(57)【要約】本発明は、細菌の検出・鑑別診断のために要される遺伝情報の細菌特異的なヌクレオシド、属特異的なヌクレオシド、種特異的なヌクレオシドにより種々のタイプのサンプルまたは検体において細菌を同定する、Bacterial Digitalcode System（ＢａＤｉｓ）と呼ばれる方法を提供する。さらに詳しくは、本発明は、病原性感染疾患細菌、食中毒誘発細菌、生物医薬品汚染誘発細菌及び環境汚染細菌などの細菌の存否及び属と種の鑑別のために細菌の２３ＳｒＤＮＡ遺伝子などの標的塩基配列から講じられた細菌特異的（bacterial specific）、属特異的（genus specific）及び種特異的（species specific）なオリゴヌクレオチド、これをプライマーとして用いて検出する重合酵素連鎖反応（polymerase chain reaction）キット及びこれをプローブとして含むマイクロアレイ、並びに、これを用いた検出方法に関する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１９のうちいずれか１の塩基配列やこれに相補的な塩基配列を含む細菌特異的な鑑別のためのオリゴヌクレオチド及び配列番号２０〜１８９のうちいずれか１の塩基配列やこれに相補的な塩基配列を含む細菌の原因菌属特異的な鑑別のためのオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、
これを支持体に付着して含むことを特徴とする、
マイクロアレイ。
【請求項２】
原因菌種特異的な鑑別のためのオリゴヌクレオチドをプローブとしてさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項３】
前記プローブは、テオクシヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）、またはペプタイドゥヌクレオチド（ＰＮＡ）、ラククドゥヌクレオチド（ＬＮＡ）及びティ−ヘクシトルリュクルレオティドゥ（ＨＮＡ）から選ばれた核酸類似体であることを特徴とする、請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項４】
前記支持体は、スライドガラス、プラスチック、メンブレイン、半導体チップ、シリコン、ジェル、ナノ材料、セラミック、金属材料、光繊維またはこれらを組み合わせてなることを特徴とする、請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項５】
配列番号１〜１９のうちいずれか１の塩基配列やこれに相補的な塩基配列を含む細菌特異的な鑑別のためのオリゴヌクレオチド及び配列番号２０〜１８９のうちいずれか１の塩基配列やこれに相補的な塩基配列を含む細菌の原因菌属特異的な鑑別のためのオリゴヌクレオチドを１セットのプライマーとして含むことを特徴とする、
ＰＣＲキット。
【請求項６】
原因菌種特異的な鑑別のためのオリゴヌクレオチドをプライマーとしてさらに含むことを特徴とする、請求項５に記載のＰＣＲキット。
【請求項７】
試料に存在する核酸を分離するステップと、
前記分離した核酸のうち標的ＤＮＡを請求項５に記載のＰＣＲキットを用いて増幅するステップと、
前記増幅されたＤＮＡを電気泳動装置により解析するステップと、を含むことを特徴とする、
細菌鑑別及び検出方法。
【請求項８】
前記核酸増幅ステップは、ホットスタートＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＤＯＰ(degenerate oligonucleotide primer)−ＰＣＲ、定量ＲＴ−ＰＣＲ、イン・サイチューＰＣＲ、マイクロＰＣＲ、またはラブ・オン・チップＰＣＲ反応を用いて行われることを特徴とする、請求項７に記載の細菌鑑別及び検出方法。
【請求項９】
試料に存在する核酸を分離するステップと、
前記分離した核酸のうち標的ＤＮＡを増幅するステップと、
前記増幅されたＤＮＡを請求項１に記載のマイクロアレイ上のプローブと混成化させるステップと、
前記形成されたハイブリッドのシグナルを検出するステップと、を含むことを特徴とする細菌鑑別及び検出方法。
【請求項１０】
アシネトバクター属（配列番号２０〜２２）、アエロモナス属（配列番号２３〜２８）、バチルス属（配列番号２９〜３４）、バクテロイデス属（配列番号３５〜４１）、ボルデテラ属（配列番号４２〜４４）、ボレリア属（配列番号４５〜４７）、ブルセラ属（配列番号４８〜５０）、バルコデリア属（配列番号５１〜５３）、カンピロバクター属（配列番号５４〜５６）、クラミジア属（配列番号５７〜５９）、シトロバクター属（配列番号６０〜６５）、クロストリジウム属（配列番号６６〜７１）、コリネバクテリウム属（配列番号７２〜７４）、エンテロバクター属（配列番号７５）、エンテロコッカス属（配列番号７６〜８０）、フゾバクテリウム属（配列番号８１〜８６）、ヘモフィルス属（配列番号８７〜８９）、ヘリコバクター属（配列番号９０〜９６）、クレブシエラ属（配列番号９７〜１０２）、レジオネラ属（配列番号１０３〜１０８）、リステリア属（配列番号１０９〜１１４）、モルガネラ属（配列番号１１５〜１１７）、マイコバクテリウム属（配列番号１１８〜１２３）、マイコプラスマ属（配列番号１２４〜１２９）、ナイセリア属（配列番号１３０〜１３５）、ペプトコッカス属（配列番号１３６〜１３８）、プレシオモナス属（配列番号１３９〜１４１）、ポルフィロモナス属（配列番号１４２〜１４４）、プロピオン酸菌属（配列番号１４５〜１４７）、プロビデンシア属（配列番号１４８〜１５１）、シュードモナス属（配列番号１５２〜１５７）、サルモネラ属（配列番号１５８〜１６０）、シゲラ属（配列番号１６１〜１６４）、スタヒロコッカス属（配列番号１６５〜１７０）、ストレプトコッカス属（配列番号１７１〜１７６）、トレポネーマ属（配列番号１７７〜１７９）、ウレアプラスマ属（配列番号１８０〜１８２）、ビブリオ属（配列番号１８３〜１８５）及びエルシニア属（配列番号１８６〜１８９）よりなる群から選ばれた１種以上の細菌を同時に探知することを特徴とする、請求項７から請求項９のいずれかに記載の細菌鑑別及び検出方法。
【請求項１１】
配列番号１〜１９のうちいずれか１の塩基配列やこれに相補的な塩基配列を含む細菌特異的な鑑別のためのオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号２０〜１８９のうちいずれか１の塩基配列やこれに相補的な塩基配列を含む細菌の原因菌属特異的な鑑別のためのオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌の検出及び鑑別診断に用いて好適なオリゴヌクレオチドとこれを用いた検出方法に係り、さらに詳しくは、細菌の鑑別のために、２３ＳｒＤＮＡまたはＩＴＳ（internal transcribed spacer region、内部転写域）遺伝子の標的塩基配列から講じられた細菌特異的、属特異的及び種特異的なオリゴヌクレオチド、これをプライマーとして用いる診断キット、及びこれを用いた検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
培養法と生化学的な解析法（biochemical method）などの伝統的な細菌同定方法は、所要期間が極めて長く、解析が困難である他、煩雑な操作を必要とする（J Clin Microbiology、12:3674-3679(1998)）。
ここ１０年間での微生物の検出のための技術の発展には目を見張るものがあり、結果として、抗体と蛍光を用いた方法、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-linked immunosorbent assay）などの種々の方法が提案されているが、これらの方法は、微量の細菌の場合には検出が困難であり、多大なコストと時間、熟練した労働力を必要とするといった短所がある。
このような状況から、迅速で且つ信頼性のある方法が求められているが、近年、分子生物学的な方法に基づく核酸の増幅方法として、極めて敏感で且つ特異的なＰＣＲ法とＤＮＡチップを用いた方法が脚光を浴びている。
【０００３】
ＰＣＲ（polymerase chain reaction、以下「ＰＣＲ」という）は、ごく少量のＤＮＡをもって特定の領域をネズミ算式に増幅させる上で有効な方法であって、検出効率が高いことから、微量の微生物の分子生物学的な検出に汎用されている。
ＤＮＡチップを用いた技術は、プローブ混成化原理を用いたものであって、数十個から数万個に至る極めて少量の遺伝物質を固形支持体に高密度にて固着することができることから、同時に多くの遺伝子を解析することができる。
この理由から、これは、遺伝子型の同定、突然変異の検出と遺伝子の発現などの検査に極めて有効な技術であると知られている。
かかる分子生物学的な診断技術を用いた遺伝子型の同定方法は、増殖速度が極めて遅いか培養条件が厳しい細菌、またはあまり知られていない細菌などを一括して臨床検体で高速で且つ敏感に検出できる方法であって、技術的に非常に進歩した方法であると言える。
【０００４】
種々の文献から明らかなように、感染疾患の原因菌を同定するために汎用されている遺伝子は、細菌において極めて保存的な共通配列として現れる１６ＳｒＤＮＡに基づいている（J Microbiol Methods、５５:５４１-５５５(２００３)、Pediatrics、９５:１６５-１６９(１９９５)、Appl Environ Microbiol、６４:７９５-７９９(１９９８)、J Clin Microbiol、３２:３３５-３５１(１９９４)、Microbiol、１４８:２５７-２６６(２００２)）。
しかしながら、これは、塩基配列変異領域が狭いため、一部の特定の細菌の鑑別が困難であるという限界がある。最近には、塩基配列変異の多い過変異領域（J Clin Microbiol、３８:４０８０-４０８５(２０００)、Microbiol、１４２:３-１６(１９９６)、GENE、２３８:２４１-２５２(１９９９)、FEMS Microbiol Letters、１８７:１６７-１７３(２０００)）、多くの塩基配列が未だ判明されていない２３ＳｒＤＮＡ（J Clin Microbiol、３８:７８１-７８８(２０００)、J Microbiol Methods、５３:２４５-２５２(２００３)）遺伝子を基に細菌を検出する方法があるが、これらは、現在の技術からみて、異なる数種の細菌を検出したり、単一の属から数種の原因菌のみを検出したりするのに留まっているという限界がある。
例えば、細胞組織や全血などにより得られる生物医薬品などに汚染を誘起する細菌は様々な属により発生するため、これらの全細菌を検出可能な方法が求められるが、これを可能にする検出方法の１がＤＮＡチップを用いた方法である。
【０００５】
細菌を検出・鑑別診断する方法の限界は、臨床検体や環境などから分離した検体で未知の細菌を同定したり、あるいは、幾つかの種類の細菌を同時に検出する方法であるというところにある。かかる問題点を克服するために、本発明においては、細菌特異的及び属特異的なプライマーやプローブがデザインし易い２３ＳｒＤＮＡと、種特異的及び亜種特異的なプライマーやプローブがデザインし易いＩＴＳにおいてプライマーやプローブをデザインしていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明の主な目的は、細菌の鑑別のために、１次スクリーニングによりほとんどの細菌の存否を確かめるための２３ＳｒＤＮＡ遺伝子由来の細菌特異的なオリゴヌクレオチドを提供し、この後、２次スクリーニングにより２３ＳｒＤＮＡ遺伝子由来の原因菌属特異的なオリゴヌクレオチドを提供し、さらに３次スクリーニングによりＩＴＳ由来の種特異的及び亜種特異的なオリゴヌクレオチドを提供するところにある。
【０００７】
また、本発明の他の目的は、前記本発明によるオリゴヌクレオチドをプライマー及びプローブとして含む細菌の鑑別診断用のＰＣＲキット及びマイクロアレイを提供するところにある。
【０００８】
さらに、本発明のまた他の目的は、前記本発明によるＰＣＲキット及びマイクロアレイを用いた細菌の鑑別及び検出方法を提供するところにある。これによれば、煩雑な操作及び診断コストの節減及び培養の困難さに起因して検出及び診断方法がなかった細菌に対しても診断を行うことができ、今後の原因菌種の正確な検出をなお一層容易にすると共に、診断の遅延及び誤診による抗生剤の誤・濫用を予防することのできる診断方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
バクテリアル・ディジタルコード・システム（Bacterial Digitalcode System：ＢａＤｉｓ）とは、細菌特異的、属特異的、種特異的及び亜種特異的なプライマーやプローブをいずれも含むか、あるいは、これらのうち一部を含む細菌同定及び鑑別診断システムである。
【００１０】
本発明の目的を達成するために、本発明は、配列番号１〜１９のうちいずれか１の塩基配列やこれに相補的な塩基配列を含む細菌の細菌特異的な鑑別のためのオリゴヌクレオチドを提供する。これらのいずれのオリゴヌクレオチドも全細菌の２３ＳｒＤＮＡを増幅・混成化することが可能であるため、一次的に細菌の存否を鑑別することができる。
【００１１】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、配列番号２０〜１８９のうちいずれか１の塩基配列やこれに相補的な塩基配列を含む細菌の原因菌属特異的な鑑別のためのオリゴヌクレオチドを提供する。これらは、異なる原因菌属の２３ＳｒＤＮＡを増幅・混成化することが可能であるため、細菌の原因菌属特異的な鑑別を行うことができる。
【００１２】
具体的に、配列番号２０〜２２はアシネトバクター属(genus Acinetobacter)、配列番号２３〜２８はアエロモナス属(genus Aeromonas)、配列番号２９〜３４はバチルス属(genus Bacillus)、配列番号３５〜４１はバクテロイズ属(genus Bacteroides)、配列番号４２〜４４はボデテルラ属(genus Bordetella)、配列番号４５〜４７はボレリア属(genus Borrelia)、配列番号４８〜５０はブルセルラー属(genus Brucella)、配列番号５１〜５３はバルコデリア属(genus Burkholderia)、配列番号５４〜５６はカンピロバクター属(genus  Campylobacter)、配列番号５７〜５９はクラミジア属(genus Chlamydia)、配列番号６０〜６５はシトロバクター属(genus Citrobacter)、配列番号６６〜７１はクロストリジウム属(genus Clostridium)、配列番号７２〜７４はコリネバクテリウム属(genus  Corynebacterium)、配列番号７５はエンテロバクター属(genus  Enterbacter)、配列番号７６〜８０はエンテロコッカス属(genus Enterococcus)、配列番号８１〜８６はフゾバクテリウム属(genus Fusobacterium)、配列番号８７〜８９はヘモフィルス属(genus Haemophilus)、配列番号９０〜９６はヘリコバクター属(genus Helicobacter)、配列番号９７〜１０２はクレブシエラ属(genus Klebsiella)、配列番号１０３〜１０８はレジオネラ属(genus Legionella)、配列番号１０９〜１１４はリステリア属(genus Listeria)、配列番号１１５〜１１７はモルガネラ属(genus Morganella)、配列番号１１８〜１２３はマイコバクテリウム属(genus Mycobacteria)、配列番号１２４〜１２９はマイコプラスマ属(genus Mycoplasma)、配列番号１３０〜１３５はナイセリア属(genus Neisseria)、配列番号１３６〜１３８はペプトコッカス属(genus Peptococcus)、配列番号１３９〜１４１はプレシオモナス属(genus Plesiomonas)、配列番号１４２〜１４４はポルフィロモナス属(genus Porphyromonas)、配列番号１４５〜１４７はプロピオン酸菌属(genus Propionibacterium)、配列番号１４８〜１５１はプロビデンシア属(genus Providencia)、配列番号１５２〜１５７はシュードモナス属(genus Pseudomonas)、配列番号１５８〜１６０はサルモネラ属(genus Salmonella)、配列番号１６１〜１６４はシゲラ属(genus Shigella)、配列番号１６５〜１７０はスタヒロコッカス属(genus Staphylococcus)、配列番号１７１〜１７６はストレプトコッカス属(genus Streptococcus)、配列番号１７７〜１７９はトレポネーマ属(genus Treponema)、配列番号１８０〜１８２はウレアプラスマ属(genus Ureaplasma)、配列番号１８３〜１８５はビブリオ属(genus Vibrio)、そして配列番号１８６〜１８９はエルシニア属(genus Yersinia)を特異的に鑑別することができる。
【００１３】
本発明者らは、細菌の鑑別のための新規なオリゴヌクレオチドを考案するために、未だ遺伝情報が判明していない多数の細菌の２３ＳｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列を解析することにより、新規に３７種の２３ＳｒＤＮＡの塩基配列（臨時配列１〜３７、図示せず）を決定した。
本発明によるオリゴヌクレオチドは、新規に塩基配列が判明した３７種の遺伝情報を含む多数の細菌の２３ＳｒＤＮＡ遺伝子の多重配列アラインメントに基づいて考案されている。前記オリゴヌクレオチドは、細菌の存否と原因菌属特異的な鑑別のための特異的な核酸分子の増幅方法に有効なプライマー配列として用いることができ、また、混成化方法に有効なプローブ配列としても用いることができる。
【００１４】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記本発明による細菌の細菌特異的及び原因菌属特異的な鑑別のためのオリゴヌクレオチドのうち１以上のオリゴヌクレオチドを含む細菌増幅用のプライマーセットを提供する。かかるプライマーセットは、本発明によるＰＣＲキットを製造する上で使用可能である。
【００１５】
本発明のまた他の目的を達成するために、本発明は、前記本発明による細菌特異的及び属特異的な鑑別のためのオリゴヌクレオチドのうち１以上のオリゴヌクレオチドを含む細菌鑑別用のプローブセットを提供する。かかるプローブセットは、本発明によるマイクロアレイを製作する上で使用可能である。
【００１６】
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、前記本発明による細菌特異的及び属特異的な鑑別のためのオリゴヌクレオチドのうち１以上のオリゴヌクレオチドを含む診断キットを提供する。
【００１７】
本発明の診断キットにおいて、前記オリゴヌクレオチドは、放射性標識法または非放射性標識法により標識することができ、非放射性の標識は、通常のビオチン、Ｄｉｇ（digoxigenin）、ＦＲＥＴ（fluorescence resonance energy transfer）、蛍光（Ｃｙ５、Ｃｙ３など）標識などを含む。また、前記オリゴヌクレオチドは、プライマーまたはプローブとして使用でき、別の標的ＤＮＡの増幅のためのプライマーが含まれていてもよい。
【００１８】
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、前記本発明の細菌特異的な鑑別のためのオリゴヌクレオチド及び本発明の原因菌属特異的な鑑別のためのオリゴヌクレオチドを１セットのプライマーとして含むＰＣＲキットを提供する。
【００１９】
本発明のＰＣＲキットにおいて、好ましくは、原因菌種特異的な鑑別のためのオリゴヌクレオチドをプライマーとしてさらに含むことを特徴とする。ここで、原因菌種特異的な鑑別のためのオリゴヌクレオチドは、従来の当業界において原因菌種特異的なプライマーとして用いられていたいずれのオリゴヌクレオチドも使用することができる。
【００２０】
本発明によるＰＣＲキットは、本発明によるプライマーの他に、ＤＮＡポリマーラーゼ、４ｄＮＴＰｓ（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ）混合物、ＰＣＲ反応バッファ及び使用説明書などをさらに含んでいてもよい。前記ＤＮＡポリマーラーゼの種類によって、taq ＤＮＡ polymerase-based amplification、klenow fragment-based amplification、Phi29 polymerase-based amplificationまたはHelicase-dependent amplificationなどの核酸の増幅を行うことが可能である。
【００２１】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記本発明による細菌特異的な鑑別のためのオリゴヌクレオチド及び本発明による原因菌属特異的な鑑別のためのオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、これを支持体に付着して含むマイクロアレイを提供する。
【００２２】
本発明によるマイクロアレイにおいて、好ましくは、原因菌種特異的な鑑別のためのオリゴヌクレオチドをプローブとしてさらに含むことを特徴とする。ここで、原因菌種特異的な鑑別のためのオリゴヌクレオチドは、従来の当業界において原因菌種特異的なプローブとして用いられていたいずれのオリゴヌクレオチドも使用することができ、例えば、マイコバクテリウム・チューバキュロウセス（Mycobacterium tuberculosis）特異的なオリゴヌクレオチド（塩基配列：ＴＧＣＡＴＧＡＣＡＡＣＡＡＡＧ）またはマイコプラスマ・ニューモニエ（Mycoplasma pneumoniae)特異的なオリゴヌクレオチド（塩基配列：ＧＴＡＡＡＴＴＡＡＡＣＣＣＡＡＡＴＣＣＣ）等を用いることができる。
【００２３】
本発明によるマイクロアレイにおける前記プローブは、テオキシヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）などの通常の核酸だけではなく、ペプチドヌクレオチド（ＰＮＡ）、ロックされたヌクレオチド（ＬＮＡ）及びジ−ヘキシトールヌクレオチド（ＨＮＡ）から選ばれた核酸類似体であってもよい。前記核酸類似体は、核酸分解酵素（nuclease）などの酵素に安定しており、構造面から塩基配列に極めて特異的な結合をすると共に、熱に安定しているという長所がある。
【００２４】
本発明によるＰＣＲキット及びマイクロアレイにおける前記プライマー及びプローブは、センス用またはアンチセンス用として製作可能である。このため、前記オリゴヌクレオチドは、前記配列番号の塩基配列またはこれに相補的な配列を有することができる。
【００２５】
本発明によるマイクロアレイにおいて、前記支持体は、スライドガラス、プラスチック、メンブレイン、半導体チップ(semiconductive chip)、シリコン、ジェル、ナノ材料、セラミック、金属材料、光繊維またはこれらを組み合わせてなることを特徴とする。本発明によるマイクロアレイは、当業界に既知の通常のピンマイクロアレイ(pin microarray)(Microarray printing technology, Don Rose, Ph.D., Cartesian Technologies, Inc., Anal Biochem, ３２０(２)：２８１-９１(２００３))、インクジェット (ink jet)(Nat Biotech, １８；４３８-４４１(２０００)、Bioconjug Chem,１３(１)；９７-１０３(２００２))、フォトリソグラフィ (photolithography)(Cur Opinion Chem Biol, ２；４０４-４１０(１９９８)、Nature genetics supplement, ２１：２０-２４(１９９９))、または電気アレイ(electric array)(Ann Biomed Eng. ２０(４)：４２３-３７(１９９２)、Psychiatric Genetics, １２；１８１-１９２(２００２))方法により製作可能である。
【００２６】
本発明によるマイクロアレイは、診断キットの形で提供されるとき、本発明によるマイクロアレイの他に、混成化反応溶液、標的遺伝子を増幅するためのプライマー入りＰＣＲキット、非混成化反応ＤＮＡ洗浄用の溶液、カバースリップ、染料、非染料結合洗浄用の溶液及び使用説明書などをさらに含んでいてもよい。
【００２７】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、試料に存在する核酸を分離するステップ、前記分離した核酸のうち標的ＤＮＡを本発明によるＰＣＲキットを用いて増幅するステップ、及び前記増幅されたＤＮＡを電気泳動装置により解析するステップを含む細菌鑑別及び検出方法を提供する。
【００２８】
本発明による幾つかの細菌鑑別及び検出方法において、前記核酸増幅ステップは、ホットスタートＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＤＯＰ(degenerate oligonucleotide primer)−ＰＣＲ、定量ＲＴ−ＰＣＲ、イン・サイチューＰＣＲ、マイクロＰＣＲ、またはラブ・オン・チップＰＣＲ反応を用いて行うことができる。これらの方法は、検出効率がはるかに高い。これらの方法のうち、ＲＴ−ＰＣＲは、活性感染の標識により転写されたＤＮＡが検出可能であり、イン・サイチューＰＣＲは、組織内の微生物に対する実験を行うことが可能であり、マイクロＰＣＲは、極少量のＤＮＡまたはＲＮＡをチューブまたはキャピラリー上において増幅し、そしてラブ・オン・チップＰＣＲは、ＤＮＡの抽出からＰＣＲを経て電気泳動の結果確認と定量までをワンストップで行うことが可能であるという長所などがある。
【００２９】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、試料に存在する核酸を分離するステップ、核酸増幅ステップを経てあるいは経ることなく、チラミド信号増幅（tyramide signal amplification）や金ナノ粒子プローブ（gold nanoparticle probe）とラマン活性染料（Raman-active dye）等を用いた信号増幅反応を行うステップ、前記増幅されたＤＮＡ及びＲＮＡの蛍光を検出するステップを含む細菌鑑別及び検出方法を提供する。
【００３０】
本発明による検出方法においては、上述の核酸増幅ステップを経てあるいは経ることなく、チラミド信号増幅（Nucleic Acids Res. 30;e4(2002)）や金ナノ粒子プローブとラマン活性染料（Science、297;1536-1540(2002)）などの信号増幅反応を用いることができる。具体的に、チラミド信号増幅は、組織検体や細胞などを培養した後、組織などからＤＮＡまたはＲＮＡを抽出し、ＰＣＲ反応を行い、マイクロアレイに混成化させ、蛍光を検出するステップを経、金ナノ粒子プローブとラマン活性染料等を用いた信号増幅は、ＤＮＡまたはＲＮＡを抽出し、ＰＣＲ反応を行い、ラマン活性蛍光としてのｃｙ３グループに変形された金ナノ粒子をプローブとして用いたマイクロアレイに混成化させ、ラマンスペクトルでの蛍光検出のステップを経る。
【００３１】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、試料に存在する核酸を分離するステップ、前記分離した核酸のうち標的ＤＮＡを増幅するステップ、前記増幅されたＤＮＡを本発明によるマイクロアレイ上のプローブと混成化させるステップ、及び前記形成されたハイブリッドのシグナルを検出するステップを含むことを特徴とする細菌鑑別及び検出方法。
【００３２】
本発明による細菌鑑別及び検出方法において、前記試料は、血液、体液、組織、喀痰、便、尿または膿などであってもよい。また、核酸の分離は、通常のＤＮＡまたはＲＮＡの分離方法やキットを用いて行うことができ、ＤＮＡの増幅は通常のＰＣＲ方法により行うことができる。さらに、検出方法としては、通常のアガロスゲルを用いた電気泳動解析方法が採用でき、シグナル検出は、通常のＣｙ５またはＣｙ３などの蛍光染料の結合及びシグナル検出用のスキャナーを用いて行うことができる。
【００３３】
本発明によれば、アシネトバクター属（配列番号２０〜２２）、アエロモナス属（配列番号２３〜２８）、バチルス属（配列番号２９〜３４）、バクテロイデス属（配列番号３５〜４１）、ボルデテラ属（配列番号４２〜４４）、ボレリア属（配列番号４５〜４７）、ブルセラ属（配列番号４８〜５０）、バルコデリア属（配列番号５１〜５３）、カンピロバクター属（配列番号５４〜５６）、クラミジア属（配列番号５７〜５９）、シトロバクター属（配列番号６０〜６５）、クロストリジウム属（配列番号６６〜７１）、コリネバクテリウム属（配列番号７２〜７４）、エンテロバクター属（配列番号７５）、エンテロコッカス属（配列番号７６〜８０）、フゾバクテリウム属（配列番号８１〜８６）、ヘモフィルス属（配列番号８７〜８９）、ヘリコバクター属（配列番号９０〜９６）、クレブシエラ属（配列番号９７〜１０２）、レジオネラ属（配列番号１０３〜１０８）、リステリア属（配列番号１０９〜１１４）、モルガネラ属（配列番号１１５〜１１７）、マイコバクテリウム属（配列番号１１８〜１２３）、マイコプラスマ属（配列番号１２４〜１２９）、ナイセリア属（配列番号１３０〜１３５）、ペプトコッカス属（配列番号１３６〜１３８）、プレシオモナス属（配列番号１３９〜１４１）、ポルフィロモナス属（配列番号１４２〜１４４）、プロピオン酸菌属（配列番号１４５〜１４７）、プロビデンシア属（配列番号１４８〜１５１）、シュードモナス属（配列番号１５２〜１５７）、サルモネラ属（配列番号１５８〜１６０）、シゲラ属（配列番号１６１〜１６４）、スタヒロコッカス属（配列番号１６５〜１７０）、ストレプトコッカス属（配列番号１７１〜１７６）、トレポネーマ属（配列番号１７７〜１７９）、ウレアプラスマ属（配列番号１８０〜１８２）、ビブリオ属（配列番号１８３〜１８５）及びエルシニア属（配列番号１８６〜１８９）よりなる群から選ばれた１種以上の細菌を同時に探知することを特徴とする細菌鑑別及び検出方法を提供することができる。したがって、本発明は、単一の検体から種々の細菌が検出可能な診断方法を提供する。
【００３４】
また、本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記細菌の存否を鑑別するための細菌特異的なオリゴヌクレオチド、原因菌属特異的、種特異的及び亜種特異的な鑑別のために考案されたオリゴヌクレオチドを用い、且つ、１つの塩基配列差を基本とするＳＢＥ（Single base extension）、シーケンシング、ＲＦＬＰ（Restriction fragment length polymorphism）、ＲＥＡ（Restriction endonucleasean alysis）等を用いた細菌の鑑別及び検出方法を提供する。
【００３５】
本発明は、細菌の存否とその原因菌属を正確に鑑別する方法に関するものであり、細菌の鑑別のためのオリゴヌクレオチドを用いた遺伝子的な検出方法に関する。具体的に、下記のステップにより構成される。
ＰＣＲ方法を用いる場合には、
（i）必要に応じて、培養検体または臨床検体などから多重核酸を分離するステップ、及び
（ii）必要に応じて、１以上の適したプライマー対で前記細菌の標的配列またはその一部を増幅及び電気泳動して解析するステップ
により構成される。
また、マイクロアレイ方法を用いる場合には、
（i）必要に応じて、培養検体または臨床検体などから多重核酸を分離するステップ、
（ii）必要に応じて、１以上の適したプライマー対で前記細菌の標的配列またはその一部を増幅するステップ、
（iii）ステップ（i）及び／または（ii）において得られた多重核酸と、表２及び表３に示す細菌の細菌特異的、属特異的及び種特異的なオリゴヌクレオチド、すなわち、プローブ配列、プローブ逆配列またはプローブ相補配列で反応しうる１以上のプローブを混成化させるステップ、
（iv）ステップ（iii）において得られたハイブリッドを検出するステップ、及び
（v）ステップ（iv）において得られた混成化シグナルから前記細菌の感染の可能性を推定するステップ
により構成される。
【００３６】
本発明者らは、細菌の存否と属特異的、種特異的な鑑別のためのオリゴヌクレオチドを考案するために、細菌の２３ＳｒＤＮＡ遺伝子とＩＴＳの塩基配列を解析することにより、上述の細菌の存否及び属特異的、種特異的な鑑別のための、極めて特異的でかつ敏感な増幅方法と混成化検定法を開発可能な根拠となる配列を得ることができた。また、本発明においては、臨床的に重要とされる新規な３７種の細菌の２３ＳｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列を解析することにより、未だ判明していないより多くの細菌の属特異的な鑑別のための極めて特異的で且つ敏感な検出を可能にするプライマー及びプローブを考案することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
以下、添付図面に基づき、本発明を詳細に説明する。
【００３８】
図１は、本発明の全体のフローチャートを簡略に示す図である。
図１Ａは、本発明による細菌同定システムである「ＢａＤｉｓ」を利用して、細菌特異的、属特異的及び種特異的なプライマーとプローブをデザインした上、培養検体及び臨床検体からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法などの核酸増幅方法やマイクロアレイ方法により細菌の存否だけではなく、属及び種の遺伝子型の同定が順次にまたは一括して行えることを裏付けるフローチャートである。
図１Ｂは、ＮＣＢＩから抽出した遺伝子データと自ら保有した遺伝子データにおいて対象となる遺伝子領域だけを抽出して多重配列アラインメントを行うものであって、ＣｌｕｓｔａｌＷを用いて多重配列アラインメントを行い、類似性の臨界値を９５％以上に設定して一致配列を得る。一致配列を用いて、微生物全体または属を鑑別可能な保存された領域を抽出し、保存された領域はＧＣの比率と熱力学的な問題点を考慮した上で、ＢＬＡＳＴ検索を通じて微生物全体を鑑別可能な包括的なプローブであるか、あるいは、属が鑑別可能なプローブであるかを確認し、最終的に、プローブの候補群として選定することを示すフローチャートである。
【００３９】
図２は、細菌を生物学的な試料上で増幅するのに用いられる標的部位と一部のプライマー及びプローブの位置を示す図である。細菌の遺伝子構造において、ほぼ全ての細菌に共通する部位である１６Ｓｒ ＤＮＡの他に、まだ塩基配列が大いに判明されていない２３ＳｒＤＮＡ遺伝子で大部分の細菌特異的及び属特異的なプライマー及びプローブをデザインし、２３ＳｒＤＮＡ遺伝子でも区分しにくい細菌については、過変異領域であるＩＴＳ遺伝子との組み合わせにより属特異的及び種特異的な塩基配列をデザインした。
【００４０】
本発明による細菌の存否と属特異的な鑑別のための具体的なプライマー及びプローブの選定は、２３ＳｒＤＮＡ塩基配列の多重配列アラインメントに基づいて行われた。公開的に使用可能なｃｌｕｓｔａｌＷを用いて多重配列アラインメントを行うが、全体的な一致配列は、多重配列での９５％以上となる領域だけを抽出し、９５％以下となる領域は「Ｎ」で表現するようにして求めた。
【００４１】
図３は、本発明の好適な実施形態である、細菌の存否を鑑別するプライマーの選定のための病原菌の２３ＳｒＤＮＡ塩基配列の多重配列アラインメントに相当する図であり、本発明による細菌特異的なオリゴヌクレオチドの配列は、四角形で囲まれた全細菌に保存的な塩基配列領域で考案した。
ＰＣＲ法の好適な具現例において、本発明は、ステップ（ii）において、１以上の好適なプライマー対で細菌の存否の鑑別のために、ＰＣＲ増幅を行った。実施例３に示す細菌増幅用のプライマーを用い、標準菌株でＰＣＲを行った。
【００４２】
図４は、本発明による細菌特異的な塩基配列を用いてデザインしたプライマー対によるＰＣＲ増幅の有無を確認した結果を示す図である。
図４の（ａ）から（ｒ）は、細菌の存否を確認するために、１６Ｓｒ ＤＮＡで考案された順方向のプライマーである１６Ｓ−１３８７Ｆと、図面順に本発明による２３ＳｒＤＮＡで考案した逆方向のプライマー（臨時番号４２、４６、４８、４９、５４、６４、７０、９０、９１、９３、９４、９９、１０５、１１５、１１７、１２０、１２２、１３２）による細菌の２３ＳｒＤＮＡ標的配列の増幅有無を確認した結果を示す図であり、全図面における検体１はアシネトバクター・バーマニー（Acinetobacter baumannii）、２はアエロモナス・サルモニシダ（Aeromonas salmonicida）、３はバクテロイデス・フォルシサス（Bacteroides forsythus）、４はクロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、５はレジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophilia）、６はモルガネラ・モルガニー（Morganella morganii）、７はポルフィロモナス・アサッカロリティカ（Porphyromonas asaccharolytica）、８はプロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、９はマイコバクテリウム・チューバキュロウセス（Mycobacterium tuberculosis）、１０はマイコプラスマ・ニューモニエ（Mycoplasma pneumoniae）に対するそれぞれのＰＣＲ増幅産物を確認した結果を示す図である。
【００４３】
また、好適な具現例において、本発明は、ステップ（ii）において、１以上の好適なプライマー対で細菌の原因菌属別のＰＣＲ増幅産物を確認した。実施例３に示す各細菌の属特異的な増幅用のプライマーを用いて、標準菌株でＰＣＲを行った。
【００４４】
図５は、本発明の好適な実施形態である細菌の属特異的なプライマーの選定のための原因菌属の、本発明において新規に判明させた２３ＳｒＤＮＡ塩基配列と既知の塩基配列で多重配列アラインメントを行った結果を示す図であって、図５Ａでは、マイコバクテリア属にのみ特異的なオリゴヌクレオチド配列でプライマー及びプローブを考案し、そして図５Ｂでは、スタヒロコッカス属にのみ特異的なオリゴヌクレオチド配列でプライマー及びプローブを考案した。
【００４５】
図６Ａは、アエロモナス属特異的なプライマーの臨時番号１９９と２０７のプライマー対によるアエロモナス属の２３ＳｒＤＮＡ標的配列の増幅の有無を確認した結果を示す図であって、１番はアエロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、２番はアエロモナス・サルモニシダ（Aeromonas salmonicida）、３番はマイコバクテリウム・ゼノピ（Mycobacterium xenopi）、４番はマイコプラスマ・ファルコニス（Mycobacterium falconis）、５番はストレプトコッカス・アンギノスス（Streptococcus anginosus）、６番はエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、７番はヒト血ＤＮＡ、８番はB型肝炎ウィルスＤＮＡを鋳型としてアエロモナス属特異的な７５２ｂｐサイズのＰＣＲ増幅産物を確認した結果を示す図である。
【００４６】
図６Ｂは、エンテロコッカス属特異的なプライマーの臨時番号６９９と７０１のプライマー対によるエンテロコッカス属の２３ＳｒＤＮＡ標的配列の増幅有無を確認した結果を示す図であって、１番はエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、２番はエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、３番はエンテロコッカス・ヒレ（Enterococcus hirae）、４番はアエロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、５番はマイコバクテリウム・ゼノピ（Mycobacterium xenopi）、６番はマイコプラスマ・ファルコニス（Mycobacterium falconis）、７番はストレプトコッカス・アンギノスス（Streptococcus anginosus）、８番はヒト血ＤＮＡ、９番はＢ型肝炎ウィルスＤＮＡを鋳型としてエンテロコッカス属特異的な５９９ｂｐサイズのＰＣＲ増幅産物を確認した結果を示す図である。
【００４７】
図６Ｃは、マイコバクテリア属特異的なプライマーの臨時番号８７５と８８０のプライマー対によるマイコバクテリア属の２３ＳｒＤＮＡ標的配列の増幅有無を確認した結果を示す図であり、１番はマイコバクテリウム・ゼノピ（Mycobacterium xenopi）、２番はマイコバクテリウム・フラヴェサンス（Mycobacterium flavescence）、３番はマイコバクテリウム・シミエ（Mycobacterium simiae）、４番はマイコバクテリウム・チューバキュロウセス（Mycobacterium tuberculosis）、５番はアエロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、６番はマイコプラスマ・ファルコニス（Mycobacterium falconis）、７番はストレプトコッカス・アンギノスス（Streptococcus anginosus）、８番はエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、９番はヒト血ＤＮＡ、１０番はＢ型肝炎ウィルスＤＮＡを鋳型としてマイコバクテリア属特異的な９６２ｂｐサイズのＰＣＲ増幅産物を確認した結果を示す図である。
【００４８】
図６Ｄは、ストレプトコッカス属特異的なプライマーの臨時番号１２８９と１２９１のプライマー対によるストレプトコッカス属の２３ＳｒＤＮＡ標的配列の増幅有無を確認した結果を示す図であって、１番はストレプトコッカス・アンギノスス（Streptococcus anginosus）、２番はストレプトコッカス・ポビス（Streptococcus bovis）、３番はアエロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、４番はマイコプラスマ・ファルコニス（Mycobacterium falconis）、５番はマイコバクテリウム・ゼノピ（Mycobacterium xenopi）、６番はエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、７番はヒト血ＤＮＡ、８番はＢ型肝炎ウィルスＤＮＡを鋳型としてマイコバクテリア属特異的な８０４ｂｐサイズのＰＣＲ増幅産物を確認した結果を示す図である。
【００４９】
マイクロアレイの好適な具現例において、本発明は、ステップ（iii）において、支持体を構成しているプローブ構成の多様性と１以上のプローブの組み合わせであることを特徴とする。さらに詳しくは、同時に細菌の存否及び原因菌属が検出可能な同じ混成化及び洗浄条件下で、前記プローブがこれらの標的部位に同時に混成化するように最適化されていることを特徴とする。
【００５０】
上記目的を達成するために、本発明による支持体に付着した細菌の存否と原因菌属及び種の鑑別のためのプローブセットを含むマイクロアレイは、単回の実験により１つの検体から同時に細菌の存否と原因菌属及び種の鑑別が行える迅速でかつ正確なマイクロアレイを提供する。
【００５１】
本発明において用いられている用語「プローブ」とは、細菌の標的配列に相補的な配列を有する単一本のオリゴヌクレオシドをいう。また、本発明によるオリゴヌクレオチドは、標的配列の２本のうちいずれか１本と混成化されなければならないため、前記配列番号のセンス、アンチセンス、そして相補的な塩基配列をいずれも含んでいてもよい。本発明によるプローブとして用いられるオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＨＮＡ及びイノシンなどの変形されたヌクレオシドのように、これらの混成化特徴を本質的に変化させない基を含むヌクレオシドであってもよい。また、細菌の細菌特異的な配列を含むオリゴヌクレオチドとして、配列番号１〜１９の塩基配列を含む１種以上のオリゴヌクレオチドを含むことを原則とする。さらに、細菌の属特異的な配列を含むオリゴヌクレオチドとして、配列番号２０〜１８９の塩基配列を含む１種以上のオリゴヌクレオチドを含むことを原則とする。
【００５２】
本発明において用いられている用語「細菌」とは、病原性感染疾患の原因となるバクテリアとその他の環境汚染バクテリアなどをいずれも含む。
【００５３】
本発明における実験に用いられている細菌の存否の鑑別及び属特異的な鑑別のためのプライマー及びプローブ用の新規なオリゴヌクレオチドの配列は、明細書の作成の便宜上、臨時番号で表示している。前記臨時番号のうち、特許請求するオリゴヌクレオチドは配列番号で表示しており、前記臨時番号と配列番号との相関関係は下記表１の通りである。なお、本発明において開発した細菌の存否と属特異的な鑑別のためのプライマー及びプローブ用の新規なオリゴヌクレオチドは、下記表２及び３の通りである。
【００５４】
【表１】
2008511313.tif 000003
本発明において用いられている臨時番号(Temp. Seq. No.)と配列番号(Seq. ID No.)との相関関係（配列番号／臨時番号）
【００５５】
【表２−１】
2008511313.tif 000004
【００５６】
【表２−２】
2008511313.tif 000005
細菌の細菌特異的な新規プライマー／プローブ
※標的位置の基準菌株：Ｅ．ｃｏｌｉ（GenBank Accession No.：ＡＪ２７８７１０）塩基配列を基準とする。※Mixed BaseのCode Name：Ｍ：Ａ＋Ｃ、Ｗ：Ａ＋Ｔ、Ｙ：Ｃ＋Ｔ、Ｒ：Ａ＋Ｇ、Ｋ：Ｇ＋Ｔ、Ｓ：Ｇ＋Ｃ、Ｖ：Ｇ＋Ａ＋Ｃ、Ｎ：Ａ＋Ｇ＋Ｃ＋Ｔ
【００５７】
【表３−１】
2008511313.tif 000006
【００５８】
【表３−２】
2008511313.tif 000007
【００５９】
【表３−３】
2008511313.tif 000008
【００６０】
【表３−４】
2008511313.tif 000009
【００６１】
【表３−５】
2008511313.tif 000010
【００６２】
【表３−６】
2008511313.tif 000011
【００６３】
【表３−７】
2008511313.tif 000012
【００６４】
【表３−８】
2008511313.tif 000013
【００６５】
【表３−９】
2008511313.tif 000014
【００６６】
【表３−１０】
2008511313.tif 000015
【００６７】
【表３−１１】
2008511313.tif 000016
【００６８】
【表３−１２】
2008511313.tif 000017
【００６９】
【表３−１３】
2008511313.tif 000018
【００７０】
【表３−１４】
2008511313.tif 000019
【００７１】
【表３−１５】
2008511313.tif 000020
【００７２】
【表３−１６】
2008511313.tif 000021
【００７３】
【表３−１７】
2008511313.tif 000022
【００７４】
【表３−１８】
2008511313.tif 000023
【００７５】
【表３−１９】
2008511313.tif 000024
細菌の属特異的な鑑別のための新規プライマー及びプローブ
※標的位置の基準菌株：Acinetobacter（GenBank Accession No.：Ｘ８７２８０）、Actinomyces（本発明の臨時番号２） Aeromonas (GenBank Accession No.:ＡＦ５０８０５６)、Bacillus (GenBank Accession No.:Ｄ１１４５９)、Bacteroides (GenBank Accession No.:ＮＣ_００４６６３)、Bordetella (GenBank Accession No.:Ｘ６８３２３)、Borrelia (GenBank Accession No.:ＮＣ_００１３１８)、Brucella (GenBank Accession No.:ＮＣ_００４３１１)、Burkhoderia (GenBank Accession No.:Ｙ１７１８２)、Campylobacter (GenBank Accession No.:Ｕ０９６１１)、Chlamydia (GenBank Accession No.:ＮＣ_０００１１７)、Citrobacter (GenBank Accession No.:Ｕ７７９２８)、Clostridium (GenBank Accession No.:Ｍ９４２６０)、Corynebacterium (GenBank Accession No.:ＮＣ_００４３６９)、Enterbacter (本発明の臨時番号６)、Enterococcus (GenBank Accession No.:ＡＪ２９５２９８)、Fusobacterium (GenBank Accession No.:ＡＪ３０７９７４)、Haemophilus (GenBank Accession No.:ＮＣ_００２９４０)、Helicobacter (GenBank Accession No.:ＡＢ０８８０５０)、 Klebsiella (本発明の臨時番号１０)、Legionella (本発明の臨時番号１２)、Listeria (GenBank Accession No.:X９２９４８)、Morganella (本発明の臨時番号１３)、Mycobacteria (GenBank Accession No.:Ｚ１７２１２)、Mycoplasma (GenBank Accession No.:Ｘ６８４２２)、Neisseria (GenBank Accession No.: ＮＣ_００３１１２)、Peptococcus (GenBank Accession No.:Ｘ６８４２８)、Plesiomonas (GenBank Accession No.:Ｘ６５４８７)、Porphyromonas (GenBank Accession No.:ＮＣ_００２９５０)、Propionibacterium (本発明の臨時番号２９)、Providencia (本発明の臨時番号３０)、Pseudomonas (GenBank Accession No.:Ｙ００４３２)、Salmonella (GenBank Accession No. :Ｕ７７９２１)、Shigella (GenBank Accession No.:ＮＣ_００４７４１)、Staphylococcus (GenBank Accession No.:Ｘ６８４２５)、Streptococcus (GenBank Accession No.:ＡＢ０９６７４０)、Treponema (GenBank Accession No.:ＮＣ_０００９１９)、Ureaplasma (GenBank Accession No.:ＮＣ_００２１６２)、Vibrio (GenBank Accession No.:ＡＪ３１０６４９)、Yersinia (GenBank Accession No.:Ｕ７７９２５) 塩基配列を基準とする。
【実施例】
【００７６】
以下、本発明を実施例を挙げて一層詳細に説明するが、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７７】
実施例１：細菌の培養及びゲノムＤＮＡの分離
本研究に用いられた約１００種の菌株は、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection、Ｕ．Ｓ．Ａ）とＫＣＴＣ（Korean Collection for Type Cultures、Ｋｏｒｅａ）から購入したものである。各細菌の培養のための培地と培養条件は、ＡＴＣＣとＫＣＴＣから提供する各マニュアルに基づいて選択した。培養された菌株については、集落を白金耳で取って１．５ｍｌのチューブに入れ、インスタジーンマトリックス（InstaGene matrix、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）を１００μｌ加えた後、恒温水槽中で５６℃の温度下で３０分間反応した。１０秒間振とう後、１００℃の温度下で８分間熱処理を施し、さらに１０秒間振とうした後、１２、０００ｒｐｍにて３分間遠心分離して得られた上澄み液を用いた。下記の実施例においては、細菌の増幅時に陰性対照群として、３次蒸溜水（図面における「Ｎ」）、ヒトＤＮＡとウィルスＤＮＡを用いた。
塩基配列の解析及び実験に用いられた菌株は、下記の通りである：
【００７８】
【表４−１】
2008511313.tif 000025
【００７９】
【表４−２】
2008511313.tif 000026
【００８０】
【表４−３】
2008511313.tif 000027
【００８１】
実施例２：細菌の鑑別のためのプライマーの考案
１．細菌の細菌特異的な鑑別のためのプライマーの考案
本発明に用いられた細菌の存否を鑑別するためのプライマーの選定は、細菌の２３ＳｒＤＮＡ塩基配列の多重配列アラインメント及びブラスト結果に基づいて行われた。選定した細菌には高い類似性を示し、他の有機体においては、類似性がないか、あるいは、低い塩基配列であって、表２の臨時番号３８から１３５に相当するプライマーを考案した。本発明による細菌特異的なプライマーは表２の塩基配列に限定されるものではなく、プライマーの性質を阻害しない限り、前記塩基配列を含むプライマーとして考案して用いることができる。
【００８２】
２．細菌の属特異的な鑑別のためのプライマーの考案
本発明による属特異的なプライマーは、表３の塩基配列に限定されるものではなく、プライマーの性質を阻害しない限り、前記塩基配列を含むプライマーとして考案して用いることができる。
（１）アエロモナス属特異的な鑑別のためのプライマーの製作
全てのアエロモナス属だけで特異的に増幅反応が起こるように、アエロモナスの２３ＳｒＤＮＡ遺伝子を標的として、アエロモナスの属特異的であり、且つ、他の有機体においては類似性が殆どない塩基配列であって、表３の臨時番号１９７から２１６に相当するプライマーを考案した。
（２）エンテロコッカス属特異的な鑑別のためのプライマーの製作
全てのエンテロコッカス属だけで特異的に増幅反応が起こるように、エンテロコッカスの２３ＳｒＤＮＡ遺伝子を標的にして、エンテロコッカス属特異的であり、且つ、他の有機体においては類似性が殆どない塩基配列として、表３の臨時番号６９９から７０３に相当するプライマーを考案した。
（３）マイコバクテリア属特異的な鑑別のためのプライマーの製作
全てのマイコバクテリア属だけで特異的に増幅反応が起こるように、マイコバクテリアの２３ＳｒＤＮＡ遺伝子を標的として、マイコバクテリア属特異的であり、且つ、他の有機体においては類似性が殆どない塩基配列であって、表３の臨時番号８７２から８８０に相当するプライマーを考案した。
（４）ストレプトコッカスの属特異的な鑑別のためのプライマーの製作
全てのストレプトコッカス属だけで特異的に増幅反応が起こるように、ストレプトコッカスの２３ＳｒＤＮＡ遺伝子を標的として、ストレプトコッカス属特異的であり、且つ、他の有機体においては類似性が殆どない塩基配列であって、表３の臨時番号１２８７から１２９８に相当するプライマーを考案した。
【００８３】
実施例３：標的ＤＮＡの増幅
細菌の存否と各原因菌属を鑑別するためのＤＮＡ増幅用のプライマーは、下記の通りである。
【００８４】
【表５】
2008511313.tif 000028
※１６Ｓ−１３８７Ｆプライマー：既に判明されている１６Ｓｒ ＤＮＡを基に考案されたほとんどの細菌検出用のプライマー（Applied and Environmental Microbiology、６４（２）、ｐ．７９５−７９９、１９９８）。
【００８５】
上記の各プライマーセットを用いて実施例１に従い分離された各標準菌株ゲノムＤＮＡを対象としてＰＣＲ技法を実施した。
【００８６】
１）ＰＣＲ反応の組成（全体の反応液２５μｌ）
１００ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１％トリトンＸ−１００、１０ｍＭ デオキシヌチレオチドトリフォスファート（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＣＴＰ）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、各１対のプライマー（それぞれ１０ｐｍｏｌｅ）、１ Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（ＱＩＡＧＥＮ、ＵＳＡ）、鋳型ＤＮＡ４μｌ。
【００８７】
２）ＰＣＲ反応の条件
９４℃の温度下、３分間十分に変成させた後、９４℃の温度下、１分間、５５℃の温度下、１分３０秒間、７２℃の温度下、２分間ずつ３０回に亘って反応を行い、最後に、７２℃の温度下、１０分間延長した。
【００８８】
実施例４：増幅産物の確認
前記実施例３の過程を経て増幅されたＰＣＲ産物は電気泳動し、それぞれ異なるサイズとして確認した。
図４は、細菌の細菌特異的な鑑別のための２３ＳｒＤＮＡ標的配列増幅が行えるプライマー対によるＰＣＲ増幅の有無を確認した結果を示す図であって、既に広く知られている１６Ｓｒ ＤＮＡから考案された順方向のプライマーである１６Ｓ−１３８７Ｆと、本発明による２３ＳｒＤＮＡから考案された逆方向のプライマー（臨時番号４２、４６、４８、４９、５４、６４、７０、９０、９１、９３、９４、９９、１０５、１１５、１１７、１２０、１２２、１３２）をそれぞれの対で組み合わせて増幅させた後に電気泳動し、約８００ｂｐにて２、５００ｂｐサイズのＰＣＲ増幅産物を確認した結果を示す図である。
【００８９】
図４の（ａ）中、（ｒ）のＭは分子量標識であり、１００ｂｐ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ：Ｎは陰性対照群：１から１０はそれぞれの細菌であって、１はアシネトバクター・バーマニー、２はアエロモナス・サルモニシ、３はバクテロイデス・フォルシサス 、４はクロストリジウム・ディフィシル 、５はレジオネラ・ニューモフィラ 、６はモルガネラ・モルガニー 、７はポルフィロモナス・アサッカロリティカ 、８はプロテウス・ミラビリス 、９はマイコバクテリウム・チューバキュロウセス、１０はマイコプラスマ・ニューモニエを示す。この結果から明らかなように、細菌特異的な各プライマー対による増幅産物により、一次的に細菌とヒトＤＮＡ、ウィルスＤＮＡなどの他の有機体との鑑別が行えるようになり、これにより、迅速で且つ正確な診断と共にコスト節減効果も得ることが可能になる。
【００９０】
図６は、細菌の属特異的な鑑別のための２３ＳｒＤＮＡ標的配列増幅が行えるプライマー対によるＰＣＲ増幅の有無を確認した結果を示す図である。
図６Ａは、アエロモナス属に特異的に反応するプライマー（臨時番号１９９と２０７）で増幅させた後に電気泳動して、７５２ｂｐサイズのＰＣＲ増幅産物を確認した結果を示す図であり、図６Ｂは、エンテロコッカス属に特異的に反応するプライマー（臨時番号６９９と７０１）で増幅させた後に電気泳動して、５９９ｂｐサイズのＰＣＲ増幅産物を確認した結果を示す図である。
【００９１】
図６Ｃは、マイコバクテリア属に特異的に反応するプライマー（臨時番号８７５と８８０）で増幅させた後に電気泳動して、９６２ｂｐサイズのＰＣＲ増幅産物を確認した結果を示す図であり、そして図６Ｄは、ストレプトコッカス属に特異的に反応するプライマー（臨時番号１２８９と１２９１）で増幅させた後に電気泳動して、８０４ｂｐサイズのＰＣＲ増幅産物を確認した結果を示す図である。この結果から明らかなように、各細菌の属特異的なプライマー対により、属特異的な増幅が行えるようになり、正確な細菌属の同定により迅速で且つ正確な診断と共に、コスト節減効果及び適切な治療効果が得られるようにし、これに伴い、抗生剤の誤・濫用をも予防することが可能になる。
【００９２】
実施例５：細菌の鑑別のためのプローブの考案
本発明に用いられた細菌の存否を鑑別するためのプローブの選定は、本発明において初めて塩基配列の解析を通じて、２３ＳｒＤＮＡ遺伝情報を解析したアシネトバクター・バーマニ、アクチノミセス・ボビス、アエロモナス・サルモシダ、バクテロイデス・ウレオリティクス、クロストリジウム・ディフィシル、エンテロバクター・アエロゲンス、エンテロコッカス・フェシウム、ユウバクテリウム・リモスム、フゾバクテリウム・モルティフェルム、クレブシエラ・オキシトカ、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィリア、モルガネラ・モルガニー、マイコバクテリウム・ゴルドネ、マイコバクテリウム・マリヌム、マイコバクテリウム・ゼノピ、マイコバクテリウム・フラヴェサンス、マイコバクテリウム・スクロフラセウム、マイコバクテリウム・シミエ、マイコバクテリウム・スズガイ、マイコプラスマ・フィルム、マイコプラスマ・クロアコレ、マイコプラスマ・オパレセンス、マイコプラスマ・サルヴァリウム、マイコプラスマ・スファルマトピ、ナイセリア・コノルホヘ、ペプトコッカス・メグナス、プロピオン酸菌・エビズム、プロピオン酸菌・グレヌーロスム、プロビデンシア・スチューアティ、サルモネラ・ボンゴリ、シゲラ・ボイディイ、シゲラ・ディセンテリエ、シゲラ・ソンネイ、スタヒロコッカス・サプロフィティクス、ストレプトコッカス・ボビスとエルシニア・シュードチューバキュロウセスを含む２３ＳｒＤＮＡ塩基配列の多重配列アラインメント結果に基づいて行われた。
【００９３】
他の有機体を除く本発明の４５属の細菌にのみ混成化反応をするように、細菌の２３ＳｒＤＮＡ遺伝子で高い類似性を示す 保存的な塩基配列であって、表２の臨時番号３８から１３５のプローブを考案した。本発明において用いられた細菌鑑別、原因菌属及び種特異的なオリゴヌクレオチドプローブは、５’末端に１５個の塩基を持つ長さのｄＴスペーサー及び１５〜２５個の塩基配列を持つプローブを合成して考案したものである。細菌特異的及び原因菌属特異的なプローブは、表２及び表３の塩基配列に限定されるものではなく、プローブの性質を阻害しない限り、前記塩基配列を含むプローブとして考案して用いることができる。本発明の実施例において、種特異的な検出のために用いた２種のプローブは、マイコバクテリウム・チューバキュロウセス（Mycobacterium tuberculosis）のＴＧＣＡＴＧＡＣＡＡＣＡＡＡＧ塩基配列とマイコプラスマ・ニューモニエ（Mycoplasma pneumoniae）のＧＴＡＡＡＴＴＡＡＡＣＣＣＡＡＡＴＣＣＣ塩基配列であった。
【００９４】
実施例６：標的ＤＮＡの準備
１．細菌の細菌特異的、属特異的及び種特異的な鑑別のための標的ＤＮＡの準備
細菌の細菌特異的及び属特異的な鑑別のための標的ＤＮＡの増幅のために、それぞれビオチンが標識化された５’−ビオチン−ＴＡＮＧＧＣＧＧＧＡＣＡＣＧＴＧＡＡＡＴ−３’（バイオ−３８９Ｆ）と５’−ビオチン−ＧＡＴＧＧＣＴＧＣＴＴＣＴＡＡＧＣＣＡＡＣ−３’（バイオ−１０７５Ｒ）、そして５’−ビオチン−ＣＣＶＧＴＡＡＡＣＧＧＣＧＧＣＣＧ−３’（バイオ−１９０６Ｆ）と５’−ビオチン−ＧＧＡＣＣＧＡＡＣＴＧＴＣＴＣＡＣＧＡＣ−３’（バイオ−２６０７Ｒ）を用い、各６８９ｂｐと７０１ｂｐサイズの２３ＳｒＤＮＡ部位を選択的に増幅した。種特異的な鑑別のためには、１６Ｓｒ ＤＮＡの後部（１６Ｓ−１３８７Ｆ）と２３ＳｒＤＮＡの先頭部（臨時番号４２）を用いて、約７００ｂｐのＩＴＳ部位を増幅した。実施例１において分離した各細菌の標準菌株に対し、前記プライマーを用いててＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃の温度下、３分間熱変性させた後、９４℃の温度下、１分間、５０℃の温度下、１分間、７２℃の温度下、１分間ずつ３５回に亘って反応させた後、最後に７２℃の温度下、１０分間延長した。
【００９５】
実施例７：支持体へのプローブの付着
実施例５において考案されたプローブのうち、細菌特異的及び各原因菌属と種に対して代表的な１種類のプローブを選定し、スポット溶液を加えて、５０ｐｍｏｌｅにて希釈した。スライドガラスの支持体にプローブをマイクロアレイヤー（Cartesian Technologies、ＰＬＸＳＹＳ ７５００ ＳＱＸＬ Microarryer、ＵＳＡ）を用いて付着させた。これを室温のスライドボックス中で約２４時間静置または５０℃の乾燥器に約５時間放置して、支持体上の表面に固定させた。
【００９６】
実施例８：未固定プローブの洗浄
支持体の表面に付着しなかったプローブを除去するために、室温下で０．２％ＳＤＳ（ソジウム・ドデシル・サルファート）溶液により洗浄した後、蒸溜水で洗浄した。ソジウム・ボロヒドリド溶液により洗浄し、さらに沸騰した蒸溜水により洗浄した。室温下で、０．２％ＳＤＳと蒸溜水を用いて洗浄した後、遠心分離機を用いて支持体の表面を完全に乾燥させて、マイクロアレイの製作を完了した。
【００９７】
実施例９：染料結合及び混成化反応
実施例６に従い製造されたビオチンで標識化された標的ＤＮＡを単一本として用いるために、９５℃以上に熱を加えた後、４℃に冷却させた。ＰＣＲ産物とプローブとの結合有無を確認するために、Ｃｙ５−ストレプトアビジンまたはＣｙ３−ストレプトアビジン（Amersham pharmacia biotech、ＵＳＡ）を含む反応溶液と１〜５μｌの標的ＤＮＡを含む混成化反応溶液１０μｌを製造した。プローブの付着と洗浄を終えたスライドに混成化反応溶液を分注し、カバーガラスを覆った後、４０℃の温度下で３０分間反応させた。
【００９８】
実施例１０：未結合ＤＮＡの洗浄
混成化反応を行ってない残余のＤＮＡを洗浄するために、２×ＳＳＣ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ Ｎａ−シトレート、ｐＨ７．０）溶液を用いてカバーガラスを除去した後、２×ＳＳＣと０．２×ＳＳＣ溶液の順番でスライドを洗浄した後、スライドを完全に乾燥させた。
【００９９】
実施例１１：結果の解析
実験を終えた後、結果を解析するために、非共焦点レーザースキャナー（non-confocal laser scanner）であるGenePix ４０００Ａ（Axon Instruments、ＵＳＡ）を用いて結果を解析した。
【０１００】
図７から図９は、本発明の好適な実施形態であるマイクロアレイを示す図である。
図７Ａは、細菌の存在を鑑別するためのプローブを１セットとして１つの支持体を構成しているマイクロアレイの図である。Ｎｏ．２からＮｏ．１９は、表２の細菌特異的な新規プローブの臨時番号（２；４２、３；４６、４；４８、５；４９、６；５４、７；６４、８；９０、９；９１、１０；９３、１１；９４、１２；７０、１３；９９、１４；１０５、１５；１１５、１６；１１７、１７；１２０、１８；１２２、１９；１３２）であり、Ｎｏ．１及びＮｏ．２０は、ポジティブプローブ（上記の全てのプローブ混合液）である。
【０１０１】
図７Ｂ及び図７Ｃは、各プローブの特異的な混成化反応に対する画像解析後、それに対する画素の強さを数値化して解析した結果を示す図である。図７Ｂは、マイコバクテリウム・チューバキュロウセス（Mycobacterium tuberculosis）の存否を鑑別するためにバイオ−３８９Ｆとバイオ−１０７５Ｒプライマーで２３ＳｒＤＮＡの前部から約６８０ｂｐ増幅させた後、細菌特異的なプローブに混成化した結果（プローブ番号；臨時番号にて表記−２；４２、３；４６、４；４８、５；４９、６；５４、７；６４、１２；７０）とそれに対する画素の強さを数値化して解析した結果を示し、図７Ｃは、ストレプトコッカス・アンギノスス（Streptococcus anginosus）の存否を鑑別するためにバイオ−１９０６Ｆとバイオ−２６０７Ｒプライマーで２３ＳｒＤＮＡの後部の約７００ｂｐを増幅させた後、細菌特異的なプローブに混成化した結果（プローブ番号；臨時番号にて表記−８；９０、９；９１、１０；９３、１１；９４、１３；９９、１４；１０５、１５；１１５、１６；１１７、１７；１２０、；１２２、１９；１３２）とそれに対する画素の強さを数値化して解析した結果を示す。その結果、画素の強さに差はあったものの、細菌特異的なプローブのいずれにおいてポジティブ・シグナルを示していた。
【０１０２】
図８Ａは、細菌の存否及び原因菌属を鑑別するためのプローブを１セットとして、１つの支持体を構成しているマイクロアレイを示す図である。Ｎｏ．１、３、５、７、９は表２の細菌特異的な新規プローブの臨時番号（１；４２、３；４６、５；４８、７；６４、９；９０）であり、Ｎｏ．２、４、６、８、１０は表３の原因菌属特異的な新規プローブの臨時番号（２；１９９、４；８７５、６；８８３、８；１２８８、１０；７０２）である。図８Ｂは、ストレプトコッカス属特異的なプローブに混成化した結果（臨時番号４２、４６、４９、６４、９１、１２８８）とそれに対する画素の強さを数値化して解析した結果を示す。混成化の結果、細菌特異的なプローブ１、３、５、７、９においてポジティブ・シグナルを、そして属特異的なプローブのうちストレプトコッカス属プローブである８（臨時番号１２８８）においてポジティブ・シグナルを示した。
【０１０３】
図９Ａは、細菌の存否及び原因菌属と種を同時に鑑別するためのプローブを１セットとして１つの支持体を構成しているマイクロアレイを示す図である。Ｎｏ．１、７、１３、１９、２５は表２の細菌特異的な新規プローブの臨時番号（１；４２、７；４６、１３；４８、１９；６４、２５；９０）であり、Ｎｏ．２、８、１４、２０、２６は表３の原因菌属特異的な新規プローブの臨時番号（２；１９９、８；８７５、１４；８８３、２０；１２８８、２６；７０２）であり、Ｎｏ．９からＮｏ．１２はマイコバクテリア種特異的なプローブであり、Ｎｏ．１５からＮｏ．１８はマイコプラスマ種特異的なプローブであり、Ｎｏ．３からＮｏ．６、Ｎｏ．２１からＮｏ．２４、Ｎｏ．２７からＮｏ．３０は空欄である。
【０１０４】
図９Ｂは、細菌マイコバクテリウム・チューバキュロウセス（Mycobacterium tuberculosis）属及び種特異的なプローブに混成化した結果（臨時番号４２、４６、４９、６４、９１、８７５）とそれに対する画素の強さを数値化して解析した結果を示す図であり、混成化の結果、細菌特異的なプローブ１、７、１３、１９、２５においてポジティブ・シグナルを、属特異的なプローブのうちマイコバクテリウム属プローブである８（臨時番号８７５）からポジティブ・シグナルを、さらに、種特異的なプローブとして植え付けたマイコバクテリウム・チューバキュロウセスにおいてポジティブ・シグナルを示した。
【０１０５】
図９Ｃは、細菌マイコプラスマ・ニューモニエ（Mycoplasma pneumoniae）属及び種特異的なプローブに混成化した結果（臨時番号４２、４６、４９、６４、９１、８８３）とそれに対する画素の強さを数値化して解析した結果を示す図であり、混成化の結果、細菌特異的なプローブ１、７、１３、１９、２５においてポジティブ・シグナルを、属特異的なプローブのうちマイコプラスマ属プローブである１４（臨時番号８８３）においてポジティブ・シグナルを、さらに、種特異的なプローブで植え付けたマイコプラスマ・ニューモニエにおいてポジティブ・シグナルを示した。これにより、一気に細菌特異的、属特異的及び種特異的なプローブに反応させることにより、細菌の存否が鑑別されると共に、正確な属に相当する種まで満遍なく同定が行われ、結果として、迅速な診断と共に、コスト節減と適切な処方及び治療が行えるようになった。
【０１０６】
なお、これは、本発明において考案した新規なオリゴヌクレオチドのうち代表的なプローブ区画の一例に過ぎず、各プローブの構成及び区画の位置は変わりうる。
【０１０７】
以上、本発明においては、具体例と実施例を挙げて本発明を説明しているが、本発明がこれらに何ら限定されるものではない。また、ここでの説明に加えて、種々の変形及び変化が可能であることは当業者にとって理解できるであろう。このような変形も特許請求の範囲に属するといえる。
【０１０８】
以上述べたように、本発明は、病原性細菌を含んで、食中毒誘発細菌、生物医薬品汚染誘発細菌及び環境汚染細菌などに相当する全ての細菌の検出及び鑑別のために、細菌の２３ＳｒＤＮＡ遺伝子の標的塩基配列から考案された細菌特異的及び属特異的なオリゴヌクレオチド、これをプライマーとして検出を行うＰＣＲと、これをプローブとして含むマイクロアレイを提供する。
また、２３ＳｒＤＮＡ領域と組み合わせられて存在するＩＴＳから、種特異的と亜種特異的なプライマーとプローブをデザインして組み合わせることにより、診断キットを開発した。
【０１０９】
すなわち、本発明は、細菌の存否をまず１次スクリーニングした後、細菌の存在が判明されると、各原因菌属の正確な鑑別のために２次スクリーニングを行うことにより、診断コストの節減と共に抗生剤の誤・濫用の予防及び適切な治療が行える迅速で且つ敏感な診断方法を提供する。また、細菌の鑑別のための新規なオリゴヌクレオチドの考案のために、未だ判明されていない多数の細菌の２３ＳｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列を解析することによって前記言及された細菌の正確な鑑別のための極めて特異的で且つ敏感な検出方法を開発可能な根拠となる、標的配列のプライマーとプローブ、これを含むＰＣＲとマイクロアレイなどの診断キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１Ａ】本発明の全体のフローチャートを概略に示す図である。
【図１Ｂ】本発明の全体のフローチャートを概略に示す図である。
【図２】細菌を生物学的な試料上で増幅するのに用いられる標的部位と一部のプライマー及びプローブの位置を示す図である。
【図３】細菌特異的なプライマーのデザインのための、各属の２３ＳｒＤＮＡ遺伝子での保存的な塩基配列の多重配列アラインメントの結果のうち一部を示す図である。
【図４】細菌特異的な塩基配列を用いてデザインしたプライマー対によりＰＣＲ増幅の有無を確認した結果を示す図である。
【図５Ａ】マイコバクテリア属特異的なプライマーのデザインのための、マイコバクテリアのそれぞれの種の２３ＳｒＤＮＡ遺伝子の保存的な塩基配列の多重配列アラインメントを示す図である。
【図５Ｂ】スタヒロコッカス属特異的なプライマーのデザインのための、スタヒロコッカスのそれぞれの種の２３ＳｒＤＮＡ遺伝子の保存的な塩基配列の多重配列アラインメントを示す図である。
【図６Ａ】アエロモナス、エンテロコッカス、マイコバクテリア及びストレプトコッカス属特異的な塩基配列でデザインしたそれぞれのプライマー対によるＰＣＲ増幅の有無を確認した結果を示す図である。
【図６Ｂ】アエロモナス、エンテロコッカス、マイコバクテリア及びストレプトコッカス属特異的な塩基配列でデザインしたそれぞれのプライマー対によるＰＣＲ増幅の有無を確認した結果を示す図である。
【図６Ｃ】アエロモナス、エンテロコッカス、マイコバクテリア及びストレプトコッカス属特異的な塩基配列でデザインしたそれぞれのプライマー対によるＰＣＲ増幅の有無を確認した結果を示す図である。
【図６Ｄ】アエロモナス、エンテロコッカス、マイコバクテリア及びストレプトコッカス属特異的な塩基配列でデザインしたそれぞれのプライマー対によるＰＣＲ増幅の有無を確認した結果を示す図である。
【図７Ａ】細菌の存在を鑑別するためのプローブを１セットとして１つの支持体を構成しているマイクロアレイを示す図である。
【図７Ｂ】各プローブの特異的な混成化反応に関する画像解析結果とそれに対する画素の強さを数値化して解析した結果を示す図である。
【図７Ｃ】各プローブの特異的な混成化反応に関する画像解析結果とそれに対する画素の強さを数値化して解析した結果を示す図である。
【図８Ａ】細菌の存否及び原因菌属を鑑別するためのプローブを１セットとして１つの支持体を構成しているマイクロアレイを示す図である。
【図８Ｂ】ストレプトコッカス属特異的なプローブの混成化反応に対する画像解析結果とそれに対する画素の強さを数値化して解析した結果を示す図である。
【図９Ａ】細菌の存否及び原因菌属と種を同時に鑑別するためのプローブを１セットとして１つの支持体を構成しているマイクロアレイを示す図である。
【図９Ｂ】マイコバクテリア属及びマイコバクテリウム・チューベキュロウセス種特異的なプローブの混成化反応に対する画像解析結果とそれに対する画素の強さを数値化して解析した結果を示す図である。
【図９Ｃ】マイコプラスマ属及びマイコプラスマ・ニューモニエ種特異的なプローブの混成化反応に対する画像解析結果とそれに対する画素の強さを数値化して解析した結果を示す図である。
【図１Ａ】
2008511313.tif 000029
【図１Ｂ】
2008511313.tif 000030
【図２】
2008511313.tif 000031
【図３ａ】
2008511313.tif 000032
【図３ｂ】
2008511313.tif 000033
【図３ｃ】
2008511313.tif 000034
【図３ｄ】
2008511313.tif 000035
【図４ａ】
2008511313.tif 000036
【図４ｂ】
2008511313.tif 000037
【図４ｃ】
2008511313.tif 000038
【図４ｄ】
2008511313.tif 000039
【図４ｅ】
2008511313.tif 000040
【図５ａ】
2008511313.tif 000041
【図５ｂ】
2008511313.tif 000042
【図６】
2008511313.tif 000043
【図７ａ】
2008511313.tif 000044
【図７ｂ】
2008511313.tif 000045
【図７ｃ】
2008511313.tif 000046
【図８ａ】
2008511313.tif 000047
【図８ｂ】
2008511313.tif 000048
【図９ａ】
2008511313.tif 000049
【図９ｂ】
2008511313.tif 000050
【図９ｃ】
2008511313.tif 000051
【配列表】
2008511313000001.app
【国際調査報告】
2008511313.tif 000052
2008511313.tif 000053
2008511313.tif 000054