(57)【要約】  本発明は、脂質ラフト内の病理プロセスに関係する障害の治療又は予防及び／又は改善のための薬剤の調製における特異的ステロイド誘導体の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質ラフト上、その中、又はその内部に発生しうる生化学的／生物物理学的病理プロセスによってひき起こされる疾患／障害の治療、予防及び／又は改善のための医薬組成物の製造のための、
【化１】
2008504329.tif 000031
｛式中、
【化２】
2008504329.tif 000032
は単結合又は２重結合であり；
−  Ｒ11a、Ｒ11b、及びＲ11cは、Ｒ11a、Ｒ11b又はＲ11cがＯ又はＳである場合にはこのＲ11a、Ｒ11b又はＲ11cを環系に連結する結合が２重結合でありその他全ての場合に前記結合が単結合であることを条件として、Ｈ、ＯＲ、ＮＲ2、Ｎ3、ＳＯ4-、ＳＯ3-、ＰＯ42-、ハロゲン、Ｏ又はＳであり；
−  Ｒ11dがＯＲ、ＮＲ2、ＳＯ4-、ＰＯ42-、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＲ2又はＯＣＯ（Ｃ1-4アルキル）であり；
−  Ｒ12a及びＲ12bは、Ｒ12a又はＲ12bがＯである場合にはこのＲ12a又はＲ12bを環系に連結する結合が２重結合であり、その他の全ての場合に前記結合が単結合であることを条件として、Ｈ、ＯＲ、ＮＲ2、Ｎ3、ハロゲン又はＯであり；
−  ここでＲ11a及びＲ12aの両方がＨであることはなく、又Ｒ11b及びＲ12bの両方がＨであることはないことを条件とし、
−  Ｒ13a、Ｒ13b、Ｒ13c及びＲ13dはＨ；Ｃ1-5アルキル（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；Ｃ12-24アルキル（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；Ｃ1-5アルキリデン（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；Ｃ12-24アルキリデン（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；Ｃ2-5アルケニル（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；Ｃ2-5アルキニル（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；１−アダマンチル：（１−アダマンチル）メチレン；Ｃ3-8シクロアルキル（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；（Ｃ3-8シクロアルキル）メチレン（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；であるが、ここでＲ13a、Ｒ13b、Ｒ13cがＣ1-5アルキリデン又はＣ12-24アルキリデンである場合には、前記Ｒ13a、Ｒ13b又はＲ13cを環系に連結する結合は２重結合であり、その他の全ての上述の場合において前記結合は単一結合であることを条件としており；そうでなければ、
−  Ｒ13a、Ｒ13b及びＲ13cは
【化３】
2008504329.tif 000033
という構造式２をもつ基であり［なお式中、
・  Ｒ23はＯ−Ｒ21又はＮＨ−Ｒ24であり；
・  Ｒ21はＣ1-4アルキル、ＣＯ（Ｃ1-4アルキル）又はＨであり、
・  Ｒ24はＣ1-4アルキル、ＣＯ（Ｃ1-4アルキル）又はＨであり、
・  各々のＲ22は独立してＨ又はＣ1-3アルキルであり、
・  Ｙは、ＹがＣＨである場合Ｙを環系に連結する結合が２重結合でありその他全ての場合において前記結合が単結合であることを条件として、ＣＨ2、ＣＨ又はＯであり；
・  各々のｎ21は独立して１又は２の整数であり、
・  ｎ22は０〜５の整数であり；
・  ＹがＯである場合にはｎ23は１であり、その他全ての場合にはｎ23は０である］；
−  Ｒ14aはＨであり；
−  Ｒ14bは、Ｒ14bがＯである場合にはＲ14bを環系に連結する結合が２重結合であり、その他全ての場合前記結合が単結合であることを条件として、Ｈ、ＯＲ、ハロゲン又はＯであり、
−  各々のＲは独立してＨ又はＣ1-4アルキルである。｝で表される構造式１ａ、１ｂ、１ｃ及び１ｄのうちの１つの構造式をもつ化合物又はその薬学的に許容可能な塩、誘導体、溶媒和物又はプロドラッグ使用。
【請求項２】
Ｒ11a、Ｒ11b及びＲ11cがＯＣＨ3、ＮＨ2、Ｎ（Ｃ1-4アルキル）2、ＳＯ4-又はＯであり、Ｒ11dがＯＣＨ3、ＮＲ2又はＯＣＯＣＨ3である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｒ12a及びＲ12bがＨ、Ｏ（Ｃ1-4アルキル）、ハロゲン又はＯである、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
Ｒ13a、Ｒ13b、Ｒ13c及びＲ13dがＨ、Ｃ1-5アルキル、Ｃ1-5アルキリデン、Ｃ12-14アルキル又はＣ12-14アルキリデンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
Ｒ13a、Ｒ13b、Ｒ13c及びＲ13dが構造式２をもつ基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
Ｒ14bがＨ、ハロゲン又はＯである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
化合物が、
【化４】
2008504329.tif 000034
で表される構造式１０ａａ〜１０ａｅのうちの１つの構造式を有する、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
化合物が、
【化５】
2008504329.tif 000035
で表される構造式１０ａｆ〜１０ａｌのうちの１つの構造式を有する、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
化合物が、
【化６】
2008504329.tif 000036
で表される構造式１０ｄａ〜１０ｄｃのうちの１つの構造式を有する、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
脂質ラフト上、その中又はその内部で起こる生化学／生物物理学的病理プロセスによってひき起こされる前記疾患／障害が、神経変性疾患、感染性疾患、免疫疾患／障害、増殖性障害及び全身性疾患から成る群から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
前記神経性疾患がアルツハイマ病又はプリオン病である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記プリオン病が、クロイツフェルト・ヤコブ病、クル、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群及び致死性家族性不眠症から成る群から選択されている、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記感染性疾患がウイルス、細菌又は寄生虫によってひき起こされる、請求項１０に記載の使用。
【請求項１４】
前記ウイルスが、インフルエンザ、ＨＩＶ、肝炎ウイルス（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ型）、ロタウイルス、呼吸器合胞体細胞ウイルス、ヘルペトピリデ（例えば単純ヘルペスウイルス、エプスタイン・バールウイルス）、エコー・ウイルス１、麻疹ウイルス、ピコルナウイルス（例えばエンテロウイルス、コクサッキーウイルス）、フィロ・ウイルス科（例えばエボラウイルス、マールブルグ・ウイルス）、パピローマウイルス及びポリオーマウイルスから成る群の中から選択されている、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記細菌が、結核菌、ウシ型結核菌、赤痢菌種、カンピロバクター・ジェジュニ、クラミジア・ニューモニア、大腸菌、エロモナス・ヒドロフィラ、ビブリオ・コレレ、クロストリジウム・ディフィシレ、破傷風菌、炭疽菌及びヘリオバクター・ピロリから成る群から選択されている、請求項１３に記載の使用。
【請求項１６】
前記寄生虫が、熱帯熱マラリア原虫、トキソプラズマ原虫、トリパノソーマ及びリーシュマニアから成る群から選択されている、請求項１３に記載の使用。
【請求項１７】
前記免疫疾患／障害が自己免疫疾患又は高アレルギー性疾患である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１８】
高アレルギー性疾患が喘息である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記自己免疫疾患が、バッテン病、全身性紅斑性狼瘡又は動脈硬化症である、請求項１７に記載の使用。
【請求項２０】
前記増殖性障害がガン性疾患である、請求項１０に記載の使用。
【請求項２１】
前記全身性疾患が糖尿病である、請求項１０に記載の使用。
【請求項２２】
化合物が構造式１０ａｄ、１０ａｅ、１０ａｆ又は１０ａｌを有し、薬学組成物がインフルエンザ感染の治療、予防及び／又は改善のために調製される、請求項１４に記載の使用。
【請求項２３】
化合物が構造式１０ａｋ、１０ｄａ、１０ｄｂ又は１０ｄｃを有し、医薬組成物がＨＩＶ感染の治療、予防及び／又は改善のために調製される、請求項１４に記載の使用。
【請求項２４】
化合物が構造式１０ａｌを有し、医薬組成物が喘息の治療、予防及び／又は改善のために調製される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２５】
以下の構造式１ａ、１ｂ、１ｃ及び１ｄのうちの１つ：
【化７】
2008504329.tif 000037
｛式中、
【化８】
2008504329.tif 000038
は単結合又は２重結合であり；
−  Ｒ11a、Ｒ11b、及びＲ11cは、Ｒ11a、Ｒ11b又はＲ11cがＯ又はＳである場合にはこのＲ11a、Ｒ11b又はＲ11cを環系に連結する結合が２重結合でありその他全ての場合に前記結合が単結合であることを条件として、Ｈ、ＯＲ、ＮＲ2、Ｎ3、ＳＯ4-、ＳＯ3-、ＰＯ42-、ハロゲン、Ｏ又はＳであり；
−  Ｒ11dがＯＲ、ＮＲ2、ＳＯ4-、ＰＯ42-、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＲ2又はＯＣＯ（Ｃ1-4アルキル）であり；
−  Ｒ12a及びＲ12bは、Ｒ12a又はＲ12bがＯである場合にはこのＲ12a又はＲ12bを環系に連結する結合が２重結合であり、その他の全ての場合に前記結合が単結合であることを条件として、Ｈ、ＯＲ、ＮＲ2、Ｎ3、ハロゲン又はＯであり；
−  ここでＲ11a及びＲ12aの両方がＨであることはなく、又Ｒ11b及びＲ12bの両方がＨであることはないことを条件とし、
−  Ｒ13a、Ｒ13b、Ｒ13c及びＲ13dはＨ；Ｃ1-5アルキル（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；Ｃ12-24アルキル（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；Ｃ1-5アルキリデン（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；Ｃ12-24アルキリデン（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；Ｃ2-5アルケニル（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；Ｃ2-5アルキニル（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；１−アダマンチル：（１−アダマンチル）メチレン；Ｃ3-8シクロアルキル（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；（Ｃ3-8シクロアルキル）メチレン（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；であるが、ここでＲ13a、Ｒ13b、Ｒ13cがＣ1-5アルキリデン又はＣ12-24アルキリデンである場合には、前記Ｒ13a、Ｒ13b又はＲ13cを環系に連結する結合は２重結合であり、その他の全ての上述の場合において前記結合は単一結合であることを条件としており；そうでなければ、
−  Ｒ13a、Ｒ13b及びＲ13cは
【化９】
2008504329.tif 000039
という構造式２をもつ基であり［なお式中、
・  Ｒ23はＯ−Ｒ21又はＮＨ−Ｒ24であり；
・  Ｒ21はＣ1-4アルキル、ＣＯ（Ｃ1-4アルキル）又はＨであり、
・  Ｒ24はＣ1-4アルキル、ＣＯ（Ｃ1-4アルキル）又はＨであり、
・  各々のＲ22は独立してＨ又はＣ1-3アルキルであり、
・  Ｙは、ＹがＣＨである場合Ｙを環系に連結する結合が２重結合でありその他全ての場合において前記結合が単結合であることを条件として、ＣＨ2、ＣＨ又はＯであり；
・  各々のｎ21は独立して１又は２の整数であり、
・  ｎ22は０〜５の整数であり；
・  ＹがＯである場合にはｎ23は１であり、その他全ての場合にはｎ23は０である］；
−  Ｒ14aはＨであり；
−  Ｒ14bは、Ｒ14bがＯである場合にはＲ14bを環系に連結する結合が２重結合であり、その他全ての場合前記結合が単結合であることを条件として、Ｈ、ＯＲ、ハロゲン又はＯであり、
−  各々のＲは独立してＨ又はＣ1-4アルキルである。｝で表される化合物及びその薬学的に許容可能な塩、誘導体、溶媒和物又はプロドラッグを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質ラフト内の病理プロセスに関係する障害の治療又は予防及び／又は改善のための医薬の製造における特異的ステロイド誘導体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞膜を形成する脂質２重層は、何十年もの間その組織が生化学者及び生物物理学者による集中的調査の対象となってきた２次元液体である。２重層の大半は均質な流体であると考えられてきたが、２重層液体の構造及び力学についての我々のモデルの中に側方不均一性部分、脂質ミクロドメインを導入する試みがくり返し行なわれてきた（Glaser, Curr. Opin. Struct. Biol. 3 (1993), 475-481; Jacobson, Comments Mol. Cell Biophys. 8 (1992), 1-144; Jain, Adv. Lipid Res. 15 (1977), 1-60; Winchil, Curr. Opin. Struct. Biol. 3 (1993), 482-488。
【０００３】
上皮細胞が、各ドメイン内に異なるタンパク質及び脂質組成物を伴った状態で頂端及び基底外側ドメインへとその細胞表面を分極するということが認識されたために、「脂質ラフト」の概念を導く新しい開発が着手された（Simons, Biochemistry 27 (1988), 6197-6202; Simons, Nature 387 (1997), 569-572）。膜タンパク質用のプラットフォームとして機能するスフィンゴ脂質及びコレステロールの集合体という概念は、これらの集合体が界面活性剤抽出を生き延びたという観察事実により推進されたものであり、界面活性剤耐性膜ＤＲＭと呼ばれる（Brown, Cell 68 (1992), 533-544）。これは、４℃でのトリトン−Ｘ１００抽出に対する耐性とラフト会合を同一視する作業上の大発見であった。界面活性剤耐性の喪失を導くメチル−β−シクロデキストリンを使用したコレステロールの枯渇という第２の規準を付加することで（Ilangumaran, Biochem. J. 335 (1998), 433-440; Scheiffele, EMBO J. 16 (1997), 5501-5508）、現場内の複数の作業班は広範な生物学的反応における脂質ミクロドメインの役割を探究するように駆り立てられることになった。現在、細胞極性、タンパク質トラフィキング及びシグナル変換を含む数多くの細胞プロセスを調節する上での脂質アセンブリの役割に対する裏づけが増々増え続けている。
【０００４】
細胞膜は２次元液体である。かくして側方不均質性は、膜平面内の液体−液体間の非混和性を暗に示している。水和した脂質２重層が温度の１関数としての相転移を起こすということは充分知られてきている。各々の脂質種について規定の温度で発生するこれらの転移にはつねに、系の秩序の幾分かの変化が関与している。これらの転移のうち最も重要なのは、２重層が秩序の高い擬似２次元結晶質固体から擬似２次元液体へと転移させられるいわゆる「主遷移」又は「連鎖融解転移」である。これには、特に２重層平面内の並進（位置）秩序及びこの平面に直交する方向での脂質鎖の配座秩序のものである、系の秩序の大幅な変化が関与する。並進秩序は、膜平面内の側方拡散係数に関係し、配座秩序は、アシル鎖内のトランス／ゴーシュ比に関係する。主転移は、秩序／無秩序相転移として記述されてきており、従って２つの相は、転移温度より低い温度での固体秩序（Ｓｏ）相及びこの温度より高い温度での液体秩序（ｌd）相として標識づけされ得る。コレステロールとリン脂質は、コレステロールの少ない液体無秩序（ｌd）相と共存できる液体秩序（ｌo）相を形成する能力をもち、かくして、完全に液相の膜内での相の共存を可能にする（Ipsen, Biochem. Biophys. Acta 905 (1987) 162-172; Ipsen, Biophys. J. 56 (1989), 661-667）。ステロールは、脂質の並進可動性を大幅に削減させることなく、ステロールが連鎖に最も隣接している場合に隣接する脂肪族鎖上で配座の秩序化を課することのできるその平坦で剛直な分子構造の結果として（Sankaram, Biochemistry 29 (1990), 10676-10684）それを行なう（Nielsen, Phys. Rev. E. Stat. Phys. Plasmas Fluids Relat. Interdiscip. Topics 59 (1999), 5790-5803）。ステロールは、ｓo（ゲル）脂質２重鎖相の結晶格子の中に正確に適合しないという事実に起因して、それは、それがこの相内で溶解する場合、結晶並進秩序を分断するが、それでも配座秩序を大幅に混乱させることはない。かくして、適切なモル画分にあるコレステロールは、ｌd又はｓo脂質２重層相を液体秩序（ｌo）相へと転換させることができる。
【０００５】
脂質ラフトは、細胞膜内部の膜構成要素を分離するように機能する（細胞膜の外層中でスフィンゴミエリン及びコレステロールを富有する）特殊な化学組成物の脂質プラットフォームである。ラフトは比較的小さい（直径３０〜５０ｎｍ、サイズ推定値は使用されるプローブ及び分析される細胞型に応じて著しく変動する）ものと理解されるが、それらは或る種の条件下で合体し得る。脂質組成に関するその特異性は、不均質なモデル膜系における相分離挙動を連想させる。実際、化学組成及び界面活性剤溶解度に関するその特性の多くは、不飽和ホスファチジルコリン・スフィンゴミエリン（又は長鎖飽和ホスファチジルコリン）及びコレステロール（de Almeida, Biophys. J. 85 (2003), 2406-2416）の三元混合物から成るモデル系の中で見られるものに類似している。ラフトは、血漿膜を構成する異種ｌ相脂質２重層内のｌo相のドメインとみなすことができる。生体膜は液体であるという意見の一致がみられることから、ｓo相共存は大部分の場合について無視することができる。その他の相（単数又は複数）がｌd相であるかｌo相であるかは、この相（これらの相）を構成するリン脂質の化学的同一性及びその中のコレステロールのモル画分によって左右されることになる。ラフトは、液体秩序相と同一視でき、非ラフト液相としての膜の残りの部分を基準とする。熱力学の枠内では、相はつねに多数の分子から成る巨視的系である。しかしながら、脂質２重層内では、相は往々にして、各々それ自体１つの相の熱力学的定義を厳密に満たすのに充分な数の分子を有することのできない小さなドメイン（わずか数千個の分子であることが多い）へと断片化される傾向をもつ。かくして液体秩序ラフト相は、膜内のラフト相の全てのドメイン（小さいもの又はクラスタ化されたもの）を含む。ラフトをとり囲む膜の残りは、均質な浸透性の液相であってもよいし、或いは又、まだ特徴づけされていない液体ドメインへとさらに細分割されてもよい。
【０００６】
Pralle, J. Cell. Biol. (2000) 148, 997-1008は、脂質ラフトのサイズを測定するために光子力顕微鏡を利用し、線維芽細胞の血漿膜の中のラフトが、約３０００個のスフィンゴ脂質により覆われた表面積に対応する直径５０ｎｍの集合体として拡散するということを発見した。その脂質組成及び細胞小器官表面積が詳細に検査された培養したベビーハムスタの腎臓（ＢＨＫ）細胞からのデータに基づいて、個々の細胞が約２０００μｍ2の表面積を有することがわかる。細胞血漿膜の脂質組成物は、２６％のホスファチジルコリン、２４％のスフィンゴミエリン、及び１２％のグリコスフィンゴ脂質を含有する。血漿膜内の脂質組織の非対称性に起因して、大部分のスフィンゴ脂質は２重層の外層を占有しているが、一方ホスファチジルコリンは半分未満しかこの層中にないと推測されてきた。
【０００７】
スフィンゴ脂質の大部分がラフト関連のものであると仮定すると、ラフトは細胞表面の半分超を網羅することになる。膜タンパク質の密度は１μｍ2あたり約２０，０００分子であると推測されてきた。かくして、血漿膜はそれに応じて約４０×１０6個のタンパク質分子を含むことになる。５０−ｎｍのラフトの数は約１０6となり、タンパク質の密度がラフト内で周囲の２重層内と同じであるならば、各ラフトは約２０のタンパク質分子を担持することになる。ＢＨＫ細胞が代表的なものであるとすると、線維芽細胞血漿膜内を浮動するラフトの密度は高いことになる。２０×１０6個のラフトタンパク質分子が多少の差こそあれ無作為に分布させられた場合、各ラフトはおそらく異なるタンパク質サブセットを含有することになる。従って、１つのラフトの細胞質ゾル層に付着したキナーゼが同じ個々のラフト内でその基質と遭遇する可能性は低い。個々のラフトの小さいサイズは、ラフトで運ばれるシグナリングタンパク質を「オフ」状態に保つために重要であり得る。従って、活性化が起こるためには、数多くのラフトが合わさってクラスタ化し、外で起こっていることにより邪魔されることなくシグナル変換プロセスに参加するタンパク質が遭遇し得るより大きなプラットフォームを形成しなくてはならない。かくして、ラフトは小さいものであり、活性化された時点でそれらはクラスタ化し、機能的に関係のあるタンパク質が相互作用し得るより大きなプラットフォームを形成する。ラフト会合及びクラスタ化を分析するための１つの方法は、特異的抗体により生きた細胞の表面上でラフト及び非ラフト構成要素をパッチングすることにある。（Harder, J Cell Biol. 141 (1998), 929-942; Janes, Semin Immunol. 12 (2000), 23-34）。２つのラフト構成要素が抗体により交差結合されている場合、それらは血漿膜内で重複するパッチを形成することになる。しかしながらラフトタンパク質及びトランスフェリンレセプタといったような非ラフトマーカーのパッチングは、分離したパッチを導く。２つのラフト構成要素の同時パッチングは、細胞に対する両方の抗体の同時付加に依存している。抗体が逐次付加された場合、分離したパッチが優位を占める。とりわけ、パッチング挙動はコレステロールに依存している。小さいサイズ及び個々のラフトの不均質な組成の結果として、これらの構造に、シグナリングが続いて起こるはずである場合、特異的な形でクラスタ化されなくてはならない。日々の臨床的実践において遭遇するこのようなラフトクラスタ化プロセスの１例は、アレルギー免疫応答中のＩｇＥシグナリングである（Sheets, Curr. Opin. Chem. Biol. 3 (1999), 95-99; Holowka, Semin. Immunol. 13 (2001), 99-105）。肥満細胞又は好塩基性細胞の脱顆粒を刺激することによりアレルギー反応を惹起するアレルゲンは多価であり、複数のＩｇＥ抗体分子を結合させる。２つ以上のＩｇＥレセプタ［Ｆｃ（ε）ＲＩ］の交差結合は、界面活性剤耐性の増大により測定されるようにラフトとのその会合を増大させる。ラフト内で、交差結合されたＦｃ（ε）ＲＩは、２重アシル化されたＳｒｃ関連キナーゼであるラフト会合Ｌｙｎによりリン酸化されたチロシンとなる。Ｆｃ（ε）ＲＩリン酸化は、Ｓｙｋ関連キナーゼを補充し、これらのキナーゼは活性化され、下流側シグ��リング分子の結合及び足場を導き、最終的にシグナリングプラットフォームの形成を導く。この構造は、ラフトタンパク質ＬＡＴ（Ｔ細胞の活性化のリンカー）を内含し、これが拡張するプラットフォーム内への付加的なラフトのクラスタ化を誘導する（Rivera, Int. Arch. Allergy Immunol. 124 (2001), 137-141）。シグナリングはカルシウム動員を導き、これが細胞内貯蔵からのヒスタミンといったような予め形成されたメディエータの放出を誘発する。ラフトプラットフォーム内により多くの関与物質が収集されればされるほど、シグナリング応答は高くなる。ラフトクラスタ化によるシグナリングカスケードの無制御増幅は、活性化過剰を誘発し、クインケ浮腫やアレルギー性ショックといったような生命を脅すような結果をもたらす可能性がある。シグナリング集合体全体を脱リンにより解離させるか又はエンドサイトーシスによる構成要素の内在化によってダウンレギュレートすることが可能である（Xu, J. Cell Sci, 111 (1998), 2385-2396）。かくしてＩｇｅシグナリングにおいては、脂質ラフトは流体ミクロドメイン内に関与タンパク質を集中させその側方拡散を制限してシグナリング部位にタンパク質がとどまるようにすることによって、効率を増大させるのに役立つ。脂質ラフトへの分配という小さな変更でさえ、増幅を通して、アレルギー反応において起こるように、シグナリングカスケードを開始させるか又は有害な量的過剰を促す可能性がある（Kholodenko, Trends Cell Biol. 10 (2000), 173-178）。ラフトクラスタ化のもう１つの臨床的に関連性ある例は、他の細菌のなかでもClostridium Streptcoccus及びAeromonas種により分泌される孔形成毒素の発病の機序である。これらの毒素は、軽いセリュライトからガス壊疽及び偽膜性大腸炎に至る範囲の疾病をひき起こす可能性がある。最も研究されているのは、海洋細菌Aeromonas hydrophila由来の毒素アエロリシンである。アエロリシンは、分泌され宿主細胞の表面上でＧＰＩ定着されたラフトタンパク質に結合する。タンパク質分解の後膜内に毒素が取込まれ、次にラフト依存的に７量体化して、その中を小分子及びイオンが流れ病原性変化を誘発するラフト会合チャンネルを形成する。アエロリシンのオリゴマー化は溶解状態で誘発され得るが生きた細胞の表面で１０5分の１未満の低い毒素濃度で発生する。この多大な効率増加は、毒素のオリゴマー化により駆動されるラフトクラスタ内への集中及びラフト結合による活性化に起因する。ここでも又、わずかな変化が、ラフトクラスタ化の増幅による莫大な効果を導き得る（Lesieur, Mol. Membr. Biol. 14 (1997), 45-64; Abrami, J. Cell Biol. 147 (1999), 175-184）。
【０００８】
脂質ラフトは、特異的タンパク質セットを含有する（van Meer, Annu. Rev. Cell Biol. 5 (1989), 247-275; Simons, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Atruct. 33 (2004), 269-295）。これらには、なかんづく、２重アシル化タンパク質、例えばｓｒｃファミリーのチロシンキナーゼ、ヘテロマーＧタンパク質のＧαサブユニット及び内皮一酸化窒素シンターゼ、コレステロール及びパルミチン酸塩連結ハリネズミタンパク質及びその他のパルミチン酸塩連結タンパク質ならびに膜貫通タンパク質が含まれる。飽和アシル鎖及びコレステロールが付着されたタンパク質を、液体秩序ラフトドメインと会合させることができる。モデル膜での研究は、このような脂質修飾を含むペプチドが液体秩序ドメインと会合するということを確認した（Wang, Biophys. J. 79 (2000,) 919-933）。ＧＰＩアンカーがその脂肪酸組成に関して異なっているということに留意すべきである。一部のＧＰＩアンカーは不飽和アシル鎖を含有しており、これらが脂質ラフトとどのように相互作用するかは、今後研究されなくてはならない。
【０００９】
膜貫通タンパク質は、２重層を横断することから、液体秩序ドメインの充てんを分断し得る。それでもｌo相は液相であり従って膜平面内に長距離秩序をもたない。脂質ラフトとタンパク質の会合は、２つの共存する相の間のタンパク質の分配のための平衡分配係数によって描写される単純な溶解度問題として考えることができ、そうでなければそれはラフト脂質に対する或る程度の化学的親和力を要求するものと理解することができる。複数のタンパク質がコレステロールと相互作用する。カベオリンが主たる例である（Murata, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 10339-10343）。同様に、ガングリオシドを含むグリコスフィンゴ脂質と相互作用する受容タンパク質の例もある（Hakomori, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002), 225-232）。スフィンゴ脂質に対する結合のため、構造タンパク質モチーフが同定されてきた（Mahfoud, J. Biol. Chem. 277 (2002), 11292-11296）。最近の結果は同様に、タンパク質が膜環境に応じて異なる状態で存在し得るということも実証している。Ｇタンパク質カップリングされた７らせん膜貫通タンパク質であるグルタミン酸塩レセプタは、コレステロールが欠如した膜へと再構成された時点で低親和力状態にある。レセプタは、液体秩序コレステロール含有膜の中でその配座を変え、今度は高い親和力でそのリガンドを結合させる（Eroglu, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (2003), 10219-10124）。ＥＧＦレセプタはガングリオシドＧＭ３との相互作用によって活性化され、コレステロール枯渇により不活性化される（Miljan, Sci. STKE. 160 (2002) 15）。該レセプタは、高親和力結合能力について脂質環境に依存していると思われる。この挙動差を検分するための１つの方法は、膜の２重層溶媒中の溶質としてタンパク質を考えることであると思われる。脂質２重層が２相を有する場合各々の相は異なる溶媒である。タンパク質は、その環境に左右され従ってそれが溶解させられている２重層溶媒相に左右される配座を有する。従って非ラフトドメイン内ではそれは１つの配座を有し、ラフトドメインではもう１つの配座を有するものと予想することができる。レセプタ活性化は、２重層中の異なる脂質ドメイン間の分配係数及び相共存により左右されることになる。もう１つの問題点は、液体秩序２重層が液体無秩序２重層に比べ厚いため、タンパク質の膜貫通ドメインの長さにある。これらのパラメータは、細胞表面に対するタンパク質選別の役割を果たす（Bretscher, Science 26 (1993), 1281-1281）。ただし、膜貫通ドメインを２重層の厚みといかに整合させるべきかは、未解決の問題である。今までのところ、異なる膜貫通ドメイン長をもつ異なる膜貫通タンパク質がいかにして液体秩序及び液体無秩序ドメインへと分配するかということからの詳細な分析は全く実施されていない。血漿膜内の単スパン膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインは通常、ゴルジ複合体内又は小胞体内に常在するタンパク質の膜貫通ドメインよりも長い。
【００１０】
Anderson, Mol. Biol. Cell 7 (1996), 1825-1834は、ホルボールエステルＰＭＡ又はマクロライドポリエン抗生物質ナイスタチン及びフィリピンを用いたＣＶ−１又はＨｅＬａ細胞の治療が可逆的にシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）による感染を遮断したということを実証している。周知の腫瘍プロモータであるホルボールエステルは、タンパク質キナーゼＣの活性剤であり、その陥入を遮断することによりカベオラを分断する（Smart (1994) J. Cell Biol. 124, 307-313）。コレステロール結合薬物ナイスタチン及びフィリピンは、構造的に類似したアンフォテリシンβといったようなポリエン抗カビ剤の成員の代表であり、真菌感染の治療のための標準的療法において広く使用されている。Anderson及び共同研究者らは、これらの薬物によるコレステロール枯渇に起因するカベオラの選択的分断が、観察された効果の原因となり、カベオラがウイルス進入を媒介する可能性があるということを推測している。
【００１１】
Gidwani, J. Cell Sci. 116 (2003), 3177-3187は、脂質ラフトを分断するために特異的両親媒性物質を利用するインビトロ検定について記述している。一部のセラミドが、細胞シグナリングにおける血漿膜構造及びホスホリパーゼＤ活性の役割を調査するための有用なプローブとして役立ち得るということが推測されている。
【００１２】
Wang, Biochemistry 43 (2004), 1010-1018は、ステロール／ステロイド構造と脂質ラフトへの参加の間の関係について調査している。いずれかのラフト環境により支持され得るプロセスと細胞内のコレステロールに依存する生物学的プロセスを区別するためにステロールを使用することができることから、これらの著者はこの重要な問題を考慮している。興味深いことに、Wang及びその共同研究者らは、生体膜内の秩序ドメインの形成を促したステロイドを発見した。
【００１３】
国際公開第０１／２２９５７号（ＷＯ０１／２２９５７）は、スフィンゴ脂質／コレステロールミクロドメインの変調のためのガングリオシドの使用について教示しており、ガングリオシドがタンパク質特にＧＰＩ−ＡＰの転位／交換によりラフトの変調をひき起こすことが教示されている。特にアンカータンパク質、アセチル化タンパク質、キナーゼ及び／又はコレステロールアンカータンパク質の場所に影響を及ぼすことによってスフィンゴ脂質−コレステロールミクロドメインを変調させるために臨床的環境下でガングリオシド、ガングリオシド誘導体又はコレステロール誘導体を使用できるということが推測されている。
【００１４】
本発明の基礎を成す問題は、脂質ラフトにより調節される生物学的／生化学的プロセスに連結される及び／又は結びつけられる障害における臨床的及び／又は薬学的介入のための手段及び方法を提供することにある。
【００１５】
この技術的問題に対する解決法は、以下で及びクレーム中で特徴づけされる実施形態を提供することによって達成される。
【発明の開示】
【００１６】
従って、本発明は、
【化１】
2008504329.tif 000002
という構造式１ａ、１ｂ、１ｃ及び１ｄのうちの１つの構造式をもつ化合物又はその薬学的に許容可能な塩、誘導体、溶媒和物又はプロドラッグの、脂質ラフト上、その中、又はその内部に発生しうる生化学的／生物物理学的病理プロセスによってひき起こされる疾患／障害の治療、予防及び／又は改善のための医薬組成物の製造のための使用を提供する。
【００１７】
以下の炭素原子の付番及びステロイド足場の環の表示は、該明細書全体を通して遵守されるものとする：
【化２】
2008504329.tif 000003
【００１８】
本書に提供されている構造式においては、
【化３】
2008504329.tif 000004
は単結合又は２重結合を表わすために使用され
【化４】
2008504329.tif 000005
は単結合、２重結合又は３重結合を表示するために用いられている。
【００１９】
さらに、本発明において与えられている一般構造式は、表示された化合物の考えられるすべての立体異性体及びジアステレオマーを網羅するように意図されている。異なる形で指示されているのでないかぎり、天然に発生するコレステロールの立体化学的形態が好まれる。
【００２０】
Ｒ11a、Ｒ11b、及びＲ11cは、Ｒ11a、Ｒ11b又はＲ11cがＯ又はＳである場合にはこのＲ11a、Ｒ11b又はＲ11cを環系に連結する結合が２重結合でありその他全ての場合に前記結合が単結合であることを条件として、Ｈ、ＯＲ、ＮＲ2、Ｎ3、ＳＯ4-、ＳＯ3-、ＰＯ42-、ハロゲン、Ｏ又はＳである。好ましくは、Ｒ11a、Ｒ11b及びＲ11cはＯＨ、Ｏ（Ｃ1-4アルキル）、ＮＲ2、ＳＯ4-、ＳＯ3-又はＯである。より好ましくは、Ｒ11a、Ｒ11b及びＲ11cはＯＨ、ＯＣＨ3、ＮＨ2、Ｎ（Ｃ1-4アルキル）2、ＳＯ4-又はＯである。
【００２１】
Ｒ11dはＯＲ、ＮＲ2、ＳＯ4-、ＰＯ42-、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＲ2又はＯＣＯ（Ｃ1-4アルキル）である。好ましくは、Ｒ11dはＯＲ、ＮＲ2、ＣＯＯＨ又はＯＣＯ（Ｃ1-2アルキル）である。より好ましくは、Ｒ11dはＯＣＨ3、ＮＲ2又はＯＣＯＣＨ3である。
【００２２】
各々のＲは独立してＨ又はＣ1-4アルキルである。
【００２３】
Ｒ12a及びＲ12bは、Ｒ12a又はＲ12bがＯである場合にはこのＲ12a又はＲ12bを環系に連結する結合が２重結合であり、その他の全ての場合に前記結合が単結合であることを条件として、Ｈ、ＯＲ、ＮＲ2、Ｎ3、ハロゲン又はＯである。好ましくは、Ｒ12a及びＲ12bはＨ、Ｏ（Ｃ1-4アルキル）、ハロゲン又はＯである。
【００２４】
Ｒ11a及びＲ12aが同時にＨであることはなく、又Ｒ11b及びＲ12bが同時にＨであることもない。Ｒ11a及びＲ12aの両方が単結合を介して環系に結合されており、両方がＨでない場合、これらは好ましくは互いに対し反対の配向にある。Ｒ11b及びＲ12bの両方が単結合を介して環系に結合されており両方がＨでない場合、これらは好ましくは互いに反対の配向にある。
【００２５】
Ｒ13a、Ｒ13b、Ｒ13c及びＲ13dはＨ；Ｃ1-5アルキル（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；Ｃ12-24アルキル（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）好ましくはＣ12-18アルキル（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；Ｃ1-5アルキリデン（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；Ｃ12-24アルキリデン（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）好ましくはＣ12-18アルキリデン（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；Ｃ2-5アルケニル（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；Ｃ2-5アルキニル（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；１−アダマンチル：（１−アダマンチル）メチレン；Ｃ3-8シクロアルキル（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；（Ｃ3-8シクロアルキル）メチレン（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；であるが、ここでＲ13a、Ｒ13b、Ｒ13cがＣ1-5アルキリデン又はＣ12-24アルキリデンである場合には、前記Ｒ13a、Ｒ13b又はＲ13cを環系に連結する結合は２重結合であり、その他の全ての上述の場合において前記結合は単一結合であることが条件とされている。
【００２６】
代替的には、Ｒ13a、Ｒ13b及びＲ13cは、
【化５】
2008504329.tif 000006
という構造式２をもつ基である。
【００２７】
Ｒ23はＯ−Ｒ21である。Ｒ23は同じくＮＨ−Ｒ24であるものとも考えられている。
【００２８】
Ｒ21はＣ1-4アルキル、好ましくはＣＨ3である。Ｒ21は同様にＣＯ（Ｃ1-4アルキル）又はＨであるものとも考えられている。好ましくはＲ21はＣＨ3又はＣＯＣＨ3である。
【００２９】
Ｒ24はＣ1-4アルキル、ＣＯ（Ｃ1-4アルキル）又はＨである。好ましくは、Ｒ24はＣＨ3、ＣＯＣＨ3又はＨである。
【００３０】
各々のＲ22は、独立してＨ又はＣ1-3アルキル、好ましくはＨ又はＣＨ3である。
【００３１】
Ｙは、ＹがＣＨである場合Ｙを環系に連結する結合が２重結合でありその他全ての場合において前記結合が単結合であることを条件として、ＣＨ2、ＣＨ又はＯである。好ましくは、ＹはＣＨ2又はＯである。
【００３２】
各々のｎ21は独立して１又は２の整数、好ましくは１である。
【００３３】
ｎ22は０〜５の整数、好ましくは１〜４である。
【００３４】
Ｙが０である場合にはｎ23は１であり、その他全ての場合にはｎ23は０である。
【００３５】
好ましくは、Ｒ13a、Ｒ13b、Ｒ13c及びＲ13dはＨ、Ｃ1-5アルキル、Ｃ1-5アルキリデン、Ｃ12-14アルキル又はＣ12-14アルキリデンである。もう１つの好ましい実施形態においては、Ｒ13a、Ｒ13b、Ｒ13c及びＲ13dは、構造式２の基である。
【００３６】
Ｒ14aはＨである。１つの実施形態においてＲ14aはベータ配向にある、すなわち化合物１ａのステロイド足場の１０位にあるＣＨ3基及びＲ14aは互いに対しシスである。ただし、Ｒ14aがアルファ配向にある、すなわち化合物１ａのステロイド足場の１０位にあるＣＨ3基及びＲ14aが互いにトランスである化合物も同じく考慮されている。
【００３７】
Ｒ14bは、Ｒ14bがＯである場合にはＲ14bを環系に連結する結合が２重結合であり、その他全ての場合前記結合が単結合であることを条件として、Ｈ、ＯＲ、ハロゲン又はＯである。好ましくは、Ｒ14bはＨ、ハロゲン又はＯである。
【００３８】
本発明に従って同様に提供されているのは、
【化６】
2008504329.tif 000007
という構造式３のうちの１つの構造式をもつ化合物又はその薬学的に許容可能な塩、誘導体、溶媒和物又はプロドラッグの、脂質ラフト上、その中、又はその内部に発生しうる生化学的／生物物理学的病理プロセスによってひき起こされる疾患／障害の治療、予防及び／又は改善のための医薬組成物の調製を目的とした使用である。
【００３９】
Ｒ31は、Ｒ31がＯである場合Ｒ31を環系に連結する結合が２重結合であり、その他全ての場合には前記結合が単結合であることを条件として、Ｈ、ハロゲン又はＯである。
【００４０】
１実施形態においては、ＸはＯである。もう１つの実施形態においては、ＸはＮ−Ｒ35である。ＸがＯである場合にはＲ31は好ましくはＨである。ＸがＮ−Ｒ35である場合には、Ｒ31は好ましくはＨ又はＯであり、より好ましくはＯである。
【００４１】
Ｒ35はＨ又はＣ1-4アルキル、好ましくはＣ1-4アルキル、より好ましくはＣＨ3である。
【００４２】
Ｒ32はＨ又はＣＨ3、好ましくはＣＨ3である。
【００４３】
Ｒ33はＨ；Ｃ1-5アルキル（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；Ｃ12-24アルキル（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；Ｃ1-5アルキリデン（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；Ｃ12-24アルキリデン（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；Ｃ2-5アルケニル（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；Ｃ2-5アルキニル（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；１−アダマンチル：（１−アダマンチル）メチレン；Ｃ3-8シクロアルキル（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；（Ｃ3-8シクロアルキル）メチレン（なおここで単数又は複数の水素はハロゲンにより任意に交換される）；であるが、ここでＲ33がＣ1-5アルキリデン又はＣ12-24アルキリデンである場合には、Ｒ33を環系に連結する結合は２重結合であり、その他の全ての上述の場合において前記結合は単一結合であることが条件とされる。大体的には、Ｒ33は、
【化７】
2008504329.tif 000008
という構造式２をもつ基である。
【００４４】
Ｒ21は、Ｃ1-4アルキル、好ましくはＣＨ3である。各Ｒ22は独立してＨ又はＣ1-3アルキル、好ましくはＣＨ3である。Ｙは、ＹがＣＨである場合にはＹを環系に連結する結合が２重結合であり、その他全ての場合に前記結合が単結合であることを条件として、ＣＨ2、ＣＨ又はＯである。好ましくはＹ又はＣＨ2又はＯである。各々のｎ21は独立して１又は２の整数、好ましくは１である。ｎ22は０〜５の整数、好ましくは１〜４である。ＹがＯである場合にはｎ23は１であり、その他全ての場合に、ｎ23は０である。好ましくはＲ33はＨ、Ｃ1-5アルキル、Ｃ1-5アルキリデン、Ｃ12-24アルキル又はＣ12-24アルキリデンである。もう１つの好ましい実施形態においては、Ｒ33は構造式２の基である。
【００４５】
Ｒ34はＨである。１つの好ましい実施形態においては、Ｒ32及びＲ34は互いにシスの配向にある。
【００４６】
ｎ3は１又は２の整数である。ＸがＯである場合には、ｎ3は好ましくは１である。ＸがＮである場合には、ｎ3は好ましくは２である。
【００４７】
本発明に従うと、驚くべきことに、ヒトの疾患及び障害に関与する生物学的及び／又は生化学的プロセスは、脂質ラフトを分断することにより影響され得るということが発見された。これは、脂質ラフト内部の調節分子の分配、脂質ラフトとのタンパク質複合体の形成及び／又は脂質ラフトのクラスタ化と干渉し、かくして病的状態を妨げる。従って、ここで提供されているのは、細胞好ましくは異常細胞の脂質ラフト中、その上又はその内部で起こる生物学的プロセス、特に病理学的プロセスと干渉する能力をもつ特異的分子すなわち以上で定義された通りのステロイド誘導体である。これらの分子は、本発明に従うと「脱ラフト化物質」とみなされる。脱ラフト化物質は、ラフト構成要素の生合成を阻害する能力、ラフト構成要素の膜内取込み（輸送）を阻害するか変調させる能力、膜からラフトの主要構成要素を抽出する能力、又は間に挿入することによりラフト構成要素間の相互作用を阻害する能力のいずれかを有する。同様に、「脱ラフト化物質」が脂質ラフトのサイズを改変させる能力をもつ化合物でありかくして前記ラフト内の単数又は複数の生物学的機能を阻害することも考慮されている。従って、脂質ラフトの体積又はサイズの「増大」も又、本書で提供されている構成要素により誘発される「脱ラフト化」プロセスとして考えられている。特に、本書に提供されている化合物は以上で記述されている生物学的プロセス、なかんづく脂質ラフト内への挿入によるラフト構成要素間の相互作用の防止／阻害において有用である。
【００４８】
添付例で立証されているように、本書で提供されている化合物の脱ラフト化特性は、全く異なる生化学、生物物理学及び／又は細胞培養実験により見極められ立証されている。これらの検定には、脱ラフト化リポソーム親ラフト検定（Ｄ−ＬＲＡ）、ウイルス出芽検定、ウイルス繁殖及び感染力検定、脱顆粒検定、ＳＶ４０感染力検定ならびにＨＩＶ感染力検定が含まれる。技術的詳細は、添付の例の中で記されている。
【００４９】
本書で提供されている化合物は、ヒトの疾患又は障害の治療（ならびに予防及び／又は改善）において特に有用である。本書で提供されている化合物は、特異的生物物理学的／生化学的試験において精査されてきており、又、細胞ベースの疾患／障害モデルの中でさらに評価されてきた。
【００５０】
従って、本書に記述された化合物は同様に脂質ラフト上、その中又はその内部で発生する生化学／生物物理学的病理プロセス（単複）によりひき起こされる疾患／障害の治療、予防及び／又は改善においても有用である。かかる疾患／障害ならびにかかる生化学／生物物理学的病理プロセスの対応する例が本書に記されている。従って、脂質ラフト上、その中はその内部で発生する生化学／生物物理学的病理プロセスという用語は、例えば、ウイルス又は細菌感染時点でクラスタ化する病原体誘発型の異常ラフトクラスタ化、病原体感染時点での脂質ラフト内の（細菌）毒素のオリゴマー構造の形成又は脂質ラフト内での（免疫グロブリンＥレセプタといった）シグナリング分子の活性増強、を意味する。同様に、通常よりもきつい脂質ラフト／脂質ラフト構成要素のパッキングも、本発明に従った「生化学／生物物理学的病理プロセス」とみなされる。
【００５１】
以下の化合物１０ａａ〜１０ａｅは、化合物１ａの好ましい例である：
【化８】
2008504329.tif 000009
【００５２】
化合物１０ａａ〜１０ａｅのうち、化合物１０ａｃ〜１０ａｅが好ましい。
【００５３】
構造式１ａを有する化合物のさらに好ましい例は、以下の化合物１０ａｆ〜１０ａｌである：
【化９】
2008504329.tif 000010
【００５４】
以下の化合物１０ｂａ及び１０ｂｃは、化合物１ｂの好ましい例である：
【化１０】
2008504329.tif 000011
【００５５】
以下の化合物１０ｃは、化合物１ｂの好ましい例である：
【化１１】
2008504329.tif 000012
（なお式中
【化１２】
2008504329.tif 000013
は単結合又は２重結合である）。
【００５６】
以下の化合物１０ｄａ〜１０ｄｃは化合物１ｄの好ましい例である：
【化１３】
2008504329.tif 000014
【００５７】
以下の化合物３０ａ及び３０ｂは、化合物３の好ましい例である：
【化１４】
2008504329.tif 000015
【００５８】
ステロイド誘導体に対し特に有利な脱ラフト化特性を付与する複数の構造的特長が存在する。これらの構造的特長は単独で存在するか又は好ましい化合物の中に組合わせた形で存在し得る。
【００５９】
これらの特長のうちの１つは、ステロイド環系のＡ及びＢ環の間のシス間融合の導入によって典型的な「平坦な」ステロイド構造から逸脱したものである。従ってＲ14aがベータ配向にある構造式１ａを有する化合物が好ましい。同様にして、Ｒ32及びＲ34が互いにシスである構造式３を有する化合物が好まれる。ステロイド環系内へのこのような「キンク」の導入が、ラフト内へのキンク型誘導体の取込み時点でラフトの秩序ある構造を混乱させると考えられている。
【００６０】
第２の構造的特長は、ステロイド足場の炭素１７上の側鎖内に巨大な基が存在することにある。このタイプのステロイド誘導体をラフト内に取込んだ時点で、巨大な側鎖はラフト構造を混乱させるものと考えられている。この機序を介して作用し得る脱ラフト化物質の例としては、Ｒ13a、Ｒ13b、Ｒ13c、Ｒ13d及びＲ33が１−アダマンチル又は（１−アダマンチル）メチレンである上述のステロイド誘導体がある。
【００６１】
代替的には、第３の構造的特長は、天然のラフト構成要素であるコレステロールの炭素１７上に存在する側鎖と比べて著しく短かい、又は著しく長い側鎖が存在するか又は全く側鎖が存在しないことにある。脂質ラフト内に取込まれた時点で、コレステロール側鎖と異なる長さをもつ側鎖を担持するこのような化合物はラフト内にさほどきつくなくパッキングでき、かくしてラフト構造を混乱させる。この機序を介して作用し得る脱ラフト化物質の例としては、Ｒ13a、Ｒ13b、Ｒ13c、Ｒ13d又はＲ33がＨ、Ｃ1-5アルキル又はＣ12-24アルキルである以上で列挙したステロイド誘導体である。
【００６２】
第４の構造的特長は、ステロイド足場の炭素１７上の側鎖内に２重又は３重結合が存在することにある。不飽和基が存在することで側鎖の可撓性は低減される。このタイプのステロイド誘導体をラフト内に取込んだ時点で、非可撓性側鎖はラフト構造を混乱させるものと考えられている。この機序を介して作用し得る脱ラフト化物質の例としては、Ｒ13a、Ｒ13b、Ｒ13c、Ｒ13d及びＲ33がＣ2-5アルケニル又はＣ2-5アルキニルである上述のステロイド誘導体がある。
【００６３】
ステロイド足場の炭素１７上で両親媒性側鎖を表示することが、第５の特長となっている。かかる部分をラフトの親水性球内に取込むことでラフト構造は著しく混乱させられると考えられている。この機序を介して作用し得る脱ラフト化物質の例としては、Ｒ13a、Ｒ13b、Ｒ13c、Ｒ13d又はＲ33が構造式２の基により代表されている、以上で列挙されたステロイド誘導体である。
【００６４】
ステロイド足場上の置換基として強水素結合アクセプタは存在するものの水素結合ドナーは存在しないということが、化合物に脱ラフト化特性を付与し得る第６の構造的特長である。従って、Ｒ11a、Ｒ11b及びＲ11cがＯ（Ｃ1-4アルキル）、Ｎ（Ｃ1-4アルキル）2、Ｎ3、Ｏ、Ｓ、ＳＯ4-、ＰＯ42-又はハロゲン特にフッ素である構造式１ａ〜１ｃの化合物が好ましいサブグループである。同様に、Ｒ12a、Ｒ12b及びＲ14bは好ましくは、化合物１ａ及び１ｂにおいてＯ（Ｃ1-4アルキル）、Ｎ（Ｃ1-4アルキル）2、Ｎ3、Ｏ又はハロゲン、より好ましくはフッ素である。環ヘテロ原子の水素結合受容特性も又、構造式３の化合物に脱ラフト能力を付与すると考えられている特長である。
【００６５】
本発明に従って用いられるべき化合物は、当該技術分野において既知の標準的方法により調製可能である。
【００６６】
構造式１ａを有する化合物は、公表された合成プロトコルに従ったさまざまな市販の出発物質から調製され得る。ステロイド足場の５位での立体化学に応じて、調製はアンドロステロン又はエピアンドロステロンのいずれかから出発する。
【００６７】
飽和側鎖が意図されている場合カーボンブラック上の水素及びパラジウムを用いて、結果として得た２重結合を水素化を行なう段階を後に伴う、ウィッティングタイプの反応を介して１７位に異なる長さ及び構造のさまざまな側鎖を容易に導入することができる（A. M. Krubiner, E. P. Oliveto, J. Org. Chem. 1966, 31, 24-26）。対照的に、側鎖内部の不飽和は、ウィティグプロセス用の適切な前駆体を用いてさまざまな共通のパラジウム媒介カップリングによって実現可能である。その上、側鎖の完全な除去は、文献（H. -J. Schneider, U. Buchheit, N. Becker, G. Schmidt, U. Siehl, J. Am. Chem. Soc. 1985, 107, 7027-7039）内で実証されているように１７−ケト官能基のWolff-Kishner還元により達成され、一方連鎖内に単数又は複数の酸素原子を有する側鎖は、適切な（ポリ）グリコール前駆体を用いてウィティグ戦略を介して導入され得る。
【００６８】
ステロイド足場の３位における置換は、さまざまな論文中で概略的に記述されている通り、それぞれ３アルファ又は３ベータ−ヒドロキシ官能基のさまざまな操作によって達成可能である（A, Casimiro-Garcia, E. De Clercq, C. Pannecouque, M. Witvrouw, T. L. Stup, J. A. Turpin, R. W. Buchheit, M. Cushman, Bioorg. Med. Chem. 2000, 8, 191-200; H. Loibner, E. Zbiral, Helv. Chim. Acta 1976, 59, 2100-2113）。
【００６９】
ステロイド足場の４位において、Abul-Hajjにより記述された通り（Y. J. Abul-Hajj, J. Org. Chem. 1986, 51, 3059-3061及び3380-3382）に調製可能な４ベータ−ブロモアンドロスタン−３，１７−ジオン中の臭素の交換によりさまざまな官能基を導入することができる。一方で、対応するエノラートのトラッピングにより、求電子置換基を導入することができる。さらに、文献（N. L. Allinger, M. A. Darooge, R. B. Hermann, J. Org. Chem. 1961, 26, 3626-3628）内に記述されている戦略に沿って調製可能なステロイド４−ケトンは、４位にさまざまな置換基を有する化合物を得るためさらに官能化され得る。代替的には、Numazawaにより概略的に示されている戦略を用いて４−オキソ−置換ステロイドを調製することができる（M. Numazawa, K. Yamada, S. Nitta, C. Sasaki, K. Kidokoro, J. Med. Chem. 2001, 44, 4277-4283）。
【００７０】
ステロイド足場構造の５位に２重結合を有する構造式１ｂの化合物は、それぞれ市販のデヒドロアンドロステロン又はデヒドロエピフンドロステロンから得ることができる。２重結合は対応する２臭化物として保護され得る（L. F. Fieser, Organic Syntheses, Collect. Vol. IV, Wiley, New York, 1963, p. 197ff）。脱保護は、脱臭化によって達成可能である（D. Landini, L. Milesi, M. L. Quadri, F. Rolla, J. Org. Chem. 1984, 49, 152-153）。
【００７１】
構造式１ｃを有する化合物は市販の４−アンドロステン−３，１７−ジオンから出発するか、又は対応するデヒドロアンドロステロン誘導体の２重結合異性化により得ることができる。１位の２重鎖は、酸化プロセスにより導入可能である（M. L. Lewbart, C. Mouder, W. J. Boyko, C. J. Singer, F. Iohan, J. Org. Chem. 1989, 54, 1332-1338）。代替的には、文献（M. G. Ward, J. C. Orr, L. L. Engel, J. Org. Chem. 1965, 30, 1421-1423）の中で記述されている通りに得ることのできる３ベータ−ヒドロキシアンドロステ−４−エン−１７−オン内のヒドロキシ基を操作することにより３位でさまざまな官能基を導入することができる。
【００７２】
構造式１ｄを有する化合物は、市販のエストロンから得られる。１７位でのさまざまなアルキル又はアルケニル側鎖の導入は、その他のステロイド例１ａについて前述した通り、ウィティッグアプローチを用いて達成可能である。３位における官能基操作は、エストロンのヒドロキシ官能基の離脱基例えばノナフラートへの変換、及びそれに続く遷移金属媒介型クロスカップリング反応を介して（M. Rottlaender, P. Knochel, J. Org. Chem. 1998, 63, 203-208; X. Zhang, Z. Sui, Tetrahedron Lett. 2003, 44, 3071-3073）か又は単純なアルキル化又はアシル化によって達成可能である。
【００７３】
構造式３のアザステロイド誘導体（すなわちＸはＮである）は文献中に記述されている通りに調製可能である（G. H. Rasmusson, G. F. Reynolds, N. G. Steinberg, E. Walton, G. F. Patel, T. Liang, M. A. Cascieri, A. H. Cheung, J. R. Brooks, C. Berman, J. Med. Chem. 1986, 29, 2298-2315、及びその中に引用されている文献；N. J. Doorenbos, C. L. Huang, J. Org. Chem. 1961, 26, 4548-4550）。
【００７４】
構造式３を有するオキサステロイド（すなわちＸはOである）に対する合成的アクセスは、Doorenbos及びその他（N. J. Doorenbos, M. T. Wu, J. Org. Chem. 1961, 26, 4550-4552; R. B. Turner, J. Am. Chem. Soc. 1950, 72, 579-585; G. R. Pettit, T. R. Kasturi, J. Org. Chem. 1961, 26, 4557-4563; H. Suginome, S. Yamada, Bull. Chem. Soc. Jpn. 1987, 60, 2453-2461、及びその中で引用されている文献）によって記述されている戦略及びそれらと構造式１ａ、１ｂ、１ｃ及び１ｄを有する化合物について記述されている戦略との組合せによって達成可能である。
【００７５】
市販のエピアンドロステロンから出発して、化合物１０ａａは、エチリデントリフェニルホスホランとのウィティッグ反応（A. M. Krubiner, E. P. Oliveto, J. Org. Chem. 1966, 31, 24-26）及びその後の２重結合水素化とそれに続く３ヒドロキシ官能基のクロム酸ピリジニウム酸化によって調製可能である。
【００７６】
市販のエピアンドロステロンから出発して、化合物１０ａｂは、１−ドデシリデントリフェニルホスホランとのウィティッグ反応とそれに続く水素化、３ベータ−メシラートの形成及びアジドによるメシル基の置換によって調製可能である（A. Casimlro-Garcia, E. De Clercq, C. Pannecouque, M. Witvrouw, T. L. Stup, J. A. Turpin, R. W. Buckheit, M. Cushman, Bioorg. Med. Chem. 2000, 8, 191-200）。
【００７７】
水素化ナトリウム及びヨウ化メチルでの処理による市販のアンドロステロンのOメチル化とそれに続く１７ケト官能基のWolff-Kishner還元（H. -J. Schneider, U. Buchheit, N. Becker, G: Schmidt, U. Siehl, J. Am. Chem. Soc. 1985, 107, 7027-7039）によって、化合物１０ａｃを得ることができる。
【００７８】
化合物１０ａｄは、文献（A. M. Krubiner, E. P. Oliveto, J. Org. Chem. 1966, 31, 24-26）中に記述されている通り市販のエピアンドロステロンから調製可能である。クロロクロム酸ピリジニウムを用いたその後の酸化により１０ａｅを提供することができる。
【００７９】
木炭上のパラジウム及び水素を用いた２重結合の水素化により、化合物１０ａｄから化合物１０ａｆを調製することができる。
【００８０】
塩化メシルとの反応及びその後のアジドによるメシラートの置換により１０ａｆから化合物１０ａｇを得ることができる。
【００８１】
化合物１０ａｈは、基質として１０ａｄから出発して、１０ａｇについて概略的に説明されたものと同じ戦略を用いて調製可能である。
【００８２】
化合物１０ａｉは、１７ケト官能基からメチレンへのWolff-Kishnerタイプの還元におけるホウ化水素ナトリウム及びｐ−トルエンスルホンヒドラジドでの処理により、市販のアンドロステロンから誘導可能である（L. Caglioti, Organic Syntheses 1972, 52, 122-124）。
【００８３】
化合物１０ａｊは、市販の臭化ドデシルトリフェニルホスホニウムを試薬として用いて、上述のウィティッグ戦略を介してエピアンドロステロンから調製可能である。
【００８４】
化合物１０ａｋは、単純なクロロクロム酸ピリジニウム媒介型酸化を利用して１０ａｊから得ることができる。
【００８５】
化合物１０ａｌは、対応するメシラートを介して１０ａｊから調製可能であり、これがアジドにより交換されその後水素化アルミニウムリチウムで対応するアミンへと還元される。
【００８６】
市販のデヒドロエピアンドロステロンの５位及び６位での臭素化（L. F. Fieser, Organic Syntheses, Collect. Vol. IV, Wlley, New York, 1963, p. 197）とそれに続く前述の通りのウィティッグ反応及び水素化及びそれに続く５，６−２重結合の回復のためのかくして得られた生成物の過剰のホウ化水素による処理（Y. Houminer, J. Org. Chem. 1975, 40, 1361-1362）から、化合物１０ｂａを得ることができる。
【００８７】
１０ｂａの調製において中間体として用いられる１７ベータ−エチル−３ベータ−ヒドロキシ置換２臭化物は、対応するメシラートへと変換され、その後アジドで置換され文献（D. Landini, L. Milesi, M. L. Quadri, F. Rolla, J. Org. Chem. 1984, 49, 152-153）中に記述されている通りにアジド及び脱臭素化されて、化合物１０ｂｃを提供する。同じ中間体を、構造式１０ｃを有する化合物の合成において使用することができる。脱臭素化（Y. Houminer, J. Org. Chem. 1975, 40, 1361-1362）、３−ヒドロキシ官能基のクロロクロム酸ピリジウム酸化とそれに続く４位と５位を連結するための２重結合の酸媒介異性化によって、１位と２位が単結合により連結されている化合物１０ｃを得ることができる。この結合は、ジクロロジシアノキノン酸化により２重結合に転換可能である（M. L. Lewbart, C. Mouder, W. J. Boyko, C. J. Singer, F. Iohan, J. Org. Chem. 1989, 54, 1332-1338）。
【００８８】
化合物１０ｄａは、標準的なウィティグ条件下で市販のヨウ化エチルトリフェニルホスホニウムでのエストロンの処理により調製可能である。
【００８９】
アセトヒドリド及びＤＭＰでの１０ｄａのアシル化及びヨウ化メチルでのメチル化は、それぞれ化合物１０ｄｂ及び１０ｄｃを提供する。
【００９０】
化合物３０ａは、上述の通りに調製可能な化合物１０ｃから出発してSuginomeにより概略的に説明されている通りに合成可能である（H. Suginome, Y. Shinji, Bull. Chem. Soc, Jpn.1987, 60, 2453-2461）。
【００９１】
化合物３０ｂの複素環Ａ環は、文献中で記述されている通りに（N. J. Doorenbos, C. L. Huang, J. Org. Chem. 1961, 26, 4548-4550）調製可能である。この戦略のための基質中で必要とされるステロイド足場の１７位にあるベータ−エチル側鎖は、上述の通りにエピアンドロステロンから出発して導入可能である。
【００９２】
本書に提供されているデータ及び情報に従って、本発明は、脂質ラフト内又はその上で発生する生物学的プロセスによって特徴づけされるヒトならびに動物の障害及び疾患の治療のための医療環境における、構造式１０ａｃ、１０ａｄ、１０ａｅ、１０ａｆ、１０ａｇ、１０ａｋ、１０ａｌ、１０ｄａ、１０ｄｂ及び１０ｄｃに示されている通りの化合物の使用を提供している。以下で詳述する通り、これらの疾患及び／又は障害には、例えばアルツハイマ病又はプリオン関連疾患／障害、クロイツフェルト・ヤコブ病、クル、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群及び致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）などの神経変性障害ならびにウイルス細菌又は寄生虫感染症などの感染性疾患が含まれる。さらに、添付の例で実証される通り、免疫障害及び／又はアレルギー障害を本書に提供されている化合物により改善、予防又は治療可能である。これらの障害には、特に高アレルギー性障害（喘息）、自己免疫疾患（バッテン病など）、全身性紅斑性狼瘡又は動脈硬化症が含まれる。増殖性障害（ガン）などのさらなる障害及び糖尿病といった全身性障害が、本書で提供されている化合物により治療されるべき価値のある標的とみなされている。しかしながらこの状況下で特に有用であるのは、感染性疾患（好ましくはウイルス及び細菌性疾患、最も好ましくはインフルエンザ感染症）ならびに喘息といったような高アレルギー性障害である。
【００９３】
さまざまな生物学的検定の中で本発明において与えられている化合物の阻害活性を調査する前に、前記化合物を複数の毒性検定で評価して、使用される濃度範囲内でのその安定性を実証するか又はその最高非毒性濃度を決定することも可能である。かくして、各々の疾患関連検定において観察される阻害効果は、評価対象の化合物により及ぼされる毒性効果に起因するものではないということを保証することができる。毒性検定は当該技術分野において周知であり、なかんづく乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）又はアデニル酸キナーゼ（ＡＫ）検定又はアポトーシス検定を含み得る。それでもこれらの（細胞）毒性検定は、当業者には周知であるとおりにこれらの検定に制限されない。従って以下の検定は、制限的な意味のない例である。
【００９４】
１つの物質に暴露された培養細胞からの乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出は、インビトロでの日常的な生体適合性試験における細胞毒性についての感応性の高い正確なマーカーを提供する（Allen, Promega Notes Magazine 45 (1994), 7）。Promega社より市販のCyto Tox-ONETM LDH検定キット（Promega # G7891）は、マルチウェル平板内に存在する生存不能細胞の数を推定するための螢光方法と組合わせた均質膜無欠性検定を代表するものである。
【００９５】
検定は、各々の化合物濃度についてトリプリケートウェル内でメーカーの使用説明書（Promega技術告示第３０６号）に従って実施することができる。インキュベーション期間はＭＤＣＫ細胞について１６時間、ＲＢＬ細胞について１．５時間であり、ＬＤＨ検定が基準として役立つ検定（病巣削減検定及び脱顆粒検定）における曝露時間に対応する。溶媒対照は、最高の溶媒濃度でのみ行なうことができる。
【００９６】
（Promegaプロトコルの中で記述されるように）９６ウェル平板の３つのウェルに界面活性剤を添加することによって最大の検定読取り値を提供することができる。背景は、細胞無しのウェルで構成され得る。各ウェルは独立して処理及び計算され得、そのため各々の平板は必要な対照を含有することになる。トリプリケート読取り値は平均され、平均背景が差し引かれ、結果として得られた値は最大％に換算される。毒性閾値は以下のように定義づけすることができる。ＭＤＣＫ細胞については、閾値を未処理又は溶媒処理済み対照の百分率の２倍として定義づけできる。
【００９７】
或る化合物濃度における結果が閾値より低い場合には、この濃度を非毒性とみなすことができる。最高の非毒性濃度、最大の許容濃度、用量は、毒性が観察されなかった最高の用量として定義づけすることができる。
【００９８】
本書で記述されている検定内での化合物の全ての評価は、ＬＤＨ放出検定内で決定される通りの最大許容濃度以下で処理され得る。
【００９９】
第２の検定においては、損傷を受けた細胞からの酵素アデニル酸キナーゼ（ＡＫ）の放出が測定される。全ての真核細胞内に存在する頑丈なタンパク質であるＡＫは、細胞が死枯したときに培地内に放出される。該酵素はＡＤＰをリン酸化してＡＴＰを産生し、これは生物発光性ホタルルシフェラーゼ反応を用いて測定される。
【０１００】
１８時間及び４８時間のインキュベーションの後、各ウェルの上清２０μＬと新しい平板内に移し、メーカーの使用説明書に従ってToxiLight検定（Cambrex）を実施する（ToxiLight, Cambrex Bio Science, Rockland, USA, カタログ番号 LT07-117）。アデニル酸キナーゼによる添加されたＡＤＰからＡＴＰへの転換の後、ルシフェラーゼは第２段階でＡＴＰ及びルシェリンからの光形成の触媒として作用する。ルミネセンス測定は、Genios Pro計器（TECAN）で実施される。
【０１０１】
この検定は、観察された阻害が細胞の化合物誘発型損傷に起因するものでないことを確認するために実験の部の中で記述されたＳＶ４０検定に先立って実施され得る。
【０１０２】
第３の検定では、本発明において提供された化合物により及ぼされるアポトーシスの誘発が評価される。細胞膜のリン脂質非対称性の喪失は、アポトーシスプロセスの最も早期の細胞変化の１つを表わす（Creutz, C. E. (1992) Science 258, 924）。アネキシンは、カルシウムの存在下でリン脂質を結合する遍在する相同タンパク質である。リン脂質２重層の外層に対する内層からのホスファチジルセリンの動きはアポトーシスの早期指標であることから、アネキシンＶ及びその染色接合体が曝露されたホスファチジルセリンと強くそして特異的に相互作用することを理由として、アポトーシス検出のためにこれを使用することができる（Vermes (1995) J. Immunol. Methods 184, 39）。
【０１０３】
検定は、メーカーの使用説明書に従って実施することができる（アポトーシス検出のためのアネキシンＶ接合体、分子プローブ、カタログ番号Ａ１３２０１）。７２時間のインキュベーション時間の後、５μＭの最終濃度で細胞に対しＤＲＡＱ５TMを添加する。１時間のインキュベーション時間の後、培地を廃棄し、Alexa Fluor 488 （Alexa 488；分子プローブ）に対し接合されたアネキシンＶを添加する（１ｍＬあたり２５０ｎｇ）。インキュベーション及び洗浄の後、細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、ＯＰＥＲＡ自動共焦点顕微鏡（Evotec Technologies GmbH）での顕微鏡分析を４８８及び６３３ｎｍのレーザー励起及び浸水１０倍対物レンズを用いて実施する。１ウェルあたり４つの画像を自動的に撮影でき、細胞の合計数（ＤＲＡＱ５）及びAnnexinV-Alexa488の面積を自動画像分析により決定することができ、又トリプリケートについての平均及び標準偏差を計算することができる。核の合計数（着色したＤＲＡＱ５）でアネクシンＶの面積（画素）を除し１００％を乗じることによりアポトーシス指数を計算することができる。結果は、背景（溶媒処理された細胞）に対する正規化の後の未処理細胞に対する比較として表現することができる。
【０１０４】
この検定は、観察された阻害が化合物添加の後のアポトーシスの誘発の結果でないことを確認するために以下に記述されたＳＶ４０検定に先立って実施することもできる。
【０１０５】
最後に、光学顕微鏡を用いた検定作業中の細胞形態を目視により評価することにより、試験対象の化合物によりひき起こされた毒性効果の証拠を査定することができる。
【０１０６】
以下では、疾患及び障害についてのより詳細な情報が示されている。これらの疾患及び障害は、本書で提供されている化合物を用いることで予防、改善又は治療され得る。理論により束縛されることなく、一部のケースでは、本書に記述されている化合物がどのように機能し得るかの機械的モデルが提供される。本書で提供されている化合物は、この医療状況下で特に有用であり、一方特に好ましい化合物は、構造式１０ａｃ、１０ａｄ、１０ａｅ、１０ａｆ、１０ａｇ、１０ａｋ、１０ａｌ、１０ｄａ、１０ｄｂ及び１０ｄｃに示されている化合物である。特に、本書で提供されている実験データは、１０ａｃ、１０ａｄ、１０ａｅ、１０ａｆ、１０ａｇ、１０ａｋ、１０ａｌ、１０ｄａ、１０ｄｂ及び１０ｄｃが全く異なる医療上の介入又は予防において特に好ましい化合物であるということを実証している。
【０１０７】
アルツハイマ病（ＡＤ）は、大きなＩ型膜貫通タンパク質ＡＰＰ、つまりアミロイド前駆体タンパク質から誘導されたフラグメントであるアミロイド・ベータ・ペプチド（Ａβ）を含有するアミロイド斑の形成に依存している。Ａβフラグメントは、ベータ−セクレターゼ（ＢＡＣＥ）及びガンマセクレターゼと呼ばれる酵素により逐次的に分割される。ＢＡＣＥは、その管腔ドメイン内でＡＰＰを分割し、分泌された細胞外ドメインを生成するアスパルチル−プロテアーゼである。結果として得られた１０ｋＤａのＣ末端フラグメントは、その後、ＡＰＰの膜貫通ドメインで作用しかくしてＡβを放出するガンマ−セクレターゼによって分割される。第３の酵素活性、アルファ−セクレターゼは、Ａβ領域の中央でＡＰＰを分割することにより、ＢＡＣＥの活性に対抗し、非アミロイド生成性の産物、すなわち、ベータフラグメント（分泌された細胞外ドメイン）及び同じくベータセクレターゼにより分割される短かいＣ末端スタブを生み出す。従って、アルファ分割は、その共通基質ＡＰＰのためにベータ分割と直接競合する。脂質ラフトは、基質ＡＰＰに対するベータセクレターゼのアクセスを調節する上で１つの役割を果たす。本書で提供されている化合物は、脂質ラフトを分断しかくしてベータ−セクレターゼ分割を阻害するものと想定されている。理論に束縛されることなく、これは、１）ラフト内のＡＰＰ及びＢＡＣＥの分配と干渉することによって、２）同じラフト内部で遭遇するためのＡＰＰ及びＢＡＣＥの細胞内トラフィキングによって、及び３）Ａβフラグメントの産生及びアルツハイマ病の発生を阻害するためのラフト内のＢＡＣＥの活性によって、達成することができる。
【０１０８】
本書で開示される通りのステロイド誘導体は、ラフト構成成分、特にスフィンゴシン及びセラミド誘導体と整列しそれに非共有結合的に結合することになる。理論により束縛されることはないが、これは、相の拡張及び無秩序化及び秩序脂質相に応じた酵素的な、例えばベータセクレターゼの及びその他の活性の阻害をひき起こす可能性が高い。かくして、本書に開示されているステロイド誘導体は、例えばアルツハイマ病（ベータセクレターゼ阻害）；クロイツフェルト・ヤコブ病（プリオンタンパク質プロセシング及びアミロイド形成の阻害）といった神経変性疾患のための調合薬として有用である。
【０１０９】
同様に、プリオン障害は、本書に提供されている化合物の医療的使用により治療及び／又は改善され得る。アミロイド形成を結果としてもたらす配座変化も同様にプリオン疾患の病因に関与している。プリオン疾患は、宿主コード化タンパク質（ＰｒＰｃ）の異常形態（ＰｒＰｓｃ）により促進されると考えられている。ＰｒＰｓｃはその正常な対応物ＰｒＰｃと相互作用し、タンパク質がＰｒＰｓｃに変わるような形でＰｒＰｃの配座を変化させる。このとき、ＰｒＰｓｃは脳内で自己凝集し、これらの凝集体は、クロイツフェルト・ヤコブ病、クル、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカ症候群又は致死性家族性不眠症といったヒトにおいて現われる障害をひき起こすものと考えられている（McConnell, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32 (2003), 469-492）。ＰｒＰｃをＰｒＰｓｃに転換させる機序には脂質ラフトが関与し得る。ＰｒＰは、ＧＰＩ−定着されたタンパク質である。ＰｒＰｃ及びＰｒＰｓｃの両方共がコレステロール依存的にＤＲＭと会合させられる。ＧＰＩアンカーは転換にとって必要である。ＧＰＩアンカーが膜貫通ドメインにより交換される場合、異常なタンパク質への転換は遮断される。インビトロでは、ＰｒＰプロテアーゼ耐性により監視されるようなＰｒＰｃからＰｒＰｓｃへの転換は、ＰｒＰｓｃを含有するミクロソームがＰｒＰを含有するＤＲＭと融合された場合に起こる（Baron (2003) J. Biol. Chem. 278, 14883-14892; Stewart (2003) J. Biol. Chem. 278, 45960-45968）。界面活性剤での抽出は、ＤＲＭ内でのラフトクラスタ化を導く。単に膜を混合するだけでは新しいＰｒＰｓｃの測定可能な生成を導くことがなかったことから、この実験では、ＤＲＭとのミクロソームの融合が必要であった。
【０１１０】
従って脂質ラフトは異常なプリオン転換を促進する。エンドサイトーシスも同様に、ＡＰＰのＢＡＣＥ分割についてそうであるように、プリオン転換に１つの役割を果たすことが示されてきた。ＰｒＰｃ及びＰｒＰｓｃを含有するラフトは恐らく、エンドサイトーシスの後にクラスタ化された状態となる。変換を媒介するものとして仮定されているタンパク質因子Ｘがエンドサイトーシス後のラフトクラスタ化に関与しているということも同様に可能である。ＰｒＰｃ及びＰｒＰｓｃがエンドサイトーシスの後に同じラフトプラットフォーム内にクラスタ化されたならば、相互作用効率の増大が結果としてもたらされ、転換の増幅が導かれることになったと思われる。従って、該発明の化合物は、同じく、プリオン病の治療及び／又は予防においても有用である。
【０１１１】
宿主細胞を感染させるために、複数のウイルス及び細菌が脂質ラフトを利用している。特に、脂質ラフトは、複数のエンベロープウイルスの進入、集合及び退出に関与する。添付の技術的例に示されているように、インフルエンザウイルスは、このようなウイルスのプロトタイプである。
【０１１２】
本発明に記述されている化合物（脱ラフト化物質）は、１）ラフトを分断し、細胞表面に対するヘマグルチニン及びノイラミニターゼの輸送と干渉し、２）Ｍタンパク質により誘発されたスパイク糖タンパク質を含有するラフトのＭタンパク質により誘発されるクラスタ化を防止し、かくしてウイルスの集合と干渉するか又は３）脂質ラフトのサイズ／体積を増大させるか、又は４）ラフト（ウイルス膜）及び非ラフト（血漿膜）の相境界で発生する出芽細孔の分体（挟み切り）を防止するために応用することができる。この点において特に好ましい化合物は、化合物１０ａｅ及び１０ａｆであり、化合物１０ａｄ及び１０ａｌが本発明に関連してさらに一層好ましい実施形態を表わす。対応する実験的証拠は、添付の例において提供されている。例えば本書に記述されているＳＶ４０検定の中で提供されているさらなるデータも同様に、特定の化合物１０ａｃ、１０ａｄ、１０ａｆならびに１０ｄｂにおける優れた阻害効果を示した、ということを指摘しておきたい。
【０１１３】
ウイルス感染においては、ラフトクラスタ化がウイルス集合プロセスに関与している。ステロイド誘導体１０ａｄ、１０ａｅ、１０ａｆ及び１０ａｌは、増大により脂質秩序構造を分断する（検定についての記述を参照のこと）。これらは同様に、ウイルス複製検定においても１つの効果を有する。理論により束縛されないものの、この効果の基礎を成す構造的特長は、例えば１０ａｄ、１０ａｅ及び１０ａｆの場合のような２つの炭素単位又は１０ａｌの場合のような１２の炭素単位を含む１７位における脂肪親和性アルキル又はアルキリデン置換基の存在及びステロイドＡ環内部の極性３−置換の組合せによって代表されると考えられている。Ａ環内で極性官能基として３α−アミノ基を使用することにより、化合物１０ａｌの効能が結果として増大することになり、かくして３α−アミノ置換パターンがさらに一層好ましい実施形態であることが示されることになる。実験の部で提供されているようなウイルス複製検定内で得られる結果によって実証される通り、これらの化合物は、薬学的介入のために有用であり得る。これとは対照的に、アンドロステロン、エピアンドロステロン及びコレステロールは有意な脱ラフト化活性を示さず、又インフルエンザ感染のためのモデル検定においても有効でない。
【０１１４】
ＨＩＶ−１についてのウイルス放出の機序は、ラフトの関与に関してインフルエンザウイルスのものと類似していることから、上述の化合物はエイズの治療のためにも開発可能である。これを実証するため、エイズの疾病モデルとしてのＨＩＶ−１菌株ＮＬ４−３（実験室適応されたＢ型菌株）によるＨｅＬａＴＺＭ細胞の感染の阻害について化合物をテストした。これに関連して特に好ましい化合物は１０ａｋ、１０ｄａ及び１０ｄｂであり、構造式１０ｄｃにより表わされる化合物は、ＨＩＶ感染の場合の薬学的介入のためのさらに一層好ましい基質を提供する。対応する証拠が実験の部で提供されている。
【０１１５】
上述の化合物又はその誘導体でアプローチできるさらなるウイルス疾患（制限的意味のない例としての）としては、ヘルペス、エボラ熱、エンテロウイルス、コクサッキーウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ロタウイルス及び呼吸器合胞体ウイルスがある。従って、特異的（ウイルス）検定又はテストシステムに関してここで提供されている特に好ましい化合物ならびに好ましい化合物は同様に、その他の感染性疾患、特にウイルス感染の医学的介入及び／又は予防において有用であるとも考えることができる。
【０１１６】
本書で詳述する通り、インフルエンザウイルスの感染を受けた細胞内での脂質ラフトの分断又はＳＶ４０検定において活性である化合物は同様に、その他の医療環境、特にその他のウイルス感染、最も好ましくはＨＩＶ感染においても利用され得る。エイズ診療／ＨＩＶ感染において有用であることが示された化合物がその他のウイルス感染といったようなさらなる感染性疾患においても有用であることも考慮されている。
【０１１７】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）進入には、ヘルペスウイルス進入メディエータ（ＨＶＥＭ又はＨｖｅＡ）又はネクチン−１（ＨｖｅＣ）といった細胞レセプタとウイルス糖タンパク質の相互作用が必要である。ＨＳＶ感染の間、ウイルス糖タンパク質ｇＢの分画は、界面活性剤耐性膜（ＤＲＭ）中での存在により明らかになるように、脂質ラフトと会合する。コレステロール枯渇を介した脂質ラフトの分断がＨＳＶ感染を阻害し、このことは、ＨＳＶが進入及び細胞シグナリングのためのプラットフォームとして脂質ラフトを使用することを示唆している（Bender）。該発明のラフト分断作用物質は、ＨＳＶの感染及び複製を阻害するための戦略としてウイルス糖タンパク質又は相互作用する分子のいずれかをラフト内に分配するのを阻害する上で利用可能である。
【０１１８】
同様にエボラ熱ウイルス集合及び出芽も脂質ラフトに依存している。これらの機能は、脂質ラフト内のオリゴマーを形成するマトリクスタンパク質ＶＰ４０に依存する。本発明中に記述されている化合物の使用は、脂質ラフトの分断を導く。これは、ＶＰ４０オリゴマー化ひいてはエボラ熱ウイルスの感染及び集合を阻害するための手段として使用することができる。
【０１１９】
エンテロウイルスは、細胞を感染させるためのレセプタとして、補体調節タンパク質崩壊加速因子（ＤＡＦ）、ＧＰＩ−定着タンパク質を使用する。その他のＧＰＩ固定タンパク質と同様に、ＤＡＦは脂質ラフトに分配する。一貫して、このレセプタ系を介して細胞を感染させるウイルスは脂質ラフトに依存している。特に脂質ラフトは細胞表面に結合した後、ウイルス進入にとって不可欠であると思われる。さらに、ＤＡＦレセプタ系を用いてウイルスはＤＲＭ抽出検定において脂質ラフト構成要素と同時に精製する。脂質ラフトはエンテロウイルスが細胞内に進入できるようにすることから、脂質ラフト又は脂質ラフトへのＤＡＦの分配又は細胞感染を導く結合後事象を分断する本発明で開示される通りの化合物は、エンテロウイルスに基づく障害の予防及び治療にも使用可能である。
【０１２０】
コクサッキーウイルスの進入及び細胞感染は脂質ラフトに依存している。レセプタ分子（インテグリンαＶβ３及びＧＲＰ７８）が、コクサッキーウイルス感染の後に脂質ラフト内に蓄積する。該発明のラフト分断化合物は、脂質ラフト又は脂質ラフトへのコクサッキーウイルスレセプタの分配又は細胞感染を導く結合後事象を分断し、従ってコクサッキーウイルスに基づく障害（ならびにコクサッキーウイルスに類似したウイルスによってひき起こされる障害）の予防及び治療のために使用可能である。
【０１２１】
ラフトは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のライフサイクル、ひいてはＡＩＤＳにも関与している。理論により束縛されないものの、本発明の脱ラフト化物質は、ラフトを分断し、細胞表面に対するＨＩＶ糖タンパク質の輸送と干渉し、Ｇａｇタンパク質により誘発されるスパインク糖タンパク質を含有するラフトのクラスタ化を防止し、かくしてウイルスアセンブリと干渉するために応用できる。従って、本書に記述されている化合物は同様に、ＨＩＶ感染及びエイズの治療及び改善においても医療上有用である。本書で上述したとおり、これに関して好ましい化合物は、本発明に従って「脱ラフト化物質」としての資格を有し、本書に記述した化合物の効能をテストするための検定である添付された「インフルエンザ検定」において陽性の結果を示す化合物である。従って、添付の「インフルエンザ検定」で陽性の結果を示す化合物は同様に、ＨＩＶ感染（例えばエイズ）などのその他のウイルス感染の治療、予防及び／又は改善において利用することもできる。
【０１２２】
脂質ラフトは同様にＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の感染サイクルにも関与する。本発明で「脱ラフト化物質」として記述されている化合物は、脂質ラフト又は脂質ラフトに対するウイルス複製複合体のタンパク質構成成分の分配を分断するか又は、ウイルス集合に導く複製事象と干渉することができる。従って、本書で記述されている化合物は同様に肝炎、特にＣ型肝炎の予防及び治療においても有用である。
【０１２３】
ロタウイルスの細胞進入は、脂質ラフトにより左右される。ガングリオシドＧＭ１、インテグリンサブユニットα２β３及び熱ショック同族タンパク質７０（ｈｓｃ７０）といったようなロタウイルスレセプタとして関与する分子は、脂質ラフトと会合させられる。さらに、ロタウイルス感染性粒子は複製中にラフトと会合し、脂質ラフトは細胞表面への輸送のために運用される。本書で記述された化合物は、脂質ラフト又はロタウイルスのためのレセプタの分配、脂質ラフトを介した輸送及び複製に必要なタンパク質及び脂質複合体の形成を分断するために利用可能である。従って、これらは、ロタウイルス感染の予防及び治療において有用である。
【０１２４】
シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）は、クラスリン被覆ピットを介してではなくむしろ非定型カベオラ媒介型エンドサイトーシス経路を介して細胞内に入る。（Anderson (1996) Mol. Biol. Cell 7, 1825-1834; Stang (1997) Mol. Biol. Cell 8, 47-57）。細胞摂取のこの機序は同様に、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）及び上気道感染といったヒトの疾患をひき起こす原因である病原体であるウイルス族Coronaviridaeの成員、及び呼吸器合胞体ウイルス（Macnaughton (1980) J. Clin. Microbiol. 12, 462-468; Nomura (2004) J. Virol. 78, 8701-8708; Drosten (2003) N. Engl. J. Med. 348, 1967-1976; Ksiazek (2003) N. Engl. J. Med. 348, 1953-1966）によっても利用される。その上、細菌も又、結核をひき起こす例えばマイコバクテリウム種のように、細胞摂取のためにこの機序を使用する。かくして本書で提示されているＳＶ４０検定は、カベオラ媒介型細胞摂取のモデルとして役立ち、上述のウイルス及び細菌によりひき起こされる疾病の場合の薬学的診療のために本発明の中で記述される化合物を使用することができる。
【０１２５】
カベオララフト内へのシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）の摂取は、細胞に進入するのにラフトを利用するさまざまな細胞及びウイルスによる感染の１つのモデルである（Pelkmans (2002) Science 296, 535-539）。カベオラ取込み、エンドサイトーシス及び早期細胞内トラフィキングの段階における細菌又はウイルス感染を阻害し得る化合物のためのスクリーンとして検定を使用する。この機序は、呼吸器合胞体ウイルス、コロナウイルス（例えばＳＡＲＳ）による感染及び結核を導くマイコバクテリウム種による細菌感染に特に関係する。従って、添付のＳＶ４０検定において陽性結果を示す化合物は、制限的な意味なく、Campylobacter spp., Legionella spp., Brucella spp., Salmonella spp., Shigella spp., Chlamydia spp., FimH and Dr+ Escherichia coli. による細菌侵入及び結核のような気道の感染の医学的診療という状況下で使用することもできる。
【０１２６】
本書に提示された化合物は、野生型ＳＶ４０ウイルスでの感染を受けたＨｅＬａ細胞を用いてＳＶ４０検定により実証された通りのカベオラ媒介型機序により、かかる摂取を阻害するのに適している。その上、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を用いた類似の検定における阻害の欠如は、ＶＳＶがクラスリン媒介型エンドサイトーシスを介して早期及び晩期エンドソーム内に進入するにつれてのこの作業仮説の能力を実証している。この状況下で、化合物１０ａｃ、１０ａｄ及び１０ａｆは、一定の与えられた感染の治療のための特に好ましい物質である。その上、化合物１０ｄｂは、ウイルス及び／又は細菌感染の場合の薬学的介入のためのさらに一層好ましい実施形態を表わしている。
【０１２７】
以上で指摘した通り、本書で記述した化合物は、分泌された細菌毒素により誘発される中毒及び細菌感染の治療又は改善において利用することもできる。
【０１２８】
コレラ（Vibrio cholerae 由来）、アエロリシン（Aeromonas hydrophilia）、炭疽菌（Bacillus anthracis）及びヘリコバクター毒素といったような細菌毒素は、その機能にとってきわめて重要であるラフト内のオリゴマー構造を形成する。ラフトは、コレラのためのガングリオシドＧＭ１といったようなラフト脂質に対する結合によってターゲティングされる。オリゴマー化の防止は、ラフトクラスタ化の防止と等価であり、従ってウイルス感染に使用されるものと同じか又は類似の化合物は、細菌毒素の活性を阻害できるはずである。しかしながら、毒素は血液から急速に一掃されることになり、一連の治療が必要であり得るウイルス感染と比べて治療が短期間でありうることから、投与計画の差異が予想されると思われる。
【０１２９】
結核、細菌性赤痢及びクラミジア及び尿路疾患病原菌による感染といったような細菌感染においては、往々にしてカベオラが関与するラフト依存性内在化プロセスにおいて、細胞内に生体が取り上げられる。ラフト内での細菌レセプタの局在化の予防又は内在化の遮断が感染を防ぐことになる。コレステロール結合タンパク質、カベオリンに依存するカベオラの場合、ステロイド誘導体でラフトからコレステロールを排除することで、病原体の摂取を防ぐことができる。
【０１３０】
結核は、ラフトが関与する細菌感染性疾患の一例である。まず第１に、補体レセプタ３型（ＣＲ３）が、ザイモサン及びＣ３ｂ１−被覆粒子を内在化させることのできるレセプタであり、かつヒト好中球内のマイコバクテリウム・カンサシイの非オプソニン食作用の原因である。これらの細胞中では、ＣＲ３は血漿膜の脂質ラフト内に局在化された複数のＧＰＩ固定タンパク質と会合した状態で発見された。コレステロール枯渇は、ザイモサン又は血清オプソニン作用を受けたＭ・カンサシイの食作用に影響を及ぼすことなくＭ・カンサシイの食作用を著しく阻害する。ＣＲ３はＧＰＩタンパク質と会合された時点で、Ｍ・カンサシイが内在化されているコレステロール富有ドメインの中で移転する。ＣＲ３がＧＰＩタンパク質と会合されていない場合、それは、これらのドメインの外側にとどまり、ザイモサン及びオプソニン作用を受けた粒子の食作用を受けた粒子の食作用を媒介するが、V gamma 9 V delta 2 Ｔ細胞を特異的に刺激するマイコバクテリア抗原であるＭ・カンサシイイソペンテニルピロホスファート（ＩＤＰ）の食作用は媒介しない。従って、本発明は同様に、マイコバクテリウム感染、好ましくはマイコバクテリウム結核感染の治療及び／又は改善における本書で開示された化合物の使用をも提供する。
【０１３１】
細菌性赤痢は、腸内細菌赤痢菌によりひき起される急性炎症性疾患である。脂質ラフト内部での感染中に分配する宿主タンパク質ＣＤ４４、ヒアルロナンレセプタ及び赤痢菌インベイシンＩｐａＢが関与する分子複合体が感染中に形成される。侵入プロセスには宿主細胞ならびにウイルスのタンパク質のラフト依存性相互作用が必要とされることから、脂質ラフト又は赤痢菌のレセプタの分配、赤痢菌タンパク質の分配、脂質ラフトを介した輸送及び複製に必要なタンパク質及び脂質複合体の形成を分断するために、本書に記述された化合物を利用することができる。従って、該発明は同様に、細菌性赤痢の治療又は改善における本書で記述されている化合物の医学／薬学的使用をも提供する。
【０１３２】
さらに心臓血管疾患と結びつけられるヒトにおける呼吸器感染の重要な原因であるクラジミア肺炎菌、ヒトにも感染する家畜及び鳥における重要な病原体であるオウム病クラミジアならびにその他のクラジミア菌株（クラジミア・トラコマチス血清型Ｅ及びＦ）は各々脂質ラフトを介して宿主細胞内に入る。
【０１３３】
該発明の化合物は、脂質ラフト又は脂質ラフトを介した複製及び輸送に必要なタンパク質及び脂質複合体の分配を分断するために使用され得、クラミジア感染、特にＣ、肺炎菌感染の予防及び治療のために使用可能である。
【０１３４】
１型線毛保有大腸菌は、その不浸透性構造にもかかわらず脂質ラフト依存性機序を介して尿路上皮組織に侵入する最も一般的なヒト尿路病原体である。本書で提供されている化合物は、脂質ラフト又はカベオラ、E. coliの結合、脂質ラフトを介した輸送及びその後の膀胱及び類似の上皮組織を横断した感染に必要なタンパク質及び脂質複合体の分配を分断することができる。従って、該発明において記述されている化合物は、細菌感染性疾患特に尿路疾患の予防及び治療のために使用可能である。
【０１３５】
さまざまな細菌毒素がその細胞毒性活性を及ぼすためにラフトを運用する。例えば、哺乳動物細胞上でアエロモナス細菌により産生される細孔形成性毒素アエロリシンは、ＢＨＫ細胞上の８０ｋＤのグリュシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）−定着タンパク質に結合し、ラフト内で分配する。このときプロトキシンは、宿主細胞プロテアーゼによりその成熟形態までプロセッシングされる。毒素と脂質ラフトの優先的会合は、局所的毒素濃度を増大させ、かくして、チャンネル形成のための前提条件であるオリゴマー化を促進する。従って、本書で記述されている化合物は同様に、細菌感染に関係する疾患の治療、予防又は改善においても有用である。本発明の状況下では、本書で記述されている化合物が同時療法アプローチにおいても利用されるということも考慮されている。従って、化合物が、さらなる薬物例えば抗生物質と組合せた形で、治療を必要とする患者に対して投与されるということも考慮されている。
【０１３６】
炭疽菌毒素の防御抗原（ＰＡ）は、細胞表面レセプタに対して結合し、かくして死的因子（ＬＦ）が取上げられその毒性効果を細胞質内で及ぼすことができるようにする。ヘプタマーＰＡ又は抗体サンドイッチとの炭疽菌毒素レセプタ（ＡＴＲ）のクラスタ化は、特殊化されたコレステロール及び血漿膜のグリコスフィンゴ脂質富有ドメイン（脂質ラフト）に対するその会合をひき起こす。薬物を用いてラフトの無欠性を改質することで、ＬＦ送達及びシトゾルＭＡＰＫキナーゼの分割が妨げられた。
【０１３７】
本書で開示されているとおりの「脱ラフト化物質」は、ラフトを分断し、毒素のクラスタ化／オリゴマー化と干渉するために利用可能である。従って、該発明の化合物は同様に、バシラス・アントラシス（炭疽菌）による感染の治療／予防においても有用である。
【０１３８】
ヘリコバクター・ピロリ（ピロリ菌）は、慢性胃炎、消化性潰瘍及び胃ガンの生成に関与してきた。脂質ラフトは、ヘリコバクター・ピロリ中毒の病原性機序において１つの役割を果たす。従って、本書で記述されている化合物は、例えば胃炎、消化性潰瘍及び／又は胃潰瘍の治療といったヘリコバクター感染の治療、予防又は改善においても有用である。
【０１３９】
本書で記述されている化合物は同様に、プラスモジウム感染、特に熱帯性マラリア原虫感染の治療／予防においても有用である。従って、本書で記述されている化合物は、脂質ラフト又はカベオラ、赤血球細胞に対する熱帯性マラリア原虫の結合又は脂質ラフトを介した輸送及びその後の感染に必要なタンパク質及び脂質複合体の分配を分断するために利用可能である。従って、これらをマラリアの予防及び治療のために用いることができる。
【０１４０】
同様に、本書で開示されている通りの化合物を用いることで、喘息及びその他の免疫疾患を治療することができる。ＦｃεＲＩ媒介型シグナリングにおける脂質ラフトの役割を研究するために最も集中的に使用される細胞は、ラット好塩基球性白血病（ＲＢＬ）細胞である。主としてＴ細胞の活性のためのリンカー（ＬＡＴ）のまわりに集合したシグナリング複合体のＦｃεＲＩ凝集に続く相互反応におけるラフトの役割が記述されている（Metzger, Mol, Immunol. 38 (2002), 1207-1211）。
【０１４１】
本書で記述されている通りの化合物は、ＲＦを分断し、かつ１）細胞表面でのＦｃεＲＩの輸送及び凝集と干渉し、２）細胞表面でのＬＡＴによるラフトの輸送及び凝集と干渉するために利用され得る。従って、該発明は同様に、喘息の治療／予防における本書で開示されている化合物の使用をも提供する。本書で記述されている化合物は、免疫障害ならびに自己免疫障害において有用である物質をテストするための検定である細胞ベースの検定（脱顆粒検定）において陽性結果を提供する。
【０１４２】
かかる治療のための特に好ましい化合物は、脱顆粒検定におけるマーカーとして効率良く用いられるβ−ヘキソサミニダーゼの放出を阻害する化合物１０ａｌである。かくして、化合物１０ａｌで例示されるように、Ａ環の内部の極性３α−アミノ官能基と長脂肪親和性１７−ドデシリデン側鎖の組合せは、免疫疾患の症例、特に喘息における薬学的介入のための好ましい置換パターンを表わす。
【０１４３】
従って、同様に自己免疫疾患ならびに高アレルギー性応答が、本書で開示されている化合物により治療され得る。
【０１４４】
バッテン病とも呼ばれるニューロンセロイド脂褐素症は、網膜ジストロフィに二次的な進行性神経障害、精神機能低下、発作及び視力喪失をひき起こす常染色体性劣性遺伝性障害の混成群である。視覚喪失が該障害の最も早期の症候であることから、若年性タイプでは、眼科医にとって特に関心が高いものである。これは、既知の機能が全く無い推定上の膜貫通タンパク質細胞Ｎ３Ｐをコードする細胞Ｎ３遺伝子内の突然変異の結果として発生する。細胞Ｎ３Ｐは脂質ラフト上に常在する。従って、本書で記述されている化合物は、例えばバッテン病の治療において有用である。
【０１４５】
全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）は、Ｔリンパ球レセプタ媒介型シグナル変換経路内の異常により特徴づけされる。リンパ球特異性タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）は、ＳＬＥ患者からのＴリンパ球の中で減少し、この減少は疾患の活性と結びつけられている。ＣＤ４５、Ｃ末端５ｒｃキナーゼ（ＣＳＫ）及びｃ−ＣｂｌといったようなＬＣＫホメオスターシスを調節する分子は、脂質ラフト内に局在化されている。従って、ＳＬＥも又、本書で開示されている化合物の使用のための医学的標的である。
【０１４６】
該発明のさらなる実施形態においては、アテローム性動脈硬化症が、医療環境内での及び／又は医薬組成物の調製のための本書で記述されている化合物の使用により治療／改善されることになる。
【０１４７】
同様にガンなどの増殖性障害も本書で記述されている化合物の標的となり得る。多数のシグナリング化合物が、ラフトに対するその分配を通して調節される。例えば、ＥＧＦレセプタのチロシンキナーゼ活性はラフト内で抑制され、コレステロールがこのプロセス中で調節の役割を果たす。同様にして、Ｈ−Ｒａｓはラフト内で不活性であり、そのシグナリング活性はラフト退出時点で起こる。ラフトは同様に、アポトーシスの調節において１つの役割を果たすことも示されてきた。本書で開示される脱ラフト化物質／化合物は、ガン治療、例えば白血病又は腫瘍性疾患ならびに黒色腫の治療において使用可能である。
【０１４８】
さらなる診療的機会は、有系分裂誘起レセプタ−シグナリングを防止することにある。免疫原性シグナリングに関しては、これにはリガンド活性化レセプタのためのラフトベースのシグナリングプラットフォームの構築が関与する。免疫グロブリンＥレセプタシグナリングについて記述されたものと類似の分子も同様に有糸分裂誘発性シグナリングを阻害することになるということが予想されると思われる。
【０１４９】
ＧＬＵＴ−４転座を導くインシュリンシグナリングは、血漿膜における脂質ラフト又はカベオラから発するインシュリンレセプタ−シグナリングに依存している。従って、該発明のさらなる実施形態においては、本書で記述されている化合物は、例えば糖尿病といった全身性障害のようなインシュリン関連性障害の治療のための医薬組成物の調製において使用可能である。
【０１５０】
本発明で記述されている化合物は、医薬組成物の製造及びヒト又は動物の疾患の治療、改善及び／又は予防のために、医療環境において特に有用である。かかる医薬組成物で治療されるべき患者は、好ましくはヒトの患者である。
【０１５１】
本書で「脱ラフト化物質」として記述されている化合物は、それ自体その薬理作用団又は医薬組成物としての使用における化合物として投与されてもよいし、又は薬剤として処方されてもよい。本発明の範囲内に入るのは、以上で定義された構造式１ａ、１ｂ、１ｃ及び１ｄのうちの１つの化合物を活性成分として含む薬学組成物である。該医薬組成物は任意には、担体、希釈剤、充てん剤、錠剤分解物質、潤滑剤、結合剤、着色剤、顔料、安定剤、防腐剤又は酸化防止剤といったような薬学的に許容可能な賦形剤を含むことができる。
【０１５２】
該医薬組成物は、Remington's Pharmaceutical Sciences第２０版の中で公表された技術といったような当業者にとって既知の技術により処方可能である。該医薬組成物は、筋内、静脈内、皮下、真皮下、動脈内、直腸内、鼻腔内、局所又は膣内投与といったような非経口、及び経口投与向けの剤形として処方可能である。経口投与向けの剤形としては、コーティング錠、素錠、軟ゼラチンカプセル、硬ゼラチンカプセル、口中錠、トローチ、溶液、エマルジョン、懸濁液、シロップ、エレキシル剤、戻し用粉末及び顆粒、分散性粉末及び顆粒、薬用ガム、そしゃく錠及び発泡錠が含まれる。非経口投与向けの剤形としては、溶液、エマルジョン、懸濁液、分散及び戻し用の粉末及び顆粒が含まれる。非経口投与のためには、エマルジョンが好ましい剤形である。直腸内及び膣内投与のための剤形には座薬及びオブラ（ｏｖｕｌａ）が含まれる。鼻腔内投与向けの剤形は、例えば計量式吸入器などにより吸入及び送気を介して投与され得る。局所投与向けの剤形には、クリーム、ジェル、軟こう、こう薬、パッチ及び経皮送達（デリバリー）系が含まれる。
【０１５３】
本発明で使用可能な化合物の薬学的に許容可能な塩はさまざまな有機及び無機酸及び塩基を用いて形成可能である。酸付加塩の例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ｃａｐｈｏｒａｔｅ、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、へプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルスルホン酸塩、リン酸塩、ｐｉｃａｔｅ、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩例えばトシル酸塩、ウンデカン酸塩などが含まれる。塩基付加塩の例としては、＜成２＞アンモニウム塩、アルカリ金属塩たとえばナトリウム、リチウム及びカリウム塩；アルカリ土類金属たとえばカルシウム及びマグネシウム塩；有機塩基（例えば有機アミンなど）を用いた塩例えばベンズアゼチン、ジシクロヘキシルアミン、ヒドラビン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミド、ｔ−ブチルアミンなど、アミノ酸を伴う塩例えばアルギニン、リジンなどが含まれる。
【０１５４】
本発明において使用可能な化合物の薬学的に許容可能な溶媒和物は、例えば水和物といった水との溶媒和物は、又はメタノール、エタノール又はアセトニトリルなどの有機溶媒とのすなわちそれぞれメタノラート、エタノラート又はアセトニトラートとしての溶媒和物の形で存在し得る。
【０１５５】
本発明の中で使用され得る化合物の薬学的に許容可能なプロドラッグは、化学的又は代謝的に分割可能な基を有しかつ、加溶媒分解によってか又は生理学的条件下で、インビボで薬学的に活性である該発明の化合物となる誘導体である。本発明の中で使用可能な化合物のプロドラッグは、アミノ又はヒドロキシ基といったような化合物の官能基を用いて従来の要領で形成され得る。プロドラッグ誘導体形態は、哺乳動物生体体内での溶解性、組織適合性又は遅延放出といった利点を提供することが多い（Bundgaard, H., Design of Prodrugs, pp. 7-9, 21-24, Elsevier, Amsterdam 1985を参照のこと）。
【０１５６】
本書で記述されているこれらの医薬組成物は、適切な用量で対象に投与することができる。投薬計画は、担当医及び臨床的要因によって決定される。医術において周知のとおり、いずれか１人の患者のための剤形は、患者の身長体重、体表面積、年令、投与すべき特定の化合物、性別、投与時間及び経路、全身健康状態、及び併用されるその他の薬物を含めた数多くの要因によって左右される。一般に、薬学組成物の規則的投与としての投薬計画は、一日に０．１μｇ〜５０００ｍｇ単位、一部の実施形態では０．１μｇ〜１０００ｍｇ単位の範囲内にあるべきである。投薬計画が連続輸液である場合、それは、それぞれ一分、体重１キログラムあたり０．１ｎｇ〜１０μｇ単位の範囲内でもあり得る。進捗は、定期評価により監視可能である。
【０１５７】
本発明は同様に、哺乳動物細胞の脂質ラフト構造の中、その上又はその内部で発生する生化学的及び／又は生物物理学的プロセスに起因する（又はそれに関係づけされる）障害又は疾患の治療、改善又は予防方法をも提供する。対応する疾患／障害は本書で以上に提供されており、かかる改善、治療及び／又は予防を必要とする患者に対して投与すべき対応する有用な化合物は、同様に以上で開示され、添付の実施例及びクレーム中で特徴づけされている。最も好ましい環境においては、本書で記述される化合物（脱ラフト化物質）は、かかる治療を必要とする対象、特にヒトの対象に対する前記化合物の投与によりこれらの治療方法の中で使用される。
【０１５８】
本発明の状況下で記述されている脱ラフト化化合物の医療上の重要性のため、該発明は同様に、単数又は複数の薬学的に受容可能な賦形剤と本書に定義されている化合物の混和物を含む薬学組成物の調製のための方法をも提供している。対応する賦形剤は、本書中で以上に言及されており、シクロデキストリンを含むが、これに制限されるわけではない。以上で指摘した通り、該発明の薬学組成物を注射又は輸液により投与すべきであるならば、その薬学組成物はエマルジョンであることが好ましい。
【０１５９】
以下の実施例は、本発明を例示するものである。
【実施例】
【０１６０】
実施例１：  化合物１０ａｄ；シス−Δ17(20)−５アルファ−プレグネン−３ベータ−オルの合成
無水ジメチルスルホキシド（５０ｍＬ）中の水素化ナトリウム（２．４ｇ、５９．８ｍｍｏｌ、鉱油中の６０％分散）の懸濁液を、アルゴン雰囲気下で約４５分間７０〜７５℃で攪拌した。結果として得た淡緑色溶液を室温まで冷却し、無水ジメチルスルホキシド（１００ｍＬ）中の市販のエチルトリフェニルホスホニウムヨウ化物の溶液を添加した。得られた赤色溶液を約５〜１５分間放置し、次に無水ジメチルスルホキシド（１００ｍＬ）中の市販のエピアンドロステロン（４ｇ、１３．７９ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、結果として得た赤色反応混合物をアルゴン雰囲気下で約１８時間５５〜６０℃で攪拌した。
【０１６１】
室温まで冷却した後、反応混合物を氷／水（約２Ｌ）中に注ぎ込み、その後ジエチルエーテル（３×８００ｍＬ）で抽出した。組合せた有機層を水（４×１Ｌ）でくり返し洗浄して残留ジメチルスルホキシドを除去し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で溶媒を除去した。粗生成物をシリカ上のカラムクロマトグラフィ（石油／酢酸エチル４：１）による精製に付して３．５１ｇ（８４％）の１０ａｄを無色の酸として得た。
【化１５】
2008504329.tif 000016
（ＮＭＲは５％未満で対応するトランス異性体を示している）。
ＭＳ（Ｅｌ）：ｍ／ｚ＝３０２（Ｍ+）
【０１６２】
実施例２：  化合物１０ａｅ：シス−Δ17(20)−５アルファ−プレグネン−３−オンの合成
ジクロロメタン（３ｍＬ）中のクロロクロム酸ピリジニウム（４５６ｍｇ、２．１１ｍｍｏｌ）の溶液を、ジクロロメタン（４ｍＬ）中のシス−Δ17(20)−５アルファ−プレグネン−３ベータ−オル（１０ａｄ）の溶液に添加した。結果として得た反応混合物を室温で約１８時間攪拌し、次に溶離剤としてジクロロメタンを用いて短いシリカカラムを通してろ過した。減圧下での溶媒の除去後、生成物を無色の固体として得た（２１０ｍｇ、８３％）。
【化１６】
2008504329.tif 000017
（ＮＭＲは、５％未満で対応するトランス異性体を示す）。
ＭＳ（Ｅｌ）：ｍ／ｚ＝３００（Ｍ+）。
【０１６３】
実施例３：  化合物１０ａｉ：５アルファ−アンドロスタン−３アルファ−オルの合成
メタノール（７０ｍＬ）中の市販のアンドロステロン（１．２ｇ、４．１４ｍｍｏｌ）及びトルエンスルフォニルヒドラジド（１．０８ｇ、５．７９ｍｍｏｌ）の混合物を１８時間還流温度で攪拌した。室温まで冷却した後、固体ホウ化水素ナトリウム（３．４６ｇ、９１ｍｍｏｌ）を１時間にわたり分量の形で添加した。結果として得た反応混合物を１６時間還流温度で攪拌した。減圧下で溶媒を除去した後、残渣をジクロロメタン（６００ｍＬ）中に溶解させ、水（１Ｌ）、希炭酸ナトリウム水（１Ｌ）、１Ｍの塩酸水（１Ｌ）そして再度水（１Ｌ）で遂次洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去して無色の固体（１．５３ｇ）を得た。予想外に、その材料の分析的評価は、アンドロステロンのトルエンスルフォニルヒドラゾンを示した。材料をＴＨＦ（２５ｍＬ）中で溶解させ、その後ホウ化水素ナトリウム（１．３８ｇ、３６．４ｍｍｏｌ）を添加した。結果としての反応混合物を２０時間還流温度で攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をジエチルエーテル（５００ｍＬ）中に溶解させ、その後水（５００ｍＬ）、飽和炭酸ナトリウム水溶液（５００ｍＬ）、１Ｍの塩酸（５００ｍＬ）及び水（５００ｍＬ）で洗浄した。硫酸ナトリウム上で有機層を乾燥させた後、溶媒を減圧下で除去し、粗製材料をカラムクロマトグラフィによる精製（ジクロロメタン／酢酸エチル４：１〜２：１）に付した。無色の固体として化合物１０ａｉを得た（８０ｍｇ、７％）。
【化１７】
2008504329.tif 000018
【０１６４】
実施例４：  化合物１０ａｃ：３アルファ−メトキシ−５アルファ−アンドロスタンの合成
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の１０ａｉ（７２ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）の溶液を固体水素化ナトリウム（１５ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ、鉱油中６０％の分散）に対しアルゴン雰囲気下で添加し、結果として得た懸濁液を室温で１０分間攪拌した。ニートのヨウ化メチル（７４ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１８時間攪拌した。混合物を水（５００ｍＬ）中に注ぎ込み、ジエチルエーテル（４００ｍＬ）で抽出した。有機層を水（２×５００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。粗製材料をシリカ上のカラムクロマトグラフィにより精製し（石油／酢酸エチル１０：１）、無色の油として１０ａｃを得た（３２ｍｇ、４２％）。
【化１８】
2008504329.tif 000019
【０１６５】
実施例５：  化合物１０ａｆ：５アルファ−プレグナン−３ベータ−オルの合成
エタノール（４ｍＬ）及びジクロロメタン（４ｍＬ）の混合物中の化合物１０ａｄ（５１０ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ）及び木炭上のパラジウム（３６０ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ、１０％のパラジウム）の溶液を、水素雰囲気下で室温で２４時間攪拌した。ジクロロメタンを溶離剤として用いてセライトパッドを通して反応混合物をろ過した。溶媒を減圧下で除去して、無色の固体（５１４ｍｇ、１００％）として分析的に純粋な１０ａｆを得た。
【化１９】
2008504329.tif 000020
【０１６６】
実施例６：  化合物１０ａｇ：５アルファ−プレグナン−３アルファ−アジドの合成
化合物１０ａｆを、以下で１０ａｄについて記述されているものと類似の要領で対応するメシラートに変換させた。
【０１６７】
ジメチルスルホキシド（１５ｍＬ）中の該メシラート（２４０ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）及びアジ化ナトリウム（４０７ｍｇ、６．２７ｍｍｏｌ）の溶液をアルゴン雰囲気下で２０時間、９０℃で攪拌した。反応混合物を水（５００ｍＬ）中に注ぎ、ジクロロメタン（４００ｍＬ）で抽出し、組合わせた有機層を水（３×５００ｍＬ）で洗浄した。硫酸ナトリウム上で乾燥させた後、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカ上のカラムクロマトグラフィ（石油）により精製した。無色の油（１４０ｍｇ、６８％）として化合物１０ａｇを得た。
【化２０】
2008504329.tif 000021
【０１６８】
実施例７：  化合物１０ａｈ：シス−Δ17(20)−５アルファ−プレグネン−３アルファ−アジドの合成
ジクロロメタン（３０ｍＬ）中の１０ａｄ（１．１３ｇ、３．７４ｍｍｏｌ）及び４−（ジメチルアミノ）ピリジン（５４８ｍｇ、４．４９ｍｍｏｌ）の溶液を０℃まで冷却し、ニートの塩化メシル（４７３ｍｇ、４．１２ｍｍｏｌ）を添加した。結果として得た反応混合物を室温まで温め、一晩攪拌した。１８時間後、混合物を水（１Ｌ）中に注ぎ、酢酸エチル（８００ｍＬ）で抽出した。有機層を水（２×１Ｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をシリカ上のカラムクロマトグラフィ（石油／酢酸エチル４：１）により精製し、無色の固体（１．３ｇ、９１％）として対応するメシラートを得た。
【０１６９】
Ｎ、Ｎ’−ジメチル−ＮＮ’−トリメチレン尿素（ＤＭＰＵ）（１０ｍＬ）中のメシラート（８９０ｍｇ、２．３４ｍｍｏｌ）及びアジ化ナトリウム（１．２１ｇ、１８．６９ｍｍｏｌ）の溶液をアルゴン雰囲気下で２日間６０℃で攪拌した。水（５００ｍＬ）中に反応混合物を注ぎ、ジクロロメタン（２×４００ｍＬ）で抽出し、組合された有機層を水（２×１Ｌ）で洗浄した。硫酸ナトリウム上で乾燥させた後、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカ上のカラムクロマトグラフィ（石油）により精製した。化合物１０ａｈを無色の固体（４４５ｍｇ、５８％）として得た。
【化２１】
2008504329.tif 000022
【０１７０】
実施例８：  化合物１０ａｊ：シス−Δ17(20)−ドデシリデン−３ベータ−アンドロスタノールの合成
乾燥ジメチルスルホキシド（１６０ｍＬ）中の市販のエピアンドロステロン（４．２１ｇ、１４．５ｍｍｏｌ）の溶液に対して調製されたばかりのドデシルイリド（５０．７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を２４時間７０℃で攪拌した。イリドは、化合物１０ａｄについて記述したものと類似の要領で乾燥ジメチルスルホキシド中で市販の臭化ドデシルトリフェニルホスホニウム及び水素化ナトリウムから調製した。水（４００ｍＬ）で急冷し、ジエチルエーテル（６×２００ｍＬ）で抽出した後、組合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。シリカ上のカラムクロマトグラフィによる粗生成物の精製（石油／酢酸エチル５：１）により無色の固体として化合物１０ａｊを得た（２．１７ｇ、３４％）。
【化２２】
2008504329.tif 000023
【０１７１】
実施例９：  化合物１０ａｋ：シス−Δ17(20)−ドデシリデン−３−アンドロスタロンの合成
ジクロロメタン（５ｍＬ）中の化合物１０ａｊ（４．２１ｇ、１４．５ｍｍｏｌ）の溶液に対して、クロロクロム酸ピリジニウム（１２０ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を添加し、結果として得た混合物を室温で３時間攪拌した。シリカ上のカラムクロマトグラフィ（ジクロロメタン／酢酸エチル混合物）による粗製反応混合物の精製により、無色の固体として化合物１０ａｋが得られた（１１９ｍｇ、９９％）。
【化２３】
2008504329.tif 000024
【０１７２】
実施例１０：  化合物１０ａｌ：シス−Δ17(20)−ドデシリデン−３アルファ−アミノアンドロスタンの合成
ニートのメシルクロリド（４５６ｍｇ、３．９８ｍｍｏｌ）を０℃でジクロロメタン（２０ｍＬ）中の化合物１０ａｊ（１．６ｇ、３．６１ｍｍｏｌ）及び４−（ジメチルアミノ）ピリジン（５２５ｍｇ、４．３ｍｍｏｌ）の溶液に対し添加した。結果として得た反応混合物を室温まで漸進的に温ため、６０時間攪拌した。水（１００ｍＬ）で急冷した後、混合物を酢酸エチル（３×２００ｍＬ）で抽出し、組合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、得られた粗生成物を次の変換の中で使用した。メシラートを無色固体（１．９ｇ、９９％）として得た。アジ化ナトリウム（４．１ｇ、１５．４ｍｍｏｌ）を、ジメチルホルムアミド（１５ｍＬ）中のこのメシラート（１．９ｇ、３．６５ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、反応混合物をアルゴン雰囲気下で１６時間１０５℃で攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、酢酸エチル（１００ｍＬ）中に残渣を溶解させ、水（２×１００ｍＬ）で洗浄した。組合せた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。シリカ上でのカラムクロマトグラフィ（石油／酢酸エチル１００：１）による粗生成物の精製により、無色固体として対応するアジドを得た（１．１４ｇ、６７％）。材料を次の変換に直接提示した。
【０１７３】
還流温度で、乾燥ジエチルエーテル（１０ｍＬ）中の水素化アルミニウムリチウム（１９０ｍｇ、５ｍｍｏｌ）の溶液に対して、乾燥ジエチルエーテル（１０ｍＬ）中の該アジド（４７０ｍｇ、１ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。さらに１８時間、還流温度で結果として得た反応混合物を攪拌し、次に室温まで冷却し、メタノール（２００ｍＬ）で希釈した。水（５００ｍＬ）で急冷した後、混合物をジクロロメタン（２×２５０ｍＬ）で抽出し、組合せた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、シリカ上のカラムクロマトグラフィ（石油／ジクロロメタン３：２）により粗製材料を精製した。化合物１０ａｌを無色の固体として得た（１７５ｍｇ、４０％）。
【化２４】
2008504329.tif 000025
【０１７４】
実施例１１：  化合物１０ｄａ：シス−Δ17(20)−１９−ノルプレグナ−１，３，５（１０），１７（２０）−テトラエン−３−オル
乾燥ジメチルスルホキシド（２０ｍＬ）中の水素化ナトリウム（６８０ｍｇ、１６．７ｍｍｏｌ、鉱油中の６０％分散）の懸濁液をアルゴン雰囲気下で７２℃で９０分間攪拌した。室温まで冷却した後、乾燥ジメチルスルホキシド（２５ｍＬ）中の市販のヨウ化エチルトリフェニルホスホニウム（７ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）溶液を添加し、結果としての赤色溶液を室温で約１５分間攪拌した。乾燥ジメチルスルホキシド（１２ｍＬ）中の市販のエストロン（１ｇ、３．７ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、６０℃で１８時間反応混合物を攪拌した。室温まで冷却した後、水（２０ｍＬ）を添加し、水（１Ｌ）中に結果として得た黄色混合物を注ぎ、ジエチルエーテル（１Ｌ）で抽出した。水（４×１Ｌ）で有機層を撤底的に洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去して粗生成物を得た。シリカ上のカラムクロマトグラフィ（ジクロロメタン）により精製を達成し、１０ｄａを無色の固体として得た（９７６ｍｇ、９４％）。
【化２５】
2008504329.tif 000026
【０１７５】
実施例１２：  化合物１０ｄｂの合成：シス−Δ17(20)−１９−ノルプレグナ−１，３，５（１０），１７（２０）−テトラエン−３−イルアセタートの合成
ジクロロメタン（４ｍＬ）中の化合物１０ｄａ（１６０ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）及び４−（ジメチルアミノ）ピリジン（９７ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）の溶液に対してニートの無水酢酸（８１ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）を添加し、結果として得た反応混合物を１８時間室温で攪拌した。反応混合物を水（５００ｍＬ）中に注ぎ、酢酸エチル（５００ｍＬ）で抽出した。有機層を水（５００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去して粗生成物を得た。シリカ上のカラムクロマトグラフィ（ジクロロメタン）による精製によって、無色の固体として化合物１０ｄｂを得た（１５１ｍｇ、８２％）。
【化２６】
2008504329.tif 000027
【０１７６】
実施例１３：  化合物１０ｄｃ：シス−Δ17(20)−１９−ノルプレグナ１，３，５（１０），１７（２０）−テトラエン−３−イルメチルエーテルの合成
乾燥ジメチルホルムアミド（６ｍＬ）中の１０ｄａ（１０５ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）及び水素化ナトリウム（２３ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ、鉱油中６０％の分散）の懸濁液に対しアルゴン雰囲気下で、ニートのヨウ化メチル（１０６ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）を添加し、結果として得た反応混合物を１８時間室温で攪拌した。水（１Ｌ）中に反応混合物を注ぎ、酢酸エチル（７００ｍＬ）で抽出した。有機層を水（３×８００ｍＬ）で撤底的に洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をシリカ上のカラムクロマトグラフィ（ジクロロメタン）により精製した。化合物１０ｄｃを無色の固体（３６ｍｇ、３３％）として得た。
【化２７】
2008504329.tif 000028
【０１７７】
実施例１４：  脱ラフト化物質検定、脱ラフト化物質−リポソームラフト親和性検定
本発明に従って、一定の与えられた化合物の脱ラフト化能力及び脂質ラフトプロセスに関係する疾患の改善、治療又は予防におけるその医学的有用性を、本書で提供されているＤ−脂質ラフトＡによってテストすることができる。
【０１７８】
或る種の螢光指標のラフト親和性は、それ自体その脂質組成及びラフトモジュレータの存在によって決定されるリポソームのラフト含有量と共に変動する。
【０１７９】
Ｄ−ＬＲＡ検定は、ラフト変調の２つの極端すなわち脱ラフト化とラフト増大を検出する。０未満の脱ラフト化％は、リポソームのラフト含有率の増大によってひき起こされる指標の分配の実際の増加の結果としてもたらされる。これはラフトの再構築、すなわち密度増加又はラフトの数量を増大させるリポソーム内へのテスト化合物の物理的挿入の結果としてもたらされ得る。２５％超（脱ラフト化）及び−２５％未満（「増大」による脱ラフト化物質）の場合に有意であるとみなされる。
【０１８０】
約５０％のラフト含有率をもつリポソーム（以下で定義する）は、潜在的脱ラフト化物質と共にインキュベートされる。ラフト含有率の変化はこのとき、１つの指標（標準的ラフト親和性）を用いて決定される。
【０１８１】
Ｄ−ＬＲＡ用材料
１．  リポソーム
ラフトリポソーム：（コレステロール３５％、スフィンゴミエリン（ＳＭ）１０．５％、ＧＭ１  ３．５％、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）２５．５％及びホスファチジルコリン（ＰＣ）２５．５％）
非ラフトリポソーム：Ｎリポソーム（５０％のＰＥ、ＰＣ）
リポソームを、窒素で洗い流した回転蒸発器内で５０℃で、ｔｅｒｔブタノール中に溶解させた脂質をガラス表面上に展延させることによって調製する。６時間の乾燥後、１ｍｇ／ｍｌの濃度まで４０ｍＭのオクチル−β−Ｄ−グルコシド（ＯＧ）中に脂質を取り込み、２２℃で２５ｇのBiobeads（Amberlite XAD-2）での５ｌのＰＢＳの交換２回に対し２４時間透析を行なった。
【０１８２】
２．  指標
指標は、ラフト内に優先的に分配する螢光化合物である。これらは、異なる構造クラス及び異なる励起／発光波長を代表するように選択される。このことは、指標螢光と干渉するラフトモジュレータがテストされる場合に重要である。
【０１８３】
２．１．  ペリレンは、膜内に完全に埋込まれるラフト親和性化合物である。
【０１８４】
２．２．  ＧＳ−９６は、一般的構造コレステロール・リンカー・ローダミン・ペプチドのラフト親和性アダクツ（コレステロールのみが膜挿入されている）である。ＧＳ−９６の構造は、コレステリル−Ｇｌｃ−ＲＲ−βＡ−Ｄ（Ｒｈｏ）−βＡ−ＧＤＶＮ−Ｓｔａ−ＶＡＥＦ（１文字アミノ酸コード；Ｇｌｃ＝グリコール酸、βＡ＝β−アラニン、Ｒｈｏ＝ローダミン、Ｓｔａ＝スタチン；Fmoc-Statine Neo-system FA08901, Strasbourg, フランス）であり、標準的手順を用いて出願人によって生成された。すなわち、Applied Biosystems 433Aペプチド合成装置を利用して、脱保護試薬としてピペリジンを用いかつカップリング試薬として２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３，−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）を用いて、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）方法を使い、固体支持体上でペプチド合成を実施した。基質として市販のＦｍｏｃ−グルタミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを用い、文献（T. Nguyen, M, B, Francis, Org, Lett. 2003, 5, 3245-3248）から抜粋された修正済み手順により調製されたローダミン標識されたＦｍｏｃ−グルタミン酸を除いて、Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸構築ブロックは市販のものである。最終的ケン化により、ペプチド合成において使用された遊離酸が生成された。文献（S. L. Hussey, E. He, B. R. Peterson, Org. Lett. 2002, 4, 415-418）に記述された通りにコレステリルグリコール酸を調製し、手作業でＮ末端アルギニンのアミノ官能基にカップリングさせた。ペプチド合成において既知の標準的手順を用いた固体支持体からの最終的分割及び分取ＨＰＬＣによるその後の精製により、ＧＳ−９６を得た。
【０１８５】
２．３．  Ｊ−１２Ｓは同じ目的に役立つより小さいアダクツである：コレステリル−Ｇｌｃ−ＲＲ−βＡ−Ｄ（Ｒｈｏ）。例えばスフィンゴミエリンアダクツといったその他の指標が同等に適している。
【０１８６】
素描されたＤ−ＬＲＡ方法
・  ２００μｇ／ｍｌの最終脂質濃度に至るまで、リポソームをＰＢＳ中に希釈させる（Ｒ：３０２μＭのＮ：２５７μＭの合計脂質）
・  サーモミキサー（１０００ｒｐｍ）上で３７℃で３０分間１００μｌのリポソームを予めインキュベートする。
・  １μｌのテスト化合物原液（１００μＭの最終濃度）又は適切な溶媒対照を添加し、上述の通り２時間インキュベートする。
・  指標（ＧＳ−９６  ０．２μＭ又はペリレン２μＭ）を添加し、さらに１時間インキュベートする。
・  ＬＲＡと同じ要領で作業を進める。すなわち、４００，０００ｇ及び３７℃でBeckman Optima遠心分離機のＴＬＡ−１００回転子内で２０分間遠心分離する。
・  上清（Ｓ）の上部５０ｍｌを撤去し、１５０μｌの５０．３ｍＭ  ＯＧが入ったマイクロタイタープレートに移す。
・  並行してインキュベートした管から、８０ｍＭのＯＧが１００μｌ入ったマイクロタイターウェルまで全リポソーム（Ｌ）を移す。
・  接着性（Ａ）指標を溶出させるべくサーモミキサー（１４００ｒｐｍ）上で５０℃で１００ｍＭのＣ８Ｅ１２（ペリレン）又は４０ｍＭのＯＧ（ＧＳ−９６）２００μｌを用いて管を洗浄し、中味をマイクロタイタープレートに移す。
・  マイクロタイタープレート内で４０ｍＭで２００μｌの指標濃度標準を調製する。
・  螢光計／平板読取り装置（Tecan Safire）の中でＳ、Ｌ及びＡ中の指標濃度を決定する。
・  分配係数ＣｐＮ、ＣｐＲ及びＣｐＮとの関係におけるラフト親和性（ｒΦ＝ＣｐＲ／ＣｐＮ）を計算する。
・
【数１】
2008504329.tif 000029
として脱ラフト化活性を計算する。
【０１８７】
詳細な方法
Ｎ及びＲリポソームを２００μｇ／ｍｌの最終脂質濃度までＰＢＳ中に希釈し、１００μｌのアリコートをサーモミキサー（１０００ｒｐｍ）上で３７℃で３０分間予備インキュベートした。
【０１８８】
１μｌのＤＭＳＯ（溶媒対照）及びテスト化合物原液（指摘されている場合を除き全てＤＭＳＯ中１０ｍＭ）を添加し、上述のとおり２時間インキュベートした。
【０１８９】
その後ＤＭＳＯ中の１μｌの指標を添加し（最終指標濃度ＧＳ−９６  ０．２μＭ、ペリレン２μＭ）、上述の通り１時間インキュベーションを続行した。
【０１９０】
４００，０００ｇ（３７℃）でBeckman Optima遠心分離機のＴＬＡ−１００回転子中で２０分間、インキュベーションミックスを遠心分離に付した。ＰＢＳ中の５３．３ｍＭのＯＧ１５０μｌが入った９６ウェルのマイクロタイタープレートに対し管の上部から５０μｌの上清（Ｓ）を移した。
【０１９１】
並行してインキュベートした管から、ＰＢＳ中の８０ｍＭのＯＧが１００μｌ入ったマイクロタイターウェルまで、全リポソーム（Ｌ）を移した。接着性（Ａ）指標を溶出させるべくサーモミキサー（１４００ｒｐｍ）上で５０℃で１００ｍＭのＣ８Ｅ１２（ペリレン）又は４０ｍＭのＯＧ（ＧＳ−９６）２００μｌで管を洗浄し、中味をマイクロタイタープレートに移した。
【０１９２】
マイクロタイタープレート内で４０ｍＭのＯＧの中で２００μｌの指標濃度標準を調製した。
【０１９３】
適切な波長、励起４１１ｎｍ、発光４４２ｎｍ（ペリレン）；励起５５３ｎｍ、発光５９２ｎｍ（ＧＳ−９６）で、螢光計／平板読取り装置（Tecan Safire）内で９６−ウェル平板を読みとった。濃度標準に基づいて、螢光読取り値を指標濃度に換算した。
【０１９４】
濃度データから分配係数ＣｐＮ及びＣｐＲを以下の通り計算した：
それぞれの相内の指標濃度を、Ｌ（全リポソーム中）、Ａ（管壁に接着）、Ｓ（水相中）と表わす。
【０１９５】
Ｃｐ＝ｆ*（Ｌ−Ｓ）／Ｓ。ｆ*（Ｌ−Ｓ）は膜内の化合物濃度であり、ここでｆは、インキュベーション体積対実際の脂質２重層体積の比である。
【０１９６】
ラフト親和性は、２つの分配係数の割当量、ｒΦ＝ＣｐＲ／ＣｐＮとして計算した。
【０１９７】
脱ラフト化活性を以下の通りに計算した：
【数２】
2008504329.tif 000030
【０１９８】
結果：  アンドロステロン、エピアンドロステロン及びコレステロールがこの試験内で０％を示したことから、本発明に従って脱ラフト化物質はゼロである。それでもＤＬＲＡ検定において、化合物１０ａｃ、１０ａｄ、１０ａｅ、１０ａｆ、１０ａｇ、１０ａｋ、１０ａｌ、１０ｄａ、１０ｄｂ及び１０ｄｃは、それぞれに高い負又は正の値を提供し、対応する調合薬として利用されうる本発明の状況下での脱ラフト化物質としてみなすことができる。特に、１０ａｄは、ペリレンでのＤＬＲＡにおいて、約−１０５％の値、そしてＧＳ−９６では約−６６％の値を提供し、１０ａｅは、約−４３％（ペリレンで）及び−２０％（ＧＳ−９６で）という対応する値を提供し、１０ａｆの評価は−２１７％（ペリレンで）、−７４．７％（ＧＳ−９６で）を結果としてもたらし、１０ａｇは−７１．８％（ペリレンで）及び−１８７％（ＧＳ−９６で）を提供した。同様に、１０ａｌは−２１６％（ペリレンで）、１０ｄａは−７２９％（ペリレンで）、１０ｄｂは−５３６％（ペリレンで）、１０ｄｃは−１３９％（ペリレンで）を提供した。かくして、これらの化合物は増加により脂質ラフトのサイズを増大させる能力を有し、本発明の状況下で脱ラフト化物質とみなされる。これとは対照的に、化合物１０ａｃは、同じ実験環境内でテストされた場合、ペリレンでのＤＬＲＡ内で約＋６８％の値を提供した。従って、化合物１０ａｃは、上述の既定の定義に従った脱ラフト化によりラフト変調を及ぼすことができ、本発明の状況下で同じく脱ラフト化物質とみなされる。
【０１９９】
実施例１５：  ウイルス出芽検定（インフルエンザ検定）
この検定のねらいは、ラフト依存性ウイルス出芽をターゲティングする化合物の同定、及びウイルス繁殖のその他の段階に対する阻害剤の効果と区別することにある。
【０２００】
ウイルス出芽検定の原理
細胞表面上の発生期ウイルス（インフルエンザ）は、感染から６又は１３時間後にパルス−ビオチニル化され、１時間テスト化合物で処理される。ビオチニル化ウイルスは、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレート上で捕捉される。捕捉されたウイルスは、ウイルス特異的な一次及びペルオキシダーゼ標識された二次抗体で検出される。ペルオキシダーゼ基質から生成された螢光シグナルは、ＣＣＤカメラ（ＬＡＳ３０００）で記録される。強度はデンシトメトリによって評価される。
【０２０１】
１００％未満の値がウイルス出芽の阻害を明らかにする。８０％未満、好ましくは７０％未満の値の場合有意であるとみなされ得る。１００％超の値は、未処理の対照中よりも多くのウイルスが放出されることを意味している。これは、さまざまな原因を有し得るウイルス放出の調節の変化を反映している。この場合、１３０％超の値は優位とみなされ得る。これらの値は、その化合物がウイルス複製の検定において阻害性を示す場合、持続することになる。
【０２０２】
ウイルス出芽検定の材料
１．  感染
・  ９６ウェルのプレートＭＤＣＫ１−２ｄ
・  インフルエンザウイルス原料
ＩＭ（感染培地）：ＭＥＭ＋Earle's（Gibco/Invitrogen 21090-022）プラス２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのHepes、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）０．２％。
【０２０３】
２．  ビオチン標識
・  原液：２０％のグルコース（約１Ｍ）、１Ｍのグリシン
・  ＰＢＳ８Ｇ：ＰＢＳｐＨ８、１ｍＭのグルコース、氷冷
・  ビオチン、２０μｇ−１００μｌ（９６ウェル平板のウェルあたり）、１ｍｇのビオチン／５ｍｌのＰＢＳ８Ｇ、氷上で調製されたばかりのもの。
・  急冷媒質（１Ｍ、１０ｍＭのグリシン）、氷冷。
【０２０４】
３．  追跡及び収獲
・  平板Ｔシフト及びテスト化合物希釈のためのアルミニウムサーモブロック
・  ＩＭ＋／−テスト化合物、３７℃
・  ＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩溶液ｐＨ７．４、１０ｍＭトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ）；ＴＢＳ+++＝ＴＢＳプラスプロテアーゼ阻害物質；希釈５％トリプシン阻害物質１：２５０、２００ｍＭのＡＥＢＳＦ１：２００及び１ｍｇ／ｍｌのアプロチニン１：１００。
・  氷冷９６ウェル平板（Ｖ底）及びMultifuge １−Ｓ−Ｒ（Heraeus）遠心分離機のＭＰ３３００マルチウェル平板回転子、２℃。
【０２０５】
４．  捕捉
・  ストレプトアビジンコーティングされた９６ウェル平板Reacti-Bind TM  ストレプトアビジンＨＢＣ（Pierce 15500）。
【０２０６】
ウイルス出芽検定方法概略
１．  感染及びノイラミニダーゼ処理
２×２００μｌのＩＭでウェルを洗浄する。３７℃で３０分間、細胞１個あたり０．５〜２感染性単位という感染多重度でＩＭ内に希釈された１００μｌのウイルスで感染させる。接種材料を除去し、１５０μｌのＩＭで交換する。
・  感染後（ｐ．ｉ．）６〜１３時間インキュベートする。
【０２０７】
２．  ビオチニル化
・  氷上に平板を置き、０．２０ｍｌの氷冷ＰＢＳ８Ｇで４回洗浄する。
・  １ウェルあたりＰＢＳ８Ｇ中０．１のビオチニル化溶液を添加する。
・  冷蔵庫内で氷上で１２分間揺動させる。
・  氷上で０．２５ｍｌの急冷培地で５回洗浄する。
【０２０８】
３．  出芽／追跡
・  プレートを予熱されたアルミニウムブロックに移す。
・  最後の洗浄液を１２５μｌの予め温めた培地＋／−テスト化合物（すなわち上述のＤ−ＬＲＡにおいて「脱ラフト化物質」、「脱ラフト化化合物」とみなされたテスト対象化合物）。
・  ブロック上の平板を３７℃で１時間インキュベータに戻す。
【０２０９】
４．  収獲
・  氷上に置く。
・  氷上で５０μｌのＴＢＳ＋＋＋（１：１希釈）の入ったＶ底遠心分離平板に５０μｌのオーバーレイを移す。
・  平板を３０分間２℃、４４００ｒｐｍで遠心分離する。
・  代替的な等価プロトコル：オーバーレイをMillipore（ＭＳＤＶＳ６５１０）透明ろ過平板ＭＳＨＴＳTMＤＶ、０．６５μｍ親水性低タンパク質結合に移し、Nunc検定平板内へと１分間１５００ｇで遠心分離する。
【０２１０】
５．  捕捉
・  ２００μｌのＴＢＳ／０．１％のTweenで３回、ＴＢＳで１回洗浄することにより、ストレプトアビジンでコーティングされた平板を調製する。
・  ５０μｌのウイルスオーバーレイ上清を捕捉用平板に移す。
・  ３７℃で２時間又は４℃で一晩、ロッカー上で捕捉する。
【０２１１】
６．  検出
・  捕捉用平板に対し、５０μｌのＴＢＳ、４０ｍＭのＯＧを添加し、４℃で２０分間ロッカー上でインキュベートする。
・  ２００μｌのＴＢＳで１回洗浄する。
２００μｌのブロックを添加し、室温で２時間、又は４℃で一晩インキュベートする。
・  室温で１時間、ブロックで１：１０００に希釈された抗ＮＰモノクローナル（ＭＡｂプール５、US Biological 17650-04A）を用いて現像し、３回洗浄する。
・  １時間室温で二次抗体としてウサギ抗マウスペルオキシダーゼ接合体１：２０００を使用し、３回洗浄する。
・  Pierce Super Signal（West-Dura）発光性又は螢光性又は比色分析基質を用いて現像する。
・  ＣＣＤカメラ（ＬＡＳ３０００、Raytest）で撮像し、デンシトメトリで定量化する。
【０２１２】
結果：  ウイルス出芽は１０ａｄを用いることにより６１％まで低減され、一方１０ａｅは約１４０％のウイルス出芽増強を提供したということが例示されている。百分率値は、未処置の対照との関係において示されており、従ってこれらの化合物は、インフルエンザ感染の治療に用いられる薬学組成物の開発用として適切な化合物である。それでも、インフルエンザウイルス繁殖及び感染力検定（以下の例を参照のこと）において見られた効果は、医療環境における本発明で提供される化合物の有用性を実証するために使用されるべきさらなる実験結果である。
【０２１３】
実施例１６：  ウイルス繁殖及び感染力検定（病巣減少検定）
この検定のねらいは、ウイルス複製を阻害するか又はウイルス感染力を低下させる脱ラフト化化合物を同定することにある。
【０２１４】
原理
マイクロタイタープレート上で行なわれ、細胞Elisaとして現像されるという点を除いて従来のプラーク減少検定と等価である、ウイルス滴定条件下の抗ウイルス効果の検定。細胞はテスト化合物希釈物と共に簡単に予めインキュベートされ、次に連続希釈されたウイルスで感染させられる。
【０２１５】
材料
低保留管及びガラス製希釈平板（フード下で乾燥された、７０％のＥｔＯＨからの（Zinsser））。
２台のサーモミキサー、１．５ｍｌ入りエッペンドルフ型及び９６ウェルのブロック
９６ウェル平板ＭＤＣＫ細胞１−２ｄ
既知の力価をもつウイルスアリコート
ＩＭ（感染培地）
トリプシン１又は２ｍｇ／ｍｌ原液、調製されたばかりのもの。
グルタルアルデヒド（Sigma、アンプル、−２０℃で保管されたもの）。
ＰＢＳ中０．０５％（１：５００希釈）、調製されたばかりのもの、１平板につき２５０ｍｌ。
細胞Elisa現像用抗体；Pierce Super Signal（West Dura）基質。
【０２１６】
方法
１．  化合物希釈物
・  ３７℃でテスト化合物を解凍し、必要とあらば超音波分解する。
・  サーモミキサー内で３７℃で低保留管中のＩＭを予熱し、以下の通りにテスト化合物［μｌ］を添加する：
１００μＭ；１０７８＋２２μｌ
５０μＭ；１０８９＋１１μｌ
２５μＭ；１０９４．５＋５．５μｌ
１０μＭ；１０９８＋２．２
・  少なくとも３０分間振とうさせた後、化合物希釈物を、３７℃でサーモミキサーマイクロプレートブロック内で予熱したガラス製の９６ウェル平板の中に移す。
・  ２枚の滴定平板について１枚のガラス平板で充分であり、左半分は、平板１用のテスト培地を収容し、右半分は平板２用のテスト培地を収容する。各ウェルは２５０μｌのテスト培地を収容する（以下の鋳型を参照のこと）。
【０２１７】
２．  感染
・  ＩＭ中に１：６４でウイルスを予備希釈する（６３０μｌ＋１０μｌ）。低温ＩＭ中にウイルスを１：２０００（＝１）で希釈し、次にさらに２つの２倍希釈物を作る。１つの９６ウェル平板用には、３、１．５、１．５ｍｌを調製し、２つの平板用には平板６、３．３ｍｌを調製し、４℃に保つ。
・  トリプシンを検量し、溶液２０μｇ／ｍｌを調製し、０．２μｍの無菌注射器フィルタに通す。次にＩＭ中で４μｇ／ｍｌまで希釈する。
・  感染の直前に１体積のトリプシン（４μｇ／ｍｌ）をウイルス希釈物又はＩＭに（模擬感染のため）添加し、感染まで４℃に保つ。
・  ２００μｌのＩＭで２回単層を洗浄する。
・  マルチチャンネルピペットで１００μｌのテスト化合物又はＩＭ中の溶媒対照を加え、各カラム（２〜１１）が１つのテスト化合物希釈物を含有するようにする。（１及び１２はＩＭを収容し、エッジ効果が最小限である場合さらなる対照として役立てることができる。
・  マルチチャンネルピペットを用いて、列Ａ及びＨ（模擬感染）に１００μｌのＩＭ、２μｇのトリプシン／ｍｌを添加する。その他の列に対しウイルス希釈物を加え、毎回先端部を交換する。各々の付加毎にピペット操作する。
・  ３７℃で１６時間インキュベートする。
・  顕微鏡：模擬感染ウェル内で毒性／細胞形態学／沈殿を査定する。
・  室温で少なくとも２０分間２５０ｍｌの０．０５％グルタルアルデヒドを用いて、平板全体を固定、浸漬／充てんすることで感染を終結させる。
【０２１８】
３．  検出
・  グルタルアルデヒドを振り落としＰＢＳで洗浄する。
・  ５０μｌのＰＢＳ中の０．１％ＴＸ−１００で３０分間、浸透化処理し、ＰＢＳで洗い流す。
・  ＲＴ（室温）で１時間又は４℃で一晩、ＴＢＳ／Tween／１０％ＦＣＳ中でロッカー上で遮断を行なう。
・  ブロックで１：１０００に希釈された抗ＮＰ（ＭＡｂプール５）を用いて、ＲＴで１時間現像し、ＴＢＳ／Tweenで３回洗浄する。
・  約１：２０００のペルオキシダーゼ接合された二次抗マウス抗体を、ＲＴでロッカー上で１時間添加し、ＴＢＳ／Tweenで２回、ＴＢＳで一回洗浄する。
【０２１９】
４．  撮像
・  Super Signal West Dura（Pierce 34076）で現像する。
・  高解像度でＣＣＤカメラＬＡＳ３０００（Fuji/Raytest）で撮像する。フレネルレンズを使用する。
・  模擬感染を受けた対照を背景として用いてデンシトメトリにより定量化する。
【０２２０】
検定結果の定量化
ＭＤＣＫ細胞単層を伴う９６ウェル平板のエッジカラムは、感染を受けていないがテスト化合物で処理されており、デンシトメトリ評価（以下参照）用の背景対照（ウェルａ）として役立つ。３つのさらなるウェルｂ、ｃ及びｄはウイルス希釈物（例えば１：５１２０００、１：２５６０００及び１：１２８０００）での感染を受けており、かくして１：１２８０００希釈物が５０〜１００の病巣を生成するようになっている。適切な希釈物はウイルス滴定によって決定された。
【０２２１】
感染を受けた細胞の病巣は、免疫組織化学的に発達させられる。最初に、１時間又は一晩、ＰＢＳ＋１０％熱不活性化されたウシ胎児血清の混合物（ブロック）を１ウェルあたり２００μＬ用いてロッカー上で全てのウェルを遮断する。この後、ブロックで１：１０００に希釈されたウェルあたり５０μＬの抗体対ウイルス核タンパク質（ＭＡｂプール５、US Biological 17650-04A）での１時間の遮断が続く。ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水）／Tween（０．１％）（ＴＴ）で５分間３回洗浄することによって抗体を除去する。次のインキュベーションは、ブロックで１：２０００希釈されたウェルあたり５０μＬのウサギ抗マウス−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼにカップリングされているもの）での１時間である。最終的に、上述の通りの２回の洗浄と、ＴＢＳで１回の洗浄が行なわれる。
【０２２２】
最後の洗浄液を定量的に除去し、ウェルあたり５０μＬの基質（Pierce 34076）で交換する。平板は、ＬＡＳ３０００ＣＣＤカメラの定焦点フレスネルレンズを通して５〜１０分露光される（高解像度モード）。
【０２２３】
画像はデンシトメトリで評価する。最初に背景が減算される（ウェルａ、以上参照）。デンシトメトリ強度は以下の通りに計算される：
Ｉ＝［０．２５×ｉ（ウェルｂ）＋０．５×ｉ（ウェルｃ）＋ｉ（ウェルｄ）］／１．７５
なお式中、ｉは関係するウェルｂ、ｃ又はｄについて測定された１部域あたりの強度の１００００倍として定義される。この計算は従来のプラーク検定に対応する。因数は個々の値の重みづけを表わす。
【０２２４】
結果は以下の通りに定義される阻害％として表わされる：
阻害％＝１００−対照％
なお対照％は、テスト化合物についての既定のＩに１００を乗じ、適切な溶媒対照についてのＩで除することによって計算される。Ｉが対照つまり溶媒対照である場合、その値は１００％として設定される。
【０２２５】
結果：  ２つの化合物１０ａｅ及び１０ａｆは、上述のＤＬＲＡテストで共に陽性となり、脱ラフト化合物として同定された。ＰＲ８ウイルス複製検定においてその阻害効果を評価した場合、両方共優れた結果を提供した。１０ａｅは１０μＭの濃度でウイルス複製を３２．９％阻害し、一方１０ａｆは５０μＭの濃度で同じプロセスを２７．９％阻害した。かくして、両方の物質共、インフルエンザ感染における薬学的介入のための好ましい化合物である。ＤＬＲＡテストで陽性であったさらに２つの化合物すなわち化合物１０ａｄ及び１０ａｌは、インフルエンザウイルス複製検定の中で特に優れた結果を提供しており、かくして、インフルエンザ感染の治療のために本書に記述されている薬物組成物の中で使用されるためのさらに一層好ましい化合物である。化合物１０ａｄの場合、ＰＲ８ウイルス複製は、溶媒ビヒクル単独に比べ２０μＭの濃度で５９．６％だけ阻害された。１２．５μＭの濃度で化合物１０ａｌを使用した場合、ウイルス複製は５４％だけ阻害され、かくして化合物１０ａｌはインフルエンザ感染の治療のためのさらに一層好ましい化合物となっている。
【０２２６】
実施例１７：  脱顆粒検定
肥満細胞は、過剰アレルギー反応又は喘息のために広く用いられているモデル系である。その表面上で、これらの細胞は、ＩｇＥ（ＦｃεＲＩ）についての高親和性レセプタを発現する。レセプタに対する抗原特異的ＩｇＥの結合時点で、細胞は抗原（アレルゲン）に対し感応性をもつようになる。感作された細胞が多価抗原に遭遇した時点で、ＩｇＥ−ＦｃεＲＩ複合体のクラスタ化が、細胞事象カスケードを開始させ、このカスケードは究極的に脱顆粒、すなわちサイトカイン、エイコサノイド、ヒスタミン及び酵素といったような炎症及び細胞活性化のメディエータの放出を導く。このカスケード内の複数の段階は、ラフトに対するＦｃεＲＩの抗原により誘発された再配置、ＬＡＴのまわりに集合したシグナリング複合体の分断及び／又はホスホイノシチドの転位、Ｃａ2+−流入（血漿膜カルシウムチャンネルのラフト局在化）、膜波打ち運動（Ａｋｔ／ＷＡＳＰ／ＦＡＫが関与する細胞骨格再組織）及びエクソサイトーシスといったようにラフト依存性のものである。従って、該検定は、ラフト変調化合物、特に喘息の医学的管理において有用である化合物を同定するためのスクリーニング方法として使用することができる。特に、ラフト変調化合物の予備選択のためのその他の検定と併せると、該検定は生物学的プロセスにおける介入のためのかかる化合物の有効性を実証するための強力な手段である。
【０２２７】
１．  序
該検定は、多価抗原−ＩｇＥ複合体を用いた高親和性ＩｇＥレセプタ（ＦｃεＲＩ）のクラスタ化に応えたさまざまな予備形成された薬理学的作用物質の放出のマーカーとしてβ−ヘキソサミダーゼの放出を測定する。肥満細胞脱顆粒の一般的に用いられるモデルであるラット好塩基球性白血病（ＲＢＬ−２Ｈ３）細胞が、抗ＤＮＰ特異的ＩｇＥで感作され、多価ＰＮＰ−ＢＳＡで攻撃誘発される。上清内へのβ−ヘキソサニダーゼの放出は、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン及び高螢光メチルウンベリフェロンへの螢光発生基質４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドの酵素的転換によって測定され、Tecan SafireTM平板読取り装置内での螢光検出により定量化される。
【０２２８】
２．  材料
化学物質及び専門試薬
Surfact-Amps X-100溶液はPierce社から、ＤＮＡ−ウシアルブミン接合体（ＤＮＰ−ＢＳＡ）及び４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド（ＭＵＧ）はCalbiochem社から、トリ（エチレングリコール）モノエチルエーテル（ＴＥＧＭＥ）はAldrich社から、DMSO Hybri-Max及びヒトＤＮＰ−アルブミンはSigmaから入手した。全ての細胞培地、緩衝液及び補助物質は、ＰＡＡ研究所（Coelbe、ドイツ）からのものであったウシ胎児血清（ＦＣＳ）を除いてInvitrogenから入手した。その他の試薬は、標準的な実験室品質又はそれ以上の品質のものであった。
【０２２９】
その他の化学物質は、相反する規定のないかぎり、標準的実験室グレード又はそれ以上のものである。
【０２３０】
緩衝液及び溶液
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び１ＭのＨＥＰＥＳは、社内サービス設備により提供された。タイロード緩衝液（ＴｙＢ）は、２ｍＭのGluta MAXTM-I Supplement （Invitrogen）及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳで補足されたフェノールレッドを含まない最小必須培溶液（Invitrogen）で構成されていた。溶菌緩衝液は、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ及び１％（ｗ／ｖ）のTriton X-100から成っていた。ヒトＤＮＰ−ＢＳＡは、Millipore水中で１ｍｇ／ｍｌまで溶解された。ＭＵＧ基質溶液は、２．５ｍＭの４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド０．０５Ｍクエン酸塩、ｐＨ４．５であり、停止溶液は０．１ＭのＮａＨＣＯ3／０．１ＭのＮａ2ＣＯ3、ｐＨ１０であった。
【０２３１】
細胞培養
ドイツ微生物及び細胞培養収集機関（Braunschweig、ドイツ）から入手したＲＢＬ−２Ｈ３細胞を、３７℃でEarleの塩を伴う７０％の最小必須培養液／２０％のＲＰＭＩ１６４０／５％ＣＯ2中の２ｍＭのGluta MAXTM-Iで補足された１０％の熱不活性化されたウシ胎児血清の中に維持し、マイコプラズマ汚染を受けていないことを日常的に検査した。１７５ｃｍ2入りフラスコ内で成長させられた細胞を０．０５％のトリプシン／ＥＤＴＡで分割し、２０ｍｌの新鮮な培地中で再懸濁させた。ウェルあたり１００及び５０μｌの細胞懸濁液を２４ウェルのクラスタ平板（Costar Schiphol-Rijk、オランダ）内に平板固定し、それぞれ平板固体から１日後又は２日後に細胞を使用した。
３．  β−ヘキソサミニダーゼ放出の測定
方法
テスト化合物でのインキュベーションより２〜２４時間前に、培地を除去し、細胞を新鮮な培地内で０．４μｇ／ｍｌの抗ＤＮＰＩｇＥで感作させた。感作の後、細胞を温かいＴｙＢで一回洗浄し、最大１００μＭ又は最高非毒性濃度（合計ビヒクル濃度は１％に調整）のテスト化合物又はＴｙＢ中の１％のビヒクルと共に３７℃で６０分間インキュベートした。ＤＮＰ−ＨＳＡ（０．１μｇ／ｍｌの最終濃度）又は緩衝液単独を添加し、３７℃で１５分間細胞をインキュベートした。２５０×ｇで５分間４℃にて平板を遠心分離に付し、直ちに氷に移した。上清を収集し、細胞を溶菌緩衝液で溶解させた。上清及び溶解物中のヘキソサニダーゼ活性を、３０分間３７℃で９６ウェル平板内で１００μｌのＭＵＧ基質溶液と共に２５μｌのアリコートをインキュベートすることによって測定した。１５０μｌの停止溶液を添加することによって反応を終結させた。３６５ｎｍの励起及び４４０ｎｍの発光環境でTecan SafireTM平板読取り装置内で螢光を測定した。
【０２３２】
検定結果の定量化
少なくとも３つの独立した実験においてデュプリケートで各化合物をテストする。以下の公式を用いて、非特異的放出（抗原の付加無しの放出）を差し引いた後、β−ヘキソサミニダーゼ放出を計算する：
脱顆粒％＝１００×ＲＦＵ上清／ＰＦＵ溶解物
【０２３３】
対照との関係におけるβ−ヘキソサミニダーゼ放出の阻害は以下のように計算される：
阻害％＝１００×（１−（ＲＦＵ化合物上清／ＲＦＵ対照の上清））
【０２３４】
独立した実験からのＣＴＢ内在化のための値は平均化され、標準偏差（ＳＤ）が１５％以下である場合受容される。
【０２３５】
結果：  ＤＬＲＡにおいてテストされ陽性であった化合物の１つ、すなわち化合物１０ａｌは、脱顆粒検定において特定の優れた結果を提供しており、従って、喘息及び関係する免疫疾患の治療について本書で記述されている薬物組成物の中で使用されるべき好ましい化合物である。化合物１０ａｌの場合、β−ヘキソサミニダーゼの放出は、溶媒ビヒクル単独に比べて１００μＭの濃度で６１％だけ阻害された。
【０２３６】
実施例１８：  シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）検定
シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）の摂取は、細胞内に進入するためにラフトドメインを利用するさまざまな細菌及びウイルスによる感染についてのモデルである（Pelkmans (2002) Science 296, 535-539）。さらに詳細には、ＳＶ４０はカベオラ媒介型エンドサイトーシスの時点でカベオソームを介して（Pelkmans (2001) Nature Cell Biol. 3, 473-483）、ならびに非カベオラ脂質ラフト媒介型エンドサイトーシスにより（Damm (2005) J. Cell Biol. 168, 477-488）小胞体に輸送される。
【０２３７】
本書に記述されたＳＶ４０検定は、カベオラ取込み、エンドサイトーシス及び早期細胞内トラフィキングの段階での細菌又はウイルス感染を阻害することのできる化合物のためのスクリーンとして使用される。この機序は特に、呼吸器合胞体ウイルス、コロナウイルス（例えばＳＡＲＳ又は上気道感染をひき起こすもの）及び結核を導くマイコバクテリウム種による感染に、特に関係するものである。
【０２３８】
これとは対照的に、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、早期及び晩期エンドソーム内へのクラスリン媒介型エンドサイトーシスを介して細胞に進入する（Sieczkarski (2003) Traffic 4, 333-343）。かくして、本書に記述されているＶＳＶ検定は、カベオラ／脂質ラフト媒介型エンドサイトーシスとは独立した機序を介して細胞内に入ることのできる化合物を明らかにする概念実証カウンタスクリーン（counterscreen）として役立つ。
【０２３９】
細胞培養
ＨｅＬａ細胞をＤＳＭＺ、Braunschweigから入手し、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ；PAN Biotech, GmbH）、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１％のペニシリン−ストレプトマイシンで補足されたフェノールレッド無しのＤ−ＭＥＭ培地（Gibco BRL）の中に維持した。細胞を５％の二酸化炭素中で３７℃でインキュベートした。細胞数をＣＡＳＹ細胞計数器（Schaerfe Syotem GmbH）で決定し、Multidrop 384ディスペンサ（Thermo）を用いて播種した。化学化合物を添加する前日に９６ウェル平板（Greiner）の中でウェルあたり次の細胞数を播種した（１００μＬの培地中）：ＶＳＶ、即刻、ウェルあたり細胞１００００個；ＳＶ４０、即刻、ウェルあたり細胞７５００個。
【０２４０】
スクリーン
化合物溶解度に応じて、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、トリエチレングリコールモノエチルエーテル（ＴＥＧＭＥ）又はＤＭＳＯ３０％とＴＥＧＭＥ７０％の混合物を用いて３枚のマスター平板を調製した。テスト化合物の濃度は３０ｍＭであった。物質を９６ウェルのガラス平板（１００μＬ：６×９フォーマット）内に移し、細胞に添加する前に１：１００で希釈した。
【０２４１】
スクリーンを細胞毒性及び機能的部分に分け、かくして物質の非毒性濃度を確保するため毒性プロファイル（アデニラート／キナーゼ放出、生／死検定及びアポトーシス検定）を実施した。結果に従って、物質を対応する溶媒で希釈した。スクリーンをトリプリケートで実施し、全ての検定について物質の最終濃度で２回反復した。
【０２４２】
マスター平板を−２０℃で保管した。作用液の調製のためには、ライブラリ含有平板を３７℃で霜取りした。血清無しでＤ−ＭＥＭ培地中で物質を希釈した。細胞から培地を除去し、トリプリケート平板の各々に対して作用液を添加した。成長対照培地を添加し、各検定のための付加的な特異的対照を適用した。最終的に、血清を細胞に供給し、５％の二酸化炭素を含有する雰囲気中で３７℃で平板でインキュベートした。
【０２４３】
ＶＳＶ感染検定
約５０％の感染細胞を発生させた濃度で細胞に対し物質を添加した後直ちにＶＳＶ−ＧＦＰを添加した。４時間のインキュベーションの後、細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、洗浄し、ＤＲＡＱ５TMで染色した。４８８及び６３３ｎｍのレーザー励起及び液浸２０倍対物レンズを用いて、自動共焦点螢光顕微鏡ＯＰＥＲＡ（Evotec Technologies GmbH）での顕微鏡分析を実施した。完全に自動的に、ウェルあたり１０個の画像を撮り、細胞合計数（ＤＲＡＱ５）及び感染細胞数（ＶＳＶ−ＧＦＰ）を自動画像解析により決定し、トリプリケートについての平均及び標準偏差を計算した。ＶＳＶ感染核の数を合計核数（ＤＲＡＱ５染色済み）で除し、それに１００％を乗じることによって、ＶＳＶ感染（百分率で）を計算した。計算値は、未処理細胞の百分率として表わされる。
【０２４４】
ＳＶ４０感染検定
細胞への物質添加の後直ちに野生型ＳＶ４０ウイルスを加えた。３６時間のインキュベートの後、細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、洗浄し、ＤＲＡＱ５TMで染色した。Ｔ−抗原発現を検出するために、Alexa Fluor 488に直接接合されたモノクローナル抗体を使用した。４８８及び６３３ｎｍのレーザー励起及び液浸２０倍対物レンズを用いて、自動共焦点螢光顕微鏡ＯＰＥＲＡ（Evotec Technologies GmbH）での顕微鏡分析を実施した。完全に自動的に、ウェルあたり１０個の画像を撮り、細胞合計数（ＤＲＡＱ５）及び感染細胞数（ＳＶ４０Ｔ−抗原に結合されたモノクローナル抗体）を自動画像解析により決定し、トリプリケートについての平均及び標準偏差を計算した。ＳＶ４０感染核の数を合計核数（ＤＲＡＱ５染色済み）で除し、それに１００％を乗じることによって、ＳＶ４０感染（百分率で）を計算した。計算値は、未処理細胞の百分率として表わされる。
【０２４５】
結果を定量化
ＳＶ４０検定の粗データは、９６ウェル平板のウェル毎に決定されたうまく感染を受けた細胞及び合計細胞の計数である。（合計細胞はＤＲＡＱ５により染色され、一方感染細胞は上述にように、発現されたＳＶ−４０Ｔ−抗原の特異的免疫−組織化学染色によって計数される）。まず第１に、以下の要領で、感染細胞対合計細胞の比が決定される。
【０２４６】
各々の個々の検定において、１つのテスト化合物あたり３枚の平行平板上の３つのウェルが評価され、感染細胞対合計細胞の比が平均され、標準偏差が決定される。その後、データは百分率に変換される：対照又はＳＶ対照は１００％に設定され、各テスト化合物についてのデータは、適切なＳＶ対照との関係における百分率値に変換される。各テスト化合物は、２回又は３回の独立した検定に付される。個々の独立した検定の対照％及び標準偏差％として、平均対照％及び標準偏差％が決定される。最後に、以下の公式を用いて阻害値が計算される；
阻害％＝１００−対照％
【０２４７】
結果：  生物物理学的ＤＬＲＡでテストして陽性でありかくして脱ラフト化合物として同定された化合物のうちの４つ、１０ａｄ、１０ａｃ、１０ａｆ及び１０ｄａが、ＳＶ４０感染検定におけるその阻害効果について評価された。これらの化合物は優れた結果を提供した。１０ａｄは、３０μＭの濃度で１５．２％だけＳＶ４０感染を阻害し、一方１０ａｃは、溶媒に比べ３０μＭの濃度で１２．９％だけ同じプロセスを阻害した。同様にして、化合物１０ａｆは１８．９％（３０μＭで）だけ感染を阻害し、化合物１０ｄａは２９．６％（１５μＭで）阻害した。かくして、これらの化合物は、上述のウイルス及び細菌感染の場合における薬学的介入のための好ましい化合物である。ＤＬＲＡでテストして陽性であった化合物のうちもう１つのもの、すなわち化合物１０ｄｂは、ＳＶ４０検定において特に優れた結果を提供し、かくして、ＳＶ４０検定がウイルス又は細菌摂取についてのモデルとして役立ち得る、ウイルス又は細菌感染によってひき起こされる疾患の治療のための本書で記述された薬物組成物において使用されるべき、より好ましい化合物である。化合物１０ｄｂは、溶媒ビヒクル単独に比べ３０μＭの濃度で５２．２％だけＳＶ４０感染を阻害した。顕著なことに、ＶＳＶカウンタスクリーン内で化合物１０ａｃ、１０ａｄ、１０ａｆ、１０ｄａ及び１０ｄｂをテストした場合、ウイルス感染に対する阻害効果は全く観察されず、かくして本発明で記述されている化合物の作用様式について本書で提供された作業仮説が証明された。
【０２４８】
実施例１９：  ＨＩＶ検定
ＨＩＶ感染によりひき起される後天的免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療のために用いられる薬物組成物の開発のためのその特異的有用性を評価するために、化合物を、ＨＩＶ−１菌株ＮＬ４−３（実験室適合されたＢ型菌株）によるＨｅＬａＴＺＭ細胞の感染の阻害についてテストした。ＴＺＭは、ＨＩＶ−１ＬＴＲ駆動されたルシフェラーゼリポータ遺伝子を含むＣＤ４−陽性でＨＩＶ感染可能なＨｅＬａ誘導体である。ＨＩＶ感染は、ルシフェラーゼ発現を誘発するウイルストランスアクチベータＴａｔの産生を導き、かくしてルシフェラーゼ活性を感染細胞について評定するのに使用することが可能である。
【０２４９】
テスト化合物は、化合物溶解度に応じてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、トリエチレングリコールモノエチルエーテル（ＴＥＧＭＥ）又はＤＭＳＯ３０％とＴＥＧＭＥ７０％の混合物中の溶液として提供された。これらの原液中のテスト化合物の濃度は３ｍＭであった。
【０２５０】
全ての検定はデュプリケートで実施された。収獲の前に、細胞を可視的細胞毒性効果について顕微鏡検査により分析した。
【０２５１】
一般に、ＨＩＶ−１、ＮＬ４−３での感染は、約５０００〜１０，０００の任意光単位を導いたが、実験及び溶媒の使用に応じて幾分か変動した。ウイルスを全く含まない溶媒対照及びＰＢＳ対照は、１００〜２００の任意光単位を生成した。
【０２５２】
一日目に、ウェルあたり５００００前後のＴＺＭ細胞を、４８ウェル平板内に播種した。翌日、３７℃で化合物を解凍し、手短かにボルテックス処理し、組織培養細胞に加える直前に細胞培地内で１：１００に希釈した。１４８μＬのＤＭＥＭ（１０％のＦＣＳ及び抗生物質を含有する）に対して２μＬの化合物溶液を加え、混合した。培地をＴＺＭ細胞から除去し、１５０μＬの化合物含有培地を添加した。その後、５％の二酸化炭素を含有する雰囲気内で３７℃で２４時間細胞をインキュベートした。（１０％のＦＣＳ及び抗生物質を含有する）ＰＲＭＩ１６４０培地中の５０μＬのウイルス（ＨＩＶ−１、ＮＬ４−３菌株に感染したＭＴ−４細胞から産生されたもの）を添加し、５％の二酸化炭素を含有する雰囲気内で３７℃で２４時間細胞をインキュベートした。３日目に、培地を除去し、細胞をＤＭＥＭで一回洗浄し、１００μＬのＤＭＥＭを添加し、その後１００μＬのSteady-Glo基質を添加した。室温で３０〜６０分間細胞をインキュベートし、その後１８０μＬを４８ウェル平板から９６ウェル平板へと移し、ＴＥＣＡＮ平板照度計を用いてルシフェラーゼ活性を測定した（ウェルあたり５ｓ）。ウイルスを伴う及び伴わない溶媒対照の両方が実施された。
【０２５３】
結果の定量化
各検定平板は、各々のテスト化合物と適切な溶媒対照についてのデュプリケートを含む。照度計読取り値を記録するとき、未感染細胞対照の背景は差し引かれる。デュプリケートを平均し、該平均を関係する溶媒対照の平均で除しかつ１００を乗じることにより対照％に換算する。検定を１回又は２回反復し、対照％を２つ又は３つの独立した検定から平均することにより、最終的結果を決定した。
【０２５４】
最終的に、阻害値を以下の公式を用いて計算する：
阻害％＝１００−対照％
【０２５５】
結果：  最初のＤＬＲＡでテストして陽性でありかくして脱ラフト化合物として同定された３つの化合物すなわち、１０ａｋ、１０ｄａ及び１０ｄｂが、ＨＩＶ感染検定において評価された。これらは優れた結果を提供した。１０ａｋは、３０μＭの濃度で２３％だけＨＩＶ感染を阻害し、一方１０ｄａは、溶媒に比べ３０μＭの濃度で１８％だけ同じプロセスを阻害した。同様にして、化合物１０ａｂは２７％（３０μＭで）だけ感染を阻害した。かくして、これらの化合物は、ＡＩＤＳの場合における薬学的介入のための好ましい化合物である。ＤＬＲＡでテストして陽性であったさらなる化合物、すなわち化合物１０ｄｃは、ＨＩＶ検定において特に優れた結果を提供し、かくして、ＡＩＤＳの治療のための本書で記述された薬物組成物において使用されるべき、より好ましい化合物である。化合物１０ｄｃは、溶媒ビヒクル単独に比べ３０μＭの濃度で３８％だけ既定の実験環境内でＨＩＶ感染を阻害した。
【国際調査報告】
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