(57)【要約】  式(I)：2008545776.tif 000045［式中、R2は式R7-(CH2)n-の基、または式-Alk-N(-R8)-R9の基（ここで、nは0、1、2または3であり、AlkはC1-C6アルキレンである）であり；R7は、(i) 任意にC1-C6アルキルもしくはアリールC1-C6アルキルで置換されていてもよい、唯一のヘテロ原子が窒素である、環炭素により結合した5または6の環原子の複素環、(ii) 1-アザ-ビシクロ[2.2.2]オクチ-3-イル、または(iii) 8-メチル-8-アザ-ビシクロ[3.2.1]オクチ-3-イルであり;R8およびR9は独立して、水素またはC1-C3アルキルから選択され；そして、残りの置換基は請求項で定義されたとおりである］の化合物は、PDK1およびCHK1活性の阻害剤であり、癌および自己免疫疾患の治療に役立つ。【選択図】なし
2008545776.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I)：
【化１】
2008545776.tif 000043
［式中、
R1は水素またはC1-C3アルキルであり；
R2は式R7-(CH2)n-の基、または式-Alk-N(-R8)-R9の基（ここで、nは0、1、2または3であり、AlkはC1-C6アルキレンである）であり；
R3およびR6は独立して、水素、フルオロまたはクロロから選択され；
R4およびR5は独立して、水素、C1-C6アルキル、ハロ、シアノ、C1-C6アルコキシカルボニル、C1-C6アルコキシ、トリフルオロメチル、-C(=O)-NH-R10、-NH-C(=O)-R11、ハロで任意に置換されていてもよい複素環、またはC3-C6シクロアルキル環から選択されるか；あるいは
R4およびR5は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、5-もしくは6-員の炭素環、または5-もしくは6-員の複素環を形成し；
R7は、(i) C1-C6アルキルもしくはアリールC1-C6アルキルで任意に置換されていてもよい、唯一のヘテロ原子が窒素である、環炭素を介して結合した5または6の環原子を有する複素環、(ii) 1-アザ-ビシクロ[2.2.2]オクチ-3-イル、または(iii) 8-メチル-8-アザ-ビシクロ[3.2.1]オクチ-3-イルであり;
R8およびR9は独立して、水素またはC1-C3アルキルから選択され；
R10およびR11は独立して、水素、C3-C7シクロアルキル、C1-C6アルキル、C1-C6アルコキシ-C1-C6アルキル、アリール、またはアリール-C1-C6アルキル（ここで、C1-C6アルキル部分はヒドロキシで任意に置換されていてもよい）から選択される］
の化合物またはその塩、水和物もしくは溶媒和物。
【請求項２】
R1が水素である、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
R1がメチルである、請求項1に記載の化合物。
【請求項４】
R2がピペリジン-4-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルメチル、ピペリジン-3-イルメチル、1-ベンジル-ピペリジン-4-イル、4-アミノ-ブチル、3-アミノ-プロピル、ピロリジン-2-イルメチル、ピロリジン-3-イルメチル、1-メチル-ピペリジン-4-イル、1-メチル-ピペリジン-3-イル、2-アミノ-エチルまたは1-アザ-ビシクロ[2.2.2]オクチ-3-イルである、請求項1〜3のいずれか一つに記載の化合物。
【請求項５】
R2がピペリジン-4-イルである、請求項1〜3のいずれか一つに記載の化合物。
【請求項６】
R3がフルオロである、請求項1〜5のいずれか一つに記載の化合物。
【請求項７】
R3が水素である、請求項1〜5のいずれか一つに記載の化合物。
【請求項８】
R6がフルオロである、請求項1〜7のいずれか一つに記載の化合物。
【請求項９】
R6が水素である、請求項1〜7のいずれか一つに記載の化合物。
【請求項１０】
R4が少なくとも一つの供与性窒素原子を含む複素環である、請求項1〜9のいずれか一つに記載の化合物。
【請求項１１】
R5が少なくとも一つの供与性窒素原子を含む複素環である、請求項1〜10のいずれか一つに記載の化合物。
【請求項１２】
R4およびR5が独立して、水素、メチル、フルオロ、クロロ、シアノ、エトキシカルボニル、アミノカルボニル、イソプロピルアミノカルボニル、シクロペンチルアミノカルボニル、2-メトキシエチルアミノカルボニル、2,3-ジヒドロインダン-1-イルアミノカルボニル、2-フェニルプロピルアミノカルボニル、イソプロピルカルボニルアミノ、イソブチルカルボニルアミノ、シクロプロピルカルボニルアミノ、シクロペンチルカルボニルアミノ、インドール-2-イルおよび2,3-ジヒドロベンゾフラン-4-イルから選択される、請求項1〜11のいずれか一つに記載の化合物。
【請求項１３】
R4およびR5が、それらが結合している炭素原子と一緒になって、少なくとも一つの供与性窒素原子を含む5-または6-員の複素環を形成する、請求項1〜9のいずれか一つに記載の化合物。
【請求項１４】
R4およびR5が、それらが結合している炭素原子と一緒になって、ベンゼン環、4,5-縮合イミダゾール環、または4,5-縮合ピラゾール環を形成する、請求項1〜9のいずれか一つに記載の化合物。
【請求項１５】
式(II)：
【化２】
2008545776.tif 000044
（式中、
R1は水素またはメチルであり；
R2はピペリジン-4-イル、ピロリジン-3-イルメチル、1-メチル-ピペリジン-4-イルまたは1-アザ-ビシクロ[2.2.2]オクチ-3-イルであり；
R4およびR5は独立して、水素、C1-C6アルキル、-C(=O)-NH-R10、ハロで任意に置換されていてもよい複素環、またはC3-C6シクロアルキル環から選択されるか；あるいは
R4およびR5は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、5-もしくは6-員の炭素環、または少なくとも一つの供与性窒素原子を含む5-もしくは6-員の複素環を形成し；
R10はC1-C6アルキル、シクロプロピル、2-メトキシエチル、2-フェニルプロピルまたは2-フェニルエチルである）
の化合物またはその塩、水和物もしくは溶媒和物。
【請求項１６】
R4およびR5が、それらが結合している炭素原子と一緒になって、ベンゼン環または4,5-縮合ピラゾール環を形成する、請求項15に記載の化合物。
【請求項１７】
R4およびR5が独立して、水素、イソプロピル、シクロプロピル、tert-ブチルまたは1H-インドール-2-イルから選択される、請求項15に記載の化合物。
【請求項１８】
R10がイソプロピルまたはイソブチルである、請求項15〜17のいずれか一つに記載の化合物。
【請求項１９】
請求項1〜18のいずれか一つに記載の化合物および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２０】
PDK1およびCHK1活性の阻害に応答する病態の治療用組成物の製造における、請求項1〜18のいずれか一つに記載の化合物の使用。
【請求項２１】
哺乳動物のPDK1およびCHK1活性の阻害に有効な請求項1〜18のいずれか一つに記載の化合物の量を、該哺乳動物に投与することを含む、PDK1およびCHK1活性の阻害に応答する病態に罹患している哺乳動物の治療方法。
【請求項２２】
PDK1およびCHK1活性の阻害に応答する病態が、癌および自己免疫疾患から選択される、請求項20に記載の使用または請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記の自己免疫疾患が、臓器移植拒絶、狼瘡、多発性硬化症、リウマチ性関節炎および変形性関節症である、請求項22に記載の使用または方法。
【請求項２４】
PKAおよび／またはCDK-2および／またはAKT-1活性より、PDK1およびCHK1活性の選択的阻害による、癌のための請求項22に記載の使用または方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、PDK1およびCHK1阻害活性を有する置換されたベンズイミダゾール化合物、癌および自己免疫疾患のようなPDK1およびCHK1の阻害に応答する疾病の治療に関連した医薬での該化合物の使用、および該化合物を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
PDK1
正常細胞が、悪性腫瘍細胞の表現型を獲得するためには、いくつかの障壁を克服しなければならない。最も重要なものの一つは、プログラム細胞死(アポトーシス)を回避できることである。それゆえ、細胞死機構の種々の相をダウンレギュレート(down regulating)する変異が、癌の顕著な特徴である。PI-3キナーゼ-AKT経路は、成長因子レセプターから下流のエフェクターに生き残りシグナルを伝達する。相当な数の癌細胞において、この経路が、PI-3キナーゼもしくはAkt遺伝子の増幅またはPTEN腫瘍サプレッサーの発現の消失のどちらかにより、不適切に活性化されている。この経路の活性化は、正常細胞が死亡する条件下で癌細胞が生き残ることを可能にし、腫瘍の継続的な拡張を可能にする。3'-ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ-1(PDK1)は、PI-3キナーゼ-AKT経路の本質的な成分である。PIP3の存在下、PI-3キナーゼにより生じるセカンドメッセンジャー、PDK1は、スレオニン308上のAktをリン酸化する（Akt活性化のために必須の修飾）。PDK1は、SGKおよびp70 S6キナーゼを含む、その他のある種のプロ-サバイバル(pro-survival) キナーゼの対応するスレオニン残基もリン酸化する(Vanhaesebroeck B & Alessi DR. Biochem J 346, 561-576 (2000))。
【０００３】
遺伝的に修飾されたマウスを用いた実験は、PDK1活性の正常なレベルの10％までの減少は、驚くほど十分に耐えられることを示す(Lawlor MAら、EMBO J 21, 3728-3738 (2002))。しかしながら、ある種の癌細胞は、アンチセンス-介在のPDK1活性の減少に耐える能力が低いと思われる(Flynn Pら、Curr Biol. 10, 1439-1442 (2000))。さらに、インビトロおよび細胞の双方でPDK1を阻害する小分子のセレコキシブおよびUCN-01は共に、培養腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導することができる(Aricoら、J. Biol. Chem. 277, 27613-27621(2002);Satoら、Oncogene 21, 1727-1738 (2002))。つい最近、Berlex Biosciences (Richmond USA)は、アポトーシスに導くG2-Mで細胞周期をインビトロで停止し、マウス肺転移モデルに対するインビボでの有効性も示すPDK1阻害剤を報告した(Journal of Biological Chemistry March 16 2005 Manuscript M501367200)。それゆえ、PDK1キナーゼを阻害する物質が、癌の治療に役立ち得る。
【０００４】
さらに、PDK1はT-細胞の機能および増殖に関与する。Alessiおよび共働者は、PDK1の遺伝子操作の影響を検討した(Nature Immunology 2004, 5(5), 539-545)。PDK1はAGCキナーゼの律速「上流(upstream)」活性化物質である。AGCファミリー キナーゼはT細胞発育に必須である。Alessiは、T-細胞系列の発育におけるPDK1の欠失の影響を分析し、PDK1の通常のレベルの10％までの減少の影響も評価した。完全なPDK1の損失は、胸腺におけるT細胞分化をブロックするが、正常の10％に減少されたPDK1の発現は、T細胞分化を可能にするが、増殖性の伸展をブロックした。
【０００５】
さらに、Ghoshおよび共働者は、PDK1が、PKC-シータの活性化を調節することおよびシグナル依存的なPKC-シータとCARD11の脂質ラフト(rafts)への動員(recruiting)を介することにおいて極めて重要な役割を有することを示した。PDK1と会合したPKC-シータは、IKK複合体を動員し、一方、PDK1と会合したCARD11は、Bc110-MALT1複合体を動員し、IKK複合体サブユニット（NF-kBの重要な調節剤(essential modifier)のNEMOとして知られている）のBc110-MALT1-依存的なユビキチン化を通してIKK複合体の活性化を可能とする。それゆえ、PDK1は、T-細胞においてTCR-誘導のNF-kB活性化経路の中核をなすことにより、重要な役割を果たす。それゆえ、PDK1キナーゼを阻害する物質は、臓器移植拒絶、狼瘡、多発性硬化症、リウマチ性関節炎および変形性関節症の治療に役立ち得る。
【０００６】
CHK1
多くの標準的な癌化学療法剤は、腫瘍成長阻害を引き起こすDNA損傷を誘導するそれらの能力により、主に作用する。しかしながら、これらの作用物質は、S-期またはG2-M境界のいずれかにおいてチェックポイントの誘導により細胞周期の停止を引き起こす。G2停止は、有糸分裂に入る前に、細胞が損傷されたDNAを修復するための時間を与える。Chk1および非関連(unrelated)セリン／スレオニンキナーゼ、Chk2は、G2-M境界で細胞周期を停止する際に中心的役割を果たす(O'Connellら、EMBO J (1997) vol 16 p545-554)。Chk1/2は、CDC25ホスファターゼのセリン216をリン酸化することによりこのチェックポイントを誘導し、サイクリン依存性キナーゼ(CDKs)上の2つの不活性化ホスフェート(inactivating phosphates)の除去を阻害する(Zhengら、Nature (1998) vol 395 p507-510)。
【０００７】
p53により仲介されるもう一つのオーバーラッピング経路(overlapping pathway)も、DNA-損傷に応答して周期の停止を引き起こす。しかしながら、p53は多くの癌で突然変異的に不活性化され、DNA-修復応答を起こすそれらの能力における不完全な欠損の原因となる。もし、p53-陰性の癌でもChk1活性が阻害されれば、DNA-損傷に応答してDNAを引き止めて修復する全ての能力が除去され、分裂の大変動を招き、DNA損傷作用物質の効果を増大する(Konariasら、Oncogene (2001) vol 20 p7453-7463; Bunch and Eastman Clin. Can. Res. (1996) vol 2 p791-797; Tenzer and Pruschy Curr. Med Chem (2003) vol 3 p35-46)。対照的に、正常細胞は、応答能のあるp53-介在細胞-周期停止経路の保持により比較的影響を受けないであろう。Chk1阻害剤(UCN-01)は、現行のDNA-損傷誘導化学療法の効果を改善するために、現在フェーズI臨床試験中である(Sausville ら、J. Clinical Oncology (2001) vol19 p2319-2333)。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の簡単な説明
本発明は、PDK1およびCHK1の阻害剤として、例えば癌の治療に役立つ、置換されたベンズイミダゾール化合物類に関する。複素環上をピラゾール環で置換されたコアのベンズイミダゾール環が、本発明に関する化合物の本質の特徴的な形体である。
【０００９】
本発明の詳細な説明
本発明によれば、式(I)：
【化１】
2008545776.tif 000003
［式中、
R1は水素またはC1-C3アルキルであり；
R2は式R7-(CH2)n-の基、または式-Alk-N(-R8)-R9の基（ここで、nは0、1、2または3であり、AlkはC1-C6アルキレンである）であり；
R3およびR6は独立して、水素、フルオロまたはクロロから選択され；
R4およびR5は独立して、水素、C1-C6アルキル、ハロ、シアノ、C1-C6アルコキシカルボニル、C1-C6アルコキシ、トリフルオロメチル、-C(=O)-NH-R10、-NH-C(=O)-R11、ハロで任意に置換されていてもよい複素環、またはC3-C6シクロアルキル環から選択されるか；あるいは
R4およびR5は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、5-もしくは6-員の炭素環、または5-もしくは6-員の複素環を形成し；
R7は、(i) C1-C6アルキルもしくはアリールC1-C6アルキルで任意に置換されていてもよい、唯一のヘテロ原子が窒素である、環炭素を介して結合した5または6の環原子を有する複素環、(ii) 1-アザ-ビシクロ[2.2.2]オクチ-3-イル、または(iii) 8-メチル-8-アザ-ビシクロ[3.2.1]オクチ-3-イルであり;
R8およびR9は独立して、水素またはC1-C3アルキルから選択され；
R10およびR11は独立して、水素、C3-C7シクロアルキル、C1-C6アルキル、C1-C6アルコキシ-C1-C6アルキル、アリール、またはアリール-C1-C6アルキル（ここで、C1-C6アルキル部分はヒドロキシで任意に置換されていてもよい）から選択される］
の化合物またはその塩、水和物もしくは溶媒和物が提供される。
【００１０】
式(I)の活性な化合物は、PDK1およびCHK1の阻害剤であり、PDK1およびCHK1により介在される疾病の治療、予防および抑制に役立つ。本発明は、PDK1およびCHK1を選択的に阻害するために、したがって、癌および自己免疫疾患の治療におけるこれらの化合物の使用に関する。
【００１１】
本明細書中で使用される、「(Ca-Cb)アルキル」（ここで、aおよびbは整数である）の用語は、a〜bの炭素原子数を有する直鎖または分枝鎖状のアルキル基を意味する。したがって、例えばaが1で、bが6である場合、その用語はメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、t-ブチル、n-ペンチルおよびn-ヘキシルを含む。
【００１２】
本明細書中で使用される、「2価の(Ca-Cb)アルキレン基」（ここで、aおよびbは整数である）の用語は、a〜bの炭素原子数および2つの非結合原子価を有する飽和の炭化水素鎖を意味する。
本明細書中で使用される、「シクロアルキル」の用語は、3〜8の炭素原子を有する飽和炭素環式基を意味し、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチルを含む。
【００１３】
本明細書中で使用される、「炭素環式」の用語は、存在する単独の環が8員環を超えない条件で、環原子が全て炭素である単環または2環式基を意味し、単環式のアリール、シクロアルキルおよびシクロアルケニル基を含む。「炭素環式」グループは、単一に架橋または複数に架橋された環状アルキルグループを含む。
本明細書中で使用される、「アリール」の用語は、単環、2環または3環の炭素環式芳香族基を意味する。そのような基の例は、フェニル、ビフェニルおよびナフチルである。
【００１４】
本明細書中で使用される、「ヘテロアリール」の用語は、S、NおよびOから選択される1以上のヘテロ原子を含む、単環、2環または3環の芳香族基を意味する。そのような基の例は、チエニル、ベンゾチエニル、フリル、ベンズフリル、ピロリル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、チアゾリル、ベンズチアゾリル、イソチアゾリル、ベンズイソチアゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、ベンズオキサゾリル、イソオキサゾリル、ベンズイソオキサゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、ベンズトリアゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、インドリルおよびインダゾリルである。
【００１５】
本明細書中で使用される、「複素環式」の用語は、上記の「ヘテロアリール」を含み、特に、S、NおよびOから選択される1以上のへテロ原子を含む、単環、2環または3環の非芳香族基、もう一つのそのような基もしくは単環の炭素環式基と共有結合する1以上のそのようなヘテロ原子を含む単環式の非芳香族基からなるグループ、および単一に架橋または複数に架橋された、S、NおよびOから選択される1以上のヘテロ原子を含む、単環、2環または3環の非芳香族基を意味する。そのような基の例は、ピロリル、フラニル、チエニル、ピペリジニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、ピラゾリル、ピリジニル、ピロリジニル、ピリミジニル、モルホリニル、ピペラジニル、インドリル、モルホリニル、ベンズフラニル、ピラニル、イソオキサゾリル、ベンズイミダゾリル、メチレンジオキシフェニル、エチレンジオキシフェニル、マレイミドおよびスクシイミド基である。
【００１６】
本明細書中で使用される、「供与性窒素原子」の用語は、カルボニル酸素または孤立電子対のような、水素結合アクセプターと相互作用する可能性を有する、共有結合した水素原子を有する窒素原子を意味する。
【００１７】
本明細書中で使用される、「塩」の用語は、塩基付加塩、酸付加塩および4級塩を含む。酸性である本発明の化合物は、アルカリ金属水酸化物、例えばナトリウムおよびカリウムの水酸化物；アルカリ土類金属水酸化物、例えばカルシウム、バリウムおよびマグネシウムの水酸化物；有機塩基、例えばN-エチルピペリジン、ジベンジルアミン等のような塩基と、医薬的または動物薬的に許容される塩を含む塩を形成できる。塩基性であるこれらの化合物(I)は、例えば塩化水素酸または臭化水素酸のようなハロゲン化水素酸、硫酸、硝酸またはリン酸等の無機酸、および例えば酢酸、酒石酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、サリチル酸、クエン酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸等の有機酸と、医薬的または動物薬的に許容される塩を含む塩を形成できる。
【００１８】
好適な塩の評価には、StahlおよびWermuthによるHandbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use(Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002)を参照されたい。
「溶媒和物」の用語は、本発明の化合物と医薬的に許容される1以上の溶媒分子、例えばエタノールの化学量論的な量とを含む分子複合体を表すために、本明細書中で使用される。「水和物」の用語は、該溶媒が水のときに用いられる。
【００１９】
本発明に関する化合物は、不斉原子または回転制限の存在により、1以上の立体異性の形態で存在してもよく、各キラル中心でのRまたはS立体化学を有する多くの立体異性体として、または各キラル軸でのRまたはS立体化学を有するアトロプ異性体として存在することができる。本発明はそのようなエナンチオマーおよびジアステレオマーならびにそれらの混合物全てを含む。
【００２０】
式(I)の化合物のいわゆる「プロドラッグ」も本発明の範囲内である。したがって、それ自身では薬理活性をほとんど有しないか、または有しないかもしれない式(I)の化合物のある種の誘導体が、生体内または体表に投与されたとき、例えば加水分解により所期の活性を有する式(I)の化合物に変換され得る。そのような誘導体を「プロドラッグ」と呼ぶ。プロドラッグの使用におけるさらなる情報は、Pro-drugs as Novel Delivery Systems, 14巻, ACS Symposium Series (T. HiguchiおよびW. Stella)およびBioreversible Carriers in Drug Design, Pergamon Press, 1987 (編集者 E. B. Roche, American Pharmaceutical Association)中に見出され得る。
【００２１】
本発明によるプロドラッグは、例えば、式(I)の化合物中に存在する適当な官能性を、例えばH. BundgaardによるDesign of Prodrugs (Elsevier, 1985)中に記載されているような、「プロ-部分(pro-moieties)」として当業者に公知のある部分で交換することによって、製造することができる。
【００２２】
式(I)の化合物の代謝物、すなわち薬物の投与でインビボで形成される化合物も、本発明の範囲内に含まれる。代謝物のいくつかの例は、
(i) 式(I)の化合物がメチル基を含む場合、そのヒドロキシメチル誘導体(-CH3 → -CH2OH)；
(ii) 式(I)の化合物がアルコキシを含む場合、そのヒドロキシ誘導体(-OR → -OH);
【００２３】
(iii) 式(I)の化合物が3級アミノ基を含む場合、その2級アミノ誘導体(-NR1R2 → -NHR1または-NHR2)；
(iv) 式(I)の化合物が2級アミノ基を含む場合、その1級誘導体(-NHR1 → -NH2)；
(v) 式(I)の化合物がフェニル部分を含む場合、そのフェノール誘導体(-Ph → -PhOH)；および
(vi) 式(I)の化合物がアミド基を含む場合、そのカルボン酸誘導体(-CONH2 → COOH)
を含む。
【００２４】
式(I)に存在する可変の置換基は、ここに、さらに定義される。開示されたあらゆる置換基または置換基のクラスが、その他の開示されたあらゆる置換基のクラスと組み合わせて存在してもよいことが、さらなる記載において推測される。
【００２５】
R1基
R1は水素またはC1-C3アルキルである。現在のところ、R1が水素またはメチルであるのが好ましい。R1がメチルである化合物が、特に好ましい。
【００２６】
R2基
R2は、式R7-(CH2)n-の基または式-Alk-N(-R8)-R9の基である。本発明に関する化合物のサブクラスは、nが0または1であり、R7が、任意にC1-C6アルキルまたはアリール-C1-C6アルキルにより置換されていてもよい、唯一のヘテロ原子が窒素である、環炭素により結合した5または6の環原子の複素環である。そのような場合、現在のところ、R2がピペリジン-4-イル、ピロリジン-3-イルメチル、1-メチル-ピペリジン-4-イルまたは1-アザ-ビシクロ[2.2.2]オクチ-3-イルであるのが好ましい。R2がピペリジン-4-イル、ピロリジン-3-イルメチルまたは1-メチル-ピペリジン-4-イルである化合物が特に好ましい。その他の構造において、例えばR8およびR9が共に水素で、Alkがエチル、プロピルまたはブチルであってもよい。
【００２７】
R3およびR6基
R3およびR6は独立して、水素、フルオロまたはクロロから選択される。現在のところ、R3およびR6が独立して、水素またはフルオロから選択される化合物が好ましく、特に水素である化合物が好ましい。
【００２８】
R4およびR5基
R4およびR5は独立して、水素、C1-C6アルキル、ハロ、シアノ、C1-C6アルコキシカルボニル、C1-C6アルコキシ、トリフルオロメチル、-C(=O)-NH-R10、-NH-C(=O)-R11もしくは複素環から選択されるか；またはR4およびR5は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、5-もしくは6-員の炭素環、または5-もしくは6-員の複素環を形成する。現在のところ、好ましい化合物の一つのクラスは、R4およびR5が独立して、水素、メチル、フルオロ、クロロ、シアノまたはエトキシカルボニルから選択されるものである。現在のところ、好ましい化合物のもう一つのサブクラスは、R10およびR11が独立して、水素、イソプロピル、イソブチル、シクロプロピル、C1-C6アルキル、2-メトキシエチル、2-フェニルプロピルまたは2-フェニルエチルから選択される場合である。その他の構造において、R4およびR5がインドール-2-イルまたは2,3-ジヒドロベンゾフラン-4-イルであってもよい。現在のところ、R4およびR5が一緒になって5-または6-員環を形成する場合、-CH=CH-CH=CH-、-NH-CH=N-、または-NH-N=CH-を形成するのが好ましい。
【００２９】
本発明のさらなる観点によれば、治療における使用のために式(I)の化合物が提供される。
本発明のさらなる観点によれば、PDK1およびCHK1により介在される疾患の治療のための医薬の製造における式(I)の化合物の使用が提供される。
【００３０】
本発明のさらなる観点によれば、式(I)の化合物、またはその医薬的に許容される塩もしくはプロドラッグの有効な用量を、PDK1およびCHK1により介在される疾患の治療を必要とする対象物に投与することを含む、該疾患の治療方法が提供される。
【００３１】
PDK1およびCHK1により介在される疾患は、癌および自己免疫疾患から選択される。
本発明は、特に、癌、臓器移植拒絶、狼瘡、多発性硬化症、リウマチ性関節炎および変形性関節症を指向する。
【００３２】
本発明は、ヒトまたは動物の対象物、より好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの患者に関して用いられ得る。
本明細書で使用されるように、ここで使用される「治療」の用語は、予防的治療を含む。
【００３３】
式(I)の化合物は、上記の疾患の治療に役立つ、1以上のさらなる薬物と組み合わせて用いられてもよく、それらの成分は、同時投与または連続投与のために、同じ製剤中または別個の製剤中に存在してもよい。
【００３４】
あらゆる特定の患者の具体的な投与量のレベルは、用いられる具体的な化合物の活性、年齢、体重、身体全体の健康、性別、食事、投与時間、投与経路、排泄速度、薬剤の組合せならびに治療を受ける特定の疾病の原因となるメカニズムおよび重篤度を含む種々の因子に依存することが理解されるだろう。一般的に、経口投与製剤の適切な投与量は、通常、1日当たり1回、2回もしくは3回で、0.1〜3000 mgの範囲であるか、または点滴もしくはその他の経路により投与される1日量に等しい量であろう。しかしながら、最適な投与量レベルおよび投与回数は、当該技術分野で慣習的なように、臨床試験により決定されるであろう。
【００３５】
本発明に関する化合物は、それらの薬物動態の性質に合致するあらゆる経路による投与用に製造され得る。経口投与可能な組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、トローチ剤、経口用、局所用もしくは無菌非経口用溶液または懸濁液のような液体またはゲル製剤の形態にされ得る。経口投与用の錠剤およびカプセル剤は、単位投与量の提示形態であってもよく、結合剤（例えばシロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、またはポリビニル-ピロリドン）；充填剤（例えば乳糖、砂糖、トウモロコシ澱粉、リン酸カルシウム、ソルビトールまたはグリシン）；錠剤用滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールまたはシリカ）；崩壊剤（例えば馬鈴薯澱粉）；またはラウリル硫酸ナトリウムのような許容される湿潤剤のような慣用の賦形剤を含んでもよい。錠剤は、通常の製剤実務でよく知られた方法によりコーティングされてもよい。
【００３６】
経口液体製剤は、例えば水性もしくは油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップまたはエリキシルの形態であり得るか、又は使用前に、水またはその他の適当な媒体で再調製される乾燥品として存在し得る。そのような液体製剤は、懸濁化剤（例えばソルビトール、シロップ、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン 水素化食用脂）；乳化剤（例えばレシチン、ソルビタンモノオレエート、またはアラビアゴム）；（食用油を含み得る）非水溶性媒体（例えばアーモンド油、ヤシ油、グリセリンのような油状エステル、プロピレングリコール、またはエチルアルコール）；保存剤（例えばメチルもしくはプロピル p-ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）のような慣用の添加剤、および所望の場合慣用の着香剤または着色剤を含み得る。
【００３７】
皮膚への局所適用に対して、薬物はクリーム、ローションまたは軟膏にされ得る。薬物に対して使用され得るクリームまたは軟膏製剤は、当該技術分野でよく知られた、例えば英国薬局方のような製薬の標準的な教科書に記載されているような医薬の慣用の製剤である。
【００３８】
活性な成分は、無菌媒体中で非経口的に投与もされ得る。使用される媒体および濃度により、薬物は、媒体に懸濁または溶解のいずれかにされ得る。有利には、局所麻酔剤、保存剤および緩衝剤のような佐剤が媒体中に溶解され得る。
【００３９】
本発明に関する化合物の合成に対して多数の合成戦略があるが、全ては公知の化学に依存し、合成有機化学者に公知である。したがって、式(I)による化合物は、標準的な文献に記載され、当業者によく知られた方法により合成することできる。典型的な文献源は、「Advanced organic chemistry」(第4版、(Wiley), J March)、「Comprehensive Organic Transformation」(第2版、(Wiley), R.C. Larock)、「Handbook of Heterocyclic Chemistry」(第2版、(Pergamon), A.R. Katritzky)、「Synthesis」、「Acc. Chem. Res.」、「Chem. Rev」中に見られるような総説、またはオンラインの標準的な文献検索によりまたは「Chemical Abstracts」もしくは「Beilstein」のような2次的情報源から特定された1次文献源である。そのような文献の方法は、本明細書中の製造実施例の方法、およびそれらの類似の方法を含む。
【００４０】
式(I)の化合物への好適なルートは、以下のスキーム1、2および3に示される。
全ての例は、官能化されたピラゾール-4-カルボン酸エステル(例えば参考例3)または対応するピラゾール-4-カルボン酸(例えば参考例4)を経るどちらかのキー中間体を経て製造された。
【００４１】
R1における変形は、ヒドラジン水和物で対応するピラゾールに環化(参考例3)の前に、3-オキソ-酪酸エステルのアシル化(参考例2)におけるアシル化剤の選択により導入される。R1 = H の場合、対応するピラゾールは、ヒドラジンで環化の前に、ジメチルホルムアミドジメチルアセタールを用いる3-オキソ-酪酸エステルの熱的縮合を経て得られる。
【００４２】
合成の容易さのため、R3、R4、R5およびR6の変形を有する実施例は、選択されたアミンR2とピラゾール-4-カルボン酸(参考例4)との最初のカルボジイミドカップリングを経て製造された。得られたカルボキシアミドは、スキーム2に示すように、その場所で(in-situ)の酸化剤として重亜硫酸ナトリウムを用いる酸化的環化より前に、二酸化マンガンを用いてアルデヒド体(参考例8)を前もって形成し進行させた。
【００４３】
R2における変形を増やすためのより好都合なルートが、スキーム3に示される。ピラゾール-4-カルボン酸(参考例4)は、ベンズイミダゾール ピラゾール-4-カルボン酸ベンジルエステル(参考例6)を与える酸化的環化より前に、最初にベンジルエステル体として保護され、続いて、同様にアルコールへの脱保護と酸化がされた。このことは、水素化により、対応する最終段階の中間体の酸へ変換されることを容易にした(参考例7)。高温(通常50〜70℃)でのカルボジイミドカップリングはR2の合成を速めた。
【００４４】
あるいは、R3、R4、R5およびR6における抵抗力のある官能性により、エチルエステル体(参考例3)は、カルボジイミドカップリングより前にケン化を用いて、スキーム3に示された方法と類似の方法で進行させることができた。
R4またはR5での芳香族および複素芳香族置換基は、対応するフェニレンジアミン(参考例9)への水素化および適当なアルデヒド(参考例8)との酸化的環化の前に、2-ニトロアニリンの5-ブロモでのスズキカップリングにより導入される。
【００４５】
【化２】
2008545776.tif 000004
【実施例】
【００４６】
次の実施例は、本発明の具体的な化合物の製造と活性を説明する。
参考例1
4-tert-ブトキシ-3-オキソ-酪酸エチルエステルの合成
【化３】
2008545776.tif 000005
【００４７】
ジメチルホルムアミド(400ml)中の水素化ナトリウム(70g 鉱油中60%分散)の懸濁液を、0℃で、エチル-4-クロロアセテート(90g)、次いでtert-ブチルアルコール(81g)で滴下処理した。混合物を0℃で維持し、次いで2時間かけて室温に戻した。混合物を2N塩酸／氷(900ml)中に注ぎ、次いで酢酸エチルで3回抽出した。合わせた有機物を硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発した。得られた黄色油状残渣を、ヘキサン〜酢酸エチルとヘキサン(1:9, v/v)の勾配で溶出するシリカのフラッシュカラムクロマグラフィーに付し、標記化合物(76g)を黄色の油状物として得た。1H-NMR (400MHz, CDCl3) δH 1.20(9H s) 1.25(3H t), 3.54(2H s), 4.00(2H s), 4.19(2H q)
【００４８】
参考例2
2-アセチル-4-tert-ブトキシ-3-オキソ-酪酸エチルエステルの合成
【化４】
2008545776.tif 000006
【００４９】
ジクロロメタン(500ml)中の4-tert-ブトキシ-3-オキソ-酪酸エチルエステル(76g)の溶液を氷水浴中で冷却し、粉末の4Åモレキュラーシーブス(40g)および乾燥塩化マグネシウム(36g)で処理した。15分後、混合物を5分かけてピリジン(61ml)で処理し、冷却を維持して、20分間撹拌を続けた。塩化アセチル(27ml)を氷冷下、10分かけて滴下添加し、全体を16時間かけて室温に戻した。反応を飽和塩化アンモニウム溶液(300ml)でクエンチ(quenched)し、全体を酢酸エチル(1リットル)で希釈した。全体をセライトのパッドを通して濾過し、層を分配した。有機物を食塩水でさらに洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、蒸発して2-アセチル-4-tert-ブトキシ-3-オキソ-酪酸エチルエステル(88g)を黄色油状物として得、これをさらに精製することなく用いた。
【００５０】
参考例3
3-tert-ブトキシメチル-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボン酸エチルエステル
【化５】
2008545776.tif 000007
【００５１】
氷酢酸(600ml)中の2-アセチル-4-tert-ブトキシ-3-オキソ-酪酸エチルエステル(88g)の溶液をヒドラジン水和物(20ml)で滴下処理し、混合物を室温で16時間撹拌した。反応混合物を蒸発し、酢酸エチルと飽和重炭酸ナトリウム溶液の間で分配した。有機物を硫酸マグネシウムで乾燥し蒸発した。残渣をヘキサン〜酢酸エチルとヘキサン(1:3, v/v)の勾配で溶出するシリカ(600g)のパッドを通して溶出した。フラクションを蒸発し、放置により結晶化する標記化合物(74g)を金色の油状物として得た。1H-NMR (400MHz, D6 DMSO) δH 1.19(9H s), 1.26(3H t), 2.34(3H s), 4.18(2H q), 4.54(2H s ブロード).
【００５２】
参考例4
3-tert-ブトキシメチル-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボン酸の合成
【化６】
2008545776.tif 000008
【００５３】
エタノール(400ml)中の3-tert-ブトキシメチル-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボン酸エチルエステル(63g)の溶液を、10%水酸化ナトリウム(水溶液)(800ml)で処理し、混合物を16時間還流した。冷却した反応混合物の容積を減らし、氷水浴中でさらに冷却した。pHを＜1に調整した。生じたクリーム色の沈殿を濾過により回収し、さらなる水で素早く洗浄した。固体を真空オーブン中で16時間乾燥し、標記化合物(29g)を得た。1H-NMR (400MHz, DMSO) δH 1.19(9H s), 2.36(3H, s), 4.58(2H s).
【００５４】
参考例5
3-ヒドロキシメチル-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボン酸ベンジルエステルの合成
【化７】
2008545776.tif 000009
【００５５】
3-tert-ブトキシメチル-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボン酸(1.0g 5.0 mmol)の1g (5.0 mmol)を、メタノール(20 ml)中の炭酸セシウム(0.815g 2.5 mmol)で処理し、窒素下、室温で1時間撹拌した。混合物を蒸発乾固し、得られた塩をDMF(10ml)中のベンジルブロマイド(0.60 ml 5.0 mmol)で処理し、全体を3時間撹拌した。混合物の容積を減らし、酢酸エチルと0.5N HCl(水溶液)との間で分配した。有機層を5% 重炭酸ナトリウム(水溶液)および食塩水でさらに洗浄した。有機物を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、蒸発した。粗残渣をトリフルオロ酢酸で処理し、窒素下、室温で4時間撹拌した。混合物を再度蒸発し、トルエン(3×20 ml)での共沸により乾燥し、粗アルコールを酢酸エチルで溶出するフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製した。フラクションを蒸発し、所期のアルコールを無色の固体(0.61 g)として得た。LC/MS: RT 2.03 (M+H+ 247 & M+Na+ 269) 1H-NMR (400MHz CDCl3) δH 2.45(3H s), 4.81(2H s ブロード), 5.27(2H s), 7.31-7.39(5H m 芳香族) 
【００５６】
参考例6
3-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボン酸ベンジルエステルの合成
【化８】
2008545776.tif 000010
【００５７】
3-ヒドロキメチル-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボン酸ベンジルエステル(0.61 g)をDME(20 ml)に溶解し、二酸化マンガン(2.16 g 24.8 mmol)で処理し、80℃で1時間加熱した。混合物を温かい間にセライトを通して濾過し、セライトを温かいメタノールでさらに洗浄した。合わせた濾液を蒸発し、残渣をフェニレンジアミン(0.3g 2.75 mmol)およびアセトニトリル(4 ml)中の重亜硫酸ナトリウム(0.43g 4.14 mmol)で処理し、160℃で10分間、マイクロウエーブ(Smith Synthesiser)中で加熱した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、蒸発した。粗3-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボン酸ベンジルエステルを酢酸エチルで摩砕することにより精製した。濾過により回収し、標記の化合物を無色の固体(0.206 g)として得た。LC/MS: RT 2.18, ([M+H]+ 333). 1H-NMR (400MHz DMSO) δH 2.50(3H s), 5.21(メジャー)および5.34(マイナー) (2H s), 7.20 - 7.70(9H 芳香族)
【００５８】
参考例7
3-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボン酸の合成
【化９】
2008545776.tif 000011
【００５９】
メタノール(5 ml)およびジクロロメタン(10 ml)中の3-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボン酸ベンジルエステル(0.070 g 0.21 mmol)および10% Pd/C (0.01g 触媒的)の混合物を、室温で1時間、水素雰囲気下で振盪した。反応混合物を5ミクロンの孔の膜フィルターにより濾過し、蒸発した。残渣をメタノールで摩砕し、濾過し、標記の化合物を無色の固体(0.02g 39%)として得た。LC/MS RT: 1.74, ([M+H]+ 243) 1H-NMR (400MHz D6 DMSO) δH 2.57(3H s), 7.33 - 7.73(4H, 芳香族)
【００６０】
参考例8
4-[(3-ホルミル-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボニル)-アミノ]-ピペリジン-1-カルボン酸ベンジルエステルの合成
【化１０】
2008545776.tif 000012
【００６１】
4-[(3-tert-ブトキシメチル-1H-ピラゾール-4-カルボニル)-アミノ]-ピペリジン-1-カルボン酸ベンジルエステル(17.39g, 41.95mmol)をDCM(20mL)中でスラリーにした。水浴で冷却している間に、TFA(50mL)を少しずつ加えた。さらにTFAの20mLを3回、1時間間隔で加え、混合物を室温で一晩撹拌した。溶液を濃縮し、残渣をTHF(150mL)および5% 水酸化リチウムの混合物に溶解した。混合物を室温で1時間撹拌した。THFを減圧下に除去し、混合物を酢酸エチルで2回抽出した。有機物を食塩水および水で洗浄し、乾燥し、濃縮して褐色の油状物を得た。次いで、油状物をDME(200mL)中でスラリーにした。酸化マンガン(II)(39.6g, 558mmol)を加え、混合物を70℃に加熱した。1時間後、混合物を熱時濾過し、残渣を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機物を濃縮し、残渣を酢酸エチルと水の間で分配した。次いで、有機物を水および食塩水で洗浄し、乾燥し、濃縮して9.90gの緑色の油状物を得、これをさらに精製することなく次の反応に用いた。LCMS (RT 2.21分 [M+H]+ 371)
【００６２】
参考例9
2-(3,4-ジアミノ-フェニル)-インドール-1-カルボン酸tert-ブチルエステルの合成
【化１１】
2008545776.tif 000013
【００６３】
DMF(10mL)に、4-ブロモ-2-ニトロアニリン(250mg, 1.15mmol)、[1-(tert-ブトキシカルボニル)-インドール-2-ボロン酸(390mg, 1.5mmol)、重炭酸ナトリウム(290mg, 6.9 mmol)、およびビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)クロライド(40mg, 0.057mmol)を加えた。水(1mL)を加え、混合物を脱気し、窒素下、90℃に加熱した。2時間後、混合物を室温まで冷却し、そこに水(10mL)を加えた。すぐに赤色の沈殿が生じ、これを濾過し、水および冷却したメタノールで洗浄し、赤色の固体を得た。次いで、この固体をメタノール(20mL)中に採取し、触媒量の10% パラジウム炭を加えた。混合物を室温で24時間水素化した。次いで、混合物を濾過し、紫／黒色の溶液を濃縮し、目的物の紫／黒色結晶(0.37g, 99%)を得た。LCMS (方法A) (RT 2.53分 [M+H]+ 324.; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δH 1.40 (s, 9H), 6.50 (s, 1H), 6.82 (m, 3H), 7.28 (m, 2H), 7.53 (d, J = 7.62 Hz, 1H), 8.16 (d, J = 8.23 Hz, 1H).
【００６４】
参考例10
2-[4-(1-ベンジルオキシカルボニル-ピペリジン-4-イルカルバモイル)-1H-ピラゾール-3-イル]-1H-ベンゾイミダゾール-5-カルボン酸の合成
【化１２】
2008545776.tif 000014
2N NaOHおよびメタノール(20mL)の1：1混合物に、2-[5-メチル-4-(ピペリジン-4-イルカルバモイル)-1H-ピラゾール-3-イル]-3H-ベンズイミダゾール-5-カルボン酸エチルエステル(586mg, 1.10mmol)を加えた。混合物を60℃に加熱した。1時間後、メタノールを減圧下に除去し、水溶液を10% HClの添加により中和した。溶液を酢酸エチルで抽出し、水で洗浄した。乾燥後、溶液を濃縮し、白色の粉末を得た(500mg, 90%)。LCMS (RT 2.17分, [M+H]+ 503); 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δH 1.75 (m, 2H), 3.13 (m, 2H), 2.65 (s, 3H), 3.42 (m, 2H), 4.11 (m, 2H), 4.22 (m, 1H), 5.20 (s, 2H), 7.40 (m, 7H), 7.61 (d, J = 8.47Hz, 1H), 7.99 (ブロード, 1H), 8.31 (br, 1H).
【００６５】
参考例11
1-クロロ-2-イソプロペニル-4-ニトロベンゼンの合成
【化１３】
2008545776.tif 000015
【００６６】
THF(10 ml)中のメチルトリフェニルホスホニウムブロマイド(1.07g, 3.0 mmol)の溶液に、窒素下、0℃でn-ブチルリチウム(2.5M ヘキサン溶液, 1.21 ml, 3.0 mmol)を加えた。混合物を5分間撹拌した後、THF(3 ml)中の2-クロロ-5-ニトロアセトフェノン(0.5g, 2.5 mmol)を0℃で滴下添加した。混合物を0℃に維持し、次いで室温に一晩放置した。反応混合物を冷却し、1N HCl(水溶液)(20 ml)でクエンチした。その溶液を酢酸エチルで抽出し、食塩水で洗浄し、乾燥(MgSO4)し、濃縮した。得られた黄色の油状残渣をヘキサンで溶出するフラッシュカラムクロマトグラフィーに付し、標記の化合物(0.17g, 35%)を透明な油状物として得た。1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ2.13(1H, s ブロード), 5.07 (1H, s ブロード), 5.36 (1H, s ブロード), 7.53 (1H d), 8.08 (2H, m 芳香族).
【００６７】
参考例12
4-クロロ-3-イソプロピル-フェニルアミンの合成
【化１４】
2008545776.tif 000016
【００６８】
エタノール(5 ml)中の1-クロロ-2-イソプロペニル-4-ニトロベンゼン(0.134g, 0.68 mmol)および5% Pt/C (0.020g, 触媒的)の混合物を、水素雰囲気下、室温で2時間振盪した。触媒を除去するために反応混合物を濾過し、蒸発して標記化合物を褐色の油状物(0.114g, 99%)として得た。LC/MS: RT 2.38 (方法A) [M+H]+ 170; 1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ1.20 (6H, d), 3.31 (1H, m), 6.51 (1H, dd), 6.66 (1H, d), 7.10 (1H, d).
【００６９】
参考例13
4-クロロ-5-イソプロピル-2-ニトロ-フェニルアミンの合成
【化１５】
2008545776.tif 000017
【００７０】
トリフルオロ酢酸無水物(20 ml)中の4-クロロ-3-イソプロピル-フェニルアミン(2.11g, 12.48 mmol)の溶液を、0℃で、分割してKNO3(1.32g, 13.06 mmol)で処理した。溶液を氷浴中で2時間撹拌し、次いで1時間かけて室温に戻した。溶液を氷-水(100 ml)で希釈し、次いでジクロロメタンで2回抽出した。合わせた有機物を食塩水で洗浄し、乾燥(MgSO4)し、濃縮した。得られた橙色の油状物をメタノール(30 ml)に溶解し、室温で7% (w/w)K2CO3水溶液(20 ml)で処理した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。メタノールを減圧下除去し、水(50 ml)で希釈し、ジクロロメタンで3回抽出した。合わせた有機物を食塩水で洗浄し、乾燥(MgSO4)し、濃縮した。得られた褐色の固形残渣をヘキサン〜酢酸エチルとヘキサン(1:9, v/v)の勾配で溶出するシリカのフラッシュカラムクロマトグラフィーに付し、標記化合物(1.92g, 72%)を橙色の固体として得た。1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ1.80 (6H, d), 3.87 (1H, m), 7.82 (1H, s), 8.69 (1H, s).
【００７１】
参考例14
3-(5-クロロ-6-イソプロピル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボン酸エチルエステルの合成
【化１６】
2008545776.tif 000018
【００７２】
4-クロロ-5-イソプロピル-2-ニトロ-フェニルアミン(1g, 4.66 mmol)および3-ホルミル-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボン酸エチルエステル(参考例5および6と類似の方法で製造、0.85g, 4.66 mmol)の懸濁液を、1M Na2S2O4(水溶液)(2.43g, 13.97 mmol)で処理し、90℃で一晩加熱した。冷却した反応混合物を5N NH4OH(水溶液)(30 ml)で滴下処理した。すぐに沈殿が生じ、次いで濾過し、水で洗浄し、真空下に乾燥して標記の化合物(1.01g, 63%)を白色固体として得た。LC/MS: RT 2.50 (方法A) [M+H]+ 347; 1H-NMR (400MHz, D6 DMSO + TFA) δ 1.25 (9H, m), 2.53 (3H, s), 3.41 (1H, m), 4.32 (2H, q), 7.84 (1H, s ブロード), 7.92 (1H, s ブロード).
【００７３】
参考例15
4-シクロプロピル-2-ニトロ-フェニルアミン
【化１７】
2008545776.tif 000019
4-シクロプロピル-2-ニトロ-フェニルアミンは、4-ブロモ-2-ニトロアニリンから出発し、参考例9と類似の方法により製造された。LC/MS: RT 2.30 (方法A) [M+H]+ 179.
【００７４】
参考例16
3-(6-シクロプロピル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボン酸エチルエステル
【化１８】
2008545776.tif 000020
3-(6-シクロプロピル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボン酸エチルエステルは、参考例14と類似の方法により製造された。LC/MS: RT 1.95 (方法A) [M+H]+ 311.
【００７５】
実施例1
3-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボン酸ピペリジン-4-イルアミドの合成
【化１９】
2008545776.tif 000021
【００７６】
DMF(40 mL)中の3-tert-ブトキシメチル-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボン酸(500 mg, 2.36 mmol)、EDC(1.35 g, 3当量)、HOBt(975 mg, 3当量)、4-アミノ-(1N-tertブトキシカルバメート)ピペリジン(945 mg, 2当量)およびDIPEA (1.25 mL, 3当量)の混合物を50℃で4.5時間加熱し、次いで冷却した。混合物を蒸発し、クロロホルムと水の間で分配した。層を分離し、水相をクロロホルム(×2)で抽出した。合わせた有機抽出物を食塩で洗浄し、乾燥(MgSO4)し、濃縮した。粗生成物を熱EtOAc - ヘキサン(1:4; 20 mL)で結晶化／摩砕し、冷却し、濾過し、EtOAc-ヘキサンで洗浄し、吸引乾燥して3-ヒドロキシメチル-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボン酸ピペリジン-4-イルアミド(545 mg, 58%)を淡橙色の粉末として得た。
【００７７】
DCM(3 mL)中の3-tert-ブトキシメチル-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボン酸ピペリジン-4-イルアミド(200 mg, 0.51 mmol)の撹拌溶液に、氷-水で冷却し、トリフルオロ酢酸(3 mL)を加えた。撹拌反応混合物を室温に戻し、4.5時間撹拌した。混合物を蒸発し、粗3-ヒドロキシメチル-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボン酸ピペリジン-4-イルアミド(395 mg)を得、さらに精製することなく次の工程に用いた。
【００７８】
3-ヒドロキシメチル-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボン酸ピペリジン-4-イルアミド(0.51 mmolと仮定)を、DME(10 mL)中で、二酸化マンガン(85%; 500 mg, 10当量)で処理した。室温で1時間撹拌後、混合物を45分間加熱還流した。この時間の後、MeOHを加え、得られた熱い懸濁液をセライトにより濾過し、熱いMeOHで溶出した。蒸発により、3-ホルミル-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボン酸ピペリジン-4-イルアミドを琥珀色の油状物として得、次の工程に直接用いた。
【００７９】
DMF(3 mL)中の3-ホルミル-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボン酸ピペリジン-4-イルアミド(0.51 mmolと仮定)の溶液に、EtOH(1 mL)、1,2-フェニレンジアミン(55 mg, 1当量)および重亜硫酸ナトリウム(95 mg, 1.8当量)を加えた。混合物を密封したマイクロウエーブ容器中で、160℃で10分間加熱した。蒸発および逆相の分取(preparative)HPLC(方法B)により、標記化合物を淡黄色の泡／固体(67.4 mg)として得た。この物質の22 mgを再精製(逆相の分取HPLC、方法B)し、3-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボン酸ピペリジン-4-イルアミドの分析的に純粋な試料をオフホワイトの固体(14 mg)として得た。
【００８０】
LC/MS 保持時間 1.38分 (方法A) m/z 325 (M+H, 100%). 1H-NMR (400 MHz; d6-DMSO) δH 11.98 (1 H, d, J 6.6 Hz), 8.42 (1 H, s), 7.63 (2 H, br s), 7.24-7.30 (2 H, m), 4.02-4.11 (2 H, m), 3.20-3.28 (2 H, m), 2.92-3.01 (2 H, m), 2.57 (3 H, s), 2.00-2.08 (2 H, m)および1.70-1.82 (2 H, m). 
【００８１】
実施例2
3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボン酸ピペリジン-3-イルアミドの合成
【化２０】
2008545776.tif 000022
【００８２】
DMF(100ml)中の3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボン酸(参考例7と類似の方法で製造)(0.99g)、EDC(0.85 g)、HOBt(0.54 g)、3-アミノ-ピペリジン-1-カルボン酸ベンジルエステル(0.94 g)およびTEA(1.1 ml)の混合物を、50℃で16時間撹拌した。混合物を酢酸エチル(200 ml)で希釈し、1N HCl(水溶液)(50 ml)、5% 重炭酸ナトリウム(水溶液)(50 ml)および食塩水(50 ml)で洗浄した。有機物を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、次いで純粋な酢酸エチルで溶出するシリカのパッドを通した。選択されたフラクションを合わせ、蒸発し、残渣をジエチルエーテルで摩砕することにより固体とし、濾過により固体を回収し、乾燥した。固体をDMF(200ml)に溶解し、60℃で48時間、10% パラジウム炭上、大気圧で水素化した。触媒を除去するために反応混合物を濾過し、蒸発した。残渣をメタノールで摩砕することにより再度固体とし、濾過により回収し、標記の化合物(0.78g)を得た。(LC/MS RT: 1.73, [M+H]+ 352), 1H-NMR (400MHz, D6 DMSO) δH 1.44- 1.47(4H m), 2.73(2H s ブロード), 2.94(2H s ブロード), 2.33(6H s), 2.57(3H s), 2.63(2H t), 2.80(2H d), 3.04(2H d), 3.83(2H,m), 11.82(2H d)
【００８３】
実施例3
3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボン酸(1-メチル-ピペリジン-3-イル)-アミドの合成
【化２１】
2008545776.tif 000023
【００８４】
メタノール(100ml)中に(0.1g)を溶解し、過剰のホルムアルデヒド水溶液(33容積%)(1ml)で処理し、16時間水素化した。触媒を濾過により除去し、残渣を10% メタノール、2% 7N メタノール中のアンモニア、残りはジクロロメタンの混合物で溶出するフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製した。選択されたフラクションを蒸発し、残留固体をアセトニトリルで摩砕し、濾過により回収した。無色の固体をジエチルエーテルでさらに洗浄し、真空下に乾燥して、標記の化合物0.062gを得た。(LC/MS RT: 1.76, [M+H]+ 367) (1H-NMR- D6 DMSO) δH 1.45 -1.56(2H m), 1.83(2H s ブロード), 2.20(3H s), 2.33(6H s), 2.56(3H s), 3.97(1H ブロード), 7.28(1H s 芳香族), 7.40(1H s 芳香族)
【００８５】
実施例4
3-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボン酸(3-アミノ-プロピル)-アミドの合成
【化２２】
2008545776.tif 000024
【００８６】
(3-｛[3-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボニル]-アミノ｝-プロピル)-カルバミン酸tert-ブチルエステル(0.04 g)をジクロロメタン(5 ml)中で撹拌し、トリフルオロ酢酸(5ml)で処理し、混合物を窒素下で2時間撹拌した。反応混合物を蒸発乾固し、トルエンから2回再蒸発した。残渣をジエチルエーテルで摩砕し、濾過により標記化合物(0.04 g 97%)を得た。(LC/MS RT: 1.45, [M+H]+ 298), 1H-NMR (400MHz D6 DMSO) δH 1.91(2H m), 2.57 (3H s), 2.98(2H s ブロード), 3.45(2H m), 7.30(2H m), 7.65(1H s ブロード), 7.78(2H s ブロード)
【００８７】
実施例5
5-メチル-3-(1H-ナフト[2,3-d]イミダゾール-2-イル)-1H-ピラゾール-4-カルボン酸ピペリジン-4-イルアミドの合成
【化２３】
2008545776.tif 000025
【００８８】
DMF中の3-tert-ブトキシメチル-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボン酸(3.71 g)、EDC(4 g)、HOBt(2.84 g)、4-アミノ(1N-tertブトキシカルバメート)ピペリジン(3.5 g)およびTEA(7.2 ml)の混合物を、50℃で16時間撹拌した。混合物を酢酸エチル(200 ml)で希釈し、1N HCl(水溶液)(50 ml)、5% 重炭酸ナトリウム(水溶液)(50 ml)および食塩水(50 ml)で洗浄した。有機物を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、蒸発した。残渣をトリフルオロ酢酸(10 ml)で処理し、3時間撹拌した。混合物を再蒸発し、トルエンとの共沸により乾燥した。得られた3-ヒドロキシメチル-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボン酸ピペリジン-4-イルアミドを、ジクロロメタン中、室温、窒素下、ジ-tert-ブチルジカーボネート(2.68 g)およびTEA (3.4 ml)で処理した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、1N HCl(水溶液)、5% 重炭酸ナトリウム(水溶液)で洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過した。濾液を蒸発し、DME(20ml)中、二酸化マンガン(0.87 g)で処理し、80℃で2時間加熱した。混合物をセライトにより熱時濾過し、マンガンを温メタノールでさらに洗浄した。合わせた濾液を蒸発し、アセトニトリル(50 ml)中の残渣を2,3-ジアミノナフチレン(0.32 g)および重亜硫酸ナトリウム(0.42 g)で処理し、混合物を16時間還流した。反応混合物を冷却し、容積を減らし、酢酸エチルと1N HCl(水溶液)の間で分配し、有機層を5% 重炭酸ナトリウム(水溶液)および食塩水で洗浄した。有機物を再度乾燥し、蒸発した。残渣を純粋な酢酸エチル(RF 0.30)で溶出するフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製した。フラクションを集め、残留固体まで蒸発した。残渣をメタノールに溶解し、過剰のHCl ジオキサンで処理し、窒素下、室温で3時間撹拌した。反応混合物を蒸発乾固し、残渣を10% (2N メタノール中のアンモニア)含むジクロロメタンで溶出してフラッシュした(flashed)。フラクションを集め、蒸発し、得られた無色の残渣をアセトニトリルで摩砕し、濾過して、標記の化合物(0.31g 4%)を得た。(LC/MS: RT 1.78 [M+H]+ 375 ) 1H-NMR (400MHz D6 DMSO) δH 1.89(2H m), 2.10(2H d), 2.60(3H s), 3.05(2H t), 3.31(2H m),  4.13(1H m), 7.41(2H d), 8.04(2H d), 12.03(1H d)
【００８９】
実施例6
2-[5-メチル-4-(ピペリジン-4-イルカルバモイル)-1H-ピラゾール-3-イル]-3H-ベンズイミダゾール-5-カルボン酸エチルエステルの合成
【化２４】
2008545776.tif 000026
【００９０】
4-[(3-ホルミル-1H-ピラゾール-4-カルボニル)-アミノ]-ピペリジン-1-カルボン酸ベンジルエステル(50mg, 0.135mmol)をアセトニトリル(20mL)中でスラリーにした。3,4-ジアミノ-安息香酸エチルエステル(25mg, 0.135mmol)および重亜硫酸ナトリウム(17mg, 0.162mmol)を加えた。混合物を48時間加熱還流し、その後、濃縮し、酢酸エチル中に採取し、水、次いで食塩水で洗浄した。次いで有機物を乾燥し、濃縮し、DMF(20mL)中に採取した。触媒量のバラジウム炭を加え、混合物を脱気し、60℃で24時間水素化した。次いで、混合物を濾過し、濃縮し、逆相HPLC (方法B)で精製し、標記の化合物をクリーム色の固体(10.1mg, 15%)として得た。LCMS  (RT 1.72分, [M+H]+  397); 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δH 1.32 (m, 3H), 1.65 (m, 2H), 1.95 (m, 2H), 2.22 (m, 2H), 2.54 (s, 3H), 3.17 (m, 2H), 3.84 (m, 1H), 4.32 (m, 2H), 7.66 (d, J = 8.53 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 8.49 Hz, 1H), 8.21 (s, 1H).
【００９１】
実施例7
2-[5-メチル-4-(ピペリジン-4-イルカルバモイル)-1H-ピラゾール-3-イル]-3H-ベンズイミダゾール-5-カルボン酸シクロペンチルアミドの合成
【化２５】
2008545776.tif 000027
【００９２】
DMF(10mL)に2-[4-(ピペリジン-4-イルカルバモイル)-1H-ピラゾール-3-イル]-1H-ベンゾイミダゾール-5-カルボン酸(50mg, 0.1mmol)を加えた。この混合物に、EDCI(57mg, 0.299mmol)、HOBt(40mg, 0.299mmol)、およびジイソプロピルエチルアミン(0.05mL, 0.299mmol)を加えた。シクロペンチルアミン(25mg, 0.299mmol)を加え、混合物を室温で2時間撹拌した。混合物を酢酸エチルと水の間で分配し、得られた有機層を水、1N HClおよび食塩水で1回洗浄した。乾燥後、溶液を濃縮し、黄色の油状物を得、それをDMF(20mL)中に採取した。触媒量のパラジウム炭を加え、混合物を脱気し、60℃で24時間水素化した。次いで、混合物を濾過し、濃縮し、逆相のHPLC(方法B)で精製し、標記の化合物をクリーム色の固体(8.67mg, 20%)として得た。LCMS  1.684MIN  436.10; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δH  1.55 (m, 4H), 1.70 (m, 4H), 1.97 (m, 4H), 2.53 (s, 3H), 2.76 (m, 4H), 3.99 (m, 1H), 4.27 (m, 1H), 7.55 (d, J = 8.45 Hz, 1H), 7.67 (d, J = 8.44 Hz, 1H), 8.03 (s, 1H).
【００９３】
実施例8
3-[6-(1H-インドール-2-イル)-1H-ベンズイミダゾ-2-イル]-5-メチル-1H-ピラゾール-4-カルボン酸ピペリジン-4-イルアミドの合成
【化２６】
2008545776.tif 000028
【００９４】
4-[(3-ホルミル-1H-ピラゾール-4-カルボニル)-アミノ]-ピペリジン-1-カルボン酸ベンジルエステル(50mg, 0.135mmol)をアセトニトリル(10mL)中でスラリーにした。これに、2-(3,4-ジアミノ-フェニル)-インドール-1-カルボン酸tert-ブチルエステル(44mg, 0.135mmol)を加えた。重亜硫酸ナトリウム(23 mg, 0.27mmol)を加え、混合物を加熱還流した。24時間後、混合物を濃縮し、酢酸エチルと水の間で分配した。食塩水で洗浄後、有機物を乾燥し、濃縮して、橙色の油状物を得た。ジクロロメタン(1mL)、次いでTFA(5mL)を加え、混合物を室温で2時間撹拌した。次いで、混合物をトルエンで2回共沸することにより濃縮し、暗緑色の油状物を得た。DMF、次いで触媒量のパラジウム炭を加え、混合物を脱気し、60℃で水素化した。24時間後、混合物を濾過し、濃縮し、分取スケールのHPLCで精製して、クリーム色の固体(5.9mg, 10%)を得た。LCMS (RT 1.94分, [M+H]+  440); 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δH 1.88 (m, 2H), 2.18 (m, 2H), 2.70 (s, 3H), 3.15 (m, 2H), 3.47 (m, 2H), 4.12 (m, 1H), 6.89 (t, J = 7.40Hz, 1H), 7.01 (t, J = 7.38Hz, 1H), 7.28 (d, J = 8.05 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 8.58 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 9.26 Hz, 1H), 7.67 (s, 1H), 7.98 (s, 1H).
【００９５】
次の表の実施例9〜47は、上記の実施例1〜8と類似の方法により製造された。36の化合物全て、以下の評価のセクションに記載されたキナーゼの評価において活性が試験された。各ケースで得られた結果を示す。
【００９６】
全ての実施例は、同様のセリン／スレオニンキナーゼと対比してPDK1およびCHK1に対して予想されなかった選択性、Akt1(＞70倍)、PKA(＞30倍)およびCDK2(＞15倍)を示す。Upstateで行われた幅広いキナーゼのスクリーニングは、実施例(1および5)が、Abl(h)、CK1e(h)、CK2(h)、IKKa(h)、JNK1a1(h)、MEK1(h)、MKK6(h)、NEK2(h)、PDGFRa(h)、PLk3(h)、ROCK-II(h)、SAPK2a(h)と対比して＞20倍の選択性を示すことを示した。さらに、実施例(14)は、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、Flt1 IGF-1R、ITK、KDR、PDGFRa、Syk、Tie2と対比して＞20倍の選択性を示した。
【００９７】
【表１−１】
2008545776.tif 000029
【００９８】
【表１−２】
2008545776.tif 000030
【００９９】
【表１−３】
2008545776.tif 000031
【０１００】
【表１−４】
2008545776.tif 000032
【０１０１】
【表１−５】
2008545776.tif 000033
【０１０２】
【表１−６】
2008545776.tif 000034
【０１０３】
【表１−７】
2008545776.tif 000035
【０１０４】
【表１−８】
2008545776.tif 000036
【０１０５】
【表１−９】
2008545776.tif 000037
【０１０６】
【表１−１０】
2008545776.tif 000038
【０１０７】
次の実施例は、PDK-1に対してIC50＜0.05μMを有する。
【表２】
2008545776.tif 000039
【０１０８】
次の実施例は、PDK-1およびCHK-1に対してIC50＜0.5μMを有する。
【表３】
2008545776.tif 000040
【０１０９】
実施例において、特徴付けおよび／または精製は、方法AおよびBに記載された条件を用いて、液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)および高性能液体クロマトグラフィーを含む標準的な分光法およびクロマトグラフ法を用いて行われた。NMR実験は、特定の溶媒中、Bruker DPX400ウルトラ シールド(ultra shield)NMR分光計で行われた。マイクロウエーブ照射下で行われた反応は、Smith Synthesizer中で行われた。
【０１１０】
LCMS 方法A
器具：HP1100
カラム：Luna 3 μm, C18(2), 30 mm×4.6 mm i.d.（Phenomenexから）
温度：22℃
溶媒：A - 水＋10 mmol/ L 酢酸アンモニウム＋0.08% (v/v)ギ酸
B - 95% アセトニトリル-5% 溶媒A＋0.08% (v/v)ギ酸
【０１１１】
勾配：
【表４】
2008545776.tif 000041
【０１１２】
検出：230、254および270 nmでのUV検出
質量分光計：HP1100 MSD、シリーズA
イオン化はポジティブまたはネガティブイオンエレクトロスプレーであった。
分子量スキャン範囲は120〜1000であった。
【０１１３】
方法B
器具：Waters FractionLynx MS自動精製システム
カラム：Luna 5 μm, C18(2), 100 mm×21.2 mm i.d.（Phenomenexから）
温度：室温
溶媒：A - 水＋0.08% (v/v)ギ酸
B- 95% メタノール-水＋0.08% (v/v)ギ酸
流速：20 cm3 分-1
【０１１４】
勾配：
【表５】
2008545776.tif 000042
【０１１５】
検出：光ダイオードアレイ210〜400 nm
質量分光計：MicroMass ZQ
イオン化はポジティブまたはネガティブイオンエレクトロスプレーであった。
分子量スキャン範囲は150〜1000であった。
回収(Collection)：選択されたマスイオンでのトリガー(Triggered)
【０１１６】
評価プロトコル
PDK1
PDK依存性キナーゼ活性に対する評価は、合成ペプチドKTFCGTPEYLAPEVRREPRILSEEEQEMFRDFDYIADWCのリン酸化をモニタリングするこにより行った。阻害剤およびPDK1酵素を含む評価混合物を、マイクロタイタープレート中で、50μlの最終容積で一緒に混合し、30℃で60分間インキュベートした。評価混合物は、0.01 mM 非ラベル化ATP、0.01μCi/μl 33P-γ-ATP、0.075mM ペプチド、 0.1mg/ml BSA、7.5mM 酢酸マグネシウム、0.05M Tris.HCl,pH 7.5、0.5% 2-メルカプトエタノールを含んでいた。反応を50mM リン酸の50μlを加えることにより停止した。混合物の90μlを、前もって湿らせた96-ウエルのMultiscreen MAPHNOB濾過(filtration)プレート(Millipore)に移し、真空マニホールドで濾過した。フィルタープレートを50mMリン酸200μlの3連続添加、次いで100μlのメタノールで洗浄した。濾過プレートを65℃で10分間乾燥し、シンチラント(scintillant)を加え、シンチレーション・カウンタ(Trilux, PerkinElmer)でリン酸化されたペプチドを定量した。
【０１１７】
CHK1
Chk1キナーゼ活性に対する評価は、アミノ酸配列、KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPRを有する合成ペプチドChktideのリン酸化をモニタリングことにより行った。阻害剤およびChk1酵素を含む評価混合物を、マイクロタイタープレート中で、50μlの最終容積で一緒に混合し、30℃で40分間インキュベートした。
評価混合物は、0.01 mM 非ラベル化ATP、0.5μCi 33P-γ-ATP、30μM Chktide、0.1mg/ml BSA、50mM Hepes-NaOH pH 7.5および11nM GST-Chk1酵素を含んでいた。反応を50mM リン酸の50μlを加えることにより停止した。混合物の90μlを、前もって湿らせた96-ウエルのmulti-screen MAPHNOB濾過プレート(Millipore)に移し、真空マニホールドで濾過した。フィルタープレートを50mMリン酸200μlの3連続添加、次いで100μlのメタノールで洗浄した。濾過プレートを65℃で10分間乾燥し、シンチラントを加え、シンチレーション・カウンタ(Trilux, PerkinElmer)でリン酸化されたペプチドを定量した。
【０１１８】
CDK2
サイクリン依存性キナーゼ活性に対する評価は、合成ペプチド、HATTPKKKRKのリン酸化をモニタリングすることにより行った。阻害剤およびサイクリンA(0.4U/ml)と複合化したCDK-2酵素を含む評価混合物を、マイクロタイタープレート中で、50μlの最終容積で一緒に混合し、30℃で40分間インキュベートした。評価混合物は、0.01 mM 非ラベル化ATP、0.01μCi/μl 33P-γ-ATP、0.03mM ペプチド、0.1mg/ml BSA、7.5mM 酢酸マグネシウム、50mM HEPES-NaOH,pH 7.5を含んだ。反応を50mM リン酸の50μlを加えることにより停止した。混合物の90μlを、前もって湿らせた96-ウエルのMultiscreen MAPHNOB濾過プレート(Millipore)に移し、真空マニホールドで濾過した。フィルタープレートを50mMリン酸200μlの3連続添加、次いで100μlのメタノールで洗浄した。濾過プレートを65℃で10分間乾燥し、シンチラントを加え、シンチレーション・カウンタ(Trilux, PerkinElmer)でリン酸化されたペプチドを定量した。
HEPESはN-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N'-[2-エタンスルホン酸]である。
BSAはウシ血清アルブミンである。
【０１１９】
Akt1
Akt評価に対するプロトコルは、3nM Akt1 (Upstate)を、基質としてのヒストン(Histone)H1と、200μMの最終ATP濃度で用いた以外は、CDK2に対するのと同じである。反応は30℃で40分間インキュベートした。
【０１２０】
PKA
PKA評価に対するプロトコルは、PKA酵素(Upstate)の10ユニットを、基質としての0.75μM Kemptideと、100μMの最終ATP濃度で用いた以外は、CDK2に対するのと同じである。PKA評価は30℃で30分間インキュベートした。
【国際調査報告】
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