(57)【要約】本発明は、試料、細胞または生体のプロテオームの定量化分析のための人工タンパク質を提供し、それはペプチドを分離するための開裂配列によって結合した少なくとも2個の連続ペプチド、この断片の絶対量の測定のための１個以上のペプチド上の単独マーカーおよびペプチドの保護のためのＮ末端およびＣ末端の延長部分を包含し、各ペプチドは試料、細胞または生体の単独タンパク質を代表し、各ペプチドは化学量論的にあらかじめ規定されている。本発明はさらに、人工タンパク質およびプロテオームの定量化分析法を包含するペプチドの集合体、ベクターおよびキットを提供する。【選択図】図１
2008545419.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料、細胞または生体のプロテオームの定量化分析のための人工タンパク質であって、
（ａ）ペプチドを分離するための開裂配列によって結合した少なくとも２つの連続ペプチドと、
（ｂ）タンパク質の絶対量の測定のための１つ以上のペプチドに対する単独マーカーと、
（ｃ）ペプチドの保護のためのＮ末端およびＣ末端の延長部分とを包含し、
各ペプチドは試料、細胞または生体の１つの単独タンパク質であり、各ペプチドはあらかじめ化学量論的に規定されている人工タンパク質。
【請求項２】
タンパク質が１０乃至１００個のペプチド、好ましくは１０乃至１００個のペプチド、より好ましくは２０乃至６０個のペプチド、もっとも好ましくは６０個のペプチドを包含する、請求項１に記載の人工タンパク質。
【請求項３】
開裂配列がプロテアーゼ、好ましくはトリプシンによって開裂される、請求項１または２に記載の人工タンパク質。
【請求項４】
単独マーカーがシステイン残基である、請求項１乃至３のいずれかに記載の人工タンパク質。
【請求項５】
１つ以上のペプチドが少なくとも１回以上同一反復して、すべてのペプチド配列間で特殊な化学量論を達成できるようにする、請求項１乃至４のいずれかに記載の人工タンパク質。
【請求項６】
タンパク質がタンパク質の精製のための親和性タグを包含する、請求項１乃至５のいずれかに記載の人工タンパク質。
【請求項７】
タンパク質が同位体で標識される、請求項１乃至６のいずれかに記載の人工タンパク質。
【請求項８】
各ペプチドが約３乃至４０個のアミノ酸、好ましくは約１５個のアミノ酸を包含する、請求項１乃至７のいずれかに記載の人工タンパク質。
【請求項９】
ペプチドがタンパク質の種々の配座、代謝または変化状態を表す、請求項１乃至８のいずれかに記載の人工タンパク質。
【請求項１０】
ペプチドが規定された分子量分布および定量化比を有する、請求項１乃至９のいずれかに記載の人工タンパク質。
【請求項１１】
ある生体の全プロテオームをカバーして、こうした生体のプロテオームを迅速に定量化することを可能にする、請求項１の段階（ｂ）で規定したペプチドの集合体。
【請求項１２】
請求項１乃至１０のいずれかに記載の人工タンパク質をコードする核酸を包含するベクター。
【請求項１３】
請求項１２のベクターおよび／または請求項１乃至１０のいずれかのに記載人工タンパク質を包含するキット。
【請求項１４】
試料、細胞または生体のプロテオームの定量化分析法であって、
（ａ）絶対的な方法で単独マーカーを含有するタンパク質または１個のペプチドの量を定量化する段階と、
（ｂ）定量化するタンパク質の調剤を生成する段階と、
（ｃ）段階（ａ）及び（ｂ）の生成物を混合する段階と、
（ｄ）請求項１乃至１０の何れかに記載の人工タンパク質および段階（ｂ）の定量化対象のタンパク質を、開裂配列において完全に開裂する段階と、
（ｅ）ペプチドを定量化する段階、（ｆ）ペプチドの絶対量を算出する段階とを包含し、
そのなかで人工タンパク質および／またはペプチドが同位体で標識されている、試料、細胞または生体のプロテオームの定量化分析法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプロテオミクス、およびより具体的にはタンパク質の絶対定量化に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテオミクスにおける絶対定量化の必要性は切実なものになりつつある。もっとも有望な方法は、安定同位体の希釈に基づくもので、代表的なタンパク質分解ペプチドおよび安定同位体で標識した類似体とを同時に測定するというものである。この方法は幅広く実行することができるが、その主要な限界とは、正確な既知量の標準的なサインペプチドの入手可能性である。
【０００３】
プロテオミクスにおける二つの主要なテーマとは、タンパク質の同定および二つの生理学的または病理学的状態におけるタンパク質の発現レベルの比較（比較プロテオミクス）である。ある細胞の全プロテオームの確認を可能にするという長期目標は依然として達成されていないが、数千のタンパク質を一回の分析で特徴付けることは現在可能になっている。
【０００４】
プロテオミクスがシステム生物学のプラットフォーム技術として役立つためには、定量化を強力なものにする急務がある（Ｒｉｇｈｅｔｔｉ，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  １０  （２００４），  ３３５−３４８）。比較プロテオミクスの試験の大半は、「相対的」な定量化を行っており、第二の細胞状態という文脈におけるタンパク質の量の変化を表現している（たとえば、Ｄｕｎｋｌｅｙ，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  （２００４）；  Ｈｏａｎｇ，  Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｔｅｃｈ  １４  （２００３），  ２１６−２３３；  Ｏｎｇ，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  （２００２），  ３７６−３８６）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、絶対的なタンパク質の細胞内濃度を、細胞あたりのモル量または分子数のいずれかとして決定することを究極的な目標にしなければならない。プロテオミクスにおけるもっとも大きな挑戦の一つである絶対定量化は、分析化学における確固とした指針に頼っており、外部標準または内部標準のいずれかを必要とする（Ｓｅｃｈｉ，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ７  （２００３），  ７０−７７；  Ｊｕｌｋａ，  Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ  ３  （２００４），  ３５０−３６３）。外部標準化の典型としては、液相法または基板上に複数の抗体を位置規則的に配列可能な抗体アレイのいずれかの免疫検出法が挙げられる（Ｗａｌｔｅｒ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ８  （２００２），  ２５０−２５３；  Ｌｏｐｅｚ，  Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ７８７  （２００３），  １９−２７）。内部標準化に頼る二番目の方法は、対象の検体のイオン（またはイオン断片）の特性を高度な選択的検出と内分標準品の使用を組み合わせる質量分析（ＭＳ）に基づくものである。
【０００６】
もっとも厳密なＭＳ分析では、検体の安定同位体種を内部標準品として使用する。もっとも重要な基礎原理は、質量分析における「相対的」なシグナル強度の測定値を、入手可能な既知量の真の標準品を参照することによって、検体の「絶対」定量化値に変換することができるということである。この方法を無傷のタンパク質に直接応用することは実用的でなく、代理の原則を採用すること、すなわち対象タンパク質に由来するタンパク質分解ペプチドを参照にして間接的に定量化するのがふつうである。
これらの原則に基づいた分析は「ＡＱＵＡ」（絶対定量化）と称されており、化学的方法でデノボ合成した内部標準品を使用する（Ｇｅｒｂｅｒ，  ＰＮＡＳ  １００  （２００３），  ６９４０−６９４５）。ただし、各Ｑペプチドを化学的に合成し、個々に定量化する必要があることから、この方法は大量のタンパク質を絶対定量化するのには向いていない。
【０００７】
ＷＯ０３／１０２２２０号として発行された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／１７６８６号は、生物学的試料に存在するタンパク質を絶対定量化する方法を示している。ＷＯ０３／１０２２２０号の原則は、各対が独自のタンパク質、特異的なタンパク質アイソフォームまたは特異的修飾タンパク質である、特異的に同位体標識したペプチド対を順番に配したアレイの生成に基づくものである。このペプチド対のある要素は合成的に生成されており、外部標準品およびその対の他方の要素は、試料混合物中のタンパク質が酵素により分解されて生成されるペプチドである。ＷＯ０３／１０２２２０号の方法を実施するには、標準ペプチドを較正して絶対量を知り、それを比較および定量化に付け加える。対象物の試料は標準ペプチドに使用するのと同じ同位体標識で標識するが、同位体標識が異なることは除く。異なる方法で標識された試料および標準ペプチドに対応するシグナル対を最後に観察し、なかに含めた特別な標準ペプチドに基づいて、予測される質量リストに関連付ける。ＷＯ０３／１０２２２０号の欠点は、標準ペプチドを個々に合成し、精製し、定量化する必要があるということである。さらに、試料および標準ペプチドの両方を、特別かつ別々に標識する必要があるため、実験間変動のおそれが高くなる。
【０００８】
このため、プロテオミクスにおける絶対定量化の簡単かつ便利な方法を開発する必要性は依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は試料、細胞または生体のプロテオームの定量化分析のための人工タンパク質に関し、
（ａ）ペプチドを分離するための開裂配列によって結合した少なくとも２つの連続ペプチドと、
（ｂ）タンパク質の絶対量の測定のための１つ以上のペプチドに対する単独マーカーと、
（ｃ）ペプチドの保護のためのN末端およびC末端の延長部分とを包含し、
各ペプチドは試料、細胞または生体の１つの単独タンパク質であり、各ペプチドはあらかじめ化学量論的に規定されている。
【００１０】
本発明の目的のため、人工タンパク質を、ＱＣＡＴタンパク質とも呼び、ＱＣＡＴタンパク質に使用されるペプチドもＱペプチドと呼ぶ。
【００１１】
２つのＱペプチド間の開裂配列は、酵素的開裂配列であっても、化学的開裂配列であってもよい。
【００１２】
Ｎ末端およびＣ末端の延長部分は、定量化ペプチドが加工されたり外部タンパク質分解を受けたりしないように保護する。この人工タンパク質は、さらにＱＣＡＴタンパク質の精製を容易にできる特性を含む。
【００１３】
Ｑペプチドはそれぞれ、試料、細胞または生体の１つの単独タンパク質であり、各ペプチドはあらかじめ化学量論的に規定されていて、通常は１：１であるがこれに限定はされない。
【００１４】
本発明はさらに、ある生体の全プロテオームをカバーするＱペプチドの集合体に関する。この集合体により、こうした生体のプロテオームの迅速な定量化が可能になる。
【００１５】
また、本発明は、ＱＣＡＴタンパク質を包含するベクターおよびベクターおよび／またはＱＣＡＴタンパク質を包含するキットに関する。
【００１６】
さらに、本発明は、（ａ）絶対的な方法で単独マーカーを含有するタンパク質または１個のペプチドの量を定量化する段階と、（ｂ）定量化するタンパク質の調剤を生成する段階と、（ｃ）段階（ａ）および（ｂ）の生成物を混合する段階と、（ｄ）請求項１乃至１０のいずれかの人工タンパク質および段階（ｂ）の定量化対象のタンパク質を、開裂配列において完全に開裂する段階と、（ｅ）ペプチドを定量化する段階、（ｆ）ペプチドの絶対量を算出する段階とを包含し、人工タンパク質および/またはペプチドが同位体で標識されている、試料、細胞または生体のプロテオームの定量化分析法に関する。
【００１７】
タンパク質は精製する必要がなく、高分解能分離技術の後の部分的に精製されたタンパク質も許容可能であることに留意することは重要である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明者は、デノボでの遺伝子設計により精製した、一連のタンパク質のトリプシンＱペプチドのコンカテマーである人工タンパク質の設計、発現および使用について説明する。このＱペプチド（ＱＣＡＴ）のコンカテマーである人工タンパク質は、N末端およびC末端の延長部分を両方含むように設計される。この延長部分の機能は、真のＱペプチドの保護、ＱＣＡＴの定量化のための精製標識（Ｈｉｓタグなど）および単独のシステイン残基の導入である。
【００１９】
新規遺伝子を高レベル発現ベクターに挿入し、大腸菌などの異種発現系で発現させる。ＱＣＡＴタンパク質においては、それぞれのＱペプチドは化学量論的に規定しておき（通常は１：１であるがこれに限定されない）、連結Ｑペプチドの全セットが、ＱＣＡＴタンパク質の測定によりモル単位で定量化することができるようにする。さらに、ＱＣＡＴタンパク質は、選択した標識を含む合成培地で発現菌株を増殖させることにより、未標識または標識された状態で容易に生成することができる。
【００２０】
本発明では、２０を超えるタンパク質から、連鎖状のトリプシンペプチド（ＱＣＡＴタンパク質）をコードする人工遺伝子を設計し構築することに成功した。このタンパク質はさらに、定量化および精製の特性を備える。人工タンパク質を大腸菌で発現させ、正しい生成物が合成されていることを質量分析で証明した。ＱＣＡＴタンパク質はトリプシンで容易に分解され、容易に定量化され、タンパク質の絶対定量化に使用することができる。この戦略により、プロテオミクス試験における多数のタンパク質を正確かつ絶対的に定量化することができる。また、タンパク質のすべての位置に、安定同位体標識アミノ酸を選択的に組み入れるか、15N窒素原子を組み入れることによりＱＣＡＴを標識した。
【００２１】
このため、本発明の目的は、試料、細胞または生体のプロテオームの定量化分析のための人工タンパク質を提供し、
（ａ）ペプチドを分離するための開裂配列によって結合した少なくとも2つの連続ペプチドと、
（ｂ）タンパク質の絶対量の測定のための１つ以上のペプチドに対する単独マーカーと、
（ｃ）ペプチドの保護のためのN末端およびC末端の延長部分とを包含し、
各ペプチドは試料、細胞または生体の１つの単独タンパク質であり、各ペプチドはあらかじめ化学量論的に規定されている。
【００２２】
本発明の望ましい実施形態において、人工タンパク質は１０乃至２００個のペプチド、好ましくは１０乃至１００個のペプチド、より好ましくは２０乃至６０個のペプチド、もっとも好ましくは６０個のペプチドを包含する。化学量論を変化させるために、特異的なペプチドを複数例含めることは可能である。
【００２３】
また別の実施形態において、開裂配列をタンパク質分解酵素、好ましくはトリプシンによって開裂し、単独マーカーはシステイン残基である。
【００２４】
さらに、人工タンパク質の１つ以上のペプチドは少なくとも１回、好ましくは１回以上同一反復して、すべてのペプチド配列の間に特殊な化学量論を達成できるようにする。
【００２５】
タンパク質の精製のため、親和性標識（ヒスチジンタグなど）を含めるのが望ましい。タンパク質のＮ末端またはＣ末端の延長部分のいずれかに親和性タグを含めるのが特に望ましい。
【００２６】
さらなる実施形態において、13Ｃ、15Ｎ、2Ｈおよび18Ｏからなる群から選択される同位体でタンパク質を標識する。
【００２７】
さらなる実施形態において、各ペプチドは約３乃至４０個のアミノ酸、好ましくは約15個のアミノ酸を包含する。
【００２８】
タンパク質の分子量は約１０乃至３００ｋＤａ、好ましくは約１５０乃至２００ｋＤａ、もっとも好ましくは約１５０ｋＤａであり、好ましくは大腸菌に発現させる。
【００２９】
プロテオームの由来、すなわち試料、細胞または生体は、好ましくはマウス、ラット、サルまたはヒトであるが、あらゆるタンパク様の源に由来することができる。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態において、ペプチドはタンパク質の種々の配座、代謝または変化状態を表し、こうしたタンパク質から翻訳後に由来するすべてのタンパク質を定量化することができる。
【００３１】
さらに、人工タンパク質のペプチドは、好ましくは規定された分子量分布および定量化比を有するのがよい。質量分析器は、好ましくは分子量で較正することができ、その結果等距離質量分光シグナルが得られる。好ましくは１つ以上のペプチドを２回示し、較正用の参照分子量を明白に標識するのがよい。
【００３２】
本発明はさらに、ある生体の全プロテオームをカバーする請求項１の段階（ｂ）で規定したペプチドの集合体に関する。ある生体のすべての発現タンパク質を、その生体のプロテオームと規定する。これにより、こうした生体のプロテオームを迅速に定量化することが可能になる。
【００３３】
本発明の開示内容にさらに含められるのは、特定の参照菌株のタンパク質レベルの絶対定量化であり、これを次に用いてこの特別な菌株または類似の菌株のタンパク質レベルを、種々の実験条件下で比較することができる。
【００３４】
また、本発明は、人工タンパク質をコードする核酸を包含するベクターおよび人工タンパク質および／または人工タンパク質をコードする核酸を包含するキットに関する。さらに、本発明はある生体のプロテオームの定量化分析法に関し、これは上に詳述されている。
【００３５】
本発明は、それに包含される実施例および添付の図を引用する結果によってよりよく理解される。
【００３６】
［図の詳細な説明］
＜図１．サインペプチドとして選択するＱペプチドの例＞
一連のタンパク質のため、ニワトリ骨格筋の可溶性画分の豊富なタンパク質として同定されたタンパク質からペプチドを選択し（複数の基準を使用）、人工タンパク質またはＱＣＡＴへと組み立てた。左側：クマシーブルーで染色された可溶性ニワトリ筋タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。中央：選択したタンパク質バンドに対応するゲルスライスのトリプシンによる分解のＭＡＬＤＩ−ＴｏＦスペクトル。ｏｖａｌで標識したペプチドイオンは、ＱＣＡＴタンパク質に含めるべく選択したペプチドである。右側：示された設計ＱＣＡＴタンパク質の範囲内のサインペプチドの質量および位置。ペプチドの詳細については表１に記載がある。
【００３７】
＜図２．ＤＮＡ配列、翻訳タンパク質配列およびＱＣＡＴの特性＞
関連クローニング部位に関する合成遺伝子のＤＮＡ配列を上に、そこから派生したアミノ酸配列を下に示す。グレーで囲まれた部分は、ドナーニワトリタンパク質由来のトリプシンペプチドの範囲、トリプシンペプチドの帰属（Ｔ１−Ｔ２５）および示されたペプチドの質量（Ｄａ）である。ホスホグリセリン酸キナーゼ中の非開裂Ａｒｇ−Ｐｒｏトリプシン部位（囲み部分）を利用して、この部位が分解されないようにする。ペプチド（白い囲み部分）は開始剤のメチオニン、Ｎ末端の犠牲的配列およびスペーサー配列は、対象タンパク質由来ではない。黒い囲み部分は、定量化のための単独のシステイン残基および精製のためのＨｉｓ6タグを運ぶ配列を強調している。Ｔ１およびＴ２は、最初の真のＱペプチド（Ｔ３）のN末端を保護するべく設計された犠牲的ペプチドである。
【００３８】
＜図３．ＱＣＡＴタンパク質およびＱペプチドの特徴化＞
ｐＥＴ２１ａ／ＱＣＡＴプラスミドを大腸菌ＤＥ３細胞に変化させ、一定期間の指数関数的増殖の後、ＩＰＴＧを用いてＱＣＡＴの発現を惹起した。前誘導および誘導細胞から得た細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で比較した（挿入画）。沈殿物を可溶化し、ＮｉＮＴＡカラムを用いた親和性クロマトグラフィーを行った後、精製されたＱＣＡＴタンパク質を均等化し、トリプシン溶液で分解した。ペプチドをＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析計で分析した。挿入画のトリプシン分解マップの影の部分は、質量スペクトルにおける各ペプチドに対応するシグナルの相対強度を示す。９００Ｄａ未満のＱＣＡＴの「犠牲的」部分に由来するペプチドは、この種の質量分析においては干渉イオンのためそれほど容易には検出されない。
【００３９】
＜図４．ＱＣＡＴタンパク質を用いた定量化＞
ＱＣＡＴタンパク質を未標識のもの（Ｌ：軽）および15Nで均一に標識したもの（Ｈ：重）として調製した。ＨおよびＬ  ＱＣＡＴタンパク質を別々に精製し、定量化し、種々の割合で混合した後、トリプシンで分解して、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析計でペプチドの強度を測定した。パネルａ）は、アデニル酸キナーゼのためのＱペプチドの質量スペクトルである（ＧＦＬＩＤＧＹＰＲ、１２個の窒素原子）。パネルｂ）では、測定したＬ：Ｈ比を、混合比に対してプロットし、３連の実験の個々の点を示す。下のパネルでは、７個のペプチドのデータを比較し、平均値±ＳＤ（ｎ＝１８−２１）で示した。点線はそれに沿う直線の９５％信頼限界を示す。
【００４０】
＜図５．筋タンパクの定量化のためのＱＣＡＴの使用＞
ニワトリ骨格筋から可溶性タンパク質を１日目に調製し、２７日目に［15Ｎ］ＱＣＡＴと混合し、トリプシンで分解して、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳで分析した。タンパク質のサブセットでは、内因性および標準ペプチドの強度を測定し、そこから各タンパク質の絶対量（ｎｍｏｌ／組織ｇ）を算出することができた。３例の動物を各時点で使用し、誤差はＳＥＭである（ｎ＝３）。タンパク質の内訳は、ＡＫ：アデニル酸キナーゼ、ＡｐｏＡ１：アポリポタンパク質Ａ１、ＬＤＨＢ：乳酸デヒドロゲナーゼＢ、Ｂｅｔａ  Ｔｒｏｐ：ベータトロポミオシン、Ｂｅｔａ  Ｅｎｏ：ベータエノラーゼ、ＧＰ：グリコーゲンホスホリラーゼ、ＡＬＤＯ  Ｂ：アルドラーゼＢ、ＴＰＩ：トリオースリン酸イソメラーゼ、ＧＡＰＤＨ：グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、Ａｃｔｉｎ：アクチン、ＡＰＩ：アクチン重合インヒビター、ＰＫ：ピルビン酸キナーゼおよびＣＫ：クレアチンキナーゼであった。
【００４１】
＜１．  Ｑタンパク質コンカテマーをコードする遺伝子の設計＞
発明者の主要な興味のひとつは、プロテオームの力学（Ｐｒａｔｔ，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １  （２００２），  ５７９−５９１）および筋発達中のタンパク質の発現の変化（Ｄｏｈｅｒｔｙ，  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ４  （２００４），  ２０８２−２０９３；  Ｄｏｈｅｒｔｙ，  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ （２００５））にある。タンパク質発現に劇的な発達的変化を示す系は、孵化後すぐに成熟に達するニワトリ胸筋である。したがって、ＱＣＡＴセットの説明のため、発明者らは、以前に骨格筋の発達において発現レベルの変化が確認されているニワトリのタンパク質２０個を選択した（Ｄｏｈｅｒｔｙ，  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ４  （２００４），  ２０８２−２０９３）。単一のトリプシン断片を選択して各タンパク質を示したが（「Ｑペプチド」）、あらゆるタンパク質分解による断片または化学的断片によって複製的に生成することのできるペプチドであれば使用してもよいこととした。この実施例においては、Ｑペプチドの選択は、理論的および実験的基準に基づいた。最初の基準は、Ｑペプチドがシステイン残基に欠けていることであった。システイン残基はＱＣＡＴの定量化に使用することができ、システイン残基がなければ、発現したタンパク質中で複雑な分子内および分子間ジスルフィド結合の形成を避けることができるためである。第二に、選択するペプチドはＱペプチドのセット内で独特であることとした。第三に、選択するペプチドは、検出感度が通常は高く、干渉シグナルが低いＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量スペクトルの領域に対応する、１０００および２０００Ｄａの質量のものとした。最後に、発明者らがＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析計で強いシグナルを発することがすでに明らかにされているペプチドを選択しているため、７５％（２０個中１５個）は末端基がＡｒｇのトリプシンペプチドであるため、操作上の基準を追加した。こうしたペプチドがＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析計でより強力なシグナルを発する性質は文献に詳細に記載されている（Ｂｒａｎｃｉａ，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２２  （２００１），  ５５２−５５９）。最後の、より重要性の低い基準は、Ｑペプチドは、ロイシンまたはバリンなどの豊富かつ化学的に反応しにくいアミノ酸を少なくとも１個含有していることとした。これにより、安定同位体標識Ｑペプチドの調製のため、アミノ酸による代謝標識が容易になるためである。これらのペプチドを表１に要約する。
【００４２】
［表１］ＱＣＡＴタンパク質のために選択したペプチド
2008545419.tif 000003
【００４３】
候補のセットが指定されたら、Ｑペプチドを組み立て、組み合わされたＱペプチドをコドンを用いてコードし、大腸菌で最大限に発現させる遺伝子を構築した。Ｃ末端に延長部分を付け加え、システイン残基およびＨｉｓタグ精製モチーフを提供した（この場合精製モチーフはベクターｐＥＴ２１ａによって提供した）。さらに一連のアミノ酸をＮ末端に付け加えて、開始剤のメチオニン残基および開裂した場合に真のＱペプチドを露わにする犠牲ペプチドを提供した（図１）。これにより、Ｎ−ホルミル化またはＱＣＡＴのＮ末端からのメチオニンの除去による問題を避けることができた。最初のＱＣＡＴ遺伝子によってコードされた転写生成物の、たとえばヘアピンループといった翻訳の障害になるような特性について、コンピュータを用いて分析した。こうした特性が認められれば、許容可能なｍＲＮＡ構造が得られるまで、Ｑペプチドの順序を交替した。ＱＣＡＴ内でのＱペプチドの配列は、定量化標準品としてのその使用とは関係がなく、このため順序に対してはこうした操作が可能である。遺伝子は一連の重複オリゴヌクレオチドから構築し、ＤＮＡシークエンシングで確認した。
【００４４】
＜２．  ＱＣＡＴの発現＞
ＱＣＡＴ遺伝子を制限部位も含めて構築し、一定範囲の発現ベクターに挿入できるようにした（図２）。この例では、遺伝子（ＤＮＡシークエンシングで確認）をＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位でｐＥＴ２１ａに挿入し、最初に栄養豊富な培地で増殖させた大腸菌（ＮｏｖａＢｌｕｅ  （ＤＥ３））で発現させた。ＩＰＴＧによる誘導後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、予測した質量（３５ｋＤａ以下）のタンパク質が高レベルで発現していることを確認した。このタンパク質は超音波処理した細胞の不溶画分に存在し、封入体内にＱＣＡＴタンパク質が存在することを仮定した。この調製物から、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を用いてＱＣＡＴタンパク質を親和性クロマトグラフィーで精製した結果、均質な調製物が得られた（図２、挿入画）。ＥＳＩ−ＭＳで測定したこのタンパク質の無傷の平均質量は、３３０３６±２Ｄａ（データは示していない）であり、ＱＣＡＴタンパク質に対し予測した質量３３１６７Ｄａと比較した場合、１３１Ｄａの差はＮ末端からのメチオニン残基の喪失量と完全に合致する。約３５ｋＤａのゲルバンドはトリプシンによるゲル内分解の対象であり、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳで分析した。予測したＱＣＡＴペプチドはすべて、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量スペクトルで容易に観察されたが、産生されたNおよびC末端の犠牲的ペプチド材料は、その設計上、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量スペクトルでは小さすぎて確認できない断片であった（図3）。ペプチドはＭＡＬＤＩ−ＴｏＦで良好なシグナルを産生するべく選択されたが、他に比べて明らかに強度の低いペプチドもあった。これらはすべて末端リジン含有ペプチドだったが、開裂不能のＡｒｇ−Ｐｒｏ部位を含むもののやはり末端にリジンを有し、やはりＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析計で強力なシグナルが産生されたＴ１７は例外とした。これは特に、乳酸デヒドロゲナーゼＡおよびＢ（それぞれＱＶＶＥＳＡＹＥＶＩＲおよびＱＶＶＤＳＡＹＥＶＩＫ）に由来するアイソフォーム特異的ＱペプチドであるＴ８およびＴ１８において明らかであった。末端リジン含有ペプチドは、末端アルギニン含有ペプチドのシグナル強度の１０％未満であり、このことはＱペプチドが主として末端がアルギニンのペプチドから引き出されたか、あるいはグアニジン化といった段階を用いてリジン残基をホモアルギニン残基に変換し、強いシグナルを得るためにこの性質を強化する必要があるかのいずれかであることを示唆した（Ｂｒａｎｃｉａ，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２２  （２００１），  ５５２−５５９）。ＱＣＡＴはきわめて効率的にトリプシンで分解され、定量化段階の障害となるようなＱペプチドの部分的タンパク質分解生成物が存在する証拠は勿論なかった。次に、発明者らは、唯一の窒素源として15ＮＨ4Ｃｌを含有する最少培地でタンパク質を発現させた。トリプシンで分解した結果得られるＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量スペクトルは高品質であり、ペプチド中の窒素原子の数に応じたしかるべき質量シフトで、すべてのＱペプチドが検出可能であった（データは示していない）。
【００４５】
次に、未標識および15Ｎ標識ＱＣＡＴタンパク質を種々の比率で混合し、トリプシンで分解して、結果得られた限定ペプチドをＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析計で分析した。ペプチドの重い変異体および軽い変異体は容易に識別でき（図３ａ）、それらの強度を一連のペプチドについて測定した（図３ｂ）。すべての例で、データは高品質であり、材料の比率と重：軽比率とは直線関係にあり、勾配は１（平均±ＳＤ  （ｎ＝６）＝１．００８±０．００８）、相関係数はきわめて高かった（すべての例においてｒ2は０．９９を超えた）。統合データ（図３ｃ）は、７個のペプチドのデータを示す。９５％信頼限界による近い境界線は、定量化の品質を示している。
【００４６】
＜結果の要約＞
発明者らはこの特殊なＱＣＡＴを、ニワトリ骨格筋のタンパク質発現の孵化後１日目および２７日目の分析に応用した（図４）。この調製物に存在する１２種類のタンパク質は、ＱＣＡＴにおいても示された。トリプシンペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴｏＦデータは容易に得ることができ、孵化後、最初の３乃至４週間のタンパク質レベルの変化を測定した。
【００４７】
タンパク質を絶対定量化したため、発明者らはタンパク質を組織の湿重量ｇ毎のｎｍｏｌとして表現することができた。３連での分析のばらつきは少なかった。発明者らは分析によるばらつきではなく生物学的なばらつきに起因すると考える。あらかじめこれらのタンパク質の７個のレベルを２Ｄゲル電気泳動およびデンシトメトリーで測定しており、両方の方法を用いた定量化間の相関関係は０．８２であった（ｒ2、ｐ＞０．００１）。この２つの方法がプロテオームの異なる発現量、たとえば電荷バリアントのアイソフォームまたは全タンパク構成要素を評価しており、デンシトメトリー法は不可避的に正確ではないことを考え合わせれば、相関関係は良好である。
【００４８】
発明者らは、Ｑペプチドの連結セットの生成のためのＱＣＡＴアプローチの実現可能性を説明してきた。理論的および実験的考察の両方を用いて設計したＱＣＡＴは、最少培地で増殖した場合でも高レベルで発現し、発現生成物の精製にも成功した。ＱＣＡＴは完全に人工的な構築物であるため、発明者らはそれが何らかの認識しうる３次元構造に折りたたまれるとは予想しておらず、また予測どおり、このタンパク質は封入体に凝集した。これは続く精製がより簡単になるという利点で、親和性精製前にそのペレットを強いカオトロープに再溶解させるだけでよくなる。さらに、ＱＣＡＴが高次構造ではないことは、ＱＣＡＴが少なくとも定量化対象の標的タンパク質よりも迅速に分解されるということを確実にする。
【００４９】
＜人工タンパク質およびＱＣＡＴペプチドの使用＞
コンカテマーの使用には２つの方法がある。第一は、内部標準品としてコンカテマーを使用する、直接Ｑペプチド法である。安定同位体標識コンカテマーを、タンパク質分解段階前に、試料または細胞調製物に直接添加することができる。あるいは、いくつかの細胞系では、注意深く既定した条件下で増殖した参照菌株の絶対定量化を達成するために、コンカテマーの定量化を使用することができる。これが間接Ｑペプチド法である。この参照菌株は、次からは安定同位体標識の菌株として、その生体を用いた将来のあらゆるプロテオミクス定量化試験において、絶対定量化標準品として使用することができる。参照菌株を一度正確に定量化したら、Ｑペプチドとして制限されたセットを用いるのではなく、あらゆるペプチドを用いて任意のタンパク質を報告することができるため、これは明らかにきわめて魅力的な提案である。これによりさまざまなプロテオミクス戦略の一般性が広がり、完全に定量化された菌株に対する未知の試料のプロテオミクスの比較分析において、ＩＣＡＴ（Ｇｙｇｉ，  Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ  １  （２００２），  ４７−５４）およびＩＴＲＡＱ（Ｒｏｓｓ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ  （２００４））などの標識法の新たな分野が創造される。
【００５０】
しかし、発明者は、このアプローチが適切ではなく、安定同位体標識コンカテマーそれ自体（直接Ｑペプチド法）が適切な標準品であるという例が多数あることを認識している。これは、あらかじめ容易に標識することができない生物学的材料を用いるたとえば動物組織におけるプロテオミクス試験またはバイオマーカー試験において特に言えることである。
【００５１】
＜特別な利点＞
発明者らが提唱する戦略は、通常は安定同位体の形態をとる個々のＱペプチドを化学合成するよりも優れたものである。化学合成は１回限りの応用に使用されてきており、ペプチド合成の過程は、生成物の過度の精製を回避できるほど十分に「クリーン」ではない。第二に、複合アッセイでは、各ペプチドを使用前に個々に定量化する必要がある。最後に、化学合成したＱペプチドは有限の資源であるのに対し、ＱＣＡＴ遺伝子を繰り返し発現させることは容易である。高品質の絶対定量化は、ゲル分析に基づくものであろうと、質量分析に基づくものであろうと、比較プロテオミクスでの現在の方法に関連する困難に打ち勝つための有効な方法でありうる。特別な細胞系を対象としてそれぞれを定量化した参照ＱＣＡＴと比較する一連の比較試験は、個々に定量化するだけではなく、データセットが成長するにつれ、あらゆる二つ一組の比較が頑健で、個々の研究室間の輸送も可能で、時間を経ても安定であるために十分に厳密なものである必要がある。
【００５２】
ペプチドの性質において、イオン化し良好なシグナルを質量分析計で生成することを因子とすることは可能である。現在、イオン強度は質量スペクトルの分析では過度に使用されていないが、近年知見に基づくアプローチを用いて強度を予測する試みがいくつかなされてきた（Ｋｒａｕｓｅ，  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７１  （１９９９），  ４１６０−４１６５；  Ｇａｙ，  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２  （２００２），  １３７４−１３９１；  Ｂａｕｍｇａｒｔ，  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  １８  （２００４），  ８６３−８６８）。
【００５３】
考慮に入れなければならないこのほかの因子は、前駆体標識の選択である。［13Ｃ］または［15Ｎ］で均一な標識を行い、すべてのペプチドが完全に標識されたことを確認しても、それぞれが安定同位体標識前駆体としてその後使用される同じアミノ酸を含有するＱペプチドを選択するのは好ましい。大半のＱＣＡＴタンパク質はトリプシンペプチドの集合体になることが予期されるため、［13Ｃ6］−リジンおよび［13Ｃ6］−アルギニンの組み入れ戦略は、大半のＱペプチドが単一標識されており、重ペプチドと軽ペプチドの間の質量の差し引きは、一定して６Ｄａであることを確認することとなる。さらに、未標識ＱＣＡＴは比較プロテオミクスのための試薬をｉｎ  Ｖｉｔｒｏで用いて標識し、絶対定量化に向かうこれらの技術がすべて強化される。
【００５４】
あらゆる特殊な理論に束縛されることなく、発明者らは、単一のＱＣＡＴに集合することのできるＱペプチドの数は、大きなタンパク質の高レベルでの異種発現を達成する能力によって制限される。本明細書に示す実施例では、発明者らは、平均長が１５個のアミノ酸であり、平均分子量が１．５ｋＤａの２０個のペプチドを選択した。１００個のタンパク質が単一のＱＣＡＴで代表される場合、結果得られる遺伝子組換えタンパク質は容易に発現できる１５０ｋＤａとなる。約６０００個のタンパク質からなる全酵母プロテオームは、その後約６０個のＱＣＡＴ構築物以内で規定することができる。
【００５５】
単一の構築物における１００個ものタンパク質を定量化することのできるこの能力は、個々のＱペプチドをＱＣＡＴに至適に集合させるという課題へと誘う。種々の基準を検討することができる。第一に、Ｑペプチド群は、特殊な細胞亜画分、またはタンパク質の特異的サブセット、たとえば転写因子またはタンパク質キナーゼの絶対定量化を可能にする。第二に、またおそらくはより重要なことに、連結は細胞内の標的タンパク質の豊富性によってなされる。同じＱＣＡＴ実験において発現レベルが大幅に異なる２種類のタンパク質を定量化することは困難であると考えられ、豊富性の低いタンパク質をコードするものではなく、豊富性の高いタンパク質をある構築物中に集合させるのが望ましい。
【００５６】
ＱＣＡＴの別の応用例は、特に広範囲にわたる臨床生物学および毒性学並びに診断学において容易に検討することができる。絶対定量化は、臨床または他のバイオマーカー監視システムにおける分析の予測値に新たな次元を開き、細胞下コンパートメントまたは複数タンパク質の複合体における個々のタンパク質の化学量論比を絶対的に規定することができる。
【００５７】
＜材料と方法＞
［材料］
［15N］H4Cl（９９％  ａｔｏｍ  ｐｅｒｃｅｎｔ  ｅｘｃｅｓｓ）はＣＫ  Ｇａｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌｔｄ．  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，  ＵＫから提供された。ほとんどの試薬は、本明細書に一覧にしたものを除き、以前に記載されている（Ｄｏｈｅｒｔｙ，  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ４  （２００４）  ２０８２−２０９３；  Ｐｒａｔｔ，  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２  （２００２），  １５７−１６０）。ヒヨコ（ｌａｙｅｒ，  Ｈｉ−Ｓｅｘ  Ｂｒｏｗｎ）骨格筋タンパク質は、１日齢および２７日齢のヒヨコから、２０．０００ｇの１０％（ｗ／ｖ）ホモジネートの上澄み液として調製した（Ｄｏｈｅｒｔｙ，  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ４  （２００４）  ２０８２−２０９３；  Ｄｏｈｅｒｔｙ，  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ５  （２００５）  ５，  ５２２−５３３）。
【００５８】
［ＱＣＡＴ遺伝子の設計および構築］
質量の単独性、イオン化および質量分析計で検出可能な傾向、特異的アミノ酸残基（ロイシンまたはバリン）の存在、他のアミノ酸残基（システイン、ヒスチジン、メチオニン）の非存在という点からＱペプチドを選択した。次に、ペプチド配列を無作為にコンピュータで連結し、大腸菌で発現させるのに至適化した遺伝子およびコドンの設計に用いた。予測された転写生成物の、発現を抑えるおそれのあるＲＮＡ二次構造を分析し、もしそれが存在する場合はペプチドの順序を変更した。ＮおよびＣ末端配列を犠牲構造として付加し、発現中の外部タンパク質分解による攻撃から真のＱペプチドの集合体を保護した。追加のペプチド配列を付加して、定量化のための開始剤のメチオニンおよびＣ末端のシステイン残基を提供した。人工遺伝子を一連の重複するオリゴヌクレオチドからデノボで合成し（Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ  ＧｍｂＨ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＤＮＡシークエンシングによって確認し、ｐＥＴ２１ａ発現ベクターのＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位に結合させ、ＱＣＡＴプラスミドのｐＥＴ２１ａ  ＱＣＡＴを産生した。His6精製標識を融合によってベクターに付けた。
【００５９】
［ＱＣＡＴ遺伝子の発現および15Nによる標識］
ＱＣＡＴプラスミドのｐＥＴ２１ａ  ＱＣＡＴを用いて、ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）（Ｋ−１２  ｅｎｄＡ１，  ｈｓｄＲ１７（ｒK12-ｍK12+），  ｓｕｐＥ４４，  ｔｈｉ−１，  ｒｅｃＡ１，  ｇｙｒＡ９６，  ｒｅｌＡ１，  ｌａｃ，  Ｆ‘［ｐｒｏＡ+Ｂ+，  ＬａｃｌｑＺ□Ｍ１５  ：：  Ｔｎ１０（ＴｃR）］細胞にアンピシリン耐性を付与した。細胞をＬｕｒｉａブロスで３７℃で培養し、アンピシリン１００μｇ／ｍＬをＡ600  ０．４乃至０．６に、ＩＰＴＧを添加して１ｍＭにした。培養をさらに5時間続け、細胞を遠心分離によって沈殿させ（５．０００ｇ、４分間、４℃）、１０ｍＬのｐＨ８．０の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液中で再懸濁し、リゾチーム（１００μｇ／ｍＬ）を室温で１０分間添加した。次に氷上で細胞に超音波処理を行い（３０秒の破砕を３回）、１４０００ｇで１０分間遠心分離した。誘導および非誘導培養物の沈殿物および上澄み液を、１２．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ  ＰＡＧＥ／クマシーブルー染色で分析した。15N標識のために、［15Ｎ］H4Ｃｌ（２０ｍＭ）を用いて調製したＭ９最少培地で細胞を培養し、上述のように誘導および加工を行った。
【００６０】
［ＱＣＡＴタンパク質の精製および分析］
超音波処理した細胞の沈殿物を、２０ｍＭイミダゾールおよび８Ｍ尿素を含有する２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）（緩衝液Ａ）中に溶解し、ＮｉＮＴＡカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に塗布した。１０本のカラムを同じ緩衝液中で洗浄した後、結合材料をイミダゾールの濃度を上昇させた緩衝液Ａ（５００ｍＭ）で溶出させた。この材料を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５スパンカラムで脱塩し、溶出したタンパク質の質量を、Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑ−ＴｏＦマイクロ質量分析計を用いて、エレクトロスプレーイオン化質量分析で測定した。質量スペクトルをＭａｘＥｎｔ  Ｉアルゴリズムを用いて加工した。精製し脱塩したタンパク質をトリプシンで分解し、結果得られたペプチドの質量を、Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析計を用いて測定した（Ｄｏｈｅｒｔｙ，  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ４  （２００４）  ２０８２−２０９３）。ＱＣＡＴの重い変異体および軽い変異体の反応比を評価するため、トリプシンによる分解およびＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析の前に、精製した「重い」および「軽い」タンパク質を異なる比率で混合した。［14Ｎ］および［15Ｎ］ペプチドの重心スペクトル上の強度を測定した。
【００６１】
［筋タンパク発現を定量化するためのＱＣＡＴの使用］
組織１００ｍｇに由来するニワトリ可溶性たんぱく質を含有する上澄み液画分を、［15Ｎ］ＱＣＡＴ  ２９０μｇと混合し、タンパク質アッセイで定量化し、トリプシンで一晩分解した。ＱＣＡＴは体内の筋タンパクよりも速く分解された（結果は示していない）。各時点で、３例の動物で実験を再現した。次に、［14Ｎ］−（筋）および［15Ｎ］−（ＱＣＡＴ）ペプチドを質量によって同定し、その相対強度をＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析計で測定した。
【００６２】
［質量分析］
この実施例における分析は、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析計を用いて実施したが、この方法は、ペプチド分析に好適な他のあらゆる質量分析法にも同様に適用できる。
【００６３】
［参考文献］
Baumgart, S. et al. The contributions of specific amino acid side chains to signal intensities of peptides in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom 18, 863-868 (2004).
Brancia, F.L. et al. A combination of chemical derivatisation and improved bioinformatic tools optimises protein identification for proteomics. Electrophoresis 22, 552-559 (2001).
Doherty, M.K. et al. The proteome of chicken skeletal muscle: changes in soluble protein expression during growth in a layer strain. Proteomics 4, 2082-2093 (2004).
Doherty, M.K., Whitehead, C., McCormack, H., Gaskell, S.J. & Beynon, R.J. Proteome dynamics in complex organisms: using stable isotopes to monitor individual protein turnover rates. Proteomics 5, 522-533. (2005)
Dunkley, T.P., Watson, R., Griffin, J.L., Dupree, P. & Lilley, K.S. Localization of organelle proteins by isotope tagging (LOPIT). Mol Cell Proteomics (2004).
Gay, S., Binz, P.A., Hochstrasser, D.F. & Appel, R.D. Peptide mass fingerprinting peak intensity prediction: extracting knowledge from spectra. Proteomics 2, 1374-1391 (2002).
Gerber, S.A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M.W. & Gygi, S.P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 6940-6945 (2003).
Gygi, S.P., Rist, B., Griffin, T.J., Eng, J. & Aebersold, R. Proteome analysis of low-abundance proteins using multidimensional chromatography and isotope-coded affinity tags. J Proteome Res 1, 47-54 (2002).
Hoang, V.M. et al. Quantitative proteomics employing primary amine affinity tags. J Biomol Tech 14, 216-223 (2003).
Julka, S. & Regnier, F. Quantification in proteomics through stable isotope coding: a review. J Proteome Res 3, 350-363 (2004).
Krause, E., Wenschuh, H. & Jungblut, P.R. The dominance of arginine-containing peptides in MALDI-derived tryptic mass fingerprints of proteins. Anal Chem 71, 4160-4165 (1999).
Lopez, M.F. & Pluskal, M.G. Protein micro- and macroarrays: digitizing the proteome. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 787, 19-27 (2003).
Ong, S.E. et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics 1, 376-386 (2002).
Pratt, J.M. et al. Stable isotope labelling in vivo as an aid to protein identification in peptide mass fingerprinting. Proteomics 2, 157-163 (2002).
Pratt JM, Petty J, Riba-Garcia I, Robertson DH, Gaskell SJ, Oliver SG, Beynon RJ. Dynamics of protein turnover, a missing dimension in proteomics.Mol Cell Proteomics. 2002 Aug;1(8):579-991 (2002). 
WO 03/102220 (Aebersold, R.)
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】サインペプチドとして選択するＱペプチドの例を示す。
【図２】ＤＮＡ配列、翻訳タンパク質配列およびＱＣＡＴの特性を示す。
【図３】ＱＣＡＴタンパク質およびＱペプチドの同定を示す。
【図４】ＱＣＡＴタンパク質を用いた定量化を示す。
【図５】筋タンパクの定量化のためのＱＣＡＴの使用を示す。
【図２】
2008545419.tif 000004
【図３】
2008545419.tif 000005
【図４】
2008545419.tif 000006
【図５】
2008545419.tif 000007
【図１】
2008545419.tif 000008
【配列表】
2008545419000001.app
【国際調査報告】
2008545419.tif 000009
2008545419.tif 000010
2008545419.tif 000011