(57)【要約】  本発明は、吸入により対象の肺上皮に神経ガス中和酵素を投与することによる、神経ガス中毒の非侵襲性処置を提供する。ここで、神経ガス中和酵素は肺に蓄積する。肺上皮における前記酵素の局在は、肺での神経ガスの中和を引き起こす。その結果、有機リン神経ガスが身体の細胞膜を通過して急速に拡散し、その濃度勾配を下げるという要因を背景として、神経ガスは肺毛細血管を通って血液から外に拡散することにより移動する。本発明は、血漿中への通過を必要とせず、また酵素の血漿活性を必要としない、神経ガス中和酵素を投与する実用的方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の神経ガス中毒の処置方法であって、
吸入により、前記対象の肺上皮に有効量の神経ガス中和酵素を与えることを含むことを特徴とする処置方法。
【請求項２】
請求項１に記載の処置方法において、
前記神経ガス中和酵素は、約０．０１μｍから約４μｍのサイズの粒子であることを特徴とする処置方法。
【請求項３】
請求項１に記載の処置方法において、
前記神経ガス中和酵素は、エアロゾル形態であることを特徴とする処置方法。
【請求項４】
請求項１に記載の処置方法において、
前記神経ガス中和酵素は、液体形態であることを特徴とする処置方法。
【請求項５】
請求項１に記載の処置方法において、
前記神経ガス中和酵素は、乾燥粉末形態であることを特徴とする処置方法。
【請求項６】
請求項１に記載の処置方法において、
前記神経ガス中和酵素は、さらに賦形剤を含むことを特徴とする処置方法。
【請求項７】
請求項１に記載の処置方法において、
前記神経ガス中和酵素は、噴霧器で投与されることを特徴とする処置方法。
【請求項８】
請求項１に記載の処置方法において、
前記神経ガス中和酵素は、吸入器で投与されることを特徴とする処置方法。
【請求項９】
請求項１に記載の処置方法において、
前記対象は、ヒトであることを特徴とする処置方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の処置方法において、
前記神経ガス中和酵素は、コリンエステラーゼ、アリルジアルキルホスファターゼ、有機リン酸加水分解酵素、カルボキシルエステラーゼ、トリエステラーゼ、ホスホトリエステラーゼ、アリルエステラーゼ、パラオキソナーゼ、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ、及び有機リン酸アンヒドラーゼより成るグループから選択されることを特徴とする処置方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の処置方法において、
前記神経ガス中和酵素は、ブチリルコリンエステラーゼであることを特徴とする処置方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の処置方法において、
投与量は約１５０ｍｇであることを特徴とする処置方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の処置方法において、
前記神経ガス中和酵素は、アセチルコリンエステラーゼであることを特徴とする処置方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載の処置方法において、
前記神経ガス中和酵素は、アセチルコリンエステラーゼであることを特徴とする処置方法。
【請求項１５】
請求項１０に記載の処置方法において、
前記神経ガス中和酵素は、カルボキシルエステラーゼであることを特徴とする処置方法。
【請求項１６】
請求項１０に記載の処置方法において、
前記神経ガス中和酵素は、アリルジアルキルホスファターゼであることを特徴とする処置方法。
【請求項１７】
請求項１０に記載の処置方法において、
前記神経ガス中和酵素は、有機リン酸加水分解酵素であることを特徴とする処置方法。
【請求項１８】
請求項１０に記載の処置方法において、
前記神経ガス中和酵素は、トリエステラーゼであることを特徴とする処置方法。
【請求項１９】
請求項１０に記載の処置方法において、
前記神経ガス中和酵素は、ホスホトリエステラーゼであることを特徴とする処置方法。
【請求項２０】
請求項１０に記載の処置方法において、
前記神経ガス中和酵素は、アリルエステラーゼであることを特徴とする処置方法。
【請求項２１】
請求項１０に記載の処置方法において、
前記神経ガス中和酵素は、パラオキソナーゼであることを特徴とする処置方法。
【請求項２２】
請求項１０に記載の処置方法において、
前記神経ガス中和酵素は、ジイソプロピルフルオロホスファターゼであることを特徴とする処置方法。
【請求項２３】
請求項１０に記載の処置方法において、
前記神経ガス中和酵素は、有機リン酸アンヒドラーゼであることを特徴とする処置方法。
【請求項２４】
哺乳類の肺系統への神経ガス中和酵素の送達のための薬学的剤形であって、
前記剤形は、治療効果のある量のコリンエステラーゼ、及び薬学的許容担体あるいは希釈剤を含み、
前記剤形は、吸入器あるいは噴霧器に収容されることを特徴とする薬学的剤形。
【請求項２５】
請求項２４に記載の薬学的剤形において、
前記神経ガス中和酵素は、約０．０１μｍから約４μｍの粒子サイズを有することを特徴とする薬学的剤形。
【請求項２６】
請求項２４に記載の薬学的剤形において、
前記剤形は、エアロゾル形態であることを特徴とする薬学的剤形。
【請求項２７】
請求項２４に記載の薬学的剤形において、
前記剤形は、液体であることを特徴とする薬学的剤形。
【請求項２８】
請求項２４に記載の薬学的剤形において、
前記剤形は、乾燥粉末であることを特徴とする薬学的剤形。
【請求項２９】
請求項２４に記載の薬学的剤形において、
前記剤形は、さらに賦形剤を含むことを特徴とする薬学的剤形。
【請求項３０】
請求項２４に記載の薬学的剤形において、
前記哺乳類は、ヒトであることを特徴とする薬学的剤形。
【請求項３１】
請求項２４に記載の薬学的剤形において、
さらにカルバメート、抗ムスカリン作用薬、コリンエステラーゼ再活性化薬、あるいは抗痙攣剤を含むことを特徴とする薬学的剤形。
【請求項３２】
請求項２４に記載の薬学的剤形において、
前記神経ガス中和酵素は、コリンエステラーゼ、アリルジアルキルホスファターゼ、有機リン酸加水分解酵素、カルボキシルエステラーゼ、トリエステラーゼ、ホスホトリエステラーゼ、アリルエステラーゼ、パラオキソナーゼ、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ、及び有機リン酸アンヒドラーゼより成るグループから選択されることを特徴とする薬学的剤形。
【請求項３３】
請求項３２に記載の薬学的剤形において、
前記神経ガス中和酵素は、ブチリルコリンエステラーゼであることを特徴とする薬学的剤形。
【請求項３４】
請求項３２に記載の薬学的剤形において、
前記神経ガス中和酵素は、アセチルコリンエステラーゼであることを特徴とする薬学的剤形。
【請求項３５】
請求項３２に記載の薬学的剤形において、
前記神経ガス中和酵素は、アリルジアルキルホスファターゼであることを特徴とする薬学的剤形。
【請求項３６】
請求項３２に記載の薬学的剤形において、
前記神経ガス中和酵素は、パラオキソナーゼであることを特徴とする薬学的剤形。
【請求項３７】
請求項３２に記載の薬学的剤形において、
前記神経ガス中和酵素は、カルボキシルエステラーゼであることを特徴とする薬学的剤形。
【請求項３８】
請求項３２に記載の薬学的剤形において、
前記神経ガス中和酵素は、有機リン酸加水分解酵素（ＯＰＨ）であることを特徴とする薬学的剤形。
【請求項３９】
請求項３２に記載の薬学的剤形において、
前記神経ガス中和酵素は、トリエステラーゼであることを特徴とする薬学的剤形。
【請求項４０】
請求項３２に記載の薬学的剤形において、
前記神経ガス中和酵素は、ホスホトリエステラーゼであることを特徴とする薬学的剤形。
【請求項４１】
請求項３２に記載の薬学的剤形において、
前記神経ガス中和酵素は、アリルエステラーゼであることを特徴とする薬学的剤形。
【請求項４２】
請求項３２に記載の薬学的剤形において、
前記神経ガス中和酵素は、ジイソプロピルフルオロホスファターゼであることを特徴とする薬学的剤形。
【請求項４３】
請求項３２に記載の薬学的剤形において、
前記神経ガス中和酵素は、有機リン酸アンヒドラーゼであることを特徴とする薬学的剤形。
【請求項４４】
哺乳類の肺系統へのコリンエステラーゼの送達のための薬学的剤形であって、
約０．０１μｍから約４μｍの直径を有するコリンエステラーゼ粒子、及び薬学的許容希釈剤あるいは担体を含むことを特徴とする薬学的剤形。
【請求項４５】
請求項４４に記載の薬学的剤形において、
前記粒子は、直径が約１μｍであることを特徴とする薬学的剤形。
【請求項４６】
請求項４４に記載の薬学的剤形において、
前記剤形は、エアロゾルであることを特徴とする薬学的剤形。
【請求項４７】
請求項４４に記載の薬学的剤形において、
前記剤形は、乾燥粉末であることを特徴とする薬学的剤形。
【請求項４８】
請求項４４に記載の薬学的剤形において、
前記神経ガス中和酵素は、ブチリルコリンエステラーゼであることを特徴とする薬学的剤形。
【請求項４９】
請求項４４に記載の薬学的剤形において、
前記神経ガス中和酵素は、アセチルコリンエステラーゼであることを特徴とする薬学的剤形。
【請求項５０】
請求項４４に記載の薬学的剤形において、
前記神経ガス中和酵素は、パラオキソナーゼであることを特徴とする薬学的剤形。
【請求項５１】
請求項４４に記載の薬学的剤形において、
前記神経ガス中和酵素は、カルボキシルエステラーゼであることを特徴とする薬学的剤形。
【請求項５２】
請求項４４に記載の薬学的剤形において、
前記神経ガス中和酵素は、有機リン酸加水分解酵素（ＯＰＨ）であることを特徴とする薬学的剤形。
【請求項５３】
請求項４４に記載の薬学的剤形において、
前記神経ガス中和酵素は、トリエステラーゼであることを特徴とする薬学的剤形。
【請求項５４】
請求項４４に記載の薬学的剤形において、
前記神経ガス中和酵素は、ホスホトリエステラーゼであることを特徴とする薬学的剤形。
【請求項５５】
請求項４４に記載の薬学的剤形において、
前記神経ガス中和酵素は、ジイソプロピルフルオロホスファターゼであることを特徴とする薬学的剤形。
【請求項５６】
請求項４４に記載の薬学的剤形において、
前記神経ガス中和酵素は、有機リン酸アンヒドラーゼであることを特徴とする薬学的剤形。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００４年８月２０日に出願された仮出願６０／６０３１８６号に基づく優先権を主張し、その内容は全体で参照することにより組み込まれている。
【０００２】
本発明は、吸入による、哺乳類の肺系統への神経ガス（ｎｅｒｖｅ  ａｇｅｎｔ）中和酵素の投与を含む、神経ガス中毒の処置方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
有機リン酸化合物の戦争における使用、及び農薬（殺虫剤）としての使用は、過去４０年で、末梢神経系及び中枢神経系の損傷、筋疾患、精神病、進行麻痺、及び死に至る、急性及び遅発性の中毒の増加をもたらした。年間５０万から１００万の農薬関連中毒のうち１９０００人が死に至っていると推定されている。これらの明らかな症状に加えて、有機リン酸メチルパラチオン（ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｃ  ｍｅｔｈｙｌ  ｐａｒａｔｈｉｏｎ）の投与が、マウス及びラットの両方で成長を抑制して骨化を誘導したこと、及びヒトにおける奇形と胎児死亡を引き起こし得ることが動物実験によって示された。
【０００４】
これらのコリンエステラーゼ阻害物質は、アセチルコリンの分解を妨げ、神経系の活動亢進に至る蓄積をもたらす。アセチルコリンは破壊されず、ムスカリン受容体部位（外分泌腺、及び平滑筋）、及びニコチン性受容体部位（骨格筋）を刺激し続ける。コリンエステラーゼ阻害物質への暴露は、コリンエステラーゼ阻害物質のタイプと量に依存して、軽度（攣縮（ｔｗｉｔｃｈｉｎｇ）、振戦（ｔｒｅｍｂｌｉｎｇ））から重度（呼吸麻痺（ｐａｒａｌｙｚｅｄ  ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）、痙攣（ｃｏｎｖｕｌｓｉｏｎｓ））の症状、極端な場合には死を引き起こすことができる。有機リン酸塩やカルバメート等のコリンエステラーゼ阻害物質の作用は、昆虫や他の害虫を管理するための農薬として非常に効果的である。残念ながら、ヒトがこれらの化合物を吸い込むか、あるいはそうでなければ暴露された場合には、同じ悪影響を受ける。血中コリンエステラーゼ活性が正常時の２０から５０％の場合には軽度の中毒となり、血中コリンエステラーゼ活性が正常時の１０から２０％の場合には中程度の中毒となり、重度の中毒では血中コリンエステラーゼ活性が正常時の１０％未満という特徴がある。血中コリンエステラーゼ活性レベルが正常時の２０％を下回った場合には深刻な神経筋作用が観察され、０に近いレベルでは通常致命的である。
【０００５】
実際、特定のコリンエステラーゼ阻害物質のヒトへの甚大な影響が、“神経ガス”、あるいは化学兵器としてのこれらの化合物の開発につながった。神経ガスは、最も有毒な化学兵器である。これらの化合物は、両方ともリン酸のエステルであるという点で、有機リン殺虫剤と関連する。主要な神経ガスは、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）、ＧＡ（タブン）、ＧＢ（サリン）、ＧＤ（ソマン）、ＧＦ（シクロサリン）、ＧＥ、ＣＶ、ｙＥ、ＶＧ（アミトン）、ＶＭ、ＶＲ（ＲＶＸ、あるいはロシア製ＶＸ）、ＶＳ、及びＶＸである。神経ガスは、その物理的性質と毒性に基づいて、ＣシリーズあるいはＶシリーズに分類される。Ｃシリーズ神経ガスは、室温で揮発性の液体であり、液体あるいは気体状態で用いることができる。ＶＸ等の１／２シリーズ神経ガスは、生地、機材、及び領域に長期間留まっていられる持続性液体物質である。Ｖシリーズ神経ガスは、通常Ｃシリーズ神経ガスよりもより有毒である。温暖な条件下で、神経ガスは無色透明な液体であり、検出が困難である。
【０００６】
有機リン中毒の本処置は、カルバメート（例えば、ピリドスチグミン）、抗ムスカリン（例えば、アトロピン）、及び塩化プラリドキシム（２−ＰＡＭ、Ｐｒｏｔｏｐａｍ）等のＣｈＥ再活性化剤を含む薬剤の種々の組み合わせの、暴露後静脈内投与あるいは暴露後筋肉内投与より成る。抗痙攣剤（例えば、ジアゼパム）もまた投与され得る。この投薬計画は、有機リン中毒による死亡を防ぐのに有効であるが、痙攣、行動欠損、あるいは恒久的な脳損傷を防ぐには有効ではない。さらに、従来の送達システムを用いて解毒剤を投与することができる前に、たとえ有機リン酸化学兵器の少量の投与であっても取り返しのつかない急性中毒を引き起こすことができるため、暴露後投薬計画はしばしば役に立たない。
【０００７】
これらの欠点が、有機リン酸暴露の処置に対するコリンエステラーゼ酵素の研究につながった。暴露後毒性は、有毒な有機リン酸塩がその生理学的標的に到達する前に隔離するように働くコリンエステラーゼでの前処理により抑えることができる。
【０００８】
前処理薬としてのコリンエステラーゼの使用は、非ヒト霊長類を含む動物において、成功裏に立証された。例えば、ウシ胎児血清由来ＡＣｈＥあるいはウマ血清由来ＢＣｈＥでのアカゲザルの前処理は、化学兵器として用いられる毒性の強い有機リン酸化合物であるピナコリル  メチルホスホノフルオリデート（ソマン）のＬＤ５Ｏの２から５回の試験（Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に対して、アカゲザルを保護した（非特許文献１、非特許文献２）。死亡率の抑制に加えて、前記前処理は、連続プローブ認識タスク（ｓｅｒｉａｌ  ｐｒｏｂｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｔａｓｋ）あるいは平衡プラットフォームパフォーマンスタスク（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｔａｓｋ）による測定で、ソマン試験後の行動不能を防いだ。十分な外因性ヒトＢＣｈＥの投与により、多数の致死量の有機リン中毒からマウス、ラット、及びサルを保護することができる（例えば、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５参照）。精製ヒトＢＣｈＥは、重大な免疫学的あるいは精神的副作用を伴わずにヒトにおける有機リン中毒を処置するために、用いられている（非特許文献６）。
【０００９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ双方での有機リン酸塩の滴定が、有機リン酸塩抑制酵素と毒性神経ガスの蓄積量との間の１：１化学量論を明示している。有機リン酸剤によるＣｈＥの阻害は、有機リン酸塩のＣｈＥ活性部位セリンとの安定化学量論的（１：１）共有抱合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の形成による。共有抱合に続いて、“エイジング（ａｇｉｎｇ）”と呼ばれる並発競合反応が起こり、ここで抑制されたＣｈＥは、一般的に用いられる再活性化剤によって再生することができない形状に変形する。これらの再活性化剤、例えば活性部位に向けられる求核剤（例えば、第四（ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ）オキシム）は通常、活性部位セリンのヒドロキシル基からリン酸部分を分離する。エイジングプロセスは、共有結合している有機リン酸基の脱アルキルが関連すると考えられ、サリン、ソマン、及びＤＦＰ等の特定の有機リン酸塩による中毒の治療を非常に困難にしている。
【００１０】
他の酵素もまた、神経ガスの中和に関して証明された有効性を持つ。これらの酵素は、アリルジアルキルホスファターゼ（ＥＣ３．１．８．１）、有機リン酸加水分解酵素（ＯＰＨ）、カルボキシルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．１）、トリエステラーゼ、ホスホトリエステラーゼ、アリルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．２）、パラオキソナーゼ、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ（ＤＦＰａｓｅｓ、ＥＣ３．１．８．２）、及び有機リン酸アンヒドラーゼ（ＯＰＡＨ）を含む。カルボキシルエステラーゼの特定の型は、サリン及びソマン等の神経ガスを加水分解することが示されており、また農薬に対する免疫を与えることが示されている（非特許文献７）。パラオキソナーゼは、有機リン酸代謝における役割を示し、また有機リン中毒に対する耐性を与える（非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、特許文献１）。同様に、トリエステラーゼ及びホスホトリエステラーゼが有機リン酸化合物を加水分解することが示されている（非特許文献１２、非特許文献１３）。コリンエステラーゼとは異なり、これらの酵素は１：１化学量論を示さず、有機リン酸化合物によりエイジングせず、あるいは不活性化されず、むしろ酵素的に振舞う。
【００１１】
有機リン酸剤による中毒は、化学戦争の状況で致死量のこれらの化合物にさらされ得る軍人が直面する重大な問題である。ＢＣｈＥの静脈内及び筋肉内投与が有効であることが示されているが、戦場においては、これらは実用的な薬剤送達の方法ではない。神経ガスを中和するための代替送達システムに対する要求の増大が、米陸軍による中小企業イノベーション研究（ｓｍａｌｌ  ｂｕｓｉｎｅｓｓ  ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ）（ＳＢＩＲ）提案書により示されている（国防総省  ２００２．２  ＳＢＩＲ提案書  Ａ０２−１８２、２００２年５月２日、バイオスカベンジャー投与用ヒト適合性無針送達システムの開発）。前記提案書は、タンパク質を基にした薬剤、特に高分子量タンパク質用の針を用いた送達システムの代替案を模索している。特に、前記提案書は、例えばＢＣｈＥ等の酵素の約２００ｍｇを４から５の吸入で行うような、肺を介した全身投与の送達が可能なＢＣｈＥ製剤を模索している。また前記提案書は、酵素を循環系へ送達するための肺送達システムの潜在的有効性を測定することを追及している。したがって、この提案は、投与された酵素の血漿活性に向けられている。
【００１２】
巨大タンパク質の肺送達における主な障害は、肺上皮を介した吸収率が悪いことである。前述の神経ガス中和酵素は、その大きさと脂質不溶性とが原因で、皮膚、消化管あるいは肺上皮を通過しない巨大オリゴマータンパク質分子である。同様に、血中の酵素は、肺上皮を横断して、気体神経ガスの吸収の初期部位である肺には至らないであろう。これらの制限のために、現在の理解のもとでの神経ガスに対する酵素の投与は、静脈内あるいは筋肉内注射を必要とする。他の技術、例えばパッチ技術は、皮膚及び他の膜を横断する拡散係数が低く、パッチへの実行不可能なほどに大量の酵素の投与が必要なため、現在のところ実行不可能である。
【００１３】
したがって、神経ガスを中和することができる酵素を非侵襲的に投与する効果的方法に対する継続的な要求がある。
【特許文献１】米国特許第５６２９１９３号明細書
【非特許文献１】Ｂｒｏｏｍｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９１，２５９：６３３−６３８
【非特許文献２】Ｗｏｌｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｘｉｃｏｌ，Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，１１７（２）：１８９−１９３
【非特許文献３】Ｒａｖｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９３，４２：２４６５−２４７４
【非特許文献４】Ｒａｖｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９７，１４５：４３−５３
【非特許文献５】Ａｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｓｅｉ．，１９９８，４３：１２１−１２８
【非特許文献６】Ｃａｓｃｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｎｅｒｖａ  Ａｎｅｓｔｅｓｉｏｌ．，１９９８，５４：３３７
【非特許文献７】Ｒ．Ｄ．Ｎｅｗｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ，１９９７，９４：７４６４−７４６８
【非特許文献８】Ｊ．Ｅ．Ｈｕｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９９，４７：１３５−１４３
【非特許文献９】Ｌ．Ｃ．Ｃｏｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ，２００３，８：１−１２
【非特許文献１０】Ｃ．Ｈａｓｓｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９１，３０：１０１４１−１０１４９
【非特許文献１１】Ｓ．Ａｋｇｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｅｉ．ｍｔ．，２００３，１３３（１−２）：１３６−１４０
【非特許文献１２】Ｍ．Ｓｏｇｏｒｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２００４，１５１（１）：２１９−２３３
【非特許文献１３】Ｄ．Ｄｕｍａｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，２６４（３３）：１９６５９−１９６６５
【発明の開示】
【００１４】
（発明の簡単な要約）
前述のとおり、現在の神経ガス中毒の治療法は、ある条件下では問題となり得る、また実行不可能であり得る、血流中への神経ガス中和酵素の投与を必要とする。本発明は、神経ガスを処置するための治療酵素の肺蓄積が問題ではなくて、むしろ解決法であるという認識を伴い、本発明は、以下に詳細に説明される、酵素が肺上皮上で効果的に働くために全身に酵素を送達する必要がないという認識に起因する。本発明は、吸入による神経ガス中和酵素の投与による、神経ガスの非侵襲的処置を提供し、ここで前記酵素は肺内に蓄積する。本発明は、血漿中への通過を必要とせず、また酵素の血漿活性を必要としない、神経ガス中和酵素を投与する実用的方法を提供する。
【００１５】
したがって、本発明は、有効量の神経ガス中和酵素を与え、例えば吸入により肺上皮に神経ガス中和酵素を送達することを含む、対象における神経ガス中毒の処置方法に向けられる。好ましい対象はヒトであるが、他の哺乳類、及び大量の血液接触をもたらす発達した肺をもつ動物は、本発明により処置することができる。
【００１６】
好ましい実施例において、神経ガス中和酵素は、約０．０１μｍから約４μｍ、好ましくは約０．５μｍから約１μｍのサイズの粒子である。より好ましい実施例において、神経ガス中和酵素粒子は、約１μｍである。
【００１７】
特定の実施例において、神経ガス中和酵素はエアロゾル形態である。さらなる実施例において、神経ガス中和酵素はさらに賦形剤を含む。他の特定の実施例において、神経ガス中和酵素は、吸入器、特に定量吸入器を用いて投与される。
【００１８】
または、神経ガス中和酵素は液体形態である。このような実施例では、神経ガス中和酵素はさらに賦形剤を含み得る。本発明のこの態様のさらなる実施例において、神経ガス中和酵素は吸入器あるいは噴霧器を用いて投与される。
【００１９】
さらに別の実施例において、神経ガス中和酵素は乾燥粉末形態である。この実施例において、神経ガス中和酵素はさらに賦形剤を含み得る。さらなる実施例において、神経ガス中和酵素は吸入器を用いて投与される。
【００２０】
他の実施例において、神経ガス中和酵素は、コリンエステラーゼ、アリルジアルキルホスファターゼ、有機リン酸加水分解酵素（ＯＰＨ）、カルボキシルエステラーゼ、トリエステラーゼ、ホスホトリエステラーゼ、アリルエステラーゼ、パラオキソナーゼ、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ、及び有機リン酸アンヒドラーゼより成るグループから選択される。好ましくは、有機リン酸加水分解酵素（ＯＰＨ）、カルボキシルエステラーゼ、トリエステラーゼ、ホスホトリエステラーゼ、パラオキソナーゼ、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ、あるいは有機リン酸アンヒドラーゼは、約０．１ｍｇから約３０ｍｇ、より好ましくは約１ｍｇから約５ｍｇの投与で送達され得る。
【００２１】
特定の実施例において、神経ガス中和酵素はコリンエステラーゼである。例えば、以下に例示されるように、神経ガス中和酵素はブチリルコリンエステラーゼであり得る。コリンエステラーゼは、約１ｍｇから約２５０ｍｇ、より好ましくは約２５ｍｇから約１５０ｍｇの投与で送達され得る。
【００２２】
他の実施例において、本発明は、哺乳類の肺系統への神経中和酵素の送達用の薬学的剤形（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍ）に向けられる。前記剤形は、治療効果のある量の酵素と薬学的許容担体あるいは希釈剤（ｄｉｌｕｅｎｔ）を含み、ここで前記剤形は、吸入器あるいは噴霧器に収容される。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
神経ガス中和酵素の吸入による投与と肺上皮での前記酵素の局在が、肺の毛細血管を通った血液からの拡散による神経ガスの中和をもたらすことが、発見されている。有機リン酸神経ガスは、拡散により身体の細胞膜を通って急速に拡散し、その濃度勾配を下げるように特別に設計されている。肺上皮細胞の内腔表面上の肺胞液に溶解した神経ガス中和酵素は、その神経ガスと反応する能力のために、ｓｔｏｉｅｈｅｏｍｅｔｒｉｃａｌに、あるいは触媒的に、呼吸器の細胞膜の内腔側における神経ガスのレベルを、非常に低レベルに保つ。これは、血液からの神経ガスについて拡散勾配を作り出す。その結果、神経ガスは血液から外に出て、神経ガス中和酵素の血流への侵入を必要とせずに、肺上皮で中和される。
【００２４】
肺上皮細胞の内腔表面上の肺胞液中に存在する神経ガス中和酵素はまた、吸入した神経ガスが血液中に吸収される前に、呼吸器の細胞膜において不活性化する化学的バリアを作り出す。したがって、神経ガスを吸入した場合、神経ガスの蓄積がなく、そのため多量の神経ガスが血液中に入ることもなく、毒性作用を引き起こさない。
【００２５】
したがって、本発明にしたがって、また現在の理解に反して、神経ガス中和酵素が機能するためには循環系に侵入する必要はない。本発明は、神経ガスの指向性の高い運動の自由度と、神経ガス中和酵素がその大きさのためにもっぱら肺の先端面に留まることに依存する。神経ガス中和酵素は比較的高分子量であり、疎油性であるため、呼吸器の細胞膜を通過して血液中に侵入し拡散することが妨げられる。
【００２６】
要するに、神経ガス中和酵素はその保護効果を発揮するために血液中に侵入する必要がなく、したがって、肺細胞膜を横断する必要がない。その親油性（脂溶性）のために細胞膜を自由に横断するのは、神経ガスである。
【００２７】
肺の双方向移動の概念は、この分野においてよく知られている。例えば、手術中は、ハロタン等の麻酔が肺に吸入される。麻酔薬は即座に呼吸器の細胞膜を横断し、その濃度勾配を下げ、血液及び脳に移動する。手術が完了すると、麻酔投与が中断され、その結果酸素が供給されて肺におけるハロタンの分圧が下がる。これは、血液から肺内腔への濃度勾配を作り出し、これにより麻酔の血液から肺内腔への拡散が起こり、麻酔は吐き出される。ハロタンのような吸入された麻酔薬の除去の８０％以上は、呼気によるものである。ハロタン分子は、拡散により中枢神経から除去され、血液に入り、その後肺で排出される（Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１９８０，ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【００２８】
分子の拡散の大きさと方向は、数学的には以下のように現される。
【００２９】
Ｍ＝ＣＡ（Ｄ１−Ｄ２）／Ｈ
ここで、Ｍは拡散する物質の質量、Ｃは拡散計数、Ａは拡散面の面積、Ｄ１は膜の片側における物質の濃度、Ｄ２はＤ１の反対側における物質の濃度、Ｈは拡散膜の厚さである。
【００３０】
この方程式を、肺を介した身体からの神経ガスの除去に以下の方式で適用する。Ｍを最大にするために、拡散のための表面積（Ａ）が大きいこと、拡散しやすい物質（Ｃ）の高い濃度勾配（Ｄ１−Ｄ２）、及びできるだけ薄い膜（Ｈ）であることが望ましい。肺は、極めて薄い呼吸器細胞膜であって非常に大きな表面積を有する。神経ガスは、拡散係数（Ｃ）が大きく、素早く呼吸器細胞膜を横断するように特別に設計された。したがって、腺胞腔（肺胞内腔）上の神経ガス中和酵素の存在は、神経ガスの濃度（Ｄ２）がゼロに近づくのを確実なものとし、そのため常に、呼吸器細胞膜を通過して血液から神経ガスが容易に抽出されて（Ｄ１）肺内腔へ至り、ここで神経ガスは蓄積した神経ガス中和酵素によって破壊される。
【００３１】
肺は多くの理由から、神経ガス酵素不活性化に望ましい部位である。肺は広い表面積を備え、ヒト呼吸器細胞膜は平均７０平方メートルである。呼吸器細胞膜は非常に薄く、高分子が拡散するように設計されており、０．２μｍ程度の薄さの部分もあり、平均厚は０．５μｍである。肺内腔は血液と直接接触しておらず、そのため肺上皮細胞に局在する酵素は、繰り返し投与のうえで、抗体により不活性化される可能性が低い。また肺は十分に血管が発達し、十分にかん流されるため、大量の血漿と接触することができる。したがって、肺上皮に蓄積した神経ガス中和酵素は、血漿からの大量の神経ガスと接触した状態となる。圧迫中は、心拍出量は上昇し、肺のかん流はさらに増加するため、神経ガスの不活性化は加速する。
【００３２】
本発明の方法は、現在の神経ガス中毒治療に数々の利点をもたらす。本発明は、神経ガス中和酵素を静脈内あるいは筋肉内注射により投与する必要がなく、これは、針と注射器の使用が現実的でない状況、例えば対象が化学防護服を着用している場合において、利点となり得る。肺投与はまた、反復投与の自己管理を可能とし、また専門的な技術の必要性や、例えば戦場において得られないであろう医療関係者の存在の必要性を排除できる。また、個々の投与量サイズはカスタマイズすることが可能であるため、個別基準で作用するような投与が可能であり、毒性が悪化するような場合には追加投与が可能である。吸入器や噴霧器等の、現在の肺送達装置は携帯できて使いやすく、吸入毎に薬剤を３０ｍｇまで送達可能である。しかしながら、実際にはより少量の例えば５ｍｇまでのものがより一般的である。実際、反復投与を肺に送達する能力は、現在の肺送達技術の実用性と制限を克服する。さらに、挿管及び機械換気は、幼児、小児、及び重病あるいは再起不能を患う患者への神経ガス中和酵素の導入に用いることができる。
【００３３】
本発明の方法のさらなる利点は、処置効果の速度である。全ての皮膚神経ガスは、皮膚を通過して、肺系統を経て、あるいは消化管を経て体内に侵入する。いったん血流に入ると、神経ガスは肺循環により最初に肺に進む。ここで神経ガスは、その後血液が体全体に広がる前に、蓄積した神経ガス中和酵素により破壊され得る。前述のように、肺投与はまた、主に肺経路を介して身体に侵入する、サリン等の高い蒸気圧の神経ガスの直接中和を可能にする。
【００３４】
本発明の方法のさらなる利点は、神経ガス中和酵素の半減期の延長である。前述のとおり、先端面への肺投与は肺白血球との接触を回避し、そのため肺のマクロファージの活動が制限され、免疫原生を抑え得る。これは、反復投与の間の神経ガス中和酵素の免疫学的不活性化を制限し、神経ガス中和酵素の非ヒト型の使用を可能にし得る。
【００３５】
凍結乾燥粉末の形態の神経ガス中和酵素は、長期間の安定性を有し、これは前方展開したグループや緊急救援団にとって重要な点である。なぜならば、備蓄薬は前方配備されるが、何年も使用されない場合があるからである。また、神経ガス中和酵素は血流中に侵入する必要がないため、血液中での神経ガス中和酵素の半減期はそれほど重要ではない。
【００３６】
定義
以下に定義される用語は、本明細書の全体で用いられ、本発明の範囲と実施の理解に役立つであろう。
【００３７】
「吸入」、あるいは「肺投与」は、例えば吸入器あるいは噴霧器の使用による、肺上皮への投与を意味する。剤形はエアロゾル化した粒子を採用し得るか、あるいはエアロゾル化剤を含み得る。または剤形は、乾燥粉末及び随意的に賦形剤を採用し得る。または剤形は、液体及び随意的に賦形剤を採用し得る。
【００３８】
「エアロゾル化した」は、投与されたものが実際に鼻腔あるいは肺の粘膜に到達するのを確実にするために、化合物が液体あるいは固体粒子に分解されることを意味する。「エアロゾル粒子」という用語は、鼻腔あるいは肺投与に適した、すなわち粘膜に到達する、液体あるいは固体粒子を表現するために、ここで用いられる。
【００３９】
「肺送達装置」は、肺投与、すなわち肺の粘膜に到達する投与用の装置を意味する。一例として、肺送達装置は、定量吸入器あるいは乾燥粉末吸入器等の吸入器、及び噴霧器を含むがこれらに限定されない。肺送達装置は、推進剤あるいはエアロゾル化剤を使用し得る。
【００４０】
「神経ガス」は、一般的に化学合成あるいは自然源からの抽出により調製される物質であって、例えば本発明の背景技術の欄において論じられたように、そのコリンエステラーゼとの高い反応性及び阻害作用のために、吸入、吸収、摂取あるいはそうでなければ接触した場合に、生物に対して有害な、あるいは望ましくない影響をもたらし得る。これらの神経ガスは、背景技術の欄において論じられた全ての物質、例えば、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）、ＧＡ（タブン）、ＧＢ（サリン）、ＧＤ（ソマン）、ＧＦ（シクロサリン）、ＧＥ、ＣＶ、ｙＥ、ＶＧ（アミトン）、ＶＭ、ＶＲ（ＲＶＸ、あるいはロシア製ＶＸ）、ＶＳ、ＶＸ、及びこれらの組み合わせ等の有機リン酸化合物を含む。前記列挙は例示であって、限定するものではない。
【００４１】
「神経ガス中毒」は、神経ガスあるいは有機リン農薬に暴露された生物に対する有害な、あるいは望ましくない影響を意味する。有機リン農薬は、アセフェート、アジンホスメチル、ベンスリド、カズサホス、クロルエトキシホス、クロルピリホス、クロルピリホスメチル、クロルチオホス、クマホス、ダイアリフロール（ｄｉａｌｉｆｌｏｒ）、ダイアジノン、ジクロルボス（ＤＤＶＰ）、ジクロトホス、ジメトエート、ジオキサチオン、ジスルホトン、エチオン、エトプロップ、エチルパラチオン、フェナミホス、フェニトロチオン、フェンチオン、ホノホス、イサゾホスメチル、イソフェンホス、マラチオン、メタミドホス、メチダチオン、メチルパラチオン、メビンホス、モノクロトホス、ナレド、オキシデメトンメチル、ホルート、ホサロン、ホスメット、ホスファミドン、ホステバピリム、ピリミホスメチル、プロフェノホス、プロペタンホス、スルホテップ、スルプロホス、テメホス、テルブホス、テトラクロルビンホス、トリブホス（ＪＤＥＦ）、トリクロルホンを含む。前記列挙は例示であって、限定するものではない。
【００４２】
「神経ガス中和酵素」は、神経ガスあるいは有機リン農薬の毒性を軽減することができるタンパク質あるいはポリペプチドを意味する。または、神経ガス中和酵素は、神経ガスへの暴露によって引き起こされた宿主の臨床的に深刻な状態を改善することができるタンパク質あるいはポリペプチドであり得る。これらの酵素は、背景技術の欄において論じされた全ての酵素、例えばコリンエステラーゼ、アリルジアルキルホスファターゼ、有機リン酸加水分解酵素（ＯＰＨ）、カルボキシルエステラーゼ、トリエステラーゼ、ホスホトリエステラーゼ、アリルエステラーゼ、パラオキソナーゼ、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ、有機リン酸アンヒドラーゼ、及びこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００４３】
「治療効果のある量」という語句は、ここでは、宿主の臨床的に深刻な状態を改善することができるのに十分な量を意味するように用いられる。例えば、治療効果のある量は、やく１５パーセント、好ましくは約５０パーセント、より好ましくは約９０パーセント軽減するのに十分な量であり、また、最も好ましくは、宿主の活性、機能及び反応における臨床的に深刻な欠損を予防するのに十分な量であり得る。
【００４４】
「粒子サイズ」という用語は、おおよそ粒子の直径を意味し、粒子が球形でない場合には粒子の最長軸方向の距離を意味する。当然のことながら、顕微鏡スケールでは、乾燥粉末粒子は不ぞろいな形である。
【００４５】
本願では、「薬学的許容（薬学的に許容される）」という語句は、一般的に安全とみなされる分子的実体及び組成、例えば、生理学的に寛容であり、ヒトに投与された場合にアレルギー反応や、異常亢進、目まい等の有害反応を通常もたらさない分子的実体及び組成を示す。好ましくは本願では、「薬学的許容（薬学的に許容される）」という用語は、連邦あるいは州政府の監督官庁に認可されたもの、もしくは、米国薬局方または動物、特にヒトで用いる他の一般的に認識された薬局方に記載されたものを意味する。「担体」という用語は、希釈剤、アジュバント、賦形剤あるいは化合物とともに投与される媒体を示す。前記薬剤提供体（ｃａｔｅｒ）は、水及び、石油、動物、植物由来のあるいは合成起源の油、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ごま油等を含む油等の滅菌液であり得る。水、あるいは水溶液、食塩水、及び含水Ｄ形グルコース及びグリセリン溶液は、好んで担体として用いられ、特に注射液用の担体として用いられる。適当な薬学的担体は、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎのＲｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに開示される。
【００４６】
本願では、「対象」という用語は、哺乳類（例えば、マウスあるいはラット等のげっ歯目、ブタ、霊長目、伴侶動物（例えばイヌ、ネコ等））を示す。特に、前記用語は、ヒトを示す。
【００４７】
「約」、及び「おおよそ」という用語は、この分野における通常の知識を有する者により測定された特定の値に対する許容できる誤差範囲内であることを意味し、その値の測定あるいは決定方法、すなわち測定システムの限界にある程度依存するものである。例えば「約」は、この分野における慣習毎の許容できる標準偏差の範囲内であることを意味し得る。または「約」は、任意の値の±２０％まで、好ましくは±１０％まで、より好ましくは±５％まで、またより好ましくは＋１％までの範囲を意味し得る。または、特に生物学的システムあるいはプロセスに関しては、前記用語は、任意の規模（ｏｒｄｅｒ  ｏｆ  ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）の範囲内、好ましくは任意の値の２倍の範囲内を意味し得る。ここで、特定の値が本願、特許請求の範囲に記載されるが、特に明記しない限り、前記用語「約」は黙示され、この文脈において前記特定の値についての許容できる誤差範囲内であることを意味する。
【００４８】
神経ガス中和酵素
本発明は、神経ガスを中和あるいは分解することができる多数の酵素を網羅する。これらの酵素は、背景技術の欄において論じされた全ての酵素、例えばコリンエステラーゼ、アリルジアルキルホスファターゼ、有機リン酸加水分解酵素（ＯＰＨ）、カルボキシルエステラーゼ、トリエステラーゼ、ホスホトリエステラーゼ、アリルエステラーゼ、パラオキソナーゼ、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ、及び有機リン酸アンヒドラーゼを含む。一実施例において、本発明はコリンエステラーゼの使用を提供する。他の実施例において、本発明はブチリルコリンエステラーゼの使用を提供する。これらの神経ガス中和酵素は、１：１の割合で神経ガスに結合して不活性化する点で、化学量論割合で作用し得る。また、これらの神経ガス中和酵素は、神経ガスを酵素的に切断するように作用し、神経ガス中和酵素１つに対して神経ガス分子２０個、あるいはそれ以上の割合で神経ガスを不活性化し得る。また本発明は、吸入器あるいは噴霧器により投与される神経ガス中和酵素を提供する。
【００４９】
（ａ）コリンエステラーゼ
一般用語コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）は、神経インパルス伝達に関連する酵素のファミリーを示す。ＣｈＥ酵素の主な機能は、コリン作動性シナプスにおいて化合物アセチルコリンの加水分解を触媒することである。シナプスと呼ばれる電気的スイッチングセンターは、ヒト、他の脊椎動物、及び昆虫の神経系全体に見られる。筋肉、分泌腺、及びニューロンは、シナプス間でのシグナルの一定の発射により促進あるいは抑制される。刺激シグナルは、神経伝達物質アセチルコリンによって伝達され、アセチルコリンの加水分解を行うＣｈＥ酵素の作用によって中断される。これらの化学反応は非常に速い速度で連続して起こり、アセチルコリンが刺激をもたらし、ＣｈＥ酵素がシグナルを終了させる。ＣｈＥの作用により、筋肉、分泌腺、あるいは神経は休止状態に戻ることができ、必要となった場合にいつでも他の神経インパルスを受容することができる。
【００５０】
コリンエステラーゼは、その基質特異性と選択的阻害剤に対する感受性に基づいて、大きく２つのグループに分類される。アセチルコリン等のアセチルエステルを特異的に加水分解し、その酵素活性が化学抑制剤ＢＷ２８４Ｃ５  １に対して感受性を有する酵素は、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）、あるいはアセチルコリンアセチルヒドロラーゼ（ＢＣ３．１．１．７）と呼ばれる。ブチリルコリン等の他のタイプのエステルを特異的に加水分解し、その酵素活性が化学抑制剤テトライソプロピルピロホスホルアミド（ｉｓｏ−ＯＭＰＡとしても知られる）に対して感受性を有する酵素は、ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ、ＢＣ３．１．１．８）と呼ばれる。また、ＢＣｈＥは、シュードコリンエステラーゼ、あるいは非特異的コリンエステラーゼとしても知られている。ＣｈＥのさらなる分類は、電荷、疎水性、細胞膜あるいは細胞外構造物との相互作用、及びサブユニット組成に基づく。
【００５１】
真の、特異的な、純粋な、赤血球、あるいはタイプＩＣｈＥとしても知られる、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）は、膜結合型糖タンパク質であり、いくつかの分子形態で存在する。アセチルコリンエステラーゼは、赤血球、神経終末、肺、脾臓、及び脳の灰白質に見られる。原形質、血清、ベンゾイル、偽の、あるいはタイプＩＩＣｈＥとしても知られる、ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）は、１１以上のアイソザイム変異体を有し、ブチリルコリン、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ基質としてのベンゾイルコリンを特異的に用いる。ＢＣｈＥは、哺乳類の血漿、肝臓、膵臓、腸粘膜、中枢神経系の白質、平滑筋、及び心臓に見られる。ＢＣｈＥは、赤血球コリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）に対して、血清コリンエステラーゼと示されることもある。
【００５２】
ＡＣｈＥ及びＢＣｈＥは、異なる数の触媒及び非触媒サブユニットより成る、多数の分子形態の平行配置で存在する。両酵素はそれぞれ約６００個のアミノ酸配列のサブユニットより成り、ともにグリコシル化されている。ＡＣｈＥは、アセチルコリン基質に対するその高い特異性、及び選択的阻害剤に対する感受性により、近似するＢＣｈＥと区別され得る。ＡＣｈＥは、体内でアセチルコリンを加水分解するために主として用いられるが、ＢＣｈＥの特異的な機能は明らかになっていない。ＢＣｈＥもまたアセチルコリンを加水分解するが、その特異的な天然基質は知られていない。
【００５３】
「ブチリルコリンエステラーゼ酵素」あるいは「ＢＣｈＥ酵素」は、アセチルコリン及びブチルコリンを加水分解することができるポリペプチドを意味し、その触媒活性は、化学抑制剤ｉｓｏ−ＯＭＰＡにより抑制される。本発明によって提供されるべき好ましいＢＣｈＥ酵素は、哺乳類ＢＣｈＥ酵素である。好ましい哺乳類ＢＣｈＥ酵素は、ヒトＢＣｈＥ酵素を含む。また、「ＢＣｈＥ酵素」という用語は、前記ポリペプチドの薬学的許容塩を包含する。
【００５４】
「組換えブチリルコリンエステラーゼ」あるいは「組換えＢＣｈＥ」は、一過性にトランスフェクトされて生成されたＢＣｈＥ酵素、安定にトランスフェクトされて生成されたＢＣｈＥ酵素、あるいはトランスジェニック宿主細胞あるいは動物のＢＣｈＥ酵素を意味する。また「組換えＢＣｈＥ」という用語は、前記ポリペプチドの薬学的許容塩を包含する。組換えブチリルコリンエステラーゼは、この分野においてよく知られており、簡単に入手できる（Ａｒｐａｇｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９０，２９：１２４−１３１；米国特許第５２１５９０９号；Ｓｏｒｅｑ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，１９８９，２６４：１０６０８−１０６１３；Ｓｏｒｅｑ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１９８４，３（６）１３７１−１３７５）。好ましい実施例において、組換えＢＣｈＥは、トランスジェニック動物の乳汁あるいは尿から高収率に得られる（ＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０５４１８２号）。
【００５５】
ヒト血清由来のブチリルコリンエステラーゼは、おおよそ３４０ｋＤａの分子量を持つ球形の四量体分子である。９つのアスパラギン結合糖鎖が、各５７４個のアミノ酸より成るサブユニットに見られる。ＢＣｈＥの四量体構造は最も安定であり、治療目的に好ましい。この分野における通常の知識を有する者は、野生型、変異型、及び人工のＢＣｈＥ酵素を調製することができる。
【００５６】
「組換えアセチルコリンエステラーゼ」あるいは「組換えＡＣｈＥ」は、一過性にトランスフェクトされて生成されたＡＣｈＥ酵素、安定にトランスフェクトされて生成されたＡＣｈＥ酵素、あるいはトランスジェニック宿主細胞あるいは動物のＡＣｈＥ酵素を意味する。また「組換えＡＣｈＥ」という用語は、前記ポリペプチドの薬学的許容塩を包含する。組換えアセチルコリンエステラーゼは、この分野においてよく知られており、簡単に入手できる（欧州特許第１１４７５６号及び３８８９０６号）。
【００５７】
好ましくは、本発明の方法にしたがって用いられるＢＣｈＥあるいはＡＣｈＥ酵素は、それぞれ哺乳類ＢＣｈＥあるいはＡＣｈＥに見られる配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む。より好ましくは、ＢＣｈＥあるいはＡＣｈＥ配列は、それぞれヒトＢＣｈＥあるいはＡＣｈＥと実質的に同一である。本発明のＢＣｈＥは、四量体、三量体、二量体、あるいは単量体として作成され得る。好ましい実施例において、本発明のＢＣｈＥあるいはＡＣｈＥは、それぞれ野生型ヒトＢＣｈＥあるいはＡＣｈＥと実質的に類似するグリコシル化（糖鎖付加）特徴を持つ。
【００５８】
（ｂ）四量体ＢＣｈＥ
本発明において用いられるＢＣｈＥは、四量体構造であり得る。ＢＣｈＥの四量体構造はより安定であり、原形質においてより長い半減期をもたらし、そのためその治療効果を高めると思われる。ＣＲＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞中で組換えにより発現したＢＣｈＥは、より安定な四量体構造ではなく、おおよそ５５％の二量体、１０から３０％の四量体、及び１５から４５％の単量体より成っていた（Ｂｌｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９９７，３２７：７４７−７５７）。コラーゲン後部（ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｔａｉｌ）タンパク質のＮ末端由来のプロリンに富むアミノ酸配列によって、アセチルコリンエステラーゼが四量体構造に組み立てられることが、最近の研究により示された（Ｂｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，２７２（５）：３０１６−３０２１、及びＫｒｅｊｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，２７２：２２８４０−２２８４７）。したがって、四量体ＢＣｈＥ酵素の量を増加させるために、本発明のＢＣｈＥ酵素をエンコードするＤＮＡ配列は、四量体構造を形成するための組換えＢＣｈＥサブユニット（例えば、単量体、二量体及び三量体）を補充する、プロリンに富む連結ドメイン（ＰＲＡＤ）を含み得る。
【００５９】
（ｃ）非四量体ＢＣｈＥ
ＢＣｈＥの他の構造（例えば、単量体、二量体、及び三量体）は、明示された基質活性を有し、また本発明に包含される。しかしながら、ＢＣｈＥの非四量体構造がｉｎ  ｖｉｖｏではあまり安定でないという観測結果は、ｉｎ  ｖｉｖｏ適用におけるその実用性を除外するものではない。非四量体構造のＢＣｈＥの高投与量での、あるいはより高頻度でのｉｎ  ｖｉｖｏ投与によって、十分な治療活性を得ることができる。
【００６０】
（ｄ）他の神経ガス中和酵素
カルボキシルエステラーゼは、有機リン剤及び神経ガスに結合する、コリンエステラーゼに近似する酵素である。カルボキシルエステラーゼは、コリンエステラーゼと同様の化学量論的活性を示し、神経ガスに接触した場合に、同じ「エイジング」プロセスを受ける。しかしながら、カルボキシルエステラーゼの突然変異体は、有機リン酸を加水分解する能力を示し、特定の生物において神経ガスに対する抵抗性をもたらす（Ｒ．Ｄ．Ｎｅｗｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９７，９４：７４６４−７４６８）。カルボキシルエステラーゼの発現レベルは種間で異なり、そのため有機リン酸に対する抵抗性は種間で異なる。例えば、げっ歯目はヒトと比べて高レベルのカルボキシルエステラーゼを発現し、したがって有機リン中毒に対してより抵抗性がある。ここに開示されるように、この分野における通常の知識を有する者は、本発明の方法にしたがってカルボキシルエステラーゼを投与することができる。
【００６１】
パラオキソナーゼは、アリルエステラーゼとも呼ばれるが、種々の有機リン酸化合物及び神経ガスの有毒代謝物（オキソン）を加水分解する酵素である。パラオキソナーゼは主に肝臓及び血液中に見られ、種間で異なる様々なレベルの活性を示す。パラオキソナーゼの酵素活性は、有機リン酸化合物の神経毒性作用を防ぎ、神経ガスへの暴露に対する抵抗性を与えることができる（11．Ｅ．Ｈｕｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９９，４７：１３５−１４３；Ｌ．Ｇ．Ｃｏｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ，２００３，８：１−１２；Ｃ．Ｈａｓｓｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９１，３０：１０１４１−１０１４９；米国特許第５６２９１９３号）。組換えパラオキソナーゼの作成方法及びパラオキソナーゼの精製方法は、この分野においてよく知られており、パラオキソナーゼは簡単に入手できる（Ｋ．Ｎ．Ｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．，１９９１，１９（１）：１００−１０６；Ｃ．Ｈａｓｓｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９１，３０（４２）：１０１４１−１０１４９；米国特許第５６２９１９３号）。ここに開示されるように、この分野における通常の知識を有する者は、本発明の方法にしたがってパラオキソナーゼを投与することができる。
【００６２】
他の酵素、例えばトリエステラーゼやホスホトリエステラーゼは、有機リン酸化合物を加水分解するという同様の特性を有することが示されている（Ｍ．Ｓｏｇｏｒｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２００４，１５１（１）：２１９−２３３；Ｄ．Ｄｕｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，２６４（３３）：１９６５９−１９６６５）。ここに開示されるように、この分野における通常の知識を有する者は、本発明の方法にしたがってトリエステラーゼ、及びホスホトリエステラーゼを投与することができる。
【００６３】
神経ガスを分解することが知られている他の酵素は、ｓａｍ、シクロサリン、ソマン、及びＶＸを分解することが知られている、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ（ＤＦＰａｓｅ；ＥＣ３．１．８．２）を含む。ＤＦＰａｓｅ遺伝子は単離されており、組換え体はこの分野においてよく知られている（Ｈａｒｔｌｅｉｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＆  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２００１，２１：２１０−２１９；Ｒｕｔｅｒｊａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．に対するドイツ特許第ＤＥ１９８０８１９２号）。
【００６４】
肺送達装置
活性物質を投与するための肺送達装置は、この分野においてよく知られている。肺送達装置は、一般的に約０．０１μｍから約４μｍの活性成分の粒子を生成し、この粒子は対象によって吸入され得る。肺送達装置は、溶液あるいは懸濁液からの活性成分の吸入、または随意的に賦形剤と混合される乾燥粉末中の活性成分の吸入のために広く用いられている。肺送達装置の例は、定量吸入器（ＭＤＩｓ）、噴霧器、及び乾燥粉末吸入器（ＤＰＩｓ）を含むが、これらに限定されない。肺送達装置は、随意的に加圧され、また推進システムを利用し得る。また、肺送達装置は、エアロゾル化された活性物質が大気中に漏れるのを防ぎ、対象がより吸入することができるように、例えばスペーサ（ｓｐａｃｅｒｓ）等の保持チャンバーを組み込み得る。
【００６５】
肺送達装置が他の送達方法よりも多くの利点をもたらすことは、この分野においてよく知られている。肺送達装置が化合物、抗体、ポリペプチド及びタンパク質を含む活性物質を送達することで肺及び肺系統に局所的な効果をもたらすことは、よく知られている。肺送達装置は、肺上皮の表面積が大きいために、活性物質のより高い生物学的利用能を可能とし、その結果より少ない投与量とより少ない副作用をもたらす。さらに、肺送達装置は費用効率が高く、取り扱いが簡単であり、非侵襲性である。
【００６６】
本発明の方法に利用される肺送達装置は、吸入により活性化可能であり、例えば対象による吸入により活性物質を自動的に投与し、また、活性成分を包含し、随意的に推進剤を包含するエアロゾル容器とともに用いられ得る。これらの装置は、統制の下に定量を複数投与することができ、対象の気管支通過及び肺上皮への活性物質の制御され一貫した投与が可能である。肺送達装置の例は、米国特許第５２９０５３９、６６１５８２６、４３４９９４５、６４６０５３７、６０２９６６１、５６７２５８１、５５８６５５０、及び５５１１５４０号に開示され、これらは参照することにより本願に組み込まれている。
【００６７】
ＭＤＩｓは、対象に吸入される一定容量の活性物質を噴出するための推進剤を利用することで作動する。またＭＤＩｓは、活性物質の凝集を防ぐための界面活性剤を含み得る。活性物質は、溶液に溶解あるいは懸濁され得る。推進剤を利用するＭＤＩｓは、ＭＤＩの同時吸入及び活性化を必要とし得る。保持チャンバー、例えばスペーサは、エアロゾル化された活性物質を保存し、同時活性化及び吸入の必要性を排除するために用いられ得る。ＭＤＩｓは活性物質の持続的な定投与量をもたらし、一貫した投与を可能にする。ＭＤＩｓの例は、米国特許第６６１５８２６、及び５２９０５３９号に開示されている。
【００６８】
噴霧器は、霧を作成して、すなわち、対象に吸入される溶液中の活性物質の製剤を霧状にして作動する。活性物質は、溶液に溶解あるいは懸濁され得る。液滴は、ファン、振動膜、あるいは超音波装置の使用を含むこの分野において知られた任意の方法で作成することができる。噴霧器は、ＭＤＩｓ及びＤＰＩｓよりもやさしく、幼児、小児、及び重病あるいは再起不能な個人等の吸入器を使えない個人に適している。噴霧器の例は、米国特許第６７４８９４５、６５３０３７０、６５９８６０２、及び６００９８６９号に開示される。
【００６９】
ＤＰＩｓは推進剤を使用せず、対象に吸入される乾燥粉末を投与する。乾燥粉末を分配するために、ＤＰＩｓは、空気圧系統、電力ファン、あるいは例えば容器の圧搾といった機械的推進を含む、活性物質を推進させるためのこの分野において知られる任意の方法を利用できる。ＤＰＩｓは、代わりに単に対象による吸入に依存し得る。ＤＰＩｓは活性物質と促進剤の混合を必要とせず、より多い最大積載量の活性物質の送達を可能にする。ＤＰＩｓの例は、米国特許第６０２９６６１号に開示される。
【００７０】
多くの場合、肺への吸入のための液体あるいは乾燥粉末剤形のエアロゾル化は、推進剤を必要とする。推進剤は、この分野において一般的に用いられる推進剤である。前記有用な推進剤の特定の非限定的な例は、トリフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、及び１，１，１，２−テトラフルオロエタン、あるいはこれらの組み合わせを含む、クロロフルオロカーボン、ハイドロフルオロカーボン、ハイドロクロロフルオロカーボン、あるいはハイドロカーボンである。推進剤剤形の例は、米国特許第５６７２５８１号に開示され、この内容は参照することにより本願に組み込まれている。
【００７１】
また本発明は、この分野において知られる肺投与のための他の方法を包含する。一例として、これらの方法は、気管内吸入、送気、あるいは挿管による送達、例えば注射器、チューブ、あるいは類似の器具による肺への溶液、粉末、あるいは霧の送達を含む。
【００７２】
本発明のコリンエステラーゼ投与方法
本発明は、対象の肺上皮への神経ガス中和酵素の投与方法を提供する。本発明は、前述の肺送達装置及び技術を含む、この分野において知られた肺送達のための任意の方法を包含する。本発明の神経ガス中和酵素は、肺上皮への吸入により投与される。吸入は、経口あるいは経鼻であり得る。神経ガス中和酵素は、ＭＤＩ、噴霧器、あるいはＤＰＩにより投与され得る。複数の神経ガス中和酵素が、同時に投与され得る。当然のことながら、一つ以上の活性物質が神経ガス中和酵素に加えて組み込まれ、「神経ガス中和酵素」という用語の使用は決して付加的な活性物質の使用を除外するものではない。
【００７３】
ここに開示される神経ガス中和酵素は、薬学的組成物中に存在し得る。薬学的組成物は、一つあるいはそれ以上の薬学的あるいは生理学的許容担体、希釈剤、もしくは賦形剤と組み合わせた神経ガス中和酵素を含む。前記組成物は、緩衝液（例えば中性緩衝生理食塩水あるいはリン酸緩衝生理食塩水）、糖質（例えば、グルコース、マンノース、スクロースあるいはデキストロース）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチド、あるいはグリシン等のアミノ酸、抗酸化物質、ＥＤＴＡあるいはグルタチオン等のキレート剤、アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）、及びまたは防腐剤を含み得る。さらに他の実施例においては、本発明の組成物は凍結乾燥体として作成され得る。
【００７４】
本発明での使用に適した神経ガス中和酵素剤形は、乾燥粉末、溶液、懸濁液、あるいは噴霧用のスラリー、及び推進剤に懸濁あるいは溶解された粒子を含む。本発明での使用に適した乾燥粉末は、非結晶性（アモルファス）活性物質、結晶性活性物質、及び非結晶性活性物質と結晶性活性物質の混合を含む。乾燥粉末活性物質は、肺の肺胞への侵入を防ぐために選択された粒子サイズ、すなわち好ましくは直径で約０．０１μｍから約４μｍ、好ましくは３μｍ未満、より好ましくは約０．５μｍから約１μｍ、最も好ましくは約１μｍのサイズを有する。これらの乾燥粉末活性物質は、約１０重量％以下、通常約５重量％以下、好ましくは約３重量％以下の含水率である。前記活性物質粉末は、ＷＯ９５／２４１８３及びＷＯ９６／３２１４９に開示されており、これらは参照することにより本願に組み込まれている。
【００７５】
乾燥粉末神経ガス中和酵素剤形は、実質的に非結晶性粉末となる条件下での噴霧乾燥により調製することができる。結晶性形状であり得るバルク神経ガス中和酵素は、生理学的許容水性緩衝液、一般的にはｐＨが約２から９のクエン酸塩緩衝液中に溶解される。神経ガス中和酵素は、０．０１重量％から１重量％、通常０．１％から０．２％の濃度で溶解される。その後溶液は、Ｎｉｒｏ  Ａ／Ｓ（デンマーク）、Ｂｕｃｈｉ（スイス）等の供給業者から入手可能な従来の噴霧乾燥機で噴霧乾燥され、実質的に非結晶性の粉末となる。これらの非結晶性粉末は、非結晶性構造をもたらす条件下での、適当な活性物質溶液の凍結乾燥、真空乾燥あるいは蒸発乾燥によっても調製することができる。このようにして産生された非結晶性神経ガス中和酵素剤形は、所望のサイズ範囲内の粒子を製造するために、砕くか、あるいは製粉することができる。また乾燥粉末神経ガス中和酵素は、結晶性形状でもあり得る。結晶性乾燥粉末は、バルク結晶性活性物質を破砕するか、あるいはジェットミルで粉砕することで調製することができる。
【００７６】
本発明の神経ガス中和酵素粉末は、呼吸器及び肺の投与に適した薬学的提供体あるいは賦形剤と随意的に結合され得る。前記担体は、患者に送達される粉末の活性物質濃度を下げることが望まれる場合には、単に構築物質として働くが、活性物質のより効率的で再現可能な送達をもたらすために粉末分散装置内での粉末の分散性を改善するために、そして製造及び粉末充填を促進するために流動性及び一貫性等の神経ガス中和酵素の取扱適性を改善するためにも働き得る。前記賦形剤は、（ａ）糖質、例えばフルクトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボース等の単糖類、ラクトース、トレハロース、セロビオース等の二糖類、２−ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン等のシクロデキストリン、及びラフィノース、マルトデキストリン、デキストラン等の多糖類、（ｂ）アミノ酸、例えばグリシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、リシン等、（ｃ）有機酸及び有機塩基から調製される有機塩、例えばクエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、グルコン酸マグネシウム、グルコン酸ナトリウム、トロメタミン塩酸塩等、（ｄ）ペプチド及びタンパク質、例えばアスパルテーム、ヒト血清アルブミン、ゼラチン等、及び（ｅ）アルジトール、例えばマンニトール、キシリトール等を含むがこれらに限定されない。提供体の好ましいグループは、ラクトース、トレハロース、ラフィノース、マルトデキストリン、グリシン、クエン酸ナトリウム、ヒト血清アルブミン、及びマンニトールを含む。
【００７７】
投与されるべき神経ガス中和酵素の量は、所望の結果を得るために、治療効果のある量の神経ガス中和酵素を送達するのに必要な量である。実際には、これは特定の神経ガス中和酵素、状態の重症度、対象の体重、望まれる治療効果に依存して大きく異なる。実際には、神経ガス中和酵素の投与量は、一回あるいはそれ以上の投与で送達され得る。
【００７８】
本発明の神経ガス中和酵素組成物は、エアロゾル形態であり得る。液体エアロゾル剤形は、生理学的許容希釈剤中に本発明の化合物及び分散剤を包含する。本発明の乾燥粉末エアロゾル剤形は、本発明の化合物の微粉化した固形形態及び分散剤より成る。液体エアロゾル剤形あるいは乾燥粉末エアロゾル剤形のいずれでも、前記剤形はエアロゾル化されなければならない。送達装置の構成、剤形中のさらなる成分、及び粒子特性等の他に考慮すべきことも重要である。薬剤の経鼻あるいは肺送達のこれらの態様は、この分野においてよく知られており、また剤形の取り扱い、エアロゾル化方法、及び送達装置の構成は、この分野における通常の知識を有する者による定期的な実験を必要とするにすぎない。
【００７９】
本発明の神経ガス中和酵素組成物は、溶液中に懸濁、分散あるいは溶解され得る。液体提供体あるいは媒介体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール等）、植物油、非毒性グリセリンエステル、及びそれらの適当な混合を包含する溶媒、あるいは液体分散性媒質であり得る。リポソームの生成、分散の場合には適当な粒子サイズの投与、あるいは界面活性剤の添加により、適当な流動性を維持することができる。微生物の活動の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、あるいはソルビン酸の投与により獲得することができる。多くの場合、体液、特に血液の浸透圧と近い浸透圧を確保するために、等浸透圧物質、例えば糖、緩衝液、及び塩化ナトリウムが推奨される。
【００８０】
滅菌溶液もまた、本発明の神経ガス中和酵素剤形と適当な溶媒、及び一つあるいはそれ以上の前述の賦形剤の混合、及びその後のろ過滅菌により調製することができる。滅菌注射液の調製における使用に適した滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥と凍結乾燥を含み、これらはイソ構造擬似多形とその後の滅菌溶液の調製に必要な賦形剤の粉末状混合物を提供する。
【００８１】
適当な投与の用量、持続時間及び頻度は、患者の状態、患者の疾患のタイプ及び重症度、及び投与方法等の要因により決定される。通常、適当な用量及び治療計画は、治療的及びまたは予防的有用性をもたらすのに十分な量の神経ガス中和酵素をもたらす。適当な投与量を決定するために考慮すべき様々なことが、例えばＧｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１９８０，ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに開示される。適当な投与量は通常、実験モデル及びまたは臨床試験を用いて決定される。通常、効果的な治療をもたらすのに十分な最低投与量が好ましい。患者は、この分野における通常の知識を有する者によく知られる身体検査、画像研究、あるいは治療、予防される状態に適した分析を用いて治療有効性を観察することができる。投与量調節は、観察結果に基づいて行うことができる。例えば、神経ガスに暴露された個人は、その後、神経ガスにより引き起こされる症状を休止するための、本発明にしたがった神経ガス中和酵素を投与される。前述の考慮すべきことに基づいて、適当な投与量の決定には、この分野における通常の知識を有する者による定期的な実験が必要とされるにすぎない。
【００８２】
特定の実施例において、必要に応じた用量が投与される。この分野における通常の知識を有する者は、本発明の剤形における神経ガス中和酵素の濃度に基づいた用量に相当する神経ガス中和酵素剤形の容量あるいは重量を容易に測定することができる。本発明の他の実施例において、正常な生理学的機能が回復しない場合には、追加の用量が投与され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８３】
本発明は、以下の実施例によっても開示される。しかしながら、本明細書全体におけるこれらの実施例及び他の実施例の使用は、単に例示的なものであり、決して本発明の範囲及び意味、あるいは例示された用語の範囲及び意味を限定するものではない。同様に、本発明はここに開示される任意の特定の好ましい実施例に限定されない。実際、本発明の多くの改善及び変更が、本明細書を読んだ上でこの分野における通常の知識を有する者にはっきりと理解できるであろう。またこのような変更は本発明の精神あるいは範囲を逸脱することなく行うことができる。したがって本発明は、添付の特許請求の範囲の用語と、加えてこれらの特許請求の範囲が享有する均等の全範囲によってのみ限定されるべきである。
【実施例１】
【００８４】
皮膚神経ガスからの保護
本実施例は、皮膚神経ガス暴露の毒性作用から個人を保護するために、どのように吸入を介して組換えヒトＢＣｈＥ（ＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０５４１８２号参照）を投与することができるかについて説明する。
【００８５】
ＶＸ（Ｏ−エチル−Ｓ−（２−イソプロピルアミノエチル）メチル  ホスホノチオラート、あるいはエチル−Ｓ−ジメチルアミノエチル  メチルホスホノチオラート）は、非常に有毒な有機リン神経ガスであり、その低い蒸気圧のために、室温で液体である。ＶＸは、皮膚への暴露により急速に血流中に吸収され、その後、中枢神経系及び末梢神経系のかん流をもたらす。ＶＸは、アセチルコリンエステラーゼを不活性化し、コリン作動性クリーゼを引き起こす。
【００８６】
神経ガスＶＸへの暴露
対象に２回のＬＤ５Ｏ、例えば２回の致死量のＶＸを試験する。ＶＸ試験は、この分野において知られた任意の方法、例えば皮膚暴露により投与することができる。２回のＬＤ５Ｏに相当するＶＸの量は、神経ガスの毒性、投与方法、及び対象の体重に基づいて、この分野における通常の知識を有する者によって決定され得る。
【００８７】
コリンエステラーゼの調製
凍結乾燥ＢＣｈＥ（Ｐｒｏｔｅｘｉａ（登録商標）の商品名でＮｅｘｉａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓより入手できる）を、直径でおおそよ１μｍ（０．０１から４μｍの範囲）の粒子を作成するために、適当な賦形剤で調製する。所定サイズの粒子を産生する方法は、この分野においてよく知られており、挽き、破砕、及びまたは篩過を含むがこれらに限定されない。
【００８８】
ＢＣｈＥの１５０ｍｇの投与がＶＸに暴露されたサルにおいて化学量論的保護をもたらすことが既に示されている（Ｒａｖｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４５：４３−５３）。ＶＸのＢＣｈＥ異化作用の既知のメカニズムは、ＶＸを２つの不活性な化学物質に開裂するエステラーゼ反応によるものである。しばしば酵素は、これらの反応産物の一つによりリン酸化あるいはアルキルリン酸化され、不活性化される（Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｏｉｌｍａｎ，１９８０；Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【００８９】
ブチリルコリンエステラーゼの投与
ＶＸ試験の所定時間後に、ＢＣｈＥの粉末化剤形を肺送達装置により投与し、約２から約２５０ｍｇのＢＣｈＥが１回あるいはそれ以上の吸入で肺に放出されるように調整する。一例として、１回の吸入で３０ｍｇのＢＣｈＥを投与するように調整されたＤＰＩは、５回の吸入で１５０ｍｇのＢＣｈＥを投与するために利用することができる。吸入の回数を増やすことにより、より多い投与量を投与することができる。例えば、２１０ｍｇのＢＣｈＥは、７回の吸入で投与することができる。投与規模は、１回の吸入で投与されるＢＣｈＥの投与量を調節し、また吸入の回数を調節することにより微調整することができ、例えば５ｍｇのＢＣｈＥを投与するように調整されたＭＤＩは、３２回の吸入で１６０ｍｇのＢＣｈＥを送達するのに利用することができる。あるいは、噴霧器、挿管あるいは強制経口投与（ｇａｖａｇｅ）等の手段により、麻酔された対象にＢＣｈＥを送達することができる。ＶＸによる阻害の程度は、市販の血液コリンエステラーゼテストで容易に測定することができる。ヒト血清及び血漿中のコリンエステラーゼの定量のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析は、Ｒｏｃｈｅ（Ｒｏｃｈｅ  ＣＩＴＥ  Ｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  ｋｉｔ  Ｃａｔ，Ｎｏ．１１４８９２５９あるいは１１４８９４４５）から入手可能であり、この分野においてよく知られる決まった技術と設備を利用するこの分野における通常の知識を有する者によって実施することができる。血液サンプルを、ＶＸ試験の前に、ＶＸ試験後すぐに、ＢＣｈＥの投与前に、ＢＣｈＥの投与後すぐに、そしてＢＣｈＥの投与後所定間隔で、回収する。サンプル中のコリンエステラーゼのレベルを測定し、ＶＸ試験がなされなかったか、あるいはＢＣｈＥを投与されなかったコントロール対象と比較する。ＶＸ試験がなされたがＢＣｈＥを投与されなかったか、あるいはＶＸ試験がなされなかったがＢＣｈＥを投与された、さらなるコントロール対象を用いることもできる。
【００９０】
ＢＣｈＥ処置の効果は、無呼吸、縮瞳（ｍｉｏｓｉｓ、ｐｕｐｉｌｌａｒｙ  ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）あるいは「ピンポイント瞳孔」、流涎、振戦、及び中枢神経系の抑制を含むＶＸ中毒の生理学的徴候を判定することにより測定することができる。ＢＣｈＥの投与後のこれらの身体的徴候の重症度の減少について、判定することができる。例えば、コリンエステラーゼ処置の効果は、対象の瞳孔反射を観察することにより判定することができる。正常な生理学的反応が得られない場合には、正常な生理学的反応が得られるまで、前述のようにさらなる投与量のＢＣｈＥを投与することができる。処置の効果は、ＢＣｈＥ投与後のこれらの身体的徴候の重症度の減少と、ＶＸ試験がなされなかったかあるいはＢＣｈＥが投与されなかったコントロール対象とを比較することで判断することができる。ＶＸ試験がなされたがＢＣｈＥを投与されなかったか、あるいはＶＸ試験がなされなかったがＢＣｈＥを投与された、さらなるコントロール対象を用いることもできる。
【００９１】
この分野における通常の知識を有する者は、ＢＣｈＥの代わりに他の神経ガス中和酵素を利用可能であることを認識するであろう。したがって、投与量の決定は、用いられる神経ガス中和酵素によって異なる。有機リン酸化合物によって不活性化されない神経ガス中和酵素の場合、投与量はかなり少なくすることができる。適当な投与量の決定には、この分野における通常の知識を有する者にとって定期的な実験が必要とされるにすぎない。
【実施例２】
【００９２】
本実施例は、肺への神経ガス暴露の毒性作用から個人を保護するために、どのように吸入を介して組換えヒトＢＣｈＥを投与することができるかについて説明する。サリンは、気体状態で送達することができる神経ガスである。
【００９３】
実施例１に示されるように、凍結乾燥ＢＣｈＥを調製し、投与する。ＢＣｈＥの投与量の決定は、実施例１と同様に行う。
【００９４】
ＢＣｈＥの投与所定時間後、２回のＬＤ５Ｏに相当する量のサリンを、吸入により対象に投与する。２回のＬＤ５Ｏの決定は、実施例１と同様に行うことができる。吸入による投与は、吸入器、マスク、気管内挿管、あるいはガス処理室を含むがこれらに限定されないこの分野において知られた任意の方法により行うことができる。
【００９５】
サリンガスの吸入の程度は、実施例１と同様に判定することができる。サリンガスへの暴露の症状は、鼻水の垂れ、涙目、縮瞳、眼痛、かすみ目、涎及び過度の発汗、咳、胸苦しさ、呼吸促迫、下痢、排尿増加、精神錯乱、眠気、衰弱、頭痛、悪心、嘔吐、及びまたは腹痛、心拍の変化、及び血圧の変化を含む。サリンガス毒性の重症度の減少の測定は、実施例１と同様に、中毒の身体的徴候を観察することにより行うことができる。
【００９６】
吸入により投与されたＢＣｈＥは肺の上皮細胞を通過するには大きすぎるため、肺におけるＢＣｈＥの局在化がもたらされる。肺に局在したＢＣｈＥは、サリンと反応する化学的邪魔板として働き、多量の神経ガスが血液中に移行するのを防ぐ。サリン中和は肺の上皮細胞で起こり、神経ガスの血液中への移行は起こらない。逆に、肺におけるＢＣｈＥの局在は、血液から肺上皮細胞上へのＢＣｈＥの移動を必要としない。
【００９７】
この分野における通常の知識を有する者は、ＢＣｈＥの代わりに他の神経ガス中和酵素を利用可能であることを認識するであろう。したがって、投与量の決定は、用いられる神経ガス中和酵素によって異なる。有機リン酸化合物によって不活性化されない神経ガス中和酵素の場合、投与量はかなり少なくすることができる。適当な投与量の決定には、この分野における通常の知識を有する者にとって定期的な実験が必要とされるにすぎない。
【００９８】
本発明は、ここに開示された特定の実施例により範囲が限定されるものではない。実際には、ここに開示されたものに加えて本発明の種々の変更が、前述の記載及び添付の図表からこの分野における通常の知識を有する者に明らかなものとなるであろう。前記変更は、添付の請求の範囲の範囲内に含まれることが意図されている。
【００９９】
特許、特許出願、公報、製品説明文書、及びプロトコルは本願全体で引用され、その開示はあらゆる目的のために全体を参照することで本願に組み込まれている。
【国際調査報告】
2008510686.tif 000002
2008510686.tif 000003
2008510686.tif 000004