(57)【要約】【課題】Ｂ群連鎖球菌属（Ｇｒｏｕｐ Ｂ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）を検出するための組成物、方法及びキット。【解決手段】特に、極めて低レベルのＢ群連鎖球菌属核酸を検出するための増幅プライマー及びハイブリダイゼーションプローブとして有用なオリゴヌクレオチドを記載する。【選択図】図１
2008529501.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）核酸を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイプローブであって、下記：
標的相補的塩基配列、及び、場合により、検出すべき核酸に対して相補的でない１以上の塩基配列を含む、プローブ配列であって、
前記標的相補的塩基配列は、配列番号３の配列に含まれる１６〜２０個の連続塩基又はその相補配列からなり、ＲＮＡ及びＤＮＡの均等物並びにヌクレオチド類似体が存在してもよく、
前記ハイブリダイゼーションアッセイプローブの長さは、最高３０塩基である；
を含む、前記ハイブリダイゼーションアッセイプローブ。
【請求項２】
プローブ配列が、検出すべき核酸に対して相補的でない１以上の任意の塩基配列を含む、請求項１のハイブリダイゼーションアッセイプローブ。
【請求項３】
さらに検出可能な標識を含む、請求項２のハイブリダイゼーションアッセイプローブ。
【請求項４】
さらに発蛍光団部分及び消光体部分を含み、ハイブリダイゼーションアッセイプローブが分子ビーコンである、請求項２のハイブリダイゼーションアッセイプローブ。
【請求項５】
標的相補的塩基配列が、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７からなる群から選択される、請求項４のハイブリダイゼーションアッセイプローブ。
【請求項６】
プローブ配列が、検出すべき核酸に対して相補的でない１以上の任意塩基配列を含まない、請求項１のハイブリダイゼーションアッセイプローブ。
【請求項７】
さらに検出可能な標識を含む、請求項６のハイブリダイゼーションアッセイプローブ。
【請求項８】
検出可能な標識が化学発光性標識及び蛍光性標識からなる群から選択される、請求項７のハイブリダイゼーションアッセイプローブ。
【請求項９】
生物試料中に存在する可能性のあるストレプトコッカス・アガラクティエ核酸配列を増幅するためのキットであって、下記：
３’末端標的相補的配列、及び、場合により、増幅すべきストレプトコッカス・アガラクティエ核酸配列に対して相補的でない第１プライマー上流配列を含む、第１プライマーであって、前記第１プライマーの３’末端標的相補的配列は、配列番号２に含まれる２５個の連続塩基を含み、ＲＮＡ及びＤＮＡの均等物並びにヌクレオチド類似体が存在してもよく；並びに
３’末端標的相補的配列、及び、場合により、増幅すべきストレプトコッカス・アガラクティエ核酸配列に対して相補的でない第２プライマー上流配列を含む、第２プライマーであって、前記第２プライマーの３’末端標的相補的配列は、配列番号１に含まれる２０個の連続塩基を含み、ＲＮＡ及びＤＮＡの均等物並びにヌクレオチド類似体が存在してもよい；
を含む、前記キット。
【請求項１０】
第１プライマー及び第２プライマーの長さが各々最高５８塩基である、請求項９のキット。
【請求項１１】
第１プライマーの３’末端標的相補的配列及び第２プライマーの３’末端標的相補的配列の長さが各々最高３１塩基である、請求項９のキット。
【請求項１２】
第２プライマーの３’末端標的相補的配列の長さが最高２１塩基である、請求項１１のキット。
【請求項１３】
第１プライマーが第１プライマー上流配列を含む、請求項１２のキット。
【請求項１４】
第１プライマー上流配列がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター配列を含む、請求項１３のキット。
【請求項１５】
第１プライマーの３’末端標的相補的配列が配列番号８、配列番号９及び配列番号１０からなる群から選択され、第２プライマーの３’末端標的相補的配列が配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群から選択される、請求項１２のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国仮特許出願第６０／６５０，５０１号（２００５年２月７日出願）に基づく優先権を主張する。この優先権出願の開示内容全体を本明細書に援用する。
【０００２】
発明の分野
本発明は生命工学分野に関する。より具体的には、本発明はＢ群連鎖球菌属（ＧｒｏｕｐＢ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ（ＧＢＳ））の核酸を検出するための診断アッセイに関する。
【背景技術】
【０００３】
より一般的にはＢ群連鎖球菌属として知られるストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）は、新生児の敗血症及び髄膜炎の主因の１つである。Ｂ群疾患の発症率は、生児出生１０００人につき２〜５人の乳児と推定される。早期発症型の本疾患は生後１週間以内に発症し、死亡率は５０％を超える。７日目以降に発症した場合、死亡率は１４〜２３％に低下する。膣部や肛門直腸部にＢ群連鎖球菌が定着している女性及び遅延分娩又は難産の女性から産まれた場合、新生児はＢ群疾患のリスクが高い。Ｂ群疾患を予防する方法として、ＣＤＣは全妊婦について妊娠３５〜３７週目に肛門性器部のＢ群連鎖球菌定着をスクリーニングすることを推奨し、これにより、保菌者と同定された全ての女性に分娩時抗菌予防処置を施すことができる。スクリーニングは膣及び／又は肛門直腸のスワブを採取し、それらをリム（Ｌｉｍ）ブロス等の推奨培地で１８〜２４時間インキュベートして培養することにより行われる。Ｂ群連鎖球菌は成人でも重篤な疾患を引き起こす可能性があるが、新生児の場合より極めて少ない。
【０００４】
ストレプトコッカス・アガラクティエの推定同定は、伝統的に生理的及び生化学的方法により行われていた。これには、グラム染色、カタラーゼ反応、ヒツジ血液寒天平板上での溶血活性、馬尿酸塩又はＬ−ピロリドニル−β−ナフチルアミド（ＰＹＲ）の加水分解、ＣＡＭＰ試験及び胆汁エスクリン試験があげられる。Ｂ群連鎖球菌コロニーのあるものはヒツジ血液寒天上で溶血しないため、Ｂ群連鎖球菌の確認同定には生化学的試験及び／又は血清学的試験を組み合わせる必要があった。
【０００５】
近年、培養物からＢ群連鎖球菌を同定する際にＤＮＡプローブ試験が役立っている。ＤＮＡプローブ試験は、Ｂ群連鎖球菌のＤＮＡ及びＲＮＡの定性検出のために核酸ハイブリダイゼーションを用いる。本試験は、ストレプトコッカス・アガラクティエを確実に同定するための非主観的で精確かつ迅速な同定法を提供する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、Ｂ群連鎖球菌検出の感度、精度及び特異性を高めて；定性的及び定量的測定能を提供し；かつリアルタイムで増幅と検出を組み合わせて複製レベルの低い標的の検出速度を高めて、ＤＮＡプローブ試験を改良する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明の第１側面は、ストレプトコッカス・アガラクティエ核酸を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイプローブに関する。本ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、標的相補的塩基配列、及び、場合により、検出すべき核酸に対して相補的でない１以上の塩基配列を含む、プローブ配列を含む。標的相補的塩基配列は、配列番号３の配列に含まれる１６〜２０個の連続塩基又はその相補配列からなり、ＲＮＡ及びＤＮＡの均等物並びにヌクレオチド類似体が存在してもよい。一般に、ハイブリダイゼーションアッセイプローブの長さは最高３０塩基でもよい。好ましい態様では、プローブ配列は検出すべき核酸に対して相補的でない任意塩基配列を含む。より好ましくは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは検出可能な標識を含む。例えば、プローブは発蛍光団部分と消光体部分を含んでもよい。この場合、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは分子ビーコン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ）でもよい。分子ビーコンの例としては、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７からなる群から選択される標的相補的塩基配列があげられる。他の好ましい態様では、プローブ配列は検出すべき核酸に対して相補的でない１以上の任意塩基配列を含まない。より好ましくは、このハイブリダイゼーションアッセイプローブは検出可能な標識を含む。検出可能な標識は、化学発光性標識及び蛍光性標識であってよい。
【０００８】
本発明の他の側面は、生物試料中に存在する可能性のあるストレプトコッカス・アガラクティエ核酸配列を増幅するキットに関する。本キットは、３’末端標的相補的配列、及び、場合により増幅すべき標的核酸に対して相補的でない第１プライマー上流配列を有する第１プライマーを含む。第１プライマーの３’末端標的相補的配列は、配列番号２に含まれる２５個の連続塩基を含み、ＲＮＡ及びＤＮＡの均等物並びにヌクレオチド類似体が存在してもよい。キットはまた、３’末端標的相補的配列、及び、場合により増幅すべき標的核酸に対して相補的でない第２プライマー上流配列を有する第２プライマーを含む。第２プライマーの３’末端標的相補的配列は、配列番号１に含まれる２０個の連続塩基を含み、ＲＮＡ及びＤＮＡの均等物並びにヌクレオチド類似体が存在してもよい。キットの好ましい態様では、第１プライマー及び第２プライマーの長さは各々最高５８塩基である。他の好ましい態様では、第１プライマーの３’末端標的相補的配列及び第２プライマーの３’末端標的相補的配列の長さは各々最高３１塩基である。この場合、第２プライマーの３’末端標的相補的配列の長さは最高２１塩基であることがより好ましい。さらに好ましくは、第１プライマーはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター配列等の第１プライマー上流配列を含む。キットの他の好ましい態様では、第１プライマーの３’末端標的相補的配列の長さが最高３１塩基で、第２プライマーの３’末端標的相補的配列の長さが最高２１塩基の場合、第１プライマーの３’末端標的相補的配列は好ましくは配列番号８、配列番号９及び配列番号１０からなる群から選択され、第２プライマーの３’末端標的相補的配列は好ましくは配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群から選択される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
定義
本発明の目的に関する以下の用語は、それと異なることを本明細書に明記しない限り下記の意味である：
本明細書の「生物試料」は、ヒト、動物又は環境試料由来のいかなる組織又はポリヌクレオチド含有材料である。本発明の生物試料としては、末梢血、血漿、血清若しくは他の体液、骨髄若しくは他の臓器、生検組織、又は生物由来の他の材料があげられる。生物試料を組織又は細胞構造の破壊のために処理して細胞内成分を、酵素、緩衝剤、塩類、界面活性剤等を含有しうる溶液中へ放出させることができる。
【００１０】
本明細書の「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ又はＤＮＡ及び配列中に存在する可能性がある合成ヌクレオチド類似体又は他の分子であって、ポリヌクレオチドと相補配列がある第２分子とのハイブリダイゼーションを妨げないものを意味する。
【００１１】
本明細書の「検出可能な標識」は、検出できる又は検出可能な応答をもたらすことができる、化学物質種である。本発明の検出可能な標識をポリヌクレオチドプローブに直接又は間接的に連結させることができ、放射性同位体、酵素、ハプテン、色素又は検出可能な色を付与する粒子（例えばラテックスビーズ又は金属粒子）等の発色団、発光性化合物（例えば生物発光性、リン光性又は化学発光性部分）及び蛍光性化合物があげられる。
【００１２】
「均一検出可能な標識」は、標的配列にハイブリダイズしたプローブ上に当該標識があるかを決定することにより均一系で検出できる標識をいう。すなわち、均一検出可能な標識は、ハイブリダイズした形の標識又は標識プローブをハイブリダイズしていない形のものから物理的に分離せずに検出できる。ＧＢＳ核酸検出のために標識プローブを用いる場合は均一検出可能な標識が好ましい。均一標識の例は、Ａｒｎｏｌｄら、米国特許５，２８３，１７４号；Ｗｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号；及びＮｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号に詳述されている。均一アッセイ法に使用するための好ましい標識としては化学発光性化合物があげられる（例えばＷｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号；Ｎｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号；及びＡｒｎｏｌｄら、米国特許第５，６３９，６０４号参照）。好ましい化学発光性標識は、標準ＡＥ又はその誘導体（例えばナフチル−ＡＥ、オルト−ＡＥ、１−又は３−メチル−ＡＥ、２，７−ジメチル−ＡＥ、４，５−ジメチル−ＡＥ、オルト−ジブロモ−ＡＥ、オルト−ジメチル−ＡＥ、メタ−ジメチル−ＡＥ、オルト−メトキシ−ＡＥ、オルト−メトキシ（シンナミル）−ＡＥ、オルト−メチル−ＡＥ、オルト−フルオロ−ＡＥ、１−又は３−メチル−オルト−フルオロ−ＡＥ、１−又は３−メチル−メタ−ジフルオロ−ＡＥ、及び２−メチル−ＡＥ）等のアクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物である。
【００１３】
「均一アッセイ」は、特異的プローブハイブリダイゼーションの程度を決定する前に、ハイブリダイズしたプローブをハイブリダイズしていないプローブから物理的に分離する必要がない検出法をいう。例えば本明細書に記載の均一アッセイ法の例では、適当な標的にハイブリダイズした場合に蛍光シグナルを発する分子ビーコンその他自己報告プローブ、ハイブリッド二本鎖中に存在しない限り化学的手段で選択的に破壊できる化学発光性アクリジニウムエステル系標識及び当業者に周知の他の均一検出可能な標識を使用できる。
【００１４】
本明細書の「増幅」は、標的核酸配列、その相補配列又はそのフラグメントの多数の複製を得るためのインビトロ法をいう。
「標的核酸」又は「標的」は、標的核酸配列を含む核酸を意味する。一般に、増幅すべき標的核酸配列は、反対側に配置された２つのプライマーの間に位置し、各プライマーに対して完全に相補的な標的核酸部分を含むであろう。
【００１５】
「標的核酸配列」又は「標的配列」又は「標的領域」は、特異的なデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド配列であって、一本鎖核酸分子及びそれに対して相補的なデオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド配列の全部又は一部を含む配列を意味する。
【００１６】
「転写関連増幅（transcription associated amplification）」は、ＲＮＡポリメラーゼを用いて核酸鋳型から多数のＲＮＡ転写体を調製するいかなる型の核酸増幅をも意味する。「転写介在増幅（Transcription Mediated Amplification）」（ＴＭＡ）という転写関連増幅法の例は、一般に、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸及びプロモーター−鋳型相補的オリゴヌクレオチドを用い、場合により１以上の類似オリゴヌクレオチドを含んでもよい。ＴＭＡの変法は当技術分野で周知であり下記：Ｂｕｒｇら、米国特許第５，４３７，９９０号；Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号及び第５，５５４，５１６号；Ｋａｃｉａｎら、国際特許出願公開ＷＯ９３／２２４６１；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、国際特許出願公開ＷＯ８８／０１３０２；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、国際特許出願公開ＷＯ８８／１０３１５；Ｍａｌｅｋら、米国特許第５，１３０，２３８号；Ｕｒｄｅａら、米国特許第４，８６８，１０５号及び第５，１２４，２４６号；ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら、国際特許出願公開ＷＯ９４／０３４７２；並びにＲｙｄｅｒら、国際特許出願公開ＷＯ９５／０３４３０に詳細に開示される。本明細書に開示する型の核酸増幅法を実施するためには、Ｋａｃｉａｎらの方法が好ましい。
【００１７】
本明細書の「オリゴヌクレオチド」又は「オリゴマー」は、少なくとも２、一般に約５〜約１００の化学物質サブユニットの高分子鎖であり、各サブユニットはヌクレオチド塩基部分、糖部分及びサブユニットを直線的な空間配置に結合する連結部分を含む。一般的なヌクレオチド塩基部分は、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）であるが、水素結合可能な他の稀な又は修飾されたヌクレオチド塩基が当業者に周知である。オリゴヌクレオチドは、場合により、糖部分、塩基部分及び主鎖構成要素のいかなる類似体を含んでもよい。本発明の好ましいオリゴヌクレオチドのサイズ範囲は約１０〜約１００残基である。オリゴヌクレオチドは天然資源から精製できるが、好ましくは様々ないかなる周知の酵素法又は化学的方法を用いても合成される。
【００１８】
本明細書の「プローブ」は、ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、核酸中、好ましくは増幅した核酸中の、標的配列に特異的にハイブリダイズして、検出可能なハイブリッドを形成するオリゴヌクレオチドである。プローブは場合により、検出可能な部分を含んでもよく、これはプローブの末端（１以上）に結合していても、内部にあってもよい。標的ポリヌクレオチドと結合するプローブのヌクレオチドは、検出可能な部分がプローブ配列の内部にある場合のように、厳密に連続しなくてもよい。検出は直接的（すなわち、標的配列又は増幅した核酸に直接ハイブリダイズするプローブから生じる）又は間接的（すなわち、プローブを標的配列又は増幅した核酸に連結する中間分子構造体にハイブリダイズするプローブから生じる）のいずれでもよい。プローブの「標的」は一般に、プローブオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に標準的な水素結合（すなわち塩基対合）により特異的にハイブリダイズする増幅核酸配列内に含まれる配列をいう。プローブは、標的特異的配列、及び、場合により、検出すべき標的配列に対して相補的でない他の配列を含んでもよい。本非相補配列としては、プロモーター配列、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、又はプローブの三次元配置に寄与する配列（例えばＬｉｚａｒｄｉら、米国特許第５，１１８，８０１号及び第５，３１２，７２８号参照）があげられる。「十分に相補的」である配列は、プローブオリゴヌクレオチドを、プローブの標的特異的配列に対して完全には相補的でない標的配列に安定にハイブリダイズさせることができる。
【００１９】
本明細書の「増幅プライマー」は、標的核酸又はその相補配列にハイブリダイズして核酸増幅反応に関与するオリゴヌクレオチドである。例えば増幅プライマー又はより簡易に「プライマー」は、場合により修飾されたオリゴヌクレオチドでもよく、鋳型核酸にハイブリダイズすることができ、かつＤＮＡポリメラーゼ活性によって延長できる３’末端があるものである。一般にプライマーは、ＧＢＳ核酸に対して相補的な下流配列、及び、場合により、ＧＢＳ核酸に対して相補的でない上流配列を有してもよい。この任意の上流配列は、例えばＲＮＡポリメラーゼプロモーターとして作用できるか又は制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を含んでもよい。
【００２０】
「実質的に相同」、「実質的に対応している」又は「実質的に対応する」は、対象オリゴヌクレオチドに、基準塩基配列内に存在する少なくとも１０個の連続塩基領域に対して少なくとも７０％相同、好ましくは少なくとも８０％相同、より好ましくは少なくとも９０％相同、最も好ましくは少なくとも１００％相同である少なくとも１０個の連続塩基領域を含む塩基配列があることを意味する（ＲＮＡ及びＤＮＡの均等物を除く）。当業者であれば、様々な％の相同性で、許容できない程度の非特異的ハイブリダイゼーションを阻止しつつオリゴヌクレオチドを標的配列にハイブリダイズさせることができるように、ハイブリダイゼーションアッセイ条件を改変できることを容易に認識するであろう。類似性の程度は、２つの配列を構成する核酸塩基の順序を比較して決定し、構造差が相補的塩基との水素結合を阻害しない限り、２配列間に存在する可能性のある他の構造差は考慮されない。２配列間の相同性の程度は、比較する少なくとも１０個の連続塩基の各組中に存在する不適正塩基対合の数でも表わすことができ、これは０〜２個の塩基差であってよい。
【００２１】
「実質的に相補的」は、対象オリゴヌクレオチドに、標的塩基配列内に存在する少なくとも１０個の連続塩基領域に対して少なくとも７０％相補的、好ましくは少なくとも８０％相補的、より好ましくは少なくとも９０％相補的、最も好ましくは少なくとも１００％相補的である、少なくとも１０個の連続塩基領域を含む塩基配列があることを意味する（ＲＮＡ及びＤＮＡの均等物を除く）。当業者であれば、様々な％の相補性で、許容できない程度の非特異的ハイブリダイゼーションを阻止しつつオリゴヌクレオチドを標的配列にハイブリダイズさせることができるように、ハイブリダイゼーションアッセイ条件を改変することを容易に認識するであろう。相補性の程度は、２つの配列を構成する核酸塩基の順序を比較して決定し、構造差が相補的塩基との水素結合を阻害しない限り、２つの配列間に存在する可能性のある他の構造差を考慮しない。２つの配列間の相補性の程度は、比較する少なくとも１０個の連続塩基の各組中に存在する不適正塩基対合の数で表わすこともでき、これは０〜２個の不適正塩基対合であってよい。
【００２２】
「十分に相補的」は、一連の相補的塩基間の水素結合により他の塩基配列にハイブリダイズしうる連続核酸塩基配列を意味する。相補的塩基配列は、オリゴヌクレオチドの塩基配列中の各位置において標準塩基対合（例えばＧ：Ｃ、Ａ：Ｔ又はＡ：Ｕ対合）により相補的であってもよく、あるいは標準水素結合により相補的ではない１以上の残基を含んでもよい（非塩基ヌクレオチドを含む）が、この場合、本相補的塩基配列全体は適切なハイブリダイゼーション条件下で他の塩基配列と特異的にハイブリダイズすることができる。連続塩基は、オリゴヌクレオチドを特異的にハイブリダイズさせる予定の配列に対して、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約１００％相補的である。適切なハイブリダイゼーション条件は当業者に周知であり、塩基配列組成に基づいて容易に推定でき、あるいはルーチン試験法を用いて経験的に決定できる（例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー，1989）1.90-1.91,7.37-7.57,9.47-9.51及び11.47-11.57章、特に9.50-9.51,11.12-11.13,11.45-11.47及び11.55-11.57章参照)。
【００２３】
「捕獲オリゴヌクレオチド」は、標的配列と固定化オリゴヌクレオチドを塩基対ハイブリダイゼーションで特異的に結合させる手段を提供する、少なくとも１の核酸オリゴヌクレオチドを意味する。捕獲オリゴヌクレオチドは、好ましくは２つの結合領域、すなわち標的配列結合領域と固定化プローブ結合領域を含む。通常は２つの結合領域は同一オリゴヌクレオチド上で連続するが、捕獲オリゴヌクレオチドは、１以上のリンカーで互いに結合した２つの異なるオリゴヌクレオチド上に存在する、標的配列結合領域と固定化プローブ結合領域を含んでもよい。例えば、固定化プローブ結合領域が第１オリゴヌクレオチド上に存在し、標的配列結合領域が第２オリゴヌクレオチド上に存在し、この２つの異なるオリゴヌクレオチドが、第１及び第２オリゴヌクレオチドの配列に特異的にハイブリダイズする配列を含む第３オリゴヌクレオチドであるリンカーと水素結合で結合してもよい。
【００２４】
「固定化プローブ」又は「固定化核酸」は、直接又は間接的に捕獲オリゴヌクレオチドを固定化支持体へ結合させる核酸を意味する。固定化プローブは、試料中の結合した標的配列を結合していない物質から分離するのを容易にする固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドである。
【００２５】
「分離」又は「精製」は、生物試料中の１以上の成分を試料の１以上の他の成分から分離することを意味する。試料成分には一般に水溶液相中の核酸が含まれ、当該相はタンパク質、炭水化物、脂質及び標識プローブ等の物質も含有してもよい。好ましくは、分離又は精製の工程により、試料中に存在する他の成分のうち少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％、よりさらに好ましくは少なくとも約９５％が除去される。
【００２６】
「ＲＮＡ及びＤＮＡの均等（同等）物」又は「ＲＮＡ及びＤＮＡの均等（同等）塩基」は、同じ相補的塩基対ハイブリダイゼーション特性をもつＲＮＡ及びＤＮＡ等の分子を意味する。ＲＮＡ及びＤＮＡの均等物は異なる糖部分（すなわちリボース対デオキシリボース）があり、ＲＮＡ中のウラシル及びＤＮＡ中のチミンの存在により異なる場合がある。均等物は特定配列に対して同程度の相補性があるため、ＲＮＡ及びＤＮＡの均等物間の相異が相同性の相異の一因となることはない。
【００２７】
「本質的に〜からなる」は、本発明の基本的かつ新規な特性を実質的に変化させない他の成分、組成物又は工程が本発明の組成物又はキット又は方法に含まれてもよいことを意味する。当該特性としては、全血又は血漿等の生物試料中のＧＢＳ核酸を選択的に検出する機能があげられる。本発明の基礎をなす新規な特性に実質的影響を与える成分、組成物又は工程はいずれも本用語に含まれない。
【００２８】
発明の詳細な説明
本明細書では血液、血漿、血清若しくは他の体液又は組織等の生物試料中のＧＢＳ核酸を選択的に検出するための組成物、方法及びキットを開示する。本発明のプライマー、プローブ及び方法は診断に用いることができる。
【００２９】
概要
本発明には、生物試料中のＧＢＳ核酸を検出するのに特に有用な組成物（プライマー及びプローブ）、方法及びキットがあげられる。当該用途に適当なオリゴヌクレオチド配列を設計するため、まず既知のＧＢＳ核酸配列を比較して、診断アッセイで細菌ゲノムの標的として使用できる候補領域を同定した。比較の結果、図１に模式的に示すプライマー及びプローブを用いる検出の標的として、ＧＢＳゲノムの３つの異なる領域（配列番号１〜３）を選択した。増幅及び増幅配列の検出に用いるのに適当な合成オリゴヌクレオチドを設計するにあたって、比較した配列間で比較的変異が少ない配列部分を選択した。
【００３０】
上記分析に基づき、以下に示す増幅プライマー及びプローブ配列を設計した。当業者であれば、ＧＢＳ等の細菌標的に特異的なプライマー配列であって、Ｔ７プロモーター配列を含むもの又は含まないものを、以下に示す様々なプライマーベースのインビトロ増幅法でプライマーとして用いることができることを認識するであろう。本明細書に開示された配列を有するオリゴヌクレオチドは、ＧＢＳ核酸を検出するアッセイで交互機能を果たすことを意図する。例えば交互検出アッセイで、本明細書に開示されたハイブリダイゼーションプローブを増幅プライマーとして用い、本明細書に開示の増幅プライマーをハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。さらに捕獲オリゴヌクレオチドを増幅前の標的核酸にハイブリダイズさせてこれを捕獲するために用いることも意図する。
【００３１】
本明細書に開示された増幅プライマーは、特に標的特異的プライマーの組合わせから数種のアンプリコンを調製できる多重増幅反応の成分として意図される。例えば、本明細書に開示の好ましいＧＢＳ特異的プライマーのいくつかは、無関係な細菌のポリヌクレオチドを、アッセイを実質的に妨げずに増幅できる多重増幅反応に用いうることを意図する。
【００３２】
有用な増幅方法
本発明に関して有用な増幅方法には、転写介在増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベース増幅（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification、ＮＡＳＢＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（Strand Displacement Amplification、ＳＤＡ）、並びに自己複製ポリヌクレオチド分子と複製酵素、例えばＭＤＶ−Ｉ ＲＮＡとＱ−ベータ酵素を用いる増幅方法が含まれる。これら種々の増幅方法を実施する方法は、各々米国特許第５，３９９，４９１号；欧州特許出願公開第０５２５８８２号；米国特許第４，９６５，１８８号；米国特許第５，４５５，１６６号；米国特許第５，４７２，８４０号；及びLizardi et al., BioTechnology 6:1197 (1988)にある。核酸増幅反応の実施方法を記載した上記文献の開示内容を本明細書に援用する。
【００３３】
本発明の極めて好ましい態様では、ＧＢＳ核酸配列をＴＭＡプロトコルにより増幅する。本プロトコルによれば、ＤＮＡポリメラーゼ活性を提供する逆転写酵素が内因性ＲＮａｓｅＨ活性をも備えている。本方法で用いられるプライマーの１つは、増幅すべき標的核酸の一方の鎖に対して相補的な配列の上流に位置するプロモーター配列を含む。本増幅方法の第１工程では、プロモーター−プライマーがＧＢＳ標的の特定部位にハイブリダイズする。逆転写酵素が、プロモーター−プライマーの３’末端から延長して標的ＲＮＡの相補的ＤＮＡ複製体を作製する。逆鎖プライマーと新たに合成されたＤＮＡ鎖との相互作用に伴い、本プライマーの末端から逆転写酵素により第２ＤＮＡ鎖が合成されて二本鎖ＤＮＡ分子が形成される。ＲＮＡポリメラーゼが本二本鎖ＤＮＡ鋳型中のプロモーター配列を認識して転写を開始する。新たに合成されたＲＮＡアンプリコンが各々ＴＭＡプロセスに再入して新たな複製の鋳型として用いられてＲＮＡアンプリコンが指数関数的に増加する。ＤＮＡ鋳型は各々１００〜１０００コピーのＲＮＡアンプリコンを作製できるため、このような増加により１００億のアンプリコンが１時間未満で得られる。本プロセス全体は自触媒反応であり、定温で行われる。
【００３４】
プライマーの構造特性
上記のように、「プライマー」は、核酸増幅反応に関与しうる、場合により修飾されたオリゴヌクレオチドを示す。好ましいプライマーは、鋳型核酸にハイブリダイズすることができ、３’末端はＤＮＡポリメラーゼ活性により延長できる。プライマーの５’側領域は標的核酸に対して相補的でなくてもよい。５’側−非相補領域にプロモーター配列が含まれる場合は「プロモーター−プライマー」という。当業者であれば、プライマーとして機能しうるいかなるオリゴヌクレオチド（すなわち、標的配列に特異的にハイブリダイズし、３’末端はＤＮＡポリメラーゼ活性により延長されるオリゴヌクレオチド）を修飾して５’側プロモーター配列を含有させてプロモーター−プライマーとして機能しうることを認識するであろう。また、いかなるプロモーター−プライマーをプロモーター配列の除去により修飾するか、又はプロモーター配列なしに合成しても、依然としてプライマーとして機能できる。
【００３５】
修飾された塩基部分がＧ、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＵと非共有結合を形成する機能を維持する限り、かつ少なくとも１の修飾ヌクレオチド塩基部分又は類似体を含むオリゴヌクレオチドと一本鎖核酸とのハイブリダイゼーションが立体障害を受けない限り、プライマーのヌクレオチド塩基部分を修飾することができる（例えばプロピン基の付加により）。有用なプローブの化学組成は以下に記載するが、本発明のプライマーの窒素塩基は以下の：一般的な塩基（Ｇ、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その既知の類似体（例えば、塩基部分にヒポキサンチンがあるイノシン、すなわち「Ｉ」；The Biochemistry of the Nucleic Acids5-36, Adams et al.著 第11版1992参照）、プリン塩基又はピリミジン塩基の既知の誘導体（例えばＮ４−メチルデオキシグアノシン、デアザ−又はアザ−プリン類及びデアザ−又はアザ−ピリミジン類、５又は６位に置換基をもつピリミジン塩基、２、６又は８位に変化又は変換された置換基をもつプリン塩基、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン類、４−アミノ−ピリミジン類、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン類、及びＯ４−アルキル−ピリミジン（Ｃｏｏｋ国際公開ＷＯ９３／１３１２１参照）、及びポリマーの１以上の残基の代わりに、主鎖が窒素塩基を含まない「非塩基」残基（Ａｒｎｏｌｄら米国特許第５，５８５，４８１号参照）でもよい。プライマー主鎖を構成する一般的な糖部分にはリボース及びデオキシリボースが含まれるが、２’−Ｏ−メチルリボース（２’−ＯＭｅ）、ハロゲン化糖及び他の修飾された糖部分も使用できる。通常、プライマー主鎖の連結基はリン含有部分、最も一般的にはホスホジエステル結合であるが、ホスホロチオエート、メチルホスホナート、並びに「ロックされた核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」（ＬＮＡ）中にみられる結合、及び「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）中にみられるペプチド様結合等のリンを含まない結合等の他の結合も、本明細書中に開示するアッセイに用いられる。
【００３６】
有用なプローブ標識系及び検出可能部分
特異的核酸ハイブリダイゼーションをモニターするのに用いられる標識系及び検出系は、本質的にいずれも本発明に用いられる。有用な標識群に含まれるものは、放射性標識、酵素、ハプテン、結合オリゴヌクレオチド、化学発光性分子、蛍光性部分（単独又は「消光体」部分と組み合わせて）及び電気的検出法に適用できるレドックス活性部分である。好ましい化学発光性分子としては、Ａｒｎｏｌｄら米国特許第５，２８３，１７４号に開示される、均一保護アッセイに関して用いられるタイプ及びＷｏｏｄｈｅａｄら米国特許第５，６５６，２０７号に開示される、多数の標的を単一反応で定量するアッセイに関して用いられるタイプのアクリジニウムエステルがあげられる。上記特許文献に含まれる開示内容を本明細書に援用する。好ましい電気的な標識法及び検出法は、米国特許第５，５９１，５７８号及び第５，７７０，３６９号並びに国際公開ＷＯ９８／５７１５８に開示され、その開示内容を本明細書に援用する。本発明で標識として有用なレドックス活性部分は、Ｃｄ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｐｄ、Ｚｎ、Ｆｅ及びＲｕ等の遷移金属があげられる。
【００３７】
本発明のプローブに特に好ましい検出可能な標識は、均一アッセイ系で検出できる（すなわちこの場合、混合物中で、結合した標識プローブは結合していない標識プローブと比較して検出可能な変化、例えば安定性又は異なる分解性を示す）。他の均一検出可能な標識、例えば蛍光性標識及び電気的に検出可能な標識を本発明の実施に使用できるが、均一アッセイに用いるのに好ましい標識は化学発光性化合物（例えばＷｏｏｄｈｅａｄら米国特許第５，６５６，２０７号；Ｎｅｌｓｏｎら米国特許第５，６５８，７３７号；又はＡｒｎｏｌｄら米国特許第５，６３９，６０４号に記載）である。特に好ましい化学発光性標識には、アクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物、例えば標準ＡＥ又はその誘導体、例えばナフチル−ＡＥ、オルト−ＡＥ、１−又は３−メチル−ＡＥ、２，７−ジメチル−ＡＥ、４，５−ジメチル−ＡＥ、オルト−ジブロモ−ＡＥ、オルト−ジメチル−ＡＥ、メタ−ジメチル−ＡＥ、オルト−メトキシ−ＡＥ、オルト−メトキシ（シンナミル）−ＡＥ、オルト−メチル−ＡＥ、オルト−フルオロ−ＡＥ、１−又は３−メチル−オルト−フルオロ−ＡＥ、１−又は３−メチル−メタ−ジフルオロ−ＡＥ、及び２−メチル−ＡＥが含まれる。アクリジニウムエステルを非ヌクレオチドリンカーによりプローブに結合させることができる。例えば、実質的に米国特許第５，５８５，４８１号並びに米国特許第５，６３９，６０４号、特に１０欄６行〜１１欄３行及び例８に記載のリンカーで結合した化学発光性アクリジニウムエステル化合物で検出プローブを標識できる。上記特許文献に含まれる開示内容を本明細書に援用する。
【００３８】
ある用途で、ハイブリダイズしていないプローブをまず検出前に除去する必要なく被験試料中のプローブ：標的二本鎖を容易に検出するためには、少なくともある程度の自己相補性を示すプローブが望ましい。例えば、別個の自己相補的領域（「標的結合ドメイン」及び「標的閉鎖ドメイン」を含む）を含む「分子トーチ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｒｃｈｅ）」という構造体を設計する；当該領域は結合領域で結合され、所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いにハイブリダイズしている。変性条件下では、分子トーチの当該２つの相補領域（これらは完全相補的でも部分相補的でもよい）が融解し、所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件が再生された際に標的結合ドメインが標的配列にハイブリダイズしうる状態になる。分子トーチは、標的結合ドメインが標的閉鎖ドメインより標的配列へのハイブリダイゼーションに指向するように設計される。分子トーチの標的結合ドメインと標的閉鎖ドメインは、分子トーチが自己ハイブリダイズしている際には分子トーチが標的核酸にハイブリダイズした場合とは異なるシグナルを発するように配置された相互作用性標識（例えば蛍光体／消光体の対）を含み、これにより、ハイブリダイズしていないプローブ（実用可能な標識がそれに結合している）の存在下で試料中のプローブ：標的二本鎖を検出できる。分子トーチについては米国特許第６，３６１，９４５号に十分に記載されており、その開示内容を本明細書に援用する。
【００３９】
本発明で用いられる自己相補的ハイブリダイゼーションアッセイプローブの他の例は、一般に「分子ビーコン」という構造体である。分子ビーコンは、標的相補的領域をもつ核酸分子、標的核酸配列が存在しなければプローブを閉鎖配置に保持する親和性対（又は核酸アーム）、及びプローブが閉鎖配置にある場合に相互作用する標識対を含む。分子ビーコンの標的相補的配列が標的核酸にハイブリダイズすると、親和性対のメンバーが分離してプローブが開放配置に移行する。開放配置への移行は、発蛍光団と消光体（例えばＤＡＢＣＹＬとＥＤＡＮＳ）等の標識対の相互作用が低下することにより検出できる。分子ビーコンは米国特許第５，９２５，５１７号に十分に記載され、本開示内容を本明細書に援用する。ＧＢＳ特異的核酸配列の検出に有用な分子ビーコンは、本明細書に開示されたプローブ配列の１のいずれかの末端に、発蛍光団を含む第１核酸アーム及び消光体部分を含む第２核酸アームを付与して作製できる。本構造体で、本明細書に開示するＧＢＳ特異的配列は、得られる分子ビーコンの標的相補的「ループ」部として用いられる。
【００４０】
分子ビーコンは、好ましくは相互作用性の検出可能な標識対で標識される。好ましい検出可能な標識は、ＦＲＥＴ又は非−ＦＲＥＴエネルギー移動機序で互いに相互作用する。蛍光共鳴エネルギー移動法（ＦＲＥＴ）では、発色団間の共鳴相互作用によりエネルギー量子が分子又は分子系中の吸収部位から利用部位へ、原子間距離よりかなり長距離にわたって、熱エネルギーに変換されず、かつ供与体と受容体が運動衝突せずに無放射伝達される。「供与体」は最初にエネルギーを吸収する部分であり、「受容体」はその後にエネルギーが移動する部分である。ＦＲＥＴのほか、供与分子から受容分子へ励起エネルギーを移動させることができる「非−ＦＲＥＴ」エネルギー移動法が少なくとも他に３つある。
【００４１】
ＦＲＥＴ又は非−ＦＲＥＴのいずれの機序でも、２つの標識を、一方の標識から放出されたエネルギーが第２標識で受容又は吸収されうるのに十分に近接して保持した場合、当該２つの標識は「エネルギー移動関係」にあるという。例えば、分子ビーコンがステム二本鎖の形成で閉鎖状態に保持され、分子ビーコンの一方のアームに結合した発蛍光団からの蛍光発光が他方のアーム上の消光体部分で消光される場合がその例である。
【００４２】
本発明の分子ビーコンに極めて好ましい標識部分は、発蛍光団と蛍光消光特性をもつ第２部分（すなわち「消光体」）を含む。本態様では、特徴的なシグナルは特定波長の蛍光であると思われるが、又は可視光シグナルでもよい。蛍光を伴う場合、発光の変化は好ましくはＦＲＥＴ又は放射エネルギー移動若しくは非−ＦＲＥＴモードによる。閉鎖状態の相互作用標識対をもつ分子ビーコンを適切な周波数の光で刺激すると、第１レベルの蛍光シグナルが発せられる。これは極めて低くてもよい。本同じ分子ビーコンが開放状態にあって適切な周波数の光で刺激された場合、発蛍光団と消光体部分は互いに十分に離れているため、それらの間でのエネルギー移動は実質的に除外される。本条件下では、消光体部分は発蛍光団部分からの蛍光を消光できない。発蛍光団を適切な波長の光エネルギーで刺激すると、第１レベルより高い第２レベルの蛍光シグナルが発せられるであろう。上記２つのレベルの蛍光の差を検出及び測定することができる。本態様で発蛍光団と消光体部分を用いると、分子ビーコンは「開放」配置でのみ「オン」であり、プローブが標的に結合していることを、容易に検出できるシグナルの発生により示す。標識部分間の相互作用を調節することで、プローブの配置状態がプローブから発せられるシグナルを変化させる。
【００４３】
ＦＲＥＴ対と非−ＦＲＥＴ対を区別しなければ、本発明に使用できる供与体／受容体標識対の例としては、下記：フルオレセイン／テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、クマリン／ＤＡＢＣＹＬ、フルオレセイン／フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ／ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、フルオレセイン／ＤＡＢＣＹＬ、ルシファーイエロー／ＤＡＢＣＹＬ、ＢＯＤＩＰＹ／ＤＡＢＣＹＬ、エオシン／ＤＡＢＣＹＬ、エリスロシン／ＤＡＢＣＹＬ、テトラメチルローダミン／ＤＡＢＣＹＬ、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）／ＤＡＢＣＹＬ、ＣＹ５／ＢＨ１、ＣＹ５／ＢＨ２、ＣＹ３／ＢＨ１、ＣＹ３／ＢＨ２、及びフルオレセイン／ＱＳＹ７色素があげられる。当業者であれば、供与色素と受容色素が異なる場合に受容体の増強蛍光の発生又は供与体の蛍光の消光によりエネルギー移動を検出できることを理解するであろう。供与体種と受容体種が同一の場合、蛍光の偏光が生じることによりエネルギーを検出できる。ＤＡＢＣＹＬ及びＱＳＹ ７色素等の非蛍光性受容体は、直接（つまり増強していない）受容体励起から発せられるバックグラウンド蛍光の潜在的な問題が有利に排除される。供与体−受容体対の一方のメンバーとして用いられる好ましい発蛍光団部分としては、フルオレセイン、ＲＯＸ及びＣＹ色素（例えばＣＹ５）があげられる。供与体−受容体対の他方のメンバーとして用いられる極めて好ましい消光体部分としては、ＤＡＢＣＹＬ及びＢＬＡＣＫ ＨＯＬＥ ＱＵＥＮＣＨＥＲ部分が含まれ、これらはBiosearch Technologies, Inc.（カリフォルニア州ノバート）から入手できる。
【００４４】
標識を核酸に結合させるための合成技術及び標識を検出する方法は、当技術分野で周知である（例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー，1989),10章；Ｎｅｌｓｏｎら米国特許第５，６５８，７３７号；Ｗｏｏｄｈｅａｄら米国特許第５，６５６，２０７号；Ｈｏｇａｎら米国特許第５，５４７，８４２号；Ａｒｎｏｌｄら米国特許第５，２８３，１７４号；Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙら米国特許第４，５８１，３３３号；及びＢｅｃｋｅｒら欧州特許出願ＥＰ０７４７７０６参照）。
【００４５】
プローブの化学組成
本発明のプローブはポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド類似体を含み、場合によりそれに共有結合した検出可能な標識を保有する。プローブのヌクレオシド又はヌクレオシド類似体には窒素複素環塩基又は塩基類似体が含まれ、これらのヌクレオシドが例えばホスホジエステル結合により互いに連結してポリヌクレオチドを形成する。したがって、プローブは一般的なリボ核酸（ＲＮＡ）及び／又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含んでもよいが、上記分子の化学的類似体を含んでもよい。プローブ主鎖は当該技術分野で既知の多様な結合で構成でき、これには１以上の糖−ホスホジエステル結合、ロックされた核酸（ＬＮＡ）結合、ペプチド−核酸結合（「ペプチド核酸」という場合もある；Ｈｙｌｄｉｇ−Ｎｉｅｌｓｅｎら国際公開ＷＯ９５／３２３０５に記載）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホナート結合又はその組合わせが含まれる。プローブの糖部分は、リボース若しくはデオキシリボース又は既知の置換基をもつ２’−Ｏ−メチルリボース及び２’ハライド置換体（例えば２’−Ｆ）等の類似化合物でもよい。窒素塩基は、一般的な塩基（Ｇ、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その既知の類似体（例えばイノシン、すなわち「Ｉ」；The Biochemistry of the Nucleic Acids5-36, Adams et al.著, 第11版, 1992参照）、プリン塩基又はピリミジン塩基の既知の誘導体（例えばＮ４−メチルデオキシグアノシン、デアザ−又はアザ−プリン類及びデアザ−又はアザ−ピリミジン類、５又は６位に置換基をもつピリミジン塩基、２、６又は８位に変化又は置換した置換基をもつプリン塩基、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン類、４−アミノ−ピリミジン類、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン類、及びＯ４−アルキル−ピリミジン（Ｃｏｏｋ国際公開ＷＯ９３／１３１２１参照）並びにポリマーの１以上の残基の代わりに主鎖が窒素塩基を含まない「非塩基」残基（Ａｒｎｏｌｄら米国特許第５，５８５，４８１号参照）でもよい。プローブはＲＮＡ及びＤＮＡ中にみられる一般的な糖、塩基及び結合のみを含んでもよく、又は一般的な成分と置換体の両方を含んでもよい（例えば、メトキシ主鎖で結合した一般的な塩基又は一般的な塩基及び１以上の塩基類似体を含む核酸）。
【００４６】
種々の長さ及び塩基組成のオリゴヌクレオチドプローブをＧＢＳ核酸の検出に使用できるが、本発明に好ましいプローブの長さは最高３０ヌクレオチド、より好ましくは２６〜３０ヌクレオチドである。しかし後記の特異的プローブ配列を核酸クローニングベクター若しくは転写体又はより長い他の核酸中で提供することもでき、これらもＧＢＳ核酸の検出に使用できる。
【００４７】
ＧＢＳ特異的増幅プライマー及び検出プローブの選択
所望の特性をもつ増幅プライマー及びプローブの設計に有用な指針を以下に記載する。ＧＢＳ核酸の増幅及び探査に最適な部位は、各々約２５０塩基の連続配列内の長さ約２０塩基以上の３つのＧＢＳゲノム保存領域である。１以上のプロモーター−プライマーを含む一組のプライマーの増幅度は、オリゴヌクレオチドがその相補配列にハイブリダイズする機能及び酵素で延長する機能を含むいくつかの要因に依存する。ハイブリダイゼーション反応の程度及び特異性は多数の要因により影響されるので、その要因の操作により個々のオリゴヌクレオチド（標的に対して完全に相補的かまたはそうでなくても）の厳密な感度及び特異性が決定されるであろう。アッセイ条件変更の影響は当業者に既知で、Ｈｏｇａｎら米国特許第５，８４０，４８８号に記載され、本開示内容を本明細書に援用する。
【００４８】
標的核酸配列の長さ、つまりプライマー配列又はプローブ配列の長さが重要な場合がある。場合により、特定の標的領域から、所望のハイブリダイゼーション特性をもつプライマー又はプローブとなる、位置及び長さの異なる数種類の配列が得られる可能性がある。完全には相補的でない核酸がハイブリダイズすることはできるが、通常は、完全に相同な塩基配列の最大長がハイブリッドの安定性を決定するであろう。
【００４９】
増幅プライマー及びプローブは、オリゴヌクレオチド：非標的核酸ハイブリッドの安定性を最小限にするように配置すべきである。増幅プライマー及びプローブは、標的配列と非標的配列を識別しうることが好ましい。プライマー及びプローブを設計する際、Ｔｍ値で表わされる融解温度の差をなるべく大きくすべきである（例えば少なくとも２℃、好ましくは５℃）。
【００５０】
非特異的延長（プライマー二量体又は非標的の複製）の程度も増幅効率に影響を与える場合がある。このためプライマーは、特に配列の３’末端で自己−又は交差−相補性が低くなるように選択される。不要なプライマー延長を少なくするため、長いホモポリマー領域及び高ＧＣ含量は避ける。市販のコンピューターソフトウェアが設計の本側面で役立つ。入手できるコンピュータープログラムとしては、ＭａｃＤＮＡＳＩＳ（商標）２．０（Hitachi Software Engineering American Ltd.）及びOLIGOver.6.6（Molecular Biology Insights；コロラド州カスケード）があげられる。
【００５１】
当業者であれば、ハイブリダイゼーションが２つの一本鎖相補核酸の会合を伴い、水素結合した二本鎖が形成されることを認識するであろう。２つの鎖の一方が完全又は部分的にハイブリッドに含まれれば、その鎖が新たなハイブリッド形成に関与する機能がより低下するのは当然である。当該配列の実質部が一本鎖であるようにプライマー及びプローブを設計して、ハイブリダイゼーションの速度及び程度を大幅に高めることができる。標的が組込みゲノム配列の場合は自然界では二本鎖形で存在するであろう（ポリメラーゼ連鎖反応の生成物の場合と同様）。当該二本鎖標的はプローブとのハイブリダイゼーションに対して当然阻害性であり、ハイブリダイゼーション工程の前に変性させる必要がある。
【００５２】
ポリヌクレオチドがその標的にハイブリダイズする速度は、標的結合領域の標的二次構造の熱安定性の尺度である。ハイブリダイゼーション速度の標準尺度はＣ０ｔ１／２であり、これはリットル当たりのヌクレオチドのモル数に秒を掛けて測定される。例えばこれは、プローブ濃度にその濃度で最大ハイブリダイゼーションの５０％が起きる時間を掛けたものである。この値は、種々の量のポリヌクレオチドを一定量の標的に一定時間ハイブリダイズして決定する。Ｃ０ｔ１／２は、当業者が慣用する標準法でグラフから得られる。
【００５３】
好ましい増幅プライマー
増幅反応を行うのに有用なプライマーは、標的結合に関与せず、増幅又は検出の操作に実質的に影響を与える可能性のない、他の配列の存在を受容するため、長さは様々であってもよい。例えば、本発明の増幅反応を行うのに有用なプロモーター−プライマーは、ＧＢＳ標的核酸にハイブリダイズするための少なくとも最小限の配列及びその最小限の配列の上流に位置するプロモーター配列をもつ。しかし、増幅反応でプライマーの有用性を妨げずに、標的結合配列とプロモーター配列の間に配列を挿入してプライマーの長さを変えてもよい。さらに、増幅プライマー及びプローブの長さは、目的とする相補配列をハイブリダイズするための最小限の必須要件にオリゴヌクレオチドの配列が適合する限り、任意に選択できる。
【００５４】
表１及び２は、ＧＢＳ核酸を増幅するためのプライマーとして用いたオリゴヌクレオチド配列の具体例を示す。表１は、ＧＢＳ核酸の一方の鎖に対するＧＢＳ標的相補的プライマーの配列を示す。表１に示した具体的プライマーには全て、配列番号１の配列に含まれる標的相補的配列がある。
【００５５】
【表１】
2008529501.tif 000003
【００５６】
表２は、ＧＢＳ核酸の逆鎖に対するＧＢＳ標的相補的プライマーと対応するプロモーター−プライマーの両方の配列を示す。上記のように、全てのプロモーター−プライマーがその３’末端にＧＢＳ標的配列に対して相補的な配列を含有し、その５’末端にＴ７プロモーター配列ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ（配列番号７）を含有していた。表２に配列番号１１〜１３と示すプライマーは、各々配列番号８〜１０と示すＧＢＳ標的相補的プライマーに対応するプロモーター−プライマーである。表２に示す具体的プライマーには全て、配列番号２の配列に含まれる標的相補的配列がある。
【００５７】
【表２】
2008529501.tif 000004
【００５８】
ＧＢＳ核酸配列を増幅するための好ましいプライマーの組としては、表２に挙げたプライマーのいずれか等のＧＢＳ標的配列にハイブリダイズする第１プライマー、及び表１に挙げたプライマーのいずれか等の第１プライマーの延長生成物の配列に対して相補的な第２プライマーがあげられる。極めて好ましい態様では、第１プライマーは５’末端にＴ７プロモーター配列を含むプロモーター−プライマーがある。
【００５９】
好ましい検出プローブ
本発明の他の側面は、ＧＢＳ核酸を検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用できるオリゴヌクレオチドに関する。ＧＢＳ核酸中に存在する標的核酸配列を増幅する方法は、アンプリコンを検出するための任意工程をさらに含んでもよい。本検出法には、被験試料とハイブリダイゼーションアッセイプローブを接触させる工程が含まれ、プローブは標的核酸配列又はその相補配列に緊縮ハイブリダイゼーション条件下で優先的にハイブリダイズして、検出に対して安定なプローブ：標的二本鎖を形成する。次いで、被験試料中のＧＢＳ核酸の存在又は不存在の指標として、本ハイブリッドが被験試料中に存在するかを判定する工程がある。これは、プローブ：標的二本鎖の検出を含んでもよく、好ましくは均一アッセイ系を含む。
【００６０】
ＧＢＳ核酸配列の検出に有用なハイブリダイゼーションアッセイプローブには、ＧＢＳ標的核酸配列に対して実質的に相補的である塩基配列が含まれる。したがって、本発明のプローブはＧＢＳ標的核酸配列の一方の鎖又はその相補配列にハイブリダイズする。当該プローブは、場合により、ターゲティングする核酸領域の外側に追加塩基があってもよく、これらはＧＢＳ核酸に対して相補的でも、そうでなくてもよい。
【００６１】
好ましいプローブは、化学発光性分子で標識したプローブについては約６０℃及び塩類濃度０．６〜０．９Ｍに相当する緊縮ハイブリダイゼーション条件下で、分子ビーコンプローブについては４２℃及び塩類濃度２０〜１００ｍＭに相当する緊縮ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするのに十分なほど、標的核酸に対して相同性がある。好ましい塩類としては塩化リチウム、塩化マグネシウム及び塩化カリウムがあげられるが、塩化ナトリウム及びクエン酸ナトリウム等の他の塩類もハイブリダイゼーション溶液に使用できる。または、高緊縮ハイブリダイゼーション条件の例は、０．４８Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、並びに各々１ｍＭ ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡにより、又は０．６Ｍ ＬｉＣｌ、１％ラウリル硫酸リチウム、６０ｍＭコハク酸リチウム、並びに各々１０ｍＭ ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡにより得られる。
【００６２】
本発明のプローブは、ＧＢＳゲノムのあるドメインに対して相補的又はそれに相当する配列がある。ＧＢＳ核酸配列を検出するのに好ましい分子ビーコンプローブは、２６〜３０ヌクレオチドの長さのプローブ配列があり、これは標的相補的塩基配列を、検出すべき核酸に対して相補的でないずれかの塩基配列と共に含む。ＧＢＳ核酸配列を検出するのに好ましい具体的な分子ビーコンプローブは、１６〜２０ヌクレオチドの長さの標的相補的配列がある。もちろん、本標的相補的配列は線状配列でもよく、また分子ビーコンの構造中、若しくは検出すべきＧＢＳ標的配列に対して相補的でない１以上の任意核酸配列がある他の構築体中に含まれていてもよい。上記のように、プローブはＤＮＡ、ＲＮＡ、組合わせＤＮＡ及びＲＮＡ、核酸類似体から構成されてもよく、または１以上の修飾ヌクレオシド（例えばリボフラノシル部分に２’−Ｏ−メチル置換をもつリボヌクレオシド）を含んでもよい。
【００６３】
簡潔には、本発明に関して目的とする標的核酸を検出するのに好ましいプローブは、ある特定のプローブドメインのうち１以上に含まれる配列又はその相補配列を含有し、ＲＮＡ及びＤＮＡの均等物並びにヌクレオチド類似体が存在してもよい。例えば、ＧＢＳ核酸を検出するのに好ましいハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号３の配列に含まれる標的相補的塩基配列を含んでもよい。検出すべき核酸配列に対して相補的でない任意配列を、プローブの標的相補的配列に連結させることができる。
【００６４】
本発明のある好ましいプローブは、検出可能な標識を含む。この標識は、発蛍光団、及び蛍光消光特性をもつ第２部分を含む。
表３は、ＧＢＳアンプリコンの検出に用いる分子ビーコンプローブのループ部に含まれるＧＢＳ標的相補的オリゴヌクレオチド配列及び対応する分子ビーコンプローブの完全配列を示す。各分子ビーコンは、分子ビーコンのループ部に含まれるＧＢＳ標的相補的配列に付与された５’側ＣＣＧＡＧアーム配列及び３’側ＣＵＣＧＧアーム配列を含んでいた。表３に配列番号１４〜１７と表示したループ部は、配列番号１８〜２１と表示した分子ビーコンに各々対応する。本発明方法に用いるＧＢＳ特異的分子ビーコンは全て、配列番号３の配列に含まれる１６〜２０個の連続ヌクレオチドを含む標的相補的配列があり、ＲＮＡ及びＤＮＡの均等物が存在してもよい。表３に示す標的相補的配列を、独立して分子ビーコンのループ領域に組み込ませた。本発明方法に用いた分子ビーコンは各々、５’末端にフルオレセイン発蛍光団及び３’末端にＤＡＢＣＹＬ消光体部分を含んでいた。
【００６５】
【表３】
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【００６６】
ＧＢＳ核酸配列を検出するための交互プローブを逆センスＧＢＳ鎖にハイブリダイズさせることができるので、本発明には表３に示す配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドも含まれる。
【００６７】
上記のように、様々な主鎖構造体を、本発明のハイブリダイゼーションプローブのオリゴヌクレオチド配列の足場として使用できる。極めて好ましい態様では、ＧＢＳアンプリコンの検出に用いるプローブ配列は、メトキシ主鎖を含み、又は核酸主鎖中に少なくとも１のメトキシ結合を含む。
【００６８】
ＧＢＳポリヌクレオチド配列を増幅及び検出するための好ましい方法
本発明の好ましい方法を後記の実施例により記載及び説明する。図１はＧＢＳ核酸の標的領域（太い水平の実線で示す）を検出するために用いられる１の系を模式的に示す。本系は、少なくとも３つのオリゴヌクレオチド（短い実線で示す）を含む；１のＴ７プロモーター−プライマー：ＧＢＳ配列の標的領域に特異的にハイブリダイズする配列、及びＴ７プロモーター配列（「Ｐ」）（二本鎖の場合にはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼに対する機能性プロモーターとして作用する）を含む；１の非Ｔ７プライマー：Ｔ７プロモーター−プライマーを用いて標的領域配列から作製された第１鎖ｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズする配列を含む；並びに１の標識プローブ：上記２つのプライマーを用いて増幅した標的領域の一部に特異的にハイブリダイズする配列を含む。
【００６９】
上記のように、２つのプライマーを用いる標的領域の増幅は、当業者に慣用のいかなる多様な公知の核酸増幅反応でも達成できる。好ましい態様では、ＴＭＡ等の転写関連増幅反応を用いる。本態様では、標的核酸の単一複製体から多数の核酸鎖が生成するので、増幅配列に結合する検出プローブから標的を検出できる。好ましくは、転写関連増幅には２種類のプライマー（１つはＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター配列（図１中に「Ｐ」と表示）を含有するので、プロモーター−プライマーという）、２種類の酵素（逆転写酵素及びＲＮＡポリメラーゼ）及び基質（デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸）を、適切な塩類及び緩衝剤と共に溶液中で用いて、核酸鋳型から多数のＲＮＡ転写体を製造する。
【００７０】
図１は、転写介在増幅の際に、Ｔ７プロモーター−プライマーとして示す第１プライマーに標的核酸がハイブリダイズする。逆転写酵素を用い、標的ＲＮＡを鋳型として用いて、Ｔ７プロモーター−プライマーから相補的ＤＮＡ鎖が合成される。非Ｔ７プライマーとして示す第２プライマーが、新たに合成されたＤＮＡ鎖にハイブリダイズし、逆転写酵素の作用で延長し、ＤＮＡ二本鎖を形成して二本鎖Ｔ７プロモーター領域が形成される。その後、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが、本機能性Ｔ７プロモーターを用いて多数のＲＮＡ転写体を生成する。ＴＭＡの自触媒作用機序は、ＲＮＡ転写体を鋳型として用いるｃＤＮＡ合成工程後のハイブリダイゼーション工程及び重合工程の反復で転写体を産生して標的領域に特異的な核酸配列を増幅する。
【００７１】
検出工程には、上記の増幅ＲＮＡ転写体、すなわちアンプリコンに特異的な、少なくとも１種類の検出プローブが用いられる。好ましくは、検出プローブは均一検出系を用いて検出できる標識で標識される。例えば、上記のように標識プローブをアクリジニウムエステル化合物で標識でき、これから化学発光シグナルを発生させて検出することができる。または標識プローブは、発蛍光団又は発蛍光団と消光体部分を含んでもよい。分子ビーコンは、均一検出系に使用できる標識プローブの１態様である。
【００７２】
ＧＢＳ核酸を検出するためのキット
本発明には、細菌の核酸鋳型を用いてポリヌクレオチド増幅反応を行うためのキットも含まれる。好ましいキットは、標的相補的塩基配列を含有するハイブリダイゼーションアッセイプローブを含み、場合により、検出すべき標的を増幅するためのプライマー又は他の補助オリゴヌクレオチドを含むであろう。他の好ましいキットは、インビトロ増幅反応で標的核酸を増幅するために使用できる一対のオリゴヌクレオチドプライマーを含むであろう。キットの例としては、増幅すべきＧＢＳ核酸配列の逆鎖に対して相補的な第１及び第２増幅オリゴヌクレオチドがあげられる。キットはさらに１以上のオリゴヌクレオチド検出プローブを含んでもよい。さらに本発明の他のキットは、増幅前にＧＢＳ鋳型核酸を他の種から精製するための捕獲オリゴヌクレオチドをさらに含んでもよい。
【００７３】
本発明の一般原理は、限定ではない下記の実施例からより十分に理解できる。
【実施例１】
【００７４】
実施例１は、いくつかのハイブリダイゼーションプローブを同定した方法を記載する。その後、これらをＧＢＳ核酸検出のためのアッセイに用いた。これらのプローブを結合するための標的として、１の合成ＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いた。
【００７５】
実施例１  ＧＢＳ核酸を検出するためのオリゴヌクレオチド
標準的実験方法により、２’−ＯＭｅヌクレオチド類似体を用いて、合成分子ビーコンを製造した。合成分子ビーコンの配列を表３に示す。
【００７６】
ハイブリダイゼーション反応には、１０ｐｍｏｌ／反応の分子ビーコン及び表４にあげる３０ｐｍｏｌ／反応の合成ＧＢＳ ＲＮＡ標的リゴヌクレオチドが含まれた。
【００７７】
【表４】
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【００７８】
２０ｍＭ ＭｇＣｌ２含有ＴＲＩＳ緩衝液１００μｌの反応容量で、合成ＧＢＳ ＲＮＡ標的リゴヌクレオチドの不存在又は存在下での分子ビーコンのハイブリダイゼーション反応を６０℃１０分間行い、続いて４２℃で６０分間インキュベートした。
【００７９】
Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ２０００計測器（Corbett Research,オーストラリア、シドニー）を用いて、４２℃で３０秒毎に９９サイクルで蛍光を測定した。蛍光反応の結果を相対蛍光単位（ＲＦＵ）で測定した。ハイブリダイゼーション反応終了後、各工程で１５秒間保持しながら反応温度を４２℃〜９９℃まで１℃ずつ上昇させ、得られたＲＦＵを測定し、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ２０００計測器に添付のデータ分析ソフトウェアを用いて分子ビーコンの融解温度（Ｔｍ）を決定した。ハイブリダイゼーション反応で得られた代表的な結果及び融解温度測定値を表５にまとめる。
【００８０】
表５に示す数値は、標的存在下で測定した終点ＲＦＵを標的の不存在下で測定した終点ＲＦＵで割ったものから計算した平均シグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ）の数値を示す。標的不存在下での分子ビーコンの融解温度計算値は分子ビーコンのステム構造の安定性を判定するのに有用であり、一方、標的配列にハイブリダイズした分子ビーコンの融解温度はハイブリッドの安定性に関する情報を提供する。
【００８１】
【表５】
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【００８２】
表５に示す結果は、合成ＧＢＳ ＲＮＡ標的リゴヌクレオチドへの結合に伴い、各分子ビーコンのＳ／Ｎ比の数値が強まることを示した。さらに、標的不存在下での分子ビーコンの融解温度は、当該分子ビーコンが安定なステム構造をもつことにより、さらに低温での分子ビーコンの非特異的「開放」が阻止されることが示された。合成ＧＢＳ ＲＮＡ標的リゴヌクレオチド存在下での分子ビーコンの高い融解温度は、実験条件下で安定なハイブリッドが形成されたことを示した。
【００８３】
アンプリコン産生をリアルタイム増幅方法で時間の関数としてモニターした。増幅反応に含まれるアンプリコン特異的分子ビーコンが、アンプリコン合成の連続モニタリング手段を提供した。経時的に高まる蛍光発光は、アンプリコンが生成して分子ビーコンにハイブリダイズし、分子ビーコンの開放配置へ検出可能な転移が起こったことを示した。
【００８４】
分子ビーコンには、標的相補的配列がある核酸分子、標的不存在下では相補的塩基対合により相互作用してステム構造（すなわち閉鎖配置）を形成する親和性対（つまり核酸アーム）及びプローブが閉鎖配置にある場合に相互作用する一組の標識対が含まれる。当業者であれば、分子ビーコンの構造内に含まれる標的相補的配列が一般にプローブの一本鎖ループ領域の形であることを理解するであろう。標的核酸とプローブの標的相補的配列がハイブリダイズすると、親和性対のメンバーが分離し、これによりプローブが開放配置に移行する。この移行は、標識対（例えば発蛍光団と消光体であってよい）のメンバー間の相互作用が低下して検出できる。分子ビーコンは米国特許第５，９２５，５１７号に十分に記載されており、その開示内容を本明細書に援用する。
【００８５】
市販のソフトウェアを利用して、ＧＢＳ核酸由来のアンプリコンに特異的な分子ビーコンを用いて得た時間依存性の結果を分析した。本分析から得た結果は、増幅反応に含まれる標的複製数と蛍光シグナルがバックグラウンド閾値を超えた時間（つまり出現時間）との間に、実質的に直線関係を示した。以下に示す結果から確認されるように、本方法は極めて広範にわたる被分析標的量を定量するのに有用であった。より具体的には、既知量の被分析ポリヌクレオチドを検量標準品として用いると、測定した出現時間を標準曲線と比較することにより、被験試料中に存在する被分析体の量を判定できる。
【００８６】
以下に記載の方法で用いた増幅反応を、増幅と検出を同時に行うために、定温で、他の検出工程のために中断せずに操作した事実により、分子ビーコンに厳密な要求が課された。より具体的には、本方法の成功のために、分子ビーコンがアンプリコンを結合し、その後アンプリコンを指数的増幅系で鋳型として用いることを妨げないことが要求された。実際、分子ビーコン存在下で増幅反応が効率的に進行し得たという知見は、本プローブとその標的との相互作用が増幅反応に不可逆的な阻害又は弊害とならなかったことを示す。
【実施例２】
【００８７】
実施例２には、各相互作用性の発蛍光団／消光体対で標識した分子ビーコンプローブをＴＭＡ反応での時間依存性アンプリコン産生のモニタリングに用いた方法を記載する。実施例２に記載の分子ビーコンは増幅核酸生成物の一方の鎖のみにハイブリダイズしたが、相補的プローブ配列が逆核酸鎖にハイブリダイズすることも予想されるため、本発明の範囲に含まれる。
【００８８】
実施例２  アンプリコン産生のリアルタイムモニタリング
標準固相ホスファイトトリエステル化学により、３’側−消光体に結合した制御ポアガラス（ＣＰＧ）及び５’側−発蛍光団で標識したホスホルアミダイトを用い、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（カリフォルニア州フォスター・シティー）ＥＸＰＥＤＩＴＥモデル８９０９自動合成装置で、ＧＢＳアンプリコンに対する結合特異性を有する分子ビーコンを合成した。分子ビーコンの構築のために発蛍光団としてフルオレセインを用い、消光体としてＤＡＢＣＹＬを用いた。全ての分子ビーコンを２’−０Ｍｅヌクレオチド類似体を用いて構築した。ＣＰＧ試薬及びホスホルアミダイト試薬をGlen Research Corporation（バージニア州スターリング）から購入した。合成後、濃水酸化アンモニウム（３０％）で６０℃２時間処理し、プローブを脱保護して固体支持体マトリックスから解離した。次いで、当業者に慣用の標準方法を用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動の後ＨＰＬＣでプローブを精製した。
【００８９】
リアルタイム増幅及び検出法に用いた核酸標的は、既知濃度の精製ｒＲＮＡであった。様々な標的濃度を三重試験した。分子ビーコンを０．２ｐｍｏｌ／μｌ（３ｐｍｏｌ／反応）のレベルで用いた。鋳型複製数５０／反応〜５×１０８／反応までを用いて、ＧＢＳ核酸を増幅する反応を実施した。
【００９０】
３ｐｍｏｌ／反応のＴ７プライマー、３ｐｍｏｌ／反応の非Ｔ７プライマー、標的ポリヌクレオチド、及び３ｐｍｏｌ／反応の分子ビーコンを、１５μｌの緩衝液（最終濃度：５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．２〜８．５），３５ｍＭ ＫＣｌ，４ｍＭ ＧＴＰ，４ｍＭ ＡＴＰ，４ｍＭ ＵＴＰ，４ｍＭ ＣＴＰ，１ｍＭ ｄＡＴＰ，１ｍＭ ｄＴＴＰ，１ｍＭ ｄＣＴＰ，１ｍＭ ｄＧＴＰ，２０ｍＭ ＭｇＣｌ２，２０ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン及び５％（ｗ／ｖ）グリセロール）中に含む反応物を、乾式加熱ブロックで６０℃１０分間インキュベートして、プライマーのアニーリングを促進した。６０℃のインキュベーション工程後、反応物を４２℃の加熱ブロックへ移し、次いで２分間インキュベートした。ＭＭＬＶ逆転写酵素及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ酵素の両方を含有する酵素試薬各５μｌを反復ピペッターで各反応物に添加した。試験管を短時間渦撹拌し、次いで４２℃に予熱したＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ２０００（Corbett Research、オーストラリア、シドニー）ローターへ移した。増幅反応を４２℃で実施し、３０秒毎に６０サイクルの蛍光読取りを行い、Ｒ２０００に付属する標準ソフトウェアを用いて結果をリアルタイムで分析した。異なる分子ビーコン及び異なるプライマー組合わせを用いて本方法で得た代表的な結果を、表６及び７に示す。
【００９１】
【表６】
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【００９２】
表６に示す結果から、３種類のプライマー組合わせ、異なるＧＢＳ特異的分子ビーコン及び特定の標的濃度（複製数５×１０８／反応）を含む増幅反応では、プライマー組合わせ配列番号４と１３及び分子ビーコン配列番号１８を除いて、所望の蛍光シグナルはプラトーに達するまで経時的に増大することが確認された。本方法に用いた各分子ビーコンは５’末端にフルオレセイン発蛍光団、３’末端にＤＡＢＣＹＬ消光体部分を含んだ。結果はすべて三重試験に含まれる反応に基づくものであった。
【００９３】
【表７】
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【００９４】
表７に示す結果から、異なるプライマー組合わせ及び特定の分子ビーコン（配列番号１９）を含む増幅反応では、所望の蛍光シグナルはプラトーに達するまで経時的に増大することが確認された。結果はすべて三重試験に含まれる反応に基づくものであった。上記結果は、特定の分子ビーコンが複製数５０／反応まで増幅生成物を検出できることをも示した。プライマー組合わせ配列番号５と１２及び配列番号６と１２のみが複製数５０／反応のレベルで２／３の複製物を検出し、一方、プライマー組合わせ配列番号６と１１についてはこのレベルでは３複製物はいずれも検出されなかった。
【００９５】
試験した各プライマー組合わせでは、少なくともある程度の時間依存性−被分析体検出が得られた。本方法で試験した、異なるプライマー組合わせの態様は、リアルタイムアッセイ様式で若干異なった。例えば、プライマー組合わせ配列番号４と１３及び配列番号６と１３を含む反応は極めて迅速に検出された。表７に示す結果はさらに、前記のプライマー及び分子ビーコンは極めて低い装入鋳型レベルのＧＢＳ核酸を検出するための高感度アッセイに使用できることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１は、ＧＢＳ核酸（太い横線で示す）内の標的領域を検出するのに用いる様々なポリヌクレオチドを示す模式図である。下記の核酸の位置を標的領域に対比して示す：「非Ｔ７プライマー」及び「Ｔ７プロモーター−プライマー」はＴＭＡを実施するのに用いる２つの増幅プライマーを示し、ここで「Ｐ」はＴ７プロモーター−プライマーのプロモーター配列を示し、「プローブ」は増幅核酸を検出するのに用いるプローブを示す。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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