(57)【要約】【解決手段】単一の媒体内に、複数の固有な選択プローブが提供される。各選択プローブは、考慮対象であるサンプル内に存在すると考えられる固有な標的配列と相補的な配列を有する。例えば、各選択プローブは、有機体の遺伝子型を決定するために使用されるＳＮＰの１つを含む配列と相補的であってよい。一本鎖の選択プローブは、選択プローブの配列によって特定される固有な標的配列を有するサンプル配列とアニーリングまたはハイブリダイズする。選択プローブとアニーリングまたはハイブリダイズしなかったサンプル由来の配列は、結合された配列から適切な技術によって分離される。結合された配列は、次いで、隔離された標的配列の混合物を提供するために解放される。該混合物は、必要に応じて、手持ちの用途に使用することができる。【選択図】なし
2008529526.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸サンプルから標的核酸配列を隔離する方法であって、
（ａ）前記サンプルから核酸断片を生成する工程と、
（ｂ）前記核酸断片を増幅する工程と、
（ｃ）前記増幅された核酸断片を、単一の反応媒体内において、少なくとも約２，０００の個別の選択プローブに暴露する工程であって、該暴露は、前記選択プローブと、前記選択プローブと相補的な前記増幅された核酸断片と、の間のアニーリングを促進する条件下で行われ、前記選択プローブは、前記標的核酸配列と相補的な配列を有する、工程と、
（ｄ）前記選択プローブに強く結合されていない前記増幅された核酸断片を除去する工程と、
（ｅ）前記標的核酸配列である、アニーリングされた増幅された核酸断片を、前記選択プローブから解放することによって、前記標的核酸配列を隔離する工程と、
を備える方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、更に、
（ｅ）で解放された前記標的核酸配列に基づいて前記核酸サンプルを特徴付ける工程を備える方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、
前記核酸サンプルを特徴付ける工程は、前記標的核酸配列を核酸アレイにあてがうことによって実施される、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、更に、
工程（ｅ）で解放された前記標的核酸配列を増幅する工程と、
前記核酸アレイに接触させる前に、前記標的核酸配列に標識付けする工程と、
を備える方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、更に、
前記標識付けの工程に先立って、前記標的核酸断片を更に断片化する工程を備える方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれかに記載の方法であって、
前記核酸サンプルを断片化する工程は、約２５塩基対から約２，０００塩基対までの平均サイズを有する核酸断片を生成する、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、
前記核酸断片の平均サイズは、約５００塩基対である、方法。
【請求項８】
請求項１ないし５のいずれかに記載の方法であって、
工程（ａ）における核酸断片の生成は、更なる断片化を伴うことなく核酸アレイにおける遺伝子型決定を可能にする平均サイズを有する核酸断片を生成する、方法。
【請求項９】
請求項１ないし５のいずれかに記載の方法であって、
前記核酸断片を増幅する工程は、（ａ）で生成された前記核酸断片のほぼ全部に対してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施することを含む、方法。
【請求項１０】
請求項１ないし５のいずれかに記載の方法であって、更に、
前記核酸断片を増幅する工程に先立って、前記増幅の工程で用いられるプライマと相補的な配列を含有するアダプタを前記核酸断片の末端に付着させる工程を備える方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、
前記アダプタは、同一の配列をそれぞれ含む、方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法であって、
前記アダプタは、ｓｓＤＮＡ末端を伴うｄｓＤＮＡを含む、方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の方法であって、
前記核酸断片の末端に付着しない超過のアダプタは、前記核酸断片を増幅する工程においてプライマとして機能する、方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載の方法であって、
前記アダプタを付着させる工程は、前記アダプタを前記核酸断片の平滑末端とライゲーションさせることを含む、方法。
【請求項１５】
請求項１ないし５のいずれかに記載の方法であって、
前記選択プローブは、固体基板への結合を促進する部分を含む、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、更に、
前記選択プローブを固体基板に結合させる工程であって、前記選択プローブの少なくとも一部は、工程（ｃ）と工程（ｄ）との間に、前記増幅された核酸断片とアニーリングされる、工程を備える方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、
前記固体基板は、複数のビーズを含む、方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法であって、
前記選択プローブに強く結合されていない前記増幅された核酸断片を除去する工程は、結合されていない核酸断片を除去するために前記固体基板を洗浄することを含む、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、
前記固体基板を洗浄することは、部分的にアニーリングされた増幅された核酸断片を、結合された選択プローブから除去する条件下において、前記固体基板を溶液に暴露することを含む、方法。
【請求項２０】
請求項１ないし５のいずれかに記載の方法であって、
前記前記増幅された核酸断片を単一の反応媒体内において個別の選択プローブに暴露する工程は、前記単一の反応媒体内に、個別の標的核酸配列とそれぞれ相補的な少なくとも約５０，０００の個別の選択プローブを提供することを含む、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、
前記単一の反応媒体内で用いられる個別の選択プローブの数は、約５０，０００から約１０7までの間である、方法。
【請求項２２】
請求項１ないし５のいずれかに記載の方法であって、
前記増幅された核酸断片を単一の反応媒体内において個別の選択プローブに暴露する工程は、前記単一の反応媒体内において少なくとも約５，０００の個別の選択プローブに前記増幅された核酸断片を暴露させることを含む、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、
前記増幅された核酸断片を単一の反応媒体内において個別の選択プローブに暴露する工程は、前記単一の反応媒体内において少なくとも約１０，０００の個別の選択プローブに前記増幅された核酸断片を暴露することを含む、方法。
【請求項２４】
標的核酸断片と非標的核酸断片との混合から標的核酸断片を隔離する方法であって、
（ａ）前記混合物内の前記標的核酸断片および前記非標的核酸断片の末端にアダプタ配列を加える工程であって、前記アダプタ配列は、約１５〜４０塩基対の長さの配列を含み、前記核酸断片の末端の数を超過して存在する、工程と
（ｂ）前記標的核酸断片および前記非標的核酸断片を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応を実施する工程であって、超過したアダプタの変性によって提供される以外のプライマ配列は、前記標的核酸断片および前記非標的核酸断片の増幅に不要である、工程と、
（ｃ）前記増幅された標的核酸断片および非標的核酸断片を複数の選択プローブに同時に接触させる工程であって、該接触は、前記選択プローブと前記標的核酸断片との間のアニーリングを促進する条件下で行われ、前記選択プローブは、前記標的核酸断片の配列と相補的な配列を含む、工程と、
（ｄ）前記アニーリングされなかった非標的核酸断片および前記部分的にアニーリングされた非標的核酸断片を、前記選択プローブに結合された前記アニーリングされた標的核酸断片から分離することによって、前記標的核酸断片を隔離する工程と、
を備える方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、
前記アダプタ配列は、二本鎖の核酸配列である、方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、
前記アダプタは、前記核酸断片の末端に付着するための平滑末端を有する、方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、
前記アダプタは、自身と相補的でない突出を有する粘着末端を有し、このため、前記アダプタの前記粘着末端は、互いにアニーリングしない、方法。
【請求項２８】
請求項２６に記載の方法であって、
前記アダプタの一本鎖は、前記アダプタの前記平滑末端におけるライゲーションに必要な部分を欠き、このため、前記アダプタの前記平滑末端は、互いにライゲーションしない、方法。
【請求項２９】
請求項２４ないし２８のいずれかに記載の方法であって、
前記アダプタは、前記核酸断片の末端の数の約１０〜１００倍存在する、方法。
【請求項３０】
標的核酸断片を非標的核酸断片から同時に選択するために使用される選択プローブセットであって、
共通の媒体内の少なくとも約１０，０００の個別の選択プローブであって、それぞれ、いずれも単一ゲノム内に見られる個別のＳＮＰを含む個別の標的配列と相補的な配列を有する、個別の選択プローブを備え、
前記個別の選択プローブは、それぞれ、約２０〜１，０００塩基対の長さである、選択プローブセット。
【請求項３１】
請求項３０に記載の選択プローブセットであって、
前記セットの個々の選択プローブは、二本鎖の核酸配列である、選択プローブセット。
【請求項３２】
請求項３０または３１に記載の選択プローブセットであって、
前記セットは、約１０4〜１０8の個別の選択プローブを含む、選択プローブセット。
【請求項３３】
請求項３０または３１に記載の選択プローブセットであって、
前記セットは、約１０4〜１０5の個別の選択プローブを含む、選択プローブセット。
【請求項３４】
請求項３０ないし３３のいずれかに記載の選択プローブセットであって、
前記個別の選択プローブは、それぞれ、更に、固体基板への結合を促進する部分を前記選択プローブ配列とは別に含む、選択プローブセット。
【請求項３５】
請求項３４に記載の選択プローブセットであって、
前記部分は、ビオチンまたはストレプトアビジンである、選択プローブセット。
【請求項３６】
請求項３０ないし３３のいずれかに記載の選択プローブセットであって、
前記セットの前記個々の選択プローブは、前記個々の選択プローブに特異的なＰＣＲ反応によって作成される、選択プローブセット。
【請求項３７】
標的核酸断片を非標的核酸断片から隔離するためのキットであって、
請求項３４に記載の選択プローブセットと、
前記選択プローブ上の前記部分と結合するための表面特徴を含むことによって、自身に対する前記選択プローブの固定化を促進する固体基板と、
を備えるキット。
【請求項３８】
請求項３７に記載のキットであって、更に、
前記核酸断片を増幅するためのプライマおよびポリメラーゼを備えるキット。
【請求項３９】
請求項３７または３８に記載のキットであって、更に、
前記標的核酸断片と相補的な配列を含む核酸アレイを備えるキット。
【請求項４０】
請求項３７ないし３９のいずれかに記載のキットであって、
前記固体基板はビーズを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸サンプル内の前もって指定された配列を選択、隔離、および／または増幅するための方法、プローブ、装置、並びにキット等に関する。本発明は、単一の反応混合物内において、複数の（しばしば何千もの）選択プローブを用いる。
【背景技術】
【０００２】
従来は、核酸サンプル内の前もって指定された領域または断片を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が使用されている。複数サイクルに及ぶ変性およびアニーリングを経て、ＰＣＲは、断片の複製を多数生成する。核酸サンプルは、しばしば、増幅から除外される他の多くの配列領域を含有している。このような場合、ＰＣＲは、関心を持たれている前もって指定された配列を、残りの核酸配列から効率的に選択または隔離する。
【０００３】
関心を持たれている多くの用途では、核酸サンプル内の複数の個別の配列を増幅するために、ＰＣＲが用いられる。これは、サンプル内に含有される増幅される配列が比較的少ない場合は、効果的なツールになりうる。しかしながら、考慮の対象である配列が多数ある場合は、高価であるうえに時間を食う。増幅される各配列は、それぞれ固有なＰＣＲプライマのセットを必要とする。これらは、作成または取得の費用がかさばる。更に、最近までは、配列ごとに、別々の反応容器内で別々のＰＣＲ反応物質を使用して別々のＰＣＲ増幅反応を実施する必要があった。
【０００４】
マルチプレックスＰＣＲは、これらの難点の一部に対処するプロセスである。このプロセスは、単一の反応容器内で複数の配列を増幅する。マルチプレックスＰＣＲにおいて、容器は、解析の対象であるサンプルと、増幅される各配列に固有なプライマセットと、全ての増幅反応で共用されるポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチド三リン酸（たとえばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ等のｄＮＴＰ）とを含む。したがって、単一の反応混合物内で何百もの配列を同時に増幅することが可能になった。これは、大幅に効率を高めることができる。しかしながら、依然として、増幅される配列ごとに固有なプライマセットが必要とされるので、このような手順の費用は、増幅または隔離される配列の数にほぼ比例する。更に、数百を遥かに上回る数の配列を増幅しなければならない用途は、数多く存在する。例えば、高等な類の固体の遺伝子型を完全に決定するためには、何千もの配列を増幅する必要がある。したがって、多数の別々のマルチプレックスＰＣＲ反応を行わなければならない。マルチプレックスＰＣＲによってもたらされる効率の向上をもってしても、プロセスが非常に高価で且つ時間を食うことは明らかである。
【０００５】
ヒトゲノムは、とりわけ解析が複雑なサンプルである。ヒトゲノムは、約５００万から約８００万までの単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含有するようである。このうち、固体の遺伝子型を完全に決定するためには、およそ２５０，０００のＳＮＰが必要であると考えられる。このＳＮＰのセット全体の情報を得るには、恐らくは何千もの異なるマルチプレックスＰＣＲ反応が必要である。これは、全ヒトゲノムの解読によって近年実現された治療可能性を解明するにあたり、実用面における大きな障害を示すものである。
【０００６】
核酸サンプルから複数の配列を隔離または選択するための、より効率的な技術は、当該分野に重要な進歩をもたらすであろう。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、単一の媒体内で複数の（通常何千もの）固有な選択プローブを用いることによって核酸サンプルから複数の配列を隔離または選択する高度な技術を提供する。各選択プローブは、考慮の対象であるサンプル内に存在しうる固有な標的配列と相補的な配列を有する。例えば、各選択プローブは、有機体の遺伝子型を決定するために使用される１つまたは複数のＳＮＰを含む配列と相補的であってよい。本発明の方法は、一本鎖の（例えば二本鎖が変性した後の）選択プローブが、該選択プローブの配列によって指定される（例えば該選択プローブの配列と相補的である）固有な標的配列を有するサンプル配列とアニーリングまたはハイブリダイズすることを可能にする。選択プローブとアニーリングまたはハイブリダイズしないサンプル由来の配列は、結合された配列から、適切な技術によって分離される。結合された配列は、次いで、隔離された標的配列の混合物を提供するために、解放することができる。該混合物は、必要に応じて、手持ちの用途に使用することができる。例えば、隔離された標的配列は、サンプルの採取元である有機体の遺伝子型を決定するために、核酸アレイに接触されてよい。
【０００８】
本発明の一態様は、核酸サンプルから標的核酸配列を選択または隔離する方法を提供する。該方法は、（ａ）サンプルから核酸断片を生成する工程と、（ｂ）核酸断片を増幅する工程と、（ｃ）増幅された核酸断片を、単一の反応媒体内において、少なくとも約２，０００、または少なくとも約５，０００、または少なくとも約１０，０００の個別の選択プローブに暴露する工程であって、該暴露は、選択プローブと、選択プローブと相補的な増幅された核酸断片と、の間のアニーリングを促進する条件下で行われる、工程と、（ｄ）選択プローブに強く結合されていない増幅された核酸断片を除去する工程と、（ｅ）アニーリングされた増幅された核酸断片を選択プローブから解放する工程と、を含む一連の工程によって特徴付けられてよい。この方法において、選択プローブは、標的核酸配列と相補的またはほぼ相補的な配列を有するものと理解される。したがって、アニーリングされた増幅された核酸断片は、標的核酸配列を含有する。この方法は、標的核酸配列を効率的に選択または隔離する。
【０００９】
上記の方法は、更に、（ｅ）で解放された標的核酸配列に基づいて核酸サンプルを特徴付ける工程を含んでよい。一実施形態において、これは、標的核酸配列を核酸アレイにあてがうことによって達成される。これを促進するため、上記のプロセスは、（ｉ）（ｅ）で解放された標的核酸配列を増幅する工程と、（ii）核酸アレイに接触させる前に、標的核酸配列に標識付けする工程と、を含んでよい。別の一実現形態の詳細にしたがうと、この方法は、更に、標識付けおよび／またはアレイとの接触に先立って、標的核酸断片を更に断片化する工程を含む。
【００１０】
サンプルの断片の生成（工程（ａ））に用いられる条件は、残りのプロセスに適したサイズおよび構造の断片を提供するように選ばれる。一実施形態において、断片化は、約２５塩基対から約２，０００塩基対まで、またはそれより多い塩基対の平均長を有する核酸断片を生成し、好ましくは、約５００塩基対の平均長を有する核酸断片を生成する。プロセスによっては、更なる断片化を伴うことなくマイクロアレイによる遺伝子型決定を可能にする平均長を有する核酸断片を生成することがある。場合によっては、ＰＣＲ抑制として知られる現象を回避するために、増幅（工程（ｂ））の前および後の２段階にわたって断片化を行う必要がある。
【００１１】
具体的な一実施形態において、増幅は、断片化の工程（ａ）によって生成された核酸断片のほぼ全部に対してＰＣＲを使用することによって実現される。このプロセスは、断片ごとに固有のプライマを提供することなく実現されるように設計することができる。例えば、このプロセスは、核酸断片の末端に「アダプタ」を付着させることを伴ってよい。アダプタは、ＰＣＲ増幅に用いられる汎用プライマと相補的な比較的短い配列を含む。全てのアダプタが同一の配列を有する場合または限られた種類の配列のみを有する場合は、全部の断片を増幅するために必要なプライマセットは、１つまたは少数のみである。言い換えると、断片に組み込まれている具体的な配列如何を問わず、アダプタを有する全部の断片を、限られた数のプライマセットで増幅することができる。具体的な一実施形態では、アダプタは、一本鎖の末端すなわち突出を有する二本鎖の配列である。別の具体的な一実施形態では、アダプタは、後続の増幅工程でＰＣＲプライマとして機能するという、追加の機能を有する。本実施形態では、全部ではなく一部のアダプタがサンプルの断片とライゲーションする。溶液中に残るアダプタは、続いて必要とされるプライマを提供する働きをする。
【００１２】
具体的な一実施形態において、増幅は、例えば工程（ｅ）の後にマイクロアレイと接触させるなどを通じて行われる更なる解析に先立って、標的核酸から生成されたほぼ全部の核酸断片に対してＰＣＲを使用することによって実現される。本実施形態では、核酸断片の増幅（工程（ｂ））に使用されたものと同一の配列を有するプライマを用いてよいが、超過した二本鎖アダプタを使用する代わりに、一本鎖のプライマを追加してよい。
【００１３】
説明されるこの方法は、選択プローブに結合している断片を、選択プローブに結合していない断片から分離する。これは、多くの方法で実現可能である。一アプローチでは、選択プローブ（一本鎖または二本鎖のいずれでもよい）は、固体基板に結合する。この固体基板は、結合されていないサンプル断片を除去するために、洗浄またはその他の方法で処理することができる。このアプローチを実現するため、選択プローブは、先ず、増幅された核酸断片に接触され(工程（ｃ））、次いで、固体基板に結合されてよい。選択プローブの少なくとも一部は、工程（ｃ）と工程（ｄ）との間に、増幅された核酸断片とアニーリングするであろう。固体基板に対する選択プローブの結合を促進するため、これらの選択プローブは、固体基板に堅く結合する部分を含むことができる。
【００１４】
選択プローブに強く結合されていない（したがって固体基板に強く結合されていない）核酸断片を除去するため、プロセスは、基板を洗浄し、結合されていないまたは結合の弱い核酸断片を除去することを伴ってよい。一アプローチでは、これは、部分的にアニーリングされた増幅された核酸断片を、結合された選択プローブから除去する条件下で、固体基板を溶液に暴露することを伴う。部分的にアニーリングされたこのような増幅された核酸断片は、標的配列との間に１つまたは２つ以上の不一致を含有しうるので、いずれの選択プローブとも完全に相補的ではないと考えられる。
【００１５】
本発明によって得られる重要なメリットは、単一の反応媒体内で何千もの個別の標的配列を選択または隔離できる能力にある。この目的を達成するため、反応媒体は、例えば約１０5から約１０8までなど何千もの配列特異的な選択プローブを含むことができる。この範囲内で、例えば少なくとも約１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、１，０００，０００、または１０，０００，０００など数千単位のみの固有な選択プローブが使用される場合は、マルチプレックスＰＣＲと比べて大きな利点を実現することができる。
【００１６】
本発明の別の一態様は、最初の増幅のために単一のプライマを用いる方法に関する。このような方法は、(ａ)混合物内の標的核酸断片および非標的核酸断片の末端に、アダプタ配列を加える工程と、（ｂ）標的核酸断片および非標的核酸断片を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応を実施する工程であって、超過したアダプタの変性によって提供される以外のプライマ配列は、これら標的核酸断片および非標的核酸断片の増幅に不要である、工程と、（ｃ）増幅された標的核酸断片および非標的核酸断片を複数の選択プローブに同時に接触させる工程であって、該接触は、選択プローブと標的核酸断片との間のアニーリングを促進する条件下で行われる、工程と、（ｄ）アニーリングされなかった非標的核酸断片および部分的にアニーリングされた非標的核酸断片を、選択プローブに結合されたアニーリングされた標的核酸断片から分離することによって、標的核酸断片を選択する工程と、によって特徴付けられてよい。上述された方法と同様、選択プローブは、標的核酸断片の配列と相補的な配列を含む。好ましくは、アダプタの配列は、約１５〜４０塩基対の長さの配列を含み、且つ／または、断片の末端の数の約１０〜１００倍存在している。
【００１７】
一実施形態において、アダプタ配列は、二本鎖の核酸配列である。アダプタ配列は、１つの平滑末端と、１つの非平滑（粘着）末端とを有することができる。本実施形態において、平滑末端は、核酸断片の末端に付着するために使用されてよい。セルフアニーリングを回避するため、粘着末端を有する二本鎖アダプタは、自身と相補的でない突出を有するように設計されてよい。更に、アダプタのセルフライゲーションを回避するため、アダプタの一本鎖は、その平滑末端（例えば５’リン酸基）におけるライゲーションに必要な部分を欠いてよい。
【００１８】
本発明の更に別の一態様は、標的核酸断片を非標的核酸断片から同時に隔離するために使用される選択プローブセットに関する。このようなプローブセットは、（ａ）共通の媒体内に少なくとも約１，０００、または５，０００、または１０，０００の個別の選択プローブを有すること、および（ｂ）個別の各選択プローブの長さが約２０〜１，０００塩基対であることによって特徴付けられてよい。一実施形態において、各選択プローブは、いずれも単一ゲノム内に見られる少なくとも１つの個別のＳＮＰを含む個別の標的配列と相補的な配列を有する。特定の実施形態において、各個別の標的配列は、１つのＳＮＰのみを含む。他の実施形態において、各個別の標的配列は、少なくとも２つまたは３つ以上のＳＮＰを含む。更に別の実施形態では、１つのＳＮＰのみを含む標的配列もあれば、２つまたは３つ以上のＳＮＰを含む標的配列もある。
【００１９】
選択プローブは、二本鎖または一本鎖のいずれでもよい。選択プローブは、特定のＰＣＲ反応などの様々な技術によって作成することができる。選択プローブのセットは、約１０4〜１０7の個別の選択プローブを含んでよく、より具体的なケースでは、約１０4〜１０5の個別の選択プローブを含んでよい。特定の実施形態において、選択プローブは、長さ約５０〜２００塩基対のＰＣＲ単位複製配列である。
【００２０】
更なる一実施形態において、各個別の選択プローブは、固体基板への結合を促進する部分を、選択プローブの配列とは別に含む。一例として、この部分は、ビオチンまたはストレプトアビジンであってよい。
【００２１】
本発明の別の一態様は、標的核酸断片を非標的核酸断片から選択するためのキットを提供する。このようなキットは、（ｉ）上述された選択プローブセット（例えば共通の媒体内の少なくとも１，０００、２，０００、５，０００、または１０，０００の個別の選択プローブ）と、（ii）選択プローブ上の部分と結合するための表面特徴を有することによって、自身への選択プローブの固定化を促進する固体基板とを含む。一例として、固体基板は、ビーズの形態をとることが可能である。更に、選択プローブは、（表面特徴を介した）固体基板への結合を促進するための部分を含むことができる。キットは、核酸断片を増幅するためのプライマおよびポリメラーゼも含む場合もある。また、標的核酸断片と相補的な配列を含むマイクロアレイも含むことができる。
【００２２】
本発明の具体的な一実施形態において、全工程手順は、（１）ゲノムから適切なサイズの核酸断片を生成する工程と、（２）単一のプライマまたは単純なプライマセットによる増幅を可能にするために、断片の両端に万能アダプタを加える工程と、（３）断片を増幅する工程と、（４）増幅された断片を、関心を持たれているＳＮＰ位置にある配列と相補的な選択プローブ（これらのプローブは、ビオチン、または固体基板への取り付けを可能にする他の分子構造を含有する）によってアニーリングする工程と、（５）選択プローブを（相補的な配列とともに）固体基板に結合させる工程と、（６）結合されていないゲノム断片および緩く結合されたゲノム断片を除去するために、基板を洗浄する工程と、（７）固定化された選択プローブから、相補的なゲノム断片を変性によって分離する工程と、（８）最初の増幅プロセスで用いられたものと同一のヌクレオチド配列を有するプライマを使用して、選択されたゲノム断片を増幅する工程と、（９）増幅された断片を、マイクロアレイとの結合に適したより小さな断片に断片化する工程と、および（１０）ゲノムの遺伝子型を決定するために、断片をマイクロアレイ上の標的プローブとハイブリダイズさせる工程と、を伴う。
【００２３】
本発明の上記のおよびその他の特徴および利点が、添付の図面を参照にしつつ、以下でより詳しく説明される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
導入および概要
本発明は、少なくとも約１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、３０，０００、５０，０００、８０，０００、１００，０００、１，０００，０００、または１０，０００，０００の個別の選択プローブを含有する単一の媒体を用いる。各選択プローブは、特定のＳＮＰに関連した配列など、関心を持たれている個別の対象と相補的な配列を有する。選択媒体の使用によって、核酸サンプル（例えばゲノムＤＮＡ）の断片は、選択プローブとアニーリングして「選択された」状態になることができる。したがって、単一の媒体を使用した１つの段階によって、サンプル内の非標的断片から何千もの標的断片が同時に選択される。この方法は、単一の反応媒体内で同時に発生できるのが数百の選択性増幅に限られるマルチプレックスＰＣＲと比べて遜色ない。要約すると、本発明は、非常に複雑な核酸サンプル内の標的配列を効率的に濃縮する。
【００２５】
選択媒体それ自体が、当該分野における進歩を示している。一例では、この選択媒体は、少なくとも約１０，０００の異なる選択プローブを含有し、各選択プローブは、長さが約５０〜５００塩基対であるとともに、固体基板への結合を促進する部分を含有することによって、アニーリングされなかった非標的断片からの、アニーリングされた標的断片の分離を促進する。
【００２６】
後ほど詳述される、もう１つの肝心な点は、ゲノムサンプルから生成された何千もの核酸断片の全てを増幅可能にする万能アダプタ配列の使用にある。同時に増幅されたサンプル断片は、多くの異なる配列を有するであろう。もし、後ほどのプロセスで第２の増幅が用いられる場合は、同一の単一のプライマを再度使用することができる。例えば、もし、選択プローブへの結合によって選択された標的断片を更に増幅する場合は、これらの標的断片を個々に増幅するために、同一のプライマを使用することができる。
【００２７】
本発明の代表的な一方法のための一連の工程の概要が、図１に示される。図に示されるように、参照番号１０１は、核酸サンプル（例えば複合ゲノムサンプル）の断片化から開始される方法の全体を指している。工程１０３を参照せよ。後述されるように、この目的には、様々な断片化技術が使用可能である。所定の一実現形態のために選ばれた断片化技術は、所望のサイズ範囲および所望の末端構造を有する断片を生成する。
【００２８】
次に、ブロック１０５に示されるように、工程１０３で生成されたサンプル断片にアダプタが付着される。アダプタは、配列如何に寄らず、限られた種類のプライマ、あるいは場合によっては僅か単一のプライマを使用して全ての断片を増幅可能にするために用いられる。アダプタは、プライマと相補的であるように選ばれた配列を有する。後述されるように、溶液中の超過したアダプタは、実施形態によっては、それら自体がプライマとして機能できる場合がある。アダプタの付着後、サンプルは、ブロック１０７に示されるように増幅される。通常、これは、例えば遊離したアダプタ配列などの適切なプライマを用いたＰＣＲプロセスを伴う。
【００２９】
次に、工程１０９では、増幅されたサンプル断片が、変性されて一本鎖配列を生成し、これらの一本鎖配列は、次いで、ゲノムサンプルから隔離するべき特定の標的配列と相補的な配列をそれぞれ有する選択プローブの大集合を使用してアニーリングされる。選択プローブは、一本鎖の形態で導入されてもよいし、あるいは二本鎖の形態で導入され、増幅されたサンプル断片と同時に変性されてもよい。上述されたように、単一の液状媒体は、しばしば、何千にも及ぶ多数の異なるプローブ配列を含有している。これは、従来の技術による場合と比べて大幅に効率良く標的配列を選択可能にする。
【００３０】
アニーリングプロセスの完了後は、多数の一本鎖選択プローブが、サンプル由来の相補的標的断片とアニーリングして、二本鎖の核酸配列を生成している。これらは、次いで、ブロック１１１に示されるように、固体基板に付着される。一実施形態において、選択プローブは、固体基板への結合を促進する部分を含有することによって、選択プローブ由来の少なくとも１つの一本鎖を含有する核酸に対する固定化を制限する。
【００３１】
次に、ブロック１１３に示されるように、結合されていない断片が固体基板から除去される。もちろん、基板には、相補的なゲノム断片によってアニーリングされたものを含む固定化された選択プローブが、依然として含有されている。除去の工程１１３には、後述されるような定められた洗浄プロトコルを用いることが可能である。
【００３２】
プロセス１０１の次の工程は、捕獲された一本鎖の断片（標的配列を有する）を、固体基板に結合された選択プローブから解放することを伴う。これは、単純に、結合された二本鎖の断片を変性する条件に固体基板を暴露することを伴ってよい。固体基板に結合する部分を含有するのは選択プローブのみであるので、捕獲された標的断片は、更なる解析のために、自由に再び溶液中に入ることができる。このような解析に先立って、標的断片は、ブロック１１７に示されるように、随意に増幅可能である。そして、解析技術次第では、捕獲、処理、および更なる解析を促進するために、更に小さいサイズに断片を断片化する必要がある。最後に、ブロック１１９に示されるように、隔離された標的断片は、例えばゲノムサンプル中にどの標的配列が存在するかを厳密に決定するために、更に解析される。前述のとおり、これは、核酸配列を固定化されたマイクロアレイを使用して実現可能である。同様に、直接シークエンシングなどのその他の技術が用いられてもよい。
【００３３】
なお、プロセス１０１の全工程が本発明のあらゆる実現形態で必要とされるわけではない点に留意せよ。例えば、実施形態によっては、予め固定化された一本鎖の選択プローブにサンプル断片をハイブリダイズさせる場合もある。このような実施形態では、選択プローブは、固定先である固体基板（例えばビーズ、カラム、マイクロアレイ等など）を提供される。この場合、標的サンプル断片は、既に固体基板上にある一本鎖の選択プローブとハイブリダイズする。この実施形態は、標的断片とハイブリダイズされたプローブを固体基板に付着させるための独立した工程を必要としない。明らかに、ハイブリダイゼーションに先立つ別の工程で、基板にプローブを付着させてよい。プロセスの他の具体的工程は、一般化することができる。したがって、本発明は、あるいは、（１）複数の核酸断片を生成するために、核酸サンプルを断片化する工程と、（２）増幅された核酸断片を、ＳＮＰまたは関心を持たれているその他の特徴に近いゲノム配列と相補的な配列を有する選択プローブとアニーリングまたはハイブリダイズさせる工程と、（３）選択プローブに結合されていない核酸断片を、選択プローブに結合されている核酸断片から隔離する工程と、（４）選択プローブに結合されている標的核酸断片の遺伝子型を決定することによって、関心を持たれている遺伝子座（例えばＳＮＰ）のみにおいて、核酸サンプルの遺伝子型を選択的に決定する工程と、を伴うことによって特徴付けられる。
【００３４】
サンプルおよびその断片
前述のとおり、本発明のプロセスは、核酸サンプルに作用する。これらのサンプルは、標的配列および非標的配列を有すると考えられる。プロセスは、標的配列を選択または隔離することによってサンプルを濃縮する。そうするにあたって、プロセスは、標的配列を増幅することもできる。概して、本発明は、複合サンプル内に少なくとも数百、数千、または数万もの個別の標的特徴すなわち標的配列があるような状況において、現行の技術と比べて最も有利である。
【００３５】
核酸サンプルは、考慮対象の有機体から得られ、例えば生検死後組織のサンプルを使用して、その有機体の任意の数の生成物から抽出することが可能である。関心を持たれている多くの用途では、サンプルはゲノム材料である。関心を持たれるゲノムは、任意の有機体のそれであってよく、最も関心を持たれるのは、しばしば、霊長類など高度な類の有機体である。ゲノムＤＮＡは、実質的に任意の組織起源から得れれてよい。手ごろな組織サンプルとして、全血、血液製剤（純粋な赤血球を除く）、精液、唾液、涙液、尿、糞便物質、汗、口腔、皮膚、および髪が挙げられる。核酸サンプルは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその化学的誘導体であってよく、一本鎖または二本鎖の形態で提供されてよい。ＲＮＡサンプルは、増幅処理を経ることも多い。この場合の増幅は、通常、逆転写に先行される。全発現ｍＲＮＡの増幅は、例えば、同一所有権者によるＷＯ９６／１４８３９およびＷＯ９７／０１６０３によって説明されるように実施することができる。
【００３６】
具体的な一実施形態において、関心を持たれている標的特徴は、ＳＮＰを含有する比較的短い配列である。上述のとおり、ヒトゲノムの場合は、約５００万から約８００万までの既知のＳＮＰが存在する。本発明は、このようなＳＮＰに関連した配列を効率的に隔離および増幅するための方法を提供する。本発明を使用して隔離可能なその他の（ＳＮＰ以外の）標的特徴として、挿入、削除、反転、転座、その他の変異、マイクロサテライト、反復配列など、基本的に、核酸配列によって区別可能な任意の特徴が挙げられる。これらの特徴は、例えば、エクソンもしくはその他の遺伝子領域、プロモータもしくはその他の調節塩基配列、または構造領域（例えば中心体もしくはテロメア）において発生しうる。標的として機能するのがＳＮＰであるか、あるいはその他の特徴であるかに寄らず、本発明は、特定の遺伝子標的に対する製剤研究（例えば薬物反応または薬物開発に関わるものなど）、表現型研究、関連研究、単染色体もしくはゲノムを含む染色体の一部に着目した研究、例えばｍＲＮＡから得られるプローブを用いて行われる発現パターンに着目した研究、ゲノムのコード領域もしくは調節領域に着目した研究、および特定の生体学的経路もしくは代謝経路に関わる遺伝子もしくは遺伝子座のみに着目した研究を含む、広範囲な用途で用いられる。言い換えると、標的配列は、関心を持たれている多くの異なる基準または特質に基づいて、サンプルから選択および隔離されてよい。他の実施例では、標的配列は、例えば標的配列をあてがわれるＤＮＡマイクロアレイの設計に基づくなど、標的配列がどのように更なる解析および処理を経るかに基づいて選択される。
【００３７】
説明されたように、元の核酸サンプルは、断片化によって、標的特徴すなわち標的配列を内包するものと内包しないものとを含む多数の異なる核酸断片を生成することができる。もちろん、最初から、別途断片化の工程を必要としない適切なサイズおよび状態を有する断片としてサンプルを提供することも可能である。（標的断片および非標的断片を問わず）全ての断片は、通常、一般的なサイズ範囲および末端特性（例えば平滑対粘着など）などの特定の共通特徴を有している。断片の集団は、平均サイズおよびサイズ分布、並びに標的配列の出現頻度によって、更に特徴付けることが可能である。これらの特性は、断片化の条件によって決定される。
【００３８】
図２Ａは、例えば人のドナーから採取されたゲノムＤＮＡの二本鎖断片など、解析されるサンプルの一部を形成する核酸連鎖２０３を示している。核酸連鎖２０３は、複数の標的特徴２０７，２０７’，２０７”……を有するものとして示される。これらは、研究対象であるＳＮＰまたはその他の特徴を表していてよい。方法１０１の工程１０３において、サンプルは断片化される。これは、図２Ｂに示され、連鎖２０３が複数の鎖２０９，２０９’，２０９”等などに断片化されている。これらの鎖のなかには、鎖２０９のように、関心を持たれている標的特徴を含有するものがある。２０９’および２０９”などの他の鎖は、標的配列を含有していない。説明されたように、本発明にしたがって核酸断片を処理する場合は、標的を含有する断片の多数または大部分が、標的を含有しない断片の多数または大部分から分離される。
【００３９】
平均断片長を選択するにあたり、様々な事項が考慮される。通常、平均断片長は、約２０〜２０００塩基対で、更に長い場合もあるが、好ましくは、約５０〜８００塩基対である。特定の実施形態において、断片の平均サイズは、約４００〜６００塩基対の長さである。他の実施形態において、断片の平均サイズは、約１００〜２００塩基対の長さである。当業者ならば容易に気づくことができるように、最適な平均断片長は、具体的な用途に依存しうる。例えば、断片は、固有の配列を含有するのに十分な大きさでなければならない。もし、標的配列の選択または解析にハイブリダイゼーションが使用されるならば、断片は、特定のハイブリダイゼーション条件下で相補的な配列と上手くハイブリダイズするのに十分な大きさでなければならない。また、断片は、後続の工程中に容易にせん断されることのないように、且つ選択プローブとのハイブリダイゼーションを妨害することのないように、十分に小さいことが望ましい。更に、断片は、例えばｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ  ＰＣＲやｓｈｏｒｔ−ｒａｎｇｅ  ＰＣＲなどの後続の工程で必要とされる適切なサイズであることが望ましい。
【００４０】
適切な断片長の決定にあたって考慮されるもう１つの要素は、考えられる最終的な配列解析技術である。例えば、もし、核酸マイクロアレイが用いられるならば、所望の断片サイズは、およそ２５〜１００塩基対である。最初に生成された断片がこれより大幅に大きい場合は、マイクロアレイによる遺伝子型決定に先立って、第２の断片化を実施しなければないない。理想を言えば、最初の断片化によって、解析に適したサイズの断片を生成し、これ以上の断片化を不要にするとよい。あいにく、サイズが２５〜１００塩基対の断片は、「ＰＣＲ抑制」を示すことがわかっている。これは、与えられた断片の、プライマと相補的な末端どうしが一本鎖のヘアピン構造を形成する場合に生じる。このようなヘアピン構造は、ＰＣＲによる増幅に参加することができない。一本鎖の末端間結合の可能性が低減され、ＰＣＲ抑制が重大な懸念でなくなるのは、断片が大幅に大きい（例えば少なくとも約３００塩基対より大きい）場合に限られる。
【００４１】
互いに相補的でない異なる２種類のアダプタ配列を用いることによって、これらのヘアピン構造の形成の可能性を最小限に抑えようとする試みがある。例えば、アダプタ配列Ａ，Ｂの使用は、２つのＡアダプタを有するライゲーション生成物をおよそ４分の１と、２つのＢアダプタを有するライゲーション生成物をおよそ４分の１と、１つのＡアダプタと１つのＢアダプタとを有するライゲーション生成物をおよそ２分の１とを得る。したがって、得られたライゲーション生成物のかなりの割合が、依然としてＰＣＲ抑制の影響を受けると考えられる。
【００４２】
アダプタ配列の付着を促進するため、断片の末端は、例えばいずれも平滑である、またはいずれも粘着であるなど、一貫した構造を有することが好ましい。後者の場合、いずれも粘着の末端は、対応するアダプタ末端への付着のための一貫した構造を提供できるように、同一の突出配列を有することが好ましい。しかしながら、好ましい一実施形態では、断片は平滑末端である。後ほど詳述される本発明の具体的な一実施形態では、完全に平滑末端のアダプタが用いられる。
【００４３】
サンプル核酸の断片化は、様々な既知の技術のうちの任意の技術を通じて実現することができる。例として、機械的分裂、化学分解、酵素による断片化、および自己分解が挙げられる。自己分解は、ＤＮＡの酸性度ゆえに、比較的高温で生じる。断片化の技術は、二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡのいずれも提供することができる。２００３年８月８日に出願された米国特許出願第１０／６３８，１１３号は、所望レベルの断片化を提供するように制御可能な様々な方法、装置、およびパラメータを記載している。同出願は、引用によって本明細書に組み込まれるものとする。
【００４４】
酵素による断片化は、ＤＮａｓｅ（デオキシリボヌクレアーゼ）などのヌクレアーゼを使用して実現される。一例では、マンガン（II)イオンの存在下でＤＮａｓｅＩが使用される。この酵素によるせん断は、相対的に平滑末端の二本鎖断片を生じる。得られた断片内には、依然として、１つまたは２つの塩基突出が存在する可能性がある。このような場合は、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼによって示されるなどの特定のエクソヌクレアーゼを用いた処理によって、中程度に粘着末端の断片から完全に平滑末端の断片を生成することができる。Ｐｆｕ酵素は、ＤＮＡ断片の両端の３’拡張を切り捨てることによって作用する。これは、また、ポリメラーゼ活性によって３’陥凹末端を満たす。平滑末端の断片を生成するためのその他の方法として、機械的せん断および酸加水分解が挙げられ、これらは、いずれも、いくつかの平滑末端といくつかの突出とを生じる。したがって、Ｐｆｕポリメラーゼを用いる場合と同様に、やはり何らかの「平滑化」を断片に施す必要がある。更に、平滑末端を残留させる特定の制限酵素（たとえばＡｌｕＩ、ＨａｅIII、ＨｉｎＤII、ＳｍａＩなど）を使用することができる。また、「平滑化」可能な突出を残留させるその他の制限酵素を用いられてもよい。もちろん、互換性のアダプタ（例えば、突出の種類に寄らずにアダプタを得ることができるようにランダムな末端を有するアダプタ）を用いるプロセスである限りは、粘着末端（ランダムな突出配列を含む）を残留させる任意の技術を、後続の平滑化を伴うことなく使用することができる。
【００４５】
アダプタおよび増幅
サンプルの断片を増幅しつつ、且つ多くの異なるプライマを作成または購入する費用を節約するために、本発明は、１種類または２種類以上の万能アダプタ配列を随意に用いる。これらのアダプタは、全サンプル断片の両端に付着され、プライマによるアニーリングのための共通の配列を提供する。図１のブロック１０５を参照せよ。また、図２Ｂの断片にアダプタ３０３を付着させた後の様子を図示した図３Ａも参照せよ。サンプルから生成された多数の断片に付着させるために提供されるアダプタは、単一種類であることが好ましい。このアプローチでは、たった１種類のプライマ配列によって全部の断片を増幅することができる。代替の実施形態では、２種類以上のアダプタ配列が用いられるが、一般に、用いられるアダプタ配列は、数種類以内であると有利である。この章では、アダプタの構造およびそれらを断片に付着させる方法の両方が説明される。
【００４６】
アダプタは、その目的に適した長さ、すなわちＰＣＲプライマとのアニーリングのための場所を提供するのに適した長さを有することが望ましい。したがって、アダプタは、通常、約２５〜５０塩基対の長さである。好ましい一実施形態では、アダプタは、１つの平滑末端と１つの粘着末端とを有する二本鎖構造である。後述されるように、これは、アダプタを一貫した向きで断片に結合させることを可能にするとともに、超過したアダプタを後続の増幅工程中にＰＣＲプライマとして機能させることも可能にする。もちろん、本発明は、この構造に限られず、アダプタは、一本鎖配列の場合もある。
【００４７】
多くの場合、アダプタの濃度は、断片の濃度を大幅に上回ることが望ましい。こうすれば、アダプタは、断片とアダプタとの間の迅速なライゲーションを促進するのに十分な量を有することを保証される。また、これは、断片間のライゲーションの可能性を低減させる。一実施形態において、アダプタの濃度は、断片の末端の濃度（普通は断片の濃度の２倍である）の約１０〜１００倍である。この濃度であれば、未反応の超過したアダプタ配列は、後続の増幅のためのプライマとして機能することができる。変性の際に、二本鎖のアダプタは、一本鎖の配列に分かれ、そのうちの一本は、一本鎖断片上の相補的な配列とアニーリングした場合にプライマとして機能することができる。
【００４８】
図３Ｂに示された実施形態では、アダプタ３０３は、粘着末端３１３と平滑末端３１１とを含む。平滑末端は、常にＤＮＡ断片２０９に付着し、粘着末端は、常に同断片と反対を向く。粘着末端３１３は、平滑末端を有する断片とはライゲーションしないので、アダプタは、断片−アダプタ間における平滑末端どうしのライゲーションに要求されるとおりに、単一の向きで付着せざるを得ない。図の例において、粘着末端３１３は、３’陥凹を有する。ライゲーションは、従来のＤＮＡリガーゼによって実現されてよい。
【００４９】
アダプタ間のセルフライゲーションを低減させる、または排除するための予防策が取られてよい。アダプタの平滑末端は、別のアダプタの粘着末端とは結合しないが、２つのアダプタの平滑末端どうしは、結合する可能性がある。また、２つのアダプタの粘着末端どうしも、それらのアダプタの突出が互いに相補的な場合に限って結合する可能性がある。この可能性は、アダプタの突出を非相補的に設計することによって排除することができる。平滑末端におけるアダプタどうしのセルフライゲーションを阻止するためには、一方の一本鎖が、隣接するもう一方の一本鎖の有する並んだアダプタの平滑末端と自身とを結合不可能にする化学的特徴を含有するように、平滑末端を設計することができる。
【００５０】
例えば、アダプタの平滑末端の５’鎖が、リン酸基を欠いていてよい。このような２つのアダプタの平滑末端が、ライゲーションを促進するような形で並んでいる場合は、これらの各鎖は、２つのアダプタ間のリン酸塩を欠いているので、適切なＤＮＡリガーゼは、これらの平滑末端をライゲーションすることができないと考えられる。なお、ＤＮＡ鎖の５’末端は、通常、３’水酸基とライゲーションするための遊離リン酸基を有する点に留意せよ。このような結合は、連続した鎖を形成する。もし、アダプタの平滑末端鎖の一方で、５’リン酸基が欠けているならば、その末端は、連続した鎖を形成することができない。このような場合は、一本鎖どうしの各５’−３’結合が阻まれるので、２つのアダプタをライゲーションすることは不可能である。この状況は、図３Ｃに示されている。図中、アダプタ３０３ａ，３０３ｂは、それぞれ平滑末端を有し、各平滑末端の５’鎖は、リン酸基を欠いている。これらのアダプタは、図に示されるように、端どうしが接するように並べられたときにライゲーションすることができない。なぜなら、上段の鎖間または下段の鎖間のいずれにおいても、連続した一本鎖を形成することができないからである。なお、リン酸塩部分の欠落は、セルフライゲーションを阻止するアプローチの１つに過ぎず、他にも、様々な化学的な阻止メカニズムが使用可能である。例えば、類似の一実施形態では、平滑末端で５’リン酸塩の代わりに３’ＯＨが欠落しているアダプタが用いられる。
【００５１】
アダプタの平滑末端が、ＤＮＡ断片の平滑末端とぴたりと合う場合は、１つの一本鎖のみが、ライゲーションを阻止される。ＤＮＡ断片から寄与された、５’末端を有する鎖は、リン酸基を有しており、これは、アダプタ配列上の一方の一本鎖の３’末端とのライゲーションを可能にする。結果得られたライゲーション生成物は、しかしながら、各アダプタとの境目に切れ目３１５を有する。図３Ｄを参照せよ。切れ目より先のアダプタ配列は、図３Ｄの下段部分に示されるように、ポリメラーゼ反応によってゲノム断片から外向きに広がっていく完全に連続した一本鎖で置き換えることができる。
【００５２】
一実施形態において、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼは、アダプタのライゲーションのあいだ、反応混合物内に留まる。ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼは、好熱性の酵素であるので、混合物の温度を（例えば約６８℃まで）上昇させることによって活性化することができる。Ｐｆｕポリメラーゼは、ｄＮＴＰの存在下で３’陥凹を満たすと考えられ、鎖置換活動を有する。このように、Ｐｆｕポリメラーゼは、５’リン酸塩の欠落ゆえに残された切れ目においてＤＮＡポリメリゼーションを開始することによって、アダプタを含有する断片に作用し、そうして、図３Ｄに示されるように、断片の３’末端を拡張し、５’リン酸塩の欠落したアダプタの鎖を置換する。これは、結果として、ＤＮＡ断片に跨る２つのアダプタ配列を含む、切れ目のない二本鎖配列を生成する。アダプタの濃度は、核酸断片の濃度と比べて、断片間のライゲーションの可能性を最小に押さえられるほど大きいので、ゲノム断片の平滑末端間のセルフライゲーションは、概して回避される。
【００５３】
核酸断片は、アダプタによる修飾後、前述のとおり増幅することができる。図１のブロック１０７を参照せよ。断片を含有する溶液に、１つまたは複数のアダプタと相補的な単一のプライマまたはプライマセットが提供される。前述のように、超過したアダプタ配列は、それら自体がプライマとして機能し、このような場合は、プライマの追加は不要である。増幅に必要とされるその他の成分（例えば特定のポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、バッファ等など）が、必要に応じて提供されてよい。上述された具体的な一実施形態では、Ｐｆｕポリメラーゼは溶液中に留まり、単独で、または米国ミズーリ州セントルイス市のＡＢ  Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ｉｎｃ．から市販されている「Ｋｌｅｎｔａｑ１」もしくは当該分野において既知のその他のポリメラーゼなどの別のポリメラーゼとともに、ＰＣＲに関与する。次いで、全断片を増幅するために、ＰＣＲ増幅が実施される。具体的な一実施形態では、増幅は、約２０サイクルにわたって実施される。しかしながら、これは、決して、最小限の要件でも最大限の要件でもない。結果として得られるＤＮＡ配列は、工程１０３で生成された個々のＤＮＡ断片に跨るアダプタ配列を有すると考えられる。また、いくつかの実施形態では、増幅後の断片の濃度は、全収量で約１μｇ〜１ｍｇである。
【００５４】
ＰＣＲ増幅方法は、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＰＣＲ技術：ＤＮＡ増幅の原則および用途）（ｅｄ．  Ｈ．Ａ．  Ｅｒｌｉｃｈ，  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ，  ＮＹ，  １９９２）、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＰＣＲの手順：方法および用途への手引き）（ｅｄｓ．  Ｉｎｎｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ，  １９９０）、Ｍａｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９，  ４９６７（１９９１）、Ｅｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １，  １７  （１９９１）、ＰＣＲ（ｅｄｓ．  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ）、および米国特許第４，６８３，２０２号に記載されており、これらの各文献は、引用によって本明細書に組み込まれるものとする。増幅生成物は、増幅反応に使用された酵素および基板に応じて、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはその誘導体であることが可能である。本発明の方法で使用可能な特定のＰＣＲ増幅方法は、例えば、２００２年１月９日に出願された米国特許出願第１０，０４２，４０６号，２００４年５月２５日に発行された米国特許第６，７４０，５１０号、および２００３年１月１４日に出願された米国特許出願第１０／３４１，８３２号に更に記載されており、これらの各文献は、引用によって本明細書に組み込まれるものとする。
【００５５】
本発明で（例えば選択プローブの隔離などのために）使用可能な増幅サンプル断片の生成方法として、その他の方法も存在する。これらの技術のなかには、例えばＤＯＰ−ＰＣＲおよびｔａｇｇｅｄ  ＰＣＲ等など、核酸断片にタグ付けするその他の方法を伴うものがあり、それらは、Ｋａｍｂｅｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．による米国出願公開特許第２００４／０２０９２９８号において極めて詳細に議論されている。該文献は、引用によって本明細書に組み込まれるものとする。
【００５６】
標的断片の選択および隔離
サンプル断片の増幅後、複数のオリゴヌクレオチド選択プローブが混合物に加えられる。好ましくは、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、３０，０００、５０，０００、８０，０００、１００，０００、１，０００，０００、または１０，０００，０００の個別の配列が、選択プローブとして混合物内に提供される（一例では、およそ８５，０００のプローブが用いられる）。説明のとおり、選択プローブは、単一の反応媒体内において、増幅された核酸断片と接触させられ、選択プローブと、選択プローブと相補的な増幅された核酸断片との間のアニーリングを促進する条件に暴露される。
【００５７】
各サンプルプローブは、サンプル内に存在すると考えられる（または少なくとも存在する可能性があると考えられる）標的配列と相補的な配列を有する。したがって、もし１，０００のプローブが使用される場合は、１，０００の標的配列が選択されてよい。このように、標的配列を有するサンプル断片のみが選択プローブと結合し、最終的に、サンプル混合物から隔離される。プローブ配列は、標的配列を一意的に選択するのに適した任意の長さであってよい。標的がＳＮＰである場合は、適切な長さ範囲は、約２０〜１，０００塩基対であり、より好ましくは、約２０〜２００塩基対（例えば約８０塩基対）である。他の用途には、他のサイズ範囲が適しているであろう。
【００５８】
選択プローブは、一本鎖または二本鎖であってよく、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはそれらの誘導体を含むことが可能である。後述されるいくつかの実施形態において、一本鎖の選択プローブは、固体基板への結合を促進する化学的部分またはその他の特徴を含む。機能的に、「プローブ」は、相補的塩基対合または水素結合形成に代表される１種類または複数種類の化学結合を通じて相補的な配列の標的核酸と結合することができる核酸である。核酸プローブは、天然塩基（すなわちＡ，Ｇ，Ｃ，またはＴ）または修飾塩基（例えば７−デアザグアノシン、イノシン）のいずれかを含んでよい。また、核酸プローブ内の塩基は、ハイブリダイゼーションを妨害しない限り、リン酸ジエステル結合以外の結合によって結ぶことが可能である。したがって、核酸プローブは、リン酸ジエステル結合ではなくペプチド結合によって結合された構成塩基を有するペプチド核酸であることも可能である。
【００５９】
通常、アニーリング混合物は、各選択プローブの複製を複数含有すると考えられる。混合物内の各選択プローブの濃度は、１００μlの反応混合物内で約１〜１００ｎｇであることが好ましいと考えられ、断片の濃度は、１００μlの反応混合物内で約１〜１０μｇであることが好ましいと考えられる。
【００６０】
概して、本発明は、任意の数の個別の選択プローブを使用可能である。関心を持たれている多くの用途では、例えば約１０4〜１０7など少なくとも約１，０００の個別の選択プローブが使用されると予想される。本発明で使用されると考えられる個別のプローブの量は、より具体的には、少なくとも約２，０００であり、更に具体的には、少なくとも約５，０００、または少なくとも約１０，０００、または少なくとも約５０，０００である。全ての選択プローブは、単一の溶液内または単一の混合物内で使用され、全てのサンプル断片と接触されるので、何千もの個別の標的配列の選択を、単一の反応混合物内で同時に行うことができる。何万または何十万もの個別の標的配列を用いる複合サンプルの場合は、約１０，０００〜１００，０００、ひいては１，０００，０００ものプローブが使用されてよい。必ずしもそうとは限らないが、全ての選択プローブは、単一の溶液内または単一の混合物内に提供されることが好ましい。
【００６１】
したがって、本発明の一実施形態は、非標的核酸断片から標的核酸断片を同時に選択するために使用される選択プローブセットを提供する。該セットは、共通の媒体内に少なくとも約１，０００（好ましくは少なくとも約１０，０００）の個別の選択プローブを含む。前述のとおり、各選択プローブは、例えば個別のＳＮＰに関連した配列などの個別の標的配列と相補的な配列を有する。選択プローブは、いずれも、単一のＳＮＰのみを有する配列と相補的であることが好ましい。全ての標的配列は、ゲノムなどの単一サンプル内に見いだすことができる。プローブセットを内包するために使用される媒体は、緩衝水溶液である。具体的な一実施形態では、該溶液は、およそ１ＭのＮａ＋＋塩を含有し、好ましくは５０％のホルムアミドおよび１０％の硫酸デキストランを伴う。
【００６２】
選択プローブセットは、標的配列および非標的配列を含有する大きいゲノム内の標的を表しているので、共通媒体の選択プローブは、非標的配列を含有するとしてもごく僅かであるか、あるいは、少なくとも、プローブによる標的配列選択能力を大幅に損なわない量のみを含有している。最低でも、共通媒体は、（生来のゲノム内またはその他のサンプル内における標的配列および非標的配列の相対量と比較すると、）選択プローブと相補的な標的配列を、非標的配列と比べて大幅に豊富に含有すると考えられる。これは、非標的配列に対する標的特異性選択プローブの相対量が、溶液中における、非標的断片配列の種類数に対する標的特異性プローブ配列の種類数、または非標的断片の総数に対する標的特異性プローブ配列の総数のいずれに基づいて測定される場合でも真である。
【００６３】
更に、選択プローブセットは、サンプルの特性決定に関連するものとして特定される全ての標的配列のためのプローブを含有する必要はない。例えば、サンプルの特性決定に関連するものとして、５０，０００の個別のＳＮＰ対立遺伝子が特定された場合でも、選択プローブは、このうち４０，０００の対立遺伝子のためのプローブのみを含有することが可能である。サンプル内に存在する可能性がある標的配列の少なくとも一部を隔離する目的で４０，０００のプローブからなるセットをサンプル混合物にあてがうことは、本発明の範囲内である。更に、プローブセットは、特定のサンプル内に存在するよりも多くの標的配列を含有することも可能である。例えば、特定の組織に由来するｍＲＮＡからサンプルを採取することが可能であり、この場合、そのサンプル内には、その組織で発現されない標的配列は存在しないと考えられる。
【００６４】
選択プローブは、オリゴヌクレオチド合成技術および有機体からの隔離を含む任意の適切な方法によって生成されてよい。後者の場合は、比較的高濃度のプローブを生成するために、ＰＣＲまたはその他の増幅技術を用いることができる。一具体例では、特定のＳＮＰを保持することが知られているヒトゲノムの配列に対してＰＣＲ（またはマルチプレックスＰＣＲ）を使用することによってプローブを得てる。このような状況では、個々の選択プローブは、このようなプローブに特異的なプライマを使用したＰＣＲ反応によって作成することができる。このようなゲノム配列は、例えば関連研究および結合解析等など、当該分野において既知の任意の方法を通じて特定することができる。
【００６５】
多くのサービス会社が、契約ベースで特注のプローブを提供している。本発明で使用される選択プローブは、このようなサービス会社に注文することができる。サービス会社の例の一部として、カリフォルニア州パロアルトのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ウィスコンシン州マディソンのＮｉｍｂｌｅＧｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．、テキサス州ヒューストンのＳｅｑＷｒｉｇｈｔ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、およびカリフォルニア州カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎが挙げられる。別のアプローチでは、標的特徴を有するものとして知られるゲノムＤＮＡ（例えばゲノムライブラリーからの単染色体またはクローン）を断片化することによって選択プローブを作成することができる。更に別のアプローチでは、発現標的配列を選択するためにｍＲＮＡをｃＤＮＡに転換することによって選択プローブを作成することができる。言い換えると、発現ｍＲＮＡは、標的配列を有している。
【００６６】
前述のとおり、選択プローブは、アニーリングプロセスの完了後における固体基板への結合を促進する部分を含んでもよい。このような部分の例は、ビオチン、アビジン、蛍光色素、ジゴキシゲニン、またはその他の修飾ヌクレオチドを含むようにＤＮＡを修飾したものを含む。一具体例において、該部分は、ビオチンまたはストレプトアビジンであり、この場合、基板表面は、ストレプトアビジンまたはビオチンをそれぞれ有している。代替の一実施形態では、選択プローブは、固体基板に予め結合された状態で提供される。このような実施形態では、固体基板は、ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、増幅された断片の溶液と接触される。独立した結合工程は不要である。
【００６７】
本発明の態様は、上で示されたように、選択プローブセットを、標的配列の濃縮および／または解析を促進する１つまたは複数の他のアイテムとともに含む、キットに関する。一実施形態では、該キットは、選択プローブ上の部分と結合するための表面特徴を有する固体基板（例えばビーズ、マイクロアレイ、カラム等など）も含むことによって、基板に対する選択プローブの固定化を促進する。該キットは、また、核酸断片を増幅するためのプライマおよびポリメラーゼを含んでもよい。更にまた、該キットは、核酸アレイ、または標的断片内に含有される標的配列を特定するための他のツールを提供されてもよい。
【００６８】
本発明の実施形態にしたがって、選択プローブの完全セットとサンプル断片とが単一の反応混合物内に提供される。混合アニーリング生成物の形成を促進するためには、これらの２つの成分の相対濃度は、例えば断片が選択プローブの約１０００倍であるなどのように、断片の濃度が選択プローブの濃度の約１００倍から約１０，０００倍であると好ましく、約５００倍から約５，０００倍であると更に好ましい。なお、多くの用途では、大きな選択プローブ「完全」セットの一部が用いられる点に留意せよ。例えば、関連研究では、関心を持たれている条件に、特定のＳＮＰが組み合わされる。「完全」プローブセットは、ＳＮＰ対立遺伝子用の個別の選択プローブを、何十万、ひいては何百万含んでいてよく、上記の関心を持たれている条件で用いられるプローブセットでは、これらのうち、数千の選択プローブのみが用いられる。
【００６９】
標的断片を実際に選択するためには、プロセスは、断片および選択プローブの両方を一本鎖の形で提供しなければならない。したがって、もし、いずれかが二本鎖の形態で存在している場合は、プロセスは、先ず、混合物内の二本鎖配列を変性することから開始する。混合物内の条件は、次いで、アニーリングを推進する条件に徐々に変更される。実現形態のなかには、アニーリングを促進するために、段階式に温度を変更する場合がある。代表的な一実現形態では、アニーリングは、約１０〜５０時間（具体的な一実現形態では３６時間）にわたって行われる。
【００７０】
一実施形態では、二本鎖のプローブおよび二本鎖の断片が、５０％のホルムアミド溶液を使用して約９４℃の温度で約２分間にわたって変性される。なお、ホルムアミドの濃度が１％増加すると、二本鎖ＤＮＡの融解温度が約０．６℃下がるので、融解温度およびホルムアミド濃度の組み合わせは、必要に応じて調整可能である。変性後、配列は、本明細書に記載されるとおり、特定の漸次的変化を伴う除冷プロセスによってアニーリングされる。先ず、混合物は、約２時間にわたって９４℃から約４２℃まで冷却される。次いで、温度は、約１２時間にわたって４２℃に維持される。その後、溶液は、約５時間にわたって４２℃から約３７℃まで除冷される。アニーリングの大部分は、この温度範囲（約３７〜４２℃）で生じる。３７℃に達した後、混合物は、約１２時間にわたってこの温度に維持される。もちろん、本発明は、これらの変性条件に限定されず、例えば、僅か１２時間など大幅に短い期間でアニーリングすることも可能である。
【００７１】
概して、アニーリングは、特定のヌクレオチド配列の存在する厳しい条件下における、その特定のヌクレオチド配列のみに対する分子の結合、二本鎖化、またはハイブリダイゼーションを意味する。厳しい条件は、プローブがその標的部分配列とハイブリダイズする一方で、他の配列とはハイブリダイズしない条件である。厳しい条件は、配列に依存し、且つ状況に応じて変動する。概して、厳しい条件は、定められたイオン強度およびｐＨの下における特定の配列の熱融点（Ｔｍ）より、約５℃低く選択される。Ｔｍは、平衡状態において、標的配列と相補的なプローブの５０％が（定められたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度のもとで）その標的配列とアニーリングする温度である。（標的配列は超過して存在しうるので、Ｔｍでは、平衡状態において、プローブの５０％が理論的に占有されている。）通常、厳しい条件は、７．０〜８．３のｐＨのもとで少なくとも約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）を含み、温度は、短いプローブ（例えば１０〜５０のヌクレオチド）に関しては少なくとも約３０℃である。厳しい条件は、また、ホルムアミドなどの非安定化剤の追加によって実現することもできる。例えば、対立遺伝子特異性のプローブによるハイブリダイゼーションに適しているのは、５ｘＳＳＰＥ（７５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、７．４のｐＨ）および温度２５〜３０℃の条件である。
【００７２】
選択プロセスの開始点および終点が、図４Ａおよび図４Ｂに図示されている。図に示されるように、各図は、単一の容器４０３内に用意された反応混合物４０５の分子スケールの塊４７０を表している。図４Ａの塊４０７は、多数の二本鎖を有する。選択プローブは、ビオチンを表す「Ｂ」の付着によって識別可能である。これらは、プローブ４１１，４１５を含む。また、各選択プローブは、「Ｘ」によって示される標的配列を含む。サンプル断片は、末端の長方形のアダプタ配列によって識別可能である。断片のなかには、標的配列Ｘを有するもの（例えば断片４１３）もあれば、標的配列Ｘを有さないもの（例えば断片４０９）もある。
【００７３】
図４Ａに示された理想的な例では、選択プローブは、標的配列Ｘ１〜Ｘ６を保持している。サンプル断片は、標的配列Ｘ１，Ｘ２，Ｘ４，Ｘ６のみを保持している。配列Ｘ３，Ｘ５は、このサインプル内には存在しない。図４Ｂの塊４０７’に示されるように、アニーリング後は、標的断片とハイブリダイズしたプローブもあれば、ハイブリダイズしなかったプローブもある。図示されるように、断片４０９などの、標的配列を有さないサンプル断片は、そのままの状態に留まる。標的Ｘ３，Ｘ５を有する選択プローブ、および標的Ｘ６を有するプローブ４１１についても同様である。プローブ４１１は、やはり標的配列Ｘ６を保持しているサンプル断片４１３と、アニーリングしなかった。相補的な選択プローブと標的断片との組み合わせには、当然ながら、互いにアニーリングしないものもある。図示された例では、標的Ｘ１，Ｘ２，Ｘ４を有する断片がクロスアニーリングした。当然ながら、標的を保持する断片および相補的な選択プローブのいずれにも、一般に、複数の複製が存在する。したがって、通常は、相補的な鎖の全部が相手を見つけてアニーリングするわけではないが、適切な条件下であれば、かなりの割合がアニーリングしてプローブとサンプルとの二本鎖生成物を生成すると考えられる。
【００７４】
サンプル断片および選択プローブは、アニーリングされた後、選択プローブに対して親和力を有する固体基板に溶液を暴露することによって固定化される。前述のとおり、選択プローブは、基板表面上の相補的部分と結合する部分を含むことができる（例えばビオチンとストレプトアビジン）。固体基板は、ビーズ、ディスク、カラム、マイクロアレイ、多孔質ガラス表面、膜組織、およびプラスチックを含む様々な形態をとってよい。具体的な一実施形態では、基板は、直径およそ１ミクロンで且つそれぞれおよそ１０5〜１０7のプローブを有するビーズである。ビオチンで標識したＤＮＡを固定化するには、Ｄｙｎａｌ（ノルウェイのオスロ）から市販されている、ストレプトアビジンを塗布された電磁ビーズが適している。ビーズ上に固定化されたＤＮＡを用いて核酸を濃縮するための手順は、Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．の第３章に記載されており、該文献は、引用によって本明細書に組み込まれるものとする。
【００７５】
図５に示された一実施形態では、表面にストレプトアビジン部分を分布させたビーズに、アニーリングされた混合物が接触される。図に示されるように、アニーリングされた混合物４０５’に、複数のビーズ５０３が加えられる。最初、個々のビーズは、選択プローブを固定化されていないが、図５の個々のビーズ５０５上の「Ｓ」で示されるように、表面上にストレプトアビジン部分を分布させている。ビーズは、溶液中に一定期間留まると、溶液中の選択プローブの一部を捕獲する。捕獲されたプローブの一部は、図５のビーズ５０５’で示されるように、標的断片とアニーリングされている。
【００７６】
具体的な一実施形態では、溶液とビーズとの接触は、約２０〜３７℃の温度で約３０分から１時間の期間に実施される。これは、ビオチン部分とストレプトアビジン部分とが互いに結合し、選択プローブと相補的ＤＮＡ断片との二本鎖配列を効率的に固定化するのに十分な時間を提供する。
【００７７】
前述のとおり、選択プローブの配列は、関心を持たれている特徴（例えば１つまたは複数のＳＮＰ）を含む標的配列を選択するように選ばれることが望ましい。関心を持たれている特徴は、プローブ配列の中心に位置することが多いが、これは、必ずしも必要ではない。関心を持たれている特徴は、場合によっては、プローブ配列の中心から外れていたり、あるいはプローブ配列の外であったりする。もし、関心を持たれている特徴がプローブ配列の外に位置するならば、プローブ配列は、そのような特徴を有する断片を拾い出すことができるように、関心を持たれている特徴に十分に近い標的配列内の領域と相補的であることが望ましい。これらの実現形態が、図６に示されている。図６（ａ）は、ＳＮＰまたは関心を持たれている他の特徴６０３が選択プローブ６０５の中心に位置する場合を、図６（ｂ）は、ＳＮＰ６０３が選択プローブ６０７内に位置するが中心から外れている場合を、図６（ｃ）は、ＳＮＰ６０３が選択プローブ６０９の範囲外に位置するがこのプローブの一端に近い場合を、それぞれ示している。
【００７８】
上記に概略を示された手順では、標的断片の少なくとも一部は、固体基板に付着される。これらの断片を濃縮するためには、付着していない断片を洗い流すか、あるいは基板から分離することが望ましい。標的断片が固定化されたプローブ配列と相補的であることを考えれば、当業者ならば、様々な隔離技術が明らかであろう。例えば、２段階の洗浄手順が用いられてよい。第１段階は、基板上にあるがＤＮＡ間相互作用を通じて結合されなかったＤＮＡ断片を除去するために用いられ、第２段階は、１つまたは複数の選択プローブと相補的であるはずの領域内にその１つまたは複数の選択プローブとの不一致を含んでいる緩くハイブリダイズされたサンプル核酸鎖を、より厳しい条件下で除去するために実施される。
【００７９】
一例として、第１段階は、室温下で６ｘＳＳＰバッファを使用して実施され、第２段階は、より高めの温度で、より小さい塩濃度（より厳しい条件を表す）を用いる最も厳しい条件下で実施される。例えば、これは、約３７℃以下のほぼ室温で、０．２ｘＳＳＰＥを使用して実施されてよい。繰り返し述べるが、この第２の洗浄は、選択プローブと部分的に相補的であると考えられる比較的緩く結合されたＤＮＡ断片を除去する。図７は、完全にハイブリダイズされた相補的な断片７１１（通常、第２段階の洗浄によって除去されないと考えられる）および部分的にハイブリダイズされた断片７１３（第２段階の洗浄によって除去される傾向が強いと考えられる）の様子を示している。いずれの断片も、選択プローブ７０５とハイブリダイズされた状態で示されている。
【００８０】
アニーリングされなかったサンプル断片および緩くアニーリングされたサンプル断片とが、上記の２段階の洗浄によって除去された後は、標的ＤＮＡ断片のみが、固体基板上に留まっていることが望ましい。言い換えると、基板は、この時点では、選択プローブに対する相補性が強く且つ標的ＤＮＡ断片であると推定される核酸断片のみを含んでいる（ことが理想的である）。したがって、この時点に至るまでのプロセスは、標的断片を、サンプルの残りの部分から効率的に隔離した。標的は、この時点で、後述される様々な方法によって更に処理または解析されてよい。本明細書の実施例は、ＤＮＡマイクロアレイを用いた解析について具体的に説明しているが、本発明は、この方法に限定されないことを理解されるべきである。
【００８１】
図１に示されるように、ブロック１１３において、標的ＤＮＡ断片は、固定化された選択プローブから、例えば変性などによって除去される。一具体例では、これは、室温下で０．１５Ｍの水酸化ナトリウムを用いた処理によって実現される。その後、溶液は、０．１５Ｍの塩酸を用いて中和される。標的断片を基板から取り除く変性処理の後は、基板それ自体（例えばビーズ）を溶液から取り除いてよい。結果として得られる溶液は、隔離され且つ濃縮された標的核酸断片を含有している。
【００８２】
隔離された標的断片の解析
いくつかの実施形態では、隔離された標的断片を直接解析することができる。特定の用途では、しかしながら、先ず、隔離された標的断片を更に増幅する且つ／または断片化する必要がある。前述のとおり、ＰＣＲ抑制の可能性は、最初の断片化手順に制約を及ぼし、形成される断片を、およそ３００〜４００塩基対またはそれより大きくする。このような断片は、ＤＮＡマイクロアレイを使用した効率的な検査には大き過ぎる。したがって、標的の鎖を更に断片化する必要が生じる。
【００８３】
濃縮された標的断片を増幅する必要があると仮定された場合（図１の工程１１７を参照せよ）は、最初の増幅（工程１０７）で使用されたものと同じ配列のプライマを使用したＰＣＲが実施される。隔離された標的断片には、依然としてアダプタ配列が付着されているので、これらのアダプタ配列は、ＰＣＲプライマによるアニーリング場所として機能することができる。多くの場合、第２の増幅では単一のプライマ配列のみが必要とされる。なぜならば、プロセスの早い段階（図１の工程１０５を参照せよ）で用いられたのが、単一のアダプタ配列のみであったからである。ただし、ここでは、最初の増幅で用いられた二本鎖のアダプタ配列ではなく、一本鎖のプライマが用いられるのが一般的である。増幅の程度は、捕獲され且つ固定化された断片の量と、配列解析技術の要件とに依存する。典型的な例では、およそ２０〜４０のＰＣＲサイクルが用いられる。
【００８４】
増幅後、隔離された断片は、ＤＮＡマイクロアレイ上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブによる効率的なハイブリダイズには大き過ぎる可能性がある。もしそうならば、前述のとおり、標的の鎖を更に断片化することが望まれる。もし第２の断片化が用いられるならば、その条件は、実施される解析技術に適したサイズの断片を生成するように選ばれる。ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子型決定の場合、最終的な断片のサイズは、約２５〜１５０塩基対の長さであることが好ましく、あるいは、実施形態によっては、約４０〜１００塩基対の長さであることが好ましい。隔離された標的配列を断片化して、このサイズの断片を最終的に生成するために、適切な期間に及ぶＤＮａｓｅとの接触を用いることができる。他の実施形態では、追加の断片化は、上述されたように、せん断や制限酵素等を使用して実現される。
【００８５】
図８は、選択された標的断片に対する第２ラウンドの増幅および断片化の進行の様子を追ったものでる。図に示されるように、アダプタ３０３を有する標的断片６１３は、増幅され、追加の複製６１３’を生成している。増幅された標的断片は、次いで、断片化され、更に小さい標的断片６２３，６２３’等を生成している。例示されているように、これらの断片のなかには、関心を持たれている標的配列を含有しないものもある。
【００８６】
単一の断片化反応のみを使用することも、当然ながら、本発明の範囲内である。このような実施形態では、最初の断片化は、例えば従来のＤＮＡマイクロアレイを使用した遺伝子型決定などの、隔離された標的断片に対する解析に適したサイズの断片を生成する。あるいは、該方法は、比較的大きい配列（例えば約３００塩基対またはそれより大きい配列）の配列決定に適したシークエンシングツールを用いる。例えば、直接シークエンシング技術が利用されてよい。他の実施形態は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サンディエゴ）および４５４  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（コネチカット州ニューヘーブン）によるシークエンシングプラットフォームを用いる。概して、本発明は、本発明を使用して隔離された標的断片を解析するためのいかなる特定の手法または製品にも限定されない。
【００８７】
もし、隔離された標的断片の配列決定にＤＮＡマイクロアレイが用いられる場合は、これらの断片は、先ず、標識付けされ、次いで、固定化されたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを促進する条件下でマイクロアレイと接触される。任意の適切な標識および標識付けの技術が利用されてよい。この目的に広く使用されている標識の多くは、蛍光信号を提供する。一具体例では、断片に標識を付けるために、末端トランスフェラーゼ酵素が用いられる。断片に標識を付着させ、マイクロアレイ上のオレゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた後は、マイクロアレイに結合された断片の検出を更に促進するために、マイクロアレイを着色および／または洗浄することができる。次いで、サンプル内における様々な標的配列の存在または不在を示すために、アレイ上の結合パターンの読み出しおよび解釈が行われる。ＳＰＮ標的の場合、リーダは、例えば、（１）アレイ上における個々のプローブの既知の配列および位置と、（２）断片がアレイ上の１つまたは複数のプローブと相補的であることを知ること、（３）そうしてその断片の配列を知ること、そして最後に、（４）その断片の遺伝子型を知ること、によって、標的配列内に存在する対立遺伝子を識別する。標識およびオリゴヌクレオチドマイクロアレイ、並びに関連のリーダーおよびソフトウェア等は、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サンタクララ）から市販されているものなど、従来から市販されている様々なＤＮＡマイクロアレイ製品によって提供される。前述のとおり、例えば各マーカーをコードする領域の直接シークエンシング、標的配列を含むライブラリの作成、更なる実験または手法におけるプローブとしての標的配列の使用、または細胞株内の機能分析における使用など、他の方法も適している。
【００８８】
図９は、上述された具体的な一実施形態において、隔離された標的断片の配列決定を行うために用いられる一連の工程を示している。工程９２１では、液状媒体内に、隔離された遊離標的断片が提供される。これらは、先ず、固体基板を洗浄して非特定断片を除去し、次いで、特異的に結合された標的断片を解放することによって得られた。標的断片内には、８３，０００のＳＮＰが表される。工程９２３では、８３，０００の全てのＳＮＰを増幅するために、単一のＰＣＲおよび単一のプライマを使用して遊離標的断片が増幅される。その後、工程９２５において、断片は、更に、断片化および標識付けを実施される。最後に、工程９２７において、ＤＮＡマイクロアレイを使用して、標識付けされた断片が検査される。
【００８９】
実施例
ＤＮＡサンプルの作成
ヒトの血中リンパ球由来のゲノムＤＮＡが、市販のキットを使用して、製造元による手引きにしたがって隔離された。およそ１００ｎｇのゲノムＤＮＡが、１ｍＭのＭｎＣｌ2の存在下でＤＮａｓｅＩを使用して断片化された。アガロースゲル電気泳動による分離後、臭化エチジウムによる着色によって可視化したところ、断片化されたＤＮＡのサイズ範囲は、約２００ｂｐ〜１ｋｂであった。断片化されたＤＮＡは、２００ｍＭのｄＮＴＰの存在下で、６５℃で、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを使用して処理され、平滑末端を有するようになった。平滑末端を有するこれらの断片は、次に、１６時間にわたって、４℃で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して二本鎖アダプタとライゲーションされた。ライゲーションされたＤＮＡは、次いで、２０〜２４サイクルのＰＣＲ反応において、テンプレート（増幅対象）として使用された。このときは、ライゲーション反応の残りであるライゲーションされなかったアダプタが、ＰＣＲプライマとして機能した。このＰＣＲ反応は、ＤＮＡ断片の末端を平滑化するために事前に使用されたＰｆｕＤＮＡポリメラーゼまたは反応に加えられた他のＤＮＡポリメラーゼ酵素による触媒作用を受けることができる。通常、ＰＣＲ生成物のサイズは、約３００ｂｐ〜１．２ｋｂの範囲にあり、大半は、約５００〜６００ｂｐである。
【００９０】
アニーリング反応
およそ５μｇのＰＣＲ生成物が、１０μｇのＣＯＴ−１  ＤＮＡおよび１００μｇのＨｅｒｒｉｎｇ  Ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡと混合され、得られた混合物は、真空での遠心分離によって凍結乾燥された。乾燥されたＤＮＡは、次いで、６ｘＳＳＣまたは６ｘＳＳＰＥなどの適切なハイブリダイゼーションバッファ内で再懸濁された。該バッファは、５０％のホルムアミド、および／または１０％硫酸デキストランもしくは１０％ポリエチレングリコールなどのハイブリダイゼーション促進剤を含むことが可能である。反応物は、およそ５０ｎｇのビオチン標識ＤＮＡ選択プローブを加えられ、２時間に及ぶ９５℃での変性後、２時間にわたって３７℃まで徐々に冷却された。このアニーリング反応は、３７℃で、２０〜３６時間にわたって継続された。
【００９１】
アニーリングされたＤＮＡ断片の選択
反応物に、ストレプトアビジンを塗布された１ミクロンの常磁性ビーズが１００μｇ加えられ、ビオチン化ＤＮＡは、３７℃で３０分間にわたってビーズに結合された。結合に続いて、ビーズは、室温で１ｍｌの６ｘＳＳＰＥバッファを使用して２回、３７℃で１ｍｌの０．２ｘＳＳＰＥを使用して２回、３０分間にわたって順に洗浄された。ビーズに捕獲されたＤＮＡは、次いで、０．１５ＭのＮａＯＨ内での定温放置によって解放され、変性されたＤＮＡは、等しい量の０．１５ＭのＨＣｌの追加によって中和された。中和されたＤＮＡは、次いで、ＤＮＡ断片の末端にあるライゲーションされたアダプタに対応するＤＮＡ配列を有する一本鎖のＰＣＲプライマを用いたＰＣＲ反応に使用された。増幅されたＤＮＡは、次いで、標準的な手順にしたがったマイクロアレイハイブリダイゼーションに備えて純化され、断片化され、末端トランスフェラーゼ酵素を使用して末端標識された。
【００９２】
本実施例および好ましい一実施形態に関する上記の説明で例示されるように、本発明は、ヒトゲノムなどの大きなサンプルを処理する際の複雑さを大幅に低減させる。参考として、ヒトゲノムは、およそ３０億の塩基対を含有する。本発明にしたがって、８０，０００の選択プローブからなるセットを使用すれば、解析されるＤＮＡの量を、およそ２０分の１に、すなわち５００ｂｐのサンプル断片の場合は約８千万の塩基対に、容易に減らすことができる。用いられる選択プローブの数が少ない場合、且つ／またはサンプル断片が小さい場合は、明らかに、より大幅に複雑さを低減させる結果となる。
【００９３】
他の実施形態
本発明は、上述されたよりも広い範囲の実現形態および適用性を有する。例えば、本発明の手法は、ＤＮＡマイクロアレイを使用した遺伝子型決定の観点から説明されてきたが、本発明による手法は、それに限定されない。例えば、本発明は、全長のｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、遺伝子などの核酸の選択および隔離、並びに遺伝子発現解析および種間比較ハイブリダイゼーションなど複雑性の低減を必要とする他の方法に、容易に拡張可能である。当業者ならば、その他の変形、変更、および置換に気づくであろう。
【００９４】
以上の説明は、例示を目的とし、非限定的である。当業者ならば、様々な実施形態および変更形態が、本出願に開示された発明に対して本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく実現可能であることが、容易に明らかである。したがって、本発明の範囲は、上記の説明を参照にして決定されるのではなく、添付の特許請求の範囲と、そのような特許請求の範囲によって権利を付与される全ての等価形態とを参照にして決定されることが望まれる。本明細書で言及された刊行物は、全て、本発明に関連して使用されうる反応物、手法、および概念の説明並びに開示を目的として引用されたものである。本明細書における如何なる記載も、これらの刊行物を、本明細書に記載された発明に関連する先行技術であると認めるものとは解釈されない。開示内容全体を通して、様々な特許、特許出願、および刊行物が言及されている。そうと明記されない限り、これらの各自は、その全体を引用によって本明細書に組み込まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】本発明の一実施形態にしたがってサンプルから標的核酸配列を隔離するための一方法を示したプロセスフローチャートである。
【図２Ａ】核酸鎖を断片化し、関心を持たれている標的配列を含有するものを含む複数の断片を生成する様子を示した図である。
【図２Ｂ】核酸鎖を断片化し、関心を持たれている標的配列を含有するものを含む複数の断片を生成する様子を示した図である。
【図３Ａ】後続の増幅を促進するために、図２（Ｂ）の断片の末端にアダプタを付着させた状態を示した図である。
【図３Ｂ】核酸断片の平滑末端に二本鎖アダプタを付着させるライゲーションプロセスを図示した図である。
【図３Ｃ】結合部分（例えばリン酸基）を欠くことによってセルフライゲーションを阻止するように設計された平滑末端を有するアダプタ構造を示した図である。
【図３Ｄ】二本鎖構成における切れ目位置より先のアダプタ配列を取り去ったアダプタを付着させた断片鎖のポリメリゼーションを図示した図である。
【図４Ａ】選択プローブの使用を通じて標的配列の選択を実現することができる媒体を示した図である。
【図４Ｂ】図４（Ａ）の媒体について、初期の配列を変性し、次いで、一本鎖の選択プローブと一本鎖の標的核酸断片との結合を促進する条件下でそれらを再アニーリングする処理を経た後の、様子を示した図である。
【図５】選択プローブを含有する二本鎖核酸を固体基板に固定化する様子を図示した図である。
【図６】選択プローブと標的核酸配列内のＳＮＰ位置との配置関係の例を３つ示した図である。
【図７】サンプルの核酸断片を選択プローブに「結合」させうる２つの異なるシナリオを示した図であり、一方は堅い結合で、他方は緩い結合である。
【図８】隔離された標的核酸配列を増幅して更に断片化するプロセスを示した図である。
【図９】隔離された標的配列をＤＮＡマイクロアレイなどの核酸アレイと接触させる様子を示した図である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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