(57)【要約】  本発明は胚幹（ＥＳ）細胞を培養するための方法および組成物に関する。当該方法は、フィーダー細胞およびＬＩＦなしで、血清なしの条件で細胞の多分化能／自己複製を維持する式（Ｉ）【化１】2008545442.tif 000015の小分子の存在下でＥＳ細胞を増殖させることに関する。これらの方法の一部は胚幹細胞生産における一貫性をより一層促進し、例えば再生医療における胚幹細胞の実際の使用の新しい道を提供する。
2008545442.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多分化能幹細胞を維持する方法であって、ａ）塩基性培地；およびｂ）式Ｉ：
【化１】
2008545442.tif 000014
〔式中、
Ｒ１は水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ６−１０アリール−Ｃ０−４アルキル、Ｃ５−１０ヘテロアリール−Ｃ０−４アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル−Ｃ０−４アルキルおよびＣ３−１０ヘテロシクロアルキル−Ｃ０−４アルキルから選択され；ここでＲ１の任意のアルキルまたはアルケニルは、所望によりハロ、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキルおよび−ＮＲ２Ｒ３から独立して選択される１〜３個の基で置換されており；ここでＲ１の任意のアリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルは、所望によりハロ、ヒドロキシ、シアノ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ２−６アルケニル、ハロ−置換−アルキル、ハロ−置換−アルコキシ、−ＸＮＲ２Ｒ３、−ＸＯＸＮＲ２Ｒ３、−ＸＮＲ２Ｓ（Ｏ）０−２Ｒ３、−ＸＣ（Ｏ）ＮＲ２Ｒ３、−ＸＮＲ２Ｃ（Ｏ）ＸＯＲ２、−ＸＮＲ２Ｃ（Ｏ）ＮＲ２Ｒ３、−ＸＮＲ２ＸＮＲ２Ｒ３、−ＸＣ（Ｏ）ＮＲ２ＸＮＲ２Ｒ３、−ＸＮＲ２ＸＯＲ２、−ＸＯＲ２、−ＸＮＲ２Ｃ（＝ＮＲ２）ＮＲ２Ｒ３、−ＸＳ（Ｏ）０−２Ｒ４、−ＸＮＲ２Ｃ（Ｏ）Ｒ２、−ＸＮＲ２Ｃ（Ｏ）ＸＮＲ２Ｒ３、−ＸＮＲ２Ｃ（Ｏ）Ｒ４、−ＸＣ（Ｏ）Ｒ４、−ＸＲ４、−ＸＣ（Ｏ）ＯＲ３および−ＸＳ（Ｏ）０−２ＮＲ２Ｒ３から選択される１〜３個の基で置換されており；ここでＸは結合またはＣ１−４アルキレンであり；Ｒ２およびＲ３は水素、Ｃ１−６アルキルおよびＣ３−１２シクロアルキルから独立して選択され；そしてＲ４はＸ、Ｒ２およびＲ３が上記のとおりであるＣ１−６アルキル、−ＸＮＲ２Ｒ３、−ＸＮＲ２ＸＮＲ２Ｒ２、ＸＮＲ２ＸＯＲ２および−ＸＯＲ２から選択される１〜３個の基で所望により置換されているＣ３−１０ヘテロシクロアルキルである〕
の化合物；およびその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物およびアイソマー中で細胞を増殖させる工程を含む方法。
【請求項２】
細胞が哺乳類細胞である請求項１の方法。
【請求項３】
細胞がヒト胚幹細胞である請求項１の方法。
【請求項４】
Ｒ１が水素、メチル、エチル、イソプロピル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、ピリミジニル、３−ヒドロキシ−１−メチル−プロピルヒドロキシ−エチル、フェニル、モルホリノ、ベンジル、［１，２，４］トリアゾール−４−イル、アリル、２−メチル−アリル、２−（２−オキソ−ピロリジン−１−イル）−エチル、ピペラジニル−エチル、ピペラジニル−プロピル、チアゾリル、オキサゾリル、ピリジニル、ピラゾリル、ピペリジニル、チアゾリル、エチル−ピロリジニル−メチル、モルホリノ−プロピル、ジメチル−アミノ−プロピル、ジエチル−アミノ−プロピル、ジエチル−アミノ−ブチル、エトキシ−カルボニル−メチルおよび［１，２，４］トリアジン−３−イル、［１，３，４］チアジアゾリルから選択され；ここで、任意のアリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルが、所望によりメチル、エチル、シアノ、ヒドロキシ、メトキシ、アミノ−カルボニル−アミノ、ヒドロキシ−メチル、メチル−ピペラジニル、メチル−ピペラジニル−カルボニル、エチル−ピペラジニル、メチル−ピペラジニル−メチル、モルホリノ−スルホニル、メチル−ピペラジニル−スルホニル、メチル−ピペラジニル−カルボニル−アミノ、メチル−スルホニル−アミノ、アミノ−カルボニル、アミノ−スルホニル、ヒドロキシ−エチル、ヒドロキシ−メチル−カルボニル−アミノ、ホルミル−アミノ、ジメチル−アミノ、ジメチル−アミノ−メチル、ジメチル−アミノ−エチル、イソプロピル−アミノ−エチル、カルボキシ、アミノ−エチル−アミノ、メチル−アミノ−エチル、モルホリノ−エチル、モルホリノ−メチル、アミノ−エチル、イミダゾリル−プロピル、ピペラジニル−エチル、ピペラジニル、トリフルオロメチル、ジエチル−アミノ−エチル、フルオロ、モルホリノ、ジメチル−アミノ−エチル−アミノ−カルボニル、ジエチル−アミノ−エトキシ、２−アミノ−プロピオニルアミノ、ジメチル−アミノ−ピロリジニル、（２−ジメチルアミノ−エチル）−メチル−アミノ、２−ジメチルアミノ−１−メチル−エトキシおよびジエチル−アミノから独立して選択される１〜３個の基で置換されている、請求項４の化合物。
【請求項５】
Ｎ−｛３−［７−（２−エチル−２Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ）−１−メチル−２−オキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル］−４−メチル−フェニル｝−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド；
Ｎ−｛４−メチル−３−［１−メチル−７−（２−メチル−２Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ）−２−オキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル］−フェニル｝−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド；
Ｎ−｛３−［７−（２，６−ジメチル−ピリジン−４−イルアミノ）−１−メチル−２−オキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル］−４−メチル−フェニル｝−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド；
Ｎ−｛３−［７−（３−ヒドロキシ−フェニルアミノ）−１−メチル−２−オキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル］−４−メチル−フェニル｝−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド；
Ｎ−｛３−［７−（３−アミノ−フェニルアミノ）−１−メチル−２−オキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル］−４−メチル−フェニル｝−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド；
Ｎ−｛３−［７−（３−メタンスルホニルアミノ−フェニルアミノ）−１−メチル−２−オキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル］−４−メチル−フェニル｝−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド；
Ｎ−｛３−［７−（２，５−ジメチル−２Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ）−１−メチル−２−オキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル］−４−メチル−フェニル｝−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド；
Ｎ−［４−メチル−３−（１−メチル−７−メチルアミノ−２−オキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル）−フェニル］−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド；および
Ｎ−［３−（７−エチルアミノ−１−メチル−２−オキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル）−４−メチル−フェニル］−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド：
から選択される、請求項４の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
発明の分野
本願は米国仮出願第６０／６７３，６２３（出願日：２００５年６月１０日）に基づき優先権を主張する。先の出願の開示はその全体をあらゆる目的のために引用し、本明細書の一部とする。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本発明は胚幹（ＥＳ）細胞を培養するための方法および組成物に関する。当該方法は、フィーダー細胞およびＬＩＦなしで、血清なしの条件で細胞の多分化能／自己複製を維持する小分子の存在下でＥＳ細胞を増殖させることに関する。これらの方法の一部は胚幹細胞生産における一貫性をより一層促進し、例えば再生医療における胚幹細胞の実際の使用の新しい道を提供する。
【０００３】
背景
胚幹細胞は自発的に分化しようとする（すなわち特定の構造的および／または機能的特徴を獲得する）ため、培地中で維持することが困難である。増殖因子、細胞外マトリックス分子および成分、環境ストレス要因ならびに直接の細胞間相互作用を含む多くの要因の結果として、幹細胞は分化する。
【０００４】
増殖未分化状態を維持したマウスまたはヒト胚幹細胞の培養の発生は、細胞を胎児ウシ血清を補った増殖培地中で、そして時々非分化細胞の「フィーダー」層で細胞を増殖させることを含む多工程の方法である。サイトカイン白血病阻害因子（ＬＩＦ）が培養培地に加えられるとき、マウス胚幹細胞をフィーダー細胞なしでインビトロで増殖させることができるが、これは細胞密度が中〜高度のときのみ有効であり、１個の細胞からのコロニー形成には血清またはフィーダー層の存在が必要である。さらに、ヒト胚幹細胞については、血清の存在下でもなお、ＬＩＦは自己複製の支持に適当ではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、血清なしの培地でＬＩＦを使用しない胚幹細胞の自己複製のための、小分子を使用する方法を提供する。胚幹細胞の多分化能を維持するための本発明の小分子の使用は、胚幹細胞生産における一貫性をより一層促進し、例えば再生医療における胚幹細胞の実際の使用の新しい道を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要約
ある局面において、本発明は多分化能幹細胞を維持する方法であって、ａ）塩基性培地；およびｂ）式Ｉ：
【化１】
2008545442.tif 000003
〔式中、
Ｒ１は水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ６−１０アリール−Ｃ０−４アルキル、Ｃ５−１０ヘテロアリール−Ｃ０−４アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル−Ｃ０−４アルキルおよびＣ３−１０ヘテロシクロアルキル−Ｃ０−４アルキルから選択され；ここでＲ１の任意のアルキルまたはアルケニルは、所望によりハロ、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキルおよび−ＮＲ２Ｒ３から独立して選択される１〜３個の基で置換されており；ここでＲ１の任意のアリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルは、所望によりハロ、ヒドロキシ、シアノ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ２−６アルケニル、ハロ−置換−アルキル、ハロ−置換−アルコキシ、−ＸＮＲ２Ｒ３、−ＸＯＸＮＲ２Ｒ３、−ＸＮＲ２Ｓ（Ｏ）０−２Ｒ３、−ＸＣ（Ｏ）ＮＲ２Ｒ３、−ＸＮＲ２Ｃ（Ｏ）ＸＯＲ２、−ＸＮＲ２Ｃ（Ｏ）ＮＲ２Ｒ３、−ＸＮＲ２ＸＮＲ２Ｒ３、−ＸＣ（Ｏ）ＮＲ２ＸＮＲ２Ｒ３、−ＸＮＲ２ＸＯＲ２、−ＸＯＲ２、−ＸＮＲ２Ｃ（＝ＮＲ２）ＮＲ２Ｒ３、−ＸＳ（Ｏ）０−２Ｒ４、−ＸＮＲ２Ｃ（Ｏ）Ｒ２、−ＸＮＲ２Ｃ（Ｏ）ＸＮＲ２Ｒ３、−ＸＮＲ２Ｃ（Ｏ）Ｒ４、−ＸＣ（Ｏ）Ｒ４、−ＸＲ４、−ＸＣ（Ｏ）ＯＲ３および−ＸＳ（Ｏ）０−２ＮＲ２Ｒ３から選択される１〜３個の基で置換されており；ここでＸは結合またはＣ１−４アルキレンであり；Ｒ２およびＲ３は水素、Ｃ１−６アルキルおよびＣ３−１２シクロアルキルから独立して選択され；そしてＲ４はＸ、Ｒ２およびＲ３が上記のとおりであるＣ１−６アルキル、−ＸＮＲ２Ｒ３、−ＸＮＲ２ＸＮＲ２Ｒ２、ＸＮＲ２ＸＯＲ２および−ＸＯＲ２から選択される１〜３個の基で所望により置換されているＣ３−１０ヘテロシクロアルキルである〕
の化合物；およびそのＮ−オキシド誘導体、プロドラッグ誘導体、保護誘導体、個々のアイソマーおよびアイソマーの混合物；ならびに当該化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物（例えば水和物）中で細胞を増殖させる工程を含む方法を提供する。
【０００７】
発明の詳細な説明
定義
基として、および他の基、例えばハロ−置換−アルキルおよびアルコキシの構造要素としての「アルキル」は、直鎖状または分枝鎖状であり得る。Ｃ１−４−アルコキシには、メトキシ、エトキシ等が含まれる。ハロ−置換アルキルには、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル等が含まれる。
【０００８】
「アリール」は、６〜１０個の環炭素原子を含む単環式または縮合二環式芳香環集合を意味する。例えば、アリールはフェニルまたはナフチル、好ましくはフェニルであり得る。「アリーレン」はアリール基に由来する２価基を意味する。「ヘテロアリール」はアリールについて定義のとおりであるが、１個以上の環員がヘテロ原子である。例えばヘテロアリールには、ピリジル、インドリル、インダゾリル、キノキサリニル、キノリニル、ベンゾフラニル、ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニル、ベンゾ［１，３］ジオキソール、イミダゾリル、ベンゾ−イミダゾリル、ピリミジニル、フラニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、チエニル等が含まれる。
【０００９】
「シクロアルキル」は、記載の数の環原子を含む飽和または部分不飽和、単環式、縮合二環式または架橋多環式環集合を意味する。例えばＣ３−１０シクロアルキルには、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等が含まれる。
「ヘテロシクロアルキル」は、記載の１個以上の炭素原子が−Ｏ−、−Ｎ＝、−ＮＲ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−から選択される基で置換されている本願で定義のシクロアルキルを意味する；ここで、Ｒは水素、Ｃ１−４アルキルまたは窒素保護基である。例えば本発明の化合物を記載するために本願で使用されているＣ３−８ヘテロシクロアルキルには、モルホリノ、ピロリジニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピペリジニロン、２−オキソ−ピロリジン−１−イル、１，４−ジオキサ−８−アザ−スピロ［４．５］デシ−８−イル等が含まれる。
【００１０】
「ハロゲン」（またはハロ）は、好ましくはクロロまたはフルオロを意味するが、ブロモまたはヨードも意味する。
【００１１】
「処置する」、「処置（treating）」および「処置（treatment）」は、疾患および／またはそれに付随する症状を軽減または寛解する方法に関する。
【００１２】
好ましい態様の記載
本発明はＥＳ細胞を培養するための方法および組成物に関する。当該方法は、フィーダー細胞およびＬＩＦなしで、血清なしの条件で細胞の多分化能／自己複製を維持する小分子の存在下でＥＳ細胞を増殖させることに関する。
【００１３】
ある態様において、式Ｉの化合物に関して：
Ｒ１は水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ６−１０アリール−Ｃ０−４アルキル、Ｃ５−１０ヘテロアリール−Ｃ０−４アルキル、Ｃ３−１０シクロアルキル−Ｃ０−４アルキルおよびＣ３−１０ヘテロシクロアルキル−Ｃ０−４アルキルから選択され；ここでＲ１の任意のアルキルまたはアルケニルは、所望によりハロ、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキルおよび−ＮＲ２Ｒ３から独立して選択される１〜３個の基で置換されており；ここでＲ１の任意のアリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルは、所望によりハロ、ヒドロキシ、シアノ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ２−６アルケニル、ハロ−置換−アルキル、ハロ−置換−アルコキシ、−ＸＮＲ２Ｒ３、−ＸＯＸＮＲ２Ｒ３、−ＸＮＲ２Ｓ（Ｏ）０−２Ｒ３、−ＸＣ（Ｏ）ＮＲ２Ｒ３、−ＸＮＲ２Ｃ（Ｏ）ＸＯＲ２、−ＸＮＲ２Ｃ（Ｏ）ＮＲ２Ｒ３、−ＸＮＲ２ＸＮＲ２Ｒ３、−ＸＣ（Ｏ）ＮＲ２ＸＮＲ２Ｒ３、−ＸＮＲ２ＸＯＲ２、−ＸＯＲ２、−ＸＮＲ２Ｃ（＝ＮＲ２）ＮＲ２Ｒ３、−ＸＳ（Ｏ）０−２Ｒ４、−ＸＮＲ２Ｃ（Ｏ）Ｒ２、−ＸＮＲ２Ｃ（Ｏ）ＸＮＲ２Ｒ３、−ＸＮＲ２Ｃ（Ｏ）Ｒ４、−ＸＣ（Ｏ）Ｒ４、−ＸＲ４、−ＸＣ（Ｏ）ＯＲ３および−ＸＳ（Ｏ）０−２ＮＲ２Ｒ３から選択される１〜３個の基で置換されており；ここでＸは結合またはＣ１−４アルキレンであり；Ｒ２およびＲ３は水素、Ｃ１−６アルキルおよびＣ３−１２シクロアルキルから独立して選択され；そしてＲ４はＸ、Ｒ２およびＲ３が上記のとおりであるＣ１−６アルキル、−ＸＮＲ２Ｒ３、−ＸＮＲ２ＸＮＲ２Ｒ２、ＸＮＲ２ＸＯＲ２および−ＸＯＲ２から選択される１〜３個の基で所望により置換されているＣ３−１０ヘテロシクロアルキルである。
【００１４】
他の態様において、Ｒ１は水素、メチル、エチル、イソプロピル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、ピリミジニル、３−ヒドロキシ−１−メチル−プロピルヒドロキシ−エチル、フェニル、モルホリノ、ベンジル、［１，２，４］トリアゾール−４−イル、アリル、２−メチル−アリル、２−（２−オキソ−ピロリジン−１−イル）−エチル、ピペラジニル−エチル、ピペラジニル−プロピル、チアゾリル、オキサゾリル、ピリジニル、ピラゾリル、ピペリジニル、チアゾリル、エチル−ピロリジニル−メチル、モルホリノ−プロピル、ジメチル−アミノ−プロピル、ジエチル−アミノ−プロピル、ジエチル−アミノ−ブチル、エトキシ−カルボニル−メチルおよび［１，２，４］トリアジン−３−イル、［１，３，４］チアジアゾリルから選択され；ここで、任意のアリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルは、所望によりメチル、エチル、シアノ、ヒドロキシ、メトキシ、アミノ−カルボニル−アミノ、ヒドロキシ−メチル、メチル−ピペラジニル、メチル−ピペラジニル−カルボニル、エチル−ピペラジニル、メチル−ピペラジニル−メチル、モルホリノ−スルホニル、メチル−ピペラジニル−スルホニル、メチル−ピペラジニル−カルボニル−アミノ、メチル−スルホニル−アミノ、アミノ−カルボニル、アミノ−スルホニル、ヒドロキシ−エチル、ヒドロキシ−メチル−カルボニル−アミノ、ホルミル−アミノ、ジメチル−アミノ、ジメチル−アミノ−メチル、ジメチル−アミノ−エチル、イソプロピル−アミノ−エチル、カルボキシ、アミノ−エチル−アミノ、メチル−アミノ−エチル、モルホリノ−エチル、モルホリノ−メチル、アミノ−エチル、イミダゾリル−プロピル、ピペラジニル−エチル、ピペラジニル、トリフルオロメチル、ジエチル−アミノ−エチル、フルオロ、モルホリノ、ジメチル−アミノ−エチル−アミノ−カルボニル、ジエチル−アミノ−エトキシ、２−アミノ−プロピオニルアミノ、ジメチル−アミノ−ピロリジニル、（２−ジメチルアミノ−エチル）−メチル−アミノ、２−ジメチルアミノ−１−メチル−エトキシおよびジエチル−アミノから独立して選択される１〜３個の基で置換されている。
【００１５】
好ましい本発明の化合物は：
Ｎ−｛３−［７−（２−エチル−２Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ）−１−メチル−２−オキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル］−４−メチル−フェニル｝−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド；
Ｎ−｛４−メチル−３−［１−メチル−７−（２−メチル−２Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ）−２−オキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル］−フェニル｝−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド；
Ｎ−｛３−［７−（２，６−ジメチル−ピリジン−４−イルアミノ）−１−メチル−２−オキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル］−４−メチル−フェニル｝−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド；
Ｎ−｛３−［７−（３−ヒドロキシ−フェニルアミノ）−１−メチル−２−オキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル］−４−メチル−フェニル｝−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド；
Ｎ−｛３−［７−（２，５−ジメチル−２Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ）−１−メチル−２−オキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル］−４−メチル−フェニル｝−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド；
Ｎ−｛３−［７−（３−アミノ−フェニルアミノ）−１−メチル−２−オキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル］−４−メチル−フェニル｝−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド；
Ｎ−｛３−［７−（３−メタンスルホニルアミノ−フェニルアミノ）−１−メチル−２−オキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル］−４−メチル−フェニル｝−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド；
Ｎ−［４−メチル−３−（１−メチル−７−メチルアミノ−２−オキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル）−フェニル］−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド；および
Ｎ−［３−（７−エチルアミノ−１−メチル−２−オキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル）−４−メチル−フェニル］−３−トリフルオロメチル−ベンズアミドから選択される。
【００１６】
さらに好ましい式Ｉの化合物は下記実施例および表１に記載されている。
【発明の効果】
【００１７】
有用性
ＥＳ細胞は移植前胚由来であり、３つの胚葉全ての細胞および組織をインビボおよびインビトロで発生することができる胎児創始細胞の発生能を保持している。ＥＳ細胞を自己複製（多分化能）または各分裂で別の分化の運命を選択しなければならない細胞と考えることができる。分化の方向の選択を支配するシグナルは、細胞の微小環境における増殖因子によって提供される。増殖因子は血清中で入手可能であるか、またはフィーダー細胞によって生産可能である。
【００１８】
これらの増殖因子を同定し、それら各々の伝達情報(input)を決定することは幹細胞介在組織発生、代謝回転および修復を理解するために極めて重要である。さらに、かかる知見を延長してエクスビボでの幹細胞の増殖および分化を制御することは、再生医療および生物製剤の発見に使用できると予期される。
【００１９】
最初にマウスＥＳ細胞を単離し、分裂能を不活性化したマウス胚繊維芽細胞のフィーダー層で共培養することで維持した。繊維芽フィーダー層の本質的機能は、サイトカイン白血病阻害因子（ＬＩＦ）を提供することである。ＬＩＦなしの繊維芽細胞は自己複製を補助するのに不完全であり、ＬＩＦはマウスＥＳ細胞の通常の増殖および新規な誘導の両方におけるフィーダーに対する要求に置き換えることができる。ｇｐ１３０受容体と結合するＬＩＦおよび関連するサイトカインは、未分化表現形、多分化能および胚コロニー形成能の基本的性質の保持によってマウスＥＳ細胞の長期自己複製を維持する分子的に定義された経路のみを提供する。
【００２０】
ＥＳ細胞をＬＩＦを補った市販の血清代用物で増殖させることはできるが、これは中〜高細胞密度でのみ有効であり、１個の細胞からのコロニー形成には血清またはフィーダー層の存在が必要である。さらに、ヒトＥＳ細胞にとって、たとえ血清の存在下であっても、ＬＩＦは自己複製を補助するのに適当ではない。
【００２１】
本発明の方法は、フィーダー細胞およびＬＩＦなしで、血清なしの条件で多分化能幹細胞を維持することができる。本発明の化合物は、ＥＲＫ１およびＲａｓＧＡＰとの相互作用によってｍＥＳ細胞の自己複製に有効である。例えば、維持されたＥＲＫ１／２活性化はニューロンへの分化を導くが、ＲａｓＧＡＰの阻害はＲａｓまたはＲａｓ様ＧＴＰアーゼによるシグナルを活性化することができ、これは次にＰ１３Ｋまたは他のシグナル経路を介して自己複製を上昇させることができる。
【００２２】
骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）は血清中に含まれるか、またはフィーダー層から提供される、ＬＩＦと共に作用してインビトロの未分化マウスＥＳ細胞を維持する因子であると考えられている。ＢＭＰがＥＳ細胞培養における血清およびフィーダー細胞要求を、Ｓｍａｄ経路の活性化および塩基性へリックス−ループ−へリックスタンパク質を負に制御することによって分化を阻止すると考えられているＳｍａｄシグナルの共通の標的であるＩｄ遺伝子発現の誘導によって置換することができることが示唆された。ＢＭＰがＥＳ細胞の自己複製を促進する正確な機構は確かではないが、最近の研究によってＳｍａｄとは無関係のマイトジェン−活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路も阻害し得ることが示唆されている。重要なことに、ｐ３８  ＭＡＰＫの阻害は胚盤胞欠損Ａｌｋ−３（ＢＭＰＲＩＡ）からＥＳ細胞の誘導を促進し、ＥＳ細胞は胚盤胞欠損Ｓｍａｄ４（全Ｓｍａｄの共通のパートナー）に由来し得る。このことはＢＭＰが血清およびフィーダーの有無による異なる機構によって作用するという仮説を裏付ける。
【００２３】
血清およびフィーダー細胞が増殖因子およびサイトカインのような細胞生存シグナルマニフェストを提供し、そして外因性生存シグナルが低細胞密度状態ではとりわけ重要であるという可能性を考慮すると、自己分泌および傍分泌因子を介した刺激が極小であるとき、最適以下の培養条件で（すなわち血清およびフィーダー細胞なしで）ＥＳ細胞はほとんどアポトーシス性となる。低細胞密度では、ＥＳ細胞は多分化能コロニーをほとんど発生しない。シグナルサイトカイン、増殖因子、および他の分子のＥＳ細胞の自己複製および分化に対する効果を分析するためには、血清なしかつフィーダーなしの条件で細胞をアポトーシス性細胞死から保護することができるかどうかが最適であろう。血清なしかつフィーダーなしの条件でのＥＳ細胞の拡大のためのＮ２−およびＢ２７−補充培地の使用によって生存率が改善され、したがって低細胞密度条件でも生存が可能となるが、ＬＩＦとこれらの補充物は、培地にさらにＢＭＰを補充しない限りＥＳ細胞の自己複製を補助することができない。Ｎ２およびＢ２７補充物はホルモン（コルチコステロン、プロゲステロンおよびＴ３）およびレチニルアセテート（レチノイン酸の前駆体）を含んでおり、そしてこれらの成分のいくつかはＥＳ細胞分化プロトコルに使用されるため、それらの存在はシグナルサイトカイン、増殖因子および他の分子のＥＳ細胞の自己複製および分化に対する効果の分析を複雑にする。
【００２４】
したがって、本発明に記載のような血清なし培地条件でのＥＳ細胞の自己複製についての小分子の開発はＥＳ細胞生産における一貫性をより一層促進し、例えば調査および再生医療におけるＥＳ細胞の実際の使用の新しい道を提供する。
【００２５】
さらに、本発明に記載のような血清なし培地条件でのＥＳ細胞の自己複製についての小分子の開発はＥＳ細胞培養環境を画定し、それによって自己複製または分化を導くシグナルインプットの定義および制御を可能とするために必須である。
【００２６】
多分化能の機構はまた、腫瘍形成の我々の理解に貢献することができる（多分化能幹細胞はインビボで腫瘍を形成し得、そして「厳格な」遺伝子における分子変化も腫瘍を導き得る）。さらに、幹細胞と腫瘍細胞の密接な関係を示唆する証拠の増殖実体が存在する：正常幹細胞と腫瘍細胞の自己複製機構が類似している；幹細胞自己複製に含まれる発生シグナルの脱制御が発がん性と関連する；腫瘍は正常幹細胞から発生し得る「がん幹細胞」を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明の化合物の製造法
本発明はまた、本発明の化合物の製造法を含む。記載の反応において、最終生成物で望まれる反応性官能基、例えばヒドロキシ、アミノ、イミノ、チオまたはカルボキシ基を保護して反応での望ましくない参加を回避する必要があり得る。常套の保護基を標準的な方法に従って使用することができる、例えばT. W. Greene and P. G. M. Wuts in “Protective Groups in Organic Chemistry”, John Wiley and Sons, 1991参照。
【００２８】
式Ｉの化合物を下記反応スキームＩ
【化２】
2008545442.tif 000004
〔式中、Ｒ１は発明の要約の式Ｉに定義のとおりである〕
のとおりに進めて製造することができる。
【００２９】
式Ｉの化合物を、適当なアシル活性化試薬（例えばＨＡＴＵ）を使用して適当な塩基（例えばＤＩＥＡ等）および適当な溶媒（例えばＤＭＦ）の存在下で式２の化合物と式３の化合物のカップリングし、完了まで３時間までかけることによって製造することができる。
【００３０】
式Ｉの化合物を下記反応スキームＩＩ
【化３】
2008545442.tif 000005
〔式中、Ｒ１は発明の要約の式Ｉに定義のとおりである〕
のとおりに進めて製造することができる。
【００３１】
式Ｉの化合物を、適当な溶媒（例えばＡｃＯＨ−水）の存在または不在下で式４の化合物を適当なアミンと反応させることによって製造することができる。式Ｉの化合物はまた、適当な溶媒（例えば１−ブタノール）の存在下で式４の化合物を適当なアミンと、ｐ−トルエンスルホン酸の補助によって、高温で反応させることによって製造することができる。
【００３２】
あるいは、式Ｉの化合物を式４の化合物を式Ｒ１Ｈの化合物と３種類の方法によって反応させることによって製造することができる。ヘテロアリールアミンまたはアリールアミンについて、反応を適当な触媒（例えば、Ｐｄ（ＩＩ）塩等）および適当な溶媒（例えば、１，４−ジオキサン等）の存在下で、約８０〜約１５０℃の温度で反応させ、完了まで約２０時間までかけることによって製造することができる。アルキルアミン転移の反応条件には、式４の化合物を５〜１０当量のアミンと共に適当な溶媒（例えば、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ等）中で加熱することが含まれる。式４の化合物のアリールアミンとの縮合について、これらを酸（例えば、ＴｓＯＨ、ＨＯＡｃ、ＨＣｌ等）の存在下で適当な溶媒（例えば、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、アルコール等）中で行う。
【００３３】
式Ｉの化合物の合成の詳細な例は、下記実施例に見出すことができる。
【００３４】
本発明の化合物の製造のための更なる方法
本発明の化合物を、遊離塩基形の化合物を薬学的に許容される無機または有機酸と反応させることによって、薬学的に許容される酸付加塩として製造することができる。あるいは、本発明の化合物の薬学的に許容される塩基付加塩を、遊離酸形の化合物を薬学的に許容される無機または有機塩基と反応させることによって製造することができる。あるいは、塩形の本発明の化合物を、出発物質または中間体の塩を使用して製造することができる。
【００３５】
遊離酸または遊離塩基形の本発明の化合物を対応する塩基付加塩または酸付加塩からそれぞれ製造することができる。例えば、酸付加塩形の本発明の化合物を適当な塩基（例えば、水酸化アンモニウム溶液、水酸化ナトリウム等）で処理することによって対応する遊離塩基に変換することができる。塩基付加塩形の本発明の化合物を適当な酸（例えば塩酸等）で処理することによって対応する遊離酸に変換することができる。
【００３６】
未酸化形の本発明の化合物を本発明の化合物のＮ−オキシドから還元剤（例えば、硫黄、硫黄ジオキシド、トリフェニルホスフィン、ホウ化水素リチウム、水素化ホウ素ナトリウム、３塩化リン、３臭化物等）で適当な不活性有機溶媒（例えば、アセトニトリル、エタノール、ジオキサン水溶液等）中で０〜８０℃で処理することによって製造することができる。
【００３７】
本発明の化合物のプロドラッグ誘導体を当業者に既知の方法によって製造することができる（例えば、さらに詳しくはSaulnier et al., (1994), Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 4, p. 1985参照）。例えば適当なプロドラッグを未誘導体化本発明の化合物を適当なカルバミル化剤（例えば、１，１−アシルオキシアルキルカルバノクロリデート、パラ−ニトロフェニルカルボネート等）で反応させることによって製造することができる。
【００３８】
本発明の化合物の保護誘導体を当業者に既知の方法によって得ることができる。保護基の製造およびその除去について使用可能な技術の詳細な記載は、T. W. Greene, “Protecting Groups in Organic Chemistry”, 3rd edition, John Wiley and Sons, Inc., 1999に見出すことができる。
【００３９】
本発明の化合物を溶媒和物（例えば水和物）として便宜に製造あるいは本発明の方法によって形成することができる。本発明の化合物の水和物をジオキシン、テトラヒドロフランまたはメタノールのような有機溶媒を使用して水／有機溶媒混合物から再結晶化することによって便宜に製造することができる。
【００４０】
本発明の化合物を、化合物のラセミ混合物を光学的に活性な分割試薬と反応させることによってジアステレオマー化合物の対を形成し、ジアステレオマーを分割し、光学的に純粋なエナンチオマーを回収することによって、個々の立体異性体として製造することができる。エナンチオマーの分割を本発明の化合物の共有ジアステレオマー誘導体を使用して行うことができるが、解離性複合体が好ましい（例えば結晶性ジアステレオマー塩）。ジアステレオマーは異なる物理的特徴（例えば融点、沸点、溶解度、反応性等）を有し、これらの不一致の利点を生かして容易に分割することができる。ジアステレオマーをクロマトグラフィーによって、または好ましくは溶解度の差に基づく分割／分解技術によって分割することができる。光学的に純粋なエナンチオマーを、分割試薬と共に、ラセミ化を起こさないあらゆる実用的な方法によって回収する。ラセミ混合物から立体異性体を分割するために使用することができる技術のより詳細な説明は、Jean Jacques, Andre Collet, Samuel H. Wilen, “Enantiomers, Racemates and Resolutions”, John Wiley And Sons, Inc., 1981に見出すことができる。
【００４１】
要約すると、式Ｉの化合物を：
（ａ）反応スキームＩおよびＩＩのもの；および
（ｂ）所望により本発明の化合物を薬学的に許容される塩に変換すること；
（ｃ）所望により塩形の本発明の化合物を非塩形に変換すること；
（ｄ）所望により未酸化形の本発明の化合物を薬学的に許容されるＮ−オキシドに変換すること；
（ｅ）所望によりＮ−オキシド形の本発明の化合物をその未酸化形に変換すること；
（ｆ）所望によりアイソマーの混合物から本発明の化合物の個々のアイソマーを分割すること；
（ｇ）所望により未誘導体化本発明の化合物を薬学的に許容されるプロドラッグ誘導体に変換すること；そして
（ｈ）所望により本発明の化合物のプロドラッグ誘導体をその未誘導体化形に変換すること；
を含む方法によって製造することができる。
【００４２】
出発物質の製造を具体的に記載していない場合、当該化合物は既知であるかあるいは当業者に既知の方法と同様に製造することができるか、または下記実施例に記載されている。
【００４３】
当業者は、上記変換は本発明の化合物の製造に関する代表的な方法に過ぎず、他の既知の方法を同様に使用することができるということを理解する。
【実施例】
【００４４】
これに限定されないが、本発明による式Ｉの化合物（実施例）の製造を説明する下記実施例によって本発明をさらに例示する。
【００４５】
実施例１
Ｎ−｛３−［７−（３−アミノ−フェニルアミノ）−１−メチル−２−オキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル］−４−メチル−フェニル｝−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド
【化４】
2008545442.tif 000006
５−ブロモ−２，４−ジクロロ−ピリミジン（２．４１ｇ、１０．６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１５ｍＬ）中メチルアミン（ＥｔＯＨ中８Ｍ、３．３ｍＬ）で約−２０℃でゆっくりと処理する。−２０℃で３０分間攪拌した後、反応混合物をＣＨＣｌ３および飽和ＮａＨＣＯ３で分配する。水層をさらなるＣＨＣｌ３で２回抽出し、合併した有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮する。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝３／７）で精製して、１．７６ｇ（７５％）の（５−ブロモ−２−クロロ−ピリミジン−４−イル）−メチルアミンを白色固体として得る。
【００４６】
ＤＭＦ中（５−ブロモ−２−クロロ−ピリミジン−４−イル）−メチルアミン（３．７５ｇ、１６．９ｍｍｏｌ）、トリス（ジベンジリジンアセトン）ジパラジウム（０）（３８８ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）、およびトリ−２−フリルホスフィン（７７７ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ）の混合物を２０分間室温で攪拌し、トリブチルビニルチン（５．９３ｍＬ、２０．３ｍｍｏｌ）を加える。１６時間約６５℃で攪拌した後、反応混合物を室温に冷却し、フッ化カリウム１０％水溶液（８００ｍＬ）およびジエチルエーテル（６００ｍＬ）と共に１時間攪拌し、その後セライトパッドでろ過する。セライトパッドをジエチルエーテル（２００ｍＬ）でさらにリンスする。水層を分離し、ＣＨＣｌ３で抽出する。合併した有機抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮して粗油状物を得て、これをフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ／Ｈｘ＝１／４）で精製して（２−クロロ−５−ビニル−ピリミジン−４−イル）−メチルアミン（２．６３ｇ、９２％）を白色固体として得る。
【００４７】
ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（１５ｍＬ／１５ｍＬ）中（２−クロロ−５−ビニル−ピリミジン−４−イル）−メチルアミン（２．５０ｇ、１４．７ｍｍｏｌ）溶液をオゾンで３０分間バブリングし、アルゴンの気流に３分間、−７８℃で通す。反応混合物を室温まで温め、ジメチルスルフィド（３．２４ｍＬ、４４．１ｍｍｏｌ）で処理する。反応混合物を減圧下で濃縮して無色油状物を得て、これをシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ／Ｈｘ＝１／３）で精製して２−クロロ−４−メチルアミノ−ピリミジン−５−カルボアルデヒド（２．４０ｇ、９５％）を白色固体として得る。
【００４８】
ＭｅＯＨ（７０ｍＬ）中２−クロロ−４−メチルアミノ−ピリミジン−５−カルボアルデヒド（１．０８ｇ、６．３ｍｍｏｌ）およびＮ−（３−アミノ−４−メチル−フェニル）−３−トリフルオロメチルベンズアミド（２．０４ｇ、６．９ｍｍｏｌ）溶液を２時間４５℃で攪拌し、シアノホウ化水素ナトリウム（１．１９ｇ、１８．９ｍｍｏｌ）および酢酸（１ｍＬ）で連続して処理する。２時間室温で攪拌した後、反応混合物をＣＨＣｌ３で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄する。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮する。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝１／２）で精製してＮ−｛３−［（２−クロロ−４−メチルアミノピリミジン−５−イルメチル）アミノ］−４−メチルフェニル｝−３−トリフルオロメチルベンズアミド（１．８０ｇ、６４％）を白色固体として得る。
【００４９】
ＴＨＦ（１５ｍＬ）中Ｎ−｛３−［（２−クロロ−４−メチルアミノピリミジン−５−イルメチル）アミノ］−４−メチルフェニル｝−３−トリフルオロメチルベンズアミド（５５９ｍｇ、１．２４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（６９３μＬ、４．９７ｍｍｏｌ）の攪拌溶液にＴＨＦ（５ｍＬ）中トリホスゲン（１４７ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）を０℃で加え、混合物を３０分間室温で攪拌する。沈殿を濾取し、ろ液を３時間１１０℃で攪拌する。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ΝａＨＣＯ３で洗浄する。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮して粗油状物を得て、これをフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン＝１／２）で精製してＮ−［３−（７−クロロ−２−オキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル）−４−メチルフェニル］−３−トリフルオロメチルベンズアミド（４２０ｍｇ、７１％）を白色固体として得る。
【００５０】
Ｎ−［３−（７−クロロ−２−オキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル）−４−メチルフェニル］−３−トリフルオロメチルベンズアミド（３５．０ｍｇ、７３．６ｍｍｏｌ）およびフェニレンジアミン（７９．５ｍｇ、７３６ｍｍｏｌ）の混合物を１時間１００℃で攪拌する。混合物を室温に冷却し、メタノール中に懸濁する。沈殿を回収し、メタノールで洗浄してＮ−｛３−［７−（３−アミノ−フェニルアミノ）−１−メチル−２−オキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル］−４−メチル−フェニル｝−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド（３４ｍｇ、８４％）を白色固体として得る；1H NMR 400 MHz (DMSO-ｄ6) δ 9.22 (s, 1H), 8.29 (s, 1H), 8.25 (d, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.95 (d, 1H), 7.78-7.76 (m, 2H), 7.62 (dd, 1H), 7.30 (d, 1H), 7.05 (d, 1H), 6.88 (d, 1H), 6.87 (s, 1H), 6.17 (dd, 1H), 4.92 (s, 2H), 4.67 (d, 1H), 4.49 (d, 1H), 3.33 (s, 3H), 2.12 (s, 3H); MS m/z 548.3 (M + 1).
【００５１】
実施例２
Ｎ−［４−メチル−３−（１−メチル−７−メチルアミノ−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル）−フェニル｝−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド
【化５】
2008545442.tif 000007
ＭｅＯＨ中エチル４−クロロ−２−メチルスルファニル−５−ピリミジンカルボキシレート（４．５０ｇ、１９．４ｍｍｏｌ）の攪拌溶液にＭｅＯＨ中７Ν  ＮＨ３（１３．９ｍＬ）を０℃で加え、混合物を２時間室温で攪拌する。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄する。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮する。粗生成物をＥｔＯＡｃとヘキサンの混合溶媒から結晶化して、２．９０ｇ（６６％）のエチル４−アミノ−２−メチルスルファニル−５−ピリミジンカルボキシレートを白色固体として得る。
【００５２】
エチル４−アミノ−２−メチルスルファニル−５−ピリミジンカルボキシレート（２．７９ｇ、１３．１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に４Ｎ  ＮａＯＨ（３．９ｍＬ）を加え、混合物を３時間６０℃で攪拌する。反応混合物を濃縮してナトリウム塩形の４−アミノ−２−メチルスルファニル−５−ピリミジンカルボキシレートを定量的収率で得る。
【００５３】
ＤＭＦ中ナトリウム塩形の４−アミノ−２−メチルスルファニル−５−ピリミジンカルボキシレート（１．２８ｇ、６．２ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−アミノ−４−メチル−フェニル）−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド（１．８２ｇ、６．２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（３．２２ｍＬ、１８．５ｍｍｏｌ）溶液にＨＡＴＵ（２．８２ｇ、７．４２ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１時間室温で攪拌する。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３５％水溶液、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液および塩水で洗浄する。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮する。粗生成物をＭｅＯＨから結晶化して、４−アミノ−２−メチルスルファニル−ピリミジン−５−カルボン酸［２−メチル−５−（３−トリフルオロメチル−ベンゾイルアミノ）−フェニル］−アミド（１．７９ｇ、６１％）を白色固体として得る。
【００５４】
ジオキサン（１０ｍＬ）中４−アミノ−２−メチルスルファニル−ピリミジン−５−カルボン酸［２−メチル−５−（３−トリフルオロメチル−ベンゾイルアミノ）−フェニル］−アミド（２８６ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（８６４μＬ、４．９６ｍｍｏｌ）の攪拌溶液にジオキサン（２ｍＬ）中トリホスゲン（１８４ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）溶液を０℃で加え、混合物を１２時間１００℃で攪拌する。反応混合物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄する。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮し、ＭｅＯＨから結晶化してＮ−［４−メチル−３−（７−メチルスルファニル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル）−フェニル］−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド（１６６ｍｇ、５５％）を白色結晶固体として得る。
【００５５】
ＤＭＦ中ＮａＨ（鉱油中６０％分散剤、１９．７ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）の懸濁液にＮ−［４−メチル−３−（７−メチルスルファニル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル）−フェニル］−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド（２１８ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を０℃で加える。Ｈ２発生が起こったとき、ヨードメタン（８４μｌ、１．３５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を３時間室温で攪拌する。混合物を酢酸エチルで希釈し、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３５％水溶液で洗浄してＤＭＦを除去する。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮する。粗生成物をＭｅＯＨから結晶化してＮ−［４−メチル−３−（１−メチル−７−メチルスルファニル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル）−フェニル］−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド（１８４ｍｇ、８２％）を白色固体として得る。
【００５６】
ＤＭＦ（４ｍＬ）とクロロホルム（４ｍＬ）の混合溶媒中Ｎ−［４−メチル−３−（１−メチル−７−メチルスルファニル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル）−フェニル］−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド（１８４ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）の攪拌溶液にｍ−クロロぺるオキシ安息香酸（最大７７％、９７ｍｇ、４４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１時間室温で攪拌する。混合物をクロロホルムで希釈し、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３５％水溶液および飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄する。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮してＮ−［３−（７−メタンスルフィニル−１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル）−４−メチル−フェニル］−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド（１６７ｍｇ、８８％）を得る。
【００５７】
Ｎ−［３−（７−メタンスルフィニル−１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル）−４−メチル−フェニル］−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド（３０ｍｇ、５８μｍｏｌ）をＴＨＦ中２Ｍメチルアミン溶液（１ｍＬ）に溶解し、混合物を１時間６０℃で攪拌する。反応混合物を濃縮し、ＤＭＳＯ中に溶解し、分取ＬＣＭＳで精製してＮ−［４−メチル−３−（１−メチル−７−メチルアミノ−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル）−フェニル］−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド（２０ｍｇ、７１％）を得る；1H NMR 400 MHz (DMSO-d6) δ 10.70 (s, 1H), 8.95 (s, 0.33H), 8.85 (s, 0.66H), 8.39 (m, 3H), 8.11 (d, 1H), 7.93 (t, 1H), 7.84 (m, 2H), 7.49 (d, 1H), 3.65 (d, 2H), 3.58 (s, 1H), 3.08 (m, 3H), 2.17 (s, 3H); MS m/z 485.3 (M + 1).
【００５８】
適当な出発物質を使用して上記実施例に記載の方法をくり返し、表１に記載の下記式Ｉの化合物を得る。
【表１】
2008545442.tif 000008
【表２】
2008545442.tif 000009
【表３】
2008545442.tif 000010
【００５９】
アッセイ
フィーダー細胞依存マウスＥＳ細胞系（Ｏｃｔ４−ＧＦＰレポーター構造物で設計し、未分化、多分化能状態でＧＦＰを発現する）を使用して、フィーダー細胞およびＬＩＦなしでＥＳ細胞の未分化状態を維持する能力について、化合物をスクリーニングする。本発明の化合物は、マウスＥＳ細胞を未分化状態に、ＬＩＦおよびフィーダー層なしで１０代以上維持する。多分化能ＥＳ細胞はＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＡＬＰ、ＳＳＥＡ−Ｉを発現し、小型コロニーを形成する。分化はルーズコロニーの存在および平石および／または玉石様細胞の存在によって示される。本発明の化合物で拡大されたマウスＥＳ細胞はＯｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−ＩおよびＡＬＰを含む多分化能細胞の複数マーカーを保持しており、インビトロで機能性神経細胞および心臓細胞に分化することができ、インビボで健康キメラマウスに寄与する。本発明の化合物が記載のＴＯＰフラッシュレポーターアッセイによってＷｎｔ経路を活性化しないこと、そしてウェスタンブロッティングによってＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路を活性化しないことも見出される。
【００６０】
マウス胚幹（ｍＥＳ）細胞自己複製の維持
マウスＥＳ細胞をＧＭ中フィーダー層細胞で、ゼラチン被覆プレートで維持する。マウスＥＳ細胞を３日ごとに、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（０．５ｍｌ／ウェル）を使用して継代する。最適な分割比率は１：６である。
【００６１】
ＥＳ細胞維持ならびに下記実施例４および５に使用する物質には、以下のものが含まれる：
Ｏｃｔ４−ＧＦＰ  ｍＥＳ細胞（フィーダー層依存細胞）；ｍＥＳ  Ｒ１細胞（フィーダー層独立細胞）；ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、１１９６５−０８４）；ノックアウトＤＭＥＭ（ＫＯ  ＤＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ、１０８２９−０１８）；ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ、１１３３０−０３２）；胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ、２６１４０−０７９）；ノックアウト血清Ｒｅｐｌａｃｅｒ（ＫＯ−ＳＲ）、（ＧＩＢＣＯ、１０８２８−０２８）；Ｂ−２７無血清サプリメント（５０Ｘ）、（ＧＩＢＣＯ  １７５０４−０４４）；Ｎ−２  サプリメント（１００Ｘ）（ＧＩＢＣＯ、１７５０２−０４８）；ＬＩＦ（１０６ユニット）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ＥＳＧ１１０６）；Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ、２５０３０−０８１）；非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ、１１１４０−０５０）；２−メルカプトエタノール（１０００Ｘ）、（ＧＩＢＣＯ、２１９８５−０２３）；０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ、２５３００−０５４）；０．１％ゼラチン溶液（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  ｔｅｃｈ．、０７９０３）；塩基性培地（ＢＭ）：ＫＯ  ＤＭＥＭ、１５％ＫＯ−ＳＲ、ＩＸ  Ｌ−グルタミン、ＩＸ非必須アミノ酸、ＩＸ  ２−メルカプトエタノール；および増殖培地（ＧＭ）：塩基性培地＋１０３ユニットＬＩＦ。
【００６２】
本発明の化合物を同定するためのスクリーニング
３８４ウェルプレートを０．１％ゼラチン溶液で３７℃で一晩コーティングする。ゼラチン溶液を吸引で除去する。Ｏｃｔ４−ＧＦＰマウスＥＳ（フィーダー層依存）細胞をゼラチン被覆プレートに１０００細胞／５０μｌ  ＧＭ／ウェルで播種する。一晩インキュベーションした後、培地をＢＭに交換し、化合物５μＭを各ウェルに加える。３日インキュベーションした後、培地を取り替え、化合物を再び加える。さらに３日後、細胞を固定し、蛍光分析イメージングプレートリーダーシステム（ＦＬＩＰＲ）を使用してアッセイする。細胞がＧＦＰ発現を保っているウェルを第１ヒットとして選択する。第１ヒットをさらに、マウスＥＳ細胞のコロニー形態で確認する。この方法を使用して、フィーダー層なしの条件下でマウスＥＳ細胞の自己複製を維持する本発明の化合物を同定する。
【００６３】
実施例３
マウスＥＳ細胞は分化培地（ＤＭ）下で多分化能を維持する。
レチノイン酸誘導ＤＭ（ＲＡ）：ＢＭ＋０．３μＭ  ＲＡ、ＦＢＳ誘導ＤＭ：ＤＭＥＭ、２０％ＦＢＳ。９６ウェルプレートを０．１％ゼラチン溶液で３７℃で一晩コーティングする。ゼラチン溶液を吸引で除去する。マウス胚幹細胞をゼラチン被覆プレートに１０４細胞／５０μｌ  ＧＭ／ウェルで播種する。一晩インキュベーションした後、培地をＤＭに交換し、本発明の化合物３μＭを各ウェルに加える。３日インキュベーションした後、培地を新鮮な培地と化合物に取り替える。さらに３日後、細胞を固定し、多分化能マーカー発現およびコロニー形態でアッセイする。有効濃度をＧＦＰ発現の維持およびコロニー形態で測定する。様々な本発明の化合物の有効濃度を下記表３に記載する。
【００６４】
実施例４
フィーダー層なし複数代培養条件
６ウェルプレートをウェル当たり１ｍｌの０．１％ゼラチンでコーティングし、３７℃で一晩インキュベートする。ゼラチン溶液を除去した後、マウスＥＳ細胞をウェル当たり２×１０５細胞／２ｍｌ培養培地で播種する。細胞を３日ごとに０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（０．５ｍｌ／ウェル）を使用して継代する。最適な分割比率は培養培地に依存して異なる（表２）。表２は本発明の化合物がＮ−｛４−メチル−３−［１−メチル−７−（２−メチル−２Ｈ−ピラゾル−３−イルアミノ）−２−オキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４．５−ｄ］ピリミジン−３−イル］−フェニル｝−３−トリフルオロメチル−ベンズアミド（化合物２１３、表１）であるときの異なるフィーダー層なしの培養条件の例を示す。
【表４】
2008545442.tif 000011
【表５】
2008545442.tif 000012
【表６】
2008545442.tif 000013
【００６５】
本明細書に記載の例示および態様は説明のみを目的としており、その様々な修飾および改変が当業者に示唆され、そして本願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲に含まれることが理解される。本明細書で言及した全ての文献、特許および特許公報を、あらゆる目的のために参照により本明細書の一部とする。
【国際調査報告】
2008545442.tif 000016
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