(57)【要約】  本発明は、一般に、ジアシルグリセロール・アシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）の生物学的活性の測定方法を提供する。具体的には、本発明は、ＤＧＡＴの生物学的活性を調節することができる化合物の迅速、大量スクリーニングのための方法を提供する。より具体的には、本発明は、ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（ＴＭ）技術とともに特定のミセル（ｍｉｃｅｌｌ）の使用に基づくＤＧＡＴ活性を測定するためのアッセイ系を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＧＡＴ活性を測定する方法であって、少なくとも１種のＤＧＡＴ基質を含んでなるミセルをミクロソームを含んでなるＤＧＡＴと接触させ、そしてこのようにして得られた反応混合液におけるトリグリセリドの生成を決定することを含んでなる、上記方法。
【請求項２】
ＤＧＡＴ基質を含んでなるミセルが、
−ホスファチジルセリンまたはホスファチジルコリンを含んでなるミセル；
−ホスファチジルセリンおよびホスファチジルコリンを含んでなるミセル；または
−ホスファチジルセリンおよびホスファチジルコリンを重量比で１：１において含んでなるミセル：
から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
反応混合液がさらにコエンザイムＡ活性化脂肪酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
コエンザイムＡ活性化脂肪酸が、パルミトイル−ＣｏＡまたはオレオイル−ＣｏＡから選ばれる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該コエンザイムＡ活性化脂肪酸の一部が検出可能に標識されている、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
該コエンザイムＡ活性化脂肪酸の一部が放射能標識されている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
コエンザイムＡ活性化脂肪酸がオレオイル−ＣｏＡであり、そして該オレオイル−ＣｏＡの一部が［３Ｈ］−オレオイルＣｏＡである、請求項３〜６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
ＤＧＡＴ基質が、ステアロイル−２−アラキドニル−ｓｎ−グリセロールまたは１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロールからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ミクロソームを含んでなるＤＧＡＴが、ヒトＤＧＡＴ１（配列番号：２）タンパク質を発現する昆虫細胞の膜調製物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
トリグリセリドの生成が、シンチレートする固体支持媒体を用いて決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
試験化合物がＤＧＡＴ活性を調節することができるか否かを検証する方法であって、試験化合物の存在および不在下で、少なくとも１種のＤＧＡＴ基質を含んでなるミセルをミクロソームを含んでなるＤＧＡＴと接触させ、そしてこのようにして得られた反応混合液におけるトリグリセリドの生成を決定することを含んでなり、そしてここで、試験化合物の存在下でのトリグリセリド生成における変化が、該化合物がＤＧＡＴ活性を調節することができることを示す、上記方法。
【請求項１２】
ＤＧＡＴ基質を含んでなるミセルが、
−ホスファチジルセリンまたはホスファチジルコリンを含んでなるミセル；
−ホスファチジルセリンおよびホスファチジルコリンを含んでなるミセル；
−ホスファチジルセリン濃度以下かまたはそれに等しいホスファチジルコリン濃度を含んでなるミセル；
−ホスファチジルセリンおよびホスファチジルコリンを３：１のモル比で含んでなるミセ
ル；
−ホスファチジルセリンおよびホスファチジルコリンを３．５：１．３のモル比で含んでなるミセル：
から選ばれる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
反応混合液がさらにコエンザイムＡ活性化脂肪酸を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
コエンザイムＡ活性化脂肪酸が、パルミトイル−ＣｏＡまたはオレオイル−ＣｏＡから選ばれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該コエンザイムＡ活性化脂肪酸の一部が検出可能に標識されている、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
該コエンザイムＡ活性化脂肪酸の一部が放射能標識されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
コエンザイムＡ活性化脂肪酸がオレオイル−ＣｏＡであり、そして該オレオイル−ＣｏＡの一部が［３Ｈ］−オレオイルＣｏＡである、請求項１３〜１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
ＤＧＡＴ基質が、ステアロイル−２−アラキドニル−ｓｎ−グリセロールまたは１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロールからなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
ミクロソームを含んでなるＤＧＡＴが、ヒトＤＧＡＴ１（配列番号：２）タンパク質を発現する昆虫細胞の膜調製物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
トリグリセリドの生成が、シンチレートする固体支持媒体を用いて決定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
病因がＤＧＡＴ酵素の作用を特徴とする疾病、特に、肥満症および高トリアシルグリセロールに関連する疾病を処置する方法であって、請求項１１〜２０のいずれか１つに記載の方法を使用して同定された化合物の治療学的に有効な量を、それを必要とする被験者に投与することを含んでなる、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、ジアシルグリセロール・アシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）の生物学的活性の測定方法を提供する。具体的には、本発明は、ＤＧＡＴの生物学的活性を調節することができる化合物の迅速、大量スクリーニングのための方法を提供する。より具体的には、本発明は、ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（ＴＭ）技術とともに特定のミセル（ｍｉｃｅｌｌ）の使用に基づくＤＧＡＴ活性を測定するためのアッセイ系を提供する。
【背景技術】
【０００２】
トリグリセリドは真核生物によって蓄えられるエネルギーの主要形態物を表す。トリグリセリド代謝における障害または不均衡は、肥満症、インスリン抵抗性症候群およびＩＩ型糖尿病、非アルコール性脂肪肝病および冠状動脈性心臓病の病因ならびにそれらの危険性の増大に係わっている（非特許文献１および非特許文献２、参照）。
さらに、高トリグリセリド血症は、しばしば、がん治療の好ましくない結末である（非特許文献３参照）。
【０００３】
トリグリセリドの合成における重要な酵素は、アシルＣｏＡ：ジアシルグリセロール・アシルトランスフェラーゼ、またはＤＧＡＴである。ＤＧＡＴは、哺乳動物組織において広範に発現され、そして小胞体において１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）と脂肪アシルＣｏＡの結合を触媒してトリグリセリド（ＴＧ）を生成するミクロソームの酵素である（非特許文献４および非特許文献５において概説されている）。ＤＧＡＴが、トリグリセリド合成のための２つの主経路、グリセロールリン酸およびモノアシルグリセロール経路におけるジアシルグリセロールのトリグリセリドへのアシル化の最終段階の触媒作用を独特に制御するということが最初に考えられた。トリグリセリドは生存のためには必須であると考えられ、そしてそれらの合成は単一のメカニズムを通して生じると考えられたので、ＤＧＡＴの活性を阻害することによるトリグリセリド合成の阻害が大規模に探求されることはなかった。
【０００４】
マウスのＤＧＡＴ１をコードしている遺伝子および関連するヒトの同族体ＡＲＧＰ１とＡＲＧＰ２が、今日クローン化され、そして特性決定されている（非特許文献６；非特許文献７）。マウスＤＧＡＴ１の遺伝子は、ＤＧＡＴノックアウトマウスを創製してＤＧＡＴ遺伝子の機能をより良く解明するために使用された。
予期せぬことに、機能的なＤＧＡＴ酵素を発現することが不可能なマウス（Ｄｇａｔ−ｌ−マウス）が生存可能であり、そしてなお、トリグリセリドを合成することができるので、このことは、多数の触媒機構がトリグリセリド合成に寄与することを示している（非特許文献８）。トリグリセリド合成を触媒する他の酵素、例えばＤＧＡＴ２およびジアシルグリセロール・トランスアシラーゼもまた、同定されている（非特許文献９および非特許文献１０）。マウスにおける遺伝子ノックアウトの研究は、ＤＧＡＴ２が哺乳動物のトリグリセリド合成において基礎的な役割を演じており、そして生存のために必要であることを明らかにした。ＤＧＡＴ２欠失マウスは脂肪欠乏症となり、そして明らかに、エネルギー代謝のための基質における顕著な減少と皮膚における浸透性バリアー機能の損傷のために、誕生後まもなく死亡する（非特許文献１１）。
【０００５】
重要なことは、Ｄｇａｔ−ｌ−マウスは、食餌に誘導される肥満症に抵抗性があり、そして痩せたままである。高脂肪食（２１％脂肪）を食した場合でさえ、Ｄｇａｔ−ｌ−マウスは通常の食餌（４％脂肪）を食したマウスに匹敵する体重を維持し、そして比較的低い総身体トリグリセリドレベルを有する。Ｄｇａｔ−ｌ−マウスにおける肥満抵抗性は、減少したカロリー摂取によるものではなく、増大したエネルギー消費およびインスリンと
レプチンに対する減少した抵抗性の結果である（非特許文献８；非特許文献４および非特許文献１２）。さらに、Ｄｇａｔ−ｌ−マウスはトリグリセリドの低下した吸収率を有する（非特許文献１３）。改善されたトリグリセリド代謝に加えて、Ｄｇａｔ−ｌ−マウスはまた、野生型マウスに比較して、グルコース負荷後に、より低いグルコースとインスリンレベルとともに改善されたグルコース代謝を有する（非特許文献４）。
【０００６】
多数の酵素がジアシルグリセロールからのトリグリセリドの合成を触媒することに寄与してするという発見は意味のあることである、何故ならば、それは、この生物化学反応の１つの触媒メカニズムを調節して、最少の好ましくない副作用により治療成績を達成する機会を与えるからである。例えば、ＤＧＡＴ１のヒト同族体の活性を特異的に阻害することによって、トリグリセリドへのジアシルグリセロールの変換を阻害する化合物は、肥満症、インスリン抵抗性症候群および明白なＩＩ型糖尿病、うっ血性心不全およびアテローム性動脈硬化症におけるトリグリセリドの異常代謝によって惹起される病因的影響ならびにがん治療の結末としての病因的影響を治療学的に克服するために、トリグリセリドの体濃度および吸収を低下させることに用途を見いだすことができる。
【０００７】
世界中の社会において肥満症、ＩＩ型糖尿病、心臓病およびがんの普及が絶えず増大しつつあるので、これらの疾病を効果的に処置および予防するために、新しい療法を開発する逼迫した必要性が存在する。したがって、ＤＧＡＴの活性を強力かつ特異的に阻害することができる化合物を開発することに関心がある。しかしながら、特異的なＤＧＡＴ阻害剤の単離のための大量スクリーニングは、そのようなアッセイの確立に関連する技術的困難のために、これまで確立されていなかった。
【０００８】
慣用のＤＧＡＴアッセイは、ＴＧ  ｐｍｏｌｅ／ｍｉｎ／ミクロソームタンパク質ｍｇの次数において低い活性を有し、そして数種の他の酵素反応の生成物によって汚染される。さらにまた、ＤＧＡＴ触媒反応の生成物は、通常ＴＬＣ分析（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）によるか、または扱いにくい有機溶媒抽出操作（非特許文献１７）を用いることによって解明される。抽出操作および低処理量のＴＬＣ分析に伴われる多数の段階があっても、現在利用できるＤＧＡＴアッセイのいずれも、高処理量スクリーニング型式では有用ではない。
【０００９】
利用可能なＤＧＡＴアッセイを改良する最初の努力では、Ｒａｍｈａｒａｃｋ  Ｒ．Ｒ．およびＳｐａｈｒＭ．Ａ．（特許文献１および特許文献２）は、アセトンおよびクロロホルムの組み合わせ物を含む溶媒系を使用することによってこの操作を変えた。そのような溶媒系を用いれば、通常の抽出操作は１段階抽出操作に単純化することができる。しかしながら、本発明の目的は、時間を費やす抽出段階の必要性を除くことによって高処理量スクリーニングに一層適する操作になるようアッセイをさらに単純化し、そして単一ウエル型式において実施できるアッセイを提供することである。
【特許文献１】ＥＰ  １  ２１９  ７１６
【特許文献２】ＵＳ  ２００２／０１２７６２７
【非特許文献１】Ｌｅｗｉｓ，ｅｔ  ａｌ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（２００２）２３：２０１
【非特許文献２】Ｍａｌｌｏｙ  ａｎｄ  Ｋａｎｅ，Ａｄｖ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ（２００１）４７：１１１
【非特許文献３】Ｂａｓｔ，ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５ｔｈ  Ｅｄ．，（２０００）Ｂ．Ｃ．Ｄｅｃｋｅｒ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｏｎｔａｒｉｏ，ＣＡ
【非特許文献４】Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｆａｒｅｓｅ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｍｅｄ（２０００）１０：１８８
【非特許文献５】Ｆａｒｅｓｅ，ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｌｉｐｉｄｏｌ（２０００）１１：２２９
【非特許文献６】Ｃａｓｅｓ，ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  ｓｃｉ（１９９８）９５：１３０１８
【非特許文献７】Ｏｅｌｋｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９８）２７３：２６７６５
【非特許文献８】Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０００）２５：８７
【非特許文献９】Ｂｕｈｍａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，前出
【非特許文献１０】Ｃａｓｅｓ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２００１）２７６：３８８７０
【非特許文献１１】Ｆａｒｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ，ＪＢＣ（２００４）２７９：１１７６７
【非特許文献１２】Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ（２００２）１０９：１０４９
【非特許文献１３】Ｂｕｈｍａｎ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２００２）２７７：２５４７４
【非特許文献１４】Ｃａｓｅｓ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ（１９９８）９５：１３０１８
【非特許文献１５】Ｃｈｅｎｇ  Ｄ．，ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．（２００１）３５９：７０７
【非特許文献１６】Ｅｒｉｃｋｓｏｎ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．（１９８０）２１：９３０
【非特許文献１７】Ｃｏｌｅｍａｎ  Ｒ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９９２）２０９：９８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記のように、本発明は、ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（ＴＭ）技術とともに特定のミセルの使用に基づく、化合物の迅速、大量のスクリーニングを可能にするように具体的に適合されたＤＧＡＴアッセイに関する。
【００１１】
したがって、第１の態様では、本発明は、ＤＧＡＴ活性を測定する方法であって、該方法が、少なくとも１種のＤＧＡＴ基質を含んでなるミセルをミクロソームを含んでなるＤＧＡＴと接触させ、そしてこのようにして得られた反応混合液におけるトリグリセリドの生成を決定することを含んでなる方法を提供する。
【００１２】
本発明の特定の実施態様では、トリグリセリドの生成は、例えばｆｌａｓｈｐｌａｔｅのようなシンチレートする固体支持システムを用いて決定される。
【００１３】
また本発明は、試験化合物がＤＧＡＴ活性を調節することができるか否かを検証する方法であって、該方法が、試験化合物の存在および不在下で、少なくとも１種のＤＧＡＴ基質を含んでなるミセルをミクロソームを含んでなるＤＧＡＴと接触させ、そしてこのようにして得られた反応混合液におけるトリグリセリドの生成を決定することを含んでなり、そしてここで、試験化合物の存在下でのＴＧ生成における変化は、該化合物がＤＧＡＴ活性を調節することができることを示す方法を提供する。
【００１４】
その他の実施態様では、前述のスクリーニングアッセイにおけるトリグリセリドの生成が、例えばｆｌａｓｈｐｌａｔｅのようなシンチレートする固体支持システムを用いて決定される。
【００１５】
本発明の特定の実施態様では、前述のスクリーニングアッセイは、ＤＧＡＴを阻害する試験化合物の能力を決定するために使用され、この場合、試験化合物の存在下でのＴＧ生
成における減少は、該化合物がＤＧＡＴ阻害剤であることを示す。
【００１６】
また、本発明の目的は、本発明による方法においてＤＧＡＴ基質を含んでなるミセルの使用を提供することである。
【００１７】
また本発明は、本発明によるスクリーニング方法において同定された化合物の治療学的に有効な量を、それを必要とする被験者に投与することを含んでなる、ＤＧＡＴに関連する症状および障害を処置または予防する方法を提供する。
【００１８】
配列の説明
配列番号：１はヒトＤＧＡＴ１のヌクレオチド配列である。
配列番号：２はヒトＤＧＡＴ１のアミノ酸配列である。
配列番号：３はヒトＤＧＡＴ２のヌクレオチド配列である。
配列番号：４はヒトＤＧＡＴ２のアミノ酸配列である。
【００１９】
本発明は、化合物のジアシルグリセロール・アシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）活性を調節する能力の迅速かつ大量のスクリーニングを可能にするアッセイにおいて、ＤＧＡＴの生物学的活性を測定する方法を提供する。
【００２０】
「ＤＧＡＴ」活性とは、１，２−ジアシルグリセロールの３位にコエンザイムＡ活性化脂肪酸を転移してトリグリセリド分子を生成することを意味する。
【００２１】
本明細書で使用されるように、用語「トリグリセリド」（ＴＧ，トリアシルグリセロールまたは中性脂肪）はグリセロールの脂肪酸トリエステルを指す。トリグリセリドは、典型的には、非極性で、かつ水不溶性である。ホスホグリセリド（またはグリセロリン脂質）は生体膜の主要脂質成分である。動物における油脂は、豊富にトリグリセリドの混合物を含む。
【００２２】
本明細書で使用されるように、用語「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」は機能を増大または減少させることを意味する。好ましくは、ＤＧＡＴ活性を調節する化合物は、少なくとも１０％、より好ましくは、少なくとも２５％、もっとも好ましくは、少なくとも５０％調節し、そしてＤＧＡＴ活性の「モジュレーター」として定義することができる。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本方法は、一般に、少なくとも１種のＤＧＡＴ基質を含んでなるミセルとミクロソームを含んでなるＤＧＡＴとを合わせ、かくして得られた反応混合液を予定された時間インキュベートし、反応を停止し、そしてＤＧＡＴ活性のインジケーターとして生成されたＴＧの量を決定する段階を含む。
【００２４】
ＤＧＡＴ基質を含んでなるミセルは、好ましくは、ホスファチジルセリン濃度以下かまたはそれに等しいホスファチジルコリン濃度を有する、典型的には、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルコリンを含んでなる、より特別には、ホスファチジルセリンとホスファチジルコリンを含んでなる、なおより特別には、ホスファチジルセリンとホスファチジルコリンを３：１のモル比で含んでなる、もっとも特別には、ホスファチジルセリンとホスファチジルコリンを３．５：１．３のモル比で含んでなる、リン脂質リポソームか
らなる。本発明の方法において一般に使用されるＤＧＡＴ基質は、１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、例えば、１−ステアロイル−２−アラキドニル−ｓｎ−グリセロールまたは１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロールおよびコエンザイムＡ活性化脂肪酸、例えばパルミトイル−ＣｏＡまたはオレオイル−ＣｏＡである。本発明の特定の実施態様では、ＤＧＡＴ基質を含んでなるミセルは、重量比１：１でホスファチジルセリンとホスファチジルコリンおよびＤＧＡＴ基質としての１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロールをを含む。好適な実施態様では、ミセルは、基質としての１．６ｍＭＤＡＧとともにそれぞれ、１．３ｍＭと３．５ｍＭのホスファチジルコリンとホスファチジルセリンからなる。該ＤＧＡＴ基質を含んでなるミセルは、例えば、この後の実施例３において提供されるように調製され、そして後の使用のために−２０℃における保存ミセルとして保存することができる。
【００２５】
本発明の方法において使用されるようなミクロソームを含んでなるＤＧＡＴは、昆虫細胞の過剰発現系または組織のミクロソーム調製物のいずれから得られてもよく、好ましくは、活性測定のための酵素起源は昆虫細胞の過剰発現系から得られる。
【００２６】
組織のミクロソーム調製物は、典型的には、例えば、Ｃｏｌｅｍａｎ  Ｒ．によって記述されるように肝臓および腸から得られる（Ｃｏｌｅｍａｎ  Ｒ．，Ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ  ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ｍｏｎｏａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ  ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９９２，２０９：９８−１０４）。
【００２７】
昆虫細胞の過剰発現系では、例えば、ＤＧＡＴ酵素をコードしている核酸配列を含んでなる、市販のＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ発現系のような適当な発現ベクターによりトランスフェクトされた昆虫細胞（ｓｆ９，ｓｆ２１またはＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞）の膜調製物が使用される。膜調製物は既知の手法を用いて得られ、典型的には、ホモジナイゼーション装置を用いて細胞を溶解およびホモジナイズし、そして超遠心によって総細胞膜を回収することを含む。かくして得られた膜調製物は一定分量づつ分けられ、そして後の使用のために−８０℃において１０％グリセロールを用いて保存できる。
【００２８】
ＤＧＡＴとその基質との反応は、一般に、コエンザイムＡ活性化脂肪酸、特にオレオイル−ＣｏＡの存在下でミクロソームを含んでなるＤＧＡＴを先に定義されたミセルと接触させることによって開始されるが、この場合、場合によっては、該コエンザイムＡ活性化脂肪酸の一部は検出可能に標識される。ここで使用されるような検出可能な標識は、放射性アイソトープ、例えば１４Ｃまたは３Ｈか、または蛍光標識物、例えばピレンデカン酸を含むことを意味する。したがって、本発明の目的は、本発明による方法における放射能標識または蛍光標識されたコエンザイムＡ活性化脂肪酸の使用、特に、［１４Ｃ］−オレオイル−ＣｏＡまたは（１−ピレン−１−イル）デカノイル−ＣｏＡの使用を提供することである。本発明のより特定の実施態様では、［１４Ｃ］−オレオイル−ＣｏＡの使用。
【００２９】
反応混合液は、典型的には、室温から３７℃までの範囲の温度で予定された時間、例えば５分〜１８０分間、より特別には、少なくとも２３℃で少なくとも１５分間、なおより特別には、３７℃で１２０分間インキュベートされる。
【００３０】
ＤＧＡＴとその基質との反応の終了は、例えば、Ｎ−エチルマレイミド、Ｎ−（７，１０−ジメチル−１１−オキソ−１０，１１−ジヒドロ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］［１，４］オキシアゼピン−２−イル）−４−ヒドロキシ−ベンズアミドまたはＯＴ−１３５４０（Ｍａｓａｈｉｋｏ  Ｉｋｅｄａ，Ｃｈｉｎａｔｓｕ  Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙａｓｕｈｉｄｅ  Ｉｎｏｕｅ：Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＯＴ−１３５４０，ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｎｔｉｏｂｅｓｉｔｙ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ，ｏｎ  ｐｌａｓｍａ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｈｙｐｅｒｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｍｉａ；ＸＩＩＩｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ（Ｋｙｏｔｏ，  Ｊａｐａｎ，）Ｓｅｐ−Ｏｃｔ，２００３）のようなＤＧＡＴ阻害剤の添加によって実施できる。あるいはまた、反応は、変性剤、例えばアルカリ性、エタノール含有停止溶液、すなわち、１２．５％無水アルコール、約１０％脱イオン水、１ＮＮａＯＨの約２．５％、および約７８．４％イソプロパノール、約１９．６％ｎ−ヘプタンおよび約２．０％脱イオン水またはクロロホルム−メタノールを含む溶液の約７５％を用いて終了される。本発明の特定の実施態様では、反応は、Ｎ−エチルマレイミド、Ｎ−（７，１０−ジメチル−１１−オキソ−１０，１１−ジヒドロ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］［１，４］オキシアゼピン−２−イル）−４−ヒドロキシ−ベンズアミドまたはＯＴ−１３５４０、より特にＮ−エチルマレイミドを用いて終了される。
【００３１】
核酸
本発明の方法において使用されるように、ＤＧＡＴ酵素をコードしている核酸配列は、ヒトＤＧＡＴ１（配列番号：２）またはヒトＤＧＡＴ２（配列番号：４）のいずれかをコードしている核酸配列、ならびにヒトＤＧＡＴ１およびＤＧＡＴ２の他の動物、特に他の哺乳動物、より特別には他の霊長類の同族体をコードしている核酸配列を含むことを意味する。該ＤＧＡＴ同族体は、典型的には、配列番号：２または配列番号：４に対して少なくとも５０％、例えば６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有するであろう。ここで使用されるような核酸配列は、ＤＮＡ（両、ゲノムおよびｃＤＮＡ）およびＲＮＡを含む。本発明による核酸がＲＮＡを含む場合、付随するリストにおいて示される配列への言及は、Ｔについて置換されたＵを有するＲＮＡ等価物を指すと考えられるべきである。
【００３２】
本発明の核酸は一本鎖または二本鎖であってもよい。本発明の一本鎖核酸はアンチセンス核酸を含む。かくして、配列番号：１またはその同族体に対する言及は、文脈が明らかに反対ではない限り、相補的配列を含むと理解すべきである。
【００３３】
本発明のＤＧＡＴのｃＤＮＡ配列は、標準のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を用いてクローン化されてもよい。これは、配列番号：１または配列番号：３の反対の鎖において５’および３’末端に対する一対のプライマーを作成し、このプライマーを哺乳動物ｃＤＮＡライブラリーから得られるｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと接触させ、所望の領域の増幅を生じさせる条件下でポリメラーゼ連鎖反応を実施し、増幅されたフラグメントを単離し（例えば、アガロースゲルにおいて反応混合液を精製することによって）、そして増幅されたＤＮＡを回収することを伴う。プライマーは、増幅されたＤＮＡが適当なクローニングベクター中にクローン化できるように、適当な制限酵素認識部位を含有するよう設計することができる。
【００３４】
配列番号：１または配列番号：３の配列に対して１００％相同ではないが、配列番号：２または配列番号：４または本発明の他のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは多数の方法において得ることができる。
【００３５】
例えば、配列番号：１または配列番号：３の配列の部位特異的突然変異誘発が実施されてもよい。これは、例えば、ポリヌクレオチド配列が発現されようとしている特定の宿主細胞のためのコドン選択を最適化するために、サイレントコドン変化が配列に対して要求される場合に有用である。他の配列変更は、制限酵素認識部位を導入するため、またはポリヌクレオチドによってコードされているポリペプチドの性質または機能を変えるために所望されてもよい。さらなる変化は、例えば、同類置換を与えるように求められる特定の
コーディング変更を表すために所望されてもよい。
【００３６】
本発明の核酸は、５’または３’末端にさらなる配列を含有してもよい。例えば、合成または天然の５’リーダー配列が本発明のポリペプチドをコードしている核酸に結合されてもよい。また付加配列は、特定の宿主細胞における本発明の核酸の転写に必要とされる５’または３’非翻訳領域を含んでもよい。
【００３７】
さらに、他の動物、特に哺乳動物（例えばラットまたはウサギ）、より特にマウスを含む霊長類の、ＤＧＡＴの同族体が得られ、そして本発明の方法において使用されてもよい。そのような配列は、作成するか、あるいは分裂細胞から作成されたｃＤＮＡライブラリーまたは他の動物種からの組織またはゲノムＤＮＡライブラリーを得て、そしてそのようなライブラリーを、高いストリンジェンシーに対する培地の条件（例えば、約５０℃〜約６０℃における０．０３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）下で、配列番号：１または配列番号：３の全部または一部を含むプローブによりプローブすることによって得られてもよい。
【００３８】
配列同一性
核酸およびポリペプチド配列の同一性パーセントは、参照配列を疑問配列と比較する市販のアルゴリズムを用いて計算することができる。次のようなプログラム（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎによって提供される）が相同性／同一性を決定するために使用されてもよい：ＢＬＡＳＴ，ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴＩＮおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、これらはデフォルト（ｄｅｆａｕｌｔ）パラメーターとともに使用されてもよい。
【００３９】
アルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して、マッチ（ｍａｔｃｈ）数を最大化し、ギャップ（ｇａｐ）数を最小化する２種の完全配列を整列させる。一般に、デフォルトパラメーターは、ギャップ・クリエーション（ｃｒｅａｔｉｏｎ）ペナルティー＝１２とギャップ・エクステンション（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ペナルティー＝４により使用される。
【００４０】
核酸配列またはその一部分と疑問配列との間の最良の全体的マッチを決定するためのその他の方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．，６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムの使用である。このプログラムは総配列の整列を提供する。該総配列の整列の結果は同一性パーセントにある。同一性パーセントを算出するためのＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ検索において使用される適当なパラメーターは、Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、およびＷｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝５００またはヌクレオチド塩基における疑問配列長のいずれか短いものである。アミノ酸整列の同一性および類似性パーセントを算出する適当なパラメーターは、Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ１５０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、およびＷｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝５００またはヌクレオチド塩基における疑問配列長のいずれか短いものである。
【００４１】
ベクター
本発明の核酸配列はベクター、特に発現ベクター中に組み入れられてもよい。ベクターは適合する宿主細胞において核酸を複製するために使用されてもよい。かくして、さらなる実施態様では、本発明は、複製可能なベクター中に本発明のポリヌクレオチドを導入し、ベクターを適合する宿主細胞中に導入し、そしてベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることによって本発明のポリヌクレオチドを作成する方法を提供する。ベクターは宿主細胞から回収することができる。適当な宿主細胞は発現ベクターと関連して以下に記述される。
【００４２】
好ましくは、ベクター中の本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコーディング配列の発現の提供を可能にする制御配列に作動可能に連結される、すなわち、ベクターは発現ベクターである。
【００４３】
用語「作動可能に連結される」は、記述された成分がそれらの意図された様式での機能を可能にする関係において存在する並置を指す。コーディング配列に「作動可能に連結された」制御配列は、コーディング配列の発現が制御配列に適合する条件下で達成されるように結合されている。
【００４４】
適当なベクターは、プロモーター配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の適当な配列を含む、適当な調節配列を含有するように選択または構築することができる。
【００４５】
ベクターは、プラスミド、ウイルスの例えばファージの、ファージミドまたはバクロウイルスの、コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ、または適当なＰＡＣであってもよい。ベクターは、遺伝子治療ベクター、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス（例えばＨＩＶまたはＭＬＶ）に基づくベクターまたはアルファウイルスベクターを含む。
【００４６】
ベクターは、該ポリヌクレオチドの発現のための複製開始点、場合によってはプロモーターおよび場合によってはプロモーターのレギュレーターとともに提供されてもよい。ベクターは１種以上の選択可能なマーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合はアンピシリン耐性遺伝子または哺乳動物ベクターのためにはネオマイシン耐性遺伝子を含有してもよい。ベクターは、例えば、ＲＮＡの生産のためにはインビトロで使用されてもよく、あるいは宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換するために使用されてもよい。またベクターは、例えば遺伝子治療の方法においてインビボで使用されるように適合されてもよい。種々の異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のための系は周知である。適当な宿主細胞は、細菌、真核細胞、例えば哺乳動物および酵母、バクロウイルス系を含む。異種ポリペプチドの発現のための当該技術分野において利用できる哺乳動物細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、乳児ハムスター腎細胞、ＣＯＳ細胞および多くの他の細胞を含む。
【００４７】
プロモーターおよび他の発現調節シグナルは、発現ベクターが設計される宿主細胞に適合するように選択されてもよい。例えば、酵母プロモーターは、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＡＬ４およびＡＤＨプロモーター、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）ｎｍｔ１およびａｄｈプロモーターを含む。哺乳動物プロモーターは、カドミウムのような重金属に応答して導入できるメタロチオネイン・プロモーターを含む。ウイルスプロモーター、例えばＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーターまたはアデノウイルスプロモーターもまた使用できる。すべてのこれらのプロモーターは当該技術分野では容易に利用できる。
【００４８】
ベクターは、ポリペプチドが融合物として生産されるように挿入された核酸、核酸配列
、および／または宿主細胞において生産されたポリペプチドが細胞から分泌されるように分泌シグナルをコードしている核酸の発現を推進するためのプロモーターまたはエンハンサーのような他の配列を含んでもよい。
【００４９】
遺伝子治療において使用する本発明のポリペプチドの生産のためのベクターは、本発明のミニ遺伝子配列を担持するベクターを含む。
【００５０】
さらなる詳細は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照。例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、細胞中へのＤＮＡの導入および遺伝子発現における核酸の操作のための多くの既知の技術、ならびにタンパク質の分析は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９２において詳細に記述されている。
【００５１】
ベクターは、本発明のポリペプチドの発現に備えるために前記の適当な宿主細胞中に形質転換されてもよい。かくして、さらなる態様では、本発明は、ポリペプチドをコードしているコーディング配列のベクターによって発現されるような条件下で、前記の発現ベクターによって形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を培養し、そして発現されたポリペプチドを回収することを含む、本発明によるポリペプチドの製造方法を提供する。また、ポリペプチドはインビトロ系、例えば網状赤血球溶解物で発現されてもよい。
【００５２】
本発明のさらなる実施態様は、本発明のポリヌクレオチドの複製および発現のためのベクターにより形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。細胞は、該ベクターに適合するように選択でき、そして例えば、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物であってもよい。宿主細胞は、コードされたポリペプチドが生産されるような遺伝子発現のための条件下で培養されてもよい。ポリペプチドが適当なシグナルリーダーペプチドに結合されて発現される場合、それは培地中に細胞から分泌される。発現による生産後、ポリペプチドは、宿主細胞および／または場合によっては培地から単離および／または精製され、それに続いて、所望のように、例えば、１種以上のさらなる成分、例えば１種以上の製薬学的に許容できる添加物、媒質または担体を含む製薬学的組成物を含んでもよい組成物の調合において使用されてもよい。
【００５３】
また、本発明によるポリヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムの生産を提供するために、アンチセンス方向で前記ベクター中に挿入されてもよい。
【００５４】
膜調製物
本発明の方法において使用されるような細胞膜を調製する詳細は、ある場合には、続いて起るアッセイの性質によって決定されてもよいが、典型的には、全細胞を収穫し、そして例えば、氷冷バッファー（例えば、２０ｍＭＴｒｉｓ  ＨＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．４，４℃）における音波処理によって細胞を破砕することを含む。得られる粗細胞溶解物は、続いて、４℃において低速遠心、例えば２００ｘｇで５分間の遠心によって細胞破片を除去される。さらなる清澄化および膜の濃厚化は、最終的には、高速遠心段階、例えば４℃で４０，０００ｘｇ、２０分間を用いて実施され、そして得られる膜ペレットは氷冷バッファーに懸濁し、そして高速遠心段階を繰り返すことによって洗浄される。最終の洗浄された膜ペレットはアッセイバッファーに再懸濁される。タンパク質濃度は標準としてウシ血清アルブミンを用いるＢｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）の方法によって決定される。この膜は直ちに使用されてもよく、また後の使用のために凍結されてもよい。
【００５５】
本発明の方法では、膜は、化合物の存在または不在下のいずれかでそれらのＤＧＡＴ活性を調節する能力を試験するために、前述されたＤＧＡＴ基質とともにインキュベートされる。ＤＧＡＴ活性はＴＧ生成を測定することによって決定され、この場合、該ＴＧ生成は、例えば市販のＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（ＴＭ）のようなシンチレートする固体支持媒体を用いて、本発明のミセルにおける放射能標識されたＴＧの組み入れを測定することによって決定される。データはＧｒａｐｈＰａｄプリズムを用いて非線形曲線にフィットされる。
【００５６】
この方式において、ＤＧＡＴ活性を調節するアゴニストまたはアンタゴニスト化合物が同定できる。本発明の特定の目的は、ＤＧＡＴ活性を阻害することができる化合物を同定する、すなわち、ＤＧＡＴアンタゴニストを同定する方法において膜調製物を使用することである。
【００５７】
治療調合物
かくして、さらに本発明は、新規な調節作用物、特に、本発明によるアッセイによって得られるアンタゴニスト、およびそのような作用物を含んでなる組成物を提供する。受容体に結合し、そしてアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有してもよい作用物は、病因がＤＧＡＴ酵素の作用を特徴とする疾病、特に、肥満症および高トリアシルグリセロールに関連する疾病を処置する方法において使用されてもよく、そしてそのような使用は本発明のさらなる態様を形成する。トリグリセリド代謝における障害または不均衡は、肥満症、インスリン抵抗性症候群およびＩＩ型糖尿病、非アルコール性脂肪肝病および冠状動脈性心臓病の病因ならびにそれに対する危険性の増大に係わっている（参照、Ｌｅｗｉｓ，ｅｔ  ａｌ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（２００２）２３：２０１およびＭａｌｌｏｙ  ａｎｄ  Ｋａｎｅ，Ａｄｖ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ（２００１）４７：１１１）。さらに、高トリグリセリド血症は、しばしば、がん治療の好ましくない結末である（参照、Ｂａｓｔ，ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５ｔｈ  Ｅｄ．，（２０００）Ｂ．Ｃ．Ｄｅｃｋｅｒ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｏｎｔａｒｉｏ，ＣＡ）。
【００５８】
また本発明は、本発明の化合物の治療学的に有効な量をそれを必要とする被験者に投与することを含む、肥満症、糖尿病、神経性食欲不振、過食症、悪液質、シンドロームＸ、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、高血糖症、高尿酸血症、高インスリン血症、高コレステロール血症、高脂血症、異常脂質血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、混合異常脂質血症、高トリグリセリド血症、非アルコール性脂肪肝病、アテローム性硬化症、動脈硬化症、急性心不全、うっ血性心不全、冠状動脈病、心筋症、心筋梗塞、狭心症、高血圧症、低血圧症、卒中、虚血症、虚血性再潅流傷害、動脈瘤、再狭窄、血管狭窄、固形腫瘍、皮膚がん、黒色腫、リンパ腫、乳がん、肺がん、結腸直腸がん、胃がん、食道がん、膵臓がん、前立腺がん、腎臓がん、肝がん、膀胱がん、頸がん、子宮がん、睾丸がんおよび卵巣がんからなる群から選ばれる症状または障害を処置または予防する方法を提供する。この方法および以下に提供される方法では、若干の実施態様において、本発明の化合物は第２の治療学的作用物と組み合わせて投与することができる。
【００５９】
作用物は、本発明の作用物の有効な量において投与されてもよい。多くの前記症状は慢性であり、しばしば治癒不能であるので、「処置」が、一定期間、例えば数時間、数日または数週の間、症候における軽減を達成することを含み、かつ疾病の経過の進行を遅らせることを含むように意図されることは理解できる。
【００６０】
そのような作用物は、製薬学的に許容できる担体または希釈剤とともに作用物を含んでなる組成物に調合されてもよい。作用物は、生理学的に機能性の誘導体、例えばエステルまたは塩、例えば酸付加塩または塩基金属塩、またはＮまたはＳオキシドの形態で存在してもよい。組成物はいかなる適当な投与経路および手段のために調合されてもよい。製薬
学的許容できる担体または希釈剤は、経口、直腸、鼻内、吸入、局所（口腔および舌下を含む）、膣内または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮膚内、包膜内および硬膜外を含む）投与に適当な調合物において使用されるものを含む。もちろん、担体または希釈剤の選択は、作用物およびその治癒目的に依存してもよい提案される投与経路によって異なるであろう。調合物は、便利には、単位用量形態物において与えられてもよく、そして製薬学の技術において周知のいかなる方法によって製造されてもよい。そのような方法は、有効成分を１種以上の補助成分を構成する担体と混合する段階を含む。一般に、調合物は、有効成分を液状担体または微粉砕した固形担体またはその両者と均質かつ緊密に混合し、次いで、必要ならばその生産物を成形することによって製造される。
【００６１】
固形組成物では、例えば、製薬級のマンニトール、ラクトース、セルロース、セルロース誘導体、例えば澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを含む、慣用の非毒性固形担体が使用されてもよい。前記活性化合物は、例えば、担体としてのポリアルキレングリコール、アセチル化トリグリセリドなどを用いて坐剤として調合されてもよい。液状の製薬学的に投与できる組成物は、例えば、前記の活性化合物および場合によっては製薬学的補助剤を、担体、例えば水、食塩デキストロース水溶液、グリセロール、エタノールなど中に溶解、懸濁するなどして液剤または懸濁剤を形成することによって製造することができる。所望ならば、投与される製薬学的組成物は、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤などのような少量の非毒性補助物質、例えば酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、酢酸トリエタノールアミンナトリウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミンなどをまた含有してもよい。そのような投薬形態物を製造する実際的方法は既知であるか、または当業者には明らかである；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｓｙｌｖａｎｉａ，１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７５、参照。
【００６２】
投与される組成物または調合物は、いかなる場合にも、処置されている被験者の症候を緩和するのに有効な量において活性化合物の量を含有できる。
【００６３】
非毒性担体から作成されるバランスにより０．２５〜９５％の範囲における有効成分を含有する投薬形態物または組成物が製造されてもよい。
【００６４】
経口投与では、製薬学的に許容できる非毒性組成物は、通常に使用される添加物、例えば、製薬級のマンニトール、ラクトース、セルロース、セルロース誘導体、ナトリウムクロスカルメロース（ｃｒｏｓｓｃａｒｍｅｌｌｏｓｅ）、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどのいずれかを組み入れることによって形成される。そのような組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性調合物などの形態をとる。そのような組成物は、１％〜９５％の有効成分、より好ましくは２〜５０％、もっとも好ましくは５〜８％を含有してもよい。
【００６５】
非経口投与は、一般に、いずれか皮下、筋肉内または静脈内の注射を特徴とする。注射剤は、液状の液剤または懸濁剤として、注射前の、液体における水溶液または懸濁液に適当な固形形態物として、または乳剤として、いずれかの慣用の形態物において製造することができる。適当な添加物は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールまたは類似のものである。さらに、所望ならばまた、投与される製薬学的組成物は、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤などのような少量の非毒性補助物質、例えば酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン、酢酸トリエタノールアミンナトリウムなどを含有してもよい。
【００６６】
そのような非経口組成物に含有される活性化合物のパーセントは、その特定の性質ならびに化合物の活性および被験者の必要性に高く依存する。しかしながら、溶液において０．１％〜１０％の有効成分のパーセントが使用可能であり、そして組成物が後に前記パーセントまで希釈される固形物である場合には、より高くすることができる。好ましくは、組成物は溶液において活性作用物の０．２〜２％を含有できる。
【００６７】
本発明は、次に続く実験の詳細を参照することによって、より良く理解されるであろうが、これらが、その後に続く請求項においてより完全に記述されるように本発明を単に具体的に説明するものであることを、当業者は容易に評価できる。さらに、この出願を通して、種々の公表物が引用される。これらの公表物の開示は、この出願中に引用によって組み入れられており、本発明が属する当該技術分野の状態をより完全に記述している。
【実施例】
【００６８】
次の実施例は本発明を具体的に説明している。他の実施態様は、当業者にとってこれらの実施例に照らして生むことができる。
【００６９】
例１：ＤＧＡＴの発現
ＤＧＡＴ、アシル−ＣｏＡ：ジアシルグリセロール・アシルトランスフェラーゼは、トリグリセリド合成における重要な酵素である。ＤＧＡＴは、その基質としてジアシルグリセロール（ＤＡＧ）と脂肪アシルＣｏＡを使用することによって、脂肪アシル−ＣｏＡからジアシルグリセロールへのアシル残基の転移反応を触媒してＴＡＧを生成する。
【００７０】
ヒトＤＧＡＴ１（配列番号：１）が、翻訳開始点、文献に記述されるようなＮ末端におけるＦＬＡＧタグおよび昆虫細胞における発現を改良するためにＡＴＧに先行するウイルスＫｏｚａｋ配列（ＡＡＸ）を含有するｐＦａｓｔＢａｃ中にクローン化された。ＤＧＡＴは膜タンパク質であるので、発現は、ＳＦ９細胞を用いて文献に記述されるように実施された（Ｃａｓｅｓ，Ｓ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｓ．Ｊ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｙ．，Ｍｙｅｒｓ  Ｈ．Ｍ．，Ｌｅａｒ，Ｓ．Ｒ．，Ｓａｎｄｅ，Ｅ．，Ｎｏｖａｋ，Ｓ．，Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｃ．，Ｗｅｌｃｈ，Ｃ．Ｂ．，Ｌｕｓｉｓ，Ａ．Ｊ．，Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｓ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｆａｒｅｓｅ，Ｒ．Ｖ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８，１３０１８−１３０２３）。
【００７１】
例２：ＤＧＡＴ膜の調製
７２時間トランスフェクトされたＳＦ９細胞が遠心（１３０００ｒｐｍ−１５分−４℃）によって回収され、そして２ｘ５００ｍｌの溶解バッファー（０．１Ｍスクロース、５０ｍＭＫＣｌ，４０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，３０ｍＭＥＤＴＡ  ｐＨ７．２）中で溶解された。細胞は細胞破砕器によってホモジナイズされた。遠心、１３８０ｒｐｍ−１５分−４℃（ＳＮ廃棄）後、ペレットは５００ｍｌ溶解バッファー中に再懸濁され、そして全細胞膜が３４０００ｒｐｍ（１０００００ｇ）で６０分間（４℃）超遠心によって回収された。回収された膜は溶解バッファーに再懸濁され、一定分量に分割され、そして１０％グリセロールとともに−８０℃で使用まで保存された。
【００７２】
例３：ミセルの調製
材料
ａ）１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール、１０ｍｇ／ｍｌ（ＤＡＧ）
窒素下でアセトニトリル溶液を蒸発させ、そして最終濃度１０ｍｇ／ｍｌにおいて
クロロホルム中で再構成する。
【００７３】
ｂ）Ｌ−α−ホスファチジルコリン、１ｍｇ／ｍｌ（ＰＣ）
最終濃度１ｍｇ／ｍｌにおいてクロロホルム中に溶解し、そして４℃において保存
する。
【００７４】
ｃ）Ｌ−α−ホスファチジル−Ｌ−セリン、１ｍｇ／ｍｌ（ＰＳ）
最終濃度１ｍｇ／ｍｌにおいてクロロホルム中に溶解し、そして４℃において保存
する。
【００７５】
方法
厚いガラス容器中ＰＣの１０ｍｌおよびＰＳの１０ｍｌに１ｍｌＤＧＡを添加する。窒素下で蒸発させ、そして１５分間氷上に置く。このようにして得られた懸濁液を氷上で音波処理することによって１０ｍｌＴｒｉｓ／ＨＣｌ（１０ｍＭ，ｐＨ７．４）中で再構成する。音波処理方法は、音波処理浴における１０秒とそれに続く１０秒の冷却の音波処理サイクルからなり、そしてこの音波処理サイクルを均質な溶液が得られるまで繰り返す（約１５分かかる）。このようにして得られたミセルは後の使用まで−２０℃において保存され、１．６１ｍＭの最終濃度でＤＡＧを含有する。
【００７６】
ＤＧＡＴ基質を含んでなるミセルにおいてホスファチジルセリンとホスファチジルコリンの重量比で最適な１：１を確認するために、ＤＧＡＴのＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（ＴＭ）アッセイにおいて種々の比率の影響が分析された。
ホスファチジルコリンとホスファチジルセリンの異なる組み合わせについて、別々の混合物が作成された。クロロホルム中ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール（１０ｍｇ／ｍｌ）、Ｌ−α−ホスファチジルコリン（１ｍｇ／ｍｌ）およびＬ−α−ホスファチジルセリン（１ｍｇ／ｍｌ）の保存液の一定分量がガラスバイアルにおいて合わされ、そして窒素下で蒸発され、１５分間氷上に置かれた。再構成は氷上で音波処理することによって１０ｍｌＴｒｉｓ／ＨＣｌ（１０ｍＭ，ｐＨ７．４）中で実施された。一定分量が−２０℃で保存された。
【００７７】
第１の実験のセットでは、ＰＣの濃度はＰＣ：ＰＳ比を変更するように変えられた。ＤＧＡＴ活性のためのホスファチジルコリンの最適なミセル濃度は、ミセル中３．５ｍＭホスファチジルセリンを有する０．８ｍＭ（図２Ａ）であった。不幸にも、この濃度は安定な、または再現可能なミセルをもたらさず、このことは、臨界のミセル濃度が到達されなかったことを示している。脂質は一般にそれらの溶解度特性に基づいて定義される。それらは非極性溶媒には容易に溶解し、実際に水には不溶性である。水における両親媒性分子の溶解度の測定値はそれらの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）である。これは、凝集形態における分子と平衡関係にある遊離溶液中の分子の濃度として定義される。典型的な洗浄液はｍＭ濃度範囲（３）においてＣＭＣを有する洗剤を含有する。他方、０．８ｍＭ以上の濃度を使用することはＤＧＡＴ活性を減少させる。本発明者らは、この条件では、１．６ｍＭホスファチジルコリンが、許容できるＤＧＡＴ活性をもつミセルの再現可能な形成のために最適であると結論した。
【００７８】
このことは、ＰＳの濃度がＰＳ：ＰＣ比を変更するように変えられた第２の実験のセットにおいて確認された。１．６ｍＭジアシルグリセロールを含有するミセルにおけるミセルのホスファチジルセリンの異なる濃度を試験することによって、３．５ｍＭまでのＤＧＡＴ活性の良好な用量応答が明らかになり、この後に、ほとんど最大のＤＧＡＴ活性が達成された（図２Ｂ）。より少ないホスファチジルセリンを使用することは、活性を低下させるだけでなく、ホスファチジルコリンと類似の低い安定性で再現不可能な結果をもたらした。ホスファチジルセリンを除外することによって、ほとんど全てのＤＧＡＴ活性は消失したが、このことは、ホスファチジルセリンが活性にとって極めて重要であることを示している。本発明者らは、この条件では、３．５ｍＭホスファチジルセリンが、許容できるＤＧＡＴ活性をもつミセルの再現可能な形成のために最適であると結論した。
最大活性のみならず、ミセルの形成における安定性および再現性もまた考慮すれば、最適
濃度はホスファチジルコリンとホスファチジルセリンについて、それぞれ１．３ｍＭと３．５ｍＭにおいて達成される。この設定において、ホスファチジルセリンはＤＧＡＴ活性について、そしてホスファチジルコリンはミセルの安定化と再現性について臨界であると考えられる。
【００７９】
例４：ＤＧＡＴのＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（ＴＭ）アッセイ
材料
ａ）アッセイバッファー
５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１５０ｍＭＭｇＣｌ２，１ｍＭＥＤＴ  
Ａ，０．２％ＢＳＡ。
【００８０】
ｂ）Ｎ−エチルマレイミド，５Ｍ
８ｍｌの１００％ＤＭＳＯの最終容量中に５ｇを溶解し、そして後の使用まで一定分
量づつ−２０℃で保存する。
【００８１】
ｃ）基質混合液（１３８４穴プレート用＝３８４０μｌ）
６１２μｌミセル保存液（５１μＭ最終）
１６．６μｌオレオイルＣｏＡ  ９．７ｍＭ
２３μｌ［３Ｈ］−オレオイルＣｏＡ（４９Ｃｉ／ｍｍｏｌ，５００μＣｉ／ｍｌ）
３１８８．４μｌ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４，１０ｍＭ
ｄ）酵素混合液（１３８４穴プレート用＝３５２０μｌ）（５μｇ／ｍｌ）
３５０８μｌアッセイバッファーに対してＤＧＡＴ膜保存液（１５００μｇ／ｍｌ保
存液）の１１．７３μｌを添加する。
【００８２】
ｅ）停止混合液（１３８４穴プレート用＝７．６８ｍｌ）（２５０ｍＭ）
３．４５６ｍｌのＤＭＳＯ  １００％にＮ−エチルマレイミド（５Ｍ）３８４μｌを
添加し、そしてさらに該溶液３．８４ｍｌを３．８４ｍｌのＤＭＳＯ  １０％により
希釈する。
【００８３】
方法
膜調製物中のＤＧＡＴ活性は、ｒｅｄ  ｓｈｉｆｔｅｄ  Ｂａｓｉｃ  ｉｍａｇｅ  ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（ＴＭ）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＭＰ４００）を使用して３８４穴型式において最終容量５０μｌ中５０μＭＤＡＧ，３２μｇ／ｍｌ
ＰＣ／ＰＳおよび８．４μＭ［３Ｈ］−オレオイルＣｏＡ（３０ｎＣｉ／ウェルの比活性において）を含有する，５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１５０ｍＭＭｇＣｌ２，１ｍＭＥＤＴＡおよび０．２％ＢＳＡにおいてアッセイされた。
詳細には、１０μｌ酵素混合液および１０μｌ基質混合液が、場合によっては１μｌのＤＭＳＯ（ブランクおよびコントロール）または試験される化合物１μｌの存在下で、アッセイバッファーの３０μｌに添加された。この反応混合液は３７℃で１２０分間インキュベートされ、そして酵素反応液は停止混合液２０μｌの添加によって停止された。プレートは密閉され、そして小胞は室温で一夜放置して沈降された。プレートは１５００ｒｐｍで５分間遠心され、そしてＬｅａｄｓｅｅｋｅｒにおいて測定された。
【００８４】
考察
現在、真に高処理量に適合するアッセイは市販されていないが、それは多分、伝統的な酵素アッセイが、小胞調製物が膜に包埋されている酵素の自然環境を模倣するように、小胞調製物を使用するという事実によるのであろう。
【００８５】
伝統的なＴＬＣ分離または溶媒抽出は、生成された放射能標識ＴＧから放射能標識ＤＡＧまたはアシルＣｏＡを分離するために必要である。これらの伝統的なアプローチを高処
理量スクリーニングのために不適当にさせる、生成された放射能標識ＴＧの測定前のこのさらなる操作段階は、アッセイのサイクル時間を増加するだけでなく、またアッセイの再現性と首尾一貫した読み取りに影響を与えるかもしれない各段階であった。
【００８６】
本発明のＤＧＡＴ活性スクリーニングは、ＤＧＡＴを含んでなる膜調製物とＤＧＡＴ基質を含んでなるミセルの両方が使用されるので、なお酵素の自然環境を模倣しているが、それは、放射能標識アシルＣｏＡから生成された放射能標識ＴＧを分離する必要のない、単一のウェル操作であるので、特にＤＧＡＴ活性の大量スクリーニングのために適合されている。観察される放射ルミネセンスが、溶液中に残る放射能標識アシルＣｏＡに対して、ｆｌａｓｈｐｌａｔｅ表面の直近に来る生成された放射活性トリアシルグリセロールからのみ生じるので、この単一のウェルスクリーニング型式が達成される。
【００８７】
結論として、本発明は、時間を浪費するＴＬＣと抽出段階の必要を除くことによって、高処理量のスクリーニングのために、より適するプラットホームを提供し、そしてより再現性があり、かつ信頼性がある結果を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】３８４穴ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（ＴＭ）スクリーニングアッセイを用いるＤＧＡＴ活性に及ぼす阻害剤の影響。
【図２】ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（ＴＭ）スクリーニングアッセイにおいてＤＧＡＴ活性に及ぼす、ＤＧＡＴ基質を含んでなるミセル中のホスファチジルセリン（ＰＳ）およびホスファチジルコリン（ＰＣ）の影響。固定濃度のＰＳ（３．５ｍＭ）と種々の濃度のＰＣにおいて（図２Ａ）、ならびに固定濃度のＰＣ（１．３ｍＭ）と種々の濃度のＰＳにおいて（図２Ｂ）。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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