(57)【要約】特定の実施形態において、本発明は、ＦｃＲｎ活性を調節するための、ポリペプチド組成物（例えば、ＦｃＲｎに結合する抗体およびその抗原結合部分）ならびに方法を提供する。他の実施形態において、本発明は、自己免疫疾患を処置するための方法および組成物を提供する。本発明は特に、ヒトＦｃＲｎのエピトープに結合する単離された抗体またはその抗原結合部分に関する。ここで、この抗体またはその抗原結合部分は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分のヒトＦｃＲｎへの結合を選択的に阻害するが、ヒトアルブミンのヒトＦｃＲｎへの結合を阻害しない。
2008538919.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＦｃＲｎのエピトープに結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、ここで、該抗体またはその抗原結合部分は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分のヒトＦｃＲｎへの結合を選択的に阻害するが、ヒトアルブミンのヒトＦｃＲｎへの結合を阻害しない、抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２】
前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３】
前記抗体またはその抗原結合部分は、ヒトに投与され得る、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４】
前記抗体またはその抗原結合部分は、インビボで、ヒトＩｇＧの血清半減期を選択的に減少させるが、ヒトアルブミンの血清半減期を減少させない、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５】
前記抗体またはその抗原結合部分は、被験体におけるヒト自己抗体によって誘導される炎症性病変を軽減または阻害する、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項６】
前記抗体は、本明細書中でＤＶＮ２１およびＤＶＮ２４として示される抗体からなる群より選択される、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項７】
前記抗体は組み換え抗体である、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８】
前記抗体はヒト化抗体である、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項９】
前記抗体はキメラ抗体である、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１０】
前記抗体はヒト抗体である、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１１】
前記抗体は二重特異的抗体または多重特異的抗体である、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１２】
前記単離された抗原結合部分は、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦｖフラグメントＣＤＲ３からなる群より選択される、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１３】
前記抗体またはその抗原結合部分は、ＦｃＲｎを発現する生細胞へ結合するその能力について選択される、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１４】
前記ＦｃＲｎは標識されている、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１５】
前記抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＩｇＧの血清半減期を減少させるが、ヒトアルブミンの血清半減期を減少させないその能力について、インビボで選択される、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１６】
前記抗体またはその抗原結合部分は、内在性ＦｃＲｎ遺伝子を欠損しているが、ヒトＦｃＲｎをコードするトランスジーンを有するトランスジェニックマウスにおいて選択される、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１７】
前記抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＦｃＲｎに、少なくとも約１×１０−８Ｍまたはそれ未満の結合親和性で、特異的に結合する、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１８】
前記単離された抗体またはその抗原結合部分は、さらなる機能的部分に共有結合されている、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１９】
前記さらなる機能的部分が標識である、請求項１８に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２０】
前記標識が検出可能な標識である、請求項１９に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２１】
前記標識が、蛍光標識、放射能標識、および特有の核磁気共鳴シグネチャーからなる群より選択される、請求項２０に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２２】
前記さらなる機能的部分が、前記抗体またはその抗原結合部分に増加した血清半減期を与える、請求項１８に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２３】
前記さらなる機能的部分が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分である、請求項２２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２４】
前記さらなる機能的部分が、ビオチン部分を含む、請求項２２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２５】
請求項１に記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞株。
【請求項２６】
前記ハイブリドーマ細胞株は、本明細書中でＤＶＮ２１およびＤＶＮ２４として示される抗体からなる群より選択される、請求項２５に記載のハイブリドーマ細胞株。
【請求項２７】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの抗体またはその抗原結合部分と、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または安定剤とを含む、組成物。
【請求項２８】
免疫刺激剤、免疫調節物質またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記免疫調節物質が、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、腫瘍壊死因子α、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記免疫刺激剤が、インターロイキン−２、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分をコードする、単離された核酸分子。
【請求項３２】
個体におけるＦｃＲｎ媒介性ＩｇＧ防御を阻害するための方法であって、該方法は、ＦｃＲｎ媒介性ＩｇＧ防御を阻害する必要がある個体に、ヒトＦｃＲｎのヒトＩｇＧへの結合を選択的に阻害するが、ヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合を阻害しないのに十分な量で、請求項１に記載の抗体を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３３】
前記個体は自己免疫疾患を有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記個体は全身性エリテマトーデスを有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
患者における自己免疫疾患を予防または処置する方法であって、患者に、該自己免疫疾患を予防または処置するのに十分な量で、請求項１に記載の抗体を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３６】
前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、インスリン抵抗性糖尿病、重症筋無力症、多発性動脈炎、自己免疫血小板減少性紫斑病、皮膚血管炎、水疱性類天疱瘡、尋常天疱瘡、落葉状天疱瘡、グッドパスチャー症候群、慢性関節リウマチ、川崎病、およびシェーグレン症候群からなる群より選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記単離された抗体またはその抗原結合部分は、全身投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記単離された抗体は、局所投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
患者に免疫調節物質を投与する工程をさらに包含する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
ヒトＦｃＲｎのヒトＩｇＧへの結合を選択的に阻害するが、ヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合を阻害しないインヒビターを同定するインビトロ法であって、該方法は、以下：
ａ）候補インヒビターと、ヒトＦｃＲｎおよびヒトＩｇＧとを、該ヒトＦｃＲｎの該ヒトＩｇＧへの結合に適切な条件下で接触させる工程；
ｂ）候補インヒビターの非存在下でのヒトＦｃＲｎの該ヒトＩｇＧへの結合と比較して、該候補インヒビターの存在下でのヒトＦｃＲｎの該ヒトＩｇＧへの結合についてアッセイする工程；
ｃ）候補インヒビターと、ヒトＦｃＲｎおよびヒトアルブミンとを、該ヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合に適切な条件下で接触させる工程；ならびに
ｄ）候補インヒビターの非存在下でのヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合と比較して、該候補インヒビターの存在下でのヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合についてアッセイする工程；
を包含し、
ここで、該候補インヒビターがＦｃＲｎの該ヒトＩｇＧへの結合を阻害するが、ヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合を阻害しない場合、該候補インヒビターは、ヒトＦｃＲｎのヒトＩｇＧへの結合を選択的に阻害するが、ヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合を阻害しないインヒビターである、方法。
【請求項４１】
ヒトＦｃＲｎのヒトＩｇＧへの結合を選択的に阻害するが、ヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合を阻害しないインヒビターを同定するインビトロ法であって、該方法は、以下：
ａ）候補インヒビターと、ヒトＦｃＲｎ、ヒトＩｇＧおよびヒトアルブミンとを接触させる工程；
ｂ）該候補インヒビターの非存在下でのヒトＦｃＲｎの該ヒトＩｇＧへの結合と比較して、該候補インヒビターの存在下でのヒトＦｃＲｎの該ヒトＩｇＧへの結合についてアッセイする工程；ならびに
ｃ）候補インヒビターの非存在下でのヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合と比較して、該候補インヒビターの存在下でのヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合についてアッセイする工程；
を包含し、
ここで、該候補インヒビターがヒトＦｃＲｎの該ヒトＩｇＧへの結合を阻害するが、ヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合を阻害しない場合、該候補インヒビターは、ヒトＦｃＲｎのヒトＩｇＧへの結合を選択的に阻害するが、ヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合を阻害しないインヒビターである、方法。
【請求項４２】
ヒトＩｇＧの半減期を選択的に減少させるが、ヒトアルブミンの半減期を減少させない因子を同定するインビボ法であって、該方法は、以下：
ａ）候補因子およびトレーサーヒトＩｇＧを、ＦｃＲｎ−／−／ｈｕＦｃＲｎ＋トランスジェニックマウスに投与する工程；
ｂ）候補因子の非存在下での該トレーサーヒトＩｇＧの半減期と比較して、該候補因子の存在下での該マウスにおける該トレーサーヒトＩｇＧの半減期を決定する工程；
ｃ）該候補因子およびトレーサーヒトアルブミンを、該ＦｃＲｎ−／−／ｈｕＦｃＲｎ＋トランスジェニックマウスに投与する工程；ならびに
ｄ）候補因子の非存在下での該トレーサーヒトアルブミンの半減期と比較して、該候補因子の存在下での該マウスにおける該トレーサーヒトアルブミンの半減期を決定する工程；
を包含し、
ここで、該候補因子が該トレーサーヒトＩｇＧの半減期を減少させるが、該トレーサーヒトアルブミンの半減期を減少させない場合、該候補因子は、ヒトＩｇＧの半減期を選択的に減少させるが、ヒトアルブミンの半減期を減少させない因子である、方法。
【請求項４３】
ヒトＩｇＧの半減期を選択的に減少させるが、ヒトアルブミンの半減期を減少させない因子を同定するインビボ法であって、該方法は、以下：
ａ）候補因子、トレーサーヒトＩｇＧ、およびトレーサーヒトアルブミンを、ＦｃＲｎ−／−／ｈｕＦｃＲｎ＋トランスジェニックマウスに投与する工程；
ｂ）候補因子の非存在下での該トレーサーヒトＩｇＧの半減期と比較して、該候補因子の存在下での該マウスにおける該トレーサーヒトＩｇＧの半減期を決定する工程；ならびに
ｃ）候補因子の非存在下での該トレーサーヒトアルブミンの半減期と比較して、該候補因子の存在下での該マウスにおけるトレーサーヒトアルブミンの半減期を決定する工程；
を包含し、
ここで、該候補因子が、該トレーサーヒトＩｇＧの半減期を減少させるが、該トレーサーヒトアルブミンの半減期を減少させない場合、該候補因子は、ヒトＩｇＧの半減期を選択的に減少させるが、ヒトアルブミンの半減期を減少させない因子である、方法。
【請求項４４】
前記因子は、抗体、ポリペプチド、合成ペプチド、ペプチド模倣物、および低分子からなる群より選択される、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記因子は、ＩｇＧポリペプチドのＦｃ部分を含む融合タンパク質である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記因子は、ＩｇＧポリペプチドのＦｃ部分である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
自己免疫疾患を処置するための薬学的調製物を製造するための、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分の、使用。
【請求項４８】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項４７に記載の使用。
【請求項４９】
癌の画像化または処置のために使用された放射性抗体または抗体結合体化毒素のクリアランスを促進するための、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分の、使用。
【請求項５０】
前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項４９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２００５年４月２９日に出願された、米国仮特許出願第６０／６７６，４１２号に対する優先権を主張する。米国仮特許出願第６０／６７６，４１２号の明細書は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（基金）
本明細書中に記載される研究は、その全体または一部が、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈのＧｒａｎｔ番号ＮＩＨ  ＤＫ  ５７５９７によって資金援助されている。米国合衆国政府は、本発明における特定の権利を有する。
【０００３】
（発明の背景）
抗体は、２０世紀以前から、感染性生物に対する免疫防御において重要な役割を果たすことが知られている。抗体を産生する免疫系細胞は、Ｂリンパ球である。４つの主要なクラス：免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ、が存在するが、ＩｇＧが最も多い抗体であり、成人における全ての抗体の約９０％を構成する。抗体の各クラスは、免疫において特異的な役割を有し、この役割としては、一次免疫応答および二次免疫応答、抗原不活性化、ならびにアレルギー反応が挙げられる。ＩｇＧは、胎盤関門を通過し得る唯一のクラスであり、それゆえ新生児の免疫系が発達する前の病原体からの防御を提供する。抗体分子は、２つの末端を有する。一方の末端が、抗原特異的レセプターであり、これは、高度に可変であり、特異的な分子の形状に結合する能力を各抗体に生じさせる。他方の末端は、Ｆｃと呼ばれ、クラス内で配列および構造の類似性を有し、免疫細胞上のレセプターに結合する能力を与える。完全に作用している免疫系においては、多様な特異性の抗原特異的レセプターが、宿主に、広範に種々の外来の感染性微生物に結合する能力を有する（その結果、その微生物および免疫性が破壊される）、多様なレパートリーの抗体を生じさせる。
【０００４】
自己免疫疾患は、正常組織を外来のものであると誤って感知し、そしてその正常組織を攻撃する場合に生じる。自己免疫性の破壊における最も一般的な免疫学的に関与する因子は、本来の目的から逸し、そして正常な正常組織を破壊するようになった自己抗体である。これは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を含む多くの型の免疫疾患をもたらす。ＳＬＥは、高γグロブリン血症、抗ＤＮＡ機能、および抗核タンパク質抗体の一般的特徴、ならびに腎糸球体、脈管系、関節および皮膚を含む多くの部位に蓄積する免疫複合体を伴う全身的な抗体の調節不全の、基本型の疾患である（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。その重篤度は、軽度から非常に重篤（最小限の消耗性から致死的）の範囲であり得る。現在、自己免疫疾患に対する有効な処置は、ほとんど存在しない。
【０００５】
したがって、より有効な組成物および自己免疫疾患を処置する方法として抗体濃度を操作するための方法を開発することが、目的である。
【非特許文献１】ＴｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｏｓおよびＤｉｘｏｎ、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９８５年、第３７巻、ｐ．２９６−３９０
【非特許文献２】ＴｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｏｓおよびＤｉｘｏｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、１９８１年、第５５巻、ｐ．１７９−２１５
【非特許文献３】Ｂｏｕｍｐａｓら、Ａｎｎ  Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．、１９９５年、第１２２巻、ｐ．９４０
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
特定の実施形態において、本発明は、ヒトＦｃＲｎ上のエピトープに結合する単離された抗体またはその抗原結合部分を提供する。ＦｃＲｎ抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＦｃＲｎのエピトープを結合し、そして上記ＦｃＲｎ抗体またはその抗原結合部分は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分のヒトＦｃＲｎへの結合を選択的に阻害するが、ヒトアルブミンのヒトＦｃＲｎへの結合を阻害しない。特定の具体的な実施形態において、上記ＦｃＲｎ抗体は、モノクローナル抗体である。特定の実施形態において、上記ＦｃＲｎ抗体またはその抗原結合部分は、ヒトに投与され得る。特定の場合において、上記ＦｃＲｎ抗体またはその抗原結合部分は、インビボで、ヒトＩｇＧの血清半減期を選択的に減少させるが、ヒトアルブミンの血清半減期を減少させない。他の場合において、上記ＦｃＲｎ抗体またはその抗原結合部分は、人間におけるヒト自己抗体によって誘導される炎症性病変を軽減または阻害する。上記抗体の例としては、本明細書中でＤＶＮ２１およびＤＶＮ２４として示されるＦｃＲｎ抗体が挙げられるが、これらに限定されない。対象のＦｃＲｎ抗体としては、組換え抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、二重特異的（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体または多重特異的（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体、および単離された抗原結合部分（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦｖフラグメントＣＤＲ３）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０００７】
特定の実施形態において、上記ＦｃＲｎ抗体またはその抗原結合部分は、ＦｃＲｎ（例えば、標識されたＦｃＲｎタンパク質）を発現している生細胞に結合するその能力について、選択される。特定の場合において、上記抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＩｇＧの血清半減期を減少させ、かつヒトアルブミンの血清半減期を実質的には減少させないその能力について、インビボで選択される。他の場合において、上記抗体またはその抗原結合部分は、内在性ＦｃＲｎを欠損しているが、ヒトＦｃＲｎをコードするトランスジーンを有するトランスジェニックマウスにおいて選択される。
【０００８】
さらなる実施形態において、上記単離された抗体またはその抗原結合部分は、さらなる機能的部分（例えば、標識）に共有結合される。具体的な実施形態において、この標識は、蛍光検出法、陽電子断層撮影検出法、および核磁気共鳴検出法からなる群より選択される方法による検出に適している。例えば、上記標識は、蛍光標識、放射能標識、および特有の核磁気共鳴シグネチャーを有する標識から選択される。特定の場合において、上記さらなる機能的部分は、上記抗体またはその抗原結合部分において、血清半減期の増加を与える。例としては、このさらなる機能的部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはビオチン部分を含む。
【０００９】
特定の実施形態において、本発明は、上述のＦｃＲｎ抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を提供する。特定の実施形態において、このハイブリドーマ細胞株は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分の、ヒトＦｃＲｎへの結合を選択的に阻害するが、ヒトアルブミンのヒトＦｃＲｎへの結合を阻害しない、モノクローナルＦｃＲｎ抗体を産生する。例えば、このハイブリドーマ細胞株は、ＤＶＮ２１およびＤＶＮ２４のようなＦｃＲｎ抗体を産生する。
【００１０】
特定の実施形態において、本発明は、上述の少なくとも１つのＦｃＲｎ抗体またはその抗原結合部分と、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤とを含む組成物を提供する。この組成物はさらに、免疫刺激物質、免疫調節物質、またはそれらの組み合わせを含む。例えば、この組成物は、免疫調節物質（例えば、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、腫瘍壊死因子α、またはそれらの組み合わせであるが、これらに限定されない）を含む。別の例としては、この組成物は、免疫刺激物質（インターロイキン−２、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない）を含む。
【００１１】
特定の実施形態において、本発明は、上述のＦｃＲｎ抗体またはその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子を提供する。
【００１２】
特定の実施形態において、本発明は、個体におけるＦｃＲｎ媒介性ＩｇＧ防御を阻害するための方法を提供する。そのような方法は、ＦｃＲｎ媒介性ＩｇＧ防御の阻害の必要のある個体に、ヒトＦｃＲｎのヒトＩｇＧへの結合を選択的に阻害するが、ヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合を阻害しないのに十分な量で、ＦｃＲｎ抗体を投与する工程を包含する。例えば、そのようなＦｃＲｎ抗体は、自己免疫疾患の個体に投与され得る。自己免疫疾患の例としては、ＳＬＥ、インスリン抵抗性糖尿病、重症筋無力症、多発性動脈炎、自己免疫血小板減少性紫斑病、皮膚血管炎、水疱性類天疱瘡、尋常天疱瘡、落葉状天疱瘡、グッドパスチャー症候群、慢性関節リウマチ、川崎病、およびシェーグレン症候群が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１３】
特定の実施形態において、本発明は、患者における自己免疫疾患を予防または処置する方法を提供する。そのような方法は、ＦｃＲｎ抗体を、患者に、その自己免疫疾患を予防または処置するのに十分な量で投与する工程を包含する。具体的な実施形態において、投与されるＦｃＲｎ抗体は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分のヒトＦｃＲｎへの結合を選択的に阻害するが、ヒトアルブミンのヒトＦｃＲｎへの結合を阻害しない。自己免疫疾患の例としては、ＳＬＥ、インスリン抵抗性糖尿病、重症筋無力症、多発性動脈炎、自己免疫血小板減少性紫斑病、皮膚血管炎、水疱性類天疱瘡、尋常天疱瘡、落葉状天疱瘡、グッドパスチャー症候群、慢性関節リウマチ、川崎病、およびシェーグレン症候群が挙げられるが、これらに限定されない。この単離された抗体またはその抗原結合部分は、個体に、全身的または局所的に投与され得る。特定の場合において、上記方法は、患者に、免疫調節物質（例えば、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、腫瘍壊死因子α、またはそれらの組み合わせ）を投与する工程を包含する。
【００１４】
特定の実施形態において、本発明は、ヒトＦｃＲｎのヒトＩｇＧへの結合を選択的に阻害するが、ヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合を阻害しないインヒビター（選択的ＦｃＲｎインヒビター）を同定するインビトロ法を提供する。そのような方法は、以下：（ａ）候補インヒビターを、ヒトＦｃＲｎ、ヒトＩｇＧおよびヒトアルブミンに接触させる工程；（ｂ）候補インヒビターの非存在下でのヒトＦｃＲｎのヒトＩｇＧへの結合と比較して、候補インヒビターの存在下でのヒトＦｃＲｎのヒトＩｇＧへの結合についてアッセイする工程；ならびに（ｃ）候補インヒビターの非存在下でのヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合と比較して、候補インヒビターの存在下でのヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合についてアッセイする工程、を包含する。所望の選択的ＦｃＲｎインヒビターは、ヒトＦｃＲｎのヒトＩｇＧへの結合を阻害するが、ヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合を阻害しない。特定の実施形態において、この選択的ＦｃＲｎインヒビターは、抗体、ポリペプチド、合成ペプチド、ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）、または低分子から選択される。特定の場合において、この選択的ＦｃＲｎインヒビターは、ＩｇＧポリペプチドのＦｃ部分を含む融合タンパク質である。あるいは、この選択的ＦｃＲｎインヒビターは、ＩｇＧポリペプチドのＦｃ部分である。
【００１５】
さらなる実施形態において、本発明は、ヒトＦｃＲｎのヒトＩｇＧへの結合を選択的に阻害するが、ヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合を阻害しないインヒビターを同定する、代替的なインビトロ法を提供する。そのような方法は、以下：（ａ）ヒトＦｃＲｎのヒトＩｇＧへの結合に適した条件下で、候補インヒビターを、ヒトＦｃＲｎおよびヒトＩｇＧに接触させる工程；（ｂ）候補インヒビターの非存在下でのヒトＦｃＲｎのヒトＩｇＧへの結合と比較して、候補インヒビターの存在下でのヒトＦｃＲｎのヒトＩｇＧへの結合についてアッセイする工程；（ｃ）ヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合に適した条件下で、候補インヒビターを、ヒトＦｃＲｎおよびヒトアルブミンに接触させる工程；ならびに（ｄ）候補インヒビターの非存在下でのＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合と比較して、候補インヒビターの存在下でのヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合についてアッセイする工程、を包含する。所望の選択的ＦｃＲｎインヒビターは、ヒトＦｃＲｎのヒトＩｇＧへの結合を阻害するが、ヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合を阻害しない。特定の実施形態において、この選択的ＦｃＲｎインヒビターは、抗体、ポリペプチド、合成ペプチド、ペプチド模倣物、または低分子から選択される。特定の場合において、この選択的ＦｃＲｎインヒビターは、ＩｇＧポリペプチドのＦｃ部分を含む融合タンパク質である。あるいは、この選択的ＦｃＲｎインヒビターは、ＩｇＧポリペプチドのＦｃ部分である。
【００１６】
特定の実施形態において、本発明は、ヒトＩｇＧの半減期を選択的に減少させるが、ヒトアルブミンの半減期を減少させない因子を同定するインビボ法を提供する。そのような方法は、以下：（ａ）候補因子およびトレーサーヒトＩｇＧを、ＦｃＲｎ−／−／ｈｕＦｃＲｎ＋トランスジェニックマウスに投与する工程；（ｂ）候補因子の非存在下でのトレーサーヒトＩｇＧの半減期と比較して、候補因子の存在下でのそのマウスにおけるトレーサーヒトＩｇＧの半減期を決定する工程；（ｃ）その候補因子およびトレーサーヒトアルブミンを、そのＦｃＲｎ−／−／ｈｕＦｃＲｎ＋トランスジェニックマウスに投与する工程；ならびに（ｄ）候補因子の非存在下でのトレーサーヒトアルブミンの半減期と比較して、候補因子の存在下でのそのマウスにおけるトレーサーヒトアルブミンの半減期を決定する工程、を包含する。その候補因子が、トレーサーヒトＩｇＧの半減期を減少させるが、トレーサーヒトアルブミンの半減期を減少させない場合、その候補因子は、ヒトＩｇＧの半減期を選択的に減少させるが、ヒトアルブミンの半減期を減少させない因子である。この因子は、例えば、抗体、ポリペプチド、合成ペプチド、ペプチド模倣物、または低分子から選択される。特定の場合において、この因子は、ＩｇＧポリペプチドのＦｃ部分を含む融合タンパク質である。あるいは、この因子は、ＩｇＧポリペプチドのＦｃ部分である。
【００１７】
特定の実施形態において、本発明は、ヒトＩｇＧの半減期を選択的に減少させるが、ヒトアルブミンの半減期を減少させない因子を同定するインビボ法を提供する。そのような方法は、以下：（ａ）候補因子、トレーサーヒトＩｇＧ、およびトレーサーヒトアルブミンを、ＦｃＲｎ−／−／ｈｕＦｃＲｎ＋トランスジェニックマウスに投与する工程；（ｂ）候補因子の非存在下でのトレーサーヒトＩｇＧの半減期と比較して、候補因子の存在下でのそのマウスにおけるトレーサーヒトＩｇＧの半減期を決定する工程；ならびに（ｃ）候補因子の非存在下でのトレーサーヒトアルブミンの半減期と比較して、候補因子の存在下でのそのマウスにおけるトレーサーヒトアルブミンの半減期を決定する工程、を包含する。所望の因子は、トレーサーヒトＩｇＧの半減期を選択的に減少させるが、トレーサーヒトアルブミンの半減期を減少させない。この因子は、例えば、抗体、ポリペプチド、合成ペプチド、ペプチド模倣物、または低分子から選択される。特定の場合において、この因子は、ＩｇＧポリペプチドのＦｃ部分を含む融合タンパク質である。あるいは、この因子は、ＩｇＧポリペプチドのＦｃ部分である。
【００１８】
特定の実施形態において、本発明は、自己免疫疾患を処置するための薬学的調製物を製造するための、単離されたＦｃＲｎ抗体またはその抗原結合部分の使用を提供する。特定の場合において、このＦｃＲｎ抗体は、ヒトＦｃＲｎの、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分への結合を阻害するが、ヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合を阻害しない。具体的な実施形態において、このＦｃＲｎ抗体は、モノクローナル抗体である。
【００１９】
特定の実施形態において、本発明は、放射性抗体または抗体結合体化毒素のクリアランスを促進するための、単離されたＦｃＲｎ抗体またはその抗原結合部分の使用を提供する。特定の実施形態において、これらの放射性抗体または抗体結合体化毒素は、癌の画像化および処置に使用される。具体的な実施形態において、このＦｃＲｎ抗体は、モノクローナル抗体である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明の特定の局面は、少なくとも部分的に、レセプターＦｃＲｎ（ＦｃＲｐ／Ｆｃｇｒｔ１）が正常なタンパク質異化からＩｇＧアイソタイプの抗体をＦｃ依存的様式で選択的に防御するという知見に基づく。ＦｃＲｎは、変化した免疫学的機能を行なうタンパク質のファミリーの新規メンバーである。上記ＦｃＲｎ分子は、マウスおよびヒトを含む成体動物の血管内皮と共に他の組織において発現される。ＦｃＲｎは、抗体分子に結合するが、ＩｇＧクラス由来の抗体分子だけに結合する。ＦｃＲｎ／ＩｇＧ複合体の結晶構造は、解明されており（ＢｊｏｒｋｍａｎおよびＳｉｍｉｓｔｅｒ、１９９２、ＰＮＡＳ  ８９：６３８−４２；ＷｅｓｔおよびＢｊｏｒｋｍａｎ、２０００、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：９６９８−９７０８）、それは、レセプター／リガンドの関係がそれら２つの分子の間に存在することを示す。さらに、ＦｃＲｎは、β２−ミクログロブリンとヘテロ二量体化し、そしてそのβ２−ミクログロブリン複合体は、ＦｃＲｎがｐＨ依存的様式でＩｇＧに結合するのに重要である。
【００２１】
ほとんどの血清タンパク質は、短い血清半減期（約１〜２日間）を有する。しかし、血清タンパク質の２つの型（アルブミンおよびＩｇＧクラスの抗体）は、大きく延長された血清半減期を有する。それらの半減期は、それらが主要組織適合遺伝子複合体ファミリータンパク質（ＦｃＲｎ）によって正常な異化による分解から天然に救済されることに起因して延長される。数人の研究者らは、ＩｇＧのＦｃ領域を異なるポリペプチドにカップリングしてそのポリペプチドの安定性を改善することによる防御効果を、間接的に示している（例えば、米国特許第６，０９６，８７１号および同第６，１２１，０２２号）。ＰＣＴ出願ＷＯ  ９７／３４６３１はまた、治療および診断を目的として薬学的組成物の安定性および寿命を増大させることにおける免疫グロブリン様ドメインの使用を記載する。さらに、出願人らは、遺伝子ターゲッティングによるＦｃＲｎの遺伝子の排除が自己免疫性関節炎からＫ／ＢｘＮマウスを防御することを示した（Ａｋｉｌｅｓｈら、２００４、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１３：１３２８−３３）。出願人はまた、遺伝子ターゲッティングによるＦｃＲｎの遺伝子の排除が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の重篤度を、遺伝的にＳＬＥ様疾患を発症する素因を有するマウスにおいて低下させることを示した。出願人および他の者は、病原性血清移入モデルにおいて、ＦｃＲｎ防御経路の機能的飽和が関節炎の軽減および免疫性血小板減少性紫斑病マウスモデルをもたらすことを示唆した（Ａｋｉｌｅｓｈら、２００４、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１３：１３２８−３３；ＨａｎｓｏｎおよびＢａｌｔｈａｓａｒ、２００２、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏ  ８８：８９８−８９９）。したがって、これらの実験は、ＦｃＲｎが自己免疫疾患（例えば、自己抗体によって引き起こされるもの）を処置するための有望な治療標的であること示唆する。出願人およびその者らの共同実験者による最近の研究（例えば、Ｃｈａｕｄｈｕｒｙら、２００３、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９７：３１５−３２２）は、ＦｃＲｎがまたアルブミンを正常な異化による排除から防御することを示した。これは、ＦｃＲｎがアルブミンに結合し、そしてＩｇＧについて見出されるものと同様の様式でアルブミンを正常な異化による排除から防御することに起因して起きる。ＩｇＧのＦｃＲｎ防御の治療的ブロックのストラテジーに対する主要な懸案事項は、このような治療がまたアルブミンの血清半減期を減少させ得ることである。これは、有害な副作用をもたらし得る。なぜならば、アルブミンの正常な血清濃度の維持は、正常な重量オスモル濃度の維持およびアルブミンが必須の役割を果たす他の生物学的機能に重要であるからである。抗ＦｃＲｎ治療のこの潜在的に深刻な副作用を回避するために、本発明の特定の実施形態は、ＩｇＧの血清半減期を選択的に減少させるが、ヒトアルブミンの血清半減期を減少させないように設計される抗ＦｃＲｎ治療を提供する。
【００２２】
（Ｉ．ＦｃＲｎ抗体および他のＦｃＲｎ結合因子）
本発明は、部分的に、ＦｃＲｎ分子の部分を選択的にターゲッティングするＦｃＲｎ結合因子（例えば、ＦｃＲｎ抗体、ＦｃＲｎ抗体の抗原結合部分、およびＦｃＲｎの非免疫グロブリン結合因子）を提供する。本明細書中に記載されるＦｃＲｎ結合因子は、種々の障害（特に、ＦｃＲｎ関連性の自己免疫疾患）を処置するために使用され得る。本発明は、ＦｃＲｎ媒介性の機能（例えば、Ｆｃ結合活性またはＩｇＧ防御活性）をモジュレート（ｍｏｄｕｌａｔｅ）（阻害または増強）する抗体およびその抗原結合部分を提供する。このような結合因子は、インビトロおよびインビボでＦｃＲｎ機能をモジュレートするため、そして特に、ＦｃＲｎ関連性の自己免疫疾患を処置するために使用され得る。特定の実施形態において、本発明は、ＦｃＲｎに対するモノクローナル抗体に関する。
【００２３】
１つの実施形態において、ＦｃＲｎ抗体（免疫グロブリン）は、単離されたヒトＦｃＲｎおよび／もしくは組換えヒトＦｃＲｎまたはそれらの部分（例えば、ペプチド）に対して惹起されるか、あるいは組換えヒトＦｃＲｎを発現する宿主細胞に対して惹起される。本明細書中で使用される場合、用語「ＦｃＲｎ」（文献においてＦｃＲｎα鎖とも称される）とは、哺乳動物（例えば、ヒトを含む）由来のＦｃＲｎポリペプチドをいう。特定の局面において、本発明の抗体は、Ｆｃ結合部位（例えば、ＷｅｓｔおよびＢｊｏｒｋｍａｎ、２０００、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：９６９８−９７０８を参照のこと）を構成するＦｃＲｎタンパク質（例えば、α２ドメインヘリックス）の領域に特異的に結合する。他の場合において、本発明の抗体は、β２−ミクログロブリン結合部位を構成するＦｃＲｎタンパク質の領域に特異的に結合する。本発明の抗体は、ＦｃＲｎのＩｇＧへの結合を阻害するが、ＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合を阻害しない。
【００２４】
「免疫グロブリン」は、四量体の分子である。天然に存在する免疫グロブリンにおいて、それぞれの四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識を担う約１００〜１１０アミノ酸以上の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を規定する。ヒト軽鎖は、κ軽鎖およびλ軽鎖として分類される。重鎖は、μ、δ、γ、α、またはεとして分類され、そしてそれらは、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして抗体のアイソタイプを規定する。軽鎖および重鎖内で、上記可変領域および定常領域は、約１２アミノ酸以上の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖はまた、約１０アミノ酸より多い「Ｄ」領域を含む。一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第７章（Ｐａｕｌ，Ｗ．編、第２版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））（全ての目的のためにその全体が参考として援用される）。それぞれの軽／重鎖対の可変領域は、インタクトな免疫グロブリンが２つの結合部位を有するように抗体内の結合部位（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）を形成する。
【００２５】
免疫グロブリン鎖は、同じ一般構造を示す：それらは、相補性決定領域またはＣＤＲともいわれる３つの超可変領域によって連結される比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。各対の２つの鎖由来のＣＤＲは、フレームワーク領域によって整列され、特定のエピトープに対する結合を可能にする。Ｎ末端からＣ末端に向かって、軽鎖および重鎖の両方は、ドメインＦＲｌ、ＣＤＲｌ、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインに対するアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７および１９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９７、１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８９、３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、インタクトな免疫グロブリン、または特異的結合に関してインタクトな抗体と競合するその抗原結合部分をいう。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術またはインタクトな抗体の酵素的切断もしくは化学的切断によって産生され得る。抗原結合部分としては、とりわけ、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄＡｂフラグメント、および相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、キメラ抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）および少なくとも免疫グロブリンの一部を含むポリペプチド（その免疫グロブリンの一部は、このポリペプチドに特異的抗原結合を与えるのに十分である）が挙げられる。用語「抗ＦｃＲｎ抗体」および「ＦｃＲｎ抗体」は、本明細書中で交換可能に使用される。
【００２７】
Ｆａｂフラグメントは、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ  Ｉドメインからなる多価フラグメントである；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントである；Ｆｄフラグメントは、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなる；Ｆｖフラグメントは、抗体の単腕（ｓｉｎｇｌｅ  ａｒｍ）のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなる；そしてｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６、１９８９）は、ＶＨドメインからなる。
【００２８】
単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、多価分子を形成するためにＶＬ領域およびＶＨ領域が単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーを介して対形成される抗体である（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６、１９８８およびＨｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３、１９８８）。ダイアボディは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現される二価の二重特異的（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体であるが、ダイアボディは、、同じ鎖上のその２つのドメインの間で対形成を可能にするには短すぎリンカーを使用し、それによってそのドメインを別の鎖の相補性ドメインと対形成させ、そして２つの抗原結合部位を形成する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８、１９９３、およびＰｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３、１９９４を参照のこと）。１つ以上のＣＤＲは、共有結合または非共有結合のいずれかで分子に組み込まれ得る。
【００２９】
抗体は、１つ以上の結合部位を有し得る。１つより多い結合部位が存在する場合、その結合部位は、互いに同一であっても異なっていてもよい。例えば、天然に存在する免疫グロブリンは、２つの同一の結合部位を有し、単鎖抗体またはＦａｂフラグメントは、１つの結合部位を有するが、「二重特異的」または「二機能性」である抗体は、２つの結合部位を有する。
【００３０】
用語「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する１つ以上の可変領域および定常領域を有する全ての抗体を含む。１つの実施形態において、可変ドメインおよび定常ドメインの全ては、ヒト免疫グロブリン配列に由来する（完全ヒト抗体）。これらの抗体は、下に記載されるような種々の方法において調製され得る。
【００３１】
用語「キメラ抗体」とは、１種の抗体由来の１つ以上の領域および１種以上の他の異なる抗体由来の１つ以上の領域を含む抗体をいう。１つの実施形態において、１つ以上のＣＤＲは、ヒト抗ＦｃＲｎ抗体に由来する。より好ましい実施形態において、ＣＤＲの全ては、ヒト抗ＦｃＲｎ抗体に由来する。別の好ましい実施形態において、１種以上のヒト抗ＦｃＲｎ抗体に由来するＣＤＲは、キメラ抗体において混成され、そして調和する。例えば、キメラ抗体は、第２のヒト抗ＦｃＲｎ抗体の軽鎖由来のＣＤＲ２およびＣＤＲ３と組み合わされた第１のヒト抗ＦｃＲｎ抗体の軽鎖由来のＣＤＲ１を含み得、そして重鎖由来のＣＤＲは、第３の抗ＦｃＲｎ抗体に由来し得る。さらに、そのフレームワーク領域は、１種の同じ抗ＦｃＲｎ抗体、１種の異なる抗体（例えば、ヒト抗体）、またはヒト化抗体に由来し得る。
【００３２】
特定の実施形態において、ＦｃＲｎ抗体またはその抗原結合部分は、さらなる機能的部分に連結される。このような連結は、共有結合であっても非共有結合であってもよい。１つの実施形態において、上記機能的部分は、治療的（例えば、薬物結合体または毒素）であり得る。
【００３３】
特定のさらなる実施形態において、ＦｃＲｎ抗体またはその抗原結合部分は、検出を容易にするために標識される。本明細書中で使用される場合、用語「標識する」または「標識される」とは、抗体における別の分子の組み込みをいう。１つの実施形態において、上記標識は、検出可能なマーカーである（例えば、放射標識されたアミノ酸の組み込み、あるいはマーカー化（ｍａｒｋｅｄ）アビジン（例えば、光学的方法または比色定量法によって検出され得る蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出され得るビオチン化部分のポリペプチドに対する結合）。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する種々の方法は、当該分野において公知であり、そしてそれらの方法が、使用され得る。ポリペプチドに対する標識の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、第２のレポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、磁性因子（例えば、ガドリニウム錯体）、毒素（例えば、百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎ  ｄｉｏｎｅ）、ミトザントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、またはプロマイシン）およびそれらのアナログまたはホモログ。いくつかの実施形態において、標識は、潜在的な立体障害を減少させるために種々の長さのスペーサーアーム（ｓｐａｃｅｒ  ａｒｍ）によって結合される。
【００３４】
下の実施例に示される通り、出願人は、ヒトＦｃＲｎに対するモノクローナル抗体、およびＦｃＲｎモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を産出した。これらの抗体は、多くの事項（例えば、ヒトＦｃＲｎとそのリガンド（例えば、ヒトＩｇＧまたはヒト血清アルブミン）との間の相互作用を阻害するそれらの能力、インビボでのＩｇＧの血清半減期を減少させるそれらの能力、インビボでのＩｇＧのクリアランスを促進するそれらの能力、および病原性のヒト抗体によって誘導される炎症性の病変を軽減するそれらの能力）においてさらに特徴付けられた。ヒトＩｇＧに特異的に結合するが、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合しないＦｃＲｎ抗体は、治療目的のために特に有用である。
【００３５】
特定の実施形態において、本発明の抗体は、ＦｃＲｎタンパク質（本明細書中で可溶性ＦｃＲｎポリペプチドとも称される）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に特異的に結合する。代表的な可溶性ＦｃＲｎポリペプチドは、以下の配列番号１のアミノ酸残基２４〜２９７を含み得る。本明細書中で使用される場合、ＦｃＲｎ可溶性ポリペプチドは、フラグメント、機能的改変体、おおよびＦｃＲｎ可溶性ポリペプチドの改変形態を含む。
【００３６】
【化１】
2008538919.tif 000003
特定の実施形態において、本発明は、ＦｃＲｎまたはＦｃＲｎの一部を特異的に結合するモノクローナルＦｃＲｎ抗体を提供する。モノクローナルＦｃＲｎ抗体の例としては、実施例において以下に記載されるようなＤＶＮ２１およびＤＶＮ２４が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、免疫グロブリンは、ＦｃＲｎに少なくとも約１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍまたはそれ未満の親和性で結合する。
【００３７】
本発明の特定の局面において、本発明の抗ＦｃＲｎ抗体は、分子選択性および種選択性の両方を示す。例えば、本明細書中に開示される抗体は、好ましくは、ＦｃＲｎに対して特異的であり、その抗体は、例えば、ＨＡＳなどの他のＦｃＲｎリガンド分子に対する最小限の結合を有する。１つの実施形態において、上記抗ＦｃＲｎ抗体としては、ヒトＦｃＲｎ、カニクイザルＦｃＲｎまたはアカゲザルＦｃＲｎに結合する。１つの実施形態において、上記抗ＦｃＲｎ抗体は、マウスＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎ、モルモットＦｃＲｎ、イヌＦｃＲｎ、ヤギＦｃＲｎまたはウサギＦｃＲｎに結合しない。あるいは、上記抗体は、異なる種（例えば、ヒトおよびマウス）由来の１種より多い異なるＦｃＲｎ分子に結合する。明細書の教示に従って、当該分野において周知である方法（例えば、免疫蛍光顕微鏡検査法、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡ）を使用して、上記抗ＦｃＲｎ抗体に関する分子選択性および種選択性を決定し得る。１つの実施形態において、上記抗ＦｃＲｎ抗体は、ＦｃＲｎに結合する傾向を有し、その傾向は、他のＦｃＲｎリガンド分子に結合する傾向よりも少なくとも５０倍大きく、そして好ましくは、１００倍または２００倍大きい。
【００３８】
特定の実施形態において、本発明の抗体は、ＦｃＲｎの１つ以上の特定のドメインに結合する。例えば、対象の抗体は、ＦｃＲｎ重鎖のＦｃ結合部位中の領域に結合する。
【００３９】
上記抗ＦｃＲｎ抗体は、ＩｇＧ分子、ＩｇＭ分子、ＩｇＥ分子、ＩｇＡ分子またはＩｇＤ分子であり得る。好ましい実施形態において、上記抗体は、ＩｇＧであり、そしてそれは、ＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、ＩｇＧ３サブタイプまたはＩｇＧ４サブタイプである。特定の実施形態において、上記抗ＦｃＲｎ抗体は、サブクラスＩｇＧ２である。ＦｃＲｎ抗体のクラスおよびサブクラスは、当該分野において公知である任意の方法によって決定され得る。一般に、抗体のクラスおよびサブクラスは、抗体の特定のクラスおよびサブクラスに対して特異的である抗体を使用して決定され得る。このような抗体は、市販されている。上記クラスおよびサブクラスは、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットおよび他の技術によって決定され得る。あるいは、上記クラスおよびサブクラスは、その抗体の重鎖および／または軽鎖の定常ドメインの全部または一部を配列決定し、それらのアミノ酸配列を免疫グロブリンの種々のクラスおよびサブクラスの公知のアミノ酸と比較し、そしてその抗体のクラスおよびサブクラスを決定することによって決定され得る。
【００４０】
特定の実施形態において、異なる種に由来する部分を含む単鎖抗体、およびキメラ抗体、ヒト化抗体または霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）抗体（ＣＤＲ移植）、ならびにキメラ単鎖抗体またはＣＤＲ移植単鎖抗体もまた、ＦｃＲｎ抗体の抗原結合部分として本発明によって包含される。これらの抗体の種々の部分は、従来の技術によって化学的に１つに連結され得るか、または遺伝子工学技術を使用して隣接したタンパク質として調製され得る。例えば、キメラの鎖またはヒト化された鎖をコードする核酸は、隣接したタンパク質を産生するために発現され得る。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許第０，１２５，０２３号；Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号；Ｂｏｓｓら、欧州特許第０，１２０，６９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、ＷＯ  ８６／０１５３３；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、欧州特許第０，１９４，２７６  Ｂ１号；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号；およびＷｉｎｔｅｒ、欧州特許第０，２３９，４００  Ｂ１号を参照のこと。霊長類化抗体に関しては、Ｎｅｗｍａｎ，Ｒ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１４５５−１４６０（１９９２）もまた参照のこと。単鎖抗体に関しては、例えば、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号；およびＢｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３−４２６（１９８８）を参照のこと。
【００４１】
さらに、キメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体または単鎖抗体のフラグメントを含む抗体の機能的フラグメントが、産生され得る。対象の抗体の機能的フラグメントは、それらが由来する完全長抗体の少なくとも１つの結合機能および／またはモジュレーション機能を保持する。好ましい機能的フラグメントは、対応する完全長抗体の抗原結合機能（例えば、ＦｃＲｎに対する特異性）を保持する。特定の好ましい機能的フラグメントは、ＦｃＲｎの１つ以上の機能の特性（例えば、結合能力または輸送能力）を阻害する能力を保持する。例えば、１つの実施形態において、ＦｃＲｎ抗体の機能的フラグメントは、ＦｃＲｎとそのリガンドの１つ（例えば、ＩｇＧ）との相互作用を特異的に阻害し得るか、そして／またはインビボで１つ以上のＦｃＲｎ媒介性の機能（例えば、ＩｇＧ輸送および自己免疫応答）を阻害し得る。
【００４２】
特定の実施形態において、ＦｃＲｎレセプターまたはその部分に結合する抗体フラグメント（Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない）が、本発明によって包含される。このようなフラグメントは、酵素的切断または組換え技術によって産生され得る。例えば、パパインまたはペプシンによる切断は、それぞれ、ＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントをもたらし得る。抗体はまた、１つ以上の終止コドンが天然の終止部位の上流に導入されている抗体コード遺伝子を使用して、種々の短縮形態で産生され得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）２重鎖部分をコードするキメラ遺伝子は、その重鎖のＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むように設計され得る。
【００４３】
ヒト化抗体は、例えば、非ヒト種に由来する抗体であり得、この抗体において、その重鎖および軽鎖のフレームワークドメインおよび定常ドメインにおける特定のアミノ酸は、ヒトにおいて免疫応答を減少または廃絶するように変異されている。あるいは、ヒト化抗体は、ヒト抗体由来の定常ドメインを非ヒト種の可変ドメインに融合することによって産生され得る。ヒト化抗体を作製する方法の例は、米国特許第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号および同第５，８７７，２９３号において見出され得る。ヒト化抗体は、異なる起源の免疫グロブリンの部分を含み得る。例えば、少なくとも１つの部分は、ヒト起源のものであり得る。したがって、本発明は、ＦｃＲｎ（例えば、ヒトＦｃＲｎ）に対する結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンに関連し、この免疫グロブリンは、非ヒト起源（例えば、げっ歯類）の抗原結合領域およびヒト起源の免疫グロブリンの少なくとも一部（例えば、ヒトフレームワーク領域、ヒト定常領域またはそれらの部分）を含む。例えば、上記ヒト化抗体は、必要な特異性を有する非ヒト起源（例えば、マウス）の免疫グロブリンに由来する部分、およびヒト起源の免疫グロブリン配列に由来する部分を有し（例えば、キメラ免疫グロブリン）、それらの部分は、従来の技術によって化学的（例えば、合成的）に１つに連結されるか、または遺伝子工学技術を使用して隣接したポリペプチドとして調製される（例えば、キメラ抗体のタンパク質部分をコードするＤＮＡは、隣接したポリペプチド鎖を産生するように発現され得る）。
【００４４】
本発明のヒト化免疫グロブリンの別の例は、１種以上の免疫グロブリン鎖を含む免疫グロブリンであり、その免疫グロブリン鎖は、非ヒト起源のＣＤＲ（例えば、非ヒト起源の抗体に由来する１つ以上のＣＤＲ）、およびヒト起源の軽鎖および／または重鎖に由来するフレームワーク領域を含む（例えば、フレームワークの変化を伴うかまたはそれを伴わないＣＤＲ移植抗体）。１つの実施形態において、上記ヒト化免疫グロブリンは、ＦｃＲｎポリペプチドに対する結合に関してマウスモノクローナル抗体と競合し得る。キメラ単鎖抗体またはＣＤＲ移植単鎖抗体はまた、用語「ヒト化免疫グロブリン」によって包含される。
【００４５】
特定の実施形態において、本発明は、ＦｃＲｎアンタゴニスト抗体を提供する。本明細書中に記載されるように、用語「アンタゴニスト抗体」は、結合活性（例えば、リガンド結合およびβ２−ミクログロブリン結合）または輸送活性（例えば、ＩｇＧを輸送し、そしてリソソームによる異化からＩｇＧを防御すること）などのＦｃＲｎの１つ以上の機能を阻害し得る抗体をいう。
【００４６】
特定の実施形態において、抗イディオタイプ抗体もまた、提供される。抗イディオタイプ抗体は、別の抗体の抗原結合部位に関連する抗原性決定因子を認識する。抗イディオタイプ抗体は、第２の抗体を産生するために使用される動物と同じ種の動物、そして好ましくは同じ系統の動物を免疫化することによって第２の抗体に対して調製され得る。例えば、米国特許第４，６９９，８８０号を参照のこと。１つの実施形態において、抗体は、ＦｃＲｎまたはその部分に対して惹起され、そしてこれらの抗体は、次に、抗イディオタイプ抗体を産生するために使用される。それによって産生された抗イディオタイプ抗体は、レセプターに結合する化合物（例えば、レセプター分画のリガンド）を結合し得、そしてこのような化合物を検出もしくは同定または定量するためにイムノアッセイにおいて使用され得る。このような抗イディオタイプ抗体はまた、ＦｃＲｎレセプター機能のインヒビターであり得るが、その抗イディオタイプ抗体は、レセプター自体を結合しない。このような抗イディオタイプ抗体はまた、アンタゴニスト抗体と称され得る。
【００４７】
特定の局面において、本発明は、ハイブリドーマ細胞株、およびこれらのハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体に関する。本発明の細胞株は、上記モノクローナル抗体の産生以外の用途を有する。例えば、本発明の細胞株は、さらなるハイブリドーマを産生するために他の細胞（例えば、適切に薬物でマーカー化した、ヒト骨髄腫細胞、マウス骨髄腫細胞、ヒト−マウス異種移植骨髄腫（ｈｅｔｅｒｏｍｙｅｌｏｍａ）細胞またはヒトリンパ芽球様（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ）細胞）と融合され、したがってモノクローナル抗体をコードする遺伝子の移入を提供し得る。さらに、上記細胞株は、抗ＦｃＲｎ免疫グロブリン鎖をコードする核酸の供給源として使用され得、その核酸は、（例えば、任意の適切な技術（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号を参照のこと）を使用して他の細胞に移入する際に）単離および発現され得る。例えば、再配列された抗ＦｃＲｎ軽鎖または抗ＦｃＲｎ重鎖を含むクローンが、単離（例えば、ＰＣＲによって）され得るか、またはｃＤＮＡライブラリーが、細胞株から単離されたｍＲＮＡから調製され得、そして抗ＦｃＲｎ免疫グロブリン鎖をコードするｃＤＮＡクローンが、単離され得る。したがって、上記抗体またはその部分の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸は、特定の免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらの改変体（例えば、ヒト化免疫グロブリン）の産生のために、種々の宿主細胞またはインビトロ翻訳系において組換えＤＮＡ技術に従って、入手および使用され得る。例えば、ｃＤＮＡを含む核酸、または改変体（例えば、ヒト化免疫グロブリンまたはヒト化免疫グロブリン鎖）をコードするその誘導体は、適切な原核生物ベクターまたは真核生物ベクター（例えば、発現ベクター）中に配置され得、そして適切な方法（例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、感染）によって適切な宿主細胞に導入され得、その結果、その核酸は、１つ以上の発現制御エレメント（例えば、ベクター中のもの、または宿主細胞ゲノムに組み込まれたもの）に作動可能に連結される。産生のために、宿主細胞は、発現に適した条件（例えば、誘導物質、適当な塩を補充した適切な培地、増殖因子、抗生物質、栄養補助物質（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）などの存在）において維持され得、それによって、そのコードされたポリペプチドが、産生される。所望の場合、そのコードされたタンパク質は、（例えば、その宿主細胞または培地から）回収および／または単離され得る。産生の方法はトランスジェニック動物の宿主細胞における発現を包含することが、認識される（例えば、ＷＯ  ９２／０３９１８、ＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（１９９２年３月１９日公開）を参照のこと）。
【００４８】
（ＩＩ．抗体産生の方法）
免疫化する抗原の調製、ならびにポリクローナル抗体産生およびモノクローナル抗体産生は、本明細書中に記載される通りに行われても、他の適切な技術を使用して行なわれてもよい。種々の方法が、記載されている。例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−４９７（１９７５）およびＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９（１９７６）；Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：５５０−５５２（１９７７）；Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉら、米国特許第４，１７２，１２４号；Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＤ．Ｌａｎｅ、１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻（第２７補遺、１９９４年夏）、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編、（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）、第１１章、（１９９１）を参照のこと。一般に、ハイブリドーマは、適切な不死の細胞株（例えば、ＳＰ２／０のような骨髄腫細胞株）を抗体産生細胞と融合することによって産生され得る。上記抗体産生細胞（好ましくは、脾臓またはリンパ節の抗体産生細胞）は、目的の抗原によって免疫化された動物から得られる。融合細胞（ハイブリドーマ）は、選択的培養条件を使用して単離され得、そして限界希釈法によってクローニングされ得る。所望の特異性を有する抗体を産生する細胞は、適切なアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）によって選択され得る。
【００４９】
必要な特異性の抗体を産生または単離する他の適切な方法が、使用され得、その方法は、例えば、ライブラリーから組換え抗体を選択する方法、またはヒト抗体の全てのレパートリーを産生し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス）の免疫化による方法を含む。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１−２５５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、米国特許第５，５４５，８０６号；Ｓｕｒａｎｉら、米国特許第５，５４５，８０７号を参照のこと。例えば、ＦｃＲｎ抗体は、合成ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリー（ＨｕＣＡＬ）から単離され得る。例えば、Ｋｎａｐｐｉｋら、２０００、Ｊ  Ｍｏｌ  ｂｏｉｌ  ２９６：５７−８６を参照のこと。
【００５０】
例示として、ＦｃＲｎポリペプチド（例えば、抗体応答を誘発し得るＦｃＲｎポリペプチドまたはその抗原性フラグメント、あるいはＦｃＲｎ融合タンパク質）に由来する免疫原が、動物（例えば、マウス、ハムスターまたはウサギ）を免疫化するために使用され得る。例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ編、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ：１９８８）を参照のこと。タンパク質またはペプチドに対して免疫原性を付与するための技術は、キャリアへの結合体化または当該分野において周知である他の技術を含む。ＦｃＲｎポリペプチドの免疫原部分は、アジュバントの存在下において投与され得る。免疫化の進行は、血漿または血清中の抗体力価の検出によってモニタリングされ得る。標準的なＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイは、抗体のレベルを評価するために、抗原のような免疫原と一緒に使用され得る。１つの実施形態において、本発明の抗体は、ＦｃＲｎタンパク質の細胞外部分またはそのフラグメントに対して特異的である。別の実施形態において、本発明の抗体は、上記ＦｃＲｎタンパク質の細胞内部分または膜貫通部分に対して特異的である。
【００５１】
ＦｃＲｎポリペプチドの抗原調製物を用いた動物の免疫化の後に、抗血清が、得られ得、そして所望の場合、ポリクローナル抗体が、その血清から単離され得る。モノクローナル抗体を産生するために、抗体産生細胞（リンパ球）は、免疫化した動物から回収され得、そしてその抗体産生細胞は、ハイブリドーマ細胞を産生するために、不死化細胞（例えば、骨髄腫）との標準的な体細胞融合手順によって融合され得る。このような技術は、当該分野において周知であり、そしてその技術としては、例えば、ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−４９７によって最初に開発された）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂａｒら、（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４：７２）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．ｐｐ．７７−９６）が挙げられる。ハイブリドーマ細胞は、ＦｃＲｎポリペプチドと特異的に反応する抗体およびこのようなハイブリドーマ細胞を含む培養物から単離されたモノクローナル抗体の産生について、免疫化学的にスクリーニングされ得る。
【００５２】
特定の実施形態において、本発明の抗体は、従来の技術を使用してフラグメント化され得、そのフラグメントは、完全な抗体の代わりに上記と同じ様式において有用性についてスクリーニングされ得る。例えば、Ｆ（ａｂ）２フラグメントは、ペプシンで抗体を処理することによって生成され得る。得られたＦ（ａｂ）２フラグメントは、ジスルフィド架橋を還元して、Ｆａｂフラグメントを生成するために処理され得る。
【００５３】
特定の実施形態において、本発明の抗体は、抗体の少なくとも１つのＣＤＲ領域によって付与されるＦｃＲｎポリペプチドに対する親和性を有する、二重特異的分子、一本鎖分子およびキメラ分子およびヒト化分子を含むことがさらに意図される。一本鎖抗体を生成するための技術（米国特許第４，９４６，７７８号）はまた、一本鎖抗体を生成するために適合され得る。また、トランスジェニックマウスまたは他の生物（他の哺乳動物を含む）は、ヒト化抗体を発現するために使用され得る。これら抗体を生成するための方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許第０，１２５，０２３号；Ｑｕｅｅｎら、欧州特許第０，４５１，２１６号；Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号；Ｂｏｓｓら、欧州特許第０，１２０，６９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、ＷＯ８６／０１５３３；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、欧州特許第０，１９４，２７６号；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｗｉｎｔｅｒ、欧州特許第０，２３９，４００号；Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．ら、欧州特許出願第０，５１９，５９６Ａ１を参照のこと。Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号；Ｈｕｓｔｏｎ、米国特許第５，４７６，７８６号；およびＢｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６（１９８８）もまた参照のこと。
【００５４】
このようなヒト化免疫グロブリンは、所望のヒト化鎖をコードする遺伝子（例えば、ｃＤＮＡ）を調製するために、合成核酸および／または組換え核酸を使用して生成され得る。例えば、ヒト化可変領域をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）配列は、ヒトの鎖またはヒト化した鎖をコードするＤＮＡ配列（例えば、予めヒト化した可変領域）の由来するＤＮＡテンプレートを変化させるために、ＰＣＲ変異誘発法を使用して構築され得る（例えば、Ｋａｍｍａｎ，Ｍ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７：５４０４（１９８９）；Ｓａｔｏ，Ｋ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：８５１−８５６（１９９３）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，Ｂ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９（９）：２４７１−２４７６（１９９１）；ならびにＬｅｗｉｓ，Ａ．Ｐ．およびＪ．Ｓ．Ｃｒｏｗｅ，Ｇｅｎｅ，１０１：２９７−３０２（１９９１）を参照のこと）。これらまたは他の適切な方法を使用して、改変体も油容易に生成され得る。一実施形態において、クローニングされた可変領域は変異誘発され得、そして所望の特異性を有する改変体をコードする配列が選択され得る（例えば、ファージライブラリーから；例えば、Ｋｒｅｂｂｅｒら、米国特許第５，５１４，５４８号；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、ＷＯ９３／０６２１３（１９９３年４月１日公開））。
【００５５】
特定の実施形態において、その抗体は、検出され得る標識にさらに結合される（例えば、標識は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素補因子であり得る）。その活性部分は、放射性因子（例えば、放射性重金属（例えば、鉄キレート化剤）、ガドリニウムもしくはマンガンの放射活性キレート、酸素、窒素、鉄、炭素もしくはガリウムの陽電子放射体、４３Ｋ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３２Ｉ、または９９Ｔｃ）であり得る。このような部分に付加される結合剤は、画像化剤として使用され得、そしてヒトのような哺乳動物における診断用途に有用な量において投与され得る。次いで、この画像化剤の位置および蓄積が検出される。その画像化剤の位置および蓄積は、ラジオシンチグラフィー、核磁気共鳴画像化法、コンピューター断層撮影法、または陽電子射出断層撮影法によって検出され得る。ＦｃＲｎに対する抗体または他の結合ポリペプチドを使用するイムノシンチグラフィーは、癌および脈管構造を検出および／または診断するために使用され得る。例えば、９９テクネチウム、１１１インジウム、１２５ヨウ素で標識したＦｃＲｎマーカーに対するモノクローナル抗体は、このような画像化法において有効に使用され得る。当業者に明らかであるように、投与されるべき放射性同位体の量は、その放射性同位体に依存する。当業者は、活性部分として使用される所定の放射性核種の比活性およびエネルギーに基づいて、投与されるべきその画像化剤の量を容易に処方し得る。代表的には、画像化剤１用量あたり０．１〜１００ミリキュリー、好ましくは、１〜１０ミリキュリー、最も頻繁には、２〜５ミリキュリーが投与される。従って、放射活性部分に結合体化した標的化部分を含む画像化剤として有用な本発明に従う組成物は、０．１〜１００ミリキュリー、いくらかの実施形態においては好ましくは１〜１０ミリキュリー、いくらかの実施形態においては好ましくは２〜５ミリキュリー、いくらかの実施形態においてはより好ましくは１〜５ミリキュリーを含む。
【００５６】
特定の好ましい実施形態において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体であり、特定の実施形態において、本発明は、新規な抗体を生成するための方法を利用する。例えば、ＦｃＲｎポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するための方法は、検出可能な免疫応答を刺激するに有効な量のＦｃＲｎポリペプチドを含む免疫原性組成物をマウスに投与する工程、そのマウスから抗体生成細胞（例えば、脾臓由来細胞）を得る工程、およびその抗体生成細胞と骨髄腫細胞とを融合して、抗体生成ハイブリドーマを得る工程、ならびにその抗体生成ハイブリドーマを試験して、ＦｃＲｎポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマを同定する工程、を包含し得る。一旦得られたら、ハイブリドーマを細胞培養において、必要に応じて、そのハイブリドーマ由来細胞がＦｃＲｎポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を生成する培養条件で、増殖させ得る。そのモノクローナル抗体は、細胞培養物から精製され得る。
【００５７】
さらに、所望の抗体を同定するために抗体をスクリーニングするために使用される技術は、得られる抗体の特性に影響を及ぼし得る。例えば、特定の治療目的に使用される抗体は、好ましくは、特定の細胞型を標的にすることが可能である。従って、この型の抗体を得るために、目的の抗原を発現する細胞に結合する抗体について（例えば、蛍光活性化セルソーティングによって）スクリーニングすることが望ましい。同様に、抗体が溶液中で抗原と結合させるために使用される場合、液相での結合（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ）を試験することが望ましい。種々の異なる技術が、抗体：抗原相互作用を試験して、特に望ましい抗体を同定するために利用可能である。このような技術としては、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴結合アッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイ、Ｂｉａ−ｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、サンドイッチアッセイ（例えば、ＩＧＥＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）の常磁性ビーズシステム）、ウェスタンブロット、免疫沈降アッセイおよび免疫組織化学が挙げられる。
【００５８】
本発明の抗体は、種々の適用（例えば、研究適用、診断適用および治療適用が挙げられる）において有用である。例えば、これら抗体は、レセプターもしくはその一部を単離および／または精製するために、ならびにレセプター構造（例えば、コンホメーション）および機能を研究するために使用され得る。
【００５９】
（ＩＩＩ．診断適用）
特定の局面において、本発明のＦｃＲｎ抗体は、例えば、ＦｃＲｎを発現する内因性細胞（例えば、腸上皮細胞および血管内皮細胞）において、またはＦｃＲｎレセプター遺伝子でトランスフェクトされた細胞において、ＦｃＲｎレセプターの発現を検出もしくは測定するために使用され得る。患者または個体におけるＦｃＲｎの検出は、ＦｃＲｎの関与が何らかの自己免疫疾患プロセスにおいて果たしている程度を決定することにおいて重要であり得る。特定の実施形態において、ＦｃＲｎ抗体は、診断目的もしくは研究目的で、細胞画像化（例えば、フローサイトメトリー、および蛍光活性化セルソーティング）において有用性を有し得る。
【００６０】
特定の実施形態において、上記抗体またはその抗体の抗原結合フラグメントは、診断目的で標識されてもよいし、標識されなくてもよい。代表的には、診断アッセイは、ＦｃＲｎへの抗体の結合から生じる複合体の形成を検出する工程を包含する。抗体は、直接標識され得る。種々の標識が使用され得る。これら標識としては、放射性核種、蛍光剤、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビターおよびリガンド（例えば、ビオチン、ハプテン）が挙げられるが、これらに限定されない。種々の適切なイムノアッセイが当業者に公知である（例えば、米国特許第３，８１７，８２７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９０１，６５４号；および同第４，０９８，８７６号を参照のこと）。標識されない場合、上記抗体は、凝集アッセイのようなアッセイにおいて使用され得る。標識されていない抗体はまた、抗体を検出するために使用され得る別の（１種以上の）適切な試薬（例えば、第１の抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体または標識されていない免疫グロブリンに対して特異的な他の抗体）と反応する標識抗体（例えば、第２の抗体））または他の試薬（例えば、標識プロテインＡ）と組み合わせて使用され得る。ＦｃＲｎ抗体はまた、化学基（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチル基もしくはエチル基、または炭水化物基）で誘導体化され得る。これら基は、上記抗体の生物学的特性を改善するために（例えば、血清半減期を増すためまたは組織結合を増すために）有用であり得る。
【００６１】
一実施形態において、本発明の抗体は、酵素イムノアッセイにおいて利用され得る。ここで本発明の抗体、または第２の抗体は、酵素に結合され得る。ＦｃＲｎタンパク質を含む生物学的サンプルが本発明の抗体と合わされる場合、この抗体とＦｃＲｎタンパク質との間で結合が生じる。一実施形態において、ＦｃＲｎタンパク質を発現する細胞（例えば、内皮細胞）を含むサンプルが本発明の抗体と合わされると、この抗体と、この抗体によって認識されるエピトープを含むＦｃＲｎタンパク質を有する細胞との間で結合が生じる。これら結合した細胞は、結合していない試薬から分離され得、その細胞に特異的に結合した抗体−酵素結合体の存在が、例えば、そのサンプルと上記酵素の基質（この酵素の基質は、その酵素が作用したときに呈色または他の検出可能な変化を生じる）とを接触させることによって、決定され得る。別の実施形態において、本発明の抗体は、標識されていなくてもよく、本発明の抗体を認識する第２の標識された抗体が添加され得る。
【００６２】
特定の局面において、生物学的サンプル中でＦｃＲｎタンパク質の存在を検出することにおいて使用するためのキットもまた、調製され得る。このようなキットは、ＦｃＲｎタンパク質またはそのレセプターの一部に結合する抗体、ならびにその抗体とＦｃＲｎもしくはその一部との間の複合体の存在を検出するに適切な１種以上の補助的な試薬を含む。本発明の抗体組成物は、凍結乾燥形態において、単独でまたは他のエピトープに対して特異的なさらなる抗体と組み合わせて提供され得る。この抗体は標識されていてもされていなくてもよく、付属成分（例えば、緩衝化剤（例えば、Ｔｒｉｓ、リン酸塩および炭酸塩）、安定化剤、賦形剤、殺虫剤および／または不活性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン））とともにキット中に含まれ得る。例えば、上記抗体は、付属成分との凍結乾燥混合物として提供されてもよいし、その付属成分は、ユーザーが組み合わせるために別個に提供されてもよい。一般に、これら付属物質は、活性抗体の量に基づいて約５重量％未満で存在し、通常、抗体濃度に基づいて少なくとも約０．００１重量％の総量で存在する。上記モノクローナル抗体に結合し得る第２の抗体が使用される場合、このような抗体は、例えば、別個のバイアルもしくは容器において、キット中に提供され得る。存在する場合、この第２の抗体は、代表的には標識され、そして上記の抗体処方物と類似の様式で処方され得る。
【００６３】
同様に、本発明はまた、ＦｃＲｎもしくは細胞によるそのレセプターの一部の発現を検出および／または定量する方法に関する。ここで細胞またはその画分（例えば、膜画分）を含む組成物は、ＦｃＲｎもしくはそのレセプターの一部に結合する抗体と、これらＦｃＲｎもしくはそのレセプターの一部への上記抗体の結合に適した条件下で接触させられ、抗体結合がモニターされる。抗体とＦｃＲＮもしくはその一部との間の複合体の形成の指標である、その抗体の検出は、上記レセプターの存在を示す。上記細胞に対する抗体の結合は、標準的な方法（例えば、作業実施例において記載される方法）によって決定され得る。その方法は、個体に由来する細胞におけるＦｃＲｎの発現を検出するために使用され得る。特定の実施形態において、内皮細胞におけるＦｃＲｎの定量的発現は、例えば、免疫蛍光顕微鏡によって評価され得る。代替の実施形態において、定量的評価は、血中白血球のフローサイトメトリーおよびフローサイトメトリーによって評価され得、そしてその染色強度が、疾患の素因、進行もしくは危険性と相関され得る。
【００６４】
本発明はまた、特定の疾患に対する哺乳動物の素因を検出する方法に関する。例示すると、この方法は、細胞上に存在するＦｃＲｎの量および／または哺乳動物におけるＦｃＲｎ陽性細胞の数に基づいて、進行する疾患に対する哺乳動物の素因を検出するために使用され得る。一実施形態において、本発明は、自己免疫疾患に対する哺乳動物の素因を検出する方法に関する。この実施形態において、試験されるべきサンプルは、ＦｃＲｎもしくはその一部に結合する抗体と、これらＦｃＲｎもしくはそのレセプターの一部への上記抗体の結合に適した条件下で接触させられる。ここでそのサンプルは、通常の個体においてＦｃＲｎを発現する細胞を含む。抗体の結合および／または結合量が検出され、このことは、自己免疫疾患に対する上記個体の素因を示し、ここでレセプターのより高いレベルは、自己免疫疾患に対する上記個体の増大した素因と相関する。
【００６５】
（ＩＶ．治療適用）
特定の実施形態において、本発明は、自己免疫疾患（または自己免疫障害）を処置するための組成物および方法を提供する。他の実施形態において、本発明は、個体におけるＦｃＲｎ媒介性ＩｇＧ保護を阻害するための方法を提供する。これら方法は、上記の１種以上のＦｃＲｎ抗体の治療上有効な量をその個体に投与する工程を包含する。これら方法は、動物、より具体的にはヒトの治療的処置および予防的処置を特に目的とする。
【００６６】
本明細書中で記載されるように、ＦｃＲｎ抗体による処置に適した自己免疫疾患としては、全身性エリテマトーデス、インスリン耐性糖尿病、重症筋無力症、多発性動脈炎、自己免疫性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚血管炎、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、グッドパスチャー症候群、慢性関節リウマチ、川崎病、およびシェーグレン症候群が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
このような方法の特定の実施形態において、１種以上のＦｃＲｎ抗体が一緒に（同時に）または異なる時間に（連続して）投与され得る。特定の実施形態において、本発明の抗体はまた、他の抗体治療剤（モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）とともに使用され得る。
【００６８】
特定の実施形態において、本発明のＦｃＲｎ抗体は、単独で使用され得る。あるいは、ＦｃＲｎ抗体は、免疫刺激剤、免疫調節剤、またはこれらの組み合わせと組み合わせて使用され得る。幅広い範囲の従来の化合物が、免疫調節活性を有することが示されている。これらの化合物としては、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、腫瘍壊死因子α、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。本発明によって、自己免疫疾患についての従来の治療の有効性が本発明の１種以上のＦｃＲｎ抗体の使用を通じて増強され得ることが認識される。
【００６９】
特定の実施形態において、本発明のＦｃＲｎ抗体は、自己免疫疾患についての公知の治療と併用され得る。このような自己免疫疾患の公知の治療の例としては、非ステロイド系抗炎症薬物（ＮＳＡＩＤ）またはコルチコステロイドでの治療が挙げられるが、これらに限定されない。自己免疫疾患についての治療の他の例としては、高用量の抗体を患者に周期的に投与することが挙げられる。
【００７０】
特定の具体的実施形態において、本発明のＦｃＲＮ抗体は、癌を画像化または処置するために使用される放射活性抗体または毒素に結合した抗体のクリアランスを促進するために使用され得る。
【００７１】
併用療法の性質に依存して、他の治療が施されると同時に本発明の抗体の投与が継続され得るか、または他の治療の後に本発明の抗体の投与が行われる。抗体の投与は、単一用量においてかまたは複数用量において行われ得る。いくらかの場合において、抗体の投与は、従来の治療の数日前に開始される一方で、他の場合には、投与は、従来の治療が施される直前またはそのときに開始される。
【００７２】
（Ｖ．薬学的組成物および投与様式）
特定の実施形態において、本発明の抗体は、薬学的に受容可能なキャリアとともに処方される。このような抗体は、単独で、または薬学的処方物（薬学的組成物）の成分として投与され得る。この化合物は、ヒトまたは獣医学における使用のための任意の好都合な様式において投与するために処方され得る。湿潤剤、乳化剤および滑沢剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム）、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、矯味矯臭剤、保存剤および抗酸化剤もまた、この組成物中に存在し得る。
【００７３】
本発明の抗体の処方物は、経口投与、食事による投与、局所投与、非経口投与（例えば、静脈内注射、動脈内注射、筋肉内注射、皮下注射）、吸入（例えば、気管支内吸入、鼻腔内吸入、または経口吸入、点鼻）、直腸投与、および／または膣内投与に適したものが挙げられる。他の適切な投与方法はまた、再充填可能なデバイスまたは生分解性デバイス、および徐放性ポリマーデバイス（ｓｌｏｗ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｄｅｖｉｃｅ）が挙げられ得る。本発明の薬学的組成物は、他の薬剤とともに併用療法の一部として（同じ処方物または別個の処方物のいずれかで）投与され得る。
【００７４】
上記処方物は、好都合には、単一投薬形態において提示され得、薬学分野で周知の任意の方法によって調製され得る。単位投薬形態を生じるためにキャリア物質と合わせられ得る活性成分の量は、処置される宿主、特定の投与様式に依存して変動する。単一投薬形態を生じるためにキャリア物質と合わせられ得る活性成分の量は、治療効果を生じるその化合物の量である。
【００７５】
特定の実施形態において、これら処方物または組成物を調製する方法は、別の型の免疫調節剤およびキャリア、および必要に応じて１種以上の補助成分をあわせる工程を包含する。一般に、上記処方物は、液体キャリア、もしくは微細に分離した固体キャリア、またはその両方とともに調製され得、次いで、必要であれば、製品に成形される。
【００７６】
経口投与のための処方物は、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ（香味をつけた基剤、通常は、スクロースおよびアカシアゴムまたはトラガカントゴムを使用する）、散剤、顆粒剤の形態で、または水溶液もしくは非水溶液での液剤もしくは懸濁剤として、または水中油滴エマルジョンもしくは油中水滴エマルジョンとして、またはエリキシル剤もしくはシロップ剤として、または錠剤（ｐａｓｔｉｌｌｅ）（不活性基剤（例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアゴム）を使用する）ならびに／あるいはマウスウォッシュなどとして存在し得る。各々は、活性成分として所定の量の１種以上の本発明の抗体を含む。
【００７７】
経口投与のための液体投薬形態としては、薬学的に受容可能なエマルジョン、マイクロエマルジョン、液剤、懸濁剤、シロップおよびエリキシル剤が挙げられる。その活性成分に加えて、その液体投薬形態は、当該分野で一般に使用される不活性希釈剤（例えば、水または他の溶媒）、可溶化剤および乳化剤（例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、カルボン酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、およびこれらの混合物）を含み得る。不活性希釈剤の他に、上記経口用組成物はまた、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、矯味矯臭剤、着色剤、香料、および保存剤のような補助剤を含み得る。
【００７８】
活性化合物に加えて、懸濁剤は、懸濁化剤（例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、およびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天（ａｇａｒ−ａｇａｒ）、およびトランガカントゴム、ならびにこれらの混合物）を包含し得る。
【００７９】
本発明の処方物（ｍｅｔｈｏｄ）は、局所的に、例えば、皮膚に投与され得る。この局所用処方物は、皮膚透過増強剤または角質透過増強剤として有効であることが公知の、幅広い種々の１種以上の薬剤をさらに含み得る。これらの例は、２−ピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、プロピレングリコール、メチルアルコールもしくはイソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、およびアゾン（ａｚｏｎｅ）である。さらなる薬剤が、上記処方物を審美的に許容可能にするためにさらに含まれ得る。これらの例は、脂肪、ワックス、油、色素、香料、保存剤、安定化剤、および界面活性剤である。表皮剥離剤（例えば、当該分野で公知のもの）がまた、含まれ得る。例は、サリチル酸および硫黄である。
【００８０】
局所投与および経皮投与のための投薬形態としては、散剤、スプレー剤、軟膏、パスタ剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル、液剤、パッチ、および吸入剤が挙げられる。本発明の抗体は、薬学的に受容可能なキャリア、および保存剤、緩衝化剤、または必要とされ得るプロペラントと、無菌条件下で混合され得る。軟膏、パスタ剤、クリーム剤およびゲルは、抗体に加えて、賦形剤（例えば、動物性脂肪および植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トランガカントゴム、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはこれらの混合物）を含み得る。
【００８１】
非経口投与に適した薬学的組成物は、１種以上の薬学的に受容可能な滅菌等張性水溶液もしくは滅菌等張性非水溶液、分散剤、懸濁剤、エマルジョン、または使用直前に滅菌注射用液もしくは分散剤に再構成され得る滅菌散剤（抗酸化剤、緩衝化剤、静菌薬、処方物を意図されたレシピエントの血液と等張性にする溶質、または懸濁化剤もしくは濃化剤を含み得る）と組み合わせて、１種以上の抗体を含み得る。本発明の薬学的組成物において使用され得る適切な水性キャリアおよび非水性キャリアの例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物、植物性油（例えば、オリーブ油）、ならびに注射用有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられる。例えば、コーティング用物質（例えば、レシチン）の使用によって、懸濁剤の場合に必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、適切な流動性が維持され得る。
【００８２】
これら組成物はまた、補助剤（例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤）を含み得る。微生物活動の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸など）を含めることによって確実にされ得る。等張剤（例えば、糖、塩化ナトリウムなど）を組成物に含めることも望ましい。さらに、注射用医薬形態の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含めることによってもたらされ得る。
【００８３】
注射用デポー形態は、生分解性ポリマー（例えば、ポリラクチド−ポリグリコリド）中に１種以上の抗体のマイクロカプセルマトリクスを形成することによって作製される。薬物対ポリマーの比、および使用される特定のポリマーの性質に依存して、薬物放出の速度は制御され得る。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射用処方物はまた、身体組織と適合するリポソームもしくはマイクロエマルジョンの中に薬物を捕捉することによって調製される。
【実施例】
【００８４】
（例示）
本発明はこれまでのところ一般的に記載されているが、本発明は、以下の実施例を参照することによって、より容易に理解される。以下の実施例は、本発明の特定の局面および実施形態を例示するために含まれているに過ぎず、以下の実施例は、本発明を限定することは意図されるものではない。
【００８５】
本出願人の最初の目的は、ｈＦｃＲｎへのｈＩｇＧおよびアルブミンの結合が細胞表面モニタリング法（例えば、フローサイトメトリー）を使用して簡便に測定され得る細胞株を作製することであった。ＦｃＲｎの定常状態での局在化は、通常ではエンドソーム局在化である（Ｃｌａｙｐｏｏｌら，２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２８０３８〜５０；Ｏｂｅｒら，２００４，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２：２０２１〜９）。ｈＦｃＲｎの可視化を容易にするために、本出願人は、末端シグナル配列コドンと成熟ｈＦｃＲｎタンパク質の最初のコドンとの間にインフレームでクローン化された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）コードｃＤＮＡフラグメントを含む、構築物を作製した。エンドソームから形質膜へとｈＦｃＲｎを向けるために、本出願人はその後、正常な細胞質エンドソーム標的化ドメインが欠失されるように、上記構築物を操作した（図１Ａ）。ヒトＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトした場合、上記ＧＦＰ改変型構築物（ｓｓＥＣＴＭ）と、ＧＦＰを欠く同様の構築物（ＥＣＴＭ）とは、ｈＦｃＲｎを通常のエンドソームパターンから形質膜へと向けた。
【００８６】
ＨＥＫ２９３細胞中に安定にトランスフェクトされたｓｓＥＣＴＭ構築物およびＨＥＫ２９３細胞中に安定にトランスフェクトされたＥＣＴＭ構築物を、その後、それらがｐＨ依存性様式でｈＩｇＧに結合する能力を分析するために、フローサイトメトリー分析のために使用した（図１Ｂ）。上記ｓｓＥＣＴＭトランスフェクト体およびＥＣＴＭトランスフェクト体は、ｐＨ６では同等のｈＩｇＧ結合を示したが、ｐＨ７．４ではそうではなかった。このことは、上記ＧＦＰタグがｈＩｇＧ−ｈＦｃＲｎのｐＨ依存性結合に影響を与えなかったことを示す。これらの結果は、ｈＩｇＧおよびＨＳＡの結合についてモニターするためにｓｓＥＣＴＭトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞株を使用することを確認した。
【００８７】
その後、フローサイトメトリーを使用して、ＨＳＡがｈＩｇＧとともにｈＦｃＲｎと相互作用する可能性を評価した（図２）。ｐＨ６にてｓｓＥＣＴＭ細胞を精製ＨＳＡとともにインキュベート（図２Ａ３；ｐ≦０．００２）およびｐＨ６にてｓｓＥＣＴＭ細胞をヒト血清とともにインキュベート（図２Ａ４；ｐ≦０．００２）すると、ＳＡ−ＡＰＣと組み合わせたＧＡＨｂｉｏによって検出されるＳＡ結合を生じたが、ｓｓＥＣＴＭ細胞をＧＡＨＳＡ−ビオチン＋ＳＡ−ＡＰＣのみとともにインキュベートした場合には、結合は観察されなかった（図２Ａ１）。ｐＨ６．０では、ｓｓＥＣＴＭ細胞をヒト血清およびＧＡＨ  ＩｇＧ−ＰＥとともにプレインキュベートした場合に、ｈＦｃＲＮ−ＧＦＰに対するｈＩｇＧの結合を検出することが同様に可能であった（図２Ａ５；ｐ≦０．００３）が、細胞をＧＡＨ  ＩｇＧ−ＰＥのみとインキュベートした場合には、結合は検出されなかった（図２Ａ２）。中性ｐＨ（ｐＨ７．４）では、ｈＦｃＲｎ−ＧＦＰを発現するｓｓＥＣＴＭ細胞に対するＩｇＧの結合もＨＳＡの結合も、観察されなかった（図２Ａ６〜図２Ａ１０）。
【００８８】
ＨＳＡ結合の特異性を確認するために、本出願人は、ビオチン化ＨＳＡを使用することによって、同様の実験を実施した（ＨＳＡ−ｂｉｏ；図２Ｂ）。酸性ｐＨにおいて、ｓｓＥＣＴＭ細胞に対するＨＳＡ−ｂｉｏの結合が、ＳＡ−ＡＰＣのみを用いた場合（図２Ｂ１）と比較して、ＳＡ−ＡＰＣを用いて検出した場合に観察された（図２Ｂ２；ｐ≦０．００１）。中性ｐＨにおいては、結合は観察されなかった（図２Ｂ３および図２Ｂ４）。同様の結果が、ＥＣＴＭ細胞（ＧＦＰタグを欠く）を使用することによって得られた。このことは、ＨＳＡ−ｂｉｏ（ｐ≦０．００６）およびｈＩｇＧ３−ＡＦ６４７（ｐ≦０．００１）の両方が、上記ＧＦＰタグとは無関係にｈＦｃＲｎに特異的に結合可能であったことを確認した（図２Ｃ）。従って、上記の酸性ｐＨ依存性結合は、ｈＦｃＲｎとＧＦＰとの融合によって生じたアーティファクトではなかった。さらに、非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞は、酸性ｐＨにおいて、認識可能なＨＳＡｂｉｏ結合もｈＩｇＧ３−ＡＦ結合も示さなかった（図２Ｄ）。これらの結果は、ｈＩｇＧおよびＨＳＡの結合を評価するためのｓｓＥＣＴＭトランスフェクト細胞の使用を確認し、ｈＩｇＧおよびＨＳＡが酸性ｐＨ（ｐＨ６．０）ではｈＦｃＲＮに結合するが、中性ｐＨ（ｐＨ７．４）では結合しないことを示唆した。
【００８９】
ｈｕＩｇＧおよびＨＳＡの両方がｐＨ依存性様式でｈＦｃＲｎに特異的に結合することが示されたので、本出願人はその後、ｈＦｃＲｎのアルブミン結合部位とｈＦｃＲｎのＩｇＧ結合部位との間に重複が存在するか否かについて取り組んだ。本出願人はまず、ＨＳＡおよびｈＩｇＧが、ヒトトランスフェリン（ｈＴＦ）とともに、ｐＨ６においてｓｓＥＣＴＭ細胞に対するｈＩｇＧ−ＡＦおよびＨＳＡ−ｂｉｏの結合を阻害する能力を評価した。ＨＳＡおよびｈＴＦは、ｈＦｃＲｎに対するｈＩｇＧの結合を認識可能には阻害しなかった（図３Ａ）。反対に、ＨＳＡは、高濃度（＞１６ｍｇ／ｍｌ）においてのみ、ｈＩｇＧ−ＡＦ６４７結合を最小限度阻害し、ｈＴＦはそれ以下であった（図３Ｂ）。これらの結果は、ＨＳＡおよびｈｕＩｇＧがｈＦｃＲｎ上にある非競合的酸性ｐＨ依存性部位に結合することを示唆する。
【００９０】
ＦｃＲｎの治療的ブロックは、ＩｇＧ自己抗体により引き起こされる自己免疫疾患を処置するための有望なアプローチとして想定される（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．１７６，４９３３〜３９；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎら、１９９７、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５９：４７８１〜９２；Ｌｉｕら、１９９７、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８６：７７７〜８３；Ａｋｉｌｅｓｈら、２００４、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１３：１３２８〜３３）。実際、ＦｃＲｎが欠損したマウスは、病原性ＩｇＧ抗体により引き起こされる関節炎に対して抵抗性である（Ａｋｉｌｅｓｈら、２００４、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１３：１３２８〜３３）。しかし、酸性ｐＨ６においてｈＩｇＧおよびＨＳＡがｈＦｃＲｎに結合するという事実が原因で、主要な懸念事項は、ＦｃＲｎのブロックが、アルブミンのＴ１／２および血清濃度の減少を生じ得ることである。アルブミンは、正常なコロイド浸透圧の維持のため、ｐＨ緩衝化、および多数の分子（胆汁酸、脂肪酸、ビタミン、および薬物が挙げられる）の輸送のために重要であると考えられている（Ｐｅｔｅｒｓ，１９９６，Ａｌｌ  Ａｂｏｕｔ  Ａｌｂｕｍｉｎ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓにおいて概説される）ので、ＦｃＲｎブロックは、深刻な副作用をもたらし得る。生じ得るそのような深刻な副作用を回避するために、抗ＦｃＲｎ治療剤は、ＩｇＧ結合を選択的に阻害するがアルブミンは阻害しない必要がある。
【００９１】
ＦｃＲｎの結合およびアルブミンの保護を損なうことなくｈＦｃＲｎに対するｈＩｇＧ結合を選択的にブロックすることが可能であるか否かを決定するために、本出願人は、抗原結合部位がｈＦｃＲｎに特異的である一群のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作製した。これを行うために、本出願人はまず、マウスＦｃＲｎを欠損したマウスを、ｈＦｃＲｎトランスジーンを発現するマウス由来の細胞で免疫した。主要な目的は、ｈＩｇＧ／ｈＦｃＲｎ相互作用をブロック可能な抗体を産生するマウスを同定することであったので、その後、それらの血清を、フローサイトメトリーアッセイにおいてｓｓＥＣＴＭ細胞株を使用してスクリーニングして、ｐＨ６においてｈＩｇＧがｈＦｃＲＮに結合するのをブロックする上記血清の能力を測定した。ブロック活性は、免疫したマウスのうちの１４％の血清において検出された。その後、その血清がブロック活性を示したマウスの脾臓細胞を、従来のハイブリドーマ技術（ＣｏｏｐｅｒおよびＰａｔｅｒｓｏｎ，２００４，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｗｉｌｅｙ．１：２．４．１〜２．５．１４）を使用して不死化した。その後、増殖中のハイブリドーマに由来する培養上清を、（材料および方法）において記載される細胞ＥＬＩＳＡを使用して、ｐＨ７．５でのｈＦｃＲｎへの結合についてスクリーニングした。再クローン化されたハイブリドーマに由来する上清を、同様にスクリーニングした。本発明にとって重要であったのは、分泌されたｍＡｂが中性条件下でｈＦｃＲｎに結合可能であるだけでなく酸性条件下でもｈＦｃＲｎに結合可能であることであったので、その後、安定なハイブリドーマクローンに由来する上清を、ｐＨ６においてｈＦｃＲｎに結合する能力についてｓｓＥＣＴＭ細胞を使用して試験した。精製ｍＡｂであるＡＤＭ１１、ＡＤＭ１２、ＤＶＮ２１、ＤＶＮ２３、ＤＶＮ２４、ＡＤＭ３１、およびＡＤＭ３２は、両方のｐＨにおいてインビトロでｈＦｃＲｎに結合した。一方、ｍＡｂであるＤＶＮ１およびＤＶＮ２２は、ｐＨ７．５ではｈＦｃＲｎに結合したが、ｐＨ６．０では結合しなかった。ＤＶＮ２４、ＡＤＭ３１、ＡＤＭ３２および非ｈＦｃＲｎ特異的コントロールｍＡｂであるＡＤＭ３３についての例示データが、図４の左および中央の分散図において示される。
【００９２】
目的は、ｈＦｃＲｎの治療的ブロックのための抗ＦｃＲｎ  ｍＡｂの使用であるので、その後、上記の抗ｈＦｃＲｎ  ｍＡｂを、それらがｐＨ６においてインビトロでｈＦｃＲｎの結合をブロックする能力について分析した。図３Ａにおいて使用したブロックアッセイの改変形を、このために使用した。図４の最も右の分散図は、ＤＶＮ２４がｈＦｃＲｎに対するｈＩｇＧ３の結合を有効にブロックしたが、同じ実験において分析した他の抗ＦｃＲｎ  ｍＡｂはどれもｈＦｃＲｎに対するｈＩｇＧ３の結合をブロックしなかったことを示すデータを示す。図５Ａは、種々の濃度の上記抗ｈＦｃＲｎ  ｍＡｂのうちのいくつかを使用して、ｐＨ６においてｈＩｇＧがｈＦｃＲｎに結合するのをそれらのｍＡｂがブロックする能力を決定した、一連のフローサイトメトリーデータを示す。２つだけのｍＡｂ（ＤＶＮ２１およびＤＶＮ２４）が、一定濃度範囲にわたって有効なブロックを示した。従って、これらの２つのｍＡｂは、ｈＦｃＲｎの治療的ブロックのための候補であり、ＤＶＮ２４が、濃度に基づいて最も有効である。
【００９３】
しかし、治療適用のためには、ｈＩｇＧの結合をブロック可能なｍＡｂが、アルブミン結合はブロックしないことが、重要であった。従って、本出願人は、図３Ｂにおいて記載されるブロックアッセイの改変形を使用して、上記の抗ｈＦｃＲｎ  ｍＡｂ群がＨＳＡのｐＨ６．０依存性結合をブロック可能であるか否かを決定した。図５Ｂにおいて示されるように、漸増濃度のＤＶＮ２１およびＤＶＮ２４は、アルブミンの結合を認識可能には阻害しなかった。対照的に、２つの抗ｈＦｃＲｎ  ｍＡｂ（ＡＤＭ３１およびＡＤＭ３２）は、ｈＦｃＲｎに対するＨＳＡの結合を有効にブロックした。
【００９４】
いくつかの抗ＦｃＲｎ  ｍＡｂが上記のｈＩｇＧのｐＨ６依存性結合を有効にブロックしたが、他の抗ＦｃＲｎ  ｍＡｂはＨＳＡ結合を有効にブロックしたという事実は、ＩｇＧ防御経路を選択的に標的とする一方でアルブミン防御経路を無傷のまま残す抗ｈＦｃＲｎ治療剤を開発し得ることを、強く示唆する。従って、ＤＶＮ２１およびＤＶＮ２４により例示される抗ｈＦｃＲｎ  ｍＡｂは、ＨＳＡをインビボで安定化するｈＦｃＲｎの選択的な治療的ブロックのための優れた候補であると、想定される。
【００９５】
本発明の主要な目的は、インビボにおいてｈＩｇＧの血清Ｔ１／２を減少させる抗ＦｃＲｎ  ｍＡｂを同定することである。これを行うために、本出願人は、マウスＦｃＲｎを欠くがｈＦｃＲｎについてトランスジェニックであるマウスを作製した（Ｃｈａｕｄｈｕｒｙら、２００３、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９７：３１５〜２２；Ｒｏｏｐｅｎｉａｎら、２００３、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０：３５２８〜３３）。マウスＦｃＲｎを欠くがｈＦｃＲｎトランスジーンは保有しないマウスと比較して長いｈＩｇＧのＴ１／２は、上記ｈＦｃＲｎトランスジーンの直接的結果である（Ｒｏｏｐｅｎｉａｎら、２００３、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０：３５２８〜３３）。その後、本出願人は、ＤＶＮ２４の注入によって、ｈＦｃＲｎがｈＩｇＧを安定化するのを治療的にブロックし、以前に投与されたｈＩｇＧトレーサー抗体の血清Ｔ１／２を短縮させ得るか否かを試験した。図６は、漸増濃度の注入ＤＶＮ２４は、実際には、用量依存性様式でｈＩｇＧトレーサーのクリアランスを促進し、従ってそのＴ１／２を減少させたことを、示す。ｈＩｇＧの濃度は、ネガティブコントロールであるアイソタイプが一致したｍＡｂの同様の用量と比較して、９日目までに３分の１に減少した。
【００９６】
その後、本出願人は、ＤＶＮ２４がｈＩｇＧのクリアランスを促進する能力とＡＤＭ３２がｈＩｇＧのクリアランスを促進する能力とを比較した。ＤＶＮ２４はまた、６日目にｈＩｇＧトレーサーの血清濃度の約３分の１への減少を促進した（図７Ａ）。しかし、ＡＤＭ３２の注入は、上記のネガティブコントロールｍＡｂによって達成されたｈＩｇＧトレーサーの血清濃度を超えて、ｈＩｇＧトレーサーの血清濃度に顕著には影響を与えなかった（図７Ａ）。さらに、ＤＶＮ２４は、ＨＳＡトレーサーの濃度に顕著には影響を与えなかった（図８Ｂ）。上記のインビトロでのブロック結果（図６）は、ＡＤＭ３１がＨＳＡ結合をブロックしたがｈＩｇＧ結合はブロックしなかったことを示した。ＤＶＮ２４は、ｈＩｇＧ結合をブロックしたがＨＳＡ結合はブロックしなかったので、これらの結果は、ｈＩｇＧのインビボクリアランスを選択的に増加させる一方でＨＳＡのクリアランスは促進しない、ｍＡｂブロック因子（ＤＶＮ２４によって例証される）を生成することが可能であることを、示す。従って、そのようなブロック因子は、血清アルブミン濃度に影響を与えることなく病原性自己抗体を除去するための主要候補であると考えられる。
【００９７】
抗ｈＦｃＲｎ治療剤の開発に向けての重要な考慮事項は、そのような治療剤が自己免疫病変から患者を防御するか否かである。実際、本出願人は、マウスＦｃＲｎの欠損が、関節炎原性（ａｒｔｈｒｉｔｏｇｅｎｉｃ）マウスＩｇＧの転移によって通常は引き起こされる関節炎性関節病変をマウスが発症することを防御することを以前に示した（Ａｋｉｌｅｓｈら、２００４、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１３：１３２８〜３３）。しかし、抗ｈＦｃＲｎ  ｍＡｂ治療剤がヒト病原性自己抗体をブロックするために使用され得るか否かが、決定されなければならない状態のままであった。従って、本出願人は、関節リウマチを有する患者に由来するＩｇＧが、体液性免疫疾患を発症するように遺伝的に過剰感作されたマウス中に移入された場合に関節炎症を引き起こすモデル（このマウスは、阻害性ＦｃレセプターであるＦｃｇｒ２ｂを欠損しているからである）を開発した（ＢｏｌｌａｎｄおよびＲａｖｅｔｃｈ，２０００，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：２７７〜８５；Ａｋｉｌｅｓｈら、２００４，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１３：１３２８〜３３）。本出願人は、関節リウマチを有すると診断された患者に由来する血清または血漿が、Ｆｃｇｒ２ｂマウス中に移入された場合に一過性の足首の腫脹および炎症を引き起こすが、非疾患コントロールに由来の血清も血漿もそうではないことを見出した。上記の炎症活性は、ＩｇＧ画分中に存在した。このことは、この炎症活性が、ＩｇＧ抗体によって引き起こされたことを示す。ＤＶＮ２４によるｈＦｃＲｎのブロックが上記の関節病変の軽減をもたらし得るか否かを研究するために、本出願人は、ｍＦｃＲｎ−／−Ｆｃｇｒ２ｂ−／−ｈＦｃＲｎトランスジェニックマウスを作製した。これらのマウスが発現する唯一のＦｃＲｎ形態がヒト形態であるので、そのようなマウスにおけるｈＩｇＧ安定化は、ｈＦｃＲｎの結果としてのみ生じるはずである。従って、抗ｈＦｃＲｎが上記炎症病変を軽減する能力は、抗ｈＦｃＲｎブロックが病原性ヒト抗体誘導性病変の処置において、正の治療的利益を提供するという、証拠である。図８において示されるデータは、ＤＶＮ２４の投与が、上記のネガティブコントロールｍＡｂの投与と比較して、上記の関節炎性病変をかなり減少したことを示す。この例示的データは、ｈＦｃＲｎの決定基に対するｍＡｂ（上記の研究は、アルブミン安定化を妨害しないことを示す）が、病原性ヒト抗体により引き起こされる病変に対する防御を提供し得ることを示す。従って、ｈＦｃＲｎによるｈＩｇＧの正常な防御についてのこの選択的治療的ブロックを提供する因子が、ヒト自己免疫疾患を処置するために使用され得ることが、想定される。
【００９８】
（材料および方法）
（マウス）
ＦｃＲｎｔｍ１Ｄｅｒについてヌル対立遺伝子を保有するマウス（Ｒｏｏｐｅｎｉａｎら、２００３、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０：３５２８〜３３）を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）マウスに対して最低１０回戻し交配した。ヒト（ｈ）ＦｃＲｎトランスジェニック（Ｔｇ）株ｈＦｃＲｎ２７６について同系であるマウスであって、異種プロモーター／エンハンサーにより駆動されるヒトＦｃＲｎ  ｃＤＮＡを保有するマウスを、記載されるように（Ｃｈａｕｄｈｕｒｙら、２００３，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９７：３１５〜２２；Ｒｏｏｐｅｎｉａｎら、２００３，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０：３５２８〜３３）、独立したＢ６初代始原（ｆｏｕｎｄｅｒ）動物から確立した。Ｆｃｇｒ２ｂ−／−について欠損性のマウスを、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から取得した。ＦｃＲｎ−／−Ｆｃｇｒ２ｂ−／−ｈＦｃＲｎトランスジェニック株２７６マウスを、ＦｃＲｎ−／−ｈＦｃＲｎトランスジェニック株２７６マウスとＦｃｇｒ２ｂ−／−マウスとの異種交配によって産生した。
【００９９】
（トレーサーヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびｈＩｇＧのインビボでのモニタリング）
１００μｇのＨＳＡ（１０：１の重量比にてＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチンでビオチン化されている；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）トレーサーおよびヒト化ＩｇＧ１（抗Ｈｅｒ−２  ＩｇＧ１；Ｇ．Ｍｅｎｇ，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から好意により提供された）トレーサーを、記載されるように（Ｒｏｏｐｅｎｉａｎら、２００３、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０：３５２８〜３３）、腹腔内注射した。血液を、上記のトレーサー注射の直前、および７日間にわたって２４時間ごとに、後眼窩静脈叢（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌ  ｐｌｅｘｕｓ）から連続収集した。マウス血清中にある抗Ｈｅｒ−２  ｈＩｇＧ１抗体トレーサーを、標準的サンドイッチＥＬＩＳＡによって検出した。このＥＬＩＳＡにおいて、捕捉抗原はＨｅｒ−２リガンドであり、検出抗体はヤギ抗ｈＩｇＧアルカリホスファターゼ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｎ，ＡＬ）であった。改変型サンドイッチＥＬＩＳＡプロトコルを使用して、マウス血清中のＨＳＡ−ビオチンを検出した。この改変型サンドイッチＥＬＩＳＡプロトコルでは、希釈緩衝液を、アルブミンを含まないＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で置換した。ウサギ抗ＨＳＡ抗体（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，５μｇ／ｍｌ）を使用して、ＨＳＡ−ビオチンを捕捉した。ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１μｇ／ｍｌ）を検出のために使用した。クリアランスは、注射の２４時間後に存在するトレーサーの量に対する、保持されたトレーサーの量に基づいた。
【０１００】
（ｈＦｃＲｎ構築物の作製および確認）
ｈＦｃＲｎ構築物（ＣＤＳ、ＥＣＴＭ、およびｓｓＥＣＴＭ）を、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクター骨格（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）中にクローン化した。１１８ｂｐの５’非コード配列と、ヒトＦｃＲＮシグナル配列をコードする最初の２３アミノ酸とを、ヒトＦｃＲＮ  ｃＤＮＡ（Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＣｌａｒｋ  Ａｎｄｅｒｓｏｎから好意的に提供された）からＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ増幅は、プライマーＦｃＲＮ．ＳｉｇＳｅｑ−Ｆ：ＣＣＣＣＣＣＣＣＧＣＴＡＧＣＧＡＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＧ  ＧＣＧＴＣＣＴＧＧＴ（配列番号２）（ＮｈｅＩ部位に下線を付している）およびプライマーＦｃＲＮ．ＳｉｇＳｅｑ−Ｒ：ＣＣＣＣＣＣＣＣＡＣＣＧＧＴＣＣＧＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡ（配列番号３）（ＡｇｅＩ部位に下線を付している）を使用した。余分な塩基をすべてのＰＣＲプライマーの５’末端に含めて、制限エンドヌクレアーゼ活性の効率を増加させた。このＰＣＲ産物を、ＣＭＶ  ＩＥプロモーターの下流のＮｈｅＩ制限部位とＡｇｅＩ制限部位との間において、ＧＦＰコード配列の上流でありかつＧＦＰコード配列とインフレームの状態であるように挿入した。この中間体構築物を使用して、下記のＮ末端ＧＦＰタグ化テールレス（ｔａｉｌ−ｌｅｓｓ）ｈＦｃＲｎ（ｓｓＥＣＴＭ）を作製した。テールレス（ｔａｉｌ−ｌｅｓｓ）ＦｃＲｎ（ｓｓＥＣＴＭ）を作製するために、ＰＣＲプライマーのＣＤＳ−ＦおよびＥＣＴＭ−Ｒ：ＣＣＣＣＣＣＣＣＧＡＡＴＴＣｔｔａＣＣＴＣＡＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＡＣＡＧＡＧＣＴ（配列番号４）（ＥｃｏＲＩ部位に下線を付している；推定停止コドンは小文字である）を使用して、コドン２４〜３２５および推定停止コドンを増幅した。このＰＣＲ産物をまた、上記のＦｃＲｎシグナル配列とＧＦＰとを含むベクター骨格中に挿入した。最後に、非ＧＦＰタグ化テールレス（ｔａｉｌ−ｌｅｓｓ）ＦｃＲｎ構築物であるＥＣＴＭを作製するために、ＰＣＲプライマーのＦｃＲｎ．ＳｉｇＳｅｑ−ＦとＥＣＴＭ−Ｒとの産物を、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクターのＮｈｅＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間に挿入して、上記ＧＦＰコードフラグメントを排除した。すべてのＰＣＲ増幅挿入物は、そのクローニング部位全体にわたって二方向の配列を確認した。
【０１０１】
（細胞培養およびトランスフェクション）
安定なＨＥＫ２９３トランスフェクト体を、選択のためにＦＣＳ補充ＤＭＥＭ（８００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含み、次いで４００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含む）を使用して、同様に作製した。その後、それらの細胞株を、分析用のｈＦｃＲｎ陽性細胞およびｈＦｃＲｎ陰性細胞の集団とともに、慎重に維持した。
【０１０２】
（フローサイトメトリー）
トランスフェクトしていないコンフルエントな接着ＨＥＫ２９３細胞、ＧＦＰ−ｈＦｃＲｎを安定に発現するコンフルエントな接着ＨＥＫ２９３細胞（ｓｓＥＣＴＭ）、またはｈＦｃＲｎを安定に発現するコンフルエントな接着ＨＥＫ２９３細胞（ＥＣＴＭ）を、ＰＢＳで一回穏やかに洗浄し、ＰＢＳ中に含まれる０．５％トリプシン／５．３ｍＭ  ＥＤＴＡとともに３７℃にて５分間インキュベートした。その後、トリプシンの活性を、５％  ＦＣＳを含むＤＭＥＭを添加することによってブロックした。その後、細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で２回洗浄して血清（およびアルブミン）を除去し、その後、ＰＢＳ（ｐＨ７．４またはｐＨ６）でさらに２回洗浄した。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，６μｇ／ｍｌ）、ヒトＩｇＧ３（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｒｏｇｅｎｅ  ＯＲ）結合体（ｈＩｇＧ３−ＡＦ６４７）（１００μｇ／ｍｌ）、または２％ヒト血清をｐＨ６．０のＰＢＳもしくはｐＨ７．４のＰＢＳの中で使用して、ＨＳＡ結合またはｈＩｇＧ結合を決定した。これらの試薬を、５０μｌ体積中の１０６個の細胞に添加した。ＨＳＡ結合を、ビオチン化ヤギ抗ＨＳＡ抗体（ＧＡＨＳＡ−ビオチン；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｄａｖｉｓ，ＣＡ）（４０μｇ／ｍｌ）またはＨＳＡ−ビオチンを用いて、検出した。ビオチン化試薬を、２μｇ／ｍｌのストレプトアビジンアロフィコシアニンまたはストレプトアビジンフィコエリトリン（ＳＡ−ＡＰＣまたはＳＡ−ＰＥ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて検出した。ｈＩｇＧを、ヤギ抗ヒトＩｇＧフィコエリトリン（ＧＡＨ  ＩｇＧ−ＰＥ；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）（２μｇ／ｍｌ）を用いて検出した。各試薬を、細胞とともに氷上にて１時間インキュベートし、それらの細胞を、各工程の間で洗浄して、非結合型試薬を除去した。各インキュベーション工程および洗浄は、示したｐＨのＰＢＳを用いて実施した。ヨウ化プロピジウムを排除した後に、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用して細胞を得た。
【０１０３】
競合実験のために、ｓｓＥＣＴＭ細胞を、ｐＨ７．５にて２回洗浄し、連続用量の非標識ＨＳＡ、非標識ｈＩｇＧ（ＧａｍｍａＧｕａｒｄ  ｈＩｇＧから精製した）、または非標識ヒトトランスフェリン（ｆＴｆｎ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、５０μｌ体積中にある１０６個のｓｓＥＣＴＭ細胞に１時間プレローディング（ｐｒｅｌｏａｄ）した。その後、ｈＩｇＧ−ＡＦ６４７（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）またはＨＳＡ−ビオチン（最終濃度２５０μｇ／ｍｌ）を添加し、ｓｓＥＣＴＭ細胞とともに６０分間インキュベートした。その後、ＨＳＡ競合のために、上記細胞を２回洗浄し、５μｇ／ｍｌのＳＡ−ＰＥを用いて染色した。３０分間後、それらの細胞を洗浄し、ＧＥＰ陽性細胞のフローデータを、ヨウ化プロピジウム排除後に得た。すべての実験は、氷上にて実施した。
【０１０４】
（抗ｈＦｃＲｎ  ｍＡｂの作製およびスクリーニング）
抗ｈＦｃＲｎ  ｍＡｂを作製するために、Ｂ６−ＦｃＲｎ−／−マウスを、ｈＦｃＲｎについてトランスジェニックであるＢ６マウス由来の２×１０７個の脾臓細胞で免疫した。その後、そのマウスに由来する血清を、その血清がｓｓＥＣＴＭ細胞に特異的に結合する能力についてスクリーニングした。認識可能な抗ｈＦｃＲｎ活性を血清が示したマウスを、Ｂ６−ｈＦｃＲｎトランスジェニック脾臓細胞で再度チャレンジし、３日間後に、これらのマウスに由来する脾臓細胞を、ハイブリドーマ作製のためにＳＰ２と融合した（ＣｏｏｐｅｒおよびＰａｔｅｒｓｏｎ，２００４（前出））。融合した細胞を、フラスコ中にある３００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ６を含む２０％  ＦＢＳ補充ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ２０）中にて１日間培養して、接着性線維芽細胞を除去し、その後、２×ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）と３００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ６とを含有する１００μｌ／ウェルのＤＭＥＭ２０を含む平底９６ウェルプレート中に約２×１０５／１００μｌ／ウェルにてプレートした。個々のウェルからの上清を、細胞ＥＬＩＳＡにおいてｓｓＥＣＴＭ細胞に対する特異的結合についてスクリーニングした。ｓｓＥＣＴＭ細胞を、３×１０５／ウェルにて９６ウェル平底プレート中にプレートした。この９６ウェルハイブリドーマ培養物からの上清を、培養８日目〜１０日目に収集し、上記プレートを遠心分離してデカントした後に上記ｓｓＥＣＴＭ細胞に添加した。３０分間の氷上でのインキュベーションの後、遠心分離およびデカントによって、細胞ＥＬＩＳＡ緩衝液（５％  ＦＢＳおよび０．０５％  ＮａＮ３を含む、ＰＢＳ）を用いて、３００μｌ／ウェルで２回洗浄した。ヤギ抗マウスＩｇＧ−アルカリホスファターゼ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を、細胞ＥＬＩＳＡ緩衝液中で１：１０００希釈し、１００μｌ／ウェルにて添加し、氷上にて３０分間インキュベートした。細胞を、細胞ＥＬＩＳＡ緩衝液を用いて３００μｌ／ウェルで２回洗浄し、抗ｈＦｃＲｎ活性を、基質ｐ−ニトロフェニルホスフェート（１ｍｇ／ｍｌにて１００μｌ／ウェル；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して検出した。プレートを、ＥＬ２１２ｅ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｂｉｏ−Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）において吸光度４０５ｎｍにて読取った。光学密度（Ｏ．Ｄ．）０．０３よりも高い吸光度を上清が示したハイブリドーマ細胞を、クローン化および再クローン化し、安定に増殖するクローンを、上記細胞ＥＬＩＳＡにおいて再試験した。その後、選択した抗ｈＦｃＲｎハイブリドーマクローンからの腹水を、ＣＢ−１７−ｓｃｉｄマウスにおいて生成し、ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）にて精製し、その特異性を、ｓｓＥＣＴＭ細胞およびＥＣＴＭ細胞を使用して確認した。各抗体のアリコートをまた、キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を使用してＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７で標識した。
【０１０５】
（ｈＦｃＲｎに対するｈＩｇＧおよびＨＳＡの結合の抗ｈＦｃＲＮ  ｍＡｂによるブロック）
抗ｈＦｃＲｎ  ｍＡｂがどのようにｈＦｃＲｎ結合についてｈＩｇＧおよびＨＳＡと競合するかを決定するために、連続用量の非標識抗ｈＦｃＲｎ  ｍＡｂをｓｓＥＣＴＭ細胞に添加した。３０分間後、ｈＩｇＧ−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７（５０μｇ／ｍｌ）またはＨＳＡ−ビオチン（２５０μｇ／ｍｌ）のうちのいずれかを、添加した。６０分間後、ｈＩｇＧ−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７染色細胞を、洗浄して得た。ＨＳＡ−ビオチン染色細胞を、２回洗浄し、５μｇ／ｍｌのＳＡ−ＰＥを用いて染色した。３０分間後、ＨＳＡ−ビオチン染色細胞を洗浄し、フローサイトメトリーデータを得た。すべてのインキュベーションは氷上にて行い、細胞洗浄は、４ｍｌ  ＰＢＳ（ｐＨ６）を使用して。
【０１０６】
（統計分析）
統計分析は、非パラメトリック順位和検定または両側スチューデントｔ検定を使用することによって実施した。差は、ｐ≦０．０５である場合に有意であると見なした。すべての値は、平均±平均標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）として表わした。
【０１０７】
（参考としての援用）
本明細書において言及されるすべての刊行物および特許は、各々の刊行物または特許が具体的かつ個別に参考として援用されると示されたかの如く、本明細書によりその全体が参考として援用される。
【０１０８】
本発明の特定の実施形態が考察されているが、上記明細書は、例示に過ぎず、限定するものではない。本発明の多くの変化形が、本明細書および特許請求の範囲を検討することによって当業者にとって明らかになる。本発明の完全な範囲は、特許請求の範囲をその等価物の完全な範囲とともに参照し、本明細書をその変化形とともに参照することによって、決定されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１Ａ〜１Ｂは、ｈＦｃＲｎ構築物の構築および検証を示す。図１Ａ：ｈＦｃＲｎ  ｃＤＮＡ構築物の概略図。ｓｓＥＣＴＭ（シグナル配列−ＧＦＰ−外側ドメイン−膜貫通ドメイン）およびＥＣＴＭ（シグナル配列−外側ドメイン−膜貫通ドメイン）。クローニングサイトおよびＦｃＲｎコドン位置が、示される。終止コドンが、＊によって示される。図１Ｂ：ＥＣＴＭトランスフェクトＨＥＫ  ２９３細胞およびｓｓＥＣＴＭトランスフェクトＨＥＫ  ２９３細胞に対するｈＩｇＧのｐＨ依存的結合のフローサイトメトリー分析。
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、ｈＦｃＲｎに対するアルブミンの結合およびｈＩｇＧの結合のフローサイトメトリーを示す。図２Ａ：ｓｓＥＣＴＭ細胞に対するＨＡＳまたはＩｇＧの結合。（１および６）；Ｃｔｒｌ  ＨＳＡ、ビオチン化ヤギ抗ＨＳＡ＋ＳＡ−ＡＰＣ。（２および７）；Ｃｔｒｌ  ｈＩｇＧ、ヤギ抗ｈＩｇＧ−ＰＥ。（３および８）；ＨＡＳ結合、ＨＳＡ＋ビオチン化ヤギ抗ＨＳＡ＋ＳＡ−ＡＰＣ。（４および１０）；ＨＡＳ結合、ヒト血清＋ビオチン化ヤギ抗ＨＳＡ＋ＳＡ−ＡＰＣ。（５および９）；ｈＩｇＧ結合、ヒト血清＋ヤギ抗ｈＩｇＧ−ＰＥ。図２Ｂ：ｓｓＥＣＴＭ細胞に対するＨＳＡ−ビオチンの結合。（１および３）；Ｃｔｒｌ  ＨＳＡ、ＳＡ−ＡＰＣ。（２および４）；ＨＡＳ結合、ビオチン化ＨＳＡ＋ＳＡ−ＡＰＣ。図２Ｃおよび２Ｄ：ＨＳＡ−ビオチンおよびｈＩｇＧ３−ＡＦ６４７のＥＣＴＭ細胞への結合（Ｃ）およびＨＥＫ２９３細胞への結合（Ｄ）。Ｃｔｒｌ  ｈＩｇＧ３、処理なし；ｈＩｇＧ３結合、ｈＩｇＧ３−ＡＦ６４７；Ｃｔｒｌ  ＨＳＡｂｉｏ、ＳＡ−ＡＰＣ；ＨＳＡｂｉｏ結合、ＨＳＡ−ビオチン＋ＳＡ−ＡＰＣ。内部ネガティブコントロールに関して、ＧＦＰ−ｈＦｃＲｎネガティブ細胞の集団は、ＧＦＰ−ｈＦｃＲｎポジティブｓｓＥＣＴＭ細胞およびＧＦＰ−ｈＦｃＲｎポジティブＥＣＴＭ細胞と一緒に慎重に維持された。相対的な平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、ｈＦｃＲｎ−ＧＦＰポジティブ集団のＭＦＩとｈＦｃＲｎ−ＧＦＰネガティブ集団のＭＦＩとの間の比である。棒グラフは、少なくとも４つの独立した実験の平均＋ｓ．ｅ．ｍ．である（Ｍ＆Ｍを参照のこと）。
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、ｈＦｃＲｎを結合することに関するＨＡＳとｈＩｇＧとの間の競合の結果を示すグラフである。ｓｓＥＣＴＭ細胞は、標識されていないｈＩｇＧ（三角）、ＨＳＡ（四角）、またはｈＴＦ（円）の表示の用量と一緒にインキュベートされ、ついでｈＩｇＧ−ＡＦ６４７またはＨＳＡ−ビオチンのいずれかが、添加された。アッセイは、ｐＨ６にて行なわれた。図３Ａ：対５０μｇ／ｍｌのｈＩｇＧ−ＡＦ６４７の競合。図３Ｂ：対２５０μｇ／ｍｌのＨＳＡ−ビオチンの競合。データは、ＧＦＰ−ポジティブなゲートされた（ｇａｔｅｄ）細胞のＭＦＩとして表される。同様の結果を有する２つの実験のうちの１つからの代表的なデータが、示される。競合因子を伴わないｐＨ７．５におけるｓｓＥＣＴＭ細胞に対するＨＩｇＧ−ＡＦ６４７結合は、６のＭＦＩを生じた。競合因子を伴わないｐＨ７．５におけるｓｓＥＣＴＭ細胞に対するＨＳＡ−ビオチン／ＳＡ−ＰＥ結合は、４のＭＦＩを生じた。
【図４】図４は、ｐＨ７．５およびｐＨ６．０における抗ｈＦｃＲｎ  ｍＡｂの結合能力、およびｐＨ６．０におけるｈＩｇＧのｈＦｃＲｎへの結合をブロックするＤＶＮ２４の能力におけるデータを示す。直接的な結合データ（左側および中央の散布図）に関して、１μｇの表示のｍＡｂは、１０６個のｓｓＥＣＴＭ細胞と一緒に、表示のｐＨ緩衝液中で４℃にて３０分間インキュベートされた。そのｓｓＥＣＴＭ細胞は、次いで、２回洗浄され、そしてフィコエリスリン結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）と一緒にインキュベートされ、次いでフローサイトメトリーによって分析された。ｈＩｇＧの阻害（右側の散布図）に関して、上記ｍＡｂは、１０μｇの濃度で１０６個のｓｓＥＣＴＭ細胞に対して、ｐＨ６．０の緩衝液中で４℃にて３０分間にわたって添加され、２回洗浄され、１μｇのＡｌｅｘｉＦｌｕｏｒ６４７結合体化ｈＩｇＧ３と一緒にインキュベートされ、２回洗浄され、そしてフローサイトメトリーによって分析された。
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、特定の抗ｈＦｃＲｎ  ｍＡｂがｈＩｇＧまたはＨＡＳのｈＦｃＲｎへの結合をｐＨ６．０において選択的にブロックすることを示すデータのグラフである。図５Ａ：ｈＩｇＧのブロック。１０６個のｓｓＥＴＣＭ細胞は、漸増濃度の精製した抗ｈＦｃＲｎ  ｍＡｂと一緒に４℃にてインキュベートされ、２回洗浄され、次いで１μｇのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７結合体化ｈＩｇＧと一緒に４℃にて１時間インキュベートされた。そのｓｓＥＣＴＭ細胞は、次いで、２回洗浄され、そしてフローサイトメトリーによって分析された。図５Ｂ：ＨＡＳのブロック。１０６個のｓｓＥＴＣＭ細胞は、漸増濃度の精製した抗ｈＦｃＲｎ  ｍＡｂと一緒に４℃にてインキュベートされ、２回洗浄され、次いで１μｇのビオチン結合体化ＨＡＳと一緒にインキュベートされた。そのｓｓＥＣＴＭ細胞は、次いで、２回洗浄され、ストレプトアビジン−フィコエリスリンと一緒にインキュベートされ、２回洗浄され、そしてフローサイトメトリーによって分析された。全てのインキュベーションは、ｐＨ６．０緩衝液中で行われた。データは、ＧＦＰポジティブなゲートされた細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）として与えられる。
【図６】図６は、ＤＶＮ２４  ｍＡｂの投与がｈＩｇＧの血清濃度を減少させることを示すデータのグラフである。１００μｇのトレーサーｈＩｇＧは、５匹のマウスＦｃＲｎ−／−ｈＦｃＲｎ系統２７６トランスジェニックマウスの群に対して、０日目において腹腔内に注射された。変化する濃度のＤＶＮ２４または１０００μｇのアイソタイプが一致したネガティブコントロールｍＡｂは、２日目、３日目、および４日目において腹腔内に注射された。連続的な眼の採血由来の血清は、次いで、注射されたｈＩｇＧトレーサーの濃度に対してＥＬＩＳＡによって分析された。データは、トレーサーの注射の２４時間後の血清トレーサーｈＩｇＧ濃度の％に基づいて与えられる。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、ＤＶＮ２４  ｍＡｂの投与が、ｈＩｇＧの血清濃度を減少させるが、ＨＡＳの血清濃度を減少させない一方で、ＡＤＭ３２  ｍＡｂの投与が、そうではないことを示すデータのグラフである。図７Ａ：ｈＩｇＧのクリアランス。図７Ｂ：ＨＡＳのクリアランス。１００μｇのトレーサーｈＩｇＧおよびトレーサーＨＡＳは、３匹のマウスＦｃＲｎ−／−ｈＦｃＲｎ（系統２７６トランスジェニック）マウスの群に対して、０日目において腹腔内に注射された。１０００μｇのＤＶＮ２４、ＡＤＭ３１、またはネガティブコントロールｍＡｂは、２日目、３日目、および４日目において腹腔内に注射された。連続的な眼の採血由来の血清は、次いで、注射されたｈＩｇＧトレーサーの濃度についてＥＬＩＳＡによって分析された。平均±標準誤差値は、トレーサーの注射の２４時間後の濃度に対する残りの血清トレーサーｈＩｇＧ濃度の％に基づく。ｐ＜０．０５の比較が、示される（＊）。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、ＤＶＮ２４がヒト慢性関節リウマチ血漿によって引き起こされた関節炎の病変を減少させることを示すデータのグラフである。３匹のｍＦｃＲｎ−／−Ｆｃｇｒ２ｂ−／−ｈＦｃＲｎトランスジェニック（系統３２）マウスの群は、腹腔内に０．５ｍｌ、１ｍｌ、および１ｍｌのヒトＲＡ血漿を、それぞれ、０日目、２日目および７日目に注射され、そしてまた、腹腔内に１ｍｇの精製したＤＶＮ２４  ｍＡｂまたはアイソタイプコントロールＩｇＧａ  ｍＡｂを１日目、３日目および８日目に注射された。足根関節幅および総合的な関節炎スコアは、記載される（Ａｋｉｌｅｓｈら、２００４、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１３：１３２８−３３）ように、２人の独立した観察者によって盲検様式で測定された。データは、平均±標準誤差である。足根関節幅のｐ＜０．０５の比較（＊）および（ｐ＜０．００５）の比較（＊＊）が、示される。
【図１】
2008538919.tif 000004
【図２】
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【図３】
2008538919.tif 000006
【図４】
2008538919.tif 000007
【図５】
2008538919.tif 000008
【図６】
2008538919.tif 000009
【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年1月28日(2008.1.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008538919000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年3月24日(2008.3.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＦｃＲｎのエピトープに結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、ここで、該抗体またはその抗原結合部分は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分のヒトＦｃＲｎへの結合を選択的に阻害するが、ヒトアルブミンのヒトＦｃＲｎへの結合を阻害しない、抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２】
前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３】
前記抗体またはその抗原結合部分は、ヒトに投与され得る、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４】
前記抗体またはその抗原結合部分は、インビボで、ヒトＩｇＧの血清半減期を選択的に減少させるが、ヒトアルブミンの血清半減期を減少させない、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５】
前記抗体またはその抗原結合部分は、被験体におけるヒト自己抗体によって誘導される炎症性病変を軽減または阻害する、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項６】
前記抗体は、本明細書中でＤＶＮ２１およびＤＶＮ２４として示される抗体からなる群より選択される、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項７】
前記抗体は組み換え抗体である、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８】
前記抗体はヒト化抗体である、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項９】
前記抗体はキメラ抗体である、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１０】
前記抗体はヒト抗体である、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１１】
前記抗体は二重特異的抗体または多重特異的抗体である、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１２】
前記単離された抗原結合部分は、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦｖフラグメントＣＤＲ３からなる群より選択される、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１３】
前記抗体またはその抗原結合部分は、ＦｃＲｎを発現する生細胞へ結合するその能力について選択される、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１４】
前記ＦｃＲｎは標識されている、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１５】
前記抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＩｇＧの血清半減期を減少させるが、ヒトアルブミンの血清半減期を減少させないその能力について、インビボで選択される、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１６】
前記抗体またはその抗原結合部分は、内在性ＦｃＲｎ遺伝子を欠損しているが、ヒトＦｃＲｎをコードするトランスジーンを有するトランスジェニックマウスにおいて選択される、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１７】
前記抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＦｃＲｎに、少なくとも約１×１０−８Ｍまたはそれ未満の結合親和性で、特異的に結合する、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１８】
前記単離された抗体またはその抗原結合部分は、さらなる機能的部分に共有結合されている、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１９】
前記さらなる機能的部分が標識である、請求項１８に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２０】
前記標識が検出可能な標識である、請求項１９に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２１】
前記標識が、蛍光標識、放射能標識、および特有の核磁気共鳴シグネチャーからなる群より選択される、請求項２０に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２２】
前記さらなる機能的部分が、前記抗体またはその抗原結合部分に増加した血清半減期を与える、請求項１８に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２３】
前記さらなる機能的部分が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分である、請求項２２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２４】
前記さらなる機能的部分が、ビオチン部分を含む、請求項２２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２５】
請求項１に記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞株。
【請求項２６】
前記ハイブリドーマ細胞株は、本明細書中でＤＶＮ２１およびＤＶＮ２４として示される抗体からなる群より選択される、請求項２５に記載のハイブリドーマ細胞株。
【請求項２７】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの抗体またはその抗原結合部分と、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または安定剤とを含む、組成物。
【請求項２８】
免疫刺激剤、免疫調節物質またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記免疫調節物質が、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、腫瘍壊死因子α、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記免疫刺激剤が、インターロイキン−２、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分をコードする、単離された核酸分子。
【請求項３２】
個体におけるＦｃＲｎ媒介性ＩｇＧ防御を阻害するための組成物であって、該組成物は、ヒトＦｃＲｎのヒトＩｇＧへの結合を選択的に阻害するが、ヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合を阻害しないのに十分な量で、請求項１に記載の抗体を含む、組成物。
【請求項３３】
前記個体は自己免疫疾患を有する、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記個体は全身性エリテマトーデスを有する、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３５】
患者における自己免疫疾患を予防または処置するための組成物であって、該自己免疫疾患を予防または処置するのに十分な量で、請求項１に記載の抗体を含む、組成物。
【請求項３６】
前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、インスリン抵抗性糖尿病、重症筋無力症、多発性動脈炎、自己免疫血小板減少性紫斑病、皮膚血管炎、水疱性類天疱瘡、尋常天疱瘡、落葉状天疱瘡、グッドパスチャー症候群、慢性関節リウマチ、川崎病、およびシェーグレン症候群からなる群より選択される、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
全身投与されることを特徴とする、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３８】
局所投与されることを特徴とする、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３９】
免疫調節物質と組み合わせて投与されることを特徴とする、請求項３５に記載の組成物。
【請求項４０】
ヒトＦｃＲｎのヒトＩｇＧへの結合を選択的に阻害するが、ヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合を阻害しないインヒビターを同定するインビトロ法であって、該方法は、以下：
ａ）候補インヒビターと、ヒトＦｃＲｎおよびヒトＩｇＧとを、該ヒトＦｃＲｎの該ヒトＩｇＧへの結合に適切な条件下で接触させる工程；
ｂ）候補インヒビターの非存在下でのヒトＦｃＲｎの該ヒトＩｇＧへの結合と比較して、該候補インヒビターの存在下でのヒトＦｃＲｎの該ヒトＩｇＧへの結合についてアッセイする工程；
ｃ）候補インヒビターと、ヒトＦｃＲｎおよびヒトアルブミンとを、該ヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合に適切な条件下で接触させる工程；ならびに
ｄ）候補インヒビターの非存在下でのヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合と比較して、該候補インヒビターの存在下でのヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合についてアッセイする工程；
を包含し、
ここで、該候補インヒビターがＦｃＲｎの該ヒトＩｇＧへの結合を阻害するが、ヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合を阻害しない場合、該候補インヒビターは、ヒトＦｃＲｎのヒトＩｇＧへの結合を選択的に阻害するが、ヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合を阻害しないインヒビターである、方法。
【請求項４１】
ヒトＦｃＲｎのヒトＩｇＧへの結合を選択的に阻害するが、ヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合を阻害しないインヒビターを同定するインビトロ法であって、該方法は、以下：
ａ）候補インヒビターと、ヒトＦｃＲｎ、ヒトＩｇＧおよびヒトアルブミンとを接触させる工程；
ｂ）該候補インヒビターの非存在下でのヒトＦｃＲｎの該ヒトＩｇＧへの結合と比較して、該候補インヒビターの存在下でのヒトＦｃＲｎの該ヒトＩｇＧへの結合についてアッセイする工程；ならびに
ｃ）候補インヒビターの非存在下でのヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合と比較して、該候補インヒビターの存在下でのヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合についてアッセイする工程；
を包含し、
ここで、該候補インヒビターがヒトＦｃＲｎの該ヒトＩｇＧへの結合を阻害するが、ヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合を阻害しない場合、該候補インヒビターは、ヒトＦｃＲｎのヒトＩｇＧへの結合を選択的に阻害するが、ヒトＦｃＲｎのヒトアルブミンへの結合を阻害しないインヒビターである、方法。
【請求項４２】
ヒトＩｇＧの半減期を選択的に減少させるが、ヒトアルブミンの半減期を減少させない因子を同定するインビボ法であって、該方法は、以下：
ａ）候補因子およびトレーサーヒトＩｇＧを、ＦｃＲｎ−／−／ｈｕＦｃＲｎ＋トランスジェニックマウスに投与する工程；
ｂ）候補因子の非存在下での該トレーサーヒトＩｇＧの半減期と比較して、該候補因子の存在下での該マウスにおける該トレーサーヒトＩｇＧの半減期を決定する工程；
ｃ）該候補因子およびトレーサーヒトアルブミンを、該ＦｃＲｎ−／−／ｈｕＦｃＲｎ＋トランスジェニックマウスに投与する工程；ならびに
ｄ）候補因子の非存在下での該トレーサーヒトアルブミンの半減期と比較して、該候補因子の存在下での該マウスにおける該トレーサーヒトアルブミンの半減期を決定する工程；
を包含し、
ここで、該候補因子が該トレーサーヒトＩｇＧの半減期を減少させるが、該トレーサーヒトアルブミンの半減期を減少させない場合、該候補因子は、ヒトＩｇＧの半減期を選択的に減少させるが、ヒトアルブミンの半減期を減少させない因子である、方法。
【請求項４３】
ヒトＩｇＧの半減期を選択的に減少させるが、ヒトアルブミンの半減期を減少させない因子を同定するインビボ法であって、該方法は、以下：
ａ）候補因子、トレーサーヒトＩｇＧ、およびトレーサーヒトアルブミンを、ＦｃＲｎ−／−／ｈｕＦｃＲｎ＋トランスジェニックマウスに投与する工程；
ｂ）候補因子の非存在下での該トレーサーヒトＩｇＧの半減期と比較して、該候補因子の存在下での該マウスにおける該トレーサーヒトＩｇＧの半減期を決定する工程；ならびに
ｃ）候補因子の非存在下での該トレーサーヒトアルブミンの半減期と比較して、該候補因子の存在下での該マウスにおけるトレーサーヒトアルブミンの半減期を決定する工程；を包含し、
ここで、該候補因子が、該トレーサーヒトＩｇＧの半減期を減少させるが、該トレーサーヒトアルブミンの半減期を減少させない場合、該候補因子は、ヒトＩｇＧの半減期を選択的に減少させるが、ヒトアルブミンの半減期を減少させない因子である、方法。
【請求項４４】
前記因子は、抗体、ポリペプチド、合成ペプチド、ペプチド模倣物、および低分子からなる群より選択される、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記因子は、ＩｇＧポリペプチドのＦｃ部分を含む融合タンパク質である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記因子は、ＩｇＧポリペプチドのＦｃ部分である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
自己免疫疾患を処置するための薬学的調製物を製造するための、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分の、使用。
【請求項４８】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項４７に記載の使用。
【請求項４９】
癌の画像化または処置のために使用された放射性抗体または抗体結合体化毒素のクリアランスを促進するための、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分の、使用。
【請求項５０】
前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項４９に記載の使用。
【国際調査報告】
2008538919.tif 000012
2008538919.tif 000013
2008538919.tif 000014
2008538919.tif 000015