(57)【要約】  本発明は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ腫瘍関連抗原を模倣する能力により特徴づけられるヒト抗イディオタイプ抗体フラグメント、特にｓｃＦｖに関する。これらの抗体フラグメントは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに陽性な癌患者のための有効な免疫療法のための候補として見込まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ腫瘍関連抗原を模倣する能力により特徴づけられる、ヒト抗イディオタイプＦａｂ又はｓｃＦｖフラグメント。
【請求項２】
ＶHドメインのＣＤＲ３領域中の配列番号３、及びＶLドメインのＣＤＲ３領域中の配列番号４を含んで成る、請求項１に記載のフラグメント。
【請求項３】
ＶHドメインのＣＤＲ３領域中の配列番号５、及びＶLドメインのＣＤＲ３領域中の配列番号６を含んで成る、請求項１に記載のフラグメント。
【請求項４】
トラスツズマブＦ（ａｂ’）2に対して産生される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のフラグメント。
【請求項５】
アミノ酸配列番号１を含んで成る、請求項２に記載のフラグメントであって、当該フラグメントがｓｃＦｖ４０と命名されているフラグメント。
【請求項６】
アミノ酸配列番号２を含んで成る、請求項３に記載のフラグメントであって、当該フラグメントがｓｃＦｖ６９と命名されているフラグメント。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体フラグメントの多量体。
【請求項８】
医薬的に受容可能な担体との結合において、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体フラグメント、又は請求項７に記載のその多量体を含んで成る医薬組成物。
【請求項９】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ−特異性保護抗腫瘍免疫を誘発するために有用な抗原提示細胞（ＡＰＣ）の調製のための生体外における方法であって、当該方法が、当該抗原細胞を請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗イディオタイプ抗体フラグメントと接触させることを含んで成る方法。
【請求項１０】
前記ＡＰＣが樹状細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の方法に従い調製される単離ＡＰＣ。
【請求項１２】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕが過剰発現される腫瘍の予防又は治療のための医薬の調製のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体フラグメント、又は請求項７に記載のその多量体の使用。
【請求項１３】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕが過剰発現される腫瘍の予防又は治療のための、請求項１１に記載のＡＰＣの使用。
【請求項１４】
前記腫瘍が腺癌である、請求項１２又は１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記腫瘍が、乳癌、卵巣癌、子宮癌、胃癌、及び肺癌から選択される、請求項１４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ腫瘍関連抗原を模倣するヒト抗イディオタイプ抗体フラグメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ＨＥＲ−２／ｎｅｕは、いくつかのヒト癌の表面上に過剰発現されるが、正常な組織におけるその発現は制限されていることから、有効な癌の免疫療法のための癌ワクチン候補として見込まれている。これは、動物及び人において免疫原生であることが示され、そしてモノクローナル抗体の標的となりうる。当該１８５ｋＤａの膜貫通型リン酸糖タンパク質は、リガンド結合及びキナーゼ活性を有する細胞内細胞質ドメインにおいて機能するシステインリッチ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）から成る。更に、ＨＥＲ−２／ｎｅｕは、上皮成長因子レセプターファミリーのメンバーである。ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質の過剰発現が生じる癌は、ヒト腺癌、例えば、乳癌（乳管癌の２０〜４０％）、又は卵巣癌（３０％）を含む。過剰発現は、より活動的な疾患及び節陽性乳癌においてより乏しい予後に結びつくが、自己癌細胞に対する免疫応答を示す炎症性浸潤を含むステージＩの乳房腫瘍を伴ういくらかの患者においては、好ましい予後に関することが確立されている(Rilke et al. 1991)。これらの患者においてより優れた結果である１つの仮説は、更に成長及び転移を直接的又は間接的に制限できるＨＥＲ−２／ｎｅｕ免疫応答の発生に関連しうる。癌を伴う患者におけるＨＥＲ−２／ｎｅｕ特異性免疫を規定する異なる研究は、高レベルのＴ細胞及び抗体免疫が、たとえ彼らの大半において低く又は欠乏しているとしても、いくらかの患者には存在することを示す(Disis et al. 1994-Fisk et al. 1995-Peoples et al. 1995)。これは、免疫耐性が存在し、おそらくＨＥＲ−２／ｎｅｕの癌胎児性起源に関係し、そしてこれが当該抗原に対する有効なワクチン接種に対する障壁を示すことが強く示唆される(Nanda et al. 1995-Disis et al. 1998)。更に、異なる研究は、抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）が腫瘍を根絶するために有効となりうることを証明した(Baselga et al. 2001)。
【０００３】
これらの発見は、更に、乳癌の治療のため、又は再発性疾患の予防のためのＨＥＲ−２／ｎｅｕに対する免疫を誘発及び増加するためのワクチンの戦略を試験するための研究をシミュレートしてきた。有効なワクチン戦略は耐性を回避しなければならない。この理由のために、当該耐性を破壊するための方法、例えば、異なる分子環境中の決定的なエピトープを、寛容化された宿主に提示すること、が開発された。いくつかの研究は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕに対する耐性がペプチド型ワクチン(Disis et al. 1996-Dakappagari et al., 2000-Disis et al. 2002)、又はＤＮＡ(Concetti et al. 1996-Di Carlo et al. 2001-Pilon et al. 2001)のいずれかでの免疫化により回避することができるかを評価した。いくつかの奨励される結果は、問題の存在、例えば、ペプチドの弱い免疫原生、又は機能的な腫瘍遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡの有害作用の可能性を伴い得られた。
【０００４】
自己タンパク質に対する免疫耐性を克服するためのワクチン戦略が発展されるなか、抗イディオタイプ抗体を伴うワクチン接種は、いくつかの悪性疾患の治療のためのアプローチを約束するものとして記載された。
【０００５】
抗イディオタイプ抗体は、他の抗体分子の抗原結合領域又は可変領域に対する抗体（イディオタイプ又はＩｄと称される）である。イディオタイプ関係のJerneのネットワークモデル(Jerne 1974-Jerne etal. , 1982)に基づく理論において、与えられた抗原のためのパラトープ(抗原結合部位)を発現する抗体分子での免疫化は、抗抗体のグループを産生し、これらのいくつかはパラトープに対する相補的な構造の抗原を共有する。抗イディオタイプ抗体の亜集団での免疫化は、順番に抗体の亜集団、又は初回抗原に反応性の免疫細胞サブセットを産出するであろう。
【０００６】
腫瘍特異性Ｉｄワクチンでの能動免疫化は、動物において腫瘍成長を阻害することが極めて早くから示された(Kennedy et al. 1985)。
【０００７】
米国特許第５，７６６，５８８号は、腫瘍免疫療法、又は免疫的予防のための抗イディオタイプ抗体を利用する方法を提案する。しかしながら、当該米国特許に記載された抗イディオタイプ抗体は、ハイブリドーマにより分泌されるマウス抗体である。
【０００８】
機能的に抗原を模倣する抗Ｉｄ抗体は、直腸結腸癌[CEA, (Foon et al. 1999) ]、Ｂ及びＴ細胞リンパ腫[それぞれ、gp72, (Kwak et al. 1992) 及び gp37 (Bhattacharya-Chatterjee et al. 1988)]の治療、及びディシアロガングリオシドＧＤ２に対する能動免疫応答により誘因される黒色腫(Foon et al. 2000)の治療に使用されてきた。ヒトの高分子量の黒色腫関連抗原を模倣する抗ディオタイプｍＡｂもまた、特異的な能動免疫療法を実行するために臨床試験において試験された(Mitttelmanet al. 1990)。
【０００９】
１９９８年において、マウスｍＡｂから作成された抗イディオタイプ一本鎖可変性フラグメント（ｓｃＦｖ）による癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の模倣は、マウスにおいて生じる液体応答のレベルに関する確証的な結果を伴い公表された(Tripathi et al. 1998)。より最近には、同グループの研究は、ヒトＨＥＲ−２／ｎｅｕの代理抗原としてマウスモノクローナル抗Ｉｄ抗体の使用を記載した(Baral et al. 2001)。
【００１０】
しかしながら、これらの先行研究において試験された大半の抗体は、マウス抗体であり、これは、人において所望されない副作用を誘発するようである。人に「外来」抗体、例えば、マウス抗体の注射を繰り返すと、実際に有害な過敏感反応、即ち抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）又は抗イディオタイプ応答を誘導するようである。当該ＨＡＭＡ応答は、増加した患者の血清由来のクリアランス速度、及び／又は患者によるアレルギー反応により、頻回投与の有効性を低下させる。当該問題は原則として、ヒト免疫系により、外来性として認識されない抗体を作成することにより回避することができる。
【００１１】
Leung et al., 2000において言及されているとおり、ヒト抗イディオタイプ抗体については未だほとんど知られていない。
【００１２】
従って、本発明は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに陽性な癌患者のための、能動免疫療法において特に有用な、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ腫瘍関連抗原を模倣するヒト抗イディオタイプ抗体フラグメントを供することにより必要性を満たす。
【００１３】
本発明は、より具体的には、ファージディスプレイにより選択され、そして既知の抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体のＦ（ａｂ’）2フラグメントに対する抗イディオタイプｓｃＦｖにより特徴づけられる。異なる免疫化スケジュールを使用する生体内実験から得られたデータは、これらのヒト抗Ｉｄ ｓｃＦｖが、有効な抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ体液性応答を誘発できることを示す。
【００１４】
これに基づき、本発明の対象は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ腫瘍関連抗原を模倣する能力により特徴づけられるヒト抗イディオタイプフラグメントである。
【００１５】
本発明の他の対象は、医薬的に受容可能な担体に結合して、このような抗体フラグメントを含んで成る医薬組成物である。
【００１６】
本発明の更なる対象は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕが過剰発現される腫瘍の予防又は治療のためのこのような抗体フラグメントの使用である。
【００１７】
本発明の他の対象は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ特異性保護抗腫瘍免疫を誘発するための抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば、樹状細胞を調製するための生体外における方法であって、当該方法は、ＡＰＣをこれらの抗体フラグメントに接触することを含んで成る。当該ＡＰＣは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕが過剰発現される腫瘍の予防又は治療に有用である。
【００１８】
一般的定義：
本発明に従い、「抗体」又は「免疫グロブリン」は同じ意味を有し、そして本発明において等しく使用される。自然抗体中、２つの重鎖はジスルフィド結合により互いに連結し、そして各重鎖はジスルフィド結合により軽鎖と連結する。ラムダ（λ）とカッパ（κ）の２つの種類の軽鎖が存在する。抗体分子の機能活性を決定する５つの主な重鎖クラス（又はイソタイプ）が存在する：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ。好ましくは、上記抗体は、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、又はＩｇＧ4である。各鎖は異なる配列ドメインを有する。軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）と定常ドメイン（ＣＬ）の２つのドメインである。重鎖は、可変ドメイン（ＶＨ）、と３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３、これらはまとめてＣＨを意味する）の４つのドメインを含む。軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の可変領域は、抗原に対する結合認識及び特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ）の定常領域は、重要な生物特性、例えば、抗体鎖の会合、分泌、経胎盤移動、相補結合、及びＦｃレセプターに対する結合性を与える。Ｆｖフラグメントは、１つの軽鎖及び１つの重鎖の可変部から成る免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末端部分である。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基の構造的相補性に帰する。抗体結合部位は、主に高頻度可変性又は相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基から作成される。時折、非高頻度可変性由来の残基又はフレームワーク領域（ＦＲ）が、全ドメイン構造及び結合領域に影響する。ＣＤＲは、未変性免疫グロブリン結合部位の自然Ｆｖ領域の結合親和性及び特異性を一緒に規定するアミノ酸配列を意味する。免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖は、それぞれ、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３、及びＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３と命名される各３つのＣＤＲを有する。このように、抗原結合部位は、各重鎖及び軽鎖のＶ領域由来のＣＤＲセットを含んで成る、６つのＣＤＲを含む。ＦＲは、ＣＤＲ間に入り込むアミノ酸配列を意味する。
【００１９】
本発明は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを模倣する、単離された機能性抗体のＦａｂ又はｓｃＦｖフラグメントを供する。好ましくは、本発明の抗体フラグメントはｓｃＦｖフラグメントである。
【００２０】
一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、ペプチドコードリンカーにより連結されるＶＨとＶＬコード遺伝子を含む遺伝子融合から通常発現される、共有結合されたＶＨ：：ＶＬへテロ二量体である。本発明のヒトｓｃＦｖフラグメントは、特に組換え技術を使用することにより適当な高次構造をとるＣＤＲを含む。
【００２１】
「精製された」又は「単離された」は、同じ種類の他の生物巨大分子の実質的な不存在下において示された分子が存在するポリペプチド（即ち、本発明の抗体フラグメント）、又はヌクレオチド配列に関しる場合を意味する。本明細書において使用される「精製された」の語は、好ましくは、少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、更により好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の同じ種類の生物巨大分子が存在することを意味する。特定のポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子は、対象のポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子を意味し、しかしながら、当該分子は当該組成物の塩基特性を有害的に影響しないいくつかの追加的な塩基又は部分を含んでよい。
【００２２】
「機能保存変異体」は、ポリペプチドの全体の高次構造及び機能を変化することなくタンパク質中のアミノ酸残基が変化されているものであり、制限することなく、類似する特性を有するものでのアミノ酸置換（例えば、極性、水素結合能、酸性、塩基性、疎水性、芳香族性等）を含む。類似する特性を有するアミノ酸は、当業界において周知である。例えば、アルギニン、ヒスチジン、及びリジンは、親水性−塩基性アミノ酸であり、そして互換的である。同様に、疎水性アミノ酸のイソロイシンは、ロイシン、メチオニン、又はバリンで置換することができる。このような変更は、タンパク質又はポリペプチドの見かけ上の分子量又は等電点においてほとんど又は全く影響しないことが予想される。保存を示す以外のアミノ酸は、いずれか２つの類似する機能のタンパク質の間のパーセントタンパク質又はアミノ酸配列の類似性は、例えば、アライメントスキーム、例えば、クラスター法に従い測定される場合、７０％〜９９％で変動又は存在するようにタンパク質中で異なってもよく、ここで類似性はＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づく。「機能保存変異体」はまた、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡアルゴリズムにより測定した場合、少なくとも６０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含み、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも８５％であり、更により好ましくは少なくとも９０％であり、そして未変性又は親タンパク質と比較した場合、同一又は実質的に類似する特性又は機能を有する。
【００２３】
８０％以上、好ましくは８５％以上、好ましくは９０％以上のアミノ酸が同一であり、あるいは約９０％以上、好ましくは９５％異常が類似（機能的に同一）である場合、当該アミノ酸配列は「実質的に相同」又は「実質的に類似」である。好ましくは類似又は相同配列は、例えば、ＧＣＧ(Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin) ｐｉｌｅｕｐプログラム、又はいずれかの配列比較アルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等を使用するアライメントにより同定される。
【００２４】
「医薬的」又は「医薬的に受容可能」は、哺乳類、特に人に適当に投与された場合、有害、アレルギー、又は他の都合の悪い反応を生じない分子的実体、及び組成物を意味する。
【００２５】
本明細書において使用される「医薬的に受容可能な担体」は、いずれか及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗細菌剤、及び抗真菌剤、等張剤、及び吸収遅延剤等を含む。医薬的に活性な物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は当業界において周知である。いずれかの慣習的な媒体又は薬剤が当該活性成分に不適合でない場合を除き、治療組成物中の使用が考慮される。補助的活性成分もまた当該組成物中に組み入れることができる。
【００２６】
本発明の抗イディオタイプ抗体フラグメントの産生
本発明は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ腫瘍関連抗原を模倣するための能力により特徴づけられる、ヒト抗イディオタイプ抗体フラグメントを供する。
【００２７】
ヒト抗体フラグメントは、ハイブリドーマ技術を経過することにより、ファージディスプレイライブラリーから単離することができる(Winter et al. 1994, U. S. 5,223, 409)。従って、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗原を模倣することができる本発明のフラグメントは、例えば、Goletz et al, 2002 に記載された技術に従い、ファージディスプレイにより産出することが好ましい。
【００２８】
ファージディスプレイ技術に従い、抗原結合可変又は抗体のＶドメインをコードする遺伝子セグメントは、バクテリオファージのコートタンパク質をコードする遺伝子と融合される。このような遺伝子融合を含むバクテリオファージは、細菌を感染させるために使用され、そして生じたファージ粒子は、バクテリオファージの外側に示される抗原結合ドメインを伴う抗体様融合タンパク質を発現する被膜を有する。その表面にそれぞれ異なる抗原結合領域を示す組換えファージの収集物は、ファージディスプレイライブラリーとして知られている。特定の抗原に特異的な抗体が、アフィニティークロマトグラフィーにより複合体混合物から単離することができる多くの同様の方法において、特定の抗原と特異的な抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原に結合するためのライブラリー中のファージを選択することにより単離することができる。結合するファージ粒子を回収し、そして新鮮な細菌を感染するために使用される。当該方法により単離された各ファージは、モノクローナル抗体に類似するモノクローナル抗原結合粒子を産生する。各ファージにユニークな抗原結合部位をコードする遺伝子は、その後ファージＤＮＡから回収することができる。抗原フラグメントをコードする遺伝子が適当な宿主細胞株、例えば、細菌に導入されると、トランスフェクトされた細胞は抗体フラグメントを分泌することができる。
【００２９】
以下（実施例）に記載されるＥＴＨ−２合成ヒト抗体ファージライブラリーは、この点に関して極めて有用であることが判明した。
【００３０】
好ましい態様において、本発明に従うＦａｂ又はｓｃｆｖ抗体フラグメントは、ファージディスプレイにより得ることが可能である。当該方法において、起源において完全にヒトである抗体フラグメントを得ることができる。注目のフラグメントは有利に製造することができ、そしてトラスツズマブと称される（RocheによりHerceptin（登録商標）として販売されている）既知の抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体のＦ（ａｂ’）2に対して産生される。
【００３１】
本発明の好ましいフラグメントは、ＶHドメインのＣＤＲ３領域中の配列番号３（ＮＹＱＩＨＰ）、及びＶLドメインのＣＤＲ３領域中の配列番号４（ＤＰＤＱＬＬ）を含んで成る。
【００３２】
本発明の他の好ましいフラグメントは、ＶHドメインのＣＤＲ３領域中の配列番号５（ＮＹＨＩＱＰ）、及びＶLドメインのＣＤＲ３領域中の配列番号６（ＥＰＴＰＰＲ）を含んで成る。
【００３３】
機能保存変異体、又は類似配列を伴う抗体フラグメントもまた包含される。
【００３４】
好ましくは、ｓｃＦｖフラグメントが供される。
【００３５】
このようなｓｃＦｖフラグメントは、好ましくはＶHドメインのＣＤＲ３領域中の配列番号３、及びＶLドメインのＣＤＲ３領域中の配列番号４を含んで成る。
【００３６】
他の好ましいｓｃＦｖフラグメントは、ＶHドメインのＣＤＲ３領域中の配列番号５、及びＶLドメインのＣＤＲ３領域中の配列番号６を含んで成る。
【００３７】
配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列をそれぞれ含んで成る、ｓｃＦｖ４０及びｓｃＦｖ６９と命名されるフラグメントは、図９に示されるとおり、最も好ましい。
【００３８】
機能保存変異体、又は相同配列を有する抗体フラグメントもまた包含される。
【００３９】
所望のフラグメントのアミノ酸配列を知ることにより、当業者は、ポリペプチドの産生のための標準的な技術により、ｓｃＦｖ４０及びｓｃＦｖ６９フラグメントを容易に産生することができる。例えば、彼らは周知の固相法(Merrifield et al. , 1962 and 1963; Tam et al. 1983)を使用して、好ましくは商業的に入手可能なペプチド合成措置（例えば、Applied Biosystems, Foster City, California製)を使用して、当該業者の説明書に従い合成することができる。
【００４０】
あるいは、抗体ｓｃＦｖフラグメントは、当業界に周知な組換えＤＮＡ技術により合成することができる(Maniatis et al. , 1982)。例えば、これらのフラグメントは所望のポリ（ペプチド）をコードするＤＮＡ配列の発現ベクターへの組み入れ、及びこのようなベクターの所望のポリペプチドを発現する適当な真核細胞又は原核細胞宿主に導入後にＤＮＡ発現産出物として得ることができ、これらは後に周知技術を使用して単離することができる。
【００４１】
フラグメントの多量体化：
本発明の他の態様において、上述の抗イディオタイプ抗体フラグメントの多量体、特には二量体又は三量体が供される。
【００４２】
多量体は、上述のＦａｂとｓｃＦｖ配列間のリンカー配列を使用して、遺伝子工学により得ることができる。
【００４３】
上記リンカー配列は、例えば、deKruif and Logtenberg, 1996 or Pack et al. , 1993に記載されるようなロイシンジッパーを含んでよい。
【００４４】
抗体フラグメントの他の架橋結合多量体は、直線的多量体、特に直線頭−尾手段において所望することができる(Miller et al., 2003)。
【００４５】
多量体は、腎臓を介する除去を減少するため、そして注目のフラグメントの安定性及び半減期を増大させるために特に有利である。
【００４６】
従って、本発明の全記載において、Ｆａｂ又はｓｃＦｖフラグメントに関して記載されている全ての製剤（即ち医薬組成物）、使用、又は方法がこれらのフラグメントの多量体に適用されることが理解されるべきである。
【００４７】
医薬組成物：
本発明は、更に、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを過剰発現する腫瘍の予防又は治療のために有用な医薬組成物を調製することを包含する。医薬製剤の例は、以下に供する。
【００４８】
医薬組成物の形態、投与経路、剤形、及び投与計画は、治療される状態、疾病の重篤度、患者の年齢、体重、及び性別等に依存する。
【００４９】
本発明の医薬組成物は、局所、経口、非経口、鼻腔内、筋肉内、皮下、又は眼内投与等のために処方することができる。
【００５０】
好ましくは、上記医薬組成物は、注射することが可能な製剤のために医薬的に受容可能である媒体を含む。これらは、特に、等張性、無菌性、生理食塩溶液（リン酸一ナトリウム又は二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウム、又はマグネシウム等、又はこれらの塩の混合物）、又は乾燥、特に凍結乾燥組成物におけるものでよく、更に無菌水、又は生理食塩水の場合には、注射溶液の構成を許容する。
【００５１】
投与に使用される用量は、多様なパラメーターの作用として、特に使用される投与の方法、関連病理、あるいは治療の所望の期間における作用として、適応することができる。
【００５２】
医薬組成物を調製するために、有効量の抗イディオタイプ抗体フラグメント又はその多量体は、医薬的に受容可能な担体又は水性媒体に溶解又は分散させることができる。
【００５３】
注射用に適当な医薬形態は、無菌水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナツ油、又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び無菌注射溶液又は分散液の即時調製のための無菌粉末を含む。全ての場合において、上記形態は無菌でなくてはならず、且つ容易なシリンジ能が存在する液体でなければならない。これは製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、且つ微生物、例えば、細菌及び真菌の汚染作用に対して保存されなければならない。
【００５４】
遊離塩基、又は医薬的に受容可能な塩としての活性化合物の溶液は、界面活性剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースと適当に混合された水中で調製することができる。分散剤もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びこれらの混合物中、並びに油中で調製することができる。通常の貯蔵及び使用条件下において、これらの調製物は微生物の成長を防止する防腐剤を含む。
【００５５】
抗イディオタイプ抗体フラグメント又はその多量体は、中性又は塩形態における組成物中に処方することができる。医薬的に受容可能な塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）を含む、そして無機酸、例えば、塩酸、又はリン酸、あるいは有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、マンデル酸等と形成される。遊離カルボキシル基と形成される塩はまた、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は三価鉄、及び有機塩基、例えば、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等に由来してよい。
【００５６】
上記担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、これらの適当な混合物、及び植物性油脂を含む溶媒又は分散媒体であってよい。当該適当な流動性は、例えば、コーティング剤、例えば、レクチンの使用により、分散の場合における必要な粒子サイズの維持により、そして界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の予防は、多様な抗細菌及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によりもたらすことができる。多くのケースにおいて、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物における使用によりもたらすことができる。
【００５７】
無菌の注射溶液は、活性化合物を、上に列挙された多様な他の成分を伴う必要量の適当な溶媒に組み込むことにより、必要である場合には、その後のろ過滅菌により調製することができる。一般的には、分散剤は、多様な無菌活性成分を、塩基性分散媒体、及び上の列挙から必要とされる他の成分を含む無菌媒体に組み込むことにより調製することができる。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分と、前もって滅菌ろ過されたその溶液由来のいずれかの追加的な所望の成分の粉末を産出する真空乾燥、及び凍結乾燥技術である。
【００５８】
直接注射のために、より高く濃縮された溶液の調製もまた考慮され、その場合、極めて速い浸透をもたらし、高濃度の当該活性成分を小さな腫瘍面積に対して送達する溶媒としてＤＭＳＯの使用が考慮される。
【００５９】
製剤において、溶液は、剤形及び治療的有効量と適合できる方法において投与される。当該剤形は、多様な剤形、例えば、上述された注射溶液のタイプにおいて容易に投与されるが、薬剤放出カプセル等もまた利用することができる。
【００６０】
水溶液における非経口投与のために、例えば、上記溶液は、必要であれば十分な生理食塩水又はグルコースで、適当に緩衝し、そして等張性を与えるべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与に特に適当である。当該関係において、利用可能な無菌水性媒体は本明細書の開示に明るい当業者に既知であろう。例えば、１つの製剤は、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解でき、そして、１０００ｍｌの皮下注入液に添加、又は注入の予定部位において注射できる（例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences"15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照のこと）。用量におけるいくらかの変動は、治療される対象の状態に依存して必要的に生じるであろう。投与に関与する人は、如何なる場合も、個々の対象に適当な用量を決定するであろう。
【００６１】
抗イディオタイプ抗体フラグメントは、用量あたり約０．０００１〜１．０ミリグラム、又は約０．００１〜０．１ミリグラム、又は約０．１〜１．０、さらには約１０ミリグラム程度を含んで成るように治療混合物中に処方することができる。複数回用量もまた投与することができる。
【００６２】
非経口投与、例えば、静脈内、又は筋肉内注射のために処方される化合物に追加して、他の医薬的に受容可能な形態は、例えば、錠剤、又は他の経口投与用固形物；時間放出カプセル；及び現在使用されるいずれかの他の形態を含む。
【００６３】
ある態様において、抗体フラグメントの宿主細胞への導入のためのリポソーム及び／又はナノ粒子の使用が考慮される。リポソーム及び／又はナノ粒子の処方及び使用は、当業界において既知である。
【００６４】
ナノカプセルは、一般的に、安定且つ再現性のある方法において化合物を包括することができる。細胞内における重合体の過負荷による副作用を回避するため、生体内で分解できる超微粒子（約０．１μｍの大きさ）が一般的にデザインされる。これらの必要性に合う生分解ポリアルキル−シアノアクリル酸塩ナノ粒子が、本発明の使用に考慮され、そしてこのような粒子は容易に作成することができる。
【００６５】
リポソームは、水性媒体中に分散されるリン脂質から形成され、そして自発的に多層同心性二重ベシクル（多重膜ベシクル（ＭＬＶ）とも称される）を形成する。ＭＬＶは、一般的に、２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、核中に水溶液を含む、２００〜５００Åの直径を有する小単層ベシクル（ＳＵＶ）の形成をもたらす。リポソームの物性は、ｐＨ、イオン強度、及び二価カチオンの存在に依存する。
【００６６】
免疫療法：
腫瘍を有する患者は、本発明の抗イディオタイプ抗体フラグメントでの免疫化により治療的に処置することができ、一方腫瘍の処置を有する患者は、このような免疫化により免疫予防的に処置することができる。当該抗イディオタイプ抗体フラグメントは、免疫学的応答を増強するために適当なアジュバントとともに形成することができる。これらのアジュバントは制限することなく、ミネラルゲル、例えば、水酸化アルミニウム；界面活性剤、例えば、リゾレシチン、プロトン性ポリオール；ポリアニオン；ペプチド；油乳濁液；及び潜在的に有用なヒトアジュバント、例えば、ＢＣＧ（カルメット・グラン桿菌）、及びコリネバクテリウムを含んでよい。他の改善されたアジュバント系、例えば、Me Cluskie and Weeratan,2001においてレビューされるものも使用することができる。
【００６７】
本発明の対象は、従って、上述のとおり、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕが過剰発現される腫瘍の予防又は治療のための医薬の調製のための、抗イディオタイプ抗体フラグメント、又はその多量体の使用である。
【００６８】
本発明の他の対象は、患者においてＨｅｒ−２／ｎｅｕが過剰発現される腫瘍の予防又は治療のための医薬の調製のための方法であり、当該方法は、上記患者に対して治療的に有効量の抗イディオタイプ抗体フラグメント、又はその多量体を投与することを含んで成る。
【００６９】
治療的有効量は、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％の有意な腫瘍の減少を示すために十分な量であり、あるいはこのような腫瘍の発達の危険を有意に減少するために十分な量である。
【００７０】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの過剰発現が観察される腫瘍は、腺癌、例えば、乳癌、卵巣癌、子宮癌、胃癌、及び肺癌を含む。
【００７１】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを模倣するヒト抗イディオタイプ抗体フラグメントを含む医薬組成物は、従って、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを過剰発現する腫瘍に影響される患者において保護的免疫応答を生じ、又は増強するためのワクチンとしての候補が見込まれる。
【００７２】
抗原提示細胞治療：
本発明の他の態様において、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ特異性保護抗腫瘍免疫を誘発するための方法であって、当該方法が：
ａ）抗原提示細胞（ＡＰＣ）を上述の抗イディオタイプ抗体フラグメントと生体外において接触させる工程；
ｂ）このように処理したＡＰＣを、このような治療が必要な患者に投与する工程、
を含んで成る方法、を供する。
【００７３】
工程ａ）はまた、抗体フラグメントによる細胞の「パルシング（pulsing)」と呼ばれる(Sahaet al. , 2003)。
【００７４】
本発明の他の対象は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ特異性保護抗腫瘍免疫を含むために有用なＡＰＣを調製するための生体外における方法であり、当該方法は、抗原提示細胞を上述の抗イディオタイプ抗体フラグメントと接触すること、又はパルスすることを含んで成る。
【００７５】
好ましくは上記ＡＰＣは、樹状細胞、特には骨髄由来の樹状細胞である。有利には、当該ＡＰＣは、投薬を意図される患者由来のものである。
【００７６】
このように処理した単離ＡＰＣもまた、本発明の一部である。
【００７７】
本発明は更に、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕが過剰発現される腫瘍の予防又は治療のための医薬の調製のためのこのようなＡＰＣの使用を供する。
【００７８】
Ｆａｂ又はｓｃＦｖフラグメントに関して上述した、製剤（医薬組成物）、使用、又は方法もまた、このようなＡＰＣに適用される。
【００７９】
以下の図及び例は、その範囲を制限することなく本発明を説明する。
【実施例】
【００８０】
代用腫瘍抗原として使用されるヒト抗イディオタイプｓｃＦｖフラグメントの単離及び性質決定。
【００８１】
材料及び方法：
材料
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを過剰発現する、ヒト卵巣ＳＫ−ＯＶ−３細胞株、及びハムスター卵巣ＣＨＯ細胞株は、American Type Culture Collection (Manassas, VA)から得られた。全ての生体内における実験は、実験動物研究のためのフランスのガイドラインを遵守して行った（協定番号A34220）。７週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスは Iffa Credo(L'arbresle, France)から得た。ｓｃＦｖフォーマットにおけるＥＴＨ−２合成ヒト抗体ファージライブラリーはスイスのチューリッヒのＥＴＨから得た。当該ライブラリーは、５×１０8以上の異なるクローンを含む。ＥＴＨ−２ライブラリーは、Pini et alの合成抗体ライブラリー(Pini et al. 1998)の改良バージョンである。抗−ＨＥＲ−２／ｎｅｕモノクローナル抗体ＦＲＰ５は、スイスのバーゼルのＦＭＩにより供された。トラスツズマブは、Roche 社から購入した(F. Hoffmann-La Roche Ltd, Bazel, Switzerland)。コントロールとして使用したヒトＩｇＧ１は、Mabgene(Ales, France)より供された。ヒトＦｃフラグメントにより連結されるレセプターの２つの細胞外ドメインから構成されるＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質は、スイスのローザンヌ大学の生化学研究所により供された。ヒトＩｇＧ１コントロール及びトラスツズマブ Ｆ（ａｂ’）2フラグメントは、０．２Ｍの酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０）中の３％（ｗｔ／ｗｔ）比のペプシン／ＩｇＧにおける、３７℃で４時間のペプシン消化により得られた(Sigma, St. Louis, MO)。当該抗体フラグメントは、セファクリル１００カラム(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)でのゲルろ過クロマトグラフィーにより精製した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（８．５％）は、沈着したタンパク質の９５％以上の純度を明らかにした。
【００８２】
抗トラスツズマブＦ（ａｂ’）2フラグメント  抗Ｉｄ ｓｃＦｖ抗体（Ａｂ２）のファージディスプレイ選択
ファージディスプレイパニングのプロトコル、及び分析は、明確に記載されている(Pini et al. 1998)。当該ファージディスプレイライブラリーは、イムノチューブ上で３ラウンドのパニングにおいて、トラスツズマブ Ｆ（ａｂ’）2フラグメントでパニングした。チューブは、３ラウンド全てのために、ＰＢＳ中、それぞれ１００、５０、及び１０μｇ／ｍｌの濃度において、トラスツズマブ Ｆ（ａｂ’）2フラグメントでコーティングした。端的には、５×１０12のファージをトラスツズマブ Ｆ（ａｂ’）2フラグメントに添加し、３０分間、持続回転下でインキュベートし、続いて室温で更に１．５時間、垂直に設置した。チューブをよく洗浄し、結合ファージを、１ｍｌの１００ｍＭトリエチルアミンの添加により溶出させ、それから大腸菌（E.coli)ＴＧ１菌株を再感染するために使用した。一昼夜での成長後、ポリエチレングリコール沈殿によりファージを単離し、そして上記サイクルを繰り返した。ファージプールをＥＬＩＳＡ法により評価した。６６ウェルマイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中のトラスツズマブ又はヒトＩｇＧ１Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、又は抗−ｆｄファージＩｇ(Sigma)のいずれかで、０．５μｇのタンパク質／ウェルと成るように４℃で一昼夜コーティングした。それから当該プレートを、ＰＢＳ／２％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳で、３７℃で２時間ブロックした。ＰＢＳ中の１００μｌのポリクローナルファージ溶液の連続希釈を各ウェルに添加した。プレートを室温で１．５時間インキュベートした。結合ファージ−ｓｃＦｖは、室温で１時間３０分間、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−結合抗Ｍ１３ｍＡｂ(Amersham Biosciences)と反応させることにより検出した。当該プレートは、業者の指示（Sigma)に従いｏ−フェニレンジアミン基質（ＯＰＤ）を使用して展開した。
【００８３】
抗トラスツズマブ Ｆ（ａｂ’）2フラグメント可溶性抗Ｉｄ ｓｃＦｖの産生及び精製
３ラウンドの選択後、ファージ結合抗体よりも可溶性抗体を産生するために、大腸菌（E.coli)ＨＢ２１５１細胞をファージで感染させた。単一のアンピシリン耐性感染大腸菌（E.coli) ＨＢ２１５１のコロニーを９６ウェル組織培養プレートに採取し、そして２×ＴＹ／１００μｇ／ｍｌのアンピシリン／０．１％（ｗ／ｖ）グルコース中において３７℃で３時間成長させた。ｓｃＦｖ発現は、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で、１ｍＭの最終濃度に３０℃で１６時間誘発させた。細菌の上清をＥＬＩＳＡ法により、トラスツズマブ、又はヒトＩｇＧ１ Ｆ（ａｂ’）2フラグメントとの反応性を評価した。当該ＥＬＩＳＡ法は、大腸菌（E.coli) ＨＢ２１５１上清のインキュベーション後に、ＨＲＰ結合抗ＦＬＡＧ−タグＭ２ Ａｂ(Sigma)を使用して結合可溶性ｓｃＦｖを１．５時間検出したことを除き、上述のとおり行った。
【００８４】
ウェスタンブロット分析のために、タンパク質抽出物を、ＳＤＳーＰＡＧＥ（１２．５％）によりサイズ分画し、そしてニトロセルロース上でエレクトロブロットした。当該ブロットは、室温において振動させながら１時間、ＴＢＳ／１％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳中でブロックし、そして室温で２時間、ＴＢＳ／５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳中の検出Ａｂ（ＨＲＰ−結合抗−ＦＬＡＧ−タグＭ２）で探索した。当該ブロットを３回洗浄して、そして基質として４−クロロ−１−ナフトール（Sigma)を使用して展開した。
【００８５】
各陽性クローンのために、NucleoSpins （登録商標）プラスミドキット(Macherey-Nagel, Dren, Germany)を使用して、１５μｇのプラスミドＤＮＡを精製した。反応のシークエンシングは、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７(Applied Biosystems, Foster City, CA)での配列の自動検出のためにダイターミネーターシークエンシングキット（Dye Terminator Sequencing kit）を使用して行った。アニーリングのために、５’−ＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧ−３’（配列番号１３）、及び５’−ＧＡＡＴＴＴＴＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧ−３’（配列番号１４）を使用した。
【００８６】
高スケールの細菌発現、及びｓｃＦｖ３９、４０、及び６９の精製のために、大腸菌（E.coli)ＨＢ２１５１単コロニーの一昼夜培養液を使用し、１ｌの２×ＹＴ／１００μｇ／ｍｌのアンピシリン／０．１％（ｗ／ｖ）グルコースを播種し、そしてＯＤ600が０．６に達するまで３７℃で成長させた。ｓｃＦｖの発現は、１ｍＭのＩＰＴＧを添加することにより誘発させ、そして３０℃で１６時間インキュベートした。細菌ペレットを、１％ＰＭＳＦを伴う溶解バッファー（３０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０％（ｗ／ｖ）スクロース、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁させ、そして氷上で３０分間冷却した。遠心分離後、上清（ぺリプラズム画分）を０．４５μｍのフィルターに通してろ過した。各培養液由来の透明な上清を金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）（３０）を使用して精製した。５ｍｌのＨｉＴｒａｐ Ｎｉ活性化キレートＨＰカラム(Amersham Biosciences)上に結合したｓｃＦｖを、０〜０．５Ｍイミダゾールの直線勾配を使用して２５ｍｌ［０．０２Ｍ リン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）］で溶出させ、そして５００μｌの画分を収集した。Ａ280濃度の測定によりモニターしたタンパク質含有画分をプールし、そしてＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ３０，０００ＭＷＣＯ(Millipore, Bedford, Massachusetts)において１ｍｌ未満の容量に濃縮した。追加的な精製は、ゲルろ過 Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ カラム(Amersham Biosciences)における高速タンパク質液体クロマトグラフィーにより達成した。最終調製物の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％）において評価した。タンパク質のバンドは、銀染色により検出した。
【００８７】
ＥＬＩＳＡ法及びＢｉａｃｏｒｅによる抗Ｉｄ ｓｃＦｖの試験管内特性決定
抗Ｉｄ ｓｃＦｖを特徴づけるために、可溶性ｓｃＦｖのトラスツズマブＦ（ａｂ’）2フラグメントに対する結合を阻害するためのＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質、又はＨｅｒ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質のＡｂ１に対する結合をブロックするための精製ｓｃＦｖのいずれかを使用して、競合的なＥＬＩＳＡ実験を行った。各可溶性ｓｃＦｖは、ＥＬＩＳＡにおいて１〜１．５のＡ490を与える希釈において使用した。Ｔ１と名づけられた、無関係の可溶性ｓｃＦｖを、ＥＴＨ−２ライブラリーから単離し、そしてこれはトラスツズマブＦ（ａｂ’）2フラグメントと結合せず、コントロールとして使用された（データは示していない）。最初のフォーマットにおいて、５０〜０μｇ／ｍｌの濃度範囲におけるＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質の連続希釈を阻害溶液として使用し；結合可溶性ｓｃＦｖは前述の通り検出した。組換えヒト癌胎児性抗原（ｒｈＣＥＡ）は、無関係な阻害剤として使用した。阻害の当該フォーマットはまた、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質によるトラスツズマブＦ（ａｂ’）2フラグメント上の個々のペリプラズム画分の結合の阻害をチェックするために３ラウンドの選択後直ぐに使用した。第二フォーマットにおいて、２５０〜０μｇ／ｍｌの範囲の溶液の多様な濃度の精製した可溶性ｓｃＦｖ、及びＥＬＩＳＡにおいて１〜１．５のＡ490を与える希釈におけるＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質を使用して競合を行った。結合ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質は、続いて、ＨＲＰ−結合抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＦＲＰ５ ｍＡｂで検出した。
【００８８】
トラスツズマブＦ（ａｂ’）2フラグメント上の抗トラスツズマブＦ（ａｂ’）2フラグメント ｓｃＦｖ及びＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質の結合実験を、ＢＩＡＣＯＲＥ ２０００機器(Biacore AB, Uppsala, Sweden)を使用して、表面プラズモン共鳴分析（ＳＰＲ）により２５℃で行った。トラスツズマブ Ｆ（ａｂ’）2フラグメントは、製造業者の指示(Biacore AB)に従うアミンカップリング法を使用して、ＣＭ５センサーチップ表面上に共有結合的に固定化された。コントロールリファレンス表面は、トラスツズマブ Ｆ（ａｂ’）2フラグメントの注射無しに、フローセル表面の同じ化学処理を使用して調製した。ＨＢＳ−ＥＰバッファー［１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、３ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣＩ、０．００５％（ｗ／ｖ） Ｐ２０］中の、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質（１５μｇ／ｍｌ）及び可溶性ｓｃＦｖ（５０μｇ／ｍｌ）をフローセルに注射し、そして解離段階は再生工程（１０μｌの１００ｍＭ ＨＣｌ）に続いた。当該流速は５０μｌ／分であった。全てのセンサーグラム（sensorgram）は、コントロールリファレンス表面の低シグナルを減算ことにより補正した。１：１Langmuir グローバルモデルを使用して、当該データを一致させるために、ＢＩＡ評価３．２ソフトウェアを使用した。阻害実験のために、抗Ｉｄ ｓｃＦｖ６９の第一注射（２μＭにおいて５０μｌ）は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質の第二注射（０．０６μＭにおいて５０μｌ）に続いた。１０μｌの１００ｍＭ ＨＣｌでの再生工程後、ｓｃＦｖの代わりにバッファーによる第一注射で類似実験を行った。当該流速は１０μｌ／分であった。パーセント阻害を評価するために、我々は、抗ＩｄｓｃＦｖ６９を注射し、長い解離工程が続いた。それから当該解離曲線はＨｅｒ−２／ｎｅｕ関連曲線から減算した。
【００８９】
マウス血清中のＡｂ３応答の分析
２つの免疫化スケジュールを行った。最初に、グループあたり５匹の６〜８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、３ヶ月間、月々、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）で乳化後、１００μｌのＰＢＳ又は溶出バッファー（ネガティブコントロールグループ）中の５０μｇの精製した可溶性抗Ｉｄ ｓｃＦｖ４０又は６９、又は２０μｇのＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質のいずれかにより腹腔内において免疫化した。続いて不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）で腹腔内において免疫化を行った（プロトコル１）。各免疫化前に血清を尾静脈から採血し、そしてアッセイのために−２０℃で保管した。Magliani et al., 1998の研究により着想された二番目のものにおいて、６〜８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを４回免疫化した。先ず、ＣＦＡでの乳化後、１０14ＴＵ／ｍｌの力価における５０μｌの新鮮に調製したファージｓｃＦｖ４０又は６９、２０μｇのＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質、又はＰＢＳのいずれかの皮下注射を行った。当該注射の２週間後、同じ用量のＩＦＡで二回目の皮下投与を行った。２回の更なる注射は、腹腔内における最初の免疫化（プロトコル２）の後２１日目及び３５日目に腹腔内にて与えられた。血清抗体測定のために、マウスは、開始免疫化後２１日及び４２日目に採血され、そして血清を−２０℃で保管した。当該血清は、上述のとおり、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合抗原においてフローサイトメトリー及びＥＬＩＳＡにより抗抗Ｉｄ（Ａｂ３）応答のために確認した。得られた結果の分析はまた、Magliani et al. , 1998により記載された方法に従い行った。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質で免疫化されたマウス由来のプールされた血清から成るポジティブコントロールを各測定に含んだ。結果は、１０００倍にしたポジティブコントロール血清の７０％の吸光度に対する検査血清の吸光度の割合として任意の単位において表した。ポジティブコントロール血清吸光度から減算された３０％が抗Ｆｃ応答によるものであった（結果のセクションを参照のこと）。
【００９０】
マウス血清中の抗抗Ｉｄ ｓｃＦｖを検出するために、９６ウェルプレートを５μｇ／ｍｌの可溶性抗Ｉｄ ｓｃＦｖでコーティングすることにより、それから洗浄し、そしてＰＢＳ／１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡにより３７℃で２時間ブロックすることにより、ＥＬＩＳＡを行った。免疫化マウス由来の血清の連続希釈［ＰＢＳ／０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中、１〜１：３２００］を、室温で１．５時間インキュベートした。ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Sigma)の１．５時間のインキュベーション後、結合ＩｇＧを検出した。
【００９１】
抗抗Ｉｄ ｓｃＦｖの存在を更に確認するために、可溶性ｓｃＦｖでの免疫化マウス由来の血清の連続希釈［ＰＢＳ／０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中、１〜１：６４０］を前もって３７℃で２時間インキュベーションすることにより、阻害（inhibition）ＥＬＩＳＡ法を行った。次に１００μｌの各混合物を当該ウェル中に添加し、可溶性抗Ｉｄ Ｆｖでコーティングした。当該プレートを室温で１．５時間インキュベートした。前述のとおり、結合ｓｃＦｖを検出した。
【００９２】
マウス血清中の抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体（Ａｂ１’）のＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ分析
９６ウェルプレートを２μｇ／ｍｌのＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質で、４℃で一昼夜コーティングすること、その後ＰＢＳ／１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡでブロックすることにより、間接ＥＬＩＳＡ法を行った。１００μｌのマウス由来の希釈血清［ＰＢＳ／０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中、１：１００］を各ウェルに添加し、そして室温で１．５時間インキュベートした。それから、１００μｌのヤギ抗マウスＩｇＧ（全分子）−ＨＲＰ接合体、ヤギ抗マウスＩｇＧ（γ鎖特異性）−ＨＲＰ接合体、又はヤギ抗マウスＩｇＭ（μ鎖特異性）−ＨＲＰ接合体のいずれかを添加し、１．５時間インキュベートし、そして上述のとおり検出した。
【００９３】
ＦＡＣＳ分析のために、ＰＢＳ／１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中で１：１００に希釈した１００μｌの各マウス血清、１ｍｇ／ｍｌのアジドとともにＨｅｒ−２／ｎｅｕ−陽性ＳＫ−ＯＶ−３、及びＨｅｒ−２／ｎｅｕ−陰性ＣＨＯ細胞株を１時間、又は１００μｌの２０μｇ／ｍｌにおけるトラスツズマブとともに４℃で１．５時間インキュベートした。洗浄後、当該細胞を、血清のために１００μｌの希釈ヒツジ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ−標識化抗体、又はトラスツズマブのために抗ヒト−ＦＩＴＣ−標識化抗体（Sigma)のいずれかとともに４℃で更に４５分間インキュベートした。染色された細胞を５００μｌのＰＢＳ中に懸濁し、フローサイトメトリーによるＦＡＣＳ分析(Becton Dickinson, Franklin Lakes, MD)前に４℃で保管した。
【００９４】
結果：
能動免疫療法のために標的抗原としてＨｅｒ−２／ｎｅｕ腫瘍性タンパク質を使用する場合の主な問題は、自己抗原に対する免疫耐性である。Ａｂ１療法、並びにペプチド又はタンパク質型ワクチンが報告されている(Disis et al. 2002-Pegram et al. 1998)。全ての実験は、有効な治療方法の研究を進めるための必要性を指摘してきた。
【００９５】
本実験は、抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ免疫応答を生じるための抗イディオタイプ（Ａｂ２）戦略の有効性を調査するために実施した。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ陽性転移性乳癌を伴う女性において、単独における、及び多様な化学療法剤との組み合わせにおける有効性が示されたＨＥＲ−２／ｎｅｕに特異的なヒト化ｍＡｂであるトラスツズマブ(Cobleigh et al. 1999-Slamon et al. 2001) がＡｂ１として選択された。
【００９６】
ヒトＩｇＧ１のＦｃ部に特異性のｓｃＦｖの選択を回避するためにトラスツズマブのタンパク質分解性の切断Ｆ（ａｂ’）2フラグメントを使用してアフィニティー選択を行った。
【００９７】
抗イディオタイプｓｃＦｖの単離
免疫化トラスツズマブ Ｆ（ａｂ’）2フラグメント（Ａｂ１）における合成ＥＴＨ−２ ｓｃＦｖライブラリーにおける３ラウンドのパニングにより行われた、抗Ｉｄ ｓｃＦｖの選択は、組換えポリクローナルファージ上清を使用してＥＬＩＳＡにより確認される場合、トラスツズマブ又はヒトＩｇＧ１ Ｆ（ａｂ’）2フラグメント（コントロールとして使用した）におけるライブラリーの実質的な親和性の向上をもたらした。また、１〜３ラウンドの選択において、２×１０4倍に増加したファージ力価が観察された。クローニング後、３ラウンドの個々のクローンが誘発された９６ウェルプレート由来の抗体上清は、それから可溶性ｓｃＦｖ抗体を産生するために、大腸菌（E.coli)ＨＢ２１５１を感染させるように使用した。ＥＬＩＳＡにより、これらのヒトＩｇＧ又はトラスツズマブ Ｆ（ａｂ’）2フラグメントとの反応性のために、９６のペリプラズム画分を試験した。ポジティブなペリプラズム画分のウェスタンブロット分析は、我々を、約３０ｋＤａの適当な分子量を伴う単一の単量体から成るｓｃＦｖ抗体の選択、及び低分子量を示すこれらのものを除外することに導いた（図１）。選択されたペリプラズム画分は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質又はｒｈＣＥＡ（無関係な阻害剤として使用される組換えヒトＣＥＡ）により、トラスツズマブ Ｆ（ａｂ’）2フラグメントにおけるこれらの結合の阻害のために、ＥＬＩＳＡにより確認した。顕著な阻害（＞５０％）を示すクローンのみを更に分析した。上記抗体のＶH及びＶL領域のＤＮＡ配列決定後、本発明者は、Ａｂ１の結合部位を認識するが、ＶH及びＶLドメインのＣＤＲ３中に５つ又は６つのアミノ酸の異なるランダムループを示すｓｃＦｖ３９、４０、及び６９と称される３つのユニークなｓｃＦｖフラグメントを選択した（９５位、表１を参照のこと）。
【００９８】
表１：３つのユニークなｓｃＦｖ３９、４０、及び６９aのＶH及びＶLドメインのＣＤＲ３領域の予想されたアミノ酸配列
【表１】
2008504221.tif 000002
aアミノ酸配列は１字のコードにおいて与えられる。ＶH及びＶLの９５位において導入される５又は６つのアミノ酸のランダムなループは、顕著な特徴を有する。
【００９９】
これらの配列の分析は、５／６つの同一のアミノ酸を供する抗Ｉｄ ｓｃＦｖ４０及び６９のために、ランダムループがＨ−ＣＤＲ３（抗体の抗原認識部位の最も大きく且つ最も多様なループ）中に付加し、一方当該抗Ｉｄ ｓｃＦｖ３９のＨ−ＣＤＲ３は配列中で極めて相違し、そしてより陽性に帯電することを示した。Ｌ−ＣＤＲ３に関して、３つのｓｃＦｖはＤＰＬ−１６生殖系列遺伝子セグメントを使用し、抗Ｉｄ ｓｃＦｖ３９のＬ−ＣＤＲ３は、全体的な陽電荷により、他のもの、特にｓｃＦｖ４０と異なる。ｓｃＦｖ６９のＬ−ＣＤＲ３は、ループ中の３つのプロリン残基により極めて高く束縛されるようである。
【０１００】
抗Ｉｄ ｓｃＦｖ３９、４０、及び６９は、金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、続いて抗Ｉｄ ｓｃＦｖ６９のために図２に示されるとおり、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５におけるゲルろ過を使用して９０％の均一性に精製された。抗Ｉｄ ｓｃＦｖ３９と４０は同じレベルの純度を伴い得られた。また、これらの３つのｓｃＦｖは、大腸菌（E.coli)ＴＧ１の感染後ファージ上で発現、表示され、そして各ファージ溶液の免疫反応性は、トラスツズマブ Ｆ（ａｂ’）2フラグメントにおけるＥＬＩＳＡにより調節された。
【０１０１】
Ａｂ２抗イディオタイプｓｃＦｖの試験管内特性決定
抗Ｉｄ ｓｃＦｖの結合特性を特徴づけるために、本発明者は、先ず、これらのｓｃＦｖが、ＨＥＲ−２／ｎｅｕエピトープのために、トラスツズマブ Ｆ（ａｂ’）2フラグメント（Ａｂ１）と競合的な結合性を示すか否かを確認した。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質が阻害因子として使用される場合、トラスツズマブ Ｆ（ａｂ’）2フラグメントにおける抗Ｉｄ ｓｃＦｖ４０及び６９の結合はともに、約９０％阻害される（図３Ａ）。抗Ｉｄ ｓｃＦｖ３９の結合は２３％のみが阻害され；従って抗Ｉｄ ｓｃＦｖ３９は続く実験には使用しなかった。ｒｈＣＥＡ（１８５ｋＤａ）を使用して同様の競合実験を行った（図３Ｂ）。阻害曲線は、高濃度のｒｈＣＥＡでさえ、当該抗原（この分子量はＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質とほぼ同じである）がトラスツズマブ Ｆ（ａｂ’）2フラグメントにおける結合のための抗Ｉｄ ｓｃＦｖと競合できないことを示した。抗Ｉｄ ｓｃＦｖ４０及び６９は、トラスツズマブ Ｆ（ａｂ’）2フラグメントにおける２つの異なる濃度においてＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質の結合を阻害するために引き続き使用した。当該フォーマットにおいて、観察された最大阻害は、２５０μｇ／ｍｌのＩｄ ｓｃＦｖ６９では４０％近くであった（図４）。Ｉｄ ｓｃＦｖ４０でも同様の結果が得られた。
【０１０２】
固定化されたトラスツズマブ Ｆ（ａｂ’）2フラグメント上の抗Ｉｄ ｓｃＦｖ４０及び６９の結合速度パラメーターは、ＳＰＲ技術を使用して測定した（図５Ａ）。両ｓｃＦｖの親和定数は、同じ程度（５×１０-6Ｍ）である一方、抗Ｉｄ ｓｃＦｖ４０は、ｓｃＦｖ６９のものよりも高い結合性及び解離速度を示した（図５Ａ）。同じ条件下において、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質の親和定数は、ナノモル範囲であった［ＫD＝（２．９±０．１）×１０-9Ｍ］。また、抗Ｉｄ ｓｃＦｖ６９による、固定化されたトラスツズマブ Ｆ（ａｂ’）2フラグメント上のＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質の結合の阻害は、当該技術を使用して評価した。抗Ｉｄ ｓｃＦｖ６９の先の注射は、トラスツズマブ Ｆ（ａｂ’）2フラグメント上のＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質の結合を８３％阻害した（図５Ｂ）。これらの結果は、競合的ＥＬＩＳＡにより得られたデータを確認し、そしてより高パーセントの阻害を与え、抗Ｉｄ ｓｃＦｖ４０及び６９が、真のＡｂ２βと成りうることを示唆した。そうであるとすれば、これらのｓｃＦｖをマウスに注射すると、ポリクローナル抗抗Ｉｄ応答（Ａｂ１’）を誘発できるはずであり、更に試験した。
【０１０３】
抗Ｉｄ ｓｃＦｖ４０及び抗Ｉｄ ｓｃＦｖ６９の免疫化特性
６〜８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、腹腔内において可溶性の精製された抗Ｉｄ ｓｃＦｖ４０及び６９（プロトコル１）、又は皮下においてファージ上で示されたｓｃＦｖ（プロトコル２）のいずれかで免疫化した。各グループの５匹のマウスの血清を、３〜４回の注射後、Ａｂ２免疫原（抗Ｉｄ ｓｃＦｖ４０又は６９）に対するこれらの反応性のためにＥＬＩＳＡにより個々を試験した。全てのマウスは、抗Ｉｄに対して有意な免疫を生じ、そして当該力価は、両プロトコルにおける更なる免疫化により更に増加した。免疫前の血清又は希釈バッファー（ＰＢＳ又は溶出バッファー）で免疫化したマウスのコントロール血清は、抗Ｉｄ ｓｃＦｖ４０及び抗Ｉｄ ｓｃＦｖ６９に対して陰性であることが検査された。野生型ファージで注射されたマウスの血清において、非特異的な応答が観察された。抗Ｉｄ ｓｃＦｖに対するＡｂ３の特異性を示すために、免疫化マウス由来の血清の連続希釈により阻害ＥＬＩＳＡはトラスツズマブ Ｆ（ａｂ’）2フラグメントにおける各抗Ｉｄ ｓｃＦｖの結合を阻害することにより行った。ファージ粒子上に示された抗Ｉｄ ｓｃＦｖ６９で免疫化したマウス由来の免疫血清の１：２０の希釈は、Ａｂ１［トラスツズマブ Ｆ（ａｂ’）2フラグメント］に対して結合するＡｂ２（抗Ｉｄ ｓｃＦｖ６９）を１００％近く阻害し、当該血清を含む抗体は、事実上、真の抗抗Ｉｄであったことを示唆した（図６）。抗Ｉｄ ｓｃＦｖ４０も同様の結果を示した。反対に、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質又はＰＢＳで免疫化したマウス由来の免疫血清においては阻害が観察されなかった。
【０１０４】
抗Ｉｄ ｓｃＦｖでの免疫化により誘発されたＡｂ３（Ａｂ１’）のイディオタイプ分析
標的抗原と結合することができる、Ａｂ１’と称される抗体のサブセットの検出のために、１：１００に希釈したマウス血清を使用して、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質においてＥＬＩＳＡを行った。異なるＨＲＰ−結合Ｉｇの使用は、我々に、抗Ｉｄ ｓｃＦｖ及びコントロール免疫原での免疫化によりマウス血清中に誘発されるＩｇＧ、ＩｇＭ、及び全Ｉｇレベルを測定することを許容した（図７）。各時間においてプロットした吸光度の値は、各グループの５匹のマウスの平均値±標準偏差（ＳＤ）に相当する。これらの結果は、（ｉ）ＩｇＧ又はＩｇＭ 抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗体の誘発パターンが、２つの免疫化プロトコルと類似したこと（図７Ａ及びＢ）；（ii）ポリクローナルＡｂ３の有意な部分が、抗原と反応し（図７Ａ及びＢ）、３〜４回の免疫原の注射後、Ａｂ１’のレベルがプラトーに達したこと；（iii ）図７Ｃに示されるとおり、ＩｇＭ並びにＩｇＧ ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質応答の力価が、予想どおり、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質で免疫化したマウスの血清において極めて高く、一方、ネガティブコントロールにおいては反応性が存在しなかったことを示した。ＬＩＣＲにより供される（Lausanne Branch)、他の組換えＦｃ融合タンパク質、いわゆるＭＩＣＡ−Ｆｃに対して陽性のＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質血清の反応性がＥＬＩＳＡにより確認される場合に示されるとおり、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質で免疫化したマウスの血清において、吸収されたタンパク質に対する極めて高い力価の部分は、抗ヒトＦｃ応答によるものであった。得られたデータは、抗Ｆｃ応答が、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質におけるＥＬＩＳＡにより観察された全応答の約３０％であるという結論に本発明者を導いた。
【０１０５】
Ａｂ１’のフローサイトメトリー分析
抗Ｉｄ ｓｃＦｖ４０及び６９での注射により誘発されたＡｂ１’の性質を更に確認するために、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ陽性ＳＫ−ＯＶ−３細胞、及びＨＥＲ−２／ｎｅｕ陰性ＣＨＯ細胞のフローサイトメトリー分析を、免疫化されたＢＬＡＢ／ｃマウス由来の血清（１：１００）で行った。トラスツズマブｍＡｂを使用して、ＳＫ−ＯＶ−３細胞の表面におけるＨＥＲ−２／ｎｅｕの過剰発現、及びＣＨＯ細胞表面におけるレセプターの発現の欠如を最初に確認した（図８Ａ及びＢ）。それから本発明者は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質で免疫化したマウス由来の血清中だけでなく、抗Ｉｄ ｓｃＦｖ４０又は抗Ｉｄ ｓｃＦｖ６９のいずれかで免疫化したマウス由来の血清中の抗体もまた、ＳＫ−ＯＶ−３細胞を特異的に染色したことを示した。ＣＨＯ細胞株においては、弱い反応性のみが観察された。２つの免疫化スケジュールの最後に得られた代表的な結果は、図８Ａ及びＢにも供される。ＣＨＯ細胞と比較した場合、ＳＫ−ＯＶ−３細胞上の蛍光強度の増加は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質、抗Ｉｄ ｓｃＦｖ４０又は６９、及びＰＢＳで免疫化したマウス由来の血清で、それぞれ約１００、２５、及び２であった。希釈バッファーで注射したマウス由来の血清を使用することにより得られた細胞の染色は、免疫前の血清のものと同程度であり、従って、バックグランドシグナルと一致した。これらの実験に基づいて、本発明者は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕレセプターに特異的に誘導されるＡｂｌ’抗体が、抗Ｉｄ ｓｃＦｖ４０又は６９で免疫化したマウスの血清中に存在することを結論づけた。
【０１０６】
参考文献
【表２】
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【０１０７】
【表３】
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【０１０８】
【表４】
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【０１０９】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】単一のアンピシリン耐性感染大腸菌（E.coli)ＨＢ２１５１コロニーの１ｍＭのＩＰＴＧでの誘発後の、抗体を含むいくつかのペリプラスム画分の免疫ブロット分析を示す。レーン１：クローン３９；レーン２：クローン４０；レーン３：クローン９２；レーン４：クローン６９。１２．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるサイズ分画後、タンパク質抽出物をニトロセルロース上でブロットした。当該免疫ブロットは、ＨＲＰ−結合Ｍ２抗ＦＬＡＧｍＡｂ（１：２０００）で発色させ、続いて４−クロロ−１−ナフトール基質を添加した。
【０１１１】
【図２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。精製の各工程における抗Ｉｄ ｓｃＦｖ６９の純度は、１２．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続く銀染色において調節された。レーン１：非精製ペリプラスミック画分。レーン２：Ｈｉｔｒａｐ Ｎｉ活性キレートカラムにおける精製ペリプラスミック画分。レーン３：Ｈｉｔｒａｐ Ｎｉ活性キレートカラム、続いてＳｕｐｒｅｄｅｘ ７５カラムにおけるゲルろ過精製による精製ペリプラスミック画分。レーン４：標準分子量マーカー。
【０１１２】
【図３】競合的ＥＬＩＳＡを使用する、（Ａ）ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質、及び（Ｂ）ｒｈＣＥＡによる、トラスツズマブ Ｆ（ａｂ’）2フラグメント上に結合する精製された可溶性ｓｃＦｖ３９、４０、及び６９の阻害を示すグラフである。増加量の阻害因子は、ＥＬＩＳＡ中１〜１．５の範囲のＡ490を与える希釈において使用された抗Ｉｄ ｓｃＦｖ３９、４０、又は６９のいずれかと混合した。トラスツズマブ Ｆ（ａｂ’）2フラグメントにおいて１．５時間インキュベートし、続いてＨＲＰ結合Ｍ２抗ＦＬＡＧｍＡｂ（１：２０００）と結合するｓｃＦｖを検出した。得られた結果は、各濃度の阻害因子におけるパーセント阻害として表す。
【０１１３】
【図４】競合的ＥＬＩＳＡにより、精製ｓｃＦｖ６９によるトラスツズマブ Ｆ（ａｂ’）2フラグメント上に結合するＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質の阻害を示すグラフである。増加量の阻害因子は、２．５〜５μｇ／ｍｌにおけるＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質と混合し、そしてトラスツズマブ Ｆ（ａｂ’）2フラグメントとともに１．５時間インキュベートした。それから、ペルオキシダーゼ結合抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＦＲＰ５ ｍＡｂ（１：３０００）で、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質結合を検出した。得られた結果は、各濃度の阻害因子におけるパーセント阻害として表す。
【０１１４】
【図５】ＢＩＡＣＯＲＥ実験の分析を示す：（Ａ）ＣＭ５センサーチップにおけるトラスツズマブ Ｆ（ａｂ’）2フラグメント上のＩｄ ｓｃＦｖ４０、６９、及び無関係なｓｃＦｖの結合速度、及び平衡親和定数（表に挿入されている）、（Ｂ）Ｉｄ ｓｃＦｖ６９による、ＣＭ５センサーチップに固定化されたトラスツズマブ Ｆ（ａｂ’）2フラグメント上に結合するＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質の阻害。
【０１１５】
【図６】阻害ＥＬＩＳＡによる、固定化されたトラスツズマブ Ｆ（ａｂ’）2フラグメントにおける抗Ｉｄ ｓｃＦｖ６９（Ａｂ２）の結合の阻害による、ＢＡＬＢ／ｃマウス（免疫化プロトコル１）の血清中のＡｂ３抗抗Ｉｄ ｓｃＦｖ６９の分析を示すグラフである。免疫前の血清又は各３グループ：ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質、又はＰＢＳ、又は抗Ｉｄ ｓｃＦｖ６９で刺激した、マウス由来の血清の連続希釈は、可溶性抗Ｉｄ ｓｃＦｖ６９とともにプレインキュベートした。続いて当該溶液をトラスツズマブ Ｆ（ａｂ’）2フラグメントにおいて２時間インキュベートし、続いてＨＲＰ−結合Ｍ２抗ＦＬＡＧｍＡｂにより結合ｓｃＦｖを検出した。
【０１１６】
【図７】マウスの血清中のＡｂ１’応答の分析を示すグラフである。（Ａ）可溶性の精製された抗Ｉｄ ｓｃＦｖ、プロトコル１；（Ｂ）ファージディスプレイｓｃＦｖ、プロトコル２；（Ｃ）ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質で免疫化後の多様な時間において採取された血清中のＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＩｇＧ、又はＩｇＭ、又は全Ｉｇレベルの検出。マウスは示された時間（矢印）において、これらの抗原で免疫化された。１：１００で希釈された血清中の結合抗体は、ＨＲＰ−結合抗−全Ｉｇ、又はμ−若しくはγ−鎖特異性抗マウスＩｇで検出した。データは、各グループの５匹のマウスに対応する５つの測定値の平均値±ＳＤ Ａ490値として表す。曲線は、ＰＢＳで免疫化したマウス由来の血清（◇）、抗Ｉｄ ｓｃＦｖ４０で免疫化したマウス由来の血清（□）、抗Ｉｄ ｓｃＦｖ６９で免疫化したマウス由来の血清（△）、及びＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質で免疫化したマウス由来の血清（○）を表す。
【０１１７】
【図８】２つの免疫化スケジュール：可溶性抗Ｉｄ ｓｃＦｖ４０及び６９でのプロトコル１、及びファージディスプレイｓｃＦｖでのプロトコル２後の細胞に対するマウス血清の結合性の分析を示すグラフである。結合性実験は、（Ａ）ＨＥＲ−２／ｎｅｕレセプターを発現しないＣＨＯ細胞、又は（Ｂ）ＨＥＲ−２／ｎｅｕレセプターを過剰発現するＳＫ−ＯＶ−細胞においておこなった。抗体の結合性は、ＦＩＴＣラベル化ヤギ抗マウス抗体を使用して、ＦＡＣＳ分析により検出した。全ての抗体結合実験は、ＦＩＴＣラベル化抗ヒト抗体を使用して検出されるトラスツズマブ、及びＦＩＴＣラベル化二次抗体単独の細胞における結合により測定されるバックグランド蛍光との比較において行った。曲線は、バックグランド蛍光（実線）、コントロールｍＡｂトラスツズマブ（黒塗り□）、ＰＢＳで免疫化したマウス由来の血清（黒塗り△）、抗Ｉｄ ｓｃＦｖ４０で免疫化したマウス由来の血清（○）、抗Ｉｄ ｓｃＦｖ６９で免疫化したマウス由来の血清（●）、及びＨＥＲ−２／ｎｅｕ ＥＣＤ−Ｆｃで免疫化したマウス由来の血清（★）を表す。
【０１１８】
【図９】ｓｃＦｖ４０及びｓｃＦｖ６９の完全配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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