(57)【要約】具体的な細胞型を同定するための組成物および方法が開示される。インビトロで実質的にあらゆる細胞型も生成できる方法、およびこの方法で使用されるかまたはこの方法に由来する組成物が、本明細書において開示される。生成されるこれらの細胞株は、例えば、正常な核型の利点を維持しながら、必要とされる任意の量でクローニングされ得、特定され得、凍結され得、そして使用され得る。これらの細胞の利用性は、ヒト幹細胞に対して現在想定される多くの潜在的な適用の実現を、可能にする。
2008507981.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸セグメントを含む多能性幹細胞であって、該核酸セグメントが構造Ｐ−Ｉを含み、Ｐが転写制御エレメントであり、Ｉがマーカーをコードする配列であり、該マーカーが形質転換因子を含む、幹細胞。
【請求項２】
前記核酸セグメントが異種性核酸セグメントである、請求項１に記載の幹細胞。
【請求項３】
前記核酸セグメントが外因性核酸セグメントである、請求項１に記載の幹細胞。
【請求項４】
前記マーカーが異種性である、請求項１に記載の幹細胞。
【請求項５】
前記Ｐおよび前記Ｉが同じベクター中に含まれる、請求項１に記載の幹細胞。
【請求項６】
前記Ｐおよび前記Ｉが異なるベクター中に含まれる、請求項１に記載の幹細胞。
【請求項７】
前記Ｉが異種性核酸配列である、請求項１に記載の幹細胞。
【請求項８】
前記核酸セグメントが自殺遺伝子をさらに含む、請求項７に記載の幹細胞。
【請求項９】
前記Ｐが組織特異的な転写制御エレメントである、請求項７に記載の幹細胞。
【請求項１０】
前記Ｐが細胞型特異的な転写制御エレメントである、請求項７に記載の幹細胞。
【請求項１１】
前記Ｐが細胞系統特異的な転写制御エレメントである、請求項７に記載の幹細胞。
【請求項１２】
前記Ｐが細胞特異的な転写制御エレメントである、請求項７に記載の幹細胞。
【請求項１３】
前記Ｐが前記Ｉを優先的に発現させるかまたは選択的に発現させる、請求項７に記載の幹細胞。
【請求項１４】
前記マーカーが温度寛容性の不死化因子を含む、請求項７に記載の幹細胞。
【請求項１５】
前記形質転換因子が温度寛容性の因子である、請求項７に記載の幹細胞。
【請求項１６】
前記ＩがＳＶ４０ラージＴ抗原を含む、請求項７に記載の幹細胞。
【請求項１７】
前記核酸セグメントが部位特異的切除配列によって挟まれている、請求項７に記載の幹細胞。
【請求項１８】
前記Ｉが部位特異的切除配列によって挟まれている、請求項７に記載の幹細胞。
【請求項１９】
前記Ｐが部位特異的切除配列によって挟まれている、請求項７に記載の幹細胞。
【請求項２０】
前記核酸セグメントが前記Ｘをさらに含み、該Ｘが部位特異的切除配列であり、該ＸがＰ−Ｉを挟み、該核酸セグメントが構造Ｘ−Ｐ−Ｉ−Ｘを含む、請求項７に記載の幹細胞。
【請求項２１】
前記核酸セグメントが前記Ｘにおいて切除される、請求項２０に記載の幹細胞。
【請求項２２】
前記ＸがｌｏｘＰ部位である、請求項２１に記載の幹細胞。
【請求項２３】
前記転写制御エレメントが活性化される条件下で請求項７に記載の幹細胞を培養し、これによって前記Ｉが優先的または選択的に発現されることによって生成される、分化細胞。
【請求項２４】
前記転写制御エレメントが活性化される条件は、前記幹細胞が分化する条件である、請求項２３に記載の分化細胞。
【請求項２５】
前記幹細胞は、前記転写制御エレメントが活性化される条件下で分化する、請求項２３に記載の分化細胞。
【請求項２６】
前記転写制御エレメントは、前記幹細胞を胚様体へ自発的に分化させることによって活性化される、請求項２３に記載の分化細胞。
【請求項２７】
前記核酸セグメントが前記分化細胞から切除される、請求項２３に記載の分化細胞。
【請求項２８】
前記核酸セグメントがアデノウイルス媒介性の部位特異的切除を使用して切除される、請求項２７に記載の分化細胞。
【請求項２９】
前記核酸セグメントがリコンビナーゼを使用して切除される、請求項２７に記載の分化細胞。
【請求項３０】
前記リコンビナーゼがＣｒｅである、請求項２９に記載の分化細胞。
【請求項３１】
前記核酸セグメントの切除は、核酸分子の組換えを生じ、該組換えにより該核酸分子から該核酸セグメントが切除される、請求項２７に記載の分化細胞。
【請求項３２】
前記Ｉの発現効果が逆転される、請求項２３に記載の分化細胞。
【請求項３３】
前記Ｉの発現効果が前記分化細胞の形質転換であり、該Ｉの発現効果の逆転が該分化細胞の形質転換の逆転である、請求項３２に記載の分化細胞。
【請求項３４】
前記Ｉの発現効果がドミナントネガティブな形質転換因子の発現によって逆転される、請求項３２に記載の分化細胞。
【請求項３５】
前記Ｉの発現効果が前記核酸セグメントの切除によって逆転される、請求項３２に記載の分化細胞。
【請求項３６】
前記分化細胞が肝細胞である、請求項２３に記載の分化細胞。
【請求項３７】
前記分化細胞が幹細胞由来の条件付き不死細胞である、請求項２３に記載の分化細胞。
【請求項３８】
請求項２３に記載の前記分化細胞を被験体中に導入する工程を包含する、方法。
【請求項３９】
前記分化細胞が、該分化細胞を前記被験体に投与することによって導入される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記分化細胞が、該分化細胞を前記被験体中に移植することによって導入される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
毒性について組成物をアッセイする方法であって、該方法が、請求項２３に記載の前記分化細胞と共に該組成物をインキュベートする工程、および毒性効果について該分化細胞を評価する工程を包含する、方法。
【請求項４２】
毒性について化合物をアッセイする方法であって、該方法が、請求項２３に記載の前記分化細胞と共に該化合物をインキュベートする工程、および毒性効果について該分化細胞を評価する工程を包含する、方法。
【請求項４３】
細胞に対する目的の効果について組成物をアッセイする方法であって、該方法は、請求項２３に記載の前記分化細胞と共に該組成物をインキュベートする工程、および目的の効果について該分化細胞を評価する工程を包含する、方法。
【請求項４４】
細胞に対する目的の効果について化合物をアッセイする方法であって、該方法は、請求項２３に記載の前記分化細胞と共に該化合物をインキュベートする工程、および目的の効果について該分化細胞を評価する工程を包含する、方法。
【請求項４５】
幹細胞から分化細胞を誘導する方法であって、該方法は：請求項７に記載の前記幹細胞を、前記転写制御エレメントが活性化される条件下で培養し、これによって前記Ｉが優先的または選択的に発現され、これによって分化細胞を誘導する工程を包含する、方法。
【請求項４６】
幹細胞由来の条件付き不死細胞型を誘導する方法であって、該方法は：
請求項７に記載の前記幹細胞を、前記転写制御エレメントが活性化される条件下で培養し、これによって前記Ｉが優先的または選択的に発現され、これによって幹細胞由来の条件付き不死細胞型を誘導する工程を包含する、工程。
【請求項４７】
幹細胞由来の条件付き不死細胞型を誘導する方法であって、該方法は：
幹細胞に、構造Ｐ−Ｉを含む核酸をトランスフェクトする工程であって、Ｐは転写制御エレメントであり、Ｉはマーカーをコードする配列であり、該マーカーは形質転換因子を含む、工程；
該転写制御エレメントが活性化される条件下で該幹細胞を培養し、これによって該Ｉが優先的または選択的に発現され、これによって幹細胞由来の条件付き不死細胞型を誘導する、工程、
を包含する、方法。
【請求項４８】
幹細胞から分化細胞を誘導する方法であって、該方法は：
幹細胞に構造Ｐ−Ｉを含む核酸セグメントをトランスフェクトする工程であって、Ｐが転写制御エレメントであり、Ｉがマーカーをコードする配列であり、該マーカーが形質転換因子を含む、工程；
該転写制御エレメントが活性化される条件下で該幹細胞を培養し、これによってＩが優先的または選択的に発現され、これによって分化細胞を誘導する、工程、
を包含する、方法。
【請求項４９】
前記転写制御エレメントが活性化される条件は、前記幹細胞が分化する条件である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記幹細胞は、前記転写制御エレメントが活性化される条件下で分化する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記転写制御エレメントは、前記幹細胞を胚様体へ自発的に分化させることによって活性化される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記Ｉを発現する細胞を選択する工程をさらに包含する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記Ｉを発現する細胞の純度を増加させる工程をさらに包含する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
前記純度を増加させる工程が、クローン細胞集団または半精製された細胞集団を作製する工程を包含する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記核酸セグメントを切除する工程をさらに包含する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５６】
前記分化細胞をクローニングする工程をさらに包含する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５７】
前記分化細胞を培養する工程をさらに包含する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５８】
前記分化細胞を凍結する工程をさらに包含する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５９】
前記選択された細胞に目的の遺伝子を添加する工程をさらに包含する、請求項４８に記載の方法。
【請求項６０】
請求項４８に記載の方法であって、以下：
前記核酸セグメントを切除する工程；および
前記選択された細胞を凍結する工程
をさらに包含する、方法。
【請求項６１】
前記核酸セグメントが切除される場合に、該核酸セグメントを以前に含んでいた核酸の末端が再結合する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記Ｉを発現する細胞を培養する工程をさらに包含する、請求項４８に記載の方法。
【請求項６３】
前記Ｉを発現する培養された細胞をクローニングする工程をさらに包含する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記分化細胞を被験体中に導入する工程をさらに包含する、請求項４８に記載の方法。
【請求項６５】
前記分化細胞が、該分化細胞を前記被験体に投与することによって導入される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記分化細胞が、該分化細胞を前記被験体中に移植することによって導入される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記分化細胞と共に組成物をインキュベートする工程、および毒性効果について該分化細胞を評価する工程をさらに包含する、請求項４８に記載の方法。
【請求項６８】
前記分化細胞と共に化合物をインキュベートする工程、および毒性効果について該分化細胞を評価する工程をさらに包含する、請求項４８に記載の方法。
【請求項６９】
前記分化細胞と共に組成物をインキュベートする工程、および目的の効果について該分化細胞を評価する工程をさらに包含する、請求項４８に記載の方法。
【請求項７０】
前記分化細胞と共に化合物をインキュベートする工程、および目的の効果について該分化細胞を評価する工程をさらに包含する、請求項４８に記載の方法。
【請求項７１】
幹細胞から分化細胞を誘導する方法であって、該方法は：
幹細胞に構造Ｐ−Ｉを含む核酸セグメントをトランスフェクトする工程であって、Ｐが転写制御エレメントであり、Ｉがマーカーをコードする配列である、工程；
該転写制御エレメントが活性化される条件下で該幹細胞を培養し、これによってＩが優先的または選択的に発現される工程であって、該転写制御エレメントが活性化される条件は該幹細胞が分化する条件であり、これによって分化細胞を誘導する、工程
を包含する、方法。
【請求項７２】
前記マーカーについて選択することによって前記分化細胞を選択する工程をさらに包含する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記マーカーを発現する細胞を同定することによって前記分化細胞についてスクリーニングする工程をさらに包含する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記転写制御エレメントが活性化される条件下で前記幹細胞が分化する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
前記転写制御エレメントは、前記幹細胞が胚様体へと自発的に分化するのを可能にすることによって活性化される、請求項７１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（Ｉ．関連出願についての相互参照）
この出願は、２００４年７月２９日に出願の米国仮特許出願第６０／５９２，０２７号の利益を請求する。２００４年７月２９日に出願された出願第６０／５９２，０２７号は、その全体が参考として本明細書により援用される。
【背景技術】
【０００２】
（ＩＩ．背景）
多能性幹細胞（例えば、ヒトの多能性幹細胞）は、我々が最近の医学を規定する多数の慢性疾患を理解および処置する能力を劇的に変えて、恩恵を与えることを約束する。薬物の発見からモノクローナル抗体の生成まで、細胞療法の実現に向けて、ヒト細胞生物学の多くは、特定の細胞型（例えば、任意のヒト細胞型）を生成する能力によって変遷されることが予想される。多能性幹細胞の医療適用および産業適用は、インビトロで単一の細胞型から多数を生成する能力を必要とする。公知のモルフォゲン、ホルモンまたは他の化学薬品を用いた処理を通して細胞分化を導く現在のストラテジーは、特定の例においては成功しているが、決して、それらの例は、研究室から出ると、あらゆる実用的な適用のためにも必要な細胞の品質および容量を生成することが可能でなかった。インビトロで細胞型を生成することが可能であることに対して、かなりの必要性が存在する。インビトロ免疫系によるモノクローナル抗体の生産、糖尿病処置のための島の生産、および神経関連性機能不全のための神経前駆体の生産は正に、特定の細胞型の安定した信頼性の高い生産を必要としているヒト疾患分野のうちのごくわずかである。このプロジェクトの経済的重要性は、劇的である。モノクローナル抗体の適用は単独で数十億ドル産業である。アメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）は、糖尿病の年間コストが米国に対して１兆３２０億ドル（ｈｔｔｐ．／／ｄｉａｂｅｔｅｓ．ｎｉｄｄｋ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｍ／ｐｕｂｓ／ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ＃１４）であると推定する。神経変性疾患の年間の国民費用についての見積もりは、１兆ドルを超えている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ．ｏｒｇ／ｐｕｂｓ／ｐｒｏｇ００．ｈｔｍ＃Ｔｈｅ％２０Ｉｍｐａｃｔ％２０ｏｆ％２０Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ％９２ｓ％２０Ｄｉｓｅａｓｅ）。
【０００３】
胚性幹細胞の生物学の実用的適用は、多数の均一な細胞型の生成を必要とする。未分化幹細胞の大量培養、その後の指向性分化は、一連の難題を提示し、これらは、代替の解決法の必要性を示唆する。ＥＳ株およびＥＧ株は、それらの株の増殖および未分化状態の維持を維持するため、高価な組換えホルモン（例えば、線維芽細胞増殖因子、および白血病抑制因子）の細胞培養培地への添加を必要とする。一般的に、ＥＳ株およびＥＧ株は、依然としてフィーダー層上で培養される。これらＥＳ株およびＥＧ株は、ゆっくり成長し、凍結融解に乏しく、そして継代が困難である。ＥＳ細胞培養およびＥＧ細胞培養をより容易にさせるプロセスがなされているものの、それら細胞は、かなりの資源および知識ある献身的なスタッフを常に必要とする。
【０００４】
指向性の分化は、更なる課題を提示する。分化は、ホルモン環境、胚様体の形成またはその両方の組合せのいずれかを変更することによって開始され得る。胚様体の形成は、現在最も広く使われている、一般的なプロセスである。この方法は、胚様体内での種々の組織型の近接から生じて、多種多様な細胞を生成するようである。この方法に関する問題は、同種の形成に関する。静置培養において、種々のサイズおよび形状の本体が形をなし、結果として種々の分化プロセスを生じる。繰り返すと、研究室規模の方法（例えば、懸滴）がこれらの課題を乗り越え得るが、それらの方法は大規模においては問題である。胚様体形成よりむしろ、分化を指向するためのホルモンおよび化学製品の使用は、より魅力的な方法のようであるが、器官形成のために必要とされる複雑な相互作用を我々が理解することは基本である。我々の理解におけるこれらの隙間の充填は、実験に利用し易くはない発生学的プロセスの綿密かつ困難な分析を必要とする。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
インビトロで実質的にあらゆる細胞型も生成できる方法、およびこの方法で使用されるかまたはこの方法に由来する組成物が、本明細書において開示される。生成されるこれらの細胞株は、例えば、正常な核型の利点を維持しながら、必要とされる任意の量でクローニングされ得、特定され得、凍結され得、そして使用され得る。これらの細胞の利用性は、ヒト幹細胞に対して現在想定される多くの潜在的な適用の実現を、可能にする。
【０００６】
（ＩＩＩ．要約）
細胞および細胞株の作製に関連した方法および組成物が開示される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
（Ｖ．詳細な説明）
本発明の化合物、組成物、物品、デバイスおよび／または方法が開示され、記載される前に、特に明記しない限り、それらのものが特定の合成方法にも特定の組換え生物工学的方法にも限定されないこと、特に明記しない限り特定の試薬にも限定されないことが、理解されるべきである。何故なら、無論、このようなものは変動するからである。本明細書において用いられる用語が、特定の実施形態を説明するのみの目的のためであり、限定していることを意図されないこともまた理解されるべきである。
【０００８】
多数の著者が、ヒト多能性幹細胞の可能性がある用途について記している（例えば、Ｇｅａｒｈａｒｔ，Ｊ（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２，１０６１−１０６２；Ｐｅｒａ，ＭＦら，（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１３，５−１０；Ｔｒｏｕｎｓｏｎ，Ａ（２００１）Ｒｅｐｒｏｄ  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｄｅｖ．２００１；１３（７−８）：５２３−３２；Ｓｕｓｓｍａｎ，ＮＬ，Ｋｅｌｌｙ，ＪＨ．（１９９４）米国特許第５，３６８，５５５号）。これらは、薬物の発見における標的の評価および毒性試験から、新規β細胞を膵臓に移植することによってＩ型糖尿病を治療することを試みることまでの範囲にわたる。これらの適用の各々は、制御された再生可能な供給源からの大量の分化細胞を必要とする。以前の技術はこの要件を満たさないが、制御され再現性ある様式で、大量の所望の細胞型をインビトロで作製し得る組成物および方法が、本明細書において開示される。
【０００９】
ヒト多能性幹細胞は、近代医学を規定する多数の慢性疾患を処置する我々の能力を、劇的に変えて、拡大することを約束する。神経変性疾患、神経筋疾患、糖尿病、自己免疫疾患、白血病および心疾患は全て、損傷した組織を置き換えて再生させることを目的とする、細胞ベースの治療のための目標の例である。
【００１０】
この展望は、主にトランスジェニックマウスを生成するために多能性幹細胞を使用することの成功に基づく（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ，ＢＰ，Ｓａｎｄｓ，ＡＴ（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．２，３８−５１）。インビトロで幹細胞を変化させて、目標とされた突然変異を有するマウスを作製する能力は、遺伝子の調節および機能、ならびに哺乳類の発生の理解の急速な進歩をもたらした。このことは、次に、マウスモデルにおいてヒト疾患を模倣する能力へと導き、薬物開発のプロセスを容易にした。マウスにおいて多能性幹細胞を用いる研究は、それら多能性幹細胞が、具体的な実験の必要性に依存して、生物体のあらゆる組織にも寄与できること、および目的の遺伝子が基本的に、個々の組織において自由に変えられ得るか、オフにされ得るか、欠失され得るか、活性化され得るか、または発現され得ることを示した。
【００１１】
これらの結果は、ヒト多能性幹細胞の研究に対する熱意を適切に促すが、これらはまた、マウスからヒトまでこの研究を一般化することにおいて、中心的な問題を構成する。モデルとしてのトランスジェニックマウスの成功、および器官型分化に導く組織の複雑な相互作用を繰り返する能力に起因して、インビトロで分化を再現する条件を規定することには、余り注意が向けられていない。それでも、細胞ベースの治療の展望を実現させるために、相当量の特定の細胞型または細胞型の特定の組が、絶対に均一な集団含んでいる分化した幹細胞を与えること、すなわち、それら幹細胞がクローン性であるかまたは半精製されることは、多能性幹細胞が通常の環境以外において移植される場合に腫瘍を形成するという、文書（Ａｎｄｒｅｗ，ＰＷ（２００２）Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３５７，４０５−４１７）で十分に裏付けられた傾向を回避するために、有用である。従って、同種の分化した幹細胞、クローン性の分化した幹細胞、半精製された分化した幹細胞、および分化した混合幹細胞が、開示される。また、細胞集団が開示され、この細胞集団は、クローン性であり得るがそうである必要はなく、同じ細胞型であり得るがそうである必要はなく、そして作製される全ての細胞型の部分集合であり得るがそうである必要はない。これらの集団は、例えば、治療のため、インビボでの毒性アッセイにおいて、または薬物スクリーニングのような他の型のインビトロアッセイにおいて、使用され得る。また、細胞の半精製された部分集合が開示され、これら部分集合は、特定の細胞のうちの少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、または２５％を含み、例えば、本明細書中に開示される任意の細胞型の任意の組み合わせ、本明細書中に開示される任意の細胞、または肝細胞である。
【００１２】
分化した幹細胞および／または一つ以上の細胞型を作製するための方法が、開示される。また、開示される方法によって作製される細胞および／または細胞型が開示される。この方法は、一般的に、分化を促進する条件下で幹細胞をインキュベートする工程、ならびに１つ以上の細胞および／または細胞型について選択またはスクリーニングする工程、を包含する。使用される幹細胞は、マーカーをコードする核酸配列に作動可能に連結された転写制御エレメントを含む核酸セグメントを含み得る。この選択またはスクリーニングは、マーカーに基づき得る。マーカーが発現される細胞および／または細胞型が選択またはスクリーニングされ得るか、あるいはマーカーが発現されない細胞および／または細胞型が選択またはスクリーニングされ得る。この方法で、特定の細胞および／または細胞型が、幹細胞から得られ得る。
【００１３】
転写制御エレメントは、組織特異的、細胞特異的、細胞型特異的、および／またはおよび／または細胞系統特異的な転写制御エレメントであり得る。このことは、特定の組織、細胞、細胞型および／または細胞系統それぞれにおいてこの転写制御エレメントに作動可能に連結される核酸配列の発現を、この転写制御エレメントが可能にするかまたは促進することを意味する。従って、マーカーは、転写制御エレメントが特異的である組織、細胞、細胞型および／または細胞系統において、開示された方法で発現され得る。この方法で、特定の細胞、特定の組織の細胞、特定の細胞型および／または特定の細胞系統の細胞は、幹細胞から得られ得る。
【００１４】
開示される方法は、目的の分化細胞が目的ではない幹細胞および分化細胞から選択され得る、特質または特徴（マーカーの発現または非発現）を提供するという利点を有する。開示される方法の概念は、出発の幹細胞が所望の細胞型または組織型（転写制御エレメントが特異的である組織型または細胞型）へと分化する場合にのみ、またはその場合に主として、その転写制御エレメントに作動可能に連結されたマーカーが発現される（または、発現されない）ことである。目的の細胞、細胞型、細胞系統および／または組織に関連する転写制御エレメントを選択することによって、目的とするあらゆる細胞、細胞型、細胞系統および／または組織も標的化され得る。
【００１５】
有用なマーカーの１つの型は、形質転換因子（例えば、オンコジーン）である。この場合、形質転換因子の発現によって、細胞の形質転換が生じ得る。この結果は、形質転換因子を発現している細胞の増殖および／または優先的な増殖であり得る。分化した幹細胞の関係において、形質転換および関連する増殖は、この形質転換因子を発現する細胞の選択および／または優先的な増殖を可能にする。なぜなら、多くの他の分化した幹細胞は、存在するにせよ、緩徐に増殖するからである。マーカーを発現している（または発現しない）細胞は、マーカーに関連する選択圧を適用することにより選択され得る。例えば、細胞に選択的な有利または不利を与えるために用いられ得る多くの遺伝子およびタンパク質が公知である。マーカーを発現している（または発現しない）細胞は、例えば、マーカーを発現している（または発現しない）細胞を識別することによってスクリーニングされ得る。例えば、多くの酵素およびタンパク質は、検出され得るシグナルを構築および／または産生することが公知である。このようなシグナルは、細胞の識別に基づき得る。
【００１６】
本方法は、マーカー発現の逆転を含むこともできる。例えば、これは、核酸セグメントの全部または一部の除去（例えば、核酸セグメントの全部または一部の切除）によって；核酸セグメント、転写制御エレメントおよび／またはマーカーの不活性化により；核酸セグメント、転写制御エレメントおよび／またはマーカーの抑制によって；そして／あるいは、逆転因子の導入および／または発現によって、達成され得る。核酸セグメントの切除は、多くの方法で達成されることができる。例えば、核酸セグメントは、リコンビナーゼを使用する、部位特異的組換えを介して切除され得る。逆転因子は、マーカーの効果を変更および／または低減し得る。例えば、マーカーがＲａｓのような形質変換因子である場合、細胞の形質転換（Ｒａｓの効果）がドミナントネガティブのＲａｓの発現によって、逆転され得る。形質転換因子の使用およびその後の形質転換の逆転を含む、開示される方法の型式は、組織特異的な可逆的形質転換（ＴＳＲＴ）ということができる。ＴＳＲＴは組織特異的な可逆的形質転換を指すが、このことは単に便宜性のみのためであり、そしてＴＳＲＴが形質転換因子の組織特異的発現、細胞特異的発現、細胞型特異的発現および／または細胞系統特異的発現を指すことが意図されている。
【００１７】
示されるように、逆転を達成するために、逆転操作の組合せが使用され得る。例えば、核酸セグメントの切除および逆転因子の発現は、開示された方法において一緒に使うことができる。（例えば、同一形の天然の細胞と比較して）最小の遺伝子の変更を有する細胞が所望される場合、核酸部分の除去は、有用な逆転操作である。このことは、例えば、これら細胞が治療上使用されるべき場合に有望である。
【００１８】
出発原料として幹細胞を用いて、あらゆる特定の細胞型の分化細胞株も確立するための組織特異的な可逆的形質転換を含む戦略が、本明細書において開示される。特定の細胞型を同定して、培養するために使用され得るトランスフォーミング遺伝子の組織特異的発現を使用する方法が、開示される。次いで、この形質転換事象は、この方法のいくつかの形態において、本明細書中に考察されるように、多くの可能性あるプロセスを使用して逆転され得、非形質転換細胞のクローン集団もしくは半精製された集団、分化細胞（異なる細胞または半精製された細胞の集団を含む）、または細胞のクローン集団を残し得る。
【００１９】
改変された幹細胞（例えば、多能性幹細胞）を含む組成物および方法が開示され、ここで、この多能性幹細胞は、例えば、転写制御エレメント（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、細胞特異的プロモーター、および／または細胞系統特異的プロモーター）によって発現制御されるマーカーを含む。次いで、改変された多能性幹細胞は、本明細書において考察されるように、細胞増殖または胚様体（ＥＢ）の形成および分化細胞の形成を可能にする条件下で、増殖され得る。この幹細胞がＥＢを形成できる場合、このＥＢは自発的分化による多くの異なる細胞型を生じる。開示される方法のいくつかの形態において、ＥＢが所望の時間の間に形をなすようにされた後、例えば、マーカーのための同族の選択培地において細胞を培養することによって、選択圧が適用され得る。この点において、多くの異なる細胞型（数は、ＥＢが選択圧なしで発生することを可能にされる時間の長さに依存する）が存在しながら、選択圧は、マーカーを有する細胞が選択的に増幅されるかまたは視覚化されるようにする。選択マーカを有する細胞は、所望の分化細胞型である。なぜなら、このマーカーは、組織特異的プロモーターから所望の細胞型において、優先的または選択的に発現されるように設計され得るからである。特定のシステムにおいて、組織特異的プロモーターにより駆動されるマーカーが一つ以上存在し得ることも理解される。異なるプロモータによって駆動される複数のマーカーを有して、選択的ストリンジェンシーは、組織特異的プロモータが単一の組織だけにおいて除外的に発現されない細胞型に対して上昇され得る。所望の細胞が同定される選択工程の後、さらなる同定工程が存在し得ることもまた、理解される。これらの同定された細胞は、次いでさらに単離され得、培養され得る。
【００２０】
選択的条件（例えば、選択圧）下で、ある期間の後、選択圧は、細胞増殖の増加を可能にするために除去され得、次いで再度適用され得る。従って、選択の反復性回転が生じ得、選択のストリンジェンシーを増加させる。選択の反復性回転はまた、同じ組織特異的プロモーターから発現されている１種より多くのマーカーを備えるシステムで生じ得る。いくつかの形態の方法において、例えば、第１のマーカーが利用され、次いで第２のマーカーが利用され、次いで第１のマーカーが利用され、そして第２のマーカーが利用される、などのように、選択のこれらの反復性回転が生じ得る。選択圧が完了された後、所望の分化細胞は非選択的条件下で増殖され得る。その点において、マーカーおよび関連のＤＮＡは必要に応じて除去され得る。これを達成するための多数の方法があり、例えば、リコンビナーゼ技術（例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘ技術）または温度特異的変異体マーカーの使用が挙げられる。マーカーが多能性幹細胞の染色体に組み込まれ得るかまたは染色体外カセット（例えば、哺乳類の人工染色体）に保持され得ることも、理解される。
【００２１】
出発原料として幹細胞を用いて、あらゆる特定の細胞型の分化細胞も確立するための方法および組成物が開示される。この機構は、マーカー（例えば、トランスフォーミング遺伝子）の組織特異的発現を使用し得、このマーカーは、特定の細胞型を同定して、培養するために用いられる。次いで、この形質転換事象は、多くの可能性あるプロセスのうちの１つを用いて逆転され得、非形質転換の分化細胞のクローン集団または半精製された集団を残し得る。
【００２２】
例えば、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原由来の、ヒト肝臓特異的プロモーター／エンハンサーにより駆動される、種々の異なるＲＡＳ遺伝子に関する組成物および方法が開示される。いくつかの形態の方法において、逆転因子としてエクジソン誘導性のドミナントネガティブＲＡＳと組み合わされた活性化ＲＡＳが、使用され得る。いくつかの形態の方法において、ＨＢＶ／ＲＡＳ構築物は、ＣＲＥリコンビナーゼにより切除され得るｌｏｘＰ部位により挟まれ得る。いくつかの形態の方法は、温度感受性（ｔｓ）の活性化ＲＡＳの生成を使用し得る。
【００２３】
代表的に、マーカー構築物は、幹細胞株（例えば、ヒト胚性生殖（ＥＧ）細胞株）にトランスフェクションされ得る。次いで、得られた細胞株の分化は、例えば、胚様体の形成によって、開始され得る。このようにして、天然の生物学的プロセスは、結果として、適切な細胞型の発生を生じる。細胞が所望の細胞型（例えば、肝細胞）になる場合、組織特異的プロモーターまたは細胞特異的プロモーター（例えば、肝臓特異的構造物）が活性化されて、マーカーが発現される。この細胞は、例えば、形質転換されるかまたはマーカーの発現によりマーキングされる。例えば、形質転換細胞のための軟寒天のような選択培地が使用され得、そして、選択培地に置かれる場合、ＥＢ中の適切に分化した形質転換細胞だけが生存するか、または選択的な利点を有する。形質転換細胞は、優先的または選択的に増殖してコロニーを形成する。コロニーは、クローン化のため採取され得、そして再度プレートされ得る。使用のため、細胞は、標準方法によって、所望の量および構成に増殖され得る。適切な時間に、例えば、逆転信号（遺伝子スイッチのためのエクジソン、ｌｏｘ構築物に対するＣＲＥリコンビナーゼ、またはｔｓ構築物のための温度シフトのいずれか）が適用され得、初代培養物に機能的に等価な細胞集団を残す。
【００２４】
例えば、構造Ｐ−Ｉ含んでいる核酸セグメントを含む多能性幹細胞が開示され、ここで：Ｐは転写制御エレメントであり；そして、Ｉはマーカーをコードする配列である。ここで、マーカーは形質転換因子を含み得る。
【００２５】
開示される細胞において、マーカーが異種性核酸から発現され、この核酸はさらに自殺遺伝子を含み、Ｐは組織特異的転写制御エレメントであり、ＰはＩを優先的または選択的に発現させ、不死化因子は温度寛容性因子であり、ＩはＳＶ４０ラージＴ抗原を含み、核酸セグメントは部位特異的切除配列によって挟まれており、Ｉは部位特異的切除配列によって挟まれており、Ｐは部位特異的切除配列によって挟まれており、そして／またはＰ−Ｉは部位特異的切除配列Ｘによって挟まれて、Ｘ−Ｐ−Ｉ−Ｘを形成する。
【００２６】
また、開示される細胞は、本明細書において開示される幹細胞から核酸セグメントを切除することによって生成される。
【００２７】
構造Ｐ−Ｉ含んでいる核酸セグメントがアデノウイルス媒介性の部位特異的切除を使用して切除され、そして／または構造Ｐ−Ｉ含んでいる核酸分子の切除が、切除されない核酸分子の遺伝子組換えを生じる細胞が、開示される。
【００２８】
幹細胞から条件付き不死細胞型の集団を導く方法が開示され、この方法は：本明細書中に開示される核酸分子Ｐ−Ｉの１つを含んでいる構築物を幹細胞にトランスフェクションする工程、エレメントＰの転写調節が活性化される環境において幹細胞を環境で培養する工程、これによって、Ｉが優先的または選択的に発現され、そしてＩを発現している細胞型を選択する工程、を包含する。
【００２９】
開示される方法は、Ｉを発現している細胞集団の純度を増加させる工程をさらに含み、ここで、この純度を増加させる工程が細胞のクローン集団または半精製された集団を作製する工程を含み、核酸を切除する工程をさらに含み、選択された細胞型を凍結する工程をさらに含み、そして／または、この細胞の集団に目的の遺伝子を加える工程をさらに含む。
【００３０】
条件付き不死細胞型を誘導する方法が開示され、この方法は、本明細書において開示される核酸分子Ｐ−Ｉの１つを含む構築物を多能性幹細胞にトランスフェクションする工程、制御エレメントＰを活性化させ、これによってＩが優先的または選択的に発現される工程、Ｉ発現している細胞型を選択して、Ｐ−Ｉ核酸分子を含む構築物を切除する工程、Ｐ−Ｉ核酸分子を含む構築物を以前に含んでいた核酸分子の末端が再結合するような環境と、これら選択された細胞型を接触させる工程；および選択された細胞型を凍結する工程、を包含する。
【００３１】
幹細胞培養物が胚様体へと自発的に分化させる方法が開示される。
【００３２】
また、細胞培養物を誘導する方法が開示され、この方法は、本明細書中に開示されるＰ−Ｉ核酸分子のうちの１つを含む構築物を多能性幹細胞にトランスフェクションする工程、転写制御エレメントＰが活性化され、かつＩが優先的または選択的に発現されるような環境とこれら細胞を接触させる工程、Ｉを発現する細胞を培養する工程、を包含する。
【００３３】
Ｉを発現している培養細胞をクローニングする工程を更に含む方法が開示される。
【００３４】
本明細書において開示される細胞を投与する工程（例えば、本明細書中に開示される細胞を移植する工程）を包含する、患者を処置する方法が開示される。
【００３５】
本明細書において開示される方法によって生成された細胞と共に組成物をインキュベートする工程を包含する、毒性について組成物をアッセイする方法が開示される。
【００３６】
構造Ｐ−Ｉ含む核酸分子構築物を含んでいる多能性幹細胞が開示され、ここでＰは組織特異的転写制御エレメントであり、ＰはＩを優先的または選択的に発現させ；そしてＩは温度寛容性の不死化因子である。
【００３７】
構造Ｘ−Ｐ−Ｉ−Ｘ含む核酸分子構築物を含んでいる多能性幹細胞が開示され、ここでＰは組織特異的な転写制御エレメントであり、ＰはＩを優先的または選択的に発現させ；そしてＩは温度寛容性の不死化因子であり；そしてＸは、部位特異的切除配列である。
【００３８】
Ｐ−Ｉが切除される細胞が開示され、ここでＰ−Ｉはアデノウイルス媒介性の部位特異的切除によって、Ｘにおいて切除され、そして／またはＰ−Ｉの切除は、Ｐ−Ｉ核酸分子を含む構築物を以前に含んでいた核酸の遺伝子組換えを可能にする。
【００３９】
幹細胞由来の条件つき不死細胞型を誘導する方法が開示され、この方法は：本明細書において開示される核酸分子構築物Ｐ−Ｉを含んでいる構築物を多能性幹細胞にトランスフェクションする工程、転写制御エレメントＰが活性化され、そしてＩが優先的または選択的に発現されるような環境とその幹細胞とを接触させる工程、Ｉを発現するこの幹細胞由来の細胞型を選択する工程；および選択された細胞をクローニングおよび凍結する工程、を包含する。
【００４０】
幹細胞由来の条件付き不死細胞型を誘導する方法が開示され、この方法は：本明細書において開示される核酸分子構築物Ｘ−Ｐ−Ｉ−Ｘを含んでいる構築物を多能性幹細胞にトランスフェクションする工程、転写制御エレメントＰが活性化され、そしてＩが優先的または選択的に発現されるような環境とその幹細胞とを接触させる工程、Ｉを発現するこの幹細胞由来の細胞型を選択する工程；および選択された細胞型をクローニングおよび凍結する工程、を包含する。
【００４１】
幹細胞由来の条件付き不死細胞型を誘導する方法が開示され、この方法は、本明細書において開示される核酸分子構築物Ｘ−Ｐ−Ｉ−Ｘを含んでいる構築物を多能性幹細胞にトランスフェクションする工程；転写制御エレメントＰが活性化され、そしてＩが優先的または選択的に発現されるような環境とその幹細胞とを接触させる工程；Ｉを発現するこの幹細胞由来の細胞型を選択する工程、Ｐ−Ｉ核酸分子を含む構築物を切除する工程；および選択された細胞型をクローニングおよび凍結する工程、を包含する。
【００４２】
ＰおよびＩが同じベクターに含まれるか、またはＰおよびＩが異なるベクターに含まれる細胞が、開示される。
【００４３】
幹細胞由来の分化細胞の生成のための組成物および方法が開示される。特に有用な形態の方法は、部位特異的組換え、および組織特異的な可逆的形質転換（ＴＳＲＴ）プロセスを包含する。例えば、この方法は、例えばｒａｓ形質転換を活性化させて適切な細胞を同定するため、ｆｌｐ／ｆｒｔ媒介性組換えおよび組織特異的プロモータを使用し得る。次いで、形質転換は、例えば、ドミナントネガティブｒａｓのテトラサイクリン調節性発現を用いて逆転され得る。これらの技術の段階的適用は、それらの発生上のプログラムについての広範囲な知識なしに、クローニングされ得、保存され得、そして培養され得る、所望のいずれの細胞型の細胞も生成する。形質転換の逆転は、分化細胞の確認可能な均一集団を生成する。このプロセスは、図７で概説され、例えば、図８において図解される核酸セグメントを使用する。あらゆる細胞型も、核酸セグメント中の組織特異的プロモーター（ＴＳプロモーター）を打ち消す（ｓｗｉｔｈ  ｏｕｔ）することにより選択され得る。α−ＭＨＣプロモータがこの例で用いられる。図８における組織特異的セレクタは、テトラサイクリン調節されるＣＭＶプロモーター（ドミナントネガティブｒａｓを駆動している）と、組織特異的プロモーター（ａ−ｒａｓを駆動している）とを含む。目的の組織型の形成は、プロモーターを活性化して、細胞を形質転換する。所望の場合、形質転換は、テトラサイクリンの追加によって逆転される。
【００４４】
本方法は、幹細胞（例えば、ヒト胚性生殖（ＥＧ）細胞株）を使用し得、この方法は、定義されたフィーダーなしの条件の下で培養され得る。いくつかの形態の方法において、ＴＳＲＴプロセスは、これらの細胞において使用され得、用いられることが可能である胚様体分化の間に形成される細胞型を同定および培養し、そして組織特異的プロモータから発現されるトランスフォーミング遺伝子（例えば、ｒａｓ）が細胞増殖を駆動する能力を利用するために使用され得る。次いで、これらの細胞は、クローニングされ得、特徴付けされ得、そして必要に応じた使用のためのマスター細胞バンクにおいて凍結され得る。これらの細胞が使用される場合（例えば、薬物スクリーニングまたは細胞療法）、形質転換プロセスは、対応するドミナントネガティブｒａｓの発現を介して逆転され得る。このようにして、必要とされるあらゆる細胞型も同定され得、あらゆる所望の大量にも培養され得、そして非形質転換の表現形へと量的に転換され得る。
【００４５】
開示される方法は、例えば、この方法に適応された改変された幹細胞の使用を含み得る。例えば、ｆｒｔ組換え部位は、幹細胞株（例えば、ＥＧ細胞株）に挿入されて、各々の選択に対して公知の同じ部位の中に組織特異的セレクタの挿入を可能にする。これらのセレクタは、例えば、発現調節された形質転換因子を含んでいる核酸セグメントであり得る。独立した単離物は、最適組み込み部位を有する幹細胞株を同定するために特徴付けられ得る。得られた幹細胞株は、ｆｒｔ挿入（ＦＩ）株ということができる。ｆｒｔ挿入株は、テトラサイクリン調節性の挿入部位を作製するために使用され得る。得られたテトラサイクリンオペレーターｆｒｔ挿入（ＴＯＦＩ）株は、ドミナントネガティブな形質転換因子の調節性発現が形質転換を逆転することを可能にする。
【００４６】
ｆｌｐは、λインテグラーゼファミリーのメンバーであり、酵母においてＤＮＡセグメントを反転させるその能力に関して指定される（ＢｒａｎｄａおよびＤｙｍｅｃｋｉ（２００４）Ｔａｌｋｉｎｇ  ａｂｏｕｔ  ａ  ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ：ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｓｉｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｓ  ｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  ６，７−２８）。それは、特定の認識配列、ｆｒｔ（ｆｌｐリコンビナーゼ標的）を介した組換えを媒介する。ｆｒｔ配列の挿入は、第２のｆｒｔ配列を含むプラスミドの部位特異的組み込みを可能にすることが実証されている。ｆｌｐ／ｆｒｔは、胚性幹細胞において効率的に機能することが実証されている（Ｄｙｍｅｃｋｉ、（１９９６）Ｆｌｐ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｓｉｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３，６１９１−６１９６）。
【００４７】
ｆｒｔ部位（または他の部位特異的な組換え部位または挿入部位）を幹細胞株に挿入することによって、セレクタ構築物（ｒａｓに結合される組織特異的プロモーター）は、任意の選択のために同じ部位に標的化され得る。これは、ＤＮＡの非指向性挿入に関する問題を排除し、ここで、分化が進行するにつれてオンまたはオフにされるゲノムセクション内または機能性遺伝子内へとこのＤＮＡが挿入される。従来のＤＮＡ挿入システムにおいて克服不可能な問題ではないが（これは、一般的に、選択培地における継続した増殖により克服され得る）、開示される方法は、的確な解決法を提供する。開示される方法は、セレクタの無作為な挿入を使用し得るが、このことは、各挿入物が挿入効果について評価されることを必要とし得るので、より多くの作業を必要とする。組換え部位を使用することは、一回での適切な細胞の生成を可能にする。次いで、この細胞は何度も使用されて、同じ部位へと繰り返し再結合し、さらなる細胞型を選択し得る。切除部位を再結合することによって、全てのトランスフェクタントは同一であり、それゆえディッシュ全体が収集され得、反復性クローニングの問題を避ける。ｆｌｐ／ｆｒｔシステムの使用はまた、トランスフェクションの効率を最大にする。
【００４８】
開示される方法は、例えば、所望の細胞型において活性な転写制御エレメントの使用に基づき、所望のあらゆる細胞型を作製するために使用され得る。例えば、心筋細胞細胞は、例えば、ｒａｓを駆動しているαミオシン重鎖（αＭＨＣ）のプロモーターを使用することにより、開示された方法において生成され得る。次いで、挿入されたテトラサイクリン調節されたドミナントネガティブｒａｓは、心筋細胞細胞の形質転換を逆転させるために使用され得る。温度感受性の形質転換体またはセレクタ（発現制御性の形質転換因子を含んでいる核酸セグメント）の切除は、ｆｌｐリコンビナーゼの調節性発現を介する。
【００４９】
（Ａ．組成物）
（１．幹細胞）
幹細胞は、「広範な増殖が可能であり、より多くの幹細胞（自己複製）およびより多くの分化した細胞子孫の作製が可能である」細胞として、定義される（Ｇｉｌｂｅｒｔ，（１９９４）ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴＡＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ，第４版，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．，３５４頁）。これらの特徴は、幹細胞能力ということができる。多能性幹細胞、成人幹細胞、胚盤胞由来の幹細胞、生殖堤由来の幹細胞、奇形腫由来の幹細胞、全能性幹細胞、多分化能幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳ）、胚性生殖細胞（ＥＧ）および胚性癌腫細胞（ＥＣ）は、幹細胞のすべての例である。
【００５０】
幹細胞は、様々な異なる特性およびこれらの特性のカテゴリを有し得る。例えば、いくつかの形態において、幹細胞は、未分化状態で少なくとも１０回、１５回、２０回、３０回またはより多くの継代の間、増殖し得る。いくつかの形態において、幹細胞は、分化することなしに１年より長い間増殖し得る。幹細胞はまた、増殖および／または分化しながら、正常な核型を維持し得る。幹細胞はまた、中胚葉組織、内胚葉組織および外胚葉組織（生殖細胞、卵子および精液が挙げられる）に分化する能力を保持可能であり得る。いくつかの幹細胞はまた、未分化状態でインビトロでの無制限の増殖が可能な細胞であり得る。いくつかの幹細胞はまた、長期にわたる培養を通して正常な核型を維持し得る。いくつかの幹細胞は、長期にわたる培養後でさえ、全３つの胚胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）の誘導体に分化する能力を維持し得る。いくつかの幹細胞は、生物体のあらゆる細胞型も形成できる。いくつかの幹細胞は、特定の条件（例えば、未分化で増殖を維持しない培地における増殖）下で胚様体を形成できる。例えば、いくつかの幹細胞は、融合により胚盤胞とキメラを形成し得る。
【００５１】
いくつかの幹細胞は、様々なマーカーにより定義され得る。例えば、いくつかの幹細胞は、アルカリホスファターゼを発現する。いくつかの幹細胞は、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０および／またはＴＲＡ−１−８１を発現する。いくつかの幹細胞は、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０および／またはＴＲＡ−１−８１を発現しない。いくつかの幹細胞は、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇを発現する（Ｒｏｄｄａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０，２４７３１−２４７３７（２００５）；Ｃｈａｍｂｅｒｓら，Ｃｅｌｌ  １１３，６４３−６５５（２００３））。いくつかの幹細胞がメッセンジャーＲＮＡレベルでこれらを発現し、そして他のものもまた依然としてタンパク質レベルでそれらを、例えば細胞表面上または細胞内で発現することが理解される。
【００５２】
幹細胞は、本明細書中に考察される任意の幹細胞の特性またはカテゴリーの任意の組み合わせを有し得ることが理解される。例えば、いくつかの幹細胞は、アルカリホスファターゼを発現し得るが、ＳＳＥＡ−１を発現し得ず、少なくとも２０回の継代の間に増殖し得、あらゆる細胞型にも分化可能であり得る。別の組の幹細胞は、例えば、細胞表面上にＳＳＥＡ−１を発現し得、内胚葉、中胚葉および外胚葉組織を成形可能であり得、分化なしに１年以上間培養され得る。別の組の幹細胞は、例えば、ＳＳＥＡ−１を発現する多能性幹細胞であり得る。別の組の幹細胞は、例えば、アルカリホスファターゼを発現する胚盤胞由来の幹細胞であり得る。
【００５３】
幹細胞は、所望のタイプの幹細胞の特性を促進する任意の培養手段を使用して培養され得る。例えば、幹細胞は、塩基性線維芽細胞増殖因子、白血病阻害因子、膜関連のスティール因子（Ｓｌ因子）（幹細胞因子）および可溶性Ｓｌ因子の存在下で培養され得、このことは多能性胚性幹細胞を生成する。米国特許第５，６９０，９２６号；同第５，６７０，３７２号および同第５，４５３，３５７号を参照のこと。これらは全て、培養における多能性胚性幹細胞を誘導して維持することに少なくとも関連した材料について、本明細書中で参考として援用される。幹細胞は、胚性線維芽細胞上で培養され得るし、そして単離された細胞は胚性フィーダー細胞上に再プレートされ得る。例えば、米国特許第６，２００，８０６号および同第５，８４３，７８０号を参照のこと。これらは、幹細胞を誘導して維持することに関連した少なくとも材料について、本明細書中で参考として援用される。
【００５４】
幹細胞の１つのカテゴリーは、多能性胚性幹細胞である。本明細書で用いられる多能性胚性幹細胞は、胚または成人の多くの分化細胞型（生殖細胞（精子および卵子）が挙げられる）を惹起し得る細胞を意味する。多能性胚性幹細胞はまた、自己複製可能であり得る。従って、これらの細胞は、生殖細胞系を占有して、成体の特定の器官を含む複数の最終分化細胞を惹起し得るだけでなく、また、それら自身を再生させることも可能である。
【００５５】
幹細胞の１つのカテゴリーは、自己再生可能であり、そして中胚葉、外胚葉および内胚葉の細胞型に分化し得るが、生殖細胞も精子も卵子も惹起しない細胞である。
【００５６】
幹細胞の別のカテゴリーは、自己再生し得、中胚葉、外胚葉および内胚葉の細胞型に分化し得るが、胎盤細胞を惹起しない幹細胞である。
【００５７】
幹細胞の別のカテゴリーは、胚または胎児に由来しない任意の型の幹細胞である成人幹細胞である。代表的に、これらの幹細胞は、新規な細胞型を生成する限られた能力を有し、そして特定の系統に傾倒されるが、成体幹細胞は、記載されている（例えば、２００４年６月３日に公開されたＦｕｒｃｈｔらによる米国特許出願公開第２００４０１０７４５３号、およびＰＣＴ／ＵＳ０２／０４６５２、これらは共に、少なくとも成体幹細胞および成体幹細胞を培養することに関する材料について参考として援用される）３つの全ての細胞型を生成し得る。成体幹細胞の例は、多分化能血液幹細胞であり、これは血液細胞の全て（例えば、赤血球、マクロファージ、Ｔ細胞およびＢ細胞）を形成する。これらのような細胞は、造血系統の中でのその多能性のため、「多能性造血幹細胞」と呼ばれる。多能性成体幹細胞は、多能性能力を有する成体幹細胞である（例えば、米国特許公開第２００４０１０７４５３号（これは、米国特許出願第１０／４６７９６３号である）を参照のこと）。
【００５８】
幹細胞の別のカテゴリーは、例えば、６４細胞期、１００細胞期または１５０細胞期より前の胚盤胞から得られた細胞に由来する多能性幹細胞である、胚盤胞由来の幹細胞である。胚盤胞由来の幹細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来し得、トランスジェニックマウスの研究において、一般的に用いられる細胞である（ＥｖａｎｓおよびＫａｕｆｍａｎ，（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１５４−１５６；Ｍａｒｔｉｎ，（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：７６３４−７６３８）。培養した胚盤胞から単離される胚盤胞由来の幹細胞は、無期限にそれらの未分化特徴を保持する永続的な細胞株を惹起し得る。胚盤胞由来の幹細胞は、現代の分子生物学の任意の技術を使用して操作され得、次いで新規な胚盤胞において再移植され得る。この胚盤胞は、胚盤胞由来の幹細胞の遺伝子構成を有する完全な意味での動物を生じさせ得る。（ＭｉｓｒａおよびＤｕｎｃａｎ，（２００２）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  １９：２２９−２３８）。このような特性および操作は、一般に、胚盤胞由来の幹細胞に適用可能である。胚盤胞由来の幹細胞は移植前または移植後の胚から得ることができることが理解され、そして胚盤胞由来の幹細胞とは移植前の胚盤胞由来の幹細胞および移植後の胚盤胞由来の幹細胞がそれぞれ存在し得ることがいわれ得ることが、理解される。
【００５９】
幹細胞の他のカテゴリーは、例えば、排卵後の発育段階の６週目、７週目、８週目、９週目もしくは１０週目、または６週後、７週後、８週後、９週後もしくは１０週後、例えばヒトの胚または胎児から得られた細胞に由来した多能性幹細胞である、生殖堤由来の幹細胞である。アルカリホスファターゼ染色は、５〜６週段階で発生する。生殖堤由来の幹細胞は、生殖堤細胞由来の例えば６〜１０週のヒトの胚または胎児の生殖堤に由来し得る。
【００６０】
幹細胞の別のカテゴリーは、１５０細胞以上から妊娠６週目までの胚に由来する胚由来の幹細胞である。代表的な胚由来の幹細胞は、胚盤胞の内部細胞塊の細胞から生じる細胞、または生殖堤細胞になる細胞（これは、内部細胞塊の細胞から生じ得、例えば、発生の間に生殖堤へと移動する細胞）に由来する。
【００６１】
幹細胞の他の組は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）および胚性癌腫細胞（ＥＣ細胞）である。
【００６２】
また、奇形腫由来の幹細胞と称される別のカテゴリーの幹細胞が開示され、この幹細胞は、奇形腫から誘導された、正常な核型の欠如によって特徴付けられ得る幹細胞である。奇形腫は、大部分の腫瘍と異なり、広範な種々の異なる組織型を含む、変わった腫瘍である。奇形腫の研究は、それらが通常の制御機構を逃れた始原性生殖線組織から生じることを示唆した。この種の特性および操作は、一般に、奇形腫由来の幹細胞に適用できる。
【００６３】
幹細胞はまた、発生へのそれらの能力により分類され得る。幹細胞の１つのカテゴリーは、全ての生物体へと成長し得る幹細胞である。幹細胞の別のカテゴリーは、全部の生物体に増殖し得ないが、生体の任意の他の型の細胞になり得る幹細胞（これは、上記の通り多能性能力を有する）である。幹細胞の他のカテゴリーは、特定の型の細胞：例えば、血液細胞または骨細胞にのみなり得る幹細胞である。幹細胞の他のカテゴリーは、全能の、多機能な、および多分化能の幹細胞が挙げられる。
【００６４】
開示される方法および組成物は、一般に、「幹細胞」または「多能性幹細胞」を参照することで記載されている。しかしながら、開示される方法は、幹細胞および多能性幹細胞の使用に限られていない。開示される方法および組成物が任意の型またはカテゴリーの幹細胞を使用し得るかまたは含み得ることが特に企図され、例えば、成体幹細胞、胚盤胞由来の幹細胞、生殖堤由来の幹細胞、奇形腫由来の幹細胞、全能性幹細胞および多分化能幹細胞、または本明細書において記載されている任意の特性を有する幹細胞である。任意の型またはカテゴリーの幹細胞を、両方または単独で、開示される方法および組成物と共に、または開示される方法および組成物において使用することが、特に企図され、そして記載される。
【００６５】
（２．インビトロでの幹細胞の分化）
最近まで、多能性幹細胞の研究は、ほぼ完全にマウスに限定されていた。株はいくつかの他の種に由来したが、マウスの実験的な利点は大部分の研究をそこに集中させるのに役立った。実験モデルとしてのマウスの第２の結果は、インビトロ分化を容易にするための条件を確立することについての研究を重視するのをやめることができた。トランスジェニックマウスを作製することの相対的な単純性は、器官型分化に導く細胞の非常に複雑な相互作用を模倣する細胞培養条件を定めることの、不確かかつ運任せの研究を減退させた。ヒト多能性細胞株についての発表を用いて、インビトロでの分化を調節する能力は、新規な卓越を獲得している。
【００６６】
例えば、フィーダー層上に、そして、適切な培地を用いて維持される多能性幹細胞は、無期限に未分化のままである。懸濁液のフィーダー層からの除去および懸濁状態での培養は、凝集物および他の分化細胞の形成を導く（Ｋｙｂａ，Ｍ，（２００３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３６５，１１４−１２９）。これらの凝集物は組織化し、胚盤胞の特徴のいくつかを発生し始める。これらの前胚盤胞（ｐｒｏｔｏｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）は、胚様体（ＥＢ）と呼ばれている。ＥＢ内で、増殖および分化の進行性の回転が起こり、発達の原型（パターン）が概ね続く。種々の広範な組織型がＥＢにおいて同定され得るが、外側の方向付けはなく、分化は混乱していて、任意の細胞型の有意な量の形成は導かない（Ｆａｉｒｃｈｉｌｄ，ＰＪ，（２００３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３６５，１６９−１８６）。多数の戦略が、任意の特定の発生経路へとより大きい比率の細胞を導くために考案されている（Ｗａｓｓａｒｍａｎ，ＰＭ，Ｋｅｌｌｅｒ，ＧＭ．（２００３）ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，第３６５巻，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，５１０頁）。これらは、公知のモルフォゲンを用いた処置、ホルモンの環境の変更、特定の基層上での細胞培養、およびインビトロで分化に影響を及ぼすことが公知の化学薬品のその後の適用という形態をとっている。これらの戦略は全て、特定の適用には成功していたが、いずれの場合においても、それらは同質で１つの細胞型である細胞を生成することが可能でなかった。
【００６７】
同質性の問題に加えて、第２の適用において特定の細胞型を実際に使用する可能性を考慮する場合、別の問題が生じる。例えば、毒性試験に用いられる正常ヒト肝細胞は、薬物開発に非常に有用であり得る。ヒト初代肝細胞（人間の肝臓から直接由来する細胞）は、極めて短命の供給（ｓｈｏｒｔ  ｓｕｐｐｌｙ）である。幹細胞の１系統に由来する肝細胞は、この問題を解決できるが、有意な数で利用可能であることを必要とする。この問題を解決できる組成物および方法が開示される。
【００６８】
幹細胞誘導産物が、実際の適用に利用されるために、大量の同一の細胞が発生されることを必要とする。理想的には、このことは、各々の細胞型に単調な実験を必要としていることよりはむしろ、広く適用されることができる一般的なプロセスであり得る。
【００６９】
（３．細胞特異的な発生）
組織特異的な可逆的選択（例えば、形質転換）は、任意の特定の型の安定な細胞系統が同定され培養されることを可能にし、次いでその全体集団が正常な表現形に復帰するかまたはその集団から排除されることを可能にする。
【００７０】
幹細胞系の組織特異的な可逆的形質転換を使用するための組成物および方法が開示され、この幹細胞は所望のあらゆる細胞型の細胞系にも発達する。開示される方法は、トランスフォーミング遺伝子の組織特異的発現を使用する。また、形質転換が、所望の細胞産物の前後関係に依存して、任意の数の戦略（例えば、トランスフォーミング遺伝子のドミナントネガティブ改変体の発現）を介して逆転する方法が、開示される。開示される組成物および方法は、幹細胞の大規模培養を避ける。なぜなら、幹細胞自体は、所望の細胞型を単離するために、研究室スケールにおいて増殖されることのみを必要とするからである。それらは、任意の大規模細胞培養用途において現在なされるように、クローニングおよび特徴づけされ得る個々の細胞型を発達させ、そしてこれら系統は、特徴付けおよび凍結され得る。これら細胞は、現在余り理解されていない生物学の一部を迂回する。なぜなら、本組成物および方法は、これらの複雑なプロセスを大規模に対して再現することを企てるよりもむしろ、現状の生物学の力を利用するからである；そして、これら細胞株は、一般の培養条件の培養において、大部分の形質転換した株のようにふるまう（すなわち、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、通常の細胞培養培地がこれら細胞株にとって十分であり得る）。本明細書において記載されるような非形質転換方法が同様に使用され得、そして形質転換方法と相互に交換可能であることが、理解される。
【００７１】
（４．改変幹細胞）
改変幹細胞が開示される。改変幹細胞は、細胞の元々の背景とは異なる遺伝的背景を有する幹細胞である。例えば、改変幹細胞は、染色体外の核酸または統合した核酸のいずれかからマーカーを発現する、幹細胞であり得る。幹細胞は、マーカーの発現を介することを含む多くの方法で改変され得る。マーカーは、幹細胞または幹細胞に由来する細胞の選択またはスクリーニングを可能にする、いずれのものでもあり得る。例えば、マーカーは、トランスフォーミング遺伝子（例えば、Ｒａｓ）であり得、これは、非形質転換細胞が増殖し得ない条件において増殖する能力を細胞に提供する。
【００７２】
細胞は選択圧の下に置かれ、この選択圧は、細胞が、マーカーに関係するいくつかの方法において細胞集団を変化させるように設計された条件下で、増殖または配置されることを意味する。例えば、マーカーがこのマーカーを発現する細胞に抗生物質耐性を付与する場合、細胞集団は抗生物質が存在する条件下に置かれ得る。抗生物質耐性を付与する遺伝子を発現している細胞のみが生存し得るか、または細胞は、抗生物質耐性遺伝子を発現していない細胞と比較して、生存的な有利を有し得る。マーカー遺伝子を発現して選択的な有利を有する細胞は、いくつかの形態の方法において、マーカーを有する他の細胞と関連して、選択的に増幅され得、このことは、それらマーカー遺伝子を発現している細胞が、マーカーを有していない細胞よりも大きな速度で増殖するか、またはそれより大きな速度で生存することを意味している。いくつかの形態の方法において、マーカーを有する細胞の選択は、特定の選択的ストリンジェンシーを有する。選択的ストリンジェンシーは、このマーカーを有さない細胞からこのマーカーを有する細胞を、このマーカーが識別する効率である。例えば、選択的ストリンジェンシーは、マーカーを生産している細胞が、そのマーカーを発現しない細胞よりも、少なくとも２倍、４倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、１００倍、２００倍、４００倍、５００倍、８００倍、１０００倍、２０００倍、４０００倍、１０，０００倍、２５０００倍、５０，０００倍の増殖の優位さを有するようなものであり得る。いくつかの形態の方法において、選択的ストリンジェンシーは、ある期間（例えば、継代）にわたって生存する、マーカーを発現する細胞の割合の、同じ時間期間にわたって生存する、マーカーを発現しない細胞の割合に対する選択比として表され得る。例えば、マーカーが開示され、このマーカーは、少なくとも１、１．５、２、４、８、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２００、４００、５００、８００、１０００、２０００、４０００、１０，０００、２５０００、５０，０００または１００，０００の選択比を与え得る。これらのマーカーは、このマーカーを発現する細胞が選択的に増殖されるかまたは視覚化されることを可能にする。このことは、このマーカーを発現する細胞が、このマーカーを発現しない細胞よりも優先的または選択的に増殖され得るか識別され得ることを意味する。
【００７３】
（ａ  マーカー）
マーカーまたはマーカー産物が、このマーカーかいくつかの他の核酸が細胞に送達されているかどうか、そして一旦送達されると発現されているかどうかを決定するために使用され得る。例えば、マーカーは、マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子の発現産物であり得る。有用なマーカー遺伝子の例としては、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子（これは、β−ガラクトシダーゼをコードする）、アデノシンホスホリボシル転移酵素（ＡＰＲＴ）、およびヒポキサンチンホスホリボシル転移酵素（ＨＰＲＴ）が挙げられる。蛍光タンパク質もまた、マーカーおよびマーカー産物として使用され得る。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、緑色サンゴ蛍光タンパク質（Ｇ−ＲＣＦＰ）、青緑色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰまたはｄｓＲｅｄ２）、および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）が挙げられる。
【００７４】
（（１）ネガティブ選択マーカー）
マーカーは、選択可能なマーカーであり得る。哺乳動物細胞のための適切な選択マーカの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシンアナログＧ４１８、ハイグロマイシン（ｈｙｄｒｏｍｙｃｉｎ）およびピューロマイシンである。このような選択可能なマーカーが哺乳類の宿主細胞中に首尾よく移送される場合、選択圧の下に配置される場合に形質転換された哺乳類宿主細胞が生存し得る。広範に使用される、選択措置の異なる２つのカテゴリーが存在する。第１のカテゴリーは、細胞代謝、および補充された培地とは無関係に増殖する能力を欠いた変異細胞株の使用に基づく。２つの例は、以下の通りである：ＣＨＯ  ＤＨＦＲ−細胞およびマウスＬＴＫ−細胞。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンのような栄養分の追加なしで増殖する能力を欠いている。これらの細胞は完全なヌクレオチド合成経路のために必要な特定の遺伝子を欠いているので、失ったヌクレオチドが補充培地において提供されない場合、それら細胞は生存し得ない。培地を補充することの代替例は、完全なＤＨＦＲ遺伝子または完全なＴＫ遺伝子を、それぞれの遺伝子を欠いている細胞に導入することであり、これによって、それらの増殖要求性を変更する。ＤＨＦＲ遺伝子またはＴＫ遺伝子によって形質転換されなかった個々の細胞は、補充されていない培地において生存し得ない。
【００７５】
（（２）優性選択マーカー）
第２のカテゴリーは、あらゆる細胞型においても使用される選択スキームに関連し、そして突然変異細胞株の使用を必要としない、優性選択である。これらのスキームは、代表的に、宿主細胞の増殖を阻むために薬物を使用する。新規な遺伝子を有する細胞は、薬剤耐性を運ぶタンパク質を発現して、選択を生き残る。このような優性選択の例は、薬物のネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｐ．およびＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ，Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．およびＢｅｒｇ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９：１４２２（１９８０））またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０−４１３（１９８５））を使用する。これら３つの例は、それぞれ、適切な薬物である、Ｇ４１８またはネオマイシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）耐性、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）耐性またはハイグロマイシン耐性を運ぶため、真核生物の制御の下で細菌遺伝子を使用する。他の例としては、ネオマイシンアナログＧ４１８およびピューロマイシンが挙げられる。
【００７６】
（（３）トランスフォーミング遺伝子）
トランスフォーミング遺伝子は、マーカーとして使用され得る。トランスフォーミング遺伝子は、細胞を癌細胞の少なくとも一つの特性（例えば、軟寒天において増殖する能力）を有するようにする、タンパク質またはＲＮＡをコードする任意の配列である。例えば、他の特性としては、接触阻害の喪失および増殖因子からの独立が挙げられる。また、形態学的な変化は、形質転換細胞に生じ得る（例えば、細胞は丸みがより少なくなる）。トランスフォーミング遺伝子はまた、形質転換遺伝子と呼ばれ得る。トランスフォーミング遺伝子、形質転換遺伝子およびそれらの産物は、トランスフォーミング因子または形質転換因子ともいわれ得る。形質転換因子は、不死化因子とも呼ばれ得る。
【００７７】
オンコジーンは、トランスフォーミング遺伝子であり得、そして代表的には、トランスフォーミング遺伝子はオンコジーンである。オンコジーンは、代表的に、シグナル伝達カスケードの構成要素についてコードする。代表的に、オンコジーンの正常な遺伝子産物は、細胞増殖を調節し、そしてタンパク質または発現の突然変異が生じ、このことは、この活性を調節解除するかまたはこの活性を増加させる。オンコジーンは代表的に、シグナル伝達経路（例えば、ＭＡＰＫ経路またはＲａｓ経路）における分子についてコードし、そして例えば、増殖因子、増殖因子レセプター、転写因子（ｅｒｂＡ：甲状腺ホルモンレセプター（ステロイドレセプター）をコードする、ｒｅｌ：転写を調節する対合の組み合わせ（ＮＦ−κＢ）を形成する、ｖ−ｒｅｌ：トリ細網内皮症、ｊｕｎおよびｆｏｓ）、プロテインキナーゼ、シグナル伝達、セリン／トレオニンキナーゼ、核タンパク質、増殖因子レセプタキナーゼ、または細胞質チロシンキナーゼ、であり得る。多くのオンコジーンが組み合わさって形質転換され得ることが理解される。開示されるオンコジーンおよびトランスフォーミング遺伝子の組合せの全セットが、特に企図される。いくつかのオンコジーン（例えば、Ｒａｓ）は、単独で形質転換性である。
【００７８】
膜結合型の伝達分子は、しばしばオンコジーンであり得る。膜結合型の伝達分子（例えば、Ｒａｓ）は、他の分子を隣接するレセプターに結合することによって、間接的に活性化される。この隣接するレセプターの活性化は、オンコジーンが活性化して正常な細胞挙動の変化へと導くシグナル伝達カスケードの開始を引き起こす。レセプターチロシンキナーゼもまた、オンコジーンでもあり得る。レセプターチロシンキナーゼは、リン酸基を標的分子へ移送し得る酵素である。標的分子（例えば、増殖因子）がキナーゼの細胞外部分と結合する場合、シグナルは細胞膜を介して送られ、シグナル伝達カスケードを引き起こす。このようなオンコジーンの例は、ＨＥＲ２タンパク質である。レセプター一体型キナーゼは、膜結合型酵素でもあるが、これらは他の隣接するレセプターを結合することにより活性化される。この結合は、キナーゼに標的タンパク質をリン酸化させて、核へのシグナル伝達を引き起こす。Ｓｒｃは、この種のオンコジーンの例である。転写因子は、ＤＮＡらせんに沿って特定の配列と結合して、核内で束縛された（ｂｏｕｎｄ）遺伝子が発現することを引き起こすタンパク質である。この種のオンコジーンの例は、ｍｙｃである。いくつかの転写因子は、リプレッサー（例えば、Ｒｂ）である。テロメラーゼは、染色体の末端を維持するタンパク質−ＲＮＡ複合体である。テロメラーゼが存在しないかまたは低量で存在する場合、重度の損傷が発生するまで、染色体は細胞分割各々につれて短くなる。テロメラーゼは、大部分の細胞において発現されないか、または存在しないか、または低量で発現するか、または低量で存在するが、大部分の形質転換細胞においては、同族の非形質転換細胞よりも高い濃度で存在する。アポトーシス調整タンパク質は、プログラム細胞死を制御するため機能するタンパク質である。ＤＮＡが損傷を受けるかまたは他の傷害が発生する場合、アポトーシスが生じ得る。それらの正常状態において多くのオンコジーンは、細胞死を防ぐように機能する（例えば、Ｂｃｌ−２）。
【００７９】
オンコジーンの非限定的な列挙は、以下である：ａｂｌ（チロシンキナーゼ活性）；ａｂｌ／ｂｃｒ（融合によって作製される新規タンパク質）；Ａｆ４／ｈｒｘ（融合が、ｈｒｘ転写因子産物を達成する）；ａｋｔ−２（タンパク質−セリン／トレオニンキナーゼのＯｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  １をコードする）；ａｌｋ（レセプタチロシンキナーゼをコードする）；ＡＬＫ／ＮＰＭ（融合によって作製される新規タンパク質）；ａｍｌ１（転写因子をコードする）；ａｍｌ１／ｍｔｇ８（融合によって作製される新規タンパク質）；ａｘｌ（レセプタチロシンキナーゼをコードする）；ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−３、ｂｃｌ−６（アポトーシス（プログラム細胞死）をブロックする）；ｂｃｒ／ａｂｌ（融合によって作製される新規タンパク質）；ｃ−ｍｙｃ（細胞増殖およびＤＮＡ合成）；ｄｂｌ（グアニンヌクレオチド交換因子）；ｄｅｋ／ｃａｎ（融合によって作製される新規タンパク質）；Ｅ２Ａ／ｐｂｘｌ（融合によって作製される新規タンパク質）；ｅｇｆｒ（チロシンキナーゼ）；ｅｎｌ／ｈｒｘ（融合によって作製される新規タンパク質）；ｅｒｇ／ｃ１６（融合によって作製される新規タンパク質）；ｅｒｂＢ（チロシンキナーゼ）；ｅｒｂＢ−２（元々はｎｅｕ）（乳房のチロシンキナーゼ）；ｅｔｓ−１（いくつかのプロモータに対する転写因子）；ｅｗｓ／ｆｌｉ−１（融合によって作製される新規タンパク質）；ｆｍｓ（チロシンキナーゼ）；ｆｏｓ（ＡＰＩのための転写因子）；ｆｐｓ（チロシンキナーゼ）；ｇｉｐ（膜結合型Ｇタンパク質）；ｇｌｉ（転写因子）；ｇｓｐ（膜結合型Ｇタンパク質）；ＨＥＲ２／ｎｅｕ（遺伝子融合によって作製される新規タンパク質）；ｈｏｘ１１（ＤＮＡ結合タンパクの過剰発現）；ｈｒｘ／ｅｎ１（融合によって作製される新規タンパク質）；ｈｒｘ／ａｆ４（融合によって作製される新規タンパク質）；ｈｓｔ（線維芽細胞増殖因子をコードする）、ＩＬ−３（タンパク質の過剰発現）；ｉｎｔ−２（線維芽細胞増殖因子をコードする）；ｊｕｎ（転写因子）；ｋｉｔ（チロシンキナーゼ）；ＫＳ３（増殖因子）；Ｋ−ｓａｎ（増殖因子レセプターをコードする）；Ｌｂｃ（グアニンヌクレオチド交換因子）；ｌｃｋ（Ｔ細胞受容体遺伝子へのチロシンキナーゼの再配置）；ｌｍｏ−１（Ｔ細胞受容体遺伝子の近くの転写因子の２つの再配置）；Ｌ−ｍｙｃ（細胞増殖およびＤＮＡ合成）；ｌｙｌ−１（ＤＮＡ結合タンパクの過剰発現）；ｌｙｔ−１０（ＩｇＨ遺伝子の近くの転写因子の再配置）；ｌｔ−１０／Ｃα１（融合によって作製される新規タンパク質）；ｍａｓ（アンギオテンシンレセプター）；ｍｄｍ−２（ａｐ５３インヒビターをコードする）Ｓａｒｃｏｍａｓ  １；ＭＬＨｌ（ＤＮＡのミスマッチ修復）；ｍｌｌ（遺伝子融合によって作製される新規タンパク質）；ＭＬＭ（細胞周期を抑止する負の増殖調節因子ｐ１６をコードする）；ｍｏｓ（セリン／トレオニンキナーゼ）；ＭＳＨ２（ＤＮＡのミスマッチ修復）；ｍｔｇ８／ａｍｌ１（融合によって作製される新規タンパク質）；ｍｙｂ（ＤＮＡ結合ドメインを有する転写因子をコードする）；ＭＹＨ１１／ＣＢＦＢ（融合によって作製される新規タンパク質）；ｎｅｕ（ここで、ｅ���ｂ−２）（チロシンキナーゼ）；Ｎ−ｍｙｃ（細胞増殖およびＤＮＡ合成）；ＮＰＭ／ＡＬＫ（融合によって作製される新規タンパク質）；ｎｒｇ／ｒｅｌ（融合によって作製される新規タンパク質）；ｏｓｔ（グアニンヌクレオチド交換因子）；ｐａｘ−５（ＩｇＨ遺伝子への転写因子の再配置）；ｐｂｘ１／Ｅ２Ａ（融合によって作製される新規タンパク質）；ｐｉｍ−１（セリン／トレオニンキナーゼ）；ＰＭＬ／ＲＡＲ（融合によって作製される新規タンパク質）；ＰＭＳｌ，２（ＤＮＡのミスマッチ修復）；ＰＲＡＤ−１（細胞周期のＧ１において重要であるサイクリンＤ１をコードする）；ｒａｆ（セリン／トレオニンキナーゼ）；ＲＡＲ／ＰＭＬ（融合によって作製される新規タンパク質）；ｒａｓＨ（細胞の信号伝達に関係する）；ｒａｓＫ（細胞の信号伝達に関係する）；ｒａｓＮ（細胞の信号伝達に関係する）；ｒｅｌ／ｎｒｇ（融合によって作製される新規タンパク質）；ｒｅｔ（レセプターチロシンキナーゼをコード化するＤＮＡ再構成）；ｒｈｏｍ−１，２（ＤＮＡ結合タンパクの過剰発現）；ｒｏｓ（チロシンキナーゼ）；ｓｋｉ（転写因子）；ｓｉｓ（増殖因子）；ｓｅｔ／ｃａｎ（遺伝子融合によって作製される新規タンパク質）；Ｓｒｃ（チロシンキナーゼ）；ｔａｌ−１，２（転写因子の過剰発現）；ｔａｎ−１（タンパク質の過剰発現）；Ｔｉａｍ−１（グアニンヌクレオチド交換因子）；ＴＳＣ２（ＧＴＰａｓｅアクティベーター）；ｔｒｋ（組換え融合タンパク）。
【００８０】
トランスフォーミング遺伝子の例はＲａｓ遺伝子であり、その例は配列番号２に示される。オンコジーンのｒａｓファミリーは、３つの主要なメンバーを含む：Ｋ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓおよびＮ−ｒａｓ。これらオンコジーンの３つ全ては、様々な癌に関係している。Ｋ−ｒａｓオンコジーンは、染色体１２ｐ１２に見出され、２１ｋＤのタンパク質（ｐ２１ｒａｓ）をコードする。Ｐ２１は、Ｇタンパク質伝達経路に関係している。Ｋ−ｒａｓクラスオンコジーンの突然変異はＧタンパク質伝達経路の構成的活性化を生成し、結果として異常な増殖および分化を生じる。
【００８１】
活性化型Ｋ−ｒａｓ突然変異は、結腸直腸アデノーマおよび癌腫の５０％を超えて存在し、そしてその大部分はオンコジーンのコドン１２において生じる。Ｋ−ｒａｓ突然変異は、膵臓癌腫および胆管癌腫における最も共通した遺伝子の異常（７５％を超える）のうちの１つである。Ｋ−ｒａｓ突然変異は、肺の腺癌においても頻度が高い。
【００８２】
同様に、開示されたトランスフォーミング遺伝子は、他の遺伝子、または特定の実験の望ましい特性を有するトランスフォーミング遺伝子の一組と対合され得る。異なる形質転換戦略は、異なる例に役立つ。例えば、活性化／ドミナントネガティブの対により形質転換された細胞は、復帰のための複数のサイクルを可能にする。次いで、これらの細胞は、初代細胞および細胞株両方の利点を有する。細胞は拡大され得、抑止され得、操作され得、次いで再度拡大され得る。Ｃｒｅ／ｌｏｘを用いて逆転された細胞は初代細胞のアナログとなり得、ゲノム中に３４ｂｐのｌｏｘ部位のみをそのままにする。これらの細胞は、細胞療法の設定に有用であり得る。
【００８３】
（ｂ  発現系）
細胞に送達される核酸は、代表的に、発現制御系を含み、そしてしばしば、これらの発現制御系は組織特異的である。これらの細胞は、組織特異的である発現制御系を含み、そして必ずしも組織特異的ではない、可能性のある別のものを含む。発現制御系は、標的核酸の発現を引き起こす系である。例えば、ウイルス系およびレトロウイルス系において挿入される遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現の制御を補助するプロモータおよび／またはエンハンサーを含む。プロモーターは、一般に、転写開始点に関係して比較的固定される場合に機能するＤＮＡ配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用のために必要とされるコアエレメントを含み、そして上流エレメントおよび応答エレメントを含み得る。転写に影響を与えるための配列は、転写制御エレメントということができる。
【００８４】
（（１）組織特異的プロモーター、および細胞特異的プロモーター）
分化は、細胞がその細胞型に特徴的な遺伝子ファミリーを転写する転写因子の特定の組を発現するように指向されるプロセスである。次いで、これらの転写因子は、特徴的な遺伝子のプロモーターにおいて組み合って作用し、同族のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現をもたらす。このようにして、限定された数の転写因子遺伝子は、特に非常により大きな組の標的遺伝子を調節し得る（Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ，Ｂｒａｙ，Ｄ，Ｌｅｗｉｓ，Ｊ，Ｒａｆｆ，Ｍ，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｋ，Ｗａｔｓｏｎ，ＪＤ．（１９９４）ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＣＥＬＬ，第３版，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１２９４頁）。
【００８５】
組織特異的プロモータは、特定の生物学的状況においてのみ最も効果的に機能する（Ｋｅｌｌｙ，ＪＨ，Ｄａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＧＪ．（１９８５）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．１９，２７３−２９６）。例えば、アルブミンは、成体肝細胞の主なタンパク質産物であって、この細胞型においてのみ顕著に発現される。このことは、ヒトアルブミン遺伝子の発現を介して達成され、このヒトアルブミン遺伝子は、アルブミン遺伝子の発現を肝細胞においてのみ駆動するプロモーターおよびエンハンサーを有する。トランスジェニックマウスにおける多数の実験により、アルブミンプロモーター／エンハンサーの制御下での異種性遺伝子が、肝細胞においてほぼ排他的に発現されることが証明された（Ｐｉｎｋｅｒｔ，ＣＡら，（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３，２６８−７６）。細胞型が特定の遺伝子およびタンパク質の発現により規定されるので、全ての特定の型は、その細胞型において排他的に、またはほぼ排他的に発現される特定の遺伝子を有する。ロドプシンは、網膜の細胞においてのみ発現され、心筋ミオシンは心筋細胞においてのみ発現され、インスリンは膵臓のβ細胞においてのみ発現される。これらの遺伝子の各々は、その細胞型においてのみ機能するプロモータにより駆動される。
【００８６】
（（ａ）細胞特異的遺伝子は細胞特異的プロモーターを有する）
表３において、遺伝子の例示的な列挙があり、これら遺伝子は、示される具体的な型の組織において全体的または部分的に発現される。これらの遺伝子の各々は、特定の発現パターンをそこで可能にする調節エレメントを含む５’上流領域を有することが、理解される。例えば、これらの遺伝子各々の１００塩基、３５０塩基、５００塩基、７５０塩基、１０００塩基、１５００塩基、２０００塩基、２５００塩基、３０００塩基、４０００塩基、または５０００塩基の５’上流領域を含む核酸が開示され、例えば、本明細書において開示される形質転換遺伝子に作動可能に連結される。また、これらの遺伝子の５’上流領域を作製および使用する方法が開示され、この方法は、本明細書において開示される特定の特性を有するこれらの領域内に含まれる特定のエレメントを同定して、単離する方法を含む。調節エレメントの識別を可能にする方法は、周知である。
【００８７】
表３は、本出願に添付される。
【００８８】
（（ｂ）特異的プロモーター）
開示される方法および組成物において使用され得る、多くの細胞特異的プロモータが存在する。プロモーターはまた、細胞型特異的であるかまたは細胞型の部分集合において存在する遺伝子の転写と関連した調節領域を同定することにより、同定され得る。
【００８９】
例えば、プロモーターおよびエンハンサーを含む脂肪細胞調節配列に関して、例えば、−９０８〜＋１４のヒトアジポネクチン（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）遺伝子配列由来の配列は、脂肪細胞を同定するために使用され得る（配列番号９）（Ｉｗａｋｉ，Ｍ．ら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５２，１６５５−１６６３，２００３，Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｑ１５８４８およびＮＭ＿００４７９７（これらの全ては、アジポネクチン遺伝子および調節配列、ならびに同じものを得る配列および方法に少なくとも関連する材料に関して、本明細書において援用される）。
【００９０】
別の例は、プロモーターおよびエンハンサーを含む肝細胞の細胞調節配列である（例えば、１６１０〜１８１０（配列番号２２）のヒトＢ型肝炎ウイルス配列、−１３７〜−３７のヒトα−１−アンチトリプシンプロモータ配列（配列番号１０）、および−４３４〜＋１２のヒトアルブミン遺伝子配列（配列番号１１））（Ｇａｂｒｉｅｌａ  Ｋｒａｍｅｒ，Ｍ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７，３７５〜３８５（２００３）。これらは、肝細胞の調節配列ならびに同じものを得る配列および方法に少なくとも関連する材料に関して、本明細書において援用される。
【００９１】
また、プロモーターおよびエンハンサーを含む心臓の細胞調節配列が開示される。例えば、−３５７〜＋４０のヒトミオシン軽鎖遺伝子ＶＬＣ１配列（配列番号１２）は、心臓の細胞特異的な方法で作用する。（Ｋｕｒａｂａｙａｓｈｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，１９２７１−１９２７８，（１９９０）、これは、心臓の調節配列ならびに同じものを得る配列および方法に少なくとも関連した材料に関して、本明細書において援用される）。
【００９２】
また、プロモーターおよびエンハンサーのような網膜調節配列が開示される（例えば、ヒトロドプシン遺伝子のための調節配列、例えば、−１７６〜＋７０および−２１４０〜−１８９４の２４６塩基対（配列番号１３））（Ｎｉｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２６６７−２６７５、これは、網膜調節配列ならびに同じものを得る配列および方法に少なくとも関連した材料に関して、本明細書において援用される）。
【００９３】
また、プロモーター配列およびエンハンサー配列のようなＢ細胞調節配列が開示される（例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖プロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントを制御している配列）（Ｍａｘｗｅｌｌ，ＩＨら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１，４２９９−４３０４，（１９９１）、これは、Ｂ細胞調節配列ならびに同じものを得る配列および方法に少なくとも関連した材料に関して、本明細書において援用される）。
【００９４】
内皮細胞調節塩基配列（例えば、プロモーター配列およびエンハンサー配列（例えば、ヒトＥ選択遺伝子についての調節塩基配列（例えば、−５４７〜＋３３の配列（配列番号１４））））もまた、開示される（Ｍａｘｗｅｌｌ，ＩＨら、Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ６，３１−３８，（２００３）（これは、少なくとも、同様に得られる配列および方法を含む内皮調節塩基配列に関連する物質に関して本明細書中に援用される））。
【００９５】
Ｔ細胞調節塩基配列（例えば、プロモーター配列およびエンハンサー配列（例えば、ヒトｐｒｅＴ細胞レセプターについての配列（例えば、−２７９〜＋５の配列配列（配列番号１５））））もまた、開示され、これは、上流のエンハンサーエレメントを含み得る（ＲｅｉｚｉｓおよびＬｅｄｅｒ，Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９４．９７９−９９０，（２００１）（これは、少なくとも、同様に得られる配列および方法を含むＴ細胞調節塩基配列に関連する物質に関して本明細書中に援用される））。
【００９６】
マクロファージ調節塩基配列（例えば、プロモーター配列およびエンハンサー配列（例えば、−３０８〜＋２のヒトＨＣｇｐ−３９遺伝子についての配列（配列番号１６）））もまた、開示される（Ｒｅｈｌｉ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，４４０５８−４４０６７，（２００３）（これは、少なくとも、同様に得られる配列および方法を含むマクロファージ調節塩基配列に関連する物質に関して本明細書中に援用される））。
【００９７】
腎細胞についての調節塩基配列（例えば、プロモーター配列およびエンハンサー配列（例えば、ヒトウロモジュリン遺伝子についての調節塩基配列（例えば、−３．７ｋｂの遺伝子由来のプロモーター配列（配列番号１７））））もまた、開示される（Ｚｂｉｋｏｗｓｋａ，ＨＭら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３６５，７−１１，（２００２）（これは、少なくとも、同様に得られる配列および方法を含む腎細胞調節塩基配列に関連する物質に関して本明細書中に援用される））。
【００９８】
脳調節塩基配列（例えば、プロモーター配列およびエンハンサー配列（例えば、ヒトグルタメートレセプター２遺伝子（ＧｌｕＲ２）についての調節塩基配列（例えば、−３０２〜＋３２０の遺伝子由来の配列（配列番号１８））））もまた、開示される（Ｍｙｅｒｓ，ＳＪら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １８，６７２３−６７３９，（１９９８）（これは、少なくとも、同様に得られる配列および方法を含む脳調節塩基配列に関連する物質に関して本明細書中に援用される））。
【００９９】
肺細胞についての調節塩基配列（例えば、プロモーター配列およびエンハンサー配列（例えば、ヒト界面活性物質タンパク質Ａ２（ＳＰ−Ａ２）についての調節塩基配列（例えば、−２９６〜＋１３の遺伝子由来の配列（配列番号１９））））もまた、開示される（Ｙｏｕｎｇ，ＰＰ，ＣＲ  Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ  Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１，Ｌ２８７−２８９，（１９９６）（これは、少なくとも、同様に得られる配列および方法を含む肺細胞調節塩基配列に関連する物質に関して本明細書中に援用される））。
【０１００】
膵臓細胞調節塩基配列（例えば、プロモーター配列およびエンハンサー配列（例えば、ヒトインスリン遺伝子についての調節塩基配列（例えば、−２７９の遺伝子由来の配列（配列番号２０））））もまた、開示される（Ｂｏａｍ，ＤＳら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，８２８５−８２９６，（１９９０）（これは、少なくとも、同様に得られる配列および方法を含む膵臓細胞調節塩基配列に関する物質に関して本明細書中に参考として援用される））。
【０１０１】
骨格筋調節塩基配列（例えば、プロモーター配列およびエンハンサー配列（例えば、ヒト速骨格筋トロポニンＣ遺伝子（ｈｕｍａｎ  ｆａｓｔ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｃ  ｇｅｎｅ）についての調節塩基配列（例えば、−９７８〜＋１の遺伝子の配列）（配列番号２１）））もまた、開示される（Ｇａｈｌｍａｎｎ，Ｒ，Ｌ．Ｋｅｂｅｓ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，１２５２０−１２５２８，（１９９０）（これは、少なくとも、同様に得られる配列および方法を含む骨格筋調節塩基配列に関連する物質に関して本明細書中に援用される））。
【０１０２】
本明細書中に開示されるような自殺遺伝子を含む核酸もまた、開示され、ここで、この遺伝子は、例えば、作動される場合、細胞を死滅させ、そしてこれらの遺伝子は、それらの発現を調節され得る。例えば、自殺遺伝子はまた、ｃｒｅ−ｌｏｘ組換え部位内に含まれ得、その結果、本明細書中に開示されるように、形質転換が行われた後、および細胞または細胞セットが形質転換培地中で選択的に増殖した後に、形質転換遺伝子はリコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ）によって切除され、自殺遺伝子もまた切除される。次いで、自殺遺伝子を作動させるために適切な条件を含む非形質転換培地において、これらの細胞のみが、組換え事象によって生存することを可能にする。組み合わせて本明細書中に開示されるマーカーおよび組成物および方法を用いるこの結果の多くのバリエーションおよび組み合わせが存在する。
【０１０３】
（（２）ウイルスプロモーターおよびエンハンサー）
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターから転写を制御する好ましいプロモーターは、種々の供給源（例えば、ウイルスのゲノム（例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはサイトメガロウイルス））から得られ得るか、または異種の哺乳動物プロモーター（例えば、βアクチンプロモーター）から得られ得る。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含むＳＶ４０制限酵素断片として簡便に得られる（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの即時型初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限酵素断片として簡便に得られる（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｇｅｎｅ  １８：３５５−３６０（１９８２））。もちろん、宿主細胞または関連種由来のプロモーターもまた、本明細書において有用である。
【０１０４】
エンハンサーとは、一般に、転写開始点から固定されていない距離で機能するＤＮＡの配列をいい、転写ユニットに対して５’側（Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：９９３（１９８１））または３’側（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．３：１１０８（１９８３））のいずれかであり得る。さらに、エンハンサーは、イントロン内（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ  ３３：７２９（１９８３））およびコード配列自体の内（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．４：１２９３（１９８４））に存在し得る。これらは通常、長さが１０ｂｐと３００ｂｐとの間であり、そしてこれらはｃｉｓで機能する。エンハンサーは、近くのプロモーターからの転写を増加させるように機能する。エンハンサーはまた、多くの場合、転写の調節を媒介する応答エレメントを含む。プロモーターはまた、転写の調節を媒介する応答エレメントを含み得る。エンハンサーは、多くの場合、遺伝子の発現の調節を決定する。現在、多くのエンハンサー配列が、哺乳動物遺伝子（グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン）由来であると知られているが、代表的に、一般的な発現のための真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。好ましい例は、複製起点の後期側（ｂｐ１００〜２７０）上のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーである。
【０１０５】
プロモーターおよび／またはエンハンサーは、それらの機能を誘発する光または特定の化学的事象のいずれかによって特異的に活性化され得る。システムは、試薬（例えばテトラサイクリンおよびデキサメサゾン）により調節される得る。照射（例えばガンマ放射線またはアルキル化化学療法剤）への曝露によって、ウイルスベクター遺伝子発現を増強する方法も存在する。
【０１０６】
プロモータおよび／またはエンハンサー領域は、構成型プロモータおよび／またはエンハンサーとして作用し、転写される転写単位の領域の発現を最大化し得る。特定の構築物において、プロモータおよび／またはエンハンサーは、たとえ、特定の時期に特定の細胞型において発現されたとしても、全ての真核細胞型において活性である。この型の好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター（６５０塩基）である。他の好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（完全長プロモーター）およびレトロウイルスベクターＬＴＦである。
【０１０７】
すべての特定の調節エレメントが、クローニングされ、使用されて、特定の細胞型（例えばメラノーマ細胞）において選択的に発現される発現ベクターを構築し得ることが示されている。グリア線維酸性蛋白（ＧＦＡＰ）プロモーターは、神経膠起源の細胞において遺伝子を選択的に発現するために使用されている。
【０１０８】
真核生物宿主細胞（酵母、菌類、昆虫、植物、動物、ヒトまたは有核細胞）において使用される発現ベクターは、ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼし得る転写の終結のために必要な配列を含むこともできる。これらの領域は、ｍＲＮＡをコードする組織因子タンパク質の非翻訳部分におけるポリアデニル化セグメントとして転写される。３’側の非翻訳領域もまた、転写終結部位を含む。転写単位もポリアデニル化領域を含むことが好ましい。この領域の１つの利点は、転写された単位がｍＲＮＡのように処理されて、輸送されるという可能性を増加させることである。発現構築物におけるポリアデニル化シグナルの識別および使用は、十分に確立されている。相同的なポリアデニル化シグナルが、導入遺伝子構築物において使用されることが好ましい。特定に転写単位において、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルに由来して、約４００塩基からなる。転写された単位が単独で、またはその転写された単位からの発現、もしくは構築物の安定性を向上させる上記配列と組み合わせて他の標準的な配列を含むこともまた、好ましい。
【０１０９】
（ｃ  可逆性形質転換）
形質転換は、それによって細胞がその増殖を正常に調節するシグナルに応答する能力を損失するプロセスである。これは、機能的変異の損失（例えば、細胞増殖のリプレッサー（例えば、ＰＴＥＮ）の損失を生じる）、または遺伝子が持続的に活性化する機能的変異の獲得（例えば、多くのＲＡＳ変異体を生じる）の形態をとり得る。多くの研究室は、正常な細胞へのこれらの形質転換遺伝子の１以上の挿入が、その増殖に対する通常の抑制をし得ず、その細胞の増殖を可能にすることを示している（Ｄｏｗｎｗａｒｄ，Ｊ．（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ３，１１−２２）。可逆性形質転換は、ある場合において形質転換遺伝子を作動させて、そして別の場合においてその形質転換遺伝子をシャットオフする。この可逆性を達成するためにいくつかの手段がある。
【０１１０】
組織特異的プロモーター／エンハンサーと可逆性形質転換遺伝子との組合せは、分化した幹細胞から、任意の特定の細胞型の同定および培養を可能にする。一般的で、大量の特定の細胞型を生成するために用いることができるという点で、この系は上記に言及した二重の利点を提供する。実際、特徴付けられ得、凍結され得る、永久的で、クローニングまたは半精製された、分化した細胞株の構築を可能にする。逆転の際に、全ての集団は戻り、特徴付けられて、分化した正常な細胞の限定されない供給源を提供する。
【０１１１】
（（１）ドミナントネガティブ逆転）
多くの形質転換遺伝子（例えばＲＡＳ）は、ドミナントネガティブである別の公知の変異体を有する。例えば、ドミナントネガティブＲＡＳは、ＲＡＦ（ＲＡＳシグナルの伝播のために必要な別のタンパク質）を引き離し、その結果、ＲＡＳシグナル伝達は停止される（Ｆｉｏｒｄａｌｉｓｉ、（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２９、１０８１３−２３)。このような活性化／ドミナントネガティブ対の遺伝子を使用することは、可逆的な系を提供する。このような対は、例えば、ＲＡＳ、ＳＲＣおよびｐ５３として公知である（ＢａｒｏｎｅおよびＣｏｕｒｔｎｅｉｄｇｅ，（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ．１９９５  Ｎｏｖ  ３０；３７８（６５５６）：５０９−１２；Ｗｉｌｌｉｓ  Ａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００４  Ｍａｒ  ２５；２３（１３）：２３３０−８）。
【０１１２】
（（２）温度感受性変異体逆転）
可逆性形質転換を達成するための別の機構は、温度感受性変異体（Ｊａｔ，ＰＳ、ら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８，５０９６−５１００）によるものである。温度感受性（ｔｓ）タンパク質は、許容温度で安定であるが、制限された温度で不安定である。Ｔ抗原（ＴＡｇ）（ＳＶ４０ウイルスの周知の形質転換遺伝子）は、いくつかのｔｓ変異体を有する。ｔｓＴＡｇが正常細胞に挿入される場合、細胞は、３２℃で形質転換されて増殖するが、通常３９℃で停止して戻る。いくつかのこのような温度感受性変異体は、例えば、ＳＶ４０Ｔ抗原およびアデノウイルスＥ１Ａとして公知である（Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ，ＭＬ，Ｌｅｗｉｓ，ＪＢ．（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３，２３４８−２３５１）。
【０１１３】
（（３）リコンビナーゼ逆転）
可逆性形質転換のための第３の機構は、実際に、可逆的に形質転換遺伝子を挿入することである。Ｃｒｅ／ｌｏｘおよびｆｌｐ／ｆｒｔは、可逆性挿入のための２つのこのような機構である（Ｓａｕｅｒ．Ｂ．（２００２）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  １９，２２１−２２８；Ｓｃｈａｆｔ，Ｊら、（２００１）Ｇｅｎｅｓｉｓ  ３１，６−１０）。遺伝子がｌｏｘ組換え部位によって、各末端でキャップされる標的細胞にトランスフェクションされる場合、ＣＲＥリコンビナーゼを用いる細胞の処理によって、挿入された配列が切除され、単一のｌｏｘ配列だけが残る。同様に、遺伝子がｆｒｔによって、各末端上でキャップされる標的細胞にトランスフェクションされる場合、ｆｌｐを用いる処理によって、挿入された配列が切除され、ｆｌｐ配列だけが残る。
【０１１４】
本明細書中で開示される配列の１つ以上を含む細胞（例えば、インスリンプロモーターによって駆動される形質転換配列を含む細胞（例えば、リコンビナーゼ配列（例えば、組換え事象の後に残っているｌｏｘまたはｆｌｐ配列）を含む精製された細胞、または半精製された細胞、またはクローン細胞の集団））を含む組成物が開示され、ここで、この細胞は、本明細書中に開示される１つ以上の核酸を予め含む細胞であった。
【０１１５】
（５．開示された方法および組成物によって生成される細胞）
成人のヒトの身体は、多くの異なる細胞型を生成する。ヒトの細胞型に関する情報は、ｈｔｔｐ：／／ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ．ｔｈｅｆｒｅｅｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ．ｃｏｍ／Ｌｉｓｔ％２０ｏｆ％２０ｄｉｓｔｉｎｃｔ％２０ｃｅｌｌ％２０ｔｙｐｅｓ％２０ｉｎ％２０ｔｈｅ％２０ａｄｕｌｔ％２０ｈｕｍａｎ％２０ｂｏｄｙで見出され得る。これらの異なる細胞型としては、角質化上皮細胞（Ｋｅｒａｔｉｎｉｚｉｎｇ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ）、湿潤層状障壁上皮細胞（Ｗｅｔ  Ｓｔｒａｔｉｆｉｅｄ  Ｂａｒｒｉｅｒ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ）、外分泌上皮細胞（Ｅｘｏｃｒｉｎｅ  Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ）、ホルモン分泌細胞、上皮吸収細胞（腸、外分泌腺および尿生殖路）、代謝および貯蔵細胞、障壁機能細胞（Ｂａｒｒｉｅｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ）（肺、腸、外分泌腺および尿生殖路）、上皮細胞内層閉塞身体内部腔（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｉｎｇ  Ｃｌｏｓｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｂｏｄｙ  Ｃａｖｉｔｉｅｓ）、推進機能を有する繊毛細胞、細胞外マトリックス分泌細胞、収縮性細胞、血液および免疫系細胞、感覚変換器細胞、自立神経性神経細胞、感覚器および末梢神経支持細胞、中枢神経系神経細胞およびグリア細胞、水晶体細胞、色素細胞、生殖細胞、ならびに栄養細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中に開示される任意の幹細胞および前駆細胞、ならびにそれらが誘導する細胞もまた含まれる。開示される方法で生成される目的の細胞および細胞型は、そのような細胞の１つ以上の特徴を参照して同定され得る。多くのそのような特徴は公知であり、それらのいくつかは、本明細書中に開示される。
【０１１６】
（細胞型）
組織学的研究に基づく通常の推測によると、代替の構造および機能を示す成人のヒトの身体において約２００の異なる細胞の種類が存在する（Ｄａｖｉｄ  Ｓ．Ｇｏｏｄｓｅｌｌ，Ｔｈｅ  Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｂｒｕｃｅ  Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｄｅｎｎｉｓ  Ｂｒａｙ，Ｊｕｌｉａｎ  Ｌｅｗｉｓ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｒａｆｆ，Ｋｅｉｔｈ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊａｍｅｓ  Ｄ．Ｗａｔｓｏｎ，Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ａｒｔｈｕｒ  Ｊ．Ｖａｎｄｅｒ，Ｊａｍｅｓ  Ｈ．Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｄｏｒｏｔｈｙ  Ｓ．Ｌｕｃｉａｎｏ，Ｈｕｍａｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｂｏｄｙ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、第５版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０）。これらの代表的な異なる分類の細胞型の顕著に異なる特徴は、形態学的に連続（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ）な任意の再分化ではない。従来の分類は、顕微鏡的形状および構造、ならびに、天然の化学的性質（例えば、種々の染色に対する親和性）に基づくが、より新しい免疫学的技術は、例えば、１０種類以上の異なる型のリンパ球が存在することを明らかにした。薬理学的および生理学的試験は、多くの異なる種類の平滑筋細胞を明らかにした。（例えば、子宮壁筋細胞は、エストロゲンおよび（妊娠後期において）オキシトシンに対して非常に感受性であるが、腸壁平滑筋細胞はそうでない）。
【０１１７】
ヒトの身体の細胞としては、以下が挙げられる：ケラチン性上皮細胞、表皮細胞ケラチノサイト（分化した表皮細胞）、表皮性基底細胞（幹細胞）、指の爪および足の爪のケラチノサイト、爪床基底細胞（幹細胞）、髄質毛幹細胞、皮質毛幹細胞、小皮（Ｃｕｔｉｃｕｌａｒ）毛幹細胞、小皮毛根鞘細胞、ハックスリー層の毛根鞘細胞、ヘンレ層の毛根鞘細胞、外側の毛根鞘細胞、毛髪マトリックス細胞（幹細胞）、湿性重層バリア上皮細胞、角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位の尿道および膣の重層扁平上皮の表層上皮細胞、角膜上皮、舌、口腔、食道、肛門管、遠位の尿道および膣の基底細胞（幹細胞）、尿上皮細胞（膀胱および尿路を裏打ちする）、外分泌上皮細胞、唾液腺粘液細胞（多糖に富んだ分泌）、唾液腺漿液細胞（糖タンパク質酵素に富んだ分泌）、舌のＶｏｎ  Ｅｂｎｅｒ腺細胞（味蕾を洗浄する）、乳腺細胞（乳汁の分泌）、涙腺細胞（涙液の分泌）、耳における耳道腺細胞（ワックス分泌）、外分泌汗腺暗細胞、（糖タンパク質の分泌）、外分泌汗腺明細胞（低分子の分泌）、アポクリン汗腺細胞（発香性の分泌、性ホルモン感受性）、眼瞼のモル細胞の腺（特化した汗腺）、皮脂腺細胞（脂質に富んだ皮脂の分泌）、鼻のボウマン腺細胞（嗅上皮を洗浄する）、十二指腸のブラナーの腺細胞（酵素およびアルカリの粘液）、精嚢細胞（精液成分の分泌、遊泳性精子のためのフルクトースを含む）、前立腺細胞（精液流体成分の分泌）、尿道球腺細胞（粘液の分泌）、バルトリン腺細胞（膣潤滑油の分泌）、リトル腺細胞（粘液の分泌）、子宮内膜細胞（炭水化物の分泌）、呼吸路および消化路の単離された杯細胞（粘液の分泌）、胃を裏打ちする粘膜細胞（粘膜の分泌）、胃線の酵素原細胞（ペプシノーゲン分泌）、胃腺の胃酸分泌細胞（ＨＣｌの分泌）、膵臓の腺房細胞（重炭酸イオンおよび消化酵素の分泌）、小腸のパネート細胞（リゾチームの分泌）、肺のＩＩ形肺細胞（界面活性剤の分泌）、肺のクラーラ細胞、ホルモン分泌細胞、成長ホルモンを分泌する下垂体前葉細胞、卵胞刺激ホルモンを分泌する下垂体前葉細胞、黄体形成ホルモンを分泌する下垂体前葉細胞、プロラクチンを分泌している下垂体前葉細胞、副腎皮質刺激ホルモンを分泌する下垂体前葉細胞、甲状腺刺激ホルモンを分泌する下垂体前葉細胞、メラニン細胞刺激ホルモンを分泌する中間下垂体細胞、オキシトシンを分泌する下垂体後葉細胞、バソプレシンを分泌する下垂体後葉細胞、セロトニンを分泌する消化管（Ｇｕｔ）および気道の細胞、エンドルフィンを分泌する消化管（Ｇｕｔ）および気道の細胞、ソマトスタチンを分泌する消化管および気道の細胞、ガストリンを分泌する消化管および気道の細胞、コレシストキニンを分泌する消化管および気道の細胞、インスリンを分泌する消化管および気道の細胞、グルカゴンを分泌する消化管（Ｇｕｔ）および気道の細胞、ボンベシンを分泌する消化管および気道の細胞、甲状腺ホルモンを分泌する甲状腺細胞、カルシトニンを分泌する甲状腺細胞、副甲状腺ホルモンを分泌する副甲状腺細胞、副甲状腺好酸素性細胞、エピネフリンを分泌する副甲状腺細胞、ノルエピネフリンを分泌する副甲状腺細胞、ステロイドホルモン（鉱質コルチコイドおよび糖コルチコイド）を分泌���る副甲状腺細胞、テストステロンを分泌している精巣のライディッヒ細胞、エストロゲンを分泌する卵胞の内膜細胞、プロゲステロンを分泌する破裂性卵胞の黄体細胞、腎臓の傍糸球体装置の細胞（レニン分泌）、腎臓の緻密斑細胞、腎臓の周血管極細胞、および腎臓のメサンギウム細胞、上皮吸収細胞（消化管、外分泌線および尿路）、腸刷子縁細胞（微小絨毛を有する）、外分泌腺線条導管細胞、ガル膀胱上皮細胞、腎臓近位尿細管刷子縁細胞、腎臓遠位尿細管細胞、小輸出管非線毛細胞（Ｄｕｃｔｕｌｕｓ  ｅｆｆｅｒｅｎｓ  ｎｏｎｃｉｌｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ）、精巣上体主部細胞（Ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ  ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｃｅｌｌ）、精巣上体基部細胞、代謝および貯蔵の細胞、肝細胞、白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞、肝臓脂肪形成細胞、バリア機能細胞（肺、消化管、外分泌腺および尿生殖腺）、Ｉ型肺細胞（肺の気腔を裏打ちする）、膵管細胞（房心細胞）、非重層胆管細胞（汗腺、唾液腺、乳腺、などの細胞）、腎糸球体壁細胞、腎糸球体有足細胞、ヘンレ薄層部分細胞のループ（Ｌｏｏｐ  ｏｆ  Ｈｅｎｌｅ  ｔｈｉｎ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｃｅｌｌ）（腎臓における）、腎臓集合管細胞、および管路細胞（精嚢、前立腺などの細胞）、閉鎖した体内腔を裏打ちする上皮細胞、血管およびリンパ血管の内皮有窓細胞、血管およびリンパ管の内皮連続細胞、血管およびリンパ血管の内皮脾細胞、滑膜細胞（関節腔の裏打ち、ヒアルロン酸の分泌）、漿膜細胞（腹膜、胸膜、および心臓周囲の空腔を裏打ちする）、扁平上皮細胞（耳の外リンパ腔を裏打ちする）、扁平上皮細胞（耳の内リンパ腔を裏打ちする）、微小絨毛を有する内リンパ嚢の円柱細胞（耳の内リンパ腔を裏打ちする）、微小絨毛のない内リンパ嚢の円柱細胞（耳の内リンパ腔を裏打ちする）、暗細胞（耳の内リンパ腔を裏打ちする）、前庭階壁細胞（耳の内リンパ腔を裏打ちする）、血管条（Ｓｔｒｉａ  ｖａｓｃｕｌａｒｉｓ）基底細胞（耳の内リンパ腔を裏打ちする）、血管条辺縁細胞（耳の内リンパ腔を裏打ちする）、クラウディウス細胞（耳の内リンパ腔を裏打ちする）、ベットヒャー細胞（耳の内リンパ腔を裏打ちする）、脈絡叢細胞（脳脊髄液の分泌）、軟骨クモ膜扁平上皮細胞、色素沈着した目の線毛上皮細胞、色素沈着のない目の線毛上皮細胞、角膜内皮細胞、前進機能を有する線毛細胞、気道線毛細胞、卵管線毛細胞（女性において）、子宮内膜線毛細胞（女性において）、精巣網線毛細胞（男性において）、小輸出管線毛細胞（男性において）、中枢神経系の線毛上衣細胞（脳の腔を裏打ちする）、細胞外マトリクス分泌細胞、エナメル芽上皮細胞（歯エナメルの分泌）、耳の前庭の半月面上皮細胞（プロテオグリカンの分泌）、コルティ歯間の上皮細胞の器官（有毛細胞を覆う蓋膜を分泌する）、疎性結合組織線維芽細胞、角膜線維芽細胞、腱線維芽細胞、骨髄細網組織線維芽細胞、他の非上皮性線維芽細胞、毛細血管周囲細胞、椎間板の髄核細胞、セメント芽／セメント細胞（歯根骨のようなセメント質分泌）、象牙芽細胞／象牙細胞（ｏｄｏｎｔｏｃｙｔｅ）（歯の象牙質の分泌）、硝子軟骨軟骨細胞、線維軟骨細胞、弾性軟骨軟骨細胞、骨芽細胞／骨細胞、前骨芽細胞（骨芽細胞の幹細胞）、目の硝子体の硝子体細胞、耳の外リンパ腔の星状細胞、収縮性細胞、赤色骨格筋細胞（遅筋）、白色骨格筋細胞（速筋）、中間の骨格筋細胞、筋紡錘の核袋細胞、筋紡錘の核鎖細胞、衛星細胞（幹細胞）、通常の心筋細胞、結節性心筋細胞、プルキニエ線維細胞、平滑筋細胞（種々のタイプのもの）、虹彩の筋上皮細胞、外分泌腺の筋上皮細胞、血液系および免疫系の細胞、赤血球、巨核球（血小板前駆体）、単球、結節性組織マクロファージ（種々のタイプのもの）、表皮ランゲルハンス細胞、破骨細胞（骨において）、樹状細胞（リンパ系組織において）、小グリア細胞（中枢神経系において）、好中球顆粒球、好酸球顆粒球、好塩基球顆粒球、マスト細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ＩｇＭのＢリンパ球細胞、ＩｇＧのＢリンパ球細胞、ＩｇＡのＢリンパ球細胞、ＩｇＥのＢリンパ球細胞、キラー細胞、血液系および免疫系に関する幹細胞および前駆（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）始原細胞（種々のタイプ）、感覚伝達細胞、目の光受容体桿体細胞、目の光レセプター青色感受性錐体細胞、目の光レセプター緑色感受性錐体細胞、目の光レセプター赤色感受性錐体細胞、コルティ器官の聴覚内耳有毛細胞、コルティ器官の聴覚外側有毛細胞、耳の前庭のＩ型有毛細胞（加速および重力）、耳の前庭のＩＩ型有毛細胞（加速および重力）、Ｉ型味蕾細胞、嗅覚ニューロン、嗅上皮の基底細胞（嗅覚ニューロンのための幹細胞）、Ｉ型頸動脈小体細胞（血液ｐＨセンサ）、ＩＩ型頸動脈小体細胞（血液ｐＨセンサ）、表皮のメルケル細胞（接触覚センサ）、接触感受性一次感覚神経（種々のタイプ）、低温感受性一次感覚神経、熱感受性一次感覚神経、疼痛感受性一次感覚神経（種々のタイプ）、固有一次感覚ニューロン（種々のタイプ）、自律神経ニューロン細胞、コリン作用性神経細胞（種々のタイプ）、アドレナリン作用性神経細胞（種々のタイプ）、ペプチド作用性神経細胞（種々のタイプ）、感覚器官および末梢ニューロンの支持細胞としては、以下が挙げられる：コルティ器官の内側柱状細胞、コルティ器官の外側柱状細胞、コルティ器官の内側支持指節骨細胞、コルティ器官の外側指節骨支持細胞、コルティ器官の境界細胞、コルティ器官のヘンゼン細胞、前庭器支持細胞、Ｉ型味蕾支持細胞、嗅覚上皮支持細胞、シュワン細胞、衛星細胞（末梢神経細胞体をカプセル化する）、腸グリア細胞、中枢神経系ニューロンおよび神経膠細胞、ニューロン細胞（種々の豊富なタイプであるが、依然としてほとんど分類されていない）、神経膠星状細胞（種々のタイプ）、希突起神経膠細胞、レンズ細胞、前方レンズ上皮細胞、クリスタリン含有レンズ線維細胞、色素細胞、メラノサイト、網膜の色素沈着した上皮細胞、胚細胞、卵原細胞／卵母細胞、精母細胞、精原細胞（精母細胞のための幹細胞）、栄養（ｎｕｒｓｅ）細胞、卵胞細胞、セルトリ細胞（精巣において）、胸腺上皮細胞。
【０１１８】
このリストの細胞は、細胞機能により構成されて、平滑筋細胞、ＣＮＳ、種々の関連の結合組織および繊維芽細胞タイプのニューロンのクラス、ならびに成熟細胞の中間段階（例えば、ケラチン合成細胞（幹細胞型および分化細胞型のみが示される））についての細区画を省略する。その他には、この目録は、ヒト成人の表現形において見出される約２１９種類の細胞の徹底的な列挙を示す（複雑性理論および生理遺伝学的な比較は、約１０５遺伝子のＮｇｅｎｅを有するヒトについて、最大数の細胞型Ｎｃｅｌｌ〜Ｎｇｅｎｅ１／２＝３７０を示唆する）（Ｓ．Ａ．Ｋａｕｆｆｍａｎ，「Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｅｐｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｒａｎｄｏｍｌｙ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｎｅｔｓ」，Ｊ．Ｔｈｅｏｒｅｔ．Ｂｉｏｌ．２２（１９６９）：４３７−４６７；Ｓｔｕａｒｔ  Ａ．Ｋａｕｆｆｍａｎ，Ｔｈｅ  Ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  Ｏｒｄｅｒ：Ｓｅｌｆ−Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３）。
【０１１９】
（細胞マーカー）
いくつかの同定する特徴が存在し、これらによって細胞は区別および同定され得る。異なる細胞型は、サイズ、形状、密度において独特であり、そして細胞内タンパク質、細胞表面のタンパク質および分泌性タンパク質の異なった発現プロフィールを有する。本明細書中に提供される分化細胞を同定および規定するために使用され得るマーカーが記載される。これらのマーカーは、抗体、プローブ、プライマーまたは当該分野で公知の他のこのような標的化手段を使用して評価され得る。分化細胞の型を同定および区別するために慣用的に使用されるマーカーの例は、表４に提供される。
【０１２０】
【化１】
2008507981.tif 000003
【０１２１】
【化２】
2008507981.tif 000004
【０１２２】
【化３】
2008507981.tif 000005
【０１２３】
【化４】
2008507981.tif 000006
細胞表面抗原は、細胞を同定および区別するためのマーカーとして、慣用的に使用される。ほとんどすべての細胞に関する種（異種型）、器官、組織または細胞型に対する抗原特異性が存在し、おそらく約１０４種ほどの異なる抗原を含む。細胞型を区別するために使用され得る細胞表面抗原の例は、表５に提供される。
【０１２４】
【化５】
2008507981.tif 000007
赤血球の場合、Ｒｈ血液型系、Ｋｅｌｌ血液型系、ダッフィ血液型系およびキッド式血液型系における抗原は、赤血球の形質膜に限定されて見出されており、血小板、リンパ球、顆粒球、血漿にも、他の成体分泌物（例えば、唾液、乳汁または羊水）においても検出されなかった（Ｐ．Ｌ．Ｍｏｌｌｉｓｏｎ，ＣＰ．Ｅｎｇｅｌｆｒｉｅｔ，Ｍ．Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ，Ｂｌｏｏｄ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第９版，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９３）。従って、この４種抗原の組のうちの任意のメンバーの検出は、赤血球の同定のための固有のマーカーを確立する。ＭＮＳ抗原およびＬｕｔｈｅｒａｎ抗原もまた赤血球に限られており、２つの例外を含める：腎臓毛細管内皮でも見出されるＧＰＡ糖タンパク質（ＭＮ活性）（Ｐ．Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｓ．Ｅ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｋ．ＭｃＬｏｕｇｈｌｉｎ，Ｍ．Ｅ．Ｊ．Ｂｅａｒｄ，Ｄ．Ｎ．Ｊ．Ｈａｒｔ，「Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＮ  Ｂｌｏｏｄ  Ｇｒｏｕｐ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  Ｋｉｄｎｅｙ」，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．１７（１９８５）：１６９７−１７００）、および腎臓内皮細胞上および肝臓肝細胞上に現れるＬｕｂ様糖タンパク質（Ｄ．Ｊ．Ａｎｓｔｅｅ，Ｇ．Ｍａｌｌｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．Ｙｅｎｄｌｅら、「Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｌｕｂ−ａｃｔｉｖｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ，ｋｉｄｎｅｙ，ａｎｄ  ｌｉｖｅｒ」，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ＩＳＢＴ−ＢＢＴＳ  Ｂｏｏｋ  ｏｆ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，１９８８，２６３頁）。対照的に、ＡＢＨ抗原は、多くの非ＲＢＣ組織細胞（例えば、腎臓および唾液腺）で見つかる（Ｉｖａｎ  Ｍ．Ｒｏｉｔｔ，Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ｂｒｏｓｔｏｆｆ，Ｄａｖｉｄ  Ｋ．Ｍａｌｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｏｗｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）。若齢の胚において、ＡＢＨは、中枢神経系の内皮細胞および上皮細胞を除いて、すべての内皮細胞および上皮細胞で見い出され得る（Ａｒｏｎ  Ｅ．Ｓｚｕｌｍａｎ，「Ｔｈｅ  ＡＢＨ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１３（１９６５）：７５２−７５４）。ＡＢＨ血液型抗原、Ｌｅｗｉｓ血液型抗原、Ｉ血液型抗原、およびＰ血液型抗原は、細胞膜上への血漿由来の吸着に部分的に起因して、血小板上およびリンパ球上に見出される。顆粒球は、Ｉ抗原を有するがＡＢＨは有さない（Ｐ．Ｌ．Ｍｏｌｌｉｓｏｎ，Ｃ．Ｐ．Ｅｎｇｅｌｆｒｉｅｔ，Ｍ．Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ，Ｂｌｏｏｄ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第９版，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９３）。
【０１２５】
血小板もまた、それら血小板がすでに生体組織細胞と共有するＨＬＡ抗原に加えて、それら血小板の形質膜上に血小板特異的アロ抗原を発現する。現在、分子レベルで規定されている５種の認識されたヒト血小板アロ抗原（ＨＰＡ）系が存在する。示される表現形の頻度は、白人集団に対するものであり；アフリカ人集団のおよびアジア人集団における頻度は、実質的に変化し得る。例えば、ＨＰＡ−１ｂは、白人の２８％の血小板上に発現されるが、日本人の集団では４％のみである（Ｔｈｏｍａｓ  Ｊ．Ｋｕｎｉｃｋｉ，Ｐｅｔｅｒ  Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ，「Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｂｌｏｏｄ  ８０（１９９２）：１３８６−  １４０４）。
【０１２６】
特定の機能活性を有するリンパ球は、それらの細胞表面上に提示される様々な分化マーカーにより区別され得る。例えば、全ての成熟Ｔ細胞は、ＣＤ３複合体と呼ばれる一組のポリペプチド鎖を発現する。ヘルパーＴ細胞もまた、ＣＤ４糖タンパク質を発現するが、一方で細胞傷害性Ｔ細胞およびサプレッサーＴ細胞はＣＤ８と呼ばれるマーカーを発現する（Ｗａｙｎｅ  Ｍ．Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄａｖｉｄ  Ｗ．Ｄｅａｍｅｒ、Ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，第２版，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ，１９９１）。従って、表現形ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８−はヘルパーＴ細胞をポジティブに同定するが、ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８＋の検出は、細胞傷害性Ｔ細胞またはサプレッサーＴ細胞を固有に同定する。全てのＢリンパ球は、それらの表面上の免疫グロブリン（それらの抗原レセプターまたはＩｇ）を発現し、そしてこのこと（例えば、Ｉｇ＋  ＭＨＣクラスＩＩ＋）に基づきＴ細胞から区別され得る。
【０１２７】
リンパ球表面も、細胞分化の特徴的な段階にのみ発現される特異的遺伝子産物を表す異なるマーカーを示す。例えば、段階ＩのＢ細胞前駆体（Ｓｔａｇｅ  Ｉ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｂ  ｃｅｌｌ）は、ＣＤ３４＋ＰｈｉＬ−ＣＤ１９−を示し；段階ＩＩのＢ細胞前駆体はＣＤ３４＋ＰｈｉＬ＋ＣＤ１９−を示し；段階ＩＩＩのＢ細胞前駆体はＣＤ３４＋ＰｈｉＬ＋ＣＤ１９＋を示し；そして最後に、Ｂ細胞前駆体段階においてＣＤ３４−ＰｈｉＬ＋ＣＤ１９＋を示す（Ｕｎａ  Ｃｈｅｎ（「第３３章、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｉｔｓ  Ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  Ａｒｔ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｆｕｔｕｒｅ」，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｐ．Ｌａｎｚａ，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｌａｎｇｅｒ，Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｌ．Ｃｈｉｃｋ編，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｒ．Ｇ．Ｌａｎｄｅｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ  ＴＸ，１９９７，５２７−５６１頁）。
【０１２８】
好中球特異的抗原および白血球に対する種々のレセプター特異的免疫グロブリン結合特異性が存在する。例えば、単核細胞ＦｃＲＩレセプターは、測定される結合特異性ＩｇＧ１＋＋＋ＩｇＧ２−ＩｇＧ３＋＋＋ＩｇＧ４＋を示し、単核細胞ＦｃＲＩＩＩレセプターはＩｇＧ１＋＋ＩｇＧ２−１ｇＧ３＋＋ＩｇＧ４−を有し、そして好中球および好酸球性上のＦｃＲＩＩレセプターはＩｇＧ１＋＋＋ＩｇＧ２＋ＩｇＧ３＋＋＋ＩｇＧ４＋を示す。好中球もまた、それらの表面上にβ−グルカンレセプターを有する（Ｖｉｃｋｉ  Ｇｌａｓｅｒ，「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｍｏｖｅ  Ｃｌｏｓｅｒ  ｔｏ  Ｍａｒｋｅｔ」Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ、１９９８年４月１５日、１頁、１２頁、３２頁、３４頁）。
【０１２９】
組織細胞も同様に、それらの表面上にの区別可能なマーカーの特異的な一組を示す。甲状腺のミクロソームの微絨毛抗原は、甲状腺に特有である（Ｉｖａｎ  Ｍ．Ｒｏｉｔｔ，Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ｂｒｏｓｔｏｆｆ，Ｄａｖｉｄ  Ｋ．Ｍａｌｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｏｗｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）。グリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）は、星状細胞の免疫細胞化学的マーカーであり（Ｃａｒｌｏｓ  Ｌｏｉｓ，Ｊｏｓｅ−Ｍａｎｕｅｌ  Ｇａｒｃｉａ−Ｖｅｒｄｕｇｏ，Ａｒｔｕｒｏ  Ａｌｖａｒｅｚ−Ｂｕｙｌｌａ，「Ｃｈａｉｎ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１（１９９６年２月１６日）：９７８−９８１）、そしてシンタキシン１Ａおよびシンタキシン１Ｂは、ニューロン細胞の形質膜においてのみ見い出されるリンタンパク質である（Ｎｉｃｏｌｅ  Ｃａｌａｋｏｓ，Ｍａｒｋ  Ｋ．Ｂｅｎｎｅｔｅ，Ｋａｒｅｎ  Ｅ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｈ．Ｓｃｈｅｌｌｅｒ，「Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３（１９９４年２月２５日）：１１４６−１１４９）。α−フォドリンは、唾液腺細胞の臓器特異的の自己抗原性マーカーである（Ｎｏｒｉｏ  Ｈａｎｅｊｉ，Ｔａｋａｎｏｒｉ  Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋｏｊｉ  Ｔａｋｉｏら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−Ｆｏｄｒｉｎ  ａｓ  ａ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  Ａｕｔｒｏａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６（１９９７年４月２５日）：６０４−６０７）。フェルチリン（ｆｅｒｔｉｌｉｎ）は、ＡＤＡＭファミリーのメンバーであり、これは哺乳類の精子の形質膜上に見出される（Ｔｏｍａｓ  Ｍａｒｔｉｎ，Ｕｌｒｉｋｅ  Ｏｂｓｔ，Ｊｕｌｉｕｓ  Ｒｅｂｅｋ，Ｊｒ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｂｙ  Ｈｙｄｒｏｇｅｎ−Ｂｏｎｄｉｎｇ  Ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｐａｃｅ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１（１９９８年９月１８日）：１８４２−１８４５）。肝細胞は、コネキシン３２、トランスフェリンおよび主要な尿タンパク質（ＭＵＰ）とともに表現型マーカーＡＬＢ＋＋＋ＧＧＴ−ＣＫ１９−」を示し、一方、胆管細胞は、マーカーＡＦＰ−ＧＧＴ＋＋＋ＣＫ１９＋＋＋かつＢＤ．１抗原、アルカリホスファターゼおよびＤＰＰ４を示す（Ｌｏｌａ  Ｍ．Ｒｅｉｄ（「第３１章．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ／Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｌｉｎｅａｇｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｋｅｙｓ  ｔｏ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｑｕｉｓｃｅｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  ｓｕｃｈ  ａｓ  Ｌｉｖｅｒ」Ｒｏｂｅｒｔ  Ｐ．Ｌａｎｚａ，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｌａｎｇｅｒ，Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｌ．Ｃｈｉｃｋ編、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅ���ｒｉｎｇ，Ｒ．Ｇ．Ｌａｎｄｅｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ  ＴＸ，１９９７，４８１−５１４頁）。クラスリン被覆された小胞の輸送に関係する、１００キロダルトンの形質膜グアノシントリホスファターゼのファミリーとしては、ダイナミンＩ（ニューロンにおいて独占的に発現される）、ダイナミンＩＩ（すべての組織で見出される）、およびダイナミンＩＩＩ（精巣、脳および肺に限定される）が挙げられ、各々は少なくとも４種の異なる立体異性体を有する）；ダイナミンＩＩもまた、ゴルジ体経由ネットワーク（ｔｒａｎｓ−Ｇｏｌｇｉ  ｎｅｔｗｏｒｋ）における細胞内局在を示す（Ｍａｒｔｉｎ  Ｓｃｈｎｏｒｆ，Ｉｎｇｏ  Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、Ｇｕｎｔｈｅｒ  Ｎｅｕｈａｏｕｓ、「Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ：Ｒｏｕｔｉｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ  ｂｙ  Ｂｕｂｂｌｅ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ」Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１０（１９９４）：２６０−２６７）。表６は、肝原細胞（ｈｅｐａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ）（例えば、胚芽細胞）および造血性細胞（例えば赤血球の原種細胞）の多数の固有の抗原性マーカーを列挙する。
【０１３０】
【化６】
2008507981.tif 000008
細胞特異的な細胞接着分子の少なくとも４種の主要なファミリーが１９９８年に同定されており、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリー（Ｎ−ＣＡＭおよびＩＣＡＭ−１が挙げられる）、インテグリンスーパーファミリー、カドヘリンファミリーおよびセレクチンファミリー（下記参照）がある。
【０１３１】
インテグリンは、広範に種々の細胞上に発現される約２００キロダルトンの細胞表面接着レセプターであり、大部分の細胞がいくつかのインテグリンを発現している。大部分のインテグリンは、細胞外マトリックスに対する細胞性連結を媒介し、これらは、細胞骨格下層への結合に関与している。細胞型に特異的な例としては、血小板特異的インテグリン（αＩＩｂβ３）、リンパ球特異的β２インテグリン、後期活性化（αＬβ２）のリンパ球抗原、腎臓の神経節軸索インテグリン（α６β１）、およびケラチノサイトインテグリン（α５β１）が挙げられる（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｏ．Ｈｙｎｅｓ「Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ：Ｖｅｒｓａｔｉｌｉｔｙ，Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ」Ｃｅｌｌ６９（１９９２年４月３日）：ｌｌ−２５）。少なくとも２０種の異なるヘテロダイマーのインテグリンレセプターが、１９９８年において公知であった。
【０１３２】
７２３〜７４８残基の膜貫通タンパク質のカドヘリン分子ファミリーは、細胞特異的である細胞−細胞接着のさらにもう一つの手段を提供する（Ｍａｓａｔｏｓｈｉ  Ｔａｋｅｉｃｈｉ，「Ｃａｄｈｅｒｉｎｓ：Ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆａｍｉｌｙ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｉｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ」Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９（１９９０）：２３７−２５２）。カドヘリンは、細胞骨格に連結される。古典的カドヘリンとしては、Ｅ−カドヘリン（上皮性）、Ｎ−カドヘリン（神経性またはＡ−ＣＡＭ）、およびＰ−カドヘリン（胎盤性）が挙げられるが、１９９８年において、少なくとも１２種の異なるメンバーのファミリーが公知であった（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ  Ｊ．Ｌｕｎａ，Ａｎｎｅ  Ｌ．Ｈｉｔｔ「Ｃｙｔｏｓｋｅｌｔｏｎｅ−Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８（１９９２）：９５５−９６４）。これらは、細胞表面上での細胞−細胞間結合に集中し（しかし独占的に見出されるのではない）、そして多細胞構築物を維持するために重要であるようである。細胞は、同一のカドヘリンタイプを発現する他の細胞に優先して接着する。肝臓肝細胞は、Ｅ−カドヘリンのみを発現する；間葉肺細胞、視覚軸索および神経上皮細胞は、Ｎ−カドヘリンのみを発現する；肺の上皮細胞は、Ｅ−カドヘリンおよびＰ−カドヘリン両方を発現する。カドヘリンファミリーのメンバーも、胚の異なる空間時間的パターンにおいて、計量分配され、カドヘリン型の発現は、細胞が分化するにつれて動的に変化する（Ｍａｓａｔｏｓｈｉ  Ｔａｋｅｉｃｈｉ，「Ｃａｄｈｅｒｉｎｓ：Ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆａｍｉｌｙ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｉｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ」Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９（１９９０）：２３７−２５２）。
【０１３３】
炭水化物は、細胞認識において重要である。すべての細胞は、糖タンパク質および糖脂質からなる薄い糖被覆（グリコカリックス）を有し、その約３０００の異なるモチーフは、１９９８年までに同定された。細胞が発達するか、分化するかまたは病気になる場合に、炭水化物細胞表層構造のレパートリは特徴的に変化する。例えば、胚が一群の緩んだ細胞から滑らかなボールへとコンパクトになる場合に、固有な三糖類（ＳＳＥＡ−ＩまたはＬｅＸ）が、正確に８細胞期〜１６細胞期において発達中の胚の細胞表面上に現れる。
【０１３４】
炭水化物のモチーフは、理論的には、ヌクレオチドベースの構造またはタンパク質ベースの構造よりも多くの多様な組み合わせである。ヌクレオチドおよびアミノ酸は一方向でのみ相互接続され得るが、オリゴ糖および多糖類の単糖単位は、複数の点において結合し得る。従って、２個のアミノ酸は２個の異なるジペプチドのみを産生し得るが、２個の同一の単糖は結合して１１個の異なる二糖類を形成し得る。なぜなら、各単糖が６個の炭素を有して合計６＋５＝１１の可能な組合せのための６つの異なる結合点を各単位に与えるからである。４個の異なるヌクレオチドは、２４個のみの異なるテトラヌクレオチドを産生し得るが、４個の異なる単糖は、分枝構造を有する多数を含め、３５，５６０個の固有の四糖類を作製し得る（Ｎａｔｈａｎ  Ｓｈａｒｏｎ，Ｈａｌｉｎａ  Ｌｉｓ，「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ」，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２６８（１９９３年１月）：８２−８９）。単一の六糖は約１０１２個の異なる構造を産生し得、対して６つのペプチドについては６．４×１０７個のみの構造を産生し得る；９マーの炭水化物は、異性体分子を産生する（Ｒｏｇｅｒ  Ａ．Ｌａｉｎｅ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４（１９９４）：１−９）。
【０１３５】
膜貫通型糖タンパク質のＣＤ４４ファミリーは、ＥＣＭ結合、細胞遊走およびリンパ球ホーミング（ｈｏｍｉｎｇ）を媒介する８０〜９５キロダルトンの細胞接着レセプターである。ＣＤ４４抗原は、多種多様な細胞特異的かつ組織特異的なグリコシル化パターンを示し、各細胞型は、炭水化物構造のそれ自身の固有のアレイでＣＤ４４コアタンパク質を装飾している（Ｊａｙｎｅ  Ｌｅｓｌｅｙ，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｈｙｍａｎ，Ｐａｕｌ  Ｗ．Ｋｉｎｃａｄｅ，「ＣＤ４４  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ」，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５４（１９９３）：２７１−３３５；Ｔｏｄ  Ａ．Ｂｒｏｗｎ，Ｔｏｄｄ  Ｂｏｕｃｈａｒｄ，Ｔｏｍ  Ｓｔ．Ｊｏｈｎ，Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ  Ｗａｙｎｅｒ，Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｇ．Ｃａｒｔｅｒ，「Ｈｕｍａｎ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ａ  Ｎｅｗ  ＣＤ４４  Ｃｏｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＤ４４Ｅ）ａｓ  ａ  Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｗｉｔｈ  Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｅｘｏｎｓ」，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １１３（１９９１年４月）：２０７−２２１）。異なるＣＤ４４細胞表面分子は、リンパ球、マクロファージ、線維芽細胞、上皮細胞およびケラチノサイトにおいて見出されている。神経系におけるＣＤ４４の発現は、健常な若年者の白質（星状細胞および膠細胞を含む）に限定されるが、加齢または疾患に伴って灰白質に現れる（Ｊａｙｎｅ  Ｌｅｓｌｅｙ，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｈｙｍａｎ，Ｐａｕｌ  Ｗ．Ｋｉｎｃａｄｅ，「ＣＤ４４  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ」，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５４（１９９３）：２７１−３３５）。いくつかの組織はＣＤ４４ネガティブであり、これら組織としては、肝臓肝細胞、腎臓管状上皮、心筋、精巣、および皮膚の一部が挙げられる。
【０１３６】
約５０キロダルトンの細胞接着レセプター糖タンパク質分子のセレクチンファミリー（Ａｊｉｔ  Ｖａｒｋｉ，「Ｓｅｌｅｃｔｉｎ  ｌｉｇａｎｄｓ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（１９９４年８月）：７３９０−７３９７；Ｍａｓａｔｏｓｈｉ  Ｔａｋｅｉｃｈｉ，「Ｃａｄｈｅｒｉｎｓ：Ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆａｍｉｌｙ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｉｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ」，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９（１９９０）：２３７−２５２）は、多様な細胞表面抗原炭水化物を認識し得、そして炎症（白血球輸送）の領域に白血球を局在化するのを助け得る。セレクチンは、細胞骨格には結合しない（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ  Ｊ．Ｌｕｎａ，Ａｎｎｅ  Ｌ．Ｈｉｔｔ，「Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ−Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８（１９９２年１１月９日）：９５５−９６４）。白血球はＬ−セレクチンレセプターを示し、血小板はＰ−セレクチンレセプターを示し、内皮細胞はＥ−セレクチンレセプター（ならびにＬ−セレクチンレセプターおよびＰ−セレクチンレセプター）を示す。セレクチンにより認識される細胞特異的分子としては、腫瘍ムチンオリゴ糖（Ｌ、ＰおよびＥにより認識される）、脳糖脂質（ＰおよびＬにより認識される）、好中性の糖タンパク質（ＥおよびＰにより認識される）、白血球シアロ糖タンパク質（ＥおよびＰにより認識される）、および内皮のプロテオグリカン（ＰおよびＬにより認識される）が挙げられる（Ａｊｉｔ  Ｖａｒｋｉ、（１９９４））。関連したＭＥＬ−１４糖タンパク質ホーミングレセプターのファミリーは、「脈管アドレッシン（腸のパイエル板、腸間膜リンパ節、肺関連のリンパ節、滑膜細胞および授乳期の胸部内皮細胞において見出される細胞特異的表面抗原）」によってコードされる特異的リンパ組織に対するリンパ球のホーミングを可能にする。ホーミングレセプターはまた、いくつかのリンパ球が結腸および空腸との間を区別することを可能にする（Ｔｅｄ  Ａ．Ｙｅｄｎｏｃｋ，Ｓｔｅｖｅｎ  Ｄ．Ｒｏｓｅｎ，「Ｄｙｎａｎｍｉｃ  Ｈｏｍｉｎｇ」，Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４４（１９８９）：３１３−３７８、Ｌｌｏｙｄ  Ｍ．Ｓｔｏｏｌｍａｎ、「Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ」，Ｃｅｌｌ  ５６（１９８９年３月２４日）：９０７−９１０）。化学誘引物質レセプターと一緒になった、そしてインテグリン−Ｉｇと一緒になったセレクチン関連の相互作用は、一連の白血球血管外遊走を調節し、生体中での細胞局在化のための３桁の「エリアコード」を確立する（Ｔｉｍｏｔｈｙ  Ａ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，「Ｔｒａｆｆｉｃ  Ｓｉｇｎａｌｓ  ｏｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ｆｏｒ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｒｅｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｅｍｉｇｒａｔｉｏｎ」，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５７（１９９５）：８２７−８７２）。
【０１３７】
最後に、細胞は、それらの固有の膜貫通細胞骨格関連のタンパク質に従ってタイプ分けされ得る。例えば、赤血球膜は、グリコホリンＣ（約２５キロダルトン、１平方ミクロンあたり約３０００分子）およびｂａｎｄ３イオン交換体（９０〜１００キロダルトン、１平方ミクロンあたり約１０，０００分子）を含む（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ  Ｊ．Ｌｕｎａ，Ａｎｎｅ  Ｌ．Ｈｉｔｔ，「Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ−Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８（１９９２年１１月６日）：９５５−９６４；Ｍ．Ｊ．Ｔａｎｎｅｒ，「Ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｄ  ｃｅｌｌ」，Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ  Ｃｌｉｎ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．６（１９９３年６月）：３３３−３５６）；血小板膜は、ＧＰ  Ｉｂ−ＩＸ糖タンパク質複合体（１８６キロダルトン）を組み込む；好中球における細胞膜拡張は、膜貫通タンパク質ポンティキュリン（ｐｏｎｔｉｃｕｌｉｎ）（１７キロダルトン）を必要とする；そして、横紋筋細胞膜は、膜貫通ジストロフィン−糖タンパク質複合体の最も外側部分において、特定のラミニン結合性糖タンパク質（１５６キロダルトン）を含む（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ  Ｊ．Ｌｕｎａ，Ａｎｎｅ  Ｌ．Ｈｉｔｔ，「Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ−Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８（１９９２年１１月６日）：９５５−９６４）。しばしば細胞表面に現れて、異なる単糖およびオリゴ糖を区別し得る様々な炭水化物−結合タンパク質（レクチン）も存在する（Ｎａｔｈａｎ  Ｓｈａｒｏｎ，Ｈａｌｉｎａ  Ｌｉｓ，「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ」，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２６８（１９９３年１月）：８２−８９）。細胞特異的レクチンとしては、肝細胞のガラクトース（アシアロ糖タンパク質）結合性レクチンおよびフコース結合性レクチン、線維芽細胞のマンノシル−６−ホスフェート（Ｍ６Ｐ）レクチン、肺胞マクロファージのマンノシル−Ｎ−アセチルグルコサミン結合性レクチン、尿路上皮細胞のうちガラビオース結合性レクチン、ならびに心臓、脳および肺のいくつかのガラクトース結合性レクチンが挙げられる（Ｎａｔｈａｎ  Ｓｈａｒｏｎ，（１９９３）；Ｍａｒｋ  Ｊ．Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ，Ｒｕｄｏｌｐｈ  Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ，「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ：Ａ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ，「Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３６（１９８４）：２７７−３３６；Ｋａｒｌ−Ａｎｄｅｒｓ  Ｋａｒｌｓｓｏｎ，「Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｇｒｏｗｉｎｇ  Ｆｉｅｌｄ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ」，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １２（１９９１年７月）：２６５−２７２；Ｎ．Ｓｈａｒｏｎ，Ｈ．Ｌｉｓ，「Ｌｅｃｔｉｎｓ−−ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｗｅｅｔ  ｔｏｏｔｈ：ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ」，Ｅｓｓａｙｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０（１９９５）��５９−７５）。
【０１３８】
さらに、開示された方法において生成され得る細胞型の説明は、本明細書中の以下または他に提供される。
【０１３９】
（ａ  角質化した上皮細胞）
角質化した上皮細胞としては、上皮ケラチノサイト（分化した上皮細胞）を含むことが挙げられる。ケラチノサイトは、表皮の細胞のほぼ９０％を形成する。表皮は、ケラチノサイトの形態学に基づいて、４層に分けられる：これらは、基底層（真皮との接合において）、顆粒層、有棘層および角質層を含む。ケラチノサイトは、ケラチノサイト幹細胞の分化を通して基底層において発達を開始する。それらは表皮層を通して押し上げられ、それらケラチノサイトが、鱗屑と呼ばれている死亡した、平板化した、高度に角質化した細胞の層を形成する角質層に達するまで、徐々に分化を受ける。この層は、本体に異物および感染因子の侵入に対する有効なバリアを形成し、湿気の損失を最小限にする。角質化した上皮細胞としてはまた、表皮性幹細胞である表皮基底細胞が挙げられる。角質化した上皮細胞としてはまた、指の爪および足の爪のケラチノサイト、爪床基底細胞（幹細胞）、髄質毛幹細胞、皮質毛幹細胞、小皮（Ｃｕｔｉｃｕｌａｒ）毛幹細胞、小皮毛根鞘細胞、ハックスリー層の毛根鞘細胞、ヘンレ層の毛根鞘細胞、外側の毛根鞘細胞および毛髪マトリックス細胞（幹細胞）が挙げられる。本明細書において開示される細胞のあらゆる幹細胞および始原細胞も挙げられる。
【０１４０】
（ｂ  湿性重層バリア上皮細胞）
ヒトの湿性重層バリア上皮細胞としては、角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位の尿道および膣の重層扁平上皮の表層上皮細胞、ならびに角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位の尿道および膣の上皮の基底細胞（幹細胞）、ならびに（膀胱および尿路を裏打ちする）尿上皮細胞が挙げられる。また、本明細書中に開示される細胞のあらゆる幹細胞および始原細胞も、ならびにそれらが導く細胞も、挙げられる。
【０１４１】
動物解剖学において、上皮は、上皮細胞からなる組織である。このような組織は代表的に、細胞膜が細胞を覆うように、身体部分を覆う。これはまた、腺を形成するために使用される。ヒト皮膚の最外層ならびに口および体腔の粘膜は、死亡した扁平上皮細胞から形成される。上皮細胞はまた、肺、胃腸管、生殖管および尿路の内部を裏打ちし、そして外分泌腺および内分泌腺を形成する。本明細書中に開示される細胞のあらゆる幹細胞および始原細胞、ならびにそれらが導く細胞もまた、含まれる。
【０１４２】
（ｃ  外分泌の分泌上皮細胞）
外分泌の分泌上皮細胞としては、以下が挙げられる：唾液腺粘液細胞（これは、多糖に富んだ分泌物を産生する）、唾液腺漿液細胞（糖タンパク質酵素に富んだ分泌）、舌におけるＶｏｎ  Ｅｂｎｅｒの腺細胞（味覚芽を洗浄する）、乳腺細胞（乳汁の分泌）、涙腺細胞（涙液の分泌）、および耳における耳道腺細胞（ワックス分泌）、外分泌汗腺暗細胞、（糖タンパク質の分泌）、外分泌汗腺明細胞（低分子の分泌）、アポクリン汗腺細胞（発香性の分泌、性ホルモン感受性）、眼瞼のモル細胞の腺（特化した汗腺）、皮脂腺細胞（脂質に富んだ皮脂の分泌）鼻のボウマン腺細胞、十二指腸のブラナー腺細胞（酵素およびアルカリの粘液）、精嚢細胞（精液成分の分泌）、前立腺細胞（精液成分の分泌物）、尿道球腺細胞（粘液の分泌）、バルトリン腺細胞（膣潤滑油の分泌）、リトル腺細胞（粘液の分泌）、子宮内膜細胞（炭水化物の分泌）、呼吸路および消化路の単離された杯細胞（粘液の分泌）、胃を裏打ちする粘膜細胞（粘膜の分泌）、胃線の酵素原細胞（ペプシノーゲン分泌）、胃腺の胃酸分泌細胞（ＨＣｌの分泌）、膵臓の腺房細胞（重炭酸イオンおよび消化酵素の分泌）、小腸のパネート細胞（リソチームの分泌）、肺のＩＩ形肺細胞（界面活性剤の分泌）、および肺のクラーラ細胞。本明細書中に開示される細胞の任意の幹細胞および始原細胞、ならびにそれらが導く細胞もまた、含まれる。
【０１４３】
（ｄ  ホルモン分泌細胞）
ホルモン分泌細胞としては、以下が挙げられる：脳下垂体前葉細胞、ソマトトロピン産生細胞、ラクトトロピン産生細胞（Ｌａｃｔｏｔｒｏｐｅ）、甲状腺刺激ホルモン産生細胞（Ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｅ）、性腺刺激ホルモン産生細胞（Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｅ）、コルチコトロピン産生細胞（Ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｅ）、中間下垂体細胞（Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ｃｅｌｌ）、メラニン細胞刺激ホルモンを分泌する細胞、大型細胞の神経分泌細胞、オキシトシンを分泌する細胞、バソプレッシンを分泌する細胞、セロトニンを分泌する腸管および呼吸路の細胞、エンドルフィンを分泌する細胞、ソマトスタチンを分泌する細胞、ガストリンを分泌する細胞、セクレチンを分泌する細胞、コレシストキニンを分泌する細胞、インスリンを分泌する細胞、グルカゴンを分泌する細胞、ボンベシンを分泌する細胞、甲状腺細胞、甲状腺上皮細胞、傍濾胞細胞、副甲状腺細胞、副甲状腺主細胞、好酸素性細胞、副腎腺細胞、クロム親和性細胞、ステロイドホルモン（鉱質コルチコイドおよび糖質コルチコイド）を産生する細胞、テストステロンを分泌する精巣のライディヒ細胞、エストロゲンを分泌する卵胞の内膜細胞、プロゲステロンを分泌する破裂性卵胞の黄体細胞、腎臓の傍糸球体装置の細胞（レニンの分泌）、腎臓の緻密斑細胞、腎臓の周血管極細胞、および腎臓のメサンギウム細胞。本明細書中に開示される細胞の任意の幹細胞および始原細胞、ならびにそれらが導く細胞もまた、含まれる。
【０１４４】
（ｅ  上皮吸収細胞（腸、外分泌線および尿路））
上皮吸収細胞としては、腸刷子縁細胞（微小絨毛を有する）、外分泌腺線条導管細胞、胆嚢上皮細胞、腎臓近位尿細管刷子縁細胞、腎臓遠位尿細管細胞、小輸出管非線毛細胞（Ｄｕｃｔｕｌｕｓ  ｅｆｆｅｒｅｎｓ  ｎｏｎｃｉｌｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ）、精巣上体主部細胞（Ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ  ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｃｅｌｌ）、および精巣上体基部細胞が挙げられる。本明細書中に開示される細胞の任意の幹細胞および始原細胞、ならびにそれらが導く細胞もまた、含まれる。
【０１４５】
（ｆ  代謝および貯蔵細胞）
代謝および貯蔵細胞としては、肝細胞、白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞および肝臓脂肪細胞が挙げられる。本明細書中に開示される細胞の任意の幹細胞および始原細胞、ならびにそれらが導く細胞もまた、含まれる。
【０１４６】
（ｇ  バリア機能細胞（肺、腸、外分泌腺および尿生殖腺））
バリア機能細胞としては、Ｉ型肺細胞（肺の気腔を裏打ちする）、膵管細胞（房心細胞）、非重層胆管細胞（汗腺、唾液腺、乳腺、などの細胞）、腎糸球体壁細胞、腎糸球体有足細胞、ヘンレ薄層部分細胞のループ（Ｌｏｏｐ  ｏｆ  Ｈｅｎｌｅ  ｔｈｉｎ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｃｅｌｌ）（腎臓における）、腎臓集合管細胞、および管路細胞（精嚢、前立腺などの細胞）が挙げられる。本明細書中に開示される細胞の任意の幹細胞および始原細胞、ならびにそれらが導く細胞もまた、含まれる。
【０１４７】
（ｈ  閉鎖した体内腔を裏打ちする上皮細胞）
閉鎖した体内腔を裏打ちする上皮細胞としては、以下が挙げられる：血管およびリンパ血管の内皮有窓細胞、血管およびリンパ血管の内皮脾細胞、滑膜細胞（関節腔の裏打ち、ヒアルロン酸の分泌）、漿膜細胞（腹膜、胸膜、および心臓周囲の空腔を裏打ちする）、扁平上皮細胞（耳の外リンパ腔を裏打ちする）、扁平上皮細胞（耳の内リンパ腔を裏打ちする）、微小絨毛を有する内リンパ嚢の円柱細胞（耳の内リンパ腔を裏打ちする）、微小絨毛のない内リンパ嚢の円柱細胞（耳の内リンパ腔を裏打ちする）、暗細胞（耳の内リンパ腔を裏打ちする）、前庭階壁細胞（耳の内リンパ腔を裏打ちする）、血管条（Ｓｔｒｉａ  ｖａｓｃｕｌａｒｉｓ）基底細胞（耳の内リンパ腔を裏打ちする）、血管条辺縁細胞（耳の内リンパ腔を裏打ちする）、クラウディウス細胞（耳の内リンパ腔を裏打ちする）、ベットヒャー細胞（耳の内リンパ腔を裏打ちする）、脈絡叢細胞（脳脊髄液の分泌）、軟骨クモ膜扁平上皮細胞、色素沈着した目の線毛上皮細胞、色素沈着のない目の線毛上皮細胞、および角膜内皮細胞が挙げられる。また、本明細書中に開示される細胞のあらゆる幹細胞および始原細胞も、ならびにそれらが導く細胞も、挙げられる。
【０１４８】
（ｉ  前進機能を有する線毛細胞）
前進機能を有する線毛細胞としては、気道線毛細胞、卵管線毛細胞（女性において）、子宮内膜線毛細胞（女性において）、精巣網線毛細胞（男性において）、小輸出管線毛細胞（男性において）、および中枢神経系の線毛上衣細胞が挙げられる。本明細書中に開示される細胞の任意の幹細胞および始原細胞、ならびにそれらが導く細胞もまた、含まれる。
【０１４９】
（ｊ  細胞外マトリクス分泌細胞
細胞外マトリクス分泌細胞としては、以下が挙げられる：エナメル芽上皮細胞（歯エナメルの分泌）、耳の前庭の半月面上皮細胞（プロテオグリカンの分泌）、コルティ歯間の上皮細胞の器官（有毛細胞を覆う蓋膜を分泌する）、疎性結合組織線維芽細胞、角膜線維芽細胞、腱線維芽細胞、骨髄細網組織線維芽細胞、他の非上皮性線維芽細胞、毛細血管周囲細胞、椎間板の髄核細胞、セメント芽／セメント細胞（歯根骨のようなセメント質分泌）、象牙芽細胞／象牙細胞（ｏｄｏｎｔｏｃｙｔｅ）（歯の象牙質の分泌）、硝子軟骨軟骨細胞、線維軟骨細胞、弾性軟骨軟骨細胞、骨芽細胞／骨細胞、前骨芽細胞（骨芽細胞の幹細胞）、目の硝子体の硝子体細胞、および耳の外リンパ腔の星状細胞。本明細書中に開示される細胞の任意の幹細胞および始原細胞、ならびにそれらが導く細胞もまた、含まれる。
【０１５０】
（ｋ  収縮性細胞）
収縮性細胞としては、以下が挙げられる：赤色骨格筋細胞（遅筋）、白色骨格筋細胞（速筋）、中間の骨格筋細胞、筋紡錘の核袋細胞、筋紡錘の核鎖細胞、衛星細胞（幹細胞）、通常の心筋細胞、結節性心筋細胞、プルキニエ線維細胞、平滑筋細胞（種々のタイプのもの）、虹彩の筋上皮細胞、および外分泌腺の筋上皮細胞。本明細書中に開示される細胞の任意の幹細胞および始原細胞、ならびにそれらが導く細胞もまた、含まれる。
【０１５１】
（ｌ  血液系および免疫系の細胞）
血液系および免疫系の細胞としては、以下が挙げられる：赤血球、巨核球（血小板前駆体）、単球、結節性組織マクロファージ（種々のタイプのもの）、表皮ランゲルハンス細胞、破骨細胞（骨において）、樹状細胞（リンパ系組織において）、小グリア細胞（中枢神経系において）、好中球顆粒球、好酸球顆粒球、好塩基球顆粒球、マスト細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、ならびに血液系および免疫系に関する幹細胞および前駆（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）始原細胞（種々のタイプ）。本明細書中に開示される細胞の任意の幹細胞および始原細胞、ならびにそれらが導く細胞もまた、含まれる。
【０１５２】
（ｍ  感覚伝達細胞）
感覚伝達細胞としては、以下が挙げられる：目の光受容体桿体細胞、目の光レセプター青色感受性錐体細胞、目の光レセプター緑色感受性錐体細胞、目の光レセプター赤色感受性錐体細胞、コルティ器官の聴覚内耳有毛細胞、コルティ器官の聴覚外側有毛細胞、耳の前庭のＩ型有毛細胞（加速および重力）、耳の前庭のＩＩ型有毛細胞（加速および重力）、Ｉ型味蕾細胞、嗅覚レセプターニューロン、嗅上皮の基底細胞（嗅覚ニューロンのための幹細胞）、Ｉ型頸動脈小体細胞（血液ｐＨセンサ）、ＩＩ型頸動脈小体細胞（血液ｐＨセンサ）、表皮のメルケル細胞（接触覚センサ）、接触感受性一次感覚神経（種々のタイプ）、低温感受性一次感覚神経、熱感受性一次感覚神経、疼痛感受性一次感覚神経（種々のタイプ）、および固有一次感覚神経（種々のタイプ）。本明細書中に開示される細胞の任意の幹細胞および始原細胞、ならびにそれらが導く細胞もまた、含まれる。
【０１５３】
（ｎ  自律神経ニューロン細胞）
自律神経ニューロン細胞としては、コリン作用性神経細胞（種々のタイプ）、アドレナリン作用性神経細胞（種々のタイプ）、およびペプチド作用性神経細胞（種々のタイプ）が挙げられる。また、本明細書中に開示される細胞のあらゆる幹細胞および始原細胞も、ならびにそれらが導く細胞も、挙げられる。
【０１５４】
（ｏ  感覚器官および末梢ニューロンの支持細胞）
感覚器官および末梢ニューロンの支持細胞としては、以下が挙げられる：コルティ器官の内側柱状細胞、コルティ器官の外側柱状細胞、コルティ器官の内側支持指節骨細胞、コルティ器官の外側指節骨支持細胞、コルティ器官の境界細胞、コルティ器官のヘンゼン細胞、前庭器支持細胞、Ｉ型味蕾支持細胞、嗅覚上皮支持細胞、シュワン細胞、衛星細胞（末梢神経細胞体をカプセル化する）、および腸グリア細胞。本明細書中に開示される細胞の任意の幹細胞および始原細胞、ならびにそれらが導く細胞もまた、含まれる。
【０１５５】
（ｐ  中枢神経系ニューロンおよび神経膠細胞）
中枢神経系ニューロンおよび神経膠細胞としては、ニューロン細胞（種々の豊富なタイプ）、神経膠星状細胞（種々のタイプ）、および希突起神経膠細胞が挙げられる。本明細書中に開示される細胞の任意の幹細胞および始原細胞、ならびにそれらが導く細胞もまた、含まれる。
【０１５６】
（ｑ  レンズ細胞）
レンズ細胞としては、前方レンズ上皮細胞およびクリスタリン含有レンズ線維細胞が挙げられる。本明細書中に開示される細胞の任意の幹細胞および始原細胞、ならびにそれらが導く細胞もまた、含まれる。
【０１５７】
（ｒ  色素細胞）
色素細胞としては、メラノサイトおよび網膜の色素沈着した上皮細胞が挙げられる。本明細書中に開示される細胞の任意の幹細胞および始原細胞、ならびにそれらが導く細胞もまた、含まれる。
【０１５８】
（ｓ  胚細胞）
胚細胞としては、卵原細胞／卵母細胞、精母細胞および精原細胞（精母細胞のための幹細胞）が挙げられる。本明細書中に開示される細胞の任意の幹細胞および始原細胞、ならびにそれらが導く細胞もまた、含まれる。
【０１５９】
（ｔ  栄養細胞）
栄養（ｎｕｒｓｅ）細胞としては、卵胞細胞、セルトリ細胞（精巣において）、および胸腺上皮細胞が挙げられる。本明細書中に開示される細胞の任意の幹細胞および始原細胞、ならびにそれらが導く細胞もまた、含まれる。
【０１６０】
（６．組成物および方法に関する特徴および技術）
（ａ  配列の類似性）
本明細書中で述べられるように、相同性および同一性の用語の使用は、類似性と同じものを意味するものと理解される。従って、例えば、相同性の語の使用が２つの非天然の配列間に使われる場合、この使用はこれらの２つの配列の進化上の関係を必ずしも示すことはなく、むしろそれらの核酸配列間の類似性または関連性に注目しているものと理解される。２つの進化上関連した分子間の相同性の決定ための多くの方法は、それらが進化的に関連があるかどうかに関係なく、配列類似性を測定するための任意の２つ以上の核酸またはタンパク質に対して、慣用的に適用される。
【０１６１】
一般に、本明細書中で開示された遺伝子およびタンパク質の中で、任意の公知の改変体および誘導体、またはそれらの生じ得るものを定義する一つの方法が、特定の既知配列への相同性に関して改変体および誘導体を定義することを介するものと理解される。本明細書中に開示される特定の配列の同一性もまた、本明細書中の他所で述べられる。一般に、本明細書中に開示される遺伝子およびタンパク質の改変体は、代表的に、その定められる配列または天然の配列に対して、少なくとも約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の相同性を有する。当業者は、２つのタンパク質または核酸（例えば、遺伝子）の相同性を決定する方法を容易に理解する。例えば、相同性がその最高レベルにあるように、この相同性は２つの配列を整列配置した後に計算され得る。
【０１６２】
相同性を計算する別の方法は、公開されたアルゴリズムにより実行され得る。比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同整列アルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピューター上での実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））、または目視検査（ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ）によって、行われ得る。
【０１６３】
同じ形式の相同性は、例えばＺｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４，４８−５２、１９８９、Ｊａｅｇｅｒら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６−７７１０，１９８９，Ｊａｅｇｅｒら  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９）（これらは、核酸の整列に関して少なくとも材料についての参照として援用される）において開示されるアルゴリズムによって、核酸に関して得られ得る。任意の方法が代表的に使用され得ること、および特定の例においてこれらの種々の方法の結果が異なり得ることが理解されるが、当業者は、同一性が少なくともこれらの方法のうちの１つを用いて見出される場合に、それらの配列は示される同一性を有すると述べられ得、そして本明細書中に開示され得ることを理解する。
【０１６４】
例えば、本明細書中で使われるように、別の配列に対して特定のパーセント相同性を有するとして示される配列は、上記の計算方法の任意の一つ以上によって計算される、示される相同性を有する配列を参照する。例えば、Ｚｕｋｅｒの計算方法を使用して第１の配列が第２の配列に対して８０％相同性を有すると計算される場合、任意の他の計算方法により算出される場合に第１の配列が第２の配列に対して８０％相同性を有しない場合であっても、本明細書で定義されるように、第１の配列は第２の配列に対して８０％相同性を有する。別の例として、Ｚｕｋｅｒの計算方法ならびにＰｅｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの計算方法の両方を使用して第１の配列が第２の配列に対して８０％相同性を有すると計算される場合、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの計算方法、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの計算方法、Ｊａｅｇｅｒの計算方法、または任意の他の計算方法によって計算されるに場合に第１の配列が第２の配列に８０％相同性を有しない場合であっても、本明細書で定義されるように、第１の配列は第２の配列に対して８０％相同性を有する。なお別の例として、各々の計算方法を使用して第１の配列が第２の配列に対して８０％相同性を有すると計算される場合、本明細書中に定義されるように、この第１の配列は第２の配列に対して８０％相同性を有する（しかし、実際には、異なる計算方法はしばしば異なる相同性％の計算値を生じる）。
【０１６５】
（ｂ  ハイブリダイゼーション／選択的ハイブリダイゼーション）
ハイブリダイゼーションという用語は代表的に、少なくとも２つの核酸分子（例えば、プライマーまたはプローブおよび遺伝子）の間の配列により駆動される相互作用を意味する。配列により駆動される相互作用は、ヌクレオチド特異的な様式で、２つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導体との間に起こる相互作用を意味する。配列により駆動される相互作用は、例えば、Ｃと相互作用しているＧ、またはＴと相互に作用しているＡである。代表的に、配列により駆動される相互作用は、ヌクレオチドのＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ面またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ面において起こる。２つの核酸のハイブリダイゼーションは、当業者に公知の多くの条件およびパラメータにより影響を受ける。例えば、反応の塩濃度、ｐＨおよび温度はすべて、２つの核酸分子がハイブリダイズするかどうかに影響する。
【０１６６】
２つの核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションのパラメーターは、当業者に周知である。例えば、選択的ハイブリダイゼーション条件は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として定義され得る。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション工程および洗浄工程の一方または両方についての、温度および塩濃度の両方により制御されてる。例えば、選択的ハイブリダイゼーションを達成するハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍ（分子の半分がそれらのハイブリダイゼーションのパートナーから分離する融解温度）より約１２℃〜２５℃低い温度での高イオン強度の溶液（６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥ）におけるハイブリダイゼーション、その後の洗浄温度がＴｍより約５℃〜２０℃低いように選択される温度および塩濃度の組み合わせでの洗浄、を含み得る。この温度および塩の条件は、予備実験において実験的に容易に決定される。ここで、フィルター上に固定される参照ＤＮＡサンプルが、目的の標識された核酸にハイブリダイズし、次いで異なるストリンジェンシー条件下で洗浄される。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションに関するハイブリダイゼーション温度は、代表的により高い。これらの条件は、ストリンジェンシーを達成するために上記の通りに使用され得るか、または当該分野で公知である通りに使用され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｋｕｎｋｅｌら  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７：１５４：３６７，１９８７、これらは、核酸のハイブリダイゼーションに関する少なくとも材料に関して参考として援用される）。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションに関する好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥ中で約６８℃（水溶液中）においてのハイブリダイゼーション、その後の６８℃における洗浄であり得る。所望の場合、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望の相補性の程度が減少されるに従って、そしてさらに、可変性が検索される領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔの豊富さに依存して、低減され得る。同様に、所望の場合、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望の相補性が増加されるに従って、そしてさらに、高い相同性が所望される任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔの豊富さに依存して、増加され得る。
【０１６７】
選択的ハイブリダイゼーションを定める別の方法は、他の核酸に結合される核酸のうちの１つの量（割合）を観察することによる。例えば、選択的ハイブリダイゼーション条件は、限定的な核酸のうちの少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％が、非限定的な核酸に結びつく場合であり得る。代表的に、非限定的なプライマーは、例えば、１０倍または１００倍または１０００倍の過剰量で存在する。この型のアッセイは、限定的なプライマーおよび非限定的なプライマーの両方が、例えば、それらのｋｄの１／１０倍または１／１００倍あるいは１／１０００倍より低い条件、または核酸分子のうちの１方のみが１０倍または１００倍または１０００倍で存在する条件、または核酸分子の一方または両方が、それらのｋｄより多い条件、において実行され得る。
【０１６８】
選択的ハイブリダイゼーションを定める別の方法は、ハイブリダイゼーションが所望の酵素操作を促進することが必要とされる条件下で酵素により操作されたプライマーの割合を観察することによる。例えば、選択的ハイブリダイゼーション条件は、プライマーのうちの少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％が、酵素操作を促進する条件下で酵素により操作される場合であり得、例えば、上記の酵素操作がＤＮＡ伸長である場合、選択的ハイブリダイゼーション条件は、少なくともプライマー分子のうちの約６０％、約６５％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％が伸長される場合であり得る。好ましい条件はまた、酵素がその操作を実行するのに適切であるように、製造業者によって提案される条件、または当該分野で示される条件が挙げられる。
【０１６９】
相同性とまさに同様に、２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションのレベルを決定するため、本明細書中に開示される様々な方法が存在することが理解される。これらの方法および条件が２つの核酸分子の間に異なる割合のハイブリダイゼーションを提供し得ることが理解されるが、特に明記しない限り、これらの任意の方法のパラメーターを合致させることで充分である。８０％のハイブリダイゼーションが必要とされる場合、そしてこれらの方法のいずれか一つの必要とされるパラメーター内でハイブリダイゼーションが起こる限り、その場合は本明細書中で開示されるとみなされる。
【０１７０】
組成物または方法が、集合的または単独のいずれかでハイブリダイゼーションを決定するためのこれらの判断基準のいずれか１つに合致する場合、これは、本明細書中に開示される組成物または方法であることが、当業者に理解される。
【０１７１】
（ｃ  核酸）
本明細書中に開示される、核酸ベースである様々な分子（例えば、Ｒａｓおよび本明細書中に開示される任意の他のタンパク質をコードする核酸が例として挙げられる）、および種々の機能性核酸が存在する。例えば、開示される核酸は、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド置換物から形成される。これらの分子および他の分子の非限定的な例は、本明細書中で考察される。例えば、ベクターが細胞内で発現される場合、発現されるｍＲＮＡは代表的に、Ａ、Ｇ、ＣおよびＵから形成されることが理解される。同様に、例えば、アンチセンス分子が、例えば外因性送達を介して細胞中または細胞環境に導入される場合、アンチセンス分子は細胞環境のアンチセンス分子の分解を減らすヌクレオチドアナログから形成されることが有利であると理解される。
【０１７２】
（（１）ヌクレオチドおよび関連分子）
ヌクレオチドは、塩基部分、糖部分およびリン酸エステル部分を含む分子である。ヌクレオチドは、リン酸エステル部分、およびヌクレオシド間結合を生成する糖部分を介して、互いに連結され得る。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン−９−イル（Ａ）、シトシン−１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イル（Ｇ）、ウラシル−１−イル（Ｕ）、およびチミン−１−イル（Ｔ）であり得る。ヌクレオチドの糖部分は、リボースまたはデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸エステル部分は、五価のリン酸である。ヌクレオチドの非限定的な例は、３’−ＡＭＰ（３’−アデノシン一リン酸）または５’−ＧＭＰ（５’−グアノシン一リン酸）である。
【０１７３】
ヌクレオチドアナログは、塩基部分、糖部分またはリン酸エステル部分のいずれかに対していくつかの型の改変を含むヌクレオチドである。ヌクレオチドに対する改変は、当該分野で公知技術であり、そしてこれら改変としては、例えば、５‐メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５‐ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチンおよび２−アミノアデニン、ならびに糖部分またはリン酸エステル部分における改変、が挙げられる。
【０１７４】
ヌクレオチド置換は、ヌクレオチドに類似な機能特性を有する分子であるが、これは、リン酸エステル部分を含まない（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））。ヌクレオチド置換は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ様式またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ様式で核酸を認識する分子であるが、リン酸エステル部分以外の部分を介して互いに連結される分子である。適切な標的核酸と相互作用する場合、ヌクレオチド置換は二重らせん型構造に適合し得る。
【０１７５】
例えば、細胞の取り込みを増強するため、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに他の型の分子を連結することも可能である。結合体は、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに化学的に連結され得る。このような結合体としては、コレステロール部分のような脂質部分が挙げられるが、これらに限られない（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３−６５５６）。
【０１７６】
Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ相互作用は、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド置換のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ面の少なくとも一つの相互作用である。ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド置換のＷａｓｔｏｎ−Ｃｒｉｃｋ面は、プリンベースのヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド置換のＣ２位、Ｎ１位およびＣ６位置を含み、そしてピリミジンベースのヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド置換の、Ｃ２位置、Ｎ３位置、Ｃ４位置を含む。
【０１７７】
Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ相互作用は、二重鎖ＤＮＡの主溝において露出する、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログのＨｏｏｇｓｔｅｅｎ面上に起こる相互作用である。Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ表面は、プリンヌクレオチドのＣ６位置において、Ｎ７位置および反応基（ＮＨ２またはＯ）を含む。
【０１７８】
（（２）配列）
例えば、ＲａｓならびにＧｅｎｂａｎｋに開示される本明細書中に開示される任意の他のタンパク質に関連する種々の配列が存在する。そしてこれらの配列および他の配列は、それらの全体およびそこに含まれる個々の配列が、参考として本明細書中に援用される。
【０１７９】
種々の配列が本明細書中で提供され、そしてこれらおよびその他の配列は、ｗｗｗ．ｐｕｂｍｅｄ．ｇｏｖにおけるＧｅｎｂａｎｋに見出され得る。当業者は、配列の矛盾および差異を解決するための方法、および特定の配列に関する組成物および方法を他の関連配列に適合させる方法を理解する。プライマーおよび／またはプローブは、本明細書中で開示されて、当該分野において公知の情報を与えられた任意の配列ぶ対して設計され得る。
（（３）プライマーおよびプローブ）
プライマーおよびプローブを含む組成物が開示され、これらは、本明細書中に開示される遺伝子と相互作用し得る。これらのプライマーは、ＤＮＡ増幅反応を支持するために使用され得る。代表的に、プライマーは配列特異的な様式で伸張され得る。配列特異的な様式でのプライマーの伸長としては、プライマーがハイブリダイズするかまたはそれ以外で結合した核酸分子の配列および／または組成物が、プライマーの伸長によって生成される産物の組成物もしくは配列を導くかまたはそれに影響する、任意の方法が挙げられる。従って、配列特異的な様式でのプライマー伸長としては、ＰＣＲ、ＤＮＡ塩基配列決定、ＤＮＡ伸長、ＤＮＡ重合、ＲＮＡ転写、または逆転写が挙げられるが、これに限定されない。配列特異的な様式でプライマーを増幅する技術および条件が好ましい。プライマーは、ＤＮＡ増幅反応（例えば、ＰＣＲまたは直接的配列決定）のために使用され得る。プライマーはまた非酵素的技術を使用して伸長され得ることが理解され、ここで、例えば、プライマーを延長するために使用されるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、それらが化学的に反応して配列特異的な様式でプライマーを伸長するように、改変される。代表的に、開示されるプライマーは、核酸もしくは核酸領域とハイブリダイズするか、またはそれらは核酸の相補体もしくは核酸領域の相補体とハイブリダイズする。
【０１８０】
（（４）機能的核酸）
機能性核酸は特定の機能を有する核酸分子であり、例えば、標的分子を結合するかまたは特異反応を触媒する。機能性核酸分子は以下のカテゴリーに分けられ得るが、限定していることは意味されない。例えば、機能性核酸としては、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、三重鎖成形分子、ＲＮＡｉおよび外部のガイド配列が挙げられる。機能性核酸分子は、標的分子により所有される特異的活性についての影響因子、インヒビター、調節因子および刺激因子として作用し得るか、または機能性核酸分子は、他のあらゆる分子もから独立してデノボ活性を備え得る。
【０１８１】
機能性核酸分子は、あらゆる高分子分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペチドまたは糖鎖）と相互作用し得る。従って、機能性核酸はＲａｓのｍＲＮＡまたはＲａｓのゲノムＤＮＡと相互作用し得るか、またはそれらはポリペチドＲａｓと相互作用し得る。機能性核酸はしばしば、標的分子と機能性核酸分子との間に配列相同性に基づいて、他の核酸と相互作用するように設計される。他の状況において、機能性核酸分子と標的分子との間の特異的認識は、機能性核酸分子と標的核酸分子との間の配列相同性に基づくのではなく、むしろ特異的認識を可能にする三次構造の形成に基づく。
【０１８２】
アンチセンス分子は、標準的な塩基対合または標準的でない塩基対合を介して標的核酸分子と相互作用するように設計される。アンチセンス分子と標的分子との相互作用は、例えば、ＲＮＡｓｅＨ媒介性のＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分解によって、標的分子の破壊を促進するように設計される。あるいは、アンチセンス分子は、標的分子上で通常起こる処理機能（例えば、転写または複製）を中断するように設計され得る。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計され得る。標的分子の大部分のアクセス可能な領域を見出すことによってアンチセンスの効率を最適化するための多くの方法が存在する。例示的な方法は、ＤＭＳおよびＤＥＰＣを使用するインビトロ選択実験およびＤＮＡ改変研究である。アンチセンス分子は、１０−６以下、１０−８以下、１０−１０以下または１０−１２以下の解離定数（ｋｄ）で標的分子に結合するが好ましい。アンチセンス分子の設計および使用を助ける方法および技術の代表例は、以下の非限定的な米国特許のリストにおいて見出される：第５，１３５，９１７号、第５，２９４，５３３号、第５，６２７，１５８号、第５，６４１，７５４号、第５，６９１，３１７号、第５，７８０，６０７号、第５，７８６，１３８号、第５，８４９，９０３号、第５，８５６，１０３号、第５，９１９，７７２号、第５，９５５，５９０号、第５，９９０，０８８号、第５，９９４，３２０号、第５，９９８，６０２号、第６，００５，０９５号、第６，００７，９９５号、第６，０１３，５２２号、第６，０１７，８９８号、第６，０１８，０４２号、第６，０２５，１９８号、第６，０３３，９１０号、第６，０４０，２９６号、第６，０４６，００４号、第６，０４６，３１９号および第６，０５７，４３７号。
【０１８３】
アプタマーは、好ましくは特定の方法で、標的分子と相互作用する分子である。代表的に、アプタマーは、規定の二次構造および三次構造（例えば、ステム−ループまたはＧ−カルテット）へと折り畳む、長さ１５塩基〜５０塩基の範囲の小さな核酸である。アプタマーは、低分子（例えば、ＡＴＰ、米国特許第５，６３１，１４６号）およびチオフィリン（米国特許第５，５８０，７３７号）、ならびに高分子（例えば、逆転写酵素、米国特許第５，７８６，４６２号）およびトロンビン（米国特許第５，５４３，２９３）に結合し得る。アプタマーは、１０−１２Ｍ未満の標的分子由来のｋｄで非常に強固に結合し得る。好ましくは、アプタマーは、１０−６未満、１０−８未満、１０−１０未満または１０−１２未満のｋｄで標的分子に結合する。アプタマーは、非常に高度の特異性で標的分子に結合し得る。例えば、標的分子と、分子上で１つの位置のみ異なる別の分子との間の結合親和性において、結合能の１００００倍より大きな差異を有するアプタマーが単離されている（米国特許第５，５４３，２９３号）。好ましくは、アプタマーは、バックグラウンドの結合性分子とのｋｄよりも、１／１０以下、１／１００以下、１／１０００以下、１／１０，０００以下、または１／１００，０００以下での標的分子とのｋｄを有する。好ましくは、例えばポリペプチドに対する比較を行う場合、バックグラウンドの分子は異なるポリペプチドである。例えば、Ｒａｓアプタマーの特異性を決定する場合、バックグラウンドタンパク質は血清アルブミンであり得る。種々の異なる標的分子に結合するアプタマーを作製および使用する方法の代表例は、以下の米国特許の非限定的なリストにおいて見出され得る：第５，４７６，７６６号、第５，５０３，９７８号、第５，６３１，１４６号、第５，７３１，４２４号、第５，７８０，２２８号、第５，７９２，６１３号、第５，７９５，７２１号、第５，８４６，７１３号、第５，８５８，６６０号、第５，８６１，２５４号、第５，８６４，０２６号、第５，８６９，６４１号、第５，９５８，６９１号、第６，００１，９８８号、第６，０１１，０２０号、第６，０１３，４４３号、第６，０２０，１３０号、第６，０２８，１８６号、第６，０３０，７７６号および第６，０５１，６９８号。
【０１８４】
リボザイムは、分子内または分子間のいずれかで、化学反応を触媒し得る核酸分子である。従って、リボザイムは触媒核酸である。リボザイムが分子間反応を触媒することが好ましい。天然の系において見出されるリボザイムに基づいたヌクレアーゼ型反応または核酸ポリメラーゼ型反応を触媒する、多くの型のリボザイムが存在し、例えば、ハンマーヘッドリボザイム（例えば、以下の米国特許であるが、これらに限定されない：第５，３３４，７１１号、第５，４３６，３３０号、第５，６１６，４６６号、第５，６３３，１３３号、第５，６４６，０２０号、第５，６５２，０９４号、第５，７１２，３８４号、第５，７７０，７１５号、第５，８５６，４６３号、第５，８６１，２８８号、第５，８９１，６８３号、第５，８９１，６８４号、第５，９８５，６２１号、第５，９８９，９０８号、第５，９９８，１９３号、第５，９９８，２０３号、ＬｕｄｗｉｇおよびＳｐｒｏａｔによるＷＯ  ９８５８０５８、ＬｕｄｗｉｇおよびＳｐｒｏａｔによるＷＯ  ９８５８０５７、ならびにＬｕｄｗｉｇおよびＳｐｒｏａｔによるＷＯ  ９７１８３１２）、ヘアピンリボザイム（例えば、以下の米国特許であるが、これらに限定されない：第５，６３１，１１５号、第５，６４６，０３１号、第５，６８３，９０２号、第５，７１２，３８４号、第５，８５６，１８８号、第５，８６６，７０１号、第５，８６９，３３９号および第６，０２２，９６２号）、およびテトラヒメナのリボザイム（例えば、以下の米国特許であるが、これらに限定されない：第５，５９５，８７３号および第５，６５２，１０７号）である。天然の系においては見出されないが、デノボで特定の反応を触媒するように操作されている多くのリボザイムが存在する（例えば、以下の米国特許であるが、これらに限定されない：第５，５８０，９６７号、第５，６８８，６７０号、第５，８０７，７１８号、および第５，９１０，４０８号）。好ましいリボザイムは、ＲＮＡ基質またはＤＮＡ基質を切断し、そしてより好ましくはＲＮＡ基質を切断する。リボザイムは代表的に、標的基質の認識および結合、引き続く切断を介して核酸基質を切断する。この認識はしばしば、概ね標準的な塩基対合相互作用または標準的でない塩基対合相互作用に基づく。この特性は、リボザイムを、核酸の標的特異的切断のための特に良好な候補にさせる。なぜなら、標的基質の認識は標的基質配列に基づくからである。様々な異なる反応を触媒するリボザイムを作製および使用する方法の代表例は、以下の米国特許の非限定的なリストに見出され得る：第５，６４６，０４２号、第５，６９３，５３５号、第５，７３１，２９５号、第５，８１１，３００号、第５，８３７，８５５号、第５，８６９，２５３号、第５，８７７，０２１号、第５，８７７，０２２号、第５，９７２，６９９号、第５，９７２，７０４号、第５，９８９，９０６号および第６，０１７，７５６号。
【０１８５】
三重鎖形成性の機能性核酸分子は、二本鎖核酸または一本鎖核酸のいずれかと相互作用し得る分子である。三重の分子が標的領域と相互作用する場合、三重鎖と呼ばれる構造が形成される。ここで、Ｗａｓｔｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合およびＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対合の両方に依存した複合体を形成する三本鎖ＤＮＡが存在する。三重鎖分子は、それらが高い親和性および特異性で標的領域に結合し得るので、好ましい。三重鎖形成分子は、くは、合成の従属部分をそれらが標的領域を高親和性および特異性で縛ることができるので、三重式の分子は好まれる。三重鎖成形分子は、１０−６未満、１０−８未満、１０−１０未満、１０−１２未満のｋｄで標的分子に結合することが好ましい。種々の異なる標的分子に結合する三重鎖成形分子を作製および使用する方法の代表例は、以下の米国特許の非限定的なリストに見出され得る：第５，１７６，９９６号、第５，６４５，９８５号、第５，６５０，３１６号、第５，６８３，８７４号、第５，６９３，７７３号、第５，８３４，１８５号、第５，８６９，２４６号、第５，８７４，５６６号および第５，９６２，４２６号。
【０１８６】
外部ガイド配列（ＥＧＳ）は、標的核酸分子を結合して複合体を形成する分子であり、そしてこの複合体はＲＮａｓｅＰにより認識されて、標的分子を切断する。ＥＧＳは、選択的にＲＮＡ分子を特異的に標的化するように設計され得る。ＲＮＡｓｅＰは、細胞内で転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）をプロセッシングするのを助ける。細菌のＲＮＡｓｅＰは、ＥＧＳを使用することによって実在する任意のＲＮＡ配列を切断するために補充され得、このＥＧＳによって、標的ＲＮＡ：ＥＧＳ複合体に天然のｔＲＮＡ基質を模倣させる。（ＹａｌｅによるＷＯ  ９２／０３５６６、ならびにＦｏｒｓｔｅｒおよびＡｌｔａｉａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：４０７−４０９（１９９０））。
【０１８７】
同様に、真核生物ＥＧＳ／ＲＮＡｓｅＰ指向性のＲＮＡの切断は、真核細胞内で所望の標的を切断するために利用され得る（Ｙｕａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：８００６−８０１０（１９９２）；ＹａｌｅによるＷＯ  ９３／２２４３４；ＹａｌｅによるＷＯ  ９５／２４４８９；ＹｕａｎおよびＡｉｒｍａｎ，ＥＭＢＯ  Ｊ  １４：１５９−１６８（１９９５）、ならびにＣａｒｒａｒａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２：２６２７−２６３１（１９９５）。種々の異なる標的分子の切断を促進するためのＥＧＳ分子を作製および使用する方法の代表例は、以下の米国特許の非限定的なリストにおいて見出される：第５，１６８，０５３号、第５，６２４，８２４号、第５，６８３，８７３号、第５，７２８，５２１号、第５，８６９，２４８号および第５，８７７，１６２号。
【０１８８】
開示される核酸がＲＮＡｉまたはＲＮＡ干渉のために使用され得ることもまた、理解される。ＲＮＡｉは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のための２段階の機構：開始工程および作動工程を含むと考えられる。例えば、第一工程において、入力した二重鎖（ｄｓ）ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、例えば２１〜２３ヌクレオチドの「ガイド配列」のような小断片にプロセッシングされる。ＲＮＡ増幅は、動物体全体において生じ得るようである。次いで代表的に、このガイドＲＮＡは、ＲＮＡを分解し得るタンパク質ＲＮＡ複合体（ヌクレアーゼ複合体）に取り込まれ、この複合体はＲＮＡ誘導性のサイレント性複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれている。このＲＩＳＣ複合体は、第２の作動工程において作用して、塩基対合の相互作用を介してガイドＲＮＡにより認識されるｍＲＮＡｓを破壊する。ＲＮＡｉは、任意の手段による細胞中への二本鎖ＲＮＡの導入を含み、標的ＲＮＡの分解を引き起こす事象を惹起する。ＲＮＡｉは、転写後の遺伝子サイレント性の形態である。ＲＮＡｉにおいて作用し得るＲＮＡヘアピンが開示される。ＲＮＡｉ分子を作製および使用することの説明に関して、例えば、Ｈａｍｍｏｎｄら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎ  ２：１１０−１１９（２００１）；Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １５：４８５−４９０（２００１）；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５（２３）：１３９５９−１３９６４（１９９８）、これらの全ては、その全体が参考として本明細書中に援用され、そしてＲＮＡｉ分子の送達および作製に関連した材料を少なくとも形成する。
【０１８９】
ＲＮＡｉは、哺乳動物細胞を含む多くの細胞で作用することが示されている。哺乳動物細胞における研究のため、ＲＩＳＣ複合体内での標的化配列として使用されるＲＮＡ分子は、より短いことが好ましい。例えば、５０ヌクレオチドまたは４０ヌクレオチドまたは３０ヌクレオチドまたは２９ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、または１０ヌクレオチド以下の長さである。これらのＲＮＡ分子はまた、切断されるべき標的ＲＮＡに対して、３’末端または５’末端上のオーバーハングを有し得る。これらのオーバーハングは、少なくとも１ヌクレオチド長、２ヌクレオチド長、３ヌクレオチド長、４ヌクレオチド長、５ヌクレオチド長、６ヌクレオチド長、７ヌクレオチド長、８ヌクレオチド長、９ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、または２０ヌクレオチド長であり得るか、あるいは１ヌクレオチド長以下、２ヌクレオチド長以下、３ヌクレオチド長以下、４ヌクレオチド長以下、５ヌクレオチド長以下、６ヌクレオチド長以下、７ヌクレオチド長以下、８ヌクレオチド長以下、９ヌクレオチド長以下、１０ヌクレオチド長以下、１５ヌクレオチド長以下、または２０ヌクレオチド長以下でであり得る。ＲＮＡｉは、哺乳動物の幹細胞（例えば、マウスＥＳ細胞）において作用する。
【０１９０】
（ｄ）細胞への組成物の送達）
インビトロまたはインビボのいずれかで核酸を細胞に送達するために使用され得る、多くの組成物および方法が存在する。これらの方法および組成物は、主に２つのクラス：ウイルスベースの送達系および非ウイルスベースの送達系に細分化され得る。例えば、核酸は、多くの直接的な送達系（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、バクテリオファージ核酸、バクテリオファージ、コスミド）を介して送達され得るか、または細胞もしくはキャリア（例えば、カチオン性リポソーム）中の遺伝子材料の移送を介して送達され得る。トランスフェクション（ウイルスベクター、化学トランスフェクタントまたはｐｈｙｓｉｃｏ機械の方法（例えば、エレクトロポレーションおよびＤＮＡの直接的な拡散））のための適切な手段は、例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８，（１９９０）；およびＷｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，８１５−８１８，（１９９１）により記載されている。このような方法は、当該分野で周知であり、本明細書中で記載されている組成物および方法を用いた使用に容易に適用可能である。特定の場合において、これらの方法は、巨大なＤＮＡ分子を用いた特異的機能化のために改変される。さらに、これらの方法は、キャリアの標的化特徴を使用することによって、特定の疾患および細胞集団を標的化するために使用され得る。
【０１９１】
（（１）核酸ベースの標的化システム）
移送ベクター（例えば、プラスミド）は細胞への遺伝子の送達のために使用されるか、または遺伝子を送達するための一般的戦略の一部として、例えば、組換えレトロウイルスまたは組換えアデノウイルス（Ｒａｍら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：８３−８８，（１９９３））の一部として使用される、任意のヌクレオチド構築物であり得る。
【０１９２】
本明細書中で使用される場合、プラスミドまたはウイルスベクターは、開示される核酸（例えば、Ｒａｓを発現する核酸）を分解なしに細胞内へと輸送する因子であり、そしてその遺伝子が送達される細胞内でその遺伝子の発現を生じるプロモータを含む。ベクターは、ウイルスまたはレトロウイルスのいずれかの由来であり得る。ウイルスベクターは、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、ニューロン栄養ウイルス（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｔｒｏｐｈｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、シンドビスウイルスおよび他のＲＮＡウイルス（ＨＩＶ骨格を有するこれらのウイルスが挙げられる）である。それらウイルスをベクターとしての用途に適合させるウイルス特性を共有する、任意のウイルスファミリーもまた好ましい。レトロウイルスとしては、マウスモロニー（Ｍａｌｏｎｅｙ）白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）およびベクターとしてＭＭＬＶの望ましい特性を発現するレトロウイルスが挙げられる。レトロウイルスベクターは、他のウイルスベクターよりも大きい遺伝子ペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）（すなわち、導入遺伝子またはマーカー遺伝子）を運搬し得、そしてこの理由のため一般的に用いられるベクターである。しかしながら、それらレトロウイルスベクターは、非増殖細胞に有用ではない。アデノウイルスベクターは、比較的安定であり、かつ用いて作業するのが容易であり、高い力価を有し、そしてエアロゾル処方物において送達され得、そして非分裂細胞にトランスフェクション可能である。ポックスウイルスベクターは巨大であり、そして挿入遺伝子のためのいくつかの部位を有し、それらは耐熱性であり、室温で貯蔵され得る。ウイルス抗原によって惹起される宿主生物の免疫応答を抑制するように操作されたウイルスベクターを使用し得る。この型の好ましいベクターは、インターロイキン８またはインターロイキン１０のためのコード領域を有する。
【０１９３】
ウイルスベクターは、細胞に遺伝子を導入するための化学的方法または物理的方法よりも、高いトランス作用能力（遺伝子を誘導する能力）を有し得る。代表的に、ウイルスベクターは、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製およびカプセル化に必要である逆方向末端反復配列、ならびにそのウイルスゲノムの転写および複製を制御するためにのプロモーターを含む。ベクターとして操作される場合、ウイルスは代表的に、離れた一つ以上の初期遺伝子が除去されており、そして遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットが、除去されたウイルスＤＮＡの代わりにウイルスゲノムに挿入される。この型の構造物は、約８ｋｂまでの外来遺伝物質を有し得る。除去された初期遺伝子の必要な機能は代表的に、トランス性に初期遺伝子の遺伝子産物を発現するために操作されている細胞株によって供給される。
【０１９４】
（（ａ）レトロウイルスベクター）
レトロウイルスは、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅのウイルスファミリーに属する動物ウイルスであり、任意の型、サブファミリー、属または親和性を含む。レトロウイルスベクタは、一般に、Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９８５，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２２９−２３２，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，（１９８５）により記載されており、これは本明細書中で参考として援用される。遺伝子治療のためにレトロウイルスベクターを使用する方法の例は、米国特許第４，８６８，１１６号および同第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ  ９０／０２８０６およびＷＯ  ８９／０７１３６；およびＭｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）に記載されており、これらの教示は本明細書中で参考として援用される。
【０１９５】
レトロウイルスは、基本的に、核酸の貨物（ｃａｒｇｏ）をその中に包んだパッケージである。核酸貨物はパッケージングシグナルを有し、このパッケージングシグナルは、複製された娘分子がパッケージ被覆内に効率的に包まれることを確実にする。パッケージシグナルに加えて、複製および複製されたウイルスのパッケージングのためにシス性に必要とされる多くの分子が存在する。代表的に、レトロウイルスゲノムは、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子を含み、これら遺伝子は、代表的に、外来ＤＮＡにより置き換えられて、標的細胞に移送され得る。レトロウイルスは代表的に、パッケージ被覆内への組み込みのためのパッケージングシグナル、ｇａｇ転写ユニットの開始に信号を送る配列、逆転写のために必要なエレメント（逆転写のプライマーｔＲＮＡに結合するためのプライマー結合部位を含む）、ＤＮＡ合成の間にＲＮＡ鎖の切り替えを導く末端反復配列、ＤＮＡ合成の第二鎖の合成のためのプライミング部位として役立つ５’ＬＴＲから３’ＬＴＲへのプリンに富んだ配列、およびレトロウイルスのＤＮＡ状態の挿入を可能にして宿主のゲノム内への挿入するＬＴＲ末端付近の特異的配列、を含む。ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子の除去は、約８ｋｂの外来遺伝子が、そのウイルスゲノム内に挿入されること、逆転写されること、および複製の際に新規のレトロウイルス粒子内にパッケージングされることを可能にする。核酸のこの量は、各転写物のサイズに依存して、多くの遺伝子に対して１つの遺伝子を送達するのに十分である。挿入物において、他の遺伝子と一緒にポジティブ選択可能なマーカーまたはネガティブ選択可能なマーカーのいずれかを含むことが、好ましい。
【０１９６】
大部分のレトロウイルスベクターにおいて、複製機構およびパッケージングタンパク質（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）が除去されているので、これらのベクターは代表的に、それらベクターをパッケージング細胞株に入れることによって生成される。パッケージング細胞株は、複製およびパッケージング機構を含むレトロウイルスをトランスフェクションしたかまたは形質転換した細胞株であるが、あらゆるパッケージングシグナルを欠いている。選択的なＤＮＡを有するベクターがこれらの細胞系にトランスフェクションされる場合、目的の遺伝子を含んでいるベクターは、ヘルパー細胞によりシス性に提供される機構によって、複製され、新規のレトロウイルス粒子内にパッケージングされる。その機構のためのゲノムはパッケージングされない。なぜなら、それらゲノムは必要な信号を欠いているからである。
【０１９７】
（ｂ）アデノウイルスベクター）
複製欠損アデノウイルス構築物が、記載されている（Ｂｅｒｋｎｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１２１３−１２２０（１９８７）；Ｍａｓｓｉｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８７２−２８８３（１９８６）；Ｈａｊ−Ａｈｍａｄら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５１：２６１−２７４（１９８６）；Ｄａｖｉｄｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１２２６−１２３９（１９８７）；Ｚｈａｎｇ  「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＰＣＲ  ａｎａｌｙｓｉｓ」ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １５：８６８−８７２（１９９３））。ベクターとしてこれらのウイルスを使用する利益は、それらが他の細胞型に伝播し得る範囲に限定されることである。なぜなら、これらウイルスは、第一の感染細胞内で複製できるが、新規な感染性ウイルス粒子を形成することができないからである。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、脈管内皮、ＣＮＳ実質細胞および多くの他の組織部位への直接のインビボ送達の後、高効率の遺伝子移入を達成することを示されている（Ｍｏｒｓｙ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１５８０−１５８６（１９９３）；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：３８１−３８７（１９９３）；Ｒｏｅｓｓｌｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１０８５−１０９２（１９９３）；Ｍｏｕｌｌｉｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１５４−１５９（１９９３）；Ｌａ  Ｓａｌｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：９８８−９９０（１９９３）；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５１２９−２５１３４（１９９２）；Ｒｉｃｈ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：４６１−４７６（１９９３）；Ｚａｂｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：７５−８３（１９９４）；Ｇｕｚｍａｎ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７３：１２０１−１２０７（１９９３）；Ｂｏｕｔ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：３−１０（１９９４）；Ｚａｂｎｅｒ，Ｃｅｌｌ  ７５：２０７−２１６（１９９３）；Ｃａｉｌｌａｕｄ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５：１２８７−１２９１（１９９３）；およびＲａｇｏｔ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４：５０１−５０７（１９９３））。組換えアデノウイルスは、野生型または複製欠損アデノウイルスとして同様に特異的な細胞表面レセプターに結合することによって遺伝子伝達を達成し、その後このウイルスは、野生型または複製欠損型アデノウイルスと同様の様式でレセプター媒介性エンドサイトーシスによって内在化する（ＣｈａｒｄｏｎｎｅｔおよびＤａｌｅｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４０：４６２−４７７（１９７０）；ＢｒｏｗｎおよびＢｕｒｌｉｎｇｈａｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２：３８６−３９６（１９７３）；ＳｖｅｎｓｓｏｎおよびＰｅｒｓｓｏｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５５：４４２−４４９（１９８５）；Ｓｅｔｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６５０−６５５（１９８４）；Ｓｅｔｈら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１５２８−１５３３（１９８４）；Ｖａｒｇａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６５：６０６１−６０７０（１９９１）；Ｗｉｃｋｈａｍら，Ｃｅｌｌ  ７３：３０９−３１９（１９９３））。
【０１９８】
ウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子が除去されたアデノウイルスに基づくものであり得、そしてこれらのビリオン（ｖｉｒｏｎ）は細胞株（例えば、ヒト２９３細胞株）において生成される。Ｅ１遺伝子およびＥ３遺伝子は、アデノウイルスゲノムから除去され得る。
【０１９９】
（（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター）
他のタイプのウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく。この不完全なパルボウイルスは好ましいベクターである。なぜならこのウイルスは、多くの細胞型に感染し得、そしてヒトに非病原性であるからである。ＡＡＶ型のベクターは、約４〜５ｋｂを運搬し得、そして野生型ＡＡＶは第１９染色体に安定して挿入することが公知である。この部位特異的な組み込み特性を含むベクターは、好ましい。この種のベクターの有用な形態は、Ａｖｉｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）により製造されるＰ４．１Ｃベクターであり、これは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）、および／またはマーカー遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子）を含み得る。
【０２００】
他の型のＡＡＶウイルスにおいて、ＡＡＶは、１対の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含み、これは、プロモーターを含む少なくとも１つの発現カセットを挟み、このプロモーターは異種性遺伝子に作動可能に連結された細胞特異的発現を指向する。この文脈において異種性とは、ＡＡＶパルボウイルスまたはＢ１９パルボウイルスに対して本来のものではないあらゆるヌクレオチド配列または遺伝子をいう。
【０２０１】
代表的に、ＡＡＶおよびＢ１９のコード領域は除去され、安全な無細胞毒性のベクターを生じる。ＡＡＶ  ＩＴＲまたはその改変体は、感染性および部位特異的組み込みを付与するが、細胞毒性は与えず、そしてそのプロモーターは細胞特異的発現を指向する。米国特許第６，２６１，８３４号は、ＡＡＶベクターに関連した材料について、本明細書中で参考として援用される。
【０２０２】
従って、開示されるベクターは、実質的な毒性を有さずに哺乳動物の染色体に組み込み得るＤＮＡ分子を提供する。
【０２０３】
ウイルスおよびレトロウイルスに挿入された遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現を制御するのを助けるためにプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。プロモーターは、一般的に、転写開始部位に関して比較的固定された位置にある場合に機能するＤＮＡの配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用のために必要とされるコアエレメントを含み、そして上流エレメントおよび応答エレメントを含み得る。
【０２０４】
（（ｄ）巨大なペイロードのウイルスベクター）
巨大なヒトヘルペスウイルスを用いた分子遺伝子の実験は、巨大な異種性ＤＮＡ断片がクローニングされ得、ヘルペスウイルスに感染可能である細胞中で増殖され得、そして確立され得る手段を提供した（Ｓｕｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８：３３−４１，１９９４、ＣｏｔｔｅｒおよびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ５：６３３−６４４，１９９９）。これらの巨大なＤＮＡウイルス（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ））は、１５０ｋｂを超えるヒト異種性ＤＮＡフラグメントを特定の細胞に送達する能力を有している。ＥＢＶ組換え体は、感染したＢ細胞において、エピソームＤＮＡとして巨大ＤＮＡ片を維持し得る。３３０ｋｂまでのヒトゲノム挿入物を有する個体クローンは、遺伝的に安定であるようであった。これらのエピソームの維持は、ＥＢＶによる感染の間に構成的に発現される、特異的なＥＢＶ核タンパク質のＥＢＮＡ１を必要とする。さらに、これらのベクターがトランスフェクションのために使用され得、ここで大量のタンパク質がインビトロで一過性に生成し得る。ヘルペスウイルスのアンプリコン系を使用して、２２０ｋｂを超えるＤＮＡ片をパッケージングし、そしてエピソームとしてＤＮＡを安定して維持し得る細胞を感染させる。
【０２０５】
他の有用な系としては、例えば、複製するワクシニアウイルスベクターおよび宿主制限された複製しないワクシニアウイルスベクターが挙げられる。
【０２０６】
（（２）非核酸ベースの系）
開示される組成物は、種々の方法で標的細胞に送達され得る。例えば、この組成物はエレクトロポレーションを介して、またはリポフェクションを介して、またはリン酸カルシウム沈殿を介して送達され得る。選択される送達機構は、標的化される細胞型に部分的に依存し、そしてその送達が例えばインビボで起るかまたはインビトロで起るかに依存する。
【０２０７】
従って、組成物は、例のため開示されたベクターに加えて、リポソーム（例えば、カチオン性リポソーム（例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ−コレステロール）またはアニオン性リポソーム）のような脂質を含み得る。リポソームはさらに、所望の場合、特定の細胞を標的化とするのを促進にするためにタンパク質を含み得る。化合物およびカチオン性リポソーム含んでいる組成物の投与は、標的器官に対して輸血液性に投与され得るか、または気道の細胞を標的化するために気道内に吸入され得る。リポソームに関して、例えば、Ｂｒｉｇｈａｍら  Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：９５−１００（１９８９）；Ｆｅｉｇｎｅｒら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７（１９８７）、米国特許第４，８９７，３５５号。さらにまた、化合物は、特定の細胞型（例えば、マクロファージ）に標的化され得るマイクロカプセルの成分、または化合物の分散またはマイクロカプセルからのその化合物の送達が特定の速度または投与量に関して設計される場合のマイクロカプセルの成分として、投与され得る。
【０２０８】
被験体の細胞内への外因性ＤＮＡの投与および取り込み（すなわち、遺伝子の移送またはトランスフェクション）を含む上記の方法において、組成物の細胞への送達は様々な機構を介し得る。一例として、送達はリポソームを介し得、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）ならびに当該分野において標準的な手順に従って開発された他のリポソームのような、市販のリポソーム調製物を使用する。さらに、開示される核酸またはベクターは、エレクトロポレーションによってインビボで送達され得、このための技術は、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から、そしてＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ機器（ＩｍａＲｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）によって利用可能である。
【０２０９】
材料は、溶液、懸濁液（例えば、微小粒子、リポソームまたは細胞に組み込まれる）であり得る。これらは、抗体、レセプターまたはレセプターリガンドを介して特定の細胞型に標的化とされ得る。以下の参照は、腫瘍組織に対して特定のタンパク質を標的化するためのこの技術の使用例である（Ｓｅｎｔｅｒら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２：４４７−４５１，（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５−２８１，（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００−７０３，（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，４：３−９，（１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１−４２５，（１９９２）；ＰｉｅｔｅｒｓｚおよびＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７−８０，（１９９２）；ならびにＲｏｆｆｌｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２−２０６５，（１９９１））。これらの技術が、種々の他の特定の細胞型のために使用され得る。ビヒクルは、例えば、「ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）」、および他の抗体の結合したリポソーム（結腸癌に対する脂質媒介性の薬物標的化が挙げられる）、細胞特異的なリガンドによるＤＮＡのレセプター媒介性標的化、リンパ球指向性の腫瘍標的化、およびインビボでのマウスの神経膠腫細胞の高特異的な治療用レトロウイルス標的化である。以下の参照は、腫瘍組織に対して特定のタンパク質を標的化するためのこの技術の使用例である（Ｈｕｇｈｅｓら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４−６２２０，（１９８９）；ならびにＬｉｔｚｉｎｇｅｒおよびＨｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１０４：１７９−１８７，（１９９２））。一般に、レセプターは、エンドサイトーシス（構成的またはリガンド起因性のいずれか）の経路に関与している。これらのレセプターは、クラトリンに被覆されたピットにおいてクラスター形成し、クラトリンに被覆された小胞を介して細胞に侵入し、レセプターが選別される酸性エンドソーム、を通過し、次いで細胞表面へと再利用するか、細胞内に蓄えられるか、またはリソソーム内で分解されるかのいずれかである。内在化経路は、種々の機能（例えば、栄養分の取り込み、活性化タンパク質の除去、巨大分子のクリアランス、ウイルスおよび毒素の日和見的な侵入、リガンドの解離および分解、ならびにレセプターレベルの制御）に役立つ。多くのレセプターは、細胞型、レセプター濃度、リガンドの型、リガンド結合価およびリガンド濃度に依存して、一つより多くの細胞内の経路に従う。レセプター媒介性エンドサイトーシスの分子機構および細胞性機構が要約されている（ＢｒｏｗｎおよびＧｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：６，３９９−４０９（１９９１））。
【０２１０】
宿主細胞ゲノムに組み込まれるべき、細胞に送達される核酸は、代表的に、組み込み配列を含む。特にウイルスベースの系が使用される場合、これらの配列はしばしばウイルス関連配列である。これらのウイルス組み込み系はまた、非核酸ベースの送達系（例えば、リポソーム）を使用して送達されるべき核酸に組み込まれ得、その結果、送達系に含まれるこの核酸は、宿主ゲノム内に組み込まれるようになり得る。
【０２１１】
宿主ゲノムへの組み込みのための他の一般の技術としては、例えば、宿主ゲノムとの相同組み換えを促進するように設計されたシステムが挙げられる。これらのシステムは代表的に、発現されるべき核酸を挟んでいる配列に依存し、この核酸配列は、宿主細胞内の標的配列と十分な相同性を有し、ベクターの核酸と標的核酸との間の組み換えを起こして、この送達された核酸を宿主ゲノム中に組み込ませる。
相同組み換えを促進するのに必要なこれらの系および方法は、当業者に公知である。
【０２１２】
（（３）インビボ／エキソビボ）
本明細書中に記載されるように、本組成物は、薬学的に受容可能なキャリアにおいて投与され得、そして当該分野で周知の種々の機構（例えば、裸のＤＮＡの取り込み、リポソーム融合、遺伝子銃を介したＤＮＡの筋肉内注射、エンドサイトーシス、など）によって、インビボおよび／またはエキソビボで被験体に送達され得る。
【０２１３】
エキソビボの方法が使用される場合、細胞または組織は、当該分野で周知の標準的なプロトコルに従って、生体外で取り出され得、維持され得る。本組成物は、任意の遺伝子移送機構（例えば、リン酸カルシウム媒介性の遺伝子送達、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、またはプロテオリポソーム）を介して、細胞中に導入され得る。次いで、形質導入された細胞は、（例えば、薬学的に受容可能なキャリアにおいて）注入され得るか、または細胞型または組織型に対する標準的方法を通じて被験体中に戻して同位置に（ｈｏｍｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ）移植され得る。被験体中への種々の細胞の移植または注入についての標準的方法は、公知である。
【０２１４】
（（ｅ）ペプチド）
（（１）タンパク質改変体）
公知でありかつ本明細書中で企図される、開示されるタンパク質の種々の多数の改変体が存在する。さらに、公知の機能性種の改変体に対して、開示される方法および組成物においても機能するタンパク質の誘導体が存在する。タンパク質の改変体および誘導体は、当業者に周知であり、そしてアミノ酸配列の改変を含み得る。例えば、アミノ酸配列改変体は、代表的に、３つのクラス：置換性改変体代用、挿入性改変体、欠失性改変体のうちの一つ以上に帰結する。挿入としては、アミノ末端融合および／またはカルボキシル末端融合、ならびに１つまたは複数のアミノ酸残基の内部配列挿入が挙げられる。例えば、挿入は、通常、アミノ末端融合またはカルボキシル末端融合の挿入よりも、例えば１残基〜４残基のオーダーでのより小さい挿入である。免疫原性の融合タンパク誘導体（例えば、実施例に記載されているもの）は、インビトロで架橋させることにより標的配列に免疫原性を付与するのに十分大きいポリペチドを融合することによって作製されるか、またはその融合物をコードするＤＮＡで形質転換された組換え細胞培養物によって作製される。欠失は、タンパク質配列からの一つ以上のアミノ酸残基の除去によって特徴付けられる。代表的に、約２残基〜６残基までが、タンパク質分子内のどれか１つの部位において欠失される。これらの改変体は通常、タンパク質をコードしているＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発により調製され、これによって、改変体をコードするＤＮＡを生成し、その後、組換え細胞培養物においてこのＤＮＡを発現する。のために、公知の配列を有するＤＮＡの所定の部位において置換突然変異を作製するための技術は、周知である（例えば、Ｍ１３プライマー突然変異誘発およびＰＣＲ突然変異誘発）。アミノ酸置換は、代表的に１残基であるが、一度にいくつかの異なる位置において生じ得る；挿入は通常、約１アミノ酸残基〜１０アミノ酸残基のオーダーについてであり；そして欠失は、約１残基〜３０残基の範囲である。欠失または挿入は、好ましくは、隣接する対において作製される（すなわち、２残基の欠失または２残基の挿入）。置換、欠失、挿入またはこれらの任意の組み合わせは、最終的な構築物に達するために組み合わされ得る。突然変異は、リーディングフレーム外に配列を配置してはならず、好ましくは、ｍＲＮＡの二次構造を生成し得る相補的領域を作製しない。置換性改変体は、少なくとも一つの残りが除去され、その位置に異なる残基が挿入されたものである。このような置換物は、一般に、以下の表１および２に従って作製され、保存的置換といわれる。
【０２１５】
【化７】
2008507981.tif 000009
【０２１６】
【化８】
2008507981.tif 000010
機能または免疫学的同一性の実質的に変化は、表２のものよりも保存的でない置換を選択すること、すなわち、以下を維持する効果がより大きく異なる残基を選択することによって作製される：（ａ）その置換領域におけるペプチド骨格の構造（例えば、シート構造またはらせん構造）、（ｂ）その標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩。一般にタンパク質特性において最大の変化をもたらすと予想される置換は、以下であるものである：（ａ）親水性残基（例えば、セリルまたはスレオニル）が、疎水性残基（例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニル）の代わりに（または、これによって）置換される；（ｂ）システインまたはプロリンが、他の任意の残基の代わりに（または、これによって）置換される；（ｃ）電気陽性の側鎖（例えば、リジル、アルギニルまたはヒスチジル）を有する残基が、電気陰性の残基（例えば、グルタミルまたはアスパルチル）の代わりに（または、これによって）置換される；または、（ｄ）嵩高い側鎖（例えば、フェニルアラニン）を有する残基が、側鎖を有さない残基（この場合、グリシン）の代わりに（または、これによって）置換される、（ｅ）硫酸化および／またはグリコシル化のための部位の数を増加させること。
【０２１７】
例えば、１つのアミノ酸残基を、生物学的および／または化学的に類似である別のアミノ酸残基に置き換えることは、保存的置換として当業者に公知である。例えば、保存的置換は、１つの疎水性残基を別のものの代わりに、または１つの極性残基を別のものの代わりに置き換えることである。これらの置換としては、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｈｙの組み合わせが挙げられる。明確に開示された各々の配列についてのこのような保存的置換された改変体は、本明細書中に提供されるモザイクポリペチドにおいて包含される。
【０２１８】
置換性突然変異誘発または欠失性突然変異誘発は、Ｎ−グリコシル化（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）またはＯ−グリコシル化（ＳｅｒまたはＴｈｒ）のための部位を挿入するために使用され得る。システイン残基または他の不安定な残基の欠失もまた望ましくありえる。潜在的なタンパク質分解部位（例えば、Ａｒｇ）の欠失または削除は、例えば、塩基性残基の１つを欠失させるか、またはグルタミニル残基もしくはヒスチジル残基によってその１つを置換することによって、達成される。
【０２１９】
特定の翻訳後誘導体化は、発現されたポリペチドに対する組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニル残基およびアスパラギニル残基は、しばしば、対応するグルタミル残基およびアスパルチル（ａｓｐａｒｙｌ）残基に翻訳後に脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、穏和な酸性条件下で脱アミド化され得る。他の翻訳後の改変としては、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル残基またはトレオニン残基の水酸基のリン酸化、リジン側鎖、アルギニン側鎖およびヒスチジン側鎖のｏ−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ｐｐ７９−８６［１９８３］）Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびにいくつかの場合、Ｃ末端カルボキシルのアミド化、が挙げられる。
【０２２０】
本明細書中に開示されるタンパク質の改変体および誘導体を定義する一つの方法は、特定の公知配列に対する相同性／同一性に関して改変体および誘導体を定義することを介することが理解される。これらの改変体が、特に開示される。定められる配列に対して少なくとも７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％の相同性を有する、本明細書中に開示されるこれらのタンパク質および他のタンパク質の改変体が、特に開示される。当業者は、２つのタンパク質の相同性を決定する方法を容易に理解する。例えば、相同性は、その相同性が最高レベルであるように２つの配列を整列した後に計算され得る。
【０２２１】
相同性を計算するための別の方法は、公開されたアルゴリズムにより実行されることができる。比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１））の局所的相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０））の相同性整列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８））の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ上での実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって、または目視検査によって、実行され得る。
【０２２２】
同じ形式の核酸に対する相同性は、例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４，４８−５２，１９８９、Ｊａｅｇｅｒら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６−７７１０，１９８９、Ｊａｅｇｅｒら  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９（これらは、核酸の整列に対する少なくとも材料に関して、本明細書中に参考として援用される）において開示されるアルゴリズムによって得られ得る。
【０２２３】
保存的突然変異および相同性についての説明、任意の組合せと一緒に組み合わされ得ること（例えば、その改変体が保存的置換である特定の配列に対して、少なくとも７０％の相同性を有する実施形態）が理解される。
【０２２４】
本明細書が種々のタンパク質およびタンパク質配列について考察する場合、それらのタンパク質配列をコードし得る核酸も開示されることが理解される。このことは、特定のタンパク質配列に関連したすべての縮重配列、すなわち、１つの特定のタンパク質配列をコードする配列を有する核酸、ならびにそのタンパク質配列の開示される改変体および誘導体をコードする全ての核酸（縮重核酸を含む）、を含む。従って、各々の特定の核酸配列が本明細書中に書き出されていなくてもよいが、各々の全ての配列は、実際に開示されるタンパク質を介して本明細書中に開示され、記載されることが理解される。どの特定のＤＮＡの配列が生物体内でタンパク質をコードするかをアミノ酸配列が示さなくても、開示されるタンパク質の特定の改変体が本明細書中に開示される場合、そのタンパク質が生じる特定の細胞においてそのタンパク質をコードする公知の核酸配列もまた公知であり、本明細書中に開示され、記載されることもまた、理解される。
【０２２５】
開示される組成物に組み込まれ得る多数のアミノ酸アナログおよびペプチドアナログが存在することが理解される。例えば、多数のＤアミノ酸、または表１および表２に示されるアミノ酸に対して異なる官能性置換基を有するアミノ酸が存在する。天然に存在するペプチドの反対の立体異性体、およびペプチドアナログの立体異性体が開示される。これらのアミノ酸は、部位特異的な方法でペプチド鎖中にアミノ酸アナログを挿入するため、ｔＲＮＡ分子にアミノ酸を選択的に充填すること、および例えばアンバーコドンを利用する遺伝子構築物を操作ことによって、ポリペプチド鎖中に容易に組み込み得る。そして、アナログアミノ酸をサイト固有方法のペプチド鎖に嵌入する、（Ｔｈｏｒｓｏｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．７７：４３−７３（１９９１）、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：３４８−３５４（１９９２）；Ｉｂｂａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３：１９７−２１６（１９９５）、Ｃａｈｉｌｌら，ＴＩＢＳ，１４（１０）：４００−４０３（１９８９）；Ｂｅｎｎｅｒ，ＴＩＢ  Ｔｅｃｈ，１２：１５８−１６３（１９９４）；ＩｂｂａおよびＨｅｎｎｅｃｋｅ，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：６７８−６８２（１９９４）（これらの全ては、アミノ酸アナログに関する少なくとも材料について、参考として本明細書中に援用される）。
【０２２６】
ペプチドに似ているが、天然のペプチド結合を介しては連結されない分子が生成され得る。例えば、アミノ酸またはアミノ酸アナログに対する結合としては、ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−および−ＣＨＨ２ＳＯ−が挙げられる（これらその他は、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２６７頁（１９８３）；Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，Ｖｅｇａ  Ｄａｔａ（１９８３年３月）第１巻第３号，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ（総説）；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ（１９８０）４６３−４６８頁；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．ら，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔ  Ｒｅｓ  １４：１７７−１８５（１９７９）（−ＣＨ２ＮＨ−、ＣＨ２ＣＨ２−）；Ｓｐａｔｏｌａら  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ３８：１２４３−１２４９（１９８６）（−ＣＨ  Ｈ２−Ｓ）；Ｈａｒｍ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．Ｉ  ３０７−３１４（１９８２）（−ＣＨ−ＣＨ−、シスおよびトランス）；Ａｌｍｑｕｉｓｔら  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−１３９８（１９８０）（−ＣＯＣＨ２−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅら  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２３：２５３３（１９８２）（−ＣＯＣＨ２−）；Ｓｚｅｌｋｅら  欧州出願ＥＰ  ４５６６５  ＣＡ（１９８２）：９７：３９４０５（１９８２）（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−）；  Ｈｏｌｌａｄａｙら  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ  ２４：４４０１−４４０４（１９８３）（−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−）；ならびにＨｒｕｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ３１：１８９−１９９（１９８２）（−ＣＨ２−Ｓ−）；これらの各々は、本明細書中で参考として援用される。特異に好ましい非ペプチド結合は、−ＣＨ２ＮＨ−である。ペプチドアナログは、結合原子（例えばｂ−アラニン、ｇ−アミノ酪酸、など）との間に一つより多くの原子を有し得ることが理解される。
【０２２７】
アミノ酸アナログおよびアナログおよびペプチドアナログはしばしば、所望の特性を増強されている（例えば、より経済的な生産、より大きな化学安定性、増強された薬理学的性質（半減期、吸収、力価、有効性、など）、変更さられた特異性（例えば、生物学的活性度の広域スペクトル）、還元した抗原性、など）。
【０２２８】
Ｄ−アミノ酸を使用してより安定ペプチドを生成し得る。何故なら、Ｄアミノ酸はペプチダーゼなどにより認識されないからである。コンセンサス配列の一つ以上のアミノ酸を同一型のＤ−アミノ酸（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）に系統的に置換することを使用して、より安定なペプチドを生成し得る。システイン残基を使用して、２つ以上のペプチドを環化または結合し得る。このことは、特定のコンフォメーションにペプチドを束縛するのに有益であり得る（ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ，Ａｒｍ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２）、これは本明細書中に参考として援用される）。
【０２２９】
（ｆ  薬学的キャリア／薬学的産物の送達）
上述の通り、本組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアにおいてインビボで投与され得る。「薬学的に受容可能な」によって、生物学的にもそれ以外にも望ましくないことのない材料が意味され、すなわちこの材料は、核酸またはベクターと一緒に、所望されないあらゆる生物学的作用を引き起こすこともその成分が含まれる薬学的組成物の任意の他の成分と有害な様式で相互作用することもなしに、被験体に投与され得る。キャリアは本質的に、当業者に周知であるように、活性成分のあらゆる分解を最小にし、そして被験体におけるあらゆる副作用を最小にするように選択され得る。
【０２３０】
組成物は、経口的、非経口的（例えば、静脈内）、筋肉内注射によって、腹腔内注射によって、経皮的、体外的、局所的、など（局所的鼻腔内投与または吸入による投与が挙げられる）により投与され得る。本明細書中で使用されるように、「局所的鼻腔内投与」は、鼻および鼻孔の一方または両方を通る鼻の通路への組成物の送達を意味し、そして噴霧機構または液滴機構による送達、または核酸もしくはベクターのエアゾール化を介した送達を含み得る。吸入による組成物の投与は、噴霧機構または液滴機構による送達により鼻または口を介し得る。送達はまた、挿管を介した呼吸器系（例えば、肺）のあらゆる領域に対するものであり得る。必要とされる組成物の正確な量は、被験体の種、年齢、重量および全身状態、処置されるべきアレルギー性障害の重篤度、使用される特定の核酸またはベクター、その投与形態などに依存して、被験体ごとに変動する。従って、すべての組成物に対する正確な量を特定することは可能でない。しかしながら、適切な量は、本明細書中の教示を与えられる慣用的な試験のみを使用して、当業者により決定され得る。
【０２３１】
使用される場合、組成物の非経口投与は通常、注射によって特徴付けられる。注射物は、液体または懸濁液、注射前に液体中での懸濁の溶液に適切な固形物形態、またはエマルジョンのいずれかとして、従来の形態で調製され得る。非経口投与のためのより最近改変されたアプローチは、一定の投与量が維持されるように、遅延性放出または徐放性の系の使用を含む。例えば、米国特許第３，６１０，７９５号を参照のこと（これは、本明細書中で参考として援用される）。
【０２３２】
材料は、溶液状態、懸濁液状態（例えば、微粒子、リポソームまたは細胞に組み込まれたもの）であり得る。これらは、抗体、レセプターまたはレセプターリガンドを介して特定の細胞型に標的化され得る。以下の参照は、腫瘍組織に対して特異的なタンパク質を標的化するためのこの技術の使用の例である（Ｓｅｎｔｅｒら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２：４４７−４５１，（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５−２８１，（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００−７０３，（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，４：３−９，（１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１−４２５，（１９９２）；ＰｉｅｔｅｒｓｚおよびＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７−８０，（１９９２）；ならびにＲｏｆｆｌｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２−２０６５，（１９９１））。ビヒクルは、例えば、「ステルス」、および他の抗体の結合したリポソーム（結腸癌に対する脂質媒介性の薬物標的化が挙げられる）、細胞特異的なリガンドによるＤＮＡのレセプター媒介性標的化、リンパ球指向性の腫瘍標的化、およびインビボでのマウスの神経膠腫細胞の高特異的な治療用レトロウイルス標的化である。以下の参照は、腫瘍組織に対して特定のタンパク質を標的化するためのこの技術の使用例である（Ｈｕｇｈｅｓら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４−６２２０，（１９８９）；ならびにＬｉｔｚｉｎｇｅｒおよびＨｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１０４：１７９−１８７，（１９９２））。一般に、レセプターは、エンドサイトーシス（構成的またはリガンド起因性のいずれか）の経路に関与している。これらのレセプターは、クラトリンに被覆されたピットにおいてクラスター形成し、クラトリンに被覆された小胞を介して細胞に侵入し、レセプターが選別される酸性エンドソーム、を通過し、次いで細胞表面へと再利用するか、細胞内に蓄えられるか、またはリソソーム内で分解されるかのいずれかである。内在化経路は、種々の機能（例えば、栄養分の取り込み、活性化タンパク質の除去、巨大分子のクリアランス、ウイルスおよび毒素の日和見的な侵入、リガンドの解離および分解、ならびにレセプターレベルの制御）に役立つ。多くのレセプターは、細胞型、レセプター濃度、リガンドの型、リガンド結合価およびリガンド濃度に依存して、一つより多くの細胞内の経路に従う。レセプター媒介性エンドサイトーシスの分子機構および細胞性機構が要約されている（ＢｒｏｗｎおよびＧｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：６，３９９−４０９（１９９１））。
【０２３３】
（（１）薬学的に受容可能なキャリア）
組成物は（抗体を含む）、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて治療的に使用され得る。
【０２３４】
適切なキャリアおよびそれらの処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第１９版）編者Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９９５に記載されている。代表的に、適切な量の薬学的に受容可能な塩が、その処方物を等張性にさせるためにその処方物において使用される。薬学的に受容可能なキャリアの例としては、制限されるわけではないが、生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液が挙げられる。この溶液のｐＨは、好ましくは、約５〜約８であり、より好ましくは約７〜約７．５である。さらにキャリアとしては徐放性調製物が挙げられ、例えば、抗体を含む固形疎水性ポリマーの半透過性マトリクスであり、このマトリクスは、成形された物品（例えば、フィルム、リポソームまたは微粒子）の形態である。特定のキャリアは、好ましくは、例えば投与経路および投与される組成物の濃度に依存していてよいことが、当業者に明らかである。
【０２３５】
薬学的キャリアは、当業者に公知である。これらは最も代表的には、ヒトに対する薬物の投与のための標準的なキャリアであり、例えば、生理的ｐＨの無菌水、食塩水および緩衝化溶液が挙げられる。組成物は、粘膜内または皮下に投与され得る。他の化合物は、当業者によって使用される標準手法に従って投与される。
【０２３６】
薬学的組成物は、選択される分子に加えて、キャリア、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤などを含み得る。薬学的組成物はまた、一つ以上の活性成分（例えば、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬、など）を含み得る。
【０２３７】
薬学的組成物は、局所的処置または全身処置が所望されるかどうか、および処置されるべき領域に依存して、多くの方法で投与され得る。投与は、局所的（眼科的、経膣的、直腸的、鼻腔内的が挙げられる）、経口的、吸入によって、または非経口的に（例えば、点滴静注、皮下注射、腹腔内注射、または筋肉内注射によって）投与され得る。開示される抗体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、体腔内、または経皮的に投与され得る。
【０２３８】
非経口投与のための調製物としては、滅菌の水溶液または非水性溶液、懸濁液およびエマルジョンが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、および注射用有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）である。水性キャリアとしては、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が挙げられ、生理食塩水および緩衝化媒体が挙げられる。非経口的ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガー液のデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液（ｌａｃｔａｔｅｄ  Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ）、または不揮発性油が挙げられる。静脈注射ビヒクルとしては、流体および栄養補充液、電解質補充液（例えば、リンガー液のブドウ糖に基づくもの）などが挙げられる。防腐剤および他の添加物もまた存在し得、例えば、抗微生物性薬剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなどである。
【０２３９】
局所投与のための処方物としては、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、液滴、坐薬、スプレー、液体および粉末が挙げられ得る。従来の薬学的キャリア、水性、粉末または油性ベース、増粘剤などは、必要でもよいし、望ましくは存在してもよい。
【０２４０】
経口投与のための組成物としては、粉末または顆粒、水または非水性媒体の懸濁液または溶液、カプセル、サシェ（ｓａｃｈｅｔ）または錠剤が挙げられる。増粘剤、矯味矯臭剤、希釈液、乳化剤、分散補助剤、または結合剤は、望ましくは存在してもよい。
【０２４１】
組成物のいくつかは、薬学的に受容可能な酸付加塩または塩基付加塩として投与され得、これらの塩は、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸およびリン酸のような無機酸、ならびにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸およびフマル酸のような有機酸との反応により形成されるか、または、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムのような無機塩基、ならびにモノアルキルアミン、ジアルキルアミン、トリアルキルアミン、およびアリールアミン、および置換されたエタノールアミンのような有機塩基との反応によって形成される。
【０２４２】
（（２）治療使用）
組成物を投与するための有効な投与量およびスケジュールは、実験的に決定され得、そしてこのような決定をすることは、当該分野の技量の範囲内である。組成物の投与のための投与量範囲は、その症状の障害が影響を受ける所望の効果を生じるのに十分大きな投与量範囲である。投与量は、有害な副作用（例えば、所望されない交差反応、アナフィラキシー反応、など）を引き起こすほど大きくあるべきではない。一般的に、投与量は、年齢、状態、性別および患者の疾患の程度、投与経路、または他の薬物がそのレジメンに含まれているかどうかによって変動し、そして当業者により決定され得る。投与量は、あらゆる反対性適応症（ｃｏｕｎｔｅｒｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）の事象において、個々の医師により調整され得る。投与量は変動し得、そして１日の間または数日の間、１日あたり１以上の用量の投与で投与され得る。ガイダンスは、薬学的製品の所定のクラスに関する適切な投与量についての文献において見られ得る。例えば、抗体に関する適切な用量を選択するためのガイダンスは、抗体の治療的使用についての文献（例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｆｅｒｒｏｎｅら編，Ｎｏｇｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｋ  Ｒｉｄｇｅ，ＮＪ．，（１９８５）  第２２章および３０３−３５７頁；Ｓｍｉｔｈら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｈａｂｅｒら編，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７７）３６５−３８９頁）において見出され得る。単独で使用される抗体の代表的な１日の投与量は、上述の要因に依存して、１日あたり体重１ｋｇあたり約１μｇ〜１００ｍｇの範囲であり得る。
【０２４３】
（ｇ  チップおよびマイクロアレイ）
少なくとも一つのアドレスが、本明細書中に開示される任意の核酸配列、ペプチドまたは細胞において記載される配列またはその配列の一部であるチップが、開示される。また、少なくとも１つのアドレスが、本明細書中に開示される任意のペプチド配列において記載される配列またはその配列の一部であるチップが、開示される。例えば、異なる９６穴プレートが与えられ得、そのうちの１つは肝細胞を有し、そのうちの１つは肺の細胞を有し、そのうちの１つは心臓細胞を有し、そして例えば、これらは試薬および媒体を備えるキットとして出荷され得る。次いで、消費者は、例えば試験されるべきものを、ウェルに添加する。他の例としては、フィルム上の化学薬品の高密度アレイを使用して、次いで組成物（例えば、細胞または他のもの）を含む種々の溶液により洗浄され、次いでそのチップ上の何かと相互作用する場合に指標を与える、スクリーニングが挙げられる。
【０２４４】
少なくとも一つのアドレスが、本明細書中に開示される任意の核酸配列、ペプチドまたは細胞において記載される配列の改変体またはその配列の一部の改変体であるチップが、開示される。
また、少なくとも一つのアドレスが、本明細書中に開示される任意のペプチド配列において記載される配列の改変体またはその配列の一部の改変体であるチップが、開示される。
【０２４５】
（ｈ  コンピューター読み取り可能な媒体）
開示された核酸およびタンパク質はアミノ酸のヌクレオチドからなる配列として表され得ることが理解される。これらの配列を示す様々な方法が存在し、例えば、ヌクレオチドグアノシンがＧまたはｇにより表され得る。同様に、アミノ酸バリンはＶａｌまたはＶにより表され得る。当業者は、任意の種々の方法においてあらゆる核酸配列またはタンパク質配列（これらの各々は本明細書中に開示される）を示し、表す方法を理解する。本明細書中で特に考察するある、コンピューター読み取り可能な媒体（例えば、市販のフロッピー（登録商標）ディスク、テープ、チップ、ハードドライブ、コンパクトディスクおよびビデオディスク、または他のコンピューター読み取り可能な媒体）上でのこれらの配列の表示が、特に企図される。また、開示される配列の二進コード表記が開示される。当業者は、どのコンピューター読み取り可能な媒体が有用であるかを理解する。従って、核酸配列またはタンパク質配列が記録されるか、記録されるか、または保存されるコンピューター読み取り可能な媒体である。
【０２４６】
本明細書中で記載される配列に関する配列および情報を含む、コンピューター読み取り可能な媒体が開示される。
【０２４７】
（ｉ  キット）
本明細書中に開示される方法を実施する際に使用され得る試薬に導かれるキットが、本明細書中に開示される。キットは、本明細書中で述べられる任意の試薬または試薬の組合せ、あるいは開示される方法の実行において必要とされるかまたは有益であると理解されるものを備え得る。例えば、キットは、所望の分子をコードする核酸、または特定の形態の方法において論じられた改変ＥＳ細胞、ならびにそれらを使用することを必要とする緩衝剤および酵素を備え得る。キットの他の例としては、毒性をスクリーニングするために有用な、本明細書中に記載される方法によって誘導される細胞を備える。これらの細胞は、スクリーニングされるべき薬物の関連するプロフィールを示す、種々の最終分化細胞を表し得る。これらの細胞は、例えば、依然としてマーカー含んでいてもよいし、またはこのマーカーが除去されていてもよい。この方法が、出発細胞としての多能性細胞の使用を可能にするので、複数の細胞型が共通の多能性細胞に由来し、これによって共通の遺伝子表現形を共有するものが生成され得る。キットは、例えば、プレート（例えば、９６ウェルプレート）を含み得、これは、本明細書中に開示される組成物によりコーティングされ得る
（Ｂ．方法）
（１．改変した幹細胞を使用する方法）
改変した幹細胞を使用して、所望の細胞型および所望の細胞型の培養物を識別し得、選択し得る。一般に、改変した幹細胞は、すべての細胞が増殖するのを可能にする条件下で培養され得る。次いで、改変した幹細胞は、選択圧下に置かれ得る（例えば、形質転換遺伝子の存在について選択する軟寒天への移行）。選択遺伝子（例えば、形質転換遺伝子）を発現している細胞は、増殖し続けるか、または識別され得る。選択遺伝子が単一の細胞型または細胞型の部分集合においてのみ発現されるように改変された幹細胞は操作されているので、これらの細胞のみが増殖し続けるかまたは識別可能なままである。識別のさらなる工程または代替的な工程（例えば、特定の細胞型のマーカーについてのセルソーティングまたは視認、ならびに引き続くサブクローニングおよびクローニングを介する工程）は、単一の細胞でありかつクローニングされる場合に単一の祖先細胞から生じた細胞集団を生成する。改変された幹細胞が適切な条件下で胚様体を形成し得る細胞である場合、胚様体が任意の細胞を自発的に生じ得るので、任意の所望の細胞型は、本明細書中に考察されるように、この改変された細胞を自発的な胚様体形成を介して進めさせ、その後の選択（例えば、形質転換遺伝子についての選択）によって、取得され得る。これらの方法および本明細書中に開示される方法は、開示される組成物を一緒に用いて、所望の細胞型（例えば、本明細書中に開示される細胞型）を生じ得ることが理解される。胚様体の形成を開始するため、代表的に、未分化細胞は、トリプシンまたは他の剥離方法を介して、フィーダー細胞の不在下での未処理のプラスチックディッシュに継代される。細胞は代表的に、特別な処置なしでは、プラスチックに容易に接着できない。これらの条件において、幹細胞は分裂して中空を有する個々のボール状の細胞を形成する。
【０２４８】
（２．分化細胞を使用する方法）
本明細書中で開示されるように、改変幹細胞を作製する方法は、インビボでの方法および／またはエキソビボでの方法および／またはインビトロでの方法に適している細胞を生成し得る。例えば、活性化／ドミナントネガティブ形質転換遺伝子ストラテジーは、例えば、インビトロでの用途に最適であり得るが、細胞療法のために望ましいものではない。なぜなら、マーカー（例えば、形質転換遺伝子）が細胞内に残るからである。一方、マーカー（例えば、形質転換遺伝子）が最終的な細胞から切除されるので、ＣＲＥ／ｌｏｘは細胞療法に適している。さらに、インビボでの機構のために、マーカーは、染色体外カセット（例えば、哺乳動物の人工染色体）内に配置され得、次いで、それは、種々の機構を用いて最終的な細胞から完全に取り除かれ得る。
【０２４９】
（ａ  分化についての条件を同定する方法）
幹細胞を分化するための条件を同定して、最適化するための方法において開示された細胞を使用する方法が、開示される。分化のプロセスは、それらの最終的な細胞型の前に、１つの前駆細胞から次へ細胞が発達する段階的な様式において進行する。例は、始原幹細胞が、最終的なＢ細胞またはＴ細胞の出現の前に、順にさらなる前駆体を生成する種々の前駆体を生じる、細網内皮系において見出され得る。この発達、または前駆体から最終産物までの任意の他のものを規定するために使用され得、開示される可逆性形質転換系を含み得る方法および組成物が開示される。
【０２５０】
機能が周知であるほとんどの遺伝子は、最終的な組織において発現される遺伝子である。これらの遺伝子は、プロモーターが最終細胞型プロモーターであるので、開示される方法および組成物に有用であるプロモーターの遺伝子である。最終細胞型は、もはや分化されない細胞型である。アルブミンは、最終細胞型において発現される遺伝子の良好な例である。アルブミンは、肝細胞においてのみ発現される。そのプロモータは、一連の公知の転写因子（例えば、ＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）およびタンパク質のフォークヘッドファミリー）によって駆動される（Ｓｃｈｒｅｍ，Ｈ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５４、１２９−１５８、２００２）。開示された方法および組成物（例えば、組織特異的可逆性形質転換手順）を用いて、胚様体由来の他の細胞の混合物内で肝細胞になる細胞を同定できる。組織特異的セレクターとしてアルブミン制御転写因子のうちの１つ由来のプロモーターを使用することができ、肝細胞になる直前の細胞を同定することができる。次いで、この細胞は単離され得、標準的なゲノム技術を用いて、その細胞において発現される遺伝子が同定され得、そしてさらなるセレクター（細胞において、独自に発現される遺伝子）が同定され得る。各々のさらなるセレクターを用いるこの手順を繰り返して、本発明者らは、系統を起源までさかのぼることができる。
【０２５１】
これに対するバリエーションが、発達の各段階についての細胞培養条件を規定するために使用され得る。例えば、マーカーとして形質転換遺伝子（例えば、活性化Ｒａｓ遺伝子）を使用して、種々の培養条件下で軟寒天において出現するコロニーの数を定量化し得る。緑色蛍光タンパク質または乳酸デヒドロゲナーゼを使用してもまた、定量化を行うことができる。セレクター、細胞または系統特異的プロモータとともに培養条件を変化させることによって、各段階で特定の経路をたどる細胞の数を最大化し得るか、または任意の他の所望の特徴を同定し得る。各段階で収率を最大化することは、例えば、セレクターを用いずに所望の細胞型を生じる分化プロトコルを設計することを可能にする。
【０２５２】
（ｂ  再形成された免疫系）
任意の所望のヒト細胞型を生成し、改変し得る方法および組成物が、本明細書中で開示される。例えば、ヒト免疫系のインビトロでの再形成が開示される。現在、モノクローナル抗体は、３段階プロセスによって、マウスにおいて生成される。マウスは、所望の抗原を最初に接種される。２、３日後に、その脾臓が取り出され、脾臓に存在する免疫細胞が、マウスＢ細胞リンパ腫株と融合される。このことは、脾臓のＢ細胞を不死化するのに役立つ。次いで、それらは培養され、適切な抗体を産生する融合物が選択される。
【０２５３】
マウスモノクローナル抗体は、それらが異質であると認識され、破壊されるので、ヒトにおいて不十分な治療法である。現在、例えば、乳癌のためのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）のような治療法のために使用されるモノクローナル抗体は、これらの問題を最低限にするためにヒト化されるか、またはキメラ化されているが、しかし、その問題は完全には取り除かれない。完全なヒトモノクローナル抗体が、解決策である。残念なことに、このことは、人に抗原を接種することを意味する。このことは、試みられた少数の場合において、評判が良くなくかつ成功しなかった。本明細書中で開示されるように、幹細胞の組織特異性の可逆性形質転換は、ヒト免疫細胞：Ｂ、Ｔおよびマクロファージ株の適合したセットの選択を可能にする。このことは、Ｂ、Ｔおよびマクロファージ細胞が正確に機能するために同じ遺伝子背景に由来するべきであるので、幹細胞からのみ達成され得る。適切な細胞が構築される場合、それらはインビトロでの免疫系を生じるために一緒に培養され得る。この系でインキュベートされる抗原は、正確にＢ細胞に進行してＢ細胞を提示し得、同種の細胞を増大させる。培養時間とともに、これらの細胞は優先的、または選択的に増殖し得、より多くの割合の総Ｂ細胞集団を含む。次いで、これらの細胞はクローニングされ得、適切な抗体を産生する細胞が選択され得る。それらは、形質転換されるので、それらは、特徴付けられ、凍結され、次いで永久に増大し得、完全なヒトモノクローナル抗体を産生する。この系は、治療のためのモノクローナル抗体の適用性を劇的に増大し得る。
【０２５４】
（（ｃ）毒性試験）
新規の薬物発見および開発の莫大な費用を引き下げるために医薬産業に望まれるのは、薬物候補の失敗を引き起こす要因の試験を強制することである。有効性の問題の後、失敗についての最も一般的な理由は、毒性である（ｖａｎ  ｄｅ  Ｗａｔｅｒｂｅｅｍｄ，Ｈ，Ｇｉｆｆｏｒｄ，Ｅ．（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．２，１９２−２０４)。上市された化合物が、認識されていない毒性のために、結果的に回収されるのは、なおさらなる問題である。トログリタゾンおよびトロバフロキサシンは、退かれた化合物の周知の例であるか、またはその使用が肝臓毒性のために厳しく抑制された化合物の周知の例であり、グレパフロキサシン（ｇｒｅｐａｆｌｏｘａｃｉｎ）は、筋肉毒性に関する問題を有し、テルフェナジンおよびアステミゾールは、心臓毒性のために退かれた（Ｓｕｃｈａｒｄ，Ｊ．（２００１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．４，１５−２０）。
【０２５５】
新規化合物の毒性特性は、認識されて開発初期に回避され得るのが理想的である。ＡＣＴＩＶＴｏｘは、ヒト肝臓細胞株に基づいて、構造毒性関連性の開発のための高スループットな、代謝的に活性なプラットフォームを提供するように設計される。化合物は、合成の次のラウンドを導くために化学者によって、使用され得る構造順位を開発するために、複数の濃度で一連の試験によってスクリーニングされる。このようにして、化合物の毒性特性が最小化され得るが、治療特性は最大化される。
【０２５６】
関連した細胞株のパネルを開発することによって、ＡＣＴＩＶＴｏｘの考えが、一般化され得る。新規化合物は、高スループット系において適合され、形質転換されていない細胞株のパネルに対して試験され得、臨床試験における成功の確率を増やす。本明細書中で記載される方法を用いて、このパネルは細胞株から構成され得、可能な限り密接に適合される多くの組織を表す。このことは、同じ親の幹細胞株（例えば、ＥＧ株）からアッセイにおいて使用される細胞の誘導によって達成され得、同じ機構によって可逆的に形質転換され得る。これらの細胞は、単一の個体から組織サンプルセットを構成し、遺伝子バックルランドが異なる問題を最小化する。
【０２５７】
開示される方法を用いる予測毒性はまた、より多くの細胞回収により実施され得る。心臓、神経細胞、腸、腎臓、肝臓、筋肉または肺の株の毒性試験の方法が、開示される。これらの株は、肝臓のために使用されるように、同じ化合物を用いて、同じ毒性アッセイにおいて、生成およびスクリーニングされ得る。
【０２５８】
例は、拍動する心臓の細胞培養物である。製薬会社の中の主要な懸念は、ＱＴ延長として公知の現象であり、それは、心臓の不整脈および場合により死を導き得る（Ｂｅｌａｒｄｉｎｅｌｌｉ，Ｌ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍｏｃｏｌ．Ｓｃｉ．２４，６１９−６２５，２００３）。数種類の化合物（例えば、テルフェナジン）は、この重大な副作用のために市場から回収された。ＱＴ延長は、電気現象であるため、現在、動物または人々を除いてＱＴ延長について試験することは難しい。拍動する心臓の細胞培養物は、この問題についての直接的な試験を可能にする。
【０２５９】
多くの異なる細胞型を用いる同じアッセイにおいて同じ化合物を試験することによって、新規化合物の毒性可能性の明白な実態が、ヒトにおいて試験する前に決定され得る。このことは、臨床試験が最も費用のかかる局面であったため、新薬開発の費用および速度に対して著しい効果を有する。
【０２６０】
（ｄ  発見用途のための特異的標的細胞）
（１）ドーパミン特異的ニューロン
組織特異的可逆性形質転換はまた、薬物開発用途のための特異的細胞型の開発を可能にする。現在、天然の標的を含む細胞が利用できないので、新規薬物は、目的の標的を含ませるために遺伝的に操作された細胞に対して頻繁に試験される。例は、ドーパミン作動性ニューロンである。多くの向神経活性薬は、ドーパミンレセプター（例えば、薬物嗜癖のための三環系抗鬱薬またはドーパミン再取込みインヒビター）を指向する。目的の特定の細胞型（例えば、任意の他の細胞型によって、夾雑されないドーパミン作動性ニューロン）の限定されずかつ再現性のある供給の有効性が、本明細書中に開示される。
【０２６１】
（ｅ  標的確認のためのノックアウト）
標的される遺伝子の相同組換えとともに組み合わされる開示される方法および組成物（例えば、組織特異的可逆性形質転換）の使用は、特定の遺伝子が欠失または修飾された細胞の開発を可能にする。薬物開発における中心的な問題は、治療標的のバリデーションである。これは、薬によってブロックまたは活性化される場合、特定のタンパク質が実際に所望の治療効果を送達するか否かの決定である。マウスにおけるノックアウトまたはノックは、頻繁にこの用途に使用される（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ，ＢＰら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．２，３８−５１，２００３）。（本明細書中に開示されるように生成された）開示される細胞および細胞株は、インビトロにおいて類似のバリデーション機会を提供する。具体例は、ヒトの低密度リポタンパクレセプターのノックアウトである。ＬＤＬレセプターは、多くのヒトウイルス（ヒトＢ型肝炎を含む）のための通路として使用される。本明細書中で開示される細胞（例えば、幹細胞）の相同組換え技術を用いて、ＬＤＬレセプター遺伝子が損傷され得、その結果、ＬＤＬレセプタータンパク質は合成されない。これらの細胞における組織特異的可逆性形質転換を用いて、ＬＤＬレセプターを有さないヒト肝細胞が作製され得る。これらの細胞は、ＨＢＶ感染におけるＬＤＬレセプターの役割を試験するために使用され得る。例えば、これらの細胞が、ＨＢＶに感染しなかった場合、ＬＤＬレセプターは、抗ＨＢＶ治療のための確認された標的であることを示す。類似のストラテジーが考え出されて、他の目的のための機能変異体の獲得または機能変異体の損失を生じ得る。上記と同じ例を用いて、ＬＤＬレセプターが、このタンパク質を正常では発現しない細胞において活性化され得る。
【０２６２】
（ｆ  エキソビボでの細胞治療）
（（１）肝臓補助デバイス）
本明細書中で開示される肝細胞株に基づいた肝臓補助デバイスが開示される。約５，０００の肝移植が、毎年米国において実施されている。現在、約１７，０００人が、待機リストに存在する。毎年リスト上の約１５００人が死亡する。
【０２６３】
現在、最終段階の肝疾患（例えば、腎臓患者のための血液透析）に入った患者を助けるための手段は、存在しない。肝臓の再生能力に起因して、この短い、重要な期間に対する支持により、適切な組織が利用可能になるまで、または患者自身の肝臓が最良の状態になるいずれかまで、患者を生存させ得る。
【０２６４】
米国および英国において動物および５２人の患者の肝臓補助デバイスが、開発され、試験された（Ｓｕｓｓｍａｎ，ＮＬら、（１９９２）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １６，６０−６５；Ｓｕｓｓｍａｎ，ＮＬら、（１９９４）Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｏｒｇａｎｓ  １８，３９０−３９６；Ｍｉｌｌｉｓ，ＪＭら、（２００２）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７４，１７３５−１７４６）。このデバイスにおいて、腎臓透析に使用される場合、ホローファイバカートリッジは、肝臓の機能を果たすヒトの肝細胞株で満たされる。細胞は、セルロースアセテート繊維によって、患者の免疫系から切り離される。血液は、繊維の内腔を通して汲み出され、低分子は、細胞の繊維を通って拡散し、それらは適切に代謝される。デバイスは安全であり、その効果を証明するのに十分な力の試験は実施されていないが、事例証拠は、生命を救い得ることを示唆している。動物の肝細胞を用いる他の同様のデバイスもまた、効果的なようである（Ｈｕｉ，Ｔら（２００１）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ  Ｐａｎｃｒｅａｔ  Ｓｕｒｇ．８，１−１５）。
【０２６５】
実用的な問題が、デバイスを満たすために肝細胞の供給源において生じる。有効であるためには、各デバイスは約２００ｇの細胞（肝臓質量全体の１５〜２０％）を必要とする。本研究の数十年の後でさえ、肝細胞は、インビボでのそれらの再生する能力にもかかわらず、培養物においていずれの範囲にも分かれない。始めの段落に記載されている統計からは、支持デバイスに細胞を供給するためにヒトの肝臓を使用することは推奨されることではない。移植は、限られた完全な臓器である。動物肝臓の使用は、十分な細胞を供給し得るが、新しい臓器の一定の収集を必要とし、再現性および品質維持の問題を提示する。不死化され、細胞バンクにおいて凍結され得るヒト肝臓細胞株を用いることによって、この問題に取り組んでいる（Ｓｕｓｓｍａｎ，ＮＬおよびＫｅｌｌｙ，ＪＨ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２，６８−７７）。これらの細胞は、一定に再生可能で、再現性があり、かつ限定されないデバイスの供給物を供給し得る。
【０２６６】
残念なことに、これらの細胞の腫瘍由来の供給源は、ヒトの治療におけるその使用のための承認および規制の問題を示した。本明細書中に開示される組成物および方法から作製される開示される肝細胞は、この障害を回避し得る。なぜなら、逆転後、それらはもはや細胞株ではないからである。
【０２６７】
（ｇ  遺伝的に適合した細胞株）
遺伝子ノイズ（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｎｏｉｓｅ）レベルが劇的に減少され得るので、遺伝的に適合した細胞株が、遺伝子発現研究およびプロテオミクス研究のために使用され得る。
【０２６８】
培養物における細胞を使用する大きな欠点は、遺伝子発現を研究する前に、開示される細胞が、同じ遺伝的背景を有さないことである。遺伝子の異なるセットは、異なる個体において異なるレベルで発現される。これは、遺伝子および環境の要素を有する。さらに、培養物中のほとんどの細胞は腫瘍に由来し、それは定義から、遺伝的に異常で、通常複数の逆転、重複および完全に複製されるかまたは失失した染色体を含む。
【０２６９】
同じ幹細胞から単離された細胞セットは、個体から組織サンプルを得るのと同じことである。例えば、肝臓および腸由来の細胞の遺伝的背景は、同じである。このことは、個体の変異性が除かれるので、遺伝子およびタンパク質の組織特異的発現の非常に明らかな決定を可能にする。開示される方法および組成物は、本明細書中に開示される任意の細胞（例えば、任意の固有の個体由来のような任意の供給源由来の幹細胞）由来の特定の細胞型の遺伝的に適合した細胞を生成するために使用され得る。
【０２７０】
（ｄ  発達経路および制御の同定）
前述のように、転写因子は、組織特異的遺伝子形質発現をもたらすために、組み合わせて作用する。開示される組成物および方法は、所定の細胞型についての特定の遺伝子を活性化する細胞の時期を同定するために使用され得る。例として肝細胞を用いると、アルブミンは、成人肝細胞の主要な製品である。数種の転写因子がその発現を調節することが公知である。そのような因子の１つは、Ｃ／ＥＢＰ（中間代謝に関与する多くの遺伝子の調節における因子）である（Ｄａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＧＪ，（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，３００５７−３００６０）。例えば、ＥＧ系におけるＣ／ＥＢＰについてのプロモータを用いて、この遺伝子を活性化させる細胞を同定し得る。これらのうちの１つは、肝芽腫（ｈｅｐａｔｉｂｌａｓｔ）（肝細胞の前駆体）である。次いで、発現がＣ／ＥＢＰを調節する遺伝子を選択することによって、本発明者らは、段階的に起源へさかのぼる発達経路を追跡し得る。
【０２７１】
明細書および添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数形の対象物を含む。従って、例えば、「薬学的キャリア」という言及は、２種以上のそのようなキャリアの混合物などを含む。
【０２７２】
開示される組成物を調製するために使用される成分、および本明細書中に開示される方法の範囲内で使用される組成物自体が、開示される。これらおよび他の物質が本明細書中に開示され、そしてこれらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示される場合、これらの化合物の各々の種々の個体および集団の組み合わせおよび順列は、明確に開示されないが、各々は、本明細書中に具体的に企図および開示される。例えば、具体的な改変されたＥＳ細胞が開示および議論され、多数の分子に対してなされ得る多数の改変（その改変されたＥＳ細胞を含む）が議論される場合、具体的にそうでないと示されない限り、可能である改変されたＥＳ細胞と改変との各々かつ全ての組み合わせおよび順列が具体的に企図される。従って、分子Ａ、ＢおよびＣのクラスが開示され、そして分子Ｄ、ＥおよびＦのクラスならびに分子Ａ−Ｄの組み合わせの例が開示される場合、たとえ各々が個々に列挙されなくても、各々は、個々および集合的に、組み合わせＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−ＥおよびＣ−Ｆを意味することが企図される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせもまた、開示される。従って、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−ＦおよびＣ−Ｅのサブグループが、開示されるとみなされる。この考えは、開示される組成物を作製および使用する方法における工程を包含する（しかし、こに限定されない）、この出願の全ての局面に適用する。従って、実施され得る種々のさらなる工程が存在する場合、これらのさらなる工程の各々が、開示される方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組み合わせを用いて実施され得ることが、理解される。
【０２７３】
本明細書中に開示される多くの異なる組成物および方法の工程が存在することが理解され、本明細書中に開示されるような各々の組成物および方法についての各々の組み合わせおよび全ての組み合わせならびに順列が、企図され、開示される。例えば、形質転換遺伝子、プロモーター、細胞型、リコンビナーゼの組み合わせ、改変幹細胞、マーカー、細胞特異的遺伝子のリストが存在し、これらの各々の各組み合わせは単独で、または全体で開示され、これは、何千もの特定の実施形態および実施形態のセットを提供する。いったん、リストおよび一部が開示されると、組み合わせもまた、各組み合わせを具体的に列挙することなく開示される。
【０２７４】
さらに、具体的にそうでないと示されない限り、または当業者にそうでないと理解されない限り、１つの特定の実施形態（例えば、Ｒａｓ形質転換遺伝子）が議論される場合、全ての他の形質転換遺伝子もまた、列挙または実施形態のために開示され、同様に本明細書中に開示される各々の組成物および方法の工程のために開示されることが理解される。
【０２７５】
範囲は、「約」１つの特定の値から、そして／または「約」別の特定の値までとして本明細書中に表され得る。このような範囲が表される場合、別の実施形態は、１つの特定の値から、そして／または他の特定の値までを含む。同様に、先行詞「約」の使用によって、値が近似値として表される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。範囲の各々の終点が、他の終点に関連して、そして他の終点に独立して両方に有意であることがさらに理解される。本明細書中に開示される多くの値が存在し、各値はまた、その値自体に加えて特定の値の「約」として本明細書中に開示されることもまた、理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」もまた開示される。値が、その値「以下」、「その値以上」であると開示される場合、当業者に適切に理解されるように、値の間の可能性にある範囲もまた開示されれることも、理解される。例えば、「１０」が開示される場合、「１０以下」および「１０以上」もまた、開示される。本明細書中全体にわたって、データが多くの異なる形式において提供され、このデータは、終点および出発点、ならびにデータポイントの任意の組み合わせについての範囲を表わすこともまた、理解される。例えば、特定のデータポイント「１０」および特定のデータポイント「１５」が開示される場合、１０および１５より大きい、１０および１５以上、１０および１５未満、１０および１５以下、ならびに１０および１５に等しいことが開示されるとみなされ、そして１０と１５との間であると理解される。例えば、１０および１５が開示される場合、１１、１２、１３および１４もまた、開示される。
【０２７６】
全体にわたって使用される場合、「被験体」によって、個体を意味する。従って、「被験体」としては、例えば、飼いならされた動物（例えば、ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモットなど）、哺乳動物、ヒト以外の哺乳動物、霊長類、ヒト以外の霊長類、齧歯類、鳥、爬虫類、両生類、魚および任意の他の動物）が挙げられ得る。被験体は、哺乳動物（例えば、霊長類またはヒト）であり得る。
【０２７７】
「処置する」または「処置」は、完全な治癒を意味しない。基礎疾患の症状が減少され、そして／またはその症状を引き起こす１種以上の細胞性原因、生理学的原因、または生化学的原因あるいは機構が減少することを意味する。この文脈において使用される場合、疾患状態に関連する手段（疾患の生理学的状態だけでなく、疾患の分子状態）を減少することを意味する。
【０２７８】
「減少する」または減少する他の形態は、事象または特徴の低下を意味する。このことは、代表的に、いくつかの標準的または予測される値に関連する（つまり、相対的であるが、言及される標準的または相対的な値を必ずしも常に必要としない）ことが、理解される。例えば、「リン酸化を減少する」とは、標準物質またはコントロールと相対的に起こるリン酸化の量を低下させることを意味する。
【０２７９】
「阻害する」または阻害する他の形態によって、特定の特徴を妨げるかまたは抑制することを意味する。このことは、代表的に、いくつかの標準的または予測される値と相対的である（つまり、これは相対的であるが、言及される標準的または相対的な値を必ずしも常に必要としない）ことが理解される。例えば、「リン酸化を阻害する」とは、標準物質またはコントロールと相対的に起こるリン酸化の量を妨げるか、または抑制することを意味する。
【０２８０】
「防止」または防止の他の形態によって、特定の特徴または状態を停止することを意味する。防止は、代表的に、例えば、減少または阻害より絶対的であるように、コントロールとの比較を必要としない。本明細書中で使用される場合、何かは、阻害または防止されないが、減少され得、一方で何かは、阻害も防止もされ得、減少され得る。具体的に他に示されない限り、減少、阻害または予防が使用される場合、他の２つの単語の使用もまた、明白に開示されることが理解される。従って、リン酸化の阻害が開示される場合、リン酸化を減少および防止することも開示される。
【０２８１】
用語「治療有効量」とは、疾患または障害の１つ以上の原因または症状を改善するのに十分な量で使用される組成物の量を意味する。そのような改善は、減少または変化のみを必要とし、除去を必ずしも必要としない。用語「キャリア」とは、化合物または組成物と組み合わされる場合、その意図される使用または目的のための化合物または組成物の調製、貯蔵、投与、送達、有効性、または任意の他の特徴を補助または促進する化合物、組成物、物質または構造を意味する。例えば、キャリアは、活性成分の任意の分解を最小化するため、そして被験体における任意の有害な副作用を最小化するために選択され得る。
【０２８２】
本明細書中の詳細な説明および特許請求の範囲全体にわたって、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびその語のバリエーション（例えば、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」）は、「が挙げられるが、それらに限定されない」を意味し、例えば、他の添加剤、構成要素、成分または工程を排除することを意図しない。
【０２８３】
具体的に示されない限り、本明細書中で使用される場合、用語「細胞」はまた、個体の細胞、細胞株、初代培養物、またはそのような細胞由来の培養物をいう。「培養物」とは、同じまたは異なる型の単離された細胞を含む組成物をいう。
【０２８４】
細胞株は、無制限に再生され得る特定の型の細胞の培養物であり、それによってその細胞株は「不死」にされる。
【０２８５】
細胞培養物は、寒天のような培地で増殖する細胞の集団である。
【０２８６】
初代細胞培養物は、細胞由来の培養物または不死化されない生きている生物から直接得た培養物である。
【０２８７】
用語「プロドラッグ」とは、生理学的条件下で、治療活性因子に変換される化合物を含むことを意図される。プロドラッグを作製するための一般的な方法は、生理学的条件下で加水分解されて、所望の分子を示す選択される部分を含むことである。他の実施形態において、プロドラッグは、宿主動物の酵素活性によって変換される。
【０２８８】
用語「代謝物」とは、化合物の生物学的環境（例えば、患者）への導入の際に生成される活性誘導体をいう。
【０２８９】
薬学的組成物に関して使用される場合、用語「安定」は、一般に、示される期間の特定の保存条件下で特定の量（通常１０％）未満の活性成分の損失を意味することとして当該分野において理解される。安定とみなされる組成物について要求される時間は、各生成物の使用に関連し、生成物を生成し、その品質維持および品質検査を保持し、それを卸売業者または直接、消費者に出荷する、商業的な実用性によって示され、その最終的な使用前に再び、貯蔵を保持される。数ヶ月間の安全な要因を含むことによって、医薬品の最低限の製品寿命は、通常、１年、および好ましくは１８ヶ月より長くなる。本明細書中で使用される場合、用語「安定」とは、それらの市場安定性ならびに容易に到達可能な環境条件（例えば、２℃〜８℃の冷凍保存）下で、製品を貯蔵および輸送する能力をいう。
【０２９０】
本明細書および結論である特許請求の範囲において、組成物または物品における特定の要素または成分の重量部との参照は、重量部として表される組成物または物品における要素または成分と任意の他の要素または成分との間の重量関係を示す。従って、成分Ｘの２重量部および成分Ｙの５重量部を含む化合物において、ＸおよびＹは、２：５の重量比として示され、さらなる成分がその化合物に含まれるか否かに関わらず、このような比で示される。
【０２９１】
具体的にそうでないと示されない限り、成分の重量パーセントは、その成分が含まれる処方物または組成物の全重量に基づく。
【０２９２】
本明細書および添付の特許請求の範囲に従って、参照が、以下の意味を有すると定義される多くの用語に関してなされる：
「任意」または「必要に応じて」とは、その後に記載される事象または状況が、起こってもよく、起こらなくてもよいことを意味し、その説明は、該事象または状況が起こる場合、および起こらない場合を含む。
【０２９３】
「プライマー」は、いくつかの型の酵素的操作を支持し得るプローブのセットであり、それは、標的核酸とハイブリダイズし得、その結果、酵素的操作が生じ得る。プライマーは、ヌクレオシドまたはヌクレオチド誘導体あるいは酵素的操作を妨げない当該分野において利用可能なアナログの任意の組み合わせから作製され得る。
【０２９４】
「プローブ」は、代表的に、配列特異的様式において（例えば、ハイブリダイゼーションによって）標的核酸と相互作用し得る分子である。核酸のハイブリダイゼーションは、当該分野において十分に理解され、本明細書中に開示される。代表的に、プローブは、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体あるいは当該分野において利用可能なアナログの任意の組み合わせから作製され得る。
【０２９５】
開示される方法において使用するための核酸セグメントはまた、核酸配列および核酸分子といわれ得る。文脈が他に示さない限り、核酸セグメント、核酸配列および核酸分子に対する参照は、任意の他の核酸から分離され得るか、または任意の他の核酸に組み込まれ得るか、または任意の他の核酸の一部である特定の配列および／または機能を有するオリゴヌクレオチド鎖またはポリヌクレオチド鎖をいうことが意図される。
【０２９６】
本明細書全体にわたって、種々の刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、関係する当該分野の状態をより十分に記載するために、それらの全体が本明細書中で参考として本出願に援用される。開示される参考文献はまた、その参考文献が基にされる文に議論されるそれらに含まれる物質について個々および別々に本明細書中に参考として援用される。
【０２９７】
（Ｄ．組成物を作製する方法）
具体的に他に示されない限り、本明細書中に開示される組成物および開示される方法を実施するために必要な組成物は、その特定の試薬または化合物について当業者に公知の任意の方法を用いて作製され得る。
【０２９８】
（１．核酸合成）
例えば、プライマーとして使用される核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）は、標準的な化学合成法を用いて作製され得るか、あるいは酵素法または任意の他の公知の方法を用いて生成され得る。このような方法は、純粋な合成法（例えば、ＭｉｌｌｉｇｅｎまたはＢｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １Ｐｌｕｓ  ＤＮＡシンセサイザーを用いるシアノエチルホスホラミダイト法（例えば、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡのＭｏｄｅｌ  ８７００自動化シンセサイザーまたはＡＢＩ  Ｍｏｄｅｌ  ３８０Ｂ））によるヌクレオチドフラグメント単離の後の標準的な酵素消化に及ぶ範囲であり得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｇａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）第５章、第６章を参照のこと）。オリゴヌクレオチドを作製するために有用は合成法はまた、Ｉｋｕｔａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３−３５６（１９８４）（リン酸トリエステル法および亜リン酸トリエステル法）、およびＮａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６５：６１０−６２０（１９８０），（リン酸トリエステル法）に記載される。タンパク質核酸分子は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．５：３−７によって記載されるような公知の方法を用いて作製され得る。
【０２９９】
（２．ペプチド合成）
開示されるタンパク質を生成する１つの方法は、タンパク質化学技術によって、２種以上のペプチドまたはポリペチドを一緒に結合することである。例えば、ペプチドまたはポリペチドは、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）化学物質のいずれかを用いる現在利用可能な実験装置を用いて化学的に合成され得る（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。当業者は、例えば、開示されるタンパク質に対応するペプチドまたはポリペプチドが、標準的な化学反応によって合成され得ることを容易に理解し得る。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは合成され得、その合成樹脂から切断されないが、ペプチドまたはタンパク質のもう一方のフラグメントは、合成され得、続いて、樹脂から切断され得、それによって、もう一方のフラグメントに機能的にブロックされる末端基を曝露する。ペプチド縮合反応によって、これらの２つのフラグメントは、それぞれ、それらのカルボキシル末端およびアミノ末端においてペプチド結合を介して共有結合されて、抗体またはそのフラグメントを形成し得る（Ｇｒａｎｔ  ＧＡ（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ．Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎおよびＣｏ．，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ  ＭおよびＴｒｏｓｔ  Ｂ．編（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｉｎｃ．，ＮＹ（これは、少なくとも、ペプチド合成に関連する物質について本明細書中に参考として援用される））。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドは、本明細書中に記載されるようにインビボで独立して合成され得る。いったん、単離されると、これらの独立したペプチドまたはポリペプチドは結合されて、同様のペプチド濃縮反応を介してペプチドまたはそのフラグメントを形成し得る。
【０３００】
例えば、クローニングされたペプチドセグメントまたは合成セグメントの酵素ライゲーションは、比較的短いペプチドフラグメントを結合させて、より大きいペプチドフラグメント、ポリペプチドまたは完全なタンパク質ドメインを生成し得る（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ  Ｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：４１５１（１９９１））。あるいは、合成ペプチドのネイティブなキメラライゲーションは、より短いペプチドフラグメントから大きなペプチドまたはポリペプチドを合成的に構築するために有用であり得る。この方法は、２段階の化学反応からなる（Ｄａｗｓｏｎら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：７７６−７７９（１９９４））。第１段階は、保護されていない合成ペプチド−チオエステルとアミノ末端Ｃｙｓ残基を含む別の保護されていないペプチドセグメントとの化学選択的反応であり、初期の共有結合生成物としてチオエステル連結中間体が得られる。反応条件を変えずに、この中間体は、自発性の急速な分子内反応を経て、ライゲーション部位においてネイティブなペプチド結合を形成する（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ  Ｍら、（１９９２）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０７：９７−１０１；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１６０７５（１９９４）；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：３１２８（１９９１）；Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ  Ｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：６６２３−３０（１９９４））。
【０３０１】
あるいは、保護されていないペプチドセグメントは、化学的に連結され得、化学的ライゲーションの結果としてのペプチドセグメント間に形成される結合は、非天然の（非ペプチド）結合である（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：２２１（１９９２））。この技術は、タンパク質ドメインのアナログおよび完全な生物学的活性を有する大量の比較的純粋なタンパク質を合成するために使用されている（ｄｅＬｉｓｌｅ  Ｍｉｌｔｏｎ  ＲＣら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＶ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２５７−２６７（１９９９））。
【０３０２】
（３．組成物を作製するためのプロセス）
組成物を作製するためのプロセスおよび組成物を生じる中間体を作製するためのプロセスが、開示される。例えば、開示される方法によって生成される細胞が、開示される。これらの組成物を作製するために使用され得る種々の方法（例えば、合成化学的方法および標準的な分子生物学的方法）が存在する。これらおよび他の開示される組成物を作製する方法が具体的に開示されることが、理解される。
【０３０３】
作動可能な様式において連結する工程を含むプロセスによって生成される核酸分子が開示され、核酸は、本明細書中に開示される配列を含み、配列は、核酸の発現を制御する。
【０３０４】
作動可能な様式において連結する工程を含むプロセスによって生成される核酸分子もまた、開示され、核酸分子は、本明細書中に開示される配列と８０％同一性を有する配列を含み、配列は、核酸の発現を制御する。
【０３０５】
作動可能な様式において連結する工程を含むプロセスによって生成される核酸分子が開示され、核酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で開示される配列に対してハイブリダイズする配列を含み、配列は、核酸分子の発現を制御する。
【０３０６】
作動可能な様式において連結する工程を含むプロセスによって生成される核酸分子が開示され、核酸分子は、本明細書中に開示されるペプチドをコードする配列を含み、配列は、核酸分子の発現を制御する。
【０３０７】
作動可能な様式において連結する工程を含むプロセスによって生成される核酸分子が開示され、核酸分子は、本明細書中に開示されるペプチドと８０％同一性を有するペプチドをコードする配列を含み、配列は、核酸分子の発現を制御する。
【０３０８】
作動可能な様式において連結する工程を含むプロセスによって生成される核酸分子が開示され、核酸分子は、本明細書中に開示されるペプチドと８０％同一性を有するペプチドをコードする配列を含み、ここで、ペプチド配列由来のあらゆる変化は、保存的変化であり、配列は、核酸分子の発現を制御する。
【０３０９】
任意の開示される核酸で細胞を形質転換するプロセスによって生成される細胞が開示される。任意の非天然に生じる開示される核酸で細胞を形質転換するプロセスによって生成される細胞が開示される。本明細書中に記載される方法によって生成される異なる細胞の組み合わせもまた、開示される。他の細胞と混合される本明細書中に開示される方法によって生成される異なる細胞の組み合わせもまた、提供される。これらの細胞は、特定の必要性または用途に基づいた種々の純度を有し得る。
【０３１０】
任意の開示される核酸を発現するプロセスによって生成される任意の開示されるペプチドが開示される。任意の開示される核酸を発現するプロセスによって生成される任意の非天然に生じる開示されるペプチドが開示される。任意の非天然の開示される核酸を発現するプロセスによって生成される任意の開示されるペプチドが開示される。
【０３１１】
本明細書中に開示される任意の核酸で細胞を動物内で形質転換するプロセスによって生成される動物が、開示される。本明細書中に開示される任意の核酸で細胞を動物内で形質転換するプロセスによって生成される動物が開示され、ここで、その動物は、哺乳動物である。本明細書中で開示される任意の核酸分子で細胞を動物内でトランスフェクションするプロセスによって生成される動物もまた、開示され、ここで、その動物は、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、霊長類である。
【０３１２】
本明細書中で開示される任意の細胞を動物に添加するプロセスによって生成される動物もまた、開示される。
【０３１３】
本明細書中に開示される核酸で細胞を形質転換することによって生成される本明細書中に開示される任意の幹細胞が、開示される。本明細書中に開示される方法（例えば、特定の細胞型を選択して単離するための方法および開示される改変幹細胞を用いる方法）によって生成される任意の細胞もまた、開示される。
【０３１４】
（Ｅ．組成物を用いる方法）
（１．研究道具として組成物を用いる方法）
開示される組成物は、研究道具として種々の様式において使用され得る。
【０３１５】
組成物は、例えば、コンビナトリアルケミストリープロトコルまたは他のスクリーニングプロトコルにおける標的として使用されて、特定の細胞型に関連する所望の機能的特性を有する分子を単離し得る。
【０３１６】
開示される組成物は、マイクロアレイにおける試薬または存在するマイクロアレイを調べるかまたは分析するための試薬のいずれかとして本明細書中に議論されるように使用され得る。開示される組成物は、単一のヌクレオチド多型性を単離または同定するための任意の公知の方法において使用され得る。組成物はまた、例えば、本明細書中に開示される特定の細胞型における特定の遺伝子の対立遺伝子分析を決定するための任意の方法において使用され得る。組成物はまた、チップ／マイクロアレイに関連するスクリーニングアッセイの任意の公知の方法において使用され得る。組成物はまた、例えば、開示される組成物に関する関連性を研究するため、または分子モデル分析を実施するために、開示される組成物のコンピューター読み取り可能な実施形態を使用する任意の公知の様式において使用され得る。
【０３１７】
（２．遺伝子修飾および遺伝子破壊の方法）
開示される組成物および方法は、これらの事象を受け得る任意の動物における標的化遺伝子を破壊または修飾するために使用され得る。遺伝子修飾および遺伝子破壊とは、哺乳動物の生殖細胞系によって改変を伝播する様式で、動物（例えば、哺乳動物）における遺伝子または染色体の伸長の選択的除去または変性を含む、方法、技術、および組成物をいう。一般に、細胞は、例えば、本明細書中に記載される細胞内に含まれる特定の染色体の領域を有する相同的組換えを設計されるベクターで形質転換される。この相同的組換え事象は、例えば、フレーム内に周囲のＤＮＡを導入される外来性ＤＮＡを有する染色体を生成し得る。このタイプのプロトコルは、細胞内に含まれるゲノム内に導入されるための非常に特異的な変異（例えば、点変異）を可能にする。この型の相同組換えを実施する方法は、本明細書中に開示される。同様に、幹細胞（例えば、多能性幹細胞）は、遺伝子をノックアウトするために使用されて、トランスジェニック動物を作製し得、幹細胞は、本明細書中に記載される方法において使用されて、種々のアッセイにおいて動物と比較され得る細胞株を生じ得る。
【０３１８】
哺乳動物細胞において相同組換えを実施する好ましい方法の１つは、所望の組換え事象が低頻度で生じるため、細胞が培養され得るべきであることである。
【０３１９】
いったん、本明細書中に記載される方法によって細胞が生成されると、動物は、幹細胞技術またはクローニング技術のいずれかによって、この細胞から生成され得る。例えば、トランスフェクション，，された核酸の細胞が、生物についての幹細胞である場合、トランスフェクションおよび培養後、この細胞は、生殖細胞系細胞において遺伝子修飾または遺伝子破壊を含む生物を生成するために使用され得、次いで、これは、その細胞の全てにおいて遺伝子修飾または遺伝子破壊を有する別の動物を生成するために使用される。その細胞の全てにおいて遺伝子修飾または遺伝子破壊を含む動物を生成するための他の方法において、クローニング技術が、使用され得る。これらの技術は、一般に、トランスフェクションされた細胞の核を取り、融合または組換えのいずれかによって、トランスフェクションされた核と卵母細胞とを融合し、次いで、これは、動物を生成するために操作され得る。ＥＳ技術の代わりにクローニングを使用する手順の利点は、トランスフェクションされ得るＥＳ細胞以外の細胞である。例えば、線維芽細胞（これは非常に培養し易い）は、トランスフェクションされる細胞として使用され得、遺伝子改変または遺伝子破壊を有し、次いで、この細胞由来の細胞は、動物全体をクローニングするために使用され得る。
【０３２０】
（Ｆ．特定の実施形態）
核酸セグメントを含む多能性幹細胞が開示され、核酸セグメントは、構造Ｐ−Ｉを含み、Ｐは、転写制御エレメントであり、Ｉは、マーカーをコードする配列であり、そのマーカーは、形質転換因子を含む。
【０３２１】
転写制御エレメントが活性化される条件下で、多能性幹細胞を培養することによって生成される分化細胞もまた、開示され、それによって、Ｉは、優先的または選択的に発現され、その多能性幹細胞は、核酸セグメントを含み、その核酸セグメントは、構造Ｐ−Ｉを含み、Ｐは、転写制御エレメントであり、Ｉは、マーカーをコードする配列であり、そのマーカーは、転写因子である。
【０３２２】
被験体に分化細胞を導入する工程を包含する方法もまた、開示され、その分化細胞は、転写制御エレメントが活性化される条件下で、多能性幹細胞を培養することによって生成され、それによって、Ｉは、優先的または選択的に発現され、その多能性幹細胞は、核酸セグメントを含み、その核酸セグメントは、構造Ｐ−Ｉを含み、Ｐは、転写制御エレメントであり、そしてＩは、マーカーをコードする配列であり、そのマーカーは、形質転換因子を含む。
【０３２３】
毒性について組成物をアッセイする方法もまた開示され、その方法は、分化細胞とともに組成物をインキュベートする工程、および毒性効果について分化細胞を評価する工程を包含し、その分化細胞は、転写制御エレメントが活性化される条件下で、多能性幹細胞を培養することによって生成され、それによって、Ｉは、優先的または選択的に発現され、その多能性幹細胞は、核酸セグメントを含み、その核酸セグメントは、構造Ｐ−Ｉを含み、Ｐは、転写制御エレメントであり、Ｉは、マーカーをコードする配列であり、そのマーカーは、形質転換因子を含む。
【０３２４】
毒性について化合物をアッセイする方法もまた開示され、その方法は、分化細胞とともに化合物をインキュベートする工程、および毒性効果について分化細胞を評価する工程を包含し、その分化細胞は、転写制御エレメントが活性化される条件下で、多能性幹細胞を培養することによって生成され、それによって、Ｉは、優先的または選択的に発現され、その多能性幹細胞は、核酸セグメントを含み、その核酸セグメントは、構造Ｐ−Ｉを含み、Ｐは、転写制御エレメントであり、Ｉは、マーカーをコードする配列であり、そのマーカーは、形質転換因子を含む。
【０３２５】
細胞に対する目的の効果について組成物をアッセイする方法もまた開示され、その方法は、分化細胞とともに組成物をインキュベートする工程、および目的の効果について分化細胞を評価する工程を包含し、その分化細胞は、転写制御エレメントが活性化される条件下で、多能性幹細胞を培養することによって生成され、それによって、Ｉは、優先的または選択的に発現され、その多能性幹細胞は、核酸セグメントを含み、その核酸セグメントは、構造Ｐ−Ｉを含み、Ｐは、転写制御エレメントであり、Ｉは、マーカーをコードする配列であり、そのマーカーは、形質転換因子を含む。
【０３２６】
細胞に対する目的の効果について化合物をアッセイする方法もまた開示され、その方法は、分化細胞とともに化合物をインキュベートする工程、および目的の効果について分化細胞を評価する工程を包含し、その分化細胞は、転写制御エレメントが活性化される条件下で、多能性幹細胞を培養することによって生成され、それによって、Ｉは、優先的または選択的に発現され、その多能性幹細胞は、核酸セグメントを含み、その核酸セグメントは、構造Ｐ−Ｉを含み、Ｐは、転写制御エレメントであり、Ｉは、マーカーをコードする配列であり、そのマーカーは、形質転換因子を含む。
【０３２７】
幹細胞から分化細胞を誘導する方法もまた開示され、その方法は、転写制御エレメントが、活性化される条件下で、幹細胞を培養する工程を包含し、それによって、Ｉは、優先的または選択的に発現され、それによって、分化細胞を誘導し、その幹細胞は、核酸セグメントを含み、その核酸セグメントは、構造Ｐ−Ｉを含み、Ｐは、転写制御エレメントであり、Ｉは、マーカーをコードする配列であり、そのマーカーは、形質転換因子を含み、Ｉは、異種核酸配列である。
【０３２８】
幹細胞由来の条件付き不死化細胞型を誘導する方法もまた開示され、その方法は、幹細胞を核酸セグメントでトランスフェクションする工程であって、その核酸セグメントは、構造Ｐ−Ｉを含み、Ｐは、転写制御エレメントであり、Ｉは、マーカーをコードする配列であり、そのマーカーは、形質転換因子を含む、工程；転写制御エレメントが活性化される条件下で、その幹細胞を培養する工程であって、それによって、Ｉは、優先的または選択的に発現され、それによって、幹細胞由来の条件付き不死化細胞型を誘導する工程、を包含する。
【０３２９】
幹細胞由来の分化細胞を誘導する方法もまた開示され、その方法は、幹細胞を核酸セグメントでトランスフェクションする工程であって、その核酸セグメントは、構造Ｐ−Ｉを含み、Ｐは、転写制御エレメントであり、Ｉは、マーカーをコードする配列であり、そのマーカーは、形質転換因子を含む、工程；および転写制御エレメントが活性化される条件下で、その幹細胞を培養する工程であって、それによって、Ｉは、優先的または選択的に発現され、それによって、分化細胞を誘導する工程、を包含する。
【０３３０】
幹細胞由来の分化細胞を誘導する方法もまた開示され、その方法は、幹細胞を核酸セグメントでトランスフェクションする工程であって、その核酸セグメントは、構造Ｐ−Ｉを含み、Ｐは、転写制御エレメントであり、Ｉは、マーカーをコードする配列である、工程；および転写制御エレメントが活性化される条件下で、その幹細胞を培養する工程であって、それによって、Ｉは、優先的または選択的に発現され、その転写制御エレメントが活性化される条件は、その幹細胞が分化する条件であり、それによって、分化細胞を誘導する工程、を包含する。
【０３３１】
核酸分子を含む多能性幹細胞もまた開示され、その核酸分子は、構造Ｐ−Ｉを含み、ここで：Ｐは、転写制御エレメントであり；そしてＩは、マーカーをコードする配列であり、そのマーカーは、形質転換因子を含む。肝細胞由来の核酸を切断することによって生成される細胞もまた開示され、その幹細胞は核酸分子を含み、その核酸分子は構造Ｐ−Ｉ含み、ここで：Ｐは、転写制御エレメントであり、Ｉは、マーカーをコードする配列であり、そのマーカーは、形質転換因子を含む。
【０３３２】
幹細胞由来の条件付き不死化細胞型の集団を誘導する方法もまた開示され、その方法は、請求項１に列挙される核酸分子Ｐ−Ｉのうちの１つを含む構築物で幹細胞をトランスフェクションする工程；エレメントＰの転写制御が活性化されるような環境中で、その幹細胞を培養する工程であって、それによって、Ｉは、優先的または選択的に発現される工程；およびＩを発現する細胞型を選択する工程、を包含する。
【０３３３】
幹細胞由来の条件付き不死化細胞型の集団を誘導する方法もまた開示され、その方法は、請求項１に列挙される核酸分子Ｐ−Ｉのうちの１つを含む構築物で幹細胞をトランスフェクションする工程；エレメントＰの転写制御が活性化されるような環境中で、その幹細胞を培養する工程であって、それによって、Ｉは、優先的または選択的に発現される工程；およびＩを発現する細胞型を選択する工程、を包含する。
【０３３４】
条件付き不死化細胞型を誘導する方法もまた開示され、その方法は、核酸分子Ｐ−Ｉのうちの１つを含む構築物で多能性幹細胞をトランスフェクションする工程；制御エレメンＰを活性化する工程であって、それによって、Ｉは、優先的または選択的に発現される工程；Ｉを発現する細胞型を選択する工程；Ｐ−Ｉ核酸分子を含む構築物を切除する工程；以前に核酸の末端が、Ｐ−Ｉ核酸分子組換えを含む構築物を含むような環境と選択された細胞型とを接触させる工程；および選択された細胞型を凍結する工程を包含する。
【０３３５】
細胞培養物を誘導する方法もまた開示され、その方法は、核酸分子Ｐ−Ｉのうちの１つを含む構築物で幹細胞をトランスフェクションする工程；転写制御エレメントＰが活性化されて、Ｉが優先的または選択的に発現されるような環境と幹細胞とを接触させる工程；およびＩを発現する細胞を培養する工程であって、Ｐは、転写制御エレメントであり；そしてＩは、マーカーをコードする配列であり、そのマーカーは、形質転換因子を含む工程、を包含する。
【０３３６】
核酸分子構築物を含む多能性幹細胞もまた開示され、その核酸分子構築物は、構造Ｐ−Ｉを含み、Ｐは、組織特異的転写制御エレメントであり；Ｐは、Ｉを優先的または選択的に発現し；そしてＩは、温度許容不死化因子である。
【０３３７】
核酸分子構築物を含む多能性幹細胞もまた開示され、その核酸分子構築物は、構造Ｘ−Ｐ−Ｉ−Ｘを含み、Ｐは、組織特異的転写制御エレメントであり；Ｐは、Ｉを優先的または選択的に発現させ；Ｉは、温度許容不死化因子であり；そしてＸは、部位特異的切除配列である。
【０３３８】
幹細胞誘導条件付き不死化細胞型を誘導する方法もまた開示され、この方法は、核酸分子構築物Ｐ−Ｉを含む構築物で多能性幹細胞をトランスフェクションする工程；転写制御エレメントＰが活性化され、Ｉが優先的または選択的に発現されるような環境とその幹細胞とを接触させる工程；Ｉを発現する幹細胞由来の細胞型を選択する工程；ならびに選択された細胞型をクローニングおよび凍結する工程であって、Ｐは、転写制御エレメントであり；そしてＩは、マーカーをコードする配列であり、そのマーカーは、形質転換因子を含む、工程を包含する。
【０３３９】
幹細胞由来の条件付き不死化細胞型を誘導する方法もまた開示され、その方法は、核酸分子構築物Ｘ−Ｐ−Ｉ−Ｘを含む構築物で多能性幹細胞をトランスフェクションする工程；転写制御エレメントＰが活性化されて、Ｉが優先的または選択的に発現されるような環境とその幹細胞とを接触させる工程；Ｉを発現する幹細胞由来の細胞型を選択する工程；ならびに選択された細胞型をクローニングおよび凍結する工程であって、Ｘは、部位特異的組換え部位であり、Ｐは、転写制御エレメントであり；そしてＩは、マーカーをコードする配列であり、そのマーカーは、形質転換因子を含む工程、を包含する。
【０３４０】
幹細胞由来の条件付き不死化細胞型を誘導する方法もまた開示され、その方法は、請求項１１に列挙される核酸分子構築物Ｘ−Ｐ−Ｉ−Ｘを含む構築物で多能性細胞型をトランスフェクションする工程；転写制御エレメントＰが活性化されて、Ｉが優先的または選択的に発現されるような環境とその幹細胞とを接触させる工程；Ｉを発現する幹細胞由来の細胞型を選択する工程；Ｐ−Ｉ核酸分子を含む構築物を切除する工程；ならびに選択された細胞型をクローニングおよび凍結する工程であって、Ｘは、部位特異的組換え部位であり、Ｐは、転写制御エレメントであり；そしてＩは、マーカーをコードする配列であり、そのマーカーは、形質転換因子を含む。
【０３４１】
患者を処置する方法もまた開示され、その方法は、幹細胞由来の細胞型を移植する工程を包含する。患者を処置する方法もまた開示され、その方法は、幹細胞由来の細胞型を移植する工程を包含する。毒性について組成物をアッセイする方法もまた開示され、その方法は、幹細胞由来の細胞とともに組成物をインキュベートする工程を包含する。
【０３４２】
核酸セグメントは、異種核酸セグメントであり得る。核酸セグメントは、外因性核酸セグメントであり得る。マーカーは、異種性であり得る。Ｉは、異種核酸配列であり得る。ＰおよびＩは、同じベクター内に含まれ得る。核酸セグメントはさらに、自殺遺伝子を含み得る。Ｐは、組織特異的転写制御エレメントであり得る。Ｐは、細胞型特異的転写制御エレメントであり得る。Ｐは、細胞系統特異的制御エレメントであり得る。Ｐは、細胞特異的転写制御エレメントであり得る。Ｐは、Ｉを優先的または選択的に発現させ得る。
【０３４３】
マーカーは、温度許容不死化因子を含み得る。形質転換因子は、温度許容因子であり得る。Ｉは、ＳＶ４０ラージＴ抗原を含み得る。核酸セグメントは、部位特異的切除配列に隣接され得る。Ｉは、部位特異的切除配列に隣接され得る。Ｐは、部位特異的切除配列に隣接され得る。核酸セグメントはさらにＸを含み得、Ｘは、部位特異的切除配列であり得、Ｘは、Ｐ−Ｉに隣接し、その核酸セグメントは、構造Ｘ−Ｐ−Ｉ−Ｘを含む。その核酸セグメントは、Ｘで切除され得る。Ｘは、ｌｏｘＰ部位であり得る。
【０３４４】
転写制御エレメントが活性化され得る条件は、幹細胞が分化する条件であり得る。幹細胞は、転写制御エレメントが活性化され得る条件下で分化し得る。転写制御エレメントは、幹細胞を胚様体に自発的に分化させることによって活性化され得る。核酸セグメントは、分化細胞から切除され得る。核酸セグメントは、アデノウイルス媒介性部位特異的切除を用いて切除され得る。核酸セグメントは、リコンビナーゼを用いて切除され得る。リコンビナーゼは、Ｃｒｅであり得る。核酸セグメントの切除は、その核酸セグメントが切断され得るところから核酸分子の組換えを生じる。
【０３４５】
Ｉの発現の効果は、逆転され得る。Ｉの発現の効果は、分化細胞の形質転換であり得、Ｉの発現の効果の逆転は、分化細胞の形質転換の逆転であり得る。Ｉの発現の効果は、ドミナントネガティブ形質転換因子の発現によって逆転され得る。Ｉの発現の効果は、核酸セグメントの切除によって逆転され得る。分化細胞は、肝細胞であり得る。分化細胞は、幹細胞由来の条件付き不死化細胞であり得る。
【０３４６】
分化細胞は、被験体に分化細胞を投与することによって導入され得る。分化細胞は、被験体に分化細胞を移植することによって導入され得る。転写制御エレメントが活性化され得る条件は、幹細胞が分化する条件であり得る。幹細胞は、転写制御エレメントが活性化され得る条件下で分化し得る。転写制御エレメントは、幹細胞を自発的に胚様体に分化させることによって活性化され得る。
【０３４７】
この方法はさらに、Ｉを発現する細胞を選択する工程を包含し得る。この方法はさらに、Ｉを発現する細胞の純度を増加させる工程を包含し得る。純度を増加させる工程は、クローンまたは半精製された細胞の集団を作製することを含む。この方法はさらに、核酸セグメントを切除する工程を包含し得る。この方法はさらに、分化細胞をクローニングする工程を包含し得る。この方法はさらに、分化細胞を凍結する工程を包含し得る。この方法はさらに、目的の遺伝子を選択された細胞に付加する工程を包含し得る。この方法はさらに、核酸セグメントを切除する工程；および選択された細胞を凍結する工程を包含し得る。以前に核酸セグメントを含む核酸の末端は、核酸セグメントが切除される場合、組換えられ得る。この方法はさらに、Ｉを発現する細胞を培養する工程を包含し得る。この方法はさらに、Ｉを発現する培養された細胞をクローニングする工程を包含し得る。この方法はさらに、分化細胞を被験体に導入する工程を包含し得る。
【０３４８】
分化細胞は、被験体に分化細胞を投与することによって導入され得る。分化細胞は、被験体に分化細胞を移植することによって導入され得る。この方法はさらに、分化細胞とともに組成物をインキュベートする工程、毒性効果について分化細胞を評価する工程を包含し得る。この方法はさらに、分化細胞とともに化合物をインキュベートする工程、および毒性効果について分化細胞を評価する工程を包含し得る。この方法はさらに、分化細胞とともに組成物をインキュベートする工程、および目的の効果について分化細胞を評価する工程を包含し得る。この方法はさらに、分化細胞とともに化合物をインキュベートする工程、および目的の効果について分化細胞を評価する工程を包含し得る。この方法はさらに、マーカーを選択することによって分化細胞を選択する工程を包含し得る。この方法はさらに、マーカーを発現する細胞を同定する分化細胞をスクリーニングする工程を包含し得る。幹細胞は、転写制御エレメントが活性化され得る条件下で分化し得る。転写制御エレメントは、幹細胞を自発的に胚様体に分化させることによって活性化され得る。
【０３４９】
マーカーは、異種核酸から発現され得る。核酸はさらに、自殺遺伝子を含み得る。Ｐは、組織特異的転写制御エレメントであり得る。Ｐは、Ｉを優先的または選択的に発現させ得る。不死化因子は、温度許容因子であり得る。Ｉは、ＳＶ４０ラージ抗原を含み得る。核酸分子は、部位特異的切除配列に隣接され得る。Ｉは、部位特異的切除配列に隣接され得る。Ｐは、部位特異的切除配列に隣接され得る。Ｐ−Ｉは、部位特異的切除配列、Ｘに隣接され得、Ｘ−Ｐ−Ｉ−Ｘを形成し得る。構造Ｐ−Ｉを含む核酸分子は、アデノウイルス媒介性部位特異的切除を用いて切除され得る。構造Ｐ−Ｉを含む核酸分子の切除は、切除されていない核酸分子の組換えを生じ得る。
【０３５０】
この方法はさらに、Ｉを発現する細胞の集団の純度を増加させる工程を包含し得る。純度を増加させる工程は、クローンまたは半精製された細胞の集団を作製する工程を包含し得る。この方法はさらに、核酸を切除する工程を包含し得る。この方法はさらに、選択された細胞型を凍結する工程を包含し得る。この方法はさらに、目的の遺伝子を細胞の集団に付加する工程を包含し得る。制御エレメントＰを活性化することは、幹細胞培養物を自発的に胚様体に分化させることを含み得る。この方法はさらに、Ｉを発現する選択された細胞をクローニングする工程を包含し得る。
【０３５１】
Ｐ−Ｉは、切除され得る。Ｐ−Ｉは、アデノウイルス媒介性部位特異的切除によってＸで切断され得る。Ｐ−Ｉの切断は、以前にＰ−Ｉ核酸分子を含む構築物を含む核酸の組換えを可能にし得る。ＰおよびＩは、異なるベクター中に含まれ得る。
【実施例】
【０３５２】
（Ｇ．実施例）
以下の実施例は、実施され、評価される本出願で特許請求される化合物、組成物、物品、デバイスおよび／または方法の完全な開示および詳細を当業者に提供するために記載され、純粋に例示的であることを意図され、開示を限定することを意図されない。数（例えば、量、温度など）に関する正確さを確実にするための試みがなされているが、しかし、いくらかの誤差および偏差が考慮されるべきである。他に示されない限り。部は重量部であり、温度は℃であるかまたは室温であり、圧力は、大気圧かまたは大気圧付近である。
【０３５３】
（１．実施例１−活性化／ドミナントネガティブ形質転換遺伝子対を用いるヒト肝細胞株の同定）
活性化およびドミナントネガティブ形質転換遺伝子の配列発現を用いるヒトＥＧ細胞から出発するヒト肝細胞株の同定を、以下のように実施し得る。ヒトＥＧ細胞を、活性化Ｈ−ＲＡＳ遺伝子（配列番号２）由来のヒトＢ型肝炎ウイルスコアプロモーター／エンハンサー（配列番号１）を含み、また必要に応じて、ドミナントネガティブＨ−ＲＡＳ遺伝子（配列番号４）由来のエクジソン誘発遺伝子スイッチプロモーター（配列番号３）を含む構築物でトランスフェクションし得る（Ｓａｎｄｉｇら（１９９６）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３，１００２−１００９；Ｓａｅｚら、（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７，１４５１２−１４５１７）。活性化Ｈ−ＲＡＳは、ＥＧ細胞の分化後に転写され得る。形質転換された肝細胞は、軟寒天中で単離され得、クローニング、増殖および凍結され得る。培養物を低密度でプレートし得、次いで、ポナステロンＡで処理して、ドミナントネガティブＲＡＳおよび逆形質転換を誘導させ得る。これらの肝細胞との同一性は、アルブミン、ｃｙｐ１Ａおよびｃｙｐ３Ａの生成によって確認され得る。
【０３５４】
この形質転換は、ｐＨＢＶ−ａＲＡＳおよびＡＣＴＥＧ１細胞を用いて実施されて、胚様体から同定され得る肝細胞株を生成し得る。
【０３５５】
（ａ）方法）
（（１）プラスミド）
プラスミドを図２に示し、ｐＬＳ−ＲＡＳは、活性化Ｈ−Ｒａｓの転写を駆動するＢ型肝炎ウイルスおよびドミナントネガティブＨ−Ｒａｓを駆動するエクジソン誘発プロモーター由来のプロモーターエンハンサーを含む。Ｒａｓ含有プラスミドは、Ｕｐｓｔａｔｅ，Ｉｎｃから得られ得る。活性化ＲａｓおよびドミナントネガティブＲａｓプラスミドの両方は、ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩで消化されて、ＣＭＶプロモーターエンハンサーを除去され得る。ヒトＢ型肝炎ウイルスにおけるヌクレオチド１６１０〜１８１０に対応する配列は、ｐＥｃｏ６３（ＡＴＣＣ）からＰＣＲ増幅によって単離され得る。このセグメントは、ＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩ断片、活性化Ｒａｓ含有プラスミド中にライゲーションされて、ｐＨＢＶ−Ｒａｓを作製し得る（図２）。ｐＥＧＳＨ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社のライセンス下）のエクジソン誘発プロモーターに対応する配列（構築物の一部に所望される場合）は、ＰＣＲ増幅によって得られ、ＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩ断片、ドミナントネガティブＲａｓ含有プラスミド中にライゲーションされて、ｐＥｃｄｙｓ−Ｒａｓを作製し得る（図２）。
【０３５６】
エクジソン誘発プロモーター、ドミナントネガティブＲａｓおよびポリＡ付加部位を含む配列は、ＰＣＲによってｐＥｃｄｙｓ−Ｒａｓから増幅され得る。プラスミドｐＬＳ−Ｒａｓは、ＳｓｐＩ消化によってアンピシリン耐性遺伝子とＨＢＶプロモーター／エンハンサーとの間に直線化されたｐＨＢＶ−Ｒａｓ中にＰＣＲ増幅産物を平滑末端ライゲーションすることによって構築され得る。
【０３５７】
（（２）細胞培養）
ヒトＥＧ細胞株ＡＣＴＥＧ１を、他のＥＧ細胞株について記載したように、グルタミン、メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、フォルスコリンまたはＬＩＦ、塩基性線維芽細胞成長因子および白血病抑制因子を補充したノックアウトＤＭＥＭ、１５％ノックアウト血清代替物（両方Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）においてマウスＳＴＯ支持細胞層上で培養し得る（米国特許第５，６９０，９２６号；同第５，６７０，３７２号および同第５，４５３，３５７号、ｄｅ  ＭｉｇｕｅｌおよびＤｏｎｏｖａｎ，（２００２）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３６５，３５３−３６３）。ＥＧ細胞株由来の特定の細胞株の単離は、エレクトロポレーションによって、ｐＨＢＶ−ａＲＡＳをＡＣＴＥＧ１（多能性幹細胞であるヒト生殖隆起由来幹細胞）中にトランスフェクションすることによって達成され得る。コローを、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）プレート上でＧ４１８耐性のために選択し得る。ＡＣＴＥＧ−ＲＡＳを、さらなる研究のために選択する。
【０３５８】
分化を誘導するために、細胞を、マトリゲルでコーティングされたプレートから取り除き得、凝集体を、懸滴培養によって形成させ得る。２日後、胚様体を回収して、細胞培養のためにコーティングされていないペトリ皿に再プレートし得る。２日ごとに培養物に再び栄養物を供給し得る。１２日目に、ＥＢを回収し、５％規定のウシ血清を含むＡｍｐｈｉｏｘｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｍｅｄ３を含む軟寒天中で懸濁し得る。１週間以内に、コロニーを寒天中で可視化し得る。コロニーをつまみ取り、Ｍｅｄ３、５％血清中に分散させ、２４ウェルプレート中にプレートし得る。形質転換したコロニーは、ほとんど胚様体由来の形状であり得る。これらのコロニーは、肝臓分化のマーカー（例えば、アルブミン、ｃｙｐ１Ａおよびｃｙｐ３）としてポジティブであり得る。
【０３５９】
コンフルエントな培養物由来の培地を、ヒトアルブミン産生のためにアッセイし得る。細胞を、トリプシン処理して、血球測定器を用いてカウントし得る。次いで、細胞を、十分な細胞培養培地で懸濁し得、その結果、懸濁液中の細胞密度は、１ミリリットルあたり約３個の細胞になり得る。次いで、この懸濁液を、１ウェルあたり２００μｌを用いて９６ウェルプレートのウェルにアリコートし得る。得られた培養物は、１ウェルあたり１個未満の細胞を有する。この様式において、出現するコロニーは、単一細胞から生じることが公知である。次いで、このクローン集団は、確実に均一の遺伝的背景を有するようにされる。
【０３６０】
この同様のクローニング工程は、混合された集団からの特定の細胞型の細胞を単離するために使用され得る。軟寒天中で生じるコロニーが混合された系統である場合、上記のように細胞をクローニングすることは、その細胞を個々の均一な集団に分ける。次いで、これらのクローンを、任意の種々の機構によって目的の細胞型について試験し得る。通常の方法は、培養上清における公知の選択されたタンパク質を測定することである。例えば、アルブミンは、肝細胞コロニーをアッセイするために測定される。特定の細胞型を同定するための他の方法は、その細胞型によって生成されるタンパク質に特異的な抗体で染色する、形態学の視覚検査、またはその細胞型によって生成される特定のＲＮＡの測定である。
【０３６１】
（（３）遺伝子スイッチコンピテント株の生成）
遺伝子スイッチコンピテント株を生成するために、ＡＣＴＥＧ１細胞を、ｐＥＲＶ３で（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐ）でトランスフェクションして、エレクトロポレーションを用いてエクジソンレセプターを挿入し得る。プラスミドｐＥＲＶ３（またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のｐＶｇＲＸＲ）は、エクジソン感受性プロモーターの発現のために必要なハイブリッドエクジソンレセプターをコードする。コロニーを、マトリゲルでコーティングされたプレート上でハイグロマイシン耐性のために選択する。ＡＣＴＥＧ１−Ｈｙｇ１を、さらなる研究のために選択し得る。ｐＶｇＲＸＲを用いる場合、コロニーを、マトリゲルでコーティングされたプレート上でゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）耐性のために選択し得る。ＡＣＴＥＧ１−Ｚｅｏ１を、さらなる研究のために選択し得る。形質転換遺伝子のシャットオフ後、細胞株のアポトーシスに取り組み得る（Ｈｉｌｇｅｒ，ＲＡら、（２００２）Ｏｎｋｏｌｏｇｉｅ２５，５１１−５１８）。生成されるドミナントネガティブの量は、異なる濃度のホルモンを用いて調節または滴定され得るために、エクジソンプロモーター系は、アポトーシスを阻止し得る。
【０３６２】
ｐＥＲＶ３を使用する場合、ＡＣＴＥＧ１−Ｈｙｇ１は、エレクトロポレーションを用いてｐＬＳ−Ｒａｓでトランスフェクションされ得る。Ｇ４１８に対するコロニー耐性を、選択して増殖させ得る。ＡＣＴＥＧ１−ＨｙｇＮｅｏを、選択し得る。ｐＶｇＲＸＲを使用する場合、ＡＣＴＥＧ１−Ｚｅｏ１は、エレクトロポレーションを用いてｐＬＳ−Ｒａｓでトランスフェクションされ得る。Ｇ４１８に対するコロニー耐性を、選択して増殖させ得る。ＡＣＴＥＧ１−ＺｅｏＮｅｏ（ＡＺＮ）を、選択し得る。
【０３６３】
分化を誘導するために、細胞を、マトリゲルでコーティングされたプレートから取り除いて、凝集体を、懸滴培養によって形成させ得る。２日後、胚様体を回収して、細胞培養のためにコーティングされていないペトリ皿に再プレートし得る。培養物に、２日ごとに再び栄養物を供給し得る。１２日目に、ＥＢを回収して、５％規定のウシ血清を含むＡｍｐｈｉｏｘｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｍｅｄ３を含む軟寒天で再懸濁し得る。１週間以内に、コロニーを寒天中で可視化し得る。コロニーをつまみ取り、Ｍｅｄ３、５％血清中に分散させ、２４ウェルプレート中にプレートし得る。
【０３６４】
コンフルエントな培養物由来の培地を、ヒトアルブミン産生のためにアッセイし得る。コロニーはポジティブであるはずである。いくつかの培養物を選択して、９６ウェルプレート中で限界希釈によってクローニングし得る。細胞株ＡＣＴＨｅｐ１からＡＣＴＨｅｐ６を、７５ｃｍ２プレート中でコンフルエンスまで増殖させ得、トリプシン処理して、制御速度フリーザー中で凍結し得、次いで、液体窒素の気相中に保存し得る。
【０３６５】
ＡＣＴＨｅｐ１−６をさらに特徴付け得る。個々のウイルスを解凍して、上記のようにＭｅｄ３、５％血清中にプレートし得る。細胞を増殖させ得、次いで、９６ウェルプレート中に１ウェルにつき１０，０００細胞の密度でプレートする。一晩のインキュベーション後、培地を、１０μＭポナステロンＡを加えたＭｅｄ３、５％血清に変更し得る。細胞は、次の２４時間にわたって増殖を停止し、ほとんどコンフルエントな密度で停止するはずである。突出した核を有する立方体形状の肝細胞を有する細胞を選択する。それらの肝細胞との同一性は、アルブミン産生、エトキシレゾルフィンからレゾルフィンの代謝（ｃｙｐ１Ａ活性）、およびテストスタロン由来の６βヒドロキシテストステロン（ｃｙｐ３Ａ活性）によって確認され得る（Ｋｅｌｌｙ，ＪＨ，Ｓｕｓｓｍａｎ，ＮＬ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒ．５，２４９−２５３）。
【０３６６】
（２．実施例２−元に戻すためにＣＲＥ／ｌｏｘ組換えを用いるヒト肝細胞株の同定）
活性化された形質転換遺伝子の組織特異的発現の同定に続いて、Ｃｒｅリコンビナーゼ切断を引き起こし得る。ヒト性腺由来幹細胞は、ｌｏｘＰ部位に隣接する活性化Ｈ−ＲＡＳ遺伝子を駆動するヒトＢ型肝炎プロモーター／エンハンサーを含む構築物でトランスフェクションされ得る。肝細胞系統の細胞株は、上記のように単離され得る。細胞は、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するプラスミドでトランスフェクションされて、活性化された癌遺伝子を切断し得る。Ｃｒｅ−リコンビナーゼ処理された細胞は、分裂を停止し、分化した肝細胞のマーカー（例えば、アルブミン産生、ｃｙｐ１およびｃｙｐ３発現）を発現するはずである。
【０３６７】
（ａ）方法）
（（１）プラスミド）
上記の肝細胞特異的選択プラスミド、ｐＨＢＶ−ａＲａｓは、合成ｌｏｘＰオリゴマー（配列番号５および配列番号６）の挿入によって、ｐｌｏｘＨＢＶ−ａＲａｓの構築のために使用され得る。ＳｓｐＩは、アンピシリン耐性遺伝子とＨＢＶプロモーター／エンハンサーとの間にｐＨＢＶ−ａＲａｓを直線化するために使用され得る。オリゴマー５’ＡＴＴ  ＡＴＡ  ＡＣＴ  ＴＣＧ  ＴＡＴ  ＡＡＴ  ＧＴＡ  ＴＧＣ  ＴＡＴ  ＡＣＧ  ＡＡＧ  ＴＴＡ  Ｔ３’（配列番号５）は、５’側のＳｓｐ１部位を再構成するためにライゲーションされ得る。次いで、このプラスミドは、ＢｂｓＩで直線化され得、オリゴマー５’ＡＴＡ  ＡＣＴ  ＴＣＧ  ＴＡＴ  ＡＡＴ  ＧＴＡ  ＴＧＣ  ＴＡＴ  ＡＣＧ  ＡＡＧ  ＴＴＡ  ＴＧＡ  ＡＧＡ  Ｃ３’（配列番号６）は、３’側のＢｂｓＩ部位を再構成するためにライゲーションされ得る。得られたプラスミド、ｐｌｏｘＨＢＶ−ａＲａｓを図４に示す。
【０３６８】
（２）細胞培養
ヒトＥＧ細胞株ＡＣＴＥＧ−１を、上記のように培養した。プラスミドｐｌｏｘＨＢＶ−ａＲａｓは、エレクトロポレーションを用いてＡＣＴＥＧ−１中にトランスフェクションされ得、コロニーを、Ｇ４１８耐性を用いて選択する。
【０３６９】
肝細胞コロニーは、軟寒天中で分化および選択された後、上記のように単離され得る。細胞株Ｈｅｐｌｏｘ１からＨｅｐｌｏｘ６を、増殖させて、凍結し得る。
【０３７０】
Ｈｅｐｌｏｘ１を、増殖させ得る。細胞を、Ｍｅｄ３，５％の規定されたウシ血清において１０，０００細胞／ｃｍ２の密度でプレートし得る。ＣＭＶプロモーターの制御下で、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＢＳ１８５は、エレクトロポレーションによってＨｅｐｌｏｘ１中に導入され得る。２日間にわたって、大部分の細胞は、分裂を停止するはずである。培養物を、上記のように、アルブミン産生、ｃｙｐ１Ａおよびｃｙｐ３Ａ活性のためにアッセイする。
【０３７１】
ｐｌｏｘＨＢＶ−ａＲａｓの切断は、１００％効果的でありそうもない。培養時間とともに、形質転換プラスミドを切断されていないコロニーが出現するはずである。他のストラテジー（例えば、ガンシクロビルにおける二次選択）が、切断された細胞の１００％の選択を得るために使用され得る。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子は、ヒト細胞上のガンシクロビルに対する感受性を与える。ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を、元の選択プラスミドにおいてインキュベートし、次いで、プラスミドを保持する細胞は、ガンシクロビルの存在下で死ぬ。次いで、ＣＲＥリコンビナーゼを用いて形質転換を逆にすることによって、ガンシクロビル中で培養し、ｐｌｏｘＨＢＶ−ａＲＡＳを欠失された細胞のみが、生存する。形質転換は可逆性である。試験される特徴は、ほとんどコンフルエントな密度での細胞の停止、肝臓特異的特性の発現の増幅であり得る。ＰＣＮＡおよびＢｒｄＵ染色；アルブミンＥＬＩＳＡ、エトキシレゾルフィン代謝、ジベンジルフルオレセイン代謝による細胞分裂の測定を行い得る。
【０３７２】
（３．実施例３−温度感受性形質転換遺伝子を用いるヒト肝細胞株の同定）
組織特異的プロモーターおよび温度感受性形質転換遺伝子の発現を用いるヒト肝細胞株の同定を、実施し得る。ヒト生殖腺由来多能性幹細胞は、温度感受性の活性化ＲＡＳ遺伝子（配列番号７）由来のヒトＢ型肝炎ウイルスプロモーターを含むプラスミドでトランスフェクションされ得る（ＤｅＣｌｕｅら、（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１，３１３２−３１３８）。３７℃で１２日間の胚様体の分化後、コロニーを、軟寒天中に分散させて、３２℃でインキュベートし得る。肝細胞系統の細胞を、上記のように単離し得る。これらの細胞の培養物を、再びプレートして、３９℃に移す場合、これらは、分裂して、ヒト肝細胞のマーカー（例えば、アルブミン、ｃｙｐ１Ａおよびｃｙｐ３Ａ）を発現する。
【０３７３】
（ａ）方法）
（（１）プラスミド）
ａＲＡＳのセリン３９を、オリゴヌクレオチド直接変異誘発（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）によってＣｙｓ３９に変異させ得る。活性化ＲＡＳは、ＥｃｏＲＩによってｐＨＢＶ−ａＲＡＳから切断され得、選択可能プラスミドｐＡＬＴＥＲ１中にサブクローニングされ得る。オリゴヌクレオチド５’−ＧＡＡＴＡＣＧＡＣＣＣＣＡＣＴＡＴＡＧＡＧＧＡＴＴＧＣＴＡＣＣＧＧＡＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＣＡＴＴＧＡＴ−３’を使用して、セリン３９をシステイン３９（配列番号８）に変化させ得る。適切なプラスミドを、抗生物質選択によって取り出し、正確さを確実にするために挿入物全体を配列決定する。変異されたａＲＡＳ（ここではｔｓａＲＡＳと呼ぶ）を、ＥｃｏＲ１を用いてｐＡＬＴＥＲプラスミドから切断して、ＥｃｏＲ１切断されたｐＨＢＶ−ａＲＡＳに挿入して、ｐＨＢＶ−ｔｓａＲＡＳを得る。
【０３７４】
（（２）細胞培養）
ヒト生殖隆起由来多能性幹細胞株ＡＣＴＥＧ−１を、上記のように培養し得る。プラスミドｐＨＢＶ−ｔｓａＲＡＳは、エレクトロポレーションを用いてトランスフェクションされ得、Ｇ４１８耐性コロニーを選択し得る。上記のような分化後、軟寒天プレートを、形質転換されたヒト肝細胞株を単離するために３２℃でインキュベートし得る。ＡＣＴｔｓＨｅｐ１〜６を単離し、クローニングして凍結し得る。ＡＣＴｔｓＨｅｐ１をさらなる特徴付けのために選択し得る。３２℃で培養された細胞を、トリプシン処理して１０，０００細胞／ｃｍ２でプレートし得、次いで、３９℃でインキュベートし得る。細胞は、２日以内に分裂を停止し、ほとんどコンフルエントな密度で停止し、ヒト肝細胞のマーカー（例えば、アルブミン、ｃｙｐ１Ａおよびｃｙｐ３Ａ）を発現する。
【０３７５】
複数の細胞型を、可逆的形質転換遺伝子の組織特異的発現を用いて選択し得る。ＲＡＳまたはいくつかの他の形質転換遺伝子を用いる数個の他の細胞型の単離を、達成し得る。単離された細胞の分析は、選択下での細胞型のマーカーの発現の特徴の分析を含み得る。
【０３７６】
（４．実施例４−肝臓補助デバイスの基礎を形成するための中空繊維バイオリアクターにおける本明細書中に開示される肝細胞株のうちの１つの培養）
（ａ）方法）
ＡＣＴＨｅｐ１およびＡＣＴｔｓＨｅｐ１を、Ａｍｐｈｉｏｘｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓヒト肝細胞株ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａの培養について記載されるように、本質的に中空繊維バイオリアクター中で培養し得る（Ｓｕｓｓｍａｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １６，６０−６５，１９９２）。簡単にいうと、細胞を、血清含有培地を用いてローラーボトル中で培養する。各々、約１ｇの細胞を含む２つのボトルの細胞を、トリプシン処理して、５０ｍｌの培地に懸濁して、中空繊維カートリッジのカプセル外側に播種する。播種後、これらのカートリッジを、培養空間を満たすために増殖させている間、約２週間、無血清のインスリン含有培地中で培養する。グルコース消費およびアルブミン産生を、毎日モニタリングすると、１日あたり約１２ｇのグルコース消費および１ｇのヒトアルブミンで最高になる（Ｋｅｌｌｙ，（１９９７）ＩＶＤ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３，３０−３７）。
【０３７７】
これらのデバイスにおいてＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａを用いて、それらの肝臓特異的生化学を複製する能力を、広範に特徴付けした。ＡＣＴＨｅｐ１およびＡＣＴｔｓＨｅｐ１の細胞株で満たされるデバイス上で類似の分析を、実施し得る。これらの研究は、基本原理（例えば、増殖曲線および培地消費速度）を用いて始める。それらが、腫瘍由来株とどのように類似しているかを決定する。例えば、ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａは、本質的に永久にこれらのデバイス中に維持され得る。腫瘍由来の株に関して、細胞死が新細胞に置き換えられる構築された特定の安定状態が存在することは明白である。安定状態を達成するために必要とされるＡＣＴＨｅｐ１細胞の量は、逆転後、デバイスにおいて細胞が形質転換されず、無制限に分裂しないため、添加され得る。これらのデバイスの、ピルビン酸およびラクトースからグルコースを合成するため、そして血清タンパク質（例えば、アルブミン、トランスフェリンおよび因子ＩＸ）を生成するための、尿素産生によってアンモニアを代謝する能力、薬物（例えば、リボカイン、カフェインおよびミダゾラム）を代謝する能力を、決定し得る。
【０３７８】
（５．毒性試験において使用するための複数の組織型を含む適合した株のパネルの生成）
（ａ）方法）
上記のように構築したプラスミドは、新細胞株の選択のための基礎となり得る。組織特異的プロモーター／エンハンサーを、適切な組織のために選択し得、次いで、ＨＢＶ配列の部位においてプラスミドに挿入し得る。提示され得る組織としては、例えば、肝臓、腎臓、心臓、脳、筋肉および腸が挙げられ得る。複数の細胞型（例えば、脳）が関与する場合、数種類の株（例えば、ニューロン、希突起膠細胞など）が、選択される。例えば、これらの細胞株の各々は、同じ多能性細胞株（例えば、上記のようなヒトＥＧ細胞株ＡＣＴＥＧ１）などから生成される。従って、細胞のパネルは、複数の利点を提供する同じ遺伝子型を有し得る。
【０３７９】
（６．実施例６−インビトロでの免疫系（ＩＶＩＳ）の生成）
モノクローナル抗体（ＭＡＢ）技術は、２５年以上も前にＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって開発された（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ２５６，４９５−４９７）。それにも関わらず、治療用途において、まだ比較的少数のＭＡＢしか存在しない。主の問題は、マウスモノクローナル抗体が、異質として認識されることであり、治療として短期間の有用性である。現在、市場に出ているＭＡＢは、マウスの抗体をヒト抗体に見出されるアミノ酸に置換する抗体遺伝子への変異体の導入によって「ヒト化」されている。
【０３８０】
完全なヒトモノクローナル抗体の産生は、数種類の問題によって妨げられている。マウスモノクローナル抗体は、抗原をマウスに注射することによって生成され、次いで、不死化のためにマウス骨髄腫と融合するために、数日間後にその脾臓を取り除く。ヒトへの抗原の注射は、一般に、実現可能ではなく、試みられている少数の例において失敗している。さらに、現在の技術は、ヒトの脾臓を取り除くことができず、末梢血細胞を使用する必要がある。最後に、適切なヒト骨髄腫は、単離することが非常に困難である。
【０３８１】
ＩＶＩＳは、完全なヒト抗体産生系を試験チューブに移動させることによって、これらの問題を回避する。本明細書中に議論されるような幹細胞（例えば、多能性胚幹細胞またはＥＧ細胞、適合したＴ細胞、Ｂ細胞およびマクロファージ株）を出発とすることが、開発されている。Ｂ細胞およびＴ細胞は、抗原で刺激される分化の適切な段階で選択され得る。３つの細胞株が、同じ親株から開発されているので、それらは、遺伝的背景が同じであり、ヒト独自の免疫系と正確に類似している。細胞は、複合体、Ｂ細胞増殖および抗体合成を刺激する共同の様式において互いを認識し得、挙動し得る。単離手順は、条件的にＢ細胞を不死化するため、抗体産生細胞は単離され得、次いで、実験スケールから産生スケールまで任意の必要な量で増殖させられ得る。
【０３８２】
（ａ）方法）
（（１）プラスミド）
必要なプラスミドの各々を、活性化ｒａｓおよびドミナントネガティブｒａｓを含むｐＬＳ−ＲＡＳから構築し得る。Ｂ細胞を選択するために、ｐＢ−ＲＡＳを、ＢａｍＨ１を用いてＨＢＶプロモーター／エンハンサーを切断することによって構築し得る。ヒト免疫グロブリン重鎖プロモーターを、その部位にライゲーションして、ｐＢ−ＲＡＳを形成させ得る。類似の構築物を、Ｔ細胞（ｐＴ−ＲＡＳ）を選択するためにｐｒｅＴ細胞プロモーター、およびマクロファージを選択するためにヒトＣＨＩ  ３Ｌ１遺伝子プロモーターを用いて作製し得る。Ｂ、Ｔおよびマクロファージ株の分化に関連するために必要とされる骨髄間質細胞株が、骨髄間質細胞抗原１（ＢＳＴ１）遺伝子由来のプロモーターを用いて選択され得る。
【０３８３】
（（２）骨髄間質細胞の選択）
ＢＳＴ１プロモーターを、Ｂａｍ／ＢｇｌＩＩ断片ｐＬＳ−ＲＡＳにライゲーションして、ｐＢＳＴ−ＲＡＳを作製し得る。これは、ＡＣＴＥＧ−１中にトランスフェクションされ得、分化がＥＢ形成によって誘発され得る。得られる骨髄間質細胞株、ＡＣＴ−ＢＭＳＴ１は、ＥＢ形成の５日後に生じる。
【０３８４】
（（３）Ｂ細胞選択）
Ｂ細胞は、ＡＣＴＥＧ−１から発生され得る。プラスミドｐＢ−ＲＡＳは、上記の幹細胞中にトランスフェクションされ得る。トランスフェクションされた幹細胞株由来のＢ細胞分化は、記載されるように開始され得る（Ｃｈｏ，ＳＫ，Ｚｕｎｉｇａ−Ｐｆｌｕｃｋｅｒ，ＪＣ  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３６５，１５８−１６９，２００３）。ヒトＡＣＴ−ＢＭＳＴ１は、マウスＯＰ９間質株と置き換えられ得る。ヒトＩｇ重鎖プロモーターを、発生の任意の段階でＢ細胞のために選択し得る。数個の株を、適切な発生段階でＢ細胞を生成するためにＩｇ軽鎖生成について特徴付けする。
【０３８５】
（（４）Ｔ細胞選択）
Ｔ細胞は、ｐｒｅＴ細胞レセプターのプロモーターを含むプラスミドのトランスフェクションによってＡＣＴＥＧ−１から発生され得る。この幹細胞株の単離後、Ｔ細胞の分化を、記載されるように実施し得る（Ｓｃｈｍｉｔｔら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５，４１０−４１７，２００４）。ＡＣＴ−ＢＭＳＴ１は、マウスＯＰ９間質株と置き換えられ得る。成熟Ｔ細胞を、ＣＤ４およびＣＤ８抗原の発現によって特徴付けし得る。
【０３８６】
（（５）マクロファージ選択）
ヒトマクロファージ株は、ＣＨＩ３Ｌ１遺伝子駆動ラットについてのプロモーターを含むプラスミドのトランスフェクションによってＡＣＴＥＧ−１から発生され得る。マクロファージコロニーは、６日目の胚様体において豊富にある（ＫｅｎｎｅｄｙおよびＫｅｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３６５，３９−５９，２００３）。
【０３８７】
（（６）インビトロでの免疫系）
個々の株の各々をクローニングし、特徴付けし、凍結し得る。不死化および適合したＢ、Ｔおよびマクロファージ株を、２４ウェルプレートにおいて適合したＡＣＴ−ＢＭＳＴ１株で培養し得る。抗原を、２週間、３日ごとに新鮮な細胞培養培地とともに添加し得る。その時に、２週間より長い間、上清を、酵素結合免疫アッセイによって抗原特異的抗体の存在のためにアッセイした。抗体が検出された後、ウェル中の個々の細胞を希釈してクローニングし得る。いったん、構築すると、各Ｂ細胞のクローンからの抗体産生は、継続し得る。適切な抗原を発現するクローンを、さらなる特徴付けまたは生成のために凍結し得る。
【０３８８】
（実施例７−ヒト胚性生殖細胞株Ｈａｙ１の確立）
Ｍａｔｓｕｉら（（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７０，８４１−８４７）に定義される技術を使用して、ヒトＥＧ株が確立される。簡潔に述べると、１０週齢の雄性マウス胎仔から生殖隆起が解体され、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて分解されて、照射したＳＴＯフィーダー層上にプレートした。非必須アミノ酸および□−メルカプトエタノール、６０ｎｇ／ｍｌ  ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、１０ｎｇ／ｍｌ  ヒト白血病阻害因子（ＬＩＦ）および１０ｎｇ／ｍｌ  ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を補充したＤＭＥＭ（１５％ウシ胎仔血清）を、毎日細胞に供給した。５日目において、２つのフラスコのうちの１つをアルカリホスファターゼについて染色した。多くのポジティブ細胞を観察した。６日目にトリプシン−ＥＤＴＡを用いて細胞を継代して、新鮮に照射したＳＴＯ層上に１対４に分けた。各々の継代におけるアルカリホスファターゼに従って、このプロセスを繰り返した。５回目の継代において、速度制御式フリーザーを使用して、ＤＭＥＭ、１５％ウシ胎仔血清、１０％ジメチルスルホキシド中で細胞のいくつかのバイアルを凍結した。ここで、マイトマイシンＣ処理したＳＴＯ層上で細胞を日常的に継代した。
【０３８９】
（ａ  Ｈａｙ１の特徴）
Ｈａｙ１細胞は、フィーダー細胞上およびプラスチック上の両方とも、下記のように、細長い細胞として増殖し、遊走性の生殖細胞に似ている（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５，１３７２６−１３７３１；Ｔｕｒｎｐｅｎｎｙら（２００３）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２１，５９８−６０９）。Ｈａｙ１はＴｕｒｎｐｅｎｎｙらにより記載される細胞と形態上同一であることを示す。アルカリホスファターゼに加え、細胞は、ＳＳＥＡ−１、ＴＲＡ１−６０およびＴＲＡ１−８０についてポジティブに染まる。ＳＳＥＡ−１を発現することはヒトＥＧ細胞の特徴であり、ヒトＥＳ細胞とは異なる。核型の決定および多組織腫瘍形成は、進行中である。フィーダー物もホルモン補充も不在下で低接着性プラスチックに切り換える場合、これらの細胞は、嚢胞性の胚様体を容易に形成する。これらの胚様体を組織培養プラスチックに再プレートする場合、これらの細胞は、劇的に異なる形態を表して、アルカリホスファターゼの発現を消失する。
【０３９０】
（ｂ  規定条件におけるＨａｙ１の培養）
フィーダー層の使用は、種々の適用の対する幹細胞の使用を複雑にする。フィーダー層の使用は、標準的なインビトロでの毒性アッセイにおいてバックグラウンドを劇的に上昇させる（例えば、ＭＴＴまたはリザズリンの還元は、これらの結果を混乱させる）。Ｈａｙ１は、既定される条件下で日常的に増殖する。標準的な培養は、ＫＯ−ＤＭＥＭ、１５％  ＫＯ−血清代替物、グルタミン、非必須アミノ酸、β−ＭｅＳＨ、１０ｎｇ／ｍｌ  オンコスタチンＭ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦおよび２５ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦからなる。この培地を使用して、Ｈａｙ１は上記に列挙したマーカーを発現し続け、そしておよそ３〜４日毎に倍化する。このことは、フィーダー層上での倍化よりも僅かに遅い。
【０３９１】
（ｃ  Ｈａｙ１はＯｃｔ４およびＮａｎｏｇを発現する）
表面マーカーおよびアルカリホスファターゼは幹細胞についての便利なマーカーであるが、転写因子Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇの発現は幹細胞の基本的な特徴であることが明らかになっている（Ｒｏｄｄａら（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０，２４７３１−２４７３７；Ｃｈａｍｂｅｒｓら（２００３）Ｃｅｌｌ  １１３，６４３−６５５）。実時間ＲＴ−ＱＰＣＲを使用して、これらの因子の発現についてＨａｙ１を検査した。標準の規定条件下での細胞の発現を、ＥＢ形成、引き続くＭｅｄ３（ＫｅｌｌｙおよびＳｕｓｓｍａｎ，（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｍｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．５，２４９−５５４）（Ｗｅｙｍｏｕｔｈ’ｓ  ＭＡＢ、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２およびＷｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅの混合物である培地）中での培養を介して分化された細胞における発現と比較した。これはまた、５％に規定されるウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含む。アクチンを標準として使用した。これらの結果は、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇの両方がＨａｙ１において発現されること、および発現は分化の際に劇的に低下することを示す。
【０３９２】
（ｄ  Ｈａｙ１は増殖のためにｇｐ１３０シグナル伝達に依存する）
Ｈａｙ１の増殖を、幹細胞増殖およびその分化に影響を与えることが公知の種々の条件下で検査した。マウスＥＧ細胞およびヒトＥＧ細胞は、培地中での増殖のためにｇｐ１３０シグナル伝達の供給源を必要とする（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら（１９９８）；Ｋｏｓｈｉｍｕｚｕら（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２，１２３５−１２４２）。３つのペプチドホルモン因子（Ｏｎｃ  Ｍ、ＳＣＦ、ｂＦＧＦ）の各々を培地から個別に除去した場合、各々は増殖に対していくらかの作用を有する。しかしながら、オンコスタチンＭの除去は、培養物の増殖を完全に止め、そしてその培養物は数日以内にアルカリホスファターゼネガティブになった。
【０３９３】
（ｅ  ＦＧＦはＯｃｔ４およびＮａｎｏｇを誘導する）
培養物からのＦＧＦの除去は、培養物の増殖に対して僅かにネガティブな作用を有し、そして形態学的に影響し、これらの細胞は培養ディッシュ上でより平たくなってより大きく広がるようになった。ＦＧＦ除去後にＯｃｔ４およびＮａｎｏｇの発現について培養物を検査し、発現の劇的な低下を観察した。ＦＧＦの再添加はＯｃｔ４の発現を以前のレベルに戻した。Ｏｃｔ４はＮａｎｏｇの発現を制御する（Ｒｏｄｄａら（２００５））ので、Ｏｃｔ４の誘導はまたｎａｎｏｇを上昇させることを期待し、そしてこのことが観察されたものである。
【０３９４】
（ｆ  Ｚｅｏｃｉｎ感受性）
ｆｒｔ挿入株の確立のための調製において、ｚｅｏｃｉｎに対するＨａｙ１の感受性を試験した。標準的な滴定曲線は、７５μｇ／ｍｌが効果的な選択濃度であることを示した。
【０３９５】
（８．実施例８−心筋細胞の分化）
（ａ  ｆｒｔ挿入（ＦＩ）細胞株ＦＩ  Ｈａｙ１の作製）
プラスミドｐＦｒｔ／ｌａｃ／Ｚｅｏ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を使用してＨａｙ１にトランスフェクションし得る。４８時間後、７５μｇ／ｍｌ  Ｚｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）を含む培地に交換することにより、耐性細胞を選択し得る。非耐性細胞は、約７日以内に死亡する。約１×１０−５／μｇの効率が予想される。ｌａｃＺの発現についておよそ１０個の個別のトランスフェクタントを選択し得、そして試験し得る。プラスミドのコピー数は、サザンブロッティングによって評価され得る。単独の挿入物を有するトランスフェクタントをさらなる分析のために選択し得る。分化の間、挿入物の挙動を試験するため、細胞をＥＢ形成に供し得、続いてＭｅｄ３（５％に規定した仔ウシ血清）中での１週間の培養に供し得る。それら細胞をｌａｃＺ発現について再評価し得る。Ｚｅｏ選択を維持し得るので、生き残っている全ての細胞はｌａｃＺ発現を保持すると予想される。挿入物に対して選択圧を維持して周囲のＤＮＡの発現を確認することは一般戦略であり、多くの他の研究において首尾よく使用されている通りである（Ｚｗｅｉｇｅｒｄｔら、（２００１）Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ５，３９９−４１３；Ｌｉｕら（２００４）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．１３，６３６−６４５；Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒら、（２００３）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２１，２５７−２６５）。
【０３９６】
次いで、それらの挿入部位について１０個のクローンを評価し得る。理想的なクローンは、ゲノムのいくらか冗長であるかまたは非官能性の部分にＤＮＡを組み込んでいる。最終的にこれはある程度主観的な評価であり得るが、この部位は、分化したクローンの後の単離を妨げ得る機能性遺伝子中には組み込まれないことが重要である。細胞からＤＮＡを単離し得、そして挿入されたＤＮＡを、いくつかの周囲の配列と一緒に、プラスミドレスキューにより回収し得、そして配列決定し得る（Ｏｒｇａｎら（２００４）ＢＭＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５，４１）。組み込み部位を、ヒト配列データベースと比較することによって決定し得る。
【０３９７】
（ｂ  テトラサイクリンオペレーターｆｒｔ挿入細胞株ＴＯＦＩ  Ｈａｙ１の作製）
上記のように生成した細胞株に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用してｐｃＤＮＡ６／ＴＲ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をトランスフェクションし得、そしてブラストサイジン（ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）耐性について選択され得る。このプラスミドは、ＣＭＶプロモータ制御下でテトラサイクリンレプレッサーを発現する。複数のクローンを、上記のように選択圧の下で継続性の発現について評価し得る。上記のように、挿入部位を評価して、さらなる評価のための適切なクローンを選択し得る。
【０３９８】
ｆｒｔ挿入物のクローニングの効率は、ｐｃＤＮＡ５／Ｆｒｔ／ＴＯ／ＣＡＴ（キットと共に提供されるコントロールプラスミド）を使用して評価され得る。プラスミドｐｃＤＮＡ５／Ｆｒｔ／ＴＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）はｆｒｔ標的化プラスミドであり、後の選択研究において使用される。このプラスミドは、テトラサイクリンにより制御されるＣＭＶプロモータのすぐ３’側にクローニング部位を含む。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）がこのプラスミドに挿入されており、コントロールとして役立つ。プラスミドｐｃＤＮＡ／Ｆｒｔ／ＴＯ／ＣＡＴを、ｆｌｐリコンビナーゼを一過性に発現するためにｐＯＧ４４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と一緒にＴＯＦＩ  Ｈａｙ１株に同時トランスフェクションし得る。ｆｒｔ−ＣＡＴプラスミドは、ＴＯＦＩ  Ｈａｙ１におけるｆｒｔ挿入部位を標的化し、組換え、そして組み込ませる。挿入物は、それがＺｅｏ耐性遺伝子を破壊するが、ハイグロマイシン抵抗を保持するように配置される。首尾よく標的化されたクローンは、ハイグロマイシンおよびブラストサイジンに耐性であるが、Ｚｅｏ感受性である。
【０３９９】
ｆｒｔ媒介性組換えの効率を、１μｇのｐｃＤＮＡ／Ｆｒｔ／ＴＯ／ＣＡＴあたり得られるハイグロマイシン耐性でブラストサイジン耐性のクローンの数を検査することにより評価し得る。挿入されたＣＡＴ遺伝子の発現効率を、上記の分化プロトコルを使用して評価し得る。プロトコルの２つのバリエーションを実行し得、１つはその手順全体を通してテトラサイクリンが存在するものであり、１つは分化が起こった後にのみテトラサイクリンが添加されるものである。
【０４００】
（ｃ  セレクタープラスミドの構築）
セレクタープラスミドを、Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ製のＭｕｌｔｉｓｉｔｅ  Ｇａｔｅｗａｙ３フラグメントベクター構築システムを使用して構築し得る（Ｈａｒｔｌｅｙら（２０００）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１０，１７８８−１７９５）。このシステムは、部位特異的λインテグラーゼ配列およびタンパク質を使用して、クローニングして順序付けされた配列に組換える。活性化ｒａｓおよびドミナントネガティブｒａｓを、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから得た。λインテグラーゼ部位を組み込む特定のプライマーを使用して、ａ−ｒａｓ配列およびｄｎ−ｒａｓ配列を増幅し得る。次いで、これらの配列を、インテグラーゼシステムを使用するキットにおける特定のプラスミドにクローニングされる。
【０４０１】
ヒトα−ＭＨＣプロモーターの−４５４〜＋３２に広がる配列が示されており、高レベルの組織特異的発現を指向する（Ｙａｍａｕｃｈｉ−Ｔａｋｉｈａｒａら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，３５０４−３５０８；Ｓｕｃｈａｒｏｖら（２００４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌｏ．２４，８７０５−８７１５）。この配列を、インテグラーゼ部位と一緒に、Ｍｕｌｔｉｓｉｔｅ  Ｇａｔｅｗａｙキットの３番目のプラスミドにクローニングされ得る。次いで、これらの配列を、４番目のプラスミド中に組み換えて、遺伝子順序「ｄｎ−ｒａｓ−α−ＭＨＣプロモーター−ａ−ｒａｓ」を有するクローンを作製し得る。
【０４０２】
ｄｎ−ｒａｓからプロモーターを横切ってａ−ｒａｓ遺伝子の終わりまでに広がる配列を、ＰＣＲを介して増幅し得、ｐｃＤＮＡ５／Ｆｒｔ／ＴＯ中にトポイソメラーゼを使用してクローニングして、ＴＯＦＩ  Ｈａｙ１部位におけるｆｒｔ組換え部位中への挿入の準備ができているセレクタープラスミドを生成し得る。これは、心臓セレクタープラスミドと称される。
【０４０３】
（ｄ  心臓選択性幹細胞株の作製）
上記心臓セレクタープラスミドを、ｆｌｐリコンビナーゼを一過性に発現するｐＯＧ４４と一緒に、ＴＯＦＩ  Ｈａｙ１にトランスフェクションし得る。上記のように、ｆｒｔ部位中への遺伝子組換えは、ハイグロマイシン耐性遺伝子を挿入し、Ｚｅｏｃｉｎ耐性を破壊する。適切な組換え体は、ブラストサイジン耐性、ハイグロマイシン耐性かつＺｅｏ感受性である。クローンをブラストサイジン／ハイグロマイシンにおいて選択し得、次いでＺｅｏｃｉｎ感受性について試験する。プラスミドレスキューおよび配列決定を使用して、正しいＤＮＡ配列が構築されていることを確認し得る。ここで、この細胞は、遺伝子順序「ＣＭＶプロモーター−ＴＯ調節されるレプレッサー−ｄｎ−ｒａｓ−α−ＭＨＣプロモーター−ａ−ｒａｓ」の挿入物を有するはずである。細胞株は、Ｈａｙ１−ｃａｒｄｉｏと称され得る。
【０４０４】
（ｅ  心筋細胞の細胞株の同定およびクローニング）
Ｈａｙ１−ｃａｒｄｉｏにおいて、Ｍｅｄ３（５％の規定の仔ウシ血清＋ハイグロマイシン／ブラストサイジン）における胚様体の形成によって、分化を開始し得る。４日後、この胚様体を、接着のために組織培養プラスチックに戻し得、そして同じ培地を供給し得る。拍動性細胞のパッチが、およそ１４日後にこのように分化中のＨａｙ１に現れる。拍動性領域の出現の間、培養物を観察し得るが、心筋細胞のｒａｓトランスフェクタントは拍動をブロックすることを示されている（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２５，１９７−２１３）。セレクターを有さないＴＯＦＩ  Ｈａｙ１の対応する培養物を、心臓分化の開始の指標として並行して一緒に実行し得る。
【０４０５】
培養組織において心臓分化を検出する場合、細胞をトリプシン処理して、軟寒天（同じＭｅｄ３ベースの培地に作製される）中にプレートし得る。他のａ−ｒａｓ形質転換株を用いたコントロール実験は、コロニーが１週以内に確認可能であることを示す。コロニーを採取して、新鮮な培地中に分散させ、そして組織培養プレートに再プレートし得る。心筋細胞特異的マーカーの発現（例えば、正しいα−ＭＨＣおよびａ−ｒａｓの発現）について細胞を分析し得る。
【０４０６】
（ｆ  「正常な」心筋細胞への逆転）
１μｇ／ｍｌのテトラサイクリンの培地への添加は、テトラサイクリンレプレッサーを解除して、ｄｎ−ｒａｓの転写を活性化させる。調査実験を使用して、ｄｎ−ｒａｓの効果、および形質転換を逆転させるが細胞を殺すことも心機能を破壊することもないように培養物に添加するテトラサイクリンの適切な量を、決定し得る。適切な調節についての明瞭な指標は、培養物内での同調した拍動の開始である。
【０４０７】
【化９】
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【０４０８】
【化１０】
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【０４０９】
【化１１】
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【０４１０】
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【０４１１】
【化１３】
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【０４１２】
【化１４】
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【０４１３】
【化１５】
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【０４１４】
【化１６】
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【０４１５】
【化１７】
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【０４１６】
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【０４１７】
【化１９】
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【０４１８】
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【０４１９】
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【０４２０】
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【０４２１】
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【０４２４】
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【化７６】
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【化７７】
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【化７８】
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【０４８９】
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【０４９０】
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【０４９８】
【化１００】
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【０４９９】
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【０５００】
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【０５０４】
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【０５０５】
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【０５０６】
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【０５０７】
【化１０９】
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【０５０８】
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【０５０９】
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【０５１１】
【化１１３】
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【０５１２】
【化１１４】
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【０５１３】
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【０５１４】
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【０５１５】
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【０５１６】
【化１１８】
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【０５１７】
【化１１９】
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【０５１８】
【化１２０】
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【０５１９】
【化１２１】
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【０５２０】
【化１２２】
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【０５２１】
【化１２３】
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【０５２２】
【化１２４】
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【０５２３】
【化１２５】
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【０５２４】
【化１２６】
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【０５２５】
【化１２７】
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【０５２６】
【化１２８】
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【０５２７】
【化１２９】
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【０５２８】
【化１３０】
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【０５２９】
【化１３１】
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【０５３０】
【化１３２】
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【０５３１】
【化１３３】
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【図面の簡単な説明】
【０５３２】
添付の図面は、本明細書中に組み込まれてこの一部を構成し、いくつかの実施形態を例示し、そして説明と一緒に開示される組成物および方法を例示する。
【図１】図１は、トランスフォーミング遺伝子の活性化されたドミナントネガティブ対の連続的な発現を使用する、可逆的形質転換のためのカセットの例についての模式図を示す。この模式図では、カセットの一部が多能性幹細胞から分化細胞までの進行の間に活性化される、一時的な進行である。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｃは、ＡＣＴＥＧｌ（生殖堤由来の多能性幹細胞）から誘導された肝細胞の単離のために使用され得るプラスミドの例を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｃは、ＡＣＴＥＧｌ（生殖堤由来の多能性幹細胞）から誘導された肝細胞の単離のために使用され得るプラスミドの例を示す。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｃは、ＡＣＴＥＧｌ（生殖堤由来の多能性幹細胞）から誘導された肝細胞の単離のために使用され得るプラスミドの例を示す。
【図３】図３には、除去可能な活性化したオンコジーンを使用する、可逆的形質転換のためのカセットの例の模式図を示す。
【図４】図４は、ｐｌｏｘＨＢＶ−ａＲａｓ（図３のようなカセットの生成において使用され得るプラスミドの例）の構造を示す。
【図５】図５は、温度感受性のトランスフォーミング遺伝子を使用する可逆的形質転換のためのカセットの例の模式図を示す。
【図６】図６は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅにより示される、ｐＥＧＳＨプラスミドの模式図を示す。
【図７】図７は、開示された組織特異的な可逆的形質転換（ＴＳＲＴ）法の１形態の図を示す。
【図８】図８は、テトラサイクリン調節性のＣＭＶプロモータを使用してドミナントネガティブのｒａｓの発現を駆動し、そして組織特異的プロモータを使用してａ−ｒａｓの発現を駆動する、可逆的形質転換のためのカセットの１例の模式図を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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