(57)【要約】  被験者における２型糖尿病、代謝症候群、準臨床的アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、卒中または糖尿病の臨床症状を発症する感受性を診断するまたは予知する方法およびキット。該方法は、その被験者からの血液試料中の小型稠密低密度リポタンパク質（ｓｄＬＤＬ）粒子上の一つまたは複数の結合したタンパク質（アポＣIII、アポＣＩ、アポＡＩまたはアポＥ）の量を検出し且つ定量することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における２型糖尿病、代謝症候群、準臨床的アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、卒中または糖尿病の臨床症状を発症する感受性を診断するまたは予知する方法であって、該被験者からの血液試料中の小型稠密低密度リポタンパク質（ｓｄＬＤＬ）粒子上の一つまたは複数の結合したタンパク質の量を検出し且つ定量することを含む方法。
【請求項２】
疾患状態が、ｓｄＬＤＬに結合したタンパク質の量およびタイプによって被験者について決定されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法を、前記血液試料から分離された血清について行う、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ｓｄＬＤＬ粒子を含有する画分を、前記血清から分離する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ｓｄＬＤＬ粒子上の一つまたは複数の結合したタンパク質の量を、健康な対照被験者から定量された量と比較する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ｓｄＬＤＬ粒子上の一つまたは複数の結合したタンパク質の量の検出および定量化を、表面増強レーザー脱離イオン化（Surface Enhanced Laser Desorption Ionization）（ＳＥＬＤＩ）分析によって行う、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ｓｄＬＤＬ粒子を、密度勾配超遠心分離を行うことによって血液または血清から単離する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
密度勾配超遠心分離を、Ｄ２Ｏ中で調製された緩衝液で行う、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ｓｄＬＤＬ粒子を、動脈血プロテオグリカン溶液での血清からのｓｄＬＤＬ粒子の沈殿によって分離する、請求項３〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記結合したタンパク質が、アポリポタンパク質ＣIII、アポリポタンパク質ＣＩ、アポリポタンパク質Ａ１およびアポリポタンパク質Ｅから成る群より選択される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ｓｄＬＤＬ粒子に結合した一つまたはそれを超えるタンパク質の、対照被験者の場合に相対して増大した量が、被験者が２型糖尿病に罹患しているかどうかを示している、請求項５〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ｓｄＬＤＬ粒子に結合した一つまたはそれを超えるタンパク質の、対照被験者の場合に相対して低下した量が、被験者が２型糖尿病に罹患しているかどうかを示している、請求項５〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ｓｄＬＤＬ粒子に結合したアポリポタンパク質ＣＩおよび／またはアポリポタンパク質Ａ１および／またはアポリポタンパク質Ｅの量を、健康な対照被験者と比較して低下させ、そしてｓｄＬＤＬ粒子に結合したアポＣIIIの量を増大させる、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
臨床試験のために患者を選択するためのバイオマーカーとしての、ｓｄＬＤＬ粒子上に結合した一つまたは複数のタンパク質のタイプおよび量のプロフィール作成方法の使用。
【請求項１５】
被験者の薬理学的介入の結果の評価用のバイオマーカーとしての、該被験者のｓｄＬＤＬ粒子上に結合した一つまたは複数のタンパク質のタイプおよび量のプロフィール作成方法の使用。
【請求項１６】
アポタンパク質ＣＩおよびアポタンパク質ＣIIIの組合せを用いる、請求項１４または請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
アポタンパク質ＣＩ、アポリポタンパク質Ａ１、アポリポタンパク質Ｅおよびアポタンパク質ＣIIIの組合せを用いる、請求項１４または請求項１５に記載の使用。
【請求項１８】
健康な対照被験者と比較して、ｓｄＬＤＬ粒子に結合したアポＣＩの量を減少させ、そしてｓｄＬＤＬ粒子に結合したアポＣIIIの量を増加させる、請求項１４〜１５のいずれかに記載の使用。
【請求項１９】
健康な対照被験者と比較して、ｓｄＬＤＬ粒子に結合したアポリポタンパク質ＣＩおよび／またはアポリポタンパク質Ａ１および／またはアポリポタンパク質Ｅの量を減少させ、そしてｓｄＬＤＬ粒子に結合したアポＣIIIの量を増加させる、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
被験者における２型糖尿病、代謝症候群、準臨床的アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、卒中または糖尿病の臨床症状を発症する感受性を診断するまたは予知する診断用キットであって、ｓｄＬＤＬ粒子上に結合したタンパク質を検出し且つ定量することが可能なタンパク質チップを含むキット。
【請求項２１】
前記チップを、カップリングした動脈血プロテオグリカンと一緒に提供する、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記チップを、ｓｄＬＤＬに結合したタンパク質の直接的決定に用いる、請求項２０〜２１に記載のキット。
【請求項２３】
動脈内膜中間厚み（arterial intima media thickness）を予測する方法であって、被験者からの血液試料中の小型稠密低密度リポタンパク質（ｓｄＬＤＬ）粒子上の一つまたは複数の結合したタンパク質の量を検出し且つ定量することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験者における２型糖尿病、代謝症候群、準臨床的アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、卒中または糖尿病の臨床症状を発症する感受性を診断するまたは予知する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管内膜のプロテオグリカン層中のＬＤＬ（低密度リポタンパク質）粒子の閉じ込めおよび修飾は、アテローム発生における臨界的初期段階であると考えられる。ＬＤＬと、アテローム発生性の原因となるものを含めた他の巨大分子および細胞との大部分の相互作用は、粒子表面において暴露される交換不能なアポＢ１００のセグメントによって制御される。（Chan L, J Biol Chem 1992;267:25621-25624; Camejo G, et al, Pathological significance 1998;139:205-222）。交換可能なアポリポタンパク質およびタンパク質は、ＬＤＬ表面に吸着した時に、若干のこれら相互作用をモジュレーションすることができると考えられる。１．０１９〜１．０６３の密度を有する操作上定義されたリポタンパク質クラスは、サイズ、脂質およびアポリポタンパク質組成が異なる粒子の集合である（Alaupovioc P, Methods Enzymol 1996;263:32-60）。増大したレベルの低分子稠密ＬＤＬ（small dense LDL：ｓｄＬＤＬ）サブクラスは、冠状動脈疾患進行に強く関連しているので、これは、インスリン抵抗性および２型糖尿病のアテローム発生性異常脂肪血症のマーカーとして考えられてきた（Krauss RM, World Rev Nutr Diet 1997;80.22-43;  Taskinen MR, Diabetologia, 2003;46:733-749）。更に、ｓｄＬＤＬの有病率は、症状発現前の大腿および頸動脈のアテローム性動脈硬化症を有する被験者において高い（Hulthe J, et al, Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 2000;20:2140-2147）。いくつかの仮説が、ｓｄＬＤＬのアテローム発生性を説明するために考えられた。これら粒子は、in vitro の動脈血プロテオグリカン（ＰＧ）への増加した親和性を有するので、いったんそれらと会合すると、より大きい一層浮遊性のＬＤＬよりも、酵素的および酸化的過程によって容易に修飾可能になる（Camejo G, et al, Pathological significance 1998;139:205-222; Hurt-Camejo E, et al,  Journal of Lipid Research 1990;31:1387-1398）。
【０００３】
浮遊性ＬＤＬ（大型）〜より稠密なＬＤＬ（低分子）へと、粒子の脂質組成および表面特性が徐々に変化している。粒子表面におけるリン脂質およびフリーコレステロールの減少は、アポＢ−１００のアポＢ／Ｅ受容体への親和性を修飾するそのセグメントの暴露の変化に関連している。このような変化は、プロテオグリカン結合に関与している３３５９〜３３６９（Ｂ部位）および３１４５〜３１５７（Ａ部位）の配列が、受容体結合にも関与していることから（Chan L, J Biol Chem 1992;267:25621-25624）、プロテオグリカンへのｓｄＬＤＬの一層大きい親和性を部分的に説明することもできる。これは、表面におけるこれら正の配列が、一層接近し且つ一層暴露された状態になることから、ｓｄＬＤＬは、ＰＧへのより高い親和性を有するという仮説を導いた（Camejo G, et al, Pathological significance 1998;139:205-222; Hurt-Camejo E, et al,  Journal of Lipid Research 1990;31:1387-1398）。
【０００４】
ＬＤＬ中の高いアポリポタンパク質ＣIII（アポＣIII）含有率は、この表現型を有する被験者が、ＬＤＬ−コレステロール値とは無関係に、低いＬＤＬ中アポＣIII含有率を有する被験者よりもはるかに高い心臓血管イベントのリスクがあることから、多くの注意が払われている（Lee S-J, et al, Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003;23(5):853-858; Lee S-J, et al., Am J Cardiol 2003;92(2):121-124）。アポＣIIIは、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）中のトリグリセリドの加水分解を阻害することにより、高トリグリセリド血症を引き起こすが、それが、ＬＤＬのアテローム発生性を増加させなければならない理由は不明である。最近になって、ＬＤＬと会合した時のアポＣIIIは、動脈血プロテオグリカンへのリポタンパク質親和性を増加させるということが分かった（Olin-Lewis K, et al, J Lipid Research 2002;43(11):1969-1977）。
【０００５】
ＷＯ２００４／０８５９９６号は、被験者が心臓血管性、代謝性または加齢性の疾患を発症する可能性を決定するために、被験者の血漿からの高密度ＨＤＬおよびＬＤＬのサイズおよびレベルを使用する方法を開示している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、被験者における２型糖尿病、代謝症候群、準臨床的アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、卒中または糖尿病の臨床症状を発症する可能性を容易に決定できるまたは予測できることである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この目的は、被験者における２型糖尿病、代謝症候群、準臨床的アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、卒中または糖尿病の臨床症状を発症する感受性を診断するまたは予知する方法であって、その被験者からの血液試料中の小型稠密低密度リポタンパク質（ｓｄＬＤＬ）粒子上の一つまたは複数の結合したタンパク質の量を検出し且つ定量することを含む方法を提供することで解決された。
本発明の別の側面により、臨床試験のために患者を選択するためのバイオマーカーとしての、ｓｄＬＤＬ粒子上に結合した一つまたは複数のタンパク質のタイプおよび量のプロフィール作成方法の使用を提供する。
【０００８】
本発明の更に別の側面により、被験者の薬理学的介入の結果の評価用のバイオマーカーとしての、その被験者のｓｄＬＤＬ粒子上に結合した一つまたは複数のタンパク質のタイプおよび量のプロフィール作成方法の使用を提供する。
【０００９】
本発明のもう一つの側面により、被験者における２型糖尿病、代謝症候群、準臨床的アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、卒中または糖尿病の臨床症状を発症する感受性を診断するまたは予知する診断用キットであって、ｓｄＬＤＬ粒子上に結合したタンパク質を検出し且つ定量することが可能なタンパク質チップを含むキットを提供する。
【００１０】
本発明の別の側面により、動脈内膜中間厚み（arterial intima media thickness）を予測する方法であって、被験者からの血液試料中の小型稠密低密度リポタンパク質（ｓｄＬＤＬ）粒子上の一つまたは複数の結合したタンパク質の量を検出し且つ定量することを含む方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明による方法は、追加の情報を伴うことなく、２型糖尿病の患者の約８０％を識別するのに用いることができる。２型糖尿病の患者からの低分子稠密ＬＤＬと会合したタンパク質について記載された具体的なプロフィールは、サイズ評価単独によって与えられるもの以上に、この疾患に関連したアテローム発生性ＬＤＬの生化学的特徴についての追加の情報を与える。これらバイオマーカーは、異常脂肪血症／糖尿病／アテローム性動脈硬化症の患者におけるＩ〜III相試験の患者選択に、そして更には、薬理学的介入の結果の評価に有用であるはずである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、被験者における２型糖尿病、代謝症候群、準臨床的アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、卒中または糖尿病の臨床症状を発症する感受性を診断するまたは予知する方法であって、その被験者からの血液試料中の小型稠密低密度リポタンパク質（ｓｄＬＤＬ）粒子上の一つまたは複数の結合したタンパク質の量を検出し且つ定量することを含む方法を提供する。
【００１３】
好ましくは、その方法は、その血液試料から分離された血清について行われる。場合により、ｓｄＬＤＬ粒子を含有する画分を、最初に血清から分離後、一つまたは複数の結合したタンパク質の量の検出および定量化を行う。
【００１４】
小型稠密低密度リポタンパク質（ｓｄＬＤＬ）粒子上の一つまたは複数の結合したタンパク質の量を、健康な対照被験者から定量された量と比較する。これは、試験被験者と同時に対照被験者について行われうるし、またはそれは、病歴対照データでありうる。
【００１５】
一つの態様において、被験者における２型糖尿病の診断または２型糖尿病を獲得する予測；代謝症候群、準臨床的アテローム性動脈硬化症、糖尿病の臨床症状またはアテローム性動脈硬化症の臨床症状（すなわち、心筋梗塞および卒中）の診断のための方法であって、
（ａ）その被験者から血液試料を採取し、その試料の血清を集め、
（ｂ）小型稠密低密度リポタンパク質（ｓｄＬＤＬ粒子）を含有する画分を分離し、
（ｃ）工程（ｂ）より得られた分離されたｓｄＬＤＬ粒子上の一つまたは複数の結合したタンパク質のレベルを検出し且つ定量し、
（ｄ）その一つまたは複数のタンパク質を識別し、そして
（ｅ）健康な対照被験者からのレベルと比較する
という工程を含む方法を提供する。
【００１６】
血液試料は、上の測定の直前に採取されうるが、それは、ずっと以前に問題の被験者から採取され且つ上の測定の前に適当な方法で貯蔵された血液試料でもありうる。
小型稠密低密度リポタンパク質（ｓｄＬＤＬ粒子）を含有する画分の分離は、他の血液成分からのｓｄＬＤＬ粒子の分離について当業者に知られているいずれかの技法を用いて行いうる。それは、例えば、Ｄ２Ｏ中で調製されたものなどの適する緩衝液での密度勾配超遠心分離を行うことによって、または動脈血プロテオグリカン溶液での血清からのｓｄＬＤＬ粒子の沈殿によって行いうる。
【００１７】
検出は、１Ｄゲル電気泳動を用いて行うことができる。検出および定量化は、免疫検定法によって行うことができる。好ましくは、ｓｄＬＤＬ粒子上の一つまたは複数の結合したタンパク質の量の検出および定量化は、表面増強レーザー脱離イオン化（Surface Enhanced Laser Desorption Ionization）（ＳＥＬＤＩ）分析によって行われる。
【００１８】
本明細書中で用いられる「結合した」という用語は、水素結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス力、イオン相互作用などのいずれかの種類の非共有結合方式でｓｄＬＤＬ粒子に結合したタンパク質を包含すると解釈されることを意味する。それらタンパク質は、リポタンパク質粒子の表面上に異なった親和性で保持され、フリープールとのまたは他のリポタンパク質クラスと会合したものとの平衡状態にありうる。
【００１９】
ｓｄＬＤＬ粒子に結合したタンパク質は、アポリポタンパク質ＣIII（アポＣIII）、アポリポタンパク質ＣＩ（アポＣＩ）、アポリポタンパク質Ａ１（アポＡＩ）およびアポリポタンパク質Ｅ（アポＥ）から成る群より選択される一つまたはそれを超えるものでありうるが、ここにおいて、アポＣIIIは、３種類のイソ型として存在し、そしてアポＣＩは、２種類のイソ型として存在する（Pullinger et al., 1997）。
【００２０】
上の方法で推定されるようなｓｄＬＤＬ粒子に結合した若干のタンパク質について、ｓｄＬＤＬ粒子に結合した一つまたはそれを超えるタンパク質の、対照被験者の場合に相対して増大した量は、被験者が、２型糖尿病、代謝症候群、準臨床的アテローム性動脈硬化症、糖尿病の臨床症状またはアテローム性動脈硬化症の臨床症状（すなわち、心筋梗塞および卒中）に罹患しているおよび／またはそれを発症するリスクがあるかどうかを示している。例えば、アポＣIIIのレベルは、健康な被験者と比較して増加する。
【００２１】
上の方法で推定されるようなｓｄＬＤＬ粒子に結合した若干のタンパク質について、ｓｄＬＤＬ粒子に結合した一つまたはそれを超えるタンパク質の、対照被験者の場合に相対して低下した量は、被験者が、２型糖尿病、代謝症候群、準臨床的アテローム性動脈硬化症、糖尿病の臨床症状またはアテローム性動脈硬化症の臨床症状（すなわち、心筋梗塞および卒中）に罹患しているおよび／またはそれを発症するリスクがあるかどうかを示している。例えば、アポＣＩ、アポＡＩおよびアポＥの量は、健康な被験者と比較して減少する。
【００２２】
一つの態様において、ｓｄＬＤＬ粒子に結合したアポＣIIIおよびアポＣＩの組合せを測定し、そしてｓｄＬＤＬ粒子に結合した一つまたはそれを超えるタンパク質の、対照被験者の場合に相対して増大した量は、被験者が、２型糖尿病、代謝症候群、準臨床的アテローム性動脈硬化症、糖尿病の臨床症状またはアテローム性動脈硬化症の臨床症状（すなわち、心筋梗塞および卒中）に罹患しているおよび／またはそれを発症するリスクがあるかどうかを示しているということを明らかにする。
【００２３】
別の態様において、ｓｄＬＤＬ粒子に結合したアポＣIIIおよび／またはアポＡＩおよび／またはアポＥおよび／またはアポＣＩの組合せを測定し、そして２型糖尿病、代謝症候群、準臨床的アテローム性動脈硬化症、糖尿病の臨床症状またはアテローム性動脈硬化症の臨床症状（すなわち、心筋梗塞および卒中）を有するおよび／またはそれを発症するリスクがある被験者において、健康な対照被験者と比較したところ、ｓｄＬＤＬ粒子に結合したアポＣＩおよび／またはアポＡ１および／またはアポＥの量はして低下し、そしてｓｄＬＤＬ粒子に結合したアポＣIIIの量は増大するということを明らかにする。
【００２４】
本発明による方法を用いることにより、ｓｄＬＤＬ粒子に結合したアポＣIII、アポＣＩ、アポＡ１、アポＥまたはこれらタンパク質の組合せの検出および定量化は、臨床試験のために患者を選択するための一つまたは複数のバイオマーカーとして用いることができる。
【００２５】
バイオマーカーは、正常な生物学的過程、病原性過程の測定可能な且つ評価可能な指標として、または例えば、治療薬の投与による治療的介入への薬理学的応答として定義することができる。したがって、ｓｄＬＤＬ粒子に結合したそれらタンパク質各々のまたはそれらタンパク質組合せの推定レベルは、異常脂肪血症および／または糖尿病および／またはアテローム性動脈硬化症の患者においてバイオマーカーとして機能するであろうし、したがって、Ｉ〜III相試験に適する被験者の選択のための優れた手段を与える。ｓｄＬＤＬ粒子に結合した上のタンパク質の推定レベルは、その被験者の薬理学的介入の結果の評価のために患者を選択するのに用いることもできる。
【００２６】
したがって、被験者のｓｄＬＤＬ粒子上に結合した一つまたは複数のタンパク質のタイプおよび量のプロフィール作成方法の使用は、その被験者の薬理学的介入の結果の評価のためにまたは臨床試験のために患者を選択するためのバイオマーカーとして用いることができる。アポＣＩおよびアポＣIIIの組合せを用いることができる。一つの態様において、ｓｄＬＤＬ粒子に結合したアポＣＩの量は、健康な対照被験者と比較して減少し、そしてｓｄＬＤＬ粒子に結合したアポＣIIIの量は増加する。更に、アポＣＩおよび／またはアポＡ１および／またはアポＥおよび／またはアポＣIIIの組合せを用いることができる。一つの態様において、ｓｄＬＤＬ粒子に結合したアポＣＩ、アポＡ１およびアポＥの量は、健康な対照被験者と比較して減少し、そしてｓｄＬＤＬ粒子に結合したアポＣIIIの量は増加する。
【００２７】
本発明は、更に、被験者における２型糖尿病、代謝症候群、準臨床的アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、卒中または糖尿病の臨床症状を発症する感受性を診断するまたは予知する診断用キットであって、ｓｄＬＤＬ粒子上に結合したタンパク質を検出し且つ定量することが可能なタンパク質チップを含むキットに関する。そのチップは、カップリングした動脈血プロテオグリカンと一緒に提供することができる。そのチップは、ｓｄＬＤＬに結合したタンパク質の直接的決定にも用いうる。そのキットは、被験者の状態に関して血液試料から情報を得るために、本発明の方法を実施する容易で且つ迅速な方法を提供するであろう。
【００２８】
本発明は、更に、被験者の動脈内膜中間厚み（arterial intima media thickness）を予測する方法であって（実施例８を参照されたい）、その被験者からの血液試料中の小型稠密低密度リポタンパク質（ｓｄＬＤＬ）粒子上の一つまたは複数の結合したタンパク質の量を検出し且つ定量することを含む方法に関する。
【００２９】
１．０１９ｇ／ｍｌ〜１．０６３ｇ／ｍｌの密度を有する血漿または血清のリポタンパク質は、超遠心分離手順を用いて、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）として操作上定義された（de Lalla, O., and J. Gofman, 1954, p. 459-478, in D. Glick ed., Methods in Biochemical Analysis, vol. 1. Wiley, Interscience, New York）。そのＬＤＬは、１．０１９〜１．０６３ｇ／ｍｌの範囲内の増加する密度を有する重複するサブクラスに部分分別することができる。電気泳動、光散乱、電子顕微鏡法または核磁気共鳴によって評価される、増加する密度と減少するサイズとの間には、強い相関がある（Krauss, R. M., 2004, Diabetes Care 27:1496-1504）。しばしば、１．０１９〜１．０３０ｇ／ｍｌの密度を有するＬＤＬ粒子は、大型で且つ浮遊性であるとみなされるが、１．０３０〜１．０６３ｇ／ｍｌの密度を有するものは、低分子で且つ稠密と称される。現在の研究では、プロテオーム（proteomic）アプローチを用いて、Ｂ表現型を有する二つのタイプの患者と、健康対照における、低分子稠密および大型のＬＤＬ粒子と会合した交換可能なアポリポタンパク質を比較した。一つの患者群は、末梢アテローム性動脈硬化症の準臨床的根拠および多くの代謝症候群の特徴を有した。研究された第二群は、２型糖尿病を有した。プロテオーム評価を、生理的塩類濃度を有するＤ２Ｏ密度勾配での超遠心分離によって単離されたＬＤＬサブクラスに行った。用いられたプロテオーム法は、ＬＤＬサブクラスに結合したタンパク質の、表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（surface enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry）（ＳＥＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ）を用いたプロフィール作成、および引き続きの変化したタンパク質の質量分析（ＭＳ）およびイムノブロッティングによる識別を伴った。得られた結果は、ＬＤＬ密度サブクラスに結合しているアポリポタンパク質アポＣIII、アポＣＩ、ＡｐｏＡＩおよびアポＥを識別した。
【００３０】
この研究の目的は、準臨床的アテローム性動脈硬化症およびＬＤＬ表現型Ｂを有する患者と、２型糖尿病および表現型Ｂを有する患者における、ＬＤＬの浮遊性サブクラスおよび稠密サブクラスが、対合した健康対照の場合とは異なることがありうる結合したアポリポタンパク質の特異的パターンを有するかどうかを調べることであった。第一研究における患者は、ＬＤＬ  Ｂ表現型を有する他に、対照よりも有意に太いウエスト、高い空腹時インスリン、高い空腹時血糖、高いトリグリセリドおよび低いＨＤＬコレステロールを有した（表１）。したがって、それら患者は、代謝症候群のいくつかの成分を共有していた。代謝症候群は、Grundy, et al., 2004, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 24:13e-18 かまたは Isomaa, B., et al., 2001, Diabetes Care 24:683-9 にしたがって定義することができる。
【００３１】
この研究における患者は全て、小または中頸動脈アテローム性動脈硬化症を示し、そしてその内の３人は、大腿斑も示した。対合した対照で、Ｂ表現型を示したものはいなかった（表１）。第二研究における２型糖尿病の患者は、Ｂ表現型の他に、対合した対照よりも太いウエスト、低いＨＤＬコレステロール、高いトリグリセリド、およびはるかに高い頸動脈斑および大腿斑の有病率も有した（表２）。
【００３２】
二つのＬＤＬサブクラスに結合した交換可能なアポリポタンパク質を分析するために、生理的塩類濃度およびｐＨにおいてそれらリポタンパク質を維持した超遠心分離手順を用いた。この手順は、高塩類濃度において超遠心分離で行われるので、循環中のＬＤＬ粒子に結合した交換可能なタンパク質およびアポリポタンパク質の分布を変化させる可能性を最小限にする（MacConathy WM, Koren K, Wieland H et al, Journal of Chromatography 1985;342:47-66）。更に、二つのＬＤＬサブクラスの結合したタンパク質のＳＥＬＤＩ分析によるプロフィール作成、および引き続きの変化したタンパク質ピークのＭＳおよびイムノブロッティングでの識別を含めたプロテオーム手順を行った。このアプローチは、いくつかのアポリポタンパク質の定量的評価および識別を、許容しうる変動係数（１４〜２４％）で可能にした。それら結果は、準臨床的末梢アテローム性動脈硬化症を有する患者、Ｂ表現型を有する患者、および２型糖尿病およびＢ表現型を有する患者における、１．０４０〜１．０６０±０．００５ｇ／ｍｌの密度を有するｓｄＬＤＬサブクラスは、健康対照の同等の画分と比較した場合、アポＣIII（３種類のイソ型）が豊富で、そしてアポＣＩ（２種類のイソ型）、アポＡＩおよびアポＥが激減しているということを示している。更に、高アポＣIIIおよび低アポＣＩを有するｓｄＬＤＬ粒子のパターンは、人体計測法によるまたは臨床的な化学パラメーターについてのいずれか他の補足的情報を必要とすることなく、研究された患者の８０％を識別することを可能にした。
【００３３】
全血漿アポＣIIIおよびそのアポＢ１００含有粒子と会合したものは、特に、代謝症候群に罹患した女性および男性の冠状動脈リスクの強い予兆である（Onat A, et al, Atherosclerosis 2003/5 2003;168(1):81-89）。更に、２型糖尿病および冠状動脈疾患を有する患者の場合、最高のアポＣIIIを有するＬＤＬの四分位数は、新たな冠状動脈イベントの相対リスクを、最低のアポＣIII含有率での四分位数に相対して６倍を超えて増加させる（Lee S-J, et al, Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003;23(5):853-858）。本発明者の結果は、代謝症候群のマーカーを有する患者および２型糖尿病を有する患者の場合、アテローム発生性ｓｄＬＤＬは、アポＣIIIが特に多く、そしてアポＣＩ、アポＡＩおよびアポＥが不足しているということを示している。
【００３４】
低分子で且つ稠密なＬＤＬサブクラスは、トリグリセリドの多い大型ＶＬＤＬの主な異化作用産物であり、最近の根拠は、そのアポＣIII含有率が、その生産速度に関係しているということを示している（Marcoux C, et al, Metabolism 2001;50(1):112-119）。更に、内臓肥満被験者での速度論研究は、トリグリセリドの多いＶＬＤＬ中の高アポＣIII含有率が、その混合過剰生産および低下した異化作用に関係しているということを示した（Chan DC, et al, Metabolism 2002;51(8):1041-1046）。これら結果は、代謝症候群および２型糖尿病を有する研究された患者において、アポＣIIIの豊富な稠密ＬＤＬを生じることができる機構を示唆している。しかしながら、現在の研究では、このような患者の稠密ＬＤＬサブクラス中で認められたアポＣＩ、アポＡＩおよびアポＥの減少した含有率について説明されない。一つの可能性は、大型ＶＬＤＬ中のアポＥについて示されたように、これが、インスリン耐性患者の血漿中のこれらアポリポタンパク質の減少した利用可能性、およびアポＣIIIの多い低分子稠密ＬＤＬ粒子表面のそれらを保持する減少した能力を反映しているということである（Breyer ED, et al, J Lipid Research 1999;40(10):1875-1882）。しかしながら、同様に推論すると、健康対照の稠密ＬＤＬの場合、アポリポタンパク質、すなわち、アポＡＩ、アポＥおよびアポＣＩの高含有率は、粒子ＬＤＬ表面からアポＣIIIを置き換えるということが考えられうる。
【００３５】
ｓｄＬＤＬが、浮遊性粒子よりもアテローム発生性である理由は未だ不明であるが、動脈血プロテオグリカンへのその高親和性は、アテローム発生における重要な第一段階である、動脈内膜中のその保持を増加させうる（Camejo G, et al, Pathological significance 1998;139:205-222）。本発明者の結果は、Ｂ表現型を有するインスリン耐性で且つ２型糖尿病の患者が、アポＣIIIの多いｓｄＬＤＬの高循環レベルを有し、それが、動脈内膜のプロテオグリカンとのその相互作用を増加させうるし、したがって、その現場の酸化的および酵素的修飾を容易にしうるということを示唆している。更に、本発明者の結果は、動脈壁中のＬＤＬをアテローム発生性修飾から保護すると仮定されたアポＡＩについて、このような粒子が不足しているということを示している（Rohrer L, et al, Current Opinion on Lipidology 2004;15(3):269-278）。これら考察に基づいて、インスリン耐性の異常脂肪血症に一般的なＬＤＬのこのクラスは、斑発生の原因の一つでありうるということが考えられうる。このような役割は、ＬＤＬ中の増加したアポＣIIIと、インスリン耐性および２型糖尿病における心臓血管疾患への増大したリスクとの顕著な関連を一部分説明しうる。
【実施例】
【００３６】
ここで、本発明を、次の非制限実施例によってより詳細に強調する。実施例において、対照と患者との間の相違の評価は、両側スチューデントｔ検定で行ったし、そしてｐ＜０．０５を有意とみなした。
【００３７】
実施例１
被験者の選択
第一研究において、ｓｄＬＤＬ（パターンＢ表現型）と、頸動脈の準臨床的アテローム性動脈硬化症を有するが、同時投薬を受けていない１０人の被験者を、代謝症候群のリスク因子（インスリン耐性の指標としての、高インスリン血症を追加したＮＣＥＰ定義）の無い、＜６．５ｍｍｏｌ／ｌの全コレステロールを有する、臨床的心臓血管疾患の無い、準臨床的アテローム性動脈硬化症の無い（頸動脈または大腿動脈中に斑が不存在）、そして投薬を受けていないし且つ臨床的に健康である、年齢・性別が対合した１０人の健康対照と比較した（表１）。
【００３８】
第二研究では、アテローム性動脈硬化症・インスリン耐性研究（Atherosclerosis and Insulin Resistance study）（ＡＩＲ）において、７４人の利用可能な患者より無作為に選択された２１人の２型糖尿病患者を、ＮＣＥＰガイドラインおよびインスリン耐性の指標としての高インスリン血症の追加によって定義の代謝症候群のリスク因子の無い、年齢が対合した２３人の健康対照と比較した（表２）。被験者は全て、３年追跡試験でのＡＩＲ研究より採用した。この研究は、以前にきわめて十分に記載された（Hulthe J, et al, Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 2000;20:2140-2147; Sigurdardottir V, et al., Diabetes Care 2004;27(4):880-884）。参加者全員のＬＤＬ表現型を、以前に記載されたようなゲル勾配電気泳動によって確かめた（Hulthe J, et al, Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 2000;20:2140-2147）。Sahlgrenska University 病院の倫理委員会が、それら研究を承認した。
【００３９】
【表１】
2008538812.tif 000002
【００４０】
【表２】
2008538812.tif 000003
【００４１】
実施例２
ＬＤＬ画分
ＬＤＬ密度サブクラスを、血清試料（１．０〜１．３５ｍｌ）から、以前に記載されたような（Hallberg C, et al., Journal of Lipid Research 1994;35:1-9）異なった量の酸化ジュウテリウム（Ｄ２Ｏ）で調製された、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２−ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Hepes を含有するｐＨ７．２緩衝液の予め形成された勾配中の超遠心分離によって単離した。勾配の上方置換によって画分を集めた。ＬＤＬ画分の全タンパク質含有率は、ＤＣ Protein Assay（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）を製造者の指示にしたがって用いて、ウシ血清アルブミンを標準として決定した。アポＢは、ＬＤＬ画分中において、濁度測定法により、抗ヒトアポＢ抗体（Dakopatts, Denmark）を用いて決定した。全コレステロールは、比色定量によって測定した（Roche Diagnostics, RmBH, Manheim, Germany）。用いられた溶液および遠心分離後の勾配の密度は、重量測定によって決定した（Hallberg C, et al., Journal of Lipid Research 1994;35:1-9）。ＬＤＬサブクラスの直径は、勾配ゲル電気泳動により、本質的には、Krauss and Burke（Krauss RM, et al., Journal of Lipid Research 1982;23:97-104）によって記載のように評価した。
【００４２】
Ｂ表現型を有する被験者および健康対照からの血清のＤ２Ｏ緩衝液中の密度勾配分別プロフィールは、図１に示されている。アポＢプロフィールは、０．５ｍｌ画分を集めて得たが、しかしながら、プロテオーム分析には、引き続きの分析を処理しうる数の範囲内で維持するために、１．０ｍｌの画分を用いた。図１に示されるように、この手順での画分４は、研究１における全ての対照被験者からの最も豊富なＬＤＬサブクラスである、１．０３０〜１．０４０±０．００５ｇ／ｍｌの密度を有するＬＤＬを含有した。このような画分は、サイズ範囲が、Krauss（Krauss RM, Diabetes Care 2004;27(6):1496-1504）のＬＤＬ２ｂ〜ＬＤＬ３ａの範囲のそれにほぼ相当する。画分５は、Krauss（Krauss RM, Diabetes Care 2004;27(6):1496-1504）のＬＤＬ３ｂ〜４ｂの画分のサイズ範囲にほぼ相当する１．０４０〜１．０６０±０．００５ｇ／ｍｌの密度を有するＬＤＬを含有した（図１）。この画分は、研究１で研究されたＢ表現型を有する１０人の被験者の内の８人において、最も豊富なクラスであった。第二研究において、２３人の対照の内の２０人は、画分４で最大値を示したが、２１人の２型糖尿病患者の内の１９人は、画分５で最大値を示した。これら結果は、Ｄ２Ｏ密度勾配が、ゲル電気泳動手順を用いたＬＤＬ表現型分類と相関し、そして双方のタイプの患者においてｓｄＬＤＬの高い有病率を示すということを示している（Hulthe J, et al, Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 2000;20:2140-2147）。
【００４３】
実施例３
ＬＤＬに結合したタンパク質のＳＥＬＤＩ分析
二つの研究において、全被験者からの１．０２０〜１．０４０ｇ／ｍｌの密度のＬＤＬ画分４と、１．０４０〜１．０６０ｇ／ｍｌの密度の画分５を、二つのタイプのタンパク質チップ表面上で分析した。５０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ６．０および５０ｍＭ Tris−ＨＣＬ、ｐＨ９．０をそれぞれ用いたカチオン（ＣＭ１０）およびアニオン（Ｑ１０）タンパク質チップ。試料は全て、タンパク質チップアレイバイオプロセッサー（Ciphergen Biosystems）を使用するように変更された Biomek Laboratory ワークステーション（Beckman-Coulter）を用いて処理した。各２０μｌのＬＤＬ画分を、８０μＬの結合用緩衝液と混合し、その混合物をチップ表面に加え、３０分間インキュベートした。次に、それらスポットをそれぞれ、１００μｌの結合用緩衝液で３回５分間洗浄して、非特異的結合を減少させ、そして最後に、１００μｌの脱イオン水で２回洗浄した。シナピン酸（sinapinic acid）（ＳＰＡ）（Aldrich Chem Co, Milw, WI）およびα−シアノ−４−ＯＨ−ケイ皮酸（ＣＨＣＡ）（Bruker Daltonics, Germany）を含めた二つの異なったタイプのマトリックスを用いた。０．５％ＴＦＡを含有する５０％アセトニトリルを含むＳＰＡ（１：２ｖ／ｖに希釈される）またはＣＨＣＡ（１：５ｖ／ｖに希釈される）の飽和溶液を、各々の乾燥した試料スポットに２回加えて、結晶を形成させた。
【００４４】
次に、それらアレイを、ＳＥＬＤＩ分析用のタンパク質チップリーダーシステム（ＰＢＳII，Ciphergen Biosystems）で読み取った。そのリーダーは、ＳＰＡ／ＣＨＣＡマトリックス中で希釈された全て込みのタンパク質／ペプチド標準を用いて外部的に検量し、そして順相タンパク質チップ（ＮＰ−２０タンパク質チップアレイ）のスポット上に直接的に適用した。タンパク質プロフィール比較は、一つの実験で集められた全てのスペクトルの全イオン電流の規格化後に行った。有意性閾値は、ｐ＜０．０５に設定した。
【００４５】
ＬＤＬサブクラスに結合したタンパク質を、ＳＥＬＤＩにより、Ｑ１０（アニオン）およびＣＭ１０（カチオン）タンパク質チップアレイ上において、二重の実験について１４〜２４％の変動係数で分析した。図２は、研究２における患者および対照からのｓｄＬＤＬの、ＳＥＬＤＩを用いたＱ１０タンパク質チップアレイ上の分析による４０００〜１００００Ｄａの分子量範囲の代表的なプロフィールを示す。患者からのｓｄＬＤＬの８９２０Ｄａ、９４２０Ｄａ、および９７２０Ｄａの質量を有するバンドについて、対照と比較して明らかに高い強度が認められた。これら三つのバンドは全て、１−Ｄゲルおよび電気溶離（electro elution）によって精製後、ＳＥＬＤＩ分析を行い、そして引き続き、ＭＳ／ＭＳ分析により、それらの対合したペプチドイオンによってヒトアポＣIIIとして識別した。それら３種類の多形の分子量の差は、それらが、異なった状態のシアリデーション（sialidation）を示すということを示唆する（Pullinger et al., 1997）。図３は、研究２による患者および対照の、ＳＥＬＤＩを用いたＣＭ１０タンパク質チップアレイ上で分析された３０００〜８０００Ｄａの分子量範囲のプロフィールを示す。６４２０Ｄａおよび６６２０Ｄａにある二つのバンドは、患者の場合よりも対照のｓｄＬＤＬにおいて明らかに顕著であった。これら二つのバンドを、１−Ｄゲル分析および電気溶離によって更に精製後、ＳＥＬＤＩを行い、そして次に、イムノブロッティングによってアポＣＩとして識別した。アポＣＩのそれら二つのバンドは、おそらくは、異なった状態のグリケーションを示す。更に、１００００〜５００００Ｄａの質量範囲のＳＥＬＤＩ分析は、二つのＬＤＬサブクラス中のアポＡＩおよびアポＥの識別および評価を可能にした。アポＡ１およびアポＥは、患者の場合と比較して、対照のｓｄＬＤＬにおいて最も顕著であった（データは示されていない）。
【００４６】
表３は、双方の研究におけるアポＢ１００含有率の補正後の、ｓｄＬＤＬ（画分５）中で識別されたアポリポタンパク質の相対含有率を示している。患者からのｓｄＬＤＬは、研究１における対合した対照からの同等の密度画分と比較した場合、アポＣIIIの三つのイソ型について有意に一層高い含有率を有する。もう一方において、それら患者は、そのｓｄＬＤＬクラス中のアポＣＩ、アポＡＩおよびアポＥについて、対照より有意に低い含有率を示した。研究２では、２型糖尿病患者および対合した対照のＬＤＬサブクラスも分析したが、そのｓｄＬＤＬは、対合した対照の密度画分よりも有意に多いアポＣIIIの３種類のイソ型と、アポＣＩ、アポＡＩおよびアポＥの低い含有率を示した。
【００４７】
更に、それら対照では、ｓｄＬＤＬ中のアポＣIIIおよびアポＣＩの含有率が、浮遊性粒子の場合よりも有意に高かった（図４）。患者では、更に、ｓｄＬＤＬは、浮遊性ＬＤＬより高いアポＣIII含有率を有したが、アポＣＩ含有率は高くなかった（図４）。
【００４８】
【表３】
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【００４９】
実施例４
示差的に発現されたタンパク質ピークの精製
Ｂ表現型を有する被験者からのＬＤＬ画分５のアリコートをプールし、真空遠心分離によって濃縮し、２００μＬのＮｕＰＡＧＥ試料緩衝液（１０％グリセロール、２％ＬＤＬ、３％ＤＴＴを含有する、０．１４Ｍトリス、０．１０Ｍトリス−ＨＣＬ、０．４ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．５）中に溶解させ、３分間沸騰させた後、ＮｕＰＡＧＥシステム（Novex（プレキャストゲル），San Diego, CA, USA）により、４〜１２％ Bis-Tris ゲル（１ウェル）を用いて分離した。ＮｕＰＡＧＥ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）ＭＥＳ緩衝系（１Ｍ  ＭＥＳ、１Ｍトリス、６９ｍＭ  ＳＤＳ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を、実験用衝液として用いた。小型全ゲルエルーター（mini whole gel eluter）（Bio-Rad）を、製造者の指示にしたがって電気溶離に用いた。溶離緩衝液（２５ｍＭヒスチジン、３０ｍＭ  ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ｐＨ６．５）を用い、そして溶離は、１００ｍＡで３０分間行った。約０．５ｍＬずつの１４個の画分を採取し、そして２５０μＬ／画分のアリコートを濃縮し、ＮＵＰＡＧＥシステムで分析後、引き続きのＭＳでのタンパク質バンド識別のために、ＳＹＰＲＯ Ruby 染色を行った。残り部分のゲルエルーター画分を、氷冷エタノールと１：４ｖ／ｖの比率で混合し、−２０℃で２時間沈殿させ、１００００ｘｇで４℃において１０分間遠心分離し、１０μＬの２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３中に溶解させた後、ＳＥＬＤＩ分析による精製戦略を追跡するために、ＮＰ２０タンパク質チップアレイ上で分析した。
【００５０】
実施例５
ＬＤＬに結合したタンパク質（アポＣIII、アポＡＩ、アポＥ）のＭＳ分析
引き続きのＭＳ分析のために、１−ゲル中で検出されたバンドをトリプシン処理し、以前に記載されたようにＭＳで分析した（Bjorhall K, Proteomics 2004;5(1):307-317）。簡単にいうと、それらゲル片を、連続してグレード変更されたトリプシン（Promega, Madison, WI, USA）で消化し、それらペプチドを、ギ酸およびアセトニトリルで抽出した。ペプチドイオンシグナルをＭＳ方式で増加させ且つＭＳ／ＭＳ分析を可能にするために、脱塩および濃縮を、ＰＯＲＯＳ２０樹脂（Perseptive Biosystems, Framingham, MA, USA）を製造者の指示にしたがって用いて行った。それらペプチドを、２μＬの７０％ＡＣＮ、０．１％ＴＦＡで、ＭＡＬＤＩ１００位置標的プレート上に直接的に溶離した。それらスポットを乾燥させた後、１．２５μＬのマトリックス溶液ＣＨＣＡ（Agilent Technologies, Waldbronn, Germany、５０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸および０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度のクエン酸ジアンモニウムで１：１に希釈される）を適用した。次に、分析を、Applied Biosystem ４７００ Proteomics Analyzer ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計（ＡＢ，Framingham, MA, USA）において反射器方式で行った。ＭＳおよびＭＳ／ＭＳデータ分析は、Mascot ペプチド質量フィンガープリントおよびＭＳ／ＭＳイオン探索ソフトウェア（Matrix sciences, London, UK）を利用するＧＰＳ ExplorerTM Software（Applied Biosystems, Framingham, MA, USA）を用いて行った。識別は、９５％の信頼レベルで正とみなした。８９２０Ｄａ、９４２０Ｄａおよび９７２０Ｄａの質量を有するピークは、１−Ｄゲルおよび電気溶離での精製および引き続きのＭＳ／ＭＳ分析のようなそれらの対合したペプチドイオンの識別後に、アポＣIIIと識別した。精製手順の後、ＳＥＬＤＩ分析を行った。２８１３０Ｄａおよび３３５７０Ｄａにあるピークは、アポＣIIIの場合のように記載された工程配列で、それぞれアポＡ１およびアポＥとして識別した。
【００５１】
実施例６
アポＣＩのイムノブロッティング分析
ＳＥＬＤＩによって分析された６４２０Ｄａおよび６６２０Ｄａそれぞれにバンドを含有するエレクトロエルーター画分の１−Ｄゲル分析後、それらタンパク質を、半乾燥ブロッティング法を用いて、ゲルからＰＶＤＦメンブラン（Millipore, Bedford, MA, USA）上に移した。そのメンブランを、アポＣ１に対する抗体（Biosciences）と一緒にインキュベートし、１：２０００に希釈した（０．０２μｇ／ｍＬ）。イムノブロッティング手順には、Western Breeze キット（Invitrogen）を用いた。それらバンドは、アポＣ１免疫反応性を示した。
【００５２】
実施例７
動脈血プロテオグリカンへのＬＤＬの結合
プロテオグリカンへの血清ＬＤＬの結合は、記載のように、ブタ大動脈内膜中間から微量修飾で単離された精製ベルシカン（versican）を用いて行った（Linden T, et al, Eur J Clin Invest 1989;19:38-44）。簡単にいうと、５０μｌの血清を、１０μｇ／ｍｌのヘキスロネートベルシカン、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．０を含有する１．０ｍｌの緩衝液Ａに加えた。ベルシカン不含の緩衝液Ａが入っているブランク試験管にも、血清を加えた。それら試験管を、４℃で１時間インキュベートし、１２０００ｘｇで４℃において１０分間遠心分離し、そしてペレットを１．０ｍｌの緩衝液Ａで洗浄し、上澄みを捨てた。最終ペレットを、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  Ｎａ２−ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ Tris 塩基、ｐＨ１０．５を含有する１００μｌの緩衝液Ｂ中に溶解させた。その溶液のアリコートを、プロテオグリカンによって血清から沈殿したＬＤＬと会合した交換可能なアポリポタンパク質のＳＥＬＤＩ分析およびコレステロール決定に用いた。
【００５３】
記載のように行われた動脈血ベルシカンとの血清のインキュベーションは、主にＬＤＬの沈殿を引き起こす（Linden T, et al, Eur J Clin Invest 1989;19:38-44）。アポＢ１００相違について補正された場合、研究２による患者血清のプロテオグリカンに結合したＬＤＬコレステロール（ＰＧ−ＬＤＬ）の量は、予想されるように、対照血清によるものより約３２％高く、ＰＧに結合したコレステロール／ｍｇアポＢは、患者について１１５±１５μｇ対対照の８０．０±９、ｐ＜０．０５であった。更に、ＰＧ−ＬＤＬ複合体のＳＥＬＤＩ分析は、患者からの不溶化したＬＤＬが、対照からの複合体よりもそれぞれ５７％、６５％および５８％多いアポＣIII−１、アポＣIII−２およびアポＣIII−３を含有し、例えば、アポＣIII−３の任意の単位は、患者の０．７０±０．３８対対照の０．３０±０．１０、ｐ＜０．００１であった（図５）。アポＣＩおよびアポＥそれぞれのレベルは（ｐ＜０．０５）、患者と対照との間で有意に変化した。アポＡＩのレベルには、統計的有意差が見出されなかった。これら知見に沿って、研究２における患者からのｓｄＬＤＬの全アポＣIII含有率と、血清からのＰＧで複合体形成したＬＤＬコレステロールの量との間には、有意の相関が見出された（図６）。対照のｓｄＬＤＬ中のアポＣIII含有率と、動脈血ベルシカンで不溶化したＬＤＬコレステロールとの間には、有意の相関がなかった。
【００５４】
実施例８
アポＢレベルについて調整されたｓｄＬＤＬに結合したタンパク質と、心臓血管リスク因子およびアテローム性動脈硬化症との間の関連
ｓｄＬＤＬ中の交換可能なアポリポタンパク質の相違についての仮説を証明した後の目的は、このタンパク質の組成が、心臓血管リスク因子、炎症および準臨床的アテローム性動脈硬化症に関連しているかどうかを調べることであった。統計学は全て、Windows １０．０用のＳＰＳＳ（ＳＰＳＳ，Inc., Chicago, IL, USA）を用いることによって分析した。それら結果を、数字（％）、平均値およびＳＤとして示す。
【００５５】
アポＣ−IIIは、伝統的リスク因子に、更には、血清中の炎症およびマトリックスメタロプロテイナーゼ−９のマーカーに一貫して且つ確実に関連していた。アポＡ−Ｉ並びにアポＥおよびアポＣ−Ｉは、上述のマーカーへの逆関係を示した（表４）。
【００５６】
アポＣIIIは、総頸動脈の内膜中間厚みに確実に関連していた（ｒ＝０．３５，ｐ＝０．０２）。アポＣＩ、アポＥおよびアポＡ１は、大腿動脈（−０．３４，ｐ＝０．０３）、頸動脈球（ｒ＝−０．４３，ｐ＝０．０１）および総頸動脈（ｒ＝−０．３８，ｐ＝０．０１）それぞれの平均ＩＭＴに逆に関連していた。アポＣIII／アポＣＩの比率は、頸動脈球および大腿動脈（それぞれ、ｒ＝０．３１，ｐ＝０．０４９；ｒ＝０．３８，ｐ＝０．０２）のＩＭＴに有意に関連していた。更に、その比率も、総頸動脈のＩＭＴに関連している傾向があった（ｒ＝０．２９，ｐ＝０．０６）。
【００５７】
【表４】
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【００５８】
実施例９
ｓｄＬＤＬ中のアポＡＩ、アポＣＩ、アポＣIIIまたはアポＥ、および血漿中のアポＡ−１およびアポＣ−IIIの中央値による糖尿病を有するオッズ比
低分子稠密ＬＤＬに結合したタンパク質の濃度を、画分５中のアポＢについて調整した。単一変量分析において、血漿中のアポＡ−ＩおよびアポＣ−III、並びに画分５中のアポＣIII、アポＡ−ＩおよびアポＣ−Ｉは全て、糖尿病患者であるリスクに有意に関連していた（表５）。アポＥは、糖尿病への統計的に有意の関連を示さなかった。アポＣ−IIIの血漿レベルも、ＬＤＬに結合したアポＣ−IIIレベルも、糖尿病を有するリスクに関連していたので、これら変数は双方とも、多重ロジスティック回帰分析に包含した。この分析の結果は、ｓｄＬＤＬ中のアポＣ−IIIだけが、糖尿病の独立した予兆であったということを示した（表６）。同じ多変量ロジスティック回帰モデルにおいて糖尿病を有するリスクに単一変量で関連していたｓｄＬＤＬに結合した全てのタンパク質を包含した場合、アポＣ−IIIおよびアポＣ−Ｉは（逆に）、糖尿病の独立した予兆であることが判明した（表７）。
【００５９】
患者および対照の臨床的特徴についての追加の情報が全くなくても、中央値より上および下それぞれのｓｄＬＤＬに結合したアポＣ−IIIは、患者の７６％および対照の７４％を、糖尿病を有するまたは有していないと正確に分類した。低および高アポＣ−Ｉについても、同様の数値を得た（データは示されていない）。
【００６０】
【表５】
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【００６１】
【表６】
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【００６２】
【表７】
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【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１。Ｄ２ＯおよびＨ２Ｏの混合物中に１４０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する、予め形成された勾配の緩衝液中で分離された血清ＬＤＬのアポＢ１００プロフィール。プロフィールＡは、健康な対照被験者による。プロフィールＢは、２型糖尿病およびＬＤＬ  Ｂ表現型を有する患者による。
【図２】図２。Ｑ１０タンパク質チップアレイで分析された（研究２）、２３人の対照の内の１０人および２２人の糖尿病患者の内の１０人からのｓｄＬＤＬのＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳタンパク質プロフィール。
【図３】図３。ＣＭ１０タンパク質チップアレイで分析された（研究２）、２３人の対照の内の１０人および２２人の糖尿病患者の内の１０人からのｓｄＬＤＬのＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳタンパク質プロフィール。
【図４ａ】図４ａ。対照（被験者１〜２３）および患者（被験者２４〜４５）における、（Ｆｒ５）ｓｄＬＤＬ粒子と比較した浮遊性（Ｆｒ４）のａ／アポＣIII／アポＢの個々の値。
【図４ｂ】図４ｂ。対照（被験者１〜２３）および患者（被験者２４〜４５）における、（Ｆｒ５）ｓｄＬＤＬ粒子と比較した浮遊性（Ｆｒ４）のｂ／アポＣＩ／アポＢの個々の値。
【図５】図５。Ｑ１０タンパク質チップアレイで分析された（研究２）、２３人の対照の内の１人および２２人の糖尿病患者の内の１人からの、ジュウテリウム分別後のｓｄＬＤＬ上およびＰＧ−ＬＤＬ複合体上それぞれのＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳタンパク質プロフィールの比較。８９２０Ｄａ、９４２０Ｄａおよび９７２０Ｄａの分子質量を有する三つのバンドは、それぞれ、対照と比較して患者のｓｄＬＤＬにおいて増加し（ｐ＜０．００１）、更には、対照の場合よりも患者のＰＧ−ＬＤＬ複合体において増加した（ｐ＜０．００１）。
【図６】図６。２型糖尿病患者のｓｄＬＤＬ中の全アポＣIII含有率と、in vitro の大動脈 versican との会合によって不溶化したＬＤＬコレステロールの量との相関。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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