(57)【要約】本発明は、２型糖尿病に関連したマーカを含むポリヌクレオチド及び、被検体において、下記表１に表示された１以上核酸の多型部位の塩基配列を決定するステップを含む２型糖尿病の診断方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の表に示されるＮＣＢＩジーンバンク許可番号で表されたポリヌクレオチドから選択される少なくとも一つのポリヌクレオチド多型部位のヌクレオチドを決定する２型糖尿病の診断方法：
【表１】
2008529524.tif 000011
【請求項２】
配列番号１ないし１８の前記多型部位におけるヌクレオチドが下記多座マーカ（１）ないし（７）のうち一つ以上に該当する場合、検体を２型糖尿病患者または２型糖尿病にかかる危険性が高いと判定する、請求項１に記載の方法：
（１）ｒｓ４８８１１５の多型部位の遺伝子型がＡＡまたはＡＧであり、ｒｓ１９８４３８８の多型部位の遺伝子型がＴＴである、
（２）ｒｓ２０５１６７２の多型部位の遺伝子型がＣＣであり、ｒｓ１９４３３１７の多型部位の遺伝子型がＡＡであり、ｒｓ７５２１３９の多型部位の遺伝子型がＡＧまたはＧＧである、
（３）ｒｓ１９４３３１７の多型部位の遺伝子型がＴＡまたはＡＡであり、ｒｓ９２９４７６の多型部位の遺伝子型がＴＴまたはＴＣであり、ｒｓ１３７７１８８の多型部位の遺伝子型がＡＴまたはＴＴである、
（４）ｒｓ５０２６１２の多型部位の遺伝子型がＴＴであり、ｒｓ２０５１６７２の多型部位の遺伝子型がＣＣであり、ｒｓ２０５８５０１の多型部位の遺伝子型がＣＣまたはＣＴであり、ｒｓ１４６１９８６の多型部位の遺伝子型がＴＴまたはＴＣである、
（５）ｒｓ１３９４７２０の多型部位の遺伝子型がＴＴまたはＴＧであり、ｒｓ１３１６９０９の多型部位の遺伝子型がＡＴまたはＴＴであり、ｒｓ１９７３６７の多型部位の遺伝子型がＡＧまたはＧＧである、
（６）ｒｓ２０５１６７２の多型部位の遺伝子型がＣＣであり、ｒｓ１３４０２６６の多型部位の遺伝子型がＡＡであり、ｒｓ４９２２２０の多型部位の遺伝子型がＴＣまたはＣＣである、
（７）ｒｓ１０３８３０８の多型部位の遺伝子型がＣＣであり、ｒｓ１０５９０３３の多型部位の遺伝子型がＴＴであり、ｒｓ６０７２０９の多型部位の遺伝子型がＡＡまたはＡＣである。
【請求項３】
前記多型部位におけるヌクレオチドを決定する操作は、直接的なヌクレオチド配列の分析またはハイブリダイゼーションによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記多型部位におけるヌクレオチドを決定する操作は、配列番号１ないし１８の一つ以上のポリヌクレオチドの多型部位を含むポリヌクレオチドプローブ、またはその相補的ポリヌクレオチドプローブが固定化されているマイクロアレイ上に、検体から得られた核酸試料をハイブリダイズさせて、かつ当該ハイブリダイゼーションの結果を検出する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
下記の表に示される多型配列からなる群から選択された１以上のポリヌクレオチド配列から由来の１０個以上の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであって、
それぞれ多型部位（１０１番目）を含むポリヌクレオチド、またはその相補的なポリヌクレオチド：
【表２】
2008529524.tif 000012
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドは、下記（１）ないし（７）からなるポリヌクレオチドセットからなる群から選択された一つ以上のポリヌクレオチドセットである、請求項５に記載のポリヌクレオチド：
（１）ｒｓ４８８１１５及びｒｓ１９８４３８８、
（２）ｒｓ２０５１６７２、ｒｓ１９４３３１７及びｒｓ７５２１３９、
（３）ｒｓ１９４３３１７、ｒｓ９２９４７６及びｒｓ１３７７１８８、
（４）ｒｓ５０２６１２、ｒｓ２０５１６７２、ｒｓ２０５８５０１及びｒｓ１４６１９８６、
（５）ｒｓ１３９４７２０、ｒｓ１３１６９０９及びｒｓ１９７３６７、
（６）ｒｓ２０５１６７２、ｒｓ１３４０２６６及びｒｓ４９２２２０、
（７）ｒｓ１０３８３０８、ｒｓ１０５９０３３及びｒｓ６０７２０９。
【請求項７】
請求項５または６に記載のポリヌクレオチドを含む、マイクロアレイ。
【請求項８】
請求項５または６に記載のポリヌクレオチドを含む、２型糖尿病を検出するための診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多座マーカを利用した２型糖尿病の診断方法、２型糖尿病に関連したマーカを含むポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むマイクロアレイ及び診断キッドに関する。
【背景技術】
【０００２】
全ての生物のゲノムは、継続的進化の過程で祖先の核酸配列の変異形態を発生させる自然発生的突然変異を経験してきている（Ｇｕｓｅｌｌａ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５，８３１−８５４（１９８６））。変異形態は、祖先の形態に比べて、進化的に利益または不利益を与えるか、または中間の場合もありうる。ある場合には、変異形態が致死的な不利益を与えて子孫に伝えられない場合もある。他の場合には、変位形態が種に進化上の利益を与え、ついには、その種のほとんどの個体のＤＮＡに変異形態が組み込まれ有利な先祖形態となる。多くの場合、この先祖形態及び変異形態は生き残って、種集団中に共存する。複数形態の配列の共存によって、多型が発生する。
【０００３】
このような多型には、ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：制限断片長多型）、ＳＴＲ（Ｓｈｏｒｔ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｒｅｐｅａｔｓ）、ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：一塩基多型）が知られている。これらのうち、ＳＮＰは、一同一の種の個体間における単一ヌクレオチドの変異形態を取る。一塩基多型は、コーディング領域の配列中に発生すると、多型形態の何れによっても欠陥蛋白質または変位蛋白質が発現されることもある。他の場合には、非コーディング領域の配列に一塩基多型が発生しうる。これらのうち一部は、欠陥蛋白質または変異蛋白質の発現を招くこともある（例えば、欠陥のあるスプライシングの結果として）。ある一塩基多型は、表現型に何らの影響を及ぼさないこともある。
【０００４】
一塩基多型は、人間の場合、約３００−１，０００ｂｐごとに１回の頻度で発生するものと知られている。これらの一塩基多型が疾病のような表現型に影響を及ぼす場合、前記一塩基多型を含むポリヌクレオチドは、このような疾病の診断にプライマーまたはプローブとして使用されうる。現在、色々な研究機関で一塩基多型の分析及びその機能の分析に関する研究を行っている。このように発見された一塩基多型の塩基配列及びその他の実験結果をデータベース化して公開することで、誰でも接近して研究に利用可能にしている。
【０００５】
しかし、このような一塩基多型は、単純に人間のゲノムまたはｃＤＮＡ上に一塩基多型が存在するということを発見しただけであって、これらが表現型に及ぼす影響を明らかにしたものではなかった。これらの発見された一塩基うちのほんの一部については、その機能が知られたものもあるが、ほとんどは、知られていない。
【０００６】
２型糖尿病（Ｔｙｐｅ２  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ）は、糖尿病患者全体の９０〜９５％を占めるものと知られている。２型糖尿病は、体内で生産されるインシュリンの量が異常であったり、またはインシュリンに対して低い応答性を示す結果血液中のグルコースレベルの変移が大きくなるような症状である。インシュリン分泌物の疾患が、２型糖尿病を招くと、血液中のグルコースが体内細胞内に輸送させられないため、食物からエネルギーへと変換が得難いと知られている。２型糖尿病の発病には、遺伝的要因があると知られており、その他の２型糖尿病の危険因子としては、４５歳以上の年齢、糖尿病の家系、過体重、高血圧及びコレステロールレベルが挙げられる。現在、糖尿病の診断は、主に空腹時の血糖値（ＦＳＢ：Ｆａｓｔｉｎｇ  Ｂｌｏｏｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ）試験及び経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ：Ｏｒａｌ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  Ｔｅｓｔ）を通じて疾病による表現型の変化、すなわち血糖量（血液中のグルコース量）を測定する方法でなされている（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｄｄｋ．ｎｉｈ．ｇｏｖ，２００３）。２型糖尿病の場合、診断となれば、運動及び食生活習慣の変化、体重調節、及び各種の薬物治療を通じて治療または糖尿病の進行速度を遅らせるため、早期診断の必要性が非常に高い疾病といえる。Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社でＨＮＦ１遺伝子にある遺伝子型の変異を探知することによって、２型糖尿病の診断及び予測が可能であると発表した（ＰＲ  Ｎｅｗｓｗｉｒｅ，Ｓｅｐｔ  １，１９９８）、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ社では、ＦＯＸＡ２（ＨＮＦ３β）遺伝子が２型糖尿病の発病と高い関連性があると発表した（ＰＲ  Ｎｅｗｓｗｉｒｅ，Ｏｃｔ  ２８，２００３）。このように、幾つかの遺伝子が２型糖尿病の発病と関連性があると報告されているが、特定の人口集団のうちの少数の染色体における特定の遺伝子にのみ研究が集中している。これにより、対象とする人種によって他の結果が現れる可能性がある。さらには、２型糖尿病の原因遺伝子が何れも明らかになったことではなく、このような分子生物学的方法を利用して、２型糖尿病を診断する場合は多くないのが現在の診断レベルである。それと共に、２型糖尿病の発病前の早期診断は、現在なされていない。したがって、全体ヒトゲノムを対象として２型糖尿病との関連性の高い新たなＳＮＰ及び関連遺伝子を探し出して、早期診断に活用せねばならないという必要性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、多座マーカを利用して２型糖尿病を診断する方法を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、２型糖尿病に関連したマーカを含むポリヌクレオチドを提供することである。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、前記ポリヌクレオチドが固定化されている基板を備えるマイクロアレイを提供することである。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、前記ポリヌクレオチドを含む２型糖尿病診断用キットを提供することである。
【００１１】
本発明は、下記の表１に示されるＮＣＢＩジーンバンク許可番号で表されたポリヌクレオチドから選択される少なくとも一つのポリヌクレオチド多型部位のヌクレオチドを決定する、２型糖尿病の診断方法を提供する。
【００１２】
【表１】
2008529524.tif 000002
【００１３】
配列番号１ないし１８は、前記ｒｓ５０２６１２、ｒｓ１３９４７２０、ｒｓ４８８１１５、ｒｓ２０５１６７２、ｒｓ１０３８３０８、ｒｓ１９４３３１７、ｒｓ９２９４７６、ｒｓ１９８４３８８、ｒｓ７５２１３９、ｒｓ２０５８５０１、ｒｓ１０５９０３３、ｒｓ４９２２２０、ｒｓ１４６１９８６、ｒｓ６０７２０９、ｒｓ１９７３６７、ｒｓ１３４０２６６、ｒｓ１３１６９０９、及びｒｓ１３７７１８８の一塩基多型部位（１０１番位置）のヌクレオチドを含む２０１ｂｐの核酸断片である。前記配列番号１ないし１８のポリヌクレオチド配列及び各一塩基多型（ＳＮＰｓ）の特性については、下記表２及び表３に示した通りである。
【００１４】
前記配列番号１ないし１８のポリヌクレオチドは、多型配列である。多型配列とは、ヌクレオチド配列のうち一塩基多型を表す多型部位を含む配列を称す。多型部位とは、多型配列のうち一塩基多型が起きる部位を称す。前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡとなりうる。
【００１５】
本発明は、配列番号１ないし１８の多型配列のうち１以上の多型部位（１０１番）が２型糖尿病と関連性のある多座マーカを利用する２型糖尿病を診断する方法を提供する。前記多座マーカは、２型糖尿病患者及び正常人から由来した血液試料から得られたＤＮＡを配列分析した結果を通じて確認できた。表２及び表３は、配列番号１ないし１８の多型配列の特性を表したものである。
【００１６】
【表２−１】
2008529524.tif 000003
【００１７】
【表２−２】
2008529524.tif 000004
【００１８】
【表２−３】
2008529524.tif 000005
【００１９】
【表３−１】
2008529524.tif 000006
【００２０】
【表３−２】
2008529524.tif 000007
【００２１】
表２及び表３において、各カラムが意味するところは、次の通りである。
【００２２】
＊  Ａｓｓａｙ＿ＩＤは、マーカの名称を表す。
【００２３】
＊  ＳＮＰは、一塩基多型部位で観察される塩基を表したものであって、ここで、Ａ１及びＡ２は、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ社の均質的ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤ（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤ：以下、ｈＭＥともいう）技法によって配列分析の結果として質量の小さい対立因子をＡ１と、質量の大きい対立因子をＡ２と任意的に実験の便宜上命名した。
【００２４】
＊  ＳＮＰを含む配列は、各ＳＮＰ部位を含む配列の配列番号を表すものであって、それぞれ１０１番目の位置にＡ１及びＡ２対立因子を含む配列を表した。
【００２５】
＊  対立因子頻度の欄で、ｃａｓ＿Ａ２、ｃｏｎ＿Ａ２及びＤｅｌｔａは、それぞれ疾病群におけるＡ２対立因子の頻度、正常群におけるＡ２対立因子の頻度及び、前記ｃａｓ＿Ａ２とｃｏｎ＿Ａ２との差の絶対値を表す。ここで、ｃａｓ＿Ａ２は、疾病群で（Ａ２Ａ２遺伝子型の頻度ｘ２＋Ａ１Ａ２遺伝子型の頻度）／（疾病群のサンプル数ｘ２）であり、ｃｏｎ＿Ａ２は、正常群で（Ａ２Ａ２遺伝子型の頻度ｘ２＋Ａ１Ａ２遺伝子型の頻度）／（正常群のサンプル数ｘ２）である。
【００２６】
＊  遺伝子型の頻度は、各遺伝子型の頻度を表すものであって、ｃａｓ＿Ａ１Ａ１、ｃａｓ＿Ａ１Ａ２及びｃａｓ＿Ａ２Ａ２及びｃｏｎ＿Ａ１Ａ１、ｃｏｎ＿Ａ１Ａ２及びｃｏｎ＿Ａ２Ａ２は、それぞれ疾病群及び正常群でＡ１Ａ１、Ａ１Ａ２及びＡ２Ａ２遺伝子型を有する人間の数を表す。
【００２７】
＊  カイ二乗（ｄｆ＝２）は、自由度が２であるカイ二乗値を表したものであって、Ｃｈｉ−ｖａｌｕｅは、カイ二乗の結果値であって、ｐ−ｖａｌｕｅ計算の基準となる値である。ｃｈｉ−ｅｘａｃｔ−ｐ−ｖａｌｕｅは、ｐ−ｖａｌｕｅ  ｏｆ  Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔ  ｏｆ  ｃｈｉ−ｓｑｕａｒｅ  ｔｅｓｔを表すものであって、遺伝子型の数の値が５より小さい値が含まれる場合、一般のカイ二乗の検定結果が不正確であるので、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔを通じてさらに正確な統計的有意性（ｐ−ｖａｌｕｅ）の検定に使われる変数である。本発明では、ｐ−ｖａｌｕｅ≦０．０５である場合、疾病群と正常群との遺伝子型が同一ではない。すなわち、有意であると判断した。
【００２８】
＊  オッズ比率は、正常群のうち対立因子Ａ１を有する確率に対する疾病群のうち対立因子Ａ１を有する確率の比率を表す。本発明では、Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌ  ｏｄｄｓ  ｒａｔｉｏ方法を使用した。ＣＩ（Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｒｖａｌ）は、オッズ比率の９５％の信頼区間を表すものであって、（下限信頼区間、上限信頼区間）を表す。信頼区間は、１を含む場合には、疾病との関連性を有意であると判断できない。
【００２９】
＊ＨＷＥ状態は、ハーディ−ワインベルグ平衡の状態を表すものであって、ｃｏｎ＿ＨＷＥ及びｃａｓ＿ＨＷＥは、正常群及び疾病群でハーディ−ワインベルグ平衡如何を表すものである。カイ二乗（ｄｆ＝１）の検定でｃｈｉ−ｖａｌｕｅ＝６．６３（ｐ−ｖａｌｕｅ＝０．０１、ｄｆ＝１）を基準に、６．６３より大きい場合には、ハーディ−ワインベルグ非平衡（ＨＷＤ：Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  Ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）と、６．６３より小さい場合には、ハーディ−ワインベルグ平衡（ＨＷＥ：Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）と判断した。
【００３０】
＊  試料コール比率は、元来、実験に投入した全体試料数に対する遺伝子型が成功的に実験された試料の数を表すものであって、ｃａｓ＿ｃａｌｌ＿ｒａｔｅ及びｃｏｎ＿ｃａｌｌ＿ｒａｔｅは、それぞれ疾病群及び正常群の実験に使われた総試料（３００名）のうち、遺伝子型が成功的に分析された比率を表すものである。
【００３１】
表２及び表３は、ＮＣＢＩ  ｂｕｉｌｄ  １２３を基準に各ＳＮＰマーカに関連した特性を記載したものである。
【００３２】
本発明の方法の一具体例は、ｒｓ５０２６１２、ｒｓ１３９４７２０、ｒｓ４８８１１５、ｒｓ２０５１６７２、ｒｓ１０３８３０８、ｒｓ１９４３３１７、ｒｓ９２９４７６、ｒｓ１９８４３８８、ｒｓ７５２１３９、ｒｓ２０５８５０１、ｒｓ１０５９０３３、ｒｓ４９２２２０、ｒｓ１４６１９８６、ｒｓ６０７２０９、ｒｓ１９７３６７、ｒｓ１３４０２６６、ｒｓ１３１６９０９、及びｒｓ１３７７１８８の一塩基多型部位のヌクレオチドが、下記（１）ないし（７）の多座マーカのうちの一つ以上に該当する場合には、検体を２型糖尿病患者または２型糖尿病にかかる危険性の高いと判定することを特徴とする方法を提供する；
（１）ｒｓ４８８１１５の多型部位の遺伝子型がＡＡまたはＡＧであり、ｒｓ１９８４３８８の多型部位の遺伝子型がＴＴである、
（２）ｒｓ２０５１６７２の多型部位の遺伝子型がＣＣであり、ｒｓ１９４３３１７の多型部位の遺伝子型がＡＡであり、ｒｓ７５２１３９の多型部位の遺伝子型がＡＧまたはＧＧである、
（３）ｒｓ１９４３３１７の多型部位の遺伝子型がＴＡまたはＡＡであり、ｒｓ９２９４７６の多型部位の遺伝子型がＴＴまたはＴＣであり、ｒｓ１３７７１８８の多型部位の遺伝子型がＡＴまたはＴＴである、
（４）ｒｓ５０２６１２の多型部位の遺伝子型がＴＴであり、ｒｓ２０５１６７２の多型部位の遺伝子型がＣＣであり、ｒｓ２０５８５０１の多型部位の遺伝子型がＣＣまたはＣＴであり、ｒｓ１４６１９８６の多型部位の遺伝子型がＴＴまたはＴＣである、
（５）ｒｓ１３９４７２０の多型部位の遺伝子型がＴＴまたはＴＧであり、ｒｓ１３１６９０９の多型部位の遺伝子型がＡＴまたはＴＴであり、ｒｓ１９７３６７の多型成部位の遺伝子型がＡＧまたはＧＧである、
（６）ｒｓ２０５１６７２の多型部位の遺伝子型がＣＣであり、ｒｓ１３４０２６６の多型部位の遺伝子型がＡＡであり、ｒｓ４９２２２０の多型部位の遺伝子型がＴＣまたはＣＣである、
（７）ｒｓ１０３８３０８の多型部位の遺伝子型がＣＣであり、ｒｓ１０５９０３３の多型部位の遺伝子型がＴＴであり、ｒｓ６０７２０９の多型部位の遺伝子型がＡＡまたはＡＣである。
【００３３】
前記（１）ないし（７）に該当する多座マーカにおける遺伝子型は、患者群と正常人群とでその出現頻度を比較することによって、有意に２型糖尿病と関連性があると判明されたものである。前記多座マーカの出現頻度に対する結果は、下記表４に表した通りである。
【００３４】
【表４】
2008529524.tif 000008
【００３５】
表４で、マーカ名称に対応するＮＣＢＩジーンバンク許可番号は、表３に示した通りである。表４の結果は、それぞれ３００人の２型糖尿病患者及び正常人での各多座マーカの遺伝子型の出現頻度を比較したものであって、前記（１）ないし（７）の多座遺伝子型のうち一つ以上を満足する場合が、３００人の患者のうち、２４７人であった（８２％）。また、表４で、オッズ比率は、正常人群での前記多重座遺伝子型の出現確率に対する患者群での前記多座遺伝子型の出現確率の比を表す。表４に示すように、オッズ比率値の何れもが３．５以上を超えるものである。この結果は、前記多座マーカ（１）ないし（７）の出現頻度が、２型糖尿病が陽性であることと非常に密接に関連されているということを表す。
【００３６】
本発明に係る２型糖尿病の診断方法は、検体から核酸を単離させて；、かつ配列番号１ないし１８のポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチドのうち１以上の多型部位（１０１番目）のヌクレオチドを決定することを含むことが好ましい。
【００３７】
本発明の方法において、まず検体から核酸を単離させる操作は、通常のＤＮＡ分離方法用いられる方法によって行われる。例えば、標的核酸をＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を通じて増幅し、これを精製して得られる。その他にリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ：Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（Ｗｕ及びＷａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４，５６０（１９８９）、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１，１０７７（１９８８））、転写増幅（Ｋｗｏｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，１１７３（１９８９））及び自己維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，１８７４（１９９０））及び核酸に基づいた配列増幅（ＮＡＳＢＡ：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が使われる。最後の２つの方法は、等温転写に基づいた等温反応に関連するものであって、増幅産物として３０または１００倍の単一鎖ＲＮＡ及び二重鎖ＤＮＡを生産する。
【００３８】
本発明の方法において、前記多型部位のヌクレオチドを決定する操作は、当業界に知られた任意の方法が使用される。例えば、ジデオキシ法のように、直接的に核酸の塩基配列を分析する方法が用いられたり、また、ハイブリダイゼーション法のように、間接的にヌクレオチド配列を決定する方法、が使用される。後者のハイブリダイゼーション方法を利用する場合、多様な方法が使われる。例えば、核酸マイクロアレイが使われる。すなわち、本発明の配列番号１ないし１８からなる群から由来の１０個以上の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであって、１０１番目のヌクレオチドを含む２型糖尿病の診断または治療用ポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチドが１個以上固定化されているマイクロアレイに前記核酸試料をハイブリダイセーショする操作と、前記ハイブリダイゼーションの結果を検出する操作と、を含みうる。
【００３９】
マイクロアレイ及びプローブポリヌクレオチドを基板上に固定化してマイクロアレイを製造する方法は、当業界に公知されている。本発明の２型糖尿病に関連したプローブポリヌクレオチドの基板上に固定化する過程もまた、このような従来の技術を使用して容易に製造しうる。また、マイクロアレイ上での核酸のハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション結果の検出は、当業界に公知されている。前記検出は、例えば、核酸試料を蛍光物質、例えば、Ｃｙ３及びＣｙ５のような物質を含む検出可能な信号を発生させうる標識物質で標識した後、マイクロアレイ上に混成化し、前記標識物質から発生する信号を検出することによって、ハイブリダイゼーションの結果を検出しうる。
【００４０】
本発明はまた、下記に示す表５の多型配列からなる群から選択された１以上のポリヌクレオチドから由来の１０個以上の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドは、それぞれ多型部位（１０１番目）を含むポリヌクレオチドまたはその相補的なポリヌクレオチドであるポリヌクレオチドを提供する。
【００４１】
【表５】
2008529524.tif 000009
【００４２】
本発明の前記ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドセットであることが好ましく、当該ポリヌクレオチドは、下記（１）ないし（７）のポリヌクレオチドセットからなる群から選択された一つ以上のポリヌクレオチドであることが好ましい；
（１）ｒｓ４８８１１５及びｒｓ１９８４３８８、
（２）ｒｓ２０５１６７２、ｒｓ１９４３３１７及びｒｓ７５２１３９、
（３）ｒｓ１９４３３１７、ｒｓ９２９４７６及びｒｓ１３７７１８８、
（４）ｒｓ５０２６１２、ｒｓ２０５１６７２、ｒｓ２０５８５０１及びｒｓ１４６１９８６、
（５）ｒｓ１３９４７２０、ｒｓ１３１６９０９及びｒｓ１９７３６７、
（６）ｒｓ２０５１６７２、ｒｓ１３４０２６６及びｒｓ４９２２２０、
（７）ｒｓ１０３８３０８、ｒｓ１０５９０３３及びｒｓ６０７２０９。
【００４３】
本発明の前記ポリヌクレオチドセットは、プライマーまたはプローブとして使われる。前記ポリヌクレオチドセットは、溶液中でだけでなく、固体基板上に固定化されて、すなわちマイクロアレイ上に固定化されて使われる。本発明の前記ポリヌクレオチドは、２型糖尿病に特異的な配列であるため、２型糖尿病を診断または治療するなどの２型糖尿病に関連した用途として使われる。
【００４４】
本発明はまた、前記本発明のポリヌクレオチドが固定化されているマイクロアレイを提供する。前記ポリヌクレオチド及びマイクロアレイについては、前記の通りである。
【００４５】
本発明はまた、前記本発明のヌクレオチドを含む２型糖尿病診断用キットを提供する。望ましくは、前記キットは、一つ以上の多座マーカのポリヌクレオチドを含むキットである。
【００４６】
本発明の診断用キットにおいて、診断用キットに含まれるポリヌクレオチドについては、前記の通りである。また、本発明の診断用キットには、使用指針書を含みうる。前記使用指針書は、使用目的によって当業者が理解できるように使用過程及び成分が記載されたものである。前記キットは、例えば、検体から分離された核酸試料に前記ポリヌクレオチドをプローブとしてハイブリダイズさせ、それから発生する信号を利用してハイブリダイズの程度を測定することによって、多型部位に特定の対立因子の有無を判別するのに使われる。前記特定の対立因子の有無または遺伝子型の有無に基づいて、検体が２型糖尿病にかかる危険性または２型糖尿病患者であるか否かを判別しうる。
【発明の効果】
【００４７】
本発明の２型糖尿病の診断方法によれば、２型糖尿病の存在または危険の有無を効果的に診断しうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
以下、本発明を実施例を通じてさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４９】
実施例１
本実施例では、韓国人のうち２型糖尿病患者と判明されて治療中である患者群（３００人）と、患者群と同一年齢帯に該当しつつ、まだ２型糖尿病の症状のない正常人（３００人）との血液からＤＮＡを分離し、特定の一塩基多型の出現頻度を分析した。本実施例に選択された一塩基多型は、公開されたデータベース（ＮＣＢＩ  ｄｂＳＮＰ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／）またはＳｅｑｕｅｎｏｍ社のｒｅａｌｓｎｐ．ｃｏｍ（ｈｔｔｐ：：／／ｗｗｗ．ｒｅａｌｓｎｐ．ｃｏｍ／）から選択し、選択された一塩基多型周辺の配列を利用したプライマーを利用して、試料のうち一塩基配列を分析した。
【００５０】
１．ＤＮＡ試料の準備
２型糖尿病患者及び正常人から収集した血液からＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ抽出は、公知の抽出方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｐ  ３９２，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）及び商業用キット（Ｇｅｎｔｒａｓｙｓｔｅｍ，Ｄ−５０Ｋ）の説明書によってなされた。抽出されたＤＮＡのうち、純度がＵＶ測定値（２６０／２８０ｎｍ）最小１．７以上となるものだけを選別して使用した。
【００５１】
２．標的ＤＮＡの増幅
分析しようとする一塩基多型が含まれた一定のＤＮＡ領域である標的ＤＮＡを、ＰＣＲを利用して増幅した。ＰＣＲ方法は、通常的な方法で進め、その条件は、次の通りであった。まず、標的ゲノムＤＮＡを２．５ｎｇ／ｍｌで準備した。次いで、次のＰＣＲ反応液を準備した。
水（ＨＰＬＣ級）                                            ２．２４μｌ１０ｘバッファ（１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有）
０．５μｌ
ｄＮＴＰミックス（ＧＩＢＣＯ）（２５ｍＭ／各）              ０．０４μｌ
Ｔａｑ  ｐｏｌ（ＨｏｔＳｔａｒ）（５Ｕ／μｌ）              ０．０２μｌ
フォワード／リバースプライマーミックス（１μＭ／各）        ０．０２μｌ
ＤＮＡ                                                      １．００μｌ
総反応体積                                                  ５．００μｌ
ここで、前記フォワード及びリバースプライマーは、公知のデータベースの一塩基多型の上流及び下流から適当な位置で選択した。前記プライマーを表４に整理した。
【００５２】
熱循環反応は、９５℃で１５分間維持し、９５℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で１分を４５回反復し、７２℃で３分間維持した後、４℃に保管した。その結果、２００個のヌクレオチド以下の長さを有する標的ＤＮＡ断片を得た。
【００５３】
３．増幅された標的ＤＮＡのうち一塩基多型の分析
標的ＤＮＡ断片のうち一塩基多型の分析は、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ社製の均質的ＭａｓｓＥｘｔｅｎｓｉｏｎ（ｈＭＥ）技法を利用した。前記ＭａｓｓＥｘｔｅｎｓｉｏｎ技法の原理は、次の通りである。まず、標的ＤＮＡ断片のうち一塩基多型直前までの塩基に相補的なプライマー（延長用プライマーともいう。）を製作する。次いで、前記プライマーを標的ＤＮＡ断片に混成化させ、ＤＮＡ重合反応を起こす。このとき、反応液中に、対象の一塩基多型対立因子のうち第１対立因子塩基（例えば、Ａ対立因子）に相補的な塩基が添加された後に反応を停止させる試薬（例えば、ｄｄＴＴＰ）を含める。その結果、標的ＤＮＡ断片に第１対立因子（例えば、Ａ対立因子）が存在する場合には、前記第１対立因子に相補的な塩基（例えば、Ｔ）が一つのみ添加された産物が得られる。一方、標的ＤＮＡ断片に第２対立因子（例えば、Ｇ対立因子）が存在する場合には、前記第２対立因子に相補的な塩基（例えば、Ｃ）が添加された最も近接した第１対立因子塩基（例えば、Ａ）まで延びた産物を得る。このように得られた前記プライマーから延びた産物の長さを質量分析を通じて決定することによって、標的ＤＮＡに存在する対立因子の種類を決定しうる。具体的な実験条件は、次の通りであった。
【００５４】
まず、前記ＰＣＲ産物から結合されていないｄＮＴＰを除去した。このために純水１．５３μｌ、ＨＭＥバッファ０．１７μｌ、ＳＡＰ（Ｓｈｒｉｍｐ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）０．３０μｌを１．５ｍｌのチューブに入れて混合して、ＳＡＰ酵素溶液を準備した。前記チューブを５，０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離した。その後、ＰＣＲ産物を前記ＳＡＰ溶液のチューブに入れて密封した後、３７℃で２０分、８５℃で５分間維持した後、４℃に保管した。
【００５５】
次いで、前記標的ＤＮＡ産物をテンプレートとして均質的延長反応を実施した。反応液は、次の通りであった。
水（ナノ級純水）                                  １．７２８μｌ
ｈＭＥ延長ミックス（２．２５ｍＭｄ／ｄｄＮＴＰｓを含む１０ｘバッファ）
０．２００μｌ
延長プライマー（各１μＭ）                              ０．０５４μｌ
Ｔｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅ（３２Ｕ／μｌ）          ０．０１８μｌ
総体積                                                  ２．００μｌ
前記反応液をよく混合した後、スピンダウン遠心分離した。前記反応液が含まれたチューブまたはプレートをよく密封した後、９４℃で２分間維持した後、９４℃で５秒、５２℃で５秒、７２℃で５秒を４０回反復した後、４℃に保管した。このように得られた均質的延長反応産物を樹脂（ＳｐｅｃｔｒｏＣＬＥＡＮＴＭ，Ｓｅｑｕｅｎｏｍ社製の＃１００５３）を使用して洗浄した。延長反応に使われた延長プライマーは、下記表６に表した。
【００５６】
【表６】
2008529524.tif 000010
【００５７】
得られた延長反応産物を、質量分析方法のうちＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ）を利用して多型部位の配列を分析した。前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは、分析しようとする物質がレーザビームを受ければ、イオン化されたマトリックスと共に飛行して真空状態で反対側にある検出器まで飛行するのにかかる時間を計算して、質量を分析する原理によって作動する。質量の小さい物質は、検出器に速く到達するが、このように得られる質量の差と公知の一塩基多型の配列とを根拠として標的ＤＮＡの一塩基多型の配列を決定しうる。
【００５８】
前記のようなＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを使用した標的ＤＮＡの多型部位の配列を決定した結果は、表２及び表３に表した。このとき、各対立因子は、各個体において、同型接合子または異型接合子の形態で存在しうる。メンデルの遺伝法則とハーディ−ワインベルグ法則とによれば、集団を構成する対立因子の組成は、一定頻度に維持され、統計的に有意な場合、生物学的機能上の意味を付与しうる。本発明の一塩基多型は、表２及び表３に示したように、２型糖尿病患者から統計的に有意なレベルに出現されて、２型糖尿病の診断に使われるということが分かった。
【００５９】
また、表４に示したように、表２及び表３から得られる一塩基多型部位の塩基配列を組合わせた遺伝子型、すなわち、多座遺伝子型と２型糖尿病との関連性を分析した結果、２型糖尿病との関連性がとても高いと確認された。
【配列表】
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【国際調査報告】
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