(57)【要約】  本発明の実施形態は、成長促進および脂肪分解などのhGHの有益な効果が保持され、インスリン抵抗性などの望ましくない性質が減少または排除される、ヒト成長ホルモン（hGH）療法を必要とする健康状態の改良された処置方法を提供する。詳細には、本発明の実施形態は、従来のhGH治療の糖尿病誘発性副作用を軽減させる処置方法に関する。本方法は、現在hGHを用いて治療されているかまたはhGHを用いて治療される可能性のある健康状態の治療における成長ホルモン変種（20kDa hGH-V）の使用を含む。
2008507559.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
予防または治療のために、成長ホルモン治療と関連した有害な代謝的健康状態にあるまたはその発症の危険性のある哺乳動物において成長ホルモンのレベルを増大させる方法であって、薬学的有効量の20kDa hGH-Vまたは20kDa hGH-Vと実質的に同一のポリペプチドを前記哺乳動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
動物が成人発症型成長ホルモン欠損症に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳動物が小児期発症型成長ホルモン欠損症に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
哺乳動物が嚢胞性線維症に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物が骨粗鬆症に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
哺乳動物が骨格異形成に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
哺乳動物が慢性腎不全に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物が鬱病に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物が記憶喪失に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物が異化促進状態に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物がターナー症候群に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
代謝的健康状態が、真性糖尿病、肥満、プラダー・ウィリ症候群、代謝症候群、インスリン抵抗性、多嚢胞性卵巣症候群、リポジストロフィー、または異脂肪血症から選択される、請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
予防または処置のために有害な代謝的健康状態にある哺乳動物中の成長ホルモンレベルを増加させる方法であって、哺乳動物に薬学的有効量の20kDa hGH-Vまたは20kDa hGH-Vと実質的に同一のポリペプチドを投与する工程を含む、前記方法。
【請求項１４】
哺乳動物が、高血圧症、心筋不全、心筋梗塞、または心不全に罹患している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
哺乳動物が、真性糖尿病、肥満、代謝症候群、インスリン抵抗性、多嚢胞性卵巣症候群、リポジストロフィー、および異脂肪血症のうちの１つまたは複数に罹患している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
投与する工程が、20kDa hGH-Vを産生することができる発現ベクターを投与する工程を含む、請求項１から請求項１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
発現ベクターが宿主細胞中に存在する、請求項１から請求項１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
発現ベクターが患者の細胞中に存在する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
成長ホルモン療法に関連する糖尿病誘発性作用を減少させる方法であって、成長ホルモン療法を必要とし、糖尿病誘発性作用を有するか糖尿病誘発性作用が現れる危険性のある哺乳動物に20kDa hGH-Vを含む組成物を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２０】
投与する工程が、哺乳動物に20kDa hGH-Vを産生することができる複製可能なベクターを有する細胞を投与する工程を含む、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本出願は、2004年7月23日に出願され、発明者がPeter GluckmanおよびStewart Gilmourであり、発明の名称が「成長ホルモンの20kDa胎盤変種を使用した増強された成長ホルモン療法」である米国特許仮出願番号60/590,794号（代理人整理番号ERNZ-01016US1）および2005年2月2日に出願され、発明者がPeter Gluckman、Stewart GilmourおよびMark Vickersであり、発明の名称が「抗糖尿病誘発性20kDa胎盤変種を使用した成長ホルモン療法」である、米国特許仮出願番号60/649,469号（代理人整理番号ERNZ-01016US2）の優先権を主張する。これらの両出願は、その全体が引用により本明細書中に取りこまれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、本発明は成長ホルモンが望ましい治療方法である健康状態および疾患に関する。詳細には、本発明は、成長ホルモンの変種を使用したこのような健康状態および疾患の処置に関する。より詳細には、本発明は、従来の成長ホルモン療法の糖尿病誘発性作用を示さない20キロダルトンの胎盤成長ホルモン変種（「20kDa hGH-V」）を使用したこのような健康状態および疾患の処置に関する。
【背景技術】
【０００３】
２つの遺伝子（下垂体で発現される遺伝子（ヒト成長ホルモン−Ｎ（「hGH-1」としても公知の「hGH-N」））および胎盤で発現される遺伝子（「hGH-2」としても公知の「hGH-V」））によって産生されるいくつかの成長ホルモンの天然に存在するイソ型が存在する。hGH-Nの主な形態は、１９１個のアミノ酸からなる22kDaのタンパク質である。hGH-Nの第２の形態は、同一遺伝子の選択的スプライシングによって産生され、これにより、22kDa hGHのアミノ酸３２〜４６に対応する領域が欠失して20-kDaのタンパク質が産生される（20kDa hGH-N）（米国特許第6,399,565号および米国特許第6,436,674号）。hGH-Nの種々の他の変種が記載されている（米国特許第4,670,393号および米国特許第5,962,411号）。
hGH-V遺伝子は、22kDa hGH-Vイソ型をコードし、このイソ型はホルモン配列にわたる種々の位置において１３個のアミノ酸が22kDa hGH-Nと異なる（米国特許第4,670,393号）。22kDa hGH-Vは、胎盤によって分泌され、妊娠中期の母体血清中に認められる。この変種の正確な機能は、なお解明されなければならないが、胎児成長の調節および発達に役割を果たすと考えられている。
【０００４】
GH療法は、種々の健康状態の治療で使用されている。しかし、従来のGH療法は、有害な副作用の存在に曝される。従来の成長ホルモンで治療された個体は治療による望ましくない副作用（糖尿病誘発性作用が含まれる）を示し得ることが公知である。これらの副作用を排除するか少なくとも緩和する方法を確立することが有利であることは明確である。この望ましくない副作用により、成長ホルモンで治療した被験体の罹患率が高くなり得る。したがって、副作用（糖尿病誘発性作用が含まれる）が軽減された成長ホルモン療法が当該分野で急務である。
【発明の開示】
【０００５】
GH療法は、種々の健康状態で使用される。しかし、従来の成長ホルモンで治療された個体は治療による望ましくない副作用（インスリン抵抗性が含まれる）（GH療法の「糖尿病誘発性作用」と呼ばれる）を示し得ることが公知である。これらの患者でGH療法の所望の体形成性効果または代謝的効果を保持しながらこれらの副作用を排除するか少なくとも緩和する方法を確立することが有利であることは明確である。
【０００６】
本発明の実施形態は、GH療法で現在使用されている22kDa hGH-Nと異なる活性範囲を有するGH変種の使用による、従来のGH治療の副作用を軽減しながら成長ホルモン療法の利益を得る方法を含む。この変種により、成長促進、IGF-1の刺激、および脂肪分解などの従来の療法の有益な効果が得られるが、糖尿病誘発性作用を含む望ましくない性質が軽減される。したがって、本発明は、現在hGHで治療されているかhGHで治療される可能性がある健康状態の治療における20kDa hGH-Vの使用に関する。詳細には、本発明は、hGH治療の糖尿病誘発性副作用が軽減される治療方法に関する。
本発明の実施形態は、哺乳動物に薬学的有効量のGH変種である20kDa hGH-V、または20kDa hGH-Vと実質的に同一のポリペプチドを投与する工程を含む、予防または治療のために哺乳動物中の成長ホルモンレベルを増加させる方法も含む。
【０００７】
１つの実施形態では、この変種は、GHの成長促進能力および脂肪分解能力を示すが、GH療法におけるGHの望ましくない糖尿病誘発性作用を誘発する能力が軽減されている。
別の実施形態では、20kDa hGH-Vを外因的に産生し、被験体に投与する。変種のサイズを考慮すると、適切な宿主細胞中で変種をコードする遺伝子の発現によってこれを産生することが好ましい。このような変種遺伝子を、GHの部位特異的変異導入によって調製することができる。このような変種遺伝子を含む発現ベクターを含む適切な宿主細胞を治療すべき動物に移植することができ、変種遺伝子発現の誘導によって20kDa hGH-V産物レベルを増加させ、それにより、治療効果を発揮することができる。
本発明の態様を、特定の実施形態を参照して記載する。本発明の他の特徴を、添付の図面を参照して認識することができる。
【０００８】
発明の詳細な記載
定義
「形質転換」は、染色体外因子としてか染色体組み込みによってDNAが複製可能なように生物にDNAを導入することを意味する。形質転換法は、例えば、Graham and van der Eb，Virology 52：456-457(1973)の方法または核注入もしくはプロトプラスト融合などによる細胞へのDNAの適切な導入方法であり得る。原核細胞などの実質的な細胞壁構築物を含む細胞については、Cohen et al,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，69：2110(1972)に記載のカルシウム処理によってトランスフェクションすることができる。さらなる方法は当該分野で周知であり、Sambrook and Russell，Molecular Cloning Third Edition，Cold Springs Harbor Laboratory Press，New York(2001)に見出すことができる。
「トランスフェクション」は、任意のコード配列が最終的に発現されるかどうかとは関係なく、宿主細胞へのDNAの導入を意味する。細胞は天然にはDNAを取り込まないので、種々の技術的方法を使用して遺伝子導入を用意にする。トランスフェクション法は当業者に知られており、例えば、CaPO4およびエレクトロポレーションが含まれる。さらなる方法が当該分野で周知であり、Sambrook and Russell（既出）、に見出すことができる。
【０００９】
「保存的アミノ酸置換」は、出発ペプチドと比較して変種ペプチドの特徴に実質的に影響を与えないアミノ酸の置換または欠失を意味する。例えば、以下の４つの群の範囲内で置換することができる：１）正電荷の残基（例えば、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ）、２）負電荷の残基（例えば、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ）、３）嵩高い脂肪族残基（例えば、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ）、および４）嵩高い芳香族残基（例えば、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）。保存的置換のさらなる同定については、例えば、Livingstone and Barton、Comput.App.Biosci.9(6)745-756、1993を参照のこと。
【００１０】
「実質的に同一」とは、１つまたは２つのアミノ酸が挿入、置換、または欠失しているか保存的アミノ酸置換が行われており、形成されたポリペプチドが実質的に20kDa hGH-Vの特徴および活性と異ならず、配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同である配列を有するポリペプチドをいう。「実質的に同一」とはまた、遺伝コードの重複性に基づく「サイレント」な相違（例えば、相違によっていかなるアミノ酸の変化もない）によって第１のオリゴヌクレオチド配列と異なるオリゴヌクレオチド配列をいう。あるいは、「実質的に同一」の配列は、ストリンジェントな条件下（例えば、０．１ＳＳＣ、６０℃、１時間）で第１のオリゴヌクレオチド配列の相補物とハイブリッド形成することができるオリゴヌクレオチド配列である。他のストリンジェンシー条件を選択することができ、依然として信頼性の高いハイブリッド形成が保持されると認識することができる。
【００１１】
「hGH−Ｎ」は、下垂体ヒト成長ホルモンを意味する。
「hGH−Ｖ」は、胎盤ヒト成長ホルモンを意味する。
「20kDa hGH-V」は、配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または、配列番号３のヌクレオチド配列、または配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同一のポリペプチド、または配列番号３のヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチドを意味する。
「20kDa hGH-N」は、配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号４のヌクレオチド配列、または配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同一のポリペプチド、または配列番号４のヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチドを意味する。
「22kDa hGH-V」は、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号１のヌクレオチド配列、または配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同一のポリペプチド、または配列番号１のヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチドを意味する。
「22kDa hGH-N」は、配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号２のヌクレオチド配列、または配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同一のポリペプチド、または配列番号２のヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチドを意味する。
【００１２】
「体形成性」には、成長促進、体重増加、および骨同化作用が含まれる。
「乳腺刺激効果」には、ＰＲＬＲシグナル伝達に関連する外因性成長ホルモンの効果が含まれる。これらの効果には、乳腺発達、浸透バランスの変化、および細胞増殖が含まれるが、これらに限定されない。
「代謝効果」には、脂肪分解、ＩＧＦ−１分泌の刺激、および糖尿病誘発性作用が含まれるが、これらに限定されない。
【００１３】
成長ホルモン療法
GHの有益な成長促進効果を有するが、副作用が軽減された方法および薬物は依然として必要とされている。
したがって、ある特徴において、本発明は、哺乳動物に薬学的有効量の20kDa hGH-Vまたは20kDa hGH-Vと実質的に同一のポリペプチドを投与する工程を含む、哺乳動物の健康状態を治療する方法を提供する。
【００１４】
20kDa hGH-V変種の投与により、22kDa hGH-Nの体形成性が保持されるが、糖尿病誘発特性を示さない。したがって、20kDa hGH-Vの使用は、従来のGH療法の望ましくない副作用によって有害になる状況で非常に望ましい。20kDa hGH-Vの使用は、特に、以下において望ましい。
・小児または成人GH欠損症または他のGH処置健康状態にある患者であって真性糖尿病、肥満症、代謝症候群、他のインスリン抵抗性関連状態（例えば、多嚢胞性卵巣症候群）、または高血圧に罹患している、またはその危険性のある患者。
・糖尿病、肥満（病的肥満が含まれる）、プラダー・ウィリ症候群、代謝症候群、他のインスリン抵抗性関連状態（例えば、多嚢胞性卵巣症候群）、高血圧症、リポジストロフィー、異脂肪血症、ターナー症候群に罹患した患者、および
・心筋不全、心筋梗塞、および心不全に罹患した患者。
【００１５】
他の態様では、本発明は、20kDa hGH-Vおよび薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物を含む。
なおさらなる態様では、本発明は、20kDa hGH-V、薬学的に許容可能な賦形剤およびバインダーを含む医薬組成物を含む。
さらなる態様では、本発明は、20kDa hGH-V、薬学的に許容可能な賦形剤およびカプセルを含む医薬組成物を含む。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、患者に20kDa hGH-Vを投与する工程を含む、成長ホルモン療法を必要とする患者を治療する方法を含む。
ある種のこれらの態様では、本方法は、20kDa hGH-Vを産生することができる発現ベクターを投与する工程を含む。
さらなる態様では、発現ベクターは宿主細胞中に存在する。
さらに他の態様では、発現ベクターは患者の細胞中に存在する。
他の態様では、本発明は、成長ホルモン療法を必要とする哺乳動物に20kDa hGH-Vを含む組成物を投与する工程を含む。
さらに他の態様では、本発明は、哺乳動物に20kDa hGH-Vを産生することができる複製可能なベクターを有する細胞を投与する工程を含む。
【００１７】
GHの副作用
22kDa hGH-Nを使用した従来のGH療法の望ましくない副作用には、以下の１以上が含まれる：浮腫、体液貯留、高血圧症、良性頭蓋内圧亢進症；耐糖能障害および／または糖尿病、女性化乳房；浮腫、良性頭蓋内圧亢進症、関節痛などの筋骨格への影響、知覚異常、および手根管症候群、または筋肉痛、知覚異常、および手根管症候群。
浮腫は、細胞中、組織中、または漿膜腔中（腹部など）の過剰量の水様体液の蓄積と定義される。症状は、眼の周囲、足、足関節、および脚の腫脹を含む。GH誘導性の塩類貯留および水分貯留により、良性頭蓋内圧亢進症を引き起こし得る。良性頭蓋内圧亢進症は、病変が占める空間の非存在下での髄液圧の増加によって特徴づけられる。これは、頭痛、視力喪失、悪心、嘔吐、およびうっ血乳頭を示し得る。
GH療法の糖尿病誘発性作用に関する懸念、特に小児期におけるその懸念が高まりつつある。GH療法は、耐糖能障害を引き起こし、インスリン感受性を減少させることが示されている。いくつかの小児群および青年群においてGH療法と２型真性糖尿病との間に罹患率の増加が立証されている（Cutfield 2000）。GH治療を受けた成人において高血糖も認められる。
【００１８】
関節痛は、１つまたは複数の関節の痛みである。
筋肉痛は、任意の筋肉を動かした時の痛みまたは不快症状である。
知覚異常は、一般に手、腕、脚、または足で感じられるが、身体の任意の部分で起こり得る異常な灼熱感または穿痛感をいう用語である。手根管症候群は、しばしば炎症によって手首の腱または靭帯が肥大した場合に発症する。手首に骨および靭帯の通路の狭窄により、指および親指の付け根の筋肉に到達する神経が締め付けられる。症状は、指、特に親指、人指し指、および中指の灼熱感、痺れてチクチクする痛みから拳を握ること拳を作ることが困難になり、物を落とすことまでの範囲である。
成長ホルモン療法を使用して治療を受けた小児で報告されているいくつかの白血病の症例に基づいて、成長ホルモン療法における「癌増殖の促進」の可能性が懸念されている。
【００１９】
GHを使用して治療される健康状態
GH療法を使用して、種々の範囲の健康状態を治療する。現在、疾病状態（成人発症型成長ホルモン欠損症（主に下垂体、腺腫、手術、または放射線治療に起因する）；小児期発症型成長ホルモン欠損症（（ａ）先天性健康状態（解剖学的異常または遺伝要因）、（ｂ）後天性健康状態（ＣＮＳ腫瘍、頭蓋照射、浸潤性疾患、外傷、低酸素発作）、または（ｃ）特発性の原因；嚢胞性線維症、骨粗鬆症、慢性腎不全、鬱病、記憶喪失、異化促進状態、摂食障害、高血圧症に起因する）が含まれるが、これらに限定されない）に対するGHの予防効力または治療効力が確立されているか示されている。
【００２０】
GH療法は、小児における成長ホルモン欠乏症、プラダー・ウィリ症候群、成人における成長ホルモン欠乏症、ターナー症候群、慢性腎不全、およびエイズ関連消耗症での使用が承認されている。成長ホルモンはまた、いくつかの他の健康状態の治療で有用である。これらの健康状態には、体質性成長遅延、嚢胞性線維症、骨粗鬆症、鬱病、記憶喪失、異化促進状態、および高血圧症が含まれる。
【００２１】
GH欠損症
成長ホルモン欠損症の診断には、成長ホルモン刺激試験が必要である。使用される試験には、高血糖試験またはインスリン抵抗性試験（ＩＴＴ）、Ｌ−ドーパ刺激試験、アルギニン負荷試験、およびアルギニン／GHRH試験が含まれる。成人におけるピーク成長ホルモン分泌レベルが３〜５ng/mL未満であることがGHDの指標である。小児期では10ng/ml未満の値では不十分であると考えられている。通常、毎日の皮下注射によって投与する組換えヒト成長ホルモンを使用して成長ホルモン欠損症を治療する。
【００２２】
小児におけるGHDの原因はいくつか存在し、大部分は視床下部または下垂体の問題に関連し得る。ある稀な症例では、身体の成長ホルモンの利用不足が生じる。成長ホルモン欠損症のほとんどの小児では、欠陥は視床下部にある。他の下垂体ホルモンも正常に分泌されない場合、その子は下垂体機能不全と呼ばれる。先天性下垂体機能不全では、胎児の発育中に下垂体または視床下部の異常形成が起こる。後天性下垂体機能不全は、出生中または出生後に起こる下垂体または視床下部の損傷に起因する。これは、重症頭部外傷、疾患に起因する脳損傷、放射線療法、または腫瘍に起因し得る。
小児のGHDの世界的発生率は、１０，０００人の生児あたり少なくとも１人と推定され、４，０００人の生児あたり１人の発生率と報告されている国もある。成長ホルモン欠損症の小児は、通常、１年間に２インチ未満の成長パターンを示す。多くの場合、小児は、２歳または３歳まで正常に成長し、その後に成長遅延の徴候が示され始める。低身長の他の可能性が除外された場合に、成長ホルモン欠損症試験を行う。GHD小児において、１週間に体重１ｋｇあたり０．３０ｍｇまでの用量を分割した１日量の皮下注射が推奨される。
【００２３】
成人では、成長ホルモン欠損症は、以下の状況で発症し得る：大きな下垂体腫瘍、下垂体腫瘍または他の脳腫瘍の手術または放射線療法後、続発性視床下部障害、および小児期成長ホルモン欠損症の成人期への継続。成人GHDの臨床的特徴には、疲労、筋力低下、運動能力の低下、重量増加、体脂肪の増加および筋肉量の減少、低密度リポ蛋白コレステロールおよびトリグリセリドの増加ならびにＨＤＬコレステロールの減少、心発作、心不全、および卒中リスクの増加、骨量の減少、不安症および鬱病、特に、幸福感の欠如、社会的隔離、およびエネルギーの減少が含まれる。米国では、成人の総GHDは35,000人であり、毎年約6,000人がGHDを新たに罹患すると予想される。平均体重が70kgの男性のための治療開始時の推奨投薬量は、毎日の皮下注射において約0.3mgである。各要件に基づいて、用量を、３５歳未満の患者では１日あたり最大1.75mgまで、３５歳を超える患者では１日あたり最大0.875mgまで増加させることができる。有害事象の発生を最小にするために用量をより低くすること、特に高齢者または過体重患者では用量をより低くすることが必要であろう。
【００２４】
プラダー・ウィリ症候群
プラダー・ウィリ症候群は、低血圧症、性腺機能低下症、過食症、認知障害、および問題行動によって特徴づけられる第１５染色体の異常である。典型的には成長ホルモンが欠損し、体重が正常な患者の場合でさえも、低身長、思春期に伴う急成長の欠如、および高い体脂肪率を引き起こす。小児および成人のいずれにおいてもGH療法の必要性を評価すべきである。小児では、成長率が減少するか身長が第３百分順位未満である場合、GH治療を考慮すべきである。成長ホルモン補充により身長の正常化が補助され、痩身体重が増加するが、これらは共に体重管理に役立つ。通常の１週間あたりの用量は、体重１ｋｇあたり0.24mgであり、これを、６回または７回分に分割して１週間投与する。
【００２５】
ターナー症候群
ターナー症候群は、２，５００人の生産女児あたり約１人発症する。これは、Ｘ染色体の異常または非存在に起因し、低身長と関連することが多く、GH治療によって改善することができる。ターナー症候群の他の特徴には、首の短縮、時折、翼状頸、外反肘、第４中手骨および第５中手骨の短縮、盾状胸、および原発性性腺機能低下症が含まれ得る。身長の伸びは、ターナー症候群患者で様々であるので、GHでの治療およびこのような治療のタイミングの決定は個体による。しばしば、患者の身長が第５百分順位未満に低下した場合または標準偏差スコアが平均より２標準偏差未満に減少した場合に治療を開始する。しばしば、GHD治療で使用したGH用量よりもわずかに高いGH用量を使用して治療を開始し、一般的な開始投薬量は、１週間あたり0.375mg/kgであり、これを１日量に分割する。
【００２６】
慢性腎不全
慢性腎不全（ＣＲＩ）は、米国で約３，０００人の小児が罹患している。腎臓が排泄物を排泄し、尿を濃縮し、電解質を貯蔵する能力の段階的および進行性の喪失によって発症する。腎疾患は成長ホルモンの代謝を妨げるので、慢性腎疾患の小児の約１／３が部分的に異常に成長する。しばしば腎疾患の治療に使用される副腎皮質ステロイドホルモンは、成長を遅延させ得る。腎移植は小児の成長を再度正常に開始させるのに役立ち得るが、ほとんどの小児は移植前に失った成長を取り戻せない。腎疾患の発症年齢が、腎機能の減少よりも成長遅延に影響を与える（すなわち、小児の発症年齢が早いほど成長が遅延する）。GH治療は、0.35mg/kg/週の投薬量でこれを１週間に６回または７回分に分割して投与することができる。
【００２７】
ＨＩＶ消耗症
ＨＩＶ感染患者の一般的な問題は、しばしば衰弱、発熱、栄養失調、および下痢を伴う意図しない進行性の体重減少と定義されるＨＩＶ消耗症候群である。悪液質としても知られるこの症候群は、生活の質を低下させ、疾患を悪化させ、ＨＩＶ患者の死の危険性を増加させ得る。身体は、主に身体に貯蔵された脂肪に頼る代わりにエネルギー源として筋肉および臓器を消費する。
消耗症は、ＨＩＶ感染自体の結果として起こり得るが、一般に、ＨＩＶ関連日和見感染症および癌に関連する。ＨＩＶ消耗症候群は、患者の体重が１０％を超えて意図せず減少したＨＩＶ感染患者で診断される。ほとんどの進行性ＨＩＶ疾患およびＡＩＤＳ患者は、最終的に、ある程度の消耗症を経験する。ＡＩＤＳ消耗症の有病率は、ＨＩＶ感染個体の４〜３０％の範囲と推定される。GH治療は、ほぼ0.1mg/kg/日の程度である。
【００２８】
体質性成長遅延
体質性成長遅延は、正常な出生前成長およびその後の乳児期および小児期の成長減速によって特徴づけられ、この時点での身長の百分順位の減少に反映される。３歳から小児期後期までの間では、正常な速度で成長が進む。思春期の開始直前に顕著な成長の減速期間が認められる。体質性成長遅延の小児は、思春期のタイミングがより遅い。時折、青年期の成長および発達の体質性遅延に伴って悪化する低身長の組み合わせは、GHD治療と同一の様式および投薬量で投与するGHでの治療が正当である十分な心理社会的な思春期のストレスを引き起こし得る。
【００２９】
嚢胞性線維症
嚢胞性線維症（ＣＦ）は、米国における最も一般的な死に至る遺伝障害である。米国で毎年１０００人の個体が嚢胞性線維症を患って誕生すると推定される。嚢胞性線維症は外分泌腺の機能障害を引き起こし、これにより、肺疾患、膵外分泌機能障害、および腸閉塞を引き起こす。早期診断および早期治療により、ＣＦに罹患した小児の死亡率が顕著に減少してきた。しかし、栄養失調症および成長が不十分であることが引き続き深刻な問題である。不十分な体重増加、体重減少、および栄養不良は、エネルギー摂取量の減少、エネルギー損失の増大、およびエネルギー消費の増加に起因する。２８％のＣＦ患者が身長について第１０百分順位未満であり、３４％が体重について第１０百分順位未満であると報告されている。研究により、GH療法により、ＣＦ患者の身長速度、体重増加速度、除脂肪体重（ＬＢＭ）、および肺機能が改善されることが示されている。
【００３０】
骨粗鬆症
骨粗鬆症は、低骨量および骨組織構造の破壊によって特徴づけられる疾患であり、特に、臀部、脊椎、および手首の骨が脆弱になり、骨折に対する感受性が増加する疾患である。骨粗鬆症は、全世界で年間１５０万を超える臀部骨折の原因である。骨折のほとんどは閉経後の女性で起こるが、全骨折の約１／３は男性で起こる。GHでの骨粗鬆症の治療は、GHが骨代謝を増加させ、骨の幾何学的配置を改善することから有利であり得る。GH/IGF-1系は、閉経後骨粗鬆症患者で異常に調節される。これは、骨粗鬆症における全身のIGFおよびIGFBP-3レベルの減少によって示され、GH/IGF系の正常な加齢過程を超える（「成長ホルモン分泌停止」）内因性GH分泌の減少またはGH受容体系の異常調節が示唆される。いくつもの研究により、GH治療によって特発性骨粗鬆症の男性で骨ミネラル濃度を改善することができることが示されている。
【００３１】
骨格異形成症
軟骨形成不全などの低身長に関連する骨格異形成症をGHで治療することができる。軟骨形成不全症は、線維芽細胞成長因子受容体III型遺伝子に影響を及ぼす遺伝障害であり、出生時に顕著である。これは、20,000人の出生児あたり約１人が罹患し、全民族および男女で発症する。胎児の成長中および小児期に、鼻および耳などのいくつかの部分を除いて軟骨は正常に骨に発達する。軟骨形成不全個体では、長骨の成長板中の軟骨細胞が骨になる速度が遅く、骨が短縮し、身長が低くなる。
軟骨形成不全症は、低身長、四肢短縮、近位端（上腕および大腿部）、身体に対して頭部が不釣り合いに大きいこと、骨格（四肢）の異常、中指と薬指との間に持続的な空間を有する手の外観の異常（三叉手）、顕著な脊柱後弯症および脊柱前弯症（脊椎湾曲）、アヒル歩行、脚部の湾曲、隆起（目立つ）前頭（前面隆起）、低血圧症、および羊水過多症（罹患乳児の出生児に示される）によって特徴づけられる。日本および南アフリカなどのいくつかの国で軟骨形成不全症の治療におけるGHの使用が承認されているが、依然としてＦＤＡは承認していない。
【００３２】
異化促進状態（Catabolic State）
異化促進状態は、タンパク質の消耗によって特徴づけられる。成長ホルモン治療を使用して、過剰なタンパク質の喪失を防止することができる。このような状態は、長期絶食、食欲不振、長期運動抑止、外傷、熱傷、および広範囲の手術後の患者で認められる。GHおよびインスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）は、異化促進状態におけるタンパク質代謝の調節で生理学的役割を果たす。このような健康状態の間、GH軸はしばしば撹乱される。
【００３３】
リポジストロフィー
GHは、リポジストロフィー、特にＡＩＤＳ関連リポジストロフィーの治療でも有利であり得る。リポジストロフィーは、単純に脂肪代謝の障害を意味する一般名である。ＨＩＶ関連リポジストロフィーは、一般に、以下の領域中の脂肪の蓄積からなる：体幹下部（腹部）の皮下組織、腹部臓器（内蔵肥満）、腋窩パッド（両側対称性脂肪腫症）、および頸部背側領域（いわゆる野牛肩）、ならびに以下の領域の皮下組織由来の脂肪の喪失：下肢、上肢、臀部、および顔（上顎骨、鼻唇、および側頭部）。このＨＩＶ関連リポジストロフィー症候群は、タンパク質エネルギー栄養失調症の消耗症候群と顕著に区別されるようである。ＨＩＶ感染患者におけるリポジストロフィーの症例の普遍的な定義はないので、診断は、一定の範囲に関して、医師の臨床上の判断に依存する。皮膚のひだの測定または臀部／腰比は、あまり正確でなく、再現性もない。第４腰椎レベルでのシングルスライスＣＴスキャンは、最も再現性のある試験であるが、高価でもある。
【００３４】
胎内発育遅延（ＩＵＧＲ）および妊娠期間の短い小児（ＳＧＡ小児）
GH治療は、胎内成長遅延の小児または妊娠期間の短い乳児（ラッセル／シルバー症候群とも呼ばれる健康状態）で有利であり得る。胎内成長遅延の１つの定義は、妊娠期間について第１０百分順位未満の体重または妊娠期間についての平均よりも２標準偏差未満の出生児体重である。複数の研究により、追い付き成長を示さない児童がGH治療の恩恵を受けることができることが示されている。
【００３５】
骨形成不全症
骨形成不全症（ＯＩ）は、Ｉ型コラーゲン遺伝子の変異に起因する。これは骨の脱灰に関連し、多くの場合、骨成長遅延に関連する。ＯＩは、明らかな原因がほとんどないか全く無くしばしば容易に骨が破壊されることによって特徴づけられる。米国におけるＯＩの患者数は知られていないが、最良推定量により、最少で２０，０００人であることが示唆されており、５０，０００人の可能性もある。しばしば、常にではないが、臨床徴候のみに基づいてＯＩを診断することが可能である。臨床遺伝学では、生化学的（コラーゲン）試験または分子（DNA）試験を行うこともでき、これらはいくつかの状況におけるＯＩの診断を確認するのに役立ち得る。いくつかの場合、骨形成不全症を、GHで有効に治療することができる。特に、患者の骨ミネラル化および成長を改善することができる。
【００３６】
炎症性腸疾患
GHを、炎症性腸疾患、クローン病、および短腸症候群の治療に使用することができる。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、消化管の炎症または潰瘍形成を引き起こす障害群である。ＩＢＤ型に依存して、口から肛門までの任意の消化管部分が罹患し得る。小腸、大腸、直腸、および肛門が最も頻繁に罹患する。潰瘍性大腸炎およびクローン病は、炎症性腸疾患の最も一般的な型である。ＩＢＤの原因は不明であるが、遺伝的傾向のある者が発症すると考えられている。これらの個体では、免疫系は、正常な腸内細菌と過剰反応して炎症を引き起こし得る。主な症状は、腹痛、直腸出血、および下痢または便秘である。熱および食欲不振も起こり得る。短腸症候群は、残存する腸の正味の吸収能力が損なわれる腸の大きな喪失によって特徴づけられる。結腸を持たない患者は、しばしば、ナトリウム／体液バランスの問題に直面し、しばしば、いくつかの栄養素の栄養失調に起因する栄養補給が必要である。
【００３７】
グルココルチコイド誘導性成長遅延
グルココルチコイド治療によって成長が遅延した非常に低身長の患者でGH治療を考慮することができる。グルココルチコイドの投薬計画を、このような患者におけるGH治療の開始前に満足な臨床効果を得るための必要最小限の用量に減少させるべきである。
【００３８】
代謝的健康状態
真性糖尿病、インスリン抵抗性、およびインスリン抵抗性関連状態、異脂肪血症、肥満、または代謝症候群などの代謝的健康状態にある患者における糖尿病非誘発性の20kDa hGH-Vの使用により、それらの患者は標準的なGH療法の糖尿病誘発性副作用を受けること無くGHの強い脂肪分解作用の恩恵を受ける。
【００３９】
真性糖尿病
II型糖尿病は、空腹時血糖試験またはグルコース負荷試験と組み合わせた身体検査によって診断される。２歳を超える小児および成人の正常な空腹時血糖値は、70mg/100ml〜105mg/100mlの範囲である。105mg/100mlから126mg/100mlのレベルは、空腹時血糖値の異常と見なされ、その後に糖尿病を発症する危険性がある。異なる２日間の126mg/100mlを超える空腹時血糖値は糖尿病発症の指標である。
グルコース負荷試験は、グルコース投与前およびその後の５つの時間間隔における血糖値の決定のために血清検体および尿検体を得ることによって患者の標準的な経口グルコース負荷に耐える能力を測定する。ピークおよび２時間の値が２回以上200mg/100mlを超える場合、真性糖尿病の指標となる。
II型糖尿病の主な危険因子は、過剰な肥満、糖尿病の家族歴、一定の民族（例えば、ラテンアメリカ系、ポリネシア人）、高齢、高血圧またはコレステロールレベルの高い人、4,000グラムを超える子供を身籠っている女性である。
【００４０】
肥満
最も一般的な肥満の統計的評価は、体重を身長の二乗で割ることによって計算される体型指数（BMI）であり、したがって、その単位はkg/m2である。25.0kg/m2を超えるBMI値が過体重と認められ、30.0kg/m2を超えるBMI値は肥満を示す。40.0kg/m2のBMI値は、罹患危険率が差し迫っていると（「病的肥満」）と同定される。
甲状腺機能低下症、クッシング症候群、プラダー・ウィリ症候群などの疾病状態、および一定の投薬によって体重が増加し、肥満を誘導し得ることが公知である。遺伝的因子、心理学的因子、および環境因子はまた、個体の肥満素因で重要な役割を果たす。
【００４１】
異脂肪血症
異脂肪血症は、HDLの増加に伴うLDL濃度およびトリグリセリド濃度の増加によって特徴づけられる。血中のトリグリセリド濃度およびコレステロール濃度を測定するために標準的な試験を行うことができる。男性患者における通常の所見は以下である：45mg/100mlより高いHDL、LDL 60〜180mg/100ml、VLDL 25％〜50％、トリグリセリド−40〜160mg/100ml。
【００４２】
代謝症候群
糖尿病、高血圧症、異脂肪血症、および中心性肥満の組合わせである代謝症候群を、同時に存在する各症状に特異的な診断方法によって診断することができる。
【００４３】
インスリン抵抗性およびインスリン抵抗性関連状態（例えば、多嚢性卵巣症候群）
標準的なグルコース負荷試験および空腹時インスリン試験を使用してインスリン抵抗性を試験することができる。インスリン抵抗性発症の危険因子には、以下が含まれる：肥満（30kg/m2を超える肥満度指数）、糖尿病の強い家族歴、妊婦の妊娠糖尿病の病歴、高血圧症、異脂肪血症、多嚢胞性卵巣症候群、糖代謝障害：110mg/100mlから125mg/100mlの間の空腹時血糖値、または２時間後の７５ｇグルコース負荷レベルにおける140mg/100mlから199mg/100mlの間の耐糖能障害。
【００４４】
高血圧症
高血圧症は、通常、数週間にわたる３つの状況における両腕で測定した140/90mmHgを超える血圧によって診断される。約140〜150/90〜100mmHgの血圧は、軽度高血圧症と呼ばれる。約150〜170/100〜110mmHgの血圧を中等度高血圧症と呼び、200/120mmHgを超える血圧を重症高血圧と見なす。
高血圧症の発症に寄与する危険因子には、以下が含まれる：家族歴、環境条件（食事、肥満、生活様式）、既存の条件（続発性高血圧症（多発性嚢胞腎、腎動脈狭窄症（腎動脈の狭小化）、甲状腺機能亢進症、高アルドステロン症、クッシング症候群、睡眠時無呼吸）。収縮期血圧を減少させるための22kDa hGH-Nの使用は、Vickers et alの先行技術（WO00/030588号）に開示されている。
【００４５】
他の健康状態
GH治療から恩恵を受け得る他の健康状態には、鬱病、記憶喪失、および不妊症が含まれる。しかし、GH療法による恩恵を受け得る任意の健康状態を、本発明の方法および薬物を使用して有利に治療することができる。
【００４６】
下垂体GHを使用した治療
現在の通常のGH治療は、22kDa下垂体GHを使用する。22kDaおよび20kDaの下垂体GHバージョンは、等価な体形成活性を有すると考えられる。20kDa hGH-Nは、自発性ドワーフ・ラットにおける成長促進アッセイにおいて22kDa hGH-Nと等価であり（Ishikawa 2000,Ishikawa 2001）、20kDaの骨タンパク同化作用は22 kDaと等価であり（Wang 1999）、全長ｈGH−Ｒ−発現細胞の細胞増殖が等価に刺激され（Wada 1998）、20kDa hGH-Nは下垂体切除するラットにおける完全なアゴニストであることが示された（Uchida 1997）。20kDa hGH-Nは、22kDa hGH-Nに類似の様式で、脂肪組織中でＬＰＬ活性を阻害し、脂肪細胞中での脂肪細胞の脂肪分解を刺激することも示されている（Takahashi 2002）。ＧＨＢＰの存在下での20kDa hGH-Nの脂肪分解活性は、22kDa hGH-Nよりも高い可能性がある（Asada 2000）。
しかし、22kDa hGH-Nは、インスリン抵抗性を誘発することが知られている。複数の研究により、20kDa hGH-Nの糖尿病誘発性は、22kDa hGH-Nよりも遥かに弱いことが示されている。オイグリセミッククランプ研究（Takahashi 2001）およびGH欠乏性ドワーフ・ラットを使用した研究（Ishikawa 2001）におけるインスリン抵抗性の誘発において、20kDa hGH-Nは22kDa hGH-Nよりも遥かに低いことが示されている。
【００４７】
20kDa hGH-Nは、22kDa hGH-Nよりも遥かに弱いプロラクチン受容体のアゴニストであり、GHの乳腺刺激効果はプロラクチン受容体によって媒介されると考えられているので、20kDa hGH-Nは22kDa hGH-Nの乳腺刺激性のいくらかを欠いている（Tsunekawa 1999）。20kDa hGH-Nの投与によって乳癌などのｈＰＲＬＲ媒介性副作用を緩和することができることが示唆されている（Tsunekawa 1999）。20kDa hGH-Nはまた、22kDa hGH-Nと異なる抗利尿作用を有する。22kDa hGH-Nの投与によって、損傷のないラットにおける尿排泄が抑制されるのに対して、20kDa hGH-Nは有意な効果を示さず（Satozawa 2000）、体液貯留によって浮腫を発症し得るのでこのことは重要である。20kDa hGH-Nは、22kDa hGH-NのＰＲＬＲ結合領域の一部を欠損していると考えられる。20kDa hGH-Nは、22kDa hGH-NのＰＲＬＲ結合領域の一部を欠していると考えられる。以下の図１および２は、本発明の方法で有用な成長ホルモン変種のオリゴヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。図１では、以下の配列番号は、以下のオリゴヌクレオチドに対するものである：22kDa hGH-V（配列番号１）、22kDa hGH-N（配列番号２）、20kDa hGH-V（配列番号３）、および20kDa hGH-N（配列番号４）。図２は、22kDa hGH-V（配列番号５）、22kDa hGH-N（配列番号６）、20kDa hGH-V（配列番号７）、および20kDa hGH-N（配列番号８）のアミノ酸配列を示す。
【００４８】
20kDa胎盤成長ホルモン変異体を使用した療法
22kDa hGH-Vは、hGH-Nイソ型と比較して、類似の体形成活性を有するが乳腺刺激活性が低いことが示されている（Igout 1995）。22kDa hGH-Vは、ソマトゲン受容体に結合し（Ray 1990）、下垂体切除ラットにおいて成長を刺激する（MacLeod 1991）。22kDa hGH-Vは、ソマトゲン受容体およびラクトゲン受容体の両方に結合するが、ソマトゲン受容体結合親和性／ラクトゲン受容体結合親和性比は22kDa hGH-Nの方が高い。この比は、ラット肝臓ラクトゲン受容体を使用した実験では７〜８倍異なり（Ray1990）、Ｎｂ２細胞ラクトゲン受容体を使用した実験では３０倍異なった（MacLeod 1991）。22kDa hGH-Nおよび22kDa hGH-Vの脂肪分解活性およびインスリン様活性は、ラット  脂肪組織で同様であることが示されている（Goodman 1991）。
GH-V遺伝子の第２のスプライシング変種は、mRNA中にイントロンＤを保持し、これにより、26kDa hGH-Vイソ型が生じる（Cooke 1988）。最近、hGH-V遺伝子の２つの新規の転写物が記載されている（Boguszewski 1998）。hGH-V3は第４のエクソンの末端付近の選択的スプライシングによって生成され、カルボキシ末端残基の配列がhGH-Vと完全に異なる24kDaタンパク質（２１９アミノ酸）と予想される。説明されるべき第２の転写物は、エクソン３以内でhGH-Nと類似の選択的スプライシングを使用し、hGH-Vの20kDaイソ型と予想される（GenBankアクセッション番号：AF006060）。
20kDa hGH-Vの転写物は以前に検出されておらず、hGH-V遺伝子がこのスプライス部位を使用しないと考えられていたが（Cooke 1998,Estes 1992）、Boguszewski et alは、４つの満期胎盤のうちの２つおよび１つの異常な胎盤中でこのイソ型の転写物を検出した（Boguszewski 1998）。この転写物の発現の相違は、転写物が全胎盤で見出されていなかったので、以前に検出できなかったことを部分的に説明することができるかもしれない。転写物は検出されているが、コードされたタンパク質は単離されておらず、従って、その生物活性は未知である。
【００４９】
上記転写物の存在に関する知識は、転写物を合成することができる、あるいは、生物活性を予想することができることを意味する、ということにはならない。例えば、20kDa hGH-Nは得ることが困難であることが証明された。20kDa hGH-Nを下垂体から少量精製することができるが、２つのホルモンの生理学的性質の類似性によって、22kDa hGH-Nから完全に分離することができない。メチオニル20kDa hGH-Nは大腸菌中で発現されているが、Ｎ末端へのメチオニン残基の付加は生物活性に影響を与える可能性があり、メチオニル22kDa hGH-Nの場合のように、タンパク質が誤ってフォールディングされ得ると考えられる（Hsiung 1988）。メチオニル20kDa hGH-Nは22kDa hGH-Nの1/20しか発現せず、COS-7細胞中で産生された20kDa hGH-Nは、22kDa hGH-Nと比較して1/30分泌されることが報告されている（Rincon-Limas 1993）。したがって、Uchida et alによる効率的な合成の開発は容易ではなかった（Uchida 1997）。
【００５０】
下垂体から単離した20kDa hGH-Nおよび真性でない組換え産物を使用した初期の研究は、「真性」バージョンの種々の研究に極めて異なった結果を生じさせた（Uchida 1997）。下垂体から精製した20kDa hGH-Nに関する初期の研究により、20kDa hGH-Nの脂肪分解活性は、22kDa hGH-Nよりも遥かに低かったことが示された（Frigeri 1979,Juarez-Aguilar 1995）。これは、真性の配列を有する組換え20kDa hGH-Nを使用して得られた結果と一致しなかった（Asada 2000,Takahashi 2002）。メチオニル20kDa hGH-Nは、耐糖能障害を誘導し（Kostyo 1985）、グルコース感受性を悪化させることが示されたが（Ader 1987）、20kDa hGH-Nに関するより最近の研究では、20kDa hGH-Nの糖尿病誘発性が22kDa hGH-Nよりも遥かに弱いことが示されている（Takahashi 2001，Ishikawa 2001）。異なる方法によって産生された20kDa hGH-Nの生物学的性質を記載した論文のこのような矛盾は、20kDa hGH-Nの生物学的性質を予想し、かつ証明することが明らかに簡単ではないことを示す。
【００５１】
本発明の新規の特徴には、20kDa hGH-VがGH-N療法に関連する糖尿病誘発性作用を示さないという驚くべき所見が含まれる。
20kDa hGH-Vの使用は、以下において望ましい。
・小児または成人のGH欠損症または他のGH治療健康状態にある患者であって真性糖尿病、肥満、代謝症候群、または他のインスリン抵抗性関連状態（例えば、多嚢胞性卵巣症候群）または高血圧の危険性があるかこれらに罹患している患者。
・糖尿病、肥満（病的肥満が含まれる）、プラダー・ウィリ症候群、代謝症候群、他のインスリン抵抗性関連状態 (例えば、多嚢胞性卵巣症候群)、高血圧症、リポジストロフィー、異脂肪血症、ターナー症候群に罹患した患者、および
・心筋不全、心筋梗塞、および心不全に罹患した患者。
【００５２】
糖尿病に罹患した患者、糖尿病を発症する危険性のある患者、または糖尿病関連状態に罹患した患者における上記で同定された障害を有効に治療することができる。従来のGH療法は、糖尿病に罹患した患者には禁忌であり得るか、本明細書中に記載の糖尿病関連健康状態にある患者には禁忌であり得る。いくつかの実施形態では、図２に記載の20kDa hGH-V（配列番号７）を使用して治療し、これは、22 kDa hGH-V、22kDa hHG-N、20kDa hGH-V、および20kDa hGH-Nの推定アミノ酸配列を示す。破線は、欠失したアミノ酸を示す。他の実施形態では、図１から選択されたオリゴヌクレオチドを使用して治療するが、図１はhGH変種のオリゴヌクレオチド配列を示す。破線は、20kDa hGH-V（配列番号３）および20kDa hGH-N（配列番号４）で欠失された区分を示す。
本発明者らは、20kDa hGH-VがGH代償療法として従来の22kDa hGH-Nよりも有利であることを発見した。20kDa hGH-Vが望ましい体形成性を示し、糖尿病誘発性作用が低いという本発明者らの発見は、この変種が実施者に従来の治療法に対する望ましい代替法を提供することを示す。
【００５３】
20kDa hGH-Vの合成および調製
本発明のポリペプチドを単離形態で提供することができ、いくつかの実施形態では、精製することができる。用語「単離された」は、その材料がその元の環境から取り出されていることを意味する。
本発明のポリペプチドは、天然に精製されたタンパク質に由来しても、化学合成産物であってもよく、組換え技術によって産生することもできる。
一連の実施形態では、組換え技術によってポリペプチドを産生することができる。宿主細胞を、発現ベクターを使用して形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、および／または20kDa hGH-Vを産生する遺伝子の増幅に適切なように改変された通常の栄養培地中で培養する。温度およびｐＨなどの培養条件は、発現のために選択する宿主について使用される培養条件であり、当業者に明らかである。この考察において、用語「DNA」、「遺伝子」、および「cDNA」は、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド配列がポリペプチドの産生に必要な情報を伝達する程度まで、用語「RNA」または「mRNA」と等価であり得ることを認識することができる。したがって、RNAをいう場合には塩基ウラシル（Ｕ）を使用し、DNAをいう場合には塩基チミン（Ｔ）を使用する。オリゴヌクレオチドがRNAまたはDNAのいずれであるかとは無関係に、いずれかの種類のオリゴヌクレオチドを使用して、得られるポリペプチドを作製することができることを認識することができるであろう。
【００５４】
原核生物宿主および真核生物宿主と共に使用されるクローニングベクターおよび発現ベクターの例は、例えば、Sambrook et al,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Third Edition,Cold Springs Harbor,N.Y.(2001)に見出すことができる。
ポリヌクレオチド（配列番号３または実質的に同一のポリヌクレオチド）を、組換え技術によるポリペプチドの産生のために使用することができる。ポリヌクレオチドは、ポリペプチド発現に適切な種々のベクターまたはプラスミドのいずれか１つに含まれ得る。このようなベクターには、染色体、非染色体、および合成のDNA配列（例えば、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージDNA、酵母プラスミド、ウイルスDNA（ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルスなど））が含まれるが、これらに限定されない。
一定の実施形態では、20kD hGH-Vをコードするオリゴヌクレオチドを発現させてmRNAを産生し、これを20kDa hGH-Vのシグナル配列の２６アミノ酸を含むポリペプチド（例えば、Met-26〜Ala-1）に翻訳することができる。次いで、内部のAla1-Phe結合に選択性を示すエンドペプチターゼによるその後の切断を使用して、治療用の「成熟」ポリペプチドを遊離することができる。このようなエンドペプチターゼの１つの例は、天然のエンドペプチダーゼ（E.C.3.4.24.11）（小さな脂肪族アミノ酸（例えば、Gly、Ala）と芳香族アミノ酸（Phe）または疎水性アミノ酸（例えば、Leu、Ile）との間のペプチドを優先的に切断する酵素）である。他のエンドペプチダーゼが当該分野で公知であり、本明細書中のこれ以降に記載する必要はない。
【００５５】
他の実施形態では、成熟20kDa hGH-Vを、開始コドン（ATG）およびその後にPheのコドン（例えば、TTTまたはTTC）を含む発現カセットを使用して産生することができる。読み取り枠の残りは、これ以外は図１に示したものと同一である。翻訳されたなら、アミノペプチダーゼを使用してペプチドを切断して、N末端Met残基を除去し、それにより、「成熟」20kDa hGH-Vを産生することができる。
なおさらなる実施形態では、Phe1のTTTまたはTTCコドンの前に3'セグメントが付加された（このセグメントはポリペプチドを発現する細胞によって通常は切断されるリーダー配列をコードする）発現カセットを構築することができる。このようにして、リーダー配列が切断され、その後に使用するための「成熟」ポリペプチドである20kDa hGH-Vが産生される。
【００５６】
細菌での使用に有用な発現ベクターを、機能プロモーターに作動可能に連結された適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナル（例えば、開始コドン（ATG）および終始コドン）と共に所望のタンパク質をコードする構造的にインフレームのDNA配列の挿入によって構築することができる。所望ならば、オリゴヌクレオチドの発現を増加させるかさもなければ調節するためにエンハンサーエレメントも含めることができる。ベクターは、ベクターの維持を確実にし、所望ならば、宿主内で複製するための１つまたは複数の表現型選択マーカーおよび複製起点を含み得る。
適切なベクターは当業者に公知であり、多数が市販されている。適切なベクターには、細菌ベクター：pBs、pQE-9(Qiagen)、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、PNH18a、pNH46a(Stratagene)、pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；真核生物ベクター：pWLneo、pSV2cat、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)、およびpET20b(+)などが含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】
適切なDNA配列を、種々の手順によってベクターに挿入することができる。一般に、当業者に公知の手順によって、DNA配列を、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入することができる。一連の実施形態では、制限酵素NcoIおよびHindIIIを使用することができる。
発現ベクター中のDNA配列を、mRNA合成を指示するための適切な発現調節配列（プロモーター）に作動可能に連結させることができる。このようなプロモーターの例には、LTRまたはSV40プロモーター、E.coli lac、trp、またはRecA、λファージＰLプロモーター、および原核細胞もしくは真核細胞またはそのウイルス中での発現を調節することが知られている他のプロモーターが含まれる。
適切なプロモーターの選択は、当業者の範囲内である。プロモーターの例には、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、trcなどの細菌プロモーター、ならびにCMV前初期、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオネイン−Ｉなどの真核生物プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
しかし、上記は例示のために引用したまでであり、他のプロモーターを使用することができる。遺伝子発現のモニタリング方法および定量方法は当該分野で公知であり、これらを使用して、20kDa hGH-Vの産生について発現レベルを検証することができる。
発現ベクターはまた、翻訳開始および転写ターミネーターのためのリボゾーム結合部位を含み得る。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列（エンハンサー）を含み得る。
哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーター、エンハンサー、任意の必要なリボゾーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー、ならびに／またはアクセプター部位、転写終結配列、および５’隣接非転写配列を含み得る。
さらに、発現ベクターは、形質転換宿主細胞の選択のための表現型形質を得るための遺伝子（選択マーカー）を含み得る。適切な選択マーカーには、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼ（dfr）もしくはネオマイシン耐性（neo）または大腸菌中でのテトラシクリン耐性もしくはアンピシリン耐性などが含まれる。
ベクターはまた、細胞膜周辺腔、細胞膜、または細胞外基質への翻訳タンパク質の分泌を指示することができるリーダー配列を含み得る。
【００５９】
適切なDNA配列および適切なプロモーター配列または調節配列を含むベクターを使用して、適切な宿主を形質転換し、宿主細胞がタンパク質を発現することができるようにすることができる。適切な宿主には、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、シュードモナス属内の種々の種、放線菌類、ブドウ球菌（Staphlococcus）、ネズミチフス菌などの細菌細胞；酵母などの真菌細胞；サル腎臓線維芽細胞のCOS-7株ならびにC127、3T3、CHO、HeLa、BHK、BL21(DE3)pLysSコンピテント細胞株などの共存可能ベクターを発現することができる他の細胞株、ならびに植物細胞などが含まれるが、これらに限定されない。適切な宿主の選択は、当業者の範囲内である。１つの実施形態では、宿主細胞は大腸菌である。
リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE、デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーションによって宿主細胞に構築物を導入することができる（Davis et al, basic methods in Molecular Biology,1986）。１つの実施形態では、カルシウムを使用して構築物を導入する。
種々の方法（トリプトファン枯渇、イソプロピルガラクトシド（IPTG）、およびナリジクス酸などが含まれるが、これらに限定されない）によって所望のタンパク質を発現するように宿主細胞を誘導することができる。一連の実施形態では、ナリジクス酸によって発現を誘導することができる。
真核細胞による本発明のポリペプチドをコードするDNAの転写を、ベクターへのエンハンサー配列の挿入によって増加させることができる。適切なエンハンサーが当該分野で公知であり、複製起点の後期におけるSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれるが、これらに限定されない。
当業者が当該分野で公知のさらなる方法を使用して発現系を産生することができ、これらの系を使用して治療目的のための組換え20kDa hGH-Vを産生することができることを認識することができる。
【００６０】
ある種の宿主細胞を治療すべき被験体に直接移植することができることも認識することができる。例えば、自家細胞を患者から採取することができ、異種細胞を本発明の発現ベクターを使用してトランスフェクトすることができる。次いで、このような細胞を患者に移植し、20kDa hGH-Vの産生を誘導して、治療量の20kDa hGH-Vをin vivoで産生することができる。
さらに、例えば、アデノウイルスなどのウイルスを使用した遺伝子療法は、治療すべき動物の宿主細胞にin vivoで導入することができる20kDa hGH-Vの発現のための発現カセットを含み得ることが認識される。
【００６１】
20kDa hGH-Vの単離
遠心分離によって細胞を採取し、物理的または化学的手段によって破壊し、得られた粗抽出物を精製することができる。タンパク質発現で使用した細菌細胞を、任意の通常の方法（凍結融解サイクリング、超音波処理、機械的破壊、細胞溶解剤（クロラムフェニコール下でBL21(DE3)pLysSによって発現されるT7リゾチームが含まれる）および界面活性剤の使用が含まれる）によって破壊することができる。
20kDa hGH-V変種を、種々の方法（硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティークロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、レクチンクロマトグラフィ、およびゲル濾過が含まれるが、これらに限定されない）を使用して、組換え細胞培養物から精製することができる。
細菌培養物中の組換えタンパク質は、まず細胞ペレットから抽出し、その後の１つまたは複数の脱塩工程、水性イオン交換工程、またはサイズ排除クロマトグラフィ工程によって単離することができる。必要に応じて、タンパク質リフォールディング工程を利用して、成熟タンパク質の立体配置を完成させることができる。最終精製のために、SDS-PAGE、イオン交換クロマトグラフィ、またはHPLCを使用することができる。
【００６２】
他の実施形態では、最初に封入体を可溶化し、その後にイオン交換クロマトグラフィおよびゲル濾過で精製することによってタンパク質を抽出することができる。次いで、タンパク質を、高pHで尿素を使用してリフォールディングを行う。
任意の適切な方法（Ｎ末端配列決定、タンパク質分解マッピング、およびペプチド配列決定が含まれるが、これらに限定されない）を使用して、タンパク質配列を確証することができる。例えば、GH受容体の活性化、免疫学的方法、および培養物中でのGH感受性細胞の刺激などを使用して、機能の特長を評価することができる。一連の実施形態では、タンパク質がhGH結合タンパク質と１：２複合体を形成する能力の測定によってタンパク質を確証することができる。他の実施形態では、GH受容体でトランスフェクトした、例えば、ウサギ由来の細胞を活性化する能力によってタンパク質機能を検証することができる。
【００６３】
ポリペプチドを産生するために組換え手順で使用した宿主に依存して、本発明のポリペプチドはグリコシル化されることもまたはグリコシル化されないこともあり、本発明のポリペプチドには、最初にメチオニンアミノ酸が含まれ得る（−１位）。ある原核生物宿主細胞はタンパク質をグリコシル化せず、ある真核生物宿主細胞はタンパク質をグリコシル化することが知られている。より高いグリコシル化度を促進するために、成長培地中の必須単糖またはその前駆体のレベルをより高くすることができる。例えば、シアル酸、フコース、ガラクトース、またはＮ−アセチル−ガラクトサミンを含むタンパク質のために、望ましくは、これらの栄養素を富化した培養培地を使用して、20kDa hGH-Vのグリコシル化形態の発現レベルを増加させることができる。20kDa hGH-Vをグリコシル化するのに必要な他の糖を使用して成長培地を補足することもできることを容易に認識することができる。さらに、所望ならば、宿主細胞のグリコシルトランスフェラーゼおよび／またはヌクレオシド三リン酸グリコシル化酵素（糖負荷酵素）の発現を増加させて、20kDa hGH-Vへの糖残基の付加を増加させることができる。グリコシル化のさらなる説明は、Alberts et al.,Molecular Biology of the Cell,Fourth Edition,Garland Science(2002)に見出すことができる。
【００６４】
20kDa hGH-Nの１４位のアミノ酸の性質は不明確な部分がある。Martial et al(Martial et al,Science 205,602,1979)は、この位置のアミノ酸をコードするmRNA配列がメチオニンをコードするAUGであることを報告し、Masuda et al(Masuda et al,Biophysica Acta,949,125,1988)はＮ末端から１４番目のアミノ酸をコードするｃDNA配列がセリンをコードするAGTであることを報告していた。20kDa hGH-V変種中のこの位置のアミノ酸はメチオニンであると考えられるが、本発明は両方のバリエーションが含まれると理解される。
さらに、１つまたは２つのアミノ酸が置換、挿入、または欠失されたアミノ酸配列が変種20kDa hGH-Vのカテゴリーに分類されると理解すべきである。保存的変異、サイレント変異、および保存的アミノ酸置換も、本発明の変種のカテゴリーに分類されると理解すべきである。
【００６５】
ヌクレオチド配列の保存的変種には、アミノ酸配列が変化しないヌクレオチド置換および保存的アミノ酸置換が起こるヌクレオチド置換、および、ヌクレオチドから翻訳されたポリペプチドの特徴が実質的に影響を受けないアミノ酸置換が含まれる。
【００６６】
医薬組成物および投与
GH療法を、以下の２つのカテゴリーに分類することができる：生理学的療法および薬理学的療法。生理学的代償療法は、より低い投薬量を含む。小児におけるGHの代償療法の出発投薬量は、0.02〜0.05mg/kg/日の範囲であり、成人では、0.00625〜0.025mg/kg/日の範囲である。７０ｋｇの男性では、通常の出発用量は0.3mg/日であり、維持用量は、0.35〜0.56mg/日である。患者によっては、一生涯にわたってGH代償を行うことができる。例えば、AIDS関連消耗症を治療するための薬理学的療法は、より高い投薬量を含み、児童では、1mg/日超であり、成人では、１〜３ｍｇ／日超であえる。このより高い投薬量では、ますます顕著な副作用が認められる。
【００６７】
本発明はまた、本明細書中に記載の20kDa hGH-V変種であって、さらなる所望の性質を提供しつつ依然としてアゴニスト特性を保持するために１つまたは複数の可溶性ポリマーと結合させた前記変種を含む。このような性質には、可溶性の増加、安定性の増加、免疫原性の減少、タンパク質分解耐性の増加、in vivo半減期の増加、および腎クリアランスの減少が含まれる。適切なポリマーには、ポリエチレングリコール、ポリプロピレン  グリコール、およびポリサッカリドが含まれるが、これらに限定されない。適切な結合体の形成方法は、当業者に公知である。ポリエチレングリコールが特に好ましく、結合方法は、例えば、WO95/32003号に記載されている。
【００６８】
一般に、本発明の化合物は医薬組成物として以下の経路のうちの１つによって投与することができる：経口、局所、全身（例えば、経皮、鼻腔内、または座剤）、非経口（例えば、筋肉内、皮下、または静脈内への注射）、移植、浸透圧ポンプなどのデバイスによる注入、および経皮パッチなど。一定の実施形態では、皮下注射、静脈内注射、または皮下送達が可能な細かい霧にて皮膚を介して化合物を含む溶液を分散させる無ニードルデバイスを使用した注射を使用することができる。
本組成物は、錠剤、丸薬、カプセル、半固体、粉末、徐放性処方物、溶液、懸濁液、エリキシル、エアゾール、または任意の他の適切な組成物の形態をとることができ、薬学的に許容可能な賦形剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物は、投与前に再構成される粉末形態であるか、GH変種を含む溶液または懸濁液である。適切な賦形剤は当業者に周知であり、当業者は、組成物の配合方法を、Gennaro AR:Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th Ed.,Lippincott,Williams and Wilkins,Philadephia,PA(2000)などの標準的な参考文献で見出すことができる。好ましい賦形剤には、塩化ナトリウム、フェノール、ｍ−クレゾール、ベンジル  アルコール、ポリソルベート  ２０、クエン酸ナトリウム、マンニトール、リン酸二水素ナトリウム、リン酸一水素二ナトリウム、グリシン、およびグリセリンが含まれるが、これらに限定されない。特に注射剤のための適切な液体担体には、滅菌水、生理食塩水、およびデキストロース水溶液などが含まれ、非経口投与には等張液が好ましい。
【００６９】
また、本発明の化合物は徐放系によっても適切に投与することができる。徐放性組成物の適切な例には、造形品形態の半透性ポリマーマトリクス（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）が含まれる。徐放性マトリクスには、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号；欧州特許第58,481号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、エチレンビニルアセテートまたはポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸（欧州特許第133,988号）が含まれる。徐放性組成物には、リポソーム封入化合物も含まれる。本化合物を含むリポソームを、本質的に、以下の公知の方法によって調製する：ドイツ特許第3,218,121号；欧州特許第52,322号；欧州特許第36,676号；欧州特許第88,046号；欧州特許第143,949号；欧州特許第142,641号；日本国特許出願83-118008号；米国特許第4,485,045号および同第4,544,545号、および欧州特許第102,324号。
【００７０】
上記説明は例示のみを目的とし、本発明の範囲を制限することを意図しないことを認識することができる。むしろ、当業者は、上記方法および組成物の修正形態を容易に使用および調製することができ、全てのこのような変形形態が本発明の範囲内に含まれると見なされることを容易に認識することができる。さらに、本明細書中に引用した全ての引例は、その全てが本明細書中で参考として援用される。
本発明の他の態様を、本発明の方法および組成物の性質を示す特定の実施形態に関して記載する。以下の実施例は、本発明の利点を例示することを意図し、本発明の範囲を制限することを意図しない。
【００７１】
実施例
実施例１：20kDa hGH-Vの糖尿病非誘発性作用
低身長の小児および成人成長ホルモン欠損症の治療における成長ホルモン療法の使用が広く確立されている。しかし、22kDa hGH-Nの身体組成、脂質プロフィール、心血管機能、および骨密度を改良する効果が周知であるにもかかわらず、22kDa hGH-N療法に関して現在いくつかの問題が存在する。これらの問題には、以下が含まれる。
（１）薬理学的に大量の22kDa hGH-Nは、GH過剰の臨床的続発症（体液貯留が含まれる）に関連し得る。
（２）22kDa hGH-N療法の糖尿病誘発性（抗インスリン）副作用（末梢インスリン抵抗性および耐糖能障害が含まれる）。
本実施例は、通常食（固形飼料）または高脂肪食のいずれかを与えたGH正常ウイスター・ラットにおける線形成長、一定の内分泌腺、および代謝マーカーに対する20kDa hGH-Vの効果を試験するように計画された。
【００７２】
材料と方法
動物モデル（ウイスター・ラット）
離乳日齢（２１〜２２日齢）の雄ウイスター・ラットを、University of Auckland のAnimal Resources Unitによって維持されたコロニー（倫理承認番号Ｒ３８）から購入した。この齢の動物に、研究者による取り扱いに対して馴化および慣れるのに要する時間（すなわち、研究齢前の３〜４週間）を取った。動物を、標準的なラット用ケージを使用して専用施設に格納し、通常の明暗サイクルの下におき、飼料および水を無制限に与えた。動物を、離乳から研究終了まで毎日モニタリングした。離乳時に、動物（ｎ＝１８／群）は、ラット用固形飼料（Harlan Teklad Diet 2018）または市販の高脂肪食（Research Diets D12451、脂肪として４５%kcals）を与えるべく体重を適合させた。
【００７３】
治療プロトコール
７〜８週齢では、雄ウイスター・ラットを、飼料の範囲内に体重を適合させ、賦形剤（生理食塩水（0.9％））またはGHのいずれかを投与するために３つの治療群のうちの１つ（ｎ＝６／群）に割り当てた。治療群を表１に示した。
【００７４】
表１  治療群
2008507559.tif 000003
【００７５】
生理食塩水（0.9％）を使用して、hGHを再構成した。炭酸緩衝化生理食塩水（pH9.4）を使用して、bGHを再構成した。胎盤20kDahGH変種を、pH11.0の滅菌水で再構成した。注射（体積100μl）を、細いゲージ（29ｇ）の糖尿病用注射器を使用して皮下注射によって８時と１７時に１日２回投与した。動物を、７日間処置し、第８日の朝、最終GH注射後に犠牲にした。
【００７６】
体重
実験期間の毎日８〜９時に動物の体重を測定した。各動物を、任意の臨床徴候の変化、処置に対する反応、または健康障害について毎日観察した。いかなる治療群においてもいかなる不都合なストレス反応および関連する症状も認められなかった。
【００７７】
飼料および水の消費
試験期間中、飼料摂取を毎日測定した。ラットあたりの相対飼料取り込み（１日に１ｇの体重あたり消費されるｇ数）を、各群における各対に与えた飼料の量および食べ残した飼料の量を使用して計算した。各実験日に同時に水ボトルを秤量することによって水消費を毎日計算した。
【００７８】
体長
標準的な測定技術を使用して、体長（鼻−肛門および鼻−尾）を死後に評価した。
【００７９】
組織および血漿の測定
一晩の絶食後、第８日に動物をハロセン麻酔によって犠牲にし、その後斬首した。体長、死体質量、臓器質量（肝臓、脾臓、腎臓、副腎、心臓、下垂体）、およびパッド（pad）質量（後腹膜）を測定した。内分泌腺分析および生化学分析のために、体幹血をヘパリン処理バキュテイナーに採取した。血液サンプルを、インスリン、グルコース、FFA、レプチン、IGF-I、グリセロール、トリグリセリド、および総タンパク質について分析した。
【００８０】
結果
体重は、高脂肪食を与えた動物で有意に増加した（p<0.05）。体重は、hGH処置動物で有意に増加したが（p<0.05）、20kDaGH処置動物中の生理食塩水と有意に異ならなかった。
【００８１】
体重
研究動物の体重を、図３ａおよび３ｂに示す。図３ａは、通常食を与え、hGH（黒塗りの四角）または20kDa hGH-V（黒塗りの円）で処置した動物が生理食塩水で処置した動物（白抜きの円）よりも成長が早かったことを示す。図３ｂは、高脂肪食を与え、hGH（黒塗りの四角）または20kDa hGH-V（黒塗りの円）で処置した動物が生理食塩水で処置した動物（白抜きの円）よりも成長が早かったことを示す。体重の全変化は、hGH処置で有意に増加した（hGH対生理食塩水；p<0.0001）。20kDa hGH-V処置動物が生理食塩水で処置した動物よりも成長が早かったが、効果は統計的に有意ではなかった（20kDa対生理食塩水；p=0.3888）。さらに、hGHによる処置は、20kDa hGH-Vによる処置よりも体重増加と関連していた（20kDa対hGH；p<0.0001）。
【００８２】
体重の毎日の変化
図４ａおよび４ｂは、通常食（図４ａ）または高脂肪食（図４ｂ）のいずれかを与えた動物に対するhGH、20kDa hGH-V、および生理食塩水の効果を示す。動物を、生理食塩水（白抜きの円）、hGH（黒塗りの四角）または20kDa hGH-V（白抜きの四角）で処置した。図４ａは、hGHでの処置が20kDa hGH-Vまたは生理食塩水での処置よりも毎日の体重増加に関連することを示す。図４ｂは、通常食を与えた動物よりも高脂肪食を与えた動物でhGHの効果が高かったことを示す。さらに、通常食（図４ａ）または高脂肪食（図４ｂ）のいずれかを与えた動物において、生理食塩水で処置した動物と比較して20kDa hGH-Vで処置した動物で毎日の体重が増加する傾向が最初にあった。しかし、２日目までに、相違は減少した。
【００８３】
飼料および水の摂取
飼料摂取は、最初の４８時間にわたりGH処置動物で増加したが、その後、処置第３日までに生理食塩水および20kDa処置動物の摂取は元に戻った。いかなる処置群においても水の取り込みに相違はなかった。
【００８４】
体長
鼻−肛門長は、高脂肪食を与えた動物で有意に増加し（p<0.05）、生理食塩水処置動物と比較してhGH動物で有意に増加した（p<0.05）。20kDa胎盤hGH-Vは、通常食を与えた動物において体長にほとんど効果がなかったか全く効果がなかったが、高脂肪食を与えた動物で20kDa hGH-Vは体長を有意に増加させた。鼻−尾長は、生理食塩水コントロールと比較して、hGH処置動物で有意に増加したが（p<0.001）、20kDa処置動物と統計的に異ならなかった。
【００８５】
脂肪量
後腹膜脂肪は、高脂肪食の全処置群において有意に増加した。図５では、左側の３つのカラムは、通常食を与えた動物で得られた結果を示す。右側の３つのカラムは、高脂肪食を与えた動物で得られた結果を示す。白抜きのカラムは、20kDa hGH-Vの効果を示す。高脂肪食を与え、生理食塩水で処置した動物は、通常食を与えた動物と比較して、後腹膜脂肪量がわずかに増加した。通常食または高脂肪食を与えた動物において、hGHまたは20kDa hGHでの処置により、生理食塩水のみと比較して後腹膜脂肪量が有意に減少した（図５）。hGH処置群と20kDa GH処置群との間の脂肪量の相違は、hGH対生理食塩水（p<0.001）および20kDa hGH-V対生理食塩水（p<0.005）について統計的に有意であるが、傾向は示されるものの、20kDa hGH対hGHで統計的に有意ではなかった（p=0.4482）。概して、飼料の効果（p<0.05）および治療効果（p<0.0001）は有意であった。
【００８６】
臓器質量
脾臓、心臓、腎臓、脳、副腎、または精巣の質量に対する飼料またはhGH治療の効果はなかった。肝臓質量（体重に対する）は、高脂肪食を与えた動物で有意に減少した。しかし、肝臓のサイズは、20kDa処置動物と生理食塩水またはhGHで処置した動物とで有意に相違した（20kDa GH対生理食塩水；p<0.005；20kDa GH対hGH；p<0.0001）。
【００８７】
ヘマトクリット
図６は、ヘマトクリットに対する飼料およびhGH処置の効果のグラフを示す（ＨＴＣ；総血液サンプル体積に対する％として示す）。左側の３つのカラムは、通常食を与えた動物由来のデータを示す。右側の３つのカラムは、高脂肪食を与えた動物由来のデータを示す。白抜きのカラムは生理食塩水の効果を示し、影をつけたカラムはhGHの効果を示し、黒塗りのカラムは20kDa hGH-Vの効果を示す。高脂肪食を与えた動物でＨＴＣが減少する傾向があったが、この効果は統計的に有意ではなかった。しかし、hGHでの処置により、通常食または高脂肪食のいずれかを与えた動物でＨＴＣが有意に減少した（p<0.05）。20kDa GHで処置した動物でＨＴＣが減少する強い傾向があったが、この効果は統計的に有意ではなかった（生理食塩水対20kDa GH；p=0.27）。したがって、20kDa hGH-VよりもhGHの効果が高い傾向があったが、この効果は統計的に有意ではなかった（p=0.36）。概して、高脂肪食を与えた動物においてＨＴＣが減少する傾向がわずかにあったが、この効果は統計的に有意ではなかった（p=0.53）。さらに、GH処置は全てに効果がある傾向があったが、この効果は統計的に有意ではなかった（p=0.14）。
【００８８】
インスリン
図７は、通常食（左側の３つのカラム）または高脂肪食（右側の３つのカラム）のいずれかを与えた動物における空腹時血漿インスリンレベルのグラフを示す。各群からの動物を、生理食塩水（白抜きのカラム）、hGH（影をつけたカラム）、または20kDa hGH-V（黒塗りのカラム）で処置した。通常食を与えた動物と比較して、高脂肪食の生理食塩水処置動物で空腹時血漿インスリン（μg/lで示す）が増加する顕著な効果があったが、この効果は統計的にあまり有意ではなかった（p=0.09）。低脂肪食を与えた動物では、hGHによって血漿インスリンがわずかに減少した（統計的に有意ではなかった）。興味深いことに、高脂肪食を与えた動物では、hGHは血漿インスリンのわずかな増加を伴っていた（p=0.7６）。したがって、hGHで処置した動物では、通常食を与えた動物と比較して、高脂肪食を与えた動物で血漿インスリンが劇的に増加した（２倍を超える増加）。しかし、非常に驚いたことに、このような効果は、20kDa hGH-Vで処置した動物で認められなかった。したがって、飼料と無関係に、20kDa hGH-V処置動物は、生理食塩水処置動物（p<0.05）またはhGH処置動物（p<0.05）と比較して、血漿インスリンレベルが減少した。
【００８９】
グルコース
20kDa GH処置動物において血漿グルコース濃度が低下する傾向があったが、空腹時血漿グルコース濃度に対する処置または飼料の効果は認められなかった（p<0.09）。
【００９０】
Ｃ−ペプチド
図８は、空腹時Ｃ−ペプチド（μg/mlで示す）についての研究結果のグラフを示す。左側の３つのカラムは通常食を与えた動物から得た結果を示し、右側の３つのカラムは高脂肪食を与えた動物から得た結果を示す。白抜きのカラムは生理食塩水処置動物で得られた結果を示し、影をつけたカラムはhGH処置動物で得たデータを示し、黒塗りのカラムは20kDa hGH-V処置動物で得たデータを示す。
【００９１】
空腹時Ｃ−ペプチド濃度は、高脂肪食を与えた動物で有意に増加した（p<0.0005、図８）。高脂肪食を与えた動物では、hGHでの処置により、生理食塩水処置対照動物と比較して、Ｃ−ペプチドレベルが上昇するが、この効果は統計的にあまり有意ではなかった（p=0.29）。さらに、hGHで処置した動物では、血漿Ｃ−ペプチドは通常食を与えられた動物で観察されるもののほぼ2.5倍に増加した。この所見は、図７に示す血漿インスリンレベルで認められた所見と類似していた。驚いたことに、20kDa hGH-Vにより、通常食を与えた動物または高脂肪食を与えた動物のいずれかで血漿Ｃ−ペプチドは増加しなかった。むしろ、20kDa hGH-Vは、通常食を与えられた動物における血漿Ｃ−ペプチドの穏やかな減少を伴っていた。非常に驚いたことに、20kDa hGH-V処置は従来のhGH処置に伴う血漿Ｃ−ペプチドの増加を消滅させ（p<0.005）、高脂肪食を与えた生理食塩水処置動物と比較してＣ-ペプチドが統計的に実際に顕著に減少した（p<0.05）。概して、処置によって統計的に有意な効果があった（p<0.05）。
【００９２】
遊離脂肪酸（ＦＦＡ）
表２に示すように、高脂肪食を与えたhGHおよび生理食塩水処置動物でＦＦＡは有意に減少した（p<0.005）。通常食または高脂肪食のいずれかを与えた20kDa hGH-V処置動物のＦＦＡ濃度は変化しなかった（表２を参照のこと）。実際、hGHと20kDa hGH-Vの効果の相違は、統計的に有意であった（p<0.05）。
【００９３】
表２  遊離脂肪酸濃度
2008507559.tif 000004
【００９４】
概して、飼料および処置の効果は統計的に有意であった（それぞれ、p<0.005およびp<0.005）。しかし、hGHおよび20kDa hGH-Vの効果は、生理食塩水処置動物で得た結果と統計的に異ならなかった（それぞれ、p=0.11およびp=0.44）。
【００９５】
トリグリセリド
図９は、通常食（左側の３つのカラム）または高脂肪食（右側の３つのカラム）のいずれかを与えた動物における空腹時血漿トリグリセリドレベル（TG;mmol/lで示す）のグラフを示す。白抜きのカラムは生理食塩水処置動物で得られた結果を示し、影をつけたカラムはhGH処置動物で得たデータを示し、黒塗りのカラムは20kDa hGH-V処置動物で得た結果を示す。
血漿トリグリセリドは、通常食を与えた動物と比較して、高脂肪食を与えた生理食塩水処置動物で減少した（p<0.0001）。通常食を与えた動物では、hGHはトリグリセリドのわずかな増加に関連したが、20kDa hGH-V処置は、hGHと比較してトリグリセリド濃度を有意に上昇させた（p<0.001）。同様に、高脂肪食を与えた動物では、hGHによってTGがわずかに増加し（p=0.52）、20kDa hGH-VによってhGHよりもTGが増加した（p<0.005）。概して有意な治療効果があった（p<0.005）。
【００９６】
グリセロール
高脂肪食には血漿グリセロールレベルを低下する効果があったが（p<0.005）、いかなる処置によっても血漿グリセロール濃度に対する統計的に有意な効果は認められなかった。概して、相違比較のための有意値は以下であった：治療効果p=0.5；20kDa hGH-V対hGH p=0.66、20kDa hGH-V対生理食塩水p=0.49、hGH対生理食塩水；p=0.26。
【００９７】
総タンパク質
高脂肪食を与えた動物は、通常食を与えた動物よりも総タンパク質濃度が有意に低かった（p<0.05）。総タンパク質は、hGHおよび20kDa hGH-V処置動物において有意に減少した（p<0.001）。概して、相違比較のための有意値は以下であった：治療効果p<0.005；20kDa hGH-V対hGH；p<0.05、20kDa hGH-V対生理食塩水p<0.005；hGH対生理食塩水；p=0.17。
【００９８】
血漿レプチン
空腹時血漿レプチンは、高脂肪食を与えた動物で有意に上昇した（p<0.001）。血漿レプチン濃度に対するhGHまたは20kDa hGH-Vの効果は認められなかった。概して、相違比較のための有意値は以下であった：治療効果p=0.25；20kDa hGH-V対hGH；p=0.018、20kDa対生理食塩水；p=0.93；hGH対生理食塩水；p=0.19。
【００９９】
考察
本発明者らは、以前に、20kDa hGH-VはhGHと同様に脂肪分解性であり、通常はhGH療法に関連する血漿体積の増加を無効にすることを示した（PCT/US2004/027187号）。ドワーフ・ラットは、成長促進におけるGH化合物の有効性の確証に理想的なモデルであるが、hGHの改変された糖尿病誘発性作用および脂質関連効果と関連した変化の評価には理想的ではない。本試験は、通常食または高脂肪食のいずれかを与えて育てたGH正常ラットの予備データを確認するためにデザインした。
【０１００】
ウイスター・ラットから得られた成長促進効果は、GH欠損ドワーフ・ラットで認められた効果と密接に並行していた。比較的弱い成長プロモーターであるが、20kDa胎盤GHはhGHと同様の脂肪分解性を示すことが見出された。さらに、20kDa hGH-Vは、hGHで認められるような血漿体積の有意な増加は引き起こさなかった。
【０１０１】
先願の出願番号60/590,794号(代理人整理番号ERNZ1016US1)（全てが本明細書中で引用により取りこまれるものとする）で、本発明者らは、肥満以外は正常であるラットは成長ホルモンの糖尿病誘発性作用の研究に適切であることを見出した。本明細書中に記載の研究結果は、従来の成長ホルモンを使用した成長ホルモン療法の主な副作用のうちの１つを本明細書中に記載の20kDa hGH-Vを使用して少なくとも部分的に緩和することができることを示す。
【０１０２】
したがって、約0.1〜約10.0mg/kgの用量の20kDa hGH-Vを使用して有効な治療を行うことができる。あるいは、約1mg/kgの用量を使用することができる。過度に実験することなくこの範囲外の他の用量を試験することができることを認識することができる。さらに、20kDa hGH-Vでの治療期間は、１日あたり約１回から１４日間にわたる反復治療までの範囲であり得る。しかし、過度に実験することなくより長い期間被験体を治療することができるとも認識することができる。したがって、本発明の方法により、成長ホルモンで治療された被験体で望ましくない副作用を生じることなく望ましい成長ホルモン促進効果を得ることができる。
【０１０３】
上述の記載は単に例示することが目的であって、本発明の範囲を制限することを意図したものではない。寧ろ、上記方法及び組成物の改変物は容易に使用および調製することができそのような変動は本発明の範囲内であることを当業者は容易に理解するであろう。さらに、本明細書中に引用した文献は本明細書に完全に取りこまれるものとする。
本明細書中で引用した各特許および論文は、その全てが引用により本明細書中に取りこまれる。本出願は、オリゴヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列を含む。コンピュータ読み取り可能形態およびフレキシブルディスク中の配列表が本出願に付属しており、この配列表およびその中の配列は、その全てが本明細書中に取りこまれるものとする。
【０１０４】
産業上の有用性
本発明の実施態様は哺乳動物の治療に関して有用であり、何らかの状態について成長ホルモン治療の必要のある哺乳動物の治療に有用な医薬の製造において有用である。他の実施態様は成長ホルモン療法と関連した糖尿病誘発状態にあるまたはその危険性のある哺乳動物の治療に有用な医薬の製造において有用である。
【０１０５】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】hGH変種のヌクレオチド配列を示す図である。破線は、20kDa hGH-Vおよび20kDa hGH−Ｎで欠失している部分を示す。下線を引いた部分は、シグナル配列を示す。
【図２】22kDa hGH-V、22kDa hGH-N、20kDa hGH-V、および20kDa hGH-Nのアミノ酸配列を示す図である。破線を引いた部分は、20kDa hGH-Vで欠失しているアミノ酸を示す。
【図３ａ】通常食を与え、生理食塩水、22kDa hGH-N、または20kDa hGH-Vで処置した動物の体重のグラフを示す。
【図３ｂ】高脂肪食を与え、生理食塩水、22kDa hGH-N、または20kDa hGH-Vで処置した動物の体重のグラフを示す。
【図４ａ】通常食を与え、生理食塩水、22kDa hGH-N、または20kDa hGH-Vで処置した動物の１日あたりの体重増加のグラフを示す。
【図４ｂ】高脂肪食を与え、生理食塩水、22kDa hGH-N、または20kDa hGH-Vで処置した動物の１日あたりの体重増加のグラフを示す。
【図５】生理食塩水、22kDa hGH-N、または20kDa hGH-Vで処置し、通常食または高脂肪食を与えた動物における後腹膜脂肪（全体重の比率として）のグラフを示す。
【図６】生理食塩水、22kDa hGH-N、または20kDa hGH-Vで処置し、通常食または高脂肪食を与えた動物における血中ヘマトクリット（％）のグラフを示す。
【図７】生理食塩水、22kDa hGH-N、または20kDa hGH-Vで処置し、通常食または高脂肪食を与えた動物における空腹時血漿インスリンレベル（μg/l）のグラフを示す。
【図８】生理食塩水、22kDa hGH-N、または20kDa hGH-Vで処置し、通常食または高脂肪食を与えた動物における空腹時血漿Ｃ−ペプチド（pg/ml）のグラフを示す。
【図９】生理食塩水、22kDa hGH-N、または20kDa hGH-Vで処置し、通常食または高脂肪食を与えた動物における空腹時血漿トリグリセリド（mmol/l）のグラフを示す。
【図１】
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【図１】
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【図２】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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