949.tif 000110
【０４５９】
【表９−３】
2008544949.tif 000111
【０４６０】
【表１０】
2008544949.tif 000112
【０４６１】
【表１１】
2008544949.tif 000113
【０４６２】
【表１２−１】
2008544949.tif 000114
【０４６３】
【表１２−２】
2008544949.tif 000115
【０４６４】
【表１３】
2008544949.tif 000116
【０４６５】
【表１４】
2008544949.tif 000117
【０４６６】
【表１５−１】
2008544949.tif 000118
【０４６７】
【表１５−２】
2008544949.tif 000119
【０４６８】
【表１６−１】
2008544949.tif 000120
【０４６９】
【表１６−２】
2008544949.tif 000121
【０４７０】
【表１６−３】
2008544949.tif 000122
【０４７１】
【表１６−４】
2008544949.tif 000123
【０４７２】
【表１６−５】
2008544949.tif 000124
【０４７３】
【表１６−６】
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【０４７４】
【表１６−７】
2008544949.tif 000126
【０４７５】
【表１６−８】
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【図面の簡単な説明】
【０４７６】
【図１Ａ】図１。ＧＡＳＭ株であるＳＦ３７０、２５８０、３２８０、３３４８、３７８９、および２９１３（配列番号：１７）２６３４（配列番号：１８）、２７２６（配列番号：１９）、２７２１（配列番号：２０）、３０４０、および３１３５（配列番号：２１）、２７２２（配列番号：２２）、２７２８（配列番号：２３）、４８８３（配列番号：２４）、２７２４（配列番号：２５）、２８９４、３６５０、５５２９、および３７７６（配列番号：２６）、２７２０（配列番号：２７）、２７２５（配列番号：２８）、４５３８（配列番号：２９）、５５３１（配列番号：３０）、５４８１（配列番号：３１）、４９５９（配列番号：３２）、Ｄ２０７１（配列番号：３３）、４４３６（配列番号：３４）、２７２７（配列番号：３５）、２７１９（配列番号：３６）、５４５５（配列番号：３７）、５４７６（配列番号：３８）、４０８８（配列番号：３９）、ＭＡＮＦＲ１０３９４（配列番号：４０）、Ｍ８２３２（配列番号：４１）、Ｍ３１５（配列番号：４２）、ならびにＳＳ１（配列番号：４３）由来のＧＡＳ４０タンパク質のアミノ酸配列のアラインメント。図１Ａ（アミノ酸１〜５０）。
【図１Ｂ】図１。ＧＡＳＭ株であるＳＦ３７０、２５８０、３２８０、３３４８、３７８９、および２９１３（配列番号：１７）２６３４（配列番号：１８）、２７２６（配列番号：１９）、２７２１（配列番号：２０）、３０４０、および３１３５（配列番号：２１）、２７２２（配列番号：２２）、２７２８（配列番号：２３）、４８８３（配列番号：２４）、２７２４（配列番号：２５）、２８９４、３６５０、５５２９、および３７７６（配列番号：２６）、２７２０（配列番号：２７）、２７２５（配列番号：２８）、４５３８（配列番号：２９）、５５３１（配列番号：３０）、５４８１（配列番号：３１）、４９５９（配列番号：３２）、Ｄ２０７１（配列番号：３３）、４４３６（配列番号：３４）、２７２７（配列番号：３５）、２７１９（配列番号：３６）、５４５５（配列番号：３７）、５４７６（配列番号：３８）、４０８８（配列番号：３９）、ＭＡＮＦＲ１０３９４（配列番号：４０）、Ｍ８２３２（配列番号：４１）、Ｍ３１５（配列番号：４２）、ならびにＳＳ１（配列番号：４３）由来のＧＡＳ４０タンパク質のアミノ酸配列のアラインメント。図１Ｂ（アミノ酸５１〜１００）。
【図１Ｃ】図１。ＧＡＳＭ株であるＳＦ３７０、２５８０、３２８０、３３４８、３７８９、および２９１３（配列番号：１７）２６３４（配列番号：１８）、２７２６（配列番号：１９）、２７２１（配列番号：２０）、３０４０、および３１３５（配列番号：２１）、２７２２（配列番号：２２）、２７２８（配列番号：２３）、４８８３（配列番号：２４）、２７２４（配列番号：２５）、２８９４、３６５０、５５２９、および３７７６（配列番号：２６）、２７２０（配列番号：２７）、２７２５（配列番号：２８）、４５３８（配列番号：２９）、５５３１（配列番号：３０）、５４８１（配列番号：３１）、４９５９（配列番号：３２）、Ｄ２０７１（配列番号：３３）、４４３６（配列番号：３４）、２７２７（配列番号：３５）、２７１９（配列番号：３６）、５４５５（配列番号：３７）、５４７６（配列番号：３８）、４０８８（配列番号：３９）、ＭＡＮＦＲ１０３９４（配列番号：４０）、Ｍ８２３２（配列番号：４１）、Ｍ３１５（配列番号：４２）、ならびにＳＳ１（配列番号：４３）由来のＧＡＳ４０タンパク質のアミノ酸配列のアラインメント。図１Ｃ（アミノ酸１０１〜１５０）。
【図１Ｄ】図１。ＧＡＳＭ株であるＳＦ３７０、２５８０、３２８０、３３４８、３７８９、および２９１３（配列番号：１７）２６３４（配列番号：１８）、２７２６（配列番号：１９）、２７２１（配列番号：２０）、３０４０、および３１３５（配列番号：２１）、２７２２（配列番号：２２）、２７２８（配列番号：２３）、４８８３（配列番号：２４）、２７２４（配列番号：２５）、２８９４、３６５０、５５２９、および３７７６（配列番号：２６）、２７２０（配列番号：２７）、２７２５（配列番号：２８）、４５３８（配列番号：２９）、５５３１（配列番号：３０）、５４８１（配列番号：３１）、４９５９（配列番号：３２）、Ｄ２０７１（配列番号：３３）、４４３６（配列番号：３４）、２７２７（配列番号：３５）、２７１９（配列番号：３６）、５４５５（配列番号：３７）、５４７６（配列番号：３８）、４０８８（配列番号：３９）、ＭＡＮＦＲ１０３９４（配列番号：４０）、Ｍ８２３２（配列番号：４１）、Ｍ３１５（配列番号：４２）、ならびにＳＳ１（配列番号：４３）由来のＧＡＳ４０タンパク質のアミノ酸配列のアラインメント。図１Ｄ（アミノ酸１５１〜２００）。
【図１Ｅ】図１。ＧＡＳＭ株であるＳＦ３７０、２５８０、３２８０、３３４８、３７８９、および２９１３（配列番号：１７）２６３４（配列番号：１８）、２７２６（配列番号：１９）、２７２１（配列番号：２０）、３０４０、および３１３５（配列番号：２１）、２７２２（配列番号：２２）、２７２８（配列番号：２３）、４８８３（配列番号：２４）、２７２４（配列番号：２５）、２８９４、３６５０、５５２９、および３７７６（配列番号：２６）、２７２０（配列番号：２７）、２７２５（配列番号：２８）、４５３８（配列番号：２９）、５５３１（配列番号：３０）、５４８１（配列番号：３１）、４９５９（配列番号：３２）、Ｄ２０７１（配列番号：３３）、４４３６（配列番号：３４）、２７２７（配列番号：３５）、２７１９（配列番号：３６）、５４５５（配列番号：３７）、５４７６（配列番号：３８）、４０８８（配列番号：３９）、ＭＡＮＦＲ１０３９４（配列番号：４０）、Ｍ８２３２（配列番号：４１）、Ｍ３１５（配列番号：４２）、ならびにＳＳ１（配列番号：４３）由来のＧＡＳ４０タンパク質のアミノ酸配列のアラインメント。図１Ｅ（アミノ酸２０１〜２５０）。
【図１Ｆ】図１。ＧＡＳＭ株であるＳＦ３７０、２５８０、３２８０、３３４８、３７８９、および２９１３（配列番号：１７）２６３４（配列番号：１８）、２７２６（配列番号：１９）、２７２１（配列番号：２０）、３０４０、および３１３５（配列番号：２１）、２７２２（配列番号：２２）、２７２８（配列番号：２３）、４８８３（配列番号：２４）、２７２４（配列番号：２５）、２８９４、３６５０、５５２９、および３７７６（配列番号：２６）、２７２０（配列番号：２７）、２７２５（配列番号：２８）、４５３８（配列番号：２９）、５５３１（配列番号：３０）、５４８１（配列番号：３１）、４９５９（配列番号：３２）、Ｄ２０７１（配列番号：３３）、４４３６（配列番号：３４）、２７２７（配列番号：３５）、２７１９（配列番号：３６）、５４５５（配列番号：３７）、５４７６（配列番号：３８）、４０８８（配列番号：３９）、ＭＡＮＦＲ１０３９４（配列番号：４０）、Ｍ８２３２（配列番号：４１）、Ｍ３１５（配列番号：４２）、ならびにＳＳ１（配列番号：４３）由来のＧＡＳ４０タンパク質のアミノ酸配列のアラインメント。図１Ｆ（アミノ酸２５１〜３００）。
【図１Ｇ】図１。ＧＡＳＭ株であるＳＦ３７０、２５８０、３２８０、３３４８、３７８９、および２９１３（配列番号：１７）２６３４（配列番号：１８）、２７２６（配列番号：１９）、２７２１（配列番号：２０）、３０４０、および３１３５（配列番号：２１）、２７２２（配列番号：２２）、２７２８（配列番号：２３）、４８８３（配列番号：２４）、２７２４（配列番号：２５）、２８９４、３６５０、５５２９、および３７７６（配列番号：２６）、２７２０（配列番号：２７）、２７２５（配列番号：２８）、４５３８（配列番号：２９）、５５３１（配列番号：３０）、５４８１（配列番号：３１）、４９５９（配列番号：３２）、Ｄ２０７１（配列番号：３３）、４４３６（配列番号：３４）、２７２７（配列番号：３５）、２７１９（配列番号：３６）、５４５５（配列番号：３７）、５４７６（配列番号：３８）、４０８８（配列番号：３９）、ＭＡＮＦＲ１０３９４（配列番号：４０）、Ｍ８２３２（配列番号：４１）、Ｍ３１５（配列番号：４２）、ならびにＳＳ１（配列番号：４３）由来のＧＡＳ４０タンパク質のアミノ酸配列のアラインメント。図１Ｇ（アミノ酸３０１〜３５０）。
【図１Ｈ】図１。ＧＡＳＭ株であるＳＦ３７０、２５８０、３２８０、３３４８、３７８９、および２９１３（配列番号：１７）２６３４（配列番号：１８）、２７２６（配列番号：１９）、２７２１（配列番号：２０）、３０４０、および３１３５（配列番号：２１）、２７２２（配列番号：２２）、２７２８（配列番号：２３）、４８８３（配列番号：２４）、２７２４（配列番号：２５）、２８９４、３６５０、５５２９、および３７７６（配列番号：２６）、２７２０（配列番号：２７）、２７２５（配列番号：２８）、４５３８（配列番号：２９）、５５３１（配列番号：３０）、５４８１（配列番号：３１）、４９５９（配列番号：３２）、Ｄ２０７１（配列番号：３３）、４４３６（配列番号：３４）、２７２７（配列番号：３５）、２７１９（配列番号：３６）、５４５５（配列番号：３７）、５４７６（配列番号：３８）、４０８８（配列番号：３９）、ＭＡＮＦＲ１０３９４（配列番号：４０）、Ｍ８２３２（配列番号：４１）、Ｍ３１５（配列番号：４２）、ならびにＳＳ１（配列番号：４３）由来のＧＡＳ４０タンパク質のアミノ酸配列のアラインメント。図１Ｈ（アミノ酸３５１〜４００）。
【図１Ｉ】図１。ＧＡＳＭ株であるＳＦ３７０、２５８０、３２８０、３３４８、３７８９、および２９１３（配列番号：１７）２６３４（配列番号：１８）、２７２６（配列番号：１９）、２７２１（配列番号：２０）、３０４０、および３１３５（配列番号：２１）、２７２２（配列番号：２２）、２７２８（配列番号：２３）、４８８３（配列番号：２４）、２７２４（配列番号：２５）、２８９４、３６５０、５５２９、および３７７６（配列番号：２６）、２７２０（配列番号：２７）、２７２５（配列番号：２８）、４５３８（配列番号：２９）、５５３１（配列番号：３０）、５４８１（配列番号：３１）、４９５９（配列番号：３２）、Ｄ２０７１（配列番号：３３）、４４３６（配列番号：３４）、２７２７（配列番号：３５）、２７１９（配列番号：３６）、５４５５（配列番号：３７）、５４７６（配列番号：３８）、４０８８（配列番号：３９）、ＭＡＮＦＲ１０３９４（配列番号：４０）、Ｍ８２３２（配列番号：４１）、Ｍ３１５（配列番号：４２）、ならびにＳＳ１（配列番号：４３）由来のＧＡＳ４０タンパク質のアミノ酸配列のアラインメント。図１Ｉ（アミノ酸４０１〜４５０）。
【図１Ｊ】図１。ＧＡＳＭ株であるＳＦ３７０、２５８０、３２８０、３３４８、３７８９、および２９１３（配列番号：１７）２６３４（配列番号：１８）、２７２６（配列番号：１９）、２７２１（配列番号：２０）、３０４０、および３１３５（配列番号：２１）、２７２２（配列番号：２２）、２７２８（配列番号：２３）、４８８３（配列番号：２４）、２７２４（配列番号：２５）、２８９４、３６５０、５５２９、および３７７６（配列番号：２６）、２７２０（配列番号：２７）、２７２５（配列番号：２８）、４５３８（配列番号：２９）、５５３１（配列番号：３０）、５４８１（配列番号：３１）、４９５９（配列番号：３２）、Ｄ２０７１（配列番号：３３）、４４３６（配列番号：３４）、２７２７（配列番号：３５）、２７１９（配列番号：３６）、５４５５（配列番号：３７）、５４７６（配列番号：３８）、４０８８（配列番号：３９）、ＭＡＮＦＲ１０３９４（配列番号：４０）、Ｍ８２３２（配列番号：４１）、Ｍ３１５（配列番号：４２）、ならびにＳＳ１（配列番号：４３）由来のＧＡＳ４０タンパク質のアミノ酸配列のアラインメント。図１Ｊ（アミノ酸４５１〜５００）。
【図１Ｋ】図１。ＧＡＳＭ株であるＳＦ３７０、２５８０、３２８０、３３４８、３７８９、および２９１３（配列番号：１７）２６３４（配列番号：１８）、２７２６（配列番号：１９）、２７２１（配列番号：２０）、３０４０、および３１３５（配列番号：２１）、２７２２（配列番号：２２）、２７２８（配列番号：２３）、４８８３（配列番号：２４）、２７２４（配列番号：２５）、２８９４、３６５０、５５２９、および３７７６（配列番号：２６）、２７２０（配列番号：２７）、２７２５（配列番号：２８）、４５３８（配列番号：２９）、５５３１（配列番号：３０）、５４８１（配列番号：３１）、４９５９（配列番号：３２）、Ｄ２０７１（配列番号：３３）、４４３６（配列番号：３４）、２７２７（配列番号：３５）、２７１９（配列番号：３６）、５４５５（配列番号：３７）、５４７６（配列番号：３８）、４０８８（配列番号：３９）、ＭＡＮＦＲ１０３９４（配列番号：４０）、Ｍ８２３２（配列番号：４１）、Ｍ３１５（配列番号：４２）、ならびにＳＳ１（配列番号：４３）由来のＧＡＳ４０タンパク質のアミノ酸配列のアラインメント。図１Ｋ（アミノ酸５０１〜５５０）。
【図１Ｌ】図１。ＧＡＳＭ株であるＳＦ３７０、２５８０、３２８０、３３４８、３７８９、および２９１３（配列番号：１７）２６３４（配列番号：１８）、２７２６（配列番号：１９）、２７２１（配列番号：２０）、３０４０、および３１３５（配列番号：２１）、２７２２（配列番号：２２）、２７２８（配列番号：２３）、４８８３（配列番号：２４）、２７２４（配列番号：２５）、２８９４、３６５０、５５２９、および３７７６（配列番号：２６）、２７２０（配列番号：２７）、２７２５（配列番号：２８）、４５３８（配列番号：２９）、５５３１（配列番号：３０）、５４８１（配列番号：３１）、４９５９（配列番号：３２）、Ｄ２０７１（配列番号：３３）、４４３６（配列番号：３４）、２７２７（配列番号：３５）、２７１９（配列番号：３６）、５４５５（配列番号：３７）、５４７６（配列番号：３８）、４０８８（配列番号：３９）、ＭＡＮＦＲ１０３９４（配列番号：４０）、Ｍ８２３２（配列番号：４１）、Ｍ３１５（配列番号：４２）、ならびにＳＳ１（配列番号：４３）由来のＧＡＳ４０タンパク質のアミノ酸配列のアラインメント。図１Ｌ（アミノ酸５５１〜６００）。
【図１Ｍ】図１。ＧＡＳＭ株であるＳＦ３７０、２５８０、３２８０、３３４８、３７８９、および２９１３（配列番号：１７）２６３４（配列番号：１８）、２７２６（配列番号：１９）、２７２１（配列番号：２０）、３０４０、および３１３５（配列番号：２１）、２７２２（配列番号：２２）、２７２８（配列番号：２３）、４８８３（配列番号：２４）、２７２４（配列番号：２５）、２８９４、３６５０、５５２９、および３７７６（配列番号：２６）、２７２０（配列番号：２７）、２７２５（配列番号：２８）、４５３８（配列番号：２９）、５５３１（配列番号：３０）、５４８１（配列番号：３１）、４９５９（配列番号：３２）、Ｄ２０７１（配列番号：３３）、４４３６（配列番号：３４）、２７２７（配列番号：３５）、２７１９（配列番号：３６）、５４５５（配列番号：３７）、５４７６（配列番号：３８）、４０８８（配列番号：３９）、ＭＡＮＦＲ１０３９４（配列番号：４０）、Ｍ８２３２（配列番号：４１）、Ｍ３１５（配列番号：４２）、ならびにＳＳ１（配列番号：４３）由来のＧＡＳ４０タンパク質のアミノ酸配列のアラインメント。図１Ｍ（アミノ酸６０１〜６５０）。
【図１Ｎ】図１。ＧＡＳＭ株であるＳＦ３７０、２５８０、３２８０、３３４８、３７８９、および２９１３（配列番号：１７）２６３４（配列番号：１８）、２７２６（配列番号：１９）、２７２１（配列番号：２０）、３０４０、および３１３５（配列番号：２１）、２７２２（配列番号：２２）、２７２８（配列番号：２３）、４８８３（配列番号：２４）、２７２４（配列番号：２５）、２８９４、３６５０、５５２９、および３７７６（配列番号：２６）、２７２０（配列番号：２７）、２７２５（配列番号：２８）、４５３８（配列番号：２９）、５５３１（配列番号：３０）、５４８１（配列番号：３１）、４９５９（配列番号：３２）、Ｄ２０７１（配列番号：３３）、４４３６（配列番号：３４）、２７２７（配列番号：３５）、２７１９（配列番号：３６）、５４５５（配列番号：３７）、５４７６（配列番号：３８）、４０８８（配列番号：３９）、ＭＡＮＦＲ１０３９４（配列番号：４０）、Ｍ８２３２（配列番号：４１）、Ｍ３１５（配列番号：４２）、ならびにＳＳ１（配列番号：４３）由来のＧＡＳ４０タンパク質のアミノ酸配列のアラインメント。図１Ｎ（アミノ酸６５１〜７００）。
【図１Ｏ】図１。ＧＡＳＭ株であるＳＦ３７０、２５８０、３２８０、３３４８、３７８９、および２９１３（配列番号：１７）２６３４（配列番号：１８）、２７２６（配列番号：１９）、２７２１（配列番号：２０）、３０４０、および３１３５（配列番号：２１）、２７２２（配列番号：２２）、２７２８（配列番号：２３）、４８８３（配列番号：２４）、２７２４（配列番号：２５）、２８９４、３６５０、５５２９、および３７７６（配列番号：２６）、２７２０（配列番号：２７）、２７２５（配列番号：２８）、４５３８（配列番号：２９）、５５３１（配列番号：３０）、５４８１（配列番号：３１）、４９５９（配列番号：３２）、Ｄ２０７１（配列番号：３３）、４４３６（配列番号：３４）、２７２７（配列番号：３５）、２７１９（配列番号：３６）、５４５５（配列番号：３７）、５４７６（配列番号：３８）、４０８８（配列番号：３９）、ＭＡＮＦＲ１０３９４（配列番号：４０）、Ｍ８２３２（配列番号：４１）、Ｍ３１５（配列番号：４２）、ならびにＳＳ１（配列番号：４３）由来のＧＡＳ４０タンパク質のアミノ酸配列のアラインメント。図１Ｏ（アミノ酸７０１〜７５０）。
【図１Ｐ】図１。ＧＡＳＭ株であるＳＦ３７０、２５８０、３２８０、３３４８、３７８９、および２９１３（配列番号：１７）２６３４（配列番号：１８）、２７２６（配列番号：１９）、２７２１（配列番号：２０）、３０４０、および３１３５（配列番号：２１）、２７２２（配列番号：２２）、２７２８（配列番号：２３）、４８８３（配列番号：２４）、２７２４（配列番号：２５）、２８９４、３６５０、５５２９、および３７７６（配列番号：２６）、２７２０（配列番号：２７）、２７２５（配列番号：２８）、４５３８（配列番号：２９）、５５３１（配列番号：３０）、５４８１（配列番号：３１）、４９５９（配列番号：３２）、Ｄ２０７１（配列番号：３３）、４４３６（配列番号：３４）、２７２７（配列番号：３５）、２７１９（配列番号：３６）、５４５５（配列番号：３７）、５４７６（配列番号：３８）、４０８８（配列番号：３９）、ＭＡＮＦＲ１０３９４（配列番号：４０）、Ｍ８２３２（配列番号：４１）、Ｍ３１５（配列番号：４２）、ならびにＳＳ１（配列番号：４３）由来のＧＡＳ４０タンパク質のアミノ酸配列のアラインメント。図１Ｐ（アミノ酸７５１〜８００）。
【図１Ｑ】図１。ＧＡＳＭ株であるＳＦ３７０、２５８０、３２８０、３３４８、３７８９、および２９１３（配列番号：１７）２６３４（配列番号：１８）、２７２６（配列番号：１９）、２７２１（配列番号：２０）、３０４０、および３１３５（配列番号：２１）、２７２２（配列番号：２２）、２７２８（配列番号：２３）、４８８３（配列番号：２４）、２７２４（配列番号：２５）、２８９４、３６５０、５５２９、および３７７６（配列番号：２６）、２７２０（配列番号：２７）、２７２５（配列番号：２８）、４５３８（配列番号：２９）、５５３１（配列番号：３０）、５４８１（配列番号：３１）、４９５９（配列番号：３２）、Ｄ２０７１（配列番号：３３）、４４３６（配列番号：３４）、２７２７（配列番号：３５）、２７１９（配列番号：３６）、５４５５（配列番号：３７）、５４７６（配列番号：３８）、４０８８（配列番号：３９）、ＭＡＮＦＲ１０３９４（配列番号：４０）、Ｍ８２３２（配列番号：４１）、Ｍ３１５（配列番号：４２）、ならびにＳＳ１（配列番号：４３）由来のＧＡＳ４０タンパク質のアミノ酸配列のアラインメント。図１Ｑ（アミノ酸８０１〜８５０）。
【図１Ｒ】図１。ＧＡＳＭ株であるＳＦ３７０、２５８０、３２８０、３３４８、３７８９、および２９１３（配列番号：１７）２６３４（配列番号：１８）、２７２６（配列番号：１９）、２７２１（配列番号：２０）、３０４０、および３１３５（配列番号：２１）、２７２２（配列番号：２２）、２７２８（配列番号：２３）、４８８３（配列番号：２４）、２７２４（配列番号：２５）、２８９４、３６５０、５５２９、および３７７６（配列番号：２６）、２７２０（配列番号：２７）、２７２５（配列番号：２８）、４５３８（配列番号：２９）、５５３１（配列番号：３０）、５４８１（配列番号：３１）、４９５９（配列番号：３２）、Ｄ２０７１（配列番号：３３）、４４３６（配列番号：３４）、２７２７（配列番号：３５）、２７１９（配列番号：３６）、５４５５（配列番号：３７）、５４７６（配列番号：３８）、４０８８（配列番号：３９）、ＭＡＮＦＲ１０３９４（配列番号：４０）、Ｍ８２３２（配列番号：４１）、Ｍ３１５（配列番号：４２）、ならびにＳＳ１（配列番号：４３）由来のＧＡＳ４０タンパク質のアミノ酸配列のアラインメント。図１Ｒ（アミノ酸８５１〜８７３）。
【図２】図２。ＧＡＳ４０タンパク質が異なるＭ型株の細胞表面上に曝露されることを証明するＦＡＣＳ分析の結果。
【図３】図３。天然のＧＡＳ４０タンパク質に指向する抗血清によって異なるＭ型株（ＤＳＭ２０７１株、２６３４株、ＤＳＭ２０７１株の低莢膜化（ｈｙｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）変異体、２７２７株、ＳＦ３７０株、２７２０株、３７８９株、２７２５株、２５８０株、２８９４株、２７２８株、２９１３株、２７２６株、３３４８株、および３２８０株）の細胞表面上のＧＡＳ４０タンパク質が検出されることを証明するＦＡＣＳ分析の結果。
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｂ。「ＧＳＴ−ＧＡＳ４０」抗原に指向する抗血清によって異なるＭ型株の細胞表面上のＧＡＳ４０タンパク質が検出されることを証明するＦＡＣＳ分析の結果。図４Ａ。３７８９株、４８８３株、ＤＳＭ２０７１株の低莢膜化変異体、５４７６株、ＳＦ３７０株、ＤＭＳ２０７１株、２７２０株、２７２３株、２７２８株、２７２４株、２５８０株、２７２５株、２７１９株、２７２６株、３７７６株。
【図４Ｂ】図４Ａ〜Ｂ。「ＧＳＴ−ＧＡＳ４０」抗原に指向する抗血清によって異なるＭ型株の細胞表面上のＧＡＳ４０タンパク質が検出されることを証明するＦＡＣＳ分析の結果。図４Ｂ。４４３６株、２７２１株、４９５９株、２７２７株、５４６８株、３６５０株、２６３４株、４０８８株、４５３８株、２７２２株。
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｂ。ＧＡＳ４０ａ抗原に指向する抗血清によって異なるＭ型株の細胞表面上のＧＡＳ４０タンパク質が検出されることを証明するＦＡＣＳ分析の結果。図５Ａ。ＤＳＭ２０７１株、ＳＦ３７０株、２７２１株、３２８０株、２７２８株、３７８９、ＤＳＭ２０７１株の低莢膜化変異体、４８８３株、５４７６株、２７２５株、２７２０株、２７２６株、２７２３株、２７２８株、２７２４株および２５８０株。
【図５Ｂ】図５Ａ〜Ｂ。ＧＡＳ４０ａ抗原に指向する抗血清によって異なるＭ型株の細胞表面上のＧＡＳ４０タンパク質が検出されることを証明するＦＡＣＳ分析の結果。図５Ｂ。２７１９株、５４６８株、３７７６株、２６３４株、４４３６株、２７２１株、４９５９株、２７２７株、３６５０株、４０８８株、４５３８株および２７２２株。
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｂ。ＧＡＳ４０ａＣＨ抗原に指向する抗血清によって異なるＭ型株の細胞表面上のＧＡＳ４０タンパク質が検出されることを証明するＦＡＣＳ分析の結果。図６Ａ。ＤＭＳ２０７１株、３２８０株、２７２１株、３７８９株、２７２８株、４８８３株、ＤＳＭ２０７１株の低莢膜化変異体、５４７６株、ＳＦ３７０株、２７２０株、２７２３株、２５８０株、２７２４株、２７１９株、２７２５株、３７７６株、２７２６株、４４３６株、２７２８株および４９５９株。
【図６Ｂ】図６Ａ〜Ｂ。ＧＡＳ４０ａＣＨ抗原に指向する抗血清によって異なるＭ型株の細胞表面上のＧＡＳ４０タンパク質が検出されることを証明するＦＡＣＳ分析の結果。図６Ｂ。５４６８株、４０８８株、２６３４株、４５３８株、２７２１株、２７２２株、２７２７株および３６５０株。
【図７】図７。ＧＡＳ４０／ＧＡＳ１１７ハイブリッド抗原に指向する抗血清によって異なるＭ型株（２７２０株、２７２６株、２７２５株、３２８０株、２５８０株、２７２８株）の細胞表面上のＧＡＳ４０タンパク質が検出されることを証明するＦＡＣＳ分析の結果。
【図８】図８。ＧＡＳ１１７／ＧＡＳ４０ハイブリッド抗原に指向する抗血清によって異なるＭ型株（ＤＳＭ２０７１株、２６３４株、ＤＳＭ２０７１株の低莢膜化変異体、２７２７株、３７８９株、２７２０株、ＳＦ３７０株、２７２５株、２５８０株、２８９４株、２７２８株、２９１３株、２７２６株、３３４８株、３２８０株）の細胞表面上のＧＡＳ４０タンパク質が検出されることを証明するＦＡＣＳ分析の結果。
【図９Ａ】図９Ａ〜Ｂ。ＧＡＳ４０ａＲＲ抗原に指向する抗血清によって異なるＭ型株の細胞表面上のＧＡＳ４０タンパク質が検出されることを証明するＦＡＣＳ分析の結果。図９Ａ。ＤＭＳ２０７１株、３２８０株、２７２１株、４７８９株、２７２８株、４８８３株、ＤＳＭ２０７１株の低莢膜化変異体、５４７６株、ＳＦ３７０株、２７２０株、２７２３株、２５８０株、２７２４株、２７１９株、２７２５株、３７７６株、２７２６株、４４３６株、２７２８株、４９５９株。
【図９Ｂ】図９Ａ〜Ｂ。ＧＡＳ４０ａＲＲ抗原に指向する抗血清によって異なるＭ型株の細胞表面上のＧＡＳ４０タンパク質が検出されることを証明するＦＡＣＳ分析の結果。図９Ｂ。５４６８株、４０８８株、２６３４株、４５３８株、２７２１株、２７２２株、２７２７株、３６５０株。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜Ｂ。ＧＡＳ４０ａＮＨ抗原に指向する抗血清によって異なるＭ型株の細胞表面上のＧＡＳ４０タンパク質が検出されることを証明するＦＡＣＳ分析の結果。図１０Ａ。ＤＭＳ２０７１株、３２８０株、２７２１株、３７８９株、２７２８株、４８８３株、ＤＳＭ２０７１株の低莢膜化変異体、５４７６株、ＳＦ３７０株、２７２０株、２７２３株、２５８０株、２７２４株、２７１９株、２７２５株、３７７６株、２７２６株、４４３６株、２７２８株、４９５９株。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜Ｂ。ＧＡＳ４０ａＮＨ抗原に指向する抗血清によって異なるＭ型株の細胞表面上のＧＡＳ４０タンパク質が検出されることを証明するＦＡＣＳ分析の結果。図１０Ｂ。５４６８株、４０８８株、２６３４株、４５３８株、２７２１株、２７２２株、２７２７株、３６５０株。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜Ｂ。ＧＡＳ４０ａＲＲＮＨ抗原に指向する抗血清によって異なるＭ型株の細胞表面上のＧＡＳ４０タンパク質が検出されることを証明するＦＡＣＳ分析の結果。図１１Ａ。ＤＭＳ２０７１株、３２８０株、２７２１株、３７８９株、２７２８株、４８８３株、ＤＳＭ２０７１株の低莢膜化変異体、５４７６株、ＳＦ３７０株、２７２０株、２７２３株、２５８０株、２７２４株、２７１９株、２７２５株、３７７６株、２７２６株、４４３６株、２７２８株、４９５９株。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜Ｂ。ＧＡＳ４０ａＲＲＮＨ抗原に指向する抗血清によって異なるＭ型株の細胞表面上のＧＡＳ４０タンパク質が検出されることを証明するＦＡＣＳ分析の結果。図１１Ｂ。５４６８株、４０８８株、２６３４株、４５３８株、２７２１株、２７２２株、２７２７株、３６５０株。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜Ｂ。発現ベクターおよび組換えＧＡＳ抗原の図。図１２Ａ。発現ベクターｐＥＴ−２１＋およびｐＧＥＸ。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜Ｂ。発現ベクターおよび組換えＧＡＳ抗原の図。図１２Ｂ。コードされた組換えタンパク質。
【図１３】図１３。マウスモデルの概略図。
【図１４】図１４。マウスモデルの結果。
【図１５】図１５。ＧＡＳ４０構造の概略図。
【図１６】図１６。異なるＧＡＳ血清型のＧＡＳ４０の発現を示すウェスタンブロット。
【図１７】図１７。ＧＡＳ４０の表面発現を示すＦＡＣＳピクトグラム。
【図１８】図１８。細菌細胞表面上のＧＡＳ４０の分布を示す顕微鏡写真。
【図１９】図１９。抗ＧＡＳ４０抗体の殺菌性を示すグラフ。
【図２０】図２０。抗ＧＡＳ４０抗体のオプソニン化性を示すグラフ。
【図２１】図２１。ＧＡＳ４０ドメインの概略図。
【図２２】図２２。ＧＡＳ４０Ｎ（配列番号９３０）で免疫化されたマウスの経時生存率の結果を示すグラフ。
【図２３】図２３。ＧＡＳ４０が異なるＭ株にわたって表面露出されていることを証明するＦＡＣＳデータ。
【図２４】図２４。試験した４つのモノクローナル抗体がＧＡＳ４０Ｎエピトープに結合しないことを証明するウェスタンブロットおよびＦＡＣＳグラフ。
【図２５Ａ】図２５Ａ〜Ｂ。ＧＡＳ１９０（配列番号１１７）の全長アミノ酸配列とアラインメントしたＧＡＳ１９０のプロテイナーゼＫ消化由来のペプチド。図２５Ａ。各ペプチド（配列番号９３２〜９４９）。
【図２５Ｂ】図２５Ａ〜Ｂ。ＧＡＳ１９０（配列番号１１７）の全長アミノ酸配列とアラインメントしたＧＡＳ１９０のプロテイナーゼＫ消化由来のペプチド。図２５Ｂ。概略図。
【図２６Ａ】図２６Ａ〜Ｂ。ＧＡＳ１９０（配列番号１１７）の全長アミノ酸配列とアラインメントしたＧＡＳ１９０のトリプシン消化由来のペプチド。図２６Ａ。各ペプチド（配列番号９５０〜９６１）。
【図２６Ｂ】図２６Ａ〜Ｂ。ＧＡＳ１９０（配列番号１１７）の全長アミノ酸配列とアラインメントしたＧＡＳ１９０のトリプシン消化由来のペプチド。図２６Ｂ。概略図。
【図２７】予測ＬＰＸＴＧ（配列番号９３１）タンパク質のまとめ。
【図２８】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図２９】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図３０】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図３１】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図３２】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図３３】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図３４】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図３５】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図３６】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図３７】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図３８】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図３９】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図４０】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図４１】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図４２】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図４３】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図４４】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図４５】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図４６】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図４７】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図４８】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図４９】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図５０】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図５１】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図５２】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図５３】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図５４】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図５５】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図５６】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図５７】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図５８】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図５９】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図６０】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図６１】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図６２】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図６３】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図６４】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図６５】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図６６】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図６７】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図６８】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図６９】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図７０】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図７１】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図７２】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図７３】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図７４】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図７５】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図７６】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図７７】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図７８】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図７９】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図８０】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図８１】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図８２】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図８３】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図８４】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図８５】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図８６】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図８７】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図８８】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図８９】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図９０】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図９１】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図９２】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図９３】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図９４】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図９５】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図９６】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図９７】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図９８】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図９９】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図１００】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図１０１】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図１０２】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図１０３】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図１０４】図２８〜１０４。同定膜結合タンパク質のトポロジーの表示。プロテアーゼ切断部位を赤色で示す。ＬＰＸＴＧ、配列番号９３１。
【図１０５Ａ】図１０５Ａ〜Ｂ。同定された全ての予測膜タンパク質のバイオインフォマティクスベースのトポロジー予測および同定ペプチドとのその適合。タンパク質を、予測膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）数順に並べ、さらに、そのＴＩＧＲアクセッション番号順に並べている。図１０５Ａは、そのペプチドがＰＳＯＲＴによって予測されたプロテオミクス適合細胞外ドメインによって同定されたタンパク質を示す。
【図１０５Ｂ】図１０５Ａ〜Ｂ。同定された全ての予測膜タンパク質のバイオインフォマティクスベースのトポロジー予測および同定ペプチドとのその適合。タンパク質を、予測膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）数順に並べ、さらに、そのＴＩＧＲアクセッション番号順に並べている。図１０５Ｂは、そのペプチドがＰＳＯＲＴによって予測されたプロテオミクス適合細胞質ドメインによって同定された膜タンパク質を示す。
【図１０６】図１０６。化膿性レンサ球菌における４つの各表面結合タンパク質型について見出されたタンパク質と予測タンパク質との比較および同定されたタンパク質のＦＡＣＳ応答。ＬＰＸＴＧタンパク質：細胞壁へのＬＰＸＴＧ（配列番号９３１）繋留モチーフを含む１７タンパク質がゲノム中に存在すると予測された。１２タンパク質（７１％）が認められ、５タンパク質（２９％）は認められなかった。同定されたタンパク質のうち、１１タンパク質を試験し、これらの全てが陽性であった。膜タンパク質：４８９の膜タンパク質をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析によって同定した。４５２タンパク質（９２％）が見出されなかったのに対して、見出されたタンパク質数は３７（８％）であり、１５タンパク質をＦＡＣＳで試験しなかった。試験したタンパク質のうち、１７タンパク質（７７％）が、陽性応答を示し、５タンパク質（２３％）が陰性であった。リポタンパク質：ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析によって予想された２８リポタンパク質のうち１１リポタンパク質（３９％）が見出され、１７リポタンパク質（６１％）が見出されなかった。見出されたタンパク質の全てをＦＡＣＳ試験し、９リポタンパク質（８１％）が陽性であり、２リポタンパク質（１９％）が負の応答を示した。分泌タンパク質：６７の分泌タンパク質が予測され、５９分泌タンパク質（８８％）が見出されず、８分泌タンパク質（１２％）が見出された。これらのうち、１分泌タンパク質をＦＡＣＳで試験しなかった。試験したタンパク質のうち、６分泌タンパク質（８６％）が陽性であり、陰性は１分泌タンパク質（１４％）のみであった。
【図１０７】図１０７。ＧＡＳ細菌のペニシリン処置の際に産生された膜脱制限（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｄｅｌｉｍｉｔｅｄ）構造の電子顕微鏡写真。
【図１０８】図１０８。Ｍ１、Ｍ３、Ｍ６、およびＭ２３ＧＡＳ細菌のヒアルロン酸含有量（ｆｇ／ＣＦＵ）を示すグラフ。
【図１０９Ａ】図１０９Ａ〜Ｃ。表面露出ＧＡＳ抗原のＦＡＣＳピクトグラム。
【図１０９Ｂ】図１０９Ａ〜Ｃ。表面露出ＧＡＳ抗原のＦＡＣＳピクトグラム。
【図１０９Ｃ】図１０９Ａ〜Ｃ。表面露出ＧＡＳ抗原のＦＡＣＳピクトグラム。
【図１１０Ａ】図１１０Ａ〜Ｃ。表面露出ＧＡＳ抗原のＦＡＣＳピクトグラム。
【図１１０Ｂ】図１１０Ａ〜Ｃ。表面露出ＧＡＳ抗原のＦＡＣＳピクトグラム。
【図１１０Ｃ】図１１０Ａ〜Ｃ。表面露出ＧＡＳ抗原のＦＡＣＳピクトグラム。
【図１１１Ａ】図１１１Ａ〜Ｃ。表面露出ＧＡＳ抗原のＦＡＣＳピクトグラム。
【図１１１Ｂ】図１１１Ａ〜Ｃ。表面露出ＧＡＳ抗原のＦＡＣＳピクトグラム。
【図１１１Ｃ】図１１１Ａ〜Ｃ。表面露出ＧＡＳ抗原のＦＡＣＳピクトグラム。
【図１１２】図１１２。６人の健常なドナーの血清サンプルから同定された一般的な免疫反応性抗原を示すグラフ。
【図１Ａ】
2008544949.tif 000160
【図１Ｂ】
2008544949.tif 000161
【図１Ｃ】
2008544949.tif 000162
【図１Ｄ】
2008544949.tif 000163
【図１Ｅ】
2008544949.tif 000164
【図１Ｆ】
2008544949.tif 000165
【図１Ｇ】
2008544949.tif 000166
【図１Ｈ】
2008544949.tif 000167
【図１Ｉ】
2008544949.tif 000168
【図１Ｊ】
2008544949.tif 000169
【図１Ｋ】
2008544949.tif 000170
【図１Ｌ】
2008544949.tif 000171
【図１Ｍ】
2008544949.tif 000172
【図１Ｎ】
2008544949.tif 000173
【図１Ｏ】
2008544949.tif 000174
【図１Ｐ】
2008544949.tif 000175
【図１Ｑ】
2008544949.tif 000176
【図１Ｒ】
2008544949.tif 000177
【図２】
2008544949.tif 000178
【図３】
2008544949.tif 000179
【図４Ａ】
2008544949.tif 000180
【図４Ｂ】
2008544949.tif 000181
【図５Ａ】
2008544949.tif 000182
【図５Ｂ】
2008544949.tif 000183
【図６Ａ】
2008544949.tif 000184
【図６Ｂ】
2008544949.tif 000185
【図７】
2008544949.tif 000186
【図８】
2008544949.tif 000187
【図９Ａ】
2008544949.tif 000188
【図９Ｂ】
2008544949.tif 000189
【図１０Ａ】
2008544949.tif 000190
【図１０Ｂ】
2008544949.tif 000191
【図１１Ａ】
2008544949.tif 000192
【図１１Ｂ】
2008544949.tif 000193
【図１２Ａ】
2008544949.tif 000194
【図１２Ｂ】
2008544949.tif 000195
【図１３】
2008544949.tif 000196
【図１４】
2008544949.tif 000197
【図１５】
2008544949.tif 000198
【図１６】
2008544949.tif 000199
【図１７】
2008544949.tif 000200
【図１８】
2008544949.tif 000201
【図１９】
2008544949.tif 000202
【図２０】
2008544949.tif 000203
【図２１】
2008544949.tif 000204
【図２２】
2008544949.tif 000205
【図２３】
2008544949.tif 000206
【図２４】
2008544949.tif 000207
【図２５Ａ】
2008544949.tif 000208
【図２５Ｂ】
2008544949.tif 000209
【図２６Ａ】
2008544949.tif 000210
【図２６Ｂ】
2008544949.tif 000211
【図２７】
2008544949.tif 000212
【図２８】
2008544949.tif 000213
【図２９】
2008544949.tif 000214
【図３０】
2008544949.tif 000215
【図３１】
2008544949.tif 000216
【図３２】
2008544949.tif 000217
【図３３】
2008544949.tif 000218
【図３４】
2008544949.tif 000219
【図３５】
2008544949.tif 000220
【図３６】
2008544949.tif 000221
【図３７】
2008544949.tif 000222
【図３８】
2008544949.tif 000223
【図３９】
2008544949.tif 000224
【図４０】
2008544949.tif 000225
【図４１】
2008544949.tif 000226
【図４２】
2008544949.tif 000227
【図４３】
2008544949.tif 000228
【図４４】
2008544949.tif 000229
【図４５】
2008544949.tif 000230
【図４６】
2008544949.tif 000231
【図４７】
2008544949.tif 000232
【図４８】
2008544949.tif 000233
【図４９】
2008544949.tif 000234
【図５０】
2008544949.tif 000235
【図５１】
2008544949.tif 000236
【図５２】
2008544949.tif 000237
【図５３】
2008544949.tif 000238
【図５４】
2008544949.tif 000239
【図５５】
2008544949.tif 000240
【図５６】
2008544949.tif 000241
【図５７】
2008544949.tif 000242
【図５８】
2008544949.tif 000243
【図５９】
2008544949.tif 000244
【図６０】
2008544949.tif 000245
【図６１】
2008544949.tif 000246
【図６２】
2008544949.tif 000247
【図６３】
2008544949.tif 000248
【図６４】
2008544949.tif 000249
【図６５】
2008544949.tif 000250
【図６６】
2008544949.tif 000251
【図６７】
2008544949.tif 000252
【図６８】
2008544949.tif 000253
【図６９】
2008544949.tif 000254
【図７０】
2008544949.tif 000255
【図７１】
2008544949.tif 000256
【図７２】
2008544949.tif 000257
【図７３】
2008544949.tif 000258
【図７４】
2008544949.tif 000259
【図７５】
2008544949.tif 000260
【図７６】
2008544949.tif 000261
【図７７】
2008544949.tif 000262
【図７８】
2008544949.tif 000263
【図７９】
2008544949.tif 000264
【図８０】
2008544949.tif 000265
【図８１】
2008544949.tif 000266
【図８２】
2008544949.tif 000267
【図８３】
2008544949.tif 000268
【図８４】
2008544949.tif 000269
【図８５】
2008544949.tif 000270
【図８６】
2008544949.tif 000271
【図８７】
2008544949.tif 000272
【図８８】
2008544949.tif 000273
【図８９】
2008544949.tif 000274
【図９０】
2008544949.tif 000275
【図９１】
2008544949.tif 000276
【図９２】
2008544949.tif 000277
【図９３】
2008544949.tif 000278
【図９４】
2008544949.tif 000279
【図９５】
2008544949.tif 000280
【図９６】
2008544949.tif 000281
【図９７】
2008544949.tif 000282
【図９８】
2008544949.tif 000283
【図９９】
2008544949.tif 000284
【図１００】
2008544949.tif 000285
【図１０１】
2008544949.tif 000286
【図１０２】
2008544949.tif 000287
【図１０３】
2008544949.tif 000288
【図１０４】
2008544949.tif 000289
【図１０５Ａ】
2008544949.tif 000290
【図１０５Ｂ】
2008544949.tif 000291
【図１０６】
2008544949.tif 000292
【図１０７】
2008544949.tif 000293
【図１０８】
2008544949.tif 000294
【図１０９Ａ】
2008544949.tif 000295
【図１０９Ｂ】
2008544949.tif 000296
【図１０９Ｃ】
2008544949.tif 000297
【図１１０Ａ】
2008544949.tif 000298
【図１１０Ｂ】
2008544949.tif 000299
【図１１０Ｃ】
2008544949.tif 000300
【図１１１Ａ】
2008544949.tif 000301
【図１１１Ｂ】
2008544949.tif 000302
【図１１１Ｃ】
2008544949.tif 000303
【図１１２】
2008544949.tif 000304
【配列表】
2008544949000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年8月14日(2008.8.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）化膿性レンサ球菌（ＧＡＳ）タンパク質よりも少なくとも１アミノ酸短く、前記ＧＡＳタンパク質の表面露出ドメインを含む表面露出ＧＡＳ抗原であって、前記ＧＡＳタンパク質が、
（１）表２に列挙したＧＡＳタンパク質、
（２）表３に列挙したＧＡＳタンパク質、
（３）表４Ａ〜４Ｒからなる群から選択される表に列挙したＧＡＳタンパク質、
（４）表５に列挙したＧＡＳタンパク質、
（５）表６に列挙したＧＡＳタンパク質、
（６）表７に列挙したＧＡＳタンパク質、
（７）表８に列挙したＧＡＳタンパク質、
（８）表９に列挙したＧＡＳタンパク質、
（９）表１１に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１０）表１２に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１１）表１３に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１２）表１４に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１３）表１５に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１４）表１６に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１５）
【化１】
2008544949.tif 000305
（１６）
【化２】
2008544949.tif 000306
（１７）
【化３】
2008544949.tif 000307
（１８）
【化４】
2008544949.tif 000308
（１９）
【化５】
2008544949.tif 000309
（２０）
【化６】
2008544949.tif 000310
（２１）
【化７】
2008544949.tif 000311
および
（２２）
【化８】
2008544949.tif 000312
、Ｍタンパク質、ＳａｇＡ、Ｓｆｂ１、およびＳｈｐからなる群から選択される、表面露出ＧＡＳ抗原、
ｂ）ＧＡＳ抗原をコードする核酸分子、および
ｃ）ＧＡＳ抗原に特異的に結合する抗体
からなる群から選択される少なくとも１つの活性因子を含む、組成物。
【請求項２】
（ａ）少なくとも２つの表面露出化膿性レンサ球菌（ＧＡＳ）抗原であって、第１のＧＡＳ抗原が第１のＧＡＳ細菌の表面上に発現し、第２のＧＡＳ抗原が第２のＧＡＳ細菌の表面上に発現し、前記第１および第２のＧＡＳ細菌が異なるＭ型である、少なくとも２つの表面露出ＧＡＳ抗原、
（ｂ）前記少なくとも２つの表面露出ＧＡＳ抗原をコードする少なくとも１つの核酸分子、および
（ｃ）少なくとも２つの抗体であって、第１の抗体が前記第１のＧＡＳ抗原に特異的に結合し、第２の抗体が前記第２のＧＡＳ抗原に特異的に結合する、少なくとも２つの抗体からなる群から選択される少なくとも２つの活性因子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第１および第２のＧＡＳ細菌のうちの１つが、Ｍ１、Ｍ３、Ｍ６、Ｍ１１、Ｍ１２、およびＭ２３からなる群から選択されるＭ型である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記第１および第２のＧＡＳ抗原のうちの１つが、少なくとも１０の異なるＧＡＳ株の表面上に発現する、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１つのＧＡＳ抗原が、
【化９】
2008544949.tif 000313
からなる群から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記第１および第２のＧＡＳ抗原のうちの少なくとも１つが、少なくとも７つの異なるＭ型細菌の表面上に発現する、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
前記少なくとも１つのＧＡＳ抗原が、
【化１０】
2008544949.tif 000314
からなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記第１および第２のＧＡＳ抗原のうちの少なくとも１つが、Ｍ１型ＧＡＳ細菌の表面上に発現する、請求項２に記載の組成物。
【請求項９】
前記少なくとも１つのＧＡＳ抗原が、
【化１１】
2008544949.tif 000315
からなる群から選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記第１および第２のＧＡＳ抗原のうちの少なくとも１つが、Ｍ３型ＧＡＳ細菌の表面上に発現する、請求項２に記載の組成物。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのＧＡＳ抗原が、
【化１２】
2008544949.tif 000316
からなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記第１および第２のＧＡＳ抗原のうちの少なくとも１つが、Ｍ６型ＧＡＳ細菌の表面上に発現する、請求項２に記載の組成物。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのＧＡＳ抗原が、
【化１３】
2008544949.tif 000317
からなる群から選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記第１および第２のＧＡＳ抗原のうちの少なくとも１つが、Ｍ１１型ＧＡＳ細菌の表面上に発現する、請求項２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのＧＡＳ抗原が、
【化１４】
2008544949.tif 000318
からなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記第１および第２のＧＡＳ抗原のうちの少なくとも１つが、Ｍ１２型ＧＡＳ細菌の表面上に発現する、請求項２に記載の組成物。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのＧＡＳ抗原が、
【化１５】
2008544949.tif 000319
からなる群から選択される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記第１および第２のＧＡＳ抗原のうちの少なくとも１つが、Ｍ２３型ＧＡＳ細菌の表面上に発現する、請求項２に記載の組成物。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのＧＡＳ抗原が、
【化１６】
2008544949.tif 000320
からなる群から選択される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ＧＡＳ抗原が、前記ＧＡＳタンパク質の少なくとも１つの膜貫通ドメインを欠く、請求項１〜請求項１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記第１のＧＡＳタンパク質が、前記第１のＧＡＳタンパク質の膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインを含まない、請求項１〜請求項２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
（１）表２に列挙したＧＡＳタンパク質、
（２）表３に列挙したＧＡＳタンパク質、
（３）表４Ａ〜４Ｒからなる群から選択される表に列挙したＧＡＳタンパク質、
（４）表５に列挙したＧＡＳタンパク質、
（５）表６に列挙したＧＡＳタンパク質、
（６）表７に列挙したＧＡＳタンパク質、
（７）表８に列挙したＧＡＳタンパク質、
（８）表９に列挙したＧＡＳタンパク質、
（９）表１１に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１０）表１２に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１１）表１３に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１２）表１４に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１３）表１５に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１４）表１６に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１５）
【化１７】
2008544949.tif 000321
（１６）
【化１８】
2008544949.tif 000322
（１７）
【化１９】
2008544949.tif 000323
（１８）
【化２０】
2008544949.tif 000324
（１９）
【化２１】
2008544949.tif 000325
（２０）
【化２２】
2008544949.tif 000326
（２１）
【化２３】
2008544949.tif 000327
および
（２２）
【化２４】
2008544949.tif 000328
、Ｍタンパク質、ＳａｇＡ、Ｓｆｂ１、およびＳｈｐ、
ｂ）ＧＡＳ抗原をコードする核酸分子、ならびに
ｃ）ＧＡＳ抗原に特異的に結合する抗体
からなる群から選択される第２の活性因子をさらに含む、請求項１〜請求項２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記少なくとも１つのＧＡＳ抗原が融合タンパク質成分である、請求項１〜請求項２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ＧＡＳタンパク質が、表１に示すアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜請求項２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ＧＡＳタンパク質が、表１に示すアミノ酸配列を含む、請求項１〜請求項２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
小児ワクチンで有用な抗原を含む、請求項１〜請求項２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
高齢または免疫不全状態の個体のためのワクチンで有用な抗原を含む、請求項１〜請求項２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
アジュバントをさらに含む、請求項１〜請求項２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ＧＡＳ抗原がポリペプチドであり、前記ポリペプチドがキャリアタンパク質にカップリングしている、請求項１〜請求項２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記キャリアタンパク質が、細菌毒素、細菌類毒素、髄膜炎菌外膜タンパク質、熱ショックタンパク質、百日咳タンパク質、インフルエンザ菌タンパク質Ｄ、サイトカイン、リンホカイン、ホルモン、成長因子、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂ、および鉄取り込みタンパク質からなる群から選択される、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
化膿性レンサ球菌に対する免疫の誘導のためのワクチンの作製方法であって、
請求項１〜請求項３０のいずれか１項に記載の活性因子と薬学的に許容可能なキャリアとを組み合わせる工程
を含む、方法。
【請求項３２】
前記活性因子がポリペプチドであり、前記ポリペプチドが、
（ａ）前記ポリペプチドをコードする発現ベクターを含む宿主細胞を培養する工程と、
（ｂ）前記ポリペプチドを回収する工程と
を含む方法によって作製される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
化膿性レンサ球菌感染に対する免疫を誘導するための薬物の製造における少なくとも２つの表面露出化膿性レンサ球菌（ＧＡＳ）抗原の使用であって、第１のＧＡＳ抗原が第１のＧＡＳ細菌の表面上に発現し、第２のＧＡＳ抗原が第２のＧＡＳ細菌の表面上に発現し、前記第１および第２のＧＡＳ細菌が異なるＭ型である、使用。
【請求項３４】
化膿性レンサ球菌感染に対する免疫を誘導するための薬物の製造における少なくとも２つの表面露出化膿性レンサ球菌（ＧＡＳ）抗原をコードする少なくとも１つの核酸分子の使用であって、第１のＧＡＳ抗原が第１のＧＡＳ細菌の表面上に発現し、第２のＧＡＳ抗原が第２のＧＡＳ細菌の表面上に発現し、前記第１および第２のＧＡＳ細菌が異なるＭ型である、使用。
【請求項３５】
化膿性レンサ球菌感染の治療のための薬物の製造における少なくとも２つの抗体の使用であって、第１の抗体が第１のＧＡＳ細菌の表面上に発現した第１の化膿性レンサ球菌（ＧＡＳ）抗原に特異的に結合し、第２の抗体が第２のＧＡＳ細菌の表面上に発現した第２のＧＡＳ抗原に特異的に結合し、前記第１および第２のＧＡＳ細菌が異なるＭ型である、使用。
【請求項３６】
化膿性レンサ球菌感染の治療のための薬物の製造における抗体の使用であって、前記抗体が第１のＧＡＳタンパク質よりも少なくとも１アミノ酸短く、前記第１のＧＡＳタンパク質の表面露出ドメインを含む表面露出ＧＡＳ抗原に特異的に結合し、前記第１のＧＡＳタンパク質がＧＡＳタンパク質からなる群から選択され、前記第１のＧＡＳタンパク質が、
（１）表２に列挙したＧＡＳタンパク質、
（２）表３に列挙したＧＡＳタンパク質、
（３）表４Ａ〜４Ｒからなる群から選択される表に列挙したＧＡＳタンパク質、
（４）表５に列挙したＧＡＳタンパク質、
（５）表６に列挙したＧＡＳタンパク質、
（６）表７に列挙したＧＡＳタンパク質、
（７）表８に列挙したＧＡＳタンパク質、
（８）表９に列挙したＧＡＳタンパク質、
（９）表１１に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１０）表１２に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１１）表１３に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１２）表１４に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１３）表１５に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１４）表１６に列挙したＧＡＳタンパク質、
（１５）
【化２５】
2008544949.tif 000329
（１６）
【化２６】
2008544949.tif 000330
（１７）
【化２７】
2008544949.tif 000331
（１８）
【化２８】
2008544949.tif 000332
（１９）
【化２９】
2008544949.tif 000333
（２０）
【化３０】
2008544949.tif 000334
（２１）
【化３１】
2008544949.tif 000335
および
（２２）
【化３２】
2008544949.tif 000336
、Ｍタンパク質、ＳａｇＡ、Ｓｆｂ１、およびＳｈｐ、ならびに
（ｘ）表１に列挙したＧＡＳ抗原
からなる群から選択される、使用。
【請求項３７】
化膿性レンサ球菌に対する免疫を誘導するための、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組成物であって、前記活性因子がポリペプチドまたは核酸分子である、組成物。
【請求項３８】
化膿性レンサ球菌感染を治療するための、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組成物であって、前記活性因子が抗体である、組成物。
【請求項３９】
キットであって、
請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組成物を含む容器と、
化膿性レンサ球菌に対する免疫を誘導する方法の説明書と
を含み、該方法は、
個体に治療有効量の請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組成物のいずれかを投与する工程
を包含し、ここで前記活性因子がポリペプチドまたは核酸分子である、
キット。
【請求項４０】
キットであって、
請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組成物を含む容器と、
化膿性レンサ球菌感染の治療方法の説明書と
を含み、該方法は、
個体に治療有効量の請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組成物のいずれかを投与する工程
を包含し、ここで前記活性因子が抗体である、
キット。
【国際調査報告】
2008544949.tif 000337
2008544949.tif 000338
2008544949.tif 000339
2008544949.tif 000340
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2008544949.tif 000342
2008544949.tif 000343
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