(57)【要約】本発明は、AAGIGILTV−HLA-A*0201複合体に対して、３μMより少ないか等しい親和性(KD)及び/又は１×10-3 S-1か若しくはそれより遅い解離速度(koff)を有するTCRを提供する。このようなTCRは、単独で又は治療剤との組合せで、前記複合体を提示するガン細胞を標的するに有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞レセプター(TCR)が、３μMより少ないか等しいAAGIGILTV−HLA-A*0201複合体に対するKD及び/又は１×10-3 Ｓ-1かそれより遅い解離速度(koff)を有することを特徴とするAAGIGILTV−HLA-A*0201への結合特性を有し且つ少なくとも１つのTCRα鎖可変ドメイン及び/又は少なくとも１つのTCRβ鎖可変ドメインを含有するTCR。
【請求項２】
TCRが１μMより少ないか等しいAAGIGILTV−HLA-A*0201複合体に対するKDを有することを特徴とする請求項１に記載のＴ細胞レセプター(TCR)。
【請求項３】
α鎖可変ドメイン及びTCRβ鎖可変ドメインの両方を含有する請求項１又は２に記載のTCR。
【請求項４】
αα又はββホモ二量体である請求項１又は２に記載のTCR。
【請求項５】
KD及び/又はkoffが表面プラズモン共鳴により測定される請求項１〜４のいずれか１項に記載のＴ細胞レセプター(TCR)。
【請求項６】
少なくとも１つの相補性決定領域中で天然型MEL TCRのα鎖可変領域(配列番号１)及び/又はβ鎖可変領域(配列番号２)に対して変異している請求項１〜５のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項７】
少なくとも１つの可変領域フレームワーク領域中で天然型MEL TCRのα鎖可変領域(配列番号１)及び/又はβ鎖可変領域(配列番号２)に対して変異している請求項１〜６のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項８】
配列番号１に示される番号付けを用いてα鎖可変領域アミノ酸28D、29R、30G、31S、49M、51I、53S、54N、72Y、94V、95A、96G、97K、98S及び99Tの１又はそれより多くが変異している請求項１〜７のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項９】
配列番号２に示される番号付けを用いてβ鎖可変領域アミノ酸45L、51S、52V、53G、54I、76I、100G、101T、102G、103E、104L及び105Fの１又はそれより多くが変異している請求項１〜８のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項１０】
配列番号１に示される番号付けを用いて28D→F、28D→Y、28D→S、28D→N、29R→Q、29R→L、29R→I、29R→F、30G→H、31S→A、49M→I、51I→T、53S→R、54N→E、72Y→H、94V→D、94V→P、94V→S、94V→L、94V→N、95A→G、95A→S、95A→E、96G→N、96G→P、96G→V、96G→M、96G→L、96G→R、97K→R、97K→Y、97K→V、97K→L、97K→H、97K→G、97K→I、97K→P、98S→L、98S→M、98S→R、99T→L又は99T→Rに対応する１又はそれより多いα鎖可変領域変異を含有する請求項１〜７のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項１１】
配列番号２に示される番号付けを用いて45L→P、51S→Y、51S→F、51S→W、52V→G、53G→P、54I→F、54I→Y、76I→V、100G→N、101T→M、101T→L、101T→V、102G→S、102G→N、102G→T、103E→G、104L→W、105F→S、105F→A、105F→Q、105F→D又は105F→Eに対応する１又はそれより多いβ鎖可変領域変異を含有する請求項１〜７のいずれか１項又は請求項１０に記載のTCR。
【請求項１２】
配列番号11〜２４又は47〜53のα鎖可変領域アミノ酸配列の１つを含有する請求項１〜７のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項１３】
配列番号54〜67のβ鎖可変領域アミノ酸配列の１つを含有する請求項１〜７のいずれか１項又は請求項１２に記載のTCR。
【請求項１４】
下記の表
【表１】
2008545426.tif 000007
に示されるα鎖及びβ鎖の可変領域対を含有する請求項３に記載のTCR。
【請求項１５】
配列番号11に示されるα鎖可変領域及び配列番号２に示されるβ鎖可変領域を含有する請求項３に記載のTCR。
【請求項１６】
配列番号47に示されるα鎖可変領域及び配列番号２に示されるβ鎖可変領域を含有する請求項３に記載のTCR。
【請求項１７】
配列番号48に示されるα鎖可変領域及び配列番号２に示されるβ鎖可変領域を含有する請求項３に記載のTCR。
【請求項１８】
配列番号53に示されるα鎖可変領域及び配列番号２に示されるβ鎖可変領域を含有する請求項３に記載のTCR。
【請求項１９】
配列番号11に示されるα鎖可変領域及び配列番号54に示されるβ鎖可変領域を含有する請求項３に記載のTCR。
【請求項２０】
配列番号11に示されるα鎖可変領域及び配列番号55に示されるβ鎖可変領域を含有する請求項３に記載のTCR。
【請求項２１】
配列番号11に示されるα鎖可変領域及び配列番号56に示されるβ鎖可変領域を含有する請求項３に記載のTCR。
【請求項２２】
配列番号11に示されるα鎖可変領域及び配列番号57に示されるβ鎖可変領域を含有する請求項３に記載のTCR。
【請求項２３】
配列番号11に示されるα鎖可変領域及び配列番号58に示されるβ鎖可変領域を含有する請求項３に記載のTCR。
【請求項２４】
配列番号11に示されるα鎖可変領域及び配列番号62に示されるβ鎖可変領域を含有する請求項３に記載のTCR。
【請求項２５】
配列番号11に示されるα鎖可変領域及び配列番号65に示されるβ鎖可変領域を含有する請求項３に記載のTCR。
【請求項２６】
配列番号11に示されるα鎖可変領域及び配列番号66に示されるβ鎖可変領域を含有する請求項３に記載のTCR。
【請求項２７】
配列番号25に示されるα鎖定常領域アミノ酸配列及び/又は配列番号26及び27に示されるβ鎖アミノ酸定常領域配列の一方を更に含有する請求項１〜２６のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項２８】
二量体Ｔ細胞レセプター(dTCR)又は単鎖Ｔ細胞レセプター(scTCR)である請求項１〜２７のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項２９】
TCRα鎖可変領域に相当するアミノ酸配列により構成される第１のセグメントと、
TCRβ鎖定常ドメイン細胞外配列に相当するアミノ酸配列のＮ末端に融合したTCRβ鎖可変領域配列に相当するアミノ酸配列により構成される第２のセグメントと、
第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に連結するリンカー配列と
を含有するscTCRである請求項５〜２８のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項３０】
TCRβ鎖可変領域に相当するアミノ酸配列により構成される第１のセグメントと、
TCRα鎖定常ドメイン細胞外配列に相当するアミノ酸配列のＮ末端に融合したTCRα鎖可変領域配列に相当するアミノ酸配列により構成される第２のセグメントと、
第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に連結するリンカー配列と
を含有するscTCRである請求項５〜２８のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項３１】
前記第１の鎖と前記第２の鎖との間にジスルフィド結合を更に含有し、該ジスルフィド結合が天然型αβＴ細胞レセプター中に等価物を有さないジスルフィド結合であり、前記リンカー配列の長さ及び該ジスルフィド結合の位置が、前記第１のセグメント及び前記第２のセグメントの可変ドメイン配列が天然型αβＴ細胞レセプター中と実質的に同様に相互に配向するような長さ及び位置である請求項２９又は３０に記載のTCR。
【請求項３２】
結合性部分において、前記リンカー配列が、前記第１のセグメントのＣ末端を前記第２のセグメントのＮ末端に連結する請求項２９〜３１のいずれか１項に記載のscTCR。
【請求項３３】
結合性部分において、前記リンカー配列が式-PGGG-(SGGGG)5-P-(配列番号41)又は-PGGG-(SGGGG)6-P-(配列番号42)(式中、Pはプロリンであり、Gはグリシンであり、Sはセリンである)を有する請求項２９〜３２のいずれか１項に記載のscTCR。
【請求項３４】
TCRα鎖可変領域配列に相当する配列がTCRα鎖定常ドメイン細胞外配列に相当する配列のＮ末端に融合した第１のポリペプチドと、
TCRβ鎖可変領域配列に相当する配列がTCRβ鎖定常ドメイン細胞外配列に相当する配列のＮ末端に融合した第２のポリペプチドと
を含有し、該第１のポリペプチド及び該第２のポリペプチドが、天然型αβＴ細胞レセプター中に等価物を有さないジスルフィド結合により連結しているdTCRである請求項１〜３及び５〜２８のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項３５】
前記ジスルフィド結合が前記定常ドメイン配列のアミノ酸残基同士を連結し、該ジスルフィド結合が天然型TCR中に等価物を有さない請求項３４に記載のTCR。
【請求項３６】
前記ジスルフィド結合が、天然型TCRにおいてβ炭素原子が0.6nm未満離れているアミノ酸残基に相当するシステイン残基同士の間にある請求項３５に記載のTCR。
【請求項３７】
前記ジスルフィド結合が、TRAC*01のエキソン１のThr 48及びTRBC1*01若しくはTRBC2*01のエキソン１のSer 57、又はこれらの非ヒト等価物から置換されたシステイン残基同士間にある請求項３５に記載のTCR。
【請求項３８】
TCRα鎖可変領域配列に相当する配列がTCRα鎖定常ドメイン細胞外配列に相当する配列のＮ末端に融合した第１のポリペプチドと、
TCRβ鎖可変領域配列に相当する配列がTCRβ鎖定常ドメイン細胞外配列に相当する配列のＮ末端に融合した第２のポリペプチドと
を含有し、該第１のポリペプチド及び該第２のポリペプチドが、TRAC*01のエキソン１のThr 48及びTRBC1*01若しくはTRBC2*01のエキソン１のSer 57又はこれらの非ヒト等価物から置換されたシステイン残基同士間の、天然型αβＴ細胞中に等価物を有さないジスルフィド結合により連結しているdTCRである請求項１〜３及び５〜２８のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項３９】
前記dTCR又はscTCRの結合性部分が、天然型TCR中でジスルフィド結合により連結される残基に相当する残基同士間のジスルフィド結合を含む請求項１４〜３８のいずれか１項に
記載のTCR。
【請求項４０】
前記dTCR又はscTCRの結合性部分が、天然型TCRの膜貫通配列に相当する配列も細胞質配列に相当する配列も含まない請求項１４〜３９のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項４１】
配列番号29のα鎖アミノ酸配列及び配列番号10のβ鎖アミノ酸配列を含有する可溶性TCR。
【請求項４２】
配列番号68のα鎖アミノ酸配列及び配列番号10のβ鎖アミノ酸配列を含有する可溶性TCR。
【請求項４３】
配列番号69のα鎖アミノ酸配列及び配列番号10のβ鎖アミノ酸配列を含有する可溶性TCR。
【請求項４４】
配列番号70のα鎖アミノ酸配列及び配列番号10のβ鎖アミノ酸配列を含有する可溶性TCR。
【請求項４５】
配列番号29のα鎖アミノ酸配列及び配列番号71のβ鎖アミノ酸配列を含有する可溶性TCR。
【請求項４６】
配列番号29のα鎖アミノ酸配列及び配列番号72のβ鎖アミノ酸配列を含有する可溶性TCR。
【請求項４７】
配列番号29のα鎖アミノ酸配列及び配列番号73のβ鎖アミノ酸配列を含有する可溶性TCR。
【請求項４８】
配列番号29のα鎖アミノ酸配列及び配列番号74のβ鎖アミノ酸配列を含有する可溶性TCR。
【請求項４９】
配列番号29のα鎖アミノ酸配列及び配列番号75のβ鎖アミノ酸配列を含有する可溶性TCR。
【請求項５０】
配列番号29のα鎖アミノ酸配列及び配列番号76のβ鎖アミノ酸配列を含有する可溶性TCR。
【請求項５１】
配列番号29のα鎖アミノ酸配列及び配列番号77のβ鎖アミノ酸配列を含有する可溶性TCR。
【請求項５２】
配列番号29のα鎖アミノ酸配列及び配列番号78のβ鎖アミノ酸配列を含有する可溶性TCR。
【請求項５３】
少なくとも１つのポリアルキレングリコール鎖と組み合わされている請求項１〜５２のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項５４】
前記ポリアルキレングリコール鎖が共有的に連結している請求項５３に記載のTCR。
【請求項５５】
前記ポリアルキレングリコール鎖が少なくとも２つのポリエチレングリコール反復単位を含有する請求項５３又は５４に記載のTCR。
【請求項５６】
α鎖又はβ鎖のＣ末端又はＮ末端に反応性システインを更に含有する請求項１〜５５の
いずれか１項に記載のTCR。
【請求項５７】
治療剤又は検出可能部分と組み合わされている請求項１〜５６のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項５８】
前記治療剤又は検出可能部分と共有的に連結している請求項５７に記載のTCR。
【請求項５９】
前記治療剤又は検出可能部分が、一方又は両方のTCR鎖のＣ末端に共有的に連結している請求項５７に記載のTCR。
【請求項６０】
免疫エフェクター分子である治療剤と組み合わされている請求項５７〜５９のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項６１】
前記免疫エフェクター分子がサイトカインである請求項６０に記載のTCR。
【請求項６２】
前記免疫エフェクター分子がIL-2又はその機能的変形体若しくはフラグメントである請求項６０に記載のTCR。
【請求項６３】
前記治療剤が細胞毒性剤である請求項５７〜５９のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項６４】
前記治療剤が放射性核種である請求項５７〜５９のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項６５】
請求項１〜６４のいずれかに記載の少なくとも２つのTCRを含有する多価TCR複合体。
【請求項６６】
非ペプチド性ポリマー鎖又はペプチド性リンカー配列により連結した請求項１〜６４のいずれかに記載の少なくとも２つのTCRを含有する多価TCR複合体。
【請求項６７】
前記ポリマー鎖又はペプチド性リンカー配列が、各TCRの可変領域配列中に位置しないアミノ酸残基同士間に伸びている請求項６５に記載のTCR複合体。
【請求項６８】
前記TCRが、ポリアルキレングリコール鎖又はヒト多量体化ドメイン由来のペプチド性リンカーにより連結されている請求項６６又は６７に記載のTCR複合体。
【請求項６９】
二価アルキレンスペーサ基が、前記ポリアルキレングリコール鎖と前記複合体のTCRへのその結合点との間に位置する請求項６８に記載のTCR複合体。
【請求項７０】
前記ポリアルキレングリコール鎖が、少なくとも２つのポリエチレングリコール反復単位を含有する請求項６８又は６９に記載のTCR複合体。
【請求項７１】
請求項１〜５６のいずれかに記載の少なくとも２つのTCRを含有し、(ｉ)該TCRの少なくとも１つが請求項５７〜６４のいずれか１項に記載のとおり治療剤と組み合わされている多価TCR複合体。
【請求項７２】
請求項１〜５２のいずれか１項に記載のTCRを提示する単離細胞。
【請求項７３】
ヒトＴ細胞又はヒト造血幹細胞である請求項７２に記載の単離細胞。
【請求項７４】
請求項１〜５２のいずれか１項に記載のTCRをコードする核酸。
【請求項７５】
細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞又は昆虫細胞における発現に適合された請求項７４
に記載の核酸。
【請求項７６】
ヒトＴ細胞又はヒト造血幹細胞における発現に適合された請求項７４に記載の核酸。
【請求項７７】
配列番号33、35又は37の完全長TCRα鎖DNA配列の１つ及び配列番号39のTCRβ鎖DNA配列、又はこれらのDNA配列に相補的な核酸若しくは対応するRNA配列からなる請求項７６に記載の核酸。
【請求項７８】
請求項１〜７１のいずれか１項に記載のTCR若しくは多価TCR複合体、又は請求項７２若しくは７３に記載の複数の細胞、又は請求項７４〜７７のいずれか１項に記載の核酸を、医薬的に許容されるキャリアと共に含有する医薬組成物。
【請求項７９】
ガンに罹患している対象に、請求項１〜７１のいずれか１項に記載のTCR若しくは多価TCR複合体、又は請求項７２若しくは７３に記載の複数の細胞、又は請求項７４〜７７のいずれか１項に記載の核酸の有効量を投与することを含んでなるガンの治療方法。
【請求項８０】
ガンの治療用組成物の製造における、請求項１〜７１のいずれか１項に記載のTCR若しくは多価TCR複合体、又は請求項７２若しくは７３に記載の複数の細胞、又は請求項７４〜７７のいずれか１項に記載の核酸の使用。
【請求項８１】
(ａ)MEL TCRのα鎖可変ドメイン及びβ鎖可変ドメインを含有し、該α鎖可変ドメイン及びβ鎖可変ドメインの一方又は両方が変異を含有するTCRの多様性ライブラリを作製し；
(ｂ)該TCRの多様性ライブラリをAAGIGILTV−HLA-A*0201と、該TCRのAAGIGILTV−HLA-A*0201への結合を可能にするに適切な条件下で接触させ、
(ｃ)相互作用のKD測定する
ことを含んでなる、
(ｉ)少なくとも１つのTCRα鎖可変ドメイン及び/又は少なくとも１つのTCRβ鎖可変ドメインを含有し、(ii)３μMより少ないAAGIGILTV−HLA-A*0201複合体に対するKDを有することを特徴とするAAGIGILTV−HLA-A*0201への結合特性を有する高親和性TCRを同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３μMより少ないか若しくはこれと等しいAAGIGILTV−HLA-A*0201複合体に対するKD及び/又は１×10-3 S-1か若しくはそれより遅い解離速度(off-rate)(koff)を有することを特徴とする、少なくとも１つのTCRα鎖可変ドメイン及び/又は少なくとも１つのTCRβ鎖可変ドメインを含有する、AAGIGILTV−HLA-A*0201への結合特性を有するＴ細胞レセプター(TCR)に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
AAGIGILTVペプチドは、新鮮なメラノーマサンプルの大多数及び約60％のメラノーマ細胞株、並びに正常メラノサイトにより発現されるメラン-Ａ(Melan-A)(Mart-1)タンパク質に由来する(Coulieら(1994) J. Exp. Med. 180:(1)1-4、及びKawakamiら(1994) PNAS USA
91:3515)。これらガン性細胞のクラスＩ HLA分子は、このタンパク質からのペプチド(AAGIGILTV(配列番号43)(メラン-Ａ27-35)を含む)を提示する。AAGIGILTV−HLA-A*0201複合体は、メラノーマ特異的Ｔ細胞の免疫優性標的(immuno-dominant target)であるようである(Kawakamiら(1994) PNAS USA 91:3515、及びRivoltiniら(1995) J. Immunol 154:2257)。したがって、このペプチド−HLA複合体は、例えばガン細胞に細胞毒性剤又は免疫刺激剤を送達する目的で、TCRが標的することができるガンマーカーを提供する。しかし、この目的には、TCRが、該ペプチド-HLA複合体に対して、当該複合体に特異的な天然型TCRより高い親和性及び/又は遅い解離速度を有することが望まれる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の簡単な説明）
本発明は、AAGIGILTV−HLA-A*0201複合体に対し、３μMより少ないか若しくはこれと等しい相互作用の高親和性(KD)及び/又は１×10-3 S-1か若しくはそれより遅い解離速度(koff)を有するTCRを初めて利用可能にする。このTCRは、単独で又は治療剤との組合せで、前記複合体を提示するガン細胞を標的するに有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、TCRが３μMより少ないか等しいAAGIGILTV−HLA-A*0201複合体に対するKD及び/又は１×10-3 S-1かそれより遅い解離速度(koff)を有することを特徴とする、AAGIGILTV−HLA-A*0201への結合特性を有し且つ少なくとも１つのTCRα鎖可変ドメイン及び/又は少なくとも１つのTCRβ鎖可変ドメインを含有するＴ細胞レセプター(TCR)を提供する。
【０００５】
本発明の更なる実施形態では、このTCRは、１μMより少ないか又はこれと等しいAAGIGILTV−HLA-A*0201複合体に対するKDを有する。
KDの測定は、公知の方法のいずれによっても行うことができる。好ましい方法は、実施例４の表面プラズモン共鳴(Biacore)法である。
【０００６】
比較のために、天然型MEL TCRのジスルフィド連結した可溶性変形体(TCRα鎖については配列番号９を、TCRβ鎖については配列番号10を参照)とAAGIGILTV−HLA-A*0201複合体との相互作用は、実施例４のBiacoreに基づく方法により測定すると、約４μMのKDを有する。
【０００７】
AAGIGILTV−HLA-A*0201複合体に特異的な天然型MEL TCRは、以下のVα鎖遺伝子及びVβ
鎖遺伝子使用(usage)を有する(T cell receptor Factsbook(2001) LeFranc and LeFranc，Academic Press，ISBN 0-12-441352-8の命名法を使用；下記参照)：
α鎖  −  TRAV12-2
β鎖：−  TRBV 30
【０００８】
天然型MEL TCRは、本発明のTCRとAAGIGILTV−HLA-A*0201複合体との間の相互作用に対して高い親和性及び/又は遅い解離速度を付与する種々の変異をその中に導入することができる鋳型として使用することができる。したがって、本発明は、その少なくとも１つの相補性決定領域(CDR)及び/又は可変領域フレームワーク領域において、天然型MEL TCRのα鎖可変領域(図1a及び配列番号１を参照)及び/又はβ鎖可変領域(図1b及び配列番号２を参照)に関して変異したTCRを包含する。また、本発明のTCRの可変領域中の他の超可変領域、例えば超可変４(HV4)領域が、高親和性変異体を作製するように変異していてもよいと企図される。
【０００９】
天然型TCRはへテロ二量体αβ又はγδ形態で存在する。しかし、単一のTCRα鎖又はTCRβ鎖からなる組換えTCRが、ペプチドMHC分子に結合することが以前に示されている。
１つの実施形態において、本発明のTCRは、α鎖可変ドメイン及びTCRβ鎖可変ドメインを両方含有する。
【００１０】
当業者には自明であろうが、TCRα鎖配列及び/又はTCRβ鎖配列中の変異は、１又はそれより多い置換、欠失又は挿入であり得る。これら変異は、任意の適切な方法(ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づくもの、制限酵素ベースのクローニング、又はライゲーション非依存性クローニング(LIC)手法を包含するがこれらに限定されない)を使用して実行することができる。これら方法は、多くの標準的な分子生物学の教科書に詳述されている。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)変異誘発及び制限酵素ベースのクローニングに関する更なる詳細に関しては、Sambrook & Russell(2001) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (第３版) CSHL Pressを参照。LIC手順についての更なる情報は、Rashtchian(1995) Curr Opin Biotechnol 6(1):30-6に見出すことができる。ファージディスプレイは、TCR変形体のライブラリを作製し得る１つの手段を提供する。各々が非天然型ジスルフィド鎖間結合を含有するTCR変形体のライブラリのファージディスプレイ及びその後のスクリーニングに適切な方法は、Liら(2005) Nature Biotech 23(3):349-354及びWO 2004/04404に詳述されている。
【００１１】
MEL TCRのものに類似するVα遺伝子及びVβ遺伝子使用、したがって類似するアミノ酸配列を含有する任意のαβTCRにより、簡便な鋳型TCRを作ることができることに留意すべきである。次いで、鋳型αβTCRの可変領域の一方又は両方をコードするDNA中に、本発明の変異した高親和性TCRを作製するに必要な変更を導入することができる。当業者には自明であろうが、必要な変異は、多くの方法(例えば、部位特異的変異誘発)により導入し得る。
【００１２】
特に反する記載がない限り、本明細書中のTCRアミノ酸配列は、一般には、Ｎ末端メチオニン(Met又はＭ)残基を含有して提供される。当業者には公知であろうが、この残基は、組換えタンパク質の産生の間に除去され得る。これもまた当業者には自明であろうが、TCRのpMHC結合特性に実質的に影響することなく、Ｃ末端及び/又はＮ末端に提供される配列を１、２、３、４、５又はそれより多くの残基だけ短縮することもまた可能である。全てのそのような平凡な(trivial)変形体は、本発明に包含される。
【００１３】
本明細書中で使用する場合、用語「可変領域」は、所定のTCRの、TCRα鎖に関してはTRAC遺伝子により、TCRβ鎖に関してはTRBC1遺伝子又はTRBC2遺伝子のいずれかによりコードされる定常ドメイン内に含まれない全てのアミノ酸を包含すると理解される(T cell re
ceptor Factsbook(2001) LeFranc and LeFranc，Academic Press，ISBN 0-12-441352-8)。
【００１４】
本明細書で使用する場合、用語「可変ドメイン」は、所定のTCRの、TCRα鎖に関してはTRAV遺伝子により、TCRβ鎖に関してはTRBV遺伝子によりコードされるアミノ酸内に含まれる全てのアミノ酸を包含すると理解される(T cell receptor Factsbook(2001) LeFranc
and LeFranc，Academic Press，ISBN 0-12-441352-8)。
【００１５】
本発明の実施形態は、28D、29R、30G、31S、49M、51I、53S、54N、72Y、94V、95A、96G、97K、98S及び99Tに相当するα鎖可変領域アミノ酸のうちの１又はそれより多くの変異、例えば：
【００１６】
28D→F、28D→Y、28D→S、28D→N、
29R→Q、29R→L、29R→I、29R→F、
30G→H、
31S→A、
49M→I、
51I→T、
53S→R、
54N→E、
72Y→H、
94V→D、94V→P、94V→S、94V→L、94V→N、95A→G、
95A→S、95A→E、
96G→N、96G→P、96G→V、96G→M、96G→L、96G→R、
97K→R、97K→Y、97K→V、97K→L、97K→H、97K→G、97K→I、97K→P、
98S→L、98S→M、98S→R、
99T→L又は99T→R
に相当する変異を含有する変異TCRを包含する。
上記で使用した番号付けは、図1a及び配列番号１に示したものと同じである。
【００１７】
本発明の実施形態は、配列番号２に示した番号付けを使用して45L、51S、52V、53G、54I、76I、100G、101T、102G、103E、104L及び105Fに相当するβ鎖可変領域アミノ酸のうちの１又はそれより多くの変異、例えば：
【００１８】
45L→P、
51S→Y、51S→F、51S→W、
52V→G、
53G→P、
54I→F、54→Y、
76I→V、
100G→N、
101T→M、101T→L、101T→V、
102G→S、102G→N、102G→T、
103E→G、
104L→W、
105F→S、105F→A、105F→Q、105F→D又は105F→E
に相当する変異を含有する変異TCRを包含する。
上記で使用した番号付けは、図1b及び配列番号２に示したものと同じである。
【００１９】
本発明の更なる好ましい実施形態は、図６(配列番号11〜24)又は図20(配列番号47〜53)
に示される変異したα鎖可変領域アミノ酸配列の１つを含有するTCRにより提供される。このようなTCRの表現型上サイレントな変形体もまた、本発明の一部を形成する。
【００２０】
本発明の更なる好ましい実施形態は、図21に示される変異したβ鎖可変領域アミノ酸配列(配列番号54〜67)の１つを含有するTCRにより提供される。このようなTCRの表現型上サイレントな変形体もまた、本発明の一部を形成する。
【００２１】
天然型TCRはへテロ二量体αβ又はγδ形態で存在する。しかし、αα又はββのホモ二量体からなる組換えTCRが、ペプチドMHC分子に結合することが以前に示されている。したがって、本発明の１つの実施形態は、TCRαα又はTCRββのホモ二量体により提供される。
【００２２】
更に好ましい実施形態は、下記に列挙するα鎖可変領域アミノ酸配列とβ鎖可変領域アミノ酸配列との組合せを含有する本発明のTCRにより提供され、このようなTCRの表現型上サイレントな変形体もまた、本発明の一部を形成する：
【００２３】
【表１】
2008545426.tif 000002
【００２４】
好ましい実施形態は、以下を含有する本発明のTCRを提供する：
配列番号11に示されるα鎖可変領域及び配列番号２に示されるβ鎖可変領域、
配列番号47に示されるα鎖可変領域及び配列番号２に示されるβ鎖可変領域、
配列番号48に示されるα鎖可変領域及び配列番号２に示されるβ鎖可変領域、
配列番号53に示されるα鎖可変領域及び配列番号２に示されるβ鎖可変領域、
【００２５】
配列番号11に示されるα鎖可変領域及び配列番号54に示されるβ鎖可変領域、
配列番号11に示されるα鎖可変領域及び配列番号55に示されるβ鎖可変領域、
配列番号11に示されるα鎖可変領域及び配列番号56に示されるβ鎖可変領域、
配列番号11に示されるα鎖可変領域及び配列番号57に示されるβ鎖可変領域、
配列番号11に示されるα鎖可変領域及び配列番号58に示されるβ鎖可変領域、
【００２６】
配列番号11に示されるα鎖可変領域及び配列番号62に示されるβ鎖可変領域、
配列番号11に示されるα鎖可変領域及び配列番号65に示されるβ鎖可変領域、
配列番号11に示されるα鎖可変領域及び配列番号66に示されるβ鎖可変領域、
又は上記TCRのいずれかの表現型上サイレントな変形体。
【００２７】
別の好ましい実施形態では、上記で詳述した可変領域の組合せを含有する本発明のTCRは、図7aに示されるα鎖定常領域アミノ酸配列(配列番号25)と図7b及び7cに示されるβ鎖アミノ酸定常領域配列(配列番号26及び27)の一方、又はそれらの表現型上サイレントな変形体を更に含有する。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語「表現型上サイレントな変形体」は、AAGIGILTV−HLA-A*0201複合体に対して３μMより少ないか若しくはこれと等しいKDを有するTCRをいうと理解される。例えば、当業者には公知であるが、AAGIGILTV−HLA-A*0201複合体との相互作用に関する親和性及び/又は解離速度を変化させることなく、上記で詳述したものと比較して軽微な変化が定常領域及び/又は可変領域に組み込まれているTCRを作製することは可能であり得る。このような平凡な変形体は本発明の範囲に包含される。１又はそれより多い保存的置換がなされたTCRもまた、本発明の一部を形成する。
【００２９】
１つの広い観点では、本発明のTCRは、WO 04/033685及びWO 03/020763に記載されるような単鎖TCR(scTCR)又は二量体TCR(dTCR)のいずれかの形態である。
【００３０】
適切なscTCR形態は、TCRα鎖可変領域に相当するアミノ酸配列により構成される第１のセグメントと、TCRβ鎖定常ドメイン細胞外配列に相当するアミノ酸配列のＮ末端に融合したTCRβ鎖可変領域配列に相当するアミノ酸配列により構成される第２のセグメントと、第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に連結するリンカー配列とを含有する。
【００３１】
或いは、第１のセグメントは、TCRβ鎖可変領域に相当するアミノ酸配列により構成されてもよく、第２のセグメントは、TCRα鎖定常ドメイン細胞外配列に相当するアミノ酸配列のＮ末端に融合したTCRα鎖可変領域配列に相当するアミノ酸配列配列により構成されてもよい。
【００３２】
上記scTCRは、第１の鎖と第２の鎖との間のジスルフィド結合を更に含有してもよく、このジスルフィド結合は、天然型αβＴ細胞レセプター中に等価物がないものであり、リンカー配列の長さ及びジスルフィド結合の位置は、第１及び第２のセグメントの可変ドメイン配列が天然型αβＴ細胞レセプター中と実質的に同様に互いに配向するような長さ及び位置である。
【００３３】
より具体的には、第１のセグメントは、TCRα鎖定常ドメイン細胞外配列に相当するアミノ酸配列のＮ末端に融合したTCRα鎖可変領域配列に相当するアミノ酸配列により構成
されていてもよく、第２のセグメントは、TCRβ鎖定常ドメイン細胞外配列に相当するアミノ酸配列のＮ末端に融合したTCRβ鎖可変領域に相当するアミノ酸配列により構成されていてもよく、ジスルフィド結合は、第１の鎖と第２の鎖との間に提供されてもよく、このジスルフィド結合は、天然型αβＴ細胞レセプター中に等価物がないものである。
【００３４】
上記scTCR形態では、リンカー配列は、第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に連結してもよく、式-PGGG-(SGGGG)n-P-(式中、ｎは５又は６であり、Ｐはプロリンであり、Ｇはグリシンであり、Ｓはセリンである)を有していてもよい。
-PGGG-SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG-P (配列番号41)
-PGGG-SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG-P (配列番号42)
【００３５】
本発明のTCRの適切なdTCR形態は、TCRα鎖可変領域配列に相当する配列がTCRα鎖定常ドメイン細胞外配列に相当する配列のＮ末端に融合している第１のポリペプチドと、TCRβ鎖可変領域配列に相当する配列がTCRβ鎖定常ドメイン細胞外配列に相当する配列のＮ末端に融合している第２のポリペプチドとを含有し、第１及び第２のポリペプチドが天然型αβＴ細胞レセプター中に等価物がないジスルフィド結合により連結している。
【００３６】
第１のポリペプチドは、TCRα鎖定常ドメイン細胞外配列に相当する配列のＮ末端に融合したTCRα鎖可変領域配列を含有してもよく、第２のポリペプチドでは、TCRβ鎖可変領域配列に相当する配列がTCRβ鎖定常ドメイン細胞外配列に相当する配列のＮ末端に融合し、第１及び第２のポリペプチドは、TRAC*01のエキソン１のThr 48及びTRBC1*01若しくはTRBC2*01のエキソン１のSer 57又はこれらの非ヒト等価物から置換したシステイン残基同士間のジスルフィド結合により連結している(本明細書中の「TRAC」などの命名法は、T
cell receptor Factsbook(2001) LeFranc and LeFranc，Academic Press，ISBN 0-12-441352-8による)。
【００３７】
本発明のTCRのdTCR形態又はscTCR形態は、ヒトαβTCRの細胞外定常領域及び可変領域の配列に相当するアミノ酸配列を有していてもよく、ジスルフィド結合は、前記定常ドメイン配列のアミノ酸残基同士を連結してもよく、このジスルフィド結合は、天然型TCR中には等価物がない。ジスルフィド結合は、β炭素原子が天然型TCR中で0.6nm未満離れているアミノ酸残基に相当するシステイン残基同士間、例えばTRAC*01のエキソン１のThr 48及びTRBC1*01若しくはTRBC2*01のエキソン１のSer 57又はこれらの非ヒト等価物から置換されたシステイン残基同士間にある。システインが導入されてジスルフィド結合を形成することができる他の部位は、TCRα鎖についてはTRAC*01のエキソン１中の、TCRβ鎖についてはTRBC1*01又はTRBC2*01のエキソン１中の以下の残基である：
【００３８】
【表２】
2008545426.tif 000003
【００３９】
本発明の具体的実施形態は、
TCRα鎖可変領域配列に相当する配列がTCRα鎖定常ドメイン細胞外配列に相当する配列のＮ末端に融合した第１のポリペプチドと、
TCRβ鎖可変領域配列に相当する配列がTCRβ鎖定常ドメイン細胞外配列に相当する配列のＮ末端に融合した第２のポリペプチドと
を含有し、該第１のポリペプチド及び該第２のポリペプチドが、TRAC*01のエキソン１のThr 48及びTRBC1*01若しくはTRBC2*01のエキソン１のSer 57又はこれらの非ヒト等価物から置換されたシステイン残基同士間の、天然型αβＴ細胞中に等価物を有さないジスルフィド結合により連結しているdTCRである本発明のTCRを提供する。
【００４０】
上記で言及した非天然型ジスルフィド結合に加えて、本発明のTCRのdTCR形態又はscTCR形態は、天然型TCR中のジスルフィド結合により連結される残基に相当する残基同士間のジスルフィド結合を含有してもよい。
本発明のTCRのdTCR形態又はscTCR形態は、好ましくは、天然型TCRの膜貫通配列に相当する配列も細胞質配列に相当する配列も含有しない。
【００４１】
現時点で好ましい本発明の実施形態は、以下を含有する可溶性TCRを提供する：
配列番号29のα鎖アミノ酸配列及び配列番号10のβ鎖アミノ酸配列
配列番号68のα鎖アミノ酸配列及び配列番号10のβ鎖アミノ酸配列
配列番号69のα鎖アミノ酸配列及び配列番号10のβ鎖アミノ酸配列
配列番号70のα鎖アミノ酸配列及び配列番号10のβ鎖アミノ酸配列
【００４２】
配列番号29のα鎖アミノ酸配列及び配列番号71のβ鎖アミノ酸配列
配列番号29のα鎖アミノ酸配列及び配列番号72のβ鎖アミノ酸配列
配列番号29のα鎖アミノ酸配列及び配列番号73のβ鎖アミノ酸配列
配列番号29のα鎖アミノ酸配列及び配列番号74のβ鎖アミノ酸配列
【００４３】
配列番号29のα鎖アミノ酸配列及び配列番号75のβ鎖アミノ酸配列
配列番号29のα鎖アミノ酸配列及び配列番号76のβ鎖アミノ酸配列
配列番号29のα鎖アミノ酸配列及び配列番号77のβ鎖アミノ酸配列
配列番号29のα鎖アミノ酸配列及び配列番号78のβ鎖アミノ酸配列。
【００４４】
本発明のTCRをコードする核酸もまた提供される。この核酸は、原核性又は真核性の宿主細胞における発現に適合された形態で提供されても良い。適切な宿主細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞又は昆虫細胞が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、宿主細胞はヒトＴ細胞又はヒト造血幹細胞であり得る。
【００４５】
この適合された核酸は、該核酸が導入される宿主細胞のコドン嗜好性を反映して変異される。導入される変異は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響しないサイレント変異である。GeneArt(Regensburg、ドイツ)は、適切な核酸最適化サービス(GeneOptimizerTM)を提供する。GeneArtが保有するWO 2004/059556は、最適化プロセスの更なる詳細を提供する。
【００４６】
更に現時点で好適な本発明の実施形態は、配列番号33、35又は37(それぞれ図12a、13a又は14a)の完全長TCRα鎖DNA配列の１つ及び配列番号39(図15aに示す)のTCRβ鎖DNA配列からなる核酸により提供される。前記核酸のいずれかに相補的な核酸、又は対応するRNA配列もまた本発明の一部を構成する。更に、当業者に明らかなように、本発明のTCRをコードする核酸は、非コード(イントロン)配列を含有し得る。
【００４７】
配列番号31、33、35、37及び39の完全長の野生型高親和性MEL TCR鎖DNA配列はそれぞれ、配列番号32、34、36、38及び40のアミノ酸配列をコードする(それぞれ図11b、12b、13b、14b及び15b)。
配列番号33、35及び37のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号11、15及び23の高親和性MEL TCRα鎖可変領域を含有する。
【００４８】
当業者に明らかなように、この完全長TCR鎖DNA配列は以下の配列をコードする：
リーダー配列、並びに細胞外、膜貫通及び細胞質のTCR配列。
本明細書中に提供される完全長DNA配列はまた、選択したベクター中へのライゲーションを容易にするための制限酵素認識配列を含む。
【００４９】
PEG化TCR単量体
１つの特定の実施形態において、本発明のTCRは、少なくとも１つのポリアルキレングリコール鎖と組み合わされている。この結合は、当業者に公知の多くの方法で引き起こされ得る。好ましい実施形態では、ポリアルキレン鎖は、TCRと共有結合している。更なる実施形態では、本発明のこの観点のポリエチレングリコール鎖は、少なくとも２つのポリエチレン反復単位を含有する。
【００５０】
多価TCR複合体
本発明の１つの観点は、少なくとも２つの本発明のTCRを含有する多価TCR複合体を提供する。この観点の１つの実施形態では、少なくとも２つのTCR分子は、リンカー部分を介して連結して多価複合体を形成する。好ましくは、この複合体は水溶性であるので、リンカー部分はそのように選択されるべきである。更に、リンカー部分は、形成される複合体の構造的多様性が最小となるように、TCR分子の規定位置に付着することができるべきであることが好ましい。この観点の１つの実施形態は、ポリマー鎖又はペプチド性リンカー配列が各TCRの可変領域配列中に位置しないアミノ酸残基同士の間に伸びる本発明のTCR複合体により提供される。
【００５１】
本発明の複合体は医薬で使用され得るので、リンカー部分は、薬学的適合性(例えば免疫原性)に当然払うべき注意をもって選択されるべきである。
上記の望ましい基準を満たすリンカー部分の例は、当該分野(例えば抗体フラグメントを連結する技術分野)で公知である。
【００５２】
本発明の多価TCR分子の製造での使用に好ましい２つのクラスのリンカーが存在する。TCRがポリアルキレングリコール鎖により連結されている本発明のTCR複合体は、この観点の１つの実施形態を提供する。
【００５３】
第１は、親水性ポリマー、例えばポリアルキレングリコールである。最も通常に使用されるこのクラスのものは、ポリエチレングリコールすなわちPEGをベースにする。その構造を下記に示す。
ＨＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)n−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ
(式中、ｎは２より大きい)。しかし、他の適切な(任意に置換されていてもよい)ポリアルキレングリコールをベースにするものもある。ポリプロピレングリコール及びエチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマーが挙げられる。
【００５４】
このようなポリマーは、治療剤、特にポリペプチド治療剤又はタンパク質治療剤を処理するか又はこれに接合するかして、該治療剤のPKプロフィールに有益な変化(例えば、減少した腎クリアランス、向上した血漿半減期、減少した免疫原性及び向上した溶解性)を達成するために使用され得る。PEG−治療剤接合体のPKプロフィールのこのような改善は、PEG分子が該治療剤の周囲に、免疫系との反応を立体的に障害し、タンパク質分解性分解を減少させる「殻」を形成することに起因すると考えられる(Caseyら(2000) Tumor Targeting 4 235-244)。使用する親水性ポリマーのサイズは、具体的には、TCR複合体の意図する治療用途に基づいて選択し得る。
【００５５】
したがって、例えば、(例えば腫瘍治療における使用のために)生成物が循環中に放出され組織に浸透することを意図する場合には、５KDaのオーダーの低分子量ポリマーを使用
することが有利であり得る。医薬製剤におけるPEG及び類似分子の使用を詳述する多くの総説論文及び本が存在する。例えば、Harris(1992) Polyethylene Glycol Chemistry - Biotechnical and Biomedical Applications，Plenum，New York，NY.、又はHarris & Zalipsky(1997) Chemistry and Biological Applications of Polyethylene Glycol ACS Books，Washington，D.C.を参照。
【００５６】
使用するポリマーは、直鎖状又は分枝状の構造を有することができる。分枝状PEG分子又はその誘導体は、グリセロール及びグリセロールオリゴマー、ペンタエリスリトール、ソルビトール並びにリジンを含む分枝成分の付加により誘導することができる。
【００５７】
通常、ポリマーは、該ポリマーがTCR中の標的部位へ連結することが可能となるように、その構造中、例えば一方又は両方の端部及び/又は主鎖からの分枝上に、化学反応性の基を有する。下記に示すように、この化学反応性の基は親水性ポリマーに直接結合させてもよいし、又は親水性ポリマーと反応性化学成分との間にスペーサ基/成分が存在していてもよい：
反応性化学成分−親水性ポリマー−反応性化学成分
反応性化学成分−スペーサ−親水性ポリマー−スペーサ−反応性化学成分
【００５８】
上記で概説したタイプの構築物の形成に使用するスペーサは、非反応性の化学的に安定な鎖である任意の有機成分であり得る。このようなスペーサには、以下が含まれるがそれらに限定されない：
-(CH2)n- (式中、ｎ=２〜５)
-(CH2)3NHCO(CH2)2
【００５９】
二価アルキレンスペーサ基がポリアルキレングリコール鎖とTCRへのその結合点との間に位置する本発明のTCR複合体は、この観点の更なる実施形態を提供する。
ポリアルキレングリコール鎖が少なくとも２つのポリエチレングリコール反復単位を含有する本発明のTCR複合体は、この観点の更なる実施形態を提供する。
【００６０】
本発明において有用であり得る反応性化学成分に直接か又はスペーサを介して連結する親水性ポリマーの商業的供給業者は多く存在する。これら供給業者としては、Nektar Therapeutics(CA、米国)、NOF Corporation(日本)、Sunbio(韓国)及びEnzon Pharmaceuticals(NJ、米国)が挙げられる。
【００６１】
本発明において有用であり得る反応性化学成分に直接か又はスペーサを介して連結する市販の親水性ポリマーには、以下のものが含まれるがそれらに限定されない。
【表３】
2008545426.tif 000004
【００６２】
種々のカップリング化学成分を使用して、ポリマー分子をタンパク質治療薬やペプチド治療薬とカップリングすることができる。最も適切なカップリング化学成分の選択は、所望するカップリング部位に大きく依存する。例えば、以下のカップリング化学成分が、PEG分子の１又はそれ以上の末端に付着されるために使用されてきた(出典：Nektar Molecular Engineering Catalogue 2003)：
【００６３】
Ｎ−マレイミド
ビニルスルホン
炭酸ベンゾトリアゾール
スクシンイミジルプロピオネート
スクシンイミジルブタノエート(succinimidyl butanoate)
チオエステル
アセトアルデヒド類
アクリレート類
ビオチン
一級アミン類
【００６４】
上記のように、非PEGベースのポリマーもまた、本発明のTCRを多量化するために適切な
リンカーを提供する。例えば、脂肪族鎖により連結されたマレイミド末端を含有する成分、例えばBMH及びBMOE(Pierce，製品番号22330及び22323)が使用できる。
【００６５】
ペプチド性リンカーが他のクラスのTCRリンカーである。これらリンカーは、アミノ酸の鎖から構成され、単純なリンカー又はTCR分子を付着させることができる多量体化ドメインを作製するために機能する。ビオチン/ストレプトアビジン系は、以前に、インビトロ結合研究用のTCR四量体を作製するために使用された(WO/99/60119を参照)。しかし、ストレプトアビジンは微生物由来のポリペプチドであり、よって治療剤における使用に理想的には適していない。
【００６６】
TCRがヒト多量体化ドメインに由来するペプチド性リンカーにより連結されている本発明のTCR複合体は、この観点の更なる実施形態を提供する。
【００６７】
多価TCR複合体の作製に使用できる多量体化ドメインを含有する多くのヒトタンパク質が存在する。例えば、p53の四量体化ドメインは、単量体scFvフラグメントと比較して、増大した血清残存率及び有意に減少した解離速度を示すscFv抗体フラグメント四量体を作製するために利用されている(Willudaら(2001) J. Biol. Chem. 276 (17)14385-14392)。ヘモグロビンもまた、この種の適用におそらく使用できる四量体化ドメインを有する。
【００６８】
少なくとも一方が治療剤と組み合わされている少なくとも２つのTCRを含有する本発明の多価TRC複合体はこの観点の最後の実施形態を提供する。
１つの観点では、本発明のTCR(又はその多価複合体)は、択一的又は追加的に、そのα鎖又はβ鎖のＣ末端又はＮ末端に反応性のシステインを含有し得る。
【００６９】
診断及び治療用途
１つの観点では、本発明のTCRは治療剤又は検出可能な成分と組み合わされてもよい。例えば、治療剤又は検出可能な成分はTCRに共有結合させてもよい。
本発明の１つの実施形態において、治療剤又は検出可能な成分は、一方又は両方のTCR鎖のＣ末端に共有結合している。
【００７０】
１つの観点において、本発明のscTCR又はdTCRの一方若しくは両方の鎖が検出可能な成分、例えば診断目的に適切な標識で標識されてもよい。このような標識TCRは、TCRリガンドと該TCRリガンドに特異的なTCR(又は多量体高親和性TCR複合体)とを接触させ、TCRリガンドへの結合を検出することを含んでなる、AAGIGILTV−HLA-A*0201複合体を検出する方法において有用である。例えばビオチン化ヘテロ二量体を用いて形成された四量体TCR複合体では、蛍光ストレプトアビジンを使用し、検出可能な標識を提供することができる。このような蛍光標識TCR四量体は、例えばこれら高親和性TCRが特異的であるAAGIGILTV−HLA-A*0201複合体を有する抗原提示細胞を検出するために、FACS分析で使用するに適切である。
【００７１】
本発明の可溶性TCRが検出され得る別の様式は、TCR特異的抗体、特にモノクローナル抗体の使用による。多くの市販の抗TCR抗体、例えばαF1及びβF1(それぞれα鎖及びβ鎖の定常ドメインを認識する)が存在する。
【００７２】
更なる観点において、本発明のTCR(又はその多価複合体)は、択一的又は追加的に、例えば細胞殺傷に使用するための毒性成分又は免疫エフェクター分子(例えばインターロイキン又はサイトカイン)であり得る治療剤と組み合わされてもよい(例えば、共有結合又はその他の結合をしていてもよい)。本発明の多価TCR複合体は、非多量体の野生型又は本発明のＴ細胞レセプターへテロ二量体と比べて、TCRリガンドに関して増強した結合能力を有し得る。したがって、本発明による多価TCR複合体は、特定の抗原を提示する細胞をイ
ンビトロ又はインビボで追跡又は標的するために特に有用であり、またそのような用途を有する更なる多価TCR複合体の製造のための中間体としても有用である。したがって、これらTCR又は多価TCR複合体は、インビボでの使用のために医薬的に許容される製剤で提供され得る。
【００７３】
本発明はまた、標的細胞に治療剤を送達するための方法を提供する。この方法は、可能性のある標的細胞を本発明によるTCR又は多価TCR複合体と、標的細胞へのTCR又は多価TCR複合体の付着を可能にする条件下で接触させることを含んでなり、当該TCR又は多価TCR複合体は、AAGIGILTV−HLA-A*0201複合体に特異的であり、これに治療剤が組み合わされている。
【００７４】
特に、本発明の可溶性TCR又は多価TCR複合体を使用して、特定の抗原を提示する細胞の位置に治療剤を送達することができる。このことは、多くの状況で、特に腫瘍に対して有用である。治療剤は、その効果を局所的にではあるが、該治療剤が結合する細胞に限らず発揮するように送達され得る。したがって、１つの特定の戦略は、腫瘍抗原に特異的な本発明のTCR又は多価TCR複合体に連結した抗腫瘍分子を考案する。
【００７５】
多くの治療剤、例えば放射活性化合物、酵素(例えばパーフォリン)又は化学療法剤(例えばシスプラチン)がこの用途に用いられ得る。確実に所望の位置で毒性効果が発揮されるために、毒素は、それがゆっくりと放出されるように、ストレプトアビジンに連結したリポソーム内にあり得る。このことにより、体内での輸送の間の損傷効果が防止され、TCRと該当する抗原提示細胞との結合後に毒素が最大効果を有することが確実になる。
【００７６】
他の適切な治療剤として、以下のものが挙げられる：
・小分子細胞毒性物質、すなわち、哺乳動物細胞を殺傷する能力を有する、分子量700ダルトン未満の化合物。このような化合物はまた、細胞毒性効果を有することができる毒性金属を含有し得る。更に、これら小分子細胞毒性物質にはまた、プロドラッグ、すなわち、生理学的条件下で崩壊又は変換して細胞毒性物質を放出する化合物が含まれると理解される。このような物質の例には、シスプラチン、メイタンシン(maytansine)誘導体、ラケルマイシン(rachelmycin)、カリケアマイシン(calicheamicin)、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ソルフィマーソディウムホトフィリンII(sorfimer sodiumphotofrin II)、テモゾロマイド(temozolmide)、トポテカン、トリメトレキサート(trimetreate)、グルクロナート、オーリスタチンＥ(auristatin E)、ビンクリスチン及びドキソルビシンが含まれる；
【００７７】
・ペプチド細胞毒素、すなわち、哺乳動物細胞を殺傷する能力を有するタンパク質又はそのフラグメント。例には、リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス細菌外毒素Ａ、DNAアーゼ及びRNAアーゼが含まれる；
・放射性核種、すなわち、１以上のα粒子若しくはβ粒子又はγ線の同時放射を伴って崩壊する元素の不安定同位体。例には、ヨウ素131、レニウム186、インジウム111、イットリウム90、ビスマス210及び213、アクチニウム225及びアスタチン213が含まれるがこれらに限定されない；キレート化剤が、高親和性TCR又はその多量体へのこれら放射性核種の結合を促進するために使用されてもよい；
【００７８】
・プロドラッグ、抗体を指向する酵素プロドラッグを含むがこれに限定されない；
・免疫刺激剤、すなわち、免疫応答を刺激する成分。サイトカイン(例えば、IL-2及びIFN)、スーパー抗原及びその変異体、pHLA複合体及びケモカイン(例えばIL-8)、血小板第４因子、メラノーマ増殖刺激タンパク質など、抗体又はそのフラグメント、補体活性因子、異種タンパク質ドメイン、同種タンパク質ドメイン、ウイルス性/細菌性タンパク質ドメイン、ウイルス性/細菌性ペプチド及び抗Ｔ細胞決定基抗体(例えば、抗CD3又は抗CD28)
を含むがこれらに限定されない。
【００７９】
機能的抗体フラグメント及び変形体
本明細書に記載の組成物及び方法での使用に適切な抗体フラグメント及び変形体/アナログは、以下を包含するがそれらに限定されない。
【００８０】
抗体フラグメント
当業者に公知のように、所定の抗体のフラグメントを、親の抗体の結合特性と実質的に同じ結合特性を保持するように作製することは可能である。以下にそのようなフラグメントの詳細を提供する：
【００８１】
ミニボディ(minibody) − この構築物は短縮されたFc部分を有する抗体からなる。よって、これは、由来する抗体の完全な結合性ドメインを保持する。
【００８２】
Fabフラグメント − これは、免疫グロブリン重鎖の一部に共有結合した単一免疫グロブリン軽鎖を含有する。よって、Fabフラグメントは１つの抗原結合部位を含有する。Fabフラグメントは、パパイン処理で遊離され得るIgGの部分によって規定されている。このフラグメントは、一般に、組換えDNA技術(Reevesら(2000) Lecture Notes on Immunology(第４版)Blackwell Science発行)により作製される。
【００８３】
F(ab')2フラグメント − これは、単一抗体に由来する両方の抗原結合部位及びヒンジ領域を含有する。F(ab')2フラグメントは、ペプシン処理で遊離され得るIgGの部分によって規定されている。このフラグメントは、一般に、組換えDNA技術(Reevesら(2000) Lecture Notes on Immunology(第４版)Blackwell Science発行)により作製される。
【００８４】
Fvフラグメント − これは、免疫グロブリン可変軽鎖ドメインに連結した免疫グロブリン可変重鎖ドメインを含有する。多くのFv設計がなされてきた。これには、２つのドメイン間の結合が導入ジスルフィド結合により強化されたdsFvが含まれる。或いは、scFvは、ペプチドリンカーを使用して２つのドメインを一緒に単一ポリペプチドとして結合して形成することができる。対応する免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖の可変ドメイン及び定常ドメインと組み合わされた免疫グロブリン重鎖又は軽鎖の可変ドメインを含有するFv構築物もまた作製されている。Fvはまた多量体化されてダイアボディ(diabody)及びトリアボディ(triabody)に形成されている(Maynardら(2000) Annu Rev Biomed Eng 2 339-376)。
【００８５】
ナノボディ(商標)(NanobodiesTM) − この構築物はAblynx(ベルギー)から市販されており、ラクダ科動物(例えば、ラクダ又はラマ)の抗体に由来する合成単一免疫グロブリン可変重鎖ドメインを含有する。
【００８６】
ドメイン抗体 − この構築物は、Domantis(ベルギー)から市販されており、親和性成熟単一免疫グロブリン可変重鎖ドメイン又は免疫グロブリン可変軽鎖ドメインを含有する。
【００８７】
抗体の変形体及びアナログ
本発明に関して規定される抗体の機能的特徴は、標的リガンドに特異的に結合する能力である。当業者に公知のように、種々の他のタンパク質中にそのような結合特性を操作してつくることは可能である。本発明の組成物及び方法での使用に適切な抗体の変形体及びアナログの例には、以下が包含されるがそれらに限定されない。
【００８８】
タンパク質足場をベースとした結合性ポリペプチド − このファミリーの結合性構築物は、天然型結合性ループを含有するタンパク質の変異アナログを含有する。例として、Affibody(スウェーデン)から市販されている、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)プ
ロテインＡのIgG結合性ドメインの１つに由来する３へリックスモチーフ(three-helix motif)に基づくアフィボディ(Affibodies)が挙げられる。別の例として、EvoGenix(オーストラリア)から市販されている、抗体結合性ループに類似するドメインが移植されているCTLA-4の細胞外ドメインに基づくエビボディ(Evibodies)が提供される。最後の例は、Regeneron Pharmaceuticals(米国)から市販されている、抗体足場にサイトカインレセプタードメインが移植されているサイトカイントラップ(Cytokine Traps)である。Nygrenら(2000)(Current Opinion in Structural biology 7 463-469)は、タンパク質中に新規な結合性部位を操作してつくるための足場の使用の総説を提供している。この総説は、足場の供給源として以下のタンパク質を述べている：CP1ジンクフィンガー、テンダミスタット(Tendamistat)、Ｚドメイン(プロテインＡアナログの１つ)、PST1、コイルドコイル、LACI-D1及びシトクロムb562。他のタンパク質足場の研究は、フィブロネクチン、緑色蛍光タンパク質(GFP)及びアンキリンリピートの使用を報告している。
【００８９】
当業者に公知のように、所定のタンパク質リガンドの種々の部分に結合する抗体又はそのフラグメント、変形体若しくはアナログを作製することができる。例えば、抗CD3抗体は、この複合体を形成しているポリペプチド鎖(すなわち、γ、δ、ε、ζ及びηCD3鎖)のいずれに対しても惹起させることができる。εCD3鎖に結合する抗体が、本発明の組成物及び方法での使用に好ましい抗CD3抗体である。
【００９０】
本発明の可溶性TCR又は多価TCR複合体は、プロドラッグを薬物に変換し得る酵素に連結されてもよい。これにより、プロドラッグが薬物を必要とする(すなわち、sTCRにより標的にされる)部位でのみ薬物に変換することが可能になる。
【００９１】
本明細書中で開示される高親和性AAGIGILTV(配列番号43)−HLA-A*0201特異的TCRは、ガンの診断方法及び治療方法に使用され得ると考えられる。
ガンの治療には、腫瘍又は転移の近傍への局在化が、毒素又は免疫刺激剤の効果を増強する。ワクチン送達には、ワクチン抗原を抗原提示細胞の近傍に局在させ、該抗原の効力を増強させ得る。この方法はまた造影目的にも適用できる。
【００９２】
１つの実施形態は、本発明のTCRを提示する単離細胞により提供される。例えば、この細胞はヒトＴ細胞又はヒト造血幹細胞であり得る。
【００９３】
本発明の更なる実施形態は、以下：
医薬的に許容されるキャリアと共に、本発明のTCR若しくは多価TCR複合体(任意に治療剤と組み合わされていてもよい)、又は本発明のTCRを少なくとも１つ提示する複数の細胞、又は本発明のTCRをコードする核酸を含有する医薬組成物により提供される。
【００９４】
本発明はまた、ガン疾患を患う対象に、本発明のTCR若しくは多価TCR複合体(任意に治療剤と組み合わされていてもよい)又は本発明のTCRを少なくとも１つ提示する複数の細胞又は本発明のTCRをコードする核酸の有効量を投与することを含んでなる、ガンの治療法を提供する。関連する実施形態では、本発明は、ガン治療用組成物の製造における、本発明のTCR若しくは多価TCR複合体(任意に治療剤と組み合わされていてもよい)又は本発明のTCRを少なくとも１つ提示する複数の細胞又は本発明のTCRをコードする核酸の使用を提供する。
当業者に明らかなように、本発明のTCRを含有する組成物による治療の影響を受け易いガンは、メラン-Ａ+ガンであり得る。
【００９５】
本発明による治療用又は造影用TCRは、通常、一般には薬学的に許容されるキャリアを含む、滅菌の医薬組成物の一部として供給される。この医薬組成物は(所望される患者への投与法に依存して)任意の適切な形態であり得る。この医薬組成物は、単位剤形で提供
されてもよく、一般には密封容器中で提供され、キットの一部として提供されてもよい。そのようなキットは、通常(必ずというわけではないが)、使用のための指示書を含む。キットは、前記の単位剤形を複数含み得る。
【００９６】
医薬組成物は、任意の適切な経路、例えば、非経口経路、経皮経路又は吸入を介する経路(好ましくは非経口経路(皮下、筋肉内又は(最も好ましい)静脈内を含む))による投与に適合され得る。このような組成物は、医薬の技術分野において公知の任意の方法(例えば、滅菌条件下で活性成分をキャリア又は賦形剤と混合すること)により製造され得る。
【００９７】
本発明の物質の投薬量は、治療すべき疾患又は障害、治療すべき個体の年齢及び状態などに依存して、広範囲に変わり得る。最終的には、医師が使用すべき適切な投薬量を決定する。
【００９８】
追加の観点
本発明のscTCR又はdTCR(好ましくは、ヒト配列に対応する定常配列及び可変配列により構成される)は、実質的に純粋な形態で、又は精製若しくは単離された調製物として提供されてもよい。例えば、本発明のscTCR又はdTCRは、他のタンパク質を実質的に含まない形態で提供されてもよい。
【００９９】
本発明はまた、TCRが(ｉ)少なくとも１つのTCRα鎖可変ドメイン及び/又は少なくとも１つのTCRβ鎖可変ドメインを含有し、且つ(ii)３μMより少ないAAGIGILTV−HLA-A*0201複合体に対するKDを有することを特徴とするAAGIGILTV−HLA-A*0201への結合特性を有する高親和性TCRを同定する方法を提供する。この方法は、
(ａ)MEL TCRのα鎖及びβ鎖の可変ドメインを含んでなり、そのα鎖及びβ鎖の可変ドメインの一方又は両方が変異を含んでなるTCRの多様性ライブラリを作製し；
(ｂ)このTCR多様性ライブラリをAAGIGILTV−HLA-A*0201と、該TCRと該AAGIGILTV−HLA-A*0201との結合を可能にするに適切な条件下で接触させ、
(ｃ)その相互作用のKDを測定する
ことを含んでなる。
【０１００】
本発明の各観点の好ましい特徴は、必要な変更を加えてではあるが、他の観点の各々についても同様である。本明細書中で言及する先行技術文献は法が許す最大限の範囲で本明細書に援用する。
【実施例】
【０１０１】
実施例
以下の実施例で本発明を更に説明する。以下の実施例は、如何なる態様でも本発明の範囲を制限しない。
以下、添付の図面に言及する：
【０１０２】
図1a及び1bはそれぞれ、天然型MEL TCRのα鎖可変領域アミノ酸配列及びβ鎖可変領域アミノ酸配列を提供する。
図2a及び2bはそれぞれ、可溶性型の天然型MEL TCRα鎖及びβ鎖のDNA配列を提供する。
図3a及び3bはそれぞれ、図2a及び2bのDNA配列から産生されるMEL TCRα鎖及びβ鎖の細胞外アミノ酸配列を提供する。
【０１０３】
図4a及び4bはそれぞれ、非天然型ジスルフィド結合を形成するための追加のシステイン残基を含むように変異した可溶性型のMEL TCRα鎖及びβ鎖のDNA配列を提供する。各鎖の変異コドンを影付きで示し、導入した制限酵素認識部位に下線を付す。
図5a及び5bはそれぞれ、図4a及び4bのDNA配列から産生されるMEL TCRα鎖及びβ鎖の細
胞外アミノ酸配列を示す。各鎖における導入システインを影付きで示す。
【０１０４】
図６は、高親和性MEL TCR変形体のα鎖可変領域アミノ酸配列を提供する。変異した残基に下線を付す。
図7aは、TRACの短縮形態のアミノ酸配列を提供する。
図7bは、TRBC1の短縮形態のアミノ酸配列を提供する。
図7cは、TRBC2の短縮形態のアミノ酸配列を提供する。
【０１０５】
図8aは、pEX202プラスミドのプラスミドマップを提供する。
図8bは、pEX202プラスミドのDNA配列を提供する。
図9aは、好ましい可溶性高親和性MEL TCR変形体のα鎖アミノ酸配列を詳述する。
図9bは、ペプチドリンカーを介して野生型ヒトIL-2に融合したTRBC2コード定常領域を使用する野生型可溶性MEL TCRのβ鎖アミノ酸配列を詳述する。リンカー及びIL-2の配列はイタリック体である。
【０１０６】
図10は、野生型の可溶性ジスルフィド連結MEL TCRとHLA−AAGIGILTV−HLA-A*0201との相互作用について作成したBiacore応答曲線を提供する。
図11a及び11bはそれぞれ、ヒト細胞中で増強発現を生じさせるために変異させた完全長野生型MEL TCRα鎖DNA配列及びそれによりコードされるアミノ酸配列を提供する。
【０１０７】
図12a及び12bはそれぞれ、ヒト細胞中で増強発現を生じさせるために変異させた完全長高親和性c1 MEL TCRα鎖DNA配列及びそれによりコードされるアミノ酸配列を提供する。
図13a及び13bはそれぞれ、ヒト細胞中で増強発現を生じさせるために変異させた完全長高親和性c1d MEL TCRα鎖DNA配列及びそれによりコードされるアミノ酸配列を提供する。
図14a及び14bはそれぞれ、ヒト細胞中で増強発現を生じさせるために変異させた完全長高親和性c9 MEL TCRα鎖配列及びそれによりコードされるアミノ酸配列を提供する。
【０１０８】
図15a及び15bはそれぞれ、ヒト細胞中で増強発現を生じさせるために変異させた完全長c9 MEL TCRα鎖配列及びそれによりコードされるアミノ酸配列を提供する。
図16は、Mel特異的CTLクローンの活性化を阻害する可溶性ジスルフィド連結型の高親和性c1 WT Mel TCRの能力を示すELISPOTアッセイを提供する。
【０１０９】
図17a及び17bはそれぞれ、完全長野生型MEL TCRα鎖ORFがコードするDNA配列及び野生型MEL TCRβ鎖ORFがコードするDNA配列を提供する。
図18は、変異アミノ酸をコードするものを除いて野生型DNAコドンを含む、完全長c1 MEL TCRα鎖ORFがコードするDNA配列を提供する。
図19aは、c1α/WTβMEL TCRをコードする非コドン最適化DNAでのJurkat細胞のトランスフェクションにより達成したTCR発現レベルに関するFACSデータを提供する。
図19bは、c1α/WTβMEL TCRをコードするコドン最適化DNAでのJurkat細胞のトランスフェクションにより達成したTCR発現レベルに関するFACSデータを提供する。
【０１１０】
図20は、更なる高親和性MEL TCRα鎖の可変領域のアミノ酸配列を提供する。変異残基に下線を付している。
図21は、高親和性MEL TCRβ鎖の可変領域のアミノ酸配列を提供する。変異残基に下線を付している。
図22は、非天然型システイン残基を含む可溶性高親和性MEL TCRα鎖のアミノ酸配列を提供する。非天然型システイン残基を強調し、変異残基に下線を付している。
図23は、非天然型システイン残基を含む可溶性高親和性MEL TCRβ鎖のアミノ酸配列を提供する。非天然型システイン残基を強調し、変異残基に下線を付している。
【０１１１】
実施例１  −  天然型MEL可変ドメインを含有する可溶性ジスルフィド連結TCRの作製
図4a及び4bは、AAGIGILTV−HLA-A*0201複合体に特異的な野生型MEL TCRの可溶性ジスルフィド連結α鎖及びβ鎖のDNA配列を提供する。これらDNA配列は、多くの受託研究会社、例えばGeneArt(Regensburg、ドイツ)により新たに合成され得る。また、これらDNA配列のpGMT7ベースの発現プラスミド(これは、E.coli株BL21-DE3における高レベル発現用のT7プロモーターを含有する(pLysS)(Panら，Biotechniques(2000) 29(6):1234-8))中へのライゲーションを容易にするために、これらDNA配列には制限酵素認識部位が付加される。
【０１１２】
NdeI及びHindIIIで切断した各TCR鎖をコードするDNA配列を、別個のpEX202 pGMT7ベースのベクター中にライゲートする。このベクターもまたNdeI及びHindIIIで切断されている(pEX202のプラスミドマップに関しては図8aを、このベクターのDNA配列に関しては図8b(配列番号28)を参照)。
【０１１３】
可溶性野生型MEL TCR鎖をコードするDNA中に導入した制限酵素認識部位：
NdeI    -  CATATG
HindIII -  AAGCTT
【０１１４】
ライゲーション
ライゲートしたプラスミドをコンピテントE.coli株XL1-blue細胞に形質転換し、100mg/mlアンピシリン含有LB/寒天プレート上に播種する。37℃で一晩のインキュベーション後、１つのコロニーを採取し、100mg/mlアンピシリンを含有する10mlのLB中で振盪させながら37℃で一晩増殖させる。クローン化プラスミドを、Miniprepキット(Qiagen)を用いて精製し、挿入物を自動DNAシーケンサ(Lark Technologies)を用いて配列決定する。
【０１１５】
図5a及び5bはそれぞれ、図4a及び4bのDNA配列から産生した可溶性ジスルフィド連結野生型MEL TCRのα鎖及びβ鎖の細胞外アミノ酸配列を示す。これらDNA配列中の制限酵素認識配列に下線を付す。
【０１１６】
実施例２  −  可溶性のジスルフィド連結MEL TCRの高親和性変形体の作製
実施例１に記載されるように作製した可溶性のジスルフィド連結天然型MEL TCRは、AAGIGILTV(配列番号43)−HLA-A*0201複合体に対して増大した親和性を有する本発明のTCRを作製するための鋳型として用いることができる。
ファージディスプレイは、高親和性変異体を同定するためにHIV Gag TCR変形体のライブラリを作製することができる１つの手段である。例えば、Liら(2005) Nature Biotech 23(3):349-354に記載されるTCRファージディスプレイ及びスクリーニング法は、HIV Gag TCRに適合させて適用することができる。
【０１１７】
野生型MELβ可変領域と組み合せるとAAGIGILTV−HLA-A*0201複合体に対して高親和性を示す変異TCRα可変領域のアミノ酸配列を、図６に列挙する(配列番号11〜24)。当業者に公知であるように、これらの変異鎖を作製するために要する必要なコドン変更は、これらの鎖をコードするDNA中に、部位特異的変異誘発により導入することができる(StratageneのQuickChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit)。
【０１１８】
簡潔には、これは、所望のコドン変更が組み込まれたプライマーと、変異誘発の鋳型として該当するMEL TCR鎖DNAを含有するpEX202プラスミドとを用いることにより達成される。
変異誘発は次の条件を用いて行う：全容量50μl中、50ngのプラスミド鋳型、１μlの10mM dNTP、５μlの製造業者により供給された10×Pfu DNAポリメラーゼ緩衝液、25pmolのfwdプライマー、25pmolのrevプライマー、１μlのpfu DNAポリメラーゼ。95℃で２分間の最初の変性工程後、反応物を、変性(95℃、10秒)、アニーリング(55℃、10秒)及び伸長(7
2℃、８分)の25サイクルに供する。得られた産物をDpnI制限酵素で消化して鋳型プラスミドを除き、E.coli株XL1-blueに形質転換する。変異誘発を配列決定により確証した。
【０１１９】
実施例３  −  可溶性TCRの発現、リフォールディング及び精製
実施例１又は２のように作製したMEL TCRα鎖及びMTL TCRβ鎖を含むpEX202発現プラスミドを、E.coli株BL21pLysSに別々に形質転換し、１つのアンピシリン耐性コロニーを37℃にてTYP(アンピシリン100μg/ml)培地中で0.4のOD600まで増殖させた後、0.5mM IPTGでタンパク質発現を誘導する。誘導の３時間後に、Beckman J-6B中で4000rpmにて30分間の遠心分離により細胞を回収する。細胞ペレットを、50mMのTris-HCl、25％(w/v)のスクロース、１mMのNaEDTA、0.1％(w/v)のNaAzide、10mMのDTTを含有する緩衝液(pH8.0)中に再懸濁する。一晩の凍結−解凍工程の後、再懸濁細胞を、Milsonix XL2020ソニケータ中での標準の12mm径プローブを使用する１分間のバーストで合計約10分間の超音波処理に付する。封入体ペレットを、Beckman J2-21遠心機における13000rpmにて30分間の遠心分離により回収する。次いで、３回の界面活性剤での洗浄を行い、細胞残渣及び膜成分を除去する。各回、封入体ペレットをTriton緩衝液(50mMのTris-HCl、0.5％のTriton-X100、200mMのNaCl、10mMのNaEDTA、0.1％(w/v)のNaAzide、２mMのDTT、pH8.0)中でホモジナイズした後、Beckman J2-21における13000rpmにて15分間の遠心分離によりペレット化する。次いで、以下の緩衝液中での同様な洗浄により界面活性剤及び塩を除去する：50mMのTris-HCl、１mMのNaEDTA、0.1％(w/v)のNaAzide、２mMのDTT、pH8.0。最後に、封入体を30mgずつ小分けし、−70℃にて凍結させた。封入体タンパク質の収率を、６Ｍグアニジン-HClで可溶化し、Bradford色素結合アッセイ(PerBio)で測定することにより定量する。
【０１２０】
約30mgのTCRβ鎖及び60mgのTCRα鎖の可溶化封入体を凍結ストックから解凍し、次いでサンプルを混合し、混合物を15mlのグアニジン溶液(６Ｍ塩酸グアニジン、10mM酢酸ナトリウム、10mM EDTA)中に希釈して、完全な鎖変性を確実に行った。次いで、十分に還元され変性したTCR鎖を含有するグアニジン溶液を、以下の１リットルのリフォールディング緩衝液中に注入する：100mM Tris pH8.5、400mM L-アルギニン、２mM EDTA、５mM還元型グルタチオン、0.5mM酸化型グルタチオン、５Ｍ尿素、0.2mM PMSF。酸化還元対(２-メルカプトエチルアミン及びシスタミン(それぞれ最終濃度6.6mM及び3.7mMまで))を加え、約５分後に変性TCR鎖を加える。この溶液を５時間±15分間放置する。リフォールディングしたTCRを、Spectrapor 1メンブレン(Spectrum；製品番号132670)中で、10Ｌの10mM Tris(pH8.1)に対し、５℃±３℃にて18〜20時間透析する。この時間の後、透析緩衝液を新鮮な10mM Tris(pH8.1)(10Ｌ)に変え、透析を５℃±３℃にて更に20〜22時間継続した。
【０１２１】
透析したリフォールディング物をPOROS 50HQアニオン交換カラムにロードし、Akta Purifier(Pharmacia)を用いて50カラム容量を超える０〜500mM NaClグラジエントで結合タンパク質を溶出することにより、sTCRを分解産物及び不純物から分離する。ピーク画分を４℃にて貯蔵し、クーマシー染色SDS-PAGEで分析した後、プールして濃縮する。最後に、sTCRを精製して、HBS-EP緩衝液(10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、3.5mM EDTA、0.05％ Nonidet p40)で予め平衡化したSuperdex 200HRゲル濾過カラムを用いて特徴付けを行う。約50kDaの相対分子量で溶出するピークをプールし、濃縮した後、BIAcore表面プラズモン共鳴分析により特徴付けを行う。
【０１２２】
実施例４  −  特異pMHCへのsTCR結合のBiacore表面プラズモン共鳴特徴付け
表面プラズモン共鳴バイオセンサ(Biscore 3000TM)を使用して、同族ペプチド−MHCリガンドへの可溶性MEL TCRの結合を分析した。これは、半配向様式(semi-oriented fashion)でストレプトアビジン被覆結合表面に固定した単一pMHC複合体(下記で説明)を作製することにより容易となった。これにより、同時に４つまでの異なるpMHC(別個のフローセルに固定)への可溶性Ｔ細胞レセプターの結合を効率的に試験することが可能になった。HLA複合体の手動での注入により、正確なレベルの固定化クラスＩ分子を容易に操作すること
が可能となった。
【０１２３】
ビオチン化クラスＩ HLA-A*0201分子を、構成サブユニットタンパク質及び合成ペプチドを含有する細菌発現封入体から、インビトロでリフォールディングさせ、続いて精製し、インビトロにて酵素でビオチン化した(O'Callaghanら(1999) Anal. Biochem. 266:9-15)。そのタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインと置換したＣ末端ビオチン化タグを有するHLA-A*0201-重鎖を適切な構築物中で発現させた。〜75mg/リットル細菌培養物の封入体発現レベルが得られた。MHC軽鎖又はβ2-ミクログロブリンもまた、適切な構築物からE.coli中の封入体として〜500mg/リットル細菌培養物のレベルで発現させた。
【０１２４】
E. coli細胞を溶解し、封入体を約80％純度まで精製した。封入体からのタンパク質を６Ｍのグアニジン-HCl、50mMのTris(pH8.1)、100mMのNaCl、10mMのDTT、10mMのEDTA中で変性させ、５℃より低いリフォールディング緩衝液中に変性タンパク質の単一パルス(single pulse of denatured protein)を添加することにより、0.4ＭのL-アルギニン-HCl、100mMのTris(pH8.1)、3.7mMのシスタミン、6.6mMのβ-システアミン、HLA-A*0201分子が搭載するために必要な４mg/mlのAAGIGILTVペプチド中で30mg/リットルの重鎖、30mg/リットルのβ2mの濃度にてリフォールディングさせた。リフォールディングは、４℃にて少なくとも１時間で完了に到達させた。
【０１２５】
緩衝液を、10容量の10mM Tris(pH8.1)での透析により交換した。溶液のイオン強度を十分に減少させるために、２回の緩衝液交換が必要であった。次いで、タンパク質溶液を1.5μm酢酸セルロースフィルターに通して濾過し、POROS 50HQアニオン交換カラム(８ml床容量)に充填した。タンパク質を０〜500mMのNaCl線形勾配で溶出させた。HLA-A*0201−ペプチド複合体は約250mM NaClで溶出した。ピーク画分を収集し、プロテアーゼ阻害剤のカクテル(Calbiochem)を加え、画分を氷上で冷却した。
【０１２６】
ビオチン化タグを付したpMHC分子を、10mM Tris(pH8.1)、５mM NaCl中に、同じ緩衝液中で平衡化したPharmacia迅速脱塩カラムを使用して移して緩衝液を交換した。溶出に際して即座に、タンパク質含有画分を氷上で冷却し、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Calbiochem)を加えた。次いで、ビオチン化試薬を加えた：１mMビオチン、５mM ATP(pH８に緩衝化)、7.5mM MgCl2及び５μg/ml BirA酵素(O’Callaghanら(1999）Anal．Biochem．266：9-15に従って精製)。次いで、混合物を室温にて一晩インキュベートした。
【０１２７】
ゲル濾過クロマトグラフィーを使用してビオチン化pHLA-A*0201分子を精製した。Pharmacia Superdex 75 HR 10/30カラムを濾過PBSで予め平衡化し、１mlのビオチン化反応混合物を充填し、カラムをPBSで0.5ml/分にて展開した。ビオチン化pHLA-A*0201分子は、約15mlで単一ピークとして溶出した。タンパク質を含む画分をプールし、氷上で冷却し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを加えた。クーマシー結合アッセイ(PerBio)を使用してタンパク質濃度を測定し、ビオチン化pHLA-A*0201分子のアリコートを−20℃で凍結保存した。標準的なアミンカップリング法によりストレプトアビジンを固定化した。
【０１２８】
この固定化複合体はＴ細胞レセプター及びコレセプターCD8αα(共に可溶相中に注入され得る)の両方に結合することができる。低濃度(少なくとも40μg/ml)でさえTCRの特異的結合が得られる。このことは、このTCRが比較的安定であることを示す。sTCRのpMHC結合特性は、sTCRが可溶相又は固定相のいずれかで使用される場合、質的にも量的にも同様であることが観察されている。これは、可溶種の部分的な活性についての重要なコントロールであり、また、ビオチン化pMHC複合体が非ビオチン化複合体と同程度に生物学的に活性であることを示唆する。
【０１２９】
新規鎖間結合を含有する可溶性MEL TCRとその同族pMHC又は無関係のpMHCとの組合せ(こ
れらの製造は上記で説明)の間の相互作用を、Biacore 3000TM表面プラズモン共鳴(SPR)バイオセンサで分析した。SPRは、レセプターリガンド相互作用を検出しその親和性及び動力学的パラメータを分析するために使用することができる原理である、小さなフローセル内のセンサ表面近くでの屈折率の変化(応答単位(RU)で表示)を測定する。β2mに架橋したビオチンとフローセルの活性化表面に化学的に架橋されているストレプトアビジンとの間の結合を介して、個々のHLA−ペプチド複合体を別個のフローセルに固定化することにより、プローブフローセルを準備した。次いで、異なるフローセルの表面上にsTCRを一定流速で通過させ、そうしている間のSPR応答を測定することにより、アッセイを実施した。
【０１３０】
平衡結合定数の測定
野生型又は変異したMEL sTCRの系列希釈物を調製し、５μl/分の一定流速で２つの異なるフローセル(一方は〜1000RUの特異AAGIGILTV−HLA-A*0201複合体を被覆し、２つめは〜1000RUの非特異HLA-A2-ペプチド複合体を被覆)に注入した。応答は、コントロールセルの測定値を用いて各濃度について規格化した。規格化データ応答を、TCRサンプルの濃度に対してプロットし、平衡結合定数KDを算出するために双曲線にフィットさせた(Price & Dwek，Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemists(第２版) 1979，Clarendon Press，Oxford)。
【０１３１】
動力学パラメータの測定
高親和性TCRについて、解離速度定数kd及び結合速度定数kaを実験的に測定することによりKDを決定した。平衡定数KDはkd/kaとして算出した。
１つは〜300RUの特異HLA-A2−AAGIGILTV複合体で被覆し、２つめは〜300RUの非特異HLA-A2−ペプチド複合体で被覆した２つの異なるセル上にTCRを注入した。流速を50μl/分に設定した。代表的には、250μlのTCRを〜３μM濃度で注入した。次いで、反応がベースラインに戻るまで緩衝液を流した。Biaevaluationソフトウェアを用いて動力学パラメータを算出した。また、半減期の算出を可能とするために、解離相を一次指数関数減衰式にフィットさせた。
【０１３２】
結果
可溶性ジスルフィド連結野生型MEL TCR(それぞれ配列番号９及び10に詳述されるαTCR鎖及びβTCR鎖からなる)とAAGIGILTV−HLA-A*0201複合体との間の相互作用を、上記の方法を用いて分析し、４μMのKDが示された(Biacore応答曲線については図12を参照)。
【０１３３】
以下の表で特定される可変領域使用を含有するTCRは、３μMより少ないか若しくは等しいKDを有する。本発明のMEL TCR以外の高親和性TCRでの経験(例えば、Liら，Nature Biotech 2005 23(3):349-354を参照)に基けば、以下の表で特定されるTCRの幾つか又は全てが、１×10-3 S-1か又はそれより遅いkoffを有すると予測され、これら可変ドメインを含有する可溶性TCRを製造することによって、確かにそのとおりであることが示されている(下記の表１を参照)。
【０１３４】
【表４】
2008545426.tif 000005
【表５】
2008545426.tif 000006
【０１３５】
実施例５  −  可溶性の高親和性MEL TCR−WTヒトIL-2融合タンパク質の作製
実質的に実施例１〜３に記載の方法を使用して、可溶性の高親和性MEL TCR−WTヒトIL-2融合タンパク質を作製することができる。簡潔には、所望のリンカー及びWTヒトIL-2をコードするDNAを、可溶性のジスルフィド連結野生型MEL TCRβ鎖のDNA配列の3'末端にTAA(「停止」)コドンの直前で付加する。図9bは、WTヒトIL-2にリンカー配列を介して融合したジスルフィド連結野生型MEL TCRβ鎖を含有する融合タンパク質のアミノ酸配列を提供する(配列番号30)。この融合タンパク質のリンカー及びIL-2部分はイタリック体で示されている。次いで、この構築物をコードするDNAは、pEX202中にライゲートすることができる。次いで、可溶性高親和性MEL TCR−IL-2融合タンパク質は、実質的に実施例３に記載された方法を使用して、このβ鎖融合タンパク質を、図６に詳述される可変領域(配列番号11〜24)のいずれかを含有する可溶性高親和性ジスルフィド連結MEL TCRα鎖TCR鎖と組み合せることにより、発現させることができる。例えば、図9a(配列番号29)は、配列番号11に詳述される可変領域を含有する可溶性高親和性ジスルフィド連結MEL TCRα鎖のアミノ酸配列を提供する。
【０１３６】
実施例６  −  可溶性高親和性Mel C1cWT Mel TCRによる細胞傷害性Ｔ細胞(CTL)活性化のインビトロ阻害を評価するためのELISPOTアッセイ
以下の方法は、Mel c1 cWT高親和性Mel TCRがAAGIGILTV−HLA-A*0201反応性Ｔ細胞クローンの活性化を阻害する能力を評価する手段を提供する。
この実験で使用した可溶性Mel c1 cWT高親和性Mel TCRは、それぞれ配列番号11及び配列番号２のMel TCRα鎖可変ドメイン及びWT Mel TCRβ鎖可変領域を含有していた。この可溶性ジスルフィド連結TCRのTCRα鎖及びβ鎖の完全アミノ酸配列は、それぞれ図9a(配
列番号29)及び図5b(配列番号10)に提供される。
【０１３７】
試薬：
アッセイ培地：10％ FCS(熱不活化，Gibco，cat# 10108-165)、88％ RPMI 1640(Gibco，cat# 42401-018)、１％グルタミン(Gibco，cat# 25030-024)及び１％ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco，cat# 15070-063)。
洗浄緩衝液：0.01Ｍ PBS/0.05％ Tween 20(１リットルの蒸留水中に溶解した、１包のTween 20含有リン酸緩衝化生理食塩水(pH7.4)(Sigma、Cat. # P-3563)により、最終組成0.01Ｍ PBS、0.138Ｍ NaCl、0.0027Ｍ KCl、0.05％ Tween 20が得られる)。
【０１３８】
PBS(Gibco、cat#10010-015)。
Diaclone EliSpotキット(IDS) EliSpotキットは、20×96ウェルプレート(IDS cat# DC-856.051.020、DC-856.000.000)と共に、必要な他の全ての試薬、すなわち捕捉抗体及び検出抗体、スキムミルク粉、BSA、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ、BCIP/NBT溶液を含む(ヒトIFN-γ PVDF Eli-spot)。
【０１３９】
以下の方法は、各キットと共に供給される製造業者の指示書に基くが、幾らかの変更も含む。
方法
100μlの捕捉抗体をプレート当たり10mlの滅菌PBS中に希釈した。100μlの希釈捕捉抗体を各ウェルに小分けし、４℃にて一晩又は室温にて２時間放置した。次いで、プレートを450μlの洗浄緩衝液、Ultrawash 96ウェルプレートウォッシャー(Thermo Life Sciences)で３回洗浄して過剰の捕捉抗体を除去した。次いで、100μlの２％スキムミルクを各ウェルに添加した(ELISPOTキットで供給された１バイアルのスキムミルク粉を50mlの滅菌PBSに溶解した)。次いで、プレートを室温にて２時間インキュベートした後、450μlの洗浄緩衝液、Ultrawash 96ウェルプレートウォッシャー(Thermo Life Sciences)で更に３回洗浄した。
【０１４０】
Mel 624及びMel 526の標的ガン細胞を、トリプシンを使用して組織培養フラスコから脱着し、アッセイ培地中での遠心分離(280×ｇで10分間)により１回洗浄し、同じ培地中に１×106/mlで再懸濁した。次いで、50μlのこの懸濁液をアッセイプレートに加えて、50,000細胞/ウェルの総標的細胞数を得た。
また、ELAGIGILTVでパルスしたT2標的細胞をコントロールとして使用した。WTペプチドより高いHLA-A*0201に対する親和性を有するので、このアナログペプチドを使用した。
【０１４１】
これらペプチドパルスした細胞を、アッセイ培地中での遠心分離(280×ｇで10分間)により１回洗浄し、同じ培地中に１×106/mlで再懸濁した。次いで、50μlのこの懸濁液をアッセイプレートに加えて、50,000細胞/ウェルの総標的細胞数を得た。
ELAGIGILTVペプチドでの自家刺激により惹起したＴ細胞クローン(KA/C5)(エフェクター細胞)を遠心分離(280×ｇで10分間)により採集し、アッセイ培地中に１×105細胞/mlで再懸濁し、50μlをアッセイプレートに加えると5000細胞/ウェルが得られた。
【０１４２】
可溶性Mel c1 cWT高親和性Mel TCR高親和性Mel TCRを、50μlをプレートに加えて最終容量150μlにすると１×最終が得られるように、アッセイ培地中で３×濃度に希釈した。試験した高親和性Mel TCRの濃度範囲は、１μM〜１nMであった。
次いで、以下を含有するウェルを調製した(各ウェル中の最終反応容量は100μlであった)：
試験サンプル(順に添加)
50μlのMel 624又はMel 526標的細胞
50μlの所望濃度の可溶性高親和性Mel c1 cWT TCR
50μlのKA/C5 Ｔ細胞クローンエフェクター細胞。
【０１４３】
ネガティブコントロール
50μlの標的細胞
50μlの最高濃度の可溶性高親和性Mel c1 cWT TCR
50μlのアッセイ培地
及び
50μlのエフェクター細胞
50μlの最高濃度の可溶性高親和性Mel c1 cWT TCR
50μlのアッセイ培地
及び
50μlのエフェクター細胞
50μlの標的細胞
50μlの最高濃度の可溶性の無関係(HLA-A*0201−Tax特異的)高親和性mTCR
50μlのアッセイ培地
【０１４４】
ポジティブコントロール
50μlのMel 624、Mel 526又はペプチドパルスしたT2標的細胞
50μlのエフェクター細胞
50μlのアッセイ培地
【０１４５】
次いで、プレートを37℃/５％CO2にて一晩インキュベートした。次いで、プレートを洗浄緩衝液で６回洗浄した後、過剰の緩衝液を軽く叩いて取り除いた。次いで、550μlの蒸留水を、ELISPOTキットで供給された検出抗体の各バイアルに加えて、希釈溶液を調製した。次いで、100μlの希釈検出抗体溶液をプレート当たり10mlのPBS/１％ BSA中で更に希釈し、100μlの希釈検出抗体溶液を各ウェルに小分けした。次いで、プレートを室温にて90分間インキュベートとした。
【０１４６】
この後、プレートを洗浄緩衝液、Ultrawash 96ウェルプレートウォッシャー(Thermo Life Sciences)で３回洗浄し(450μlの洗浄緩衝液で３回)、軽く叩いて乾燥させた。次いで、10μlのストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼをプレート当たり10mlのPBS/１％ BSAで希釈し、100μlの希釈ストレプトアビジンを各ウェルに加え、室温にて１時間インキュベートした。次いで、プレートを再び450μlの洗浄緩衝液で３回洗浄し、軽く叩いて乾燥させた。
【０１４７】
100μlのBCIP/NBT供給溶液を各ウェルに加えた。プレートをホイルで覆い、５〜15分間放置して現像する。この期間、いつ反応が終結したかを決定するために、プレートをスポット形成について定期的に検査した。
次いで、プレートを水道水中で十分に洗浄し、振った後に分解し、卓上で放置して乾燥させた。
【０１４８】
乾燥したら、プレートをELISPOTリーダー(Autoimmun Diagnotistika，ドイツ)を用いて読み取った。
各ウェルに現れたスポットの数は、活性化したＴ細胞の数に比例する。したがって、高親和性Mel TCRを含有するウェル中のスポット数の減少は、KA/C5 CTLクローン活性化の阻害を示す。
【０１４９】
結果
図16に示されるように、可溶性c1 cWT高親和性Mel TCRはKA/C5 CTLクローン活性化の阻害に有効であった。これらデータは、CTL活性化の100％阻害が１μMの可溶性c1 cWT高親
和性Mel TCRを使用して達成されたことを示す。
【０１５０】
実施例７  −  高親和性(c1α WTβ)MEL TCRをコードするコドン最適化及び非コドン最適化のDNAでトランスフェクトしたJurkat細胞上でのTCR発現レベルの比較
10％熱不活化ウシ胎仔血清培地を含むRMPI中で増殖させた４×106のJurkat細胞を、無血清培地中で洗浄し、以下のいずれかでトランスフェクトした：
【０１５１】
ａ）MELα c1変異体完全長TCR鎖をコードする非コドン最適化配列を含有する５μgのエンドトキシンフリーのプラスミドpCIneo、及びMELβ wt完全長TCR鎖をコードする非コドン最適化配列を含有する５μgのエンドトキシンフリーのプラスミドpCI(これら配列のORFはそれぞれ、図18(配列番号46)及び図17b(配列番号45)に提供される)；又は
ｂ）ORFコドン最適化MELα c1変異体完全長TCR鎖を含有する５μgのエンドトキシンフリーのプラスミドpCIneo、及びORFコドン最適化MELβ wt完全長TCR鎖を含有する５μgのエンドトキシンフリーのプラスミドpCI(これら配列のORFはそれぞれ、図12a(配列番号33)及び図15a(配列番号39)に提供される)。
【０１５２】
BioRad Genepulser装置において、0.27kV及び975μFの条件を用い0.4cmキュベットを使用するエレクトロポレーションによりトランスフェクションを達成した。
細胞を、20％の熱不活化ウシ胎仔血清を含有する６mlのRPMIに、37℃にて72時間播種した。
【０１５３】
細胞を、1μl(0.54μg)のPE標識ストレプトアビジン/pHLA-A2四量体(ペプチドは、ヘテロクリティック(heteroclytic)MELペプチドELAGIGILTV又はネガティブコントロールNY-ESOペプチドSLLMWITQCのいずれかであった)を使用して容量100μlのPBS中で染色した。
室温にて20分後、細胞を５ml RPMI中で１回洗浄し、800μl RPMI中に再懸濁し、FC500 Beckman Coulter装置で分析した。
【０１５４】
結果
図19a及び図19bに示されるFACs染色データは、c1α/WTβMEL TCRをコードする非コドン最適化及びコドン最適化DNAでトランスフェクトしたJurkat細胞について得られた同族pMHC四量体染色のレベルである。これらデータは、対応する非コドン最適化DNAを用いて達成されたレベルと比較して高レベルのTCR表面発現が、コドン最適化DNAを用いて達成されたことを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１ａ】天然型MEL TCRのα鎖可変領域アミノ酸配列を示す。
【図１ｂ】天然型MEL TCRのβ鎖可変領域アミノ酸配列を示す。
【図２】可溶性型の天然型MEL TCRα鎖(ａ)及びβ鎖(ｂ)のDNA配列を示す。
【図３】図２のDNA配列から産生されるMEL TCRα鎖(ａ)及びβ鎖(ｂ)の細胞外アミノ酸配列を示す。
【図４】非天然型ジスルフィド結合を形成するための追加のシステイン残基を含むように変異した可溶性型のMEL TCRα鎖(ａ)及びβ鎖(ｂ)のDNA配列を示す。
【０１５６】
【図５】図４のDNA配列から産生されるMEL TCRα鎖(ａ)及びβ鎖(ｂ)の細胞外アミノ酸配列を示す。
【図６−１】高親和性MEL TCR変形体のα鎖可変領域アミノ酸配列を示す。
【図６−２】図６−１の続きである。
【図６−３】図６−２の続きである。
【図７】短縮形態のTRAC(ａ)、短縮形態のTRBC1(ｂ)、短縮形態のTRBC2(ｃ)のアミノ酸配列を示す。
【０１５７】
【図８ａ】pEX202プラスミドのプラスミドマップを示す。
【図８ｂ−１】pEX202プラスミドのDNA配列を示す。
【図８ｂ−２】図８ｂ−１の続きである。
【図９】ａは、好ましい可溶性高親和性MEL TCR変形体のα鎖アミノ酸配列を示す。ｂは、ペプチドリンカーを介して野生型ヒトIL-2に融合したTRBC2コード定常領域を使用する野生型可溶性MEL TCRのβ鎖アミノ酸配列をしめす。
【図１０】野生型の可溶性ジスルフィド連結MEL TCRとHLA−AAGIGILTV−HLA-A*0201との相互作用について作成したBiacore応答曲線を示す。
【０１５８】
【図１１】ヒト細胞中で増強発現を生じさせるために変異させた完全長野生型MEL TCRα鎖DNA配列(ａ)及びそれによりコードされるアミノ酸配列(ｂ)を示す。
【図１２】ヒト細胞中で増強発現を生じさせるために変異させた完全長高親和性c1 MEL TCRα鎖DNA配列(ａ)及びそれによりコードされるアミノ酸配列(ｂ)を示す。
【図１３】ヒト細胞中で増強発現を生じさせるために変異させた完全長高親和性c1d MEL TCRα鎖DNA配列(ａ)及びそれによりコードされるアミノ酸配列(ｂ)を示す。
【図１４】ヒト細胞中で増強発現を生じさせるために変異させた完全長高親和性c9 MEL TCRα鎖配列(ａ)及びそれによりコードされるアミノ酸配列(ｂ)を示す。
【０１５９】
【図１５】ヒト細胞中で増強発現を生じさせるために変異させた完全長c9 MEL TCRα鎖配列(ａ)及びそれによりコードされるアミノ酸配列(ｂ)を示す。
【図１６】Mel特異的CTLクローンの活性化を阻害する可溶性ジスルフィド連結型の高親和性c1 WT Mel TCRの能力を示すELISPOTアッセイを提供する。
【図１７】完全長野生型MEL TCRα鎖ORFがコードするDNA配列(ａ)及び野生型MEL TCRβ鎖ORFがコードするDNA配列(ｂ)を示す。
【図１８】変異アミノ酸をコードするものを除いて野生型DNAコドンを含む、完全長c1 MEL TCRα鎖ORFがコードするDNA配列を示す。
【０１６０】
【図１９】ａは、c1α/WTβMEL TCRをコードする非コドン最適化DNAでのJurkat細胞のトランスフェクションにより達成したTCR発現レベルに関するFACSデータを示す。ｂは、c1α/WTβMEL TCRをコードするコドン最適化DNAでのJurkat細胞のトランスフェクションにより達成したTCR発現レベルに関するFACSデータを示す。
【図２０】図20は、更なる高親和性MEL TCRα鎖の可変領域のアミノ酸配列を示す。
【図２１−１】高親和性MEL TCRβ鎖の可変領域のアミノ酸配列を示す。
【図２１−２】図２１−１の続きである。
【図２１−３】図２１−２の続きである。
【０１６１】
【図２２】非天然型システイン残基を含む可溶性高親和性MEL TCRα鎖のアミノ酸配列を示す。
【図２３−１】非天然型システイン残基を含む可溶性高親和性MEL TCRβ鎖のアミノ酸配列を示す。
【図２３−２】図２３−１の続きである。
【図２３−３】図２３−２の続きである。
【図１ａ】
2008545426.tif 000008
【図１ｂ】
2008545426.tif 000009
【図２】
2008545426.tif 000010
【図３】
2008545426.tif 000011
【図４】
2008545426.tif 000012
【図５】
2008545426.tif 000013
【図６−１】
2008545426.tif 000014
【図６−２】
2008545426.tif 000015
【図６−３】
2008545426.tif 000016
【図７】
2008545426.tif 000017
【図８ａ】
2008545426.tif 000018
【図８ｂ−１】
2008545426.tif 000019
【図８ｂ−２】
2008545426.tif 000020
【図９】
2008545426.tif 000021
【図１０】
2008545426.tif 000022
【図１１】
2008545426.tif 000023
【図１２】
2008545426.tif 000024
【図１３】
2008545426.tif 000025
【図１４】
2008545426.tif 000026
【図１５】
2008545426.tif 000027
【図１６】
2008545426.tif 000028
【図１７】
2008545426.tif 000029
【図１８】
2008545426.tif 000030
【図１９】
2008545426.tif 000031
【図２０】
2008545426.tif 000032
【図２１−１】
2008545426.tif 000033
【図２１−２】
2008545426.tif 000034
【図２１−３】
2008545426.tif 000035
【図２２】
2008545426.tif 000036
【図２３−１】
2008545426.tif 000037
【図２３−２】
2008545426.tif 000038
【図２３−３】
2008545426.tif 000039
【国際調査報告】
2008545426.tif 000040
2008545426.tif 000041
2008545426.tif 000042
2008545426.tif 000043
2008545426.tif 000044