(57)【要約】  本発明は、シノビオリンをコードする遺伝子を含むトランスジェニックハエを提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シノビオリン(Synoviolin)をコードする遺伝子を含むトランスジェニックハエ。
【請求項２】
ハエがキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)である、請求項１に記載のトランスジェニックハエ。
【請求項３】
ハエが可視的な眼の欠陥表現型および／または羽の欠陥表現型を示す、請求項１に記載のトランスジェニックハエ。
【請求項４】
可視的な眼の欠陥表現型が、脱色、でこぼこした眼、および光沢のある眼からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項３に記載のトランスジェニックハエ。
【請求項５】
羽の欠陥表現型が、しわのある羽、曲がった羽、切込み、およびパウチ(pouch)を有する羽からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項３に記載のトランスジェニックハエ。
【請求項６】
ハエが細胞核へのp53の輸送抑制を示す、請求項１に記載のトランスジェニックハエ。
【請求項７】
シノビオリンをコードする遺伝子をハエのゲノムに導入することを含む、ハエにシノビオリンを発現させる方法。
【請求項８】
シノビオリン発現を抑制する活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって：
（ａ）候補化合物を請求項１に記載のトランスジェニックハエに接触させること；及び
（ｂ）前記候補化合物を接触させなかった請求項１に記載のハエの表現型と比較して、請求項１に記載のハエの表現型変化をアッセイすること
を含む前記方法。
【請求項９】
抗腫瘍剤として有用な化合物をスクリーニングする方法であって：
（ａ）候補化合物を請求項１に記載のトランスジェニックハエに接触させること；及び
（ｂ）前記候補化合物を接触させなかった請求項１に記載のハエの表現型と比較して、請求項１に記載のハエの表現型変化をアッセイすること
を含む前記方法。
【請求項１０】
ハエが可視的な眼の欠陥表現型および／または羽の欠陥表現型を示す、請求項８または9に記載の方法。
【請求項１１】
可視的な眼の欠陥表現型が、脱色、でこぼこした眼、および光沢のある眼からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
羽の欠陥表現型が、しわのある羽、曲がった羽、切込み、およびパウチを有する羽からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ハエが細胞核へのp53の輸送促進を示す、請求項８または9に記載の方法。
【請求項１４】
表現型が、請求項１に記載のトランスジェニックハエの細胞または組織におけるp53の生物学的および／または病理学的発現シグナルである、請求項８または9に記載の方法。
【請求項１５】
細胞におけるシノビオリン活性を抑制することを含む、p53活性を発現させる方法。
【請求項１６】
標的細胞または組織におけるp53の調節機能を分析する方法であって、以下のステップ：
（ａ）請求項１に記載のトランスジェニックハエから調製した細胞または組織におけるシノビオリンの発現を抑制すること；
（ｂ）標的表現型を獲得した前記標的細胞または組織におけるp53の生物学的および／または病理学的発現シグナルを検出すること；並びに
（ｃ）シノビオリンの発現を抑制しなかった前記細胞または組織の表現型と前記細胞または組織を比較し標的表現型における変化をアッセイすること
を含む前記方法。
【請求項１７】
p53が抗腫瘍活性を導くという調節機能を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アポトーシスまたは細胞増殖を増強する活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって：
（ａ）候補化合物を請求項１に記載のトランスジェニックハエに接触させること；及び
（ｂ）前記候補化合物を接触させなかった請求項１に記載のハエの表現型と比較して、請求項１に記載のハエの表現型変化をアッセイすること
を含む前記方法。
【請求項１９】
アポトーシスまたは細胞増殖を抑制する活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって：
（ａ）候補化合物を、ドミナントネガティブ型の請求項１に記載のトランスジェニックハエに接触させること；及び
（ｂ）前記候補化合物を接触させなかったドミナントネガティブ型の請求項１に記載の前記ハエの表現型と比較して、ドミナントネガティブ型の請求項１に記載のハエにおける羽の欠陥表現型の変化をアッセイすること
を含む前記方法。
【請求項２０】
ドミナントネガティブ型の請求項１に記載のトランスジェニックハエが、配列番号２に示す305番目のアミノ酸残基システインがセリンに置換されたポリペプチドを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ハエが可視的な眼の欠陥表現型および／または羽の欠陥表現型を示す、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
可視的な眼の欠陥表現型が光沢のある眼である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
羽の欠陥表現型が、しわのある羽および曲がった羽からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シノビオリン(Synoviolin)をコードする遺伝子を含むトランスジェニックハエに関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ(RA)は、全世界での有病率が約1%の、最もよく見られる関節疾患の1つである(Harris 1990; Feldmann et al. 1996)。この疾患の慢性的な性質は、進行性関節破壊をもたらし、それは重篤な運動障害および生活の質の悪化を導く。その病因の解明には大きな進歩がみられたが、RAの正確な原因はいまだに僅かしか分かっていない。近年、筋骨格系疾患の社会への負荷が世界中で認識され、そしてRAは「運動器の10年」運動（社会に対する筋骨格系障害の社会的および財政的コストを削減するために、世界保健機構(WHO)によって2000年に始められた運動）( HYPERLINK "http://www.bonejointdecade.org/" http://www.bonejointdecade.org/)において最も重要な疾患の1つと規定された。したがって、根本的な治療法ならびに今ある症状の治療法を開発する必要がある。
【０００３】
RAの臨床特徴には、滑膜細胞の異常増殖を伴う全身関節の慢性的炎症が含まれ、これが結果的に関節における軟骨および骨の破壊を引き起こす(Schett et al. 2001; Aarvak and Natvig 2001)。炎症は、炎症性細胞によって制御されているサイトカイン系の活性化から生じると考えられる(Arend 2001)。炎症過程の間、活性化マクロファージは腫瘍壊死因子α（TNFα）、インターロイキン(IL)-1およびIL-6を産生する。次に、これらのサイトカインは、滑膜細胞の異常増殖を刺激して滑膜組織のかたまり（パンヌスと呼ばれる）を形成し、これが破骨細胞活性化およびプロテアーゼ産生を経て骨および軟骨に侵入する(Tak and Bresnihan 2000; Hofbauer and Heufelder 2001; Kaneko et al. 2001; Rehman and Lane 2001; Szekanecz and Koch 2001)。RAは自己免疫疾患と考えられるので、炎症を標的とする医薬治療がなされてきた。しかし、TNFα遮断療法がこの疾患の完全な寛解を導くことはほとんどなく、またRA患者の約25%がそのような療法に応答しないことが報告されている(Green 2000; Clair 2002)。したがって、全ての患者においてRAの病因を炎症のみによっては説明することはできない。つまり、炎症が後に起こる滑膜の過形成を引き起こすのか、または原発性自発性滑膜細胞増殖が炎症を導くのか、明らかでない。いずれにせよ、滑膜細胞はRAにおいて重大な役割を果たしているという一般的合意が存在する。
【０００４】
この概念に基づいて、滑膜細胞がRAにおいて果たす病因的役割を解明するため、本発明者らは滑膜細胞に焦点をあてた一連の実験を実施した。まず第一に、本発明者らはリウマチ滑膜細胞(RSC)のクローン化に成功し、そしてこれらの細胞が、培養下で異常なサイトカイン産生を有する「不死化形質転換細胞」に似た自律増殖特性を有することを見い出した(Goto et al., 1987; 1990)。RSCを研究する一方、本発明者らはヒトT細胞白血病ウイルスI型(HTLV-I)（流行性ヒトレトロウイルスの１つ）が関節症の引き金を引きうることを見い出した。また、本発明者らは、これがRAの原型であると提案し、そしてHTLV-I関連関節症(HAAP)と名づけた（Kitajima et al. 1991）。さらに、本発明者らはウイルス性形質転換遺伝子taxがHAAPを引き起こし、その産物であるpp40Taxが患者およびそれを過剰発現するマウスにおいて滑膜細胞をRSCに形質転換できることを突き止めた(Iwakura et al. 1991; Nakajima et al 1993; Aono et al 1998)。しかし、pp40Taxの発現はヒトRSCには見られない。これらのデータにより、本発明者らは、HAAP滑膜細胞におけるpp40Taxと機能的に等価なRSC中の内因性遺伝子産物を決定することとした。
【０００５】
RSCの特定分子を単離するため、本発明者らは、抗RSC抗体を用いてRSCのヒトcDNAライブラリーの免疫スクリーニングを実施した。その結果、E3ユビキチンリガーゼである「シノビオリン」がクローン化された。
この分子の役割を調べるため、本発明者らはショウジョウバエ(Drosophila)シノビオリンを過剰発現するトランスジェニックハエを作出した。
【０００６】
さらに、予期せぬことに、シノビオリンは培養された哺乳動物細胞においてp53活性を抑制した。多大な努力にも関わらず、哺乳動物細胞における複雑なp53ネットワークは十分理解されているとは到底言いがたい。さらに、培養細胞から得られたこの情報の大部分は、完全な生物におけるp53の生理学的機能を完全に反映していない可能性がある。
【発明の開示】
【０００７】
本発明の目的は、シノビオリンをコードする遺伝子を含むトランスジェニックハエを提供することである。この目的を達成するために鋭意研究を行った結果、本発明者らはトランスジェニックハエを確立することに成功した。本発明者らは、ハエ遺伝学的アプローチを適用した。そして、dsynoがp53のショウジョウバエ相同体(Dmp53)をin vitroでユビキチン化できることを初めて確認した。本発明は以下に記述する通りである。
（１）シノビオリン(Synoviolin)をコードする遺伝子を含むトランスジェニックハエ。
（２）ハエがキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)である、（１）に記載のトランスジェニックハエ。
（３）ハエが可視的な眼の欠陥表現型および／または羽の欠陥表現型を示す、（１）に記載のトランスジェニックハエ。
（４）可視的な眼の欠陥表現型が、脱色、でこぼこした眼、および光沢のある眼からなる群より選択される少なくとも1つである、（３）に記載のトランスジェニックハエ。
（５）羽の欠陥表現型が、しわのある羽、曲がった羽、切込み、およびパウチ(pouch)を有する羽からなる群より選択される少なくとも1つである、（３）に記載のトランスジェニックハエ。
（６）ハエが細胞核へのp53の輸送抑制を示す、（１）に記載のトランスジェニックハエ。
（７）シノビオリンをコードする遺伝子をハエのゲノムに導入することを含む、ハエにシノビオリンを発現させる方法。
（８）シノビオリン発現を抑制する活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって：
（ａ）候補化合物を（１）に記載のトランスジェニックハエに接触させること；及び
（ｂ）前記候補化合物を接触させなかった（１）に記載のハエの表現型と比較して、（１）に記載のハエの表現型変化をアッセイすること
を含む前記方法。
（９）抗腫瘍剤として有用な化合物をスクリーニングする方法であって：
（ａ）候補化合物を（１）に記載のトランスジェニックハエに接触させること；及び
（ｂ）前記候補化合物を接触させなかった（１）に記載のハエの表現型と比較して、（１）に記載のハエの表現型変化をアッセイすること
を含む前記方法。
（１０）ハエが可視的な眼の欠陥表現型および／または羽の欠陥表現型を示す、（８）または（９）に記載の方法。
（１１）可視的な眼の欠陥表現型が、脱色、でこぼこした眼、および光沢のある眼からなる群より選択される少なくとも1つである、（１０）に記載の方法。
（１２）羽の欠陥表現型が、しわのある羽、曲がった羽、切込み、およびパウチを有する羽からなる群より選択される少なくとも１つである、（１０）に記載の方法。
（１３）ハエが細胞核へのp53の輸送促進を示す、（８）または（９）に記載の方法。
（１４）表現型が、（１）に記載のトランスジェニックハエの細胞または組織におけるp53の生物学的および／または病理学的発現シグナルである、（８）または（９）に記載の方法。
（１５）細胞におけるシノビオリン活性を抑制することを含む、p53活性を発現させる方法。
（１６）標的細胞または組織におけるp53の調節機能を分析する方法であって、以下のステップ：
（ａ）（１）に記載のトランスジェニックハエから調製した細胞または組織におけるシノビオリンの発現を抑制すること；
（ｂ）標的表現型を獲得した前記標的細胞または組織におけるp53の生物学的および／または病理学的発現シグナルを検出すること；並びに
（ｃ）シノビオリンの発現を抑制しなかった前記細胞または組織の表現型と前記細胞または組織を比較し標的表現型における変化をアッセイすること
を含む前記方法。
（１７）p53が抗腫瘍活性を導くという調節機能を有する、（１６）に記載の方法。
（１８）アポトーシスまたは細胞増殖を増強する活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって：
（ａ）候補化合物を（１）に記載のトランスジェニックハエに接触させること；及び
（ｂ）前記候補化合物を接触させなかった（１）に記載のハエの表現型と比較して、（１）に記載のハエの表現型変化をアッセイすること
を含む前記方法。
（１９）アポトーシスまたは細胞増殖を抑制する活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって：
（ａ）候補化合物を、ドミナントネガティブ型の（１）に記載のトランスジェニックハエに接触させること；及び
（ｂ）前記候補化合物を接触させなかったドミナントネガティブ型の（１）に記載のハエの表現型と比較して、ドミナントネガティブ型の（１）に記載のハエの表現型の変化をアッセイすること
を含む前記方法。
（２０）ドミナントネガティブ型の（１）に記載のトランスジェニックハエが、配列番号２に示す305番目のアミノ酸残基システインがセリンに置換されたポリペプチドを含む、（１９）に記載の方法。
（２１）ハエが可視的な眼の欠陥表現型および／または羽の欠陥表現型を示す、（１９）に記載の方法。
（２２）可視的な眼の欠陥表現型が光沢のある眼である、（２１）に記載の方法。
（２３）羽の欠陥表現型が、しわのある羽および曲がった羽からなる群より選択される少なくとも1つである、（２１）に記載の方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下に本発明を詳細に説明する。
本明細書に引用する全ての特許出願、特許、刊行物およびウェブサイトは、参照によりその全体を本明細書に組み入れる。
【０００９】
本発明は、ショウジョウバエシノビオリン(dsyno)をコードする遺伝子を含むトランスジェニックハエに関する。dsynoの過剰発現は、羽および眼に可視的表現型を引き起こす。対照的に、ドミナントネガティブ型のdsyno (C305S)の過剰発現は、ハエにおいて可視的表現型をなんら引き起こさない。したがって、本発明のトランスジェニックハエは、dsyno変更因子(modifier)をスクリーニングするためのモデルハエとして利用することが可能である。
【００１０】
さらに、dsynoとp53のショウジョウバエ相同体(Dmp53)は相互作用し、そしてdsynoはDmp53に対して支配的因子として作用する。したがって、dsynoをコードする遺伝子を含むトランスジェニックハエは、抗腫瘍剤として有用な化合物をスクリーニングするためのモデルハエとして利用することが可能である。
【００１１】
１．定義
本明細書においては、「トランスジェニック」生物とは、そのゲノム内に挿入された余分な遺伝子材料を有する生物をいう。本明細書においては、「トランスジェニックハエ」という用語は、ゲノム内にランダムに挿入された同一または別の生物由来のDNA配列を含有する、胚、幼虫および成虫形態のキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）を含む。キイロショウジョウバエが好ましいが、ショウジョウバエ属の任意のハエを本発明に用いることが意図されている。
【００１２】
本明細書においては、トランスジーンの「異所性の」発現とは、通常は発現されない組織または細胞、または特定の発生段階における、トランスジーンの発現をいう。
【００１３】
本明細書においては、「表現型」という用語は、遺伝的性質および環境的影響の両方によって決定される、生物の観察可能な物理的または生化学的特徴をいう。
【００１４】
本明細書においては、「発現制御配列」または「ドライバー」という用語は、プロモーターおよびエンハンサーをいう。「プロモーター」という用語は、転写の開始時にDNA依存性RNAポリメラーゼによって直接的または間接的に認識され、結合されるDNA配列をいい、エンハンサーエレメントを含む。本発明に用いられるエンハンサーは、酵母Gal4転写制御因子によって活性化されるUASエレメントを含む。本明細書において、「UAS」エレメントとは、GAL-4転写活性化因子によって認識される上流活性化配列をいう。
【００１５】
「転写因子」という用語は、真核細胞において転写を開始または制御するのに必要とされる任意のタンパク質をいう。
【００１６】
本明細書において、「対照」ハエとは、表現型改変の為に試験されている変異を担持していないこと、または候補化合物を投与されていないことを除き、本発明の方法に用いられた幼虫または成虫ハエと同一の遺伝子型を有する幼虫または成虫ハエをいう。
【００１７】
２．シノビオリン
本発明に用いられるシノビオリンは、E3ユビキチンリガーゼであり、RA患者の滑膜細胞に見い出されるものである。本発明のシノビオリン活性とは、自己ユビキチン化活性を意味する。
【００１８】
シノビオリンは、酵母からヒトまで高度に保存されている。本発明の好ましい実施形態においては、ショウジョウバエシノビオリン(dsyno)を用いることができる。好ましくは、キイロショウジョウバエ由来のdsyno遺伝子CG1937が用いられる。ショウジョウバエシノビオリン(dsyno)遺伝子CG1937は、哺乳動物シノビオリンと最も高い相同性(63%)を有する、哺乳動物シノビオリンのハエ相同体である。これは、フライベースblastサイト( HYPERLINK "http://flybase.bio.indiana.edu/blast/" http://flybase.bio.indiana.edu/blast/)のblastp（タンパク質-タンパク質blast）によってショウジョウバエ遺伝子の間で確認された。さらに、CG1937のRINGドメイン（これはユビキチンキナーゼの活性中心である）は、高度に保存されている(82%)。したがって、この遺伝子はE3ユビキチンリガーゼとして機能することが可能である。ショウジョウバエシノビオリン(dsyno)遺伝子CG1937の塩基配列および該遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を、配列番号１および配列番号２にそれぞれ示す。
【００１９】
本発明において、dsyno遺伝子はハエのゲノムライブラリーから得ることができる。例えば、所望のクローンを細菌人工染色体(BAC)ライブラリーからハイブリダイゼーション法によって得ることができる。または、PCR法等によって得ることもできる。
【００２０】
ショウジョウバエシノビオリン(dsyno)遺伝子は、配列番号１に示す塩基配列からなるDNAの相補的DNAに高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる任意のDNAであってよく、かつシノビオリン活性を有する。ハイブリダイゼーションは、公知の諸方法またはそれらの変法によって実施することができる。例えば、Molecular Cloning, 第2版(J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法にしたがって実施することができる。本明細書で用いる高ストリンジェントな条件は、例えば、1-2 x SSCおよび0.1-0.5% SDS、温度約48-68℃である。
【００２１】
３．トランスジェニックハエ
本発明は、シノビオリンをコードする遺伝子を含むトランスジェニックハエに関する。用いることができるハエの例としては、ショウジョウバエ科のメンバー、好ましくはキイロショウジョウバエが挙げられる。本発明は、シノビオリンを含むポリペプチド(配列番号２)をコードするDNA配列（配列番号１）をゲノム内に含むトランスジェニックハエを開示する。DNA配列は、使用される発現系に依存して、組織特異的発現制御配列（例えば、プロモーター領域または上流活性化配列(UAS)）に機能しうる形で結合される。これらの発現制御配列には、眼、羽、脚および平均棍、等の器官に特異的な制御配列が含まれる。これらの組織特異的制御配列の制御下で、コードされたペプチドは転写されてmRNAとなる。このmRNAは翻訳されて検出可能レベルのdsynoペプチドとなり、ハエにおける表現型の変更を引き起こす。これらの表現型の変化をアッセイすることで、これらのハエは、シノビオリンの抑制経路に影響を及ぼしうる、そしてp53とシノビオリンとの相互作用の分子的および生化学的メカニズムへの洞察を提供しうる遺伝子または化合物の同定に利用することができる。
【００２２】
トランスジェニックショウジョウバエを含むトランスジェニックハエを得る方法は、当業者に周知である。例えば、Pエレメント媒介形質転換の参照文献として一般に用いられているのはSpradling, 1986である。EPエレメント技術とは、酵母Gal4転写活性化因子およびUAS配列を用いるバイナリー系（binary system）をいい、これは内因性ショウジョウバエ遺伝子の転写を異所的に制御するために用いられる。この技術は、Brand and Perrimon, 1993に記述されている。
【００２３】
本発明を実施する際には、分子生物学および組換えDNA分野における多数の常用技法が用いられる。これらの技法は周知であり、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II, and III, 1997 (F. M. Ausubel ed.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, 1985 (D. N. Glover ed.); A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)等に説明されている。周知のショウジョウバエ分子遺伝子学技法は、例えば、Robert, D. B., Drosophila, A Practical Approach (IRL Press, Washington, D.C., 1986) に見い出すことができる。Flystockの記述は、 HYPERLINK "http://flybase.bio.indiana.edu" http://flybase.bio.indiana.eduのFlybaseデータベースに見い出すことができる。
【００２４】
１）組換えベクターの構築
従来の発現制御系を用いて、目的のタンパク質（本発明のdsynoペプチドを含む）の異所性の発現を達成することができる。そのような発現は、生化学経路のかく乱および変更された表現型の生成をもたらしうる。そのような発現制御系の１つは、DNA配列と組織特異的に発現される遺伝子の発現制御配列（プロモーターまたはエンハンサー等）との直接融合を含む。本発明に用いることができる別の発現制御系は、バイナリーGal4-転写活性化系である。
【００２５】
上記Gal4系は、目的の遺伝子の発現を組織特異的に導くために、酵母転写活性化因子Gal4を用いる。Gal4遺伝子は、一時的かつ組織特異的な方法で発現を動かすゲノムエンハンサーの制御下にあるように、従来の形質転換系を用いてハエゲノムにランダムに挿入されている。これらのインサートを担持するハエの各系統（「ドライバー」と称する）が確立されている。
【００２６】
Gal4系において、目的の遺伝子は、その転写がGal4応答性エレメントであるUAS 配列(Upstream Activating Sequence:上流活性化配列) の制御下に入るように、形質転換ベクター中にクローン化されている。UAS-(目的の遺伝子)の配列を担持するハエ系統を、組織特異的エンハンサーの制御下でGal4遺伝子を発現するハエ系統と交配すると、該遺伝子は組織特異的パターンで発現される。
【００２７】
成虫組織において容易に見ることができ、したがって遺伝子スクリーニングに用いうる表現型を作出するために、本発明においてはハエ発生の後期段階において発現を導くGal4「ドライバー」を用いることができる。これらのドライバーを用いると、発現は羽、眼、脚、および異なる感覚器官に欠陥をもたらす。これらの「ドライバー」の例としては、Ser-Gal4(羽)、MS1096-Gal4 (羽)、e16E-Gal4 (羽)、gmr-Gal4(眼)およびpGMR-Gal4 (眼)が挙げられる。
【００２８】
本発明のトランスジェニックキイロショウジョウバエを作出するには、種々のDNA構築物を用いることができる。例えば、構築物はシノビオリン遺伝子及び機能しうる形で結合した組織特異的プロモーターを含むことができる。このような構築物のハエゲノムへの挿入は、Pエレメント組換え、相同組換え、または当業者に公知の他の標準的技法により行うことができる。
【００２９】
本発明の1つの実施形態において、本発明のトランスジェニックハエは、組換えベクターを胚に導入することによって作製される。該組換えベクターは、所望のDNAを発現ベクター中にサブクローン化することによって作製される。この組換えベクターは、従来の遺伝子工学技法によって得ることができる。すなわち、適切なプライマーを用いてRT-PCRおよび／またはDNA-PCRを実施することによりシノビオリン遺伝子を増幅することができる。必要であれば、PCR産物の配列を、TAクローニング等の公知の方法を用いて確認することができる。次に、公知の制限酵素を用いて、シノビオリンDNA断片を切り出すことができる。次に、シノビオリンDNA断片を公知のベクターに挿入し、そしてシノビオリンの上流に制限酵素で切断した適切なプロモーター配列を挿入することができる。
【００３０】
シノビオリンの発現ベクターとしては、ショウジョウバエ由来プラスミド、大腸菌(Escherichia coli)由来プラスミド、枯草菌(Bacillus subtilis)由来プラスミド、酵母由来プラスミド等を用いることができる。好ましくは、ショウジョウバエ由来プラスミドが用いられる。ショウジョウバエ由来プラスミドの例としては、pUAST、pUAS、pChs およびpPTGALが挙げられる。
【００３１】
２）胚の形質転換
本発明のシノビオリンDNAを含むトランスジェニックハエ（以下、略して「本発明のDNAトランスジェニックハエ」と称する）は、任意の従来のプロトコールを用いて作製することができる。必要な発現パターンを有するシノビオリンDNA（トランスジーン）の組み込み体を得るために、多数の異なる戦略を用いることが可能である。一般に、この対象のトランスジェニックハエを作製する方法は、細胞やハエ細胞（例：胚の生殖細胞）内へ適切なベクター（プラスミド等）で表されたトランスジーンの安定した組み込み方法を含む。トランスジーンの導入は、任意の従来のプロトコールを用いて達成することができる。適切なプロトコールは当業者に周知であり、例えば、マイクロインジェクション(Spradling, A.C. (1986))等である。細胞へのトランスジーンの導入後、組換えによって該トランスジーンは細胞のゲノム内に安定に組み込まれる。UAS-dsynoトランスジェニック(TG)ハエは、CG1937のESTクローンであるGH11117をpUASTベクター中にサブクローン化することによって作製することができる。GH11117は購入可能である（Open Biosystems）。次に、得られたUAS-dsynoベクターを、マイクロインジェクションによりw1118ハエ胚に導入することができる。UASドミナントネガティブ型のdsyno (dsynoDN)ハエ(UAS-dsynoDNハエ)は、従来の方法によって作製することができる。すなわち、CG1937 cDNAを改変して、ドミナントネガティブ型のdsynoタンパク質を産生できるCG1937(C305S)とし、この改変したcDNAをpUASベクター中にサブクローン化すればよい。C305Sは、CG1937ポリペプチド(配列番号２)のアミノ酸残基305番目のシステインがセリンに置換された改変アミノ酸配列を意味する。pUAS-dsynoDNベクターもまたw1118ハエの胚に注入することができる。
【００３２】
３）dsynoまたはdsynoDNの過剰発現
dsynoまたはdsynoDNの発現は、適切な系、例えば種々の組織特異的プロモーターおよびエンハンサーを含むGal4ドライバーを用いるGal4-UAS系によって種々の組織中に導くことができる。Gal4ドライバーのうち、gmr-Gal4、Ser-Gal4、MS1096-Gal4およびe16E-Gal4が好ましく用いられる。
【００３３】
dsynoまたはdsynoDNの発現は、免疫染色によって確認することができる。dsynoの発現は、in situハイブリダイゼーションによっても確認された。
【００３４】
胚は、Ponzielli et al. (2002)が記述するように固定することができる。解剖した三齢幼虫をSolano et al. (2003)が記述するように固定することができる。In situハイブリダイゼーションは、Ponzielli et al. (2002)が記述するように、例えば、CG1937に特異的なジゴキシゲニン(Dig)標識センスまたはアンチセンスRNAプローブを用いて実施することができる。ただし、RNAプローブを合成するための直鎖状のDNA鋳型は、適切な2組のプライマーを用いて成虫ハエの全RNAからRT-PCRにより調製される点のみが異なる。In situハイブリダイゼーションによって、例えば、dsynoがショウジョウバエ胚の異なる段階で発現されることが明らかである。さらに、dsynoの転写物は、ハエの胚発生の非常に早い段階において、または三齢幼虫期の成虫原基において検出される。胚発生の期間を通して、メッセージは偏在的なパターンで継続的に発現される。
【００３５】
ショウジョウバエの発生段階におけるdsynoの発現は、RT-PCRによってdsyno mRNAの発現を調べることによって確認することができる。本発明のトランスジェニックハエは、適切な系統と交配することができる。その子孫を、三齢幼虫期に適切な条件下でインキュベートする。幼虫から、例えばeasy-Blue Total RNA Extraction kit (iNtRON)を用いて、使用説明書に従って全RNAを抽出する。抽出した全RNAは、Reverse Transcription system (Promega)を用いたcDNA合成反応の実施に用いられる。Dsynoおよび偏在的に発現されたショウジョウバエリボソームタンパク質遺伝子rp49 mRNAの量は、適切なプライマーを用いたPCRおよびゲル電気泳動分析によって測定することが可能である。dsynoメッセージは、胚から成虫へのハエの異なる発生段階で検出することができる。dsyno (CG1937)は、キイロショウジョウバエの全発生段階を通じて偏在的に発現されることが示された。
【００３６】
トランスジェニックハエにおけるdsynoまたはdsynoDNの過剰発現は、種々の組織、特に眼および羽に可視的な欠陥表現型を引き起こす。例えば、眼におけるdsynoの発現は、眼の脱色またはでこぼこ、または光沢のある眼を引き起こしうる。眼におけるdsynoDNの発現は、可視的な表現型をなんら引き起こさない。
本明細書に用いる「脱色」表現型という用語は、個眼および個眼間の剛毛(bristles)の組織崩壊によって特徴付けられ、これは色素細胞の変性によって引き起こされうる。
本明細書に用いる「でこぼこした眼」表現型という用語は、個眼および個眼間の剛毛の組織崩壊によって特徴付けられ、これは神経細胞の変性によって引き起こされうる。
本明細書に用いる「光沢のある眼」表現型という用語は、眼の表面がワックスでみがいたように艶があって滑らかであることによって特徴付けられ、これは個眼の異常な発達によって引き起こされうる。この表現型は、手術用立体顕微鏡により見ることができる。
【００３７】
本発明のさらなる実施形態において、羽翼(wing blade)におけるdsynoの発現は、しわのある羽、曲がった羽、切込み、およびパウチの出現、等の羽欠陥表現型を示す。
本明細書において、「しわのある羽」表現型という用語は、羽が縮む等の羽の異常な折り畳みによって特徴付けられる。
本明細書において、「曲がった羽」表現型という用語は、羽が長端部に沿って上向きまたは下向きに曲げられる等の異常な折り畳みによって特徴付けられる。
本明細書において、「切込み」表現型という用語は、羽が縁に沿ってぎざぎざになっている等の羽の縁の異常な切込みによって特徴付けられる。
本明細書において、「パウチ」表現型という用語は、羽に泡が生じる等の羽の異常な形態によって特徴付けられる。
【００３８】
４）ショウジョウバエシノビオリンは、p53依存性アポトーシス経路を制御する。
dsynoはDmp53に対する支配的因子であることが確認された。なぜなら、dsynoはp53のショウジョウバエ相同体（Dmp53）をユビキチン化し、Dmp53を生理学的に代謝するからである。Dmp53を過剰発現するトランスジェニックハエは、e16E-Gal4ドライバーを用いて作製することができる。UAS-dsynoおよびUAS-Dmp53を含むトランスジェニックハエは、標準的手順(Spradling, 1986)にしたがって組換えDNAをキイロショウジョウバエ胚に注入することによって作出できる。DsynoおよびDmp53の発現は、組織特異的プロモーターおよびエンハンサーを含むe16E-Gal4ドライバーを用いて、羽の後ろ半分において導くことが可能である。e16E-Gal4/UAS-Dmp53; UAS-dsyno/+ハエは、e16E-Gal4/UAS-Dmp53 雌とe16E-Gal4/CyO; UAS-dsyno/TM2 雄との交配によって作出することができる。さらに、各トランスジェニック系統を異種交配することができる。その結果、UAS-Dmp53ハエにおけるパウチのある羽表現型のみが、dsynoの過剰発現によって抑制された(図28)。
【００３９】
さらに、Dmp53はdsynoの過剰発現によって顕著に減少した（図29）。e16E-Gal4/UAS-Dmp53; UAS-dsyno/+ハエの翅原基におけるDmp53の発現レベルを分析して、dsynoがDmp53をin vivoで代謝することを免疫染色により下記のように証明することが可能である。すなわち、翅原基をPBS中で解剖し、適切なバッファー中で固定し、適切なブロッキングバッファーを用いてブロックするとよい。固定した翅原基を、適切な条件下でウサギ抗Dmp53抗体と共にインキュベートするとよい。適切な洗浄バッファーで洗浄した後、適切な条件下でロバ抗ウサギFITCと共にインキュベートし、洗浄バッファーで洗浄し、適切なマウンティング溶液にマウントするとよい。
【００４０】
シノビオリンは、ハエおよび哺乳動物の両方においてp53の生理学的制御に関与する。p53の制御は、アクリジンオレンジ染色によって確認することができる。
【００４１】
ショウジョウバエ等のより単純な生物を用いてp53を研究することは、p53ネットワークの基本的構成要素およびそれらの機能をより一層解明するために非常に有用である（Brodsky et al., 2000; Jin et al., 2000; Ollmann et al., 2000）。さらに、そのような系は、生物という環境においてp53ネットワーク内での遺伝子-遺伝子相互作用を研究するのに好都合な遺伝子ツールを提供する。
【００４２】
４．シノビオリン活性または抗癌活性を有する化合物のスクリーニング方法
上述のように、異所的に発現された遺伝子は、dsyno経路の破壊により表現型の変更をもたらしうる。同一のdsyno経路において働く遺伝子内の変異は、上記の変更された表現型の改変を引き起こすことが予測される。したがって、この系は、プロセシングされたdsyno遺伝子産物の機能の解明、ならびに該遺伝子産物と直接的または間接的に相互作用する他の遺伝子の同定に極めて有益である。dsyno経路に関与する遺伝子はこのように同定可能であって、そして次にこれらの遺伝子は、癌を含むがこれに限定されない疾患をもたらす、シノビオリン経路の異常に関連する病態の治療剤を開発する際の標的として役立ちうる、と考えられる。
【００４３】
前記スクリーニング方法は、候補化合物を本発明のトランスジェニックハエと接触させ、そして次に該化合物と接触させていない対照トランスジェニックハエの表現型と比較した該トランスジェニックハエの表現型の変化をアッセイすることを含んでいてもよい。例えば、候補化合物は、従来の方法を用いてdsynoを発現している幼虫に給餌することができる。次に、この幼虫を成虫段階まで発育させて、dsynoによって誘導された表現型の改変をアッセイすることができる。候補化合物を成虫ハエに給餌して、表現型の改変をアッセイすることも可能である。ハエを試験化合物と接触させるためには、例えば、経口投与、マイクロインジェクション等が利用され、そして試験ハエの状態、試験化合物の特性等により必要な処置を適切に選択することができる。さらに、試験化合物の投与量は、投与経路、試験化合物の特性等により適宜選択することができる。
【００４４】
このようにして同定された化合物の作用機構は、遺伝子操作によって生じた表現型と、目的の化合物を投与することにより誘導された表現型とを比較することによって検討することができる。そのような化合物としては、トランスジェニックハエに見られる変更された表現型を軽減または悪化させうる化合物が含まれる。公知の遺伝子改変に関連する表現型に類似した表現型をある化合物が誘導する場合、これは該遺伝子改変が影響を及ぼしているのと同一の経路に該化合物が作用していることを示唆するものであろう。本発明の1つの実施形態においては、試験化合物を試験ハエに投与し、上述の表現型のうち1つが対照ハエと比較して試験ハエに現れたときは、該試験化合物はシノビオリン活性を有する化合物として選択することができる。
【００４５】
スクリーニングには、広範な種類の低分子量化合物を用いることができる。そのような化合物としては、限定するものではないが、リード創薬のために試験される任意の組成物が含まれる。化合物は水溶性であっても脂溶性であってもよい。化合物は溶解していても、または溶液に懸濁していてもよい。ショウジョウバエにマイクロインジェクションする用量および容量は、今後の試験のために用量を最適化するため、または化合物を毒性および／または力価についてランク付けるため、変動させうる。
【００４６】
候補化合物の例としては、遺伝子、ペプチド、タンパク質、非ペプチド化合物、合成化合物、発酵産物、細胞抽出物、植物抽出物、動物組織抽出物、血漿等が挙げられる。これらの化合物は、新規化合物であっても公知化合物であってもよい。
【００４７】
上記スクリーニング方法によって得られた化合物は塩を形成してもよく、生理学的に許容される酸（例：無機酸、有機酸、等）または塩基（例：アルカリ金属塩）との塩の形で、好ましくは生理学的に許容される酸付加塩の形で用いることができる。
【００４８】
本発明のトランスジェニックハエを用いた化合物のスクリーニングに加えて、そのような化合物は、in vitroおよび他のin vivo疾患モデルを用いてさらにアッセイすることが可能である。例えば、多数の細胞株を腫瘍のin vitroモデルとして用いることができ、それらは当業者によく知られている。例としては、細胞株CCL-116が挙げられる。in vivoモデルもまた存在し、例えば、哺乳動物（ヒト、マウス、またはラット等）疾患モデルが挙げられる。
【００４９】
疾患の例としては、限定するものではないが、関節リウマチ、癌、繊維症、動脈硬化、キャッスルマン病、多発骨髄腫、クローン病、全身性若年性特発性関節炎、脳腫瘍、舌癌、咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、胆嚢癌、十二指腸癌、結腸癌、肝臓癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、骨肉種、軟骨肉腫、皮膚癌、脾臓癌、甲状腺癌、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、成人T細胞白血病または悪性リンパ腫が挙げられる。
【００５０】
p53のショウジョウバエ相同体(Dmp53)によってコードされるタンパク質の機能または発現に影響を及ぼしうる(例えば、抑制または促進する)化合物は、腫瘍またはp53経路の制御における欠陥に関連する他の病態を治療するのに有用であると考えられる。
【００５１】
本発明のさらなる実施形態において、dsynoはDmp53に対する支配的因子である。なぜなら、dsynoはp53のショウジョウバエ相同体(Dmp53)をユビキチン化する、すなわちDmp53を生理学的に代謝するからである。さらに、Dmp53はdsynoの過剰発現によって顕著に減少する。さらに、Dmp53が過剰発現しているところに見い出されるアポトーシス細胞は、dsynoの過剰発現によって顕著に減少する。したがって、シノビオリンは、ハエおよび哺乳動物の両方においてp53の生理学的制御に関与している。上述のように、アポトーシスと関連するp53をより単純な生物（ショウジョウバエ等）を用いて研究することは、p53ネットワークの基本的構成要素およびそれらの機能をさらに解明するために非常に有用である（Brodsky et al., 2000; Jin et al., 2000; Ollmann et al., 2000）。さらに、そのような系は、生物という環境においてアポトーシスに関連するp53ネットワーク内での遺伝子-遺伝子相互作用を研究するのに好都合な遺伝子ツールを提供する。さらに、アポトーシスは細胞増殖と密接に関連しているので、p53ネットワークが細胞増殖に関連していることは明らかである（Ko et al. 1996; Levin et al. 1997; el-Deiry et al. 1993）。
【００５２】
したがって、本発明は、標的細胞または組織におけるp53の制御機能を分析する方法を提供する。この方法は、以下のステップ：
（ａ）本発明のトランスジェニックハエから調製した細胞または組織におけるシノビオリンの発現を抑制すること；
（ｂ）標的表現型を獲得した前記標的細胞または組織におけるp53の生物学的および／または病理学的発現シグナルを検出すること；並びに
（ｃ）シノビオリンの発現を抑制しなかった前記細胞または組織の表現型と前記細胞または組織を比較し標的表現型における変化をアッセイすること
を含む。
【００５３】
p53の異なる種類の生物学的および／または病理学的発現シグナルをアッセイすることによって、腫瘍細胞の増殖に関連しているp53の機能的側面を評価することが可能である。特定の生物学的および／または病理学的系は、このアプローチを活用するために特によく適合している。例えば、ショウジョウバエの発生生物学は、十分特徴付けられており、容易に再現され、また大規模スクリーニング方法に適している。本発明の好ましい実施形態において、生物学的系の例は、限定するものではないが、アポトーシスおよび細胞増殖を含む。
【００５４】
遺伝子発現モニタリングは、例えば、分化しつつある組織、胚、または幼虫の発生段階を確定するために用いることができる。特徴的な遺伝子発現パターンは、密接におよび／または間接的に関連する発生段階と比較することによって、特定の段階の為に確立することが可能である。そのようなパターンは、細胞または組織の発生的段階付け(staging)に用いることができる。
【００５５】
本発明の他の目的、特徴、利点および態様は、以下の説明より当業者に明らかになるであろう。しかし、以下の説明および実施例は本発明の好ましい実施形態を示すものであるが、説明のためにのみ提供するものである。開示された発明の趣旨および範囲内にある種々の変更および改変は、以下の説明および本開示の他の部分を読めば当業者には容易に明らかになるであろう。
【実施例】
【００５６】
以下に本発明を実施例によってより詳細に説明する。しかし、本発明はこれらの実施例のみに限定するものではない。
【００５７】
実施例１
dsynoを含むトランスジェニックハエの作製
１）組換えベクターの構築
ショウジョウバエシノビオリン(dsyno)遺伝子として、CG1937を用いた。CG1937は、フライベースblastサイト( HYPERLINK "http://flybase.bio.indiana.edu/blast/" http://flybase.bio.indiana.edu/blast/)のblastp（タンパク質-タンパク質blast）によって、哺乳動物シノビオリンと最も高い相同性(63%)を有する遺伝子として見い出された。さらに、CG1937の推定上のRINGドメイン（これはユビキチンリガーゼの活性中心である）は高度に保存されている(82%)。したがって、この遺伝子は哺乳動物シノビオリンのハエ相同体であり、かつE3ユビキチンリガーゼとして機能しうるであろうと予測された。次に、ショウジョウバエシノビオリン(dsyno)が酵素活性を有するかどうかを調べるため、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)-dsynoΔ膜貫通ドメイン(TM)を用いて、自己ユビキチン化活性を分析した。in vitro自己ユビキチン化アッセイの手順は、以前に記述されている(Amano et al., 2003)。すなわち、1μgのGST-dsynoタンパク質を40 ngのE1 (Affiniti-Reserch)、0.3μgのE2 (His-UbcH5c)および0.75μgの32P標識ユビキチンと混合した。その結果、GST-dsynoΔTMは、哺乳動物シノビオリンと同一の自己ユビキチン化活性を示した(Amano et al., 2003)（図１）。そして、この活性は、dsynoのRINGドメインにおける突然変異(C305S)によって完全に消失した（図１）。
したがって、CG1937は哺乳動物シノビオリンのハエ相同体であることが示された。
【００５８】
CG1937のcDNAを含有するEST GH11117は、Open Biosystemsから購入した。CG1937の2.3 kb (約2282bp) cDNA（ショウジョウバエ）はEcoRI/Xho Iを用いてEST GH11117から切り出し、pUASTベクター中にサブクローン化した(Brand and Perrimon, 1993)。
【００５９】
２）キイロショウジョウバエの形質転換
UAS-dsynoを含むトランスジェニックハエ（以下、略して「UAS-dsyno TGハエ」と称する)は、当業者に周知の標準的手順によって組換えDNAを1μg/μlの濃度で遺伝子型W1118のキイロショウジョウバエ胚に注入することによって作製した (Spradling, Drosophila: A Practical Approach, D.B. Roberts, ed., IRL Press, DC(1986), pp. 175-197)。具体的には、UAS-dsyno TGハエ作製のため、CG1937のESTクローンである GH11117を購入して、pUASTベクター中にサブクローン化した。得られたUAS-dsynoベクターをマイクロインジェクションによりW1118ハエの胚に導入した。40のトランスジェニック系統が回収され、安定化された（図２）。UASドミナントネガティブ型のdsyno (dsynoDN)ハエ(UAS-dsynoDNハエ)を作製するためには、本発明者はCG1937 cDNAを改変して、ドミナントネガティブ型のdsynoタンパク質を産生できるCG1937(C305S)とし、この改変したcDNAをpUASベクター中にサブクローン化した。このpUAS-dsynoDNベクターをw1118ハエの胚に注入した。30のトランスジェニック系統が回収され、安定化された。
【００６０】
３）ショウジョウバエにおけるシノビオリンの発現
dsynoの発現は、以下に記述する免疫染色によって確認した。すなわち、成虫原基をPBS中で解剖し、固定バッファー（50 mM Tris-Cl [pH6.8], 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2 mM MgSO4, 150 mM NaClおよび2.2% ホルムアルデヒド）中で15分間固定し、そしてブロッキングバッファー（50 mM Tris-Cl [pH 6.8], 150 mM NaCl, 0.5% NP40および 5 mg/ml BSA）を用いてブロックした。固定した成虫原基を、ウサギ抗シノビオリン抗体の200倍希釈物中で、4℃で一晩インキュベートした。洗浄バッファー（50 mM Tris-Cl [pH 6.8], 150 mM NaCl, 0.5% NP40および1 mg/ml BSA）で洗浄後、ロバ抗ウサギFITCの200倍希釈溶液において4℃で3時間インキュベートし、洗浄バッファーで洗浄した。その後、マウンティング溶液（5 mg/ml フェニルエチレンジアミン、30% グリセリン、150 mM NaClおよび50 mM Tri-Cl [pH 6.8]）にマウントした。抗シノビオリン抗体を用いたショウジョウバエ成虫原基の免疫染色の結果を図３に示した。本発明者によって行われた抗シノビオリンモノクローナル抗体を用いた免疫組織染色（Amano et al., 2003）は、ショウジョウバエの成虫原基に何ら特定の染色パターンを示さなかった。用いた抗体は、シノビオリンのハエ相同体であるCG1937を認識しないのかもしれない事が考えられた。ハエにおけるdsynoタンパク質発現パターンを調べるため、CG1937に特異的な抗dsyno抗体を作製した。
【００６１】
dsynoの発現は、以下に記述するin situハイブリダイゼーションによる確認も行った。すなわち、Ponzielli et al. (2002)の記述のとおり胚を固定した。解剖した三齢幼虫をSolano et al. (2003)の記述のとおり固定した。In situハイブリダイゼーションは、CG1937に特異的なジゴキシゲニン(Dig)標識センスまたはアンチセンスRNAプローブを用いて、Ponzielli et al. (2002)の記述のとおり実施した。ただし、RNAプローブ合成する為の直鎖状のDNA鋳型は、2組のプライマーを用いて成虫ハエの全RNAからRT-PCRにより調製した点のみが異なっていた。
【００６２】
１）アンチセンスRNAプローブの合成
Synoviolin-AntiSense-Rev: 5'-catcatgcagctgctcttatcgtc -3'（配列番号３）および
Synoviolin-AntiSense-For-T7: 5' -taatacgactcactataggggttgacatcagattgtagggcgtc -3'（配列番号４）
２）センスRNAプローブの合成
Synoviolin-Sense-Rev: 5’ -gttgacatca gattgtagggcgtc -3’ （配列番号５）および
Synoviolin-Sense-For-T7: 5’-taatacgactcactatagggcatcatgcagctgctcttatcgtc -3’
（配列番号６）
【００６３】
ショウジョウバエ胚の異なる段階におけるdsyno (CG1937)のin situハイブリダイゼーションの結果を図4に示した。dsynoの転写物は、ハエの胚発生の非常に早い段階で検出された。メッセージは、胚発生の全段階を通して継続的に偏在的パターンで発現された。三齢幼虫期の成虫原基におけるin situハイブリダイゼーションの結果を図5に示した。dsyno転写物は、三齢幼虫の成虫原基に検出された。眼、触角、脚および翅原基が、CG1937のアンチセンスプローブによって染色された。該転写物は幼虫脳にも検出された。この染色は、対応するセンスプローブはこれらの組織のいずれも染色しなかったので、非特異的ではない。
【００６４】
以下に記述するようにRT-PCRによりdsyno mRNAの発現を調べることによって、ショウジョウバエの各発生段階におけるdsynoの発現を確認した。すなわち、トランスジェニックハエをhsp70-Gal4系統と交配した。子孫を三齢幼虫期に37℃で2時間インキュベートした。easy- Blue Total RNA Extraction kit (iNtRON)を用いて、使用説明書に従って5匹の幼虫から全RNAを抽出した。抽出した全RNA（1μg）はReverse Transcription system (Promega)を用いたcDNA合成反応に使用した。dsyno mRNAおよび偏在的に発現されるショウジョウバエリボソームタンパク質遺伝子rp49のmRNAの量を、以下のプライマーを用いたPCR（94℃で5分間アニーリング；94℃30秒、60℃1分、72℃1分30秒を38サイクル実施して増幅；および72℃7分）により測定した。
dsyno forward: 5' - ggtgattggatttgcctactacca - 3'（配列番号７）；
dsyno reverse: 5' - gatacagggtattcatgttgcgaa - 3'（配列番号８）；
rp49 forward: 5' - atgaccatccgcccagcatac - 3'（配列番号９）；
rp49 reverse: 5' - gagaacgcaggcgaccgttgg- 3'（配列番号１０）
その結果、dsynoメッセージは胚から成虫までハエの異なる発生段階で検出された（図６）。
dsyno(CG1937)がキイロショウジョウバエの全発生段階を通じて偏在的に発現されることが明確に示された。
【００６５】
実施例２
ショウジョウバエシノビオリン(dsyno)を過剰発現するトランスジェニックハエ
種々の組織特異的プロモーターおよびエンハンサーを含むGal4ドライバー（例：gmr-Gal4、Ser-Gal4、MS1096-Gal4およびe16E-Gal4）を用いたGal4-UAS系により種々の組織にdsynoの発現を導いた。
【００６６】
１）GE27750におけるdsyno過剰発現の効果
GE27750におけるdsyno過剰発現の効果を確認した。GE27750は、GenExel EPライブラリー由来の系統で、Δ2-3トランスポザーゼによるEPエレメントのランダム可動化によって作製した（図７）。これは、CG1937のUTR領域にEPエレメントのインサートを含む。GE27750 (R)は、dsynoの欠失変異体または新たな挿入変異体を作るためのEPエレメントジャンピングアウト(jumping-out)の過程で作製された(図８)。この新しい挿入EP系統において、EPエレメントは元の位置から8-10塩基対離れて挿入されており、その方向は逆向きになっている。GE27750系統は、セミホモ接合致死性である。（GE27750(R)系統は、ホモ接合致死性である）。
【００６７】
異なる組織に特異的な複数のGal4ドライバーをGE27750と交配した。これらのGal4ドライバーは、種々の組織特異的制御エレメントの制御下でGAL4タンパク質を発現し、そして眼、羽または脚におけるCG1937の発現をもたらす。しかし、これらのGal4ドライバーのみを用いた場合は、可視的な表現型はまったく示されなかった。したがって、CG1937はこの系統でGal4ドライバーによって過剰発現させうることが示された（図9および10）。
【００６８】
２）組織特異的Gal4ドライバーを用いたUAS-dsynoトランスジェニックハエにおけるdsyno過剰発現の効果
GE27750におけるCG1937の過剰発現と比較して、UAS-dsynoトランスジェニックハエにおけるCG1937の過剰発現は、眼および羽に可視的な欠陥表現型を引き起こした（図11および12）。gmr-Gal4ドライバーを用いた眼におけるCG1937の発現は、25℃で眼の脱色を引き起こした（図11）。ハエにおけるこの眼の表現型は、29℃で飼育した場合一層悪化した(図13)。重度の脱色、でこぼこ、光沢のある眼という表現型が、29℃で飼育したgmr-gal4;UAS-dsynoトランスジェニックハエにおいて示された。Ser-Gal4ドライバーを用いた羽翼におけるCG1937の発現は、下向きに曲がった羽をもたらした(図12)。Ser-Gal4は羽の背側領域にUAS-標的遺伝子の発現を導くので、下向きに曲がった表現型は、羽の背側領域における細胞増殖に由来するのかもしれない。別の羽特異的Gal4ドライバーであるMS1096-Gal4もまた、UAS-dsyno TGハエに羽の欠陥を引き起こす(図14)。MS1096-Gal4; UAS-dsynoハエは、上向きに曲がった羽を有する。MS-1096は、羽パウチにGAL4タンパク質の発現を導く。e16E-Gal4; UAS-dsynoハエにおいて、最も明瞭な欠陥羽表現型を調べた(図15)。この系統においては、羽翼の後ろ半分にGAL4タンパク質が発現される。このハエの羽の前半分は正常であるが、後ろ半分にはしわがあった。ハエを29℃で飼育した場合、羽の欠陥はよりひどくなった。
【００６９】
CG1937の過剰発現による眼および羽の欠陥表現型は、UAS-dsynoトランスジェニック系統のなかで同一ではない。ある特定のトランスジェニック系統のみが欠陥表現型を示し、そして各系統の欠陥の程度は異なっていた。UAS-dsynoベクターが各UAS-dsynoトランスジェニック系統に挿入されている染色体環境の差に由来するのかもしれない。各系統の欠陥の程度を決定し、そして最終的にはシノビオリンの変更因子スクリーニングに適したUAS-dsyno TG系統を見つけ出すため、e16E-Gal4ドライバーを用いて40のUAS-dsyno TG系統の全てを試験した。40のUAS-dsyno TG系統のうち、10系統が羽の後ろ半分にしわを示し、また2系統が他の羽欠陥（切込みおよび短いL4翅脈）を示した。羽の後ろ半分のしわという表現型を示した10のTG系統のうち、#21は最も重度の欠陥を示した（図16）。#9はe16E-Gal4と交配すると致死であったが、生存したハエは#21より一層重度の羽の欠陥を示した。#21は、変更因子スクリーニングのための良い候補であると考えられる。
【００７０】
しわのある羽という表現型を示した7のトランスジェニック系統において、RT-PCRによってCG1937の発現を調べた。予測したように、羽の欠陥が重度であるほどCG1937の発現は高かった(図17)。インバースPCR(inverse PCR）により、11のUAS-dsyno TG系統におけるUAS-dsynoベクターの挿入位置を調べた(図18)。#9-2はＸ染色体に2つのインサートを有し、また#21を含む6系統では第3染色体に1つのインサートを有し、4系統では第2染色体に1つのインサートを有する。
【００７１】
曲がった羽という表現型が三齢幼虫期に存在するかどうか決定するため、幼虫翅原基を調べた。すなわち、MS1096-Gal4; wg-LacZ; UAS-dsynoハエの幼虫翅原基をLacZで染色した(図19)。しかし、背側および腹側羽袋状部(wing pouch)の間に大きさの相違は検出されなかった。
その結果、dsynoの過剰発現は羽および眼に可視的な表現型を引き起こすことが示された。
【００７２】
実施例３
組織特異的Gal4ドライバーを用いたdsynoDNの過剰発現
１）羽におけるdsynoDN (CG1937-C305S)過剰発現の効果
種々の組織特異的Gal4ドライバーを用いたドミナントネガティブ型のdsyno (dsynoDN)の過剰発現は、25℃では#12トランスジェニックハエを除いてトランスジェニックハエの羽になんら欠陥を引き起こさなかった。#12 TG系統は、第3染色体に3つのインサートを有する。e16E-Gal4は、野生型CG1937の過剰発現により引き起こされた羽表現型と比較して逆の羽表現型を引き起こした。e16E-Gal4; UAS-dsynoDN#12 ハエにおいては、羽の後ろ半分が欠失していた(図20および21)。さらに、Ser-Gal4; UAS-dsynoDN#12 ハエにおいては、羽は上向きに曲がっていた（図20および22）。MS1096-Gal4ドライバーもまたUAS-dsynoDN#12 に羽欠陥を引き起こしたが、それはUAS-dsynoハエに見られたのと同じ上向きの羽表現型であった。
【００７３】
２）眼におけるdsynoDNの過剰発現の効果
#12 TG系統のみがgmr-Gal4ドライバーと交配したときに眼の欠陥を示した。gmr-Gal4; UAS-dsynoDN#12ハエは、光沢のある眼という表現型を示した（図23）。
【００７４】
３）CG1937(C305S)の発現レベル
UAS-dsynoDN TG系統において、ドミナントネガティブ型のCG1937の発現をRT-PCRにより調べた（図24）。#12系統におけるCG (C305S)の発現レベルは、他のTG系統の発現レベルよりも高くなかった。したがって#12系統における羽および眼の表現型は、dsynoDNタンパク質の過剰発現の結果ではないのかもしれない。
その結果、ドミナントネガティブ型のdsyno (C305S)の過剰発現は、ハエに可視的な表現型をなんら引き起こさないことが示された。
【００７５】
実施例４
dsyno突然変異体の有糸分裂クローン(mitotic clone)
１）82FRT-GE27750染色体の作製：
FRT-GE27750染色体を作製するため、GE27750系統を82B-w+ FRT 系統と交配し、そしてF1子孫中の相同染色体間の減数分裂交差（CO）により82B-w+-GE27750または82B-w--GE27750 染色体を作製した。F2世代でCO染色体を回収した。G418培地で生育する能力によってCO子孫におけるFRTの存在を試験し、そしてFRT特異的プライマーを用いたPCRにより確認した。GE27750の存在は、そのホモ接合致死性によって同定した。3つの82FRT-w+-GE27750 CO 系統および4つの82FRT-w--GE27750 CO系統を回収した。
【００７６】
２）発生途中のハエおよび成虫ハエの組織におけるdsyno喪失の効果
ハエにおけるdsynoの機能を理解するため、FLP/FRT系を用いて発生途中の眼および成虫の眼においてGE27750の有糸分裂クローンを作製した。先に記述したように、GE27750ホモ接合の成虫ハエは致死であり、死因は不明である。eye-FLPドライバーを用いてGE27750-/-クローンを作製した場合、eye-FLP; 82FRT-GFP/82FRT-GE27750 ハエの眼および触角原基は多数のGE27750-/-クローンを含んでおり、クローンサイズは様々であった（図25）。あまりにも多くの有糸分裂クローンを作製したため、各クローンのツインスポット（twin spot）を決定することはできなかった。したがって、クローンとそのツインスポットとのサイズは比較しなかった。この分析のため、hs-FLPを用いた有糸分裂クローンの作製が現在進行中である。GE27750-/-クローンを含む成虫の眼は、可視的な欠陥をなんら示さなかった（図26)。
その結果、GE27750-/-の有糸分裂クローンは眼に可視的な欠陥をなんら示さないことが判明した。
e16E-Gal4; UAS-dsynoハエは、dsyno変更因子をスクリーニングするためのハエモデルとして用いることが可能である。
【００７７】
実施例５
ショウジョウバエシノビオリンはp53依存性アポトーシス経路を制御する。
１）Dmp53を過剰発現するトランスジェニックハエの作製
dsynoがDmp53をin vivoで代謝することを証明するため、羽の後ろ半分にのみ発現を導くe16E-Gal4ドライバーを用いて、p53のショウジョウバエ相同体(Dmp53)を過剰発現するトランスジェニックハエを以下に記述するように作製した。Dmp53をコードするDNA配列を配列番号11に示す。Dmp53のアミノ酸配列を配列番号12に示す。標準的手順(Spradling, 1986)に従って組換えDNAを1μg/μlの濃度でキイロショウジョウバエ胚に注入することによって、UAS-dsynoおよびUAS-Dmp53を含むトランスジェニックハエを作製した。組織特異的プロモーターおよびエンハンサーを含むe16E-Gal4ドライバーを用いたGal4-UAS系により、羽の後ろ半分にdsynoおよびDmp53の発現が導かれた。e16E-Gal4/UAS-Dmp53; UAS-dsyno/+ハエは、e16E-Gal4/UAS-Dmp53 雌およびe16E-Gal4/CyO; UAS-dsyno/TM2雄の交配によって作製した。
【００７８】
その結果、羽翼の後ろ半分におけるDmp53の発現のみが、羽の前半分および後ろ半分の間の不均等な細胞増殖によって引き起こされた、泡のある羽という表現型を示した(図27)。他方、e16E-Gal4ドライバーを用いたdsynoの過剰発現は、しわのある羽および泡のある羽という表現型を示した（図27）。したがって、dsynoおよびDmp53が本当にin vivoで相互作用しうるのかどうかを明らかにするため、各トランスジェニック系統を異種交配した。驚くべきことに、ハエにおけるdsynoの過剰発現によって、UAS-Dmp53ハエの切込みのある羽という表現型のみが抑制された(図28)。この結果は、dsynoはDmp53をユビキチン化するばかりでなく、dsynoはDmp53を生理学的に代謝すること、そしてdsynoはDmp53に対する支配的因子であり得ることを強く示唆する。
【００７９】
２）翅原基の免疫染色
次に、dsynoがDmp53をin vivoで代謝することを証明するため、e16E-Gal4/UAS-Dmp53; UAS-dsyno/+ハエの翅原基におけるDmp53の発現レベルを以下に記述するように免疫染色により分析した。すなわち、翅原基をPBS中で解剖してバッファー（50 mM Tris-HCl (pH6.8), 1 mM EGTA, 1% Triton Χ-100, 2 mM MgSO4, 150 mM NaCl, 2.2% ホルムアルデヒド）中で15分間固定し、ブロッキングバッファー（50 mM Tris-HCl (pH6.8), 150 mM NaCl, 0.5% NP40 および5 mg/mL BSA）を用いてブロックした。固定した翅原基を、ウサギ抗Dmp53抗体の200倍希釈物中で、4℃で一晩インキュベートした。洗浄バッファー（50 mM Tris-HCl [pH 6.8], 150 mM NaCl, 0.5% NP40および1 mg/ml BSA）で洗浄後、ロバ抗ウサギFITCの200倍希釈物中で4℃で3時間インキュベートし、洗浄バッファーで洗浄し、そしてマウンティング溶液（5 mg/ml フェニルエチレンジアミン、30% グリセリン、150 mM NaClおよび50 mM Tri-HCl [pH 6.8]）にマウントした。
その結果、dsynoの過剰発現によってDmp53は顕著に減少した（図29）。この結果は、個々のクローンによって確認された。
【００８０】
３）アクリジンオレンジ染色
さらに、dsynoの過剰発現によって低下したDmp53の発現レベルがアポトーシスの阻止を引き起こすかどうかを調べるため、下記のようにアクリジンオレンジ染色を実施した。すなわち、翅原基を解剖バッファー（1xPBS、ショウジョウバエリンゲル液）中で解剖し、組織を1.6×10-6 Mのアクリジンオレンジ溶液［1.6μLの1 mMアクリジンオレンジストック（1.51 mgのアクリジンオレンジを5 mlの無水エタノールに溶解）をショウジョウバエリンゲル液で希釈］中で5分間インキュベートする。ショウジョウバエリンゲル液で簡単にすすいだ後、ショウジョウバエリンゲル液にマウントし、カバースリップで覆う。
【００８１】
その結果、e16E-Gal4/UAS-Dmp53ハエの翅原基中のアポトーシス細胞が、Dmp53が過剰発現している翅原基の後ろ半分に見い出された（図30）。しかし、これらのアポトーシス細胞は、e16E-Gal4/UAS-Dmp53; UAS-dsyno/+ハエの翅原基では顕著に減少していた（図30）。したがって、ハエおよび哺乳動物の両方においてシノビオリンがp53の生理学的制御に関与することが明確に示された。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明のトランスジェニックハエは種々の用途、例えば、特定の疾患（RAおよび癌等）の機構を解明するためのツール；特定の疾患（RAおよび癌等）の治療用化合物を同定するためのスクリーニングツール；などに利用可能である。本発明のトランスジェニックハエは、RAおよび癌等の特定の疾患を治療するために用いる治療剤を同定するために設計されたスクリーニング方法に特に有用である。シノビオリンの過剰発現によるRSCの異常増殖を含むRAの病因が、モデル生物としての本発明のトランスジェニックハエによって証明されるであろう。
【００８３】
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【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】in vitro自己ユビキチン化アッセイの結果を示す。
【図２】組織特異的Gal4ドライバーを用いた、UAS-dsyno (GH11117)トランスジェニックハエにおけるCG1937過剰発現の効果を示す。
【図３】抗シノビオリン抗体を用いた、ショウジョウバエ成虫原基の免疫染色の結果を示す。
【図４】ショウジョウバエ胚の異なる段階におけるCG1937のin situハイブリダイゼーションの結果を示す。
【図５】三齢幼虫期の成虫原基におけるCG1937のin situハイブリダイゼーションの結果を示す。
【図６】ショウジョウバエの異なる発生段階におけるCG1937の発現の結果を示す(RT-PCR)。
【図７】CG1937のUTR領域における2つのEP系統を示す。
【図８】dsyno欠失変異体作製の概要を示す。
【図９】GE27750およびGE27750(R)におけるCG1937 (dsyno)の発現の結果を示す。
【図１０】組織特異的Gal4ドライバーを用いた、GE27750におけるCG1937過剰発現の効果を示す。
【図１１】gmr-Gal4; UAS-dsynoトランスジェニック系統における眼の表現型を示す（25℃）。
【図１２】Ser-Gal4; UAS-dsynoトランスジェニックハエにおける羽の表現型を示す。
【図１３】gmr-Gal4; UAS-dsynoトランスジェニック系統における眼の表現型を示す（29℃）。
【図１４】MS1096-Gal4; UAS-dsynoトランスジェニックハエにおける羽の表現型を示す。
【図１５】e16E-Gal4; UAS-dsynoトランスジェニックハエにおける羽の表現型を示す。
【図１６】e16E-Gal4ドライバーを用いた、UAS-dsynoトランスジェニックハエにおけるCG1937過剰発現の効果を示す。
【図１７】UAS-dsynoトランスジェニックハエにおけるCG1937の発現を示す(RT-PCR)。
【図１８】インバースPCR（Inverse PCR）によるUAS-dsynoトランスジェニック系統のアノテーション(annotation)を示す。
【図１９】MS1096-Gal4; wg-LacZ; UAS-dsynoハエの幼虫翅原基を示す。
【図２０】組織特異的Gal4ドライバーを用いた、ドミナントネガティブ型CG1937過剰発現の効果を示す。
【図２１】e16E-Gal4; UAS-dsynoDN#12トランスジェニック系統の羽の欠陥を示す。
【図２２】Ser-Gal4; UAS-dsynoDN#12ハエの羽の表現型を示す。
【図２３】gmr-Gal4; UAS-dsynoDN#12ハエの29℃における眼の表現型を示す。
【図２４】UAS-dsynoDNトランスジェニックハエにおけるドミナントネガティブ型CG1937 (C305S)の発現を示す（RT-PCR）。
【図２５】GE27750の有糸分裂（mitotic）クローンの翅原基を示す。
【図２６】GE27750の有糸分裂クローンの成虫の眼を示す。
【図２７】e16E-Gal4; UAS-Dmp53トランスジェニックハエの羽の表現型を示す。
【図２８】e16E-Gal4; UAS-Dmp53トランスジェニックハエの羽の表現型を示す。
【図２９】e16E-Gal4; UAS-Dmp53トランスジェニックハエの羽の表現型の、抗p53抗体を用いた免疫染色を示す。
【図３０】e16E-Gal4; UAS-Dmp53トランスジェニックハエのアクリジンオレンジ染色を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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