(57)【要約】  本発明は、虚血性脳卒中を含むが、これに限定されない脳に対する血流の喪失と関連した少なくとも一つの症状を治療、改善または緩和させるための組成物及び方法を提供する。本発明の組成物は、胆汁酸化合物及び炭水化物を含み、ここで、これら二つの物質は、選択されたｐＨ値範囲内の溶液の全てのｐＨ値に対して溶液状態であることを特徴とする。前記症状は、梗塞体積、機能回復、細胞自滅死及び／またはｅＮＯＳ発現を含む。
2008511651.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
虚血性脳卒中を有するか、虚血性脳卒中を有する危険のある対象で虚血性脳卒中の梗塞体積を減少させる方法であって、
（ａ）胆汁酸、胆汁酸の水可溶性誘導体、胆汁酸塩及びアミド結合によってアミンとコンジュゲートされた胆汁酸からなる群から選択された胆汁酸物質と、
（ｂ）水可溶性でんぷん転化物または水可溶性非でんぷん多糖類からなる群から選択された炭水化物と、
（ｃ）水と、を含む組成物を前記対象に投与することを含み、
前記胆汁酸物質と炭水化物の両方共が、選択されたｐＨ値範囲内の溶液の全てのｐＨ値に対して溶液状態であり、梗塞体積が減少することを特徴とする方法。
【請求項２】
虚血性脳卒中を有するか、虚血性脳卒中を有する危険のある対象で機能回復を増強させる方法であって、
（ａ）胆汁酸、胆汁酸の水可溶性誘導体、胆汁酸塩及びアミド結合によってアミンとコンジュゲートされた胆汁酸からなる群から選択された胆汁酸物質と、
（ｂ）水可溶性でんぷん転化物または水可溶性非でんぷん多糖類からなる群から選択された炭水化物と、
（ｃ）水と、を含む組成物を前記対象に投与することを含み、
前記胆汁酸物質と炭水化物の両方共が、選択されたｐＨ値範囲内の溶液の全てのｐＨ値に対して溶液状態であり、機能回復が向上することを特徴とする方法。
【請求項３】
虚血性脳卒中を有するか、虚血性脳卒中を有する危険のある対象でｅＮＯＳの発現を増大させる方法であって、
（ａ）胆汁酸、胆汁酸の水可溶性誘導体、胆汁酸塩及びアミド結合によってアミンとコンジュゲートされた胆汁酸からなる群から選択された胆汁酸物質と、
（ｂ）水可溶性でんぷん転化物または水可溶性非でんぷん多糖類からなる群から選択された炭水化物と、
（ｃ）水と、を含む組成物を前記対象に投与することを含み、
前記胆汁酸物質と炭水化物の両方共が、選択されたｐＨ値範囲内の溶液の全てのｐＨ値に対して溶液状態であり、ｅＮＯＳの発現が増大することを特徴とする方法。
【請求項４】
虚血性脳卒中を有するか、虚血性脳卒中を有する危険のある対象で細胞自滅死を抑制し、ｅＮＯＳの発現を増大させる方法であって、
（ａ）胆汁酸、胆汁酸の水可溶性誘導体、胆汁酸塩及びアミド結合によってアミンとコンジュゲートされた胆汁酸からなる群から選択された胆汁酸物質と、
（ｂ）水可溶性でんぷん転化物または水可溶性非でんぷん多糖類からなる群から選択された炭水化物と、
（ｃ）水と、を含む組成物を前記対象に投与することを含み、
前記胆汁酸物質と炭水化物の両方共が、選択されたｐＨ値範囲内の溶液の全てのｐＨ値に対して溶液状態であり、細胞自滅死が減少し、ｅＮＯＳの発現が増大することを特徴とする方法。
【請求項５】
虚血性脳卒中を有するか、虚血性脳卒中を有する危険のある対象で虚血性脳卒中の少なくとも一つの症状を治療する方法であって、
（ａ）胆汁酸、胆汁酸の水可溶性誘導体、胆汁酸塩及びアミド結合によってアミンとコンジュゲートされた胆汁酸からなる群から選択された胆汁酸物質と、
（ｂ）水可溶性でんぷん転化物または水可溶性非でんぷん多糖類からなる群から選択された炭水化物と、
（ｃ）水と、を含む組成物を前記対象に投与することを含み、
前記胆汁酸物質と炭水化物の両方共が、選択されたｐＨ値範囲内の溶液の全てのｐＨ値に対して溶液状態であり、虚血性脳卒中の少なくとも一つの症状が治療されることを特徴とする方法。
【請求項６】
対象の脳に胆汁酸物質を輸送する方法であって、
（ａ）胆汁酸、胆汁酸の水可溶性誘導体、胆汁酸塩及びアミド結合によってアミンとコンジュゲートされた胆汁酸からなる群から選択された胆汁酸物質と、
（ｂ）水可溶性でんぷん転化物または水可溶性非でんぷん多糖類からなる群から選択された炭水化物と、
（ｃ）水と、を含む組成物を前記対象に投与することを含み、
前記胆汁酸物質と炭水化物の両方共が、選択されたｐＨ値範囲内の溶液の全てのｐＨ値に対して溶液状態であり、胆汁酸物質が脳に伝達されることを特徴とする方法。
【請求項７】
前記組成物は、少なくとも１種の薬物を薬剤学的有効量でさらに含むことを特徴とする請求項１ないし６のうち何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記薬物は、抗凝固剤、繊維素溶解抑制剤、抗血小板化合物、カルシウムチャネル遮断剤、コルチコステロイド、神経節遮断剤、造血成長因子、止血性化合物、酸化窒素ドナー、血栓溶解剤、血管作用剤、漢薬及び個別化合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記薬物は、アニシンジオン、ジクマロール、ワルファリンナトリウム、クエン酸デキストロース溶液、ダナプロイドナトリウム（danaproid  sodium）、ヘパリンナトリウム、アミノカプロン酸、トラネキサム酸、チクロピジンＨＣｌ、重硫酸クロピドグレル、エプチフィバタイト、チロフィバンＨＣＬ、アムロジピン塩、ベプリジルＨＣＬ、ジルチアゼムＨＣＬ、フェロジピン、ニフェジピン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、フルドロコルチゾン、フルニソリド、ヒドロコルチゾン、メカミラミンＨＣｌ、カンシル酸トリメタファン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、微細繊維性コラーゲン、吸収性ゼラチン、トロンビン、Ｌ―アルギニン、酸化窒素合成酵素阻害剤、アムシクシマブ（amciximab）、アルテプラーゼ、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、ジアゾキシド、ヒドララジンＨＣｌ、ミノキシジル、ダンセン（dan  shen）、デンズハンフア（dengzhanhua）、ディダンタン（didang  tang）、銀杏（ginkgo  biloba）、ルベルゾール、マンニトール溶液、ナフティドロフリ（naftidrofury）、ペントキシフィリン、プロペントフィリン、ペンチフィリンピラセタム、プロスタサイクリン、プエラリン、サンチ（sanchi）、テオフィリン、アミノフィリン、チリラザド、トリフルサール及びビンポセチンからなる群から選択されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物は、透明な溶液であることを特徴とする請求項１ないし６のうち何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記胆汁酸物質は、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、コール酸、ヒオデオキシコール酸、デオキシコール酸、７―オキソリトコール酸、リトコール酸、ヨードデオキシコール酸、イオコール酸、タウロウルソデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロリトコール酸、グリコウルソデオキシコール酸、タウロコール酸、グリココル酸、及びステロイド核にあるヒドロキシル基またはカルボキシル酸基でのそれらの誘導体からなる群から選択されることを特徴とする請求項１ないし６のうち何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記胆汁酸物質は、ウルソデオキシコール酸であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物は、乾燥した可溶化ウルソデオキシコール酸製剤であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記投与は、前記対象がウルソデオキシコール酸を約２５ｍｇ／ｋｇ〜４００ｍｇ／ｋｇ受けるように行われることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記投与は、虚血性脳卒中の間またはその後に行われることを特徴とする請求項１ないし６のうち何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象は、人間以外の哺乳動物であることを特徴とする請求項１ないし６のうち何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象は、人間であることを特徴とする請求項１ないし６のうち何れか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物には、シクロデキストリンが添加されていないことを特徴とする請求項１ないし６のうち何れか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記投与は、経口投与、舌下投与、非経口投与、真皮内注射、皮下注射、甲状腺内注射、静脈内注射、鼻腔内投与、経皮投与及び経結膜投与からなる群から選択される経路による投与を含むことを特徴とする請求項１ないし６のうち何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳卒中を減少させられる１種以上の胆汁酸の透明な水溶液を提供するシステム及び方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近の米国の統計によれば、毎年４００，０００名以上の患者が初発脳卒中を経験していると推定される。また、脳卒中は、障害の主な原因及び死亡の３番目の主な原因である。男性は、女性よりも脳卒中を起こす危険が高い。全体の脳卒中の約８０％は、（例えば、頭蓋内（ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ）血栓症または頭蓋外（ｅｘｔｒａｃｒａｎｉａｌ）塞栓症に起因した）急性虚血性脳卒中である。また、全体の脳卒中の約１／４が６５才以下の個人に起きるが、このような特性は、脳卒中が中壮年層の疾患であるとの認識のために多少意外に思える。
【０００３】
虚血カスケードは、最初の数秒〜数分から始まり、脳に対するかん流の喪失を伴うので、治療を介入させない場合、神経系損傷が引き起こされる。この損傷は、二つの領域、すなわち、損傷が非可逆的である梗塞部位と、損傷が可逆的である虚血半影部位（ｐｅｎｕｍｂｒａ）に分けられる。しかしながら、血行の損傷後の数時間〜数日に、梗塞の場合と同様に、半影部位での損傷が非可逆的になる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、梗塞体積を減少させ及び／または、神経系機能を保存する処置に対する要求が存在する。したがって、本発明は、梗塞体積を減少させ及び／または、虚血性脳卒中後の機能回復を増強させられる胆汁酸組成物に関するものである。一部の実施形態において、作用の如何なる特定のメカニズムに制限されることなく、これは、細胞自滅死の抑制及び／またはｅＮＯＳ発現の増進を通して起きる。一態様において、本発明は、（１）胆汁酸、胆汁酸誘導体、胆汁酸塩またはアミンによってコンジュゲートされた胆汁酸と、（２）水と、（３）胆汁酸とでんぷん転化物を、選択されたｐＨ範囲内の如何なるｐＨでも溶液状態に維持させるための充分な量の水可溶性でんぷん転化物と、を含む組成物を提供する。
【０００５】
また、本発明は、（１）胆汁酸、胆汁酸誘導体、胆汁酸塩またはアミンによってコンジュゲートされた胆汁酸と、（２）水と、（３）胆汁酸と多糖類を、選択されたｐＨ範囲内の如何なるｐＨでも溶液状態に維持させるために充分な量の水可溶性非でんぷん（ｎｏｎ―ｓｔａｒｃｈ）多糖類と、を含む組成物に関するものである。
【０００６】
また、本発明は、（１）胆汁酸、胆汁酸誘導体、胆汁酸塩またはアミンによってコンジュゲートされた胆汁酸と、（２）水と、（３）薬剤学的に適正量の薬剤学的化合物と、（４）胆汁酸、薬剤学的化合物及び炭水化物を、選択されたｐＨ範囲内の如何なるｐＨでも溶液状態に維持させるために充分な量の水可溶性でんぷん転化物及び水可溶性非でんぷん転化物と、を含む薬剤学的組成物に関するものである。本発明の一つの非制限的な実施形態によると、薬剤学的化合物は、抗脳卒中治療分子または混合物である。
【０００７】
また、本発明は、胆汁酸組成物の溶液剤形に関するものである。これら溶液剤形は、胆汁酸の改善された生体利用率及び／または吸収性及び／または膜透過性を示す。また、これら溶液剤形は、薬剤学的化合物の改善された生体利用率及び／または吸収性及び／または膜透過性も示す。さらに、胆汁酸の存在は、薬物の毒性及び／または副作用を減少及び／または除去させうる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一部の実施形態においては、（１）胆汁酸、胆汁酸誘導体、胆汁酸塩またはアミンによってコンジュゲートされた胆汁酸と、（２）水と、（３）胆汁酸成分及び炭水化物を、選択されたｐＨ範囲内の如何なるｐＨでも溶液状態に維持させるための充分な量の炭水化物と、を含み、前記炭水化物が水可溶性でんぷん転化物と水可溶性非でんぷん多糖類との配合物である組成物を提供する。可溶性非でんぷん多糖類及び高分子量でんぷん転化物を全て含有する実施形態において、それぞれの量は、前記組成物中に一緒に配合された場合、胆汁酸成分、高分子量でんぷん転化物、可溶性非でんぷん多糖類及び薬剤学的化合物があるなら、これらを選択されたｐＨ範囲内の如何なるｐＨでも溶液状態に維持させるのに充分であればよい。
【０００９】
本発明の実施形態においては、薬物の反応強度または効能を増加させる配合治療組成物を提供する。このような組成物は、低容量の薬剤学的化合物の投与を許容し、複合疾患を様々な箇所で攻撃し、除去に影響を及ぼし及び／または、薬剤学的化合物の吸収を変更させうる。本発明の組成物は、一部の実施形態において薬物の毒性及び／または副作用の減少をもたらすか、毒性及び／または副作用の減少に寄与する。
【００１０】
一部の実施形態において、本発明は、虚血性脳卒中を有するか、虚血性脳卒中を有する危険のある対象で虚血性脳卒中の梗塞体積を減少させる方法に関するものである。この方法は、（ａ）胆汁酸、胆汁酸の水可溶性誘導体、胆汁酸塩及びアミド結合によってアミンとコンジュゲートされた胆汁酸からなる群から選択された胆汁酸物質と、（ｂ）水可溶性でんぷん転化物または水可溶性非でんぷん多糖類からなる群から選択された炭水化物と、（ｃ）水と、を含む組成物を前記対象に投与することを含み、ここで、前記胆汁酸物質と炭水化物の両方共が、選択されたｐＨ値範囲内の溶液の全てのｐＨ値に対して溶液状態であり、梗塞体積が減少する。
【００１１】
本発明は、一部の実施形態において、虚血性脳卒中を有するか、虚血性脳卒中を有する危険のある対象で機能回復を増強させる方法に関するものである。一部の実施形態によると、機能回復は、所定の神経系、認知、感覚及び／または運動機能のうち何れの回復も含むが、前記機能がこれらに限定されることはない。上記の方法は、（ａ）胆汁酸、胆汁酸の水可溶性誘導体、胆汁酸塩及びアミド結合によってアミンとコンジュゲートされた胆汁酸からなる群から選択された胆汁酸物質と、（ｂ）水可溶性でんぷん転化物または水可溶性非でんぷん多糖類からなる群から選択された炭水化物と、（ｃ）水と、を含む組成物を前記対象に投与することを含み、ここで、前記胆汁酸物質と炭水化物の両方共が、選択されたｐＨ値範囲内の溶液の全てのｐＨ値に対して溶液状態であり、機能回復が向上する。
【００１２】
一部の実施形態によると、本発明は、虚血性脳卒中を有するか、虚血性脳卒中を有する危険のある対象でｅＮＯＳの発現を増大させる方法に関するものである。上記の方法は、（ａ）胆汁酸、胆汁酸の水可溶性誘導体、胆汁酸塩及びアミド結合によってアミンとコンジュゲートされた胆汁酸からなる群から選択された胆汁酸物質と、（ｂ）水可溶性でんぷん転化物または水可溶性非でんぷん多糖類からなる群から選択された炭水化物と、（ｃ）水と、を含む組成物を前記対象に投与することを含み、ここで、前記胆汁酸物質と炭水化物の両方共が、選択されたｐＨ値範囲内の溶液の全てのｐＨ値に対して溶液状態であり、ｅＮＯＳの発現が増大する。
【００１３】
一部の実施形態において、本発明は、虚血性脳卒中を有するか、虚血性脳卒中を有する危険のある対象で細胞自滅死を抑制し、ｅＮＯＳの発現を増大させる方法に関するものである。上記の方法は、（ａ）胆汁酸、胆汁酸の水可溶性誘導体、胆汁酸塩及びアミド結合によってアミンとコンジュゲートされた胆汁酸からなる群から選択された胆汁酸物質と、（ｂ）水可溶性でんぷん転化物または水可溶性非でんぷん多糖類からなる群から選択された炭水化物と、（ｃ）水と、を含む組成物を前記対象に投与することを含み、ここで、前記胆汁酸物質と炭水化物の両方共が、選択されたｐＨ値範囲内の溶液の全てのｐＨ値に対して溶液状態であり、細胞自滅死が減少し、ｅＮＯＳの発現が増大する。
【００１４】
本発明は、一部の実施形態において、虚血性脳卒中を有するか、虚血性脳卒中を有する危険のある対象で虚血性脳卒中を治療（例えば、虚血性脳卒中と関連した少なくとも一つの症状を治療、改善または緩和）する方法に関するものである。上記の方法は、（ａ）胆汁酸、胆汁酸の水可溶性誘導体、胆汁酸塩及びアミド結合によってアミンとコンジュゲートされた胆汁酸からなる群から選択された胆汁酸物質と、（ｂ）水可溶性でんぷん転化物または水可溶性非でんぷん多糖類からなる群から選択された炭水化物と、（ｃ）水と、を含む組成物を前記対象に投与することを含み、前記胆汁酸物質と炭水化物の両方共が、選択されたｐＨ値範囲内の溶液の全てのｐＨ値に対して溶液状態であり、虚血性脳卒中（例えば、虚血性脳卒中の少なくとも一つの症状）が治療される。
【００１５】
一部の実施形態によると、本発明は、対象で胆汁酸物質を脳（例えば、血液脳障壁を横切って）に伝達する方法に関するものである。上記の方法は、（ａ）胆汁酸、胆汁酸の水可溶性誘導体、胆汁酸塩及びアミド結合によってアミンとコンジュゲートされた胆汁酸からなる群から選択された胆汁酸物質と、（ｂ）水可溶性でんぷん転化物または水可溶性非でんぷん多糖類からなる群から選択された炭水化物と、（ｃ）水と、を含む組成物を前記対象に投与することを含み、ここで、前記胆汁酸物質と炭水化物の両方共が、選択されたｐＨ値範囲内の溶液の全てのｐＨ値に対して溶液状態であり、胆汁酸物質が脳に伝達される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
胆汁酸の主成分であるウルソデオキシコール酸（３α―７β―ジヒドロキシ―５β―コラン酸）（“ＵＤＣＡ”）及び胆汁酸の他の形態は、高疎水性を有する。また、多数は、生理的及び酸性ｐＨ（例えば、約ｐＨ８．４以下）で水溶液に不溶性である。さらに、ＵＤＣＡ及びその他の胆汁酸は、経口投与時に充分な耐性があり得るが、これらは、その味及び後味が非常に苦くて不快である。
【００１７】
ＵＤＣＡの薬理作用は、限定されるものではないが、容量依存的に（１）毒性胆汁酸の取替え及び／または置換と、（２）細胞保護効果と、（３）細胞膜の安定化及び／または保護と、（４）抗細胞自滅効果と、（５）免疫調節効果（例えば、細胞内グルココルチコイド受容体の活性による）と、（６）抗炎症効果（例えば、ＮＦ―ｋＢの抑制及び酸化窒素合成酵素の誘導阻害による）と、（７）胆汁分泌の刺激と、（８）細管膜伝達体の細胞外流出及び挿入の刺激とを含む。
【００１８】
胆汁酸の所定の形態は、一つ以上の病状に対する治療剤として有用である。例えば、ＵＤＣＡは、多くの種類の肝疾患に対する保護を含む（しかし、これらに限定されるものではない）一つ以上の病状の治療に有用である。その医薬的用途は、放射線透過性の胆石の溶解と、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、妊娠性肝内胆汁うっ滞、嚢胞性繊維症と関連した肝疾患、小児肝障害及び肝の慢性移植片対宿主病を含む（しかし、これらに限定されることはない）一つ以上の胆汁障害と、を含む。
【００１９】
治療学的活性剤として、そして、担体及び／またはアジュバントとしての胆汁酸の有用な薬理的性質にもかかわらず、胆汁酸の商業的用途は、低溶解度及び／または生体利用率によって制限される。例えば、多くの胆汁酸剤形は、溶液または懸濁液中の粒子及び／または沈降物として、または、錠剤の成分として胆汁酸からの固形分形態を含む。これら剤形は、ｐＨ１〜８で可溶性の悪い胆汁酸の結晶を含有しうる。結晶ＵＤＣＡの溶解は、極めて遅くて不完全な場合もある。
【００２０】
一部の場合において、投与されたＵＤＣＡの約３０％〜６０％以下が吸収されることもある。これは、主に小腸で溶解-制限された受動的非イオン性拡散によって起きる。ＵＤＣＡ結晶に対する改善された可溶化は、約管内（endoluminal）ｐＨ８．４以上で可能であるが、この数値は、膵臓または十二指腸分泌の間に生体内で得ることが困難であった。したがって、既存の胆汁酸の多くの形態は、不充分な生体利用率を有する。これは、既存の多くの形態のＵＤＣＡ投与後、体循環での胆汁レベルが極めて低いことを意味する。したがって、既存の多くの胆汁酸剤形は、ＵＤＣＡを体全体に伝達する有用性が制限されており、ＵＤＣＡを脳に伝達する有用性はさらに制限されている。
【００２１】
肝細胞は、ＵＤＣＡを取り入れてコンジュゲートしてから、一次通過除去（first‐pass  clearance）と呼ばれるプロセスでこれを胆汁に分泌する。胆汁中のＵＤＣＡの濃度は、投与後の約１時間〜３時間で最高値に達する。胆汁中での遊離ＵＤＣＡは、胆管細胞によって再び吸収される。この胆嚢肝シャント（cholehepatic  shunt）と呼ばれる現象は、増加した胆汁重炭酸塩分泌と関連している。また、慢性摂取後の胆汁中のＵＤＣＡの豊富さの程度は、日々の投与量と関連している。一部の既存のＵＤＣＡ剤形を用いると、１日当り１０±１２ｍｇ／ｋｇを上回る容量は、胆汁でのＵＤＣＡの比率をそれ以上増加させられない。これは、ケノデオキシコール酸に対するエピマー化及び／または一次胆汁酸の肝合成を抑制することができないことに起因する。したがって、ＵＤＣＡの吸収は、既存の剤形を用いたＵＤＣＡの容量増加によって実際に減少する。したがって、増加した溶解度、生体利用率及び／または膜透過性を有する胆汁組成物が必要となる。さらに、ＵＤＣＡのＣＤＣＡへのエピマー化がより少ない胆汁組成物も必要となる。
【００２２】
本発明の一部の実施形態によると、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の塩、前駆体及び／または誘導体は、脳組織に対する血液の供給の中断を経験した患者で有利な効果を有する。胆汁酸の脳への治療的伝達は、ＵＤＣＡの腸肝循環作用、血液中のＵＤＣＡの極めて低い濃度、そして、強い親水性及び酸性特性による低減した膜透過性によって妨害を受ける。本発明の実施形態は、これら障害を改善または克服できる胆汁剤形を提供する。
【００２３】
本発明の具体的な実施形態では、可溶化された胆汁酸剤形の神経保護効果を試験した。６３匹の一過性局所虚血ラットが、一過性局所虚血モデルとして用意された。可溶化されたＵＤＣＡは、それぞれ食塩水単独、２５ｍｇ  ＵＤＣＡ／ｋｇ、１００ｍｇ  ＵＤＣＡ／ｋｇ、４００ｍｇ  ＵＤＣＡ／ｋｇ及び４００ｍｇ  ＴＵＤＣＡ／ｋｇの５群での再かん流直後、一回それぞれの容量で静脈内に投与された。各群において、梗塞体積及び機能成果を測定し、胆汁酸分析のために脳を採取した。可溶化ＵＤＣＡによって処置されたラットにおいて、梗塞体積が減少し、行動点数が向上した。可溶化ＵＤＣＡ処置群では、半影部位内での減少したＴＵＮＥＬ―陽性細胞、低いカスパーゼ（caspase）活性度、及びＵＤＣＡの高い大脳濃度が観察された。したがって、特定の作用メカニズムに制限されることはないが、可溶化ＵＤＣＡは、抗細胞自滅メカニズム及び／または抗炎症作用によって大脳虚血に対する神経保護効果を有すのであろう。
【００２４】
一部の実施形態において、可溶性胆汁酸は、制限なしに如何なる類型の水可溶性胆汁酸も含んでよい。また、胆汁酸塩は、一部の実施形態において、胆汁酸の如何なる水可溶性塩であってもよい。一部の実施形態によると、胆汁酸の水性溶解塩は、上述した胆汁酸とアミンとの反応によって形成される。このアミンには、トリエンチン、ジエチレントリアミン、テトラエチレンペンタミンなどの脂肪族遊離アミン類；アルギニン、リシン、オルニチンなどの塩基性アミノ酸；アンモニア；Ｄ―グルカミン、Ｎ―アルキルグルカミンなどのアミノ糖類と；コリンなどの４級アンモニウム誘導体；ピペラジン、Ｎ―アルキルピペラジン、ピペリジン、Ｎ―アルキルピペリジン、モルホリン、Ｎ―アルキルモルホリン、ピロリジンなどの複素環式アミン；トリエタノールアミン及びトリメタノールアミンなどが含まれるが、これらに限定されることはない。本発明の具体的な実施形態によると、胆汁酸とシクロデキストリン及びその誘導体の包接化合物、水可溶性Ｏ―スルホン化胆汁酸を含む胆汁酸の水可溶性金属塩も可溶性胆汁酸塩として含まれる。
【００２５】
本発明の可溶性胆汁酸誘導体は、対応する誘導体されていない胆汁酸に比べて、水溶性が同一であるか、それより高い誘導体である。胆汁酸誘導体には、ハロゲン及びアミノ基を含み、これらに限定されるものではないが、他の作用基を有する胆汁酸のヒドロキシル及びカルボキシル酸基で形成された誘導体も含む。可溶性胆汁酸は、無機酸（例えば、塩酸、硫酸、リン酸及び酸性リン酸塩）及び／または有機酸（例えば、クエン酸、酒石酸及び酢酸）と配合される胆汁酸の遊離酸形態の水性製剤を含む。
【００２６】
一部の実施形態によると、胆汁酸としては、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、コール酸、ヒオデオキシコール酸、デオキシコール酸、７―オキソリトコール酸、リトコール酸、ヨードデオキシコール酸、イオコール酸、タウロウルソデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロリトコール酸、グリコウルソデオキシコール酸、タウロコール酸、グリココル酸、及びステロイド核にあるヒドロキシル基またはカルボキシル酸基でのそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されることはない。しかし、一部の実施形態において、本発明の組成物は、１種以上の前記胆汁酸（例えば、タウロウルソデオキシコール酸）を排除することもある。
【００２７】
本発明の一部の実施形態において、溶液での胆汁酸（例えば、ＵＤＣＡ）の輸送は、既存の製剤より一層高い生体内胆汁酸（例えば、ＵＤＣＡ）レベルを達成する。したがって、胆汁酸（例えば、ＵＤＣＡ）の治療上の可能性は、既存の剤形よりも充分に多く達成される。胆汁酸は、本発明の剤形に完全に溶解されうるので、本実施形態では、低い容量が投与される場合も、一層高い生体内胆汁酸レベルを達成することができる。
【００２８】
一部の実施形態によると、本発明の組成物は、制限なしに任意の有効なモードを通して対象に投与される。
【００２９】
ホルモンは、制限なしに任意の開口部及び／または皮膚を含む所定の有効なモードを通して投与される。例えば、投与経路には、経口投与、舌下投与、非経口投与、真皮内注射、皮下注射、甲状腺内注射、静脈内注射、鼻腔内投与、経皮投与及び経結膜投与などが含まれる。
【００３０】
一部の実施形態において、本発明の組成物は、摂取可能な錠剤、口腔錠、口内錠、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、オブラート、丸薬、顆粒、粉末、カシェ剤（cachet）、乳化液、液体、エアロゾル、軟質または硬質ゼラチンカプセル、注射用滅菌液、滅菌粉末などからなる群から選択された形態を有する。
【００３１】
本発明の一部の実施形態において、複数の胆汁酸が、単一の剤形に用いられる。異なる疎水性活性の２種以上の胆汁酸の混合物は、中間疎水性活性の単一の胆汁塩として働く。その結果、異なる疎水性活性の２種以上の胆汁酸の混合物の洗浄性及び毒性は、個別成分に対するものの中間である。
【００３２】
本発明で適切に用いられる炭水化物には、水可溶性でんぷん転化物及び水可溶性非でんぷん多糖類が含まれる。本発明の一部の実施形態によると、水可溶性でんぷん転化物は、各種のｐＨ条件下で、でんぷんの部分または不完全加水分解から直接得られた炭水化物を含む。非制限的な例としては、マルトデキストリン、デキストリン、液体グルコース、コーンシロップ固形分（液体グルコースの乾燥粉末）及び可溶性でんぷんが挙げられる。一部の実施形態において、炭水化物は、ＭＡＬＴＲＩＮ（登録商標）Ｍ２００、ＭＡＬＴＲＩＮ（登録商標）Ｍ２０５０、コーンシロップ固形分、及びＭＡＬＴＲＩＮ（登録商標）Ｍ７００、ＭＡＬＴＲＩＮ（登録商標）Ｍ０４０、ＭＡＬＴＲＩＮ（登録商標）Ｍ０５０、ＭＡＬＴＲＩＮ（登録商標）Ｍ１００、ＭＡＬＴＲＩＮ（登録商標）Ｍ１５０、ＭＡＬＴＲＩＮ（登録商標）Ｍ１８０、マルトデキストリンからなる群から選択されるが、これらは、全て米国アイオワ州のマスカティンに所在するグレイン・プロセッシング・コーポレーション（Grain Processing Corporation）の商品名ＧＰＣ（登録商標）で製造される。本実施形態の目的のために、“コーンシロップ”という用語は、コーンシロップと液体グルコースを全て含んでもよい。でんぷん転化物が重合体からなる場合、この重合体は、少なくとも一つの還元末端と、少なくとも一つの非還元末端を有し、直鎖または分岐鎖である。また、分子量は、約１００質量単位〜１０６質量単位以上である。
【００３３】
本発明の一部の実施形態によると、水可溶性非でんぷん多糖類は、各種の加水分解または合成メカニズムによって各種のｐＨ条件下で得られる。非制限的な例としては、デキストラン、グアーゴム、ペクチン、消化不可能な可溶性繊維などが挙げられる。また、重合体からなる場合、該当の重合体は、少なくとも一つの還元末端と、少なくとも一つの非還元末端を有する。前記重合体は、直鎖または分岐鎖である。分子量は、約１００質量単位〜１０６質量単位以上である。
【００３４】
本発明の実施形態で用いられる高分子量の水可溶性でんぷん転化物及び／または可溶性非でんぷん多糖類の量は、少なくとも製剤において選択された胆汁酸に、好ましい濃度及び好ましいｐＨ範囲で可溶性を与えるのに必要な量である。本発明の一部の実施形態において、ＵＤＣＡ析出を防止するために必要なＵＤＣＡに対するマルトデキストリンの最小重量比は、６：１（すなわち、水１００ｍｌ中、ＵＤＣＡ０．２ｇごとに１．２ｇ、ＵＤＣＡ１ｇごとに６ｇ、及びＵＤＣＡ２ｇごとに１２ｇ）とすることができる。本発明の一部の実施形態において、マルトデキストリンの最小量は、ケノデオキシコール酸２００ｍｇごとに３０ｇ、７―ケトリトコール酸２００ｍｇごとに１２ｇ、コール酸２００ｍｇごとに１０ｇ、及びデオキシコール酸２００ｍｇごとに５０ｇである。本発明の一部の実施形態において、本発明の水溶液剤形から胆汁酸の析出を防止するために必要なＵＤＣＡに対する液体グルコース（市販の低廉なコーンシロップ）の最小重量比は、約１６０：１（すなわち、水１００ｍｌ中、ＵＤＣＡ５００ｍｌごとに８０ｇ、及び水２００ｍｌ中、ウルソデオキシコール酸５００ｍｇごとに８０ｇ）とすることができる。高分子量水可溶性でんぷん転化物または可溶性非でんぷん多糖類の最小必要量は、主に濃度よりも溶液剤形での胆汁酸の絶対量によって決定される。
【００３５】
本発明の一部の実施形態において、剤形は、でんぷん転化物及び／または非でんぷん多糖類の他にも、サイクロデキストリンを含む。他の実施形態において、本発明の組成物は、サイクロデキストリン及びその誘導体を排除する。
【００３６】
本発明の一部の実施形態において、前記剤形は、食物繊維をさらに含む。食物繊維の非制限的な例としては、グアーゴム、ペクチン、オオバコ、オートゴム、ダイズ繊維、オーツ麦、コーン皮、セルロース及びふすまなどが挙げられる。
【００３７】
本発明の一部の実施形態において、前記剤形は、乳化剤をさらに含む。本発明の一部の実施形態において、乳化剤は、乳化剤及び懸濁剤を含む。乳化剤の非制限的な例としては、グアーガム、ペクチン、アカシア、カラギーナン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポビドン、トラガカントガム、キサンタンガム及びソルビタンエステルが挙げられる。
【００３８】
剤形が、その胆汁酸、でんぷん転化物、可溶性非でんぷん多糖類及び／またはその薬剤学的化合物を析出させない範囲として選択されるｐＨは、水系で得られる任意の範囲のｐＨレベルである。例えば、この範囲は、約ｐＨ１〜ｐＨ１４または約ｐＨ１〜ｐＨ１０である。一部の実施形態において、この範囲は、薬剤学的剤形が溶液中に維持されるのに充分な水系で得られる任意の下位セットのｐＨレベルである。例えば、薬物は、投与方法によって、製剤から溶液状態で体内に投与されて吸収される。したがって、組成物は、薬剤学的化合物が口腔、胃及び腸で優勢なｐＨレベルで析出されることなく、溶液状態で薬剤学的製剤として用いられる。本発明の一部の実施形態において、胆汁酸は、酸性条件下での胆汁酸の一般的な不溶性にもかかわらず、遊離胆汁酸として酸性条件下で溶解状態に置かれる。
【００３９】
薬剤学的化合物は、他の薬物に対する反応に（例えば、定量的及び定性的に）影響を及ぼす。例えば、定量的な効果は、胆汁酸との共同投与が、薬剤学的化合物の治療効果の強度を増大させる場合に起きる。定量的な効果は、例えば、胆汁酸との共同投与が、生体内の異なるか追加的な活性部分の生成を招く場合に起きる。
【００４０】
本発明によると、薬物の広範囲な用途が想定される。非制限的な例としては、ホルモン、ホルモン拮抗制、鎮痛剤、解熱剤、抗炎症薬物、免疫活性薬物、抗新生物性薬物、抗生物質、抗炎症剤、交感神経興奮剤、抗感染薬、抗腫瘍剤及び痲酔剤を含む。さらに、非制限的な例としては、胃腸管、肝、心血管系及び呼吸系統を標的とするか、胃腸管、肝、心血管系及び呼吸系統に影響を及ぼす薬物を含む。さらに、薬剤学的化合物の非制限的な例としては、インシュリン、ヘパリン、カルシトニン、アンピシリン、オクトレオチド、クエン酸シルディナフィル、カルシトリオール、ジヒドロタキステロール、アポモルヒネ、ヨヒンビン、トラザドン、アシクロビル、アマンタジン・ＨＣｌ、リマンタジン・ＨＣｌ、シドフォビル、メシル酸デラビルジン、ディダノシン、ファムシクロビル、フォスカルメットナトリウム（foscarmet  sodium）、フルオロウラシル、ガンシクロビルナトリウム、イドクスウリジン、インターフェロン―α、ラミブジン、ネビラピン、ペンシクロビル、リバビリン、スタブジン、トリフルリジン、バラシクロビル・ＨＣｌ、ザルシタビン、ジドブジン、インディナビル・Ｈ２ＳＯ４、リトナビル、ネルフィナビル・ＣＨ３ＳＯ３Ｈ、サクイナビル・ＣＨ３ＳＯ３Ｈ、ｄ―ペニシラミン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、アウロチオグルコース、金チオリンゴ酸ナトリウム、オーラノフィンレバミソール、ダカルバジン、イソプリノシン、メチルイノシンモノフォスフェート、ムラミールジペプチド、ジアゾキシド、ヒドララジン・ＨＣｌ、ミノキシジル、ジピリダモール
、イソクスプリン・ＨＣｌ、ナイアシン、ナイリドリン・ＨＣｌ、フェントラミン、ドキサゾシン・ＣＨ３ＳＯ３Ｈ、プラゾシン・ＨＣｌ、テラゾシン・ＨＣｌ、クロニジン・ＨＣｌ、ニフェジピン、モルシドミン、アミオダロン、アセチルサリチル酸、ベラパミル、ジルチアゼム、ニソルジピン、イスラジピン、ベプリジル、イソソルビド・ジニトレート、ペンタエリスリトール・テトラナイトレート、ニトログリセリン、シメチジン、ファモチジン、ニザチジン、ラニチジン、ランソプラゾール、オメプラゾール、ミソプロストル、スクラルフェート、メトクロプラミド・ＨＣｌ、エリスロマイシン、ビスマス化合物、アルプロスタジル、アルブテロール、ピルブテロール、テルブタリン・Ｈ２ＳＯ４、サルメテロール、アミノフィリン、ダイフィリン、エフェドリン、エチルノルエピネフリン、イソエタリン、イソプロテレノール、メタプロテレノール、ネドクロミル、オクストリフィリン、テオフィリン、ビトルテロール、フェノテロール、ブデソニド、フルニソリド、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、プロピオン酸フルチカゾン、コデイン、硫酸コデイン、リン酸コデイン、デキストロメトルファン・ＨＢｒ、トリアムシノロン・アセトニド、モンテルカストナトリウム、ザフィルルカスト、ジレウトン、クロモグリク酸ナトリウム、臭化イプラトロピウム、ネドクロミルナトリウムベンゾエート、ジフェンヒドラミン・ＨＣｌ、ヒドロコドン・二酒石酸塩、メタドン・ＨＣｌ、硫酸モルヒネ、アセチルシステイン、グアイフェネシン、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酒石酸カリウムアンチモン、グリセリン、抱水テルピン、パルミチン酸コルホスセリル、アトロバスタチン・カルシウム、セリバスタチン・ナトリウム、フルバスタチン・ナトリウム、ロバスタチン、プラバスタチン・ナトリウム、シンバスタチン、ピクロルハジアクロア（picrorrhazia  kurroa）、アンドログラフィスパニクラタ、モリンガオレイフェラ、アルピッツァレベック（albizzia  lebeck）、アドハトーダバシカ、クルクマ・ロンガ（curcuma  longa）、苦瓜（momordica  charantia）、ギムネマシルベスタ（gymnema  sylvestre）、ターミナリアアルジュナ（terminalia  arjuna）、アザデラクチャインディカ、ティノスポリアコルディフォリア（tinosporia  cordifolia）、メトロニダゾール、アムホテリシンＢ、クロトリマゾール、フルコナゾール、ハロプロジン、ケトコナゾール、グリセオフルビン、イトラコナゾール、テルビナフィン・ＨＣｌ、エコナゾール・ＨＮＯ３、ミコナゾール、ニスタチン、オキシコナゾール・ＨＮＯ３、スルコナゾール・ＨＮＯ３、セチリジン・２ＨＣｌ、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、コーチゾン、カテキン及びその誘導体、グリシルリジン、グリシルリジン酸、ベタメタゾン、酢酸フルドロコルチゾン、フルニソリド、プロピオン酸フルチカゾン、メチルプレドニゾロン、ソマトスタチン、リスプロ、グルカゴン、プロインシュリン、不溶性インシュリン、アカルボース、クロルプロパミド、グリピザイド、グリブライド、メトホルミン・ＨＣｌ、レパグリニド、トルブタミド、アミノ酸、コルヒチン、スルフィンピラゾン、アロプリノール、ピロキシカム、トルメチンナトリウム、インドメタシン、イブプロフ���ン、ジフルニサル、メフェナム酸、ナプロキセン及びトリエンチンが挙げられる。
【００４１】
本発明の組成物に含まれる薬剤学的化合物の追加例としては、本発明の剤形に追加される場合、可溶性になるか、溶解状態にある任意の化合物、（例えば、所望の反応を増幅させ、同一レベルの効果を達成するのに必要な容量を低下させ、作用のメカニズムを多様化させ、または、吸収を向上させることで）他の薬剤の効能を増進させる任意の化合物、及び（例えば、同一時刻及び／または異なる時刻に投与された）薬剤の毒性を減少させる任意の化合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の組成物が追加的な薬剤学的化合物を含む一部の実施形態によると、溶液中の胆汁酸は、アジュバント、担体または増強剤として作用する。例えば、胆汁酸は、追加的な薬剤学的化合物の治療効果または代謝を増進させられる。
【００４２】
一部の実施形態において、治療的活性剤としては、抗凝固剤（例えば、アニシンジオン、ジクマロール、ワルファリンナトリウム、クエン酸塩デキストロース溶液、ダナプロイドナトリウム（danaproid  sodium）、ヘパリンナトリウム）、繊維素溶解抑制剤（例えば、アミノカプロン酸、トラネキサム酸）、抗血小板化合物（例えば、チクロピジンＨＣｌ、重硫酸クロピドグレル、エプチフィバタイド、チロフィバンＨＣＬ）、カルシウムチャネル遮断剤（例えば、アムロジピン塩、ベプリジルＨＣＬ、ジルチアゼムＨＣＬ、フェロジピン、ニフェジピン）、コルチコステロイド（例えば、ベタメタゾン、デキサメタゾン、フルドロコルチゾン、フルニソリド、ヒドロコルチゾン）、神経節遮断剤（例えば、メカミラミンＨＣｌ、カンシル酸トリメタファン）、造血成長因子（例えば、エリトロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子）、止血性化合物（例えば、微細繊維性コラーゲン、吸収性ゼラチン、トロンビン）、酸化窒素ドナー（例えば、Ｌ―アルギニン、酸化窒素合成酵素阻害剤）、血栓溶解剤（例えば、アムシクシマブ（amciximab）、アルテプラーゼ、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ）、血管作用剤（例えば、ジアゾキシド、ヒドララジンＨＣｌ、ミノキシジル）、漢方薬（例えば、ダンセン（dan  shen）、デンズハンフア（dengzhanhua）、ディダンタン（didang  tang））、及び個別化合物（例えば、銀杏（ginkgo  biloba）、ルベルゾール、マンニトール溶液、ナフティドロフリ（naftidrofury）、ペントキシフィリン、プロペントフィリン、ペンチフィリンピラセタム、プロスタサイクリン、プエラリン、サンチ（sanchi）、テオフィリン、アミノフィリン、チリラザド、トリフルサール、ビンポセチン）が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００４３】
本発明の一部の実施形態は、ｐＨ調節剤によって実行される。非制限的な例としては、ＨＣｌ、リン酸、Ｈ２ＳＯ４、ＨＮＯ３、ＣＨ３ＣＯＯＨ、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、エデト酸（eidetic acid）、リン酸塩及びアルカリ性物質が挙げられる。
【００４４】
本発明の一部の実施形態において、剤形は、液体、固体、粉末または錠剤として投与されるように変形される。本発明の一部の実施形態において、剤形は、シロップ、濃厚シロップまたはペーストからなる。シロップの非制限的な例は、マルトデキストリンの濃度が１．０ｋｇ／リットル未満であるマルトデキストリン溶液である。濃厚シロップの非制限的な例は、マルトデキストリンの濃度が１．０ｋｇ／リットル以上、１．２ｋｇ／リットル以下の間であるマルトデキストリン溶液である。ペーストの非制限的な例は、マルトデキストリンの濃度が１．２ｋｇ／リットルを超えるマルトデキストリン溶液である。
【００４５】
本発明の組成物は、一部の実施形態において、補助治療、神経系合併症の治療、抗血栓療法、血栓溶解療法及び再組合組織型プラズミノゲン活性剤（ｒｔ―ＰＡ）療法を含むが、これらに限定されない他の脳卒中療法と関連しても投与される。
【００４６】
本発明の一部の実施形態によると、胆汁酸化合物と炭水化物を含む水溶液は透明である（すなわち、人の目に見える沈殿物がない）。一部の実施形態に係る透明度は、肉眼検査法及び／または分光光度法（文献：Dasta  JF  et  al.,Am.J.Hospital  Pharm.(1988)45:2361―2366）によって評価される。分光光度法が用いられる実施形態によると、吸光度は、制限なしに２６０ｎｍ、４００ｎｍ、５８０ｎｍ、６８０ｎｍ及び７２０ｎｍを含む任意の有用な波長で検出される。一部の実施形態において、本発明の溶液の吸光度は、胆汁酸化合物を含まない水単独または炭水化物を有する水と比較される。一部の実施形態において、選択された波長での比較による差は、０．１吸光度ユニット未満であるが、他のものでは、０．０５吸光度ユニット未満である。一部の実施形態において、前記差は、０．０１吸光度ユニット未満または０．００５吸光度ユニット未満である。
【００４７】
一部の実施形態において、本発明の胆汁溶液は、乾燥しているものである（“乾燥ｓ―ＵＤＣＡ”）。乾燥形態は、凍結乾燥、蒸発または当業界で知られた脱水のその他の手段によって胆汁酸組成物の溶液剤形から誘導される。本発明の溶液は、部分的に乾燥して半固体形態を生成する。前記溶液は、完全に乾燥して固体、粉末及び顆粒を形成する。一部の実施形態において、乾燥形態は、元の水分含有量の約２０％未満を有する。一部の実施形態において、乾燥形態は、元の水分含有量の約１０％未満を有する。一部の実施形態において、乾燥形態は、元の水分含有量の約５％未満を有する。一部の実施形態において、乾燥形態は、元の水分含有量の約１％未満を有する。一部の実施形態において、乾燥形態は、元の水分含有量の約０．２％未満を有する。一部の実施形態において、水溶液の乾燥形態は、実質的に水を含有しないこともある。乾燥形態は、流体プロセス、トレープロセス、スプレープロセス及び／または冷凍プロセスによって乾燥される。乾燥形態は、固体剤形として直接投与されるか、または、投与前に水と配合される。
【００４８】
一部の実施形態において、本発明の組成物は、２００１年２月５日付けにて出願された米国特許出願第０９／７７８，１５４号及び／または２００４年１１月２４日付けにて出願された米国特許第１０／９９６，９４５号に開示された方法によって製造される。これら二つの特許出願に開示された内容は、全体的に参照として本明細書に組み込まれている。
【実施例】
【００４９】
実施例１：可溶性ＵＤＣＡの製造
自然そのままのＵＤＣＡ、及び低いデキストロース当量を有する水可溶性でんぷんを含む可溶化ＵＤＣＡ（ｓ―ＵＤＣＡ）の透明な水溶液を製造した。要約すると、水酸化ナトリウムペレット６．４８ｇを精製水５００ｍｌに溶解させた。次に、ＵＤＣＡ６０ｇを室温で攪拌して前記水酸化ナトリウム溶液に溶解させた。次いで、前記透明な溶液に炭水化物（マルトデキストリン）４００ｇを少しずつ添加して攪拌した。得られた透明な溶液に、甘味料、防腐剤（及び／または甘味料及び香味料）を薬剤学的剤形に適した量で添加した。前記透明な溶液のｐＨを重リン酸ナトリウムで７〜７．５に調整した。精製水を添加し、総１０００ｍｌとした。必要であれば、前記透明な溶液を、ＧＰプラス（＋）メンブレイン及び０．２２μｍを有するステリカップフィルターユニットによってろ過することもできる。
【００５０】
実施例２：可溶性ＵＤＣＡの製造
自然そのままのＵＤＣＡ、及び低いデキストロース当量を有する水可溶性でんぷんを含む可溶化ＵＤＣＡ（ｓ―ＵＤＣＡ）の透明な水溶液を製造した。要約すると、水酸化ナトリウムペレット１．１ｇを精製水５００ｍｌに溶解させた。次に、ＵＤＣＡ１０ｇを室温で攪拌して前記水酸化ナトリウム溶液に溶解させた。次いで、前記透明な溶液に、炭水化物（コーンシロップ固形分）５００ｇを少しずつ添加して攪拌した。得られた透明な溶液に、甘味料、防腐剤（及び／または甘味料及び香味料）を薬剤学的剤形に適した量で添加した。前記透明な溶液のｐＨを重リン酸ナトリウムで７〜７．５に調整した。精製水を添加し、総１０００ｍｌとした。
【００５１】
この組成物のＣｍａxは２０．４μｇ／ｍｌであり、これは、米国ニュージャジー州のニューアーク市に所在するノバルティス・ファーマシューティカル社で製造されたアクティガル（actigall）に対して報告されたものより７倍高かった。この点については、文献［“Results  of  a  phase  I  multiple―dose  clinical  study  of  ursodeoxycholic  Acid"  Cancer  Epidemiol  Biomarkers  Prev.2004  May;13(5):861―7］からのデータを参照すればよい。また、この組成物は、アクティガルよりＴｍａｘが５．５倍短く、溶解度は２，５００倍高かった（５０ｇ／リットル）。下記の表１は、実施例２の剤形と他の剤形との比較を示す。
【００５２】
【表１】
2008511651.tif 000003
【００５３】
実施例３：可溶性ＵＤＣＡの製造
自然そのままのＵＤＣＡ、及び低いデキストロース当量を有する水可溶性でんぷんを含む可溶化ＵＤＣＡ（ｓ−ＵＤＣＡ）の透明な水溶液を製造した。要約すると、水酸化ナトリウムペレット２．２７ｇを精製水１００ｍｌに溶解させた。次に、ＵＤＣＡ２５ｇを室温で攪拌して前記水酸化ナトリウム溶液に溶解させた。次いで、精製水４００ｍｌに炭水化物（マルトデキストリン）７４５ｇを少しずつ添加し、溶解されるまで攪拌した。得られた透明な炭水化物溶液を前記ＵＤＣＡ溶液のナトリウム塩と配合して攪拌した。得られた透明な溶液に、甘味料、防腐剤（及び／または甘味料及び香味料）を薬剤学的剤形に適した量で添加した。前記透明な溶液のｐＨを重リン酸ナトリウムで６．５〜７．５に調整した。精製水を添加し、総１０００ｍｌとした。得られた溶液を真空（１．３×１０−１Ｐａ）下で９０〜９５℃で回転蒸発器で乾燥させ、可溶化ＵＤＣＡの乾燥粉末形態を得た。
【００５４】
実施例４：実験動物及び可溶性ＵＤＣＡ投与
体重約２５０ｇのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄ラット（Genomics）６３匹をケタミン（３０ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン塩酸塩（４ｍｇ／ｋｇ）で麻酔させ、顔面マスクを通して２０％酸素で換気させた。動脈のＰＣｏ２を３５〜４０ｍｍＨｇで維持し、パッドの加熱によって直腸温度を調節して約３７℃に維持した。ラットは、施術１日前、一晩中水に対する接近を自由にしたが、食物は供給しなかった。
【００５５】
管内糸閉塞法（intraluminal  thread  occlusion  method）によって局所ＭＣＡ（Focal  middle  cerebral  artery；中間大脳動脈）梗塞を誘発させた。要約すると、切開して左側頸動脈分岐部を露出させた。翼口蓋分岐を確認して結紮させた。シリコン被覆先端を有するナイロン縫合糸によって総頸動脈の閉塞を達成した。これは、中間大脳動脈の根源を遮断するまで、外頸動脈から内頸動脈の内腔中に進行された（文献：Yanaka  et  al.,1996,J.Neurosurg.85:125）。脳血流をモニターした結果、血流がベースラインに対して７５％ほど減少した場合、閉塞として見なされた。縫合糸を完全に除去することで、９０分後に再かん流が行われた。
【００５６】
ラットは５群に分離し、再かん流直後、各群に対してビヒクル（ｎ＝１８）、２５ｍｇ  ｓ−ＵＤＣＡ／ｋｇ（ｎ＝９）、１００ｍｇ  ＵＤＣＡ／ｋｇ（ｎ＝１８）、４００ｍｇ  ＵＤＣＡ／ｋｇ（ｎ＝９）及び４００ｍｇ  ＴＵＤＣＡ／ｋｇ（ｎ＝９）の静脈内単一注入を行った。
【００５７】
回復期間中、虚血を確認するために、ラットの前肢曲げ及び反対側旋回（circling）に対して評価した。ＭＣＡ閉塞後の如何なる時刻にも、実験の間に発作事例が観察されなかった。直腸温度は、フィードバック―調節加熱システムを用いて３７±０．５℃に維持された。麻酔から回復した後、食物と水に対する自由な接近を許容した。ラットは、実験期間中、２４±０．５℃で空気が換気されるケージ内で維持された。２週間後に、体重を調節するために、効果を示す２８日までペレットの量を３０ｇ／日に制限した。
【００５８】
実施例５：血しょう及び脳の胆汁酸分析
ｓ―ＵＤＣＡ、ＴＵＤＣＡまたはビヒクルを注入した後、１時間目に血液及び脳を回収し、胆汁酸分析のためにＨＰＬＣによって評価を行った。要約すると、全体の血液を取り出して凝集させ、遠心分離して血しょうを分離して冷凍させた。適切な無痛麻酔（５％の抱水クロラール）及びリン酸緩衝液のかん流後、脳を除去してフラッシュ-冷凍させ、−７０℃で保存した。遊離ＵＤＣＡ濃度をＨＰＬＣ（ＪＡＳＣＯ  ＨＰＬＣ胆汁酸分析システム）によって測定した。例えば、２００１年２月５日付けにて出願され、その全体内容が参照として本明細書に組み込まれている米国特許出願第０９／７７８，１５４号に基づいてＨＰＬＣによって胆汁酸を評価した。
【００５９】
結果は、下記の表２に表示されている。ビヒクルを注入した対照群動物の脳と異なって、ＵＤＣＡを注入した動物の脳でのＵＤＣＡ濃度は、ｓ―ＵＤＣＡの注入量によって増加した。ＴＵＤＣＡ
４００ｍｇを注入した動物よりも、ｓ―ＵＤＣＡ２５ｍｇを注入した動物の脳で一層高いＵＤＣＡ濃度が観察された。ビヒクルを注入した対照群動物の脳または血清では、遊離ＵＤＣＡが検出されなかった。
【００６０】
【表２】
2008511651.tif 000004
【００６１】
実施例６：行動検査
ロータロッド検査及びＭＬＰＴ（modified  limb  placement  test）を、既に説明したように（文献：Jeong  et  al.,2003,Stroke  34:2258）閉塞後の２日及び７日目に行った。要約すると、行動検査に割り当てられたラットは、ロータロッド検査（文献：Chen  et  al.,2001,Stroke  32:1005）での学習効果を緩和させるために、３日間、事前訓練させた。ロータロッド検査において、加速ロータロッドシリンダー（４〜４０ｒｐｍ）上にラットを置いた後、この動物がロータロッド上に留まる時間を３回測定した。
【００６２】
ロータロッド検査データは、内部ベースライン対照群（虚血前）に比べて、最大期間の百分率として図２Ａに表示されている。７日目に試験した場合、ビヒクルのみを与えられたラットは、ベースライン時間の３６．６％の間に前記シリンダー上に滞留した反面、ｓ―ＵＤＣＡ  １００ｍｇ／ｋｇを与えられたラットは、ベースライン時間の７６．３％の間に滞留した。
【００６３】
ＭＬＰＴは、触感及び固有刺激に対する反応をチェックして、前肢及び後肢の感覚運動の統合を評価する二肢置き（two  limb  placing）課業で構成されていた（文献：Jeong  et  al.,;Song  et  al.,2003,Stroke  34:2215）。まず、各ラットをテーブル上の１０ｃｍに懸けておき、そのテーブルに向かった前肢伸ばしを観察して評価した。正常伸ばし０点；非正常屈曲１点。次に、各ラットを前記テーブルの縁部に沿って位置させ、その前肢が前記縁部上に懸けられたテーブルから自由に動くようにした。各前肢（前肢―第２課業、後肢―第３課業）を徐々に下側に引っ張り、回復及び位置をチェックした。最後に、各ラットをテーブルの縁部に向かせた後、前肢の横方向位置に対してチェックした。前記三つの課業を次のような方式で点数化した。正常実行０点；遅延（２秒）及び／または不完全な実行１点；実行なし２点；７点は最大神経系欠陥を意味し、０点は正常実行を意味する。結果は、図２Ｂに表示されている。ビヒクルを単独で受けた動物は３．２点である反面、ｓ―ＵＤＣＡ１００ｍｇ／ｋｇを受けたラットは１．５点であった。
【００６４】
ｓ―ＵＤＣＡで処置された動物は、対照群動物よりも良好に実行した。また、ＵＤＣＡ
１００ｍｇを受けた動物群は、ＵＤＣＡ ２５ｍｇ及びＴＵＤＣＡ ４００ｍｇを受けた群より有意に良好な性能を示した。ｓ―ＵＤＣＡ １００ｍｇで処置された群は、対照群に比べてｓ―ＵＤＣＡ  ２５ｍｇ及びＴＵＤＣＡ  ４００ｍｇ群で少ない程度で、７日後にロータロッド及びＭＬＰＴに対する最上の実行を示した（図２を参照）。再かん流後２８日目に、ロータロッド実行は、予め訓練されたレベルの８０％向上を示した反面、ビヒクルのみが注入された対照群は、４０％を示した（データは表示省略）。初期の体重と、４週過程を経た後の体重は同一であった。
【００６５】
実施例７：梗塞体積
行動検査後に脳を除去し、ブレーンマトリックス装置を用いて全体の脳を通して１ｍｍ厚さの連続切片を切断した。次いで、各切片をナイセル（Nissl）によって染色した。各切片の梗塞した反対側領域での皮質、線条（striatal）及び半球体積を追跡し、画像分析システム（Ｉｍａｇｅ―Ｐｒｏ  ＰｌｕｓＴＭ、Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、米国メリーランド州シルバースプリング市に所在）を用いて測定した。コンピュータ画像分析システムを用いて損傷程度の定量化を決定した。これを達成するために、各切片のデジタル画像を獲得し、損傷部位には、ニッセルが減少しない領域の輪郭を探して線で描いた。深刻な壊死によって組織が実際に損失されて、境界線が直接評価されない場合は、損傷された脳の体積を推定するために反対側の輪郭を用いた。梗塞の総体積は、カバリエリ（Cavalieri）方法によって算出した。
【００６６】
梗塞と思われるはっきりとした薄い部位は、左側半球で見られる（図１Ａ）。２日目の梗塞体積は、特に皮質でｓ―ＵＤＣＡ１００ｍｇを受けた動物において著しく減少した（図１Ａ）。
【００６７】
２日目のｓ―ＵＤＣＡ １００ｍｇ処置群の平均梗塞体積（４１．０３±２９．２ｍｍ３）は、ビヒクルが注入された梗塞（９０．５９±３３．０３ｍｍ３、Ｐ＜０．０５）の半分未満であった（図１Ｂ）。同様の結果が、再かん流後７日目に観察された。対照群で８６．６４±１８．７８ｍｍ３、ｓ―ＵＤＣＡ ２５ｍｇ群で３９．０７±２６．３６ｍｍ３、ＵＤＣＡ１００ｍｇ群で２６．８７±２６．６３ｍｍ３（図１Ｂ）。ｓ―ＵＤＣＡ ４００ｍｇ群の動物の梗塞体積は、対照群の動物より少なかったが、この特定実験での差は、統計学的に有意性を有すると見なされない。
【００６８】
実施例８：ＴＵＮＥＬ染色
再かん流後２日及び７日目に、ＴＵＮＥＬ分析を用いて細胞自滅死細胞を定量化した。ＴＵＮＥＬは、ＤＮＡ分節検出キット（ｃａｔ．ｎｏ．：ＱＩＡ３３；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、米国マサチューセッツ州のボストン市に所在）を用いて達成した。３％のＨ２Ｏ２１００μｌ中に５分間浸漬した後、切片を湿潤室内のＴｄＴ標識化反応混合物（キットによって供給される）で３７℃で９０分間培養してから、停止緩衝液で３７℃で５分間培養した。切片をＰＢＳで洗浄し、遮断緩衝液（キットによって供給される）で室温で３０分間培養し、ジアミノベンジジン―Ｈ２Ｏ２溶液で着色し、メチルグリーンで対照染色を行った。形態学的基準によると、染色質凝縮によるＴＵＮＥＬ―陽性核及び断片核は、可能な細胞自滅死細胞として見なされ、核の拡散軟褐色標識化によるＴＵＮＥＬ―陽性細胞及び細胞質は、可能な怪死細胞として見なされた。
【００６９】
定量的検査は、ＴＵＮＥＬ染色で行われた。外側尾状核被殻（ｌａｔｅｒａｌ  ｃａｕｄｏｐｕｔａｍｅｎ）及び上部前頭頭頂皮質（ｕｐｐｅｒ  ｆｒｏｎｔｏｐａｒｉｅｔａｌ  ｃｏｒｔｅｘ）を分析のために選択したが、その理由は、これら二つの部位が虚血性損傷によって典型的に影響を受け、皮質脳機能減少の程度が異なるように表れるためである。したがって、このＭＣＡ閉塞モデルにおいて、外側尾状核被殻は虚血中心に該当し、前頭頭頂皮質は境界領域または半影部位に該当する。切片当り領域当り５個の非重畳顕微鏡フィールド及び脳当り２個の切片を、盲目的な調査者によって分析した。各領域での細胞自滅死細胞の数を高倍率（×４００）で計数し、これを個数／ｍｍ２として表現した。
【００７０】
標識化された組織の顕微鏡写真は、図３Ａに示されており、結果チャートは、図３Ｂに示されている。
【００７１】
図３Ａに示すように、ＴＵＮＥＬ―陽性細胞自滅死細胞は、再かん流後７日目に、全ての群の外側尾状核被殻及び前頭頭頂皮質で検出された（図３Ａ）。これら結果は、ｓ―ＵＤＣＡ  ２５ｍｇ投与群及びｓ―ＵＤＣＡ  １００ｍｇ投与群がＭＣＡ閉塞に対する半球の同一側でのＴＵＮＥＬ―陽性細胞の個数を有意に減少することを示す。
【００７２】
定量的な分析結果、ｓ―ＵＤＣＡ ２５ｍｇ投与群において、細胞自滅死細胞の約５０％減少を示した。また、一層高い容量、すなわち、ｓ―ＵＤＣＡ  １００ｍｇを投与した場合、細胞自滅死細胞の減少が約７０％に到達した。具体的に、ビヒクル対照群ラットは、フィールド当りＴＵＮＥＬ―陽性細胞数（ｈｉｔ）（以下、“ＨＥＰ”（ｈｉｔ  ｐｅｒ  ｆｉｅｌｄ）と称する）が６７．５であることに観察され（図３Ｂ）、これに対し、ｓ―ＵＤＣＡ  １００ｍｇ／ｋｇを受けたラットは、１６．７ＨＦＰを有することに観察された。細胞自滅死細胞は、スチューデントのｔ―検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ―ｔｅｓｔ）を用いて統計的に調査した。
【００７３】
実施例９：カスパーゼ活性度
再かん流後７日目に、単離用緩衝液で全体の脳を均質化し、ＤＥＶＤ―特異的カスパーゼ活性度に対して評価するために、４℃で１５分間溶解緩衝液（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．５％Ｔｒｉｔｏｎ―Ｘ１００）に直ちに置いた。次に、溶解物を１０００ｇで４℃で１０分間遠心分離し、上清液を１７，０００ｇで４℃で２０分間遠心分離した。次いで、ブラッドフォード方法（Bradford method）（Ｂｉｏ―Ｒａｄ、米国カリフォルニア州のリッチモンド市に所在）を用いて蛋白質濃度を求めた。カスパーゼ―３活性度分析のために、Ａｃ―ＤＥＶＤ―ＡＭＣ［Ｎ―アセチル―Ａｓｐ―Ｇｌｕ―Ｖａｌ―Ａｓｐ―ＡＭＰ（７―アミノ―４―メチルクマリン）］（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、米国カリフォルニア州のサンディエゴ市に所在）を用いて、９６―ウェルプレートの各ウェルに蛋白質２００μｇ、反応緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０％グリセロール、４ｍＭ  ＤＴＴ）２００μｌ及び再構成されたＡｃ―ＤＥＶＤ―ＡＭＣ５μｌ（１μｇ／μｌ）を添加した。この反応混合物を３７℃で１時間培養した。ＡＭＣ放出量は、３８０ｎｍ励起波長及び４６０ｎｍ放出波長で蛍光光度計（ＬＳ―５０Ｂ、Ｐｅｒｋｉｎ―Ｅｌｍｅｒ、米国マサチューセッツ州のウェルズリー市に所在）を用いて測定した。
【００７４】
図３Ｃの結果では、ｓ―ＵＤＣＡも、カスパーゼ―３の活性度を妨害することに示されたし、この活性度は、比色測定基質（colorimetric  substrate）ＤＥＶＤ―ｐＮＡを用いて測定した。ｓ―ＵＤＣＡ２５ｍｇ及び１００ｍｇを投与した群は、再かん流後７日目に減少したカスパーゼ―３活性度を示した。“*”は、Ｐ＜０．０５を示し、これは、ＡＮＯＶＡによる分析後、フィッシャーの保護された最小有意差検定（Fisher's  protected  least  significant  difference  test）を施行したように、対照群と虚血後の群との間に有意差を構成した。カスパーゼ―３活性度は、再かん流後７日目に、対照群（０．５６±０．５１、ｎ＝３）に比べてｓ―ＵＤＣＡ  １００ｍｇ群（１．７２±０．３２、ｎ＝３）において有意に減少したことが確認された。また、カスパーゼ活性度は、ｓ―ＵＤＣＡ  ２５ｍｇまたはｓ―ＵＤＣＡ  ４００ｍｇが注入された動物において減少したが、ｓ―ＵＤＣＡ  ４００ｍｇによる減少は、この実施例において統計学的に有意でないであろう。
【００７５】
実施例１０：ウエスタンブロット分析
任意の神経保護効果をさらに評価するために、再かん流後７日目にウェスタンブロットによってｅＮＯＳ発現を評価した。その結果は、図４に示されている。
作用の如何なるメカニズムにも制限されることなく、前記結果は、ｓ―ＵＤＣＡが、細胞自滅死の阻害及びｅＮＯＳ発現の増大を通して、虚血性脳卒中後に梗塞体積を減少させると同時に、機能回復を増強させられることを示す。一部の実施形態において、１００ｍｇ  ＵＤＣＡ／ｋｇ容量は、一層効果的である反面、４００ｍｇ  ＵＤＣＡ／ｋｇ容量は、高い死亡率と関連している。具体的な一部の実施形態において、マルトデキストリンによる増加した溶液粘度は、増加した死亡率と関連している。一部の実施形態によると、ｓ―ＵＤＣＡは、脳と血液でのＵＤＣＡ濃度と相互関連を有する。しかし、ＵＤＣＡ濃度は、ＴＵＤＣＡ注入後に脳でやや増大したが、ＵＤＣＡ及びＴＵＤＣＡ投与後に、ＴＵＤＣＡは脳だけでなく血液でも検出されなかった。
【００７６】
実施例１１：生理的パラメーター
対照群、ｓ―ＵＤＣＡ ２５ｍｇ群及びｓ―ＵＤＣＡ  １００ｍｇ群の動物は、全て１週間後の手術にもかかわらず生き残った。しかし、ｓ―ＵＤＣＡ  ４００ｍｇ群は、粘性ｓ―ＵＤＣＡ溶液の静脈内注射による血管閉塞によって頻繁に呼吸困難及び死亡（死亡率７５％）する結果となった。これは、剖検によって確認された。生き残った動物中、平均動脈血圧、血液ガス、血清グルコース及び体温を含む生理的パラメーターは、梗塞前、梗塞中または梗塞後に如何なる実験群でも有意差がなかった。
【００７７】
実施例１２：統計学的分析
データは、平均±標準偏差として提供された。生理的変数の統計学的分析は、１次元分散分析を用いて行った。スチューデントのｔ―検定は、各群間の梗塞体積及び細胞自滅死細胞の数における任意の差の有意性を求めるために用いた。カスパーゼ―３活性度のレベルは、分散分析に引き続き、フィッシャーの保護された最小有意差検定によって調査した。０．０５より小さいＰ値は、有意なものとして見なされた。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１Ａ】ナイセルによって染色されたラットの脳の冠状断面を示した図である。
【図１Ｂ】再かん流後２日及び７日目の梗塞体積を示したグラフである（データは、平±標準偏差として示す（ｎ＝６））。
【図２Ａ】ロータロッド検査（Rotarod test）の結果を示したグラフである（各群には、９匹のラットがあり、”＊”は、Ｐ＜０．０５を示す。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  検定）。
【図２Ｂ】ＭＬＰＴ（modified limb placing test）結果を示したグラフである（各群には、９匹のラットがあり、“＊”は、Ｐ＜０．０５を示す。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  検定）。
【図３Ａ】ＴＵＮＥＬ標識化後の虚血性半影部位での細胞を示した顕微鏡写真である。
【図３Ｂ】反対側及び同一側半球でのフィールド当りＴＵＮＥＬ陽性細胞の数を示したグラフである（データは、平均±標準偏差（棒）数値として示す）。
【図３Ｃ】各処置群で観察されたカスパーゼ活性度（任意の単位）を示したグラフである（データは、平均±標準偏差として示す）。
【図４】ウエスタンブロット（Western Blot）分析によって測定されたｅＮＯＳ発現を表示した図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【国際調査報告】
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