(57)【要約】  常染色体優性脊髄小脳失調（ＳＣＡ）は、継続中の病因の発見を伴う、成長しかつ異種の臨床表現型を示す。方法：発明者らはＤＮＡを採取しかつ優性運動失調を分離している三世代のフィリピン人家族を臨床的に特徴づけた。数種の既知のＳＣＡ遺伝子座の除外後、１９ｑ１３の追加的な精緻なマッピングを行うとともに全ゲノム連鎖試験を行った。結果：罹患した家族員の臨床的特徴づけでは、歩行運動失調、四肢運動失調／測定障害、よろめき、低血圧、構音障害、および眼振を含む小脳徴候が示された。連鎖をマーカーＤ１９Ｓ８６７およびＤ１９Ｓ５５３に境界される１９ｑ１３の約４ｃＭの領域内で見出し、ここでマーカーＤ１９Ｓ９０４、Ｄ１９Ｓ２４６、およびＤ１９Ｓ９０７の最大ＬＯＤスコアは３．８９であった。この領域は互いに重複するが、上記のＳＣＡ１３遺伝子座を顕著に減少させる。結論：ＳＣＡ１３とは臨床的に識別可能な常染色体優性小脳性運動失調は、染色体１９ｑ１３．３上のＳＣＡ１３遺伝子座と重複する。
2008538699.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性疾患を診断する方法であって、電位依存性カリウムチャネルをコードする遺伝子内の変異を検出するステップを含む方法。
【請求項２】
前記電位依存性カリウムチャネルがＫｖ１、Ｋｖ２、Ｋｖ３、およびＫｖ４チャネルからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記電位依存性カリウムチャネルがＫｖ３チャネルである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記電位依存性カリウムチャネルがＫＣＮＣ３である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記変異がドットブロットハイブリダイゼーションによって検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記変異がサザンブロットハイブリダイゼーションによって検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記変異が前記増幅産物を配列決定することによって検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記変異が前記電位依存性カリウムチャネルの保存ドメイン内に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記保存ドメインがイオン選択孔および電圧センサドメインからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記変異がＲ４２０Ｈ、Ｒ４１７Ｈ、およびＦ４４８Ｌからなる群から選択されるアミノ酸置換を引き起こす、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００５年４月２２日出願の米国仮特許出願第６０／６７４，１８２号明細書および２００５年９月２６日出願の米国仮特許出願第６０／７２０，９１４号明細書の優先権を主張するものである。
【０００２】
政府の権利
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）によって授与された助成金番号Ｒ０１ＧＭ４３４５９、Ｒ０１ＧＭ６６６８６、Ｒ０１Ｎ５３３１２３およびＴ３２ＧＭ０６５８２３の下で米国政府の後援によって行われた。米国政府は本発明における特定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、神経発達および神経変性疾患の診断および治療に関する。
【背景技術】
【０００４】
優性脊髄小脳失調（ＳＣＡ）は、錐体外路徴候、構音障害、動眼神経麻痺異常、上位および下位運動ニューロン徴候、認知減退、てんかん、自律機能障害、感覚障害、ならびに精神医学的徴候の有無にかかわらず小脳性運動失調からなる表現型を有する増加しつつある異種の神経変性疾患群である（非特許文献１、非特許文献２）。全部で２６の遺伝子座は知られており、１０のＳＣＡにおいて原因遺伝子または変異体は決定されている。これらの大部分は、異常なＣＡＧリピート伸長によって示される。
【０００５】
優性運動失調における遺伝子座および遺伝子の同定における進歩は目覚ましいが、約４０％のＳＣＡは不明のままである。異なる遺伝子の変異においてファミリー内とファミリー間の双方にある程度のばらつきおよび表現型の類似性が見られることを所与とすれば、優性ＳＣＡの臨床的特徴づけは困難である（非特許文献３、非特許文献４）。ポリグルタミンリピート伸長を共有する運動失調の場合であっても、インビボおよびインビトロ実験では病因における顕著な差異は示されていない（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）。したがって、神経発達および神経変性疾患を誘発する変異の同定ならびに疾患を誘発する分子機構の解明は、神経変性および神経発達疾患の診断および治療における大きな進歩を示す。
【非特許文献１】プルスト  Ｓ．Ｍ．（Ｐｕｌｓｔ  Ｓ．Ｍ．）ら、「Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｍｏｖｅｍｅｎｔ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」  アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、２００２年
【非特許文献２】ショールス  Ｌ．（Ｓｃｈｏｌｓ  Ｌ．）、バウワー  Ｐ．（Ｂａｕｅｒ  Ｐ．）、シュミット  Ｔ．（Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｔ．）、シュルテ  Ｔ．（Ｓｃｈｕｌｔｅ  Ｔ．）、リエス  Ｏ．（Ｒｉｅｓｓ  Ｏ．）  「Ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａｓ：ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ，ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ」  Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２００４年、（５）：２９１−３０４頁
【非特許文献３】マンチュアノ  Ｅ．（Ｍａｎｔｕａｎｏ  Ｅ．）、ヴェネツィアーノ  Ｌ．（Ｖｅｎｅｚｉａｎｏ  Ｌ．）、ジョディス  Ｃ．（Ｊｏｄｉｃｅ  Ｃ．）、フロンタリ  Ｍ．（Ｆｒｏｎｔａｌｉ  Ｍ．）  「Ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ  ｔｙｐｅ  ６  ａｎｄ  ｅｐｉｓｏｄｉｃ  ａｔａｘｉａ  ｔｙｐｅ  ２：ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｗｏ  ａｌｌｅｌｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２００３年、１００（１−４）：１４７−１５３頁
【非特許文献４】ゴメス  Ｃ．Ｍ．（Ｇｏｍｅｚ  Ｃ．Ｍ．）、サブラモニ  Ｓ．Ｈ．（Ｓｕｂｒａｍｏｎｙ  Ｓ．Ｈ．）  「Ｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ  ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  ａｔａｘｉａｓ」  Ｓｅｍｉｎ  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２００３年、１０（３）：２１０−２１２頁
【非特許文献５】ラナム  Ｌ．Ｐ．（Ｒａｎｕｍ  Ｌ．Ｐ．）、デイ  Ｊ．Ｗ．（Ｄａｙ  Ｊ．Ｗ．）  「Ｍｙｏｔｏｎｉｃ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：ＲＮＡ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｃｏｍｅｓ  ｉｎｔｏ  ｆｏｃｕｓ」  Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ２００４年、７４（５）：７９３−８０４頁
【非特許文献６】リーバーマン  Ａ．Ｐ．（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  Ａ．Ｐ．）、フィッシュベック  Ｋ．Ｈ．（Ｆｉｓｃｈｂｅｃｋ  Ｋ．Ｈ．）  「Ｔｒｉｐｌｅｔ  ｒｅｐｅａｔ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ」  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ  ２０００年、２３（６）：８４３−５０頁
【非特許文献７】ミカリク  Ａ．（Ｍｉｃｈａｌｉｋ  Ａ．）、ヴァン・ブロックホーヴェン  Ｃ．（Ｖａｎ  Ｂｒｏｅｃｋｈｏｖｅｎ  Ｃ．）（２００３年）  「Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ」  Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ２００３年、１２（２）：１７３−１８６頁
【発明の開示】
【０００６】
図面の簡単な説明
図１：最小数の組換え事象を仮定した、フィリピン人家系における６種の有用な第１９染色体マーカーにおけるハプロタイプ。ＩＩ−５とＩＩ−８の個人における重要な組換え事象に注意のこと。罹患者は黒塗りの記号で示される。試験時の年齢および発症年齢はハプロタイプの上に太字で示される。
図２：１２種の第１９染色体マーカーを用いた多点連鎖分析。最大のＬＯＤは７８ｃＭで３．８３である。０．００１の対立遺伝子頻度および９５％（実線）または９９％（破線）の浸透度を有する常染色体優性遺伝を仮定した連鎖分析が行われる。遺伝的距離はマーシュフィールド（Ｍａｒｓｈｆｉｅｌｄ）遺伝子地図に基づく。
図３：表１：選択された罹患した家族員における臨床的特徴（＋−軽度、＋＋−中等度、＋＋＋−重度）。
図４：常染色体優性の脊髄小脳失調を有するフィリピン人家系。ａ．フィリピン人家系および最小数の組換え事象を仮定した５種の有用な第１９染色体マーカーにおけるハプロタイプ。ＩＩ−５とＩＩ−８の個人における重要な組換え事象に注意のこと。疾患で分離しているハプロタイプブロックは網掛けされている。罹患者は黒塗りの記号で示される。試験時の年齢および発症年齢はハプロタイプの上に太字で示される。発端者は矢印で示される。ＩＩＩ−２（ｂ）およびＩＩ−１（ｃ）の個人におけるＴ１シーケンスの矢状ＭＲ画像は著明な小脳容量の欠損を示す。疾患の期間は、ＩＩＩ−２では１６年、ＩＩ−１では４３年であり、これはＩＩ−１における変性がより著明であることを示すようである。ｄ．およびｅ．ＤＮＡ配列分析では、ＳＣＡ１３を誘発する、Ｋｖ３．３のエクソン２における１５５４Ｇ→Ａおよび１６３９Ｃ→Ａの点変異が見られた。野生型（ＷＴ）の配列と同様、センス鎖とアンチセンス鎖の双方が示される。変異はアスタリスクで指定される。
【０００７】
図５：Ｓｈａｗ−サブファミリーの電位依存性カリウムチャネルの機能モチーフおよび配列比較。ａ．６つの機能ドメインおよびリエントラントループを図示する単一のＫｖ３．３サブユニットの概略図。セグメントＳ１〜Ｓ４は電圧センサドメインを形成する。Ｓ４センス内で正に帯電したアルギニン残基の電圧は変化する。セグメントＳ５、Ｓ６およびリエントラントループはイオン選択孔を形成する。Ｓ５は、孔外部ヘリックスを形成し、孔の開口および閉鎖を伴う電圧センサの高次構造変化と共役するように機能する。ＳＣＡ１３の変異は矢印で示される。ｂ．Ｋｖ３．３のＳ４およびＳ５機能ドメインの種全体にわたるアミノ酸配列比較では、１００％の保存が見られる。黄色はＲ４２０Ｈ（Ｓ４）およびＦ４４８Ｌ（Ｓ５）の変異を強調する。赤色は３番目の位置ごとに生じる正に帯電したアルギニン残基を強調する。
図６：Ｒ４２０Ｈのサブファミリーに特異的な優性阻害効果。ａ．野生型（左）およびＲ４２０Ｈ（右）チャネルからの電流トレースが、電圧を−９０ｍＶから−８０〜＋７０ｍＶの範囲に１０ｍＶずつ漸増させることにより誘発された。野生型では、部分的な不活性化が＋２０ｍＶよりも高電位で観察された。野生型チャネルからの０ｍＶ記録値が、図４ａとの比較のために表記される。ｂ．上パネルは、単独で（１：０）またはＲ４２０Ｈの指定比率での存在下で発現された野生型Ｋｖ３．３における、−９０ｍＶ〜＋６０ｍＶの漸増により誘発された代表的な電流トレースを示す。下パネルは、単独で発現された（１：０）または指定比率でＫｖ３．３−Ｒ４２０ＨもしくはＳｈａｋｅｒ−Ｃ４６２Ｋ（Ｓｈ−Ｃ４６２Ｋ、非機能的Ｓｈａｋｅｒサブユニット２４）とともに発現されたＫｖ３．３野生型における、＋６０ｍＶで正規化されたピーク電流増幅値をプロットしたものである。さらに、単独で発現された（１：０）または指定比率でＫｖ３．３−Ｒ４２０ＨもしくはＳｈ−Ｃ４６２Ｋとともに発現された、不活性化を除いたＳｈａｋｅｒ（Ｓｈ−ＩＲ）における、＋６０ｍＶでのピーク電流増幅値も示される。値が平均±ＳＥＭ、ｎ＝４〜１０として与えられる。一元配置分散分析により試験される統計的有意性、ｐ＜０．０５：＊、１：０と異なる、＊＊、１：１と異なる、＊＊＊、１：２．５と異なる。
【０００８】
図７：Ｆ４４８Ｌにおけるゲート開閉の変化。ａ．Ｆ４４８Ｌチャネルからの電流トレースが、電圧を−９０ｍＶから−８０〜＋７０ｍＶの範囲に１０ｍＶずつ漸増させることにより誘発された。０ｍＶ記録値が、図３ａとの比較のために表示される。ｂ．電圧の関数としての開口の確率（Ｐｏ）を測定するため、−９０ｍＶから様々な試験電位に漸増させ、次いで−９０ｍＶに再分極することにより、野生型またはＦ４４８Ｌの電流が誘発された。槽溶液は８９ｍＭのＲｂ＋を含有した。等時性のテイル電流増幅値が、実験で得られた最大値に正規化され、試験電位に対してプロットされた。野生型は黒四角、Ｆ４４８Ｌは白四角である。値が平均±ＳＥＭ、ｎ＝６（Ｆ４４８Ｌ）または７（野生型）として与えられる。データセットを単一のボルツマン関数（実線）と適合させることで、野生型およびＦ４４８Ｌチャネルに対してそれぞれ２．８±１．０ｍＶおよび−９．６±１．３ｍＶの中点電圧ならびに７．６±０．３および７．６±０．１の傾斜因子がもたらされた。中点電圧は有意に異なっていた（一元配置分散分析でｐ＜０．０５）。ｃ．＋６０ｍＶで得られる代表的な電流トレースが、野生型（固体）およびＦ４４８Ｌ（破線）において縮尺され、重ね合わせられている。ｄ．左パネル：８９ｍＭのＲｂ＋槽溶液中で記録された、野生型（固体）およびＦ４４８Ｌ（破線）からの代表的なテイル電流が＋２０〜−９０ｍＶに漸減させることによって得られた。トレースは縮尺され、重ね合わせられている。テイル電流を単一の指数関数（実線）と適合させることで、非活性化時間定数τｄｅａｃｔについての値が得られた。右パネル：野生型およびＦ４４８Ｌにおけるτｄｅａｃｔのボックスプロット。平均値±ＳＥＭは、野生型（ｎ＝７）およびＦ４４８Ｌ（ｎ＝４）に対してそれぞれ２±０．２ｍｓおよび１３．３±１．０ｍｓであった。τｄｅａｃｔの値は、一元配置分散分析により有意に異なっていた（＊、ｐ＜０．０５）。
図８：ＫＣＮＣ３内の残基Ｒ４２０、Ｒ４１７およびＦ４４８を含む残基の保存を示す、電位依存性カリウムチャネルのＫＣＮＣファミリーの配列アラインメント。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明は、電位依存性カリウムチャネルにおける変異が発達障害および変性神経疾患を誘発しうることを最初に実証するものである。成人発症性運動失調を有する家系の評価後、脊髄小脳失調における原因変異が、小児期発症性の精神遅滞、運動失調、および発作を有するフランス人家系において記載がなされたＳＣＡ１３遺伝子座と重複する、第１９染色体、遺伝子座ｑ１３にマッピングされた。遺伝子の配列決定により、小脳での発現に富むＫＣＮＣ３（Ｋｖ３．３）、電位依存性Ｓｈａｗカリウムチャネルが示され、それは変異としてフィリピン人における１５５４Ｇ→Ａ（Ｒ４２０Ｈ）、フランス人家系における１６３９Ｃ→Ａ（Ｆ４４８Ｌ）、およびＲ４１７Ｈを有する。アフリカツメガエル卵母細胞内で発現される野生型ＫＣＮＣ３チャネルは、推定される脱分極の活性化範囲および高速の非活性化速度を有した。ＫＣＮＣ３  Ｒ４２０Ｈは、単独で発現される場合には検出可能なチャネル活性を全く有することなく、野生型と同時発現される場合には強力な優性阻害効果を有した。ＫＣＮＣ３  Ｆ４４８Ｌは活性化が過分極の方に約１３ｍＶ変化するようにゲート開閉を変化させ、かつチャネル閉鎖の速度が野生型よりも約７倍低下した。Ｒ４２０ＨおよびＦ４４８Ｌの変異は、高速スパイクを発する小脳ニューロンの出力特性を変化させると想定され、それはＫＣＮＣチャネルが高頻度発火に対する能力を与える場合である。したがって、本発明は、神経変性疾患に関与する遺伝子の新規クラスとしての電位依存性カリウムチャネルの変異の同定について提供する。
【００１０】
ＫＣＮＣ３がＫ＋チャネルのＳｈａｗサブファミリーに属する電位依存性カリウムチャネルをコードすることから、ここで、神経変性疾患に関与する、カリウムチャネルと同じまたは関連するファミリーに属する他の電位依存性カリウムチャネルにおける変異を同定することが可能になる。例えば、電位依存性カリウムチャネルのＳｈａｋｅｒ、Ｓｈａｂ、Ｓｈａｗ、Ｓｈａｌファミリーは、本発明で神経発達および神経変性疾患に関与するものとして示されている機能ドメイン全体にわたる有意な相同性を共有する。したがって、ここでは、染色体１２ｐ１３、ＫＣＮＡ１（Ｋｖ１．１）、ＫＣＮＡ２（Ｋｖ１．２）、ＫＣＮＡ３（Ｋｖ１．３）、ＫＣＮＡ４（Ｋｖ１．４）、ＫＣＮＡ４Ｌ、ＫＣＮＡ５（Ｋｖ１．５）、ＫＣＮＡ６（Ｋｖ１．６）、ＫＣＮＡ７、ＫＣＮＡ８／ＫＣＮＡ９（ＫＣＮＱ１）、ＫＣＮＡ１０、ＫＣＮＡＢ１（Ｋｖ−β−１．１）、ＫＣＮＡＢ２（Ｋｖ−β−１．２）、ＫＣＮＡＢ３、ＫＣＮＢ（Ｓｈａｂ）、ＫＣＮＢ１（Ｋｖ２．１）、ＫＣＮＢ２（Ｋｖ２．２）、ＫＣＮＣ（Ｓｈａｗ）、ＫＣＮＣ１（Ｋｖ３．１）、ＫＣＮＣ２（Ｋｖ３．２）、ＫＣＮＣ３（Ｋｖ３．３）、ＫＣＮＣ４（Ｋｖ３．４）、ＫＣＮＤ（Ｓｈａｌ）、ＫＣＮＤ１（Ｋｖ４．１）、ＫＣＮＤ２（Ｋｖ４．２）、ＫＣＮＤ３（Ｋｖ４．３）上のクラスタ内に位置するＫＣＮＡ（Ｓｈａｋｅｒ）すなわちＫＣＮＡ１、５および６の遺伝子における変異を、神経発達および神経変性疾患において検出しかつ診断してもよい。上記のすべての電位依存性カリウムチャネルは周知であり、それらのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は公開されている。さらに、図８に示されるように、ＫＣＮＣチャネル１〜４は、互いに有意な配列相同性を共有し、Ｒ４２０、Ｒ４１７およびＦ４４８などの多数の高度に保存された残基を含む。さらに、異なる電位依存性カリウムチャネルファミリーの一部のメンバーは、ヘテロ多量体形成などの場合、互いに相互作用する。例えば、ＫＣＮＣ３はＫＣＮＣファミリーの他のメンバーとヘテロニ量体を形成することが多い。したがって、ＫＣＮＣファミリーの密接に関連するメンバーのいずれかの機能ドメイン内の変異が、本明細書にて特徴づけられるＲ４２０Ｈ、Ｒ４１７Ｈ、およびＦ４４８Ｌの変異によって生成される表現型に類似するものを生成すると予測される。優性脊髄小脳失調（ＳＣＡ）は、小脳性運動失調、錐体外路徴候、構音障害、動眼異常、運動ニューロン徴候、認知減退、てんかん、自律機能障害、感覚障害、および精神医学的徴候からなる表現型を有する異種の神経変性疾患群である。
【００１１】
本発明は、電位依存性カリウムチャネル遺伝子座と関連がある疾患関連変異を検出することで個人における神経変性および／または神経発達疾患を診断する方法を提供する。疾患関連変異は電位依存性カリウムチャネルをコードする遺伝子に関連するが遺伝子外部に存在しうる、あるいはコーディング配列５’もしくは３’調節領域内またはイントロン配列内などの遺伝子内部に存在しうる。
【００１２】
本発明の方法では、疾患関連変異は、例えば優性阻害遺伝子産物を含む機能的に欠陥がある遺伝子産物をもたらしうる。電位依存性カリウムチャネルのヌクレオチド配列内で生じる神経発達および神経変性疾患に関連する変異の例として、ヌクレオチド１５５４、ＫＣＮＣ３のヌクレオチド１６３９、および関連チャネルに類似の位置でのヌクレオチド変異が挙げられる。
【００１３】
電位依存性カリウムチャネルでの変異の検出に有用な種々の分子的方法は、当該技術分野で周知である。例えば、対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションは、例えば疾患関連配列に完全に相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドプローブの使用を含む。適切な条件下で、対立遺伝子に特異的なプローブは、疾患関連変異を有する核酸にハイブリダイズするが、１つもしくは複数のヌクレオチドミスマッチを有する対応する野生型核酸配列にハイブリダイズしない。必要に応じ、野生型配列にマッチする、第２の対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブの使用も可能である。同様に、対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド増幅の技術を用い、例えば疾患に関連する多型配列を、疾患関連対立遺伝子のヌクレオチド配列に完全に相補的であるが対応する野生型配列と比べて１つもしくは複数のミスマッチを有する、対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの使用により選択的に増幅することが可能である（ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら（編）、「Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」  バークハウザー（Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ）、ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ）（１９９４年）、参照により本明細書中に援用される）。
【００１４】
ヘテロ二本鎖移動度アッセイ（ＨＭＡ）は、本発明の方法に記載の電位依存性カリウムチャネル内での変異によって誘発される神経変性および／または神経発達疾患の診断に使用可能な別の周知のアッセイである。ＨＭＡは、多型配列の存在を検出するのに有用である。なぜなら野生型と変異ＤＮＡ断片の間のヘテロ二本鎖などのミスマッチを有するＤＮＡ二本鎖はポリアクリルアミドゲル内の移動度を完全に塩基対をなした二本鎖の移動度と比べて低下しているからである（デルワート（Ｄｅｌｗａｒｔ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１２５７−１２６１頁（１９９３年）、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １２：３０１−３０６頁（１９９２年）、これらの各々は参照により本明細書中に援用される）。一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）の技術を用い、電位依存性カリウムチャネル内での変異の存在を検出することも可能である（ハヤシ（Ｈａｙａｓｈｉ）、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．１：３４−３８頁（１９９１年）を参照、これは参照により本明細書中に援用される）。この技術を用い、非変性ゲル電気泳動時に電気泳動移動度の変化をもたらす、一本鎖ＤＮＡの二次構造における差異に基づいて変異を検出することが可能である。
【００１５】
変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を用い、電位依存性カリウムチャネル内の変異を検出することも可能である。ＤＧＧＥでは、二本鎖ＤＮＡが濃度が増加した変性剤を含有するゲル内で電気泳動され、ミスマッチの野生型からなる二本鎖断片および疾患関連配列がより速やかに溶解するセグメントを有し、これによりかかる断片にて正常人から得られる完全に相補的な配列と比べて異なる移動が引き起こされる（シェフィールド（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ）ら  「Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｂｙ  Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」  イニス（Ｉｎｎｉｓ）ら、上記、２０  １９９０年）。
【００１６】
変異を分析するための他の周知のアプローチには、自動配列決定、ＲＮＡアーゼミスマッチ技術（ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：７５７５−７５７９頁（１９８５年）、参照により本明細書中に援用される）および制限断片長多型の使用（イニス（Ｉｎｎｉｓ）ら、上記、１９９０年を参照）が含まれる。疾患関連変異が規定されているファミリーにおいては、目的領域の自動配列決定は、神経変性または神経発達疾患の診断に特に有用でありうる。さらに、ドットブロットハイブリダイゼーション、ＲＦＬＰ分析および当該技術分野で周知のさらに多数の技術を本発明の目的のために用いてもよい。
【００１７】
ＭＲイメージング上で著明な小脳徴候および症状ならびに小脳萎縮を有する優性運動失調を分離している三世代のフィリピン人家族については過去に記載がなされている（図１ａおよびｂ）。画像化された臨床的表現型は変性ＳＣＡに特有である。全ゲノム連鎖スキャンによると、３．８９ＬＯＤスコアを有する１９ｑ１３の約４ｃＭ領域内に疾患遺伝子座が見られた。この領域はＳＣＡ１３遺伝子座と部分的に重複したが４、フィリピン人の表現型は、ＳＣＡ１３とは臨床的に識別可能であった。高解像度マッピングにおいては、発明者らはＥｎｓｅｍｂｌゲノムブラウザ（３１．３５ｄでリリース）から新規のジヌクレオチドマーカーを生成した。連鎖領域は約９００Ｋ塩基まで減少した。新規マーカーにおけるハプロタイプが図１ａに示される。Ｄ１９Ｓ９０４を含む数種のマーカーは、組換え事象を全く示さなかった。偏性（ｏｂｌｉｇａｔｅ）組換え体がＤ１９Ｓ８６７とＤ１９Ｓ５５３の双方において検出され、それらはＤ１９Ｓ９０４近傍の疾患遺伝子の推定位置を提供するＬＯＤ−１ドロップ（ｄｒｏｐ）間隔を有する物理的候補領域を定めた。この領域はＫＣＮＣ３を含む約４０の候補遺伝子を有していた。直接配列決定によると、エクソン２内で２つのミスセンス変異が見られた。フィリピン人家系は１５５４Ｇ→Ａを有しており、それはＳ４内での３番目の保存されたアルギニン残基におけるＲ４２０Ｈをコードしていた（図１ｃ）。フランス人家系は１６３９Ｃ→Ａを有しており、それはＳ５の細胞質末端近傍のＦ４４８Ｌをコードしていた（図１ｄ）。
【００１８】
電位依存性Ｋ＋チャネルの中で、Ｋｖ３チャネルの機能特性は特有である。Ｋｖ３チャネルは、より脱分極される範囲内で活性化し、他のＫｖチャネルと比べてずっと高速に閉じる５。これらの特性は、哺乳類の新皮質、海馬、聴神経核、および小脳において見られる神経集団に特有の、ほとんどまたは全く順応を伴わない活動電位の高頻度発火を促進する５。Ｋｖ３チャネルは、他の電位依存性Ｋ＋チャネルと同様、四量体である。異なるＳｈａｗファミリーサブユニットは互いに共会合可能であるが、他のＫｖサブファミリー由来のサブユニットとは共会合できない６，７。各サブユニットは、６つの膜貫通セグメントおよびリエントラントループ（ｒｅ−ｅｎｔｒａｎｔ  ｌｏｏｐ）を有する（図２ａ）。最初の４つの膜貫通セグメントＳ１〜Ｓ４が電圧センサドメインを構成する一方、最後の２つのセグメントのＳ５およびＳ６とリエントラントループはイオン選択孔（ｉｏｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｏｒｅ）を形成する８。フィリピン人における変異は、主な電圧感応素子のＳ４内に位置し、膜電位の変化に応答する複数の正に帯電した残基の１つを変化させる９，１０。フランス人における変異はＳ５の細胞質末端内に存在し、それは孔の開口および閉鎖を伴うカップリング電圧センサの高次構造変化に関与する１１。Ｋｖ３チャネルに特有の脱分極の電圧依存性および速やかな非活性化は、電圧センサおよびＳ５における特定のアミノ酸残基によって与えられる関連特性である１１，１２。重要なことに、Ｓ４およびＳ５内のＫＣＮＣ３タンパク質配列は、ｐｈｙｌａ内で１００％保存され、これはこれらのチャネルの専門化した役割に対する強い選択性を示唆している（図２ｂ）。この観察に合致して、フィリピン人またはアングロ−ヨーロッパ家系の正常人に由来する４００以上の対立遺伝子のスクリーニングでは、いずれの部位でも多型が全く見られなかった。
【００１９】
ＳＣＡ１３の変異の機能的な結果を検討するため、発明者らは野生型および変異体のＫＣＮＣ３対立遺伝子をアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞内で発現させ、チャネル活性を２つの電極電圧クランプを用いて記録した。野生型Ｋｖ３．３チャネルの活性化が−１０ｍＶおよびより正の電位で検出された（図３ａ）。−９０ｍＶへの再分極時、チャネルは速やかに閉じた。それに対し、Ｒ４２０Ｈの発現により検出可能なチャネル活性は全く生じなかった（図３ａ）。野生型Ｋｖ３．３およびＲ４２０Ｈサブユニットの同時発現により、優性阻害効果に一致する電流増幅の抑制がもたらされた（図３ｂおよびｃ）。Ｒ４２０Ｈは、Ｋｖ１ファミリーのメンバーであるＳｈａｋｅｒの発現を抑制しなかった（図３ｃ）。これらの結果により、野生型および変異体のサブユニットのＫｖ３サブファミリーに特異的な共会合が非機能的チャネルをもたらすことが示された。
【００２０】
Ｆ４４８Ｌの発現により、ゲート開閉の変化を伴うチャネルが生じた。Ｆ４４８Ｌの活性化が、野生型における−１０ｍＶに対し、−２０ｍＶで検出された（図４ａ）。電圧の関数としての開口の確率に関する分析により、活性化が過分極の方に約１３ｍＶ変化することが確認された（図４ｂ）。Ｆ４４８Ｌおよび野生型の活性化速度は、双方が最大の開口確率を有する場合の電圧では類似していた（図４ｃ）。しかし、Ｆ４４８Ｌの非活性化速度は劇的に低下していた。−９０ｍＶへの再分極後、テイル電流を８９ｍＭのＲｂ＋槽溶液を用いて記録し、単一の指数関数成分に適合させた（図４ｄ）。これから、Ｆ４４８Ｌチャネルにおいてチャネル閉鎖が約７倍遅延することが示された。開口確率および非活性化速度の低下における過分極変化は、Ｆ４４８Ｌが開口状態の相対的安定性における向上を示すことに関連した研究結果である。Ｆ４４８Ｌは、Ｋｖ３．３チャネルの特性を、通常ロイシン残基を類似位置に有するＳｈａｋｅｒおよび他のチャネルの特性により近づける（図２ｂ）。
【００２１】
イオンチャネルの異常は心臓、腎臓、および骨格筋に関する疾患の原因としてまれであるが１３，１４、カリウムチャネルの変異が神経変性ではなくてんかんおよび発作性運動失調などの一時的現象に関連することから、ＫＣＮＣ３は変性運動失調における有望な候補ではなかった。さらに、マウスにおけるＫＣＮＣ３の欠損により、表現型が生じなかった１５。
【００２２】
小脳におけるＫｖ３チャネルの生理機能は、神経変性に関与する他のＳＣＡ遺伝子と異なり、幅広く研究されており、かなりよく理解されている１６，１７。小脳顆粒細胞、プルキンエ細胞、および深部小脳ニューロンにおいてはＫｖ３．３が発現され、そこでＫｖ３．１および／またはＫｖ３．４との共会合によりそれはヘテロ多量体チャネルを形成しうる１８，１９。プルキンエ細胞内では、Ｋｖ３チャネルは、体細胞のＮａ＋スパイクと樹状細胞のＣａ３＋スパイクの双方の再分極に関与する１７。Ｋｖ３チャネルは、ほとんどまたは全く頻度順応を伴わない１秒当たり数百の活動電位を発火させるニューロン内での高速スパイクにとって必須である５。その脱分極の活性化範囲が理由で、Ｋｖ３チャネルが活動電位の間のみ開口し、高速の再分極に寄与することから、Ｎａ＋チャネルの不活性化からの回復が促進される。Ｋｖ３チャネルの高速の非活性化によって過分極後の経時変化が制限され、それにより不応期が短縮される。
【００２３】
ＳＣＡ１３の変異は、高速スパイクの小脳ニューロンの発火特性を破壊する可能性が高い。Ｋｖ３．３のノックアウトマウスは明確な運動表現型を全く有していないが、Ｋｖ３．１／Ｋｖ３．３の二重ノックアウトマウスは、震えおよび重度の運動失調を含む激しい症状を有する１５。Ｒ４２０ＨおよびＲ４１７ＨがＫｖ３．３ならびにＫｖ３ファミリー内の他のサブユニットにおける機能発現を抑制すると想定されることから、これらの変異は二重ノックアウトマウスにより匹敵しうる。小脳ニューロン内でのＫｖ３活性の薬理学的抑制により、活動電位の拡大、スパイク頻度順応、および蓄積されたＮａ＋チャネルの不活性化からのスパイク欠陥がもたらされる１７。Ｒ４２０ＨおよびＲ４１７Ｈは類似の効果を有しうる。それに対し、Ｆ４４８Ｌは小脳ニューロンの最大発火速度を低下させると予測される。閉鎖速度の低下に起因して過分極後が延長されることから、閾値への回復が遅延しかつスパイク間間隔が増大することになると思われる。細胞レベルでの変異の異なる効果は、２つの家系における対照的な表現型に合致する。Ｒ４２０Ｈがチャネル特性上の変化を全く伴うことなく電流増幅を低下させる一方、Ｆ４４８Ｌはゲート開閉の主要なパラメータを変化させる。Ｆ４４８Ｌの機能的変化の増大は、フランス人家系において観察される発症の早期化および疾患経過の沈静化と合致する。
【００２４】
Ｋｖ３チャネルの生理的特性は、神経変性の有望な機構における興味深い手掛かりをもたらす。Ｋｖ３チャネルは、プルキンエ細胞内での樹状のＣａ２＋スパイクの再分極に有意に寄与する１７。スパイク期間が拡大すればＣａ２＋の流入が増加することになり、これは神経細胞死に寄与しうる。さらに、Ｋｖ３．３およびＫｖ３．４チャネルの機能特性は、反応酸素種により調節される２０〜２２。変異体のＫｖ３．３サブユニットは、小脳ニューロンの酸化ストレスへの対応能に作用しうる。最終的に、形態分化と優れた電気特性の発生は、プルキンエ細胞内で密接な関連がある。これにより、形態的かつ電気的な成熟が独立した現象であるという可能性が高まる２３。適切な電気特性の取得を破壊する変異は、ニューロンの長期生存性を低下させるわずかな発育不全を誘発しうる。
【００２５】
本明細書で提供される結果は、発達障害から遅発性神経変性疾患に至る表現型に関与する遺伝子における有効な候補が電位依存性カリウムチャネルであることを示している。小脳発生、成熟生物における小脳機能および神経細胞死を阻止するのに適するチャネル機能の役割という３つの別々であるが相関した機能に対する変異体ＫＣＮＣ３の重要性を評価するのにインビボ系が必要である可能性がある。両方の変異は、代償機構の重要性を強調する一部のファミリー間の表現型のばらつきおよび他の遺伝的かつ環境的な修飾因子の存在可能性を示す。小脳変性における電位依存性Ｋチャネルの役割をさらに理解することにより、チャネル機能を調節し、小脳機能を回復するだけでなく神経変性を低下させることを目的とした治療法がもたらされうる。
【００２６】
患者：小脳性運動失調における優性形質を分離しているフィリピン人大家族について試験することができた。三世代にわたる罹患者は１１名であった。生存罹患者には、女家長、第二世代における８名および第三世代における３名が含まれる。さらに、第二世代では非罹患者が５名であり、第三世代では非罹患者が１名で危険な状態にある患者が３９名と推定され、彼らを対象とした試験はまだ行われていない。１５名の家族員から書面によるインフォームドコンセントが得られた後、血液が採取され、ＤＮＡが抽出された。第三世代から１名の罹患者に脳ＣＴイメージングを使用することができた。
【００２７】
変異および連鎖解析：ＳＣＡ１、２、３、６、７、８、１２、１７、およびＤＲＰＬＡ遺伝子における変異が、直接ＰＣＲ分析により、考えられる病因として除外された（プルスト  Ｓ．Ｍ．（Ｐｕｌｓｔ  Ｓ．Ｍ．）  「Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓ：ｓｉｎｇｌｅ  ｇｅｎｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｐｓｙｃｈ  ２００３年、７４：１６０８−１６１４頁）。ＰＣＲによって増幅できない伸長変異（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）を有するＳＣＡ１０では、すべての罹患者において２つの正常な対立遺伝子が観察された（マツウラ  Ｔ．（Ｍａｔｓｕｕｒａ  Ｔ．）、ヤマガタ  Ｔ．（Ｙａｍａｇａｔａ  Ｔ．）、ブルゲス  Ｄ．Ｌ．（Ｂｕｒｇｅｓｓ  Ｄ．Ｌ．）ら  「Ｌａｒｇｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＴＴＣＴ  ｐｅｎｔａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｐｅａｔ  ｉｎ  ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ  ｔｙｐｅ  １０」  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２０００、２６（２）：１９１−１９４頁）。ＳＣＡ５、１１、１３、１４、１６、１８、１９、２１、２３、および２５における遺伝子座に対する連鎖が、これらの遺伝子座の近接位置での組換え事象の観察により除外された。
【００２８】
連鎖のための全ゲノムスクリーニングでは、ヒトＡＢＩ  Ｌｉｎｋａｇｅ  Ｓｅｔ  ｖ２．５において全部で３７７の蛍光標識されたマイクロサテライトマーカーが使用された。これらのマーカーは、１０ｃＭの平均的なマーカー間遺伝的距離を有する全ゲノムをカバーする。マーカーは毛細管系を用いてＡＢＩ  ３１００上で作動された。
【００２９】
１９ｑ１３領域における連鎖を評価するため、上記のように、女家長、第二世代における罹患者８名および非罹患者５名ならびに第三世代における罹患者３名について追加のスクリーニングが行われた（ズー  Ｌ．（Ｚｕ  Ｌ．）、フィゲロア  Ｋ．Ｐ．（Ｆｉｇｕｅｒｏａ  Ｋ．Ｐ．）、グレワル  Ｒ．（Ｇｒｅｗａｌ  Ｒ．）、プルスト  Ｓ．Ｍ．（Ｐｕｌｓｔ  Ｓ．Ｍ．）「Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ  ｔｏ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ２２」  Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  １９９９、６４（２）：５９４−５９９頁）。高解像度マッピングが、Ｅｎｓｅｍｂｌゲノムブラウザ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ、１／１５／０５）から１９ｑ１３の領域内で得られるジヌクレオチド反復マーカーを用いて行われた。
【００３０】
１００ｎｇのゲノムＤＮＡ鋳型、１００ｐモルの各プライマー、２．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２５ＵのＴａｑポリメラーゼ、およびベンダーより提供された緩衝液を含有する反応物２０μｌにおいてＰＣＲが行われた。上流プライマーは、ＰＣＲに先立ち、製造業者の使用説明書に従い、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）カタログ番号Ｍ４１０１）を用いてγ−３２Ｐ−ＡＴＰで末端標識された。反応条件は、９５℃で５分間の初期変性、９５℃で３０秒間の３５サイクルの変性、６２℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で４０秒間の伸長、ならびに７２℃で１０分間の最終伸長であった。反応全体はＭ．Ｊ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰＴＣ  ２００サーモサイクラーにおいて行われた。ＰＣＲ産物は、ＩＢＩ  ＢａｓｅＲｕｎｎｅｒ  ２００シーケンサー上の６％変性ポリアクリルアミドゲル（ナショナル・ダイアグノスティクス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、アトランタ（Ａｔｌａｎｔａ）、ジョージア州）上で電気泳動により分析された。ゲルがＨｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＭＰ（アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、英国）に暴露され、かつコダック（Ｋｏｄａｋ）製Ｘ−Ｏｍａｔ自動プロセッサで現像された。
【００３１】
統計分析：ペアワイズおよび多点連鎖解析が、９５％もしくは９９％で設定された浸透度で、常染色体優性遺伝および０．００１の疾患対立遺伝子の頻度を想定して、ジーンハンター（Ｇｅｎｅｈｕｎｔｅｒ）（クルグルヤク  Ｌ．（Ｋｒｕｇｌｙａｋ  Ｌ．）、ランダー  Ｅ．Ｓ．（Ｌａｎｄｅｒ  Ｅ．Ｓ．）  「Ｆａｓｔｅｒ  ｍｕｌｔｉｐｏｉｎｔ  ｌｉｎｋａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｆｏｕｒｉｅｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ」  Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  １９９８年、５：１−７頁、クルグルヤク  Ｌ．（Ｋｒｕｇｌｙａｋ  Ｌ．）、ダリ  Ｍ．Ｊ．（Ｄａｌｙ  Ｍ．Ｊ．）、リーブ−ダリ  Ｍ．Ｐ．（Ｒｅｅｖｅ−Ｄａｌｙ  Ｍ．Ｐ．）、ランダー  Ｅ．Ｓ．（Ｌａｎｄｅｒ  Ｅ．Ｓ．）  「Ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ａｎｄ  ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ｌｉｎｋａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ：ａ  ｕｎｉｆｉｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｏｉｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ」  Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  １９９６年、５８：１３４７−１３６３頁）を用いて行われた。プログラムサイズパラメータ（最大ビット）が、遺伝子型が特定されたすべての被験者が分析に含められるように固定された。ジーンハンター（Ｇｅｎｅｈｕｎｔｅｒ）は、ここで示されたパラメトリックな結果と実質的に異ならないノンパラメトリックな結果ももたらした。
【００３２】
結果：家族の臨床的特徴。拡大親族における１９名が試験された。三世代からの臨床上の罹患者１０名が試験に利用可能であった。発端者としての８２歳の婦人が６０歳で発症の疾患を有する最高齢の罹患者である。彼女は、生存する子供１２名、すなわち女性７名（そのうち罹患者４名）と男性５名（そのうち罹患者３名）を有する。第二世代における罹患した子孫７名は４６〜６５歳であり、発症年齢は２２〜４８歳の範囲（平均３６．４歳）である。第三世代は３名の罹患者を有し、平均発症年齢は２４．５歳であった。これは３０歳女性（発症年齢２６）、２５歳男性および新たな症状を示す男性（各発症年齢が２３歳と２２歳）を含む。罹患者１０名の中で顕著な小脳徴候には、歩行運動失調、四肢運動失調／測定障害、よろめき、低血圧、構音障害、および眼振が含まれた。２名は、バビンスキー徴候を全く伴わない軽度の対称性反射亢進を有する。疾患の期間は１〜４３年の範囲で平均１３年である。最高齢の罹患者３名は最も重度の運動失調を有し（２名は車いすに束縛されている）、疾患の期間はそれぞれ２４年、４３年、および３４年である。３０歳の第三世代の女性におけるＣＴ脳イメージング（症状出現の初年度内に実施）によると、軽度の小脳萎縮を呈した。
【００３３】
既知の遺伝子座の除外：直接ＰＣＲ分析により、ＳＣＡ１、２、３、６、７、８、１２、１７、およびＤＲＰＬＡにおけるＤＮＡリピート伸長の変異が除外された。罹患者における２種の正常な対立遺伝子においてヘテロ接合性を実証することにより、ＳＣＡ１０遺伝子におけるペンタヌクレオチドのリピート伸長が除外された。連鎖分析により、他のＳＣＡ遺伝子座が除外された。これは、ＳＣＡ５、１１、１３、１４、１６、１８、１９、２１、２３、および２５に連結されたマーカーを用いる分析を含んだ。各遺伝子座においては、少なくとも１つの組換え事象が、連結領域内でかつ同領域に隣接するマーカーにおいて観察された。
【００３４】
全ゲノムスクリーニング：家系の構成から、個人Ｉ：２でのヘテロ接合性が第二世代における情報として必要であったことから約１５％のマーカーが有用でなかった。この制限を仮定すると、初期スキャンの結果は、隣接する有用でないマーカーに起因しゲノム内にいくつかの大きなギャップを残した。したがって、４種のゲノム領域（染色体１、１４、１９、および２２）がＥｎｓｅｍｂｌゲノムブラウザ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ、登録日２００５年１月１５日）から得られるＣＡ反復マーカーを用いてさらにスクリーニングされた。
【００３５】
発明者らは、染色体１、１４、および２２への連鎖の除外後、ゲノムスキャンが５３．０２ＭｂでＤ１９Ｓ９０２および６１．７１ＭｂでＤ１９Ｓ２１０によって規定される大きい領域内で情報を提供しなかったことから１９ｐ１３領域に対する連鎖を再試験した。この領域は、脊髄小脳失調タイプ１３が予めフランス人の大家族における１９ｑ１３．３〜ｑ１３．４にマッピングされていたことから興味深いものであった（ヘルマン−バート  Ａ．（Ｈｅｒｍａｎ−Ｂｅｒｔ  Ａ．）、ステヴァニン  Ｇ．（Ｓｔｅｖａｎｉｎ  Ｇ．）、ネッター  Ｊ．Ｃ．（Ｎｅｔｔｅｒ  Ｊ．Ｃ．）ら  「Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ  １３  ｔｏ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １９ｑ１３．３−ｑ１３．４  ｉｎ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ  ａｎｄ  ｍｅｎｔａｌ  ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ」  Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ２０００年、６７：２２９−２３５頁）。本発明者らのゲノムスキャンでは、Ｄ１９Ｓ２１０での罹患者におけるいくつかの組換え事象およびマーカーＤ１９Ｓ９０２での第二世代非罹患者における１つの組換え事象が同定された。
【００３６】
追加の有用なマーカーにおけるハプロタイプが図１に示される。Ｄ１９Ｓ９０４を含む数種のマーカーは、罹患者または非罹患者における組換え事象を全く示さなかった。Ｄ１９Ｓ８６７とＤ１９Ｓ５５３の双方において偏性組換え体が検出された。これらのマーカーは１Ｍｂの物理的候補領域を定める。
【００３７】
正式な多点連鎖分析は図２に示される。ＬＯＤ−１ドロップ間隔は、Ｄ１９Ｓ９０４近傍の４ｃＭ領域内に疾患遺伝子の最も確定的な位置を提供する。
【００３８】
考察：ＳＣＡ１３の臨床的な表現型は、フランス人に起源をもつ１つの家系における観察に基づく（ヘルマン−バート  Ａ．（Ｈｅｒｍａｎ−Ｂｅｒｔ  Ａ．）、ステヴァニン  Ｇ．（Ｓｔｅｖａｎｉｎ  Ｇ．）、ネッター  Ｊ．Ｃ．（Ｎｅｔｔｅｒ  Ｊ．Ｃ．）ら「Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ  １３  ｔｏ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １９ｑ１３．３−ｑ１３．４  ｉｎ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ  ａｎｄ  ｍｅｎｔａｌ  ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ」Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ２０００年、６７：２２９−２３５頁）。発症は小児期であり、患者は軽度の精神遅滞ならびに構音障害、眼振、および分離した錐体路の特徴を有する比較的純粋な小脳性運動失調を有していた。このＳＣＡにおける遺伝子座は、５０．６４〜５６．２４Ｍｂから１９ｑ１３．３〜１３．４上の８ｃＭの領域に及ぶ（ゲネソン・アンド・センター・フォア・メディカル・ジェネティクス（Ｇｅｎｅｔｈｏｎ  ａｎｄ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、マーシュフィールド・メディカル・リサーチ・ファウンデーション（Ｍａｒｓｈｆｉｅｌｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）の遺伝子地図）（ディブ  Ｃ．（Ｄｉｂ  Ｃ．）、フォーレ  Ｓ．（Ｆａｕｒｅ  Ｓ．）、フィザメス  Ｃ．（Ｆｉｚａｍｅｓ  Ｃ．）ら「Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｐ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ５，２６４  ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ」  Ｎａｔｕｒｅ  １９９６年、３８０（６５７０）：１５２−４頁、ブロマン  Ｋ．Ｗ．（Ｂｒｏｍａｎ  Ｋ．Ｗ．）、マレー  Ｊ．Ｃ．（Ｍｕｒｒａｙ  Ｊ．Ｃ．）、シェフィールド  Ｖ．Ｃ．（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ  Ｖ．Ｃ．）、ホワイト  Ｒ．Ｌ．（Ｗｈｉｔｅ  Ｒ．Ｌ．）、ウェーバー  Ｊ．Ｌ．（Ｗｅｂｅｒ  Ｊ．Ｌ．）「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｐｓ：ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ａｎｄ  ｓｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  １９９８年、６３（３）：８６１−９頁）。この報告におけるフィリピン人家系における疾患遺伝子は、第１９染色体のゲノム配列の５５．４６および５６．２４Ｍｂに位置する遺伝マーカー間のＳＣＡ１３候補領域の末端セグメントにマッピングされる。
【００３９】
大部分の記載されたＳＣＡにおける疾患の機構がトリヌクレオチドのリピート伸長であるが、フランス人のＳＣＡ１３家系の記述においては明確な予想を行う上での証拠が乏しい。さらに、高速伸長検出（Ｒａｐｉｄ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）（ＲＥＤ）分析（ザンダー  Ｃ．（Ｚａｎｄｅｒ  Ｃ．）、テラウス  Ｊ．（Ｔｈｅｌａｕｓ  Ｊ．）、リンドブラッド  Ｋ．（Ｌｉｎｄｂｌａｄ  Ｋ．）、カールソン  Ｍ．（Ｋａｒｌｓｓｏｎ  Ｍ．）、シェーベルグ  Ｋ．（Ｓｊｏｂｅｒｇ  Ｋ．）、シャリング  Ｍ．（Ｓｃｈａｌｌｉｎｇ  Ｍ．）  「Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅｐｅａｔ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  １９９８年、８：１０８５−１０９４頁）またはポリグルタミン配列を選択的に認識する抗体を用いるウエスタンブロッティング（トロッティア  Ｙ．（Ｔｒｏｔｔｉｅｒ  Ｙ．）、ルッツ  Ｙ．（Ｌｕｔｚ  Ｙ．）、ステヴァニン  Ｇ．（Ｓｔｅｖａｎｉｎ  Ｇ．）ら「Ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｉｎ  Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｆｏｕｒ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａｓ」Ｎａｔｕｒｅ  １９９５年、３７８：４０３−４０６頁）のいずれにしても、ＳＣＡ１３．１３における（予想では疾患に共通して見られる）ＣＡＧ伸長に対する証拠は見られなかった。ここでのフィリピン人家系は、平均発症年齢が第二世代における３６歳から第三世代における２４歳へと低下するという予想における証拠である。しかし、個々の家系における観察数が少ないことからこの結果の解釈には注意を要する。さらに、遺伝性痙性対麻痺（Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  Ｓｐａｓｔｉｃ  Ｐａｒａｐｌｅｇｉａ）における予想について記述がなされており４、ここでの変異事象は病的なリピート伸長ではない（ラスキンド  Ｗ．Ｈ．（Ｒａｓｋｉｎｄ  Ｗ．Ｈ．）、ペリカク−ヴァンス  Ｍ．Ａ．（Ｐｅｒｉｃａｋ−Ｖａｎｃｅ  Ｍ．Ａ．）、レノン  Ｆ．（Ｌｅｎｎｏｎ  Ｆ．）、ウォルフ  Ｊ．（Ｗｏｌｆｆ  Ｊ．）、リペ  Ｈ．Ｐ．（Ｌｉｐｅ  Ｈ．Ｐ．）、バード  Ｔ．Ｄ．（Ｂｉｒｄ  Ｔ．Ｄ．）「Ｆａｍｉｌｉａｌ  ｓｐａｓｔｉｃ  ｐａｒａｐａｒｅｓｉｓ：ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｃｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ，ａｎｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＳＰＧ４  ｌｏｃｕｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｈｏｒｔ  ａｒｍ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ２」Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  １９９７年：７４（１）：２６−３６頁）。我々の家族によって規定される領域内の約百万塩基対のゲノム配列の試験でも、１０より大きい連続したＣＡＧリピートトラクトの領域が示されなかった。
【００４０】
発明者らがいくつかの組換え事象の観察に基づいてＣＨＲ１９ｑ上のＳＣＡ１３遺伝子座を最初に除外していたことは意外であった。振り返ると、すべての罹患者によって共有される染色体領域が非常に小さいことは明らかである。これによって連鎖の初期検出が困難になったが、非常に小さい候補領域がもたらされた。発明者らおよびヘルマン−バート（Ｈｅｒｍａｎ−Ｂｅｒｔ）らによって規定された重複領域内の遺伝子が潜在的候補として同定されている。これらは、転写因子、トラフィッキング（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）タンパク質、およびイオンチャネルのファミリーに属する遺伝子を含む。
【００４１】
フランス人のＳＣＡ１３の変異およびフィリピン人家族における変異が対立遺伝子であると仮定すれば、ここでの結果はＳＣＡ１３候補領域を大幅に狭めることになる。しかし、顕著な差異によって上記のＳＣＡ１３表現型と我々の家系における表現型が区別される。これらは、フランス人家系において記述されたＳＣＡ１３および精神遅滞における発症年齢の著しい低下を含む。さらに、本明細書に記載のフィリピン人家族における予想が示唆されている。２つの家族の中で記述されたある程度変化しない表現型によると、２種の異なる遺伝子における変異または対立遺伝子の異質性を解釈するのが好ましい。ＳＣＡ１３領域のサイズを考慮すると、原因遺伝子がこれらの２つの条件下で異なる可能性がある。ＳＣＡ１５において類似の現象が示唆されており、そこではいくつかの重複遺伝子座が類似するが臨床的に異なる表現型をもたらす（ドゥディング  Ｔ．Ｅ．（Ｄｕｄｄｉｎｇ  Ｔ．Ｅ．）、フレンド  Ｋ．（Ｆｒｉｅｎｄ  Ｋ．）、ショフィールド  Ｐ．Ｗ．（Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ  Ｐ．Ｗ．）、リー  Ｓ．（Ｌｅｅ  Ｓ．）、ウィルキンソン  Ｉ．Ａ．（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  Ｉ．Ａ．）、リチャーズ  Ｒ．Ｉ．（Ｒｉｃｈａｒｄｓ  Ｒ．Ｉ．）「Ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｎｏｎ−ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ａｔａｘｉａ  ｏｖｅｒｌａｐｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＳＣＡ１５  ｌｏｃｕｓ」Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２００４年、６３：２２８８−２２９２頁）。あるいは、表現型の差異は、遺伝的な背景または環境要因に起因する、対立遺伝子の異質性または観察された差異を有する同一の変異を示しうる。対立遺伝子の異質性については、ＳＣＡ１４において十分に記載され、かつ精神遅滞での早期発症および純粋な遅発性の小脳性運動失調などの本質的に異なる表現型を含み、これらは１９ｑ１３にマッピングされるフランス人およびフィリピン人家系における２つの表現型を連想させる（ステヴァニン  Ｇ．（Ｓｔｅｖａｎｉｎ  Ｇ．）、ハーン  Ｖ．（Ｈａｈｎ  Ｖ．）、ローマン  Ｅ．（Ｌｏｈｍａｎｎ  Ｅ．）ら「Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  γ  ａｎｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ  ｔｙｐｅ  １４．」Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２００４年、６１：１２４２−１２４８頁、チェン  Ｄ．Ｈ．（Ｃｈｅｎ  Ｄ．Ｈ．）、シミノ  Ｐ．Ｊ．（Ｃｉｍｉｎｏ  Ｐ．Ｊ．）、ラナム  Ｌ．Ｐ．Ｗ．（Ｒａｎｕｍ  Ｌ．Ｐ．Ｗ．）ら「Ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｆ  ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ  １４」  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２００５年、６４：１２５８−１２６０頁）。
【実施例】
【００４２】
以下の実施例は、特許請求された本発明をよりよく例示するために提供され、かつ本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。特定の物質が述べられる限りでは、それはあくまで例示目的であり、本発明の限定が意図されることはない。当業者であれば、発明がもつ可能性を行使することなく、かつ本発明の範囲から逸脱することもなく、等価な手段または反応物を開発することができる。
【００４３】
実施例１
患者：小脳性運動失調における優性形質を分離しているフィリピン人家族について試験した。発端者、第二世代における７名および第三世代における３名を含む罹患者が１１名であった。さらに、第二世代では非罹患者が５名であり、第三世代では非罹患者が１名で危険な状態にある患者が１９名であった。１５名の家族員からインフォームドコンセントが得られた後、血液を採取し、ＤＮＡを抽出した。
【００４４】
変異および連鎖分析：１９ｑ１３領域内での連鎖をさらに評価するため、発端者、第二世代における７名の罹患者および４名の非罹患者ならびに第三世代における３名の罹患者において、さらなるマーカーをタイピングした。高解像度マッピングを、Ｅｎｓｅｍｂｌゲノムブラウザ（３１．３５ｄでリリース）からの１９ｑ１３の領域内で得たジヌクレオチド反復マーカーのＰＣＲ増幅により行った。ＰＣＲ産物を６％変性ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により分析した。
【００４５】
配列分析：ＡＢＩ（フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）、カリフォルニア州）「ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１」サイクル配列決定キットおよび以下のプロトコルを用い、ＤＮＡ配列決定を行った。５ｎｇ（５μｌ）の精製ＰＣＲアンプリコン、反応予備混合物４μｌ、５倍の配列決定緩衝液２μｌ、３．２ｐモル（２μｌ）の適切なプライマー、および脱イオン水７μｌを９６ウェルのマイクロタイタープレートに添加し、ＰＣＲサーモサイクラー（ＭＪリサーチ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）  ＰＴＣ−２００）に移し、１）９６℃で１分間、２）９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、次いで６０℃で４分間からなるＸ２５サイクルに従って繰り返した。次いで、ＡＢＩ  Ｃｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐ（商標）スピンカラムを使用して配列決定産物を精製した。次いで、再懸濁試料を、製造業者のプロトコルに従い、ＡＢＩ  ３７７  ＤＮＡシーケンサーにおける４．５％アクリルアミドゲル上で電気泳動させた。すべての配列を、バイオエディット（ＢｉｏＥｄｉｔ）の生物学的配列アラインメントエディタのバージョン５．０．９．１を用いて分析した。
【００４６】
結果
ＭＲイメージング上で著明な小脳徴候および症状ならびに小脳萎縮を有する優性運動失調を分離している三世代のフィリピン人家族について同定した（図１ａおよびｂ）。画像化された臨床的表現型は変性ＳＣＡに特有である。全ゲノム連鎖スキャンによると、３．８９ＬＯＤスコアを有する１９ｑ１３の約４ｃＭ領域内に疾患遺伝子座が見られた。この領域はＳＣＡ１３遺伝子座と部分的に重複したが（ヘルマン−バート  Ａ．（Ｈｅｒｍａｎ−Ｂｅｒｔ  Ａ．）ら、「Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ  １３  ｔｏ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １９ｑ１３．３−ｑ１３．４  ｉｎ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｔａｘｉａ  ａｎｄ  ｍｅｎｔａｌ  ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ」Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６７、２２９−２３５頁（２０００年））、フィリピン人の表現型はＳＣＡ１３とは臨床的に識別可能であった。高解像度マッピングにおいては、Ｅｎｓｅｍｂｌゲノムブラウザ（３１．３５ｄでリリース）から新規のジヌクレオチドマーカーが得られた。連鎖領域は約９００Ｋ塩基まで減少した。新規マーカーにおけるハプロタイプを図４ａに示す。Ｄ１９Ｓ９０４を含む数種のマーカーは、組換え事象を全く示さなかった。偏性組換え体がＤ１９Ｓ８６７とＤ１９Ｓ５５３の双方において検出され、それらはＤ１９Ｓ９０４近傍の疾患遺伝子の推定位置を提供するＬＯＤ−１ドロップ間隔を有する物理的候補領域を定めた。この領域はＫＣＮＣ３を含む約４０の候補遺伝子を有していた。直接配列決定によると、エクソン２内で２つのミスセンス変異が見られた。フィリピン人家系は１５５４Ｇ→Ａを有しており、それはＳ４内での３番目の保存されたアルギニン残基におけるＲ４２０Ｈをコードする（図４ｃ）。フランス人家系は１６３９Ｃ→Ａを有しており、それはＳ５の細胞質末端近傍のＦ４４８Ｌをコードする（図４ｄ）。
【００４７】
実施例２
電位依存性Ｋ＋チャネルの中で、Ｋｖ３チャネルの機能特性は特有である。Ｋｖ３チャネルは、他のＫｖチャネルと比べてより脱分極される範囲内で活性化し、ずっと高速に閉じる（ルディ  Ｂ．（Ｒｕｄｙ  Ｂ．）およびマクベイン  Ｃ．Ｊ．（ＭｃＢａｉｎ  Ｃ．Ｊ．）「Ｋｖ３  ｃｈａｎｎｅｌｓ：ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  Ｋ＋  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｆｉｒｉｎｇ」Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．９，５１７−５２６頁（２００１年））。これらの特性は、哺乳類の新皮質、海馬、聴神経核、および小脳において見られる神経集団に特有の、ほとんどまたは全く順応を伴わない活動電位の高頻度発火を促進する。Ｋｖ３チャネルは、他の電位依存性Ｋ＋チャネルと同様、四量体である。異なるＳｈａｗファミリーサブユニットは、互いに共会合可能であるが、他のＫｖサブファミリー由来のサブユニットとは共会合できない（コバルビアス  Ｍ．（Ｃｏｖａｒｒｕｂｉａｓ  Ｍ．）、ウェイ  Ａ．（Ｗｅｉ  Ａ．）およびサルコフ  Ｌ．（Ｓａｌｋｏｆｆ  Ｌ．）「Ｓｈａｋｅｒ，Ｓｈａｌ，Ｓｈａｂ，ａｎｄ  Ｓｈａｗ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｋ＋  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍｓ」Ｎｅｕｒｏｎ  ７，７６３−７７３頁（１９９１年）、シェン  Ｎ．Ｖ．（Ｓｈｅｎ  Ｎ．Ｖ．）およびファフィンガー  Ｐ．Ｊ．（Ｐｆａｆｆｉｎｇｅｒ  Ｐ．Ｊ．）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  Ｋ＋  ｃｈａｎｎｅｌ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｎｅｕｒｏｎ  １４，６２５−６３３頁（１９９５年））。
【００４８】
各サブユニットは、６つの膜貫通セグメントおよびリエントラントループを有する（図５ａ）。最初の４つの膜貫通セグメントＳ１〜Ｓ４が電圧センサドメインを構成する一方、最後の２つのセグメントのＳ５およびＳ６とリエントラントループはイオン選択孔を形成する（ロング  Ｓ．Ｂ．（Ｌｏｎｇ  Ｓ．Ｂ．）、キャンベル  Ｅ．Ｂ．（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｅ．Ｂ．）およびマッキノン  Ｒ．（ＭａｃＫｉｎｎｏｎ  Ｒ．）「Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｔｅ  ｏｆ  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｓｈａｋｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  Ｋ＋  ｃｈａｎｎｅｌ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９、８９７−８９０頁（２００５年））。フィリピン人における変異は、主な電圧感応素子のＳ４内に位置し、膜電位の変化に応答する複数の正に帯電した残基の１つを変化させる（アガルバル  Ｓ．Ｋ．（Ａｇｇａｒｗａｌ  Ｓ．Ｋ．）およびマッキノン  Ｒ．（ＭａｃＫｉｎｎｏｎ  Ｒ．）「Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓ４  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｔｏ  ｇａｔｉｎｇ  ｃｈａｒｇｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓｈａｋｅｒ  Ｋ＋  ｃｈａｎｎｅｌ」Ｎｅｕｒｏｎ  １６、１１６９−１１７７頁（１９９６年）、セオ  Ｓ．Ａ．（Ｓｅｏｈ  Ｓ．Ａ．）、シグ  Ｄ．（Ｓｉｇｇ  Ｄ．）、パパジアン  Ｄ．Ｍ．（Ｐａｐａｚｉａｎ  Ｄ．Ｍ．）およびベザニリャ  Ｆ．（Ｂｅｚａｎｉｌｌａ  Ｆ．）「Ｖｏｌｔａｇｅ−ｓｅｎｓｉｎｇ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓ２  ａｎｄ  Ｓ４  ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｈａｋｅｒ  Ｋ＋  ｃｈａｎｎｅｌ」Ｎｅｕｒｏｎ  １６、１１５９−１１６７頁（１９９６年））。
【００４９】
フランス人における変異はＳ５の細胞質末端内に存在し、それは孔の開口および閉鎖を伴うカップリング電圧センサの高次構造変化に関与する（シエ  Ｃ．Ｃ．（Ｓｈｉｅｈ  Ｃ．Ｃ．）、クレミック  Ｋ．Ｇ．（Ｋｌｅｍｉｃ  Ｋ．Ｇ．）およびキルシュ  Ｇ．Ｅ．（Ｋｉｒｓｃｈ  Ｇ．Ｅ．）「Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｅｇｍｅｎｔ  Ｓ５  ｏｎ  ｇａｔｉｎｇ  ｏｆ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｋ＋  ｃｈａｎｎｅｌｓ」Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０９、７６７−７７８頁（１９９７年））。Ｋｖ３チャネルに特有の脱分極の電圧依存性および速やかな非活性化は、電圧センサおよびＳ５における特定のアミノ酸残基によって与えられる関連特性である（スミス−マクスウェル  Ｃ．Ｊ．（Ｓｍｉｔｈ−Ｍａｘｗｅｌｌ  Ｃ．Ｊ．）、レドウェル  Ｊ．Ｌ．（Ｌｅｄｗｅｌｌ  Ｊ．Ｌ．）およびアルドリッチ  Ｒ．Ｗ．（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｒ．Ｗ．）「Ｕｎｃｈａｒｇｅｄ  Ｓ４  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１１、４２１−４３９頁（１９９８年））。重要なことに、Ｓ４およびＳ５内のＫＣＮＣ３タンパク質配列は、ｐｈｙｌａ内で１００％保存され、これはこれらのチャネルの専門化した役割に対する強い選択性を示唆している（図５ｂ）。この観察に合致して、フィリピン人またはアングロ−ヨーロッパ家系の正常人に由来する４００以上の対立遺伝子のスクリーニングでは、いずれの部位でも多型が全く見られなかったが、追加的な変異としてＲ４１７Ｈが見られた。それはまた、神経変性性の運動失調に関与するＫＣＮＣ３のＳ４セグメントにマッピングされる。
【００５０】
ＳＣＡ１３の変異の機能的な結果を検討するため、野生型および変異体のＫＣＮＣ３対立遺伝子をアフリカツメガエル卵母細胞内で発現させ、チャネル活性を２つの電極電圧クランプを用いて記録した。野生型Ｋｖ３．３チャネルの活性化が−１０ｍＶおよびより正の電位で検出された（図６ａ）。−９０ｍＶへの再分極時、チャネルは速やかに閉じた。それに対し、Ｒ４２０Ｈの発現により検出可能なチャネル活性は全く生じなかった（図６ａ）。野生型Ｋｖ３．３とＲ４２０Ｈサブユニットとの同時発現により、優性阻害効果に一致する電流増幅の抑制がもたらされた（図６ｂおよびｃ）。Ｒ４２０Ｈは、Ｋｖ１ファミリーのメンバーであるＳｈａｋｅｒの発現を抑制しなかった（図６ｃ）。これらの結果により、野生型および変異体のサブユニットのＫｖ３サブファミリーに特異的な共会合が非機能的チャネルをもたらすことが示された。
【００５１】
実施例３
電気生理学：ヒトＫｖ３．３  ｃＤＮＡクローン（ラエ  Ｊ．Ｌ．（Ｒａｅ  Ｊ．Ｌ．）およびシャパード  Ａ．Ｒ．（Ｓｈｅｐａｒｄ  Ａ．Ｒ．）「Ｋｖ３．３  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｉｎ  ｌｅｎｓ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ａｎｄ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ」Ｅｘｐ．Ｅｙｅ．Ｒｅｓ．７０、３３９−３４８頁（２０００年））のコーディング領域をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫベクターに転移した。ＲＮＡを転写し、標準的方法を用いた２つの電極電圧クランプ分析のためにアフリカツメガエル卵母細胞内に注入した（シルバーマン  Ｗ．Ｒ．（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  Ｗ．Ｒ．）、タン  Ｃ．Ｙ．（Ｔａｎｇ  Ｃ．Ｙ．）、モック  Ａ．Ｆ．（Ｍｏｃｋ  Ａ．Ｆ．）、フー  Ｋ．Ｂ．（Ｈｕｈ  Ｋ．Ｂ．）およびパパジアン  Ｄ．Ｍ．（Ｐａｐａｚｉａｎ  Ｄ．Ｍ．）「Ｍｇ（２＋）  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｂｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ  Ｓ２  ａｎｄ  Ｓ３．」Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１６、６６３−６７７頁（２０００年））。電流を、４ｍＭ  ＫＣｌ、８５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  ヘペス、ｐＨ７．２を含有する槽溶液中で注入後４８〜７２時間記録した。テイル電流を記録するため、槽溶液を８９ｍＭ  ＲｂＣｌ、２．４ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、０．８２ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ３）２、０．４１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭヘペス、ｐＨ７．２に交換した。優性阻害の実験のため、１ｎｇのＫｖ３．３またはＳｈａｋｅｒ  ＩＲ  ＲＮＡを、指定比率の変異体ＲＮＡの非存在下または存在下で注入した。
【００５２】
結果：Ｆ４４８Ｌの発現により、ゲート開閉の変化を伴うチャネルが生じた。Ｆ４４８Ｌの活性化が、野生型における−１０ｍＶに対し、−２０ｍＶで検出された（図７ａ）。電圧の関数としての開口の確率に関する分析により、活性化が過分極の方に約１３ｍＶシフトすることが確認された（図７ｂ）。Ｆ４４８Ｌおよび野生型の活性化速度は、双方が最大の開口確率を有する場合の電圧では類似していた（図７ｃ）。しかし、Ｆ４４８Ｌの非活性化速度は劇的に低下していた。−９０ｍＶへの再分極後、テイル電流を８９ｍＭのＲｂ＋槽溶液を用いて記録し、単一の指数関数成分に適合させた（図７ｄ）。これから、Ｆ４４８Ｌチャネルにおいてチャネル閉鎖が約７倍遅延することが示された。開口確率および非活性化速度の低下における過分極変化は、Ｆ４４８Ｌが開口状態の相対的安定性における向上を示すことに関連した研究結果である。Ｆ４４８Ｌは、Ｋｖ３．３チャネルの特性を、通常ロイシン残基を類似位置に有するＳｈａｋｅｒおよび他のチャネルの特性により近づける（図５ｂ）。
【００５３】
イオンチャネルの異常は心臓、腎臓、および骨格筋に関する疾患の原因としてまれであるが（グラベス  Ｔ．Ｄ．（Ｇｒａｖｅｓ  Ｔ．Ｄ．）およびハンナ  Ｍ．Ｇ．（Ｈａｎｎａ  Ｍ．Ｇ．）「Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｎｎｅｌｏｐａｔｈｉｅｓ」Ｐｏｓｔｇｒａｄ．Ｍｅｄ．Ｊ．８１、２０−３２頁（２００５年）、ドゥヴォラコウスカ  Ｂ．（Ｄｗｏｒａｋｏｗｓｋａ  Ｂ．）およびドロウィ  Ｋ．（Ｄｏｌｏｗｙ  Ｋ．）「Ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ」Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈ．Ｐｏｌ．４７、６８５−７０３頁（２０００年））、カリウムチャネルの変異が神経変性ではなくてんかんおよび発作性運動失調などの一時的現象に関連することから、ＫＣＮＣ３は変性運動失調における有望な候補ではなかった。さらに、マウスにおけるＫＣＮＣ３の欠損により、表現型が生じなかった（エスピノサ  Ｆ．（Ｅｓｐｉｎｏｓａ  Ｆ．）ら、「Ａｌｃｏｈｏｌ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｍｙｏｃｌｏｎｕｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  Ｋｖ３．１  ａｎｄ  Ｋｖ３．３」Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１、６６５７−６６６５頁（２００１年））。
【００５４】
小脳におけるＫｖ３チャネルの生理機能は、神経変性に関与する他のＳＣＡ遺伝子と異なり、幅広く研究されており、かなりよく理解されている（マルティナ  Ｍ．（Ｍａｒｔｉｎａ  Ｍ．）、ヤオ  Ｇ．Ｌ．（Ｙａｏ  Ｇ．Ｌ．）およびビーン  Ｂ．Ｐ．（Ｂｅａｎ  Ｂ．Ｐ．）「Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ  ｏｆ  ｒａｔ  ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  Ｐｕｒｋｉｎｊｅ  ｎｅｕｒｏｎｓ」Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３、５６９８−５７０７頁（２００３年）、マッケイ  Ｂ．Ｅ．（ＭｃＫａｙ  Ｂ．Ｅ．）およびターナー  Ｒ．Ｗ．（Ｔｕｒｎｅｒ  Ｒ．Ｗ．）「Ｋｖ３  Ｋ＋  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｅｎａｂｌｅ  ｂｕｒｓｔ  ｏｕｔｐｕｔ  ｉｎ  ｒａｔ  ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  Ｐｕｒｋｉｎｊｅ  ｃｅｌｌｓ」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０、７２９−７３９頁（２００４年））。小脳顆粒細胞、プルキンエ細胞、および深部小脳ニューロンにおいてはＫｖ３．３が発現され、そこでＫｖ３．１および／またはＫｖ３．４との共会合によりそれはヘテロ多量体チャネルを形成しうる（ゴールドマン−ウォール  Ｄ．Ｓ．（Ｇｏｌｄｍａｎ−Ｗｏｈｌ  Ｄ．Ｓ．）Ｄ．Ｓ．、チャン  Ｅ．（Ｃｈａｎ  Ｅ．）、ベアード  Ｄ．（Ｂａｉｒｄ  Ｄ．）およびハインツ  Ｎ．（Ｈｅｉｎｔｚ  Ｎ．）「Ｋｖ３．３ｂ：ａ  ｎｏｖｅｌ  Ｓｈａｗ  ｔｙｐｅ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  Ｐｕｒｋｉｎｊｅ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｄｅｅｐ  ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ｎｕｃｌｅｉ」Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４、５１１−５２２頁（１９９４年）、ワイサー  Ｍ．（Ｗｅｉｓｅｒ  Ｍ．）ら「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｈａｗ−ｒｅｌａｔｅｄ  Ｋ＋  ｃｈａｎｎｅｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ」Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４、９４９−９７２頁（１９９４年））。プルキンエ細胞内では、Ｋｖ３チャネルは、体性のＮａ＋スパイクと樹状のＣａ３＋スパイクの双方の再分極に関与する。Ｋｖ３チャネルは、ほとんどまたは全く頻度順応を伴わない１秒当たり数百の活動電位を発火させるニューロン内での高速スパイクにとって必須である。その脱分極の活性化範囲が理由で、Ｋｖ３チャネルが活動電位の間のみ開口し、高速の再分極に寄与することから、Ｎａ＋チャネルの不活性化からの回復が促進される。Ｋｖ３チャネルの高速の非活性化によって過分極後の経時変化が制限され、それにより不応期が短縮される。
【００５５】
ＳＣＡ１３の変異は、高速スパイクの小脳ニューロンの発火特性を破壊する可能性が高い。Ｋｖ３．３のノックアウトマウスは明確な運動表現型を全く有していないが、Ｋｖ３．１／Ｋｖ３．３の二重ノックアウトマウスは、震えおよび重度の運動失調を含む激しい症状を有する。Ｒ４２０ＨがＫｖ３．３ならびにＫｖ３ファミリー内の他のサブユニットにおける機能発現を抑制すると想定されることから、この変異は二重ノックアウトマウスにより匹敵しうる。小脳ニューロン内でのＫｖ３活性の薬理学的抑制により、活動電位の拡大、スパイク頻度の順応、および蓄積されたＮａ＋チャネルの不活性化からのスパイク欠陥がもたらされる。Ｒ４２０ＨおよびＲ４１７Ｈは類似の効果を有しうる。それに対し、Ｆ４４８Ｌは小脳ニューロンの最大発火速度を低下させると予測される。閉鎖速度の低下に起因して過分極後が延長されることから、閾値への回復が遅延しかつスパイク間の間隔が増大することになると思われる。細胞レベルでの変異の異なる効果は、２つの家系における対照的な表現型に合致する。Ｒ４２０Ｈがチャネル特性上の変化を全く伴うことなく電流増幅を低下させる一方、Ｆ４４８Ｌはゲート開閉の主要なパラメータを変更する。Ｆ４４８Ｌの機能的変更をさらに厳しくすることは、フランス人家系において観察される発症の早期化および疾患経過の沈静化と合致する。
【００５６】
Ｋｖ３チャネルの生理的特性は、神経変性の有望な機構における興味深い手掛かりをもたらす。Ｋｖ３チャネルは、プルキンエ細胞内での樹状のＣａ２＋スパイクの再分極に有意に寄与する。スパイク期間が拡大すればＣａ２＋の流入が増加することになり、これは神経細胞死に寄与しうる。さらに、Ｋｖ３．３およびＫｖ３．４チャネルの機能特性は、反応酸素種により調節される（ラッパースバーグ  Ｊ．Ｐ．（Ｒｕｐｐｅｒｓｂｅｒｇ  Ｊ．Ｐ．）「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｓｔ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＩＫ（Ａ）  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｂｙ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ」  Ｎａｔｕｒｅ  ３５２、７１１−７１４頁（１９９１年）、ヴェガ−サエンツ・デ・ミエラ  Ｅ．（Ｖｅｇａ−Ｓａｅｎｚ  ｄｅ  Ｍｉｅｒａ  Ｅ．）およびルビー  Ｂ．（Ｒｕｄｙ  Ｂ．）（１９９２年）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  １８６、１６８１−１６８７頁、デュプラット  Ｆ．（Ｄｕｐｒａｔ  Ｆ．）「Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  Ｋ＋  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｔｏ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２、１１７９６−１１８００頁（１９９５年））。変異体のＫｖ３．３サブユニットは、小脳ニューロンの酸化ストレスへの対応能に作用しうる。最終的に、形態分化と優れた電気特性の発生は、プルキンエ細胞内で密接な関連がある。これにより、形態的かつ電気的な成熟が独立した現象であるという可能性が高まる（マッケイ  Ｂ．Ｅ．（ＭｃＫａｙ  Ｂ．Ｅ．）およびターナー  Ｒ．Ｗ．（Ｔｕｒｎｅｒ  Ｒ．Ｗ．）「Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  Ｐｕｒｋｉｎｊｅ  ｃｅｌｌ」Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．印刷版に先行する電子出版（２００５年））。適切な電気特性の取得を破壊する変異は、ニューロンの長期生存性を低下させるわずかな発育不全を誘発しうる。
【００５７】
本発明者らの結果は、発達障害から遅発性神経変性疾患に至る表現型に関与する遺伝子における有効な候補が電位依存性カリウムチャネルであることを示している。小脳発生、成熟生物における小脳機能および神経細胞死を阻止するのに適するチャネル機能の役割という３つの別々であるが相関した機能に対する変異体ＫＣＮＣ３の重要性を評価するのにインビボ系が必要である可能性がある。両方の変異は、代償機構の重要性を強調する一部のファミリー間の表現型のばらつきおよび他の遺伝的かつ環境的な修飾因子の存在可能性を示す。小脳変性における電位依存性Ｋチャネルの役割をさらに理解することにより、チャネル機能を調節し、小脳機能を回復するだけでなく神経変性を低下させることを目的とした治療法がもたらされうる。
【００５８】
実施例４
カリウムチャネルは、天然に遍在し、哺乳類における神経および筋肉組織の電気興奮性において重要な役割を果たす。カリウムイオンチャネル障害は、ヒトにおいて一時的な神経疾患を誘発するものとして知られている。本発明では、神経発達／変性疾患のＳＣＡ１３を誘発する電位依存性カリウムチャネルＫＣＮＣ３（Ｋｖ３．３）における変異が同定されている。電圧感応ドメイン内に位置する１つの変異は、優性阻害効果を引き起こす。孔の開口および閉鎖をもたらす電圧センサの高次構造変化を生じさせるドメイン内に位置する第２の変異は、活性化曲線を負の方に変化させ、かつチャネルの閉鎖を遅延させる。この特性は、神経疾患におけるカリウムチャネルの役割を広げ、神経発達と神経変性の双方におけるその重要性を示唆している。
【００５９】
カリウムチャネルは、神経および筋肉における電気興奮性の多数の局面に作用し、かつその遺伝子における変異については一時的な神経疾患において記載がなされている１〜３。ここで本発明は、Ｋ＋チャネルの変異が神経発達／変性疾患の脊髄小脳失調も誘発することを示す。成人発症性運動失調を有するフィリピン人家系では、原因遺伝子は、小児期発症性の精神遅滞、運動失調および発作を有するフランス人家系において先行的に記載がなされたＳＣＡ１３遺伝子座と重複する１９ｇ１３にマッピングされている４。この領域は、小脳での発現に富む電位依存性ＳｈａｗカリウムチャネルをコードするＫＣＮＣ３（Ｋ０．３）を有する。ＫＣＮＣ３の配列決定により、フィリピン人家系における変異１５５４Ｇ→Ａ（Ｒ４２０Ｈ）およびフランス人家系における１６３９Ｃ→Ａ（Ｆ４４８Ｌ）が示された。両方の変異は、アフリカツメガエル卵母細胞発現系内のＫＣＮＣ３機能を変更する。チャネルの電圧センサ内に位置するＫＣＮＣ３  Ｒ４２０Ｈ６は、単独に発現される場合、検出可能なチャネル活性を全く有することなく、野生型ＫＣＮＣ３と同時発現される場合、強力な優性阻害効果を有していた。ＫＣＮＣ３  Ｆ４４８Ｌは、活性化曲線を負の方にシフトさせ、チャネル閉鎖の速度を約７倍低下させる。したがって、Ｒ４２０ＨおよびＦ４４８Ｌの変異は、ＫＣＮＣチャネルが高頻度発火のための能力を与える場合、高速スパイクの小脳ニューロンにおける出力特性を変化させると想定される。本発明では、電位依存性カリウムチャネルが発達障害から成人発症性神経変性に至る範囲の表現型に関与する遺伝子における有効な候補として同定されている。
【００６０】
優性脊髄小脳失調（ＳＣＡ）は、小脳性運動失調、錐体外路徴候、構音障害、動眼異常、運動ニューロン徴候、認知減退、てんかん、自律機能障害、感覚障害、および精神医学的徴候からなる表現型を有する異種の神経疾患である７，８。２６個のＳＣＡ遺伝子座については記載がなされており、１０においては原因遺伝子または変異体が決定されている。大部分のＳＣＡ遺伝子の正常機能についてはほとんど知られていないが、その大半はポリグルタミン（ポリＱ）拡大疾患を示す。
【００６１】
磁気共鳴イメージング（図４）上で著明な小脳徴候および症状９ならびに小脳萎縮を有する成人発症性の優性運動失調を分離している三世代フィリピン人家族が先行的に同定されている。画像化された臨床的表現型は変性ＳＣＡに特有である。全ゲノム連鎖スキャンによると、３．８９ＬＯＤスコアを有する１９ｑ１３の約４ｃＭ領域内に疾患遺伝子座が見られた。この領域は、軽度精神遅滞、早期発症性運動失調、および進行遅延を有するフランス人家系においてマッピングされるＳＣＡ１３遺伝子座４と部分的に重複したが、フィリピン人の表現型は、ＳＣＡ１３とは臨床的に識別可能であった。高解像度マッピングにより、連鎖領域は−９００Ｋ塩基まで減少した。ハプロタイプを図４に示す。
【００６２】
数種のマーカーによると、組換え事象が全く示されなかった。偏性組換え体がＤ１９Ｓ８６７とＤ１９Ｓ５５３の双方において検出され、それらはＤ１９Ｓ９０４近傍の疾患遺伝子の推定位置を提供するＬＯＤ−１ドロップ間隔を有する物理的候補領域を定めた。この領域はＫＣＮＣ３を含む約４０の候補遺伝子を有していた。
【００６３】
電位依存性Ｋ＋チャネルの中で、Ｋｖ３チャネルの機能特性は特有である。Ｋｖ３チャネルは、他のＫｖチャネルと比べてより脱分極される範囲内で活性化し、ずっと高速に閉じる１０。これらの特性は、哺乳類の新皮質、海馬、聴神経核、および小脳において見られる神経集団に特有の、ほとんどまたは全く順応のない活動電位の高頻度発火を促進する１０。Ｋｖ３チャネルは、他の電位依存性Ｋ＋チャネルと同様、四量体である。異なるＳｈａｗファミリーサブユニットは互いに共会合可能であるが、他のＫｖサブファミリー由来のサブユニットとは共会合できない１１，１２。各サブユニットは、６つの膜貫通セグメントおよびリエントラントループを有する（図５ａ）。最初の４つの膜貫通セグメントＳ１〜Ｓ４が電圧センサドメインを構成する一方、最後の２つのセグメントのＳ５およびＳ６とリエントラントループはイオン選択孔を形成する１３。Ｋｖ３チャネルに特有の脱分極の電圧依存性および速やかな非活性化は、電圧センサおよびＳ５における特定のアミノ酸残基によって与えられる関連特性である１４，１５。フィリピン人における変異（図４Ｅ）は、主な電圧感応素子のＳ４内に位置し（図５Ａ）、膜電位の変化に応答する正に帯電した残基の１つを変化させる６，１６。フランス人における変異（図４Ｆ）はＳ５の細胞質末端内に存在し（図５Ａ）、それは孔の開口および閉鎖を伴うカップリング電圧センサの高次構造変化に関与する１４。これらの変異は、高度に浸透した表現型（ｈｉｇｈｌｙ  ｐｅｎｅｔｒａｎｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ）をもたらすものであり、すべての罹患者において同定されたが、臨床的に正常な家族員においては同定されなかった。この観察に合致して、フィリピン人またはアングロ−ヨーロッパ家系の正常人に由来する４００以上の対立遺伝子のスクリーニングでは、いずれの部位でも多型が全く見られなかった。重要なことに、Ｓ４およびＳ５内のＫＣＮＣアミノ酸配列は、ｐｈｙｌａ内で１００％保存され、これはこれらのチャネルの高度に専門化した役割に対する強い選択性を示唆している（図５）。
【００６４】
ＳＣＡ１３の変異の機能的な結果を検討するため、野生型および変異体のＫＣＮＣ３対立遺伝子をアフリカツメガエル卵母細胞内で発現させ、チャネル活性を２つの電極電圧クランプを用いて記録した。野生型Ｋｖ３．３チャネルの活性化が−１０ｍＶおよびより正の電位で検出された（図６Ａ）。−９０ｍＶへの再分極時、チャネルは速やかに閉じた。それに対し、Ｒ４２０Ｈの発現により検出可能なチャネル活性は全く生じなかった（図６Ａ）。野生型Ｋｖ３．３およびＲ４２０Ｈサブユニットの同時発現により、優性阻害効果に一致する電流増幅の抑制がもたらされた（図６Ｂ）。Ｒ４２０Ｈは、Ｋｖ１ファミリーのメンバーであるＳｈａｋｅｒの機能発現を抑制しなかった（図６Ｂ）。これらの結果により、野生型および変異体のサブユニットのＫｖ３サブファミリーに特異的な共会合が非機能的チャネルをもたらすことが示された。
【００６５】
Ｆ４４８Ｌの発現により、ゲート開閉の変化を伴うチャネルが生じた。Ｆ４４８Ｌの活性化が、野生型における−１０ｍＶに対し、−２０ｍＶで検出された（図７Ａ）。電圧の関数としての開口の確率に関する分析により、活性化が過分極の方に約１３ｍＶシフトすることが確認された（図７Ｂ）。Ｆ４４８Ｌおよび野生型の活性化速度は、双方が最大の開口確率を有する場合の電圧では類似していた（図７Ｃ）。しかし、Ｆ４４８Ｌの非活性化速度は劇的に低下していた。−９０ｍＶへの再分極後、テイル電流を８９ｍＭのＲｂ＋槽溶液を用いて記録し、単一の指数関数成分に適合させた（図７Ｄ）。これから、Ｆ４４８Ｌにおいてチャネル閉鎖が約７倍遅延することが示された。開口確率および非活性化速度の低下における過分極変化は、Ｆ４４８Ｌが開口状態の相対的安定性における向上を示すことに関連した研究結果である。Ｆ４４８Ｌは、Ｋｖ３．３チャネルの特性を、通常ロイシン残基を類似位置に有するＳｈａｋｅｒおよび他のチャネルの特性により近づける（図５Ｂ）。
【００６６】
脊髄小脳失調に関与する他の遺伝子と異なり、小脳におけるＫｖ３チャネルの生理機能については幅広く研究されており、かなりよく理解されている１７．１８。小脳顆粒細胞、プルキンエ細胞、および深部小脳ニューロンにおいてはＫｖ３．３が発現され、そこでＫｖ３．１および／またはＫｖ３．４との共会合によりそれはヘテロ多量体チャネルを形成しうる１９，２０。プルキンエ細胞内では、Ｋｖ３チャネルは、体細胞のＮａ＋スパイクと樹状細胞のＣａ２＋スパイクの双方の再分極に関与する１８。ＫＣＮＣ１（Ｋｖ３．１）、ＫＣＮＣ２（Ｋｖ３．２）、ＫＣＮＣ３（Ｋｖ３．３）、およびＫＣＮＣ４（Ｋｖ３．４）を含むＫｖ３チャネルは、ほとんどまたは全く頻度順応を伴わない１秒当たり数百の活動電位を発火させるニューロン内での高速スパイクにとって必須である１０。その脱分極の活性化範囲が理由で、Ｋｖ３チャネルが活動電位の間のみ開口し、高速の再分極に寄与することから、Ｎａ＋チャネルの不活性化からの回復が促進される。Ｋｖ３チャネルの高速の非活性化によって過分極後の経時変化が制限され、それにより不応期が短縮される。
【００６７】
ＳＣＡ１３の変異は、高速スパイクの小脳ニューロンの発火特性を破壊する可能性が高い。Ｋｖ３．３のノックアウトマウスは明確な運動表現型を全く有していないが、Ｋｖ３．１／Ｋｖ３．３の二重ノックアウトマウスは、震えおよび重度の運動失調を含む激しい症状を有する２１。Ｒ４２０ＨがＫｖ３．３ならびにＫｖ３ファミリー内の他のサブユニットにおける機能発現を抑制すると想定されることから、この変異は二重ノックアウトマウスにより匹敵しうる。小脳ニューロン内でのＫｖ３活性の薬理学的抑制により、活動電位の拡大、スパイク頻度順応、および蓄積されたＮａ＋チャネルの不活性化からのスパイク欠陥がもたらされる１８。Ｒ４２０Ｈは類似の効果を有しうる。それに対し、Ｆ４４８Ｌは小脳ニューロンの最大発火速度を低下させると予測される。閉鎖速度の低下に起因して過分極後が延長されることから、閾値への回復が遅延しかつスパイク間間隔が増大することになると思われる。細胞レベルでの変異の異なる効果は、２つの家系における対照的な表現型を示しうる。
【００６８】
Ｋｖ３チャネルの生理的特性は、神経変性の有望な機構における興味深い手掛かりをもたらす。Ｋｖ３チャネルは、プルキンエ細胞内での樹状のＣａ２＋スパイクの再分極に有意に寄与する１８。スパイク期間が拡大すればＣａ２＋の流入が増加することになり、これは神経細胞死に寄与しうる。さらに、Ｋｖ３．３およびＫｖ３．４チャネルの機能特性は、反応酸素種により調節される２２〜２４。
【００６９】
変異体のＫｖ３．３サブユニットは、小脳ニューロンの酸化ストレスへの対応能に作用しうる。最終的に、形態分化と優れた電気特性の発生は、プルキンエ細胞内で密接な関連がある。これにより、形態的かつ電気的な成熟が独立した現象であるという可能性が高まる２５。適切な電気特性の取得を破壊する変異は、ニューロンの長期生存性を低下させるわずかな発育不全を誘発しうる。
【００７０】
本発明では、ＫＣＮＣ３の変異がＳＣＡ１３における原因物質として同定され、かつ発達障害から遅発性神経変性疾患に至る表現型における電位依存性カリウムチャネルの重要性が示される。インビボ系が小脳発生、成熟生物における小脳機能および神経細胞死を阻止するのに適するチャネル機能の役割という３つの別々であるが相関した機能に対する変異体ＫＣＮＣ３の重要性を評価できるという可能性がある。両方の変異は、代償機構の重要性を強調する一部のファミリー間の表現型のばらつきおよび他の遺伝的かつ環境的な修飾因子の存在可能性を示す。小脳変性における電位依存性Ｋチャネルの役割をさらに理解することにより、チャネル機能を調節し、小脳機能を回復しかつ神経変性を低下させることを目的とした治療法がもたらされうる。
【００７１】
方法
患者：小脳性運動失調における優性形質を分離しているフィリピン人家族について試験した。発端者、第二世代における７名および第三世代における３名を含む罹患者が１１名であった。さらに、第二世代では非罹患者が５名であり、第三世代では非罹患者が１名で危険な状態にある患者が１９名であった。１５名の家族員からインフォームドコンセントが得られた後、血液を採取し、ＤＮＡを抽出した。
【００７２】
変異および連鎖解析：１９ｑ１３領域内での連鎖をさらに評価するため、発端者、第二世代における７名の罹患者および４名の非罹患者ならびに第三世代における３名の罹患者において、さらなるマーカーをタイピングした。高解像度マッピングを、Ｅｎｓｅｍｂｌゲノムブラウザ（３１．３５ｄでリリース）からの１９ｑ１３の領域内で得たジヌクレオチド反復マーカーのＰＣＲ増幅により行った。ＰＣＲ産物を６％変性ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により分析した。
【００７３】
配列分析：ＡＢＩ（フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）、カリフォルニア州）「ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１」サイクル配列決定キットおよび以下のプロトコルを用い、ＤＮＡ配列決定を行った。５ｎｇ（５ｍｌ）の精製ＰＣＲアンプリコン、反応予備混合物４ｍｌ、５倍の配列決定緩衝液２ｍｌ、３．２ｐモル（２ｍｌ）の適切なプライマー、および脱イオン水７ｍｌを９６ウェルのマイクロタイタープレートに添加し、ＰＣＲサーモサイクラー（ＭＪリサーチ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）  ＰＴＣ−２００）に移し、１）９６℃で１分間、２）９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、次いで６０℃で４分間からなるＸ２５サイクル、および３）エクソン１−５’ＴＡＧ  ＧＴＧ  ＡＧＧ  ＧＣＧ  ＴＧＣ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＴＴ、３’ＧＣＣ  ＣＧＣ  ＧＧＡ  ＡＧＧ  ＡＣＧ  ＡＧＡ  Ｃ、５’ＣＴＣ  ＣＣＡ  ＣＣＣ  ＡＡＴ  ＣＣＣ  ＧＴＣ  ＧＧＴ  Ｃ、３’ＧＣＧ  ＡＴＧ  ＣＴＧ  ＣＣＧ  ＧＴＡ  ＧＧＴ  ＣＡＴ  ＣＣ、５７ＴＣ  ＧＣＧ  ＴＡＣ  ＧＴＧ  ＣＴＣ  ＡＡＣ  ＴＡＣ  ＴＡ、３’ＴＧＧ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＧＧＣ  ＴＴＣ  ＴＡＧ  ＧＡＧ、エクソン２−５’ＧＧＧ  ＣＡＣ  ＴＧＧ  ＡＡＧ  ＧＧＴ  ＣＴＴ、３’ＡＴＧ  ＧＧＧ  ＡＴＧ  ＴＴＣ  ＴＴＧ  ＡＡＧ  ＴＡＧ  ＧＴ、５’ＣＧＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＴ  ＴＴＡ  ＣＴＡ  ＣＧＣ、３’ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＴＣＣ  ＣＴＣ  ＡＣＣ  ＴＣＴ  ＴＣＧ  ＡＣ、エクソン３／４−５’ＡＴＣ  ＴＴＧ  ＣＣＣ  ＣＡＣ  ＣＧＣ  ＧＴＧ  ＴＴＣ  Ａ、３’ＣＧＧ  ＴＣＡ  ＧＴＧ  ＧＧＧ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＴＧＴ  ＴＣ、エクソン５−５’ＧＡＡ  ＡＴＧ  ＡＴＣ  ＣＣＧ  ＧＣＧ  ＧＣＧ  ＴＴＴ  ＣＴ、３’ＧＧＣ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＧＣＧ  ＧＧＡ  ＴＧＧ  ＴＧのような配列決定プライマーに従って繰り返した。次いで、ＡＢＩ  Ｃｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐ’ｍスピンカラムを使用して配列決定産物を精製した。次いで、再懸濁試料を、製造業者のプロトコルに従い、ＡＢＩ  ３７７  ＤＮＡシーケンサーにおける４．５％アクリルアミドゲル上で電気泳動させた。すべての配列を、バイオエディット（ＢｉｏＥｄｉｔ）の生物学的配列アラインメントエディタのバージョン５．０．９．１を用いて分析した。
【００７４】
電気生理学：ヒトＫｖ３．３  ｃＤＮＡクローンのコーディング領域をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫベクターに転移した。ＲＮＡを転写し、標準的方法を用いた２つの電極電圧クランプ分析のためにアフリカツメガエル卵母細胞内に注入した２８。電流を、４ｍＭ  ＫＣｌ、８５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  ヘペス、ｐＨ７．２を含有する槽溶液中で注入後４８〜７２時間記録した。テイル電流を記録するため、槽溶液を８９ｍＭ  ＲｂＣｌ、２．４ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、０．８２ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ３）２、０．４１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭヘペス、ｐＨ７．２に交換した。優性阻害の実験のため、１ｎｇのＫｖ３．３またはＳｈａｋｅｒ  ＩＲ  ＲＮＡを、指定比率の変異体ＲＮＡの非存在下または存在下で注入した。
【００７５】
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
１．  Ｔ．  Ｄ．  Ｇｒａｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｇ．  Ｈａｎｎａ，  Ｐｏｓｔｇｒａｄ．  Ｍｅｄ．  Ｊ．  ８１，  ２０  （２００５）．
２．  Ｄｗｏｒａｋｏｗｓｋａ  ａｎｄ  Ｋ．  Ｄｏｌｏｗｙ，  Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈ．  Ｐｏｌ．  ４７，  ６８５  （２０００）．
３．  Ｊ．  Ｃ．  Ｍｕｌｌｅｙ，  Ｉ．  Ｅ．  Ｓｃｈｅｆｆｅｒ，  Ｓ．  Ｐｅｔｒｏｕ，  Ｓ．  Ｆ．  Ｂｅｒｋｏｖｉｃ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  １６，１７１  （２００３）．
４．  Ａ．  Ｈｅｒｍａｎ−Ｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  ６７，  ２２９  （２０００）．
５．  Ｐ．  Ｇｈａｎｓｈａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １２，  １９０  （１９９２）．
６．  Ｓ．  Ｋ．  Ａｇｇａｒｗａｌ  ａｎｄ  Ｒ．  ＭａｃＫｉｎｎｏｎ，  Ｎｅｕｒｏｎ  １６，１１６９  （１９９６）．
７．  Ｓ．  Ｍ．  Ｐｕｌｓｔ，  Ｅｄ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｍｏｖｅｍｅｎｔ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ２００２．
８．  Ｌ．  Ｓｃｈｏｌｓ，  Ｐ．  Ｂａｕｅｒ，  Ｔ．  Ｓｃｈｍｉｄｔ，  Ｔ．  Ｓｃｈｕｌｔｅ，  Ｏ．  Ｒｉｅｓｓ，  Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．  ５，  ２９１  （２００４）．
９．  Ｍ．  Ｆ．  Ｗａｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ  （２００５）．
１０．  Ｂ．  Ｒｕｄｙ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｊ．  ＭｃＢａｉｎ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ９，  ５１７  （２００１）．
１１．  Ｍ．  Ｃｏｖａｒｒｕｂｉａｓ，  Ａ．  Ｗｅｉ，  Ｌ．  Ｓａｌｋｏｆｆ，  Ｎｅｕｒｏｎ  ７，  ７６３  （１９９１）．
１２．  Ｎ．  Ｖ．  Ｓｈｅｎ，  ａｎｄ  Ｐ．  Ｊ．  Ｐｆａｆｆｉｎｇｅｒ，  Ｎｅｕｒｏｎ  １４，  ６２５  （１９９５）．
１３．  Ｓ．  Ｂ．  Ｌｏｎｇ，  Ｅ．  Ｂ．  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  Ｒ．  ＭａｃＫｉｎｎｏｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９，  ８９７  （２００５）．
１４．  Ｃ．  Ｃ．  Ｓｈｉｅｈ，  Ｋ．  Ｇ．  Ｋｌｅｍｉｃ，  Ｇ．  Ｅ．  Ｋｉｒｓｃｈ，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １０９，  ７６７  （１９９７）．
１５．  Ｃ．  Ｊ．  Ｓｍｉｔｈ−Ｍａｘｗｅｌｌ，  Ｊ．  Ｌ．  Ｌｅｄｗｅｌｌ，  Ｒ．  Ｗ．  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １１１，  ４２１  （１９９８）．
１６  Ｓ．  Ａ．  Ｓｅｏｈ，  Ｄ．  Ｓｉｇｇ，  Ｄ．  Ｍ．  Ｐａｐａｚｉａｎ，  Ｆ．  Ｂｅｚａｎｉｌｌａ，  Ｎｅｕｒｏｎ  １６，１１５９  （１９９６）．
１７．  Ｍ．  Ｍａｒｔｉｎａ，  Ｇ．  Ｌ．  Ｙａｏ，  Ｂ．  Ｐ．  Ｂｅａｎ，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２３，  ５６９８  （２００３）．
１８．  Ｂ．  Ｅ．  ＭｃＫａｙ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｗ．  Ｔｕｒｎｅｒ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２０，  ７２９  （２００４）．
１９．  Ｄ．  Ｓ．  Ｇｏｌｄｍａｎ−Ｗｏｈｌ，  Ｅ．  Ｃｈａｎ，  Ｄ．  Ｂａｉｒｄ，  Ｎ．  Ｈｅｉｎｔｚ，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １４，  ５１１  （１９９４）．
２０．  Ｍ．  Ｗｅｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １４，  ９４９  （１９９４）．
２１．  Ｆ．  Ｅｓｐｉｎｏｓａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２１，  ６６５７  （２００１）．
２２．  １  Ｐ．  Ｒｕｐｐｅｒｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５２，  ７１１  （１９９１）．
２３．  Ｅ．  Ｖｅｇａ−Ｓａｅｎｚ  ｄｅ  Ｍｉｅｒａ，  Ｂ．  Ｒｕｄｙ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  １８６，  １６８１  （１９９２）．
２４．  Ｆ．  Ｄｕｐｒａｔ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９２，  １１７９６  （１９９５）．
２５．  Ｂ．  Ｅ．  ＭｃＫａｙ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｗ．  Ｔｕｒｎｅｒ，  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ  （２００５）．
２６．  Ｃ．  Ｔ．  Ｓｃｈｕｌｔｅｉｓ，  Ｎ．  Ｎａｇａｙａ，  Ｄ．  Ｍ．  Ｐａｐａｚｉａｎ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３，  ２６２１０  （１９９８）．
２７．  １  Ｌ．  Ｒａｅ，  Ａ．  Ｒ．  Ｓｈｅｐａｒｄ，  Ｅｘｐ．  Ｅｙｅ．  Ｒｅｓ．  ７０，３３９  （２０００）．
２８．  Ｗ．  Ｒ．  Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，  Ｃ．  Ｙ．  Ｔａｎｇ，  Ａ．  Ｆ．  Ｍｏｃｋ，  Ｋ．  Ｂ．  Ｈｕｈ，  Ｄ．  Ｍ．  Ｐａｐａｚｉａｎ，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  ＰｈｙｓｉｏＬ  １１６，  ６６３  （２０００）．
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】最小数の組換え事象を仮定した、フィリピン人家系における６種の有用な第１９染色体マーカーにおけるハプロタイプ。ＩＩ−５とＩＩ−８の個人における重要な組換え事象に注意のこと。罹患者は黒塗りの記号で示される。試験時の年齢および発症年齢はハプロタイプの上に太字で示される。
【図２】１２種の第１９染色体マーカーを用いた多点連鎖分析。最大のＬＯＤは７８ｃＭで３．８３である。０．００１の対立遺伝子頻度および９５％（実線）または９９％（破線）の浸透度を有する常染色体優性遺伝を仮定した連鎖分析が行われる。遺伝的距離はマーシュフィールド（Ｍａｒｓｈｆｉｅｌｄ）遺伝子地図に基づく。
【図３】表１：選択された罹患した家族員における臨床的特徴（＋−軽度、＋＋−中等度、＋＋＋−重度）。
【図４】常染色体優性の脊髄小脳失調を有するフィリピン人家系。ａ．フィリピン人家系および最小数の組換え事象を仮定した５種の有用な第１９染色体マーカーにおけるハプロタイプ。ＩＩ−５とＩＩ−８の個人における重要な組換え事象に注意のこと。疾患で分離しているハプロタイプブロックは網掛けされている。罹患者は黒塗りの記号で示される。試験時の年齢および発症年齢はハプロタイプの上に太字で示される。発端者は矢印で示される。ＩＩＩ−２（ｂ）およびＩＩ−１（ｃ）の個人におけるＴ１シーケンスの矢状ＭＲ画像は著明な小脳容量の欠損を示す。疾患の期間は、ＩＩＩ−２では１６年、ＩＩ−１では４３年であり、これはＩＩ−１における変性がより著明であることを示すようである。ｄ．およびｅ．ＤＮＡ配列分析では、ＳＣＡ１３を誘発する、Ｋｖ３．３のエクソン２における１５５４Ｇ→Ａおよび１６３９Ｃ→Ａの点変異が見られた。野生型（ＷＴ）の配列と同様、センス鎖とアンチセンス鎖の双方が示される。変異はアスタリスクで指定される。
【図５】Ｓｈａｗ−サブファミリーの電位依存性カリウムチャネルの機能モチーフおよび配列比較。ａ．６つの機能ドメインおよびリエントラントループを図示する単一のＫｖ３．３サブユニットの概略図。セグメントＳ１〜Ｓ４は電圧センサドメインを形成する。Ｓ４センス内で正に帯電したアルギニン残基の電圧は変化する。セグメントＳ５、Ｓ６およびリエントラントループはイオン選択孔を形成する。Ｓ５は、孔外部ヘリックスを形成し、孔の開口および閉鎖を伴う電圧センサの高次構造変化と共役するように機能する。ＳＣＡ１３の変異は矢印で示される。ｂ．Ｋｖ３．３のＳ４およびＳ５機能ドメインの種全体にわたるアミノ酸配列比較では、１００％の保存が見られる。黄色はＲ４２０Ｈ（Ｓ４）およびＦ４４８Ｌ（Ｓ５）の変異を強調する。赤色は３番目の位置ごとに生じる正に帯電したアルギニン残基を強調する。
【図６】Ｒ４２０Ｈのサブファミリーに特異的な優性阻害効果。ａ．野生型（左）およびＲ４２０Ｈ（右）チャネルからの電流トレースが、電圧を−９０ｍＶから−８０〜＋７０ｍＶの範囲に１０ｍＶずつ漸増させることにより誘発された。野生型では、部分的な不活性化が＋２０ｍＶよりも高電位で観察された。野生型チャネルからの０ｍＶ記録値が、図４ａとの比較のために表記される。ｂ．上パネルは、単独で（１：０）またはＲ４２０Ｈの指定比率での存在下で発現された野生型Ｋｖ３．３における、−９０ｍＶ〜＋６０ｍＶの漸増により誘発された代表的な電流トレースを示す。下パネルは、単独で発現された（１：０）または指定比率でＫｖ３．３−Ｒ４２０ＨもしくはＳｈａｋｅｒ−Ｃ４６２Ｋ（Ｓｈ−Ｃ４６２Ｋ、非機能的Ｓｈａｋｅｒサブユニット２４）とともに発現されたＫｖ３．３野生型における、＋６０ｍＶで正規化されたピーク電流増幅値をプロットしたものである。さらに、単独で発現された（１：０）または指定比率でＫｖ３．３−Ｒ４２０ＨもしくはＳｈ−Ｃ４６２Ｋとともに発現された、不活性化を除いたＳｈａｋｅｒ（Ｓｈ−ＩＲ）における、＋６０ｍＶでのピーク電流増幅値も示される。値が平均±ＳＥＭ、ｎ＝４〜１０として与えられる。一元配置分散分析により試験される統計的有意性、ｐ＜０．０５：＊、１：０と異なる、＊＊、１：１と異なる、＊＊＊、１：２．５と異なる。
【図７】Ｆ４４８Ｌにおけるゲート開閉の変化。ａ．Ｆ４４８Ｌチャネルからの電流トレースが、電圧を−９０ｍＶから−８０〜＋７０ｍＶの範囲に１０ｍＶずつ漸増させることにより誘発された。０ｍＶ記録値が、図３ａとの比較のために表示される。ｂ．電圧の関数としての開口の確率（Ｐｏ）を測定するため、−９０ｍＶから様々な試験電位に漸増させ、次いで−９０ｍＶに再分極することにより、野生型またはＦ４４８Ｌの電流が誘発された。槽溶液は８９ｍＭのＲｂ＋を含有した。等時性のテイル電流増幅値が、実験で得られた最大値に正規化され、試験電位に対してプロットされた。野生型は黒四角、Ｆ４４８Ｌは白四角である。値が平均±ＳＥＭ、ｎ＝６（Ｆ４４８Ｌ）または７（野生型）として与えられる。データセットを単一のボルツマン関数（実線）と適合させることで、野生型およびＦ４４８Ｌチャネルに対してそれぞれ２．８±１．０ｍＶおよび−９．６±１．３ｍＶの中点電圧ならびに７．６±０．３および７．６±０．１の傾斜因子がもたらされた。中点電圧は有意に異なっていた（一元配置分散分析でｐ＜０．０５）。ｃ．＋６０ｍＶで得られる代表的な電流トレースが、野生型（固体）およびＦ４４８Ｌ（破線）において縮尺され、重ね合わせられている。ｄ．左パネル：８９ｍＭのＲｂ＋槽溶液中で記録された、野生型（固体）およびＦ４４８Ｌ（破線）からの代表的なテイル電流が＋２０〜−９０ｍＶに漸減させることによって得られた。トレースは縮尺され、重ね合わせられている。テイル電流を単一の指数関数（実線）と適合させることで、非活性化時間定数τｄｅａｃｔについての値が得られた。右パネル：野生型およびＦ４４８Ｌにおけるτｄｅａｃｔのボックスプロット。平均値±ＳＥＭは、野生型（ｎ＝７）およびＦ４４８Ｌ（ｎ＝４）に対してそれぞれ２±０．２ｍｓおよび１３．３±１．０ｍｓであった。τｄｅａｃｔの値は、一元配置分散分析により有意に異なっていた（＊、ｐ＜０．０５）。
【図８】ＫＣＮＣ３内の残基Ｒ４２０、Ｒ４１７およびＦ４４８を含む残基の保存を示す、電位依存性カリウムチャネルのＫＣＮＣファミリーの配列アラインメント。
【図１】
2008538699.tif 000003
【図２】
2008538699.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2008538699.tif 000008
【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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