(57)【要約】  チミジンキナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、スプライスドナー部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのうち少なくとも１つが別のヌクレオチドに置き換えられ、かつスプライスアクセプター部位のヌクレオチドは変化していない、上記ポリヌクレオチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
チミジンキナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、スプライスドナー部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのうち少なくとも１つが別のヌクレオチドに置き換えられ、かつスプライスアクセプター部位のヌクレオチドは変化していない、上記ポリヌクレオチド。
【請求項２】
図１に示す野生型配列（Ｔｋ ｗｔ）の３２９位および３３０位にあるスプライスドナー部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのうち少なくとも１つが別のヌクレオチドに置き換えられている、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
図１に示す野生型配列の３２９位および３３０位にあるスプライスドナー部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのいずれもが別のヌクレオチドに置き換えられている、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
３３０位に対応するヌクレオチドがＴからＣに換わっている、請求項２または３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
チミジンキナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、図１に示す野生型配列（Ｔｋ ｗｔ）の３２９位および３３０位にあるスプライスドナー部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのうち少なくとも１つが別のヌクレオチドに置き換えられ、かつスプライスアクセプター部位のヌクレオチドは変化していない、上記ポリヌクレオチド。
【請求項６】
３２９位および３３０位に対応するヌクレオチドのいずれもが別のヌクレオチドに置き換えられている、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
３３０位に対応するヌクレオチドがＴからＣに換わっている、請求項５または６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
チミジンキナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、図１に示す野生型配列（Ｔｋ ｗｔ）の３２９位および３３０位にあるスプライスドナー部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのうち少なくとも１つが別のヌクレオチドに置き換えられ、かつ図１に示す野生型配列の５５４位および５５５位にあるスプライスアクセプター部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのうち少なくとも１つ、ならびに６６２位および６６３位にあるスプライスアクセプター部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのうち少なくとも１つは変化していない、上記ポリヌクレオチド。
【請求項９】
５５４位および５５５位に対応するヌクレオチドがいずれも変化していない、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
６６２位および６６３位に対応するヌクレオチドがいずれも変化していない、請求項８または９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
３２９位および３３０位に対応するヌクレオチドのいずれもが別のヌクレオチドに置き換えられている、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
３３０位に対応するヌクレオチドがＴからＣに換わっている、請求項８〜１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
図１に示すＴｋＭｕｔ２配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１４】
チミジンキナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、図１に示す野生型配列（Ｔｋ ｗｔ）の３２９位および３３０位にあるヌクレオチドに対応するスプライスアクセプター部位ヌクレオチドのうち少なくとも１つが別のヌクレオチドに置き換えられ、かつ図１に示す野生型配列の５４１位および５４２位にあるスプライスアクセプター部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのうち少なくとも１つが別のヌクレオチドに置き換えられている、上記ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
５４１位および５４２位に対応するヌクレオチドのいずれもが別のヌクレオチドに置き換えられている、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
３２９位および３３０位に対応するヌクレオチドのいずれもが別のヌクレオチドに置き換えられている、請求項１４または１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
３３０位に対応するヌクレオチドがＴからＣに換わっている、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
５４１位に対応するヌクレオチドがＡからＴに換わっている、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
５４２位に対応するヌクレオチドがＧからＣに換わっている、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
図１に示す野生型配列の５５４位および５５５位にあるスプライスアクセプター部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのうち少なくとも１つもまた別のヌクレオチドに置き換えられ、それによりスプライス部位が存在しないこととなっている、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
５５５位に対応するヌクレオチドがＧからＡに換わっている、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
図１に示すＴｋＭｕｔ２３配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２３】
図１に示すＴｋＭｕｔ２３４配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２４】
チミジンキナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、図１に示す野生型配列（Ｔｋ ｗｔ）の３２９位および３３０位にあるヌクレオチドに対応するスプライスアクセプター部位ヌクレオチドのうち少なくとも１つが別のヌクレオチドに置き換えられ、かつ図１に示す野生型配列の５５４位および５５５位にあるスプライスアクセプター部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのうち少なくとも１つが別のヌクレオチドに置き換えられている、上記ポリヌクレオチド。
【請求項２５】
図１に示す野生型配列（Ｔｋ ｗｔ）の３２９位および３３０位に対応するヌクレオチドのいずれもが別のヌクレオチドに置き換えられている、請求項２４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
３３０位に対応するヌクレオチドがＴからＣに換わっている、請求項２４または２５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
５５５位に対応するヌクレオチドがＧからＡに換わっている、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２８】
図１に示すＴｋＭｕｔ２４配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２９】
チミジンキナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、図１に示す野生型配列（Ｔｋ ｗｔ）の５５４位および５５５位にあるスプライスアクセプター部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのうち少なくとも１つが別のヌクレオチドに置き換えられている、上記ポリヌクレオチド。
【請求項３０】
５５５位に対応するヌクレオチドがＧからＡに換わっている、請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３１】
図１に示す野生型配列の５４１位および５４２位にあるヌクレオチドに対応するスプライスアクセプター部位ヌクレオチドのうち少なくとも１つもまた別のヌクレオチドに置き換えられている、請求項２９または３０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３２】
５４１位および５４２位に対応するヌクレオチドのいずれもが別のヌクレオチドに置き換えられ、それによりスプライス部位が存在しないこととなっている、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３３】
５４１位に対応するヌクレオチドがＡからＴに換わっている、請求項３１または３２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３４】
５４２位に対応するヌクレオチドがＧからＣに換わっている、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３５】
図１に示すＴｋＭｕｔ４配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項３６】
図１に示すＴｋＭｕｔ３４配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項３７】
ヌクレオチド置換が前記ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの配列を変化させない、請求項１〜３６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３８】
請求項１〜３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項３９】
請求項１〜３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または請求項３８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４０】
請求項１〜３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項３８に記載のベクター、または請求項３９に記載の宿主細胞と、製薬上許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項４１】
（ｉ）    請求項１〜３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または請求項３８に記載のベクター、または請求項３９に記載の宿主細胞、または請求項４０に記載の医薬組成物、および
（ｉｉｉ）チミジンキナーゼによって毒性薬剤に変換される、実質的に無毒な薬剤
を含んでなるキット。
【請求項４２】
医療における使用のための、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項３８に記載のベクター、請求項３９に記載の宿主細胞、または請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
破壊の必要がある細胞を有する患者の治療における同時の、分離した、もしくは連続的な使用のための、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項３８に記載のベクター、請求項３９に記載の宿主細胞、または請求項４０に記載の医薬組成物と、実質的に無毒な薬剤とを含む製品であって、該実質的に無毒な薬剤はチミジンキナーゼによって毒性薬剤に変換されるものである、上記製品。
【請求項４４】
（ｉｉ）  請求項１〜３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または請求項３８に記載のベクターを細胞に導入するステップ、および
（ｉｉ）  該細胞を、チミジンキナーゼによって毒性薬剤に変換される実質的に無毒な薬剤と、同時に、分離して、または連続的に接触させるステップ
を含む、細胞を破壊する方法。
【請求項４５】
（ｉ）    請求項１〜３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または請求項３８に記載のベクターを細胞に導入するステップ、
（ｉｉ）  該細胞にチミジンキナーゼを発現させるステップ、および
（ｉｉｉ）該細胞を、チミジンキナーゼによって毒性薬剤に変換される実質的に無毒な薬剤と接触させるステップ
を含む、細胞を破壊する方法。
【請求項４６】
（ｉ）    請求項１〜３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項３８に記載のベクター、または請求項４０に記載の医薬組成物を患者に導入するステップ、および
（ｉｉ）  チミジンキナーゼによって毒性薬剤に変換される実質的に無毒な薬剤を、同時に、分離して、または連続的に該患者に導入するステップ
を含む、破壊の必要がある細胞を有する患者を治療する方法。
【請求項４７】
（ｉ）    請求項１〜３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項３８に記載のベクター、または請求項４０に記載の医薬組成物を患者に導入するステップ、
（ｉｉ）  該ポリヌクレオチドまたはベクターを細胞に取り込ませるステップ、
（ｉｉｉ）該細胞にチミジンキナーゼを発現させるステップ、および
（ｉｖ）  チミジンキナーゼによって毒性薬剤に変換される実質的に無毒な薬剤を該患者に導入するステップ
を含む、破壊の必要がある細胞を有する患者を治療する方法。
【請求項４８】
（ｉ）    患者由来の細胞またはドナー細胞を取り出すステップ、
（ｉｉ）  請求項１〜３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３８に記載のベクターをｅｘ ｖｉｖｏで該細胞に導入するステップ、
（ｉｉｉ）該改変細胞を該患者に導入するステップ、
（ｉｖ）  該細胞にチミジンキナーゼを発現させるステップ、および
（ｖ）    チミジンキナーゼによって毒性薬剤に変換される実質的に無毒な薬剤を該患者に投与するステップ
を含む、破壊の必要がある細胞を有する患者を治療する方法。
【請求項４９】
（ｉ）    請求項１〜３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３８に記載のベクターを含むように遺伝子操作されたＴ細胞を宿主に投与するステップ、および
（ｉｉ）  実質的に無毒な薬剤とチミジンキナーゼとの相互作用により該遺伝子操作されたＴ細胞を死滅させるのに十分な量の該薬剤を、移植片対宿主病が発生する前に該宿主に投与するステップ
を含む、患者での移植片対宿主病を予防する方法。
【請求項５０】
前記実質的に無毒な薬剤が、ガンシクロビル、アシクロビル、トリフルオロチミジン、１−［２−デオキシ，２−フルオロ，β−Ｄ−アラビノフラノシル］−５−ヨードウラシル、ａｒａ−Ａ、ａｒａ１、１−β−Ｄアラビノフラノシルチミン、５−エチル−２’デオキシウリジン、５−ヨード−５’−アミノ−２，５’−ジデオキシウリジン、イドクスウリジン、ＡＺＴ、ＡＩＶ、ジデオキシシチジン、ＡｒａＣ、およびブロモビニルデオキシウリジン（ＢＶＤＵ）のうちいずれか１つである、請求項４３に記載の製品または請求項４４〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
患者における細胞の破壊のための医薬の調製における、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項３８に記載のベクター、または請求項３９に記載の宿主細胞の使用。
【請求項５２】
癌の治療のための医薬の調製における、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項３８に記載のベクター、または請求項３９に記載の宿主細胞の使用。
【請求項５３】
移植片対宿主病の予防のための医薬の調製における、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項３８に記載のベクター、または請求項３９に記載の宿主細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する分野
本発明は、実質的にスプライシングされないチミジンキナーゼ遺伝子をコードする核酸および治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
遺伝子治療における代謝性自殺遺伝子の使用は大変注目されている。多数の自殺遺伝子が文献に記載されており、それは、例えば、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼまたはチミジンキナーゼをコードする遺伝子である。これらの遺伝子のうち、単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）をコードする遺伝子は治療的観点から特に有利である。ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子は酵素を発現し、それがヌクレオシドアナログであるガンシクロビルと組み合わせて使用されると、分裂細胞を特異的に排除することができる。特に重要なのは、ＨＳＶ−ｔｋ／ガンシクロビルの使用に伴って、伝播性の毒性効果（「巻き添え（bystander）」作用）が存在することである。この効果は、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子が組み込まれている細胞だけでなく、隣接細胞もまた破壊される現象として現れる。
【０００３】
ＨＳＶ−ｔｋ／ガンシクロビル系の作用機序の概略は下記の通りであろう：ＴＫ酵素を発現するように改変された哺乳動物細胞がガンシクロビルのリン酸化の第一段階を実行し、ガンシクロビル一リン酸を生成させる。その後、細胞のキナーゼによって前記ガンシクロビル一リン酸から二リン酸、次いで三リン酸への連続的な代謝が可能になる。前記のように生成されたガンシクロビル三リン酸は次いでＤＮＡに組み込まれることによって有毒作用を生じ、細胞のＤＮＡポリメラーゼαを部分的に阻害し、それによってＤＮＡ合成の停止を誘発し、ゆえに細胞死を招く（Moolten, 1986; Mullen, 1994）。
【０００４】
ＨＳＶ−ｔｋ／ガンシクロビル系は多数の治療的用途で使用することができ、過去十年間に多数の臨床試験が実施されている。遺伝子治療でＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を使用する方法は、例えば、ＷＯ９０／０７９３６、ＵＳ５，８３７，５１０、ＵＳ５，８６１，２９０、ＷＯ９８／０４２９０、ＷＯ９７／３７５４２およびＵＳ５，６３１，２３６に開示されている。
【０００５】
ＨＳＶ−ｔｋ／ガンシクロビル系の興味深い用途の１つは移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の予防における用途である。この疾患は、同種間骨髄移植の転帰、多数の血液学的悪性腫瘍に関して選択される処置を妨害しうる症状である。ＧｖＨＤが生じるのは、移植された幹細胞移植物中のＴ細胞がレシピエントの身体に対して攻撃を開始した場合である。移植物からＴ細胞を除去すると、ＧｖＨＤが妨げられる場合があるが、同時に疾患再発および移植物拒絶を促進する。これらの影響に対抗するために、同種間骨髄移植後、一定の間隔をおいてドナーＴリンパ球を導入することによって、同種間骨髄移植患者を治療することができる。ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子をドナーＴリンパ球へ移入することによって、ＧｖＨＤが発生した場合にガンシクロビル投与後のそれらの細胞の除去が可能となる。ある試みでは、患者は、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を形質導入されている高用量のドナーリンパ球とともにＴ細胞枯渇骨髄移植を受けた（Tiberghienら, 2001）。全患者において、移植後の長期にわたって、循環性のＨＳＶ−ｔｋ発現細胞を検出することができた。１２患者のうち６患者はＧｖＨＤを発症し、ガンシクロビル投与を受け、循環性改変細胞の数が実質的に減少した（絶対数で８５％の平均減少）。
【０００６】
ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の突然変異体であって、その生物学的活性を増大させる突然変異体が作成されている。そのような突然変異体ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の例は、例えば、Kokorisら（1999）、ＷＯ９５／３０００７、ＵＳ５，８７７，０１０、ＷＯ９９／１９４６６およびＷＯ９５／１４１０２に記載されている。しかし、チミジンキナーゼ／ガンシクロビル系に関連する深刻な問題はＨＳＶ−ｔｋ形質導入細胞におけるガンシクロビル耐性の発生である。治療経過中に、ガンシクロビルに耐性である細胞の相対的割合が急速に増加する可能性があるため、このことは特に重要である。
【０００７】
ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を含有するレトロウイルスベクターで形質導入されたリンパ芽球様ヒトＴ細胞株におけるガンシクロビル耐性の存在は、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の２２７塩基対の欠失と関連していることが見出された（Fillatら, 2003）。また、そのベクターで形質導入されたヒト初代Ｔ細胞にも、形質導入ドナーＴ細胞を投与された１２人の患者にも同欠失が存在した（Garinら, 2001）。ＷＯ０１／７９５０２では、その欠失の原因が、異常型の遺伝子を保持する一定の割合のウイルス粒子の生産を誘発するためにスプライス部位として働くヌクレオチド配列がＨＳＶ−ｔｋ ｍＲＮＡ中に存在するせいであると考えられることが開示されている。この場合、その残りは完全長遺伝子を保持する。チミジンキナーゼ遺伝子の突然変異体はＷＯ０１／７９５０２およびChalmers 2001, Molecular Therapy 4:146-148に開示されている。その突然変異体では、スプライス部位が除去されていて、異常型のチミジンキナーゼ遺伝子の生産が減少している。しかし、この突然変異体は依然として有害な量の遺伝子スプライシングと関連している。Rettigら, 2003にはＣＤ３４−ｔｋ融合構築物が開示されている。これらの融合構築物は改変ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を含有する。しかし、その改変遺伝子がＨＳＶ−ｔｋ ｍＲＮＡのスプライシングを減少させることは実証されていない。
【特許文献１】ＷＯ９０／０７９３６
【特許文献２】ＵＳ５，８３７，５１０
【特許文献３】ＵＳ５，８６１，２９０
【特許文献４】ＷＯ９８／０４２９０
【特許文献５】ＷＯ９７／３７５４２
【特許文献６】ＵＳ５，６３１，２３６
【特許文献７】ＷＯ９５／３０００７
【特許文献８】ＵＳ５，８７７，０１０
【特許文献９】ＷＯ９９／１９４６６
【特許文献１０】ＷＯ９５／１４１０２
【特許文献１１】ＷＯ０１／７９５０２
【非特許文献１】Moolten, Cancer Res. 46, p5276 (1986)
【非特許文献２】Mullen, Pharmac. Ther. 63, p199 (1994)
【非特許文献３】Tiberghienら, Blood 97, p63 (2001)
【非特許文献４】Kokorisら, Gene Terapy 6, p1415-1426 (1999)
【非特許文献５】Fillatら, Current. Gene Therapy 3, p13 2003
【非特許文献６】Garinら, Blood 97, p122 (2001)
【非特許文献７】Chalmers, Molecular Therapy 4 p146 (2001)
【非特許文献８】Rettigら, Molecular Therapy 8, p29 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ゆえに、遺伝子スプライシングに感受性ではなく、また、ガンシクロビル耐性に関連する問題に対処する改変チミジンキナーゼ遺伝子に関する必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本発明は、既に開示されているＨＳＶ−ｔｋ遺伝子と比べて高い割合のスプライスされない（unspliced）ｍＲＮＡを発現するＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を提供することによって上述の問題を克服する。本発明者らは、既に特定されているアクセプター部位の１４塩基対上流にスプライスアクセプター部位を特定した。本発明者らは、既に特定されているドナー部位およびアクセプター部位を改変することによってスプライシングを阻害する先行する試みによって、本アクセプター部位およびその後の遺伝子スプライシングを活性化することができることを示す。驚くべきことに、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子をある特定のヌクレオチド位置で改変すると、実質的にスプライスされないｍＲＮＡを発現する能力を有するＨＳＶ−ｔｋ遺伝子が得られることを本発明者らは実証する。特に、本発明者らは、スプライスドナー部位のヌクレオチドのうち少なくとも１つを突然変異させることによってスプライシングを実質的に妨げることができることを示す。
【００１０】
発明の提示
本発明の第１の態様では、チミジンキナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、スプライスドナー部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのうち少なくとも１つが別のヌクレオチドに置き換えられ、かつスプライスアクセプター部位のヌクレオチドは変化していないポリヌクレオチドを提供する。
【００１１】
好ましくは、図１に示す野生型配列（Ｔｋ ｗｔ）の３２９位および３３０位にあるスプライスドナー部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのうち少なくとも１つが別のヌクレオチドに置き換えられ、かつスプライスアクセプター部位のヌクレオチドは変化していない。
【００１２】
一実施形態では、３３０位のヌクレオチドがＴからＣに換わっている。
【００１３】
本発明の第２の態様では、チミジンキナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、図１に示す野生型配列（Ｔｋ ｗｔ）の３２９位および３３０位にあるスプライスドナー部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのうち少なくとも１つが別のヌクレオチドに置き換えられ、かつスプライスアクセプター部位のヌクレオチドは変化していないポリヌクレオチドを提供する。
【００１４】
一実施形態では、図１に示す野生型配列の３２９位および３３０位にあるスプライスドナー部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのいずれもが別のヌクレオチドに置き換えられている。
【００１５】
一実施形態では、３３０位のヌクレオチドがＴからＣに換わっている。
【００１６】
本発明の第３の態様では、チミジンキナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、図１に示す野生型配列（Ｔｋ ｗｔ）の３２９位および３３０位にあるスプライスドナー部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのうち少なくとも１つが別のヌクレオチドに置き換えられ、かつ図１に示す野生型配列の５５４位および５５５位にあるスプライスアクセプター部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのうち少なくとも１つ、ならびに６６２位および６６３位にあるスプライスアクセプター部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのうち少なくとも１つは変化していないポリヌクレオチドを提供する。
【００１７】
好ましくは、５５４位および５５５位に対応するヌクレオチドがいずれも変化していない。
【００１８】
好ましくは、６６２位および６６３位に対応するヌクレオチドがいずれも変化していない。
【００１９】
一実施形態では、図１に示す野生型配列の３２９位および３３０位にあるスプライスドナー部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのいずれもが別のヌクレオチドに置き換えられている。
【００２０】
一実施形態では、３３０位のヌクレオチドがＴからＣに換わっている。
【００２１】
本発明の第４の態様では、図１に示すＴｋＭｕｔ２配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００２２】
本発明の第５の態様では、チミジンキナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、図１に示す野生型配列（Ｔｋ ｗｔ）の３２９位および３３０位にあるヌクレオチド（群）に対応するスプライスアクセプターヌクレオチドのうち少なくとも１つが別のヌクレオチドに置き換えられ、かつ図１に示す野生型配列の５４１位および５４２位にあるスプライスアクセプター部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのうち少なくとも１つが別のヌクレオチドに置き換えられているポリヌクレオチドを提供する。
【００２３】
一実施形態では、図１に示す野生型配列の３２９位および３３０位にあるスプライスドナー部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのいずれもが別のヌクレオチドに置き換えられている。
【００２４】
一実施形態では、３３０位に対応するヌクレオチドがＴからＣに換わっている。
【００２５】
別の実施形態では、図１に示す野生型配列の５４１位および５４２位にあるスプライスアクセプター部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのいずれもが別のヌクレオチドに置き換えられている。
【００２６】
別の実施形態では、５４１位のヌクレオチドに対応するヌクレオチドがＡからＴに換わっている。
【００２７】
別の実施形態では、５４２位のヌクレオチドに対応するヌクレオチドがＧからＣに換わっている。
【００２８】
別の実施形態では、図１に示す野生型配列の５５４位および５５５位にあるスプライスアクセプター部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのうち少なくとも１つもまた別のヌクレオチドに置き換えられ、それによりスプライス部位が存在しないこととなっている。
【００２９】
一実施形態では、図１に示す野生型配列の５４１位および５４２位にあるスプライスアクセプター部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのいずれもが別のヌクレオチドに置き換えられ、それによりスプライス部位が存在しないこととなっている。
【００３０】
別の実施形態では、５５５位のヌクレオチドに対応するヌクレオチドがＧからＡに換わっている。
【００３１】
本発明の第６の態様では、図１に示すＴｋＭｕｔ２３配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００３２】
本発明の第７の態様では、図１に示すＴｋＭｕｔ２３４配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００３３】
本発明の第８の態様では、チミジンキナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、図１に示す野生型配列（Ｔｋ ｗｔ）の３２９位および３３０位にあるヌクレオチド（群）に対応するスプライスアクセプター部位ヌクレオチドのうち少なくとも１つが別のヌクレオチドに置き換えられ、かつ図１に示す野生型配列の５５４位および５５５位にあるスプライスアクセプター部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドが別のヌクレオチドに置き換えられているポリヌクレオチドを提供する。
【００３４】
一実施形態では、図１に示す野生型配列の３２９位および３３０位にあるスプライスドナー部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのいずれもが別のヌクレオチドに置き換えられている。
【００３５】
別の実施形態では、図１に示す野生型配列の５５４位および５５５位にあるスプライスアクセプター部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのいずれもが別のヌクレオチドに置き換えられている。
【００３６】
好ましくは、３３０位のヌクレオチドに対応するヌクレオチドがＴからＣに換わっている。
【００３７】
好ましくは、５５５位のヌクレオチドに対応するヌクレオチドがＧからＡに換わっている。
【００３８】
本発明の第９の態様では、図１に示すＴｋＭｕｔ２４配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００３９】
本発明の第１０の態様では、チミジンキナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、図１に示す野生型配列（Ｔｋ ｗｔ）の５５４位および５５５位にあるスプライスアクセプター部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのうち少なくとも１つが別のヌクレオチドに置き換えられているポリヌクレオチドを提供する。
【００４０】
一実施形態では、図１に示す野生型配列の５５４位および５５５位にあるスプライスドナー部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのいずれもが別のヌクレオチドに置き換えられている。
【００４１】
一実施形態では、５５５位のヌクレオチドに対応するヌクレオチドがＧからＡに換わっている。
【００４２】
一実施形態では、図１に示す野生型配列の５４１位および５４２位にあるヌクレオチドに対応するスプライスアクセプター部位ヌクレオチドのうち少なくとも１つもまた別のヌクレオチドに置き換えられ、それによりスプライス部位が存在しないこととなっている。
【００４３】
別の実施形態では、図１に示す野生型配列の５４１位および５４２位にあるスプライスアクセプター部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのいずれもがまた別のヌクレオチドに置き換えられ、それによりスプライス部位が存在しないこととなっている。
【００４４】
別の実施形態では、５４１位のヌクレオチドに対応するヌクレオチドがＡからＴに換わっている。
【００４５】
別の実施形態では、５４２位のヌクレオチドに対応するヌクレオチドがＧからＣに換わっている。
【００４６】
本発明の第１１の態様では、図１に示すＴｋＭｕｔ４配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００４７】
本発明の第１２の態様では、図１に示すＴｋＭｕｔ３４配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００４８】
好ましくは、ヌクレオチド置換は前記ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの配列を変化させない。
【００４９】
本発明の第１３の態様では、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００５０】
好ましくは、前記ベクターは発現ベクターである。
【００５１】
本発明の第１４の態様では、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００５２】
本発明の第１５の態様では、本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞と、製薬上許容される担体とを含んでなる医薬組成物を提供する。
【００５３】
本発明の第１６の態様では、
（ｉ）本発明のポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞または医薬組成物；および
（ｉ）チミジンキナーゼによって毒性薬剤（物質）に変換される、実質的に無毒な薬剤
を含んでなるキットを提供する。
【００５４】
本発明の第１７の態様では、医療における使用のための、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞または医薬組成物を提供する。
【００５５】
本発明の第１８の態様では、破壊の必要がある細胞を有する患者の治療（処置）における同時の、分離した、もしくは連続的な使用のための、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞または医薬組成物と、実質的に無毒な薬剤とを含む製品であって、該実質的に無毒な薬剤はチミジンキナーゼによって毒性薬剤に変換されるものである製品を提供する。
【００５６】
本発明の第１９の態様では、細胞を破壊する方法であって、下記ステップを含む方法を提供する：
（ｉ）  本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを該細胞に導入するステップ；および
（ｉｉ）該細胞を、チミジンキナーゼによって毒性薬剤に変換される実質的に無毒な薬剤と、同時に、分離して、または連続的に接触させるステップ。
【００５７】
本発明の第２０の態様では、細胞を破壊する方法であって、下記ステップを含む方法を提供する：
（ｉ）  本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを該細胞に導入するステップ；
（ｉｉ）該細胞にチミジンキナーゼを発現させるステップ；および
（ｉｉ）該細胞を、チミジンキナーゼによって毒性薬剤に変換される実質的に無毒な薬剤と接触させるステップ。
【００５８】
本発明の第２１の態様では、破壊の必要がある細胞を有する患者を治療する方法であって、下記ステップを含む方法を提供する：
（ｉ）  本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは医薬組成物を患者に導入するステップ；
（ｉｉ）チミジンキナーゼによって毒性薬剤に変換される実質的に無毒な薬剤を、同時に、分離して、または連続的に該患者に導入するステップ。
【００５９】
本発明の第２２の態様では、破壊の必要がある細胞を有する患者を治療する方法であって、下記ステップを含む方法を提供する：
（ｉ）    本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは医薬組成物を患者に導入するステップ；
（ｉｉ）  該ポリヌクレオチドまたはベクターを該細胞に取り込ませるステップ；
（ｉｉｉ）該細胞にチミジンキナーゼを発現させるステップ；および
（ｉｖ）  チミジンキナーゼによって毒性薬剤に変換される実質的に無毒な薬剤を該患者に導入するステップ。
【００６０】
本発明の第２３の態様では、破壊の必要がある細胞を有する患者を治療する方法であって、下記ステップを含む方法を提供する：
（ｉ）    患者由来の細胞またはドナー細胞を取り出すステップ；
（ｉｉ）  本発明のポリヌクレオチドまたはベクターをｅｘ ｖｉｖｏで該細胞に導入するステップ；
（ｉｉｉ）該改変細胞を該患者に導入するステップ；
（ｉｖ）  該細胞にチミジンキナーゼを発現させるステップ；および
（ｖ）    チミジンキナーゼによって毒性薬剤に変換される実質的に無毒な薬剤を該患者に投与するステップ。
【００６１】
本発明の第２４の態様では、患者での移植片対宿主病を予防する方法であって、下記ステップを含む方法を提供する：
（ｉ）  本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターを含むように遺伝子操作されたＴ細胞を宿主に投与するステップ；および
（ｉｉ）実質的に無毒な薬剤とチミジンキナーゼとの相互作用により該遺伝子操作されたＴ細胞を死滅させるのに有効な量の該薬剤を、移植片対宿主病が発生する前に該宿主に投与するステップ。
【００６２】
好ましくは、本発明で使用される実質的に無毒な薬剤は、ガンシクロビル、アシクロビル、トリフルオロチミジン（triflurothymidine）、１−［２−デオキシ，２−フルオロ，β−Ｄ−アラビノフラノシル］−５−ヨードウラシル、ａｒａ−Ａ、ａｒａ１、１−β−Ｄアラビノフラノシルチミン、５−エチル−２’デオキシウリジン（5-ethyl-2'deoxyurine）、５−ヨード−５’−アミノ−２，５’−ジデオキシウリジン、イドクスウリジン、ＡＺＴ、ＡＩＶ、ジデオキシシチジン、ＡｒａＣおよびブロモビニルデオキシウリジン（ＢＶＤＵ）のうちいずれか１つである。
【００６３】
本発明の第２５の態様では、患者における細胞の破壊のための医薬の調製における、本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞の使用を提供する。
【００６４】
本発明の第２６の態様では、癌の治療のための医薬の調製における、本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞の使用を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６５】
詳細な説明
以下、本発明の種々の好ましい特徴および実施形態を非限定的な例として記載する。
【００６６】
本発明の実施では、特に指定しない限り、通常の当業者の能力の範囲内である慣用の化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の技術を使用する。前記技術は文献で説明されている。例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M.ら (1995および定期的な補遺; Current Protocols in Molecular Biology, 第 9, 13, および16章, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (編), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; and E. M. Shevach and W. Strober, 1992および定期的な補遺, Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, NYを参照のこと。これらの一般的な教科書は参照により本明細書中に組み入れられる。
【００６７】
ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子
本明細書中で使用される用語「変化していない」とは、野生型配列（Ｔｋ ｗｔ）から変化していないことを意味する。
【００６８】
本明細書中で使用される用語「別のヌクレオチドに置き換えられている」とは、野生型配列（Ｔｋ ｗｔ）とは異なるヌクレオチドに置き換えられていることを意味する。前記置換を施すと、対応するスプライスドナー部位またはスプライスアクセプター部位が除去されることとなる。
【００６９】
本発明のチミジンキナーゼ突然変異体は多種多様なチミジンキナーゼから作製してよい。好ましくは、前記チミジンキナーゼ突然変異体はヘルペスウイルス科（Herpesviridae）のチミジンキナーゼ由来であり、例えば、霊長類ヘルペスウイルス、および非霊長類ヘルペスウイルス（例えばトリヘルペスウイルス）の両者が含まれる。適切なヘルペスウイルスの代表例には、単純ヘルペスウイルス１型（McKnightら, 1980）、単純ヘルペスウイルス２型（Swain and Galloway, 1983）、水痘帯状疱疹ウイルス（Davidson and Scott, 1986）、マーモセットヘルペスウイルス（Otsuka and Kit, 1984）、ネコヘルペスウイルス１型（Nunbergら,, 1989）、偽性狂犬病ウイルス（Kit and Kit, 米国特許第４，５１４，４９７号, 1985）、ウマヘルペスウイルス１型（Robertson and Whalley, 1988）、ウシヘルペスウイルス１型（Mittal and Field, 1989）、シチメンチョウヘルペスウイルス（Martinら, 1989）、マレック病ウイルス（Scottら, 1989）、リスザルヘルペスウイルス（herpesvirus saimiri）（Honessら, 1989）およびエプスタイン・バーウイルス（Baerら, 1984）が含まれる。
【００７０】
前記ヘルペスウイルスは、American Type Culture Collection（「ＡＴＣＣ」, Rockville, Maryland）等の商業的な供給元から容易に取得することができる。特定の上記指定ヘルペスウイルスの寄託物はＡＴＣＣから容易に取得することができる。その寄託物は、例えば：AＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ−５３９（単純ヘルペス１型）；ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ−７３４およびＶＲ−５４０（単純ヘルペス２型）；ＡＴＣＣ ＮＯ．ＶＲ−５８６（水痘帯状疱疹ウイルス）；ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ−７８３（感染性喉頭気管炎（Infectious laryngothracheitis））；ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ−６２４，ＶＲ−９８７，ＶＲ−２１０３，ＶＲ−２００１，ＶＲ−２００２，ＶＲ−２１７５，ＶＲ−５８５（マレック病ウイルス）；ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ−５８４ＢおよびＶＲ−５８４Ｂ（シチメンチョウヘルペスウイルス）；ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ−６３１およびＶＲ−８４２（ウシヘルペスウイルス１型）；およびＡＴＣＣ Ｎｏ．ＶＲ−２００３，ＶＲ−２２２９およびＶＲ−７００（ウマヘルペスウイルス１型）である。また、ヘルペスウイルスは天然に存在する供給源から（例えば、感染動物から）容易に単離および同定することができる。
【００７１】
チミジンキナーゼ遺伝子を容易に単離し、下記のように突然変異させることができる。その突然変異の目的は、突然変異していないチミジンキナーゼと比較して、その遺伝子のスプライシングを実質的に減少させる１つまたはそれ以上の突然変異を含むチミジンキナーゼ遺伝子をコードする核酸分子を構築することである。本明細書中で使用される場合、「突然変異していないチミジンキナーゼ」とは、McKnightら（Nucl. Acids Res. 8:5949-5964, 1980）に記載のチミジンキナーゼ等のネイティブまたは野生型チミジンキナーゼを表すことが理解されよう。
【００７２】
注意すべきは、本出願におけるヌクレオチド位置が、図１に示す位置を参照することによって表されることである。しかし、前記参照が行われる場合でも、本発明は、その図に記載される厳密な配列に限定されるものではなく、その変異体および誘導体を含むことが理解される。ゆえに、他のチミジンキナーゼ配列におけるヌクレオチド位置（すなわち、当業者であれば、図１で特定される位置に対応するとみなす位置のヌクレオチド）の特定が意図される。当業者は、容易に、類似配列をアライメントし、同一のヌクレオチド位置を特定することができる。
【００７３】
ＨＳＶ−ｔｋ突然変異体の構築
本発明のチミジンキナーゼ突然変異体は種々の技術を使用して構築することができる。例えば、突然変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することによって特定の遺伝子座に突然変異を導入することができる。その変異配列に制限部位を隣接させて、それによりネイティブ配列の断片にライゲーションすることを可能とすることができる。ライゲーション後に得られる再構築配列は所望のアミノ酸挿入、置換、または欠失を有する誘導体をコードする。
【００７４】
あるいは、オリゴヌクレオチドを標的にする部位特異的（またはセグメント特異的）突然変異誘発法を使用して、必要な置換、欠失、または挿入に応じて改変された特定のコドンを有する改変遺伝子を提供することができる。チミジンキナーゼ突然変異体の欠失または切断（truncation）誘導体は、所望の欠失に隣接する好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位を利用して構築してもよい。制限切断の次に、突出配列を埋めて、ＤＮＡを再度ライゲーションすることができる。上記改変を施す典型的な方法はSambrookら（Molecular cloning: A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）に開示されている。
【００７５】
チミジンキナーゼ突然変異体は、ＰＣＲ突然変異誘発、化学的突然変異誘発、化学的突然変異誘発（Drinkwater and Klinedinst, 1986）、強制ヌクレオチド誤取り込み（forced nucleotide misincorporation）（例えば、Liao and Wise, 1990）によるか、あるいはランダムに突然変異誘発されたオリゴヌクレオチドの使用（Horwitzら, 1989）による技術を利用して構築してもよい。
【００７６】
本発明の好ましい実施形態では、コドンが、同一アミノ酸残基をコードする縮重コドンに変化するように遺伝暗号に留意してヌクレオチドを改変する。この方法で、野生型タンパク質をコードするが、機能的スプライス部位を含有しない目的のタンパク質のコード領域を作成することが可能である。
【００７７】
スプライス部位
スプライシング中に除去（または「スプライスアウト」）されるＲＮＡの一部分は通常はイントロンと称され、スプライシングによって連結されるイントロンの両側の２片のＲＮＡは通常はエキソンと称される（図２）。
【００７８】
スプライスドナー部位とは、スプライシングプロセス中に除去されるＲＮＡの５’側にあるＲＮＡ中の部位であり、切断されてスプライスアクセプター部位内のヌクレオチド残基に再連結される部位を含有する。ゆえに、スプライスドナー部位はエキソンの終点とイントロンの始点の接合部であり、典型的にジヌクレオチドＧＵで終結する。本発明の好ましい実施形態では、スプライスドナー部位の末端ＧＵジヌクレオチド（または対応するＤＮＡ配列中のＧＴジヌクレオチド）の一方または両方を改変してスプライス部位を除去する。
【００７９】
スプライスアクセプター部位とは、スプライシングプロセス中に除去されるＲＮＡの３’側にあるＲＮＡ中の部位であり、切断されてスプライスドナー部位内のヌクレオチド残基に再連結される部位を含有する。ゆえに、スプライスアクセプター部位はイントロンの終点（典型的にジヌクレオチドＡＧで終結する）と下流エキソンの始点の接合部である。本発明の好ましい実施形態では、スプライスアクセプター部位の末端ＡＧジヌクレオチドの一方または両方を改変してスプライス部位を除去する。
【００８０】
ポリヌクレオチド
本発明で使用されるポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡを含む。それらは一本鎖または二本鎖であってよい。当業者には、遺伝暗号の縮重の結果として、多数の異なるポリヌクレオチドが同一ポリペプチドをコードしうることが理解される。さらに、当業者は、通常の技術を使用して、本発明で使用されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響しないヌクレオチド置換を施し、前記ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映することができることが理解されよう。当技術分野で利用可能な任意の方法によってポリヌクレオチドを改変してよい。本発明のポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏ活性または寿命を向上させるためにかかる改変を実行することができる。
【００８１】
本発明で使用されるポリヌクレオチドは、例えば、発現ポリペプチドの細胞性分泌を支援するために融合タンパク質をコードすることができる。例えば、ＨＳＶ−ｔｋポリペプチドを細胞から発現させたい場合、該タンパク質を特定の細胞区画または分泌経路に向けるターゲティング配列を付加することが望ましいであろう。前記ターゲティング配列は当技術分野において詳しく明らかにされている。
【００８２】
ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡポリヌクレオチドは、組換え、合成、または当業者が利用可能な任意の手段によって作製することができる。また標準的技術によってそれらをクローニングしてよい。
【００８３】
長いポリヌクレオチドは、一般的に、組換え手段を使用して、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を使用して作製される。これには以下が含まれる：クローニングしたい脂質ターゲティング配列の領域をつなげたプライマー（例えば約１５〜３０ヌクレオチド）のペアを作製し、動物またはヒト細胞から取得されたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに前記プライマーを接触させ、所望の領域の増幅を生じさせる条件下でポリメラーゼ連鎖反応を実施し、増幅された断片を（例えばアガロースゲルで反応混合物を精製することによって）単離し、増幅されたＤＮＡを回収する。プライマーは、適切な制限酵素認識部位を含有し、増幅されたＤＮＡを適切なクローニングベクターにクローニングすることができるように設計してよい。
【００８４】
本発明のポリヌクレオチドは突然変異体チミジンキナーゼのコード領域のみを含有してよいことが理解される。しかし、ポリヌクレオチドが、作動可能な連結により、標的細胞中でコード配列の効率的な翻訳を可能にする核酸の部分をさらに含むのであれば好ましい。ポリヌクレオチドが（ＤＮＡ形態である場合）、コード領域および、標的細胞中でのコード領域の効率的な翻訳を可能にする核酸の部分の転写を可能にする、作動可能に連結されたプロモーターをさらに含むのであればさらに好ましい。
【００８５】
タンパク質
本明細書中で使用される用語「タンパク質」には、一本鎖ポリペプチド分子ならびに複数ポリペプチドの複合体が含まれる。その複合体では、個々の成分であるポリペプチドが共有結合または非共有結合によって連結されている。本明細書中で使用される用語「ポリペプチド」および「ペプチド」とは、モノマーがアミノ酸であり、それらがペプチド結合またはジスルフィド結合によって連結されているポリマーを表す。サブユニットおよびドメインという用語もまた、生物学的機能を有するポリペプチドならびにペプチドを表す場合がある。
【００８６】
変異体、誘導体、アナログ、ホモログおよび断片
本明細書中で記載される具体的なタンパク質およびヌクレオチドに加えて、本発明はその変異体、誘導体、アナログ、ホモログおよび断片の使用をも包含する。
【００８７】
本発明との関連では、任意の所与の配列の変異体（variant）とは、（アミノ酸残基であろうと核酸残基であろうと）その具体的な残基の配列が、対象となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドが少なくとも１つのその固有の機能を保持する様式で改変されている配列である。変異体配列は、天然に存在するタンパク質中に存在する少なくとも１個の残基についての付加、欠失、置換改変置き換え（substitution modification replacement）および／または変異（variation）を施すことによって得ることができる。
【００８８】
本発明のタンパク質またはポリペプチドに関して、本明細書中で使用される用語「誘導体」は、その配列からの、あるいはその配列への１個（またはそれ以上）のアミノ酸残基の置換、変異、改変、置き換え、欠失および／または付加を含み、ただし、結果として生じるタンパク質またはポリペプチドが少なくとも１つのその固有の機能を保持するものである。
【００８９】
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関して、本明細書中で使用される用語「アナログ」は、任意のミメティック、すなわち、それが模倣するポリペプチドまたはポリヌクレオチドの少なくとも１つの固有の機能を有する化合物を含む。
【００９０】
典型的に、アミノ酸置換、例えば１、２または３〜１０または２０個の置換を施してよく、ただし、改変された配列が必要な活性または能力を保持することを条件とする。アミノ酸置換とは、天然に存在しないアナログの使用を含むことができる。
【００９１】
本発明で使用するタンパク質は、サイレントな変化を引き起こし、機能上等価なタンパク質を生じさせるアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有することもできる。輸送またはモジュレーション機能が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質の類似性に基づいて、意図的なアミノ酸置換を施してよい。例えば、負荷電アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ；正荷電アミノ酸には、リシンおよびアルギニンが含まれ；ならびに、同等の親水性値を有する非荷電極性頭部基（head groups）を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが含まれる。
【００９２】
例えば下記の表にしたがって保存的置換を施すことができる。第２欄の同一ブロックおよび好ましくは第３欄の同一行のアミノ酸を互いに置換することができる：
【表１】
2008502342.tif 000002
【００９３】
「断片」もまた変異体であり、この用語は、典型的に、機能上あるいは、例えばアッセイにおいて関心の持たれる、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの選択された領域を表す。ゆえに「断片」とは、完全長ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの一部分であるアミノ酸または核酸配列を表す。
【００９４】
前記変異体は、標準的組換えＤＮＡ技術、例えば部位特異的突然変異誘発を使用して作製することができる。挿入が施される場合、挿入部位の両側にある天然に存在する配列に対応する５’および３’隣接領域とともにその挿入物をコードする合成ＤＮＡを使用する。前記隣接領域は、天然に存在する配列中の部位に対応する好都合な制限部位を含有し、それにより、その配列を適切な酵素（群）で切断して、前記合成ＤＮＡをその切断物にライゲーションすることができる。次いで本発明にしたがってそのＤＮＡを発現させ、コードされたタンパク質を生成させる。これらの方法は、単に、ＤＮＡ配列の操作に関する当技術分野において公知の多数の標準的技術を説明するためのものであり、他の公知の技術を使用してもよい。
【００９５】
ポリヌクレオチド変異体は好ましくはコドン最適化配列を含む。コドン最適化は、ＲＮＡの安定性を向上させ、したがって遺伝子発現を向上させる方法として当技術分野において公知である。遺伝暗号の重複とは、複数の異なるコドンが同一アミノ酸をコードしうることを意味する。例えば、ロイシン、アルギニンおよびセリンはそれぞれ６種の異なるコドンによってコードされる。異なる生物では、異なるコドンの使用が優先される。ＨＩＶ等のウイルスは、例えば、多数の稀なコドンを使用する。稀なコドンがそれに対応する哺乳動物で一般に使用されるコドンに置き換えられるようにヌクレオチド配列を変化させることによって、哺乳動物標的細胞中でのその配列の発現を増加させることができる。哺乳動物細胞ならびに種々の他の生物に関するコドンの使用表は当技術分野において公知である。好ましくは、配列の少なくとも一部分においてコドンを最適化する。さらにより好ましくは、配列全体にわたってコドンを最適化する。
【００９６】
ベクター
当技術分野において周知であるように、ベクターはある環境から別の環境への物質の移動を可能にするかまたは促進するツールである。本発明にしたがって、かつ一例として、組換えＤＮＡ技術で使用されるいくつかのベクターは、物質、例えばＤＮＡのセグメント（例えば異種ＤＮＡセグメント、例えば異種ｃＤＮＡセグメント）を宿主および／または標的細胞に移動することを可能にする。その目的は、本発明で使用されるヌクレオチド配列を含むベクターを複製させること、および／または本発明で使用されるタンパク質を発現させることである。組換えＤＮＡ技術で使用されるベクターの例には、非限定的に、プラスミド、染色体、人工染色体またはウイルスが含まれる。
【００９７】
好ましくは、本発明で使用されるポリヌクレオチドをベクターに組み入れる。好ましくは、本発明で使用するためのベクター中のポリヌクレオチドは、宿主細胞によるそのコード配列の発現をもたらすことが可能な制御配列に作動可能に連結される。すなわち、そのベクターは発現ベクターである。用語「作動可能に連結」とは、記載される構成要素が、それらがその意図される様式で機能することを可能にする関係にあることを意味する。コード配列に「作動可能に連結」されている調節配列は、その制御配列と適合する条件下でそのコード配列の発現が達成されるように連結されている。
【００９８】
制御配列は、例えば、その制御配列によって主導される転写のレベルが転写調節因子にさらに応答性となるようにする別の転写調節エレメントを付加することによって改変することができる。
【００９９】
ベクターを適切な宿主に形質転換またはトランスフェクトして、ｔｋ遺伝子産物の発現を提供してよい。そのプロセスは、ベクターによる、タンパク質をコードするコード配列の発現をもたらす条件下で、上記発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養するステップ、および場合により発現されたタンパク質を回収するステップを含んでよい。
【０１００】
本発明で使用されるベクターは、例えば、複製開始点、場合によりポリヌクレオチドの発現用のプロモーターおよび場合によりそのプロモーターのレギュレーターを備えたプラスミドまたはウイルスベクターであってよい。前記ベクターは、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子、および／または追跡可能なマーカー、例えばＧＦＰを含有してよい。ベクターを使用して、例えば、宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換してよい。
【０１０１】
本発明で使用するためのタンパク質をコードする配列に作動可能に連結されている制御配列には、プロモーター／エンハンサーおよび他の発現調節シグナルが含まれる。これらの制御配列は、発現ベクターがそこで使用されるように設計されている対象の宿主細胞と適合性であるように選択することができる。用語「プロモーター」は当技術分野において周知であり、最小プロモーターから、上流エレメントおよびエンハンサーを含むプロモーターまでにわたるサイズおよび複雑さの核酸領域を包含する。
【０１０２】
プロモーターは、典型的に、哺乳動物細胞において機能性であるプロモーターから選択されるが、原核生物のプロモーターおよび他の真核細胞において機能性のプロモーターを使用してよい。プロモーターは、典型的に、ウイルスまたは真核生物の遺伝子のプロモーター配列由来である。例えば、発現が生じる場である細胞のゲノム由来のプロモーターであってよい。真核生物のプロモーターに関して、それらは、ユビキタスな様式（例えばａ−アクチン、ｂ−アクチン、チュブリンのプロモーター）で、あるいは組織特異的様式（例えばピルビン酸キナーゼに関する遺伝子のプロモーター）で機能するプロモーターであってよい。ウイルスのプロモーター、例えばモロニーマウス白血病ウイルス末端反復配列（ＭＭＬＶ ＬＴＲ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーターまたはヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーターを使用してもよい。
【０１０３】
また、プロモーターが誘導性であり、それにより、細胞の寿命の期間、異種遺伝子の発現レベルを調節できることも有利である場合がある。誘導性とは、プロモーターを使用して得られる発現のレベルが調節できることを意味する。
【０１０４】
さらに、別の調節配列、例えばエンハンサー配列を付加することによって任意の前記プロモーターを改変することができる。上記２種またはそれ以上の異なるプロモーター由来の配列エレメントを含むキメラプロモーターを使用してもよい。
【０１０５】
好ましくは、ウイルスベクターは特定の細胞タイプまたは細胞タイプ群に優先的に形質導入されるものである。
【０１０６】
レトロウイルスベクター
一実施形態では、本発明で使用されるベクターは、ウイルスが標的細胞に侵入した後、複製できず、子孫の感染性ウイルス粒子を産生できないように遺伝子操作されているレトロウイルスに基づくベクターである。組織培養条件および生存生物中の両方における遺伝子の送達に広く使用される多数のレトロウイルスが存在する。その例には、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、フジナミ肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉腫ウイルス（ＦＢＲ ＭＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、アベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ−ＭＬＶ）、トリ骨髄球腫症ウイルス−２９（ＭＣ２９）、およびトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）およびレンチウイルスをはじめとするすべての他のレトロウイルス科が含まれるが、それらに限定されない。レトロウイルスの詳細なリストはCoffinら, 1997, "retroviruses", Cold Spring Harbour Laboratory Press, JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus(編) pp 758-763に見出すことができる。
【０１０７】
レトロウイルスゲノムの基本構造は５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲであり、その間またはその範囲内に、そのゲノムのパッケージングを可能にするパッケージングシグナル、プライマー結合部位、宿主細胞ゲノムへの組込みを可能にする組込み部位およびパッケージング構成要素をコードするｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子（これらはウイルス粒子の組立てに必要なポリペプチドである）が位置する。さらに複雑なレトロウイルスは追加の特徴を有し、その追加の特徴は、例えばＨＩＶのｒｅｖおよびＲＲＥ配列である。これらは組込まれたプロウイルスのＲＮＡ転写産物を感染した標的細胞の核から細胞質へ効率的に運ぶことを可能にする。
【０１０８】
プロウイルスでは、これらの遺伝子には、末端反復配列（ＬＴＲ）と称される領域がその両端につながっている。ＬＴＲはプロウイルスの組込み、および転写を担う。ＬＴＲはエンハンサー−プロモーター配列としても働き、ウイルス遺伝子の発現を制御することができる。レトロウイルスＲＮＡのキャプシド形成は、ウイルスゲノムの５’末端に位置するｐｓｉ配列により引き起こされる。
【０１０９】
ＬＴＲ自体は一致する配列であり、それはＵ３、ＲおよびＵ５と称される３つのエレメントに分けることができる。Ｕ３はＲＮＡの３’末端に特有の配列由来である。ＲはＲＮＡの両端で反復される配列由来であり、Ｕ５はＲＮＡの５’末端に特有の配列由来である。前記３つのエレメントのサイズは種々のレトロウイルス間でかなり変動しうる。
【０１１０】
欠損レトロウイルスベクターゲノムでは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖは存在しないか、あるいは機能性でなくてよい。そのＲＮＡの両端のＲ領域は反復配列である。Ｕ５およびＵ３はそれぞれＲＮＡゲノムの５’および３’末端に特有の配列である。
【０１１１】
より好ましくは、ウイルスベクターは標的化ベクターであり、すなわち、それはネイティブのウイルスと比較して改変された組織親和性を有し、それによりそのベクターは特定の細胞を標的にするようになっている。その標的化はレトロウイルスのＥｎｖタンパク質を改変することによって達成することができる。好ましくは、エンベロープタンパク質は、無毒なエンベロープまたは一次標的細胞内で無毒な量で産生されるであろうエンベロープ、例えばＭＭＬＶ広宿主性エンベロープまたは改変型広宿主性エンベロープである。
【０１１２】
好ましくは、エンベロープはヒト細胞への形質導入を可能にするエンベロープである。適切なｅｎｖ遺伝子の例には、非限定的に、ＶＳＶ−Ｇ、ＭＬＶ広宿主性ｅｎｖ、例えば４０７０Ａ ｅｎｖ、ＲＤ１１４ネコ白血病ウイルスｅｎｖまたはインフルエンザウイルス由来の赤血球凝集素（ＨＡ）が含まれる。Ｅｎｖタンパク質は、限られた数のヒト細胞タイプの受容体に結合する能力を有するＥｎｖタンパク質であってよく、また、ターゲティング部分を含有する操作されたエンベロープであってよい。ｅｎｖおよびｇａｇ−ｐｏｌコード配列は、選択されたパッケージング細胞株において活性なプロモーターおよび場合によりエンハンサーから転写され、その転写ユニットはポリアデニル化シグナルによって終結する。例えば、パッケージング細胞がヒト細胞である場合、適切なプロモーター−エンハンサーの組み合わせはヒトサイトメガロウイルス主要前初期（ｈＣＭＶ−ＭＩＥ）遺伝子由来のものであり、また、ＳＶ４０ウイルス由来のポリアデニル化シグナルを使用してよい。他の適切なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルは当技術分野において公知である。
【０１１３】
ＭＬＶ
好ましくは、本発明で使用されるレトロウイルスベクターはマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ベクターである。広宿主性モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ−Ａ）由来のレトロウイルスベクターは世界中の臨床プロトコルで一般に使用される。これらのウイルスは細胞表面リン酸輸送体受容体を侵入に使用し、次いで増殖性細胞の染色体に恒久的に組込まれる。その後、前記遺伝子は細胞の寿命期間にわたって維持される。ＭＬＶに基づく構築物上の遺伝子活性は制御が容易であり、長期間にわたって有効でありうる。これらＭＬＶに基づく系を用いて行われる臨床試験では、その耐容性が良好であり、有害な副作用がないことが示されている。
【０１１４】
本発明で使用するためのＭＬＶベクターの一例はＳＦＣＭＭ−３由来のベクターである。このベクターは自殺遺伝子ＨＳＶ−ｔｋおよびマーカー遺伝子ΔＬＮＧＦＲの両者を保持する（Verzeletti 98, Human Gene Therapy 9:2243）。ＳＦＣＭＭ−３の作製に使用される元のベクターはＬＸＳＮである（Millerら Improved retroviral vectors for gene transfer and expression. BioTechniques 7:980-990, 1989）（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号＃２８２４８）。ＬＸＳＮベクターの改変は、唯一のＨｐａ Ｉ部位（「平滑末端切断」）にＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を挿入し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＮａｅ Ｉで消化することによってｎｅｏ遺伝子を除去し、その部位にΔＬＮＧＦＲをコードするｃＤＮＡを挿入することによって行った。
【０１１５】
レンチウイルスベクター
一実施形態では、本発明のベクターはレンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターはレトロウイルスベクターの大きな群の一部分である。レンチウイルスの詳細なリストはCoffinら（"Retroviruses" 1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press, JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus (編) pp 758-763）に見出すことができる。簡単には、レンチウイルスは霊長類群および非霊長類群に分類することができる。霊長類レンチウイルスの例には、非限定的に：ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因物質、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれる。非霊長類レンチウイルス群には、原型「スローウイルス」ビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）、ならびに関連するヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）およびさらに最近報告されたネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が含まれる。
【０１１６】
レンチウイルスファミリーと他の種類のレトロウイルスの相違は、レンチウイルスが分裂および非分裂細胞の両者に感染する能力を有することである（Lewis, 1992; Lewis and Emerman, 1994）。対照的に、他のレトロウイルス、例えばＭＬＶは、非分裂性または緩やかに分裂する細胞、例えば、筋肉、脳、肺および肝臓組織を構成する細胞等には感染することができない。レンチウイルスは最終分化細胞／初代（primary）細胞に形質導入することができるので、レンチウイルスによるスクリーニングストラテジーの使用により、主要な標的である非分裂性または緩やかに分裂する宿主細胞でのライブラリーの選択が可能にされる。
【０１１７】
アデノウイルスベクター
別の実施形態では、本発明のベクターはアデノウイルスベクターである。アデノウイルスは二本鎖の直線状ＤＮＡウイルスであり、ＲＮＡ中間体を経由しない。５０種を超える種々のヒト血清型のアデノウイルスが存在し、遺伝子配列のホモロジーに基づいて６亜群に分類される。アデノウイルスの天然の標的は呼吸上皮および胃腸上皮であり、一般に軽度の症状しか生じさせない。アデノウイルスベクター系では、血清型２型および５型（９５％の配列ホモロジーを有するもの）が最も一般に使用され、通常それらは若年者の上気道感染症に関連する。
【０１１８】
アデノウイルスはエンベロープを有さず、正二十面体（icosohedrons）である。典型的なアデノウイルスは１４０ｎｍのキャプシドに包まれたＤＮＡウイルスを含む。二十面体の対称性のウイルスは１５２個のキャプソメア：２４０個のヘキソンおよび１２個のペントンから構成される。粒子のコアは３６ｋｂ直線状二重鎖ＤＮＡを含有し、それは５’末端で末端タンパク質（ＴＰ）と共有結合していて、ＤＮＡ複製用のプライマーとして働く。前記ＤＮＡは逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を有し、それらの長さは血清型によって異なる。
【０１１９】
アデノウイルスはエンベロープを有さない二本鎖ＤＮＡのウイルスであり、広い範囲のヒトおよび非ヒト起源の細胞タイプへのｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入が可能である。これらの細胞には、呼吸気道上皮細胞、肝細胞、筋細胞、心筋細胞、滑膜細胞、初代乳房上皮細胞および分裂後の最終分化細胞、例えば神経細胞が含まれる。
【０１２０】
またアデノウイルスベクターは非分裂細胞に形質導入する能力を有する。このことは、肺上皮中の罹患細胞が緩やかなターンオーバー率を有する疾患、例えば嚢胞性線維症に関して非常に重要である。実際、アデノウイルスの媒介により、嚢胞性線維症に罹患している成人患者の肺に嚢胞性線維症輸送体（ＣＦＴＲ）を導入することを利用する複数の試みが進行中である。
【０１２１】
アデノウイルスは遺伝子治療および異種遺伝子の発現用のベクターとして使用されている。その大きな（３６キロベースの）ゲノムは８ｋｂまでの外来性挿入ＤＮＡを収容することができ、補完細胞株で効率的に複製して、１０１２までの非常に高い力価を得ることができる。ゆえにアデノウイルスは初代非複製細胞で遺伝子の発現を研究するのに最良な系の１つである。
【０１２２】
アデノウイルスゲノムからのウイルス遺伝子または外来遺伝子の発現は複製中の細胞を必要としない。アデノウイルスベクターは受容体媒介性のエンドサイトーシスによって細胞に侵入する。細胞の内側に入った後、アデノウイルスベクターが宿主染色体に組込まれることはめったにない。その代わりに、エピソームとして（宿主ゲノムから独立して）、宿主の核中の直線状ゲノムとして機能する。ゆえに、組換えアデノウイルスを使用すると、宿主ゲノムへのランダムな組込みに関連する問題が軽減される。
【０１２３】
ポックスウイルスベクター
本発明にしたがってポックスウイルスベクターを使用してよい。その理由は、そのゲノムに大きいＤＮＡ断片を容易にクローニングすることができるからである。また、組換え弱毒化ワクシニア変異体が報告されている（Meyerら, 1991; Smith and Moss, 1983）。
【０１２４】
ポックスウイルスベクターの例には、非限定的にレポリポックスウイルス：Uptonら, 1986,（ショープ線維腫ウイルス）；カプリポックスウイルス：Gershonら, 1989,（ケニアヒツジ−１）；オルソポックスウイルス：Weirら, 1983,（ワクシニア）；Espositoら,1984,（サル痘および天然痘ウイルス）；Hrubyら, 1983,（ワクシニア）；Kilpatrickら, 1985,（ヤバサル腫瘍ウイルス）；アビポックスウイルス：Binnsら,（1988）（鶏痘）；Boyleら, 1987,（鶏痘）；Schnitzleinら, 1988,（鶏痘，ウズラ痘）；エントモポックス（Lytvynら, 1992が含まれる。
【０１２５】
ポックスウイルスベクターは真核細胞での目的の遺伝子に関する発現運搬体として広く使用される。種々の宿主細胞でのそのクローニングおよび増殖の容易さにより、特に、外来タンパク質の発現用に、ならびにワクチン抗原の送達運搬体としてポックスウイルスベクターが広く使用されている（Moss, 1991）。
【０１２６】
ワクシニアウイルスベクター
本発明のベクターはワクシニアウイルスベクター、例えばＭＶＡまたはＮＹＶＡＣであってよい。最も好ましいのは、ワクシニア株の改変型ウイルスであるアンカラ（ＭＶＡ）またはその派生株である。ワクシニアベクターの代替物には、アビポックスベクター、例えば鶏痘またはＡＬＶＡＣとして公知のカナリア痘およびその派生株が含まれ、それらはヒト細胞に感染し、組換えタンパク質を発現することができるが、複製することができない。
【０１２７】
送達系
本発明は、本発明の突然変異体ｔｋポリヌクレオチドに関する送達系をさらに提供する。
【０１２８】
本発明の送達系はウイルス性または非ウイルス性送達系であってよい。非ウイルス性送達機構には、非限定的に脂質媒介性のトランスフェクション、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、カチオン性表面両親媒性物質（cationic facial amphiphiles）（ＣＦＡ）およびそれらの組み合わせが含まれる。
【０１２９】
任意の適切な遺伝子送達運搬体（ＧＤＶ）によって標的細胞集団にポリヌクレオチドを送達することができる。ＧＤＶには、脂質またはタンパク質複合体中で製剤化されるか、あるいは裸のＤＮＡとしてインジェクションまたは微粒子銃送達によって投与されるＤＮＡ、ウイルス、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、マウス白血病ウイルス、セムリキ森林ウイルスおよびバキュロウイルスが含まれるが、それらに制限されない。別法では、細胞、例えば単球、マクロファージ、リンパ球または造血幹細胞によってポリヌクレオチドが送達される。特に、細胞依存的送達系が使用される。この系では、ＴＫタンパク質をコードするポリヌクレオチドが１種またはそれ以上の細胞にｅｘ ｖｉｖｏで導入され、次いで患者に導入される。
【０１３０】
本発明の薬剤は単独で投与してよいが、一般には医薬組成物として投与される。
【０１３１】
宿主細胞
本発明のベクターおよびポリヌクレオチドは、そのベクター／ポリヌクレオチドを複製し、ならびに／あるいは本発明のポリヌクレオチドによってコードされるＴＫを発現する目的で宿主細胞に導入することができる。宿主細胞は、細菌細胞または真核細胞、例えば酵母、昆虫または哺乳動物細胞であってよい。
【０１３２】
宿主細胞はウイルスのパッケージングおよび増殖のための細胞、例えば当技術分野において周知のレトロウイルスのパッケージング細胞株であってよい。
【０１３３】
宿主細胞は、動物または（ヒトであろうと動物であろうと）患者の、破壊することが望まれる細胞であってよい。本発明のポリヌクレオチドおよびベクターは破壊対象の細胞を標的にするのに有用である。ＴＫを発現する細胞を、ＴＫによって毒性形態に変換される実質的に無毒な薬剤と接触させてよい。
【０１３４】
細胞を破壊する方法
本発明の一態様では、細胞を破壊する方法であって、下記ステップを含む方法を提供する：
（ｉ）  本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを該細胞に導入するステップ；
（ｉｉ）該細胞にチミジンキナーゼを発現させるステップ；および
該細胞を、チミジンキナーゼによって毒性薬剤に変換される実質的に無毒な薬剤と接触させるステップ。
【０１３５】
ポリヌクレオチドまたはベクターを細胞に導入するステップ、および細胞を実質的に無毒な薬剤と接触させるステップは、任意の順序であってよい。破壊対象の細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、例えば培養中で生育している細胞であってよく、あるいはそれらは動物の一部分である細胞であってよい。破壊することが望まれる細胞の代表例は、Ｔ細胞、自己免疫性細胞、腫瘍細胞、特定の遺伝子を発現しないか、あるいは不適切に発現する細胞、および細菌、ウイルス、または他の細胞内寄生虫が感染している細胞である。
【０１３６】
治療
本明細書中のすべての、治療への言及には、治癒的、緩和的および予防的治療が含まれることが理解されよう。哺乳動物の治療が特に好ましい。ヒトおよび動物の治療はともに本発明の範囲内である。
【０１３７】
本発明の一態様では、破壊の必要がある細胞を有する患者を治療する方法であって、下記ステップを含む方法を提供する：
（ｉ）    本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは医薬組成物を患者に導入するステップ；
（ｉｉ）  該ポリヌクレオチドまたは発現ベクターを該細胞に取り込ませるステップ；
（ｉｉｉ）該細胞にチミジンキナーゼを発現させるステップ；および
（ｉｖ）  チミジンキナーゼによって毒性薬剤に変換される実質的に無毒な薬剤を該患者に導入するステップ。
【０１３８】
本発明の別の態様では、破壊の必要がある細胞を有する患者を治療する方法であって、下記ステップを含む方法を提供する：
（ｉ）    患者由来の細胞またはドナー細胞を取り出すステップ；
（ｉｉ）  本発明のポリヌクレオチドまたは発現ベクターをｅｘ ｖｉｖｏで該細胞に導入するステップ；
（ｉｉｉ）該改変細胞を該患者に導入するステップ；
（ｉｖ）  該細胞にチミジンキナーゼを発現させるステップ；および
チミジンキナーゼによって毒性薬剤に変換される実質的に無毒な薬剤を該患者に投与するステップ。
【０１３９】
本発明のポリヌクレオチド、ベクターおよび方法によって治療することができる疾患の代表例には、癌、角質増殖、前立腺肥大、甲状腺機能亢進症、多種多様な内分泌疾患、自己免疫疾患、アレルギー、再狭窄、多種多様なウイルス性疾患、例えばＨＩＶおよびＡＩＤＳ、肝炎および細胞内寄生虫症等の疾患が含まれる。
【０１４０】
本発明のポリヌクレオチド、ベクターおよび方法は、同種間骨髄移植後の治療経過において使用してよい。同種間骨髄移植は、多数の血液学的悪性腫瘍、例えば白血病、リンパ腫および多発性骨髄腫に関して選択される治療である。同種間骨髄移植では、特に高用量の化学放射線療法とともに使用すると、自己または同系移植と比較して優れた結果が得られることが示されている。
【０１４１】
同種間骨髄移植を実施する場合、移植物からアロ反応性Ｔリンパ球を除去して、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を予防してよい。ＧｖＨＤが生じるのは、移植された幹細胞移植物中のＴ細胞がレシピエントの身体に対して攻撃を開始する場合である。しかし、このような細胞の除去により、疾患再発、移植物拒絶およびウイルス感染の再活性化の発生率が増加しうる。これらの影響に対抗するために、同種間骨髄移植後、一定の間隔をおいてドナーＴリンパ球を導入することによって、同種間骨髄移植患者を治療することができる。しかし、同種間骨髄移植後にドナーＴリンパ球を遅延導入することについての治療上の見込みは、その治療の頻繁に起りうる潜在的に致死の合併症であるＧｖＨＤによって制限される。この問題は、「自殺遺伝子」をコードするポリヌクレオチドを含むように遺伝子操作されたＴ細胞を患者に投与することによって対処されている。突然変異体ＴＫをコードする本発明のポリヌクレオチドおよびベクターをこの関連で使用してよい。
【０１４２】
ゆえに本発明の一態様では、患者での移植片対宿主病を予防する方法であって、下記ステップを含む方法を提供する：
（ｉ）  本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含むように遺伝子操作されたＴ細胞を宿主に投与するステップ；および
（ｉｉ）実質的に無毒な薬剤とチミジンキナーゼとの相互作用により、該患者において移植片対宿主効果をもたらす能力を有する遺伝子操作されたＴ細胞を死滅させるのに有効な量の該薬剤を、移植片対宿主病が発生する前に該宿主に投与するステップ。
【０１４３】
突然変異体ｔｋ遺伝子をコードするポリヌクレオチドまたはベクターを含む細胞は、好ましくは、突然変異体ｔｋ遺伝子の存在をモニターするために使用してよいマーカー遺伝子を含む。好ましくは、そのマーカー遺伝子は本発明のポリヌクレオチドまたは発現ベクターによってコードされる。前記マーカー遺伝子の一例は改変型低親和性神経成長因子受容体（ΔＬＮＧＦＲ）である。改変型ＬＮＧＦＲは、形質導入された細胞の表面で発現されると、そのリガンドに関して、対応する改変されていないＮＧＦ受容体の結合特性を保持するが、リガンド結合の結果としてのシグナル伝達を達成することができない。具体的なＬＮＧＦＲの改変例は米国特許出願第０８／６０２，７９１号に記載されている。
【０１４４】
医薬組成物
医薬組成物は、治療上有効量の製薬上活性な薬剤を含むか、あるいはそれからなる組成物である。医薬組成物は、好ましくは、製薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤（それらの組み合わせを含む）を含む。治療用途に関して許容される担体または希釈剤は製薬分野において周知であり、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.（A. R. Gennaro 編 1985）に記載されている。製薬用担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図される投与経路および標準の製薬上の実務に鑑みて選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤または希釈剤として、あるいはそれに加えて、任意の適切な結合剤（群）、滑沢剤（群）、懸濁化剤（群）、コーティング剤（群）、可溶化剤（群）を含んでよい。
【０１４５】
製薬上許容される担体の例には、例えば、水、塩溶液、アルコール、シリコン、ワックス、黄色ワセリン（petroleum jelly）、植物油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、リポソーム、糖、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、界面活性剤、ケイ酸、粘性パラフィン（viscous paraffin）、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、石油（petroethral）脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、等が含まれる。
【０１４６】
適切であれば、医薬組成物の投与は下記の任意の１つ以上の様式によって行うことができる：吸入、坐剤または膣坐剤の剤形で、ローション剤、溶液剤、クリーム剤、軟膏剤または散布粉剤の剤形で局所的に、皮膚パッチの使用により、賦形剤、例えばデンプンまたはラクトースを含有する錠剤の剤形で、あるいは単独または賦形剤との混合物中のカプセルまたは卵形剤（ovules）中で、あるいは香味剤または着色剤を含有するエリキシル剤、溶液剤または懸濁液剤の剤形で経口的に投与するか、あるいは例えば空洞内（intracavernosally）、静脈内、筋肉内または皮下に非経口的に注射することができる。非経口投与では、滅菌水溶液の剤形で組成物を最良に使用することができる。滅菌水溶液には、他の物質、例えば十分な塩または単糖を含有させて、該溶液を血液と等張にすることができる。頬腔または舌下投与では、錠剤またはロゼンジ剤の剤形で組成物を投与してよい。錠剤またはロゼンジ剤は慣用の様式で製剤化することができる。
【０１４７】
異なる送達系では組成物／製剤についての異なる必要条件が存在するであろう。一例として、本発明の医薬組成物は、ミニポンプを使用して、あるいは粘膜経路によって、例えば鼻内スプレーまたは吸入用のエアロゾルまたは内服液として、あるいは非経口的に送達する目的で製剤化してよい。非経口の場合、組成物は、例えば静脈内、筋肉内または皮下経路による送達のための注射可能な剤形によって製剤化される。あるいは、両経路によって送達されるように製剤を設計してよい。
【０１４８】
以下、本発明の別の好ましい特徴および実施形態を、非限定的な例として、添付の図面を参照して説明する。
【実施例１】
【０１４９】
ＳＦＣＭＭ−３＃３５上清および形質導入された細胞中のスプライス型のＨＳＶ−ｔｋの相対出現頻度
ＴａｑＭａｎ ７７００システムを使用して、ＨＳＶ−ｔｋのそれぞれの型に特異的な２種類の定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（上清由来のＲＮＡ）またはＰＣＲ（形質導入されたリンパ球由来のＤＮＡ）によって、スプライス型の相対出現頻度（スプライス型／スプライス型＋非スプライス型（％））を評価した。
【０１５０】
材料および方法
ＳＦＣＭＭ−３レトロウイルスベクター
ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２（Ａｍ１２）から誘導した産生細胞株であるＳＦＣＭＭ−３クローン３５（Ａｍ１２／ＳＦＣＭＭ−３＃３５）を、２ｍＭグルタミンおよび１０％の放射線照射済みＦＢＳ（Hyclone）を含有するＤＭＥＭ（Cambrex）培地中で５日間増殖させた。２ｍＭグルタミンを添加したＸ−ＶＩＶＯ １５培地（Cambrex）中でコンフルエントになったフラスコからレトロウイルス上清を回収した。回収は、細胞を３３℃で２４時間インキュベートした後に行った。ウイルス含有上清をろ過し、次に使用するまで−８０℃で保存した。
【０１５１】
Ｔ細胞の形質導入
健康なドナーから末梢血単核細胞を収集し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Nycomed）で遠心分離することによって単離した。
【０１５２】
末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をＯＫＴ３（３０ｎｇ／ｍｌ）（Orthoclone）で刺激し、３％の自家（autologus）血漿、２ｍＭグルタミンを含有し、６００ＩＵ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン２（Proleukin）を添加したＲＰＭＩ（Hyclone）中で培養した。ＯＫＴ３で刺激されたＰＢＬ上でレトロウイルスベクター粒子（Ａｍ１２／ＳＦＣＭＭ−３＃３５由来の上清）を遠心することによってＰＢＬの形質導入を実施した。ＯＫＴ３で刺激した後２日目および３日目に２回の遠心サイクルを実施した。
【０１５３】
形質導入段階の後、リンパ球を収集し、実際に形質導入された細胞のパーセンテージをＦＡＣＳ分析によって評価した。その分析は、細胞表面マーカーとしてΔＬＮＧＦＲ分子を用いて行った。次いで、磁気ビーズ（Dynabeads）にコンジュゲートされた抗体によって、形質導入された細胞を選別し、数日間培養して増殖させ、全１０日間の培養の後に凍結した。
【０１５４】
サンプル調製
ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Qiagen）を製造元のプロトコルにしたがって使用して１〜２×１０６個の細胞からＤＮＡを精製し、ＯＤ２６０を測定することによって収量を決定した。ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Qiagen）を製造元のプロトコルにしたがって使用して１４０μｌの上清からＲＮＡを精製した。１３．５μｌの精製ＲＮＡをまず２５℃で２０分間のＤＮアーゼ処理に付し、９５℃で５分間、ＤＮアーゼを失活させた。次いでＤＮアーゼ処理ＲＮＡの半分を４２℃で１時間逆転写した。その逆転写では、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Invitrogen）およびオリゴｄＴを使用した。合成されたｃＤＮＡを５倍希釈してから、リアルタイムＰＣＲで使用した。
【０１５５】
リアルタイムＰＣＲによるスプライス型の定量
非スプライス型および切断型のＨＳＶ−ｔｋをｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯベクター（Invitrogen）にサブクローニングすることによってＤＮＡの標準曲線を作成した。Ｐｒｉｍｅｒ ＥｘｐｒｅｓｓＴＭ １．５ソフトウェア（PE Applied Biosystems）を使用して、非スプライス型およびスプライス型のＨＳＶ−ｔｋを選択的に増幅して検出できるように、２つの異なる組のプライマーおよびプローブを設計した。ＴａｑＭａｎ／ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００配列検出システムを使用して、ＨＳＶ−ｔｋのそれぞれの型に特異的な２種類の定量的リアルタイムＰＣＲを準備した。
【０１５６】
ＨＳＶ−ｔｋの非スプライス型に特異的な定量的リアルタイムＰＣＲを準備するために、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子のスプライシングされる領域中にプライマーおよびプローブを設計した。上記のように調製された１００〜５００ｎｇのゲノムＤＮＡまたは１０μｌのｃＤＮＡ、１×ＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックス（PE Applied Biosystems）、各３００ｎＭの２種類のプライマーＴＫｗｔｆｏｒ（５’−ＣＧＧ ＣＧＧ ＴＧＧ ＴＡＡ ＴＧＡ ＣＡＡ Ｇ−３’）およびＴｋｗｔｒｅｖ（５’−ＧＣＧ ＴＣＧ ＧＴＣ ＡＣＧ ＧＣＡ ＴＡ−３’）および２００ｎＭのＴＫｗｔ ＭＧＢプローブ（５’−ＦＡＭ ＣＣＡ ＧＡＴ ＡＡＣ ＡＡＴ ＧＧＧ Ｃ−３’）を含有する２５μｌ反応混合物中で、非スプライス型についてリアルタイムＰＣＲを実施した。
【０１５７】
ＨＳＶ−ｔｋのスプライス型を選択的に検出するようにスプライス接合部を包含するＴａｑＭａｎプローブを設計した。上記のように調製された１００〜５００ｎｇのゲノムＤＮＡまたは１０μｌのｃＤＮＡ、１×マスターミックス（PE Applied Biosystems）、各３００ｎＭの２種類のプライマーＴＫＳＰ１８（５’−ＧＧＡ ＴＧＡ ＧＧＧ ＣＣＡ ＣＧＡ Ａ−３’）およびＴＫＳＰ１６（５’−ＣＧＡ ＡＣＡ ＴＣＴ ＡＣＡ ＣＣＡ ＣＡＣ ＡＡＣ Ａ−３’）および２００ｎＭのＴａｑ ＭａｎプローブＰＳＰ１０（５’ＦＡＭ−ＣＣＡ ＧＣＡ ＣＧＧ ＣＣＣ ＴＧＧ ＴＣＧ−ＴＡＭＲＡ ３’）を含有する２５μｌ反応混合物中で、ＴＫのスプライス（切断）型に特異的な定量的リアルタイムＰＣＲを実施した。サーマルサイクルの条件は下記の通りとした：５０℃で２分間のＵＮＧの初期活性化、次いで９５℃で１５分間のＴａｑ Ｇｏｌｄの活性化およびＵＮＧの不活性化。その後、９５℃で１５秒間および６０℃で１分間、４０サイクルの増幅を実施した。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出システム（Applied Biosystems）を使用し、ＭｉｃｒｏＡｍｐ光学用９６ウェル反応プレート（Applied Biosystems）中で両方のＰＣＲを並行して実施した。ＰＣＲサイクル３〜１５から平均のベースライン蛍光を計算し、Ｃｔを、レポーター色素の標準化蛍光強度が０．０５に等しいＰＣＲサイクルとして規定した。各ＴａｑＭａｎアッセイにおいて、最初に投入したＤＮＡ量の対数に対してＣｔ値をプロットすることによって、既知のコピー数（１０６〜４コピー／反応）を有する２種類の標準曲線を作成した。標準希釈物およびｃＤＮＡサンプルをそれぞれ２および３回分析した。両方のＰＣＲを検証したところ、拡大したダイナミックレンジ（６対数）、高感度（＜１０コピー／反応）、良好な再現性（ＣＶ＜５％）および繰り返し精度（ＣＶ＜５％）が示された。
【０１５８】
結果
結果は表１に示される通りである。６種類の臨床用グレードのロットのＳＦＣＭＭ−３ベクターの上清、ならびに形質導入されたリンパ球の９種類の調製物について分析した。
【０１５９】
スプライス型の相対出現頻度は、６種類の臨床用グレードのロットのＳＦＣＭＭ−３上清のすべてにおいて５％未満であり（１．１２＋／−０．７５、範囲０．６５〜２．６０）、ＳＦＣＭＭ−３上清で形質導入されたＴリンパ球の９種類の調製物でも同様であった（１．８９＋／−１．２２、範囲０．８４〜４．００）。
【実施例２】
【０１６０】
ｓｃＳＦＣＭＭ−３上清および形質導入された細胞中のスプライスされたＴＫの変異体
材料および方法
ｓｃＳＦＣＭＭ−３レトロウイルスベクターおよび産生細胞株
ベクターＤＮＡ ＴＫ３（ＴＫ３（Molmed）およびＴＫ３は同一プラスミドｓｃＳＦＣＭＭ−３の異なる調製物であり、Chalmers 2001, Molecular Therapy 4:146-148に記載されている）を、リン酸カルシウム共沈によって、エコトロピックパッケージング細胞株ＧＰ＋ Ｅ−８６（Ｅ８６）にトランスフェクトした。Ｅ８６細胞の一時的トランスフェクションから得られた上清をろ過し、それを使用してＡｍ１２細胞株を感染させた。免疫磁気選択を使用することによってＴＫ３を含有する細胞のフラクションを単離し、得られたＡｍ１２／ＴＫ３バルク培養を増殖させた。Ａｍ１２／ＴＫ３バルク培養を限界希釈した後、高い増殖能力およびＴリンパ球に対する形質導入効率に基づいて、クローン＃５３、＃７１、および＃８０を選択した。
【０１６１】
２ｍＭグルタミンおよび１０％放射線照射済みＦＢＳ（Hyclone）を含有するＤＭＥＭ（Cambrex）中でＡｍ１２／ＴＫ３クローンを増殖させた。２ｍＭグルタミンを添加したＸ−ＶＩＶＯ １５培地（Cambrex）中でレトロウイルス上清を回収した。回収は、細胞を３３℃で２４時間インキュベートした後に行った。０．２２μｍフィルターでウイルス含有上清をろ過し、次に使用するまで−８０℃で保存した。
【０１６２】
Ｔ細胞の形質導入
複数の健康なドナーから末梢血単核細胞を収集し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Nycomed）で遠心分離することによって単離した。
【０１６３】
末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をＯＫＴ３（３０ｎｇ／ｍｌ）（Orthoclone）で刺激し、３％の自家血漿、２ｍＭグルタミンを含有し、６００ＩＵ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン２（Proleukin）を添加したＲＰＭＩ（Hyclone）中で培養した。ＯＫＴ３で刺激されたＰＢＬ上にレトロウイルスベクター粒子を遠心することによってＰＢＬの形質導入を実施した。ＯＫＴ３で刺激した後２日目および３日目に２回の遠心サイクルを実施した。
【０１６４】
形質導入段階の後、ＰＢＬを収集し、実際に形質導入された細胞のパーセンテージをＦＡＣＳ分析によって評価した。その分析は、細胞表面マーカーとしてΔＬＮＧＦＲ分子を用いて行った。次いで、磁気ビーズ（Dynabeads）にコンジュゲートされた抗体によって、形質導入された細胞を選別し、数日間培養して増殖させ、ＰＣＲ分析のためにペレットを調製した。
【０１６５】
ポリメラーゼ連鎖反応
バルクの産生細胞株（Ａｍ１２／ＴＫ３ｂｕｌｋ２）ならびに限界希釈によって得られた単一産生細胞クローン（Ａｍ１２／ＴＫ３＃５３、＃７１および＃８０）を分析した。感染性ウイルス粒子を含有する培養上清からＲＮＡを抽出した。
【０１６６】
ＨＴＫ４＋プライマー（５’−ＴＴＣ ＴＣＴ ＡＧＧ ＣＧＣ ＣＧＧ ＡＡＴ ＴＣＧ ＴＴ−３’）およびＨＴＫ２−プライマー（５’−ＡＴＣ ＣＡＧ ＧＡＴ ＡＡＡ ＧＡＣ ＧＴＧ ＣＡＴ ＧＧ−３’）またはＴＫＡ１プライマー（５’−ＣＧＴ ＡＣＣ ＣＧＡ ＧＣＣ ＧＡＴ ＧＡＣ ＴＴ−３’）およびＴＫＢ１プライマー（５’−ＴＧＴ ＧＴＣ ＴＧＴ ＣＣＴ ＣＣＧ ＧＡＡ ＧＧ−３’）を用いてＲＴ−ＰＣＲを実施した。１０μｌのＤＮアーゼ処理ＲＮＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む１×ＲＴ−ＰＣＲバッファー（PE Applied Biosystems）、各２００μＭのデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、各２００ｎＭのプライマー、５ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２０ＵのＲＮアーゼ阻害剤、１μｌのＴｉｔａｎ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘを含有する５０μｌ反応混合物中で、Ｔｉｔａｎ Ｏｎｅ ｔｕｂｅ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Roche）を使用して、ＲＴ ＰＣＲを実施した。
【０１６７】
Ａｍ１２／ＳＦＣＭＭ−３＃３５由来の上清およびＳＦＣＭＭ−３で形質導入されたリンパ球由来のＤＮＡを対照として使用した。ＲＴ（−）対照も並行して分析した。
【０１６８】
ＲＴ−ＰＣＲサイクルのプロファイルは、５０℃で３０分間の最初の逆転写ステップ、９４℃で２分間の変性ステップ、次いで９５℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリングおよび６８℃で１分３０秒間の伸長の４０サイクル、ならびに６８℃で１０分間の１回の最終伸長ステップからなるものとした。１０マイクロリットルの増幅産物をアガロースゲル電気泳動によって分析した。
【０１６９】
ＳＦＣＭＭ−３またはＴＫ３ベクターで形質導入された複数のドナーのＰＢＬからゲノムＤＮＡを抽出した。１００〜５００ｎｇのゲノムＤＮＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む１×ＰＣＲバッファー（Applied Biosystems）、各２００μＭのｄＮＴＰ、各１６００ｎＭのプライマーＴＫ２Ｓ（５’−ＣＣＡ ＴＡＧ ＣＡＡ ＣＣＧ ＡＣＧ ＴＡＣ Ｇ−３’）およびＴＫＡＳ（５’−ＧＡＡ ＴＣＧ ＣＧＧ ＣＣＡ ＧＣＡ ＴＡＧ Ｃ−３’）を含有する２５μｌ反応混合物中でＰＣＲを実施した。
【０１７０】
ＰＣＲサイクルのプロファイルは、９４℃で１５分間の最初の変性ステップ、次いで９５℃で１分間の変性、６５℃で３０秒間のアニーリングおよび７２℃で１分間の伸長の３８サイクル、ならびに７２℃で１０分間の１回の最終伸長ステップからなるものとした。１０マイクロリットルの増幅産物をアガロースゲル電気泳動によって分析した。
【０１７１】
同一サンプルに対して、１００〜５００ｎｇのゲノムＤＮＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む１×ＰＣＲバッファー（Applied Biosystems）、各２００μＭのｄＮＴＰ、各３００ｎＭのプライマーＨＴＫ４＋（５’−ＴＴＣ ＴＣＴ ＡＧＧ ＣＧＣ ＣＧＧ ＡＡＴ ＴＣＧ ＴＴ−３’）およびＨＴＫ２−（５’−ＡＴＣ ＣＡＧ ＧＡＴ ＡＡＡ ＧＡＣ ＧＴＧ ＣＡＴ ＧＧ−３’）、１．２５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（Applied Biosystems）を含有する２５μｌ反応混合物中でＰＣＲを実施した。ＰＣＲサイクルのプロファイルは、９４℃で１５分間の最初の変性ステップ、次いで９５℃で３０秒間の変性、６０℃で５０秒間のアニーリングおよび７２℃で１分間の伸長の４０サイクル、ならびに７２℃で１０分間の１回の最終伸長ステップからなるものとした。１０マイクロリットルの増幅産物をアガロースゲル電気泳動によって分析した。
【０１７２】
ＴＫ３のスプライス型のｃＤＮＡ配列解析
自動蛍光ＤＮＡシーケンス装置を使用して、Ａｍ１２／ＴＫ３＃５３上清からＨＴＫ４＋／ＨＴＫ２−プライマーで増幅された産物の下側のバンドをシーケンシングした。シーケンシングはＰＲＩＭＭ（Milan, Italy）によって行われた。
【０１７３】
結果
培養上清のＲＮＡからのＨＳＶ−ｔｋ ＲＴ−ＰＣＲ
Ａｍ１２およびＥ８６パッケージング細胞株によって産生されたＳＦＣＭＭ−３ならびにＴＫ３ベクター由来のＲＮＡを分析すると２種類のＰＣＲ産物が検出された（図３）。ＴＫ３ベクターは、報告されているｓｃＳＦＣＭＭ−３ベクター（Chalmers, 2001）と一致する。主要な産物（上側のバンド）は、すべてのサンプル中で非スプライス型のＨＳＶ−ｔｋ（ＨＴＫ４＋／ＨＴＫ２−プライマーの場合は１０２０塩基対（ｂｐ）；ＴＫＡ１／ＴＫＢ１プライマーの場合は４０１ ｂｐ）に相当する。ＳＦＣＭＭ−３サンプル中の少ない方の産物（下側のバンド）のサイズは、２２７ ｂｐが欠失している報告されているスプライス型に相当する（Garin 2001, Blood 97:122-129）。
【０１７４】
一方、ＴＫ３サンプル中の少ない方の産物のサイズはわずかに大きく、別のスプライス型の存在を示唆する。その型では、より小さい断片が欠失している；ＳＦＣＭＭ−３とＴＫ３サンプル間のその差異はＴＫ２Ｓ／ＴＫＡＳプライマーの場合に特にはっきりわかる。ＨＴＫ４＋／ＨＴＫ２−プライマーの場合にのみ観察される追加の中間産物は、起こりうるＰＣＲのアーチファクトであると考えられる。
【０１７５】
形質導入されたリンパ球由来のＤＮＡに対するＨＳＶ−ｔｋ ＰＣＲ
ＳＦＣＭＭ−３ならびにＴＫ３で形質導入されたＰＢＬ由来のＤＮＡを分析すると２種類のＰＣＲ産物が検出された（図４）。主要な産物（上側のバンド）は、非スプライス型のＨＳＶ−ｔｋ（ＴＫ２Ｓ／ＴＫＡＳプライマーの場合は６４４ ｂｐ；ＨＴＫ４＋／ＨＴＫ２−プライマーの場合は１０２０ ｂｐ）に相当する。ＳＦＣＭＭ−３サンプルでの下側のバンド（報告されているスプライス型に相当する）のサイズは、ＴＫ２Ｓ／ＴＫＡＳプライマーの場合は４１７ ｂｐであり、ＨＴＫ４＋／ＨＴＫ２−プライマーの場合は７９３ ｂｐである。
【０１７６】
ＳＦＣＭＭ−３とＴＫ３におけるＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の重要部分の配列
ＳＦＣＭＭ−３とＴＫ３におけるＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の重要部分の配列は図５に示される通りである。スプライス型のＳＦＣＭＭ−３およびＴＫ３で欠失する遺伝子セグメントは斜体で示される。対応するスプライシングドナー部位およびアクセプター部位には下線が付してある。
【０１７７】
配列データから、ＳＦＣＭＭ−３（２２７ ｂｐ欠失）およびＴＫ３（２１４ ｂｐ欠失）サンプルにおいて、別のスプライス型が生成されることが確認される。両事例で予測される通り、欠失対象の配列の５’および３’境界にそれぞれＧＵおよびＡＧジヌクレオチドが存在する。
【実施例３】
【０１７８】
部位特異的突然変異誘発（site direct mutagenesis）によるスプライシングの排除
材料および方法
野生型ＳＦＣＭＭ−３ベクターから出発して、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子中に種々の突然変異を有する組換えプラスミドを部位特異的突然変異誘発によって作製した（図６）。３番目の塩基の縮重変化を導入したが、すべての事例でＨＳＶ−ｔｋ酵素の野生型アミノ酸配列が保存された。
【０１７９】
部位特異的突然変異誘発
ｐｃＤＮＡ３．１−ｔｋプラスミドを作製するために、ＳＦＣＭＭ−３プラスミドをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで消化したｐｃＤＮＡ３．１（Invitrogen）にそのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ断片をライゲーションした。
【０１８０】
ｐｃＤＮＡ３．１−ｔｋプラスミドから、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（Stratagene）を使用して部位特異的突然変異誘発によってすべてのＨＳＶ−ｔｋ突然変異体を作製した。所望の突然変異の導入に使用したオリゴヌクレオチドプライマーは前記ベクターの反対の鎖にそれぞれ相補的なものとした。センスプライマーの配列は下記の表に報告される通りである：
【表２】
2008502342.tif 000003
【０１８１】
得られたベクターをシーケンシングして、適正なヌクレオチド置換を確認した。次いでＨＳＶ−ｔｋ突然変異断片をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化することによってｐｃＤＮＡ３．１から切り出して、ＳＦＣＭＭ−３プラスミドにクローニングし、ＳＦＣＭＭ−３ ＨＳＶ−ｔｋ突然変異体を得た。
【０１８２】
ＳＦＣＭＭ−３ ＨＳＶ−ｔｋ突然変異体の配列（図１）を確認した後、各種類について１種類のプラスミドクローンを使用して、Ｅ８６細胞を一時的にトランスフェクトした。ＳＦＣＭＭ−３およびＴＫ３プラスミドを対照として使用した。Ｅ８６培養物から上清を収集し、それを使用して、実施例２の材料および方法の項に記載のようにアンホトロピックパッケージング細胞株Ａｍ１２に安定的に形質導入した。得られた細胞集団をΔＬＮＧＦＲ発現に関して選択した。
【０１８３】
感染性レトロウイルス粒子を含有するＥ８６ならびにＡｍ１２培養上清からＲＮＡを抽出した。Ｅ８６およびＡｍ１２上清由来のＲＮＡに対して、ＴＫＡ１およびＴＫＢ１プライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲ反応を実行した。その際、実施例２の材料および方法の項に記載のプロトコルにしたがった。
【０１８４】
ＣＥＭ Ａ３０１細胞株およびＰＢＬの形質導入およびＰＣＲ分析
１０％ ＦＢＳ（Hyclone）および２ｍＭグルタミンを添加したＲＰＭＩ １６４０（Hyclone）中でＣＥＭ Ａ３０１細胞を培養した。ＳＦＣＭＭ−３ ＨＳＶ−ｔｋ突然変異体２および２３４を含有するＡｍ１２培養上清でＣＥＭ Ａ３０１細胞を感染させた。形質導入前日に５×１０５細胞／ｍｌで培養した。次いで細胞上にレトロウイルスベクター粒子の１回の遠心サイクルを施すことによって形質導入を実施した。形質導入段階の後、細胞を収集し、実際に形質導入された細胞のパーセンテージをＦＡＣＳ分析によって評価した。３つの異なるドナー由来のＰＢＬに対して、ＳＦＣＭＭ−３ ＨＳＶ−ｔｋ突然変異体２ならびにＳＦＣＭＭ−３を含有するＡｍ１２上清で（実施例２の材料および方法の項に記載の通り）形質導入を行った。
【０１８５】
次いで、形質導入された細胞をΔＬＮＧＦＲ発現に関して選別し、数日間培養して増殖させた。
【０１８６】
実施例２の材料および方法の項に記載の通りに、形質導入された非選択細胞ならびに形質導入された選択細胞から、ＰＣＲ分析用に１つのペレットを調製した。ペレット細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、１００〜５００ｎｇのゲノムＤＮＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む１×ＰＣＲバッファー（Applied Biosystems）、各２００ｎＭのｄＮＴＰ、各３００ｎＭのプライマー、１．２５単位のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（Applied Biosystems）を含有する２５μｌ反応混合物中で、（下記の表で指定される）ＴＫＡ１およびＴＫＢ１またはＴＫＹ１およびＴＫＹ２またはＴＫＺ１およびＴＫＺ２プライマーを用いてＰＣＲ反応を実行した。ＰＣＲサイクルのプロファイルは、９４℃で１５分間の最初の変性ステップ、次いで９４℃で３０秒間の変性、６０℃で５０秒間のアニーリングおよび７２℃で１分間の伸長の４０サイクル、ならびに７２℃で１０分間の１回の最終伸長ステップからなるものとした。１０マイクロリットルの増幅産物をアガロースゲル電気泳動によって分析した。
【表３】
2008502342.tif 000004
【０１８７】
結果
Ｅ８６上清中のＨＳＶ−ｔｋ突然変異体のスプライシング特性
非スプライス型のＨＳＶ−ｔｋ（４０１ ｂｐ）に相当する主要な産物（上側のバンド）は、陰性対照（トランスフェクトされていないＥ８６細胞、Ｅ８６ Ｃ−由来の上清）を除くすべてのサンプル中で検出される（図７）。
【０１８８】
Ｅ８６パッケージング細胞株によって産生されるすべての突然変異体ベクター由来のＲＮＡでは、ＳＦＣＭＭ−３およびＴＫ３ベクターと比べて、少ない方の産物（下側のバンド）の量が少ない。
【０１８９】
Ａ１２上清中のＨＳＶ−ｔｋ突然変異体のスプライシング特性
陰性対照（非感染細胞、Ａｍ１２ Ｃ−由来の上清およびＨ２Ｏ）を除くすべてのサンプル中で、非スプライス型のＨＳＶ−ｔｋが検出される（図８）。ＴｋＭｕｔ４（突然変異４）およびＴｋＭｕｔ３４（突然変異３＋４）突然変異体では下側のバンドが検出され、それぞれ、ＴＫ３およびＳＦＣＭＭ−３サンプルの下側のバンドに相当する。臭化エチジウムシグナルの強度はＴＫ３およびＳＦＣＭＭ−３と比較して弱く、その突然変異体ではスプライスされた産物が目立たないことが示される。ＴｋＭｕｔ２（突然変異２）、ＴｋＭｕｔ２３４（突然変異２＋３＋４）およびＴｋＭｕｔ２４（突然変異２＋４）突然変異体では、このバンドは検出されない。実際には、ＴｋＭｕｔ２、ＴｋＭｕｔ２３４およびＴｋＭｕｔ２４突然変異体では、約１００および２００ ｂｐの２つの非常に弱いバンドが検出される。
【０１９０】
形質導入されたＣＥＭ Ａ３０１細胞およびＰＢＬ中のＨＳＶ−ｔｋ突然変異体のスプライシング特性
ＴｋＭｕｔ２およびＴｋＭｕｔ２３４突然変異体ならびにＳＦＣＭＭ−３およびＴＫ３上清で形質導入されたＣＥＭ Ａ３０１由来のゲノムＤＮＡを、ＴＫＡ１／ＴＫＢ１プライマーを使用してＰＣＲによって分析した。陰性対照（形質導入されていない細胞、ＣＥＭ ＮＴ、およびＨ２Ｏ）を除くすべてのサンプル中で、非スプライス型のＨＳＶ−ｔｋ（４０１ ｂｐ）が検出される（図９）。ＴＫ３およびＳＦＣＭＭ−３の選択前および選択後サンプルでは下側のバンドが検出され、それらはスプライス型のＨＳＶ−ｔｋ遺伝子に相当する。ＴｋＭｕｔ２およびＴｋＭｕｔ２３４突然変異体で形質導入されたＣＥＭでは、選択前も選択後も、下側のバンドが観察されない。
【０１９１】
ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の別の領域で生じるオルタナティブスプライシング事象の可能性を除外するために、ＴＫＹ１／ＴＫＹ２およびＴＫＺ１／ＴＫＺ２プライマーを使用して、ＴｋＭｕｔ２ならびにＳＦＣＭＭ−３上清で形質導入されたＣＥＭ Ａ３０１についてのさらに詳細な分析を行った。
【０１９２】
すべてのサンプル中で、非スプライス型のＨＳＶ−ｔｋ（それぞれ５４２ ｂｐおよび１１４９ ｂｐ）が検出される（図１０）。ＳＦＣＭＭ−３の選択前および選択後サンプルでは下側のバンドが検出され、それらはスプライス型のＨＳＶ−ｔｋ遺伝子に相当する。ＴｋＭｕｔ２で形質導入されたＣＥＭでは、ＰＣＲプライマーＴＫＹ１／ＴＫＹ２を用いても、ＴＫＺ１／ＴＫＺ２を用いても、下側のバンドが観察されない。
【０１９３】
ＳＦＣＭＭ−３および／またはＴｋＭｕｔ２上清で形質導入された３人の異なるドナー（Ｄｏｎ１、Ｄｏｎ２、Ｄｏｎ３）のＰＢＬ由来のゲノムＤＮＡを、ＴＫＡ１／ＴＫＢ１プライマーを使用してＰＣＲによって分析した。すべてのサンプル中で、非スプライス型のＨＳＶ−ｔｋ（４０１ ｂｐ）が検出される（図１１）。ＳＦＣＭＭ−３サンプルでは下側のバンドが検出され、それはスプライス型のＨＳＶ−ｔｋ遺伝子に相当する。ＴｋＭｕｔ２で形質導入されたＰＢＬでは下側のバンドが観察されない。ＴＫＺ１／ＴＫＺ２プライマーを使用して同一の結果が得られ（図１２）、この場合、完全長ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子（１１４９ ｂｐ）が包含されるので、導入された突然変異によって別のスプライシング変異体が生じうる可能性が除外された。
【０１９４】
全体として、これらの知見は、導入された突然変異によって、形質導入されたＣＥＭおよび形質導入されたリンパ球中の、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子のいずれのスプライス型も消失するか、または少なくとも非常に顕著に減少することを示す。
【表４】
2008502342.tif 000005
【０１９５】
上記明細書中に記載のすべての刊行物は参照により本明細書中に組み入れられる。本発明の上記方法および系についての種々の改変およびバリエーションは、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に明らかである。本発明は具体的な好ましい実施形態に関連して説明されてきたが、特許を受けようとする発明はその具体的な実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されよう。事実、生化学およびバイオテクノロジーまたは関連分野の当業者には明らかな、本発明を実行するための上記様式についての種々の改変は特許請求の範囲内であるものとする。
【０１９６】
参照文献
2008502342.tif 000006
【０１９７】
2008502342.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【０１９８】
【図１−１】ＨＳＶ−１チミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）突然変異体（ＴｋＭｕｔ２（配列番号２）、ＴｋＭｕｔ２３（配列番号３）、ＴｋＭｕｔ２４（配列番号４）、ＴｋＭｕｔ３４（配列番号５）、ＴｋＭｕｔ４（配列番号６）およびＴｋＭｕｔ２３４（配列番号７）のヌクレオチド配列のマルチプルアライメントを示す。塩基は野生型ＨＳＶ−ｔｋ配列のＡＴＧ開始コドンから番号付けされている。配列はＴＫ ｗｔ配列（ＴＫ ｗｔ、配列番号１）に対してアライメントされている。突然変異の位置はアライメントの上部の番号によって示されている。位置（３３０）、（５４１および５４２）、および（５５５）の突然変異はそれぞれ番号２、３および４によって表される。
【図１−２】ＨＳＶ−１チミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）突然変異体（ＴｋＭｕｔ２（配列番号２）、ＴｋＭｕｔ２３（配列番号３）、ＴｋＭｕｔ２４（配列番号４）、ＴｋＭｕｔ３４（配列番号５）、ＴｋＭｕｔ４（配列番号６）およびＴｋＭｕｔ２３４（配列番号７）のヌクレオチド配列のマルチプルアライメントを示す。
【図１−３】ＨＳＶ−１チミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）突然変異体（ＴｋＭｕｔ２（配列番号２）、ＴｋＭｕｔ２３（配列番号３）、ＴｋＭｕｔ２４（配列番号４）、ＴｋＭｕｔ３４（配列番号５）、ＴｋＭｕｔ４（配列番号６）およびＴｋＭｕｔ２３４（配列番号７）のヌクレオチド配列のマルチプルアライメントを示す。
【図２】スプライシングコンセンサス配列を示す。
【図３】ＳＦＣＭＭ−３（Verzelletti, 1998, Human Gene Therapy 9:2243-2251）および／またはＴＫ３（ｓｃＳＦＣＭＭ−３）（Chalmers, 2001）ベクターでトランスフェクトされたエコトロピックパッケージング細胞株ＧＰ＋ Ｅ８６の上清およびアンホトロピックパッケージング細胞株ｇｐ＋ ｅｎｖ Ａｍ１２（Ａｍ１２）から調製されたｃＤＮＡのＨＳＶ−ｔｋ ＰＣＲ産物を示す。
【図４】ＳＦＣＭＭ−３および／またはＴＫ３（ｓｃＳＦＣＭＭ−３）ベクターで形質導入された末梢血リンパ球（ＰＢＬ）でのＰＣＲ増幅されたＨＳＶ−ｔｋを示す。
【図５】ＳＦＣＭＭ−３とＴＫ３（ｓｃＳＦＣＭＭ−３）でのＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の重要部分の配列を示す。ＳＦＣＭＭ−３とＴＫ３（ｓｃＳＦＣＭＭ−３）ベクター間で異なるヌクレオチド位置は四角で縁取られている。スプライス型のＳＦＣＭＭ−３およびＴＫ３で欠失している遺伝子セグメントは斜体で示されている。対応するスプライシングドナー部位およびアクセプター部位が示されている。
【図６】ＳＦＣＭＭ−３ベクターに導入された突然変異の模式的概要を示す。
【図７】図１に示されるＨＳＶ−ｔｋ突然変異体を含むＳＦＣＭＭ−３由来の組換えプラスミドで一時的にトランスフェクトされたＥ８６細胞の上清由来のｃＤＮＡのＨＳＶ−ｔｋ ＰＣＲ産物を示す。
【図８】図７に記載のＥ８６培養から収集された上清で形質導入されたＡｍ１２培養の上清由来のｃＤＮＡのＨＳＶ−ｔｋ ＰＣＲ産物を示す。
【図９】図８に記載のＡｍ１２培養から収集された上清で形質導入されたＣＥＭ Ａ３０１細胞由来のＤＮＡのＴＫＡ１／ＴＫＢ１ ＨＳＶ−ｔｋ ＰＣＲ産物を示す。
【図１０】図８に記載のＡｍ１２培養物から収集された上清で形質導入されたＣＥＭ Ａ３０１細胞由来のＤＮＡのＴＫＹ１／ＴＫＹ２およびＴＫＺ１／ＴＫＺ２ ＨＳＶ−ｔｋ ＰＣＲ産物を示す。
【図１１】図８に記載のＡｍ１２培養物から収集された上清で形質導入されたＰＢＬ由来のＤＮＡのＴＫＡ１／ＴＫＢ１ ＨＳＶ−ｔｋ ＰＣＲ産物を示す。
【図１２】図８に記載のＡｍ１２培養物から収集された上清で形質導入されたＰＢＬ由来のＤＮＡのＴＫＺ１／ＴＫＺ２ ＨＳＶ−ｔｋ ＰＣＲ産物を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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