(57)【要約】  哺乳動物被験体に導入されると硬組織を産生し得る組成物が提供され、そしてこの組成物は、ａ）ｉ）キトサン並びにｉｉ）ヘパリン、ヘパラン硫酸及びデキストラン硫酸からなる群より選択される負電荷の多糖、のイオン性複合体、並びにｂ）硬組織を産生する増殖因子を包含し、このイオン性複合体は、この硬組織を産生する増殖因子のキャリアである。また、この組成物を用いた骨移植片代替物をインビトロ調製する方法、この方法を実施するキット、並びに硬組織の産生を必要とする哺乳動物被験体中で硬組織を産生させるための医療装置の調製におけるこの組成物の使用、及び硬組織の産生を必要とする哺乳動物被験体に所望の部位で硬組織を産生させる方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物被験体に導入されると硬組織を産生し得る組成物であって、この組成物は、以下：
ａ）ｉ）キトサン；並びにii）ヘパリン、ヘパラン硫酸及びデキストラン硫酸からなる群より選択される負電荷の多糖；のイオン性複合体、並びに
ｂ）硬組織を産生する増殖因子
を包含し、該イオン性複合体が、該硬組織を産生する増殖因子のキャリアである、上記組成物。
【請求項２】
イオン性複合体において、キトサンによって寄与される正電荷数が、負電荷の多糖によって寄与される負電荷数よりも多い、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
硬組織を産生する増殖因子が、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９及びＢＭＰ−１４からなる群より選択される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
硬組織を産生する増殖因子がＢＭＰ−２である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
負電荷の多糖がヘパリンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
キトサン：ヘパリンの質量比が、およそ１：２〜およそ１０：１である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
キトサン：ヘパリンの質量比が、およそ１：１〜およそ５：１である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
キトサン：ヘパリンの質量比が、およそ２：１〜およそ５：１である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
キトサン：ヘパリンの質量比が、およそ３：１〜およそ４：１である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
キトサン：ヘパリンの質量比が、およそ２：１〜およそ３：１である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
キトサンが、およそ５０％〜およそ９８％の脱アセチル化度を有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
キトサンが、およそ８０％〜およそ９０％の脱アセチル化度を有する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
硬組織を産生する増殖因子の含量が、イオン性複合体及び硬組織を産生する増殖因子の総重量に基づいて、およそ０.１質量％〜およそ１０質量％、好ましくはおよそ０.５質量％〜およそ５質量％である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
イオン性複合体がゲルの形態である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
硬組織を産生する増殖因子が、ゲル１ｍｌ当たりおよそ５μｇ〜およそ５００μｇの濃度、好ましくはゲル１ｍｌ当たりおよそ１μｇ〜およそ１００μｇの濃度で存在する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
イオン性複合体が凍結乾燥体形態である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
硬組織を産生する増殖因子が、凍結乾燥体１ｍｇ当たりおよそ１μｇ〜およそ５０μｇの濃度、好ましくは凍結乾燥体１ｍｇ当たりおよそ２μｇ〜およそ２５μｇの濃度で存在する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
骨移植片代替物をインビトロ調製する方法であって、この方法は、
ａ）ｉ）キトサン；並びにii）ヘパリン、ヘパラン硫酸及びデキストラン硫酸からなる群より選択される負電荷の多糖；のイオン性複合体を提供する工程、
ｂ）該イオン性複合体を、所望の形状の骨移植片代替物に成形する工程、そして
ｃ）該イオン性複合体を、該所望の形状を有する固体又は半固体の骨移植片代替物構造にする工程
を包含し、
この方法はまた、硬組織を産生する増殖因子をこのイオン性複合体に添加する工程を包含する、
上記方法。
【請求項１９】
工程ｂ）及び工程ｃ）が鋳型中で行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
イオン性複合体を凍結乾燥体に凍結乾燥することをさらに包含する、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
硬組織を産生する増殖因子を添加する工程が、凍結乾燥体上へこの増殖因子溶液を吸着させることを包含する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
硬組織を産生する増殖因子が、請求項３、４及び１３のいずれか１項に定義される通りである、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
負電荷の多糖が請求項５に定義される通りである、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
キトサンが請求項１１又は１２に定義される通りである、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
イオン性複合体が請求項２、６〜１０及び１４〜１７のいずれか１項に定義される通りである、請求項１８〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
−ｉ）キトサン；並びにii）ヘパリン、ヘパラン硫酸及びデキストラン硫酸からなる群より選択される負電荷の多糖；のイオン性複合体を含む第一の容器、
−硬組織を産生する増殖因子を含む第二の容器、並びに
−請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の方法を実施するための指示書
を包含するキット。
【請求項２７】
硬組織を産生する増殖因子が、請求項３、４及び１３のいずれか１項に定義される通りである、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
負電荷の多糖が請求項５に定義される通りである、請求項２６又は２７に記載のキット。
【請求項２９】
キトサンが請求項１１又は１２に定義される通りである、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３０】
イオン性複合体が請求項２、６〜１０及び１４〜１７のいずれか１項に定義される通りである、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３１】
硬組織の産生を必要とする哺乳動物被験体中で硬組織を産生させるための医療装置の調製における、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項３２】
硬組織が骨組織である、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
被験体が脊椎円板変性、非治癒性の長骨骨折、手術又は外傷に起因した骨の損失及び先天性の骨欠損から選択される状態を患う、請求項３１又は３２に記載の使用。
【請求項３４】
被験体が移植に関連して骨形成の増強を必要とする、請求項３１又は３２に記載の使用。
【請求項３５】
被験体が骨再構成を必要とする、請求項３１又は３２に記載の使用。
【請求項３６】
硬組織の産生を必要とする哺乳動物被験体に所望の部位で硬組織を産生させる方法であって、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の有効量の組成物を、この組成物がその生物学的機能を発揮できるような条件下で、該部位に投与して、硬組織を該部位で産生させることを包含する、上記方法。
【請求項３７】
硬組織が骨組織である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
被験体が、脊椎円板変性、非治癒性の長骨骨折、手術又は外傷に起因した骨の損失及び先天性の骨欠損から選択される状態を患う、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
被験体が移植に関連して骨形成の増強を必要とする、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項４０】
被験体が骨再構成を必要とする、請求項３６又は３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増殖因子組成物の分野、及び特に好適なキャリア中の硬組織を産生する増殖因子の提供に関する。本発明はさらに、硬組織再構成の分野、及び移植片、例えば骨移植片代替物の作製に関する。
【背景技術】
【０００２】
増殖因子
増殖因子は、細胞表面上の糖衣の受容体に結合するタンパク質であり、主に細胞増殖及び／又は分化の活性化をもたらす。多くの増殖因子はかなり万能で、多くの異なる細胞型において細胞分裂を刺激するが、一方他の増殖因子は、特定の細胞型に特異的である。ヘパラン硫酸は、最も周知かつ十分に研究された増殖因子の受容体である。ヘパラン硫酸は、ほとんどすべての哺乳動物細胞の表面上に存在する（例えば、シンデカン、パールカン、グリピカン）。これらのヘパラン硫酸の炭水化物部分は、高度に荷電した（硫酸化）異種多糖である。この多糖（グリコサミノグリカン又はＧＡＧ）は、複合糖質の特異的な生物学的活性を担い、そしてとりわけ結合の際に増殖因子に利用される。
【０００３】
増殖因子の例としては、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）が挙げられる。ＢＭＰは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する分泌タンパク質である。ＢＭＰは、本来無機質が脱落した骨から同定及び精製され、そして筋肉の異所性部位に骨形成を誘導する能力によって特徴付けられた。ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４の分子クローニングは、これらの分子の骨誘導性能力を確認した。大半のＢＭＰは骨に見出され、そして骨形成原細胞の拘束及び分化に不可欠な媒介物である。いくつかのインビトロモデルにおいて、ＢＭＰは、骨形成系統への間葉細胞の分化を開始させ、そして２つの骨関連マーカーであるオステオカルシン及びアルカリホスファターゼの発現を誘導することを示している。いくつかのインビトロ及びインビボ研究は、組換えヒト（ｒｈ）ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９及びＢＭＰ−１４の骨誘導性能力を実証している。
【０００４】
硬組織を産生する増殖因子のキャリア
多くの増殖因子の効果と同様に、異なるＢＭＰの骨誘導効果は、送達媒体に非常に左右される。ＢＭＰは、体液に容易に拡散する水溶性の二量体タンパク質である。キャリアを伴わずにインビボで局所的に投与されると、このＢＭＰは、置かれた部位に数分を超えて耐えられない。ＢＭＰの臨床使用の可能性が確認され、そして種々のキャリアが、実験的及び臨床的の両方で研究されているため（例えば、「Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、Ｃｈｅｎ  ＲＲ及びＭｏｏｎｅｙ  ＤＪ、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２０（８）：１１０３−１２（２００３）に概説される）、キャリアの必要性が認識されている。ＢＭＰキャリアは、無機塩、天然に存在する高分子物質、合成高分子並びに合成高分子及び天然に存在する高分子の複合体に大まかに分類され得る。理想的なキャリアは、炎症応答も誘導せず、免疫反応も引き起こすべきではない。キャリアの分解は、毒性の残留物をもたらすべきでない。理想的には、キャリアは、骨の治癒と同時に吸収され、残留物を残すべきではない。現在コラーゲンは、最も一般的に使用されるＢＭＰのキャリアであり、そして１型コラーゲンが好ましい。１型コラーゲンは、皮膚、骨、腱及び靭帯から得られ得る。ウシコラーゲンは、臨床背景において多くの増殖因子のキャリアとして現在使用されており、そしてＦＤＡによってヒトへの使用が承認されている。ＢＭＰは、軸方向荷重により、そして圧力下でコラーゲンから容易に押し出され得るので、椎体間融合のためのケージに収容されなければならない。骨形成タンパク質−１（ＯＰ−１、またＢＭＰ−７ともいわれる）を含む製品は、キャリアとして骨由来のコラーゲンを利用する。このコラーゲンは、おそらく水素結合を通じてＢＭＰに強力に結合する。ＢＭＰのキャリアとしての無機質が脱落した骨基質は、免疫原性の危険性及び疾患伝染の危険性が理由で支持を得ていない。増殖因子のキャリアと考えられている他の天然の高分子は、ヒアルロン酸、フィブリン、キトサン、アルギン酸塩及び他の動物由来又は植物由来の多糖である。これらのうちのどれも、ヒトへの使用に対する承認をまだ得ていない。増殖因子のキャリア物質として提案される別のカテゴリーの合成高分子は、供給が無制限であること、抗原性が低いか又はないこと、分解生成物が予測可能であること、そして疾患伝染の危険性がないという利点を有する。ポリグリコール酸誘導体及びポリ乳酸誘導体のような合成高分子が研究されているが、それらの分解生成物は、巨細胞反応を生じ得、そしてこれらの合成高分子へのＢＭＰの結合親和性は良好ではない。
【０００５】
増殖因子の安定化及び増強
ヘパラン硫酸に構造的に関連するグリコサミノグリカンであるヘパリンは、ＢＭＰを含む多数の増殖因子の機能的活性を安定化及び増強することが公知である。これは上述したように、これらの増殖因子が受容体としてヘパリン硫酸を利用するという事実におそらく起因している。ヘパリン及びヘパラン硫酸へのタンパク質の結合は、極めて特異的であり、そして両方の多糖に存在する独特の配列の単糖単位を必要とする。
【０００６】
ヘパリンをＢＭＰの安定剤及び活性化剤として使用する可能性が研究されているが、この試みは、一応の成功しか得ていない。一応の成功という理由は、出血合併症が現れることと、インビボでのヘパリンの耐久性が短いことである。平均してヘパリンは、血中及び他の組織中で９０分未満の半減期を有する。
【０００７】
ヘパリン
ヘパリンは市販される多糖であり、哺乳動物組織（ブタ粘膜又はウシ肺）から単離される。１９１６年にＪａｙ  ＭｃＬｅａｎによって発見されて以来、ヘパリンは、抗凝血性質が認められている。ヘパリンは、抗凝血剤及び抗血栓剤として５０年以上も臨床的に使用されている。ヘパラン硫酸と対照的に、ヘパリンは、マスト細胞の好塩基顆粒にしか存在しない。今日ヘパリンは、抗凝血剤及び／又は抗炎症剤としてクリニックで広範に使用されている。
【０００８】
ヘパリン及びヘパラン硫酸といったグリコサミノグリカンは、Ｄ−グルコサミン並びにウロン酸残基（Ｌ−イズロン酸及びＤ−グルクロン酸）の交互の繰り返しから形成される。これらは、高度に荷電した（硫酸化）異種多糖である。
【０００９】
キトサン
多糖であるキチンは、まさにセルロースの次に最も豊富な有機化合物である。商業的には、キチンは、カニ及びエビの殻から主に得られる。キチンは、規則的な構造を有し、そしてβ−１,４−結合したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基から構成される。キトサンは正に荷電しており、そして例えば強塩基でのキチンの処理を介して、キチンの部分的なＮ−脱アセチル化によって得られる。
【００１０】
インビボでキトサンは、リゾチーム及び他のグリコサミノダーゼ（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｄａｓｅ）によってモノマー及びオリゴマーに分解される。Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基が豊富なキトサンは、Ｄ−グルコサミン残基を高い割合で有するキトサンよりも、インビトロ、そしておそらくまたインビトロでより速く分解される。
【００１１】
キトサンは、増殖因子の送達媒体として提唱されている（例えば、以下で議論される米国特許第６１２４２７３号を参照のこと）。しかし、キトサンは血液凝固を引き起こすことが示されているので、懸念が存在する。キトサンは、外傷の出血を減少させるための応急的な包帯として米国ＦＤＡに承認されている。従って、増殖因子の媒体としてキトサンを単独で使用することは制限され得る。なぜなら、キトサンは潜在的に、移植部位の血栓形成及び壊死性細胞死を誘導し得るからである。
【００１２】
従来技術
米国特許第５８９４０７０号は、硬組織の再生を刺激するために、硬組織に不動化されたキトサン及び多糖を含む物質を使用することを記載している。この多糖は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸及びデキストラン硫酸から選択される。この文書に記載される実験は、骨再生の刺激に関して、任意のさらなる成分を欠くキトサン−ヘパリン組成物の使用を可能にする。
米国特許第６１２４２７３号は、例えば、増殖因子の送達キャリアとしてヒドロゲル形態のキトサンを用いて、インビボで活性物質を徐放する系を記載している。
【００１３】
韓国公開ＫＲ２００３０１１４０７のＷＰＩ要約書第２００３−７５３２９５は、ゲル形成剤、例えばキトサン；骨形成タンパク質；抗生物質；及び疼痛軽減剤を含む組成物を記載している。この組成物は、ぞうげ質形成剤としての使用が意図される。
【００１４】
米国特許出願公開２００３／０１５８３０２は、液体成分及び固体成分を含む自己形成性の無機質−高分子ハイブリッド組成物を開示している。この液体成分は、副成分としてキトサンを含み得る。この組成物は、増殖因子、例えば骨形成タンパク質をさらに含み得る。
【００１５】
米国特許第６７７３７２３号及び同第６９３６２７６号は、組織再生に有用な２つの高分子層を含む生分解性マトリックスを記載している。薬物、増殖因子、ポリペプチド、タンパク質、ｃＤＮＡ、遺伝子構築物及び他の生理活性治療物質が、このマトリックスに包含され得る。この二重層のマトリックスは、少なくとも２つの多孔性高分子層を含み、これらの層は、組成、密度及び多孔率が異なり、その結果、成長中の組織環境内で異なる性質を有する。この２つの高分子層は、互いに別々に調製される。別個の層の形成に使用する高分子の例として、多くの異なる高分子、例えばキトサン及びヘパリンについて言及されている。キトサン及びヘパリンのイオン性複合体については言及されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、例えば硬組織の産生を目的として、硬組織の産生を必要とする被験体に硬組織を産生する増殖因子を送達するための新規かつ効率的な技術の提供を主要な目的として有する。
本発明の第二の目的は、硬組織を産生する増殖因子の送達のための処方物を提供することであり、この処方物は、この硬組織を産生する増殖因子を安定化させ、そして臨床的局面でその効果を促進するか、又はそうでなければ、例えば新しい骨組織を再生する効果を促進するように作用する。
本発明の第三の目的は、硬組織を産生する増殖因子を含む処方物を提供することであり、これは、投与時に処置部位に実質的に残留するように設計され得る。
本発明の第四の目的は、硬組織を産生する増殖因子の処方物を作製することであり、これは、投与領域の再生されるべき硬組織の形状を擬態するように成形され得る。
本発明の第五の目的は、硬組織、例えば骨又は軟骨をインビボ及びインビトロで再生する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
これらの目的及び他の目的について、本発明は、第一の局面において、哺乳動物被験体に導入されると硬組織を産生し得る組成物を提供し、この組成物は、以下：
ａ）ｉ）キトサン並びにii）ヘパリン、ヘパラン硫酸及びデキストラン硫酸  からなる群より選択される負電荷の多糖、のイオン性複合体、並びに
ｂ）硬組織を産生する増殖因子
を包含し、このイオン性複合体は、この硬組織を産生する増殖因子のキャリアである。
【００１８】
従って、キトサン及び負電荷の多糖のイオン性複合体が、増殖因子のキャリアとして有利に使用され得ることが本発明者らによって見出されている。負電荷の多糖及びキトサンの溶液が混合されると、イオン性複合体が直ちに形成され、そして沈殿する。驚くべきことに、キトサンは、負電荷の多糖をインビボでの酵素的分解から保護し、そしてそれによって負電荷の多糖の半減期が著しく延びることが見出された。予想外に、増殖因子は、キトサン及び負電荷の多糖のイオン性複合体に包含されると、より長い期間にわたって安定化される。
【００１９】
背景の節で言及されるように、この負電荷の多糖であるヘパリンは、ヘパリン自身だけで哺乳動物組織に導入されると、あまり大きくない濃度でさえ出血合併症を引き起こし得る。キトサンを含むイオン性複合体において、ヘパリンは、イオン結合によってキトサンに固く結合しており、これは、出血合併症の危険性が相当減少することを意味する。言及されるように、キトサンは、移植されると血栓形成及び壊死性細胞死を誘導し得る。しかし、負電荷の多糖及びキトサンの組み合わせは、血小板の接着及び活性化を阻害することが実証された。従って、キトサン及び負電荷の多糖のイオン性複合体は、移植可能又は注入可能なキャリア若しくはマトリックスとして有利であることが見出され、これは、血栓形成の危険性を減少させる。
【００２０】
要約すると、増殖因子のキャリアとしてのキトサン及び負電荷の多糖の本発明のイオン性複合体の利点のいくつかは、以下の通りである：
−この負電荷の多糖は、このイオン性複合体中ののキトサンによって安定化され、そしてその酵素的分解は相当に遅れる；
−この負電荷の多糖は、キトサンの血液凝固作用の危険性を減少又は排除する；
−キトサンは、この負電荷の多糖の抗凝血性質を不活性化するので、出血合併症の危険性を減少又は排除する。
【００２１】
本発明のこの局面の組成物の好ましい実施態様において、このイオン性複合体において、このキトサンによって寄与される正電荷数は、この負電荷の多糖によって寄与される負電荷数よりも多い。負電荷の多糖に比べて荷電に関して過剰にキトサンを有する本発明の組成物のこの実施態様の投与の際に、この組成物は処置部位に不動化される。なぜならこれは、一般にすべての細胞は負電荷だからである。処置されるべき部位でのこの組成物の不動化は、増殖因子の徐放及び局所放出をもたらし、そして負電荷の多糖を獲得する。
【００２２】
本発明の組成物中の硬組織を産生する増殖因子の非限定的な例は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９及びＢＭＰ−１４からなる群より選択される。これらの中で、好ましい増殖因子はＢＭＰ−２である。
【００２３】
本発明の組成物の好ましい実施態様において、この負電荷の多糖は、ヘパリンである。従ってこの実施態様において、本発明の組成物は、増殖因子を保有するキトサン−ヘパリンのイオン性複合体からなる。このようなイオン性複合体において、キトサン：ヘパリンの質量比は、およそ１：２〜１０：１、例えばおよそ１：１〜およそ５：１、例えばおよそ２：１〜およそ５：１であり得る。より特定の間隔の例は、およそ３：１〜およそ４：１、及びおよそ２：１〜およそ３：１である。このイオン性複合体中のキトサン：ヘパリンの質量比は、この複合体の物理的特性、特にレオロジー的性質、及び接着力に影響を及ぼす。さらに、キトサンの量よりも２倍を超えて過剰なヘパリンを有することは、ヘパリンに起因した望まれない抗凝血作用という本質的な危険性を引き起こす。上記で与えられる範囲は、当業者がこの組成物が使用される特定の状況に基づいて最適比を見出すためのガイドラインとみなされるべきである。
【００２４】
本発明の組成物の実施態様において、このイオン性複合体キャリア中のキトサンは、およそ５０％〜およそ９８％、例えばおよそ５０％〜およそ９５％、例えばおよそ８０％〜およそ９０％の脱アセチル化度を有し得る。この脱アセチル化度は、キトサンの溶解度及びその分解速度に影響を及ぼす。上記の好ましい範囲は、当業者がこの組成物が使用される特定の状況に基づいて最適な脱アセチル化度を見出すためのガイドラインである。
【００２５】
本発明の組成物に使用する増殖因子の濃度は、広い範囲内で変化し得る。例えば、この硬組織を産生する増殖因子の含量は、このイオン性複合体及び硬組織を産生する増殖因子の総重量に基づいて、およそ０．１質量％〜およそ１０質量％、好ましくはおよそ０．５質量％〜およそ５質量％であり得る。
【００２６】
キトサン及び負電荷の多糖のイオン性複合体は、任意の物理的形態に処方され得る。好ましい実施態様において、この複合体はゲル形態である。ゲル形態の複合体の場合、この増殖因子は、ゲル１ｍｌ当たりおよそ５μｇ〜およそ５００μｇの濃度、好ましくはゲル１ｍｌ当たりおよそ１μｇ〜およそ１００μｇの濃度で存在し得る。
【００２７】
なおより好ましい実施態様において、この複合体は凍結乾燥体形態である。凍結乾燥体形態の複合体の場合、この硬組織を産生する増殖因子は、凍結乾燥体１ｍｇ当たりおよそ１μｇ〜およそ５０μｇの濃度、好ましくは凍結乾燥体１ｍｇ当たりおよそ２μｇ〜およそ２５μｇの濃度で存在し得る。凍結乾燥形態のキトサン及び負電荷の多糖のイオン性複合体は、乾燥した海綿様の外観を有する。凍結乾燥前に増殖因子を含むか又は含まない複合体を成形することにより、任意の所望の形状のこのような海綿様の凍結乾燥体を調製し得る。前もって添加されない場合、硬組織を産生する増殖因子の溶液がこの凍結乾燥体上に吸着されて、本発明の組成物を提供し得る。
【００２８】
驚くべきことに、本発明のこの実施態様の組成物、すなわち例えば海綿様構造の形態で、凍結乾燥体キャリア中に増殖因子を含む組成物は、本発明の組成物の他の物理的形態の効果よりも有利な効果を示す。増殖因子の効果に対するこの物理的形態の驚くべき影響は、以下の実施例において増殖因子ＢＭＰ−２について実証される。凍結乾燥形態のイオン性複合体を使用する利点は、硬組織形成が、大きさ及び形態に関して移植された「海綿」によって定められるという事実に起因すると考えられる。このタイプのキャリアを使用することにより、骨形成の無制御な拡散が回避され、これは、多くの適用において決定的に重要である（例えば、Ｐｏｙｎｔｏｎ  ＡＲ及びＬａｎｅ  ＪＭ、Ｓｐｉｎｅ  １５；２７（１６  補遺１）：Ｓ４０−８（２００２）を参照のこと）。
【００２９】
本発明のさらなる局面において、本発明の第一の局面の組成物の有利な性質は、骨再構成の分野に応用される。
従って、本発明の第二の局面は、骨移植片代替物をインビトロ調製する方法を提供し、この方法は、以下：
ａ）ｉ）キトサン並びにｉｉ）ヘパリン、ヘパラン硫酸及びデキストラン硫酸からなる群より選択される負電荷の多糖、のイオン性複合体を提供し、
ｂ）このイオン性複合体を、所望の形状の骨移植片代替物に成形し、そして
ｃ）このイオン性複合体を、この所望の形状を有する固体又は半固体の骨移植片代替物構造に固める工程を包含し、
この方法はまた、硬組織を産生する増殖因子をこのイオン性複合体に添加する工程を包含する。
【００３０】
この硬組織を産生する増殖因子は、この方法の任意の段階でこの複合体に添加され得る。例えばこの硬組織を産生する増殖因子は、工程ａ）の後に直接、すなわちキトサン及び負電荷の多糖の混合後に直接この複合体に添加され得る。この場合、キャリア及び硬組織を産生する増殖因子の混合物は、この組成物を固体又は半固体の骨移植片代替物構造に成形する前に完成する。あるいはこの硬組織を産生する増殖因子は、固体又は半固体の骨移植片代替物構造を固める間又は後に、例えば工程ｂ）の直後の工程において、工程ｃ）の間、又は工程ｃ）の後に添加され得る。この組成物の成分の貯蔵安定性の理由のために、硬組織を産生する増殖因子を添加せずにこの固体又は半固体の骨移植片代替物構造を第一に調製し、そして引き続いて骨移植片代替物を臨床使用する直前に、硬組織を産生する増殖因子を添加することが有利であり得る。
【００３１】
この操作は、イオン性複合体が凍結乾燥体に凍結乾燥される本発明のこの局面の実施態様により例示される。この凍結乾燥体は、乾燥した海綿様固体の形態を採用し得る。この骨移植片代替物の成形は、凍結乾燥の前又は後、及び硬組織を産生する増殖因子を添加する前又は後に行われ得る。本発明のこの局面の方法において、本発明の組成物の凍結乾燥体、例えば海綿様構造の形態でのこのような使用は、イオン性複合体及び硬組織を産生する増殖因子の組成物を凍結乾燥体という物理的形態で有する驚くべき有利な効果を利用するさらなる利点を有する。
【００３２】
本発明の方法の工程ｂ）及び工程ｃ）は、鋳型中で有利に行われ得る。
本発明の第三の局面において、以下：
−ｉ）キトサン並びにii）ヘパリン、ヘパラン硫酸及びデキストラン硫酸からなる群より選択される負電荷の多糖、のイオン性複合体を含む第一の容器；
−硬組織を産生する増殖因子を含む第二の容器；並びに
−本発明の第二の局面の方法を実施するための指示書
を包含するキットが提供される。
【００３３】
本発明のこの局面のキットは、骨移植片代替物を調製する本発明の方法の実施に好適である。
この方法及び／又はキットのさらなる特徴の異なる実施態様、例えば硬組織を産生する増殖因子、負電荷の多糖の個々の選択、キトサンの性質などは、本発明の組成物の局面に関して上に記載される通りである。
【００３４】
第四の局面において、本発明は、硬組織の産生を必要とする哺乳動物被験体中で硬組織を産生させるための医療装置の調製における本発明の第一の局面の組成物の使用を提供する。
【００３５】
また、本発明の第五の局面において、硬組織の産生を必要とする哺乳動物被験体に所望の部位で硬組織を産生させる方法が提供され、この方法は、この組成物がその生物学的機能を発揮できるような条件下で有効量の本発明の第一の局面の組成物をこの部位に投与して、硬組織をこの部位で産生させることを包含する。
【００３６】
本発明のこれらの局面の実施態様において、この被験体は、脊椎円板変性（脊椎固定を必然的に伴う）、非治癒性の長骨骨折（例えば脛骨骨折）、手術（例えば、神経外科手術後の骨弁壊死；骨腫瘍切除）又は外傷（例えば、骨格の挫傷を伴う交通事故）に起因した骨の損失及び先天性の骨欠損（例えば、槽裂又は他の脳顔面頭蓋奇形）から選択される状態を患い得る。
【００３７】
他の実施態様において、この被験体は、移植、例えば歯科インプラント及び股関節部、膝又は他の解剖学的領域の整形プロテーゼに関連して、骨形成の増強を必要とし得る。
他の実施態様において、この被験体は、骨再構成を必要とし得る。これらの場合、本発明の組成物は、例えば筋肉又は脂肪中での骨の事前加工の目的で使用され得る。この事前加工された骨は、引き続いて骨再構成方法に使用され得る。
【００３８】
本発明のすべての局面のすべての実施態様のすべての特徴は、当業者が過度に実験を行わずに確認するとき、このような化合物が明らかに実行不可能ではないという条件で、その任意の可能な組み合わせに使用され得る。
【００３９】
本明細書中で使用される用語「硬組織」は、硬い細胞間物質を有する組織、及び／又は鉱化した組織を包含することが意図される。硬組織の例は、骨及び軟骨である。
本発明の文脈において、用語「骨移植片代替物」は、哺乳動物体に導入されるかそして／又は哺乳動物組織と接触させるときに、骨組織の再生に使用され得るすべての構造を包含することが意図される。骨移植片代替物はまた、「骨組織構造」と互換的に示され得る。
本明細書中で使用される用語「哺乳動物」、「哺乳類」などは、別段の通知がない限りヒトを包含する。
【実施例】
【００４０】
本発明のさらなる理解のために、以下の非限定的な実施例が与えられる。
実施例１：異なるＢＭＰ−２キャリアの比較
Ａ．コラーゲン／ＢＭＰ−２組成物の調製
ウシＩ型コラーゲン（Ｖｉｔｒｏｇｅｎ  １００、Ｃｏｈｅｓｉｏｎ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を、製造業者が記載する通りに調製した。手短に言えば、冷蔵Ｖｉｔｒｏｇｅｎコラーゲン８ｍｌを、１０×リン酸緩衝化生理食塩水溶液１ｍｌ及び０.１Ｍ  ＮａＯＨ  １ｍｌと混合した。この混合物のｐＨを、ｐＨ紙によって測定し、そして０.１Ｍ  ＨＣｌ又は０.１Ｍ  ＮａＯＨを数滴添加することによって７.４に調整した。この中和したコラーゲン溶液を、４℃で貯蔵した。３０分間以内に、組換えヒトＢＭＰ−２（ＩｎｄｕｃｔＯｓ、Ｗｙｅｔｈ  Ｌｅｄｅｒｌｅ）を、コラーゲンゲル１ｍｌ当たりＢＭＰ−２  ５０μｇ又はコラーゲンゲル１ｍｌ当たりＢＭＰ−２  ２５０μｇの最終濃度まで撹拌によって添加した。このＢＭＰ／コラーゲンゲルを、１ｍｌシリンジに移し、そして室温でおよそ１０〜１５分間維持した。その後、サンプル０.２ｍｌを、下記の通りに動物に注入した。
【００４１】
Ｂ．ヘパリン／コラーゲン／ＢＭＰ−２組成物の調製
ＢＭＰ−２を、コラーゲンゲルを添加する前にヘパリン（ヘパリンナトリウム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１０００ＩＵと混合すること以外は、Ａに記載される方法を反復した。
【００４２】
Ｃ．キトサン／ＢＭＰ−２組成物の調製
脱アセチル化度８４％のキトサン（４.５ｇ）（ＣｈｉｔｏＣｌｅａｒ（登録商標）、Ｐｒｉｍｅｘ  ｅｈｆ、Ｎｏｒｗａｙ）を、水１２５ｇに添加した。ＨＣｌ（４Ｍ）を、この撹拌混合物に室温で一滴ずつ添加した。ｐＨ４.７の透明な溶液が得られると、この反応を終結させた。この溶液を、密閉容器中に一晩維持した。この容量を１５０ｍｌに調整し、そしてｐＨ値を５.０に調整した。
このキトサン溶液に、ゲル１ｍｌ当たりＢＭＰ−２  ５０μｇ又はゲル１ｍｌ当たりＢＭＰ−２  ２５０μｇの最終濃度まで撹拌によって組換えヒトＢＭＰ−２（ＩｎｄｕｃｔＯｓ、Ｗｙｅｔｈ  Ｌｅｄｅｒｌｅ）を添加した。このＢＭＰ−キトサンゲルを、１ｍｌシリンジに移し、そしてサンプル０.２ｍｌを、下記の通りに動物に注入した。
【００４３】
Ｄ．キトサン／ヘパリン／ＢＭＰ−２組成物の調製
脱アセチル化度８４％のキトサン（４.５ｇ）（ＣｈｉｔｏＣｌｅａｒ（登録商標）、Ｐｒｉｍｅｘ  ｅｈｆ、Ｎｏｒｗａｙ）を、水１２５ｇに添加した。ＨＣｌ（４Ｍ）を、この撹拌混合物に室温で一滴ずつ添加した。ｐＨ４.７の透明な溶液が得られると、この反応を終結させた。ヘパリン（１.８ｇ）（ヘパリンナトリウム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、水２５ｇに溶解した。この溶液を、密閉容器中に一晩維持した。このヘパリン溶液を、撹拌のもとキトサン溶液に添加した。最終調製物中のキトサン：ヘパリンの質量比は５：２であり、そして形成されるゲルのｐＨは５.７であった。４Ｍ  ＨＣｌでｐＨ値を４.９に調整した後、調製物の最終質量が１５０ｇになるように水を添加した。得られるゲルの試験により、相分離がなく巨視的に均一系であることが示された。安定性は良好であった。
【００４４】
このキトサン／ヘパリンゲルに、組換えヒトＢＭＰ−２（ＩｎｄｕｃｔＯｓ、Ｗｙｅｔｈ  Ｌｅｄｅｒｌｅ）を、ゲル１ｍｌ当たりＢＭＰ−２  ５０μｇ又はゲル１ｍｌ当たりＢＭＰ−２  ２５０μｇの最終濃度まで撹拌によって添加した。このキトサン／ヘパリン／ＢＭＰ−２ゲルを、１ｍｌシリンジに移し、そしてサンプル０.２ｍｌを、下記の通りに動物に注入した。各々の注入物は、ＢＭＰ−２とともにキトサン６.０ｍｇ及びヘパリン２.４０ｍｇを含んだ。
【００４５】
Ｅ．骨形成に対する異なるＢＭＰ−２組成物の効果
体重２５０〜３００グラムの青年期の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット６０匹を、Ｔｅｍｇｅｓｉｃ（登録商標）（体重１ｋｇ当たり０.１６ｍｌ）で麻酔した。各々のラットに、上記の通りに調製した４つの異なるＢＭＰ−２ゲルのうちの１つを、２２Ｇ針を用いて四頭筋に０.２ｍｌ注入した。このラットを、各群５匹ずつ１２の群に分けた。各々のラットに、４つの異なるキャリア、コラーゲン、ヘパリン／コラーゲン、キトサン及びヘパリン／キトサンのうちの１つにおけるＢＭＰ−２  ０μｇ、ＢＭＰ−２  １０μｇ又はＢＭＰ−２  ５０μｇを与えた。このラットを、この処置の後自由に行動させた。このラットを、注入から４週間後にＣＯ2によって安楽死させた。
【００４６】
Ｆ．Ｘ線撮影及びＣＴスキャン
注入から４週間後、安楽死させたラットの後脚を切断し、そしてＸ線撮影を行った。このラットのＣＴスキャンを同じ後脚に対して行って、誘導された異所性の骨量及び骨無機質密度を算出した。
【００４７】
Ｇ．結果及び議論
新しく形成された骨組織の量及び密度の両方に関する結果を、表１並びに図１及び図２に示す。
【表１】
2008527033.tif 000002
【００４８】
コラーゲン単独又はキトサン及びヘパリンの組み合わせを含む実験において、出血合併症も血栓形成も観察されなかった。
ＢＭＰ−２を含まないコラーゲン及びコラーゲン／ヘパリンは、いかなる骨形成も誘導せず、一方キトサン／ヘパリン複合体単独は、５つの標本のうちの１つにおいて、少量の異所性の骨を誘導した。ＢＭＰ−２  １０μｇと混合したとき、コラーゲンもコラーゲン／ヘパリンも、異所性の骨形成を誘導しなかった。ＢＭＰ−２  １０μｇを含むキトサン／ヘパリンによって、一応の骨形成が誘導された。ＢＭＰ−２量が５０μｇに増大すると、このコラーゲン／ヘパリンキャリアは、１つの標本において骨形成を誘導した。キトサン単独を、ＢＭＰ−２  ５０μｇとともに送達媒体として使用したとき、異所性の骨形成量は、すべての標本において劇的に増大した。キトサン／ヘパリンをＢＭＰ−２キャリアとして使用したとき、誘導された骨量に対する効果は一層高かった（表１、図１）。骨無機質密度の有意な差異は、群間で算出されなかった（図２）。
ＢＭＰ−２  ５０μｇを用いた実験を反復し、ほぼ同一の結果を得た。
【００４９】
実施例２：凍結乾燥したＢＭＰ−２キャリア
Ａ．凍結乾燥したキトサン／ヘパリン複合体の調製
キトサン（９.０ｇ）（ＣｈｉｔｏＣｌｅａｒ（登録商標）、Ｐｒｉｍｅｘ  ｅｈｆ、Ｎｏｒｗａｙ）を、撹拌のもと純水およそ２００ｇに添加した。ＨＣｌ（４Ｍ、水性）を、撹拌のもと一滴ずつ添加した。キトサンが完全に溶解したら、ｐＨを４.７±０.２に調整した。この溶液を、室温に１時間置き、そして最終容量が２４６.４ｍｌになるように水を添加した。ヘパリン水溶液（５０ｍｌ中３.６ｇ）（ヘパリンナトリウム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、撹拌のもと５分間キトサン溶液に添加した。得られるゲルのｐＨ値は５.０であった。
【００５０】
このように形成されたヘパリン／キトサン複合体ゲルを、直径９ｃｍのペトリ皿に、１皿当たり複合体ゲルを４０ｇの量で注いだ。この複合体が完全に凍結するまで、この皿をおよそ−１０℃のフリーザーに置いた。このペトリ皿を凍結乾燥器に移し、そして完全に乾燥するまで乾燥させ、これにより、白色の海綿様固体物質の複合体を得た。
【００５１】
Ｂ．凍結乾燥したキャリア／ＢＭＰ−２組成物の調製及び移植
上記のヘパリン／キトサン海綿及びＩ型コラーゲン海綿（ＩｎｄｕｃｔＯｓ、Ｗｙｅｔｈ  Ｌｅｄｅｒｌｅ）を、４×６ｍｍ片に切断した。水溶液中のＢＭＰ−２  ５０μｇ（ＩｎｄｕｃｔＯｓ、Ｗｙｅｔｈ  Ｌｅｄｅｒｌｅ）を、各群の海綿に添加した。この４×６ｍｍのヘパリン／キトサン海綿は、各々キトサン６.１ｍｇ及びヘパリン２.４２ｍｇを含んだ。この吸着したＢＭＰ−２を含む海綿を、少なくとも１５分間室温に維持し、次いで青年期の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの四頭筋に１５ｍｍの皮膚切開を通じて移植した。２つの異なる物質の各々に対して、６つの移植を行った。このラットを、処置後自由に行動させた。
【００５２】
Ｃ．結果及び議論
異所性の骨形成を、移植から４週間後にＸ線によって研究した。豊富な骨形成が、キトサン／ヘパリン／ＢＭＰ群において６匹のラットのうち５匹に観察され、一方コラーゲン／ＢＭＰ群においては、骨形成は観察されなかった。
凍結した「ヘパリン／キトサン海綿」をＢＭＰ−２送達媒体として使用する場合の誘導された骨に対する効果は、骨形成が、凍結乾燥体移植によって限定された明らかに区切られた部位に制限された点において、ヘパリン及びキトサンのイオン性複合体をゲル形態で用いた実施例１で観察された効果よりも優れていた。
【００５３】
実施例３：異なるＢＭＰ−４キャリアの比較
ＢＭＰ−２の代わりにＢＭＰ−４を用いた以外は、実施例１及び実施例２を反復した。
骨形成に関する類似の結果が予期された。
【００５４】
実施例４：ケーススタディ
背景
広範に頭蓋骨を欠損した４２歳の女性を、クリニックへ回した。４年前にこの女性は、手術及び術後照射により脳腫瘍を処置されていた。この女性の右前頭頭頂領域の７×９ｃｍの大きさの骨弁が、手術後の感染により失われた。皮膚を通じた移植片の感染及び貫入のために、異なる移植片を用いた４を超える頭蓋再構成の試みが失敗している。
【００５５】
方法
患者の頭蓋欠損の手術前写真は、この欠損が頭蓋の右前頭頭頂部位に位置することを明らかにした。
ＢＭＰ−２（ＷｙｅｔｈからのＩｎｄｕｃｔＯｓキットに提供される；組換えヒトＢＭＰ−２、サッカロース、グリシン、グルタミン酸、ＮａＣｌ、ポリソルベート（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔ）８０及びＮａＯＨを含む粉末）１２ｍｇを、滅菌水（ＩｎｄｕｃｔＯｓキット、Ｗｙｅｔｈ）８ｍｌに溶解した。このＢＭＰ溶液を、実施例２に記載される通りに調製したキトサン−ヘパリン凍結乾燥体の滅菌海綿（７×９×０.５ｃｍ）の２つのサンプル上に分散させた。
この欠損を外科的に露出させ、そしてこの海綿のうちの１つを硬膜上に直接接触させ、その後、足場として役立つ頭蓋チタンメッシュ（Ｗａｌｔｅｒ  Ｌｏｒｅｎｚ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．、Ｊａｃｋｓｏｎｖｉｌｌｅ、Ｆｌｏｒｉｄａ、ＵＳＡ）を接触させた。このチタンメッシュを、第二のキトサン−ヘパリン海綿で覆い、頭蓋輪郭を再構築した。
最後にこの移植片を、皮膚を閉じる前に局部の骨膜弁で覆った。
【００５６】
結果
手術前の細菌試験により、キトサン−ヘパリン海綿が無菌であることが実証された。
術後のＣＴ−スキャンにより、移植部位に石灰化硬膜が示された。
出血合併症は観察されず、そしてＡＰＴＴレベルは、処置及びその後を通して正常であった。６〜８週後に移植部位の毛がなくなり、これは、ＢＭＰ−２を用いた処置に関連した周知の副作用である。毛は、およそ１６〜２０週後に再成長した。
チタンメッシュの感染及び貫入は、再構成の一般的な合併症であり、そして患者を処置するこれまでのすべての試みの際に生じたという事実にもかかわらず、８ヶ月後この患者には、このチタンメッシュの感染も貫入も生じなかった。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】示されるキャリアにおいてＢＭＰ−２を与えられるラットの新しく形成された骨組織量を示す図である。
【図２】示されるキャリアにおいてＢＭＰ−２を与えられるラットの新しく形成された骨組織密度を示す図である。
【図１】
2008527033.tif 000003
【図２】
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【国際調査報告】
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2008527033.tif 000006
2008527033.tif 000007
2008527033.tif 000008
2008527033.tif 000009
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