(57)【要約】本発明は、臨床的に関連する抗腫瘍免疫応答の標的としての前立腺幹細胞抗原(PSCA)の同定に関するものである。本発明は、PSCA特異的CD8+T細胞応答を含む抗腫瘍免疫応答の誘導に有用な、PSCAまたはそのフラグメントを含むワクチンを提供する。癌を処置するために組成物を使用する方法も提供する。本発明は、抗腫瘍ワクチンに有用な化合物を同定する方法および癌免疫療法に対する患者の応答を評価する方法をさらに提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺幹細胞抗原(PSCA)を発現している腫瘍に対するT細胞応答が誘導される方法であって、以下の段階を含む方法：
該腫瘍を有するかまたは該腫瘍を除去された哺乳動物に、MHCクラスI結合エピトープまたはMHCクラスII結合エピトープを含むポリペプチドを含み、全腫瘍細胞を含まない組成物を投与し、それによりPSCAに対するT細胞応答が哺乳動物に誘導される段階。
【請求項２】
腫瘍が、由来する正常組織に比べて、前立腺幹細胞抗原を過剰発現している、請求項1記載の方法。
【請求項３】
腫瘍が、膵臓癌、膀胱癌または前立腺癌である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
哺乳動物がヒトであり、かつPSCAがヒトPSCAである、請求項1記載の方法。
【請求項５】
MHCクラスI結合エピトープが、HLA-A2拘束性エピトープ、HLA-A3拘束性エピトープ、またはHLA-A24拘束性エピトープである、請求項1記載の方法。
【請求項６】
ポリペプチドが、MHCクラスI結合エピトープおよびMHCクラスII結合エピトープの両方を含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
ポリペプチドが、PSCAの複数のMHCクラスI結合エピトープを含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
ポリペプチドが、哺乳動物により発現される対立遺伝子型のMHCクラスIと結合する、PSCAの複数のMHCクラスI結合エピトープを含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
ポリペプチドがPSCAを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
T細胞応答がPSCA特異的CD8+T細胞の誘導を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
T細胞応答がPSCA特異的CD4+細胞の誘導を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
組成物がアジュバントまたは非PSCA抗原をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
組成物が、腫瘍の退行を誘導するのに十分な量で投与される、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
組成物が、哺乳動物における癌の進行を阻害するのに十分な量で投与される、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
組成物が、腫瘍を除去された哺乳動物における癌の再発を遅延するまたは予防するのに十分な量で投与される、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
組成物が無細胞性である、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
組成物が、ポリペプチドを発現している細菌、ウイルスまたは酵母を含む組換えベクターを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
細菌が、フレクスナー赤痢菌(Shigella flexneri)、大腸菌(E. coli)、リステリア菌(Listeria monocytogenes)、エルシニアエンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、ネズミチフス菌(Salmonella Typhimurium)、チフス菌(Salmonella typhi)、およびマイコバクテリウムからなる群より選択される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
前立腺幹細胞抗原(PSCA)を発現している腫瘍に対するT細胞応答が誘導される方法であって、以下の段階を含む方法：
該腫瘍を有するかまたは該腫瘍を除去された哺乳動物に、MHCクラスI結合エピトープまたはMHCクラスII結合エピトープを有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含み、全腫瘍細胞を含まない組成物を投与し、それによりPSCAに対するT細胞応答が哺乳動物に誘導される段階。
【請求項２０】
腫瘍が、由来する正常組織に比べて、前立腺幹細胞抗原を過剰発現している、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
腫瘍が、膵臓癌、膀胱癌または前立腺癌である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
哺乳動物がヒトであり、かつPSCAがヒトPSCAである、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
MHCクラスI結合エピトープが、HLA-A2拘束性エピトープ、HLA-A3拘束性エピトープ、またはHLA-A24拘束性エピトープである、請求項19記載の方法。
【請求項２４】
ポリペプチドが、MHCクラスI結合エピトープおよびMHCクラスII結合エピトープの両方を含む、請求項19記載の方法。
【請求項２５】
ポリペプチドがPSCAの複数のMHCクラスI結合エピトープを含む、請求項19記載の方法。
【請求項２６】
ポリペプチドが、哺乳動物により発現される同一の対立遺伝子型のMHCクラスIと結合する、PSCAの複数のMHCクラスI結合エピトープを含む、請求項19記載の方法。
【請求項２７】
ポリペプチドがPSCAを含む、請求項19記載の方法。
【請求項２８】
T細胞応答が特異的CD8+T細胞の誘導を含む、請求項19記載の方法。
【請求項２９】
T細胞応答がPSCA特異的CD4+細胞の誘導をさらに含む、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
組成物がアジュバントまたは非PSCA抗原をさらに含む、請求項19記載の方法。
【請求項３１】
組成物が腫瘍の退行を誘導するのに十分な量で投与される、請求項19記載の方法。
【請求項３２】
組成物が哺乳動物における癌の進行を阻害するのに十分な量で投与される、請求項19記載の方法。
【請求項３３】
組成物が、腫瘍を除去された哺乳動物における癌の再発を阻害するのに十分な量で投与される、請求項19記載の方法。
【請求項３４】
組成物が無細胞性である、請求項19記載の方法。
【請求項３５】
組成物が、ポリヌクレオチドを含む細菌、ウイルスまたは酵母を含み、かつポリペプチドを発現している組換え生物性ベクターを含む、請求項19記載の方法。
【請求項３６】
細菌が、フレクスナー赤痢菌、大腸菌、リステリア菌、エルシニアエンテロコリチカ、ネズミチフス菌、チフス菌、およびマイコバクテリウムからなる群より選択される、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
PSCAを発現している腫瘍を有するかまたはPSCAを発現している腫瘍を除去された哺乳動物おける癌を処置する方法であって、以下の段階を含む方法：
MHCクラスI結合エピトープまたはMHCクラスII結合エピトープを含むポリペプチドを含み、全腫瘍細胞を含まない組成物を哺乳動物に投与し、それによりPSCAに対するT細胞応答が哺乳動物に誘導される段階；および
哺乳動物を化学療法、放射線、外科手術、ホルモン療法または追加的な免疫療法でさらに処置する段階。
【請求項３８】
PSCAを発現している腫瘍を有するかまたはPSCAを発現している腫瘍を除去された哺乳動物における癌を処置する方法であって、以下の段階を含む方法：
MHCクラスI結合エピトープまたはMHCクラスII結合エピトープを含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含み、全腫瘍細胞を含まない組成物を哺乳動物に投与し、それによりPSCAに対するT細胞応答が哺乳動物に誘導される段階；および
哺乳動物を化学療法、放射線、外科手術、ホルモン療法または追加的な免疫療法でさらに処置する段階。
【請求項３９】
哺乳動物において前立腺幹細胞抗原(PSCA)を発現している腫瘍に対するT細胞応答を発生させる方法であって、以下の段階を含む方法：
該腫瘍を有するかまたは該腫瘍を除去された哺乳動物に、PSCA特異的CD8+T細胞集団を含む有効量の組成物を投与する段階。
【請求項４０】
組成物が抗腫瘍ワクチンに有用であると同定する方法であって、以下の段階を含む方法：
組成物が投与された哺乳動物のリンパ球を試験して、その存在が組成物が抗腫瘍ワクチンに有用であることを指し示すPSCA特異的CD8+T細胞を、リンパ球が含むかどうかを判定する段階。
【請求項４１】
哺乳動物が抗腫瘍ワクチンに対して良好な応答を有しているかどうかを評価する方法であって、以下の段階を含む方法：
組成物が投与された哺乳動物のリンパ球を試験して、その存在が哺乳動物が抗腫瘍ワクチンに対して良好な応答を有していることを指し示すPSCA特異的CD8+T細胞を、リンパ球が含むかどうかを判定する段階。
【請求項４２】
ヒトにおいてPSCAを発現している腫瘍細胞に対するT細胞応答を誘導し、全腫瘍細胞を含まず、以下を含むワクチン：
MHCクラスI結合エピトープまたはMHCクラスII結合エピトープを含むポリペプチド；および
アジュバント。
【請求項４３】
ヒトにおいてPSCAを発現している腫瘍細胞に対するT細胞応答を誘導し、全腫瘍細胞を含まず、以下を含むワクチン：
MHCクラスI結合エピトープまたはMHCクラスII結合エピトープを含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；および
アジュバント。
【請求項４４】
ヒトにおいてPSCAを発現している腫瘍細胞に対するT細胞応答を誘導する、以下を含むワクチン：
選択または改変前の腫瘍細胞系に比べて、MHCクラスI結合エピトープまたはMHCクラスII結合エピトープを含むポリペプチドを過剰発現するように選択または改変された該腫瘍細胞系由来の全細胞；および
アジュバント。
【請求項４５】
前立腺幹細胞抗原(PSCA)を発現している腫瘍に対するT細胞応答を誘導する方法であって、以下の段階を含む方法：
該腫瘍を有するかまたは該腫瘍を除去された哺乳動物に、選択または改変前の腫瘍細胞系に比べて、MHCクラスI結合エピトープまたはMHCクラスII結合エピトープを含むポリペプチドを過剰発現するように選択または改変された該腫瘍細胞系由来の全細胞を含む組成物を投与し、それによりPSCAに対するT細胞応答が該哺乳動物に誘導される段階。
【請求項４６】
腫瘍が、由来する正常組織に比べて、前立腺幹細胞抗原を過剰発現している、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
腫瘍が、膵臓癌、膀胱癌または前立腺癌である、請求項45記載の方法。
【請求項４８】
哺乳動物がヒトであり、かつPSCAがヒトPSCAである、請求項45記載の方法。
【請求項４９】
MHCクラスI結合エピトープが、HLA-A2-拘束性エピトープ、HLA-A3拘束性エピトープ、またはHLA-A24拘束性エピトープである、請求項45記載の方法。
【請求項５０】
ポリペプチドが、MHCクラスI結合エピトープおよびMHCクラスII結合エピトープの両方を含む、請求項45記載の方法。
【請求項５１】
ポリペプチドが、PSCAの複数のMHCクラスI結合エピトープを含む、請求項45記載の方法。
【請求項５２】
ポリペプチドが、哺乳動物により発現される対立遺伝子型のMHCクラスIと結合する、PSCAの複数のMHCクラスI結合エピトープを含む、請求項45記載の方法。
【請求項５３】
ポリペプチドがPSCAを含む、請求項45記載の方法。
【請求項５４】
T細胞応答がPSCA特異的CD8+T細胞の誘導を含む、請求項45記載の方法。
【請求項５５】
T細胞応答がPSCA特異的CD4+細胞の誘導を含む、請求項45記載の方法。
【請求項５６】
組成物が、アジュバントまたは非PSCA抗原をさらに含む、請求項45記載の方法。
【請求項５７】
組成物が、腫瘍の退行を誘導するのに十分な量で投与される、請求項45記載の方法。
【請求項５８】
組成物が、哺乳動物における癌の進行を阻害するのに十分な量で投与される、請求項45記載の方法。
【請求項５９】
組成物が、腫瘍を除去された哺乳動物における癌の再発を遅延するまたは予防するのに十分な量で投与される、請求項45記載の方法。
【請求項６０】
ポリペプチドがMHCクラスI結合エピトープを含む、請求項1、19、37、38、または45記載の方法。
【請求項６１】
ポリペプチドがMHCクラスII結合エピトープを含む、請求項1、19、37、38、または45記載の方法。
【請求項６２】
ポリペプチドがMHCクラスI結合エピトープを含む、請求項42、43、または44記載のワクチン。
【請求項６３】
ポリペプチドがMHCクラスII結合エピトープを含む、請求項42、43、または44記載のワクチン。
【請求項６４】
MHCクラスI結合エピトープが、HLA-A2拘束性エピトープ、HLA-A3拘束性エピトープ、またはHLA-A24拘束性エピトープである、請求項62記載のワクチン。
【請求項６５】
ポリペプチドが、MHCクラスI結合エピトープおよびMHCクラスII結合エピトープの両方を含む、請求項42、43、または44記載のワクチン。
【請求項６６】
ポリペプチドが、PSCAの複数のMHCクラスI結合エピトープを含む、請求項42、43、または44記載のワクチン。
【請求項６７】
ポリペプチドが、哺乳動物により発現される対立遺伝子型のMHCクラスIと結合する、PSCAの複数のMHCクラスI結合エピトープを含む、請求項42、43、または44記載のワクチン。
【請求項６８】
ポリペプチドがPSCAを含む、請求項42、43、または44記載のワクチン。
【請求項６９】
T細胞応答がPSCA特異的CD8+T細胞の誘導を含む、請求項42、43、または44記載のワクチン。
【請求項７０】
T細胞応答がPSCA特異的CD4+細胞の誘導を含む、請求項42、43、または44記載のワクチン。
【請求項７１】
アジュバントまたは非PSCA抗原をさらに含む、請求項42、43、または44記載のワクチン。
【請求項７２】
無細胞性である、請求項42または43記載のワクチン。
【請求項７３】
組成物が、ポリペプチドを発現している細菌、ウイルスまたは酵母を含む組換えベクターを含む、請求項42または43記載の方法。
【請求項７４】
細菌が、フレクスナー赤痢菌、大腸菌、リステリア菌、エルシニアエンテロコリチカ、ネズミチフス菌、チフス菌、およびマイコバクテリウムからなる群より選択される、請求項73記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、癌の治療および予後の分野に関するものである。さらに具体的には、一部の局面では、本発明は、臨床的に関連する抗癌免疫応答を誘導することができる腫瘍抗原としてのPSCAの同定、および癌ワクチンにおける、または癌の予後のためのPSCAまたはそのフラグメントの使用に関するものである。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、2005年1月13日出願の米国仮特許出願第60/643,703号の優先権を主張し、この出願は全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０００３】
連邦支援研究開発に関する記載
本発明は、一部、NIH/NCI助成金番号R01CA95012およびNIH/NCI助成金番号P50CA62924の政府の援助を受けて成されたものである。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
癌免疫療法の計画および評価への重要な構成要素は、臨床的に関連する抗腫瘍応答の標的である特異的腫瘍抗原を同定することである。特異的腫瘍抗原がペプチド、タンパク質、組換えDNA、組換えウイルス、組換え細菌または組換え酵母に基づくワクチンに組み込まれる「抗原特異的」免疫療法を計画するために、甚だしい努力が続いている。これらのワクチンは、関連腫瘍特異的抗原を発現している癌を有する患者を免疫処置するために利用される。癌免疫療法の代替的な取り組みには、腫瘍抗原に特異的なモノクローナル抗体またはT細胞の養子移入が挙げられる。ワクチン、T細胞養子移入およびモノクローナル抗体移入の試験における予備的臨床結果は、抗癌治療におけるこれらの取り組みの有用性を実証している。
【０００５】
それぞれの癌免疫療法の取り組みにとって、候補となる多数の腫瘍特異的抗原または腫瘍選択的抗原のうちどれが免疫応答を発生させるための最良の標的であるかを判定することが望ましい。分子遺伝学によって、腫瘍がそのゲノムでの突然変異事象により発生した独特の抗原と、その遺伝子の転写レベルの変化またはタンパク質の安定性増大を生じる転写後プロセシングの変化が原因で過剰発現されたタンパク質を意味する腫瘍選択的抗原との両方を発現することが実証された。加えて、組織特異的抗原もその組織型から生じる腫瘍によって発現され、その抗原は、(前立腺癌、乳癌、黒色腫、膵臓癌、卵巣癌などの)特にその腫瘍が生命に必須ではない組織由来である場合に、免疫療法の潜在的な標的ともなりうる。これらのカテゴリーの抗原は、それぞれ多数の潜在的な抗原性標的を提供するが、免疫系によって実際に認識される抗原サブセットを劇的に狭める多数の過程が存在することは今や明らかである。T細胞による腫瘍の認識に関して、関連標的であるためには、候補抗原由来のペプチドが腫瘍および宿主両方のMHC分子によって効率的に提示されなくてはならない。加えて、T細胞レパートリーに対する制約および免疫トレランスのメカニズムが、有効な免疫応答を発生することができる抗原の数をさらに制限する。したがって、癌免疫療法の中心となる目標の一つは、臨床的に関連する免疫応答を誘発することができる抗原を同定することであった。
【０００６】
免疫的関連抗原を同定する以前の取り組みは、腫瘍特異的T細胞系およびクローンを発生させることに続いて、認識される腫瘍抗原についてのcDNAライブラリーをスクリーニングするためにこれらのT細胞系およびクローンを適用することを伴った。この取り組みは、黒色腫および多数の他の癌において候補となる抗原を同定した。しかし、これらのT細胞を長期培養する過程は、インビボで免疫優性の抗原性標的を代表していない抗原特異性を選択する可能性を有する。加えて、この取り組みにより同定された抗原の大部分は、活発に成長している癌を有する患者から培養されたT細胞系およびクローンを利用しているため、この抗原は必ずしも臨床的に有効な抗癌免疫応答と相関するわけではない。
【発明の開示】
【０００７】
本発明の簡潔な概要
前立腺幹細胞抗原(PSCA)は、大部分の膵臓癌および前立腺癌を含む他の癌にも同様に過剰発現しているタンパク質である。本発明は、部分的には免疫療法に応答した膵臓癌患者由来のT細胞により認識することができる関連腫瘍抗原としてのPSCAの同定に関するものである。これらの結果は、PSCAを過剰発現している腫瘍(例えば、膵臓癌および前立腺癌)を有し、癌の能動免疫療法(ワクチン)および養子免疫療法(T細胞および/または抗体の移入)を受けている患者での免疫応答についてのマーカーとしてこの抗原を確立するものである。これらの結果は、この抗原を癌免疫療法のための臨床的に有効な標的としても確立する。したがって一部の局面では、本発明は、癌ワクチンとして有用な多様な組成物、それらの組成物を使用して哺乳動物(例えばヒト)における癌を処置する方法、患者が癌ワクチンに対して良好な応答を有しているかどうかを評価する方法、およびワクチンの候補として組成物をスクリーニングする方法を提供する。
【０００８】
一局面では、本発明は、前立腺幹細胞抗原(PSCA)を発現している腫瘍に対するT細胞応答を誘導する方法を提供し、前記方法は、前記腫瘍を有するかまたは前記腫瘍を除去された哺乳動物に、MHCクラスI結合エピトープおよび/またはMHCクラスII結合エピトープを含むポリペプチドを含む組成物を投与することにより、PSCAに対するT細胞応答がその哺乳動物に誘導される段階を含む。一部の態様では、その組成物は全腫瘍細胞を含まない。
【０００９】
別の局面では、本発明は、前立腺幹細胞抗原(PSCA)を発現している腫瘍に対するT細胞応答を誘導する方法を提供し、前記方法は、前記腫瘍を有するかまたは前記腫瘍を除去された哺乳動物に、MHCクラスI結合エピトープおよび/またはMHCクラスII結合エピトープを含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む組成物を投与することにより、PSCAに対するT細胞応答がその哺乳動物に誘導される段階を含む。一部の態様では、その組成物は全腫瘍細胞を含まない。
【００１０】
別の局面では、本発明は、PSCAを発現している腫瘍を有するか、またはPSCAを発現している腫瘍を除去された哺乳動物における癌を処置する方法を提供し、方法は、その哺乳動物に、MHCクラスI結合エピトープおよび/またはMHCクラスII結合エピトープを含むポリペプチドを含む組成物を投与することにより、PSCAに対するT細胞応答がその哺乳動物に誘導される段階、およびその哺乳動物を、化学療法、放射線、外科手術、ホルモン療法または追加的な免疫療法でさらに処置する段階を含む。一部の態様では、その組成物は全腫瘍細胞を含まない。
【００１１】
別の局面では、本発明は、PSCAを発現している腫瘍を有するか、またはPSCAを発現している腫瘍が除去された哺乳動物における癌を処置する方法を提供し、その方法は、その哺乳動物に、MHCクラスI結合エピトープおよび/またはMHCクラスII結合エピトープを含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む組成物を投与することにより、PSCAに対するT細胞応答がその哺乳動物に誘導される段階、およびその哺乳動物を、化学療法、放射線、外科手術、ホルモン療法または追加的な免疫療法でさらに処置する段階を含む。一部の態様では、その組成物は全腫瘍細胞を含まない。
【００１２】
さらに別の局面では、本発明は、ヒトにおいてPSCAを発現している腫瘍細胞に対するT細胞応答を誘導するワクチンを提供し、そのワクチンは、MHCクラスI結合エピトープおよび/またはMHCクラスII結合エピトープを含むポリペプチドと、アジュバントとを含む。一部の態様では、そのワクチンは全腫瘍細胞を含まない。
【００１３】
さらに別の局面では、本発明は、ヒトにおいてPSCAを発現している腫瘍細胞に対するT細胞応答を誘導するワクチンを提供し、そのワクチンは、MHCクラスI結合エピトープおよび/またはMHCクラスII結合エピトープを含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドと、アジュバントとを含む。一部の態様では、そのワクチンは全腫瘍細胞を含まない。
【００１４】
さらなる局面では、本発明は、ヒトにおいてPSCAを発現している腫瘍細胞に対するT細胞応答を誘導するワクチンを提供し、そのワクチンは、選択または改変前の腫瘍細胞系に比べてポリペプチドを過剰発現するように選択または改変された腫瘍細胞系由来の全細胞と、アジュバントとを含み、ここで、そのポリペプチドは、MHCクラスI結合エピトープおよび/またはMHCクラスII結合エピトープを含む。
【００１５】
別の局面では、本発明は、前立腺幹細胞抗原(PSCA)を発現している腫瘍に対するT細胞応答を誘導する方法を提供し、前記方法は、前記腫瘍を有するかまたは前記腫瘍を除去された哺乳動物に、選択または改変前の腫瘍細胞系に比べてポリペプチドを過剰発現するように選択または改変された腫瘍細胞系由来の全細胞を含む組成物を投与することにより、PSCAに対するT細胞応答がその哺乳動物に誘導される段階を含み、ここで、そのポリペプチドは、MHCクラスI結合エピトープおよび/またはMHCクラスII結合エピトープを含む。
【００１６】
別の局面では、本発明は、PSCAを発現している腫瘍に対するT細胞応答を誘導する方法を提供し、前記方法は、前記腫瘍を有するかまたは前記腫瘍を除去された哺乳動物に、MHCクラスI結合エピトープを含むポリペプチドを含む組成物を投与することにより、PSCAに対するT細胞応答が哺乳動物に誘導される段階を含み、ここで、組成物は全腫瘍細胞を含まない。一部の態様では、腫瘍は、腫瘍が由来する正常組織に比べて前立腺幹細胞抗原を過剰発現している腫瘍である。例えば、一部の態様では、腫瘍は膵臓癌、膀胱癌または前立腺癌である。一部の態様では、哺乳動物はヒトであり、PSCAはヒトPSCAである。一部の態様では、MHCクラスI結合エピトープは、HLA-A2拘束性エピトープ、HLA-A3拘束性エピトープまたはHLA-A24拘束性エピトープである。一部の態様では、ポリペプチドはMHCクラスII結合エピトープをさらに含む。一部の態様では、ポリペプチドは、PSCAの複数のMHCクラスI結合エピトープを含む。一部の態様では、ポリペプチドは、哺乳動物により発現される対立遺伝子型のMHCクラスIと結合する複数のMHCクラスI結合エピトープを含む。一部の態様では、ポリペプチドはPSCAを含む。一部の態様では、T細胞応答はPSCA特異的CD8+T細胞の誘導を含む。一部の態様では、T細胞応答はPSCA特異的CD4+細胞の誘導をさらに含む。一部の態様では、組成物はアジュバントまたは非PSCA抗原をさらに含む。一部の態様では、組成物は、その哺乳動物における腫瘍の退行を誘導するか、または癌の進行を阻害するのに十分な量で投与される。一部の態様では、組成物は哺乳動物における癌の再発を遅延するまたは予防するために十分な量で投与され、ここで、哺乳動物は腫瘍を除去されている。一部の態様では、組成物は無細胞性である。一部の態様では、組成物は、ポリペプチドを発現している、細菌(例えばリステリア菌(Listeria monocytogenes))、ウイルスまたは酵母を含む組換えベクターを含む。
【００１７】
別の局面では、本発明は、PSCAを発現している腫瘍に対するT細胞応答を誘導する方法を提供し、前記方法は、前記腫瘍を有するかまたは前記腫瘍を除去された哺乳動物に、MHCクラスI結合エピトープを含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む組成物を投与することにより、PSCAに対するT細胞応答が哺乳動物に誘導される段階を含み、ここで、組成物は全腫瘍細胞を含まない。一部の態様では、腫瘍は、腫瘍(例えば膵臓癌、膀胱癌または前立腺癌)が由来する正常組織に比べて前立腺幹細胞抗原を過剰発現している腫瘍である。一部の態様では、哺乳動物はヒトであり、PSCAはヒトPSCAである。一部の態様では、MHCクラスI結合エピトープは、HLA-A2拘束性エピトープ、HLA-A3拘束性エピトープまたはHLA-A24拘束性エピトープである。一部の態様では、ポリペプチドはMHCクラスII結合エピトープをさらに含む。一部の態様では、ポリペプチドは複数のMHCクラスI結合エピトープを含む。一部の態様では、ポリペプチドは、哺乳動物により発現される対立遺伝子型のMHCクラスIと結合する複数のMHCクラスI結合エピトープを含む。一部の態様では、ポリペプチドはPSCAを含む。一部の態様では、T細胞応答はPSCA特異的CD8+T細胞の誘導を含む。一部の態様では、T細胞応答はPSCA特異的CD4+細胞の誘導をさらに含む。一部の態様では、組成物はアジュバントまたは非PSCA抗原をさらに含む。一部の態様では、組成物は、哺乳動物における腫瘍の退行を誘導するか、または癌の進行を阻害するのに十分な量で投与される。一部の態様では、組成物は、哺乳動物における癌の再発を遅延するまたは予防するのに十分な量で投与され、ここで、哺乳動物は腫瘍を除去されている。一部の態様では、組成物は無細胞性である。一部の態様では、組成物は、ポリヌクレオチドを含みポリペプチドを発現している細菌(例えばリステリア菌)、ウイルスまたは酵母を含む組換えベクターを含む。
【００１８】
なお別の局面では、本発明は、PSCAを発現している腫瘍を有するか、またはPSCAを発現している腫瘍を除去された哺乳動物における癌を処置する方法を提供し、方法は、哺乳動物に、MHCクラスI結合エピトープを含むポリペプチドを含む組成物を投与することにより、PSCAに対するT細胞応答が哺乳動物に誘導される段階、および哺乳動物を、化学療法、放射線、外科手術、ホルモン療法または追加の免疫療法でさらに処置する段階を含み、ここで、組成物は全腫瘍細胞を含まない。
【００１９】
別の局面では、本発明は、PSCAを発現している腫瘍を有するか、またはPSCAを発現している腫瘍を除去された哺乳動物における癌を処置する方法を提供し、方法は、哺乳動物に、MHCクラスI結合エピトープを含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む組成物を投与することにより、PSCAに対するT細胞応答が哺乳動物に誘導される段階、および哺乳動物を化学療法、放射線、外科手術、ホルモン療法または追加の免疫療法でさらに処置する段階を含み、ここで、組成物は全腫瘍細胞を含まない。
【００２０】
なお別の局面では、本発明は、哺乳動物において前立腺幹細胞抗原(PSCA)を発現している腫瘍に対するT細胞応答を発生させる方法を提供し、前記方法は、前記腫瘍を有するかまたは前記腫瘍を除去された哺乳動物に、PSCA特異的CD8+T細胞集団を含む有効量の組成物を投与する段階を含む。
【００２１】
さらなる局面では、本発明は、抗腫瘍ワクチンに有用であると組成物を同定する方法を提供し、方法は、組成物が投与された哺乳動物のリンパ球を試験して、前記リンパ球がPSCA特異的CD8+T細胞を含むかどうかを判定する段階を含み、ここで、PSCA特異的CD8+T細胞の存在は、組成物が腫瘍抗癌ワクチンに有用であることを指し示す。
【００２２】
別の局面では、本発明は、哺乳動物が抗腫瘍ワクチンに対して良好な応答を有しているかどうかを評価する方法を提供し、方法は、組成物が投与された哺乳動物のリンパ球を試験して、前記リンパ球がPSCA特異的CD8+T細胞を含むかどうかを判定する段階を含み、ここで、PSCA特異的CD8+T細胞の存在は、哺乳動物が抗腫瘍ワクチンに対して良好な応答を有していることを指し示す。
【００２３】
別の局面では、本発明は、ヒトにおいてPSCAを発現している腫瘍細胞に対するCD8+T細胞応答を誘導するワクチンを提供し、ワクチンは、ヒトPSCAのMHCクラスI結合エピトープを含むポリペプチドを含み、ここで、ワクチンは全腫瘍細胞ではない。一部の態様では、ワクチンはアジュバントをさらに含む。
【００２４】
なおさらなる局面では、本発明は、ヒトにおいてPSCAを発現している腫瘍細胞に対するCD8+T細胞応答を誘導するワクチンを提供し、ワクチンは、ヒトPSCAのMHCクラスI結合エピトープを含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含み、ここで、ワクチンは全腫瘍細胞ではない。一部の態様では、ワクチンはアジュバントをさらに含む。
【００２５】
前述の局面および本明細書に記載された他の局面のそれぞれの一部の態様では、MHCクラスI結合エピトープは、それが投与された哺乳動物により発現された対立遺伝子型のMHCクラスIに結合する。同様に、前述の局面および本明細書に記載された他の局面のそれぞれの一部の態様では、MHCクラスII結合エピトープは、それが投与された哺乳動物により発現された対立遺伝子型のMHCクラスIIに結合する。
【００２６】
前述の局面および本明細書に記載された他の局面のそれぞれの一部の態様では、MHCクラスI結合エピトープおよび/またはMHCクラスII結合エピトープを含むポリペプチドはPSCA(例えばヒトPSCA)を含む。
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明は、一部の局面では、免疫関連(immunologically relevant)腫瘍抗原としての前立腺幹細胞抗原(PSCA)の同定に関するものである。PSCAは腫瘍抗原として同定され、GM-CSF遺伝子を改変された同種膵臓癌ワクチンを用いたワクチン接種後に、腫瘍抗原に対するT細胞応答が誘発される。具体的には、正常な膵臓組織および他の正常な組織に比べて、膵臓癌で過剰発現されると遺伝子発現解析により実証された抗原(Argani et al, Cancer Research, 61:4320-4324 (2001))である前立腺幹細胞抗原(PSCA)由来のペプチドに対するT細胞応答が、GM-CSFを発現するように操作された同種膵臓腫瘍細胞系を用いて処置された膵臓癌患者で評価された(それぞれが全体として参照により本明細書に組み入れられる、Jaffee et al., J. of Clinical Oncology, 19:145-156 (2001)および米国公開特許第2005/0175625号を参照されたい)。処置された患者により発現されたHLA対立遺伝子(A2、A3、およびA24)に対応するHLA結合ペプチドが合成され、定量エリスポット(Elispot)アッセイに利用された。PSCA由来の多数のHLA A2結合ペプチド、ならびに二つのHLA A3結合ペプチドおよび二つのHLA 24結合ペプチドは、適切に一致したHLA対立遺伝子を発現している、ワクチン接種された膵臓癌患者由来のT細胞により実際に認識された。具体的には、膵臓癌ワクチンに対する臨床応答を示している患者3人中2人では、ワクチン接種後に適切なHLA PSCAペプチドに対して5倍を超えるT細胞前駆細胞数の増加が存在した。対照的に、匹敵する用量のワクチンを投与されたが、臨床応答を示さなかった患者は、ワクチン後にPSCAに応答しているT細胞数に有意な増大を示なかった。したがって、遺伝子改変された全細胞ワクチンに対する臨床応答と、ワクチンが誘導した、定量エリスポットアッセイで測定されたPSCAに対するT細胞応答の増大との間に良好な相関が存在した。これらの結果は、抗腫瘍免疫応答の発生のための関連標的および抗腫瘍免疫応答の発生のための関連マーカーとしてPSCAを規定するものである。
【００２８】
一部の態様では、PSCAは、ペプチド性ワクチン、ならびに核酸性ワクチン、組換えウイルス性ワクチン(ワクシニアウイルス(vaccinia virus)、牛痘(cow pox)、カナリヤ痘(canary pox)、アデノウイルス(adenovirus)、改変ワクシニアancra(modified vaccinia ancra)、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(Venezuelan equine encephalitis virus)など)、組換え細菌ワクチン(組換えリステリア(Listeria)、組換えサルモネラ(Salmonela)、組換えシゲラ(Shigella)など)、および組換え酵母ワクチンにPSCA遺伝子が組み込まれる組換えワクチンを含む他種類のワクチン製剤により、免疫療法に組み込まれる。一部の態様では、PSCAに対する免疫応答は、造血幹細胞へのPSCA遺伝子の導入に続く、移植および樹状細胞活性化因子の全身投与により発生する。一部の態様では、タンパク質、遺伝子、または特異的HLA拘束性ペプチドとしてのPSCA抗原を使用して、患者からPSCA特異的T細胞系およびクローンをインビトロで発生させることができるであろう。次に、癌を有する患者に細胞が養子移入される。別の態様では、PSCA特異的モノクローナル抗体を利用して、PSCAを過剰発現している癌を有する患者が処置される。または、一部の態様では、PSCA特異的T細胞からクローニングされたT細胞受容体をベクターに導入することができ、次に、続いてベクターは、自己T細胞に導入され、PSCA特異的T細胞集団が発生する。一部の態様では、PSCAのペプチド、タンパク質、または遺伝子を抗原提示細胞(具体的には樹状細胞)に負荷するために使用することができよう。抗原提示細胞は癌を有する患者を免疫処置するために利用される。
【００２９】
または、一部の態様では、PSCAは、様々な癌ワクチンおよび他の免疫療法を試験するためのマーカーとして利用される。これは、遺伝子および適切なベクター、タンパク質またはペプチドのいずれかを抗原提示細胞に負荷するために利用することによって行うことができ、抗原提示細胞は、細胞内サイトカインアッセイ、クロム放出アッセイまたは定量エリスポットアッセイにおいてT細胞を刺激するために利用されるであろう。加えて一部の態様では、同定されたPSCAペプチドを使用して、二量体または四量体の形態の拘束性HLA分子に負荷するために使用することができ、HLA分子は、頻度ならびにフローサイトメトリー染色を使用したPSCA特異的T細胞の数、細胞表面マーカーおよび機能の状態をモニターするための試薬として利用することができよう。
【００３０】
一局面では、本発明は、前立腺幹細胞抗原(PSCA)を発現している腫瘍に対するT細胞応答を誘導する方法を提供し、前記方法は、前記腫瘍を有するか、前記腫瘍を除去された哺乳動物に、MHCクラスI結合エピトープおよび/またはMHCクラスII結合エピトープを含むポリペプチドを含む組成物を投与することにより、PSCAに対するT細胞応答が哺乳動物に誘導される段階を含む。一部の態様では、組成物は全腫瘍細胞を含まない。
【００３１】
別の局面では、本発明は、前立腺幹細胞抗原(PSCA)を発現している腫瘍に対するT細胞応答を誘導する方法を提供し、前記方法は、前記腫瘍を有するか、前記腫瘍を除去された哺乳動物に、MHCクラスI結合エピトープおよび/またはMHCクラスII結合エピトープを含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む組成物を投与することを含むことにより、PSCAに対するT細胞応答が哺乳動物に誘導される段階を含む。一部の態様では、組成物は全腫瘍細胞を含まない。
【００３２】
別の局面では、本発明は、PSCAを発現している腫瘍を有するか、またはPSCAを発現している腫瘍を除去された哺乳動物における癌を処置する方法を提供し、方法は、哺乳動物に、MHCクラスI結合エピトープおよび/またはMHCクラスII結合エピトープを含むポリペプチドを含む組成物を投与することにより、PSCAに対するT細胞応答が哺乳動物に誘導される段階、および哺乳動物を化学療法、放射線、外科手術、ホルモン療法または追加的な免疫療法でさらに処置する段階を含む。一部の態様では、組成物は全腫瘍細胞を含まない。
【００３３】
別の局面では、本発明は、PSCAを発現している腫瘍を有するか、またはPSCAを発現している腫瘍を除去された哺乳動物における癌を処置する方法を提供し、方法は、哺乳動物に、MHCクラスI結合エピトープおよび/またはMHCクラスII結合エピトープを含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド含む組成物を投与することにより、PSCAに対するT細胞応答が哺乳動物に誘導される段階、および哺乳動物を化学療法、放射線、外科手術、ホルモン療法または追加的な免疫療法でさらに処置する段階を含む。一部の態様では、組成物は全腫瘍細胞を含まない。
【００３４】
なお別の局面では、本発明は、PSCAを発現している腫瘍細胞に対するT細胞応答をヒトに誘導するワクチンを提供し、そのワクチンは、MHCクラスI結合エピトープおよび/またはMHCクラスII結合エピトープを含むポリペプチドと、アジュバントとを含む。一部の態様では、ワクチンは全腫瘍細胞を含まない。
【００３５】
なお別の局面では、本発明は、PSCAを発現している腫瘍細胞に対するT細胞応答をヒトに誘導するワクチンを提供し、ワクチンは、MHCクラスI結合エピトープおよび/またはMHCクラスII結合エピトープを含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドと、アジュバントとを含む。一部の態様では、ワクチンは全腫瘍細胞を含まない。
【００３６】
さらなる局面では、本発明は、PSCAを発現している腫瘍細胞に対するT細胞応答をヒトに誘導するワクチンを提供し、ワクチンは、選択または改変前の腫瘍細胞系に比べて、ポリペプチドを過剰発現するように選択または改変された腫瘍細胞系由来の全細胞と、アジュバントとを含み、ここで、ポリペプチドはMHCクラスI結合エピトープおよび/またはMHCクラスII結合エピトープを含む。
【００３７】
別の局面では、本発明は、前立腺幹細胞抗原(PSCA)を発現している腫瘍に対するT細胞応答を誘導する方法を提供し、前記方法は、前記腫瘍を有するかまたは前記腫瘍を除去された哺乳動物に、選択または改変前の腫瘍細胞系に比べてポリペプチドを過剰発現するように選択または改変された腫瘍細胞系由来の全細胞を含む組成物を投与することにより、PSCAに対するT細胞応答が哺乳動物に誘導される段階を含み、ここで、ポリペプチドはMHCクラスI結合エピトープおよび/またはMHCクラスII結合エピトープを含む。
【００３８】
別の局面では、本発明は、前立腺幹細胞抗原(PSCA)を発現している腫瘍に対するT細胞応答を誘導する方法を含み、前記方法は、前記腫瘍を有するかまたは前記腫瘍を除去された哺乳動物に、MHCクラスI結合エピトープを含むポリペプチドを含む有効量の組成物を投与することにより、PSCAに対するT細胞応答が哺乳動物に誘導される段階を含み、ここで、組成物は全腫瘍細胞を含まない。
【００３９】
別の局面では、本発明は、前立腺幹細胞抗原(PSCA)を発現している腫瘍に対するT細胞応答を誘導する方法を提供し、前記方法は、前記腫瘍を有するかまたは前記腫瘍を除去された哺乳動物に、MHCクラスI結合エピトープを含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む有効量の組成物を投与することにより、PSCAに対するT細胞応答が哺乳動物に誘導される段階を含み、ここで、組成物は全腫瘍細胞を含まない。
【００４０】
なお別の局面では、本発明は、PSCAを発現している腫瘍を有するか、またはPSCAを発現している腫瘍を除去された哺乳動物における癌を処置する方法を提供し、方法は、哺乳動物に、MHCクラスI結合エピトープを含むポリペプチドを含む組成物を投与することにより、PSCAに対するT細胞応答が哺乳動物に誘導される段階、および哺乳動物を化学療法、放射線、外科手術、ホルモン療法または追加的な免疫療法でさらに処置する段階を含み、ここで、組成物は全腫瘍細胞を含まない。
【００４１】
別の局面では、本発明は、PSCAを発現している腫瘍を有するか、またはPSCAを発現している腫瘍を除去された哺乳動物における癌を処置する方法を提供し、方法は、哺乳動物に、MHCクラスI結合エピトープを含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド含む組成物を投与することにより、PSCAに対するT細胞応答が哺乳動物に誘導される段階、および哺乳動物を化学療法、放射線、外科手術、ホルモン療法または追加的な免疫療法でさらに処置する段階を含み、ここで、組成物は全腫瘍細胞を含まない。
【００４２】
なお別の局面では、本発明は、前立腺幹細胞抗原(PSCA)を発現している腫瘍に対するT細胞応答を哺乳動物に発生させる方法を提供し、前記方法は、前記腫瘍を有するかまたは前記腫瘍を除去された哺乳動物に、PSCA特異的CD8+T細胞集団を含む有効量の組成物を投与する段階を含む。
【００４３】
さらなる局面では、本発明は、抗腫瘍ワクチンに有用であると組成物を同定する方法を提供し、方法は、組成物が投与された哺乳動物のリンパ球を試験して、前記リンパ球がPSCA特異的CD8+T細胞を含むかどうかを判定する段階を含み、ここで、PSCA特異的CD8+T細胞の存在は、組成物が腫瘍抗癌ワクチンに有用であることを指し示す。
【００４４】
別の局面では、本発明は、哺乳動物が抗腫瘍ワクチンに対して良好な応答を有しているかどうかを評価する方法を提供し、方法は、組成物が投与された哺乳動物のリンパ球を試験して、前記リンパ球がPSCA特異的CD8+T細胞を含むかどうかを判定する段階を含み、ここで、PSCA特異的CD8+T細胞の存在は、哺乳動物が腫瘍抗癌ワクチンに対して良好な応答を有していることを指し示す。
【００４５】
別の局面では、本発明は、PSCAに対するCD8+T細胞応答を誘導するワクチンを提供し、ワクチンは、(a) MHCクラスI結合エピトープを含むポリペプチドと、(b)アジュバントまたは追加的な腫瘍抗原とを含む。
【００４６】
なおさらなる局面では、本発明は、PSCAに対するCD8+T細胞応答を誘導するワクチンを提供し、ワクチンは、(a) MHCクラスI結合エピトープを含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドと、(b)アジュバントまたは追加的な腫瘍抗原とを含む。
【００４７】
PSCAは、膵臓癌、前立腺癌、および膀胱癌などの多数の腫瘍に発現されることが公知である。このように、本発明のワクチンは、少なくともこれらの種類の腫瘍を処置するために有用である。同様にPSCAを発現している他の腫瘍もまた同様に処置することができる。処置される前立腺癌は、アンドロゲン非依存性前立腺癌またはアンドロゲン依存性前立腺癌のいずれかでありうる。一部の態様では、本明細書に記載された方法は、骨転移した前立腺癌を有する患者を処置するために使用される。
【００４８】
一部の態様では、腫瘍は、腫瘍が由来する正常組織に比べて前立腺幹細胞抗原を過剰発現している腫瘍である。PSCAは、前立腺癌(例えば、Reiter et al., PNAS, 95:1735-1740 (1998); Ross et al., American Journal of Pathology, 158:809-816; Lam et al., Clin. Cancer Res., 11:2591-2596 (2005); Zhigang et al., World Journal of Surgical Oncology, 2:13 (2004)を参照されたい)、膵臓癌(例えば、Argani et al., Cancer Research, 61:4320-4324 (2001); McCarthy et al., Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology, 11:238-243 (2003)を参照されたい)、および膀胱癌を含む多数の癌で過剰発現していると同定された。
【００４９】
一部の態様では、本発明のワクチンまたは他の組成物は、少なくとも一つのMHCクラスI結合エピトープまたは少なくとも一つのMHCクラスII結合エピトープを含むポリペプチドを含む。または、本発明のワクチンは、場合によっては少なくとも一つのMHCクラスI結合エピトープまたは少なくとも一つのMHCクラスII結合エピトープを含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む。場合によっては、ワクチンのポリペプチド(またはワクチンのポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド)は、PSCAのMHCクラスI結合エピトープおよび/またはPSCAのMHCクラスII結合エピトープを複数含む。ポリペプチドの多数のエピトープは同一または異なるMHC対立遺伝子分子と結合しうる。一態様では、ポリペプチドのエピトープは多様なMHC対立遺伝子分子と結合する。
【００５０】
MHCクラスI結合エピトープは本発明の実施に有効であるが、MHCクラスII結合エピトープもまた使用することができる。前者はCD8+T細胞を活性化するために、後者はCD4+T細胞を活性化するために有用である。公共利用できるアルゴリズムを使用して、MHCクラスI分子および/またはMHCクラスII分子に結合するエピトープを選択することができる。例えば、予測アルゴリズム「BIMAS」は、ペプチド/HLA複合体の予測される解離半減期により潜在的HLA結合エピトープを順位付けする(Parker et al., J. Immunol., 152: 163-175 (1994))。「SYFPEITHI」アルゴリズムは、第一HLA結合アンカー残基および第二HLA結合アンカー残基の存在を説明するスコアによりペプチドを順位付けする(Rammensee et al., Immunogenetics, 50: 213-219 (1999))。(Lu et al., Cancer Research 60, 5223-5227 (2000)も参照されたい)。両方のコンピュータアルゴリズムは、以前に公表されたHLA結合エピトープに類似した結合モチーフを有する所与のタンパク質内のアミノ酸配列に基づいて候補エピトープのスコアを付ける。さらなる生物学的試験のための候補を同定するために他のアルゴリズムもまた使用することができる。
【００５１】
細胞傷害性T細胞応答を生じる免疫処置用のポリペプチドは、場合によっては8から25アミノ酸残基長である。9アミノ酸残基長のポリペプチドが具体的に本明細書に開示されているが、それらの9アミノ酸残基長ポリペプチドの連続する8アミノ酸のうち任意のものを同様に使用することができる。このポリペプチドを他のようなエピトープポリペプチドに融合させることができるし、またポリペプチドをB-7、インターロイキン-2またはインターフェロン-γなどの担体に融合させることができる。融合ポリペプチドは、組換え産生または化学結合により、例えばヘテロ二官能基型結合試薬を使用して作成することができる。ポリペプチドの混合物を使用することができる。これらは、単一対立遺伝子型のMHC分子に対するエピトープの混合物、または多様な対立遺伝子型に対するエピトープの混合物のことがある。ポリペプチドは、一つのエピトープ配列の繰り返しまたは連続した異なるエピトープ配列を含むこともある。
【００５２】
ワクチンにおける免疫原としてのMHCクラスI結合エピトープまたはMHCクラスII結合エピトープの有効性は、エピトープを有するペプチドが、抗原提示細胞上のMHC分子に結合し、Tリンパ球を活性化させるために適切な条件で、かつ十分な時間でTリンパ球と接触する場合に、(PSCAを過剰発現している腫瘍が由来する正常組織に比べて)腫瘍に対して成功した免疫応答を有する個体由来のTリンパ球をペプチドが活性化できるかどうかを評価することにより評価することができる。
【００５３】
一部の態様では、本発明のワクチンまたは他の組成物はPSCAを含む。一部の態様では、本発明のワクチンまたは他の組成物はヒトPSCAを含む。一部の態様では、それらは少なくとも一つのMHCクラスI結合エピトープおよび/またはMHCクラスII結合エピトープ(例えばヒトPSCA)を有するポリペプチドを含む。一部の態様では、ポリペプチドはPSCAのフラグメントである。
【００５４】
ヒトPSCA配列は、例えばGenBankアクセッション番号第BC048808号、第AF043498号、第BC065183号、および第BC023582号に開示されている。ヒトPSCAのアミノ酸配列は、例えば、Reiterら、(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1735-1740）にも報告されている。
【００５５】
本発明のワクチンは、場合によっては、PSCAまたはPSCAをコードしているポリヌクレオチドを含む。例えばワクチンは、成熟型PSCA、PSCA遺伝子の一次翻訳産物、またはPSCA遺伝子の完全長翻訳産物を含むか、またはコードしうる。一態様では、ワクチンはPSCAのcDNAを含む。天然型PSCA(またはその型をコードしているポリヌクレオチド)の使用に加えて、PSCAのフラグメントを有するポリペプチドまたはPSCAのフラグメントをコードしているポリヌクレオチドをワクチンに使用することができる。ワクチン中のポリペプチドまたはワクチンのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、場合によってはPSCAと少なくとも約95%、少なくとも約90%、少なくとも約85%、少なくとも約80%、少なくとも約75%、少なくとも約70%、少なくとも約65%、少なくとも約60%、少なくとも約55%または少なくとも約50%同一である。
【００５６】
加えて、本発明のワクチンに使用されるMHCクラスI結合エピトープおよびMHCクラスII結合エピトープは、PSCA内の天然エピトープ配列と必ずしも配列が同一である必要はない。天然エピトープ配列は、必ずしもCTL応答を刺激するために最適なペプチドではない。(例えば、Parkhurst, M. R. et al., J. Immunol., 157:2539-2548, (1996); Rosenberg, S. A. et al., Nat. Med., 4:321-327, (1998)を参照されたい)。このように、エピトープがCTL応答をより容易に誘導するようにエピトープを改変することに有用性が存在しうる。一般に、エピトープを2種類の位置で改変することができる。MHC分子と相互作用すると予測されるアミノ酸残基でエピトープを改変することができ、この場合、目標は、MHC分子に対して親エピトープよりも高い親和性を有するペプチド配列を生み出すことである。CTL上のT細胞受容体と相互作用すると予測されたアミノ酸残基でエピトープを改変することもでき、この場合、目標は、T細胞受容体に対して親エピトープよりも高い親和性を有すエピトープを生み出すことである。これらの両種類の改変の結果として、親エピトープに関係するが、親エピトープよりもCTL応答をよりよく誘導することができる変異体エピトープが生じうる。一部の態様では、PSCAエピトープの免疫原性は、MHCクラスIプロセシング、MHCクラスIとの結合、および/またはT細胞受容体とMHC/ペプチド複合体との相互作用の最適化により改善することができる。例えば、Setteら、Tissue Antigens, 59:443-451 (2002)、Setteら、Current Opinion in Immunology, 15:461-470 (2003)、およびKershら、Nature, 380: 495-8 (1996)を参照されたい。
【００５７】
本発明の方法の適用により同定されたPSCAのMHCクラスI結合エピトープまたはPSCAのMHCクラスII結合エピトープは、一部の態様では、エピトープ配列内の、異なる、あるいは選択的な部位での一つまたは複数の残基の置換により可変されうる。当該置換は、例えば疎水性アミノ酸が別の疎水性アミノ酸に交換される場合などの、一つのアミノ酸が類似の構造および性質のアミノ酸に交換される保存的性質のものでありうる。ロイシンがイソロイシンに交換される場合などの、同一または類似のサイズおよび化学的性質のアミノ酸の交換はさらにいっそう保存的であろう。天然相同タンパク質ファミリーにおける配列変異の実験では、ある種のアミノ酸置換がその他の置換よりも許容されることが多く、これらは、本来のアミノ酸と交換物との間でサイズ、電荷、極性および疎水性の類似性と相関を示すことが多く、このことは「保存的置換」を定義するための基礎である。
【００５８】
保存的置換は、本明細書において以下の5群のうち一つの中での交換として定義される:第1群--小型脂肪族非極性または微極性残基(Ala、Ser、Thr、Pro、Gly);第2群--極性負荷電残基およびそれらのアミド(Asp、Asn、Glu、Gln)；第3群--極性正荷電残基(His、Arg、Lys);第4群--大型脂肪族非極性残基(Met、Leu、lie、Val、Cys)；および第4群--大型芳香族残基(Phe、Tyr、Trp)。酸性アミノ酸を異なる酸性アミノ酸に置換することもでき、または塩基性(すなわちアルカリ性)アミノ酸を異なる塩基性アミノ酸に置換することもできうる。あまり保存的でない置換は、アラニンからイソロイシン残基への交換などの、一つのアミノ酸から類似の性質を有するがサイズがいくらか異なる別のアミノ酸への交換を伴いうる。
【００５９】
好ましい態様では、MHCクラスI結合エピトープは、組成物が投与されるか、または投与される予定の哺乳動物により発現される対立遺伝子型のMHCクラスIに結合する。
【００６０】
一部の態様では、MHCクラスII結合エピトープは、組成物が投与されるか、または投与される予定の哺乳動物により発現される対立遺伝子型のMHCクラスIIに結合する。
【００６１】
一部の態様では、MHCクラスI結合エピトープは、HLA-A2拘束性エピトープ、HLA-A3拘束性エピトープ、および/またはHLA-A24拘束性エピトープである。一部の態様では、ワクチンとして使用される組成物は、下記実施例1の表1から選択される一つまたは複数のMHCクラスI結合エピトープを含むポリペプチド(または表1から選択される一つまたは複数のMHCクラスI結合エピトープを含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド)を含む。一部の態様では、組成物は、以下のペプチド番号からなる群より選択されるエピトープのうち一つまたは複数を含むポリペプチドを含む(表1参照):6318;6319;6321;6443;6444;6440;および6441。一部の態様では、組成物は、以下のペプチド番号からなる群より選択されるエピトープのうち一つまたは複数を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む(表1参照):6318;6319;6321;6443;6444;6440;および6441。
【００６２】
一部の態様では、ポリペプチドは一つのMHCクラスII結合エピトープを含む。一部の態様では、ポリペプチドはPSCAの複数のMHCクラスII結合エピトープを含む。一部の態様では、ポリペプチドは、哺乳動物により発現される対立遺伝子型のMHCクラスIIと結合する複数のMHCクラスII結合エピトープを含む。
【００６３】
一部の態様では、ポリペプチドは複数のMHCクラスI結合エピトープを含む。一部の態様では、ポリペプチドは、哺乳動物により発現される対立遺伝子型のMHCクラスIと結合する複数のMHCクラスI結合エピトープを含む。
【００６４】
一部の態様では、組成物は無細胞性である。例えば、組成物はサブユニットワクチンまたはDNAワクチンでありうる。
【００６５】
一部の態様では、本発明のワクチンおよび他の組成物は、PSCAを含むポリペプチドを含み、一部の態様では、ポリペプチドはヒトPSCAを含む。
【００６６】
一部の態様では、本発明のワクチンおよび他の組成物は、PSCA(例えばヒトPSCA)を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む。
【００６７】
一部の態様では、組成物は、抗原提示細胞(APC)(例えば樹状細胞)などの細胞を含む。抗原提示細胞には、マクロファージ、樹状細胞およびB細胞などの細胞型が挙げられる。他のプロフェッショナル抗原提示細胞には、単球、辺縁帯クッパー細胞、ミクログリア、ランゲルハンス細胞、指状嵌入(interdigitating)樹状細胞、濾胞樹状細胞およびT細胞が挙げられる。通性(facultative)抗原提示細胞も使用することができる。通性抗原提示細胞の例には、星状細胞、濾胞細胞、内皮細胞および線維芽細胞が挙げられる。
【００６８】
一部の態様では、組成物は、ポリペプチドを含み、かつポリペプチドを発現している細菌(例えばリステリア菌)、ウイルスまたは酵母を含む組換えベクターを含む。
【００６９】
本明細書において記載された組成物は、ポリペプチドを発現および/もしくは分泌するように、またはポリヌクレオチドの送達に続いて、ポリヌクレオチドがワクチン接種された個体の細胞に発現および/または分泌されるように形質転換された細菌細胞を含むことがある。
【００７０】
プラスミドおよびウイルスベクターは、例えば宿主細胞に腫瘍抗原タンパク質を発現させるために使用することができる。宿主細胞は任意の原核細胞または真核細胞でありうる。このように、例えばPSCAポリペプチドのクローニングに由来し、完全長タンパク質の全てまたは選択された部分をコードしているヌクレオチド配列を使用して、微生物または真核生物の細胞過程を介して組換え型のPSCAポリペプチドを産生させることができる。コード配列をベクターにライゲートすることができ、負荷されたベクターは、真核細胞(例えば、酵母、鳥類、昆虫類、もしくは哺乳類)または原核細胞(細菌)のいずれかである宿主を形質転換するまたは宿主にトランスフェクトするために使用することができる。このような技法は、当技術分野で周知の標準的な手順を伴う。
【００７１】
典型的には、インビボまたはインビトロでポリペプチドを発現させるために使用される発現ベクターは、少なくとも一つの転写調節配列に機能的に連結している抗原ポリペプチドをコードしている核酸を含む。調節配列は当技術分野で認識されており、所望のやり方(時間および場所)で対象タンパク質の発現を指令するようにその調節配列を選択することができる。転写調節配列は、例えばGoeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。
【００７２】
HLA結合エピトープを含むポリペプチドの発現に適したベクターには、以下の種類のプラスミドが挙げられる：大腸菌などの原核細胞に発現させるためのpBR322由来プラスミド、pEMBL由来プラスミド、pEX由来プラスミド、pBTac由来プラスミド、およびpUC由来プラスミド。哺乳動物発現ベクターは、細菌におけるベクターの増殖を容易にするための原核生物配列および真核生物配列の両方、ならびに真核細胞で発現させることのできる一つまたは複数の真核生物転写ユニットを含みうる。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neoおよびpHyg由来ベクターは、真核細胞のトランスフェクションに適した哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターの一部は、原核細胞および真核細胞の両方での複製および選択を容易にするために、pBR322などの細菌プラスミド由来配列を用いて改変されている。または、ウシパピローマウイルス(BPV-1)またはEpstein-Barrウイルスなどのウイルスの誘導体(pHEBo、pREP由来およびp205)を、真核細胞でのタンパク質の一過性発現のために使用することができる。ワクシニアウイルスベクターおよび鳥類ウイルスベクターもまた使用することができる。ベクターの調製および宿主生物の形質転換に採用することができる方法は、当技術分野で周知である。他に適した発現系は当業者に周知である。
【００７３】
他の種類の発現カセットも使用することができる。例えば、ウイルス性ベクター、細菌性ベクター、および酵母性ベクターに関して下に記載された参照は、本発明に使用することができる追加的な発現ベクターを例示している。
【００７４】
本発明の別の態様では、本明細書に記載されたポリペプチドまたはポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、酵母を含む免疫原性組成物の形で宿主生物に送達される。抗原デリバリーのための生きた酵母性DNAワクチンベクターの使用が最近解説されており、腫瘍抗原またはHIV-1抗原を発現している組換えサッカロミセスセレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)全酵母を用いたマウスモデルにおいて有効であると報告されている(Stubbs et al. (2001) Nature Medicine 7: 625-29を参照されたい)。
【００７５】
生きた酵母ワクチンベクターの使用は当技術分野で公知である。さらに、その内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,830,463号は、本発明への使用に特に有用なベクターおよび系を記載している。酵母が追加のアジュバントの不在下でさえも細胞性免疫を誘発すると思われることから、酵母デリバリーシステムの使用は、本発明の腫瘍/癌ワクチンの方法および製剤への使用に特に有効でありうる。一部の態様では、酵母ワクチンデリバリーシステムは、免疫応答を調節することができる少なくとも一つの組換え発現系を有する非病原性酵母である。
【００７６】
細菌もまた、本発明のエピトープのための担体として使用することができる。典型的には、使用される細菌は突然変異体または組換え体である。細菌は、場合によっては弱毒化されている。例えば、ワクチンとしての使用のためにフレクスナー赤痢菌(Shigella flexneri)、大腸菌、リステリア菌、エルシニアエンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、チフス菌(Salmonella typhi)またはマイコバクテリウムを非限定的に含むいくつかの細菌種が開発されており、細菌種を本発明に使用することができる。免疫原性組成物に使用される細菌ベクターは、通性細胞内細菌ベクターでありうる。本明細書に記載されたポリペプチドを宿主生物中の抗原提示細胞に送達するために細菌を使用することができる。抗原送達のための生きた細菌ワクチンベクターの使用が総説されている(例えば、Medina and Guzman (2001) Vaccine 19: 1573-1580; Weiss and Krusch, (2001) Biol. Chem. 382: 533-41;およびDarji et al. (2000) FEMS Immunol and Medical Microbiology 27: 341-9を参照されたい)。さらに、その内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,261,568号および第6,488,926号は、癌ワクチンに有用な系を記載している。
【００７７】
細菌に仲介される遺伝子移入は、プラスミドの筋肉内投与、皮内投与または経口投与による遺伝子ワクチン接種に特に有用であり、そのようなワクチン接種は、ワクチンを接種された対象での抗原発現を誘導する。さらに一部の態様では、細菌はアジュバント効果および免疫系の誘導部位をターゲッティングする能力を提供することができる。さらに、細菌性ワクチンベクターは、ほぼ無限のコーディング容量を有する。細菌性担体の使用は、粘膜または経口の直接デリバリーの可能性などのなお他の重大な有益性と関連することが多い。(生きた、ウイルス性または細菌性のワクチン担体以外にさらに)使用することができる他の粘膜直接デリバリーシステムには、粘膜アジュバント、ウイルス粒子、ISCOM、リポソーム、および微粒子が挙げられる。
【００７８】
弱毒化微生物を含む微生物は、ワクチン抗原の担体としてうまく使用されている。一部の態様では、本発明に使用することができる弱毒化粘膜病原体には、リステリア菌、サルモネラ種(Salmonella spp.)、コレラ菌(V. cholorae)、シゲラ種(Shigella spp.)、マイコバクテリウム、Y.エンテロコリチカが挙げられる。本発明に使用することができる市販の株には、S.ゴルドニイ(S. gordonii)、ラクトバチルス種(Lactobacillus spp.)、およびスタフィロコッカス種(Staphylococcus spp.)が挙げられる。製剤に使用される担体株の遺伝的背景、弱毒化を実現するために選択された突然変異の種類、および免疫原の内因的性質を、誘発される免疫応答の程度および質を最適化するように調整することができる。細菌担体により刺激される免疫応答を最適化するために考慮されるべき一般的要因には、担体の選択;特異的バックグラウンド株、弱毒化突然変異、および弱毒化レベル;弱毒化表現型の安定化および最適投与量の確立が挙げられる。考慮すべき他の抗原関連要因には、抗原の内因的性質;発現系、抗原表出形式、および組換え表現型の安定化;調節分子の同時発現およびワクチンの接種スケジュールが挙げられる。
【００７９】
ネズミチフス菌は、本発明の免疫原性組成物における細菌性ベクターとして使用することができる。ワクチン用の有効なベクターとしてのこの細菌の使用は、当技術分野において実証されている。例えば、経口体細胞導入遺伝子ワクチン接種のための弱毒化ベクターとしてのネズミチフス菌の使用が記載されている(例えば、Darji et al. (1997) Cell 91: 765-775; およびDarji et al. (2000) FEMS Immun and Medical Microbiology 27: 341-9を参照されたい)。実際に、細菌介在性遺伝子移入の大部分の知識は、担体として弱毒化ネズミチフス菌を使用して獲得された。使用された二つの代謝的に弱毒化された株には、芳香族アミノ酸を合成することができないネズミチフス菌aroAおよびプリン代謝を欠損しているネズミチフス菌22-11が挙げられる。これらの担体を使用していくつかの抗原が発現されており、最初にリステリオリシンおよびactA(リステリア菌の二つの病原因子)ならびに大腸菌のベータ-ガラクトシダーゼ(β-gal)がうまく試験された。組換えサルモネラの単回投与の経口適用後にこれらの抗原に対する細胞傷害性T細胞およびヘルパーT細胞、ならびに特異的抗体を検出することができた。加えて、リステリオリシンをコードしている発現プラスミドを有するサルモネラを用いた免疫処置は、リステリア菌を用いた致死的攻撃に対する防御応答を誘発した。導入遺伝子の経口ワクチン接種の方法論が、単純ヘルペスウイルス2型およびB型肝炎感染モデルでの防御応答を含むように今や拡張されており、細胞性免疫応答は粘膜レベルで検出されている。
【００８０】
β-galを代替腫瘍抗原として使用する腫瘍モデルにおいて、浸潤性線維肉腫に対する部分的な防御免疫が、β-galをコードしているプラスミドを有するサルモネラを経口投与することにより誘導された(Paglia et al. (1998) Blood 92: 3172-76を参照されたい)。マウス腎細胞癌系RENCAのβ-gal発現性トランスフェクタントを使用した類似の実験において、ZllerおよびChrist (Woo et al. (2001) Vaccine 19: 2945-2954)は、裸のDNAを使用することに対照的に、抗原をコードしているプラスミドを細菌担体中に送達した場合に優れた効率を実証した。興味深いことに、サルモネラを使用してマウス黒色腫B16に対する腫瘍成長遅延応答を誘導することができる。このサルモネラは、ユビキチンに融合した自己腫瘍抗原gp100およびTRP2のエピトープをコードしているミニ遺伝子を有する。これは、そのような状況で自己抗原に対する末梢性トレランスが克服されうることを示唆している。これは、マウス神経芽腫系での自己抗原としてチロシンヒドロキシラーゼのエピトープの類似の構築体を使用して、同グループ(Lode et al. (2000) Med Ped Oncol 35: 641-646)により確認された。さらに、これらの発見は、膜結合型の完全なヒト発癌性抗原(hCEA)をコードしているプラスミドを使用して、hCEAについてトランスジェニックであるマウスを免疫処置することにより最近広がった。この場合、hCEA発現性結腸癌系が試験され、エフェクター期のアジュバントとしてのインターロイキン2(IL-2)の全身適用により、腫瘍を用いた致死的攻撃を改善することができた(Xiang et al. (2001) Clin Cancer Res 7: 856s-864sを参照されたい)。
【００８１】
本明細書に記載された免疫原性組成物に使用することができる別の細菌性ベクターはチフス菌である。免疫処置に通常使用されるチフス菌株であるTy21a galEは、細胞壁合成に不可欠な構成要素を欠如している。最近開発された改良株には、グアニン生合成経路の必須酵素をコードしているguaBAにおける突然変異によって弱毒化された株が挙げられる(Pasetti et al., Infect. Immun. (2002) 70:4009-18; Wang et al., Infect. Immun. (2001) 69:4734-41; Pasetti et al., Clin. Immunol. (1999) 92:76-89)。DNAワクチン用の送達ベクターとしてのチフス菌および他のサルモネラ株の使用を記載している追加の参照には以下のものが挙げられる：Lundin, Infect. Immun. (2002) 70:5622-7; Devicoら、ワクチン、(2002) 20:1968-74; Weissら、Biol. Chem. (2001) 382:533-41;およびBumannら、FEMS Immunol. Med. Microbiol. (2000) 27:357-64。
【００８２】
本発明のワクチンおよび免疫原性組成物は、デリバリービヒクルとしてフレクスナー赤痢菌を採用することができる。フレクスナー赤痢菌は、宿主細胞の空胞からサイトゾルに回避することから、細菌性DNA移入ビヒクルの原型に相当する。フレクスナー赤痢菌のいくつかの弱毒化突然変異体は、細胞系にDNAをインビトロ移入するためにうまく使用されている。栄養要求性株は、細胞壁合成(Sizemore et al. (1995) Science 270: 299-302およびCourvalin et al. (1995) C R Acad Sci Ser III, 318: 1207-12)、芳香族アミノ酸の合成(Powell et al. (1996) Vaccines 96: Molecular Approaches to the Control of Infectious Disease; Cold Spring Harbor Laboratory Press)またはグアニンヌクレオチドの合成(Anderson et al. (2000) Vaccine 18: 2193-2202)を欠損していた。
【００８３】
一部の態様では、本発明のワクチンおよび免疫原性組成物は、リステリア菌を含む(Portnoy et al, Journal of Cell Biology, 158:409-414 (2002); Glomski et al., Journal of Cell Biology, 156:1029-1038 (2002))。リステリア菌がワクチンベクターとして役立つ能力は、Wesikirchら、Immunol. Rev. 158:159-169 (1997)に総説されている。リステリア菌株は、異種タンパク質の効果的な細胞内デリバリービヒクルとして最近開発され、癌(米国特許第6,051,237号; Gunn et al., J. Of Immunology, 167:6471-6479 (2001); Liau, et al., Cancer Research, 62: 2287-2293 (2002); 米国特許第6,099,848号; WO99/25376; およびWO96/14087)およびHIV(米国特許第5,830,702号)などの疾患起炎因子の注射を許容しない臨床状態に対して免疫応答を誘導するために、免疫系への抗原の送達を提供する。リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)抗原を発現している組換えリステリア菌ワクチンもまた、抗原に対して細胞性防御免疫を誘導することが示されている(Shen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 3987-3991 (1995)。
【００８４】
通性細胞内細菌として、リステリア菌は体液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方を誘発する。リステリアは、宿主生物の細胞に侵入後に、リステリアが宿主貪食細胞のファゴリソソームからその細胞のサイトゾルに回避することを可能にするリステリア特異的タンパク質を産生する。ここで、リステリア菌は、生存に必要なタンパク質を発現しながらだけでなく、リステリアプロモータに機能的に連結している異種遺伝子も発現しながら増殖する。MHCタンパク質による貪食細胞表面上でのこれらの異種タンパク質のペプチド提示は、T細胞応答の発生を許す。ワクチンとして使用するための細菌に異種遺伝子を導入するために有用な二つの組み込みベクターには、Lauerら、Journal of Bacteriology, 184: 4177-4186 (2002)に記載されているようにpL1およびpL2が挙げられる。
【００８５】
加えて、免疫原性組成物に有用な弱毒化型のリステリア菌が産生されている。リステリア菌のActAタンパク質は、細胞内移動を担うアクチンの動員および重合事象を促進するのに十分である。ヒトの安全性実験は、actA/plcB欠失弱毒化型のリステリア菌の経口投与が成人に重症の続発症を起こさなかったと報告している(Angelakopoulos et al., Infection and Immunity, 70:3592-3601 (2002))。他の種類の弱毒化型リステリア菌もまた記載されている(例えば、異種抗原を発現している栄養要求性弱毒化リステリア株を記載しているWO99/25376および米国特許第6,099,848号を参照されたい)。異種抗原を発現することができ、ワクチン中の組換えベクターとして使用されることができる追加的な弱毒化型のリステリア菌は、例えば、それぞれが全体として参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第2004/0228877号、第2004/0197343号、第2005/0249748号、および第2005/0281783号に記載されている。
【００８６】
エルシニアエンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)は、本発明の免疫原性組成物における細菌性ベクターとして場合によっては使用することができる別の細胞内細菌である。ワクチンベクターとしてのエルシニアエンテロコリチカ弱毒化株の使用は、PCT公開公報WO02/077249に記載されている。
【００８７】
本発明のさらなる態様では、本発明の免疫原性組成物は、カルメット-ゲラン菌(Bacillus Calmette-Guerin)(BCG)などのマイコバクテリウムを含む。カルメット-ゲラン菌は、マウスモデルにおいてワクチンベクターとして使用されている(Gicquel et al., Dev. Biol. Stand 82:171-8 (1994))。Stoverら、Nature 351: 456-460 (1991)も参照されたい。
【００８８】
または、ウイルス性ベクターを使用することができる。ウイルス性ベクターは、典型的には高度弱毒化非複製ウイルスを含むものである。ウイルスベクターには、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ニューカッスル病(Newcastle disease)ウイルスなどの鳥類ウイルス、ワクシニアウイルスなどのポックスウイルス、およびアデノ随伴ウイルスを含むパルボウイルスなどのDNAウイルスベクター；ならびにレトロウイルスベクターを非限定的に含むRNAウイルスベクターが挙げられるが、それに限定されるわけではない。ワクシニアベクターおよび免疫プロトコールに有用な方法は、米国特許第4,722,848号に記載されている。レトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス、およびヒト免疫不全ウイルスなどのレンチウイルスが挙げられる。Naldiniら (1996) Science 272:263-267。レトロウイルスゲノムの部分として本発明のポリヌクレオチドを有する複製欠損レトロウイルスベクターを使用することができる。当該ベクターは詳細に記載されている。(Miller, et al. (1990) Mol. Cell Biol. 10:4239; Kolberg, R. (1992) J. NIH Res. 4:43; Cornetta, et al. (1991) Hum. Gene Therapy 2:215)。
【００８９】
本発明に有用なアデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターは、当技術分野ですでに教示された方法により産生することができる。(例えばKarlsson, et al. (1986) EMBO 5:2377; Carter (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzcyzka (1992) Current Top. Microbiol. Immunol. 158:97-129; Gene Targeting: A Practical Approach (1992) ed. A. L. Joyner, Oxford University Press, NYを参照されたい)。いくつかの異なる取り組みを実行できる。
【００９０】
ベネズエラウマ脳炎(Venezuelan Equine Encephalitis)(VEE)ウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス(Semliki Forest virus)(SFV)ベクター、およびシンドビス(Sindbis)ウイルスベクターなどのアルファウイルスベクターを効率的な遺伝子デリバリーに使用することができる。複製欠損ベクターを入手することができる。例えば鼻腔内または腫瘍内などの当技術分野で公知の様々な手段のうち任意のものにより当該ベクターを投与することができる。Lundstrom, Curr. Gene Ther. 2001 1:19-29を参照されたい。
【００９１】
本発明の方法に使用することができるであろうウイルスベクターを記載している追加的な参照には以下のものが挙げられる：Horwitz, M. S., Adenoviridae and Their Replication, in Fields, B.ら、(eds.) Virology, 第2巻, Raven Press New York, pp. 1679-1721, 1990); Graham, F.ら、pp. 109-128 in Methods in Molecular Biology, 第7巻: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray, E. (ed.), Humana Press, Clifton, N.J. (1991); Millerら、(1995) FASEB Journal 9:190-199, Schreier (1994) Pharmaceutica Acta Helvetiae 68:145-159; Schneider and French (1993) Circulation 88:1937-1942; Curielら、(1992) Human Gene Therapy 3:147-154; WO95/00655; WO95/16772; WO95/23867; WO94/26914; WO95/02697(1995年1月26日)；およびWO95/25071。
【００９２】
別の形態のワクチンでは、DNAは、細胞表面受容体をターゲッティングすることの多いリポソームまたはリガンドと複合体化される。この複合体は、分解からDNAを保護することを助け、プラスミドを特異的組織にターゲッティングすることを助ける点で有用である。この複合体は、典型的には静脈内または筋肉内に注射される。
【００９３】
ワクチンとして使用されるポリヌクレオチドを、コロイド分散系との複合体にして使用することができる。コロイド系には、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースの系が挙げられる。本発明の好ましいコロイド系は、脂質と複合体化したDNAまたはリポソーム製剤化されたDNAである。前者の取り組みでは、例えば脂質を用いてDNAを製剤化する前に、所望のDNA構築体を有する導入遺伝子を含むプラスミドを最初に発現のために実験的に最適化することができる(例えば、5'非翻訳領域でのイントロンの包含および不必要な配列の除去(Felgner, et al., Ann NY Acad Sci 126-139, 1995)。次に、例えば、様々な脂質物質またはリポソーム物質を用いたDNAの製剤を、公知の方法および物質を使用して実施し、レシピエントである哺乳動物に送達することができる。例えば、Canonicoら、Am J Respir Cell Mol Biol 10:24-29, 1994; Tsanら、Am J Physiol 268; Altonら、Nat Genet. 5:135-142, 1993および米国特許第5,679,647号を参照されたい。
【００９４】
加えて、複合コアセルベーションは、二つの反対に荷電したポリ電解質が水溶液中で混合される場合に起きる自然相分離の過程である。2種の高分子間の静電相互作用の結果として、上清(低ポリマー相)からのコアセルベート(高ポリマー相)の分離が生じる。この現象を使用してミクロスフェアを形成させ、多様な化合物をカプセル封入することができる。カプセル封入工程を完全に水溶液中で低温で行うことができ、したがって、この工程はカプセル封入物の生体活性を保つ可能性が十分にある。注射用放出制御系の開発にあたり、数個の薬物およびタンパク質をカプセル封入するためのゼラチンおよびコンドロイチン硫酸の複合コアセルベーションが利用されており(Truong, et al. (1995) Drug Delivery 2: 166を参照されたい)、癌ワクチン接種のためにサイトカインがこれらのミクロスフェアにカプセル封入されている(Golumbek et al. (1993) Cancer Res 53: 5841を参照されたい)。骨関節炎の処置のために関節に関節内送達するため、抗炎症薬も組み込まれている(Brown et al. (1994) 331: 290)。米国特許第6,193,970号、第5,861,159号および第5,759,582号は、本発明のDNAワクチンデリバリーシステムとして使用するための複合コアセルベートの組成物および使用方法を記載している。特に米国特許第6,475,995号は、経口投与された場合に有効なワクチンとして役立つ核酸およびポリカチオンのナノ粒子コアセルベートを利用するDNAワクチンデリバリーシステムを教示している。
【００９５】
本発明は、哺乳動物において抗腫瘍免疫応答を誘導することができる多様な免疫原性組成物を提供する。誘導された免疫応答は、場合によっては細胞性免疫応答、体液性免疫応答またはその両方である。
【００９６】
一部の態様では、免疫応答は、PSCA特異的CD8+T細胞および/またはPSCA特異的CD4+T細胞の誘導を含むT細胞応答である。
【００９７】
一部の態様では、本明細書に記載された組成物は免疫原性である。一部の態様では、免疫原性組成物は癌の処置のためのワクチンとして有用である。一部の態様では、本明細書に記載された組成物は薬学的組成物である。
【００９８】
一部の態様では、組成物は、哺乳動物における腫瘍の退行を誘導するか、または癌の進行を阻害するのに十分な量で投与される。一部の態様では、組成物は哺乳動物における癌の再発を遅延するまたは予防するのに十分な量で投与され、ここで、哺乳動物は腫瘍を除去されている。
【００９９】
本明細書に使用されるように、本明細書に記載された組成物を用いた癌の処置のプラス効果には、一つまたは複数の以下のプラス効果が挙げられるが、それに限定されるわけではない:腫瘍の退行誘導、癌の進行阻害、癌の再発阻害、癌に関連する疼痛の減少、および/または生存率の増加。
【０１００】
他の態様では、哺乳動物はマウスまたは霊長類である。一部の態様では、哺乳動物はラット、マウス、サル、ウサギまたはモルモットである。
【０１０１】
本明細書に記載された全ての組成物の有効性を、マウスモデルなどの動物モデルで評価することができる。ヒト前立腺癌のための一つの樹立された動物モデルは、マウス前立腺のトランスジェニック腺癌(TRAMP)である(例えば、Ross et al., American Journal of Pathology, 158: 809-816 (2001); Yang et al., Cancer Research, 61:5857-5860 (2001); Drake et al., Cancer Cell, 7:239-249 (2005)を参照されたい)。加えて、様々なヒト前立腺および膵臓癌の異種移植マウスモデルは、抗PSCA治療抗体および免疫複合体の有効性を試験するためにうまく使用されている(例えば、Gu et al., Cancer Res., 65: 9495-9500 (2005); Saffran et al., PNAS, 98:2658-2663); Ross et al., Cancer Research 62:2546-2553 (2002);およびWente et al., Pancreas 31:119-125 (2005)を参照されたい)。
【０１０２】
非限定的な例として、マウスモデルにおいて候補癌ワクチンを試験するために、所望の腫瘍抗原を含む候補ワクチンを、PSCAを発現している腫瘍細胞系を用いた攻撃の前または後のいずれかにマウスの集団に投与することができる。このように、マウスモデルを使用して、候補ワクチンの治療効果および予防効果の両方を試験することができる。候補ワクチンを用いたワクチン接種を、ワクチン接種されていないか、ビヒクル単独をワクチン接種されたか、または無関係な抗原を含むワクチンをワクチン接種されたいずれかの対照集団と比較することができる。ワクチンが組換え微生物であるならば、相対有効性を、ゲノムが抗原を発現するように改変されていない微生物集団と比較することができる。候補ワクチンの有効性を、腫瘍体積に及ぼす作用または生存率により評価することができる。候補ワクチンをワクチン接種されたマウスにおける腫瘍体積は、ワクチン接種されていないか、またはビヒクルもしくは無関係な抗原を発現している(もしくは別の方法で含む)ワクチンをワクチン接種されたかのいずれかのマウスでの腫瘍体積よりも約5%、約10%、約25%、約50%、約75%、約90%または約100%小さいことがある。腫瘍体積の差は、マウスに腫瘍細胞を移植した少なくとも約10日後、少なくとも約17日後または少なくとも約24日後に観察することができる。核酸で改変された微生物を用いてワクチン接種されたマウスにおける生存期間の中央値は、ワクチン接種されていないか、またはビヒクルもしくは無関係な抗原を含むワクチンをワクチン接種されたかのいずれかのマウスよりも 少なくとも約2日、少なくとも約5日、少なくとも約7日または少なくとも約10日長いことがある。
【０１０３】
T細胞性細胞傷害応答を誘導するために、当技術分野で公知の任意の手段により本発明のワクチンを投与することができる。これらの手段には、経口投与、静脈内注射、経皮的乱切、皮下注射、筋肉内注射、および鼻腔内投与が挙げられる。ワクチンは遺伝子銃により皮内投与することができる。DNAで被覆された金粒子を遺伝子銃に使用することができる。当技術分野で公知の他の接種経路を使用することができる。
【０１０４】
一部の態様では、本明細書に記載されたワクチンおよび他の組成物はアジュバントを含む。本明細書に使用されるアジュバントは、PSCA抗原が免疫系を刺激する能力を増大させる。アジュバントには、B7補助刺激分子、インターロイキン-2、インターフェロン-γ、GM-CSF、CTLA-4アンタゴニスト、OX-40/OX-40リガンド、CD40/CD40リガンド、サルグラモスチン、レバミソール、ワクシニアウイルス、カルメット-ゲラン菌(BCG)、リポソーム、ミョウバン、フロイントの完全アジュバントまたは不完全アジュバント、無毒化エンドトキシン、鉱物油、界面活性物質(リポレシチン、プルロニック(pluronic)ポリオール、ポリアニオン、ペプチドなど)、および油性または炭化水素性エマルションが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。抗体応答に対して細胞傷害性T細胞応答を刺激するアジュバントが好ましいが、両方の種類の応答を刺激するアジュバントも同様に使用することができる。一部の態様では、ワクチンが免疫応答を引き起こす、増強するまたは延長する能力を増大させるために、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムなどのアジュバントが添加される。サイトカイン、ケモカイン、およびCpGなどの細菌性核酸配列などの追加の物質も潜在的アジュバントである。アジュバントの他の代表的な例には、キラヤ(Quillaja saponaria)の樹皮から精製された均一なサポニンおよびコリネバクテリウムパルブム(Corynebacterium parvum)を含む合成アジュバントQS-21が挙げられる(McCune et al., Cancer, 1979; 43:1619)。アジュバントは最適化に供されることが了解されているものである。言い換えれば、当業者は、使用に最良のアジュバントを決定するために日常的な実験に従事することができる。
【０１０５】
保存料、安定化剤、佐剤、抗生物質、および他の物質などのさらなる添加物を同様に使用することができる。特に多回使用または多回投与を意図するワクチンバイアルで生じうるような、不注意な混入に起因する細菌または真菌の成長を遅延または停止させるために、チメロサールまたは2-フェノキシエタノールなどの保存料を添加することができる。乳糖またはグルタミン酸一ナトリウム(MSG)などの安定化剤を添加して、温度の変動または凍結乾燥工程などの様々な条件に対してワクチン製剤を安定化させることができる。
【０１０６】
ウイルスベクターを使用して、PSCAエピトープを含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを投与することができる。当該ウイルスベクターには、ワクシニアウイルスおよびニューカッスル病ウイルスなどの鳥類ウイルスが挙げられる。当技術分野で公知であるように他のウイルスも使用することができる。
【０１０７】
ポリペプチドワクチンを投与するための特定の一方法は、APCまたは樹状細胞にポリペプチドをインビトロでパルスすることによる。ポリペプチドはAPCまたは樹状細胞表面のMHC分子に結合する。インターフェロン-γを用いたAPCまたは樹状細胞の前処理を使用して、APCまたは樹状細胞上のMHC分子数を増大させることができる。次に、パルスされた細胞を、ポリペプチドについての担体として投与することができる。ペプチドパルスはMeleroら、Gene Therapy 7:1167 (2000)に教示されている。
【０１０８】
裸のDNAを宿主に直接注射して免疫応答を生み出すことができる。そのような裸のDNAワクチンを、ヒトの筋肉組織に筋肉内に、または典型的にはバイオリスティック(biolistic)介在性遺伝子移入(すなわち遺伝子銃)を使用して、ワクチンDNAの経皮デリバリーもしくは皮内デリバリーを介して注射することができる。DNA免疫処置用の遺伝子銃および筋肉注射デリバリー戦略を記載している最近の総説には、Tuting, Curr. Opin. Mol. Ther. (1999) 1: 216-25、Robinson, Int. J. Mol. Med. (1999) 4: 549-55、およびMumper and Ledbur, Mol. Biotechnol. (2001) 19: 79-95が挙げられる。プラスミドDNAを送達するための他の可能性のある方法には、エレクトロポレーションおよびイオン泳動が挙げられる。
【０１０９】
別の可能性のある遺伝子デリバリーシステムは、DNAおよびポリカチオン性リポソームの間で形成されたイオン複合体を含む(例えば、Caplen et al. (1995) Nature Med. 1: 39を参照されたい)。静電相互作用により相互に結合しているため、生物学的流体中の高分子電解質の電荷スクリーニング効果が原因でこれらの複合体は解離することがある。強塩基性脂質組成物が複合体を安定化することができるが、当該脂質は細胞毒性であるおそれがある。DNAを送達するための他の可能性のある方法には、エレクトロポレーションおよびイオン泳動が挙げられる。
【０１１０】
DNAワクチンにおける細胞内および細胞間ターゲッティング戦略の使用は、PSCA特異的抗腫瘍効果をさらに高めることができる。以前には、細胞内ターゲッティング戦略および細胞間波及戦略が、抗原のMHCクラスI提示またはMHCクラスII提示を高め、強力なCD8+またはCD4+T細胞介在性抗腫瘍免疫をそれぞれ生じさせるために使用されてきた。例えば、モデル抗原であるHPV-16E7のMHCクラスI提示は、DNAワクチンの状況でE7との結核菌熱ショックタンパク質70 (HSP70) (Chen, et al., (2000), Cancer Research, 60: 1035-1042)、カルレティキュリン(Cheng, et al., (2001) J Clin Invest, 108: 669-678)、または緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)エキソトキシンA (ETA(dII)) (Hung, et al., (2001) Cancer Research, 61: 3698-3703)の移行ドメイン(ドメインII)の連結を用いて高められた。MHCクラスII抗原のプロセシングを高めるために、リソソーム関連膜タンパク質(LAMP-1)のソーティングシグナルがE7抗原に連結され、Sig/E7/LAMP-1キメラが作成された(Ji, et al, (1999), Human Gene Therapy, 10: 2727-2740)。裸のDNAワクチンの効力をさらに高めるために、細胞間の抗原の波及を容易にする細胞間戦略を使用することができる。これによりDNAワクチンの効力が改善される。例えば、このことは、細胞間輸送の顕著な特性が実証され、多数の周辺細胞にタンパク質を分布させることができるHSV-1テグメントタンパク質である単純ヘルペスウイルス(HSV-1)VP22を使用して示された(Elliot, et al., (1997) Cell, 88: 223-233)。連結したタンパク質の細胞間波及がそのように高まる結果として、抗原特異的CD8+T細胞性免疫応答および抗腫瘍効果の増強が生じる。任意のそのような方法を使用して、メソテリン発現腫瘍に対するDNAワクチンの効力を高めることができる。
【０１１１】
本発明のワクチン、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、細胞、およびウイルスをヒトまたは他の哺乳動物のいずれかに投与することができる。他の哺乳動物は、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、およびヒツジなどの家畜のことがあり、またイヌ、ウサギ、およびネコなどのペットのことがある。他の哺乳動物は、マウス、ラット、ウサギ、サルまたはロバなどの実験対象のことがある。
【０１１２】
本発明の治療法に使用される試薬は、薬学的組成物中に存在する。薬学的組成物は、典型的には滅菌性、等張性、安定性、および非発熱性について工業基準を満たし、採用される投与量および濃度でレシピエントに無毒性の、薬学的に許容される担体を含む。使用される特定の担体は、組成物中の治療剤の種類および濃度、ならびに意図される投与経路に依存する。所望であれば、安定化化合物を含ませることができる。薬学的組成物の製剤は周知であり、例えば米国特許第5,580,561号および第5,891,725号に記載されている。
【０１１３】
治療有効用量の決定は、当業者の能力の範囲内に十分属する。治療有効用量は、治療有効用量の不在下で生じる抗腫瘍細胞傷害性T細胞活性に比べて、活性を増大させる活性成分の量を表す。
【０１１４】
任意の物質について、最初に細胞培養アッセイまたは通常はマウス、ウサギ、イヌ、もしくはブタの動物モデルのいずれかで治療有効用量を推定することができる。動物モデルを使用して、適切な濃度範囲および投与経路を決定することもできる。次に、そのような情報を使用して、ヒトでの有用な用量および投与経路を決定することができる。
【０１１５】
治療の有効性および毒性、例えばED50(集団の50%に治療的に有効な用量)およびLD50(集団の50%に致死的な用量)を、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順により決定することができる。毒性作用および治療効果の用量比が治療指数であり、それを比LD50/ED50として表現することができる。
【０１１６】
大きな治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒトへの使用のための投与量の範囲を明確に表すために使用される。当該組成物に含まれる投与量は、好ましくはED50を含み、毒性をほとんどまたは全く有さない循環中の濃度範囲内に入る。投与量は、採用された剤形、患者の感受性および投与経路に応じてこの範囲内を変動する。
【０１１７】
正確な投与量は、処置を必要とする対象に関する要因に照らし、医師によって決定されるものである。十分なレベルの活性成分を提供するために、または所望の効果を維持するために、投与量および投与は調整される。考慮することができる要因には、病状の重症度、対象の全身の健康状態、対象の年齢、体重、および性別、食事、投与の時間および回数、薬物併用、反応感受性、ならびに治療に対する耐性/応答が挙げられる。長期作用型薬学的組成物を、特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて3日から4日毎、毎週または隔週に投与することができる。
【０１１８】
通常の投与量は、投与経路に応じて0.1から100,000マイクログラム、最大約1gの総用量まで変動することがある。特定の投与量についての案内およびデリバリー方法は文献に提供され、一般に当業者に利用可能である。当業者は、タンパク質またはその阻害剤についてよりも、ヌクレオチドについて種々の製剤を採用するものである。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのデリバリーは特定の細胞、条件、位置などに特異的なものである。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの有効インビボ投与量は、約100ngから約200ng、500ngから約50mg、約1.mu.gから約2mg、約5μgから約500μg、および約20μgから約100μgの範囲である。
【０１１９】
抗腫瘍ワクチンとしての使用に望ましい免疫原は、腫瘍およびそれに対応する正常組織の間で高度に異なって発現される免疫原である。発現の差は、好ましくは少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍または10倍でさえある。SAGE、マイクロアレイ、ノーザンブロット、およびウェスタンブロットを非限定的に含む当技術分野で公知の任意の手段により発現を測定することができる。免疫原としてのそのようなタンパク質への関心は、タンパク質により特異的に活性化されるCD4T細胞またはCD8T細胞を発生することにより、ヒトがタンパク質(またはそれをコードしている遺伝子)を用いた免疫処置に応答することを判定することにより高まる。当該活性化についての試験は、とりわけMHC複合体中で潜在的な抗原を提示するヒトT2細胞系などのTAP欠損細胞系を使用して行うことができる。当技術分野で公知の任意のアッセイにより活性化を測定することができる。当該アッセイの一つはエリスポットアッセイである。
【０１２０】
腫瘍ワクチンに対するさらなる応答は、CD8+T細胞および/またはCD4+T細胞の応答に基づいて推定することができる。腫瘍ワクチンがPSCAまたは少なくとも一つのT細胞エピトープを含むならば、PSCAに対するCD8+応答および/またはCD4+応答をモニターすることにより、有用な予後情報が提供される。頑健なCD8+応答および/またはCD4+応答は、患者が有効な免疫応答をすでに備えており、当該応答を備えていない患者よりも有意に長期間生存するであろうことを示す。腫瘍ワクチンは、全腫瘍細胞、特に膵臓細胞、卵巣細胞または中皮腫細胞を含むことがある。腫瘍ワクチンは、腫瘍細胞と樹状細胞とのポリエチレングリコール融合体を含むことがある。腫瘍ワクチンは、樹状細胞と共にインキュベートされたアポトーシス性または壊死性腫瘍細胞を含むことがある。腫瘍ワクチンは、樹状細胞と共にインキュベートされたmRNAまたは全RNAを含むことがある。PSCAに対するT細胞応答は、エリスポットアッセイを含む、当技術分野で公知の任意のアッセイにより測定することができる。または、当該腫瘍ワクチンに対する将来的な応答は、PSCAに対する遅延型過敏応答についてアッセイすることによりモニターすることができる。当該応答は、正の予後指標として同定されている。
【０１２１】
実施例
実施例1
大多数の膵臓腺癌患者について免疫標的として役立つことのできる遺伝子を同定するために、突然変異しておらず、大多数の膵臓癌患者に過剰発現され、ワクチン細胞系により過剰発現されると考えられる遺伝子だけに焦点を合わせた。この遺伝子の一つがPSCAであった。
【０１２２】
二つの公用コンピュータアルゴリズムの組み合わせを使用して、三つの共通ヒト白血球抗原(HLA)-クラスI分子に結合する9残基長ペプチドを予測した。予測アルゴリズム「BIMAS」は、ペプチド/HLA複合体解離の予測半減期により潜在的HLA結合エピトープを順位付けする。「SYFPEITHI」アルゴリズムは、HLAと結合する第1および第2アンカー残基の存在を説明するスコアによりペプチドを順位付けする。両方のコンピュータアルゴリズムは、以前に公表されたHLA結合エピトープに類似した結合モチーフを有する、所定のタンパク質内のアミノ酸配列に基づき候補エピトープのスコアを付ける。
【０１２３】
HLA-A2、A3およびA24に結合すると予測されるPSCAペプチドを下記表1に挙げる。
【０１２４】
(表1)HLA-A2、A3およびA24に結合すると予測されたPSCAペプチド
2008527001.tif 000002
【０１２５】
対応するHLAクラスI分子(T2-A2、T2-A3またはT2-A24)を発現しているTAP欠損T2細胞をパルスすることにより、エピトープとそれぞれのHLAクラスI分子との結合を試験した。HLA-A2、HLA-A3およびHLA-A24分子に結合するPSCA由来ペプチドを同定するT2結合実験の結果を図1A〜1Cに示す。
【０１２６】
材料および方法
候補遺伝子の同定およびエピトープの選択
遺伝子発現の連続分析法(SAGE)を使用して、膵臓癌細胞系および新鮮組織に過剰発現される遺伝子の一つとして前立腺幹細胞抗原(PSCA)が同定された。一般に利用可能であり、インターネットによりアクセス可能な二つのコンピュータアルゴリズムを使用して、HLA-A2、HLA-A3およびHLA-A24分子に結合するPSCA由来ペプチドを予測した。「BIMAS」はK.C. Parker and collaborators (bimas.dcrt.nih.gov)によって、「SYFPEITHI」はRammenseeら、(www.uni-tuebingen.de/uni/kxi)によって開発された。
【０１２７】
材料および方法
ペプチドおよびT2細胞系
全てのペプチドは純度95%を超えるまで精製され、公表された配列に従ってMacromolecular Resources (Fort Collins, CO)によって合成された:インフルエンザマトリックスタンパク質由来M1ペプチドGILGFVFTL(配列番号:17)(アミノ酸位置58〜66)、利用可能なデータベースを使用して同定されたPSCA A2ペプチド、およびHIV-gag A2ペプチドSLYNTVATL(アミノ酸位置75〜83)(配列番号:2)はHLA-A2結合モチーフを含む。PSCA A3ペプチド、HIV-NEF A3ペプチドQVPLRPMTYK(配列番号:3)(アミノ酸位置94〜103)、およびインフルエンザA(PR8)核タンパク質由来Flu NPペプチドILRGSVAHK(配列番号:18)(アミノ酸位置265〜273)はHLA-A3結合モチーフを含む。PSCA A24ペプチド、チロシナーゼペプチドAFLPWHRLF(アミノ酸位置206〜214)(配列番号:4)、およびEBV EBNA3CペプチドRYEDPDAPL(アミノ酸位置721〜729)(配列番号:19)はHLA-A24結合モチーフを含む。PSCAおよび対照ペプチドの原液(1〜2mg/ml)を、10〜100% DMSO (JTBaker, Phillippsburg, NJ)中に調製し、各アッセイについて細胞培地中にさらに希釈した。T2細胞は、HLA-A*0201対立遺伝子のみを発現するヒトBリンパ芽球およびTリンパ芽球のハイブリッドである。T2細胞はTAPを欠損しているため、新たにプロセシングされたHLAクラスI結合エピトープを、サイトゾルからこのエピトープが通常発生期のHLA分子に結合して細胞表面に発現するために分子を安定化する小胞体に輸送できない。T2-A3細胞は、HLA-A*0301対立遺伝子を発現するように遺伝的に改変されたT2細胞であり、Walter Storkus博士(University of Pittsburgh)から贈与いただいたものであった。T2-A24細胞は、HLA-A24対立遺伝子を発現するように遺伝的に改変されたT2細胞である。HLA-A24遺伝子はPaul Robbins博士(Surgery Branch, National Cancer Institute)から贈与いただいたものであった。200μM L-グルタミン(JRH Biosciences, Lenexa, KS)、50ユニット-μg/ml Pen/Strep (Sigma, St. Louis, MO)、1% NEAA (Sigma, St. Louis, MO)、および1%ピルビン酸Na (Sigma, St. Louis, MO)を補充したRPMI-1640 (Gibco, Grand Island, NY)、10%ウシ胎仔血清(Hyclone, Logan, UT)中で5% CO2内で、T2細胞を37℃で懸濁培養して成長させた。
【０１２８】
材料および方法
ペプチド/MHC結合アッセイ
対象となるHLA分子を発現しているT2細胞をAimV無血清培地(Gibco, Grand Island, NY)に再懸濁し、濃度1×106細胞/mlにして、それに0〜225μg/mlのペプチド濃度で室温で一晩3μg/ml β-2ミクログロブリン(β2-M)(Sigma, St. Louis, MO)およびペプチドをパルスした。細胞を洗浄し、2×105細胞/mlに再懸濁した。T2およびT2-A24細胞の細胞表面で安定化されたMHCのレベルを、未標識抗クラスI mAb W6/32およびFITC標識ヤギ抗マウスIgG2a二次抗体を用いて細胞試料を直接染色することにより分析した。T2-A3細胞の細胞表面で安定化されたMHCのレベルを、未標識抗HLA-A3 mAb GAPA3およびFITC標識ヤギ抗マウスIgG2a二次抗体を用いて細胞試料を直接染色することにより分析した。プロピジウムヨージド(PI)の排除により判定された生細胞を、Cell Quest分析ソフトウェア(Becton Dickenson, San Jose, CA)を用いたデュアルレーザーFACS-Calibur(Becton Dickenson, San Jose, CA)のフローサイトメトリーにより分析した。  
【０１２９】
実施例2
PSCAがCD8+T細胞により認識されたかどうかを判定するために、同種GM-CSF分泌膵臓腫瘍ワクチンの投与を受けた患者由来のCD8+T細胞濃縮PBLを用いて、抗原をパルスされたT2細胞をスクリーニングした(Jaffee et al., J. of Clinical Oncology, 19:145〜156 (2001)。報告されたワクチン実験で処置された患者は、膵十二指腸切除の8〜10週間後でアジュバント化学放射線の6か月のクールを受ける4週間前に初回ワクチン接種を受けた。これらの患者のうち6人は6か月の終わりに無病を維持し、1か月間隔でさらに最大3回のワクチン接種を受けた。最高2回のワクチン投与を受けている患者8人のうち3人で、自己腫瘍に対するワクチン接種後のインビボ遅延型過敏(DTH)応答の関連が以前に報告された。これらの「DTH応答者」(そのそれぞれは最初の外科的切除の時点で予後不良の指標を有した)だけが、診断後4年を超えて臨床的に無膵臓癌を維持している患者である。ワクチン接種前および初回ワクチン接種の28日後に得られたPBLを最初に分析した。
【０１３０】
二つのA3結合エピトープをパルスしたT2-A3細胞を、非DTH応答者(診断の9か月後に再発した)および13人のDTH応答者(無病を維持している)の患者の末梢血から単離したCD8+T細胞濃縮リンパ球と共に一晩インキュベートし、γインターフェロン(IFN-γ)エリスポットアッセイを使用して分析した。エリスポットアッセイを選択したのは、比較的少数のリンパ球が必要であり、抗原特異的T細胞を定量するための最も高感度のインビトロアッセイの中に入り、抗原特異的T細胞数と機能(サイトカイン発現)を相関させるからである。
【０１３１】
ワクチン接種後のPSCAに対するCD8+Tリンパ球誘導について、14人の患者のリンパ球を評価した。結果は、実験の初期段階で、PSCAがワクチン接種後の3人のDTH応答者に免疫応答を誘発しなかったことを示した。両方のアルゴリズムによって支持されたHLA-A2、HLA-A3およびHLA-A24についての上位2位までのエピトープを用いてT2結合アッセイを行い、エリスポットにより分析した。いずれの患者にもワクチン接種後にPSCA特異的T細胞の誘導が観察されなかった。したがって、各HLAクラスI分子について追加的な4個のPSCAペプチドを合成した。これらのペプチドの分析によっても、ワクチン接種後にPSCA特異的CD8+T細胞応答が誘導されることを実証できなかった(それぞれ図3A、3Bおよび3C)。8人の非応答者でもPSCA特異的応答を実証できなかった(図3D)。
【０１３２】
材料および方法
末梢血リンパ球(PBL)およびドナー
以前に報告された第I相ワクチン実験の一部として同種GM-CSF分泌性膵臓腫瘍ワクチンの投与を受けた14人の患者全てから、末梢血(ワクチン接種前および各ワクチン接種の28日後に100cc)を得た。ワクチンの臨床試験を完了し、無病を維持した全ての患者から年1回血液200ccを得た。この抗原同定実験のために使用されるリンパ球を預けることについてのインフォームドコンセントを、その実験に患者を登録する時点で得た。Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Uppsala, Sweden)を使用した密度勾配遠心分離により、ワクチン接種前および接種後にPBLを単離した。細胞を無血清RPMI-1640を用いて2回洗浄した。PBLを10% DMSOを含む90% AIM-V培地中で-180℃で凍結保存した。
【０１３３】
材料および方法
CD8+T細胞についてのPBLの濃縮
製造業者(MACS, Milteryi Biotec, Auburn, CA)の説明書通りにMagnetic Cell Sorting of Human Leukocytesを使用して、解凍したPBL細胞からCD8+T細胞を単離した。細胞をCD8-PE抗体(Becton Dickenson, San Jose, CA)で蛍光染色し、陽性集団がCD8+T細胞を含むことを確認し、フローサイトメトリーにより細胞を分析した。この手順により、一貫して純度>95%のCD8+T細胞が得られた。
【０１３４】
材料および方法
エリスポットアッセイ
マルチスクリーン96ウェル濾過プレート(Millipore, Bedford, MA)に一晩4℃で60μl/ウェルの10μg/ml抗hIFN-γマウスモノクローナル抗体(Mab)1-D1K (Mabtech, Nacka, Sweden)をコーティングした。次に、ウェルを3回、それぞれ1×PBSで洗浄し、T細胞培地で2時間ブロッキングした。ブロッキング後に、T細胞培地200μl中のペプチド(10ng/ml)および新たに解凍し、濃縮された1×105個のCD8+PBLを3〜6回の繰り返しでパルスした1×105個のT2細胞をウェルに負荷した。次に、プレートを5% CO2内で37℃で一晩インキュベートした。PBS+0.05% Tween20 (Sigma, St. Louis, MO)で6回洗浄することによりエリスポットプレートから細胞を除去した。60μl/ウェルの2μg/mlビオチン化Mab抗hIFNγ7B6-1(Mabtech, Nacka, Sweden)を使用してウェルを5% CO2中で37℃で2時間インキュベートした。PBS/Tween (0.05%)で6回洗浄後に、アビジンペルオキシダーゼ複合体(Vectastain ELITE ABC kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA)を1ウェルに100μl加え、室温で1時間インキュベートした。PBS/Tween 0.05%で3回洗浄し、PBSで3回洗浄後に、AEC-基質溶液(3-アミノ-9-エチルカルバゾール)を100μl/ウェルの濃度で加え、室温で4〜12分間インキュベートした。水道水で洗浄することにより呈色を止めた。プレートを一晩室温で乾燥させ、自動画像システムエリスポットリーダ(Axioplan2, Carl Zeiss Microimaging Inc., Thornwood, NY)を使用して、呈色したスポットをカウントした。
【０１３５】
実施例3
本実験に使用した二つの同種ワクチン細胞系によるPSCA発現のフローサイトメトリー分析を行った。結果を図2に示す。PSCAは一つのワクチン細胞系(Pane 6.03)にのみ発現されることが見出された。PSCAを発現しなかった細胞系Panc 10.05は、本実験で患者に与えられた最初のワクチン接種に使用された細胞系であった。
【０１３６】
材料および方法
フローサイトメトリー
ワクチン系上でのPSCAの発現がフローサイトメトリー分析により評価された。このワクチン系を2回洗浄し、「FACS」緩衝液(1% PBS、2% FBS、および0.2%アジ化ナトリウムを補充したHBSS)に再懸濁し、次にPSCA特異的マウスモノクローナルIgG1抗体(クローン1G8)(Dr. Robert E. Reiter, UCLAからの贈与)に続いてFITC標識ヤギ抗マウスIgG1(BD PharMingen, San Jose, CA)で染色した。染色された試料を、FACS-Caliburッフローサイトメータ(Becton Dickenson, San Jose, CA)およびCell Quest分析ソフトウェア(Becton Dickenson, San Jose, CA)を使用して分析した。
【０１３７】
実施例4
初期のワクチン接種後の時点で見られた陰性の結果とは顕著に対照的に、ずっと後の時点である4回目のワクチン接種後のエリスポット実験から、DTH応答者3人中2人が実際に有意なPSCA特異的T細胞応答を発現したことが実証された。処置された患者により発現されるHLA対立遺伝子(A2、A3およびA24)に対応するHLA結合ペプチドを合成し、それを定量エリスポットアッセイに利用した。PSCA由来の多数のHLA A2結合ペプチドならびに二つのHLA A3結合ペプチドおよび二つのHLA 24結合ペプチドは、処置の完了の4年後の時点で適切に一致したHLA対立遺伝子を発現している3人のワクチン接種された膵臓癌患者のうち2人由来のT細胞によって実際に認識された。具体的には、膵臓癌ワクチンに対して臨床応答を示している患者3人中2人では、ワクチン接種後に適切なHLA PSCAペプチドに対するT細胞前駆細胞数が5倍を超えて増大した。エリスポット実験の結果を図4〜9に示す。対照的に、匹敵する用量のワクチンの投与を受けているが、臨床応答を示さなかった患者は、ワクチン接種後にPSCAに対して応答しているT細胞数に有意な増大を示さなかった。したがって、遺伝的に改変された全細胞ワクチンに対する臨床応答と、ワクチンに誘導される、定量エリスポットアッセイを用いて測定されるPSCAに対するT細胞応答の増大との間に良好な相関が存在した。(有意なPSCA特異的T細胞応答を示さなかった3番目のDTH応答者は、医学的介入およびワクチン実験の中止を必要とする、マイトマイシンCに原因があるとされる遅延性自己免疫抗体性合併症を後に発症したことから、実験中に2回のワクチンの投与だけを受けた(その1回だけがPSCA発現腫瘍細胞を含んでいた))。
【０１３８】
本明細書に記載された実施例および態様は例示だけを目的とし、それに照らした様々な改変および変更は当業者に示唆されるであろうし、本出願の精神および範囲内に含まれるものであることが了解されている。
【０１３９】
本明細書に引用された全ての刊行物、特許、特許出願、およびアクセッション番号(ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の両方を含む)は、それぞれ個別の刊行物、特許、特許出願またはアクセッション番号が具体的かつ個別に参照により組み入れられることが意図されるかの如く、全ての目的に関してその全体がそのように参照により本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】HLA-A2、A3およびA24分子に結合するPSCAタンパク質由来エピトープを同定するT2結合アッセイを示す図である。1mlあたり225マイクログラムのペプチドを一晩室温でT2細胞にパルスしてからフローサイトメトリーにより分析した。HLA-A2(A)またはHLA-A24(C)を発現しているT2細胞を未標識マウス抗HLAクラスI分子モノクローナル抗体W6/32およびヤギ抗マウスFITC標識IgG2a二次抗体で染色した。A3(B)を発現するように遺伝的に改変されたT2細胞を未標識マウス抗ヒトHLA-A3特異的モノクローナル抗体GAPA3およびFITC標識IgG2a二次抗体で染色した。メソテリンA1(309〜317)(EIDESLIFY)(配列番号:1)ペプチドを非結合陰性対照として使用した。
【図２】Panc 6.03およびPanc 10.05ワクチン系での表面PSCAの発現を示す図である。一次抗体としてPSCA特異的モノクローナル抗体1G8および二次抗体としてヤギ抗マウスIgG FITCを使用して、膵臓腫瘍ワクチン系Panc 6.03およびPanc 10.05の表面PSCAレベルについて、それらのワクチン系をフローサイトメトリーにより分析した。実線はアイソタイプ対照を表し、灰色部分はPSCA染色を表す。
【図３】図3A〜Dは、ワクチン接種前およびワクチン接種のすぐ後のPBMC由来CD8+T細胞のエリスポット(ELISPOT)分析を示す図である。最初は、膵臓癌についての同種GM-CSF分泌腫瘍ワクチンの投与を受けたDTH応答者および非DTH応答者においてワクチン接種後のPSCA特異的T細胞の誘導は観察されなかった。図3A:HLA-A2およびHLA-A3陽性であった患者2人(DTH応答者である患者2.38(図の凡例の上4個)およびDTH非応答者である患者2.18 (図の凡例の下4個)）由来PBLのエリスポット分析；図3B:HLA-A3陽性であった患者2人(DTH応答者である患者2.71 (図の凡例の上7個)およびDTH非応答者である患者2.62(図の凡例の下7個))由来PBLのエリスポット分析；図3C:HLA-A24陽性であった患者2人(DTH応答者である患者2.73 (図の凡例の上6個)およびDTH非応答者であった患者2.22(図の凡例の下6個))由来PBLのエリスポット分析。図3D:非応答者であった患者8人由来PBLのエリスポット分析。ワクチン接種の前日または各ワクチン接種の28日後に単離されたPBMCを用いて、IFN-γ発現細胞についてのエリスポット分析を行った。ficoll-hypaque分離によりリンパ球を単離し、アッセイ日まで液体窒素中で凍結保存した。分析前にCD8+T細胞の濃縮を行った。表示したように6個のPSCA由来エピトープをT2-A3細胞にパルスした。陰性対照のHIV-NEFA3(94〜103)値を減算した。表示した3個のPSCA由来エピトープをT2-A2細胞にパルスした。陰性対照のHIV-GAG (77〜85)値を減算した。表示した5個のPSCA由来エピトープでT2-A24細胞をパルスした。陰性対照のチロシナーゼA24 (206〜214)値を減算した。非特異的背景の検出のために、無関係の対照ペプチドに特異的なCD8+T細胞についてのIFN-γのスポット数を計数した。HLA-A2結合HIV-GAGタンパク質由来エピトープ(SLYNTVATL)(配列番号:2)、HLA-A3結合HIV-NEFタンパク質由来エピトープ(QVPLRPMTYK)(配列番号3)、およびHLA-A24結合チロシナーゼタンパク質由来エピトープ(AFLPWHRLF)(配列番号4)をこれらのアッセイにおける陰性対照ペプチドとして使用した。データは、3回の繰り返しでアッセイされた各条件の平均を表し、標準偏差は5%未満であった。105個のCD8+T細胞あたりのヒトインターフェロンγ(hIFNg)のスポット数をプロットする。各患者のPBLの分析を少なくとも2回行った。
【図４】処置完了4年後のDTH応答者である患者2.38のPBMC由来CD8+T細胞のエリスポット分析を示す図である。PSCA特異的T細胞に誘導は観察されなかった。
【図５】処置完了4年後のDTH応答者である患者2.71のPBMC由来CD8+T細胞のエリスポット分析を示す図である。PSCA特異的T細胞の有意な誘導が観察された。
【図６】処置完了4年後のDTH応答者である患者2.73のPBMC由来CD8+T細胞のエリスポット分析を示す図である。PSCA特異的T細胞の有意な誘導が観察された。
【図７】処置完了4年後のDTH応答者である患者2.38のPBMC由来CD8+T細胞のエリスポット分析を示す図である。PSCA特異的T細胞に誘導は観察されなかった。(本実験は、図4に示した結果の繰り返しであった。)
【図８】処置完了4年後のDTH応答者である患者2.71のPBMC由来CD8+T細胞のエリスポット分析を示す図である。PSCA特異的T細胞の有意な誘導が観察された。(本実験は、図5に示した結果の繰り返しであった。)
【図９】処置完了4年後のDTH応答者である患者2.73のPBMC由来CD8+T細胞のエリスポット分析を示す図である。PSCA特異的T細胞の有意な誘導が観察された。(本実験は、図6に示した結果の繰り返しであった。)
【図１０】ヒトゲノムDNA (GenBankアクセッション番号BC048808)の分析から得られたヒトPSCA (配列番号:20)のヌクレオチド配列を示す図である。開始コドンを太字で、下線付きで示す。
【図１１】(ヒトゲノムDNAではなく) cDNAの分析から得られたヒトPSCAのヌクレオチド配列(GenBankアクセッション番号BC065183)(配列番号:21)を示す図である。開始コドンを太字で、下線付きで示す。
【図１２】ヒトPSCAのタンパク質配列(配列番号:22)を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年9月18日(2007.9.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2008527001.tif 000020