(57)【要約】本発明は、野生型ヒトＦＧＦ−２１と比較して酵母において発現する場合、Ｏ型グリコシル化の能力が減少するヒト線維芽細胞成長因子２１の新規な突然変異タンパク質に関する。タンパク質及びそれらをコードする核酸種が開示される。また、本発明は、上記核酸配列の増殖及び上記突然変異タンパク質の産生のためのベクター及び宿主細胞を具体化する。２型糖尿病、肥満症、又は代謝性症候群を治療する方法もまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質又はその生物活性ペプチドであって、Ｓｅｒ１６７に対するＳｅｒ又はＴｈｒ以外のアミノ酸置換を含み、アミノ酸の番号付けは配列番号１に基づき、前記突然変異タンパク質は、酵母において発現する場合、野生型ヒトＦＧＦ−２１と比較してＯ型グリコシル化の能力が減少する突然変異タンパク質又はその生物活性ペプチド。
【請求項２】
前記突然変異タンパク質が、Ｓｅｒ１６７Ａｌａ、Ｓｅｒ１６７Ｇｌｕ、Ｓｅｒ１６７Ａｓｐ、Ｓｅｒ１６７Ａｓｎ、Ｓｅｒ１６７Ｇｌｎ、Ｓｅｒ１６７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１６７Ｖａｌ、Ｓｅｒ１６７Ｈｉｓ、Ｓｅｒ１６７Ｌｙｓ、及びＳｅｒ１６７Ｔｙｒからなる群から選択される請求項１に記載の突然変異タンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載の突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記核酸がＤＮＡである請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項７】
ポリペチドを産生する工程であって、請求項６に記載の宿主細胞から、前記ＤＮＡによってコードされる前記ポリペチドを発現することを含む工程。
【請求項８】
肥満症、２型糖尿病、インスリン抵抗性、インスリン過剰血症、グルコース不耐性、高血糖、又は代謝性症候群の１又は複数を呈する患者を治療するのに有用な医薬組成物であって、
（ａ）治療上有効量の請求項１に記載のＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質と、
（ｂ）薬理学的に許容できる担体と、を含む医薬組成物。
【請求項９】
肥満症、２型糖尿病、インスリン抵抗性、インスリン過剰血症、グルコース不耐性、高血糖、又は代謝性症候群の１又は複数を呈する患者を治療する方法であって、そのような治療を必要とする前記患者に、治療上有効量の請求項１に記載のＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質を投与することを含む方法。
【請求項１０】
ヒトＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質又はその生物活性ペプチドであって、アルギニン１９、チロシン２０、ロイシン２１、チロシン２２、スレオニン２３、アスパラギン酸２４、アスパラギン酸２５、アラニン２６、グルタミン２７、グルタミン２８、アラニン３１、ロイシン３３、イソロイシン３５、ロイシン３７、バリン４１、グリシン４２、グリシン４３、グルタミン酸５０、グルタミン５４、ロイシン５８、バリン６２、ロイシン６６、グリシン６７、リジン６９、アルギニン７２、フェニルアラニン７３、グルタミン７６、アルギニン７７、アスパラギン酸７９、グリシン８０、アラニン８１、ロイシン８２、グリシン８４、セリン８５、プロリン９０、アラニン９２、セリン９４、フェニルアラニン９５、ロイシン１００、アスパラギン酸１０２、チロシン１０４、チロシン１０７、セリン１０９、グルタミン酸１１０、プロリン１１５、ヒスチジン１１７、ロイシン１１８、プロリン１１９、アスパラギン１２１、リジン１２２、セリン１２３、プロリン１２４、ヒスチジン１２５、アルギニン１２６、アスパラギン酸１２７、アラニン１２９、プロリン１３０、グリシン１３２、アラニン１３４、アルギニン１３５、ロイシン１３７、プロリン１３８、又はロイシン１３９の２つ以上のアミノ酸に対するシステインの置換と共に、Ｓｅｒ１６７に対するＳｅｒ又はＴｈｒ以外のアミノ酸置換を含み、アミノ酸の番号付けは配列番号１に基づき、前記突然変異タンパク質は、酵母において発現する場合、野生型ヒトＦＧＦ−２１と比較してＯ型グリコシル化の能力が減少する突然変異タンパク質又はその生物活性ペプチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載の突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記核酸がＤＮＡである請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１５】
ポリペチドを産生する工程であって、請求項１４に記載の宿主細胞から、前記ＤＮＡによってコードされる前記ポリペチドを発現することを含む工程。
【請求項１６】
肥満症、２型糖尿病、インスリン抵抗性、インスリン過剰血症、グルコース不耐性、高血糖、又は代謝性症候群の１又は複数を呈する患者を治療するのに有用な医薬組成物であって、
（ａ）治療上有効量の請求項１０に記載のヒトＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質と、
（ｂ）薬理学的に許容できる担体と、を含む医薬組成物。
【請求項１７】
肥満症、２型糖尿病、インスリン抵抗性、インスリン過剰血症、グルコース不耐性、高血糖、又は代謝性症候群の１又は複数を呈する患者を治療する方法であって、そのような治療を必要とする前記患者に、治療上有効量の請求項１０に記載のヒトＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質を投与することを含む方法。
【請求項１８】
ヒトＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質又はその生物活性ペプチドであって、グリシン４２、グルタミン５４、アルギニン７７、アラニン８１、ロイシン８６、フェニルアラニン８８、リジン１２２、ヒスチジン１２５、アルギニン１２６、プロリン１３０、アルギニン１３１、ロイシン１３９、アラニン１４５、ロイシン１４６、イソロイシン１５２、アラニン１５４、グルタミン１５６、グリシン１６１、セリン１６３、グリシン１７０、又はセリン１７２の１又は複数のアミノ酸位置に対する荷電及び／又は極性かつ無電荷のアミノ酸置換と共に、Ｓｅｒ１６７に対するＳｅｒ又はＴｈｒ以外のアミノ酸置換を含み、アミノ酸の番号付けは配列番号１に基づき、前記突然変異タンパク質は、酵母において発現する場合、野生型ヒトＦＧＦ−２１と比較してＯ型グリコシル化の能力が減少する突然変異タンパク質又はその生物活性ペプチド。
【請求項１９】
請求項１８に記載の突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離されるポリヌクレオチド。
【請求項２０】
前記核酸がＤＮＡである請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項２０に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項２２】
請求項２１に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２３】
ポリペチドを産生する工程であって、請求項２２に記載の宿主細胞から、前記ＤＮＡによってコードされる前記ポリペチドを発現することを含む工程。
【請求項２４】
肥満症、２型糖尿病、インスリン抵抗性、インスリン過剰血症、グルコース不耐性、高血糖、又は代謝性症候群の１又は複数を呈する患者を治療するのに有用な医薬組成物であって、
（ａ）治療上有効量の請求項１８に記載のヒトＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質と、
（ｂ）薬理学的に許容できる担体と、を含む医薬組成物。
【請求項２５】
肥満症、２型糖尿病、インスリン抵抗性、インスリン過剰血症、グルコース不耐性、高血糖、又は代謝性症候群の１又は複数を呈する患者を治療する方法であって、そのような治療を必要とする前記患者に、治療上有効量の請求項１８に記載のＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質を投与することを含む方法。
【請求項２６】
前記突然変異タンパク質は、Ｎ末端から４個以下のアミノ酸が切断されている請求項１、１０、又は１８のいずれかに記載の突然変異タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母において発現する場合、Ｏ結合型グリコシル化が減少する線維芽細胞成長因子２１の新規な突然変異タンパク質の同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
線維芽細胞成長因子は、成長中の組織（Ｂａｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ，  ３：２３９−２４３，  １９９１）において広範に発現される大きなポリペプチドであり、血管形成、有糸分裂誘発、パターン形成、細胞分化、代謝調節、及び組織傷害の修復を含む複数の生理機能において重要な役割を果たす（ＭｃＫｅｅｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｇ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５９：１３５−１７６，  １９９８）その刊行物によれば、ＦＧＦファミリーは、現在、ＦＧＦ−１〜ＦＧＦ−２３の少なくとも２３メンバーからなる（Ｒｅｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．  ３１３：１３９−１５７  （２００３）。
【０００３】
線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ−２１）は、肝臓に選択的に発現することが報告されており（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１４９２：２０３−２０６，  （２０００）、国際公開第０１／３６６４０号パンフレット、及び国際公開第０１／１８１７２号パンフレット）、虚血性血管疾患、創傷治癒、並びに肺、気管支、又は肺胞細胞機能の損失及びその他多くの障害に関連した疾患の治療として記載されている。最近では、ＦＧＦ−２１は、インスリンの有無において、ある期間の治療（７２ｈ）後のマウス３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のグルコース摂取を刺激し、ｏｂ／ｏｂマウス並びにｄｂ／ｄｂマウス、及び８週齢のＺＤＦラットにおける摂食時の血糖値並びに空腹時血糖値、トリグリセリド、及びグルカゴンレベルを減少することが示され、従って、用量依存的な方法で糖尿病及び肥満症の治療法として、ＦＧＦ−２１の使用についての基礎をもたらす（国際公開第０３／０１１２１３号パンフレット）。
【０００４】
組換えＤＮＡ技術の開発は、外来性の生成物をコードする外因性のＤＮＡ配列が導入される宿主細胞において、ＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質などの外来性の生成物の産生を可能している。この技術の利点は、高収率、非常に精製された形、及び、低リスク的なウィルス汚染などの汚染において、生成物を産生することが可能であるという点である。これらの組換え技術は、原核生物細胞や真核宿主細胞において組換えタンパク質を産生するために広く使われている。
【０００５】
しかしながら、これらの技術による組換え生成物の大量産生は、これらの外因性のＤＮＡ配列の発現効率の問題や、ベクターの不安定性、及び、組み換え生成物が産生される宿主細胞による組換え生成物の細胞内分解によって、現在も制限される。更に、組み換え生成物は、対応する天然由来の生成物と異なる場合がある。例えば、非相同の真核宿主において産生される組み換え生成物は、通常、グリコシル化の程度が、対応する自然発生型の生成物と異なる。これは、あらゆる炭水化物構造の存在「対」不在、生成物における前記炭水化物構造の局在、更には、炭水化物の本質性の欠如に関連する。詳しくは、酵母由来の組み換え生成物が、対応する天然由来の生成物と比較して、不自然なＯ型グリカンを産生する場合があることを示している（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｓｔｅｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ａｎｄ  Ｍｏｌｅ．  Ｂｉｏｌ．  ３３（３）：１５１−２０８，  １９９８）。
【０００６】
本発明は、酵母において発現する場合、野生型ＦＧＦ−２１と比較してＯ型グリコシル化の程度が減少するＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質を提供することによって、酵母由来の組換え型タンパク質に関連する異常なＯ型グリコシル化の問題を解決する。出願人らは、Ｏ型グリコシル化の程度が減少するＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質が、工業発酵の状態で生成され、２型糖尿病、肥満症、及び代謝性症候群を含むがこれに限定されない障害のある被検者を治療するのに有用である生物活性を維持することができることを見出した。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第１の実施形態においては、本発明は、ヒトＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質又はその生物活性ペプチドであって、Ｓｅｒ１６７に対するＳｅｒ又はＴｈｒ以外のアミノ酸置換を含み、アミノ酸の番号付けは配列番号１に基づき、前記突然変異タンパク質は、酵母において発現する場合、野生型ヒトＦＧＦ−２１と比較してＯ型グリコシル化の能力が減少する突然変異タンパク質又はその生物活性ペプチドを提供する。
【０００８】
本発明の第２の実施形態は、ヒトＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質又はその生物活性ペプチドであって、アルギニン１９、チロシン２０、ロイシン２１、チロシン２２、スレオニン２３、アスパラギン酸２４、アスパラギン酸２５、アラニン２６、グルタミン２７、グルタミン２８、アラニン３１、ロイシン３３、イソロイシン３５、ロイシン３７、バリン４１、グリシン４２、グリシン４３、グルタミン酸５０、グルタミン５４、ロイシン５８、バリン６２、ロイシン６６、グリシン６７、リジン６９、アルギニン７２、フェニルアラニン７３、グルタミン７６、アルギニン７７、アスパラギン酸７９、グリシン８０、アラニン８１、ロイシン８２、グリシン８４、セリン８５、プロリン９０、アラニン９２、セリン９４、フェニルアラニン９５、ロイシン１００、アスパラギン酸１０２、チロシン１０４、チロシン１０７、セリン１０９、グルタミン酸１１０、プロリン１１５、ヒスチジン１１７、ロイシン１１８、プロリン１１９、アスパラギン１２１、リジン１２２、セリン１２３、プロリン１２４、ヒスチジン１２５、アルギニン１２６、アスパラギン酸１２７、アラニン１２９、プロリン１３０、グリシン１３２、アラニン１３４、アルギニン１３５、ロイシン１３７、プロリン１３８、又はロイシン１３９の２つ以上のアミノ酸に対するシステインの置換と共に、Ｓｅｒ１６７に対するＳｅｒ又はＴｈｒ以外のアミノ酸置換を含み、アミノ酸の番号付けは配列番号１に基づき、前記突然変異タンパク質は、酵母において発現する場合、野生型ヒトＦＧＦ−２１と比較してＯ型グリコシル化の能力が減少する突然変異タンパク質又はその生物活性ペプチドを提供する。
【０００９】
本発明の第３の実施形態は、ヒトＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質又はその生物活性ペプチドであって、１又は複数のアミノ酸に対して、グリシン４２、グルタミン５４、アルギニン７７、アラニン８１、ロイシン８６、フェニルアラニン８８、リジン１２２、ヒスチジン１２５、アルギニン１２６、プロリン１３０、アルギニン１３１、ロイシン１３９、アラニン１４５、ロイシン１４６、イソロイシン１５２、アラニン１５４、グルタミン１５６、グリシン１６１、セリン１６３、グリシン１７０、又はセリン１７２の１又は複数のアミノ酸に対する荷電及び／又は極性かつ無電荷のシステイン置換と共に、Ｓｅｒ１６７に対するＳｅｒ又はＴｈｒ以外のアミノ酸置換を含み、アミノ酸の番号付けは配列番号１に基づき、前記突然変異タンパク質は、酵母において発現する場合、野生型ヒトＦＧＦ−２１と比較してＯ型グリコシル化の能力が減少する突然変異タンパク質又はその生物活性ペプチドを提供する。
【００１０】
その他の実施形態は、第１、第２、及び第３の実施形態の突然変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、及び前記ベクターを有する宿主細胞を提供する。別の実施形態はポリペチドを生成するための工程であって、前記ポリペチドを生成する能力がある細胞を生成し、前記ポリペチドをコードするベクターを含むＤＮＡを生成する工程を提供する。
【００１１】
更に別の実施形態は、肥満症、２型糖尿病、インスリン耐性、高インスリン血症、グルコース不耐性、高血糖、又は代謝症候群からなる群からの徴候の１又は複数を示す患者を治療するための方法であって、治療上有効量の第１、第２、又は第３の実施形態のヒトＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質を、このような治療の必要がある患者に投与することを含む方法を導く。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本願明細書において開示及び主張される本発明の目的のために、以下の用語が定義される。
【００１３】
ＦＧＦ−２１は、２７アミノ酸リーダー配列を含む２０８アミノ酸のポリペプチドである。ヒトＦＧＦ−２１は、マウスＦＧＦ−２１と７９％以下の同一性を有するアミノ酸、及び、ラットＦＧＦ−２１と８０％以下の同一性を有するアミノ酸を有する。ヒトＦＧＦ−２１は、本発明の突然変異タンパク質の好ましいポリペプチド鋳型であるが、当業者は、他の哺乳類のＦＧＦ−２１のポリペプチド配列に基づいて突然変異タンパク質を容易に生成できることが認識されよう。
【００１４】
本発明の突然変異タンパク質のアミノ酸位置は、以下に示すように成熟ヒト１８１アミノ酸ＦＧＦ−２１のポリペプチドから決定される（配列番号１）。
【化１】
2008511323.tif 000002
【００１５】
成熟ヒト１８１アミノ酸ＦＧＦ−２１のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、配列番号２である。
【化２】
2008511323.tif 000003
【００１６】
アミノ酸は、３文字コード又は標準的な１文字コードを使用して示すことができる。突然変異は、元のアミノ酸の３文字コード、アミノ酸番号、置換アミノ酸の３文字コードの順で示される。各突然変異タンパク質の番号付けは、成熟野生型ヒトＦＧＦ−２１の１８１アミノ酸配列に基づく。例えば、位置１６７（即ちＳｅｒ１６７）のセリンに対する非極性／疎水性アミノ酸（アラニン（Ａｌａ））との置換は、Ｓｅｒ１６７Ａｌａ又はＳ１６７Ａとして示される。位置１１８のロイシン及び位置１３４のアラニン（Ｌｅｕ１１８、Ａｌａ１３４）に対する硫黄を含むアミノ酸（システイン（Ｃｙｓ））との二置換は、Ｌｅｕ１１８Ｃｙｓ／Ａｌａ１３４Ｃｙｓ又はＬ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃとして示される。
【００１７】
用語「アミノ酸」は、本願明細書において最も広義に使用され、非自然発生型のアミノ酸と自然発生型のアミノ酸を含み、アミノ酸の類似体及び誘導体を含む。後者は、アミノ酸部分を含む分子を含む。当業者は、この広い定義を鑑みて、本願明細書において参照されるアミノ酸が、例えば、自然発生型のタンパク新生のＬアミノ酸、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸の類似体及び誘導体などの化学的に修飾されたアミノ酸、ノルロイシン、β−アラニン、オルニチンなどの自然発生型の非タンパク新生のアミノ酸、及びアミノ酸の特性である従来技術において周知の属性を有する化学合成化合物である。
【００１８】
ヒトＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質は、野生型成熟タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されたヒトＦＧＦ−２１を含むとして定義される。ＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質の例は、米国特許出願第６０／５２８，５８２号明細書に記載されており、参照によって本願明細書に含まれる。一般的に、突然変異タンパク質は、野生型タンパク質のいくつかの修飾特性、修飾構造、又は修飾機能を有する。例えば、突然変異タンパク質は、有利な生理活性プロフィールを維持しながら、濃縮溶液（例えば、非疎水性の媒介された凝集）中での物理安定度を強化又は改善することができる。突然変異タンパク質は、薬理学的な防腐剤（例えば、ｍ−クレゾール、フェノール、ベンジルアルコール）との適合性が増加するので、貯蔵の間にタンパク質の物理化学的特質及び生物活性を維持する保存製剤を調製することができる。酵母において発現する場合、突然変異タンパク質は、Ｏ型グリコシル化の程度を減少させることができる。このようなＯ型グリコシル化は、タンパク質上に新規な免疫学的な決定因子を導入するため、ヒトに投与される場合は抗原性であり、タンパク質の薬物動態学特定を改変し、及び／又はタンパク質の生物活性に作用することができる。従って、グリコシル化が減少する酵母は、野生型ＦＧＦ−２１と比較される場合、生物学的な効力を維持すると共に、免疫原性ではなく、有利な薬物動態学的プロファイルを有する。本願明細書に使用されるこれらの用語は、限定することを意味するものではなく、得られる突然変異タンパク質が野生型タンパク質の１又は複数の修飾された特質を有することは専ら可能である。
【００１９】
「治療上有効量」は、治療の利益を患者に与えるために必要な活性薬剤の最小量である。例えば、「治療上有効量」は、２型糖尿病、肥満症、若しくは代謝症候群に罹患或いは罹患、又は、罹患を予防する患者に病理学的徴候、疾患進行、前述の障害に関連した生理学的症状、或いは前述の障害を克服するような耐性の改善を誘発、寛解、或いは生じさせる量である。本発明の目的における「被検者」又は「患者」は、好ましくはヒトである。
【００２０】
２型糖尿病は、インスリンが有効的であるにもかかわらず、過剰なグルコース産生を特徴とし、不適切なグルコースクリアランスの結果として、循環しているグルコースレベルが過度に高い状態にある。
【００２１】
グルコース不耐性は、グルコースに対して異常な過敏症として定義することができる。
【００２２】
高血糖は、血液中の過剰の糖（グルコース）として定義される。
【００２３】
低血糖症（低血糖とも呼ばれる）は、血糖値が低すぎて身体の活性のために十分なエネルギーを生成することができないときに発症する。
【００２４】
高インスリン血症は、血液中のインスリンが正常レベル以上であるとして定義される。
【００２５】
インスリン耐性は、正常な量のインスリンに対して正常以下の生物反応が生じる状態として定義される。
【００２６】
「肥満症」は、ヒト被験者に関して、所定の集団の理想体重より２０パーセント以上の体重である状態として定義することができる（Ｒ．Ｈ．  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，  １９７４，  ｐ．９０４−９１６）。
【００２７】
「代謝症候群」は、以下の少なくとも３つの症候群として定義することができる。
腹部脂肪−男性の大半において胴囲が４０インチ以上
高血糖−絶食後に１デシリットルあたり少なくとも１１０ミリグラム（１１０ｍｇ／ｄｌ）、
高トリグリセリド−血流中に少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬ、低ＨＤＬ−４０ｍｇ／ｄｌ未満、及び１３０／８５以上の血圧
【００２８】
本発明は、グリコシル化部位の番号及び／又は型が、天然のＦＧＦ−２１と比較して改変されるグリコシル化突然変異タンパク質を提供する。そのような実施形態は、Ｏ結合型グリコシル化部位に対して小さい番号を含むＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質を含む。Ｏ結合型グリコシル化部位を特定するコンセンサスアミノ酸配列は存在せず、このような識別は困難な課題である。通常、Ｏ結合型グリコシル化は、セリン又はスレオニン残基の側鎖に生じる。Ｏ結合型グリコシル化部位が特定されると、この配列を除去するアミノ酸置換が、既存のＯ結合型糖鎖を除去する。本発明において特定されるＯ結合型グリコシル化部位は、Ｓｅｒ１６３、Ｓｅｒ１６４、Ｓｅｒ１６７、Ｓｅｒ１７２、及びＳｅｒ１７６を含む。Ｏ型グリコシル化の原発部位は、Ｓｅｒ１６７である。出願人らは、Ｓｅｒ１６７位の除去は、突然変異タンパク質を発現した酵母がＯ型グリコシル化の有意な減少を引き起こすことを見出した。Ｓｅｒ１６７は、Ｏ型グリコシル化を除去する変異の好ましい位置であるが、ヒトＦＧＦ−２１（Ｓｅｒ１６３、Ｓｅｒ１６４、Ｓｅｒ１７２、及び、Ｓｅｒ１７６）において、Ｏ型グリコシル化する他の位置への変異は、本発明の範囲内である。
【００２９】
従って、好ましい第１の実施形態において、本発明は、ヒトＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質又はその生物活性ペプチドであって、Ｓｅｒ１６７に対するＳｅｒ又はＴｈｒ以外のアミノ酸置換を含み、アミノ酸の番号付けは配列番号１に基づき、前記突然変異タンパク質は、酵母において発現する場合、野生型ヒトＦＧＦ−２１と比較してＯ型グリコシル化の能力が減少する突然変異タンパク質又はその生物活性ペプチドを提供する。第１の実施形態の好ましい突然変異タンパク質は、Ｓｅｒ１６７Ａｌａ、Ｓｅｒ１６７Ｇｌｕ、Ｓｅｒ１６７Ａｓｐ、Ｓｅｒ１６７Ａｓｎ、Ｓｅｒ１６７Ｇｌｎ、Ｓｅｒ１６７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１６７Ｖａｌ、Ｓｅｒ１６７Ｈｉｓ、Ｓｅｒ１６７Ｌｙｓ、及びＳｅｒ１６７Ｔｙｒである。
【００３０】
本発明の第２の実施形態は、ヒトＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質又はその生物活性ペプチドであって、アルギニン１９、チロシン２０、ロイシン２１、チロシン２２、スレオニン２３、アスパラギン酸２４、アスパラギン酸２５、アラニン２６、グルタミン２７、グルタミン２８、アラニン３１、ロイシン３３、イソロイシン３５、ロイシン３７、バリン４１、グリシン４２、グリシン４３、グルタミン酸５０、グルタミン５４、ロイシン５８、バリン６２、ロイシン６６、グリシン６７、リジン６９、アルギニン７２、フェニルアラニン７３、グルタミン７６、アルギニン７７、アスパラギン酸７９、グリシン８０、アラニン８１、ロイシン８２、グリシン８４、セリン８５、プロリン９０、アラニン９２、セリン９４、フェニルアラニン９５、ロイシン１００、アスパラギン酸１０２、チロシン１０４、チロシン１０７、セリン１０９、グルタミン酸１１０、プロリン１１５、ヒスチジン１１７、ロイシン１１８、プロリン１１９、アスパラギン１２１、リジン１２２、セリン１２３、プロリン１２４、ヒスチジン１２５、アルギニン１２６、アスパラギン酸１２７、アラニン１２９、プロリン１３０、グリシン１３２、アラニン１３４、アルギニン１３５、ロイシン１３７、プロリン１３８、又はロイシン１３９の２つ以上のアミノ酸に対するシステインの置換と共に、Ｓｅｒ１６７に対するＳｅｒ又はＴｈｒ以外のアミノ酸置換を含み、アミノ酸の番号付けは配列番号１に基づき、前記突然変異タンパク質は、酵母において発現する場合、野生型ヒトＦＧＦ−２１と比較してＯ型グリコシル化の能力が減少する突然変異タンパク質又はその生物活性ペプチドを提供する。好ましくは、「２つ以上」という用語は、上述した位置で、うちの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４のアミノ酸残基に対するシステイン置換のことである。より好ましくは、上記の位置において、２又は４のアミノ酸残基に対するシステイン置換のことである。
【００３１】
また、当業者は、天然のシステイン、システイン７５、及びシステイン９３は座位として使用され、改善された特質を与えることができる新規なジスルフィド結合を導入するができることが認識されよう。セリン８５又はフェニルアラニン７３におけるシステイン置換の導入が、システイン９３又はシステイン７５のいずれかの同時変化とそれぞれ組み合わせられることが具体的に想定され、この場合、後者の部位は、他のアミノ酸で置換される。
【００３２】
Ｃｙｓ７５−Ｃｙｓ９３における自然発生型のタンパク質に加えて、設計されたジスルフィド結合を有するＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質は、米国特許出願第６０／５２８，５８２号明細書に記載されている。第２の実施形態で最も好ましい突然変異タンパク質は、Ｌｅｕ１１８Ｃｙｓ−Ａｌａ１３４Ｃｙｓ−Ｓｅｒ１６７Ａｌａ、Ｌｅｕ２１Ｃｙｓ−Ｌｅｕ３３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ１６７Ａｌａ、Ａｌａ２６Ｃｙｓ−Ｌｙｓ１２２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ１６７Ａｌａ、又はＬｅｕ２１Ｃｙｓ−Ｌｅｕ３３Ｃｙｓ／Ｌｅｕ１１８Ｃｙｓ−Ａｌａ１３４Ｃｙｓ−Ｓｅｒ１６７Ａｌａである。
【００３３】
本発明の第３の実施形態は、ヒトＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質又はその生物活性ペプチドであって、１又は複数のアミノ酸に対して、グリシン４２、グルタミン５４、アルギニン７７、アラニン８１、ロイシン８６、フェニルアラニン８８、リジン１２２、ヒスチジン１２５、アルギニン１２６、プロリン１３０、アルギニン１３１、ロイシン１３９、アラニン１４５、ロイシン１４６、イソロイシン１５２、アラニン１５４、グルタミン１５６、グリシン１６１、セリン１６３、グリシン１７０、又はセリン１７２の１又は複数のアミノ酸位置に対する荷電及び／又は極性かつ無電荷のシステイン置換と共に、Ｓｅｒ１６７に対するＳｅｒ又はＴｈｒ以外のアミノ酸置換を含み、アミノ酸の番号付けは配列番号１に基づき、前記突然変異タンパク質は、酵母において発現する場合、野生型ヒトＦＧＦ−２１と比較してＯ型グリコシル化の能力が減少する突然変異タンパク質又はその生物活性ペプチドを提供する。
【００３４】
荷電アミノ酸は、正荷電アミノ酸又は負荷電アミノ酸として定義される。正荷電アミノ酸は、ヒスタジン、リジン、アルギニン、及びこれらの非天然発生の類似体（例えば、γアミノ酪酸、オルニチンなど）を含むと定義される。負荷電アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びこれらの非天然発生の類似体（例えば、アミノアジピン酸）を含むとして定義される。極性かつ無電荷アミノ酸は、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、及びこれらの非天然発生の類似体を含むとして定義される。第３の実施形態の好ましい突然変異タンパク質は、Ｇｌｎ５４Ｇｌｕ−Ｓｅｒ１６７Ａｌａ、Ｌｅｕ１３９Ｇｌｕ−Ｓｅｒ１６７Ａｌａ、Ａｌａ１４５Ｇｌｕ−Ｓｅｒ１６７Ａｌａ、Ｌｅｕ１４６Ｇｌｕ−Ｓｅｒ１６７Ａｌａ、Ｉｌｅ１５２Ｇｌｕ−Ｓｅｒ１６７Ａｌａ、Ｇｌｎ１５６Ｇｌｕ−Ｓｅｒ１６７Ａｌａ、Ｓｅｒ１６３Ｇｌｕ−Ｓｅｒ１６７Ａｌａ、及びＩｌｅ１５２Ｇｌｕ−Ｓｅｒ１６３Ｇｌｕ−Ｓｅｒ１６７Ａｌａである。
【００３５】
本発明の更なる実施形態は、ヒトＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質又はその生物活性ペプチドであって、本発明の第１の実施形態、本発明の第２の実施形態、及び本発明の第３の実施形態の組合せを含み、前記突然変異タンパク質は、酵母において発現する場合、野生型ヒトＦＧＦ−２１と比較してＯ型グリコシル化の能力が減少する突然変異タンパク質又はその生物活性ペプチドを提供する。
【００３６】
野生型ヒトＦＧＦ−２１と比較して酵母において発現する場合、本発明の実施形態は、Ｏ型グリコシル化の能力が減少するＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質に関するとはいえ、野生型ＦＧＦ−２１と比較して、突然変異タンパク質の生物学的な効力を維持することは、同様に考慮すべき重要な要素である。従って、本発明の突然変異タンパク質の生物学的な効力は、インビトロにおける３Ｔ３−Ｌ１細胞アッセイ（実施例２）において測定される突然変異タンパク質のグルコース摂取に作用する能力、及び／又は、ｏｂ／ｏｂマウスアッセイ（実施例３）においてインビボで測定される血漿血糖値と血漿トリグリセライドの低下によって定義される。
【００３７】
本発明に従って投与されるＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質は、当技術分野において公知の任意の手段によって生成され、及び／又は単離されてもよい。突然変異タンパク質を産生する最も好ましい方法は、組換えＤＮＡ技法を介するものであり、当業者に周知である。このような方法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．）に記載されており、参照として本願明細書に組み入れられる。
【００３８】
更に、好ましい実施形態は、本願明細書において記載される突然変異タンパク質に由来する生物活性ペプチドを含み、このようなペプチドは、少なくとも、記載されている一置換を含み、対応する非変異型のペプチドと比較してＯ型グリコシル化の能力が減少することを呈することから生物活性を所有するようになる。この生物活性は、インビトロでの３Ｔ３−Ｌ１細胞アッセイ（実施例２）において測定されるペプチドのグルコース摂取に作用する能力、及び／又は、ｏｂ／ｏｂマウスアッセイ（実施例３）においてインビボで測定される血漿血糖値と血漿トリグリセライドの低下によって定義される。ペプチドは、当業者にとって公知の任意の手段によって生成されてもよく、例えば、酵素消化、化学合成、又は組換えＤＮＡの方法論を含むが、これに限定されない。
【００３９】
一定の線維芽細胞成長因子のペプチドフラグメントが生物学的に活性であることは、当技術分野において確立されている。例えば、Ｂａｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  （ＵＳＡ）  ８５：２３２４−２３２８  （１９８８）、及びＪ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｈｙｓ．  Ｓｕｐｐｌ．  ５：１０１−１０６  （１９８７）を参照されたい。例えば、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）は、神経ペプチド、内分泌ペプチド、及びサイトカインの不活性化に関与するセリン型プロテアーゼであることが公知である（Ｄａｍｍｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７２：  ４２−５６，  （１９９９））。ＦＧＦ−２１のＮ末端は、ＤＰＰ−ＩＶに対する潜在的な基質となる２つのジペプチドを含み、４アミノ酸によってＮ末端で切断されているフラグメントを生じる。予想外に、この野生型ＦＧＦ−２１のフラグメントは、生物活性を保持することが証明されており（表１）、従って、本発明のいずれの実施形態のアミノ酸置換で組み合わされる４アミノ酸によって、Ｎ末端において切断されている本発明の突然変異タンパク質も生物活性を保持する。更に、出願人らは、Ｎ末端からの５つ以上のアミノ酸の切断によって生物活性に否定的な影響を与えることを発見した。
【００４０】
また、本発明は、上記突然変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドを包含し、これらは、ＲＮＡの形態又はＤＮＡの形態であってもよく、ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖であってもよい。本発明の突然変異タンパク質をコードするコード配列は、遺伝コードの冗長又は縮重の結果として異なっていてもよい。
【００４１】
本発明の突然変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、突然変異タンパク質のコード配列のみ、突然変異タンパク質のコード配列と機能的ポリペプチドなどの付加的なコード配列、又はリーダー配列若しくは分泌配列若しくはプロタンパク質配列、突然変異タンパク質のコード配列及び突然変異タンパク質のコード配列のイントロン又は非コード配列５’及び／又は３’などの非コード配列を含んでもよい。従って、「突然変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド」という用語は、突然変異タンパク質のコード配列だけでなく、付加的なコード配列及び／又は非コード配列を含むポリヌクレオチドも含んでもよいポリヌクレオチドを包含する。
【００４２】
更に、本発明は、示される置換を含むポリペプチドのフラグメント、類似体、及び誘導体をコードする記載されたポリヌクレオチドの変異体にも関する。ポリヌクレオチドの変異体は、上記のヒトＦＧＦ−２１の配列、非天然型の変異体、又は切断されている変異体の天然型の対立遺伝子変異体であってもよい。従って、本発明は、また、上記の突然変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びこのようなポリヌクレオチドの変異体を含み、これらの変異体は、対応する非変異型のフラグメント、誘導体（ｄｅｒｉｖｉａｔｉｖｅ）、又は類似体と比較してＯ型グリコシル化の能力が減少することを呈する、開示された突然変異タンパク質のフラグメント、誘導体、又は類似体をコードする。このようなヌクレオチド変異体は、第１、第２、又は第３の実施形態に示されるアミノ酸置換のうちの少なくとも１つが存在する限り、欠失変異体、置換変異体、切断変異体、及び付加変異体又は挿入変異体を含む。
【００４３】
本発明のポリヌクレオチドは、配列が発現制御配列に作動可能に結合された後に宿主細胞において発現する。これらの発現ベクターは、典型的には、エピソームとして、又は宿主染色体のＤＮＡの必須部分として、宿主生物において複製可能である。一般に、発現ベクターは、選択マーカー、例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、及びジヒドロ葉酸還元酵素を含み、所望のＤＮＡ配列で形質転換されたこれらの細胞の検出を可能にする。好ましくは、宿主細胞は、菌類細胞又は酵母細胞である。
【００４４】
本発明の突然変異タンパク質を発現するために使用される酵母細胞は、メタノール資化酵母、酵母、分裂酵母、及びピキア・アンガスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔ）を含む。酵母宿主細胞は、プロモーターなどの発現制御配列を有する適切なベクターを含み、必要であれば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の糖分解酵素、及び、複製開始点、終結配列などを含む。本発明の好ましい酵母宿主は、発現ベクターが宿主染色体ＤＮＡに組み込まれるメタノール資化酵母である。クロコウジカビ、トリコデルマ・レッセイ、及びスエヒロタケは、真菌宿主の例であるが、その他を選択して使用してもよい。
【００４５】
対象となるポリヌクレオチド配列（例えば、ＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質及び発現制御配列）を含むベクターを、これは宿主細胞の型に応じて周知の方法によって宿主細胞に移すことができる。例えば、塩化カルシウムのトランスフェクションは、原核細胞に対して一般的に利用されるが、他の細胞の宿主のためにリン酸カルシウムによる処置又はエレクトロポーレーションを使用してもよい。
【００４６】
タンパク質精製の様々な方法を使用してもよく、このような方法は、当技術分野において公知であり、例えばＤｅｕｔｓｃｈｅｒ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８２：  ８３−９  （１９９０）  及び  Ｓｃｏｐｅｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  ＮＹ  （１９８２）に記載されている。選択される精製工程は、例えばＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質に使用される生産プロセスの性質に依存する。
【００４７】
ＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質を含む組成物は、患者の臨床症状、ＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質組成物の送達部位、投与方法、投与計画、及び医師に公知の他の因子を考慮して、優れた医療に合う方法で処方及び投薬されるべきである。従って、本願明細書の目的におけるＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質の「治療上有効量」は、このような考慮によって決定される。
【００４８】
ＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質及び本発明の薬理学的な組成物は、２型糖尿病、肥満症、代謝症候群の患者を治療する一般的に意図される目的を達成するいずれの手段によって投与してもよい。好ましい投与経路は、非経口であり、本願明細書において、静脈内、筋肉内、腹腔内、気管内、皮下、及び関節内への注射並びに注入を含む投与様式に言及して定義される。投与される用量は、レシピエントの年齢、健康、及び重量に、平行治療の種類（もしあれば）、治療の頻度、及び要求される効果の性質に依存する。本発明の範囲内の組成物は、ＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質が、２型糖尿病、肥満症、又は代謝症候群の治療に対する所望の医学的効果を達成する有効量で存在する全ての組成物を含む。個々の必要性は患者によるが、本成分の全ての有効量の最適範囲の決定は、当業者の臨床医の能力範囲内である。
【００４９】
本発明のＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質は公知の方法に従って調製され、薬理学的に有用な組成物を調製する。所望の製剤は、任意の薬理学的に許容できる担体、防腐剤、賦形剤、又は安定剤を含む適切な希釈剤又は高純度の水溶液で再構成される安定した凍結乾燥物である。［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９８０）］。本発明の突然変異タンパク質は、及び安定性及び投与性を許容できるように調整されたｐＨの薬理学的に許容できる緩衝液と組み合わせてもよい。更に、本発明の突然変異タンパク質は、バイアル、カートリッジ、ペン型の送送達装置、注射器、静脈内投与用のチューブ及びバッグからなる群から選択される容器に配置され、この場合、該容器は単位投与用の容器である。
【００５０】
一般的に、非経口投与において、ＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質は、所望の純度で、注射可能な単位用量形態（溶液、懸濁液、又はエマルジョン）において、薬理学的に許容できる担体、即ち、使用用量及び使用濃度でレシピエントに対して非毒性であり、かつ、製剤の他の成分と適合する担体と共に、１又は複数の種類を混合して処方される。好ましくは、１又は複数の薬理学的に許容できる抗菌性薬剤を添加してもよい。フェノール、ｍ−クレゾール、及びベンジルアルコールは、好ましい薬理学的に許容できる抗菌性薬剤である。
【００５１】
任意的に、イオン強度又は等張力を調整するために、１又は複数の薬理学的に許容できる塩を添加してもよい。製剤の等張性を調整するために、１又は複数賦形剤を更に添加してもよい。グリセリン、塩化ナトリウム、及びマンニトールは、等張性を調整する賦形剤の例である。
【００５２】
当業者は、ＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質を含む治療用組成物の薬理学的な有効用量及び投与処方計画を、優れた医療及び個々の患者の臨床症状によって決定して容易に最適化することが可能であろう。投与されるＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質の適切な用量は血糖値を低下させ、迅速かつ効率的なグルコース利用によってエネルギー消費を増加させると考えられるため、２型糖尿病、肥満症、及び代謝症候群を治療するのに有用である。
【００５３】
更にまた、ＦＧＦ−２１は、インスリンを投与されたネズミと比較して、痩せたＺＤＦネズミにおいて低血糖を誘発しなかった（国際公開第０３／０１１２１３号パンフレット）。このデータは、ＦＧＦ−２１が、インスリン独自の方法において血漿血糖値に作用することを示し、本発明のＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質もまた、Ｉ型の糖尿病の治療において使用されてもよいことを示す。
【００５４】
本発明の別の実施形態において、本願明細書において記載されるヒトＦＧＦ−２１又はその生物活性ペプチドの突然変異タンパク質は、医薬として使用される。
【００５５】
本発明の更に別の実施形態において、有効量の本願明細書に記載されるＦＧＦ−２１又はその生物活性ペプチドの突然変異タンパク質は、２型糖尿病、肥満、又は代謝性症候群から選択される１又は複数の症状の治療又は予防する医薬の製造において使用される。
【００５６】
本発明を詳細に説明するため、以下の実施例を参照することによって明確に理解されるが、これらの実施例は、例示目的のみにおいて本願明細書に含まれ、本発明を限定することは意図されない。
【００５７】
本願明細書で言及される特許及び刊行物の全てが、参照として明白に組み入れられる。
【実施例】
【００５８】
実施例１
酵母におけるＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質の発現及び精製
メタノール資化酵母、メチロトローフ酵母又は出芽酵母などの酵母においてＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質を発現させる。ピキア・パストリスにおける産生には、市販されているシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）によって、組換えタンパク質の高レベル発現を促進する強力なＡＯＸ１（アルコールオキシダーゼ）プロモーターを有するベクターが使用される。また、高レベルな構成的発現のために、ＧＡＰ遺伝子（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）由来プロモーターを使用するベクターも利用できる。ピキアの多コピー型の発現ベクターにより、ゲノムに組み込まれる対象の遺伝子の複数のコピーをもつ株を得ることができる。組換えピキア株において対象となる遺伝子のコピーの数を増加することにより、タンパク質発現レベルを増加することができる。更に別の酵母発現系は、出芽酵母である。発現ベクターは、ＧＡＬ１遺伝子由来のプロモーター及びエンハンサー配列を含む。ＧＡＬ１プロモーターは、ガラクトースで誘導する際の強力な転写活性によって、最も広く使用される酵母プロモーターのうちの１つである。
【００５９】
解析特性（質量スペクトル解析）は、ピキア・パストリスにおいて発現するＦＧＦ−２１が切断されていることを示す（野生型のＮ末端の４つのアミノ酸除去）。マウス３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞アッセイ法（実施例２を参照されたい）においてアッセイされる場合、この切断されているＦＧＦ−２１の変異体は、野生型ＦＧＦ−２１と同じレベルでグルコース摂取を刺激する（表１）。
【００６０】
実施例２
マウス３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるグルコース摂取
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から３Ｔ３−Ｌ１細胞を入手する。細胞をダルベッコ変法イーグル培地中に１０％の鉄を富化したウシ胎児血清を含む増殖培地（ＧＭ）において培養する。標準的な脂肪細胞分化は、細胞が周密状態に達した２日後（０日とする）に、１０％のウシ胎児血清、１０μｇ／ｍｌインスリン、１μＭデキサメサゾン、及び０．５μＭイソブチルメチルキサンチンを含む分化培地（ＤＭ）に細胞を８時間曝す。次いで、１０％のウシ胎児血清、及び１０μｇ／ｍｌインスリンを含む再分化培地中で細胞を維持する。
【００６１】
グルコース輸送アッセイ法−０．１ｍＭの２−デオキシ−Ｄ−［１４Ｃ］グルコースの蓄積によってアッセイされるヘキソース摂取は、以下のとおりに測定される。１２ウェルプレート内の３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を３７℃に温めて、０．２％のＢＳＡを含むＫＲＰ緩衝液（１３６ｍＭ  ＮａＣｌ、４．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＰＯ４、０．９ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．９ｍＭ  ＭｇＳＯ４、ｐＨ  ７．４）で２回洗浄し、０．２％のＢＳＡを含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ−１５培地において大気中３７℃で２時間インキュベートして、０．２％のＢＳＡ緩衝液を含むＫＲＰで再び２回洗浄し、ＫＲＰ、０．２％のＢＳＡ緩衝液中で、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎの非存在下（Ｍｅ２ＳＯのみ）又は存在下において大気中３７℃で３０分間インキュベートする。次いで、インスリンを１００ｎＭの終濃度となるように１５分かけて添加し、２−デオキシ−Ｄ−［１４Ｃ］グルコースの摂取を最後の４分間測定する。非特異的な摂取量（１０μＭサイトカラシンＢの存在下において測定）を全値から減算する。タンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅのビシンコニン酸によるアッセイ法で決定する。摂取量は、各実験について３回又は４回、定期的に測定する。
【００６２】
インビトロの効力は、野生型ＦＧＦ−２１のインビトロにおける活性に対して規準化して１．０に指定し、陽性対照として使用する。本発明のＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質のインビトロでの能力を表１の野生型ＦＧＦ−２１と比較する。表１に示すように、本発明の突然変異タンパク質は、野生型ＦＧＦ−２１と比較して様々な生物学的な効力を維持した。
【００６３】
【表１】
2008511323.tif 000004
【００６４】
実施例３
ｏｂ／ｏｂマウスモデル
雄ｏｂ／ｏｂマウスを使用した肥満症モデルにおける実験を行い、媒体及びインスリン対照群と比較して、ＦＧＦ−２１で処置した後の血漿グルコースレベル及びトリグリセリドレベルを観察する。雄ｏｂ／ｏｂマウス（７週間目）の試験群には、媒体（０．９％のＮａＣｌ）のみ、又は、ＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質（０．１２５ｍｇ／ｋｇ）（０．１ｍＬ、毎日一回）を皮下に７日間注射する。７日目の化合物を最後に注射した１時間後に断尾して採血し、標準的なプロトコルを使用して血漿グルコースレベルを測定する。媒体対照と比較して、血漿グルコースレベルを低下させるＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質の能力を表２に示す。表２は、媒体対照と比較して血漿グルコースレベルを低下させたことを示す。媒体対照と比較して、トリグリセリドレベルを低下させる本発明の突然変異タンパク質の能力を表３に示す。
【００６５】
【表２】
2008511323.tif 000005
【００６６】
【表３】
2008511323.tif 000006
【００６７】
実施例４
ＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質の薬理学的な安定性
本発明のＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質の安定性を、シミュレートされた生理学的及び薬理学的な条件下で解析する。生理学的な条件をシミュレートするために、突然変異タンパク質を、１０ｍｇ／ｍｌ（ｐＨ  ７．４）の標的タンパク質濃度において室温（ＲＴ）でのＰＢＳ中の安定性について解析する。ＰＢＳ中での突然変異タンパク質の溶解性／物理安定性は、サイズ排除クロマトグラフィー及び／又は逆相クロマトグラフィーで測定される調製後のタンパク質の回収がＲＴにおいて９０％以上の回収を生じる場合は良好であるとみなす。表４及び５に示すように、本発明の突然変異タンパク質はこの基準を満たす。
【００６８】
本発明の突然変異タンパク質の薬理学的な製剤は、保存された多目的製剤である可能性が高いことが予想されるため、一般的な保存剤との適合性を解析する。製剤適合性について試験するために、保存剤、ｍ−クレゾール（３ｍｇ／ｍＬの終濃度、一般的に、中性ｐＨ条件における保存剤の有効性についての欧州薬局方Ｂ基準を満たすのに十分な濃度）を、室温において、ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）に約１０ｍｇ／ｍｌの突然変異タンパク質を含む溶液に添加する。ＲＴにおける逆相クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーの後に、主なクロマトグラフピークにおけるタンパク質回収を決定して、最初に保存剤の存在下における物理安定性を求める。更にまた、３７℃におけるＤＬＳ（動的光散乱）によって測定される凝集の範囲を、２時間後のｍ−クレゾールの存在下における粒子の平均直径として野生型ＦＧＦ−２１と比較して示す。大きな平均直径は、タンパク質会合及び／又は凝集の増大に対応する。野生型ＦＧＦ−２１と比較した本発明の第１及び第２の実施形態の突然変異タンパク質の保存剤との適合性（粒子の平均直径の関数として）を表４に示す。野生型タンパク質は大腸菌において発現し、突然変異タンパク質は酵母（メタノール資化酵母）において発現する。ＰＢＳにおいて安定性があり、かつ保存剤適合性の本発明の突然変異タンパク質は、野生型ＦＧＦ−２１と比較して、強化又は改善された薬理学的な特質を有することを示す。表４に示すように、野生型ＦＧＦ−２１と比較して強化された薬理学的な特質を有する本発明の好ましい突然変異タンパク質は、Ｌ１１８Ｃ−Ａ１３４Ｃ、及びＬ１１８Ｃ−Ａ１３４Ｃ−Ｓ１６７Ａである。
【００６９】
【表４】
2008511323.tif 000007
【００７０】
実施例５
Ｏ型グリコシル化の分析
ＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質は、メタノール資化酵母において発現し、Ｚｏｒｂａｘ、３３０−ＳＢ  Ｃ８、４．６×５０  ｍｍ、４０℃の３．５μｍ粒子カラムを使用して、ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ２６９５）により培養液から精製される（移動相Ｃ：１０％のＡＣＮ、及び、９０％のＨ２Ｏにおける０．１％のＴＦＡ、移動相Ｄ：ＡＣＮにおける０．１％のＴＦＡ）。
【００７１】
精製されたＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質のＯ型グリコシル化レベルは、標準のＬＣ／ＭＳ分析で測定される。典型的な突然変異タンパク質のＯ型グリコシル化の割合は、ヒト野生型ＦＧＦ−２１と比較して表５において示される。好ましい突然変異タンパク質Ｌ１１８Ｃ−Ａ１３４Ｃ−Ｓ１６７ＡのＯ型グリコシル化レベルは、野生型ＦＧＦ−２１又は突然変異タンパク質（ｍｕｔｉｅｎ）Ｌ１１８Ｃ−Ａ１３４ＣのＯ型グリコシル化レベルが６０％より大きいのに対して僅か３％であり、Ｓ１６７Ａ突然変異タンパク質（ｍｕｔｉｅｎ）は、Ｏ型グリコシル化のレベルが有意に減少することが明らかに例証される。
【００７２】
【表５】
2008511323.tif 000008
【配列表】
2008511323000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年2月28日(2007.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008511323000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年12月26日(2007.12.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008511323000001.app
【国際調査報告】
2008511323.tif 000013
2008511323.tif 000014
2008511323.tif 000015