(57)【要約】  本発明は、疾患の治療において使用する、コードしたタンパク質または核酸治療分子を対象の細胞において調節発現するための、改善された発現系を提供する。具体的には、本発明は、疾患の治療のための、改善された、調節された遺伝子発現系、およびその医薬組成物およびその使用を提供する。
2008545639.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのベクターを含む疾患の治療において使用するための調節発現系であって、前記ベクターが、
ｉ）治療活性を有する治療分子（ＴＭ）をコードする第１の核酸配列の挿入のためのクローニング部位と、ｉｉ）前記第１のクローニング部位に挿入されると前記第１の核酸配列に作動可能に連結される第１のプロモーターおよび第１のポリ（Ａ）部位とを含む第１の発現カセットとを含み、
前記ＴＭが対象の細胞において発現され、前記ＴＭ発現または活性が配向依存的であり、調節分子（ＲＭ）の存在下で調節される、調節発現系。
【請求項２】
前記ベクターが、ｉ）前記調節分子（ＲＭ）をコードする第２の核酸配列の挿入のための第２のクローニング部位と、ｉｉ）前記第２のクローニング部位に挿入されると前記第２の核酸配列に作動可能に連結される第２のプロモーターおよび第２のポリ（Ａ）部位とを含む第２の発現カセットとをさらに含み、
前記ＲＭが前記細胞において発現される、請求項１に記載の調節発現系。
【請求項３】
前記第１のクローニング部位に挿入された前記治療分子（ＴＭ）をコードする第１の核酸配列をさらに含む、請求項１に記載の調節発現系。
【請求項４】
前記第１のクローニング部位に挿入された前記治療分子（ＴＭ）をコードする第１の核酸配列、および前記第２のクローニング部位に挿入された調節分子（ＲＭ）をコードする第２の核酸配列をさらに含む、請求項３に記載の調節発現系。
【請求項５】
少なくとも１つのベクターを含む疾患の治療において使用するための調節発現系であって、前記ベクターが以下を含む調節発現系：
Ａ．ｉ）治療活性を有する治療分子（ＴＭ）をコードする第１の核酸配列と、ｉｉ）前記第１の核酸配列に作動可能に連結される第１のプロモーターおよび第１のポリ（Ａ）部位とを含む第１の発現カセット（ここで、前記ＴＭは対象の細胞において発現され、前記ＴＭ発現または活性は用量依存的であり、調節分子（ＲＭ）の存在下で調節される）；および
Ｂ．ｉ）前記調節分子（ＲＭ）をコードする第２の核酸配列と、ｉｉ）前記第２の核酸配列に作動可能に連結される第２のプロモーターおよび第２のポリ（Ａ）部位とを含む第２の発現カセット。
【請求項６】
少なくとも１つのベクターを含む疾患の治療において使用するための調節発現系であって、前記ベクターが以下を含む調節発現系：
Ａ．ｉ）治療活性を有する治療分子（ＴＭ）をコードする第１の核酸配列と、ｉｉ）前記第１の核酸配列に作動可能に連結される第１のプロモーターおよび第１のポリ（Ａ）部位とを含む第１の発現カセット（ここで、前記ＴＭは対象の細胞において発現され、前記ＴＭ発現または活性は用量依存的であり、調節分子（ＲＭ）の存在下で調節される）；および
Ｂ．ｉ）前記調節分子（ＲＭ）をコードする第２の核酸配列と、ｉｉ）前記第２の核酸配列に作動可能に連結される第２のプロモーターおよび第２のポリ（Ａ）部位とを含む第２の発現カセット（ここで、前記ＲＭは前記細胞において発現され、活性化因子分子（ＡＭ）の存在下で活性化し、これにより前記ＴＭ発現または活性を調節する）。
【請求項７】
少なくとも１つのベクターを含む疾患の治療において使用するための調節発現系であって、前記ベクターが以下を含む調節発現系：
Ａ．ｉ）治療活性を有する治療分子（ＴＭ）をコードする第１の核酸配列と、ｉｉ）前記第１の核酸配列に作動可能に連結される第１のプロモーターおよび第１のポリ（Ａ）部位とを含む第１の発現カセット（ここで、前記ＴＭは対象の細胞において発現され、前記ＴＭ発現または活性は用量依存的であり、活性化調節分子（ＲＭ）の存在下で誘導される）および：
Ｂ．ｉ）前記調節分子（ＲＭ）をコードする第２の核酸配列と、ｉｉ）前記第２の核酸配列に作動可能に連結される第２のプロモーターおよび第２のポリ（Ａ）部位とを含む第２の発現カセット（ここで、前記ＲＭは前記細胞において発現され、活性化因子分子（ＡＭ）の存在下で活性化し、これにより前記ＴＭ発現または活性を誘導する）。
【請求項８】
前記調節発現系が、前記ベクターから個別に投与される活性化因子分子（ＡＭ）をさらに含む、請求項７に記載の調節発現系。
【請求項９】
前記ＴＭ発現または活性が前記調節分子（ＲＭ）の存在下で誘導される、請求項５に記載の調節発現系。
【請求項１０】
ＴＭ発現または活性が調節分子（ＲＭ）の存在下で抑制される、請求項５に記載の調節発現系。
【請求項１１】
ＴＭ発現または活性が調節分子（ＲＭ）の存在下で増大する、請求項５に記載の調節発現系。
【請求項１２】
調節分子（ＲＭ）が活性化され、これによりＴＭ発現または活性を調節する、請求項５に記載の調節発現系。
【請求項１３】
調節分子（ＲＭ）が活性化因子分子（ＡＭ）の存在下で活性化される、請求項１２に記載の調節発現系。
【請求項１４】
調節分子（ＲＭ）がＲＭにおける立体構造変化によって活性化される、請求項１２に記載の調節発現系。
【請求項１５】
調節分子（ＲＭ）がＲＭの修飾によって活性化される、請求項１２に記載の調節発現系。
【請求項１６】
活性化因子分子（ＡＭ）をさらに含む、請求項１３に記載の調節発現系。
【請求項１７】
前記活性化因子分子（ＡＭ）が天然由来分子またはその変異体である、請求項１６に記載の調節発現系。
【請求項１８】
活性化因子分子（ＡＭ）が修飾分子である、請求項１６に記載の調節発現系。
【請求項１９】
活性化因子分子（ＡＭ）が合成分子である、請求項１６に記載の調節発現系。
【請求項２０】
活性化因子分子（ＡＭ）が化合物である、請求項１６に記載の調節発現系。
【請求項２１】
前記化合物が抗プロゲスチンである、請求項２０に記載の調節発現系。
【請求項２２】
前記抗プロゲスチンがミフェプリストンである、請求項２１に記載の調節発現系。
【請求項２３】
前記調節分子（ＲＭ）の発現が構成的または一時的である、請求項５に記載の調節発現系。
【請求項２４】
調節分子（ＲＭ）の発現が構成的である、請求項２３に記載の調節発現系。
【請求項２５】
調節分子（ＲＭ）の発現が調節される、請求項５に記載の調節発現系。
【請求項２６】
第２のプロモーターが調節プロモーターである、請求項２５に記載の調節発現系。
【請求項２７】
第２のプロモーターが組織特異的プロモーターである、請求項５に記載の調節発現系。
【請求項２８】
第２のプロモーターが筋特異的プロモーターである、請求項２７に記載の調節発現系。
【請求項２９】
第２のプロモーターがアクチンプロモーターである、請求項２８に記載の調節発現系。
【請求項３０】
前記調節分子（ＲＭ）が前記第１のプロモーターに結合し、これにより前記ＴＭ発現または活性を誘導する、請求項９に記載の調節発現系。
【請求項３１】
調節分子（ＲＭ）が活性化し、これにより第１のプロモーターに結合してＴＭ発現または活性を誘導する、請求項９に記載の調節発現系。
【請求項３２】
前記調節分子（ＲＭ）がトランス活性化ドメインを含む、請求項５に記載の調節発現系。
【請求項３３】
前記トランス活性化ドメインがＶＰ１６またはｐ６５トランス活性化ドメインである、請求項３２に記載の調節発現系。
【請求項３４】
前記調節分子（ＲＭ）がリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を含む、請求項５に記載の調節発現系。
【請求項３５】
前記調節分子（ＲＭ）がリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を含み、前記活性化因子分子（ＡＭ）が前記ＬＢＤに結合し、これにより前記ＲＭを活性化する、請求項３４に記載の調節発現系。
【請求項３６】
前記調節分子がＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を含む、請求項５に記載の調節発現系。
【請求項３７】
前記ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）がＧＡＬ−４ＤＢＤを含む、請求項３６に記載の調節発現系。
【請求項３８】
前記第２の発現カセットが前記第２の核酸配列に作動可能に連結される第２の機能的配列をさらに含む、請求項５に記載の調節発現系。
【請求項３９】
前記第２のポリ（Ａ）部位がシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ポリ（Ａ）部位である、請求項５に記載の調節発現系。
【請求項４０】
前記調節分子（ＲＭ）が天然由来分子またはその変異体である、請求項５に記載の調節発現系。
【請求項４１】
前記調節分子（ＲＭ）が修飾分子である、請求項５に記載の調節発現系。
【請求項４２】
前記調節分子（ＲＭ）がタンパク質である、請求項４１に記載の調節発現系。
【請求項４３】
前記タンパク質がヒト化タンパク質である、請求項４２に記載の調節発現系。
【請求項４４】
前記タンパク質がヒトタンパク質またはその変異体である、請求項４２に記載の調節発現系。
【請求項４５】
前記タンパク質が転写活性化因子である、請求項４４に記載の調節発現系。
【請求項４６】
前記転写活性化因子が核ステロイド受容体である、請求項４５に記載の調節発現系。
【請求項４７】
前記転写活性化因子が修飾核ステロイド受容体である、請求項４５に記載の調節発現系。
【請求項４８】
前記修飾核ステロイド受容体が修飾プロゲステロン受容体である、請求項４７に記載の調節発現系。
【請求項４９】
前記治療分子（ＴＭ）の発現が構成的または一時的である、請求項５に記載の調節発現系。
【請求項５０】
前記第１のプロモーターが調節プロモーターである、請求項５に記載の調節発現系。
【請求項５１】
第１のプロモーターが誘導的プロモーターである、請求項５に記載の調節発現系。
【請求項５２】
第１のプロモーターが組織特異的プロモーターである、請求項５に記載の調節発現系。
【請求項５３】
第１のプロモーターが、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、低酸素反応性要素（ＨＲＥ）プロモーター、内皮白血球付着分子（ＥＬＡＭ）プロモーター、ＣＭＶ／アクチンキメラプロモーター、サイクリンＡプロモーター、およびｃｄｃ６プロモーターからなるプロモーター群から選択される、請求項５に記載の調節発現系。
【請求項５４】
前記第１のプロモーターがＰｏｌ  ＩＩプロモーターである、請求項５に記載の調節発現系。
【請求項５５】
前記Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターがＥ１Ｂプロモーターである、請求項５４に記載の調節発現系。
【請求項５６】
第１のプロモーターが、前記調節分子（ＲＭ）の前記ＤＮＡ結合ドメインのための結合部位を含む、請求項３６に記載の調節発現系。
【請求項５７】
前記結合部位が少なくとも１つのＧＡＬ−４結合部位を含む、請求項５６に記載の調節発現系。
【請求項５８】
前記結合部位が前記ＧＡＬ−４結合部位の多量体を含む、請求項５７に記載の調節発現系。
【請求項５９】
前記結合部位が３−１８のＧＡＬ−４結合部位を含む、請求項５８に記載の調節発現系。
【請求項６０】
前記第１のポリ（Ａ）部位がヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリ（Ａ）部位である、請求項５に記載の調節発現系。
【請求項６１】
前記第１の発現カセットが前記第１の核酸配列に作動可能に連結される第１の機能的配列をさらに含む、請求項５に記載の調節発現系。
【請求項６２】
前記第１の機能的配列が５’非翻訳領域および／またはイントロンをコードする、請求項６１に記載の調節発現系。
【請求項６３】
前記第１の機能的配列がＵＴ１２を含む５’非翻訳領域をコードする、請求項６２に記載の調節発現系。
【請求項６４】
前記機能的配列がＩＶＳ８を含むイントロンをコードする、請求項６２に記載の調節発現系。
【請求項６５】
前記治療分子（ＴＭ）が天然由来分子の変異体である、請求項５に記載の調節発現系。
【請求項６６】
治療分子（ＴＭ）が修飾分子である、請求項５に記載の調節発現系。
【請求項６７】
治療分子（ＴＭ）が合成または組換え分子である、請求項５に記載の調節発現系。
【請求項６８】
治療分子（ＴＭ）がタンパク質である、請求項５に記載の調節発現系。
【請求項６９】
治療分子（ＴＭ）がヒトタンパク質またはその変異体である、請求項６８に記載の調節発現系。
【請求項７０】
治療分子（ＴＭ）がＧＭＣＳＦ、ロイキン（Ｌｅｕｋｉｎｅ）（登録商標）、ＩＦＮ−α、およびＩＦＮ−β、または前記タンパク質の変異体からなるタンパク質群から選択される、請求項６９に記載の調節発現系。
【請求項７１】
治療分子（ＴＭ）がＧＭＣＳＦである、請求項７０に記載の調節発現系。
【請求項７２】
前記治療タンパク質（ＴＭ）がモノクローナル抗体である、請求項６８に記載の調節発現系。
【請求項７３】
前記モノクローナル抗体がＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）である、請求項７２に記載の調節発現系。
【請求項７４】
前記ベクターがプラスミドベクターである、請求項３に記載の調節発現系。
【請求項７５】
前記プラスミドベクターがｐＧＴ１、ｐＧＴ２、ｐＧＴ３、ｐＧＴ４、ｐＧＴ１１、ｐＧＴ１２、ｐＧＴ１３、およびｐＧＴ１４からなる群から選択される、請求項７４に記載の調節発現系。
【請求項７６】
前記ベクターがプラスミドベクターである、請求項５に記載の調節発現系。
【請求項７７】
前記プラスミドベクターがｐＧＴ２３、ｐＧＴ２４、ｐＧＴ２５、ｐＧＴ２６、ｐＧＴ２７、ｐＧＴ２８、ｐＧＴ２９、およびｐＧＴ３０からなる群から選択される、請求項７６に記載の調節発現系。
【請求項７８】
前記ベクターがシャトルプラスミドである、請求項３に記載の調節発現系。
【請求項７９】
前記ベクターがシャトルプラスミドである、請求項５に記載の調節発現系。
【請求項８０】
前記シャトルプラスミドがアデノ関連性ウイルス（ＡＡＶ）シャトルプラスミドである、請求項７９に記載の調節発現系。
【請求項８１】
前記ＡＡＶがＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ−１）である、請求項８０に記載の調節発現系。
【請求項８２】
前記ＡＡＶ−１シャトルプラスミドがｐＧＴ５３、ｐＧＴ５４、ｐＧＴ５７、ｐＧＴ５８、ｐＧＴ７１５、およびｐＧＴ７１６からなるＡＡＶ−１ベクター群から選択される、請求項８１に記載の調節発現系。
【請求項８３】
前記活性化因子分子（ＡＭ）が経口投与され、これにより前記調節分子（ＲＭ）を活性化する、請求項１３に記載の調節発現系。
【請求項８４】
前記ベクターが注射によって投与される、請求項５に記載の調節発現系。
【請求項８５】
ベクターが前記細胞を前記ベクターとインビボまたはエクスビボで接触させることによって投与される、請求項５に記載の調節発現系。
【請求項８６】
前記接触がインビボおよび注射による、請求項８５に記載の調節発現系。
【請求項８７】
前記注射が筋内注射による、請求項８４に記載の調節発現系。
【請求項８８】
注射が骨格筋細胞の筋内注射による、請求項８７に記載の調節発現系。
【請求項８９】
前記接触がエクスビボおよびエレクトロポレーションによる、請求項８５に記載の調節発現系。
【請求項９０】
ｐＧＴ１、ｐＧＴ２、ｐＧＴ３、ｐＧＴ４、ｐＧＴ１１、ｐＧＴ１２、ｐＧＴ１３、またはｐＧＴ１４である、調節発現系において使用するためのベクター。
【請求項９１】
ｐＧＴ２３、ｐＧＴ２４、ｐＧＴ２５、またはｐＧＴ２６である、調節発現系において使用するためのベクター。
【請求項９２】
ｐＧＴ２７、ｐＧＴ２８、ｐＧＴ２９、またはｐＧＴ３０である、調節発現系において使用するためのベクター。
【請求項９３】
ｐＧＴ５３、ｐＧＴ５４、ｐＧＴ５７、ｐＧＴ５８、ｐＧＴ７１５、およびｐＧＴ７１６である、調節発現系において使用するためのベクター。
【請求項９４】
ｐＧＴ５３である、調節発現系において使用するためのベクター。
【請求項９５】
請求項５〜８９のいずれかに記載の調節発現系を使用する、対象の細胞における治療分子（ＴＭ）の発現を調節するための方法であって、ＴＭが対象細胞において発現され、ＴＭ発現または活性が前記細胞における前記調節分子（ＲＭ）の存在下で調節されるように、前記細胞と前記発現系とを接触させることを含む方法。
【請求項９６】
請求項５〜８９のいずれかに記載の調節発現系を使用する、対象の細胞に治療分子（ＴＭ）を投与するための方法であって、ＴＭが対象細胞において発現され、ＴＭ発現または活性が前記細胞における調節分子（ＲＭ）の存在下で調節されるように、前記細胞と前記発現系とを接触させることを含む方法。
【請求項９７】
請求項５〜８９のいずれかに記載の調節発現系を使用する、対象の細胞に治療分子（ＴＭ）を輸送するための方法であって、ＴＭが前記細胞において発現または活性化され、ＴＭ発現が前記細胞における前記調節分子（ＲＭ）の存在下で調節されるように、前記細胞と前記発現系とを接触させることを含む方法。
【請求項９８】
請求項５〜８９のいずれかに記載の調節発現系を使用する、インビボまたはエクスビボで対象の細胞において治療分子（ＴＭ）を発現する方法であって、ＴＭが対象細胞において発現され、ＴＭ発現または活性が前記細胞における前記調節分子（ＲＭ）の存在下で調節されるように、前記細胞と前記発現系とを接触させることを含む方法。
【請求項９９】
請求項５〜８９のいずれかに記載の少なくとも１つの発現系を含む医薬組成物。
【請求項１００】
請求項９１〜９４のいずれかに記載のベクターを含む医薬組成物。
【請求項１０１】
対象の細胞に治療分子（ＴＭ）を輸送するためのキットであって、請求項１〜８９のいずれかに記載の少なくとも１つの調節発現系を含むキット。
【請求項１０２】
対象の細胞に治療分子（ＴＭ）を輸送するためのキットであって、が請求項９０に記載の少なくとも１つのベクターを含むキット。
【請求項１０３】
対象の細胞に治療分子（ＴＭ）を輸送するためのキットであって、請求項９１〜９４のいずれかに記載の少なくとも１つのベクターを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照によりその全体が本明細書に含まれる２００５年５月１９日出願の米国仮特許出願第６０／６８２，７６１号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、疾患の治療において使用するためのコードされたタンパク質または核酸治療分子の調節発現のための改善された発現系に関する。具体的には、本発明は、改善された調節遺伝子発現系、および医薬組成物、および疾患の治療のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
疾患の治療のための治療分子（ＴＭ）をコードする核酸の輸送は、従来の治療方法に対して治療様式として多大な可能性を提供すると考えられている。具体的には、治療タンパク質をコードする核酸の輸送は、遺伝子療法において、ボーラスタンパク質（ｂｏｌｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の投与を必要とする従来の療法に対して顕著な利点を提供する可能性を有する。これらの潜在的利点としては、例えば、患者の細胞におけるＴＭの長期および調節された発現が挙げられ、これは最大限の治療効果および最小限の副作用とともに、毒性および感染性不純物、および浸透性不純物の回避をもたらす。
【０００４】
例えば、疾患の治療のためのボーラスタンパク質の輸送は、例えば、感染性および毒性不純物、浸透性毒性、注射部位壊死、インフルエンザ様症状、悪寒、発熱、疲労、食欲不振、および体重減少と関連したものを含む有害な副作用をもたらすことが知られている。場合によっては、これらの事象は用量を制限し、また治療の全面停止に至りうる。さらに、一部のタンパク質治療薬への連続的曝露は、時間とともに耐性をもたらしうることが知られている。したがって、ＴＭの治療有効レベルを持続的にまたは長期間提供し、同時に動的治療濃度域内でＴＭのレベルを迅速に減少させるまたは調節するというさらなる特徴を有する調節発現系が必要である。より具体的には、ＴＭの濃度が潜在的に毒性であるレベルに達すれば止められる能力を有する調節発現系が必要である。さらに、ＴＭのレベルが滴定出来れば、時間とともにＴＭに対する耐性が増加する可能性がある場合に投薬を調節することが可能となる。
【０００５】
特に興味深く、かつ必要なのは、標的患者細胞において発現し、結果として疾患をもたらす状態または疾患によって引き起こされる状態を改善する、または疾患の進行を停止させる、もしくは遅くする治療タンパク質をコードする遺伝子を輸送輸送することである。例えば、多くの病状の病因は、１つもしくはそれ以上の欠陥遺伝子産物の発現または１つもしくはそれ以上の遺伝子産物の欠陥発現、例えば、それぞれ、突然変異型タンパク質の発現、またはタンパク質の過剰もしくは過少発現の結果である。したがって、従来の治療方法としては、かかるタンパク質の欠陥発現または欠陥タンパク質の発現を修正する組換えタンパク質の投与が挙げられる。しかし、患者へのタンパク質治療薬の投与は、結果として、タンパク質に対する抗体の生成、および異物として患者の免疫系によるその拒絶をもたらすことが周知である。
【０００６】
多発性硬化症（ＭＳ）に対する治療の周知の方法としては、ＩＦＮ−βタンパク質治療薬の投与が挙げられる。ＭＳは、北米におけるおよそ４０万の患者および世界中で約百万人に影響を及ぼす中枢神経系の慢性炎症性自己免疫疾患である。ＭＳは男性よりも多くの女性に影響を及ぼす疾患であり、発症年齢は一般的に２０〜４０歳である。さらに同疾患は進行性であり、初期段階では、数時間〜数日にわたる亜急性の後、数ヵ月続く改善の段階を伴う神経学的機能不全の「発病」または「再発」によって特徴づけられる再発性および寛解性の段階によって特徴づけられる（Ｂ．Ｍ．キーガン（Ｋｅｅｇａｎ）ら（２００２年）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５３：２５８−３０２頁、Ｊ．ノーズワーシー（Ｎｏｓｅｗｏｒｔｈｙ）（２０００年）３４３：９３８−５２）。症状としては、例えば、麻痺につながる眼、手足、および体軸筋の協調運動の障害が挙げられる。疾患の経過は数年間にわたって、患者が重度身体障害になるまで神経学的症状とともに展開する。ＭＳの症状および徴候は脳のニューロン軸索の脱髄を反映し、結果として軸索に沿った神経インパルスの伝導性障害をもたらしうる。さらにＭＳの病理は、例えば、病名の由来となった慢性多病巣性硬化性斑を最終的にもたらす急性病巣性炎症性脱髄および軸索喪失として現れうる（Ａ．コンプストン（Ｃｏｍｐｓｔｏｎ）とＡ．コールス（Ｃｏｌｅｓ）（２００２年）Ｌａｎｃｅｔ  ３５９：１２２１−３１頁、Ｌ．シュテインマン（Ｓｔｅｉｎｍａｎ）（１９９６年）Ｃｅｌｌ  ８５：２９９−３０２）。
【０００７】
これまで、ＭＳの治療法はなく、また実質的にすべての承認治療薬は疾患の炎症性成分を標的としている。シェリング  アーゲー（ＳｃｈｅｒｉｎｇＡＧ）によって１９９３年に初めて紹介された組換えインターフェロンベータ（ＩＦＮ−β）は、ＭＳ患者における再発の数の減少（全体的に毎年３０−３７％）、進行を遅らせること、また疾患と関係した身体障害の削減において明らかな利点を証明することによってＭＳの治療におけるブレークスルーを示した。これらの効果は、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）によって測定されるように治療されたＭＳ患者の脳における脱髄性病変の数の顕著な削減によって明らかにされる。
【０００８】
現在、ＭＳの再発寛解型形態に対して承認された３つのＩＦＮ−β製品がある。すなわち、１）ベータセロン（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ）（登録商標）またはベータフェロン（Ｂｅｔａｆｅｒｏｎ）（登録商標）（シェリング（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）、２）アボネックス（Ａｖｏｎｅｘ）（登録商標）（ビオゲン（Ｂｉｏｇｅｎ））、および３）レビフ（Ｒｅｂｉｆ）（登録商標）（セロノ（Ｓｅｒｏｎｏ））である。また、ベータセロン（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ）（登録商標）は、ＥＵ、カナダ、およびヨーロッパにおいて二次進行性ＭＳに対して承認されている。これらの承認ＩＦＮ−β製品は精製組換えタンパク質製剤である。ベータセロン（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ）（登録商標）またはベータフェロン（Ｂｅｔａｆｅｒｏｎ）（登録商標）（ＩＦＮ−β１ｂ）の場合、組換えタンパク質は、タンパク質を発現する細菌細胞培養（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））から精製されうる。アボネックス（Ａｖｏｎｅｘ）（登録商標）およびレビフ（Ｒｅｂｉｆ）（登録商標）（ＩＦＮ−β１ａ）の場合、組換えタンパク質は、タンパク質を発現する哺乳類細胞培養から精製される。ＭＳのためのこれらＩＦＮ−β製品は、週１回〜１日おきの頻度でボーラスタンパク質溶液の皮下（ｓ．ｃ．）または筋内（ｉ．ｍ．）注射によって投与されうる。
【０００９】
さらに、Ｉ型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−β）は、ＭＳに加えて、一部の癌およびウイルス疾患徴候を含む一部の徴候に対して承認されている。しかし、かかるＩＦＮタンパク質治療薬は用量依存副作用、例えば、患者におけるインフルエンザ様症状、悪心、および白血球減少を引き起こしうることが周知である（Ｅ．Ｕ．ウォルター（Ｗａｌｔｈｅｒ）（１９９９年）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５３：１６２２−２７頁）。これらの副作用は、結果として、さらなるＩＦＮ療法に対する不耐性をもたらしうる。また、ＩＦＮタンパク質の皮下（ｓ．ｃ．）または筋内（ｉ．ｍ．）注射を受ける一部の患者は、壊死になりうる局所注射部位反応も経験し、これは結果として、ＩＦＮ療法の中止をもたらしうる（Ａ．バイヤス（Ｂａｙａｓ）とＲ．ゴールド（Ｇｏｌｄ）（２００３年）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５０（４年）：ＩＶ３−ＩＶ８）。さらに、ＭＳに対するＩＦＮ−β療法を受けている一部のＭＳ患者は、時間とともに薬剤の治療的利点を制限しうる中和抗体を生成することが周知である（Ｓ．Ｍ．マルッチ（Ｍａｌｕｃｃｈｉ）（２００４年）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ６２：２０３１−３７頁）。最後に、薬物動態試験では、ＩＦＮが循環において短い半減期を有し、患者への組換えタンパク質のボーラス輸送後、数時間以内にレベルが検出不可能になることが示されている（Ｒ．ウイルス（Ｗｉｌｓ）Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．１９：３９０−９９頁、Ｐ．サルモン（Ｓａｌｍｏｎ）ら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．１６：７５９−６４頁、Ｐ．−Ａ．ブッフワルダー（Ｂｕｃｈｗａｌｄｅｒ）ら（２０００年）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．２０：５７−６６頁）。
【００１０】
したがって、タンパク質の調節された長期発現を提供し、結果として治療効果をもたらすと同時に、用量限定的毒性副作用を最小限にする、疾患を治療するための治療タンパク質の遺伝子ベースの輸送輸送が必要である。かかる調節発現系は、現在のタンパク質治療薬と関係した主な制限因子の多くを回避しうる。しかし、最も周知の核酸輸送輸送系は臨床使用に適切ではなく、細胞において調節された、または長期の発現を提供することはできない。ほんのわずかだけの周知の核酸輸送輸送系が、実験室条件下に導入遺伝子発現を調節する能力を有することが報告されているが、臨床使用におけるこれら輸送輸送系の適合性および実行可能性は周知ではない（例えば、Ｍ．ゴッセン（Ｇｏｓｓｅｎ）とＨ．ブヤード（Ｂｕｊａｒｄ）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１７６６−６９頁、Ｄ．ノー（Ｎｏ）ら（１９９６年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：３３４６−５１頁、Ｊ．Ｆ．アマラ（Ａｍａｒａ）ら（１９９７年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１０６１８−２３頁、Ｙ．ワング（Ｗａｎｇ）（１９９４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８１８０−８４頁、Ｊ．Ｌ．ノルドストローム（Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ）（２００２年）１３：４５３−５８頁を参照）。
【発明の開示】
【００１１】
［発明の概要］
本発明は、疾患の治療において使用するためのコードされたタンパク質または核酸治療分子（ＴＭ）の調節された発現のための改善された発現系を提供し、ＴＭの治療効果が最大限にされ、かつ副作用が最小限にされうる。具体的には、本発明は、改善された調節された遺伝子発現系、および医薬組成物、および疾患の治療のためのその方法を提供する。コードされたＴＭは、疾患を有する、または疾患にかかりやすい対象に治療的利点を提供する核酸またはタンパク質でありうる。例えば、かかる治療的利点または活性としては、疾患または疾患の症状の改善、変調、減少、安定化、または予防が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１２】
１つの態様において、本発明は、対象の細胞に輸送されると、コードされたＴＭが発現され、かつＴＭの発現および／または活性が調節分子（ＲＭ）の存在下で調節されるように、ＴＭをコードする核酸配列を有する少なくとも１つの第１の発現カセットを含む改善された調節発現系を提供する。かかる調節の例としては、ＲＭの存在下でのＴＭ発現および／または活性の誘導、抑制、増加、または減少が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１３】
本発明の１つの態様において、ＴＭの発現および／または活性は、対象の細胞に存在する、または対象に投与されるＲＭの量に従って用量−反応性または用量依存的に調節される。他の態様において、ＴＭの発現および／または活性は、例えば、対象の細胞に存在する、または対象に投与される活性化因子分子（ＡＭ）または不活性化因子分子（ＩＭ）の量に従って用量−反応性または用量依存的に調節される。
【００１４】
本発明の別の態様において、ＴＭの発現および／または活性は配向依存的である。例えば、１つの態様において、細胞におけるＴＭの発現および／または活性は、ＴＭをコードする発現カセットの５’〜３’配向に対して、またはコードされたＴＭの転写または翻訳の５’〜３’配向に対して修飾される。したがって、ＴＭ発現および／または活性は、ＴＭをコードする発現カセットの特定の配向またはＴＭの転写または翻訳の配向の選択によって修飾されうる。
【００１５】
別の態様において、本発明の調節発現系は、対象の細胞に輸送されると、コードされたＲＭが発現し、かつその存在がＴＭの発現および／または活性を調節するようにＲＭをコードする第２の発現カセットをさらに含む。好ましい態様において、ＴＭをコードする第１の発現カセットおよび本発明のＲＭをコードする第２のカセットは単一ベクターにおいて存在する。別の好ましい態様において、単一ベクターはｐＧＴ２３、ｐＧＴ２４、ｐＧＴ２５、ｐＧＴ２６、ｐＧＴ２７、ｐＧＴ２８、ｐＧＴ２９、またはｐＧＴ３０である。さらに別の好ましい態様において、単一ベクターはｐＧＴ５４、ｐＧＴ５７、ｐＧＴ７１３、ｐＧＴ１５、またはｐＧＴ１６である。
【００１６】
本発明のＴＭは、単離ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはタンパク質、または核酸配列によってコードされ、かつ治療活性を有するその変異体でありうる。より詳しくは、本発明のＴＭは修飾、合成、または組換えＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質でありうる。本発明の別の態様において、コードされたＴＭは核酸、例えば、治療活性を有するＤＮＡまたはＲＮＡでありうる。本発明の１つの態様において、コードされたＴＭはＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである。本発明の別の態様において、コードされたＴＭは、治療活性を有するタンパク質、および、好ましくは、ヒトタンパク質またはその変異体である。１つの態様において、コードされたＴＭは治療活性を有するモノクローナル抗体である。１つの態様において、コードされたＴＭは、モノクローナル抗体、ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）である。別の態様において、かかるタンパク質をコードする核酸配列は遺伝子または遺伝子フラグメントである。１つの態様において、コードされたＴＭは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）またはＧＭＣＳＦの変異体（例えば、ロイキン（Ｌｅｕｋｉｎｅ）（登録商標））である。別の態様において、コードされたＴＭは、インターフェロン、例えば、インターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−α）またはインターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−β）、およびより詳しくは、ＩＦＮ−β−１ａである。
【００１７】
本発明のＲＭは天然由来分子もしくはその変異体、または単離分子でありうる。一部の態様において、本発明のＲＭは合成または組換え分子である。例えば、一部の態様において、本発明のＲＭは化合物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質である。さらに、一部の態様において、本発明のＲＭは修飾分子である。１つの態様において、ＲＭはヒト化タンパク質である。別の態様において、ＲＭはヒトタンパク質もしくはその変異体である。例えば、１つの態様において、ＲＭは転写活性化因子、例えば、ステロイド受容体および、より詳しくは、プロゲステロン受容体である。１つの態様において、ＲＭはトランス活性化ドメイン（例えば、ＶＰ１６またはｐ６５トランス活性化ドメイン）を含む。別の態様において、ＲＭはリガンド−結合ドメイン（ＬＢＤ）を含む。さらに、１つの態様において、ＡＭはＲＭのＬＢＤに結合し、それによって、活性化ＲＭの存在がＴＭ発現および／または活性を調節するようにＲＭを活性化する。別の態様において、ＲＭはＤＢＤ、例えば、ＧＡＬ−４ＤＢＤを含む。１つの態様において、ＲＭは、ＴＭをコードする核酸に作動可能に連結される機能的配列（例えば、プロモーター配列）に結合し、それによってＴＭ発現を調節する（例えば、ＴＭ発現を誘導する）ＤＢＤを含む。
【００１８】
別の態様において、本発明のＲＭは活性化され、それによってＴＭ発現および／または活性が活性化ＲＭの存在下で調節される。１つの態様において、本発明のＲＭは、不活性化形態で対象の細胞において発現または存在し、そしてＡＭの存在下で活性化し、それによってＴＭ発現および／または活性は活性化ＲＭによって調節される。１つの態様において、ＡＭはバイオマーカーである。別の態様において、ＡＭは疾患または状態のバイオマーカーであり、またより詳しくは、病状または状態、またはその症状のバイオマーカーである。１つの態様において、ＡＭはＲＭの立体構造変化、酵素プロセシングまたは修飾、特異的結合、または二量化を促進または阻害することによってＲＭを活性化する。好ましい態様において、ＡＭはＲＭのホモ二量体を促進することによってＲＭを活性化する。
【００１９】
本発明のＡＭは天然由来分子もしくはその変異体、または単離分子でありうる。一部の態様において、本発明のＡＭは合成または組換え分子である。例えば、一部の態様において、本発明のＡＭは化合物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質である。さらに、一部の態様において、本発明のＡＭは修飾分子である。１つの態様において、ＡＭはヒト化タンパク質である。別の態様において、ＡＭはヒトタンパク質またはその変異体である。１つの態様において、ＡＭは化合物、例えば、抗プロゲスチンである。好ましい態様において、ＡＭはミフェプリストンである。
【００２０】
別の態様において、本発明のＲＭが不活性化し、それによってＴＭ発現および／または活性が不活性化ＲＭの存在下で調節される。１つの態様において、本発明のＲＭは活性化形態で対象の細胞において発現または存在し、そしてＩＭの存在下で不活性化し、それによってＴＭ発現および／または活性が不活性化ＲＭによって調節される。１つの態様において、ＩＭはバイオマーカーである。別の態様において、ＩＭは疾患または状態のバイオマーカーであり、より詳しくは、病状または状態、またはその症状のバイオマーカーである。１つの態様において、ＩＭはＲＭの立体構造変化、酵素プロセシング、特異的結合、または二量化を促進または阻害することによってＲＭを不活性化する。好ましい態様において、ＩＭはＲＭのホモ二量化を阻害することによってＲＭを不活性化する。
【００２１】
本発明のＩＭは天然由来分子もしくはその変異体、または単離分子でありうる。一部の態様において、本発明のＩＭは合成または組換え分子である。例えば、一部の態様において、本発明のＩＭは化合物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質である。さらに、一部の態様において、本発明のＩＭは修飾分子である。１つの態様において、ＩＭはヒト化タンパク質である。別の態様において、ＩＭはヒトタンパク質またはその変異体である。好ましい態様において、ＩＭは化合物である。
【００２２】
本発明のＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭの発現は構成的または一時的でありうる。一部の態様において、ＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭの発現は調節され、または組織特異的（例えば、筋特異的）である。調節されるＲＭの例としては、ＡＭによって活性化される、またはＩＭによって不活性化されるＲＭが挙げられるが、これに限定されない。１つの態様において、本発明のＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭの発現は調節プロモーターまたは組織特異的プロモーターによって推進される。別の態様において、調節または組織特異的プロモーターはＲＭの存在下で、より詳しくは、そのプロモーターへのＲＭの結合によって調節される。例えば、１つの態様において、本発明のＲＭは、ＴＭをコードする核酸配列に作動可能に連結されるプロモーターに結合し、それによって、対象の細胞において、本明細書に記載されているようにコードされたＴＭの発現を調節する。１つの態様において、ＴＭをコードする核酸に作動可能に連結されるプロモーターは、少なくとも１つのＧＡＬ−４ ＤＮＡ−結合部位（ＤＢＳ）を含み、好ましくは３−１８ＧＡＬ−４ ＤＢＳを含む。別の態様において、プロモーターはＰｏｌ  ＩＩまたはＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターである。１つの態様において、プロモーターはＰｏｌ  ＩＩプロモーターＵ６Ｈ１である。別の態様において、プロモーターは次のものからなる群から選択されるＰｏｌ  ＩＩプロモーターである。すなわち、筋クレアチンキナーゼプロモーター（ＭＣＫ）、低酸素反応性要素（ＨＲＥプロモーター）を含むプロモーター、内皮白血球付着分子（ＥＬＡＭ）プロモーター、キメラプロモーター（例えば、ＣＭＶ／アクチンキメラプロモーター）、サイクリンＡプロモーター、およびｃｄｃ６プロモーター。
【００２３】
本発明は、本明細書に記載されているように改善された本発明の調節発現系を含む、疾患または状態の治療のための医薬組成物および方法をも提供する。特定の態様において、本発明は、以下のような疾患または状態を治療する医薬組成物および方法を提供する：ＴＭの発現を調節し、ＴＭを投与し、４）ＴＭを輸送し、または対象の細胞においてＴＭを発現させる（ここで、この方法は、コードされたＴＭが細胞において発現し、かつかかるＴＭ発現がＲＭの存在下で調節されるように、細胞を本発明の調節発現系と接触させることを含む）。１つの態様において、本発明は、白血病、黒色腫、肝炎、および心筋症の治療のための医薬組成物および方法を提供する。好ましい実施形態において、本発明の調節発現系のコードされたＴＭはＩＦＮ、例えば、白血病、黒色腫、肝炎、または心筋症の治療のためのＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βである。
【００２４】
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載されている発現系の少なくとも１つ、具体的には、本発明のＴＭおよびＲＭの少なくとも１つ、より詳しくは、本発明のベクター（例えば、ｐＧＴ２３、ｐＧＴ２４、ｐＧＴ２５、ｐＧＴ２６、ｐＧＴ２７、ｐＧＴ２８、ｐＧＴ２９、ｐＧＴ３０、ｐＧＴ５４、ｐＧＴ５７、ｐＧＴ７１３、ｐＧＴ７１５、ｐＧＴ７１６、ｐＴＲ−ｍＩＦＮ−β、またはｐＴＲ−ｈＩＦＮ−β）の少なくとも１つを含む。一部の態様において、本発明の医薬組成物は、本発明のＡＭまたはＩＭの少なくとも１つを含む。１つの態様において、本発明の医薬組成物は、少なくとも１つのＴＭおよび／またはＲＭをコードする１つもしくはそれ以上のベクターを含む。本発明のＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、およびＩＭは、個別または一緒に、エクスビボまたはインビボで、本明細書に記載された、または当業界で周知の適切な投与手段を使用して対象に投与されうる。かかる適切な投与手段の例としては、注射（例えば、皮下注射）、経口投与、およびエレクトロポレーションが挙げられるが、これらに限定されない。１つの態様において、本発明のＴＭおよびＲＭは単一ベクターにおいて存在し、ＲＭを活性化するＡＭとは個別に投与される（それによって、活性化ＲＭの存在がＴＭ発現および／または活性を調節する）。別の態様において、ＡＭは経口投与される化合物（例えば、ミフェプリストン）であり、ＴＭおよびＲＭをコードする単一ベクターは、対象の細胞（例えば、骨格筋細胞）に注射またはエレクトロポレーションによって投与される単一ベクターである。
【００２５】
本発明はさらに、改善された本発明の調節発現系を含むベクターおよびキットを提供する。一部の態様において、改善された本発明の調節発現系は、１つもしくはそれ以上のベクターを含み、各々のベクターは１つもしくはそれ以上の発現カセットを含む。１つの態様において、改善された本発明の調節発現系は、少なくとも１つの発現カセット、より好ましくは、少なくとも２つの発現カセットを有する単一ベクターを含む。好ましい態様において、改善された本発明の調節発現系は、ＴＭをコードする第１の核酸配列の挿入のための少なくとも１つのクローニング部位を有する第１の発現カセット、およびＲＭをコードする第２の核酸配列の挿入のための少なくとも１つのクローニング部位を有する第２の発現カセットを含む単一ベクターを含む。別の態様において、ベクターは、ウイルス、例えば、アデノ関連性ウイルス（ＡＡＶ）シャトルプラスミド、より詳しくは、ＡＡＶ−１シャトルプラスミドを産生するために使用されるベクターである。１つの態様において、本発明のベクターは非ウイルスベクター（すなわち、ウイルスを産生することがないベクター）、例えば、ウイルスを産生することがないプラスミドベクターである。好ましい態様において、ベクターは、ＴＭをコードする配列を含む核酸配列の挿入のためのクローニング部位を含む本発明のプラスミドベクターである。本発明のかかるプラスミドベクターの例としては、ｐＧＴ１、ｐＧＴ２、ｐＧＴ３、ｐＧＴ４、ｐＧＴ１１、ｐＧＴ１２、ｐＧＴ１３、またはｐＧＴ１４が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
本発明の発現カセットは、本発明のコードされた分子、例えば、ＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭの発現のための機能的配列を含む。一部の態様において、発現カセットは、本発明の分子をコードする核酸配列に作動可能に連結される少なくとも１つの機能的配列を含む。機能的配列の例は、５’または３’非翻訳領域（例えば、ＵＴ１２）、イントロン（例えば、ＩＶＳ８）、ポリ（Ａ）部位（例えば、ＳＶ４０またはｈＧＨポリ（Ａ）部位）、またはＤＮＡ−結合部位（ＤＢＳ）（例えば、ＧＡＬ−４ ＤＢＳ）であるが、これらに限定されない。１つの態様において、機能的配列は、少なくとも１つのＧＡＬ−４ ＤＢＳ、好ましくは、ＧＡＬ−４ ＤＢＳの多量体（例えば、３−１８のＧＡＬ−４ ＤＢＳ）を含む。かかる機能的配列としては、例えば、本発明の発現カセットにおけるかかる機能的配列に作動可能に連結される核酸配列によってコードされた分子の、調節または組織特異的発現をそれぞれ促進する、調節プロモーターまたは組織特異的プロモーターをコードする配列も挙げられる。別の態様において、本発明の発現カセットは、少なくとも１つのクローニング部位、より好ましくは、本発明の分子、例えば、ＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭをコードする核酸配列の挿入のための多重クローニング部位（ＭＣＳ）を含む。
【００２７】
１つの態様において、本発明の第１の発現カセットは、ＴＭをコードする第１の核酸配列の挿入のためのＭＣＳ、少なくとも１つのＤＢＳ（例えば、３−１８ＧＡＬ−４ ＤＢＳ）を含む誘導的プロモーター、５’非翻訳領域（例えば、ＵＴ１２）、イントロン（例えば、ＩＶＳ８）、およびｈＧＨポリ（Ａ）部位を含み、第１の核酸配列がＭＣＳに挿入されると、これらの機能的配列がこの配列に作動可能に連結されるようになっている。別の態様において、本発明の第２の発現カセットは、調節ＲＭおよびＳＶ４０ポリ（Ａ）部位をコードする第２の核酸配列の挿入のためのＭＣＳを含み、第２の核酸配列がＭＣＳに挿入されると、これらの機能的配列がこの配列に作動可能に連結されるようになっている。好ましい態様において、第１および第２の発現カセットは、単一ベクターにおいて存在する。
【００２８】
本発明のキットは、本明細書に記載された本発明の発現系の少なくとも１つ、より詳しくは、本発明の医薬組成物、ベクター、または分子（例えば、ＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭ）の少なくとも１つを含む。
【００２９】
［発明の詳細な説明］
例えば、特許、特許出願、雑誌、書籍、およびウェブサイトの刊行物を含む本明細書に引用された参考文献は、その全体が参照により本明細書で援用される。
【００３０】
略語
ＡＡＶ（アデノ関連性ウイルス）
ＡＡＶ−１（アデノ関連性ウイルス、血清型１）
ＡＡＶ−２（アデノ関連性ウイルス、血清型２）
ＡＭ（活性化因子分子）
ＡＭＰ（アンピシリン）
ｂｐ（塩基対）
ＢＲＥＳ−１（ベルレックス（Ｂｅｒｌｅｘ）調節発現系−１）
ＢＧＨ（ウシ成長ホルモン）
ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）
ＤＢＤ（ＤＮＡ−結合ドメイン）
ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）
ＥＡＥ（実験的アレルギー性脳脊髄炎）
ｅｎｈ（エンハンサー）
Ｅ１ｂＴＡＴＡ（アデノウイルスＥ１ｂ遺伝子プロモーターＴＡＴＡボックス）
ＥＢＮＡ−１（エプスタイン・バールウイルス核抗原）
ＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸）
ＥＦ−１α（伸長因子−１アルファ）
ＥＬＡＭ（内皮白血球付着分子）
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）
ＥＰ（エレクトロポレーション）
ＥＰＯ（エリスロポエチン）
ＧＡＬ−４（酵母ＧＡＬ−４タンパク質）
６×ＧＡＬ−４（ＧＡＬ−４ ＤＮＡ結合部位の６つのコピー）
ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ）
ＧＭＣＳＦ（顆粒球マクロファージ刺激因子）
ｈＧＭＣＳＦ（ヒト顆粒球マクロファージコロニー−刺激因子）
ｈＩＦＮ（ヒトインターフェロン）
ｈＩＦＮ−β（ヒトインターフェロン−β）
ｈｒ（時間）
ＨＲ（ホルモン受容体）
ＨＲＥ（低酸素反応性要素）
ｈＧＨ（ヒト成長ホルモン）
ｈＰＲ（ヒトプロゲステロン受容体）
ＨＴＬＶ（ヒトＴ−細胞白血球ウイルス）
ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）
Ｈｙｇｒｏ（ハイグロマイシン）
ＩＦＮ−β（インターフェロン−β）
ＩＦＮ−β１ａ（インターフェロン−β１ａ）
ＩＦＮβ１ｂ（インターフェロン−β１ｂ）
ＩＦＮ  ｓｉｇ  ｓｅｑ（インターフェロンシグナル配列）
ＩｇＫ（免疫グロブリンカッパ）
ｉ．ｍ．またはＩＭ（筋内）
ｉｎｊ．（注射）
ＩＮＲまたはｉｎｒ（転写開始要素）
ＩＰ−１０またはＩＰ−１０（インターフェロン−アルファ誘導的タンパク質１０）
ＩＴＲ（逆方向末端反復）
ｉ．ｐ．またはＩＰ（腹腔内）
ＩＶＳ８（介在配列またはイントロン８）
ｉ．ｖ．またはＩＶ（静脈内）
ＪＥ（ＭＣＰ−１のマウス類似体）
ｋＤＡ（キロダルトン）
ｋａｎ（カナマイシン）
ＫａｎＲ（カナマイシン耐性遺伝子）
ＬＢＤ（リガンド−結合ドメイン）
ＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質）
ＭＣＳ（多重クローニング部位）
ＭＦＰ（ミフェプリストン）
ｍｇ（ミリグラム）
ｍＧＭＣＳＦ（マウス顆粒球マクロファージコロニー−刺激因子）
ｍＩＦＮ（マウスインターフェロン）
ｍＩＦＮ−β（マウスインターフェロン−ベータ）
ｍｌ（ミリリットル）
ｍｉｎ（分）
ＭＣＫ（筋クレアチンキナーゼ）
Ｍｘ１（ＭｘＡのマウス相同体）
ＭｘＡ（ヒトミキソウイルスタンパク質）
ｎｇ（ナノグラム）
ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）
Ｏｒｉ（複製の起点）
ＯｒｉＰ（エプスタイン・バールウイルスの複製起点）
ｐＢＲＥＳ（プラスミドベルレックス（Ｂｅｒｌｅｘ）調節発現系）
ｐ６５（転写調節ドメインのＮＦカッパＢｐ６５タンパク質）
ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）
ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）
ＰＩＮＣ（保護相互作用非凝縮ポリマー）
ｐｇ（ピコグラム）
ｐｋ（薬物動態）
ポリＡまたはポリ（Ａ）（ポリアデニル化部位）
ＰＲ（プロゲステロン受容体）
ｐｒｏ（プロモーター）
ＰＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子のプロモーター）
ｐＵＣ  ｏｒｉ（ｐＵＣプラスミドの複製起点）
ｒ（逆）
ＲＭ（調節分子）
ＲＮＡ（リボ核酸）
ｒｐｍ（毎分回転数）
ＲＴ（室温）
ｓ．ｃ．またはＳＣ（皮下）
ＳＥＡＰ（分泌アルカリホスファターゼ）
ＳＨＲ（ステロイドホルモン受容体）
ｓｈＲＮＡ（短ヘアピンＲＮＡ）
ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）
ｓｋアクチンｐｒｏ（骨格筋プロモーター）
ＳｋＭまたはＳｋ（骨格筋）
ＳＶ４０（シミアンウイルス４０）
ＴＫ（チミジンキナーゼ）
ＴＫｐＡ（チミジンキナーゼポリＡ）
ＴＭ（治療分子）
ＵｂｉＢ（ユビキチンＢ）
ｕｇ（マイクログラム）
５’ＵＴＲ（５’非翻訳領域）
ＵＴ１２（非翻訳領域１２）
ＶＰ−１６（ヘルペスウイルスＶＰ−１６トランス活性化ドメイン）
ｖｏｌ．（体積）
ＷＰＲＥ（ウッドチャック転写後調節要素）
【００３１】
技術および科学用語
本明細書で使用される技術および科学用語は、他に規定がない限り、本発明が関連する当業者に一般的に理解される意味を有する。参照は本明細書で当業者に周知のさまざまな方法に対して行われる。参照が行われるかかる周知の方法を記載している刊行物および他の資料は、全部記載されているかのようにその全体が参照により本明細書に含まれる。組換えＤＮＡ技術の一般原理を記載している標準的基準著作物としては、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．ら（１９８９年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｐｌａｎｖｉｅｗ、ニューヨーク州（Ｎ．Ｙ．）、マックファーソン（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ），Ｍ．Ｊ．編（１９９１年）Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬプレス（Ｐｒｅｓｓ）、Ｏｘｆｏｒｄ、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ），Ｊ．（１９９２年）Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、オックスフォード・サイエンス・パブリケーションズ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、Ｏｘｆｏｒｄ、オーステン（Ａｕｓｔｅｎ），Ｂ．Ｍ．とウェストウッド（Ｗｅｓｔｗｏｏｄ），Ｏ．Ｍ．Ｒ．（１９９１年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓ、ＩＲＬ．プレス（Ｐｒｅｓｓ）、Ｏｘｆｏｒｄが挙げられる。当業者に周知のあらゆる適切な材料および／または方法を本発明の実施において利用できるが、好ましい材料および／または方法が記載されている。参照が以下の説明および実施例において行われる材料、試薬などは、他に言及されていない限り、商業的供給源から入手可能である。
【００３２】
調節発現系
改善された本発明の調節発現系は、対象の細胞に輸送され、発現されうる治療分子（ＴＭ）をコードする核酸を提供し、発現されたＴＭの発現および／または活性は調節可能であり、疾患の治療のために対象に治療的利点を提供する、きわめて革新的な技術である。本発明の調節発現系の利点は、治療分子（ＴＭ）、例えば、対象の細胞におけるタンパク質または核酸のしっかりと修飾される発現を提供することである。本発明の別の利点は、（本明細書に記載されているように）例えば、対象に存在し、または投与される調節分子（ＲＭ）の量、またはＴＭをコードする核酸の配向によって、それぞれ、用量依存または配向依存的に、対象の細胞におけるＴＭの発現および／または活性を提供することである。したがって、本発明の組成物および方法の別の利点は、対象の疾患または病状に特異的な方法で療法を最適化するために使用されうることである。本発現系の別の利点は、一回の注射によって対象に投与可能な単一の核酸ベクターを含みうることである。したがって、本発現系は、周知の核酸ベースの療法またはボーラスタンパク質ベースの療法に対して顕著な利点を提供する。
【００３３】
具体的には、本発明の発現系は、対象の細胞におけるＴＭ（例えば、タンパク質または核酸）の調節された長期の発現を提供し、結果として治療効果をもたらすと同時に、用量限定的副作用を最小限にする。より詳しくは、本発明の発現系を使用する遺伝子療法は、タンパク質の調節された長期の発現を提供し、それによって用量限定的副作用を最小限にし、対象における疾患の治療のためのタンパク質の治療効果を最大限にしうる。例えば、インターフェロンベータ（ＩＦＮ−β）は、疾患の重篤度の軽減およびその進行の減速において多発性硬化症（ＭＳ）を有する対象のための有効なタンパク質薬であることが示されている。しかし、ＩＦＮ−βは、循環において短い半減期を有することが知られている。さらに、タンパク質の頻繁の局所投与は用量依存の副作用をもたらしうる。しかし、本発明の調節発現系を使用することにより、ＩＦＮ−β（例えば、ＩＦＮ−β−１ａ）をコードする核酸が対象の細胞に投与できるとともに、細胞におけるコードされたＩＦＮ−βの発現が長期的に調節され、かつ最適化され、ＭＳの治療のために、ＩＦＮ−β薬の最大限の治療効果および最小限の用量限定的副作用を達成しうる。
【００３４】
１つの実施形態において、小分子活性因子であるＡＭが、経口利用可能な錠剤の形で、プロモーター誘導、およびその後の本発明の調節発現系の核酸配列にコードされたＴＭの発現を制御する。このようにして、対象における循環の発現ＴＭ（例えば、タンパク質または核酸）のレベルは、オン／オフ的におよび／または用量依存的にしっかりと調節されうる。本発明のＡＭは、直接または間接にＴＭの発現を制御しうる。例えば、１つの実施形態において、ＡＭはＲＭを活性化し、これによる活性化ＲＭの存在は、対象の細胞におけるＴＭの発現を調節する（例えば、誘導誘導する）。したがって、本発明の調節発現系の別の利点は、対象の細胞において発現されるＴＭ（例えば、タンパク質または核酸）の連続的対脈動性療法(continuous versus pulsatile therapy)の選択、およびＴＭの治療効果を最適化すると同時にその副作用を最小限にするためのＴＭの発現レベルの調節、を可能にすることである。具体的には、本発明の調節発現系は、ＭＳ対象における連続的および永続的対脈動性のＩＦＮ−βタンパク質療法の選択を初めて可能にする。さらに、本発明の別の利点は、ＴＭをコードする核酸ベクターの反復投与によって、対象の細胞におけるＴＭの再生可能な発現を提供しうることである。
【００３５】
より詳しくは、本調節発現系は、対象の細胞におけるＴＭの発現レベルを調節および最適化することによって、対象特異的または疾患特異的療法の最大限の治療効果および最小限の副作用を達成可能にする。本明細書で使用される「対象特異的」または「疾患特異的」療法なる語は、特定の疾患、疾患の段階、または疾患状態、または症状を有する対象に特異的である治療を指す。例えば、本発明の調節発現系を使用することにより、ＭＳを有する対象の細胞において発現されるＩＦＮ−βのレベルが修飾され、最適化され、ＭＳ（例えば、再発寛解型、一次進行性、または二次進行性）の特定の状態、症状、または段階の治療のために、またはＩＦＮ−βに対する対象の反応または耐性に従って、最大限の治療効果および最小限の副作用を達成しうる。
【００３６】
より具体的には、本発明は、疾患の治療のための改善された調節遺伝子発現系、および医薬組成物、およびその方法を提供する。コードされたＴＭは、疾患を有する、またはそれにかかりやすい対象に治療的利点を提供する核酸またはタンパク質でありうる。本明細書で使用される、「治療的利点」または「治療活性」として、疾患の開始または進行、または疾患の症状または状態の改善、変調、減少、抑制、安定化、もしくは予防、遅延、または減速が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「対象」は、哺乳類（例えば、ヒト）を指し、より詳しくは、疾患の治療を必要とする哺乳類を指す。「治療」、「治療すること」、「治療する」、またはその文法上の相当語句は、疾患の段階、症状、または状態を含め、疾患に対して対象に治療的利点を提供することを指す。本明細書で使用される「疾患」は、疾患の段階、症状、状態、もしくは病理、または疾患の遺伝的素因を包含する。かかる疾患は自己免疫または炎症性疾患でありうる。一部の実施形態において、疾患は癌である。一部の実施形態において、疾患は、例えば、多発性硬化症、白血病、黒色腫、肝炎、または心筋症である。さらに、改善された本発明の調節発現系は、動物ゲノム（例えば、マウスゲノム）における工学的変更の新規な方法を提供し、動物モデルにおける遺伝子機能が正確に分析され、ヒト疾患の確かな動物モデル（例えば、マウスモデル）が生成されうる。具体的には、改善された本発明の調節発現系は、本系を使用することにより、標的分子、例えば、動物ゲノムにおける標的遺伝子（または本発明の他の分子）の発現が時間的および空間特異的に調節されうるという点で生物医学的研究の貴重な手段を提供する。
【００３７】
さらに、改善された本発明の調節発現系は、インビトロおよびインビボで標的ｓｈＲＮＡの選択的または単独の発現の新規な方法を提供する。例えば、本発明の調節発現系を使用することにより、ポリメラーゼＩＩ（ＰＯＬＩＩ）ベースの発現系が修飾され、標的ｓｈＲＮＡを選択的にまたは単独で生成しうる。例えば、標的ｓｈＲＮＡを単独で生成するために、本調節発現系を修飾して用い、イントロン含有遺伝子にＰＯＬ  ＩＩプロモーターを作動可能に連結し、標的ｓｈＲＮＡを発現するためのＭＩＲ配列を包含することにより、スプライスされたイントロンが加工されることによって、ｓｈＲＮＡを生成することができる。また、例えば、本ベクターおよび本明細書に記載された発現カセットのＲＭタンパク質標的化ＧＡＬ−４結合部位をＵ６プロモーターの上流に挿入して、ｐ６５転写活性化因子をポリメラーゼＩＩＩ（ＰＯＬ  ＩＩＩ）活性化因子（例えば、Ｏｃｔ−２Ｑ）と交換するさらなる潜在的な修飾を有するＲＭ反応系を創出できる可能性がある。
【００３８】
１つの実施形態において、本発明は、対象の細胞に輸送されると、コードされたＴＭが発現し、ＴＭの発現および／または活性が調節分子（ＲＭ）の存在下で調節されるような、ＴＭをコードする核酸配列を有する少なくとも１つの第１の発現カセットを含む改善された調節発現系を提供する。本明細書で使用される、本発明の分子（例えば、ＴＭ）の活性および／または発現の「調節」は、結果として、例えば、かかる分子の活性および／または発現の誘導、抑制、増加、または減少をもたらす分子の発現および／または活性の変調を指す。かかる調節の別の例としては、本発明の分子（例えば、ＴＭ）の量、配座、シグナル変換、結合特異性、半減期、安定性、または他の細胞性修飾またはプロセシングの変調が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態においては、本発現系のＴＭが調節される。しかし、本発現系における調節に適切である他の分子の例としては、本明細書に記載されているように、ＲＭ、活性化因子分子（ＡＭ）、および不活性化因子分子（ＩＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
本発明の１つの実施形態において、ＴＭの発現および／または活性は用量−反応性または用量依存的に、例えば、対象の細胞に存在する、または対象に投与されるＲＭの量に従って調節される。他の実施形態において、ＴＭの発現および／または活性は用量−反応性または用量依存的に、例えば、対象の細胞に存在する、または対象に投与される活性化因子分子（ＡＭ）、または不活性化因子分子（ＩＭ）の量に従って調節される。１つの実施形態において、ＴＭの発現および／または活性は、対象の細胞に存在する、または対象に投与される同じＴＭまたは異なるＴＭの量に従って用量−反応性または用量依存的に調節される。本明細書で使用される「用量−反応性」または「用量依存的」は、本発明の分子（例えば、ＴＭ）の発現および／または活性と、第２の分子の対象の細胞における存在、または投与、特定の用量または量との相関を指す。かかる第２の分子の例としては、ＲＭ、ＡＭ、ＩＭ、またはＴＭが挙げられるが、これらに限定されない。第２の分子の別の例としては、細胞分子、例えば、バイオマーカー（例えば、疾患と関係したバイオマーカー）が挙げられる。
【００４０】
本明細書で使用される「対象の細胞」は対象からの自己細胞、または対象からではなく、本明細書に記載されているように、対象に輸送または投与される異種細胞（またはドナー細胞）を指す。好ましくは、自己細胞は対象に存在し、および異種細胞は対象に輸送され、対象に存在する。好ましい実施形態において、本発明の組成物、例えば、ＴＭおよび／またはＲＭをコードするベクターは、対象の自己細胞にインビボで輸送され、コードされた分子が対象に存在する細胞において発現するようになっている。１つの実施形態において、本発明の組成物、例えば、ＴＭおよび／またはＲＭをコードするベクターは、対象の自己または異種細胞にエクスビボで輸送され、次いで処置細胞が対象に輸送され、コードされた分子が対象に存在する細胞において発現するようになっている。
【００４１】
本発明の別の実施形態において、ＴＭの発現および／または活性は配向依存的である。本明細書で使用される「配向依存的」は、本発明のＴＭをコードする発現カセットの５’〜３’の配向、または本発明のコードされたＴＭの転写または翻訳の５’〜３’の方向を指し、一部の実施形態において、配向は以下に関するものである：発現カセットを含む、またはＴＭをコードするベクター；同じベクター上の別の発現カセットの配向；または同じベクターによってコードされた別の分子の発現の配向。例えば、１つの実施形態において、細胞におけるＴＭの発現および／または活性は、ＴＭをコードする発現カセットの５’〜３’の配向に対して、またはコードされたＴＭの転写または翻訳の５’〜３’の配向に対して修飾される。したがって、ＴＭ発現および／または活性は、ＴＭをコードする発現カセットの特定の配向またはＴＭの転写または翻訳の配向の選択によって修飾されうる。
【００４２】
本発明の調節発現系は、ＴＭをコードする少なくとも１つの発現カセットを含み、また本発明の分子、例えば、ＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭの１つもしくはそれ以上をコードする追加の発現カセットを含みうる。さらに、１つもしくはそれ以上の発現カセットは単一ベクター、または２つ以上のベクターに存在しうる。さらに、本発明は単一のＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭに限定されず、本発明のＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭの１つもしくはそれ以上または多数を有する実施形態を包含し、これらは単一ベクターまたは２つ以上のベクターに単独でまたは一緒に存在しうる。本明細書で使用される「ベクター」は、本発明の分子、例えば、ＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭの１つもしくはそれ以上をコードする核酸配列を細胞に挿入し、発現させるために適した核酸を指す。本明細書で使用される「発現カセット」は、本発明の分子（例えば、タンパク質または核酸ＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭ）の細胞における発現のための必要成分または機能的配列をコードする核酸を指し、ここでその分子は発現カセットに操作可能に挿入され（例えば、発現カセットのクローニング部位で）、発現カセットの機能的配列に作動可能に連結された核酸によってコードされる。本明細書で使用される「作動可能に連結される」または「操作可能に挿入される」配列は、それぞれの配列機能が、意図したように、周知のように、および／または特定の結果を達成するように、別の配列と融合、結合、付着、または接合される配列を指す（例えば、コードされた遺伝子の転写を促進するために遺伝子配列に作動可能に連結されるプロモーター配列）。
【００４３】
図１Ａおよび１Ｂは以下を含む本発明の調節発現系の非限定的例を示す：１）治療分子（ＴＭ）をコードする第１の核酸配列およびＤＮＡ結合部位（ＤＢＳ）をコードする第１のプロモーター配列、および第１の核酸配列に作動可能に連結されるＴＡＴＡ配列を含む第１の発現カセット；２）調節分子（ＲＭ）をコードする第２の核酸配列および第２の核酸配列に作動可能に連結される第２のプロモーター配列を含む第２の発現カセット（ここでＲＭはＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）、および調節ドメイン（ＲＤ）、より具体的には、図１Ｂにおける活性化ドメイン（ＡＤ）を含む）；および４）活性化または不活性化ＲＭの存在がＴＭの発現および／または活性を調節するように、それぞれＲＭを活性化し、またはＲＭを不活性化する活性化因子または不活性化因子分子（Ａ／ＩＭ）。
【００４４】
１つの実施形態において、第１の発現カセットは次の作動可能に連結される機能的配列を含む。すなわち、６ｘＧＡＬ−４ ＤＢＳ、Ｅ１ｂＴＡＴＡ、および転写開始部位（例えば、配列番号１）、５’非翻訳領域ＵＴ１２（例えば、配列番号２）、合成イントロンＩＶＳ８（例えば、配列番号３）、多重クローニング部位（例えば、配列番号４または配列番号５）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化（ポリ（Ａ））部位（例えば、配列番号６）、そして第２の発現カセットは次の作動可能に連結される機能的配列を含む。すなわち、ニワトリ骨格筋アルファ−アクチンプロモーター（例えば、配列番号７）およびＳＶ４０ポリ（Ａ）部位（例えば、配列番号８）。好ましい実施形態において、第１および第２の発現カセットは単一ベクターに存在する（例えば、図１Ａ−Ｂに図式的に示されているように）。別の好ましい実施形態において、ベクターは単一プラスミドベクター、例えば、ｐＧＴ１（配列番号９および配列番号４の配列を含む）、ｐＧＴ２（配列番号１０および配列番号４の配列を含む）、ｐＧＴ３（配列番号１１および配列番号４の配列含む）、またはｐＧＴ４（配列番号１２）（ここで各々のベクターは、ＩＶＳ８の３’およびｈＧＨポリ（Ａ）部位の５’に位置した多重クローニング部位（配列番号４）（例えば、図１４Ａ−Ｄに図式的に示されているように）を含む）、またはｐＧＴ１１（配列の配列番号９および配列番号５の配列を含む）、ｐＧＴ１２（配列番号１０および配列番号５の配列含む）、ｐＧＴ１３（配列番号１１および配列番号５の配列を含む）、またはｐＧＴ１４（配列番号１２および配列番号５の配列を含む）（ここで各々のベクターは、ＩＶＳ８の３’およびｈＧＨポリ（Ａ）部位の５’に位置した多重クローニング部位（配列番号５）含む）である。
【００４５】
さらに、好ましい実施形態において、ＴＭはＩＦＮ−βまたはＧＭＣＳＦである。例えば、１つの実施形態において、第１の核酸配列は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むヒトＩＦＮ−β１ａであり、配列番号１４の核酸配列によってコードされる、ＴＭをコードする。別の実施形態において、第１の核酸配列は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むマウスＩＦＮ−βであり、配列番号１６の核酸配列によってコードされる、ＴＭをコードする。別の実施形態において、第１の核酸配列は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むヒトＧＭＣＳＦであり、配列番号１８の核酸配列によってコードされる、ＴＭをコードする。別の実施形態において、第１の核酸配列は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むマウスＧＭＣＳＦであり、配列番号２０の核酸配列によってコードされる、ＴＭをコードする。さらに、好ましい実施形態において、ＲＭは野生型または天然由来プロゲステロン受容体（ＰＲ）の変異体である。例えば、１つの実施形態において、第２の核酸配列は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む突然変異型ＰＲであり、配列番号２１の核酸配列によってコードされる、ＲＭをコードする。
【００４６】
好ましい実施形態において、ＴＭをコードする核酸配列は、単一プラスミドベクターの第１の発現カセットのＭＣＳのＳｐｅ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉ制限酵素部位へ挿入またはクローン化される。１つの実施形態において、ＴＭをコードする核酸配列を含む単一プラスミドベクターは、例えば、ｐＧＴ２３（配列番号２３）、ｐＧＴ２４（配列番号２４）、ｐＧＴ２５（配列番号２５）、またはｐＧＴ２６（配列番号２６）であり（ここでコードされたＴＭは、（例えば、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、および／または配列番号１６を含む核酸配列によってコードされる）マウスＩＦＮ−βである）、コードされたＴＭおよび挿入された核酸配列の転写の５’−３’配向は図１５Ａに図式的に示されている（矢印を参照）。別の実施形態において、ＴＭをコードする核酸配列を含む単一プラスミドベクターは、例えば、ｐＧＴ２７（配列番号２７）、ｐＧＴ２８（配列番号２８）、ｐＧＴ２９（配列番号２９）、またはｐＧＴ３０（配列番号３０）であり（ここでコードされたＴＭは、（例えば、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、および／または配列番号１４を含む核酸配列によってコードされる）ヒトＩＦＮ−βである）コードされたＴＭおよび挿入された核酸配列の転写の配向は図１５Ｂに図式的に示されている（矢印を参照）。
【００４７】
さらに、１つの実施形態において、単一プラスミドベクターは、ベクター骨格（例えば、配列番号１２）、ＭＣＳ（例えば、配列番号３１）、およびＳｐｅＩ−ＮｏｔＩフラグメント（配列番号３１）の核酸配列を含み、ここでそのフラグメントはマウスＩＦＮ−βであるＴＭをコードし、ＭＣＳのＳｐｅI−ＮｏｔI部位へのフラグメントの挿入に適合的に５’末端にＳｐｅI配列、３’末端にＮｏｔI配列を有し、ＭＣＳのＳｐｅI−ＮｏｔI部位に挿入される。さらに、１つの実施形態において、単一プラスミドベクターは、ベクター骨格（例えば、配列番号１２）、ＭＣＳ（例えば、配列番号３２）、およびＳｐｅI−ＮｏｔIＳｐｅI−ＮｏｔIフラグメント（配列番号３１）の核酸配列を含み、ここでそのフラグメントはヒトＩＦＮ−βであるＴＭをコードし、ＭＣＳのＳｐｅI−ＮｏｔI部位へのフラグメントの挿入に適合的に５’末端にＳｐｅI配列、３’末端にＮｏｔI配列を有し、ＭＣＳのＳｐｅI−ＮｏｔI部位に挿入される。
【００４８】
さらに、１つの実施形態において、ＡＭはＲＭに結合し、ＲＭを活性化し、それによって活性化ＲＭはＴＭ配列に作動可能に連結されるプロモーター配列のＤＢＳに結合し、結果として細胞（例えば、哺乳類細胞）におけるＴＭ発現および／または活性の誘導をもたらす。しかし、別の実施形態において、不活性化因子分子（ＩＭ）はＲＭに結合し、ＲＭを不活性化し、それによって不活性化ＲＭはＴＭプロモーターのＤＢＳに結合することはなく、結果としてＴＭ発現および／または活性の誘導の抑制または欠如をもたらす。図１Ｂに示された実施例の１つの実施形態において、活性化因子分子（ＡＭ）はＲＭのＬＢＤに結合し、ＲＭを活性化し、それによって活性化ＲＭはＴＭ配列に操作可能に結合されるプロモーターのＤＢＳに結合するホモ二量体を形成し、結果として細胞（例えば、哺乳類細胞）におけるＴＭ発現および／または活性の誘導をもたらす。図１Ａおよび１Ｂに示された実施例の別の実施形態において、第１および第２の発現カセットは単一ベクターに存在する。別の好ましい実施形態において、ＴＭをコードする第１の発現カセット、および本発明のＲＭをコードする第２の発現カセットは単一ベクター（例えば、ｐＧＴ２３（配列番号２３）、ｐＧＴ２４（配列番号２４）、ｐＧＴ２５（配列番号２５）、ｐＧＴ２６（配列番号２６）、ｐＧＴ２７（配列番号２７）、ｐＧＴ２８（配列番号２８）、ｐＧＴ２９（配列番号２９）、またはｐＧＴ３０（配列番号３０））に存在する。
【００４９】
本明細書で使用される「治療分子」または「ＴＭ」は、治療活性を有する、または治療的利点を提供する分子を指す。本発明のＴＭは、単離ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはタンパク質、または核酸配列によってコードされ、治療活性を有するその変異体でありうる。本明細書で使用される「変異体」としては、突然変異タンパク質、例えば、単離ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、または化合物の突然変異タンパク質が挙げられる。より詳しくは、本発明のＴＭは、修飾、合成、または組換えＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質でありうる。本明細書で使用される「修飾」は、例えば、突然変異型、融合、またはキメラ分子を含む、化学的、合成的、または組換え技術によって修飾される分子を包含する。１つの実施形態において、コードされたＴＭは、対象の細胞において発現され、切断され、または加工され、それによって多重ＴＭ、または活性化ＴＭ、または発現および非開裂または非加工ＴＭとは異なるＴＭを生じるタンパク質である。本発明の別の実施形態において、コードされたＴＭは治療活性を有する核酸（例えば、ＲＮＡ）である。１つの実施形態において、コードされたＲＮＡは、対象の細胞において多重にまたは異なってスプライスされる多重スプライス部位をコードする。一部の実施形態において、多重にまたは異なってスプライスされたＲＮＡは、同様のもしくは別個の治療活性を有する、異なるまたは変異体タンパク質をコードする、または異なるまたは変異体ＲＮＡを含む。一部の実施形態において、多重にまたは異なってスプライスされるＲＮＡは、特定の因子、疾患、状態、または組織の存在に応じてスプライスされる。
【００５０】
本発明の別の実施形態において、コードされたＴＭは、治療活性を有するタンパク質、好ましくは、ヒトタンパク質またはその変異体である。別の実施形態において、かかるタンパク質をコードする核酸配列は、遺伝子または遺伝子フラグメントである。１つの実施形態において、ＴＭは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）である。別の実施形態において、ＴＭはインターフェロン、例えば、インターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−β）、およびより詳しくは、ＩＦＮ−β１ａまたはＩＦＮ−β１ｂである。一部の実施形態においてコードされたＴＭは抗体、好ましくはモノクローナル抗体（例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ）である。モノクローナル抗体をコードする適切な配列は、当業界で周知の方法を使用することにより同定および作成でき、本明細書に記載されているように、本発明の調節発現系のベクターへ挿入できる。モノクローナル抗体の治療活性は報告されている（例えば、ガット（Ｇａｔｔｏ），Ｂ．（２００４年）４：４１１−４１４頁、グローナー（Ｇｒｏｎｅｒ）ら（２００４年）４：５３９−５４７頁を参照）。
【００５１】
本明細書で使用される「調節分子」または「ＲＭ」は、本発明のＴＭの発現および／または活性を調節する分子を指す。本発明のＲＭによるかかる調節の例としては、ＴＭ発現および／または活性の変調、より詳しくは、本発明のＲＭによるＴＭ発現および／または活性の増加、減少、活性化（または誘導）、または不活性化（または抑制）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに本発明のＲＭによるＴＭ発現および／または活性のかかる変調は、直接的（例えば、ＲＭのＴＭとの直接接触）または間接的（例えば、ＲＭがシグナル変換経路中の分子に作用すると、ＴＭ発現および／または活性の変調が起こる場合）でありうる。さらに、本発明の調節発現系において使用するために適切なＲＭの例としては、本発明のＴＭの細胞発現、活性、またはプロセシングをもたらす分子が挙げられるが、これらに限定されない。かかる適切なＲＭに例としては、転写調節分子（例えば、発現ＴＭのＲＮＡの転写を活性化し、不活性化し、減少させ、または増加させる）、ＲＮＡプロセシング分子（例えば、発現ＴＭのＲＮＡのＲＮＡスプライシング、ポリアデニル化、または切断などのＲＮＡプロセシングを活性化し、不活性化し、減少させ、または増加させる分子）、またはタンパク質翻訳またはタンパク質の翻訳後プロセシングをもたらす分子（例えば、発現ＴＭのタンパク質の特定の配座または多量体形態のリン酸化、切断、または形成を活性化し、不活性化し、減少させ、または増加させる酵素）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
本発明のＲＭは天然由来もしくは単離分子、またはその変異体でありうる。一部の実施形態において、本発明のＲＭは合成または組換え分子である。例えば、一部の実施形態において、本発明のＲＭは化合物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質である。さらに、一部の実施形態において、本発明のＲＭは修飾分子である。１つの実施形態において、ＲＭはヒト化タンパク質である。別の実施形態において、ＲＭはヒトタンパク質またはその変異体である。例えば、１つの実施形態において、ＲＭは転写活性化因子、例えば、ステロイド受容体、より詳しくは、プロゲステロン受容体である。１つの実施形態において、ＲＭはトランス活性化ドメイン（例えば、ＶＰ１６またはｐ６５トランス活性化ドメイン（例えば、シュミッツ（Ｓｃｈｍｉｔｚ）ら（１９９１年）ＥＭＢＯ  Ｊ  １０：３８０５−３８１７頁、ムーア（Ｍｏｏｒｅ）ら（１９９３年）Ｍｏｌｅｃ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３：１６６６頁、ブレア（Ｂｌａｉｒ）ら（１９９４年）Ｍｏｌｅｃ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４：７２２６−７２３４頁を参照）、および／または共活性化因子（例えば、ｐ３００／ＣＢＰ）、基礎転写因子（例えばＴＦＩＩＢ）、またはヒストンアセチルトランスフェラーゼ（例えば  ｐ３００／ＣＢＰまたはＰ／ＣＡＦ、ラッチマン（Ｌａｔｃｈｍａｎ），Ｄ（２００４年）Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｓ、エルセビア・アカデミック・プレス（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｌｏｎｄｏｎ、グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）ら（２０００年）Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｌ  １４：１５５３−１５７７頁、シカマ（Ｓｈｉｋａｍａ）ら（１９９７年）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ  ７：２３０−２３６頁）の他の機能的ドメイン（例えば、基礎因子相互作用ドメイン（ｂａｓａｌ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）を含む。別の実施形態において、ＲＭはリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を含む。さらに、１つの実施形態において、ＡＭはＲＭのＬＢＤに結合し、それによってＲＭを活性化し、活性化ＲＭの存在がＴＭ発現および／または活性を調節するようになっている。別の実施形態において、ＲＭはＤＢＤ、例えば、ＧＡＬ−４ＤＢＤを含む。１つの実施形態において、ＲＭは、ＴＭをコードする核酸に作動可能に連結される機能的配列（例えば、プロモーター配列）に結合し、それによってＴＭ発現を調節する（例えば、ＴＭ発現を誘導誘導する）ＤＢＤを含む。
【００５３】
別の実施形態において、本発明のＲＭは活性化因子分子（ＡＭ）によって活性化され、それによって、ＴＭ発現および／または活性は活性化ＲＭの存在下で調節される。本明細書で使用される「活性化因子分子」または「ＡＭ」は、本発明のＲＭの発現および／または活性を誘導または増加させる分子を指す。ＡＭによるかかる活性化の例としては、本発明のＲＭの発現および／または活性の誘導または増加が挙げられるが、これらに限定されない。さらに本発明のＡＭによるＲＭ発現および／または活性のかかる活性化は、直接的（例えば、ＡＭのＲＭとの直接接触による）または間接的（例えば、ＡＭがシグナル変換経路の分子に作用すると、ＲＭ発現および／または活性の変調が起こる場合）でありうる。さらに本発明の調節発現系において使用するために適切なＡＭの例としては、本発明のＲＭの細胞プロセシングをもたらす分子が挙げられるが、これに限定されない（かかる細胞プロセシングの例は、例えば、上記の本明細書に記載されている）。
【００５４】
１つの実施形態において、ＡＭはバイオマーカーである。別の実施形態において、ＡＭは疾患または状態のバイオマーカーであり、より詳しくは、病状または状態、またはその症状のバイオマーカーである。１つの実施形態において、ＡＭは、ＲＭの立体構造変化、酵素プロセシングまたは修飾、特異的結合、または二量化を促進または阻害することによってＲＭを活性化する。好ましい実施形態において、ＡＭは、ＲＭのホモ二量化を促進することによってＲＭを活性化する。１つの実施形態において、ＡＭは、ＲＭに、より詳しくは、ＲＭの機能的ドメイン、例えば、ＲＭのＡＤに結合することによってＲＭを活性化する。
【００５５】
本発明のＡＭは天然由来もしくは単離分子、またはその変異体でありうる。一部の実施形態において、本発明のＡＭは合成または組換え分子である。例えば、一部の実施形態において、本発明のＡＭは化合物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質である。さらに、一部の実施形態において、本発明のＡＭは修飾分子である。１つの実施形態において、ＡＭはヒト化タンパク質である。別の実施形態において、ＡＭはヒトタンパク質またはその変異体である。１つの実施形態において、ＡＭは化合物、例えば、抗プロゲスチンである。好ましい実施形態において、ＡＭはミフェプリストンである。
【００５６】
１つの実施形態において、本発明の調節発現系は以下を含む。すなわち、１）ＴＭをコードする第１の核酸配列、および少なくとも１つのＧＡＬ−４ ＤＮＡ結合部位（ＤＢＳ）、より詳しくは、上流に位置し、第１の核酸配列に作動可能に連結される６つのＧＡＬ−４ ＤＢＳ（６ＸＧＡＬ−４ ＤＢＳ）を有する第１の発現カセット、２）ＶＰ−１６ＡＤまたはｐ６５ＡＤ（例えば、配列番号３９の核酸配列または配列番号４０のアミノ酸配列を含むｐ６５ＡＤ）、プロゲステロン（ＰＲ）ＬＢＤ、およびＧＡＬ−４ＤＢＤを含む修飾プロゲステロン受容体であるＲＭをコードする第２の核酸配列、および上流に位置し、第２の核酸配列に作動可能に連結されるアクチンプロモーター配列を有する第２の発現カセット、および３）小分子誘導剤であるＡＭ、例えば、対象に経口投与されると、対象の細胞における発現ＲＭを活性化し、それによって活性化ＲＭが、６ＸＧＡＬ−４ ＤＢＳに結合する二量体を形成し、コードされたＴＭの発現を誘導するするミフェプリストン（ＭＦＰ）。好ましい実施形態において、第１のおよび第２の発現カセットは単一ベクターに存在する。
【００５７】
別の実施形態において、本発明のＲＭは転写制御因子、より詳しくは、突然変異型ステロイド受容体である。１つの実施形態において、ＲＭは突然変異型ヒトＰＲ（ｈＰＲ）であり、突然変異型ｈＰＲ受容体ＬＢＤ（例えば、約１９−６６個のアミノ酸のＣ末端欠損を有する）を含み、ここでＲＭは、突然変異型ＰＲがそれから由来した野生型ＰＲのアンタゴニストであるＡＭの存在下で活性化される。別の実施形態において、本発明のＲＭは、調節ドメイン（ＲＤ）、例えば、活性化ドメイン（ＡＤ）、より詳しくは、トランス活性化ドメイン（ＴＤ）を含む。本発明のＲＭにおいて使用するための適切な調節ドメインの例としては、当業界で周知または本明細書に記載されているもの（例えば、ＴＡＦ−１、ＴＡＦ−２、ＴＡＵ−１、およびＴＡＵ−２）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
別の実施形態において、本発明のＲＭは不活性化され、それによってＴＭ発現および／または活性が不活性化ＲＭの存在下で調節される。本明細書で使用される「不活性化因子分子」または「ＩＭ」は、本発明のＲＭの発現および／または活性を不活性化する分子を指す。ＩＭによるかかる不活性化の例としては、本発明のＲＭの発現および／または活性の抑制または減少が挙げられるが、これらに限定されない。さらに本発明のＩＭによるＲＭ発現および／または活性のかかる不活性化は、直接的（例えば、ＩＭのＲＭとの直接接触による）または間接的（例えば、ＩＭがシグナル変換経路の分子に作用すると、ＲＭ発現および／または活性の変調が起こる場合）でありうる。さらに本発明の調節発現系において使用するために適切なＩＭの例としては、本発明のＲＭの細胞プロセシングをもたらす分子が挙げられるが、これに限定されない（かかる細胞プロセシングの例は、例えば、上記の本明細書に記載されている）。
【００５９】
１つの実施形態において、本発明のＲＭは活性化形態で対象の細胞において発現し、または存在し、不活性化因子分子（ＩＭ）の存在下で不活性化し、それによって、ＴＭ発現および／または活性が不活性化ＲＭによって調節される。別の実施形態において、ＩＭはバイオマーカーである。別の実施形態において、ＩＭは疾患または状態のバイオマーカーであり、より詳しくは、病状または状態、またはその症状のバイオマーカーである。１つの実施形態において、ＩＭはＲＭの立体構造変化、酵素プロセシング、特異的結合、または二量化を促進または阻害することによってＲＭを不活性化する。好ましい実施形態において、ＩＭはＲＭのホモ二量化を阻害することによってＲＭを不活性化する。１つの実施形態において、ＩＭはＲＭに、より詳しくは、ＲＭの機能的ドメイン、例えば、ＲＭのＡＤに結合することによってＲＭを不活性化する。
【００６０】
本発明のＩＭは天然由来もしくは単離分子、またはその変異体でありうる。一部の実施形態において、本発明のＩＭは合成または組換え分子である。例えば、一部の実施形態において、本発明のＩＭは化合物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質である。さらに、一部の実施形態において、本発明のＩＭは修飾分子である。１つの実施形態において、ＩＭはヒト化タンパク質である。別の実施形態において、ＩＭはヒトタンパク質またはその変異体である。好ましい実施形態において、ＩＭは化合物である。
【００６１】
本発明のＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭの発現は構成的または一時的でありうる。一部の実施形態において、ＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭの発現は調節され、または組織特異的（例えば、筋特異的）である。調節されるＲＭの例としては、ＡＭによって活性化され、またはＩＭによって不活性化されるＲＭが挙げられるが、これに限定されない。１つの実施形態において、本発明のＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭの発現は調節プロモーターまたは組織特異的プロモーターによって推進される。別の実施形態において、調節または組織特異的プロモーターはＲＭの存在下で、より詳しくは、ＲＭがそのプロモーターに結合することによって調節される。例えば、１つの実施形態において、組織特異的プロモーターは筋特異的プロモーター、より詳しくは、アクチンプロモーターである。１つの実施形態において、本発明のＲＭは、ＴＭをコードする核酸配列に作動可能に連結されるプロモーターに結合し、それによって、対象の細胞において、本明細書に記載されているようにコードされたＴＭの発現を調節する。
【００６２】
本発明のＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭは、例えば以下で本明細書に記載されているように、核酸、タンパク質、および化合物の周知の方法およびアッセイを使用することにより単離、産生、および修飾されうる。
【００６３】
医薬組成物および治療方法
本発明は、本明細書に記載されているように、改善された本発明の調節発現系を含むさまざまな疾患の治療のための医薬組成物および方法をも提供する。
【００６４】
特定の実施形態において、本発明は、疾患または状態を治療し、ＴＭの発現を調節し、ＴＭを投与し、ＴＭを輸送し、または対象の細胞においてＴＭを発現させるための医薬組成物および方法を提供し、この方法は、対象における細胞を本発明の調節発現系と接触させることを含み、コードされたＴＭが対象の細胞において発現し、かかるＴＭ発現がＲＭの存在下で調節されるようになっている。
【００６５】
本発明の医薬組成物は、本発明のＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭの少なくとも１つを含み、一部の実施形態において、かかる分子をコードする核酸配列は単一ベクターまたは２つ以上のベクターにおいて単独でまたは一緒に存在する。他の実施形態において、本発明の医薬組成物は、ＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭの各々の２つ以上、およびその２つ以上の種類（例えば、第１および第２のＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、および／またはＩＭ）を含みうる。より詳しくは、本発明の医薬組成物は、ＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭの各々の２つ以上、およびその２つ以上の種類をコードする核酸配列を含みうる。１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、本発明のベクターの少なくとも１つ（例えば、ｐＧＴ２３（配列番号２３）、ｐＧＴ２４（配列番号２４）、ｐＧＴ２５（配列番号２５）、ｐＧＴ２６（配列番号２６）、ｐＧＴ２７（配列番号２７）、ｐＧＴ２８（配列番号２８）、ｐＧＴ２９（配列番号２９）、またはｐＧＴ３０（配列番号３０））を含む。
【００６６】
一部の実施形態において、医薬本発明の組成物は、本発明のＡＭまたはＩＭの少なくとも１つを含む。１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、ＴＭおよび／またはＲＭの少なくとも１つをコードする１つもしくはそれ以上のベクターを含む。本発明のＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭは、本明細書に記載された、または当業界で周知の適切な手段を使用することにより、個別にまたは一緒に、エクスビボまたはインビボで対象に投与されうる。かかる適切な投与の手段の例としては、注射（例えば、筋内または皮下注射）、経口投与、およびエレクトロポレーションが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、本発明のＴＭおよびＲＭは単一ベクターに存在し、ＲＭを活性化するＡＭとは個別に投与される（それによって、活性化ＲＭの存在はＴＭ発現および／または活性を調節する）。別の実施形態において、ＡＭは対象に経口投与される化合物（例えば、ミフェプリストン）であり、ＴＭおよびＲＭをコードする単一ベクターは、対象の細胞（例えば、骨格筋細胞）に注射またはエレクトロポレーションによって投与される単一ベクターである。さらに本発明の組成物を投与するための適切な手段の例としては、組成物、例えば、ＴＭおよび／またはＲＭをコードする核酸ベクターの対象の細胞へのエクスビボ輸送、次いでコードされた分子が対象の細胞において発現されるように処置細胞の対象への輸送が挙げられる（例えば、スタデニー（Ｓｔｕｄｅｎｙ）ら（２００４年）Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ９６（２１）：１５９３−１６０３頁、スタデニー（Ｓｔｕｄｅｎｙ）ら（２００２年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ６２（１３）：３６０３−３６０８頁を参照）。
【００６７】
１つの実施形態において、本発明の調節発現系は、注射によって対象に投与される治療的遺伝子（例えば、ＩＦＮ−β遺伝子）をコードする核酸配列を含む。本明細書で使用される「治療的遺伝子」は、ＴＭ、例えば、治療活性を有するタンパク質（例えば、ＩＦＮ−β１ａまたは１ｂ）をコードする遺伝子を指す。特定の実施形態において、遺伝子はＩＦＮ−β１ａであり、本発明のベクターを使用して単回筋内注射で定期的に（例えば３〜６ヵ月）投与される。他の実施形態において、治療的遺伝子は１−３ヵ月、３〜６ヵ月、６〜９ヵ月、または９〜１２ヵ月ごとに投与される。別の実施形態において、発現タンパク質の循環レベルの調節は、標的対象細胞または組織におけるコードされたタンパク質の発現を推進するプロモーターの制御された誘導によって達成される。
【００６８】
好ましい実施形態において、ＲＭは、プロモーター誘導、およびその後のＴＭ、より詳しくは、治療的遺伝子の発現を制御する、経口利用可能な錠剤の形態での小分子活性化因子である。このようにして、循環における発現ＴＭ（例えば、タンパク質または核酸）のレベルは、オン／オフ的に、および／または用量依存的にしっかりと調節されうる。したがって、本発明の調節発現系は初めて、連続的対脈動性療法におけるＴＭ（例えば、タンパク質または核酸）の選択、および、ＴＭの治療効果を最適化すると同時にその副作用を最小限にするための、ＴＭの発現レベルの変調を可能にする。具体的には、本発明の調節発現系は、対象における連続的対脈動性ＴＭ療法の選択を初めて可能にし、より詳しくは、疾患の治療のために、対象の細胞におけるＴＭの発現レベルを調節し、最適化して最大限の治療効果および最小限の副作用を達成することによって対象特異的療法を可能にする。
【００６９】
本発明の調節発現系を使用することにより、ＴＭ（例えば、タンパク質または核酸）をコードする核酸は、疾患の治療のために、対象の標的細胞に輸送されうる。より詳しくは、本発明の調節発現系を使用することにより、ＴＭをコードする核酸は、発現ＴＭが治療有効用量または量で提供されるように、対象の標的細胞に輸送されうる。本明細書で使用される本発明のＴＭの「治療有効用量」または「治療有効量」は、疾患の治療を必要とする対象の細胞に存在すると、結果として対象に治療的利点をもたらす（すなわち、結果として疾患の治療をもたらす）用量または量である。さらに、対象に投与される、または対象の細胞に存在するＴＭをコードする核酸の適切な量または用量、または、対象の細胞に投与され、および／または存在し、結果として、対象の細胞におけるＴＭの存在および／またはＴＭの治療有効量をもたらす、ＲＭ、ＡＭ、もしくはＩＭ、またはＲＭ、ＡＭ、もしくはＩＭをコードする核酸の量または用量は、当業者によって実験的に測定されうる。例えば、１つの実施形態において、対象に投与されるＲＭまたはＲＭをコードする核酸の適切な用量または量は、治療有効用量が達成されるように、対象の細胞におけるＴＭ発現および／または活性のＴＭを調節する（例えば、誘導する）用量または量である。
【００７０】
治療有効用量を構成するＴＭの量に影響を及ぼす因子としては、治療される疾患の重篤度および過程、療法を受けている対象の年齢、健康状態、および身体状態が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のＴＭの治療有効用量は、治療を受けている対象の投与頻度および疾患の重篤度にも左右されうる。本発明のＴＭの投与計画は、所望の効果、すなわち、例えば、本明細書に記載されているように、疾患、疾患と関係した症状、疾患重篤度、および／または疾患の再発の周期性の予防および／または改善を達成するために必要なだけ継続されうる。１つの実施形態において、投与方式は１年までないし無期限、例えば、１ヵ月〜３０年、約３ヵ月〜約２０年、約６ヵ月〜約１０年の期間、継続される。
【００７１】
本発明の調節発現系において使用するための適切な核酸の例としては、治療活性を有するホルモン、成長因子、酵素、サイトカイン、受容体、またはＭＨＣ分子の遺伝子をコードする核酸が挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明の組成物および方法において使用するために適切な遺伝子としては、目的の遺伝子をコードする核酸が導入される細胞に対して外因性または内因性である核酸配列が挙げられる。疾患の治療のために本発明の組成物および方法において使用するために特に興味深く、適切であるのは、遺伝的疾患を有する対象またはこれにかかりやすい対象において、存在しないか、減少した量で産生されるか、または突然変異型形態で産生されるポリペプチドをコードする遺伝子である。かかる遺伝的疾患の例としては、網膜芽腫、ウィルムス腫瘍、アデノシンデアミナーゼ欠乏（ＡＤＡ）、サラセミア、嚢胞性線維症、鎌状細胞疾患、ハンチントン病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、フェニールケトン尿症、レッシュ・ナイハン症候群、ゴーシェ病およびテイ・サックス病が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
また、疾患の治療のために本発明の組成物および方法において使用するために特に興味深く、適切であるのは、腫瘍抑制遺伝子をコードする核酸である。かかる適切な腫瘍抑制遺伝子の例としては、網膜芽腫、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、ＴＮＦ、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−α、ヘモグロビン、インターロイキン、共刺激因子Ｂ７、インスリン、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＥＰＯ、およびβ−グロビン、およびかかる遺伝子によってコードされたタンパク質の生物学的または治療的活性突然変異タンパク質も挙げられるが、これらに限定されない。標的細胞に輸送するために適切な遺伝子は、すべての種からのものであるが、好ましくは、哺乳類種、より好ましくは、ヒトからのものでありうる。さらに、適切な遺伝子の供給源として好ましい種は、目的の遺伝子が本発明の方法および組成物を使用して輸送される種、例えば、哺乳類種、好ましくは、ヒトである。
【００７３】
さらに、本発明の組成物および方法において使用するための適切な核酸の例としては、抗炎症性、抗ウイルス、または抗癌活性を有するタンパク質または核酸ＴＭをコードするものが挙げられるが、これらに限定されない。かかる適切な核酸の例としては、顆粒球マクロファージ刺激コロニー因子（ＧＭＣＳＦ）または抗癌活性を有するその変異体（例えば、ロイキン（Ｌｅｕｋｉｎｅ）（登録商標）またはヒトＧＭＣＳＦＬｅｕ２３Ａｓｐ２７Ｇｌｕ３９））をコードするものが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、米国特許第５，０３２，６７６号明細書、同第５，３９１，４８５号明細書、および同第５，３９３，８７０号明細書のＧＭＣＳＦ突然変異型を参照）。また、例えば、適切な核酸としては、抗炎症性または抗ウイルス活性を有するインターフェロンをコードするもの、例えば、インターフェロン、詳しくは、ＩＦＮ−β、より詳しくは、ＩＦＮ−β１ａまたはＩＦＮ−β１ｂが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
好ましい実施形態において、本発明の組成物および方法は、ＩＦＮ−βであり、より詳しくは、ＩＦＮ−β１ａであるＴＭをコードする核酸を治療を必要とする対象に輸送することによってＭＳを治療するために使用され、ＩＦＮ−βが対象の細胞において発現され、および／またはＩＦＮ−βの発現および／または活性が、本明細書に記載されているように、ＲＭによって調節されるようになっている。
【００７５】
ＭＳは中枢神経系（ＣＮＳ）における病巣性炎症によって特徴づけられる慢性および重篤疾患である（例えば、ヘマー（Ｈｅｍｍｅｒ）ら（２００２年）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ３：２９１−３０１頁、キーガン（Ｋｅｅｇａｎ）ら（２００２年）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５３：２８５−３０２頁、ヤング（Ｙｏｕｎｇ），Ｖ．ウィー（Ｗｅｅ）（２００２年）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５９：８０２−８０８頁、グッドイン（Ｇｏｏｄｉｎ）ら（２００１年）Ａｍ．Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５８：１６９−１７８頁を参照）。神経細胞の軸索周囲からの絶縁髄鞘の付随喪失（脱髄）および軸索の変性も同疾患の顕著な特徴である。病巣性炎症により、星状細胞神経膠症が白質における硬化性病変の形成をもたらす（例えば、プリネアス（Ｐｒｉｎｅａｓ）（１９８５年）  Ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｅｌｓｖｅｖｉｅｒ：Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、ライネ（Ｒａｉｎｅ）（１９８３年）Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ウィリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）とウィルキンズ（Ｗｉｌｋｉｎｓ）：Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ライネ（Ｒａｉｎｅ）ら（１９８８年）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．２０：１８９−２０１頁  、およびマルチン（Ｍａｒｔｉｎ）（１９９７年）Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ（補遺）４９：５３−６７頁を参照）。
【００７６】
疾患の開始時点でＭＳ対象集団の２つの主要な型がある。すなわち、再発寛解型ＭＳを有する対象および一次進行性ＭＳを有する対象である。再発寛解型ＭＳは、新しい神経障害が出現し、または既存の神経障害が悪化するエピソード（いわゆる再発または増悪）、および臨床症状が安定化しまたは減少する寛解の期間によって特徴づけられるが、一次進行性ＭＳ対象は増悪なしに進行性神経学的荒廃に苦しむ。再発寛解型ＭＳを有する対象の大部分もその疾患の経過中に、混合型再発を伴って、または伴わないで、再発と無関係である神経症状の悪化を経験する。この疾患の段階に達すると、これは二次進行性ＭＳを呼ばれる。
【００７７】
ＭＳの臨床症状は、血液脳関門（ＢＢＢ）における病巣性破壊に起因すると考えられているが、これにより脳および脊髄への炎症性浸潤の侵入が可能となる。さらに、これらの浸潤は、脱髄、軸索変性および瘢痕組織形成、およびＣＮＳ髄鞘産生に必須である乏突起膠細胞の変性をもたらすさまざまな白血球およびマクロファージからなると考えられている（例えば、マルチン（Ｍａｒｔｉｎ）（１９９７年）Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ（補遺）４９：５３−６７頁を参照）。したがって、神経絶縁髄鞘および乏突起膠細胞の損傷髄鞘を修復する能力が著しく侵害される（例えば、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２６９（１９９３年）：１０６−１１４頁を参照）。これらのＭＳの症状としては、腕および脚における疼痛および刺痛、局所および全身のしびれ、筋けいれんおよび衰弱、起立および歩行時の平衡困難、発話および嚥下困難、認知障害、および腸および膀胱機能障害が挙げられる。
【００７８】
ＭＳの周知の治療法はないが、インターフェロンによる免疫調節療法がＭＳを有する対象における基礎疾患の重篤度の軽減に有効であることが判明している。インターフェロンは、抗ウイルス、抗増殖、および免疫調節活性によって特徴づけられる重要なサイトカインである。これらの活性は、多発性硬化症を有する対象の治療において確認されている臨床上の利点の基礎を形成する。インターフェロンは、Ｉ型およびＩＩ型クラスに分類される。ＩＦＮ−βはＩ型インターフェロンのクラスに属するが、これにはインターフェロンアルファ、タウ、およびオメガも含まれるが、インターフェロンガンマは明確なＩＩ型クラスの唯一周知のメンバーである。
【００７９】
ヒトＩＦＮ−βは１６６個のアミノ酸残基からなる２２ｋＤａの分子量を有する調節ポリペプチドである。ポリペプチドは、ウイルス感染または他の生物への曝露に応じて、体内で大部分の細胞、具体的には線維芽細胞によって産生されうる。さらに、ＩＦＮ−βは多量体細胞表面受容体に結合し、生産的受容体結合は結果として細胞内事象のカスケードをもたらし、ＩＦＮ−β誘導的遺伝子の発現につながり、これは次いで、抗ウイルス、抗増殖、および免疫調節として分類されうる効果を生じる。
【００８０】
ヒトＩＦＮ−βは十分に特徴づけられたポリペプチドである。ヒトＩＦＮ−βのアミノ酸配列は周知である（例えば、Ｇｅｎｅ  １０：１１−１５頁、１９８０年、および  欧州特許第８３０６９号明細書、欧州特許第４１３１３号明細書、および米国特許第４，６８６，１９１号明細書を参照）。また、ヒトおよびマウスＩＦＮ−βの結晶構造が、それぞれ報告されている（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１１８１３−１１８１８頁、１９９７．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５３：１８７−２０７頁、１９９５年、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５４：１２０３−１２０６頁、１９９８年掲載を参照）。また、ＩＦＮ−βのタンパク質改変変異体が報告されている（例えば、国際公開第９５／２５１７０号パンフレット、国際公開第９８／４８０１８号パンフレット、米国特許第５，５４５，７２３号明細書、米国特許第４，９１４、０３３号明細書、欧州特許第２６０３５０号明細書、米国特許第４，５８８，５８５号明細書、米国特許第４，７６９，２３３号明細書、スチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）ら、ＤＮＡ  第６巻、第２号、１９８７年、１１９−１２８頁、ルンケル（Ｒｕｎｋｅｌ）ら、１９９８年、Ｊｏｕｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３、第１４号、８００３−８００８頁を参照）。また、ＣＨＯ細胞におけるＩＦＮ−βの発現も報告されている（例えば、米国特許第４，９６６，８４３号明細書、米国特許第５，３７６，５６７号明細書および米国特許第５，７９５，７７９号明細書を参照）。さらに、ＩＦＮ−β融合タンパク質が、例えば、国際公開第００／２３４７２号パンフレットにおいて報告されている。
【００８１】
ＩＦＮ−βの市販の製剤がＭＳを有する対象の治療のために承認されており、ベータセロン（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ）（登録商標）（ベータフェロン（Ｂｅｔａｆｅｒｏｎ）（登録商標）またはＩＦＮ−β１ｂｓｅｒ１７とも呼ばれ、これは組換え細菌細胞を使用して非グリコシル化されて生成され、Ｎ末端メチオニン残基の欠失およびＣ１７Ｓ突然変異を有する）、アボネックス（Ａｖｏｎｅｘ）（登録商標）およびレビフ（Ｒｅｂｉｆ）（登録商標）（ＩＦＮ−β１ａとも呼ばれ、これは組換え哺乳類細胞を使用してグリコシル化されて生成されている。）の名称で販売されている。さらに、構造および機能についてＩＦＮ−β１ａとＩＦＮ−β１ｂの比較がＰｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１５：６４１−６４９頁、１９９８年に示されている。
【００８２】
ＩＦＮ−βは、ＭＳの進行を遅らせることが示されている第１の治療的介入である。また、ＩＦＮ−βの承認用量はＭＳの増悪率の削減において有効であることが示されており、多くの対象がプラセボ処置対象と比べ長時間、増悪なしのままである。さらに、身体障害の蓄積率が削減される（例えば、Ｎｅｕｒｏｌ．５１：６８２−６８９頁、１９９８年を参照）。
【００８３】
ＩＦＮ−βは白血球の増殖および抗原提示に対する抑制効果を有する。さらに、ＩＦＮ−βは抗炎症性表現型に向けてサイトカイン産生のプロフィールを調節しうる。最後に、ＩＦＮ−βは、Ｔ細胞マトリクスメタロプロテイナーゼの活性を阻害することによってＴ細胞移動を減少させうる。このようなＩＦＮ−βの活性は、一致協力して作用し、ＭＳを有する対象の治療におけるＩＦＮ−βの有利な効果を創出する可能性がある（例えば、Ｎｅｕｒｏｌ．５１：６８２−６８９頁、１９９８年を参照）。
【００８４】
好ましい実施形態において、本発明の組成物および方法は、再発寛解型ＭＳ、異なる型の進行性ＭＳ（例えば、一次性および二次性進行性ＭＳ、進行性再発性ＭＳを含むがこれらに限定されない）を含むがこれらに限定されない臨床上認められたさまざまな形態のＭＳ、およびまた臨床的に単独認識されたＭＳを示唆する症候群に罹患した対象の治療において使用される。
【００８５】
本明細書で使用される、「再発寛解型」ＭＳは、その間に現存の症状がより重篤になり、および／または新しい症状が現れる、明らかに確定した散発性の増悪または再発によって特徴づけられるＭＳの臨床経過である。かかる増悪または再発には、部分的回復、または完全回復、および寛解が伴いうる。これらの散発性増悪または再発間の時間の長さは数ヵ月または数年でありうるが、その期間に炎症性病変、脱髄、軸索喪失、および瘢痕形成が依然として進行しうる。再発寛解型ＭＳはＭＳの最も一般的な開始段階であり、症例の約５０％が１０〜１５年以内に進行し、別の４０％は発症の２５年以内に進行することが報告されている。
【００８６】
本明細書で使用される「一次進行性」ＭＳは、その開始から進行性疾患と特徴づけられるＭＳの臨床経過であり、停滞期または寛解がなく、または時折の停滞期およびきわめて短期間のわずかな改善がある。疾患の進行とともに、対象は、一般に、再発寛解型に特徴的な明らかな炎症性発病はないが、歩行における困難、運動技能における着実な低下、および何ヵ月および何年にもわたる身体障害の増加を経験しうる。
【００８７】
本明細書で使用される「二次進行性」ＭＳは、当初は再発寛解型であるが、次いで再発とは無関係に可変速度で進行性になるＭＳの臨床経過である。この型のＭＳを経験する対象は、継続して炎症性発病または増悪を経験し、最終的に、増悪および寛解期間は縮小し、一次進行性ＭＳで確認された特徴的な減退を示す疾患を伴う。
【００８８】
本明細書で使用される「進行性再発性」ＭＳは、疾患の開始から永続的な神経学的荒廃を示しうるが、再発寛解型ＭＳのように見える明らかな急性増悪または再発を伴うＭＳの臨床経過である。これらの対象については、失われた機能は決して回復しえない。この型のＭＳは未処置の場合には高い死亡率を有することが報告されている。
【００８９】
ＭＳを示唆する臨床的に単独確認された症候群としては、早期発症多発性硬化症および単一症状ＭＳが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の目的において、「多発性硬化症」という語は、他に指定がない限り、ＭＳを示唆する疾患および臨床的に単独確認された症候群のこれら臨床症状の各々を包含することが意図されている。例えば、ＭＳまたはＭＳと関係した症状を有する対象は、ＭＳまたはＭＳの関連症状の治療を必要とする対象である。１つの実施形態において、ＭＳに罹患した対象が本発明の医薬組成物および方法に従って治療を受ける場合、治療は結果として、ＭＳ病状、疾患重篤度、および／または疾患の再発の周期性の予防および／または改善をもたらしうる、すなわち、本発明の組成物および方法を使用するＭＳの治療は、結果として、症状が突発するエピソード間の期間の延長をもたらし、および／または、未処置で放置すると疾患の進行および身体障害を強化しうる、疾患と関係した進行中の免疫または自己免疫を抑制しうる。
【００９０】
さらに、対象は、本発明の医薬組成物または方法を使用する治療前に、医薬組成物で前処置された対象、または医薬組成物で前処置されていない薬品未投与対象でありうる。例えば、ＭＳの治療のために、前処置対象は、本発明の組成物または方法による治療前に、ＩＦＮ−βタンパク質薬剤（例えば、ＩＦＮ−β１ａ）またはＩＦＮ−β変異体（例えば、ＩＦＮ−β１ｂ）で前処置されている対象でありうる。例えば、承認された用量のベータセロン（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ）（登録商標）、アボネックス（Ａｖｏｎｅｘ）（登録商標）、またはレビフ（Ｒｅｂｉｆ）（登録商標）は、前処置対象において使用されうる。このように、本発明の医薬組成物および方法は、前処置および薬品未投与対象の治療において使用するのに適切である。
【００９１】
本発明の医薬組成物および方法は、疾患と関係した生理学的および病原性荒廃、例えば、脳および神経系の他の領域における炎症性反応、血液脳関門の破壊または障害、脳の病変の出現、組織破壊、脱髄、自己免疫炎症性反応、急性または慢性炎症性反応、神経細胞の死、および／または神経膠の死を阻止または削減するためにも使用されうる。本発明の医薬組成物および方法の有利な効果としては、疾患の予防、確定した疾患の開始の遅延、疾患の症状の改善、増悪率の削減、疾患の進行の遅延、および認知低下、失業、入院、および最終的に死亡を含む身体障害の延期または予防が挙げられるが、これらに限定されない。特定の型の疾患（例えばＭＳ）の一時的再発は、例えば、エピソードと関係した（上述された症状などの）症状の重篤度を減少させること、またはエピソードの発生間の期間を、例えば、数日、数週、数ヵ月、または数年延長させること（ここでエピソードとは、病状の突然の再発と特徴づけられうる）、または、例えばＭＳにおける脳炎症性病変の出現の予防または遅延によって治療されうる（例えば、アダムス（Ａｄａｍｓ）（１９９３年）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、７７７頁、神経学的炎症性病変の記述について参照）。
【００９２】
さらに、本発明の組成物および方法において使用するために適切な核酸は、融合もしくはキメラタンパク質、または融合もしくはキメラ核酸（例えば、ＲＮＡ）であるＴＭをコードしうる。一部の実施形態において、本発明のＴＭは、遺伝子産物の発現を調節し、または生物経路（例えば、セプシス経路）における１つもしくはそれ以上のステップを阻止し、それによって、治療的利点を提供しうる。さらに、その核酸はＴＭに融合した毒素（例えば、腫瘍細胞またはウイルスなどの標的へ、融合毒素を方向づける受容体リガンド遺伝子または抗体）をコードし、それによって治療効果を有しうる。本発明の操作可能に挿入および／または融合するための標準方法、核酸配列、またはアミノ酸配列への挿入および／またはアミノ酸配列は、本明細書および当業界において記載されている（例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州（Ｎ．Ｙ．）（１９８９年）、オズベル（Ａｕｓｕｂｅｌら）（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｌｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  および  Ｓｏｎｓ（１９８７年）を参照）。
【００９３】
一部の疾患治療方式による副作用が当業界で周知である（例えば、ムンシャウアー（Ｍｕｎｓｃｈａｕｅｒ）ら（１９９７年）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ１９（５）：８８３−８９３頁、ウォルター（Ｗａｌｔｈｅｒ）ら（１９９９年）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ５３：１６２２−１６２７頁、ルブリン（Ｌｕｂｌｉｎ）ら（１９９６年）４６：１２−１８頁、バイヤス（Ｂａｙａｓ）ら（２０００年）２：１４９−１５９頁、リー（Ｒｅｅ）ら（２００２年）８：１５−１８頁、ウォルター（Ｗａｌｔｈｅｒ）ら（１９９８年）５（２）：６５−７０頁を参照）。例えば、ＭＳの治療による副作用の一部としては、例えば、インフルエンザ様症状、痙性の増大または神経学的症状の悪化、月経不順、検査所見の異常（例えば、ヘモグロビン、白血球、顆粒球、リンパ球、または血小板の異常血球数／値）、肝酵素（例えば、ビリルビン、トランスアミナーゼ、またはアルカリホスファターゼ）の異常な検査値、注射部位反応（例えば、炎症、疼痛、紅斑）、皮膚または皮下壊死、およびうつ病が挙げられるが、これらに限定されない。疾患（例えば、ＭＳ）の治療による副作用を治療するための本発明の組成物および方法と併用した適切な併用薬剤およびこれら併用薬剤の使用は、かかる作用の治療ために一般に当業界で周知の併用薬剤に従って決定されうる（例えば、ムンシャウアー（Ｍｕｎｓｃｈａｕｅｒ）ら（１９９７年）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ１９（５）：８８３−８９３頁、ウォルター（Ｗａｌｔｈｅｒ）ら（１９９９年）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ５３：１６２２−１６２７頁、ルブリン（Ｌｕｂｌｉｎ）ら（１９９６年）４６：１２−１８頁、バイヤス（Ｂａｙａｓ）ら（２０００年）２：１４９−１５９頁、リー（Ｒｅｅ）ら（２００２年）８：１５−１８頁、ウォルター（Ｗａｌｔｈｅｒ）ら（１９９８年）５（２）：６５−７０頁を参照）。かかる併用薬剤の用量および投与方式も一般に周知である。かかる併用薬剤は当業界で公知であり、例えば、疾患または疾患の治療による副作用の改善または緩和に役立つものが挙げられるが、これに限定されない。かかる併用薬剤の例としては、鎮痛剤、非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、およびステロイドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
併用薬剤の他の適切な例としては、例えば、イブプロフェン、アセトアミノフェン、アセチルサリチル酸、プレドニゾン、ペントキシフィリン、バクロフェン、ステロイド、抗菌剤、および抗うつ剤が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、ウォルター（Ｗａｌｔｈｅｒ）ら（１９９９年）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ５２：１６２２−１６２７頁を参照）。例えば、インフルエンザ様症状はＮＳＡＩＤ（例えば、イブプロフェンまたはアセチルサリチル酸）またはパラセタモルまたはペントキシフィリンによって、痙性および神経学的症状の悪化の増大もＮＳＡＩＤおよび／または筋弛緩剤（例えば、バクロフェン）によって、月経不順は経口避妊薬によって、注射部位反応は浸透性ＮＳＡＩＤおよび／またはステロイド（例えば、ヒドロコチゾン）によって、皮膚または皮下壊死は抗菌剤によって、うつ病は抗うつ剤によって治療されうる（例えば、ウォルター（Ｗａｌｔｈｅｒ）ら（１９９９年）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ５３：１６２２−１６２７頁を参照）。
【００９５】
特定の疾患の治療において有効であり、異なる有害事象プロフィールを有する他の薬剤との併用療法は、治療効果を増加させ、有害事象プロフィールを安定させうる。ＭＳの治療のための、併用療法の例としては、例えば、グラチラマーアセテート（コパキソン（Ｃｏｐａｘｏｎｅ））、ミトキサントロン、シクロホスファミド、シクロスポリンＡ、クラドリビン、モノクローナル抗体（例えば、カンパチ（Ｃａｍｐａｔｈ）−Ｈ１（登録商標）またはアンテグレン（Ａｎｔｅｇｒｅｎ）（登録商標）／ナタズリマブ（Ｎａｔａｚｕｌｉｍａｂ）（登録商標）、およびスタチンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
本発明の方法を使用する、対象における疾患の有効な治療は、例えば、ＥＤＳＳ（総合障害度評価尺度）スコア、機能的複合評価尺度（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｓｃｏｒｅ）、認知試験、増悪の出現、または、例えば、ＭＳの治療のためのＭＲＩを含む一部の別の方法で検査されうる。ＥＤＳＳはＭＳによる臨床障害を採点する手段である（例えば、クルツケ（Ｋｕｒｔｚｋｅ）（１９８３年）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ３３：１４４４頁を参照）。８つの機能システム、歩行範囲、歩行能力、およびセルフケア機能を維持する能力が、神経障害の型および重篤度について評価される。例えば、治療前に、次の系における障害が評価される。すなわち、錐体、小脳、脳幹、感覚、腸および膀胱、視覚、脳など。歩行範囲、補助デバイスの有無による歩行能力、およびセルフケア機能を維持する能力の評価とともに、最終ＥＤＳＳスコアを計算する。次いで、フォローアップスコアを治療の規定間隔で得る。段階尺度は、例えば、０（正常）〜１０（ＭＳによる死亡）でありうる。１つの完全ステップ（またはより高いベースラインのＥＤＳＳスコアでの２分の１ステップ）の増加が疾患進行を規定しうる（例えば、クルツケ（Ｋｕｒｔｚｋｅ）（１９９４年）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３６：５７３−７９、グッドキン（Ｇｏｏｄｋｉｎ）（１９９１年  ）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．４１：３３２頁を参照）。
【００９７】
ＭＳの治療において、増悪は、ＭＳに起因し適切な新しい神経異常を伴う新しい症状の出現と定義されうる（例えば、ＩＦＮ−βＭＳ研究群を参照）。増悪は一般的に少なくとも２４時間持続し、少なくとも３０日間の安定もしくは改善、または最後の事象の開始から少なくとも３０日の分離によって進行する。標準の神経学的検査の結果は、神経症状評価尺度（例えば、サイプ（Ｓｉｐｅ）ら（１９８４年）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ３４：１３６８頁）の変化、および／またはＥＤＳＳスコアの変化もしくは評価医師の見解に従って、軽度、中等度、または重度のいずれかで分類される増悪でありうる。次いで、年間増悪率（または、例えば、反復性再発の危険率のような再発頻度についての他の測定値）、増悪のない対象の割合、および疾患活動性についての他の再発ベースの測定値を測定し、これらの測定のいずれかについて、処置群とプラセボ群との間で療法の有効性を評価する。
【００９８】
さらに、疾患の治療のための本発明の組成物および方法において使用するために適切なベクターは、最小の免疫毒性を有するもの、例えば、プラスミドまたはＡＡＶベクターである。例えば、ＣＭＶプロモーターの制御下にＴＧＦ−βまたはＩＬ−４のいずれかをコードするプラスミドベクターは、最小の免疫毒性でミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）誘導性ＥＡＥからマウスを保護することが報告されている（例えば、Ｃ．Ａ．ピチリロ（Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｏ）とＧ．Ｊ．プリュドム（Ｐｒｕｄ’ｈｏｍｍｅ）（１９９９年）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ１０：１９１５−２２頁を参照）。さらに、髄腔内投与後にＩＬ−４、ＩＬ−１０、またはＩＬ−１アンタゴニストを発現する非複製単純ヘルペス（ＨＳＶ）１型ベクターを含めて、さまざまなベクターおよび標的組織が、ＥＡＥモデルにおいてサイトカインを発現するための使用に適切であることが報告されている（例えば、Ｇ．マルチノ（Ｍａｒｔｉｎｏ）ら（２０００年）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ  １０７：１８４−９０頁を参照）。
【００９９】
疾患（例えば、ＭＳ）の治療を診断および管理するために多くの新しい技術も使用されうる。例えば、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）走査が疾患および疾患活動度の同時指標として使用され、診断手段としても使用されうる（例えば、パティ（Ｐａｔｙ）ら（１９９３年）  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４３：６６２−６６７頁、フランク（Ｆｒａｎｋ）ら（１９９４年）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ３６（補遺）：Ｓ８６−Ｓ９０頁、（１９９５年）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４５：１２７７−１２８５頁、フィリッピ（Ｆｉｌｉｐｐｉ）ら（１９９４年）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４４：６３５−６４１頁を参照）。例えば、ＭＳの治療のために、ＭＲＩは、例えば、ガドリニウム−ＤＴＰＡ強化Ｔ１加重映像法を使用して活性病変（例えば、マクドナルド（ＭｃＤｏｎａｌｄ）ら（２００１年）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．５０：１２１−１２７頁）またはＴ２加重法およびＴ１加重法を使用して病変の位置および程度を測定するために使用されうる。ベースラインＭＲＩを得ることができ、その後、同じ画像面および対象位置がその後の試験の各々のために使用されうる。ＭＳについて、病変の面積の概要を示し、全病変面積のスライスによってスライスを合計することができ、さまざまな基準を検査することができる。例えば、１）新しい病変の証拠、２）活性または新しい病変の出現率、および３）病変面積または病変体積の変化（例えば、パティ（Ｐａｔｙ）ら（１９９３年）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４３：６６５頁）。したがって、例えば、ベースラインと比べた個々の対象において、または処置群対プラセボ群において統計的に有意な改善がある場合、治療による改善が認められうる。
【０１００】
組成物の製剤化および投与
好ましい実施形態において、本発明の核酸組成物は、対象の細胞に投与または輸送するために製剤化される。一部の実施形態において、本発明の核酸組成物は、非−イオン性および／またはアニオン性ポリマーで製剤化される。かかるポリマーは、核酸によってコードされた分子のトランスフェクション効率および発現を強化し、変性から核酸を保護しうる。したがって、製剤化された本発明の核酸組成物を使用してトランスフェクション効率または発現が強化される一部の実施形態においては、より低量の核酸組成物（例えば、本発明の分子、例えば、本発明のＴＭおよび／またはＲＭをコードするベクター）が使用されうる。本明細書で使用される「生分解性ポリマー」は、対象によってインビボで代謝または除去されうるとともに、対象に対する毒性効果または副作用がない、または最小限であるポリマーを指す。
【０１０１】
本明細書で使用される「アニオン性ポリマー」は、例えば、中性ｐＨにおいて正味の負電荷を有するイオン化カルボキシル、リン酸、または硫酸基を含む反復サブユニットを有するポリマーを指す。本発明において使用するために適切なアニオン性ポリマーの例としては、ポリ−アミノ酸（例えば、ポリ−グルタミン酸、ポリ−アスパラギン酸およびその組合せ）、ポリ−核酸、ポリ−アクリル酸、ポリ−ガラクツロン酸、およびポリ−硫酸ビニルが挙げられるが、これらに限定されない。ポリマーがポリマー酸である一部の実施形態において、ポリマーは塩形態で利用される。他のポリマーの例としては、ＰＶＰ、ＰＶＡ、およびキトサンが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「ポリ−Ｌ−グルタミン酸」は、本明細書では「ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ナトリウム塩」、「ナトリウムポリ−Ｌ−グルタミン酸塩」、および「ポリ−Ｌ−グルタミン酸塩」と同じ意味で使用される。本明細書で使用される「ポリ−Ｌ−グルタミン酸塩」は、ポリ−Ｌ−グルタミン酸のナトリウム塩を指す。さらに、好ましい実施形態において、ポリグルタミン酸のＬ立体異性体が本発明の組成物において使用されるが、他の実施形態においては、異性体の他の立体異性体またはラセミ混合物が本発明の組成物において使用するために適切である。さらに、一部の実施形態においては、アニオン性アミノ酸ポリマーの他の塩が本発明の組成物において使用するために適切である。
【０１０２】
本明細書で使用される「アニオン性アミノ酸ポリマー」という語は、所定のアニオン性アミノ酸、例えば、ポリ−グルタミン酸またはポリ−アスパラギン酸のポリマー形態である。一部の実施形態においては、アニオン性アミノ酸、例えば、グルタミン酸およびアスパラギン酸の混合物で形成されたポリマーが本発明の組成物において使用するために同じく適切でありうる。
【０１０３】
医薬組成物を製剤化するための方法は一般に当業界で周知である。例えば、レミントンの（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ）薬学（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）１８、追加編集：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．：Ｅａｔｏｎ、ペンシルベニア州（Ｐａ）、１９９０年を、製剤化および製薬的に許容される担体、安定剤、およびイソモライト（ｉｓｏｍｏｌｙｔｅ）の選択に関する徹底的な議論について参照のこと（例えば、米国特許第４，５８８，５８５号明細書、同第５，１８３，７４６号明細書、同第５，７９５，７７９号明細書、および同第５，８１４，４８５号明細書、米国特許出願第１０／１９０，８３８号明細書、同第１０／０３５，３９７号明細書、および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／２１４６４号明細書、および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／５１０７４号明細書も参照）。
【０１０４】
製薬的に許容される担体および他の成分（例えば、併用薬剤）が本発明の医薬組成物および方法において使用されうる。本明細書で使用される「製薬的に許容される担体」は、医薬組成物の貯蔵、投与、および／または治療成分の所望の効果を促進するために当業界で従来使用されている担体または希釈剤である。担体は、本発明の医薬組成物の対象への投与または輸送の望ましくない副作用を削減することもできる。適切な担体は、好ましくは、安定しており、例えば、製剤化において他の成分と反応することができない。さらに、適切な担体は、療法に使用される用量および濃度で対象における顕著な局所または浸透性の副作用を生じることがない。かかる担体は一般に当業界で周知である。
【０１０５】
適切な製薬的に許容される担体は、例えば、溶剤、分散培地、抗菌および抗真菌剤、マイクロカプセル、リポソーム、陽イオン性脂質担体、等張性および吸収遅延剤などであり、本発明の医薬組成物の成分と不適合性ではないものである。治療有効成分または活性成分のためのかかる培地および薬剤の使用は当業界で公知である。補助活性成分も本発明の医薬組成物に組込みことができ、本発明の方法において使用されうる。
【０１０６】
本発明の医薬組成物において使用するための薬剤として適切な担体のさらなる例は、アルブミン、ゼラチン、コラーゲン、多糖類、単糖類、ポリビニルピロリドン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、固定油、オレイン酸エチル、リポソーム、グルコース、スクロース、ラクトース、マンノース、デキストロース、デキストラン、セルロース、マンニトール、ソルビトール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルギン酸ヘパリンなどの大きな安定したマクロ分子である。ヒアルロン酸などの徐放担体も適切でありうる。
【０１０７】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、デキストロース、トレハロース、チオグリセロール、およびジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの安定剤を本発明の医薬組成物に安定性を強化するために添加してもよい。適切な安定化剤としては、エチレンジアミン４酢酸酸（ＥＤＴＡ）またはジナトリウムＥＤＴＡなどのその塩の１つ、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、例えば、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ８０）、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ２０）、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンエステル、例えば、プルロニックＦ６８およびプルロニックＦ１２７、ポリオキシエチレンアルコール、例えば、Ｂｒｉｊ３５、セメチコン、ポリエチレングリコール、例えば、ＰＥＧ４００、リソホスファチジルコリン、およびポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチフェノール、例えば、トリトンＸ−１００が挙げられるが、これらに限定されない。界面活性剤による医薬組成物の安定化は一般に当業界で周知である（例えば、レビン（Ｌｅｖｉｎｅ）ら（１９９１年）Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ    Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．４５（３）：１６０−１６５頁を参照）。
【０１０８】
本発明の医薬組成物の他の許容される成分としては、水、生理食塩水、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸、アスパラギン酸塩、および他の有機酸またはその塩などの等張性を強化するバッファーが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明の医薬組成物は、組成物に体液との等張性を与えるのに十分な量で非イオン性等張化剤を含む。本発明の医薬組成物は、例えば以下のような当業者に一般に周知の多くの非イオン性等張化修飾剤によって等張性にされうる：さまざまな等級の糖質（例えば、ボエット（Ｖｏｅｔ）とボエット（Ｖｏｅｔ）（１９９０年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）；アルドースとして分類される単糖類（例えば、グルコース、マンノース、アラビノース）、およびリボース、ならびにケトースとして分類されるもの（例えば、フラクトース、ソルボース、およびキシルロース）；二糖類（例えば、スクロース、マルトース、トレハロース、およびラクトース）；およびアルジトール（非環式ポリヒドロキシアルコール）例えば、グリセロール、マンニトール、キシリトール、およびソルビトール。好ましい実施形態において、非イオン性等張化剤は、トレハロース、スクロース、およびマンニトール、またはその組合せである。
【０１０９】
好ましくは、非−イオン性等張化剤は製剤に体液との等張性を与えるのに十分な量で添加される。１つの実施形態において、本発明の医薬組成物（例えば、ＨＳＡを含まない医薬組成物を含む）へ組込む場合、非イオン性等張化剤は使用される薬剤によって約１％〜約１０％の濃度で存在する（例えば、米国特許出願第１０／１９０，８３８号明細書、同第１０／０３５，３９７号明細書、およびＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／２１４６４号明細書および同ＰＣＴ／ＵＳ０１／５１０７４号明細書を参照）。
【０１１０】
さらに、好ましい本発明の医薬組成物は、注射に起因する局所疼痛および刺激を減少させる、または本発明の医薬組成物の（例えば、ＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭ含む、および／またはコードする）成分の溶解性もしくは安定性を改善するバッファーを含みうる。かかるバッファーとしては、例えば、低リン酸、アスパラギン酸、およびコハク酸バッファーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１１】
本発明の医薬組成物は、さらに、組成物の成分の溶解性を強化することができる可溶化化合物または製剤を含みうる。適切な可溶化剤としては、例えば、グアニジウム基、好ましくは、アルギニンを含有する化合物が挙げられる。適切な可溶化化合物のさらなる例としては、例えば、本発明のＩＦＮ−β突然変異タンパク質の溶解性を強化する能力を保持するアミノ酸アルギニン、またはアルギニンのアミノ酸類似物が挙げられるが、これらに限定されない。かかるアミノ酸類似物の例としては、例えば、アルギニンを含有するジペプチドおよびトリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。適切な可溶化化合物の別の例は、例えば、米国特許第４，８１６，４４０号明細書、同第４，８９４，３３０号明細書、同第５，００５，６０５号明細書、同第５，１８３，７４６号明細書、同第５，６４３，５６６号明細書、およびワング（Ｗａｎｇ）ら（１９８０年）Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｄｒｕｇ  Ａｓｓｏｃ．３４：４５２−４６２頁において議論されている。
【０１１２】
好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物（例えば、ＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭ含みを含み、および／またはコードする）は、溶液、懸濁液、または乳剤などの単位投与量および注射形態で、または、溶液、懸濁液、もしくは乳剤に投与前に変換されうる凍結乾燥粉末の形態で形成される。本発明の医薬組成物は、膜ろ過によって滅菌されうるが、これにより凝集体も除去され、密閉バイアル、アンプル、または注射など１回用量または多重用量の容器で保存されうる。
【０１１３】
別の実施形態において、本発明のＡＭまたはＩＭは経口投与のために製剤化される。１つの実施形態において、本発明のＴＭおよび／またはＲＭをコードする核酸は注射またはエレクトロポレーションによって投与するために製剤化され、本発明のＡＭおよび／またはＩＭは経口投与のために製剤化される。例えば、好ましい実施形態において、本発明の調節発現系は、注射またはエレクトロポレーションによる対象の細胞への輸送のために製剤化される少なくとも１つのＴＭおよびＲＭ、および対象への経口投与のために製剤化されるＡＭをコードする単一ベクターを含み、対象の細胞におけるＡＭの存在がＲＭを活性化し、それによってＲＭが対象の細胞におけるＴＭの発現を誘導するようになっている。
【０１１４】
本発明の液体、凍結乾燥、またはスプレー乾燥組成物は、当業界で周知のように、例えば、本発明の方法に従って、対象への後の投与のために水性または非水性溶液または懸濁液として調製されうる。これら医薬組成物の各々は治療的または予防的有効または活性成分を含みうる。本明細書で使用される治療的または予防的「有効」または「活性」成分とは、本発明の医薬組成物および方法を用いた、治療を必要とする対象における疾患または状態の治療、予防、または診断に関する所望の治療的または予防的反応を引き起こすために、本発明の医薬組成物に含ませる、本発明の分子（例えばＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、および／またはＩＭを含み、および／またはコードする）の量である。好ましくは、本発明の医薬組成物は、調製および貯蔵中の生物活性または治療活性の喪失と関係する問題を最小限にするために、適切な安定化剤、増量剤、または両方を含む。
【０１１５】
本発明の医薬組成物の製剤は、好ましくは、製造および貯蔵および保存の条件下で、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して安定である。微生物汚染を予防する方法は公知であり、例えば、さまざまな抗菌および抗真菌剤の付加により達成されうる。
【０１１６】
本明細書の医薬組成物の適切な形態としては、滅菌注射液または分散液を即席に調製するための滅菌水溶液または分散液、および滅菌粉末を挙げることができる。適切な形態は、好ましくは、それらが注射器によって容易に取込まれ注射されうる程度までに、滅菌されており、また流動性を有する。一般的な担体としては、例えば、水緩衝水溶液（すなわち、生体適合性バッファー）、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどのポリオール類、その適切な混合物、界面活性剤、または植物油を挙げることができる。滅菌は、ろ過、または抗菌もしくは抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、またはチメロサルの付加を含むが、これらに限定されない当業界で認められた方法によって行われうる。さらに、糖または塩化ナトリムなどの等張性剤を対象組成物に組込むことができる。
【０１１７】
本発明の医薬組成物を含有する滅菌注射液の製造は、組成物を所望の量で、さまざまな成分（例えば、本明細書で列挙したもの）とともに適切な製剤に所望通り組込み、その後に滅菌することによって行われうる。滅菌粉末を得るには、上記の溶液は必要に応じて真空乾燥または凍結乾燥されうる。
【０１１８】
したがって、本発明の医薬組成物は、製薬的に許容される適切な治療有効量の担体とともに、便利で有効な投与のために製薬的に有効な量が配合されうる。ヒトに適用するための本発明の組成物および方法の正確な治療有効量は、ＭＳ対象の年齢、体重、炎症性細胞による細胞浸潤の程度における個々の差を考慮して当業者によって測定されうる。
【０１１９】
投与のしやすさおよび投与量の均一性のために投与量単位形で非経口組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される投与量単位形は、治療する哺乳類対象に対して単一用量として適している物理的に個別の単位を指し、各々の単位は、必要な製薬担体と共同して所望の治療効果をもたらすように計算された所定の量の活性物質を含有する。
【０１２０】
主要な活性成分は、本明細書に記載されているような投与量単位形の製薬的に許容される適切な担体とともに、便利で有効な投与のために治療有効量が配合されうる。さらに、併用薬剤が一般に当業界で周知の量で単位投与量形で含有される。補助活性成分、例えば併用薬剤を含有する組成物の場合、その用量は、例えば、その成分の周知の投与用量および方法を参照して決定されうる。
【０１２１】
本発明の医薬組成物は、投与剤形と適合する方法および治療的に有効となる量で投与されうる。さらに、本発明の医薬組成物は、医学的に許容され、治療される疾患または付随症状の特異的型または段階に依存しうる方法で投与されうる。可能な投与経路としては、注射、血管内、静脈内、動脈内、皮下、筋内、腫瘍内、腹腔内、静脈内、硬膜外内などの非経口経路によって、および経口、鼻腔内、眼内、直腸、局所、または吸入によるものが挙げられる。好ましい実施形態において、投与経路は筋内である。好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物は３〜１２ヶ月ごとに筋内投与される。別の好ましい実施形態において、筋内投与は医薬組成物の自動または手動注射（例えば、注射器を使用）によるものである。持続放出投与も、例えば、侵食されうるインプラントを使用することにより考えられている。
【０１２２】
具体的には、本発明の核酸医薬組成物は、例えば、注射または他の適切な手段を含めて、本明細書に記載された、または当業界で周知の手段を使用して対象の細胞に輸送されうる。例えば、物理的手段によって細胞に核酸を輸送する周知の方法は使用に適しており、これにはエレクトロポレーション、ソノポレーション、および圧力が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、本発明の核酸組成物の輸送はエレクトロポレーションによるものであり、細胞膜において一時的な孔をもたらすパルス電場の適用を含み、それによって、外因性分子、例えば、本発明の核酸組成物が細胞に輸送される。エレクトロポレーションシステムによって生成される電気的パルスを調整することにより、核酸分子が、かかる処置中にもたらされる細胞における通路または孔を通じてその道を見出しうることが周知である（例えば、米国特許第５，７０４，９０８号明細書、米国特許第５，７０４，９０８号明細書を参照）。
【０１２３】
本明細書で使用される「パルス電圧デバイス」、または「パルス電圧注射デバイス」は、電気の局在パルスを細胞に放出することによって対象の  細胞へ核酸分子の取込みをもたらすことができる、またはもたらし、それによって細胞膜を不安定にし、結果として細胞膜における通路または孔をもたらす装置を指す。この型の従来のデバイスは、本発明の核酸組成物の輸送における使用に適している。一部の実施形態において、デバイスは較正され、したがって、当業者がパルス電圧の所望の振幅電圧および／または持続時間を選択および／または調整することが可能となる。パルス電圧核酸輸送デバイスとしては、例えば、米国特許第５，４３９，４４０号明細書、米国特許第５，７０４，９０８号明細書、米国特許第５，７０２，３８４号明細書、国際公開第９６／１２５２０号パンフレット、国際公開第９６／１２００６号パンフレット、国際公開第９５／１９８０５号パンフレット、または国際公開第９７／０７８２６号パンフレットに記載されているエレクトロポレーション装置が挙げられうる。
【０１２４】
本発明の医薬組成物の活性成分を含有するために使用されるパッケージング材料は、ガラス、プラスチック、金属または他の適切な不活性材料を含みうるとともに、好ましくは、その中に含まれるいずれの成分とも化学反応することがないパッケージング材料である。１つの実施形態において、医薬組成物は透明なガラスの１回使用バイアルにパッケージングされており、また各々の薬剤のバイアル用に希釈剤を含有する別のバイアルが含まれている。別の好ましい実施形態において、希釈剤は注射器で提供される（すなわち、注射器には希釈剤が予め充填されている）。さらに別の好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物は注射器の溶液で提供され（すなわち、注射器には医薬組成物の溶液が予め充填されている）、いつでも使用できる状態である。１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、２°〜８℃（３６°〜４６°Ｆ）の冷却下に保存されうる。好ましい実施形態において、医薬組成物は室温で保存される。
【０１２５】
ベクターおよびキット
本発明は、疾患の治療のために改善された本発明の調節発現系を含むベクターおよびキットを提供する。一部の実施形態において、改善された本発明の調節発現系は、１つもしくはそれ以上のベクターを含み、各々のベクターは１つもしくはそれ以上の発現カセットを含む。１つの実施形態において、改善された本発明の調節発現系は、少なくとも１つの発現カセットおよび、より好ましくは少なくとも２つの発現カセットを有する単一ベクターを含む。
【０１２６】
本発明の調節発現系において使用するための適切なベクターとしては、対象の細胞に投与されると、本発明のコードされたＴＭおよび／または他のコードされた分子（例えば、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭ）を発現することができるものが挙げられるが、これらに限定されない。適切なベクターの例としては、ウイルスを産生するためのベクター、および非ウイルスベクター（ウイルスを産生することがないベクター）を含む、本明細書に記載され、当業者に周知のものが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、１つのクラスの適切なベクターでは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、またはＳＶ４０ウイルスなどの動物ウイルス由来の自己複製染色体外プラスミドを提供するＤＮＡ要素が利用される。さらに、ウイルスを産生するための周知のベクター（例えば、ワング（Ｗａｎｇ）ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、４：４３２−４４１頁、１９９７年、オリギノ（Ｏｌｉｇｉｎｏ）ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、５：４９１−４９６頁、１９９８年を参照）が、本発明の調節発現系において使用するために修飾および適合されうる。さらに、本発明のベクターは、さらなる機能およびコードされた分子の最適な発現のための作動可能に連結された配列を含むように修飾されうる。適切な機能的配列の例としては、スプライシング、ポリアデニル化および他の型のＲＮＡプロセシング配列、および転写プロモーター、エンハンサー、および終止配列が挙げられるが、これらに限定されない。かかる機能的配列を組込む適切なｃＤＮＡ発現ベクターとしては、オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ），Ｈ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０（１９８３年）などによって記載されているものが挙げられる。
【０１２７】
本明細書で使用される「プラスミド」は、通常、染色体ＤＮＡとは無関係に複製しうる環状二本鎖ＤＮＡの染色体外遺伝物質を含む組成物を指す。プラスミドは本明細書に記載されているようにベクターとして使用されうる。本明細書で使用される「ベクター」は、標的細胞の形質転換またはトランスフェクションを方向づけるためにデザインされた遺伝物質を含む組成物（例えば、核酸コンストラクト）を指す。さらに、ベクターは、本発明のコードされた分子が転写され、必要な場合には、トランスフェクトまたは形質転換細胞において翻訳されうるように、ベクターの他の配列に対して位置的および連続的に方向づけられた多重機能的配列を含有しうる。ベクターまたはカセットが本発明の分子（例えば、ＴＭ、ＲＭ、ＡＭまたはＩＭ）をコードする場合、これは本明細書に記載された本発明の調節発現系に従って、異種細胞（例えば、対象の細胞）におけるコードされた分子の発現のための本質的な成分（例えば、プロモーター、ポリ（Ａ）部位、転写開始および停止部位）を含む。
【０１２８】
好ましい実施形態において、改善された本発明の調節発現系は、ＴＭをコードする第１の核酸配列の挿入のための少なくとも１つのクローニング部位を有する第１の発現カセット、およびＲＭをコードする第２の核酸配列の挿入のための少なくとも１つのクローニング部位を有する第２の発現カセットを含む単一ベクターを含む。別の実施形態において、ベクターは、本明細書に記載されているように、対象の細胞に輸送するための本発明の分子（例えば、ＴＭおよび／またはＲＭ）をコードするウイルスを産生するためのベクター、例えば、シャトルプラスミド、より詳しくは、ＡＡＶ−１シャトルプラスミドである（例えば、表８を参照）。
【０１２９】
別の好ましい実施形態において、ベクターは単一プラスミドベクター、例えば、ｐＧＴ１（配列番号９および配列番号４の配列を含む）、ｐＧＴ２（配列番号１０および配列番号４の配列を含む）、ｐＧＴ３（配列番号１１および配列番号４の配列を含む）、またはｐＧＴ４（配列番号１２）であり、（ここで各々のベクターは、ＩＶＳ８の３’およびｈＧＨポリ（Ａ）部位の５’に位置した多重クローニング部位（配列番号４）を含む（例えば、図１４Ａ−Ｄにおいて図式的に示されている））、またはｐＧＴ１１（配列番号９および配列番号５の配列を含む）、ｐＧＴ１２（配列番号１０および配列番号５の配列を含む）、ｐＧＴ１３（配列番号１１および配列番号５の配列を含む）、またはｐＧＴ１４（配列番号１２および配列番号５の配列を含む）である（ここで各々のベクターはＩＶＳ８の３’およびｈＧＨポリ（Ａ）部位の５’に位置した多重クローニング部位（配列番号５）を含む）。
【０１３０】
本発明の発現カセットは、本発明のコードされた分子、例えば、ＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭの発現のための機能的配列を含む。一部の実施形態において、発現カセットは、本発明の分子をコードする核酸配列に作動可能に連結される少なくとも１つの機能的配列を含む。本明細書で使用される「機能的配列」は、細胞における機能または活性、例えば、細胞発現、プロセシング、または分子のクローニング、または分子の生物または細胞活性または機能に関係する機能または活性を有する核酸またはアミノ酸配列を指す。機能的配列の例としては、本発明の分子（例えば、ＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭ）をコードする配列、プロモーター、タンパク質または核酸結合部位、スプライス部位、転写停止部位、調節ドメイン（例えば、活性化ドメイン）、転写開始部位、タンパク質または核酸安定化部位、介在配列、制限酵素部位またはクローニング部位、ウイルスパッケージングシグナル、または他の細胞、タンパク質、または核酸プロセシングまたは調節シグナル（例えば、シグナル変換配列または組織特異的配列）が挙げられる。さらに、機能的配列の例は、５’または３’非翻訳領域（例えば、ＵＴ１２、配列番号２）、イントロン（例えば、ＩＶＳ８、配列番号３）、ポリアデニル化（ポリ（Ａ））部位（例えば、ＳＶ４０、配列番号８またはｈＧＨポリ（Ａ）部位、配列番号６）、またはＤＮＡ結合部位（ＤＢＳ）（例えば、配列番号４９）であるが、これらに限定されない。
【０１３１】
かかる機能的配列としては、例えば、本発明の発現カセットにおけるかかる機能的配列に作動可能に連結される核酸配列によってコードされた分子の、それぞれ、調節または組織特異的発現を促進する調節プロモーターまたは組織特異的プロモーターをコードする配列も挙げられる。適切なプロモーターの例としては、ＣＭＶプロモーター、筋特異的プロモーター（例えば、アクチンプロモーターまたは筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター）、状態特異的（例えば、低酸素または炎症）プロモーターまたは要素（例えばＥＬＡＭプロモーターまたはＨＲＥ）、構成的プロモーター（例えば、ユビキチン、ＰＧＫ、またはＥＦ１αプロモーター）、合成またはキメラプロモーター（例えば、ＣＭＶ／アクチンプロモーター）、細胞周期特異的プロモーター（例えば、サイクリンＡまたはｃｄｃ６プロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、プロモーターは生理学的に反応性のプロモーター、例えば、炎症に反応性、好ましくは、サイトカインまたはケモカイン、または疾患または状態の開始または存在を示す他の細胞または生物分子の存在に反応性のプロモーターである。適切なプロモーターのさらなる例が下表１に示されている。
【表１】
2008545639.tif 000003
【表２】
2008545639.tif 000004
【０１３２】
１つの実施形態において、本発明の調節発現系は、融合またはキメラタンパク質である本発明の分子をコードする核酸配列に作動可能に連結されるＣＭＶプロモーター配列を有する少なくとも１つの発現カセットを含む１つもしくはそれ以上のベクターを含み、プロモーターはコードされた分子（例えば、ＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭ）の発現を推進する。一部の実施形態において、適切なプロモーターは、対象の細胞におけるコードされた分子の発現の永続的レベルの発現を提供するものとなりうる。１つの実施形態において、核酸ベクターは、対象の細胞における永続的発現を提供するプロモーターに作動可能に連結される本発明の分子（例えば、ＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭ）をコードし、またその核酸ベクターはエレクトロポレーションによって対象の細胞に投与され、分子が細胞において、好ましくは、投与の部位で発現されるようになっている。好ましい実施形態において、コードされた分子はＴＭである。
【０１３３】
別の実施形態において、本発明の調節発現系は、本発明のＴＭをコードする核酸配列に作動可能に連結される少なくとも１つのＧＡＬ−４ ＤＢＳｗｐを含むプロモーター配列を有する第１の発現カセットを含む１つもしくはそれ以上のベクターを含む。１つの実施形態において、プロモーター配列は、ＧＡＬ−４ ＤＢＳの多量体、例えば、３−１８ＧＡＬ−４ ＤＢＳを含む。
【０１３４】
さらに、本発明の発現カセットは、適切に修飾され、所望の核酸配列の挿入のためのクローニング部位を含みうる。別の実施形態において、本発明の発現カセットは少なくとも１つのクローニング部位を含み、より好ましくは、本発明の分子、例えば、ＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭをコードする核酸配列の挿入のための多重クローニング部位（ＭＣＳ）を含む。本明細書で使用される「クローニング部位」は、核酸における酵素部位または他の部位を指し、ここで核酸配列は挿入され、操作可能連結され、または、その他の場合は、例えば、配列はその使用目的のために機能するように、当業界で周知の従来の方法を使用して付着されうる。１つの実施形態において、本発明の第１の発現カセットは、ＴＭをコードする第１の核酸配列の挿入のためのＭＣＳ、少なくとも１つのＤＢＳ（例えば、３−１８  ＧＡＬ−４ ＤＢＳ）を含む誘導的プロモーター、５’非翻訳領域（例えば、ＵＴ１２、配列番号２）、イントロン（例えば、ＩＶＳ８、配列番号３）、およびｈＧＨポリ（Ａ）部位（例えば、配列番号６）を含み、第１の核酸配列がＭＣＳ（例えば、配列番号４、または配列番号５）で挿入されると、これらの機能的配列は第１の核酸配列に作動可能に連結されるようになっている。別の実施形態において、本発明の第２の発現カセットは、調節ＲＭおよびＳＶ４０ポリ（Ａ）部位（例えば、配列番号８）をコードする第２の核酸配列の挿入のためのＭＣＳを含み、第２の核酸配列がＭＣＳで挿入されると、これらの機能的配列は第２の核酸配列に作動可能に連結されるようになっている。好ましい実施形態において、第１および第２の発現カセットは単一ベクターに存在する。
【０１３５】
本発明のキットは、本明細書に記載された本発明の発現系の少なくとも１つ、より詳しくは、本発明の医薬組成物、ベクター、または分子（例えば、ＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭ）の少なくとも１つを含む。
【０１３６】
組成物の単離および調製
本発明の組成物としては、例えば、化合物、タンパク質、および核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子）、詳しくは、タンパク質またはＲＮＡをコードする核酸が挙げられる。本発明の組成物の化学物質、核酸、およびタンパク質は、本明細書および当業界で記載されているように、従来の方法およびアッセイを使用することにより、単離、調製、および／または試験されうる。
【０１３７】
本明細書で使用される「タンパク質」または「アミノ酸分子」は、ペプチド、完全長タンパク質、または完全長タンパク質のフラグメントもしくは部分を指す。さらに、本発明のタンパク質は、融合、キメラ、修飾、単離、合成、または組換えアミノ酸分子でありうる。具体的には、本発明の組成物および方法において使用するために適切なタンパク質の例としては、野生型、完全長タンパク質（その分泌形態を含む）、または類似物、誘導体、または、生物または治療活性を有するその変異体が挙げられるが、これらに限定されない。より詳しくは、本発明のタンパク質変異体は突然変異タンパク質でありうる、すなわち、突然変異、例えば、単一または多重アミノ酸置換、欠落、または付加を含み、変異体が生物または治療活性を保持または有するようになっている。タンパク質をコードする配列としては、例えば、野生型タンパク質配列のコドン最適化変異体、またはヒト化配列を挙げることができる。ヒトにおける最適なコドン利用は、発現ヒト遺伝子のコドン利用頻度から同定されうるとともに、当業界で周知の方法、例えば、ウィスコンシン配列分析パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ）、バージョン８．１、ジェネティックス・コンピューター・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州（ＷＩ）からのプログラム「Ｈｕｍａｎ  Ｈｉｇｈ．ｃｏｄＮ」によって決定されうる。例えば、高発現ヒト遺伝子において最も高頻度に使用されるコドンが、ヒト対象の組織における発現の最適なコドンであり、したがって、合成コード配列を作製するための基礎として使用されうる。
【０１３８】
本発明の分子に関連して本明細書で使用される「核酸」は、核酸分子、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ、またはその融合、キメラ、修飾、単離、合成、または組換え形態を指す。具体的には、本発明の組成物および方法において使用するために適切な核酸の例としては、タンパク質をコードする野生型、完全長ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、または生物または治療活性を有する他の核酸分子（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチド）、またはその類似物、誘導体、または変異体が挙げられるが、これらに限定されない。より詳しくは、本発明の核酸変異体は、突然変異タンパク質でありうる、すなわち、突然変異、例えば、単一または多重核酸置換、欠落、または付加を含み、変異体が生物または治療活性を保持または有するようになっている。
【０１３９】
さらに、本発明の調節発現系の修飾は、本明細書および当業界で記載されているように、従来の方法およびアッセイを使用することにより行われ、試験されうる。
【０１４０】
本発明の分子（例えば、ＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭを含む、および／またはコードする）に関連して本明細書で使用される「修飾」は、結果として、基準核酸、アミノ酸、または化学分子の変化または変質がもたらされ、本発明の所望の組成物または分子に達する（例えば、野生型タンパク質または核酸の突然変異が特定の生物および／または治療活性を有するその所望の変異体に達する；タンパク質または核酸配列の突然変異が所望のヒト化配列に達する；または化合物の突然変異が所望の化学構造、および／または生物および／または治療活性に達する）反応または操作を指す。本発明の分子に作動可能に連結される、または本発明の分子をコードする配列（例えば、ベクター配列または転写調節配列など）を含む、本発明の分子の機能的ドメインまたは機能的配列は、修飾されて本発明の所望の組成物または分子に達しうる。
【０１４１】
具体的には、本発明の調節発現系は修飾または最適化され、特定の特異性（例えば、特定の組織、状態、疾患、またはバイオマーカーまたは他の分子に特異的）、厳密性、または、本明細書に記載されているように、疾患の治療において使用するための調節、発現、および／または活性の量を達成しうる。例えば、本発明の調節発現系は修飾または最適化され、単離および構成によってかかる目的を達成しうる。すなわち、１）ＲＭのＬＢＤの所望の結合特異性を有する新規または変異体ＡＭおよびＩＭ、２）新規または変異体ＡＤ、ＬＢＤ（例えば、新規または変異体ＡＭまたはＩＭに結合する）、および／またはＤＢＤ（例えば、新規または変異体プロモーター配列に結合する）、３）特定のＲＭの存在に対してきわめて特異的反応性である活性を有するプロモーター（例えば、特定のＲＭの存在下で、例えば、特定のＲＭの結合によって、活性化または不活性化される）、４）完全にヒト化された配列（例えば、配列が完全にヒト化されるように、ＧＡＬ−４ＤＢＤおよびＧＳＡＬ−４ＤＢＳをコードする修飾配列）、５）ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、またはアンチセンスＲＮＡ）、詳しくは、ＲＮＡ  ＴＭの発現のための発現カセット、および６）プロモーターまたは他の機能的配列に作動可能に連結される配列によってコードされた、特にＴＭの、非特異的発現を削減する修飾プロモーターまたは他の機能的配列。
【０１４２】
１つの実施形態において、本発明の調節発現系は、ＲＭが投与されたことの確証を強くするために、ＴＭの基礎発現が顕著に削減されるように修飾され、これによって、投与されるプラスミドの用量に依るよりむしろ、外因的に調節されたＴＭ発現であるという安全性が高められる。例えば、ＴＭをコードする核酸コード配列に作動可能に連結されるプロモーター配列は、プロモーターの反応性（および結果として生じるＴＭ発現）がＧＡＬ−４ＤＢＤを有するＲＭの存在（例えば、その結合）によって調整されるように、ＧＡＬ−４ＤＢＳのコピーの数について修飾および最適化することができる。また、例えば、最小のプロモーターを、標準方法を使用して構築、修飾し、ＴＭに作動可能に連結して、ＴＭの基礎発現を削減することができる。
【０１４３】
さらに、一部の実施形態において、ＴＭは、ＴＭが対象の細胞に輸送される、および／または存在する場合に、低レベルで発現される、核酸配列によってコードされる。一部の実施形態においては、対象の細胞に輸送される、および／またはこれに存在するＴＭをコードする核酸の固有の特性によってＴＭ発現のレベルを調節することが好ましい。例えば、一部の実施形態において、対象の細胞における基礎ＴＭ発現がＴＭをコードする核酸の量の増大に伴い増加する時、弱いプロモーターを利用することによって対象の細胞において発現されるＴＭタンパク質の量を削減することが望ましい場合がある。
【０１４４】
プロモーター領域における独自の制限エンドヌクレアーゼ部位を利用することにより、プロモーターおよび５’ＵＴＲの異なる領域を修飾して、本発明のＲＭの存在または非存在下でＴＭの発現に対して影響を持つ配列を除去することができる。例えば、別の実施形態において、転写開始領域（ｉｎｒ）をコードする配列において欠失を生じさせ、ＴＭをコードする配列に作動可能に連結される誘導的プロモーターの固有の活性を修飾する、例えば、活性を減少または増加させる。別の実施形態において、転写開始領域（ｉｎｒ）の下流が、ＵＴ１２をコードする作動可能に連結される配列である（ＣＭＶの５’非翻訳領域、＋／−１〜＋／−１１２）。
【０１４５】
別の実施形態において、ＴＭは、ＴＡＴＡボックス配列に作動可能に連結される６×ＧＡＬ−４ ＤＢＳを有する誘導的プロモーター配列（例えば、配列番号１）に作動可能に連結される核酸配列によってコードされる。アデノウイルス２型（ＮＣＢＩ登録番号Ｊ０１９１７の残基１６６５−１６７７）のＥＩｂ領域からのＴＡＴＡボックスを含有する−３３〜−２２の配列が、本発明のかかる実施形態において使用するために適切である。別の実施形態において、プロモーター配列は、Ａｄ  ＥＩｂ  ＴＡＴＡボックス配列およびＣＭＶプロモーターの推定の開始（ｉｎｒ）領域を含有するＣＭＶ配列に作動可能に連結される６×ＧＡＬ−４ ＤＢＳを含み（マチアス（Ｍａｃｉａｓ）ら、Ｊｏｕｒｎ．ｏｆＶｉｒｏｌ．７０（６）：３６２８（１９９６年））、これらの機能的配列がＴＭをコードする核酸に作動可能に連結されるようになっている。
【０１４６】
一部の実施形態において、ＴＭは、１７のヌクレオチド配列５’−ＴＧＧＡＧＴＡＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧ−３’または５’−ＣＧＧＡＧＴＡＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧ−３’（例えば、配列番号４９のコンセンサスＧＡＬ−４ ＤＢＳの）を含むＧＡＬ−４ ＤＢＳの多重コピーに作動可能に連結される核酸配列によってコードされる。１つの実施形態において、ＴＭは、例えば、配列番号５０におけるようにヌクレオチド配列５’−ＡＧＴＴＴＡＡＡＡＧ−３’を有する１０個のヌクレオチドスペーサーによって分離される１７のヌクレオチド配列５’−ＣＧＧＡＧＴＡＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧ−３’を含む各々のＧＡＬ−４ ＤＢＳの４つのコピーに作動可能に連結される核酸配列によってコードされる。別の実施形態において、ＴＭは、ＧＡＬ−４ ＤＢＳの各々３つのコピーを有する２群に配置された６つのコピーのＧＡＬ−４ ＤＢＳに作動可能に連結される核酸配列によってコードされ、ここで、１）各々の群（ＧＡＬ−４ ＤＢＳの３つのコピーを含有）において、ＧＡＬ−４ ＤＢＳの第２のコピーは、１７のヌクレオチド配列５’−ＴＧＧＡＧＴＡＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧ−３’を含み、ＧＡＬ−４ ＤＢＳの第１および第３のコピーは各々、１７のヌクレオチド配列５’−ＣＧＧＡＧＴＡＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧ−３を含み、２）３つのコピー群内の各々のコピーが２つのヌクレオチド５’−ＡＧ−３’によって分離され、３）３つのコピーの２群間に長いスペーサー配列５’−ＡＧＴＣＧＡＧＧＧＴＣＧＡＡＧ−３’（例えば、記載されているように、ＧＡＬ−４ ＤＢＳの６つのコピーを含む配列番号５１の配列）がある。
【０１４７】
特定の組織における発現が望ましい一部の実施形態において、本発明の調節発現系は修飾され、組織特異的プロモーターを含みうる。例えば、ＴＭ発現の標的組織が筋である場合は、ＴＭをコードする核酸配列は筋特異的プロモーター、例えば、アクチンプロモーター配列に作動可能に連結されうる。組織特異的プロモーター、（例えば、筋特異的プロモーター）は、コードされたＴＭの発現の忠実度を増加しうる。一部の実施形態において、組織特異的プロモーターは、樹状および他の抗原提示細胞の発現を削減するという利点を提供し、したがって、発現ＴＭ（例えば、タンパク質または核酸）に対する免疫反応を回避しうる。
【０１４８】
１つの実施形態において、本発明の調節発現系は修飾され、ＴＭ（例えば、ベクター）をコードする核酸の輸送とＴＭ発現の誘導との間の遅延時間を与え、詳しくは、ここで核酸輸送に対する炎症性反応が認められる。この実施形態において、ＴＭ発現は、炎症性反応の削減が認められるまで遅延されうる。例えば、一部の実施形態において、例えば、１２〜５４日の遅延期（ＴＭ発現を誘導する前の時間）の長さを増大させることによって、抗ＴＭ抗体産生の発生が減少されうる。さらに、一部の実施形態においては、ＴＭをコードする核酸の導入と、対象の細胞におけるＴＭの発現および／または活性を調節するＡＭ（例えば、ＭＦＰ）の投与との間の遅延を長くすることが望ましい（例えば、ここでＡＭはＲＭを活性化し、活性化ＲＭの存在が、それによってＴＭ発現および／または活性を調節する）。１つの実施形態において、遅延は１２日、好ましくは、２０日、より好ましくは、５５日であり、または免疫反応が減少するまでである。
【０１４９】
１つの実施形態において、調節発現系は、ＴＭ発現および／または活性の特異性、選択性、正確なタイミング、および／またはレベルがＲＭの存在下で修飾されるように修飾される。別の実施形態において、ＲＭは本発明のＲＭが投与される対象における迅速なクリアランスを有する。
【０１５０】
１つの実施形態において、ＲＭはタンパク質であり、修飾され、これが特異的または同種リガンドの存在下で活性化され、それによって、活性化ＲＭの存在がＴＭの発現および／または活性を調節する。さらに、ＲＭの活性化の特異性および厳密性が、ＲＭのＧＡＬ−４ＤＢＤの突然変異によって最適化され、ＡＭの非存在下で二量体を形成する傾向を最小限にしうる。より具体的には、（例えば、ＡＭの非存在下で）ＲＭの非特異的活性化および／または二量体形成を最小限にするために、ＧＡＬ−４ＤＢＤのＣ末端部分（例えば、２０Ｃ末端残基）を欠失さもなければ突然変異させ、それによって、ＧＡＬ−４ホモ二量体形成の一因となると予測されるコイルドコイル構造の長さを削減することによるＧＡＬ−４ドメインの突然変異によって、ＲＭを修飾することができる。
【０１５１】
一部の実施形態において、ＧＡＬ−４ ＤＮＡ結合ドメイン（「ＧＡＬ−４ＤＢＤ」）は、ＧＡＬ−４のＮ末端ＤＢＤのアミノ酸１−９３の部分またはフラグメントを含む（ここで、例えば、アミノ酸２−９３の配列は配列番号３７であり、アミノ酸１はメチオニンである）。例えば、一部の実施形態において、ＧＡＬ−４ＤＢＤはＧＡＬ−４のＮ末端ＤＢＤのアミノ酸２−９３である（例えば、配列番号３８のアミノ酸配列を含み、または配列番号３７の核酸配列によってコードされる）。１つの実施形態において、ＧＡＬ−４ＤＢＤは、ＧＡＬ−４のＮ末端ＤＢＤのアミノ酸２−９３、および、例えば、配列番号４６におけるように（または配列番号４５の核酸配列によってコードされるように）作動可能に連結されるＮ末端ペプチド配列を含み、ここで、例えば、Ｎ末端ペプチド配列の直後にＧＡＬ−４のＮ末端ＤＢＤのアミノ酸２−９３が続く。他の実施形態において、ＧＡＬ−４ＤＢＤはＧＡＬ−４のＮ末端ＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸２−７４を含む（例えば、配列番号４８のアミノ酸配列を含み、または配列番号４７の核酸配列によってコードされる）。一部の実施形態において、適切なＧＡＬ−４ＤＢＤは、結果としてＧＡＬ−４ＤＢＤの突然変異をもたらす核酸配列またはアミノ酸配列における修飾を有し、これは正準な１７−ｍｅｒ結合部位、ＣＧＧＡＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＣＣＧに結合する能力を保持するが、自己二量化に必要ならせん状三次構造を形成する能力が減少している。一部の実施形態において、突然変異または欠失は、ＧＡＬ−４ＤＢＤ配列のアミノ酸７５〜９３および／または５４〜７４にまたがる領域に行われる。例えば、１つの実施形態において、欠失がＧＡＬ−４ＤＢＤ配列のアミノ酸５４〜６４または６５〜７５で作られ、ＲＭのコイルドコイル領域が突然変異型ＧＡＬ−４ＤＢＤを含むことによって、自己二量体形成が最小限になるようにされている。
【０１５２】
１つの実施形態において、ＲＭの核酸配列は修飾され、１つもしくはそれ以上の機能的ドメイン、例えば、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）、および／または調節ドメイン（ＲＤ）（例えば、活性化ドメイン）を含む融合またはキメラタンパク質をコードする。本発明の融合またはキメラタンパク質において使用するための適切な機能的ドメインの例としては、ＧＡＬ−４ＤＢＤ、ヒトプロゲステロン受容体（ｈＰＲ）ＬＢＤ、およびＮＦＫａｐｐａＢｐ６５ＡＤが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５３】
本発明のＲＭにおいて使用するための適切な調節ドメイン（ＲＤ）の例としては、ＮＦＫａｐｐａＢｐ６５、ＶＰ−１６、ＴＡＦ−１、ＴＡＦ−２、ＴＡＵ−１、ＴＡＵ−２、ＯＲＦ−１０、ＴＥＦ−１、および調節機能（例えば、本発明の分子の発現および／または活性を調節する）、より詳しくは、転写調節機能を有する他の核酸配列またはアミノ酸配列が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、ファム（Ｐｈａｍ）ら（１９９２年）６（７）：１０４３−５０頁、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、ダールマン・ライト（Ｄａｈｌｍａｎ−Ｗｒｉｇｈｔ）ら（１９９４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１、１６１９−１６２３頁、ミルホン（Ｍｉｌｈｏｎ）ら（１９９７年）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１（１２）：１７９５−８０５頁、モリウチ（Ｍｏｒｉｕｃｈｉ）ら（１９９５年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２（２０）：９３３３−７頁）、ワング（Ｈｗａｎｇ）ら（１９９３年）ＥＭＢＯＪ１２（６）：２３３７−４８頁を参照）。１つの実施形態において、好ましいＲＤはヒトトランス活性化ドメイン（例えば、ＮＦＫａｐｐａＢｐ６５）である。別の実施形態において、ＲＭ、詳しくはＲＭの機能的ドメイン（例えば、ＲＤ）はヒト化されている。
【０１５４】
１つの実施形態において、本発明のＲＭのＬＢＤは、ステロイド受容体ファミリーの受容体、例えば、プロゲステロン受容体（ＰＲ）およびより詳しくは、ヒトプロゲステロン受容体（ｈＰＲ）の野生型ＬＢＤと相関するアミノ酸配列由来である。別の実施形態において、ＲＭはステロイド受容体であり、ステロイド受容体（例えば、ＰＲ、およびより詳しくはｈＰＲ）のＬＢＤのアミノ酸配列は突然変異により、プロゲスチンではなく抗プロゲスチンであるＡＭに選択的に結合する突然変異型ステロイド受容体ＬＢＤ（例えば、突然変異型ｈＰＲＬＢＤ）となっている。したがって、この実施形態において、突然変異型ステロイド受容体ＬＢＤ（例えば、突然変異型ｈＰＲＬＢＤ）であるＲＭは、天然由来プロゲスチンではなく抗プロゲスチンであるＡＭによって選択的に活性化されうる。具体的には、１つの実施形態において、抗プロゲスチンは天然ＰＲに結合するが、アンタゴニストとして作用する。
【０１５５】
１つの実施形態において、プロゲスチンは野生型ＰＲに結合し、アゴニストとして作用し、切断型または突然変異型ＰＲに結合することはない。別の実施形態において、突然変異型ＰＲは抗プロゲスチンに結合する能力を保持するが、アゴニストとしてそれらに反応する。好ましい実施形態において、抗プロゲスチンがＲＭである突然変異型ＰＲに結合すると、突然変異型ＰＲタンパク質は活性化され、二量体を形成する。この実施形態において、二量体−抗プロゲスチン複合体は、次いで、プロモーター配列のＤＢＳに結合し、それによってＴＭをコードする核酸配列の転写を誘導する（ここでその核酸配列はプロモーターに作動可能に連結されている）。
【０１５６】
１つの実施形態において、抗プロゲスチンＭＦＰ（ＲＵ４８６）の存在下、キメラＲＭはＴＭをコードする核酸配列に作動可能に連結される１７−ｍｅｒ  ＧＡＬ−４ ＤＢＳに結合し、結果としてＴＭ発現の有効なリガンド誘導的トランス活性化をもたらす。ＲＭの修飾ステロイドホルモンＬＢＤは、カルボキシ末端アミノ酸、好ましくは、約１〜１２０カルボキシ末端アミノ酸の欠失によっても修飾されうる。所望のリガンドに対する選択性、および、そのリガンドが投与された場合の高誘導性の両方を、標準の分子生物学的方法を用いて達成することにより、望ましい程度の欠失を得ることができる。１つの実施形態において、突然変異型ステロイドホルモン受容体ＬＢＤは、約１〜約６０のカルボキシ末端アミノ酸の欠失による突然変異型である。別の実施形態において、４２のカルボキシ末端アミノ酸が欠失している。高い選択性および高い誘導性を有するさらに別の実施形態において、１９のカルボキシ末端アミノ酸が欠失している。
【０１５７】
１つの実施形態において、ＲＭの核酸配列は、切断型ＧＡＬ−４ＤＢＤをコードする配列、１９アミノ酸のＣ末端欠失を有する突然変異型プロゲステロン受容体、およびｐ６５トランス活性化ドメイン（例えば、配列番号３９）を含む。別の実施形態において、ＲＭの核酸配列は、突然変異型プロゲステロン受容体リガンド結合ドメイン、切断型ＧＡＬ−４ ＤＮＡ結合ドメイン、およびＶＰ１６またはｐ６５トランス調節ドメインを有するキメラ受容体をコードする配列を含むが、ここでｐ６５トランス調節ドメインは、ＮＦｋａｐｐａＢ複合体の成分、ヒトｐ６５タンパク質の活性化ドメインの一部である。ＶＰ１６をさまざまなヒト由来活性化ドメイン、例えば、ヒトｐ６５の残基２８６−５５０で置換することによって、キメラ受容体の有力な誘導性が保持されると同時に、タンパク質を「ヒト化」し、ウイルスＶＰ１６成分による外来タンパク質免疫反応の可能性を削減する。
【０１５８】
本発明のＲＭのＤＢＤは、本明細書に記載されているように修飾ＧＡＬ−４ＤＢＤに限定されない。例えば、一部の実施形態において、適切なＤＢＤは、修飾されており、結合部位の認識に本質的ではないが、その二次構造によって自己二量化の一因となることが予測されうる配列を除去するものである。こうして修飾され、適切でありうる他のＤＢＤとしては、例えば、ステロイド受容体ファミリー（例えば、グルコオルチコイド受容体、プロゲステロン受容体、レチノイン酸受容体、甲状腺受容体、アンドロゲン受容体、エクジソン受容体）、またはｃＡＭＰ反応要素結合タンパク質（ＣＲＥＢ）、またはＳＰ１などの亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質など他の細胞ＤＮＡ結合タンパク質のメンバーの周知のＤＢＤが挙げられる。
【０１５９】
遺伝子調節タンパク質のステロイド受容体ファミリーも本発明のＲＭの構成に適切である。ステロイド受容体は、そのリガンドがステロイドからレチノイドまでの範囲でありうるリガンド活性化転写因子、脂肪酸、ビタミン、甲状腺ホルモン、および他の現在同定されていない小分子である。これらの化合物は受容体に結合し、ステロイド調節遺伝子の発現を上方調節または下方調節する。これらの化合物は、現存の機序によって体から除去され、通常、非毒性であることが報告されている。本発明において、ステロイド受容体のリガンドは、例えば、ステロイド受容体のＬＢＤに結合し、さもなければ、これと相互作用することによって、ステロイド受容体を活性化する化合物または分子でありうる。
【０１６０】
本明細書で使用される「ステロイドホルモン受容体」という語は、ステロイド受容体のスーパーファミリーにおけるステロイドホルモン受容体を指す。ステロイドホルモン受容体ファミリーの代表的な例はとしては、エストロゲン、プロゲステロン、グルコオルチコイド、ミネラルコオルチコイド、アンドロゲン、甲状腺ホルモン、レチノイン酸、レチノイドＸ、ビタミンＤ、ＣＯＵＰ−ＴＦ、エクジソン、Ｎｕｒｒ−１およびオーファン受容体が挙げられるが、これらに限定されない。ステロイド／甲状腺／レチノイドスーパー遺伝子ファミリーにおけるホルモンの受容体は、例えば、ホルモン感受性遺伝子の調節領域内の標的配列に結合してその転写を強化または抑制する転写因子である。これらの受容体は、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、二量化ドメイン、および１つもしくはそれ以上のトランス活性化ドメインを含む、一連の個々の構造的ドメインにおいて、進化的に保存された類似性を有する。
【０１６１】
異なる構造的ドメインのアミノ酸配列におけるさまざまな突然変異または変化が生成され、変異体ステロイド受容体、またはより具体的には、突然変異型ステロイド受容体を形成しうる。１つの実施形態において、突然変異型ステロイド受容体は、野生型または天然由来ホルモン受容体リガンドに結合するのではなく、非天然または野生型(non-native)リガンドに優先的に結合する。１つの実施形態において、突然変異型ホルモン受容体は、基準ホルモン受容体（例えば、野生型または天然由来ホルモン受容体）のカルボキシ末端でのアミノ酸の欠失、例えば、基準ホルモン受容体のカルボキシ末端からの約１〜約１２０アミノ酸の欠失によって生成される。別の実施形態において、本発明の突然変異型プロゲステロン受容体は、基準プロゲステロン受容体（例えば、野生型または天然由来ホルモン受容体）の約１〜約６０アミノ酸のカルボキシ末端欠失を含む。別の実施形態において、突然変異型プロゲステロン受容体は、基準プロゲステロン受容体（例えば、野生型または天然由来ホルモン受容体）の１９アミノ酸のカルボキシ末端欠失を含む。
【０１６２】
本発明の組成物および方法において修飾および／または使用するための修飾または突然変異型ステロイドホルモン受容体の別の例が、例えば、（１）「Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」国際公開第００３１２８６号パンフレット（ＰＣＴＡＪＳ９９／２６８０２）、（２）「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，  Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ／  Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｈｙｂｒｉｄｓ」国際公開第９８１８９２５号パンフレット（ＰＣＴＡＪＳ９７／１９６０７）、（３）「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ」国際公開第９６４０９１１号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０４３２）、（４）「Ｍｕｔａｔｅｄ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｗｉｔｃｈ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」国際特許公報第９３２３４３１号明細書（ＰＣＴＡＪＳ９３／０４３９）、（５）「Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｃ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｓ」、米国特許第５，３６４，７９１号明細書、（６）「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｗｉｔｃｈ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」米国特許第５，８７４，５３４号明細書、および（７）「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｗｉｔｃｈ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」米国特許第５，９３５，９３４号明細書に記載されている。
【０１６３】
さらに、突然変異型ステロイドホルモン受容体ＬＢＤは、野生型受容体のアゴニストの存在下でも突然変異型受容体を活性化する野生型ステロイドホルモン受容体のアンタゴニストの能力に基づき選択されうる。例えば、１つの実施形態において、プロゲステロンは、プロゲステロン受容体の正常リガンドであり、受容体の強力なアゴニストとして機能する。抗プロゲスチン、ＭＦＰ（ＲＵ４８６）はプロゲステロン受容体の非天然または非野生型リガンドである。ＭＦＰは、野生型プロゲステロン受容体に対してアゴニスト効果を発揮することができるが、ＭＦＰはプロゲステロンのアゴニスト効果を阻害するという点で「抗プロゲスチン」とみなされている。したがって、ＭＦＰは、正常アゴニストの存在下、すなわち、ＭＦＰおよびプロゲステロンが野生型プロゲステロン受容体の存在下で一緒である場合、野生型プロゲステロン受容体の「アンタゴニスト」とみなされうる。しかし、本発明の１つの実施形態において、突然変異型プロゲステロンステロイドホルモン受容体は、プロゲステロン（野生型受容体のアゴニスト）によって活性化されないが、ＭＦＰ（野生型受容体の「アンタゴニスト」）の存在下で活性化される。また、１つの実施形態において、プロゲステロンは、ＭＦＰによる突然変異型ステロイドホルモン受容体の活性化を阻止することがない。したがって、突然変異型受容体は、野生型プロゲステロン受容体のアゴニスト（例えば、プロゲステロン）の存在下でも野生型受容体のアンタゴニスト（例えば、ＭＦＰ）に結合されると活性化と特徴づけられうる。
【０１６４】
１つの実施形態において、突然変異型ステロイド受容体は野生型ステロイドホルモン受容体のアンタゴニストの存在下で所望のＴＭの転写を活性化する。一部の実施形態において、アンタゴニストは、野生型ステロイド受容体（例えば、野生型ステロイドホルモン受容体）のアンタゴニストとして作用する非天然由来または非野生型リガンドである。１つの実施形態において、野生型ステロイドホルモン受容体のアンタゴニストは、野生型ステロイドホルモン受容体と相互作用するまたは結合する分子であり、受容体のアゴニストの活性を阻止する。別の実施形態において、野生型ステロイドホルモン受容体のアゴニストは、野生型ステロイドホルモン受容体と相互作用し、対象の細胞におけるＴＭの発現および／または活性を調節する分子である。かかるアゴニストの例としては、プロゲステロン受容体１０に対するプロゲステロンまたはプロゲスチンが挙げられるが、これらに限定されず、ここでプロゲステロンは野生型プロゲステロン受容体に結合し、プロゲステロン調節性遺伝子の転写を活性化する。
【０１６５】
１つの実施形態において、適切なプロゲステロン受容体アゴニストは、プロゲステロンによく似る化合物である。例えば、ミフェプリストン（ＭＦＰ）はまたはＲＵ４８６として周知であるが、野生型プロゲステロン受容体にも結合し、プロゲステロンと結合について競合する非天然リガンドである。１つの実施形態において、プロゲステロンおよび野生型プロゲステロン受容体の存在下で、ＭＦＰはプロゲステロンによる受容体の活性化を阻止することによって受容体に対する拮抗作用を発揮する。
【０１６６】
プロゲステロン受容体（ＰＲ）は、例えば、プロゲステロン受容体のＬＢＤにおいて修飾され、ＭＦＰのみに結合し、プロゲステロンには結合しないようになりうる。例えば、プロゲステロン受容体のＬＢＤの突然変異は、ＭＦＰの結合がプロゲステロン受容体を活性化するようになりうる。１つの実施形態において、突然変異型ＰＲ  ＬＢＤ、またはより一般に他の突然変異型ステロイド受容体ＬＢＤは、特定のＤＢＤ（例えば、ＧＡＬ−４ＤＢＤ）と融合し、ＭＦＰの結合が選択的にＲＭを活性化し、ＰＲのＤＢＤによって認識されるプロモーターによって推進されるＴＭ発現および／または活性をトランス活性化するようになっている。したがって、一部の実施形態において、本発明の突然変異型ステロイド受容体は、野生型ステロイド受容体のアゴニストの存在下で活性化されないが、その代わりにその突然変異型ステロイド受容体は非天然リガンドの存在下で活性化される。
【０１６７】
「非天然リガンド」または「非野生型リガンド」という語は、受容体のリガンド結合ドメインに結合する非野生型または天然由来ではないリガンドである化合物を指す。非天然リガンドの例は、選択的プロゲステロン受容体調節剤（ＳＰＲＭ）またはメゾプロゲスチンである（例えば、チュワリス（Ｃｈｗａｌｉｓｚ）ら（２００２年）Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９５５：３７３−３８８頁、エルガー（Ｅｌｇｅｒ）ら（２０００年）Ｓｔｅｒｏｉｄ  ６５（１０−１１）：７１３−７２３頁、チュワリス（Ｃｈｗａｌｉｓｚ）ら（２００４年）  Ｓｅｍｉｎ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｍｅｄ  ２２（２）：１１３−１１９頁、デマノ（ＤｅＭａｎｎｏ）ら（２００３年）６８（１０−１３）：１０１９−１０３２年、フールマン（Ｆｕｈｒｍａｎｎ）ら（２０００年）Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４３（２６）：５０１０−５０１６頁を参照）。ＳＰＲＭまたはメゾプロゲスチンの例は下表２に記載されて説明されている（化合物１−１６）。
【０１６８】
表２
１．名称：１７β−メトキシ−１７α−（メトキシメチル）−１１β−メトキシフェニル−４，９−エストラ−ジエン−３−オン
構造：
【化１】
2008545639.tif 000005
式：Ｃ２８Ｈ３６Ｏ４
分子量：４３６．６０ｇ／ｍｏｌ
融点：１８４−１８６℃（ジクロロメタン）
２．名称：４−［１７β−メトキシ−１７α−（メトキシメチル）−３−オキソエストラ−４，９−ジエン−１１β−イル］ベンズアルデヒド−１（Ｅ）−［Ｏ−（エトキシ）カルボニル］オキシム
構造：
【化２】
2008545639.tif 000006
式：Ｃ３１Ｈ３９ＮＯ６
分子量：５２１．６６ｇ／ｍｏｌ
融点：１４３−１５１℃（分解性メタノール）
３．名称：４−［１７β−メトキシ−１７α−（メトキシメチル）−３−オキソエストラ−４，９−ジエン−１１β−イル］ベンズアルデヒド−１（Ｅ）−オキシムアセテート
構造：
【化３】
2008545639.tif 000007
式：Ｃ３０Ｈ３７ＮＯ５
分子量：４９１．６３ｇ／ｍｏｌ
融点：１１０−１１９℃（エチルアセテート）
４．名称：４−［１７α−（エトキシメチル）−１７β−メトキシ−３−オキソエストラ−４，９−ジエン−１１β−イル］ベンズアルデヒド−１（Ｅ）−オキシム
構造：
【化４】
2008545639.tif 000008
式：Ｃ２９Ｈ３７ＮＯ４
分子量：４６３．６２ｇ／ｍｏｌ
融点：９０−９５℃（メチルｔｅｒｔ．ブチルエーテル）
純度ＨＰＬＣ：９８．９面積％（２６４ｎｍ）
５．名称：４−［１７β−メトキシ−１７α−（メトキシメチル）−３−オキソエストラ−４，９−ジエン−１１β−イル］ベンズアルデヒド−  チオセミカルバゾン
構造：
【化５】
2008545639.tif 000009
式：Ｃ２９Ｈ３７Ｎ３Ｏ３Ｓ  
分子量：５０７．６９ｇ／ｍｏｌ
融点：２１７−２３６℃（メタノール）
６．名称：４−［１７β−ヒドロキシ−１７α−（メトキシメチル）−３−オキソエストラ−４，９−ジエン−１１β−イル］ベンズアルデヒド−１（Ｅ）−オキシムアセテート
構造：
【化６】
2008545639.tif 000010
式：Ｃ２９Ｈ３５ＮＯ５
分子量：４７７．６１
融点：１１２℃（アセトン、分解性）、αＤ＝＋／−２０９°（ＣＨＣｌ３）  
７．名称：４−［１７β−ヒドロキシ−１７α−（メトキシメチル）−３−オキソエストラ−４，９−ジエン−１１β−イル］ベンズアルデヒド−１−（Ｅ）−［Ｏ−（エチルアミノ）カルボニル］オキシム
構造：
【化７】
2008545639.tif 000011
式：Ｃ３０Ｈ３８Ｎ２Ｏ５
分子量：５０６．６５ｇ／ｍｏｌ
融点：１８４−１９０℃（メチレンクロライド／エチルアセテート）
８．名称：４−［１７β−メトキシ−１７α−（メトキシメチル）−３−オキソエストラ−４，９−ジエン−１１β−イル］ベンズアルデヒド−１−（Ｅ）−［Ｏ−（メトキシ）カルボニル］オキシム（ＺＫ２８０９９３）
構造：
【化８】
2008545639.tif 000012
式：Ｃ３０Ｈ３７ＮＯ６
分子量：５０７．６３ｇ／ｍｏｌ
融点：１１０℃（ｍｔｂｅ、分解性）
９．名称：４−［１７β−ヒドロキシ１７α−メチル−３−オキソエストラ−４，９−ジエン−１１β−イル］ベンズアルデヒド−１（Ｅ）−オキシム（ＺＫ２８０９９９）
構造：
【化９】
2008545639.tif 000013
式：Ｃ２６Ｈ３１ＮＯ３
分子量：４０５．５３ｇ／ｍｏｌ
融点：１６３−１６５℃（エタノール／水）  
１０．名称：４−［１７β−メトキシ−１７α−（メトキシメチル）−３−オキソエストラ−４，９−ジエン−１１β−イル］ベンズアルデヒド−１（Ｅ）−［Ｏ−（エチルチオ）カルボニル］オキシム（ＺＫ１９０４２５）
構造：
【化１０】
2008545639.tif 000014
式：Ｃ３１Ｈ３９ＮＯ５Ｓ
分子量：５３７．７２ｇ／ｍｏｌ
融点：１４８−１５５℃分解性（アセトン／ｎ−ヘキサン）
１１．名称：４−［１７β−ヒドロキシ−１７α−（２−プロポキシメチル）−３−オキソエストラ−４，９−ジエン−１１β−イル］ベンズアルデヒド−１（Ｅ）−オキシム（ＺＫ２８１１００）
構造：
【化１１】
2008545639.tif 000015
式：Ｃ２９Ｈ３７ＮＯ４
分子量：４６３．６２ｇ／ｍｏｌ
融点：１９２−１９６℃（ジエチルエーテル、分解性）
１２．名称：４−（４’−Ｂｒｏｍ−１７β−メトキシ１７α−（メトキシメチル）−３−オキソエストラ−４，９−ジエン−１１β−イル］ベンズアルデヒド−１（Ｅ）−オキシム（ＺＫ２８１１１７）
構造：
【化１２】
2008545639.tif 000016
式：Ｃ２６Ｈ３４ＢｒＮＯ４
分子量：５２８．４８ｇ／ｍｏｌ
融点：１３８−１４１℃（ジエチルエーテル／ｎ−ヘキサン）
１３．名称：４−［１７β−メトキシ−１７α−（メトキシメチル）−３−オキソエストラ−４，９−ジエン−１１β−イル］アセトフェノン１１β−（４−アセチルフェニル）１７β−メトキシ−１７α−（メトキシメチル）−４，９−エストラジエン−３−オン（ＺＫ１３９９０５）
構造：
【化１３】
2008545639.tif 000017
式：Ｃ２９Ｈ３６Ｏ４
分子量：４４８．６１ｇ／ｍｏｌ
融点：１３３−１３７℃（ジエチルエーテル／メチレンクロライド）
１４．名称：１１β−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−１７β−メトキシ−１７α−（メトキシメチル）−４，９−エストラジエン−３−オン（ＺＫ２８１３１７）
構造：
【化１４】
2008545639.tif 000018
式：Ｃ２９Ｈ３９ＮＯ３
分子量：４４９．６４
泡状（ヘキサン）、αＤ＝＋１８４°（ＣＨＣｌ３）
１５．名称：４−［１７α−エチニル−１７β−メトキシ−３−オキソエストラ−４，９−ジエン−１１β−イル］ベンズアルデヒド−１（Ｅ）−オキシム（ＺＫ２８１５２７）
構造：
【化１５】
2008545639.tif 000019
式：Ｃ２８Ｈ３１ＮＯ３
分子量：４２９．５６ｇ／ｍｏｌ
融点：１４９−１５７℃（アセトン）
１６．名称：４−［９α、１０α−エポキシ−１７β−ヒドロキシ−１７α−（メトキシメチル）−３−オキソエステル−４−ｅｎ−１１β−イル］ベンズアルデヒド−（Ｅ）−オキシム（ＺＫ２３４９６５）
構造：
【化１６】
2008545639.tif 000020
式：Ｃ２７Ｈ３３ＮＯ５
分子量：４５１．５７
融点：１１０°Ｃ分解性（アセトン／メチルｔｅｒｔブチルエーテル）
【０１６９】
また、非天然リガンドおよび非野生型リガンドの例は次のものを含みうる抗ホルモンである。すなわち、１１−（４−ジメチルアミノフェニル）−１７−ヒドロキシ−１７ｃ−プロピニル−４，９−エストラジエン−３−オン（ＲＵ３８４８６またはミフェプリストン）、１１−（４−ジメチルアミノフェニル）−１７ｏ−ヒドロキシ−１７−（３−ヒドロキシプロピル）−１３−メチル−４，９−ゴナジエン−３−オン（ＺＫ９８２９９またはオナプリストン）、１１−（４−アセチルフェニル）−１７−ヒドロキシ−１７ｃ−（１−プロピニル）−４，９−エストラジエン−３−オン（ＺＫ１１２９９３）、１１−（４−ジメチルアミノフェニル）−１７−ヒドロキシ−１７（ｚ−（３−ヒドロキシ−１（Ｚ）−プロペニル−エストラ−４，９−ジエン−３−オン（ＺＫ９８７３４）、（７、１１、１７）−１１−（４−ジメチルアミノフェニル）−７−メチル−４’，５’−ジヒドロスピロ［エステル−４，９−ジエン−１７、２１（３’Ｈ）−フラン］−３−オン（Ｏｒｇ３１８０６）、（１１，１４，１７ｃ）−４’，５’−ジヒドロ−１１−（４−ジメチルアミノフェニル）−［スピロエストラ−４，９−ジエン−１７、２’（３’Ｈ）−フラン］−３−オン（Ｏｒｇ３１３７６）、５−ｃ−プレグナン−３、２−ジオン、Ｏｒｇ３３６２８（クルースターボエル（Ｋｌｏｏｓｔｅｒｂｏｅｒ）ら（１９９５年）Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｊｕｎ  １２、７６１：１９２−２０１頁）、Ｏｒｇ３３２４５（シューネン（Ｓｃｈｏｏｎｅｎ）ら（１９９８年）Ｊ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｆｅｂ、６４（３−４）：１５７−７０頁）。かかるリガンドの別の例が、例えば、本発明のＲＭの誘導剤として作用する非ステロイドプロゲステロン受容体結合リガンドである。
【０１７０】
アミノ酸または核酸修飾（例えば、欠失、挿入、点突然変異、融合を含む）の標準方法を使用することにより、本発明の分子（例えば、ＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、ＩＭ、またはＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭをコードする核酸）のタンパク質ドメイン（例えば、ＡＤ、ＬＢＤ、ＤＢＤ）または機能的核酸配列（例えば、タンパク質、ＲＮＡ、プロモーター、スプライス部位、イントロン、ＤＮＡ結合部位、またはポリ（Ａ）部位をコードする配列）は、かかる調節、発現、および／または活性のために修飾または最適化されうる。さらに、本発明の分子（例えば、ＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、ＩＭ、またはＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭをコードする核酸）は、分子の発現および／または活性が一時的または構成的であり、および／または特定の状態、疾患、バイオマーカーまたは他の分子の存在下で調節され、または自己調節されるように修飾されうる。より詳しくは、本発明の核酸またはアミノ酸分子、または化合物の一次、二次、または三次構造は修飾され、結合、活性化、不活性化、または配座の特定の厳密性、特異性、または量を達成しうる（例えば、ホモまたはヘテロ二量体または他の多量体を形成する、または特異的または同種リガンドまたは部位に結合する）。
【０１７１】
例えば、本発明の発現カセットの転写部分は、作動可能に連結され、コードされ、発現される分子（例えば、ＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭ）の発現および／または活性の特異性、レベル、および忠実度を最適化するまたは改善する転写後要素（例えば、ＵＴＲ、スプライス部位、イントロン、および／またはポリ（Ａ）シグナル）を含むように修飾することができる。さらに、本発明の分子をコードする作動可能に連結される配列のプロモーター配列は、コードされた分子の発現が、例えば、一時的または構成的である、誘導的または抑制性である、および／または変調されるかさもなければ特定の状態または分子の存在によって調節されるように、修飾することができる。
【０１７２】
本発明の発現カセットのさまざまな機能的配列は修飾され、コードされた分子（例えば、ＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭ）の発現および／または特性を最適化することができる。例えば、イントロン配列は修飾され、かかる配列からのＲＮＡ転写産物のきわめて有効正確なスプライシングを最適化することができる。それによって、あいまいな(cryptic)スプライシングが最小限にされ、本発明の核酸によってコードされた所望の分子（例えば、ＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭ）の発現が最大化されうる。本発明の組成物において使用するために適切な合成イントロンの例としては、５’スプライス部位、３’スプライス部位、および／または分岐点のコンセンサス配列が挙げられるが、これらに限定されない。５’スプライス部位は、Ｕ１ｓｎＲＮＡとペアとなることが報告されている。適切な５’スプライス部位コンセンサス配列は、Ｕ１ＲＮＡと合成５’スプライス部位、例えば、５’−ＣＡＧＧＵＡＡＧＵ−３’を含む５’スプライス部位配列との間のヘリックス形成の自由エネルギーを最小限にするために最適化されているものである。さらに、単一バルジＡ残基を除く分岐点（ＢＰ）配列が、Ｕ２ｓｎＲＮＡとペアとなることが報告されている。したがって、分岐点配列は、Ｕ２ＲＮＡと配列とのヘリックス形成の自由エネルギーを最小限にするために最適化されうる。ＢＰは一般的に３’スプライス部位の上流の１８−３８ｎｔｓに位置している。１つの実施形態において、合成イントロンのＢＰ配列は３’スプライス部位から上流の２４ｎｔｓに位置し、例えば、５’ＵＡＣＵＡＣ  ３’を含むＢＰ配列である。さらに、３’スプライス部位のコンセンサス配列のポリピリミジントラクトは、３’スプライス部位機能のために最適化されうる。例えば、少なくとも５連続ウラシル残基が３’スプライス部位機能のために最適であることが報告されており、したがって、一部の実施形態において、本発明の合成イントロンのポリピリミジントラクトは７連続ウラシル残基を有する。
【０１７３】
同様に、イントロンの長さが最適化されうる。例えば、天然由来イントロンは長さが９０−２００ｎｔでありうることが周知である。１つの実施形態において、結果として生じる内部エキソンの長さは３００ヌクレオチド未満である。１つの実施形態において、合成イントロンはＩＶＳ８（例えば、配列番号３）であり、制限酵素部位、ＢｂｓｌおよびＥａｒｌ（合成イントロン内に位置）のほか、ＰｓｔｌおよびＮｈｅｌを含む。制限酵素Ｂｂｓｌは、正確に５’スプライス部位でＤＮＡを切断するために使用され、Ｅａｒｌは正確に３’スプライス部位でＤＮＡを切断するために使用されうる。さらに、合成イントロンは、本発明の分子をコードする核酸配列の複数の位置に挿入されうる。例えば、一部の実施形態において、本発明の分子をコードする核酸配列は修飾され、複数のイントロンを含む。
【０１７４】
別の実施形態において、合成イントロン、ＩＶＳ８（例えば、配列番号３）に加えて、本発明の発現カセットは修飾され、ＵＴ１２と呼ばれるＣＭＶ５’ＵＴＲをコードする核酸配列、発現制御要素（例えば、配列番号２）を含む。別の実施形態において、本発明の発現カセットは修飾され、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルをコードする核酸配列（例えば、配列番号８）を含む。さらに別の実施形態において、本発明の発現カセットは修飾され、ヒト成長ホルモン（「ｈＧＨ」）ポリ（Ａ）シグナルをコードする核酸配列（例えば、配列番号６）を含む。本明細書に記載されたこれらおよび他の修飾を使用し、本明細書に記載されているように、本発明の核酸配列によってコードされた（例えば、発現カセット、またはベクターの核酸配列によってコードされた）分子（例えば、ＴＭ、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭ）の発現のレベルおよび忠実度を最適化することができる。
【０１７５】
本明細書で使用される「イントロン」という語は、ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡへ転写されるが、成熟メッセンジャーＲＮＡを形成するためにスプライシングによって除去されるＤＮＡ配列にコードされた配列を指す。「合成イントロン」は、最初は天然由来イントロン配列から複製されず、一般に天然由来配列を有さないが、正常な転写後プロセシング中にＲＮＡ転写産物から除去される配列を指す。かかる合成イントロンは、さまざまな異なる特徴を有するようにデザインされうる。具体的には、かかるイントロンはスプライス部位の所望の強さおよび所望の長さを有するようにデザインされうる。本発明の好ましい実施形態において、分子スイッチ発現カセットおよび治療的遺伝子発現カセットの両方が合成イントロンを含む。合成イントロンとしては、５’スプライス部位、３’スプライス部位、および分岐点のコンセンサス配列が挙げられる。治療的遺伝子を発現するようにデザインされた真核ベクターへ組込まれると、合成イントロンはきわめて有効正確な方法でＲＮＡ転写産物のスプライシングを方向づけ、それによってあいまいなスプライシングを最小限にし、所望の遺伝子産物の産生を最大化する。
【０１７６】
さらに、周知の方法を使用することにより、タンパク質のドメインをコードする機能的配列は修飾され、タンパク質の活性のために最適化することができる。例えば、分子モデリングを使用することにより、ＧＡＬ−４ＤＢＤを有するタンパク質の配列特異的ＤＮＡ結合活性を保持しつつ二量化の可能性がより低くなるように、切断突然変異型をデザインすることができる。ＧＡＬ−４ＤＢＤは、二量体として、パリンドローム１７−ｍｅｒＧＡＬ−４ ＤＢＳ（ＣＧＧＡＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＣＣＧ）に結合することが報告されており、かかる二量体結合が、結果としてＧＡＬ−４ ＤＢＳを有する誘導的プロモーターの活性化をもたらすことが報告されている。したがって、ＧＡＬ−４ＤＢＤを有するタンパク質をコードする核酸配列は、ＧＡＬ−４ＤＢＤの三次構造が最適化されて、調節されたのではない（例えば、ＡＭ依存性）または望ましくない二量化が減少し、結果として誘導的プロモーターの活性化をもたらすように修飾されうる。
【０１７７】
ＧＡＬ−４ＤＢＤ配列の構造および機能は周知である（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ０１／３０３０５号明細書を参照）。例えば、システイン（Ｃ）は亜鉛のキレート化に関与しうる；二量化要素を形成するコイルドコイルは、残基５４−７４および８６−９３を含む；一般に疎水性アミノ酸は、各７アミノ酸リピート配列の第１および第４の位置にあることが報告されている；残基Ｓｅｒ４７およびＡｒｇ５１は二量体を形成するタンパク質鎖間で水素結合を形成することが報告されている；残基８−４０はＺｎ結合ドメインまたはＤＮＡ認識単位を形成することが報告されている。このＤＮＡ認識単位は、２つのアルファへリックスドメインを有し、これは小型の球状構造を形成し、Ｚｎの存在下で結果として、亜鉛フィンガーではなく報告によると二核の金属イオンクラスターである構造となる、すなわち、システインリッチのアミノ酸配列（ＣｙｓＸａ−Ｘａａ２−Ｃｙｓ１４−Ｘａａａ−ＣｙｓＺ１−Ｘａａ６−ＣｙｓＺＳ−Ｘａａ２−Ｃｙｓ３１−Ｘａａａ−Ｃｙｓ３８）が２つのＺｎ（ＩＩ）イオンに結合する（パン（Ｐａｎ）とコールマン（Ｃｏｌｅｍａｎ）（１９９０年）ＰＮＡＳ８７：２０７７−８１頁）。Ｚｎクラスターは、１７−ｍｅｔ結合部位の極末端の３ｂｐの主溝との接触に関与する可能性があり；報告によると、２６にあるプロリン（シスプロリン）が、亜鉛クラスタードメインの２つのアルファヘリックスドメインを連結するループを形成し、この機能に重要である。さらに、残基４１−４９は、ＤＮＡ認識単位と二量化要素、残基５４−７４と８６−９３を結合させることが報告されている。
【０１７８】
二量化されると、二量体の残基４７−５１はまた、ＤＮＡ標的のリン酸と相互作用しうる。残基５０−６４は弱い二量化に関与しうる。二量体は、両親媒性アルファヘリックスを形成する短いコイルドコイルからなり、ここで２つのアルファヘリックスはロイシンジッパーと同様の平行コイルドコイルへ配置される。残基５４−７４内に存在する３対のロイシンおよび１対のバリンの疎水性相互作用に加えて、２つのＡｒｇ−Ｇｌｕ２Ｏ塩の連結、および一方の単量体のＡｒｇ５１と他方の単量体のＳｅｒ４７の間の水素結合が存在する。残基６５−９３は、強い二量化ドメインを形成しうる。残基６５−７１の構造は１つの７アミノ酸リピートについてのコイルドコイル構造の継続である。残基７２−７８はプロリンを含有し、したがって両親媒性ヘリックスを分裂させる。しかし、残基７９−９９は、３つのより強力にアルファヘリカルな７アミノ酸配列を含有する（マルモーシュタイン（Ｍａｒｍｏｒｓｔｅｉｎ）ら（１９９２年）Ｎａｔｕｒｅ３５６：４０８−４１４頁）。さらに、ＧＡＬ−４残基１−１００の結合についてのＫｄが３ｎＭであることが報告されている（リース（Ｒｅｅｃｅ）とプタシュン（Ｐｔａｓｈｎｅ）（１９９３年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６１：９０９−９１１頁）。
【０１７９】
ＧＡＬ−４ＤＢＤ配列の構造および機能に照らして、多くの可能な修飾がＧＡＬ−４ドメインの領域に行われうる。一部の実施形態において、ＧＡＬ−４領域を修飾して、基礎発現の除去または削減および配列特異的ＤＮＡ結合の保持について最適化する。より詳しくは、一部の実施形態において、ＧＡＬ−４ＤＢＤの、相互作用するコイルドコイル配列（例えば、残基５４−７４および残基８６−９３）を含有する領域の長さは、欠失、例えば、アミノ酸配列５４−６４、６５−７４、５４−７４、または８６−９３の欠失によって短縮されうる。また、コイルドコイル領域の１つを欠失させることによって、１つのみのコイルドコイル領域を有するＧＡＬ−４突然変異型を作製することができる。さらに、例えば、各アルファヘリックス７アミノ酸配列の結合部に位置する独自の制限部位を利用して、ＧＡＬ−４ドメインに突然変異型または人工配列を挿入することもできる。このように、漸進的に減少したアルファヘリックス７アミノ酸配列を有する、ＧＡＬ−４ドメインの修飾型が産生されうる。
【０１８０】
一部の実施形態において、野生型(native)ＧＡＬ−４配列を修飾して、Ｎ−末端メチオニンを除去し、追加のアミノ酸を配列のＮ−末端に付加する。これらの実施形態において、野生型ＧＡＬ−４配列のＮ末端アミノ酸を修飾することは、Ｚｎ結合ドメインの残基８−４０の三次構造に影響を及ぼさない限り重大ではない。さらに、一部の実施形態において、小分子ＡＭ（例えば、ＭＦＰ）の、ＧＡＬ−４ＤＢＤを有するタンパク質（例えば、ＲＭ）の突然変異型ｈＰＲ  ＬＢＤとの特異的結合は、タンパク質の立体構造が変化しタンパク質の二量化が開始する引き金となる。また、一部の実施形態において、本発明の発現カセットは、配列番号３７のＧＡＬ−４ＤＢＤ配列の残基２−９３をコードする核酸配列を含む。さらに、１つの実施形態において、ＧＡＬ−４ＤＢＤのＤＮＡ認識配列は、配列番号３７のＧＡＬ−４ＤＢＤ配列の残基９−４０を含む。
【０１８１】
本発明の１つの実施形態において、ＧＡＬ−４ドメインはＧＡＬ−４ＤＢＤのＣ末端部分での１９アミノ酸の欠失によって切断され、配列番号３７のＧＡＬ−４ＤＢＤ配列の残基７５−９３を含む。１つの実施形態において、本発明のＲＭは、配列番号３７のＧＡＬ−４ＤＢＤ配列の残基２−７４を含む突然変異型プロゲステロン受容体を含むキメラタンパク質であり、具体的にはＡＭの存在下で活性化される突然変異型プロゲステロン受容体ＬＢＤである。さらに、ＡＭの非存在下では、ＲＭ活性化および結果として生じるＧＡＬ−４ ＤＢＳを有するプロモーターに作動可能に連結される核酸配列の転写の誘導または活性化はほとんど、またはまったく認められない。
【０１８２】
すでに述べたように、天然分子（例えば、タンパク質または核酸）の変異体をコードする核酸も本発明の組成物および方法において使用するために適切である。例えば、ＩＦＮ−β（例えば、ＩＦＮ−β  １ｂ）の変異体は、本発明の組成物および方法のために、詳しくは、ＭＳの治療のためにＴＭとして適切に使用される。好ましくは、ＩＦＮ−β変異体は天然ヒトＩＦＮ−βの変異体である。天然由来（例えば、ＩＦＮ−β遺伝子座で生じる対立遺伝子変異体）または組換えまたは合成的に産生されうる野生型ヒトＩＦＮ−βの変異体は、成熟野生型ＩＦＮ−β配列と同様または実質的に同様であるアミノ酸配列を有する。野生型ヒトＩＦＮ−β（例えば、配列番号１３のアミノ酸配列を含む）をコードする核酸は、本発明の組成物および方法において使用するために適切である（例えば、ＩＦＮ−β１ａ（例えば、配列番号１４））。また、ヒトＩＦＮ−β変異体をコードする核酸も本発明の組成物および方法において使用するために適切である（例えば、ＩＦＮ−β１ｂ）（例えば、米国特許第４，５８８，５８５号明細書、同第４，７３７，４６２号明細書、および同第４，９５９，３１４号明細書を参照）。変異体は、生物または治療活性を保持する天然分子（例えば、タンパク質または核酸）のフラグメントまたは切断型をコードする核酸をも包含する。例えば、野生型タンパク質のこれら生物活性フラグメントまたは切断型をコードする核酸である。さらに、一部の実施形態において、本発明の発現タンパク質は、グリコシル化される場合もあり、グリコシル化されない場合もある。
【０１８３】
さらに、本発明の組成物および方法において使用するために適切なタンパク質または核酸変異体は、それぞれ、トリ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、および  ヒトを含むが、これらに限定されない哺乳類種の野生型(native or wiled-type)タンパク質または核酸の変異体でありうる。本発明に包含されるＩＦＮ−β変異体の非限定的例（例えば、核酸によってコードされる、例えば、ナガタ（Ｎａｇａｔａ）ら（１９８０年）Ｎａｔｕｒｅ  ２８４：３１６−３２０頁、ゲッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら（１９８０年）Ｎａｔｕｒｅ  ２８７：４１１−４１６頁、イエルベルトン（Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ）ら（１９８１年）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：７３１−７４１頁、ストロイリ（Ｓｔｒｅｕｌｉ）ら（１９８１年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国Ａ．７８：２８４８−２８５２頁、ＥＰ０２８０３３Ｂ１、およびＥＰ１０９７４８Ｂ１。例えば、米国特許第４，５１８，５８４号明細書、同第４，５６９，９０８号明細書、同第４，５８８，５８５号明細書、同第４，７３８，８４４号明細書、４，７５３，７９５号明細書、同第４，７６９，２３３号明細書，同第４，７９３，９９５号明細書、同第４，９１４，０３３号明細書、同第４，９５９，３１４号明細書、同第５，５４５，７２３号明細書、および同第５，８１４，４８５号明細書も参照。これらの引例は生物活性を失うことなく改変されうるＩＦＮ−βタンパク質の残基および領域に関する指針も提供する。）
【０１８４】
本発明の発現タンパク質および核酸（例えば、ＲＮＡ）の変化または修飾は、それらをコードするヌクレオチド配列へ突然変異によって導入され、それによって、発現分子の生物または治療活性を変化させることなく発現タンパク質または核酸配列のアミノ酸配列における変化をもたらしうる。例えば、基準または開始タンパク質のアミノ酸配列と異なる配列を有する変異体タンパク質をコードする単離核酸分子は、１つもしくはそれ以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失を対応するヌクレオチド配列へ導入することによって作製でき（ＩＦＮ−β変異体については、例えば、米国特許第５，５８８，５８５号明細書、米国特許第４，９５９，３１４号明細書、同第４，７３７，４６２号明細書、Ｌ．リン（Ｌｉｎ）（１９９８年）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９６：９７−１０４頁を参照）、１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失が基準または開始タンパク質をコードする配列へ導入され、それによって結果として、コードタンパク質が発現すると変異体タンパク質が生じるようになっている。例えば、突然変異は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ介在変異誘発など核酸またはアミノ酸配列を修飾するための標準方法によって導入されうる。
【０１８５】
さらに、タンパク質をコードする核酸配列は、１つもしくはそれ以上の、予想する、好ましくは、非必須アミノ酸残基に保存的アミノ酸置換をコードするように、修飾することができる。本明細書で使用される「非必須」アミノ酸残基は、その生物または治療活性を変化させることなくタンパク質の基準配列から改変されうる残基であるが、一方「必須」アミノ酸残基は、そのような活性にとって必要である。本明細書で使用される「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当業界において規定されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸などが挙げられる。好ましい実施形態において、かかる置換は、保存アミノ酸残基、または保存モチーフ内に存在するアミノ酸残基については行われない。
【０１８６】
さらに、変異体分子のヌクレオチド配列は、飽和変異誘発などにより、基準分子のコード配列の全部または一部に沿ってランダムに突然変異を導入することによって作製でき、結果として生じる突然変異型を生物または治療活性についてスクリーニングすることができる。変異誘発後、コードタンパク質は組換え技術により発現させることができ、タンパク質の活性は、本明細書に記載された、または当業界で周知の標準アッセイ法を使用して測定できる。好ましい実施形態において、生物または治療的活性タンパク質変異体は、比較または参照の基礎となる基準タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８０％、より好ましくは約９０％〜約９５％もしくはそれ以上、最も好ましくは約９６％〜約９９％もしくはそれ以上のアミノ酸の配列同一性を有する。本明細書で使用される「配列同一性」は、変異体のアミノ酸配列の指定した隣接セグメントを整列させ、基準となるタンパク質分子のアミノ酸配列と比較した時に、変異体タンパク質と基準タンパク質分子内に確認される同じアミノ酸残基である。
【０１８７】
配列同一性判定のための２つの配列の最適なアラインメントにおいて、変異体のアミノ酸配列の隣接セグメントは、基準分子のアミノ酸配列に対して追加のアミノ酸残基または欠失アミノ酸残基を有しうる。基準アミノ酸配列との比較のために使用される隣接セグメントは、少なくとも２０の隣接アミノ酸残基を含むであろう。変異体のアミノ酸配列にギャップを含ませることに関連して配列同一性を増加させる修正を、ギャップペナルティーを割り当てることによって行うことができる。配列アラインメントの方法は当業界で公知である。
【０１８８】
例えば、２つの配列間の同一性度の判定は、数学アルゴリズムを使用して行われうる。配列の比較のために利用される数学アルゴリズムの非限定的例は、例えば、マイヤース（Ｍｙｅｒｓ）とミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）（１９８８年）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１−１７頁のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、ＧＣＧ  アラインメント  ソフトウェア  パッケージの一部である、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）で利用される。アミノ酸配列を比較する際に、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーが、ＡＬＩＧＮプログラムで使用されうる。２つの配列の比較において使用するための数学アルゴリズムの別の好ましい非限定的例は、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）とアルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）（１９９０年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７頁のアルゴリズムであり、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）とアルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７頁で修正されている。かかるアルゴリズムは、アルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０頁のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムへ組込まれる。ＢＬＡＳＴアミノ酸配列検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で行われ、目的のタンパク質と同様のアミノ酸配列を得ることができる。
【０１８９】
比較目的のギャップアラインメントを得るために、ギャップＢＬＡＳＴが、アルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２頁に記載されているように利用されうる。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用し、分子間の遠い関係を検出する総合的検索を行うことができる（例えば、アルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９７年）上記を参照）。ＢＬＡＳＴ、ギャップＢＬＡＳＴ、またはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムの利用に際しては、デフォルトパラメータを使用することができる（例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照）。また、ＡＬＩＧＮプログラム（タンパク質の配列および構造５：補遺３のアトラス、国立生物医学研究基金（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、ワシントンＤ．Ｃ．におけるデイホフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）（１９７８年））およびウィスコンシン配列分析パッケージ、バージョン８（ジェネティックス・コンピューター・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州（Ｗｉｓ）から入手可能）のプログラム、例えば、プログラムのデフォルトパラメータが利用されるＧＡＰプログラムも参照。
【０１９０】
アミノ酸配列同一性の割合の検討に際しては、保存的アミノ酸置換の結果として一部のアミノ酸残基位置が異なりうるが、これはタンパク質機能の特性に影響を及ぼすことがない。これらの場合は、保存的置換アミノ酸の類似性を考慮して配列同一性度は上方調整されうる。かかる調整は当業界で公知である（例えば、マイヤース（Ｍｙｅｒｓ）とミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）（１９８８年）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１−１７頁を参照）。
【０１９１】
さらに、ＲＭ、ＡＭ、またはＩＭがタンパク質である実施形態において、タンパク質は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはアルブミンと共有結合されうる。これらの共有ハイブリッド分子は、対象への投与後の血清半減期の延長など特定の所望の特性を有しうる。ＰＥＧ−ＩＦＮ付加体を作成するための方法は、本発明のタンパク質と反応する活性化化合物を生じさせるモノメトキシポリエチレングリコールの化学修飾を含む。ＰＥＧ連結タンパク質を作成および使用するための方法が、例えば、デルガド（Ｄｅｌｇａｄｏ）ら（１９９２年）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ．ＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔ．９：２４９−３０４頁において報告されている（および発明の背景において本明細書に記載）。アルブミン融合タンパク質を作成するための方法は、目的のタンパク質とアルブミンをコードする配列の融合を含み、例えば、米国特許第５，８７６，９６９号明細書において報告されている。
【０１９２】
本発明によって包含される生物学的または治療的活性タンパク質または核酸変異体は、好ましくは、生物または治療活性を保持し、またはこれを有する。一部の実施形態において、変異体は基準分子（例えば、タンパク質または核酸）の生物または治療活性の少なくとも約２５％、約５０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％もしくはそれ以上を保持する。その活性が基準分子（例えば、タンパク質または核酸）の活性と比べ増加した変異体も包含される。変異体の生物または治療活性は、当業界で周知の方法によって測定されうる（例えば、フェロウス（Ｆｅｌｌｏｕｓ）ら（１９８２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７９：３０８２−３０８６頁、ツェルニッキ（Ｃｚｅｒｎｉｅｃｋｉ）ら（１９８４年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９（２）：４９０−４９６頁、マーク（Ｍａｒｋ）ら（１９８４年）Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：５６６２−５６６６頁、ブランカ（Ｂｒａｎｃａ）ら（１９８１年）Ｎａｔｕｒｅ２７７：２２１−２２３頁、ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ら（１９７９年）Ｎａｔｕｒｅ２８２：５８２−５８６頁、ハーバーマン（Ｈｅｒｂｅｒｍａｎ）ら（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ２７７：２２１−２２３頁、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）ら（１９８２年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７（１９）：１１３０１−１１３０４頁に記載されているアッセイを参照）。
【０１９３】
一般に、クローニング、試験、および本明細書で記載された他の使用のために、本発明の核酸、タンパク質、および化学組成物は、当業界で周知の方法を使用して製造または合成されうる。例えば、タンパク質は、本発明のタンパク質または核酸をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養することによって製造されうる。宿主細胞は、ヌクレオチド配列を転写し、所望のタンパク質または核酸を産生しうるとともに原核（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））または真核（例えば、酵母、昆虫、または哺乳類細胞）でありうるものである。適切な発現ベクターを含むＩＦＮ−βの組換え製造の例は、例えば、マンタイ（Ｍａｎｔｅｉ）ら（１９８２年）Ｎａｔｕｒｅ２９７：１２８、オオノ（Ｏｈｎｏ）ら（１９８２年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１０：９６７、スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら（１９８３年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６年、および米国特許第４，４６２，９４０号明細書、同第５，７０２，６９９号明細書、および同第５，８１４，４８５号明細書、米国特許第５，７９５，７７９号明細書）に示されている。
【０１９４】
さらに、遺伝子は組換えＤＮＡ（「ｒＤＮＡ」）を使用してクローン化されており、例えば、動物もしくは植物、またはトランスジェニック動物において製造および試験されうる（例えば、ナゴラ（Ｎａｇｏｌａ）ら（１９８０年）Ｎａｔｕｒｅ２８４：３１６頁、ゲデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら（１９８０年）Ｎａｔｕｒｅ２８７：４１１頁、イエルベルトン（Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ）ら（１９８１年）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．９：７３１頁、ストロイリ（Ｓｔｒｅｕｌｉ）ら（１９８１年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．ＳＡ．７８：２８４８頁を参照）。タンパク質も、ｒＤＮＡ技術を用いて、例えば、ウイルス誘導ヒト細胞からポリ−Ａ−リッチ１２ＳメッセンジャーＲＮＡを抽出し、テンプレートとしてｍＲＮＡを使用して二本鎖ｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡを適切なクローニングベクターへ導入し、そのベクターによって適切な微生物を形質転換し、微生物を回収し、その微生物からタンパク質を抽出することによって、製造されうる（例えば、欧州特許出願第２８０３３号明細書（１９８１年５月６日公開）、同第３２１３４号明細書（１９８１年７月１５日公開）、および同第３４３０７号明細書（１９８１年８月２６日公開）を参照）。
【０１９５】
また、タンパク質は化学的に合成され、ペプチド分野の当業者に周知であるいくつかの方法のいずれによっても試験されうる（例えば、リー（Ｌｉ）ら（１９８３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：２２１６−２２２０頁、スチュワード（Ｓｔｅｗａｒｄ）とヤング（Ｙｏｕｎｇ）（１９８４年）Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ピアス・ケミカル・カンパニー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州（Ｉｌｉ）、およびバーネイ（Ｂａｒａｎｅｙ）とマリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）（１９８０年）  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｂｉｏｌｏｇｙ、グロス（Ｇｒｏｓｓ）とマインホーファー（Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ）編、第２巻（アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州（Ｎ．Ｙ．）１９８０年）、３−２５４頁、固相ペプチド合成法の議論（ｄｉｓｃｕｓｓｉｎｇ  ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、およびボンダンスキー（Ｂｏｄａｎｓｋｙ）（１９８４年）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（シュプリンガー・フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、Ｂｅｒｌｉｎ）およびグロス（Ｇｒｏｓｓ）とマインホーファー（Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ）編（１９８０年）、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ａｎａｌｙｓｅ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻（アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、古典的溶液合成の議論（ｄｉｓｃｕｓｓｉｎｇ  ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓを参照）。本発明のタンパク質は、例えば、同時多重ペプチド合成の方法によって化学的にも調製されうる。例えば、ホーテン（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ）（１９８４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５１３１−５１３５頁、および米国特許第４，６３１，２１１号明細書を参照。
【０１９６】
さらに、当業者は、一般的に認められた、当業界で周知の適切な動物モデルおよび方法を使用して疾患の治療のための本発明の組成物をいかにして試験するかを承知しているであろう。例えば、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、関節炎、狼瘡、およびＮＯＤ糖尿病モデルなどを含む、一部の動物の自己免疫疾患モデルにおいて遺伝子輸送系を用いてサイトカインを輸送することができることが報告されている（例えば、Ｇ．Ｃ．ソコス（Ｔｓｏｋｏｓ）とＧＴ．ネポム（Ｎｅｐｏｍ）（２０００年）Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０６：１８１−８３頁、Ｇ．Ｊ．プリュドム（Ｐｒｕｄ’ｈｏｍｍｅ）（２０００年）Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．２：２２２−３２頁を参照）。ＥＡＥは、特定のＣＮＳ自己抗原、例えば、脳由来プロテオリピドまたはミエリン塩基性タンパク質の免疫付与後に結果として起こる中枢神経系炎症のモデルである。その経過および臨床症状はヒトにおいて多発性硬化症（ＭＳ）と類似しており、ＭＳを試験する一般に認められたモデルになった。マウスおよびラットＥＡＥモデルにおいて、タンパク質（１５−２０）として、ベクターによって輸送されるＩ型ＩＦＮの試験を記載しているいくつかの報告がある（例えば、Ｋ．トリアンタフィロポウロス（Ｔｒｉａｎｔａｐｈｙｌｌｏｐｏｕｌｏｓ）ら（１９９８年）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ５：２５３−６３頁、Ｊ．Ｌ．クロックスフォード（Ｃｒｏｘｆｏｒｄ）ら（１９９８年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：５１８１−８７頁を参照）。ユー（Ｙｕ）らは、ＥＡＥ疾患誘導時にｍＩＦＮ−βタンパク質を投与したマウスが、通常の(normal)マウスと比べ、障害（臨床スコアによって測定）の進行の遅延、再発開始の遅延、および増悪頻度の減少を示した（例えば、Ｍ．ユー（Ｙｕ）ら（１９９６年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６４：９１−１００頁を参照）。この結果は、ＩＦＮ−β治療によるヒトの結果と酷似している。プラスミドベースのベクターは、ニューロン特異的プロモーターの制御下にＣＮＳにＩＦＮ−βを輸送する遺伝子治療ベースの方法においてトリアンタフィロポウロス（Ｔｒｉａｎｔａｐｈｙｌｌｏｐｏｕｌｏｓ）らによって使用された（例えば、Ｋ．トリアンタフィロポウロス（Ｔｒｉａｎｔａｐｈｙｌｌｏｐｏｕｌｏｓ）ら（１９９８）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ５：２５３−６３を参照）。これらのベクターをＥＡＥのエフェクター段階中にマウスへ頭蓋内注射すると、疾患の臨床徴候が軽減または防止された。マウスＥＡＥモデルにおいてＩＦＮ−βを使用するこれまで行われた試験の結果は、ＩＦＮは、ＥＡＥモデルにおける疾患の発症を遅延させ、臨床症状を逆行させることにおいて有効な療法であることを明らかに示している。本モデルにおけるＩＦＮ−βを輸送するための遺伝子治療法（局所頭蓋内投与）は有効であることが示されている。
【実施例】
【０１９７】
次の実施例は例示の目的で示されており、決して発明を限定することは意図されていない。
【０１９８】
次の実施例に記載されているように、ヒトＩＦＮ−β（ｈＩＦＮ−β）およびマウスＩＦＮ−β（ｍＩＦＮ−β）発現ベクターを構築し、アッセイを展開し、ＩＦＮ−βを直接、血清において測定し、インビボでＩＦＮ−β発現と相関するバイオマーカーを同定した。さらに、ＩＦＮ−βの遺伝子ベースの輸送をボーラスタンパク質輸送と比較することにより薬物動態試験を正常マウスにおいて実行し、ＩＦＮ−βをコードする非ウイルスプラスミドＤＮＡまたはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの筋内注射を使用することにより優れた薬物動態プロフィールが示された。また、ｈＩＦＮ−βを発現するＡＡＶ−１ベクターにより、ｈＩＦＮ−βの長期の安定した発現が、ほぼ６ヵ月間確認された。また、ｍＩＦＮ−βをコードするプラスミドＤＮＡの単回筋内注射も実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）のマウスモデルにおいて有効であり、ｍＩＦＮ−βの一日おきの注射と同程度に有効であることが示された。以下に記載されているように、本発明の調節発現系の実施例を構成し、試験した。例えば、ＩＦＮ−βの調節された発現が、ＴＭおよびＲＭが単一プラスミドベクターに含有されている本発明の調節発現系を使用することにより正常マウスにおいて明らかに示された。
【０１９９】
これらの実施例に記載された試験からのデータは、ＴＭをコードする核酸を輸送するための本発明の調節発現系の、患者の治療における潜在能力を実証している。具体的には、これらの実施例は、ＭＳの治療において、ＩＦＮ−β（例えば、ＩＦＮ−β１ａ）を長期間調節して発現するために、そのタンパク質をコードする核酸を輸送する本発明の調節発現系を使用することの潜在能力を実証している。１つの実施形態において、輸送ベクターは、それぞれＴＭ（例えば、ＩＦＮ−β）およびＲＭをコードする第１および第２の発現カセットを含む単一プラスミドベクターであるが、ＡＭ、例えば、小分子誘導剤（例えば、ＭＦＰ）の経口投与により持続的（例えば、３ヵ月超）および再生可能な発現を提供し、さらに、そのベクターは筋内注射によって反復投与ができる。
【０２００】
[実施例１]：ＩＦＮ−βまたはＧＭＣＳＦ遺伝子療法において使用するためのベクターの構築
Ａ．プラスミドベクター：細菌発現ベクターｐｂＳＥＲ１８９からのマウスＩＦＮ−β（ｍＩＦＮ−β）遺伝子を、免疫グロブリンカッパ（Ｉｇｋ）（タンパク質精製用）またはｍＩＦＮ−β（遺伝子療法用）シグナル配列を５’プライマーに付加してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を発現ベクターｐＣＥＰ４／ＷＰＲＥにおけるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの下流に挿入し、組換えタンパク質発現および精製用のｐＧＥＲ９０（図２Ａ）を作製し、ｐｇＷｉｚへ挿入し、遺伝子療法用のｐＧＥＲ１０１（図２Ｂ）を作製した。
【０２０１】
細菌発現ベクターｐｂＳＥＲ１７８からのヒトＩＦＮ−β遺伝子をｍＩＦＮ−β遺伝子と同じ手順（遺伝子療法ベクター用のｈＩＦＮシグナル配列を除く）によってＰＣＲ増幅し、ｐＣＥＰ４／ＷＰＲＥへ挿入し、組換えタンパク質発現および精製用のｐＧＥＲ１２３（図２Ｃ）を作製し、ｐｇＷｉｚへ挿入し、遺伝子療法用のｐＧＥＲ１２５（図２Ｄ）を作製した。
【０２０２】
プラスミドベクターの構成は方法と材料のセクション、サブセクションＦに完全に記載されている。
【０２０３】
Ｂ．ＡＡＶ−１ベクター：ｈＩＦＮ−βをコードするｐＧＷＩＺ／ｈＩＦＮ−βの平滑末端化Ｈｉｎｃｌｌ／ＮｏｔｌフラグメントをＡＡＶ−１ベクターの平滑末端化Ａｇｅｌ−Ｓａｌｌ部位、ｐＴＲｅＧＦＰへ挿入することによって、ｈＩＦＮ−βをコードするＡＡＶ−１−ｈＩＦＮ−βシャトルプラスミドを構築した。生じたシャトルプラスミドをｐＧＴ６２（配列番号４４）と命名し、これを使用してｈＩＦＮ−βをコードするＡＡＶ−１ウイルスを産生した。ＡＡＶ−１ウイルスの２つのバッチを標準方法を使用することにより本明細書に記載されているように調製し、薬物動態試験（図４）において使用した。これらの２つのウイルスバッチにおけるｈＩＦＮ−βの発現レベルをＥＬＩＳＡによって検証した。
【０２０４】
また、ｍＧＭＣＳＦまたはｈＧＭＣＳＦをコードするＡＡＶ−１−ＧＭＣＳＦシャトルプラスミドｐＧＴ７１４およびｐＧＴ７１３（図３０Ｂ）を、ｍＧＭＣＳＦまたはｈＧＭＣＳＦをコードするフラグメントをベクターｐＧＥＮＥ／Ｖ５ＨｉｓＡ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））へ挿入することによって構築した。生じたベクターをｐＧＴ７２３−ＧＥＮＥ／ｈＧＭＣＳＦおよびｐＧＴ７２４−ＧＥＮＥ／ｍＧＭＣＳＦと命名した。次いで、ｍＧＭ−ＣＳＦをコードするフラグメントを、Ｋｐｎｌ−Ｘｂａｌでベクターを消化することによってｐＧＴ７２４−ＧＥＮＥ／ｍＧＭＣＳＦから切除した。同様に、ｈＧＭ−ＣＳＦをコードするフラグメントをＫｐｎｌ−Ｘｂａｌでベクターを消化することによってｐＧＴ７２３−ＧＥＮＥ／ｈＧＭＣＳＦから切除した。ベクターｐＺａｃ２．１をＫｐｎｌ−Ｘｂａｌで消化し、子牛腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処置し、次いで切除したｍＧＭＣＳＦまたはｈＧＭＣＳＦのいずれかをコードするフラグメントを、ｐＺａｃ２．１のＫｐｎｌ−Ｘｂａｌ部位に挿入した。生じたシャトルプラスミドをｐＧＴ７１３（ｐＺａｃ２．１−ＣＭＶ−ｈＧＭＣＳＦ）およびｐＧＴ７１４（ｐＺａｃ２．１−ＣＭＶ−ｍＧＭＣＳＦ）と命名した（図３０Ｂ）。
【０２０５】
本発明のベクターの構成は方法および材料セクション、サブセクションＦに完全に記載されている。
【０２０６】
[実施例２]：ＩＦＮ−β遺伝子輸送の薬物動態試験
Ａ．ヒトＩＦＮ−βによる薬物動態試験：薬物動態試験を正常マウスで実行し、ヒトＩＦＮ−β（ｈＩＦＮ−β）のボーラスタンパク質対遺伝子ベースの輸送を比較した。
【０２０７】
１）ヒトＩＦＮ−β１タンパク質薬物動態試験：筋内（ＩＭ）または静脈内（ｉ．ｖ．）注射のいずれかによって輸送される組換えｈＩＦＮ−β１ａのボーラス注射を使用することによりＣ５７／Ｂｌ６マウスにおいて薬物動態試験を行い、市販のＥＬＩＳＡを用いてｈｌＦＮ−βの血清レベルを検出した。図３は、２５ｎｇ（１ｕｇ／ｋｇ）または２５０ｎｇ（１０ｕｇ／ｋｇ）のｈＩＦＮ−β１aタンパク質の一回ｉ．ｍ．またはｉ．ｖ．注射後のマウスの血清中のｈｌＦＮ−βタンパク質の薬物動態プロフィールを示す。ｉ．ｖ．注射後、第１の時点（３０分）で用量依存的に血清中にｈｌＦＮ−β１ａを検出し、迅速に除去され、レベルは６時間でアッセイのほぼ検出限界（ＬＯＤ）であった（ＬＯＤ＝１２．５ｐｇ／ｍｌ）。組換えｈＩＦＮ−β１aタンパク質のｉ．ｍ．注射後、ｈＩＦＮ−β１ａ血清レベルは注射後２時間で最大限のレベルに達し、次いで６時間でおよそ１０倍減少した。６時間の時点で血清中に残ったｈＩＦＮ−β１ａの量はｉ．ｖ．注射と比べｉ．ｍ．注射で高かった。ｉ．ｖ．およびｉ．ｍ．注射により、血清ｈＩＦＮ−β１ａレベルにおける１０倍の差が高用量と低用量との間に確認された。組換えｈＩＦＮ−β１ａのボーラス注射後に示されたきわめて一時的な動態は、ヒトおよび他の動物種において以前に報告された結果と酷似している（ブッフワルダー（Ｂｕｃｈｗａｌｄｅｒ）、Ｐ−Ａら（２０００年）Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ  ２０：５７−６６頁、ペピンスキー（Ｐｅｐｉｎｓｋｙ）、ＲＢら（２００１年）Ｊ  Ｐｈａｍ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２９７：１０５９−５５頁）。
【０２０８】
２）ＡＡＶ−１−ＣＭＶ  ｈＩＦＮ−β１ａの遺伝子−ベースの輸送の薬物動態試験：ヒトＩＦＮ−β（ＡＡＶ−１−ＣＭＶ  ｈＩＦＮ−β１ａ）を構成的に発現するＡＡＶ−１ベクターを構築し、３つの用量（０．５×１０１０、１．０×１０１０、または５．０×１０１０ウイルス粒子）でｉ．ｍ．注射によってＣ５７Ｂｌ／６マウスへ輸送した。結果は図４に示されている。マウスの血清中ヒトＩＦＮ−β１ａは２日目には低いが、１０日までに迅速に増加し、この時点で血清レベルは３つの用量群すべてでプラトーに達するかまたは徐々に増加した。明らかな用量反応が、投与されたＡＡＶ−１−ＣＭＶ  ｈＩＦＮ−β１ａベクターの量の増大とともに確認された。２つの高用量では、ｈｌＦＮ−β１ａ発現の定常レベルは注射後１７１日目の血清中に検出された。組換えｈＩＦＮ−β１aタンパク質のボーラスｉ．ｍ．注射を使用する試験と対照的に、ｈｌＦＮ−β１ａをコードするＡＡＶ−１ベクターの遺伝子ベースの輸送を使用する本試験は、ベクターの一回注射後の血清中ｈｌＦＮ−β１ａの長期の発現を明らかに示す。
【０２０９】
[実施例３]：遺伝子療法のためのＩＦＮ−βバイオマーカーの同定および使用
Ａ．ｍＩＦＮ−βバイオマーカーの開発：インビボでのマウスＩＦＮ−β（ｍＩＦＮ−β）活性の検出を高感度で行うために、ｍＩＦＮ−β活性のバイオマーカーがｍＩＦＮ−βタンパク質またはｍＩＦＮ−βコード遺伝子療法ベクターの注射後のマウスにおいて同定された。バイオマーカーを使用して、ベータセロン（ＩＦＮ−β１ｂ）で処置した患者の臨床試料におけるヒトＩＦＮ−β活性を追跡することができる（例えば、アマソン（Ａｍａｓｏｎ），ＢＧ（１９９６年）Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ｌｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  ８１：１−１１頁、ダイセンハマー（Ｄｅｉｓｅｎｈａｍｍｅｒ），Ｆら（２０００年）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５４：２０５５−６０頁、クノブラー（Ｋｎｏｂｌｅｒ），ＲＬら（１９９３年）Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｒｅｓ  １３：３３３−４０頁、クラッケ（Ｋｒａｃｋｅ），Ａら（２０００年）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５４１：１９３−  ９頁を参照）。ＩＦＮ−β臨床試験において使用される一次バイオマーカーの１つはＭｘＡであるが（例えば、クラッケ（Ｋｒａｃｋｅ），Ａら（２０００年）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５４１：１９３−  ９頁、ベルトロト（Ｂｅｒｔｏｌｏｔｏ）、Ａら（２００１年）Ｊ  ｌｍｍ    Ｍｅｔｈ  ２５６：１４１−１５２頁を参照）、それはＩ型ＩＦＮによって特異的に誘導されるためである（例えば、フォン・ウソウ（ｖｏｎ  Ｗｕｓｓｏｗ），Ｐら（１９９０年）Ｊ  ｌｍｍ  ２０：２０１５−１９頁を参照）。本試験において、マウス末梢血単球（ＰＢＭＣｓ）から単離されたＭｘＡマウス相同体、Ｍｘ１の発現（例えば、フグ（Ｈｕｇ），Ｈら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８：３０６５−７９頁、パブロビック（Ｐａｖｌｏｖｉｃ），Ｊ（１９９３年）Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ  １７６：２３３−４３頁）を利用して生物活性ｍＩＦＮ−βの存在を検出した。
【０２１０】
定量的ＰＣＲ／ＲＴ−ＰＣＲアッセイを展開し、マウスＰＢＭＣｓにおけるＭｘ１ｍＲＮＡのレベルを定量した。具体的には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を、ｍＩＦＮ−βタンパク質またはその後のｍＩＦＮ−β遺伝子の遺伝子ベースの輸送のいずれかで処置したマウスから単離した。処置マウスから得た血液試料をフィコールクッション（ｆｉｃｏｌｌ  ｃｕｓｈｉｏｎ）上で２５分間、２，０００ｒｐｍで遠心分離した。精製ＰＢＭＣｓをペレット化し、Ｍｘ１アッセイ用のＲＮＡをキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）製の「ＲＮＡｅａｓｙ」ミニ抽出キットを使用して精製した。ＲＮＡをＨ２Ｏ中に−８０℃で保存した。Ｍｘ１  ＲＴ−ＰＣＲをＴａｑＭａｎ（登録商標）化学を使用して実行し、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（ＡＢＩ）ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００配列検出器で分析した。ＲＮＡの逆転写およびｃＤＮＡの増幅のために、ＡＢＩ製の「ワンステップ（Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ）ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＮＡ」キットを使用した。ＲＮＡを３０分間４８℃で逆転写し、増幅を９５℃で３０秒間の変性ステップ、および６０℃で１分間のアニーリング／伸長ステップとともに４０周期で行った。Ｍｘ１特異的プローブ／プライマーコンビネーションで試料を分析した。ＡＢＩ製の標準アッセイを使用して同時に測定されるＧＡＰＤＨ発現にＭｘ１発現を標準化した。
【０２１１】
精製組換えｍＩＦＮ−βタンパク質で処置したマウスＬ９２９細胞におけるＭｘ１  ＲＮＡ誘導を検査することによってインビトロでアッセイを検証した（図５）。Ｍｘ１  ＲＮＡの発現における用量依存増加が確認され、ＥＣ５０はＭｘ１  ＲＮＡのレベルの１００倍の増加がもたらされるおよそ５０ｐｇ／ｍｌのｍＩＦＮ−βであった。
【０２１２】
Ｂ．インビボでの一時的バイオマーカー反応を誘導するｍＩＦＮ−βタンパク質のボーラス注射：精製組換えｍＩＦＮ−βのボーラス注射後のバイオマーカー反応をこれらの試験で測定した。Ｍｘ１  ＲＮＡ発現の誘導（ビヒクル注射マウスに対して２５〜５０倍）が、投与がｉ．ｖ．であろうとｉ．ｍ．であろうと試験されたｍＩＦＮ−β濃度の各々で確認された（図６）。最高Ｍｘ１発現レベルは注射後２時間で測定された。その時点で、ｍＩＦＮ−βがｉ．ｍ．で輸送された場合に明らかな用量反応が確認された。Ｍｘ１発現は迅速に低下し、注射後１２時間を越えるとバックグラウンドより上のＭｘ１  ＲＮＡレベルは検出されなかった。ｍＩＦＮ−βをｉ．ｖ．注射した場合、１５０ｎｇで最高誘導が確認された。５００ｎｇ用量では、減少したレベルのＭｘ１  ＲＮＡ誘導が認められた。この飽和効果は他の試験において確認されており、そこでは、高ＩＦＮ−βレベルが、おそらくＩＦＮ  Ｉ型受容体の下方調節により、生物応答の明らかな下方調節をもたらしている（例えば、マーガー（Ｍａｇｅｒ），ＤＥとジュスコ（Ｊｕｓｋｏ），ＷＪ（２００２年）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ１９：１５３７−４３を参照）。ｉ．ｖ．注射マウスにおけるＭｘ１  ＲＮＡ発現も注射後およそ２時間でピークに達し、その後、迅速に低下した。
【０２１３】
マウスにおけるｍＩＦＮ−βの活性を追跡するためのバイオマーカーとしてＭｘ１  ＲＮＡの発現を利用したのは、これが初めてである。その結果は、Ｍｘ１  ＲＮＡはマウスＰＢＭＣｓにおいて構成的に低レベルで発現され、ｍＩＦＮ−β処置によって強力に上方調節されうることを明らかに示している。しかし、上方調節は短期であり、１２−２４時間以内に高発現レベルからバックグラウンドレベルへ迅速に低下する。迅速な動態は、ヒト（例えば、サルモン（Ｓａｌｍｏｎ），Ｐら（１９９６年）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．１６：７５９−６４頁、ブッフワルダー（Ｂｕｃｈｗａｌｄｅｒ）、Ｐ−Ａら（２０００年）Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ  ２０：５７−６６を参照）および他の動物種（ペピンスキー（Ｐｅｐｉｎｓｋｙ），ＢＲら（２００１年）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２９７：１０５９−５５頁、マーガー（Ｍａｇｅｒ），ＤＥら（２００３年）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ３０６：２６２−７０）においてＩ型インターフェロンについて報告されている短い半減期と一致する。
【０２１４】
Ｃ．ケモカインＩＰ−１０およびＪＥ：ｍＩＦＮ−βタンパク質で処置したマウスからの血漿試料の分析中、２つのマウスケモカイン、ＩＰ−１０、およびＭＣＰ−１のマウス相同体であるＪＥ（単球走化性タンパク質、例えば、ヨシムラ（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ），Ｔ（１９８９年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２４４：４８７−９３頁を参照）もＭｘ１  ＲＮＡと同様のｍＩＦＮ−βに対する反応および活性化を有することが確認された（図７および８）。ＩＰ−１０およびＪＥの強力な誘導が、ｉ．ｖ．またはｉ．ｍ．のいずれかによるｍＩＦＮ−βタンパク質の投与後２時間に確認された。ＩＰ−１０レベルはｉ．ｖ．による高用量の輸送で３０００倍に増加した。試験された３つのｍＩＦＮ−β用量の各々でＩＰ−１０およびＪＥの血漿レベルにおけるバックグラウンドへの迅速な低下が２４時間までに確認された。ＩＰ−１０およびＪＥの明らかな用量反応が両方の投与経路で確認された。
【０２１５】
ＩＦＮ−βによるＩＰ−１０およびＪＥのかかる強力な用量依存誘導は、本明細書に記載されているように、本発明者によって明らかに示されるまで周知ではなかった。ＩＰ−１０はプロモーター領域におけるインターフェロン反応性要素（ＩＳＲＥ）によってＩＦＮ−γのバイオマーカーとして周知ではあるが（例えば、ルスター（Ｌｕｓｔｅｒ），ＡＤら（１９８５年）Ｎａｔｕｒｅ３１５：６７２−７６）、マウスにおけるｍＩＦＮ−βの特異的バイオマーカーであることは以前には示されていなかった。
【０２１６】
Ｄ．インビボでのｍＩＦＮ−β遺伝子輸送後の長期バイオマーカー反応：これらの試験は、ｍＩＦＮ−βをコードするプラスミドＤＮＡまたはＡＡＶ−１ベクターの筋内輸送後のマウスにおいて測定されるｍＩＦＮ−βバイオマーカーの誘導を明らかに示している。
【０２１７】
[実施例４]：ｍＩＦＮ−β遺伝子の輸送
Ａ．ｍＩＦＮ−β遺伝子のプラスミド輸送：プラスミドの輸送において、ｍＩＦＮ−βをコードするプラスミドＤＮＡの異なる用量をマウスへｉ．ｍ．注射した後、注射した筋のエレクトロポレーションを行った。Ｍｘ１発現を個々の動物の各々から単離したＰＢＭＣｓから測定し、対照群のバックグラウンドレベルに対する倍の増加で表した（図９）。注射後２日目に４つのｍＩＦＮ−βプラスミドＤＮＡ投与群すべてにおいてＭｘ１  ＲＮＡの強力な上方調節（４０〜１３０倍の誘導）が認められた。４群のすべてにおけるＭｘ１発現が有意にバックグラウンドを上回った（ｐ＜０．００２）。Ｍｘ１発現データは、２５０μｇにおいて最適なＤＮＡ濃度として用量反応があることを示した。エレクトロポレーション後の第１日目に初期ピークが認められた後、発現が低下し、その後の時点で発現レベルは再び増加した。バイオマーカー反応におけるこの変動は、ケモカイン ＩＰ−１０ およびＪＥのレベルにおいても示され（データ示さず）、ＩＦＮ−βのプラスミド輸送を使用する他の試験における再現可能な現象であると思われる。Ｍｘ１誘導の顕著なレベルが試験の４９日目まで確認された。
【０２１８】
Ｂ．ｍＩＦＮ−β遺伝子のＡＡＶ−１輸送：Ｃ５７Ｂｌ／６ マウスに対しｍＩＦＮ−βをコードするｐＧＴ６１のＤＮＡ、またはｍＩＦＮ−βをコードするｐＧＴ６１から産生したウイルス、またはＳＥＡＰをコードするｐＧＥＲ７５のＤＮＡを注射した（材料と方法、サブセクションＧを参照）。
【０２１９】
マウスを注射後２、１０、１４、および１７日目に採血した。ｐＧＴ６１ ＤＮＡを投与したマウスは、２日目にバックグラウンドに対してＭｘ１  ＲＮＡのおよそ１５倍の誘導を示した（図１０）。Ｍｘ１発現は１０日までにバックグラウンドに対して１００倍超にまで増加し続けた。１７日までにＭｘ１  ＲＮＡ発現レベルはバックグラウンドの約１８０倍になった。ｐＧＥＲ７５ＤＮＡを投与した対照群においてＭｘ１発現は確認されなかった。
【０２２０】
ｐＧＴ６１から産生したウイルスを投与したマウスにおけるＭｘ１  ＲＮＡ発現は、ｐＧＴ６１  ＤＮＡを投与したマウスにおけるよりも１０、１４、および１７日目で約５倍高かった。これは注射した筋で実行したＩＦＮ−βＲＮＡＲＴ−ＰＣＲ分析によって裏づけられた。動物を屠殺した１７日目、筋におけるｍＩＦＮ−β  ＲＮＡ発現は、ウイルス注射した筋において２．０×１０６コピー／μｇＲＮＡであったのに比べＤＮＡ注射した筋において９．０×１０５コピー／μｇＲＮＡであった（データを示さず）。
【０２２１】
血漿試料をＩＰ−１０およびＪＥについても分析した（図７および８）。得られた結果は、Ｍｘ１  ＲＮＡ誘導について得られた結果と酷似していた。２日目、エレクトロポレーションによってＤＮＡを投与したマウスは、ＡＡＶ−１−ｍＩＦＮ−β発現ウイルスを注射したマウスと比べ高いＩＰ−１０血漿レベルを示した。しかし、１０日までに、ＡＡＶ−１−ｍＩＦＮ−βを注射したマウスにおけるＩＰ−１０レベルは強力な増加を示し、プラスミドｍＩＦＮ−β注射マウスより平均しておよそ５〜１０倍高かった。
【０２２２】
Ｃ．要約と結論：ヒトＩＦＮ−β１ａタンパク質のボーラス注射後の薬物動態プロフィールは、以前に発表された、ｈＩＦＮ−β１ａを正常ヒトボランティアと患者に投与する研究の報告と酷似している（例えば、ブッフワルダー（Ｂｕｃｈｗａｌｄｅｒ）、Ｐ−Ａら（２０００年）Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ  ２０：５７−６６頁を参照）。ｉ．ｖ．注射したヒトＩＦＮ−β１ａタンパク質は迅速に除去され、６時間までに血清レベルはアッセイの検出限界以下になる。タンパク質のｉ．ｍ．注射後、ピーク値は低いが、血清半減期は延長する。しかし、動態は依然としてきわめて迅速であり、血清レベルは数時間内に検出限界以下となる。ＩＦＮ−β１ａのＰＥＧ化形態を使用するマウス、ラット、サルにおける最近の薬物動態試験は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の２０−ｋＤａポリマーの付着が半減期（ｔ１／２）をおよそ１時間から１０時間に延長することを示す（例えば、ペピンスキー（Ｐｅｐｉｎｓｋｙ），ＲＢら（２００１年）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２９７：１０５９−６６頁を参照）。
【０２２３】
プラスミドＤＮＡ輸送後のｈｌＦＮ−βの血清レベルを測定する試みは、ＥＬＩＳＡによってｈＩＦＮ−βタンパク質の検出可能なレベルが注射した筋の溶解物において測定されているとは言えども、おそらく導入遺伝子の低発現により失敗している（データを示さず）。しかし、ｈＩＦＮ−βをコードするＡＡＶ−１ベクターを使用することにより、ｈＩＦＮ−βタンパク質のきわめて高い血清レベルが、ｉ．ｍ．注射後に用量依存的にｈＩＦＮ−β  ＥＬＩＳＡによって検出された。さらに、きわめて安定した持続的レベルが注射後ほぼ６ヵ月まで測定された。本モデルにおける外来導入遺伝子としてのｈＩＦＮ−β発現に対する明らかな免疫原性反応の欠如に注目することは興味深いが、血液は抗ｈＩＦＮ−β抗体の存在について分析されなかった。ｈＩＦＮ−βのボーラスタンパク質輸送が他の動物モデル（例えばサル、文献３３を参照）においてきわめて免疫原性であることが報告されている。その結果は、ｈｌＦＮ−βをコードするＡＡＶ−１ベクターのｉ．ｍ．投与は、長時間にわたって高い導入遺伝子発現を達成するプラットフォームとして展開されうることを示している。
【０２２４】
３つのｍＩＦＮ−βバイオマーカーが同定され、マウスＩＦＮ−βタンパク質または遺伝子輸送を使用する薬物動態試験を行うための有効性が確認された。ｍＩＦＮ−β投与マウスのＰＢＭＣｓから単離されたＭｘ１  ＲＮＡの誘導を測定するきわめて高感度の定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイが開発された。２つのマウスケモカイン、ＩＰ−１０およびＪＥも高感度のＩＦＮ−βバイオマーカーとして同定され、市販のＥＬＩＳＡがＭｘ１  ＴａｑＭａｎアッセイにより得られる結果を迅速に定量して裏づけることを可能にした。２つの異なる型の遺伝子輸送ベクター、プラスミドＤＮＡ（とエレクトロポレーション）およびＡＡＶ−１を試験した。ｉ．ｖ．またはｉ．ｍ．のいずれかによるボーラスｍＩＦＮ−βタンパク質の投与は結果として、３つのバイオマーカーすべての強力であるが一時的な誘導をもたらし、およそ２時間のＴｍａｘを示した。バイオマーカーレベルは、注射後１２〜２４時間以内にバックグラウンドに迅速に低下した。ｍＩＦＮ−βをｉ．ｍ．注射するとＭｘ１、ＩＰ−１０、およびＪＥの用量反応が確認された。バイオマーカーレベルの迅速な低下は、ボーラスタンパク質投与後のＩＦＮ−βの迅速な全身クリアランスを直接反映する。
【０２２５】
プラスミドとエレクトロポレーションまたはＡＡＶ−１ベクターを使用するｍＩＦＮ−βの遺伝子ベース輸送は結果として、ｍＩＦＮ−βタンパク質を注射した場合に確認されたものよりも大きなバイオマーカー反応をもたらした。プラスミドＤＮＡを用いると、４９日までバイオマーカーが測定され、６３日目にバックグラウンドレベルに低下した。これらのデータは、ｍＩＦＮ−β発現プラスミドが少なくとも７週間、生物活性ｍＩＦＮ−βを発現できることを初めて示した。バイオマーカー反応の動態は、ｍＩＦＮ−β  ＤＮＡがＡＡＶ−１ベクターによって輸送されるとわずかに異なった。反応は感染後早期では比較的低く、第１週にわたって増大した。高レベルでのバイオマーカーの安定化が感染後第２週および第３週で確認された。
【０２２６】
要約すれば、優れた薬物動態プロフィールが、マウスにおけるボーラスタンパク質投与と比べヒトおよびマウスＩＦＮ−βの遺伝子ベースの輸送について明らかに示されている。第一に、発現されるＩＦＮ−βのレベルは、血清中で直接測定され、ＩＦＮ−βバイオマーカーの誘導によって反映されるように、タンパク質輸送で達成されるレベル以上である。第二に、ＩＦＮ−βベクターの単回注射からのＩＦＮ−β発現の持続時間は、タンパク質投与で確認された一時的動態（数時間）と比べ、はるかに長い（数週間〜数ヵ月間、安定した発現）。
【０２２７】
[実施例５]：ｍＩＦＮ−βの遺伝子ベースの輸送を使用する有効性試験
これらの試験は、遺伝子ベースの輸送がＭＳの動物モデルにおいて有効であることを明らかに示す。齧歯類ＥＡＥモデルは一般的に認められたＭＳのモデルであり、ＩＦＮ−βがこれらのモデルにおいて活性であることが示されている（ユー（Ｙｕ），Ｍら（１９９６年）Ｊｌｍｍ６４：９１−１００頁）。ＩＦＮ−βの遺伝子ベースの輸送がこれらのモデルの一部において有効であることも報告されている（例えば、Ｔｒｉａｎｔａｐｈｙｌｌｏｐｏｕｌｏｓ），Ｋ．ら（１９９８年）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：２５３−６３頁）。これらの試験の結果により、ｍＩＦＮ−βタンパク質を用いるマウスＥＡＥモデルの有効性が確認され、モデルにおける遺伝子ベースの輸送およびタンパク質輸送が比較される。
【０２２８】
Ａ．マウス急性ＥＡＥモデルにおけるｍＩＦＮ−βタンパク質の有効性：８週齢メスＳＪＬマウスを１日目にプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）で免疫付与し、次いで、異なる用量（１０，０００、２０，０００、３０，０００、または１００，０００単位（１群当たり））の精製組換えマウスＩＦＮ−βタンパク質の皮下（ｓ．ｃ．）注射で試験の経過中１日おきに処置した。本試験に使用される陽性対照は、１日２回、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与されるメゾプラムおよびプレドニゾロンであった。
【０２２９】
具体的には、ｍＩＦＮ−βをコードする遺伝子をｐＣＥＰ４発現ベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））へクローン化した。ｍＩＦＮ−βをコードする発現プラスミドをＸ−ｔｒｅｍｅＧｅｎｅＲｏ−１５３９トランスフェクション試薬（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を使用して一時的に２９３Ｅ細胞（エッジバイオシステム（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））にトランスフェクトした。イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーによって培地からマウスＩＦＮ−βタンパク質を精製した。生成物を希釈バッファー（５０ｍＭナトリウムアセテート、ｐＨ５．５、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および５％ポリプロピレングリコール）に対して透析および濃縮し、滅菌ろ過した。精製タンパク質のアリコートを−８０℃下に保存した。アクセス・バイオメディカル（Ａｃｃｅｓｓ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州（ＣＡ））製の市販のｍＩＦＮ−β標準品を使用するルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ（ハーディー（Ｈａｒｄｙ）ら（２００１年）Ｂｌｏｏｄ９７：４７３−４８２）を使用して精製タンパク質の活性を評価した。精製タンパク質の活性は２×１０８単位／ｍｇであった。
【０２３０】
動物実験のために、ｍＩＦＮ−βを希釈バッファーで１００ｕｇ／ｍＬに希釈した。動物の注射直前に、ｍＩＦＮ−β保存溶液をｍＩＦＮ−βの所望の濃度に希釈した。これらの試験で使用されるビヒクル対照はｍＩＦＮ−βを差し引いた希釈バッファーであった。
【０２３１】
試験の結果は図１１に示されている。１００，０００単位のＩＦＮ−β（およそ５００ｎｇ、２０ｕｇ／ｋｇ）で処置したマウスは、ビヒクル処置マウスと比べＥＡＥ臨床スコアの顕著な減少を示した（ｐ＝０．００４６）。３０，０００単位のＩＦＮ−βで処置したマウスもビヒクル処置マウスと比べ臨床スコアの減少を明らかに示したが、この減少は統計的有意性に達することはなかった。本試験における陽性対照、メゾプラムおよびプレドニゾンも有意に臨床スコアを減少させた。
【０２３２】
Ｂ．ｍＩＦＮ−βの遺伝子ベースの輸送はマウス急性ＥＡＥモデルにおいて有効である：ｍＩＦＮ−βタンパク質がマウス急性ＥＡＥモデルにおいて有効であることを示す以前の試験の結果に基づき、第２の試験を行って試験し、ｍＩＦＮ−βのプラスミド輸送をタンパク質輸送と比較した。第１試験におけるように、マウスに対し第１日目にＰＬＰを注射した。遺伝子輸送において、試験の２日目に、ＰＢＳ、ＮｕｌｌプラスミドＤＮＡ（ｐＮｕｌｌ）とエレクトロポレーション（ＥＰ）、ｍＩＦＮ−βプラスミドＤＮＡ（とＥＰ）、または「ＰＩＮＫ」と呼ばれるポリマー製剤で形成されたｍＩＦＮ−βプラスミドＤＮＡのいずれかをマウスに筋内注射した（ムンパー（Ｍｕｍｐｅｒ），ＲＪら（１９９８年）Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ５２：１９１−２０３頁）。タンパク質輸送において、マウスに対し１日おきにマウスＩＦＮ−βタンパク質（１００，０００単位、ｓ．ｃ．注射）またはビヒクルを注射した。
【０２３３】
本試験の結果は図１２に示されている。以前の試験におけるように、１００，０００単位のｍＩＦＮ−βタンパク質で処置したマウスは、ビヒクル対照処置マウスと比べ臨床スコアの有意な減少を示した（ｐ＝０．０４５）。ｍＩＦＮ−β＋ＥＰの遺伝子輸送もｐＮｕｌｌ＆ＥＰの遺伝子輸送と比べ、臨床スコアを顕著に減少させた（ｐ＝０．０１７１）。ＩＦＮ−βのＰＩＮＣ製剤を使用する遺伝子輸送は、ｐＮｕｌｌと比べ臨床スコアを統計的に減少させなかった（データを示さず）。本発明の完全な結果は、材料と方法、サブセクションＡ、および図１３に記載されている。
【０２３４】
Ｃ．要約と結論：組換えｍＩＦＮ−βタンパク質を使用するマウス急性ＥＡＥモデルは、試験経過中の１００，０００単位のｍＩＦＮ−βの１日おきの注射がビヒクル対照と比べ疾患の重篤度を有意に減少させたことを示すことによって、有効性が認められている。エレクトロポレーションによるｍＩＦＮ−βをコードするプラスミドの遺伝子ベースの輸送は、疾患マウスにおける臨床スコアを有意に減少させることが示された。試験の２日目のプラスミドの単回注射が、スコアの削減においてＩＦＮ−βタンパク質の１日おきの注射と同じく有効であった。これらの結果は、ＩＦＮ−βの遺伝子ベースはＭＳの動物モデルにおいて有効であることを示す。
【０２３５】
[実施例６]：調節発現系を使用するインビボでのＩＦＮ−βの調節発現
Ａ．計画、構成、およびインビトロ検証：本発明の調節発現系は周知の発現系に対して利点を有する。好ましい実施形態において、本発明の系は、単一ベクターにおいて目的の治療分子（ＴＭ）（例えば、ＩＦＮ−β導入遺伝子）をコードする第１の発現カセット、およびＴＭの発現を調節する調節分子（ＲＭ）をコードする第２の発現カセットを有する。
【０２３６】
１つの好ましい実施形態の例として、本発明は新しく改善された調節発現系を提供する。この実施形態において、本発明の発現カセットの調節発現系はＢＲＥＳ−１と呼ばれる単一プラスミドベクターに存在する。ＢＲＥＳ−１単一ベクターは、調節タンパク質の発現を推進する種々の導入遺伝子および種々のプロモーターの挿入のための多重クローニング部位（ＭＣＳ）など、その設計へ組込まれる多くの多用途の特徴を有する。また、ＢＲＥＳ−１のサイズは、プラスミドおよびＡＡＶベクターなどの多くの種々の輸送ベクターと適合性である。
【０２３７】
Ｂ．遺伝子療法のためのｍＩＦＮ−βおよびｈＩＦＮ−β誘導的発現ベクターの構築：それぞれ、ｐＧＥＲ１０１およびｐＧＥＲ１２５からのｍＩＦＮ−βおよびｈＩＦＮ−β遺伝子を一連の４つのＢＲＥＳ−１ベクターへ移した（図１４Ａ−Ｄ）。結果として生じるプラスミドはマウスまたはヒトＩＦＮ−β遺伝子をコードする発現カセットおよび互いに対して４つの異なる配向のＲＭ遺伝子をコードする発現カセットを有する（図１５Ａ−Ｂ）。結果として生じるｍＩＦＮ−βをコードするＢＲＥＳ−１プラスミドをｐＧＴ２３、ｐＧＴ２４、ｐＧＴ２５、およびｐＧＴ２６（図１５Ａ）とし、結果として生じるｈＩＦＮ−βをコードするＢＲＥＳ−１プラスミドをｐＧＴ２７、ｐＧＴ２８、ｐＧＴ２９、およびｐＧＴ３０（図１５Ｂ）とした。これらのプラスミドの構成の完全な説明については、材料と方法、サブセクションＦを参照。
【０２３８】
Ｃ．ＩＦＮ−β発現ベクターのインビトロ検証：構成的（ｐＧＥＲ１２５）および誘導的（ｐＧＴ２７、ｐＧＴ２８、ｐＧＴ２９、およびｐＧＴ３０）ｈＩＦＮ−β発現プラスミドをマウス筋Ｃ２Ｃ１２細胞へトランスフェクトした。細胞を誘導剤、ＭＦＰで処置し、培地をＥＬＩＳＡによってｈｌＦＮ−βについて分析した（図１６）。結果はＭＦＰの非存在下でｈｌＦＮ−β発現をほとんど示さない。ＢＲＥＳ−１−ｈＩＦＮ−βプラスミドからのヒトＩＦＮ−β発現は、ＭＦＰによっておよそ２０〜９０倍、ＣＭＶプロモーター（ｐＧＥＲ１２５）から発現されるものの約５０％までのレベルに誘導される。２つのプラスミド発現系（ｐＧＳ１６９４に加えてｐＧＥＲ１２９）と比べ、ＢＲＥＳ−１系の４つのプラスミドの配向すべては、ＭＦＰの非存在下で同等の基礎活性を、またＭＦＰの存在下でその２つのプラスミド以上の誘導活性を示した。同様のインビトロ試験をｍＩＦＮ−βＢＲＥＳ−１プラスミドで実行し（図１７）、結果はｈＩＦＮ−βＢＲＥＳ−１プラスミドにより記載されているものと酷似していた。
【０２３９】
Ｄ．インビボでのＩＦＮ−βの調節発現：、Ｓａｌ  ＩによるｐＧＥＲ１０１の消化、５’オーバーハングにおけるクレノウＤＮＡポリメラーゼの充填による平滑末端化、Ｓｐｅ  Ｉリンカーのライゲーション、Ｓｐｅ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉによる消化、および、結果として生じた、ｐＧＴ４のＳｐｅ  ＩとＮｏｔ  Ｉ部位の間にｍＩＦＮ遺伝子を有するフラグメントの挿入によって構築されたｍＩＦＮ−βＢＲＥＳ−１プラスミドベクターｐＧＴ２６を用いて、未処置(naive)Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて試験を実行した。
【０２４０】
プラスミドベクターｐＧＴ２６を使用し、ｍＩＦＮ−βの発現が誘導剤、ＭＦＰの経口投与によるオフ／オン／オフの脈動性の方法で調節されうるかを試験した。構成的および誘導的ＢＲＥＳ−１ｍＩＦＮ−β発現プラスミドをマウスの後肢筋へ注射しエレクトロポレーションした。マウスをプラスミド注射後７日目からＭＦＰで４日間連続処置した。注射後１１および１８日目に採血し、ＰＢＭＣｓを単離し、Ｍｘ１  ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって測定した。血漿試料をケモカインＩＰ−１０およびＪＥについても分析した。Ｍｘ１  ＲＮＡのバイオマーカー分析およびケモカイン分析の試験結果は、ぞれぞれ、図１８および１９に示されている。ＭＦＰの非存在下で７日目にはバイオマーカー誘導がほとんどまたはまったく確認されない。ＭＦＰの経口投与後、１１日目にはすべてのバイオマーカーがＣＭＶ−ｍＩＦＮ−βによるよりも高いレベルに強く誘導された。１８日までにケモカインレベルはベースラインに戻り、Ｍｘ１  ＲＮＡレベルはほぼベースラインに減少していた（試験および対照の説明については以下の材料と方法、サブセクションＧを参照）。
【０２４１】
Ｅ．要約および結論：本発明者は、慢性疾患、例えば、ＭＳを治療する治療分子（ＴＭ）例えばＩＦＮ−β遺伝子の輸送に適切である２つのベクター、非ウイルスプラスミドＤＮＡおよびＩ型アデノ関連性ウイルス（ＡＡＶ−１）を同定した。さらに、本発明者は、両方のベクターが筋内注射によって骨格筋に輸送され、マウス動物モデルにおいて測定可能持続的であるＩＦＮ−β発現レベルを生成しうることを示した。プラスミドＤＮＡの場合、本発明者は、ｍＩＦＮ−βコードプラスミドの単回注射（およびエレクトロポレーション）が有効であり、ＭＳの動物モデルにおけるｍＩＦＮ−βタンパク質の１日おきの注射と同じく有効であることを明らかに示した。本発明者は、ｍＩＦＮ−βのバイオマーカーを開発し、プラスミドにコードされたｍＩＦＮ−β発現が単回プラスミド注射後少なくとも４５日間持続することを示した。ＡＡＶ−１ベクターの場合、本発明者は、ヒトＩＦＮ−βコードＡＡＶ−１ベクターの単回筋内注射が結果として、６ヵ月間持続するヒトＩＦＮ−βタンパク質の高い血清レベルをもたらすことを示した。プラスミドおよびＡＡＶ−１ベクターの両方は、本発明のＢＲＥＳ−１調節発現系と適合性であることが示されている。例えば、本発明者は、本発明の単一プラスミドベクターＢＲＥＳ−１調節発現系を使用するマウスにおけるＩＦＮ−βの調節された発現を明らかに示した。
【０２４２】
新しく改善されたＢＲＥＳ−１調節発現系の１つの実施形態において、発現カセットは単一ベクター、例えば、単一プラスミドベクターに存在する。この実施形態において、ＢＲＥＳ−１単一プラスミドベクターは、調節分子（ＲＭ）（例えば、修飾ステロイドホルモン受容体などの転写活性化因子）および治療分子（ＴＭ）（例えば、ヒトまたはマウスＩＦＮ−β）の発現カセットを単一シャトルプラスミド発現ベクター上に含有する。ＢＲＥＳ−１調節発現系の単一ベクターは多重クローニング部位（ＭＣＳ）を含有し、プロモーター、調節要素、および導入遺伝子のプラスミド骨格への挿入または交換を簡単にする。本発明者によって本明細書に明らかに示されているように、ＢＲＥＳ−１ｍＩＦＮ−βおよびＢＲＥＳ−１ｈＩＦＮ−β単一プラスミドベクターが構築され、インビトロで試験し、活性化因子分子（ＡＭ）、小分子誘導剤ＭＦＰの非存在下で低いバックグラウンド活性を有することが示され、ＭＦＰの存在下で（２−プラスミド系と同等の）高い誘導性が示された。
【０２４３】
インビボ試験をＢＲＥＳ−１ｍＩＦＮ−βプラスミドベクターおよび経口投与のＭＦＰを用いて正常マウスにおいて行った。ｍＩＦＮ−β発現レベルをモニタリングするバイオマーカーを使用することにより、結果はＭＦＰの非存在下でｍＩＦＮ−βバイオマーカーの低いバックグランド発現、ＭＦＰ投与後の強い誘導、およびＭＦＰの中止と同時に発現の基礎レベルへの戻りを示した（図１８および１９）。これらの結果に基づき、本発明者は、本発明の調節発現系を使用するインビボでのＩＦＮ−βの調節発現を達成した。
【０２４４】
このように、本発明のこれらの試験および組成物および方法の結果は、疾患または状態、例えば、抗炎症性疾患または状態、より好ましくはＭＳの治療に対して長期の調節されたＩＦＮ−βの発現を提供しうる、ＩＦＮ−βの遺伝子ベースの輸送系である。本発明の遺伝子療法ベクターは、疾患または状態の治療のために目的の治療分子（ＴＭ）（例えば、ＩＦＮ−β）の輸送のための１つもしくはそれ以上の発現カセットを組込むことができる。１つの実施形態において、本明細書に記載されている調節発現系は、小分子誘導剤、ＭＦＰの経口投与による長期の再生可能な発現を提供しうる。単一ベクターＢＲＥＳ−１系は、例えば、筋内注射によって反復投与でき、病院における連続的対脈動性ＩＦＮ−βの試験を可能にする。
【０２４５】
[実施例７]：候補ベクターの選択
実施例７：ＢＲＥＳ−１調節発現系
Ａ．ＢＲＥＳ−１配向性：実行したインビボ試験では、図１５に記載されているように構成された４つのＢＲＥＳ−１配向の１つが利用された。本明細書に記載されているように、これは、コンストラクト、ｐＧＴ２６がＭＦＰの存在下で導入遺伝子発現の最高レベルを示したインビトロデータに基づいた。これら４つのＢＲＥＳ−１配向を、本明細書に記載されたプロトコールを用いてインビボで試験し、どの配向が導入遺伝子発現の最良の「ウィンドウ」を提供しうるかを決定できる（例えば、マイナスＭＦＰで最低基礎発現レベル、およびプラスＭＦＰで最高誘導発現レベル）。
【０２４６】
ｉ．ＢＲＥＳ−１プラスミドにおける標的遺伝子発現に対する配向性依存効果：ｍＩＦＮ−βＢＲＥＳ−１プラスミドベクターｐＧＴ２３、２４、２５、および２６を使用して未処置(naive)Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて試験を実行し、ｍＩＦＮ発現のバイオマーカーとなるケモカインＩＰ−１０のレベルによって分析されるｍＩＦＮ発現のレベルを測定した。ｐＧＴ２３、ｐＧＴ２４、ｐＧＴ２５、およびｐＧＴ２６を、１群あたり１５匹のマウスの後肢筋へ注射しエレクトロポレーションした。各々の群からのマウス５匹をＭＦＰの非存在下で７日目に採血した。各々の群の残りのマウス１０匹をプラスミド注射後７日目から４日間連続してＭＦＰで処置した。血液を注射後１１および１８日目に採取し、ＩＰ−１０について血漿試料を分析した（詳細については「実験計画」を参照）。結果は、ｐＧＴ２６がインビトロでの結果と一致して低発現−ＭＦＰおよび高発現＋ＭＦＰの最良の組合せを提供することを示した（図３２）。ｐＧＴ２４はＩＰ−１０発現の最高誘導を示したが、ＭＦＰの非存在下でＩＰ−１０レベルは他の配向よりも高かった。ｐＧＴ２５は−および＋ＭＦＰの両方で低いＩＰ−１０レベルを示し、ｐＧＴ２３はｐＧＴ２６とほぼ同じＩＰ−１０レベル＋ＭＦＰを示した。しかし、ｐＧＴ２４−ＭＦＰのＩＰ−１０レベルは、ｐＧＴ２６についてよりも相当に高かった。これらの結果は全体として基礎および誘導標的遺伝子に対する配向依存効果を示す。
【０２４７】
実験計画：ＢＲＥＳ−１／ｍＩＦＮプラスミドのインビボトランスフェクションおよびｐＢＲＥＳ−１／ｍＩＦＮの４つの配向の比較を次の通り実行した。正常Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに対し単一ベクターＢＲＥＳ−１マウスＩＦＮ発現プラスミドを注射およびエレクトロポレーションした。ｍＩＦＮ発現をバイオマーカー反応およびｍＩＦＮ  ＲＮＡ分析によってモニタリングした。マウスはＭＦＰ処置のオフ／オン／オフ周期を通過した。
【０２４８】
ＤＮＡ溶液：すべての注射群の各々のマウスに対し１５０ｕｌのＰＢＳ中プラスミドＤＮＡ２５０ｕｇを投与した。
【表３】
2008545639.tif 000021
【０２４９】
ＤＮＡ輸送：成体オスＣ５７Ｂｌ／６マウスに対し１５０ｕｌ  ＰＢＳ中２５０ｕｇプラスミドＤＮＡを０日目に両側的に注射した。ＤＮＡ溶液を脛骨筋へ２５ｕｌ注射し、各後脚の腓腹筋へ５０ｕｌ注射した後、キャリパーでエレクトロポレーションを行った（２００Ｖ／ｃｍ、１Ｈｚ、２０ミリ秒／パルスで８パルス）。
【０２５０】
ＭＦＰ処置：１−４群（全注射マウス）に対し、下表に示されているように０．３３ｍｇ／ｋｇ（ゴマ油中０．０８３ｍｇ／ｍｌの１００ｕｌ、新しく調製）で強制経口投与によってＭＦＰを投与した。
【表４】
2008545639.tif 000022
【０２５１】
採血およびエンドポイント分析／アッセイ手順：マウスを、尾に切り目を入れて、または心穿刺（ターミナル採血）によって上表に示した時点で採血した。血液をＲＴ（室温）で（ＥＤＴＡを含有する）マイクロテイナー管へ収集した。血漿をＩＰ−１０アッセイのために尾採血から収集した。ＰＢＭＣｓをターミナル採血から分離および収集し、残りの血漿をＥＬＩＳＡによってＩＰ−１０について分析した。
【０２５２】
ｉｉ．ＲＥＳ−１プラスミドにおける標的遺伝子発現に対する配向性依存効果：ＢＲＥＳ−１／ｈＩＦＮプラスミドも上述と同様にして試験した。構成的（ｐＧＥＲ１２５）または誘導的ＢＲＥＳ−１／ｈＩＦＮ（ｐＧＴ２７、ｐＧＴ２８、ｐＧＴ２９、およびｐＧＴ３０）プラスミドを未処置(naive)Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの後肢筋へ注射しエレクトロポレーションした。マウスをＭＦＰの非存在下で４日目に採血し、プラスミド注射後７日目から４日間連続してＭＦＰで処置した。注射後１１および１８日目に採血した。血清を凝固血液から収集し、ｈＩＦＮについてＥＬＩＳＡによって分析した（詳細について以下の「実験計画」を参照）。
【０２５３】
結果は、ｐＧＴ２８がインビトロでの結果と一致して低発現−ＭＦＰおよび高発現＋ＭＦＰの最良の組合せを提供することを示した（図３３）。４日目のｈＩＦＮ−ＭＦＰの発現は、すべてのＢＲＥＳ−１／ｈＩＦＮプラスミドについて検出不能であった。７日目のｈＩＦＮ＋ＭＦＰの発現は、ｐＧＴ２７についてはＣＭＶプロモーターによるものよりも低かったが、ｐＧＴ２８、２９、および３０については高かった。ｐＧＴ２８からのｈＩＦＮの発現は、ＣＭＶからのものよりも５倍程度高かった。発現は１８日までにすべてのＢＲＥＳ−１／ｈＩＦＮプラスミドについてほぼ検出不能に低下しており、ｐＧＴ２８はその時点で最低の発現を示した。これらの結果は全体として基礎および誘導標的遺伝子発現に対する配向依存効果を示す。
【０２５４】
実験計画：ＢＲＥＳ−１／ｈＩＦＮプラスミドのインビボトランスフェクションおよびｐＢＲＥＳ−１／ｈＩＦＮの４つの配向の比較を次の通り実行した。正常成体Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに対しＢＲＥＳ−１／ｈＩＦＮまたはＣＭＶ−ｈＩＦＮ発現カセットを有するプラスミドベクターを注射した。ヒトＩＦＮ発現をＭＥＰ処置のオフ／オン／オフ周期により分析した。
【０２５５】
プラスミドＤＮＡ溶液：２−６群のマウス（プラスミド）に対し１５０ｕｌの容量中マウス１匹当たり２５０ｕｇのＤＮＡを投与した。
【表５】
2008545639.tif 000023
【０２５６】
ＤＮＡ輸送：２−６群のマウス（プラスミド）に対し、２５ｕｌのＤＮＡ溶液を脛骨筋筋へ注射し、各々の後脚の腓腹筋へ５０ｕｌを注射した後、キャリパーでエレクトロポレーションを行った（２００Ｖ／ｃｍ、１Ｈｚ、２０ミリ秒／パルスで８パルス）。
【０２５７】
ＭＦＰ処置：２−５群に対し、下表に示されているように７〜１０日目に０．３３ｍｇ／ｋｇ（ゴマ油中０．０８３ｍｇ／ｍｌの１００ｕｌ、新しく調製）でｉ．ｐ．注射によってＭＦＰを投与した。
【表６】
2008545639.tif 000024
【０２５８】
採血およびエンドポイント分析／アッセイ手順：マウスを、尾に切れ目を入れて、または心穿刺（ターミナル採血）によって上表に示した時点で採血した。血液をマイクロテイナー管へ収集した（非抗凝固）。血清を血液から分離および収集し、次いでＥＬＩＳＡによってｈＩＦＮについて分析した。
【０２５９】
ｉｉｉ．ＢＲＥＳ−１プラスミドにおける標的遺伝子発現に対する配向性依存効果：ＢＲＥＳ−１／ｈＥＰＯプラスミドも上述と同様にして試験した。誘導的１プラスミドＢＲＥＳ−１／ｈＥＰＯ（ｐＧＴ１５、ｐＧＴ１６、ｐＧＴ１７、およびｐＧＴ１８）または２プラスミド（ｐＧＳ１６９４＋／−ｐＥＰ１６６６）ベクターを、１群当たり１０匹の天然Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの後肢筋へ注射しエレクトロポレーションした。各々の群からのマウス５匹をプラスミド注射後７日目から４日間連続してＭＦＰで処置し、各々の群からのマウス５匹にはＭＦＰを投与しなかった。注射後１０日目、最後のＭＦＰ処置後６時間に採血した。血清を凝固血液から収集し、ｈＥＰＯについてＥＬＩＳＡによって分析した（詳細について以下の「実験計画」を参照）。結果は、誘導発現レベルが４つのＢＲＥＳ−１／ＥＰＯプラスミドの３つについて２つのプラスミド系よりも高いこと、発現レベルがｍＩＦＮおよびｈＩＦＮ  ＢＲＥＳ−１プラスミドと一致して配向とともに変動することを示す（図３４Ａ）。結果は、ＥＰＯ発現とヘマトクリットレベルとの優れた相関を示し（図３４Ｂ）、誘導的ＥＰＯ遺伝子の生理学的効果を明らかに示す。これらの結果は全体として基礎および誘導標的遺伝子発現に対する配向依存効果を示す。
【０２６０】
実験計画：ＢＲＥＳ−１／ｈＥＰＯ  プラスミドのインビボトランスフェクションおよび２プラスミド調節発現系におけるｐＢＲＥＳ−１／ｈＥＰＯの４つの配向の比較を次の通り実行した。正常成体Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに対しＢＲＥＳ−１／ｈＥｐｏプラスミドベクターまたはＥｐｏを有する２プラスミド調節発現系をＧＳ反応性標的遺伝子として注射した。ヒトＥｐｏ発現をＭＦＰ処置の非存在および存在下で分析した。次のプロトコールは、５群のマウスからなる（Ｎ＝１０、ここで「Ｎ」は動物の数である）。各々の群について、全１０匹のマウスに対し４つのｐＢＲＥＳ−１プラスミドのうち１つまたは２つのプラスミドを注射／エレクトロポレーションした。Ｎ＝１０の追加の群（群６）に対しては陰性対照のために注射しなかった。
【０２６１】
以下の各々の尾採血またはターミナル採血のために、血液１０ｕｌをヘマトクリットアッセイ用に直ちに採集し、残りの血液から血清も採集した。以下の「血液採集およびエンドポイント分析／アッセイ手順」を参照。１−５群の各々について、７日目に５匹のマウスに対し７−１０日の午前にＭＦＰを注射し、１０日目の午後、最後のＭＦＰ注射後６時間に尾採血した（誘導試料）。各々の群の残りの５匹のマウスはＭＦＰで誘導せず、１１日目にターミナル採血した（ターミナル採血は正確な非誘導レベルのために必要であった）。群６は１１日目にターミナル採血した。
【０２６２】
このようおに、本実験において、ｐＢＲＥＳ−１および２つのプラスミド系をそのＭＦＰ誘導および非誘導レベルに関して比較し、時間とともに一定に誘導されるレベルも比較した。
【０２６３】
プラスミドＤＮＡ溶液：群１のマウスに対し１５０ｕｌの容量でマウス１匹につき各々のプラスミド１００ｕｇを投与した。群２−５のマウスに対し１５０ｕｌの容量でマウス１匹につき２００ｕｇＤＮＡを投与した。
【表７】
2008545639.tif 000025
【０２６４】
ＤＮＡ輸送：２５ｕｌのＤＮＡ溶液を脛骨筋へ注射し、各々の後脚の腓腹筋へ５０ｕｌを注射した後、キャリパーでエレクトロポレーションを行った（２００Ｖ／ｃｍ、１Ｈｚ、２０ミリ秒／パルスで８パルス）。
【０２６５】
ＭＦＰ処置：マウスに対し、１００ｕｌのＭＦＰ溶液（ゴマ油中０．０８３ｍｇ／ｍｌ）を腹腔内注射によって投与した。
【表８】
2008545639.tif 000026
【０２６６】
採血およびエンドポイント分析／アッセイ手順：マウスを上表に示した時点で尾に切れ目を入れて、または心穿刺（ターミナル採血）によって採血した。血液をマイクロテイナー管に採集し（非抗凝固）、凝固させ、遠心分離し、血清採取した。血清をＥＬＩＳＡによってｈＥＰＯについて分析した。
【０２６７】
ヘマトクリット：およそ１０ｕｌの血液を尾に入れた切れ目から毛細管に直接採集（吸引）し、粘土で密閉し、収集後１０分以内に約１０，０００ｇで約５分遠心分離した。血液を毛細管で３層に分離した、すなわち、底のＲＢＣ（４０−５０％全容積）、「バフィー層」、および残りの血漿。滑り尺を使用し、ヘマトクリット（総血液に対するＲＢＣの割合）を読取った。
【０２６８】
Ｂ．ＢＲＥＳ−１基本骨格：本明細書に記載されているように、（本明細書に記載された方法によって測定される）遺伝子発現のレベルおよび／または持続時間の有意な増加を明らかに示す、本発明のＢＲＥＳ−１ベクターのプラスミド基本骨格修飾のいずれかを、本発明のＢＲＥＳ−１ベクターに組込むことができる。本発明のＢＲＥＳ−１ベクターに対する追加の修飾として強力なプロモーターの使用を挙げることができる。この種の修飾はＢＲＥＳ−１系のモジュラー設計により容易に試験される。
【０２６９】
Ｃ．ＢＲＥＳ−１／ベクター試験：本発明者による薬物動態および有効性試験では、ＣＭＶプロモーターエンハンサーを利用するＩＦＮ−β発現カセットが使用された。本発明のＢＲＥＳ−１発現系は、本明細書に記載されているように特定の治療的必要に適合するように調製されうる。例えば、本発明のベクターまたは発現カセットの変化または修飾は、Ｃ５７Ｂｌ／６未処置(naive)マウスにおいて試験されうる。これらの試験は、例えば、１）連続的または脈動性治療パラダイムのいずれかのために、全身に治療分子（ＴＭ）（例えば、ＩＦＮ−β）の治療的レベルを達成するために必要な、ベクターおよび活性化因子分子（ＡＭ）（例えば、小分子誘導剤ＭＦＰ）の最適な用量を決定するため、および２）時間とともに遺伝子発現時間の持続時間を測定し、ベクターおよび誘導剤の反復投与の最適な時間を規定するために実行されうる。これらのパラメーターがマウス（または他の適切な動物）において確定されていると、遺伝子ベースの輸送対タンパク質輸送の優れた薬物動態プロフィール（例えば、発現のレベル、発現の持続性、再生可能な発現）が、別の種、好ましくは、非ヒト霊長類においてこれら最適化輸送状態を使用して確定されうる。
【０２７０】
実施例８：候補ベクターの選択
ベクターの型の選択は特異的試験によって決定されうる。例えば、プラスミドＤＮＡについて、エレクトロポレーションが、治療分子（ＴＭ）の治療的レベル、例えば、ＩＦＮ−βの治療的レベルを得るために、筋内注射の望ましいの構成要素かどうかを決定できる。本発明の遺伝子療法ベクターのエレクトロポレーションによる投与が望ましい場合は、本明細書に記載されているように、さらに当業界で周知であるように、臨床的に実行可能であり、許容可能でありうるデバイスおよびプロトコールが計画されうる。例えば、本発明のＡＡＶ−１ベクターについて、ベクターの反復投与が、ＡＡＶベクターについて報告された潜在的な免疫原性特性に基づき望ましいかを判定することができる（例えば、チルムール（Ｃｈｉｒｍｕｌｅ），Ｎら（２０００年）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７４：２４２０−２５頁を参照）。
【０２７１】
Ａ．プラスミドＤＮＡを使用する骨格筋のトランスフェクションを改善する方法：プラスミドＤＮＡは、単純、非免疫原性、産生および製造が容易であるという点で遺伝子ベースの輸送の望ましいベクターである。筋内注射によるプラスミドＤＮＡの骨格筋（ＳｋＭ）トランスフェクション効率を強化するためにいくつかの異なる方法が開発されている。これらの方法として、輸送前に筋および周囲の細胞外マトリックスを処置するためのヒアルロニダーゼなどの酵素（例えば、メヌンニ（Ｍｅｎｎｕｎｉ）Ｃら（２００２年）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １３：３５５−６５頁を参照）、さまざまなポリマー製剤（例えば、ムンパー（Ｍｕｍｐｅｒ），ＲＪら（１９９８年）Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ５２：１９１−２０３頁、ニコル（Ｎｉｃｏｌ），Ｆら（２００２）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９：１３５１−５８頁を参照）、およびエレクトロポレーションなどのデバイス（例えば、アイハラ（Ａｉｈａｒａ），Ｈら（１９９８年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ  １６：８６７−７０頁、ブロクエル（Ｂｌｏｑｕｅｌ），Ｃら（２００４年）Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  ６：１１−２３頁）または超音波（例えば、シュラッツベルガー（Ｓｃｈｒａｔｚｂｅｒｇｅｒ），Ｐら（２００２年）  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ６：５７６−８３頁を参照）の使用が挙げられる。高圧および大容積を使用する肢ＳｋＭへのプラスミドＤＮＡの血管内輸送（「カフ」法）もプラスミドＤＮＡの高トランスフェクションおよびこの標的組織への広い分布の達成において有効であることが示されている（例えば、バドカー（Ｂｕｄｋｅｒ），Ｖら（１９９８年）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ５：２７２−７６頁を参照）。これらの方法のすべてのうち、エレクトロポレーションおよび血管内輸送が最も有効であることが報告されており、いくつかの動物モデルにおいて、裸のＤＮＡのみの場合を２〜３けたの規模で上回って、プラスミドＤＮＡのＳｋＭへのトランスフェクションを強化することが示されている（例えば、ブロクエル（Ｂｌｏｑｕｅｌ），Ｃら（２００４年）Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  ６：１１−２３頁、キアン（Ｑｉａｎ），ＨＳら（２００４年）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ９：補遺１、９１頁を参照）。プラスミドＤＮＡを使用する本発明者は、血清における検出可能レベルのＩＦＮ−β（血清における測定可能なＩＦＮ−βタンパク質、バイオマーカー反応、または有効性）が、エレクトロポレーションがプラスミドＤＮＡの輸送で行われると達成されることを示した。
【０２７２】
ＩＦＮ−βプラスミドＤＮＡの輸送における臨床使用のための適切なエレクトロポレーションデバイスが、本明細書に記載された、または当業界で周知の方法を使用することによりウサギおよび他の大きな動物における試験によって評価および測定されうる。かかる試験および使用に適切でありうるエレクトロポレーションデバイスとしては、イノビオ（Ｉｎｏｖｉｏ）ＡＳ、イコール・メディカル・システムズ（Ｉｃｈｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ジェネトロニックス社（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．）によって開発されたものを挙げることができる。ジェネトロニックス（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ）は、ヒトにおけるデバイスの試験を報告した（生物電気化学に関するゴルドン研究会議（Ｇｏｒｄｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ）での未公開発表、７月２５−３０日、ニューハンプシャー州（ＮＨ））。イノビオ（Ｉｎｏｖｉｏ）は、ヒトボランティアにおけるエレクトロポレーション技術の試験も報告した（例えば、ケレン（Ｋｊｅｌｅｎ），Ｒら（２００４年）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ９：補遺１、６０頁を参照）。イコール・メディカル・システムズ（Ｉｃｈｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）は最近、治療的ＤＮＡの輸送に適切なエレクトロポレーションデバイスの開発を報告した（例えば、エバンス（Ｅｖａｎｓ），ＣＦら（２００４年）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ９：補遺１、５６頁を参照）。
【０２７３】
ＬａｃＺレポーター遺伝子をコードするプラスミドを使用することにより、本発明者は、プラスミド溶液の動脈内輸送を用いるラット後肢骨格筋への高トランスフェクション効率を明らかに示した。ミルス（Ｍｉｒｕｓ）は最近、本明細書に記載された、または当業界で周知の方法を使用することにより、ＳｋＭへのプラスミド輸送のために試験されうる、減圧下で体積が減少したプラスミドＤＮＡを輸送するための静脈内輸送法を報告した（例えば、ハグストローム（Ｈａｇｓｔｒｏｍ），ＪＥら（２００４年）ＭｏｌｅＴｈｅｒ１０：３８６−９８頁を参照）。
【０２７４】
ＳｋＭへのプラスミドＤＮＡの取込みおよびその後の導入遺伝子の発現を強化するエレクトロポレーションまたは血管内輸送以外の方法が試験されうるとともに、プラスミドＤＮＡの輸送のその適合性が、本明細書に記載された、または当業界で周知の方法を使用することにより判定されうる。この点で、ＳｋＭへのベクター取込みを強化することが報告されている特定の化学薬品、例えばポリマー製剤およびアンテナペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）ペプチド（ＡＰ）などが試験されうるとともに、本発明のプラスミドベクターの輸送において使用するために適切でありうる。例えば、「Ｆ６８」は、プラスミドＤＮＡを形成し、輸送するために使用されうるとともに、プラスミドＤＮＡのＳｋＭへの輸送をおよそ１０倍に強化することが報告されているポロクサマーである（例えば、ムンパー（Ｍｕｍｐｅｒ），ＲＪら（１９９８年）Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ５２：１９１−２０３頁、キアン（Ｑｉａｎ），ＨＳら（２００４年）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ９：補遺１、９１頁を参照）。アンテナペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）（ＡＰ）ペプチドおよび同様の組成物の他のペプチドは、細胞膜を横断する大きなマクロ分子の輸送を促進することが報告されている（例えば、ブッチ（Ｂｕｃｃｉ），Ｍら（２０００年）Ｎａｔ．Ｍｅｄ  ６：１３６２−６７頁、グラットン（Ｇｒａｔｔｏｎ），Ｊ−Ｐら（２００３年）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９：３５７−６２頁を参照）。
【０２７５】
Ｂ．プラスミドＤＮＡベクターからのＩＦＮ−β発現のレベルおよび持続時間を増大させる方法：ＳｋＭへのプラスミドＤＮＡ取込みを強化する特定の化学薬品の評価に加えて、さまざまな方法を使用し、本発明のプラスミドＤＮＡベクターからの導入遺伝子発現のレベルおよび持続時間を増大させることができる。例えば、プラスミドＤＮＡから細菌ＤＮＡ配列を除去して発現カセットのみを含有する環状プラスミド（「ミニサークルＤＮＡ」）を作製すると、結果として、マウスにおける肝臓のトランスフェクション後の標準プラスミドＤＮＡと比べ（導入遺伝子として第ＩＸ因子およびアルファ１−抗トリプシンを使用することにより）１０〜１００倍高い導入遺伝子発現をもたらすことが報告されている（例えば、チェン（Ｃｈｅｎ），Ｚ−Ｙら（２００３年）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ８：４９５−５００頁を参照）。ＣｐＧ領域に豊富な細菌ＤＮＡ配列の除去は、導入遺伝子発現サイレンシングを減少させ、結果として、プラスミドＤＮＡベクターからのより持続的な発現をもたらすことが示されている（例えば、エアハルト（Ｅｈｒｈａｒｄｔ），Ａら（２００３年）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０：２１５−２５頁、イェット（Ｙｅｔ），ＮＳ（２００２年）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ５：７３１−３８頁、チェン（Ｃｈｅｎ），ＺＹら（２００４年）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １１：８５６−６４頁を参照）。本発明の調節発現系は、かかる方法を使用することにより修飾され、プラスミドＤＮＡベクターを使用する導入遺伝子発現のレベルを増大および延長させることができる。好ましい実施形態において、ＩＦＮ−βをコードするＢＲＥＳ−１プラスミドベクターは修飾され、導入遺伝子発現を増大および延長させる。好ましい実施形態において、ＩＦＮ−βをコードするＢＲＥＳ−１プラスミドベクターを修飾して、導入遺伝子発現のレベルを増大し、延長させることができる。
【０２７６】
１つの実施形態において、本発明の調節発現系におけるＩＦＮ−β導入遺伝子は、ＩＦＮ−βを構成的に発現する強力なサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）  プロモーターによって推進された。ＣＭＶプロモーターを使用する遺伝子ベースの発現が、インビボでのプロモーター領域の広範囲のメチル化によりサイレンシングを受けることが報告されている（例えば、ブルックス（Ｂｒｏｏｋｓ），Ａら（２００４年）Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  ６：３９５−４０４頁を参照）。また、ＢＲＥＳ−１遺伝子療法プラスミドベクターｐＧＴ２６−ｍＩＦＮ−βを使用する本発明者によるインビボ試験からの結果は、ＣＭＶ推進発現カセットを使用して達成されるレベルよりもＢＲＥＳ−１発現カセットを使用することにより高いＩＦＮ−βレベルを示した（例えば、実施例６を参照）。これらの結果を考えると、本発明のＩＦＮ−β  ＢＲＥＳ−１発現系は、ＣＭＶ推進プラスミドＤＮＡ発現カセットを使用して大いに確認されているものより有意に高くより持続的な発現レベルを有しうるとともに、したがって、エレクトロポレーションなしにＢＲＥＳ−１プラスミドベクターの輸送を検査するために適切である。
【０２７７】
好ましい実施形態において、投与の方法は、エレクトロポレーションの非存在下でＩＦＮ−βプラスミド溶液の筋内注射によるものである。血清におけるＩＦＮ−βの検出可能なレベルは、未処置(naive)マウスへの筋内注射によってプラスミドベクターを投与することによって試験されうる。ＢＲＥＳ−１発現カセットの発現レベルおよび持続性の完全な特徴づけを行い、以前に使用されたＣＭＶベクターと比較することができる。Ｆ６８ポロクサマーおよびアンテナペディアペプチドを含むプラスミド製剤は、ＳｋＭのプラスミドトランスフェクションを強化するその能力、およびその後のＩＦＮ−β導入遺伝子発現について試験されうる。最後に、プラスミドベクター基本骨格の修飾（例えば、細菌配列の除去）が、導入遺伝子発現を増大および延長させる手段として調査されうる。
【０２７８】
Ｃ．ＡＡＶ−１ベクター：アデノ関連性ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒトからのアデノウイルス単離株における混入物質として最初に単離された一本鎖ＤＮＡウイルス（パルボウイルス）である。ＡＡＶは、遺伝子療法ベクターとして特に魅力的となる多くの特長を有する。ヘルパーウイルスの非存在下でのその非病原性および複製欠損性質に加えて、これは２つの遺伝子、ｒｅｐおよびｃａｐのみからなるきわめて単純なゲノムを含有する。これらの遺伝子は組換えＡＡＶベクターにおいて、各々およそ１３５の塩基対の特徴的な５’および３’逆位末端配列（ＩＴＲ）と隣接して所望の導入遺伝子と置換される。ＩＴＲはベクター輸送に必要とされるＡＡＶ由来の唯一の残りの成分である。これまでの研究では、ｒｅｐ遺伝子がない組換えＡＡＶはインビボで組み込まれることはないが、非分裂細胞において依然としてエピソームのままである大きなコンカテマー構造を形成することが示されている（例えば、デュアン（Ｄｕａｎ），Ｄら（１９９８年）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：８５６８−７７頁、ビンセント・ラカゼ（Ｖｉｎｃｅｎｔ−Ｌａｃａｚｅ），Ｎら（１９９９年）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：１９４９−５５頁、シュネップ（Ｓｃｈｎｅｐｐ），ＢＣら（２００３年）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７：３４９５−３５０４頁を参照）。
【０２７９】
ＡＡＶは、ＤＮＡに対しておよそ４．５ｋｂの比較的小さな容量を有するが、これは通常、すべての、ただし最大の治療的導入遺伝子に適合するには十分である。ＡＡＶ２がヒト遺伝子療法の治験で試験されており、長期の発現および最小の炎症を提供することが示されている（例えば、シルウェル（Ｓｉｌｗｅｌｌ），ＪＬおよびサムルスキー（  Ｓａｍｕｌｓｋｉ），ＲＪ（２００３年）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３４：１４８−５９頁を参照）。最近、別のＡＡＶ血清型が、このベクター系の長期発現の特徴に加えて、ＳｋＭに対する優れたトランスフェクション効率を有することが示されている（例えば、グリム（Ｇｒｉｍｍ），Ｄ  およびケイ（Ｋａｙ）、ＭＡ（２００３年）Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ３：２８１−３０４頁）。ＣＭＶプロモーター下にルシフェラーゼを発現するＡＡＶ−１ベクターを使用する本発明者による試験は、マウスの後肢への筋内注射後１２ヵ月を越えて維持される高い発現を示した（例えば、キアン（Ｑｉａｎ），ＨＳら（２００４年）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ９：補遺１、６０頁）。ヒト以外の霊長類における５年に達するｈＥＰＯの持続的発現が報告されている（例えば、シャオ（Ｘｉａｏ）、Ｗら（１９９９年）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：３９９４−４００３頁）。
【０２８０】
本明細書に記載されているように、本発明者は、ＡＡＶ−１  ＩＦＮ−β発現ベクター（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーを使用する構成的発現）を試験し、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの後肢への筋内注射後のｈＩＦＮ−βタンパク質およびｍＩＦＮ−βバイオマーカー反応の健全なレベルを明らかに示した。
【０２８１】
ＭＳなどの慢性疾患を治療するためのウイルスベースの輸送ベクターの選択において、本発明の調節発現系は、本明細書に記載された、または当業界で周知の方法を使用することにより、治療的導入遺伝子の長期発現を明らかに示すその能力だけではなく、遺伝子をを再投与するその能力についても試験されうる（例えば、チルムール（Ｃｈｉｒｍｕｌｅ），Ｎら（２０００年）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７４：２４２０−２５頁を参照）。ＡＡＶ−１が再投与に適切なベクターであるかを判定するために、例えば、ヒト集団において最も流行していると考えられている血清型である、候補ベクター、ＡＡＶ−１、およびＡＡＶ２を使用することにより試験が行われうる。かかる方法を使用し、１）ＡＡＶ２またはＡＡＶ−１に対する既存の抗体がＡＡＶ−１ベクターにおいてコードされた遺伝子を輸送および発現する能力に影響を及ぼすか、および２）ＡＡＶ−１ベクターがマウスにおけるＩＦＮ−βの治療的レベルを維持するのに十分な量で再投与されうるかを判定することができる。ＡＡＶ−１またはＡＡＶ２ベクターのいずれかにおけるレポーター遺伝子ルシフェラーゼまたは治療的遺伝子、マウスＩＦＮ−βのいずれかを発現するベクターを、異なる用量でｉ．ｍ．投与し、導入遺伝子発現をモニタリングすることができる。４週間後、ベクターは再投与され、再び導入遺伝子発現がモニタリングされうる。中和抗体は、細胞ベースのアッセイにおける、免疫マウス血清の、ウイルス取込みを阻害する能力によってエクスビボで測定されうる。
【０２８２】
ｉ．ｐＢＲＥＳ−１−ｈＩＦＮ  ＡＡＶベクターのインビボ活性：マウスの後肢筋へ注射されるｈＩＦＮ−βＢＲＥＳ−１ＡＡＶベクターＡＡＶ−１ＧＴ５８を使用することにより天然Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて試験を実行した。マウスをＭＦＰの非存在下で４日目に採血し、次いでプラスミド注射後７日目から４日間連続でＭＦＰで処置した。血液を注射後１１および１８日目に収集した。血清を凝固血液から収集し、ＥＬＩＳＡによってｈＩＦＮについて分析した（詳細について以下の「実験計画」を参照）。次いで、マウスをＭＦＰ処置のさらなる７つの周期にかけ、および約６〜８週間の間隔をおいて採血を行った。各々周期はＭＦＰ処置前３日の採血、ついで４日のＭＦＰ、次いでＭＦＰの最終日後の採血、次いでその後７日の別の採血で構成された。結果は、きわめて高い誘導的ｈＩＦＮ発現を示し、最も強力なＢＲＥＳ−１／ｈＩＦＮプラスミドにより得られたものよりも７５倍もの高いレベルで注射の約３ヶ月後にピークに達した（図３５）。ｈＩＦＮ発現は時間とともに徐々に減少し、バックグラウンド発現−ＭＦＰは実験中の全期間にわたって依然として低いままであった。これはＡＡＶベクターからの治療的標的遺伝子の長期の持続的（実施例９Ｂも参照）、誘導的発現を明らかに示す。
【０２８３】
実験計画：正常成体Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに対しＢＲＥＳ−１／ｈＩＦＮ発現カセットを有するＡＡＶベクターを次の通り注射した。ヒトＩＦＮ発現をＭＥＰ処置の複数のオフ／オン／オフ周期により分析した。
【０２８４】
ウイルス溶液：群１マウス（ＡＡＶ）に対し７５ｕｌの容量でマウス１匹当たり５×１０１０ウイルス粒子（ｖｐ）を投与した。
【表９】
2008545639.tif 000027
【０２８５】
ＭＦＰ処置：群１に対し、下表に示されているように０．３３ｍｇ／ｋｇ（ゴマ油中０．０８３ｍｇ／ｍｌの１００ｕｌ、新しく調製）で７−１０日目に腹腔内注射によって投与した。
【表１０】
2008545639.tif 000028
【表１１】
2008545639.tif 000029
【０２８６】
採血およびエンドポイント分析／アッセイ手順：マウスを尾に切れ目を入れて上表に示した時点で採血した。血液をマイクロテイナー管へ収集し（非抗凝固）、血清の分離および採取のために遠心分離した。血清をＥＬＩＳＡによってｈＩＦＮについて分析した。
【０２８７】
[実施例９]：調節発現系を使用する遺伝子療法
Ａ．用量／反応および動態試験：用量／反応試験を実行し、プラスミドまたはＡＡＶ−１のどちらによる輸送かに関係なく、マウス（または他の適切な動物）における治療分子（ＴＭ）（例えば、ＩＦＮ−β）の治療的レベルを達成するため必要である、輸送のための本発明の遺伝子療法ベクターの量を測定することができる。１つの実施形態において、治療的レベルは、ｍｇ／ｋｇベースでヒトにおいて投与される治療タンパク質のボーラスの治療的量によって達成される治療タンパク質のレベルと同等である、ベクターによって全身に達成される治療分子（ＴＭ）例えば治療タンパク質をコードする導入遺伝子の誘導レベルとして規定される。例えば、好ましい実施形態において、治療的レベルは、ｍｇ／ｋｇベースでヒトにおいて投与される治療タンパク質のボーラスの治療的量によって達成されるＩＦＮ−βのレベルと同等である、本発明の遺伝子療法ベクターによって全身に達成されるＩＦＮ−βの誘導レベルとして規定される。ヒトにおいて、ＩＦＮ−β１ａの現在の単回用量は３０ｕｇまたは４４ｕｇ（レビフ（Ｒｅｂｉｆ））のいずれかである。
【０２８８】
また、活性化因子分子（ＡＭ）を用いて、治療分子（ＴＭ）の完全な薬物動態プロフィールを実行し、ＡＭ用量／反応、およびＡＭ投与後のＴＭ発現の誘導の動態を測定することができる。例えば、好ましい実施形態において、誘導剤ＭＦＰを用いてＩＦＮ−β発現の完全な薬物動態プロフィールを実行し、ＭＦＰ用量／反応、およびＭＦＰ投与後のＩＦＮ−β誘導の動態を測定することができる。
【０２８９】
ｉ．インビボでのＭＦＰ用量／反応およびＢＲＥＳ−１／ｍＩＦＮプラスミドを用いたプラスミド再注射：ｍＩＦＮ−βＢＲＥＳ−１プラスミドベクターｐＧＴ２６を用いて未処置(naive)Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおける試験を実行し、ケモカインＰ−１０のレベルによって分析される、ＭＦＰのさまざまな用量に応じたｍＩＦＮ発現のレベルを測定した。ｐＧＴ２６をマウスの後肢筋へ注射しエレクトロポレーションし、動物をプラスミド注射後７−１０日目に０．００３３ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇのＭＦＰで処置した。血液を注射後１１日目に収集し、血清試料をＩＰ−１０について分析した（詳細については以下の「実験計画」を参照）。結果はＩＰ−１０レベルのＭＦＰ用量依存的増加を示す（図３６）。ＭＦＰの非存在下または０．００３３ｍｇ／ｋｇでバックグラウンドＩＰ−１０レベルを超える増加は認められなかった。次いで、ＩＰ−１０レベルは、０．０１から１．０ｍｇ／ｋｇまでのＭＦＰで増加する。ＭＦＰ誘導の第２および第３の周期を３９日目および６７日目に同じ濃度で実行した。６７日までにＩＰ−１０のレベルは１１日目のレベルから数倍減少しており、そこでプラスミドＤＮＡを７７日目に注射した。別の周期のＭＦＰ処置を実行し、マウスを８８日目に採血した。結果は、１１日目と同じレベルまでＩＰ−１０発現が再生誘導されたことを示す。１０２および１３７日目に２つの追加のＭＦＰ周期を実行し、ＭＦＰ用量反応は依然として確認され、ＩＰ−１０レベルは時間とともに徐々に減少した。その後、プラスミドＤＮＡを１８９日目に３回注射し、２００日目の次のＭＦＰ周期および採血ではもう一度、強いＭＦＰ用量反応を示し、ＩＰ−１０発現は再生され１１および８８日目とほぼ同じレベルになった。これは誘導剤用量との標的遺伝子発現の陽性相関、およびプラスミドベクターの反復投与による遺伝子発現の持続性および再生を明らかに示す（以下の実施例９Ｂを参照）。
【０２９０】
ヒトにおける安全性試験のために、活性化因子分子（ＡＭ）の中止後にＡＭおよびＴＭ発現が「オフ」となる速度の完全な特徴決定を行うことができる。ＴＭの定常状態レベルを達成するために必要なＡＭ投与の頻度を評価することができる。好ましい実施形態において、ＭＦＰおよびＩＦＮ−β発現が誘導剤の中止後に「オフ」となる速度の完全な特徴決定を評価することができる。さらに、ＩＦＮ−βの定常状態レベルを達成するために必要なＭＦＰ投与の頻度を評価することができる。
【０２９１】
実験計画：正常Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに対し、単一ベクターＢＲＥＳ−１マウスＩＦＮ発現プラスミドを注射およびエレクトロポレーションし、さまざまな用量のＭＦＰで処置し、ｍＩＦＮ発現をバイオマーカー反応によって、次の通り分析した。
【表１２】
2008545639.tif 000030
【０２９２】
【表１３】
2008545639.tif 000031
【表１４】
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【０２９３】
ＤＮＡ溶液：各々のマウスに対し、１５０ｕｌＰＢＳ中２５０ｕｇのプラスミドＤＮＡを投与した。
【０２９４】
ＤＮＡ輸送：成体オスＣ５７Ｂｌ／６マウスに対し、１５０ｕｌＰＢＳ中２５０ｕｇプラスミドＤＮＡを０日目に両側的に注射した。ＤＮＡ溶液を２５ｕｌ脛骨筋へ注射し、各後脚の腓腹筋へ５０ｕｌ注射した後、キャリパーでエレクトロポレーションを行った（２００Ｖ／ｃｍ、１Ｈｚ、２０ミリ秒／パルスで８パルス）。
【０２９５】
ＭＦＰ処置：上表および下表に示されているように、群１−７に対し、７−１０日目に腹腔内注射によって１００ｕｌゴマ油のみおよびＭＦＰをさまざまな濃度で投与した。
【表１５】
2008545639.tif 000033
【表１６】
2008545639.tif 000034
【表１７】
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【０２９６】
７７日目のＤＮＡの再注射
各々のマウスに対し、１５０ｕｌＰＢＳ中２５０ｕｇのプラスミドＤＮＡを投与した。
【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【０２９７】
１８９日目のＤＮＡの再注射：各々のマウスに対し、１５０ｕｌＰＢＳ中２５０ｕｇのプラスミドＤＮＡを投与した。群９は、年齢をできる限り厳密にマッチさせた新しい対照マウスであった。群１にもプラスミドを注射した。
【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【０２９８】
採血およびエンドポイント分析／アッセイ手順：マウスを尾に切れ目を入れて、または心穿刺によって採血し、血液をマイクロテイナー管へ収集した（非抗凝固）。血清を血液から分離および収集し、次いでＥＬＩＳＡによってＩＰ−１０について分析した。
【０２９９】
ｉｉ．インビボでのＢＲＥＳ−１ＡＡＶベクターからのｈＩＦＮの誘導および脱誘導動態の測定：ｈＩＦＮ−βＢＲＥＳ−１ＡＡＶベクターＡＡＶ−１ＧＴ５８を用いて未処置(naive)Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて試験を実行し、誘導および脱誘導の動態を検査した。ＡＡＶ−１ＧＴ５８をＣ５７Ｂｌ／６マウスの後肢筋へ注射し、その動物に対し４日連続で腹腔内注射によってＭＦＰを投与し、その期間中に最初のＭＦＰ注射後のさまざまな時点で採血し、誘導動態を測定した。次いで、最後のＭＦＰ注射後のさまざまな時点で採血し、脱誘導動態を測定した（詳細については以下の「実験計画」を参照）。血清をＥＬＩＳＡによってｈＩＦＮについて分析した。結果は、誘導および脱誘導動態が迅速であり、最初のＭＦＰ処置後４８−７２時間までにｈＩＦＮのピークレベルに達し（図３７Ａ）、ＭＦＰ処置後９６時間以内にバックグラウンドレベルに減少した（図３７Ｂ）ことを示す。これは、ＢＲＥＳ−１系が迅速にインビボでオンおよびオフになったことを明らかに示す。
【０３００】
実験計画：正常成体Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに対し、ＢＲＥＳ−１／ｈＩＦＮ発現カセットを有するＡＡＶ１ベクターを次の通り注射した。各々の群について、動物５匹（ｎ＝５）を下表の指定の「採取時間」で屠殺した。ヒトＩＦＮ発現をＭＦＰの非存在下または単回／複数回ＭＦＰ投与後にＥＬＩＳＡによって血清において測定した。
【表２５】
2008545639.tif 000043
【０３０１】
ウイルス溶液および輸送：群１マウスに対しては７５ｕｌのＰＢＳを投与し、群２−６のマウスに対しては片方の後脚（右脚）に７５ｕｌのＰＢＳの容量でマウス１匹当たり５×１０１０ウイルス粒子（ｖｐ）を投与した。２５ｕｌを脛骨筋へ注射し、５０ｕｌを腓腹筋へ注射した。
【表２６】
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【０３０２】
ＭＦＰ処置：群３−６に対し、ＭＦＰを０．３３ｍｇ／ｋｇ（ゴマ油中０．０８３ｍｇ／ｍｌの１００ｕｌ、新しく調製）で腹腔内注射によって次のスケジュールに従って投与した。すなわち、群３＝１７日目、群４＝１６＋１７日目、群５＝１５−１７日目、および群６＝１８−２１日目。
【０３０３】
採血およびエンドポイント分析／アッセイ手順：マウスを心穿刺（ターミナル採血）によって表２７に示した時点で採血した。血液をマイクロテイナー管に収集し（非抗凝固）、血清を血液から分離し、収集し、ＥＬＩＳＡによってｈＩＦＮについて分析した。
【０３０４】
Ｂ．発現の持続性および反復投与試験：これまで生成されたデータは、ＣＭＶプロモーターベースのコンストラクトを用いる構成的ＩＦＮ−βの発現が、プラスミドＤＮＡを用いると少なくとも４９日、ＡＡＶ−１ベクターを用いると６ヵ月持続することを示した。計画は、ＢＲＥＳ−１系を有する候補ベクターを用いてこれらの試験を反復および延長し、少なくとも３ヵ月間のＩＦＮ−βの持続的、および調節可能な発現を実証することである。これらの試験は未処置のＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいて行われうる。
【０３０５】
本発明のＢＲＥＳ−１ベクターは、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（または他の適切な動物）において、活性化因子分子（ＡＭ）の投与を行い、ＥＬＩＳＡまたは投与に応じた反復バイオマーカーエンドポイントについて、試験されうる。ＢＲＥＳ−１ベクター、発現治療分子（例えば、導入遺伝子）、調節分子（ＲＭ）、または治療タンパク質に対する中和抗体の存在がモニタリングされうる。例えば、活性化因子分子（ＡＭ）を長期的に、脈動性に投与し、時間とともに治療分子（ＴＭ）の発現レベルを維持する能力、およびＡＭ投与によりオン／オフ的に再生可能な発現レベルを提供する能力を評価することができる。
【０３０６】
１つの好ましい実施形態において、本発明のＩＦＮ−βＢＲＥＳ−１ベクターは、ＭＦＰ投与またはＩＦＮ−βの投与に応じた反復バイオマーカーエンドポイントについてＣ５７Ｂｌ／６マウス（または他の適切な動物）において試験される。ベクター、ＩＦＮ分子（ＩＦＮＭ）（例えば、ＩＦＮ−β導入遺伝子）、調節分子（ＲＭ）、またはＩＦＮ−βタンパク質に対する中和抗体の存在がモニタリングされうる。ＭＦＰを長期的に、脈動性に投与し、時間とともにＩＦＮ−β発現レベルを維持する能力、ＭＦＰ投与によりオン／オフ的に再生可能な発現レベルを提供する能力を評価することができる。
【０３０７】
ｉ．ＢＲＥＳ−１プラスミド、脈動性および長期ＭＦＰ処置からのｍＩＦＮ誘導および脱誘導の動態：ｐＧＴ２６を用いて未処置のＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいて試験を実行し、ｍＩＦＮ−βＢＲＥＳ−１プラスミドベクターによる誘導および脱誘導の動態を検査し、ＭＦＰの脈動性または長期の投与に応じたｍＩＦＮ遺伝子発現を比較し、数ヵ月にわたる遺伝子発現の持続性を検査した。構成的（ｐＧＥＲ１０１、ＣＭＶ）または誘導的（ｐＧＴ２６、ＢＲＥＳ−１）ｍＩＦＮ発現プラスミドを２０匹（１群当たり）のマウスの後肢筋へ注射しエレクトロポレーションし、各々の群の５匹のマウスをＭＦＰの非存在下で７日目に採血した。ｐＧＴ２６を投与した２０匹のマウスすべてをプラスミド注射後７−１０日目にＭＦＰで処置した。脱誘導の動態を検査するために、注射後１１、１２、１４、１６、および１８日目の各々で各々の群の５匹のマウスから血液を収集した。次いで、２０匹のｐＧＴ２６マウスに対し、２１−２４日目にＭＦＰを投与し、誘導の動態を検査するために、２２、２３、２５日目の各々で各々の群の５匹のマウスから血液を収集した（詳細については以下の「実験計画」を参照）。ＭＦＰによる連続的処置に応じた標的遺伝子発現を検査するために、ｐＧＴ２６を投与したマウスに対し、３５−５０日から毎日ｉ．ｐ．でＭＦＰを注射し、各々の群からの５匹のマウスを３５日（ＭＦＰ処置前）、３９、４２、４５、および５１日目にこの期間中に採血した。３．５ヵ月後の遺伝子発現を検査するために、マウスを１０５日目に採血し、次いで１０５−１０８日目にＭＦＰで処置し、１０９および１１６日目に採血した。血清試料をｍＩＦＮ発現のバイオマーカーとしてのＩＰ−１０について分析した。
【０３０８】
結果（図３７Ｃ）は、ＢＲＥＳ−１プラスミドからのＩＦＮ発現の誘導がＭＦＰ処置により２４時間以内に起こり、発現がピーク誘導後２４−４８時間にベースラインに減少したことを示す。ＢＲＥＳ−１系からのｍＩＦＮの発現は、ＣＭＶプロモーターによって推進されるものよりも高かった。２〜３ヵ月の経過にわたるｍＩＦＮ発現の３つの周期のすべては高レベルであった。連続ＭＦＰ処置の結果として、２週間にわたってｍＩＦＮの高レベルの発現が持続した。３．５ヵ月後のＩＰ−１０レベルは早期のＭＦＰ周期における約半分〜３分の２未満であったが、バックグラウンドＩＰ−１０レベルを依然として十分に上回り、ＣＭＶプロモーターからのｍＩＦＮの発現によって生成されるものよりも相当に高かったが、これも時間とともにほぼ同じ動態で減少した（３．５ヵ月後３分の２の発現の喪失）。全体で、この実験は、ＢＲＥＳ−１系の、数ヵ月にわたて連続的、高レベルに標的遺伝子を発現する能力、および迅速に何回も再びオフおよびオンになる能力を明らかに示す。
【０３０９】
実験計画：正常Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに対し、単一ベクターＢＲＥＳ−１およびＣＭＶプロモーターマウスＩＦＮ発現プラスミドを、次の通り、注射およびエレクトロポレーションした。ｍＩＦＮ活性のエンドポイントバイオマーカーとしてＩＰ−１０を使用することによりＩＦＮ発現を少なくとも数ヵ月間モニタリングした。ＭＦＰ処置および採血を「オン」および「オフ」反応の動態を測定するために計画した。
【０３１０】
ＤＮＡ溶液：すべての注射群の各々のマウスに対し、１５０ｕｌのＰＢＳ中２５０ｕｇのプラスミドＤＮＡを投与した。
【表２７】
2008545639.tif 000045
【０３１１】
ＤＮＡ輸送：成体オスＣ５７Ｂｌ／６マウスに対し、１５０ｕｌのＰＢＳ中２５０ｕｇプラスミドＤＮＡを０日目に両側的に注射した。ＤＮＡ溶液を２５ｕｌ脛骨筋へ注射し、各後脚の腓腹筋へ５０ｕｌ注射した後、キャリパーでエレクトロポレーションを行った（２００Ｖ／ｃｍ、１Ｈｚ、２０ミリ秒／パルスで８パルス）。
【０３１２】
ＭＦＰ処置：群２に対し、ＭＦＰを０．３３ｍｇ／ｋｇ（ゴマ油中０．０８３ｍｇ／ｍｌの１００ｕｌ、新しく調製）で腹腔内注射によって下表に示されているように投与した。
【０３１３】
スケジュール：周期１（７−１８日目）：「オフ」動態を測定。周期２（２１−２５日目）：「オン」動態を測定。
【表２８】
2008545639.tif 000046
【表２９】
2008545639.tif 000047
【表３０】
2008545639.tif 000048
【０３１４】
採血およびエンドポイント分析／アッセイ手順：マウスを尾に切れ目を入れて、または心穿刺（ターミナル採血）によって上表の示した時点で採血した。血液をマイクロテイナー管へ収集し（非抗凝固）、血清の分離および収集のために遠心分離した。群１および２からの血清をＥＬＩＳＡによってＩＰ−１０について分析した。
【０３１５】
Ｃ．生物学的等価性試験：薬物動態試験は、正常マウスおよび他の種、好ましくは、ヒト以外の霊長類において、例えば、上述の試験において確定されているように、輸送条件下に、候補ベクターおよびＢＲＥＳ−１発現系を使用することにより行われうる。「生物学的等価性」は、例えば、本発明の調節発現系が、例えば、下表に規定されているが、これに限定されない両方の動物モデルにおいて、ＩＦＮ−βタンパク質輸送を上回ってＩＦＮ−β遺伝子ベースの輸送が優れた薬物動態プロフィールを提供することを、実証するものでありうるが、これに限定されない。
【０３１６】
【表３１】
2008545639.tif 000049
【０３１７】
Ｄ．安全性／毒性試験：ＡＡＶ−１が候補ベクターとして選択される場合は、候補ベクターのｉ．ｍ．投与後の生体内分布試験が実行されうる。エンドポイントとしては、標的組織（筋）、血液、リンパ、心、肝、腎、肺、男性および女性生殖器（精巣、卵巣）へのベクターＤＮＡおよび発現ＩＦＮ−βＲＮＡおよびタンパク質の分布などが挙げられる。
【０３１８】
Ｅ．疾患または状態の治療のための遺伝子ベースの輸送：これらの研究からの成果は、疾患または状態の治療のために、治療分子（ＴＭ）、例えば、治療タンパク質をコードする導入遺伝子を輸送するための遺伝子ベースの輸送系である。好ましい実施形態において、本発明は、ＭＳの治療のためのＩＦＮ−βの長期の調節された発現を提供する、ＩＦＮ−β導入遺伝子の輸送の調節発現系を提供する。好ましい実施形態において、これらの研究の成果は、本発明のＢＲＥＳ−１ベクターが、小分子誘導剤、ＭＦＰの経口投与により持続的な再生可能な発現（例えば、３ヵ月超）を提供しうるとともに、筋内注射によって反復投与が可能であることである。
【０３１９】
ｉ．ＥＡＥ疾患マウスにおけるＢＲＥＳ−１ｍＩＦＮプラスミド活性の特徴決定：ＭＳの動物疾患モデルにおける生物学的効果を示すために、活性ＥＡＥを有するＳＪＬマウスにおいて試験を実行した。構成的（ｐＧＥＲ１０１、ｐｍＩＦＮ）または誘導的（ｐＧＴ２６、ｐＢＲＥＳ−１／ｍＩＦＮ）ｍＩＦＮ発現プラスミドおよびｎｕｌｌプラスミド対照をＳＪＬマウスの後肢筋へ注射しエレクトロポレーションした。ｐｍＩＦＮの注射前後の日、およびｐＢＲＥＳ−１／ｍＩＦＮの注射後７および９日にＰＬＰ１３９−１５１／百日咳毒素の注射によってマウスにおいてＥＡＥを誘導した。プラスミド注射後１日１回（ｄ）または３日おきに（ｅｔｄ）腹腔内注射によってＭＦＰ（０．３３ｍｇ／ｋｇ）でマウスを処置した。血液を注射後５日目に収集した。ＰＢＭＣｓを血液から単離し、ＲＮＡを調製しＲＴ−ＰＣＲによって分析し、Ｍｘ１ＲＮＡのレベルを測定した（詳細については以下の「実験計画」を参照）。結果は、ｐＢＲＥＳ−１／ｍＩＦＮに加えて毎日のＭＦＰ注射によりＭｘ１  ＲＮＡレベルの約８倍の増加を示し、ＭＦＰの非存在下ではｎｕｌｌベクターを越える有意な増加は示さない（図３８）。これは本モデルにおいて有効であることが示されている生物反応と同様の、動物疾患モデルにおける生物反応を実証している。
【０３２０】
実験計画：メスＳＪＬマウス（８週齢、ジャクソン・ラボ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）、〜２０ｇ）を１２群（ｎ＝１３（１群当たり））に分け、各々の群に対し、１日目および３日目にＰＬＰ  １３９−１５１／百日咳を、次の通り、確立されたマウスＡ−ＥＡＥプロトコールに従って注射した。
【０３２１】
群１、未処置、非処置対照
【０３２２】
群２−３、ＣＭＶプラスミド＋エレクトロポレーション（ＥＰ）：２日目にｎｕｌｌ（ｐｇＷｉｚ）またはｍＩＦＮ（ｐＧＥＲ１０１）ＣＭＶプラスミドＤＮＡのいずれかを脛骨筋（２０ｕｌ）および腓腹筋（４０ｕｌ）へ２回両側筋内（ｉｍ）注射した後、直ちにＥＰを行い投与した。
【０３２３】
群４−９、ＢＲＥＳ−１＋ＥＰ：疾患の開始前１週間（７日）にＢＲＥＳ−１ｎｕｌｌ（ｐＧＴ４）またはＢＲＥＳ−１ｍＩＦＮ（ｐＧＴ２６）プラスミドＤＮＡのいずれかを脛骨筋（２０ｕｌ）および腓腹筋（４０ｕｌ）へ２回両側筋内（ｉｍ）注射した後、ＥＰを行い投与した。ＭＦＰ（０．３３ｍｇ／ｋｇ）を毎日または３日おき（ｅｔｄ）に、１日目から腹腔内注射によって投与した。「ｅｔｄ」でＭＦＰを投与する動物は、１、４、７、１０、１３、１６、１９、および２２日目に投与した。
【０３２４】
群１０−１１、バッファー対照、ｍＩＦＮタンパク質：ＩＦＮタンパク質バッファーまたはｍＩＦＮタンパク質（１００，０００単位＝５００ｎｇ）を１日目から皮下注射によって１日おきに投与した。
【０３２５】
群１２、プレドニゾロン：プレドニゾロン、毎日２回、１日目から腹腔内（ｉｐ）注射によって投与した。
【０３２６】
【表３２】
2008545639.tif 000050
【０３２７】
【表３３】
2008545639.tif 000051
【０３２８】
群１１  ｍＩＦＮタンパク質：１００，０００単位（５００ｎｇ）／１００ｕｌ  ｉｎｊ．×１３匹の動物×１５回の注射＝１．９５×１０７単位（９７．５ｕｇ）／１９．５ｍｌ。保存ｍＩＦＮ溶液＝１００μｇ／ｍＬまたは２×１０７単位／ｍＬ。希釈管は１００ｕＬ×１５匹の動物＝１．５ｍＬを含んだ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５、５％プロピレングリコールを含有して合計１５本の希釈管を作製した）。７５ｕＬの保存溶液を各々の管に添加した。最終濃度＝１０６単位／ｍＬ。
【０３２９】
エンドポイント分析（Ｍｘ１  ＲＮＡ分析）：群１−９からの３匹の動物を５日目に屠殺し、Ｍｘ１  ＲＮＡ分析のために（ＥＤＴＡを含有するパープル管を使用することにより）ターミナル採血し、注射した筋をＩＦＡ  ＲＮＡ分析のために採取した。
【０３３０】
Ｆ．製造：ＢＲＥＳ−１  ｈＩＦＮ−β発現カセットを含む本発明の遺伝子療法ベクターの産生のための方法がｃＧＭＰ製造に適切でありうる。本明細書に記載された、または当業界で周知の方法を使用することにより、本発明のＢＲＥＳ−１ベクターは、十分な純度、有効性、および安定性で製造され、前臨床開発試験を実行しうる。本発明の遺伝子療法ベクター、好ましくは、本発明のＢＲＥＳ−１ベクターは、プラスミド骨格、カプシド（ＡＡＶの場合に輸送ベクターとして）、導入遺伝子発現産物（ＩＦＮ−β）、および誘導剤（ＭＦＰ）に関して、本明細書に記載された、または当業界で周知の方法を使用することにより完全に特徴決定されうる。
【０３３１】
Ｇ．薬理学：タンパク質輸送における生物学的等価性は動物モデルにおいて明らかに示されうる。ベクターおよび誘導剤または活性化因子分子（ＡＭ）（例えば、小分子誘導剤ＭＦＰ）の用量／反応は特徴決定され、インビボで最適化されうる。導入遺伝子発現の反復投与および持続性は完全に特徴決定されうる。免疫原性試験が候補ベクターで行われうる。
【０３３２】
Ｈ．薬物動態／安全性／毒性学：発現ＩＦＮ−β導入遺伝子の薬物動態試験は、発現導入遺伝子の直接検出およびＩＦＮ−βバイオマーカーの測定を使用することにより実行されうる。ＡＡＶ−１が選択される候補ベクターである場合は、生体内分布試験を実行し、ベクターＤＮＡのおよびその発現産物運命を検査することができる。
【０３３３】
材料と方法
Ａ．マウス急性ＥＡＥにおけるマウスＩＦＮ−βタンパク質の遺伝子ベースの輸送の有効性：ジャクソン・ラボ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）製の８週齢のメスＳＪＬマウス７０匹を、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７Ｒａ  ２００ｕｇを補充したフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）中プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）１３９−１５１  １５０ｕｇを含有する０．１ｍｌ  ＳＣ（尾の基部と上背部との間で分割）注射で免疫付与した。この乳剤は、３ｍｇ／ｍｌＰＬＰを１：１で含有する生理食塩水を４ｍｇ／ｍｌグラウンド結核筋を含むＩＦＡと混合することによって得られた。免疫付与直後、すべてのマウスに対し、百日咳毒素の０．１ｍｌのＩＰ注射を投与した。免疫付与後の２日目（試験の３日目）、すべてのマウスに対し、百日咳毒素の第２のＩＰ注射を投与した。
【０３３４】
ＩＦＮ−βタンパク質またはそのビヒクル（２０ｎＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ５．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％プロピレングリコール）で処置するマウスに、免疫付与の日から試験の終了まで１日おきに１回ＳＣで０．１ｍｌを投与した。本試験のために使用される陽性対照は、９ｍｇ／ｋｇメゾプラム（ＺＫ−１１７１３７）および２．５ｍｇ／ｋｇプレドニゾロンであった。両方の対照では、０．１ｍｌ／注射の投与量が使用され、免疫付与の朝から試験の終了まで毎日２回ＩＰ投与される。
【０３３５】
実験群（ｎ＝１０）：
１．ビヒクル
２．１０Ｋ単位マウスＩＦＮ−β
３．２０Ｋ単位マウスＩＦＮ−β
４．３０Ｋ単位マウスＩＦＮ−β
５．１００Ｋ単位マウスＩＦＮ−β
６．メゾプラム、９ｍｇ／ｋｇＩＰ
７．プレドニゾロン、２．５ｍｇ／ｋｇＩＰ
【０３３６】
マウス急性ＥＡＥの臨床採点：マウスを毎日次の採点システムで採点した。
０＝正常
１＝だらりとした尾
２＝立直り困難
３＝片方または両方の後肢の不完全麻痺
４＝片方または両方の後肢の完全麻痺、または後肢の可動性だが障害性
５＝両方の後肢の完全麻痺および前肢の虚弱／麻痺、瀕死、または死亡
【０３３７】
瀕死のマウスは安楽死させた。半分のスコアが境界臨床症状を示すマウスに付加される。１００Ｋ単位のＩＦＮ−βで処置したマウスは、ビヒクル処置マウスと比べＥＡＥの臨床スコアの有意な減少を示した（ｐ＝０．００４６）。３０Ｋ単位のＩＦＮ−βで処置したマウスもビヒクル処置マウスと比べ臨床スコアの減少を示したが、この減少は統計的有意性に達することはなかった。本試験における陽性対照、メゾプラムおよびプレドニゾロンも臨床スコアを有意に減少させた。実施例５および図１３を参照。
【０３３８】
Ｂ．マウス急性ＥＡＥにおけるマウスＩＦＮ−βの遺伝子ベースの輸送の有効性：ジャクソン・ラボ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）製の８週齢のメスＳＪＬマウス１３０匹を、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７Ｒａ  ２００ｕｇを補充したフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）中プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）１３９−１５１  １５０ｕｇを含有する０．１ｍｌ  ＳＣ（尾の基部と上背部との間で分割）注射で免疫付与した。この乳剤は、３ｍｇ／ｍｌＰＬＰを１：１で含有する生理食塩水を４ｍｇ／ｍｌグラウンド結核筋を含むＩＦＡと混合することによって得られた。免疫付与直後、すべてのマウスに対し、百日咳毒素の０．１ｍｌのＩＰ注射を投与した。２日目、プラスミド＋エレクトロポレーション群のマウスに対し、適切な筋内注射の直後、エレクトロポレーションを行った。プラスミド＋ＰＩＮＣ群のマウスに対しても適切な筋内注射を投与した。免疫付与の２日後（試験の３日目）、すべてのマウスに対し、百日咳毒素の第２の０．１ｍｌ  ＩＰ注射を投与した。５日目、プラスミド＋ＰＩＮＣ群のマウスは２日目と同じ処置を受けた。
【０３３９】
ＩＦＮ−βタンパク質またはそのビヒクル（２０ｎＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ５．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％プロピレングリコール）で処置するマウスに、免疫付与の日から試験の終了まで１日おきに１回ＳＣで０．１ｍｌを投与した。本試験のために使用される陽性対照は、９ｍｇ／ｋｇメゾプラム（ＺＫ−１１７１３７）および２．５ｍｇ／ｋｇプレドニゾロンであった。両方の対照では、０．１ｍｌ／注射の投与量が使用され、免疫付与の朝から試験の終了まで毎日２回ＩＰ投与される。
【０３４０】
本試験において合計１０群が存在した。各々群が１３匹のマウスを有した。各々の群の最後の３匹のマウスをＭｘ１  ＲＮＡ分析のために試験の６日目に尾に切れ目を入れて採血した。６日目に採血した同じ３匹の動物をＰＢＭＣｓからのＭｘ１  ＲＮＡ分析のために試験の１３日目に心穿刺により採血し、注射した筋を分析のために採取した。
【０３４１】
実験群（ｎ＝１３）：
１．ＰＢＳ対照
２．ｐＮｕｌｌ＋ＥＰ
３．ｐｍＩＦＮ−β＋ＥＰ
４．ｐＮｕｌｌ＋ＰＩＮＣ
５．ｐｍＩＦＮ−β＋ＰＩＮＣ
６．ＩＦＮ−βタンパク質（１００Ｋ単位）ＳＣ
７．ビヒクル、ＳＣ
８．メゾプラム、９ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ
９．プレドニゾロン、２．５ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ
１０．未処置
【０３４２】
ＥＡＥの臨床採点：マウスを毎日次の採点システムで採点した。
０＝正常
１＝だらりとした尾
２＝立直り困難
３＝片方または両方の後肢の不完全麻痺
４＝片方または両方の後肢の完全麻痺、または後肢の可動性だが障害性
５＝両方の後肢の完全麻痺および前肢の虚弱／麻痺、瀕死、または死亡
【０３４３】
瀕死のマウスを安楽死させた。半分のスコアが境界臨床症状を示すマウスに付加される。１００Ｋ単位のＩＦＮ−βタンパク質で処置したマウスは、ビヒクル処置マウスと比べＥＡＥの臨床スコアの有意な減少を示した（ｐ＝０．００４５）。マウスＩＦＮ−β＋ＥＰの遺伝子輸送もｐＮｕｌｌおよびＥＰの遺伝子輸送と比べ臨床スコアを有意に減少させた（ｐ＝０．０１７１）。ＩＦＮ−βのＰＩＮＣ製剤を使用する遺伝子輸送は、ｐＮｕｌｌおよびＰＩＮＣと比べ臨床スコアを統計的に減少させることはなかった。ＥＡＥモデルの陽性対照、メゾプラムおよびプレドニゾロンは、臨床スコアを有意に減少させた。
【０３４４】
Ｃ．インビボでのｍＩＦＮ−βの調節発現
ＩＦＮ１５−ＧＳ５：ＢＲＥＳ−１／ＩＦＮプラスミドのインビボトランスフェクション：マウス筋へエレクトロポレーションしたＢＲＥＳ−１／ｍＩＦＮ−βプラスミドからのミフェプリストン（ＭＦＰ）調節性マウスインターフェロン−ベータ（ｍＩＦＮ−β）発現の証明。
【０３４５】
実験計画：正常Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは、以下の表３４および３５に記載されているように本発明のＢＲＥＳ−１単一ベクターおよび対照プラスミドＤＮＡを注射およびエレクトロポレーションされる。
【表３４】
2008545639.tif 000052
【０３４６】
【表３５】
2008545639.tif 000053
【０３４７】
ｍＩＦＮ−β発現は、３つの時点で筋におけるバイオマーカーおよびＲＮＡレベルによって分析されうる。ＤＮＡ注射後７日目、群１、３、および４はターミナル採取され、群２は尾採血され、非注射マウス（群１）および空のＢＲＥＳ−１ベクターを受けるマウス（群２）と比較してＧＳ／ｍＩＦＮ−ＭＦＰを受けるマウス（群３）における非誘導バックグラウンドｍＩＦＮ−β発現およびバイオマーカー活性が測定されうる。ＣＭＶ／ｍＩＦＮ（群４）は陽性対照となる。群１２は尾採血され、ＳＥＡＰ発現の非誘導バックグラウンドレベルを測定することができる。
【０３４８】
群 ２、６、９、１１、および１２におけるマウスは、ＤＮＡ注射後７−１０日目にＭＦＰで処置されうる。１１日目、群５−７はターミナル採取され、ＣＭＶ／ｍＩＦＮを受けるマウス（群７）と比較してＲＭ／ｍＩＦＮ＋ＭＦＰを受けるマウス（群６）における誘導ｍＩＦＮ発現およびバイオマーカー活性を測定することができる。ＲＭ／ｍＩＦＮ−ＭＦＰを受けるマウス（群５）における非誘導レベルも分析される。群２（空のＢＲＥＳ−１ベクター）はターミナル採血され、ＭＦＰがバイオマーカー反応を刺激するかを判定することができる。郡８−１０は尾採血され、バイオマーカー活性が小容量の血液から検出可能であるかを判定し、１８日目に非誘導レベルを比較する同じマウスにおいて誘導時点を提供することができる。群１１（ＣＭＶ／ｍＩＦＮ＋ＭＦＰ）はターミナル採取され、ＭＦＰがｍＩＦＮ発現に影響をおよぼすか、またはバイオマーカー反応を阻害するかを判定することができる。群１２は尾採血され、ＳＥＡＰ発現の誘導レベルを判定することができる。群１３はＳＥＡＰ発現の陰性対照を提供する。
【０３４９】
１８日目、最後のＭＦＰ処置の８日後、群８−１０をターミナル採取し、ＲＭ／ｍＩＦＮ−／＋／−ＭＦＰ群（群９）におけるｍＩＦＮ−βＲＮＡレベルおよびバイオマーカー活性が、ＭＦＰを投与しなかったＲＭ／ｍＩＦＮマウス（群８）と比較してベースラインに戻ったかどうかを判定できる。ＣＭＶ／ｍＩＦＮ（群１０）はこの場合も陽性対照となる。群１２はターミナル採血され、ＳＥＡＰ発現がベースラインに戻ったかを判定することができる。
【０３５０】
Ｄ．試薬
ＤＮＡ試薬：群２−１１における各々マウスは、１５０ｕｌ  ＰＢＳ中２５０ｕｇのプラスミドＤＮＡを受けることができる。群１２における各々のマウスは、１５０ｕｌ  ＰＢＳ中２５ｕｇのプラスミドＤＮＡを受けることができる（以下の表３６を参照）。
【０３５１】
【表３６】
2008545639.tif 000054
【０３５２】
Ｅ．動物処置
１）ＤＮＡ輸送（群２−１２）：成体オスＣ５７Ｂｌ／６マウス（１群５匹）に対し、０日目に１５０ｕｌ  ＰＢＳ中マウス１匹当たり２５０ｕｇ（群２−１１）または２５ｕｇ（群１２）のプラスミドＤＮＡを両側的に注射することができる。ＤＮＡ溶液を２５ｕｌの脛骨筋へ注射し、各々の後脚の腓腹筋へ５０ｕｌを注射し、キャリパーでエレクトロポレーションを行うことができる（２００Ｖ／ｃｍ、１Ｈｚ、２０ミリ秒／パルスで８パルス）。
【０３５３】
２）ＭＦＰ処置（群２、６、９、１１、および１２）：群２、６、９、１１、および１２のマウスに対し、下表３７に示されているように、注射後７〜１０日目にＭＦＰを強制経口投与によって０．３３ｍｇ／ｋｇ（ゴマ油中０．０８３ｍｇ／ｍｌの１００ｕｌ、新しく調製）で投与することができる。群１２のマウスは７日目のＭＦＰ処置前に採血されうる。
【表３７】
2008545639.tif 000055
【０３５４】
３）血液および筋の採取（群１−１１）：上表６に示されているようにＤＮＡ注射後の適切な日に、マウスを尾採血またはターミナル採血することができる。マウスがターミナル採血される場合、注射した筋が採取されうる。
【０３５５】
血液：血液をＲＴでマイクロテイナー管（ＥＤＴＡを含有）へ収集し、次いでＰＢＭＣｓを分離および収集することができる。残った血漿はサイトカインアッセイのために−２０℃で保存されうる。
【０３５６】
筋：両脚の注射した筋を採取、いっしょにプールし、片側で５ｍｍ以下の部分に切断することができる。刻んだ筋のおよそ４分の１を２ｍｌ管中のＲＮＡ−Ｌａｔｅｒ溶液１．５ｍｌへ配置することができる。残りの筋は−７０℃で保存されうる。ＤＮＡおよびＲＮＡは、ＲＮＡ−Ｌａｔｅｒ溶液中の筋試料から抽出されうる。試料は少なくとも２４時間４℃で保存され、次いで、それらが６日間以上保存されうる場合は、−２０℃にうつされうる。
【０３５７】
血液（群１２および１３）：群１２におけるマウスは７日目および１１日目に尾採血され、１８日目に黄色マイクロテイナー管へターミナル採血されうる（非抗凝固）。マウスは７日目のＭＦＰ処置前に採血されうる。群１３におけるマウスは、１１日目に黄色マイクロテイナー管へターミナル採血されうる（非抗凝固）。
【０３５８】
４）エンドポイント分析／アッセイ手順
バイオマーカーアッセイの結果：Ｍｘ１  ＲＮＡおよび両方のケモカイン（ＩＰ−１０およびＪＥ）は、７日目にＭＦＰの非存在下ではＢＲＥＳ−１−ｍＩＦＮ−β（ｐＧＴ２６）による活性をほとんどまたはまったく示さなかった。すべてのバイオマーカーは、１１日目にＭＦＰの存在下でＣＭＶ−ｍＩＦＮ−βによるよりも高いレベルに強く誘導された。１８日目、ＭＦＰの非存在下で、ケモカインレベルはベースラインに戻っており、Ｍｘ１  ＲＮＡはほぼベースラインに減少していた。図１８および１９を参照。
【０３５９】
ＰＢＭＣからのＭｘ１  ＲＮＡ：ＲＮＡは分離ＰＢＭＣｓから調製され、ＴａｑＭａｎによってＭｘ１  ＲＮＡについて分析されうる。
【０３６０】
血漿からのＪＥおよびＩＰ−１０タンパク質：血漿はＥＬＩＳＡによってＪＥおよびＩＰ−１０サイトカインについて分析されうる。
【０３６１】
筋からのｍＩＦＮ−β  ＲＮＡ：ＲＮＡは注射した筋から調製され、ＴａｑＭａｎによってｍＩＦＮ−β  ＲＮＡについてアッセイされうる。
【０３６２】
筋からのプラスミドＤＮＡ：ＤＮＡは注射した筋から調製され、ＴａｑＭａｎによってプラスミドＤＮＡについてアッセイされうる。ＣＭＶプロモーターに特異的なプライマーおよびプローブが、群４、７、１０、および１１からのＤＮＡのために使用されうる。調節タンパク質のＧＡＬ−４ ＤＮＡ結合ドメインに特異的なプライマーおよびプローブは、群２、３、５、６、８、および９のために使用されうる。
【０３６３】
血清からのＳＥＡＰタンパク質：血清は、希釈剤として群１３のマウスからの血清を用いて、化学発光活性アッセイによってＳＥＡＰ発現についてアッセイされうる。
【０３６４】
Ｆ．プラスミドベクターの構築
ｐＧＥＲ１０１（ｐｇＷｉｚ／ｍＩＦＮ）：マウス  ＩＦＮ−β（ｍＩＦＮ−β）遺伝子を、５’プライマー上に配置されたｍＩＦＮシグナル配列、および５’および３’末端に付加されたＳａｌ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉ制限酵素部位を有するプラスミドベクターｐｂＳＥＲ１８９（図２０Ａ）からＰＣＲによって増幅した。フラグメントをＳａｌ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉで消化し、プラスミドベクターｐｇＷｉｚのＳａｌ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉ部位へ挿入し（図２０Ｂ）、結果として、プラスミドベクターｐＧＥＲ１０１が生じた（図２０Ｃ）。
【０３６５】
ｐＧＥＲ１２５（ｐｇＷｉｚ／ｈＩＦＮ）：ヒトＩＦＮ−β（ｈＩＦＮ−β）遺伝子を、５’プライマー上に置換されたｈＩＦＮシグナル配列および５’および３’末端に付加されたＳａｌ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉ制限酵素部位を有するプラスミドベクターｐｂＳＥＲ１７８からＰＣＲによって増幅した。フラグメントをＳａｌ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉで消化し、およびプラスミドベクターｐｇＷｉｚのＳａｌ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉ部位へ挿入し、結果として、プラスミドベクターｐＧＥＲ１２５が生じた（図２１）。
【０３６６】
ｐＧｅｎｅ／Ｖ５−ＨｉｓＡ：プラスミドベクターをインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から購入したが、これは最小のプロモーター（Ｅ１ｂＴＡＴＡ）の上流に６つのＧＡＬ−４結合部位、ＣＭＶ由来のＵＴ１２である５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、合成イントロン８（ＩＶＳ８）、多重クローニング部位（ＭＣＳ）、およびウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリ（Ａ）部位を含有する。ＭＣＳで挿入される遺伝子は、調節分子（ＲＭ）によって調節されうる。例えば、ＭＣＳで挿入される遺伝子は、活性化ＲＭがＧＡＬ−４部位に結合すると（例えば、配列番号２２のアミノ酸配列を含む、または配列番号２１の核酸配列によってコードされた）修飾プロゲステロン受容体の活性化形態によって誘導されうる（図２２）。
【０３６７】
ｐＧｅｎｅ−ｍＩＦＮ（ｐＧＥＲ１２７）：プラスミドベクターｐＧＥＲ１０１をＳａｌ  Ｉで消化し、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）で充填し、ＨｉｎｄＩＩＩリンカーにライゲートし、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔ  Ｉで消化した。ｍＩＦＮ−β遺伝子フラグメントをプラスミドベクターｐＧｅｎｅ／Ｖ５−ＨｉｓＡのＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔ  Ｉ部位へ挿入し、結果として、プラスミドベクターｐＧｅｎｅ−ｍＩＦＮが生じた（図２３）。
【０３６８】
ｐＧｅｎｅ−ｈＩＦＮ（ｐＧＥＲ１２９）：プラスミドベクターｐＧＥＲ１２５をＳａｌ  Ｉで消化し、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）で充填し、ＨｉｎｄＩＩＩリンカーにライゲートし、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔ  Ｉで消化した。ｍＩＦＮ−β遺伝子フラグメントをプラスミドベクターｐＧｅｎｅ／Ｖ５−ＨｉｓＡのＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔ  Ｉ部位へ挿入し、結果として、プラスミドベクターｐＧｅｎｅ−ｈＩＦＮ（ｐＧＥＲ１２９）が生じた（図２４）。
【０３６９】
ｐＳｗｉｔｃｈ：このプラスミドベクターはインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から購入したが、これは、ＣＭＶおよび合成イントロン８（ＩＶＳ８）由来の５’非翻訳領域１２（ＵＴ１２）の上流の自己誘導的ＲＭ反応性プロモーター（４×ＧＡＬ−４ ＤＮＡ結合部位およびチミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーター）に連結される（例えば、配列番号２２のアミノ酸配列を含み、または配列番号２１の核酸配列によってコードされた）修飾プロゲステロン受容体をコードし、ＲＭタンパク質の遺伝子の発現を推進する（図２５）。
【０３７０】
ｐＧＳ１６９４：プラスミドベクターｐＧＳ１６９４は、バレンティス（Ｖａｌｅｎｔｉｓ）によって提供されたが、これはニワトリ骨格筋アクチンプロモーター（ｓｋアクチンｐｒｏ）、５’非翻訳領域１２（ＵＴ１２）、および（合成イントロン８（ＩＶＳ８））を含有し、（例えば、配列番号２２のアミノ酸配列を含み、配列番号２１の核酸配列によってコードされた）修飾プロゲステロン受容体をコードする遺伝子の発現を推進する（図２６）。
【０３７１】
ｐＬＣ１６７４：プラスミドベクターｐＬＣ１６７４は、バレンティス（Ｖａｌｅｎｔｉｓ）によって提供されたが、これは「ＲＭ−反応性」プロモーター（すなわち（例えば、配列番号２２のアミノ酸配列を含み、または配列番号２１の核酸配列によってコードされた）修飾プロゲステロン受容体の活性化形態に反応性のプロモーター）、５’非翻訳領域１２（ＵＴ１２）、および合成イントロン８（ＩＶＳ８）を含有し、蛍光ルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ）をコードする遺伝子の発現を推進する（図２７）。
【０３７２】
Ｇ．ウイルスを製造するためのベクターの構成
ウイルスを製造するためのベクター（例えば、シャトルプラスミド）およびウイルス（例えば、ＡＡＶ−１ウイルス）を製造するための方法は当業界で周知であり、本発明のウイルスを製造するために使用されうる。一部の実施形態において、本発明のウイルスは、シャトルプラスミド（例えば、表３８を参照）から製造され、疾患の治療のために対象の細胞における本発明の分子（例えば、ベクターに含まれる配列によってコードされたＴＭおよび／またはＲＭ）の輸送および発現のために使用される。
【０３７３】
ｐＧＴ２／ｍＧＭＣＳＦおよびｐＧＴ／ｈＧＭＣＳＦ：シャトルプラスミドｐＧＴ２／ｍＧＭＣＳＦおよびｐＧＴ／ｈＧＭＣＳＦは、次の通り構築された（図２８）。ｐＯＲＦ９−ｍＧＭＣＳＦ（図３０）から、マウスＧＭＣＳＦ（ｍＧＭ−ＣＳＦ）をコードするフラグメントを、ＡｇｅｌおよびＮｈｅｌでベクタープラスミドを消化することによって切除した。次いで、このフラグメントを平滑化した。同様に、ｐＯＲＦ−ｈＧＭＣＳＦ（図３０）から、ヒト（ｈＧＭ−ＣＳＦ）をコードするフラグメントを、ＳｇｒＡＩおよびＮｈｅｌでベクタープラスミドを消化することによって切除した。次いで、このフラグメントを平滑化した。ｍＧＭＣＳＦまたはｈＧＭＣＳＦのいずれかをコードする、切除し、平滑化したフラグメントをｐＧＴ２ベクタープラスミドのＥｃｏＲＶ部位へ挿入した。次いで、挿入の配向を制限消化マッピングによってチェックした。結果として生じるシャトルプラスミドをｐＧＴ２／ｍＧＭＣＳＦ（コードマウスＧＭＣＳＦ）およびｐＧＴ２／ｈＧＭＣＳＦ（コードヒトＧＭＣＳＦ）と命名した（図２８）。
【０３７４】
ｐＺａｃ２．１−ＲＭ−ｈＧＭＣＳＦおよびｐＺａｃ２．１−ＲＭ−ｍＧＭＣＳＦ：シャトルプラスミドｐＺａｃ２．１−ＲＭ−ｈＧＭＣＳＦおよびｐＺａｃ２．１−ＲＭ−ｍＧＭＣＳＦは、次の通り構築された（図２９Ａ）。プラスミドｐＯＲＦ９−ｍＧＭＣＳＦから、マウスＧＭＣＳＦをコードするフラグメントを、ＡｇｅｌおよびＮｈｅｌでプラスミドを消化することによって切除し（図３０）、平滑化し、結果として生じる平滑フラグメントをプラスミドｐＧＴ２のＥｃｏＲＶ部位へ挿入し、結果として、プラスミドｐＧＴ２／ｍＧＭＣＳＦが生じた。同様に、プラスミドｐＯＲＦ−ｈＧＭＣＳＦから、ヒトＧＭＣＳＦをコードするフラグメントを、ＳｇｒＡＩおよびＮｈｅｌでプラスミドを消化することによって切除し（図３０）、平滑化し、結果として生じる平滑フラグメントをプラスミドｐＧＴ２のＥｃｏＲＶ部位へ挿入し、結果として、プラスミドｐＧＴ２／ｈＧＭＣＳＦが生じた。結果として生じるベクタープラスミドにおける挿入を各々チェックし、制限消化マッピングによって検証した。
【０３７５】
次いで、ベクタープラスミドｐＧＴ２／ｈＧＭＣＳＦおよびｐＧＴ２／ｍＧＭＣＳＦを各々、ＦｓｅｌおよびＳｒｆｌで消化した。次いで、これらのＢＲＥＳ−１−ＧＭＣＳＦフラグメントを平滑化した。プラスミドベクターｐＺａｃ２．１をＢｇｌ２およびＣＩａＩで消化し、平滑化した。平滑ＢＲＥＳ−１−ＧＭＣＳＦフラグメントを各々、平滑ｐＺａｃ２．１ベクターにライゲートした。陽性クローンを制限消化によって検証した。結果として生じるシャトルプラスミドをｐＺａｃ２．１−ＲＭ−ｈＧＭＣＳＦ（コードヒトＧＭＣＳＦ）およびｐＺａｃ２．１−ＲＭ−ｍＧＭＣＳＦ（コードマウスＧＭＣＳＦ）と命名した（図２９Ａ）。
【０３７６】
ｐＺａｃ２．１−ＣＭＶ−ｍＧＭＣＳＦおよびｐＺａｃ２．１−ＣＭＶ−ｈＧＭＣＳＦ：シャトルプラスミドｐＺａｃ２．１−ＣＭＶ−ｍＧＭＣＳＦおよびｐＺａｃ２．１−ＣＭＶ−ｈＧＭＣＳＦは、次の通り構築された（図２９Ｂ）。ヒトＧＭＣＳＦをコードするフラグメント、およびマウスＧＭＣＳＦをコードするフラグメントを各々個別にプラスミドベクターｐＧＥＮＥ／Ｖ５ＨｉｓＡ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））へクローン化し、結果として、それぞれ、プラスミドｐＧＴ７２３−ＧＥＮＥ／ｈＧＭＣＳＦ（コードヒトＧＭＣＳＦ）およびｐＧＴ７２４−ＧＥＮＥ／ｍＧＭＣＳＦ（コードマウスＧＭＣＳＦ）が生じた。ｐＧＴ７２４／ｍＧＭＣＳＦから、マウスＧＭＣＳＦをコードするフラグメントを、ＫｐｎｌおよびＸｂａｌでプラスミドを消化することによって切除し、ｐＧＴ７２３／ｈＧＭＣＳＦから、ヒトＧＭＣＳＦをコードするフラグメントを、ＫｐｎｌおよびＸｂａｌでプラスミドを消化することによって切除した。結果として生じるフラグメントを各々個別に、ＫｐｎｌおよびＸｂａｌで消化されていたベクターｐＺａｃ２．１のＫｐｎｌ／Ｘｂａｌ部位へ挿入し、子牛アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理した。結果として生じるシャトルプラスミドを、ヒトＧＭＣＳＦをコードするｐＧＴ７１３（またはｐＺａｃ２．１−ＣＭＶ−ｈＧＭＣＳＦ）と命名し、マウスＧＭＣＳＦをコードするｐＧＴ７１４（またはｐＺａｃ２．１−ＣＭＶ−ｍＧＭＣＳＦ）と命名した（図２９Ｂ）。
【０３７７】
追加のシャトルプラスミドを下表３８に記載されているように構成した。
【０３７８】
【表３８】
2008545639.tif 000056
【表３９】
2008545639.tif 000057
【０３７９】
上表３８において、ＡＡＶ−１−ＢＲＥＳ−１コンストラクトにおいて、ＢＲＥＳ−１配列を含有するフラグメントのベクターへの挿入を可能にするために、ｐＺＡＣ２．１シャトルプラスミドがＭＣＳで修飾され、結果として、シャトルプラスミドｐＧＴ５３が生じた。ＢＲＥＳ−１配列を含有するフラグメントをｐＧＴ５３へ挿入するために、適切なｐＧＴプラスミド（表８において上述されているように）を制限酵素で消化し、結果として、それぞれのＩＦＮをコードする全ＢＲＥＳ−１配列を含有するフラグメントが生じ、このフラグメントがｐＧＴ５３の適合部位へ挿入された。結果として生じるＡＡＶ−１シャトルプラスミドは、ＡＡＶ−１ウイルスを製造するための標準方法を用いて、本明細書に記載されているようにＡＡＶ−１ウイルス製剤を製造するために使用された。
【０３８０】
ＣＭＶ−プロモーターを含有するシャトルプラスミドにおいて、適切なプラスミドベクターからそれぞれのＩＦＮ遺伝子をコードするフラグメントを制限酵素消化によって単離し、上表８に記載されているように（ａ）適合性の制限部位でｐＺＡＣ２．１プラスミドベクターへ挿入した。
【０３８１】
ＢＲＥＳ−１  ｈＧＭＣＳＦシャトルプラスミドにおいて、ｈＧＭＣＳＦをコードするｐＯＲＦ９−ｈＧＭＣＳＦ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））のＳｒｇＡｌ／Ｎｈｅｌフラグメントを平滑末端化し、ｐＧＴ２のＥｃｏＲＶ部位へ挿入し、結果としてｐＧＴ７１１が生じた。全ＢＲＥＳ−１配列を含有するｐＧＴ７１２のＦｓｅｌ／Ｓｒｆｌフラグメントを平滑末端化し、ｐＺＡＣ２．１へ挿入し、結果としてｐＧＴ７１５が生じた（図３１Ａ）。
【０３８２】
ＢＲＥＳ−１  ｍＧＭＣＳＦシャトルプラスミドにおいて、ｍＧＭＣＳＦをコードするｐＯＲＦ９−ｍＧＭＣＳＦ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））のＡｇｅｌ／Ｎｈｅｌフラグメントを平滑末端化し、ｐＧＴ２ベクターのＥｃｏＲＶ部位へ挿入し、結果として、ｐＧＴ７１２が生じた。全ＢＲＥＳ−１配列を含有するｐＧＴ７１２のＦｓｅｌ／Ｓｒｆｌフラグメントを平滑末端化し、ｐＺＡＣ２．１へ挿入し、結果としてｐＧＴ７１６が生じた（図３１Ｂ）。
【０３８３】
それぞれのｐＯＲＦ９プラスミド（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））からのマウスおよびヒトＧＭＣＳＦ遺伝子をプラスミドｐＧＥＮＥ／Ｖ５ＨｉｓＡプラスミド（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））によりクローン化し、それらが各々Ｋｐｎｌ／Ｘｂａｌで切除され、ｐＺＡＣ２．１へクローン化されうるようにした。
【０３８４】
当業者は、本明細書に記載された目的を行い、目標および利点を得るために、ならびに本発明にける固有のもののために、本発明の組成物および方法が十分に適応されていることを容易に理解するであろう。当業者は本発明の組成物および方法への変更、および他の使用を思いつくであろうが、そのような変更は本明細書に記載され、請求されているものと考え、本明細書に包含される。
【図面の簡単な説明】
【０３８５】
本発明の前記および他の目的、そのさまざまな特徴、および発明そのものは、添付の図面とともに読むと、次の説明からより完全に理解されうる。
【０３８６】
【図１Ａ】本発明の調節発現系の非限定的例を示す図である。以下を含む本発明の調節発現系の非限定的例を示す図である。すなわち、１）治療分子（ＴＭ）をコードする第１の核酸配列およびＤＮＡ結合部位（ＤＢＳ）をコードする第１のプロモーター配列、および第１の核酸配列に作動可能に連結されるＴＡＴＡ配列を含む第１の発現カセット、２）調節分子（ＲＭ）をコードする第２の核酸配列および第２の核酸配列に作動可能に連結される第２のプロモーター配列を含む第２の発現カセット、３）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）、および調節ドメイン（ＲＤ）を含む融合またはキメラタンパク質である発現ＲＭ、および４）それぞれ、ＲＭを活性化し、またはＲＭを不活性化する活性化因子または不活性化因子分子（Ａ／ＩＭ）。１つの実施形態において、活性化因子分子（ＡＭ）はＲＭに結合し、ＲＭを活性化し、それによって活性化ＲＭはＴＭ配列に作動可能に連結されるプロモーター配列のＤＢＳに結合し、結果として細胞（例えば、哺乳類細胞）におけるＴＭ発現の誘導をもたらす。別の実施形態において、第１のおよび第２の発現カセットは単一ベクターに存在する。
【図１Ｂ】本発明の調節発現系の非限定的例を示す図である。以下を含む本発明の調節発現系の非限定的例を示す図である。すなわち、１）ＴＭをコードする第１の核酸配列およびＤＢＳをコードする第１のプロモーター配列、および第１の核酸配列に作動可能に連結されるＴＡＴＡ配列を含む第１の発現カセット、２）調節分子（ＲＭ）をコードする第２の核酸配列および第２の核酸配列に作動可能に連結される第２のプロモーター配列を含む第２の発現カセット、３）ＤＢＤ、ＬＢＤ、および活性化ドメイン（ＡＤ）を含む融合またはキメラタンパク質である発現ＲＭ、および４）活性化因子または不活性化因子分子（Ａ／ＩＭ）。１つの実施形態において、活性化因子分子（ＡＭ）はＲＭに結合し、ＲＭを活性化し、それによって活性化ＲＭはＴＭ配列に作動可能に連結されるプロモーターのＤＢＳに結合するホモ二量体を形成し、結果として細胞（例えば、哺乳類細胞）におけるＴＭ発現の誘導をもたらす。別の実施形態において、第１のおよび第２の発現カセットは単一ベクターに存在する。
【図２Ａ】組換えタンパク質の生成のためのマウスＩＦＮ−βプラスミドベクターを示す図である。図２Ａは、組換えタンパク質の生成（Ａ、ｐＧＥＲ９０（ｐＣＥＰ４／ｍＩＦＮ）のためのマウスＩＦＮ−β発現ベクターを示す。ｐＧＥＲ９０に存在するＣＭＶプロモーターおよびエンハンサーは、５’ＵＴＲまたはイントロンを有さない転写開始部位に対して−８３１ｂｐ〜＋１ｂｐから伸びる。
【図２Ｂ】組換えタンパク質の生成のためのマウスＩＦＮ−βプラスミドベクターを示す図である。図２Ｂは、遺伝子ベースの輸送試験（Ｂ、ｐＧＥＲ１０１（ｐｇＷｉｚ／ｍＩＦＮ）のためのマウスＩＦＮ−β発現ベクターを示す。ｐＧＥＲ１０１に存在するＣＭＶ配列としては、−６７４ｂｐ〜＋９４２ｂｐからのプロモーター、エンハンサー、５’ＵＴＲ、および天然イントロンＡが挙げられる。
【図２Ｃ】組換えタンパク質の生成のためのヒトＩＦＮ−βプラスミドベクターを示す図である。図２Ｃは、組換えタンパク質の生成（Ｃ、ｐＧＥＲ１２３（ｐＣＥＰ４／ｈＩＦＮ）のヒトＩＦＮ−β発現ベクターを示す。
【図２Ｄ】組換えタンパク質の生成のためのヒトＩＦＮ−βプラスミドベクターを示す図である。図２Ｄは、遺伝子ベースの輸送試験（Ｄ、ｐＧＥＲ１２５（ｐｇＷｉｚ／ｈＩＦＮ）のヒトＩＦＮ−β発現ベクターを示す。
【図３】マウスにおけるヒトＩＦＮ−β１ａタンパク質の注射後の薬物動態プロフィールを示す図である。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに対し、ｉ．ｖ．またはｉ．ｍ．注射によって、２５ｎｇ（低用量）または２５０ｎｇ（高用量）のいずれかの組換えｈＩＦＮ−β１ａタンパク質を投与した。ヒトＩＦＮ−βレベルを、注射後の示した時点にマウスのターミナル採血から得られた血清試料においてＥＬＩＳＡ（トレイ・フギ  バイオ（Ｔｏｒａｙ−Ｆｕｇｉ  Ｂｉｏ）、バイオソース  インターナショナル（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））によって測定した（時点当りのマウス数ｎ＝４）。各々のデータ点は平均値±標準偏差を表す。
【図４】マウスにおけるＡＡＶ−１−ｈＩＦＮ−βの筋内注射後の薬物動態プロフィールを示す図である。Ｃ５７／Ｂｌ／６  マウス（１群当たりｎ＝６）に対し、ＡＡＶ−１−ｈＩＦＮ−βの０．５×１０１０、１．０×１０１０、または５．０×１０１０ウイルス粒子をｉ．ｍ．注射した。血液試料を注射後の特定時点で採取し、ｈＩＦＮ−β血清レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。各々のデータ点は平均値±標準偏差を表す。
【図５】ｍＩＦＮ−βによる（Ｌ９２９細胞における）インビトロでのＭｘ１ＲＮＡ誘導を示す図である。Ｌ９２９細胞を６ウェルプレート中に５×１０５細胞で播種し、精製組換えｍＩＦＮ−βタンパク質を増量して刺激した。処置の４時間後、細胞を回収し、ＲＮＡを単離し、Ｍｘ１ＲＮＡ定量をＴａｑＭａｎ分析によって定量した。Ｍｘ１ＲＮＡ発現がＧＡＰＤＨ  ＲＮＡに対して倍の増加でプロットされている。
【図６】ｍＩＦＮ−βタンパク質のｉ．ｖ．（Ａ）またはｉ．ｍ．注射（Ｂ）後のＭｘ１ＲＮＡ誘導を示す図である。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに対し、ｉ．ｖ．（尾静脈経由で）またはｉ．ｍ．注射のいずれかによって精製組換えｍＩＦＮ−βタンパク質（比活性度−２．０×１０８単位／ｍｇ）１５、１５０、または５００ｎｇを投与した（１群当たりのマウス数ｎ＝３）。注射後の特定時点でマウスを採血し、ＲＮＡをＰＢＭＣｓから単離した。Ｍｘ１ＲＮＡを定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。Ｍｘ１ＲＮＡにおける倍の増加が同じ試料において測定されたＧＡＰＤＨ値に対して発現される。対照には未処置マウス（Ｎ）、およびビヒクルバッファーのみを注射した後、注射後２時間（Ｖ２ｈ）または４時間（Ｖ４ｈ）の時点でＭｘ１分析したマウスが含まれる。各々の列は平均値±標準偏差を表す。
【図７】マウスＩＦＮ−βタンパク質のｉ．ｖ．またはｉ．ｍ．注射後のＩＰ−１０（Ａ）およびＪＥ（Ｂ）の誘導レベルを示す図である。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに対し、ｉ．ｖ．（尾静脈経由で）またはｉ．ｍ．注射のいずれかによって精製組換えｍＩＦＮ−βタンパク質（比活性度＝２．０×１０８単位／ｍｇ）１５、１５０、または５００ｎｇを投与した（１群当たりのマウス数ｎ＝３）。マウスを注射後２、４、６、１２、２４、および４８時間の時点で採血し、ＩＰ−１０およびＪＥの血漿レベルをＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ系）によって測定した。
【図８】マウスにおけるＡＡＶ−１−ｍＩＦＮ−βＤＮＡまたはｍＩＦＮ−βプラスミドＤＮＡの筋内注射およびエレクトロポレーション（ＥＰ）後のＩＰ−１０の誘導を示す図である。正常マウス（Ｃ５７Ｂｌ／６）に対し、ＡＡＶ−１−ｍＩＦＮ−β（５×１０９ウイルス粒子）、またはｍＩＦＮ−βプラスミドＤＮＡ（１５０ｕｇ）のいずれかをｉ．ｍ．注射しエレクトロポレーションした。マウスを特定時点で採血し、血漿中のＩＰ−１０レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。各々の列は平均値±標準偏差（１群当たりのマウス数ｎ＝５）を表す。
【図９】ｍＩＦＮ−βプラスミドＤＮＡの筋内注射後のＭｘ１ｍＲＮＡの誘導を示す図である。マウスに対し、ｍＩＦＮ−βをコードする異なる量のプラスミドＤＮＡ（６２．５、１２５、２５０、または５００ｕｇ）を後肢腓腹筋および脛骨筋へｉ．ｍ．注射した後、エレクトロポレーションした（１群当たりｎ＝５）。マウスを注射後の特定時点に採血し、ＲＮＡをＰＢＭＣｓから単離し、Ｍｘ１発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。Ｍｘ１  ＲＮＡレベルはＧＡＰＤＨ発現に標準化し、未処置対照（対照、ｎ＝４）と比較した０日目に測定されたバックグラウンドに対する倍の誘導で示されている。各々の列は平均値±標準偏差を表す。
【図１０】マウスにおけるＡＡＶ−１−ｍＩＦＮ−βウイルスまたはｍＩＦＮ−βプラスミドＤＮＡの筋内注射およびエレクトロポレーション（ＥＰ）後のＭｘ１ｍＲＮＡの誘導を示す図である。正常マウス（Ｃ５７Ｂｌ／６）に対し、ＡＡＶ−１−ｍＩＦＮ−β（５×１０１０ウイルス粒子）、またはｍＩＦＮ−βプラスミドＤＮＡ（１５０ｕｇ）のいずれかをｉ．ｍ．注射しエレクトロポレーションした。対照にはＰＢＳ注射マウス（ｉ．ｍ．対照）、およびＳＥＡＰプラスミド（ｐＳＥＡＰ）またはＳＥＡＰを発現するＡＡＶ−１（ＡＡＶ−ＳＥＡＰ）を注射したマウスが含まれた。マウスを特定時点で採血し、Ｍｘ１ＲＮＡレベルをＰＢＭＣｓから単離されたＲＮＡにおける定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。Ｍｘ１ＲＮＡ発現はＧＡＰＤＨ発現に標準化され、ＰＢＳ注射対照マウスにおける０日目に測定されたバックグランドに対して倍の誘導で示されている。各々の列は平均値±標準偏差（１群当たりのマウス数ｎ＝５）を表す。
【図１１】（実施例５および材料と方法サブセクションＡに記載されているように）マウス急性ＥＡＥモデルにおけるＩＦＮ−βタンパク質の有効性を示す図である。１００Ｋ単位のＩＦＮ−βで処置したマウスは、ビヒクル処置マウスと比べＥＡＥの有意に減少した臨床スコアを生じた（ｐ＝０．００４６）。３０Ｋ単位のＩＦＮ−βで処置したマウスもビヒクル処置マウスと比べ減少した臨床スコアを生じたが、この減少は統計的有意性に達することはなかった。本試験における陽性対照、メゾプラムおよびプレドニゾロンも臨床スコアを有意に減少させた。
【図１２】マウス急性ＥＡＥモデルにおけるｍＩＦＮ−βの遺伝子ベースの輸送の有効性を示す図である。メスＳＪＬマウスを材料と方法に完全に記載されているように１日目にＰＬＰ／百日咳毒素で免疫付与した。マウスの群（１群当たりｎ＝１０）に対し、ＰＢＳ、Ｎｕｌｌプラスミド（ｐＮｕｌｌ）とエレクトロポレーション（ＥＰ）（ｐＮｕｌｌ＋ＥＰ、１２０ｕｇ）、またはｍＩＦＮ−β（ｐｍＩＦＮ−β）をコードするプラスミドＤＮＡとＥＰ（ｐｍＩＦＮ−β＋ＥＰ、１２０ｕｇ）のいずれかを試験の２日目に注射した。タンパク質輸送については、組換えｍ−ＩＦＮ−βタンパク質（１００，０００単位）を試験の１日目から１日おきにｓ．ｃ．注射によって別の動物群に投与した。疾患重篤度の有意な減少がｐｍＩＦＮ−β＋ＥＰでｐＮｕｌｌ＋ＥＰ対照群に対して確認された（ｐ＝０．０１７１）。試験の結果は材料と方法に完全に記載されている。
【図１３】実施例５および材料と方法において完全に記載されているようにマウス急性ＥＡＥモデルにおけるＩＦＮ−βタンパク質の有効性を示す図である。
【図１４】本発明の１−プラスミド調節発現ベクターの非限定的例であるプラスミドベクターｐＧＴ１、ｐＧＴ２、ｐＧＴ３、およびｐＧＴ４（それぞれＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）を示す図である。これらの例において、本発明の調節発現ベクターは、単一のプラスミドベクターにおいて以下を含有する。すなわち、１）治療分子（ＴＭ）をコードする核酸の挿入のための多重クローニング部位（ＭＣＳ）を有する第１の発現カセット、および２）調節分子（ＲＭ）をコードする核酸の挿入のためのクローニング部位を有する第２の発現カセット。これら４つのベクターは各々、説明され、例示されているように互いに対して第１および第２の発現カセットの異なる配向を提供する。第１の発現カセットにおいて、プラスミドｐＬＣ１６７４からの骨格筋プロモーター（ｓｋアクチンｐｒｏ）、非翻訳領域１２（ＵＴ１２）、介在配列８（ＩＶ８）がＭＣＳおよびヒト成長ホルモンポリ（Ａ）部位（ｈＧＨポリＡ）の上流に位置している。目的の治療分子（ＴＭ）、例えば、導入遺伝子を含む核酸がＭＣＳで挿入されうる。
【図１５】マウスＩＦＮ−β（ｐＧＴ２３、ｐＧＴ２４、ｐＧＴ２５、およびｐＧＴ２６）（Ａ）、またはヒトＩＦＮ−β（ｐＧＴ２７、ｐＧＴ２８、ｐＧＴ２９、およびｐＧＴ３０）（Ｂ）の遺伝子ベースの輸送のための本発明の調節発現プラスミドベクターの非限定的例を示す図である。これらの例において、本発明の調節発現ベクターは、単一プラスミドベクターにおいて以下を含有する。すなわち、１）多重クローニング部位（ＭＣＳ）およびＭＣＳに挿入されるヒトＩＦＮ−β遺伝子またはマウスＩＦＮ−β遺伝子のいずれかをコードする核酸を有する第１の発現カセット、２）クローニング部位および、クローニング部位に挿入される、プロゲステロン受容体（例えば、配列番号２２のアミノ酸配列を含み、または配列番号２１の核酸配列によってコードされる）の修飾ＬＢＤを含有する調節分子（ＲＭ）をコードする核酸を有する第２の発現カセット。これらのベクターは各々、材料と方法、サブセクションＦにおいて完全に記載されているように、説明され、例示されているように互いに対して第１および第２の発現カセットの異なる配向を提供する。
【図１６】実施例６、サブセクションＣに完全に記載されているように、マウス骨格筋細胞における本発明のｈＩＦＮ−β調節発現プラスミドベクターのインビトロ検証を示す図である。構成的（ｐＧＥＲ１２５）および誘導的（ｐＧＴ２７、ｐＧＴ２８、ｐＧＴ２９、およびｐＧＴ３０）ｈＩＦＮ−βプラスミドベクターをマウス筋Ｃ２Ｃ１２細胞へトランスフェクトし、ＭＦＰ（１０ｎＭ）で処置し、培地を採取した。培地をＥＬＩＳＡによってｈＩＦＮ−βについて分析した。２つの独立したトランスフェクションの平均が示されている。プラスミドベクターｐＧＳ１６９４＋ｐＧＥＲ１２９は、本発明者がｈＩＦＮ−β遺伝子を挿入したバレンティス（Ｖａｌｅｎｔｉｓ）の２プラスミド系である。本発明の調節発現ベクターは、順（ｈＩＦＮ、→）または逆（ｈＩＦＮｒ、←）方向のいずれか、ＲＭカセットの上流または下流のいずれかのｈＩＦＮ−β遺伝子により構成された。
【図１７】実施例６、サブセクションＣに完全に記載されているように、マウス骨格筋細胞における本発明のｍＩＦＮ−β調節発現プラスミドベクターのインビトロ検証を示す図である。構成的（ｐＧＥＲ１０１）および誘導的（ｐＧＴ２３、ｐＧＴ２４、ｐＧＴ２５、およびｐＧＴ２６）ｍＩＦＮ−β発現プラスミドをマウス筋Ｃ２Ｃ１２細胞へトランスフェクトした。トランスフェクション後２４時間（ｈｒ）にＭＦＰ（１０ｎＭ）を含むまたは含まない新鮮培地と交換した。培地を２４時間後に採取し、レポーター遺伝子アッセイによってｍＩＦＮ−βついて分析した。チャートは、３つの独立したトランスフェクションの平均を示す。ｐＧＳ１６９４＋ｐＧＥＲ１２７は本発明者がｍＩＦＮ−β遺伝子を挿入したバレンティス（Ｖａｌｅｎｔｉｓ）の２プラスミド系である。本発明の調節発現ベクターは、順（ｍＩＦＮ、→）または逆（ｍＩＦＮｒ、←）方向のいずれか、ＲＭカセットの上流または下流のいずれかのｍＩＦＮ−β遺伝子により構成された。
【図１８】本発明のｐＢＲＥＳ−１  ｍＩＦＮ−β調節発現系を使用するインビボでのＭｘ１  ＲＮＡ誘導を示す図である。構成的（ｐＧＥＲ１０１）および誘導的調節発現（ｐＧＴ２６）ｍＩＦＮ−βプラスミドベクターを、マウスの脛骨筋および腓腹筋へ注射しエレクトロポレーションした（１動物当たり１５０ｕｇ）。血液を注射後７日目に採取した。マウスを注射後７−１０日に１日１回、強制経口投与によってＭＦＰ（０．３３ｍｇ／ｋｇ）で処置した。血液を注射後１１および１８日目に採取した。ＰＢＭＣｓを血液から単離し、ＲＮＡをＰＢＭＣｓから調製し、ＲＴ−ＰＣＲによって分析してＭｘ１ＲＮＡのレベルを測定した。Ｍｘ１発現レベルをＧＡＰＤＨに標準化した。結果は平均（１群当りの動物数ｎ＝５）±標準偏差で示されており、材料と方法、サブセクションＣに完全に記載されているように、ｐＢＲＥＳ−１−ｍＩＦＮを用いたＭＦＰ非存在下の場合７日目にＭｘ１  ＲＮＡの活性はほとんど、またはまったく示さず、ＭＦＰの存在下の場合１１日目にＣＭＶ−ｍＩＦＮにおけるよりも高いレベルの強い誘導を示す。１８日目には、ＭＦＰ非存在下では、Ｍｘ１  ＲＮＡはほぼベースラインに減少した。
【図１９】本発明のｐＢＲＥＳ−１ｍＩＦＮ−β調節発現系によるＩＰ−１０およびＪＥ誘導を示す図である。構成的（ｐＧＥＲ１０１）および誘導的ｐＢＲＥＳ−１（ｐＧＴ２６）ｍＩＦＮ発現プラスミドをＣ５７Ｂｌ／６マウスの後肢筋へ注射し、エレクトロポレーションした。動物を採血し、７日目（ＭＦＰの非存在）、１１日目（４日連続のＭＦＰの経口投与後）、および１８日目にＥＬＩＳＡによってケモカインＩＰ−１０およびＪＥについて血漿を分析した。結果は平均（１群当りの動物数ｎ＝５）±標準偏差で示されており、材料と方法、サブセクションＣに完全に記載されているように、ｐＢＲＥＳ−１−ｍＩＦＮを用いたＭＦＰ非存在下の場合７日目にケモカイン（ＩＰ−１０およびＪＥ）の活性はほとんど、またはまったく示さず、１１日目にはＭＦＰ存在下でＣＭＶ−ｍＩＦＮにおけるよりも高いレベルの強い誘導を示す。１８日目には、ＭＦＰ非存在下で、ケモカインレベルはベースラインに戻った。
【図２０】材料と方法、サブセクションＦに完全に記載されているように、プラスミドベクターｐＧＥＲ（ｐｇＷｉｚ／ｍＩＦＮ）（Ｃ）の構築において使用されるプラスミドベクターｐｂＳＥＲ１８９（Ａ）およびｐｇＷＩＺ（Ｂ）を示す図である。
【図２１】材料と方法、サブセクションＦに完全に記載されているように、プラスミドベクターｐＧＥＲ１２５（ｐｇＷｉｚ／ｈＩＦＮ）を示す図である。
【図２２】材料と方法、サブセクションＦに完全に記載されているように、プラスミドベクターｐＧｅｎｅ／Ｖ５−ＨｉｓＡを示す図である。
【図２３】材料と方法、サブセクションＦに完全に記載されているように、プラスミドベクターｐＧｅｎｅ−ｍＩＦＮ（ｐＧＥＲ１２７）を示す図である。
【図２４】材料と方法、サブセクションＦに完全に記載されているように、プラスミドベクターｐＧｅｎｅ−ｈＩＦＮ（ｐＧＥＲ１２９）を示す図である。
【図２５】材料と方法、サブセクションＦに完全に記載されているように、プラスミドベクターｐＳｗｉｔｃｈ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を示す図である。
【図２６】材料と方法、サブセクションＦに完全に記載されているように、プラスミドベクターｐＧＳ１６９４を示す図である。
【図２７】材料と方法、サブセクションＦに完全に記載されているように、プラスミドベクターｐＬＣ１６７４を示す図である。
【図２８】材料と方法、サブセクションＦに完全に記載されているように、ｐＧＴ−ｈＧＭＣＳＦおよびｐＧＴ−ｍＧＭＣＳＦシャトルプラスミドおよびその構築を示す図である。
【図２９】材料と方法、サブセクションＦに完全に記載されているように、ｐＺａｃ２．１−ＲＭ−ｈＧＭＣＳＦおよびｐＺａｃ２．１−ＲＭ−ｍＧＭＣＳＦ（Ａ）およびｐＺａｃ２．１−ＣＭＶ−ｈＧＭＣＳＦ（ｐＧＴ７１３）およびｐＺａｃ２．１−ＣＭＶ−ｍＧＭＣＳＦ（ｐＧＴ７１４）（Ｂ）シャトルプラスミドおよびその構築を示す図である。
【図３０】材料と方法、サブセクションＦに完全に記載されているように、それぞれ、ｐＺａｃ２．１−ＲＭ−ｈＧＭＣＳＦおよびｐＺａｃ２．１−ＲＭ−ｍＧＭＣＳＦの構築において使用されるｐＯＲＦ−ｈＧＭＣＳＦおよびｐＯＲＦ９−ｍＧＭＣＳＦを示す図である。
【図３１】材料と方法、サブセクションＦに完全に記載されているように、ｐＧＴ７１５（Ａ）およびｐＧＴ７１６（Ｂ）シャトルプラスミドを示す図である。
【図３２】本発明のｍＩＦＮ−β調節発現プラスミドベクターによるインビボでのＩＰ−１０誘導を示す図である。誘導的（ｐＧＴ２３、ｐＧＴ２４、ｐＧＴ２５、およびｐＧＴ２６）ｍＩＦＮ−β発現プラスミドをＣ５７Ｂｌ／６マウスの後肢筋へ注射し、エレクトロポレーションした。動物を採血し、７日目（ＭＦＰの非存在）、１１日目（４日連続のＭＦＰの経口投与後）、および１８日目にＥＬＩＳＡによってケモカインＩＰ−１０について血清を分析した。結果は平均（１群当りの動物数ｎ＝５）±標準偏差で示されている。
【図３３】本発明のｈＩＦＮ−β調節発現プラスミドベクターによるインビボでのｈＩＦＮ−β誘導を示す図である。構成的（ｐＧＥＲ１２５）および誘導的（ｐＧＴ２７、ｐＧＴ２８、ｐＧＴ２９、およびｐＧＴ３０）ｈＩＦＮ−β発現プラスミドをＣ５７Ｂｌ／６マウスの後肢筋へ注射し、エレクトロポレーションした。動物を採血し、７日目（ＭＦＰの非存在）、１１日目（４日連続のＭＦＰの経口投与後）、および１８日目にＥＬＩＳＡによってｈＩＦＮについて血清を分析した。結果は平均（１群当りの動物数ｎ＝５）±標準偏差で示されている。
【図３４Ａ】本発明のｈＥＰＯ調節発現プラスミドベクターによるインビボでのｈＥＰＯ誘導を示す図である。誘導的２プラスミド（ｐＧＳ１６９４＋ｐＥＰ１６６６）および１プラスミドＢＲＥＳ−１（ｐＧＴ２７、ｐＧＴ２８、ｐＧＴ２９、およびｐＧＴ３０）ｈＥＰＯ発現プラスミドをＣ５７Ｂｌ／６マウスの後肢筋へ注射し、エレクトロポレーションした。各々の群の動物５匹に対し、４日連続（７−１０）腹腔内注射によってＭＦＰを投与し、すべてを最後のＭＦＰ注射６時間後に採血した。各々の群の残りの動物５匹を１０日目にＭＦＰ処置の非存在下で採血した。血清をｈＥＰＯについてＥＬＩＳＡによって分析した。結果は平均（１群当りの動物数ｎ＝５）±標準偏差で示されている。
【図３４Ｂ】本発明のｈＥＰＯ調節発現プラスミドベクターによるインビボでのヘマトクリット数の誘導を示す図である。誘導的２プラスミド（ｐＧＳ１６９４＋ｐＥＰ１６６６）および１プラスミドＢＲＥＳ−１（ｐＧＴ２７、ｐＧＴ２８、ｐＧＴ２９、およびｐＧＴ３０）ｈＥＰＯ発現プラスミドをＣ５７Ｂｌ／６マウスの後肢筋へ注射し、エレクトロポレーションし、動物をＭＦＰで処置し、または未処置のままにし、上記のように採血した。血液を凝固させ、微小毛細管で遠心分離し、赤血球（ＲＢＣ）の割合（％）を測定した。結果は平均（１群当りの動物数ｎ＝５）±標準偏差で示されている。
【図３５】本発明のｈＩＦＮ−β調節発現ＡＡＶベクターによるインビボでの長期、持続的、多重ｈＩＦＮ誘導を示す図である。誘導的ｈＩＦＮ−β発現ＡＡＶベクターＡＡＶ−１−ＧＴ５８をＣ５７Ｂｌ／６マウスの後肢筋へ注射した。動物を採血し、血清をｈＩＦＮについてＭＦＰの非存在または存在下（４日連続の腹腔内注射）に指定されているようにＥＬＩＳＡによって分析した。結果は平均（１群当りの動物数ｎ＝５）±標準偏差で示されている。
【図３６】本発明のｍＩＦＮ−β調節発現プラスミドベクターの反復投与によるインビボでのＭＦＰの用量増加に応じた長期、持続的、多重ＩＰ−１０誘導を示す図である。誘導的ｍＩＦＮ−β発現プラスミドｐＧＴ２６をＣ５７Ｂｌ／６マウスの後肢筋へ０日目に注射し、エレクトロポレーションした。その動物に対し、４日連続（７−１０および６３−６６日）腹腔内注射によってさまざまな濃度でＭＦＰを投与し、次いで翌日（１１および６７日目）に採血し、プラスミドＤＮＡを７７および１８９日目に再注射した。プラスミド再注射後のＭＦＰ処置を８４−８７日目および１９６−１９９日目にそれぞれ行った。それぞれ、８８および２００日目に採血した。血清をケモカインＩＰ−１０についてＥＬＩＳＡによって分析した。結果は平均で示されている（１群当りの動物数ｎ＝５）。
【図３７Ａ】本発明のｈＩＦＮ−β調節発現ＡＡＶベクターによるインビボでのｈＩＦＮ誘導の動態を示す図である。誘導的ｈＩＦＮ−β発現ＡＡＶベクターＡＡＶ−１ＧＴ５８をＣ５７Ｂｌ／６マウスの後肢筋へ注射した。その動物に対し、４日連続の腹腔内注射によってＭＦＰを投与し、次いで、チャートに示されているように最初のＭＦＰ注射後のさまざまな時点で採血した。血清をｈＩＦＮについてＥＬＩＳＡによって分析した。結果は平均（１群当りの動物数ｎ＝５）±標準偏差で示されている。
【図３７Ｂ】本発明のｈＩＦＮ−β調節発現ＡＡＶベクターによるインビボでのｈＩＦＮ脱誘導の動態を示す図である。誘導的ｈＩＦＮ−β発現ＡＡＶベクターＡＡＶ−１ＧＴ５８をＣ５７Ｂｌ／６マウスの後肢筋へ注射した。その動物に対し、４日連続の腹腔内注射によってＭＦＰを投与し、次いで、チャートに示されているように最後のＭＦＰ注射後のさまざまな時点で採血した。血清をｈＩＦＮについてＥＬＩＳＡによって分析した。結果は平均（１群当りの動物数ｎ＝５）±標準偏差で示されている。
【図３７Ｃ】本発明のｍＩＦＮ−β調節発現プラスミドベクターによる数ヵ月にわたるｍＩＦＮ誘導および脱誘導、脈動性または長期ＭＦＰ処置に対する反応、および遺伝子発現の持続性の動態を示す図である。構成的（ｐＧＥＲ１０１、ＣＭＶ）および誘導的（ＢＲＥＳ−１、ｐＧＴ２６）ｍＩＦＮ発現プラスミドをマウスの後肢筋へ注射しエレクトロポレーションし、チャートに示されているようにＭＦＰ処置前、処置中、または処置後のさまざまな時点で動物を採血した。血清をケモカインＩＰ−１０についてＥＬＩＳＡによって分析した。結果は平均（１群当りの動物数ｎ＝５）で示されている。
【図３８】本発明のｍＩＦＮ−β調節発現プラスミドベクターによるインビボでのＭｘ−１誘導を示す図である。誘導的ｍＩＦＮ−β発現プラスミドｐＢＲＥＳ−１ｍＩＦＮ（ｐＧＴ２６）またはｐＢＲＥＳ−１Ｎｕｌｌ−ＭＦＰ（対照）プラスミドを、急性ＥＡＥを有するＳＪＬマウスの後肢筋へ注射してエレクトロポレーションした。マウスをプラスミド注射後１日１回（ｄ）または３日に１回（ｅｔｄ）の腹腔内注射によってＭＦＰ（０．３３ｍｇ／ｋｇ）で処置した。血液を注射後５日目に採取した。ＰＢＭＣｓを血液から単離し、ＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲによって分析し、Ｍｘ１  ＲＮＡのレベルを測定した。Ｍｘ１発現レベルをＧＡＰＤＨに標準化した。結果は平均±標準偏差で示されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年1月29日(2008.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2008545639.tif 000185
2008545639.tif 000186
2008545639.tif 000187
2008545639.tif 000188