(57)【要約】  本発明は、ヒトＴｒｋＢに対するモノクローナル抗体を提供する。特定の実施態様において、本発明の抗体は、ヒトＴｒｋＢと結合し、そしてそれを活性化する。特定の実施態様において、本発明の抗体は、それらがヒトＴｒｋＡまたはヒトＴｒｋＣと結合しない（または、それを活性化しない）という点でヒトＴｒｋＢに選択的である。いくつかの実施態様において、本発明のモノクローナル抗体は、マウスＴｒｋＢと交差反応する。本発明の抗体のヒト化または張り合わせ型もまた含まれる。本発明の抗体を含む医薬組成物が、本発明の抗体を製造する方法および処置、検出または精製目的のためのこれらの使用方法と同様に提供される。
2008545781.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴｒｋＢに結合するモノクローナル抗体。
【請求項２】
ヒトＴｒｋＢとの結合が約１０ｐＭ〜約５００ｎＭの範囲のＥＤ５０を有する、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
ヒトＴｒｋＢとの結合が約１０ｐＭ〜約１ｎＭの範囲のＥＤ５０を有する、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
ヒトＴｒｋＢとの結合が約１０ｐＭ〜約１００ｐＭの範囲のＥＤ５０を有する、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
ヒトＴｒｋＢとの結合が約１０ｐＭ〜約５０ｐＭの範囲のＥＤ５０を有する、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
モノクローナル抗体が、約１０ｐＭ〜約５００ｎＭの範囲のＥＣ５０でヒトＴｒｋＢを活性化する、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
モノクローナル抗体が、約１０ｐＭ〜約１ｎＭの範囲のＥＣ５０でヒトＴｒｋＢを活性化する、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
モノクローナル抗体が、約１０ｐＭ〜約１００ｐＭの範囲のＥＣ５０でヒトＴｒｋＢを活性化する、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
モノクローナル抗体が、約１０ｐＭ〜約５０ｐＭの範囲のＥＣ５０でヒトＴｒｋＢを活性化する、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
モノクローナル抗体がヒトＴｒｋＡに結合しない、および／またはヒトＴｒｋＡを活性化しない、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
モノクローナル抗体が、約１ｎＭより高い抗体濃度で、ヒトＴｒｋＡとの検出可能な結合を示さない、および／またはヒトＴｒｋＡのいかなる検出可能な活性化も引き起こさない、請求項１０記載のモノクローナル抗体。
【請求項１２】
モノクローナル抗体が、約１０ｎＭより高い抗体濃度で、ヒトＴｒｋＡとの検出可能な結合を示さない、および／またはヒトＴｒｋＡのいかなる検出可能な活性化も引き起こさない、請求項１０記載のモノクローナル抗体。
【請求項１３】
モノクローナル抗体が、約１００ｎＭより高い抗体濃度で、ヒトＴｒｋＡとの検出可能な結合を示さない、および／またはヒトＴｒｋＡのいかなる検出可能な活性化も引き起こさない、請求項１０記載のモノクローナル抗体。
【請求項１４】
モノクローナル抗体が、約１μＭより高い抗体濃度で、ヒトＴｒｋＡとの検出可能な結合を示さない、および／またはヒトＴｒｋＡのいかなる検出可能な活性化も引き起こさない、請求項１０記載のモノクローナル抗体。
【請求項１５】
モノクローナル抗体がヒトＴｒｋＣと結合しない、および／またはヒトＴｒｋＣを活性化しない、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項１６】
モノクローナル抗体が、約１ｎＭより高い抗体濃度で、ヒトＴｒｋＣとの検出可能な結合を示さない、および／またはヒトＴｒｋＣのいかなる検出可能な活性化も引き起こさない、請求項１５記載のモノクローナル抗体。
【請求項１７】
モノクローナル抗体が、約１０ｎＭより高い抗体濃度で、ヒトＴｒｋＣとの検出可能な結合を示さない、および／またはヒトＴｒｋＣのいかなる検出可能な活性化も引き起こさない、請求項１５記載のモノクローナル抗体。
【請求項１８】
モノクローナル抗体が、約１００ｎＭより高い抗体濃度で、ヒトＴｒｋＣとの検出可能な結合を示さない、および／またはヒトＴｒｋＣのいかなる検出可能な活性化も引き起こさない、請求項１５記載のモノクローナル抗体。
【請求項１９】
モノクローナル抗体が、約１μより高い抗体濃度で、ヒトＴｒｋＣとの検出可能な結合を示さない、および／またはヒトＴｒｋＣのいかなる検出可能な活性化も引き起こさない、請求項１５記載のモノクローナル抗体。
【請求項２０】
モノクローナル抗体がヒトＴｒｋＣと結合しない、および／またはＹｒｋＣを活性化しない、請求項１０記載のモノクローナル抗体。
【請求項２１】
モノクローナル抗体がＢＤＮＦとヒトＴｒｋＢとの間の結合をブロックする、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項２２】
モノクローナル抗体が、約１００ｐＭ〜約５００ｎＭの範囲のＩＣ５０でＢＤＮＦとヒトＴｒｋＢとの間の結合をブロックする、請求項２１記載のモノクローナル抗体。
【請求項２３】
モノクローナル抗体が、約１００ｐＭ〜約１ｎＭの範囲のＩＣ５０でＢＤＮＦとヒトＴｒｋＢとの間の結合をブロックする、請求項２１記載のモノクローナル抗体。
【請求項２４】
モノクローナル抗体が、約１００ｐＭ〜約５００ｐＭの範囲のＩＣ５０でＢＤＮＦとヒトＴｒｋＢとの間の結合をブロックする、請求項２１記載のモノクローナル抗体。
【請求項２５】
モノクローナル抗体がＢＤＮＦとヒトＴｒｋＢとの間の結合をブロックしない、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項２６】
モノクローナル抗体が、約１ｎＭより高い抗体濃度で、検出可能なブロッキング活性を示さない、請求項２５記載のモノクローナル抗体。
【請求項２７】
モノクローナル抗体が、約１０ｎＭより高い抗体濃度で、検出可能なブロッキング活性を示さない、請求項２５記載のモノクローナル抗体。
【請求項２８】
モノクローナル抗体が、約１００ｎＭより高い抗体濃度で、検出可能なブロッキング活性を示さない、請求項２５記載のモノクローナル抗体。
【請求項２９】
モノクローナル抗体が、約１μＭより高い抗体濃度で、検出可能なブロッキング活性を示さない、請求項２５記載のモノクローナル抗体。
【請求項３０】
モノクローナル抗体がＩｇＧ１アイソタイプを有する、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３１】
モノクローナル抗体がＩｇＧ２ａアイソタイプを有する、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３２】
モノクローナル抗体がＩｇＧ２ｂアイソタイプを有する、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３３】
モノクローナル抗体がマウスＴｒｋＢと結合する、および／またはマウスＴｒｋＢを活性化する、請求項１〜３２のいずれか１項記載のモノクローナル抗体。
【請求項３４】
マウスＴｒｋＢとの結合が約１０ｐＭ〜約５００ｎＭの範囲のＥＤ５０を有する、請求項３３記載のモノクローナル抗体。
【請求項３５】
マウスＴｒｋＢとの結合が約１０ｐＭ〜約１ｎＭの範囲のＥＤ５０を有する、請求項３３記載のモノクローナル抗体。
【請求項３６】
マウスＴｒｋＢとの結合が約１０ｐＭ〜約５００ｐＭの範囲のＥＤ５０を有する、請求項３３記載のモノクローナル抗体。
【請求項３７】
マウスＴｒｋＢとの結合が約１０ｐＭ〜約１００ｐＭの範囲のＥＤ５０を有する、請求項３３記載のモノクローナル抗体。
【請求項３８】
モノクローナル抗体が、配列ＫＮＥＹＧＫＤ（配列番号７）およびＫＧＮＰＫＰ（配列番号８）を有するヒトＴｒｋＢのエピトープの一方または両方に結合する、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３９】
モノクローナル抗体が、配列ＫＮＥＹＧＫＤ（配列番号７）およびＲＧＮＰＫＰ（配列番号９）を有するマウスＴｒｋＢのエピトープの一方または両方にさらに結合する、請求項３８記載のモノクローナル抗体。
【請求項４０】
モノクローナル抗体が、配列ＥＮＬＶＧＥＤ（配列番号１０）を有するヒトＴｒｋＢのエピトープと結合し、そしてＡＧＤＰＶＰ（配列番号１１）を有するヒトＴｒｋＢのエピトープと結合してもよい、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項４１】
モノクローナル抗体が、配列ＥＮＬＶＧＥＤ（配列番号１０）を有するマウスＴｒｋＢのエピトープとさらに結合する、請求項４０記載のモノクローナル抗体。
【請求項４２】
２００５年８月１８日にＡＴＣＣに寄託されそしてＡＴＣＣ特許寄託名ＰＴＡ−６９４８を有するハイブリドーマまたはその前駆細胞から産生されるモノクローナル抗体。
【請求項４３】
２００５年８月１８日にＡＴＣＣに寄託されそしてＡＴＣＣ特許寄託名ＰＴＡ−６９４９を有するハイブリドーマまたはその前駆細胞から産生されるモノクローナル抗体。
【請求項４４】
モノクローナル抗体が請求項４２記載のモノクローナル抗体と同じエピトープに結合する、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項４５】
モノクローナル抗体が請求項４３記載のモノクローナル抗体と同じエピトープに結合する、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項４６】
請求項１〜４１のいずれか１項記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項４７】
２００５年８月１８日にＡＴＣＣに寄託されそしてＡＴＣＣ特許寄託名ＰＴＡ−６９４８を有するハイブリドーマまたはその前駆細胞。
【請求項４８】
２００５年８月１８日にＡＴＣＣに寄託されそしてＡＴＣＣ特許寄託名ＰＴＡ−６９４９を有するハイブリドーマまたはその前駆細胞。
【請求項４９】
異なる種のＴｒｋＢタンパク質に由来する少なくとも２つのタンパク質免疫原を用いて動物を免疫する工程；および
免疫された動物由来の脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させて、ハイブリドーマを製造する工程、
を包含する方法
【請求項５０】
少なくとも２つのタンパク質免疫原がヒトＴｒｋＢ由来の第１の免疫原および非ヒトＴｒｋＢ由来の第２の免疫原を含む、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
第１の免疫原がヒトＴｒｋＢの細胞外ドメインを含み、そして第２の免疫源が非ヒトＴｒｋＢの細胞外ドメインを含む、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
第２の免疫原が、マウスＴｒｋＢ、ラットＴｒｋＢおよびニワトリＴｒｋＢからなる群より選択される非ヒトＴｒｋＢの細胞外ドメインを含む、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
第２の免疫原がマウスＴｒｋＢの細胞外ドメインを含む、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
免疫する工程において、第１の免疫原および第２の免疫原が約１より大きな比率を有する量（重量）で投与される、請求項５０記載の方法。
【請求項５５】
比率が約５より大きい、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
比率が約１０である、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
第１および第２の免疫原が、ＴｒｋＢの細胞外ドメインの外側に見出されるいずれのアミノ酸も含まない、請求項５１記載の方法。
【請求項５８】
請求項４９〜５７のいずれか１項記載の方法に従って製造されるハイブリドーマ。
【請求項５９】
ハイブリドーマからモノクローナル抗体を生成する工程をさらに包含する、請求項４９〜５７のいずれか１項記載の方法。
【請求項６０】
請求項５９記載の方法に従って製造されるモノクローナル抗体。
【請求項６１】
請求項１〜４１のいずれか１項記載のモノクローナル抗体の治療有効量を個体に投与する工程を包含する、個体におけるヒトＴｒｋＢの活性化方法。
【請求項６２】
個体がＴｒｋＢの活性化を必要とする神経学的状態に罹患している、請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
個体の神経系が創傷、外科手術、虚血、感染症、代謝疾患、栄養失調、悪性腫瘍または毒性薬物によって損傷されている、請求項６１記載の方法。
【請求項６４】
個体が脳卒中、脊髄損傷または軸索切断に罹患している、請求項６１記載の方法。
【請求項６５】
個体が先天性または神経変性状態に罹患している、請求項６１記載の方法。
【請求項６６】
状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）からなる群より選択される、請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
モノクローナル抗体が非経口で個体に投与される、請求項６１記載の方法。
【請求項６８】
モノクローナル抗体が静脈内または腹膜間で個体に投与される、請求項６１記載の方法。
【請求項６９】
モノクローナル抗体とヒトＴｒｋＢとの間の特異的な結合を可能にする条件下で、請求項１〜４１のいずれか１項記載のモノクローナル抗体を、ヒトＴｒｋＢの量を含むサンプルと合する工程；および
特異的な結合を検出し、それによりサンプル中のヒトＴｒｋＢの存在を示す工程、
を包含する方法。
【請求項７０】
モノクローナル抗体とヒトＴｒｋＢとの間の特異的な結合を可能にする条件下で、請求項１〜４１のいずれか１項記載のモノクローナル抗体を、ヒトＴｒｋＢの量を含むサンプルと合し、それにより抗体−ＴｒｋＢ複合体を生じさせる工程；
抗体−ヒトＴｒｋＢ複合体を、サンプルの残りから分離する工程；および
抗体をヒトＴｒｋＢから分離し、それにより精製ヒトＴｒｋＢを得る工程、
を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権情報
本出願は、２００５年６月６日出願のＵ．Ｓ．  Ｓｅｒｉａｌ  Ｎｏ．  ６０／６８７，７０５の利益を主張し、その全体の内容を出典明示で援用する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Ｔｒｋチロシンキナーゼ受容体は、生存、分化、増殖および再生を含む広い範囲の神経細胞応答において重要な役割を担う多ドメイン１回膜貫通受容体である。それらは神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）およびニューロトロフィン４／５（ＮＴ−４／５）を含むタンパク質増殖因子のファミリーであるニューロトロフィンの高親和性受容体である。ニューロトロフィンは高度に保存された構造的特徴を共有するが、それらの特有のアミノ酸配列は、各メンバーが特異的なＴｒｋ受容体（すなわち、ＴｒｋＡ、ＢまたはＣ）の細胞外ドメインとの高親和性相互作用を誘発することを可能にする。従って、ＮＧＦはＴｒｋＡについての好ましいリガンドであり；ＢＤＮＦおよびＮＴ−４／５はＴｒｋＢについての好ましいリガンドであり；そして、ＮＴ−３はＴｒｋＣと結合することが示されているが、それはまたＴｒｋＡおよびＴｒｋＢにより低い親和性で結合するようである。
Ｔｒｋ受容体の中で、ＴｒｋＢの役割は、中枢神経系（ＣＮＳ）においてよく特徴付けられている。ＴｒｋＢは、新皮質、海馬、線条体、嗅覚形成および脳幹を含む脳において広く分布している。同族のリガンドとしてＢＤＮＦを使用して、神経細胞生存、分化および神経再生におけるＴｒｋＢの不可欠な役割が、脳卒中、脊髄損傷、軸索切断およびＡＬＳを含む多くの神経変性モデルにおいて示されている。
【０００３】
種々のシグナル伝達分析および受容体ノックアウト系を通じて、ＢＤＮＦの応答は、ＴｒｋＢの結合および活性化に依存することが示されている。上記のように、Ｔｒｋ受容体は、多ドメイン１回膜貫通タンパク質である。それらは、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通領域および細胞内チロシンキナーゼドメインからなる。細胞外ドメインは、２つのシステインクラスターおよび２つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインによって隣接されるロイシンリッチモチーフから構成される。リガンドドッキングにおける他の領域（例えば、ロイシンリッチモチーフおよび第１のＩｇドメイン）の寄与が提唱されているが、Ｔｒｋ受容体は主に第２のＩｇ様ドメインを通じてそれらのリガンドと相互作用することが示されている。リガンド−受容体複合体およびＴｒｋ受容体のリガンド結合ドメインの結晶構造が決定されている。リガンド−受容体インターフェースは、以下の２つのパッチからなるようである：全てのニューロトロフィンの間で共有される保存された結合モチーフについての一方、および各ニューロトロフィンに特異的な他方。
【０００４】
ニューロトロフィンのＴｒｋ受容体への結合に際して、受容体二量体形成および続く立体構造変化が起き、これは細胞内チロシンキナーゼドメインの活性化を導くと考えられている。Ｔｒｋ受容体の細胞内ドメイン中に、いくつかの保存されたチロシンが存在する。キナーゼドメインの自己調節ループのリン酸化はキナーゼ活性を活性化し、他の残基のリン酸化は、これらの受容体を細胞内シグナル伝達カスケード（Ｒａｓ／細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）タンパク質キナーゼ経路、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔキナーゼ経路およびホスホリパーゼＣγを含む）と共役させるアダプタータンパク質のためのドッキング部位を作ることによってシグナル伝達を促進する。いくぶん重複するものの、これらの個々の経路は、別個の生物学的活性に関与する：Ｒａｓ／ＭＡＰＫは神経細胞の分化および増殖を調節し、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路はアクチン動態および生存を制御し、そしてＰＬＣγはカルシウム動員に関与する。
【０００５】
今日までに、ＴｒｋＢの強力かつ選択的なインビボアゴニストとして作用する試薬の成功例は存在しない。多くのインビトロおよびインビボでのＣＮＳ変性モデルにおいて、ＢＤＮＦ（組換えタンパク質として）は、神経細胞生存および神経再生を増加させることが示されているが、おそらくＢＤＮＦが短いインビボ半減期を有するので、臨床におけるＢＤＮＦタンパク質療法の成績は否定的であった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
それゆえ、当該分野において、ＴｒｋＢの強力かつ選択的なインビボアゴニストとして作用する医薬試薬の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明は、ヒトＴｒｋＢに対するモノクローナル抗体を提供する。特定の実施態様において、本発明の抗体は、ヒトＴｒｋＢに結合し、そしてそれを活性化する。特定の実施態様において、本発明の抗体は、それらがヒトＴｒｋＡまたはヒトＴｒｋＣよりＴｒｋＢに優先的に結合する点で、ヒトＴｒｋＢに選択的である。いくつかの実施態様において、本発明のモノクローナル抗体は、マウスＴｒｋＢと交差反応する。
【０００８】
本発明はまた、１つ以上のこれらの抗体を含む医薬組成物を提供する。本発明はさらに、本発明のモノクローナル抗体を調製する方法を提供する。本発明の抗体のヒト化または張り合わせ（veneered）型もまた、本発明の抗体を産生するハイブリドーマと同様に含まれる。
【０００９】
本発明はさらに、これらのモノクローナル抗体をＴｒｋＢのアゴニストとして使用する方法を提供する。特定の実施態様において、モノクローナル抗体は、ヒトＴｒｋＢのアゴニストとして使用される。そのような実施態様によれば、抗体は、ＴｒｋＢの活性化を必要とする状態（神経学的な状態を含む）を処置するために使用され得る。
【００１０】
本発明はさらに、本発明の抗体を使用して、サンプル中のＴｒｋＢを検出する方法およびサンプルからＴｒｋＢを精製する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
特定の実施態様の説明
本発明は、一つには、ＴｒｋＢ受容体の細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体が、ＴｒｋＢを二量体化し、そしてＢＤＮＦによって媒介されるものと同様の、受容体の活性化および生物学的応答を誘導するために十分であり得るという認識に端を発する。
【００１２】
一般に、モノクローナル抗体は、研究、医学的診断および疾患の臨床的処置における多様な有用性を有するタンパク質の特有のクラスを表す。有利には、モノクローナル抗体は組換えタンパク質（例えば、ＢＤＮＦ）より高い薬物動態学的安定性を有すると考えられており、それにより臨床的適用について有意な利益を有する持続可能な薬理学的効果を可能にする。例えば、モノクローナル抗体薬物療法の現在臨床的に承認されている使用としては、臓器移植拒絶反応の予防、ガン（例えば、乳、結腸、非ホジキンリンパ腫、白血病）の処置、関節リウマチ、呼吸器多核体ウイルス疾患に対する予防、クローン病、経皮的冠動脈形成術および喘息が挙げられる。モノクローナル抗体を用いて種々のヒト疾患を処置するための他の医学的適用はまた現在、臨床試験中である。これらのモノクローナル抗体の生物学的効果は一般に、内因性リガンドによって発揮される分子事象をブロックまたは中和し、従って主に特異的高親和性アンタゴニストとして作用することによって伝達される。本発明において、モノクローナル抗体は、受容体−リガンド相互作用の生物学的効果を模倣するアゴニストとして使用される。
【００１３】
１．モノクローナル抗体およびハイブリドーマ
１つの態様において、本発明はヒトＴｒｋＢ（配列番号１）に結合するモノクローナル抗体を提供する。特定の実施態様において、これらの抗体は、約１０ｐＭ〜約５００ｎＭの範囲、例えば、約１０ｐＭ〜約１ｎＭ、約１０ｐＭ〜約１００ｐＭまたは約１０ｐｍ〜約５０ｐＭの範囲のＥＤ５０でヒトＴｒｋＢ（配列番号１）に結合する。本明細書において用いる用語「約」は、±１５％の変動を含むと定義される。
【００１４】
１つの実施態様において、本発明の抗体はまた、ヒトＴｒｋＢのアゴニストである。特定の実施態様において、これらの抗体は、約１０ｐＭ〜約５００ｎＭの範囲、例えば、約１０ｐＭ〜約１ｎＭ、約１０ｐＭ〜約１００ｐＭまたは約１０ｐＭ〜約５０ｐＭの範囲のＥＤ５０でヒトＴｒｋＢ（配列番号１）を活性化する。
【００１５】
１つの実施態様において、本発明の抗体は、それらがヒトＴｒｋＡ（配列番号５）またはヒトＴｒｋＣ（配列番号６）よりＴｒｋＢ（配列番号１）に優先的に結合するという点でヒトＴｒｋＢ（配列番号１）に選択的である。いくつかの実施態様において、本発明の抗体は、ヒトＴｒｋＡまたはヒトＴｒｋＣに結合しない。本明細書で定義する場合、本発明の抗体は、それが約１ｎＭより高い、例えば、約１０ｎＭより高い、約１００ｎＭより高い、または１μＭより高い濃度でヒトＴｒｋＡ（配列番号５）またはヒトＴｒｋＣ（配列番号６）との検出可能な結合を示さない場合、これらの受容体に「結合しない」。
【００１６】
１つの実施態様において、本発明の抗体は、それらがヒトＴｒｋＡ（配列番号５）またはヒトＴｒｋＣ（配列番号６）を活性化しないという点でヒトＴｒｋＢに選択的である。本明細書で定義する場合、本発明の抗体は、それが約１ｎＭより高い、例えば、約１０ｎＭより高い、約１００ｎＭより高い、または約１μＭより高い濃度でヒトＴｒｋＡ（配列番号５）またはヒトＴｒｋＣ（配列番号６）との検出可能な活性化を引き起こさない場合、これらの受容体を「活性化しない」。
【００１７】
１つの実施態様において、本発明の抗体は、約１００ｐＭ〜約５００ｎＭの範囲、例えば、約１００ｐＭ〜約１ｎＭ、または約１００ｐＭ〜約５００ｐＭの範囲のＩＣ５０でＢＤＮＦとＴｒｋＢ（配列番号１）との間の結合をブロックする。他の実施態様において、これらの抗体はＢＤＮＦとヒトＴｒｋＢ（配列番号１）との間の結合をブロックしない。本明細書で定義する場合、本発明の抗体は、それが約１ｎＭより高い、例えば、約１０ｎＭより高い、約１００ｎＭより高い、または１μＭより高い濃度で検出可能なブロッキング活性を示さない場合、ＢＤＮＦとヒトＴｒｋＢ（配列番号１）との間の結合をブロックしない。
【００１８】
特定の実施態様において、本発明の抗体は、ＩｇＧアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂアイソタイプ）に属する。
【００１９】
別の態様において、本発明は、マウスＴｒｋＢ（配列番号２）にさらに結合する、および／またはそれを活性化する上記の特性のいずれかを有するモノクローナル抗体を提供する。特定の実施態様において、これらの抗体は、約１０ｐＭ〜約５００ｎＭの範囲、例えば、約１０ｐＭ〜約１ｎＭの範囲（約１０ｐＭ〜約５００ｐＭの範囲および約１０ｐＭ〜約１００ｐＭの範囲を含む）のＥＤ５０でマウスＴｒｋＢ（配列番号２）に結合する、および／またはそれを活性化する。
【００２０】
別の態様において、本発明は、ヒトＴｒｋＢ（配列番号１）の１つ以上の特異的エピトープ、および所望によりマウスＴｒｋＢ（配列番号２）の１つ以上の特異的エピトープにさらに結合する上記の特性のいずれかを有するモノクローナル抗体を提供する。特定の実施態様において、これらの抗体は、配列ＫＮＥＹＧＫＤ（配列番号７、配列番号１のアミノ酸３６４〜３７０）およびＫＧＮＰＫＰ（配列番号８、配列番号１のアミノ酸３０８〜３１３）を有するヒトＴｒｋＢのエピトープの一方または両方に結合する。１つの実施態様において、これらの抗体はまた、配列ＫＮＥＹＧＫＤ（配列番号７、配列番号２のアミノ酸３６４〜３７０）およびＲＧＮＰＫＰ（配列番号９、配列番号２のアミノ酸３０８〜３１３）を有するマウスＴｒｋＢのエピトープの一方または両方に結合する。他の実施態様において、本発明は、配列ＥＮＬＶＧＥＤ（配列番号１０、配列番号１のアミノ酸２６９〜２７５）を有するヒトＴｒｋＢのエピトープ、および所望により配列ＡＧＤＰＶＰ（配列番号１１、配列番号１のアミノ酸２２１〜２２６）を有するヒトＴｒｋＢのエピトープに結合する抗体を提供する。１つの実施態様において、これらの抗体はまた、配列ＥＮＬＶＧＥＤ（配列番号１０、配列番号２のアミノ酸２６９〜２７５）を有するマウスＴｒｋＢのエピトープに結合する。
【００２１】
さらに別の態様において、本発明は、これらのモノクローナル抗体のいずれかを産生するハイブリドーマを提供する。例えば、２００５年８月１８日にＡＴＣＣに寄託され、そしてＡＴＣＣ特許寄託名ＰＴＡ−６９４８（１７Ｄ１１）およびＰＴＡ−６９４９（２９Ｄ７）が与えられたハイブリドーマが提供される。
【００２２】
さらに別の態様において、本発明は、２００５年８月１８日にＡＴＣＣに寄託され、そしてそれぞれＡＴＣＣ特許寄託名ＰＴＡ−６９４８（１７Ｄ１１）およびＰＴＡ−６９４９（２９Ｄ７）が与えられたハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体を提供する。本発明はまた、これらの抗体の結合をブロックし、それゆえヒトＴｒｋＢ（配列番号１）上の同じ結合エピトープを共有する抗体を提供する。
【００２３】
２．モノクローナル抗体およびハイブリドーマの調製
本発明のモノクローナル抗体は、任意の公知の方法によって調製され得ることが理解されるべきである。例えば、それらは、合成、組換え、またはハイブリドーマ技術（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅ．  ＨａｒｌｏｗおよびＤ．  Ｌａｎｅ編，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８８、またはＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｊ．Ｗ．  Ｇｏｄｉｎｇ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９６）に記載）を使用して調製され得る。特に、本発明の抗体は、最初にヒトＴｒｋＢまたはその誘導体（例えば、ヒトＴｒｋＢの細胞外ドメインを含む組換えタンパク質）を用いて動物を免疫し、次いで適切に調製されたハイブリドーマからモノクローナルを調製することによって調製され得ることが理解される。
【００２４】
１つの態様において、本発明のモノクローナル抗体は、異なる種のＴｒｋＢタンパク質に由来する少なくとも２つのタンパク質免疫原を使用する標準的なハイブリドーマ技術によって調製される。例えば、免疫原は、ヒトＴｒｋＢに由来する第１の免疫原および非ヒトＴｒｋＢに由来する第２の免疫原を含み得る。好ましくは、各免疫原は、ＴｒｋＢの細胞外ドメインを含む。特定の実施態様において、少なくとも２つの免疫原は免疫の目的のために混合物として合せられる。
【００２５】
１つの実施態様において、これらの免疫原の第１のものは、ヒトＴｒｋＢの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む組換えタンパク質である。ヒトＴｒｋＢのＥＣＤは、全長タンパク質（図１２において配列番号１として記載される、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＰ＿００６１７１）由来のアミノ酸残基Ｃ３２〜Ｈ４３０から構成される。出願日時点でＧｅｎＢａｎｋ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＥＭＢＬデータベース、または任意の他の公的に利用可能なデータベースに存在する全てのタンパク質および核酸配列を出典明示で援用することに留意のこと（限定するものではないが、ニューロトロフィン（例えば、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５など）の配列を含む）。第２の免疫原は、マウスＴｒｋＢの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む組換えタンパク質である。マウスＴｒｋＢのＥＣＤは、全長タンパク質（図１３において配列番号２として記載される、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｐ１５２０９）由来のアミノ酸残基Ｃ３２〜Ｈ４２９から構成される。当業者は、これらのドメインを含む適切な免疫原が、標準的な組換え技術（例えば、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．，  Ａｕｓｕｂｅｌら編，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  １９８９およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．，  Ｓａｍｂｒｏｏｋら編，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，  ＮＹ，  １９８９（その内容を出典明示で援用する））を使用して調製され得ることを理解する。
【００２６】
特定の実施態様において、第１および第２の免疫原は、約１より大きな比率（重量）で投与される。例えば、比率は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより大きくてもよい。１つの実施態様において、比率は約５より大きい。１つの実施態様において、比率は約１０である。１つの実施態様において、第１および第２の免疫原は、混合物として同時に投与される。
【００２７】
１つの実施態様において、一方または両方の免疫原は、天然ドメインとわずかに異なるそれらのそれぞれの細胞外ドメインの型を含む。例えば、細胞外ドメインのＮまたはＣ末端のアミノ酸は欠損し得る。あるいは、天然配列内の少数のアミノ酸は変異され得る。好ましくは、これらの変異は保存的置換である。これらの非天然型は、配列番号１または配列番号２において見出される細胞外ドメインと少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、そしてさらにより好ましくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むであろうことが理解されるべきである。
【００２８】
特定の実施態様において、第１および／または第２の免疫原は、ＴｒｋＢの細胞外ドメインの外側に見出されるいずれのアミノ酸も含まない（例えば、それらは、ＴｒｋＢの膜貫通および／または細胞内ドメインにおいて見出されるアミノ酸を含まない）。特定の実施態様において、免疫原は天然ＴｒｋＢタンパク質に存在しない１つ以上の末端アミノ酸を含み得る。特に、組換えタンパク質の発現を増加させるために末端アミノ酸が付加され得る（発現のために使用されるベクターの結果としてなど）。さらに、タンパク質アレルゲンに存在しないアミノ酸セグメントが、組換えタンパク質のアミノおよび／またはカルボキシル末端に付加され得る（例えば、精製用のタグ、検出用の標識、組換えアレルゲンの可溶性を増加させるタグ、免疫原の安定性を増加させるタグ、非関連タンパク質またはアジュバント担体タンパク質との融合など）。組換えタンパク質が精製、吸収などされた後に、付加されたセグメントの除去を可能にするように、付加されたアミノ酸セグメントと組換えタンパク質末端の連結部にタンパク質切断部位が導入され得る。組換え技術において使用される一般的な末端修飾は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．，  Ａｕｓｕｂｅｌら編，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  １９８９、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．，  Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，  ＮＹ，  １９８９に記載される。
【００２９】
１つの実施態様において、第１および第２の免疫原は、実施例において記載され、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．  （それぞれＣａｔ．  Ｎｏ．  ３９７−ＴＲ／ＣＦおよび１４９４−ＴＢ／ＣＦ））から入手した２つの免疫原と同じ組成を有する。
【００３０】
特定の実施態様において、第１の免疫原は上記のとおりであるが、第２の免疫原はマウス以外（例えば、ラット、ニワトリ、ウサギなど）の非ヒトＴｒｋＢ種由来の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む。ラットＴｒｋＢのＥＣＤは、全長タンパク質（図１４において配列番号３として記載される、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＰ＿０３６８６３）由来のアミノ酸残基Ｃ３２〜Ｈ４２９から構成される。ニワトリＴｒｋＢのＥＣＤは、全長タンパク質（図１５において配列番号４として記載される、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＣＡＡ５４４６８）由来のアミノ酸残基Ｃ３２〜Ｔ４２８から構成される。
【００３１】
一旦適切な免疫原が調製されると、免疫原は任意の広範な動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）に注射される。１つの実施態様において、免疫原は、実施例に記載のようにマウスに注射される。例えば、免疫原は、フロイント完全アジュバントを用いて皮下および腹腔内に注射される。特定の実施態様において、各動物は複数の異なる部位で皮下に注射される。この工程において、組換えタンパク質はさらなる修飾なしに免疫原として作用し得る。あるいは、組換えタンパク質がアジュバント担体タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））に結合される場合、優れた免疫応答が誘発され得る。好ましくは、１つ以上の追加免疫を組み込む、事前に決定されたスケジュールに従って、免疫原は動物宿主に注射され、そして動物は定期的に採血される。例えば、特定の実施態様において、１つ以上の追加免疫が静脈内に投与される。次いで、免疫血清と第１（および所望により第２）の免疫原との間の結合が所望により評価されて、抗体の適切な力価が生じたことが確認される。
【００３２】
一方または両方の免疫原に特異的なモノクローナル抗体は任意の標準的な方法によって調製され得る。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６：５１１，  １９７６の技術およびその改良が使用され得る。簡潔に記載すると、これらの方法は一般に、所望される特異性を有する抗体を産生する能力を有する不死細胞株の調製を含む。そのような細胞株は、例えば、上記のように免疫された１つ以上の動物から得られた脾臓細胞から製造され得る。次いで、例えばミエローマ細胞融合パートナー（好ましくは、免疫化動物と同系もの）との融合によって、脾臓細胞は不死化される。特定の実施態様において、適切な血清を有する動物は、脾臓細胞が取り出される前に、第１および／または第２の免疫原を用いて１回以上追加免疫される。種々の融合技術が用いられ得る。例えば、脾臓細胞およびミエローマ細胞は、非イオン性界面活性剤と数分間合せられ、次いでハイブリッド細胞の増殖は支持するがミエローマ細胞の増殖は支持しない選択培地上に低密度でプレーティングされ得る。特定の選択技術は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を使用する。十分な時間（通常、約１〜２週間）の後に、ハイブリッドのコロニーが観察される。単コロニーが選択され、そして下記のように第１（および所望により第２）の免疫原に対する結合活性についてそれらの培養上清が試験される。
【００３３】
モノクローナル抗体は、増殖中のハイブリドーマコロニーの上清から単離され得る。さらに、収量を増強するために種々の技術（例えば、ハイブリドーマ細胞株の適切な脊椎動物宿主（例えば、マウス）の腹腔への注入）が用いられ得る。次いで、モノクローナル抗体は、腹水または血液から回収され得る。混入物は、従来技術（例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈降および抽出）によって抗体から除去され得る。抗体アイソタイプは、標準的な方法を使用して決定され得る。実施例において考察されそして表１に示されるように、本発明者らは、これらの方法を使用して、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂに属する特異的マウス抗体を調製した。
【００３４】
３．抗体結合の特徴付け
特定の実施態様において、本発明の抗体は、ヒトＴｒｋＢに対するそれらの結合活性について特徴付けられる（例えば、実施例に記載のようなＥＬＩＳＡおよび／またはＦＡＣＳを使用して）。特定の実施態様において、細胞表面上で発現されるヒトＴｒｋＢタンパク質に対する結合もまた評価され得る（例えば、実施例に記載のようなＨＥＫ２９３細胞を使用して）。好ましくは、本発明の抗体はまた、それらの異種間結合活性（例えば、第２の免疫原との）について試験される。これは、両方の種由来のＴｒｋＢに結合するモノクローナル抗体が同定されることを可能にする。これらの抗体は、それらがまたヒト臨床試験に適用され得るとの知見を有してそれらを動物モデルにおいて試験し得るので、興味深い。
【００３５】
特定の実施態様において、任意の所定のモノクローナル抗体の結合特性をさらに特徴付けることが有利であると判明し得る。特に、競合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＳＡ）を使用して、抗体がＴｒｋＢとＢＤＮＦの相互作用をブロックするかどうかを決定し得る。また、抗体が非ヒトＴｒｋＢおよび／またはヒトＴｒｋＡもしくはＴｒｋＣに結合するかどうか評価し得る。
【００３６】
例えば、他の抗体のＴｒｋＢに対する結合のブロックにおける個別の抗体各々の活性を検討することによって、ＴｒｋＢ（ヒトまたはその他）上の相対的抗体結合エピトープのマッピングがまた実施され得る。例えば、２つの抗体が互いの結合をブロックするという観察は、これらの抗体がＴｒｋＢ上の同じエピトープまたは重複するエピトープに結合し得ることを示唆する。
【００３７】
４．抗体機能の特徴付け
特定の実施態様において、本発明の抗体は、ヒトＴｒｋＢを活性化するそれらの機能的能力について特徴付けられる。任意のアゴニストアッセイが使用され得る。実施例は、ＴｒｋＢの活性化を選択的に表すことが示された例示的なルシフェラーゼアッセイを記載する。ＴｒｋＢ自己リン酸化（例えば、ウェスタンブロットによって測定される）はまた、ＴｒｋＢ活性化の尺度として使用され得る。
【００３８】
あるいはまたはさらに、本発明の抗体のヒトＴｒｋＢアゴニスト活性は、内因性ＴｒｋＢを含むアッセイ（例えば、ヒト神経芽細胞腫ＳＹ５Ｙ細胞における）において評価され得る。実施例に記載のように、そのようなアッセイは、各抗体が神経突起成長を促進する能力、または損傷（例えば、血清除去損傷）後の分化細胞の生存を増加させる能力について試験する。特定の実施態様において、神経突起成長および／または細胞生存率に対する本発明の抗体の用量依存的な効果が測定される。
【００３９】
特定の実施態様において、精製モノクローナル抗体はまた、非ヒトＴｒｋＢ（例えば、マウス、ラット、ニワトリ、ウサギなど）を活性化するそれらの機能的能力について特徴付けられる。実施例は、抗体を、ラット小脳顆粒神経細胞（ＣＧＮ）培養物において、内因性ラットＴｒｋＢ受容体に対する活性について試験したアッセイを記載する。ヒト細胞と同じように、神経突起成長アッセイおよび神経保護アッセイが実施され得る。他の有用なアッセイは当該分野において公知であり、当業者によって認識される。
【００４０】
さらに他の実施態様においてそして実施例に記載のように、精製モノクローナル抗体は、ヒトＴｒｋＡおよび／またはＴｒｋＣを活性化するそれらの機能的能力についてさらに特徴付けられる。
【００４１】
５．ヒト化および張り合わせ抗体
治療目的のために本発明の抗体を使用する場合、目的の抗体のヒト化または張り合わせ型を使用して、任意の潜在的な免疫原性反応を減少させることが有利であると判明し得る。一般に、ヒト化または張り合わせ抗体は、ヒトレシピエントにおける非ヒト抗体の治療的適用の持続期間および有効性を制限する望まれない免疫学的な応答を最小化する。
【００４２】
非ヒト抗体由来の抗原結合部分を含むヒト化抗体の多くの調製方法が、当該分野において記載されている。特に、ヒト定常ドメインに融合されたげっ歯類可変領域およびそれらの関連相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗体が記載されている（例えば、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３，  １９９１；Ｌｏｂｕｇｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：４２２０，  １９８９；Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３８：４５３４，  １９８７；およびＢｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４７：３５７７，  １９８７を参照のこと）。適切なヒト抗体定常ドメインとの融合の前にヒト支持フレームワーク領域（ＦＲ）にグラフトされたげっ歯類ＣＤＲ（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３，  １９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４，  １９８８；およびＪｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２，  １９８６を参照のこと）ならびに組換え張り合わせげっ歯類ＦＲによって支持されたげっ歯類ＣＤＲもまた記載されている（例えば、ＥＰＯ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂ．  Ｎｏ．  ５１９，５９６を参照のこと）。
【００４３】
完全ヒト抗体は特に、ヒト患者の治療的処置に望ましい。そのような抗体は、内因性免疫グロブリンＨおよびＬ鎖遺伝子を発現できないが、ヒトＨおよびＬ鎖遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを使用して製造され得る。（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ  Ｉｎｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３：６５−９３，  １９９５、ならびにＵ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．  ５，５４５，８０６；  ５，５６９，８２５；  ５，６２５，１２６；  ５，６３３，４２５；および５，６６１，０１６を参照のこと）
【００４４】
本発明の抗体の張り合わせ型はまた、本発明の方法において使用され得る。張り合わせのプロセスは、実質的に全ての天然ＦＲタンパク質折り畳み構造を保持する抗原結合部分を含む抗体を提供するために、例えば、マウスＨまたはＬ鎖可変領域由来のＦＲ残基をヒトＦＲ残基と選択的に置換することを含む。張り合わせ技術は、抗原結合部分の抗原結合特性が、抗原会合表面内のＨ鎖およびＬ鎖ＣＤＲセットの構造および相対的配置によって主に決定されるという理解に基づく（例えば、Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５９：４３９，  １９９０を参照のこと）。従って、抗原会合特異性は、ＣＤＲ構造、それらの互いの相互作用および可変領域ドメインの残りとのそれらの相互作用が慎重に維持されたヒト化抗体においてのみ保持され得る。貼り合わせ技術を使用することによって、免疫系によって容易に遭遇される外部（例えば、溶媒接近可能）ＦＲ残基がヒト残基と選択的に置換されて、弱く免疫原性のまたは実質的に非免疫原性の張り合わせ表面のいずれかを含むハイブリッド分子を提供する。
【００４５】
６．単鎖抗体
単鎖抗体はまた、本発明の抗体に基づいて調製され得る。例えば、単鎖抗体（ｓｃＦＶ）は、例えばＣｏｌｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８８０：２６３−８０，  １９９９；およびＲｅｉｔｅｒ，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２：２４５−５２，  １９９６に記載のように加工され得る。特定の方法を実施例に記載する。単鎖抗体は、ヒトＴｒｋＢの異なるエピトープに対する特異性を有する多価抗体を生成するように２量体化または多量体化され得る。
【００４６】
７．医薬組成物
本発明のモノクローナル抗体は、本発明に従ってＴｒｋＢを活性化するために混ぜ物なしで投与され得る。しかしより一般には、それらは、医薬組成物の処方のために当業者に公知の１つ以上の他の成分とともに１つ以上の抗体の治療有効量を含む医薬組成物の関連で投与され得る。
【００４７】
本明細書で使用される用語「医薬有効量」または「治療有効量」は、意味ある患者の利益（すなわち、ＴｒｋＢ活性化を必要とする状態の処置、予防または寛解）を示すために十分である医薬組成物または方法の各有効成分の総量を意味する。単独で投与される個別の有効成分に適用される場合、用語はその有効成分単独をいう。有効成分の組み合わせに適用される場合、組み合わせで、連続してまたは同時にのいずれで投与されるかどうかにかかわらず、用語は治療効果をもたらす有効成分の組み合わされた量をいう。
【００４８】
本発明の特定の実施態様において、本発明の抗体は、約０．１〜約１０００ｍｇ／ｋｇ体重、または約１〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重、特定の実施態様において約１０〜約３００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の１週間当たりの用量を用いて投与される。用量は、単一養生法または１日もしくは１週間の過程にわたって２回以上の用量に分割された連続的養生法として投与され得る。送達は、ボーラスとして、または特定の実施態様において徐々の注入として（例えば、３０分間にわたる注射によって）であり得る。特定の実施態様において、１回以上のより高い用量（例えば、２、３、４倍高い）が最初に投与され得、１回以上のより低い維持用量がそれに続く。より高い用量が処置の開始時にのみまたは各処置周期の最初に投与され得る。本明細書において、これらの投与量レベルおよび他の投与量レベルは、静脈内または腹腔内投与用である。当業者は、異なる経路投与に必要とされる投与量レベルを容易に決定することができる。一般に、使用される正確な用量は、処方する医師によって決定され、そして対象の体重および投与経路だけでなく、対象の年齢および症状の重篤度にも依存することが理解される。
【００４９】
本発明に従う医薬組成物の調製において有用であるさらなる成分としては、例えば、担体（例えば、液体もしくは固体形態での）、香味剤、潤滑剤、可溶化剤、懸濁剤、充填剤、流動促進剤、圧縮補助剤、結合剤、錠剤崩壊剤、被包化材料、乳化剤、緩衝剤、保存料、甘味料、増粘剤、着色剤、粘性調節剤、安定化剤もしくは浸透圧調節剤、またはその組み合わせが挙げられる。
【００５０】
好ましくは、液体医薬組成物は１つ以上の本発明のモノクローナル抗体および１つ以上の液体担体を含んで、溶液、懸濁液、乳濁液、シロップ、エリキシル剤または加圧組成物を形成する。医薬上許容される液体担体としては、例えば、水、有機溶媒、医薬上許容される油もしくは脂肪、またはその組み合わせが挙げられる。液体担体は、他の適切な医薬添加物（例えば、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、保存料、甘味料、香味料、懸濁剤、増粘剤、色、粘性調節剤、安定化剤もしくは浸透圧調節剤、またはその組み合わせ）を含み得る。液体処方物が小児用途を意図される場合、一般に、アルコールの含有を回避することが望ましい。
【００５１】
経口または非経口投与に適切な液体担体の例としては、水（好ましくは、添加剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体）を含む）、アルコールまたはその誘導体（一価アルコールもしくは多価アルコール（例えば、グリコール）を含む）あるいは油（例えば、分別ヤシ油およびピーナッツ油）が挙げられる。非経口投与について、担体はまた、油性エステル（例えば、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピル）であり得る。加圧組成物のための液体担体は、ハロゲン化炭化水素または他の医薬上許容される噴霧剤であり得る。
【００５２】
好ましくは、固体医薬組成物は、１つ以上の固体担体および所望により１つ以上の他の添加物（例えば、香味料、潤滑剤、可溶化剤、懸濁剤、充填剤、流動促進剤、圧縮補助剤、結合剤もしくは錠剤崩壊剤または被包化材料）を含む。適切な固体担体としては、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリジン、低融点ワックスもしくはイオン交換樹脂、またはその組み合わせが挙げられる。散剤医薬組成物において、好ましくは、担体は、細かく分割された有効成分と混合された細かく分割された固体である。錠剤において、有効成分は一般に、適切な割合で必要な圧縮特性を有する担体、および所望により他の添加物と混合され、そして所望の形状および大きさに圧縮される。
【００５３】
本発明のいくつかの実施態様において、医薬組成物は、単位投与形態（例えば、錠剤またはカプセル）で提供される。そのような形態において、組成物は、適切な量の有効成分を含む単位用量に細分される。単位投与形態は、包装組成物（例えば、小包散剤、バイアル、アンプル、前充填シリンジまたはサッシェ（液体を含む））であり得る。単位投与形態は、例えば、カプセルまたは錠剤自体であり得、あるいは適切な数の任意のそのような包装形態の組成物であり得る。
【００５４】
従って、本発明はまた、ＴｒｋＢを活性化するための単位投与形態の医薬組成物を提供し、ここで組成物は、少なくとも１つの本発明のモノクローナル抗体の治療有効単位投与量を含む。当業者が認識するように、特定の医療有効単位投与量は、投与方法に依存する。
【００５５】
本発明はまた、本発明のモノクローナル抗体をＴｒｋＢ活性化を必要とする状態について処置される個体に分配するための治療包装を、提供する。いくつかの実施態様において、治療包装は、少なくとも１つの本発明のモノクローナル抗体の１つ以上の単位投与量、１つ以上の単位投与量を含む容器、および処置のための包装の使用を指示するラベルを含む。特定の実施態様において、単位用量は錠剤またはカプセル形態である。いくつかの場合、各単位投与量は治療有効量である。
【００５６】
８．他の医薬剤
本発明によれば、本発明のモノクローナル抗体は単独で投与されて、ＴｒｋＢ活性を調節し得る。あるいは、抗体は、ＴｒｋＢ活性を必要とする１つ以上の状態（症状、障害、または疾患を含む）の処置、予防または寛解において有用な１つ以上の他の医薬剤との組み合わせで（同時または順次のいずれかにかかわらず）投与され得る。
【００５７】
例えば、ＴｒｋＢ活性を調節し得る他の医薬剤は、本発明のモノクローナル抗体との組み合わせで使用され得る（ＴｒｋＢの他の活性化剤を含む）。Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．  ５，７７０，５７７；  ６，０７７，８２９；  ６，７２３，７０１および６，８００，６０７（各々その全体を出典明示で援用する）は、本発明の実施に従って有用であり得るＢＤＮＦ誘導体および組成物を記載する。
【００５８】
さらにまたはあるいは、モノクローナル抗体は、神経学的障害および疾患の処置、予防または寛解において有用である他の医薬剤と共同して使用され得る。特定の実施態様において、モノクローナル抗体は神経系への損傷（例えば、創傷、外科手術、虚血、感染症、代謝疾患、栄養失調、悪性腫瘍、有毒薬物など）によって引き起こされる障害および疾患の処置、予防または寛解において有用である薬剤と組み合わされる。ｔｈｅ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，  ５５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２００１  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｖａｌｅ，  ＮＪ出版（その関連部分を出典明示で援用する）において列挙されるものを含む、当該分野において公知の任意の適切な薬剤が使用され得ることが理解されるべきである。
【００５９】
９．治療用途
１つの態様において、本発明の抗体は、ＴｒｋＢの活性化を必要とする状態（症状、障害または疾患を含む）を処置するために有用である。そのような方法は、１つ以上の本発明の抗体の治療有効量を個体に投与することを包む。特定の実施態様において、本発明は、神経学的状態を処置するための方法を提供する。例えば、限定するものではないが、本発明の抗体は、創傷、外科手術、虚血、感染症、代謝疾患、栄養失調、悪性腫瘍、有毒薬物などによって損傷した神経系を有する個体を処置するために使用され得る。特定の例としては、脳卒中、脊髄損傷、外傷性脳損傷、網膜変性症および軸索切断が挙げられる。本発明の抗体はまた、障害（例えば、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、抑鬱および年齢関連性精神的欠陥）を処置するために使用され得る（すなわち、認知増強を提供することによって）。本発明の抗体はまた、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびそれらに関連する状態を含む、先天性または神経変性状態を処置するために使用され得る。非神経学的疾患（例えば、ガンおよび糖尿病）の処置におけるＴｒｋＢ活性化の利益もまた記載されており、そして本発明の抗体はそれゆえ、そのような関連における有用性を見出し得る（例えば、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．  ５，８７７，０１６および６，８００，６０７はそれぞれ、ガンおよび糖尿病の処置についてのＴｒｋＢ活性化の利益を記載する）。
【００６０】
本発明の方法は、成人および小児において本明細書に記載の状態を処置するために有用である。それらはまた、獣医学的適用（特に、イヌおよびネコ適用を含む）のために利用され得る。所望の場合、本明細書の方法はまた、家畜（例えば、ヒツジ、ウシ、ブタおよびウマ品種）に使用され得る。
【００６１】
本発明の方法は、例えば、非経口、静脈内、局所、経鼻、経口（頬側もしくは舌下を含む）、直腸または他の型を含む任意の適切な投与経路を介する本発明のモノクローナル抗体の送達を含む。一般に、抗体は、即時、遅延、改変、持続、パルス、または制御放出送達のために処方され得る。
【００６２】
特定の実施態様において、抗体は、注射による送達のために処方される。そのような実施態様において、投与は例えば、空洞内、静脈内、動脈内、腹腔内、くも膜下腔内、脳室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内もしくは皮下で、または注入もしくは無針注射技術を介してであり得る。そのような非経口投与について、本発明の抗体は、従来の凍結乾燥処方物中に調製および維持され、そして投与の前に医薬上許容される生理食塩水（例えば、０．９％生理食塩水）を用いて再構成され得る。注射用処方物のｐＨは、当該分野において公知のように、医薬上許容される酸（例えば、メタンスルホン酸）を用いて調整され得る。用いられ得る他の許容されるビヒクルおよび溶剤としては、リンゲル液およびＵ．Ｓ．Ｐ．が挙げられる。さらに、滅菌固定油が溶媒または懸濁媒体として慣習的に用いられる。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む、任意の無刺激性固定油が用いられ得る。さらに、脂肪酸（例えば、オレイン酸）が、注射液の調製において使用される。注射用処方物は、例えば、細菌保持フィルターを通しての濾過によって、または使用前に滅菌水もしくは他の滅菌注射用媒体中で溶解または分散され得る滅菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって滅菌され得る。
【００６３】
本発明の抗体の効果を延長するために、筋肉内または皮下注射からのその吸収を遅延させることが望ましくあり得る。そのような投与抗体の遅延吸収は、油性ビヒクル中に薬剤を溶解または懸濁することによって達成され得る。注射用デポー形態は、生分解性ポリマー（例えば、ポリ乳酸−ポリグリコリド）中に抗体のマイクロカプセル（microencapsule）マトリックスを形成することによって製造される。ポリマーに対する抗体の速度、および用いる特定のポリマーの性質に依存して、抗体放出の比率は制御され得る。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射用処方物はまた、身体組織と適合性であるリポソームまたはマイクロエマルジョン中に抗体を封入することによって調製される。
【００６４】
皮膚への局所的な適用について、抗体は、例えば、以下の１つ以上との混合物中で懸濁または溶解された有効成分を含む適切な軟膏として処方され得る：鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ろうおよび水。あるいは、それらは、例えば、以下の１つ以上の混合物中で懸濁または溶解された適切なローションまたはクリームとして処方され得る：鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水。
【００６５】
本発明の抗体はまた、鼻腔内でまたは吸入によって投与され得、加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザまたはネブライザからの、適切な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、ヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素または他の適切な気体の使用有りまたは無しでの乾燥粉末吸入器またはエアロゾルスプレー提示の形態で簡便に送達される。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、計量された量を送達するための弁を提供することによって決定され得る。加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザまたはネブライザは、抗体の溶液または懸濁液を含み得る（例えば、エタノールと噴射剤の混合物（これはさらに潤滑剤（例えば、トリオレイン酸ソルビタン）を含み得る）を溶媒として使用する）、。吸入器または注入器における使用のためのカプセルおよび薬包（例えば、ゼラチンから製造される）が、本発明の抗体および適切な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプン）の粉末混合物を含むように処方され得る。
【００６６】
経口送達を利用する本発明の方法について、そのような送達は、固体または液体処方物（例えば、錠剤、カプセル、多微粒子、ゲル、フィルム、小卵、エリキシル剤、溶液または懸濁液の形態の）を使用して達成され得る。特定の実施態様において、モノクローナル抗体は、経口錠剤またはカプセルとして投与される。例えば、子供、錠剤を嚥下する能力が損なわれている個体、または動物への投与を容易にするために、所望される場合、そのような調製物は、混合された、咀嚼可能なまたは液体の処方物または食品材料または液体であり得る。
【００６７】
好ましくは、直腸投与用の組成物は、本発明の抗体を適切な非刺激性賦形剤または担体（例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、または坐薬ワックス（これらは周囲温度では固体であるが体温では液体であり、それゆえ直腸円蓋において融解し、抗体を放出する））と混合することによって調製され得る坐薬である。保持浣腸および直腸カテーテルがまた当該分野において公知であるように使用され得る。粘性増強担体（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）はまた、直腸投与のための本発明の特定の担体である。なぜならそれらは直腸内での医薬組成物の保持を促進するからである。一般に、医薬組成物に添加される担体の容量は、組成物の保持を最大化するように選択される。特に、容量は、直腸円蓋における投与された組成物の保持を危うくするほど大きくあるべきでない。
【００６８】
１０．診断用途
別の態様において、本発明の抗体は、サンプル中のＴｒｋＢを検出するために（例えば、ＴｒｋＢの過剰または過小発現によって特徴付けられる障害を診断するために）使用され得る。そのような方法に従って、本発明の抗体は、特異的な結合を可能にする条件下でサンプルと合される。次いで、特異的な結合が検出され、それによりサンプル中のＴｒｋＢの存在が示される。
【００６９】
サンプルは、体液（例えば、脳脊髄液、血液、血清、尿など）または細胞もしくは組織の抽出物（例えば、生検サンプル）に由来し得る。結合の検出は、抗体を検出可能な物質と結合（すなわち、物理的に連結）させる（すなわち、抗体標識化する）ことによって、容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、βガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ；そして、適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【００７０】
ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳを含む、抗体結合を測定するための種々のプロトコルが当該分野において公知であり、そしてＴｒｋＢ発現の変化したまたは異常なレベルを診断するための基礎を提供する。実施例において、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳがさらに記載される。ＴｒｋＢ発現についての正常または標準的な値は、複合体形成に適切な条件下で、正常な個体から採取されたサンプルを本発明の抗体と合することによって確立される。標準的な複合体形成の量は、検出可能な物質の性質に依存して種々の方法によって定量化され得る。好ましくは、標準的な複合体形成の量は、測光手段によって定量化される。次いで、罹患個体由来のサンプル中のＴｒｋＢ発現のレベルは標準値と比較される。標準および罹患値の間の偏差は、疾患を診断するためのパラメーターを確立する。
【００７１】
特定の実施他態様において、本発明の方法は、ＴｒｋＢの過剰または過小発現によって特徴付けられる神経学的状態を診断するために使用され得る。例えば、限定するものではないが、本発明の方法は、創傷、外科手術、虚血、感染症、代謝疾患、栄養失調、悪性腫瘍、有毒薬物などによって損傷した神経系を同定するために使用され得る。特定の例としては、脳卒中、脊髄損傷、外傷性脳損傷、網膜変性症および軸索切断が挙げられる。本発明の方法はまた、障害（例えば、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、抑鬱および年齢関連精神的欠陥）を診断するために使用され得る（すなわち、認知増強を提供することによって）。本発明の方法はまた、先天性または神経変性状態（アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびそれらに関連する状態を含む）を診断するために使用され得る。
【００７２】
１１．精製用途
本発明はまた、以下の工程を包含する、抗体を使用してサンプルからＴｒｋＢを精製する方法を提供する：特異的な結合を可能にする条件下で、本発明の抗体をサンプルと合し、それによって抗体−ＴｒｋＢ受容体複合体を生じさせる工程、抗体−ＴｒｋＢ受容体複合体をサンプルの残りから分離する工程、次いで抗体をＴｒｋＢ受容体から分離し、それによって精製ＴｒｋＢ受容体を得る工程。本発明の抗体が、任意の標準的な技術（例えば、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降）によってＴｒｋＢを単離するために使用され得ることが理解される。
【実施例】
【００７３】
以下の実施例によって、本発明をさらに説明および支持する。しかし、これらの実施例が本発明の範囲をさらに制限するとは決してみなすべきではない。それとは反対に、当業者は、本発明の精神および／または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、本発明の他の実施態様、改変および等価物が存在することを容易に理解する。
【００７４】
実施例１
この実施例では、複数のＴｒｋＢ抗体の調製およびインビトロでの特徴付けおよび試験を記載する。
材料および方法
免疫原
以下の２つのタンパク質免疫原の混合物を使用して、マウス抗ＴｒｋＢ抗体を調製した：ヒトＴｒｋＢの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む第１の組換えタンパク質（ｒｈＴｒｋＢ−ＥＣＤ）（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ３９７−ＴＲ／ＣＦ）、およびマウスＴｒｋＢの細胞外ドメインを含む第２の組換えタンパク質（ｒｍＴｒｋＢ−ＥＣＤ）（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  １４９４−ＴＢ／ＣＦ）。
【００７５】
ヒトＴｒｋＢの細胞外ドメインは全長タンパク質（図１２において配列番号１として記載する、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＰ＿００６１７１）のアミノ酸残基Ｃ３２〜Ｈ４３０から構成される。マウスミエローマ細胞株ＮＳ０においてｒｈＴｒｋＢ−ＥＣＤを発現させた。単量体ｒｈＴｒｋＢ−ＥＣＤの計算上の分子量は４４ｋＤａである；しかし、グリコシル化された場合、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、それは８０〜１００ｋＤａのブロードなバンドとして移動する。
【００７６】
マウスＴｒｋＢの細胞外ドメインは全長タンパク質のアミノ酸残基Ｃ３２〜Ｈ４２９から構成される（図１３において配列番号２として記載する、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｐ１５２０９）。この実施例について使用したｍｈＴｒｋＢ−ＥＣＤにおいて、この配列は、発現の間に切断されるＮ末端ヒトＣＤ３３シグナルペプチド、およびＣ末端Ｈｉｓタグに隣接される。マウスミエローマ細胞株ＮＳ０において、ｒｈＴｒｋＢ−ＥＣＤもまた発現させた。単量体ｍｈＴｒｋＢ−ＥＣＤの計算上の分子量は、４５．９ｋＤａである；しかし、グリコシル化された場合、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、それは７５〜１００ｋＤａのブロードなバンドとして移動する。
【００７７】
免疫化スケジュール
フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）と事前に混合したｒｈＴｒｋＢ−ＥＣＤ  １０μｇを用いて、５匹の８週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。混合物を、２週間毎に４回（すなわち、０、２、４および６週目で）皮下および腹腔内に注射する部分に分離した。フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）と事前に混合したｒｍＴｒｋＢ−ＥＣＤ  １μｇを用いた皮下および腹腔内注射によって、７週目でマウスをまた免疫した。５および７週目でマウスの採血をし、血清中での抗体応答を評価した。
【００７８】
マウス抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の生成
細胞融合（１２週目に行った）の３日前、ｒｈＴｒｋＢ  １０μｇおよびｒｍＴｒｋＢ  １μｇを用いて、静脈内に、５匹のマウスのうち３匹をさらに追加免疫した。５０％  ポリエチレングリコール（ＭＷ１５００）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ７８３６４１）を使用して、４：１の比率で、これらの３匹のマウス由来の脾細胞をマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ＣＲＬ−１５８０）と融合させた。融合後に、９６ウェルプレートにおいて１×１０５細胞／ウェルで選択培地（２０％  ＦＢＳおよび５％  Ｏｒｉｇｅｎを含むＲＰＭＩ１６４０）  （ＩＧＥＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ２１０００１）、２  ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００  Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、１×ＨＥＰＥＳならびに１×ＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）（Ｓｉｇｍａ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  Ｈ０２６２）中に細胞を播種し、そして培養した。ハイブリドーマ上清を、ＥＬＩＳＡ、およびＦＡＣＳ分析によるｒｈＴｒｋＢ発現ＨＥＫ２９３安定細胞に対する染色によってｒｈＴｒｋＢとの結合についてスクリーニングした（下記を参照のこと）。続いて、陽性であると選択されたハイブリドーマ上清を、ルシフェラーゼアッセイを使用してｒｈＴｒｋＢに対するアゴニスト活性について試験した（下記を参照のこと）。段階希釈によって４回、ＦＡＣＳソーティングによって１回、選択したハイブリドーマをサブクローニングした（下記を参照のこと）。安定ハイブリドーマ培養物から馴化培地を回収した。Ｐｒｏｓｅｐ−Ａ（Ｍｏｎｔａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｐｉｎカラム，  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  Ｐ３６４８６）を使用して、ハイブリドーマ馴化培地からＩｇＧを精製した。各ｍＡｂのＩｇクラスを、マウスｍＡｂアイソタイピングキット（ＩｓｏＳｔｒｉｐ，  Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  １４９３０２７）を用いて決定した。
【００７９】
ＥＬＩＳＡ
ＴｒｋＢ特異的抗体の存在を測定するために、９６ウェルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，  Ｎｕｎｃ）を、１μｇ／ｍｌのｒｈＴｒｋＢ−ＥＤＣ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ６８８−ＴＫ）またはｒｍＴｒｋＢ−Ｆｃ  （Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄し、１％  ＢＳＡおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）を用いてウェルをブロッキングした後で、１００μｌの希釈した免疫血清またはハイブリドーマ上清を添加し、１時間室温でインキュベートした。プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＰＩＥＲＣＥ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ３１４３４）を使用し、続いて基質ＴＭＢ（ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ＴＭＢＷ＿１０００−０１）とともにインキュベートして、結合した抗ＴｒｋＢ抗体を検出した。分光光度計で、４５０ｎｍでの吸光度値を決定した。
【００８０】
ハイブリドーマ上清中でのｍＡｂ濃度を決定するために、９６ウェルプレートをＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃγ）（ＰＩＥＲＣＥ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ３１１２３）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。１％  ＢＳＡおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳを用いてウェルを洗浄およびブロッキングした後で、１００μｌの希釈したハイブリドーマ上清を１時間室温で添加した。精製アイソタイプ適合マウスＩｇＧを、抗ＴｒｋＢ  ＩｇＧ濃度の定量化についての標準として使用した。プレートを洗浄し、ＨＲＰ標識化ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃを添加し、１時間室温でインキュベートした。ウェルの洗浄後に、基質ＴＭＢを添加した。４５０ｎｍでの吸光度を決定した。
【００８１】
競合結合を使用する相対抗体結合エピトープの特徴付け
ＴｒｋＢタンパク質への抗ＴｒｋＢ  ＩｇＧの結合がどのようにしてＴｒｋＢとのＢＤＮＦの相互作用に影響を及ぼすかを決定するために、９６ウェルプレートをＰＢＳ中の０．３μｇ／ｍｌのＢＤＮＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ２４８−ＢＤ／ＣＦ）でコーティングし、一晩４℃でインキュベートした。１％  ＢＳＡおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳを用いてウェルを洗浄およびブロッキングした後で、事前にインキュベートしたハイブリドーマ上清（または希釈した免疫血清）のｒｈＴｒｋＢ−ＥＤＣ−Ｆｃとの混合物１００μｌをプレートに添加し、１時間室温でインキュベートした。プレートを洗浄した後に、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ、（Ｆｃγ）（ＰＩＥＲＣＥ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ３１４１６）を添加し、１時間室温でインキュベートした。ウェルを洗浄し、基質ＴＭＢを添加した。４５０ｎｍでの吸光度を決定した。
【００８２】
ｒｈＴｒｋＢ上の相対抗体結合エピトープをマッピングするために、９６ウェルプレートをＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌの個別のＴｒｋＢ特異的ｍＡｂの各々でコーティングし、一晩４℃でインキュベートした。１％  ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳを用いてウェルを洗浄およびブロッキングした後で、個別の事前にインキュベートしたＴｒｋＢ  ｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）およびｒｈＴｒｋＢ−ＥＤＣ−Ｆｃ（０．１μｇ／ｍｌ）の各々の混合物１００μｌをウェルに添加し、１時間室温でインキュベートした。プレートを洗浄し、そしてペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ、（Ｆｃγ）とともに１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後に、基質ＴＭＢを添加した。４５０ｎｍにおける吸光度を決定した。
【００８３】
ルシフェラーゼアッセイ
ｐｃＤＮＡ−ｈＴｒｋＢ（全長、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ＿００６１８０を参照のこと）を用いてＨＥＫ−２９３細胞をトランスフェクトすることによって、ｒｈＴｒｋＢを発現するＨＥＫ−２９３細胞の安定株を生成した。限界希釈を用いて２週間ハイグロマイシンの存在下で、トラスフェクトした細胞を選択した。最初の評価の後、研究のために細胞の単一クローンを選択した。ルシフェラーゼアッセイのために、９６ウェルプレート中、増殖培地１００μｌ中に１．５×１０４細胞／ウェルで細胞をプレーティングした。翌日、細胞を試験抗体または１０×終濃度のＢＤＮＦ  １０μｌで処理した。製造者のプロトコルに従って、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏアッセイキットを使用して、処理の１６時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。簡潔に記載すると、培地を１００μｌのＰＢＳと置換し、そして１００μｌのＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ試薬を添加した。ＴｏｐＳｅａｌを用いてプレートを密封した後で、Ｔｉｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ  Ｓｈａｋｅｒでプレートを振盪（速度約５、５分間）し、次いでＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ  ｖ２．１３機器（Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して発光を測定した。
【００８４】
ＦＡＣＳ分析
５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳを用いて、ｒｈＴｒｋＢを発現するＨＥＫ−２９３細胞をプレートから剥がし、２×１０５細胞／チューブで５ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ３５２０６３）中に移した。遠心分離（８００ｒｐｍ、４℃、３分間）することによって細胞を１回ＰＢＳで洗浄し、そして１００μｌのハイブリドーマ培養上清、精製抗体、または１％  ＦＢＳを含むＰＢＳ中に希釈した免疫血清とともに、３０分間４℃でインキュベートした。１％  ＦＢＳを含むＰＢＳ  １ｍｌを用いて細胞を３回洗浄し、３０分間４℃で暗所において、１％  ＦＢＳを含むＰＢＳ中のＰＥ標識化ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ＤＡＫＯ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  Ｒ０４８０）とともにインキュベートした。再び細胞を３回洗浄し、１％  ＦＢＳを含むＰＢＳ  ２５０μｌ中に再懸濁した。ヨウ化プロピジウムを死細胞の検出のために使用し、これを分析から除外した。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトフルオロメータ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって、５０００細胞／チューブの蛍光を計数した。
【００８５】
ＴｒｋＢ自己リン酸化アッセイ
ｒｈＴｒｋＢを発現するＨＥＫ−２９３細胞を、ＤＭＥＭ培地中、２×１０５細胞／ウェルで２４ウェルプレート中にプレーティングした。翌日、細胞を無血清ＤＭＥＭ中で９０分間インキュベートし、次いで、異なる濃度のＢＤＮＦまたは試験抗体を用いて、３０分間３７℃で刺激した。ＰＢＳで１回洗浄した後に、細胞を９５℃で事前に加熱したＬａｅｍｍｌｉ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中に溶解した。溶解物をＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を通して流し、サンプル２０μｌを４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離した。ニトロセルロース膜へのトランスファーの後、ＰＹ４９０  リン酸Ｔｒｋ特異的抗体（１：１００，  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ９１４１）を使用して自己リン酸化ＴｒｋＢバンドを検出し、続いてＨＲＰ結合抗ウサギ二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）とともにインキュベートした。ＥＣＬプラスキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、シグナルを発色させた。
【００８６】
神経突起成長アッセイ
ヒト神経芽細胞腫ＳＨ-ＳＹ５Ｙ細胞を、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１５％  ＦＢＳおよびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを補充したＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）中で増殖させた。神経突起成長アッセイのために、細胞を、４×１０３細胞／ウェルの密度で９６ウェル組織培養プレート中にプレーティングし、そして１０μＭ  オールトランスレチノイン酸（ＲＡ）とともにインキュベートして、神経細胞分化を誘導した。３日目に、結果において示すように、培地を、ＢＤＮＦまたは試験抗体を含むまたは含まない新たな培地と置換した。さらに３日間培養した後に、細胞をＩＣ-Ｆｉｘによって３０分間室温において固定し、さらにβチューブッリンＩＩＩの免疫染色について処理した。最初に、リン酸緩衝化溶液中の０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ（ＴＰＢＳ）中での短時間インキュベーションによって、細胞を透過処理した。次いで、サンプルをＴＰＢＳ中の１．５％  正常ヤギ血清（ＮＧＳ）中で３０分間インキュベートして、非特異的な結合をブロックし、続いて１．５％  ＮＧＳ／ＴＰＢＳ中の抗βチューブリンＩＩＩ  ｍＡｂ（Ｔｕｊ１，  １：１０００，  Ｃｏｖａｎｃｅ）とともにインキュベートした。Ａｌｅｘａ  ４８８マウス抗ヤギ抗体（１：５００，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して、Ｔｕｊ１シグナルを検出し、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓアレイスキャンを使用して神経突起成長を分析した。
【００８７】
一次神経細胞における神経突起促進効果の測定のために、ラットまたはマウス小脳顆粒神経細胞（ＣＧＮ）培養物を調製した。簡潔に記載すると、出生後７日目の動物由来の小脳を解剖し、小片に切断した。組織を、パパイン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．）を用いて３０分間３７℃で処理し、穏やかな研和によって分散した。遠心分離（３００ｇ、５分間）の後に、分離した細胞を、Ｂ２７補充剤、０．５ｍＭ  ｌ−グルタミンおよび２５ｍＭ  塩化カリウムを含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中で再構成し、そしてポリ−ｄ−リジンで事前にコーティングした９６ウェルＢｉｏｃｏａｔプレート（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中に１．２×１０４細胞／ウェルの密度でプレーティングした。細胞をＢＤＮＦまたは試験抗体を用いて２４時間処理し、ＩＣ−Ｆｉｘを用いて３０分間室温で固定し、そして上記のようにＴｕｊ１免疫染色のために処理した。
【００８８】
細胞生存アッセイ
ＳＨ-ＳＹ５Ｙ細胞を、９６ウェルプレート中に１×１０４細胞／ウェルでプレーティングし、そしてＲＡ（１０μＭ）とともにインキュベートして、神経細胞分化を誘導した。３日後に、培地を血清を含まない増殖培地（無血清培地）に切り替え、そして細胞をＢＤＮＦ、試験抗体またはビヒクルで処理した。さらに２日間培養した後に、製造者のプロトコルに従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ｎｏｎ-Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用するＭＴＴアッセイによって、細胞生存率を測定した。
【００８９】
神経保護アッセイ
上記のように７日齢の子からラットまたはマウスＣＧＮ培養物を調製し、７．３×１０４細胞／ウェルの密度でポリ−ｄ−リジンで事前にコーティングした９６ウェルＢｉｏｃｏａｔプレート（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中にプレーティングした。プレーティングの２４時間後に、細胞を、小脳顆粒神経細胞の有意な死滅をもたらすことが知られているカリウム血清欠乏（ＫＳＤ）損傷に供した。姉妹培養物を、ＢＤＮＦまたは試験抗体を用いて同時処理した。２４時間のインキュベーションの後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ｎｏｎ-Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、細胞生存率を測定した。
【００９０】
結果
ＴｒｋＢ免疫化マウス由来の抗体応答の評価
ＴｒｋＢに対する特異的免疫応答を評価するために、第３および第４の免疫化の１週間後に５匹の免疫化マウス（Ｍ１〜Ｍ５）から採血した。第３および第４両方の採血においてＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析によって、血清中での高い抗ＴｒｋＢ抗体力価を決定した。図１は、第４の免疫化後の採血由来の結果を表す。５匹全てのマウスが、ＥＬＩＳＡにおいてｒｈＴｒｋＢ−ＥＣＤおよびｒｍＴｒｋＢ−ＥＣＤの両方を認識する高い力価を生じた（図１Ａおよび１Ｂ）。
【００９１】
ＢＤＮＦ結合部位に相対的なｈＴｒｋＢ上の抗体結合エピトープの位置もまた評価した。競合ＥＬＩＳＡ由来の結果は、免疫採血がＭ２＝Ｍ５＞Ｍ３＞Ｍ４＝Ｍ１の順序でｒｈＴｒｋＢ−ＥＤＣ−ＦｃとＢＤＮＦとの相互作用をブロックし得ることを示した（図１Ｃ）。興味深いことに、ｒｈＴｒｋＢ−ＢＤＮＦ相互作用のブロッキングにおける抗体の有効性は、抗体結合力価と相関した（図１Ａと１Ｃを比較のこと）。ＦＡＣＳ分析によって実証されるように、全ての免疫採血もまた、ＨＥＫ−２９３細胞上の細胞表面で発現されたｒｈＴｒｋＢに結合することが示された。
【００９２】
ｈＴｒｋＢに対する免疫血清の高力価特異的結合の観察の後、これらの免疫採血を、それらのアゴニスト活性を試験するためのルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて評価した。ｒｈＴｒｋＢを発現するＨＥＫ−２９３細胞におけるルシフェラーゼ活性は、ＴｒｋＢの活性化を選択的に表すことが示されている（図２）。これらの細胞の免疫採血とのインキュベーションは、ルシフェラーゼシグナルを有意に用量依存的に増加させた（図３）。再び、アゴニスト活性の有効性は、Ｍ２＝Ｍ５＞Ｍ３＞Ｍ４＝Ｍ１の順序であった。最高の抗体力価および強力なアゴニスト活性を有する３匹のマウス（Ｍ２、Ｍ３およびＭ５）を、続くハイブリドーマ生成のために選択した。
【００９３】
モノクローナル抗体の製造
前記のように、３匹の選択したマウス（Ｍ２、Ｍ３およびＭ５）を、融合の３日前に１０μｇのｒｈＴｒｋＢ−ＥＣＤおよび１μｇのｒｍＴｒｋＢ−ＥＣＤを用いて静脈内に追加免疫した。１回目のハイブリドーマスクリーニングから、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてｒｈＴｒｋＢ−ＥＤＣ−Ｆｃに対して強く結合する９４個のクローンを取り出した。これらのクローンのうち２０個が、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてｒｍＴｒｋＢ−ＥＣＤと交差反応した。ＦＡＣＳ分析により、５４個のクローンがＨＥＫ−２９３細胞の表面上で発現されるｒｈＴｒｋＢに結合することが確認された。
【００９４】
ルシフェラーゼアッセイを使用して各クローンのＴｒｋＢアゴニスト活性を試験し、そしてさらなる特徴付けのために、１７個の最高の活性を有するハイブリドーマクローンを選択した。これらのクローンの安定化、段階希釈を用いた３回のサブクローニングおよびＦＡＣＳソーティングを用いた１回のサブクローニングの後、各馴化培地由来のモノクローナル抗体を収集し、そしてＰｒｏＳｅｐ−Ａ  （Ｍｏｎｔａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ）を使用することによって精製した。各抗体のＩｇＧアイソタイプを、Ｍｕｒｉｎｅ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ試験キットによって決定した（表１）。抗体濃度をマウスＩｇＧ定量化ＥＬＩＳＡによって決定し、１７個のクローン全てが培地上清中で良好なレベルのＩｇを産生した。
【００９５】
【表１】
2008545781.tif 000003
【００９６】
モノクローナル抗体の特徴付け
精製ＴｒｋＢ特異的モノクローナル抗体を、ｈＴｒｋＢに対するそれらの結合活性についてＥＬＩＳＡによって特徴付けた。クローン２９Ｄ７（これについては、精製後に、ＥＤ５０が１０−１１（Ｍ）から１０−１０（Ｍ）に低下した（データは示さず））を除いて、大部分の抗体が高い結合親和性（ＥＤ５０＝１０−１１（Ｍ））でｒｈＴｒｋＢと結合した。２つのクローン１２Ｆ４および１８Ｃ８は、精製後にそれらの結合活性を失い、そのゆえ優先順位リストから除外した（従って、表１中には含まれない）。ＦＡＣＳ分析を使用して、残りの１５個のＴｒｋＢ結合ｍＡｂの全てが、ＨＥＫ２９３細胞の表面上に発現されたｈＴｒｋＢと特異的に結合することもまた示された。抗体を、ＥＬＩＳＡによってｒｍＴｒｋＢに対するそれらの異種間結合活性についてもまた試験した。大部分の抗体がｒｍＴｒｋＢに対して弱く結合することが見出されたが、クローン１７Ｄ１１、１８Ｃ３および２９Ｄ７はＥＤ５０＝１０−１０〜−１１（Ｍ）でｒｍＴｒｋＢに結合することが見出された（表２）。
【００９７】
競合ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、抗体がｒｈＴｒｋＢとＢＤＮＦの相互作用をブロックするかどうか決定した。クローン２９Ｄ７はブロッキング活性を示さなかったが、クローン１７Ｄ１１、１８Ｃ３および１９Ｅ１２はｒｈＴｒｋＢ−ＢＤＮＦ相互作用を部分的にブロックした。他の全てのクローンは、ＩＣ５０＝３〜５×１０−１０（Ｍ）でｒｈＴｒｋＢ−ＢＤＮＦ相互作用をブロックした（表２）。
【表２】
2008545781.tif 000004
【００９８】
ｒｈＴｒｋＢ上の相対的抗体結合エピトープのマッピングを、他の抗体のｒｈＴｒｋＢに対する結合のブロックにおける個別抗体各々の活性を検討することによって実施した。例えば、２つの抗体が互いのｒｈＴｒｋＢとの結合をブロックするという観察は、これら抗体がｒｈＴｒｋＢ上の同じエピトープまたは重複するエピトープに結合し得ることを示唆する（表３）。表３において、事前に結合した抗体を各列に示し、一方競合する（すなわち、コーティングした）抗体を各行に示す。結果は、クローン１１Ｅ１、１９Ｅ１２および２９Ｄ７が特有のエピトープを認識し得ることを示した。クローン１７Ｄ１１および１８Ｃ３は同じ結合部位について競合するようである。残りの全てのクローンが互いに競合し、同じ結合エピトープを共有し得る。
【００９９】
【表３】
2008545781.tif 000005
【０１００】
ルシフェラーゼ活性
アゴニスト活性を実証するためにルシフェラーゼアッセイを使用して精製ＴｒｋＢ特異的抗体を検査した。全ての抗体が、１０−１０（Ｍ）の範囲のＥＣ５０でシグナルの用量依存的な増加を引き起こした（図４）。大部分の抗体について、最大シグナルウィンドウは基礎の約７倍であり、これは２００ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦによって誘導された応答（基礎の６．２倍）に匹敵した。
【０１０１】
ｍＡｂｓの機能的活性
ＴｒｋＢ結合抗体が内因性ＴｒｋＢ受容体活性化によって媒介される機能的アゴニスト活性を有するかどうか試験するために、これらの抗体を用いた処理の後に、神経突起促進効果を評価した。抗体の種特異的な結合特性に基づいて、発明者らはまず、神経細胞分化の際にＴｒｋＢを発現することが知られているヒト神経芽細胞腫ＳＹ５Ｙ細胞を利用した。以前の報告と一致して、発明者らは、ＢＤＮＦの添加が、神経突起長および分枝部位数の増加によって示されるように、神経突起成長を促進することを観察した（図５Ａおよび５Ｂ）。重要なことに、大部分の抗体はまた、ＢＤＮＦに匹敵するかまたはより優れた有効性で神経突起成長を有意に増加させた（図５Ａおよび５Ｂ）。少数の処理群の代表的な画像の例を、図５Ｃに示す。
【０１０２】
全用量応答分析のために、７つの最高の活性を有するＴｒｋＢ抗体（６Ｅ２、７Ｆ５、１１Ｅ１、１６Ｅ１１、１７Ｄ１１、１９Ｅ１２および２９Ｄ７）を選択した。それらは、約１０−１０（Ｍ）のＥＣ５０で神経突起成長の用量依存的な増加を誘導した（図５Ｄ、６Ｅ２についてのデータは得ず）。血清除去損傷後の分化ＳＹ５Ｙ細胞の生存を増加させるそれらの能力についてもまた、これらの抗体を試験した。結果は、ＢＤＮＦおよびいくつかの抗体が分化ＳＹ５Ｙ細胞を保護したことを示し、細胞生存率の用量依存的な増加を示した（図６）。
【０１０３】
また、内因性ラットＴｒｋＢ受容体に対する活性について、ラット小脳顆粒神経細胞（ＣＧＮ）培養物中で、２つのＴｒｋＢ抗体、１７Ｄ１１、１８Ｃ３および２９Ｄ７（これらはｒｍＴｒｋＢに結合することが示された）を試験した。神経突起成長アッセイおよび神経保護アッセイの両方において、２９Ｄ７のみがＢＤＮＦに匹敵する活性を示したが、一方１７Ｄ１１および１８Ｃ３は不活性であった（図７、データは示さず）。１７Ｄ１１および１８Ｃ３は、ラットＴｒｋＢ中の異なるアミノ酸を含むマウスＴｒｋＢ上のエピトープを認識することが示唆され得る。
【０１０４】
ＴｒｋＢリン酸化分析
上記の全ての活性に基づいて選択された７つのＴｒｋＢ抗体（６Ｅ２、７Ｆ５、１１Ｅ１、１６Ｅ１１、１７Ｄ１１、１９Ｅ１２および２９Ｄ７）を、ＴｒｋＢ自己リン酸化の誘導について、ウェスタン分析において評価した。全ての抗体が強力なＴｒｋＢリン酸化を導き、そしてこれらの効果はキナーゼ阻害剤Ｋ２５２ａを用いた処理によって拮抗された。このことは、これらのＴｒｋＢ結合抗体がＴｒｋＢの活性化を引き起こしたことを示す（図８）。
【０１０５】
また、内因性ラットＴｒｋＢ受容体に対する活性について、ラット小脳顆粒神経細胞（ＣＧＮ）培養物中で、２つのＴｒｋＢ抗体、１７Ｄ１１、１８Ｃ３および２９Ｄ７（これらはｒｍＴｒｋＢに結合することが示された）を試験した。神経突起成長アッセイおよび神経保護アッセイの両方において、２９Ｄ７のみがＢＤＮＦに匹敵する活性を示したが、一方１７Ｄ１１および１８Ｃ３は不活性であった（図７、データは示さず）。１７Ｄ１１および１８Ｃ３はラットＴｒｋＢ中の異なるアミノ酸を含むマウスＴｒｋＢ上のエピトープを認識することが示唆され得る。
【０１０６】
ＴｒｋＢリン酸化分析
上記の全ての活性に基づいて選択された７つのＴｒｋＢ抗体（６Ｅ２、７Ｆ５、１１Ｅ１、１６Ｅ１１、１７Ｄ１１、１９Ｅ１２および２９Ｄ７）を、ＴｒｋＢ自己リン酸化の誘導について、ウェスタン分析において評価した。全ての抗体が強力なＴｒｋＢリン酸化を導き、そしてこれらの効果はキナーゼ阻害剤Ｋ２５２ａを用いた処理によって拮抗された。このことは、これらのＴｒｋＢ結合抗体がＴｒｋＢの活性化を引き起こしたことを示す（図８）。
【０１０７】
ＡＴＣＣ寄託
１７Ｄ１１および２９Ｄ７  ＴｒｋＢ抗体を産生するハイブリドーマを、２００５年８月１８日にＡＴＣＣに寄託し、それぞれＡＴＣＣ特許寄託名ＰＴＡ−６９４８およびＰＴＡ−６９４９が与えられた。
【０１０８】
実施例２
この実施例では、複数のＴｒｋＢ抗体のさらなるインビトロでの特徴付けおよび試験を記載する。特に、この実施例では、実施例１の抗体のいくつかのＴｒｋＢ対ＴｒｋＡおよびＴｒｋＣ特異性を評価するために行った実験を記載する。
【０１０９】
材料および方法
ＦＡＣＳ分析
ヒトＴｒｋＡを発現するＨＥＫ−２９３細胞を５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳを用いてプレートから剥がし、５ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ３５２０６３）中に２×１０５細胞／チューブで移した。遠心分離（８００ｒｐｍ、４℃、３分間）することによって細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１％  ＦＢＳを含むＰＳＢ中に希釈した免疫血清またはハイブリドーマ培養上清１００μｌとともに３０分間４℃でインキュベートした。１％  ＦＢＳを含むＰＢＳ  １ｍｌで細胞を３回洗浄し、そして１％  ＦＢＳを含むＰＢＳ中のＰＥ標識化ヤギ抗マウスＩｇＧ，  Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ＤＡＫＯ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  Ｒ０４８０）とともに暗所で３０分間４℃でインキュベートした。再び細胞を３回洗浄し、１％  ＦＢＳを含むＰＢＳ  ２５０μｌ中に再懸濁した。ヨウ化プロプロビジウムを死細胞の検出のために使用し、これを分析から除外した。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトフルオロメータ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって５０００細胞／チューブの蛍光を計数した。
【０１１０】
ルシフェラーゼアッセイ
ヒトＴｒｋＡ（またはヒトＴｒｋＣ）を発現するＨＥＫ−２９３細胞の安定株を調製した。限界希釈を用いて２週間ハイグロマイシンの存在下で、トランスフェクトした細胞を選択した。最初の評価の後、研究のために細胞の単一クローンを選択した。ルシフェラーゼアッセイのために、９６ウェルプレート中、増殖培地１００μｌ中に１．５×１０４細胞／ウェルで細胞をプレーティングした。翌日、細胞を試験抗体または１０×終濃度のＮＧＦ（もしくはＮＴ−３）１０μｌで処理した。製造者のプロトコルに従って、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏアッセイキットを使用して、処理の１６時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。簡潔に記載すると、培地を１００μｌのＰＢＳと置換し、そして１００μｌのＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ試薬を添加した。ＴｏｐＳｅａｌでプレートを密封した後で、Ｔｉｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ  Ｓｈａｋｅｒでプレートを振盪（速度約５、５分間）し、次いでＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ  ｖ２．１３機器（Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して発光を測定した。
【０１１１】
結果
モノクローナル抗体のＦＡＣＳ分析
ＦＡＣＳによって、ヒトＴｒｋＡに対するそれらの結合活性について、表１の各ＴｒｋＢ特異的モノクローナル抗体についての混ぜ物なしの馴化培地を特徴付けた。試験した全ての抗体は、ヒトＴｒｋＡに結合できなかった。詳細には、約５〜約６０μｇ／ｍｌの範囲の濃度（表１中の各抗体についての詳細な濃度を参照のこと、これらは約３０〜約５００ｎＭの範囲の濃度に対応する）で抗体を試験し、そして各抗体はいかなる検出可能な結合も示さなかった。ＦＡＣＳデータを図９Ａに示す。
【０１１２】
ルシフェラーゼ活性
また、アゴニスト活性を評価するためにＴｒｋＡまたはＴｒｋＣルシフェラーゼアッセイを使用して表２の精製ＴｒｋＢ特異的抗体のサブセットを検査した。試験した抗体のいずれも、ＴｒｋＡまたはＴｒｋＣを活性化しなかった。詳細には、約３μｇ／ｍｌ（約２０ｎＭ）までの濃度で抗体を試験し、そして各々の場合において、抗体は基礎を超える検出可能な増加を引き起こさなかった（ＴｒｋＡについては図９Ｂを、そしてＴｒｋＣについては図１０を参照のこと）。対照的に、ＮＧＦはＴｒｋＡについて３００ｎｇ／ｍｌで基礎の約６倍の増加を誘導し（図９Ａ）、そしてＮＴ−３はＴｒｋＣについて３００ｎｇ／ｍｌで基礎の約６倍のシグナル増加を誘導した（図１０）。
【０１１３】
実施例３
この実施例では、新生児虚血性低酸素症（ＨＩ）のげっ歯類モデルにおける複数のＴｒｋＢ抗体のインビボ試験を記載する。
【０１１４】
材料および方法
動物および外科的手順
新生児虚血性低酸素症（ＨＩ）のげっ歯類モデルは、図１１に記載するＬｅｖｉｎｅ手順に基づいた（例えば、Ｌｅｖｉｎｅ，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ３６：１−１７，  １９６０；  Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．，  ９：１３１−１４１，  １９８１およびＧｉｄｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｌｅｔｔ．  １６８：２２１−２２４，  １９９４を参照のこと（各々を出典明示で援用する））。簡潔に記載すると、Ｐ７の子を２．５％ハロタンを用いて麻酔し、そして左総頸動脈を永久結紮した。切開部を縫合した後に、回復および給餌のために子を飼育ケージに戻した。２時間後に、子を個別の容器に入れ、そこを通して加湿８％酸素を流した。２．５時間の虚血性低酸素期間の後に、子をそれらの飼育ケージに戻した。処置のために、動物に、低酸素性発作の直前に０．１または０．３ｎｍｏｌの、ＢＤＮＦ、抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体２９Ｄ７、コントロールＩｇＧ１またはビヒクルのいずれかの脳室内注射５μｌを与えた。
【０１１５】
脳組織損失の評価
Ｐ１４で、何匹かのマウスから脳切片を調製して、ＨＩ損傷によって引き起こされた損傷を決定した。線状体、皮質および海馬の冠状切片を、クレシルバイオレットを用いて染色し、病変半球における％領域損失をインタクトな領域と比較した。図２３は、異なる処置について線状体および海馬から得られた染色を比較する。図２４Ａおよび２４Ｂは、それぞれ異なる処置についての総脳組織損失および小領域組織損失を比較する。データを平均および平均の標準偏差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）として示す。ＢＤＮＦおよび抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体２９Ｄ７は、有意な用量依存的なＨＩ損傷からの脳の保護を示した。保護は脳のいかなる特定の小領域にも局在化していなかったが、最大の保護は一般に皮質において観察された。
【０１１６】
生化学的分析
ＨＩ損傷の２４時間後に、生化学的分析のために、マウスのサブセットから脳切片を調製した。海馬および皮質脳組織を解剖し、溶解し、そしていくつかの生化学的アッセイに供した。
【０１１７】
ＤＥＶＤ−ＡＭＣ切断アッセイを使用して、カスパーゼ３活性を決定した（例えば、Ｎａｇａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ８４：２３，  ２００２を参照のこと（出典明示で援用する））。異なる試験試薬０．１ｎｍｏｌを与えたマウスについて、脳の異なる領域についての結果を図２５に示す（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ）。ＢＤＮＦおよび抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体２９Ｄ７は、ＨＩ損傷によって引き起こされるカスパーゼ３活性化をブロックした。
【０１１８】
０．３ｎｍｏｌの異なる試験試薬で処置したマウス由来のタンパク質サンプル（３０μｇ／レーン）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、特定のカスパーゼ３基質（ＰＡＲＰおよびαスペクトリン）に対する抗体を用いたイムノブロッティングに供した。βアクチンに対する抗体をコントロールとして使用して、負荷したタンパク質が等しいことを確認した。図２６に示す結果は、ＢＤＮＦおよび抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体２９Ｄ７によるこれらのカスパーゼ３基質の切断の阻害を実証する（頸動脈結紮のＣ＝対側およびＩ＝同側）。
【０１１９】
フォローアップ実験
以下は、この研究のマウスに対して実施し得る予言的フォローアップ実験である。空間学習および記憶試験における残りのマウスの成績を評価し得る（例えば、限定するものではないが、Ａｌｍｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １６６：９９−１１４，  ２０００（出典明示で援用する）に記載される試験）。例えば、マウスをＰ２０〜Ｐ３０の間で試験し得る。所望により、その期間の間の数日にわたって、またはより後の時点でさえ成績を評価し得る。
【０１２０】
陽性の結果（脳組織損失の減少、空間学習および記憶における改善またはその他によって測定される）を生じる処置プロトコルを、投与量のより広い範囲にわたってさえ反復し得る。あるいはまたはさらに、処置プロトコルを、異なった型の投与（例えば、腹腔内投与、静脈内投与など）を用いて；異なる開始点（例えば、結紮前、低酸素の直後、低酸素後の可変遅延を用いてなど）を用いて；および／または異なる持続期間または頻度（例えば、損傷後に２週間毎日処置）を用いて反復し得る。
【０１２１】
実施例４
この実施例では、ヒトＴｒｋＢに対するヒト単鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）抗体の調製および試験を記載する。以下の方法を使用して、単鎖Ｆｖフラグメントを含むヒト抗体ファージディスプレイライブラリー（ＣＳ，  ＢＭＶおよびＤＰ−４７；  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をＴｒｋＢ結合について選択した。
【０１２２】
材料および方法
パニングによる抗体の選択
１０μｇのｈＴｒｋＢ−ＥＤＣ−Ｆｃを１００μｌ中でＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート上にコーティングし、一晩４℃で放置した。ファージライブラリーを事前にブロッキングし（２×ＰＢＳ中の６％スキムミルク５０μｌに添加したファージアリコート５０μｌ）、１時間室温でＰＳＧＬ−Ｆｃ（Ｗｙｅｔｈ，  Ｌｏｔ．  Ｎｏ．  ００Ｈ２５Ｍ００４）に対してネガティブ選択をして、Ｆｃに対して反応性のファージを枯渇させた。除外したファージを標的タンパク質コーティングプレート（ｈＴｒｋＢ−ＥＤＣ−Ｆｃ）に移し、室温で２時間インキュベートした。ウェルを、ＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を用いて１０回、そしてＰＢＳを用いて５回洗浄した。結合したファージを新たに作製した１００ｍＭ  ＴＥＡ（超純水１０ｍｌ中のＴＥＡ  １４０μｌ）５０μｌ／ウェルを用いて溶出した。滅菌１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５  ２５μｌを使用して、溶出したファージを中和した。ファージを、対数増殖期中期（６００ｎｍでのＯ．Ｄ＝０．５）のイーコリＴＧ１細胞１０ｍｌに感染させた。形質転換した細胞を２×ＴＹＡＧ寒天Ｂｉｏａｓｓａｙプレート上に広げ、一晩３０℃でインキュベートした。
【０１２３】
可溶性ファージ選択（ビオチン選択）
以下の例外を有して、上記のプロトコルに従ってビオチン化ｈＴｒｋＢ−ＥＤＣ−Ｆｃを使用して、ファージ抗体を選択した。まず、１００ｎＭビオチン化ＰＳＧＬ−Ｆｃに対して、事前にブロッキングしたファージを除外し、続いて１００  ｎＭビオチン化ｈＴｒｋＢ−ＥＤＣ−Ｆｃに対してポジティブ選択をした。事前にブロッキングした磁性ストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ-２８０  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  １１２．０６）を使用して、ヒトＴｒｋＢ特異的ファージを捕獲した。ビーズを、ＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０で１０回、ＰＢＳで３回洗浄した。結合したファージを新たに作製した１００ｍＭ  ＴＥＡ（超純水１０ｍｌ中のＴＥＡ  １４０μｌ）２００μｌを用いて溶出し、滅菌１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５  １００μｌを溶出したファージに使用して中和して、ＴＥＡを中和した。ファージをイーコリに感染させ、上記の工程に記載のように増殖させた。
【０１２４】
ファージレスキュー
ファージを感染させたイーコリをＢｉｏａｓｓａｙ寒天プレートから掻き取り、Ｂｉｏａｓｓａｙプレート当り２×ＴＹＧＡ１０ｍｌと混合した（１００μｇ／ｍｌ  Ａｍｐおよび２％グルコースを含む２×ＴＹ）。２×ＴＹＡＧ  ２０ｍｌを細胞懸濁物１００μｌとともにインキュベートし、３７℃（３００ｒｐｍ）で６００ｎｍでのＯＤ＝０．３〜０．５まで増殖させた。イーコリをＭＫ１３ＫＯ７ヘルパーファージ３．３μｌに重感染させ、３７℃（１５０ｒｐｍ）で１時間インキュベートした。重感染させた細胞を、２×ＴＹＡＫ培地（２×ＴＹ／１００μｇ／ｍｌ  Ａｍｐ／５０μｇ／ｍｌカナマイシン）２０ｍｌ中に再懸濁し、一晩２５℃、２８０ｒｐｍで増殖させた。イーコリを３５００ｒｐｍで１５分間スピンし、ファージを含む上清を次回の選択のために使用した。
【０１２５】
ＥＬＩＳＡのためのファージ抗体調製
感染させたイーコリの単コロニーを、１ウェル当り２×ＴＹＡＧ培地（２％グルコース）１５０ｍｌを含むマイクロタイターウェル（Ｃｏｓｔａｔ  Ｃｅｌｌｗｅｌｌｓ）に取り出した。クローンを３７℃（１００〜１２０ｒｐｍ）で５〜６時間（６００ｎｍでのＯＤ＝０．５）増殖させた。Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージストック（１０１３ｐｆｕ／ｍｌ）を２×ＴＹＡＧ培地を用いて１：１０００に希釈し、２０μｌを各ウェルに添加した。ウェルを、３７℃（１００ｒｐｍ）で１時間インキュベートした。プレートを、遠心分離（３２００ｒｐｍ、１０分間）し、上清を除き、そして細胞を２×ＴＹＡＫ培地１５０μｌ中に再懸濁した。培養物を一晩２５℃（１２０ｒｐｍ）で増殖させた。翌日、プレートを遠心分離（３２００ｒｐｍ、１５分間）し、そして上清をファージＥＬＩＳＡアッセイのために新たなプレートに移した。
【０１２６】
ファージＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌ  ｈＴｒｋＢ−ＥＤＣ−Ｆｃ（コントロールとしてＢＳＡ）５０μｌ／ウェルで、４℃で一晩コーティングした。ウェルを、ＰＢＳで３回リンスし、ＰＢＳ／３％スキムミルク  ３００μｌ／ウェルを用いて室温で１時間ブロッキングした。ファージを、等量のＰＢＳ／６％スキムミルクでブロッキングし、室温で１時間インキュベートした。ブロッキングしたファージ５０μｌをＥＬＩＳＡウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎで３回、続いてＰＢＳで３回洗浄した。ＰＢＳ／３％  スキムミルク中のＨＲＰ−マウス抗Ｍ１３抗体（１：５０００，  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ２７−９４２１−０１）５０μｌを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、ＴＭＢ基質５０μｌを各ウェルに添加し、２〜５分間発色させた。０．５Ｍ硫酸５０μｌを添加することによって反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。
【０１２７】
ＦＡＣＳのための単鎖Ｆｖ調製
単コロニーを取り出し、３７℃で５〜６時間２×ＴＹＡＧ培地０．９ｍｌを含むディープウェルマイクロタイタープレート中で増殖させた。２×ＴＹ培地中０．０２ｍＭの終濃度になるようにＩＰＴＧを添加することによってｓｃＦｖ発現を誘導し、３０℃で一晩増殖させた。一晩の増殖の後にイーコリを回収し、水中で１：５希釈したＴＥＳ緩衝液１５０μｌを用いて浸透圧ショックし、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を遠心分離し、上清をＦＡＣＳアッセイのために新たなプレートに移した。ＴｒｋＢを用いて安定にトランスフェクトされた２９３細胞を、上記のように調製したｓｃＦｖを用いて染色した。細胞を氷上で３０分間インキュベートし、次いでＰＢＳ緩衝液で洗浄した。１：１０００に希釈した９Ｅ１０抗ｍｙｃ抗体を含む溶液を使用し、続いて１：５００に希釈したＰＥ結合抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ抗体を添加することによって単鎖Ｆｖを検出した。染色した細胞を、Ｂｅｃｔｉｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで分析した。
【０１２８】
結果
ファージＥＬＩＳＡ
表４は、異なるファージライブラリー選択（パニングおよび可溶性選択）からのファージＥＬＩＳＡアッセイ由来の結果を示す。図１８は、ＴｒｋＢ陽性クローン（ＢＭＶライブラリーパニング選択）の代表的なセット由来のファージ結合ＥＬＩＳＡデータを示す。大部分のＴｒｋＢ選択クローンは、ＴｒｋＢ−ＥＤＣ−Ｆｃに対して強く特異的な反応性を示し、コントロールタンパク質ＰＳＧＬ−Ｆｃに対してはそうではなかった。
【０１２９】
【表４】
2008545781.tif 000006
【０１３０】
２回のパニング選択の後で、ＣＳライブラリーからランダムに取り出したクローンの７８％がＴｒｋＢ−ＥＤＣ−Ｆｃ結合について陽性であったが、ＰＳＧＬ−Ｆｃ結合についてはそうでなかった。同様に、２回の可溶性選択の後で、クローンの３％は陽性であった。ＢＭＶおよびＤＰ−４７ライブラリーについての数は、パニング選択からは５８％および４５％陽性クローンであり、可溶性選択からは６％および１０％であった。ＤＮＡ配列決定を使用して、本発明者らは、ＣＳパニングクローンの５３％は特有であり、一方ＣＳ可溶性選択クローンの１００％が特有であることを確認した。ＢＭＶおよびＤＰ−４７ライブラリーについての数は、パニング選択からは２３％および３９％特有であり、可溶性選択からは５０％および５０％特有であった。
【０１３１】
ＦＡＣＳ分析
図１９は、ＦＡＣＳアッセイを使用して試験したＴｒｋＢ選択ｓｃＦｖ抗体の結合特異性を示す。データは、ＴｒｋＢ選択ｓｃＦｖ抗体が、特異的に（青色塗りつぶしヒストグラム）、コントロール細胞に対する交差反応性を有さないで（緑色白抜きヒストグラム）脱会合ＴｒｋＢと反応することを示す。
【０１３２】
実施例５
この実施例では、２９Ｄ７  ＴｒｋＢ抗体および２９Ｄ７  ＦａｂフラグメントのヒトおよびマウスＴｒｋＢに対する結合活性を比較する。実施例１に記載のように、マウス（ｒｈＴｒｋＢ−ＥＤＣ−Ｆｃ）およびヒト（ｒｍＴｒｋＢ−ＥＤＣ）ＴｒｋＢをＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。
【０１３３】
図２０Ａおよび２０Ｂは、それぞれヒトおよびマウスＴｒｋＢについてのＥＬＩＳＡ結合結果を示す。２９Ｄ７  ＩｇＧ抗体およびそのＦａｂフラグメントの両方が、ヒトおよびマウスＴｒｋＢに対して用量依存的な結合活性を有する。しかし、ＦａｂのＥＤ５０値は、インタクトな２７Ｄ７のものより約１００倍低かった。アイソタイプコントロールＩｇＧ１もそのＦａｂフラグメントもＴｒｋＢに結合しなかった。
【０１３４】
実施例６
この実施例では、実施例５の、２９Ｄ７  ＴｒｋＢ抗体およびＦａｂフラグメントのヒトＴｒｋＢに対するアゴニスト活性を比較する。実施例１に記載のルシフェラーゼアッセイ、および表面ｒｈＴｒｋＢを発現するＨＥＫ−２９３細胞を使用して、アゴニスト活性を検討した。
【０１３５】
ＨＥＫ２９３細胞を、示した濃度の２９Ｄ７  ＩｇＧまたは２９Ｄ７  Ｆａｂを用いて処理し、蓄積したルシフェラーゼ活性を処理の１６時間後に測定した。図２１に示すように、２９Ｄ７の全ＩｇＧおよびＦａｂの両方が用量依存的なルシフェラーゼ活性を誘導し、ＴｒｋＢの活性化を示した。しかし、２９Ｄ７  ＦａｂのＥＣ５０値は、２７Ｄ７  ＩｇＧのものより約２７倍高かった（２７Ｄ７  ＩｇＧおよび２９Ｄ７  Ｆａｂについて、それぞれ０．０８３ｎＭおよび２．２８ｎＭ）。アイソタイプコントロールＩｇＧ１もそのＦａｂフラグメントもＴｒｋＢ活性化に対して効果を有さなかった。
【０１３６】
実施例７
この実施例では、特定の本発明のＴｒｋＢモノクローナル抗体のエピトープマッピング分析を記載する。ヒトＴｒｋＢ細胞外ドメイン内の配列から推定される直鎖状、単ループおよび二重ループペプチドに対して、マッピングを実施した。
【０１３７】
図２２に示すように、１７Ｄ１１モノクローナル抗体はヒトＴｒｋＢのＩｇＧ２セグメントのループ３（ＫＮＥＹＧＫＤ、配列番号７、配列番号１のアミノ酸３６４〜３７０）；およびヒトＴｒｋＢのＩｇＧ２セグメントのループ１（ＫＧＮＰＫＰ、配列番号８、配列番号１のアミノ酸３０８〜３１３）を認識する。前者のエピトープに対するマウス配列（ＫＮＥＹＧＫＤ、配列番号７、配列番号２のアミノ酸３６４〜３７０）は、ヒト配列と同一である。後者のエピトープに対するマウス配列（ＲＧＮＰＫＰ、配列番号９、配列番号２のアミノ酸３０８〜３１３）は、１つのアミノ酸で異なる。
【０１３８】
図２２に示すように、２９Ｄ７、７Ｆ５、１１Ｅ１および１９Ｅ１２モノクローナル抗体の全てが、ヒトＴｒｋＢのＩｇＧ１セグメントのループ３（ＥＮＬＶＧＥＤ、配列番号１０、配列番号１のアミノ酸２６９〜２７５）を認識し；そしてヒトＴｒｋＢのＩｇＧ１セグメントのループ１（ＡＧＤＰＶＰ、配列番号１１、配列番号１のアミノ酸２２１〜２２６）もまた認識し得る。前者のエピトープに対するマウス配列（ＥＮＬＶＧＥＤ、配列番号１０、配列番号２のアミノ酸２６９〜２７５）は、ヒト配列と同一である。後者のエピトープに対するマウス配列（ＧＧＤＰＬＰ、配列番号１２、配列番号２のアミノ酸２２１〜２２６）は、２つのアミノ酸で異なる。
【０１３９】
実施例８
この実施例では、抗ＴｒｋＢ抗体２９Ｄ７を用いて実施したインビボでのＴｒｋＢ活性化実験を記載する。簡潔に記載すると、Ｐ７の子に０．３ｎｍｏｌの、抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体２９Ｄ７またはビヒクルのいずれかの脳室内注射５μｌを与えた。次いで、注射の１、２、６、１２および２４時間後に、脳組織を解剖した。組織を溶解し、等量のタンパク質サンプル（３０μｇ／レーン）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＴｒｋＢ活性化の結果としてリン酸化されたタンパク質（リン酸−ＥＲＫ１／２およびリン酸−ＡＫＴ）に特異的な抗体を用いたイムノブロッティングに供した。βアクチンに対する抗体をコントロールとして利用して、負荷したタンパク質が等しいを確認した。図２７の結果は、抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体２９Ｄ７が、ＥＲＫ１／２およびＡＫＴの時間依存的なリン酸化を誘導することを示す（海馬および皮質サンプル由来のデータを示し、これは４つの他のサンプルから得られた結果の代表である）。
【０１４０】
図２８は、図２７に示すＥＲＫリン酸化の濃度測定定量である。図２９は図２７に示すＡＫＴリン酸化の濃度測定定量である。図３０は、固定し、神経細胞特異的マーカーＮｅｕＮに対する抗体（左）および抗リン酸ＥＲＫ１／２抗体（中央）を用いて免疫蛍光標識化した、ビヒクルおよび２９Ｄ７処理した脳組織を示す。右の図は、これらの２つを合わせたものを示す。ＥＲＫ１／２リン酸化は、２９Ｄ７処理したサンプルにおいて有意により強い。図３１は、抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体２９Ｄ７の脳室内注射後の、皮質および海馬組織におけるＥＲＫ１／２活性化の経時変化を示す。
【０１４１】
実施例９
この実施例では、抗ＴｒｋＢ抗体２９Ｄ７を用いて実施したＭＡＧ／ミエリン誘導神経突起阻害アッセイを記載する。簡潔に記載すると、組換えラットＭＡＧ（１−５）または精製ラットミエリン５０μｌのアリコートを９６ウェル平底組織培養プレートに添加し、一晩室温で風乾した。別に示さない限り、ＭＡＧ（１−５）またはミエリンの全量は、０．２５〜０．５μｇ／ウェルであった。翌日、ＭＡＧまたはミエリンコーティングプレートをポリ−Ｄ−リジン（１７μｇ／ｍｌ）５０μｌで１．５時間処理し、続いて１０％  ＦＢＳを含む培地とともに１時間３７℃でインキュベートした。培地の吸引後に、ラットＣＧＮ細胞を、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２Ｍ  ＫＣｌおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＢ２７補充Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ増殖培地中に８０００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。示した場合、処理試薬を細胞のプレーティング時に添加した。神経細胞を、５％  ＣＯ２で平衡化した３７℃インキュベーター中で増殖させた。プレーティングの約２０時間後に、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、Ｔｕｊｌ染色のために処理した。細胞を０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ／ＰＢＳ（ＴＰＢＳ）を用いて５分間室温で透過処理し、続いてＴＰＢＳ中の１．５％正常ヤギ血清（Ｓ−ＰＢＳ）とともに３０分間インキュベートして、非特異的な結合をブロックした。ａｎｔｉ−Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｃｌａｓｓ  ＩＩＩ  ｂ  Ｔｕｂｕｌｉｎモノクローナル抗体（Ｔｕｊ１，  １：１０００；  Ｃｏｖａｎｃｅ  ＃  ＭＭＳ−４３５Ｐ）のアリコートを、細胞に添加した。１時間室温でインキュベートした後で、ＰＢＳを用いて非結合抗体を３回洗浄し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８マウス抗ヤギＩｇＧ抗体（１：５００，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ  ＃  Ａ−１１００１）のアリコートを添加して、シグナルを可視化した。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ  ＃  Ｈ−３５７０，  ２μｇ／ｍｌ）を核を標識するために含めた。洗浄した後に、プレートを密封し、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓアレイスキャンを使用して神経突起成長について分析した。代表的には、１ウェルあたり、９つの領域由来の約３００個の細胞を分析し、各処置を四連で行った。
【０１４２】
ＭＡＧおよびミエリンは、培養物中の一次小脳顆粒神経細胞の神経突起成長を阻害する。漸増濃度の組換えラットＭＡＧ（１−５）または精製ラットミエリンを９６ウェル組織培養プレート上にコーティングし、一次神経細胞の神経突起伸展を、上記のように２０時間目に測定した。図３２に示すように、（Ａ）ＭＡＧおよび（Ｂ）ミエリンは、神経突起成長の用量依存的な阻害をもたらした。
【０１４３】
次いで、コントロールまたは一定の範囲の濃度のＴｒｋＢ抗体２９Ｄ７とともに、ＣＧＮ神経細胞をＭＡＧまたはミエリンのいずれかでコーティングしたプレートにプレーティングした。神経突起伸展を、処理の２０時間後に測定した。図３３に示すように、２９Ｄ７は、（Ａ）ＭＡＧおよび（Ｂ）ミエリン媒介神経突起阻害の逆転を導いた。
【０１４４】
他の実施態様
本発明の他の実施態様は、本明細書で開示される本発明の明細書または実施の考慮から当業者にとって明白となる。明細書および実施例は例示のみとして考えられ、本発明の真の範囲は特許請求の範囲によって示されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】図１は、５匹の免疫化マウス（Ｍ１〜Ｍ５）由来の免疫血清中のＴｒｋＢ特異的抗体活性を示す。ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合されたヒトＴｒｋＢの細胞外ドメインを含む組換えタンパク質（ｒｈＴｒｋＢ−ＥＤＣ−Ｆｃ）を用いたＥＬＩＳＡアッセイ由来の免疫血清結合結果を（Ａ）において示す。マウスＴｒｋＢの細胞外ドメインを含む組換えタンパク質（ｒｍＴｒｋＢ−ＥＤＣ）を用いたＥＬＩＳＡアッセイの免疫血清結合結果を（Ｂ）に示す。競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、免疫血清がｒｈＴｒｋＢ−ＥＤＣ−ＦｃとＢＤＮＦとの相互作用をブロックし得る程度を（Ｃ）に示す。ＨＥＫ−２９３細胞上の表面ｒｈＴｒｋＢへの免疫血清結合を（Ｄ）に示す。
【図２】図２は、表面ｒｈＴｒｋＢを発現するＨＥＫ−２９３細胞を使用するルシフェラーゼ活性アッセイにおいてニューロトロフィンを用いて得られたコントロール結果を示す。これらのコントロール結果は、アッセイがＴｒｋＢの活性化を選択的に表し得ることを示す。
【図３】図３は、図２と同じルシフェラーゼ活性アッセイにおいて、免疫血清を用いて得られた結果を示す。これらの結果は、ｈＴｒｋＢ細胞の免疫採血とのインキュベーションが、用量依存的にルシフェラーゼシグナルを有意に増加させたことを示す。
【図４】図４は、図２と同じルシフェラーゼ活性アッセイにおいて、特定のＴｒｋＢ抗体を用いて得られた結果を示す。全ての抗体が、１０−１０（Ｍ）の範囲のＥＣ５０でシグナルの用量依存的な増加を行き起こした。最大シグナルウィンドウは、大部分の抗体について基礎の約７倍であり、これは２００ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦによって誘導された応答（基礎の６．２倍）に匹敵した。
【図５】図５は、神経突起成長アッセイにおいて特定のＴｒｋＢ抗体を用いて得られた結果を示す。アッセイは、神経細胞分化に際してＴｒｋＢを発現することが知られているヒト神経芽細胞腫ＳＹ５Ｙ細胞を使用した。神経突起長（Ａ）および分枝部位数（Ｂ）の増加によって実証されるように、ＢＤＮＦおよび大部分の抗体の添加は、神経突起成長を促進した。少数の処理グループの代表的な画像を（Ｃ）に示す。これらの抗体のサブセットについて得られた全用量応答分析の結果を（Ｄ）に示す。
【図６】図６は、神経保護アッセイにおいて特定のＴｒｋＢ抗体を用いて得られた結果を示す。アッセイは、血清除去損傷後の分化ＳＹ５Ｙ細胞の生存を測定する。結果は、ＢＤＮＦおよびいくつかの抗体が分化ＳＹ５Ｙ細胞を保護したことを示し、このことは用量依存的な細胞生存率の増加を実証する。
【図７】図７は、組換えマウスＴｒｋＢ（ｒｍＴｒｋＢ）に結合することが示された３つの抗ＴｒｋＢ抗体（１８Ｃ３、２９Ｄ７および１７Ｄ１１）を、ラット小脳顆粒神経細胞（ＣＧＮ）培養物中で、内因性ラットＴｒｋＢ受容体に対する活性について試験した場合に得られた結果のいくつかを示す。神経突起成長アッセイおよび神経保護アッセイについての結果を示す（２９Ｄ７のみ）。
【図８】図８は、ＴｒｋＢ自己リン酸化の誘導について、ウェスタン分析において特定の抗ＴｒｋＢ抗体を評価した場合に得られた結果を示す。全ての抗体が強力なＴｒｋＢリン酸化を導き、これらの効果はキナーゼ阻害剤Ｋ２５２ａを用いた処理によって拮抗され、このことはこれらのＴｒｋＢ結合抗体がＴｒｋＢの活性化を引き起こしたことを示す。
【図９】図９は、特定の抗ＴｒｋＢ抗体を用いて得られたＦＡＣＳ  ＴｒｋＡ結合アッセイ（Ａ）およびＴｒｋＡルシフェラーゼ活性アッセイ（Ｂ）の結果を示す。これらの結果は、本発明の抗体がヒトＴｒｋＡ細胞と結合せず、それを活性化しないことを示す。
【図１０】図１０は、ＴｒｋＣルシフェラーゼ活性アッセイにおいて特定の抗ＴｒｋＢ抗体を評価した場合に得られた結果を示す。これらの結果は、本発明の抗体がヒトＴｒｋＣ細胞を活性化しないことを示す。
【図１１】図１１は、Ｌｅｖｉｎｅ手順に基づく新生児虚血性低酸素症（ＨＩ）のげっ歯類モデルを示す。
【図１２】図１２は、ヒトＴｒｋＢのアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図１３】図１３は、マウスＴｒｋＢのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図１４】図１４は、ラットＴｒｋＢのアミノ酸配列（配列番号３）を示す。
【図１５】図１５は、ニワトリＴｒｋＢのアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図１６】図１６は、ヒトＴｒｋＡのアミノ酸配列（配列番号５）を示す。
【図１７】図１７は、ヒトＴｒｋＣのアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図１８】図１８は、ＴｒｋＢ陽性ｓｃＦｖクローンの代表的なセット（ＢＭＶライブラリーパニング選択）由来のファージ結合ＥＬＩＳＡデータを示す。
【図１９】図１９は、ＦＡＣＳアッセイを使用して試験されたＴｒｋＢ選択ｓｃＦｖ抗体の結合特異性を示す。データは、ＴｒｋＢ選択ｓｃＦｖ抗体が、特異的に（塗りつぶしたヒストグラム）コントロール細胞に対して交差反応性を有さずに（白抜きのヒストグラム）、膜結合ＴｒｋＢと反応することを示す。
【図２０】図２０は、２９Ｄ７  ＩｇＧ抗体およびそのＦａｂフラグメントについてのヒト（Ａ）およびマウス（Ｂ）ＴｒｋＢとのＥＬＩＳＡ結合結果を示す。２９Ｄ７の全ＩｇＧおよびＦａｂの両方が、ヒトおよびマウスＴｒｋＢに対する用量依存的な結合活性を示した。しかし、ＦａｂのＥＤ５０値は、インタクトな２７Ｄ７のものより約１００倍低かった。アイソタイプＩｇＧ１もそのＦａｂフラグメントもＴｒｋＢに結合しなかった。
【図２１】図２１は、２９Ｄ７  ＩｇＧまたは２９Ｄ７  Ｆａｂを用いた処理の１６時間後に測定されたＨＥＫ−２９３細胞におけるルシフェラーゼ活性を示す。２９Ｄ７の全ＩｇＧおよびＦａｂの両方が用量依存的なルシフェラーゼ活性を誘導し、ＴｒｋＢの活性化を示した。しかし、２９Ｄ７  ＦａｂのＥＣ５０値は、２７Ｄ７  ＩｇＧのものより約２７倍高かった（２７Ｄ７  ＩｇＧおよび２９Ｄ７  Ｆａｂについて、それぞれ０．０８３ｎＭおよび２．２８ｎＭ）。アイソタイプコントロールＩｇＧ１もそのＦａｂフラグメントもＴｒｋＢ活性化に対する効果を有さなかった。
【図２２】図２２は、抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体１７Ｄ１１、２９Ｄ７、７Ｆ５、１１Ｅ１および１９Ｅ１２のエピトープマッピング分析の結果を示す。１７Ｄ１１モノクローナル抗体は、ヒトＴｒｋＢのＩｇＧ２セグメントのループ３（ＫＮＥＹＧＫＤ、配列番号７、配列番号１のアミノ酸３６４〜３７０）；および、ヒトＴｒｋＢのＩｇＧ２セグメントのループ１（ＫＧＮＰＫＰ、配列番号８、配列番号１のアミノ酸３０８〜３１３）を認識する。２９Ｄ７、７Ｆ５、１１Ｅ１および１９Ｅ１２モノクローナル抗体は全て、ヒトＴｒｋＢのＩｇＧ１セグメントのループ３（ＥＮＬＶＧＥＤ、配列番号１０、配列番号１のアミノ酸２６９〜２７５）を認識し；ヒトＴｒｋＢのＩｇＧ１セグメントのループ１（ＡＧＤＰＶＰ、配列番号１１、配列番号１のアミノ酸２２１〜２２６）もまた認識し得る。
【図２３】図２３は、虚血性低酸素症（ＨＩ）損傷後の異なる処置について、線条体および海馬から得られた染色を比較する。
【図２４】図２４は、ＨＩ損傷後の異なる処置について、全脳組織損失（Ａ）および小領域組織損失（Ｂ）を比較する。データを平均および平均の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）として示す。ＢＤＮＦおよび抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体２９Ｄ７は、ＨＩ損傷由来の脳の有意な用量依存的保護を示した。保護は、いずれの特定の脳の小領域にも局在化されなかったが、最大の保護は一般に皮質において観察された。
【図２５】図２５は、ＨＩ損傷の後の異なる処置について、カスパーゼ３活性を決定するために使用したＤＥＶＤ−ＡＭＣ切断アッセイの結果を示す。脳の異なる領域についての結果を平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示す。ＢＤＮＦおよび抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体２９Ｄ７は、ＨＩ損傷によって引き起こされたカスパーゼ３活性化をブロックした。
【図２６】図２６は、ＨＩ損傷の後に異なる処置を与えられたマウスから取得されたタンパク質サンプルのイムノブロットを示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってサンプルを分離し、特定のカスパーゼ３基質（ＰＡＲＰおよびαスペクトリン）に対する抗体を用いるイムノブロッティングに供した。βアクチンに対する抗体をコントロールとして使用して、負荷したタンパク質が等しいことを確認した。結果は、これらのカスパーゼ３基質の切断が、ＢＤＮＦおよび抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体２９Ｄ７によって阻害されたことを示す（頸動脈結紮のＣ＝対側およびＩ＝同側）。
【図２７】図２７は、抗ＴｒｋＢ抗体２９Ｄ７（または、コントロールとしてビヒクル）の脳室内注射後の正常マウスから取得されたタンパク質サンプルのイムノブロットを示す。注射の１、２、６、１２および２４時間後にサンプルを取得した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってサンプルを分離し、ＴｒｋＢ活性化の結果としてリン酸化されたタンパク質（リン酸−ＥＲＫ１／２およびリン酸−ＡＫＴ）に特異的な抗体を用いた免疫ブロッティングに供した。βアクチンに対する抗体をコントロールとして使用して、負荷したタンパク質が等しいことを確認した。結果は、抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体２９Ｄ７がＥＲＫ１／２およびＡＫＴの時間依存的なリン酸化を誘導したことを示す（海馬および皮質サンプル由来のデータを示し、これは４つの他のサンプルから得られた結果の代表である）。
【図２８】図２８は、図２７において示されるＥＲＫリン酸化の濃度測定定量である。
【図２９】図２９は、図２７において示されるＡＫＴリン酸化の濃度測定定量である。
【図３０】図３０は、固定し、神経細胞特異的マーカーＮｅｕＮに対する抗体（左）および抗リン酸ＥＲＫ１／２抗体（中央）を用いて免疫蛍光標識した、ビヒクルおよび２９Ｄ７処理脳組織を示す。右側の図は、これらの２つを合わせたものを示す。ＥＲＫ１／２リン酸化は、２９Ｄ７処理サンプルにおいて有意により強い。
【図３１】図３１は、抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体２９Ｄ７の脳室内注射後の、皮質および海馬組織におけるＥＲＫ１／２活性化の経時変化を示す。
【図３２】図３２は、（Ａ）ＭＡＧおよび（Ｂ）ミエリンによって引き起こされる一次小脳顆粒神経細胞の神経突起成長の用量依存的な阻害を示す。
【図３３】図３３は、抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体２９Ｄ７によって引き起こされる（Ａ）ＭＡＧおよび（Ｂ）ミエリン媒介神経突起阻害の逆転を示す。
【図１−１】
2008545781.tif 000007
【図１−２】
2008545781.tif 000008
【図１−３】
2008545781.tif 000009
【図２】
2008545781.tif 000010
【図３−１】
2008545781.tif 000011
【図３−２】
2008545781.tif 000012
【図４−１】
2008545781.tif 000013
【図４−２】
2008545781.tif 000014
【図５−１】
2008545781.tif 000015
【図５−２】
2008545781.tif 000016
【図５−３】
2008545781.tif 000017
【図５−４】
2008545781.tif 000018
【図６】
2008545781.tif 000019
【図７−１】
2008545781.tif 000020
【図７−２】
2008545781.tif 000021
【図８】
2008545781.tif 000022
【図９−１】
2008545781.tif 000023
【図９−２】
2008545781.tif 000024
【図９−３】
2008545781.tif 000025
【図１０】
2008545781.tif 000026
【図１１】
2008545781.tif 000027
【図１２】
2008545781.tif 000028
【図１３】
2008545781.tif 000029
【図１４】
2008545781.tif 000030
【図１５】
2008545781.tif 000031
【図１６】
2008545781.tif 000032
【図１７】
2008545781.tif 000033
【図１８】
2008545781.tif 000034
【図１９−１】
2008545781.tif 000035
【図１９−２】
2008545781.tif 000036
【図１９−３】
2008545781.tif 000037
【図１９−４】
2008545781.tif 000038
【図２０】
2008545781.tif 000039
【図２１】
2008545781.tif 000040
【図２２】
2008545781.tif 000041
【図２３】
2008545781.tif 000042
【図２４−１】
2008545781.tif 000043
【図２４−２】
2008545781.tif 000044
【図２５】
2008545781.tif 000045
【図２６】
2008545781.tif 000046
【図２７】
2008545781.tif 000047
【図２８】
2008545781.tif 000048
【図２９】
2008545781.tif 000049
【図３０】
2008545781.tif 000050
【図３１】
2008545781.tif 000051
【図３２】
2008545781.tif 000052
【図３３】
2008545781.tif 000053
【国際調査報告】
2008545781.tif 000054
2008545781.tif 000055
2008545781.tif 000056
2008545781.tif 000057