(57)【要約】  免疫組織化学（ＩＨＣ）的、インサイチューのハイブリッド形成法（ＩＳＨ）又はその他の特別染色法又は組織化学的もしくは細胞化学的操作の前に、バッチ法又は自動化装置を使用して、液体組成物により、包埋媒質の融点より低い温度で、生体サンプルから包埋媒質を緩徐に除去するための方法及び装置。
2008527330.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）自動化組織染色装置中に複数のパラフィン包埋生体サンプルを装填し、
（ｂ）１０〜１６個の炭素原子を有するパラフィン可溶化液体アルカンを生体サンプルと直接接触させて配置し、
（ｃ）パラフィン基剤の包埋媒質の少なくとも一部が液体アルカン中に可溶性になるために十分な時間、パラフィン基剤の包埋媒質の融点より低い温度で液体アルカンを生体サンプルと接触させて維持し、そして
（ｄ）生体サンプルから可溶化パラフィン基剤包埋媒質を包含する液体アルカンを除去して、脱パラフィン処理生体物質を形成する（そこで生体サンプルの温度は段階（ｂ）及び（ｃ）の期間中、包埋媒質の融点以上にはならない）、
段階を含んでなる、パラフィン包埋生体サンプルからパラフィン基剤の包埋媒質を除去する方法。
【請求項２】
生体サンプルの温度が段階（ｂ）及び（ｃ）の期間中、本質的に室温に維持される請求項１の方法。
【請求項３】
１０〜１６個の炭素原子を有する線状アルカンがドデカン、ペンタデカン及びそれらの混合物からなる群から選択される請求項１の方法。
【請求項４】
鉱油が液体組成物に添加される請求項１の方法
【請求項５】
（ａ）支持体上にパラフィン基剤包埋媒質で包埋された少なくとも１種の生体サンプルを置き、その支持体を自動化脱パラフィン処理装置中に装填し、
（ｂ）非極性有機溶媒を含んでなる液体組成物に生体サンプルと接触するように指令し、（ｃ）パラフィン基剤包埋媒質の少なくとも一部が液体組成物中で可溶化になるのに十分な時間、液体組成物とパラフィン包埋生体サンプルとの接触を維持させ、そして
（ｄ）生体サンプルから可溶性包埋媒質を包含する液体組成物を除去して脱パラフィン処理された生体物質を形成する（ここで段階（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）は自動化脱パラフィン処理装置により実施され、そして生体サンプルの温度は段階（ｂ）及び（ｃ）の期間中、包埋媒質の融点以上にならない）、
段階を含んでなるパラフィン基剤の包埋媒質で包埋された生体サンプルを脱パラフィン処理する自動化された方法。
【請求項６】
段階（ｂ）及び（ｃ）の期間中、生体サンプルの温度が本質的に室温に維持される請求項５の方法。
【請求項７】
液体組成物が６〜１８個の炭素原子を有する非芳香族炭化水素である請求項５の方法。
【請求項８】
非芳香族炭化水素がアルカン又は線状アルカンである請求項７の方法。
【請求項９】
非芳香族炭化水素が１０〜１６個の炭素原子を有する線状アルカンである請求項７の方法。
【請求項１０】
非芳香族炭化水素がドデカン、ペンタデカン及びそれらの混合物からなる群から選択される請求項７の方法。
【請求項１１】
鉱油が液体組成物に添加される請求項５の方法。
【請求項１２】
脱パラフィン処理された生体物質が、インサイチューで標的ｍＲＮＡ配列と相補的であ
るポリヌクレオチドプローブと脱パラフィン処理した生体物質を接触させることにより更に操作される請求項１の方法。
【請求項１３】
（ａ）パラフィンの融点より低い温度の非極性有機溶媒とパラフィン包埋生体サンプルを接触させ、
（ｂ）非極性有機溶媒を穏やかに撹拌して非極性有機溶媒中のパラフィンの溶解度を高め、
（ｃ）脱パラフィン処理した生体サンプル中の非極性有機溶媒を水性溶媒と交換し、そして
（ｄ）検出可能なポリヌクレオチドプローブと脱パラフィン処理した生体サンプルを接触させる、
段階を含んでなるパラフィン包埋生体サンプル中のＲＮＡ／ＤＮＡを検出する方法。
【請求項１４】
生体サンプルの温度が段階（ａ）〜（ｂ）の期間中、包埋媒質の融点以上にはならない請求項１３の方法。
【請求項１５】
生体サンプルの温度が段階（ａ）〜（ｂ）の期間中、本質的に室温に維持される請求項１３の方法。
【請求項１６】
非極性有機溶媒がミネラルスピリットである請求項１３の方法。
【請求項１７】
非極性有機溶媒が１０〜１６個の炭素原子を有する線状アルカンである請求項１３の方法。
【請求項１８】
線状アルカンがドデカン、ペンタデカン及びそれらの混合物からなる群から選択される請求項１７の方法。
【請求項１９】
鉱油が段階（ａ）の前に非極性有機溶媒に添加される請求項１５の方法。
【請求項２０】
ポリヌクレオチドプローブが可視的に検出可能である請求項１５の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願との関係】
【０００１】
本出願は２００４年１２月３０日出願の米国特許仮出願第６０／６４０，４７７号に対し優先権を請求する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は包埋媒質の融点より低い温度で、生体サンプルから包埋媒質を緩徐に除去するために、液体化合物、そして好ましくはアルカンを使用する方法及び装置に関する。該方法は免疫組織化学的（ＩＨＣ）、インサイチューのハイブリッド形成（ＩＳＨ）あるいはその他の特別な染色又は組織化学的又は細胞化学的操作の前にバッチにより又は自動化装置を使用して実施することができる。本発明はまた、ｍＲＮＡのＩＳＨの検出を増加するような細胞又は組織の低温処理のための方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
疾病をもつ生体から採取される組織又は細胞サンプルの解釈に基づく疾病の診断は過去数年間にわたり劇的に拡大してきた。伝統的な組織学的染色法及び免疫組織化学的アッセイに加えて、インサイチューのハイブリッド形成及びインサイチューポリメラーゼ連鎖反応のようなインサイチューの方法が今日、ヒトにおける疾病状態診断を補助し、そして組織切片中の遺伝子発現サイトを解明するために使用される。従って、細胞形態学のみならずまた、細胞及び組織内の特定の分子（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質）の存在をも測定することができる種々の方法がある。これらの各方法は、サンプルの細胞又は組織がアルデヒド（ホルムアルデヒ、グルタルアルデヒドのような）、ホルマリン代用物、アルコール（エタノール、メタノール、イソプロパノールのような）のような化学薬品でサンプルを固定する工程又は、パラフィン、セロイジン、寒天、ポリマー、樹脂、低温媒質又は種々のプラスチックの包埋媒質（エポキシ樹脂及びアクリル樹脂のような）のような不活性物質中にサンプルを包埋する工程を包含することができる準備法を受けることを必要とする。その他のサンプル組織又は細胞の標本は冷凍（冷凍組織切片）又は細針による吸引（細針吸引（ＦＮＡ））のような物理的操作を必要とする。
【０００４】
組織又は細胞サンプルあるいはその準備又は保存方法にかかわらず、技術者の目標はデータの正確な解釈を可能にする、正確な、読み取り可能なそして再現可能な結果を得ることである。正確な、読み取り可能なそして再現可能なデータを提供する１つの方法は、使用される技術にかかわらず、試験結果を最適化する方法で、組織又は細胞を準備することである。免疫組織化学的（ＩＨＣ）及びインサイチューのハイブリッド形成（ＩＳＨ）法の場合には、これは特定の抗体及びプローブから得られるシグナルの量を増加することを意味する。組織化学的染色法の場合には、それは染色の強度を増加又は染色コントラスト増加を意味するかも知れない。
【０００５】
試験結果を改善する１つの方法は与えられたサンプルから得られるシグナルを増加することである。概括的に、増加したシグナルはその標的に対する与えられた分子の接近性を増加することにより得ることができる。細胞内の標的は細胞の透過性を増加し、細胞中へのより多数の分子の侵入を許し、そしてそれにより分子がその標的を「発見する」であろう確率を増加することにより、更に接近性にさせることができる。このような増加した透過性はＩＳＨ、ＩＨＣ、組織化学及び細胞化学のような方法に対し特に重要である。
【０００６】
組織及び細胞は将来の分析のためにそれらを保存する補助をするために、種々の不活性媒質（パラフィン、セロイジン、ＯＣＴＴＭ、寒天、プラスチック又はアクリル樹脂、等）中に包埋される。多数のこれらの不活性物質は疎水性である。それに対し、組織学的及び細胞学的適用に使用される試薬は主として親水性である。従って、試薬が、包埋された生体物質に接近するためには、試験前に不活性媒質を生体サンプルから除去することが必要かも知れない。スライドを、トルエン、キシレン、リモネン又はその他の適当な溶媒のような種々の有機溶媒中に通過させることにより、組織切片からパラフィンを除去することにより、次の試験のために、パラフィン包埋そして／又は注入（ｉｎｆｕｓｅｄ）組織切片を準備することが標準的な先行技術の方法である。これらの有機溶媒は非常に揮発性で、毒性の可能性があり、そして特別の処理（例えば、換気フード中で脱パラフィン処理を実施する）を必要とすること、及び特別の廃棄物投棄法を必要とすることを包含する、種々の問題を引き起こす可能性がある。これらの有機溶媒の使用は分析の経費及び試験される各組織サンプルと関連する露出の危険を増加し、そして、それらに露出される個体及び環境に重大な不都合な影響を有する。
【０００７】
生体サンプルから包埋そして／又は注入パラフィンを除去する代わりの方法は特許文献１に開示され、その明細は引用により本明細書に取り入れられている（特許文献１参照）。特許文献１は生体サンプルに液体パラフィン不混和性溶液−水のような−の適用前又は後にパラフィンの融点を超える温度にパラフィン包埋又は注入生体サンプルを加熱する工程を開示している（特許文献１参照）。包埋そして／又は注入パラフィンの融点を超える温度にサンプルを加熱する工程はパラフィンを液化させ、それが不混和性液体の上部に浮揚し、そこでそれが生体サンプルから容易に分離される。この方法は溶媒の脱パラフィン処理に比較して生体サンプルに対する破壊性が弱いが、注入又は包埋媒質の融点より高い温度に生体サンプルを加熱する工程はｍＲＮＡのような感受性標的から得られるシグナルに不都合に影響する可能性がある。
【０００８】
組織処理工程中の標的組織の脱水もまた、それらのエンハンスメント及び検出に不都合に影響する可能性がある。引用により本明細書にその明細が取り込まれている特許文献２は、湿った又は覆われた組織の上部にＬＩＱＵＩＤ  ＶＯＶＥＲＳＬＩＰＴＭ層−蒸発インヒビター液−を適用することにより組織の脱水を妨げる方法を開示している（特許文献２参照）。蒸発抑制−液体層は包埋媒質がサンプルから除去された後に水和組織サンプルに適用される。特許文献２に従うと蒸発抑制液は組織サンプルを覆う水分より濃度が濃くはなく、好ましくは、６〜１８個の炭素原子を有する非芳香族炭化水素である。その結果、蒸発抑制液体層がサンプルを覆う水性バッファーの上部に留まる間に、水性試薬をスライド上に配置された生体サンプルに適用することができる。染色液を含有する、より濃厚な１種又は複数の水溶液は蒸発抑制液体層を通過して、生体サンプルに接触する。この方法を使用して、組織サンプルを最少のサンプルの脱水を伴って又は全く脱水を伴わずにＩＳＨのような高温工程にさらすことができる。
【０００９】
自動化及びバッチ式生体サンプル処理におけるこれらの進歩にもかかわらず、自動化された方法でサンプル組織から不活性媒質を緩徐に除去するための処理法の必要がいまだ残る。
【特許文献１】米国特許第６，５４４，７９８号明細書
【特許文献２】米国特許第５，２２５，３２５号明細書
【発明の開示】
【００１０】
本発明の方法はａ）強力な有機溶媒の使用を伴わず、激しい洗浄を伴わず、そして包埋又は注入された生体サンプルを包埋又は注入媒質の融点を超える温度に加熱せずに生体サンプルからのパラフィン基剤の包埋媒質の自動化除去を許す。
【００１１】
本発明の方法は自動化ＩＳＨ装置の誤った操作の結果として発見された。正常の操作においては、液体の包埋媒質と不混和性液体を包埋媒質の融点を超える温度に加熱された生体サンプルに適用する。液化包埋媒質を加熱された不混和性液体の数回の連続的適用により生体サンプルから洗浄する。加熱された不混和性液体は生体サンプルに激しい影響をもつ傾向がある。発明者はｍＲＮＡ  ＩＳＨに使用された時に、例外的に好都合に実施され
た自動化ＩＳＨ装置を発見した。発明者は該装置が前記のように意図されたように作動していないことを見いだした。生体サンプルから液化包埋媒質を洗浄するために不混和性液体を使用する代わりに、装置は包埋生体サンプルに包埋媒質の融点より低い温度で非極性液を適用した。従ってサンプルは高温の不混和性液体の洗浄段階を伴わずに、処理された。従って、発明者は、包埋された生体サンプルがパラフィン基剤の包埋媒質の融点より低い温度において緩徐に脱パラフィン処理することができ、そして生成される脱パラフィン処理生体サンプルが驚くべきことには、その後の処理に対して損なわれず、そして細胞核が特にｍＲＮＡのＩＳＨに対して損なわれないことを発見した。
【００１２】
本発明の方法は先行技術の脱パラフィン処理法に比べて多数の改善点を提供する。本発明の方法は穏やかで、細胞を暴露し、細胞学的又は組織学的標本の透過性を増加し、それによりサンプルの読み易さを増加しそして試験データの解釈を改善するために、自動化システム中のガラスのスライド上に配置された生体サンプル上で室温で又は室温の近位で実施することができる。本発明の方法は細胞学的及び組織学的染色法と関連して使用される大部分の組織学的及び細胞学的サンプルの染色性及び読み易さを改善するために使用することができる。更に、本発明の方法はｍＲＮＡのＩＳＨ法における検出を強化するために特に有用である。
【００１３】
本発明の１つのアスペクトは（ａ）自動化組織染色装置中に複数のパラフィン包埋生体サンプルを装填し、（ｂ）１０〜１６個の炭素原子を有するパラフィン可溶化液体アルカンを生体サンプルと直接接触させて配置し、（ｃ）パラフィン基剤の包埋媒質の少なくとも一部が液体アルカン中に可溶性になるために十分な時間、パラフィン基剤の包埋媒質の融点より低い温度で、液体アルカンを生体サンプルと接触させて維持し、そして（ｄ）生体サンプルから可溶化パラフィン基剤包埋媒質を包含する液体アルカンを除去して脱パラフィン処理された生体物質を形成する（そこで生体サンプルの温度は段階（ｂ）及び（ｃ）の期間中、包埋媒質の融点以上にならない）、段階を含んでなる、パラフィン包埋生体サンプルからパラフィン基剤の包埋媒質を除去する方法である。
【００１４】
本発明の幾つかのアスペクトの１つの態様は、生体サンプルの温度が段階（ａ）＆（ｂ）の期間中、包埋媒質の融点以上には決してならないようにその温度を制御することである。
【００１５】
本発明の幾つかのアスペクトのもう１つの態様において、生体サンプルの温度が本質的に室温に維持される。
【００１６】
本発明の幾つかのアスペクトのもう１つの態様において、液体組成物は非芳香族の炭化水素である。１つの好ましい態様において、液体組成物は６〜１８個の炭素原子を有する非芳香族炭化水素である。もう１つの好ましい態様において、非芳香族炭化水素はアルカンであり、そしてより好ましくは、ドデカン又はペンタデカンのような１０〜１６個の炭素原子を有する線状アルカンである。
【００１７】
本発明の幾つかのアスペクトの更にもう１つの態様において、鉱油が液体組成物に添加される。
【００１８】
本発明の幾つかのアスペクトの更にもう１つの態様において、段階（ａ）及び（ｂ）は段階（ｃ）の後に少なくとも１回反復される。あるいは又は更に、脱パラフィン処理された生体物質を更に、免疫組織化学的（ＩＨＣ）方法、インサイチューのハイブリッド形成（ＩＳＨ）法、特別染色法、組織化学法、細胞化学法から選択される方法により操作するかあるいは脱パラフィン処理した生体物質をインサイチューで、標的ｍＲＮＡ配列に相補的であるポリヌクレオチドプローブと接触させることができる。
【００１９】
本発明のもう１つのアスペクトは、（ａ）支持体上にパラフィン基剤包埋媒質で包埋された少なくとも１種の生体サンプルを置き、そしてその支持体を自動化脱パラフィン処理装置中に装填し、（ｂ）非極性有機溶媒を含んでなる液体組成物に生体サンプルと接触するように指令し、（ｃ）パラフィン基剤包埋媒質の少なくとも一部が液体組成物中で可溶化になるのに十分な時間、液体組成物を、パラフィン包埋生体サンプルと接触させて維持し、そして（ｄ）生体サンプルから可溶性包埋媒質を包含する液体組成物を除去して脱パラフィン処理された生体物質を形成する（ここで段階（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を自動化脱パラフィン処理装填により実施し、そして生体サンプルの温度は段階（ｂ）及び（ｃ）の期間中、包埋媒質の融点以上にはならない）、段階を含んでなる、パラフィン基剤の包埋媒質で包埋された生体サンプルを脱パラフィン処理する方法である。
【００２０】
本発明の更にもう１つのアスペクトは（ａ）パラフィンの融点より低い温度でパラフィン溶解性の非極性有機溶媒とパラフィン包埋生体サンプルを接触させ、（ｂ）パラフィン可溶化非極性有機溶媒を穏やかに撹拌してパラフィンの溶解度を高め、（ｃ）パラフィン可溶化非極性有機溶媒を除去し、（ｄ）脱パラフィン処理した生体サンプル中の除去する非極性有機溶媒を水性溶媒と交換し、そして（ｅ）検出可能なポリヌクレオチドプローブと脱パラフィン処理した生体サンプルを接触させる、段階を含んでなるパラフィン包埋生体サンプル中のＲＮＡ／ＤＮＡを検出する方法である。
【００２１】
本特許又は出願ファイルはカラーで作成された少なくとも１枚の図面を含有する。１枚又は複数のカラー図面を伴う本特許又は特許出願刊行物のコピーは要請及び必要経費の支払い時に当局により提供されるであろう。
【００２２】
本発明は毒性の有機溶媒、著しい高温又は激しい洗浄法を使用せずに、生体サンプルを包埋している媒質を除去することにより、組織学的又は細胞学的試験法における更なる処理のために生体サンプルを脱パラフィン処理する方法に関する。
【００２３】
本発明の１つの態様は、生体サンプルが保存及び支持のために包埋された不活性物質を除去することによる生体サンプルの暴露に関する。本発明のこの態様において、生体サンプルをその後の組織処理段階に十分暴露するためにサンプルから十分なパラフィン基剤の包埋物質を除去するのに十分な時間、包埋物質の融点より低い温度で、パラフィン可溶化非極性有機溶媒を含んでなる液体組成物に生体サンプルを暴露することにより、パラフィン又はパラフィン基剤の包埋物質のような不活性包埋物質を、生体サンプルから除去する。
【００２４】
用語「包埋物質」は本明細書では生体物質に注入そして／又はそれを包埋するために使用される不活性なパラフィン基剤の物質を表わすことと規定される。本発明に有用な包埋物質は包埋物質の融点より低い温度で、以下に特定される液体組成物中に少なくとも一部は可溶性でなければならない。好ましい包埋物質はパラフィン基剤の包埋物質である。
【００２５】
用語「脱パラフィン処理」は本明細書では広義に、パラフィン基剤の包埋物質を注入そして／又はそれで包埋された包埋及び／又は注入された生体サンプルからのあらゆる種類の包埋物質の除去を表わすことと規定される。
【００２６】
用語「液体組成物」は本明細書では広義に、包埋物質がパラフィン基剤の包埋物質の融点より低い温度で少なくとも一部は可溶性である非極性有機溶媒を含んでなるあらゆる液体組成物を表わすことと規定される。
【００２７】
用語「非極性有機溶媒」は、２５℃の室温より十分に上、好ましくは１１０℃より上、
より好ましくは約１４０℃から約２５０℃の沸点を有し、本発明で使用される温度で（通常１５〜５０℃）液相にあり、そして包埋生体標本に使用されるパラフィンを溶解することができる、非極性炭化水素又は炭化水素の混合物（例えば石油蒸留物からのような）を表わす。非極性有機溶媒は例えば、脂肪酸及び高級グリコールのエステルを含有する長鎖線状及び分枝アルカン炭化水素の複雑な混合物であることができる。２５℃の溶媒中のパラフィンの溶解度は典型的には溶媒１リッター当り少なくとも０．１グラム、好ましくは溶媒１００ｍｌ当り０．１グラム、より好ましくは溶媒１０ｍｌ当り０．１グラムのパラフィン、そしてもっとも好ましくは溶液重量で溶媒の約５０％に等しいパラフィン量を溶解することができる。
【００２８】
非極性有機溶媒の限定はしない例は芳香族炭化水素、脂肪族炭化水素、テルペン、その他の油及び石油蒸留物を包含する。好ましい非極性有機溶媒はほとんど又は全く毒性効果をもたない。更に、好ましい溶媒は環境保護機関により有害廃棄物と分類されないものである。好ましいパラフィン可溶化溶媒は更に、可燃性を最少にする約６０℃を超える発火点を有する。好ましい溶媒は更に、毒性、発癌性及び腐食性をもたない。イソパラフィン炭化水素は一部は毒性、発癌性、腐食性及び可燃性のその不在のために好ましいパラフィン可溶化溶媒の１例である。好ましいイソパラフィンはおよそＣ１０〜Ｃ１５の範囲の炭素骨格長をもつ分枝脂肪族炭化水素又はそれらの混合物である。１つの好ましいイソパラフィン炭化水素混合物は約７４℃の発火点を有する。もう１つの好ましいパラフィン可溶化溶媒は１５０℃の沸点〜約２５０℃の蒸留範囲をもつＣ１０〜Ｃ５０の分枝又は線状炭化水素鎖の混合物であり、そしてｎ＝１０〜５０、そしてｍ＝０〜４である場合のＣｎＨ（２ｎ＋ｍ）の一般式を有する。更により好ましいものは、デカンからヘキサデカン（Ｃ１０〜Ｃ１６）のような中間鎖のアルカン族の油である。好ましい中間鎖のアルカンはペンタデカンのようなＣ１５アルカンである。
【００２９】
特に好ましい非極性有機溶媒はＮＯＲＰＡＲ（Ｒ）１５、ミネラルスピリット又はＶｅｎｔａｎａからのＬＩＱＵＩＤ  ＣＯＶＥＲＳＬＩＰＴＭを包含する。ＮＯＲＰＡＲ（Ｒ）１５は低い揮発性及び高い沸点をもつ、名目上線状Ｃ１５を含んでなる高濃度の（＞９５％）通常のパラフィン炭化水素流体（ＥｘｘｏｎＭｏｂｉｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）である。短鎖の線状及び分枝脂肪族炭化水素を含んでなるミネラルスピリットはもう１つの好ましいパラフィン可溶化有機溶媒である。好ましいテルペンはリモネンである。使用することができるその他のテルペンはテルピン、テルピネン及びテルピネオールを包含する。それほど好ましくはないが、溶媒はアルキルベンゼン、例えばトルエン又はジアルキルベンゼン、例えばキシレンのような芳香族炭化水素溶媒である。トルエン及びキシレンはそれらの毒性及び有害廃棄物としての分類のためにあまり好ましくない。更に、以下に考察されるように、キシレン又はトルエンは本発明の態様に使用される時ですら、その後のアルコール洗浄物は排除され、非有害水性洗浄液と置き換えられる。
【００３０】
本発明の液体組成物は脱パラフィン処理が起る温度に応じて、単独で又は鉱油と組み合わせて使用することができる。用語「鉱油」は本明細書では石油から得られる炭化水素の液体混合物を表わすためにその通常の意味に従って使用される。好ましい態様において、発明者はＮＯＲＰＡＲ（Ｒ）１５が生体サンプルからパラフィン基剤の包埋媒質を除去する際に低温で単独で十分有効であることを発見した。彼らはまた、生体サンプルから包埋媒質を除去する際に、室温より上であるが包埋物質の融点より低い温度が使用されると、鉱油及びＮＯＲＰＡＲ（Ｒ）１５の組み合わせ物が、生体サンプルからパラフィン基剤の包埋媒質を除去するのに有効であることを発見した。ＮＯＲＰＡＲ（Ｒ）１５は１：１００〜１００：１の容量比、好ましくは約１：１の比率で本発明の液体組成物と組み合わせることができる。
【００３１】
本発明の方法はほぼ室温（１５〜３０℃）から包埋媒質の融点より僅かに低い温度まで
の範囲の様々な温度で実施することができる。液体組成物は生体サンプルを更なる処理及び強化に暴露するために十分なパラフィン基剤包埋媒質を除去するのに十分な時間、生体サンプルを含有する包埋媒質と接触させられる。概括的に液体組成物は約１分から約３０分間以上、そして好ましくは約５〜１５分間の範囲の期間、包埋媒質と接触するであろう。  
【００３２】
包埋物質は本発明の方法がもっとも有効であるためには室温で液体組成物中に少なくとも僅かに可溶性である。従って、前記に開示された好ましい液体アルカンは生体サンプルからパラフィン基剤の包埋物質を除去するのに特に有用である。一旦所望量の包埋物質が液体組成物に可溶化にされた後に、生体サンプルを洗浄して液体組成物／包埋物質の溶液を除去し、その後、生体サンプルは次の抗原回収又は標的検出及び染色工程のために利用可能である。
【００３３】
本発明の脱パラフィン処理法の１つのアスペクトにおいて、液体組成物がその後の方法に生体サンプルを暴露するために生体サンプルに１回適用される。代わりの態様において、液体組成物が生体サンプルに数回適用され、そして例えば、生体サンプルから包埋物質を更に有効に除去するために液体組成物の各適用後に洗浄段階を実施することができる。いずれの態様においても、生体物質はまた、生体物質から除去される包埋物質の量を最大にするために種々の温度に暴露することができる。例えば、生体サンプルが液体組成物と接触されるたびに生体サンプルの温度を高めることができる。あるいはまた、生体サンプルの温度をその後の液体組成物との接触段階において低下させることができる。生体サンプルからの包埋媒質の除去を改善する生体サンプルのその他の操作を本発明の方法に利用することができる。例えば、液体組成物中の包埋物質の溶解度を高めるために、液体組成物を生体サンプルと接触する時に撹拌する、又は増加した又は減少した圧力を使用することができる。  
【００３４】
本発明の方法はバッチ法又は連続的方法で徒手であるいは自動化プラットホーム上で実施することができる。更に、該方法はガラススライド、キュベット、ミクロアレープレート等のような様々な容器上又はそれらの中に配置された生体サンプルにつき実施することができる。本発明の好ましい方法において、ガラスの顕微鏡スライド上に配置されたパラフィン包埋生体サンプルは、その明細がそれぞれ引用により本明細書に取り入れられている米国特許第６，０５４，７５９号、第５，５９５，７０７号、第６，４０５，６０９号及び第６，２９６，８０９明細書中に記載された装置のような自動化染色装置並びにＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｔｕｓｃｏｎ  ＡＺ）により製造されたＢｅｎｃｈＭａｒｋ（Ｒ）、ＮｅｘＥＳ（Ｒ）、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｒ）及びＥＯＳ装置のような装置中で処理される。
【００３５】
本発明の方法において前記のような液体組成物が生体サンプルに適用され、生体サンプルから包埋物質を除去するのに十分な時間、液体組成物を生体サンプルと接触させ、それによりその後の処理のために生体サンプルを暴露する。特別の態様において、液体組成物はサンプルから包埋物質の実質的にすべてを除去するのに十分な時間、生体サンプルと接触される。
【００３６】
本発明の方法を自動化するために有用な装置の１例は、全体に同様な部品が同様な参照番号により表わされている図１〜４を参照して考察される。図１には、ＮｅｘＥＳ（Ｒ）特別染色装置として市場でも知られている、概括的に参照番号１０で表わされる分子病理学装置の透視図が示される。装置１０は自動的に染色するかあるいは、「特別」染色剤として知られる化学薬品及び／又は特定の時間及び設定温度に対して所望の順序でそれらと関連する他の試薬で、顕微鏡スライド上に設置された組織を処理するようになっている。次にそのように染色又は処理された組織切片を患者の診断、予後又は処置の目的のために
顕微鏡下で観察あるいは例えば、遺伝子発現と組織形態間の相関を決定することができる。
【００３７】
１つの態様において、装置１０は更にホストコンピューター１４、好ましくはパーソナルコンピューター、モニター１６、キーボード１８、マウス２０、バルク流体容器２２、廃棄物容器２３及び関連装置を含んでなる、システム１２（図２）の染色モジュールとして働く。更なる染色モジュール又は他の装置をシステム１２に付け加えてサーバーとして働くコンピューター１４とネットワークを形成することができる。あるいはまた、これらの別々の構成部品の幾つか又はすべてを装置１０に取り入れて、独立した装置にすることができるであろう。
【００３８】
システム１２のみならずまた、装置１０の好ましい形態は概括的に、引用によりその明細が本明細書に取り込まれている米国特許第６，０４５，７５９号明細書並びにその内容が引用により本明細書に取り込まれている、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｔｕｓｃｏｎ，Ａｒｉｚ）から入手できるＶｅｎｔａｎａ  ＮｅｘＥＳ（Ｒ）の使用者ガイドに記載されている。端的には、装置１０は、標準的ガラスの顕微鏡スライド上に固定された組織に化学的及び生物学的試薬を自動的に適用するマイクロプロセッサー制御染色モジュールである。カルーセル支持の放射状に配置されたガラススライドはステッピング・モーターにより回転されて、各スライドを一連の試薬分配装置の１つの下に配置する。装置１０は分配、洗浄、混合及び加熱を制御して、反応力学を最適化する。コンピューター制御自動化は現場を離れて、すなわちほとんど徒手作業を必要とせずに装置１０の使用を許す。
【００３９】
図３において更に具体的に、装置１０は上部の区域３２に移動可能に固定又はヒンジで取り付けられた下方区域３０から形成されたハウジングを含んでなる。スライドカルーセル３４は軸Ａ−Ａの回りを回転するために下方区域３０内に設置されている。複数の熱プラットホーム５０をカルーセル３４の周囲に放射状に固定することができ、その上に組織サンプルを伴う標準的ガラススライドを配置することができる。カルーセル３４は好ましくはステンレス鋼から構成される。装置１０内にはまた、洗浄物分配ノズル３６、液体組成物分配ノズル３７、流体ナイフ３８、洗浄物容量調整ノズル３９、バーコード読み取り鏡４０及び空気渦ミキサー４２が収納され、それらの詳細は以下に考察される。
【００４０】
試薬カルーセル２８が上部区域３２の上に回転可能に設置されている。分配装置２６は試薬トレー２９（図４）に取り外し可能に設置され、それは順次カルーセル２８とかみ合うようになっている。試薬はそれらに限定はされないが、本発明の液体組成物、核酸プローブ又はプライマー、ポリメラーゼ、一次抗体及び二次抗体、消化酵素、予備定着剤、後定着剤、遮断剤、読みだし化学薬品及び対比染色剤を包含する、スライドに通常適用されるあらゆる化学的又は生物学的物質を包含することができる。試薬分配装置２６は好ましくは、コンピューターによる識別のためにバーコード標識２７される。各スライドに対し、１種の試薬が適用され、次に温度制御環境内で正確な期間、インキュベートされる。試薬の混合はスライドの端に沿って向けられる圧縮空気ジェット（空気渦ミキサー）４２により実施され、それにより試薬の回転を引き起こす。適当なインキュベート後に、ノズル３６を使用して試薬をスライドから洗い落とす。次に容量調整ノズル３９を使用して残りの洗浄バッファーの容量を調整する。
【００４１】
本発明の液体組成物はノズル３７によりスライドに適用することができる。スライドは非加熱（室温で維持）でもよく又はスライドを包埋物質の融点より低い温度に加熱することができる。包埋物質がパラフィンワックスである時は、その温度は約６０℃である。包埋物質を可溶化させるために、非極性有機溶媒を含んでなる液体組成物を一定時間、包埋生体物質と直接接触させる。一旦一定量の包埋物質が包埋生体物質サンプルから溶解され
た後、液体組成物を含有する可溶化されたパラフィン基剤の包埋物質を洗い落とすことができ、その後生体サンプル−今や本質的に脱パラフィン処理された−は次の処理段階に利用可能である。代わりの態様において、非極性有機溶媒を生体サンプルと接触したまま維持させることができ、そこでそれは生体サンプル及び生体サンプルに適用された試薬の脱水を妨げるカバー物質として働く。この態様において、エアーナイフ３８が好ましくは、液体組成物を含有するパラフィンを切断し、その後、所望の試薬を生体サンプルに適用することができ、その後、エアーナイフを終了し、そして液体組成物を含有する可溶化パラフィン基剤包埋物質が適用された試薬及び生体サンプルを覆う。脱パラフィン処理プロトコールが完了するまで、これらの段階はカルーセルが回転するたびに反復される。
【００４２】
ホストコンピューター１４に加えて、装置１０は好ましくは、ホストコンピューター１２からの情報がそれにダウンロードされるそれ自身のマイクロプロセッサー４４（図３）を包含する。とりわけコンピューターはマイクロプロセッサー４４に、実行プログラム中の段階の順序及びセンサーモニター及び「ランルール」と呼ばれる制御ロジック並びにプロトコールの温度パラメーター双方をダウンロードする。Ｄａｌｌａｓ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ，Ｄａｌｌａｓ  Ｔｅｘ．からのモデルＮｏ．ＤＳ２２５１Ｔ  １２８Ｋはこの機能を実施することができるマイクロプロセッサーの１例である。
実施例
【実施例１】
【００４３】
特別染色剤
種々の定常的に準備された臨床パラフィン組織ブロックを切片にし（５μｍ）、ガラススライド上に置いた。空気乾燥したスライドを：方法１）キシレンによる徒手脱パラフィン処理（対照群）又は方法２）Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｔｕｓｃｏｎ  ＡＺ）により製造されたＮｅｘＥＳ（Ｒ）  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｓｔａｉｎｓ  Ｓｙｓｔｅｍを使用してＮＯＲＰＡＲ（Ｒ）１５で４１℃で１２分間本発明の方法に従う脱パラフィン処理（試験群）を受けた。次に可溶化パラフィン包埋物質含有ＮＯＲＰＡＲ（Ｒ）１５をｔｒｉｓ−基剤洗浄バッファーを使用して組織サンプルから洗浄した。
【００４４】
包埋物質を方法１又は方法２により生体サンプルから除去後、生体サンプルを種々の自動化特別染色剤適用のために処理した。これらの方法は種々の特別染色剤で染色された種々の細胞上で実施した。実施された特別染色試験は下記の表１に報告されている。すべての事例において、包埋媒質を除去するために本発明の液体組成物と接触された細胞は染色することができた。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
図５Ａ〜５ＢはＡＦＢＩＩＩ１適用により染色されたヒトの肺細胞を示し、そこでパラフィン包埋細胞をキシレンで徒手で脱パラフィン処理したか（図５Ａ）又は本発明の方法に従う液体組成物で脱パラフィン処理した（図５Ｂ）。図５Ａ及び５Ｂの比較は本発明の脱パラフィン法がＡＦＢＩＩＩ１特別染色の結果に対し何の悪影響ももたないことを示す。これは本発明の方法が低温で生体サンプルの実質的に完全な脱パラフィン処理を提供することを示す。更に、表１の結果は、幾つかの事例においては、本発明の方法の脱パラフィン処理は、キシレンで脱パラフィン処理されたサンプルに比較して、特定の生体サンプルの染色性を実際に高めることを示す。図面は図５Ｂにおける細胞染色が図５Ａの染色より強力で濃く、本発明の方法がその後の処理及び染色段階のために細胞を暴露するための、キシレン脱パラフィン処理法より優れることを示す。
【実施例２】
【００４７】
ｍＲＮＡのインサイチューハイブリッド形成
ホルマリン固定され、パラフィン包埋されたマウス腎サンプルを切片にし（５μｍ）、ガラススライド上に置いた。空気乾燥したスライドを：方法１）キシレンによる徒手の脱パラフィン処理（対照群１）、方法２）水溶液による自動化加熱脱パラフィン処理（対照群２）又は方法３）Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｔｕｓｃｏｎ  ＡＺ）により製造されたＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｒ）自動化インサイチューハイブリッド形成装置上でＮＯＲＰＡＲ（Ｒ）１５で室温（３７℃）で１０分間脱パラフィン処理（試験群）を受けた。脱パラフィン処理後、標準的方法を使用してＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ  ＩＳＨのためにすべてのスライドを処理した。
【００４８】
前記の各方法により脱パラフィン処理したｍＲＮＡに対するＶＥＧＦ  ＩＳＨの結果を図６Ａ〜６Ｃに示した断面図に示し、そこで６Ａは方法１のキシレンで徒手で脱パラフィン処理した切片の結果であり、６Ｂは包埋パラフィンの融点を超える温度にパラフィン包埋組織を加熱し、その後方法２の、液化パラフィンがそれに不混和性である界面活性剤含有水溶液により細胞から液化パラフィンを除去することにより脱パラフィン処理した細胞の結果であり、そして６Ｃは本発明の方法を使用して脱パラフィン処理した切片の結果で
ある。図６Ｂ及び６Ｃ中のアステリスクは比較の目的のための物質の断面における同一部位を表わす。染色はＶＥＧＦのｍＲＮＡ標的のシグナルを示す。
【００４９】
図６Ａ、６Ｂ及び６Ｃの比較は、開示された方法を使用する低温の脱パラフィン処理は細胞核中のｍＲＮＡの可視的染色をもたらすことを示す。それに対し、脱パラフィン処理方法１及び２は細胞核中の可視的ｍＲＮＡを提供しなかった。これは開示された脱パラフィン処理法がｍＲＮＡ  ＩＳＨ検出のための細胞及び他の生体物質を暴露するための先行技術の方法より優れることを示す。
【実施例３】
【００５０】
免疫組織化学
定常的に準備された臨床組織サンプルを切片にし（５μｍ）ガラススライド上に置いた。空気乾燥したスライドを：方法１）キシレンによる徒手による脱パラフィン処理（対照群１）、方法２）自動化加熱脱パラフィン処理（対照群２）又は方法３）Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｔｕｓｃｏｎ  ＡＺ）により製造されたＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｒ）  自動化ＩＳＨ装置を使用して室温で（３７℃）１０分間ＮＯＲＰＡＲ  １５で脱パラフィン処理（試験群）を受けた。脱パラフィン処理後、すべてのスライドを生物学的マーカーＣＤ２０の存在に対してＩＳＨにより処理した。
【００５１】
本実施例のＣＤ２０の結果は図７Ａ〜７Ｃに報告され、そこで７Ａはキシレンにより徒手で脱パラフィン処理した組織切片に対するＣＤ２０の結果であり（方法１）、７Ｂは熱及び不混和性液体を使用して脱パラフィン処理した組織切片上のＣＤ２０検出の結果であり（方法２）そして図７Ｃは本発明の方法により脱パラフィン処理した組織サンプルに対するＣＤ２０検出の結果である（方法３）。これらの結果は本発明の方法がＣＤ２０  ＩＨＣ検出法におけるその後の処理のための細胞暴露における先行技術の脱パラフィン処理法に少なくとも同等であることを示す。より特別には、サンプル上でより暗い染色点として見える各サンプル中に検出されるＣＤ２０の量が各脱パラフィン処理サンプルに対して本質的に等しい。
【００５２】
本発明の方法に従って脱パラフィン処理し、そして（ｉ）ＧＦＡＰマーカーを検出するように処理したヒトの脳組織又は（ｉｉ）ＭＡマーカーを検出するように処理したヒトの腸組織についても同様な結果をみた。しかし脱パラフィン処理した脳組織は幾らかの未染色部分を包含した。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】スライドフードを明け、カルーセルのドアを外して示された本発明の自動化法に有用な装置の透視図である。
【図２】コンピューター及びそれによりコンピューターがオペレートする他の装置と関連して示される本発明の自動化法に有用な装置の透視図である。
【図３】本発明の自動化法に有用な装置の分解図である。
【図４】試薬分配装置を伴って示された本発明の自動化法に有用な装置の透視図である。
【図５Ａ−５Ｂ】切片がキシレンを使用し（図５Ａ）又は本発明の方法を使用して（図５Ｂ）脱パラフィン処理されるＡＦＢ  ＩＩＩ１特別染色により染色されたヒトの肺切片である。
【図６Ａ−６Ｃ】キシレンにより徒手で（図６Ａ）、米国特許第６，５４４，７９７号明細書に開示された先行技術の脱パラフィン処理法を使用して（図６Ｂ）及び本発明の脱パラフィン処理を使用して（図６Ｃ）脱パラフィン処理されたマウスの腎臓切片のＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ  ＩＳＨの結果である。
【図７Ａ−７Ｃ】切片がキシレンを使用して徒手で（図７Ａ）、米国特許第６，５４４，７９７号明細書に開示された脱パラフィン処理法を使用して（図７Ｂ）又は本発明の脱パラフィン処理法を使用して（図７Ｃ）脱パラフィン処理された、ＣＤ２０  ＩＨＣ検出法を使用して処理されたヒトの組織の切片である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７ｃ】
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【国際調査報告】
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