(57)【要約】  本発明は、少なくとも３つの型のモノマー単位を含むコポリマーに関し、この３つの型のモノマー単位は、温度感受性単位、親水性単位及び少なくとも１つのｐＨ感受性部分を含む疎水性単位からなり、疎水性モノマー単位は共重合可能な不飽和脂肪酸に由来する。
2008502785.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも３つの型のモノマー単位からなるコポリマーであって、前記３つの型のモノマー単位は、
温度感受性単位と、
親水性単位と、
少なくとも１つのｐＨ−感受性部分を含む疎水性単位と、からなり、
前記疎水性モノマー単位は共重合可能な不飽和脂肪酸に由来する、コポリマー。
【請求項２】
前記脂肪酸は５乃至５０又はそれ以上の主鎖炭素原子を含む、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項３】
前記脂肪酸は１つの炭素−炭素二重結合（モノ不飽和）を含む、請求項２に記載のコポリマー。
【請求項４】
前記脂肪酸は、（Ｅ）−９−オクタデセン酸、（Ｚ）−９−オクタデセン酸、（Ｚ）−１１−オクタデセン酸、（Ｅ）−９−ヘキサデセン酸、（Ｚ）−９−ヘキサデセン酸、（Ｚ）−９−テトラデセン酸、（Ｚ）−１１−エコセン酸、（Ｚ）−１３−ドコセン酸及び（Ｚ）−１５−テトラコセン酸からなる群より選択される、請求項３に記載のコポリマー。
【請求項５】
前記脂肪酸はオメガ−１脂肪酸である請求項３に記載のコポリマー。
【請求項６】
前記脂肪酸は、４−ペンテン酸、７−オクテン酸、１０−ウンデセン酸、１５−ヘキサデセン酸及び１９−エコセン酸からなる群より選択される、請求項５に記載のコポリマー。
【請求項７】
前記脂肪酸は少なくとも二つの炭素−炭素二重結合（ポリ不飽和）を含む、請求項２に記載のコポリマー。
【請求項８】
前記脂肪酸は、（Ｅ，Ｅ）−９，１２−オクタデカジエン酸、（Ｚ，Ｚ）−９，１２−オクタデカジエン酸、（Ｅ，Ｅ）−９，１１−オクタデカジエン酸、（Ｚ、Ｚ，Ｚ）−９，１２，１５−オクタデカトリエン酸、（Ｚ、Ｚ，Ｚ）−６，９，１２−オクタデカトリエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ）−６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸、（Ｚ，Ｚ）−１１，１４−エコサジエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ）−５，８，１１−エイコサトリエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ）−１１，１４，１７−エイコサトリエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ）−８，１１，１４−エイコサトリエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ）−８，１１，１４，１７−エイコサテトラエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ）−５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ）−５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸、（Ｚ，Ｚ）−１３，１６−ドコサジエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ）−１３，１６，１９−ドコサトリエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ）−７，１０，１３，１６−ドコサテトラエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ）−４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ）−７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ、Ｚ）−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸及び（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ）−６，９，１２，１５，１８，２１−テトラコサヘキサエン酸からなる群より選択される、請求項７に記載のコポリマー。
【請求項９】
前記温度感受性モノマー単位は、Ｎ−アクロイルピペラジン、Ｎ−ｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−ピペリジル−メタクリルアミド及びＮ−イソプロピルアクリルアミドからなる群から由来する、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項１０】
前記親水性モノマー単位は、アクリル酸、アクリルアミド、アクリレート、ピロリドン、エチレングリコール及びそれらの置換された誘導体からなる群から由来する、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項１１】
前記アクリルアミドは、アクリルアミド（ＡＡｍ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡｍ）及びＮ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミドからなる群より選択される、請求項１０に記載のコポリマー。
【請求項１２】
終端部、リガンド、薬物、タグ、ラジオイムノ結合体、化学的部分及びスペーサからなる群より選択される少なくとも１つの部分からなる末端基をさらに含む、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項１３】
前記終端部は水酸基、カルボキシル基及びアミノ基からなる群より選択される官能基を含む、請求項１２に記載のコポリマー。
【請求項１４】
前記終端部は、連鎖移動剤又は官能基移動剤により導入される、請求項１３に記載のコポリマー。
【請求項１５】
前記終端部は、リビング重合法により導入される、請求項１３に記載のコポリマー。
【請求項１６】
前記終端部は、前記ポリマーのモノマー単位の一部である、請求項１３に記載のコポリマー。
【請求項１７】
前記連鎖移動剤は、クロロホルム、四塩化炭素、アルキル−メルカプタン、アミノエタンチオール、メルカプト−プロピオン酸、メルカプト−コハク酸、チオグリコール酸、メルカプトエタノール及びその第２級アルコール、アルキルハライド及び５未満の酸化数を有するリン酸塩、からなる群より選択される、請求項１４に記載のコポリマー。
【請求項１８】
前記アルキル−メルカプタンは、オクタンチオール、デカンチオール、ｎ−ドデカンチオール又はｔ−ドデカンチオールからなる群より選択される、請求項１７に記載のコポリマー。
【請求項１９】
前記リガンドは、前記終端部の官能基に直接取り付けられる請求項１２に記載のコポリマー。
【請求項２０】
前記リガンドは、スペーサにより前記終端部に取り付けられる、請求項１２に記載のコポリマー。
【請求項２１】
前記スペーサは１０を超える主鎖原子を含む、請求項２０に記載のコポリマー。
【請求項２２】
前記リガンドは、小さな標的分子、タンパク質、ペプチド及び炭水化物からなる群より選択される、請求項２１に記載のコポリマー。
【請求項２３】
前記スペーサはポリ（エチレングリコール）及びポリ（プロピレングリコール）からなる、請求項２１に記載のコポリマー。
【請求項２４】
前記コポリマーはランダムコポリマーである、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項２５】
前記コポリマーはブロックコポリマーである、請求項１に記載のコポリマー。
【請求項２６】
温度及びｐＨに感受性の組成物であって、
治療剤と、
コポリマー、とからなり、
前記コポリマーは少なくとも３つの型のモノマー単位からなり、同３つの型のモノマー単位は、
温度感受性単位と、
親水性単位と、
少なくとも１つのｐＨ−感受性部分を含む疎水性単位と、からなり、かつ
前記疎水性モノマー単位は共重合可能な不飽和脂肪酸に由来する組成物。
【請求項２７】
前記治療剤は、抗癌剤、抗炎症剤及び神経疾患を治療するための薬物からなる群より選択される、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記抗癌剤は、ドキソルビシン、アナストロゾール、エキセメスタン、シクロホスファミド、エピルビシン、トレミフェン、レトロゾール、トラスツズマブ、メゲストロール、ノルバデックス、パクリタキセル、ドセタキセル、カペシタビン、酢酸ゴセレリン、ヒドロキシウレア、エリスロマイシン、シクロスポリン及びシスプラチンからなる群より選択される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記コポリマーの分子量は、４００００未満である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３０】
前記コポリマーの下限臨界溶液温度は７．２未満のｐＨでは３７℃よりも小さい、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３１】
前記コポリマーの下限臨界溶液温度は通常の生理学的ｐＨであるｐＨ７．４において３７℃よりも大きい、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３２】
前記コポリマーに存在する、温度感受性モノマー単位と親水性モノマー単位と少なくとも１つのｐＨ感受性部分を含む疎水性モノマー単位とのモル比は、約３．７５：１．２５：０．５である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３３】
動物又はヒトに選択された治療剤を提供する方法において、
前記動物又はヒトに温度及びｐＨ感受性の組成物を投与する工程を含み、前記組成物は、
治療剤と、
コポリマー、とからなり、
前記コポリマーは少なくとも３つの型のモノマー単位からなるコポリマーであり、同３つの型のモノマー単位は、温度感受性単位と、親水性単位と、少なくとも１つのｐＨ−感受性部分を含む疎水性単位と、からなり、かつ前記疎水性モノマー単位は共重合可能な不飽和脂肪酸に由来し、
前記コポリマーは、疎水性コア及び親水性シェルからなる少なくとも１つのナノ粒子に調製され、かつ前記治療剤は前記疎水性コア内に包含される、方法。
【請求項３４】
前記組成物は経口にて送達される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記組成物は局所的に送達される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記組成物は静脈内投与にて送達される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記組成物は局所に送達される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記組成物は非経口的に送達される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記組成物は吸入にて送達される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記組成物は眼を介して送達される、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なコポリマーに関し、より詳細には、温度及びｐＨに感受性の両親媒性コポリマーに関する。本発明はまた、薬物送達に有用な新規なコポリマーを含む組成物、並びに選択された治療剤を動物又はヒトに提供するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療薬の精密な標的化、タイミング及び用量を提供する高度な製薬組成物及び薬物送達法の開発は、癌、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、嚢胞性繊維症のような疾病による臓器特異的な治療においては複雑な要求により、一部では必要とされてきた。治療の複雑な要求に関与する幾らかの要素としては、そのような疾病の治療において使用される薬物の毒性、同薬物の治療上における制限された活性、並びに罹患された臓器への到達が不能であること及び同臓器の不均質性が挙げられる。
【０００３】
薬物の送達、特に、低毒性であるとともに罹患された細胞への標的化が改善されている薬物担体の開発は進歩を遂げてきた。リポソーム、薬物−ポリマー結合体及びナノ粒子を含む、薬物送達を改善することができる幾らかの型の薬物担体が研究されてきた。
【０００４】
ポリマー性のコア−シェル・ナノ粒子が、水に難溶性かつ両親媒性の薬物及び遺伝子を腫瘍部位に標的化するための優れたコロイド性担体として最近報告された（非特許文献１、２及び３）。ポリマー性のコア−シェル・ナノ粒子はサイズが小さく、通常２００ｎｍ未満であり、疎水性薬物、遺伝子又はタンパク質を、疎水性相互作用、静電作用及び水素結合等によりその内側のコア中にて安定化させることができる一方で、その親水性のシェルが外部環境にさらされている。これは、封入された生物活性化合物を崩壊から効率的に保護し、細網内皮系（ＲＥＳ）による除去を回避することにより全身循環系における持続的な活性を可能にする。ポリマー性のコア−シェル・ナノ粒子を用いることにより、受動的及び能動的のいずれにおいても透過及び保持効果の向上（ＥＰＲ効果）（非特許文献４）及びミセル表面上の識別信号の組み込み（非特許文献５）により標的化が達成されるか、又は温度及びｐＨのような生理学的環境における変化に感受性の高いポリマーを導入する標的化が達成され得る。
【０００５】
温度感受性ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）から構成されたシェルを有するポリマー性ナノ粒子は、ポリマーの温度反応性ゆえに近年かなり注目されてきた。ＰＮＩＰＡＡｍは水溶液中にて約３２℃という下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）を呈しており、その温度より低い温度ではポリマーは水溶性であり、かつその温度より高い温度では不溶性である（非特許文献６）。ポリマーが温度感受性であることは、薬物担体を熱的に標的化する手段を好適に提供する。
【０００６】
オカノ（Ｏｋａｎｏ）らは、ＰＮＩＰＡＡｍ−ｂ−ポリ（ブチルメタクリレート）及びＰＮＩＰＡＡｍ−ｂ−ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）ブロックコポリマーに由来するアドリアマイシン封入ミセル構造体の合成を報告している（非特許文献７及び非特許文献８）。コア−シェル・ナノ粒子はＬＣＳＴ未満で良好に形成されるが、ＬＣＳＴより高い温度にて変形される。薬物の放出は局所的な加熱と冷却のサイクルの組み合わせにより調整される。しかしながら、深い組織又は腫瘍の標的化において温度の調整のみでは不十分であることが明らかとなった。
【０００７】
温度感受性薬物担体の１つの代替物はｐＨ感受性薬物担体である。例えば、最も固形化した腫瘍の細胞外のｐＨは５．７乃至７．８の範囲である（非特許文献９）である一方、腫瘍の間質液のｐＨはまれにしかｐＨ６．５未満とはならない。そのような狭い範囲のｐＨを備えた薬物担体を提供することは１つの課題である（非特許文献１０）。
【０００８】
チェン（Ｃｈｅｎ）及びホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）は、ＮＩＰＡＡｍ及びアクリル酸のコポリマーの合成並びにそのｐＨ依存性ＬＳＣＴを報告しており、薬物の標的化におけるその可能性の見込まれる用途を提唱している（非特許文献１１）。更に最近では、ポリ（Ｌ−ヒスチジン）−ｂ−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）から形成されたコア−シェル・ナノ粒子がｐＨ感受性であり、封入された薬物であるドキソルビシン（ＤＯＸ）を７．４乃至６．８のｐＨにて放出したことが報告されている（非特許文献１２及び非特許文献１３）。酸性の環境はコア−シェル・ナノ粒子の不安定化を誘引し、腫瘍組織にて封入された薬物分子を放出する。
【０００９】
特許文献１は、疎水性のコアと親水性のシェルを有するポリマー性ミセルから構成されたコロイド状組成物の使用を開示している。ｐＨ及び温度に感受性のミセルはＮＩＰＡＡｍ、メタクリル酸及びオクタデシルアクリレートのコポリマーに由来する。温度感受性及びｐＨ感受性の部分は、ミセルのシェルに存在している。
【００１０】
そのような開発がなされているにも関わらず、現在の薬物担体には、その性能を改善するための継続的な努力を必要とするような制約が存在している。
【特許文献１】国際公開第０１／８７２２７Ａ２号パンフレット
【非特許文献１】カタオカ（Ｋａｔａｏｋａ）ら、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．、４７、２００１年、１１３−１３１頁
【非特許文献２】ブイ．ピー．トルチリン（Ｖ．Ｐ．Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ）、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．、７３、２００１年、１３７−１７２頁
【非特許文献３】アレン（Ａｌｌｅｎ）ら、Ｃｏｏｌ．Ｓｕｒｆ．Ｂ：Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ、１６、１９９９年、３−２７頁
【非特許文献４】マツムラ（Ｍａｔｓｕｍｕｒａ）ら、Ｃｅｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４６、１９８６年、６３８７−６３９２頁
【非特許文献５】カバノフ（Ｋａｂａｎｏｖ）ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２５８、１９８９年、３４３−３４５頁
【非特許文献６】テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら、Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．：Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄ．、１３、１９７５年、２５５１−２５７０頁
【非特許文献７】チャン（Ｃｈｕｎｇ）ら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．、６２、１９９９年、１１５−１２７頁
【非特許文献８】コホリ（Ｋｏｈｏｒｉ）ら、Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ｂ：Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ、１６、１９９９年、１９５−２０５頁
【非特許文献９】バウペル（Ｖａｕｐｅｌ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４１、１９８１年、２００８−２０１３頁
【非特許文献１０】ドルモンド（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ）ら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３９、２０００年、４０９−４６０頁
【非特許文献１１】チェン及びホフマン、Ｎａｔｕｒｅ、３７３、１９９５年、４９−５２頁
【非特許文献１２】リー（Ｌｅｅ）ら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．、９０、２００３年、３６３−３７４頁
【非特許文献１３】リーら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．、９１、２００３年、１０３−１１３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、本発明の目的は、ｐＨ及び温度の感受性が改善された薬物担体として使用することのできるポリマー性化合物を提供すること及び薬物送達の性能を改善することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、薬物送達用材料として使用可能なｐＨ及び温度に感受性のコポリマーを提供する。一態様において、本発明は、少なくとも３つの型のモノマー単位からなるコポリマーに関し、同３つの型のモノマー単位は、温度感受性単位、親水性単位及び少なくとも１つのｐＨ感受性の部分を含む疎水性単位を含み、同疎水性モノマー単位は共重合化が可能である不飽和脂肪酸に由来する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、温度及びｐＨ感受性組成物に関し、同組成物は、治療剤と、少なくとも３つの型のモノマー単位からなるコポリマーを含み、同３つの型のモノマー単位は、温度感受性単位、親水性単位及び少なくとも１つのｐＨ感受性の部分を含む疎水性単位を含み、同疎水性モノマー単位は共重合化が可能である不飽和脂肪酸に由来する。
【００１４】
更に別の態様において、本発明は選択された治療剤を動物又はヒトに提供する方法を提供し、同方法は、動物又はヒトに温度及びｐＨ感受性組成物を投与する工程を含み、同組成物は治療剤と、少なくとも３つの型のモノマー単位からなるコポリマーを含み、同３つの型のモノマー単位は、温度感受性単位、親水性単位及び少なくとも１つのｐＨ感受性の部分を含む疎水性単位を含み、同疎水性モノマー単位は共重合化が可能である不飽和脂肪酸に由来し、同コポリマーは疎水性コアと親水性シェルとからなる少なくとも１つのナノ粒子に調製され、かつ同治療剤は同疎水性コアの内部に包含される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のこれらの態様は、以下の詳細な説明、図面及び非限定的な実施例を考慮してより完全に理解されるであろう。
本発明は、疎水性かつｐＨ感受性の官能基として脂肪酸を組み込んだコポリマーから得られたコア−シェル・ナノ粒子が薬物担体として優れた特性を有するという知見に基づくものである。本発明のコポリマーは疎水性のコアを含むコア−シェル構造体に自身でアセンブリ可能であり、同構造体において、脂肪酸のような疎水性の部分がコポリマーの親水性部分からなる親水性のシェルにより包囲されて配置されている。薬物は、コア内に物理的に封入されるか若しくは化学的に結合されて取り込まれる。これらのナノ粒子は、環境のｐＨの狭い範囲の変化に対応してその物理的な形態を変更することが可能であり、同ナノ粒子の疎水性コアに封入された薬物を結果として解放する。
【００１６】
本発明のコポリマーの１つの利点は、これらのコポリマーから形成されたコア−シェル・ナノ粒子の下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）が環境ｐＨに依存していることにあり、それはコア−シェル・ナノ粒子の構造的が変形が環境ｐＨの変化により誘引されることを意味する。この特性は環境が特徴的に酸性である器官又は腫瘍組織の標的化に使用することができる。通常の生理学的なｐＨにおいて、コア−シェル・ナノ粒子は通常の体温（約３７℃）より大きいＬＣＳＴを有する。しかしながら、わずかに酸性の環境では、ナノ粒子のＬＣＳＴは通常の体温よりも低い。これは、コア−シェル・ナノ粒子が生理学的な環境においては安定であるが酸性環境においては不安定であるか若しくは凝集することを意味する。
【００１７】
理論と結びつけるつもりはないが、コポリマーの疎水性かつｐＨ感受性の部分として脂肪酸を使用することにより本発明のコポリマーにより大きなｐＨ感受性を与えることができると考えられる。ｐＨ感受性の官能基は脂肪酸の疎水性セグメントと結合され、それらはコア−シェル・ナノ粒子のコアに組み込まれることを意味する。これらのポリマーから形成されたコア−シェル・ナノ粒子はゆるく集合されており（ｐａｃｋｅｄ）、それによりｐＨ感受性の官能基はナノ粒子のコアに配置されているにもかかわらず外部環境とアクセスすることができる状態となっている。外部環境のｐＨが変化すると、ｐＨ感受性官能基も変化する、即ち、例えばイオン化または脱イオン化される。これにより脂肪酸の疎水性が変化し、よってナノ粒子のＬＣＳＴが変化し、薬物分子を放出する。更に、脂肪酸は天然の化合物であるので、それらは生体適合性が非常に高いと考えられ、人体における毒性が非常に低いものであると考えられる。
【００１８】
本発明のコポリマーは、少なくとも３つの型のモノマー単位を含む。「モノマー単位（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  ｕｎｉｔ）」なる用語はポリマーに重合化されるモノマーを参照することを本明細書にて明確に記載したい。これは、ポリマーに重合化された特定の分子全体を指す「モノマー（ｍｏｎｏｍｅｒ）」なる用語とは区別される。
【００１９】
本発明のコポリマーに必要とされる１つの型のモノマー単位は温度感受性／応答性単位である。本発明において、温度感受性のモノマー単位は、コポリマーに対して温度感受性を与えるために使用され、温度感受性コポリマーを形成する。温度感受性コポリマーは典型的には、相転移温度としても知られている固有のＬＣＳＴ又はＵＣＳＴ（上限臨界溶液温度）を呈する。固有のＬＣＳＴを有するコポリマー（以下においては「ＬＣＳＴシステム」として知られる）はＬＣＳＴより上では水に不溶性である一方、固有のＵＣＳＴを有するコポリマーはＵＣＳＴより低い温度にて不溶性である。この特徴は、温度の変化が臨界溶液温度を超えて起こった場合、或いはコポリマーの臨界溶液温度が例えばｐＨ変化に対応して静的環境温度を超えてシフトした場合のいずれかにおける、ポリマーのコンフォーマルな変化により証明されている。一般的に、大部分の薬物送達の用途はＬＣＳＴシステムを使用する。環境温度がＬＣＳＴ以上となった場合、突然の収縮及びそれによるＬＣＳＴシステムの不溶性は本発明のコポリマーの水相を放出し、疎水性の相とするために、細胞膜との相互作用を容易にする。更に、温度感受性モノマー単位は、アクリルアミド（ＡＡｍ）のような親水性コモノマー又はその他の型の改質コモノマーと共重合されて、より高い、若しくはより低いＬＣＳＴを達成する。そのようなコポリマーは薬物の放出速度を制御するための機能的な薬物送達材料として応用され得る。
【００２０】
本発明の使用に適した温度感受性モノマー単位は、例えば、第１級、第２級若しくは第３級アミノ基、アミド基、カルボキシル基、カルボニル基、または水酸基のようなひとつ以上の極性官能基を有しており、それらの全ては本来極性を有する。一般的に、極性官能基が存在することにより、温度感受性のモノマー単位はまた生来的に親水性となる。本発明にて使用され得る温度感受性モノマー単位の例としては、置換されたアクリルアミド、アクリレート、ピロリドン、ピペリジン及びセルロースのようなモノマーに由来するモノマー単位を含む。適切な温度感受性モノマー単位の特殊な例としては、例えば、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）、Ｎ−ヒドロキシプロピルアクリレート、Ｎ−アクリロイルピロリドン（ＡＰｙ）、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルピペラジン、ヒドロキシ−メチルセルロース、Ｎ−ｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−ピペリジル−メタクリルアミド、を含むがそれらに限定されるものではない。本発明の温度感受性モノマー単位として使用される現在好ましいモノマーはＮＩＰＡＡｍである。ＮＩＰＡＡｍのモノマー単位を含むポリマーは非常に温度感受性が高く、負の温度感受性を呈し（即ち、ＬＣＳＴシステム）、それらはそのＬＣＳＴ未満に温度が下がると水溶性となることを意味する。
【００２１】
本発明のコポリマーにおいて必要とされる別の型のモノマー単位は親水性単位である。一般的に、親水性のモノマー単位は本発明のコポリマーのＬＣＳＴを改質する／シフトするための手段を提供する。親水性単位は温度感受性親水性単位よりも比較的親水性であるので、コポリマーのＬＣＳＴは増大する：逆に、比較的親水性単位が少ない場合又は疎水性単位が存在する場合、コポリマーのＬＣＳＴは低くなる。本発明に適した親水性モノマー単位は任意の適切な共重合可能なモノマーを含み、同モノマーは、例えば第１級、第２級又は第３級アミノ基、アミド基、スルフヒドリル基、カルボキシル基、カルボニル基又は水酸基のような１つ以上の極性官能基を有する。極性官能基も存在しており、故に生来的に親水性である温度感受性モノマー単位に対して、本発明にて必要とされる親水性モノマー単位は温度感受性である必要はない。
【００２２】
ある実施形態において、親水性モノマー単位は温度感受性親水性単位と比較してより親水性である。これは得られたコポリマーのＬＣＳＴを増大するために供される。これらの実施形態に存在する親水性モノマー単位は以下のモノマー：アクリル酸、アクリルアミド、アクリレート、ピロリドン、エチレングリコール及びそれらの誘導体、に由来するがこれらに限定されるものではない。特殊な実施形態において、親水性モノマー単位は、アクリルアミド（ＡＡｍ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡｍ）及びＮ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミドを含むアクリルアミド及びＮ−置換アクリルアミド誘導体モノマーに由来するが、これらに限定されるものではない。本発明のコポリマー中にＤＭＡＡｍが存在している好ましい実施形態において、熱感受性が高められ、それにより体温におけるより小さな温度変化に応答して、「オン−オフ」薬物放出を可能にする。付随的に、本発明のコポリマー中にＮＩＰＡＡｍ及びＤＭＡＡｍを備えることにより、本発明のコポリマーのＬＣＳＴが（３７℃よりわずかに高い温度まで）上昇する。生理学的な条件下においてコポリマーのＬＣＳＴが体温よりわずかに高いポリマーを使用することが一般的には望ましい。通常の生理学的なｐＨ（典型的には７．４）から７．２以下までの環境ｐＨの変化が、通常体温より高い値から通常体温より低い値までＬＣＳＴを移行させることが可能である限り、ＬＣＳＴの上限は必要ではないと考えられる。
【００２３】
本発明のコポリマーにおいて必要とされる第３の型のモノマー単位は、共重合可能な不飽和脂肪酸に由来する疎水性単位であり、少なくとも１つのｐＨ感受性の部分を含む。少なくとも１つのｐＨ感受性官能基を有する任意の適切な不飽和脂肪酸が本発明において使用可能である。適切な不飽和脂肪酸はすべての天然の及び人工的に改質／合成された脂肪酸を含み、かつ１，２，３，４，５，６，７，８又はそれ以上の炭素二重結合及び／又は三重結合を有するすべてのモノ不飽和脂肪酸及びポリ不飽和脂肪酸、並びにそのシス型異性体及びトランス型異性体の全てを含む。脂肪酸の不飽和部分、即ち、炭素−炭素二重結合部分は、同脂肪酸の主たる炭素鎖の任意の位置に存在し得る。
【００２４】
不飽和脂肪酸の炭化水素鎖はコポリマーの主たる疎水性部分を構成する。疎水性部分は、本発明のコポリマーに疎水性の性質を与えることに寄与する。疎水性部分はコア−シェル構造体を形成するために必要であり、抗癌剤分子のようなその他の疎水性材料とコポリマーとの相互作用を可能にする。適切な脂肪酸の炭化水素鎖は、典型的には天然の脂肪酸（分岐したアルキル鎖を含む）に見出される直鎖の分岐していないアルキル鎖を含み得る。例えば、カルボン酸、アミン及び水酸基のような官能基で選択的に置換された環状若しくは分岐状アルキル鎖の場合もある。官能基の位置に関してはいかなる制限もない。カルボン酸は特にコポリマーにｐＨ感受性を提供するとともに適切なリガンドと結合することを可能にする。脂肪酸に存在する任意のその他のｐＨ感受性官能基もまたこれらの機能に供され得る。
【００２５】
一実施形態において、本発明のコポリマーは以下の構造式（Ｉ）を有する：
【００２６】
【化１】
2008502785.tif 000003
上記式において定義されたＡ、Ｂ及びＣは、それぞれランダムに、温度感受性単位、親水性単位及び疎水性単位である共重合されるモノマー単位、又はそのポリマーブロックを示している。Ｘは脂肪酸の疎水性セグメントと直接結合するカルボン酸官能基を示す。
【００２７】
別の実施形態において、不飽和脂肪酸は（包含的に）５乃至５０以上の主鎖炭素原子を含むものからなる。この実施形態において、脂肪酸は１つの炭素−炭素二重結合を含み、モノ不飽和脂肪酸であることを意味する。疎水性モノマー単位が由来する特殊なモノマーは、例えば、ペンテン酸、ヘキセン酸、ヘプテン酸、オクテン酸、ノネン酸、デセン酸、ウンデセン酸及びドデセン酸を含む。脂肪酸の炭素−炭素二重結合の位置に特別な制限はない。
【００２８】
現在のところ好ましいモノ不飽和脂肪酸は、（Ｚ）−９−テトラデセン酸、（Ｅ）−９−ヘキサデセン酸、（Ｚ）−９−ヘキサデセン酸、（Ｅ）−９−オクタデセン酸、（Ｚ）−９−オクタデセン酸、（Ｚ）−１１−オクタデセン酸、（Ｚ）−１１−エコセン酸（Ｅｃｏｓｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、（Ｚ）−１３−ドコセン酸及び（Ｚ）−１５−テトラコセン酸からなる群より選択される脂肪酸を含むが、それらに限定されるものではない。
【００２９】
一実施形態において、モノ不飽和脂肪酸はオメガ−１脂肪酸であり、脂肪酸のカルボン酸官能基の位置の反対側にある端部の最初の炭素原子と二番目の炭素原子との間に二重結合が存在しているものを意味する。オメガ−１脂肪酸を使用する利点は、炭素−炭素間の二重結合が嵩高いアルキル鎖に立体的に妨害されないので必要とされる温度感受性モノマー単位及び親水性モノマー単位と同脂肪酸とが容易に共重合される点にある。現在好ましいオメガ−１脂肪酸は、４−ペンテン酸、７−オクテン酸、１０−ウンデセン酸、１５−ヘキサデセン酸及び１９−エコセノン酸からなる群より選択される。
【００３０】
別の実施形態において、脂肪酸は少なくとも２つの炭素−炭素二重結合を含み、脂肪酸はポリ不飽和であることを意味する。適切なポリ不飽和脂肪酸はオメガ−３、オメガ−６、及びオメガ−９脂肪酸並びにその他の型の脂肪酸を含む。本発明に使用され得るポリ不飽和脂肪酸の適切な例は、（Ｅ，Ｅ）−９，１２−オクタデカジエン酸、（Ｚ，Ｚ）−９，１２−オクタデカジエン酸、（Ｅ，Ｅ）−９，１１−オクタデカジエン酸、（Ｚ、Ｚ，Ｚ）−９，１２，１５−オクタデカトリエン酸、（Ｚ、Ｚ，Ｚ）−６，９，１２−オクタデカトリエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ）−６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸、（Ｚ，Ｚ）−１１，１４−エコサジエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ）−５，８，１１−エイコサトリエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ）−１１，１４，１７−エイコサトリエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ）−８，１１，１４−エイコサトリエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ）−８，１１，１４，１７−エイコサテトラエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ）−５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ）−５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸、（Ｚ，Ｚ）−１３，１６−ドコサジエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ）−１３，１６，１９−ドコサトリエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ）−７，１０，１３，１６−ドコサテトラエン酸（Ｏｃｏｓａｔｅｔｒａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ）−４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ）−７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ、Ｚ）−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸及び（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ）−６，９，１２，１５，１８，２１−テトラコサヘキサエン酸を含む。
【００３１】
本発明のコポリマーは上述の３つの型のモノマー単位のみを含むか、あるいは付随的にその他の型のモノマー単位を含み得る。例えば、ＮＩＰＡＡｍ及びＮ−ｔ−ブチルアクリルアミド、又はＮＩＰＡＡｍ及びＮ−ピペリジル−メタクリルアミドのような二つ以上の温度感受性モノマー単位を使用することも可能である。同様に、ＤＭＡＡｍ及びＡＡｍ、又はＤＭＡＡｍ及びＡＰｙのような二つ以上の親水性モノマー単位を使用することも可能である。その他の型のモノマー単位はまた、コポリマーの物理化学的特性を調整するか、若しくは更なるリガンドとの結合のための官能基又はスペーサを導入するためにコポリマー骨格に組み込むことが可能であり、これらのモノマー単位は、例えばＮ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド又はヘテロ２官能基ＰＥＧを含む。
【００３２】
本発明のコポリマーは、３つの主要な型のモノマー単位、即ち、温度感受性モノマー単位、親水性モノマー単位及び疎水性単位がコポリマー内にランダムに分配されているランダムコポリマーであり得る。コポリマーは、ジブロック若しくはトリブロックコポリマーのようなブロックコポリマー並びにブロック−グラフトコポリマーとしても合成され得る。一実施形態において、温度感受性モノマー及び親水性モノマーは１つのブロックのポリマーを形成するために共重合され、かつ親水性モノマーは別のブロックのポリマーを形成するために共重合され、それによりジブロックコポリマーを形成する。
【００３３】
一実施形態において、コポリマーは更に少なくとも１つの末端基を含む。末端基は、終端部、リガンド、薬物分子、タグ、ラジオイムノ結合体、コポリマーの物理化学的特性を改質するための部分及びスペーサ（リンカー）からなる群より選択される少なくとも１つの部分を含む。
【００３４】
特殊な実施形態において、本発明のコポリマーは以下の式（ＩＩ）に従う構造を有する終端部を構成する末端基を含む：
【００３５】
【化２】
2008502785.tif 000004
ここでＹは終端部である。
【００３６】
本実施形態において、末端基は、コポリマーの炭素骨格（即ち、モノマー単位を結合する炭素鎖）の末端炭素原子に結合され得る。典型的には、終端部は、所望の末端構造を含む連鎖移動剤を反応するモノマーの混合物に加えることによりコポリマーに導入されるか、或いはリビング重合法により生成される。連鎖移動剤は「クエンチング」原子を成長する鎖の端部にて活性ラジカルに提供することにより成長するポリマー鎖の同成長を停止することができる。同様に、未反応のモノマーを攻撃し、よって新たな鎖の成長を開始するラジカルとして残される。従って、連鎖移動剤は、本発明においては、適切な反応性官能基をコポリマーに提供するため、及び低分子量のポリマーを得るために使用され得る。連鎖移動剤の例としては、クロロホルム、四塩化炭素、アミノエタンチオール、アルキル−メルカプタン、オクタンチオール、デカンチオール、ｎ−ドデカンチオール又はｔ−ドデカンチオール、メルカプト−プロピオン酸、メルカプト−コハク酸、チオグリコール酸、そのメルカプトエタノール第２級アルコール、アルキルハライド、酸化数が５未満のリン酸塩、及び当業者に周知のその他の添加物／鎖制限剤を含む。本発明において使用され得るその他の連鎖移動剤の例としては、溶媒、不純物又は適切な改質剤を含む。
【００３７】
更なる実施形態において、終端部は水酸基、カルボキシル基、カルボニル基及びアミノ基からなる群より選択される少なくとも１つの官能基を含む。アミノ基は現在のところ好ましいものであり、第１級アミノ基及び第２級アミノ基を含む。アミノ基は例えば、コポリマーの末端に結合されるアルキルチオール基、例えば２−アミノエタンチオール又は２，２−ジアミノ−エタンチオール、に存在している。終端部にアミノ基が存在していることによりポリマー及び標的となる官能基の修飾が可能となり、同修飾は例えば、それらに限定されるものではないが、小さな標的分子（例えば、葉酸、その他のビタミン及びアセチルコリン等）、タンパク質（例えば、トランスフェリン及びモノクロナール／ポリクロナール抗体等）、ペプチド（例えばＴＡＴ）及び炭水化物（例えばガラクトース及び多糖）を含むリガンドとの結合によりなされ、所望の細胞、組織又は器官において特異的なレセプターにより認識され得る。加えて、アミノ基はまた、薬物又はタグ（例えば、関心のある生物学的な系においてナノ粒子を視認又は精製するための蛍光プローブ）又はラジオイムノ結合体、又は、例えばポリマーの疎水性を増大するために疎水性セグメントを付着するためにポリマーの特性を改質する化学部分と結合され得る。
【００３８】
終端部Ｙは、タンパク質のような、リガンド、タグ、ラジオイムノ結合体、薬物又はその他の化学部分に存在する官能基と反応する官能基となるように適合され得ることは当業者に理解されるであろう。例えば、１つ以上のカルボン酸官能基が選択されたリガンドに存在している場合、アミノ基を有する終端部が結合を容易にするために使用され得る。逆に、アミノ基を含む生物学的な分子はカルボン酸官能基を有する終端部に取り付けられ得る。
【００３９】
標的のセレプターの生物学的な認識に適した官能基を提供するために、コポリマーは同コポリマーに存在する官能基と結合することができる１つ以上のリガンドと結合され得る。使用され得るリガンドは、小さな標的分子、タンパク質、ペプチド及び炭水化物を含むがそれらに限定されるものではない。
【００４０】
一実施形態において、末端基は終端部及びリガンドから構成されている。リガンドを保持するコポリマーは生体内の所望の組織又は細胞の特異的な型若しくは部分を効率的に標的化するために使用され得る。コポリマーの標的化の効率は本発明のコポリマーのｐＨ感受性により高められる。
【００４１】
本発明のコポリマーと結合するために使用され得るリガンドは、小さな標的分子（例えば、葉酸、その他のビタミン及びアセチルコリン等）、タンパク質（例えば、トランスフェリン及びモノクロナール／ポリクロナール抗体等）、ペプチド（例えばＴＡＴ）及び炭水化物（例えばガラクトース及び多糖）を含むが、それらに限定されるものではない。１つのコポリマーに存在する生物学的に活性を有するリガンドの数は、１、２、３、４、５、又はそれ以上の数の範囲にある。
【００４２】
本発明における使用が意図されている成長因子（タンパク質及びペプチド）の例としては、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦｓ）、形質転換成長因子−ｂ（ＴＧＦｓ−ｂ）、形質転換成長因子−ａ（ＴＧＦ−ａ）、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、インターフェロン−ｇ（ＩＮＦ−ｇ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）を含む。使用が意図されているサイトカイン（タンパク質）は、リンフォカイン及びモノカインを含み、例としてはインターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）が含まれる。癌が治療されるべき疾病である場合、選択されたリガンドは、好ましくは癌細胞の特異的レセプターによって認識されるべきである。本発明のコポリマーとともに使用されることが意図されている特異的な型の癌細胞レセプターのリガンドは、葉酸、ターグレチン、アリトレチノイン、大腸菌毒、Ｃ３開裂フラグメント（Ｃ３ｄ、Ｃ３ｄｇ及びｉＣ３ｂ）、エプスタイン−バーウィルスｇｐ３５０／２２０及びＣＤ２３を含み、本発明のコポリマーと結合され得る。抗体もまた癌細胞リガンドとして使用可能であり、当業者に周知の、マウス、ウサギ、ニワトリ、ヤギ及びヒツジから得られるモノクロナール及びポリクロナール免疫グログリン、及びＦｕフラグメント、ｓｃＦｕフラグメント、Ｆａｂフラグメントのような組換え抗体、又は二重特異性抗体を含み得る。使用を意図されているサイトカインは、ＴＮＦファミリーのサイトカインを含み、腫瘍壊死因子−ａ（ＴＮＦ−ａ）、腫瘍壊死因子−ｂ（ＴＮＦ−ｂ）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）を含む。その他の適切なリガンドは、トランスフェリン、アセチルコリン、ビオチンラベル及び葉酸を含む。リガンド又は本発明のコポリマーの前修飾（例えば、リガンド上の相補的な官能基と反応する官能基を組み込むことによって）は、必要に応じて実施され得る。
【００４３】
別の実施形態において、末端基は、終端部、リガンド、タグ、薬物分子、ラジオイムノ結合体又は任意のその他の化学部分（例えば、コポリマーの物理化学的特性を改質するための部分）から構成される群より選択され得る。
【００４４】
リガンド、薬物、タグ、ラジオイムノ結合体又はその他の化学部分を組み込むコポリマーは、式（ＩＩＩ）に従う一般的な構造を含み得る：
【００４５】
【化３】
2008502785.tif 000005
終端部Ｙは、上式に示されるように、Ｑにより示されるリガンド、タグ、薬物、ラジオイムノ結合体又は化学部分に結合され得る。
【００４６】
リガンド、タグ、薬物、ラジオイムノ結合体又は化学部分は終端部に限定的に結合されてはいない。その他の実施形態において、リガンド、タグ、薬物、ラジオイムノ結合体又は化学部分は、温度感受性単位又は親水性単位に配置される官能基に連結又は結合され得る。代替的に末端基は、終端部Ｙに代えて親水性単位又は温度感受性単位の官能基のようなモノマー単位の任意の１つに結合され得る。そのような実施形態において、終端部は存在しているかもしれないし、していないかもしれない。本実施形態は、以下の式（ＩＶ）及び（Ｖ）にて示される：
【００４７】
【化４】
2008502785.tif 000006
本実施形態において、Ｐはリガンド、タグ、薬物、ラジオイムノ結合体又は化学部分であり得る。
【００４８】
別の実施形態において、薬物分子（例えば、ドキソルビシン）のような疎水性分子Ｐ’又はコポリマーの疎水性を改質するための部分は、Ｘに結合されている。その際、コポリマーは疎水性分子がコア内に配置されているコア・シェル構造体に配置され得る（式（ＶＩ））：
【００４９】
【化５】
2008502785.tif 000007
上記式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）及び（ＶＩ）に示される実施形態において、スペーサ−ｓ−はリガンド、タグ、ラジオイムノ結合体、薬物又は化学部分と終端部との間に選択的に配置され得る（式ＩＩＩｓ）：
【００５０】
【化６】
2008502785.tif 000008
或いは、選択的にＢとＰとの間に配置され得る（式ＩＶｓを参照）：
【００５１】
【化７】
2008502785.tif 000009
或いは、選択的にＡとＰとの間に配置され得る（式Ｖｓを参照）：
【００５２】
【化８】
2008502785.tif 000010
或いは、選択的にＰ’とカルボニル基との間に配置され得る（式ＶＩｓを参照）。
【００５３】
【化９】
2008502785.tif 000011
Ｐ、Ｐ’及びＱはそれぞれ、以下の式（ＶＩＩ）に例示されているように、単一のコポリマー内の、終端部（Ｙ）及び親水性モノマー単位Ｂの官能基の両方、又はＢ及びＸ、又はＸ及びＹ、又はＸ及びＡ、又はＹ及びＡ、又はＡ及びＢ、或いはＡ、Ｂ、Ｘ及びＹのうちの任意の３つとそれぞれ結合され得る。
【００５４】
【化１０】
2008502785.tif 000012
上式（ＶＩＩ）の各スペーサ−ｓ−は同じであるか、又は異なっている。
【００５５】
スペーサは、コポリマーのナノ粒子への自己アセンブリの後に、リガンド、タグ又はラジオイムノ結合体が、細胞、組織又は器官に自由にアクセスできるものである限り、任意の適切な長さ又は数の主鎖原子を有し得る。
【００５６】
好ましい実施形態において、１つのスペーサが使用され、そのスペーサは１０を超える主鎖原子を含む。そのようなスペーサの例は例えば、ポリ（エチレングリコール）及びポリ（プロピレングリコール）のようなポリオキシアルキレン化合物に由来し得る。リガンド、タグ又はラジオイムノ結合体は、スペーサ分子上の任意の位置に存在し得る。一実施形態において、リガンド、タグ又はラジオイムノ結合体は、スペーサ分子の末端主鎖原子に配置された官能基に結合される。その他の実施形態において、リガンド、タグ又はラジオイムノ結合体は、存在する場合はスペーサ分子の側鎖の任意の１つに配置された官能基に結合される。
【００５７】
本発明のコポリマーは、薬物送達、特に本来疎水性である薬物の送達のための材料として有利に使用され得る。コポリマーが本来両親媒性であり、かつコポリマーの水に対する溶解性が温度及び／又はｐＨの変化により操作可能であるので、疎水性の薬物は本発明のコポリマーを使用して、典型的にはコア−シェル・ナノ粒子として周知のコア−シェル構造体内に簡便に包まれる。本発明の組成物は、コポリマーのＬＣＳＴ未満にて水相にて調製される場合、コポリマー及び疎水性薬物はコア−シェル配列に自身にてアセンブリされ、それにより疎水性薬物はコアに配置され、同コアにて脂肪酸モノマー単位の疎水性セグメントと反応する。温度感受性モノマー単位及び親水性モノマー単位はシェル内に配置され、溶媒（水）分子又はその他の極性分子と反応し、それにより疎水性薬物を水相に溶解する。このようにして、疎水性薬物は水に溶けるようになり、血流に運ばれる。疎水性セグメント（即ち、脂肪酸単位）にカルボン酸基が存在しているので、親水性薬物、タンパク質又はペプチドはまた、ナノ粒子のコア内に封入され、封入された薬物、タンパク質及びペプチドを崩壊から保護し、細網内皮系（ＲＥＳ）の除去を回避することによって体循環において長時間にわたる活性を示す。薬物がコア−シェル・ナノ粒子に包み込まれる場合、組成物を形成し、同組成物は、静脈内に、経口にて、筋肉注射にて、局所的に、又は眼の経路により、若しくは吸入により、患者に容易に投与され得る。一般的に、ナノ粒子を形成するために使用されるコポリマーの分子量は制限されない。しかしながら、ポリマーが腎臓から排出されるためにはコポリマーの分子量を４００００未満に維持することが好ましい。ポリマーの濃度、薬物の装填量及びナノ粒子の製造条件を含む幾つかのパラメータが本発明のコポリマーを使用して形成されるナノ粒子のサイズに影響を与える。本明細書に開示されているコポリマーから合成されるナノ粒子のサイズは典型的には、血漿内での透過性及び保持性を高める効果（ＥＰＲ）のため及び長期にわたり循環するためには２００ｎｍ未満であり得る。
【００５８】
少なくとも３つのモノマー単位の各々は任意の適切な比率にて本発明のコポリマー中に存在し得る。一般的に、モノマー単位の比率は、所望のＬＣＳＴ及びｐＨ特性を達成するために変更され得る。同比率はまた、各モノマー単位に存在する官能基の型及び数並びにポリマーのｐＨ感受性及び温度感受性のようなその他の因子に依存する。コポリマーに存在するモノマー単位のモル比は、コポリマーを調製するために使用される各モノマー単位の供給モル比に主として依存する。
【００５９】
一実施形態において、本発明のコポリマーに存在する温度感受性モノマー単位のモル量は、最終的なコポリマーの温度感受性に対して親水性単位の希釈効果を避けるために親水性モノマー単位のモル量より大きく、一方、親水性モノマー単位のモル量はコポリマーの疎水性モノマー単位の量よりも大きい。ある実施形態において、本発明のコポリマーを調製するために使用される温度感受性モノマーの供給モル量は、親水性モノマーの供給モル量の約２乃至６倍であり、かつ疎水性モノマーの供給モル量の約４乃至８倍である。有用なコポリマーを形成するために使用される供給モル比の例は、温度感受性モノマーの１乃至４モル比であり、親水性モノマーの０．５乃至１．５モル比であり、疎水性モノマーの０．０１乃至０．７５モル比である。特に適した実施形態において、供給モル比のこの範囲に従って使用されたそれぞれのモノマーは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド及び１０−ウンデセン酸である。
【００６０】
１つの好ましい実施形態において、コア−シェル・ナノ粒子のＬＣＳＴは７未満のｐＨ、好ましくは７．２未満のｐＨにて３７℃未満である。別の実施形態において、コア−シェル・ナノ粒子の下限臨界溶液温度は通常の生理学的な条件（ｐＨ７．４）下にて３７℃よりも高い。コポリマーのＬＣＳＴはコポリマーを形成するために使用されるモノマー単位の割合又は親水性モノマー単位の性質を変更することにより、上げたり、下げたりと制御可能であることを明記したい。生理学的なｐＨにおけるコア−シェル・ナノ粒子のＬＣＳＴは通常の体温即ち３７℃よりも高く、かつＬＣＳＴは酸性環境においては通常の体温未満であるコポリマーを備えることが現在のところ好ましい。可逆性かつｐＨ依存性ＬＣＳＴ及び相転移特性は本発明のコポリマーを使用して形成されたナノ粒子により示された。例えば、モル比が３．７５：１．２５：０．５であるＮ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド及び１０−ウンデセン酸のコポリマーから水溶液中にコア−シェル・ナノ粒子を自己アセンブリする１つの特殊な実験設定において、この特定の組成物にて形成されたコア−シェル・ナノ粒子のＬＣＳＴはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中では３８．５℃であり、わずかに酸性の環境（例えば、ｐＨ６．６未満である場合）においては顕著に減少する（３５．５℃）。
【００６１】
本発明にて使用されることを意図された薬物は、抗癌剤、抗炎症剤、神経系疾患を治療するための薬物及び免疫抑制剤等を含むがそれらに限定されるものではない。例えば、ドキソルビシン、アナストロゾール、エキセメスタン、シクロホスファミド、エピルビシン、トレミフェン、レトロゾール、トラスツズマブ、メゲストロール、ノルバデックス、パクリタキセル、ドセタキセル、カペシタビン、酢酸ゴセレリン、シクロスポリン、シスプラチン、インドメタシン、ベタメタゾン及びドキシシクリン。
【００６２】
効率的な薬物送達のために、病巣の標的化及び細胞内へのアクセスを高めるための薬物担体が有利である。薬物担体のある条件下における標的化及びそれに続く内在化は、薬物担体を、天然のエンドサイトーシス経路を利用して正常に取り込まれたリガンドと結合することにより達成される。この戦略を使用して、本発明のコポリマーは、モノクロナール抗体、成長因子またサイトカインのような種々のリガンドとともに組み込まれ、担体の標的細胞内への取り込みを容易にするために使用され得る。小さな非抗原性のリガンドは、生物学的なバリア、例えば、標的細胞の細胞壁及び免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｃｉｔｙ）を介して拡散する困難性を回避するために本発明において使用されることを意図されている。
【００６３】
一実施形態において、葉酸はリガンドとして使用される。葉酸（ＭＷ＝４４１Ｄａ）は低分子量かつ非抗原性リガンドであり、腫瘍細胞の標的化シグナルとして良好である。葉酸はそのレセプターがヒト癌細胞の表面に頻繁に発現されるビタミンである。付随的に、それは細胞表面レセプターと非常に高い親和性を示し（Ｋｄ〜１０−１０Ｍ）かつ細胞質に移動可能である。葉酸は、リソソームにて終わるよりはむしろカベオラ媒介エンドサイトーシスを追従し、その含量は迅速に分解することが見出された。従って、本明細書に開示されたコポリマーを使用する薬物組成物におけるリガンドとして葉酸を使用することにより、薬物は所望の細胞内の位置に送達され、分解性酵素からも安全である。カベオラ経路を介して到達可能なエンドソームはまた酸性であることが知られている。この酸性であることにより、エンドソームはナノ粒子のＬＣＳＴを変更し（体温より高い温度から体温より低い温度まで）、エンドソーム膜を破壊する。従って、細胞質への細胞内薬物送達が達成され得る。
【００６４】
本発明に関係する組成物は、コポリマーの疎水性部分との疎水性相互作用によりナノ粒子の疎水性コア内に治療薬が装填されるコア−シェル・ナノ粒子に制限されるものではない。例えば、脂肪酸のカルボキシル基が薬物分子のアミノ基又は水酸基と反応することによるような、薬物分子がコポリマーの任意の部分に配置された適切な官能基と反応することにより、治療薬分子とコポリマーとの共有結合も可能である。薬物分子がコポリマーと結合されている組成物は、コア−シェル構造体又はミセル構造体の両方、或いは薬物送達を容易にするのに適したその他の安定な構造体が想定される。薬物と本発明のコポリマーとの結合体は代替体を提供するが、薬物を標的器官／細胞位置に送達する同様に効果的な手段である。
【００６５】
本発明の組成物中における治療薬としてドキソルビシンが使用される別の実施形態において、ドキソルビシンはカルボジイミド化学によりコポリマーと結合される。ドキソルビシンのアミン基は図２３及び２４に示されているように、本発明のコポリマーのカルボキシル基と結合される。
【００６６】
以下の例は、本発明をより完全に示すために提供されており、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるものではない。
【実施例１】
【００６７】
ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド−コ−１０−ウンデセン酸）［Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ−ｃｏ−ＵＡ）］の合成
Ａ）実験の部
ｉ）材料
特に明記されていない限り、全ての試薬及び溶媒は市販のグレードのものであり、入荷されたものとして使用した。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド及び１０−ウンデセン酸（９８％）はアルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）社から購入し、結晶化（ｎ−ヘキサン）及び減圧蒸留にてそれぞれ精製した。連鎖移動剤（ＣＴＡ）である２−アミノエタンチオール塩酸塩（ＡＥＴ．ＨＣｌ）はシグマ，アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ，Ａｌｄｒｉｃｈ）社から購入した。１Ｍのトリニトロベンゼンスルホネート（ＴＮＢＳ）水溶液は、フルカ（Ｆｌｕｋａ）社から購入した。塩酸ドキソルビシンは、インドに所在のサン・ファーマシューティカルズ社（Ｓｕｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）から厚意により譲り受けた。３−［４，５−ジメチルチアゾリル−２−］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ、ドゥシェファ（Ｄｕｃｈｅｆａ）社）は、細胞の定量化のために５ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）中にて使用した。溶液は青色のホルマザン結晶を除去するために０．２２μｍのフィルタにて濾過した。
ｉｉ）合成
種々の組成物を備えたＰ（ＮｉＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ−ｃｏ−ＵＡ）ポリマーは、レドックス対の過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）及び２−アミノエタンチオール塩酸塩（ＡＥＴ．ＨＣｌ）を用いてラジカル共重合により合成した（図１）。［ボカイス（Ｂｏｋｉａｓ）ら、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．、１９９、１９９８年、１３８７−１３９２頁］。重合化工程を以下に簡単に説明する。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（３．９６５ｇ，３４．９９ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（１．４８ｇ，１４．９９ｍｍｏｌ）を１０ｍＬの超純水に溶解した。ウンデセン酸（０．９２１ｇ，５．０ｍｍｏｌ）は５ｍＬの４％水酸化ナトリウム溶液と反応させることによりナトリウム塩とし、ナトリウム塩の透明な溶液を、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド及びＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドの溶液に加えた。混合物を精製した窒素ガスで１５分間浄化した。ＡＰＳ（０．２５４ｇ，モノマー供給量の４．０モル％）及びＡＥＴ．ＨＣｌ（０．２４４ｇ，２．１６ｍｍｏｌ，モノマー供給量の４．０モル％）を５．０ｍＬの超純水に溶解した。溶液を、連続して攪拌しながら、ゆっくりとモノマー溶液に加えた。反応は、窒素下にて２７℃で４８時間実施した。完了後、粗生成物を過剰の塩化ナトリウムを加えることにより沈殿させ、真空にて乾燥した。粗生成物をエタノールに溶解し、分子量カットオフが２０００（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ）である膜を使用して、超純水、次にエタノールにて透析した。精製品はエタノールを蒸発後に回収した。
【００６８】
ポリマーの化学構造は、１ＨＮＭＲ（ＢｒｕｋｅｒＡＶＡＮＣＥ４００）及びフーリエ変換赤外分光法（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ２０００，ＫＢｒ）により特徴付けた。ポリマーの分子量は、２５℃にて、ＴＨＦ（溶出速度：１ｍｌ／分）におけるゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ，ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）社、ポリスチレン標準品）にて決定した。示差走査熱量測定（ＤＳＣ）は、３℃／分のランプ速度を用いてＴＡ２９２０モジュレートＤＳＣ装置（ＣＴ，アメリカ合衆国）を用いて実施した。熱重量分析は、ＴＧＡ７（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）社，アメリカ合衆国）を使用して実施した。
ｉｉｉ）酸−塩基滴定及びアミン基決定
酸−塩基滴定はカルボン酸基及びポリマーのｐＫａを推定するために実施した。要約すると、１００ｍｇのポリマーを１０ｍＬの超純水に溶解し、フェノールフタレインを指示薬として０．０１ＮのＮａＯＨにて滴定した。ポリマーの見かけの分配係数ｐＫａも塩基の添加時に連続的にｐＨを測定しながらこの滴定法により決定した。ｐＨ対塩基容量のグラフから、ｐＫａは当量点における塩基の容量の半量におけるｐＨとして計算した。ポリマー中の遊離アミン基は分光学的決定により推定した。量が既知であるポリマーを、０．０１ＭのＴＮＢＳを含む２．０ｍＬの炭酸水素ナトリウム水溶液（２．０ｗ／ｖ％）に溶解した。溶液を４０℃にて２時間維持し、その後冷却して、特定の容量にて希釈した。サンプル中のＴＮＢＳで誘導体化されたアミン官能基の量は、標準品としてＬ−アラニンを採用して３４５ｎｍにおけるＵＶ−ＶＩＳ分光光度計（ＵＶ−２５０１ＰＣ、シマズ社）を使用して決定した。
ｉｖ）透過率の測定
異なるｐＨ値の緩衝溶液中のポリマーのＬＣＳＴは、温度を関数とした光学透過率の変化を監視することにより決定した。サンプル溶液（０．５ｗｔ％）は、中和したフタル酸緩衝液（ｐＨ５．０）、ＰＢＳ（ｐＨ６．０、６．６及び７．４）並びにｐＨが９．０及び１０．０であるアルカリ性ホウ酸塩緩衝液のような緩衝液中にて調製した。全ての緩衝液は、１５４ｍＭのイオン強度にて調製した。ポリマー溶液の光学透過率は、温度コントローラ（ＴＣＣ−２４０Ａ、シマズ社）を使用したサーモスタットで制御された、サンプルセルを備えたＵＶ−ＶＩＳ分光光度計を使用して５００ｎｍにて測定した。加熱速度は、０．１℃／分に設定した。ポリマー溶液のＬＣＳＴ値は５０％の光学透過率を示す温度に決定した。ＬＣＳＴにおけるタンパク質の効果は１０（ｗ／ｖ）％ウシ血清アルブミン（モデルタンパク質としてのＢＳＡ）の存在下においても調べた。
ｖ）蛍光測定
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）におけるポリマーのＣＭＣ値は、ピレンをプローブとして蛍光分光法にて決定した。ピレン溶液のアリコート（アセトン中に１．５４×１０−５Ｍ，４００μｌ）を１０ｍＬの容量フラスコに加え、アセトンを蒸発させた。１．０×１０−５乃至１．０ｇ／Ｌの範囲の濃度のポリマー溶液をＰＢＳにて調製した。次いで、１０ｍＬの水溶性ポリマー溶液をピレン残渣が含まれた容量フラスコに加えた。サンプル溶液の全てには６．１６×１０−７Ｍである同一の濃度にて過剰のピレン含量が含まれていたことを明記したい。溶液は平衡となるように２４時間室温（２０℃）にて放置した。次に、ポリマー溶液の蛍光スペクトルを室温にて、ＬＳ５０Ｂ発光分光計（パーキンエルマー社，アメリカ合衆国）にて記録した。放出スペクトルは３５０乃至５００ｎｍにて記録され、３４０ｎｍに励起波長が存在していた。励起及び放出帯域幅はいずれも５ｎｍに設定した。第３のバンド（３９１ｎｍ，ｌ３）の第１のバンド（３７１ｎｍ，ｌ１）に対する強度（ピーク高さ）比（ｌ３／ｌ１）は、ピレン放出スペクトルからポリマー濃度の関数として分析した。ＣＭＣ値は、曲線の屈曲部における接線と、低濃度における地点を通る水平方向の接線との交点から求めた。
ｖｉ）ブランクの、及び薬物が装填されたコア−シェル・ナノ粒子の調製
ブランクのコア−シェル・ナノ粒子は、同ナノ粒子のサイズに対するｐＨ及び温度の影響を調べるために調製した。ポリマーを０．５（ｗ／ｖ）％の濃度にてジメチルアセタミド（ＤＭＡｃ）に溶解し、次に室温にて２０００の分子量カットオフ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ）膜を用いて２４時間、０．０２ｗｔ％ＨＣｌと０．０２ｗｔ％ＮａＯＨにてそれぞれ透析した。得られたナノ粒子溶液は、０．４５μｍのシリンジフィルタを用いてろ過した後に凍結乾燥し、更なる分析を行う前に４．０℃にて保存した。エフ．コホリら（前述）により報告されたものと同様のプロトコルを使用して、コア−シェル・ナノ粒子にＤＯＸを装填した。簡単に述べると、７．５ｍｇのＤＯＸを３ｍＬのＤＭＡｃ中の２モルの過剰量のトリエチルアミンで中和し、薬物を溶解するために溶液を攪拌した。次に、１５ｍｇのポリマーを溶液に加えた。混合物を５０ｍＬの脱イオン水に対して４８時間透析した。ＤＯＸ装填ナノ粒子をろ過し、凍結乾燥した。ＤＯＸの装填量を決定するために、容量が既知のＤＯＸ装填ナノ粒子を１ｍＬのメタノールに溶解して、次いでＰＢＳを用いて希釈した。ＤＯＸ濃度はＵＶ−ＶＩＳ分光光度計を使用して、４８５ｎｍにて推定された。薬物の装填は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のＤＯＸから得られた標準曲線に基づいて計算した。
ｖｉｉ）動的光散乱（ＤＬＳ）分析
異なるｐＨにて製造されたコア−シェル・ナノ粒子のサイズはＨｅ−Ｎｅレーザビーム（６７０ｎｍ）が装備されたＺｅｔａＰａｌｓ（ブルックヘブンインスツルメンツ社（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｓ），アメリカ合衆国カリフォルニア州）を使用して分析した。各測定を５回繰り返して、良好な一致を見出した。５回の測定から平均値を得た。ナノ粒子のサイズはまた、同ナノ粒子の相可逆性を調べるために種々の温度にて測定した。再分散され、かつ凍結乾燥されたナノ粒子の安定性は、１０（ｗ／ｖ）％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）におけるそれらのサイズを測定することにより監視した。
ｖｉｉｉ）透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）試験
コア−シェル・ナノ粒子の形態はＴＥＭにより分析した。０．０１（ｗ／ｖ）％のリンタングステン酸を含む新たに調製されたナノ粒子溶液の一滴をポリマーフィルムでコーティングされた銅グリッドにおいて、室温にて風乾した。ＴＥＭ観察は、２００ｋｅＶの電子運動エネルギーを備えたＪＥＭ−２０１０顕微鏡にて実施した。
ｉｘ）細胞毒性試験
ポリマー溶液を原料濃度にて調製した。これらの溶液は、０．２２μｍのシリンジフィルタを用いて滅菌し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）及び培養基を用いて希釈し、１０、１００、３００及び４００μｇ／ｍＬの最終濃度のポリマーを得た。３３．３μｇ／ｍＬの濃度であるポリ（Ｌ−リジン）及びＰＥＧ（Ｍｗ８０００）を陽性及び陰性の対照としてそれぞれ使用した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）はブランクサンプルとして代わりに使用した。
【００６９】
Ｌ９２９マウス繊維芽細胞を、補給されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ，１０％仔牛血清，１％Ｌ−グルタメート，１％ペニシリン−ストレプトマイシン）（ギブコビーアールエル（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）社）にて培養し、３７℃、５％ＣＯ２下にてインキュベートした。細胞を９６−ウェルプレートにウェル当たり１０，０００個の細胞を播種した。次にプレートをインキュベータに戻し、細胞をコンフルエンスの状態まで成長させた。試験開始の朝に、ウェル内の培地は１５０μｌの予め調製された培養基−サンプル混合物と置き換えた。プレートを再びインキュベータに戻して、３７℃、５％ＣＯ２下にて、２４、４８及び７２時間維持した。露出期間の間、各ウェルの混合物は毎朝新たなアリコートに置き換えた。各サンプルはプレート当たり８回繰り返して試験した。３つのプレートが各露出期間において使用され、サンプル当たり合わせて２４回繰り返した。
【００７０】
新たな培養基及び２０μＬのＭＴＴ溶液のアリコートを所定の露出期間の後に各ウェルにおいて混合物と置換するために使用した。次にプレートをインキュベータに戻して、３７℃、５％ＣＯ２下にて更に３時間維持した。次に、各ウェルにおける培養基及び過剰のＭＴＴを除去した。次に１５０μｌのＤＭＳＯを各ウェルに加えて内在化した紫色のホルマザン結晶を溶解した。１００μＬのアリコートを各ウェルから取り出して、新たな９６ウェルのプレートに移した。次に、プレートを５５０ｎｍ及び６９０ｎｍにて定量した。ホルマザン結晶の吸収測定値は、５５０ｎｍの値から６９０ｎｍの値を引くことにより得られた。結果は、培養基に加えられたブランクであって比較量のＰＢＳを含むブランクの吸光度の百分率で表した。
ｘ）インビトロ薬物放出試験
ナノ粒子からのＤＯＸの放出は、ｐＨ６．０、６．６及び７．４にて試験した。所定量のＤＯＸ装填凍結乾燥ナノ粒子を２００μＬの対応する緩衝液に分散し、２０００の分子量カットオフ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ）に配置する前に３０分間安定化させた。次に透析バッグをｐＨが６．０、６．６又は７．４である２５ｍＬのＰＢＳに３７℃にて浸漬した。サンプルを特定の時間間隔にて採取し、本実施例のパラグラフＡ（ｖｉ）に記載されているように、ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計を用いて薬物濃度を分析した。
Ｂ）結果及び考察
ｉ）ポリマー合成及び特徴化
コポリマーの合成及び特徴化における概要を表１に示した。これらの反応において、ＮＩＰＡＡｍのＤＭＡＡｍに対する供給モル比は変更したが１０−ウンデセン酸の含量は一定とした。ＣＴＡをモノマー供給量の０．２及び０．４モル％にて使用した。重合化はチオールラジカルにより開始され、以下の式に従って、ＡＥＴ．ＨＣｌと過硫酸イオンとの反応から形成された：
【００７１】
【化１１】
2008502785.tif 000013
ここで、Ｒはアミノエチル基を示す。更に、チオール基は有効な連鎖移動剤として周知である（グリーク（Ｇｒｅｅｇ）他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、７０、１９４８年、３７４０−３７４３頁）。従ってこの場合、形成された鎖の長さはＡＥＴ．ＨＣｌのモノマー供給量に対するモル比と、重合化を開始し、かつ連鎖移動反応を行う効率と、により制御される。酸化還元系におけるチオールラジカルのこの開始機構は十分に確立されている（クーン（Ｋｈｕｎｅ）ら、Ｐｏｌｙｍ．Ｐｒｐｒ．、２２、１９８１年、７６−７７頁）。加えて、この開始剤対を用いて調製された我々のポリマーに対して、各ポリマー分子におけるアミン基の平均数は１．３乃至１．７であると推定された。ポリマーの平均分子量が計算により得られているという事実によって結果は僅かに大きく見積られていた。反応媒体のｐＨにおける更なる減少が観察され、それは酸性であるＨＳＯ４−の生成を示している。ＧＰＣにより決定された分子量は、ＣＴＡ含量の増大が分子量の減少を生じたことを示しており、それはジー．ボカイスら（前述）により報告された結果と一致していた。
【００７２】
３つのポリマーの全ての１ＨＮＭＲスペクトルは、類似したパターンを共有していた。ＣＤＣｌ３中のポリマーＩＩＩ（ＮＩＰＡＡｍ：ＤＭＡＡｍ：ＵＡ＝３．５０：１．５０：０．５０）の典型的な１ＨＮＭＲスペクトルを図２に示す。連鎖移動剤の存在下におけるＮＩＰＡＡｍと、ＤＭＡＡｍと、１０−ウンデセン酸との共重合が成功したことは、ビニル基のプロトンシグナルがδ５．４−６．６において存在していないことにより証明された。δ１．５−１．８（シグナルａ＋ａ’）及びδ２．１−２．４（シグナルｂ＋ｂ’）におけるブロードピークは、ＮＩＰＡＡｍ部分及びＤＭＡＡｍ部分における−ＣＨ２−及び−ＣＨ−基のプロトンにそれぞれ帰属している。イソプロピル基（δ４．０における−ＣＨＭｅ２及びδ１．１５における−ＣＨＭｅ２−、それぞれシグナルｄ及びｅ）及びδ２．９における−ＮＭｅ２基（シグナルｆ）からのその他のプロトンシグナルがまた観察され、それらの化学シフトはモノマーのそれに類似している。シグナルｅのシグナルｆに対する積分比から、ｍ／ｎ比が推定され、その値は二つのモノマーの供給比とほぼ等しいものであった。これは、二つのモノマーが重合化反応において類似した活性を有していたことを意味する。ポリマーＩＩＩのＦＴ−ＩＲスペクトルを図３に示す。ＮＩＰＰＡｍセグメント及びＤＭＡＡｍセグメントから約１６４７ｃｍ−１（νＣ＝Ｏ）及び１５４８ｃｍ−１（νＣ−Ｎ）に強い吸収を示した。１０−ウンデセン酸セグメントにおけるνＣ＝Ｏの吸収は約１７１３ｃｍ−１に現れた。ＵＡの含量は酸−塩基滴定の分析により４４．２ｍｇ／ｇのポリマーＩＩとして推定された（表１）。ポリマーＩＩのｐＫａは約６．８であった。ポリマーは、水にも共通した有機溶媒（ＣＨＣｌ３、ＣＨ２Ｃｌ２、アセトン及びＴＨＦ等）にも良好な可溶性を示した。
ｉｉ）ポリマーのＬＣＳＴ及びｐＨ及びタンパク質の影響
ＰＮＩＰＡＡｍは水中で３２℃の明確なＬＣＳＴを示した。ＬＣＳＴは導入する疎水性又は親水性モノマーを介して調整され得る。この研究において合成されたポリマーは疎水性セグメントとしてポリ（１０−ウンデセン酸）を含んでいる。従って、環境ｐＨはカルボン酸基によって１０−ウンデセン酸セグメントの疎水性に影響を与え、最終的にはポリマーのＬＣＳＴに影響を与える。図４乃至６は、異なるｐＨ値を有する緩衝溶液中の０．５ｗｔ％濃度のポリマーの温度の関数とした場合の光学透過率の変化を示す。ＤＬＳ分析から、緩衝液中のポリマーは０．５ｗｔ％の濃度にてコア−シェル・ナノ粒子内に自己アセンブリした。ＮＩＰＡＡｍ／ＤＭＡＡｍ／ＵＡ比が４．００：１．００：０．５であるポリマーＩから自己アセンブリされたコア−シェル・ナノ粒子のＬＣＳＴは、ｐＨ６．０、６．６及び７．４において、それぞれ３２．５℃、３３．０℃及び３３．２℃であった（図４）。しかしながら、ｐＨ５．０においてＬＳＣＴは２７．８℃まで急激に減少した、親水性のＤＭＡＡｍセグメントの長さが増大しているポリマーＩＩ（ＮＩＰＡＡｍ：ＤＭＡＡｍ：ＵＡ比＝３．７５：１．２５：０．５）の場合、全てのｐＨ値におけるコア−シェル・ナノ粒子のＬＣＳＴは、ポリマーＩと比較して増大した（図５）。ｐＨ値はポリマーＩＩナノ粒子のＬＣＳＴに大きな影響を与えた。例えば、ｐＨ９．０及び７．４において、ＬＣＳＴはそれぞれ４０．５℃及び３８．５℃であり、通常の体温以上であることがわかった。しかしながら、ｐＨ６．６及び５．０において、ＬＣＳＴは３５．５℃及び３５．２℃までそれぞれ減少し、それは通常の体温よりはるかに小さい値であった。仮にナノ粒子が十分に分離されたコア−シェル構造体であるか、或いはコアが十分に剛性である場合、ナノ粒子のＬＣＳＴは、ｐＨ感受性部分が疎水性セグメントにあるので環境のｐＨにより影響を受けないであろう。これらのポリマーから形成されたコア−シェル・ナノ粒子は、ゆるく集合されているのであろう。従って、ナノ粒子のコアは外部環境に十分にアクセスできるであろう。外部環境のｐＨが増大すると、１０−ウンデセン酸セグメントのカルボン酸基が更に脱プロトン化されるので、１０−ウンデセン酸セグメントの疎水性が低減する。これはポリマーのＬＣＳＴにおける増大を生じ、よってナノ粒子のＬＣＳＴが増大する。ポリマーＩ及びポリマーＩＩは類似した含量のカルボン酸基を有しているにも関わらず、ポリマーＩＩのｐＨ感受性におけるカルボン酸基の脱プロトンの影響はポリマーＩに対するものよりもより重要であった。それは、ポリマーＩがより大きな分子量を有することによるのかもしれない。ＬＣＳＴを超える熱力学的な相分離は混合の低エントロピーに起因するので、混合のエントロピーは分子量の増大とともに減少する（スタイル（Ｓｔｉｌｅ）ら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、３、２００２年、５９１−６００頁、レッサード（Ｌｅｓｓａｒｄ）ら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．、７９、２００１年、１８７０−１８７４頁）。これは分子量がポリマーのｐＨ感受性に影響を与える重要な因子であることを示している。
【００７３】
親水性セグメントの長さが更に増大すると、図６に示されるようにＬＣＳＴも大きくなる。ポリマーの中では、ＮＩＰＡＡｍ／ＤＭＡＡｍ／ＵＡ比が３．５：１．７５：０．５であるポリマーＩＩＩが全てのｐＨ条件下において、最も高いＬＣＳＴのコア−シェル・ナノ粒子を提供し、その温度は通常の体温よりも大きい値であった。例えば、ｐＨが１１．０、７．４、６．６、６．０及び５．５であるポリマーＩＩＩナノ粒子のＬＣＳＴは、それぞれ、４３．０、４３．０、４１．０、４０．７及び３９．０℃であった。ポリマーＩＩＩナノ粒子のＬＣＳＴはまた、ｐＨに依存した。しかしながら、温度感受性は低かった。これは、ＤＭＡＡｍの希釈効果によるものと考えられる、即ち、コポリマー内のＰＮＩＰＡＡｍセグメントは高いモル比にて、ＤＭＡＡｍセグメントにより十分に分離かつ希釈されており、それがＮＩＰＡＡｍの近隣のアミド基間の分子内水素結合を低減することによるものであると考えられる。その結果、コポリマーの温度反応性はゆっくりとしている（リウ（Ｌｉｕ）ら、Ｊ．Ａｐｐ．Ｐｏｌｙ．Ｓｃｉ．、９０、２００３年、３５６３−３５６８頁、カツモト（Ｋａｔｓｕｍｏｔｏ）ら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ａ．、１０６、２００２年、３４２９−３４３５頁）。
【００７４】
ＬＣＳＴにおけるタンパク質の影響は、ポリマーＩＩを用いて調べた。図７に示されるように、１０ｗｔ％ＢＳＡの存在は、コア−シェル・ナノ粒子のＬＣＳＴを変えなかった。
【００７５】
これらの結果は、ｐＨ環境の変化にてポリマーが通常の体温より上又は下の異なるＬＣＳＴ値を示すことを示している。３つのポリマーの全てから自己アセンブリされたコア−シェル・ナノ粒子は、実際にはｐＨ依存性のＬＣＳＴを示し、それはポリマーの疎水性セグメントにおけるカルボン酸基のプロトン化又は脱プロトン化に主として起因しているのであろう。ナノ粒子のＬＣＳＴはＮＩＰＡＡｍのＤＭＡＡｍに対するモル比によって非常に影響を受けていた。特に、ポリマーＩＩナノ粒子のＬＣＳＴは、生理学的な環境（ｐＨ７．４）においては通常の体温よりも高かったが、僅かに酸性の環境では通常の体温よりも低くなった。このことは、ナノ粒子は生理学的な環境においては可溶性であり安定であるが、酸性の環境では安定性を欠いている／凝集されていることを意味する。この独特の特性は環境が特徴的に酸性となる腫瘍組織又は細胞内部への薬物の標的化に使用され得る。
ｉｉｉ）ポリマーＩＩのＣＭＣ
ＣＭＣはコア−シェル・ナノ粒子の安定性を特徴付ける重要なパラメータである。ＣＭＣより上では、両親媒性のポリマー分子はコア−シェル構造化ナノ粒子に自己アセンブリされ得る。ポリマーＩＩナノ粒子の水中における疎水性微細環境をプローブとしてピレンを使用した蛍光光度法により調べた。Ｉ３のＩ１に対する比率は、ポリマー濃度の関数として監視された。図８はポリマーＩＩに対するＩ３／Ｉ１のプロットを示す。ピレンがより疎水性の環境に配置されている場合に高い比率が得られる（ドン（Ｄｏｎｇ）ら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．、６２、１９８４年、２５６０−２５６５頁）。ピレンのこの特徴は、コア−シェル・ナノ粒子の形成及び変形を研究するために使用され得る。ＣＭＣ値は約１０．０ｍｇ／Ｌであると決定された。コア−シェル・ナノ粒子の形成後のＩ３／Ｉ１における変化は、小さいことを明記する。これは、ＵＡセグメントのカルボキシル基の存在及び／又は不十分な疎水性によりコアがゆるく集合されていることによるものであろう。
ｉｖ）ｐＨ及び温度変化により誘引されたポリマーＩＩナノ粒子のサイズの変化
ポリマーＩＩナノ粒子のサイズは、ｐＨ依存性であることがわかった。０．０２ｗｔ％のＨＣｌ溶液において、ポリマーＩＩナノ粒子の平均粒子径は約３１９ｎｍであり、０．０２ｗｔ％のＮａＯＨ溶液においては、ナノ粒子のサイズは約２４０ｎｍまで減少した。酸性溶液において形成されたかなり大きなサイズのナノ粒子は、低ｐＨにてＵＡの疎水性が大きくなることにより、酸性溶液中のナノ粒子はより多くの凝集体を含んでいたことを示している。一方、高ｐＨにおける脱プロトン化カルボン酸の反発は凝集体の程度を小さくし、より小さなサイズの粒子となる。ＤＯＸが装填されたナノ粒子の平均サイズは、約１６０−２００ｎｍであり、図９に示されるように狭い粒度分布を有している。ＴＥＭの写真（図１０）から、ナノ粒子のサイズは、固体状態では約５０−６０ｎｍであり、それはポリマーのフリーの親水性セグメントの崩壊及びポリマー鎖の脱水によるものであろう。一方、ナノ粒子は、３７℃（ＬＣＳＴ未満）でｐＨ７．４の場合に安定であり、かつサイズは約２６５ｎｍであった。溶液を４０℃（ＬＣＳＴを超える）まで加熱すると、凝集によりサイズは約９８８ｎｍまで増大した。この凝集体は冷却することにより再分散し、もとの値までサイズが低減した。同様の現象は、ｐＨ６．６におけるナノ粒子においても観察された。これらの結果は、コア−シェル・ナノ粒子がｐＨ及び温度の両方に感受性を有していたという事実を更に支持するものである。ｐＨ及び温度の反応は可逆的であった。
【００７６】
薬物装填コア−シェル・ナノ粒子の安定性は、１０（ｗ／ｖ）％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）において調べた。ＢＳＡを用いて７時間試験した後に、サイズは僅かに増大した（１０４ｎｍから１６４ｎｍへ）。この初期のサイズの増大は凍結乾燥ナノ粒子の水和によるものであると考えられる。水和の後、サイズはもとの値に戻り、次の３時間は変化しないままであった。これは、ナノ粒子はＢＳＡの存在下において安定であったことを示す。
ｖ）ポリマーＩＩの細胞毒性試験
Ｌ９２９細胞は１０乃至４００ｍｇ／Ｌ（ｐｐｍ）の濃度にてポリマーにさらされた。図１１から、陰性対照と比較した場合、ポリマーＩＩサンプルにはいかなる重要な細胞毒性も認められなかった。７２時間までは、ポリマーＩＩのサンプルの全ては陽性対照よりも細胞毒性が小さかった。
ｖｉ）インビトロ放出
この試験にて使用された製造条件下において、ＤＯＸの実際の装填量は約２．７重量％であった。インビトロ薬物放出試験は腫瘍のｐＨを刺激する僅かに酸性の環境（ｐＨ６．０及び６．６）と、生理学的な環境（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）にて実施した。ＤＯＸの放出プロファイルを図１２に示した。３７℃でｐＨ７．４におけるナノ粒子からの薬物放出は、最初の約１８％の破裂を伴い、かなりゆっくりであった。この最初の破裂は、ナノ粒子のシェルに存在している薬物分子によるものであろう。しかしながら、薬物の放出は、３７℃で、ｐＨ６．０及び６．６でははるかに早かった。約７０％の薬物が、実験の４８時間以内にて放出した。加えて、薬物装填ナノ粒子はｐＨ７．４の緩衝液中では良好に分散されたが、ｐＨ６．０及び６．６では透析バッグの底部に凝集し、沈んでいた。これらの結果は、ナノ粒子は実際にはｐＨ感受性であり、７．４のｐＨから６．６又は６．０のｐＨへの僅かな変化が薬物装填コア−シェル・ナノ粒子の変形及び沈殿を生じ、それにより封入された薬物成分が放出されたことを示している。加えて、ＤＯＸの透析バッグからの放出をｐＨ７．４及び６．０において調べた。ｐＨによる顕著な効果は観察されなかった。そのことは、ＤＯＸのナノ粒子からのｐＨ依存性の溶出は、薬物の溶解度よりも、むしろ主としてナノ粒子のｐＨ応答性によるものであることが更に確認できた。
Ｃ）結論
種々の組成物を備えた両親媒性の三元共重合体である、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド−コ−１０−ウンデセン酸）はフリーのアミン末端基を用いたフリーラジカル溶液の重合化により合成した。ＮＩＰＡＡｍ／ＤＭＡＡｍ／ＵＡ比が３．７５：１．２５：０．５であるポリマーから自己アセンブリされたコア−シェル・ナノ粒子は、ｐＨ７．４において通常の体温よりも十分に高いＬＣＳＴであり、僅かに酸性の環境においては通常の体温よりもはるかに低いＬＣＳＴであった。ポリマーは７２時間までの期間においては顕著な細胞毒性は示さなかった。ＤＯＸ装填ナノ粒子は、３７℃かつｐＨ７．４にて安定であり、サイズは約１６０−２００ｎｍであった。しかしながら、ｐＨ６．０及び６．６において、ナノ粒子の構造は変形され、それにより封入されていた薬物分子は放出する。これらの特徴は、ナノ粒子の選択的な蓄積と、酸性の腫瘍組織における薬物な選択的な放出とを助けるであろう。合成されたポリマーの更なる１つの利点はポリマーがフリーのアミン官能基を備えていることであり、それにより活性的な標的化に対して生物学的なシグナルを取り付けることによりポリマーの更なる修飾を可能にするであろう。
【実施例２】
【００７７】
葉酸塩標的基を有するポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド−コ−１０−ウンデセン酸）［Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ−ｃｏ−ＵＡ）］の合成
Ａ）実験の部
ｉ）材料
ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド−コ−１０−ウンデセン酸）［Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ−ｃｏ−ＵＡ），ポリマーＩＩ］は実施例１に説明したようにフリーラジカル重合化により合成した。葉酸二水和物、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）はシグマアルドリッチ社から購入した。パクリタキセルはメルク（Ｍｅｒｃｋ）社から購入した。
ｉｉ）葉酸のＰ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ−ｃｏ−ＵＡ）への結合及び葉酸のコレステロールでグラフト化されたＰ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ−ｃｏ−ＵＡ）への結合
葉酸のＮＨＳエステル（ＮＨＳ−葉酸塩）は以下の方法にて調製した：葉酸（１００ｍＬのＤＭＳＯ及び２．５ｍＬのトリエチルアミンに５ｍｇを溶解したもの）は、ＤＣＣ（４．７ｇ）の存在下にて室温にて一晩、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（２．６ｇ）と反応させた。副産物であるジシクロヘキシルウレアをろ過にて除去した（図１３，スキーム２に示されるように）。葉酸とポリマーＩＩを結合する（Ｐｏｌｙ−ＦＡ）ために、ＤＭＳＯ中の活性化ＮＨＳ−葉酸塩をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中のポリマーＩＩに加え、室温にて５時間一定に攪拌した（図１４，スキーム３）。葉酸−結合ポリマーはＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）の存在下にて２４時間透析することにより精製され、次に２０００の分子量カットオフ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ）を用いて２４時間超純水にて精製した。ポリマーを凍結乾燥して、更なる使用のために気密容器に保存した。葉酸はまた、コレステロールでグラフト化されたポリマーＩＩと結合した（Ｐｏｌｙ−ＣＨ−ＦＡ）。コレステロールでグラフト化されたポリマーＩＩ（Ｐｏｌｙ−ＣＨ）は、ＮＨＳで活性化されたポリマーＩＩ（工程は、ポリマーＩＩとＮＨＳとＤＣＣがそれぞれ１：２：２のモル比のものを使用することによる葉酸の活性化に類似する）を含水アルコール溶液中の等モル濃度のコレステロールと室温にて４８時間反応させることにより合成した（図１５、スキーム４）。
【００７８】
ポリマーの化学構造は、１ＨＮＭＲ（ＢｒｕｋｅｒＡＶＡＮＣＥ４００）及びフーリエ変換赤外分光法（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ２０００，ＫＢｒ）により特徴付けた。示差走査熱量測定試験（ＤＳＣ）は、３℃／分のランプ速度を用いてＴＡ２９２０モジュレートＤＳＣ装置（ＣＴ，アメリカ合衆国）を用いて実施した。
ｉｉｉ）薬物装填ポリマー−ＣＨ−ＦＡコア−シェル・ナノ粒子の調製
ドキソルビシンは以下のようにコア−シェル・ナノ粒子に装填した：７．５ｍｇ又は５．０ｍｇのＤＯＸを３ｍＬのＤＭＡｃ又はＤＭＦに攪拌しながら溶解した。次に、１５ｍｇのポリマーを溶液中に溶解した。混合物を５００ｍＬの脱イオン水にて４８時間透析した。ＤＯＸの装填量を決定するために、量が既知のＤＯＸ装填ナノ粒子を１ｍＬのメタノールに溶解して、ＰＢＳにて希釈した。ＤＯＸの濃度はＵＶ−ＶＩＳを用いて推定した。初期の試験はまた、水に不溶性の抗癌剤であるパクリタキセルをコア−シェル・ナノ粒子に装填することによっても実施した。簡単に述べると、１５ｍｇのポリマー及び２．５ｍｇのパクリタキセルを３ｍＬのＤＭＦに溶解し、ポリマー薬物溶液を超純水の存在下にて２４時間透析した。薬物装填ナノ粒子は０．４５μｍの孔サイズを有するディスクフィルタにてろ過し、凍結乾燥した。パクリタキセルの装填量を決定するために、１ｍＬのクロロホルム中にナノ粒子に溶解することにより、ポリマー性ナノ粒子からパクリタキセルを抽出し、ポリマーを２ｍＬのジエチルエーテルを加えることにより沈殿させた。遠心分離後、上澄み液を回収し、乾燥し、ＨＰＬＣで分析した（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）社，モデル２６９０、Ｃ８  １５×４．６ｃｍカラム）。移動相は、２０ｍＭの酢酸アンモニウムとアセトニトリルとメタノールとが３５：４５：２０の容積比で構成されている。標準パクリタキセル溶液は５乃至１００ｐｐｍの範囲の濃度にてメタノール中に調製した。
Ｂ）結果及び考察
葉酸はポリマーＩＩとコレステロールでグラフト化したポリマーＩＩとの結合に成功した。これはＮＭＲ試験により確認した（図１６及び１７）。葉酸の結合が成功したことは、葉酸分子の芳香性プロトン２，６及び３，５からのδ６．６−６．８及びδ７．５−７．７におけるプロトンシグナルの存在によって証明された（図１４、スキーム３）。ポリマーＩＩへのコレステロールの結合はまた、コレステロールの５つのＣＨ３基からのプロトンシグナル（δ０．６−１．１）から証明された。
【００７９】
実施例１から、ポリマーＩＩのＬＣＳＴはｐＨ７．４において３８．５℃であり、それはｐＨ６．６では３５．５℃に減少した。これは、ｐＨの変化に伴うポリマーのプロトン化及び脱プロトン化、それによりポリマーの疎水性が変化することによるものである。Ｐｏｌｙ−ＦＡとポリマーＩＩでは、ｐＨ７．４におけるＬＣＳＴに顕著な差は認められなかった。しかしながら、ｐＨ６．６ではＬＣＳＴは増大し、温度感受性は低下した（図１８）。これは、葉酸がこのｐＨにおいてポリマーの親水性を増大させたという事実によるものであろう。しかしながら、ｐＨ５．０におけるポリマーの溶解性は低く、溶液は濁っていた。ポリマーのＬＣＳＴは３６℃まで減少し、温度感受性は高くなった（データは示されていない）。これは葉酸がｐＨ５．４付近にｐＫａを有し、かつそのカルボキシル基がｐＨ５．０でプロトン化し、ポリマーの疎水性を増大させることによると考えられる。この特性は、ｐＨ５．０（エンドソーム内）において、通常の体温より低いＬＣＳＴにより薬物の細胞内送達を助け、それはｐＨ５．０がエンドソーム膜の破壊を助けるからであろう。コレステロールがポリマーＩＩに結合された場合、ポリマーのＬＣＳＴは図１９に示されるようにｐＨ７．４にて３５．７℃であり、その値はポリマーＩＩよりも低い。これは、コレステロールをグラフト化することによりポリマーの疎水性が増大し、ＬＣＳＴが減少することによるものである。一方、Ｐｏｌｙ−ＣＨ−ＦＡのＬＣＳＴはｐＨ７．４及びｐＨ６．６でそれぞれ３９．０℃及び３４．５℃であった（図２０）。これは、コレステロールの導入に起因するポリマーの疎水性の増大が葉酸分子により等しく相殺されるという事実によるものであろう。
【００８０】
ＡＴＣＣＬ９２９細胞を１０乃至１００ｍｇ／Ｌ（ｐｐｍ）の濃度にてポリマーにさらした。図２１から、陰性対照［ポリ（エチレングリコール）］と比較した場合、Ｐｏｌｙ−ＣＨ−ＦＡサンプルは顕著な細胞毒性を認めなかった。しかしながら、Ｐｏｌｙ−ＣＨ−ＦＡの全てのサンプルは、陽性対照［ポリ（Ｌ−リジン）］よりも細胞毒性が低かった。
【００８１】
典型的な透析法は、空の、及び薬物装填されたＰｏｌｙ−ＣＨ−ＦＡコア−シェル・ナノ粒子を調製するために使用した。塩酸ドキソルビシン及びパクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）を水溶性及び水不溶性薬物として選択した。ドキソルビシンの薬物装填における溶媒の影響を調べた。ＤＭＡｃの使用により、封入効率は１２．９％であり、４．３１重量％の薬物が装填されていた。粒子の平均径は約２６５ｎｍであった。しかしながら、ＤＭＦを溶媒として使用した透析法の場合、薬物装填は２．４％の封入効率を伴い０．６％まで減少し、１００乃至１６０ｎｍの平均粒子径であった。後者の処方において薬物装填量が減少したことは、ＤＭＦの溶解度（１２．１ｃａｌ／ｃｍ３）がＤＭＡｃの溶解度（１０．８ｃａｌ／ｃｍ３）と比較して高いという事実に起因するものであり、それは封入化される前に薬物の初期の散失を促進するものである。粒子径の減少は薬物装填の減少に起因する。
【００８２】
パクリタキセルはコア−シェル・ナノ粒子に装填され、平均粒子径は９６ｎｍであり、封入効率は１３．０％であり、かつ薬物装填率は１．９％であった。パクリタキセルは融点が２２０℃である結晶状薬物である（図２２）。パクリタキセルの融点はナノ粒子に封入後は消失し、薬物が分子的に分配されたことを示している。
Ｃ）結論
腫瘍細胞への活性標的化シグナル（葉酸）を備えたコア−シェル・ナノ粒子を合成した。ナノ粒子はｐＨ感受特性を保持し、細胞毒性は低かった。二つの抗癌剤をコア−シェル・ナノ粒子に装填した。薬物の粒子径及び装填量は製造条件を変更することにより操作可能であった。
【実施例３】
【００８３】
ドキソルビシン結合ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド−コ−１０−ウンデセン酸）［Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ−ｃｏ−ＵＡ）］の合成
ｉ）ドキソルビシンのコポリマーへの結合
ポリマーＩＩを反応性の官能基を有する薬物にも結合した。ドキソルビシン（図２３）は、カルボジイミド化学により結合され、ドキソルビシンのアミン基が図２４に示されるようにポリマーＩＩのカルボキシル基に結合されている。簡単に述べると、ドキソルビシン結合ポリマーＩＩ（Ｐｏｌｙ−ＤＯＸ）は、ＮＨＳで活性化されたポリマーＩＩ（工程は実施例２に記載された葉酸の活性化に類似する）とリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）中のドキソルビシン（その濃度はポリマーＩＩの２倍であった）との室温による４８時間の反応により合成した。２０００の分子量カットオフの透析膜を用いた超純水存在下における４８時間の透析と、それに続く凍結乾燥により血のように赤い生成物が得られた。ゲル透過クロマトグラフィーからポリマーＩＩの分子量はＭｗ：９０５１，Ｍｎ：６７８１からＭｗ：１１１２９，Ｍｎ：９１１８まで増大し、図２５に示されるように保持時間の減少が確認された。更に、結合物の示差走査熱量測定は、ドキソルビシンの２０２℃の融点が遷移していないことを示しており（図２６に示されるように）、それは薬物がポリマー鎖の一部であったことを示す。
ｉｉ）ドキソルビシン結合ポリマーＩＩからのミセルの製造
薬物のポリマー鎖上への結合の後に、ポリマーが水に比較的不溶性であることが観察された。このポリマーを使用して、透析及び溶媒蒸発法によりコア−シェル・ナノ粒子（ミセル）を調製することを試みた。ポリマーがより疎水性である場合、ポリマーの沈殿及び８００−１０００ｎｍの範囲であるより大きな粒子の形成が起こるので、透析は適切な方法ではなかった。しかしながら、溶媒蒸発法を使用することにより、２８０ｎｍの平均粒子径を有するミセルを製造することができた。溶媒蒸発法の工程は以下のとおりである：１５ｍｇの結合ポリマーを４ｍＬのジメチルアセタミドと１ｍＬのジクロロメタンに溶解し、ポリマー溶液を２０ｍＬの超純水中にて乳化し、５分間超音波処理した。溶媒を蒸発し、溶液を遠心分離して、粒子径を測定した。薬物のミセルに対する結合は、ポリマーのｐＨに誘引された温度感受性により変更できた。３８℃を超える（ＬＣＳＴを超える）と粒子径が減少し、それはｐＨ７．４における温度感受性セグメントの崩壊によるものであると思われる。この現象は可逆的かつ再生可能であることがわかった（図２７）。
【実施例４】
【００８４】
ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド−ｂ−ポリ（１０−ウンデセン酸）［Ｐ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−ＤＭＡＡｍ）−ｂ−ＰＵＡ）］ブロックコポリマーの合成
ポリマーＩＩのブロックコポリマーの合成は、温度感受性／親水性セグメントと、ｐＨ感受性脂肪酸セグメントとを別々に合成することにより実施され、それらは次に図２８及び２９に示されるようにブロックコポリマーを形成するために結合された（スキーム５及び６）。簡単に述べると、温度感受性セグメントはモノマー比が３．７５：１．２５である精製したＮ−イソプロピルアクリルアミド及びＮ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミドを、開始剤であるアゾビスイソブチロニトリルの存在下において、４０ｍＬのアルコール中の連鎖移動剤，２−アミノエタンチオール塩酸塩（ＡＥＴ．ＨＣｌ）との、７０℃における２４時間の反応により合成した。ポリマーはクロロホルム中に溶解して、ジエチルエーテル中にて沈殿することにより、精製した。ポリマーの分子量はＧＰＣにより分析され、Ｍｗ１１２２１であることが明らかとなった。一方、ポリ（１０−ウンデセン酸）は、過硫酸アンモニウム（０．８ｇ）の存在下においてモノマーのナトリウム塩（０．０９７ｍｏｌ）を水中にて７０℃で２４時間反応することにより合成した。ポリマーを冷エタノールの存在下にて沈殿させた。ポリ（１０−ウンデセン酸）はＤＣＣの存在下にてＮＨＳにより活性化され、この製品は更に水中にて、アルカリ性のｐＨにて温度感受性ブロックと結合した。ポリマー分子量はＭｗ２９１１７であった（図３０）。ブロックポリマーはＬＣＳＴを測定することによりそのｐＨ及び温度に対する感受性を測定した。図３１に示されるように、ブロックコポリマーは実際にｐＨ及び温度に感受性であることが確認された。ブロックコポリマーのＰＢＳ（ｐＨ７．４）におけるＬＣＳＴは３９．５℃であり、ポリ（１０−ウンデセン酸）でブロックされた場合３８．５℃まで減少した。ブロックコポリマーはｐＨ６．０では３６．７℃のＬＣＳＴを示した。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】例示的な目的のためのスキーム１を示し、同スキーム１はＮ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド及び１０−ウンデセン酸のモノマーと、連鎖移動剤であるアミノエタンチオールと、を使用した本発明のコポリマーの合成を実施するための１つの可能なスキームを示す。表１は例示的な実験において本発明のコポリマーを形成するために使用される種々の供給モル比及び得られたコポリマーの物理的特性、即ち、分子量、ガラス転移温度、親水性単位の温度感受性単位に対する実際のモル比、酸性度、熱劣化温度を示す。アミノエタンチオールは終端部をこれらのコポリマーに導入するための連鎖移動剤として使用した。
【図２】Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド及び１０−ウンデセン酸のモノマーをそれぞれＣＤＣｌ３中にて３．５：１．５：０．５の供給モル比（ポリマーＩＩＩ）にて合成して得られたポリマーの典型的な１Ｈ  ＮＨＲスペクトルを示す。
【図３】ポリマーＩＩＩの典型的なＦＴ−ＩＲスペクトルを示す。
【図４】Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド及び１０−ウンデセン酸のモノマーをそれぞれ４．０：１．００：０．５の供給モル比（ポリマーＩ）にて合成して得られたポリマーの、種々のｐＨにて温度の関数としての５００ｎｍにおける光透過率を示す。
【図５】Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド及び１０−ウンデセン酸のモノマーをそれぞれ３．７５：１．２５：０．５の供給モル比（ポリマーＩＩ）にて合成して得られたポリマーの、種々のｐＨにて温度の関数としての５００ｎｍにおける透過率のプロットを示す。
【図６】ポリマーＩＩＩの、種々のｐＨにて温度の関数としての５００ｎｍにおける透過率のプロットを示す。
【図７】ポリマーＩＩの、１０（ｗ／ｖ）％ＢＳＡを有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）における温度の関数としての５００ｎｍにおける透過率のプロットを示す。
【図８】ポリマー濃度（ポリマーＩＩ）の関数として、Ｉ３／Ｉ１のプロットを示す。
【図９】ＤＯＸが装填されたナノ粒子の粒度分布の典型例を示す。
【図１０】薬物が装填されたナノ粒子のＴＥＭ写真を示す。
【図１１】Ｌ９２９細胞に対するポリマーＩＩの細胞毒性を示す。
【図１２】３７℃における種々のｐＨに対する、ポリマーＩＩナノ粒子からのＤＯＸの放出プロファイルを示す。
【図１３】葉酸のＮ−ヒドロスクシニミド（ＮＨＳ）との活性化を図示するスキーム２を示す。
【図１４】葉酸のポリマーＩＩへの結合を図示するスキーム３を示す。
【図１５】コレステロールのＮＨＳ活性化を介したポリマーＩＩへの結合を図示するスキーム４を示す。
【図１６】葉酸−結合ポリマーＩＩのＮＭＲスペクトルを示す。
【図１７】コレステロールグラフト化ポリマーＩＩのＮＭＲスペクトルを示す。
【図１８】ポリ−葉酸及びポリマーＩＩの種々のｐＨにおける温度の関数としての５００ｎｍにおける光透過率を示す。
【図１９】ポリ−コレステロールのｐＨ７．４における温度の関数としての５００ｎｍにおける光透過率を示す。
【図２０】ポリ−コレステロール−葉酸の異なるｐＨにおける温度の関数としての５００ｎｍにおける光透過率を示す。
【図２１】Ｌ９２９細胞に対するポリ−コレステロール−葉酸の細胞毒性を示す棒グラフである。
【図２２】コポリマー、パクリタキセル及びパクリタキセル装填コア−シェル・ナノ粒子のＤＳＣ分析を示す。
【図２３】塩酸ドキソルビシンの構造式を示す。
【図２４】ドキソルビシン結合ポリマーＩＩの合成を示す。
【図２５】ドキソルビシン結合ポリマーＩＩのゲル透過クロマトグラムを示す。
【図２６】ドキソルビシン結合ポリマーＩＩの示差走査クロマトグラムを示す。
【図２７】ｐＨ７．４におけるＰＢＳ中の薬物結合ミセルの温度感受性可逆粒子径を示す。
【図２８】ＮＩＰＡＡｍ及びＤＭＡＡｍから構成される温度ブロックの合成及びポリ（１０−ウンデセン酸）の合成を図示するスキーム５を示す。
【図２９】ブロックコポリマーの合成を図示するスキーム６を示す。
【図３０】温度感受性ブロック及びブロックコポリマーのゲル透過クロマトグラムを示す。
【図３１】ブロックコポリマーから形成されたＬＣＳＴ測定を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年7月17日(2006.7.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも３つの型のモノマー単位からなるコポリマーであって、前記３つの型のモノマー単位は、
温度感受性単位と、
親水性単位と、
少なくとも１つのｐＨ−感受性部分を含む疎水性単位と、からなり、
前記疎水性モノマー単位は共重合可能な不飽和脂肪酸に由来し、かつ
み、かつ
前記脂肪酸は、（Ｅ）−９−オクタデセン酸、（Ｚ）−９−オクタデセン酸、（Ｚ）−１１−オクタデセン酸、（Ｅ）−９−ヘキサデセン酸、（Ｚ）−９−ヘキサデセン酸、（Ｚ）−９−テトラデセン酸、（Ｚ）−１１−エコセン酸、（Ｚ）−１３−ドコセン酸及び（Ｚ）−１５−テトラコセン酸からなる群より選択される、コポリマー。
【請求項２】
少なくとも３つの型のモノマー単位からなるコポリマーであって、前記３つの型のモノマー単位は、
温度感受性単位と、
親水性単位と、
少なくとも１つのｐＨ−感受性部分を含む疎水性単位と、からなり、
前記疎水性モノマー単位は共重合可能な不飽和脂肪酸に由来し、
前記脂肪酸は５乃至５０又はそれ以上の主鎖炭素原子を含み、前記脂肪酸は、その二重結合が同脂肪酸のカルボン酸基の位置の反対側に位置する同脂肪酸の最初の炭素原子と２番目の炭素原子との間に存在しているオメガ−１脂肪酸である、コポリマー。
【請求項３】
前記脂肪酸は、４−ペンテン酸、７−オクテン酸、１０−ウンデセン酸、１５−ヘキサデセン酸及び１９−エコセン酸からなる群より選択される、請求項２記載のコポリマー。
【請求項４】
少なくとも３つの型のモノマー単位からなるコポリマーであって、前記３つの型のモノマー単位は、
温度感受性単位と、
親水性単位と、
少なくとも１つのｐＨ−感受性部分を含む疎水性単位と、からなり、
前記疎水性モノマー単位は共重合可能な不飽和脂肪酸に由来し、
前記脂肪酸は５乃至５０又はそれ以上の主鎖炭素原子を含み、かつ前記脂肪酸は少なくとも二つの炭素−炭素二重結合（ポリ不飽和）を含む、コポリマー。
【請求項５】
前記脂肪酸は、（Ｅ，Ｅ）−９，１２−オクタデカジエン酸、（Ｚ，Ｚ）−９，１２−オクタデカジエン酸、（Ｅ，Ｅ）−９，１１−オクタデカジエン酸、（Ｚ、Ｚ，Ｚ）−９，１２，１５−オクタデカトリエン酸、（Ｚ、Ｚ，Ｚ）−６，９，１２−オクタデカトリエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ）−６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸、（Ｚ，Ｚ）−１１，１４−エコサジエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ）−５，８，１１−エイコサトリエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ）−１１，１４，１７−エイコサトリエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ）−８，１１，１４−エイコサトリエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ）−８，１１，１４，１７−エイコサテトラエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ）−５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ）−５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸、（Ｚ，Ｚ）−１３，１６−ドコサジエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ）−１３，１６，１９−ドコサトリエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ）−７，１０，１３，１６−ドコサテトラエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ）−４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ）−７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸、（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ、Ｚ）−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸及び（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ）−６，９，１２，１５，１８，２１−テトラコサヘキサエン酸からなる群より選択される、請求項４に記載のコポリマー。
【請求項６】
前記温度感受性モノマー単位は、Ｎ−アクロイルピペラジン、Ｎ−ｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−ピペリジル−メタクリルアミド及びＮ−イソプロピルアクリルアミドからなる群から由来する、請求項１乃至５のいずれか一項に記載のコポリマー。
【請求項７】
前記親水性モノマー単位は、アクリル酸、アクリルアミド、アクリレート、ピロリドン、エチレングリコール及びそれらの置換された誘導体からなる群から由来する、請求項１乃至６のいずれか一項に記載のコポリマー。
【請求項８】
前記アクリルアミドは、アクリルアミド（ＡＡｍ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡｍ）及びＮ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミドからなる群より選択される、請求項７に記載のコポリマー。
【請求項９】
終端部、リガンド、薬物、タグ、ラジオイムノ結合体、化学的部分及びスペーサからなる群より選択される少なくとも１つの部分からなる末端基をさらに含む、請求項１乃至８のいずれか一項に記載のコポリマー。
【請求項１０】
前記終端部は水酸基、カルボキシル基及びアミノ基からなる群より選択される官能基を含む、請求項９に記載のコポリマー。
【請求項１１】
前記終端部は、連鎖移動剤又は官能基移動剤により導入される、請求項１０に記載のコポリマー。
【請求項１２】
前記終端部は、リビング重合法により導入される、請求項１０に記載のコポリマー。
【請求項１３】
前記終端部は、前記ポリマーのモノマー単位の一部である、請求項１０に記載のコポリマー。
【請求項１４】
前記連鎖移動剤は、クロロホルム、四塩化炭素、アルキル−メルカプタン、アミノエタンチオール、メルカプト−プロピオン酸、メルカプト−コハク酸、チオグリコール酸、メルカプトエタノール及びその第２級アルコール、アルキルハライド及び５未満の酸化数を有するリン酸塩、からなる群より選択される、請求項１１に記載のコポリマー。
【請求項１５】
前記アルキル−メルカプタンは、オクタンチオール、デカンチオール、ｎ−ドデカンチオール又はｔ−ドデカンチオールからなる群より選択される、請求項１４に記載のコポリマー。
【請求項１６】
前記リガンドは、前記終端部の官能基に直接取り付けられる請求項９に記載のコポリマー。
【請求項１７】
前記リガンドは、スペーサにより前記終端部に取り付けられる、請求項９に記載のコポリマー。
【請求項１８】
前記スペーサは１０を超える主鎖原子を含む、請求項１７に記載のコポリマー。
【請求項１９】
前記リガンドは、小さな標的分子、タンパク質、ペプチド及び炭水化物からなる群より選択される、請求項１８に記載のコポリマー。
【請求項２０】
前記スペーサはポリ（エチレングリコール）及びポリ（プロピレングリコール）からなる、請求項１９に記載のコポリマー。
【請求項２１】
前記コポリマーはランダムコポリマーである、請求項１乃至２０のいずれか一項に記載のコポリマー。
【請求項２２】
前記コポリマーはブロックコポリマーである、請求項１乃至２０のいずれか一項に記載のコポリマー。
【請求項２３】
温度及びｐＨに感受性の組成物であって、
治療剤と、
コポリマー、とからなり、
前記コポリマーは少なくとも３つの型のモノマー単位からなり、同３つの型のモノマー単位は、
温度感受性単位と、
親水性単位と、
少なくとも１つのｐＨ−感受性部分を含む疎水性単位と、からなり、かつ
前記疎水性モノマー単位は共重合可能な不飽和脂肪酸に由来する組成物。
【請求項２４】
前記治療剤は、抗癌剤、抗炎症剤及び神経疾患を治療するための薬物からなる群より選択される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記抗癌剤は、ドキソルビシン、アナストロゾール、エキセメスタン、シクロホスファミド、エピルビシン、トレミフェン、レトロゾール、トラスツズマブ、メゲストロール、ノルバデックス、パクリタキセル、ドセタキセル、カペシタビン、酢酸ゴセレリン、ヒドロキシウレア、エリスロマイシン、シクロスポリン及びシスプラチンからなる群より選択される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記コポリマーの分子量は、４００００未満である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
前記コポリマーの下限臨界溶液温度は７．２未満のｐＨでは３７℃よりも小さい、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２８】
前記コポリマーの下限臨界溶液温度は通常の生理学的ｐＨであるｐＨ７．４において３７℃よりも大きい、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２９】
前記コポリマーに存在する、温度感受性モノマー単位と親水性モノマー単位と少なくとも１つのｐＨ感受性部分を含む疎水性モノマー単位とのモル比は、約３．７５：１．２５：０．５である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３０】
動物又はヒトに選択された治療剤を提供する方法において、
前記動物又はヒトに温度及びｐＨ感受性の組成物を投与する工程を含み、前記組成物は、
治療剤と、
コポリマー、とからなり、
前記コポリマーは少なくとも３つの型のモノマー単位からなるコポリマーであり、同３つの型のモノマー単位は、温度感受性単位と、親水性単位と、少なくとも１つのｐＨ−感受性部分を含む疎水性単位と、からなり、かつ前記疎水性モノマー単位は共重合可能な不飽和脂肪酸に由来し、
前記コポリマーは、疎水性コア及び親水性シェルからなる少なくとも１つのナノ粒子に調製され、かつ前記治療剤は前記疎水性コア内に包含される、方法。
【請求項３１】
前記組成物は経口にて送達される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記組成物は局所的に送達される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記組成物は静脈内投与にて送達される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記組成物は局所に送達される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記組成物は非経口的に送達される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記組成物は吸入にて送達される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記組成物は眼を介して送達される、請求項３０に記載の方法。
【国際調査報告】
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