(57)【要約】  本発明は、機能性クロライドチャンネルについてアッセイするための非放射性方法を提供する。該方法はクロライドチャンネルにより伝導されるヨウ化物の量を比色分析で検出する。それらはハイスループットアッセイもしくはスクリーニングに容易に適応することができる。
2008504027.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）クロライドチャンネルをヨウ化物と接触させる段階；および
ｂ）クロライドチャンネルにより伝導される（ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ）ヨウ化物の量を比色分析で検出する段階
を含んでなるクロライドチャンネル伝導性（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）の測定方法。
【請求項２】
該方法がクロライドチャンネルを有する細胞もしくは膜小胞へのヨウ化物の流入を測定し、接触させる段階がヨウ化物を含んでなる溶液中でクロライドチャンネルを有する細胞もしくは膜小胞をインキュベーションすることおよび溶液から細胞もしくは膜小胞を分離することを含んでなり；そして比色検出段階が比色検出方法を用いて細胞もしくは膜小胞内のヨウ化物の量を測定することを含んでなる請求項１の方法。
【請求項３】
クロライドチャンネルを有する細胞もしくは膜小胞が患者から得られる請求項２の方法。
【請求項４】
該方法がクロライドチャンネルを有するヨウ化物負荷細胞もしくは膜小胞からのヨウ化物の流出を測定し、接触させる段階がヨウ素を実質的に含まない溶液中でクロライドチャンネルを有するヨウ化物負荷細胞もしくは膜小胞をインキュベーションすることおよび溶液から細胞もしくは膜小胞を分離することを含んでなり；そして比色検出段階が比色検出方法を用いて細胞もしくは膜小胞内のまたは溶液中のヨウ化物の量を測定することを含んでなる請求項１の方法。
【請求項５】
クロライドチャンネルを有する細胞もしくは膜小胞が患者から得られる請求項４の方法。
【請求項６】
比色検出段階が細胞もしくは膜小胞内のヨウ化物の量に対する溶液中のヨウ化物の量の比率を決定する段階をさらに含んでなる請求項４の方法。
【請求項７】
クロライドチャンネルにより伝導されるヨウ化物の量を比色分析で検出する段階の前にクロライドチャンネルを開くかもしくは活性化する段階をさらに含んでなる請求項１の方法。
【請求項８】
該クロライドチャンネルが電圧ゲート性（ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ）クロライドチャンネル、リガンドゲート性（ｌｉｇａｎｄ−ｇａｔｅｄ）クロライドチャンネル、膨張活性化（ｓｗｅｌｌｉｎｇ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）クロライドチャンネル、カルシウム活性化クロライドチャンネルおよびＣＬＩＣクロライドチャンネルよりなる群から選択される請求項１の方法。
【請求項９】
該クロライドチャンネルがγ−アミノ酪酸もしくはグリシンの受容体である請求項８の方法。
【請求項１０】
該クロライドチャンネルが嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）である請求項８の方法。
【請求項１１】
比色検出方法がサンデル・コルトフ（Ｓａｎｄｅｌｌ  ａｎｄ  Ｋｏｌｔｈｏｆｆ）反応：
【化１】
2008504027.tif 000004
に基づく請求項１の方法。
【請求項１２】
比色検出方法が基質澱粉を伴う請求項１の方法。
【請求項１３】
比色検出方法が基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを伴う請求項１の方法。
【請求項１４】
比色検出方法が基質チオシアン酸塩を伴う請求項１の方法。
【請求項１５】
ａ）クロライドチャンネルを試験化合物およびヨウ化物と接触させる段階；
ｂ）クロライドチャンネルにより伝導されるヨウ化物の量を比色分析で検出する段階；および
ｃ）段階ｂ）において検出されるヨウ化物の量をクロライドチャンネルを試験化合物と接触させないコントロールのヨウ化物の量と比較する段階
を含んでなるクロライドチャンネルの伝導性における試験化合物の効果を決定する方法。
【請求項１６】
該方法がクロライドチャンネルを有する細胞もしくは膜小胞へのヨウ化物の流入を測定し、接触させる段階が最初に：ヨウ化物を含有する溶液中でクロライドチャンネルを有する細胞もしくは膜小胞をインキュベーションし、次に細胞もしくは膜小胞を試験化合物と接触させ、そして溶液から細胞もしくは膜小胞を分離する段階を含んでなり；そして比色検出段階が比色検出方法を用いて細胞もしくは膜小胞内のヨウ化物の量を測定する段階を含んでなる請求項１５の方法。
【請求項１７】
該方法がクロライドチャンネルを含んでなるヨウ化物負荷細胞もしくはヨウ化物負荷膜小胞からのヨウ化物の流出を測定し、接触させる段階がヨウ素を実質的に含まない溶液中でクロライドチャンネルを有するヨウ化物負荷細胞もしくは膜小胞をインキュベーションすることおよび細胞もしくは膜小胞を試験化合物と接触させることおよび溶液から細胞もしくは膜小胞を分離することを含んでなり；そして検出段階が比色検出方法を用いて細胞もしくは膜小胞内のまたは溶液中のヨウ化物の量を測定することを含んでなる請求項１５の方法。
【請求項１８】
細胞もしくは膜小胞内のヨウ化物の量に対する溶液中のヨウ化物の量の比率を決定する段階をさらに含んでなる請求項１７の方法。
【請求項１９】
比色検出段階の前にクロライドチャンネルを開くかもしくは活性化する段階をさらに含んでなる請求項１５の方法。
【請求項２０】
該クロライドチャンネルが電圧ゲート性クロライドチャンネル、リガンドゲート性クロライドチャンネル、膨張活性化クロライドチャンネル、カルシウム活性化クロライドチャンネルおよびＣＬＩＣクロライドチャンネルよりなる群から選択される請求項１５の方法。
【請求項２１】
該クロライドチャンネルがγ−アミノ酪酸もしくはグリシンの受容体である請求項２０の方法。
【請求項２２】
該クロライドチャンネルが嚢胞性線維症膜貫通調節因子である請求項２０の方法。
【請求項２３】
比色検出方法がサンデル・コルトフ反応：
【化２】
2008504027.tif 000005
に基づく請求項１５の方法。
【請求項２４】
比色検出方法が基質澱粉を伴う請求項１５の方法。
【請求項２５】
比色検出方法が基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを伴う請求項１５の方法。
【請求項２６】
比色検出方法が基質チオシアン酸塩を伴う請求項１５の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願へのクロスリファレンス】
【０００１】
本願は、２００４年６月２３日に出願された出願第６０／５８２，３３８号に優先権を請求する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、クロライドチャンネル伝導性（ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）を決定する方法に関する。さらに特に、本発明はクロライドチャンネル伝導性をアッセイするための比色検出方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
クロライドチャンネルは、イオン恒常性、膜電位調節、細胞容積調節、経上皮輸送、および電気興奮性の調節が包含されるがこれらに限定されるものではない、重要な生理的役割を果たす。それらは、嚢胞性線維症およびバーター症候群における経上皮輸送の障害、先天性ミオトニーにおける増加した筋興奮性、デント病における低下したエンドソーム酸性化およびエンドサイトーシス障害、ならびに破骨細胞および大理石骨病および失明における細胞外酸性化障害のような多種多様な疾患におけるそれらの関連性のために、製薬産業にとって重要性を増している標的クラスである。クロライドイオンチャンネルの異なるファミリーは異なる構造を有するが、それらは共通の機能要素を共有する。例えば、該チャンネルは全て、それらの電気化学的勾配に沿ってクロライドイオン（Ｃｌ−）の受動拡散を可能にする生体膜におけるタンパク性細孔である。これらのチャンネルはまた、Ｂｒ−、Ｉ−、ＮＯ３−、ＨＣＯ３−、ＳＣＮ−のような他の負に荷電したイオンおよびいくつかの小さな有機酸を伝導することもできる。主として、クロライドは生体系における最も豊富な陰イオンであるという理由で、それらはクロライドチャンネルと命名される。
【０００４】
クロライドチャンネルの３つの確立した遺伝子ファミリーがある：ＣＬＣ、ＣＦＴＲ、ならびにリガンド依存性ＧＡＢＡおよびグリシン受容体（非特許文献１）。ＣＬＩＣもしくはＣＬＣＡのような他の遺伝子ファミリーもまた、クロライドチャンネルをコードすると報告されたが、あまり特性化されていない（非特許文献１）。ＣｌＣファミリーは、これまでに確立されたクロライドチャンネルの全てのクラスのうち最も遍在的に発現される。ＣＬＣ遺伝子は、原核生物および真核生物の両方に存在する。多数のＣＬＣチャンネルは電位依存性であり、そしてＩ−よりＣｌ−により大きい伝導性を示す。上記のもののような疾患を引き起こすのは、ＣＬＣ遺伝子における突然変異である。嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）、ＣＦＴＲは電圧非依存性（ｖｏｌｔａｇｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）陰イオンチャンネルであり、それは効率のよい活性のために加水分解可能なヌクレオシド三リン酸の存在を必要とする。ＣＦＴＲはＩ−よりＣｌ−により大きい陰イオン透過性を有し、そして嚢胞性線維症と関連する。ＧＡＢＡおよびグリシン受容体は、リガンドゲート性（ｌｉｇａｎｄ−ｇａｔｅｄ）クロライドチャンネルである。ＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）およびグリシンは、哺乳類中枢神経系（ＣＮＳ）における素早い抑制性神経伝達のための主要な神経伝達物質である。それらはそれらの受容体に結合し、そして固有の陰イオンチャンネルを開き、電気化学的駆動力によりＣｌ−流入もしくは流出をもたらす。ＧＡＢＡおよびグリシン受容体は両方とも、Ｃｌ−よりＩ−により大きい透過性を示す。それらは、抗癲癇薬、抗不安薬、鎮静剤、睡眠薬、筋弛緩剤および麻酔薬を包含する、広範囲の臨床的に重要な薬剤の標的である。
【０００５】
クロライドチャンネル活性を調節するために新薬を同定することが必要とされるが、クロライドチャンネルの容易に利用可能な高親和性リガンドはない。対照的に、陽イオンチ
ャンネルは、動物性毒素に由来することが多い非常に特異的なチャンネル遮断薬を有し、スクリーニングアッセイの開発をより簡単にしている。クロライドチャンネル遮断薬はむしろ非特異的であり、そしてマイクロモル〜ミリモルさえの範囲の有効遮断濃度で低い効能を有する。
【０００６】
クロライドチャンネルのモジュレーターを同定するための既存の技術は、スループット、生理的関連性、感度およびロバスト性間の妥協である。現在最もよく知られたアッセイは、おそらくパッチクランプ技術である。パッチクランプ技術は、膜の小パッチを横切るもしくは全細胞の原形質膜を横切る電位差を制御する。該技術は、イオンチャンネルを通してその電圧で膜を横切るイオンによって運ばれる電流を直接評価する。この技術は、単一細胞もしくは単一チャンネル（膜の小パッチ内）レベルでイオンチャンネル機能の質の高いそして生理的に関連するデータを与える。しかし、パッチクランプ実験を設定することは、振動および電気的雑音からの干渉を系が受けにくくするために高度に訓練された人材を必要とする複雑なプロセスである。熟練パッチクランパーのスループットは、せいぜい、１日当たり１０〜３０データ点である（非特許文献２）。そのような低いスループットおよび高い労働コストは、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）目的のために許容しうるには程遠い。いくつかの企業はパッチクランププロセスを自動化しようと試みているが、実験設定の現在の複雑さおよび再現性は、それをＨＴＳ用途に不適当にする。
【０００７】
フラックスアッセイに基づく技術は、イオンチャンネル薬剤スクリーニング用に完全に自動化されたハイスループット形態において現在利用可能である。フラックスアッセイは、クロライドチャンネルの機能研究に使用されている（概説、非特許文献３を参照）。細胞内クロライドイオン（Ｃｌ−）濃度は高いので、クロライドイオンのマイクロモル以下の濃度の変化を比色分析で測定することによりクロライドチャンネル伝導性の変化を検出することは難しい。従って、放射性標識された３６Ｃｌ−もしくは１２５Ｉ−イオン流入が、クロライドチャンネル伝導性を測定するために使用されている。放射性標識された３６Ｃｌ−もしくは１２５Ｉ−、またはＣｌ−感受性蛍光指示薬はまた、クロライドチャンネルからのイオン流出を測定するためにも使用されている。
【０００８】
ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）形態に容易に適応可能なクロライドチャンネルの高感度の非放射性定量アッセイ方法が必要とされる。
【非特許文献１】Ｊｅｎｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．８２：５０３−５６８
【非特許文献２】Ｘｕ，ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，６：１２７８−１２８８７
【非特許文献３】Ｓｉｋａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（２００３），１（５），７０９−７１７
【発明の開示】
【０００９】
［発明の要約］
本発明は、機能性クロライドチャンネルについてアッセイするための比色分析法を提供する。該方法は、ハイスループットアッセイもしくはスクリーニングに容易に適応することができる。
【００１０】
本発明の他の態様、特徴および利点は、本発明の詳細な記述およびその好ましい態様ならびに添付の請求項を包含する以下の開示から明らかである。
［発明の詳細な記述およびその好ましい態様］
以下に引用する全ての公開は、引用することにより本明細書に組み込まれる。他に定義されない限り、本明細書において用いる全ての技術および科学用語は、本発明が関係する
当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００１１】
本明細書において用いる場合、「含んでなる」、「含有する」、「包含する」および「有する」という用語は、それらのオープンな（ｏｐｅｎ）限定されない意味で用いられる。
【００１２】
本発明は、トレーサーとして非放射性ヨウ化物を用いてクロライドチャンネル伝導性を研究する比色検出方法を提供する。大部分のクロライドチャンネルはヨウ化物を伝導し、そしてヨウ化物の細胞内濃度は非常に低い。従って、本発明のクロライドチャンネルの伝導性を測定する方法は：ａ）クロライドチャンネルをヨウ化物と接触させる段階；およびｂ）クロライドチャンネルにより伝導されるヨウ化物の量を比色分析で検出する段階を含んでなる。
【００１３】
本明細書において用いる場合、「比色検出方法」（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）は、そのサンプルにおけるヨウ素濃度の指示薬として試験サンプルにおける着色した薬剤を検出する段階を含んでなる方法をさす。信頼性のあるそして高感度の「比色検出方法」は、食品もしくは尿サンプルのような生体サンプルにおけるヨウ素含有量の調査において使用されている（例えば、Ｙａｐｉｎｇ  Ｚ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．１９９６  Ｄｅｃ；４２（１２）：２０２１−７を参照）。本発明の方法は、試験サンプルにおけるヨウ素の量を決定するために使用されているかもしくはこれから開発される様々な「比色検出方法」を利用することができる。そのような比色検出方法は、ヨウ素（Ｉ）またはヨウ化物（Ｉ−）もしくはヨウ素酸（ＩＯ３−）のようなそのイオンの触媒効果に基づくことが多い。
【００１４】
１つの好ましい態様において、試験サンプルにおけるヨウ化物の量を決定するために用いることができる「比色検出方法」は、サンデル・コルトフ（Ｓａｎｄｅｌ  ａｎｄ  Ｋｏｌｔｈｏｆｆ）の方法（ＳＫ法）（Ｓａｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９３７，Ｍｉｋｒｏｃｈｅｍ．Ａｃｔａ，１：９）に由来する。ＳＫ法は、サンデル・コルトフ反応：
【００１５】
【化１】
2008504027.tif 000003
【００１６】
に基づく。ＳＫ法は、亜ヒ酸による無色のＣｅ３＋への黄色に着色したセリウムイオン（Ｃｅ４＋）の還元へのヨウ化物（Ｉ−）の触媒効果を利用する。試験サンプルに存在するヨウ化物が多いほど、ＳＫ反応は速くなり、そして黄色に着色したＣｅ４＋はより速く消失する。試験サンプルにおけるＣｅ４＋の量は、試験サンプルを含んでなる液体により吸収される光の量として定義される、光の吸光度により決定することができる。特に、吸光度は、液体サンプルを通して既定波長で光を発し、そして液体サンプルを通過する光の量を測定することにより、比色計もしくは分光光度計を用いて測定することができる。例えば、試験サンプルにおけるＣｅ４＋の量は、約４０５ｎｍの波長での光の吸光度（ＯＤ４０５）により測定することができる。ＳＫ反応に基づく比色検出方法の例は、実証の目的のために以下に提供される。ＳＫ検出系は高感度で且つ信頼性があり、そして世界保健機関（ＷＨＯ）により国際基準ヨウ素検出方法として提示されている。
【００１７】
別の態様において、試験サンプルにおけるヨウ化物の量を決定するために用いることができる「比色検出方法」は、ヨウ化物転化試験である。この試験では、最初にヨウ化物をヨウ素に転化し、そして次にヨウ素澱粉試験を用いてヨウ素の量を決定する（Ｗａｄｅ，１９２５，Ｉｎｄ．Ｅｎｇ．Ｃｈｅｍ．，１７：４７０）。ヨウ化物は、それを塩素のような任意の適当な酸化剤と反応させることにより遊離のヨウ素に酸化することができる。
遊離のヨウ素は、澱粉と青色に着色した複合体を形成することができる。反応混合物に存在するヨウ化物が多いほど、青色に着色した澱粉ヨウ素複合体がより多く形成される。反応混合物における澱粉ヨウ素複合体の量は、例えば、４８０ｎｍの波長で（ＯＤ４８０）、水（上）相の光の吸光度により決定することができる（Ｋｏｚｕｔｓｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１５８：９３−９８）。
【００１８】
試験サンプルにおけるヨウ化物の量を決定するために用いることができる「比色検出方法」の別の例は、Ｓｖｅｉｋｉｎａの方法に由来する（Ｍｏｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ａｎａｌｙｓｔ，１０５：３４４−３５２；およびＫｅｎｎｅｔｈ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｐｏｌｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１０：３５−３８）。この方法では、ヨウ化物は、鉄（ＩＩＩ）イオンの添加により生成されるチオシアン酸鉄（ＩＩＩ）の橙色の付随する減少を伴って、亜硝酸塩によるチオシアン酸塩の破壊を触媒する。サンプルに存在するヨウ化物が多いほど、より少ないチオシアン酸鉄（ＩＩＩ）が生成される。チオシアン酸鉄（ＩＩＩ）の量は、例えば約４３０ｎｍの波長で、光の吸光度により決定することができる。
【００１９】
試験サンプルにおけるヨウ化物の量を決定するために用いることができる「比色検出方法」のさらに別の例は、着色生成物を生成せしめる、過酢酸／Ｈ２Ｏ２での３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）のヨウ化物触媒による酸化に基づく（Ｒｅｎｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ，８３（３）：１００７−１２）。第一の着色生成物は、親ジアミンとジアミン酸化生成物の青色の電荷移動錯体である。この種は、ＴＭＢラジカルカチオンと迅速平衡状態で存在する。高いヨウ化物濃度で、試験サンプルは青色になり、緑色段階を通過し、そして最終的に黄色になる。試験サンプルにおけるヨウ化物の量は、例えば約６５５ｎｍの波長で、光の吸光度により定量的に測定することができる。
【００２０】
比色検出方法は、任意のクロライドチャンネルに関連して利用することができる。そのようなクロライドチャンネルには、電圧ゲート性（ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ）クロライドチャンネル、リガンドゲート性（ｌｉｇａｎｄ−ｇａｔｅｄ）クロライドチャンネル、膨張活性化（ｓｗｅｌｌｉｎｇ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）クロライドチャンネル、カルシウム活性化クロライドチャンネルおよびＣＬＩＣクロライドチャンネルが包含されるがこれらに限定されるものではない。本発明の方法を用いてアッセイすることができる好ましいクロライドチャンネルは、ＣＬＣ、ＣＦＴＲ、ならびにリガンド依存性ＧＡＢＡおよびグリシン受容体である。
【００２１】
クロライドチャンネルは陰イオンの受動拡散を可能にするので、それらの活性化は、陰イオンの電気化学ポテンシャルにより、陰イオンの受動流入もしくは流出をもたらすことができる。本明細書において用いる場合、クロライドチャンネルを通した系への陰イオンの「流入」（ｉｎｆｌｕｘ）は、系の表面上に組み込まれたクロライドチャンネルを介して系の外側の陰イオンが系に入ってくるプロセスをさす。細胞もしくは膜小胞への陰イオンの「流入」は、細胞膜もしくは膜小胞の膜に位置するクロライドチャンネルを介して細胞もしくは膜小胞の外側の陰イオンが細胞もしくは膜小胞に入ってくるプロセスをさす。本明細書において用いる場合、クロライドチャンネルを通した系からの陰イオンの「流出」（ｅｆｆｌｕｘ）は、系の表面上に組み込まれたクロライドチャンネルを介して系の内側の陰イオンが系から出でくるプロセスをさす。細胞もしくは膜小胞からの陰イオンの「流出」は、細胞膜もしくは膜小胞の膜に位置するクロライドチャンネルを介して細胞もしくは膜小胞の内側の陰イオンが細胞もしくは膜小胞から出てくるプロセスをさす。例えば、活性化の際に、ＣＦＴＲもしくはＧＡＢＡ受容体は細胞からの陰イオンの流出を媒介することができ、そしてＧＡＢＡ受容体はまた細胞への陰イオンの流入を媒介することもできる。
【００２２】
本発明の方法は、クロライドチャンネルを含んでなる系へのヨウ化物の流入ならびにクロライドチャンネルを含んでなる系からのヨウ化物の流出を測定するために用いることができる。本明細書において用いる場合、「クロライドチャンネルを含んでなる系」は、成分の表面上にリン脂質二重層膜、および膜に組み込まれたクロライドチャンネルを有する任意の構造的に別個の成分をさす。
【００２３】
１つの好ましい態様において、「クロライドチャンネルを含んでなる系」は、クロライドチャンネルを発現する細胞であることができる。細胞は、細菌細胞もしくは酵母細胞のような微生物細胞、植物細胞、またはヒト、マウス、ラットもしくは他の哺乳類に由来する細胞のような動物細胞であることができる。細胞は、興味のあるクロライドチャンネルを内因的に発現する自然宿主細胞であることができる。例えば、多くの上皮細胞はＣＦＴＲチャンネルの自然宿主であることができ、そしてニューロンはＧＡＢＡ受容体の自然宿主であることができる。好ましくは、興味のあるクロライドチャンネルは、アッセイ条件下で活性である唯一のもしくは主要なタイプのクロライドチャンネルである。興味のあるチャンネルを特異的に活性化するために下記の方法を用いることに加えて、細胞における所望されないクロライドチャンネルを不活性化する方法は、当業者に既知である。例えば、細胞における所望されないクロライドチャンネルは、チャンネルの遮断薬もしくはインヒビターのような特定の化学物質に細胞を供することにより一時的に不活性化することができる。もしくは、所望されないクロライドチャンネルは、遺伝子ノックアウトもしくはアンチセンス技術のような遺伝子操作により永久的に不活性化することができる。
【００２４】
クロライドチャンネルを発現する細胞はまた、組み換え宿主細胞であることもできる。興味のあるクロライドチャンネルを発現することができる核酸分子で細胞をトランスフェクションすることができる。クロライドチャンネル遺伝子は、例えば、細胞に安定にもしくは一時的にトランスフェクションされるベクターから発現することができる。遺伝子発現に適当なベクターは当該技術分野において既知であり、そして多くのものは市販されている。
【００２５】
別の好ましい態様において、「クロライドチャンネルを含んでなる系」は、膜にクロライドチャンネルを含んでなる膜小胞であることができる。膜小胞は、クロライドチャンネルを含んでなる組織膜、原形質膜、細胞膜もしくは内部細胞小器官膜のような生体膜から調製することができる。例えば、ＣＦＴＲは様々な上皮の頂端膜において、最も顕著には腸、気道、分泌腺、胆管および精巣上体のものにおいて発現される。そのような頂端膜の膜小胞は、ＣＦＴＲを研究するために用いることができる。生体膜小胞の単離および調製の方法は、当業者に既知である。例えば、そのような方法には、組織もしくは細胞の機械的もしくは酵素的破壊段階、他の成分から膜を分離するための遠心分離段階、および適当なバッファー溶液に膜小胞を再懸濁する段階を含むことができる。
【００２６】
膜小胞はまた、人工膜から調製することもできる。精製されたクロライドチャンネルタンパク質を脂質二重層に再構成して人工膜小胞を形成することができる（Ｃｈｅｎ  ｅｔ
ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０８：２３７−２５０を参照）。これらの膜小胞はわずかなタンパク質しか含有することができず、そして少なくとも１つのそしておそらく１つのタイプのみのクロライドチャンネルタンパク質を含有するように製造し、それによりクロライドチャンネルの単一タイプを含有する小胞を反映するようにデータの焦点を合わせることができる。人工膜小胞の調製の方法は当業者に既知である。
【００２７】
膜小胞はさらに、細胞小器官の膜に存在するクロライドチャンネルを有する細胞内小器官であることができる。本発明の方法において使用することができる細胞内小器官の例には、ミトコンドリア、ゴルジ装置、リソソームおよびエンドソームが包含されるがこれら
に限定されるものではない。細胞内小器官を単離するかもしくは濃縮する方法は当業者に既知である。
【００２８】
ある態様において、細胞溶解および／もしくは剪断はアッセイ中にそれほど問題ではないので、興味のあるクロライドチャンネルを含んでなる膜小胞はより容易な形態を提供することができる。しかしながら、別の態様において、例えば、細胞膜調製方法が興味のあるチャンネルを破壊するかもしくは不活性化する場合、興味のあるクロライドチャンネルを発現する細胞が好ましい。
【００２９】
１つの態様において、クロライドチャンネルの伝導性は、クロライドチャンネルを有する細胞もしくは膜小胞へのヨウ化物流入の量により測定される。そのような方法は：ａ）ヨウ素を含んでなる溶液中でクロライドチャンネルを有する細胞もしくは膜小胞をインキュベーションし、溶液から細胞もしくは膜小胞を分離する段階；およびｂ）比色検出方法を用いて細胞もしくは膜小胞内のヨウ化物の量を測定する段階を含んでなる。細胞もしくは膜小胞内の内容物は、溶解もしくは物理的破壊により遊離させるかもしくは抽出することができる。内容物内のヨウ化物の量は、上記の比色検出方法のいずれかにより測定することができる。細胞もしくは膜小胞内に存在するヨウ化物が多いほど、陰イオンに対するクロライドチャンネルの伝導性は強くなる。
【００３０】
別の態様において、クロライドチャンネルの伝導性は、クロライドチャンネルを有するヨウ化物負荷細胞もしくは膜小胞からのヨウ化物流出の量により測定される。そのような方法は：ａ）ヨウ素を実質的に含まない溶液中でクロライドチャンネルを有するヨウ化物負荷細胞もしくは膜小胞をインキュベーションする段階；ｂ）溶液から細胞もしくは膜小胞を分離する段階；およびｃ）比色検出方法を用いて溶液中のヨウ化物の量を測定する段階を含んでなる。
【００３１】
「ヨウ化物負荷細胞もしくは膜小胞」は、方法の段階（ａ）の前にヨウ化物を含んでなる溶液とインキュベーションした細胞もしくは膜小胞である。１つの態様において、「ヨウ化物負荷細胞もしくは膜小胞」は、ヨウ化物とインキュベーションした後にヨウ化物を含まない溶液もしくはヨウ素を実質的に含まない溶液で洗浄される。以下の実施例３は、「ヨウ化物負荷細胞もしくは膜小胞」をどのようにして調製するかについての方法を説明する。
【００３２】
「ヨウ素を実質的に含まない溶液」は、ヨウ素またはヨウ化物もしくはヨウ化物のようなそのイオンを全く含有しないかもしくは非常にわずかな量を含有する溶液をさす。例えば、「ヨウ素を実質的に含まない溶液」は、約１ｎＭ未満のヨウ素もしくはそのイオンを有することができる。より多くのヨウ化物が溶液に存在するほど、陰イオンに対するクロライドチャンネルの伝導性は強くなる。
【００３３】
ある態様において、ヨウ化物流出を測定する方法は、細胞内のヨウ化物の量を測定する段階のみを含んでなる。細胞内のヨウ化物濃度が低いほど、陰イオンに対するクロライドチャンネルの伝導性は強くなる。
【００３４】
別の態様において、ヨウ化物流出を測定する方法は、細胞内のヨウ化物の量に対する溶液中のヨウ化物の量の比率を決定する段階をさらに含んでなる。該比率は、クロライドチャンネルの機能の指標として用いることができる。比率が高いほど、陰イオンに対するクロライドチャンネルの伝導性は強くなる。
【００３５】
本発明の方法は、ヨウ化物濃度の測定の前に興味のあるクロライドチャンネルを活性化するかもしくは開く段階をさらに含んでなることができる。本明細書において用いる場合
、クロライドチャンネルを「活性化するかもしくは開くこと」には、クロライドチャンネルによる増加したイオン伝導をもたらす手段が包含される。チャンネルのタイプにより、クロライドチャンネルは異なる手段によって活性化するかもしくは開くことができる。多数のＣＬＣチャンネルのようなあるクロライドチャンネルは電圧ゲート性である。従って、ＣＬＣチャンネルの伝導性を調節する（開く／閉じる）ために電気パルスのような電気的シグナルを用いることができる。あるクロライドチャンネルはリガンンドにより調節され、従って、小分子を加えることで活性化することができる。例えば、ＣＦＴＲは効率のよい活性にｃＡＭＰの存在を必要とし；天然のＣａ２＋活性化Ｃｌ−チャンネルは活性化に細胞内Ｃａ２＋の存在を必要とし；ＧＡＢＡ受容体は活性化にＧＡＢＡを必要とし；グリシン受容体は活性化にグリシンを必要とするなど。さらに、あるクロライドチャンネルは細胞膨張、すなわち、細胞容積の増加により活性化することができる。
【００３６】
本発明の１つの一般的な態様は、機能性クロライドチャンネルの存在について細胞もしくは膜調製物を分析するために本発明の方法を使用できることである。特に、本発明の方法は、患者から採取した臨床サンプル由来の細胞もしくは膜調製物を分析することにより患者におけるクロライドチャンネルの適切な機能を評価するために用いることができる。
【００３７】
クロライドチャンネルの機能不全は、多くの病状にかかわっている。例えば、ＣＦＴＲにおける突然変異は、細胞膜を通したクロライドイオンの正常な通過を妨げる（Ｗｅｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，８：８２１−８２９（１９９２）。これは、気道、膵臓、腸、汗腺および男性生殖管を包含する、上皮細胞内層を有する臓器の分泌および吸収細胞における減少したクロライドイオン透過性をもたらす。これは次に上皮を横切る水の輸送を減らし、そして嚢胞性線維症を引き起こす。肺およびＧＩ管はこの疾患において冒される主要な臓器系であり、そして病状は粘性の高い粘液での気道およびＧＩ管の遮断を特徴とする。本発明の方法は、患者が嚢胞性線維症を患っているかどうかを診断する試験の１つとして用いることができる。
【００３８】
本発明の別の一般的な態様は、クロライドチャンネルの伝導性への試験化合物の効果を決定するために本発明の方法を使用できることである。そのような方法は：ａ）試験化合物およびヨウ化物とクロライドチャンネルを接触させる段階；ｂ）クロライドチャンネルにより伝導されるヨウ化物の量を比色分析で検出する段階；およびｃ）クロライドチャンネルを試験化合物と接触させないコントロールのものと検出されるヨウ化物の量を比較する段階を含んでなる。接触させる段階に必要とされるインキュベーション時間の量は、例えば、既知のクロライドチャンネルモジュレーターで時間的経過を行いそして時間の関数として細胞変化を測定することにより、実験的に決定することができる。
【００３９】
１つの態様において、該方法はクロライドチャンネルを有する細胞もしくは膜小胞へのヨウ化物の流入を測定し、ヨウ化物を含有する溶液中でクロライドチャンネルを有する細胞もしくは膜小胞をインキュベーションする段階；細胞もしくは膜小胞を試験化合物と接触させる段階；溶液から細胞もしくは膜小胞を分離する段階；比色検出方法を用いて細胞もしくは膜小胞内のヨウ化物の量を測定する段階；および測定されるヨウ化物の量を、クロライドチャンネルを試験化合物と接触させないコントロールの量と比較する段階を含んでなる。クロライドチャンネルを通した系への陰イオンの流入を増加する試験化合物は、コントロールのものと比較した場合に系内のヨウ化物のより高い濃度をもたらす。クロライドチャンネルを通した細胞もしくは膜小胞への陰イオンの流入を減少する（もしくは増加する）試験化合物は、コントロールの量と比較した場合に細胞もしくは膜小胞内のヨウ化物のより低い（もしくはより高い）量をもたらす。
【００４０】
別の態様において、該方法はクロライドチャンネルを有するヨウ化物負荷細胞もしくは膜小胞からのヨウ化物の流出を測定し、ヨウ素を実質的に含まない溶液中でクロライドチ
ャンネルを有するヨウ化物負荷細胞もしくは膜小胞をインキュベーションする段階；細胞もしくは膜小胞を試験化合物と接触させる段階；溶液から細胞もしくは膜小胞を分離する段階；比色検出方法を用いて溶液中のヨウ化物の量を測定する段階；および測定されるヨウ化物の量を、クロライドチャンネルを試験化合物と接触させないコントロールの量と比較する段階を含んでなる。クロライドチャンネルを通した細胞もしくは膜小胞からの陰イオンの流出を減少する（もしくは増加する）試験化合物は、コントロールの量と比較した場合に溶液中のヨウ化物のより低い（もしくはより高い）量をもたらす。
【００４１】
ある態様において、ヨウ化物流出を測定する方法は、細胞内のヨウ化物の量を測定する段階のみを含んでなる。細胞内のヨウ化物濃度が低いほど、陰イオンに対するクロライドチャンネルの伝導性は強くなる。
【００４２】
別の態様において、該方法は細胞内のヨウ化物の量に対する溶液中のヨウ化物の量の比率を決定する段階をさらに含んでなる。該比率は、クロライドチャンネルの機能の指標として用いることができる。クロライドチャンネルを通した細胞もしくは膜小胞からの陰イオンの流出を減少する（もしくは増加する）試験化合物は、コントロールの量と比較した場合により低い（もしくはより高い）そのような比率をもたらす。
【００４３】
本明細書に記載の化合物同定方法は、通常の実験室形態を用いてもしくはハイスループットに適応したアッセイにおいて行うことができる。「ハイスループット」（ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）という用語は、同時に多数のサンプルの容易なスクリーニングを可能にするアッセイ設計をさし、そしてロボット操作の潜在的可能性を包含することができる。ハイスループットアッセイの別の望ましい特徴は、所望の分析を行うために試薬の使用を減らすかもしくは操作の数を最小限にするように最適化されるアッセイ設計である。アッセイ形態の例には、９６ウェルもしくは３８４ウェルプレート、浮揚液滴および液体処理実験に使用される「ラボ・オン・チップ」（ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ）マイクロチャンネルチップが包含される。プラスチック金型および液体処理装置の小型化が進むにつれて、もしくは改善されたアッセイ装置が設計されるにつれて、より多数のサンプルを本発明の設計を用いて実施できることは当業者に周知である。
【００４４】
典型的に試験化合物もしくは候補化合物は有機化合物であるが、それらには多数の化学物質クラスが包含される。好ましくは、それらは小有機化合物、すなわち、５０より大きいが約２５００未満の分子量を有するものである。候補化合物は、ポリペプチドとの構造的相互作用に必要な官能性化学基を含んでなり、そして典型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルもしくはカルボキシル基、好ましくはこれらの官能性化学基の少なくとも２つ、そしてより好ましくはこれらの官能性化学基の少なくとも３つを含む。候補化合物は、上記に同定される官能基の１つもしくはそれ以上で置換された環状炭素もしくは複素環式構造および／または芳香族もしくは多環芳香族構造を含んでなることができる。候補化合物はまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロール、イソプレノイド、プリン、ピリミジン、上記の誘導体もしくは構造的アナログ、またはその組み合わせなどのような生体分子であることもできる。化合物が核酸である場合、非天然の結合もしくはサブユニットを有する改変された核酸もまた意図されるが、化合物は典型的にＤＮＡもしくはＲＮＡ分子である。
【００４５】
候補化合物は、合成もしくは天然化合物のライブラリーを包含する多種多様な供給源から得られる。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現、合成有機組み合わせライブラリー、ランダムペプチドのファージディスプレイライブラリーなどを包含する、多種多様な有機化合物および生体分子のランダムおよび指向性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）合成に多数の手段が利用可能である。候補化合物はまた、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な並行固相もしくは液相ライブラリー；解析を必要とする合成ライブラリー法；「１
ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５）を包含する、当該技術分野において既知である組み合わせライブラリー法における多数の方法のいずれかを用いて得ることもできる。あるいはまた、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが利用可能であるか、もしくは容易に製造される。さらに、天然および合成的に製造されたライブラリーおよび化合物は、通常の化学的、物理的および生化学的手段によって容易に改変することができる。
【００４６】
さらに、既知の薬理学的薬剤は、薬剤の構造的アナログを製造するためにアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などのような選択的もしくはランダム化学修飾を受けることができる。候補化合物はランダムに選択することができ、またはクロライドチャンネル活性に結合しそして／もしくはその機能を調節する既存の化合物に基づくことができる。従って、候補薬剤の供給源は、クロライドチャンネルの伝導性を増加するかもしくは減少する既知の化合物に基づく分子のライブラリーであり、ここで、既知の化合物の構造は、より多くのもしくはより少ない化学部分（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ）または異なる化学部分を含有するように分子の１つもしくはそれ以上の位置で改変される。アナログアクチベーター／インヒビターのライブラリーを作製する際に分子に行われる構造的改変は、選択的、ランダム、または選択的およびランダム置換および／もしくは付加の両方の組み合わせであることができる。組み合わせライブラリーの製造における当業者は、そのようなライブラリーを容易に製造することができる。
【００４７】
様々な他の試薬もまた方法に含むことができる。これらには、最適なタンパク質−タンパク質および／もしくはタンパク質−核酸結合を促進するために用いることができる塩、バッファー、中性タンパク質（例えばアルブミン）、洗剤などのような試薬が包含される。そのような試薬はまた、反応成分の非特異的もしくはバックグラウンド相互作用を減少することもできる。ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤などのような、アッセイの効率を向上する他の試薬もまた用いることができる。
【００４８】
分子ライブラリーの合成の方法の例は当該技術分野において、例えば：Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ｊ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８に見出すことができる。化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）、またはビーズ（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（特許第５，５７１，６９８号）、プラスミド（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）もしくはファージ（例えば、Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０を参照）上に提示することができる。
【００４９】
本発明は、クロライドチャンネルの機能分析のための比色検出方法を提供する。本発明の好ましい態様は、他の関連する方法と比較して多数の利点を提供する。例えば、本発明の方法に関与する放射性物質はなく、必要とされる資源および試薬の点で減少したコストおよび減少した廃棄物をもたらす。さらに、本発明の方法は高感度であり、０．０１ＰＰＭという低いヨウ素濃度を検出することができる。さらに、本発明の方法は、ハイスループット形態に容易に適応することができる。
【００５０】
本発明をさらに説明するために、以下の実施例が提供される。
【実施例】
【００５１】
実施例１
基準ＮａＩ溶液についてのサンデル・コルトフ（ＳＫ）アッセイ
【００５２】
材料
全ての化学物質は、他に示される以外はＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＳ）から購入した。
【００５３】
ヒ酸混合物を調製するために以下の方法を用いた：１）１９．８ｇの三酸化ヒ素（Ａｓ２Ｏ３）を３００ｍｌの精製水および５０ｍｌの水酸化アンモニア（２５％）からなる溶液に溶解し；２）３２ｍｌの硫酸および２５ｇの塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）を溶液に加え；そして３）精製水を加えて溶液の最終容量を１０００ｍｌにした。
【００５４】
硫酸Ｃｅ（ＩＶ）アンモニア（ａｍｍｏｎｉａ−Ｃｅ（ＩＶ）−ｓｕｌｆａｔｅ）混合物を製造するために以下の方法を用いた：１）１０ｇの硫酸Ｃｅ（ＩＶ）アンモニア（（ＮＨ４）４Ｃｅ（ＳＯ４）４・２Ｈ２Ｏ）を４００ｍｌの精製水に懸濁し；２）硫酸Ｃｅ（ＩＶ）アンモニアを溶解するのを助けるために２６ｍｌの硫酸を溶液に加え；そして３）黄色の塩を溶解した後に、精製水を加えて溶液の最終容量を約５００ｍｌにした。
【００５５】
基準ＮａＩ溶液は、最初にＮａＩを１００ＰＰＭの最終濃度になるように精製水に溶解し、次に約１０、１、０．１、０．０１および０．００１、０．０００１および０．００００１ＰＰＭの最終濃度になるように９６ウェルプレート（カタログ番号３９０３、Ｃｏｒｎｉｎｇ）において１００ＰＰＭ溶液の１：１０連続希釈を行うことにより調製した。
【００５６】
方法
以下の試薬を９６ウェルプレートのウェルにおいて混合した：１００μｌのＮａＩ基準溶液、１００μｌのヒ酸混合物および１００μｌの硫酸Ｃｅ（ＩＶ）アンモニア混合物。反応混合物を室温で約３０分間インキュベーションした。ヨウ化物は無色のＣｅ３＋へのヒ酸による硫酸Ｃｅ（ＩＶ）アンモニアにおける黄色に着色したセリウムイオン（Ｃｅ４＋）の還元を触媒するので、反応混合物中のヨウ化物が多いほど、より少ない硫酸Ｃｅ（ＩＶ）アンモニアが混合物に残る。反応混合物における硫酸Ｃｅ（ＩＶ）アンモニアの量は、分光計（Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ  Ｐｌｕｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、ＣＡ）を用いて反応混合物のＯＤ４０５として測定した。
【００５７】
結果
図１に示されるように、ＮａＩの量が０．０１から１０ＰＰＭまで増加した間に、反応混合物における硫酸Ｃｅ（ＩＶ）アンモニアの増加する量が無色のＣｅ３＋に転化されたので、ＯＤ４０５の減少する値がＳＫアッセイから測定された。本明細書に記載のＳＫアッセイを用いて、０．０１ＰＰＭという低いＩ−を検出することができた。シグナル変化は、０．０１〜１０ＰＰＭの範囲内でほぼ直線状である。
【００５８】
実施例２
外向き整流ＧＡＢＡＡ受容体についてのサンデル・コルトフ（ＳＫ）アッセイ
【００５９】
材料
実施例１に記載のものと同様の化学物質および試薬を本実施例において使用した。さらに、１５０ｍＭのＮａＩ、２ｍＭのＣａＣｌ２、０．８ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭのＭｇＣｌ２および５ｍＭのＩＫ、２％のＦＢＳ（＃３５−０１０−ＡＶ、ＣＥＬＬＧＲＯ、ＶＡ）ｐＨ７．４からなるヨウ素負荷バッファーは、精製水に各記載の成分を混合しそして溶解し、それに応じてｐＨを調整することにより調製した。
【００６０】
ヒトＧＡＢＡＡ（アデノウイルスタイプ）を発現する細胞系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔ
ｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ−２０２９）から入手した。細胞は、ＤＭＥＭ培地（＃１０−０１７−ＣＶ、ＣＥＬＬＧＲＯ、ＶＡ）、４ｍＭのＬ−グルタミン、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、４．５ｇ／Ｌのグルコース、１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび１０％のウシ胎仔血清（＃３５−０１０−ＡＶ、ＣＥＬＬＧＲＯ、ＶＡ）からなる補足ＤＭＥＭ培地において培養した。
【００６１】
方法
補足ＤＭＥＭ培地中の細胞（２００μｌ、約２５０，０００細胞／ｍｌ）をＤ−リシン被覆９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３６６７）の各ウェルに加え、そして９０％の空気／１０％のＣＯ２下で３７℃で組織培養インキュベーターにおいて一晩インキュベーションした。次に、補足ＤＭＥＭ培地をマルチチャンネルピペッターで除き、そして２００μｌのヨウ素負荷バッファーをＲａｐｉｄ  ＰｌａｔｅＴＭ（Ｚｙｍａｒｋ、ＭＡ）で各ウェルに加えた。細胞を９０％の空気／１０％のＣＯ２下で３７℃で２〜４時間インキュベーションし、そして続いてリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）もしくは培養培地で洗浄した。ＤＰＢＳ（１００〜２００μｌ）を各ウェルに加えた。ＧＡＢＡを１００、３０、１０、３、１、０．３、０．１もしくは０μＭの最終濃度でＺｙｍａｒｋ  Ｒａｐｉｄプレート（Ｚｙｍａｒｋ、ＭＡ）で各ウェルに加えた。いくつかのアッセイでは、ＧＡＢＡに加えて、既知のＧＡＢＡＡチャンネルアンタゴニスト、ピクロトキシニン（Ｐ−８３９０、Ｓｉｇｍａ、ＭＯ、Ｋｈｒｅｓｔｃｈａｔｉｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎｅｕｒｏｎ  ３：７４５−５３）もしくはビククリン（Ｂ−６８８９、Ｓｉｇｍａ）のような試験化合物もまた細胞に加えた。細胞を試験化合物の存在下もしくは不在下でＧＡＢＡと５分間インキュベーションした後に、それらを懸濁バッファーから分離し、そして１００μｌの細胞溶解バッファー（１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で溶解した。溶解した細胞におけるＩ−の量を実施例１に記載のＳＫアッセイ方法により測定した。
【００６２】
結果
図２により、ＳＫアッセイにより測定した場合にＧＡＢＡＡチャンネルの外向き伝導性がＧＡＢＡの量を増加するとともに増加することが示された。ＧＡＢＡはＧＡＢＡＡチャンネルを活性化し、細胞からのヨウ化物の流出をもたらした。図１に示されるように、反応混合物中のヨウ化物が多いほど、ＯＤ４０５でのより低い吸光度値がＳＫアッセイから測定される。ＧＡＢＡＡチャンネルの伝導性は、１００＊（ＯＤ４０５ｓａｍｐｌｅ−ＯＤ４０５ｌｏｗ）／（ＯＤ４０５ｈｉｇｈ−ＯＤ４０５ｌｏｗ）（ここで、ＯＤ４０５ｓａｍｐｌｅは様々な濃度のＧＡＢＡで処理した細胞についてＳＫアッセイから測定され；ＯＤ４０５ｈｉｇｈは３００μＭのＧＡＢＡで処理した細胞についてＳＫアッセイから測定され；そしてＯＤ４０５ｌｏｗはＧＡＢＡ処理なしの細胞についてＳＫアッセイから測定される）として定義される、チャンネルのパーセント活性として表される。３００μＭのＧＡＢＡでの反応と比較した場合にＧＡＢＡＡチャンネルの活性が半分誘導されるＧＡＢＡの濃度である、ＧＡＢＡの測定ＥＣ５０は７．６９＋／−０．３μＭであった。
【００６３】
図４により、ＳＫアッセイにより測定した場合にＧＡＢＡＡチャンネルの伝導性がＧＡＢＡＡチャンネルの非競合的インヒビターもしくは競合的遮断薬の量を増加するとともに減少することが示された。ここでもまた、ＧＡＢＡチャンネルの伝導性は、上記に定義されるようなチャンネルのパーセント活性として表される。本明細書に記載のアッセイ条件下で、ＧＡＢＡＡチャンネル非競合的インヒビターピクロトキシンは、３０μＭのＧＡＢＡの存在下で約５．３μＭのＩＣ５０、そして３００μＭのＧＡＢＡの存在下で約１０μＭのＩＣ５０を有した。ＧＡＢＡチャンネル競合的遮断薬ビククリンは、３０μＭのＧＡＢＡの存在下で約１μＭのＩＣ５０、そして３００μＭのＧＡＢＡの存在下で約５０μＭのＩＣ５０を有した。既定のＧＡＢＡ濃度の存在下での試験化合物のＩＣ５０は、試験化合物なしのしかしＧＡＢＡの同じ濃度での反応と比較した場合にＧＡＢＡＡチャンネルの
伝導性が半分減少される試験化合物の濃度である。ＩＣ５０は、ＩＤＢＳ  ＸＬ−ｆｉｔモデル２０５（ＩＤＢＳ、ＵＫ）で計算した。
【００６４】
外向き整流リガンド依存性クロライドチャンネルの他のタイプを測定するために本実施例に記載のものと同様のアッセイ方法を用いることができる。
【００６５】
実施例３
外向き整流ＣＦＴＲチャンネルについてのサンデル・コルトフ（ＳＫ）アッセイ
【００６６】
材料
実施例２に記載のものと同様の化学物質および試薬を本実施例において使用した。
【００６７】
ヒトＣＦＴＲチャンネルを内因的に発現するＨＴＢ−７９細胞系は、ＡＴＣＣから入手した。欠損したＣＦＴＲチャンネルを有するＣＲＬ−１９１８細胞系もまた、ＡＴＣＣから入手した。細胞は、イスコフ改変培地（ＣＥＬＬＧＲＯ、ＶＡ）および４ｍＭのＬ−グルタミン、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムおよび２０％のＦＢＳ（ＣＥＬＬＧＲＯ、ＶＡ）からなるイスコフ改変ダルベッコ培地において培養した。
【００６８】
方法
イスコフ改変ダルベッコ培地中のＨＴＢ−７９細胞（２００μｌ、約５００，０００細胞／ｍｌ）をｃｏｓｔａｒ９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ、ＮＹ）の各ウェルに加え、そして９０％の空気／５％のＣＯ２下で３７℃で組織培養インキュベーターにおいて一晩インキュベーションした。次に、イスコフ改変ダルベッコ培地を除き、そして２００μｌのヨウ素負荷バッファーをプレートの各ウェルに加えた。細胞を９０％の空気／５％のＣＯ２下で３７℃で２〜４時間インキュベーションし、そしてＤＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）もしくは培養培地で洗浄した。ＤＰＢＳ（１００〜２００μｌ）を各ウェルに加えた。フォルスコリン（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）を１００、３０、１０、３、１、０．３、０．１，０．０３および０．０１μＭの最終濃度で各ウェルに加えた。細胞を室温でさらに５分間インキュベーションした後に、それらを懸濁バッファーから分離し、そして１００μｌの細胞溶解バッファー（１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で溶解した。溶解した細胞におけるＩ−の量を実施例１に記載のＳＫアッセイ方法により測定した。
【００６９】
結果
図５は、ＳＫアッセイにより測定した場合に、フォルスコリンの量を増加することによりＣＦＴＲチャンネルの増加する伝導性がもたらされることを示した。フォルスコリンはアデニル酸シクラーゼ活性を刺激し、ｃＡＭＰの増加したレベルをもたらし、それは次にＣＦＴＲチャンネルを活性化した。図５Ａにより、ＳＫアッセイにより測定した場合に、ＣＦＴＲチャンネルを内因的に発現するＨＴＢ−７９細胞におけるクロライドチャンネル伝導性をフォルスコリンが活性化することが示された。フォルスコリンの測定ＥＣ５０は、１μＭであった。フォルスコリンのＥＣ５０は、１００μＭのフォルスコリンでの反応と比較した場合にＣＦＴＲチャンネルの活性が半分誘導されるフォルスコリンの濃度である。ＳＫアッセイは、３００ｎＭという低い濃度でフォルスコリンによるＣＦＴＲの活性化を検出することができた。図５Ｂにより、ＳＫアッセイにより測定した場合に、１００μＭの濃度まで、フォルスコリンが、欠損したＣＦＴＲチャンネルを発現するＣＲＬ−１９１８細胞におけるクロライドチャンネル伝導性を活性化しないことが示された。ＣＦＴＲ受容体の伝導性は、１００＊（ＯＤ４０５ｓａｍｐｌｅ−ＯＤ４０５ｌｏｗ）／（ＯＤ４０５ｈｉｇｈ−ＯＤ４０５ｌｏｗ）（ここで、ＯＤ４０５ｓａｍｐｌｅはフォルスコリンで処理した細胞についてＳＫアッセイから測定され；ＯＤ４０５ｌｏｗは１００μＭのフォルスコリンで処理した細胞についてＳＫアッセイから測定され；そしてＯＤ４０５ｈ
ｉｇｈはフォルスコリン処理なしの細胞についてＳＫアッセイから測定される）として定義される、チャンネルのパーセント活性として表される。
【００７０】
実施例４
内向き整流ＧＡＢＡＡ受容体についてのサンデル・コルトフ（ＳＫ）アッセイ
【００７１】
材料
実施例２に記載のものと同様の化学物質および試薬を本実施例において使用した。
【００７２】
方法
補足ＤＭＥＭ培地中の細胞（２００μｌ、約２５０，０００細胞／ｍｌ）をＤ−リシン被覆９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３６６７）の各ウェルに加え、そして９０％の空気／１０％のＣＯ２下で３７℃で組織培養インキュベーターにおいて一晩インキュベーションした。次に、補足ＤＭＥＭ培地をマルチチャンネルピペッターで除き、そして２００μｌのヨウ素負荷バッファーを各ウェルに加えた。ＧＡＢＡをＺｙｍａｒｋ  Ｒａｐｉｄプレート（Ｚｙｍａｒｋ、ＭＡ）で１００、３０、１０、３、１、０．３、０．１もしくは０μＭの最終濃度で細胞に加えた。細胞を５分間インキュベーションした後に、それらをリン酸緩衝食塩水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）で３回洗浄し、そして１００μｌの細胞溶解バッファーで溶解した。細胞におけるＩ−の量を実施例１に記載のＳＫアッセイ方法により測定した。
【００７３】
結果
図７により、ＳＫアッセイにより測定した場合にＧＡＢＡＡチャンネルの伝導性がＧＡＢＡの量を増加するとともに増加することが示された。ＧＡＢＡはＧＡＢＡＡチャンネルを活性化し、細胞へのヨウ化物の流入をもたらした。図１に示されるように、反応混合物中のヨウ化物が多いほど、より低いＯＤ４０５がＳＫアッセイから測定される。ＧＡＢＡＡチャンネルの伝導性は、１００＊（１−（ＯＤ４０５ｓａｍｐｌｅ−ＯＤ４０５ｌｏｗ）／（ＯＤ４０５ｈｉｇｈ−ＯＤ４０５ｌｏｗ））（ここで、ＯＤ４０５ｓａｍｐｌｅは様々な濃度のＧＡＢＡで処理した細胞についてＳＫアッセイから測定され；ＯＤ４０５ｌｏｗは１０００μＭのＧＡＢＡで処理した細胞についてＳＫアッセイから測定され；そしてＯＤ４０５ｈｉｇｈはＧＡＢＡ処理なしの細胞についてＳＫアッセイから測定される）として定義される、チャンネルのパーセント活性として表される。ＧＡＢＡなしの反応と比較した場合にＧＡＢＡＡチャンネルの活性が半分誘導されるＧＡＢＡの濃度である、ＧＡＢＡの測定ＥＣ５０は２９４μＭであった。
【００７４】
図３は、３０μＭのＧＡＢＡで細胞を刺激することにより、ＧＡＢＡで刺激しない細胞と比較した場合にＳＫアッセイからＯＤ４０５の約４．５倍の減少がもたらされることを示した。従って、本明細書に記載のアッセイ条件下で、ＧＡＢＡＡの伝導性を減少することができる試験化合物は、ＧＡＢＡで刺激しない細胞と比較した場合に、３０μＭのＧＡＢＡの存在下でＳＫアッセイからＯＤ４０５の４．５倍未満の減少をもたらすその能力により同定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】サンデル・コルトフ（ＳＫ）アッセイで試験したＮａＩの基準サンプルの濃度滴定曲線を示す。基準サンプルは、横軸上に与えられるような様々な濃度のＮａＩを含んでなった。各データ点は、同じＮａＩ濃度を有する８個のサンプルの平均を表す。ＯＤ４０５吸光度は、反応物を室温で１５分間（図１Ａ）もしくは１０（黒四角）、１５（上向きの三角）、２０（下向きの三角）、２５（ひし形）、３０（丸）および７０（白四角）分間（図１Ｂ）インキュベーションした後に測定した。
【図２】ＳＫアッセイにより測定した場合に、活性％として表される、外向き整流ＧＡＢＡＡチャンネルの伝導性がＧＡＢＡの量を増加するとともに増加することを示す。
【図３】ＧＡＢＡで刺激しない細胞と比較した場合に３０μＭのＧＡＢＡで細胞を刺激することによりＳＫアッセイにおけるＯＤ４０５の約４倍の減少、従ってヨウ化物濃度の４倍の増加がもたらされることを示す。各データ点は、同じＧＡＢＡ濃度で刺激した４個のサンプルの平均を表す。
【図４】ＳＫアッセイにより測定した場合に、外向き整流ＧＡＢＡＡチャンネルの伝導性がＧＡＢＡＡチャンネルの非競合的インヒビター（ピクロトキシン、三角）もしくは競合的遮断薬（ビククリン、四角）の量を増加するとともに減少したことを示す。図４Ａ．３０μＭのＧＡＢＡの存在下；および図４Ｂ．３００μＭのＧＡＢＡの存在下。
【図５】ＳＫアッセイにより測定した場合に、外向き整流ＣＦＴＲクロライドチャンネルの伝導性がチャンネルの活性化因子、フォルスコリンの量を増加するとともに増加したことを示す。図５Ａ．内因性の機能性ＣＦＴＲチャンネルを有する細胞でアッセイを行った；図５Ｂ．欠損したＣＦＴＲチャンネルを有する細胞でアッセイを行った。
【図６】ＳＫアッセイにより測定した場合に、内向き整流ＧＡＢＡＡチャンネル伝導性（活性％として表される）がＧＡＢＡの量を増加するとともに増加したことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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