(57)【要約】  本発明は、生物活性因子が酵素的に分解可能な連結によって、バイオマテリアルに共有結合している、生物活性因子が組み入れられている合成バイオマテリアルおよびその形成法を特徴とする。これらのバイオマテリアルは、薬学的活性成分、生物活性因子の局所化送達のため、組織修復および再生のため、そして特に、皮膚、骨、腱および軟骨などの軟組織または硬組織の再生のため、使用可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物活性因子または２ドメイン生物活性因子を含む合成前駆体構成要素または合成バイオマテリアルであって、該生物活性因子または２ドメイン生物活性因子が、酵素的に分解可能な連結によって該前駆体構成要素またはバイオマテリアルに共有結合している、前記合成前駆体構成要素または合成バイオマテリアル。
【請求項２】
２ドメイン生物活性因子が第一のドメインおよび第二のドメインを含み、第一のドメインが架橋可能な酵素の基質ドメインを含み、そして第二のドメインが生物活性因子を含む、請求項１記載の合成前駆体構成要素または合成バイオマテリアル。
【請求項３】
架橋可能な酵素の基質ドメインが組織トランスグルタミナーゼ基質ドメインである、請求項２記載の合成前駆体構成要素または合成バイオマテリアル。
【請求項４】
組織トランスグルタミナーゼ基質ドメインが因子ＸＩＩＩａ基質ドメインである、請求項３記載の合成前駆体構成要素または合成バイオマテリアル。
【請求項５】
生物活性因子が、小分子、ホルモン、ヌクレオチド、ペプチド、およびタンパク質で構成される群から選択される、請求項２〜４のいずれかに記載の合成前駆体構成要素または合成バイオマテリアル。
【請求項６】
生物活性因子が、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）からなる群より選択される、請求項５記載の合成前駆体構成要素または合成バイオマテリアル。
【請求項７】
ポリエチレングリコールを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の合成前駆体構成要素または合成バイオマテリアル。
【請求項８】
バイオマテリアルに共有結合した少なくとも１つの生物活性因子を含む、合成バイオマテリアルを形成する方法であって、少なくとも１つの酵素を用いて、共有結合の形成を触媒することを含む、前記方法。
【請求項９】
酵素が組織トランスグルタミナーゼである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
組織トランスグルタミナーゼが因子ＸＩＩＩａである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
生物活性因子が第一のドメインおよび第二のドメインを含む２ドメイン生物活性因子であり、第一のドメインが架橋酵素の基質ドメインを含み、そして第二のドメインが生物活性因子を含む、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
第一のドメインが因子ＸＩＩＩａ基質ドメインである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
マイケル型付加反応を用いて、少なくとも２つの前駆体構成要素からバイオマテリアルを形成する工程をさらに含み、第一の前駆体構成要素がｎ個の求核基を含み、そして第二の前駆体構成要素がｍ個の求電子基を含み、ｎおよびｍが少なくとも２であり、そしてｎ＋ｍの合計が少なくとも５である、請求項８〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
求核基がチオール基を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
求電子基が共役不飽和基を含む、請求項１３または１４記載の方法。
【請求項１６】
生物活性因子が第一のドメインおよび第二のドメインを含む２ドメイン生物活性因子であり、第一のドメインが架橋酵素の基質ドメインを含み、そして第二のドメインが生物活性因子を含み、そして前駆体構成要素の少なくとも１つが少なくとも１つのアミン基をさらに含む、請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法であって、前駆体構成要素の少なくとも１つの上の少なくとも１つのアミン基で、酵素触媒作用を介して、２ドメイン生物活性因子の第一のドメインと反応する工程をさらに含む、前記方法。
【請求項１７】
第二の前駆体構成要素が少なくとも１つのアミン基を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ＨＳ−（Ｘ）ｎ−ＮＨ２およびＨＳ−（Ｘｉ）ｎ−ＮＨ２、式中、Ｘは任意の適切な基である、からなる群より選択される式を有するリンカー分子と、前駆体構成要素を反応させることによって、第二の前駆体構成要素を形成する工程をさらに含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
ＨＳ−（Ｘ）ｎ−ＮＨ２がメルカプトエチルアミンである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１つの前駆体構成要素がポリエチレングリコールを含む、請求項１３〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
生物活性因子が、小分子、ホルモン、ヌクレオチド、ペプチド、およびタンパク質からなる群より選択される、請求項８〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
生物活性因子が、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞増殖因子からなる群より選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
共有結合した２ドメイン生物活性因子または生物活性因子を含む合成バイオマテリアルであって、該生物活性因子または２ドメイン生物活性因子が、酵素触媒作用によってバイオマテリアルに共有結合している、前記合成バイオマテリアル。
【請求項２４】
バイオマテリアルが少なくとも２つの前駆体構成要素から形成され、第一の前駆体構成要素がｎ個の求核基を含み、そして第二の前駆体構成要素がｍ個の求電子基を含み、ｎおよびｍが少なくとも２であり、そしてｎ＋ｍの合計が少なくとも５であり、そして第一の前駆体および第二の前駆体がマイケル型付加反応を経ることが可能である、請求項２３記載のバイオマテリアル。
【請求項２５】
求核基がチオール基を含む、請求項２４記載のバイオマテリアル。
【請求項２６】
求電子基が共役不飽和基を含む、請求項２４または２５記載のバイオマテリアル。
【請求項２７】
２ドメイン生物活性因子が第一のドメインおよび第二のドメインを含み、第一のドメインが架橋可能な酵素の基質ドメインを含み、そして第二のドメインが生物活性因子を含む、請求項２４〜２６のいずれかに記載のバイオマテリアル。
【請求項２８】
第一のドメインが因子ＸＩＩＩａ基質ドメインである、請求項２７記載のバイオマテリアル。
【請求項２９】
前駆体構成要素の少なくとも１つが、酵素触媒作用下で、２ドメイン生物活性因子の第一のドメインまたは生物活性因子と反応可能な少なくとも１つのアミン基をさらに含む、請求項２４〜２８のいずれかに記載のバイオマテリアル。
【請求項３０】
第二の前駆体構成要素が少なくとも１つのアミン基を含む、請求項２９記載のバイオマテリアル。
【請求項３１】
生物活性因子が、小分子、ホルモン、ヌクレオチド、ペプチド、およびタンパク質からなる群から選択される、請求項２３〜３０のいずれかに記載のバイオマテリアル。
【請求項３２】
生物活性因子が、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）からなる群より選択される、請求項３１記載のバイオマテリアル。
【請求項３３】
前駆体構成要素がポリエチレングリコールを含む、請求項２４〜３２のいずれかに記載のバイオマテリアル。
【請求項３４】
組織修復および再生のための、生物活性因子の局在化送達または全身性送達用の剤の製造のための、先行する請求項のいずれかに記載のバイオマテリアルの使用。
【請求項３５】
前記再生が、皮膚、骨、腱および軟骨などの軟組織および硬組織の再生である、請求項３４記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
本出願は、２００４年１２月２２日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／６３８，５１８に優先権を請求する。
発明の分野
本発明は、生物活性因子が組み入れられた合成バイオマテリアル、前記バイオマテリアルに生物活性因子を結合させ、そして前記バイオマテリアルから生物活性因子を放出させる方法、および生物活性因子を補充した前記バイオマテリアルを適用し、そして用いるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
フィブリン・マトリックスまたはポリエチレンに基づく合成ヒドロゲルのような、天然および合成バイオマテリアルは、薬学的適用および外科適用を含む、多様な適用において使用可能である。これらは、例えば、被験体に生物活性因子を送達するため、接着剤または密封剤、組織操作または創傷治癒の足場、あるいは細胞移植デバイスとして、使用可能である。
【０００３】
ヒトおよび動物の体における適用のため、体内の必要な部位でのバイオマテリアルのｉｎ−ｓｉｔｕ形成は、バイオマテリアルが最小限に侵襲性の手術によって適用可能であるため、最適な技術である。しかし、体における適用は、（ｉ）バイオマテリアルを形成する前駆体構成要素の性質、（ｉｉ）バイオマテリアルのｉｎ−ｓｉｔｕ形成のための架橋機構、および（ｉｉｉ）前駆体構成要素および／またはバイオマテリアルに生物活性因子を組み入れるための架橋機構に関して、化学的性質の選択を制限する。
【０００４】
前駆体構成要素に関しては、多様なアプローチが使用されてきている。１つのアプローチでは、天然存在前駆体構成要素が利用され；別のアプローチは完全に合成の前駆体構成要素に重点を置き；そしてさらに別のアプローチでは、天然存在および合成前駆体構成要素あるいは一方または他方の修飾の組み合わせが用いられる。
【０００５】
コラーゲン、変性コラーゲン（ゼラチン）および特にフィブリンのような、天然存在または化学的に修飾された天然存在タンパク質に基づくバイオマテリアルが、ヒトおよび動物の体において適用されてきている。特に、フィブリンおよびコラーゲンに基づくマトリックスで、優れた反応が達成されてきている。他の例には、セルロース、アルギン酸塩およびヒアルロン酸のような炭水化物が含まれる。
【０００６】
天然または合成バイオマテリアルまたはその混合物における生物活性因子の組み入れは、例えば米国特許第６，１１７，４２５号および第６，１９７，３２５号ならびにＷＯ０２／０８５４２２に記載されているように、主に、物理的相互作用を通じた、生物活性因子の組み入れにより行われる。バイオマテリアルへの生物活性因子の共有結合は、より進歩した技術であり、バイオマテリアルからの生物活性因子の放出プロフィールの制御を可能にする。バイオマテリアルの形成中または形成後、前駆体構成要素またはバイオマテリアルの１以上の官能基と反応可能な官能基の組み入れを通じて、生物活性因子を修飾することによって、生物活性因子の共有架橋を行ってもよい。トランスグルタミナーゼの作用を通じた、フィブリン・マトリックスへの小さい合成または天然存在分子、ペプチドおよび／またはタンパク質の組み入れが、米国特許第６，３３１，４２２号；第６，４６８，７３１号および第６，９６０，４５２号ならびにＷＯ０３／０５２０９１に記載されてきている。合成バイオマテリアルに関しては、生物活性因子中のチオール基が、例えばＷＯ００／４４８０８に記載されるような適切な条件下で、合成前駆体構成要素またはバイオマテリアル中の多様な官能基と反応可能である、強力な基である。こうして形成されたチオエステル結合の加水分解を通じて、バイオマテリアルからの生物活性因子の放出機構を達成してもよい。
【０００７】
生物活性因子が、野生型の修飾されていない型で、バイオマテリアルから放出されるように、共有組み入れを設計することも可能であるが、先行技術に記載される、合成前駆体構成要素または合成バイオマテリアルへの生物活性因子の連結機構および生じるバイオマテリアルは、不都合な点を示す。例えば、ペプチドおよび特にタンパク質、例えば増殖因子におけるさらなるシステイン／チオール基の組み入れは、再フォールディング・プロセスにおいて誤って確立されたジスルフィド結合を導き、そしてその結果、ペプチドまたはタンパク質の不活性を導きうる。チオール基の代わりにアミン基を組み入れると、アミンの反応が、バイオマテリアル／前駆体構成要素の非常に活性な官能基に対してさえ、同じ官能基へのチオール基の反応よりはるかにより特異的でないため、前駆体構成要素および／またはバイオマテリアルへの生物活性因子の非特異的でそして制御不能な架橋を導きうる。
【０００８】
さらに、前駆体構成要素および／またはバイオマテリアルの官能基に、チオールまたはアミンを反応させることによって形成される連結の性質は、加水分解に感受性である可能性もあり、そしてしたがって、バイオマテリアルからの生物活性因子の放出は、主に、加水分解環境に依存し、そしてほとんど制御不能である。
【０００９】
本発明の目的は、加水分解以外の機構によってバイオマテリアルから放出される生物活性因子が組み入れられた合成バイオマテリアルを提供することである。
本発明のさらなる目的は、合成前駆体構成要素および／またはバイオマテリアルにおける特定の側に選択的に生物活性因子を連結するための機構を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに別の目的は、合成バイオマテリアルからの生物活性因子の徐放を改善することである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
発明の概要
上記目的は、生物活性因子または２ドメイン生物活性因子を含む合成前駆体構成要素または合成バイオマテリアルであって、該生物活性因子または２ドメイン生物活性因子が、酵素的に分解可能な連結によって該前駆体構成要素またはバイオマテリアルに共有結合している、前記合成前駆体構成要素または合成バイオマテリアルによって解決されるとともに、該合成前駆体構成要素または合成バイオマテリアルを形成する方法によって解決され、そして共有結合している２ドメイン生物活性因子または生物活性因子を含む合成バイオマテリアルであって、該生物活性因子または２ドメイン生物活性因子が、酵素触媒作用によって該バイオマテリアルに共有結合している、前記合成バイオマテリアルによって解決される。
【００１２】
本発明はまた、バイオマテリアルに対して架橋された生物活性因子または２ドメイン生物活性因子を含み、該生物活性因子または２ドメイン生物活性因子が、架橋可能酵素の基質ドメインを含む、合成バイオマテリアルを形成するための方法であって、
（ａ）共役不飽和基を含む、第一の前駆体構成要素を提供し、
（ｂ）少なくとも１つのチオール基および少なくとも１つのアミン基を含むリンカー分子を提供し、
（ｃ）共役不飽和基の一部とチオール基を反応させて、アミンで修飾された前駆体構成要素を形成し；
（ｄ）生物活性因子または２ドメイン生物活性因子の基質ドメインおよびアミンで修飾された前駆体構成要素のアミン基の間の架橋反応を触媒することが可能な酵素を提供し；
（ｅ）アミンで修飾された前駆体構成要素のアミン基と、生物活性因子または２ドメイン生物活性因子の基質ドメインを反応させて、生物活性因子−前駆体構成要素を形成し；
（ｆ）強い求核基を含む第二の前駆体構成要素を提供し、そして
（ｇ）マイケル型付加反応において、第二の前駆体構成要素の強い求核基と、生物活性因子−前駆体構成要素の共役不飽和基を反応させて、バイオマテリアルを形成する
ことを含む、前記方法にも関する。
【００１３】
本発明はまた、ポリエチレングリコールで修飾された生物活性因子を形成する方法であって
（ａ）少なくとも１つのアミン基を含むポリエチレングリコール分子を提供し；
（ｂ）架橋可能酵素の基質ドメインを含む生物活性因子または２ドメイン生物活性因子を提供し；
（ｃ）生物活性因子または２ドメイン生物活性因子の基質ドメインおよびアミン基の間の架橋反応を触媒することが可能な酵素を提供し；そして
（ｄ）生物活性因子または２ドメイン生物活性因子を、ポリエチレングリコール分子上のアミン基に架橋する
ことを含む、前記方法にも関する。
【００１４】
酵素的に分解可能な連結によって、合成前駆体構成要素および／またはバイオマテリアルに共有結合している生物活性因子または修飾生物活性因子を含有する合成バイオマテリアルを本明細書に記載する。酵素触媒作用によって、合成バイオマテリアルに生物活性因子を共有結合させる方法、該方法を用いて産生されるバイオマテリアル、およびこれらの方法を実施するために必要な生物活性因子をさらに記載する。生物活性因子は、架橋可能酵素の基質ドメインとして働きうるアミノ酸配列を含有する。該酵素は、生物活性因子の基質ドメイン、および酵素的に触媒される架橋反応に感受性であるバイオマテリアルおよび／または合成バイオマテリアルを形成可能な合成前駆体構成要素の官能基の間の架橋反応を触媒する。好ましい態様において、生物活性因子が、トランスグルタミナーゼの作用を通じて、好ましくは組織トランスグルタミナーゼによって、そしてさらにより好ましくは因子ＸＩＩＩａの作用を通じて、バイオマテリアルおよび／または合成バイオマテリアルを形成可能な合成前駆体構成要素に架橋可能であるように、生物活性因子の基質ドメインを選択する。好ましくは、生物活性因子の基質ドメインは、トランスグルタミナーゼ基質ドメイン、さらにより好ましくは組織トランスグルタミナーゼ基質ドメイン、そして最も好ましくは因子ＸＩＩＩａ基質ドメインを含む。
【００１５】
サイモシンβ４のようないくつかの生物活性因子は、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列の一部として、架橋可能酵素の基質ドメインを生得的に提供する。生物活性因子の一次構造が架橋酵素の基質ドメインを含まない場合、生物活性因子は、合成的に、すなわち化学合成によって、または組換え的に、２ドメインまたはキメラ分子として形成され、ここで、第一のドメインは、架橋酵素の基質ドメインを含み、そして第二のドメインは生物活性因子を含む。本明細書において、一般的に、「２ドメイン生物活性因子」は、酵素的に架橋可能な基質ドメインが、生物活性因子の配列、またはより一般的には分子構造に付着している、生物活性因子を意味する。酵素触媒作用による、バイオマテリアルおよび／または合成バイオマテリアルを形成可能な、適切な合成前駆体構成要素への、２ドメイン生物活性因子の共有架橋が、好ましい態様である。
【００１６】
バイオマテリアルおよび／または合成バイオマテリアルを形成可能な合成前駆体構成要素の官能基は、（ｉ）これらが、架橋酵素によって、好ましくは組織トランスグルタミナーゼによって、そしてさらにより好ましくは因子ＸＩＩＩａによって、生物活性因子の基質ドメインに架橋可能であり、そして（ｉｉ）必要であれば、バイオマテリアルを形成するため、同じかまたは異なる前駆体構成要素に架橋可能であるように選択される。バイオマテリアルを形成可能な合成前駆体構成要素は、直鎖または分枝鎖であってもよく、好ましくは末端に、官能基を有する。好ましい態様において、生物活性因子の酵素的に架橋可能な基質ドメインと反応可能な合成前駆体構成要素および／または合成バイオマテリアルの官能基は、アミン基であり、そして特に一級アミン基である。生物活性因子の反応パートナーとして働く官能基に加えて、バイオマテリアルを形成するため、好ましくはバイオマテリアルをｉｎ  ｓｉｔｕ形成するため、前駆体構成要素中にはさらなる官能基がある。バイオマテリアルの形成に関与する官能基は、生物活性因子の架橋に関与する官能基と同じであってもまた異なってもよい。局所薬剤送達の目的のため、任意の種類の硬組織または軟組織の組織修復および操作のため、例えば損傷を受け、そして罹患した皮膚、骨、腱および軟骨の修復および再生のため、バイオマテリアルを用いてもよい。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
「接着部位または細胞付着部位」は、本明細書において、一般的に、細胞表面上の分子、例えば接着促進受容体が結合する、ペプチド配列を指す。
【００１８】
「バイオマテリアル」は、本明細書において、一般的に、マトリックスの性質に応じて、水で膨張可能であるが、水に溶解不能であり、すなわち特定の期間、体内に留まるヒドロゲルを形成可能である、ポリマー、好ましくは架橋された三次元ポリマー性ネットワークを指す。バイオマテリアルは、生物学的系と調和して、材料に応じて、永続的または一時的のいずれかで、体の任意の組織、臓器または機能を評価するか、治療するか、増大させるか、修復するか、再生するかまたは置換するよう意図される。
【００１９】
「天然バイオマテリアル」は、本明細書において、天然に存在し、そしてそこから単離可能であるかまたは合成的に再操作可能である、バイオマテリアルを指す。
「合成バイオマテリアル」は、本明細書において、天然には存在しないバイオマテリアルを指す。
【００２０】
用語「バイオマテリアル」および「マトリックス」は、本明細書において、同義的に用いられる。
「生体適合性」または「生体適合性がある」は、本明細書において、一般的に、物質が、特定の適用において、適切な宿主応答を伴って機能する能力を指す。最も広い意味において、「生体適合性」または「生体適合性がある」は、患者に対する物質および／または治療の利益を上回る方式での、体に対する不都合な影響を欠くことを意味する。
【００２１】
「生物活性因子」は、本明細書において、一般的に、ヒトまたは動物の体に薬学的効果を有する、合成または天然存在分子、ヌクレオチド、ペプチドまたはタンパク質を指す。生物活性因子は、天然供給源から単離可能であるし、あるいは合成的にまたは組換え的に産生される。
【００２２】
「２ドメイン生物活性因子」は、本明細書において、第一のドメインが酵素的に架橋可能な基質ドメインを含み、そして第二のドメインが生物活性因子を含む、生物活性因子を指す。したがって、基質ドメインは、生物活性因子の生得的な部分ではない。第一のドメインおよび第二のドメインの間に、酵素分解部位もまた存在してもよく、そしてこれは「ｐｌ」と略される。したがって、分解部位を含む２ドメイン生物活性因子が、分解部位で切断されたならば、生物活性因子が放出される。組織トランスグルタミナーゼおよび特に因子ＸＩＩＩａのような架橋可能酵素は、生物活性因子の基質ドメインおよび前駆体構成要素またはバイオマテリアルの適切な官能基の間の共有結合の形成を触媒可能である。
【００２３】
「生物学的活性」は、本明細書において、一般的に、関心対象の生物活性因子に仲介される機能的事象を指す。いくつかの態様において、生物学的活性は、ポリペプチドと別のポリペプチドの相互作用を測定することによって測定される。他の態様において、生物学的活性は、関心対象のタンパク質が、細胞増殖、分化、死、遊走、接着、他のタンパク質との相互作用、酵素活性、タンパク質リン酸化または脱リン酸化、転写、あるいは翻訳に対して有する影響をアッセイすることによって、測定される。
【００２４】
「共役不飽和結合」は、本明細書において、一般的に、炭素−炭素、炭素−ヘテロ原子またはヘテロ原子−ヘテロ原子多重結合の単結合での改変を指す。こうした結合は、付加反応を経ることも可能である。共役不飽和結合は、合成ポリマーまたはタンパク質などの巨大分子に官能基を連結するための付加反応を経ることも可能である。
【００２５】
「共役不飽和基」は、本明細書において、一般的に、炭素−炭素、炭素−ヘテロ原子またはヘテロ原子−ヘテロ原子多重結合の単結合での改変を含有する分子または分子領域であって、付加反応を経ることも可能な多重結合を有する、前記分子または分子領域を指す。共役不飽和基の例には、限定されるわけではないが、ビニルスルホン、アクリレート、アクリルアミド、キノン、およびビニルピリジニウム、例えば２−または４−ビニルピリジニウムおよびイタコネートが含まれる。
【００２６】
「架橋」は、本明細書において、一般的に、分子内または分子間の、１より多い共有結合の形成を意味する。
「官能性を持たせる」は、本明細書において、一般的に、官能基または部分の付着を生じる方式で、分子を修飾することを指す。例えば、分子を強い求核剤または共役不飽和にする分子の導入によって、分子に官能性を持たせることも可能である。好ましくは、分子、例えばＰＥＧに官能性を持たせて、チオール、アミン、アクリレート、またはキノン基を含ませる。タンパク質もまた、特に、未結合（ｆｒｅｅ）チオールを生成する、ジスルフィド結合の部分的または完全還元によって、有効に官能性を持たされうる。
【００２７】
「官能性」は、本明細書において、一般的に、分子上の反応性部位の数を指す。
「硬組織」は、骨、軟骨、腱または靭帯を意味する。
「ヒドロゲル」は、水性媒体中で膨張するが、水には溶解しない、ポリマー物質のクラスを意味する。
【００２８】
「多官能性」は、本明細書において、一般的に、分子（すなわちモノマー、オリゴマーまたはポリマー）あたりの、１より多い求電子および／または求核官能基を指す。
「ポリマー性ネットワーク」は、本明細書において、一般的に、モノマー、オリゴマーまたはポリマーの実質的にすべてが、利用可能な官能基を通じた分子間共有結合によって結合されて、１つの巨大分子を生じ、これがバイオマテリアルとして作用する、プロセスの産物を意味する。
【００２９】
「前駆体構成要素」は、本明細書において、一般的に、バイオマテリアルを形成するのに適した、モノマー、オリゴマーおよび／またはポリマーを意味する。
「生理学的」は、本明細書において、一般的に、生存する脊椎動物において見られうるような条件を意味する。特に、生理学的条件は、温度、ｐＨなどのヒト体内の条件を指す。生理学的温度は、特に、３５℃〜４２℃の温度範囲、好ましくは３７℃前後を意味する。
【００３０】
「再生」は、本明細書において、一般的に、硬組織、例えば骨、または軟組織、例えば皮膚など、何かの一部またはすべてが再び成長することを意味する。
「感受性生物学的分子」は、本明細書において、一般的に、その存在下で、他の分子と反応可能である細胞において、または体において見られる分子を指す。感受性生物学的物質に不都合に影響を及ぼすことなく、感受性生物学的物質の存在下で、バイオマテリアルを作製してもよい。
【００３１】
「自己選択性反応」は、本明細書において、一般的に、組成物の第一の前駆体構成要素が組成物の第二の前駆体構成要素と、そしてその逆で、混合物または反応部位に存在する他の化合物とよりも、はるかにより迅速に反応することを意味する。本明細書において、他の生物学的化合物に対してよりも、求核剤は、求電子剤に優先的に結合し、そして求電子剤は、強い求核剤に優先的に結合する。
【００３２】
「軟組織」は、特に非骨格組織、すなわち骨、靭帯、腱および軟骨を除くすべての組織を意味し、そして脊椎円板および線維性組織を含む。
「強い求核剤」は、本明細書において、一般的に、極性結合形成反応において、電子対を求電子剤に供与可能な分子を指す。好ましくは、強い求核剤は、生理学的ｐＨで、水よりも求核性である。強い求核剤の例は、チオールおよびアミンである。
【００３３】
「補充されたバイオマテリアル」は、本明細書において、一般的に、生物活性因子を組み入れたバイオマテリアルを指す。
ＩＩ．組成物
生物活性因子が組み入れられた合成バイオマテリアルおよびその産生法、ならびに特に皮膚、骨および軟骨再生のための、軟組織および硬組織修復、再生および／またはリモデリングにおける使用を本明細書に記載する。生物活性因子は、酵素相互作用を通じて、合成バイオマテリアル内に架橋され、そして該バイオマテリアルから放出されうる。合成バイオマテリアルは、生体適合性であり、そして生物分解性であり、そして移植部位で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、最小限に侵襲性に形成可能である。放出されたら、完全な生物活性を保持するように、バイオマテリアルにおいて、非常に特定のあらかじめ設計された部位で、生物活性因子をバイオマテリアルに組み入れることも可能である。バイオマテリアルを徐放ビヒクルとして使用可能であるように、生物活性因子が、どのように、いつ、そしてどのくらいの度合いまで放出されるかに関して制御を提供する技術を用いて、生物活性因子を放出可能に組み入れることも可能である。合成バイオマテリアルは、バイオマテリアルの機械的特性を増進する安定化物質をさらに含有してもよい。適切な安定化物質の例は、ヒドロキシアパタイト、骨セメント、リン酸カルシウム、硫酸カルシウムなどである。
Ａ．合成バイオマテリアル
多様な方式で、ヒトまたは動物の体に適用するためのバイオマテリアルを調製してもよい。いくつかのバイオマテリアルは、Ｈｅｒｎら，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．  ３９：２６６−２７６，  １９９８に記載されるもののように、不飽和二重結合を含有する、２以上の前駆体構成要素間のフリーラジカル重合を通じて、調製される。他のバイオマテリアルは、２以上の求核基、Ｘを含有する第一の前駆体構成要素と、第一の前駆体構成要素上の求核基と架橋可能な、２以上の求電子基、Ｙを含有する少なくとも第二の前駆体構成要素を反応させることによって、調製される。関与する反応機構は、米国特許第５，８７４，５００号に開示されるものなどの求核置換反応、縮合反応および／またはＷＯ  ００／０４４８０８に記載されるものなどのマイケル型付加反応であってもよい。適切な求核基、Ｘには：−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＯＨ、−ＰＨ２、および−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２が含まれる。適切な求電子基、Ｙには：−ＣＯ２Ｎ（ＣＯＣＨ２）２、−ＣＯ２Ｈ、ＣＨＯ、−ＣＨＯＨ２、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、−ＳＯ２ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｎ（ＣＯＣＨ）、および−Ｓ−Ｓ−（Ｃ５Ｈ４Ｎ）が含まれる。前駆体構成要素は、１以上の求核基を有してもよく、この場合、求核基は互いに同じであってもまた異なってもよい。第二の前駆体構成要素は、１以上の求電子基を有してもよく、この場合、求電子基は互いに同じであってもまた異なってもよい。したがって、前駆体構成要素は、２以上の異なる官能基を有してもよい。
１．マイケル型付加反応
共役不飽和系上の求核基の１，４付加反応は、マイケル型付加反応と称される。バイオマテリアル形成のための好ましい架橋機構は、マイケル型付加反応を通じる。マイケル型付加反応は、感受性生物学的物質の存在下であってさえ、自己選択的方式で、生理学的条件下、体の必要な部位での、少なくとも第一および第二の前駆体構成要素のｉｎ  ｓｉｔｕ架橋を可能にする。したがって、第一の前駆体構成要素は、感受性生物学的環境において、他の構成要素とよりも第二の前駆体構成要素と、はるかにより迅速に反応し、そして第二の前駆体構成要素は、体に存在する感受性生物学的環境において、他の構成要素とよりも第一の前駆体構成要素と、はるかにより迅速に反応する。前駆体構成要素の１つが、少なくとも２つの官能性を有し、そして他の前駆体構成要素の少なくとも１つが、２より多い官能性を有する場合、系は自己選択的に反応して、架橋された三次元バイオマテリアルを形成するであろう。
【００３４】
マイケル型付加反応において、付加機構は純粋に極性であるか、またはラジカル様中間状態（単数または複数）を通じて進行することも可能である。ルイス酸または塩基、あるいは適切に設計された水素結合種が、触媒として作用しうる。用語「共役」は、炭素−炭素、炭素−ヘテロ原子またはヘテロ原子−ヘテロ原子多重結合の単結合での改変、あるいは合成ポリマーまたはタンパク質などの巨大分子への官能基の連結の両方を指すことも可能である。ＣＨまたはＣＨ２単位によって区切られた二重結合は、「ホモ共役二重結合」と称される。バイオマテリアルを形成するための、共役不飽和基へのマイケル型付加は、生理学的温度、特に体温で、しかし体温よりより低い温度およびより高い温度でもまた、実質的に定量的な収率で起こることも可能である。これらの反応は、非常に多様な求核基を用いて、穏やかな条件下で起こる。バイオマテリアル形成動力学および機構、ならびにバイオマテリアルの輸送特性を、適用の必要性を持たすように仕立ててもよい。
ａ．マイケル型付加反応を実行するための求核基
マイケル型付加反応を実行するのに有用な前駆体構成要素（第一または第二の前駆体構成要素いずれか）の求核基は、共役不飽和基と反応可能である。求核基は、これらがヒトまたは動物の体に存在するような条件下で、共役不飽和基に対して反応性であるように選択される。求核基の反応性は、不飽和基の同一性に応じるが、不飽和基の同一性はまず、生理学的ｐＨでの水との反応によって制限される。したがって、有用な求核基は、生理学的ｐＨで、水よりも求核性である。好ましい求核基は、毒性学の理由から、生物学的系において一般的に見られるものであるが、細胞外部の生物学的系において、一般的に、未結合では見られないものである。したがって、好ましい求核基はチオールおよびアミンであり、そして最も好ましくはチオールである。
【００３５】
チオールは、ジスルフィド連結として、対の形で細胞外の生物学的系に存在する。最高の度合いの自己選択性が望ましい場合（例えば架橋反応が組織の存在下で行われ、そしてその組織の化学的修飾が望ましくない場合）、チオールが、選択される強い求核基を代表するであろう。
【００３６】
しかし、最高レベルの自己選択性が必要でない可能性もある、他の状況もある。これらの場合、アミンが適切な求核基として働きうる。ここで、脱プロトン化されたアミンがプロトン化されたアミンよりもはるかに強い求核剤であるため、ｐＨに特に注意が払われる。したがって、例えば、典型的なアミノ酸上のアルファ・アミン（アスパラギンに関してｐＫは８．８というほど低く、プロリンを除くすべての２０の一般的なアミノ酸に関しては平均９．０である）は、リジンの側鎖イプシロン・アミン（ｐＫ  １０．８０）より、はるかに低いｐＫを有する。こうしたものとして、強い求核剤として用いられるアミンのｐＫに特に注意を払うと、実質的な自己選択性が得られうる。低いｐＫを持つアミンを選択し、そして次いでｐＨがそのｐＫの近くであるように最終的な前駆体を配合することによって、系に存在する他のアミンでなく、提供されるアミンを用いた、不飽和の反応を優遇しうる。自己選択性がまったく望ましくない場合、求核剤として用いられるアミンのｐＫにはそれほど注意を払う必要はない。しかし、許容しうる迅速な反応速度を得るため、これらのアミンの適切な数が脱プロトン化されるように、最終的な前駆体溶液のｐＨを調整しなければならない。
【００３７】
要約すると、特定の求核基の有用性は、想定される状況および望ましい自己選択性の量に応じる。チオールは、前駆体混合物中のｐＨのため、そして最大の自己選択性を得るため、一般的に、本発明の好ましい強い求核剤であるが、アミンもまた有用な強い求核基として働くであろう状況がある。
【００３８】
求核基の概念は、この用語が、時に、官能基自体（例えばチオールまたはアミン）だけでなく、官能基を含有する分子も含むように用いられるように、本明細書においては拡張されている。
【００３９】
求核基は、分子、典型的には前駆体構成要素の１つに含有されていてもよく、全体の構造に大きな柔軟性を伴う。例えば、二官能性求核剤は、Ｘ−Ｐ−Ｘの形で存在してもよく、式中、Ｐは前駆体構成要素、すなわちモノマー、オリゴマーまたはポリマーを指し、そしてＸは求核基を指す。同様に、分枝ポリマー、Ｐが、いくつかの求核基で誘導体化されて、Ｐ−（Ｘ）ｉを生成してもよい。ＸはＰの鎖末端に示される必要はなく、例えば反復構造：（Ｐ−Ｘ）ｉが想定可能である。こうした構造において、すべてのＰまたはＸが同一である必要はない。
ｂ．マイケル型付加反応のための求電子基
マイケル型付加反応を実行するのに有用な前駆体構成要素（第一または第二の前駆体構成要素いずれか）の求電子基は、好ましくは、共役不飽和基である。
【００４０】
前駆体構成要素、Ｐ、および共役不飽和基の構造は、求核基に関して上に詳述されるものと類似であってもよい。前駆体構成要素が、少なくとも２つのこうした共役不飽和基（すなわち２つより多いかまたは等しい、こうした共役不飽和基）を含有しさえすればよい。
【００４１】
非常に多様な共役不飽和化合物に対して、求核性付加反応、特にマイケル型付加反応を行うことが可能である。以下に示す構造において、前駆体構成要素は、モノマー構造、オリゴマー構造またはポリマー構造であってもよく、そしてＰと示される。Ｐの特定の同一性に関して、多様な好ましい可能性が、本明細書において、さらに論じられる。Ｐは、１〜２０と番号付けられ、そして表１に列挙されるものなどの構造において、反応性の共役不飽和基にカップリング可能である。
【００４２】
表１：選択される共役不飽和基
【００４３】
【表１−１】
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【００４４】
【表１−２】
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【００４５】
【表１−３】
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【００４６】
反応性二重結合を、直鎖ケトン、エステルまたはアミド構造（１ａ、１ｂ、２）の１以上のカルボニル基に共役させるか、あるいはマレイン酸またはパラキノイド誘導体におけるような環系（３、４、５、６、７、８、９、１０）中の２つに共役させてもよい。後者の場合、環を融合させてナフトキノン（６、７、１０）または４，７−ベンズイミダゾールジオン（８）を生じ、そしてカルボニル基をオキシム（９、１０）に変換してもよい。二重結合をヘテロ原子−ヘテロ原子二重結合、例えばスルホン（１１）、スルホキシド（１２）、スルホネートまたはスルホンアミド（１３）、ホスホネートまたはホスホンアミド（１４）に共役させてもよい。最後に、二重結合を電子不足芳香族系、例えば４−ビニルピリジニウムイオン（１５）に共役させてもよい。カルボニルまたはヘテロ原子に基づく多重結合との共役に、三重結合を用いてもよい（１６、１７、１８、１９、２０）。
【００４７】
１ａ、１ｂおよび２などの構造は、炭素−炭素二重結合と１つまたは２つの電子求引基の共役に基づく。これらの１つは常にカルボニルであり、アミドからエステル、次いでフェノン構造の順に、反応性が増加する。求核付加は、立体障害が減少すると、またはアルファ位での電子求引力が増加すると、より容易になる：ＣＨ３＜Ｈ＜ＣＯＯＷ＜ＣＮ。
【００４８】
求核攻撃が起こるベータ位の置換基のかさ高性を変化させることによって、最後の２つの構造を用いることによって得られる、より高い反応性を調節することも可能である：反応性はＰ＜Ｗ＜Ｐｈ＜Ｈの順に減少する。したがって、Ｐの位置もまた、求核基に対する反応性を調整するのに使用可能である。このファミリーには、その毒性および薬剤における使用に関して非常に多くが知られる、いくつかの化合物が含まれる。例えば、末端にアクリレートおよびメタクリレートを伴う水溶性ポリマーがｉｎ  ｖｉｖｏで重合される（フリーラジカル機構によって）。このように、アクリレートおよびメタクリレート含有ポリマーは、以前、臨床製品において、体において見られてきているが、劇的に異なる化学反応スキームで使用するためであった。
【００４９】
構造３〜１０は、二重結合のｃｉｓ立体配置および２つの電子求引基の存在の両方のため、求核基に対する非常に高い反応性を示す。不飽和ケトンは、これらのカルボニル基のより強い電子陰性度のため、アミドまたはイミドより迅速に反応する。したがって、シクロペンタジオン誘導体は、マレイミド性のもの（３）より、より迅速に反応し、そしてパラキノンは、より拡張された共役のため、マレイン酸ヒドラジド（４）より、より迅速に反応し、そしてまたシクロヘキサノンより迅速に反応する。最高の反応性は、ナフトキノン（７）によって示される。Ｐは、不飽和基の反応性を減少させない位、すなわち環の反対側（３、５）に配置するか、別の環上（７、８）に配置するか、またはパラキノン・モノオキシムを通じてＯ連結してもよい（９、１０）。Ｐはまた、求核付加速度を減少させようとする場合、反応性二重結合（６、８）に連結してもよい。
【００５０】
また、ヘテロ原子に基づく電子求引基を用いることによって、求核付加に対する二重結合の活性化を得てもよい。実際、ケトン（１１、１２）、エステルおよびアミド（１３、１４）のヘテロ原子含有類似体は、類似の電子の振る舞いを提供する。求核付加に対する反応性は、基の電子陰性度とともに、すなわち１１＞１２＞１３＞１４の順に増加し、そして芳香族環との連結によって増進される。芳香族環に基づく電子求引基を用いて、二重結合の強い活性化を得ることもまた可能である。ピリジニウム様陽イオンを含有する芳香族構造（例えばキノリン、イミダゾール、ピラジン、ピリミジン、ピリダジンの誘導体、および類似のｓｐ２−窒素含有化合物）はいずれも、二重結合を強く極性化し、そして迅速なマイケル型付加を可能にする。
【００５１】
炭素またはヘテロ原子に基づく電子求引基と共役した、炭素−炭素三重結合は、イオウ求核剤と容易に反応して、単純付加および二重付加からの産物を生じる。二重結合を含有する類似の化合物に関しては、反応性は、置換基によって影響を受ける。
【００５２】
規則正しい凝集物（リポソーム、ミセル）の形成または水環境における単純な相分離は、不飽和基の局所濃度を増加させ、そしてしたがって反応速度を増加させる。この場合、後者はまた、親油特性が増進した分子に関して増加する、求核基の分配係数にも依存する。
Ｂ．前駆体構成要素、Ｐ
第一および第二の前駆体構成要素は、モノマー性、オリゴマー性またはポリマー性であってもよく、そして本明細書において、「Ｐ」と略される。適切な前駆体構成要素には、タンパク質、ペプチド、ポリオキシアルキレン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（エチレン−コ−ビニルアルコール）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コ−アクリル酸）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレン−コ−ビニルピロリドン）、ポリ（マレイン酸）、ポリ（エチレン−コ−マレイン酸）、ポリ（アクリルアミド）、またはポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（酸化プロピレン）ブロックコポリマーが含まれる。第一および第二の前駆体構成要素に特に好ましいのは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。別の好ましい態様において、第二の前駆体構成要素は合成ペプチドである。
【００５３】
官能化ＰＥＧは、合成バイオマテリアルの形成において、特に好ましい特性を結集させることが示されてきている。親水性が高く、そして哺乳動物酵素による分解可能性が低く、そして毒性が低いことから、ＰＥＧは、体における適用に特に有用となっている。直鎖（２つの端を持つことを意味する）または分枝鎖（２より多い端を持つことを意味する）ＰＥＧは容易に購入または合成可能であり、そして次いで、選択した反応機構にしたがって、ＰＥＧ端基を官能化することも可能である。
【００５４】
１つの好ましい態様において、第一の構成要素は、三官能性の３アームの１５ｋＤａポリマーであり、すなわち各アームが５ｋＤａの分子量を有し、そして第二の前駆体構成要素は、０．５〜１．５ｋＤａの間の範囲の、さらにより好ましくは１ｋＤａ前後の分子量の二官能性直鎖分子である。好ましくは、第一および第二の前駆体構成要素は、ポリエチレングリコール分子である。
【００５５】
別の好ましい態様において、第一の前駆体構成要素は、各アームの末端に官能基を有する４アームの１５ｋＤａ〜２０ｋＤａポリマーであり、そして第二の前駆体構成要素は、１〜４ｋＤａの間の範囲、好ましくは３〜４ｋＤａ前後、そして最も好ましくは３．４ｋＤａの分子量を持つ二官能性直鎖分子である。好ましくは、第一の前駆体構成要素は、共役不飽和基または結合、好ましくはアクリレートまたはビニルスルホン、そして最も好ましくはアクリレートを含み、そして第二の前駆体構成要素は求核基、好ましくはチオールまたはアミン基を含む。
【００５６】
好ましくは第一の前駆体構成要素はポリエチレングリコールであり、そして第二の前駆体構成要素はペプチドまたはやはりポリエチレングリコールである。最も好ましい態様において、どちらの前駆体構成要素もポリエチレングリコール分子である。１つの好ましい態様は、４アームの１５ｋＤのＰＥＧアクリレートおよび３．４ｋＤの直鎖ＰＥＧチオールの組み合わせで作製されるバイオマテリアルである。
Ｃ．細胞付着部位
さらに好ましい態様において、細胞付着のためのペプチド部位がバイオマテリアルに組み入れられる。細胞付着部位は、細胞表面上の接着促進受容体に結合するペプチドである。付着部位の例には、限定されるわけではないが、ＲＧＤ配列およびＹＩＧＳＲ（配列番号１）が含まれる。特に好ましいのは、フィブロネクチン由来のＲＧＤ配列、ラミニン由来のＹＩＧＳＲ（配列番号１）配列である。組み入れは、例えば、チオール含有前駆体構成要素などの、求核基を含む残りの前駆体構成要素と混合する数分前に、システイン含有細胞付着ペプチドを、ＰＥＧアクリレート、ＰＥＧアクリルアミドまたはＰＥＧビニルスルホン酸などの、共役不飽和基を含む前駆体構成要素と混合することによって、単純に実行可能である。細胞付着部位がシステインを含まない場合、システインを含むように化学的に合成してもよい。この最初の工程中に、接着促進ペプチドは、共役不飽和で多重に官能化された前駆体の一端に組み入れられ；残りのマルチチオールが系に添加されると、バイオマテリアルが形成されるであろう。
Ｄ．生物活性因子
広い範囲の生物活性因子が合成バイオマテリアルに組み入れ可能である。適切な生物活性因子には、軟組織および硬組織、特に皮膚、骨および軟骨の治癒、修復および再生を誘導しそして援助することが可能な、ヌクレオチド、ペプチドまたはタンパク質が含まれる。好ましい生物活性因子には、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、およびヒトまたは動物の体内で同じ効果を有する変異体が含まれる。最も好ましい生物活性因子には、ＰＤＧＦ  ＡＢ、ＰＴＨ１−３４、ＢＭＰ  ２、ＢＭＰ  ７、ＴＧＦ  βｌ、ＴＧＦ  β３、ＶＥＧＦ  １２１、およびＶＥＧＦ  １１０が含まれる。他の適切な生物活性因子には、抗生物質、抗癌薬剤、疼痛減少薬剤、抗増殖剤等が含まれる。
【００５７】
１つの態様において、生物活性因子は、２ドメイン生物活性因子であり、第一のドメインが酵素的に架橋可能な基質ドメインを含み、そして第二のドメインが生物活性因子を含む。場合によって、２ドメイン生物活性因子は、第一のドメインおよび第二のドメインの間に酵素分解部位（「ｐｌ」と略される）を含有する。これによって、生物活性因子の徐放が可能になる。合成前駆体構成要素または合成バイオマテリアルに組み入れられる、最も好ましい２ドメイン生物活性因子は、プラスミン分解可能部位を含む因子ＸＩＩＩａ基質ドメイン（「ＴＧ配列」）および上に列挙する好ましいまたは最も好ましい生物活性因子の１つの組み合わせである。しかし、抗生物質、抗癌薬剤、疼痛減少薬剤等の任意の他の生物活性因子が２ドメイン生物活性因子に含まれ、そしてバイオマテリアルに組み入れられてもよいことが理解される。
１．生物活性因子の酵素的に架橋可能な基質ドメイン
生物活性因子、および特に２ドメイン生物活性因子を、生物活性因子および／または２ドメイン生物活性因子の架橋可能基質ドメインを通じて、前駆体構成要素および／またはバイオマテリアルの適切な官能基に架橋してもよい。基質ドメインは、酵素に関するドメインであり、好ましくはトランスグルタミナーゼ、より好ましくは組織トランスグルタミナーゼ（「ＴＲ−ドメイン」）、そしてさらにより好ましくは因子ＸＩＩＩａの基質ドメインである。
【００５８】
哺乳動物トランスグルタミナーゼは、構造的にそして機能的に関連する遺伝子のファミリーによってコードされる。９つのトランスグルタミナーゼ遺伝子が同定されてきており、このうち８個が活性酵素をコードする。トランスグルタミナーゼ酵素ファミリーには：（ａ）大部分、上皮組織中で発現される、細胞内トランスグルタミナーゼ１、３および５アイソフォーム；（ｂ）多様な組織種で発現され、そして細胞内型および細胞外型で存在する、トランスグルタミナーゼ２；（ｃ）前立腺中で発現される、トランスグルタミナーゼ４；（ｄ）血液中で発現される因子ＸＩＩＩａ（「ＦＸＩＩＩａ」と略される）；（ｅ）組織分布が未知のトランスグルタミナーゼ６および７、ならびに（ｆ）酵素活性を失っており、そして赤血球膜完全性を維持するように働く、膜の構成要素タンパク質である、バンド４．２が含まれる。大部分の場合、トランスグルタミナーゼは、タンパク質に結合したグルタミニル残基のガンマ−カルボキサミド基およびリジン残基のイプシロン−アミノ基の間のアシル−トランスファー反応を触媒し、Ｎ−イプシロン−（ガンマ−グルタミル）リジン・イソペプチド側鎖架橋の形成を生じる。酵素的に架橋可能な基質ドメインのアミノ酸配列は、切断部位をさらに含有するように設計可能であり、一次構造がほとんどまたはまったく修飾されずに、生物活性因子が放出されることも可能であり、これは、生物活性因子のより高い活性を生じうる。切断部位が酵素的に分解可能である場合、生物活性因子の放出は、細胞特異的プロセス、例えば局在化タンパク質分解によって制御される。生物活性因子の保存は、特に増殖因子およびその生物学的利用能の場合は、特徴として、最初の爆発的な放出で生物活性因子のかなりの量の損失を生じる、拡散徐放デバイスの使用に勝る、細胞特異的タンパク質分解活性を利用する、注目すべき利点である。これらの分解可能部位によって、合成バイオマテリアルからの、生物活性因子のより特異的な放出の操作が可能になる。トランスグルタミナーゼ基質ドメインおよびそのアミノ酸配列を表２に列挙する。
表２：トランスグルタミナーゼ基質ドメイン
【００５９】
【表２】
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【００６０】
本明細書において、一般的に、組織トランスグルタミナーゼ基質ドメインは、「ＴＲ−ドメイン」と略され、そしてトランスグルタミナーゼ基質ドメインによって修飾される生物活性因子は、「ＴＲ−生物活性因子」と略される。ＴＲ−ドメインには、ＧＡＫＤＶ（配列番号２）およびＫＫＫＫ（配列番号３）が含まれてもよい。２ドメイン生物活性因子の産生は、生物活性因子の性質に応じ；化学合成または組換え技術によって実行可能である。例えばＴＲ−ＰＴＨは化学合成によって産生可能であり、一方、ＴＲ−ＰＤＧＦまたはＴＲ−ＢＭＰ、ＴＲ−ＩＧＦのようなＴＲ−増殖因子は、細菌または哺乳動物組換え発現系によって産生され、続いて再フォールディングおよび精製工程を伴う。
【００６１】
最も好ましい因子ＸＩＩＩａ基質ドメインは、ＮＱＥＱＶＳＰＬ（配列番号４）のアミノ酸配列を有し、そして本明細書において、「ＴＧ」およびＴＧ−生物活性因子と称される。トランスグルタミナーゼが認識する他のタンパク質、例えばフィブロネクチンを生物活性因子にカップリングしてもよい。
ａ．生物活性因子の酵素的に架橋可能な基質ドメインにおける分解部位
生物活性因子が、実質的に修飾されていない型で、酵素によってバイオマテリアルから切断可能であるように、好ましくは、２ドメイン生物活性因子の架橋可能基質ドメインには、酵素的に分解可能なアミノ酸配列が含まれる。特に、生物活性因子および酵素的に架橋可能な基質ドメインの間のリンカーとして、プラスミン分解可能配列が付着される。２ドメイン生物活性因子の第一のドメインおよび第二のドメインの間の配列ＧＹＫＮＲ（配列番号６）は、連結をプラスミン分解可能にする。したがって、最も好ましい２ドメイン生物活性因子は、ＴＧｐｌＰＤＧＦ  ＡＢ、ＴＧ−ｐｌＰＴＨ１−３４、ＴＧｐｌＢＭＰ２、ＴＧｐｌＴＧＦβ３、ＴＧｐｌＶＥＧＦ  １２１、およびＴＧｐｌＶＥＧＦ  １１０である。
【００６２】
酵素活性に基づく分解によって、バイオマテリアルを通じた因子の拡散によるのではなく、細胞プロセスによって、生物活性因子の放出が制御されることが可能になる。分解可能部位または連結は、細胞から放出される酵素がマトリックス内に侵入し、これを分解し、そしてそこに留まるのにつれて、切断される。これによって、バイオマテリアル内の細胞の位置に応じて、同じバイオマテリアル内で、生物活性因子が異なる速度で放出されることが可能になる。これはまた、放出が長期間に渡り、そして細胞プロセスによって制御されるため、必要とされる生物活性因子の総量も減少させる。生物活性因子の保存およびその生物学的利用能が、拡散徐放デバイスの使用に勝る、細胞特異的タンパク質分解活性を利用する、注目すべき利点である。合成バイオマテリアルに共有結合したＴＧｐｌＰＴＨ１−３４またはＴＧｐｌＢＭＰ２が骨欠損を強く治癒させることの１つのありうる説明において、ＰＴＨまたはＢＭＰ２が長期間に渡って局所投与され、そしてＰＴＨの場合、単一のパルス用量としてだけではないことが重要であるようである。合成バイオマテリアルに対して架橋されたＴＧｐｌＰＤＧＦ  ＡＢに関しても同じことが当てはまる。最後に、生物活性因子の療法効果が欠陥領域に局在し、そして続いて増幅される。
【００６３】
タンパク質分解に使用可能な酵素は数多くある。タンパク質分解可能部位には、コラゲナーゼ、プラスミン、エラスターゼ、ストロメリシン、またはプラスミノーゲン活性化因子の基質が含まれうる。例示的な基質を以下の表３に列挙する。Ｎ１〜Ｎ５は、タンパク質分解が起こる部位から、タンパク質のアミノ末端に向かうアミノ酸１〜５位を示す。Ｎ１’〜Ｎ４’は、タンパク質分解が起こる部位から、タンパク質のカルボキシ末端に向かうアミノ酸１〜４位を示す。
表３：プロテアーゼの実例の基質配列
【００６４】
【表３】
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【００６５】
ＩＩＩ．バイオマテリアルおよび／または前駆体構成要素（単数または複数）への生物活性因子の組み入れ法
バイオマテリアルまたは合成バイオマテリアルを形成可能な合成前駆体構成要素に、生物活性因子または２ドメイン生物活性因子を連結させる、いくつかの方法がある。
Ａ．アミンで修飾された前駆体構成要素
１．第一の方法：アミンで修飾された前駆体構成要素
一般的に、第一の工程において、アミンまたはマルチアミンで修飾された前駆体構成要素を形成する。この前駆体構成要素は、本明細書に先に記載するように、直鎖または分枝鎖のいずれであってもよい。例えば、直鎖または分枝鎖ＰＥＧアミン、ポリアミン、ポリイミド、ポリイミンのような、アミノが末端である前駆体構成要素が、例えばＮｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＵＳから提供可能であるし、または既知の合成によって形成可能である。
２．第二の方法：２ドメインリンカーを用いた、アミンで修飾された前駆体構成要素の形成
別の方法において、共役不飽和基を含む前駆体構成要素を提供し、好ましくは、共役不飽和基は、前駆体構成要素の末端に位置する。これらの分子は、本明細書に先に記載されている。
【００６６】
次の工程において、前駆体構成要素は多官能性リンカー分子と反応し、該リンカー分子は、少なくとも１つのチオール、ならびに少なくとも１つのアミン基を含み、アミン基は好ましくは一級アミン基である。好ましいリンカー分子は、一般的に、ＨＳ−（Ｘ）ｎ−ＮＨ２またはＨＳ−（Ｘｉ）ｎ−ＮＨ２と表される。Ｘは、−ＨＳおよび−ＮＨ２の反応を妨害しない限り、いかなる適切な基または原子であることも可能であり、そして分枝鎖でもまた直鎖でもよい。ＨＳ−（Ｘ）ｎ−ＮＨ２またはＨＳ−（Ｘｉ）ｎ−ＮＨ２は、システイン含有天然ペプチド、ホルモンまたはタンパク質、ＣＲＤＧ（配列番号１５）のようにシステインを含む任意の合成ペプチドのような多様な分子から選択可能である。さらに、例えばメルカプトエチルアミンなどのメルカプトアミンが適切である。好ましくは、Ｘはメチレン基（−ＣＨ２−）であり；ｎは好ましくは２より大きい数から選択される。
【００６７】
好ましい態様において、リンカー分子は、ＣＧＫＧ（配列番号１６）のような、式（ＣＸＫＸ）の合成または天然ペプチドからなる群より選択される。アミノ酸リジンＫは、因子ＸＩＩＩａによって実行される架橋に関与し、Ｃは、マイケル型付加反応において、前駆体構成要素の共役不飽和基と反応するチオール基を提供し、そしてＸは、架橋反応に有害な影響を及ぼさないいかなる分子または原子であってもよい。別の好ましい態様において、リンカー分子は、アミノ酸配列ＣＲＧＤ（配列番号１５）を有し、ここで、細胞付着部位として働くＲＧＤの官能性が、チオールおよびアミン官能性と組み合わされる。別の好ましい態様において、Ｘはメチレン基であり、そしてｎは２より大きい。メルカプトエチルアミンは、優れた性能を示している。
【００６８】
リンカーのチオール基は、マイケル型付加反応において、前駆体構成要素の末端にある共役不飽和基と反応し、これが、生じるアミン前駆体構成要素の末端に未結合一級アミノ基を導く。
Ｂ．生物活性因子およびアミン前駆体構成要素の間の酵素的に触媒される架橋反応
アミン前駆体構成要素またはマルチアミン前駆体構成要素が形成されたならば、該構成要素は、次の工程で、酵素的に触媒される、生物活性因子または２ドメイン生物活性因子およびアミン（またはマルチアミン）前駆体構成要素の間の架橋反応において、反応パートナーとして働く。好ましくは架橋反応はトランスグルタミナーゼによって触媒される。ＴＧ−生物活性因子の場合、ＴＧ−生物活性因子は、カルシウムおよび活性化された因子ＸＩＩＩａの存在下で、アミン前駆体構成要素と混合される。生理学的条件下で、因子ＸＩＩＩａは、ＴＧ−生物活性因子をアミン前駆体構成要素のアミン基に連結しはじめ、生物活性因子およびアミン前駆体構成要素の間の共有結合を生成する。
【００６９】
例えば、（ａ）少なくとも１つのアミン基を含むポリエチレングリコール分子を提供し；（ｂ）架橋可能酵素のための基質ドメインを含む生物活性因子または２ドメイン生物活性因子を提供し；（ｃ）生物活性因子または２ドメイン生物活性因子の基質ドメインおよびアミン基の間の架橋反応を触媒可能な酵素を提供し；そして（ｄ）ポリエチレングリコール分子上のアミン基に生物活性因子または２ドメイン生物活性因子を架橋することによって、ポリエチレングリコールで修飾された生物活性因子を形成してもよい。
Ｃ．生物活性因子−前駆体構成要素、および強い求核基を含む前駆体構成要素の間の反応
第二の方法における、生物活性因子−前駆体構成要素の形成後、この構成要素は、最後の工程において、強い求核基を含む少なくとも第二の前駆体構成要素と反応する。第二の前駆体構成要素の強い求核基は、マイケル型付加反応において、生物活性因子−前駆体構成要素の共役不飽和基（生物活性因子との反応によって消費されて（ｃｏｎｓｕｍｍａｔｅｄ）いなかったもの）と反応し、したがって、生物活性因子を補充した合成バイオマテリアルを形成するであろう。第一の方法の場合、共役不飽和基を含有する第一の前駆体構成要素を添加し、そして前駆体構成要素の未結合アミン基（生物活性因子との反応によって消費されていなかったもの）は、他の前駆体構成要素の共役不飽和基と反応する。好ましくは、第一および第二の前駆体分子の官能基の当量の比は、２ドメイン生物活性因子または生物活性因子との反応を考慮に入れずに、０．９〜１．１の間である。官能基の当量の比を好ましい範囲に維持するため、使用する生物活性因子の濃度に応じて、第一および第二の前駆体構成要素の濃度を調整する。
【００７０】
例えば、バイオマテリアルに対して架橋された生物活性因子または２ドメイン生物活性因子を含む合成バイオマテリアルであって、該生物活性因子または２ドメイン生物活性因子が架橋可能酵素の基質ドメインを含む、前記バイオマテリアルは、（ａ）共役不飽和基を含む第一の前駆体構成要素を提供し、（ｂ）少なくとも１つのチオール基および少なくとも１つのアミン基を含むリンカー分子を提供し、（ｃ）共役不飽和基の一部（すなわちすべてではない）とチオール基を反応させて、アミンで修飾された前駆体構成要素を形成し、（ｄ）生物活性因子または２ドメイン生物活性因子の基質ドメインおよびアミンで修飾された前駆体構成要素のアミン基の間の架橋反応を触媒することが可能な酵素（例えばトランスグルタミナーゼ）を提供し；（ｅ）アミンで修飾された前駆体構成要素のアミン基と、生物活性因子または２ドメイン生物活性因子の基質ドメインを反応させて、生物活性因子−前駆体構成要素を形成し；（ｆ）強い求核基を含む第二の前駆体構成要素を提供し、そして（ｇ）マイケル型付加反応において、第二の前駆体構成要素の強い求核基と、生物活性因子−前駆体構成要素の共役不飽和基を反応させて、バイオマテリアルを形成することによって形成可能である。
ＩＶ．補充されたバイオマテリアルを適用しそして用いる方法
熱可逆性バイオマテリアルの場合のように、バイオマテリアルの形成が容易に逆転可能ではない場合、第一および第二の前駆体構成要素は、バイオマテリアルの形成が望ましい時期以前に、前駆体構成要素の重合を可能にする条件下で、互いに混合されるかまたは接触するようにすべきではない。これは、一般的に、少なくとも第一および第二の前駆体構成要素を、互いに分離して含む系によって達成される。生物活性因子または２ドメイン生物活性因子および／または二官能性リンカー分子は、前駆体構成要素と別個に保存されるか、または適切な条件下で、前駆体構成要素の１つと混合され、そして保存されるかいずれかである。好ましくは、酸素および光を排除し、そして低温、例えば＋４℃前後で、第一の前駆体構成要素、第二の前駆体構成要素、リンカー分子および／または生物活性因子または２ドメイン生物活性因子を保存して、使用前の官能基の分解を回避する。
【００７１】
１つの態様において、酵素、２ドメイン生物活性因子および／またはリンカー分子を一緒に保存する。適用時、これらを溶解し、そして生物活性因子または２ドメイン生物活性因子との酵素的架橋に対して反応性である、溶解された前駆体構成要素と混合する。生物活性因子または２ドメイン生物活性因子の前駆体構成要素への架橋が完了した後、生物活性因子−前駆体構成要素を第二の前駆体構成要素と混合して、バイオマテリアルを形成する。
【００７２】
生物活性因子の局在化または全身性送達のため、組織修復および再生のため、そして特に皮膚、骨、腱および軟骨などの軟組織および硬組織の再生のため、バイオマテリアルを用いてもよい。
【００７３】
本発明の範囲は、共有的に組み入れられた生物活性因子を有するｉｎ  ｓｉｔｕ形成性の合成バイオマテリアルの形成であるが、２ドメイン生物活性因子または生物活性因子の合成前駆体分子への酵素架橋反応を用いて、例えば、体への全身性適用のため、生物活性因子をＰＥＧ化してもよいことが理解されるべきである。
【００７４】
本発明は、以下の限定されない実施例を参照することによってさらに理解されるであろう。
【実施例】
【００７５】
実施例
材料および方法
表４は、実施例１および２に用いる材料の説明および略語を提供する。
【００７６】
表４．材料および略語
【００７７】
【表４】
2008529972.tif 000007
【００７８】
（実施例１）
ＬｙｓおよびＣｙｓを含有する二官能性ペプチドリンカー分子、ＰｅｐＩ（Ａｃ−ＦＫＧＧ−ＧＰＱＧＩＷＧＱ−ＥＲＣＧ（配列番号１７）の一次構造を持つ；中央の配列は、分解可能配列に相当する）を、８アーム末端官能化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）マクロマーのビニルスルホン端基に共役させて、前駆体構成要素を形成した。このペプチドリンカー修飾前駆体ＰＥＧ構成要素は、ＰＥＧ化された生物活性因子を形成する、ＴＧ−ｐｌＰＴＨおよびＴＧ−ｐｌ−ＰＤＧＦ（ＴＧ配列：ＮＱＥＱＶＳＰＬ；配列番号４）の続く架橋のためのアミン構成要素として働いた。
１．マイケル型付加を介した８アームＰＥＧ−ＶＳへのＰｅｐＩのカップリング
０．３Ｍトリエタノールアミン（ｐＨ８．０）中、ビニルスルホン基より１．２倍モル過剰で、ＰｅｐＩを８アームＰＥＧ−ＶＳに、３７℃で２時間添加した。続いて、反応溶液を、超純水に対して、４℃で３日間透析した（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）７Ｋ、ＭＷＣＯ：７０００、ＰＩＥＲＣＥ、イリノイ州ロックフォード）。透析後、産物（本明細書において、８ＰＥＧ−ＰｅｐＩと称する）を凍結乾燥して、白色粉末を得た。
【００７９】
２．  ８ＰＥＧ−ＶＳ−ＰｅｐＩへのＴＧ−ｐｌＰＴＨおよびＴＧ−ｐｌＰＤＧＦの、因子ＸＩＩＩａが触媒するカップリング
ａ）トロンビンによる、ＦＸＩＩＩａの活性化
１００μｌの因子ＸＩＩＩａ（１７０〜２００Ｕ／ｍｌ）を５０μｌのトロンビン（２０Ｕ／ｍｌ）で、３７℃で３０分間活性化した。さらなる使用のため、ＦＸＩＩＩａの少量のアリコットを−２０℃で保存した。
ｂ）８ＰＥＧ−ＶＳ−ＰｅｐＩへのＴＧ−ｐｌＰＴＨおよびＴＧ−ｐｌＰＤＧＦの共役
一般的に、ＦＸＩＩＩａが仲介するＰＥＧ化には、以下のあらかじめ最適化された条件を用いた：４μｌのＴＧ−ｐｌＰＴＨ（０．８ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中に溶解）またはＴＧ−ｐｌＰＤＧＦ（０．７３ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中に溶解）を、それぞれ、１０．８μｌの８ＰＥＧ−ＶＳ−ＰｅｐＩ溶液（ＴＧ−ＰｌＰＴＨの場合、Ｇｌｎアクセプターよりもおよそ７倍過剰のＬｙｓドナーに相当する、０．３７ｍｇ／ｍｌ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．６中）に添加した。
【００８０】
第二の工程において、０．７μｌの活性化されたＦＸＩＩＩａ（反応中、１０Ｕ／ｍｌ）を上記溶液に添加した。
最終溶液をボルテックスし、そして室温で１０、３０、および６０分間反応させた。試料を液体窒素に浸すことによって反応を停止し、そして−２０℃で保存した。反応直後、製造者のプロトコルにしたがって、ＮｕＰＡＧＥＴＭ１２％（ＭＥＳ中、ＰＴＨ用）および４〜１２％（ＭＥＳ中、ＰＤＧＦ）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で試料を分離し、そして銀染色した（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｔａｉｎ  Ｐｌｕｓ、ＢＩＯ−ＲＡＤ）。
【００８１】
結果および考察
ＰＥＧ−ＶＳ−ＰｅｐＩへのＴＧ−ＰＴＨの、因子ＸＩＩＩａが触媒する共役
銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＦＸＩＩＩａがＴＧのＮ末端のグルタミン・アクセプターペプチドおよびＰＥＧに共役されたリジン・ドナーペプチドの間の反応を触媒し、こうしてＰＥＧで修飾されたＴＧ−ｐｌＰＴＨを生じうることを立証した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中、４．５ｋＤａのＴＧｐｌＰＴＨのバンドが消失し、そして反応産物に相当するバンドが、４９ｋＤａ、６２ｋＤａおよび８５ｋＤａ前後に現れることが観察可能である。この変化は、４．５ｋＤａのみでバンドを示す、ＴＧｐｌＰＴＨのみを泳動したものと比較される。架橋反応に必要な３つの構成要素（ＴＧｐｌＰＴＨ、修飾されたＰＥＧおよび因子ＸＩＩＩａ）の１つが欠けている場合、４．５ｋＤａのバンドは変化しない。ＴＧｐｌＰＴＨが、因子ＸＩＩＩａの作用を通じて、修飾されたＰＥＧと迅速にそして特異的に反応することがわかる。
【００８２】
８ＰＥＧ−ＶＳ−ＰｅｐＩのみではＴＧ−ＰＴＨに影響を及ぼさないようであるため、反応は、ＦＸＩＩＩが存在することによる。
ＴＧ−ｐｌＰＴＨバンド（６ｋＤａマーカーの下）およびＰＥＧ共役後の同じバンドを比較すると、ＰＴＨの大部分（＞９０％と概算される）が反応したようである。さらに、８ＰＥＧ−ＶＳ−ＰｅｐＩ（かなり広い分子量分布を示し、主なバンドは４９ｋＤａ、６２ｋＤａ前後であり、そしていくつかのバンドは６２〜９８ｋＤａの間である）およびＦＸＩＩＩａの強い染色のため、反応産物（ＰＥＧ化されたＰＴＨ、理論的分子量は５４ｋＤａ前後である）は同定が困難である。にもかかわらず、４９ｋＤａ、６２ｋＤａおよび９８ｋＤａのすぐ下にあるバンドは、ＰＥＧ共役ＰＴＨに相当するようである。
【００８３】
ポリアクリルアミドゲルは、活性化された因子ＸＩＩＩａの存在下で、組織トランスグルタミナーゼ基質ドメインを形成するためにリジン基質とあらかじめ反応させた、ビニルスルホンを末端とするＰＥＧと、ＴＧｐｌＰＴＨを反応させると、４．５ｋＤａのＴＧｐｌＰＴＨのバンドが消失し、そして反応産物に相当するバンドが、４９ｋＤａ、６２ｋＤａおよび８５ｋＤａ前後に現れることを示した。この変化は、４．５ｋＤａのみでバンドを示した、ＴＧｐｌＰＴＨのみを泳動したものと比較される。架橋反応に必要な３つの構成要素（ＴＧｐｌＰＴＨ、修飾されたＰＥＧおよび因子ＸＩＩＩａ）の１つが欠けている場合（すなわちＴＧｐｌＰＴＨ＋ＦＸＩＩＩまたはＴＧｐｌＰＴＨ＋修飾されたＰＥＧ）、４．５ｋＤａのバンドは変化しない。このゲルは、ＴＧｐｌＰＴＨが、因子ＸＩＩＩａの作用を通じて、修飾されたＰＥＧと迅速にそして特異的に反応することを示した。
【００８４】
因子ＸＩＩＩａが触媒するＰＥＧ化は迅速である
ＴＧ−ＰＴＨバンドから判断すると、反応時間（１０、３０および６０分間）の間の有意な相違は観察不能である。しかし、おそらく、より高い分子量のＰＥＧ修飾ＰＴＨに対応するバンドが、長時間に渡って増加する強度を示し、６０分の時点まで、反応が連続することを強く示唆した。
【００８５】
因子ＸＩＩＩａは、ＰＥＧ−ＶＳ−ＰｅｐＩへのＴＧ−ＰＤＧＦの共役を触媒する
ＴＧ−ＰＤＧＦの組み入れに関して、類似の図が浮かび上がる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色は、ＦＸＩＩＩａがＴＧ−ＰＤＧＦおよび８ＰＥＧ−ＶＳ−ＰｅｐＩの共役を触媒可能であることを明らかに示した。ＴＧ−ＰＤＧＦの染色がはるかにより強いため、銀染色反応をより早い時点で停止して、ＰＥＧおよびＦＸＩＩＩａのより少ないバックグラウンド染色を生じた。ここでも、因子ＸＩＩＩａ触媒作用によって反応が可能になり、そして８ＰＥＧ−ＶＳ−ＰｅｐＩまたは因子ＸＩＩＩａのみが関与する副反応はなかった。
【００８６】
ポリアクリルアミドゲルにおいて、３５ｋＤａ前後のＴＧ−ＰＤＧＦバンドは、因子ＸＩＩＩａの存在下での８ＰＥＧ−ＶＳ−ＰｅｐＩとの反応に際してほぼ完全に消失し、カップリングが高い効率であることが示唆され、そして反応産物に相当するバンドが、８５ｋＤａ前後およびゲルの最上部に現れる。この変化は、３５ｋＤａのみでバンドを示す、ＴＧｐｌＰＤＧＦのみを泳動したもの（レーンＴＧｐｌＰＤＧＦ）と比較される。酵素、因子ＸＩＩＩａが欠けている場合、３５ｋＤａのバンドは変化しない。このゲルから、ＴＧｐｌＰＤＧＦが、因子ＸＩＩＩａの作用を通じて、修飾されたＰＥＧと迅速にそして特異的に反応することがわかる。
【００８７】
この反応の時間依存性は、１０分の反応時点で可視であり、より遅い時点より、より高いバンド強度が示された。
興味深いことに、別個の反応産物（ＰＥＧ化ＰＤＧＦ）は、染色されたＳＤＳゲル上で明らかに見えるようではなかった。しかし、対照レーンには存在しない、９８〜１８８ｋＤａの間の明らかに可視のスメアが見えた。８ＰＥＧ−ＶＳ−ＰｅｐＩ自体の広い分子量分布を考慮すると、これは、ＰＥＧで修飾された増殖因子に対応しうる。Ｌｙｓドナーは、ＰＤＧＦ上のＧｌｎアクセプターよりおよそ７倍過剰で用いられたのみであるため、結合した１より多いＰＥＧを伴うＰＤＧＦの形成がありうる。これらのマルチマー共役は、非常に高い分子量で現れるであろう。実際、染色されたゲルは、分子量があまりにも大きいため、外見上、ゲル中をまったく泳動しないいくつかのバンドを示す。
【００８８】
（実施例２）
２つのリンカー分子、メルカプトエチルアミン（ＭＥＡ）および一次配列ＡｃＦＫＧＧＥＲＣＧ（Ｐｅｐ  ＩＩ）（配列番号１８）を、第一の工程で、４アームの末端官能化ポリエチレングリコール四アクリレート（１５ｋＤａ）に共役させて、２つの前駆体構成要素を形成した。第二の工程において、メルカプトエチルアミンまたはペプチドで修飾された前駆体ＰＥＧ構成要素を、ＴＧｐｌＰＴＨ  １−３４（ＮＱＥＱＶＳＰＬＹＫＮＲ−ＰＴＨ１−３４）（配列番号１９）およびＴＧｐｌＰＤＧＦ．ＡＢ（ＭＮＱＥＱＶＳＰＬＰＶＥＬＰＬＩＫＭＰＨ−ＰＤＧＦ．ＡＢ）（配列番号２０）に共役させて、ＰＥＧ化された生物活性因子を形成した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの銀染色によって、共役を視覚化した。
【００８９】
次に、ＰＥＧ化された生物活性因子を、第二の前駆体構成要素、３．４ｋＤａポリエチレングリコール直鎖末端官能化ジチオールおよび１５ｋＤａポリエチレングリコール四アクリレートと反応させて、共有結合した生物活性因子を含有する３次元ヒドロゲルマトリックスを形成した。次いで、ＰＥＧマトリックスからの生物活性因子の放出をｉｎ  ｖｉｔｒｏで研究した。
【００９０】
１．マイケル型付加を介した４アームＰＥＧ−ＡｃｒへのＭＥＡおよびＰｅｐＩＩのカップリング
ＰｅｐＩＩおよびＭＥＡを、脱気した０．３Ｍ  ＴＥＡ中、アクリレート基より０．６または１．２倍モル過剰で、ＰＥＧ−Ａｃｒと反応させた（ｐＨ８．０、３７℃で１時間）。構成要素の濃度を表４に列挙し、反応のさらなる詳細を表５に提供する。
【００９１】
すべてのアクリレート基が、ＭＥＡまたはＰｅｐＩＩによって誘導体化されているはずであるならば、生じる分子は、本明細書において、それぞれ、「ＰＥＧ−Ａｃｒ−４ＭＥＡ」または「ＰＥＧ−Ａｃｒ−４ＰｅｐＩＩ」と称される。４つのアクリレート基のうち２つのみがＭＥＡまたはＰｅｐＩＩによって誘導体化されている場合、生じる分子は、本明細書において、それぞれ、「ＰＥＧ−Ａｃｒ−２ＭＥＡ」または「ＰＥＧ−Ａｃｒ−２Ｐｅｐ  ＩＩ」と称される。
表５．ＰＥＧ−Ａｃｒ−ＭＥＡおよびＰＥＧ−Ａｃｒ−ＰｅｐＩＩＰを産生するための反応スキーム
【００９２】
【表５】
2008529972.tif 000008
【００９３】
反応におけるチオール含量をＥｌｌｍａｎアッセイで監視した。したがって、すべてのストック溶液、ならびに反応を混合した直後および完了した後の反応物の５μｌを、ショック凍結した。チオール検出のため、２０μｌのＤＮＴＢストック溶液（０．８ｍｇ／ｍｌ）を２００μｌの反応緩衝液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）と混合し、そして２０μｌの標準または２０μｌの未知のものを添加し（最終的におよそ０．１〜１ｍＭに希釈される）、そして簡単にボルテックスした。２００μｌを９６ウェルプレートにピペッティングし、そしてＵＶ読取装置（ＬＭＲ１、Ｌａｂ  Ｅｘｉｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて、４０５ｎｍで吸光度を読み取った。０．０６７５〜１ｍＭの範囲のシステイン標準で得られた直線回帰に基づいて、チオール含量を計算した。
【００９４】
続いて、生じた産物を、超純水に対して、４℃で３日間透析した（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ、Ｐｅｒｂｉｏ、ＭＷＣＯ  ７０００）。透析後、産物を凍結乾燥して、白色粉末を得た。
【００９５】
２．  ４ＰＥＧ−Ａｃｒ−ＰｅｐＩＩおよび４ＰＥＧ−Ａｃｒ−ＭＥＡへの、ＴＧ−ｐｌＰＴＨおよびｐｌＴＧ−ｐｌＰＤＧＦの、因子ＸＩＩＩａが触媒するカップリング、ならびにその結果生じるＰＥＧ−マトリックスへの共役
ａ）トロンビンによるＦＸＩＩＩａの活性化
４０ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液にトロンビンを可溶化し（５００Ｕ／ｍｇ最終濃度）、そして２０μｌのトロンビンを４６．５μｌのＣａＣｌ２溶液でさらに希釈した。１３．３μｌを２００μｌのＦＸＩＩＩａ（１７３Ｕ／ｍｌ）に添加し、そして３７℃で３０分間活性化した。少量のアリコット（２０μｌ）のＦＸＩＩＩａ（２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２中、１６３Ｕ／ｍｌ、４Ｕ／ｍｇトロンビン）を、さらに使用するまで−２０℃で保存した。
【００９６】
ｂ）ＴＧ−ｐｌＰＴＨ−ダンシルへのＰＥＧ−Ａｃｒ−４ＭＥＡおよびＰｅｇ−Ａｃｒ−４ＰｅｐＩＩの共役
ＴＧ−ｐｌＰＴＨ−ダンシルに関しては、以下の連結法にしたがった：１０μｌのＰＥＧ−Ａｃｒ−４ＭＥＡまたはＰＥＧ−Ａｃｒ−４ＰｅｐＩＩ（５０ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６中、３ｍｇ／ｍｌ）を３．５μｌのＴＧ−ｐｌＰＴＨ−ダンシル（ＰＢＳ、ｐＨ７．４中、１ｍｇ／ｍｌ）と混合して、７：１のリンカー対ＴＧ比を生じた。混合後、１．９μｌの活性化ＦＸＩＩＩａ（Ｔｒｉｓ中で８０Ｕ／ｍｌに希釈）を添加した（反応中、１０Ｕ／ｍｌ）。３７℃で反応を行い、そしてショック凍結によって、１０、３０、および６０分後に反応を停止した。ＰＥＧ、ＰＴＨ、ＦＸＩＩＩａ、および各々の組み合わせの対照を、対応する緩衝液で希釈して、試料と同じ濃度を生じた。すべての試料を蒸留水で１：３に希釈した。製造者のプロトコルにしたがって、１０〜２０％のプレキャスト・トリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色を行った。ゲル上のＰＴＨ−ダンシルの位置を確実にするため、ダンシル標識ペプチドを用いて、そしてＵＶ光によってゲルを視覚化した。
【００９７】
より高い濃度のＰＥＧ−Ａｃｒ−ＰｅｐＩＩおよびＴＧ−ｐｌＰＴＨもまた試した。反応中、ＦＸＩＩＩａ濃度を１０Ｕ／ｍｌに維持したが、ＰＥＧ−Ａｃｒ−４ＰｅｐＩＩおよびＴＧ−ｐｌＰＴＨ濃度を２倍、３倍にし、そして１０倍に増加させた。
【００９８】
ｃ）ＰＥＧ−Ａｃｒ−４ＭＥＡおよびＰＥＧ−Ａｃｒ−４ＰｅｐＩＩとＴＧ−ｐｌＰＤＧＦの共役
ＴＧ−ｐｌＰＤＧＦに関しては、１０μｌのＰＥＧ−Ａｃｒ−４ＭＥＡおよびＰＥＧ−Ａｃｒ−４ＰｅｐＩＩ（３ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６中、０．５８０ｍｇ／ｍｌ）を、４．３μｌのＴＧ−ｐｌＰＤＧＦ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４中、２．８ｍｇ／ｍｌ）と混合して、７：１のリンカー対ＴＧ比を生じた。混合後、２．０μｌの活性化ＦＸＩＩＩａ（Ｔｒｉｓ中で８０Ｕ／ｍｌに希釈）を添加した（反応中、１０Ｕ／ｍｌ）。３７℃で反応を行い、そしてショック凍結によって、１０、３０、および６０分後に反応を停止した。ＰＥＧ、ＴＧ−ｐｌＰＤＧＦ、ＦＸＩＩＩａ、および各々の組み合わせの対照を、対応する緩衝液で希釈して、試料と同じ濃度を生じた。すべての試料を蒸留水で１：７に希釈した。製造者のプロトコルにしたがって、１０〜２０％のプレキャスト・トリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色を行った。銀染色の代わりに、ＰＤＧＦ特異的ウェスタンブロットによって、ＴＧ−ｐｌＰＤＧＦおよびＴＧ−ｐｌＰＤＧＦを検出した。
【００９９】
ｄ）マトリックスの形成
ＴＧ−ｐｌＰＴＨ−ダンシル含有マトリックスを２工程反応で作製した。ＰＥＧ−Ａｃｒ−４ＰｅｐＩＩは、最も優れた連結性能を示したため（以下を参照されたい）、このリンカーのみを用いて放出研究を行った。
【０１００】
まず、ＴＧ−ｐｌＰＴＨのＰＥＧ−Ａｃｒ−４ＰｅｐＩＩへの連結に関して上述するものと同じ反応を行い、それによって、５０％のアクリレート基が未反応で残るようにＰＥＧ−Ａｃｒ−４およびＰｅｐＩＩの比を選択した（ＰＥＧ−Ａｃｒ−２ＰｅｐＩＩと称する）。０．１ｍｇ／ｍｌマトリックス体積の最終ＴＧ−ｐｌＰＴＨ−ダンシル濃度を目指した。したがって、４２．２μｌのＴＧ−ｐｌＰＴＨ−ダンシル（ＰＢＳ、ｐＨ７．４中、１ｍｇ／ｍｌ）を、７倍過剰のＰＥＧ−Ａｃｒ−２−ＰｅｐＩＩ（１２１μｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２中、３．５１ｍｇ／ｍｌ）および１１μｌ  ＦＸＩＩＩａ（上記を参照されたい、反応中、１０Ｕ／ｍｌのＦＸＩＩＩａ）と混合した。あるいは、２倍濃いＰＥＧ−Ａｃｒ−２−ＰｅｐＩＩを用いて、ＴＧ−残基より１４倍過剰のリジンを達成した。１時間反応させた後、後のゲル電気泳動用に、６μｌをショック凍結した。その結果の第二工程において、残りの１６８μｌを１５０μｌのＰＥＧ−Ａｃｒ（０．３ＴＥＡ、ｐＨ７．４中、２７７ｍｇ／ｍｌ）および１５０μｌのＰＥＧ−チオール（０．３Ｍ  ＴＥＡ、ｐＨ７．４中、１４１ｍｇ／ｍｌ）と混合して、１：１のアクリレート−チオール比を、そしてＰＥＧによる１０％体積増加を考慮して、７．５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ−Ａｃｒマトリックスを生じた。溶液を３０秒間ボルテックスして、そしてカットした１ｍｌシリンジに１００μｌをピペッティングした。マトリックスの重量を測定し、そして３７℃で１時間置いた後、放出緩衝液に移した。
【０１０１】
ＦＸＩＩＩａを含まない対照マトリックスもまた産生した。
ＴＧ−ｐｌＰＤＧＦに関して、上述のようなＴＧ−ｐｌＰＴＨ−ダンシル含有マトリックスと同様にマトリックスを作製したが、０．０１ｍｇの２ドメイン生物活性因子／ｍｌマトリックス体積しか組み入れなかったことが異なった。典型的なレシピでは、１８．７μｌのＰＥＧ−Ａｃｒ−２ＰｅｐＩＩ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、３ｍＭ  ＣａＣｌ２中、１．０３ｍｇ／ｍｌ）を、８．１μｌのＴＧ−ｐｌＰＤＧＦ（ＰＢＳ中、０．７ｍｇ／ｍｌ）と混合し、そして第二の工程において、３．８μｌのＦＸＩＩＩａ（最終反応において１０Ｕ／ｍｌ）を添加した。あるいは、２倍濃いＰＥＧ−Ａｃｒ−２ＰｅｐＩＩを用いて、ＴＧ−残基より１４倍過剰のリジンを達成した。３７℃で１時間、反応を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に７．６μｌを取り除いた。その結果の第二工程において、残りを２００μｌのＰＥＧ−Ａｃｒ（０．３Ｍ  ＴＥＡ、ｐＨ７．４中、１７４．４ｍｇ／ｍｌ）および２００μｌのＰＥＧ−チオール（０．３Ｍ  ＴＥＡ、ｐＨ７．４中、１０６．１ｍｇ／ｍｌ）と混合した。これらの２工程後、ＰＴＨ−マトリックスに用いたものと同じ方法（上述）にしたがった。
【０１０２】
ｅ）放出研究
ＴＧ−ｐｌＰＴＨ−ダンシル含有マトリックスを１．５ｍｌのＰＢＳに入れ、そして４時間後、ならびに１、２、３、５および７日後に試料を抜き取り、そして分析まで−２０℃で保存した。サンプリング後、緩衝液を完全に交換した。３３０／５４３ｎｍの励起／発光の波長で、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ５０Ｂ発光分光測定装置を用いた、ダンシル蛍光検出によって、放出されたペプチドを測定した。０．７５〜１０μｇ／ｌ  ＴＧ−ｐｌＰＴＨ−ダンシルの範囲で、試料からの直線回帰によって、ＴＧ−ｐｌＰＴＨ−ダンシルの較正曲線を得た。
【０１０３】
ＴＧ−ｐｌＰＤＧＦ含有マトリックスを１０μｌ  ＰＢＳ（０．１％ウシ血清アルブミンを含有する、１０ｍＭ、ｐＨ７．４）に３７℃で入れ、そして４時間後、そして１、２、３および５日後に１５０μｌの試料を抜き取り、そして分析まで−２０℃で保存した。試料をＴＢＳ、０．１％ＢＳＡで４０倍に希釈し、そしてＴＧ−ｐｌＰＤＧＦ−ＡＢに特異的なＥＬＩＳＡによって分析した。
【０１０４】
結果および考察
ＰＥＧ−Ａｃｒ−２ＭＥＡおよびＰＥＧ−Ａｃｒ−２ＰｅｐＩＩ、ＰＥＧ−Ａｃｒ−４ＭＥＡおよびＰＥＧ−Ａｃｒ−４ＰｅｐＩＩの産生
４アームＰＥＧ−Ａｃｒを官能化して、完全にアミン誘導体化されたＰＥＧ−Ａｃｒ、ならびに平均して２つのアミン基および２つのアクリレート基を持つ４アームＰＥＧの両方を得た。マイケル型付加による、ＭＥＡまたはＰｅｐＩＩのチオール残基とＰＥＧ−Ａｃｒの反応は、ｐＨ８．０で非常に迅速に進行した（数分程度）。理論的な出発および終了チオール濃度は、ＭＥＡの場合、測定値とよく一致した。ペプチドの場合、１．２のチオール−アクリレート比を使用すると、チオールの完全な消失が見られ、ジスルフィド形成が、少ない度合いで生じていた（おそらくすでに出発材料中にあった）ことを示した。にもかかわらず、それぞれ５０％および１００％に近い官能化が達成されたと仮定された（表６）。
【０１０５】
表６．ＰＥＧ−Ａｃｒ−リンカー産生：チオール濃度の期待値および測定値
【０１０６】
【表６】
2008529972.tif 000009
【０１０７】
ＴＧ−ｐｌＰＴＨ−ダンシルのＰＥＧ化およびマトリックス形成
ＰＥＧ−Ａｃｒ−４ＰｅｐＩＩ。蛍光検出を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびその結果の銀染色によって、ゲル上のＴＧ−ｐｌＰＴＨ−ダンシルの明らかな位置決定およびそのＭＷの決定が可能になった。ＰＥＧ−Ａｃｒ−ＰｅｐＩＩ、ＴＧ−ｐｌＰＴＨ−ダンシルおよびＦＸＩＩＩａを反応させると、５ｋＤａのバンドがより弱くなり、そしておよそ４０ｋＤａに蛍光性の新たな広いバンドが出現した。ＰＥＧは、タンパク質よりも大きい旋回半径を有するため、１５ｋＤａより大きいＭＷに出現すると期待されうる。したがって、４０ｋＤａの蛍光バンドは、ＰＥＧ−ＴＧ−ＰＬＰＴＨ−ダンシルと決定された。このバンドは、ＦＸＩＩＩａを添加しないと出現せず、反応がＦＸＩＩＩａに依存していることが立証された。しかし、連結の定量化は困難であった。バンド強度を比較することによって、５０〜８０％のＴＧ−ｐｌＰＴＨが反応したと概算された。ＰＥＧ−ＶＳ−ＰｅｐＩで得た結果に比較して、誘導体化はより完全でなく、システインおよびリジン基の間にスペーサーがあることが反応に有益でありうることが示された。
【０１０８】
メルカプトエチルアミン・リンカー
ＰＥＧ−Ａｃｒ−ＰｅｐＩＩ同様、ＰＥＧ−Ａｃｒ−ＭＥＡを、ＦＸＩＩＩａの存在下で、ＴＧ−ｐｌＰＴＨ−ダンシルと反応させると、およそ４０ｋＤａにバンドが現れた。しかし、このバンドははるかにより弱かった（ＰＥＧ−Ａｃｒ−ＰｅｐＩＩに関して見られるものの１０〜２０％）。したがって、エチルアミンに対するＦＸＩＩＩａの親和性は、リジンに存在する場合のブチルアミンに対するものより低いようであった。
【０１０９】
マトリックス形成およびＰＴＨ−ダンシルの保持
高いＴＧ−ｐｌＰＴＨ−ダンシル濃度（１ｍｇ／ｍｌマトリックス）を達成するため、先の実験より３倍および１０倍高い濃度のＴＧ−ｐｌＰＴＨ−ダンシルで連結実験を行った。しかし、既に３倍濃度で、そして特に１０倍濃度では、ＰＥＧの存在下でＴＧ−ｐｌＰＴＨ−ダンシルの沈殿が生じ、そしてその結果の連結は成功しなかった。
【０１１０】
したがって、元来の共役レシピをわずかに適応させて、そして１ｍｌのマトリックスあたり０．１ｍｇのＴＧ−ｐｌＰＴＨ−ダンシルを含有するマトリックスを産生した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ならびに蛍光および銀染色によるペプチドの検出によって、ＴＧ−ｐｌＰＴＨ−ダンシルが、ＰＥＧ−Ａｃｒ−２ＰｅｐＩＩに連結されていたことが確認された。ＰＥＧ−Ｐｅｐ−ＴＧ−ｐｌＰＴＨ−共役の２つの残りのアクリレート基を、ＰＥＧ−ジチオールのマイケル型付加によって、ＰＥＧ−マトリックス中に共有結合させてもよい。
【０１１１】
ＴＧ−ｐｌＰＴＨ−ダンシルの放出プロフィールによって、連結およびその結果のマトリックスへの架橋が成功したことが明らかに確認された。ＴＧ−ｐｌＰＴＨより７倍過剰のＰＥＧ−ペプチド基が使用された場合、ＴＧ−ｐｌＰＴＨ−ダンシルがマトリックスに６３％保持され、そして１４倍過剰の場合、８８％が保持されたのに比較して、ＦＸＩＩＩａの非存在下では、５日（１６８時間）を超えると、７％のＴＧ−ｐｌＰＴＨ−ダンシルしか保持されなかった（表７を参照されたい）。
【０１１２】
表７．ダンシル−蛍光によって測定した際のＰＥＧマトリックスからの％でのＴＧ−ｐｌＰＴＨ−ダンシルの保持
【０１１３】
【表７】
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【０１１４】
ＴＧ−ｐｌＰＤＧＦのＰＥＧ−Ａｃｒ−ＰｅｐＩＩへのＰＥＧ化およびマトリックス形成
ＰＥＧ−Ａｃｒ−ＰｅｐＩＩ−リンカーがＴＧ−ｐｌＰＴＨに関して最も成功したため、ＴＧ−ｐｌＰＤＧＦに関しては、このリンカーのみを試験した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色は、ＴＧ−ｐｌＰＤＧＦ（３５ｋＤａに泳動する２量体）の部分的消失を示した。ウェスタンブロットによって、５０〜９０ｋＤａの間の範囲のスメアの形で新たなバンドが同定可能であり、５０、６０および７０ｋＤａ前後により強いバンドが見られ、これらはＦＸＩＩＩａが反応中で欠けているかまたはＦＸＩＩＩａがＴＧ−ｐｌＰＤＧＦのみと混合されている場合には現れなかった。ＴＧ−ｐｌＰＤＧＦが２つのＴＧ部位を有するため、２つのＰＥＧに連結したタンパク質が形成可能であり、または各ＰＥＧが平均２つのリジンを所持するため、多数のＴＧ−ｐｌＰＤＧＦを持つＰＥＧが形成可能である。これらの反応はすべて、異なるＭＷを生じ、これがおそらくいくつかのバンドが存在する理由である。３５ｋＤａのＴＧ−ｐｌＰＤＧＦのバンド強度を、１００％、３３％および１０％のＴＧ−ｐｌＰＤＧＦの標準と比較すると、７０％を超えるＴＧ−ｐｌＰＤＧＦがＰＥＧ−Ａｃｒ−４ＰｅｐＩＩに連結されたと概算される。
【０１１５】
２工程反応において、マトリックスを作製し、第一の工程は、先の連結実験に相当するが、二官能性ＰＥＧを用いた点が異なった（２つのペプチドおよび２つのアクリレート基を含有、ＰＥＧ−Ａｃｒ−２ＰｅｐＩＩと称する）。この反応から試料を抜き取り、そしてさらなる標準とともに、ＳＤＳ−ゲル上を泳動させた。ＰＥＧ−Ａｃｒ−２ＰｅｐＩＩを、ＦＸＩＩＩａの存在下でＴＧ−ｐｌＰＤＧＦと反応させた場合、ＴＧ−ｐｌＰＤＧＦより７倍過剰のＰＥＧ−Ａｃｒ−２ＰｅｐＩＩを使用すると、３５ｋＤａのバンド強度がおよそ５０〜６０％減少したことが、銀染色によって示された（ＴＧ−ｐｌＰＤＧＦ標準との視覚的比較によって判断した際）。１４倍過剰を使用しても、バンド強度減少は、わずかにより顕著になるのみであった。ＰＥＧ濃度が高ければ、反応を妨害するＰＥＧがより多いことによって、より好ましいアミン−ドナー比が横ばい状態になる（ｏｕｔ  ｌｅｖｅｌｅｄ）可能性がある。
【０１１６】
ＦＸＩＩＩａが欠けている場合には、バンドシフトがまったく見られないため、反応は明らかにＦＸＩＩＩａ依存性であった。
放出緩衝液中に現れるＴＧ−ｐｌＰＤＧＦをＥＬＩＳＡアッセイによって測定する放出実験によって、連結の成功を確認した。ＦＸＩＩＩａの非存在下では、５日を超えると、４％のＴＧ−ｐｌＰＤＧＦしかマトリックス中に保持されなかったが、ＴＧ部位より７倍過剰のリジン基を用いた反応中でＦＸＩＩＩａが使用されると、４７％が保持され、そして１４倍過剰では、実に５４％が保持された。
【０１１７】
表８．ＥＬＩＳＡよって測定した際のＰＥＧマトリックスからの％でのＴＧ−ｐｌＰＤＧＦの保持
【０１１８】
【表８】
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【０１１９】
当業者は、本明細書に記載する本発明の特定の態様の多くの同等物を認識するか、または日常的な実験を超えたものを用いずに、こうした同等物を確かめることが可能であろう。こうした同等物は、請求項に含まれると意図される。
【配列表】
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【国際調査報告】
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