(57)【要約】  処理手段を含む装置を用いて生物学的材料のサンプルを分析する方法を提供する。当該方法は、（ａ）電磁および／または電離放射線をサンプルに照射するステップと、（ｂ）サンプルから出る電磁放射線を検出し、これに応答して信号を生成するステップと、（ｃ）ステップ（ａ）の開始後のユーザ入力に応答して、および／または放射線検出ステップ（ｂ）において生成された信号の処理手段による分析に応答して、当該装置で、サンプル、当該サンプル中の標識および／または当該サンプルの環境条件を変更するステップとを含む。こうして、変更が決定され、実験が進むにつれて相互作用的に実行され得る。したがって、当該変更が、実験中に特定の対象として識別される特定の構造および／または事象に向けられ得る。
2008511824.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプルの光変更を実行するための方法であって、
（ａ）前記サンプルを照射するステップと、
（ｂ）前記照射されたサンプルに基づいて１つ以上の信号を検出するステップと、
（ｃ）１つ以上のプロセッサ手段を用いて、前記検出された信号を分析し、１つ以上の照射パラメータを決定するステップと、
（ｄ）前記照射パラメータについて条件付けられている（ａ）に戻るステップとを含む、方法。
【請求項２】
（ａ）は、電磁源および／または電離（ionizing）源で前記サンプルを照射するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）は、光源で前記サンプルを照射するステップを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記生物学的サンプルは蛍光標識を含み、（ｂ）は、前記標識が発する蛍光放射線を検出するステップを含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
（ａ）は、前記サンプルにおける１つ以上の蛍光標識を低減および／またはブリーチングするよう照射源を選択するステップを含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
（ｄ）は、１つ以上の光切換可能蛍光標識の光学特性を変更するステップを含む、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記照射パラメータは、照射源、照射の開始時間、照射期間、繰返し照射サイクルの数、照射サイクル間の遅延、照射の波長帯、照射のエネルギレベル、照射のパワーレベル、照射の偏光、照射の位置、照射領域のサイズ、照射領域の形状、および照射環境パラメータを含む、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記照射環境パラメータは、照射中の前記サンプルの温度、前記サンプルの濃度特性、前記サンプルのｐＨ、前記サンプルの電位、前記サンプルの圧力、前記サンプルの物理的構造、および／または前記サンプルに関連付けられるガス濃度を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記１つ以上のプロセッサ手段は、前記照射環境パラメータを設定するよう１つ以上の装置を制御する、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記装置は、サンプル移送機構、サンプルヒータ、分配機構、偏光設定および／または焦点駆動機構を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルに従った選択可能な構成および／または光ブリーチング構成に基づいて、前記検出された信号を分析するよう前記プロセッサ手段を構成するステップをさらに含む、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
（ｃ）は、前記サンプルの移動部分の位置、前記サンプルのうち少なくとも一部の強度の変化、前記サンプルのうち少なくとも一部の蛍光寿命の相対変化、前記サンプルにおける１つ以上の基礎構造の識別もしくは位置、および／または１つ以上のサンプル変化の検出に基づいて、前記照射パラメータを決定するステップを含む、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記照射源がパルスにされ、光学トラップ、光学ピンセット、レーザ切開機構、および／またはレーザ切除機構である、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
（ｂ）は、光検出器、光電子増倍管および／または撮像検出器を用いて検出するステップを含む、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
（ｃ）は、前記サンプルにおける選択された細胞の膜に開口部を形成するよう前記照射パラメータを決定するステップを含む、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
（ｃ）は、所定のプロトコルに基づいて前記照射パラメータを決定するステップをさらに含む、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
処理手段を含む装置を用いて生物学的材料のサンプルを分析する方法であって、
（ａ）電磁および／または電離放射線をサンプルに照射するステップと、
（ｂ）前記サンプルから出る電磁放射線を検出し、それに応答して信号を生成するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）の開始後のユーザ入力に応答して、および／または、放射線検出ステップ（ｂ）において生成された信号の前記処理手段による分析に応答して、前記装置で、前記サンプル、前記サンプル中の標識および／または前記サンプルの環境条件を変更するステップとを含む、方法。
【請求項１８】
前記サンプルは蛍光標識を含み、ステップ（ａ）は、前記サンプルに励起エネルギを照射するステップを含み、ステップ（ｂ）は、前記励起エネルギによって励起された場合に前記サンプル中の標識が発する蛍光放射線を検出するステップを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記変更ステップ（ｃ）は、前記サンプルの少なくとも一部にエネルギ光線を照射するステップを含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記変更ステップ（ｃ）で実行される照射は、前記サンプルのその部分における標識の蛍光を低減するよう機能する、請求項１８に従属する場合、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ａ）〜（ｃ）はステップ（ｃ）の後に繰返され、ステップ（ｃ）の終わりとステップ（ａ）の開始との間の期間および／または繰返された場合のステップ（ｃ）のパラメータは前記処理手段による前記分析に依存する、請求項１７から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記変更ステップ（ｃ）は、前記部分における光切換可能蛍光標識の光学特性を変更するように、前記サンプルのうち少なくとも一部にエネルギ光線を照射するステップを含む、請求項１８に従属する場合には請求項１９、または請求項２０に従属する場合には請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記変更ステップ（ｃ）は、前記サンプルのうち少なくとも一部の物理的構造を変更するステップを含む、請求項１７から２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記変更ステップ（ｃ）は、材料が開口部を通って細胞内に入ることを可能にするように、前記サンプルにおける選択された細胞の膜に開口部を形成するステップを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記開口部は、局所的なエネルギ光線を用いて形成される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（ｃ）の変更は、前記ユーザ入力および／または前記処理手段による前記分析に応答して選択されたサンプルの領域に適用される、請求項１７から２５に記載の方法。
【請求項２７】
ステップ（ｃ）の変更の少なくとも１つのパラメータは、前記装置に記憶されたデータに関連して前記処理手段によって決定される、請求項１７から２６に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ（ｃ）の変更は、前記処理手段による前記サンプルにおける所定の事象の発生の検出に依存する、請求項１７から２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記処理手段による分析によって生成されたデータは、次の変更ステップのパラメータを決定する際にそれを参照することを容易にするように前記装置に記憶される、請求項１７から２８に記載の方法。
【請求項３０】
生物学的材料のサンプルを分析するための装置であって、
前記サンプルに電磁および／または電離放射線を照射するための照射手段と、
前記サンプルから出る放射線を検出し、それに応答して出力信号を出力するための検出手段と、
前記サンプル、前記サンプル中の標識および／または前記サンプルの環境条件を変更するための変更手段と、
前記検出手段からの前記出力信号を分析するための処理手段と、
前記サンプルの照射後のユーザ入力に応答して、および／または、前記処理手段による前記検出手段からの前記出力信号の分析に応答して前記変更手段を制御するための制御手段とを含む、装置。
【請求項３１】
前記変更手段による変更のパラメータを決定する際に、前記制御手段が参照するための、前記処理手段による分析によって生成されるデータを記憶するためのデータ記憶手段を含む、請求項３０に記載の装置。
【請求項３２】
前記検出手段によって検出された放射線の印をユーザに示すためのディスプレイ手段と、検出された放射線に応答して、ユーザが前記変更手段による変更の少なくとも１つのパラメータを制御することを可能にするための入力手段とを含む、請求項３０または３１に記載の装置。
【請求項３３】
前記入力手段は、ユーザが前記変更手段による変更のためにサンプルにおける特定の位置を識別することを可能にする、請求項３２に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
この発明は、生物学的材料のサンプルを分析するための方法および装置に関する。より特定的には、この発明は、細胞機能を妨げ得ない方法で細胞などのサンプルにおけるプロセスを調査することに関する。このような調査は、生命科学および医学における複雑なプロセスに関するより深い理解を与え、新しい薬剤候補の評価を助け、さらに、病気または異常なプロセスの検出を可能にし得る。
【背景技術】
【０００２】
背景
生体サンプルを検査することにより、細胞プロセスおよび細胞内プロセスのダイナミクスへのアクセスが提供される。小規模な細胞プロセスの研究は典型的には光学顕微鏡法を用いて実行されてきた。
【０００３】
場合によっては、単独で、または少数の他のプロセスと組合せて研究することのできる特定の種類のプロセスを分離するためのツールが必要になるほどにプロセスが複雑になる。（蛍光顕微鏡法における蛍光分子の形の）標識を用いてこの性質のツールを提供してきた。
【０００４】
標識は、外来性であり得る（すなわち、サンプルに追加される）か、または、内在性（たとえば、本質的に特徴的に着色されているかまたは蛍光性であるサンプルに存在する分子など）であり得る。
【０００５】
蛍光分子は、特定の励起スペクトルを有しており、ある波長ではより強く励起され、他の波長でより弱く励起される。これはまた、特定の発光スペクトルを有しており、ある波長ではより強く発光し、他の波長ではより弱く発光する。励起スペクトルおよび発光スペクトルは紫外線から赤外線の範囲であり得る。
【０００６】
ローダミンおよびフルオレセインなどの化学分子から広範囲の蛍光標識を発生させた。さらに、発光生物、たとえば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をもたらす発光クラゲ（Aequorea Jellyfish）や、DsRedおよびHcRedをもたらすさまざまなサンゴに見出される分子から蛍光標識を発生させた。これらは、ＡＦＰ（発光蛍光タンパク質）と称された。
【０００７】
蛍光標識は、対象となる特定の分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、炭水化物、抗体など）に関連付けられてもよい。代替的には、これら蛍光標識を、或る特徴（たとえば、イオン濃度、ｐＨ、電位、温度、特定の酵素の存在、特定の酵素物質の存在、力など）に対して敏感になるように作製して、これらの特徴に従って蛍光特性を変えてもよい。これらの標識は、細胞膜を通過することによって、または注入によって細胞に投入され得る。代替的には、これらは、ＡＦＰなどの遺伝的に符号化された標識の場合には、細胞の通常の機能の一部として内部に形成されてもよい。
【０００８】
図１ａに示されるサンプルを撮像するための公知の装置においては、顕微鏡１０は、サンプル４ｂを照らすための光源１２を備えている。これは、たとえばランプ、レーザまたは発光ダイオードの形であってもよい。当該顕微鏡は、サンプルから出る光を選択された波長帯で観察することができるように光学フィルタ１４を備える。サンプルからの光の空間的かつ時間的な分散を検査することにより、当該サンプルの構造およびダイナミクスについての情報が得られる。
【０００９】
位相差照明を用いて、薄いサンプルの撮像を向上させ得る。偏光を用いることにより、たとえば微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）技術を用いて、非常に薄いサンプルを、屈折率の変化を小さくして視覚化することが可能となり得る。
【００１０】
当該顕微鏡は、サンプルの動的な挙動を取込んでオフラインで分析できるように、ＣＣＤカメラなどの（紫外線から赤外線に対して感度の高い）光検出器１６と、メモリ素子２０を備えたビデオレコーダまたはコンピュータ１８などの記録手段とを含む画像取得システムを備える。たとえば、サンプルの移動部分の速度、その移動した距離およびその経路を監視することができる。
【００１１】
当該システムは、撮像焦点面の位置を変えるための焦点駆動機構を用い得る。さまざまなアルゴリズムを用いて光学焦点面を設定および維持し得る。デコンボリューション技術を用いて、容積測定（ＸＹＺ）および容積測定時系列（ＸＹＺＴ）データを獲得し得る。好適な励起波長帯を選択および／または好適な光学フィルタセットを選択することにより、容積測定多重波長（ＸＹＷＺ）および容積測定多重波長時系列（ＸＹＷＺＴ）データを獲得し得る。
【００１２】
顕微鏡の動作は、コンピュータ１８の形をした処理手段からのコマンドに応答して顕微鏡コントローラ２４によって制御される。命令は、キーボード２６、マウス２８およびディスプレイ３０を用いてユーザによってコンピュータに入力されてもよい。
【００１３】
一例として、図１ａは、たとえば、線３２によるフィルタ選択、線３６による対物レンズ３４、３４′の選択、線２２による焦点、線４０による液体ディスペンサ３８、サンプル４６の環境条件を変更するための、線４４による環境ユニット４２、および、線５０を介した制御によって顕微鏡のレンズに対してサンプル４６を移動させるためのサンプル移送ユニット４８などの局面のための、コントローラから顕微鏡に延在する制御線を示す。
【００１４】
当該装置はまた、以下に記載のとおり用いられる活性化光線５４を発生させるための活性化光源５２を含み得る。活性化光線の方向はガイド５６で調整され得る。
【００１５】
活性化光線５４はダイクロイックミラー６０に入射する。当該ミラーがその光線を対物レンズ３４の方に向け、当該光線がサンプル４６に入射する。サンプル４６から出る光は、対物レンズ３４を通って戻るが、ミラー６０によっては反らされず、このため、検出器１６に当たる前にフィルタ１４を通過する。検出器１６からの出力信号が線６２に沿ってコンピュータ１８に供給される。
【００１６】
環境ユニット４２は、たとえば、サンプルの温度および／またはサンプルを蔽うガスの組成および流れを制御し得る。
【００１７】
コンピュータにロードされたソフトウェアは、検出器からの出力信号で搬送される画像データを取得することを可能にする。
【００１８】
当該ソフトウェアはまた、ユーザが、当該装置のさまざまな局面の動作についてのパラメータ、たとえば活性化光線など、を選択することを可能にする。
【００１９】
当該コントローラは、以下のパラメータのうちの１つ以上の設定によって活性化光線を方向付けることを可能にする。
【００２０】
−  サンプル上における対象となる１つ以上の領域（位置、サイズおよび形状）
−  波長帯
−  パワーレベル
−  活性化の開始時間
−  活性化の期間
−  繰返し活性化サイクルの数
−  活性化サイクル間の遅延。
【００２１】
当該コンピュータは、所与のデータレートでデジタイザを介して検出器から画像データを記録することを可能にする。顕微鏡におけるフィルタセットおよび照明光源１２の波長帯は、１つ以上の波長のデータセットの取得を可能にするよう制御され得る。
【００２２】
蛍光標識を含む生物学的サンプルを撮像するための公知の装置が図１ｂに示される。これは図１ａに示される装置に類似しているが、照明光源１２ではなく、光線５５を発生させる励起光源１１を含む。この光源は、サンプル中に存在する１つ以上の蛍光標識を１つ以上の特定の波長帯で照射することによって励起することができる。フィルタ１４は、選択された波長帯で標識が発する光を通すように選択され得る。
【００２３】
図１ｃは、サンプル６における対象となる構成要素４、４′への蛍光標識２、２′の付加を示す。複数の標識を用いて、標識付けされた構成要素の共局在についての情報、たとえば細胞の細胞骨格の構成を明らかにする情報を提供し得る。
【００２４】
蛍光標識がパルスに追従する光を放出するのにかかる時間を用いて、蛍光寿命イメージング（ＦＬＩＭ）と称される技術で異なる標識を識別し得るように、図１の装置において用いられる励起光源１１をパルスにし、検出器にゲート装置を取付けてもよい（R. Cubedda, J. Phys. D: Appl. Phys., 2002, Vol. 35, R61-R76）。
【００２５】
活性化光線５４は、生体の細胞などのサンプルにおける動的なプロセスの理解をより深めることを可能にし得る（多くの場合、これは、励起光源に基づき得る）。活性化光線は、この光線からの強い光がサンプルを変化させおよび／または当該サンプルに存在する標識をあせさせ（ブリーチ：bleach）、それらの蛍光を低減させるような態様で、サンプルの部分に向けられてもよい。この領域および／または当該サンプルにおける他の場所から出てくる光のその後の変化を観察することにより、標識付けされたさまざまな構成要素の相互作用および／または交換のメカニズムについての情報を得ることができる。
【００２６】
当該光線は、外部物質が入るのを可能にするよう細胞壁を穿孔するか、細胞の全体もしくは一部を切開するか、細胞の全体もしくは一部を破壊するか、またはサンプルの環境を変えるよう機能し得る。
【００２７】
ブリーチングされた領域における蛍光の強度の、時間に対するグラフが図１ｄに示される。
【００２８】
たとえば、ブリーチングされた部分における蛍光の急速な回復は、標識がどの程度まで当該領域に自由に戻れるかを示す。そのメカニズム、拡散または局所的な合成は、拡散速度および可動割合（fraction）を推定することによって決定され得る（AxelRod, Biophys. J. , 1977, Vol. 18, pp. 129-131）。
【００２９】
さらなる分析および実験により、分子結合速度、集合／分解および移送機構についての情報にアクセスすることが可能となり得る（J. Lippincott-Schwartz 他, Nature Supp Imaging in Cell Biol, Sept 2003, S7-S14）。細胞におけるプロセス、たとえばタンパク質の輸送、寿命および運命（再利用および分解）のダイナミクスおよび調整を探索するた
めのこのような技術が普及している。
【００３０】
従来、このようなブリーチング（bleaching）技術は、図１ｅに示される４つの段階を含む「ブリーチングプロトコル」として適用され得る。
【００３１】
（１）ある期間にわたって通常の蛍光を用いてサンプルを撮像するプリブリーチ段階。
（２）ある期間にわたって特定のより高いパワーレベルをもつ特定の波長の光で予め規定された領域を照らすよう活性化光線を方向付けるブリーチ段階。
【００３２】
（３）ある期間にわたって通常の蛍光を用いてサンプルを再び撮像するポストブリーチ段階。
【００３３】
（４）さまざまな時点で画像上のさまざまな領域における蛍光強度に従って拡散速度および可動割合などの対象となるパラメータを決定するよう、収集されたデータを処理する分析段階。
【００３４】
１組の関連する技術は一般にＦＲＡＰ（Fluorescence recovery after photo-bleaching（光退色後蛍光回復））と称される。同じ領域を繰返しブリーチングしたり他の部分をブリーチングしたり等（ＦＬＡＰ、ＦＬＩＰ、ｉＦＲＡＰ）することによって当該システムをさらに探求するのに基本的なプロトコルの変形例を用いてもよい（J. Lippincott-Schwartz 他, 上述を参照; Phair 他, Nature, 2000, Vol. 404, pp. 604-609）。
【００３５】
代替的には、サンプル中の標識、サンプル自体またはその環境は、活性化光線によって照らされると活性群を放出する（アンケージ（uncaging）として公知のプロセス）ケージド化合物を含み得る（J. C. Politz, Trend Cell Biol., 1999, Vol. 9, pp. 284-287）。活性群は蛍光標識であり得る。代替的には、活性群は蛍光標識でなくてもよく、たとえば、活性群は、むしろ、サンプルのｐＨに影響を及ぼす可能性がある。活性群は、間接的に可視であるかまたは測定可能である影響をサンプルに及ぼす可能性がある。
【００３６】
加えて、構造の変化を観察するのに、パターン光ブリーチングとして公知の技術を用いてもよい（J. Ellenberg 他, Nature Supp Imaging in Cell Biol, Sept 2003, S14-S19）。この技術においては、ブリーチプロセスを用いて、サンプルの一部上の視覚的に特徴的なランドマークパターン、たとえばグリッドを導入し、その動きが、たとえば膜の変形またはせん断のメカニズムを理解するために或る期間にわたって追跡され得る。
【００３７】
蛍光プローブにおける最近の開発によりもたらされた新しい標識（光切換可能標識）は、それらがそれら自体の光学特性を変えてそれらの発光スペクトルおよび／または励起スペクトルを変更するように、入射光に対して敏感である。この例には、光活性化可能ＧＦＰ（ＰＡ−ＧＦＰ）およびKaedeが挙げられる（J. Lippincott- Schwartz 他、上述を参照）。さらに、これらのプローブのうちのいくつかは、それらの特性を可逆的または不可逆的に変えることを可能にする。このようなプローブは、異なる波長帯で活性化され（より強く発するように作られ）得るか、またはクエンチされ（より弱く発するように作られ）得る。たとえば、発火ＦＰ  ＫＦＰ１（kindling FP KFP1）がある（D.M. Chudakov 他, J. Biol. Chem., 2003, Vol. 278(9), pp. 7215-7219）。
【００３８】
光切換可能標識を励起し、これらの光学特性を変化させるよう適合された活性化光線を用いた計器類が開発された。これは、たとえば、実験中に標識付けされた構成要素を明らかにするかまたは隠したり、有機体の発達などの長期間のプロセスを研究する際に有用であり得る（D.M. Chudakov 他, Nature Biotechnology, Feb 2003, Vol. 21, pp. 191-194）。
【００３９】
以後、光ブリーチングおよびその変形例（ＦＲＡＰ、ｉＦＲＡＰ、ＦＬＩＰ、ＦＬＡＰ）、光活性化、光切換ならびにパターン光ブリーチングを含む光変更という語を用いる。
【００４０】
活性化光線の従来の制御には、いくつかの活性化パラメータの設定が含まれ、ユーザが適切な値を推定できることが必要とされる。一般に、これらは、余分な材料を用いた試行錯誤によって決定される。（図１ｄの図と同様に）活性化の深さをたとえば３０％に設定することが望ましく、これを達成するための適切なレーザ出力設定および期間を決定しなければならない。同様に、曲線の回復時間により、拡散係数によって決定されるポストブリーチ期間における適切なサンプリングレジーム（画像の数、画像間の間隔）が決定されるだろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００４１】
これらの活性化パラメータは実験前に規定されなければならない。これらは、条件の変化に合うよう適合させることができない。これはつまり、変化するサンプルに対し試行錯誤によってその方策を適用させることしかできないことを意味する。このため、急速な変化および／または稀な事象を研究することが極めて難しくなる可能性がある。
【００４２】
加えて、既存の光ブリーチング手順においては、ブリーチ後の回復が、変化を追跡する際の長期間の実験（１０分強）を妨げる。というのも、標識がより短期間で回復し、その後、認識可能なブリーチングされた区域が存在しないからである。
【課題を解決するための手段】
【００４３】
発明の概要
この発明は、処理手段を含む装置を用いて生物学的材料のサンプルを分析する方法を提供する。当該方法は、
（ａ）サンプルに電磁および／または電離放射線を照射するステップと、
（ｂ）サンプルから出る電磁放射線を検出し、それに応答して信号を生成するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）の開始後のユーザ入力に応答して、および／または、放射線検出ステップ（ｂ）において生成される信号の処理手段による分析に応答して、当該装置で、当該サンプル、当該サンプル中の標識および／または当該サンプルの環境条件を変更するステップとを含む。
【００４４】
この発明は、撮像と、集められた画像の１つ以上の特徴の測定と、サンプル、サンプル中の標識および／またはサンプルの環境条件の変更とを組合せて、実行された測定に従って変更パラメータを手動および／または自動で決定することを可能にし得る。
【００４５】
これに比べて、従来のシステムでは、ユーザは実験の開始前に変更パラメータを手作業で入力しなければならないので、これらのパラメータの動的な設定および変更と、このため、複合的なシステムの相互作用的な精査とが妨げられてしまう。
【００４６】
このため、この発明に従うと、このような変更は、実験が進むのに伴って決定され、「実時間で」相互作用的に実行され得る。この柔軟性により、より長期間の実験を行なうことが可能となる。また、受精または突然変異のすべての事象などの稀な、簡潔な、および／または急速な事象を検出し、それに従って作用することが可能となる。同時発生的な事象のように人のオペレータにとって検出することが難しい事象を検出し、これに従って作用することが可能となる。
【００４７】
この方法が光学顕微鏡を用いて実行される場合、照明光源によって照射がもたらされる。この場合、サンプルから出る電磁放射線は、下方から照らされる場合にはサンプルによって透過される光の形であり得るか、または、サンプルが上方から照らされる場合には反射光の形であり得る。
【００４８】
好ましい方策においては、当該サンプルは蛍光標識を含み、ステップ（ａ）はサンプルに励起エネルギを照射するステップを含み、ステップ（ｂ）は、励起エネルギによって励起された際に当該サンプル中の標識が発する蛍光放射線を検出するステップを含む。
【００４９】
励起エネルギは、たとえば、電磁エネルギ（好ましくは光）または電離放射線の形であり得る。
【００５０】
変更ステップ（ｃ）は、サンプルの少なくとも一部にエネルギ光線を照射するステップを含み得る。標識がサンプル中に存在する場合、この光線は、その部分における標識の蛍光が低減されるかまたは「ブリーチングされる」ように選択され得る。特定の実施例においては、ステップ（ａ）〜（ｃ）がステップ（ｃ）の後に繰返され、ステップ（ｃ）の終わりとステップ（ａ）の開始との間の期間および／または繰返される場合のステップ（ｃ）のパラメータは、処理手段による当該分析に依存している。
【００５１】
好ましい実施例においては、当該装置は、照射段階と変更段階との間で繰返すように動作し、サンプルの外見に結果としてもたらされる変化が検出される。
【００５２】
別の方策においては、変更ステップ（ｃ）は、当該サンプルのうち少なくとも一部に、当該部分における光切換可能蛍光標識の光学特性を変更するようにエネルギ光線を照射するステップを含む。
【００５３】
たとえば、長期間にわたって何度も細胞内の拡散を測定することが望ましいかもしれない。公知のＦＲＡＰ実験を繰返すことにより累積的な光ブリーチング効果を及ぼすと、細胞が直ちに見えなくなるだろう。光切換可能標識を用いると、領域をブリーチングするのではなく切換えることができる。この発明に従うと、拡散（または他の）プロセスが測定され得、そして、プロセスおよび／またはその測定が完了したと処理手段が判断した場合、光切換可能標識が「クエンチされ」て元の状態に戻されてから、当該プロセスが繰返される。光ブリーチングの繰返しを避けることにより、サンプルをより長く撮像することができ、この発明は、検出された蛍光放射線に応答した長期間にわたるプロセスの繰返しおよび／または一連の測定の実行を可能にする。
【００５４】
光ブリーチングの繰返しを避けることはまた有用である。というのも、活性化光線はしばしば強く、それを使用することによりサンプルが損傷を受けるかまたは一重項酸素などの反応種が作られてしまう可能性があり、これが研究中のプロセスを混乱させることにより高度な制御実験が必要となり、このため、非侵襲性でなくなってしまうからである。
【００５５】
ステップ（ｃ）の後、サンプルの環境条件を再び変化させ、その後サンプルから出る光を分析のために検出し得る。
【００５６】
別の実施例においては、環境の変化は、サンプル中の標識が物質を放出することを引起すよう選択される。
【００５７】
さらなる実施例においては、環境の変化は、サンプルおよび／または当該サンプル中の標識が照射に応答する態様を変更するよう選択される。たとえば、それは、サンプルの色、またはサンプル中の標識の励起スペクトルおよび／もしくは発光スペクトルを変化させ
る可能性がある。特に、環境の変化は、制御された活性化光であり得る。
【００５８】
プロセス中に標識の応答を変更する能力により、実験中に物理的に標識を投入する必要性をなくすことができる。実験中に標識をサンプルに投入するための手順は習得するのが極めて難しく、ユーザ側で付加的な機器、知識および技術が必要となる。しばしば、実験を何度も繰返さなければならない。微量注入の場合、このような手順はまた、サンプルに対して侵襲的となる。サンプル中に既に存在する標識の相互作用的な変更が追加の標識の物理的な投入を必要としないかもしれないことが分かる。標識は選択された領域において活性化され得るかまたは「オンに切換えられ」得る。
【００５９】
さらに好ましい方策においては、変更ステップ（ｃ）は、サンプルのうち少なくとも一部の物理的構造を変更するステップを含む。たとえば、これは、材料の通過を可能にするように、サンプルにおける選択された細胞の膜に開口部を形成することを含み得る。当該開口部は、たとえば、レーザなどの局所的なエネルギ光線を用いて形成されてもよい。このようにして、対象となる挙動を示している個々の細胞がサンプルにおいて選択され得、ユーザは、材料においてその挙動への応答を可能にするよう細胞壁に開口部を形成することができる。エネルギ光線の強度は、好ましくは、細胞膜がその形成直後に開口部を閉じるかまたは「修復する」ことができるように選択される。遺伝物質の侵入を可能にするためにこのように細胞に開口部を形成することは、しばしば、「トランスフェクション（transfection）」と称される。
【００６０】
当該開口部は、細胞への標識などの作用物が、細胞における特定の構造および／もしくはプロセスと相互作用するかもしくはそれを強調するか、または、その光学特性を変えることを可能にし得る。これは、遺伝物質が細胞に移ることを可能にし得る。代替的には、物質は細胞を殺すためにその細胞に移ることができてもよい。
【００６１】
全体として細胞の組成を変えるために液体をサンプル中に分配することと対照的に、上述の技術を用いると細胞などの個々の構造の変更が可能となる。これはまた、液体の分配と組合せて用いられてもよく、これにより、流体分配ステップが、エネルギ光線によって形成される開口部を通過する材料をもたらす。
【００６２】
変更すべきサンプルの環境条件は、その温度、あるイオンの濃度、サンプルのｐＨ、サンプルの電位、特定の酵素の存在またはサンプルの圧力であり得る。サンプル中の標識はこれらの条件に敏感であり得、所定の範囲に到達すると活性化し得る。
【００６３】
別の実施例においては、サンプルの環境は、サンプル付近のガスの組成を変えることによって変更される。たとえば、サンプル中の標識は、酸素などの所定のガスにさらされるかまたは当該所定のガスを濃縮することによって活性化され得る。
【００６４】
さらなる実施例においては、サンプルの環境は、当該サンプルに活性化エネルギを照射することによって変えられる。
【００６５】
当該サンプルは、当該サンプルの選択された部分を照射するよう配置された活性化エネルギ光線で照射され得る。当該光線は、たとえばグリッドなどのパターンを規定し得る。
【００６６】
当該プロセッサによって決定される活性化エネルギ照射のパラメータは、以下の例のうちの１つ以上であり得る。すなわち、照射の開始時間；照射すべきサンプルの部分；エネルギの波長帯；パワーレベル；照射期間；活性化照射エネルギの繰返しサイクルの数；繰返しサイクル間の遅延、である。
【００６７】
この発明を実現するプロセスであるステップ（ｃ）で実行される変更は、ユーザ入力および／または処理手段による分析に応答して選択されたサンプルの領域に適用され得る。
【００６８】
ステップ（ｃ）の変更のパラメータは、当該装置に記憶されたデータに関連して処理手段によって決定され得る。
【００６９】
さらなる実現例においては、ステップ（ｃ）の変更は、処理手段による、サンプルにおける所定の事象の発生の検出に依存している。
【００７０】
好ましくは、処理手段による分析によって生成されるデータは、次の変更ステップのパラメータを決定する際にそれを参照することを容易にするよう当該装置に記憶される。
【００７１】
この発明はさらに、蛍光標識を含む生物学的材料のサンプルを分析するための装置を提供する。当該装置は、
サンプルに電磁および／または電離放射線を照射するための照射手段と、
サンプルから出る放射線を検出し、それに応答して出力信号を出力するための検出手段と、
サンプル、サンプル中の標識および／またはサンプルの環境条件を変更するための変更手段と、
検出手段からの出力信号を分析するための処理手段と、
サンプルの照射後のユーザ入力に応答して、および／または、処理手段による検出手段からの出力信号の分析に応答して変更手段を制御するための制御手段とを含む。
【００７２】
好ましい実施例においては、当該装置は、変更手段による変更のパラメータを決定する際に制御手段が参照するための、処理手段による分析によって生成されるデータを記憶するためのデータ記憶手段を含む。
【００７３】
当該装置はさらに、検出手段によって検出された電磁放射線の印をユーザに示すためのディスプレイ手段と、検出された放射線に応答してユーザが変更手段による変更の少なくとも１つのパラメータを制御することを可能にするための入力手段とを含み得る。好ましくは、当該入力手段は、ユーザが、変更手段による変更のためにサンプルにおける特定の位置を識別することを可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７４】
発明の詳細な説明
この発明の先行技術および実施例を、添付の概略的な図面に関連して一例として説明する。
【００７５】
図２から図７に関連して説明される実施例は、サンプルおよび／またはサンプル中の標識の光変更に関する。この発明に従って実行される変更が他の形を取り得ることが認識されるだろう。
【００７６】
図２〜図７は、好適な装置の処理手段が追従するプロトコルを、当該装置の他の部分に供給される関連する入力および制御出力とともに概略的に表す。
【００７７】
図２は、光変更の相互作用的な制御を可能にするこの発明の第１の実施例を示す。ユーザインターフェイスは、実験の実行中にパラメータを設定および／または変更することを可能にする。当該パラメータは、図に示される例のようにサンプル、サンプル中の標識および／またはサンプルの直接の環境を変更し得る活性化光源および／または補助装置の動作を制御する。
【００７８】
活性化光線がサンプル中の蛍光標識をブリーチングする実現例においては、このプロトコルは、「ＦＲＡＰオンデマンド（FRAP on demand）」と称され得る。
【００７９】
図２の実施例においては、当該システムは、ユーザが、サンプル上の対象となる領域、波長帯、それらの波長帯におけるパワーレベル、および活性化の期間を含む、活性化光線のパラメータを設定することを可能にする。ユーザは、キーのプレスなどの好適な動作によってサンプルを撮像し、活性化の開始時間を決定することができる。
【００８０】
ユーザは、キーのプレスなどの好適な動作によって、活性化の期間もしくは終わり、繰返しサイクルの数および活性化のサイクル間における遅延、ならびに活性化の波長のうちの１つ以上を決定することができるだろう。
【００８１】
さらに、ユーザは、コンピュータマウスなどの入力装置の操作などの好適な動作により、活性化の位置ならびに／または照射された領域のサイズおよび形状を決定することができるだろう。
【００８２】
標識は温度の影響を受けやすいドメインを有する可能性があり、当該サンプルはホルダに保持されてもよく、その温度は、プロセスにおける適切な時点で標識を活性化するようユーザによってコンピュータを介して制御されてもよい。
【００８３】
標識は、酸素などのガスに敏感である可能性があり、サンプル環境ユニットは、実験中に標識を活性化するようユーザによってコンピュータを介して制御され得る。
【００８４】
図３は、知識ベースを用いることにより、ユーザによるパラメータの設定および／または変更を支援することを可能にする第２の実施例を示す。
【００８５】
図３の実施例においては、システムは図２のとおりであり、加えて、経験の乏しいユーザが、ブリーチングすべき標識の種類などの光変更パラメータのうち高レベルの或るパラメータを設定することを可能にする。当該システムは知識ベースを用いて、ハードウェアが使用すべき波長およびパワーレベルなどの低レベルのパラメータを決定する。
【００８６】
加えて、より経験を積んだユーザであれば知識ベースを変更することもできるだろう。
活性化光線がサンプル中の蛍光標識をブリーチングする実現例においては、このプロトコルは「エキスパートＦＲＡＰ（expert FRAP）」と称され得る。
【００８７】
図４ａは、変更前（観察）段階中に収集された画像から抽出された情報を用いて光変更パラメータを設定する第３の実施例を示す。
【００８８】
活性化光線がサンプル中の蛍光標識をブリーチングする実現例においては、このプロトコルは「クレバーＦＲＡＰ（clever FRAP）」と称され得る。
【００８９】
図４ｂは、状態機械の形で実現される第３の実施例を示す。当該プロトコルにおける各々の段階は、出口条件が満たされるまで繰返される。変更前段階においては、出口条件は、画像分析モジュールが開始信号を送信する場合である。変更段階においては、出口条件は、画像分析モジュールが停止信号を送信する場合である。送信すべき付加的なパラメータはこの図には示されない。
【００９０】
図４ａおよび図４ｂの実施例においては、当該システムは、ユーザが活性化光線の或るパラメータを設定しながらも、変更前段階中に得られたデータから抽出された情報に基づ
いて他のパラメータを設定することを可能にする。特に、画像データは、活性化光線をトリガするために細胞などのサンプル中の構成要素の動きなどの事象を検出するよう分析され得る。
【００９１】
ユーザは、キーのプレスなどの好適な動作によって活性化の期間または終わりを決定することができるだろう。
【００９２】
当該データを分析して、
活性化光線を方向付けるようサンプルの移動部分の位置を決定し、
活性化光線を方向付けるよう当該サンプルの一部の強度の変化を決定し、
活性化光線を方向付けるよう当該サンプルの一部の強度の相対変化を決定し、
活性化光線を方向付けるよう当該サンプルの一部の蛍光寿命の相対変化を決定し、
細胞成分、細胞小器官、小胞または他の粒子などの、対象となる１つ以上の基礎構造の位置を突き止め、この場合、当該粒子の位置および／またはサイズは活性化光線を方向付けるのに用いられ、さらに、
細胞成分、細胞小器官、小胞または他の粒子などの、対象となる１つ以上の基礎構造の位置を突き止め、この場合、当該粒子の位置、動き、形状、速度、方向、相対距離および／またはサイズは活性化光線をトリガするのに用いられ、さらに、
活性化光線をトリガするために、細胞サイクルにおける主要な事象（たとえば、細胞分裂、細胞死、ウイルス侵入、エンドサイトーシス、エキソサイトーシス、管状化（tubulation）、遺伝子導入など）および／または２つ以上の事象の一致を検出し、
自動的に計器を制御し、
照射源の設定を指示し、
発光波長の設定を指示し得る。たとえば、発光波長の変化に追従し、照射光の波長を調節してサンプル中の標識の発光強度を最大にすることにより、サンプルの特徴に対する変化を測定することができ、このため、より有効に
光の偏光の設定を指示し、
焦点駆動機構の設定と、こうして顕微鏡の焦点面とを指示し、
サンプル移送機構を指示し、
サンプルヒータの温度を設定し、
液体分配機構を制御することができる。
【００９３】
データは、サンプルの全体または一部の変形または動きに起因する歪みを除去するよう前処理されてもよい。
【００９４】
図５は、画像分析モジュールが、光変更を完了するために最適なパラメータ設定、たとえばの光の量を決定するよう、各段階において得られた画像データを処理する第４の実施例を示す。
【００９５】
図５の実施例においては、当該システムは、ユーザが活性化光線の或るパラメータを設定することを可能にしながらも、プリブリーチ段階、ブリーチ段階およびポストブリーチ段階中に得られたデータから抽出された情報に基づいて他のパラメータを設定する。特に、段階を終了させるためにサンプルにおける構成要素の変化などの事象を検出するよう画像データが分析されてもよい
図６は、当該システムが、収集された画像から抽出された情報に従って監視段階から変更段階に移る第５の実施例を示す。活性化光線がサンプル中の蛍光標識をブリーチングする実現例においては、このプロトコルは「自動ＦＲＡＰ（automated FRAP）」と称され得る。
【００９６】
これは、活性化され繰返しクエンチされ得る光切換標識とともに用いられ、かつ、個々
の構成要素の寿命を追跡するのに用いられる場合、特に有用であると考えられる。
【００９７】
図６の実施例においては、当該システムは、サンプルが励起光源を用いて撮像される監視段階と、サンプルが活性化光源を用いて撮像される変更段階との切換を可能にする。２つの段階間の移行およびその段階についてのパラメータは、収集された画像データを分析することによって決定される。
【００９８】
図７は、当該システムが、得られた画像から抽出された情報に従って監視段階から変更段階に移り、図３において言及された知識ベースを設定するためにいくつかのパラメータ設定での活性化光線に対するサンプル挙動についての情報を集める第６の実施例を示す。活性化光線がサンプル中の蛍光標識をブリーチングする実現例においては、このプロトコルは「自動構成ＦＲＡＰ（autoconfig FRAP）」と称され得る。
【００９９】
図７の実施例においては、当該システムは、図５に関連して記載されるとおり、変更前段階、変更段階、変更後段階および分析段階の制御を可能にする。各段階で用いられるパラメータは、相互作用的なプロセスにより迅速かつ効率的にハードウェア設定（レーザ出力、変更期間など）を決定するためにサンプルの実現可能なパラメータの探求を可能にするようなものであり、これらの設定は、図３に関連して述べられた知識ベースに渡される。適切なフィルタセットでは、当該システムは、変更のパラメータを監視するよう、変更段階中、たとえばブリーチプロセス中に撮像可能であるだろう。
【０１００】
さらなる実施例においては、当該サンプルは１つ以上の光切換可能標識を含んでおり、このため、活性化光線は、短い時間スケール（高速移動構成要素）、中程度の時間スケールまたは長い時間スケール（稀な事象または構成）にわたって標識付けされた構成要素を観察するために上述のとおり標識の活性化、クエンチまたは切換えを行なうことができる。
【０１０１】
標識は、ＮＡＤＨなどの自然発生的な蛍光分子、「Fura」などのカルシウムプローブ、および／または、蛍光分子で標識付けされかつ選択された種に結合された抗体を含み得る。
【０１０２】
標識は、蛍光共鳴エネルギ移動（「ＦＲＥＴ」）において用いられる種類の重複した発光／励起スペクトルを有する１対の蛍光分子を含み得る。活性化光線は、サンプルの領域において、ＦＲＥＴプロセスがその領域で確認され得るように受容体分子を光ブリーチングするよう設定され得る。
【０１０３】
ＦＲＥＴの対のうちの一方は光切換標識であってもよく、活性化光線は、当該サンプルの領域において、ＦＲＥＴプロセスがその領域で確認され得るように光切換標識を切換えるよう設定され得る。
【０１０４】
標識は、活性化光線で照らされる場合、活性群を放出するケージド化合物を含み得る（J. C. Politz、上述を参照）。
【０１０５】
さらなる実施例においては、励起光源１１は、ランプなどの広帯域光源から１つ以上のスペクトル帯域を放出し得る。さらに、当該励起光源は、異なる標識を識別するために、２つ以上の別個の波長帯で励起光を供給するよう制御可能であり得る。いくつかのプロセスにおいては、励起光源にとってパルスにすることが有利であり得る。
【０１０６】
励起光源は、蛍光スペックル顕微鏡法で用いられる種類のものであってもよい（M. C. Adams 他, Methods, 2002, Vol. 29, pp. 29-41）。
【０１０７】
さらなる実施例においては、活性化光線は励起光と同じ源から得られてもよい。
活性化光線は、
パルスにされ得るか、
光学トラップまたは光学ピンセット構成であり得るか、
次の処理のために当該サンプルから対象となる領域を除去するためのレーザ切開機構であり得るか、または、
次の処理のために当該サンプルから対象となる領域を除去するためのレーザ切除機構であり得る。
【０１０８】
サンプルから出る検出された放射線に応答して細胞などの構造に開口部を形成するのに局所的なエネルギ光線が用いられてもよい。好ましくはレーザが用いられる。これは、たとえば、Ｔｉ：サファイア、アルゴンイオンまたは周波数シフトＮｄ：ＹＡＧレーザであってもよい。代替的には、より低費用であり得るダイオードレーザが用いられてもよい。
【０１０９】
４０ｍｓにわたって細胞をダイオードレーザからの０．３ｍＷの紫光に晒すと、細胞膜に孔が開くことがわかった。直径約１ミクロンの点を形成するために、ｘ１００の顕微鏡対物レンズを用いて光線の焦点を細胞に合わせた。これにより、約１２００ＭＷ／ｍ2の出力密度がもたらされる。細胞膜はプロセスの後直ちにそれ自体を「修復する」ことができ、外見上では長期間にわたる損傷または変化を被っていなかった（Optics Express, Vol.13, p. 595）。
【０１１０】
構造に開口部を形成するために、励起光線については、活性化光線を発生させるのに用いられるのと同じ光源を用いて局所的なエネルギ光線を発生させてもよい。
【０１１１】
さらなる実施例においては、当該システムは１つ以上の光検出器、たとえば、光電子増倍管、ならびに励起光線および／もしくは検出器への発光経路の走査構成、ならびに／またはサンプルの一部もしくは全体を観察するための検出器など、を有し得る。
【０１１２】
当該システムは、異なる標識を識別するために異なる光フィルタリング構成要素を備えた２つ以上の撮像検出器を有し得る。
【０１１３】
蛍光標識がパルスに追従する光を放出するのにかかる時間を用いて異なる標識を識別することができるように、当該検出器がゲート装置を備え、励起光源がパルスにされてもよい。
【０１１４】
コントローラは、ハードウェアおよび／またはソフトウェアで実現され得る。
さらなる実施例においては、当該システムは、１つ以上のピンホールおよび走査機構を用いることによって単一の画像面に光を集める共焦点原理を用いてもよい。
【０１１５】
代替的には、サンプルを異なる深さで光学的に切断するのに、構造化された照明技術が用いられてもよい（M. A. A. Neil, R. Juskaitis および T. Wilson, Optical Letters,
22(24): 1905-1907, Dec. 15 1997）。これは、従来の光学顕微鏡で実行され得るとおり、レーザ走査共焦点システムよりも費用効果が大きくなるだろう。
【０１１６】
励起光源がサンプル間のキャリア面で内部に反射するよう向けられ、こうして、サンプルのうち表面に近い部分だけを励起する全内部反射（ＴＩＲＦ：total internal reflection）原理が用いられてもよい。
【０１１７】
さらに、当該システムはデコンボリューション原理を用いて、異なる画像面に焦点が合
わされた画像のグループを取込み、デコンボリューションプロセスを適用して、容積測定（ＸＹＺ）データを得ることができるだろう。容積測定時系列（ＸＹＺＴ）データ、容積測定多重波長（ＸＹＷＺ）データまたは容積測定多重波長時系列（ＸＹＷＺＴ）データを得ることができるだろう。
【０１１８】
長波長（８００〜１２００ｎｍ）の高速パルスレーザを用いる多光子顕微鏡は、励起光源および／または活性化光線を形成し得る（J. Pawley, Handbook of Confocal Microscopy）。
【０１１９】
光学顕微鏡または蛍光顕微鏡は、照射光源からの光および活性化光線をサンプルに向け、放出された光線を集め、これを検出器に向けるためのサンプルホルダ、拡大対物レンズおよびダイクロイックミラーの簡略化された構成と置き換えられてもよい。
【０１２０】
代替的には、蛍光顕微鏡は内視鏡と置き換えられてもよい。
当該サンプルは、細胞培養物などの細胞の同種の集団であり得る。代替的には、当該サンプルは、細胞培養物などの異種の多細胞の集まり；組織培養物などの多細胞の集まり；幹細胞サンプル；組織サンプル；目もしくは網膜または腸管もしくは血管の内部などの臓器；エレガンス線虫、昆虫、魚、哺乳動物もしくは両生類などの動物すべて；植物もしくは菌、分裂細胞もしくは胚の全体もしくは一部；スライドガラスもしくはマルチウェルプレートなどのマルチサイトキャリアに保持され連続的に走査される１つ以上のサンプル；または、１つ以上の種の拡散などの何らかの変化を被る材料サンプルであり得る。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１ａ】サンプルにおけるプロセスを調査するための公知の光学顕微鏡装置を示すブロック図である。
【図１ｂ】サンプルにおけるプロセスを調査するための公知の蛍光顕微鏡装置を示すブロック図である。
【図１ｃ】蛍光標識の公知の用途を示す図である。
【図１ｄ】蛍光標識についての典型的なブリーチ回復曲線を示す図である。
【図１ｅ】公知のブリーチングプロトコルを示すフロー図である。
【図２】この発明のそれぞれの実施例に従った変更プロトコルを示すフロー図である。
【図３】この発明のそれぞれの実施例に従った変更プロトコルを示すフロー図である。
【図４】この発明のそれぞれの実施例に従った変更プロトコルを示すフロー図である。
【図４ａ】この発明のそれぞれの実施例に従った変更プロトコルを示すフロー図である。
【図４ｂ】この発明のそれぞれの実施例に従った変更プロトコルを示すフロー図である。
【図５】この発明のそれぞれの実施例に従った変更プロトコルを示すフロー図である。
【図６】この発明のそれぞれの実施例に従った変更プロトコルを示すフロー図である。
【図７】この発明のそれぞれの実施例に従った変更プロトコルを示すフロー図である。
【図１ａ】
2008511824.tif 000003
【図１ｂ】
2008511824.tif 000004
【図１ｃ】
2008511824.tif 000005
【図１ｄ】
2008511824.tif 000006
【図１ｅ】
2008511824.tif 000007
【図２】
2008511824.tif 000008
【図３】
2008511824.tif 000009
【図４ａ】
2008511824.tif 000010
【図４ｂ】
2008511824.tif 000011
【図５】
2008511824.tif 000012
【図６】
2008511824.tif 000013
【図７】
2008511824.tif 000014
【国際調査報告】
2008511824.tif 000015
2008511824.tif 000016
2008511824.tif 000017
2008511824.tif 000018
2008511824.tif 000019
2008511824.tif 000020
2008511824.tif 000021