(57)【要約】  本発明は、グラプトペタルム属を含む組成物およびその使用に関する。グラプトペタルム属は、炎症、脂肪症、および線維症のような肝疾患および病状から動物を保護できる。特に、グラプトペタルム属は、肝線維症において中枢的役割を有する活性化肝星細胞の増殖を阻害できる。グラプトペタルム属はまた抗線維症活性を有し、肺線維芽細胞の増殖を阻害する。故に、肝臓のための予防的および治療的薬剤であることに加えて、グラプトペタルム属は、肝臓以外の組織または臓器、特に肺、腎臓、および膀胱の線維症または炎症に対して有用である。ベンケイソウ科の他の植物、特にエケベリア属はグラプトペタルム属と同様の効果を有する。
2008511551.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラプトペタルム属またはエケベリア属を含む、医薬組成物。
【請求項２】
該グラプトペタルム属がグラプトペタルム・パラグアイエンセである、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
該グラプトペタルム属またはエケベリア属が抽出物である、請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項４】
該抽出物が、１種以上の水性溶媒、無極性溶媒、アルコール溶媒、またはそれらの混合物の抽出物である、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
薬学的に許容される賦形剤または担体をさらに含む、請求項１から４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
経口または局所投与に適している、請求項１から５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
対象における肝臓の疾患または病状の予防または処置法であって、有効量の請求項１から６のいずれかに記載の医薬組成物を該対象に投与することを含み、該肝臓の疾患または病状が、肝炎、脂肪肝、肝線維症、肝硬変、およびＢ型肝炎から選択される、方法。
【請求項８】
該肝臓の疾患または病状が肝炎である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
該肝臓の疾患または病状が肝線維症である、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
平滑筋α−アクチン分泌が減少している、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
平滑筋α−アクチン分泌が肝星細胞において減少している、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該肝臓の疾患または病状が肝硬変である、請求項７記載の方法。
【請求項１３】
該肝臓の疾患または病状がＢ型肝炎である、請求項７記載の方法。
【請求項１４】
該肝臓の疾患または病状が脂肪肝である、請求項７記載の方法。
【請求項１５】
肝星細胞増殖の阻害法であって、該肝星細胞を、請求項１から６のいずれかに記載の医薬組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項１６】
該肝星細胞が哺乳動物中に存在している、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
該哺乳動物がヒトである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
肝星細胞を選択的に殺す方法であって、該肝星細胞を、請求項１から６のいずれかに記載の医薬組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項１９】
該肝星細胞が哺乳動物中に存在している、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
該哺乳動物がヒトである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
哺乳動物におけるＢ型肝炎ウイルス表面抗原発現を阻害する方法であって、該哺乳動物に、請求項１から６のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２２】
Ｂ型肝炎ウイルス複製が該哺乳動物中で阻害される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該哺乳動物がヒトである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
哺乳動物における線維症または炎症を抑制または処置する方法であって、該哺乳動物に請求項１から６のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２５】
該線維症または炎症が肺、腎臓および膀胱から成る群から選択される臓器で起こる、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
該組成物を経口で投与する、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
該組成物を注射により投与する、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２８】
炎症または線維症の付加的な治療剤または予防剤を投与することをさらに含む、請求項２４から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
治療的使用のための医薬の製造における、グラプトペタルム属またはエケベリア属の使用。
【請求項３０】
該グラプトペタルム属がグラプトペタルム・パラグアイエンセである、請求項２９記載の使用。
【請求項３１】
該グラプトペタルム属またはエケベリア属が抽出物である、請求項３０記載の使用。
【請求項３２】
肝疾患の処置用医薬としてのグラプトペタルム属またはエケベリア属の使用。
【請求項３３】
該グラプトペタルム属がグラプトペタルム・パラグアイエンセである、請求項３２記載の使用。
【請求項３４】
該グラプトペタルム属またはエケベリア属が抽出物である、請求項３２記載の使用。
【請求項３５】
該肝疾患が、肝炎、脂肪肝、肝線維症、肝硬変、またはＢ型肝炎から選択される、請求項３２記載の使用。
【請求項３６】
該医薬が平滑筋α−アクチン分泌を減少させる、請求項３２記載の使用。
【請求項３７】
該医薬が肝星細胞における平滑筋α−アクチン分泌を減少させる、請求項３６記載の使用。
【請求項３８】
該医薬が肝星細胞増殖を阻害する、請求項３２記載の使用。
【請求項３９】
該医薬が哺乳動物におけるＢ型肝炎ウイルス表面抗原発現を阻害する、請求項３２記載の方法。
【請求項４０】
哺乳動物においてＢ型肝炎ウイルス複製が阻害される、請求項２１記載の使用。
【請求項４１】
医薬が哺乳動物における線維症または炎症を予防または処置する、請求項３２記載の使用。
【請求項４２】
該線維症または炎症が、肺、腎臓および膀胱から成る群から選択される臓器で起こる、請求項４１記載の使用。
【請求項４３】
該医薬が経口投与用に製剤されている、請求項４０または４１記載の使用。
【請求項４４】
該医薬が注射による投与用に製剤されている、請求項４０または４１記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に肝臓関連疾患および病状のための、グラプトペタルム属および近親植物の治療的および予防的効果に関する。
【０００２】
引用文献
米国特許５,０２３,２５２。
Desmet V.J., et al. (1994). Classification of chronic hepatitis: diagnosis, grading and staging. Hepatol 19(6):1513-1520.
Friedman, S.L. (1993). The cellular basis of hepatic fibrosis. Mechanism and treatment strategies. Engl J Med. 328(25):1828-1835.
Giladi, H., et al. (2003). Small interfering RNA inhibits hepatitis B virus replication in mice. Mol Ther. 8(5):769-776.
Pines, M. (1997). Halofuginone, a specific inhibitor of collagen type I synthesis, prevents dimethylnitrosamine-induced liver cirrhosis. J Hepatol. 27(2):391-398.
Saller, R., et al. (2991). The use of silymarin in the treatment of liver diseases. Drugs. 61(14):2035-2063.
【０００３】
上記または本明細書のどこかに引用する刊行物、特許および特許出願の全ては、その全体を、各個々の刊行物、特許出願または特許の開示が、具体的にかつ個々にその全体を引用により本明細書に包含すると示したのと同程度に、その全体を引用により本明細書に包含する。
【背景技術】
【０００４】
肝臓は、多機能臓器である。その基本的な機能は３カテゴリーに分けることができる：(１)血液の貯蔵および濾過のための管機能、(２)身体のほとんどの代謝系に関与する代謝機能、および(３)胆汁形成を担う分泌および排出機能。肝臓の主要な活動は、内因性および外因性の両方の毒素の解毒および排泄、アミノ酸の脱アミノ化とウレアの形成、グリコーゲン形成を介する血糖の調節、血漿タンパク質の形成、胆汁の産生および分泌、ならびに内臓(腸)循環からの特定の物質の食作用を含む。
【０００５】
肝臓の多くの異なる役割の結果、肝臓が損傷を受けたとき、その種々の機能は、損傷の性質および部位に依存して、異なる組合せで同時に障害される。何らかの原因の肝臓損傷は肝臓再生、壊死(細胞死)、変性、炎症、線維症、またはこれらの過程の組合せをもたらし得る。肝臓は非常に機能が保存されているが、傷害が進むと、肝臓機能の障害は生命を脅かす結果となり得る。肝疾患の一般的な最終段階である硬変は、西洋では死亡原因の上位１０番までに入る一つである。
【０００６】
肝疾患の重大さおよび重篤になる可能性にもかかわらず、治療法は限定されている。多くのタイプの肝疾患はウイルスが原因であり(例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型およびＥ型肝炎)有効な抗ウイルス治療はほとんどなく、しばしば重篤になる可能性のある副作用の原因である。他の肝疾患は、以前の毒物暴露(例えばアルコール性硬変および毒性植物、または環境汚染物質への暴露)の結果である。さらに別の症例では、肝疾患は遺伝因子、環境条件および免疫系活動(自己免疫性肝炎)を含む、ほとんど理解されていない種々の因子の相互作用の結果である。何が原因であれ、肝疾患の治療法は２つの因子が複雑にする。肝臓が解毒を担っているため、薬剤の全ての使用が、肝臓における負荷を増加し得、状態の悪化に至り得る。さらに、多くの肝疾患および状態で起こる肝線維症は、一般に不可逆的な過程である。結果として、肝臓の使用可能な部分は線維症の進行に伴い減少し、肝臓機能に依存している他の臓器の合併症の増加をもたらす。
【０００７】
故に、肝臓のための薬剤は、理想的には線維症の発症または進行を止めなければならない。加えて、該薬剤が肝臓における代謝的負荷を起こさず、そして副作用が少ないかないことが望まれる。
【発明の開示】
【０００８】
発明の要約
本発明は、とりわけ、グラプトペタルム属を含む組成物を提供する。本発明者らは、このありふれた植物が、肝臓の炎症および線維症、体重減少、脾臓腫脹、および最終的な脂肪の原因となる毒物から動物を保護できることを発見した。グラプトペタルム属の投与により、炎症および線維症は著しく阻害された；動物の体重、肝臓重量および脾臓重量はほぼ正常であった；そして生存率は非常に改善した。特に、グラプトペタルム属は肝線維症において中枢的役割を有する活性肝星細胞の増殖を阻害する。この観察と一致して、グラプトペタルム属はコラーゲンの蓄積を阻害し、線維症の発症または進行を予防する。加えて、本組成物は、高投与量でさえ、検出可能な副作用は示さない。エケベリア属は類似の効果を有する。
【０００９】
従って、本発明の一つの局面は、グラプトペタルム属またはエケベリア属を含む医薬組成物を提供する。グラプトペタルム属は、任意のグラプトペタルム属種または任意の調製物の形であり得る。好ましくは、グラプトペタルム属種はグラプトペタルム・パラグアイエンセである。同様に、エケベリア属は任意のエケベリア属種または任意の調製物の形であり得る。好ましくは、エケベリア属は、エケベリア・ピーコッキーである。グラプトペタルム属またはエケベリア属は、好ましくは抽出物、特に１種以上の水性溶媒、無極性溶媒、アルコール溶媒またはそれらの混合物の抽出物である。
【００１０】
本医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤または担体をさらに含み得る。本医薬組成物は、少なくとも１種の他の薬剤、特に抗炎症、抗脂肪症、抗ウイルス、または抗線維症活性を有する薬剤も含み得る。例えば、本薬剤はアルブチン、レモン抽出物、キュウリ抽出物、メルカプトコハク酸、メルカプトデキストラン、コウジ酸、コウジ酸誘導体、ビタミンＣ、ヒドロキノン、グルタチオン、システイン、クワの実抽出物、カンゾウ抽出物およびクマコケモモ抽出物から成る群から選択され得る。
【００１１】
本医薬組成物は任意の投与経路用、好ましくは経口または局所投与用に製剤され得る。
【００１２】
本発明の他の局面は、対象における肝臓の疾患または病状の予防または処置法であって、有効量のここに記載の医薬組成物を対象に投与することを含み、該肝臓の疾患または病状が肝炎、脂肪肝、肝線維症、肝硬変、およびＢ型肝炎から成る群から選択される、方法を提供する。肝線維症または硬変のために使用されるとき、本組成物が、特に肝星細胞における、平滑筋α−アクチンの発現を現象できることが好ましい。
【００１３】
本発明の他の局面は肝星細胞増殖の阻害法であって、該肝星細胞を、グラプトペタルム属またはエケベリア属を含む本医薬組成物と接触させることを含む、方法を提供する。本発明のさらに他の局面は、肝星細胞を殺す方法であって、該肝星細胞を、グラプトペタルム属またはエケベリア属を含む本医薬組成物を接触させることを含む、方法を提供する。該肝星細胞は、好ましくは哺乳動物、および最も好ましくはヒト中に存在する。
【００１４】
また提供されるのは、哺乳動物におけるＢ型肝炎ウイルス表面抗原発現の阻害法であって、該哺乳動物に本医薬組成物を投与することを含む、方法である。該哺乳動物は好ましくはヒトである。
【００１５】
グラプトペタルム属およびエケベリア属に加えて、ベンケイソウ科の他の多肉植物もここに記載のものと同じ方法で使用できる。この科は、アドロミスクス属、アエオニウム属、アイクリソン属、ブリオフィルム属、チアストフィラム属、コチレドン属、クラッスラ属、クレムノフィラ(Cremnophila)属、ディアモルファ属、ダドレア属、エケベリア属、グラプトペタルム属、グリーノビア属、ヒロテレフィウム属、ヒパゴフィタム(Hypagophytum)属、ジョビバルバ属、カランコエ属、キチンギア(Kitchingia)属、レノフィルム属、メテロスタキス属、モナンテス属、オロスタキス属、パキフィツム属、ペリエロセダム(Perrierosedum)属、ピストリニア(Pistorinia)属、プロメテウム(Prometheum)属、プセウドセダム属、ロディオラ属、ロスラリア属、セデラ(Sedella)属、セダム属、センペルビブム属、シノクラッスラ属、タキタス属、テスミッサ(Telmissa)属、トンプソネラ(Thompsonella)属、チレコドン属、ウンビリクス属およびビラディア属を含む。グラプトペタルム属およびエケベリア属は、本発明の実施のために好ましい属である。
【００１６】
本発明の他の局面は、グラプトペタルム属またはその近親植物を使用する、肺、腎臓、および膀胱のような他の組織および臓器の線維症または炎症の処置または予防法を提供する。
【００１７】
図面の簡単な記載
図１は、媒体コントロール(コントロール)、ＤＭＮとグラプトペタルム属(ＤＭＮ−ＧＰ)、ＤＭＮとシリマリン(ＤＭＮ−シリマリン)またはＤＭＮ単独(ＤＭＮ)を受けたラットの生存数を示す。
【００１８】
図２は、培養ラット肝星細胞に対する粗グラプトペタルム属抽出物の抗増殖作用を示す。ラット肝星細胞を２５０または５００μg／mlのグラプトペタルム属粗抽出物中でインキュベートし、そして生存細胞数を毎日数えた。記載の生存率は、グラプトペタルム属を受けていないコントロール細胞と比較した生存率％である。
【００１９】
図３は、培養ラット肝星細胞に対する種々のグラプトペタルム属抽出物の抗増殖作用を示す。ラット肝星細胞を、記載のグラプトペタルム属抽出物とインキュベートし、そして生存細胞数を毎日数えた。記載の生存率は、グラプトペタルム属を受けていないコントロール細胞と比較した生存率％である。
【００２０】
図４は、記載の濃度のグラプトペタルム属抽出物中でインキュベートしたＨｅｐ３ＢまたはＨｅｐＡ２細胞におけるＨｂｓＡｇの発現レベルを示す。
【００２１】
図５は、培養マウス肺線維芽細胞に対する、種々のグラプトペタルム属抽出物の抗増殖作用を示す。一次培養肺線維芽細胞を、記載のグラプトペタルム属抽出物とインキュベートし、そして、生存細胞数を５日間のインキュベーション後に数えた。記載の生存率は、グラプトペタルム属を受けていないコントロール細胞と比較した生存率％である。
【００２２】
発明の詳細な記載
本発明は、グラプトペタルム属および／または近親植物を含む組成物、およびその使用に関する。グラプトペタルム属は、肝臓の炎症および線維症、体重減少、脾臓腫脹、および最終的な脂肪の原因となる毒物から動物を保護できる。特に、グラプトペタルム属は肝線維症において中枢的役割を有する活性肝星細胞の増殖を阻害する。グラプトペタルム属の抗線維症活性は肝臓に限定されない。グラプトペタルム属は、また肺線維芽細胞の増殖を阻害し、肺における炎症および線維症の原因となる毒物から動物を保護する。故に、グラプトペタルム属は、特に組織線維症の予防および治療薬である。グラプトペタルム属と近親の植物も同じ方法で使用できる。
【００２３】
本発明をさらに詳細に記載する前に、本明細書で使用する用語を、特記しない限り、下記の通り定義する。
【００２４】
定義
ここで使用する“グラプトペタルム属”は、グラプトペタルム属の全ての植物、またはその一部もしくは複数の部分を意味する。植物の部分は、限定するものではなく、葉、花、茎、根、果実、および種子を含み得る。この用語は粉末、抽出物、乾燥抽出物、ホモジェネート、顆粒または沈殿のようなまた植物またはその一部(複数もある)の修飾形態も含む。グラプトペタルム属、またはその一部の１種以上の組合せも意図される。グラプトペタルム属は、好ましくはグラプトペタルム・パラグアイエンセである。
【００２５】
ここで使用する“エケベリア属”は、エケベリア属の全ての植物、またはその一部もしくは複数の部分を意味する。植物の部分は、限定するものではなく、葉、花、茎、根、果実、および種子を含み得る。この用語は粉末、抽出物、乾燥抽出物、ホモジェネート、顆粒または沈殿のようなまた植物またはその一部(複数もある)の修飾形態も含む。エケベリア属、またはその一部の１種以上の組合せも意図される。エケベリア属は好ましくはエケベリア・ピーコッキーである。
【００２６】
“抽出物”は、抽出すべき物質の溶媒への浸漬または溶媒との混合により得られる溶液である。典型的に、抽出物は、グラプトペタルム属を乾燥させ、続く該乾燥物質の切断または粉砕により製造する。該抽出工程は、次いで溶媒、典型的に水、エタノール、エタノール／水混合物、メタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、アセトン、ヘキサン、石油エーテルまたは他の有機溶媒の適当な選択の助けを借りて、例えば、浸漬、浸透、再浸透、向流抽出、ターボ抽出、または二酸化炭素超臨界(温度／圧力)抽出の手段により行い得る。本抽出物を、次いでさらに蒸発させ、こうして濃縮して、軟抽出物(extractum spissum)および／または最終的に乾燥抽出物(extracum siccum)を、例えば、噴霧乾燥、真空乾燥、流動床乾燥または凍結乾燥の手段により得ることができる。好ましくは、本抽出物を、グラプトペタルム属またはその近親植物を沸騰させることなく製造する。植物の抽出に油を使用しないことも好ましい。
【００２７】
疾患または病状の“予防”は、疾患または病状の症状を、疾患または病状の発症前に顕在化させることを予防することを意味する。
【００２８】
疾患または病状の“処置”は、疾患または病状の発症後の、疾患または病状の症状の軽減または完全な除去を意味する。
【００２９】
“肝臓の疾患または病状”は、肝臓またはそのどこかの部分の損傷が関与する疾患または病状を意味する。肝疾患および病状は、肝線維症、肝硬変、慢性肝炎(例えばＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅまたは他の形態)、非アルコール性脂肪肝、アルコール性脂肪肝、および肝臓腫瘍(特に肝癌腫)を含むが、これらに限定されない。
【００３０】
“有効量”は、意図する目的を達成するのに十分な薬剤の量である。例えば、肝硬変を処置するための有効量のグラプトペタルム属は、グラプトペタルム属非存在下において顕在化する症状と比較して、肝硬変の症状を軽減または除去するのに十分な量である。ある薬剤の有効量は、薬剤の性質、投与経路、該薬剤を受ける動物のサイズおよび種、ならびに投与の目的のような因子に依存して変化する。各個々の場合の有効量は、本明細書の開示におよび当分野で確立された方法に従い、当業者が経験的に決定できる。
【００３１】
用語“単位投与形態”は、ヒト対象および他の哺乳動物への単一投与のために適当な物理的に分かれた単位を意味し、各単位は、適当な医薬賦形剤と共に、所望の効果を産生するために計算された予定された量のグラプトペタルム属を含む。
【００３２】
線維症および炎症に対するグラプトペタルム属の効果
グラプトペタルム属は、ロゼット状に配置された葉を有する多肉植物である。グラプトペタルム属はグラプトペタルム・パラグアイエンセ(朧月)、グラプトペタルム・アメチスチナム(酔美人)、グラプトペタルム・ベルム(タキタス・ベルスとしても既知)、およびグラプトペタルム・マクドガリーを含む、１２種を含む。
【００３３】
損傷した肝臓に対するグラプトペタルム属の効果を試験するために、我々は、肝臓傷害の動物モデルを使用した。故に、ラットに毒性化学物質、ジメチルニトロソアミン(ＤＭＮ)を注射し、これは肝臓の炎症および線維症の原因となった。肝臓機能は、種々の生化学的パラメーターにより示される通り、これらの動物で低下した。体重および肝臓重量は両方とも減少し、他方脾臓重量は増加し、そしてこれらの動物の大多数が数週間以内に塩部した。対照的に、ＤＭＮに加えてグラプトペタルム属を受けた動物は、ほぼ正常な体重および肝臓重量であり、それらの脾臓は腫脹しなかった(実施例１)。これらの動物の大多数は生存し、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ(ＧＯＴ)、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ(ＧＰＴ)、プロトロンビン時間(ＰＴ)、血小板、ビリルビンおよびアルブミン濃度を含むそれらの肝臓機能指標は、比較的正常であった(実施例２)。故に、グラプトペタルム属は、肝臓に対するＤＭＮの損傷効果を劇的に減少させる。肝臓の既知の治療剤であるシリマリン(Saller et al., 2001)を、ポジティブコントロールとして並行して試験した。シリマリンもまた動物生存、体重および肝臓重量、ならびに肝臓機能を増加できた。グラプトペタルム属は、しかしながら、シリマリンよりもさらに有効であった。
【００３４】
ＤＭＮは肝炎および線維症の原因となることが知られている。実際、ＤＭＮで３週間処置後、肝臓は組織化学的分析により、大量の壊死および炎症細胞浸潤を示した(実施例３)。グラプトペタルム属を受けたラットは、他方、壊死または浸潤がほんのわずかであるか無く、グラプトペタルム属を炎症の処置または予防に使用できることを示す。
【００３５】
肝線維症に対するグラプトペタルム属も試験した。ＤＭＮ処置後、微細な、均一な顆粒が肝臓表面上に観察された。顕微鏡分析は、肝臓における硬変様構造パターン：グリソン鞘中の線維性結合組織成分、偽小葉形成、線維性中隔(fibrous septa)の形成、および中央領域に結合している肥厚したレチクリン線維を確認した。ＤＭＮおよびシリマリンの両方で処置した動物はまだ、線維性結合組織の小葉中心および門脈周囲への激しい沈着を示した。対照的に、グラプトペタルム属を受けた、ＤＭＮ処置ラットの肝臓は、軽度の線維性架橋形成、小葉中心および門脈周囲の両方での減少した線維症、および肝臓腺房の減少した変形しか示さなかった(実施例４)。
【００３６】
線維性の肝臓においては、細胞外マトリックスが沈着する。細胞外マトリックスの増加したレベルは、最終的に肝硬変に至る線維症のさらなる進行に重要である。コラーゲンが細胞外マトリックスの主成分であるため、我々は、ＤＭＮ単独またはＤＭＮとグラプトペタルム属の組合せで処置した動物におけるコラーゲン含量を決定した。コントロールラットの肝臓には非常に低レベルのコラーゲン沈着しか存在しなかったが、ＤＭＮ処置ラットは、小葉を囲むコラーゲンの束および大きな線維性中隔を示し、重篤な線維症の発症を示した。線維症の定量的分析は、グラプトペタルム属およびシリマリン処置がＤＭＮ誘発肝コラーゲン含量を、各々８０％および２５％ほど、著しく低下させることを証明する(実施例５)。
【００３７】
特異的肝臓細胞である肝星細胞(ＨＳＣ)は、線維性の肝臓における細胞外マトリックス増加を担う。正常肝臓において、本来脂肪細胞であるＨＳＣは、レチノイドのための主要な貯蔵沈着物である。これらの細胞は、ビタミンＡを含む顕著な液滴により同定できる。活性化により、ＨＳＣは細胞増殖および増加した線維形成に付され、線維症に至る(例えば、Friedman, 1993参照)。活性化ＨＳＣが、休止ＨＳＣとは逆に、大量の平滑筋アルファ・アクチン(α−ＳＭＡ)ｍＲＮＡおよびタンパク質を産生するため、α−ＳＭＡは活性化ＨＳＣおよび肝線維症のマーカーである。予測される通り、α−ＳＭＡの激しい、特異的染色が、ＤＭＮ処置肝臓の主要な領域で観察された。このα−ＳＭＡのＤＭＮ誘発発現は、グラプトペタルム属またはシリマリンの経口投与により劇的に抑制され、グラプトペタルム属は、シリマリンよりもさらに有効であった(実施例６)。合わせて、これらの結果は、従って、グラプトペタルム属が、おそらくＨＳＣに対するその効果を介して、肝線維症を減少または予防できることを示す。
【００３８】
我々は、培養ＨＳＣをグラプトペタルム属とインキュベートし、ＨＳＣに対するグラプトペタルム属作用の可能性のある機構を決定した。この結果は、グラプトペタルム属が、ＨＳＣ増殖を時間および用量依存的方法で阻害することを示す。数日間のインキュベーション後、ＨＳＣは形態が変化し、培養容器から離れ、そして死亡した(実施例７)。対照的に、同じ方法でインキュベートした肝細胞は、明らかな影響は受けなかった。故に、グラプトペタルム属はＨＳＣに対して選択的に細胞毒性である。
【００３９】
従って、本発明は、対象に有効量のグラプトペタルム属を投与することを含む、対象における肝線維症または硬変の処置または予防法を提供する。グラプトペタルム属の量は、対象の肝臓において、好ましくはコラーゲン形成の減少、ＨＳＣ増殖の阻害、および／またはα−ＳＭＡ  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害に十分である。対象は、肝線維症の何らかの徴候が顕在化する前にグラプトペタルム属を受け得る；あるいは、対象は肝線維症、または硬変でさえ始まった後に、グラプトペタルム属を受け得る。ほとんど全ての慢性肝臓状態が、最終的に肝硬変の原因となる。故に、グラプトペタルム属は、慢性肝炎(例えばＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅまたは他の形態)、非アルコール性脂肪肝、アルコール性脂肪肝、および肝臓腫瘍(特に肝癌腫)を含む、種々の肝疾患または状態の症状の軽減に使用できる。
【００４０】
本発明の他の局面は、グラプトペタルム属を使用する、ＨＳＣ増殖の阻害法を提供する。ＨＳＣ増殖は、ＨＳＣ数の計数、ＨＳＣの生化学マーカー(例えばα−ＳＭＡ  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現)の測定、コラーゲンレベルの測定、または当分野で確立されている任意の他の方法により測定できる。
【００４１】
本発明の他の局面は、対象の肝臓における炎症を予防または処置する方法であって、該対象に有効量のグラプトペタルム属を投与することを含む、方法を提供する。グラプトペタルム属を単独で、または他の抗炎症剤と組み合わせて使用できることは企図される。これらの他の抗炎症剤は、限定するものではなく、グルココルチコイド、アスピリン、イブプロフェン、シクロペンテノンプロスタグランジン、セスキテルペンラクトン、スルファサラジン、クロルフェニラミンマレエート、クレマスチン、およびデオキシスペルグアリンを含み得るグラプトペタルム属を少なくとも１種の他の抗炎症剤と組み合わせて投与するとき、グラプトペタルム属および他の薬剤を、対象に投与するための１個の組成物中に混合してよく、または、それらは別々に投与してよい。
【００４２】
我々は、グラプトペタルム属がＢ型肝炎ウイルス表面抗原を阻害できることをさらに発見した(実施例８)。Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の妨害が、Ｂ型肝炎ウイルス複製を阻害することが示されているため(例えば、Giladi et al., 2003参照)、グラプトペタルム属はウイルス複製の阻害のために同様に使用できる。本発明は、故に、対象におけるＢ型肝炎ウイルス感染の処置または予報法であって、該対象に有効量のグラプトペタルム属を投与することを含む、方法を提供する。グラプトペタルム属は単独で、または他の抗ウイルス剤と組み合わせて使用できる。これらの他の抗ウイルス剤は、限定するものではなく、インターフェロン、ラミブジン(３ＴＣ)、アデフォビル、リバビリン、目的のウイルスに対する特異的抗体、およびそれらの組合せを含み得る。グラプトペタルム属を少なくとも１種の他の抗ウイルス剤と組み合わせて投与するとき、グラプトペタルム属および他の薬剤を、対象に投与するための１個の組成物中に混合してよく、または、それらは別々に投与してよい。
【００４３】
グラプトペタルム属を、肺、腎臓、膀胱などのような他の組織または臓器の線維症の処置または予防にも使用できることは企図される。故に、例えばここに記載の方法によるグラプトペタルム属の投与は、組織中の細胞外マトリックス物質の異常な蓄積を減少または予防できる。同様に、グラプトペタルム属は、肝臓以外の組織または臓器の炎症の処置または予防のために同様に使用できる。実施例１０および１１は、肺線維芽細胞増殖および肺線維症／炎症に対するグラプトペタルム属の阻害効果を証明する。
【００４４】
本発明に従いグラプトペタルム属を受けている対象は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト、非ヒト霊長類、ネコ科、イヌ科、マウス、齧歯類、ウマ、ブタ、ウシおよびヒツジから成る群から選択される哺乳動物、および最も好ましくはヒトである。好ましくは、該対象は、肝臓の疾患または病状に罹患しているか、または肝臓の疾患または病状の危険性がある。例えば、対象が普通の用量を超えるアルコールを頻繁に摂取する、慢性肝疾患または状態の家族歴がある、輸血の必要性が予測される、または何らかの肝炎ウイルスまたは有害な物質に暴露されやすいならば、対象は肝臓の疾患または病状の危険性がある。
【００４５】
グラプトペタルム属は、検出可能な副作用はない。実施例７に示す通り、高レベルのグラプトペタルム属に長期間暴露されてさえ、実験動物に対する何らかの明白な損傷を起こさなかった。故に、グラプトペタルム属を健康食品／栄養補助食品として、定期的に使用することは対象にとって特に興味深い。故に、グラプトペタルム属を食事または餌と混合する、飲料とする、錠剤、カプセル、ピル、粉末などの形をとることができる。定期的な消費を容易にするために、容易に飲料にできるグラプトペタルム属粉末が入った袋を製造できる。グラプトペタルム属を含むクッキー、クラッカー、ケーキ、チップまたは他のスナックも企図される。一般に、グラプトペタルム属の推奨１日投与量は、体重kgあたり０.１ｇから３０ｇのグラプトペタルム属全植物(湿重量)に相当する。本投与量は、好ましくは０.３から２０、より好ましくは０.５から１５、さらに好ましくは１から１０(ｇ／体重kg)である。
【００４６】
好ましい投与経路は経口であるが、グラプトペタルム属は任意の他の方法で投与できる。例えば、グラプトペタルム属は、皮下に、血管内に、静脈内に、腹腔内に、局所的に、経鼻的に、または肺に投与できる。
【００４７】
我々は、グラプトペタルム属と近親の植物であるエケベリア属も、ここに記載のものと同様の効果を有することをさらに発見した。エケベリア属およびグラプトペタルム属は、両方ともベンケイソウ科の属である。これは、アドロミスクス属、アエオニウム属、アイクリソン属、ブリオフィルム属、チアストフィラム属、コチレドン属、クラッスラ属、クレムノフィラ属、ディアモルファ属、ダドレア属、エケベリア属、グラプトペタルム属、グリーノビア属、ヒロテレフィウム属、ヒパゴフィタム)属、ジョビバルバ属、カランコエ属、キチンギア属、レノフィルム属、メテロスタキス属、モナンテス属、オロスタキス属、パキフィツム属、ペリエロセダム属、ピストリニア属、プロメテウム属、プセウドセダム属、ロディオラ属、ロスラリア属、セデラ属、セダム属、センペルビブム属、シノクラッスラ属、タキタス属、テスミッサ属、トンプソネラ属、チレコドン属、ウンビリクス属およびビラディア属を含む、多肉の、柔らかい耐寒性植物の科である。ベンケイソウ科の他の多肉植物もグラプトペタルム属および／またはエケベリア属の代わりにまたはそれに加えて使用できることを企図する。例えば、本発明の予防的または治療的組成物は、グラプトペタルム属および所望によりベンケイソウ科、好ましくはエケベリア属の１種以上の植物、より好ましくはエケベリア・ピーコッキーを含み得る。
【００４８】
組成物
本発明はまた、活性成分としてのグラプトペタルム属、ならびに薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、医薬組成物も含む。上記の通り、ベンケイソウ科の他の多肉植物も、グラプトペタルム属の代わりにまたはそれと組み合わせて使用できる。故に、グラプトペタルム属を含む製剤および組成物の使用を以下に記載するが、ベンケイソウ科の他の多肉植物も同じ方法で有用である。
【００４９】
本発明の組成物の製造において、グラプトペタルム属を、通常賦形剤と混合し、賦形剤により希釈し、またはカプセル、サシェット、紙または他の容器の形であり得る担体中に包含させる。薬学的に許容される賦形剤が希釈剤として働くとき、それは、活性成分の媒体、担体または媒質として作用できる固体、半固体、または液体物質であり得る。故に、本組成物は、錠剤、ピル、粉末、ロゼンジ、サシェット、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁液、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾル(固体としてまたは液体媒質中)、例えば、１０重量％までの活性化合物軟膏、軟および硬ゼラチンカプセル、坐薬、滅菌注射溶液、および滅菌包装粉末の形であり得る。
【００５０】
適当な賦形剤のいくつかの例は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップ、およびメチルセルロースを含む。本製剤は、さらに：タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油のような滑剤；湿潤剤；乳化および懸濁化剤；メチルおよびプロピルヒドロキシ安息香酸エステルのような防腐剤；甘味剤；および香味剤を含み得る。本発明の組成物は、当分野で既知の方法を用いて、患者に投与後に活性成分の急速な、持続したまたは遅延した放出を提供するように製剤できる。
【００５１】
錠剤のような固体組成物の製造のために、主活性成分を医薬賦形剤と混合して、本発明の化合物の均質な混合物を含む、固体前製剤組成物を形成する。これらの前製剤組成物を均質と言うとき、本活性成分が、本組成物が錠剤、ピルおよびカプセルのような等しく有効な単位投与形態に容易に分割できるように、本組成物を通して均質に分散されていることを意味する。
【００５２】
本発明の錠剤またはピルを、長期作用の利益を提供する投与形態を提供するために、コートするか、または他の方法で混成する。例えば、本錠剤またはプルは、内部投与成分および外部投与成分を含み、後者は前者を覆う形である。この２成分を、胃での分解に耐え、内部成分が無傷で十二指腸まで到達するために働く、または、放出を遅らせるための、腸溶層により分けてよい。種々の物質をこのような腸溶性層またはコーティングのために使用でき、このような物質は、多くのポリマー酸および、ポリマー酸とセラック、アセチルアルコールおよびセルロースアセテートのような物質とこの混合物を含む。
【００５３】
本発明の組成物を経口または注射により投与するために包含し得る液体形態は、水性溶液、適当に香味付けされたシロップ、水性または油性懸濁液、およびコーン油、綿実油、ゴマ油、ココナッツ油、またはピーナッツ油のような食用油を含む香味付けされたエマルジョン、ならびにエリキシル剤および類似の医薬媒体を含む。
【００５４】
吸入または吹き入れ(insufflation)のための組成物は、薬学的に許容される、水性または有機溶媒、またはそれらの混合物中の溶液および懸濁液、ならびに粉末を含む。本液体または固体組成物は、ここに記載の通りの適当な薬学的に許容される賦形剤を含む。好ましくは、本組成物は、局所または全身作用のために経口または経鼻的呼吸経路により投与する。好ましくは薬学的に許容される溶媒中の組成物は、不活性ガスの使用により霧化できる。霧化溶液を、直接噴霧デバイスから吸入してよく、または噴霧デバイスをフェイス・マスク・テントもしくは間欠性の陽圧呼吸器に接続してよい。溶液、懸濁液、または粉末組成物を、好ましくは経口でまたは経鼻的に、本製剤を適当な方法で送達するデバイスから投与できる。
【００５５】
本発明の方法において用いる他の好ましい製剤は、経皮送達デバイス(“パッチ”)を用いる。このような経皮パッチは、制御された量でのグラプトペタルム属の連続的なまたは不連続的な注入を提供するために使用し得る。薬剤の送達のための経皮パッチの構築および使用は当分野で既知である。例えば、引用により本明細書に包含させる米国特許５,０２３,２５２参照。このようなパッチは、薬剤の連続した、搏動性の、または要事の送達のために構築できる。
【００５６】
本発明で使用するための他の適当な製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciencesに見ることができる。
【００５７】
本医薬組成物は、必要な物質が適当な容器中に包装されている、簡便なキット中に提供し得る。本組成物は１回用量、または多回用量(すなわち、１回分を超える用量)で投与できる。多回用量は同時にまたは連続的に(例えば、数日間または数週間にわたり)投与できる。本組成物は、好ましくは各投与量が約１から５００ｇのグラプトペタルム属全植物(湿重量)に相当する量を含む、単位投与形態に製剤する。
【００５８】
本発明の組成物を、既知の抗炎症剤、抗脂肪症剤、抗ウイルス剤または抗線維症剤と共に投与し得ることがさらに企図される。加えて、シリマリンのような肝臓を保護するために一般的に使用されている他の物質も、グラプトペタルム属組成物と共に使用できる。これらの全ての薬剤または物質は、グラプトペタルム属と同じ組成物に混合するかまたは別々に投与し得る。
【００５９】
下記実施例は本発明を説明するために提供し、いかなる方法でも本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。
【実施例】
【００６０】
下記実施例において、下記の略語は下記の意味を有する。定義していない略語は、その一般に認められている意味を有する。
【表１】
2008511551.tif 000003
【００６１】
材料および方法
試薬
ＤＭＮおよびシリマリンは、Sigma Company(St. Louis, MO)から得た。抗α−ＳＭＡおよび抗タイプＩコラーゲン抗体は、Calbiochem-Merck(Cambridge, MA)から購入した。Fast GreenはCurr, BDH Chemical(Canada)から購入し、ヘマトキシリン／エオシン染色試薬はSigma Company(St. Louis, MO)から得た。ＧＯＴ、ＧＰＴ、ビリルビンおよびアルブミンのキットは和光(東京、日本)から得た。有機溶媒はSigma Chemical Co. (St. Louis, MO)から購入した。Whatman No.1濾紙は、Fisher Scientific(Fair Lawn, NY)から購入した。
【００６２】
グラプトペタルム属の製造
グラプトペタルム属は、台湾の地元のハーブ農家から購入した。グラプトペタルム属を蒸留水で洗浄し、一晩空気乾燥させ、次いで−５０℃のフリーズドライヤーで凍結乾燥した。グラプトペタルム属を、次いで粉末(１００メッシュ)に挽き、凍結乾燥し、４℃の密封条件下で、使用時まで貯蔵した。特記しない限り、グラプトペタルム属抽出物は、グラプトペタルム属粉末を水に溶解し、エタノールを８０％の最終濃度まで徐々に添加することにより張性した。１４００×ｇで２０分遠心分離後、上清を０.２２μmフィルターを通して濾過し、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固した。エタノール処理後のグラプトペタルム属抽出物の回収率は６５％(ｗ／ｗ)であった。本乾燥抽出物を貯蔵溶液として、５０mg／mlの濃度に水で溶解した。本貯蔵溶液を、次いで適当な作業溶液に希釈した。
【００６３】
動物
３００から３５０ｇの雄Sprague-DawleyラットをNational Laboratory Animal Breeding and Research Center, National Science Council, 台湾から購入した。全ての実験は、National Laboratory Animal Breeding and Research Center's guidelinesに沿って行った。
【００６４】
肝臓傷害および線維症動物モデルとしてのラットの準備
肝臓傷害および線維症モデルラットを、先の報告(１０)をわずかに変えて、ＤＭＮを投与することにより準備した。簡単に言うと、ＤＭＮをリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)で希釈し、ラットの腹腔内(ｉ.ｐ.)に各週最初の３日間、７mg／kg／日で３週間投与した。コントロール群はＰＢＳのみの注射を受けた。
【００６５】
グラプトペタルム属またはシリマリンの投与
７２匹のラットを無作為に下記の通りの４実験群に分けた(各群ｎ＝１８)：
(１)ＰＢＳ−水(ＰＢＳ  ｉ.ｐ.注射および水経口投与)；
(２)ＤＭＮ−水(ＤＭＮ  ｉ.ｐ.注射および水経口投与)；
(３)ＤＭＮ−グラプトペタルム属(ＤＭＮ  ｉ.ｐ.注射および最初のＤＭＮ注射１週間後グラプトペタルム属経口投与)；および
(４)ＤＭＮ−シリマリン(ＤＭＮ  ｉ.ｐ.注射および最初のＤＭＮ注射１週間後シリマリン経口投与)。
【００６６】
グラプトペタルム属粉末またはシリマリンを水に溶解し、ＤＭＮの最初の注射７日後から開始して、１日１回、５週間、１ｇ／体重kg(グラプトペタルム属粉末)または０.４ｇ／体重kg(シリマリン)の投与量で経口投与した。コントロール動物は同量の蒸留水のみを投与された。６週間処置後、ラットを秤量し、殺し、血液サンプルを生化学的指標(ＧＯＴ、ＧＰＴ、ビリルビン、アルブミン、プロトロンビン時間、および血小板数を含む)の測定のために回収し、肝臓および脾臓を組織化学のために摘出し、秤量し、ホルムアルデヒドに固定した。
【００６７】
肝臓の組織病理学的試験
肝臓切片をリン酸緩衝化ホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、ヘマトキシリン−エオシンで染色した。コラーゲン性および非コラーゲン性タンパク質の差異染色を、飽和ピクリン酸中対比染色として０.１％Sirius redおよび０.１％fast greenで行った。この方法によりコラーゲンは赤色に染まる。線維症および構築的変化の程度を、先に記載の通り、各群由来の肝臓調製物を使用した盲検方式で、無関係な病理医による半定量的方法で採点した(Desmet et al., 1994)。肝臓組織セクションは、顕微鏡(オリンパスIX70、日本)を使用して写真撮影した。
【００６８】
実施例１
グラプトペタルム属は、ＤＭＮにより誘発される体重および肝臓重量減少を予防する
グラプトペタルム属の肝臓傷害および線維症に対する効果を決定するために、動物モデルを、既知の肝毒性物質であるＤＭＮを使用して確立した。材料および方法に記載の通りＤＭＮを受けた動物に、次いでグラプトペタルム属を与え、効果を決定した。グラプトペタルム属の効果を、また既知の肝保護活性剤であるシリマリンのものと比較した。ＤＭＮを受けていない正常動物をコントロールとして使用した。
【００６９】
グラプトペタルム属の経口投与の、ＤＭＮｉ.ｐ.注射有りまたは無しのラットの体重および肝臓重量に対する効果を表１に示す。ＤＭＮでの処置は、コントロールラット(ＰＢＳ−水群)と比較して、ラット体重および肝臓重量(ＤＭＮ−水群)の有意な減少をもたらした。経口的に与えたグラプトペタルム属は、ＤＭＮ介在ラット体重および肝臓重量減少を著しく予防する(ＤＭＮ−グラプトペタルム属群)；グラプトペタルム属はまたＤＭＮ介在ラット脾臓重量増加も予防する。体重、肝臓および脾臓重量は正常なコントロールラットでは変化しない。これらの結果は、グラプトペタルム属がＤＭＮの損傷を起こす影響を著しく減少させることを示す。
【表２】
2008511551.tif 000004
ｎ、群中の生存ラット数
【００７０】
加えて、６週間後、ＤＭＮ処置群で１８匹のラット中１３匹が、ＤＭＮ−シリマリン処置群で１８匹のラット中８匹が死亡し、そしてグラプトペタルム属を経口的に与えたＤＭＮ処置群では１８匹のラット中６匹しか死亡しなかった(図１)。ＤＭＮ、グラプトペタルム属またはシリマリンで処置しなかった全てのコントロールラット(各群１８匹)は生存していた。故に、グラプトペタルム属はＤＭＮの毒性から動物を効果的に保護し、そしてシリマリンよりも有効であった。
【００７１】
実施例２
血清ビリルビン、アルブミン、血小板およびプロトロンビン時間に対するグラプトペタルム属の効果
グラプトペタルム属の肝臓機能に対する効果をさらに調査するため、肝臓機能の指標を測定した。表２に示す通り、グラプトペタルム属の共投与は、ＤＭＮ処置後の血清ＧＯＴおよびＧＰＴレベルの増加を予防する。さらに、血清ビリルビンレベルおよびプロトロンビン時間は、正常コントロールと比較してＤＭＮ処置ラットで上昇した。しかしながら、グラプトペタルム属の毎日の経口投与は、ＤＭＮ処置ラットのビリルビン増加およびアルブミン減少を有意に予防した。加えて、ＤＭＮでの処置は、血清血小板の著しい減少およびプロトロンビン時間の延長をもたらした。対照的に、ＤＭＮ−グラプトペタルム属処置群でプロトロンビン時間の改善は有意であり、血小板数は一貫して高かった。
【００７２】
【表３】
2008511551.tif 000005
ＧＯＴ、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ
ＧＰＴ、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ
ＰＴ、プロトロンビン時間
ＰＬＴ、血小板
ｎ、群中の生存ラット数
従って、グラプトペタルム属は肝臓機能を有意に増強した。
【００７３】
実施例３
ＤＭＮ投与後の炎症および壊死反応に対するグラプトペタルム属の効果
ＤＭＮ誘発肝臓傷害は炎症反応が関与すると見なされているため、我々は、次に、グラプトペタルム属が、ＤＭＮ中毒後の肝臓における壊死または炎症反応を予防するか否かの問題に取り組んだ。結果は、ＤＭＮ処置３週間後の肝臓において、中心周囲および中心帯領域(mid-zonal area)の大量の壊死と、炎症細胞の浸潤が観察された。グラプトペタルム属の共投与は、しかしながら、ＤＭＮ誘発壊死および炎症を予防した。故に、グラプトペタルム属は、肝臓における壊死および炎症反応を予防できる。
【００７４】
実施例４
ＤＭＮ処置ラットにおけるグラプトペタルム属による肝線維形成の予防
ＤＭＮの腹腔内投与は、肝臓表面への均一な微細な顆粒をもたらす。顕微鏡分析は、６週間ＤＭＮを受けた動物の肝臓における硬変様構造パターン：グリソン鞘中の線維性結合組織成分、偽小葉形成、線維性中隔の形成、および中央領域に結合している肥厚したレチクリン線維を。ＤＭＮおよびシリマリンの両方で処置した動物はまだ、線維性結合組織の小葉中心および門脈周囲への激しい沈着を示した。対照的に、グラプトペタルム属を５週間受けたＤＭＮ処置ラット(ＤＭＮ−グラプトペタルム属群)の肝臓は、軽度の線維性架橋形成、小葉中心および門脈周囲の両方での減少した線維症、および肝臓腺房の減少した変形しか示さなかった。故に、グラプトペタルム属は、肝硬変への重要な進行である、肝臓の線維形成を減少するために使用できる。
【００７５】
実施例５
グラプトペタルム属は肝臓コラーゲンおよびヒドロキシプロリン含量を減少した
線維性の肝臓において、細胞外マトリックスが蓄積する。細胞外マトリックスの増加したレベルは、最終的に肝硬変に至る線維症のさらなる進行に重要である。コラーゲンが細胞外マトリックスの主成分であるため、我々は、ＤＭＮ単独またはＤＭＮとグラプトペタルム属の組合せで処置した動物におけるコラーゲン含量を決定した。
【００７６】
肝臓中のコラーゲン含量をFast green染色により検出した。ＤＭＮ処置ラットは、肝臓中のコラーゲン線維含量の徐々のかつ著しい増加、および小葉を囲むコラーゲンの束および大きな線維性中隔を示し、重篤な線維症の発症を示した。ＤＭＮ−シリマリン処置ラットにおいて、肝臓コラーゲン含量は健常コントロールと比較して有意に高かった。しかしながら、使用した染色法では赤色に染まるコラーゲン束の厚さは、ＤＭＮ−グラプトペタルム属処置ラットにおいて著しく減少した。コントロールラットの肝臓には非常に低レベルのコラーゲン沈着しかなかった。映像分析法による線維症の定量的分析は、グラプトペタルム属およびシリマリン処置がＤＭＮ誘発肝臓コラーゲン含量を、各々８０％および２５％ほど、著しく低下させることを証明する。
【００７７】
肝臓線維症をまた肝臓ヒドロキシプロリンの測定により定量した。ＤＭＮ処置群のヒドロキシプロリン含量(８２０±３１μg／ｇ)はＤＭＮ−グラプトペタルム属処置群(５５８±５３μg／ｇ)、ＤＭＮ−シリマリン処置群(７４９±７２μg／ｇ)、およびコントロール群(４９８±２２μg／ｇ)のものより有意に高かった。
上記の２個の実験と一致して、グラプトペタルム属は肝臓線維症を著しく予防した。
【００７８】
実施例６
グラプトペタルム属はＤＭＮ処置ラットにおけるα−ＳＭＡ発現を抑制した
次に、活性化ＨＳＣのマーカーであるα−ＳＭＡの発現を測定した。線維性の肝臓において、細胞外マトリックスが蓄積される。細胞外マトリックスの増加したレベルは、最終的に肝硬変に至る線維症のさらなる進行に重要である。特異的肝臓細胞である肝星細胞(ＨＳＣ)は細胞外マトリックス増加を担う。活性化ＨＳＣが、休止ＨＳＣとは逆に、大量の平滑筋α−アクチン(α−ＳＭＡ)ｍＲＮＡおよびタンパク質を産生するため、α−ＳＭＡは活性化ＨＳＣおよび肝線維症のマーカーである。
【００７９】
α−ＳＭＡを、最初のＤＭＮ投与６週間後の肝臓において免疫組織化学的染色により測定した。予測される通り、激しい、α−ＳＭＡの激しい、特異的染色が、ＤＭＮ処置肝臓の主要な領域で観察された。このα−ＳＭＡのＤＭＮ誘発発現は、グラプトペタルム属またはシリマリンの経口投与により劇的に抑制され、グラプトペタルム属は、シリマリンよりもさらに有効であった。媒体コントロールを受けたラットの肝臓は、予測される通り、α−ＳＭＡについて負の染色であった。また、これらの発見は、グラプトペタルム属は肝臓における線維形成性応答を予防することを示す。
【００８０】
実施例７
培養ラット肝星細胞に対するグラプトペタルム属抽出物の抗増殖作用
種々のグラプトペタルム属抽出物を、肝臓星細胞に対するグラプトペタルム属の活性を決定するために調整した。抽出物は下記の通り調製した：
粗水性抽出物
グラプトペタルム属の全植物を凍結乾燥し、粉末にした。この粉末にした物質の５ｇを、２５０mLの水で２５℃で２時間、１００rpmのロータリーシェーカーで抽出した。本抽出は凍結乾燥後ピンク色であった。
【００８１】
水−エタノール抽出物
上記の粗水性抽出物を活性化炭(０.０３６ｇ／mL抽出物)と３０分撹拌した。本混合物を次いでWhatman No. 1濾紙で濾過し、蒸留水で２回洗浄し、および０.６Ｌ  ５０％ＥｔＯＨで抽出した。濾過および真空蒸発後、３００mgの乾燥エタノール抽出物を暗褐色ペーストとして得た。主成分はグリコシド、オリゴマーのガロタンニン、およびフラボノイドであった。テルペノイドおよびサポニンも検出された。本暗褐色ペーストは水に可溶性であり、メタノールに一部可溶性であった。メタノールからの沈殿を分析し、それはポリサッカライドおよび糖タンパク質を含んだ。
【００８２】
エタノール抽出物
上記の活性化炭を、５０％エタノールで抽出後、次いで０.６Ｌ  ９５％エタノールで抽出した。濾過および真空蒸発後、２００mgの乾燥エタノール抽出物を得た。この暗褐色ペーストの主成分はフラボノイドおよびテルペノイドであった。
【００８３】
アセトン抽出物
前段落に記載の活性化炭を、９５％エタノールで抽出後、０.６Ｌ  アセトニトリル、続いて０.６Ｌ  ７０％アセトンで抽出した。本抽出物を合わせ、濾過し、真空蒸発させて、５０mgの乾燥アセトン抽出物を得た。主成分はオリゴマーのガロタンニン、フラボノイド、サポニンおよびトリテルペノイドであった。この暗褐色ペーストは水、エタノールおよびメタノールに可溶性であった。
【００８４】
クロロホルム抽出物
活性化炭を、前段落に記載の通りアセトンで抽出後、０.６Ｌ  クロロホルムで抽出した。濾過および真空蒸発後、乾燥アセトン抽出物を暗褐色ペーストとして得た。主成分はフラボノイド、サポニンおよびトリテルペノイドであった。本暗褐色ペーストは水に不溶性であり、アセトンに一部可溶性であった。アセトン沈殿は白色であった。
【００８５】
粗メタノール性抽出物
グラプトペタルム属の全植物を凍結乾燥し、粉末にした。この粉末にした物質の５ｇを２５０mLのメタノールで２５℃で２時間、１００rpmのロータリーシェーカーで抽出した。本抽出物を濾過し、真空蒸発させた。得られた生成物は一部水溶性であった。水溶性部分は２００mgの赤みがかったフラボノイドを含み、水不溶性部分は４００mgのフラボノイドおよびトリテルペンを含んだ。
【００８６】
ＨＳＣの増殖に対するグラプトペタルム属フラクションの効果を試験した。細胞数は、６日間の培養中、ウェルあたり１.２±０.３×１０５(ｎ＝９)から３.６±０.５×１０５(ｎ＝９)細胞に増加した。グラプトペタルム属抽出物は、ＨＳＣの細胞増殖を時間および用量依存的方法で阻害した。高用量のグラプトペタルム属粗抽出物(５００μg／ml)の培養活性化ラットＨＳＣおよび肝細胞への添加は、光学顕微鏡で判断して、５日後にＨＳＣにおける著しい形態学的変化をもたらした。故に、ＨＳＣは、明確な細胞−細胞界面を有する平らな線維芽細胞表現型から、基層が脱離した、円形に代わり、明確な細胞外マトリックス網目構造を培養フラスコの底に残す。対照的に、グラプトペタルム属の粗抽出物は、同じ用量で肝細胞にほとんど影響がなかった。故に、グラプトペタルム属はＨＳＣに優先的に毒性であり、最終的に細胞死をもたらした(図２)。理論に縛られることを望まないが、この選択的細胞毒性効果は、グラプトペタルム属の抗線維性活性の基礎であり得る。
【００８７】
上記の水抽出物、水−エタノール抽出物、エタノール抽出物、メタノール抽出物、アセトン抽出物、およびクロロホルム抽出物を含む種々のグラプトペタルム属抽出物の抗増殖作用を決定した。図３に示す通り、グラプトペタルム属の全ての試験した抽出物が肝星細胞に対する細胞毒性効果を示し、これらの抽出物が抗線維性活性を有することを示す。
【００８８】
グラプトペタルム属の安全性をさらなる実験により証明した。９０日間の高用量のグラプトペタルム属(５ｇ／体重kg)の毎日の経口投与は、ラットにおいて目に見える有害事象は何も起こさず、死亡の証拠はなく、または肝臓組織学的切片の試験で肝臓損傷の証拠はなかった。さらに、これらのグラプトペタルム属処置ラットはコントロール群または低用量グラプトペタルム属−処置群(１ｇ／kg)と比較して、体重、肝臓重量、または血清ＧＯＴ、ＧＰＴ、ビリルビン、およびアルブミンレベルにおいて何も著しい変化は示さなかった(データは示していない)。故に、グラプトペタルム属は、高用量でさえ正常細胞は安全であるが、活性化肝星細胞は効率的に殺す。
【００８９】
実施例８
ＨｂｓＡｇ発現の阻害
グラプトペタルム属のＢ型肝炎ウイルスに対する効果を、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原(ＨｂｓＡｇ)を構成的に発現するヒト肝癌Ｈｅｐ３ＢおよびＨｅｐＡ２細胞を使用して試験した。Ｈｅｐ３ＢおよびＨｅｐＡ２細胞をグラプトペタルム属抽出物とインキュベーション後、ＨｂｓＡｇの発現レベルをＥＬＩＳＡアッセイで試験した。図４に記載の通り、２５０μg／ml  グラプトペタルム属での処置は、Ｈｅｐ３ＢおよびＨｅｐＡ２細胞からのＨｂｓＡｇの発現を、それぞれ７５％および４０％ほど、著しく減少させた。故に、グラプトペタルム属はＢ型肝炎ウイルス複製阻害に使用できる。
【００９０】
実施例９
臨床患者に対するグラプトペタルム属の効果
１４名の患者を脂肪肝と診断した(男１０名、女４名；平均年齢４９歳)。この診断は、全患者で脂肪肝が示された超音波検査により確認した。患者は、６０−２００mg／体重kg／日のグラプトペタルム属(乾燥粉末)の経口用量を６ヶ月受け、超音波検査で再検査した。結果は、ほとんど全ての患者が完全に脂肪肝から回復していることを示した。故に、グラプトペタルム属は脂肪肝の患者に非常に有効である。
【００９１】
加えて、グラプトペタルム属は、軽度または中程度の肝線維症患者の生化学マーカーを著しく改善した。例えば、一つの試験で、グラプトペタルム属は１６名の患者(男１１名および女５名；平均年齢５２歳)中１０名の血清ＧＯＴ、ＧＰＴおよびビリルビンのレベルを著しく減少させたが、血清アルブミンのレベルは増加させた。超音波検査像に基づき、グラプトペタルム属が数名の患者の肝線維症を著しく減少させることも判明した。さらに、グラプトペタルム属は、肝硬変末期の４名の患者(男３名および女１名、平均年齢５１歳)のクオリティ・オブ・ライフを改善した。
【００９２】
実施例１０
肺線維症に対するグラプトペタルム属の効果
肺線維芽細胞の単離：肺組織の細かく切った切片を、０.５mM  ＥＤＴＡ含有ハンクス平衡塩溶液中、１時間コラゲナーゼ(０.５mg／ml)およびＤＮａｓｅ(０.０５mg／ml)で消化させた。細胞を消化組織から、ポリアミドナイロンメッシュを通した濾過により分離し、遠心分離により回収し、そして培地で１回洗浄した。１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中に再懸濁後、細胞を培養プレートに播種した。３回継代後、培養は約１００％肺線維芽細胞を含んだ。一次培養肺線維芽細胞を種々のグラプトペタルム属抽出物で５日間処理した。インキュベーション後、細胞数をトリパンブルー色素排出法を使用して直接計数した。
【００９３】
結果は、試験した全てのグラプトペタルム属抽出物が、肺線維芽細胞の細胞増殖を用量依存的方法で阻害することを示す(図５)。肺線維芽細胞に対する抗増殖効果は、故に、グラプトペタルム属の肺における抗線維性活性の基礎として働き得る。
【００９４】
実施例１１
肺に対するグラプトペタルム属の効果
ブレオマイシン誘発肺線維症の動物モデルを使用して、肺に対するグラプトペタルム属の効果を試験した。雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス(６−８週齢)をケタミンで麻酔し、０.１５Ｕ／kgのブレオマイシン(Blenoxane;Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA)または滅菌塩水を気管内注射した。マウスを、分析のためにブレオマイシン暴露１日、３日、７日、１４日、２１日後に殺した。別の実験で、ブレオマイシン処置マウスに、毎日１ｇ／体重kgのグラプトペタルム属粉末または水を殺すまで与えた。これらの実験のための動物使用は、Institutional Animal Care and Use Committees of the Taichung Veterans General Hospital, Taiwanにより認可された。
【００９５】
各処置群の５匹の動物を、下記の通り、実験の最後にそれらの肺の組織学的評価のために選んだ。殺した後、肺組織を緩衝化１０％ホルマリン溶液で４８時間固定し、パラフィンに包埋した。組織を、次いで３□mに切り、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、炎症細胞浸潤および肺線維症について試験した。肺線維症採点の基準は下記の通りであった：グレード０＝正常肺；グレード１＝肺胞または細気管支壁の微小な線維性肥厚；グレード２＝肺構造の明確な損傷および線維性束または小線維性塊の形成を伴う、増加した線維症；およびグレード３＝重篤な肺構造の歪みおよび大きな線維性領域。
【００９６】
全マウスは殺すまで生きていたが、ブレオマイシンのみで処置したマウスは、著しい体重減少に苦しみ、グラプトペタルム属で処置したマウスよりも悪い状態であった。組織学的試験において、ブレオマイシン／水群の肺は、炎症細胞の広汎性のおよび著しい浸潤、ならびに典型的な線維性の変化を伴う肺胞壁厚の増加を示した。対照的に、ブレオマイシン／グラプトペタルム属群の肺は、少ない線維性の病巣および炎症細胞の局所浸潤を示した。ブレオマイシンを受けていないグラプトペタルム属群の肺は、同定可能な病巣は何も示さず、グラプトペタルム属自体が肺に何も変化をもたらさないことを証明した。ブレオマイシン／グラプトペタルム属群の肺線維症スコア(１.４±０.５)はブレオマイシン／水群(２.６±０.４)より有意に低かった。正常コントロール群(塩水／水)およびグラプトペタルム属群(塩水／グラプトペタルム属)のスコアは、各々おおよそ０および０であった。
【００９７】
これらの結果は、グラプトペタルム属が肺線維芽細胞の増殖を阻害することを示す実施例１０のものと矛盾しない。従って、グラプトペタルム属は肺線維症および炎症に対して有効である。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】図１は、媒体コントロール(コントロール)、ＤＭＮとグラプトペタルム属(ＤＭＮ−ＧＰ)、ＤＭＮとシリマリン(ＤＭＮ−シリマリン)またはＤＭＮ単独(ＤＭＮ)を受けたラットの生存数を示す。
【図２】図２は、培養ラット肝星細胞に対する粗グラプトペタルム属抽出物の抗増殖作用を示す。ラット肝星細胞を２５０または５００μg／mlのグラプトペタルム属粗抽出物中でインキュベートし、そして生存細胞数を毎日数えた。記載の生存率は、グラプトペタルム属を受けていないコントロール細胞と比較した生存率％である。
【図３】図３は、培養ラット肝星細胞に対する種々のグラプトペタルム属抽出物の抗増殖作用を示す。ラット肝星細胞を、記載のグラプトペタルム属抽出物とインキュベートし、そして生存細胞数を毎日数えた。記載の生存率は、グラプトペタルム属を受けていないコントロール細胞と比較した生存率％である。
【図４】図４は、記載の濃度のグラプトペタルム属抽出物中でインキュベートしたＨｅｐ３ＢまたはＨｅｐＡ２細胞におけるＨｂｓＡｇの発現レベルを示す。
【図５】図５は、培養マウス肺線維芽細胞に対する、種々のグラプトペタルム属抽出物の抗増殖作用を示す。一次培養肺線維芽細胞を、記載のグラプトペタルム属抽出物とインキュベートし、そして、生存細胞数を５日間のインキュベーション後に数えた。記載の生存率は、グラプトペタルム属を受けていないコントロール細胞と比較した生存率％である。
【図１】
2008511551.tif 000006
【図２】
2008511551.tif 000007
【図３】
2008511551.tif 000008
【図４】
2008511551.tif 000009
【図５】
2008511551.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月8日(2007.5.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラプトペタルム属またはエケベリア属を含む、医薬組成物。
【請求項２】
該グラプトペタルム属がグラプトペタルム・パラグアイエンセである、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
該グラプトペタルム属またはエケベリア属が抽出物である、請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項４】
該抽出物が、１種以上の水性溶媒、無極性溶媒、アルコール溶媒、またはそれらの混合物の抽出物である、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
薬学的に許容される賦形剤または担体をさらに含む、請求項１から４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
経口または局所投与に適している、請求項１から５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
肝臓の疾患または病状の予防または処置用医薬の製造における、グラプトペタルム属またはエケベリア属の使用であって、該肝臓の疾患または病状が、肝炎、脂肪肝、肝線維症、肝硬変、およびＢ型肝炎から選択される、使用。
【請求項８】
該グラプトペタルム属がグラプトペタルム・パラグアイエンセである、請求項７記載の使用。
【請求項９】
該グラプトペタルム属が抽出物である、請求項７記載の使用。
【請求項１０】
該抽出物が、１種以上の水性溶媒、無極性溶媒、アルコール溶媒、またはそれらの混合物の抽出物である、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
該肝臓の疾患または病状が肝炎である、請求項７記載の使用。
【請求項１２】
該肝臓の疾患または病状が肝線維症である、請求項７記載の使用。
【請求項１３】
平滑筋α−アクチン分泌が減少している、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
平滑筋α−アクチン分泌が肝星細胞において減少している、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
該肝臓の疾患または病状が肝硬変である、請求項７記載の使用。
【請求項１６】
該肝臓の疾患または病状がＢ型肝炎である、請求項７記載の使用。
【請求項１７】
該肝臓の疾患または病状が脂肪肝である、請求項７記載の使用。
【請求項１８】
肝星細胞増殖の阻害法であって、該肝星細胞を、請求項１記載の医薬組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項１９】
該肝星細胞が哺乳動物中に存在している、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
該哺乳動物がヒトである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
肝星細胞を選択的に殺す方法であって、該肝星細胞を、請求項１記載の医薬組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項２２】
該肝星細胞が哺乳動物中に存在している、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該哺乳動物がヒトである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
哺乳動物におけるＢ型肝炎ウイルス表面抗原発現阻害用医薬の製造のための、グラプトペタルム属またはエケベリア属の使用。
【請求項２５】
Ｂ型肝炎ウイルス複製が該哺乳動物中で阻害される、請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
該哺乳動物がヒトである、請求項２５記載の使用。
【請求項２７】
哺乳動物における線維症または炎症の抑制または処置用医薬の製造のための、グラプトペタルム属またはエケベリア属の使用。
【請求項２８】
該線維症または炎症が肺、腎臓および膀胱から成る群から選択される臓器で起こる、請求項２７記載の使用。
【請求項２９】
該組成物を経口で投与する、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
該組成物を注射により投与する、請求項２７記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成19年10月11日(2007.10.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラプトペタルム属またはエケベリア属を含む、医薬組成物。
【請求項２】
該グラプトペタルム属がグラプトペタルム・パラグアイエンセである、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
該グラプトペタルム属が抽出物である、請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項４】
該抽出物が、１種以上の水性溶媒、無極性溶媒、アルコール溶媒、またはそれらの混合物の抽出物である、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
薬学的に許容される賦形剤または担体をさらに含む、請求項１から４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
経口または局所投与に適している、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項７】
肝臓の疾患または病状の予防または処置用医薬の製造における、グラプトペタルム属またはエケベリア属の使用であって、該肝臓の疾患または病状が、肝炎、脂肪肝、肝線維症、肝硬変、およびＢ型肝炎から選択される、使用。
【請求項８】
該グラプトペタルム属がグラプトペタルム・パラグアイエンセである、請求項７記載の使用。
【請求項９】
該グラプトペタルム属が抽出物である、請求項７記載の使用。
【請求項１０】
該抽出物が、１種以上の水性溶媒、無極性溶媒、アルコール溶媒、またはそれらの混合物の抽出物である、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
該肝臓の疾患または病状が肝炎である、請求項７記載の使用。
【請求項１２】
該肝臓の疾患または病状が肝線維症である、請求項７記載の使用。
【請求項１３】
平滑筋α−アクチン分泌が減少している、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
平滑筋α−アクチン分泌が肝星細胞において減少している、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
該肝臓の疾患または病状が肝硬変である、請求項７記載の使用。
【請求項１６】
該肝臓の疾患または病状がＢ型肝炎である、請求項７記載の使用。
【請求項１７】
該肝臓の疾患または病状が脂肪肝である、請求項７記載の使用。
【請求項１８】
肝星細胞増殖の阻害法であって、該肝星細胞を、請求項１記載の医薬組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項１９】
該肝星細胞が哺乳動物中に存在している、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
該哺乳動物がヒトである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
肝星細胞を選択的に殺す方法であって、該肝星細胞を、請求項１記載の医薬組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項２２】
該肝星細胞が哺乳動物中に存在している、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該哺乳動物がヒトである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
哺乳動物におけるＢ型肝炎ウイルス表面抗原発現阻害用医薬組成物の製造のための、グラプトペタルム属またはエケベリア属の使用。
【請求項２５】
Ｂ型肝炎ウイルス複製が該哺乳動物中で阻害される、請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
該哺乳動物がヒトである、請求項２５記載の使用。
【請求項２７】
哺乳動物における線維症または炎症の抑制または処置用医薬組成物の製造のための、グラプトペタルム属またはエケベリア属の使用。
【請求項２８】
該線維症または炎症が肺、腎臓および膀胱から成る群から選択される臓器で起こる、請求項２７記載の使用。
【請求項２９】
該組成物を経口で投与する、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
該組成物を注射により投与する、請求項２７記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明の他の局面は、対象における肝臓の疾患または病状の予防または処置法であって、有効量のここに記載の医薬組成物を対象に投与することを含み、該肝臓の疾患または病状が肝炎、脂肪肝、肝線維症、肝硬変、およびＢ型肝炎から成る群から選択される、方法を提供する。肝線維症または硬変のために使用されるとき、本組成物が、特に肝星細胞における、平滑筋α−アクチンの発現を減少できることが好ましい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
発明の詳細な記載
本発明は、グラプトペタルム属および／または近親植物を含む組成物、およびその使用に関する。グラプトペタルム属は、肝臓の炎症および線維症、体重減少、脾臓腫脹、および最終的な死亡の原因となる毒物から動物を保護できる。特に、グラプトペタルム属は肝線維症において中枢的役割を有する活性肝星細胞の増殖を阻害する。グラプトペタルム属の抗線維症活性は肝臓に限定されない。グラプトペタルム属は、また肺線維芽細胞の増殖を阻害し、肺における炎症および線維症の原因となる毒物から動物を保護する。故に、グラプトペタルム属は、特に組織線維症の予防および治療薬である。グラプトペタルム属と近親の植物も同じ方法で使用できる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
実施例７
培養ラット肝星細胞に対するグラプトペタルム属抽出物の抗増殖作用
種々のグラプトペタルム属抽出物を、肝臓星細胞に対するグラプトペタルム属の活性を決定するために調製した。抽出物は下記の通り調製した：
粗水性抽出物
グラプトペタルム属の全植物を凍結乾燥し、粉末にした。この粉末にした物質の５ｇを、２５０mLの水で２５℃で２時間、１００rpmのロータリーシェーカーで抽出した。本抽出は凍結乾燥後ピンク色であった。
【国際調査報告】
2008511551.tif 000011
2008511551.tif 000012
2008511551.tif 000013
2008511551.tif 000014