(57)【要約】本発明は、プロテオロドプシンアポプロテインおよびレチナールアナログを含有する光互変性物質に関する。一実施態様において、レチナールアナログは、アズレン様レチノイド化合物である。別の実施態様において、レチナールアナログは、オール-トランス-レチナールに構造的に類似した別の化合物である。プロテオロドプシンアポプロテインおよびレチナールアナログは、同じプロテオロドプシンアポプロテインおよびオール-トランス-レチナールによって形成された対応する光互変性物質のスペクトルと異なるスペクトル特性を有する光互変性物質を形成する。本発明の実施態様において、レチナールアナログ含有プロテオロドプシンは、オール-トランス-レチナール含有プロテオロドプシンと有意にオーバーラップしない吸収スペクトルを持つ。本発明の別の実施態様において、レチナールアナログ含有プロテオロドプシンは、オール-トランス-レチナール含有プロテオロドプシン発色団と比較して赤方偏移した視覚的発色団を提供する。本発明の光互変性物質は、光学データ保存担体として、不正防止光学データ担体、安全インクおよび他の光学的用途において、有用である。
2008502791.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテオロドプシンアポプロテインおよび
式Ｉ
【化１】
2008502791.tif 000026
式Ｉ
［式中、R'、R''およびR'''は、各々独立して、H、C1-4直鎖アルキル、またはC1-4 分岐鎖アルキルであり、
nは、1〜4の整数であり;
XaおよびX'b は、各々独立してH、C1-4 アルキル、F、ClまたはCF3であり；
Yは、存在しないかまたは、Yは、パラ−、メタ−またはオルト-フェニルであり;そして
Zは、CHOである］
のアズレン様レチノイド化合物を含む、光互変性物質。
【請求項２】
R'およびR'''がC1-4直鎖アルキルであり、およびR''がC1-4分岐鎖アルキルである、請求項１記載の光互変性物質。
【請求項３】
R'= R'''=メチル、およびR''=イソプロピルである、請求項2記載の光互変性物質。
【請求項４】
Yが存在していない、請求項1記載の光互変性物質。
【請求項５】
アズレン様レチノイド化合物が、化合物A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、MおよびNからなる群から選択される、請求項1記載の光互変性物質。
【請求項６】
プロテオロドプシンアポプロテインおよびレチナールアナログを含み、該レチナールアナログが、p-ジメチルアミノシンナムアルデヒド、化合物O、P、Q、RおよびSからなる群から選択される、光互変性物質。
【請求項７】
光互変性物質が、プロテオロドプシンアポプロテインおよびオール-トランス-レチナールを含む対応する光互変性物質のスペクトル特性とは異なるスペクトル特性を有する、請求項1 または 6記載の光互変性物質。
【請求項８】
光互変性物質が、プロテオロドプシンアポプロテインおよびオール-トランス-レチナールを含む対応する光互変性物質の吸収スペクトルと有意にオーバーラップしない吸収スペクトルを持つ、請求項7記載の光互変性物質。
【請求項９】
光互変性物質が、プロテオロドプシンアポプロテインおよびオール-トランス-レチナールを含む対応する光互変性物質の極大吸収波長と比較して、赤方偏移した極大吸収波長を有する、請求項7記載の光互変性物質。
【請求項１０】
光互変性物質の極大吸収波長が550-750 nmの間にある、請求項9記載の光互変性物質。
【請求項１１】
光互変性物質の極大吸収波長が600-700 nmの間にある、請求項10に記載光互変性物質。
【請求項１２】
プロテオロドプシンアポプロテインがBacA8またはその変異体から得られる、請求項1または6記載の光互変性物質。
【請求項１３】
プロテオロドプシンアポプロテインがHot75mlまたはその変異体から得られる、請求項1または6記載の光互変性物質。
【請求項１４】
請求項1または6記載の光互変性物質を含む、固体物質。
【請求項１５】
固体物質が、固体形態へと固化する前に該光互変性物質と共に均質相を形成できる、1以上の親水性ポリマーをさらに含む、請求項14記載の固体物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、プロテオロドプシンアポプロテインおよびレチナールアナログ、例えばアズレン様（azulenic）レチノイド化合物およびその他の化合物を含む光互変性物質に関する。プロテオロドプシンアポプロテインおよびレチナールアナログは、同じプロテオロドプシンアポプロテインおよびオール-トランス-レチナールによって形成される光互変性物質のものとは異なるスペクトル特性を有する光互変性物質を形成する。本発明の光互変性物質は、光学データ保存担体、不正防止(fraud-proof）光学データ担体、安全インクおよび他の光学的用途において使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
(発明の背景)
バクテリオロドプシン(BR)は、Halobacterium salinariumと呼ばれる海洋真正細菌の光合成系において見出されたレチナールタンパク質分子である。BR分子は、一般的に紫膜と呼ばれる2D タンパク質-脂質アレイを形成する細胞膜に位置する。光学データ保存のための光互換性タンパク質様バクテリオロドプシン(BR)の使用は、将来性があると考えられてきた。BRを基にした光学フィルムは、過去２０年間の間役立ってきたが、これらのフィルムは、データ保存用途に対して、それらを商業的に実施し得るために要求される特性を持ってはいなかった。BRを基にしたフィルムを用いる問題の一つは、BRが、0.2-1 μMサイズのタンパク質-脂質パッチを形成することである。BRをこのパッチから抽出し、モノマータンパク質を形成させると、不安定となり、数日の間に不活性となる。光学フィルムにおいてこれらのBRパッチを用いる問題は、パッチがフィルムと干渉するために使用される光の波長とおおよそ同一サイズである点であり、これは、読み取り、書き出しサイクルの間に顕著な光散乱を生じ、これによってノイズが増加し、フィルムの性能が低下することである。さらに、BRパッチは、互いに粘着する傾向があり、その結果、フィルム中のBRタンパク質の不均質な分布を生じ、BRを基にした光学フィルムの性能をさらに低下させる。
【０００３】
BRの別の問題は、大量で提供するためには高価であることである。BRは、それが完全に機能的であるためには、天然生物H. salinarum において発現されなければならない[Dunn, et al., J Biol Chem, 262: 9246-9254 (1987); Hohenfeld, et al., FEDB lett, 442: 198-202 (1999))］。H. salinarum は、増殖が非常遅く、細胞密度が低く、増殖培地において多量の塩の存在を必要とする。H. salinarumの低生産性、および培養および高塩性増殖培地に耐え得る回収設備を特注するのに高額な費用が必要なため、高いBR産生コストをもたらす。
【０００４】
プロテオロドプシン(PR)は、バクテリオロドプシンとは遠縁である(22-24% 配列 同一性)。プロテオロドプシンは、完全な膜タンパク質である；それらは、非培養性の海洋真正細菌から単離され、光駆動プロトンポンプとして機能する。オール-トランス-レチナール補助因子が光を吸収すると、プロテオロドプシンは光サイクルを多くの中間体を介して通過する。プロテオロドプシン分子が光刺激により励起すると、プロテオロドプシン／レチナール複合体は不安定な中間エネルギー状態に励起されると考えられている。プロテオロドプシンは、エネルギー安定状態または中間状態、例えば、"M-様状態" もしくは "M-状態"、"K-様状態" もしくは "K-状態"、"N-様状態" もしくは "N-状態" または "O-様状態" もしくは "O-状態"を含む一連の不安定なエネルギー状態を経て進行する。やがて、この複合体は、プロトンの輸送の進行に伴ってさらに安定な基底状態（basal state）に戻る。
【０００５】
プロテオロドプシンおよびバクテリオロドプシンは、異なるタンパク質ファミリーである。これらのタンパク質は、いくつかの共通する特性を有するが、明らかに異なる性質も有する。プロテオロドプシンは、プロテオロドプシンの発現および産生が容易であるため、いくつかの技術的用途においてバクテリオロドプシンよりもさらに利点を持つ。プロテオロドプシンは、迅速に高レベルのタンパク質を発現し得る細菌宿主、E. coliにおいて機能的に発現され得る。そのため、プロテオロドプシンの生産は、バクテリオロドプシンの生産よりもより経済的かつ効率的である。
【０００６】
Beja ら(Science 289:1902-6, 2000)は、海洋性γ−プロテオバクテリアの非培養メンバー (すなわち、"SAR86" グループ)に由来のプロテオロドプシン遺伝子のクローニングを開示した。このプロテオロドプシンは、E.coli で発現され、オール-トランス-レチナールと結合して、活性な光駆動プロトンポンプを形成した。
【０００７】
Beja ら(Nature 411:786-9, 2001) は、種々の源からの２０以上の変異体プロテオロドプシン遺伝子のクローニングを開示した。これらのプロテオロドプシン変異体は、全世界に渡って分布し、様々な波長に光の極大吸収を示す広範囲のプロテオロドプシン変異体ファミリーに属すると思われる。
【０００８】
Dioumaev ら(Biochemistry, 42: 6582-6587 (2003))は、閃光光分解および可視範囲における吸収変化の測定に、ポリアクリルアミドゲルに封入したプロテオロドプシン含有膜フラグメントを用いたことを開示した。
米国特許第 5,235,076 (Asato)は、アズレン様レチノイド化合物および治療組成物を開示する。該組成物は、皮膚疾患、例えばアクネおよび乾癬を処置する際に有用である。 
【０００９】
米国特許第 4,896,049 (Ogawa)は、多様なレチナールの合成アナログを開示しており、異なる吸収波長を持つ。Ogawaらに開示された合成レチナールアナログは、出典明示により本明細書の一部とする。
【００１０】
Khodonov ら(SensorsおよびActuators B 38-39:218-221 (1997))は、天然バクテリオロドプシン発色団、オール-トランス-レチナールをそのアナログで置換することによって修飾されたバクテリオロドプシンを説明している。Khodonovらにおいて開示されたレチナールアナログは、出典明示により本明細書の一部とする。
【００１１】
Imai ら(PhotochemistryおよびPhotobiology, 70: 111-115 (1999))は、アズレン様レチナールアナログが、赤方偏移した視覚色素アナログを与えることはできないが、ポリエナール 3-メトキシ-3-デヒドロレチナールおよび14F-3-メトキシ-3-デヒドロレチノールの9-cis アイソマーは、663および720 nmでアイオドプシンの色素アナログを提供することを開示している。
【００１２】
光学データ保存は保存能が非常に高く、データの読み書きも迅速に提供するため、光学データ保存はコンピューター産業に大改革をもたらす可能性がある。さらに、光学シグナル処理を用いると、現在のコンピューター技術によって行うことは困難である、パターン認識のための高度な並行処理様式に使用できる。これらの用途を実現するには、光の散乱が少ない有効な光学物質を用いる必要がある。
【００１３】
紙幣、紙幣、身分証明書などの書類は、それらを複製または偽造することが困難となるような安全対策特徴を組み込むことが多い。これらのほとんどは、紙を製造する段階で安全対策特徴類のすかし模様などが導入された特別な紙を用いるか、または複製を困難にするように非常に細い線模様（hairline pattern）を印刷するかのいずれかに基づいている。しかし、このような特徴は絶えず人目にさらされており、精巧な安全対策的要件を満たしていない。
【００１４】
効率的かつ経済的に製造でき、バックグラウンドのノイズを低下させる光学的情報担体が必要とされている。かかる光学的情報担体は、光学データ保存物質または不正防止光学データ担体として効果的である。異なる発色団を有するプロテオロドプシンは、光学的情報担体の改善を提供する。
【００１５】
最も赤方偏移した天然視覚色素(λmax =630 nm)は、魚の網膜において同定され、これは発色団(Imai, 上掲)として3-デヒドロレチノールを持っている。光学保存機器リーダーでコスト効果的な赤色レーザーを使用できるように、赤方偏移したプロテオロドプシン/レチナールアナログ組成物が、必要とされている。
【発明の開示】
【００１６】
発明の要約
本発明は、光学的用途に有用な光互変性物質を目的とするものである。光互変性物質は、プロテオロドプシンアポプロテインおよびレチナールアナログを含む。一実施態様において、レチナールアナログは、アズレン様レチノイド化合物である。別の実施態様において、レチナールアナログは、オール-トランス-レチナールと構造的に類似している化合物である。
【００１７】
プロテオロドプシンアポプロテインおよびレチナールアナログは、同じプロテオロドプシンアポプロテインおよびオール-トランス-レチナールによって形成される対応する光互変性物質のものとは有意に異なるスペクトル特性を有する光互変性物質を形成する。本発明の一実施態様において、プロテオロドプシンアポプロテインおよびレチナールアナログは、オール-トランス-レチナール含有プロテオロドプシンのものと有意にオーバーラップしない吸収スペクトルを有する光互変性物質を形成する。本願の別の実施態様において、プロテオロドプシンアポプロテインおよびレチナールアナログは、オール−トランス−レチナール発色団と比較して赤方偏移した視覚的発色団をもたらす光互変性物質を形成する。
【００１８】
本発明の光互変性物質は、光学データ保存担体、不正防止光学データ担体、安全インクおよび他の光学的用途で使用できる。
【００１９】
（図面の簡単な説明）
図１は、pH 9.7でオール−トランス−レチナールまたはレチナールアナログ(化合物A、BまたはC) を含有する界面活性剤で可溶化した精製Bac31A8プロテオロドプシンのスペクトルを示す。
【００２０】
図２は、pH 9.7でオール−トランス−レチナールまたはレチナールアナログ(化合物A、BまたはC)を含有する界面活性剤で可溶化した精製Hot75M1プロテオロドプシンのスペクトルを示す。
【００２１】
図３は、時間に対する640 nmでの化合物 B含有Bac31A8E108Q プロテオロドプシンの吸収を示す。プロテオロドプシンを、630 nmの光フィルターと共役した光を用いて照射した。光はt = 20 秒で点灯させ、t = 60 秒で消した。
【００２２】
図４は、時間に対する640 nmでの化合物 B含有Bac31A8E108Q プロテオロドプシンの吸収を示す。プロテオロドプシンを、475 nmの光フィルターと共役した光を用いて照射した。光はt = 20 秒で点灯させ、t = 60 秒で消した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（発明の詳細な説明）
定義
本明細書において使用したように、用語"作用光"は、光互変性物質において光互換性変化を与えることができる放射エネルギー、特に可視および紫外スペクトル領域における放射エネルギーを示す。
【００２４】
本明細書において使用したように、用語"アポプロテイン"は、共役タンパク質のタンパク質の一部を意味する。"プロテオロドプシンまたはバクテリオロドプシンアポプロテイン"は、オール−トランス−レチナールまたはレチナールアナログを含まないプロテオロドプシンまたはバクテリオロドプシンタンパク質それ自身を意味する。
【００２５】
本明細書において使用したように、用語"アズレン様レチノイド化合物"は、修飾されるか、または修飾されていないオール−トランス−レチナールのバックボーンに結合したアズレン様基を有する化合物を意味する。 
【００２６】
本明細書において使用したように、用語"基底状態"または"B-状態"または"B-様状態"は、光励起のないプロテオロドプシン分子またはバクテリオロドプシン分子の光反応サイクルの基底状態を意味する。用語"M-状態" または "M-様状態"とは、基底状態に比して光サイクルの励起されたスペクトル状態を意味する。
【００２７】
本明細書において使用したように、"光互換性"は、放射エネルギー(光として)に暴露されると、色を変化させる能力を有することを意味する。
【００２８】
本明細書において使用したように、用語"レチナールアナログ"は、オール-トランス-レチナールを置き換えて、プロテオロドプシンのアポプロテインと結合できる化合物を意味する。 
【００２９】
我々は、特定のレチナールアナログが、光プロテオロドプシンアポタンパク質に組み込まれ、反応サイクルをもたらし、有用な光互変性物質を形成することを見出した。
【００３０】
本発明は、プロテオロドプシンアポプロテインおよびレチナールアナログを含む光互変性物質を目的としている。一実施態様において、レチナールアナログは、アズレン様レチノイド化合物である。別の実施態様において、レチナールアナログは、構造的にオール-トランス-レチナールに類似した化合物である。
【００３１】
プロテオロドプシンアポプロテインおよびレチナールアナログは、同じプロテオロドプシンアポプロテインおよびオール-トランス-レチナールによって形成される対応する光互変性物質のものと異なるスペクトル特性を有する光互変性物質を形成する。スペクトル特性における差違により、光学データ保存の能力を増加させ、および／または並行処理を可能にする複数の光の波長を使用する機会が提供される。スペクトル特性における差違により、安全インクの用途においてプロテオロドプシンの異なる色がさらに提供される。赤方偏移したレチナールアナログ含有プロテオロドプシンは、赤色レーザーと共に用いられ、これはオール-トランス-レチナール含有プロテオロドプシンに必要な緑色レーザーと比して、コスト効率がよい。
【００３２】
プロテオロドプシンは、一般的にシリンダー形態のチャンネルを形成する７回の脂質膜-貫通α-ヘリックス構造を有するトランス-膜タンパク質である。正しくフォールドされ、およびオール-トランス-レチナールが与えられた場合、プロテオロドプシンの７つのα-ヘリックスは、オール-トランス-レチナールを取り巻くケージとして配置される。プロテオロドプシンアポプロテインは、シッフ塩基結合によって、保存性のリジン残基で(Bac31A8ではK231およびHot75M1ではK234)オール−トランス−レチナールと結合し、光の可視波長範囲において吸収する色素を形成する。一般的には天然プロテオロドプシンアポプロテインおよびオール−トランス−レチナールは、極大吸収波長範囲が約480-550 nm、多くは488-526 nmを有する光互変性物質を形成する(Man, et al. Embo J. 22:1725-1731 (2003))。
【００３３】
本発明の実施態様において、プロテオロドプシンアポプロテインは、レチナールアナログに結合し、光互変性物質を形成し、この吸収スペクトルは、同じプロテオロドプシンアポプロテインおよびオール-トランス-レチナールによって形成された対応する光互変性物質の吸収スペクトルと有意にオーバーラップしない。"有意にオーバーラップしない"とは、特定の波長が、１つのプロテオロドプシンの吸収波長での吸収(光学密度)が、同一条件(例えば温度)下で別のプロテオロドプシンの吸収よりも、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、または少なくとも10倍高いように選択され得ることを意味する。例えば、600 nmで、光互変性物質Xが1.0 ODの吸収を示し、光互変性物質Yが0.5と等しいかまたは0.5より低い、好ましくは0.33、好ましくは0.2、より好ましく0.1 ODの吸収を有するなら、そのため光互変性物質XおよびYの吸収スペクトルは有意にオーダーラップしない。異なる吸収スペクトルを提供することによって、本発明の光互変性物質は、複数の色を提供し、および／または光学データ保存の能力を増強する。
【００３４】
本発明の別の実施態様において、プロテオロドプシンアポプロテインは、レチナールアナログと結合し、同じプロテオロドプシンアポプロテインおよびオール-トランス-レチナールによって形成される対応する複合体と比して、赤方偏移した発色団をもたらす光互変性物質を形成する。本発明の光互変性物質の極大吸収波長は、550-750 nm、好ましくは600-700 nm、より好ましくは625-650 nmの範囲であり、これは同じプロテオロドプシンアポプロテインおよびオール-トランス-レチナールによって形成された複合体の極大吸収波長から赤方偏移した範囲である。赤方偏移した発色団は、例えば、書き込み用(光活性化)光源として赤色レーザーと共に使用されるのに有用である。
【００３５】
オール-トランス-レチナール
オール−トランス−レチナールの構造は下記に示される:
【化１】
2008502791.tif 000003
【００３６】
レチナールアナログ
レチナールアナログは、式Ｉ： 
【化２】
2008502791.tif 000004
式Ｉ
[式中、R'、R''およびR'''は、各々独立して、H、C1-4直鎖アルキル、またはC1-4 分岐鎖アルキルであり、
nは、1〜4の整数であり;
XaおよびX'b は、各々独立してH、C1-4 アルキル、F、ClまたはCF3であり；
Yは、存在しないかまたは、Yは、パラ−、メタ−またはオルト-フェニルであり;そして  Zは、CHOである]
のアズレン様レチノイド化合物を含む。
【００３７】
本発明の一実施態様において、R'、R''およびR'''は、独立してH、メチル、イソプロピルである。好ましくはR'= R'''=メチル、R''=イソプロピルである。
【００３８】
本発明の好ましい実施態様において、Yは存在しない。
【００３９】
アズレン様レチノイド化合物の製造は、例えば米国特許第 5,235,076 (Asato)に開示されており、これは出典明示により本明細書の一部とする。
【００４０】
本発明にとって有用である式Ｉの具体的な例には、下記の化合物が包含される:
【化３】
2008502791.tif 000005
化合物 A
【化４】
2008502791.tif 000006
化合物 B
【００４１】
【化５】
2008502791.tif 000007
化合物 C
【００４２】
【化６】
2008502791.tif 000008
化合物 D
【化７】
2008502791.tif 000009
化合物 E
【００４３】
【化８】
2008502791.tif 000010
化合物 F
【００４４】
【化９】
2008502791.tif 000011
化合物 G
【００４５】
【化１０】
2008502791.tif 000012
化合物 H
【００４６】
【化１１】
2008502791.tif 000013
化合物 I
【００４７】
【化１２】
2008502791.tif 000014
化合物 J
【００４８】
【化１３】
2008502791.tif 000015
化合物 K
【００４９】
【化１４】
2008502791.tif 000016
化合物 L
【００５０】
【化１５】
2008502791.tif 000017
化合物 M
【００５１】
【化１６】
2008502791.tif 000018
化合物 N
【００５２】
本発明の有用なレチナールアナログは、オール-トランス-レチナールと構造的に類似している下記の非アズレン様化合物も包含する:
【化１７】
2008502791.tif 000019
化合物O (米国特許第 4,896,049 (Ogawa))
【００５３】
【化１８】
2008502791.tif 000020
化合物 P (米国特許第 4,896,049 (Ogawa))
【００５４】
【化１９】
2008502791.tif 000021
化合物 Q (米国特許第 4,896,049 (Ogawa))
【００５５】
【化２０】
2008502791.tif 000022
化合物 R  Khodonov ら(SensorsおよびActuators B 38-39:218-221 (1997))
【００５６】
【化２１】
2008502791.tif 000023
化合物 S  Khodonovら(SensorsおよびActuators B 38-39:218-221 (1997))
【００５７】
【化２２】
2008502791.tif 000024
P-ジメチル アミノシンナムアルデヒド(DMCA)
【００５８】
DMCAは、例えばSigma-Aldrich (St. Louis, MO) The Lab Depot, Inc. (Alpharetta, GA)およびthe Science Lab.com (Kingwood, TX)を通してFluka AG (Buchs, Switzerland)から市販購入し得る。
【００５９】
プロテオロドプシン
本発明に有用なプロテオロドプシンは、あらゆる天然プロテオロドプシンから誘導され得る。多様な天然のプロテオロドプシンをコードしている天然の核酸配列は、自然界に存在する細菌分野のメンバーから得られる。かかるメンバーは、SAR86 グループなどの海洋細菌を包含する。プロテオロドプシンの天然核酸配列がクローニングされ、プロテオロドプシンの天然形態が発現される。プロテオロドプシンの多くの天然形態が存在する；海洋細菌から誘導されるものおよび非海洋細菌から得られるものを包含する；この全てのものが本発明に使用され得る。
【００６０】
例えば、プロテオロドプシンの天然形態には、Hot75m1、Bac31A8、Bac40E8、Bac41B4、Bac64A5、Hot0m1、Hot75m3、Hot75m4、Hot75m8、MB0m1、MB0m2、MB20m2、MB20m5、MB20m12、MB40m1、MB40m5、MB100m5、MB100m7、MB100m9、MB100m10、PalB1、PalB2、PalB5、PalB7、PalB6、PalB8、PalE1、PalE6、PalE7、MED 26、MED27、MED36、MED101、MED102、MED106、MED25、MED202、MED204 MED208、REDA9、REDB9、REDF9、RED19、RED2、RED23、RED27、RED30、RED4、RED5、REDr6a5a14、REDr6a5a6、REDr7_1_4、REDs3_7、REDr7_1_15、REDs3_15、medA15r8ex6、REDr7_1_16、medA15r11b9、medA15r9b5、medA15r8b3、medA15r11b3、medA15_r8_1、medA17R9_1、medA15r8b9、medA19_R8_16、medA19_R8_19、medA17_R8_6、medA15r9b7、medA15_R8_3、medA15r10b5、medA19_r9_9、medA15_r8ex7、medA19_R8_20、medA15_R8ex9、medA15_r9_3、medA17_r8_15、medA17_r8_11、medA15r8b8、medA15r8ex4、ANT32C12 PRおよびHOT2C01 PRが包含される［Baja, et al., Nature 411:786-9 (2001); Man, et al., EMBO J., 22:1725-1731 (2003);およびSabehi, et al., Environ. Microbiol., 5: 842-9 (2003)を参照されたい］。上記多様なプロテオロドプシンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は受託番号AF349976-AF350003、AF279106、AY210898-AY210919、AY250714-AY250741、AY372453およびAY372455としてGenbankに寄託されている。さらに、Venterら (Science 304: 66-74 (2004))は、近年782種のこの新規ロドプシンアナログを報告しており、これらの大部分はサルガッソー海で見出されたプロテオロドプシンである。上記引例に記載されているプロテオロドプシンは本発明に適している。
【００６１】
本発明にとって有用なプロテオロドプシンは、あらゆる非天然プロテオロドプシン、例えばプロテオロドプシン変異体からでも得られる。用語"プロテオロドプシン変異体"は、プロテオロドプシンの天然の配列から１以上のアミノ酸残基および／またはヌクレオチドを、挿入、削除および／または置換する１以上の突然変異を含むプロテオロドプシンを意味する。例えば、ヌクレオチド配列は、その配列内で同一または機能的に等価なアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換、即ちサイレント変化を生じることによって変更され得る。例えば、配列内のアミノ酸残基は、類似した極性または類似したクラスの別のアミノ酸によって置換され得る。非極性(疎水性)アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、グリシンおよびメチオニンを包含する。極性中性アミノ酸は、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンを包含する。陽性電荷の(塩基性)アミノ酸は、アルギニン、リジンおよびヒスチジンを包含する。陰性電荷の(酸性)アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を包含する。
【００６２】
本発明に有用なプロテオロドプシン変異体は、例えば、Bac31A8 H75K、Bac31A8 H75N、Bac31A8 H75Q、Bac31A8 E108Q、Bac31 A8 D97N、Hot75ml H77K、Hot75ml H77N、Hot75ml H77Q、Hot75ml H77E、Hot75ml H77D、Hot75ml H77W、Hot75ml R96A、Hot 75ml E110Q、Hot75ml D99N、Hot75ml R96EおよびHot75ml R96Qのアミノ酸配列を包含する。この中で、Bac31A8 H75Kは、天然Bac31A8の75個のアミノ残基が、ヒスチジンからリジンに突然変異されたことを意味する。プロテオロドプシン変異体は、同時継続の米国出願公開番号2005-0095605に開示されている；これは、出典明示により本明細書の一部とする。
【００６３】
レチナールアナログ含有プロテオロドプシンは、宿主細胞中でレチナールアナログの存在においてプロテオロドプシンを発現することによって上手く調製できる。例えばE. coliは、オール-トランス-レチナールを産生しないため、効果的な宿主細胞である。オール−トランス−レチナールの合成経路が遮断された別の宿主細胞は、アナログ含有プロテオロドプシンを調製するために有効な宿主細胞であり得る。アナログが、細胞培養物に添加され、宿主細胞の増殖およびプロテオロドプシン発現中にプロテオロドプシンタンパク質に挿入される。一方で、レチナールアナログ含有バクテリオロドプシンは、その宿主細胞 H. salinarum中でバクテリオロドプシンの発現中にアナログを添加することによっては、上手く調製できない。オール−トランス−レチナールは、H. salinarumによって産生され、オール−トランス−レチナール含有バクテリオロドプシンはバクテリオロドプシンの発現中に形成される。レチナールアナログ含有バクテリオロドプシンを調製するために、オール−トランス−レチナールは、レチナール含有バクテリオロドプシンから取り出され、次いでレチナールアナログがバクテリオロドプシンアポプロテインに添加され、バクテリオロドプシンとレチナールアナログとの複合体を形成されるべきである。
【００６４】
固定化レチナールアナログ含有プロテオロドプシン
本発明は、固定化レチナールアナログ含有プロテオロドプシンを含む固体物質を提供する。固体物質は、レチナールアナログ含有プロテオロドプシンが固体中に均等に分布するように、固体形態へと固化する前にレチナールアナログ含有プロテオロドプシンと共に均質相を形成できる１以上の親水性ポリマーとを含む。"均質"とは、レチナールアナログ含有プロテオロドプシンと、親水性ポリマーまたはその前駆体が、混合物中で一様な構造または組成物を形成することを意味する。本明細書において使用したように"固定化"とは、プロテオロドプシンが、移動せず、物質中に固定されていることを意味する。プロテオロドプシンと該物質との相互作用は、共有結合していてもしていなくてもよい。例えば、プロテオロドプシンは、物質内に物理的に封入され得る。また、プロテオロドプシンは、静電気的帯電、H-結合、疎水性、親水性またはファンデルワールス相互作用によっても該物質に結合できる。固定化によって、プロテオロドプシン分子は固定され、光学シグナルがプロテオロドプシン分子の拡散によって失われないように、固体物質内で拡散しないかまたは非常にゆっくりと拡散する。
【００６５】
親水性ポリマーは、不透明でない、即ち光学的に透明な固体物質を提供し、それを含有する光互変性物質の光励起を効率的にさせ得る。
【００６６】
本発明に適当な親水性ポリマーは、シリカゾルゲル、ゼラチン、ポリアクリルアミド、アラビアゴム、寒天、カラゲナンカルシウム、アルギン酸カルシウム、アルギン酸ナトリウムまたはアルギン酸の他の塩、アルギン、アガロース、コラーゲン、メチルセルロース、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリル酸、部分架橋したポリアクリル酸、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレンオキシド、ペクチンおよびそれらの混合物などを包含する。
【００６７】
ビニルポリマーおよびその誘導体も本発明に有用である。ポリビニルアルコール(PVA)はホモポリマーまたはコポリマーとして定義されるものであり、酢酸ビニルが開始モノマー単位であり、そのほとんどまたは全てのアセテート部分(70-100％)が、後にアルコール分子に加水分解される。本発明に有用な他のビニルポリマーには、ポリ酢酸ビニルおよびポリビニルピロリドンが含まれるが、これらに限定されない。PVA-メタクリル酸メチルコポリマーなどのコポリマーも、本発明に用いることができる。広範囲の分子量や粘性の、ポリ酢酸ビニル前駆体から加水分解の程度が様々なPVAが、商業的に利用可能である。
【００６８】
本発明のために有用な別のポリマーは、ヒドロゲル、例えばカルボポール(Carbopol(登録商標))、酸性カルボキシポリマーを形成するポリマーを包含する；シアナメイ(Cyanamey)-O ポリアクリルアミド、交差結合したインデン-無水マレイン酸ポリマー、ポリオックス(Polyox(登録商標))ポリエチレンオキシドポリマー；スターチグラフトコポリマー；例えば、ジエステル架橋ポリグルカンなどの縮合グルコース単位からなるアクア-キープソ(Aqua-Keepso)アクリル酸ポリマー多糖体が包含される。ヒドロゲルを形成する代表的なポリマーは、米国特許第3,865,108; 4,002,173；4,207,893；およびScott、Roff著、オハイオ州、クリーブランドのChemical Rubber Company出版、一般的ポリマーハンドブック(Handbook of Common Polymers)に記載されている。
【００６９】
親水性ポリマーまたは親水性ポリマー混合物中に固定化レチナールアナログ含有プロテオロドプシンを含有する固体物質は、最初に親水性ポリマーまたはその前駆体を、水中または緩衝水溶液中でプロテオロドプシンと混合し、均質溶液を形成し、次いで該ポリマーを固体化するステップによって調製される。ここでプロテオロドプシン分子は、ポリマー中で固定され得る。ポリマーの固体化は、乾燥、冷却、硬化または重合化によって実施され得る。
【００７０】
例えば、固定化レチナールアナログ含有プロテオロドプシンを含有するポリビニルアルコール物質は、後記ステップを含む方法によって調製される；(a)ポリビニルアルコール、水または約pH 3-12を示す緩衝液、およびアナログ含有プロテオロドプシンを混合し、溶液を形成する；(b)該溶液を固体の表面上に塗布する;そして(c)該溶液を乾燥させ、固定化アナログ含有プロテオロドプシンを有するポリビニルアルコール物質を形成する。
【００７１】
固定化レチナールアナログ含有プロテオロドプシンを含有するポリアクリルアミド物質は、後記ステップを含む方法によって調製され得る；(a)水またはpH 3-12を示す緩衝液中でアクリルアミド、ビスアクリルアミド、膜不含アナログ含有プロテオロドプシン、および１以上の重合化開始剤を混合すること;および(b)アクリルアミドゲルを重合化すること;これによって、プロテオロドプシンは、ポリアクリルアミドゲルマトリックス内で固定化される。一般的に使用される重合化開始剤は、過硫酸塩アンモニウムおよびN,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)を包含する。あるいは、該方法は、後記ステップを含む；(a)水またはpH 3-12を示す緩衝液中で、アクリルアミド、ビスアクリルアミド、膜-遊離アナログ含有プロテオロドプシン、および１以上のUV-活性化フリーラジカル発生剤を混合すること；そして(b) 該混合物をUV光に暴露し、アクリルアミドゲルを重合化する。UV-活性化フリーラジカル生成剤は、リボフラビンおよびTEMED (一緒に用いる)、2,2-ジメトキシ-2-フェニルアセトフェノン(DMPA)、およびこれらのSE 96047-3特許に記載されたものを包含する。
【００７２】
固定化レチナールアナログ含有プロテオロドプシンを含有するゾル−ゲルは後記のステップを含む方法によって調製され得る：(a) pH 1.5-4を示す酸性溶液をシラン前駆体に添加し、該シラン前駆体を加水分解し、シリケートゾルを形成する; (b) pH 約 5-9でアナログ含有プロテオロドプシンと共にシリケートゾル水溶液に添加すること;そして(c) (b)をインキュベートしてゲルを形成する;これにより、プロテオロドプシンはゾルゲルマトリックス内で固定化される。シラン前駆体は、テトラアルキルオルトシリケート、アルキルトリアルコキシシラン、アリールトリアルコキシシラン、ジアルキルジアルコキシシラン、ジアリールジアルコキシシラン、アルカリ金属シリケート、ポリオールシリケート、ポリオールシロキサン、ポリ(メチルシリケート)およびアルコール不含ポリ(シリク酸)を包含する。好ましいシラン前駆体は、テトラアルキルオルトシリケートおよびポリ(グリセリル)シリケートを包含する。
【００７３】
固定化レチナールアナログ含有プロテオロドプシンを含有するゼラチンは、後記ステップを含む方法によって調製され得る:(a) 水または緩衝液中でゼラチンを加熱および溶解し、均質の水性ゼラチン溶液を形成すること;(b)ゼラチン溶液を約39-45℃に冷却すること;(c)冷却したゼラチン溶液をレチナールアナログ含有プロテオロドプシンと混合すること;および(d) (c)をインキュベートし、ゲルを形成すること;これによって、レチナールアナログ含有プロテオロドプシンがゼラチンゲルマトリックス内で固定化される。
【００７４】
レチナール アナログ含有プロテオロドプシンの技術用途
レチナールアナログ含有プロテオロドプシンは、多くの技術用途を有する。例えば、それらは、光互換性用途、光電気用途および／または光転送用途を有する機器または器具中に組み込み得る。
【００７５】
光互換性用途において、レチナールアナログ含有プロテオロドプシンは、光学データ保存、干渉分光法および／または光通信のため、その光吸収性について使用できる。光互換性用途は、ホログラムフィルムを包含するがこれに限定するものではない。レチナールアナログ含有プロテオロドプシンは、光学データ保存機器、例えば2-D 保存、3-D 保存、ホログラフ保存、連合的保存などに使用できる。レチナールアナログ含有プロテオロドプシンは、光学的二重安定／光交換、光学的フィルター、信号処理、神経ネットワーク、空間光変調器、位相共役、パターン認識、干渉計使用法などの情報処理のための機器に使用できる。
【００７６】
光転送用途において、レチナールアナログ含有プロテオロドプシンは、膜を透過する光誘導性のプロトン輸送、例えば光電池装置に使用できる。１つのこのような光電池装置は、プロテオロドプシンを含む光駆動エネルギー発生体である。これにより、光エネルギーが、化学エネルギーに変換され得る。レチナールアナログ含有プロテオロドプシンは、反応体におけるATP発生のための装置、海水の脱塩および／または太陽光の電気への変換に使用され得る。
【００７７】
レチナールアナログ含有プロテオロドプシンは、2D 高調波発生、放射エネルギー検出、バイオセンサー用途などの機器にも使用できる。
【００７８】
一実施態様において、本発明は光学的情報担体に適当な物質を提供する。特に該物質は光学データ保存物質または不正防止光学データ担体に適する。
【００７９】
一実施態様において、本発明は、光学的情報の処理および保存に適当な物質を提供する。
【００８０】
一実施態様において、本発明は、光学データの保存(書き込み)において使用するための物質を提供する。該物質はデータを非破壊的に検出する（読み取り）間データを保持することができ、データを光学的に消去した後も再利用可能な物質を提供する。
一実施態様において、本発明は模造者が模倣するのを困難にさせる情報担体物質を提供する。
【００８１】
一実施態様において、本発明は、光に暴露すると色を変える不正防止インクを提供する。
【００８２】
本発明は、固定化レチナールアナログ含有プロテオロドプシンを有する固体物質、および基材、例えばガラス、紙、金属、織物、プラスチック材を含み、該固体物質は該基材上に沈着される、光学的情報担体を提供する。例えば、基材はディスク、カードまたは書類である。本発明の光学的情報担体は、二次元フィルムと呼ばれ得る薄いフィルムまたは膜の形態であってもよいし、または三次元層またはブロックと言われる厚いフィルムの形態であってもよい。固体物質の厚さは、三次元よりも二次元の長さが大きい薄い保存層から、全次元が同程度の桁の長さである厚い成型対象に至る範囲まで、様々である。そのように作成された光学的情報担体は、光に暴露され、基底状態からM状態へと分子を変換し得るプロテオロドプシン分子を包含する。
【００８３】
オール-トランス-レチナール含有プロテオロドプシンの基底吸収極大は、一般的に、480 nm-530 nmの間であり、しばしば488-526 nmの間にある。本発明のレチナールアナログ含有プロテオロドプシンの基底吸収極大は、一般的に、550-750 nmから、好ましくは600-700 nm、より好ましくは625-650 nmの範囲である。
【００８４】
M状態のプロテオロドプシンの吸収極大は、一般的に350 nm-450 nm、しばしば約410 nmの間にある。M-状態は、別の同定されるスペクトル状態、K-、N-およびO-様状態とは区別され、これらの全ては基底状態と比較して吸収スペクトルが赤方に偏移(例えば＞530nm)している。
【００８５】
光学的情報担体としてプロテオロドプシンを使用する一つの利点は、プロテオロドプシンはE. coliで機能的に発現され、大量のタンパク質(グラムまたはキログラム)を経済的かつ効率的に提供できる点である。プロテオロドプシン発現細胞は、溶菌され、膜分画を含有する該ペレットが回収される。プロテオロドプシンタンパク質は、さらに界面活性剤による可溶化により膜から抽出され得る。プロテオロドプシンを含有する膜または膜フラグメント、または精製プロテオロドプシンタンパク質のいずれかであっても、親水性ポリマー中に固定化され、光学的情報担体、例えば光学データ保存物質または不正防止データ担体として使用され得る。
【００８６】
光学的情報担体としてプロテオロドプシンを使用するその他の利点は、0.2-1μM サイズのタンパク質-脂質パッチを形成するバクテリオロドプシンとは異なって、膜不含または界面活性剤で可溶化したプロテオロドプシンが光散乱を引き起こさないという点にある。界面活性剤で可溶化したプロテオロドプシンは、通常モノマー(約5 nmのサイズ)の形態にあり、時にはオリゴマー(ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマーまたはヘキサマー)の形態である;かかる小さなサイズは、可視範囲において光散乱を引き起こさない。バクテリオロドプシンとは異なり、プロテオロドプシンタンパク質は、少なくとも１ヶ月室温または４℃で１年間、そのモノマーまたはオリゴマー状態で安定である。用語「安定」とは、プロテオロドプシンが、そのスペクトル性質を有意に変化させず(極大吸収波長30 nm以下)、光による励起に対して基底状態からM-状態への遷移を包含する光反応サイクルを生みだし得ることを言う。プロテオロドプシンのモノマーまたはオリゴマー安定性は、光を散乱させるμMサイズの粒子を含まない光学データ保存物質の成分として好ましいものとなる。さらに、小さなサイズの個々のプロテオロドプシンモノマーは、光学データ保存物質中で均質なタンパク質分布を獲得することをさらに容易にする。
【００８７】
光学データ保存において多様な極大吸収波長を持つ様々なレチナールアナログ含有プロテオロドプシンを用いる利点は、データ保存の能力を増加させ、データの並行処理を可能にすることである。
【００８８】
本発明は、１以上の固定化アナログ含有プロテオロドプシンを有する固体物質を含む不正防止データ担体を提供する。固定化プロテオロドプシンを含有する物質は、不正防止データ担体として使用するために、ガラス、紙、織物物質、プラスチック物質、金属表面または無機表面の表面に、塗布され、噴霧され、固化され、印刷され、保存または乾燥され得る。固定化プロテオロドプシンを含有する物質は、モールド成型され、三次元不正防止データ担体を形成できる。
【００８９】
例えば、該固体物質は、製品の立証を保証するために、製品上に、例えば紙幣、書類、IDカード、パスポート、運転免許書、キーカード、小切手、保証書（securities）、ステッカー、箔、容器、製品梱包材などの上に沈着される。プロテオロドプシンが励起波長光に暴露されると、活性化M-状態に励起され、黄色に変化する。その色は、時間とともにまたは該物質を第２の光に暴露することにより自然に基底色に戻る。例えば、プロテオロドプシン含有物質は、黄色光または緑光色によって励起され、赤または紫から黄色へと変化する;この色の変化は、自然に、または該物質を紫または青色光を照射することによって消失する。この色の変化は、基底状態とM-状態との間で可逆的であり、これにより偽造に対する防護を提供する。物質の特性に目に見える変化を起こさずに、書き込み、読み取り、消去のサイクルを複数回繰り返すことができる。色素または有機染料を基にした従来のインクでは、この色の変化を模倣することはできない。このような色の変化の特徴により、プロテオロドプシン物質は、偽造者が模倣することを困難にしている。レチナールアナログ含有プロテオロドプシンを使用することによって、様々な基底色は、安全インクまたは書類を提供でき、これにより偽造することをより困難にする。
【００９０】
追加された安全性として、様々な有色のプロテオロドプシンを含有する固体物質は、紙幣、IDカード、パスポート、運転免許証、キーカード、小切手、保証書、ステッカー、箔、容器などの上の様々な局在化された表面領域に沈着され得る。これらの異なった有色のプロテオロドプシンは、それらが異なる極大吸収波長を有する限り、オール-トランス-レチナール含有プロテオロドプシンとレチナールアナログ含有プロテオロドプシンとのあらゆる組合せがあり得る。
【００９１】
様々なレチナールアナログ含有プロテオロドプシンを用いて、１つの不正防止書類の様々な局在領域上で、単色の代わりに多色の安全対策的特徴を為すことができる。多色の安全対策的特徴により、偽造がより困難となる。
【００９２】
一方、固体物質は、いくつかの異なる有色のプロテオロドプシンを含有するように調製され得る。かかる固体物質は、いくつかの異なる有色のプロテオロドプシンを含有する混合物を使用し、固定化レチナールアナログ含有プロテオロドプシンを含有する固体物質を調製するために、上記と同一のステップに供することによって調製され得る。かかる固体物質は、紙幣、IDカード、パスポート、運転免許証、キーカード、小切手、保証書、ステッカー、箔、容器などの表面領域で沈着され得る。例えば、適当なアナログ含有プロテオロドプシンおよびレチナール含有プロテオロドプシンを選択することによって、いくつかのプロテオロドプシンは、緑色レーザーによってB-状態からM-状態へと励起され、そしていくつかのプロテオロドプシンは、赤色レーザーによって励起される。
【００９３】
本発明は、１以上の親水性ポリマーおよびプロテオロドプシンアポプロテインおよびレチナールアナログを含有する光互変性物質を含む安全インクをさらに提供するものであって、ここで該光互変性物質および該親水性ポリマーは均質な液体相を形成し、該インクを、表面上に適用後に固化するか、または乾燥させて、該インクが用いられる特定の場所にプロテオロドプシンを固定化する。
【００９４】
下記実施例は、本発明をさらに説明するものである。これらの実施例は、本発明の説明について単に例示的な意味を示すものであって、限定を意味するものではない。
【実施例１】
【００９５】
実施例１：レチナールアナログ含有プロテオロドプシンの調製(天然形態)
プロテオロドプシン発現プラスミドプラスミド(pTrcHis2-Bac31A8およびpTrcHis2-Hot75m1)およびコントロールプラスミドpTrcHis2-LacZ (Invitrogen)を、製造者指示書のとおりにE. Coli BL21-コドンプラス-RIL 株(Stratagene)のコンピテントセルに形質転換した。形質転換した細胞を、LA (Luria アガー) ＋ 0.5% グルコース ＋ 100 μg/ml カルベニシリン ＋ 25 μg/ml クロラムフェニコールプレートに播種し、終夜37℃でインキュベートした。これらのプレートからの細胞を、LB (Luria Broth) ＋ 0.5% グルコース ＋ 100 μg/ml カルベニシリン ＋ 25 μg/ml クロラムフェニコール ＋ 10 μM オール−トランス−レチナールまたはレチナールアナログ (化合物A、B、CおよびDMCA）の一つを含有する培地（6 ml）で、細胞が初期定常段階に達するまでガラス管内で37℃で6 時間増殖させた。該細胞は、非誘導pTrcプロモーターからプロテオロドプシンを構成的に発現する。細胞を、4,500xg、6 分間での遠心分離により回収し、培地を廃棄し、該細胞を滅菌水（5 ml）に再懸濁した。細胞サンプル（900 μl）を1.0 M CHES (pH 9.5)のアリコート（100 μl）に添加した。
【実施例２】
【００９６】
実施例２：インタクトな細胞におけるレチナールアナログ含有プロテオロドプシン(天然形態)のスペクトル
プロテオロドプシンを含有するオール-トランス-レチナールおよびプロテオロドプシンを含有するレチナールアナログのスペクトルを、インタクトな細胞において、サンプルキュベットに隣接して光電子増倍管検出器を置くことによって濁ったサンプルでの使用に適応した分光光度計(On-Line Instrument Systems, Inc.)を使用して測定した。コントロールプラスミド(pTrcHis2-LacZ)を含有する株からの吸収を、プロテオロドプシン含有サンプルから差しひいた。サンプルおよび参照との間の細胞密度の変動によって引き起こされるバックグラウンドの光散乱における違いを補正するために、各スペクトルにおける最初の１０波長と最後の１０波長、および吸光度の最小二乗法によって決定された直線的なベースラインを、各スペクトルから差し引いた。次いで、該スペクトルを、最小値における差違を差し引くことによって、同じ最小値に調整した。
【００９７】
様々なpH値で、インタクトな細胞内部の典型的なプロテオロドプシンのスペクトル、例えばBac31A8およびHot75m1のスペクトルを、波長に対する吸光度をプロットすることによって作成した。
【００９８】
表１は、pH 9.7でオール−トランス−レチナールまたはアナログ含有プロテオロドプシンの極大吸収波長を示す。アナログ含有プロテオロドプシンは、レチナール含有プロテオロドプシンと比べて極大吸収の赤方側のシフトを引き起こした。
【００９９】
【表１】
2008502791.tif 000025
【実施例３】
【０１００】
実施例３：レチナールアナログ含有プロテオロドプシンの精製(天然形態)
実施例２に記載した結果を、インタクトな細胞中のプロテオロドプシンを用いて得た。この場合、該タンパク質はサイトプラズマ膜に存在する。他細胞成分の非存在下に、プロテオロドプシン含有アナログのスペクトル特性を特徴分析するために、オール−トランス−レチナールおよびレチナールアナログ含有Bac31A8およびHot75m1プロテオロドプシンを、下記のとおりに精製した。
【０１０１】
プロテオロドプシン発現プラスミド(pTrcHis2-Bac31A8およびpTrcHis2-Hot75m1)を、製造者の指示書に従って、株 BL21-コドンプラス-RIL (Stratagene)コンピテントセルに形質転換した。形質転換した細胞を、LA + 0.5% グルコース + 100 μg/ml カルベニシリン + 25 μg/ml クロラムフェニコール プレートに播種し、終夜37℃でインキュベートした。これらのプレート由来の細胞を、バッフル付振盪フラスコ内（500 ml）でLB + 0.5% グルコース + 100 μg/ml カルベニシリン + 10 μM オール−トランス−レチナールまたはレチナールアナログ(化合物A、B、CまたはDMCA)を含有する培地（200 ml）において37℃で培養した。培養物を、新しい形質転換プレートから直接植菌した。異なる培養物中でプロテオロドプシン発現を誘導し、0.5 mM IPTG ＋ 10 μM オール−トランス−レチナールまたはレチナールアナログを添加することによって、培養物のOD600が約0.8(4 時間の増殖後)であった場合に、該培養物をさらに4時間37℃でインキュベートした。該細胞を、3,500xg、10分間遠心分離によって回収し、-80℃で貯蔵した。細胞を、50 mM Tris（pH 7.7）およびプロテアーゼ阻害剤(Roche Applied Scienceからの完全EDTA-不含プロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット)を含有する溶菌緩衝液中に再懸濁させた;そして、0℃でフレンチプレスセルを３回通して溶菌した。インタクトな細胞と他の不溶性破砕物を、15,000xg、30 分間の遠心分離によって除去した。細胞膜を、500,000xg１時間遠心分離によって回収した。該膜を、組織ホモジナイザーを用いて、プロテアーゼ阻害剤(Roche Applied Scienceからの完全EDTA-不含プロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット)および2% ドデシル-β-D-マルトシドを含有する50 mM Tris（pH 7.7）に懸濁した。可溶化膜分画を、50 mM Tris, pH 7.7および0.5% ドデシル-β-D-マルトシドを含有する洗浄緩衝液（1 ml）にて平衡化したTalon spin columns (Clontech)中の樹脂と共に、16 時間インキュベートした。該樹脂を、50 mM Tris, pH 7.7および0.5% ドデシル-β-D-マルトシドを含有する洗浄緩衝液（1 ml）で３回洗浄した。プロテオロドプシンを、該樹脂から、50 mM Tris pH 7.7、0.5% ドデシル-β-D-マルトシドおよび250 mM EDTAを含有する溶出緩衝液（0.5 ml）を用いて２回溶出した。この２つの溶離物をプールし、製造者指示書の通りにMicrocon YM-10 遠心分離用フィルターユニット(Millipore)を用いて１０倍濃縮を３回連続して行い、50 mM Tris（pH 7.7）を含有する緩衝液を用いる希釈により、EDTAを除去した。その後、該プロテオロドプシンサンプルを１０倍に濃縮し、4℃で貯蔵した。
【実施例４】
【０１０２】
実施例４：精製レチナールアナログ含有プロテオロドプシン(天然形態)のスペクトル
精製プロテオロドプシン（5 μl）を、100 mMクエン酸緩衝液(pH 5.09)またはCHES(pH 9.50)を含有する緩衝液（500μl）に希釈した。250 nm-800 nm の波長スペクトルを、室温でCary3 分光光度計(Varian)で得た。
【０１０３】
図1は、pH 9.7でオール−トランス−レチナールまたはレチナールアナログ(化合物A、BまたはC)を含有する界面活性剤で可溶化した精製Bac31A8 プロテオロドプシンのスペクトルを示す。
【０１０４】
図2は、pH 9.7でオール−トランス−レチナールまたはレチナールアナログ(化合物A、BまたはC)を含有する界面活性剤で可溶化した精製Hot75M1 プロテオロドプシンのスペクトルを示す。
【０１０５】
この結果から、オール-トランス-レチナール含有プロテオロドプシンと比較した場合、アナログ(化合物A、BまたはC)含有プロテオロドプシンが異なるスペクトルを示すことがわかる。吸収スペクトル(>120 nm)の大きな赤色へのシフトが、レチナールアナログ含有プロテオロドプシンを用いて観察される。
【実施例５】
【０１０６】
実施例５：レチナールアナログのプロテオロドプシン変異体への導入
化合物Bを、(a) 発現プラスミド(pTrcHis2-Bac31A8-E108Q)を用いること、および(b)化合物Bをフレンチプレス、均質化、カラム抽出および遠心濃縮法の後に、プロテオロドプシンに添加することを除いて、実施例1および3に記載したものと類似したプロトコールによってプロテオロドプシン変異体 Bac31A8E108Qに導入した。
【０１０７】
導入した化合物Bは、640および480 nmで極大波長の２つのピークをもつ。
【実施例６】
【０１０８】
実施例６：レチナールアナログ含有プロテオロドプシン変異体の光サイクル
250 mM CAPS 緩衝液（pH 11）中の化合物B含有Bac31A8E108Q プロテオロドプシンサンプルをキュベットに入れた。640 nmでの吸光度を、分光光度計によって連続測定し、一方で該サンプルを、20-60 秒の間、630、610または475 nmのカットオフフィルターと共役した光源により照射した。光源を、t= 20 秒で点灯させ、t= 60 秒で消した。
【０１０９】
図3は、630 nmの光フィルターを用いる640 nmでの吸光度の時間経過のグラフを示す。光を20-60 秒のあいだにサンプル上に照射した場合、該吸収は劇的に低下し、光を点灯した時間中ほぼ同じであった。光を60秒で消した後、該吸光度は直ちに可逆的に戻る。610 nmでの光フィルターにより、同様の時間経過グラフを生じる。
【０１１０】
図4は、475 nmでの光フィルターと共に、640 nmでの吸光度の時間経過のグラフを示す。光を20-60 秒の間にサンプル上に照射した場合、該吸光度は劇的に低下し、光が点灯した時間から連続的に低下した。光を60 秒で点灯させた後、該吸収は突然増加した。
【０１１１】
図3および4は、化合物 B含有Bac31A8E108Qプロテオロドプシンの640 nm での吸収が低下し、光のオン／オフに対する応答において増加することを示し、これは光サイクルの特徴である。
【０１１２】
本発明は現時点で好ましい実施形態に対して記載してきたが、本発明の範囲を逸脱しないような様々な修飾を行うことは可能であると理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】図１は、pH 9.7でオール−トランス−レチナールまたはレチナールアナログ(化合物A、BまたはC) を含有する界面活性剤で可溶化した精製Bac31A8プロテオロドプシンのスペクトルを示す。
【図２】図２は、pH 9.7でオール−トランス−レチナールまたはレチナールアナログ(化合物A、BまたはC)を含有する界面活性剤で可溶化した精製Hot75M1プロテオロドプシンのスペクトルを示す。
【図３】図３は、時間に対する640 nmでの化合物 B含有Bac31A8E108Q プロテオロドプシンの吸収を示す。
【図４】図４は、時間に対する640 nmでの化合物 B含有Bac31A8E108Q プロテオロドプシンの吸収を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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