(57)【要約】  損傷若しくは傷害を受け又は病変若しくは老化した軟骨を、関節軟骨の病変部位に埋め込んだ新軟骨構造体を用いて治療する方法。新軟骨構造体を埋め込むことにより、周囲に元からある軟骨への新軟骨の組み込みが始まり達成され、また関節軟骨の病変部位上に成長しこれを封止する新たな表層性軟骨層が形成される。本発明は、新軟骨構造体及びその調整方法にも関するものである。
2008507971.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
損傷若しくは傷害を受け又は病変若しくは老化した軟骨を機能性の軟骨に修復し回復させる方法であって、
ａ）スポンジ、多孔性スキャフォルド又はヒドロゲル基質支持体に組み込まれ、所定のアルゴリズム条件で処理した自己由来又は異種の軟骨細胞を有する新軟骨構造体を調製するステップと、
ｂ）この構造体を軟骨病変部位に埋め込むステップと
を有する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
この方法がさらに、前記病変部位に埋め込まれた前記構造体上に、生物学的に許容されうる頂部シーラント層を沈着させるステップを有する方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法において、
この方法がさらに、前記病変部位の底部に、生物学的に許容されうる底部シーラント層を沈着させるステップを有する方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法において、
前記頂部及び前記底部シーラント層が、同じものであるか又は異なるものである方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、
前記構造体及び前記頂部シーラントを組合せることにより、前記軟骨病変部位を生体位で封止する表層性軟骨層の形成及び成長がなされるようにする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、
病変腔に埋め込む前記新軟骨構造体を、その埋め込み処理前に本発明のアルゴリズムで処理する方法であって、
前記アルゴリズムが、軟骨細胞を処理する条件として、可変の静水圧若しくは大気圧又は無圧力の条件と、可変の灌流速度条件と、可変の培地組成条件と、可変の酸素若しくは窒素若しくは二酸化炭素の濃度条件と、可変の温度条件と、可変の細胞密度条件と、可変の時間条件とを有する方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法において、
前記新軟骨構造体の支持基質を、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、グリコサミノグリカン若しくは糖蛋白質若しくはプロテオグリカンを含む細胞収縮コラーゲン、ゼラチン、アガロース、フィブロネクチン、ラミニン、生理活性ペプチド成長因子、ヒアルロン酸、サイトカイン、エラスチン、ポリ乳若しくはポリグリコール若しくはポリアミノ酸から形成される合成高分子繊維、ポリカプロラクトン、ポリアミノ酸、ポリペプチドゲル、高分子温度可逆性ゲル化ヒドロゲル（ＴＲＧＨ）及びこれらの共重合体並びにこれらの組合せからなる群から選択された材料から調製する方法。
【請求項８】
請求項７の方法において、
前記静水圧を、約０．０１〜約１Ｈｚにおいて大気圧より上で約０ＭＰａ〜約１０ＭＰａの圧力とし、
前記静水圧を加える前記時間を、約９０日〜約１日に亘り１日あたり０〜約２４時間とし、
静大気圧を約９０日〜約１日に亘り１日あたり０〜約２４時間加える処理の前又は後に、前記静水圧を加える処理を行い、
前記流速を、約１μＬ／分〜約５００μＬ／分とし、
前記細胞密度を、１ｍＬあたり約３００００００〜６０００００００とし、
前記酸素濃度を、約１％〜約２０％とする方法。
【請求項９】
請求項８の方法において、
前記新軟骨構造体が、１ｍＬあたり約１２００００００〜約１５００００００の密度でＴＲＧＨ中に懸濁された軟骨細胞を含むようにし、
前記０．１〜約０．５Ｈｚにおいて約０．０５ＭＰａ〜約３ＭＰａの圧力とした周期的な静水圧を加えるか、大気圧より上で約０〜約３ＭＰａの一定圧を加えるかし、
このような圧力を、約７日〜約２８日間に亘り加え、
前記灌流流速を、約５０μＬ〜約５μＬとし、
前記灌流処理を、約２％〜約５％の酸素の存在下で行う方法。
【請求項１０】
損傷若しくは傷害を受け又は病変若しくは老化した関節軟骨を治療し再生させる関節軟骨の治療及び再生方法であって、
ａ）関節軟骨病変部位を清拭するステップと、
ｂ）清拭中に、約５０〜４０００ｍｇのガラス軟骨を採取するステップと、
ｃ）これら軟骨細胞を分離するステップと、
ｄ）前記軟骨細胞を培地で増殖させるステップと、
ｅ）前記軟骨細胞を、１ｍｌあたり約３００００００〜約６０００００００の細胞密度で支持基質に懸濁させ、新軟骨構造体を生成するステップと、
ｆ）前記構造体に対し、約２％〜約２０％の酸素の存在下で約１〜約５００μＬの灌流流速において、約１２日〜約２０日の静大気圧を加える処理期間の後に、約５日〜約１０日間の期間に亘り周期的な又は一定の静水圧を加えるアルゴリズムを行うステップと、
ｇ）前記ステップｆ）により得られた前記構造体を、ステップａ）の病変部位に埋め込むステップと、
ｈ）前記病変部位に埋め込まれた前記構造体を、生物学的に許容されうる頂部シーラントにより被覆し、前記病変部位の外面を被覆するステップと
を有する関節軟骨の治療及び再生方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の関節軟骨の治療及び再生方法において、
この方法がさらに、前記病変部位の底部に生物学的に許容されうる底部シーラントを沈着させるステップを有する関節軟骨の治療及び再生方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の関節軟骨の治療及び再生方法において、
前記頂部又は前記底部シーラントを、ゼラチン、ポリエチレングリコール及びポリ乳酸若しくはポリグリコリドの共重合体、過ヨウ素酸酸化ゼラチン、４腕のペンタエリスリトールチオール及びポリエチレングリコールジアクリレート、４腕のテトラスクシンイミジルエステル若しくはテトラチオール誘導体化ＰＥＧ、光重合性ポリエチレングリコール共重合（ａ−ヒドロキシ酸）ジアクリレートマクロマー、メチル化コラーゲンを加えたスクシンイミジルエステル及びチオールにより誘導体化した４腕のポリエチレングリコール、ヒドロゲル、誘導体化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルキル化コラーゲンにより架橋した誘導体化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、テトラヒドロスクシンイミジル若しくはテトラチオール誘導体化ＰＥＧ、メチル化コラーゲンで架橋したＰＥＧ並びにこれらの組合せからなる群から選択し、これら頂部及び底部シーラントが、同じものであるか又は異なるものとする関節軟骨の治療及び再生方法。
【請求項１３】
請求項１３に記載の関節軟骨の治療及び再生方法において、
前記シーラントを、メチル化コラーゲンで架橋したＰＥＧとする関節軟骨の治療及び再生方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の関節軟骨の治療及び再生方法において、
採取する軟骨細胞を、関節鏡検査中に患者から得られる非骨関節炎又は骨関節炎の軟骨細胞とし、
プロテアーゼ及びリアーゼの双方を順次に又は混合して使用することにより、前記軟骨細胞を分離させ、
これら軟骨細胞を、培地にて培養して増殖させてゾル−ゲル溶液又は温度可逆性ゲル化ヒドロゲル中に懸濁させ、支持基質に播種する関節軟骨の治療及び再生方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の関節軟骨の治療及び再生方法において、
前記支持基質を、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、グリコサミノグリカン若しくは糖蛋白質若しくはプロテオグリカンを含む細胞収縮コラーゲン、ゼラチン、アガロース、フィブロネクチン、ラミニン、ヒアルロン酸、生理活性ペプチド成長因子、サイトカイン、エラスチン、ポリ乳若しくはポリグリコール若しくはポリアミノ酸から形成される合成高分子繊維、ポリカプロラクトン、ポリアミノ酸、ポリペプチドゲル、高分子温度可逆性ゲル化ヒドロゲル（ＴＲＧＨ）及びこれらの共重合体並びにこれらの組合せからなる群から選択された材料から調製されたスポンジ、多孔性スキャフォルド若しくはヒドロゲルとする関節軟骨の治療及び再生方法。
【請求項１６】
請求項１５の関節軟骨の治療及び再生方法において、
前記基質を、ゾル−ゲル懸濁液を静水圧を加える前に導入したスポンジとするか、又は前記基質を、液体ゾルの形態となる約３０℃より低い温度で軟骨細胞を懸濁させたＴＲＧＨであって、その後約３０℃〜約３７℃より高い温度まで上昇させることにより固体ゲルの形態に転換させた当該ＴＲＧＨとし、前記固体ゲルを前記ステップｆ)のアルゴリズムにより処理し、新軟骨構造体を形成する関節軟骨の治療及び再生方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の関節軟骨の治療及び再生方法において、
前記構造体を、前記頂部シーラント層及び前記底部シーラント層の間に形成された病変部位の病変腔内に埋め込む関節軟骨の治療及び再生方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の関節軟骨の治療及び再生方法において、
前記構造体を、軟骨細胞を組み込んだ前記ＴＲＧＨとし、この構造体を３０℃より低い温度まで冷却して液体ゾルに転換してゾルとして埋め込み処理を行い、このゾルを体温まで加温し前記ゾルを前記病変腔を充填する固体ゲルに転換させる関節軟骨の治療及び再生方法。
【請求項１９】
請求項１８の関節軟骨の治療及び再生方法において、
前記新軟骨構造体が、ＴＲＧＨ中に懸濁させた軟骨細胞を含むようにし、
約１２日間に亘り静的大気圧を加える処理の後又は前において、０．１Ｈｚにおいて約３ＭＰａとした周期的な静水圧又は約０〜約３ＭＰａとした一定の静水圧を加え、
前記灌流流速を約５μＬとし、
前記灌流処理を、約２％〜約５％の酸素の存在下で行う方法。
【請求項２０】
請求項１６に記載の関節軟骨の治療及び再生方法において、
前記構造体を、軟骨細胞を組み込んだスポンジとし、この構造体を、底部シーラントを沈着させた後で且つ頂部シーラントを沈着させる前に、前記病変部位の底部シーラント上方に埋め込む関節軟骨の治療及び再生方法。
【請求項２１】
軟骨病変部位に埋め込むための新軟骨構造体であって、
前記構造体は、培養して分化させた自己由来若しくは異種の軟骨細胞又は分化して軟骨細胞になりうる細胞であって、支持基質に組み込まれたものを含み、軟骨細胞に対する可変の静水圧若しくは大気圧又は無圧力の条件と、可変の灌流速度条件と、可変の培地組成条件と、可変の酸素若しくは窒素若しくは二酸化炭素の濃度条件と、可変の温度条件と、可変の細胞密度条件と、可変の時間条件とを含む本発明のアルゴリズムで処理したものである新軟骨構造体。
【請求項２２】
請求項２１に記載の構造体において、
前記支持基質が、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、グリコサミノグリカン若しくは糖蛋白質若しくはプロテオグリカンを含む細胞収縮コラーゲン、ゼラチン、アガロース、フィブロネクチン、ラミニン、生理活性ペプチド成長因子、サイトカイン、エラスチン、ヒアルロン酸、ポリ乳若しくはポリグリコール若しくはポリアミノ酸から形成される合成高分子繊維、ポリカプロラクトン、ポリアミノ酸、ポリペプチドゲル、高分子温度可逆性ゲル化ヒドロゲル（ＴＲＧＨ）及びこれらの共重合体並びにこれらの組合せからなる群から選択された材料から調製されたスポンジ若しくは多孔性スキャフォルド若しくはヒドロゲルである構造体。
【請求項２３】
請求項２２に記載の構造体において、
前記支持基質がＴＲＧＨである構造体。
【請求項２４】
請求項２３に記載の構造体において、
前記静水圧を周期的な又は一定の圧力とした構造体。
【請求項２５】
請求項２４の構造体において、
前記静水圧は、約０．０１〜約１Ｈｚにおいて大気圧より上で約０ＭＰａ〜約１０ＭＰａの圧力とされ、
前記静水圧を加える前記時間は、約９０日〜約１日にわたり１日あたり０〜約２４時間とされ、
約９０日〜約１日に亘る１日あたり０〜約２４時間の静大気圧を加える処理の前又は後に、前記静水圧を加える処理が行われ、
前記流速が、約１μＬ／分〜約５００μＬ／分とされ、
前記細胞密度は、１ｍＬあたり約３００００００〜６０００００００とされ、
前記酸素濃度が、約１％〜約２０％とされた構造体。
【請求項２６】
請求項２５に記載の構造体において、
０．１〜約０．５Ｈｚにおいて約０．０５ＭＰａ〜約３ＭＰａの圧力とした周期的な静水圧か、又は大気圧より上で約０〜約３ＭＰａとした一定圧が、約７日〜約２８日間に亘り加えられた構造体。
【請求項２７】
請求項２６に記載の構造体において、
約０〜約２８日の大気圧に曝す期間の後又は前に、前記静水圧を加える処理を行う構造体。
【請求項２８】
請求項２７に記載の構造体において、
前記軟骨細胞が自己由来のものである構造体。
【請求項２９】
請求項２７に記載の構造体において、
前記軟骨細胞が異種のものである構造体。
【請求項３０】
軟骨病変部位内に埋め込むのための３次元新軟骨構造体の製造方法であって、
ａ）支持基質構造体を調製するステップと、
ｂ）ドナーから一片の軟骨を採取して軟骨細胞を分離するステップと、
ｃ）軟骨細胞を培養し増殖させるステップと、
ｄ）増殖させた軟骨細胞を懸濁させて懸濁液とするステップと、
ｅ）前記懸濁させた軟骨細胞を基質に組み込むステップと、
ｆ）本発明のアルゴリズムを用いて、前記軟骨細胞を２次元又は３次元の新軟骨構造体内で伝播させるステップと
を有する新軟骨構造体の製造方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の新軟骨構造体の製造方法において、
前記支持基質構造体を、コラーゲン、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、グリコサミノグリカン若しくは糖蛋白質若しくはプロテオグリカンを含む細胞収縮コラーゲン、ゼラチン、アガロース、フィブロネクチン、ラミニン、ヒアルロン酸、生理活性ペプチド成長因子、サイトカイン、エラスチン、ポリ乳酸若しくはポリグリコール若しくはポリアミノ酸から形成される合成高分子繊維、ポリカプロラクトン、ポリアミノ酸、ポリペプチドゲル、ヒドロゲル及びこれらの共重合体並びにこれらの組合せからなる群から選択された材料から調製する新軟骨構造体の製造方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の新軟骨構造体の製造方法において、
前記支持基質を、コラーゲン、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン又はＩＶ型コラーゲンから調製する新軟骨構造体の製造方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の新軟骨構造体の製造方法において、
前記コラーゲン、前記Ｉ型コラーゲン、前記ＩＩ型コラーゲン又は前記ＩＶ型コラーゲンを凍結乾燥させるか、又はスポンジ又はスポンジ様構造体に凍結乾燥させる新軟骨構造体の製造方法。
【請求項３４】
請求項３１に記載の新軟骨構造体の製造方法において、
前記支持基質を、高分子温度可逆性ゲル化ヒドロゲル（ＴＲＧＨ）又は高分子ゾル−ゲルヒドロゲルとする新軟骨構造体の製造方法。
【請求項３５】
請求項３１に記載の新軟骨構造体の製造方法において、
培養し増殖させた軟骨細胞を、ゲル溶液中で懸濁させて前記支持基質に組み込む新軟骨構造体の製造方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の新軟骨構造体の製造方法において、
支持基質を、コラーゲンスポンジ又はスポンジ様構造体とし、軟骨細胞を、ＴＲＧＨ又はゾル−ゲルヒドロゲルとして前記スポンジに組み込む新軟骨構造体の製造方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の新軟骨構造体の製造方法において、
軟骨細胞を、約３００００００〜約６０００００００細胞／ｍｌの密度で前記スポンジに組み込む新軟骨構造体の製造方法。
【請求項３８】
請求項３７の新軟骨構造体の製造方法において、
前記静水圧を、約０．０１〜約１Ｈｚにおいて大気圧より上で約０ＭＰａ〜約１０ＭＰａの圧力とし、
前記静水圧を加える前記時間を、約９０日〜約１日にわたり１日あたり０〜約２４時間とし、
約９０日〜約１日に亘り１日あたり０〜約２４時間の静的大気圧を加える処理の前又は後に、前記静水圧を加える処理を行い、
前記流速を、約１μＬ／分〜約５００μＬ／分とし、
前記細胞密度を、１ｍＬあたり約１２００００００〜１５００００００とし、
前記酸素濃度を、約１％〜約２０％とする新軟骨構造体の製造方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の新軟骨構造体の製造方法において、
０．１〜約０．５Ｈｚにおいて約０．０５ＭＰａ〜約３ＭＰａの圧力とした周期的な静水圧か、又は大気圧より上で約０〜約３ＭＰａとした一定圧を、約７日〜約２８日間に亘り加える新軟骨構造体の製造方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の新軟骨構造体の製造方法において、
前記静水圧を加える処理を、約０〜約２８日に亘り大気圧に曝す期間の後又は前に行う新軟骨構造体の製造方法。
【請求項４１】
関節軟骨の病変部位上に表層性軟骨層を形成させる表層性軟骨層の形成方法であって、
ａ）自己由来又は異種の軟骨片を得るステップと、
ｂ）軟骨細胞を分離して培養し新軟骨内で増殖させるステップと、
ｃ）新軟骨構造体を調製するステップと、
ｄ）前記新軟骨構造体を前記病変部位に埋め込むステップと、
ｅ）前記新軟骨構造体上に生体適合性で接着性の頂部シーラントを沈着させるステップと
を有する表層性軟骨層の形成方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の表層性軟骨層の形成方法であって、
この方法が更に、前記病変部位の底部に生体適合性で接着性の底部シーラントを沈着させるステップを有し、前記頂部及び前記底部シーラントは、同じものとしても又は異なるものとしてもよい表層性軟骨層の形成方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の表層性軟骨層の形成方法であって、
前記新軟骨構造体が支持基質に埋め込まれた新軟骨軟骨細胞を含むようにする表層性軟骨層の形成方法。
【請求項４４】
請求項４２に記載の表層性軟骨層の形成方法であって、
前記支持基質を、高分子温度可逆性ゲル化ヒドロゲル、コラーゲンゲル、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ゼラチン、アガロース、プロテオグリカンを含む細胞収縮コラーゲン、グリコサミノグリカンを含む細胞収縮コラーゲン、糖蛋白質を含む細胞収縮コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、成長因子、サイトカイン、エラスチン、ヒアルロン酸、フィブリン、ポリ乳から形成される合成高分子繊維、ポリグリコールから形成される合成高分子繊維、ポリアミノ酸から形成される合成高分子繊維、ポリカプロラクトン、ポリアミノ酸、ポリペプチドゲル、これらの共重合体並びにこれらの組合せからなる群から選択された化合物から調製した２次元又は３次元の構造体とする表層性軟骨層の形成方法。
【請求項４５】
請求項４４の表層性軟骨層の形成方法において、
前記基質を、温度可逆性ゲル化ヒドロゲル（ＴＲＧＨ）とし、このＴＲＧＨを、約３０℃より低い温度で液体ゾル状態とし、前記温度可逆性ヒドロゲル高分子を、約３０℃より高い温度で固体のゾル状態とし、前記温度可逆性ゲル化ヒドロゲルを、頂部シーラントの下又は底部及び頂部シーラント間に形成された病変腔内に、軟骨細胞を内部に含む新軟骨構造体として埋め込むか、或いは前記ＴＲＧＨを、いかなる新軟骨軟骨細胞も用いずに空間保持ゲルとして前記病変腔に埋め込む表層性軟骨層の形成方法。
【請求項４６】
請求項４５の表層性軟骨層の形成方法において、
前記新軟骨構造体は、培養して分化させた自己由来若しくは異種の軟骨細胞又は分化して軟骨細胞になりうる細胞を含み、これら軟骨細胞又は細胞が前記支持基質内に組み込まれたものであって、軟骨細胞に対する一定の又は周期的な静水圧の条件と、大気圧若しくは無圧力の条件と、灌流速度条件と、培地組成条件と、温度条件と、細胞密度条件と、酸素濃度条件と、時間条件とを含む本発明のアルゴリズムにより処理されたものとする表層性軟骨層の形成方法。
【請求項４７】
請求項４５に記載の表層性軟骨層の形成方法において、
前記頂部又は前記底部のシーラントが、ゼラチン、ポリエチレングリコール及びポリ乳酸若しくはポリグリコリドの共重合体、過ヨウ素酸酸化ゼラチン、４腕のペンタエリスリトールチオール及びポリエチレングリコールジアクリレート、４腕のテトラスクシンイミジルエステル若しくはテトラチオール誘導体化ＰＥＧ、光重合性ポリエチレングリコール共重合（ａ−ヒドロキシ酸）ジアクリレートマクロマー、メチル化コラーゲンを加えたスクシンイミジルエステル及びチオールにより誘導体化した４腕のポリエチレングリコール、ヒドロゲル、誘導体化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルキル化コラーゲンにより架橋した誘導体化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、テトラヒドロスクシンイミジル若しくはテトラチオール誘導体化ＰＥＧ、メチル化コラーゲンで架橋したＰＥＧ並びにこれらの組合せからなる群から選択したものであり、これら頂部及び底部シーラントが、同じものであるか又は異なるものである表層性軟骨層の形成方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の表層性軟骨層の形成方法において、
前記シーラントを、メチル化コラーゲンで架橋したＰＥＧとする表層性軟骨層の形成方法。
【請求項４９】
請求項４８に記載の表層性軟骨層の形成方法において、
前記新軟骨構造体を、管内、生体外又は生体内で調製する表層性軟骨層の形成方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の表層性軟骨層の形成方法において、
前記新軟骨構造体を、生体外で調製し本発明のアルゴリズムで処理する表層性軟骨層の形成方法。
【請求項５１】
請求項５０に記載の表層性軟骨層の形成方法において、
前記アルゴリズムは、周期的な又は一定の静水圧の条件と、静圧の条件と、流速の条件と、温度の条件と、時間の条件と、細胞密度の条件と、酸素及び二酸化炭素含量の条件とを含む表層性軟骨層の形成方法。
【請求項５２】
請求項５１の表層性軟骨層の形成方法において、
前記静水圧を、約０．０１〜約１Ｈｚにおいて大気圧より上で約０ＭＰａ〜約１０ＭＰａの圧力とし、
前記静水圧を加える前記時間を、約９０日〜約１日にわたり１日あたり０〜約２４時間とし、
約９０日〜約１日に亘り１日あたり０〜約２４時間の静的大気圧を加える処理の前又は後に、前記静水圧を加える処理を行い、
前記流速を、約１μＬ／分〜約５００μＬ／分とし、
前記細胞密度を、約３００００００〜６０００００００とし、
前記酸素濃度を、約１％〜約２０％とする表層性軟骨層の形成方法。
【請求項５３】
請求項５２に記載の表層性軟骨層の形成方法において、
０．１〜約０．５Ｈｚにおいて約０．０５ＭＰａ〜約３ＭＰａの圧力とした周期的な静水圧か、又は大気圧より上で約０〜約３ＭＰａとした一定圧を、約７日〜約２８日間に亘り加える表層性軟骨層の形成方法。
【請求項５４】
請求項５３に記載の表層性軟骨層の形成方法において、
前記静水圧を加える処理を、約０〜約２８日に亘り大気圧に曝す期間の後又は前に行う表層性軟骨層の形成方法。
【請求項５５】
請求項５４に記載の表層性軟骨層の形成方法において、
前記灌流流速を、約５０μＬ／分〜約５μＬ／分とする表層性軟骨層の形成方法。
【請求項５６】
請求項５５に記載の表層性軟骨層の形成方法において、
前記灌流流速を、約５μＬ／分とする表層性軟骨層の形成方法。
【請求項５７】
請求項５６に記載の表層性軟骨層の形成方法において、
前記灌流処理及び加圧処理を、約２％〜約５％の酸素の存在下で行う表層性軟骨層の形成方法。
【請求項５８】
請求項５７に記載の表層性軟骨層の形成方法において、
前記新軟骨構造体を、前記２層のシーラント層間の前記病変部位に埋め込む表層性軟骨層の形成方法。
【請求項５９】
請求項５８に記載の表層性軟骨層の形成方法において、
前記新軟骨が、前記表層性軟骨層により覆われるようにする表層性軟骨層の形成方法。
【請求項６０】
請求項５９に記載の表層性軟骨層の形成方法において、
前記新軟骨と、周囲に元からある軟骨とが、互いに一体化する表層性軟骨層の形成方法。
【請求項６１】
請求項６０に記載の表層性軟骨層の形成方法において、
前記新軟骨構造体が、温度可逆性ゲル化ヒドロゲルを有するものとし、当該新軟骨構造体を液体ゾルとして病変部位に埋め込み、この構造体を体温まで暖めて液体ゾルを固体ゲルに転換させるが、このプロセスは、３０℃より低い温度まで前記病変部位を冷却することにより逆転可能なプロセスであり、それにより前記ゲルをゾルとして取り除くことができる表層性軟骨層の形成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、損傷若しくは傷害を受け又は病変若しくは老化した軟骨を、関節軟骨の病変部位に埋め込んだ新軟骨構造体を用いて治療する方法に関するものである。この方法は、特に損傷若しくは傷害を受け又は病変若しくは老化した軟骨の機能を修理及び回復させるのに有用である。特に、本発明は、新軟骨構造体を埋め込むことにより、周囲に元からある軟骨への新軟骨の組み込みが始まり達成され、また関節軟骨の病変部位上に成長しこれを封止する新たな表層性軟骨層が形成される方法に関するものである。本発明の新軟骨構造体は、少なくとも、本発明のアルゴリズム従って処理して支持基質内に組み込まれた軟骨細胞を有する。この構造体は、１層の生物学的に許容されるシーラント下で、或いは代表的には２層のシーラント間にある関節軟骨の病変部位内に埋め込まれる。関節軟骨の治療のための方法は、自己由来又は異種の軟骨細胞から生体外で新軟骨構造体を調製する処理と、任意のステップであるが、病変部位の底部に第１シーラント化合物を沈着させ、関節軟骨の病変部位を封止し血液由来物質の影響から構造体を保護防止する前記構造体を埋め込むための病変部位を調製する処理と、この第１シーラント上に本発明の構造体を埋め込む処理と、この構造体の上に第２シーラント化合物を沈着させる処理とを有する。
【０００２】
本発明は更に、２層の生物学的に許容されるシーラント間に新軟骨構造体を埋め込むことにより、損傷若しくは傷害を受け又は病変若しくは老化した軟骨を完全に機能的な状態に修復及び回復させる方法、並びに損傷又は傷害を受けた軟骨を治療する方法に関するものである。
また、本発明は、新軟骨の生成方法及び新軟骨構造体に関するものである。
【０００３】
背景技術及び関連出願
活動的な人や老人に起こる関節軟骨への損害は、急性又は反復性の外傷や老化により、極めて頻繁に起こるものである。このような損傷した軟骨は疼痛を伴い、移動に影響を与え、衰弱性の障害を引き起こす。
【０００４】
代表的な治療選択肢には、病変や症状の重傷度にもよるが、安静及び他の対症療法や、損傷した軟骨領域の表面を清掃して平滑にする関節鏡的小手術や、微小破壊、穿孔及び剥離のような他の外科手術がある。これらの治療法は全て、症状を緩和することはできるが、特に患者が手術前の活動レベルを維持する場合には、この効果は通常一時的なものでしかない。これらの治療法は全て症状を軽減しうるが、特にその人の傷害前の活動レベルが維持されるとすれば、その効果は通常、一時的なものでしかない。年間約２０００００件の膝関節全体の置換手術が行われている。人工関節は一般に、１０〜１５年しかもたないため、一般的に５０歳以下の人には推奨されない。
【０００５】
従って、軟骨を傷害前の状態に効果的に治療する、これらの傷害の生体位での治療方法が利用可能となれば極めて有利である。
【０００６】
関節軟骨を修復するための手段及び方法を提供しようという試みは、例えば、米国特許第５７２３３３１号、第５７８６２１７号、第６１５０１６３号、第６２９４２０２号、及び第６３２２，５６３号明細書、並びに米国特許出願第０９／８９６９１２号（２００１年６月２９日出願）明細書に開示されている。
【０００７】
米国特許第５７２３３３１号明細書には、接着性表面を有する生体外のウェルに接種して生体外で増殖させた軟骨由来の細胞を用いた、関節軟骨を修復するための合成軟骨を調製する方法及びその組成物が記載されている。これらの細胞は、再分化して軟骨特異的な細胞外基質を分泌し始め、これにより、無限の合成軟骨を関節欠損部位に手術的に付与する。
【０００８】
米国特許第５７８６２１７号明細書では、多細胞層の合成軟骨パッチを調整する方法が記載されている。この調製方法は、上述した米国特許第５７２３３３１号のものとほぼ同じであるが、剥離した細胞が分化しない点と、細胞の培養を、細胞が分化して多細胞層の合成軟骨を形成するのに必要な時間だけ行うという点において異なっている。
【０００９】
米国特許出願第０９／８９６，９１２号（２００１年６月２９日出願）は、軟骨、半月板、靭帯、腱、骨、皮膚、角膜、歯周組織、膿瘍、切除腫瘍及び潰瘍を、組織に接着して組織修復のための細胞増殖を支持するような少なくとも１種類の血液成分と組み合わせて、組織内に温度依存性高分子ゲルを導入することによって組織を修復する方法に関するものである。
【００１０】
しかし、上述した引用文献はいずれも、関節軟骨の病変部位を封止する表層性軟骨層を新規に形成することを含め、生体位における軟骨の修復及び再生方法を開示していない。
【００１１】
したがって、本発明の主たる目的は、損傷若しくは傷害を受けた軟骨を再生するための方法及び手段であって、傷害を受けた軟骨の病変部位に腔を形成し、少なくとも１層の但し代表的には２層の独立した生物学的に許容されうる接着性シーラント層を付与し、前記腔内又は前記一方の層の下に新軟骨を含む構造体を埋め込むことにより軟骨を再生する方法及び手段を提供することにある。本発明による方法によれば、病変部位上に成長しこの病変部位を封止する表層性軟骨層が得られる。
【００１２】
本明細書において引用する全ての特許、特許出願及び刊行物は、参考として記載したものである。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の第１の観点は、損傷若しくは傷害を受け又は病変若しくは老化した軟骨を機能性の軟骨に修復し回復させる方法であって、
ａ）スポンジ、多孔性スキャフォルド又は温度可逆性ゲル化ヒドロゲル（ＴＲＧＨ）基質支持体に組み込み、本発明による所定のアルゴリズム条件にさらした自己由来又は異種の軟骨細胞を有する新軟骨構造体を調製するステップと、
ｂ）随意的に、病変部位内に生物学的に許容されうる第１シーラント層を導入するステップと、
ｃ）この第１シーラント層上の病変腔又は病変部位に、前記軟骨構造体を埋め込むステップと、
ｄ）この構造体上に、生物学的に許容されうる第２シーラント層を導入するステップであって、この第２シーラント層は、前記第１シーラント層と同じものでも異なるものでもよく、前記構造体とこの第２シーラント層とを組合せることにより、軟骨病変部位を生体位で封止する表層性軟骨層の形成及び成長がなされるようにする当該ステップと
を有する方法である。
【００１４】
本発明の第２の観点は、損傷若しくは傷害を受け又は病変若しくは老化した軟骨を機能性の軟骨に修復し回復させる方法であって、
ａ）自己由来又は異種の軟骨細胞を得るステップと、
ｂ）前記軟骨細胞を生体外で培養して新軟骨にするステップであって、前記新軟骨が、本発明のアルゴリズムにさらされたスポンジ又はＴＲＧＨ基質支持体内に組み込まれた自己由来又は異種の軟骨細胞を含むようにする当該ステップと、
ｃ）任意的に、生物学的に許容される第１シーラント層を軟骨病変部位に導入するステップと、
ｄ）空間保持温度可逆性ゲル（ＳＨＴＧ）又はＴＲＧＨを、病変部位に又は第１シーラント層上に形成された病変腔内に沈着させ、このことにより、生体外で培養される新軟骨が成長し分化するのに充分な時間が得られるようにするステップであって、前記空間保持温度可逆性ゲル（ＳＨＴＧ）は、約５〜約２５℃の間の温度でゾルとして前記病変腔に沈着させ、前記ＳＨＴＧは、前記病変腔内で体温において流体ゾルから固体ゲルに変わり、ＳＨＴＧはこの形態で、生体外で培養された新軟骨をその後導入するための空間を保持すると共に、肋軟骨下の空間及び滑液被膜から前記病変腔に細胞及び血液由来物質が移動するのを防止し、更に、このＳＨＴＧの存在により、軟骨病変部位を覆う新たな表層性軟骨層の形成に対する基板を提供してその形成を促進させる当該ステップと、
ｅ）軟骨病変部位上に生物学的に許容されうる第２シーラント層を沈着させるステップと、
ｆ）前記病変部位を冷却してＳＨＴＧをゾルに変えることにより、前記ＳＨＴＧを除去するステップと、
ｆ）２層のシーラント間に形成された病変腔内及び新たに形成された表層性軟骨層の下に、生体外で培養した前記新軟骨を沈着させるステップと、
ｇ）新軟骨が、形成された表層性軟骨層の下にある元からある軟骨と一体化した後、約５〜約１５℃に前記病変部位を冷却して固体ゲルを流体ゾルに変換して前記ゾルを除去することにより、腔から前記ＳＨＴＧ又はＴＲＧＨを除去するか、又は前記ＳＨＴＧ又はＴＲＧＨを放置して分解させ自然に除去するステップと
を有する。
【００１５】
本発明の第３の観点は、損傷若しくは傷害を受け又は病変若しくは老化した軟骨を機能性の軟骨に修復し回復させる方法であって、
ａ）自己由来又は異種の軟骨細胞を生体外で培養することにより新軟骨の完全な独立片を調製し、前記培養された軟骨細胞を温度可逆性ゲル化ヒドロゲル（ＴＲＧＨ）中に懸濁し、この軟骨細胞の懸濁液を３０℃より高い温度に暖め、ＴＲＧＨを固体ゲルに変換し、この固体ゲルを本発明のアルゴリズムにさらすステップと、
ｂ）軟骨病変部位に、生物学的に許容されうる第１及び第２シーラント層を導入するステップと、
ｃ）前記ＴＲＧＨ／新軟骨を５〜１５℃に冷却してゾル状態にするステップと、
ｄ）ＴＲＧＨに懸濁させた新軟骨を、２層のシーラント間に形成された病変腔に、約５〜約２５℃の温度でゾルとして沈着させ、前記ＴＲＧＨは、前記病変腔内で体温において流体ゾルから固体ゲルに変わり、ＴＲＧＨはこの形態で、堆積された新軟骨を保護し、この新軟骨が周囲の元からある軟骨と一体化しうるようにし、更に、このＴＲＧＨの存在により、軟骨病変部位を覆う新たな表層性軟骨層の形成に対する基板を提供してその形成を促進させるステップと、
ｅ）このＴＲＧＨを分解するまで放置しておくか、或いは新軟骨が一体化し表層性軟骨層が形成された後、前記病変部位を約５〜約１５℃に冷却して前記ＴＲＧＨをゾルとして病変腔から取り除くステップと、
ｆ）周囲の元からある軟骨への新軟骨の組み込みを評価するステップと
を有する。
【００１６】
本発明の第４の観点は、損傷若しくは傷害を受け又は病変若しくは老化した軟骨を機能性の軟骨に修復し回復させる方法であって、
ａ）ゲル又は温度可逆性ゲルマトリックス支持体に生体外で組み込んだ自己由来の培養軟骨細胞を含み、本発明のアルゴリズムにさらされた構造体を有する新軟骨又は新軟骨を調製するステップと、
ｂ）軟骨病変部位に、生物学的に許容されうる第１シーラント層を導入するステップと、
ｃ）この第１シーラント層上に前記構造体又は前記新軟骨を埋め込むステップと、
ｄ）軟骨病変部位に沈着した新軟骨構造体又は新軟骨上に、生物学的に許容されうる第２シーラント層を沈着させ、この第２シーラントで病変部位を被覆し、前記新軟骨は、経時的に元からある軟骨と一体化されるようになっており、これら新軟骨構造体及び第２シーラント層の存在により、軟骨病変部位を覆う新たな表層性軟骨層の形成及び成長を促進するステップと
を有する。
【００１７】
本発明の他の観点は、生体位での軟骨病変部位への埋め込みに適した新軟骨構造体である。
【００１８】
本発明のさらに他の観点は、軟骨病変部位の生物学的に許容されうる１層のシーラント層の下、又は２層のシーラント層の間に埋め込まれる新軟骨構造体である。
【００１９】
本発明のさらに別の観点は、２層のシーラント層間の軟骨病変部位に埋め込まれる新軟骨構造体であって、第１シーラントが軟骨病変部位の底部に沈着されており、第２シーラントが、埋め込まれた構造体上で軟骨病変部位の頂部に沈着されており、この第２シーラントは、前記軟骨病変部位を封止する表層性軟骨層の形成及び成長にもたらすものである当該新軟骨構造体である。
【００２０】
本発明の更に他の観点は、本発明の３次元新軟骨構造体の製造方法であって、
ａ）支持基質構造体を調製するステップと、
ｂ）軟骨細胞を分離するためにドナーから一片の軟骨を採取するステップと、
ｃ）軟骨細胞を培養し増殖させるステップと、
ｄ）増殖させた軟骨細胞を懸濁させて懸濁液とするステップと、
ｅ）前記懸濁させた軟骨細胞を基質に組み込むステップと、
ｆ）本発明のアルゴリズムを用いて前記軟骨細胞を２次元又は３次元の新軟骨構造体内に伝播させるステップと
を有する新軟骨構造体の製造方法である。
【００２１】
本発明のさらに別の観点は、自己由来の軟骨細胞のためのキャリア支持体を生成して新軟骨とすることにより、自己由来型の新軟骨を形成する方法であって、前記支持体は、生物学的に許容されうる細胞−キャリア温度可逆性高分子ゲルであるか、又は温度可逆性ゲル化ヒドロゲル（ＣＣＴＧに、ＴＲＧＨ又はＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標））であり、前記新軟骨は、ＣＣＴＧ中に懸濁させ、得られたＣＣＴＧ／新軟骨若しくはＴＲＧＨ／新軟骨又はこれらの懸濁液を、軟骨病変部位に注入する方法である。
【００２２】
本発明のさらに別の観点は、新軟骨、新軟骨ゲル、新軟骨懸濁液又は新軟骨構造体を導入するための病変部位の一体性を確立し、これを滑液被膜から維持し、病変腔内への肋軟骨下及び滑膜細胞並びに細胞及び血液由来物質の移動を遮断し、前記新軟骨又は新軟骨構造体若しくは懸濁液を病変部位に導入する前に、自己由来の軟骨細胞を培養して新軟骨とするまでの間、生物学的に許容されうる空間保持温度可逆性ゲル（ＳＨＴＧ）を、清浄にした病変部位に導入することにより病変部位上に成長する表層性軟骨層を形成する方法である。
【００２３】
本発明のさらに別の観点は、病変部位に新軟骨構造体を埋め込む上述した任意の方法を用いることにより、損傷若しくは傷害を受け又は病変若しくは老化した軟骨を治療する方法である。
【００２４】
定義
本願明細書において用いられる用語は以下のように定義されるものである。
【００２５】
「軟骨細胞」とは、軟骨基質の小腔に入っている非分裂性の軟骨の細胞を意味する。
「同原軟骨細胞」は、１つの細胞が分裂して得られる軟骨細胞のクローンを意味する。同原軟骨細胞は、同質のゲノム巣と称されるクラスタで発生する。
「自己由来の軟骨細胞」は、ドナー自身の健康な関節軟骨から分離した軟骨細胞を意味する。
「異種軟骨細胞」とは、異なる種のドナーから得られる軟骨細胞、同種のドナーであるがレシピエント個体ではないドナーから得られる軟骨細胞、レシピエント個体から得られるものであるが関節でない軟骨のドナー組織、異なる種の軟骨細胞から分離させたドナー組織がある。
【００２６】
「支持基質」とは、増殖した軟骨細胞を播種するのに適した、生物学的に許容されうるゾル・ゲル又はスポンジスキャフォルドであって、軟骨細胞の成長及び３次元的伝播を構造的に支持するものを意味する。支持基質は、例えば、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ゼラチン、アガロース、（プロテオグリカン、グリコサミノグリカン若しくは糖蛋白質を含む）細胞収縮性コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、生理活性ペプチド成長因子、サイトカイン、エラスチン、フィブリン、（ポリ乳酸、ポリグリコール若しくはポリアミノ酸、ポリカプロラクトン、ポリアミノ酸、ポリペプチドゲル、これらの共重合体のようなポリ酸から形成された）合成高分子並びにこれらの組み合わせといった材料から調製する。ゲル溶液基質は高分子温度可逆ゲル化ヒドロゲルとすることができる。支持基質は、好ましくは、生体適合性、生分解性、親水性、非反応性であり、電気的に中性で、所定の構造をとりうるものである。
【００２７】
「新軟骨」とは、軟骨細胞に対する細胞外基質の比率が、成熟ガラス軟骨より低い未成熟ガラス軟骨を意味する。
「成熟ガラス軟骨」とは、コラーゲン基質全体に分散している小腔内に位置する同原軟骨細胞の群からなる軟骨を意味する。
【００２８】
「自己由来培養軟骨細胞」とは、ドナー自身の健康な関節軟骨から分離した軟骨細胞から、生体外で成長させたヒアリン（ガラス質）の新軟骨組織を意味する。
「新軟骨構造体」、「ＮＥＯＣＡＲＴ（登録商標）」又は「ＮｅｏＣａｒｔ（登録商標）」とは、本発明のアルゴリズムを受けた又はそれにより処理した基質支持体内に組み込んだ軟骨細胞を含む三次元構造組成物を意味する。すなわち、新軟骨構造体とは、傷害を受け又は老化若しくは病変した軟骨内に埋め込むための、培養軟骨細胞から形成される独立したヒアリン新軟骨片であって、埋め込み後に、病変部位内の元からある軟骨と一体化するものを意味する。ＮｅｏＣａｒｔ（登録商標）は、米国マサチューセッツ州のイーストハンプトンにあるHistogenics社の独自開発品であり、同社により製造されている。
【００２９】
「ＴＥＳＳ（商標名）」は、関節鏡生検サンプルから準備した軟骨細胞を培養するためのＴＥＳＳ培養プロセサユニットとして利用可能なＴｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍを意味する。このユニットは、必要に応じて、周期的に静水圧を変化させることを含めて静水圧を変化させることができ、温度、ガス濃度、媒体潅流速度及びその他のパラメータといった他の物理的パラグラフを制御することができる。関連する詳細な情報は、参考として組み入れた、米国特許第６，４３２，７１３号明細書、米国特許出願第０９／８９５１６２号及び同第０９／８９５１６１号明細書、国際特許出願ＰＣＴ／ＪＰＯ１／０１５１６号の明細書、並びに日本国特許出願第２００１−１２６５４３号及び同２００１−２６１５５６号明細書に記載されている。
【００３０】
「シーラント」とは、生物学的に許容されうる、一般には急速にゲル化する製剤であって、所定範囲の接着性及び凝集性を有するものを意味する。
シーラントは、接着性及び粘着性の双方又はいずれか一方を有する生物学的に許容されうるゲル化合成化合物であり、一般には、代表的にアルキル化コラーゲンであるコラーゲン化合物により架橋されているのが好ましい誘導ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなヒドロゲルである。好適なシーラントの例としては、テトラヒドロスクシニミジル若しくはテトラチオール誘導ＰＥＧ又はこれらの組合わせであって、文献J. Biomed Mater. Res Appl. Biomater.（2001年）58の第５４５〜５５５頁に記載されており、米国カリフォルニア州のパロアルトにあるCohesion Technologies社からＣｏＳｅａｌの登録商標名で市販されているもので、米国特許第６，３１２，７２５号明細書に記載されているように、急速に基質を形成する２部分の高分子組成物であり、これら化合物のうち少なくとも１つが、ポリアミノ酸、多糖類、ポリアルキレンオキサイド又はポリエチレングリコールのような高分子で、これら２部分が共有結合により結合されているものや、メチルコラーゲンにより架橋したポリエチレングリコールヒドロゲルのようなメチルコラーゲンにより架橋したＰＥＧがある。本発明のシーラントは、代表的には、組織、特にはコラーゲンを含有する組織と接触するとゲル化及び結合の双方又はいずれか一方を生ずるものである。
【００３１】
「第１シーラント」とは、病変部位の底部に沈着させる生物学的に許容可能な組織シーラント意味する。
「第２シーラント」とは、病変部位内に埋め込まれた新軟骨構造体上に沈着させる生物学的に許容されうるシーラントを意味する。この第２シーラントは、第１シーラントと同じものちすても異なるものとしてもよいが、メチルコラーゲンで架橋したポリエチレングリコールヒドロゲルとするのが好ましい。
【００３２】
「静水圧」とは、大気圧より上で測定された圧力を意味する。
「周期的な静水圧」又は「Ｃｙ−ＨＰ」とは、サイン波形の測定圧を発生させる所定の負荷間隔の静水圧を繰返しの２又は複数の周期で加えることを意味する。
「一定の静水圧」、「一定のＨＰ」又は「ＣＨＰ」とは、非変動性又は非周期性の圧力負荷を所定の周期に亘って加えることを意味する。
【００３３】
「負荷」又は「負荷間隔」とは、周期的な静水圧の負荷を加えた後外圧を加えてない大気圧に戻す周期を意味する。
「休止期間」とは、細胞を周期的な静水圧に曝した後又はこの静水圧下で培養した後に当該細胞を大気圧の培地中に保持する可変時間を意味する。
【００３４】
「新規の」又は「新規形成」とは、多層システム、スキャフォルド若しくはコラーゲン基質のような支持構造体内における、分化しうる軟骨細胞、線維芽細胞、繊維軟骨細胞、腱細胞、骨細胞及び幹細胞のような細胞の新規産生、或いは軟骨結合組織、ガラス軟骨、線維軟骨、腱及び骨のような組織の新規産生、或いは表層性軟骨層の形成を意味する。
【００３５】
「表層性軟骨層」とは、軟骨の最外層であって、第２のシーラント層を被覆して病変部位上に成長する扁平上皮様の平坦表層性領域の軟骨細胞の層を形成するものを意味する。
【００３６】
「温度可逆性」とは、温度に応じて、ゾルからゲルに粘性及び稠性といった物理学的特性を変化する化合物又は組成物を意味する。温度可逆性の組成物は一般に、約５〜１５℃ではゾル（液体）状態であり、約３０℃より高い温度ではゲル（固体）状態となる。この間の温度でのゲル／ゾル状態は、温度に応じたものとなりより低い又はより高い粘性を呈する。温度が１５℃より高くなると、ゾルはゲルに変化し始め、温度が３０〜３７℃に近づくにつれゾルはゲルとして硬化された状態になる。より低い温度、典型的には１５℃より低い温度では、ゾルはより液状の稠性を有する。
【００３７】
「ＴＲＧＨ」とは、温度可逆性ゲル化ヒドロゲル材料であって、寒天及びゼラチンとは逆の温度サイクルでゾル・ゲル転移を生ずるものを意味する。従って、ゾル段階では粘着性液体相となり、ゲル段階では固体相となる。ＴＲＧＨは、非常に短時間でゾル・ゲル転換するもので、硬化時間を必要とせず、また、ヒステリシスなく温度の関数として簡単にゾル・ゲル転換が起こる。ゾル・ゲル転移温度は、温度可逆性ゲル化高分子（ＴＧＰ）の分子設計に応じて、５℃〜７０℃の範囲の任意の温度に設定することができ、ヒドロゲルの形成にはこのうちの高分子量の高分子を５重量％未満にすれば十分である。
「ＳＨＴＧ」とは、空間保持性の温度可逆性ゲルを意味する。
【００３８】
「ゾル・ゲル溶液」とは、ある条件下で液体（ゾル）から固体材料（ゲル）に転移するコロイド懸濁液を意味する。「ゾル」とは、熱処理によりゲルに転移する水性コラーゲンの懸濁液である。
【００３９】
「ＧＡＧ」とは、グリコサミノグリカンを意味する。
「Ｓ−ＧＡＧ」とは、硫酸グリコサミノグリカンを意味する。
「ＭＭＰ」とは、基質メタロプロテイナーゼ、すなわち傷害を受けた又は病変した関節における軟骨の分解に関連する酵素を意味する。
「ＤＭＢ」とは、軟骨細胞の染色に用いるジメチレンブルーを意味する。
「ＭＰａ」とは、メガパスカルを意味する。１ＭＰａは、１４５ｐｓｉに等しい。
【００４０】
「表層領域軟骨」とは、軟骨細胞からなる扁平化した最外層であって、中間の細胞外基質領域と、非分裂性細胞が分散しているより深部の成熟関節軟骨領域を被覆するものを意味する。
【００４１】
「結合組織」とは、体内器官を保護及び支持する組織、及び体内器官を共に保持する組織を意味する。このような組織の例には、間葉性、粘液性、結合性、網状、弾性、コラーゲン性の組織や、骨や、血液や、ガラス軟骨、線維軟骨及び弾性軟骨のような軟骨組織がある。
【００４２】
「アルゴリズム」は、変化可能な規定条件、例えば、可変の圧力若しくは非圧力条件、可変の潅流速度、種々の媒体、種々の細胞密度、種々の温度、可変の時間、種々の酸素及び二酸化炭素条件その他であって、新軟骨細胞構造体を成熟した新軟骨構造体に変化させるために使用される条件を意味する。
【００４３】
「接着強度」とは、接着剥離強度の測定結果を意味し、接着剤で結合した２つのプラスチックタブにより測定することができる。これらのタブは、ポリスチレン秤量ボートから１×５ｃｍの細条を切り出すことにより形成することができる。この秤量ボートの表面に、（市販のシアノアクリル酸Ｓｕｐｅｒｇｌｕｅを使用して）ソーセージケーシングのシート（コラーゲンシートで肉屋生産財卸売商から入手できる）を結合する。このソーセージケーシングを水又は生理食塩水で２０分〜１時間水和させ、タブの一方の端部における１×１ｃｍの領域に接着剤を塗布し、この接着剤を硬化させる。次に、このタブの自由端を各々湾曲して引張試験装置の上部及び下部グリップにそれぞれ取り付け、１０ｍｍ／分の歪速度で引っ張り、剥離する力をニュートン単位で記録する。一定の力のトレースを調べることにより、Ｎ／ｍ、すなわち細条の幅当たりの力を測定することができる。細条の幅当たりの力は、最小でも１０Ｎ／ｍあるのが望ましいが、１００Ｎ／ｍ以上あるのがより望ましい。
【００４４】
或いは又、同種の（単一の）タブを、手術中に生きた動物から露出させた組織又は切り出した組織の１×１ｃｍの領域に結合させることができる。このタブの自由端を、携帯引張試験装置（オメガＤＦＧ５１−２デジタルフォースゲージ：コネチカット州スタンフォードにあるオメガエンジニアリング社製）のフックに縫合により把持させ、このタブを、約１ｃｍ／秒で上方へ引っ張る。組織からタブを剥離させるのに必要な最大の力を記録する。このような測定において所望されるタブを引きはがすのに最小の力は、０．１Ｎである。この力は０．２〜１Ｎであるのがより望ましい。
【００４５】
「凝集力」とは、引張破損させるのに必要な力を意味し、引張試験装置を用いて（伸張方向に引っ張って）測定する。にかわ剤又は接着剤は、「犬用の骨」の形状をした型で硬化させることができる。形成した固体接着体の幅広端部を、シアノアクリル酸（Ｓｕｐｅｒｇｌｕｅ）を用いてプラスチックタブに固定し、試験装置に握持させることができる。延伸方向において破損する力は、少なくとも０．２ＭＰａ（２Ｎ／ｃｍ2 ）である必要があり、０．８〜１ＭＰａ以上であるのが好ましい。
【００４６】
「引張剪断測定」とは、結合強度の試験を意味し、この試験では、シーラント剤を、組織の重ね合せたタブに被着させて硬化させ、次に、これらのタブを引っ張って分離させる力を測定する。この試験には接着結合性及び凝集結合性が反映される。強力な接着剤では、重なり領域について０．５〜４乃至６Ｎ／ｃｍ2 の値が示される。
【００４７】
発明の詳細な説明
本発明は、新軟骨又は新軟骨構造体を、傷害若しくは外傷を受け又は老化若しくは病変した軟骨の病変部位内、すなわち頂部シーラント下又は第１（底部）及び第２（頂部）シーラント層の間に沈着させれば、この新軟骨が、所定時間内に周囲の元からある軟骨内に組み込まれ、また、このような環境下では、上記第２頂部シーラントにより、新軟骨を埋め込んだ軟骨病変部位上における新たな表層性軟骨層の生体位形成が促進されるという知見に基づくものである。
【００４８】
すなわち、本発明は、その最も広い範囲では、新軟骨を埋め込むことにより、損傷、傷害若しくは外傷を受け又は老化した軟骨を修復及び回復させて完全な機能を有するようにする方法や、損傷、傷害若しくは外傷又は老化により生じた疾病又は病変を治療する方法に関するものであり、更には、ドナーから採取した軟骨細胞から新軟骨を調整する方法や、支持基質を形成する方法や、新軟骨構造体を製造する方法や、生体位において表層性軟骨層を新たに形成させる方法にも関するものである。
【００４９】
簡単には、本発明は、採取した自己の又は異種の軟骨細胞から新軟骨を調製する処理であって、軟骨細胞を培養して増殖させ、これらの軟骨細胞をコラーゲン又は温度可逆性ゲル支持基質内に播種し、軟骨細胞を２次元又は３次元に増殖させる処理を含むものである。このような軟骨細胞の増殖を達成するために、軟骨細胞を播種した支持基質を可変条件のアルゴリズムで処理する。例えば、静気圧や、一定若しくは周期性の静水圧や、温度や、酸素及び二酸化炭素の双方又はいずれか一方のレベルを変化させたり、成長因子やドナーの血清やアスコルビン酸やＩＴＳ等のような種々のサプリメントの存在下で培地の潅流量を変化させたりする。このようにして処理した軟骨細胞を播種した支持基質が、関節軟骨の病変部位内に埋め込むのに好適な新軟骨構造体（新軟骨）となる。
【００５０】
この新軟骨構造体を、頂部シーラント下の病変部位内、又は２層の接着性シーラント層により形成された腔内に埋め込む。第１シーラント層は、病変部位の底部に堆積してこれを被覆するもので、その機能は、細胞の遊走や、種々の血液及び組織の代謝物の影響からこの病変部位の統合性を保護するとともに、新軟骨構造体を堆積させる腔の底部を形成することにある。
【００５１】
一例においては、新軟骨構造体を病変腔内に配置した後に、この新軟骨構造体の頂部上に接着性の第２層を堆積させ、数ヶ月以内にこの病変部位を完全に封止する表層性軟骨層が形成されるようにする。
【００５２】
他の例においては、間に腔が形成されることになる２層の接着性の層は、腔内に新軟骨構造体を埋め込むのと同時に沈着させることもできるし、或いはそれ以前に沈着させておくこともできる。この場合、この腔は、当面の間、空間を保持する温度可逆性ゲル（ＳＨＴＧ）で充填しておくことができる。シーラント層及び軟骨構造体の双方又は空間を保持する空間保持ゲルは、所定の予め定めた期間、代表的には１週間〜数ヶ月に亘って病変腔内に残り、或いは空間保持ゲルの場合には、新軟骨構造体が生体外で調製され埋め込む準備ができるまで残ることになる。病変部位の頂部に亘って堆積される第２シーラント層は、表層性軟骨層の形成を促進し、この表層性軟骨層は、病変部位の外側を被覆し最終的には完全に病変部位上に成長するため、病変部位及びこの病変部位内に堆積させた新軟骨構造体の完全若しくはほぼ完全な封止がなされ、新軟骨が元からある軟骨内に組み込まれ、傷害又は外傷を受けた軟骨が治癒されることになる。或いは又、温度可逆性ゲルは、表層性軟骨層の形成を促進するためのイニシエータとしても作用しうる。
【００５３】
新軟骨構造体の支持基質と、病変部位内に堆積させた温度可逆性の空間保持ゲルとは、双方とも生分解性の材料であり、且つ表層性軟骨層の形成を促進すると共に、新軟骨構造体からの軟骨細胞が病変腔内において元からある軟骨内に一体化するようにする材料出ある。このような軟骨細胞の一体化は、埋め込み後数週間から数ヶ月のうちに始まり数ヶ月間継続しうるもので、新軟骨を、健常な軟骨と一体化した正常な軟骨に成長させ成熟させる。頂部シーラント層は、このシーラント自体が分解して代表的には約２〜３週間内に病変部位上に表層性軟骨層を成長させるよう作用する。
【００５４】
他の例においては、外側の表層性軟骨層が形成されるまで病変腔に空間保持ゲルを充填しておき、この表層性軟骨層が形成された時点において、温度可逆性ゾルに懸濁させた生体外増殖軟骨細胞を含む新軟骨構造体を、５〜１５℃の温度で導入する。この新軟骨構造体を液体ゾルとして病変腔内に導入した後で、導入された温度可逆性のゾル−ゲルは、３７℃の体温、すなわち滑液腔の温度と同じ又は同様の温度において固体ゲルに変換される。病変部位に導入された新軟骨構造体は、この腔の周囲に元からある軟骨細胞と一体化し、表層性軟骨層により完全に被覆される。
【００５５】
更に他の例においては、新軟骨構造体は、傷害若しくは外傷を受け又は老化若しくは病変した軟骨の病変部位内の第１（底部）シーラント層上に沈着させ、この新軟骨構造体の温度可逆性ゲルが、その位置で表層性軟骨層の形成を促進して、第２シーラントを付加する必要がないようにする。
【００５６】
傷害若しくは外傷を受け又は病変若しくは老化した軟骨の治療方法には、上述した方法と、上述したステップ若しくは構成要素の任意の組合わせとの双方又はいずれか一方により調製された埋め込み新軟骨構造体を用いて、傷害若しくは外傷を受け又は病変若しくは老化した軟骨を治療する処理を含む。
【００５７】
Ｉ．新軟骨構造体の調製
軟骨の病変部位内に埋め込む新軟骨構造体の調製には、軟骨細胞を採取し培養させる処理と、これらを支持基質内に播種しこれを調製する処理と、これら軟骨細胞を、生体外、管内又は生体内のいずれかで増殖させる処理とが伴われる。
【００５８】
Ａ．軟骨及び新軟骨
軟骨は、関節及び骨を被覆する結合組織である。新軟骨は、未成熟な軟骨であり、本発明により病変部位内に沈着させると最終的に成熟した軟骨と一体化しその特性を得るようになる。これら２種類の軟骨の差は、その成熟性にある。軟骨は、代謝的に活性だが被分裂性の軟骨細胞を有する成熟組織であり、新軟骨は、分裂及び増殖しうる代謝的及び遺伝的に活性な軟骨細胞を有する未成熟の軟骨である。本発明は、新軟骨の特性を利用して、新軟骨が病変部位の周囲にある成熟した軟骨と一体化しそれにより欠損を修復しうるようにすることで、外傷を受けた軟骨に健康な軟骨の完全な機能を回復させ修復するものである。
【００５９】
ａ）軟骨
軟骨は、血管分布が少なく堅い稠性を有することを特徴とする結合組織である。軟骨は、成熟した非分裂性の軟骨細胞（セル）と、コラーゲン（線維からなる間隙性基質）と、粉砕したプロテオグリカン基質（グリコアミノグリカン又はムコ多糖類）とから構成されるものである。後者の２つは、細胞外基質として次第に知られてきたものである。
【００６０】
軟骨には３つの種類、すなわちガラス軟骨、弾性軟骨及び線維軟骨がある。ガラス軟骨は、主として関節に見受けられるもので、プロテオグリカンにより不透明となった微細なＩＩ型コラーゲンを含む間隙物質を具えすりガラス状の外観を有する。弾性軟骨は、コラーゲン線維及びプロテオグリカンに加えて、セルが、弾性線維網を有する間隙性基質により囲まれた皮膜性基質により包囲されている軟骨である。弾性軟骨は、例えば喉頭蓋の中央部に見られる。線維軟骨は、Ｉ型コラーゲン線維を含み、代表的には腱、靱帯又は骨の間の遷移組織に見られる。
【００６１】
膝軟骨のような関節の関節軟骨は、（全体積で）約９５％の細胞外基質に埋め込まれた（全体積で）約５％の軟骨細胞からなるガラス軟骨である。細胞外基質は、コラーゲン及びプロテオグリカンを含む種々の高分子を有する。このガラス軟骨の構造により、衝撃を良好に吸収し剪断力及び圧迫力に耐えうるようになる。通常のガラス軟骨は、関節表面における摩擦係数が極めて低いものでもある。
【００６２】
しかし、健康なガラス軟骨は、連続的に統一されており、いかなる病変、断裂、クラック、裂傷、孔又は断絶表面も有さない。変形性関節症のような外傷、損傷若しくは病変、又は老化によりガラス軟骨の表面の連続性が障害を受け、軟骨の表面にクラック、断裂、裂傷、孔又は断絶表面が表れ軟骨病変部位となる。ガラス軟骨が無血管であることもあって、人間その他のほ乳類では大きな欠損は自然的に治癒しないとと考えられている。すなわち関節軟骨の回復能力は、たとえ存在するにしても限定的なものでしかない。
【００６３】
損傷した軟骨を回復させる試みにおいて、様々な外科的手法が開発され使用されてきた。これらの外科的手法は、骨髄細胞が欠損部位内に浸潤しその治癒が促進されうるようにすることを目的としている。これらの手法は、概ね部分的にしか成功していない。たいていの場合、これらの手法により線維軟骨組織（線維軟骨）が形成され、このような線維軟骨組織は、軟骨病変部位を充填して修復するものの、Ｉ型コラーゲン線維から形成されており通常の関節（ガラス）軟骨と質的に相違するため、（ガラス）軟骨よりも耐久性が悪く弾性が低い。従って、このような線維軟骨組織は、健康なガラス軟骨よりも限定された耐衝撃及び耐剪断能力しか有さない。全ての可動結合（diarthroid）関節、特に膝関節は、常に比較的大きな負荷及び剪断力を受けることになるため、健康なガラス軟骨が線維軟骨に置き換わることは、完全な組織の修復及び機能の回復にはならない。
【００６４】
ｂ）新軟骨
新軟骨は、軟骨細胞に対する細胞外基質の割合が、成熟したガラス軟骨よりも低い未成熟なガラス軟骨である。成熟したガラス軟骨における細胞外基質と軟骨細胞との割合は、約９５：５である。新軟骨では、成熟した軟骨よりも軟骨細胞に対する細胞外基質の比率が低く、５％より多くの軟骨細胞を有する。
【００６５】
本発明の開発過程において、後述する環境下で、老化した不活性の軟骨細胞を、静的な非分裂段階から、細胞が分裂し増殖して細胞外基質の成長を促し新たな軟骨（新軟骨）に成長する活性段階に活性化しうることを発見した。従って、新軟骨は、若返った軟骨細胞であって、新たに合成された細胞外基質高分子で包囲された軟骨細胞を含むようになる。活性化処理には、所定の期間、代表的には約１週間〜約３ヶ月必要とされることが確かめられており、従って新軟骨は、養分の要求や機械的負荷が良好に規定されている生体外で調製するのが好ましい。
【００６６】
Ｂ．新軟骨の調製
本発明により調製する新軟骨は、ほ乳類のドナーソースから分離した軟骨細胞から細胞外で成長されるものである。代案として、新軟骨を、後述する条件下で本来の位置すなわち生体内で成長させることもできる。
【００６７】
ほ乳類の軟骨細胞の代表的なドナーソースは、ブタ又は人間である。人間に使用する本発明の新軟骨は、関節鏡検査中に患者から得た自己の軟骨細胞から成長させるのが好ましい。人間に使用する軟骨細胞は自己由来のものとするのが好ましいが、他のほ乳類のソースから得られる軟骨細胞も、損傷若しくは病変し又は老化した軟骨を治療するための新軟骨を調製するのに好適であることを理解されたい。自己由来の軟骨細胞を使用すること、及び異種の軟骨細胞を使用することの双方とも本発明の範囲に含まれることを意図している。
【００６８】
ａ）軟骨細胞の分離
ブタの軟骨を使用してほ乳類の軟骨細胞を分離する具体的の手法を例として実施例１に記載する。本発明による人間の軟骨細胞の分離及び自己由来の人間の新軟骨の調製については、実施例２に記載する。
【００６９】
簡単には、ドナーの軟骨は、人間のドナーから関節鏡生検により、又は例えば屠殺した動物の大腿骨のような関節若しくは骨から採取し、実施例１又は２に説明するように処理する。この関節軟骨は、好ましくは約０．１５％のコラゲナーゼを含む溶液中で、コラゲナーゼや、強力なプロテアーゼ、最も好ましくはＩ型コラゲナーゼにより消化させるのが好ましい。この消化は、数時間〜数日間、好ましくは約１８時間にわたり実行する。
【００７０】
他の例では、細胞外物質を、ヘパリチナーゼ、ヘパリナーゼ、コンドロイチナーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼＢ及びコンドロイチナーゼＡＣを含む（但しこれに限定されるものではない）糖リアーゼ又はプロテアーゼにより消化させることができる。リアーゼは、コラゲナーゼとの混合物として添加するか、又は逐次の酵素消化ステップにおいて添加する。これらリアーゼは、細胞周囲の環境のグリコサミノグリカンの破壊を含めて細胞外基質ＥＣＭからの軟骨細胞の更なる分離を促進することにより、軟骨細胞が、分裂すること、すなわち新たな健康な細胞外基質を生成するのを妨げる抑制シグナルを受け取らないようにする。この発見は、分裂速度が極めて遅く細胞外基質を生成する能力が小さい変形性関節症の軟骨細胞に関しては特に重要になる。
【００７１】
このことは、分裂速度が極めて遅くＥＣＭを生成する能力が小さい変形性関節症の軟骨細胞に関して特に重要である。米国特許第５９１６５５７号明細書には、軟骨細胞にコンドロイチナーゼＡＢＣを管内で適用することにより、経験と異なり新たな軟骨の生成が促進されることが開示されている。
【００７２】
細胞外及び細胞周囲の全ての抑制材料から軟骨細胞を遊離させそれにより細胞を増殖及び分化させる能力は、自己の変形性軟骨性組織において特に重要であり、このような能力がなければ、これらの軟骨細胞ではＥＣＭを生成する能力が小さいため成長速度が遅くなってしまう。この場合、ＴＥＳＳプロセッサにおいて圧力下で新軟骨を形成することで、この過程の早期のステップが大幅に改善される。更に、軟骨細胞の成長及び分化を刺激するこの方法は、細胞を培養する前に酵素を使用せずに洗浄するため、新軟骨形成における遅い段階で成長因子又は他の化学刺激剤を使用する方法と比べて、比較的穏やかなものである。
【００７３】
ｂ）軟骨細胞の増殖
その後、分離された軟骨細胞を、上述した目的に適した任意の方法、例えば好適な成長培地において約３７℃で代表的には約３日〜３０日、好ましくは１４日に亘って培養することにより増殖させる。軟骨細胞を増殖させるのに、いかなる種類の培養又はインキュベーション装置又はチャンバを用いてもよい。軟骨細胞を増殖させるに際しては、培養及び増殖させる軟骨細胞を選択する前に、死んだ軟骨細胞や残留している生来の細胞外基質や他の細胞残屑を取り除いておくのが好ましい。選択した軟骨細胞は、トリプシン処理又は他の適切な方法を用いて収集し分離する。
【００７４】
次に、増殖させた軟骨細胞を、適切な溶液中に懸濁させて支持基質内に播種し播種基質を形成する。この播種基質を、代表的には組織プロセッサで処理する。
【００７５】
ｃ）軟骨細胞の懸濁及び支持基質内への播種
軟骨細胞を増殖させるのに続いて、これら軟骨細胞を、任意の好適な溶液、好ましくはコラーゲン含有溶液中に懸濁させる。本発明の目的のために、このような溶液は、代表的にはゲルとし、好ましくは、室温より高い温度で液体ゾルから固体ゲルに溶液の状態が転移するゾル−ゲル転移溶液とする。最も好ましい溶液は、温度可逆性ゲル化ヒドロゲル又は温度可逆性ゲル高分子ゲルである。温度可逆特性は、支持基質内への軟骨細胞の固定と、軟骨の病変部位内への新軟骨構造体の埋め込みとの双方に関して重要となる。
【００７６】
ゾル−ゲルの１つの特徴は、液体形態から固体形態に硬化又は転移する能力である。この特性は、搬送、貯蔵又は保存のために、軟骨細胞の懸濁液を支持基質内で固化させるのに有利に用いることができる。更に、ゾル−ゲルのこれらの特性は、温度可逆性ゲル化ヒドロゲルについて以降に詳細に説明するように、温度を上昇又は下降させてゾル−ゲル転移を変化させることにより、或いは種々の化学的若しくは物理的条件又は紫外線放射にゾル−ゲルを曝すことにより、当該ゾル−ゲルを支持基質として使用しうるようにするものでもある。
【００７７】
一例においては、増殖させた軟骨細胞を、支持基質内に組み込む（播種）する前にコラーゲンゾル−ゲル溶液内に懸濁させる。このゾル−ゲル溶液の粘性により、剪断力を使用する必要なく軟骨細胞を容易に混合することができる。好適なゾル−ゲル溶液の例としては、米国カリフォルニア州のパロアルトにあるCohesion社からＶＩＴＲＯＧＥＮの登録商標名で市販されているＩ型コラーゲンからほぼ構成される溶液がある。このＶＩＴＲＯＧＥＮは、０．０１２ＮのＨＣｌに溶解させた精製ペプシン可溶化ウシコラーゲンである。更に、組織培養用の無菌コラーゲンを、例えば米国マサチューセッツ州のベッドフォードにあるCollaborative Biomedical社や仏国のサン・プリエストにあるGattefosse社のようなその他の販売元から入手することもできる。
【００７８】
ＶＩＴＲＯＧＥＮ溶液を使用する際には、細胞密度を約５〜１０×１０6 細胞／ｍｌとする。しかし、細胞密度、細胞を播種する体積及び溶液の強度は、いずれも本発明のアルゴリズムの範囲内で変更することができ、支持基質の寸法及び軟骨の病変部位の寸法に応じて、より多くの又はより少ない数の軟骨細胞を、より大きな又はより小さな体積の懸濁液中に懸濁させることができる。
【００７９】
いずれにせよ、懸濁させた軟骨細胞を支持基質内に播種することにより、この支持基質内に軟骨細胞を均一に分散させることができる。細胞の播種は、懸濁液と支持基質とを緊密に接触させて、毛管作用により懸濁液を支持基質内へウィッキング又は吸引させるか、懸濁液内へ支持基質を挿入するか、支持基質内へ軟骨細胞を均一に分散させるような吸引作用、正若しくは負圧、注入又はその他の手段を用いることにより行う。
【００８０】
他の例では、軟骨細胞を、５〜１５℃の温度で温度可逆性ゲル化ヒドロゲル又は高分子ゲル内に懸濁させる。この温度では、ヒドロゲルは液体ゾル状態であり、軟骨細胞はこのゾル内に容易に溶解させることができる。ゾル内に軟骨細胞を均一に分散させたら、このゾルに約３０〜３７℃のより高い温度を加える。この温度で、液体のゾルが固化して固体のゲルとなり、その内部には均一に分散された軟骨細胞が含まれることになる。ゲル化時間は、約数分〜数時間であるが、代表的には約１時間である。この場合、固化したゲル自体を支持基質として使用することもできるし、ゾル状態の懸濁液を、スポンジ又はハニカムスポンジのような個別の支持基質内に入れることもできる。
【００８１】
懸濁ゲルは、温度可逆性である必要はなく、他の手段も好適に利用することができる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体であって、一方のＰＥＧ鎖がアクリル酸又はスルホン酸ビニルの末端基を有し、他方のＰＥＧ鎖が遊離チオール基を有するＰＥＧ誘導体は、供給結合してチオエーテル結合を形成する。一方又は双方のパートナーＰＥＧ分子が分鎖している（３又は４の腕を有する）場合には、結合により網様構造、すなわちゲルが得られる。これらＰＥＧ鎖の分子量が数千ダルトン（分子量）（任意の直鎖部分で５００〜１０００ダルトン）であれば、網様構造は水により開いて膨潤可能となり、生きている細胞と適合性があるものとなる。結合反応は、水性バッファ又は細胞培養媒体に各ＰＥＧ個別に５〜２０％（ｗ／ｖ（容積当りの重量））の溶液を調製することにより達成することができる。軟骨細胞は、チオール−ＰＥＧ溶液に加えることができる。支持基質内に組み込む直前に、軟骨細胞を加えたチオール−ＰＥＧと、スルホン酸ビニル又はアクリルＰＥＧとを混合して、基質内に注入する。１〜５分以内に自然にゲル化が始まり、このゲル化速度は、ＰＥＧ試薬の濃度及びｐＨによりある程度変更することができる。結合の速度は、ｐＨ６．５よりもｐＨ７．８の方が早い。このようなゲルは、追加的なエステル又は不安定な結合を鎖に組み込まない限り、分解可能とはならない。このようなＰＥＧ試薬は、米国アラバマ州のハンツビルにあるShearwater社又は韓国のSunBio社から購入することができる。
【００８２】
第２の例では、アルギン酸溶液をカルシウムイオンの存在下でゲル化させることができる。この反応は、ゲル又はマイクロカプセル内に細胞を懸濁させるのに長年に亘って使用されてきたものである。セルは、カルシウム又は他の２価イオンの存在しない培養媒体中で１〜２％（ｗ／ｖ）のアルギニン溶液と混合させ、支持基質内に注入することができる。その後、この基質を、塩化カルシウムを含む溶液中に浸潤させ、この塩化カルシウムを基質内に拡散させ、アルギン酸をゲル化させて細胞を捕捉し支持させることができる。同様の反応は、ヒアルロン酸のような負に帯電したカルボキシル基を有する他の高分子により達成することができる。ヒアルロン酸の粘性溶液は、細胞を懸濁させるのに用いることができ、鉄イオンの分散によりゲル化することができる。
【００８３】
本発明のアルゴリズムにより、支持基質内に取り込んだり、又は固体支持体内にゲル化させた懸濁液を処理することができる。このような処理は、ＴＥＳＳプロセッサのような処理装置において行う。
【００８４】
Ｃ．支持基質の調製
増殖させた軟骨細胞を播種する支持基質は、軟骨細胞を成長させ２次元又は３次元に伝播させるのを構造的に支持する。一般的に支持基質は、生物学的に分解可能で親水性であり、好ましくは中性の電荷を有する。
【００８５】
代表的には、支持基質は、２次元又は３次元構造の組成物或いはこのような構造体に変換可能な組成物であって、流体的に連結された間隙網様構造に空間を分割する複数の細孔を含むものである。ある例では、支持構造体は、スポンジ様構造体又はハニカム様格子体とする。
【００８６】
一般に、組織により生分解性であり且つ必要な幾何学形状を有するものであれば、任意の高分子材料を支持構造体として作用させることができる。高分子材料は、天然のものでも合成されたものでも、線維又はコアセルベートが形成されるようにすることができ、その後、水性分散体としてフリーズドライしスポンジを形成することができる。代表的には、このようなスポンジは、例えば電離放射線により架橋させて安定させる必要がある。実際例としては、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ｐＨＥＭＡ）のフリーズドライスポンジであって、随意的には内部にゼラチンのような追加的な分子を取り込むと有利なスポンジを調製する処理が含まれる。このような種類のスポンジは、本発明において支持基質として有利に機能しうる。アガロース、ヒアルロン酸又は他の生活性高分子を組み込んで細胞応答を調製するのに使用することができる。幅広い範囲の高分子が、支持基質のスポンジを製造するのに好適なものとなり得、このような高分子には、アガロース、ヒアルロン酸、アルギニン酸、デキストラン、ポリＨＥＭＡ及びポリビニルアルコール又はこれらの組合わせがある。
【００８７】
代表的には、支持基質は、コラーゲンゲル又はゲル溶液から調製するが、これには、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ゼラチン、アガロース、ムコ多糖類若しくは糖蛋白質若しくはプロテオグリカンを含む細胞収縮コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、生物活性ペプチド成長因子、サイトカイン、エラスチン、フィブリンであったり、（ポリ乳酸、ポリグリコール酸若しくはポリアミノ酸のような）ポリ酸や、ポリカプロラクトンや、ポリアミノ酸や、ポリペプチドゲルや、これらの共重合体から形成された合成高分子線維であったり、或いはこれらを組合わせたものが含まれる。好ましくは、支持基質は、Ｉ型コラーゲンを含むのが最も好ましいゲル溶液、又は温度可逆性とするのが好ましい高分子ゲル基質である。
【００８８】
支持基質を調製するのに用いるゲル又はゲル溶液は、代表的には水で洗浄した後フリーズドライ又は凍結乾燥させて、軟骨細胞を支持基質内に組み込む又はウィッキングすることができるスポンジ様基質を得る。本発明の細胞支持基質は、軟骨細胞が均一に分散された軟骨細胞懸濁液で浸潤させると、スポンジのように作用する。
【００８９】
支持基質の重要な観点は、支持基質の細孔寸法である。異なる細孔寸法を有する支持基質により、その基質内への軟骨細胞の浸潤を早くしたり遅くしたり、細胞の成長及び伝播を早くしたり遅くしたりすることができ、究極的には新軟骨構造体内の細胞密度を高くしたり低くしたりすることができる。このような細孔寸法は、ゲル溶液のｐＨや、コラーゲンの濃度や、凍結乾燥の条件等を変化させることにより調整することができる。代表的には、支持基質の細孔寸法は、約５０〜約５００μｍであり、好ましくは１００〜３００μｍであり、最も好ましくは約２００μｍである。
【００９０】
支持基質は、実施例３に記載した手法か、又は本明細書中に参考として組み入れた例えば米国特許第６０２２７４４号、同第５２０６０２８号、同第５６５６４９２号、同第４５２２７５３号及び同第６０８０１９４号明細書に開示された任意の他の手法により調製することができる。
【００９１】
好ましい種類の支持基質は、日本国の東京にある高研株式会社からハニカムスポンジの商標名で市販されているスポンジ内に形成したＩ型コラーゲンの支持基質である。
【００９２】
コラーゲンから形成され且つ軟骨組織が播種された代表的な新軟骨構造体は、図１に示されている。この図１は、ゾル−ゲルから形成されたスポンジの線図であり、このコラーゲンスポンジ内に軟骨細胞が分散された状態が示されている。図１Ｂは、直径が４ｍｍで厚さが１．５ｍｍの実際の新軟骨構造体（Ｎｅｏ−Ｃａｒｔ（商標名））の顕微鏡写真である。この新軟骨構造体の播種密度は、２５μｌのコラーゲン溶液あたり３０００００〜３７５０００個の軟骨細胞となっており、これは約１２００００００〜１５００００００細胞／ｍｌに相当する。
【００９３】
ａ)ハニカム細胞支持基質
本発明の一例において、支持基質は、本明細書において新軟骨と記載される活性軟骨細胞を細胞的に支持するハニカム様の格子基質である。このハニカム様の基質は、新軟骨のための成長プラットフォームを支持し、新軟骨が３次元に伝播しうるようにする。
【００９４】
このハニカム様の基質は、コラーゲン、ゼラチン、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン又は好ましい特性を有する他の任意のポリマーのような高分子化合物から製造される。好適例において、このハニカム様の基質は、Ｉ型コラーゲンを含む溶液から調製する。
【００９５】
ハニカム様の基質の細孔は、この基質内で均一に分散されており、粘性溶液中に懸濁させた新軟骨を取り込んで均一に分散させうるスポンジ様の構造体が形成されている。
【００９６】
ｂ）ゾル−ゲル細胞支持基質
他の例において、支持基質は、温度を変化させることにより、ゾルからゲルへ及びその逆に変化し得るゾル−ゲル材料から形成する。ゾル−ゲル転移は、これらの材料に関して、寒天及びゼラチンゲルの逆の温度サイクルで生じることになる。したがって、これらの材料では、より高い温度で、ゾルが固体ゲルに変化する。ゾル−ゲル材料は、１５℃より低い温度で粘性のゾルであり、３７℃周辺かそれより高い温度で固体ゲルとなる材料である。一般に、これらの材料は、約１５℃〜３７℃の温度において転移によってゾルからゲルへ形態を変化し、１５℃〜３７℃の温度では転移状態にある。最も好ましい材料は、ゲルを含有するＩ型コラーゲンと、急速なゲル化点を有する温度可逆性ゲル化ヒドロゲル（ＴＲＧＨ）である。
【００９７】
ある実施例において、ゾル・ゲル材料は、Ｉ型コラーゲンからほぼ構成されるもので、０．０１２Ｎの塩酸溶液中に溶解させた純度９９．９％のペプシン可溶化ウシ皮膚コラーゲンの形態で、カルフォルニア州パロアルトにあるCohesion社からVITROGENの登録商標名で市販されている。このゾル・ゲルの１つの重要な特徴は、転移により、混合や注入その他の阻害を受けない固体ゲル形態に硬化しうる能力で、それにより、固定化軟骨細胞を含む固体構造体が形成される。
【００９８】
Ｉ型コラーゲンのゾル・ゲルは、通常、軟骨細胞を懸濁させ、ゾルの形態で個別に調製した支持基質内に播種するのに適したもので、この支持基質を適当な温度、通常は３０〜３７℃程度の温度まで加熱することにより、ゾルを固体ゲルにゲル化させ、播種された支持基質はこの形態で処理する。この種のゾル・ゲルは、本発明のプロセッサにおいて軟骨細胞含有ゲルを新軟骨構造体に加工するための支持基質としても使用することができる。
【００９９】
他の例では、このゾル・ゲルを温度可逆性ゲル化ヒドロゲル（ＴＲＧＨ）とする。ゾル・ゲル支持基質の調製に用いるゾル・ゲル温度可逆性材料は、１５℃より低い温度では粘性のゾルであり、３０℃より高い温度では固体のゲルとなる。温度可逆性ゲル化ヒドロゲル（ＴＲＧＨ）の主たる特徴は、体温でゲル化し、１５〜２５℃より低い温度ではゾル化すること、体内で分解される際に生物学的に有害な物質を残さないこと、ゲル化温度で水を吸収しないことである。ＴＲＧＨは、非常に短時間でゾル・ゲル転換するもので、この転移は、硬化時間を必要とせず、ヒステリシスなく温度の関数として簡単に生じる。ゾル・ゲル転移温度は、温度可逆性ゲル化高分子（ＴＧＰ）の分子設計により５℃〜７０℃の範囲の任意の温度に設定することができ、このうち高分子重合体は５重量％未満とすればヒドロゲル形成には十分である。
【０１００】
代表的なＴＲＧＨは、通常、親水性ポリマーブロックにより架橋された多数の疎水性ドメインを含む高分子量重合体のブロックから形成される。ＴＲＧＨは、低い浸透圧を有し、温度をゾル・ゲル転移温度より高く維持すれば水に溶解しないため非常に安定している。ヒドロゲル内の親水性ポリマーブロックは、ゲル化の間におけるヒドロゲルからの水の分離及び巨視的相分離を防止する。これらの特性は、安全な貯蔵及び長期の品質保持に特に適している。
【０１０１】
温度可逆性ゲル、特に空間保持性の温度可逆性ゲル（ＳＨＴＧ）は、３７℃未満の約３２℃の温度、すなわち一般に３７℃より低い関節の滑膜包の温度までは、圧縮に強く安定である必要があるが、３０〜３１℃未満の温度では容易に可溶化して腔からゾルとして簡便に取り除きうるものでなければならない。ＳＨＴＧ又はＴＲＧＨの圧縮強さは、関節の通常の活動における圧迫に耐えうるものでなければならない。
【０１０２】
この点に関して、温度可逆性ヒドロゲルは、温度可逆性ゲル化高分子（ＴＧＰ）の水溶液であり、加熱するとヒドロゲルに変わり、冷却すると液化するものである。ＴＧＰは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）若しくはポリプロピレンオキシドのような温度反応性ポリマー（ＴＲＰ）ブロック又はポリエチレンオキシドのような親水性ポリマーブロックから構成されるブロック共重合体である。
【０１０３】
ポリエチレンオキシド及びポリプロピレンオキシドの共重合体からなる温度可逆性ヒドロゲルは、Pluronicsの商標名で、BASF Wyandotte Chemical社から入手可能である。
【０１０４】
一般に、温度可逆性は、たとえば、コラーゲンやポリエチレンオキシド及びポリプロピレンオキシドの共重合体のように、同じポリマー鎖上に疎水基及び親水基が存在することにより得られる。ポリマー溶液を加熱すると、疎水的相互作用によって鎖会合及びゲル化が生じる。ポリマー溶液を冷却すると、疎水的相互作用が失われ、ポリマー鎖は解離してゲルが溶解する。このような特性を有する好適な生体適合性のあるポリマーであれば、天然であろうと合成であろうと、いかなるものでも同様の可逆性ゲル化挙動を呈する。
【０１０５】
この種の温度可逆性ゲル化ヒドロゲルは、特に病変部位内に構造体を埋め込む際の新軟骨構造体の調製に特に好ましい。この種の温度可逆性ゲル化ヒドロゲルは、特に病変部位内に構造体を埋め込む際の新軟骨構造体の調製に特に好ましい。このような場合、採取された軟骨細胞をＴＲＧＨゾル中に懸濁させ、その後約３７℃まで暖めると固体ゲルとなり、それ自体で軟骨細胞が播種された支持基質となる。播種された支持基質を、後述する静止期間を含む本発明のアルゴリズムを用いて組織プロセッサ内で処理し、それにより新軟骨構造体を形成する。次に、この構造体を冷却してその形態をゾルに変化させ、この形態で、新軟骨構造体を病変部位内に注入する。この病変部位内で、ゾルは、体温まで暖められると直ちに新軟骨を含むゲルに変わる。遅からず、この注入された新軟骨は既存の軟骨と一体化し、その後ＴＲＧＨは、不所望な破片を残ずに分解される。
【０１０６】
Ｄ.処理新軟骨及び組織プロセッサ
軟骨細胞及び新軟骨の双方又はいずれか一方の３次元的な成長及び伝播を促進するためには、これらの成長条件を変更することにより、このような成長及び伝播を促進するのが有利であり、また場合によっては必要となる。このような促進処理は、生体外、管内又は生体内でで開始させることができる。
【０１０７】
本発明では、この処理は、懸濁させた増殖した軟骨細胞又は懸濁させた軟骨細胞が組み込まれた支持基質を、このような伝播を促進することが確認された特定プロトコル（アルゴリズム）の条件に曝すことにより達成される。このような条件には、例えば、一定の又は周期的な静水圧の適用や、静止期間の適用や、媒体の再循環及び流速の変更や、酸素又は二酸化炭素濃度の調節や、細胞密度や、制御ｐＨや、栄養分の入手可能性や、補助因子などがある。代表的には、この処理は、上述したような条件を変化させることができる装置、好ましくはＴＥＳＳ（商標名）組織プロセッサで行う。
【０１０８】
ａ）新軟骨組織プロセッサ
一般的な設計の組織プロセッサは、軟骨細胞を培養する装置であって、培地を具える培養チャンバを有する培養ユニット及び培地を連続的及び断続的に搬送するための供給ユニットと、大気圧又は大気圧より上の一定の若しくは周期的な静水圧を組織チャンバに加えるための圧力発生器であって、圧力を変化させ、大気圧又は一定の若しくは周期的な静水圧のタイミングを調整し、或いはこのような圧力を所定の周期で加える手段を有する当該圧力発生器と、随意的には、窒素、二酸化炭素及び酸素のようなガスを搬送したり、吸収したり或いはこれらの双方を行うことができる手段とを有している。さらに、代表的には、プロセッサは、加熱、冷却及び加湿手段を具えるハーメチック封止された空間を有する。
【０１０９】
本発明の目的に適した播種された支持系に対して、静水圧を加え、このような支持系に搬送される媒体の流速を変化させ、ガス濃度を調整するのに適した組織プロセッサの代表例を図２Ａに示す。図２Ｂに示す組織プロセッサは、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴＥＳＳ）として既知のものであり、明細書中に参考として組み入れた２００２年８月１３日に特許された米国特許第６４３２７１３号明細書及び米国特許出願第０９／８９５１６２号明細書に開示されたものである。
【０１１０】
ｂ）新軟骨構造体の生物学的及び組織学的試験
新軟骨構造体の代謝活性、遺伝子活性及び組織外観を試験する。
【０１１１】
代表的には、新軟骨構造体は、６日目及び１８日目に採取する。未成熟の及び成熟した軟骨基質を組織学的に評価するために、４％のパラホルムアルデヒドで固定したパラフィン切片を、サフラニンＯ及びＩＩ型コラーゲン抗体で着色する。生化学的分析のために、新軟骨構造体を、60ーＣにパパインにより６０℃で１８時間にわたり消化させ、例えば、文献Ａｎａｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ１７４（１９８８年）の第１６８〜１７６頁に記載されているヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３２５８染色法を用いてＤＮＡを測定する。軟骨細胞培養物の代謝活性を示すグリコアミノグリカン（ＧＡＧ）又は硫酸グリコサミノグリカン（Ｓ-ＧＡＧ）の生成を、例えば、文献Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９（１９８２）の第２４７〜２４８頁に記載されている変性ジメチレンブルー（ＤＭＢ）の微量検定法を用いて試験する。
【０１１２】
ｃ）軟骨細胞の伝播条件、新軟骨及び新軟骨構造体の調製
本明細書において使用される新軟骨構造体とは、軟骨細胞を播種し本発明により処理した基質を意味する。新軟骨構造体は、これら構造体を沈着させる病変部位の寸法に近い、新軟骨を有する３次元パッチとして製造することもできるし、又は広範囲な軟骨損傷部位の修復に用いる三次元シートとして製造することもできる。新軟骨構造体の寸法及び形状は、支持基質の形状及び寸法により定まる。新軟骨構造体の機能は、構造体を処理する条件（アルゴリズム）により決定される。
【０１１３】
支持基質内で軟骨細胞を３次元的に伝播させ新軟骨構造体を形成する条件は、この新軟骨構造体を使用する用途や意図する機能に応じて調整し変更することができ、使用する温度可逆性ヒドロゲルの種類及び播種する軟骨細胞の密度に応じたものとなる。したがって、小さな新軟骨構造体を製造するための条件は、広範囲に損傷又は傷害を受けた、例えば骨関節炎の軟骨を部分的又は完全に置き換えるのに用いる広範囲な新軟骨シートの製造や大きな新軟骨構造体の製造に要求されるものと異なる。
【０１１４】
ｉ）可変流速での新軟骨の処理
本発明の一観点は、軟骨細胞を播種した支持基質を、媒体流速を変化させて潅流させれば、細胞外基質の蓄積量の増加により評価される細胞増殖を有利に増減されうるという知見にある。一般に、媒体の流速を遅くするほど、細胞外基質の蓄積が大きくなる。
【０１１５】
灌流速度は、支持基質に組み込まれた軟骨細胞を培養するのに重要な可変条件である。より速い灌流速度を使用することにより、細胞外基質の集積を減速させ、軟骨細胞の成長及び伝播に影響を与えることができ、このことは、硫酸グリコサミノグリカン（Ｓ-ＧＡＧ）の製造により測定される。一方で、潅流速度をより遅くすると、Ｓ−ＧＡＧが多く生成されることになる。これらの結果は、新軟骨の成長を制御するのに重要であり、また、例えば新軟骨構造体の貯蔵、保存、輸送及び貯蔵期限に関して重要となる。
【０１１６】
本発明のために好適な灌流速度は、約０．００１〜約０．５ｍｌ／分であり、好ましくは約０．００５〜約０．０５ｍｌ／分である。媒体の潅流速度を０．００５  ｍｌ／分とすると、細胞外基質の蓄積は、潅流速度を０．０５ｍｌ／分とした後に観察される細胞外基質の蓄積と比べて著しく増加する（ｐ＜０．０５）。最適流速は、培養チャンバにおける細胞の合計数に依存する。
【０１１７】
ｉｉ）異なる種類の圧力下での新軟骨の処理
灌流速度を低減させるのに関連して、播種した支持基質を静水圧に曝すことは、本発明による培養処理システムにおける不可欠な部分である。異なる種類の静水圧を用いることは、大気圧のみを用いる場合と比べて、グリコサミノグリカンの生成、すなわち細胞外基質の蓄積に顕著な影響を与える。静水圧、特に本発明により加えられる周期的な静水圧により、軟骨細胞の増殖や細胞外基質の蓄積に寄与する代謝が刺激される。
【０１１８】
支持基質内に播種された軟骨細胞を処理するのに好適な静水圧は、一定の又は周期的な静水圧であり、その圧力は大気圧より高い。播種された支持基質を処理するのに適した周期的な静水圧は、約０．５Ｈｚとするのが好ましい０．０１Ｈｚ〜約２．０Ｈｚにおいて、約０．０１〜約１０．０ＭＰａ、好ましくは約０．５〜約５．０ＭＰａ、最も好ましくは約３．０ＭＰａであり、静止期間を設けて又は設けずに、約１時間〜約３０日間、好ましくは約７日に亘り適用する。代表的には、静水圧を加える期間に続いて、通常は約１日〜約３０日の、好ましくは約１６日〜１８日の静止期間を設ける。
【０１１９】
本発明を支持する研究により、細胞の生存度は、静水圧によって影響されるものでなく、軟骨細胞が支持基質内で均一に分散されていることにより維持されることが示されている。静水圧による治療後のＤＮＡ及びＳ−ＧＡＧの蓄積度は、負荷を加えていない培養物の場合と比べて著しく増大する。このことは、培養環境により、軟骨細胞の活性並びに代謝及び遺伝子の活性を制御しうることを意味している。
【０１２０】
iii)  酸素濃度を減少させての新軟骨の処理
播種された支持基質の処理における他の可変条件は、酸素、二酸化炭素及び窒素の濃度である。
上述した軟骨細胞を播種した支持基質は更に、ＴＥＳＳプロセッサにおける新軟骨の形成処理中に、酸素濃度を低減させて（すなわち２０％未満の飽和度）培養させることができる。軟骨における酸素濃度の減少は生体内で観察されるが、このような酸素濃度の減少は、軟骨に血管が通常存在しないため隣接組織と比べて酸素分圧が低くなることによりに生じる。本発明における研究では、支持基質内に播種した軟骨細胞又は新軟骨を、約０％〜約２０％の飽和度の酸素濃度で、又は５％の二酸化炭素濃度で培養した。
【０１２１】
Ｅ）アルゴリズムを最適化するための条件の決定
本発明の最終的な目的は、軟骨病変部位内に埋め込むための新軟骨構造体であって、１層以上のシーラント層を堆積させるのと連携して、ａ)埋め込まれた新軟骨構造体を保護し病変部位上に成長してこれを完全に被覆する表層性軟骨層を成長させるステップと、ｂ）新軟骨構造体として病変部位内に埋め込まれた新軟骨を一体化させるステップと、ｃ）その後新軟骨構造体及びシーラント材料を分解させるステップとにより、損傷若しくは障害を受け又は病変若しくは老化した軟骨を治療するための当該新軟骨構造体を調製する条件（アルゴリズム）を見出し確かめることにある。
【０１２２】
以降に説明する本発明の基礎となる研究により、媒体の潅流や静水圧を利用して持続的に培養するという適切に計画され最適化された培養条件によって、本発明により１層のシーラント層の下又は２層のシーラント層の間に埋め込むと元からある軟骨と一体化する新軟骨構造体が形成されることが示されている。
【０１２３】
新軟骨構造体を調製するため方法の一般的な構成は、
ａ）ドナーの組織から軟骨細胞を分離するステップと、
ｂ）これら軟骨細胞を約３〜２８日間に亘り増殖させるステップと、
ｃ）これら軟骨細胞を温度可逆性若しくはコラーゲンゲル又はコラーゲンスポンジの支持基質に播種するステップと、
ｄ）軟骨細胞を播種したゲル又はスポンジに対し、５μｌ／分の潅流速度で数日（５〜１０日）間に亘り、大気圧より高い一定の又は周期的な静水圧（０．５Ｈｚにおいて約０．５〜３．０ＭＰａ）を加えるステップと、
ｅ）播種されたゲル又はスポンジに、一定の（大気）圧で１０〜１４日間の静止期間を付与するステップと
を有する。
【０１２４】
上述した条件及び方法を用いて得られる新軟骨構造体により、細胞の増殖及び細胞外基質の蓄積が大きくなるという点で、静水圧及び一定圧の複合アルゴリズムが、通常の培養方法より有利であることが示される。温度可逆性若しくはコラーゲンゲル又はコラーゲンスポンジの支持基質を使用することにより、当該支持基質内での細胞の均一な分布が維持され、更に新たに合成された細胞外基質もこれにより支持される。得られる３次元の新軟骨構造体は、操作や扱いが容易であり、外科的な配置の際に容易に且つ安全に埋め込むことができる。
【０１２５】
低い媒体潅流速度において静水圧を周期的に加える処理に続き、定常的な培養（静止期間）期間を設けるという処理の組合せにより、細胞の増殖が増大し、ＩＩ型コラーゲンの生成が増大し、ＤＮＡ含量が増え、ＳＧＡＧの蓄積量が増える。
【０１２６】
細胞の増殖が増大されることは、収集された非分裂性の不活性軟骨細胞が、分裂性で増殖性の活性軟骨細胞を含む新軟骨に活性化されることを示す。ＤＮＡのレベルが増加することは、不活性の軟骨細胞が遺伝的に活性化されることを示す。ＩＩ型コラーゲン及びＳ-ＧＡＧの生成が増えることは、細胞外基質の生成が上記のアルゴリズムを用いることにより活性化されたことを示す。
【０１２７】
上述したような最適化されたアルゴリズムを用いるのが好ましいが、このアルゴリズムは、各条件について詳細に前述したように、周期的な静水圧、流速、圧力の持続期間及び静止期間を様々な範囲で変更することにより、有利に変更させうるものであることを理解されたい。全ての条件に関する全ての変更及びこれらの組合せは、本発明の範囲内に含まれることを意図するものである。
【０１２８】
Ｆ．本発明を裏付ける実験的研究
新軟骨構造体の製造における支持基質内での軟骨細胞の伝播に対する種々の条件の影響を試験するために、本発明の開発時に、前述した条件を組合わせて処理を最適化させる研究を行った。この結果を、図３〜図９、及び表１〜３に示す。
【０１２９】
以下の全ての研究に関して、研究条件の変更に関する実験計画は以下の通りである。実施例７にて説明したように、軟骨は、ブタ後肢の気管から無菌状態で収集し、細かく分割し、消化させた。これらの軟骨細胞を、３７℃で５日間増殖させて、ＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）（３０００００／３０μｌ）中に懸濁させた。この懸濁液を、図１に示すように支持基質内、通常はコラーゲンスポンジ（直径４ｍｍ及び厚さ２ｍｍ）内に吸収させた。コラーゲンスポンジは、日本国の東京にある高研社から市販されている。軟骨細胞を播種したこれらスポンジを、３７℃で１時間にわたり予保温しコラーゲンをゲル化させ、図２に示すＴｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴＥＳＳ（商標名））プロセッサにおいて３７℃で５％二酸化炭素の培地にて保温して培養する。
【０１３０】
ａ）静水圧の影響の評価
圧力及び媒体潅流速度の双方又はいずれか一方の影響を評価するために、ＴＥＳＳプロセッサにおいて、細胞を播種したスポンジに対して、０．５Ｈｚで０．５ＭＰａの周期的な静水圧（Ｃｙ−ＨＰ）又は一定の静水圧（ｃｏｎｓｔａｎｔ−ＨＰ）で６日間にわたり、５μｌ／分（０．００５ｍｌ／分）又は５０μｌ／分（０．０５ｍｌ／分）の媒体潅流を行った。その後、大気圧下で１２日間の静止期間を設けた。播種したスポンジの一部を対照群として用いた。これらのスポンジは、大気圧下で全１８日間に亘り３７℃で培養し、潅流はさせなかった。細胞を播種した後２４時間の時点（０日目）で採取したスポンジを、初期対照群として用いた。より詳細な条件については、実施例に後述してある。
【０１３１】
培養期間が終了した時点で支持基質を採取し、生化学的及び組織学的分析を行った。硫酸グリコサミノグリカンの生成を、変性ジメチレンブルー微量検定法を用いて測定した。組織学的分析には、サフラニン−Ｏ染色法を用いた。より詳細な条件は、実施例に記載してある。
【０１３２】
最初の研究は、Ｓ−ＧＡＧの生成に対する一定の（大気）圧、周期的な又は一定の静水圧の影響を決定することを目的とした。
【０１３３】
培養期間が終了した時点で、対照群及び試験群の双方の基質を採取し、生化学的及び組織学的分析を行った。生化学的分析のために、硫酸グリコサミノグリカン（Ｓ-ＧＡＧμｌ／細胞構造体）の生成を、実施例７に記載する変性ジメチルメチレンブルー（ＤＭＢ）及びＤＮＡ微量検定法を用いて測定した。この結果を、表１及び表２並びに図３〜６に示す。
【０１３４】
表１及び表２に示される研究結果は、本発明のアルゴリズムにより処理した基質内で観察されたＳ−ＧＡＧの生成量の増加数を示している。
【０１３５】
【表１】
2008507971.tif 000003
【０１３６】
表１は、インキュベータ内で１８日間に亘り大気圧に曝した播種された基質（対照群 ｎ＝６ ）と、ＴＥＳＳプロセッサ内で０．５Ｈｚで６日間に亘り３ＭＰａの周期的な静水圧により処理し、その後インキュベータ内で大気圧で１２日間処理した基質（試験群ｎ＝６ ）とにより得られた結果をまとめたものである。
【０１３７】
表１に示されるように、播種された基質あたりのＳ−ＧＡＧの生成（μｇ／細胞構造体）は、対照群を１００％とすると試験群は１３２％となり著しく増大している（図３Ａ）。図３Ｂ及び図３Ｃ（Ｓ−ＧＡＧに対してサフラニンＯで染色）に示す組織学的な結果は、生化学的に得られた結果と整合性のあるものであった。図３Ｂは、１８日間静圧下においたパラフィン切片上のＳ−ＧＡＧに対してサフラニンＯ染色を施した状態を示す顕微鏡画像である。図３Ｃは、６日間に亘り周期的な静水圧を加えた後１２日静置培養を行った細胞構造体のパラフィン切片上のＳ-ＧＡＧに対してサフラニンＯ染色を施した状態を示す顕微鏡画像である。
【０１３８】
図３Ｂに示されるように、細胞構造体に静大気圧を加えた場合（図３Ｂ）、その構造体におけるＳ−ＧＡＧの蓄積は、６日間に亘り周期的な静水圧を加えその後１２日間の静大気圧を加えた場合（図３Ｃ）よりも著しく低くなる。
【０１３９】
軟骨細胞の増殖刺激及び基質の蓄積に対する静水圧の影響を決定するために、前述したように、軟骨を無菌状態で収集した。軟骨細胞を、３７℃で５日間に亘り増殖させ、ＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）（３０００００／３０μｌ）内に懸濁させた。この懸濁液を、図１に示すようにハニカム支持基質又はコラーゲンスポンジ内に吸収させた。この細胞構造体を、図２に示すＴｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴＥＳＳ（登録商標））プロセッサ内で、５％の二酸化炭素及び２０％の酸素中で３７℃の培地において、０．５ＭＰａの周期的な静水圧を加えて培養するか、又は６日間に亘り０．５ＭＰａの一定の静水圧を加えその後１２日間培養した。対照群を有する残りの細胞基質は、５％の二酸化炭素及び２０％の酸素中で３７℃で１８日間に亘り大気圧において培養した。
【０１４０】
培養期間終了後、基質を収集して生化学的分析を行った。この結果を表２に示す。グリコサミノグリカンの生成は、変性ジメチルメチレンブルー（ＤＭＢ）微量検定法を用いて測定した。細胞の増殖は、変性ヘキストダイＤＮＡ分析法を用いて測定した。新組織の形成は、サフラニンＯ染色法により評価した。これらの結果を、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ａ及び図５Ｂ並びに表２に示す。
【０１４１】
【表２】
2008507971.tif 000004
【０１４２】
全ての培養物を、５％の二酸化炭素及び２０％の酸素中で３７℃で培養した。
ＴＥＳＳ培養において、媒体流速は０．０５ｍｌ／分とした。各群から２つの細胞基質を収集し、組織学的分析を行った。
【０１４３】
表２に示すように、対照群の欄に示す条件で処理した基質、周期的な静水圧（Ｃｙ−ＨＰ）を加えた基質及び一定の静水圧（ｃｏｎｓｔ−ＨＰ）を加えた基質では、Ｓ−ＧＡＧの生成はそれぞれ５９．８５、９１．０５及び９７．８５μｇ／細胞構造体となり、ＤＮＡ指数は、それぞれ１、１．４９及び１．７４（対処群＝１）となった。これらの結果は、周期的であれ一定であれ静水圧下で培養しその後静置培養して得られた新軟骨は、静大気圧条件（対照群）の下で処理したものより遺伝的及び代謝的に活性であることを明確に示している。これらの結果は図４にグラフとして示されており、これら図面においては、硫酸グリコサミノグリカン（図４Ａ）及びＤＮＡ含有量（図４Ｂ）の生成に対する静水圧の影響が示されている。
【０１４４】
図４Ａは、表２に列記した結果をグラフにより示すもので、セル構造体における硫酸グリコサミノグリカンの生成を表し、図中、対照は、播種された基質に大気圧を加えたものを示しており、Ｃｙ−ＨＰは、播種された基質に周期的な静水圧（０．５ＭＰａ）を加えたものを示し、ｃｏｎｓｔａｎｔ−ＨＰは、基質に一定の静水圧（０．５ＭＰａ）を加えたものを示す。
【０１４５】
上述した条件での表２に示す結果を、図４Ａにグラフにより図示する。周期的な静水圧を加えた群（Ｃｙ−ＨＰ）と、一定の静水圧を加えた群（ｃｏｎｓｔａｎｔ−ＨＰ）との双方において、大気圧（対照群）を用いた群と比べて、Ｓ−ＧＡＧの生成量の増加が顕著であった。具体的には、対照群でのＳ−ＧＡＧの生成は、５９．８５μｌ／細胞構造体であった。Ｃｙ−ＨＰの群においては、Ｓ−ＧＡＧの生成は、９１．０５μｌ／細胞構造体であった。ｃｏｎｓｔａｎｔ−ＨＰの群における細胞構造体の生成は、９７．８５であった。これらの結果によれば、対照群と比較して、Ｃｙ−ＨＰの群では、Ｓ−ＧＡＧの生成が１５２％まで増大し、ｃｏｎｓｔａｎｔ−ＨＰの群では１６２％に増加した。
【０１４６】
図４Ｂは、ＤＮＡに関して表２に示される結果に対応するＤＮＡの生成を示しており、同様に、周期的な又は一定の静水圧下で処理した構造体におけるＤＮＡの生成量の増加を示す。
【０１４７】
図５Ａは、ＴＥＳＳプロセッサで処理される支持基質に対して、一定の気圧を加えた場合（対照）と、圧力に関する対照群として用いる０ＭＰａの静水圧を加えた場合（０ＭＰａ）と、０．５ＭＰａの周期的な静水圧を加えた場合（Ｃｙ−ＨＰ）と、０．５ＭＰａの一定の静水圧を加えた場合（Ｃｏｎｓｔａｎｔ−ＨＰ）の６日目及び１８日目における作用を比較したグラフである。全ての基質は、３７℃で１８日間に亘り培養した。Ｃｙ−ＨＰ及びＣｏｎｓｔａｎｔ−ＨＰは、最初の６日間だけ適用しその後は大気圧で１２日間培養した。
【０１４８】
図５Ａに示す結果は、Ｃｙ−ＨＰ又はＣｏｎｓｔａｎｔ−ＨＰと大気圧で培養する静止期間とを組合せると、このようにして処理した基質におけるＳ−ＧＡＧの生成量の増加は、潅流のみで大気圧で処理した基質で観察されるＳ−ＧＡＧの生成量と比べて著しく大きくなることを示している。
【０１４９】
図５Ｂは、６日間及び１８日間にわたり大気圧の媒体に、静圧を加えた場合（対照）と、０ＭＰａの静水圧を加えた場合（０ＭＰａ）と、周期的な静水圧を加えた場合（Ｃｙ−ＨＰ）と、一定の静水圧を加えた場合（Ｃｏｎｓｔａｎｔ−ＨＰ）の基質のＤＮＡ含量の指数（初期＝１）を示す。これらのアルゴリズム条件で処理した基質のＤＮＡ含量の増加は、周期的な静水圧を加えた場合及び一定の静水圧を加えた場合の双方において明らかに示されている。初期及び対照群のＤＮＡレベルと比較した、静水圧を加えた３つの全ての群において常に得られるＤＮＡレベルによれば、周期的な静水圧を加えた構造体のＤＮＡレベルは、１８日よりも６日において高く、一定の静水圧を加えた構造体のＤＮＡレベルは、１８日よりも６日において低くなることが分る。高レベルのＤＮＡは、一定の静水圧を加えた１８日目の基質において観察される。
【０１５０】
図６Ａ及び図６Ｂは、サフラニンＯで染色した基質の組織学的評価を示す。図６Ａは、大気圧を加えた基質の１８日目におけるＳ−ＧＡＧの蓄積を示す。図６Ｂは、６日間にわたり周期的な静水圧（Ｃｙ−ＨＰ）を加えるのに続いて１２日間大気圧を加えた基質におけるＳ−ＧＡＧの蓄積を示す。Ｃｙ−ＨＰによる培養基質においてＳ−ＧＡＧの蓄積がより大きいことは、構造体において明確に視認できる可視顕微画像での密度の増大から明白である。図３Ｃは、大気圧又は周期的な静水圧（図６Ｄ）を加えた基質におけるＩＩ型コラーゲンの蓄積を示す。ＩＩ型コラーゲンがより多く蓄積していることは、図６Ｄから明らかに分る。
【０１５１】
これらの結果は、軟骨細胞を培地内に配置して、硫酸グリコサミノグリカン（Ｓ-ＧＡＧ）のような細胞外基質高分子により、新軟骨構造体と一体化させうることを証明している。
【０１５２】
ｂ）灌流の影響の評価
第２の研究は、軟骨細胞の増殖（ＤＮＡ含量）及び細胞外基質の蓄積（Ｓ−ＧＡＧの蓄積）に対する潅流の影響を調べるために実施した。これらの結果を、表３並びに図７Ａ及び図７Ｂに示す。
【０１５３】
図７は、細胞の増殖に対する潅流速度の影響を、０日、６日及び１８日におけるＤＮＡのレベル（図７Ａ）、Ｓ−ＧＡＧの蓄積（図７Ｂ）を調べることにより測定したものである。
【０１５４】
図７Ａは、潅流速度をより遅くすれば（５μｌ／分）、細胞の増殖を決定するための指標として用いられるＤＮＡ含量がより高くなることを示している。具体的には、ＤＮＡ含量指数は、培養潅流速度を５μｌ／分とした場合、１の初期ＤＮＡ含量と比べて約５０％増大し約１．５になる。潅流速度をより高くすると（５０μｌ／分）、ＤＮＡ含量指数の増加は極めて小さくなり約１．２となる。
【０１５５】
表３は、前述したように潅流速度を０．０５ｍｌ／分（５０μｌ／分）又は０．００５ｍｌ／分（５μｌ／分）とした場合の、処理される基質におけるＳ−ＧＡＧの生成量に対する潅流速度の影響を示す。
【０１５６】
【表３】
2008507971.tif 000005
【０１５７】
全ての培養物は、３７℃、５％二酸化炭素及び２０％酸素において培養した。培養中には、細胞基質に対して０．５ＭＰａの周期的な圧力を０．５Ｈｚで加えた。組織学的分析のために各群から２つの基質を採取した。
【０１５８】
表３に示すように、潅流速度（５μｌ／分）を遅くした場合のＳ−ＧＡＧの製造量は、潅流速度（５０μｌ／分）を速くした場合の約１．５倍となった。
【０１５９】
これらの結果を、図７Ｂのグラフに示す。図７Ｂは、６日目及び１８日目における、播種した支持基質を０．００５ｍｌ／分の媒体灌流速度に曝した場合のＳ−ＧＡＧの生成量を、基質を０．０５ｍｌ／分の媒体灌流速度に曝した場合と比較したグラフを示す。図７Ｂに示すように、０．００５ｍｌ／分のより遅い潅流速度を用いた基質では、Ｓ−ＧＡＧの生成量が１３６％まで増大した（ｐ＜０．０５）。
【０１６０】
図７Ａ及び図７Ｂにまとめたこれらの結果により、細胞構造体におけるＤＮＡ指数及びＳ−ＧＡＧの生成量の双方は、潅流速度を０．０５ｍｌ／分とした場合より０．００５ｍｌ／分とした場合に顕著に増大することが明らかに示されている。媒体内に放出されるＳ−ＧＡＧの量は、これら２つの潅流速度の間で顕著な差はない。従って、低い潅流速度を使用し剪断を回避することができる。
【０１６１】
灌流速度を周期的な又は一定の静水圧と組合せることにより、細胞外基質の生成が増大するか否かについても研究した。その結果を、図８に示す。
【０１６２】
図８は、トルイジンブルー染色法により測定した、灌流（０．００５ｍｌ／分）のみの場合（図８Ａ）と、周期的な静水圧２．８ＭＰａを０．０１５Ｈｚで加えた場合（図８Ｂ）と、一定の静水圧２．８ＭＰａを０．０１５Ｈｚ（図８Ｃ）で加えた場合とによりそれぞれ処理した基質における培養から１５日後の細胞外基質の形成を示す線図である。この図は、静水圧及び媒体灌流を用いることにより、細胞外基質の生成が増大されることを示している。
【０１６３】
低酸素圧の影響の評価
第３番目の研究は、軟骨細胞の増殖（ＤＮＡ含量）及び細胞外基質の生成（Ｓ−ＧＡＧ蓄積）に対する低酸素圧の影響を判断するために行ったものである。この結果を、表４及び図９Ａ及び９Ｂに示す。
【０１６４】
【表４】
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【０１６５】
全ての培養物は、３７℃、５％二酸化炭素において培養した。ＴＥＳＳ培養における媒体流速は、０．００５ｍｌ／分とした。組織学的分析のために各群から２つの細胞基質を採取した。
【０１６６】
表４に示すように、酸素圧を低くする（２％の酸素濃度）ことにより、Ｓ−ＧＡＧの生成量が、大気の酸素濃度に対応する高い酸素濃度（２０％）の場合の約１．７の高さになった。これらの結果を図９Ａのグラフに示す。
【０１６７】
図９Ａは、細胞構造体を２％の酸素濃度にさらし、周期的な静水圧（Ｃｙ−ＨＰ）を加えた後静置培養した場合の当該細胞構造体によるＳ−ＧＡＧの生成量を、２０％の酸素濃度にさらしＣｙ−ＨＰを行いその後静置培養した場合と比べたグラフである。既に表４に示したように、２０％の酸素濃度の場合と比べて２％の酸素濃度では、Ｓ−ＧＡＧの生成量が約７０％上昇した。
【０１６８】
図９Ｂは、Ｃｙ−ＨＰ培養で２％又は２０％の酸素濃度に曝した後静置培養を行った細胞構造体のＤＮＡ含量指数（初期＝１）を示す。２％の酸素濃度の場合と、２０％の酸素濃度の場合との間でＤＮＡ含量指数の顕著な相違はない。これらの結果は、酸素圧を低くする措置を、周期的な静水学的培養を行った後静置培養する処理と組合わせることにより、細胞構造体におけるＳ−ＧＡＧの生成が刺激されることを示している。但し、ＤＮＡ含量指数として表される細胞増殖は、酸素圧の変化により影響されない。
【０１６９】
すなわち、本発明のアルゴリズムは、低灌流速度及び低酸素圧を、所定の期間の静水圧の処理の後、外部負荷を加えない休止培養期間を設ける処理と組合わせることを含むものである。
【０１７０】
ｄ）種々の細胞に対するアルゴリズムの一般的な適用可能性
軟骨細胞に用いる上述のアルゴリズムは、異なる種類の細胞及び組織、例えば分裂可能な幹細胞、線維芽細胞、線維軟骨細胞、腱細胞及び骨芽細胞や、軟骨結合組織、線維軟骨、腱及び骨のような組織にも同様に適用できる。アルゴリズムの条件は、同じものでも異なるものでもよいが、通常は、上述した範囲内にある。
【０１７１】
ＩＩ．新軟骨組成物構造体
新軟骨組成物構造体は、細胞支持基質に組み込まれた生軟骨細胞を少なくとも含む多層三次元構造をしている。支持基質には、生きている軟骨細胞が播種されている。
【０１７２】
この構造体は、軟骨病変部位に埋め込む前に、管内及び生体外で形成する。構造体は、上記のアルゴリズムと称する方法及び条件を用いて形成するが、いかなる条件も、搬送方法又は用途に応じて所定の範囲内で変えることができる。
【０１７３】
実施例では、自己由来又は異種の軟骨細胞を、上述したように所定の媒体灌流速度と、周期的な又は一定の静水圧と、低減又は増大させた濃度の酸素及び二酸化炭素の双方又はいずれか一方とを使用して培養し、支持基質に播種し、新軟骨構造体へと処理する。新軟骨構造体は、軟骨病変部位内に埋め込まれて２層のシーラント層間に堆積され、その場所に残留して元からある軟骨細胞と一体化する。
【０１７４】
Ｉ．表層性軟骨層の形成方法
本発明の主要な観点は、上述した手順及び条件に従って形成した新軟骨、新軟骨構造体又は播種された支持基質を、軟骨病変部位内に埋め込み、生体適合性の接着シーラントによりこれを被覆すれば、これらの組み合わせにより、この病変部位上を完全に覆う表層性軟骨層が形成されるという知見にある。
【０１７５】
この方法は、支持基質を有する新軟骨及び新軟骨構造体であって、この支持基質に、本発明のアルゴリズムによる処理された増殖した軟骨細胞が埋め込まれたものを形成することに基づくものである。軟骨細胞は代表的には、温度可逆性で体温でゾルからゲルに容易に変化するコラーゲンゾル内に懸濁させる。これにより、新軟骨構造体を体外で準備し、ゾルの形態で病変部位内に埋め込むことができるようになる。このゾルは、病変部位内に埋め込まれて体温まで加温されるとゲルに転移する。
【０１７６】
新軟骨構造体を、病変部位に埋め込み生物学的に許容されうる接着性シーラント層により被覆する。任意には、病変部位内に第１シーラント層を導入しその底部にこれを沈着させる。この第１シーラントの機能は、血液由来物質、細胞及び細胞片等の外来成分の肋軟骨下細胞及び滑膜細胞が、病変腔内に移動してここに入り込み、病変腔中における新軟骨の一体化を阻害するのを防止することである。第２シーラント層は、構造体の表面に配置される。新軟骨構造体と共にこれら双方のシーラントが存在することにより、新軟骨が関節軟骨に一体化するようになる。
【０１７７】
この方法は、いくつかのモードで実施することができ、各モードは以下に概説する一般的なステップを変更可能な組合せとして有する。
【０１７８】
外傷若しくは損傷を受け又は病変若しくは老化した軟骨を機能的軟骨に回復させ修復する方法を実施する一般的なやり方は、以下のステップを行うものである。
【０１７９】
ａ）新軟骨、新軟骨構造体又は軟骨細胞支持基質の調製
このステップは、新軟骨、構造体を有する新軟骨、及び自己由来若しくは異種の軟骨細胞を内部に組み込んだ支持基質を調製する処理を伴う。上に挙げたこれら３つの物質については、セクションＩ.Ｂ〜Ｄに詳細に記載してある。
【０１８０】
ｂ）病変部位内への第１及び第２シーラントの沈着
このステップは、生物学的に許容されうる第１及び第２シーラントの第１及び第２層を軟骨病変部位に導入する処理を伴う。これら第１及び第２のシーラントは、同じものとしてもよいし、異なるものとしてもよい。第１底部層の使用は任意であり、第１底部層なしでも表層性軟骨層を形成しうることを理解されたい。
【０１８１】
具体的には、このステップでは、病変部位の底部に第１シーラントを沈着させ、病変部位上に第２シーラントを沈着させる。これら第１及び第２シーラントは、同じものとしてもよいし、異なるものとしてもよいが、これら第１及び第２シーラントの双方とも、その機能を果たすための所定の特性を有する必要がある。
【０１８２】
新軟骨を埋め込む前に病変腔内に沈着させる第１シーラントは、病変腔の統合性を保護するよう作用する。すなわち、この第１シーラントは、外来の物質から病変腔をするだけでなく、後に新軟骨を埋め込むことを予定して病変腔に空間保持ゲルを充填した場合に、この病変腔に線維軟骨が形成されるのを一時的に防止するようにも作用する。第２シーラントは、病変部位の外側の保護体として作用すると共に、２つのシーラント間に形成された病変腔内に埋め込まれた新軟骨構造体の保護体としても作用し、更に表層性軟骨層の形成開始剤としても機能する。
【０１８３】
１．第１シーラント
任意的に沈着させる第１シーラントは、導入される新軟骨構造体と、元からある軟骨との間の界面をなす。病変部位の底部に沈着させる第１シーラントは、肋軟骨下の空間に軟骨細胞が移動するのを防止するとともに、これから新軟骨構造体を保護しうるものでなければならない。さらに、第１シーラントは、血管及び不所望な細胞及び細胞片が新軟骨構造体に浸潤するのを防止し、線維軟骨の形成も防止する。
【０１８４】
２．第２シーラント
第２シーラントは、新軟骨構造体又は病変腔の外側の保護体として作用するもので、代表的には新軟骨を病変腔内に埋め込む前又は後に病変部位上の沈着させる。このようにして、第２シーラントは、細胞浸潤又は分解性の物質のような外部環境のいかなる不所望な影響からも病変腔の統合性を保護し、新軟骨を埋め込む前では空間保持ゲルを適所に封止するものとなる。第２シーラントは、２つのシーラント間に形成された病変腔内に埋め込まれた新軟骨構造体の保護体としても作用する。このように、第２シーラントは、第１シーラント上に新軟骨を埋め込んだ後に沈着させることができる。或いは、第２シーラントは、空間保持ゲル上に沈着させることもできる。第２のシーラントの第３の機能は、表層性軟骨層を形成するための開始剤又は基板としてのものである。本発明の開発中に実施した研究により、第２シーラントを軟骨病変部位上の沈着させると、元からある表層性軟骨層の延長として表層性軟骨層が成長することを確かめた。この表層性軟骨層は、病変腔を空間保持ゲル又は温度可逆性ゲルで充填した場合に特によく発達した。このことにより、このようなゲルが、このような表層性軟骨層を形成するための基板となりうるという結論が導かれる。
【０１８５】
３．第１及び第２のシーラント特性
本発明の第１又は第２シーラントは、以下の特性を有する必要がある。
シーラントは、生物学的に許容されうるもので、使いやすく、必要な接着特性及び凝集特性を具える必要がある。
シーラントは、生物学的に組織と適合性があり、非毒性で、過度に膨張するものでなく、過度に強固又は剛固でないものとする。その理由は、これによりシーラントが摩耗したり、組織部位からシーラントが突出するおそれがあるためである。また、シーラントは、新たな軟骨の形成に干渉したり、又は骨若しくは血管のような他の干渉性の若しくは不所望な組織の形成を促進するものであってはならず、許容されうる経路で再吸収又は分解されるものとするか、又は組織に組み込まれるものとする必要がある。
【０１８６】
シーラントは、３〜１５分以内、好ましくは３〜５分以内に、流動可能な液体又はペーストから負荷支持ゲルに急速にゲル化するものでなければならない。ゲル化時間がより長くなると、外科的な時間の制約と相容れないものとなる。さらに、複雑な使用手順では外科医に受け入れられないため、ゲルの全体的な使用モードを比較的簡単なものとする必要がある。
【０１８７】
シーラント製剤を組織に取り付け、このような組織を支持し封止するために、接着性の結合が必要になる。シーラントの最小剥離強度は、少なくとも３Ｎ／ｍ、好ましくは１０〜３０Ｎ／ｍとすべきである。さらに、シーラント自体が、内部断裂しないような充分な強度を有する必要がある。すなわち、抗張力として測定した場合に０．２ＭＰａ、好ましくは０．８〜１．０ＭＰａの充分な結合力を有する必要がある。或いは、引張せん断強さの測定値をシーラント製剤の結合強度を規定するのに割当てることができ、この場合この値は、少なくとも０．５Ｎ／ｃｍ2 、好ましくは１〜６Ｎ／ｃｍ2 とする必要がある。
【０１８８】
必要な特性を有するシーラントは、代表的には高分子である。このようなシーラント材料は、未硬化のすなわち液体の状態では、互いに架橋してない自由に流動可能な高分子鎖から構成されており、原液であるか、又は生理的に適合性の水性緩衝液に溶解されている。また、高分子鎖は側鎖又は利用可能基を有し、この側鎖又は利用可能基は、適切なトリガステップにより互いに結合する、すなわち高分子鎖を共に架橋させることができる。高分子鎖が分枝している場合、すなわち少なくとも１つのパートナー上に３本以上の腕を有する場合、このカップリング反応により、無限の分子量の網様構造すなわちゲルが形成される。
【０１８９】
形成されたゲルは、鎖間架橋数、架橋間の鎖長さ（分子量）、ゲル中の溶剤含有度、強化剤の存在及びその他の要素に応じた結合力を有する。通常は、接続点（架橋結合）間の鎖セグメントの分子量が１００〜５００ダルトンである網様構造体が、強固で丈夫であり、過度に膨張しない。鎖セグメントが５００〜２５００ダルトンである網様構造体は、水性溶媒中で著しく膨張し、機械的に脆弱になる。場合によっては、後者の種類のゲルは、所定の強化分子により強化することができる。例えば、メチルアルコール化コラーゲンは、１００００ダルトンの４腕のＰＥＧ（１つの鎖セグメントにつき２５００ダルトン）から形成されるゲルを強化する。
【０１９０】
ゲルの接着力は、静電気、疎水性又は共有結合の形成を含む１以上のメカニズムにより、隣接する生物組織への付着を可能にする。接着は、機械的連結によっとも行うことができ、この場合、未硬化の液体が組織の不規則部及び亀裂に流入し、その後ゲルが凝固して組織表面に機械的に取り付けられる。
【０１９１】
使用に際しては、ある種のトリガとなる作用が必要となる。例えば、この作用は、２種の反応性パートナの混合としてもよいし、ｐＨを上げる薬剤の追加としてもよいし、又は熱若しくは光エネルギーの付加としてもよい。
【０１９２】
シーラントは、ひとたび所定の場所に設置したら、隣接した組織に非毒性でなくてはならず、組織に組み込まれて永久に保持されてその場所で分解されるか、或いは自然に通常は加水分解又は酵素分解により除去されるものでなければならない。分解は、高分子鎖内において内部的に起こる、すなわち鎖架橋部の分解によって起こりうるもので、その後、高分子断片が生理学的な流体に溶解して拡散し取り除かれる。
【０１９３】
シーラントの他の特性は、組織環境中で起こる膨張の程度である。過度の膨張は望ましくないが、この理由は、過度の膨張により圧力及び応力が局所的に生じてしまうとともに、水を吸収した溶媒（この場合、溶媒は生理学的な流体である）の可塑化作用により、膨張したシーラントゲルの抗張力が失われてしまうためである。ゲルの膨張は、高分子鎖の疎水性により調整する。場合によっては、シーラントの基盤高分子の親水性を低下させるように誘導するのが望ましいこともある。例えば、シーラントを含むメチル化コラーゲンの機能の一つはおそらく、ゲルの膨張を制御することにあると考えられる。他の例では、ペンタエリトリトールテトラチオール及びポリエチレングリコールジアクリレートから形成されるシーラントを変性させて、ポリプロピレングリコールジアクリレートを含むようにし、ポリエチレングリコールよりも、親水性を低下させることができる。更に他の例では、ゼラチン及びデンプンを含むシーラントを、ゼラチン及びデンプンの双方に関してメチル化させて同様に親水性を低下させることができる。
【０１９４】
４．好適なシーラント及び不適なシーラント
本発明の目的に好適なシーラントは、ゼラチン及びジアルデヒドデンプンから調製されるシーラントであって、ゼラチン及びジアルデヒドデンプンの水溶液を混合させることにより自然に反応してゲル化する反応が引き起こされるものである。ゲルは、デンプン分子上アルデヒド基と、組織のタンパク質上のアミノ基とが反応することにより組織に結合し、比較的堅固で強固な材料の特徴とされる８×１０6 Ｐａの弾性率及び最大１００Ｎ／ｍの接着強度を有する。生理流体中で膨張した後では、この接着強度が低減してしまう。ゲル化されたシーラントは、ゼラチンのペプチド結合及びデンプンのグリコシド結合を切断する酵素により分解される。
【０１９５】
他の許容されうるシーラントは、ポリエチレングリコール及びポリ乳酸若しくはポリグリコライドの共重合体であって、更にアクリレート側鎖を有し何らかの活性化分子の存在下で光によりゲル化するものである。結合は、フリーラジカル化学により形成される。ゲルは、硬化前に組織の表面不整合部分に流入することで、機械的相互結合により組織に結合する。シーラントは、ポリエチレングリコール鎖間の結合の加水分解により組織から分解され、その後、生理液に溶解して排出される。
【０１９６】
過ヨウ素酸酸化ゼラチンから形成された許容されうるシーラントは、酸性ｐＨの液体のままである。その理由は、ゼラチン上の遊離アルデヒド基及び遊離アミノ基が反応しえないためである。ゲル化を引き起こすには、この酸化ゼラチンを、溶液がゲル化するｐＨまでｐＨを上昇させるバッファと混合し、溶液をゲル化させる。組織に対する結合は、ゼラチン上のアルデヒド基が組織上のアミノ基と反応することを通じてなされる。ゲル化の後、シーラントは、ゼラチンのペプチド結合を切断することにより酵素で分解することができる。
【０１９７】
４つの腕を有するペンタエリスリトールチオール及びポリエチレングリコールジアクリレートから製造される更に他のシーラントは、これら２種の原液（水性バッファに溶解させていない）を混合することで形成される。ゲル化速度は触媒の量によって制御される。触媒は、トリエタノールアミンのような４原子のアミノ化合物とすることができる。チオール及びアクリレート間で共有結合が形成され、チオエーテル結合が形成される。得られるゲルは、強固でほとんど膨張しないものとなる。このゲルの抗張力は２ＭＰａと高く、この値は、シアノアクリル酸の許容されうるＳｕｐｅｒｇｌｕｅと匹敵するものである。このようなゲルは、生体内でゆっくりと分解する。従って、ゲルを、カプセル化したり、又は組織に組み込んだりすることができる。
【０１９８】
本発明に用いるのに適した他の例のシーラントには、サクシニミジルエステル及びチオールにより誘導体化され、メチル化コラーゲンを加えた４つの腕を有するポリエチレングリコールがある。粉末形態の反応性ＰＥＧ試薬を、（予め水に溶解させてある）メチルアルコールと混合した粘性コラーゲン溶液と混合させる。その後、この粘性溶液を高ｐＨのバッファと混合させ、ゲル化反応を生ぜしめる。硬化したゲルの抗張力は、約０．３ＭＰａである。分解は、スクシンイミジルエステルＰＥＧに存在するエステル結合の加水分解により起こり、可溶ＰＥＧ鎖が放出され排出される。
【０１９９】
一般に、本出願の目的に有用なシーラントは接着性である、すなわち少なくとも１０Ｎ／ｍ、好ましくは１００Ｎ／ｍの剥離強度を有する。また、このようなシーラントは、０．２ＭＰａ〜３ＭＰａ、好ましくは０．８〜１．０ＭＰａの抗張力を有する必要がある。いわゆる「引張剪断」結合試験においては、０．５〜４乃至６Ｎ／ｃｍ2 の値が得られ、強力な生物接着剤の特徴を具えている。
【０２００】
このような特性は、天然及び合成の様々な材料により得られる。好適なシーラントの例には、１）ゼラチン及びジアルデヒドデンプン（国際公開パンフレットＷＯ９７／２９７１５（１９９７年８月２１日））や、２）４腕を有するペンタエリスリトールテトラチオール及びポリエチレングリコールジアクリレート（国際公開パンフレットＷＯ００／４４８０８（２０００年８月４日）の実施例１４）や、３）光重合可能なポリエチレングリコール共重合（ａ−ヒドロキシ酸）ジアクリレートマクロマー（米国特許第５４１００１６号（１９９５年４月２５日））や、４）過ヨウ素酸酸化ゼラチン（米国特許第５６１８５５１号（（１９９７年４月８日））や、５）マレイミジル、サクシニミジル、フタリミジル及び関連する活性基で誘導体化した２官能基性ポリエチレングリコール及び血清アルブミン（国際公開パンフレットＷＯ９６／０３１５９（１９９６年２月８日））や、６）サクシニミジルエステル及びチオールにより誘導体化され、メチル化コラーゲンを加えた４腕を有するＣＴ３と称されるポリエチレングリコールがある（米国特許第６３１２７２５号（（２００１年１１月６日）））がある。
【０２０１】
種々のシーラント製剤がこの他にも市販されており、又は文献に記載されている。しかし、これらの多くは、種々の理由から本発明を実施するのには好適でない。
【０２０２】
例えば、線維素シーラントは、軟骨の形成に干渉するため好ましくない。
シアノアクリル酸すなわちＳｕｐｅｒｇｌｕｅは極めて強固であるが、組織中で毒性反応を呈するおそれがある。
【０２０３】
種々の種類の強化されてないヒドロゲルは、代表的には０．０２ＭＰａ未満の抗張力しかなく、本発明の目的のために必要とされる接着性を維持するには弱過ぎる。その理由は、このようなゲルは、過度に膨張し、極めて裂け易く、極めて早く崩壊するためである。
【０２０４】
シーラントの機械的強度や分解パターンを決めるのが、ゼラチンやポリエチレングリコールといった、特定のタンパク質又は高分子鎖の有無ではないということは注目に値する。機械的強度及び分解パターンは、得られる硬化ゲルの架橋密度や、存在する分解可能な結合の種類や、ゲルの膨張及び内部結合に影響を与えうる修飾体の種類及び強化分子の有無により制御される。
【０２０５】
５．好適なシーラント
本発明の第１又は第２シーラントは、生物学的に許容されうるものでなければならず、代表的には接着性、結合性及び粘着性のいずれか又はこれらの任意の組み合わせを有する急速にゲル化する合成化合物である必要があり、代表的には、コラーゲン化合物、典型的にはアルキル化コラーゲンにより架橋されてあるのが好ましい誘導ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなヒドロゲルである。シーラントは少なくとも０．３ＭＰａの抗張力を有する必要がある。好適なシーラントの例は、テトラヒドロスクシンイミジル若しくはテトラチオール誘導ＰＥＧ又はこれらの組合わせであり、米国カリフォルニア州のパロアルトにあるCohesion Technologies社からＣｏＳｅａｌの登録商標名で市販されており、また文献J. Biomed Mater. Res (Appl. Biomater.)（2001年）58の第５４５〜５５５頁に記載されているものである。その他の好適な化合物は、本明細書に参考として組み込んだ米国特許第６３１２７２５号明細書に記載されている急速にゲル化する生物適合性高分子組成物である。加えて、シーラントは、急速に基質を形成する２部分以上の高分子組成物であって、少なくとも１つの化合物が、例えば、ポリアミノ酸、多糖類、ポリアルキレンオキサイド若しくはポリエチレングリコールといった高分子であり、これら２つの部分が共有結合により架橋されたものや、市販のコラーゲンにより架橋されたＰＥＧとすることができる。
【０２０６】
本発明のシーラントは一般に、組織、特にコラーゲンを有する組織と接触してから、急速にゲル化する。第２シーラントは、第１シーラントと同じものであっても、異なるものであってもよい。これら第１シーラント及び第２シーラントの双方とも、メチル化コラーゲンにより架橋されたポリエチレングリコールヒドロゲルであって、接着特性を有するものとするのが好ましい。
【０２０７】
ｃ）新軟骨構造体の埋め込み
本発明の方法における次のステップは、第２シーラント層下又は２層のシーラント層間に形成された病変腔内に新軟骨を埋め込む処理であって、この病変腔の内部を埋め込んだ新軟骨構造体により充填する処理を有する、或いは任意的に、当該病変腔内に、約５℃〜約２５℃の温度でゾルとして埋め込んだ空間保持温度可逆性ゲル（ＳＨＴＧ）により充填し、このＳＨＴＧを、病変腔内において体温でゾルからゲルに転換させ、ＳＨＴＧは、この形態で新軟骨構造体の導入のための空間を保持すると共に新軟骨を保護し、その存在により更に、軟骨病変部位を覆う新たな表層性軟骨層の形成を促進するようにする処理を有する。
【０２０８】
上述したステップには、以下のように種々の変形を加えることができるもので、新軟骨は、第１シーラントを沈着させた後で第２シーラントを沈着させる前に、病変腔内に埋め込むこともできるし、又は新軟骨を培養し処理する際に、まず第１及び第２のシーラントを沈着させて、空間保持温度可逆性ゲルで病変腔を一時的に充填してもよいし、又は第１シーラントなしで病変腔に沈着させて第２シーラントによりこれを被覆してもよい。
新軟骨は、自己由来又は異種のものとすることができ、セクションＩ．Ｂ．ａ〜ｃに前述したようにして調製する。
【０２０９】
ａ）病変腔からの空間保持又は温度可逆性ゲルの除去
新軟骨は、表層性軟骨層の形成前又は形成後に病変腔内に埋め込む。いかなる場合でも、第１シーラントを使用するならば、最初に第１シーラントを埋め込む。実施例においては、代表的には異種の新軟骨を含む新軟骨構造体を、第１シーラント層上に沈着させ、直ちに第２シーラント層により被覆することができる。このような場合、新軟骨は、表層性軟骨層が形成され、新軟骨が周囲の軟骨と一体化するまで病変腔内に残る。この際、新軟骨構造体に使用する材料に応じて、スポンジゲル又は温度可逆性ゲル化ヒドロゲルが病変腔に残り分解される。
【０２１０】
２つのシーラントを最初に沈着させる場合、任意であるが、病変腔内の空間を、空間保持温度可逆性ゲルのような高分子ゲルで充填する。このようなゲルは、新軟骨構造体が培養され処理されて埋め込む準備ができるまで病変腔に残しておく。この間、このような温度可逆性ゲルは完全に又は部分的に分解する場合もあるし、そうでない場合もあるが、ゲルがゾルとなる温度である約５℃の温度まで病変部位を冷却させることにより、及び例えばインジェクションにより病変腔から前記ゾルを取り除くことにより病変腔から除去することができる。同じ処理、すなわち新軟骨の固体ゲルを冷却させる処理を、新軟骨構造体を病変腔内に導入する際に逆にして用いることができ、この場合、ゾルを体温まで暖めてこのゾルを固体ゲルに転換させる。
【０２１１】
したがって、この処理の主たる前提は、空間保持ゲルの導入及び除去の双方又はいずれか一方或いは新軟骨構造体の導入は、組成物がゾル状態である冷たい温度で進行しておき、より暖かい温度で固体ゲルに転換させることにある。このようにして、新軟骨が一体化し表層性軟骨層が形成された後に、ゲルをゾルとして病変腔から取り除くことができる。
【０２１２】
ｅ．表層性軟骨層の生成
温度可逆性ゲルに懸濁させた新軟骨又は軟骨細胞を播種した支持基質を含む新軟骨構造体を、接着性の高分子第２シーラントと組合わせることにより、病変腔上に表層性軟骨層が成長し病変腔が完全に若しくはほぼ完全に封止されるようになる。
【０２１３】
変形例では、温度可逆性ゲルの表面化学特性に応じて、このような表面化学特性がこのような表層性軟骨層の成長に対して好適なものであれば、表層性軟骨層を、新軟骨構造体上に直接成長させることができる。
【０２１４】
通常は、生物学的に許容されうる第２シーラント、好ましくはメチルコラーゲンシーラントにより架橋したＰＥＧヒドロゲルを、病変腔に埋め込まれた新軟骨構造体上に、又は新軟骨構造体を病変腔内に埋め込む前に病変部位上の沈着させる。第２シーラントは、経時的に病変部位上に完全に成長する表層性軟骨層を形成するための開始剤として作用する。表層性軟骨層は、数週間又は数月以内に完全に病変部位を被覆し、新軟骨構造体の新軟骨又は支持基質内に播種した軟骨細胞が、線維軟骨をほとんど形成することなく、周囲の元からある軟骨と一体化しうるようにする。
【０２１５】
表層性軟骨層の形成は、軟骨の治癒並びに修理及び再生において非常に重要な観点となる。
【０２１６】
Ｉ．ブタの膝体重支持領域における生体内研究
本発明による方法を、生体内での研究において試験し確認した。この研究では、ブタのモデルで実施した３ヵ月の研究において表層性軟骨層の生成を確かめ、豚の新軟骨構造体の周囲の軟骨への一体化を評価した。
【０２１７】
本発明の方法による調製した新軟骨構造体を、ブタの膝に人工的に形成した病変部位に埋め込んだ。この研究の詳細な条件は、実施例８に記載する。この研究の結果は、サフラニンＯ染色法を用いた、人工的に形成した軟骨病変部位の組織学的評価を示す図１０、図１１及び図１２に示す。
【０２１８】
簡単に言うと、この研究は、全ての動物に対して右膝関節の開放関節切開術を行う処理を有する。軟骨の生検材料を得た。軟骨生検材料から軟骨細胞を分離して、前述したようにしてＴｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴＥＳＳ（登録商標））においてコラーゲン基質中で培養し、以降の埋め込み処理で使用する豚の新軟骨構造体を得た。
【０２１９】
右膝の内側大腿顆に欠陥を形成した。この欠陥は、対照群として使用するもので、新軟骨構造体は埋め込んでない。この空の欠陥部位を図１０Ａに示す。手術後、外部固定装置によりこの関節を約２週間固定した。右膝に関節切開術を行った３週後に、左膝に対して開放関節切開術を行い、この内側大腿顆に同じ欠陥を形成した。ブタの新軟骨を、この膝の欠陥中に埋め込み同様にして固定した。ブタの新軟骨埋め込み部位を図１０Ｂに示す。この図は、埋め込み処理の２週間後に表層性軟骨層の形成が開始されていることも示している。
【０２２０】
手術部位は、１月ごと関節鏡検査により観察した。続いて、ブタの新軟骨構造体を埋め込んでから３ヶ月後に動物を安楽死させ、組織学的評価のために関節を採取し調製した。埋め込み部位を調製し組織学的に検査した。図１１（関節切開術の４ヵ月後の対照群）及び図１２は、関節切開術を行い本発明により新軟骨を埋め込んで３ヵ月後の試験膝を比較して示す。これら図面は、対照群の膝では線維軟骨が形成が視認され、実験群（図１２Ａ〜Ｄ）では、ブタの新軟骨構造体を埋め込んだことにより、高密度の再生ガラス軟骨が生成されていることを示しており、また同じ実験群において、軟骨細胞の一体化（図１２Ｃ及び図１２Ｄ）及び表層性軟骨層の形成（図１２Ａ及び図１２Ｂ）が明らかに示されている。
【０２２１】
このように、図１１Ａ〜１１Ｃは、新軟骨構造体による治療を行わずに手術した場合の４ヵ月後の対照群の病変部位を示す。図１１Ａでは、欠陥部位内で線維軟骨が急増していることが顕著に分かる。
【０２２２】
図１１は、４ヵ月の時点でのｐｏｒｃｉｎｅ−ＮｅｏＣａｒｔ（商標名）のない対照群を示す。欠陥部位内で線維軟骨が急増していることが顕著に分かる。肋軟骨下の空間に滑膜組織が浸潤していることも分かる。
【０２２３】
一方で、図１２Ａ〜１２Ｄは、膝の重量支持領域にポスト埋め込み処理を行って３ヵ月後には、ブタの新軟骨が、高密度のガラス軟骨を生成し、軟骨下骨の界面において及び横方向にホスト軟骨と一体化されいることを示している。
【０２２４】
図１２は、埋め込み部位における再生ガラス様軟骨の形成を示す。図１２Ｂは、ブタの新軟骨と元からある軟骨との間で横方向に及び軟骨下骨において一体化が開始されていることを示す。
【０２２５】
ブタの新軟骨は、２層のシーラント間に新軟骨構造体を埋め込むことにより欠陥部位に導入した。埋め込み処理後３ヵ月の時点において、この欠陥部位上に新たな表層性軟骨層が形成されていることが、明らか視認される。
【０２２６】
図１２は、膝の重量支持領域内への埋め込み処理の３ヵ月後に、ｐｏｒｃｉｎｅ−ＮｅｏＣａｒｔ（商標名）が、高密度ガラス様軟骨を形成し、横方向において及び軟骨下骨との界面でホスト軟骨と一体化してることを示し裏付けるものである。
【０２２７】
これらの結果は、傷害若しくは損傷した又は病変若しくは老化した軟骨を、本発明のアルゴリズムにより調製した新軟骨を埋め込むことにより修復しうることを裏付けるものである。
【０２２８】
Ｖ．人間の骨関節炎軟骨
関節軟骨は、血管、神経、リンパの供給がない唯一の組織である。血管及びリンパの循環の欠如は、繊維性又は線維軟骨性の組織を形成することなく、関節軟骨を回復する能力が本来的に乏しい又はほぼ存在しない理由のひとつである。重度の傷害又は病変、例えば変形性関節症（ＯＡ）の後では、関節軟骨の固有の機械的機能は決して自然に回復しない。
【０２２９】
変形性関節症においては、個体の基質タンパク質の変性による基質の構造的一体性の破壊が、機械的特性を低減させ機能を損ねる。
【０２３０】
現在、高齢患者における、高度の変形性膝関節症に対する唯一利用可能な治療は、膝関節を完全に置き換えることである。しかし、若年及び中年の患者ではこの治療法は最適の治療法ではない。
【０２３１】
変形性関節症の治療に対する本発明の適性を評価するために、新軟骨スキャフォルド構造体を用いるＴＥＳＳ培養システムを含む本発明のアルゴリズムを使用するとともに、人間のＯＡ軟骨細胞、細胞増殖及びＯＡ軟骨細胞における細胞外基質の蓄積に対して本発明のアルゴリズム（静水圧及び媒体灌流）を使用した研究を行った。
これらの結果を、表５及び図１３〜１５に示す。
【０２３２】
【表５】
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【０２３３】
ＴＥＳＳプロセッサにおいて、媒体流速は０．００５ｍｌ／分とし、表に示すような静水圧とした。組織学的分析のために各群から２つの細胞基質を採取した。
【０２３４】
表５及び図１３Ａに示すように、媒体灌流を加えると共に周期的な静水圧に曝した細胞構造体におけるＳ−ＧＡＧの生成は、大気圧に曝した（対照群）ものより著しく大きかった。特に、周期的な静水圧を１４日間に亘り使用しその後７日間に亘り静的大気圧を用いたＣｙ−ＨＰ＃２において、Ｓ−ＧＡＧの生成量（μｇ／細胞構造体）が、対照群より著しく増大した（１４４％）。
【０２３５】
図１３Ｂは、ＤＮＡに関して表５に示される結果に対応するＤＮＡ含量指数を示しており、同様にＤＮＡが増大していることが示されている。一定の静水圧に曝した新軟骨構造体を使用した細胞構造体のＤＮＡ含量指数が、初期レベルと比べて増大していることが明らかに示されている。媒体灌流させて一定の静水圧に曝した細胞構造体のＤＮＡレベルは、初期ＤＮＡレベル指数と比べて１４２％まで著しく増大した。
【０２３６】
図１４Ａ〜１４Ｅは、サフラニンＯによる細胞構造体の組織学的評価を示す。図１４Ａは、０日（初期）におけるＳ−ＧＡＧの蓄積を示す。図１４Ｂは、大気圧にさらした細胞構造体（対照群）の２１日目でのＳ−ＧＡＧの蓄積を示す。図１４Ｃは、周期的な静水圧（Ｃｙ−ＨＰ＃１）に７日間曝した後大気圧に１４日間さらした細胞構造体の２１日目におけるＳ−ＧＡＧの蓄積を示す。図１４Ｄは、周期的な静水圧（Ｃｙ−ＨＰ＃２）に１４日間曝した後大気圧に７日間さらした細胞構造体の２１日目におけるＳ−ＧＡＧの蓄積を示す。図１４Ｅは、一定の静水圧（Ｃｏｎｓｔａｎｔ−ＨＰ）に７日間曝した後大気圧に１４日間さらした細胞構造体の２１日目におけるＳ−ＧＡＧの蓄積を示す。周期的な静水圧に曝した細胞構造体の双方（７日間及び１４日間）においてＳ−ＧＡＧの蓄積がより大きくなることが、図１４Ｃ及び図１４Ｄに示される顕微鏡画像の増加した密度から明らかに分かる。
【０２３７】
これらの結果は、媒体灌流とともに静水圧を利用することにより、人間のＯＡ軟骨細胞を播種したスキャフォルド新軟骨構造体において、細胞増殖及び新軟骨の表現活性の双方、すなわち軟骨の細胞外基質生成が促進されることを証明するものである。この事実は、ＴＥＳＳ培養システム及び静水圧を媒体灌流と組合わせて用いる本発明のアルゴリズムが、人間のＯＡ軟骨細胞を再生させ、このＯＡ軟骨を健康なガラス軟骨に変換することを示している。
【０２３８】
本発明による傷害若しくは損傷を受け又は病変若しくは老化した軟骨を治療する方法波、急性の傷害による微小な病変部位を治療するのに適しているだけでなく、変形性関節症その他の関節変性病変による大きな病変部位を治療したり、病変ＯＡ軟骨を健康なガラス軟骨に変換するのにも適している。
【０２３９】
この方法は、５つの新しい特徴、すなわち、自己由来の軟骨細胞から発生される新軟骨のためのキャリア支持基質として生物学的に許容されうる温度可逆性高分子ゲルを使用することと、本発明の方法により自己由来の新軟骨を発生させることと、自己由来の新軟骨を生成する際に、一時的に空間保持手段として生物学的に許容されうる温度可逆性ゲルを使用することと、病変部位に１又は２層の接着性シーラントを沈着させることと、シーラントの沈着後にこのように形成された病変腔内に新軟骨を埋め込み、病変部位を被覆し内部に埋め込まれた新軟骨の一体性を保護する表層性軟骨層を形成させることと、を含んでいる。
【０２４０】
この方法は、一般的に、
ａ）関節軟骨病変部位を清拭すると共に、清拭中に非骨関節炎のガラス軟骨を少量（５０〜４０００ｍｇ）を採取するるステップと、
ｂ）前述した手順により新軟骨構造体を形成し処理するステップと、
ｃ）１又は２層のシーラント層を沈着させることにより新軟骨構造体を埋め込むための病変部位を準備するステップであって、前述した多種の変型例を用いて、（任意の）第１シーラント層を病変部位の底部に沈着させ、第２シーラント層を病変部位の上部に沈着させ、頂部シーラント層の下若しくはこれら２層のシーラント層の間に形成された病変腔内に新軟骨構造体を埋め込むか、又は新軟骨構造体を調製する際に一時的に病変腔の一体性を保持するために２層のシーラント層間の病変腔内に空間保持温度可逆性高分子ゲルを沈着させる当該ステップと、
ｄ）２層のシーラント層間に形成された前記病変腔内に新軟骨構造体を埋め込んみ、新軟骨を周囲の元からある傷のない軟骨と一体化させ、且つ表層性軟骨層を形成させるステップと、
ｅ）任意的に、新軟骨の埋め込み前に病変腔から空間保持高分子ゲルを取り除くステップと
を有する。
【０２４１】
他の治療方法においては、増殖及び分裂した軟骨細胞を、代表的には好適な温度可逆性ゲル化ヒドロゲル溶液として、関節病変部位に直接堆積することができる。
【０２４２】
本発明の方法には複数の利点がある。第一に、この方法は非常に融通がきくもので、いずれの変型例も所定の損傷若しくは損害又は老化若しくは病変の治療に有利に利用することができる。
【０２４３】
この方法は、自己由来の新軟骨が調製されるまで、２層のシーラント層間の空間を維持する代替的手段を設けることにより自己由来の新軟骨の生成を可能にする。この方法は、より高密度の新軟骨の生成並びに軟骨細胞及び細胞外基質の３次元的増殖を可能にする。
【０２４４】
第２頂部シーラント層を沈着させ表層性軟骨層を形成させることにより、滑膜層の代替物が構成され、病変部位における自己由来の新軟骨の成長及び組み込みを補助する重要な代謝因子を保護して含有し提供すると共に病変部位上に成長する健康な関節軟骨の外面が得られる。
【０２４５】
第１底部シーラント層の沈着により、手術中に清掃後の病変部位の一体性が保護され、肋軟骨下及び滑膜細胞の移動が防止され、これにより、細胞生成物が、新軟骨から健康なガラス軟骨を形成するための環境を作り出すとともに、線維軟骨の形成をも防止する。
【０２４６】
この方法は更に、空間保持ゲル又は温度可逆性高分子ゲルを、単独で又は懸濁処理新軟骨と共に、５℃〜２５℃の温度でゾルとして病変部位内に沈着させることもできる。温度可逆性ゲルの選択が重要となる場合もある。なぜなら、ある種のＴＲＧＨは、第２のシーラントを適用させる必要く、表層性軟骨層の成長の促進剤として作用しうるためである。
【０２４７】
この方法によれば更に、ヒアルロン酸を通常は約５〜約５０％、好ましくは２０％（ｖ／ｖ）添加することで、温度可逆性ヒドロゲルを強化することができ、このようなヒアルロン酸はゲルの基質形成特性のエンハンサとして作用し、一般には滑液空間において、特には病変部位腔中で水分補給因子として作用する。
【０２４８】
さらに、ゲルは、ヒアルロン酸の緩放出ユニットとして作用し、病変腔内での水和期間を著しく長くすると共に、表層性軟骨層形成のための基板としても作用する。また、このゲルは、３７℃で形成された固体ゲルがゾルに転換されるように病変部位を冷却することにより、必要に応じて、取り除くこともできるし、或いはインジェクションその他の方法により取り除くこともできる。
【０２４９】
軟骨の治療のためには、本発明に従って、患者を、病変部位に埋め込まれる調製された自己由来若しくは異種の新軟骨又は新軟骨構造体により治療する。この新軟骨又は新軟骨構造体は、２〜３ヵ月の間病変部位に残るが、通常は、いかなる他の措置も必要としない。その理由は、この３ヵ月の間に、新軟骨は、元からある軟骨と完全に一体化し、表層性軟骨層で被覆された完全に機能する軟骨となるためである。この表層性軟骨層は、最終的には、完全な関節の滑膜層と同種の表面に成長する。
【０２５０】
最終的に、病変した骨関節炎軟骨は、本発明のアルゴリズムにより処理することで、再生ガラス様軟骨と完全に置換することができる。
【０２５１】
このアルゴリズム及び埋め込みプロトコルの双方又はいずれか一方は、本発明の範囲内において可能な又は上述したいかなる変型例とすることもできる。したがって、治療プロトコル（軟骨生成のアルゴリズム）のいかなる及び全ての変型例とも本発明の範囲内に入ることを意図されたものである。
【０２５２】
実施例１
ソース組織からの軟骨細胞の分離
この実施例は、ブタの軟骨から軟骨細胞を分離するのに使用する手法を説明する。
軟骨細胞は、６ヵ月のブタの後肢から無菌条件下で採取した軟骨から酵素処理により分離した。露出した脛骨及び気管頭部から大腿骨を分離した。外科刃を用いて気管から軟骨細条を取り除いた。
【０２５３】
軟骨は、細かく切り刻んで、１％のペニシリンストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）の１：１混合物であるＤＭＥＭ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）中の０．１５％Ｉ型コラゲナーゼ溶液で消化させ、３７℃で１８時間穏やかに攪拌した。軟骨細胞を収集し、遠心分離により１５００回転／分で５分間にわたり２回リンスした。軟骨細胞は、１％のペニシリンストレプトマイシン及び１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２中にて再懸濁させた。
これら軟骨細胞を、３７℃で約５日間にわたり増殖させた。
【０２５４】
実施例２
人間の新軟骨構造体の生成
この実施例は、人間に使用する新軟骨の生成条件を説明するものである。
患者に対し、同側の膝からの健康な軟骨小片（２００〜５００ｍｇ）の関節鏡生検を行う。生検は、大腿顆の非重量支持部位から、又は患者にとって最も適当であると判断される大腿切痕から行う。生検サンプルは、無菌性、非細胞毒性及び非発熱性の標本容器内に配置し、これをパッケージして研究室に運び込む。
【０２５５】
研究室において、この生検サンプルを判定基準に関して検討し、その後軟骨細胞の分離及び増殖領域に搬送する。生検材料搬送輸送バッファからのサンプルを、無菌性及びマイコプラズマに関して試験する。増殖した軟骨細胞を、カリフォルニア州のパロアルトにあるＣｏｈｅｓｉｏｎ社から市販されているＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）のゲル化可能コラーゲン溶液中に懸濁させる。日本の高研社から市販されている予め形成されたコラーゲンスポンジ（２２×２２ｍｍ平方及び厚さ２〜４ｍｍ、但し厚さは患者の軟骨の厚さに応じたものとする）、又は、本発明による得られるハニカム基質を、得られた軟骨細胞懸濁液中に配置し、軟骨細胞／コラーゲン懸濁液をこの基質に吸収させる。
【０２５６】
軟骨細胞を有する得られた基質を３７℃まで暖め、ＶＩＴＲＯＧＥＮをゲル化させ、軟骨細胞を支持基質中で空間的に固定する。その後、軟骨細胞を有する支持基質を、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴＥＳＳ（登録商標））培養ユニット内に配置する。生検サンプルの除去から軟骨細胞を有する培養基質をＴＥＳＳ培養ユニットに配置するまでの代表的な細胞増殖期間は、１０〜４０日である。ＴＥＳＳ培養ユニット内において、約３０日〜約１時間に亘り周期的な又は一定の静水圧を使用し、軟骨細胞が成長を開始して、これら軟骨細胞による軟骨生成プログラムが発現されるようにする。
【０２５７】
なお発育中の新たな軟骨を、一定圧の休止培養段階に移す。新軟骨生成プロセスでは、休止培養段階において最小１０日間の期間を要する。この１０日の最小期間後に、新軟骨（以下新軟骨構造体と称する）を、最終検査しパッケージして埋め込み処理のためにクリニックに戻す。リリース時における無菌性、エンドトキシン及びマイコプラズマ汚染に関する検査では、微生物及びマイコプラズマ汚染については陰性（ネガティブ）を示し、エンドトキシンについては≦０．５ＥＵ／ｍｌである必要がある。
【０２５８】
実施例３
支持基質の調製
この実施例は、ＴＥＳＳ基質とも称する細胞支持基質の形成を説明する。
ｐＨ３．０に保持した１％水性アテロコラーゲン溶液（ＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標））３００グラムを１０×２０ｃｍのトレイに注ぐ。次に、このトレイを５リットルの容器内に設置する。次に、３％アンモニア水溶液３０ｍｌをいれた５０ｍｌのふたの開いた容器を、上述した１％水性アテロコラーゲン溶液３００グラムが入った５リットル容器内に設置する。そして、アンモニア及びアテロコラーゲンの入ったふたの開いたトレイをいれたこの５リットルの容器を密封して、室温に１２時間そのままにしておく。この間に、アンモニア水をいれたふたの開いた容器からアンモニアガスが放出され、このガスは密封した５リットルの容器に閉じこめられた水性アテロコラーゲンと反応して水性アテロコラーゲン溶液をゲル化する。
【０２５９】
コラーゲンゲルを水で一晩洗浄し、次に凍結乾燥してスポンジ状基質を作る。この凍結乾燥した基質はその後、正方形に裁断して、殺菌して、無菌ラップ下に保存する。
【０２６０】
或いは又、支持基質を以下のように調製することもできる。
約４ｍｍ〜１０ｍｍの厚みを有する多孔性コラーゲン基質を、湿度を調整したチャンバを用いて、相対湿度８０％、温度２５℃で６０分間水和する。コラーゲン材料を、２枚のテフロン（登録商標）シート間で０．２ｍｍ未満の厚さに圧縮する。この圧縮したコラーゲン材料を次に、０．５％ホルムアルデヒド、１％炭酸水素ナトリウム溶液中で、ｐＨ８で６０分間架橋させる。この架橋させた膜を完全に水ですすぎ、約４８時間凍結乾燥する。高密度のコラーゲンバリアは、絡み合って多層構造体となっている高密度充填線維の内側埋め込体を有する。
【０２６１】
他の例では、統合化層を、空気乾燥させるとシート状になるコラーゲンを主成分とする分散体又は溶液から調製する。乾燥処理は、約４〜４０℃の温度で、約７〜４８時間行う。
【０２６２】
実施例４
ＴＥＳＳ基質への細胞の播種
この実施例は、ＴＥＳＳ基質に細胞を播種するのに使用する手法を説明する。
分離した軟骨細胞を、標準のインキュベータ内で３７℃で５日間にわたり培養した。その後、軟骨細胞を、トリプシン処理により収集した。
【０２６３】
約１９μｌの容積の基質につき、１８μｌのＶＩＴＲＯＧＥＮ溶液中に１５００００の細胞を有する細胞懸濁液を播種し、１群あたり９つの基質を用意した。播種する基質（直径４ｍｍ、厚さ１．５ｍｍのコラーゲンスポンジ）は、容積を増大させてスケールアップすることができ、この場合、上述した約１μｌの細胞懸濁液を１μｌの基質中に播種する。対照群の基質は、３７℃のインキュベータにおいて培養し、実験群の基質は、ＴＥＳＳにおいて培養した。
【０２６４】
代案として、分離した軟骨細胞を、標準のインキュベータ内で３７Ｃで５日間に亘り培養した。その後、細胞を、トリプシン処理により収集した。
約１９μｌの容積の基質につき、１８μｌのＶＩＴＲＯＧＥＮ溶液中に３００００の細胞を有する細胞懸濁液を播種し、１群あたり８つの基質を用意した。
【０２６５】
実施例５
周期的な静水圧の影響
この実施例は、軟骨細胞を播種した支持基質を生体外形成する際の周期的な静水圧の影響を決定するのに使用する手法を説明するものである。
ブタ骨関節軟骨細胞（ｓＡＣｓ）を、Ｉ型コラゲナーゼにより軟骨から酵素的に分離した。これらの細胞を、上述したようにコラーゲン（ＶＩＴＲＯＧＥＮ）中に懸濁させ、細胞支持基質のハニカムスポンジ素子に加えた。支持基質中に播種した細胞を、３７℃で、５％二酸化炭素及び２０％酸素中で培養した。これらの細胞基質を、２４時間後にＴＥＳＳ（商標名）プロセッサに搬送し、前述したようにして媒体灌流（０．０５ｍｌ／分）を用いると共に周期的な又は一定の０．５又は３．０ＭＰａの静水圧を加えて７日間に亘り培養し、その後１２日又は１４日の休止期間を設けた。基質に播種された軟骨細胞を有する対照群は、５％二酸化炭素及び２０％若しくは２％酸素中で、大気圧において３７℃で、１８又は２１日間に亘り培養した。
【０２６６】
培養期間の終了時点（１８日又は２１日）において、基質を、生化学的及び組織学的分析のために採取した。生化学的分析については、硫酸グリコサミノグリカン（Ｓ-ＧＡＧ）の生成量を、変性ジメチルメチレンブルー（ＤＭＢ）微量検定法を使用して測定した。
組織学的分析のために各群からの２つの基質を採取した。
【０２６７】
実施例６
コラーゲンスポンジにおける軟骨細胞の細胞外基質の蓄積に対する媒体流速の影響
この実施例は、コラーゲンスポンジに播種された軟骨細胞による細胞外基質の生成及び蓄積に対する媒体流速の影響を決定するために使用する条件を説明するものである。
【０２６８】
軟骨細胞の分離
ブタの脚を、現地の畜殺場から得た。虐殺後４〜６時間以内に、ブタ後肢の滑車から無菌条件下で軟骨を採取した。この軟骨を、細かく切り刻んで、１％のペニシリンストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２の０．１５％Ｉ型コラゲナーゼ溶液中で３７℃で１８時間に亘りで消化させた。分離したブタの関節軟骨細胞（ｓＡＣｓ）を収集してリンスし、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１％のＰ／Ｓを追加したＤＭＥＭ／Ｆ−１２中に再懸濁させた。その後、このｓＡＣｓを、３７℃で５日間に亘り増殖させた。
【０２６９】
コラーゲンスポンジへの細胞の播種
このｓＡＣｓを、トリプシンＥＤＴＡにより収集し、細胞生存力をトリパンブルー除外法で測定した。３０００００のｓＡＣｓを、中和した３０μｌの０．２５％コラーゲン溶液（ＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）、カリフォルニア州のパロアルトにあるＣｏｈｅｓｉｏｎ社）中に懸濁させた。この懸濁液を、日本の高研社から市販されている直径４ｍｍ及び厚さ２ｍｍのコラーゲンスポンジに吸収させた。播種されたスポンジを、３７℃で１時間に亘り予培養してコラーゲンをゲル化し、続いて培地において５％二酸化炭素中で３７℃で培養した。
【０２７０】
Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴＥＳＳ（商標名））での培養
培養後、播種したスポンジを、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴＥＳＳ（商標名））プロセッサに移しそこで培養処理を行った。媒体潅流速度の影響を評価するために、スポンジを、５μｌ／分又は５０μｌ／分の媒体灌流にさらした。０〜０．５ＭＰＡの周期的な静水圧（Ｃｙ−ＨＰ）を、０．５Ｈｚで６日間に亘り加えた。幾つかのスポンジは、大気圧の一定条件下で灌流なしで合計１８日間に亘り３７℃で培養した。細胞を播種してから２４時間後に採取したスポンジ（０日）を初期対照群として使用した。
【０２７１】
組織学的及び生化学的分析
培養してから６日後及び１８日後に細胞構造体を採取した。組織学的評価のために、４％パラホルムアルデヒドに固定したパラフィン切片を、サフラニンＯ（Ｓａｆ−０）及びＩＩ型コラーゲン抗体により染色した。
【０２７２】
生化学的な分析のために、播種したスポンジをパパインで６０℃で１８時間消化させ、ＤＮＡ含有量をヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３２５８色素法を用いて測定した。硫酸グリコサミノグリカン（Ｓ−ＧＡＧ）の蓄積を、変性ジメチルメチレンブルー（ＤＭＢ）微量検定法を用いて測定した。
【０２７３】
実施例７
生化学的及び組織学的検定法
この実施例は、生化学的及び組織学的研究（ＤＭＢ分析）のために使用した検定法を説明するものである。
【０２７４】
生化学的（ＤＭＢ）検定法
培養物終了後、各群から６つの基質を生化学分析のために使用した。
基質を、マイクロ遠心管へ移し３００μｌのパパイン（０．１Ｍリン酸ナトリウム、５ｍＭの二ナトリウムＥＤＴＡ及び５ｍＭのＬ−システイン−ＨＣｌ中に１２５μｇ／ｍｌ）中で６０℃で１８時間に亘り消化させた。基質におけるＳ−ＧＡＧの生成量を、文献Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２年）９：第２４７〜２４８頁の記載に従い、サメのコンドロイチン硫酸を対照として、変性ジメチルメチレンブルー（ＤＭＢ）微量検定法を用いて測定した。
【０２７５】
ＤＮＡ含有量を、文献Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８年）１７４：第１６８〜１７６頁の記載に従って、ヘキスト３３２５染色法にて測定した。
【０２７６】
組織学的分析
各群からの残りの基質を４％パラホルムアルデヒドに固定した。基質を処理してパラフィンに包埋した。１０μｍの切片をミクロトーム上に切り出し、サフラニン−Ｏ（Ｓａｆ−Ｏ）にて染色した。
【０２７７】
実施例８  ブタモデルでのブタ新軟骨の一体性の評価
この実施例は、ブタモデルにおけるブタ新軟骨の一体性を評価するために行った研究の手法及び結果を説明するものである。
【０２７８】
全ての動物について右膝の関節を切開し、軟骨の生検材料を得た。
軟骨細胞を、軟骨生検材料から分離し、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴＥＳＳ（商標名））のコラーゲン基質中で培養し、以降の埋め込み処理に用いるｐｏｒｃｉｎｅ−Ｎｅｏｃａｒｔ（商標名）を得た。
【０２７９】
ブタの右膝の大腿骨内側顆に欠損を作成した。対照群におけるこの欠損部位には、ｐｏｒｃｉｎｅ−Ｎｅｏｃａｒｔ（商標名）は埋め込まなかった。手術後、関節を外固定インプラントにて２週間固定した。右膝の関節を切開してから２週間後に、左膝の関節を切開し、この左膝の大腿骨内側顆に欠損を作成した。左膝の欠損部位にはｐｏｒｃｉｎｅ−Ｎｅｏｃａｒｔ（商標名）を埋め込み、右膝のときと同様に固定した。手術部位は、埋め込み措置又は欠損作成後２週間の時点で関節鏡検査にて観察し、その後は１月ごとに観察した。ｐｏｒｃｉｎｅ−Ｎｅｏｃａｒｔ（商標名）を埋め込んでから約３ヶ月の時点で、動物を安楽死させ関節を採取し、組織学的検査のために調製した。埋め込み部位を調製して、組織学的検査を行った。
【０２８０】
これらの結果を、図１０〜１２に示す。図１０は、関節鏡検査の結果を示す。空の欠陥は、図１０Ａに示されている。ｐｏｒｃｉｎｅ−ＮｅｏＣａｒｔ（商標名）の埋め込み部位は、図１０Ｂに示されており、なお明らかな吸収性縫合糸及びｐｏｒｃｉｎｅ−ＮｅｏＣａｒｔ上に成長した表層性軟骨層が示されている。
【０２８１】
実施例９
生体内、生体外又は管内でブタの新軟骨を成長させるためのプロトコル
自己由来のブタの軟骨細胞を、細胞支持基質に播種し、周期的な静水圧の下において５％二酸化炭素中で３７℃で培養する。周期的な静水圧は、０．５Ｈｚにおいて０．５ＭＰａ又は３．０ＭＰａである。この周期的な圧力を加える期間は、約６日であり、その後、３７℃に維持したインキュベータ内で大気圧で１２日間に亘り休止期間を設ける。この休止期間終了後、生化学的及び組織学的分析のために基質を採取した。
【０２８２】
他のプロトコル、すなわち生体内及び管内での細胞成長に関するアルゴリズムでは、分離した元の位置の軟骨に静水圧を加えるか、約１〜８時間に亘り静水圧を加えた後、約１６〜２３時間に亘り回復期間を設ける。
【０２８３】
実施例１０
人間の軟骨細胞の再生
この実施例は、人間の軟骨細胞を再生させるのに使用する手法を説明するものである。
骨関節炎（ＯＡ）の患者（４０歳）からの軟骨細胞を、３７℃で単層培地において１８日間に亘り増殖させ、ＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）中に懸濁させた（３０００００細胞／30μｌ）。細胞懸濁液を、支持基質、通常はコラーゲンハニカムスポンジ（日本の高研社製の直径４ｍｍ及び厚さ２ｍｍのもの）に吸収させた。細胞構造体は、ＴＥＳＳ（商標名）プロセッサ中で、１０％のＦＢＳ及び１％のＩＴＳ（Ｓｉｇｍａ社製のインシュリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム）を追加した培地において、二酸化炭素を５％とし及び酸素を２０％として、７日間又は１４日間に亘り３７℃で、０．５ＭＰａ周期的な静水圧（Ｃｙ-ＨＰ）で、又は０．５ＭＰａの一定の静水圧（一定のＨＰ）で培養した。その後、３７℃としたＣＯ2 インキュベータ内で７日間又は１４日間に亘り大気圧で培養した。対照群を含んでいる残りの細胞構造体を、５％二酸化炭素及び２０％酸素中において大気圧で３７℃で２１日間に亘り培養した。
【０２８４】
培養を始める前に、幾つかの細胞構造体を採取し、初期状態として生化学的及び組織学的分析を行った。培養期間終了後、生化学的及び組織学的分析のために細胞構造体を採取した。変性ジメチルメチレンブルー（ＤＭＢ）マイクロ検定法を使用して、硫酸グリコサミノグリカンの生成量を測定した。変性ヘキストダイＤＮＡ検定法を使用して細胞の増殖を測定した。新組織の形成は、サフラニンＯ染色法により分析した。
【図面の簡単な説明】
【０２８５】
【図１】図１は、新軟骨を有する構造体を示す。  図１Ａは、ゾル／ゲルから形成したコラーゲンスポンジの線図であって、当該スポンジ内での軟骨細胞の分布を示している。  図１Ｂは、鉗子に保持した、直径が４ｍｍで厚さが１．５ｍｍの実際の新軟骨構造体を示す顕微鏡画像である。この新軟骨構造体の播種密度は、２５μｌのコラーゲン溶液あたり３０００００個の軟骨細胞（１２００００００細胞／ｍｌ）である。
【図２】図２Ａは、静水圧培養システムを示す線図である。図２Ｂは、ＴＥＳＳ培養プロセサユニットを示す。
【図３】図３Ａは、静的大気圧（対照群）又は周期的な静水圧（試験群）にさらした細胞構造体におけるＳ−ＧＡＧの蓄積を示すグラフである。図３Ｂは、静水圧にさらした１８日におけるパラフィン切片上のＳ−ＧＡＧに関するサフラニン−Ｏ染色を示す顕微鏡画像である。図３Ｃは、６日に亘り静水圧にさらした後１２日間の周期的な静水圧を加えたパラフィン切片上のＳ−ＧＡＧに関するサフラニン−Ｏ染色を示す顕微鏡画像である。
【図４】図４は、Ｓ−ＧＡＧの生成（図４Ａ）及びＤＮＡの生成（図４Ｂ）に対する周期的な及び一定の静水圧の影響を示すグラフである。
【図５Ａ】図５Ａは、以下の持続的な培養条件、すなわち静置培養（対照群）、媒体灌流（ＣＯＭＰａ）、媒体灌流（対照）と組合わせた周期的な静水圧（Ｃｙ−ＨＰ）及び媒体灌流（Ｃｏｎｓｔａｎｔ−ＨＰ）と組合わせた一定の静水圧の条件で培養した場合の細胞構造体におけるＳ−ＧＡＧの蓄積を示すグラフである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、静状態（対照）、媒体灌流（ＣＯＭＰａ）のみ、周期的な静水圧（Ｃｙ−ＨＰ）及び一定の静水圧（Ｃｏｎｓｔａｎｔ−ＨＰ）に曝した細胞構造体の６日及び１８日におけるＤＮＡ含量を示するグラフである。
【図６】図６Ａは、静的大気圧にさらした細胞構造体の１８日におけるパラフィン切片上のＳ−ＧＡＧに関するサフラニン−Ｏ染色を示す顕微鏡画像である。図６Ｂは、６日に亘り周期的な静水圧にさらした後１２日間の静圧を加えた細胞構造体のパラフィン切片上のＳ−ＧＡＧに関するサフラニン−Ｏ染色を示す顕微鏡画像である。図６Ｃは、静的大気圧に曝した細胞構造体の６日におけるパラフィン切片上のＩＩ型コラーゲンの免疫組織化学を示す顕微鏡画像である。図６Ｄは、６日に亘り周期的な静水圧にさらした細胞構造体のパラフィン切片上のＩＩ型コラーゲンの免疫組織化学を示す顕微鏡画像である。
【図７Ａ】図７Ａは、細胞構造体を０．００５ｍｌ／分又は０．０５ｍｌ／分の速度の媒体潅流に曝したことによる細胞の増殖（ＤＮＡ含量）に対する潅流速度の影響を示すグラフである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、Ｓ−ＧＡＧの生成に対する潅流速度の影響を示すグラフである。
【図８】図８は、トルイジンブルー染色法により組織学的に測定した、媒地に対して、灌流を加えた場合（図８Ａ）と、周期的な静水圧を加えた場合（図８Ｂ）と、一定の静水圧を加えた場合（図８Ｃ）とにおける１５日後の蓄積状態を示す線図である。
【図９】図９は、Ｓ−ＧＡＧの生成に対する低酸素圧の影響（図９Ａ）と、細胞増殖に対する低酸素圧の影響（図９Ｂ）とを示すグラフである。
【図１０Ａ】図１０Ａは、対照群である空の欠損部位の形成後２週間の時点における、当該欠損部位を示す関節鏡画像である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ブタの新軟骨培養物（Ｐｏｒｃｉｎｅ-ＮｅｏＣａｒｔ（商標名）を埋め込んだ後２週間における当該埋め込み部位を示す関節鏡画像である。
【図１１】図１１は、ブタの新軟骨による治療を行っていない対照群の欠損部位を示しており、４ヵ月後の時点でこの欠損部位内に線維軟骨が増殖していることが明らかに認められる。図１１Ａは、線維軟骨が形成された部位を有する軟骨下骨と比較して欠陥部位を示す。図１１Ｂは、欠陥部位での滑膜及び滑液の移動状態を示す線図である。図１１Ｃは、欠陥部位及び線維軟骨の形成を示す。
【図１２】図１２Ａ及び図１２Ｂは、３ヵ月後にホスト軟骨内の病変部位へブタの新軟骨が一体化する状態を示す。図１２Ｃは、ブタの新軟骨を埋め込んだ部位における再生ガラス様軟骨を示す。図１２Ｄは、ブタの新軟骨及びホスト軟骨が横方向で及び軟骨下骨おいて一体化していることを示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、媒体灌流を加えると共に大気圧（対照群）及び周期的な静水圧に曝した細胞構造体におけるＳ−ＧＡＧの生成を示すグラフである。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、媒体灌流を加えると共に周期的な及び一定の静水圧に曝した細胞構造体におけるＤＮＡ含量を示すグラフである。
【図１４】図１４は、サフラニンＯによる細胞構造体の組織学的評価を示す。図１４Ａは、０日（初期）におけるＳ−ＧＡＧの蓄積を示す。図１４Ｂは、大気圧にさらした細胞構造体（対照群）の２１日目でのＳ−ＧＡＧの蓄積を示す。図１４Ｃは、周期的な静水圧（Ｃｙ−ＨＰ＃１）に７日間曝した後大気圧に１４日間さらした細胞構造体の２１日目におけるＳ−ＧＡＧの蓄積を示す。図１４Ｄは、周期的な静水圧（Ｃｙ−ＨＰ＃２）に１４日間曝した後大気圧に７日間さらした細胞構造体の２１日目におけるＳ−ＧＡＧの蓄積を示す。図１４Ｅは、一定の静水圧（Ｃｏｎｓｔａｎｔ−ＨＰ）に７日間曝した後大気圧に１４日間さらした細胞構造体の２１日目におけるＳ−ＧＡＧの蓄積を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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