(57)【要約】本発明は、ＰＡＲＰアクチベーターのスクリーニング方法に関する。本スクリーニング法は、細胞、細胞溶解産物または精製ＰＡＲＰを用いて、試験化合物のＰＡＲＰ活性化効果を評価するステップを含む。本発明はまた、癌を治療する方法を提供する。本治療方法は、被験体に治療上有効な量のＰＡＲＰアクチベーターを投与するステップを含む。本発明は例えば、ＰＡＲＰアクチベーターのスクリーニング方法であって、ＰＡＲＰをコードするＤＮＡを含有する細胞において試験化合物のＰＡＲＰ活性化効果を評価するステップを含む。
2008526237.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＡＲＰアクチベーターのスクリーニング方法であって、ＰＡＲＰをコードするＤＮＡを含有する細胞において試験化合物のＰＡＲＰ活性化効果を評価するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記ＰＡＲＰがＰＡＲＰ−１、ＰＡＲＰ−２またはＰＡＲＰ−１とＰＡＲＰ−２との両方である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞においてＰＡＲＰ活性化効果を評価するステップが、
該細胞を試験化合物に曝露するステップと、
該試験化合物の存在下および非存在下で該細胞におけるＰＡＲＰの活性を測定するステップと、
該試験化合物の存在下と非存在下とでＰＡＲＰの活性を比較するステップとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＰＡＲＰ活性化効果をポリ（ＡＤＰリボース）合成の増大によって決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が癌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記癌細胞が脊椎動物、哺乳類またはヒトの癌中の細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記癌細胞が脊椎動物、哺乳類またはヒトの癌に由来する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記癌細胞が培養癌細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記培養癌細胞が、ＭＣＦ−７（ヒト乳癌細胞）、ＤＬＤ１（ヒト結腸細胞）、ＳＷ４８０（ヒト結腸細胞）およびＰａｃａ−２（ヒト膵臓癌細胞）からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記試験化合物が低分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記試験化合物がβ−ラパコンの類似体、誘導体または代謝産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＰＡＲＰをコードするＤＮＡを含有する正常細胞において前記試験化合物のＰＡＲＰ活性化効果を評価するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記正常細胞においてＰＡＲＰ活性化効果を評価するステップが、
該正常細胞を試験化合物を曝露するステップと、
該試験化合物の存在下および非存在下で該正常細胞におけるＰＡＲＰの活性を測定するステップと、
該試験化合物の存在下と非存在下とでＰＡＲＰの活性を比較するステップとを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記正常細胞が、脊椎動物、哺乳類またはヒト中の正常細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記正常細胞が、脊椎動物、哺乳類またはヒトに由来する正常細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記正常細胞が培養正常細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記培養正常細胞が、ＭＣＦ−１０Ａ（非形質転換乳房上皮細胞）、ＮＣＭ４６０（正常結腸上皮細胞）、ＰＢＭＣ（増殖性末梢血単核細胞）からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記正常細胞においてよりも前記癌細胞においてより高いＰＡＲＰ活性化効果を有する試験化合物を選択するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
ＰＡＲＰアクチベーターのスクリーニング方法であって、ＰＡＲＰをコードするＤＮＡを含有する細胞の溶解産物において試験化合物のＰＡＲＰ活性化効果を評価するステップを含む、方法。
【請求項２０】
前記細胞が癌細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＰＡＲＰをコードするＤＮＡを含有する正常細胞の溶解産物において試験化合物のＰＡＲＰ活性化効果を評価するステップと、
前記癌細胞溶解産物においてと該正常細胞溶解産物においてとで前記試験化合物のＰＡＲＰ活性化効果を比較するステップと
をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＰＡＲＰアクチベーターのスクリーニング方法であって、
ＰＡＲＰを試験化合物と接触させるステップと、
該試験化合物の存在下および非存在下でＰＡＲＰの活性を測定するステップと、
該試験化合物の存在下と非存在下とでＰＡＲＰの活性を比較するステップと
を含む、方法。
【請求項２３】
前記ＰＡＲＰがＰＡＲＰ−１またはＰＡＲＰ−２である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＰＡＲＰ活性を高める試験化合物を選択するステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
ＰＡＲＰをコードするＤＮＡを含有する癌細胞または該細胞の溶解産物において、前記選択された化合物のＰＡＲＰ活性化効果を評価するステップと、
ＰＡＲＰをコードするＤＮＡを含有する正常細胞の溶解産物または該溶解産物において、該選択された化合物のＰＡＲＰ活性化効果を評価するステップと、
該癌細胞または該溶解産物においてと該正常細胞または該溶解産物においてとで、該選択された化合物のＰＡＲＰ活性化効果を比較するステップと
をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
被験体において癌を治療または予防する方法であって、該被験体の癌細胞においてＰＡＲＰ活性を高めるステップを含む、方法。
【請求項２７】
前記被験体の癌細胞においてＰＡＲＰ活性を選択的に高めるステップを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記被験体に治療上有効量のＰＡＲＰアクチベーターを投与するステップを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記被験体に治療上有効量のＰＡＲＰの選択的アクチベーターを投与するステップを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記化合物がβ−ラパコンの類似体、誘導体または代謝産物である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記被験体が脊椎動物、哺乳類またはヒトである、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は２００５年１月７日に出願された米国仮出願第６０／６４２，３５３号の利益を主張し、その内容は参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ；「ポリ（ＡＤＰ−リボース）合成酵素」としても知られる）は、酸化型のニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド（「ＮＡＤ＋」）を基質として用いてＡＤＰ−リボースポリマーを合成し、そのポリマーをその他のタンパク質上に移す（「ポリＡＤＰ−リボシル化」）、核酵素のファミリーである。多数のタンパク質、例えば、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、ヒストン、トポイソメラーゼおよびＰＡＲＰ自身が、ＰＡＲＰによって修飾され得る。（非特許文献１、非特許文献２；非特許文献３）
ＰＡＲＰファミリーについては、１８のメンバーが同定されている（非特許文献３）。中でも、ＰＡＲＰ−１およびＰＡＲＰ−２は、ＤＮＡ損傷に対して応答性であるとわかっている。それらの触媒活性は、ＤＮＡ鎖切断によって即座に刺激される。ＰＡＲＰ−１は、よく研究されたＰＡＲＰであり、１１３ｋＤａという分子量を有する酵素である（非特許文献４）。ＰＡＲＰ−１は細胞機能の二重レギュレーターと見なされている：ＤＮＡ修復または細胞死のいずれかに関与する。ＤＮＡ損傷が中程度である場合には、ＰＡＲＰ−１はＤＮＡ修復において役割を果たす。しかし、ＤＮＡ傷害が大きい場合には、過剰なＰＡＲＰ−１活性化がＮＡＤ＋／ＡＴＰの枯渇とそれによる壊死による細胞死を導く。実際、過剰なＰＡＲＰ−１活性化および結果として起こる細胞死は、いくつかの疾患、例えば、卒中、心筋梗塞、糖尿病、ショック、神経変性障害、アレルギーおよびいくつかのその他の炎症プロセスの発病と関連づけられている（非特許文献５、非特許文献１）。
【０００３】
ＰＡＲＰ−２は、６２ｋＤａという分子量を有し、ＰＡＲＰ−１と重複する役割を有する。ＰＡＲＰ−１およびＰＡＲＰ−２両遺伝子のノックアウトは、マウスにとっては致死性であるが、ＰＡＲＰ−１欠乏症自体はマウスにとって致死性ではない（同書）。
【０００４】
ＰＡＲＰ阻害剤は、ＤＮＡ修復または細胞死におけるそれらの重要な役割のために、種々の疾患の治療において使用できる。一方で、ＰＡＲＰ阻害剤は、癌療法においてアジュバント剤として、具体的には、化学療法および放射線療法において化学増感剤および放射線増感剤として使用できる。ＰＡＲＰ活性の阻害は、ＰＡＲＰ−１およびＰＡＲＰ−２が重要なメンバーであるとわかっているＤＮＡ修復機構を抑制する。このようにして、ＤＮＡ修復の抑制が、ＤＮＡ損傷剤の細胞感受性を高め、鎖の再結合を阻害する。次に、ＤＮＡ損傷の蓄積がアポトーシスによる細胞死につながる。
【０００５】
他方、ＰＡＲＰ阻害剤は、疾患、例えば、卒中、心筋梗塞、糖尿病、ショック、神経変性障害、アレルギーをはじめとする疾患およびいくつかのその他の炎症性プロセスを治療するための薬剤として使用できる。ＰＡＲＰ阻害剤は、過剰なＰＡＲＰ活性化を抑制し、それによってＮＡＤ＋／ＡＴＰの枯渇によって引き起こされる細胞死を防ぐことができる（同書）。
【０００６】
β−ラパコンは、強力な選択性の抗腫瘍化合物であるとわかっている。ＰＡＲＰの調節におけるβ−ラパコンの役割はまだ明らかではない。ある研究はＰＡＲＰ活性はβ−ラパコンによって阻害されると示している（非特許文献６）のに対し、別の研究は、ＰＡＲＰ活性はβ−ラパコンによって誘導されるＵ２−ＯＳ細胞の壊死に関与していると示している（非特許文献７）。ＰＡＲＰ活性におけるβ−ラパコンの阻害的役割についてのＶｉｌｌａｍｉｌのデータは、β−ラパコンで治療した後のＰＡＲＰ活性の増強を示すＬｉｕのものと矛盾する。
【０００７】
本明細書に引用される参照文献は、特許請求される本発明の先行技術であると認められているわけではない。
【非特許文献１】Ｎｇｕｅｗａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６４：１００７−１０１４（２００３）
【非特許文献２】Ｔｅｎｔｏｒｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４５：７３−８５（２００２）
【非特許文献３】Ａｍｅ’，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  ２６：８８２−８９３（２００４）
【非特許文献４】Ｄｅ  Ｍｕｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，  １３：４５５−４６２（１９９１）
【非特許文献５】Ｔｅｎｔｏｒｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４５：７３−８５（２００２）
【非特許文献６】Ｖｉｌｌａｍｉｌ  Ｓ．Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．  １１５（２）：２４９−５６（２００１）
【非特許文献７】Ｌｉｕ  Ｔ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １８２（２）：  １１６−２５（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
進行型転移性癌に治癒をもたらす単一の薬剤または薬剤の組合せはなく、患者は、通常、数年で癌のために死亡する。したがって、命にかかわる腫瘍の発症を延期し、かつ／または腫瘍量をさらに減少させることによって生活の質を向上させることができる新規薬剤または組合せは、非常に重要である。癌およびその他の過剰増殖性疾患の治療のためのその他の抗増殖性化合物を単離する必要性が存在する。本明細書には、これらの化合物のスクリーニング方法およびこれらの化合物を用いてアポトーシスを調節する方法が開示されている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、ＰＡＲＰアクチベーターのスクリーニング方法に関する。本方法は、ＰＡＲＰをコードするＤＮＡを含有する細胞において、試験化合物のＰＡＲＰ活性化効果を評価するステップを含む。ＰＡＲＰは、ＰＡＲＰ−１、ＰＡＲＰ−２またはＰＡＲＰ−１とＰＡＲＰ−２の両方であり得る。一実施形態では、細胞においてＰＡＲＰ活性化効果を評価するステップは、細胞に試験化合物を曝露するステップと、試験化合物の存在下および非存在下で細胞におけるＰＡＲＰの活性を測定するステップと、試験化合物の存在下および非存在下におけるＰＡＲＰの活性を比較するステップとを含む。ＰＡＲＰ活性化効果は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）合成の増大によって調べることができる。
【００１０】
一実施形態では、スクリーニングに用いられる細胞は癌細胞である。癌細胞は、癌中の細胞、癌または培養癌細胞に由来する癌細胞であり得る。癌は、脊椎動物、哺乳類またはヒト由来であり得る。培養癌細胞の例としては、ＭＣＦ−７（ヒト乳癌細胞）、ＤＬＤ１（ヒト結腸細胞）、ＳＷ４８０（ヒト結腸細胞）およびＰａｃａ−２（ヒト膵臓癌細胞）が挙げられる。
【００１１】
試験化合物は低分子であり得、β−ラパコンの類似体、誘導体または代謝産物であることが好ましい。
【００１２】
本発明はまた、ＰＡＲＰの選択的アクチベーターをスクリーニングする方法を提供する。この方法は、ＰＡＲＰをコードするＤＮＡを含有する正常細胞において試験化合物のＰＡＲＰ活性化効果を評価するステップをさらに含む。一実施形態では、正常細胞においてＰＡＲＰ活性化効果を評価するステップは、正常細胞を試験化合物に曝露するステップと、試験化合物の存在下および非存在下で正常細胞におけるＰＡＲＰの活性を測定するステップと、試験化合物の存在下および非存在下におけるＰＡＲＰの活性を比較するステップとを含む。
【００１３】
正常細胞は、脊椎動物、哺乳類またはヒト中の正常細胞、脊椎動物、哺乳類またはヒトまたは培養正常細胞に由来する正常細胞であり得る。培養正常細胞の例としては、ＭＣＦ−１０Ａ（非形質転換乳房上皮細胞）、ＮＣＭ４６０（正常結腸上皮細胞）、ＰＢＭＣ（増殖性末梢血単核細胞）が挙げられる。この方法は、正常細胞においてよりも癌細胞において、高いＰＡＲＰ活性化効果を有する試験化合物を選択するステップをさらに含む。
【００１４】
本発明は、細胞溶解産物を用いるＰＡＲＰアクチベーターのスクリーニング方法をさらに提供する。この方法は、ＰＡＲＰをコードするＤＮＡを含有する細胞の溶解産物において試験化合物のＰＡＲＰ活性化効果を評価するステップを含む。一実施形態では、細胞は癌細胞である。この方法は、ＰＡＲＰをコードするＤＮＡを含有する正常細胞の溶解産物において試験化合物のＰＡＲＰ活性化効果を評価するステップと、癌細胞溶解産物および正常細胞溶解産物における試験化合物のＰＡＲＰ活性化効果を比較するステップとをさらに含み得る。
【００１５】
本発明は、ＰＡＲＰを用いるＰＡＲＰアクチベーターのスクリーニング方法をさらに提供する。この方法は、ＰＡＲＰを試験化合物と接触させるステップと、試験化合物の存在下および非存在下でＰＡＲＰの活性を測定するステップと、試験化合物の存在下および非存在下におけるＰＡＲＰの活性を比較するステップとを含む。一実施形態では、ＰＡＲＰは、ＰＡＲＰ−１またはＰＡＲＰ−２である。この方法は、ＰＡＲＰ活性を高める試験化合物を選択するステップをさらに含み得る。この方法は、化合物を選択した後、ＰＡＲＰをコードするＤＮＡを含有する癌細胞またはその細胞の溶解産物において、選択した化合物のＰＡＲＰ活性化効果を評価するステップと、ＰＡＲＰをコードするＤＮＡを含有する正常細胞の溶解産物またはその溶解産物において、選択した化合物のＰＡＲＰ活性化効果を評価するステップと、癌細胞または溶解産物および正常細胞または溶解産物における選択した化合物のＰＡＲＰ活性化効果を比較するステップとをさらに含み得る。
【００１６】
本発明はさらに、被験体において癌を治療または予防する方法に関する。この方法は、被験体の癌細胞においてＰＡＲＰ活性を高める、好ましくはＰＡＲＰ活性を選択的に高めるステップを含むことを含む。この方法は、被験体に治療上有効量のＰＡＲＰアクチベーター、好ましくは、ＰＡＲＰの選択的アクチベーターを投与するステップを含み得る。本化合物は、β−ラパコンの類似体、誘導体または代謝産物であり得る。被験体は、脊椎動物、哺乳類またはヒトであり得る。
【００１７】
本発明のその他の特徴および利点は、種々の実施例をはじめとする本明細書に提供されるさらなる説明から明らかである。提供される実施例は、本発明を実施するのに有用な、種々の化合物および方法論を例示する。実施例は特許請求される発明を制限するものではない。当業者ならば、本開示内容に基づいて、本発明を実施するのに有用なその他の成分および方法論を同定し、用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＰＡＲＰアクチベーターのスクリーニング方法および癌の予防および治療におけるＰＡＲＰアクチベーターの使用に関する。一実施形態では、ＰＡＲＰアクチベーターは、β−ラパコンの類似体、誘導体または代謝産物である。
【００１９】
（１．ＰＡＲＰアクチベーターのスクリーニング方法）
本発明は、試験化合物のＰＡＲＰ活性化効果を評価するステップを含む、ＰＡＲＰアクチベーターのスクリーニング方法を提供する。本明細書において、「試験化合物のＰＡＲＰ活性化効果」とは、ＰＡＲＰ活性を増大させる試験化合物の能力を指す。用語「増大させる」、「増強する」、「誘導する」または「促進する」は、本明細書では、同じ意味で用いられる。さらに、用語「減少させる」、「低下させる」、「阻害する」または「防ぐ」は、本明細書では同じ意味で用いられる。
【００２０】
ＰＡＲＰ活性は、ポリ（ＡＤＰリボース）合成の測定によって調べることができる。ＰＡＲＰ活性の測定は、当技術分野では公知である（例えば、Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｍａｒａｌａ，  Ｊ．  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄ  ４７：１３７−１４１（２００２）、Ｃｈｅｕｎｇ  ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８２：２４−２８（２０００）およびＤｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５：１１６９−１１７２（１９９９））参照のこと。ＰＡＲＰ活性を増大させる試験化合物は、ＰＡＲＰアクチベーターである。あるいは、ＰＡＲＰの活性は、ＰＡＲＰ阻害剤、例えば、３−アミノベンズアミドの存在下および非存在下で、細胞におけるアポトーシスをモニターすることによって測定することができる。
【００２１】
試験化合物のＰＡＲＰ活性化効果は、試験化合物の存在下および非存在下でのＰＡＲＰ活性の比によって測定できる。一実施形態では、試験化合物の存在下でのＰＡＲＰ活性は、試験化合物の非存在下でのＰＡＲＰ活性の約１．５倍、約２倍、約４倍、約１０倍、約２０倍、約４０倍、約１００倍、約２００倍、約５００倍、約１，０００倍または１，０００倍を超える。
【００２２】
ＰＡＲＰアクチベーターは、種々の機構を介してＰＡＲＰ活性を増大させ得る。ＰＡＲＰアクチベーターは、ＰＡＲＰの転写、転写後、翻訳もしくは転位置、または上記の組合せを増大させ得る。ＰＡＲＰアクチベーターは、ＰＡＲＰと直接相互作用する場合もあるし、ＰＡＲＰのモジュレーターと相互作用する場合もあるし、両方と相互作用する場合もある。一実施形態では、ＰＡＲＰアクチベーターのスクリーニング方法は、化合物を、ＰＡＲＰの活性または発現を増大させるその能力についてスクリーニングするステップを含む。
【００２３】
試験化合物のＰＡＲＰ活性化効果は、種々の系、例えば、動物モデル、培養細胞、細胞溶解産物もしくは単離ＰＡＲＰ、または上記の組合せを用いて評価できる。
【００２４】
（１．１．細胞を用いる評価法）
一実施形態では、ＰＡＲＰアクチベーターのスクリーニング方法は、細胞において試験化合物のＰＡＲＰ活性化効果を評価するステップを含む。評価に用いる細胞は、ＰＡＲＰをコードするＤＮＡを含んでいなくてはならない。ＰＡＲＰ活性化効果を評価するステップは、細胞を試験化合物に曝露するステップと、試験化合物の存在下および非存在下で細胞におけるＰＡＲＰの活性を測定するステップと、試験化合物の存在下および非存在下におけるＰＡＲＰ活性を比較するステップとを含み得る。次いで、ＰＡＲＰ活性を増大させる試験化合物を、ＰＡＲＰアクチベーターとして選択できる。
【００２５】
もう１つの実施形態では、ＰＡＲＰアクチベーターのスクリーニング方法は、試験化合物の、ＰＡＲＰの活性または発現を増大させる能力を測定するステップを含む。一実施形態では、この方法は、ＰＡＲＰを発現する細胞に試験化合物を曝露するステップと、次いで、ＰＡＲＰの発現を測定するステップとを含む。次いで、試験化合物の存在下でのＰＡＲＰの発現を、試験化合物の非存在下でのＰＡＲＰの発現と比較する。試験化合物の存在下でのＰＡＲＰの発現が、試験化合物の非存在下でのＰＡＲＰの発現よりも多い場合には、試験化合物は、ＰＡＲＰ発現を誘導または促進するＰＡＲＰアクチベーターである。発現は当技術分野で公知のいずれかの手段、例えば、ウエスタンブロッティングによって測定できる。試験化合物に曝露されていない細胞におけるＰＡＲＰの発現は、試験化合物に曝露された細胞における発現の約０％、約１％、約１０％、約２０％、約５０％または約７５％であり得る。
【００２６】
評価に用いる細胞は、真核生物、好ましくは、脊椎動物、より好ましくは、哺乳類、さらに好ましくは、ヒトから直接得た細胞であり得る。あるいは、評価に用いる細胞は、培養細胞であり得る。
【００２７】
評価に用いる細胞は、癌細胞であることが好ましい。本明細書において、「癌細胞」とは、脊椎動物、好ましくは、哺乳類、より好ましくは、ヒトから直接得た、原発性癌、転移性癌または血液由来癌に由来する細胞を指す。癌細胞は、限定されるものではないが、ほとんどの場合、いわゆる「癌化表現型」を示し、制限されない複製能をその細胞に付与する遺伝子欠損を有し、さらに、半固体組織培養培地（ソフトアガーなど）において足場独立的に増殖する能力を示すと特徴づけられ、免疫学的に易感染性または致死量以下の照射を受けた、げっ歯類またはその他の動物モデルに注入または移植された場合に皮下腫瘍を形成する能力を特徴とする。癌細胞は脊椎動物、哺乳類またはヒトから得られる癌中の細胞であり得る。癌細胞はまた、キメラ動物から得られる癌中の細胞、またはキメラ動物における癌に由来する細胞であり得る。キメラ動物の一例として、ヒト異種移殖片腫瘍を有するマウスがある（例えば、Ｃａｌａｂｒｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ９６：５６−６７（２００４）参照のこと。あるいは、癌細胞は、滅菌ポリスチレンプレートにおいて接着単層として無制限に増殖した培養癌細胞であり得る。培養癌細胞の例としては、ＭＣＦ−７（ヒト乳癌細胞）、ＤＬＤ１（ヒト結腸細胞）、ＳＷ４８０（ヒト結腸細胞）およびＰａｃａ−２（ヒト膵臓癌細胞）が挙げられる。
【００２８】
ＰＡＲＰアクチベーターは、正常細胞においてよりも癌細胞においてＰＡＲＰ活性を増大させるＰＡＲＰの選択的アクチベーターであることが好ましい。ＰＡＲＰの選択的アクチベーターをスクリーニングするためには、ＰＡＲＰアクチベーターのスクリーニング方法は、正常細胞ならびに癌細胞において試験化合物のＰＡＲＰ活性化効果を評価するステップをさらに含み得る。正常細胞においてＰＡＲＰ活性化効果を評価するステップは、正常細胞を試験化合物に曝露するステップと、試験化合物の存在下および非存在下で正常細胞におけるＰＡＲＰの活性を測定するステップと、試験化合物の存在下および非存在下でのＰＡＲＰの活性を比較するステップとを含み得る。次いで、正常細胞においてよりも癌細胞においてＰＡＲＰ活性を増大させる試験化合物を、ＰＡＲＰの選択的アクチベーターとして選択できる。
【００２９】
ＰＡＲＰアクチベーターの選択性は、癌細胞および正常細胞における試験化合物のＰＡＲＰ活性化効果の比によって測定できる。一実施形態では、癌細胞における試験化合物のＰＡＲＰ活性化効果は、癌細胞における試験化合物のＰＡＲＰ活性化効果の、約１．５倍、約２倍、約４倍、約１０倍、約２０倍、約４０倍、約１００倍、約２００倍、約５００倍、約１，０００倍または１，０００倍を超える。
【００３０】
本明細書において、「正常細胞」とは、癌細胞と比較して制限された複製能を有し、有限数の細胞分裂の後、培養において分裂を停止する細胞を指す。これらの正常細胞は、癌細胞のいわゆる「癌化表現型」を示さず、半固体組織培養培地（ソフトアガーなど）において足場独立的に増殖せず、免疫学的に易感染性または致死量以下の照射を受けた、げっ歯類またはその他の動物モデルに注入または移植された場合に皮下腫瘍を形成しない細胞を包含する。正常細胞は、脊椎動物、好ましくは、哺乳類、より好ましくは、ヒトの組織から直接単離した細胞、例えば、皮膚生検から得られるヒト皮膚線維芽細胞、全血から単離される増殖性末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または乳房縮小術後に正常乳房組織から単離されるヒト上皮細胞であり得る。正常細胞は、脊椎動物、哺乳類またはヒト中の正常細胞であり得る。あるいは、正常細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖され、癌化表現型をとることなく複製能の増大を獲得した（「不死化」した）培養細胞株、例えば、ＭＣＦ−１０Ａ（非形質転換乳房上皮細胞）、ＮＣＭ４６０（正常結腸上皮細胞）であってもよい。
【００３１】
ＰＡＲＰの選択的アクチベーターをスクリーニングする方法では、癌細胞および正常細胞は、いくつかの主な特徴を共有することが好ましい。例えば、Ｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  １００：２６７４−２６７８（２００３）参照のこと。
【００３２】
（１．２．細胞溶解産物を用いる評価法）
もう１つの実施形態では、ＰＡＲＰアクチベーターのスクリーニング方法は、細胞の溶解産物において試験化合物のＰＡＲＰ活性化効果を評価するステップを含む。評価に用いる細胞は、ＰＡＲＰをコードするＤＮＡを含んでいなくてはならない。ＰＡＲＰ活性化効果を評価するステップは、細胞溶解産物を試験化合物に曝露するステップと、試験化合物の存在下および非存在下で細胞溶解産物におけるＰＡＲＰ活性を測定するステップと、試験化合物の存在下および非存在下におけるＰＡＲＰ活性を比較するステップとを含み得る。次いで、ＰＡＲＰ活性を増大させる化合物を、ＰＡＲＰアクチベーターとして選択できる。
【００３３】
細胞溶解産物は、当技術分野で公知の種々の方法によって作製できる。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｊｏｈｎ  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｗｉｌｅｙ  １９９５−２００２  Ｅｄｉｔｉｏｎ：（ｖ．  １）参照のこと。
【００３４】
評価法は、癌細胞の溶解産物を用いることが好ましい。癌細胞としては節１．１に記載されるものがある。
【００３５】
同様に、癌細胞溶解産物におけるおよび正常細胞溶解産物における、試験化合物のＰＡＲＰ活性化効果を比較できる。次いで、正常細胞溶解産物においてよりも癌細胞溶解産物においてＰＡＲＰ活性を増大させる試験化合物を、ＰＡＲＰの選択的アクチベーターとして選択できる。ＰＡＲＰアクチベーターの選択性は節１．１においてと同様に調べることができる。
【００３６】
（１．３．ＰＡＲＰを用いる評価法）
もう１つの実施形態では、ＰＡＲＰアクチベーターのスクリーニング方法は、ＰＡＲＰを試験化合物と接触させるステップと、試験化合物の存在下および非存在下でＰＡＲＰの活性を測定するステップと、試験化合物の存在下および非存在下でのＰＡＲＰの活性を比較するステップとを含む。次いで、ＰＡＲＰ活性を増大させる試験化合物を、ＰＡＲＰアクチベーターとして選択できる。
【００３７】
一実施形態では、試験化合物の評価に用いるＰＡＲＰは、ＰＡＲＰ−１である。好ましい実施形態では、ＰＡＲＰ−１は単離ＰＡＲＰ−１である。一実施形態では、ＰＡＲＰ−１は、表１に示されるアミノ酸配列を有するヒトタンパク質である。活性は、ポリ（ＡＤＰリボース）基の量をモニターすることによって測定されるＰＡＲＰの活性をモニターすることによって測定する。
【００３８】
【表１】
2008526237.tif 000003
試験化合物をＰＡＲＰアクチベーターとして選択すると、ＰＡＲＰ活性化におけるその選択性についてアクチベーターをさらに試験できる。さらなる試験は上記の手順に従うことができる。そのため、この方法は、ＰＡＲＰをコードするＤＮＡを含有する癌細胞、または癌細胞の溶解産物においてアクチベーターのＰＡＲＰ活性化効果を評価するステップと、ＰＡＲＰをコードするＤＮＡを含有する正常細胞、または正常細胞の溶解産物においてアクチベーターのＰＡＲＰ活性化効果を評価するステップと、癌細胞または溶解産物および正常細胞または溶解産物におけるアクチベーターのＰＡＲＰ活性化効果を比較するステップとをさらに含み得る。次いで、正常細胞または溶解産物においてよりも癌細胞または溶解産物においてＰＡＲＰ活性を増大させる試験化合物を、ＰＡＲＰの選択的アクチベーターとして選択できる。ＰＡＲＰアクチベーターの選択性は、節１．１においてと同様に調べることができる。
【００３９】
（１．４．抗癌剤候補のスクリーニング方法）
本発明はまた、ＰＡＲＰ活性化または発現に対して増強効果を有し、ひいては、癌細胞の細胞死を促進する、候補または試験化合物または薬剤を同定する方法（本明細書において「スクリーニングアッセイ」とも呼ばれる）を提供する。本発明はまた、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイにおいて同定される化合物を含む。
【００４０】
さらにもう１つの実施形態では、本発明は、前癌状態または癌の治療に使用するための可能性ある治療薬を同定する方法であって、細胞、組織または動物を提供するステップと、細胞、組織または動物を、ＰＡＲＰ活性または発現を増強する試験化合物を含む組成物に曝露させるステップと、前癌状態または癌の進行をモニターし、前癌状態または癌の進行が低減される場合に候補化合物を可能性ある治療薬として同定するステップとを含む方法を対象とする。
【００４１】
一実施形態では、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、これでは、癌細胞を試験化合物に曝露させ、試験化合物の、ＰＡＲＰの活性化または発現を直接的にまたは間接的に増強し、前癌状態または癌の進行を低減する能力を調べる。細胞は、例えば、哺乳類またはヒト起源のものであり得、前癌状態または癌の細胞であり得る。試験化合物の、前癌状態または癌の進行を低減する能力を調べるステップは、例えば、前癌状態または癌の進行をモニターすることによって達成できる。
【００４２】
本発明はまた、（ｉ）薬剤の投与に先立って被験体から投与前サンプルを採取ステップと、（ｉｉ）投与前サンプルにおいて、前癌状態または癌の細胞におけるＰＡＲＰの発現または活性のレベルを検出するステップと、（ｉｉｉ）被験体から１以上の投与後サンプルを採取するステップと、（ｉｖ）投与後サンプルにおいて、前癌状態または癌の細胞のＰＡＲＰの発現または活性のレベルを検出するステップと、（ｖ）投与前サンプルにおける前癌状態または癌の細胞のＰＡＲＰの発現または活性のレベルを、投与後サンプルまたはサンプル類における前癌状態または癌の細胞と比較するステップと、（ｖｉ）被験体への薬剤の投与をそれに沿って変更するステップとを含む、ＰＡＲＰの活性化または発現を直接的にまたは間接的に増強する試験化合物または薬剤を用いる被験体の治療の有効性をモニターする方法を提供する。
【００４３】
適したｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを実施してＰＡＲＰ活性または発現を増強する組成物の効果を、またその投与が前癌状態または癌の細胞の増殖を阻害するかどうかを調べることができる。種々の特定の実施形態では、代表的な前癌状態または癌の細胞を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを実施し、所与の治療薬が、その細胞種（類）に対して所望の効果を発揮するかどうかを調べることができる。治療に用いる化合物は、ヒト被験体における試験に先立って、適した動物モデル系、例えば、それだけには限らないが、ラット、マウス、ウシ、サル、ウサギなどで試験できる。同様に、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験については、ヒト被験体への投与に先立って当技術分野で公知の動物モデル系はいずれも使用できる。
【００４４】
（２．試験化合物）
試験化合物は、タンパク質、ペプチド、ペプチドミメティック、核酸、低分子またはその他の薬物候補であり得る。好ましい実施形態では、試験化合物は低分子である。本明細書において「低分子」とは、分子量が約５ｋＤ未満である、最も好ましくは、約４ｋＤ未満である組成物を指すものとする。低分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメティック、炭水化物、脂質またはその他の有機もしくは無機分子であり得る。化学的および／または生物学的混合物、例えば、真菌、細菌または藻類抽出物のライブラリーは当技術分野で公知であり、本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングできる。
【００４５】
好ましい実施形態では、本発明に用いる低分子は、β−ラパコンまたはその類似体、誘導体または代謝産物である。本発明のもう１つの実施形態では、候補化合物と接触させた細胞におけるＰＡＲＰの活性を、β−ラパコンと接触させた細胞におけるＰＡＲＰの活性と比較する。候補化合物の存在下でのＰＡＲＰの活性が、β−ラパコンの存在下でのＰＡＲＰの活性と同様である場合には、候補化合物はＰＡＲＰ活性を誘導または促進し、アポトーシスを誘導または促進し、細胞および組織におけるアポトーシスの調節において有用である。
【００４６】
ＰＡＲＰの発現の増大はまた、その他のアプローチでも達成され得る。具体的には、この方法は、細胞においてＰＡＲＰを異種発現させる方法とともに、アンチセンスおよびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を含む。ＰＡＲＰの発現を調節するための特異的ｓｉＲＮＡおよびアンチセンスヌクレオチドも本発明に含まれる。
【００４７】
（２．１．試験化合物のライブラリー）
本発明の試験化合物は、当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれか、例えば、生物学的ライブラリー、空間的にアドレス可能なパラレル固相または液相ライブラリー、デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法、「１ビーズ１化合物」ライブラリー法およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を用いて得ることができる。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されるが、その他の４種のアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは低分子ライブラリーの化合物に適用できる。例えば、Ｌａｍ，  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １２：１４５（１９９７）参照のこと。
【００４８】
分子ライブラリーの合成法の例は、当技術分野において、例えば、ＤｅＷｉｔｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  ９０：６９０９（１９９３）、Ｅｒｂ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  ９１：１１４２２（１９９４）、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３７：２６７８（１９９４）、Ｃｈｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１  ：１３０３（１９９３）、Ｃａｒｒｅｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ３３：２０５９（１９９４）、Ｃａｒｅｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ３３：２０６１（１９９４）およびＧａｌｌｏｐ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３７：１２３３（１９９４）に見出すことができる。
【００４９】
化合物のライブラリーは溶液中に（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１（１９９２））またはビーズ上に（Ｌａｍ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４（１９９１））、チップ上に（Ｆｏｄｏｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６（１９９３））、細菌で（Ｌａｄｎｅｒ，米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子で（Ｌａｄｎｅｒ，米国特許第５，２３３，４０９号）、プラスミドで（Ｃｕｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ，  ８９：１８６５−１８６９（１９９２））またはファージ上に（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０（１９９０）、Ｄｅｖｌｉｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６（１９９０）、Ｃｗｉｒｌａ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  ８７：６３７８−６３８２（１９９０）、Ｆｅｌｉｃｉ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：３０１−３１０（１９９１）、Ｌａｄｎｅｒ，  米国特許第５，２３３，４０９号）提供できる。
【００５０】
（２．２  β−ラパコンの類似体、誘導体または代謝産物）
実施例において示されるように、β−ラパコンはＰＡＲＰアクチベーターである。ＰＡＲＰ経路をβ−ラパコンによって誘導されるアポトーシスにおける主要な決定因子として、初めて証明した。さらに、β−ラパコンがＰＡＲＰ酵素を直接活性化することを発見した。
【００５１】
実施例において示されるように、β−ラパコンは、細胞溶解産物（図９）および無傷の細胞（図４）の双方においてＰＡＲＰ活性を増強する。細胞および溶解産物をβ−ラパコンで処理し、ＰＡＲＰ産物ポリ（ＡＤＰ−リボース）の量を測定した。ＰＡＲＰによるポリ（ＡＤＰ−リボース）の生成の増強に対するβ−ラパコンの効果は、既知のＰＡＲＰ阻害剤３−アミノベンズアミドの添加によって打ち消された（図５および６）。
【００５２】
β−ラパコンはまた、ＨｅＬａおよびＤＬＤ１細胞において細胞傷害性を誘導する（図１〜３）。３−アミノベンズアミドは、ＨｅＬａおよびＤＬＤ１細胞における細胞傷害性の誘導を阻止する（図１〜３）。ＰＡＲＰは基質としてＮＡＤ＋を用いてポリ（ＡＤＰ）基を合成する。ＰＡＲＰの活性化は、ＮＡＤ＋の枯渇を引き起こし、これが細胞傷害性の増大をもたらす。
【００５３】
β−ラパコンは、細胞において細胞ＮＡＤ＋レベルの迅速な枯渇を引き起こす（図７）。この枯渇は、３−アミノベンズアミドの添加によって阻害された。β−ラパコン投与に伴って起こる細胞傷害性の増大は、ＮＡＤ＋の投与によって元に戻すことができた（図８）。同様の結果が、ＭＣＦ７、ＤＬＤ１、ＨｅＬａおよびＳＷ４８０細胞において見られた。このデータは、β−ラパコンはＰＡＲＰと直接的に相互作用し、ＰＡＲＰ活性の増強を介して細胞傷害性を引き起こすということを示す。
【００５４】
β−ラパコンは、癌細胞ではＥ２Ｆ１を特異的に誘導し、それによって、癌細胞において細胞死を選択的に誘導する（Ｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  １００：２６７４−２６７８（２００３））。実施例において示されるように、β−ラパコンは、Ｅ２Ｆ１を介してＰＡＲＰ活性を活性化し、Ｅ２Ｆ１の阻害は、β−ラパコンによって誘導されるＰＡＲＰ活性化を抑制する。したがって、β−ラパコンはまた、癌細胞においてＰＡＲＰ活性を選択的に増大させるＰＡＲＰの選択的アクチベーターである。
【００５５】
一実施形態では、候補化合物はβ−ラパコン類似体、誘導体または代謝産物である。本明細書ではさらに、語句「β−ラパコン」とは、３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−２Ｈ−ナフサ［１，２−ｂ］ピラン−５，６−ジオンを指し、以下の化学構造を有する
【００５６】
【化１】
2008526237.tif 000004
本発明に従う、β−ラパコンまたはその類似体、誘導体または代謝産物は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる米国特許第６，４５８，９７４号に記載のとおり合成できる。好ましい誘導体および類似体は以下に論じる。
【００５７】
もう１つの実施形態では、β−ラパコンの類似体として、還元β−ラパコン（式Ｉａ、式中、Ｒ’およびＲ’’は各々水素である）ならびに還元β−ラパコンの誘導体（式Ｉａ、式中、Ｒ’およびＲ’’は各々独立に水素、低級アルキルまたはアシルである）が挙げられる。
【００５８】
さらにもう１つの実施形態では、β−ラパコン誘導体または類似体、例えば、ラパコールおよび、
【００５９】
【化２】
2008526237.tif 000005
その薬剤組成物および製剤が本発明に一部である。このようなβラパコン類似体としては、それだけには限らないが、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／０７８７８（ＷＯ９４／０４１４５）において列挙されたものが挙げられ、これは次式の化合物を開示する：
【００６０】
【化３】
2008526237.tif 000006
［式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立に、水素、置換および非置換アリール、置換および非置換アルケニル、置換および非置換アルキルならびに置換または非置換アルコキシである］。アルキル基は、１〜約１５個の炭素原子を有することが好ましく、１〜約１０個の炭素原子がより好ましく、１〜約６個の炭素原子がさらにより好ましい。用語アルキルとは、別に修飾のない限り、環状および非環状基の双方を指し、ただし、もちろん環状基は少なくとも３個の炭素環員を含む。直鎖または分枝鎖非環状アルキル基は、通常、環状基よりもより好ましい。直鎖アルキル基は、通常、分枝よりもより好ましい。アルケニル基は、２〜約１５個の炭素原子を有することが好ましく、２〜約１０個の炭素原子がより好ましく、２〜６個の炭素原子がさらにより好ましい。特に好ましくいアルケニル基は３個の炭素原子を有し（すなわち１−プロペニルまたは２−プロペニル）、アリル部分を有することが特に好ましい。フェニルおよびナフチルは、通常、好ましいアリール基である。アルコキシ基は、１以上の酸素結合を有するアルコキシ基を含み、１〜１５個の炭素原子を有することが好ましく、１〜約６個の炭素原子がより好ましい。置換Ｒ１およびＲ２基は、１以上の利用可能な位置で、１以上の適した基、例えば、アルキル基、例えば、１〜１０個の炭素原子または１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、アルケニル基、例えば、２〜１０個の炭素原子または２〜６個の炭素原子を有するアルケニル基、６〜１０個の炭素原子を有するアリール基、ハロゲン、例えば、フルオロ、クロロおよびブロモならびにＮ、ＯおよびＳなどによって置換されていてもよく、ヘテロアルキル、例えば、１以上のヘテロ原子結合を有し（したがって、アルコキシ、アミノアルキルおよびチオアルキルを含む）、１〜１０個の炭素原子または１〜６個の炭素原子を有するヘテロアルキルを含む。
【００６１】
本発明に従って考慮されるその他のβ−ラパコン類似体としては、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる米国特許第６，２４５，８０７号に記載されるものが挙げられ、これでは、以下の構造を有するβ−ラパコン類似体および誘導体を開示している
【００６２】
【化４】
2008526237.tif 000007
［式中、ＲおよびＲ１は各々独立に、水素、ヒドロキシ、スルフヒドリル、ハロゲン、置換アルキル、非置換アルキル、置換アルケニル、非置換アルケニル、置換アリール、非置換アリール、置換アルコキシ、非置換アルコキシおよびそれらの塩から選択され、環炭素間の点線の二重結合は、任意の環二重結合を表す］。
【００６３】
さらなるβ−ラパコン類似体および誘導体は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ００／１０１６９（ＷＯ００／６１１４２）に列挙されており、これでは以下の構造の化合物を開示している
【００６４】
【化５】
2008526237.tif 000008
［式中、Ｒ５およびＲ６は独立に、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、−−（ＣＨ２）ｎ−フェニルから選択されてよく、Ｒ７は水素、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、−−（ＣＨ２）ｎ−アミノ、−−（ＣＨ２）ｎ−アリール、−−（ＣＨ２）ｎ−ヘテロアリール、−−（ＣＨ２）ｎ−複素環または−−（ＣＨ２）ｎ−フェニルであり、ｎは０〜１０の整数である］。
【００６５】
その他のβ−ラパコン類似体および誘導体は、米国特許第５，７６３，６２５号、同５，８２４，７００号および同５，９６９，１６３号に、ならびに、Ｓａｂｂａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２７：９９０−９９４（１９８４）などの科学論文に開示されており、これでは以下の位置のうち１以上に置換を有するβ−ラパコンを開示している：２−、８−および／または９−位。Ｐｏｒｔｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍ  ５１  ：２７５−２８３（１９９６）（２−および９−位での置換）、Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  ８４７−８５０（１９７７）、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ３９：８２２１−８２２４（１９９８）、Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  １：１６７−１７６（１９９８）（２−および３−位での置換）、Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６Ｂ：  ３５−３７（１９７８）、Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｓｃｉ  ４６：３３７（１９７７）（３−および４−位での置換）、ＤｉＣｈｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４４：  ２４８６−２４８９（２００１）（モノアリールアミノ誘導体）も参照のこと。上記の参照文献の各々は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【００６６】
本願によって考慮されるβ−ラパコン類似体および誘導体は、以下の一般式ＩＩおよびＩＩＩを有する化合物を包含するよう意図されることがより好ましい：
【００６７】
【化６】
2008526237.tif 000009
［式中、環炭素間の点線の二重結合は、任意の環二重結合を表し、ＲおよびＲ１は各々独立に、水素、ヒドロキシ、スルフヒドリル、ハロゲン、置換アルキル、非置換アルキル、置換アルケニル、非置換アルケニル、置換アリール、非置換アリール、置換アルコキシ、非置換アルコキシおよびそれらの塩から選択される］。アルキル基は、１〜約１５個の炭素原子を有することが好ましく、１〜約１０個の炭素原子がより好ましく、１〜約６個の炭素原子がさらにより好ましい。用語アルキルとは、環状および非環状基の双方を指す。直鎖または分枝鎖非環状アルキル基は、通常、環状基よりもより好ましい。直鎖アルキル基は、通常、分枝よりもより好ましい。アルケニル基は、２〜約１５個の炭素原子を有することが好ましく、２〜約１０個の炭素原子がより好ましく、２〜６個の炭素原子がさらにより好ましい。特に好ましくいアルケニル基は３個の炭素原子を有し（すなわち１−プロペニルまたは２−プロペニル）が、アリル部分を有することが特に好ましい。フェニルおよびナフチルは、通常、好ましいアリール基である。アルコキシ基は、１以上の酸素結合を有するアルコキシ基を含み、１〜１５個の炭素原子を有することが好ましく、１〜約６個の炭素原子がより好ましい。置換ＲおよびＲ１基は、１以上の利用可能な位置で、１以上の適した基、例えば、１〜１０個の炭素原子または１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、２〜１０個の炭素原子または２〜６個の炭素原子を有するアルケニル基、６〜１０個の炭素原子を有するアリール基、ハロゲン、例えば、フルオロ、クロロおよびブロモならびにＮ、ＯおよびＳなどによって置換されていてもよく、これとしては、ヘテロアルキル、例えば、１以上のヘテロ原子結合を有し（したがって、アルコキシ、アミノアルキルおよびチオアルキルを含む）、１〜１０個の炭素原子または１〜６個の炭素原子を有するヘテロアルキルが挙げられる。また、式中、Ｒ５およびＲ６は独立に、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、−−（ＣＨ２）ｎ−アリール、−−（ＣＨ２）ｎ−ヘテロアリール、−−（ＣＨ２）ｎ−複素環または−−（ＣＨ２）ｎ−フェニルから選択されてもよく、Ｒ７は水素、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、−−（ＣＨ２）ｎ−アミノ、−−（ＣＨ２）ｎ−アリール、−−（ＣＨ２）ｎ−ヘテロアリール、−−（ＣＨ２）ｎ−複素環または−−（ＣＨ２）ｎ−フェニルであり、ｎは０〜１０の整数である。
【００６８】
本発明によって同様に考慮される好ましいβ−ラパコン類似体および誘導体として、また、以下の一般式ＩＶの化合物が挙げられる
【００６９】
【化７】
2008526237.tif 000010
［式中、Ｒ１は（ＣＨ２）ｎ−Ｒ２であり、ｎは０〜１０の整数であり、Ｒ２は水素、アルキル、アリール、複素芳香族化合物、複素環式化合物、脂肪族化合物、アルコキシ、アリルオキシ、ヒドロキシル、アミン、チオール、アミドまたはハロゲンである。
【００７０】
本発明によって同様に考慮される類似体および誘導体として、また、４−アセトキシ−β−ラパコン、４−アセトキシ−３−ブロモ−β−ラパコン、４−ケト−β−ラパコン、７−ヒドロキシ−β−ラパコン、７−メトキシ−β−ラパコン、８−ヒドロキシ−β−ラパコン、８−メトキシ−β−ラパコン、８−クロロ−β−ラパコン、９−クロロ−β−ラパコン、８−メチル−β−ラパコンおよび８，９−ジメトキシ−β−ラパコンが挙げられる。
【００７１】
本発明によって同様に考慮されるその他のβ−ラパコン類似体および誘導体として、また、以下の一般式Ｖの化合物が挙げられる：
【００７２】
【化８】
2008526237.tif 000011
［式中、Ｒ１〜Ｒ４は各々独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、−−（ＣＨ２）ｎ−アリール、−−（ＣＨ２）ｎ−ヘテロアリール、−−（ＣＨ２）ｎ−複素環または−−（ＣＨ２）ｎ−フェニルからなる群から選択され、または合わせたＲ１およびＲ２が、上記の群から選択される単一の置換基であり、合わせたＲ３およびＲ４は、上記の群から選択される単一の置換基であり、この場合には−−−−は二重結合である。
【００７３】
本発明によって同様に考慮される好ましいβ−ラパコン類似体および誘導体として、また、ズンニオンおよび２−エチル−６−ヒドロキシナフサ［２，３−ｂ］−フラン−４，５−ジオンが挙げられる。
【００７４】
本発明によって同様に考慮される好ましいβ−ラパコン類似体および誘導体として、また、以下の一般式ＶＩの化合物が挙げられる：
【００７５】
【化９】
2008526237.tif 000012
［式中、Ｒ１はＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３およびＮＯ２から選択される］。
【００７６】
本発明の方法およびキットにおいて有用なさらなる好ましいβ−ラパコン類似体は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／３７２１９（ＷＯ２００４／０４５５５７）に列挙されており、これでは以下の式ＶＩＩによって表される化合物
【００７７】
【化１０】
2008526237.tif 000013
またはその製薬上許容される塩またはその位置異性体混合物を開示している［式中、Ｒ１〜Ｒ６は各々独立に、Ｈ、ＯＨ、置換および非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換および非置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、置換および非置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換および非置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、置換および非置換Ｃ１〜Ｃ６アシル、−（ＣＨ２）ｎ−アミノ、−（ＣＨ２）ｎ−アリール、−（ＣＨ２）ｎ−複素環および−（ＣＨ２）ｎ−フェニルからなる群から選択されるか、またはＲ１もしくはＲ２の一方とＲ３もしくはＲ４の一方、またはＲ３もしくはＲ４の一方とＲ５もしくはＲ６の一方が縮合環を形成し、ここで、環は４〜８環員を有し、Ｒ７〜Ｒ１０は各々独立に、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、置換または非置換アルキル、置換または非置換アルコキシ、ニトロ、シアノまたはアミドであり、ｎは０〜１０の整数である］。
【００７８】
好ましい実施形態では、Ｒ１およびＲ２はアルキルであり、Ｒ３〜Ｒ６は独立に、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、置換または非置換アシル、置換アルケニルまたは置換アルキルカルボニルであり、Ｒ７〜Ｒ１０は水素である。もう１つの好ましい実施形態では、Ｒ１およびＲ２は各々メチルであり、Ｒ３〜Ｒ１０は各々水素である。もう１つの好ましい実施形態では、Ｒ１〜Ｒ４は各々水素であり、Ｒ５およびＲ６は各々メチルであり、Ｒ７〜Ｒ１０は各々水素である。
【００７９】
本発明の方法およびキットにおいて有用なさらなる好ましいβ−ラパコン類似体は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／３７２１９（ＷＯ２００４／０４５５５７）に列挙されており、これでは次式ＶＩＩＩによって表される化合物
【００８０】
【化１１】
2008526237.tif 000014
またはその製薬上許容される塩、またはその位置異性体混合物を開示している［式中、Ｒ１〜Ｒ４は各々独立に、Ｈ、ＯＨ、置換および非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換および非置換Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、置換および非置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換および非置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニル、置換および非置換Ｃ１〜Ｃ６アシル、−（ＣＨ２）ｎ−アミノ、−（ＣＨ２）ｎ−アリール、−（ＣＨ２）ｎ−複素環および−（ＣＨ２）ｎ−フェニルからなる群から選択されるか、またはＲ１もしくはＲ２の一方およびＲ３もしくはＲ４の一方が縮合環を形成し、ここで、環は４〜８環員を有し、Ｒ５〜Ｒ８は各々独立に、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、置換または非置換アルキル、置換または非置換アルコキシ、ニトロ、シアノまたはアミドであり、ｎは０〜１０の整数である］。式ＶＩＩＩの特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は各々同時にＨではない。
【００８１】
（３．哺乳類前癌状態、癌または過剰増殖性疾患を診断および治療する方法）
本発明によって提供されるＰＡＲＰアクチベーターは、ＰＡＲＰの活性を増大させることによって癌細胞を死滅させる新規薬物として使用できる。この抗癌剤は、ＰＡＲＰ関連障害の細胞、例えば、前癌状態または癌細胞、過剰増殖性細胞またはＤＮＡ損傷と関連している細胞において細胞死を促進する。
【００８２】
治療される種々の癌としては、それだけには限らないが、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、肝細胞腫、脳癌、黒色腫、多発性骨髄腫、血液腫瘍およびリンパ腫瘍が挙げられる。過剰増殖性障害とは、細胞の調節されていないおよび／または異常な増殖が、癌性または非癌性の、例えば、乾癬状態であり得る、望まれていない状態または疾患の発生をもたらし得る状態を指す。本明細書において、用語「乾癬状態」とは、ケラチノサイト過剰増殖、炎症性細胞浸潤およびサイトカイン変更を含む障害を指す。治療される過剰増殖性疾患／障害として、それだけには限らないが、エピデルミック（ｅｐｉｄｅｒｍｉｃ）嚢胞および類皮嚢胞、脂肪腫、腺腫、毛細血管および皮膚血管腫、リンパ管腫、母斑病変、奇形腫、腎腫瘍、筋線維腫症、骨形成腫瘍およびその他の形成異常腫瘤などが挙げられる。ＰＡＲＰ関連障害は、ＤＮＡ修復障害、例えば、それだけには限らないが、毛細血管拡張性運動失調症、早期老化症候群、リー・フラウメニ症候群および前癌状態、例えば、ＢＲＣＡ家系であり得る。本発明の組成物はまた、癌への進行の危険の増した、前癌状態、臨床状態にとっても有用であり得る。
【００８３】
本発明はまた、癌細胞の細胞死を調節する候補化合物の使用のために広く描かれている。これらの試験化合物を用いるアポトーシスの調節は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで生じ得る。調節は、癌細胞、細胞株および原発性細胞において生じ得る。
【００８４】
本発明のもう１つの実施形態は、前癌状態または癌の細胞の増殖を防ぐまたは阻害する方法であり、この方法は細胞に、細胞においてＰＡＲＰ活性または発現を増強する組成物を、前癌状態または癌の細胞の増殖を阻害するのに十分な量で細胞に投与するステップを含む。この方法は、哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞で実施でき、またｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏで実施できる。
【００８５】
本発明のもう１つの実施形態は、被験体において哺乳類前癌状態または癌を診断および治療する方法であり、この方法は、被験体から前癌状態または癌細胞を得るステップと、被験体から得た前癌状態または癌細胞を、ＰＡＲＰの存在について試験するステップと、ＰＡＲＰ活性または発現を増強する組成物を、前癌状態または癌の細胞の増殖を阻害するのに十分な量で被験体に投与するステップとを含む。この方法に用いる組成物は、ＰＡＲＰの発現を増大させる、β−ラパコン類似体、誘導体またはその代謝産物、またはｍＲＮＡであり得る。
【００８６】
本発明のもう１つの実施形態は、哺乳類被験体において前癌状態または癌を治療する方法であり、この方法は、ＰＡＲＰ活性または発現を増強する組成物を哺乳類に投与するステップと、前癌状態または癌の状態を調べるために哺乳類をモニターするステップとを含み、組成物は前癌状態または癌の細胞の増殖を阻害するのに十分な量で投与する。この方法に用いる組成物は、ＰＡＲＰの発現を増大させる、β−ラパコン類似体、誘導体またはその代謝産物、またはｍＲＮＡであり得る。
【００８７】
本発明のもう１つの実施形態は、前癌状態または癌を有する哺乳類被験体に投与されると、哺乳類被験体においてＰＡＲＰの活性化または発現を選択的に増強し、腫瘍細胞増殖の退行をもたらす組成物を用いる治療に受容性である患者を診断する方法である。この方法は、患者から細胞を得るステップと、ＰＡＲＰの存在またはＰＡＲＰ活性の存在のいずれかについて細胞を試験するステップとを含み、細胞におけるＰＡＲＰの存在またはＰＡＲＰ活性の存在のいずれかが、治療に受容性である患者を示す。
【００８８】
この実施形態では、β−ラパコン類似体、誘導体またはその代謝産物などの化合物を用いて癌を診断できる。被験体から単離された細胞を、β−ラパコン類似体、誘導体またはその代謝産物の存在下または非存在下で培養できる。対照と比較して、β−ラパコン類似体、誘導体またはその代謝産物で処理された細胞においてその増殖速度が阻害された細胞は、前癌状態または癌の細胞である。次いで、この被験体を前癌状態または癌を有すると診断できる。
【００８９】
本発明のＰＡＲＰアクチベーターは、種々の形の組織損傷、例えば、虚血、再潅流傷害、機械的傷害、炎症または免疫学的損傷の際のアポトーシスを阻害する薬物の開発に役立ち得る。
【００９０】
（３．１  試験化合物およびＰＡＲＰアクチベーターの組成物）
上記で論じたように、一態様では、本発明は、前癌状態、癌または過剰増殖性障害を有する哺乳類被験体に投与されると、哺乳類細胞および被験体においてＰＡＲＰ活性を選択的に増強し、細胞増殖の退行をもたらす組成物を提供する。この組成物はまた、薬剤組成物またはキットの形であり得る。
【００９１】
本発明の組成物は、投与に適した薬剤組成物に組み込むことができる。このような組成物は、通常、ＰＡＲＰ活性または発現を増強する物質と製薬上許容される担体とを含む。本明細書において、「製薬上許容される担体」とは、薬剤投与に適した、ありとあらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤など含むものとする。適した担体は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版、この技術分野の標準的基準教本に記載されている。このような担体または希釈剤の好ましい例としては、それだけには限らないが、水、生理食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液および５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。リポソームおよび非水性ビヒクル、例えば、硬化油も使用できる。製薬上活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野では周知である。従来の媒体または薬剤はいずれも、活性化合物と不適合である場合を除き、組成物におけるその使用が考慮される。驚くべきことに、活性化合物もまた本組成物に組み込むことができる。
【００９２】
本発明の薬剤組成物は、その意図される投与経路と適合するよう製剤される。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内の、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（すなわち、局所）、経粘膜および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内または皮下適用に用いられる溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈液、例えば、注射水、生理食塩水、硬化油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート化剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；  酢酸、クエン酸またはリン酸などのバッファー、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張力を調整する薬剤。ｐＨは、酸または塩基、例えば、塩酸または水酸化ナトリウムを用いて調整できる。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製の、アンプル、ディスポーザブルシリンジまたは複数用量バイアルに封入できる。
【００９３】
注射用使用に適した薬剤組成物は、滅菌注射用溶液または分散物の即時調製のための、滅菌水溶液（水溶性である場合）または分散物と、滅菌散剤とを含む。静脈内投与には、適した担体として、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，  Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，  Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において、組成物は無菌でなくてはならず、容易な注射針通過性が存在するという点で液体であるべきである。製造および保存条件下で安定でなくてはならず、微生物、例えば細菌および真菌の汚染作用から守られなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）を含有する溶媒または分散媒、ならびにそれらの適した混合物であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆剤を用いることによって、分散物の場合には必要な粒径を維持することによって、界面活性剤を用いることによって維持できる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成できる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マニトール（ｍａｎｉｒｏｌ）、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによってもたらすことができる。
【００９４】
滅菌注射用溶液は、必要に応じて、必要な量の活性化合物（例えば、ＰＡＲＰ活性または発現を増強する物質）を、上記で列挙された成分のうちの１種またはその組合せとともに適当な溶媒中に組み込むことと、それに続いて、滅菌濾過することによって調製できる。一般に、分散物は、活性化合物を、基礎分散媒と、上記で列挙されたものから必要なその他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製する。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌散剤の場合には、調製方法は、事前に滅菌濾過したその溶液から有効成分およびいずれかのさらなる所望の成分の散剤を生成する真空乾燥および凍結乾燥である。
【００９５】
経口組成物は、通常、不活性希釈剤または食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセルに封入でき、または錠剤に打錠できる。経口治療投与の目的で、活性化合物を腑形剤とともに組み込み、錠剤、トローチ剤またはカプセル剤の形で使用できる。経口組成物はまた、マウスウォッシュとして用いるために液体担体を用いて調製でき、これでは、液体担体中の化合物を経口的に適用し、局所使用し、吐き出すか飲み込む。製薬上適合する結合剤および／またはアジュバント物質を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分のいずれか、または同様の性質の化合物を含み得る：結合剤、例えば、微晶質セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン；賦形剤、例えば、デンプンまたはラクトース、崩壊剤、例えば、アルギン酸、プリモゲルまたはコーンスターチ；滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステロート（Ｓｔｅｒｏｔｅ）；流動促進剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えば、スクロースまたはサッカリンあるいは矯味剤、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味料。
【００９６】
吸入による投与用には、本化合物は、適した噴射剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含む加圧型容器またはディスペンサーからの、または噴霧器からのエアゾールスプレーの形で送達される。
【００９７】
全身投与はまた、経粘膜または経皮手段によってであり得る。経粘膜または経皮投与用には、通過しようとする障壁に対して適当な浸透剤を製剤中に用いる。このような浸透剤は、一般に、当技術分野で公知であり、例えば、経粘膜投与用には、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は鼻腔用スプレーまたは坐剤の使用によって達成できる。経皮投与用には、活性化合物は、一般に、当技術分野で知られるような、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲルまたはクリームに製剤する。
【００９８】
本化合物はまた、直腸送達用の坐剤（例えば、ココアバターおよびその他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含む）または保留浣腸の形で調製できる。
【００９９】
一実施形態では、活性化合物は、身体からの迅速な排出から化合物を保護する担体、例えば、インプラントおよびマイクロカプセル型送達系をはじめとする放出制御製剤を用いて調製する。生分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用できる。このような製剤の調製方法は、当業者には明らかであろう。材料は、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．から商業的に得ることができる。また、リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を含む感染細胞を標的とするリポソームを含む）を、製薬上許容される担体として使用できる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載される当業者に公知の方法に従って調製できる。
【０１００】
投与が容易なようにおよび投与量の均一性のために、経口または非経口組成物を、単位投与形に製剤することは特に有利である。本明細書において単位投与形とは、治療される被験体のための単位投与量として適した物理的に分離した単位を指し、各単位は、必要な薬剤担体と関連して所望の治療効果を生じるよう算出された所定量の活性化合物を含む。本発明の単位投与形の仕様は、活性化合物の独特の特徴および達成されるべき特定の治療効果および個体の治療のためのこのような活性化合物の配合の技術分野に特有の制限によって決定され、それらに応じて直接的に変わる。
【０１０１】
薬剤組成物は、投与のための使用説明書とともに容器、パックまたはディスペンサーに含めることができる。
【実施例】
【０１０２】
本発明の種々の特徴をさらに例示するために、実施例を以下に提供する。実施例はまた、本発明を実施するための有用な方法論を例示する。これらの実施例は特許請求される本発明を制限するものではない。
【０１０３】
（実施例１：ＰＡＲＰスクリーニング）
（１．細胞死アッセイ）
示したように、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイによって、またはトリパンブルー排出によって細胞死を調べた。手短には、ＨｅＬａおよびＤＬＤ１細胞を、１０，０００個細胞／ウェルで９６ウェルプレートにプレーティングし、完全増殖培地で２４時間培養し、次いで、種々の濃度のβ−ラパコンで４時間処理した。ＭＴＴを終濃度０．５ｍｇ／ｍｌに添加し、１時間インキュベートし、続いて、５７０ｎｍでマイクロプレートリーダーを用いて細胞生存力を評価した。
【０１０４】
トリパンブルー排出アッセイには、ＨｅＬａおよびＤＬＤ１細胞を、６ウェルプレートにプレーティングし、同様に処理した。それらを回収し、細胞懸濁液にトリパンブルー色素溶液を添加した。血球計を用いて全細胞数および生存細胞数を調べた。ＰＡＲＰ阻害研究のためには、細胞をＰＡＲＰ阻害剤３−アミノベンズアミド（３−ＡＢ、５ｍＭ）で１時間前処理し、次いで、阻害剤およびβ−ラパコンでさらに４時間同時処理し、続いて、ＭＴＴアッセイまたはトリパンブルー染色を行った。
【０１０５】
ＮＡＤ＋補給実験のためには、ＭＣＦ７細胞を、１０，０００個細胞／ウェルという密度で９６ウェルプレートにプレーティングした。１６〜１８時間後、細胞を、５μＭの３−アミノベンズアミド、１０ｍＭ  ＮＡＤ＋またはビヒクル対照を用い、３７℃で１時間前処理した（すべての処理は増殖培地：１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中で策定された）。このインキュベーションの後、細胞（各プレインキュベーション処理下）を、示された濃度のβ−ラパコンを用いて、３７℃で４時間処理した。次いで、ＭＴＴアッセイを上記の通り実施した。
【０１０６】
（２．免疫蛍光解析）
ＰＡＲＰ活性実験のために、ＨｅＬａおよびＤＬＤ１細胞をカバースリップ上で増殖させた。種々の時点で４μＭのβ−ラパコンで処理した細胞をメタノールアセトン（７０／３０、ｖ／ｖ）を用い、−２０℃で１０分間固定した。カバースリップを風乾し、ＰＢＳ中、室温で１０分間再水和した。次いで、サンプルを、加湿チャンバー中で、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ、５％ＰＢＳ）中、室温で１０分間インキュベートした。細胞をモノクローナル抗ポリ（ＡＤＰ−リボース）抗体（１０Ｈ、１：１００希釈）とともに４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、細胞を、ＦＩＴＣ結合抗マウス抗体の１：５００希釈物とともに室温で１時間インキュベートした。ＰＡＲＰ阻害研究のためには、細胞をＰＡＲＰ阻害剤３−アミノベンズアミド（３−ＡＢ、５ｍＭ）とともに１時間前処理し、次いで、阻害剤およびβ−ラパコンでさらに１０分間同時処理し、続いて、免疫蛍光染色を行った。免疫蛍光はＣＣＤカメラを備えた免疫蛍光顕微鏡を用いて評価した。
【０１０７】
（３．ＮＡＤ枯渇アッセイ）
ＨｅＬａ細胞を６×１０５個細胞／ウェル（３５ｍｍ、６ウェルディッシュ）でプレーティングした。プレーティングの１８時間後、細胞を増殖培地（ＤＭＥＭ；１０％ＦＢＳ）においてβ−ラパコン（０、２、４または８μＭ）を用い、示した時間（１５、３０および６０分）処理した。薬物処理した後、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。その後、細胞を２００μＬのＮＡＤ溶解バッファー（６１ｍＭ  グリシル−グリシン、ｐＨ７．４、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）に溶解した。１６，０００ｇで１０分間の遠心分離によって細胞溶解産物を清澄化した。清澄化した溶解産物のアリコートを９６ウェルプレート（３連で２５μＬサンプル）に移し、ＮＡＤ＋濃度を調べた。
【０１０８】
溶解産物ＮＡＤレベルの決定は、Ｙｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ（ＰＮＡＳ，  ９８（２１）：１２２２７−３２（２００１））によって記載されたＮＡＤ再利用アッセイの改変を用いて実施した。手短には、ＮＡＤ反応混合物は、６１ｍＭ  Ｇｌｙ−Ｇｌｙバッファー（ｐＨ  ７．４）中、０．１ｍＭ  ３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、０．９ｍＭ  フェナジンメトスルファート、１３ユニット／ｍｌアルコール脱水素酵素（酵母抽出物由来、Ｓｉｇｍａ）、１００ｍＭ  ニコチンアミドおよび５．７％エタノールからなっていた。細胞溶解産物の各アリコートに、２００μＬの反応混合物を加えた。５分間の間、毎分、吸光度読み取り値（５６０ｎｍ）をとった。結果を、ＮＡＤ＋標準を用いて校正し、続いて、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイを用いて調べられたタンパク質濃度に対して標準化した。最後に、このデータを対照処理した細胞（１５分で０μＭ  β−ラパコン）に対して標準化し、残存する細胞ＮＡＤ＋レベルパーセントをプロットした。
【０１０９】
（４．ＰＡＲＰ活性測定法）
ＭＣＦ７細胞の１５ｃｍ（約８０％コンフルエント）ディッシュを削り取り、プロテアーゼ阻害剤を含有するＰＡＲＰバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）１．５ｍｌに入れることによって細胞抽出物を作製した。細胞懸濁液を、氷上で３０％振幅で３×１０秒バーストを用いて超音波処理した。続いて、４℃、１６，０００ｇで１０分間遠心分離することによって、細胞溶解産物を清澄化した。清澄化した溶解産物を、コットンパッドフィルターを含む５ｍｌのシリンジに通すことによって残存する不溶性の物質をいずれも除去した。抽出物のタンパク質濃度は、通常、０．６〜１．０μｇ／ｍｌの間であった。
【０１１０】
ＴＲＥＶＩＧＥＮ（商標）からのＰＡＲＰ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの改変を用いてＰＡＲＰ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を調べた。反応液は以下を含んでいた：約６０μｇの細胞タンパク質、１００μＭ  ＮＡＤ、１０μｇのヒストンＨ１、β−ラパコン（種々の濃度で）またはＤＭＳＯ対照、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０。反応液を室温で１０分間インキュベートし、９００μＬの冷２５％トリクロロ酢酸を添加することによって終結させた。終結させた反応液を氷上で１０分間インキュベートした。反応液を真空下でガラス繊維フィルターを通すことによって、ＴＣＡ沈殿させたタンパク質を単離した。続いて、フィルターを５ｍｌの５％  ＴＣＡで３回洗浄し、続いて冷エタノールで２回洗浄した。フィルターを乾燥させ、シンチレーションカクテルに移した。次いで、液体シンチレーション測定によって、ポリリボシル化タンパク質に組み込まれた３２Ｐ標識ＮＡＤの量を調べた。
【０１１１】
（実施例２：細胞死のβ−ラパコン誘導は、ＰＡＲＰ阻害剤３−アミノベンズアミドによって阻害される）
ＭＴＴアッセイにより、β−ラパコン誘導細胞死はＰＡＲＰ阻害剤３−アミノベンズアミド（３−ＡＢ）によって阻止されることが示された。ＨｅＬａおよびＤＬＤ１細胞を、１０，０００個細胞／ウェルで９６ウェルプレートにプレーティングし、完全増殖培地で２４時間培養し、ＰＡＲＰ阻害剤３−ＡＢ（５ｍＭ）または等容積のＤＭＳＯで１時間前処理し、次いで、さらに４時間種々の濃度のβ−ラパコンに曝露し、続いて、ＭＴＴアッセイを行った。
【０１１２】
図１に示されるように、ＨｅＬａ細胞生存パーセントはＨｅＬａ細胞では約５％から６０％に、ＤＬＤ１細胞では約７５％に上昇する。
【０１１３】
同様の結果が、トリパンブルー染色を用いて、ＨｅＬａ細胞（図２）およびＤＬＤ１細胞（図３）において示された。
【０１１４】
（実施例３：β−ラパコンは、ＰＡＲＰの迅速な細胞性活性化を誘導し、これは３−アミノベンズアミドによって阻止される）
β−ラパコンは、ＨｅＬａ細胞においてＰＡＲＰの迅速な活性化を誘導する。ＨｅＬａ細胞をカバースリップ上で２４時間増殖させ、次いで、種々の時点で４μＭ  β−ラパコンで処理し、メタノールアセトン（７０／３０、ｖ／ｖ）で１０分間固定した。サンプルを、加湿チャンバー中、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ中５％ＦＢＳ）中、室温で１０分間インキュベートした。細胞を、モノクローナル抗ポリ（ＡＤＰ−リボース）抗体（１０Ｈ  １：１００）とともに４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、細胞をＦＩＴＣ結合抗マウス抗体（１：１，０００）とともに室温で１時間インキュベートした。免疫蛍光をＣＣＤカメラを備えた免疫蛍光顕微鏡を用いて評価した。
【０１１５】
図４に示されるように、β−ラパコンは、ＰＡＲＰの産物と結合しているモノクローナル抗ポリ（ＡＤＰ−リボース）抗体の存在による蛍光を増大させ、このことは、β−ラパコンがＰＡＲＰの活性化を誘導したことを示す。
【０１１６】
ＨｅＬａ細胞におけるＰＡＲＰのβ−ラパコン誘導性活性化は、３−ＡＢによって阻止される。ＨｅＬａ細胞をカバースリップ上で２４時間増殖させ、５ｍＭのＰＡＲＰ阻害剤３−ＡＢまたはＤＭＳＯで１時間前処理し、次いで、４μＭ  β−ラパコンに１０分間曝露し、続いて、上記のように免疫蛍光染色を行った。
【０１１７】
図５に示されるように、ＨｅＬａ細胞におけるＰＡＲＰのβ−ラパコン誘導性活性化は、図４に見られたのと同様に、３−アミノベンズアミドによって阻害され、このことは、ＰＡＲＰ産物、ポリ（ＡＤＰ−リボース）が、ＰＡＲＰによって実際に生じ、その蓄積はＰＡＲＰ活性のβ−ラパコン活性化によって引き起こされるということを証明する。
【０１１８】
ＤＬＤ１細胞において、図５についての上記の方法を用いて同様の結果が見られた。これらの結果は図６に示されている。
【０１１９】
（実施例４：β−ラパコンは、細胞においてＮＡＤ＋枯渇を誘導し、これらの細胞へのＮＡＤ＋の再構成はβ−ラパコン誘導性細胞傷害性を低減する）
図７に示されるように、β−ラパコンは、細胞ＮＡＤ＋レベルの迅速な枯渇を誘導する。８μＭのβ−ラパコン処理は、ＮＡＤ＋レベルを１５分以内に対照の約２０％に低下させた。３０分までに、ＩＣ５０（約２．８μＭ）を超えるβ−ラパコン濃度は、細胞ＮＡＤ＋レベルを対照の５０％未満に低下させた。β−ラパコン媒介性ＮＡＤ＋枯渇の迅速な動力学は、この現象が酵素プロセスによるということを示唆する。さらに、このプロセスは化合物３−アミノベンズアミドによって阻害される（データは示していない）。これらのデータは一緒になって、ＰＡＲＰ活性がβ−ラパコン誘導性ＮＡＤ＋枯渇に関与していることを示唆する。
【０１２０】
図８に示されるように、細胞増殖培地へのＮＡＤ＋の外からの添加は、β−ラパコン処理の細胞傷害性を低減し得る（ＭＣＦ７細胞における、対照対ＮＡＤ＋補給の、それぞれ約２．７および約６．６μＭというＩＣ５０値）。外からのＮＡＤ＋の、β−ラパコン誘導性細胞傷害性から細胞を保護する能力は、この荷電分子の細胞取り込みによって制限される可能性が高い。同様の結果が、ＤＬＤ１、ＨｅＬａおよびＳＷ４８０細胞を用いる実験で観察された。これらの結果は、図７におけるものと一緒になって、細胞ＮＡＤ＋レベルの枯渇はβ−ラパコン誘導性細胞傷害性の寄与因子であるということを示唆する。
【０１２１】
（実施例５：β−ラパコンは細胞溶解産物においてＰＡＲＰの活性化を誘導する）
図９は、細胞溶解産物へのβ−ラパコンの添加が、基礎レベル（０μＭ  β−ラパコン対照）を上回るＰＡＲＰ活性の増強を誘導することを示す。さらに、このβ−ラパコンによるＰＡＲＰ活性化の誘導は、β−ラパコン濃度に依存していた（用量依存性）。この観察結果は、ＰＡＲＰファミリーメンバーがβ−ラパコンの直接標的であることを示すという点で重大である。
【０１２２】
（実施例６：ＤＬＤ１およびＳＷ−４８０細胞において、Ｅ２Ｆ１発現の誘導はアポトーシスを促進する）
Ｅ２Ｆ１誘導性アポトーシスを調べるために、誘導可能な系を確立した。変異ｐ５３遺伝子を有するヒト結腸癌細胞株を用いて、Ｅ２Ｆ１誘導性細胞株を作製した（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ，  ８７：７５５５−９（１９９０））。Ｅ２Ｆ１発現は効果的に誘導され、テトラサイクリンの添加によってしっかりと制御された（図１０Ａ）。テトラサイクリン誘導条件下で、相当なパーセンテージの、アポトーシスを起こしているＤＬＤ１細胞が、所与の時点で検出されることが（３日目に１０％、４日目に１５％）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色およびフローサイトメトリーによって調べられた（図１０Ｂ）。アポトーシスは、Ｅ２Ｆ１の発現後の形態変化をアッセイすることによってさらに確認された（図１０Ｃ）。同様のデータが、Ｅ２Ｆ１誘導性ＳＷ４８０ヒト結腸癌細胞において得られた。Ｅ２Ｆ１は、アポトーシス促進性機能に加え、細胞増殖にとって必須の転写因子である（Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：３４９−５２（１９９３）、Ｗｕ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４１４：４５７−６２（２００１））。これらの実験条件下では、細胞周期分布全体では有意な変化は観察されなかった。癌細胞のコロニー形成は、Ｅ２Ｆ１誘導によって完全に取り除かれ（図１０Ｄ）、このことは、Ｅ２Ｆ１のアポトーシス促進性機能および腫瘍サプレッサー機能と一致し（Ｙａｍａｓａｋｉ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ８５：５３７−４８（１９９６）、Ｆｉｅｌｄ，  Ｓ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ８５：５４９−６１（１９９６））、このことは、Ｅ２Ｆ１誘導性アポトーシスは癌遺伝子のアポトーシス促進性活性とは異なることを示唆する。
【０１２３】
（実施例７：Ｅ２Ｆ１はカスパーゼ依存性アポトーシスを活性化する）
Ｅ２Ｆ１誘導性アポトーシスの機構をさらに調べるために、カスパーゼ活性化の役割を調べた。２つの型のカスパーゼ−３、プロカスパーゼおよび切断されたカスパーゼをウエスタンブロット解析によって検出した。Ｅ２Ｆ１の発現後、細胞は明らかにアポトーシスを起こしたが、驚くべきことに、０〜７２時間のテトラサイクリン誘導後、および２４時間および４８時間の対照で、カスパーゼ−３、カスパーゼ依存性アポトーシスの最終エフェクターの活性化はなかった（図１０Ｅ）。さらに、Ｅ２Ｆ１誘導性の、ｐ５３非依存性アポトーシスが、パンカスパーゼ阻害剤を用いてカスパーゼ機能を阻害することによって影響を受けるかどうかを調べた。カンプトセシン、既知のカスパーゼ−３アクチベーターによって誘導されたアポトーシスを、陽性対照として用いた。５０μＭのパンカスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤの添加は、カンプトセシン誘導性アポトーシスを阻止したが、Ｅ２Ｆ１誘導性アポトーシスは阻止できなかった（図１０Ｆ）。Ｚ−ＶＡＤ添加単独には、細胞傷害性作用が全くなかった。これらの結果は、Ｅ２Ｆ１はｐ５３変異癌細胞においてカスパーゼ非依存性細胞死経路を誘導するということを示唆する。
【０１２４】
ＰＡＲＰ−１の活性化は、カスパーゼ非依存性アポトーシスと関係があるとされている。Ｅ２Ｆ１誘導性細胞死がＰＡＲＰ−１活性化を含むかどうかを調べた。ポリＡＤＰリボシル化（ＰＡＲ）、ＰＡＲＰ−１活性化の機能的指標を、特異的抗ＰＡＲ抗体を用いてイムノブロットによって検出した。図１１Ａに示されるように、Ｅ２Ｆ１は、タンパク質のポリＡＤＰリボシル化を強力に活性化した。ＰＡＲの免疫細胞化学的染色により、ＰＡＲＰ−１の活性をさらに確認した（図１１Ｂ）。核ＰＡＲ染色は、Ｅ２Ｆ１の発現後、２４時間増大し、４８時間でプラトーに達した。ポリＡＤＰリボシル化が、Ｅ２Ｆ１誘導性アポトーシスにおいて因果的役割を果たすかどうかを調べるために、３’−アミノベンズアミド（３’−ＡＢ）、ＰＡＲＰ活性の普遍的阻害剤を用いた。図１１Ｃに示されるように、３’−ＡＢは、５ｍＭという濃度で、Ｅ２Ｆ１誘導性アポトーシスを７０％より多く阻害した（Ｐ＜０．０００１）。３’−ＡＢ添加単独は、対照群全体でアポトーシスに対して効果を示さなかった。これらのデータは、Ｅ２Ｆ１が、カスパーゼ非依存性アポトーシスに寄与する、タンパク質ポリＡＤＰリボシル化を活性化することを示唆する。
【０１２５】
（実施例８：Ｅ２ＦはＰＡＲＰのタンパク質発現に影響を及ぼす）
タンパク質ポリＡＤＰリボシル化は、１８種の遺伝子からなるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼファミリーのメンバーによって触媒される（Ａｍｅ，  Ｊ．  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２６：８８２−９３（２００４））。ＰＡＲＰ−１タンパク質は、ほとんどの細胞において優性のメンバーであり、ＤＮＡ損傷によって誘導されるポリＡＤＰリボシル化全体の大部分を導く（Ｄａｖｉｄｏｖｉｃ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２６８：７−１３（２００１））。ＰＡＲＰファミリーのどのメンバーがＥ２Ｆ１誘導性アポトーシスに関与したかを識別するために、ｓｉＲＮＡ技術を用いてＰＡＲＰ−１タンパク質レベルを低下させた。化学合成したＰＡＲＰ−１  ｓｉＲＮＡプールをＤＬＤ１−Ｅ２Ｆ１誘導性細胞株にエレクトロポレーションした。ＰＡＲＰ−１タンパク質は２日で減少し始め、４日で最低レベルに達し、６日から徐々に回復したことが、ウエスタンブロット（図１２Ａ）および免疫細胞化学的染色によって示された。Ｅ２Ｆ１の発現後、ＰＡＲＰの核蓄積は、ｓｉＰＡＲＰ−１のトランスフェクションによって抑制され（図１２Ｂ）、このことはＥ２Ｆ１誘導性ＰＡＲＰ活性はＰＡＲＰ−１によって媒介されるということを示唆する。Ｅ２Ｆ１誘導性アポトーシスは、ＰＡＲＰ−１ノックダウン後に損なわれた（Ｐ＜０．００１）（図１２Ｃ）。これらのデータは一緒になって、Ｅ２Ｆ１はカスパーゼ非依存性アポトーシス経路を活性化するのにＰＡＲＰ−１およびその活性を必要とするということを示唆する。
【０１２６】
Ｅ２Ｆ１は転写因子として知られている。しかし、いくつかの系列の証拠が、Ｅ２Ｆ１の転写活性はそのアポトーシス機能にとって重要でないということを示唆している（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，  Ａ．  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １１：１８５３−６３（１９９７）；  Ｈｓｉｅｈ，  Ｊ．  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １１：１８４０−５２（１９９７））。次に、Ｅ２Ｆ１がＰＡＲＰ−１の転写に影響を及ぼすかどうかを調べた。Ｅ２Ｆ１の発現は、ＰＡＲＰ−１タンパク質レベルを大幅に増大させ（図１２Ｄ）、このことは、Ｅ２Ｆ１は、ＰＡＲＰ−１のトランス活性化によってＰＡＲＰ−１発現を誘導したという可能性を示唆する。しかし、ＲＴ−ＰＣＲおよびノーザンブロット解析は、Ｅ２Ｆｌ誘導性ＰＡＲＰ−１タンパク質上昇は、ｍＲＮＡレベルではなくタンパク質レベルで起こることを示した（図１２Ｅ、図１２Ｆ）。これらの結果は、Ｅ２Ｆ１は、ＰＡＲＰ−１を非転写機構を介して誘導するということを示唆する。
【０１２７】
内因性Ｅ２Ｆ１がＰＡＲＰ−１タンパク質レベルに影響を及ぼすかどうかを調べるために、非誘導系においてＥ２Ｆ１をサイレンシングした。ｓｉＲＮＡを用いたサイレンシングＥ２Ｆ１は、内因性ＰＡＲＰ−１タンパク質レベルを低下させたが、サイレンシングＰＡＲＰ−１はＥ２Ｆ１タンパク質レベルに対して何の効果もなく（図１３）、このことは、ＰＡＲＰ−１タンパク質レベルの調節におけるＥ２Ｆ１の役割を示唆する。
【０１２８】
（実施例９：Ｅ２Ｆ１は、ＰＡＲＰ依存的にＡＩＦの転位置を誘導することによってアポトーシスを媒介する）
ミトコンドリアから核へのアポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）の転位置は、ＰＡＲＰ−１によって誘導されるアポトーシスに関係があるとされている（Ｙｕ，  Ｓ．  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：２５９−６３（２００２）、Ｄａｖｉｄｏｖｉｃ，  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２６８：７−１３（２００１））。次に、ＰＡＲＰ−１タンパク質レベルのＥ２Ｆ１媒介性増大がＡＩＦ転位置の誘因となるかどうかを調べた。Ｅ２Ｆ１の発現は、ミトコンドリアからのＡＩＦおよびシトクロムｃ放出およびＡＩＦの核への転位置をもたらした（図１４Ａ、図１４Ｂ）。Ｅ２Ｆ１誘導性ＡＩＦ転位置がＰＡＲＰ−１によって主に媒介されるかどうかを調べるために、ｓｉＲＮＡを用いてＰＡＲＰ−１タンパク質レベルを低下させた。Ｅ２Ｆ１誘導は、対照ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされた細胞においてＡＩＦの核転位置を駆動したが、特異的ｓｉＲＮＡを用いたサイレンシングＰＡＲＰ−１はＡＩＦのＥ２Ｆ１誘導性核転位置を阻止した（図１４Ｃ、図１４Ｄ）。これらの結果は、Ｅ２Ｆ１−ＰＡＲＰ−１アポトーシス経路はＡＩＦ転位置を含むことを示唆する。
【０１２９】
Ｅ２Ｆ１は、Ｅ２Ｆ１の転写依存性アポトーシス経路に寄与するアポトーシス遺伝子、特に、ｐ７３およびａｐａｆ１を転写によって調節することがわかっている（Ｉｒｗｉｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：６４５−８（２０００）、Ｆｕｒｕｋａｗａ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：３９７６０−８（２００２））。ｐ７３は、ｐ５３非依存性アポトーシス経路におけるＥ２Ｆ１の標的遺伝子であることがわかった。ｐ７３  ｍＲＮＡは、Ｅ２Ｆ１発現後にわずかに誘導されたことが、ＲＴ−ＰＣＲによって検出された（図１５）が、ｓｉＲＮＡによるｐ７３の効果的なノックダウンは、Ｅ２Ｆ１誘導性アポトーシスに対して保護効果を全く示さなかった。Ｅ２Ｆ１は、ａｐａｆ１の転写を誘導することもわかっている（Ｆｕｒｕｋａｗａ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７，  ３９７６０−８（２００２））。しかし、ＲＴ−ＰＣＲデータは、Ｅ２Ｆ１誘導性細胞においてａｐａｆ１の発現変化を全く示さなかった（図１５）。ｐ７３およびａｐａｆ１の大幅な誘導がない理由は明らかではないが、Ｅ２Ｆ１レベル、期間の相違、およびＰＡＲＰ−１誘導による相対的に迅速な細胞死による可能性がある。
【０１３０】
一実施形態では、ＰＡＲＰ発現またはＰＡＲＰ活性の調節および結果として生じるアポトーシスの調節は、Ｅ２Ｆ発現または活性の調節を介して起こる。好ましい実施形態では、Ｅ２ＦはＥ２Ｆ１である。Ｅ２Ｆ１−ＰＡＲＰ−１細胞死経路は、チェックポイントレギュレーターとアポトーシスの間のｐ５３非依存性関連を提供する。Ｅ２Ｆ１はＡＴＭおよびＣｈｋ２によってリン酸化され、これがＥ２Ｆ１の安定化を導く（Ｌｉｎ，  Ｗ．  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １５：１８３３−４４（２００１）、Ｂａｒｔｅｋ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２：８７７−８６（２００１））。反対に、Ｅ２Ｆ１は、ＡＴＭおよびＣｈｋ２キナーゼを活性化し、それによって正のフィードバックループを形成する（Ｒｏｇｏｆｆ，  Ｈ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２４：２９６８−７７（２００４）、Ｂｅｒｋｏｖｉｃｈ，  Ｅ．  ＆  Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，  Ｄ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：１６１−７（２００３））。癌遺伝子シグナルまたはＤＮＡ損傷によるＡＴＭ−Ｃｈｋ２活性化の存在が、侵襲の規模に応じて、Ｅ２Ｆ１−ＰＡＲＰ−１経路の活性化を導く可能性があり、これがアポトーシス、ＤＮＡ修復または細胞周期停止を導く場合があり、これが腫瘍形成の予防において重要な機能を果たす可能性があるということが推測される。この経路は、Ｅ２Ｆ１の観察されている腫瘍サプレッサー機能の根底にあるものであり得る（Ｙａｍａｓａｋｉ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ８５：５３７−４８（１９９６）、Ｆｉｅｌｄ，  Ｓ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ８５：５４９−６１（１９９６））。
【０１３１】
Ｅ２Ｆ１とＰＡＲＰ−１間の相互作用は、細胞周期調節とゲノムサーベイランス間の新規関連を確立する。結果は、ＰＡＲＰ−１タンパク質の内因性レベルは、Ｅ２Ｆ１に応じて変わることを示唆する。ＰＡＲＰ−１はＥ２Ｆ１の転写活性を増強することが示唆されている（Ｓｉｍｂｕｌａｎ−Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，  Ｃ．  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：５０１５−２３（１９９９）、Ｓｉｍｂｕｌａｎ−Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，  Ｃ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：８４６０−７１（２００３））。これらの観察結果は、ゲノムサーベイランスと細胞周期調節の間の正のフィードバックループを示唆する。これらのフィードバック相互作用は、回復不能なＤＮＡ損傷を有する細胞の増殖を阻止し、それらの排出を促進する高度に感受性の機構を提供し得る。
【０１３２】
ヒト癌においてＥ２Ｆ１およびＰＡＲＰ−１の変異がないことは、化学療法の抗癌活性の媒介におけるこのチェックポイント−アポトーシス経路の重要性を示唆し、このことは、癌、例えば、ｐ５３経路に変異を有するものに対する有効な新規治療を開発するためのこのチェックポイント経路の活性化の可能性を提供する。
【０１３３】
その他の実施形態は、特許請求の範囲内にある。いくつかの実施形態が示され、説明されているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく種々の改変を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】図１Ａは、３−アミノベンズアミドを伴うか伴わない、種々の濃度のβ−ラパコンにおけるＨｅＬａ細胞の生存パーセントを示すグラフである。図１Ｂは、３−アミノベンズアミドを伴うか伴わない、種々の濃度のβ−ラパコンにおけるＤＬＤ１細胞の生存パーセントを示すグラフである。
【図２】図２は、３−アミノベンズアミドを伴うか伴わない、種々の濃度のβ−ラパコンにおけるＨｅＬａ細胞のトリパンブルー染色の一連の光学顕微鏡写真を示す図である。
【図３】図３は、３−アミノベンズアミドを伴うか伴わない、種々の濃度のβ−ラパコンにおけるＤＬＤ１細胞のトリパンブルー染色の一連の光学顕微鏡写真を示す図である。
【図４】図４Ａは、ＤＭＳＯで処理した（対照）ＨｅＬａ細胞での抗ポリ（ＡＤＰ−リボース）抗体の蛍光顕微鏡写真を示す図である。図４Ｂは、４μＭのβ−ラパコンで５分間処理したＨｅＬａ細胞での抗ポリ（ＡＤＰ−リボース）抗体の蛍光顕微鏡写真を示す図である。図４Ｃは、４μＭのβ−ラパコンで１０分間処理したＨｅＬａ細胞での抗ポリ（ＡＤＰ−リボース）抗体の蛍光顕微鏡写真を示す図である。図４Ｄは、４μＭのβ−ラパコンで２０分間処理したＨｅＬａ細胞での抗ポリ（ＡＤＰ−リボース）抗体の蛍光顕微鏡写真を示す図である。図４Ｅは、４μＭのβ−ラパコンで３０分間処理したＨｅＬａ細胞での抗ポリ（ＡＤＰ−リボース）抗体の蛍光顕微鏡写真を示す図である。図４Ｆは、４μＭのβ−ラパコンで１時間処理したＨｅＬａ細胞での抗ポリ（ＡＤＰ−リボース）抗体の蛍光顕微鏡写真を示す図である。図４Ｇは、４μＭのβ−ラパコンで２時間処理したＨｅＬａ細胞での抗ポリ（ＡＤＰ−リボース）抗体の蛍光顕微鏡写真を示す図である。
【図５】図５Ａは、ＤＭＳＯで処理した（対照）ＨｅＬａ細胞での抗ポリ（ＡＤＰ−リボース）抗体の蛍光顕微鏡写真を示す図である。図５Ｂは、４μＭのβ−ラパコンで１０分間処理したＨｅＬａ細胞での抗ポリ（ＡＤＰ−リボース）抗体の蛍光顕微鏡写真を示す図である。図５Ｃは、４μＭのβ−ラパコンおよび５ｍＭの３−アミノベンズアミドで１０分間処理したＨｅＬａ細胞での抗ポリ（ＡＤＰ−リボース）抗体の蛍光顕微鏡写真を示す図である。
【図６】図６Ａは、ＤＭＳＯで処理した（対照）ＤＬＤ１細胞での抗ポリ（ＡＤＰ−リボース）抗体の蛍光顕微鏡写真を示す図である。図６Ｂは、４μＭのβ−ラパコンで１０分間処理したＤＬＤ１細胞での抗ポリ（ＡＤＰ−リボース）抗体の蛍光顕微鏡写真を示す図である。図６Ｃは、４μＭのβ−ラパコンおよび５ｍＭの３−アミノベンズアミドで１０分間処理したＤＬＤ１細胞での抗ポリ（ＡＤＰ−リボース）抗体の蛍光顕微鏡写真を示す図である。
【図７】図７は、種々の濃度のβ−ラパコンで処理したＤＬＤ１細胞中に残存する細胞ＮＡＤ＋のパーセントを示すグラフである。
【図８】図８は、ＮＡＤ＋を外から添加したか添加していない、種々の濃度のβ−ラパコンで処理したＤＬＤ１細胞の生存パーセントを示すグラフである。
【図９】図９は、ＤＬＤ１細胞から得た細胞溶解産物における、種々の濃度のβ−ラパコンにおけるＰＡＲＰ活性の活性化倍数を示すグラフである。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ｐ５３欠損であり、外因性Ｅ２Ｆ１遺伝子と機能しうる形で連結されたテトラサイクリン誘導プロモーターでトランスフェクトされたヒト結腸癌細胞株（ＤＬＤｌ）におけるＥ２Ｆ１のウエスタンブロットを示す図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、テトラサイクリンとともに３日間および４日間インキュベートされたＥ２Ｆ１  ｔｅｔ誘導性ＤＬＤ１細胞のフローサイトメトリーデータを示す図である。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、テトラサイクリンとともに３日間および４日間インキュベートされたＥ２Ｆ１  ｔｅｔ誘導性ＤＬＤ１細胞の光学顕微鏡写真である。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、Ｅ２Ｆ１  ｔｅｔ誘導性ＤＬＤ１細胞を用いたコロニー形成アッセイの写真である。
【図１０Ｅ】図１０Ｅは、種々の期間の間テトラサイクリンを用いた、Ｅ２Ｆ１  ｔｅｔ誘導性ＤＬＤ１細胞におけるカスパーゼ−３のウエスタンブロットを示す図である。
【図１０Ｆ】図１０Ｆは、５０μＭのパンカスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤおよびテトラサイクリンとともにインキュベートした場合のＥ２Ｆ１  ｔｅｔ誘導性ＤＬＤ１細胞のアポトーシスパーセントを示す棒グラフである。
【図１１Ａ】図１１Ａは、テトラサイクリンのインキュベーションが異なる、Ｅ２Ｆ１  ｔｅｔ誘導性ＤＬＤ１細胞におけるＰＡＲのイムノブロット示す図である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＰＡＲおよびＤＡＰＩについて染色した、Ｅ２Ｆ１  ｔｅｔ誘導性ＤＬＤ１細胞の光学顕微鏡写真である。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、３’−アミノベンズアミドおよびテトラサイクリンとともにインキュベートした場合の、Ｅ２Ｆ１  ｔｅｔ誘導性ＤＬＤ１細胞におけるアポトーシスパーセントを示す棒グラフである。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ＰＡＲＰ−１  ｓｉＲＮＡに曝露されたＥ２Ｆ１  ｔｅｔ誘導性ＤＬＤ１細胞におけるＰＡＲＰのウエスタンブロットを示す図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ＤＡＰＩ染色と比較したＰＡＲの免疫局在性を示すＥ２Ｆ１  ｔｅｔ誘導性ＤＬＤ１細胞の一連の光学顕微鏡写真である。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、ＰＡＲＰ  ｓｉＲＮＡおよびテトラサイクリンとともにインキュベートした場合の、Ｅ２Ｆ１  ｔｅｔ誘導性ＤＬＤ１細胞のアポトーシスパーセントを示す棒グラフである。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、テトラサイクリンとともに種々の期間インキュベートしたｔｅｔ誘導性ＤＬＤ１細胞における、ＰＡＲＰ、Ｅ２Ｆ１およびアクチンのウエスタンブロットを示す図である。
【図１２Ｅ】図１２Ｅは、ｔｅｔ誘導性ＤＬＤ１細胞における、ＰＡＲＰ、Ｅ２Ｆ１およびアクチンのＲＴ−ＰＣＲを示す図である。
【図１２Ｆ】図１２Ｆは、テトラサイクリンとともに種々の期間インキュベートしたｔｅｔ誘導性ＤＬＤ１細胞における、ＰＡＲＰ、Ｅ２Ｆ１およびアクチンのノーザンブロットを示す図である。
【図１３】図１３は、Ｅ２Ｆ１およびＰＡＲＰ１のｓｉＲＮＡとともにインキュベートしたｔｅｔ誘導性ＤＬＤ１細胞における、ＰＡＲＰ、Ｅ２Ｆ１およびアクチンのウエスタンブロットを示す図である。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ＤＡＰＩ染色およびＰＡＲＰ−１活性化と比較した、シトクロムｃの免疫局在性を示すＥ２Ｆ１  ｔｅｔ誘導性ＤＬＤ１細胞の一連の光学顕微鏡写真である。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ＤＡＰＩ染色およびＰＡＲＰ−１活性化と比較した、ＡＩＦの免疫局在性を示すＥ２Ｆ１  ｔｅｔ誘導性ＤＬＤ１細胞の一連の光学顕微鏡写真である。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、ＤＡＰＩ染色および対照ｓｉＲＮＡと比較した、ＡＩＦの免疫局在性を示すＥ２Ｆ１  ｔｅｔ誘導性ＤＬＤ１細胞の一連の光学顕微鏡写真である。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、ＤＡＰＩ染色およびＰＡＲＰ−１  ｓｉＲＮＡと比較した、ＡＩＦの免疫局在性を示すＥ２Ｆ１  ｔｅｔ誘導性ＤＬＤ１細胞の一連の光学顕微鏡写真である。
【図１５】図１５は、テトラサイクリンとともに種々の期間インキュベートしたＥ２Ｆ１  ｔｅｔ誘導性ＤＬＤ１細胞における、Ａｔｍ、Ｐ７３およびＡｐａｆ−１のノーザンブロットを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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