(57)【要約】  本発明は、複数の標的検体の濃度を連続的に測定するための装置に関する。装置は、前記検体に対して透過性である膜により取り囲まれている、複数の標的に特異的な検体結合領域を含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つを超える標的検体の濃度を測定するための装置であって、前記装置は、
ａ）各検体結合領域が前記標的検体の少なくとも１つに特異的かつ可逆的に結合することができる、複数の検体結合領域、および
ｂ）前記標的検体に対して透過性である、前記結合領域を取り囲む膜
を含み、
前記装置は、前記標的検体の前記結合領域に対する結合の有無を、検出器に伝達することができることを特徴とする装置。
【請求項２】
前記装置は、前記標的検体の前記結合領域に対する結合の有無を、検出器に連続的に伝達することができることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記標的検体は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、糖タンパク質、プロテオグリカン、リポタンパク、薬物、薬物代謝物、有機小分子、無機分子、ポリマー、およびこれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記標的検体の１つは、脂肪酸、乳酸、Ｃ反応性タンパク質、およびグルコースからなる群から選択されることを特徴とする、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
前記標的検体は、少なくとも脂肪酸、乳酸、およびグルコースであることを特徴とする、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
１つまたは複数のポリペプチドまたはタンパク質は、前記複数の検体結合領域を含むことを特徴とする、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記１つまたは複数のポリペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つは、ガラクトース／グルコース結合タンパク質（ＧＧＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、リボース結合タンパク質（ＲＢＰ）、アラビノース結合タンパク質（ＡＢＰ）、ジペプチド結合タンパク質（ＤＰＢＰ）、グルタミン結合タンパク質（ＱＢＰ）、鉄結合タンパク質（ＦｅＢＰ）、ヒスチジン結合タンパク質（ＨＢＰ）、リン酸結合タンパク質（ＰｈｏｓＢＰ）、オリゴペプチド結合タンパク質（ＯｐｐＡ）、および脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）、およびこれらの誘導体からなる群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記１つまたは複数のポリペプチドまたはタンパク質は、ＧＧＢＰ、ＦＡＢＰ、およびＧＧＢＰ誘導体であることを特徴とする、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記標的検体は、グルコース、脂肪酸、および乳酸からなる群から選択される少なくとも２つであることを特徴とする、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記少なくとも２つの検体はグルコースおよび脂肪酸であることを特徴とする、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記少なくとも２つの検体はグルコースおよび乳酸であることを特徴とする、請求項９に記載の装置。
【請求項１２】
前記ポリペプチドまたはタンパク質は少なくとも１つの標識をさらに含むことを特徴とする、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの標識は、蛍光標識、りん光標識、化学発光標識、生物発光標識、および電気化学標識からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
前記膜は脂質を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の装置。
【請求項１５】
前記脂質はグリセロリン脂質であることを特徴とする、請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記グリセロリン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
前記膜はポリマーを含むことを特徴とする、請求項１２に記載の装置。
【請求項１８】
前記ポリマーは、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリＮ−ビニルピロリドン、ポリエチレンオキシド、ポリ加水分解化アクリロニトリル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ｐｏｌｙＨＥＭＡ）、ポリメチルメタクリレート（ｐｏｌｙＭＭＡ）、ポリウレタン、ポリエチレンアミン、ポリエチレングリコール、ポリメタクリル酸−ホスホリルコリン（ｐｏｌｙＭＰＣ）、ポリラウリルメタクリレート（ｐｏｌｙＬＭＡ）、ヒドロキシエチルメタクリレート−メチルメタクリレートコポリマー（ｐｏｌｙＨＥＭＡ−ＭＭＡ）、オルトケイ酸テトラメチル、オルトケイ酸テトラエチル、セルロース、酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ペクチン酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、キトサン、カルボキシメチルキトサン、キチン、コラーゲン、プルラン、ジェラン、キサンタン、カルボキシメチルデキストラン、コンドロイチン硫酸、カチオン化グアー、カチオン化デンプン、ならびにそれらの塩およびエステルからなる群から選択される化合物を含むことを特徴とする、請求項１６に記載の装置。
【請求項１９】
請求項２に記載の装置を対象に埋め込んで代謝性基質レベルの測定を可能にし、前記基質レベルの前記測定値を収集することを含むことを特徴とする、対象における代謝性基質レベルをモニターする方法。
【請求項２０】
請求項２に記載の装置を対象に埋め込むことを含み、前記標的検体の１つは、脂肪酸、乳酸、およびグルコースからなる群から選択されることを特徴とする、対象における糖尿病をモニターする方法。
【請求項２１】
標的検体の１つがグルコースであることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１つを超える標的検体の濃度を連続的に測定するための装置に関する。詳細には、この装置は、複数の検体結合領域を含み、各領域は、標的検体の少なくとも１つに特異的かつ可逆的に結合することができる。この装置は、標的検体に対して透過性であるこれらの結合領域を取り囲む膜をさらに含む。この装置は、結合の情報を検出器に伝達する。本発明は、個体における慢性疾患の状態をモニターすることを含む、この装置を用いる方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコースは、今日、糖尿病を診断し管理するために、最もモニターされているエネルギー代謝産物である。実際に、集中的なインスリン治療を用いて、血糖を「正常」範囲である７０から１２０ｍｇ／ｄＬ以内に維持し、グルコースの増加をモニターすることで、糖尿病患者の長期的な健康を大幅に増進することができる。グルコースのモニターの性能については、漸増的な進歩が着実になされている一方で、現在利用可能なモニターのほとんどについては、患者から血液を採取し、別のモニターによりグルコースレベルを分析することが依然として必要とされている。この技術の限界はよく知られている（主に、苦痛、不都合、および服薬不履行）。さらに、現在の反応に基づくセンサーは通常、補助因子、メディエータ、反応生成物（例えば、過酸化水素）、または補基質（例えば、酸素）を含むことがある酵素反応に依拠しているが、これらは、センサーの開発および機能解析を複雑にすることが多い。対象および医師の立場から、より望ましいセンサーは、多くの複雑な状態を受けやすくない、より信頼できる装置であり、また、ｉｎ  ｖｉｖｏの寿命の長い装置は規則的な（短い）間隔でグルコース濃度を定量的に評価することが可能であり、指穿刺の血液サンプルを用いるキャリブレーションを最小限しか必要としない装置である。
【０００３】
グルコースのモニタリングは、糖尿病を有するあらゆる者の生存に重要であるが、グルコースレベルだけでは、この疾患およびその発症の根底をなす、複雑かつ動的な代謝プロセスを理解するために提供されるデータは不十分である。グルコースは、脳が使用する主なエネルギー発生性の代謝物であるが、１日のエネルギーの大半は、脂肪酸の組織代謝により生成されている。したがって、グルコースおよび脂肪酸の両者のレベルをリアルタイムでモニターすることは、ある人の代謝状態に関する情報をより多く提供し、代謝を理解し正常化するのにおそらくは重要である。脂肪酸のモニタリングは、特に２型糖尿病で、前糖尿病状態またはインスリン抵抗性の早期の発症をもたらす事象を理解するのに、特に重要なことがある。
【０００４】
同様に、侵襲性が最小の代謝物のモニターは、運動選手または兵士における疲労レベルのモニタリングなど、他の応用に望ましいことがある。実際、運動もまた対象の代謝状態に影響を及ぼし、中程度から強度の運動の副生成物である乳酸は、エネルギー支出および運動負荷のマーカーとして作用する。したがって、乳酸濃度の変化は、グルコース代謝の変更も表す。したがって、グルコース、乳酸、および脂肪酸のセンサーを連携させて使用することにより、疲労および消耗をより正確にモニターする装置をもたらすことができる。例えば、複数の代謝物を連続してモニターすることで、運動選手または兵士が、向上した迅速性を維持し、労作後の回復時間を短縮することができるようになる。
【０００５】
現在、ｉｎ  ｖｉｖｏの代謝物を連続的にモニターするセンサーは存在しない。さらに、現在入手可能な単一の代謝物のセンサーのうち、１つを超える代謝物を直接測定するものはない。したがって、当技術分野では、複数の代謝物をモニターし、かつ最小の侵襲性で、または最小の苦痛でモニターするセンサーが必要とされている。さらに、多種検体バイオセンサーは、酵素の副生成物などの複雑な状態がないようにデザインしなければならない。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６６４２０１５号明細書
【特許文献２】米国特許第６７０６５３２号明細書
【特許文献３】米国特許出願第１０／０４００７７号明細書
【特許文献４】米国特許出願第１０／７２１７９７号明細書
【非特許文献１】McArthur M.J.,et al.,J.Lipid Res., 40: 1371-1383, (1999)
【非特許文献２】Abreu,M.S.C.,et al., Biophys.J.,84: 386-399, (2003)
【非特許文献３】Weisiger.R.A., Am.J.Physiol-Gastr., 277: G109-G119, (1999)
【非特許文献４】Smith,E.R. and Storch,J., J.Biol. Chem., 274(50): 35325-35330 (1999)
【非特許文献５】Looger et al., Nature 423 (6936): 185-190 (2003)
【非特許文献６】T.E.Creighton, Proteins--Structure And Molecular Properties, 2nd Ed., W.H.Freeman and Company, New York (1993)
【非特許文献７】Wold,F., "Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects" in Posttranslational Covalent Modifications of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983)；
【非特許文献８】Seifter et al., Methods in Enzymol, 182: 626-646 (1990)
【非特許文献９】Rattan et al., Ann NY Acad.Sci., 663: 48-62 (1992)
【非特許文献１０】Richieri, G.V. et al., J. Biol.Chem, 267: 23495-501 (1992)
【非特許文献１１】de Lorimier,R.M. et al., Protein Science 11: 2655-75 (2002)
【非特許文献１２】"Bioconjugate Techniques", G.T.Hermanson, Academic Press, San Diego, CA (1996) pp. 531-533
【非特許文献１３】B.D.Ratner and A.S.Hoffmann, "Thin Films, Grafts, and Coatings" Chapter 2, in "Biomaterials Science: An Introduction to Materials in Medicine",B.D.Ratner, A.S.Hoffman, F.J.Shoen, J.E.Lemons, editors, Academic Press, San Diego, CA, 1996
【非特許文献１４】Civelek,V.N. et al., Proc Nat'l.Acad.Sci., 93: 10139-10144 (1996)
【非特許文献１５】Quinn et al., Biomaterials, 18: 1665-1670 (1997)
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、１つを超える標的検体の濃度を連続的に測定するための装置に関する。詳細には、この装置は、複数の検体結合領域を含み、各領域は、標的検体の少なくとも１つに、特異的かつ可逆的に結合することができる。この装置は、標的検体に対して透過性である、これらの結合領域を取り囲む膜をさらに含む。この装置は、結合の情報を検出器に伝達する。本発明は、個体における慢性疾患の状態をモニターすることを含む、装置を使用する方法にも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、１つを超える標的検体の濃度を連続的に測定するための装置に関する。詳細には、この装置は、複数の検体結合領域を含み、各領域は、標的検体の少なくとも１つに、特異的かつ可逆的に結合することができる。この装置は、標的検体に対して透過性である、これらの結合領域を取り囲む膜をさらに含む。この装置は、結合の情報を検出器に伝達する。本発明は、個体における慢性疾患の状態をモニターすることを含む、装置を使用する方法にも関する。
【０００９】
本発明の装置は、バイオセンサーとして使用することができる。本発明のバイオセンサーは、標的検体の結合の際の結合領域の高次構造の変化を妨害しないような方法で、物理的な捕捉または固定化により結合領域を保持している。第２に、このセンサーにより検体の効率的な拡散が可能になり、その結果、それが領域と平衡になることから数量化可能なシグナルを生成することができる。また、センサーの構成要素はバックグラウンドシグナルを最小にしかまたは全く生成せず、その結果、シグナルは、例えば光ファイバーまたは表面プラズモン共鳴などの、検出プロトコールに適合性がある。センサーは、また、十分な構造上の安定性および機械的安定性を提供して、その保管中およびその後のｉｎ  ｖｉｖｏでの使用の間のその性能を保証する。最後に、センサーは、ｉｎ  ｖｉｖｏで連続的に使用するのにできるだけ安全で生体適合性でなければならない。
【００１０】
本発明の装置を、１つを超える標的検体の濃度を評価または測定するために用いることができる。本明細書で用いられる濃度は、当技術分野で用いられる通りに用いられる。濃度は、定性的な値として表してもよく、またはおそらくは定量値として表してもよい。本明細書で用いられる検体の定量は、相対的または絶対的な量であることができる。もちろん、任意の検体の量（濃度）は、求める特定の検体が存在しないことを示すゼロに等しくてもよい。量は、任意のさらなる測定または操作をせずに、単に測定されたシグナル、例えば蛍光でもよい。あるいは、量は、それだけには限定されないが、標準のまたは別の検体を含む別の化合物の測定値に対する、特定の検体の測定値の差、パーセント値、または比率として表してもよい。差は、測定された検体の量の減少を示す、負の値でもよい。また、量は、異なる時点で測定した、検体のそれ自体に対する差または比率として表してもよい。検体の量は、生成されたシグナルから直接決定してもよく、生成されたシグナルを、生成されたシグナルの値のサンプルにおける検体の量に対する相関に対してデザインしたアルゴリズムで用いてもよい。
【００１１】
本発明の装置は、１つを超える検体の濃度を連続的に測定する能力を有するようにデザインされている。もちろん、「１つを超える」は、これらに限定されないが、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、および１０個、またはそれを超える検体を含む。本明細書で検体の測定と関連した「連続して」という用語は、装置の寿命の間常に検出可能なシグナルを生成し、または生成することができる装置を意味するために用いられる。検出可能なシグナルは、シグナルが検出されなくても、装置がシグナルを常に生成するという点で、一定であることができる。あるいは、任意の所望のときに検出可能なシグナルを生成し、検出することができるように、装置を一時的に使用してもよい。
【００１２】
標的検体は、濃度の測定が望まれる任意の分子または化合物であることができる。一実施形態では、標的検体を標識化しない。本発明の必要条件ではないが、この装置は、標的検体が対象に生じ、または現れている際の標的検体を測定するためのｉｎ  ｖｉｖｏ環境（ｓｅｔｔｉｎｇ）に特に有用である。したがって、標的検体を標識化する必要はない。もちろん、非標識化の標的検体を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕの環境で測定してもよい。別の一実施形態では、標的検体を標識化してもよい。標識化された標的検体を、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕの環境で測定することができる。
【００１３】
測定することができる検体の種類の具体例には、これらに限定されないが、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、糖タンパク質またはプロテオグリカン、リポタンパク、リポ多糖、薬物、薬物代謝物、有機小分子、無機分子、および天然または合成のポリマーが含まれる。本明細書で用いられる「炭水化物」は、これらに限定されないが、単糖、二糖、オリゴ糖、および多糖が含まれる。「炭水化物」には、また、これらに限定されないが、従来の糖の定義に含まれない炭素、水素、および酸素を含む分子、すなわち、少なくとも３個の炭素原子を含む直鎖多価アルコールのアルデヒドまたはケトン誘導体も含まれる。したがって、例えば、炭水化物は３個より少ない炭素原子を含んでもよい。本明細書で用いられる「脂質」は、当技術分野で用いられる通りに用いられ、すなわち、主に、または独占的に、非極性の化学基でできており、したがってほとんどの有機溶媒に容易に溶けるが、水性溶媒にはほんの少ししか溶けない、生物起源の物質に用いられる。脂質の具体例は、これらに限定されないが、脂肪酸、トリアシルグリセロール、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、コレステロール、ステロイド、およびこれらの誘導体が含まれる。例えば、「脂質」は、これらに限定されないが、スフィンゴ脂質の誘導体であるセラミド、ならびに、スフィンゴミエリン、セレブロシド、およびガングリオシドなど、セラミドの誘導体を含む。また、「脂質」には、これらに限定されないが、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロールなどの、グリセロリン脂質（すなわちリン脂質）の一般的な種類も含まれる。本明細書で用いられる「薬物」は、特定の細胞タイプに対するこれらの活性または作用がまだ知られていない、既知の薬物または薬物候補であることができる。「薬物代謝物」は、別の一つの化合物または複数の化合物に化学的に変化した、任意の薬物の副生成物または分解産物である。本明細書で用いられる「有機小分子」には、これらに限定されないが、本明細書で強調した他の分類に正確に当てはまらない有機の分子または化合物が含まれる。
【００１４】
一実施形態では、標的検体は全て、タンパク質、または脂肪酸もしくは炭水化物など、同じ種類の化合物である。別の一実施形態では、標的検体の少なくとも１つは、他の標的検体と異なる化合物の種類である。例えば、この装置は、タンパク質またはポリペプチド、および一つの炭水化物または複数の炭水化物を測定することができる。本発明のさらに別の一実施形態では、標的検体のどれもが、同じ種類の化合物ではない。さらに、標的検体は、グルコース、パルミテート、ステアレート、オレエート、リノレエート、リノレネート、およびアラキドネートなどの、ある種類の化合物内の特定の化合物であることができる。あるいは、標的検体は、全種類の化合物、またはその一部分もしくは下位分類、例えば、脂肪酸であってもよい。標的検体の特定の具体例には、これらに限定されないが、グルコース、遊離脂肪酸、乳酸、Ｃ反応性タンパク質、および、サイトカイン、エイコサノイド、またはロイコトリエンなどの抗炎症性のメディエータが含まれる。一実施形態では、標的検体は、脂肪酸、Ｃ反応性タンパク質、およびロイコトリエンである。別の一実施形態では、標的検体は、グルコース、乳酸、および脂肪酸である。
【００１５】
本明細書で用いられる「脂肪酸」は、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）および他の分子とエステル化した脂肪酸を含めた、全ての脂肪酸を含む。特定の脂肪酸の具体例には、これらに限定されないが、パルミテート、ステアレート、オレエート、リノレエート、リノレネート、およびアラキドネートが含まれる。「遊離脂肪酸」は、本明細書では、ＦＦＡが、トリグリセリドまたはリン脂質などの他の分子の部分ではないという意味で、当技術分野で用いられる通りに用いられる。遊離脂肪酸には、アルブミンに結合し、またはその上に吸着される非エステル化の脂肪酸も含まれる。本明細書で用いられる「非結合の遊離脂肪酸」（非結合のＦＦＡ）は、アルブミンまたは他の血清タンパク質に結合せず、またはその上に吸着されない一つの遊離脂肪酸または複数の遊離脂肪酸を意味するために用いられる。実際、非結合のＦＦＡは、体内を低レベルで循環すると考えられている（その全文が参照として本明細書に組み込まれる非特許文献１を参照されたい）。さらに、アルブミンと結合した遊離脂肪酸と非結合の遊離脂肪酸との間に、細胞膜を介し平衡が存在し、容易に確立することができ証拠も存在する。例えば、非結合のＦＦＡは、脂肪細胞から越えてアルブミン上に拡散することができ、アルブミンでＦＦＡは他の組織に輸送される。アルブミンに結合したＦＦＡは、次いで、ＦＦＡを貯え、またはエネルギー源として使用することができる別の細胞の細胞膜を越えて拡散する（その全文が参照として本明細書に組み込まれる非特許文献２、および非特許文献３を参照されたい）。
【００１６】
本発明の装置は、複数の結合領域を含む。本明細書で用いられる「複数の」は、これらに限定されないが、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、および１０個、またはそれを超えることを含む、１つを超えることである。本明細書で用いられる「結合領域」は、当技術分野に用いられる通りに用いられる。すなわち、結合領域は、標的に特異的に結合する分子である。結合領域は、分子全体、またはその部分を含むことができる。本明細書で用いられる「結合する実体（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｎｔｉｔｙ）」は、一つの結合領域または複数の結合領域を含む分子または化合物である。結合する実体または結合領域は、スライドガラスなどの固体の支持体上に直接固定化することができる。これらは、ハイドロゲルまたはゾル−ゲル上またはその中に直接固定化することができる。他の表面には、これらに限定されないが、光ファイバー、シリコンまたはガラス上の導波管またはエッチングした格子、プラズマ処理したポリスチレン、チオール化した（ｔｈｉｏｌａｔｅｄ）金を含む修飾された金属表面が含まれる。あるいは、これらは直接固定化してなくてもよい。結合する実体の具体例には、これらに限定されないが、ポリペプチドおよびタンパク質が含まれる。本発明の一実施形態では、結合する実体には、単一のポリペプチドまたはタンパク質が含まれる。単一のポリペプチドまたはタンパク質は複数の結合領域を含んでおり、したがって装置の結合領域が全て単一のタンパク質またはポリペプチド鎖の中にある。別の一実施形態では、１つを超える結合する実体は、複数のタンパク質またはポリペプチドを含んでいる。複数のタンパク質またはポリペプチドは、複数の結合領域を含んでいる。特に、１つのタンパク質またはポリペプチド上に、１つの結合領域が存在することができる。
【００１７】
一般に、結合領域は、１対１の様式で数々の標的検体と対応するが、これは必須ではない。この実施形態では、この装置は、標的検体１個あたりただ１つの結合領域を含む。別の一実施形態では、この装置は、標的検体１個あたり１つを超える結合領域を含む。
【００１８】
本発明の一実施形態では、結合する実体はポリペプチドまたはタンパク質を含む。特に、結合領域を含むタンパク質には、これらに限定されないが、ペリプラズム結合タンパク質（ＰＢＰ）が含まれる。本明細書で用いられるＰＢＰは、そのアミノ酸配列（１次構造）ではなく３次元の高次構造（３次構造）を特徴とし、かつローブ−ヒンジ−ローブ領域を特徴とするタンパク質である。ＰＢＰは、通常、ＰＢＰのローブの間のクレフト（ｃｌｅｆｔ）領域で、検体に特異的に結合している。さらに、クレフト領域における検体の結合は、次いで、ＰＢＰの高次構造の変化を引き起して、検体の検出を可能とする。本発明のペリプラズム結合タンパク質は、本明細書に記載した構造上の特徴を有する任意のタンパク質を含み、そして、タンパク質の３次元構造を分析してＰＢＰの特有のローブ−ヒンジ−ローブ領域構造を決定することは、十分当業者の能力の範囲内である。ＰＢＰの具体例は、これらに限定されないが、グルコース−ガラクトース結合タンパク質（ＧＧＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、リボース結合タンパク質（ＲＢＰ）、アラビノース結合タンパク質（ＡＢＰ）、ジペプチド結合タンパク質（ＤＰＢＰ）、グルタミン酸結合タンパク質（ＧｌｕＢＰ）、鉄結合タンパク質（ＦｅＢＰ）、ヒスチジン結合タンパク質（ＨＢＰ）、リン酸結合タンパク質（ＰｈｏｓＢＰ）、グルタミン結合タンパク質（ＱＢＰ）、オリゴペプチド結合タンパク質（ＯｐｐＡ）、またはこれらの誘導体、ならびに、ペリプラズム結合タンパク質ｌｉｋｅＩ（ＰＢＰ−ｌｉｋｅＩ）、およびペリプラズム結合タンパク質ｌｉｋｅＩＩ（ＰＢＰ−ｌｉｋｅＩＩ）で知られているタンパク質の一群に属する他のタンパク質が含まれる。ＰＢＰ−ｌｉｋｅＩおよびＰＢＰ−ｌｉｋｅＩＩタンパク質には、平行のβ−シートおよび隣接するαへリックスからなる２つの類似のローブ領域がある。グルコース−ガラクトース結合タンパク質（ＧＧＢＰ）はタンパク質のＰＢＰ−ｌｉｋｅＩ群に属し、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）はタンパク質のＰＢＰ−ｌｉｋｅＩＩ群に属する。リボース結合タンパク質（ＲＢＰ）は、タンパク質のＰＢＰ群のメンバーでもある。ペリプラズム結合タンパク質の他の非限定的な例を、表１に列挙する。
【００１９】
【表１−１】
2008502917.tif 000003
【００２０】
【表１−２】
2008502917.tif 000004
【００２１】
【表１−３】
2008502917.tif 000005
【００２２】
【表１−４】
2008502917.tif 000006
【００２３】
結合領域を含むことができるタンパク質の他の例には、これらに限定されないが、腸管脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）が含まれる。ＦＡＢＰは、少なくとも、肝臓、腸、腎臓、肺、心臓、骨格筋、脂肪組織、異常な皮膚、脂肪、内皮細胞、乳腺、脳、胃、舌、胎盤、精巣、網膜で発現されるタンパク質の一群である。ＦＡＢＰの一群は、一般的には、非共有性の相互作用により脂肪酸および他の疎水性のリガンドに結合している小型細胞内タンパク質の一群（約１４ｋＤａ）である。その全文が参照として本明細書に組み込まれる非特許文献４を参照されたい。ＦＡＢＰ一群のタンパク質のメンバーの例には、これらに限定されないが、ＦＡＢＰ１、ＦＡＢＰ２、ＦＡＢＰ３、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５、ＦＡＢＰ６、ＦＡＢＰ７、ＦＡＢＰ（９）、およびＭＰ２の遺伝子によりコード化されたタンパク質が含まれる。ＦＡＢＰに属するタンパク質には、いくつかを挙げると、Ｉ−ＦＡＢＰ、Ｌ−ＦＡＢＰ、Ｈ−ＦＡＢＰ、Ａ−ＦＡＢＰ、ＫＬＢＰ、ｍａｌ−１、Ｅ−ＦＡＢＰ、ＰＡ−ＦＡＢＰ、Ｃ−ＦＡＢＰ、Ｓ−ＦＡＢＰ、ＬＥ−ＬＢＰ、ＤＡ１１、ＬＰ２、メラニン形成阻害物質が含まれる。
【００２４】
本発明の一実施形態では、ＧＧＢＰ、ＦＡＢＰおよびＧＧＢＰの誘導体は、結合領域を含む。詳細には、ＦＡＢＰはＩ−ＦＡＢＰである。本明細書で用いられるタンパク質またはポリペプチドの「誘導体」は、野生型のタンパク質と実質的な配列の同一性を共有するタンパク質またはポリペプチドである。誘導体タンパク質の例には、これらに限定されないが、変異タンパク質および融合タンパク質が含まれる。「変異タンパク質」は、当技術分野で用いられる通りに本明細書で用いられる。一般的に、変異タンパク質は、タンパク質またはポリペプチドの野生型の１次構造の付加、欠失、または置換により作り出すことができる。突然変異には、例えば、システイン基の付加または置換、非天然に存在するアミノ酸、および実質的に非反応性のアミノ酸の反応性アミノ酸での置換が含まれる。
【００２５】
変異タンパク質は、突然変異して、１つを超える検体に特異的に結合することができる。実際、変異タンパク質は、その野生型の検体および別の標的のリガンドに対する特異性を有することがある。
【００２６】
同様に、変異タンパク質は、野生型の結合タンパク質が結合しない一つの検体または複数の検体に結合することのみができることがある。変異タンパク質を生成する方法は、当技術分野ではよく知られている。例えば、本明細書に参照として組み込まれる非特許文献５は、タンパク質に新規な検体結合性をもたらすペリプラズム結合タンパク質内の結合部位を再デザインするための方法を開示している。これらの突然変異の結合タンパク質は、検体が結合する際に直接産生されるシグナルを生成することができる高次構造の変化を受ける能力を保持している。Ｌｏｏｇｅｒらは、５と１７の間のアミノ酸の変化を導入することにより、各々がＴＮＴ（トリニトロトルエン）、Ｌ−乳酸、またはセロトニンに対して新規な選択性を有する、いくつかの変異タンパク質を構築した。例えば、Ｌｏｏｇｅｒらは、ＡＢＰ、ＧＧＢＰ、ＲＢＰ、ＨＢＰ、およびＱＢＰから、Ｌ−乳酸結合タンパク質を産生した。一実施形態では、この装置は、グルコースに特異的なＧＧＢＰ、脂肪酸に特異的なＦＡＢＰ、および、ＧＧＢＰ誘導体がＬ−乳酸に特異的に結合するＧＧＢＰ誘導体を含む。この実施形態では、標的検体は、実際に、グルコース、脂肪酸、およびＬ−乳酸である。別の一実施形態では、この装置は、脂肪酸に特異的なＦＡＢＰ、およびグルコースに特異的なＧＧＢＰまたはＧＧＢＰ誘導体を含む。さらに別の一実施形態では、この装置は、グルコースに特異的なＧＧＢＰ誘導体、およびＬ−乳酸に特異的なＧＧＢＰ誘導体を含む。表ＩＩは、ＧＧＢＰに対する他の突然変異を列挙し、本明細書に参照として組み込まれる非特許文献５からの抜粋である。
【００２７】
【表２】
2008502917.tif 000007
【００２８】
本発明の誘導体タンパク質またはポリペプチドは、当業者にはよく知られている技術により作製し、または調製することができる。このような技術の例には、これらに限定されないが、突然変異誘発および直接合成が含まれる。
【００２９】
誘導体タンパク質は、翻訳後プロセシングなどの天然のプロセスにより、または当技術分野ではよく知られている化学的修飾技術のいずれかにより、修飾することもできる。このような修飾は、基本的な教科書に、より詳しいモノグラフに、および複数の研究文献によく記載されている。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含めた、ポリペプチド鎖のあらゆるところで行われることができる。同じタイプの修飾が、所与のポリペプチドまたはタンパク質におけるいくつかの部位で、同一の、または様々な度合いで存在しうることが理解されよう。また、所与のポリペプチドまたはタンパク質は、１つを超える修飾を含んでもよい。修飾の具体例には、これらに限定されないが、グリコシル化、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合性架橋結合の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解性のプロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、アルギニル化（ａｒｇｉｎｙｌａｔｉｏｎ）などトランスファーＲＮＡが媒介するアミノ酸のタンパク質への付加、およびユビキチン化が含まれる。ポリペプチドまたはタンパク質は、ユビキチン化の結果として分枝してもよく、分枝があるか、またはない環状であってもよい。（例えば、全て参照として本明細書に組み込まれる、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、および非特許文献９を参照されたい。）
ＧＧＢＰタンパク質、例えば、２３アミノ酸リーダー配列のない（すなわち、成熟した鎖）のＧｅｎＢａｎｋ受諾番号Ｎｏ．Ｐ０２９２７のＧＧＢＰタンパク質などの突然変異の具体例は、これらに限定されないが、１１位のリジンに置換したシステイン（Ｋ１１Ｃ）、１４位のアスパラギン酸に置換したシステイン（Ｄ１４Ｃ）、１９位のバリンに置換したシステイン（Ｖ１９Ｃ）、４３位のアスパラギンに置換したシステイン（Ｎ４３Ｃ）、７４位のグリシンに置換したシステイン（Ｇ７４Ｃ）、１０７位のチロシンに置換したシステイン（Ｙ１０７Ｃ）、１１０位のスレオニンに置換したシステイン（Ｔ１１０Ｃ）、１１２位のセリンに置換したシステイン（Ｓ１１２Ｃ）、１１２位のセリンに置換したシステインおよび２３８位のロイシンに置換したセリンを含む二重変異体（Ｓ１１２Ｃ／Ｌ２３８Ｓ）、１１３位のリジンに置換したシステイン（Ｋ１１３Ｃ）、１３７位のリジンに置換したシステイン（Ｋ１３７Ｃ）、１４９位のグルタミン酸に置換したシステイン（Ｅ１４９Ｃ）、１４９位のグルタミン酸に置換したシステインおよび２１３位のアラニンに置換したアルギニンを含む二重変異体（Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ）、１４９位のグルタミン酸に置換したシステインおよび２３８位のロイシンに置換したセリンを含む二重変異体（Ｅ１４９Ｃ／Ｌ２３８Ｓ）、２１３位のアラニンに置換したセリンおよび１５２位のヒスチジンに置換したシステインを含む二重変異体（Ｈ１５２Ｃ／Ａ２１３Ｓ）、１８２位のメチオニンに置換したシステイン（Ｍ１８２Ｃ）、２１３位のアラニンに置換したシステイン（Ａ２１３Ｃ）、２１３位のアラニンに置換したシステインおよび２３８位のロイシンに置換したシステインを含む二重変異体（Ａ２１３Ｃ／Ｌ２３８Ｃ）、２１６位のメチオニンに置換したシステイン（Ｍ２１６Ｃ）、２３６位のアスパラギン酸に置換したシステイン（Ｄ２３６Ｃ）、２３８位のロイシンに置換したシステイン（Ｌ２３８Ｃ）、２８７位のアスパラギン酸に置換したシステイン（Ｄ２８７Ｃ）、２９２位のアルギニンに置換したシステイン（Ｒ２９２Ｃ）、２９６位のバリンに置換したシステイン（Ｖ２９６Ｃ）、１４９位のグルタミン酸に置換したシステインおよび２１３位のアラニンに置換したセリンおよび２３８位のロイシンに置換したセリンを含む三重変異体（Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ａ／Ｌ２３８Ｓ）、１４９位のグルタミン酸に置換したシステインおよび２１３位のアラニンに置換したアルギニンおよび２３８位のロイシンに置換したセリンを含む三重変異体（Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ／Ｌ２３８Ｓ）、１４９位のグルタミン酸に置換したシステインおよび２１３位のアラニンに置換したシステインおよび２３８位のロイシンに置換したセリンを含む三重変異体（Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｃ／Ｌ２３８Ｓ）を有するものが含まれる。さらなる実施形態には、Ｙ１０Ｃ、Ｎ１５Ｃ、Ｑ２６Ｃ、Ｅ９３Ｃ、Ｈ１５２Ｃ、Ｍ１８２Ｃ、Ｗ１８３Ｃ、Ｌ２５５Ｃ、Ｄ２５７Ｃ、Ｐ２９４Ｃ、およびＶ２９６ＣにおけるＧＧＢＰの突然変異が含まれる。
【００３０】
さらなる具体例は、これらに限定されないが、Ｄ９５Ｃ、Ｆ９２Ｃ、Ｉ３２９Ｃ、Ｓ２３３Ｃ、およびＳ３３７Ｃを含むマルトース結合タンパク質の突然変異である。
【００３１】
ヒスチジン結合タンパク質に対する突然変異のさらなる具体例は、これらに限定されないが、Ｅ１６７Ｃ、Ｋ２２９Ｃ、Ｖ１６３Ｃ、Ｙ２３０Ｃ、Ｆ２３１Ｃ、およびＹ８８Ｃが含まれる。
【００３２】
硫酸結合タンパク質の突然変異のさらなる具体例は、これらに限定されないが、例えば、Ｌ６５Ｃ、Ｎ７０Ｃ、Ｑ２９４Ｃ、Ｒ１３４Ｃ、Ｗ２９０Ｃ、およびＹ６７Ｃが含まれる。
【００３３】
アラビノース結合タンパク質の突然変異のさらなる具体例は、これらに限定されないが、Ｄ２７５Ｃ、Ｆ２３Ｃ、Ｋ３０１Ｃ、Ｌ２５３Ｃ、およびＬ２９８Ｃが含まれる。
【００３４】
ジペプチド結合タンパク質の突然変異のさらなる具体例は、これらに限定されないが、Ｄ４５０Ｃ、Ｋ３９４Ｃ、Ｒ１４１Ｃ、Ｓ１１１Ｃ、Ｔ４４Ｃ、およびＷ３１５Ｃが含まれる。
【００３５】
グルタミン酸／アスパラギン酸結合タンパク質の突然変異のさらなる具体例は、これらに限定されないが、Ａ２０７Ｃ、Ａ２１０Ｃ、Ｅ１１９Ｃ、Ｆ１２６Ｃ、Ｆ１３１Ｃ、Ｆ２７０Ｃ、Ｇ２１１Ｃ、Ｋ２６８Ｃ、Ｑ１２３Ｃ、およびＴ１２９Ｃが含まれる。
【００３６】
グルタミン結合タンパク質の突然変異のさらなる具体例は、これらに限定されないが、Ｎ１６０Ｃ、Ｆ２２１Ｃ、Ｋ２１９Ｃ、Ｌ１６２Ｃ、Ｗ２２０Ｃ、Ｙ１６３Ｃ、およびＹ８６Ｃが含まれる。
【００３７】
Ｆｅ（ＩＩＩ）結合タンパク質の突然変異のさらなる具体例は、これらに限定されないが、Ｅ２０３Ｃ、Ｋ２０２Ｃ、Ｋ８５Ｃ、およびＶ２８７Ｃが含まれる。
【００３８】
リボース結合タンパク質の突然変異のさらなる具体例は、これらに限定されないが、Ｔ１３５Ｃ、Ｄ１６５Ｃ、Ｅ１９２Ｃ、Ａ２３４Ｃ、Ｌ２３６Ｃ、およびＬ２６５Ｃが含まれる。
【００３９】
ホスフェート結合タンパク質の突然変異のさらなる具体例は、これらに限定されないが、Ａ２２５Ｃ、Ｎ２２３Ｃ、Ｎ２２６Ｃ、Ｓ１６４Ｃ、Ｓ３９Ｃ、およびＡ１９７Ｃが含まれる。
【００４０】
突然変異は、いくつかの目的の１つまたは複数に貢献しうる。例えば、熱安定性を含めた、タンパク質の長期間の安定性を変更するために突然変異させて、タンパク質を特別なカプセル化マトリックスまたはポリマーに結合したり、結合性部位を検出可能なレポーター基に提供したり、その結合定数を特別な検体に関して調節したり、またはこれらを組合せることができる。
【００４１】
一実施形態では、検体および突然変異したタンパク質は、結合相手として働く。本明細書で用いられる「結合する（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）」または「結合する（ｂｉｎｄ）」は、検出手段によるタンパク質への結合の検出を可能にするのに十分強力な相対的な結合定数（Ｋｄ）を有する相手同士を結合することを意味する。Ｋｄは、半分のタンパク質が結合するときの遊離検体の濃度として計算することができ、または逆の場合も同様である。対象の検体がグルコースである場合、結合相手に対するＫｄ値は、約０．０００１ｍＭと約５０ｍＭとの間である。
【００４２】
また、誘導体のポリペプチドまたはタンパク質は、結合性の特徴を変化させる他に、例えば、ポリペプチドまたはタンパク質などの、結合領域を含む結合する実体を標識部分で標識化できるように、結合する実体もしくは結合領域上、またはその中に、標識部分を組み入れるためにも用いられる。したがって、本発明の一実施形態では、結合領域を含む結合する実体を全て標識化する。別の一実施形態では、全てに満たないが、少なくとも１つの結合する実体を標識化する。さらに別の一実施形態では、結合する実体のどれも標識化しない。結合する実体のいくつかまたは全てを標識化する場合には、結合する実体１つにつき１つの標識部分が存在することができ、または結合する実体１つにつき１つを超える標識部分が存在することができる。
【００４３】
本発明に用いられる標識は、結合領域における変化を示すために用いられる。結合領域における変化の具体例は、これらに限定されないが、３次元の高次構造の変化、タンパク質の結合領域のアミノ酸側鎖の配向性における変化、および結合領域の酸化還元状態が含まれる。タンパク質の１次構造中への１つまたは複数の残基の付加／置換によって、本発明の方法および組成物で用いる標識部分を、還元、酸化、抱合、および縮合反応などの化学的手段により結合することができるものもある。タンパク質を標識化するのに通常用いる残基の具体例は、これらに限定されないが、リジンおよびシステインが含まれる。例えば、任意のチオール反応性の基を用いて、フルオロフォアなどの標識部分を、ポリペプチドの１次構造内の天然に存在するか、または操作されたシステインに結合することができる。また、例えば、リジン残基を、フルオロフォアのスクシンイミドエステル誘導体を用いて標識することができる。本明細書に参照として組み込まれる非特許文献１０を参照されたい。
【００４４】
本明細書で用いられる「標識部分」は、検出可能な非放射性シグナルを有するか、もしくは有するようになった化学化合物またはイオンを意味するものとされる。標識部分の具体例は、これらに限定されないが、遷移金属、ランタニドイオン、および他の化学化合物が含まれる。非放射性のシグナルは、これらに限定されないが、蛍光、リン光、生物発光、電気化学発光、および化学発光が含まれる。
【００４５】
本発明の一実施形態では、結合する実体は、フルオロフォアである少なくとも１つの標識を、集合的に含む。フルオロフォアの具体例は、これらに限定されないが、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、５−ＴＭＲＩＡ（テトラメチルローダミン−５−ヨードアセトアミド）、ｏ−アミノ安息香酸（ＡＢＺ）、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、４−［（４−ジメチルアミノ）フェニル］−アゾ）安息香酸（ＤＡＮＳＹＬ）、５−または５（６）−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−または５（６）−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、５−（２−アミノエチルアミノ）−１−ナフタレンスルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−（ジメチルアミノ）アゾベンゼン−４’−カルボン酸（ＤＡＢＣＹＬ）、４−（ジメチルアミノ）アゾベンゼン−４’−スルホニルクロリド（ＤＡＢＳＹＬ）、ニトロ−チロシン（Ｔｙｒ（ＮＯ2））、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｒｅｄ（登録商標）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）、Ｃｙ３（登録商標）、７−ニトロ−４−ベンゾフラザニル（ＮＢＤ）、Ｎ−（（２−ヨードアセトキシ）エチル）−Ｎ−メチル）アミノ−７−ニトロベンズオキサジアゾール（ＩＡＮＢＤ）、６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン（アクリロダン）、ピレン、ルシファーイエロー、Ｃｙ５（登録商標）、Ｄａｐｏｘｙｌ（登録商標）（２−ブロモアセトアミドエチル）スルホンアミド、（Ｎ−（４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−イル）ヨードアセトアミド（Ｂｏｄｉｐｙ（登録商標）５０７／５４５  ＩＡ）、Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−Ｎ’−ヨードアセチルエチレンジアミン（ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０  ＩＡ）、５−（（（（２−ヨードアセチル）アミノ）エチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸（１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ）、カルボキシ−Ｘ−ローダミン、５／６−ヨードアセトアミド（ＸＲＩＡ５，６）、エオシン、アクリジンオレンジ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４０５（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４３０（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５００（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５１４（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５３２（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６１０（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３５（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６６０（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７００（登録商標）、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７５０（登録商標）が含まれる。他の発光の標識部分には、ユーロピウム（Ｅｕ３＋）、およびテルビウム（Ｔｂ３＋）などのランタニド、ならびに、通常フェナントロリンなどのジイミンのリガンドと���複合体のルテニウム［Ｒｕ（ＩＩ）］、レニウム［Ｒｅ（Ｉ）］、またはオスミウム［Ｏｓ（ＩＩ）］の金属リガンドの複合体が含まれる。本発明の詳細な一実施形態では、結合領域１つにつき１つの標識部分が存在し、標識部分はアクリロダン、ＮＢＤ、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６６０（登録商標）である。詳細には、ＦＡＢＰはアクリロダンで標識化され、グルコースに特異的なＧＧＢＰまたはＧＧＢＰ誘導体はＮＢＤで標識化され、Ｌ−乳酸に特異的なＧＧＢＰ誘導体はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６６０（登録商標）で標識化される。アクリロダン標識化されたＦＡＢＰは、「ＡＤＩＦＡＢ」として市販されている（ＦＦＡ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＬＬＣ、カリフォルニア州サンディエゴ）。蛍光標識部分で標識化された、結合領域を含む数々の結合タンパク質は、本明細書に参照として組み込まれる、非特許文献１１に開示されている。
【００４６】
蛍光標識を、ＧＧＢＰなどの突然変異したタンパク質に、当技術分野では知られているあらゆる従来の手段により結合させることができる。例えば、レポーター基は、タンパク質上のアミンまたはカルボキシル残基により結合することができる。代表的な実施形態には、突然変異したまたは天然のタンパク質のシステイン残基上のチオール基による共有結合が含まれる。例えば、突然変異したＧＧＢＰに対して、システインは、１０位、１１位、１４位、１５位、１９位、２６位、４３位、７４位、９２位、９３位、１０７位、１１０位、１１２位、１１３位、１３７位、１４９位、１５２位、１５４位、１８２位、１８３位、１８６位、２１１位、２１３位、２１６位、２３８位、２４０位、２４２位、２５５位、２５７位、２８７位、２９２位、２９４位、および２９６位に位置することができる。
【００４７】
当技術分野では知られている任意のチオール反応性の基は、フルオロフォアなどの標識部分を、天然のまたは操作したまたは変異タンパク質におけるシステインに対して結合させるために用いることができる。例えば、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、またはマレイミドは、この目的に用いることができる、よく知られているチオール反応性の部分である。
【００４８】
しかし、標識は、結合領域における変化を示すのに必ず必要なわけではない。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）では、タンパク質などの結合領域を含む、標識化されていない結合する実体を用いて、標的検体の有無を検出することができる。したがって、本発明の一実施形態では、結合領域は標識化されていない。
【００４９】
本発明の装置は、結合領域を取り囲む膜も含む。一実施形態では、個々の結合領域が、それぞれ、膜により取り囲まれている。別の一実施形態では、１つを超える結合領域が、単一の膜によって取り囲まれている。さらに別の一実施形態では、この装置の結合領域が全て、単一の膜によって取り囲まれている。本発明は、いくつかの代替を包含するが、必ずしも相互に排他的なわけではなく、複数の検体を同時に検出するための装置を構成する実施形態は、これらに限定されないが、（１）単一の膜および単一の装置内の、単一の励起波長を有する複数の標識化された結合領域および複数のルミネセンス発光波長強度の検出、（２）単一の膜および装置内の、複数の励起波長を有する複数の標識化された結合領域および複数のルミネセンス発光波長強度の検出、（３）膜および装置内の、単一の励起波長を有する複数の標識化された結合領域および複数のルミネセンス寿命の検出、（４）１つの装置における複数の膜の中の、単一の励起波長を有する複数の標識化された結合領域および複数のルミネセンス発光波長強度の検出、（５）１つの装置における複数の膜の中の、複数の励起波長を有する複数の標識化された結合領域および複数の発光波長強度の検出、（６）１つの装置における複数の膜の中の、単一の励起波長を有する複数の標識化された結合領域および複数のルミネセンス寿命の検出、（７）同一の励起での各々が標識化された結合領域および膜を有する複数の装置、ならびに、同一波長での各装置からのルミネセンス発光の検出、（８）同一の励起での、各々が標識化された結合領域および膜を有する複数の装置ならびにルミネセンス寿命の検出が含まれる。
【００５０】
膜は、標的検体に対して透過性でなければならない。また、膜は、膜が少なくとも部分的に細胞膜を模倣するように、少なくともある程度の疎水性も有しなければならない。結合領域が自身を直接に固定化しない場合に、膜は、結合領域を間接的に固定化するよう働くことができる。
【００５１】
膜は、通常の細胞膜を主に構成するリン脂質などの、天然に存在する脂質で作られることができる。膜を構成しうる脂質の種類の具体例は、これらに限定されないが、脂肪酸、トリアシルグリセロール、リン脂質、スフィンゴ脂質、ステロイド、およびコレステロールを含む。一実施形態では、膜は、１つまたは複数のリン脂質を含む。詳細には、リン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、またはこれらの組合せである。
【００５２】
膜に用いられるリン脂質には、これらに限定されないが、飽和もしくは不飽和の、一置換もしくは二置換の脂肪酸、およびそれらの組合せを含むリン脂質も含まれる。このようなリン脂質の具体例は、これらに限定されないが、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、パルミトイルオレオイルホスファチジルセリン、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジン酸、パルミテライドイルオレオイルホスファチジルコリン（ｐａｌｍｉｔｅｌａｉｄｏｙｌｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、パルミテライドイルオレイルホスファチジルセリン、パルミテライドイルオレイルホスファチジルエタノールアミン、パルミテライドイルオレイルホスファチジルグリセロール、パルミテライドイルオレイルホスファチジン酸、ミリストルオイロレオイルホスファチジルコリン（ｍｙｒｉｓｔｏｌｅｏｙｌｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ミリストルオイロレオイルホスファチジルセリン、ミリストルオイロレオイルホスファチジルエタノールアミン、ミリストルオイロレオイルホスファチジルグリセロール、ミリストルオイロレオイルホスファチジン酸、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルセリン、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジリノレオイルホスファチジルグリセロール、ジリノレオイルホスファチジン酸、パルミチックリノレオイルホスファチジルコリン（ｐａｌｍｉｔｉｃｌｉｎｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、パルミチックリノレオイルホスファチジルセリン、パルミチックリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミチックリノレオイルホスファチジルグリセロール、パルミチックリノレオイルホスファチジン酸が含まれる。また、これらのリン脂質は、ホスファチジルコリンのモノアシル化された誘導体（リゾホファチジリジルコリン（ｌｙｓｏｐｈｏｐｈａｔｉｄｙｌｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ））、ホスファチジルセリンのモノアシル化された誘導体（リゾホスファチジルセリン（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ））、ホスファチジルエタノールアミンのモノアシル化された誘導体（リゾホスファチジルエタノールアミン）、ホスファチジルグリセロールのモノアシル化された誘導体（リゾホスファチジルグリセロール）、およびホスファチジン酸のモノアシル化された誘導体（リゾホスファチジン酸）であってもよい。これらのリゾホファチジル誘導体におけるモノアシル鎖は、パルミトイル、オレオイル、パルミトレオイル（ｐａｌｍｉｔｏｌｅｏｙｌ）、リノレオイル、ミリストイル、またはミリストルオイル（ｍｙｒｉｓｔｏｌｅｏｙｌ）であってもよい。
【００５３】
脂質から構成される膜の具体例には、リポソームが含まれる。リポソームは、水性の空間を取り囲む１つまたは複数の脂質二重層を含む小胞の一般的カテゴリーである。リポソームには、単一の膜または脂質二重層から構成される単層の小胞、および１つを超える同心性の膜（または脂質二重層）から構成される多重膜の小胞が含まれる。リポソームは、一般にリン脂質から調製され、オレイン酸などの脂肪酸、タンパク質またはポリペプチド、および、コレステロールなどの他の分子も含むこともできる。リポソームを調製し、タンパク質などの分子をリポソーム内にカプセル化するための技術は、当技術分野ではよく知られている。本明細書に参照として組み込まれる非特許文献１２を参照されたい。
【００５４】
結合領域を取り囲むことができる膜の別の具体例は、ラングミュアーブロジェット膜である。ラングミュアーブロジェット膜（ＬＢ膜）は、固体の基質上に堆積した脂肪酸など、両親媒性の分子が機械的に集合した配列である。しかし、ＬＢ膜は、無機分子を含む他の分子を含んでもよい。ＬＢ膜は、当業者であれば容易に組み立てることができる。非特許文献１３を参照されたい。非特許文献１３は、本明細書に参照として組み込まれる。
【００５５】
また、膜は、ポリマーを含んでもよい。膜を構成することができるポリマーの具体例は、これらに限定されないが、ビニルアルコール、アクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、エチレンオキシド、加水分解したアクリロニトリル、アクリル酸、メタクリル酸、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、メチルメタクリレート（ＭＭＡ）、ウレタン、エチレンアミン、エチレングリコール、メタクリレート−ホスホリルコリン（ＭＰＣ）、ラウリルメタクリレート（ＬＭＡ）、オルトケイ酸テトラメチル、オルトケイ酸テトラエチル、セルロース、酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ペクチン酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、キトサン、カルボキシメチルキトサン、キチン、コラーゲン、プルラン、ジェラン、キサンタン、カルボキシメチルデキストラン、コンドロイチン硫酸、カチオン化グアー、カチオン化デンプン、ならびにこれらの塩およびエステルが含まれる。例えば、本発明の一実施形態では、膜は、ポリマーである、メタクリレート−ホスホリルコリンおよびラウリルメタクリレートを含む。詳細には、この実施形態は、膜の全体の電荷および疎水性を調整するために、ならびに、架橋結合およびタンパク質の固定化に影響を及ぼすことがある他の性質を修飾するために、ヒドロキシエチルメタクリレートおよび／またはメチルメタクリレートも含むこともある。
【００５６】
本発明の一実施形態では、膜を用いて結合領域を取り囲み、固定化する。例えば、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（アクリレート）、および／またはテラアルキルアンモニウム（ｔｅｒａａｌｋｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）のハイドロゲルを、結合領域が物理的に捕捉され、該ハイドロゲルにより取り囲まれているか、または結合領域がハイドロゲルに共有結合し、該ハイドロゲルにより取り囲まれているところで生成することができる。例えば、必要であれば、ハイドロゲル膜の構成成分を修飾して、ハイドロゲルの疎水性および電荷を変化させることができる。
【００５７】
周囲の膜の構成成分に関係なく、周囲の膜は人工の細胞膜を確立するために用いることができ、この人工の細胞膜は、細胞膜に類似する膜の２つの面の間の平衡を確立するのに有用であり得る。例えば、細胞内のｐＨの変化により、細胞膜を越えた受動的なＦＦＡの動きがもたらされることが示されている。（本明細書に参照として組み込まれる非特許文献１４を参照されたい。）したがって、本発明の装置に用いられる膜を用いて、ＦＦＡ、または膜を越えた他の標的検体の拡散を促進することができる内部のｐＨを確立し、維持してもよい。この膜は、膜を越えた拡散を促進することもできる等電位および濃度勾配などの他の生理学的に関連性のある特徴を確立して、細胞の状態を模倣することができる。濃度勾配を調節することにより、特定の検体の濃度範囲に対して、特に生理学的な検体または疾患に特異的な検体の濃度に相当する範囲に応答するように、所与の結合領域の応答を変更することができる。
【００５８】
本発明の装置は、シグナルを検出することができる検出器に、シグナルを伝達することができなければならない。本発明の一実施形態では、装置はシグナル検出器をさらに含む。別の一実施形態では、装置はシグナル検出器を含まない。生成されたシグナルは、標的検体の結合領域への結合を直接示すものである。換言すれば、標的検体の結合領域への結合は、検出器を用いて認識できるシグナルの特性を作り出し、または変更する。シグナルの特性における変化には、これらに限定されないが、光波長シフトおよびシグナル強度が含まれる。一実施形態では、結合領域は、標的検体に結合していない場合には、シグナルを生成しない。別の一実施形態では、結合領域は標的検体に結合していない場合でもシグナルを生成するが、しかし、標的検体の結合により、結合が認識できるようにシグナルの特性がさらに変化する。標的検体の結合領域への結合は、シグナルの変更が検出器に認識可能である場合にのみ、シグナル強度の低下を引き起こすことができることも確かに可能である。
【００５９】
本発明の一実施形態では、検出器は、蛍光光線の波長および／または強度を測定することができる蛍光光度計である。他の検出器の例には、赤外線分光光度計、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のプロトコールで用いることができるフォトダイオード、およびさらに肉眼があり得る。ＳＰＲでは、標的の分子が存在する場合に、サンプルの表面付近の屈折率特性が変化し、反射した光の強度が、サンプルとガラスメディアとの界面に金属表面が存在することにより弱められる。「共鳴角度」と呼ばれている、２つのメディアの屈折率に依存している特定の角度で強度の低下が生じる。
【００６０】
本発明の装置は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、およびｉｎ  ｓｉｔｕを含む様々な環境で使用することができる。本発明の一実施形態では、この装置は、医療用具またはインプラントである。インプラントをｉｎ  ｖｉｖｏ環境で用いる場合、インプラントは、検出可能な炎症／拒絶反応を殆どまたは全く生じないように、生体適合性でなければならない。インプラントをより生体適合性にするための一実施形態は、ポリ（ウレタン）エラストマー、ポリ（尿素）、およびポリ（塩化ビニル）などの生体適合性のポリマーでインプラントをコーティングすることを含む。ポリ（ウレタン）エラストマーは、引っ張り強度が高く、引裂きおよび摩擦の抵抗性が良好で、生物学的環境で安定性が比較的良好であるということを含めた、優れた機械的特性を有している。セグメントにしたポリウレタンの優れた機械的特性は、柔軟なセグメントと堅牢なセグメントのミクロ相分離に由来する、それら２相の相形態によるものである。ポリウレタンを長期の医療用インプラント用に使用する場合、柔軟なセグメントは、通常、ポリ（テトラメチレンオキシド）（ＰＴＭＯ）などのポリ（エーテル）マクロジオールから形成し、一方堅牢なセグメントは、４，４’−メチレンジフェニルジイソシアネート（ＭＤＩ）などのジイソシアネート、および１，４−ブタンジオールなどのジオール鎖エキステンダーに由来する。インプラントの他のコーティングには、本明細書に参照として組み込まれる特許文献１に開示されているポリ（尿素）組成物が含まれ得る。インプラントを生体適合性にする他の配合は、本明細書に参照として組み込まれる特許文献２に開示されている。さらに、本明細書に参照として組み込まれるＱｕｉｎｎらの非特許文献１５は、酵素のバイオセンサーに生体適合性をもたらすために、外側層としてポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）ハイドロゲルで構築された電流測定型グルコース電極バイオセンサーについて報告している。
【００６１】
本発明は、センサーを対象の中に埋め込むことを含む、対象における代謝性基質レベルをモニターする方法に関する。本明細書では、「対象」と「患者」という用語は、交換可能に用いられる。本明細書で用いられる「対象」という用語は、動物、特に哺乳動物、さらにより詳細には非ヒトおよびヒトの霊長動物を意味するために用いられる。インプラントは、様々な代謝物を同時にモニターするために設計することができ、その測定は対象の代謝状態または身体状態の概略を知るために用いられることができる。例えば、長期間の激しい運動の間に、グルコースは嫌気的過程で乳酸に分解される。バイオセンサーは、運動選手の乳酸の閾値を判定して、トレーニングの恩恵を最大にし、回復時間を短縮するのに有用である。同様に、バイオセンサーは、兵士の乳酸の閾値を判定して、疲労および消耗を防ぎ、回復時間を短縮するのに有用である。その目的のために、本発明のセンサーは、運動または身体的ストレスの間中、グルコースレベル、乳酸レベル、および他の代謝物をモニターするのに有用である。
【００６２】
本発明は、対象における疾患状態をモニターする方法にも関する。本発明の一実施形態では、モニターする疾患は、これらには限定されないが、心臓疾患、冠状動脈疾患、糖尿病、代謝性障害、関節リウマチなどの炎症性疾患、および癌などの慢性疾患である。様々な代謝性障害には、これらに限定されないが、高脂血症、低脂血症、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症が含まれる。
【００６３】
本発明は、救急治療室または術後回復室または病院などの急性期治療用施設における患者をモニターすることにも関する。研究によると、グルコースレベルをモニターし、正常に保った場合、術後患者における死亡率を３０％ほど減少できることが示されている。このように、本発明の多種検体バイオセンサーを、グルコースのモニタリングまたは他の代謝物が、対象の回復または全身の健康に必須である状況に用いることができる。
【００６４】
インプラントは、慢性疾患の特定のマーカーをモニターするために設計されている。分子の人工産物ならびに疾患状態に関し有害なおよび／または有利な分子の濃度のモニタリングにより、患者の進行、退行、または安定性を容易に評価することができ、次いで、治療をそれに応じて調節しまたは修正することができる。したがって、本発明の方法は、本発明のバイオセンサーの使用を含む、その処置を必要とする対象を処置する方法に関する。
【００６５】
例えば、バイオセンサーを用いてｉｎ  ｖｉｖｏでモニターすることができる心臓疾患のマーカーには、これらに限定されないが、全脂肪酸、ラクタート、グルコース、遊離脂肪酸、ならびに、これらに限定されないが、強心配糖体および交感神経作用薬などの様々な強心薬が含まれる。糖尿病のマーカーには、例えば、これらに限定されないが、グルコース、ラクタート、および脂肪酸が含まれる。冠状動脈疾患のためのマーカーには、これらに限定されないが、Ｃ反応性ペプチドおよび遊離脂肪酸が含まれてもよい。様々な代謝性障害のマーカーには、これらに限定されないが、特定の脂肪酸が含まれる。特定の脂肪酸の濃度をモニターする場合、結合領域は個々の脂肪酸種に特異的でなければならない。
【００６６】
先に言及した通り、本発明は、薬物治療をモニターする方法にも関する。実際、バイオセンサーは、薬物、薬物候補、または薬物代謝物に特異的に結合するように設計され得る。この方法で、薬物の血漿濃度をモニターすることができ、投与量を、センサーが提供する濃度測定値に基づいて調節し、または維持することができる。したがって、本発明の一実施形態では、本発明は、薬物または薬物代謝物に特異的かつ可逆的に結合して薬物の血漿濃度を決定することができるバイオセンサーを埋め込むことを含む、薬剤処方計画（ｒｅｇｉｍｅｎ）を対象に対して個別化する方法に関する。次いで、センサーが提供する濃度を用いて、対象における薬物の生物学的利用能（ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）を決定することができる。次いで、対象に投与した薬物の投与量を、変更して、対象に対する薬物の生物学的利用能を上昇させ、または低下させて、最大の治療上の利点をもたらし、毒性を避けることができる。
【実施例１】
【００６７】
光ファイバー上のハイドロゲルグルコースバイオセンサー
本実施例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでグルコース濃度を連続的にモニターするための装置として、光ファイバー上に結合タンパク質をコーティングしたハイドロゲルの使用を説明するものである。１．５ｍＬのエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）バイアル中に、８アームＰＥＧ−ＮＨ２  ２５．７ｍｇを０．３ｍＬ  ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）に溶かした溶液を、ＰＢＳバッファー中のＮＢＤ標識したＥ１４９Ｃ／Ａ２３１Ｒ／Ｌ２３８Ｓ  ＧＧＢＰの２００μＬと混合した（タンパク質濃度は１２５．５μＭで、色素／タンパク質比は０．９である）。ＮＢＤ標識化したＥ１４９Ｃ／Ａ２３１Ｒ／Ｌ２３８Ｓ  ＧＧＢＰを、本明細書に参照として組み込まれる２００２年１月４日出願の特許文献３に記載されているように調製した。次に、ＰＢＳバッファー０．５ｍＬ中のＢＴＣ−ＰＥＧ−ＢＴＣ２４．５ｍｇを混合物に加えた。完全に混合した後、最終の混合物を、４７０μｍの光ファイバー（Ｃｅｒａｍ  Ｏｐｔｅｃ、マサチューセッツ州、Ｅａｓｔ  Ｌｏｎｇｍｅａｄｏｗ）の末端上に手作業でコーティングし、少なくとも２時間、反応を継続させた。数分以内にゲルが形成し、光ファイバーの先端上に約１００から約５００μｍの厚さの非常に薄いハイドロゲルフィルムが形成した。ＰＥＧは親水性ポリマーであるので、ファイバーの先端のシリカのコアの表面上に、ヒドロキシル基で強力な水素結合を形成することができる。
【００６８】
特注の蛍光光度計を用いてグルコース濃度の変化を連続的にモニターするために、ハイドロゲルのバイオセンサーを用いた。蛍光光度計の例は、本明細書に参照として組み込まれる２００３年１１月２６日出願の特許文献４に記載されている。蛍光光度計には４７０ｎｍのＬＥＤ光源および二色性フィルターを装着し、ファイバーの入力末端に向けて４７０ｎｍの励起を反射し、単光子計数光電子倍増管管状検出器に導く５５０ｎｍのバンドパスフィルターに向けてファイバーから蛍光を伝達した。光線視準（ｂｅａｍ  ｃｏｌｌｉｍａｔｉｏｎ）のために、ならびに光の焦点をファイバー中および検出機上に合わせるために、ガラスの非球面レンズを用いた。図２は、指示されたグルコース濃度（グルコース０、３０、および１００ｍＭ）の溶液中に浸漬した後の、ファイバーの光学センサーの蛍光の応答を表している。バイオセンサーは薄いので、グルコースはハイドロゲルのマトリックスに速やかに浸透することができ、センサーは約１分以内に見かけの平衡に達し、センサーを用いてリアルタイムでグルコース濃度の変化をモニターできることを実証した。
【００６９】
上記に記載した一般的な手順を用いて、さらなるハイドロゲルのバイオセンサーを製作したが、光ファイバーを２１ゲージの針の内側に接着し、ハイドロゲルをファイバーの先端上にコーティングして針の斜角を完全に満たす点が異なった。センサーを用いて、ブタで、ｉｎ  ｖｉｖｏのグルコース濃度の変化を追跡した。２つのファイバーの光学センサーを、麻酔したブタの側面中に挿入した。乳酸化リンゲル液の、１０％デキストロース入りおよびなしの溶液を交互に、ブタの耳静脈から注入して、制御可能な様式でグルコースレベルを上昇し、低下させた。１０分間隔で、胸のカテーテルを通してブタの大静脈から血液サンプルを採取し、ハンドヘルドの血糖測定器で血糖値を試験した。図３に示すように、２つのバイオセンサーの蛍光強度を観察して、麻酔したブタの血糖の変化を追跡した。
【実施例２】
【００７０】
ＰＥＧハイドロゲルに固定化した脂肪酸結合タンパク質
本実施例は、脂肪酸を検出するためのハイドロゲルバイオセンサーの製造を記載するものである。ＡＤＩＦＡＢ（色素／タンパク質比が約１．０であるアクリロデーテッド腸型脂肪酸結合タンパク質（ＡｃｒｙｌｏＤａｔｅｄ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）２００μｇを１．０ｍＬバッファー（Ｔｒｉｓ５０ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ、アジ化物０．０５％、ｐＨ８．０）に溶かした溶液を調製した。１．５ｍＬのエッペンドルフバイアル中で、結合タンパク質溶液（２１０μＬ）を、８アームＰＥＧ−ＮＨ２（１００００ＭＷ、Ｎｅｋｔａｒ）２１ｍｇと結合させた。８アームＰＥＧ−ＮＨ２と、結合タンパク質との混合物を、ＢＴＣ−ＰＥＧ−ＢＴＣ（３４００ＭＷ、Ｎｅｋｔａｒ）の１８０μＬ  ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）１８ｍｇとさらに混合し、ボルテックスにかけた。２ｍｍのスペーサーで分けた２つのガラスプレート間に、混合物を直ちに注入した。反応が完結した後、形成されたハイドロゲルのシートを、直径５ｍｍのディスクに穿孔し、次いで、ディスクを、ＰＢＳバッファー中に２日間浸漬して非結合タンパク質およびモノマーの残留物を洗い流した。ハイドロゲルディスクへの脂肪酸の結合を、Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光光度計および９６ウェルのプレートを用いて測定した（励起は３９０ｎｍであった）。図４は、ハイドロゲルディスクの、広範囲の濃度のアラキドン酸に対する蛍光の応答を表している。ハイドロゲルのセンサーは、蛍光発光波長が４３２ｎｍから４８６ｎｍにシフトして、ＦＡ（脂肪酸、例えばアラキドン酸）に応答した。ＦＡの濃度の上昇は、４８６ｎｍにおける発光強度の上昇を引き起こした。
【実施例３】
【００７１】
グルコースおよび乳酸を検出するための光ファイバー上の多検体ハイドロゲルバイオセンサー
本実施例は、グルコースおよびＬ−乳酸を同時にモニターするための装置として、光ファイバー上にコーティングした２つの結合性タンパク質を有するハイドロゲルの使用を説明するものである。ＮＢＤ標識化ＧＧＢＰ誘導体を用いてグルコースをモニターし、選択的な乳酸の結合に対する突然変異を有するアクリロダン標識化ＧＧＢＰ誘導体を用いて、Ｌ−乳酸をモニターする。１．５ｍＬのエッペンドルフバイアル中、８アームＰＥＧ−ＮＨ2２５．７ｍｇを０．３ｍＬ  ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）に溶かした溶液を、（各々約５０〜６５μＭ）の（１）ＮＢＤ標識化したグルコース特異的なＧＧＢＰ突然変異Ｅ１４９Ｃ／Ａ２３１Ｒ／Ｌ２３８Ｓ、および（２）アクリロダン標識化した乳酸特異的なＧＧＢＰ突然変異Ｙ１０Ｋ／Ｄ１４Ｋ／Ｎ９１Ｋ／Ｋ９２Ｌ／Ｅ１４９Ｃ／Ｈ１５２Ｍ／Ｄ１５４Ｈ／Ｒ１５８Ｋ／Ｗ１８３Ｋ／Ｄ２３６Ａ／Ｎ２５６ＤのＰＢＳバッファー溶液の１：１等モル混合物２００μＬと混合した。次に、ＢＴＣ−ＰＥＧ−ＢＴＣ２４．５ｍｇの０．５ｍＬ  ＰＢＳバッファー溶液を混合物に加えた。混合した後、最終混合物を４７０μｍの光ファイバー（Ｃｅｒａｍ  Ｏｐｔｅｃ、マサチューセッツ州、Ｅａｓｔ  Ｌｏｎｇｍｅａｄｏｗ）の末端上に手作業でコーティングし、少なくとも２時間、反応を継続させた。蛍光光度計を用いてグルコースおよび乳酸の濃度変化を連続してモニターするために、ハイドロゲルのバイオセンサーを用いる。３９０ｎｍにおける励起し、および約５１５ｎｍで狭いバンドパスフィルターを通した発光の測定により、Ｌ−乳酸の存在および濃度に対応するシグナルがもたらされる。４７５ｎｍにおける励起、および約５５０ｎｍでバンドパスフィルターを通した発光の測定により、グルコースの存在および濃度に対応するシグナルがもたらされる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】３つの検体をモニターするためにデザインされた多検体センサーのいくつかの実施形態を示す図である。
【図２】様々な濃度のグルコースに応答する本発明のバイオセンサーの応答時間を示すグラフである。
【図３】本発明のハイドロゲルバイオセンサーを用いて、ブタにおけるｉｎ  ｖｉｖｏのグルコース濃度の変化の追跡を示すグラフである。
【図４】ハイドロゲルバイオセンサーによる、様々な濃度の脂肪酸に対する応答を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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