(57)【要約】【課題】  高いプロセッシビティと鎖置換活性とを併せもつ精製組換えＤＮＡポリメラーゼを提供する。バクテリオファージＤＮＡポリメラーゼをコードする単離核酸、並びにＤＮＡを増幅するためのキット及び方法も提供する。【解決手段】  （ａ）配列番号１のアミノ酸配列２〜５５７、（ｂ）配列番号１の８アミノ酸残基以上の断片、（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）に基づく単離ポリペプチドであって、（ａ）又は（ｂ）の配列からの逸脱の９５％以上が保存的置換である単離ポリペプチド、及び（ｄ）上記（ａ）又は（ｂ）の単離ポリペプチドとのアミノ酸配列相同性が６５％以上の単離ポリペプチドからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドであって、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する単離プリペプチド。【選択図】  図１
2008526204.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列２〜５５７、
（ｂ）配列番号１の８アミノ酸残基以上の断片、
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）に基づく単離ポリペプチドであって、（ａ）又は（ｂ）の配列からの逸脱の９５％以上が保存的置換である単離ポリペプチド、及び
（ｄ）上記（ａ）又は（ｂ）の単離ポリペプチドとのアミノ酸配列相同性が６５％以上の単離ポリペプチド
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドであって、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する単離プリペプチド。
【請求項２】
以下の（ｉ）〜（ｖｉ）：
（ｉ）配列番号２のヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド配列の縮重変異であるヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列２〜５５７を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸配列２〜５５７の保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｖ）配列番号１のアミノ酸配列２〜５５７の中程度の保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は
（ｖｉ）上記（ｉ）〜（ｖ）のいずれかのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列
のいずれかの核酸分子を含むように形質転換した宿主細胞又はその子孫を、上記核酸分子でコードされるタンパク質が発現する条件下で培養することを含む方法で産生される単離ポリペプチド。
【請求項３】
以下の（ｉ）〜（ｖｉ）：
（ｉ）配列番号２のヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド配列の縮重変異であるヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）配列番号２との配列相同性が９０％以上のヌクレオチド配列、
（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸配列２〜５５７を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｖ）配列番号１の２〜５５７との配列相同性が９０％以上のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、及び
（ｖｉ）上記（ｉ）〜（ｖ）のいずれかのヌクレオチド配列の完全相補配列であるヌクレオチド配列
からなる群から選択される配列を有するポリヌクレオチドを含む単離核酸であって、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸。
【請求項４】
以下の（ｉ）〜（ｖｉ）：
（ｉ）配列番号２のヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド配列の縮重変異であるヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）配列番号２との配列相同性が９５％以上のヌクレオチド配列、
（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸配列２〜５５７を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｖ）配列番号１の２〜５５７との配列相同性が９５％以上のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、及び
（ｖｉ）上記（ｉ）〜（ｖ）のいずれかのヌクレオチド配列の完全相補配列であるヌクレオチド配列
からなる群から選択される配列を有するポリヌクレオチドを含む単離核酸であって、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸。
【請求項５】
以下の（ｉ）〜（ｖｉ）：
（ｉ）配列番号２のヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド配列の縮重変異であるヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）配列番号２との配列相同性が９９％以上のヌクレオチド配列、
（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸配列２〜５５７を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｖ）配列番号１の２〜５５７との配列相同性が９９％以上のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉ）上記（ｉ）〜（ｖ）のいずれかのヌクレオチド配列の完全相補配列であるヌクレオチド配列と
からなる群から選択される配列を有するポリヌクレオチドを含む単離核酸であって、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸。
【請求項６】
請求項３記載の単離核酸を含んでなる複製可能なベクター。
【請求項７】
請求項３記載の単離核酸を含んでなる発現ベクター。
【請求項８】
請求項６記載の複製可能なベクターを含むように形質転換した宿主細胞、又は前記複製可能なベクターを含有するその子孫。
【請求項９】
請求項７記載の発現ベクターを含むように形質転換した宿主細胞、又は前記発現ベクターを含有するその子孫。
【請求項１０】
ポリペプチドの生産方法であって、請求項９記載の宿主細胞を、前記核酸でコードされるタンパク質が発現する条件下で培養することを含んでなる方法。
【請求項１１】
発現したタンパク質を単離する段階をさらに含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
核酸鋳型とプライマーと核酸ポリメラーゼと１種類以上のヌクレオシドポリリン酸とのポリメラーゼ反応を含む核酸増幅方法であって、上記ポリメラーゼ反応を請求項１記載のＤＮＡポリメラーゼを用いて実施することを改良点とする方法。
【請求項１３】
増幅をＲＣＡ（rolling circle amplification）法、ＳＤＡ（strand displacement amplification）法又はＮＡＳＢＡ（nucleic acid sequence based amplification）法によって増幅を実施する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項１記載のＤＮＡポリメラーゼを含む、ＤＮＡ配列決定用又は増幅用キット。
【請求項１５】
１組のランダム配列プライマーをさらに含む、請求項１４記載のキット。
【請求項１６】
前記プライマーが４〜１０ヌクレオチドの鎖長のものである、請求項１５記載のキット。
【請求項１７】
前記プライマーが六量体である、請求項１５記載のキット。
【請求項１８】
前記プライマーがヌクレアーゼ耐性である、請求項１５記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ増幅に適したＤＮＡポリメラーゼに関する。具体的には、本発明は鎖置換活性を有するバクテリオファージΦ１５ＤＮＡポリメラーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ配列決定では、一方の末端が一定で他方の末端が異なる一本鎖ＤＮＡ断片の集団が４種類生成する。可変的な末端は常にある所定のヌクレオチド塩基（グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）又はシトシン（Ｃ）のいずれか）で停止する。異なる４種類の断片は高分解能ポリアクリルアミドゲルで各々それらの鎖長に基づいて分離され、ゲル上の各バンドはＤＮＡ配列の特定のヌクレオチドと共線的に対応するので、そのヌクレオチド塩基の配列中の位置が同定される。
【０００３】
一般に２通りのＤＮＡ配列決定法がある。一つの方法（マクサム・ギルバート法）は各々その一方の末端を１つの放射性標識で標識した単離ＤＮＡ断片の化学分解によるものであり、各反応は４種類の塩基（Ｇ、Ａ、Ｔ、又はＣ）の１種類以上の位置で特異的に限定的な切断を生じる。この方法は一般にＤＮＡポリメラーゼを一切必要としないが、もう一方のジデオキシ配列決定法が過去２５年間にわたって種々の改良を加えられているため、人気を失っている。
【０００４】
第二の方法（ジデオキシ法）ではＤＮＡ鎖を酵素で合成する。４種類の合成を別々に行って、各反応で適当な鎖伸長停止ジデオキシヌクレオチドの取込みを介して特定の塩基（Ｇ、Ａ、Ｔ、又はＣ）で鎖の伸長を停止させる。ＤＮＡ断片が（末端標識ではなく）均一に標識され、大きなＤＮＡ断片ほど放射能が強いので、後者の方法が好ましい。さらに、３２Ｐ標識ヌクレオチドに代えて３５Ｓ標識ヌクレオチドを用いることもでき、シャープな解像度が得られる。また、各レーンはＧ、Ａ、Ｔ又はＣのいずれかにしか対応しないので、反応生成物の解釈が簡単である。大半のジデオキシ配列決定法で用いられる酵素は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメント（「クレノー」）、ＡＭＶ逆転写酵素及びＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ（特許文献１）である。配列決定に用いられるＴ７  ＤＮＡポリメラーゼはプロセッシブで、エキソヌクレアーゼ活性を一切伴わず、ヌクレオチドアナログの取込みを区別せず、小さなオリゴヌクレオチドもプライマーとして利用できるので、他のＤＮＡポリメラーゼよりも有利であると記載されている。こうした特性から、このポリメラーゼはＤＮＡ配列決定に理想的なものとなると記載されている（上掲）。
【０００５】
ターゲットＤＮＡ分子の増幅手段は、増幅ＤＮＡがその後のＤＮＡ配列決定、クローニング、マッピング、遺伝子型同定、プローブの生成及び診断検査を始めとする分析法に多用されるので有用である。
【０００６】
核酸を増幅できる確立された方法が幾つか存在する。これらの方法の大部分は、特異的なプローブ又はプライマーを用いた所定又は特定のＤＮＡターゲットの増幅に関して設計されている。例として、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法、ＬＣＲ（ligase chain reaction）法、３ＳＲ（self-sustained sequence replication）法、ＮＡＳＢＡ（nucleic acid sequence based amplification）法、ＳＤＡ（strand displacement amplification）法及びＱβレプリカーゼ（非特許文献１、非特許文献２）での増幅が挙げられる。
【０００７】
さらに、幾つかの方法はプラスミド又はＭ１３などのバクテリオファージ由来のＤＮＡのような環状ＤＮＡ分子の増幅に利用されている。一つの（クローニング）方法は単にこれらの分子を適当な大腸菌宿主株で増殖させた後、十分に確立されたプロトコル（非特許文献３）でＤＮＡを単離することである。ＰＣＲも、プラスミド又はＭ１３などのバクテリオファージ由来のＤＮＡのようなＤＮＡターゲットの特定の配列の増幅に多用されている方法である（非特許文献４）。これらの方法の幾つかは、手間とコストと時間がかかり、非効率的で、感度が悪いという問題がある。
【０００８】
こうした方法の改良法であるＬＲＣＡ（linear rolling circle amplification）法では、環状ターゲットＤＮＡ分子にアニールしたプライマーを使用し、ＤＮＡポリメラーゼを加える。増幅ターゲットサークル（ＡＴＣ）は新たなＤＮＡが合成される鋳型として作用し、ポリメラーゼがプライマーを連続鎖として伸長させる。ポリメラーゼが鋳型を一周すると、生成した鎖を置換して鋳型を複製し続け、サークルに相補的な配列が連なった反復配列を生じる。このプロセスでは、数時間の反応で数百、さらには数千もの鋳型のコピーを生じることができ、コピーの数は経時的に直線的に（加速せずに）増加する。ＬＲＣＡの改良法が指数関数的ＲＣＡ（ＥＲＣＡ）である。指数関数的又は加速増幅を達成するため、複製された相補鎖にアニールする追加のプライマーを用いる。これは生成鎖に新らたな増幅中心を生じて、加速・指数関数的な反応速度及び増幅の増大をもたらす。指数関数的ローリングサークル増幅（ＥＲＣＡ）では、ＨＲＣＡとも呼ばれる鎖置換反応のカスケードを用いる（非特許文献５）。しかし、ＥＲＣＡでは、環状ＤＮＡターゲット分子にアニールする１種類のプライマーと生成鎖用の１種類のプライマーしか使用できない。もう一つの制限は、プライマーを作製するため、環状ターゲット配列内の特定のＤＮＡ配列を知る必要があることである。さらに、環状ＤＮＡターゲット分子は、ニックの入った又は少なくとも部分的に一本鎖となった環状のものでなければならない。
【０００９】
こうした短所の幾つかを解消する別の方法（本明細書では、多重プライミングローリングサークル増幅（ＭＰＲＣＡ（multiply-primed rolling circle amplification）と呼ぶ）は、個々のターゲットサークルの増幅に複数のプライマーを用いることによって、複数の特異的プライマーを用いてローリングサークル増幅を実施する。これは、各環状鋳型分子上の複数の成長点で合成が一段と速やかに進行するという利点を有する。すべてのプライマーが環状ターゲット鎖にしかアニールしなければ増幅は直線的となるが、両方の鎖にプライマーを与えると増幅は指数関数的となる。
【００１０】
この方法は、サークル内の既知又は未知のターゲットＤＮＡの「インビトロクローニング」つまり生物へのクローニングを必要としないクローニングの機構を与える。パドロックプローブを用いるとギャップ充填法でサークル中にターゲット配列をコピーすることができる（非特許文献５）。或いは、他の多くの慣用法によって、ターゲット配列を環状ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡにコピー又は挿入することができる。ＲＣＡ増幅では、生物内でのクローニングによってＤＮＡの増幅収率を得る必要性が解消される。
【００１１】
特異的なターゲット増幅が広く用いられているが、ターゲット試料中のすべての配列の全体的増幅も有用である。これはＭＰＲＣＡにおいて任意又はランダム配列のプライマーの集合を用いて達成できる。こうすると、未知の配列の環状ターゲットＤＮＡ分子の増幅が達成できる。もう一つの利点は、一本鎖又は二本鎖環状ターゲットＤＮＡ分子の増幅を等温及び／又は室温で実施できる。他の利点として、ローリングサークル増幅の新らたな用途に極めて有用であり、低コストで、低濃度のターゲットサークルにも感度が高く、順応性、特に検出試薬の使用に関して順応性があり、汚染の危険性が低いことが挙げられる（特許文献２、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。
【００１２】
ある実施形態では、反応系に存在しかねないエキソヌクレアーゼ活性による分解に耐性の複数のプライマーを用いることによって増幅産物のＤＮＡ収率を向上させる方法を用いる。これは、エキソヌクレアーゼ活性を有し、長時間のインキュベーションで実施される反応でプライマーが存続し続けることができるという利点を有する。プライマーが存続し続けると、反応の全インキュベーション時間で新たなプライミングを起こうことができる。これはＥＲＣＡの特質の一つであり、増幅ＤＮＡの収率を増大させるという利点をもつ。
【００１３】
ランダムプライマーＲＣＡも二本鎖産物を生成するという利点をもつ。これは環状鋳型の複製で生成した直鎖状ｓｓＤＮＡ産物が、ＤＮＡ合成のランダムプライミングによってそれ自体二本鎖の形態に変換されるからである。二本鎖ＤＮＡ産物は、いずれの鎖でもＤＮＡ配列決定でき、しかも制限酵素消化、並びにクローニング、標識及び検出に用いられる他の方法も行えるという利点がある。
【００１４】
縮重プライマー（非特許文献９）及びランダムプライマー（非特許文献１０）を用いて全ゲノム増幅を行う方法が発表されており、これらの方法では、ゲノムＤＮＡのような複雑なターゲット混合物のサブセットが増幅される。複雑さの低減がこれらの方法の目的である。
【００１５】
しかし、バクテリオファージΦ２９（ＰＨＩ２９）由来のＤＮＡポリメラーゼをランダム配列六量体プライマーと併用すると、指数関数的ＭＰＲＣＡ機構による環状ＤＮＡ配列の全体的増幅に特に有利であることが判明した。さらに、この組合せが、多重置換増幅のためのＭＤＡと呼ばれるプロセスにおける直鎖状ＤＮＡ分子の増幅にも有効であることも判明した。バクテリオファージλの５０ｋｂ染色体又は単離ヒト染色体ＤＮＡのような大きな直鎖状分子の増幅が可能である。この方法は、Φ２９ＤＮＡポリメラーゼのもつ独特な特性、すなわち、プロセッシビティと、合成中に鋳型鎖にアニールした鎖を置換する能力（いわゆる鎖置換活性）とを利用したものである（非特許文献１１）。ほとんどのＤＮＡポリメラーゼは鋳型にアニールした鎖に遭遇すると減速又は停止するが、Φ２９ＤＮＡポリメラーゼは、二本鎖鋳型から鎖を置換しなければならない場合にも、一本鎖ＤＮＡにおけるのと同じ合成速度を有する。また、ほとんどのＤＮＡポリメラーゼが鋳型に結合しているのは、数ヌクレオチドから約１０００のヌクレオチドを重合するのに十分な期間でしかない。ポリメラーゼが離れるとその特定の部位で合成が停止し、その後で別の分子ポリメラーゼが結合したときにしか合成は再開されない。対照的に、Φ２９ＤＮＡポリメラーゼは、数千ものヌクレオチドを重合するまで停止せずに結合し続け、長く伸びた鋳型配列の合成を伸ばす。併せて、こうしたΦ２９ＤＮＡポリメラーゼの独特な特性から、六量体のようなランダム配列プライマーを用いたＭＤＡ及びＭＰＲＣＡに特に有効なものとなる。
【００１６】
種々のＤＮＡポリメラーゼを用いた実験から、これらの酵素の多くはＭＤＡによる増幅には対応しないことが判明した。これは、一本鎖鋳型での合成で既にコピーされた領域のような鋳型ＤＮＡの二本鎖領域にこうした酵素が遭遇すると減速又は停止するためと推定される。そのため、試料中の一本鎖ＤＮＡがすべて二本鎖ＤＮＡに変換されると合成が止まる。このため増幅は最大２倍に制限されるが、Φ２９ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡを百万倍以上に容易に増幅する。
【特許文献１】米国特許第４７９５６９９号明細書
【特許文献２】米国特許第６３２３００９号明細書
【非特許文献１】Birkenmeyer and Mushahwar, J. Virological Methods, 35:117-126 (1991); Landegren, Trends Genetics, 9:199-202 (1993)
【非特許文献２】Landegren, Trends Genetics, 9:199-202 (1993)
【非特許文献３】Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
【非特許文献４】PCR Protocols, 1990, Ed. M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, Academic Press, San Diego.
【非特許文献５】Lizardi, P. M. et al. Nature Genetics, 19, 225-231 (1998)
【非特許文献６】Genomics 2002 Vol. 80, No. 6, 691-8
【非特許文献７】Biotechniques 2002 June Suppl. 44-47
【非特許文献８】Genome Research, 2001 Vol. 11 No. 6, 1095-9
【非特許文献９】Cheung, V. G. and Nelson, S. F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 14676-14679 (1996)
【非特許文献１０】Zhang, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5847-5851 (1992)
【非特許文献１１】Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 May 3;102(18):6407-12
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
新規なポリメラーゼが望まれている。以下に詳しく説明すると通り、このニーズに取り組んだ。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、バクテリオファージΦ１５由来の新規ＤＮＡポリメラーゼの単離及び精製、並びにＤＮＡ増幅におけるその使用に関する。ＤＮＡ増幅では、ＤＮＡ配列の鎖にプライマーをアニールさせ、アニールした混合物を、バクテリオファージΦ１５から単離したＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本明細書では、図１に記載のアミノ酸配列を含む精製組換えＤＮＡポリメラーゼについて教示する。本明細書では、ＤＮＡポリメラーゼをコードする単離核酸であって、図２に記載のヌクレオチド配列を含む単離核酸についても教示する。変異型核酸が、図１に記載のアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼをコードしていてもよい。
【００２０】
本明細書では、上記ＤＮＡポリメラーゼでＤＮＡの配列決定及び増幅する方法、並びに、上記ＤＮＡポリメラーゼを含むＤＮＡ配列決定用又は増幅用キットについても教示する。
【００２１】
第１の態様では、本発明は、Φ２９型のＤＮＡポリメラーゼであるΦ１５ＤＮＡポリメラーゼに関する。
【００２２】
本明細書で用いるΦ２９型のＤＮＡポリメラーゼとは、ＤＮＡの複製開始に用いられる末端タンパク質を含む近縁ファージから単離されるＤＮＡポリメラーゼもいう。こうしたファージについては、Salas, The Bacteriophages 169, 1988に概説されている。これらのファージは、染色体の構造と、場合によってはＤＮＡポリメラーゼの配列とが近似しており、６残基のアミノ酸しか差がなく、その５残基は類似アミノ酸で置換されているものもある。これらのファージは、長さ約６〜３００ヌクレオチドの短い逆位末端反復配列を有する。これらのポリメラーゼは強い３′−５′エキソヌクレアーゼ活性を有するが、５′−３′エキソヌクレアーゼ活性はもたない。
【００２３】
バクテリオファージΦ２９ＤＮＡポリメラーゼは、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔａｑ及びバクテリオファージＴ７が属するＡ型ファミリーではなく、ＤＮＡポリメラーゼのＴ４つまりＢ型ファミリーに属する。このＴ４ファミリーのポリメラーゼ（Gene. 1992 Mar 1;112(1):139-44）は通例ジデオキシヌクレオチドのような鎖伸長停止剤を認識することができるので、ＤＮＡ配列決定に有用であると思われるが、概してバクテリオファージＴ７  ＤＮＡポリメラーゼほど有用ではない。
【００２４】
一般に、本発明のＤＮＡポリメラーゼはプロセッシブである。本ポリメラーゼは鎖置換活性も有する。
【００２５】
プロセッシブ又はプロセッシビティとは、ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡ合成反応その他のプライマー伸長反応に通常用いられる条件下で、プライマー分子及び／又は鋳型分子から解離せずに、同じプライマー鋳型を用いて連続的にヌクレオチドを組込むことができることをいう。
【００２６】
本発明のポリメラーゼが鎖置換を起こす能力は、プロセッシブとの組合せによって、７０ｋｂ以上の長いＤＮＡ分子を合成できるようになるので、本発明において有益である。鎖置換活性は標準的方法で測定され、例えばポリメラーゼを一本鎖環状ＤＮＡ分子（例えばＭ１３）及びプライマーとの混合物中でインキュベートすればよい。元の環状分子よりも長いＤＮＡ分子が合成されれば、そのポリメラーゼは二本鎖分子のＤＮＡ鎖を置換してＤＮＡを合成し続けることができるので、鎖置換活性を有する。かかる活性は単一のタンパク質分子に存在することができ、ＤＮＡの合成には通常のデオキシヌクレオシド三リン酸しか必要とされず、ＡＴＰ又はその等価物のエネルギーを必要としない。この活性は、ＤＮＡ合成が末端タンパク質で開始される場合にも観察される。
【００２７】
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ及びＤＮＡ増幅に有用である。
【００２８】
本発明の一実施形態は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列、（ｂ）配列番号１の８アミノ酸残基以上の断片、（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）に基づく単離ポリペプチドであって、（ａ）又は（ｂ）の配列からの逸脱の９５％以上が保存的置換である単離ポリペプチド、及び（ｄ）上記（ａ）又は（ｂ）の単離ポリペプチドとのアミノ酸配列相同性が６５％以上の単離ポリペプチドからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドに関する。
【００２９】
本発明の別の実施形態は、（ｉ）配列番号２のヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド配列の縮重変異であるヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｖ）配列番号１のアミノ酸配列の中程度の保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は（ｖｉ）上記（ｉ）〜（ｖ）のいずれかのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列のいずれかの核酸分子を含むように形質転換した宿主細胞又はその子孫を、上記核酸分子でコードされるタンパク質が発現する条件下で培養することを含む方法で産生される単離ポリペプチドに関する。
【００３０】
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸にも関する。そこで、本発明の一実施形態は、（ｉ）配列番号２のヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド配列の縮重変異であるヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）配列番号２との配列相同性が９０％以上のヌクレオチド配列、（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｖ）配列番号１との配列相同性が９０％以上のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、及び（ｖｉ）上記（ｉ）〜（ｖ）のいずれかのヌクレオチド配列の完全相補配列であるヌクレオチド配列からなる群から選択される配列を有するポリヌクレオチドを含む単離核酸であって、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸に関する。
【００３１】
本発明の別の実施形態は、（ｉ）配列番号２のヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド配列の縮重変異であるヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）配列番号２との配列相同性が９５％以上のヌクレオチド配列、（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｖ）配列番号１との配列相同性が９５％以上のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、（ｖｉ）上記（ｉ）〜（ｖ）のいずれか１つのヌクレオチド配列の完全相補配列であるヌクレオチド配列とからなる群から選択される配列を有するポリヌクレオチドを含む単離核酸であって、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸に関する。
【００３２】
本発明のさらに別の実施形態は、（ｉ）配列番号２のヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド配列の縮重変異であるヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）配列番号２との配列相同性が９９％以上のヌクレオチド配列、（ｉｖ）配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｖ）配列番号１との配列相同性が９９％以上のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、（ｖｉ）上記（ｉ）〜（ｖ）のいずれかのヌクレオチド配列の完全相補配列であるヌクレオチド配列とからなる群から選択される配列を有するポリヌクレオチドを含む単離核酸であって、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸に関する。
【００３３】
本発明は、上記単離核酸を含む複製可能なベクター、並びに上記単離核酸を含む発現ベクターにも関する。本発明は、上記複製可能なベクターを含むように形質転換した宿主細胞、又は上記複製可能なベクターを含有するその子孫、並びに上記発現ベクターを含むように形質転換した宿主細胞、又は上記発現ベクターを含有するその子孫に関する。
【００３４】
本発明は、さらに、ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドの生産方法であって、上記単離核酸を含む発現ベクターを含有する宿主細胞を、上記核酸分子でコードされるタンパク質が発現する条件下で培養し、発現タンパク質を単離することを含んでなる方法も提供する。
【００３５】
一態様では、本発明は、Φ１５ＤＮＡポリメラーゼの標品を備えるＤＮＡの配列決定用又は増幅用キットに関する。キットとは、別々に隔てられた成分を、好ましくはＤＮＡ配列決定又は増幅反応に用いられる状態で保持するように設計された容器を意味する。適宜、キットは１組のランダム配列プライマーをさらに備えていてもよい。好ましくは、プライマーは４〜１０ヌクレオチドの鎖長のものである。最も好ましくは、プライマーは六量体である。プライマーがヌクレアーゼ耐性であることも好ましい。
【００３６】
別の態様では、本発明は、ＤＮＡ配列の増幅法に関する。本方法は、
核酸鋳型とプライマーと核酸ポリメラーゼと１種類以上のヌクレオシドポリリン酸とのポリメラーゼ反応を含んでおり、ポリメラーゼ反応をΦ１５ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施することを改良点とする。増幅は、ＲＣＡ法、ＳＤＡ法又はＮＡＳＢＡ法で実施される。
【００３７】
以下の実施例を参照して、本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００３８】
以下の実施例で本発明の幾つかの好ましい実施形態について例示するが、あらゆる実施形態の例示を意図したものではない。これらの実施例は、特許請求の範囲及び／又は本発明の技術的範囲を限定するものではない。
【００３９】
実施例１
Φ１５ＤＮＡポリメラーゼ発現用遺伝子のクローニング
バクテリオファージΦ１５は、バクテリオファージΦ２９の近縁生物である（J. Mol. Evol. 1999, 48:197-208）。このグループの他のバクテリオファージと同様、約２０ｋｂのＤＮＡ染色体の５′末端にタンパク質が結合していて、ゲノム構成に数多くの類似点をもつことを特徴とする。まず、Φ１５ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を、以下の２種類のプライマーを用いたＰＣＲによってファージＤＮＡから増幅した。
【００４０】
【化１】
2008526204.tif 000003
上記ＢａｍＨＩプライマーの配列は、融合ポリメラーゼ−ＧＳＴタンパク質の発現率が高まるように、コード配列の５′末端の元のＡＴＧコドンが除かれるように選んだ。ＰＣＲプロセスはＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、この酵素の標準的反応条件を用いて実施した。得られた１．８ｋｂ産物をグラスファイバーフィルター吸着を用いて精製し、クローニングベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−２（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）と同様に、ＢａｍＨＩとＸｈｏＩとの組合せで切断した。なお、ｐＧＥＸ−６Ｐ−２は、目的タンパク質（ＤＮＡポリメラーゼ）がＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）と融合するように設計されたベクターである。消化ＤＮＡを連結し、大腸菌ＤＨ５αの形質転換に用いた。得られたコロニーの幾つかを正確なサイズの挿入配列（１．８ｋｂ）の有無について検査し、その１つを選択して大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換させた。これを配列決定及び酵素発現に用いた。
【００４１】
実施例２
Φ１５ＤＮＡポリメラーゼの発現及び精製
上記融合タンパク質クローンを、６００ｎｍのＯＤ（光学密度）が１．５に達するまで２Ｌの２×ＹＴ培地で培養した。次いで、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を最終濃度１ｍＭとなるように添加し、プラスミドからの発現を誘導した。さらに２時間培養を続けた後培地を冷やし、菌体を回収して、８．８ｇの菌体ペーストを得た。誘導前後に採取した試料をＳＤＳゲル電気泳動分析にかけたところ（図３）、分子量６６０００のポリメラーゼと３００００のＧＳＴとの融合タンパク質で予測される分子量約９５０００の新規タンパク質種が誘導されたことが認められた。
【００４２】
次に、菌体ペーストを、２ｍＭ  ＤＴＴ及び２ｍＭ  ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオライド）を含有する３０ｍｌの氷冷ＰＢＳ緩衝液に懸濁した。Ａｖｅｓｔｉｎ社製ＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ（商標）ホモジナイザーを用いて、約１５０００ｐｓｉで３回通して菌体を破砕した。次いで、非イオン性界面活性剤ＮＰ−４０を最終濃度１％（ｖ／ｖ）となるように添加し、懸濁液を４℃で３０分間穏やかに振盪させた。２０００ｒｐｍ、３０分間の遠心分離で残渣を除去し、上清をグルタチオンセファロース４Ｂ（１０ｍｌ）と共に４℃で一晩振盪させ、このアフィニティ樹脂に融合タンパク質を結合させた。
【００４３】
次いで、タンパク質の結合したセファロースをカラムに充填し、カラム容積の５倍量の緩衝液（１％ＮＰ−４０、２ｍＭ  ＤＴＴ及び２ｍＭ  ＰＭＳＦを含有するＰＢＳ緩衝液）で樹脂を洗浄した。次いで、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（商標）プロテアーゼ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用説明書通りに用いて、カラムに結合した融合タンパク質を４℃で４時間消化した。次いで、切断されたタンパク質を５０ｍＭトリスｐＨ７．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び３００ｍＭ  ＮａＣｌで溶出し、各１ｍｌの画分を回収した。画分の試料をＳＤＳゲル電気泳動で分析したところ、ポリメラーゼの予測分子量と一致する分子量６６０００の高純度精製タンパク質が認められた（図４）。すべての画分に少量（＜５％）のプロテアーゼ（＜５％）が認められたが、３番以降の最も純粋な画分をその後の実験に使用した。
【００４４】
実施例３
Φ１５ＤＮＡポリメラーゼの活性
精製Φ１５ＤＮＡポリメラーゼ画分のＤＮＡポリメラーゼ活性を、放射化学ポリメラーゼアッセイを用いて、精製Φ２９ＤＮＡポリメラーゼの活性と対比した。各アッセイ反応混合物（５０μｌ）は、２μｇのｐＵＣ１８ＤＮＡ、２ｎｍｏｌのランダム配列六量体プライマー（９７℃で１２分間加熱して変性してから氷上で冷却したもの）、各０．２ｍＭのｄＮＴＰ（α３３Ｐ  ｄＣＴＰを含む）及び標記の量の希釈ポリメラーゼを含んでいた。反応系を３０℃で３０分間インキュベートし、次いでトリクロロ酢酸で沈殿させて酸不溶性画分の放射能を測定した。このアッセイは、ＭＤＡ及びＭＰＲＣＡに用いられた反応条件（米国特許第６３２３００９号）に相当するもので、これらの用途における活性を反映するものと思われる。
【００４５】
このアッセイを用いると、Φ１５ＤＮＡポリメラーゼの比活性は、高純度精製Φ２９ＤＮＡポリメラーゼの比活性の５０〜６５％であった（図５）。これは、単離したタンパク質が実際に高活性ＤＮＡポリメラーゼであることを実証している。
【００４６】
当業者であれば、本明細書に開示された本発明の教示内容に基づいて本発明に様々な変更をなし得る。このような変更も、特許請求の範囲に記載された本発明の技術的範囲に属する。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】Φ１５ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）を示す図。
【図２】Φ１５ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号２）を示す図。
【図３】バクテリオファージΦ１５ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローンを含有する細胞での新規タンパク質の誘導を示すＳＤＳ電気泳動実験の図である。誘導されたタンパク質はポリメラーゼとグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質である。
【図４】Φ１５ＤＮＡポリメラーゼの精製を示すＳＤＳ電気泳動実験の図。
【図５】精製Φ１５ＤＮＡポリメラーゼの比活性を、精製Φ２９ＤＮＡポリメラーゼの比活性と対比したＤＮＡポリメラーゼアッセイを示す図。
【図１】
2008526204.tif 000004
【図２】
2008526204.tif 000005
【図３】
2008526204.tif 000006
【図４】
2008526204.tif 000007
【図５】
2008526204.tif 000008
【配列表】
2008526204000001.app
【国際調査報告】
2008526204.tif 000009
2008526204.tif 000010
2008526204.tif 000011
2008526204.tif 000012