(57)【要約】  多くの堆積技術のいずれか１つを用いて、好ましい実施の形態ではマイクロプレートの単一ウェル内に位置する、単一のバイオセンサ上に対照領域と試料領域を作製することが可能な方法について述べる。バイオセンサの表面に対照領域と試料領域を作製する補助に利用可能な堆積技術には、（１）バイオセンサの反応性表面への非活性化剤のプリンティング／スタンピング；（２）バイオセンサの反応性表面へのターゲット分子(目標とするタンパク質)のプリンティング／スタンピング；もしくは（３）バイオセンサの別の非反応性表面への活性化剤のプリンティング／スタンピングが含まれる。
2008527333.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
堆積技術を用いることにより部分的に作製された、対照領域および試料領域を備えた表面を有するバイオセンサ。
【請求項２】
前記表面を反応性薬剤でコーティングし、
前記コーティングされた表面の所定の領域に不活性化剤を堆積させて対照領域を作製し、
前記表面をターゲット分子に晒し、ここで前記ターゲット分子が不活性化剤で処理されていない前記コーティングされた表面の所定の領域にある前記表面と結合して試料領域を作製する、
各工程を行うことにより、前記表面に前記対照領域および前記試料領域が作製されたことを特徴とする請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記表面を反応性薬剤でコーティングし、
前記コーティングされた表面の所定の領域にターゲット分子を堆積させて試料領域を作製し、
前記コーティングされた表面を不活性化剤に晒し、曝露された反応性薬剤をまだ有している前記コーティングされた表面部分を不活性化させて対照領域を作製する、
各工程を行うことにより、前記表面に前記対照領域および前記試料領域が作製されたことを特徴とする請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項４】
前記表面の所定の領域上に活性化剤を堆積させ、少なくとも曝露された活性化剤を有する前記コーティングされた表面部分にターゲット分子を付着させて試料領域を作製し、
活性化剤のない領域を対照領域として利用する、
各工程を行うことにより、前記表面に前記対照領域および前記試料領域が作製されたことを特徴とする請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項５】
前記堆積技術がスプレー式であることを特徴とする請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項６】
自身の中に形成された複数のウェルを備えたフレームと、
堆積技術を用いて部分的に作製された対照領域および試料領域を伴う表面を有するバイオセンサを備えている各ウェルと、
を含むマイクロプレート。
【請求項７】
前記表面を反応性薬剤でコーティングし、
前記コーティングされた表面の所定の領域に不活性化剤を堆積させて対照領域を作製し、
前記表面をターゲット分子に晒し、ここで前記ターゲット分子が、不活性化剤で処理されていない前記コーティングされた表面の所定の領域において前記表面と結合して試料領域を作製する、
各工程を行うことにより、前記表面に前記対照領域および前記試料領域が作製されたことを特徴とする請求項６記載のマイクロプレート。
【請求項８】
前記表面を反応性薬剤でコーティングし、
前記コーティングされた表面の所定の領域にターゲット分子を堆積させて試料領域を作製し、
前記コーティングされた表面を不活性化剤に晒し、曝露された反応性薬剤をまだ有している前記コーティングされた表面部分を不活性化させて対照領域を作製する、
各工程を行うことにより、前記表面に前記対照領域および前記試料領域が作製されたことを特徴とする請求項６記載のマイクロプレート。
【請求項９】
前記表面の所定の領域上に活性化剤を堆積させ、少なくとも曝露された活性化剤を有する前記コーティングされた表面部分にターゲット分子を付着させて試料領域を作製し、
対照領域として活性化剤のない領域を利用する、
各工程を行うことにより、前記表面に前記対照領域および前記試料領域が作製されたことを特徴とする請求項６記載のマイクロプレート。
【請求項１０】
堆積技術を用いて、前記バイオセンサの表面に対照領域および試料領域を作製する工程を有してなる、
バイオセンサ上にパターン化された表面を調製する方法。
【請求項１１】
前記表面を反応性薬剤でコーティングし、
前記コーティングされた表面の所定の領域に不活性化剤を堆積させて対照領域を作製し、
前記表面をターゲット分子に晒し、ここで前記ターゲット分子が、不活性化剤で処理されていない前記コーティングされた表面の所定の領域において前記表面と結合して試料領域を作製する、
各工程を行うことにより、前記バイオセンサの前記表面に対照領域および試料領域を作製することを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記表面を反応性薬剤でコーティングし、
前記コーティングされた表面の所定の領域にターゲット分子を堆積させて試料領域を作製し、
前記コーティングされた表面を不活性化剤に晒し、曝露された反応性薬剤をまだ有している前記コーティングされた表面部分を不活性化させて対照領域を作製する、
各工程を行うことにより、前記バイオセンサの前記表面に対照領域および試料領域を作製することを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記表面の所定の領域上に活性化剤を堆積させ、少なくとも曝露された活性化剤を有する前記コーティングされた表面の部分にターゲット分子を付着させて試料領域を作製し、
対照領域として活性化剤のない領域を利用する、
各工程を行うことにより、前記バイオセンサの前記表面に対照領域および試料領域を作製することを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
前記バイオセンサが２つ以上の対照領域および／または２つ以上の試料領域を備えることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
前記対照領域および前記試料領域を有する前記バイオセンサが、前記試料領域が生体分子結合事象の検出に利用可能であり、また、前記対照領域が生体分子結合事象の検出に悪影響を与えうる疑似変化を見出し排除するのに利用可能であることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
前記堆積技術が、接触ピンプリンティング、非接触プリンティング（インクジェットプリンティング、エアロゾル式プリンティング）、ミクロ接触プリンティング、パッドプリンティング、およびスクリーンプリンティング、シルクプリンティング、マイクロピペッティング、およびスプレー式のいずれかを含むことを特徴とする請求項１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の説明】
【０００１】
本出願は、「空間操作型光読み取り系およびその方法」（代理人整理番号ＳＰ０４−１４９）という名称で２００４年１２月２９日に出願した、米国特許出願第１１／０２７，５４７号の関連出願である「バイオセンサ上に対照領域および試料領域を作製する方法ならびにバイオセンサ」という名称で２００４年１２月２９日に出願した、米国特許出願第１１／０２７，５０９号の優先権を主張するものである。これらの内容は、参照することにより本明細書中に取り込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、部分的にプリンティングもしくはスタンピングなどの堆積技術を利用することによって作製される対照領域および試料領域の両方の表面を有するバイオセンサに関する。ある実施の態様では、バイオセンサはマイクロプレートのウェル内部に取り込まれている。
【背景技術】
【０００３】
今日、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサまたは共鳴導波管グレーティングセンサなどのバイオセンサによって、光ラベル独立検出(optical label independent detection)（ＬＩＤ）技術を、バイオセンサ表面で生体分子の結合事象を検出するために用いることが可能になっている。特に、ＳＰＲセンサおよび共鳴導波管グレーティングセンサは、光ＬＩＤ技術をバイオセンサの屈折率／光応答の変化の測定に用いることを可能にし、言い換えれば、バイオセンサ表面での生体分子の結合事象の検出を可能にしている。様々な光ＬＩＤ技術を伴うこれらのバイオセンサは、タンパク質間相互作用およびタンパク質−小分子相互作用を含む多種多様な生体分子の結合事象の研究に用いられている。
【０００４】
高感度測定では、測定する屈折率／光応答における擬似変化をもたらしうる要因(温度、溶剤効果、バルク屈折率の変化および非特異的結合など) を注意深く制御し、または比較し排除することが重要である。マイクロチップを用いたＬＩＤ技術では、これは、典型的には、２種類のバイオセンサを用いることにより成し遂げられる。１つは実際のバイオセンサであり、もう一方は、前述の要因を比較し排除するために用いる隣接したバイオセンサである。２つの典型的なマイクロチップを用いたＬＩＤバイオセンサには、対照として４つの近接するフローチャネルの１つを用いるビアコア社(Biacore)製のＳＰＲ基板および対照としてセンサパッドの隣に分離パッドを用いるDubendorfer氏の装置が含まれる。以下の書類にビアコア社のＳＰＲ基板およびDubendorfer氏の装置の詳細な説明が記載されている：非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３。
【０００５】
これらのタイプの対照スキームを利用する上での有利な点は、ビアコア社のＳ５１によって実証されており、最新かつ最も高感度のＳＰＲ基板が今日では市場で入手可能である。この機器はノイズ、温度の影響、ドリフト、および、単一チャネル中のバルク屈折率効果を最小限にするための、いわゆる流体力学的対照の利用に基づいて改良された対照に起因して、感度と性能が非常に改良されている。しかしながら、マイクロチップに基づくＬＩＤ技術ではフローセル技術を利用する必要があり、それ自体、マイクロプレートに利用するために容易には適合できない。
【０００６】
マイクロプレート用に設計されたバイオセンサは、高処理スクリーニング用途に忠実に従うため、非常に魅力的である。しかしながら、今日使用されているマイクロプレートは、試料のバイオセンサを備えた１つのウェルと対照のバイオセンサを備えた隣接したウェルを有している。２つのバイオセンサ間にこういった大きな分離距離があることにより、温度の影響を比較し排除することは困難である。さらには、２つの隣接したバイオセンサの利用によって、試料ウェルならびに対照ウェルにおける２種類の溶液を利用する必要性が生じ、必然的に、２溶液間にピペット誤差、希釈誤差、およびバルク屈折率変化を導きうる。結果として、対照の有効性が損なわれる。これらの問題点を解決する試みとして、数種類の取り組みが、特許文献１に記載されており、単一のバイオセンサの光応答および様々な偏光の同時測定が、温度の影響を比較し排除するために利用されている。しかしながら、これらの試みは実行するのが容易ではなく、バルク屈折率効果および非特異的結合を考慮し、補正することができない。
【０００７】
さらに別の試みでは、O'Brienらが、レーザー切断を表面化学の電気化学的パターニングと組み合わせて用いることにより対照領域を作製する、二成分ＳＰＲセンサを用いた。しかしながら、この試みは実行するのが難しく、金属基材を用いるため、適用が制限される。二成分ＳＰＲセンサについての詳細な説明およびこの試みについては、O'Brienらの非特許文献４の中で提供されている。
【特許文献１】米国出願公開第２００３／０００７８９６号明細書
【非特許文献１】"Improving Biosensor Analysis", Myska, J. Mol. Recognit, 1999, 12, 279-284
【非特許文献２】"Hydrodynamic Addressing of Detection Spots in Biacore S51", Biacore Technology Note 15
【非特許文献３】J. Dubendorfer et al . "Sensing and Reference Pads for Integrated Optical Immunosensors" , Journal of Biomedical Optics 1997, 2(4) , 391-400
【非特許文献４】O'Brien et al . "SPR Biosensors: Simultaneously Removing Thermal and Bulk Composition Effects", Biosensors & Bioelectronics 1999, 14, 145-154
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
以上のように、マイクロプレートに利用可能で、生体分子の結合事象の検出に利用可能であり、それと同時に温度の影響、ドリフト、バルク屈折率効果、および非特異的結合を比較し排除するバイオセンサが必要とされている。本発明は、この必要性および他の必要性を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明には、数種類の堆積技術(例えば、接触ピンプリンティング、非接触プリンティング、ミクロ接触プリンティング、スクリーンプリンティング、スプレープリンティング、スタンピング、スプレー式)のいずれかによって、例えば、マイクロプレートの単一ウェル内に配置可能な単一のバイオセンサ上の対照領域と試料領域を作製可能な方法が含まれる。バイオセンサの表面に対照領域と試料領域を作製するのに用いられる方法の実施には、（１）バイオセンサの活性表面への非活性化剤の選択的堆積；（２）バイオセンサの活性表面へのターゲット分子(例えばタンパク質)の選択的堆積；もしくは（３）バイオセンサの別の非反応性表面への活性化剤の選択的堆積が含まれる。対照領域と試料領域の両方を持つ表面を有するバイオセンサによって、試料領域を利用して生体分子の結合事象の検出を可能にし、また、対照領域を利用して、生体分子の結合事象の検出に悪影響を与える擬似変化を比較し排除することを可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、添付の図面と共に、以下の詳細な説明を参照することにより、さらに完全に理解されるであろう。
【００１１】
図１は、マイクロプレート１０８の単一ウェル１０６の底に位置する単一バイオセンサ１００上の対照領域１０２および試料領域１０４を作製するための３種類の方法の説明の補助に用いられる図式である。しかしながら、本発明の詳細について論じる前に、好ましいバイオセンサ１００は、ＳＰＲセンサ１００および共鳴導波管グレーティングセンサ１００などのＬＩＤ技術の実行に利用可能であることに留意すべきである。以下の文献では、本発明に利用可能なこれら典型的なバイオセンサ１００の構造および機能性についての詳細が開示されている。
【００１２】
●欧州特許出願公開第０２０２０２１号明細書、"Optical Assay: Method and Apparatus" 
●米国特許第４，８１５，８４３号明細書、"Optical Sensor for Selective Detection of Substances and/or for the Detection of Refractive Index Changes in Gaseous, Liquid, Solid and Porous Samples"
これらの文献の内容はここで引用することによって、本明細書に包含される。
【００１３】
図１は、マイクロプレート１０８の単一ウェル１０６内に位置する単一のバイオセンサ１００上の対照領域１０２および試料領域１０４を作製する補助をするための、特定の堆積技術を用いた３種類の方法を示す。第１の方法では、バイオセンサ１００の表面１１０が、活性化剤１１２（例えば、無水マレイン酸化ポリエチレン(poly(ethylene-alt-maleic anhydride)（ＥＭＡ））でコーティングされる(工程１ａ)。（活性化剤１１２の例としては、限定はしないが、無水物基、活性エステル、マレイミド基、エポキシド、アルデヒド、イソシアネート、イソチオシアネート、塩化スルホニル、カーボネート、イミドエステル、またはハロゲン化アルキルが存在する薬剤が挙げられる。）次に、表面１１０の所定の場所を、遮断薬／不活性化剤１１６をその上に堆積することにより、特に不活性化する(工程１ｂ)。例えば、表面１１０をＥＭＡなどのアミン反応性のコーティング剤でコーティングする場合は、エタノールアミン（ＥＡ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、トリスヒドロキシメチルアミノエタン（ｔｒｉｓ）、Ｏ，Ｏ−ビス（２−アミノプロピル）ポリエチレングリコール１９００（ＰＥＧ１９００ＤＡ）もしくは、他のポリエチレングリコールアミンまたはジアミンなど、多くのアミン含有薬剤が、遮断／不活性化に利用可能である。あるいは、非アミン含有薬剤もまた、反応基の加水分解に利用可能であろう。その後の(固定化工程１ｃ)では、ターゲット分子１１８(例えば、タンパク質１１８)をウェル１０６に加える。ターゲット分子は不活性化剤１１６で処理されていない領域にあるセンサとのみ結合する。ターゲット分子としては、タンパク質、ペプチド、合成または生体膜、小分子、合成または生体ＤＮＡまたはＲＮＡ、細胞、細菌、ウイルスなどが考えられる。これが、単一のバイオセンサ１００上に対照領域１０２および試料領域１０４を作製するのに利用可能な１つの方法である。
【００１４】
第２の方法では、バイオセンサ１００の表面１１０は活性化剤１１２でコーティングされる(工程２ａ)。ターゲット分子１１８は、次に、活性化剤１１２でコーティングされた表面１１０の所定の場所に直接プリンティングされる(工程２ｂ)。その後、ウェル１１６全体を不活性化剤１１６に晒し(工程２ｃ)、対照領域１０２として用いられる表面１１０の非プリンティング領域を不活性化／遮断する。これが、単一のバイオセンサ１００上に対照領域１０２および試料領域１０４を作製するのに利用可能な別の方法である。
【００１５】
第３の方法では、バイオセンサ１００の表面１１０は、反応基へと変化可能な官能基（カルボン酸基など）を有する材料でコーティングされる（工程３ａ）。工程３ｂでは、１−[３−（ジメチルアミノ）プロピル]−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）などの活性化剤を表面に堆積することにより、表面の所定の場所を反応性にする。次に、ウェル１０６全体を、ターゲット分子１１８を含む溶液に晒し、活性化剤１１２をプリンティングすることによって活性化された表面１１０の領域と、ターゲット分子１１８を結合させる。付着したターゲット分子１１８を持たない表面１１０の領域は、対照領域１０２として利用可能である。これが、単一のバイオセンサ１００上に対照領域１０２および試料領域１０４を作製するのに利用可能な、さらに別の方法である。
【００１６】
前述の方法に利用可能な異なる堆積技術がたくさん存在することに、留意すべきである。例えば、堆積技術としては、接触ピンプリンティング、非接触プリンティング(インクジェットプリンティング、エアロゾル式プリンティング)、キャピラリー式プリンティング、ミクロ接触プリンティング、パッドプリンティング、スクリーンプリンティング、シルクスクリーンプリンティング、マイクロピペッティング、およびスプレー式が挙げられる。
【００１７】
当業者が上述の方法を利用して表面１００上に複数の異なるスポットを印刷し、マイクロプレート１０８の同一ウェル１０６内に、対照領域１０２、陽性／陰性コントロールおよび／または複数の種類のターゲット分子番号１〜２（例えば）を形成可能であろうこともまた、留意されるべきである。このシナリオの例が図１の下部に示されている。
【００１８】
以下は、本発明にかかる３種類の方法それぞれの実現可能性を評価する目的で行った実験についての説明である。
【００１９】
本発明にかかる第１の方法に関する実験に関しては、蛍光測定およびコーニング社(Corning)のＬＩＤ測定を用いて、バイオセンサ１００上の対照（非結合）領域１０２および試料（結合）領域１０４を作製する実現可能性について評価した。コーニング社のＬＩＤ測定とは、共鳴導波管グレーティングセンサを用いて行った測定のことをいう。最初の一連の実験では、ホウ酸塩緩衝剤（１００ｍＭ、ｐＨ９）に溶かした３種類の不活性化剤１１６（エタノールアミン（ＥＡ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、およびＯ,Ｏ’−ビス（２−アミノプロピル）ポリエチレングリコール１９００（ＰＥＧ１９００ＤＡ））を反応性の薬剤１１２（無水マレイン酸化ポリエチレン（ＥＭＡ））でコーティングされたスライド上の３種類のウェルにプリンティングした。プリンティングは、５×７に配列された個々のスポット（３００μｍの間隙あり）にプリンティングする＃１０のクイルピン(quill pin)を備えた直交軸ロボット型のピンプリンター(Cartesian robotic pin printer)を用いて行い、プリンティングされた(対照)領域１０２を作製した。スポットが互いに融合して矩形領域を作製するように、互いに十分に近接させてプリンティングした。次に、ウェルを、プリンティング工程の有効性の評価に用いるビオチン−ＰＥＯ−アミン１１８と共に培養した。ビオチン１１８がウェルの非プリンティング（試料）領域１０４とのみ結合するであろうことが予測された。次に、ウェルをｃｙ３−ストレプトアビジンの溶液に晒し、蛍光スキャナで撮像した。
【００２０】
図２にこれらの実験結果をまとめる。図に示すとおり、不活性化剤１１６をプリンティングした領域に対応する各ウェル内の円形部分では、蛍光シグナルは観測されなかった。本結果は、ＥＡ、ＰＥＧ１９００ＤＡおよびＥＤＡを含む３種類の遮断薬のすべてが、反応性薬剤１１２（ＥＭＡ）の不活性化に有効であり、それによって、ビオチン１１８とｃｙ３−ストレプトアビジンの結合を妨げたことを示唆する。グラフは、プリンティングされた(対照)領域１０２では非プリンティング(試料)領域１０４と比較して、蛍光強度が９８％以上低下したことを示している。蛍光画像の試験では、不活性化剤１１６のプリンティングされた(対照)領域１０２の外側への明らかな拡散がなかったことも示されている。
【００２１】
別の一連の実験では、不活性化剤１１６の濃縮が行われることの影響についての調査を行った。不活性化剤１１６を濃縮しすぎた溶液の利用では、非プリンティング(試料)領域１０４への二次汚染が起こる可能性がある。図３では、ｃｙ３−ストレプトアビジン結合アッセイを、様々な濃度のＥＡ１１６をプリンティングしたスライド上で行った後に得られた５枚の蛍光画像が示されている。高濃度のＥＡ１１６を用いた画像＃１〜２では、著しい拡散／二次汚染があったことがわかる。また、低濃度のＥＡ１１６を用いた画像＃３〜４では、ＥＡ１１６はプリンティングされた領域に限定され、その領域において低い蛍光シグナル強度が観察されたことからも明らかなように、表面は効果的に不活性化されたままであったことがわかる。最後の画像＃５はＥＡ１１６をプリンティングされなかったものである。
【００２２】
さらに別の一連の実験は、（i）ウェル１０６内においてプリンティングされた不活性化剤１１６を利用しても、続いて行われるターゲット分子１１８の非プリンティング(反応性)領域１１２上での固定化に悪影響を与えないこと、および（ii）プリンティングされた不活性化剤１１６を利用しても、バルク溶液中で用いられる不活性化剤と同様の働きをすること、を実証するために行われた。これらの実験では、コーニング社製のＬＩＤマイクロプレート１０８（薄いＴａ２Ｏ５の導波管層を備えている）の各ウェル１０６を、最初に反応性薬剤１１２（ＥＭＡ）でコーティングした。次に、不活性化剤（ＰＥＧ１９００ＤＡ）１１６をコーニング社製のＬＩＤマイクロプレート１０８のそれらのウェル１０６の各所定の領域にプリンティングした。コントロールとして、付加的なウェル１０６もまた、同一の遮断薬１１６の溶液と共に培養するか、または、処理せず放置した。次に、すべてのウェル１０６をビオチン−ＰＥＯ−アミン１１８の溶液に晒し、続いてｃｙ３−ストレプトアビジンと共に培養した。
【００２３】
図４は、これらの蛍光画像の実験結果を示している。ストレプトアビジンのビオチン１１８との特異結合に由来して、非活性化剤１１６を含まないウェル１０６に比べて領域の半分が不活性化剤（ＰＥＧ１９００ＤＡ）１１６で遮断されたウェル１０６について、ｃｙ３蛍光シグナルと等価のものが観察された。このことは、遮断薬１１６がプリンティングされた領域の外側の領域へ拡散しなかったことを示唆する。バルク溶液での堆積と比べてプリンティングで堆積した場合、各処理での蛍光シグナルの度合いが低いことから示唆されるように、不活性化剤(遮断薬)１１６の有効性は、両方法において等しいことが示された。
【００２４】
ウェル内の対照について本発明を利用する有利性を実証するため、コーニング社製のＬＩＤマイクロプレート１０８を利用した追加の実験を行った。これらの実験では、ＬＩＤマイクロプレート１０８には、プリンティングされた不活性化剤（ＰＥＧ１９００ＤＡ）１１６と共に、数種類のＥＭＡでコーティングされたウェル１０６が存在した。次にビオチン−ＰＥＯ−アミン溶液と共にウェル１０６を培養することにより、ビオチンを表面に固定した。その後、マイクロプレート１０８をコーニング社製のＬＩＤ機器に入れ、ストレプトアビジンの結合（１００ｎＭ、ＰＢＳ中）を時間関数としてモニタした。アッセイの間、ＬＩＤ機器で、各ウェル１０６／バイオセンサ１００の下に沿って連続的にスキャンし、対照(非結合)領域１０２および試料（結合）領域１０４におけるシグナルをモニタした。ＬＩＤ機器についてのさらなる詳細な説明は、前述の本出願と同時出願した米国特許出願第１１／０２７，５４７号明細書（代理人整理番号ＳＰ０４−１４９）、発明の名称"Spatially Scanned Optical Reader System and Method for Using Same"を参照されたい。
【００２５】
図５Ａは、アッセイの経過する間の１つのウェル１０６内に存在する対照領域１０２および試料領域１０４の反応を示すグラフである。このグラフにおける「差異パッド_Ｂ６」のグラフ線は、対照のグラフ線「対照パッド_Ｂ６」を、試料のグラフ線である「シグナルパッド_Ｂ６」から差し引いて得られた対照補正データである。図に示すように、最初約１０分間は、両方のチャネルにおいて、時間に対するシグナル（すなわち、ドリフト）の系統的な減少が見られた。しかしながら、このドリフトは、対照で補正されたグラフ線「差異パッド_Ｂ６」において、事実上排除された。具体的にいえば、ドリフト速度は、補正されていないグラフ線「シグナルパッド_Ｂ６」では約−２．５ｐｍ／分であり、対照のグラフ線「対照パッド_Ｂ６」では約０ｐｍ／分であった。
【００２６】
図５Ｂはウェル内（ウェルＢ６シグナルおよび対照領域）もしくはウェル相互間の対照（ウェルＢ６シグナル領域−近接ウェルＢ５対照領域）を用いた同一のアッセイの最初の１０分間を示すグラフを表している。データは、ウェル内対照技術がバイオセンサ１００の周囲環境由来のドリフトを排除するのに非常に有効であることを明確に示している。
【００２７】
図５Ｃは、センサ１００の様々な位置に応じた波長シフト全体（ストレプトアビジンの結合後）の輪郭線を示している。図に示すとおり、センサ１００上の対照(遮断)領域１０２および試料（非遮断）領域１０４の間には、明確なきれいな変化が存在し、プリンティング処理を制御下で行いうることを示している。
【００２８】
以下に、本発明にかかる第２の方法に関する実験について述べる。本発明にかかる第２の方法でも、やはり、反応性表面１００上に、直接、ターゲット分子１１８をプリンティングすることにより、単一バイオセンサ１００内に対照領域１０２およびセンシング領域１０４を作製し、次に不活性剤１１６で処理することによって表面１００の残りの部分を不活性化する。この方法の利点は、バルク溶液を利用したタンパク質の固定化（＞約１０μｌ）と比較して、タンパク質の消費量が大幅に低減される（＜約１ｎｌ）ことである。
【００２９】
この方法の実現可能性を実証するため、ＢＳＡ−ビオチン１１８（５０μｇ／ｍｌ、１００ｍＭホウ酸塩ｐＨ９）をコーニング社製ＬＩＤマイクロプレート１０８の各ウェル１０６にプリンティングした。次に、それぞれのウェルにエタノールアミン１１６（２００ｎＭホウ酸塩緩衝液、ｐＨ９）で処理し、続いてｃｙ３−ストレプトアビジン（１００ｎＭ、ＰＢＳ中）と共に培養した。図６は、ＢＳＡ−ビオチン１１８がプリンティングされた試料領域１０４で強い蛍光シグナルが観測され、対照領域１０２では非常に低いシグナル(センシング領域のシグナルの＜３％)が観測された蛍光画像である。これらの結果は、（i）プリンティング工程はＢＳＡ−ビオチン１１８を固定する際に有効であり；（ii）ＢＳＡ−ビオチン１１８のプリンティング領域外への拡散は起こらず；（iii）プリンティングされたＢＳＡ−ビオチン１１８は、ストレプトアビジンとの結合能力を維持したことを実証している。図７は、コーニング社のＬＩＤ機材を用いて行った同様の実験結果を示すグラフである。２４０ｐｍ以下のレベルの結合シグナルは、大量のタンパク質１１８が表面に結合したことを示している。前述の蛍光実験結果と一致して、ストレプトアビジンの結合は、バイオセンサ１００の対照部分１０２では観察されなかった。
【００３０】
以下に、本発明にかかる第３の方法に関する実験について述べる。本発明にかかる第３の方法でも、やはり、活性化剤１１２（例えば、１−［３−(ジメチルアミノ)プロピル] −３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ，アルドリッチ社(Aldrich)製）およびＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ，アルドリッチ社製））を他の不活性表面（例えば、カルボン酸基が存在する表面）上にプリンティングすることにより、単一バイオセンサ１００内に対照領域１０２およびセンシング領域１０４を作製し、ターゲット分子１１８を付着させるための反応性の結合表面１０４を形成する。
【００３１】
この構想を実証するため、ＥＤＣ（１ｍＭ）およびＮＨＳ（１ｍＭ）を含む水溶液をマイクロプレート１０８のウェル１０６にある加水分解されたＥＭＡ上にプリンティングした。次に、ウェル１０６全体をビオチン−アミン１１８と共に培養し、ｃｙ３−ストレプトアビジンの蛍光性結合アッセイを行った。図８は、蛍光シグナルがプリンティングされた領域に対応する領域でのみ観察されたグラフおよび写真を示しており、ターゲット分子の付着が選択的に制御され、非プリンティング領域は対照領域１０２として機能しうることを実証するものである。
【００３２】
プリンティング／スタンピング技術を用いて本発明に従ったＬＩＤバイオセンサ１００のウェル内に対照を作製することのいくつかの付加的な特性および有利性を次に述べる。
【００３３】
１）同一ウェル内に作製された対照は、温度、バルク屈折率効果、および、非特異結合によって生じる誤差を劇的に低減または排除可能である。ウェル内の対照を用いてこれらの影響を比較し排除することは、近接したウェルを対照として用いるのに比べて、さらに効果的である。
【００３４】
２）ウェル内部の対照領域は、離れた対照（コントロール）ウェルを用いる必要性を排除することにより、薬剤の消費を低減させる。
【００３５】
３）プリンティング／スタンピング技術は、マイクロプレートの製造規模に応じて拡大縮小可能である。
【００３６】
４）ターゲットタンパク質のプリンティング／スタンピングは、バルク溶液反応を利用するタンパク質の固定化に比べて、用いるタンパク質の量を結果的に約１００から１０，０００分の１に減少可能である。
【００３７】
５）プリンティング／スタンピング技術は、実質上、バイオセンサ上の表面を作るのに利用可能な、いかなる型の基材にも適用可能である。
【００３８】
６）第２の検出方法は、また、質量分析法などの生体分子結合のさらなる詳細な情報を提供するために用いることが可能である。
【００３９】
本発明にかかる幾つかの実施の態様について、添付の図面において図示し、前述の発明の詳細な説明で述べてきたが、本発明は開示された実施の態様に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲によって説明され、明らかにされるとおり、本発明の精神から離れることなく、様々な再配列、修正および置換が可能であることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明にしたがって単一のバイオセンサ上に対照領域および試料領域を作製する３種類の方法についての説明を補助するための図式。
【図２】本発明にかかる第１の方法の実行可能性を評価するために行われた実験の結果を示すグラフおよび写真。
【図３】本発明にかかる第１の方法の実行可能性を評価するために行われた実験の結果を示す写真。
【図４】本発明にかかる第１の方法の実行可能性を評価するために行われた実験の結果を示すグラフおよび写真。
【図５Ａ】本発明にかかる第１の方法の実行可能性を評価するために行われた実験の結果を示すグラフ。
【図５Ｂ】本発明にかかる第１の方法の実行可能性を評価するために行われた実験の結果を示すグラフ。
【図５Ｃ】本発明にかかる第１の方法の実行可能性を評価するために行われた実験の結果を示すグラフ。
【図６】本発明にかかる第２の方法の実行可能性を評価するために行われた実験の結果を示すグラフおよび写真。
【図７】本発明にかかる第２の方法の実行可能性を評価するために行われた実験の結果を示すグラフ。
【図８】本発明にかかる第３の方法の実行可能性を評価するために行われた実験の結果を示すグラフおよび写真。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年2月19日(2008.2.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図７】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図８】
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【国際調査報告】
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