(57)【要約】  本発明は微小血管障害、眼疾患および呼吸器障害を治療するための、RTP801遺伝子および/またはタンパク質の阻害を基礎とした、新規な分子、組成物、方法および使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
呼吸器障害、眼疾患、微小血管障害、または脊髄損傷または疾患の患者を治療する方法であって、該患者に該患者を治療するための有効量のRTP801阻害剤を含む医薬組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項２】
眼疾患は黄斑変性症である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
呼吸器障害はCOPDである、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
呼吸器障害は喘息である、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
呼吸器障害は慢性気管支炎である、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
呼吸器障害は肺気腫である、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
微小血管障害は糖尿病網膜症である、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
微小血管障害は急性腎不全である、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
阻害剤は、配列番号1に記載のRTP801遺伝子配列内に存在する配列に対して、該阻害剤と該遺伝子とのハイブリダイゼーションを可能にするために十分な鎖長と相同性とを有する配列をもつ連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
阻害剤は、図2に示す配列(配列番号2)の連続アミノ酸を含むポリペプチド内に存在するエピトープに特異的に結合する抗体を含むことを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
呼吸器障害、眼疾患、微小血管障害、または脊髄損傷または疾患の患者を治療する方法であって、該患者に該患者を治療するための治療有効量のポリヌクレオチドRTP801阻害剤を含む医薬組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドはsiRNAである、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
siRNAはTable A〜C(配列番号3〜344)のいずれか1つに記載の配列のいずれか1つと配列同一性を有する連続ヌクレオチドを含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
阻害剤はsiRNA分子、sRNA分子を含むベクター、siRNA分子を発現することができるベクター、およびsiRNA分子へと内在的にプロセッシングされる分子からなる群より選択される、請求項11に記載の方法。
【請求項１５】
治療有効量のRTP801阻害剤の、呼吸器障害、眼疾患、微小血管障害、または脊髄損傷または疾患の患者の回復を促進する薬剤の調製への使用。
【請求項１６】
眼疾患は黄斑変性症である、請求項15に記載の使用。
【請求項１７】
呼吸器障害はCOPDである、請求項15に記載の使用。
【請求項１８】
呼吸器障害は喘息である、請求項15に記載の使用。
【請求項１９】
呼吸器障害は慢性気管支炎である、請求項15に記載の使用。
【請求項２０】
呼吸器障害は肺気腫である、請求項15に記載の使用。
【請求項２１】
微小血管障害は糖尿病網膜症である、請求項15に記載の使用。
【請求項２２】
微小血管障害は急性腎不全である、請求項15に記載の使用。
【請求項２３】
阻害剤は、配列番号1に記載のRTP801遺伝子配列内に存在する配列に対して、該阻害剤と該遺伝子とのハイブリダイゼーションを可能にするために十分な鎖長と相同性とを有する配列をもつ連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項15〜22のいずれか1項に記載の使用。
【請求項２４】
阻害剤は、図2に示す配列(配列番号2)の連続アミノ酸を含むポリペプチド内に存在するエピトープに特異的に結合する抗体を含むことを特徴とする、請求項15〜22のいずれか1項に記載の使用。
【請求項２５】
ポリヌクレオチドは遺伝子RTP801の発現を抑制する、請求項15〜22のいずれか1項に記載の使用。
【請求項２６】
ポリヌクレオチドはsiRNAである、請求項15〜22に記載の使用。
【請求項２７】
siRNAはTable A〜C(配列番号3〜344)のいずれか1つに記載の配列のいずれか1つと配列同一性を有する連続ヌクレオチドを含む、請求項26に記載の使用。
【請求項２８】
阻害剤はsiRNA分子、sRNA分子を含むベクター、siRNA分子を発現することができるベクター、およびsiRNA分子へと内在的にプロセッシングされる分子からなる群より選択される、請求項25に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は欧州特許出願第EP 04019405.2号(2004年8月16日出願); 米国暫定特許出願第60/601,383号(2004年8月17日出願); 同第60/604,668号(2004年8月25日出願); 同第60/609,876号(2004年9月14日出願); 同第60/638,659号(2004年12月22日出願); 同第60/664,236号(2005年3月22日出願)および同第60/688,943号(2005年6月8日出願)の優先権を主張するものであり、各出願種類は参照によりここにその全体が開示される。
本願発明はRTP801遺伝子を抑制する新規なsiRNA分子およびそうした分子の各種呼吸器障害(肺疾患を含む)、眼疾患・病態、微小血管障害、血管新生関連およびアポトーシス関連疾患の治療への使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性閉塞性肺疾患(COPD)
慢性閉塞性肺疾患(COPD)は米国では1,600万人が罹患しており、死亡原因の第4位を占める。その発症原因はほとんどが喫煙にあるが、他の環境因子も排除できない[Petty TL. 2003. Definition, epidemiology, course, and prognosis of COPD (COPDの定義、疫学、経過および予後). Clin. Cornerstone, 5-10]。
【０００３】
COPDの主病態は肺気腫である。肺気腫の顕著な所見は末梢気腔、遠位〜終末細気管支の恒久的な破壊である[Tuder RM, et al. Oxidative stress and apoptosis interact and cause emphysema due to vascular endothelial growth factor blocade (血管内皮増殖因子が遮断されると酸化ストレスとアポトーシスが相互作用し気腫を引き起こす). Am J Respir Cell Mol Biol, 29:88-97; 2003]。気腫はまた、マクロファージや好中球などのような炎症細胞の、細気管支と肺胞構造への集積を所見とする(Petty, 2003)。
【０００４】
気腫の病因は複雑で、多因子性である。ヒトでは、炎症細胞によって産生されるプロテアーゼ阻害剤たとえばアルファ1-アンチトリプシンなどの欠乏症がプロテアーゼ/アンチプロテアーゼ不均衡をもたらし、以ってタバコ煙(CS)誘発気腫における肺胞細胞外マトリックスの破壊を促すことが示されてきた[Eriksson, S. 1964. Pulmonary Emphysema and Alpha1-Antitrypsin Deficiency(肺気腫とアルファ1-アンチトリプシン欠乏症). Acta Med Scand 175:197-205.; Joos, L., Pare, P.D., and Sandford, A.J. 2002. Genetic risk factors of chronic obstructive pulmonary disease(慢性閉塞性肺疾患の遺伝的リスク因子). Swiss Med Wkly 132:27-37]。実験肺気腫モデルでは、マクロファージメタロエラスターゼを欠失させたノックアウトマウスが長期CS吸入によって引き起こされる肺気腫への抵抗力を示すことから裏付けられるように、マトリックスメタロプロテアーゼ類(MMPs)が中心的な役割を果たしている[Hautamaki et al: Requirement for macrophage elastase for cigarette smoke-induced emphysema in mice(タバコ煙誘発気腫のマウスでの発症にはマクロファージエラスターゼが必要). Science 277:2002-2004]。さらに、トランスジェニックマウスの肺でのインターロイキン-13の過剰発現はMMP依存性/カテプシン依存性の気腫をもたらす[Zheng T, et al. 2000. Inducible targeting of IL-13 to the adult lung causes matrix metalloproteinase- and cathepsin-dependent emphysema(マトリックスメタロプロテアーゼ依存性/カテプシン依存性の気腫を引き起こすIL-13の成体肺への誘発性誘導). J Clin Invest 106:1081-1093]。最近の発表論文では、気腫につながる肺組織破壊への中隔細胞アポトーシスの関与が指摘されている[Rangasamy T, et al. Genetic ablation of Nrf2 enhances susceptibility to cigarette smoke-induced emphysema in mice(マウスのタバコ煙誘発気腫への感受性を高めるNrf2遺伝子の破壊). Submitted to Journal of Clinical Investigation.; Tuder RM et al. 2003(前記).; Yokohori N, Aoshiba K, Nagai A, Increased levels of cell death and proliferation in alveolar wall cells in patients with pulmonary emphysema(肺気腫患者の肺胞壁細胞の細胞死および増殖レベルの上昇). Chest. 2004 Feb. 125(2):125(2)626-32.; Aoshiba K, Yokohori N, Nagai A, Alveolar wall apoptosis causes lung destruction and emphysematous changes(肺破壊と気腫性変化を引き起こす肺胞壁アポトーシス). Am J Respir Cell Mol Biol. 2003 May; 28(5):555-62]。
【０００５】
気腫の両肺破壊経路の根底に横たわる機序のうち、真っ先に挙げるべきは活性酸素種(ROS)の過形成である。血液および肺組織中にはプロオキシダント/アンチオキシダント不均衡が存在することは既定の事実である[Hulea SA, et al: Cigarette smoking causes biochemical changes in blood that are suggestive of oxidative stress: a case-control study(酸化ストレスを示唆する血中生化学変化の原因となる喫煙). J Environ Pathol Toxicol Oncol. 1995; 14(3-4):173-80.; Rhaman I, MacNee W. Lung glutathione and oxidative stress: implications in cigarette smoke-induced airway disease(肺グルタチオン濃度と酸化ストレス: タバコ煙誘発軌道疾患との関連). Am J Physiol. 1999 Dec; 277(6 Pt 1):  L1067-88.; MacNee W. Oxidants/antioxidants and COPD(オキシダント/アンチオキシダントとCOPD).Chest. 2000 May; 117(5 Suppl 1):303S-17S.; Marwick JA, Kirkham P, Gilmour PS, Donaldson K, MacNee W, Rhaman I. Cigarette smoke-induced oxidative stress and TGF-beta1 increase p21waf1/cip1 expression in alveolar epithelial cells(タバコ煙誘発酸化ストレスとTGF-ベータ1は肺胞上皮細胞でのp21waf1/cip1の発現を増大させる). Ann N Y Acad Sci. 2002 Nov; 973:278-83.; Aoshiba K, Koinuma M, Yokohori N, Nagai A, Immunohistochemical evaluation of oxidative stress in murine lungs after cigarette smoke exposure(タバコ煙暴露後のマウス肺の酸化ストレスの免疫組織化学的評価). Inhal Toxicol. 2003 Sep;15(10):1029-38.; Dekhuijzen PN. Antioxidant properties of N-acetylcysteine: their relevance in relation to chronic obstructive pulmonary disease(N-アセチルシステインのアンチオキシダント特性: 慢性閉塞性肺疾患との関連性). Eur Respir J. 2004 Apr;23(4):629-36.; Tuder RM et al. 2003(前記)]。マウスをCSに1時間暴露すると、肺胞(特にII型)上皮細胞の8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシン(8-OHdG)濃度は劇的に上昇する[前記Inhal Toxicol. 2003 Sep;15(10):1029-38を参照]。
【０００６】
過剰生産された活性酸素種はその細胞傷害活性で知られるが、そうした活性は直接的なDNA損傷効果およびアポトーシスシグナル伝達経路の活性化に由来する[Takahashi A, Masuda A, Sun M, Centonze VE, Herman B. Oxidative stress-induced apoptosis is related with alterations in mitochondrial caspase activity and Bcl-2-dependent alterations in mitochondrial pH (pHm)(酸化ストレス誘発アポトーシスはミトコンドリアカスパーゼ活性の変化およびミトコンドリアpH(pHm)のBcl-2依存的変化に関連する). Brain Res Bull. 2004 Feb 15;62(6):497-504.; Taniyama Y, Griendling KK. Reactive oxygen species in the vasculature: molecular and cellular mechanisms(血管系内の活性酸素種: 分子細胞機構). Hypertension. 2003 Dec;42(6):1075-81. Epub 2003 Oct 27.; Higuchi Y. Chromosomal DNA fragmentation in apoptosis and necrosis induced by oxidative stress(酸化ストレス誘発アポトーシスおよびネクローシスにおける染色体DNA断片化). Biochem Pharmacol. 2003 Oct 15;66(8): 1527-35.; Punj V, Chakrabarty AM. Redox proteins in mammalian cell death: an evolutionarily conserved function in mitochondria and prokaryotes(哺乳動物細胞死におけるレドックスタンパク質: ミトコンドリアと原核生物における進化的に保存された機能). Cell Microbiol. 2003 Apr;5(4):225-31.; Ueda S, Masutani H, Nakamura H, Tanaka T, Ueno M, Yodoi J. Redox control of cell death(細胞死のレドックス制御). Antioxid Redox Signal. 2002 Jun;4(3)405-14]。
【０００７】
ROSはそれ自体が細胞傷害性であるだけでなく、炎症誘発性刺激物質でもあり、レドックス感受性転写因子NFκBおよびAP-1の活性化因子として傑出している[Rahman I. Oxidative stress and gene transcription in asthma and chronic obstructive pulmonary disease: antioxidant therapeutic targets(喘息と慢性閉塞性肺疾患における酸化ストレスと遺伝子転写: アンチオキシダント治療の標的. Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 2002 Sep;1 (3):291-315で概説]。両転写因子のほうは、炎症性サイトカイン転写の刺激に強く関わるし[Renard P, Raes M. The proinflammatory transcription factor NFkappaB: a potential target for novel therapeutical strategies(炎症誘発性転写因子NFκB: 新規治療法の潜在的な標的). Cell Biol Toxicol. 1999;15(6)341-4.; Lentsch AB, Ward PA. The NFkappaBb/IkappaB system in acute inflammation(急性炎症におけるNFκB/IκB系). Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2000;48(2)59-63で概説]、またマトリックス分解性プロテアーゼの転写にも強く関わる[Andela VB, Gordon AH, Zotalis G, Rosier RN, Goater JJ, Lewis GD, Schwarz EM, Puzas JE, O’Keefe RJ. NFkappaB: a pivotal transcription factor in prostate cancer metastasis to bone(NFκB: 前立腺がんの骨転移できわめて重要な役割を果たす転写因子). Clin Orthop. 2003 Oct;(415 Suppl):S75-85.; Fleenor DL, Pang IH, Clark AF. Involvement of AP-1 in interleukin-1alpha-stimulated MMP-3 expression in human trabecular meshwork cells(ヒト線維柱帯細胞でのインターロイキン-1α刺激MMP-3発現へのAP-1の関与). Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003 Aug;44(8):3494-501.; Ruhul Amin AR, Senga T, Oo ML, Thant AA, Hamaguchi M. Secretion of matrix metalloproteinase-9 by the proinflammatory cytokine, IL-1beta: a role for the dual signaling pathways(炎症性サイトカインIL-1βによるMMP-9の分泌: 二重シグナル伝達経路向けの役割). Akt and Erk. Genes Cells. 2003 Jun;8(6):512-23]。炎症性サイトカインのほうは、やはりマトリックス分解酵素類、サイトカイン類および活性酸素種を分泌する炎症細胞を集積させる役目を果たす。従って、CSなどのような病原因子が病的ネットワークを作動させ、その中で活性酸素種が肺破壊の主要な媒介物質として機能するように見受けられる。吸い込んだタバコ煙に由来する活性酸素種(ROS)と炎症細胞により内因的に形成されるROSの両方が肺内オキシダント負荷の増大を招く。
【０００８】
COPDの発生に関連するもう1つの追加的な病原因子は、気腫患者の肺におけるVEGFおよびVEGFRIIの発現量観測値の低下である[Yasunori Kasahara, Rubin M. Tuder, Carlyne D. Cool, David A. Lynch, Sonia C. Flores, Norbert F. Voelkel. Endothelial Cell Death and Decreased Expression of Vascular Endothelial Growth Factor and Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 in Emphysema(肺気腫における内皮細胞死と血管内皮細胞増殖因子/血管内皮細胞増殖因子受容体2の発現低下). Am J Respir Crit Care Med Vol 163. pp 737-744, 2001]。さらに、VEGFRの化学阻害剤によるVEGFシグナル伝達の阻害は肺胞中隔内皮細胞の、次いで上皮細胞の、アポトーシスを招くが、それはおそらく肺胞内の両タイプの細胞の緊密な構造的/機能的結合の破壊に起因すると思われる[Yasunori Kasahara, Rubin M. Tuder, Laimute Taraseviciene-Stewart, Timothy D. Le Cras, Steven Abmen, Peter K. Hirth, Johannes Waltenberger, Norbert F. Voelkel. Inhibition of VEGF receptors causes lung cell apoptosis and emphysema (VEGF受容体の阻害は肺細胞アポトーシスと気腫を引き起こす). J Clin Invest. 106:1311-1319 (2000).; Voelkel NF, Cool CD. Pulmonary vascular involvement in chronic obstructive pulmonary disease(慢性閉塞性肺疾患への肺血管関与). Eur Respir J Suppl. 2003 Nov;46:28s-32s]。
【０００９】
黄斑変性
65歳超の米国人の最良矯正視力低下の最も一般的な原因は加齢黄斑変性(AMD)である。AMDは進行に伴う中心視力の低下を所見とする。AMDの患部は黄斑すなわち網膜中心の小領域であり、主に視細胞からなる。AMD患者の約85〜90%を占めるいわゆる「乾燥型」AMDは網膜色素分布の変化、視細胞の減少、および全般的な細胞萎縮に起因する網膜機能の低下を伴う。いわゆる「湿潤型」AMDは、網膜下腔への血塊または瘢痕の形成につながる異常脈絡膜血管の増殖を伴う。従って湿潤型AMDが発症するのは神経性網膜下で異常脈絡膜血管網が形成される(脈絡膜血管新生、CNV)ためである。この新生血管は漏出性がきわめて高い。これは網膜下液と血液の集積を、ひいては視力の低下を招く。結局、脈絡膜と網膜に絡む円板状瘢痕が形成する関連領域では、網膜機能が完全に失われる。乾燥型AMD患者は視力の低下にとどまろうが、湿潤型AMDはしばしば失明に至る[Hamdi & Kenney, Age-related Macular degeneration - a new viewpoint (加齢黄斑変性-新しい視点). Frontiers in Bioscience, e305-314, May 2003]。CNVは湿潤型AMDだけでなく、他の眼病変たとえば眼ヒストプラスマ症、血管線条、ブルッフ膜破裂、近視性変性、眼腫瘍、ある種の網膜変性疾患などでも起こる。
【００１０】
種々の研究が行われて、AMDの危険因子がいくつか究明されてきた。たとえば喫煙、加齢、家族歴[Milton, Am J Ophthalmol 88, 269 (1979); Mitchell et al. Ophthalmology 102, 1450-1460 (1955); Smith et al. Ophthalmology 108, 697-704 (2001)]、性別[確率は女性のほうが7倍も高い: Klein et al. Ophthalmology 99, 933-943 (1992)]、人種(罹患率は白人が最も高い)などである。他に、目の特質たとえば遠視や淡色系の目の色、および心血管障害や高血圧などが危険因子として挙げられることもある。AMDの発症進行への遺伝的関与の証拠もまた示されてきた(前記Hamdi & Kenney)。
最近、Acuity PharmaceuticalsとSirna Therapeuticsの2社が、VEGF、VEGF-R1(Flt-1)をそれぞれ阻害するAMD治療用のsiRNA分子についてINDを提出した。これらの分子はそれぞれCand5阻害剤、027阻害剤と命名されている。
【００１１】
微小血管障害
微小血管障害は、主に微細な毛細血管とリンパ管に影響を及ぼす幅広い症候群からなり、従って直接的な外科的介入の埒外にある。微小血管障害は大きく血管攣縮性疾患、脈管炎およびリンパ管閉塞症に分けられる。また、微小血管的な要素をもつ既知血管障害も多い。
【００１２】
・    血管攣縮性疾患: 血管攣縮性疾患は一群の比較的一般的な疾患であり、末梢血管収縮反射が、未知の原因から、過敏であることを所見とする。これは不適切な血管収縮と組織虚血を招き、場合によっては組織欠損に至る。血管攣縮性疾患は通常、温度または振動機械の使用に関連するが、他の疾患に続発する場合もある。
・    脈管炎疾患: 脈管炎疾患は微小循環内の1次炎症過程に関わる疾患である。脈管炎は通常、自己免疫または結合組織障害の1つであり、一般に外科的治療になじまず、症状が重篤な場合には免疫抑制治療が必要である。
・    リンパ管閉塞症: 下肢または上肢の慢性腫大(リンパ浮腫)は末梢リンパ管閉塞の結果である。これは比較的まれな症状であり、きわめて多数の先天的、後天的原因を有する。治療の柱は圧迫帯の適正装着や間歇的圧迫装置の使用である。
【００１３】
糖尿病関連の微小血管病変
糖尿病は失明の主な原因であり、四肢切断とインポテンスの原因の第1位であり、また発症頻度の高い慢性小児疾患である。糖尿病は米国では末期腎不全の主な原因でもあるが、その糖尿病有病率は31%である。糖尿病はまた、最も高頻度の腎移植適応疾患であり、全臓器植の22%を占める。
【００１４】
一般に、糖尿病合併症は微小血管型、大血管型に大別できる。微小血管合併症の例は神経障害(ニューロパシー)、腎症(ネフロパシー)、視力障害(たとえば網膜症、緑内障、白内障、角膜疾患)などである。網膜、糸球体、および神経脈管では、類似の病態生理学的所見が糖尿病特異的な微小血管障害を明らかにする。
【００１５】
糖尿病関連の微小血管病変は糖尿病を長年患ってきた人々などを見舞う最小血管(毛細血管)の疾患と定義される。その血管壁は異常に厚く、しかも脆くなる。そのため毛細血管は出血し、タンパク質を漏出させ、また体内の血流を鈍らせる。
【００１６】
臨床/動物モデルデータは、慢性高血糖が各種の糖尿病性微小血管障害の中心的な誘発因子であることを示唆する。高血糖の持続期間と程度はどちらも糖尿病性微小血管障害の程度と進行速度に強く関連する。糖尿病細胞はみな高血糖にさらされるが、高血糖性障害は細胞内高血糖を来たす細胞型(たとえば内皮細胞)に限定される。内皮細胞が細胞内高血糖を来たすのは、他の数多くの細胞と異なり、細胞外高血糖にさらされたときにグルコース輸送を抑制することができないためである。細胞内高血糖が糖尿病性病変を来たすための必要十分条件であることは、正常血糖環境で培養したメサンギウム細胞内でのGLUT1グルコース輸送体の過剰発現が糖尿病の表現型を、糖尿病性高血糖と同じIV型コラーゲン、Ｉ型コラーゲンおよびフィブロネクチン遺伝子発現の増加を含めて、再現するという事実によっても示される。
【００１７】
内皮細胞機能異常: 糖尿病の経過中の、構造的変化が明白になる前の初期に、高血糖のために網膜、糸球体および末梢神経脈管が血流と血管透過性に異常をきたす。この血流と毛細血管内圧力の増大は、毛細血管床の輸出側での高血糖誘発性の酸化窒素(NO)産生低下を、またおそらくはアンジオテンシンIIに対する感受性の増大を、反映すると考えられる。毛細血管内圧力の増大と内皮細胞の機能障害の結果として、網膜毛細管ではフルオレセインの漏出が増加し、また糸球体毛細血管ではアルブミン排出率(AER)が高まった。末梢神経脈管でも同様の変化が起こる。透過性の上昇は糖尿病の経過の初期には可逆的であるが、時間の推移に伴い不可逆的になる。
【００１８】
血管壁へのタンパク質集積の増加
糖尿病性微小血管障害の一般的な病態生理学的所見は血管腔の漸進的狭隘化と最終的な閉塞であり、それは患部組織の潅流/機能障害を招く。初期の高血糖誘発性の微小血管性高血圧と血管透過性の上昇は次の3つの過程によって不可逆的な微小血管閉塞をもたらす。
・    第1は過ヨウ素酸シッフ染色(PAS)陽性の含糖質血漿タンパク質の異常漏出であり、該タンパク質は毛細血管壁に沈積するし、また周皮細胞やメサンギウム細胞などのような血管周囲細胞を刺激して増殖因子や細胞外マトリックスを産生させることもある。
・    第2は増殖因子たとえばトランスフォーミング増殖因子β1 (TGF-β1)の血管外漏出であり、それは細胞外マトリックス成分の過剰産生を直接刺激するし、またある種の合併症関連細胞型ではアポトーシスを誘発することもある。
・    第3は、glut-1グルコース輸送体、増殖因子、増殖因子受容体、細胞外マトリックス成分、および循環白血球を活性化しうる接着分子などを含む内皮細胞および支持細胞による病態遺伝子発現の高血圧誘発性刺激である。眼/腎動脈狭窄のある側で糖尿病性微小血管障害の重篤度の片側性軽減が見られるという事実はこの考え方に一致する。
【００１９】
微小血管細胞の消失と血管閉塞
糖尿病微小血管腔の漸進的狭隘化と閉塞はまた、大血管細胞の消失を伴う。網膜では、糖尿病はミューラー細胞とガングリオン細胞、周皮細胞および内皮細胞のプログラム細胞死を誘発する。糸球体では、腎機能低下は広範囲にわたる毛細血管閉塞および有足細胞消失と関連するが、糸球体細胞消失のメカニズムはなお不明である。神経脈管では、内皮細胞と周皮細胞の変性が起こるが、これらの微小血管の変化は糖尿病末梢神経障害の発現に先行する模様である。糖尿病における軸索変性の多発的な分布は微小血管閉塞への因果的役割を支持するが、高血糖誘発性のニューロトロフィン減少が、正常な軸索修復再生を妨げるという形で寄与している可能性もある。
【００２０】
糖尿病性微小血管障害のもう1つの一般的な所見は「高血糖の記憶」と呼ばれてきたが、これは高血糖誘発性の微小血管変化がその後の正常グルコース代謝期にも持続または進行する現象である。こうした現象の最も顕著な例は、糖尿病モデル犬で2年半の高血糖期の後の2年半の正常血糖期に、組織学的に正常な眼に発現した重度の網膜症である。高血糖誘発性の、特定マトリックス遺伝子転写の増加もまたin vivoで正常血糖を回復した後数週間にわたり持続するし、またそれほど顕著ではないが質的には同様の例として、培養内皮細胞では高血糖誘発性の、特定マトリックス遺伝子転写の持続的な増加が起こる。
【００２１】
詳しくは、“Shared pathophysiologic features of microvascular complications of diabetes(糖尿病微小血管合併症に共通の病態生理学的所見)” (Larsen: Williams Textbook of Endocrinology, 10th ed., Copyright (c) 2003 Elsevier)を参照。
微小血管合併症は顕性糖尿病で起こるだけでなく、耐糖能異常(IGT)にも起因する。IGT微小血管合併症: 神経障害、網膜症、および腎性微量タンパク尿症。
【００２２】
糖尿病神経障害
糖尿病神経障害は糖尿病に関連する神経障害(末梢神経障害)である。この種の疾患は通常、神経に血液を供給する小血管(神経脈管)に絡む糖尿病性微小血管損傷に由来する。糖尿病神経障害に関連する比較的一般的な疾患の例は第3神経麻痺; 単神経障害; 多発性単神経障害; 糖尿病性筋萎縮症; 有痛性多発性神経障害; 胸腹部神経障害; および最も一般的な形であり主に足と下腿を患部とする末梢性神経障害などである。糖尿病神経障害の発現には次の4因子が絡む: 微小血管障害、最終糖化産物(AGE)、プロテインキナーゼC、およびポリオール経路。
【００２３】
糖尿病神経障害における微小血管障害
血管障害と神経疾患は密接に関連し絡み合っている。血管は正常な神経機能に依存し、神経は十分な血流に依存する。微小血管の最初の病変は血管収縮である。病気の進行に伴い神経機能障害と血管異常(たとえば毛細血管基底膜の肥厚や内皮過形成)の発現が密接に相関するが、そうした血管異常は低酸素圧と低酸素症を招く。神経虚血は糖尿病神経障害の所見の1つである。神経血流の相当の改善とそれに対応した神経伝導速度の改善は血管拡張剤(アンジオテンシン転換酵素阻害剤、アルファ1アンタゴニストなど)でもたらすことができる。従って微小血管の機能障害は、糖尿病の初期に起こり、神経の機能障害と並行し、また場合によっては糖尿病神経障害に見られる構造的、機能的および臨床的変化の重篤性にも十分見合う。末梢性神経障害(下腿)、感覚運動神経障害は糖尿病下腿潰瘍の重要な病因の1つである。
【００２４】
神経障害は一般的な糖尿病合併症であり、2型糖尿病患者の半数以上でいずれ発症する。神経障害は糖尿病診断時に患者の10〜18%ですでに存在することが神経伝導検査で判明しており、これは末梢神経の損傷が糖尿病の初期段階で起こり、比較的経度の血糖調節障害を伴うことを示唆する。神経障害は糖尿病の初期臨床兆候であると考え方は40年余り前に提起されており、ほとんどの研究でIGTと神経障害の関連が報告されている。ほとんどのIGT/関連神経障害患者は顕著な神経障害性疼痛を伴う対称性の遠位性感覚性多発性神経障害を患う。IGT神経障害[J. Robinson Singleton, Microvascular complications of impaired glucose tolerance - Perspectives in Diabetes(耐糖能異常の微小血管合併症: 糖尿病の視点), Diabetes December 1, 2003]は初期の糖尿病神経障害と表現型が似ており、やはり疼痛を含む感覚性症状や自律神経機能障害を引き起こす。初期糖尿病神経障害患者669人の調査では、感覚性症状は>60%で、インポテンスは40%近くで、また他の自立神経障害は33%で見られたが、運動性障害の証拠は12%で見られたにすぎない。こうした臨床所見は、疼痛、温度、自律神経の各シグナルを運ぶ小さな無髄神経線維の顕著な初期障害を示唆する。皮膚生検からの無髄表皮内神経線維の直接定量では、IGT関連と初期糖尿病関連の両神経障害の患者は似たような線維消失と形態変化を示した。
【００２５】
自律神経機能障害特に勃起不全と心臓迷走神経反応の変化は糖尿病における神経損傷の一般的な初期的所見である。IGT患者の研究はまた迷走神経性の自律神経失調症が多いことを示唆するが、別個の検査では運動後心拍回復の異常、深呼吸時R-R間隔変動の鈍化、および呼気/吸気比の低下(いずれも迷走神経性の自律神経失調症の指標)が判明した割合はIGT患者群のほうが年齢を対応させた正常血糖対照群よりも高かった。
【００２６】
糖尿病の神経障害は運動、感覚および自律の各神経線維に影響する。運動神経障害は筋脱力、萎縮および不全麻痺を引き起こす。感覚神経障害は痛、圧、熱の各防御知覚の消失を招く。痛覚の消失は無感覚の足に数多くの問題たとえば潰瘍形成、無知覚の外傷、シャルコー(神経病性)関節症を招く。患者は創傷が悪化して初めて治療を求めることになろう。複合的な感覚/運動神経障害は患者をして異常なストレスを足に及ぼさせ、それが外傷を、ひいては感染症を招く結果となる。交感自律神経性神経障害は血管拡張と発汗減少を引き起こすが、それは皮膚創傷や微小血管血流の機能的変化を特にこうむりやすい温かい、過度に乾燥した足をもたらす結果となる。自律神経機能障害(および皮膚組織の神経麻痺)はまた、皮膚の完全性を失わせる結果ともなり、微生物進入に格好の場を提供することにもなる。神経障害性の足の潰瘍形成は自然発生的なものではなく、神経障害に何らかの外傷が重なった結果である。
【００２７】
微小血管の機能障害は、糖尿病の初期に起こり、神経の機能障害と並行し、また場合によっては糖尿病神経障害に見られる構造的、機能的および臨床的変化の重篤性にも十分見合う。
【００２８】
最終糖化産物(AGE): 細胞内糖濃度の上昇はタンパク質との非酵素的共有結合を引き起こすが、それはタンパク質の構造を変化させ、機能を失わせる。こうした糖化タンパク質のあるものは糖尿病神経障害や他の長期糖尿病合併症の病理に関連する。
プロテインキナーゼC (KPC): PKCは糖尿病神経障害の病理に関連する。糖濃度の上昇は、PKCを活性化させる細胞内ジアシルグリセロールの増加を招く。動物モデルでは、PKC阻害剤は神経血流を増加させることにより神経伝導速度を増すであろう。
【００２９】
感覚運動性多発性神経障害
神経線維は長いもののほうが短いものよりも影響を受けやすい。それは神経の長さに反比例して神経伝導速度が鈍るからである。この症候群では知覚の低下と反射の消失がまず足指で左右対称性に起こり、次いで上方に拡大する。それは通常、しびれ、知覚消失、感覚異常および夜間痛といった症状の手袋靴下型分布として記述される。痛みの感覚は燃えるような、刺すような、うずくような、または鈍いなどと形容される。チクチク刺すような感覚が一般的である。固有感覚の消失すなわち手足の空間的位置に関する知覚への影響が初期に現れる。患者は異物たとえばガラス片などを踏んでも、あるいは靴擦れにより「たこ」が出来ても、気がつかない。そのため、足や下腿が潰瘍や感染症に見舞われやすくなり、下肢切断に至りかねない。同様に、そうした患者は膝、足関節または足を多重骨折し、またシャルコー関節を発症しかねない。運動神経機能の低下は足指の背屈拘縮いわゆる槌趾をもたらす。この種の拘縮は足だけでなく手でも起こる。
【００３０】
自律神経性神経障害
自律神経系は心臓、胃腸管および泌尿器系を支配する神経からなる。自律神経性神経障害はこれらの臓器系のいずれにも影響を及ぼしうる。糖尿病の自律神経機能障害として最も一般的なのは起立性低血圧または立ちくらみである。糖尿病性自律神経性神経障害の場合には、それは心臓と大動脈の側で心拍と血管緊張の適切な調節による脳への血流の継続的かつ十二分な確保ができなくなるためである。この症状は通常、正常呼吸に見られる通常の心拍変化である洞性呼吸性変動の消失を伴う。これら2つの所見があれば、心臓自律神経性神経障害が存在する。
【００３１】
胃腸管症状には胃排出遅延、胃不全麻痺、吐き気、鼓腸、下痢などがある。糖尿病患者は経口糖尿病薬を服用する場合が多いが、そうした薬の吸収は胃排出遅延により大きく影響される。これは、経口糖尿病薬が食前に服用されしかも何時間も場合により何日間も後になって血糖値がすでに低下しあるいは低血糖になっているのに吸収されずに残る場合には、低血糖症の原因となる。小腸の運動が鈍いと細菌の過剰増殖を招き、高血糖の存在がそれに輪をかける。これは鼓腸、緒なら、下痢の原因となる。
泌尿器系の症状には頻尿、尿意切迫、尿失禁、残尿などがある。この場合も、糖尿が残留するため尿路感染症が起こりやすい。残尿は膀胱憩室症、結石、逆流性腎症などの原因となる。
【００３２】
脳神経障害
脳神経が侵される場合は、動眼(第3脳)神経障害が最も一般的である。動眼神経は眼球を動かす諸々の筋肉を、外側直筋と上斜筋を除いて、支配する。また、瞳孔を収縮させ、瞼を開ける役目も果たす。通常、糖尿病性第3脳神経麻痺の発症は突然であり、前頭痛または眼窩周囲痛に始まり複視へと進む。侵される可能性があるのは、第3脳神経の支配を受ける諸々の動眼筋肉であるが、瞳孔の大きさをコントロールする筋肉は除く。眼球の外側直筋(眼球を横方向に動かす)を支配する第6脳神経すなわち外転神経は侵されるのが普通であるが、(眼球を下方に動かす上斜筋を支配する)第4脳神経すなわち滑車神経の病変は珍しい。胸部または腰椎神経の単神経障害が起こり、心筋梗塞、胆のう炎または虫垂炎に似た有痛性症候群の原因となることもある。糖尿病になると手根管症候群などのようなエントラップメント神経障害の罹患率が高くなる。
【００３３】
糖尿病性肢虚血と糖尿病性足部潰瘍
糖尿病と圧力は微小血管循環を損ない、下肢の皮膚を病変させ、ひいては潰瘍の形成や感染症を招く可能性がある。微小血管病変は肢筋肉微小血管障害、それに末梢性虚血の素因および虚血イベントに対する血管新生代償反応の低下の原因となる。微小血管病変は末梢血管障害(PVD)[または末梢動脈疾患(PAD)または下肢動脈疾患(LEAD) - 大血管合併症 - アテローム硬化症に起因する下肢動脈狭窄]を悪化させる。PVDは糖尿病初期に発現し、一段と重篤かつ広範囲であり、また下肢、眼および腎を侵す微小循環障害の併発をしばしば伴う。
【００３４】
足部潰瘍および壊疽はしばしばPADの併存疾患である。感覚障害を伴う併発性末梢神経障害は足部が外傷、潰瘍形成および感染を受けやすくする。糖尿病によるPADの進行は、末梢性神経障害や足部および下肢の疼痛、外傷に対する無感覚などのような併存疾患によってひどくなる。循環障害や感覚障害と表裏一体の形で潰瘍形成や感染症が起こる。骨髄炎や壊疽へと進行すると下肢切断が必要になろう。
【００３５】
糖尿病患者は非糖尿病患者と比較して下肢切断をこうむる可能性が最大25倍も高くなるが、足部潰瘍とその後の下肢喪失を防止する必要性がそこで明確になる。糖尿病性足部潰瘍はPADとの関連で起こるだけでなく、神経障害、静脈機能障害(静脈瘤)、外傷および感染症に関連する場合もある。PADはこれらの他疾患の一因となることでも、足部潰瘍の生成または促進に関わる。足部潰瘍は、臨床で十分な末梢動脈潅流があっても発生する場合があるため、PADの進行を必ずしも意味しない。患者ベースの研究によれば、末梢性神経障害と高足底圧をもつ糖尿病患者では足部潰瘍に見舞われるリスクが高まる。米国ウィスコンシン州南部での住民を対象とした調査によれば、足部または足関節に潰瘍または褥創履歴のある割合は全糖尿病患者の15%であった。この割合は30歳未満で糖尿病と診断された患者ではもっと高く、女性(13%)よりも男性(16%)のほうがやや高く、またインスリン治療を受けている患者(17%)のほうがインスリン投与を受けていない患者(10%)よりも高かった。この割合は年齢と共に上昇したが、それは30歳未満で糖尿病と診断された患者で特に目立った。欧州での研究では、糖尿病患者の足部潰瘍有病率は50歳未満層で3%、60歳未満層で7%、80歳未満層で14%であった。70歳の比較では男性の有病率のほうが女性よりも高かった。
【００３６】
糖尿病患者では、足部虚血および感染症は重大な、場合によっては命に関わる疾患であるが、治療が最も困難なのは神経障害である。糖尿病足の臨床/病理症状の諸側面に関する内科的、外科的文献は圧倒的である。糖尿病足の治療には神経障害、血管障害、網膜症および腎症が単独で、または組み合わさって、また様々な度合いに、影響を及ぼすようである。
【００３７】
毎年、82,000件の肢切断が糖尿病患者に対して行われる。そうした患者の大半は高齢者である。糖尿病に由来する肢切断は複数の原因疾患を有する。たとえば足部潰瘍、虚血、(静脈逆流続発性の)静脈性下腿潰瘍、踵潰瘍(未治療の褥創に由来する)などである。これらの肢切断の大半は潰瘍に由来する。糖尿病患者の足部潰瘍有病率は12%である。また1型糖尿病患者における下肢潰瘍の、20年累計罹患率は9.9%である。糖尿病関連の肢切断は5年死亡率が39%〜68%であり、追加肢切断のリスク増大とも関連する。入院期間は糖尿病性足部潰瘍のある患者ではそうした潰瘍のない患者に比して約60%長くなる。
【００３８】
糖尿病神経障害は、正常なC線維性侵害受容器機能に依存し痛刺激に反応して局所的な血管拡張を引き起こす神経軸索反射を低下させる。この状態はさらに、神経障害糖尿病足の、傷害または炎症といったストレス条件下での血管拡張反応を損なう。こうした機能障害は、神経障害糖尿病足のある種の潰瘍が、下肢血管再生術の成功にもかかわらず、なかなか、またはまったく、治癒しない理由を部分的に説明してくれる。
従って、糖尿病足の潰瘍形成への最も一般的な因果経路は神経障害(知覚消失)、変形(中足骨骨頭の突出など)および外傷(例: 足に合わない履物が原因)の組み合わせとして特定することが出来る。
【００３９】
ほとんどの外科医は膝窩動脈または脛骨動脈のバイパス術を行いたがる。より近位の処置と比べて患肢救済率も開存率も低いためである。触知可能な足の脈拍を膝窩動脈または脛骨動脈のバイパス術で回復できない場合には、下腿動脈バイパスが糖尿病および虚血性足部創傷の患者にとって持続性、有効性の高い患肢救済術になると報告されている。糖尿病患者の広範囲にわたるマルチセグメント動脈閉塞性疾患でさえも患肢救済の妨げにはならない。重度の創傷合併症は悲惨な結果をもたらすかもしれないが、そうした事態は下腿動脈バイパス移植術後はまれである。先在足感染症の適切な管理と慎重な移植片トンネリングは、新たな合併症を防止するうえで有効であることが示された。下肢血管形成術は次第に普及している。しかし、血管形成術が有効であるには、遠位血管または栄養血管が開存していなければ、より近位の血管形成術を成功させることはできないことを力説する必要がある。
【００４０】
糖尿病性潰瘍/肢病変は患者によっては[デブリドマン、抗生物質治療、肉芽組織(新生コラーゲンおよび血管新生)刺激製剤の使用、および創傷部の細菌負荷の軽減などにより]管理することが可能であるが、これらの疾患を治療するおよび/または症状を緩和する医薬組成物があれば助かろう。
詳しくはAmerican Journal of Surgery, Volume 187・Number 5 Suppl 1・May 1, 2004, Copyright (c) 2004 Elsevierを参照。
【００４１】
糖尿病性の冠微小血管機能障害
糖尿病での組織病理と微小循環障害の関連は古い実験研究や病理解剖から十分に明らかであり、そこでは基底膜肥厚、血管周囲線維症、血管希薄化、毛細血管出血がしばしば認められる。こうした病変と閉塞性微小血管機能障害の関連が最近の論文で示されている(Am J Physiol 2003; 285)とはいえ、これらのデータをin vivoで確認するのはなお困難である。しかし、きわめて多数の臨床研究は、顕性糖尿病だけでなく代謝調節障害もまた冠微小循環に及ぼすことを示唆する(Hypert Res 2002;25:893)。WernerはSambuceti et al (Circulation 2001;104:1129)の重要論文にそれとなく触れるように、梗塞責任動脈の再疎通成功後の患者における微小血管機能障害の持続を示したが、そうした事態はこれらの患者で心血管系罹患率および死亡率が高くなる理由になるかもしれない。緊急再潅流に関する大規模調査では、罹患率と死亡率は梗塞責任動脈の再疎通それ自体には無関係であって、むしろTIMI flow ± 心筋内微細血管陰影(myocardial blush)のほうに大きく依存するとの証拠が強まっている(Stone 2002; Feldmann, Circulation 2003)。Hermannは特に、これとの関連では冠微小循環の完全性がおそらく最も重要な臨床/予後因子であることを示した(Circulation 2001)。保護デバイス微小循環の中立的な効果[TIMI flow、ST回復、MACE(主要有害心イベント)のいずれにも関連変化を及ぼさない]は、微小循環機能障害が大きな予後決定因であることを示唆するかもしれない。冠微小血管機能障害は非閉塞性のCAD(冠動脈疾患)でも大きな役割を果たしているとの証拠も強まっている。冠動脈内皮機能障害はこれらの患者では引き続き強力な予後予測因子となっている。
【００４２】
糖尿病腎症(糖尿病患者の腎機能障害)
糖尿病腎症は微量アルブミン尿症(微小血管障害の影響)、タンパク尿およびESRD(末期腎不全)を包含する。糖尿病は腎不全の最も一般的な原因であり、新症例の40%余りは糖尿病に由来する。薬物やダイエットで糖尿病を抑制することができるときでも、糖尿病は腎症や腎不全の原因となりうる。ほとんどの糖尿病患者は腎不全の原因となるほどのひどい腎症にはならない。米国では約1,600万人の糖尿病患者がおり、また約10万人が糖尿病の結果としての腎不全を患っている。
【００４３】
糖尿病網膜症
糖尿病状態では、高血糖は網膜血流の低下、網膜透過性亢進、視神経伝導の遅延、および網膜神経の細胞死を招く。持続期間の短い糖尿病では、神経細胞死は網膜の内顆粒層内で確認されている。特に、アポトーシスはミュラー細胞や星状細胞などのようなグリア細胞に限局され、またSTZ誘発糖尿病ラットモデルでは発病1か月以内に起こることが示されてきた。これらの事象の原因は多因子性であり、ジアシルグリセロール/PKC経路の活性化、酸化ストレス、非酵素的糖化などが絡む。これらの事象の複合が網膜を低酸素にし、最終的に糖尿病網膜症の発現を招く。網膜虚血と糖尿病網膜の初期変性の間の、考えられる1つの結び付きは低酸素誘導性の増殖因子(たとえばVEGF)産生である。低酸素応答のマスター調節因子は低酸素誘導因子1(HIF-1)と同定されているが、HIF-1は細胞増殖や血管新生を調節する遺伝子を制御する。HIF-1ユビキチン化の阻害は低酸素応答配列(HRE)への結合とVEGF mRNAの生成を招くことが、以前の研究で示されている。
【００４４】
糖尿病網膜症は慢性高血糖症に起因する進行性の網膜血管系機能障害と定義される。糖尿病網膜症の重要所見は微小動脈瘤、網膜出血、硬性白斑(retina lipid exudates)、綿花様白斑、毛細血管非潅流、黄斑浮腫、新生血管などである。付随所見は硝子体出血、網膜剥離、血管新生緑内障、未熟白内障、脳神経麻痺などである。
【００４５】
米国には1型、2型の糖尿病患者が1,600万人いる。1型糖尿病患者の80%は15年以内に糖尿病網膜症になり、また2型糖尿病患者の84%は19年以内に網膜症になる。これらの数字は眼の新生血管系疾患を対象とする治療薬の市場の大きさを物語る。糖尿病網膜症の発現は時間依存的である。最適血糖管理にもかかわらず、疾患が長期わたる患者はいずれ何らかの形の網膜症になるものと見込まれる。米国失明予防協会は、国内の糖尿病患者のうち400〜600万人が糖尿病網膜症になっていると推定している。増殖性糖尿病網膜症と糖尿病黄斑浮腫の年間罹患数は推定でそれぞれ65,000人、75,000人であり、それぞれの患者数は70万人、50万人である。米国では毎年12,000〜24,000人が糖尿病網膜症のために失明を余儀なくされている。網膜症は重度の視力喪失の減少に有効である外科的な方法で治療されるが、レーザー治療部分は網膜が不可逆的に破壊される。化学療法はまだない。
【００４６】
糖尿病で主に毛細血管を侵す微小血管障害は結膜、網膜および中枢神経系の血管系を破壊することによって眼を侵す。患者は長期にわたる球結膜の充血という履歴や、正常を上回る食欲(多食)の下での体重減少、異常なのどの渇き(多飲)および異常な頻尿(多尿)という全身性の訴えを示す可能性がある。
【００４７】
不安定血糖に伴う視力変動は一般的な眼の徴候である。水晶体の膨潤は突然の大幅な屈折力変化と未熟白内障形成をもたらす。視力変動は疾患の重度と病期に依存しよう。
網膜では、細動脈と毛細血管の脆弱化が特徴的な外観の網膜内点状/しみ状出血、白斑、網膜内微小血管異常(IRMA)、浮腫および綿花状梗塞(cotton wool infarcts)を来たすことがある。増殖性糖尿病網膜症は重大な血管機能障害の結果であって、乳頭上血管新生(NVD)、乳頭外血管新生(NVE)、および虹彩血管新生(NVIまたはrubeosis irides)として見ることができる。神経系合併症の例は第3、第4および第6脳神経麻痺、それに糖尿病性の視神経乳頭炎および顔面神経麻痺などである。
【００４８】
糖尿病は耐糖能異常を共通所見とする、遺伝的影響のある疾患群である。その特徴は、インスリン欠乏または機能不全もしくは細胞インスリン受容体欠乏または機能不全の結果としての代謝調節異常である。
【００４９】
血管内皮細胞をサポートする細胞である星状細胞の破壊にはソルビトールの生成に関係する生化学反応が絡む。サポート役の星状細胞が死滅すると、毛細血管内皮細胞は機能が低下し、血液、タンパク質および脂質の血管漏出を招く。これは粘度を増した高血糖血液と相俟って、血管機能不全、毛細血管非潅流、網膜低酸素症、構造変性、機能低下を招く。網膜新生血管の発生に関与する血管増殖因子の生成と放出については理解があまり深まっていない。
【００５０】
視力を脅かさない糖尿病続発症はほんどが、メディカルコントロールの後、数週間〜数か月のうちに自然に症状が消失する。大幅な屈折力変化がある場合には、屈折力が安定するまで一時的な眼鏡の処方が必要になるかもしれない。網膜症が黄斑を侵すおそれがある場合には、または新血管が増殖する場合には、患者をレーザー光凝固療法にゆだねることもある。The Diabetic Retinopathy Study (DRS)は、汎網膜光凝固療法が高リスク患者の重度の視力低下というリスクを低減するうえで有効であることを完全に証明した。DRSは高リスクの特徴を、(1)視神経乳頭直径の1/4〜1/3にわたる乳頭血管新生(NVD)および(2)硝子体出血を伴う乳頭外血管新生(NVE)と定義している。
【００５１】
糖尿病黄斑浮腫(DME)
DMEは糖尿病網膜症の合併症であり、網膜血管を侵す病気である。糖尿病網膜症は網膜に複合的な異常をもたらす。たとえば網膜肥厚・浮腫、出血、血流障害、血管からの過度の体液漏出、最終病期での異常血管増殖などである。この血管増殖は大規模出血や重度の網膜損傷を招きかねない。糖尿病網膜症の血管漏出に起因する黄斑の膨潤をDMEという。DMAの主な症状は中心視力の喪失である。DMEに付随するリスク因子は管理不良の血糖値、高血圧、体液うっ帯の原因となる腎機能異常、高コレステロール値、および他の一般的な全身性因子などである。
【００５２】
WHO(世界保健機関)によれば、糖尿病網膜症は就業年齢成人の失明の主要な原因であり、また糖尿病での視力低下の主要な原因である。米国糖尿病協会は米国内の糖尿病患者を1,600万人、新規診断患者を年間130万人と報告している。米国失明予防協会と国立眼研究所は米国では年齢18歳以上の糖尿病網膜症患者が530万人余りにのぼり、うち約50万人はDME患者であると推定している。CDC(米国疾病対策センター)は米国では毎年、75,000人ほどが新たにDME患者に加わると推定している。
【００５３】
他の神経障害
糖尿病の他に、帯状ヘルペス感染、慢性または急性外傷(手術を含む)および種々の神経毒もまた神経障害の一般的な原因である。神経障害性疼痛はがんでは、末梢神経に対するがんの直接的な結果(たとえば腫瘍による圧迫)の結果として、また数多くの化学療法薬の副作用として、一般的である。
【００５４】
微小血管障害: 血管障害と神経疾患は密接に関連し絡み合っている。血管は正常な神経機能に依存し、神経は十分な血流に依存する。微小血管の最初の病変は血管収縮である。病気の進行に伴い神経機能障害と血管異常(たとえば毛細血管基底膜の肥厚や内皮過形成)の発現が密接に相関するが、そうした血管異常は低酸素圧と低酸素症を招く。神経虚血は糖尿病神経障害の所見の1つである。神経血流の相当の改善とそれに対応した神経伝導速度の改善は血管拡張剤(アンジオテンシン転換酵素阻害剤、アルファ1アンタゴニストなど)でもたらすことができる。
【００５５】
臨床所見
神経障害は諸々の末梢神経すなわち痛覚神経、運動神経、自律神経を侵す。従って、そうした神経が張り巡らされている諸々の臓器や系にも影響を及ぼす。影響を受ける臓器や系に基づく症候群がいくつか区別されているが、それらは決して排他的な区分ではない。患者は感覚運動系+自律神経系の神経障害または他の任意の組み合わせをもつことができる。
【００５６】
神経障害の代謝性の原因について理解が深まっているにもかかわらず、そうした病理過程の遮断を狙いとした治療は効能の欠如や副作用のために限られてきた。従って、治療は対症療法的であり、根本原因に対処するものではない。感覚運動神経障害に起因する疼痛用の薬剤には三環系抗うつ薬(TCA)、セロトニン再取り込み阻害薬(SSRI)、抗てんかん薬(AED)などがある。これらの薬剤はどれも、糖尿病網膜症につながる病理過程を逆転させるものではないし、また容赦のない疾病の進行を変えるものでもない。従って、これらの疾患の治療の改善および/または症状の緩和につながる医薬組成物が得られれば助かるであろう。
【００５７】
他の網膜障害
網膜微小血管障害(AIDS網膜症)
網膜微小血管障害はAIDS患者の100%に見られる。その所見は網膜内出血、微小動脈瘤、Roth斑、綿花様白斑(神経線維層の微小梗塞)、および血管周囲シース形成(sheathing)などである。AIDS網膜症は病因不明であるが、循環免疫複合体、細胞傷害物質の局所的放出、血液レオロジー異常、および内皮細胞のHIV感染などによるものと考えられてきた。該網膜症は今日ではごく一般的であるため、糖尿病や高血圧はないがHIVリスクを抱えた患者で綿花様白斑が認められれば、医師はウイルス検査を検討して然るべきである。AIDS網膜症だけの治療法はないが、それが長引く場合には医師はHIV療法の効果や患者のコンプライアンスを再検討するのがよいかもしれない。
【００５８】
骨髄移植(BMT)網膜症
骨髄移植網膜症は1983年に初めて報告された。6か月以内に発症するのが普通であるが、BMT後62か月も経てから発症する場合もある。糖尿病や高血圧といったリスク因子は虚血性微小血管障害を悪化させることによりBMT網膜症の発現を促すかもしれない。BMT網膜症を発現しやすい年齢、性または人種の存在は不明である。患者は症状として視力低下および/または視界欠損を示す。後区所見は一般に両側性、対称性である。臨床所見は多発性の綿花様白斑、毛細血管拡張、微小動脈瘤、黄斑浮腫、硬性白斑、網膜出血などである。蛍光眼底血管造影検査により、毛細血管非潅流および脱落、網膜内微小血管異常、微小動脈瘤および黄斑浮腫が示される。BMT網膜症の厳密な病因は未解明であるが、シクロスポリンの細胞傷害性、全身放射線照射(TBI)および化学療法薬といった、いくつかの因子が作用している模様である。シクロスポリンは移植片対宿主免疫反応を抑制する強力な免疫調節薬であり、内皮細胞の損傷と神経性副作用を起こす可能性があり、そのためにBMT網膜症の原因とされてきた。しかし、BMT網膜症はシクロスポリンを使用しない場合でも発現しうるし、またシクロスポリンは自家または同系骨髄移植患者にBMT網膜症を発現させないことが示されている。従ってシクロスポリンがBMT網膜症の唯一の原因であるとは思われない。全身放射線照射(TBI)もまたはBMT網膜症の原因とされてきた。放射線は網膜の微小血管系を損傷し、虚血性血管障害を招く。放射線の総照射量や放射線照射と骨髄除去の時間間隔といった変数は重要そうに見える。しかし、BMT網膜症はTBIを受けない患者でも発現しうるし、また同様の線量の照射を受けた固形臓器移植患者では認められない。従って、TBIはBMT網膜症発現の唯一の原因ではなく、もう1つの発現寄与因子である。化学療法薬はBMT網膜症の潜在的な寄与因子とされてきた。シスプラチン、カルムスチン、シクロホスファミドといった治療薬は眼への副作用たとえばうっ血乳頭、視神経炎、視界欠損、皮質盲などを引き起こしかねない。これらの薬物療法薬は患者に放射線誘発性網膜損傷が生じやすくし、また放射線の悪影響を強めるするのかもしれない。一般に、BMT網膜症患者は予後良好である。BMT網膜症は通常、シクロスポリン投与を止めるまたは減らすと2〜4か月以内に症状が解消する。ある報告では、患者の69%が網膜所見の完全解消を経験し、また46%がベースラインの視力を完全に回復した。BMT網膜症は予後が良好なうえに比較的非進行性でもあるため、積極的介入は通常、不要である。
【００５９】
虚血性疾患
虚血は2種類に分けられる。第1は、一般に糖尿病患者で大腿、膝窩および後脛骨動脈に生じる加速化アテローム硬化症に関連する。これらの血管は、しばしば直径が1cmまたは2cmにすぎないため、アテローム斑を形成し、結果的に血流を著しく低下させることがある。大きな血管が完全に閉塞した後では、脳卒中、心筋梗塞、虚血、および治療困難な糖尿病性足部潰瘍が起こりやすくなる。この種の虚血は基本的に大血管障害である。
【００６０】
脳卒中後認知症
25%の人々は脳卒中後に認知症になり、また他の多くの人々も5〜10年後に認知症を発症する。加えて、高次脳機能の微妙な障害を経験していて、続発性の認知症に見舞われるリスクがきわめて高い人も多い。この過程で脳の深部を見舞うごく小さな脳卒中(微小血管障害という)は、脳卒中後認知症に特異的な特有の脳萎縮パターンを生み出す過程に不可欠であるように見える。
【００６１】
眼虚血症候群
眼虚血症候群(OIS)の患者は一般に50歳台〜80歳台の高齢者である。性別では男性が女性の2倍である。患者はごくまれに無症状である。診察時に視力低下を訴える患者は90%にのぼり、40%は付随の眼痛を訴える。一過性虚血発作または一過性黒内症(amaurosis fugax)を付随症状または既往歴とする場合もある。患者はまた診察時に重要な既知または未知の全身性疾患をもつ。最も一般的に見られる全身性疾患は高血圧、糖尿病、虚血性心疾患、脳卒中、末梢血管障害である。それよりはまれながら、巨細胞性動脈炎(GCA)の結果としてOISを来たす患者もいる。
【００６２】
患者の80%で片側性の所見が得られる。一般的な所見は進行性の片側性白内障、前区炎症、無症状の前房反応、黄斑浮腫、非蛇行性網膜静脈の拡張、中間周辺部の点状およびしみ状出血、綿花様白斑、浸出物、乳頭および網膜血管新生などであろう。他に自然動脈拍動、高眼内圧、血管新生緑内障(NVG)を伴う虹彩/隅角血管新生もまたあろう。患者は前区血管新生を示すことがあるとはいえ、毛様体への低動脈潅流に起因する低眼圧が起こることもある。場合によっては、網膜栓塞(Hollenhorst斑)が見られる。
【００６３】
OIS所見は総頸動脈分岐部の内頸動脈アテローム潰瘍形成および狭窄に起因する。内頸動脈狭窄患者の5%はOISを発現する。しかし、OISが発症するのは狭窄度が90%を超える場合に限られる。頸動脈の狭窄は眼への潅流圧を低下させ、結果的に上述の虚血現象を来たす。狭窄がひとたび90%に達すると、網膜中心動脈(CRA)内の潅流圧がわずか50%へと低下する。この動脈圧の低下はしばしば、CRAの自然拍動として現れる。所見は可変的であり、前記のうち任意のまたはすべての所見を含む場合がある。
【００６４】
OIS患者は重要な全身性疾患を持っており、それについては正しい症状の判定が必要である。OIS患者の第1の死因は心臓死であり、その5年死亡率は40%である。こうした理由から、OIS患者は心臓内科医を紹介してもらい、完全な血清検査、EKG、ECG、および頸動脈検査を受ける必要がある。
【００６５】
腎臓の微小血管障害
腎臓は全身および腎微小血管系を侵す多数の個別臨床病理学的疾患に関係する。そうした疾患には内皮細胞の1次的損傷を特徴とするものある。たとえば:
・   溶血性尿毒症症候群(HUS)と血栓性血小板減少性紫斑病(TTP): HUSとTTPは密接に関連し合った疾患であり、微小血管障害性溶血性貧血を、また場合により臓器障害をも、特徴とする。HUSの診断が下されるのは伝統的に、小児の場合が一般にそうであるように、症候群のなかで腎不全が支配的な所見となる場合である。成人では神経障害がしばしば支配的であり、そうした症候群はTTPという。両症候群とも根底にある病変は血栓性微小血管障害であり、HUSまたはTTP患者の臨床および検査所見はかなり重複する。そのため一部の研究者は両症候群を単一疾患単位の連続体とみなすようになった。発症の仕組み: 内皮細胞損傷がHUS/TTP発症の初期事象であることを実験データは強く示唆する。内皮の損傷が限局性血管内凝固、フィブリン沈着、血小板活性化、および凝集などを含む一連の事象の引き金になる。その結末は種々の形のHUS/TTP症候群に共通する血栓性微小血管障害とい組織病理学的所見である。HUS/TTPを治療せずに放置しておくと、死亡率は90%近くになる。HUS/TTP患者の延命改善には支持療法(透析、降圧剤投与、輸血、神経系合併症の管理などを含む)が役立つ。下痢を伴う一般的なHUSの治療では適切な体液バランスと腸管安静が重要である。
・   放射線腎炎: 2500ラドを超える腎放射線照射の長期的な結果は次の5臨床症候群に分けられる:
(i) 患者の40%は6〜13か月の潜伏期を経た後に急性放射線腎炎を発症する。臨床所見は高血圧の突発、タンパク尿、浮腫、および進行性腎不全であり、ほとんどの場合末期腎に至る。
(ii) 一方、慢性放射線腎炎の潜伏期は最初の放射線傷害後18か月〜14年である。発症は潜行性であり、所見は高血圧、タンパク尿、および段階的な腎機能低下である。
(iii) 第3の症候群は放射線被ばくの5〜19年後に、良性タンパク尿+正常腎機能の形で発症する。
(iv) 第4の患者群は2〜5年後に両性高血圧を示すだけであり、場合によりタンパク尿を伴う。慢性放射線腎炎または両性高血圧の患者に放射線照射すると18か月〜11年後に後期悪性高血圧を起こす。侵された腎を切除すると高血圧は収まった。放射線誘発性の腎動脈損傷は腎血管性高血圧を伴うことが報告されている。
(v) 全身放射線照射(TBI)処置を受けた骨髄移植(BMT)患者では急性放射線腎炎に類似する腎不全症候群が観察された。
【００６６】
放射線照射は照射後初期段階で内皮機能障害を引き起こすが血管平滑筋細胞は侵さない。放射線はDNAを直接損傷し、これらの細胞の再生減退や、糸球体毛細血管と尿細管の基底膜剥皮(denudement)を招く。この最初の傷害がやがて糸球体硬化症、尿細管萎縮、および間質性線維症をもたらす仕組みは不明である。内皮細胞層の変性は毛細血管とさらに細かな細動脈の血管内血栓をもたらすとされる。放射線腎炎の所見である進行性腎線維症と高血圧は、この腎内血管障害から説明がつこう。放射線照射マウス腎の最近の研究で腎皮質内の白血球の線量依存的な増加が示されたが、それは放射線腎炎における炎症過程のある種の役割を示唆する。
【００６７】
他の腎疾患では、腎微小血管系が全身性硬化症(強皮症)などの自己免疫疾患に関与する。全身性硬化症への腎臓の関与は緩徐進行性慢性腎疾患として、または悪性高血圧と急性高窒素血症を特徴とする強皮症腎クリーゼ(SRC)として、現れる。SRCは腎臓におけるレイノー様現象に起因するとされる。重度の血管痙攣は皮質虚血とレニンおよびアンジオテンシンIIの産生増進を招き、以って腎血管収縮を固定化する。レイノー様動脈血管痙攣の引き金になりうるのはホルモンの変化(妊娠)、身体的精神的ストレス、または寒い気温である。腎虚血の固定化に果たすレニン-アンジオテンシン系の役割は、SRC治療におけるACE阻害薬の著しい効果によって明示される。抗高血圧治療にもかかわらず重度の腎不全へと進行したSRCの患者では、透析が不可欠となる。腹膜透析と血液透析の両方が採用されてきた。1983〜1985年に透析を受けた全身性硬化症誘発性ESRDの患者311人に関するEnd-Stage Renal Disease (ERSD) Networkレポートによれば、3年生存率は33%である。
【００６８】
腎微小循環は鎌状赤血球病でも障害を来たすことがある。腎臓は特にこの病気の影響を受けやすい。それは、直細血管による向流酸素移動の結果として腎髄質の深層血管内で実現される低酸素分圧のためである。さらに細かい腎動脈および細動脈もまた、もっと太い血管の壁から遊離した含コレステロール物質に由来する血管塞栓性損傷を受ける部位となりかねない。
【００６９】
腎微小血管系の一時的または恒久的閉塞を引き起こす種々の疾患は、一まとめで捉えると、一様に糸球体潅流を妨げ、従って糸球体ろ過速度を低下させ、以って全身性の止血に対する重大な脅威となる。
【００７０】
急性腎不全(ARF)
AFRは微小血管性または大血管性疾患(主要腎動脈閉塞または重症腹部大動脈疾患)に起因する場合もある。古典的な微小血管障害はしばしば微小血管障害性溶血と、しばしば血小板減少症を伴う糸球体毛細血管血栓症または閉塞に起因する急性腎不全とを併発する。これらの疾患の代表例は次のとおりである:
a) 血栓性血小板減少性紫斑病:発熱、神経障害、腎不全、微小血管障害性溶血性貧血、血小板減少症が古典的な5大徴候である。
b) 溶血性尿毒症症候群: 血栓性血小板減少性紫斑病に似るが、神経障害を伴わない。
c) HELLP(溶血、肝酵素上昇、血小板減少)症候群: 妊婦を見舞う一種の溶血性貧血症候群であり、アミノ基転移酵素の上昇を伴う。
【００７１】
急性腎不全はあらゆる医療現場に見られるが、病院で起こることが多い。この病態は入院患者の5%で発現し、入院患者の約0.5%が透析を必要とする。過去40年間、急性腎不全の生存率は向上していないが、その主因は患者が高齢化し、併存疾患が増えている点にある。急性腎不全患者の死因の75%は感染症であり、その次に多いのは心肺系合併症である。死亡率は腎不全の重症度にもよるが、7%〜80%程度である。急性腎不全は腎前性ACR、腎性ACR、腎後性ACRの3つに分類される。腎性ACRは尿細管性疾患、糸球体性疾患、血管性疾患(微小血管性疾患を含む)、間質性疾患の4つに分類される。
【００７２】
進行性腎疾患
進行性腎疾患は微小血管系の段階的消失を特徴とするとの証拠が出ている。微小血管系の消失は糸球体性および尿細管間質性瘢痕の形成と直接関連する。その機序は内皮増殖応答の低下により部分的に媒介され、またこの毛細血管修復障害は腎内での血管新生因子(血管内皮増殖因子)と抗血管新生因子(トロンボスポンジン1)の両方の局所発現の変化によって媒介される。血管新生的な増殖因子のバランスの変化はマクロファージ関連サイトカイン(インターロイキン-1β)と血管作用物質の両方によって媒介される。最後に、血管新生および/または毛細血管修復の刺激は腎機能を安定化して進行を遅らせる可能性があること、またそうした効果はBPまたはタンパク尿に対する作用とは独立に起こることを示す興味深い証拠も出ている。
【００７３】
詳しくはBremer & Rector’s The Kidney, 7th ed., Copyright (c) 2004 Elsevier: Chapter 33 - Microvascular diseases of the Kidney (微小血管性腎疾患)およびTiwari and Vikrant, Journal of Indian Academy of Clinical Medicine Vol.5, No.1 Review Article - Sepsis and the Kidney(総論: 敗血症と腎臓)を参照。
要するに、COPD、黄斑変性症および微小血管障害の予防治療のための今日の治療方法は不満足なものであり、従ってこの目的のための新規な化合物の開発が必要である。本願発明の新規化合物はここで開示した諸々の疾患と適応症だけでなく、ここで開示した他の疾患や病態たとえばMIにも、使用してよい。
【００７４】
RTP801
遺伝子RTP801は本願譲受人により初めて報告された。いずれも本願譲受人が譲り受けた米国特許第6455674号、第6555667号および第6740738号の各明細書は、RTP801ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、それに該ポリペプチドに対する抗体そのものを開示し、特許請求している。RTP801は、VEGFなどのような増殖因子とは独立に低酸素誘導性の血管新生を調節する低酸素誘導因子-1(HIF-1)のユニークな遺伝子標的である。
本願発明者はすでに、種々の呼吸器障害の改善を目的とした遺伝子RTP801の阻害という新規な考え方につながる種々の発見をしている。
【００７５】
以下の特許出願書類および刊行物は種々の背景情報を提供してくれる
WO 2001070979は卵巣がん細胞内で過剰発現する核酸マーカーに関する。
US 6673549はステロイド処理に反応して差次的に発現するcDNAを含む複合物を開示する。
US application 2003165864はDNA脱メチル化剤で処理した細胞内で差次的に発現するcDNAに関する。
US application 2003108871は処理済みヒトC3A肝細胞培養液中で差次的に発現する数種のcDNAを含む、肝疾患の治療に有用とされる組成物に関する。
US application 2002119463は、前立腺がんの治療と診断に有用な新しい組成物であって、前立腺がん中で差次的に発現するをヒトcDNAを含む新しい組成物を開示する。
WO2004018999は子宮頸がんを評価、解析、監視、予防および治療する方法を開示する。
【００７６】
EP 1394274は、被検者由来の生物試料中のマーカー遺伝子発現レベルを健常被検者に由来する試料中の該遺伝子の発現レベルと比較することにより気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患を検査する方法に関する。
WO 200201075は、ヒト子宮頸がんの検出、解析、予防および治療に有用な単離核酸分子に関する。
WO 200301025は、創傷、網膜症、虚血、炎症、微小血管障害、骨折および皮膚炎症の治療を目的とした血管新生の阻害に関する。
WO 2002046465は低酸素調節性病態の治療を目的とした、疾患に関与する遺伝子の特定に関する。
WO 2002031111は新規とされるポリペプチド類とそれらがコード化されたタンパク質、それにそれらの多数の使用方法に関する。
WO 2001012659は組み換えDNA手法に有用な核酸に関する。
WO 2001077289は種々のヒト組織に由来する623種のポリヌクレオチドを開示する。
WO 2003101283は、呼吸器障害において差次的に発現するとされる多数のcDNAおよびタンパク質を含む組成物に関する。
JP 2003101283は多数の肝線維症疾患マーカーに関する。
【００７７】
Tzipora Shoshani, et al. Identification of a Novel Hypoxia-Inducible Factor-1-Responsive Gene, RTP801, Involved in Apoptosis(アポトーシスに関与する新規の低酸素誘導因子-1反応性遺伝子RTP801の同定). MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, Apr. 2002, pp.2283-2293; この論文は本願発明者も共同執筆しているが、RTP801遺伝子(当時の新規なHIF-1依存遺伝子)の発見について詳述している。
【００７８】
Leif W. Ellisen, et al. REDD1, a Developmentally Regulated Transcriptional Target of p63 and p53, Links p63 to Regulation of Reactive Oxygen Species(発生段階的に制御されるp63およびp53転写標的であるREDD1はp63を活性酸素種の調節へとリンクする). Molecular Cell, Vol. 10, 995-1005, November, 2002; この論文はRTP801(論文での呼称はREDD1)の過剰発現が活性酸素種の生成増の原因となることを示している。
【００７９】
Richard DR, Berra E, and Pouyssegur J. Non-hypoxic pathway mediates the induction of hypoxia-inducible factor 1 alpha in vascular smooth muscle cells(血管平滑筋細胞内で低酸素誘導因子1アルファの誘導を媒介する非低酸素経路). J Biol Chem. 2000, Sep 1; 275(35): 26765-71; この論文はHIF-1依存性の転写が活性酸素種の過剰生成によって誘導されることを示している。
【００８０】
Rangasamy T, et al. Genetic ablation of Nrf2 enhances susceptibility to cigarette smoke-induced emphysema in mice(マウスはNfr2遺伝子の欠失によりタバコ煙誘発気腫を発症しやすくなる). Submitted to Journal of Clinical Investigation. この論文は(論文中でNrf2と呼んでいるRTP801の生殖系列不活性化により)抗酸化防御機能を低下させたマウスに関する。
【発明の開示】
【００８１】
発明の要約
本発明は微小血管障害、黄斑変性症、呼吸器障害、および脊髄損傷または疾患を治療するための新規な方法および組成物を提供する。
一実施形態では、RTP801を阻害し、従って種々の疾患および適応症の治療に使用することができる新規な分子が提供される。
【００８２】
別の実施形態では、本発明は微小血管障害、黄斑変性症または呼吸器障害の患者を治療する方法であって、RTP801阻害剤を含む医薬組成物を該患者に投与するステップを含む方法を提供する。
本発明の別の実施形態は、COPD患者を治療する方法であって、治療有効量のRTP801阻害剤を含む医薬組成物を該患者に投与するステップを含む方法に関する。一実施形態では、該阻害剤はsiRNA分子、アンチセンス分子、抗体(中和抗体など)、優性阻害ペプチドまたはリボザイムである。
【００８３】
本発明の別の実施形態は、黄斑変性症患者を治療する方法であって、治療有効量のRTP801阻害剤を含む医薬組成物を該患者に投与するステップを含む方法に関する。一実施形態では、該阻害剤はsiRNA分子、アンチセンス分子、抗体(中和抗体など)、優性阻害ペプチドまたはリボザイムである。
【００８４】
本発明の別の実施形態は、微小血管障害の患者を治療する方法であって、治療有効量のRTP801阻害剤を含む医薬組成物を該患者に投与するステップを含む方法に関する。一実施形態では、該阻害剤はsiRNA分子、アンチセンス分子、抗体(中和抗体など)、優性阻害ペプチド、またはリボザイムである。
本発明の追加的な実施形態は、治療有効量のRTP801阻害剤の、呼吸器障害患者の回復を促進する薬剤の調製への使用を提供する。一実施形態では、該呼吸器障害はCOPDであり、該阻害剤は好ましくはsiRNAである。
【００８５】
本発明の追加的な実施形態は、治療有効量のRTP801阻害剤の、黄斑変性症患者の回復を促進する薬剤の調製への使用を提供する。一実施形態では、該黄斑変性症はAMDであり、該阻害剤は好ましくはsiRNAである。
【００８６】
本発明の追加的な実施形態は、治療有効量のRTP801阻害剤の、微小血管障害患者の回復を促進する薬剤の調製への使用を提供する。一実施形態では、該微小血管障害は糖尿病網膜症であり、該阻害剤は好ましくはsiRNAである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８７】
発明の詳細な説明
本発明は、一部の実施形態では、眼疾患、呼吸器障害および微小血管障害などの治療のための、RTP801遺伝子またはポリペプチドの阻害に関する。追って説明するように、本発明で使用する好ましい阻害剤は生体分子である。
【００８８】
本願発明者は理論にとらわれることなく、RTP801が微小血管障害、眼疾患、呼吸器障害および脊髄損傷め疾患を含む種々の病態に関与しており、したがってそうした疾患または障害を治療するためにはRTP801を阻害するのが有効であることを見出した。RTP801を阻害する方法、分子および組成物についてはここで詳しく論じるが、そうした分子および/または組成物はどれも前記いずれの患者の治療に用いても有効であろう。
【００８９】
本発明はRTP801遺伝子の発現をin vivoで阻害するための方法と組成物を提供する。該方法は一般に、特定のmRNAへと誘導されそのmRNAとハイブリダイズする低分子干渉RNA(すなわちsiRNA)などのようなオリゴリボヌクレオチドまたは細胞内でsiRNAを生成しうるような核酸物質を、標的遺伝子の発現をRNA干渉機構によって抑制するに足る量投与するステップを含む。特に、本方法は呼吸器障害、微小血管障害または眼疾患の治療のためのRTP801遺伝子発現の阻害に使用することができる。
【００９０】
従って一実施形態では、本発明は微小血管障害、眼疾患または呼吸器障害の患者を治療する方法であって、該患者を治療するために治療有効量のRTP801阻害剤を含む医薬組成物を該患者に投与するステップを含む方法を提供する。本発明はさらに、微小血管障害、眼疾患または呼吸器障害の患者を治療する方法であって、RTP801阻害剤を含む医薬組成物を、回復を促進するに足る用量および期間、該患者に投与するステップを含む方法を提供する。眼疾患は特に加齢黄斑変性症(AMD)などのような黄斑変性症でもよい。微小血管障害は特に糖尿病網膜症または急性腎不全でもよい。呼吸器障害は特に慢性閉塞性肺疾患(COPD)、肺気腫、慢性気管支炎、喘息、肺がんなどでもよい。RTP801阻害剤は多種多様な分子から選択してもよいが、そうした分子の非限定的な例は次のとおり: ポリヌクレオチド、AS断片、RTP801遺伝子mRNAを標的とするRNA分子たとえばリボザイムまたはsiRNA(たとえばTable A〜CのsiRNA、特にTable AのsiRNA番号14、22、23、25、27、39、41、42、49および50)またはそれらを含む発現ベクターなどのような化合物; 優性阻害体、抗体(図2に示す配列(配列番号2)の連続アミノ酸を含むポリペプチド内のエピトープと特異的に結合する抗体など)または場合により酵素などのようなポリペプチド。加えて、RTP801阻害剤は低分子などのような化学阻害剤たとえば低分子量(たとえば2000Da未満)の化学分子でもよい。RTP801阻害剤の具体例は追って示す。
【００９１】
本発明はさらに、黄斑変性症、COPDまたは糖尿病網膜症の患者を治療する方法であって、該患者を治療するために、RTP801遺伝子から転写されたmRNAと特異的にハイブリダイズするおよび/またはRTP801遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドを含むRTP801阻害剤を治療有効量含む医薬組成物を患者に投与するステップを含む方法を提供する。該ポリヌクレオチドは、Table A〜Cに示す配列(配列番号3〜344)のいずれか1つと同じ配列を有する連続ヌクレオチドを含むsiRNA、特にTable AのsiRNA番号14、22、23、25、27、39、41、42、49および50でもよい。
【００９２】
さらに、本発明の追加の実施形態は、微小血管障害、呼吸器障害または眼疾患の患者を治療する方法であって、siRNA分子(随意にTable A〜Cのいずれか1つに詳しく記したsiRNA分子)を含むRTP801阻害剤を治療有効量含む医薬組成物を、該患者を治療するための用量および期間、該患者に投与するステップを含む方法を提供する。
【００９３】
微小血管障害、呼吸器障害または眼疾患の患者を治療する方法であって、RTP801遺伝子mRNAを標的とするRNA分子を治療有効量含む医薬組成物を、該患者を治療するための用量および期間、該患者に投与するステップを含む方法が提供される。該RNA分子はsiRNA分子たとえばTable A〜Cに詳しく記したsiRNA分子特にTable AのsiRNA番号14、22、23、25、27、39、41、42、49および50、またはリボザイムでもよい。
【００９４】
本発明はさらに、呼吸器障害、微小血管障害または眼疾患もしくは本明細書で開示する任意の病態の患者を治療する方法であって、RTP801遺伝子mRNAを標的とするsiRNA分子随意にTable A〜Cに詳しく記したsiRNA分子を治療有効量含む医薬組成物を、該患者を治療するための用量および期間、該患者に投与するステップを含む方法を提供する。さらに、眼疾患は加齢黄斑変性症(AMD)などのような黄斑変性症でもよい; 微小血管障害は糖尿病網膜症または急性腎不全でもよい; 呼吸器障害は特に慢性閉塞性肺疾患(COPD)でもよいし、またCOPDの治療対象面は肺気腫、慢性気管支炎、またはそれらの両方を非限定的に含んでもよい。
【００９５】
「疾患を治療する」は、疾患に関連する症状を軽減する、疾患の重症度を緩和するまたは疾患を治癒する、または疾患の発症を予防するなどの点で有効な治療剤を投与することをいう。
「治療有効量」は、生存率向上、回復促進、または症状の緩和または解消、および当業者が適切な判定基準として選ぶような他の指標を非限定的に含む改善を患者または患者の生理系に実現するうえで有効な医薬化合物または組成物の量をいう。
【００９６】
開示のかつ本発明に包含される疾患治療方法は、RTP801阻害剤を、追加のRTP801阻害剤、追って詳述するような有効成分の薬理特性を改善する物質、または治療対象疾患たとえば特に黄斑変性症、COPD、ARF、DRなどの治療に有効であると判明している追加の化合物と併せて投与するステップを含んでもよい。「と併せて」は「の前に」「の後に」または「と同時に」を意味する。例示的な併合療法については追って詳述する。
【００９７】
別の実施形態では、本発明は黄斑変性症、COPD、ARF、DR、または先に詳述した他の眼疾患、微小血管または呼吸器系病態のいずれかの患者の回復を促進する薬剤の調製への治療有効量のRTP801阻害剤の使用、および該疾患・病態の治療用薬剤の調製への治療有効量のRTP801阻害剤の使用を提供する。この実施形態では、RTP801阻害剤は図1に示す配列(配列番号1)に対するアンチセンス配列を含む配列を有する連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含んでもよい。該使用に従うRTP801阻害剤はまた、図2に示す配列(配列番号2)の連続アミノ酸を含むポリペプチド内のエピトープと特異的に結合する中和抗体などのような抗体でもよい。加えて、該RTP801阻害剤はRTP801遺伝子mRNAを標的とするRNA分子、随意にsiRNA、随意にTable A〜Cに示す配列(配列番号3〜344)のいずれか1つと同じ配列を有する連続ヌクレオチドを含むsiRNA、特にTable AのsiRNA番号14、22、23、25、27、39、41、42、49および50、またはリボザイムでもよい。
【００９８】
従って、本願開示の情報によれば、開示の任意の用途および開示の任意の医薬組成物に開示の方法で使用するRTP801阻害剤は、siRNA分子、siRNA分子を含むベクター、siRNA分子を発現しうるベクター、およびsiRNA分子へと内在的にプロセッシングされる任意の分子からなる群より選択してもよい。追って詳述するように、該siRNA分子は好ましくは、Table A〜Cに示す配列(配列番号3〜344)のいずれか1つと同じ配列を有する連続ヌクレオチドを含むsiRNA、特にTable AのsiRNA番号14、22、23、25、27、39、41、42、49および50である。
【００９９】
「呼吸器障害」は、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、肺気腫、慢性気管支炎、喘息、肺がんなど各種肺疾患を非限定的に含む呼吸器系の病態、疾患または症候群をいう。肺気腫と慢性気管支炎はCOPDの一症状でも、独立した症状でもよい。
【０１００】
「微小血管障害」は微細な毛細血管とリンパ管に影響を及ぼす任意の病態、特に血管攣縮性疾患、脈管炎およびリンパ管閉塞症をいう。微小血管障害の例は次のとおりである: 眼疾患たとえば一過性黒内障(AF)(塞栓性またはSLE続発性)、抗リン脂質抗体症候群(apla syndrome)、Prot CSおよびATIII欠乏症、IV(静注)薬使用に起因する微小血管病変、タンパク異常血症、側頭動脈炎、前部虚血性視神経症、(原発性または自己免疫疾患に続発性の)視神経炎、緑内障、von Hippel-Lindau症候群、角膜疾患、角膜移植拒絶反応性の白内障、Eales病、凍瘡分枝血管炎、輪状締結術、扁平部炎を含むブドウ膜炎、脈絡膜悪性黒色腫、脈絡膜血管腫、視神経形成不全; 網膜疾患たとえば網膜動脈閉塞症、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、HIV網膜症、全身性血管炎および自己免疫疾患の網膜症、糖尿病網膜症、高血圧網膜症、放射線網膜症、網膜動脈分枝または静脈分枝閉塞症、突発性網膜血管炎、動脈瘤、網膜神経炎、網膜動脈塞栓、Birdshot網脈絡膜症、長期網膜剥離; 全身性病態たとえば糖尿病、糖尿病網膜症(DR)、糖尿病関連の微小血管病変(追って詳述)、過粘稠度症候群、頸動脈海面静脈洞ろう、多発性硬化症、SLE(全身性エリスマトーデス)、SS-A自己抗体のある細動脈炎、急性多巣性出血性血管炎、感染症に伴う血管炎、ベーチェット病に伴う血管炎、サルコイドーシス、凝結障害、神経障害、腎症、腎微小血管障害、微小血管虚血。
【０１０１】
微小血管障害は血管新生要素を含んでもよい。用語「血管新生障害」は、血管の形成(血管新生)が患者に有害であるような状態をいう。眼血管新生の例は網膜疾患(糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、慢性緑内障、網膜剥離、鎌状赤血球網膜症); 虹彩ルベオーシス; 増殖性硝子体網膜症; 炎症性疾患; 慢性ブドウ膜炎; 新生物(網膜芽細胞腫、偽網膜膠腫、黒色腫); フックスの異色性毛様体炎; 血管新生緑内障; 角膜血管新生(炎症性、移植、発生過程での虹彩形成不全); 複合的な硝子体切除+晶子体切除後の血管新生; 血管疾患(網膜虚血、脈絡膜血管障害、脈絡膜血栓症および頸動脈虚血); 視神経血管新生; および眼球穿孔または眼球挫傷に起因する血管新生。これらの血管新生病態はどれも本発明の化合物および医薬組成物を使用して治療してもよい。
【０１０２】
「眼疾患」は眼の病態、疾患または症候群をいい、脈絡膜血管新生(CNV)、湿潤型および乾燥型AMD、眼ヒストプラスマ症候群、血管線条、ブルッフ膜破裂、近視性変性症、眼腫瘍、網膜変性疾患、網膜静脈閉塞(RVO)などに絡む任意の病態を非限定的に含む。ここで開示するある種の病態たとえばDRは本発明の方法によって治療してもよいが、ここで開示する定義によれば、微小血管障害か眼疾患か、またはその両方とみなされる。
【０１０３】
「RTP801遺伝子」は図1に示すRTP801コード配列オープンリーディングフレーム(配列番号1)を、または配列同一性が好ましくは少なくとも70%、より好ましくは80%、さらになお好ましくは90%または95%であるその相同配列を、いう。これは本願で開示する突然変異、変化、または修飾をこうむった、配列番号1に由来する任意の配列を包摂する。従って好ましい実施形態では、RTP801は配列番号1による核酸配列によってコードされる。本発明による核酸はRTP801をコードする核酸の一部分に対してだけ相補性または同一性を有するが、第1ストレッチ(stretch)および第1ストランドは好ましくは一般に本発明による核酸よりも短いので、それもまた本発明の範囲内であるものとする。また、当業者には自明であるが、RTP801のアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列が遺伝暗号から割り出せる。しかし、本発明による核酸の、想定される作用形態のために、RTP801をコードする核酸、好ましくはそのmRNAは、RTP801の発現が抑制されることになる生物、組織および/または細胞内に存在するものであるのが最も好ましい。
【０１０４】
「RTP801ポリペプチド」はRTP801遺伝子のポリペプチドをいい、また本発明では任意の生物、随意にヒトに由来する「RTP779」「REDD1」「Ddit4」「FLJ20500」「Dig2」および「PRF1」を、また生理活性を保持するスプライス変異体およびその断片、および配列同一性が好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらになお好ましくは少なくとも90%または95%であるその相同体を含むものとする。この用語はさらに、RTP801コード配列の小さな変化たとえば点突然変異、置換、欠失または挿入など、得られるポリペプチドと天然RTP801の間に少数のアミノ酸の違いをもたらすようなRTP801コード配列の変化に由来するポリペプチドを包含するものとする。この用語には、技術上周知の(たとえばAusubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1988), updated in 1995 and 1998)高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でRTP801コード配列またはゲノム配列に結合する核酸配列によってコードされるポリペプチドもまた包含される。化学修飾RTP801または化学修飾RTP801断片もまた、生理活性が維持される限りで、この用語に包含される。RTP801は好ましくは配列番号2に従うアミノ酸配列を有するまたは含む。当然ながら該アミノ酸配列には、本発明による核酸が本発明の種々の実施形態において適用されることになる一生物の種々の組織間で、同種生物の異なる個体間で、また異種生物間で、違いが存在する場合もある。しかし、本発明による任意の核酸の設計に際しては本願で提供する技術的教示に基づき各配列を適宜考慮することができる。特定RTP801断片は図2に示す配列のうちのアミノ酸1〜50、50〜100、101〜150、151〜200、および201〜232を含む。さらなる特定RTP801断片は図2に示す配列のうちのアミノ酸25〜74、75〜124、125〜174、175〜224、および225〜232を含む。RTP801は本願ではとりわけ国際公開第WO 99/09046号パンフレットで開示されているタンパク質である。RTP801はRTP801とも呼ばれるが、Shoshani T et al. (Shoshani et al. 2002, Mol Cell Biol, 22, 2283-93)はHIF-1αの転写標的と説明している。さらに、Ellisen et al. (Ellisen et al. Mol Cell, 10, 995-1005)はRTP801をp53依存性DNA損傷応答遺伝子として、また上皮分化に関与するp63依存性遺伝子として、特定している。またRTP801は組織特異的なパターンがp53ファミリーメンバーのp63とそっくりであり、TP63と同様に、またはTP63に加えて、効果があり、in vitro分化の阻害剤であり、また活性酸素種の調節に関与する。それとは別に、RTP801は低酸素応答性転写因子である低酸素誘導因子1(HIF-1)に対して反応性であり、また一般に、虚血性脳卒中の動物モデルではin vitro、in vivoのいずれでも低酸素症のときに抑制される。RTP801は活性酸素種(ROS)の調節に関与している模様であり、またROSレベルと低下した酸化ストレス感受性とはどちらもRTP801の異所性発現の後に上昇する(前掲Ellisem et al. 2002; 前掲Soshani et al. 2002)。RTP801は好ましくは、生理活性RTP801タンパク質であり、好ましくはこうした特質のうちの少なくとも1つを、好ましくは2つ以上を、そして最も好ましくはこれらの特質をことごとく示す。
【０１０５】
RTP801の関連遺伝子はRT801Lであり、REDD2とも呼ばれるが、これを発見したのは本願発明者である。RTP801LはRTP801の相同体であり、酸化ストレスに対して同じように反応する。従って、RTP801LはおそらくRTP801と類似機能をいくつか有するであろう。
理論にとらわれはしないが、(低酸素症、酸化ストレス、熱ストレスまたはERストレスに応答する)ストレス誘導性タンパク質であるRTP801はエネルギー不均衡に対する細胞反応の微調整に関わる因子である。そのため次のような場合には任意の疾患の治療のための恰好の標的となる: すなわちストレス条件(たとえば正常細胞の死を伴う疾患)に起因するアポトーシスから細胞を救済する必要がある場合、またはRTP801発現の変化に起因するストレス条件に適合した細胞(たとえばがん細胞)を死滅させる必要がある場合である。後者の場合には、RTP801はがん細胞にとっての生存因子とみなされ、その阻害剤が単剤療法として、または化学療法または放射線療法と併用する感作剤として、がんを治療することになる。
【０１０６】
用語「ポリヌクレオチド」はDNAヌクレオチド、RNAヌクレオチドまたは両者の混合からなる任意の分子であり、複数の塩基特にグアニジン、シトシン、チミジン、アデニン、ウラシルまたはイノシンを含む。ポリヌクレオチドは天然ヌクレオチド、化学修飾ヌクレオチドおよび合成ヌクレオチド、またはそれの類似体を含んでもよい。この用語は「オリゴヌクレオチド」を包含し、また「核酸」を包摂する。
【０１０７】
用語「アミノ酸」は20種の天然アミノ酸、アミノ酸化学修飾体(以下を参照)、または合成アミノ酸のうちいずれか1つからなる分子をいう。
用語「ポリペプチド」は複数のアミノ酸残基からなる分子をいい、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ペプチドミメティクスを包含する。
「ペプチドミメティクス」は天然親ペプチドの生理活性を模倣することができる非ペプチド性構造要素を有する化合物である。ペプチドミメティクスには、古典的なペプチドの性質のいくつか、たとえば酵素的に切断可能なペプチド結合といった性質は存在しないのが普通である。
【０１０８】
用語「優性阻害(dominant negative)ペプチド」は、あるタンパク質の一部分をコードするcDNA断片によってコードされるポリペプチドを意味する[Herskowitz I.: Functional inactivation of genes by dominant negative mutations(優性阻害突然変異による遺伝子機能の不活性化). Nature. 1987 Sep 17-23;329(6136):219-22を参照。概説にRoninson IB et al. Genetic suppressor elements: new tools for molecular oncology(遺伝抑制因子: 分子腫瘍学の新ツール) - thirteenth Cornelius P. Rhoads Memorial Award Lecture. Cancer Res. 1995 Sep 15;55(18): 4023がある]。このペプチドは元のタンパク質とは異なる機能をもつことができる。たとえば元の全長タンパク質と相互作用してその活性を阻害することが、または元の全長(親)タンパク質との応答の中で他タンパク質と相互作用しその活性を阻害することが、可能である。優性阻害は、該ペプチドが天然親タンパク質を圧倒してその活性を阻害し、以って細胞に新しい特質たとえば細胞死への抵抗性または感受性、あるいは任意の関心表現型を付与することができることを意味する。治療的介入では、該ペプチドそれ自体を医薬組成物の有効成分として送達してもよいし、周知の方法によりcDNAを細胞に送達してもよい。
【０１０９】
ペプチドおよびポリペプチドの調製
ポリペプチドはいくつかの方法で生産することができる:
1)合成法:
市販の装置を使用して、既知のRTP801配列またはその一部分から合成ポリペプチドをつくることができる。
2)遺伝子組み換え法:
RTP801ポリペプチドまたはその断片をつくる方法として好ましいのは、RTP801遺伝子のcDNAを含むポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングし、該ベクターを入れた細胞を培養し、以ってコード化されたポリペプチドを発現させ、得られたポリペプチドを精製するというものであるが、これらのステップはいずれも、Marshak et al. “Strategies for Protein Purification and Characterization. A laboratory course manual(タンパク質精製解析法: 実習コースマニュアル).” CSHL Press (1996) などに記載されているような技術上周知の方法で行われる[さらに、Bibl haematol. 1965;23:1167-74; Appl Microbiol. 1967 Jul;15(4):851-6; Can J Biochem. 1968 May;46(5)441-4; Biochemistry. 1968 Jul;7 (7):2574-80; Arch Biochem Biophys. 1968 Sep 10;126(3) :746-72; Biochem Biophys Res Commun. 1970 Feb 20;38(4): 825-30なども参照]。
【０１１０】
発現ベクターは異種遺伝物質の転写を調節するプロモーターを含んでもよいし、またプロモーターは選択的転写を可能にする構成的、誘導的いずれのプロモーターでもよい。必要な転写レベルの達成に必要とされる可能性のあるエンハンサーを随意に含めてもよい。発現ベクターにはまた、選択遺伝子を含めてもよい。
細胞または組織へのベクターの導入には技術上周知の多様な方法のうちいずれかを用いることができる。そうした方法の概説は次の資料に求めることができる: Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989, 1992); Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Vega et al. Gene Targeting, CRS Press, Ann Arbor, MI(1995); Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworth, Boston MA(1988); Gilboa et al. (1996)。
【０１１１】
3)天然源からの精製:
RTP801ポリペプチドまたはその断片は天然源(組織など)から、抗RTP801抗体による免疫沈降またはRTP801に結合することが判明している任意の分子によるマトリックス結合アフィニティークロマトグラフィーなど技術上周知の様々な方法を使用して精製することができる。タンパク質の精製はMarshak et al. “Strategies for Protein Purification and Characterization. A laboratory course manual(タンパク質精製解析法: 実習コースマニュアル).” CSHL Press (1996) などに記載されているような技術上周知の要領で行う。
【０１１２】
「RTP801の生理作用」または「RTP801生理活性」は呼吸器障害におけるRTP801の直接または間接作用を意味し、理論に縛られることなく、低酸素または過酸素状態によって誘導される肺胞細胞アポトーシスへのRTP801の作用を含む。直接作用の非限定的な例は、アポトーシスをもたらすシグナル伝達カスケードに関与するいくつかの分子のうちの1つにに対するRTP801の結合または作用である。
【０１１３】
「アポトーシス」はある種の細胞機構の活性化に由来する生理的なタイプの細胞死、すなわち細胞機構により制御される細胞死をいう。アポトーシスを招く細胞機構の活性化はたとえば外部的な誘因たとえば細胞死を招くようなサイトカインまたは抗FAS抗体によるものでも、内部シグナルによるものでもよい。用語「プログラム細胞死」もアポトーシスと同じ意味で使用される。
【０１１４】
「アポトーシス関連疾患」は、その病因がアポトーシス過程に全面的または部分的に関連している疾患をいう。該疾患はアポトーシス過程の異常に起因しても(がんや自己免疫疾患の場合)、アポトーシス過程の過活性に起因しても(ある種の神経変性疾患の場合)よい。RTP801が関与する疾患はアポトーシス関連疾患であることも多い。たとえば視細胞および色素上皮細胞の緩慢な萎縮が主に網膜中心(黄斑)領域で起こる乾燥型AMDでは、アポトーシスが重要な機序である。神経網膜アポトーシスは糖尿病網膜症の重要な機序でもある。
【０１１５】
「阻害剤」はある遺伝子またはその遺伝子産物の活性を、初期の生物生理作用を実現するところまで、阻害しうる化合物である。「RTP801阻害剤」はRTP801遺伝子またはその遺伝子産物の、特にヒトRTP801遺伝子またはその遺伝子産物の活性を阻害しうる化合物である。そうした阻害剤の例は遺伝子の転写または翻訳に影響を及ぼす物質や遺伝子産物の活性に影響を及ぼす物質などである。RTP801阻害剤はまた、RTP801プロモーター阻害剤でもよい。そうした阻害剤の例はポリヌクレオチドたとえばAS断片、siRNAまたはそれらを含むベクター; ポリペプチドたとえば優性阻害体、抗体および酵素; 触媒型RNAたとえばリボザイム; 低分子量(たとえば分子量2000Da未満の)の化学分子などである。
【０１１６】
「発現ベクター」は異種DNA断片を組み込み異種細胞内で発現させることのできるベクターである。多数の原核生物および真核生物発現ベクターが公知であり、また市販されてもいる。適切な発現ベクターの選択は当業者に自明である。
【０１１７】
用語「抗体」は特にIgG、IgM、IgD、IgAおよびIgE抗体をいう。その定義にはポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が含まれる。この用語は全抗体または抗原結合ドメインを含むその断片、たとえばFc部分を欠く抗体、一本鎖抗体、ミニ抗体、基本的に可変部だけを含む断片、抗体の抗原結合ドメインなどをいう。用語「抗体」はまた、cDNAワクチン接種によって生成されるポリヌクレオチド配列に対する抗体をもいう。この用語はまた、次に例示するような、抗原または受容体に選択的に結合する能力を維持している抗体断片を包含する:
(1) Fab。全抗体を酵素パパインで消化して軽鎖と重鎖の一部分とに分解することにより得られる抗体分子の1価抗原結合断片を含む断片;
(2) (Fab')2。全抗体を酵素ペプシンで消化することにより、その後の還元を経ずに得られる抗体断片。F(ab’2)は2つのFab断片を2つのジスルフィド結合で結びつけた2量体である。
(3) Fv。2本鎖として発現する軽鎖可変部と重鎖可変部とを含む遺伝子組み換え断片; および
(4) 一本鎖抗体(SCA)。好適なポリペプチドリンカーにより遺伝子組み換え1本鎖分子として連結された軽鎖可変部と重鎖可変部とを含む遺伝子組み換え分子。
用語「エピトープ」は本願では、抗体の結合先となる抗原上の抗原決定基を意味する。エピトープは通常、化学活性表面の分子群たとえばアミノ酸または糖鎖からなり、また特異的な3次元構造特性や特異的な電荷特性を有する。
【０１１８】
抗RTP801抗体の調製
RTP801またはその断片に結合する抗体は、より小さなポリペプチドを免疫抗原として含むインタクトのポリペプチドまたはその断片を使用して調製してもよい。たとえばRTP801のN-またはC-末端または他の好適なドメインに特異的に結合する抗体を生成させるのが望ましいであろう。動物の免疫に使用するポリペプチドはcDNA翻訳または化学合成から作製し、必要なら担体タンパク質に結合させてもよい。該ポリペプチドに化学的に結合されるそうした常用担体の例はキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、サイログロブリン、ウシ血清アルブミン(BSA)、破傷風トキソイドなどである。動物の免疫には結合後のポリペプチドを使用する。
【０１１９】
必要なら、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、たとえば該抗体を形成させる元になった該ポリペプチドまたはペプチドを結合させたマトリックスに結合させ、溶出することにより、さらに精製することができる。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の精製および/または濃縮のための種々の一般的な免疫学的手法は当業者には自明である(Coligan et al. Unit 9, Current Protocol in Immunology, Wiley Interscience, 1994)。
【０１２０】
各種の抗体およびその断片を調製する方法は技術上周知である(たとえばHarlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)を参照)。免疫法は、免疫原と好適なアジュバントの混合体の調製、抗体結合の測定、抗体の単離、モノクローナル抗体の獲得、モノクローナル抗体のヒト化など必要な諸々のステップを含めて、当業者には自明である。
【０１２１】
抗体はヒト化抗体でもヒト抗体でもよい。抗体は技術上周知の種々の方法を使用してヒト化することができる。そうした方法の例はCDR-grafting(EP239,400: WO 91/09967; USP 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089); veneeringまたはresurfacing (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al. Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska et al. PNAS 91:969-973 (1994)); およびchain shuffling (USP 5,565,332)などである。
【０１２２】
モノクローナル抗体は1つの種(たとえばマウス、ウサギ、ヤギ、ラット、ヒトなど)に由来する抗体のほかに、複数の種に由来する抗体たとえばキメラ抗体やヒト化抗体をも含むものとする。
【０１２３】
完全ヒト抗体はヒト患者の治療的処置に特に好適である。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用するファージディスプレイ法などを含む技術上周知の多様な方法によって調製することができる。参照を以ってその全体がここに開示される次の特許明細書およびパンフレットを参照: USP 4,444,887およびUSP 4,716,111; WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, WO 91/10741。
【０１２４】
ヒト化抗体、ヒト抗体および抗体断片を含む各種抗体に関する追加情報は、参照を以ってその全体がここに開示される国際公開第WO 01/05998号パンフレットに求められる。
【０１２５】
中和抗体は前述の方法により、おそらくたとえば生存試験による中和活性のスクリーニングという追加ステップを加えることにより、調製することができる。
用語「化学化合物」「低分子」「化学分子」「低分子化学化合物」は本願では互換的に使用されるが、合成的に生産されるまたは天然源から獲得される、通常、分子量が2000Da未満、1000Da未満、さらには600Da未満の、何らかの特定タイプの残基をいうものとする。
【０１２６】
本発明はまた、2本鎖構造を含む機能性核酸、薬剤の製造へのその使用、そうした機能性核酸を含む医薬組成物、および患者治療の方法に関する。
低酸素症は、酸素不足と低酸素状態に対する組織破壊的な応答とに関連する脳卒中、肺気腫および心筋梗塞などきわめて多数の疾患の発症機序における重要要素とみなされてきた。腫瘍などを含む急増殖組織では、酸素不足は好ましくない血管新生によって補償される。従って、少なくともがん疾患の場合には血管系の増殖は好ましくない。
【０１２７】
この点から、血管新生と血管増殖の阻害がそれぞれ盛んに研究されている。今日ではすでに、好ましくない血管新生、血管増殖を阻害するいくつかの化合物が得られる。比較的目立つのはVEGFやVEGF受容体を阻害する化合物である。どちらの場合にもVEGFの作用が妨げられるが、その方法はVEGFそれ自体を、たとえばGenentechのAVASTIN(VEGF特異的モノクローナル抗体)が追求しているように、VEGF抗体の使用によって遮断するか(Ferrara N. Endocr Rev. 2004 Aug;25(4):581-611)、または対応する受容体すなわちVEGF受容体を遮断するか(Traxler P. Cancer Res. 2004 Jul 15;64(14):4931-41; またはStadler WM et al. Clin Cancer Res. 2004 May 15;10(10):3367-70)のいずれかである。
【０１２８】
しかし、血管新生と血管増殖はどの動物や人間でもきわめて基礎的かつ重要な過程であるため、この種の化合物の作用は血管新生と血管増殖が本当に好ましくない特定の部位に集中させる必要がある。従って、この種の治療方法では薬物の適切な誘導または送達が決定的な問題となる。
そこで、望ましくない血管増殖、血管新生にそれぞれ関与する疾患のさらなる治療手段の提供が本発明の目的となる。
「siRNA (低分子干渉RNA)」は、内在性の細胞内対応物の遺伝子/mRNAの発現を抑制するまたは封じる(silence)(妨げる)RNA分子を意味する。この用語は「RNA干渉(RNAi)」を包摂するものとする。RNA干渉(RNAi)は哺乳動物における、低分子干渉RNA(siRNA)に媒介された、配列特異的な転写後遺伝子サイレンシング過程をいう(Fire et al. 1998, Nature 391, 806)。対応する過程は植物では一般に特異的転写後遺伝子サイレンシングまたはRNAサイレンシングといい、また真菌ではクウェリング(quelling)ともいう。このRNA干渉応答ではsiRNAを含むエンドヌクレアーゼ複合体(一般にRNA-induced silencing complex、RISCという)が主役となる。RISCは2本鎖siRNAのアンチセンスストランドに対して相補的な配列をもつ1本鎖RNAの開裂を媒介する。標的RNAの開裂は2本鎖siRNAのアンチセンスストランドに対して相補的な領域の中間で起きる(Elbashir et al. 2001, Genes Dev. 15, 188)。これらの用語や提唱されているメカニズムに関する新情報については、Bernstein E, Denli AM, Hannon GJ. The rest is silence (あとは黙る). RNA. 2001 Nov;7(11):1509-21; およびNishikura J. A short primer on RNAi: RNA-directed RNA polymerase acts as a key catalyst (RNAi入門:重要触媒として機能するRNA依存性RNAポリメラーゼ). Cell. 2001 Nov 16;107(4):415-8を参照。本発明に使用してもよいsiRNA分子の例はTable A〜Cに示す。
【０１２９】
近年、RNAiが遺伝子不活性化の最も効率的な方法として浮上してきた(Nature Reviews, 2002, v.3, p737-47; Nature, 2002, v.418, p.244-51)。それは、特定のタンパク質複合体に入り込めるというdsRNA種の能力を土台にした方法であり、その後は該複合体が相補的な細胞RNAへと誘導され、該RNAを特異的に分解する。やや詳しく説明すれば、dsRNAをIII 型RNAse(DICER、Droshaなど)で消化して、小さな(17〜29 bp)阻害性RNA断片(siRNA)とする。これらの断片と相補性mRNAは特異的なRISCタンパク質複合体によって認識される。標的mRNAのエンドヌクレアーゼ切断で全過程が終了する(Nature Reviews, 2002, v.3, p737-47; Curr Opin Mol Ther. 2003 Jun;5(3):217-24)。
【０１３０】
既知遺伝子に合わせてsiRNAを設計、調製する方法の開示については、Chalk AM, Wahlestedt C, Sonnhammer EL. Improved and automated prediction of effective siRNA(有効siRNAの改良自動化予測). Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004 Jun 18;319(1):264-74; Sioud M, Leirdal M. Potential design rules and enzymatic synthesis of siRNAs(siRNAの潜在設計ルールと酵素的合成), Methods Mol Biol. 2004; 252:457-69; Levenkova N, Gu Q, Rux JJ. Gene specific siRNA selector(遺伝子特異的siRNAセレクター), Bioinformatics. 2004 Feb 12;20(3):430-2; およびUi-Tei K, Naito Y, Tkahashi F, Haraguchi T, Ohki-Hamazaki H, Juni A, Ueda R, Saigo K. Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference(哺乳動物およびヒヨコRNA干渉用の効果の高いsiRNA配列の選択のための指針). Nucleic Acids Res. 2004 Feb 9;32(3):936-48などを参照。また、Liu Y, Braasch DA, Nulf CJ, Corey DR. Efficient and isoform-selective inhibition of celluar gene expression by peptide nucleic acids(ペプチド核酸による細胞遺伝子発現の効率的、アイソフォーム選択的阻害). Biochemistry, 2004 Feb 24;43(7):1291-7を参照。また国際公開第WO 2004/015107号(Atugen)および第WO 02/44321号(Tuschl et al.)パンフレット、さらにChiu YL, Rana TM. siRNA function in RNAi: a chemical modification analysis(RNAiにおけるsiRNAの役割: 化学修飾分析), RNA 2003 Sep;9(9):103-48、修飾/安定性向上siRNAの調製に関する米国特許第5898031号および第6107094号(Crooke)の各明細書を参照。
【０１３１】
細胞内でsiRNAを生成させることができるDNA系ベクターが開発された。その方法は一般に、細胞内で効率的にプロセッシングされてsiRNAを形成するような低分子のヘアピンRNAの転写に関係する。Paddison et al. PNAS 2002, 99:1443-1448; Paddison et al. Genes & Dev 2002, 16:948-958; Sui et al. PNAS 2002, 8:5515-5520; およびBrummelkamp et al. Science 2002, 296:550-553。これらの報文は数多くの内因性および外因性発現遺伝子を特異的に標的にすることができるsiRNAを生成させる方法を説明している。
siRNAの送達に関しては、たとえばShen et al (FEBS letters 539:111-114 (2003); Xia et al. Nature Biotechnology 20: 1006-1010 (2002); Reich et al. Molecular Vision 9: 210-216 (2003); Sorensen et al. J.Mol.Biol. 327:761-766 (2003); Lewis et al. Nature Genetics 32:107-108 (2002); Simeoni et al. Nucleic Acids Research 31, 11:2717-2724 (2003)を参照。siRNAは最近、霊長類に使用して阻害に成功している。詳細はTolentino et al. Retina 24(1) February 2004 pp 132-138を参照。
【０１３２】
本発明のsiRNA
本発明のsiRNAの概説
一般に、本発明に使用するsiRNAは2本鎖構造のリボ核酸を含むが、該2本鎖構造は第1ストランドと第2ストランドを含み、第1ストランドは第1ストレッチの連続ヌクレオチドを含み、該第1ストレッチは標的核酸に対して少なくとも部分的に相補的であり、また第2ストランドは第2ストレッチの連続ヌクレオチドを含み、該第2ストレッチは標的核酸と少なくとも部分的に同じであり、該第1ストランドおよび/または該第2ストランドは複数の2'位修飾型修飾ヌクレオチド群を含み、該ストランド内では各修飾ヌクレオチド群が一端または両端で隣接ヌクレオチド群と隣接し、該隣接ヌクレオチド群を形成する隣接ヌクレオチドは非修飾ヌクレオチドであるかまたは該修飾ヌクレオチドの修飾とは異なる修飾を有するヌクレオチドである。さらに、該第1ストランドおよび/または該第2ストランドは該複数の修飾ヌクレオチドを含んでもよいし、また該複数の修飾ヌクレオチド群を含んでもよい。
【０１３３】
修飾ヌクレオチド群および/または隣接ヌクレオチド群はある数のヌクレオチドを含んでよいが、その数は1ヌクレオチド〜10ヌクレオチドからなる群より選択される。本願で指定する任意の範囲に関連して、各範囲は該範囲の両端を示す各数値の間の任意の整数を、該数値を含めて開示するものとする。従って本例の場合には、ヌクレオチド群は1ヌクレオチド、2ヌクレオチド、3ヌクレオチド、4ヌクレオチド、5ヌクレオチド、6ヌクレオチド、7ヌクレオチド、8ヌクレオチド、9ヌクレオチドおよび10ヌクレオチド含むことになる。
【０１３４】
該第1ストランドの修飾ヌクレオチドパターンは該第2ストランドの修飾ヌクレオチドパターンと同じでもよいし、該第2ストランドのパターンとアラインメントしてもよい。さらに、該第1ストランドの修飾ヌクレオチドパターンは該第2ストランドの修飾ヌクレオチドパターンと比べて単数または複数ヌクレオチド分シフトしてもよい。
前述の修飾はアミノ、フルオロ、メトキシ、アルコキシおよびアルキルからなる群より選択してもよい。
【０１３５】
siRNAの2本鎖構造は片側または両側が平滑末端でもよい。特に、該2本鎖構造は第1ストランドの5'末端と第2ストランドの3'末端とを有する側が平滑末端でもよいし、第1ストランドの3'末端と第2ストランドの5'末端とを有する側が平滑末端でもよい。
また、2本鎖のうち少なくとも一方のストランドは5'末端側に少なくとも1ヌクレオチドのオーバーハングを有してもよく、また該オーバーハングは少なくとも1デオキシリボヌクレオチドからなってもよい。2本鎖のうち少なくとも一方のストランドはまた随意に、3'末端に少なくとも1ヌクレオチドのオーバーハングを有する。
2本鎖構造のsiRNAの鎖長は一般に、約17〜21塩基であり、より好ましくは18または19塩基である。さらに、該第1ストランドの鎖長および/または該第2ストランドの鎖長は互いに独立に、約15〜約23塩基、17〜21塩基および18または18塩基からなる群より選択してもよい。
【０１３６】
さらに該第1ストランドと標的核酸との相補性は完全でもよいし、また第1ストランドと標的核酸とで形成される少なくとも15ヌクレオチドを含む2本鎖に両鎖間のミスマッチが1つまたは2つ存在していてもよい。
【０１３７】
場合によっては、第1ストランドと第2ストランドは各々、少なくとも1つの修飾ヌクレオチド群と少なくとも1つの隣接ヌクレオチド群とを含むが、各修飾ヌクレオチド群は少なくとも1つのヌクレオチドを含み、また各隣接ヌクレオチド群は少なくとも1つのヌクレオチドを含み、第1ストランドの各修飾ヌクレオチド群は第2ストランドの隣接ヌクレオチド群とアラインメントしており、第1ストランドの最末端5'ヌクレオチドは該修飾ヌクレオチド群のヌクレオチドであり、また第2ストランドの最末端3'ヌクレオチドは該隣接ヌクレオチド群のヌクレオチドである。各修飾ヌクレオチド群および/または各隣接ヌクレオチド群は単一ヌクレオチドからなってもよい。
さらに、第1ストランド上で隣接ヌクレオチド群を形成するヌクレオチドは修飾ヌクレオチド群を形成するヌクレオチドに対して3'方向に配置される非修飾ヌクレオチドであり、また第2ストランド上で修飾ヌクレオチド群を形成するヌクレオチドは隣接ヌクレオチド群を形成するヌクレオチドに対して5'方向に配置される修飾ヌクレオチドであることも可能である。
【０１３８】
さらに、siRNAの第1ストランドは8〜12の好ましくは9〜11の修飾ヌクレオチド群を含んでよいし、また第2ストランドは7〜11の好ましくは8〜10の修飾ヌクレオチド群を含んでもよい。
第1ストランドと第2ストランドは、非核酸高分子たとえばポリエチレングリコールなどからなるループ構造で連結されていてもよい。あるいは該ループ構造は核酸からなってもよい。
【０１３９】
さらに、siRNAの第1ストランドの5'末端は第2ストランドの3'末端に連結されていてもよいし、また第1ストランドの3'末端が第2ストランドの5'末端に連結されていてもよいが、該連結は鎖長が一般に10〜2000核酸塩基である核酸リンカーを介する。
【０１４０】
本発明のsiRNAの詳説
本発明は次の構造(構造A)を有する化合物を提供する:
5'(N)x-Z3'(アンチセンスストランド)
3'Z'-(N')y5'(センスストランド)
(式中各NおよびN'は糖残基が修飾体または非修飾体であるリボヌクレオチドであり、(N)xと(N')yはオリゴマーであって、その中では各連続NまたはN'がその隣のNまたはN'と共有結合で結合されている;
ｘとyは各々19〜40の整数である;
ZとZ'は各々存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合にはdTdTであり、また自らが存在するストランドの3'末端に共有結合的に付加されている; また
(N)xの配列はRTP801遺伝子のcDNAに対するアンチセンス配列を含む。)
【０１４１】
特に本発明は、前記の化合物であって、(N)xの配列がTable A〜Cに示すアンチセンス配列を単数または複数含むことを特徴とする化合物を提供する。
特に、本発明は前記の化合物であって、共有結合はホスホジエステル結合であり、x=yであり、好ましくはx=y=19であり、ZとZ'は共に存在せず、少なくとも1つのリボヌクレオチドはその糖残基が2'位で修飾されており、該2'位の部分はメトキシ(2'-O-メチル)であり、交互配列型リボヌクレオチドはアンチセンスストランドとセンスストランドの両方で修飾され、またアンチセンスストランドの5'末端と3'末端のリボヌクレオチドは糖残基が非修飾体であることを特徴とする化合物を提供する。
【０１４２】
特に、本発明に使用するsiRNAは、一方のストランドが(センスストランドである)配列番号3〜52または配列番号103〜174または配列番号247〜295に示す5'→3'配列を有する連続ヌクレオチドを含むオリゴリボヌクレオチドであって、複数の塩基が好ましくは2-O-メチルによって修飾されてもよいことを特徴とするオリゴヌクレオチドであるか、または各末端領域の2個までのヌクレオチドで塩基が変化しているその類似体であることを特徴とする。
【０１４３】
さらに、本発明は呼吸器障害、眼疾患、微小血管障害または脊髄損傷/疾患の患者を治療する方法であって、該患者を治療するために、前記構造(A)の(前記のうちいずれかの特質を備える)化合物を含む医薬組成物を治療有効量該患者に投与するステップを含む方法を提供する。また、本発明は呼吸器障害、眼疾患、微小血管障害または脊髄損傷/疾患の患者の回復を促進する薬剤の調製への、治療有効量の前記構造(A)の(前記のうちいずれかの特質を備える)化合物の使用を提供する。
【０１４４】
本発明は追加の態様で、本願で開示する任意の疾患および病態の治療のための、前記構造(A)の化合物を含む医薬組成物を提供する。
この態様ではさらに、本願で開示する任意の疾患および病態の治療のための、前記構造(A)の複数の化合物を含む医薬組成物であって、該複数化合物を、同等のまたは他の点で有利な活性をもたらすような量において物理的に混合して医薬組成物とすることを、または共有結合または非共有結合させ、または鎖長2〜100ヌクレオチド、好ましくは2〜50または2〜30ヌクレオチドの核酸リンカーで結合させることを、特徴とする医薬組成物を提供する。従って、そうしたsiRNA分子は開示のような2本鎖からなるが、Table A〜Cより、好ましくはTable AのsiRNA番号14、22、23、25、27、39、41、42、49および50より、選択される2つのsiRNA配列を共有結合または非共有結合させ、または鎖長38〜150ヌクレオチドの、好ましくは38または40〜60ヌクレオチドの、また3以上のsiRNA配列がタンデム分子に含まれる場合にはもっと長い鎖長の、核酸リンカーで結合させることを、特徴とする。内部細胞プロセッシングを経て生成されるsiRNAをコードする複数の比較的長い配列からなる比較的長いタンデム分子たとえばdsRNAもまた、複数のshRNAをコードするタンデム分子と同様に、見込まれる。そうしたタンデム分子もまた本発明の一部とみなされるが、その詳細を以下開示する。
【０１４５】
該結合またはタンデム構造は、各siRNAの毒性および/または標的以外への作用(off-target effects)を最小限に抑えながら薬効を高めるうえで有利である。
特に、実施例で使用したsiRNAは2'-O-Me基がアンチセンスストランドの第1、第3、第5、第7、第9、第11、第13、第15、第17および第19ヌクレオチド上の存在するように修飾し、また同じ修飾すなわち2'-O-Me基がセンスストランドの第2、第4、第6、第8、第10、第12、第14、第16および第18ヌクレオチド上に存在するようにしてある。また、本発明によるこれらの特定の核酸では、第1ストレッチは第1ストランドと同じであり、また第2ストレッチは第2ストランドと同じであり、またこれらの核酸は平滑末端でもある。siRNAはリン酸化されているが、大規模に調製するなら非リン酸化体のほうが簡単であると見込まれるし、またREDD-14の非リン酸化体(REDD-14NP)の生理活性はREDD-14と変わらないことがCNVモデルで判明している(実施例6参照)。このsiRNAの、実施例6〜8の実験に使用する配列はREDD-14のそれ、すなわち内部参照番号14 (Table A参照)の配列である。
【０１４６】
オリゴヌクレオチドの末端領域は19マー配列(Table AおよびB)では塩基1〜4および/または16〜19をいい、21マー配列(Table C)では塩基1〜4および/または18〜21をいう。
また、本発明に使用するsiRNAは、一方のストランドが(センスストランドである)配列番号53〜102または配列番号175〜246または配列番号296〜344に示す5'→3'配列を有する連続ヌクレオチドを含むオリゴリボヌクレオチドであるか、または各末端領域の2個までのヌクレオチドで塩基が変化しているその類似体であることを特徴とする。従って特定の態様では、該オリゴヌクレオチドは2本鎖構造を含むが、該2本鎖構造は第1ストランドと第2ストランドを含み、第1ストランドは第1ストレッチの連続ヌクレオチドを含み第2ストランドは第2ストレッチの連続ヌクレオチドを含み、第1ストレッチはRTP801遺伝子をコードする核酸配列に対して相補性または同一性を有し、また第2ストレッチはRTP801をコードする核酸配列に対して相補性または同一性を有する。該第1ストレッチは少なくとも14ヌクレオチドを、好ましくは少なくとも18ヌクレオチドを、さらになお好ましくは19ヌクレオチドを、さらには少なくとも21ヌクレオチドを含む。一実施形態では、第1ストレッチは約14〜40ヌクレオチドを、好ましくは約18〜30ヌクレオチドを、さらになお好ましくは約19〜27ヌクレオチドを、そして最も好ましくは約19〜23ヌクレオチドを含む。一実施形態では、第2ストレッチは約14〜40ヌクレオチドを、好ましくは約18〜30ヌクレオチドを、さらになお好ましくは約19〜27ヌクレオチドを、そして最も好ましくは約19〜23ヌクレオチドを、さらには約19〜21ヌクレオチドを含む。一実施形態では、第1ストレッチの最初のヌクレオチドはRTP801をコードする核酸配列の一ヌクレオチドに対応し、第1ストレッチの最後のヌクレオチドはRTP801をコードする核酸配列の一ヌクレオチドに対応する。一実施形態では、第1ストレッチは一オリゴヌクレオチドの少なくとも14連続ヌクレオチドの配列を含むが、そうしたオリゴヌクレオチドは配列番号3〜344を含む群より、好ましくはTable Aの通し番号14、22、23、25、27、39、41、42、49および50のいずれかの配列を有するオリゴリボヌクレオチドを含む群より、選択される。また、本発明に使用してもよいsiRNA分子の明細は、ジヌクレオチドdTdTが3'末端に共有結合したオリゴヌクレオチド、および/または少なくともぬつのヌクレオチドで糖残基が、おそらく2'-O-メチル修飾を含む修飾を受けるオリゴヌクレオチドを提供する。さらに、2'-OH基は-H-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2CH3、-NH2およびFを含む群より選択される基または部分に置き換わってもよい。さらに、ここで開示した本発明の好ましい化合物はリン酸化体でも非リン酸化体でもよい。
【０１４７】
また、本発明に使用するsiRNAは、交互配列型ヌクレオチドにおいて修飾糖が両ストランドに存在するようなオリゴリボヌクレオチドでもよい。特に、該オリゴリボヌクレオチドは末端5'および3'ヌクレオチドの糖が非修飾体であるセンスストランドの1つを、または末端5'および3'ヌクレオチドの糖が修飾体であるアンチセンスストランドの1つを、含んでもよい。
【０１４８】
また、本発明に使用するさらなる核酸は配列番号3〜344のいずれか1つの配列の少なくとも14連続ヌクレオチドを、より好ましくは前記のような第1ストレッチと第2ストレッチからなる2本鎖構造の任意の一端の14連続ヌクレオチド塩基対を、含む。当業者には自明であろうが、本発明による核酸の潜在鎖長および特に本発明によるそうした核酸を形成する個別ストレッチの鎖長を考えれば、配列番号1に示すようなRTP801遺伝子の各末端方向への若干のシフトが可能であり、両方向に最長1、2、3、4、5および6ヌクレオチド分シフトさせて生じた2本鎖核酸分子もまたは本発明の範囲に包摂されるものとする。
【０１４９】
本発明の追加の態様は、2本鎖構造を含む機能性核酸であって、該2本鎖構造が
第1ストランドと第2ストランドを含み;
第1ストランドは第1ストレッチの連続ヌクレオチドを含み、また第2ストランドは第2ストレッチの連続ヌクレオチドを含み;
該第1ストレッチはRTP801遺伝子をコードする核酸配列に対して相補性または同一性を有し、また該第2ストレッチはRTP801をコードする核酸配列に対して相補性または同一性を有する;
ことを特徴とする機能性核酸に関する。
【０１５０】
一実施形態では、該核酸はRTP801を抑制するが、RTP801の抑制はRTP801機能の抑制、RTP801タンパク質の抑制およびRTP801 mRMA発現の抑制を含む群より選択される。
一実施形態では、第1ストレッチは少なくとも14ヌクレオチドを、好ましくは少なくとも18ヌクレオチドを、さらに好ましくは19ヌクレオチドを含む。
【０１５１】
一実施形態では、第1ストレッチは約14〜40ヌクレオチドを、好ましくは約18〜30ヌクレオチドを、より好ましくは約19〜27ヌクレオチドを、そして最も好ましくは19〜23ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、第2ストレッチは約14〜40ヌクレオチドを、好ましくは約18〜30ヌクレオチドを、より好ましくは約19〜27ヌクレオチドを、そして最も好ましくは19〜23ヌクレオチドを含む。
【０１５２】
一実施形態では、第1ストレッチの最初のヌクレオチドはRTP801をコードする核酸配列の一ヌクレオチドに対応し、第1ストレッチの最後のヌクレオチドはRTP801をコードする核酸配列の一ヌクレオチドに対応する。
一実施形態では、第1ストレッチは一核酸配列の少なくとも14連続ヌクレオチドの配列を含むが、そうした核酸配列はTable A〜Cに示す配列より、好ましくは配列番号53、66、67、72、73、74、75、76、77、91、92、93、94、96、101および102を含む群より選択され、より好ましくは配列番号66、75、79、91、94、101および102を含む群より選択され、最も好ましくは配列番号66、74、75および79を含む群より、選択される。
【０１５３】
一実施形態では、他方のストレッチは一核酸配列の少なくとも14連続ヌクレオチドの配列を含むが、そうした核酸配列はTable A〜Cに示す配列より、好ましくは配列番号3、16、22、23、24、26、26、27、29、41、42、43、44、45、46、51および52を含む群より選択され、より好ましくは配列番号16、24、25、29、41、44、51および52を含む群より選択され、最も好ましくは配列番号16、24、25および29を含む群より、選択される。
【０１５４】
一実施形態では:
第1ストレッチは配列番号53による配列を有し、また第2ストレッチは配列番号3による配列を有する;
第1ストレッチは配列番号66による配列を有し、また第2ストレッチは配列番号16による配列を有する;
第1ストレッチは配列番号67による配列を有し、また第2ストレッチは配列番号17による配列を有する;
第1ストレッチは配列番号72による配列を有し、また第2ストレッチは配列番号22による配列を有する;
第1ストレッチは配列番号73による配列を有し、また第2ストレッチは配列番号23による配列を有する;
第1ストレッチは配列番号74による配列を有し、また第2ストレッチは配列番号24による配列を有する;
第1ストレッチは配列番号75による配列を有し、また第2ストレッチは配列番号25による配列を有する;
第1ストレッチは配列番号76による配列を有し、また第2ストレッチは配列番号26による配列を有する;
第1ストレッチは配列番号77による配列を有し、また第2ストレッチは配列番号27による配列を有する;
第1ストレッチは配列番号79による配列を有し、また第2ストレッチは配列番号29による配列を有する;
第1ストレッチは配列番号91による配列を有し、また第2ストレッチは配列番号41による配列を有する;
第1ストレッチは配列番号92による配列を有し、また第2ストレッチは配列番号42による配列を有する;
第1ストレッチは配列番号93による配列を有し、また第2ストレッチは配列番号43による配列を有する;
第1ストレッチは配列番号94による配列を有し、また第2ストレッチは配列番号44による配列を有する;
第1ストレッチは配列番号95による配列を有し、また第2ストレッチは配列番号45による配列を有する;
第1ストレッチは配列番号96による配列を有し、また第2ストレッチは配列番号46による配列を有する;
第1ストレッチは配列番号101による配列を有し、また第2ストレッチは配列番号51による配列を有する;
第1ストレッチは配列番号102による配列を有し、また第2ストレッチは配列番号52による配列を有する。
【０１５５】
一実施形態では第1ストレッチは配列番号53、66、67、72、73、74、75、76、77、79、91、92、93、94、95、96、101および102を含む群より選択される核酸配列を有する。
用語「第1」および「第2」ストレッチは本発明の核酸との関連で使用するが、これら用語は便宜的に使用するにすぎず、本発明の任意の核酸であって、第1ストレッチのX配列と第2ストレッチのY配列有するとされる核酸は第1ストレッチのY配列と第2ストレッチのX配列を有するとしても、本願で定める用語の意味や明細に従って、一方のストレッチがアンチセンスストランドに含まれ、RTP801遺伝子のコード配列の一部分に対してアンチセンスでなければならず、また他方のストレッチがセンスストランドに含まれ、該アンチセンスストランドに対して(必ずしも100%ではないが)相補的でなければならないとされる限り、変わりはないものする。
【０１５６】
一実施形態では、第1ストランドおよび/または第2ストランドは3'末端に少なくとも1つのオーバーハングヌクレオチドを含むが、該ヌクレオチドはRTP801をコードする核酸配列の対応するヌクレオチドに対して同一性または相補性を有する。
一実施形態では、第1ストランドおよび/または第2ストランドは3'末端に少なくとも1〜15オーバーハングヌクレオチドを含み、好ましくは第1ストランドおよび/または第2ストランドは3'末端に少なくとも1〜10オーバーハングヌクレオチドを含み、なお好ましくは第1ストランドおよび/または第2ストランドは3'末端に少なくとも1〜5オーバーハングヌクレオチドを含み、最も好ましくは第1ストランドおよび/または第2ストランドは3'末端に少なくとも1〜2オーバーハングヌクレオチドを含む。
【０１５７】
一実施形態では、第1ストランドおよび/または第2ストランドは少なくとも1つのオーバーハングヌクレオチドを含むが、該ヌクレオチドはRTP801をコードする核酸配列の対応するヌクレオチドとは異なる。
【０１５８】
一実施形態では、第1ストランドは第1ストレッチだけを含む。
一実施形態では、第2ストランドは第2ストレッチだけを含む。
一実施形態では、第1ストレッチおよび/または第1ストランドはリボヌクレオチドを含む。
一実施形態では、第2ストレッチおよび/または第2ストランドはリボヌクレオチドを含む。
一実施形態では、第1ストレッチおよび/または第2ストランドはリボヌクレオチドを含む。
【０１５９】
一実施形態では、該リボヌクレオチドはいくつかまたはすべてが修飾体である。
好ましい実施形態では、そうした修飾はヌクレオチドの核酸塩基部分に、ヌクレオチドの糖部分に、および/またはリン酸部分に、関連する。
より好ましい実施形態では、修飾は糖部分の修飾であり、該修飾は2'位の修飾であって、それにより2'-OH基が-H-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2CH3、-NH2、および-Fを含む群より選択される基または部分と置き換わる。
【０１６０】
一実施形態では、修飾は核酸塩基部分の修飾であり、該修飾または修飾核酸塩基は、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、6-メチル-、2-プロピルおよび他アルキル-アデニン、5-ハロウラシル、5-ハロシトシン、6-アザシトシン、6-アザチミン、シュードウラシル、4-チオウラシル、8-ハロアデニン、8-アミノアデニン、8-チオールアデニン、8-チオールアルキルアデニン、8-ヒドロキシルアデニンおよび他の8-置換アデニン、8-ハログアニン、8-アミノグアニン、8-チオールグアニン、8-チオアルキルグアニン、8-ヒドロキシルグアニンおよび他の置換グアニン、他のアザ-およびデアザ-アデニン、他のアザ-およびデアザ-グアニン、5-トリフルオロメチルウラシルおよび5-トリフルオロシトシンを含む群より選択される。
【０１６１】
一実施態様では、修飾はリン酸部分の修飾であり、修飾リン酸部分はホスホロチオアートを含む群より選択される。
一実施形態では、第1ストレッチおよび/または第2ストレッチは複数の2'位修飾型修飾ヌクレオチド群を含み、ストレッチ内の各修飾ヌクレオチド群は一端または両端で隣接ヌクレオチド群と隣接し、該隣接ヌクレオチド群を形成する隣接ヌクレオチドは非修飾ヌクレオチドであるかまたは該修飾ヌクレオチドの修飾とは異なる修飾を有するヌクレオチドである。
【０１６２】
好ましい実施形態では、第1ストレッチおよび/または第2ストレッチはリボヌクレオチドからなる。
なお好ましい実施形態では、第1および第2ストレッチは複数の修飾ヌクレオチド群を含む。
一実施形態では、第1ストレッチは該複数の修飾ヌクレオチド群を含む。
一実施形態では、第2ストレッチは該複数の修飾ヌクレオチド群を含む。
一実施形態では、各修飾ヌクレオチド群および/または各隣接ヌクレオチド群はある数のヌクレオチドを含むが、その数は1ヌクレオチド〜10ヌクレオチドからなる群より選択される。
【０１６３】
一実施形態では、第1ストレッチは第1パターンの修飾ヌクレオチドを含み、第2ストレッチは第2パターンの修飾ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、第1パターンは第2パターンと同じパターンである。
別の実施形態では、第1パターンは第2パターンとアラインメントする。
好ましい実施形態では、第1パターンは第2パターンと比べて単数または複数ヌクレオチド分シフトしている。
一実施形態では、各修飾ヌクレオチド群は1つの修飾ヌクレオチドからなり、各隣接ヌクレオチド群は1つの非修飾ヌクレオチドまたは該修飾ヌクレオチドの修飾とは異なる修飾を有するヌクレオチドからなる。
【０１６４】
好ましい実施形態では、修飾ヌクレオチドは2'位に-OMe基を有する。
好ましい実施形態では、隣接ヌクレオチドは2'-OH基を有するリボヌクレオチドである。
一実施形態では、第1ストレッチは5'末端の修飾ヌクレオチドで始まり、該ストレッチ内の他の各ヌクレオチドもまた修飾ヌクレオチドであるが、5'末端から始まる第2のヌクレオチドと他の各ヌクレオチドは非修飾ヌクレオチドまたは該修飾ヌクレオチドの修飾とは異なる修飾を有するヌクレオチドである。
一実施形態では、第1ストレッチはRTP801をコードする核酸配列に対してアンチセンス方向にある。
【０１６５】
本発明の追加の態様は、本発明の第1態様による核酸および/または本発明の第2態様によるベクターを製薬上許容しうる担体と共に含む、随意に全身投与または経口投与用の、医薬組成物に関する。
一実施形態では、該組成物は腫瘍疾患を含む群より選択される疾患の治療が目的である。
【０１６６】
追加の態様では、本発明の根底にある問題が、本発明による核酸および/または本発明によるベクターおよび/または本発明による医薬組成物を投与するステップを含む、予防および/または治療を必要とする患者を予防および/または治療する方法によって解決される。
追加の実施形態では、本発明による核酸および/または本発明によるベクターを薬剤の製造に使用する。該薬剤は腫瘍疾患を含む群より選択される疾患の予防および/または治療が目的である。腫瘍疾患は充実性腫瘍、PTEN陰性腫瘍を含む転移性腫瘍、薬剤耐性腫瘍およびRTP801阻害を増感に使用しうる腫瘍を含む群より選択してもよい。さらに、腫瘍疾患は晩期腫瘍疾患でもよいし、また腫瘍抑制因子陰性の細胞に関係してもよい。該腫瘍抑制因子はPTENでもよい。
【０１６７】
本発明の追加の態様は、RTP801の抑制に好適な核酸の、次のステップを含む設計またはスクリーニング方法によって解決される:
a)  RTP801の抑制に好適な核酸を設計またはスクリーニングする;
b)  本発明の前記態様のいずれかによる核酸の欠陥を評価する;
c)  ステップa)の核酸の作用をステップb)の核酸の作用と比較する。
一実施形態では、該作用はRTP801の抑制である。
【０１６８】
本発明の追加の態様は、本発明による核酸の、増感剤特に疾患治療の増感剤としての使用であるが、該疾患は好ましくは腫瘍特に化学療法および/または放射線療法による治療に対して耐性の腫瘍を含む群より選択される。本発明の核酸が増感剤として役立ちうる追加の疾患は追って開示する。
【０１６９】
本願は、RTP801に対して特異的である2本鎖構造を含む核酸が血管新生/血管系の増殖、および血管漏出(既存血管と増殖途上血管の両方に由来)を阻害する好適な手段であることを開示する。また本願は、(低酸素、酸化ストレス、熱ストレス、ERストレスにより誘発される)ストレス誘発性タンパク質であるRTP801がエネルギー不均衡に対する細胞応答の微調整に関与する因子であることを(理論にとらわれることなく)開示する。従って、そうした2本鎖核酸によるRTP801の阻害は、ストレス条件(たとえば正常細胞の死に付随する疾患など)によるアポトーシスから細胞を救済する必要があるようなまたはRTP801発現の変化に起因するストレス条件に適合した細胞(腫瘍細胞など)を死滅させる必要があるような任意の疾患の治療に好適である。後者の場合には、そうした2本鎖核酸によりRTP801を阻害すると、低酸素細胞特に低酸素がん細胞内で抗アポトーシス機能を果たすこの生存因子は無効化され、それによりRTP801媒介型保護を失った該細胞はアポトーシスへと追い込まれる。これは、他のアポトーシス促進因子が存在する場合には、追加的に起こりうる。そうした他のアポトーシス促進因子の一例は化学療法や放射線療法などである。言い換えれば、本発明の2本鎖核酸はがん治療に単独でも(単剤療法としても)、補助療法としても、有効であろう。
【０１７０】
そうした2本鎖構造は第1ストランドと第2ストランドを含むが、第1ストランドは第1ストレッチの連続ヌクレオチドを含み第2ストランドは第2ストレッチの連続ヌクレオチドを含み、第1ストレッチはRTP801遺伝子をコードする核酸配列に対して相補性または同一性を有し、また第2ストレッチはRTP801をコードする核酸配列に対して相補性または同一性を有する。従って、特にRTP801をそうした2本鎖核酸の標的として使用すると、血管系の増殖や発生および血管新生に関与するカスケード内の標的に直接、言わばVEGF抗体などのようなVEGF阻害剤の場合とは異なる経路で、対処することが可能となる。本願発明者はいかなる理論にも縛られることなく、本発明による核酸が、好ましくない特に低酸素誘導性の血管新生および/または血管系の増殖または発生が起こるような、任意の疾患に関連して生じるまたは観測される、背景をもたらす細胞内で、その作用を働かせるものと考える。こうした理解は次のような知見からも裏付けられる。すなわち、RTP801ノックアウトマウスは非低酸素条件下では野生型マウスと異なる表現型を何ら示さないが、腫瘍増殖などのような病態の下で観測される低酸素状態を導入すると初めて、RTP801関連ノックアウトはこの種の疾患のヒト患者で観測されるものと類似の病理を招く。
【０１７１】
本発明による核酸は好ましくは機能性核酸であるものとする。ここでは、用語「機能性核酸」は好ましくは、細胞内で任意のhnRNA、mRNAまたは他の任意の転写産物の転写のための鋳型としての活性を有することとは異なるような機能をもつ核酸を意味するが、該hnRNA、nRNAまたは他の任意の転写産物はそれぞれ、または本発明に従う核酸は、翻訳プロセス好ましくは細胞内翻訳プロセスを経て、生理活性RTP801タンパク質をもたらす。ここで使用される機能性核酸は好ましくは標的核酸の発現を抑制しうるものとする。なお好ましくは、そうした抑制は標的核酸の転写後遺伝子サイレンシングのプロセスに基づく。さらになお好ましくは、そうした抑制はRNA干渉に基づく。最も好ましい形態の機能性核酸はsiRNA分子またはsiRNA分子と同じ作用をさらなる任意の分子である。そうしたさらなる分子はsiRNA、合成siRNA、shRNA、合成shRNAを含む群より選択される。siRNAはここでは、発現ベクター由来siRNAを追加的に含んでよいが、その場合、該発現ベクターは好ましい実施形態ではウイルスたとえばアデノウィルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスなどである。shRNAはここでは低分子ヘアピンRNAを意味する。そうしたshRNAは合成的に作製することも、発現ベクターから、好ましくはRNAポリメラーゼIII プロモーターを使用して、生成させることもできる。これに関連して、本発明の機能性核酸はここでは好ましくは標的とも呼ばれるRTP801および該標的をコードする(標的核酸としての)核酸へと誘導されるものとする。
【０１７２】
ここで使用するのが好ましい本発明による核酸の2本鎖構造は任意の2本鎖構造を含むが、そうした2本鎖構造は、基本設計を有する核酸によって提供される第1ストレッチと第2ストレッチにより生成されるのが好ましい。該2本鎖構造は1個またはまたは数個のミスマッチを含んでもよい。そうした2本鎖構造はWatson-Crick型塩基対合および/またはHoogsteen型塩基対合および/または類似の塩基対合機構により形成される。本発明による核酸の基本設計によれば、一方のストレッチはRTP801をコードする核酸配列またはその一部分に対してアンチセンス方向にあり、また他方のストレッチはRTP801をコードする核酸配列またはその一部分に対してセンス方向にあるのが好ましい。そのため、一方のストレッチはRTP801をコードする核酸配列またはその一部分に対して相補性を有し、また他方のストレッチはRTP801をコードする核酸配列またはその一部分に対して同一性を有する。これに関連して、同一性はもちろんる部分的同一性をも意味するものとし、その場合、相同性として表示され同一性は少なくとも80%、好ましくは90%、より好ましくは95%、96%、97%、98%、99%または100%である。同一性の定義と同様に、相補性もまた相同性の点から定義することができるが、相補鎖がWatson-Crick型塩基対合規則に従って同一鎖へと翻訳される場合には、そうした相同性は同一性と同じ範囲とする。代替実施形態では、一方のストレッチはRTP801をコードする核酸配列またはその一部分に対して同一性を有し、他方のストレッチはRTP801をコードする核酸配列またはその一部分に対して相補性を有する。
【０１７３】
好ましい実施形態では、本発明による核酸はRTP801機能を抑制する。RTP801機能の抑制は好ましくはタンパク質レベルおよび/またはmRNAレベルでの発現レベルの低下によって起こり、そうした発現レベルの低下は、好ましくはタンパク質レベルでの低下であり、その低下幅は本発明による核酸が投与されていないまたは機能的に活性ではない条件下での発現を基準にして、小幅なほうで5%、大幅なほうで100%である。そうした条件は発現系好ましくはRTP801発現系のの、またはそうした発現系内に存在する、条件である。そうした発現系は好ましくは翻訳系であり、in vitro翻訳系でもよいが、より好ましくは細胞、器官および/または生物である。該生物は好ましくは多細胞生物であり、より好ましくは哺乳動物であり、そうした哺乳動物は好ましくはヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウシ、ウマおよびブタからなる群より選択される。この抑制に関連して、該抑制は時間の関数である、すなわち抑制効果は本発明による核酸の投与または機能的活性化により直ちに観測されるとは限らず、時間的にも、空間的にもすなわち種々の細胞、組織または器官により、繰り延べを伴うものとする。そうした繰り延べは5%〜100%好ましくは10〜50%の範囲となろう。当業者には自明であろうが、長期にわたる5%の低下はもっと短期間での100%の低下と同程度に有効かもしれない。やはり当業者には自明であろうが、そうした繰り延べは実際に使用する特定の機能性核酸に、また標的細胞集団に、また従って最終的には本願の技術的教示に従う治療および/予防の対象疾患に、大きく依存する。その限りで、長期にわたる5%の低下はもっと短期間での100%の低下と同程度に有効かもしれない。やはり当業者には自明であろうが、そうしたレベル低下の繰り延べは前述のいずれのレベルでも、すなわち機能(RTP801によって示される任意の機能)低下の繰り延べ、タンパク質発現低下の繰り延べ、またはmRNA発現レベル低下の繰り延べの形で起こりうる。
【０１７４】
好ましい実施形態では、第1ストレッチは少なくとも14連続ヌクレオチドを、好ましくは14連続ヌクレオチドを含む。当業者には自明であろうが、第1ストレッチはRTP801をコードする核酸配列(特にRTP801の発現を抑制する必要のある翻訳系内に存在する形での、RTP801をコードする核酸配列)に特異的に対処することを可能にする好適な鎖長を有するのがよい。やはりいかなる理論にも、または本発明による核酸のいかなる作用形態にも、縛られるつもりはないが、本発明による核酸とRTP801をコードする核酸配列の間には、好ましくは転写レベルで、すなわちRTP801をコードする核酸配列からのmRNA生成後に、相互作用が存在する模様である。本発明による任意の核酸配列はゲノムまたは翻訳系のトランスクリプトームに含まれるある配列に対して同一性または相補性を有する可能性があるため、第1ストレッチの鎖長は、RTP801をコードする核酸配列と本発明による核酸の一方のストランドとの間にはある種の塩基対合が実際に起こるとの想定の下に、RTP801をコードする配列だけがそうした塩基対合に当てられ、ゲノムまたはトランスクリプトームの他のコード配列好ましくは他の必須コード配列はそうした塩基対合に当てられないことを確実にするような長さにするのがよい。そうした鎖長により、標的以外への作用の発生を減らし、好ましくは一掃することができる。RTP801とそれをコードする核酸配列への特異的対処というこの種のストリンジェンシーを強めるには、第1ストレッチは鎖長を少なくとも18または19ヌクレオチドとするのが好ましい。第1ストレッチの鎖長の上限は好ましくは50ヌクレオチドであるが、鎖長はそれよりもずっと長く、100、200、さらには500ヌクレオチドを含んでもよいし、またこれらの間の任意の長さでもよい。それはさておき、当業者は短めの第1ストレッチを好むであろう。特に、本発明による核酸を化学合成する場合にはそうであるが、それは配列が短ければ短いほど、合成に要する時間も材料も少なくて済むし、間違ったヌクレオチドが合成配列に挿入される割合も低くなるためである。第1ストレッチの鎖長を決める場合に考慮する必要があるもう1つの因子は、一般に50ヌクレオチド以上の鎖長では、非特異的インターフェロン応答が場合により見られることである。この種の非特異的インターフェロン応答が耐えられるかどうかは個別の治療対象疾患次第である。たとえば、インターフェロン応答および/または遺伝子発現を病変細胞に限定させることができるならば、インターフェロン応答は耐えられよう。
【０１７５】
この点を考えると、第1ストレッチのより好ましい鎖長は約14〜40ヌクレオチド、18〜30ヌクレオチド、19〜27ヌクレオチド、21〜27ヌクレオチド、および19〜23ヌクレオチドである。
第1ストレッチに関する前述の配慮はそのまま第2ストレッチにも当てはまるので、第1ストレッチに関する任意の鎖長が第2ストレッチにも適用されよう。本発明では、第1ストレッチの鎖長は第2ストレッチの鎖長とは異なってもよいが、両配列の鎖長は同じであるのが好ましい。
【０１７６】
該核酸の基本設計によれば、第1ストレッチと第2ストレッチは本発明による核酸の第1ストランドと第2ストランドにそれぞれ属する。第1ストランドおよび/または第2ストランドはいずれの末端にも、すなわち5'末端、3'末端のいずれにも1個または数個のヌクレオチドを、好ましくは追加のヌクレオチドを、任意の組み合わせで含んでよいものとする。
これに関連して、各ストランドに対応するストレッチの末端を越える個別ストランドのヌクレオチドは、該ストレッチの相補性/同一性に、従ってRTP801をコードする核酸配列への特異的対処に、さらに寄与させるよう使用することができるものとする。
【０１７７】
基本的に、本願の技術的教示によれば、本発明による核酸は、RTP801をコードする、好ましくはRTP801の発現を抑制する必要のある発現系内の、RTP801をコードする核酸配列の任意の部分に対処することができる。その限りで、本発明は本願で規定するような特質を有する任意の核酸を含み、本発明による核酸の、相補性および同一性を有するストランドおよびストレッチは基本的に、RTP801をコードする核酸配列の任意のヌクレオチドから開始することができる。従って、本発明による核酸の第1ストレッチがRTP801をコードする核酸配列に対して相補性を有する、すなわちそのアンチセンスストランドである、またはそれに対してアンチセンス方向にある限りで、該ストレッチの最初のヌクレオチドすなわち5'最末端のヌクレオチドはRTP801をコードする核酸配列の3'末端に位置する最後のヌクレオチドに対応すなわちアラインメントする。さらなる実施形態では、そうした5'最末端のヌクレオチドはRTP801をコードする核酸配列の最後から2番目のヌクレオチド対応し、以下同様にして最後の位置に至るが、アンチセンスストランドストレッチの鎖長からして、本発明による核酸のアンチセンスストランドがRTP801をコードする核酸配列に対して相補性を有することをなお可能にする。その限りで、本発明による任意の核酸は本発明の範囲内であり、RTP801をコードする核酸配列をその5'最末端から走査し、本発明による核酸の基本設計をかぶせ、本発明によるそうした核酸について特質を具現することにより、生成させることができる。同じ配慮は、本願で開示する実施形態にも当てはまる。本発明による核酸の相補性と同一性が第1ストレッチと第2ストレッチによってそれぞれもたらされるだけでなく、そうした相補性と同一性が第1および第2ストレッチをそれぞれ越え、そこでそれぞれ第1ストランドおよび第2ストランドの一部となるような、単数または複数のヌクレオチドにも関わる。
【０１７８】
本願で開示する本発明による種々の核酸のうち(Table Aの)内部参照番号14、22、23、25、27、39、41、42、49および50の核酸は特に好ましい。ついでに言えば、本発明によるこれらの核酸は、ヒトと動物(たとえばラットおよび/またはマウス)モデルの両方に使用可能であるため特に有用である。本発明によるこれら特定の核酸の驚くべき利点は、これらの核酸がヒトと動物モデルの両方に有効であり、動物モデルで得られる試験結果が動物モデルから人間へとそのまま、すなわちヒト配列に(本発明による核酸が、種間で−特に動物モデルに使用される種と究極の好ましい生物または患者としての人間との間で−異なる配列を含めるように設計されている場合には必要となる)何らかの変化を加える必要もなく、横滑りさせられる点にある。さらに、これらの核酸が実施例でも開示するような修飾パターンを有する点も好ましい。
【０１７９】
しかし、内部参照番号14、22、23、25、27、39、41、42、49および50を有する本発明による核酸分子の元となった配列番号3、16〜17、22〜27、29、41〜46、51〜53、66〜67、72〜77、79、91〜96および101〜102の任意の配列とそれぞれの組み合わせもまた、本発明によるさらなる核酸には部分的にしか含まれていないが、やはり本発明の範囲内である。好ましくは、そうした本発明によるさらなる核酸は配列番号3、16〜17、22〜27、29、41〜46、51〜53、66〜67、72〜77、79、91〜96および101〜102の少なくとも14連続ヌクレオチドを、より好ましくは14連続ヌクレオチド塩基対を、前Tableに示すような第1ストレッチと第2ストレッチからなる2本鎖構造のいずれかの末端に、含む。当業者には自明であろうが、本発明による核酸の、また特にそうした本発明による核酸を形成する個別ストレッチの、潜在的な鎖長を考えると、RTP801のコード配列に対する各末端側への若干のシフトが可能であり、そうした可能なシフトは両方向で最大1、2、3、4、5および6ヌクレオチド分であり、それによって生成される2本鎖核酸分子もまた本発明の範囲内とする。
【０１８０】
本発明の好ましい実施形態では、第1ストレッチと第2ストレッチは鎖長が同じである。同様に、第2ストランドと第2ストレッチが同じ鎖長であるのも好ましいし、また第1ストランドと第2ストレッチが同じ鎖長であれば、なお好ましい。さらになお好ましい実施形態では、第1ストランドは第1ストレッチだけを含み、第2ストランドは第2ストレッチだけを含む。さらになお好ましい実施形態では、第1ストレッチも第2ストレッチも、従って第1ストランドも第2ストランドも、オーバーハングを含まない。言い換えれば、本発明による2本鎖核酸は好ましくはその各末端が平滑端であることもまた本発明の範囲内である。そうした平滑端構造は、本発明による核酸の他の任意の実施形態との関連で、特に本発明による核酸が修飾パターンを、より好ましくは本願で開示するような修飾パターンを有する実施形態との関連で、実現することもできる。
【０１８１】
さらなる態様では、本発明による核酸は従って、本発明による核酸の2本鎖構造の両末端に平滑端を設けるような基本設計を有する。しかし、オーバーハングすなわち2本鎖構造から突き出た1つのまたは1ストレッチのヌクレオチドが存在することもまた本発明の範囲内である。オーバーハング存在しうるのは一般に、アンチセンスストランドの5'末端と3'末端、それにセンスストランドの5'末端と3'末端である。これらのオプションの実現はいずれか1つでも任意の組み合わせでも本発明の範囲内であるものとする。より好ましいのは、オーバーハングがアンチセンスストランドの3'末端とセンスストランドの3'末端に存在するという組み合わせである。オーバーハングがアンチセンスストランドの5'末端とセンスストランドの5'末端に存在することもまた本発明の範囲内である。さらに、オーバーハングが2本鎖構造のアンチセンスストランドだけに、より好ましくは2本鎖構造のアンチセンスストランドの3'末端に存在することも、本発明の範囲内である。
【０１８２】
オーバーハングに関連して、オーバーハングとストレッチは好ましくはストランドを形成し、またストレッチに関して本願で規定した鎖長はこれらの実施形態にも適用されるものとする。個別オーバーハングはその位置とは無関係に、少なくとも1ヌクレオチドからなる。しかし、個別オーバーハングは10ヌクレオチドを含んでよく、好ましくは2ヌクレオチドを含む。第1ストランドがRTP801をコードする核酸配列に対して相補性を有する場合には、アンチセンスストランドの3'または5'末端のオーバーハングを形成するヌクレオチド(群)もまたRTP801をコードする該核酸配列に対して相補性を有し、また第1ストランドがRTP801をコードする核酸配列に対して同一性を有する場合には、オーバーハングを形成するヌクレオチド(群)がRTP801をコードする該核酸配列に対して同一性を有することは本発明の範囲内である。同じことは本発明による核酸の基本設計の第2ストレッチに位置する任意のオーバーハングにもあてはまるが、第2ストレッチのオーバーハング設計は第1ストレッチのオーバーハング設計とは独立に扱えるものとする。
【０１８３】
オーバーハングを形成するヌクレオチドはRTP801をコードする核酸配列の対応するヌクレオチドに対し相補性も同一性も有しないこともまた本発明の範囲内である。「対応する」は本願では、また好ましくは本実施形態では、ストレッチの5'末端および/または3'末端の各後続ヌクレオチド(群)であって、RTP801をコードする核酸上にヌクレオチド対応物を有することを意味する。
【０１８４】
好ましくは、第1ストランドはその3'末端に2つのヌクレオチドを、好ましくはデオシキヌクレオチドを、なお好ましくは2つのTTを含み、および/または第2ストランドはこの種のヌクレオチドの3'末端に含むが、より好ましくは第1ストレッチと第2ストレッチの鎖長19ヌクレオチドである。こうして両ストランドはストレッチとオーバーハングからなる。この実施形態では、2本鎖構造は19塩基対からなり、オーバーハングは個別ストレッチの各3'末端の2ヌクレオチドからなる。
【０１８５】
好ましい実施形態では、第1ストレッチおよび/または第1ストランドはリボヌクレオチドを含むが、第1ストレッチはその全体がリボヌクレオチドからなるのが特に好ましい。同じことは第2ストレッチと第2ストランドにも、それぞれ言える。しかしこれに関連して、第1ストレッチと第2ストレッチのヌクレオチドは好ましい実施態様ではそれぞれことごとく修飾体である。同じことは第1ストランドと第2ストランドにも、それぞれ言える。特に末端ヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドの区別なく、OH-基を有し相応の修飾を受けることがある。そうしたOH-基は該ヌクレオチドの糖部分、より好ましくは5'OH-基の場合には5'位および/または3'OH-基の場合には3'位に由来するか、または各末端ヌクレオチドの糖部分に結合したリン酸基に由来する。該リン酸基は原則としてヌクレオチドの糖部分の任意のOH-基に結合してよい。好ましくは、該リン酸基は遊離5'OH-基の場合には糖部分の5'OH-基に、および/または遊離3'OH-基の場合には糖部分の3'OH-基に、それぞれ結合し、本願で遊離5'または3'OH-基と呼んでいるものをなお提供する。
【０１８６】
用語「末端修飾」は、本願開示の任意のRNAi設計戦略または任意のRNAi実施形態との関係では、第1および/または第2ストランドの5'または3'最末端ヌクレオチドに付加される化合物(chemical entity)を意味する。そうした末端修飾の非限定的な例は欧州特許第EP 0 586 520 B1号または第EP 0 618 925 B1号明細書の開示によれば、3'または5'リン酸、inverted  (deoxy)abasics、アミノ、フルオロ、クロロ、ブロモ、CN、CF、メトキシ、イミダゾール、カルボキシラート、チオアート、C1〜C10 低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリルまたはアラルキル、OCF3、OCN; O-、S-またはN-アルキル; O-、S-またはN-アルケニル; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2、N3; ヘテロシクロアルキル; ヘテロシクロアルカリル; アミノアルキルアミノ; ポリアルキルアミノまたは置換シリルなどである。
アルキルまたは「アルキル」を含む任意の用語は好ましくは炭素原子数1〜12の、好ましくは1〜6の、なお好ましくは1〜2の炭素原子鎖を意味する。
【０１８７】
さらなる末端修飾はビオチン基である。そうしたビオチン基は好ましくは、第1および/または第2ストランドの5'最末端または3'最末端に、または両末端に、付加する。より好ましい実施形態では、ビオチン基はポリペプチドまたはタンパク質にカップリングする。該ポリペプチドまたはタンパク質は他の前記のような末端修飾を介して付加することも本発明の範囲内である。該ポリペプチドまたはタンパク質は本発明による核酸分子にさらなる特質を付与してもよい。該ポリペプチドまたはタンパク質は特に他分子に対するリガンドとして機能してもよい。該他分子が受容体である場合には、該受容体の機能および作用は該リガンドの結合によって活性化されてもよい。該受容体は内部化活性を示し、本発明による核酸のリガンド結合体の効果的なトランスフェクションを可能にする。本発明の核酸分子にカップリングするようなリガンドの例はVEGFであり、対応する受容体はVEGF受容体である。
【０１８８】
次の表1(Table 1)に、本発明の、種々の末端修飾を有するRNAiの様々な実施形態を示す。
【０１８９】
【表１】
2008510019.tif 000002
【０１９０】
ここに開示する種々の末端修飾は好ましくは本発明による核酸のヌクレオチドのリボース部分に位置する。特に、末端修飾は、修飾対象が末端ヌクレオチドである限りで、2'OH、3'OHおよび5'OH位を非限定的に含むリボース部分のOH-基のいずれか1つに対して付加または置換される。inverted abasicsはヌクレオチド(デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド)の核酸塩基を欠く脱塩基体である。この種の化合物についてはSternberger, M., Schmiedeknecht, A., Kretschmer, A., Gebhardt, F., Leenders, F., Czauderna, F., Von Calowitz, I., Engle, M., Giese, K., Beigelman, L. & Klippel, A. (2002). Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 12, 131-43を参照。前述の末端修飾はどれも、Table 1に記載の様々な実施形態のRNAiと併用してもよく、前記の5'末端修飾は通常、siRNA分子のセンスストランドにだけ存在する。
【０１９１】
さらなる修飾は個別ヌクレオチドの核酸塩基部分、糖部分またはリン酸部分に関連する。
核酸塩基部分のそうした修飾は、アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンおよびウラシルの各誘導体が修飾されるという形をとる。特に好ましい修飾核酸塩基はイノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、6-メチル-、2-プロピルおよび他アルキル-アデニン、5-ハロウラシル、5-ハロシトシン、6-アザシトシン、6-アザチミン、シュードウラシル、4-チオウラシル、8-ハロアデニン、8-アミノアデニン、8-チオールアデニン、8-チオールアルキルアデニン、8-ヒドロキシルアデニンおよび他の8-置換アデニン、8-ハログアニン、8-アミノグアニン、8-チオールグアニン、8-チオアルキルグアニン、8-ヒドロキシルグアニンおよび他の置換グアニン、他のアザ-およびデアザ-アデニン、他のアザ-およびデアザ-グアニン、5-トリフルオロメチルウラシルおよび5-トリフルオロシトシンを含む群より選択される。
【０１９２】
別の好ましい実施形態では、ヌクレオチドの糖部分が修飾されるが、そうした修飾は好ましくはヌクレオチドのリボース部分、デオキシリボース部分のそれぞれ2'位の修飾とする。より好ましくは、2'OH基はアミノ、フルオロ、アルコキシおよびアルキルを含む群より選択される基または部分に置き換わる。アルコキシは好ましくは、メトキシまたはエトキシである。また、アルキルは好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソブチル、ブチルおよびイソブチルである。さらになお好ましくは、修飾の種類に関係なく、ヌクレオチドはリボヌクレオチドである。
【０１９３】
リン酸部分の修飾は好ましくはホスホロチオアートを含む群より選択される。
当業者には自明であろうが、本発明の核酸は多数のヌクレオチドからなるが、それらのヌクレオチドはホスホジエステル結合により、またはホスホロチオアート結合により、または両者の混合により、個別のストランドまたはストレッチのヌクレオチド配列の長さ沿いに連結される。
使用されるヌクレオチドのさらなる形態は実際には、国際公開第WO 03/070918号パンフレットで開示されているようなsiNAなどでもよい。
【０１９４】
本発明による核酸の第1ストレッチと第1ストランドをそれぞれ形成するヌクレオチドは単数または複数の修飾ヌクレオチドを含んでよいが、個別の修飾ヌクレオチドは好ましくは本願で開示するような修飾を有する。修飾は、そうした特定の修飾に加えて、ある種の標識そのものでも、ある種の標識を含んでもよいが、そうした標識は化学発光標識、蛍光標識および放射性標識をふくむ群より選択される。その種の標識は技術上周知であり、たとえばAusubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1998)に記載されている。本発明による標識核酸は、好ましくは本願開示の任意の疾患に関連する診断、作用部位および治療段階のモニタリングに用いてもよい。
【０１９５】
好ましい実施形態では、本発明による核酸は修飾により、センスストレッチまたはセンスストランドのピリミジンヌクレオチドは2'O-Meピリミジンヌクレオチドとなり、また追加的または択一的に、センスストレッチまたはセンスストランドのプリンヌクレオチドは2'-デオキシプリンヌクレオチドとなる。さらなる実施形態では、センスストレッチまたはセンスストランドのピリミジンヌクレオチドは2'-デオキシ-2'-フルオロピリミジンヌクレオチドである。
【０１９６】
代替実施形態では、修飾はヌクレオチドの化学的性質に基づかない、すなわち修飾は修飾対象のヌクレオチドがプリン型、ピリミジン型のいずれであるかに依存するが、本発明による核酸の基本設計の全体としての2本鎖構造内の、個別ヌクレオチドの空間的配置に主に基づく。
【０１９７】
もっと具体的に言えば、第1ストランドおよび第1ストレッチはそれぞれ、または第2ストランドおよび第2ストレッチはそれぞれ、該ストレッチおよびストランドをそれぞれ形成するヌクレオチドの修飾の空間的なパターンを示す。
まず第1ストレッチに焦点を合わせると、修飾ヌクレオチド群と非修飾ヌクレオチド群のパターンが存在する。非修飾ヌクレオチド群はここでは隣接ヌクレオチド群ともいう。より好ましくは、該パターンは修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドの群からなる。さらになお好ましくは、該パターンは規則的なパターンであり、さらになお好ましくは本発明の核酸の第1ストレッチの鎖長に沿った交互パターンである。修飾ヌクレオチド群は1個または数個の修飾ヌクレオチド好ましくは2'位修飾ヌクレオチドすなわち糖部分に修飾を有するヌクレオチドからなる。この修飾はより好ましくは2'O-Me修飾である。
非修飾ヌクレオチド群は1個または数個の非修飾ヌクレオチドからなるが、該非修飾ヌクレオチドは好ましくはリボヌクレオチドであるか、または修飾ヌクレオチド群を形成するヌクレオチドが示す修飾とは異なる修飾を有するヌクレオチドである。さらになお好ましくは、該非修飾ヌクレオチドはリボヌクレオチドである。非修飾を意味するnon-modifiedとnot-modifiedは特に断らない限り互換的に使用される。本発明による核酸の第1ストレッチは修飾ヌクレオチド群から始まっても、非修飾ヌクレオチド群から始まってもよいが、修飾ヌクレオチド群から始まるのが好ましい。最も好ましくは、修飾ヌクレオチド群は単一ヌクレオチドからなる。本実施形態に関連して、第1ストレッチは好ましくは、RTP801をコードする核酸に対してアンチセンス方向にある。修飾ヌクレオチド群を形成するヌクレオチドが示す修飾は第1ストレッチ上のすべての修飾ヌクレオチド群で同じであることもまた本発明の範囲内である。しかし、修飾ヌクレオチド群によっては第1ストレッチ上の1つまたはいくつかの修飾ヌクレオチド群とは異なる修飾を有することもまた本発明の範囲内である。
【０１９８】
本発明による核酸の第2ストランドでは、第1ストレッチに関して述べたようなパターンをやはり実現することができる。一実施形態では、第2ストレッチ上にも第1ストレッチに関して述べたのと同じ特質を実現することができるが、第2ストレッチは、RTP801をコードする核酸に対してセンス方向にある限りで、本発明による核酸の第2ストランドは非修飾ヌクレオチド群から始まるのが好ましい。
【０１９９】
本発明による2本鎖構造を含む核酸は、開示の修飾パターンを有する第1ストレッチを含んでもよい。あるいは、本発明による2本鎖核酸は前述の修飾パターンを有する第2ストレッチを含んでもよい。しかし、本発明による2本鎖核酸は第1ストレッチと第2ストレッチからなり、その両方が開示のような空間的修飾パターンを有するのが最も好ましい。
修飾ヌクレオチド群および非修飾ヌクレオチド群の大きさや実際に使用される修飾という点での空間的な修飾パターンの特質が両ストレッチ上で同じであることは本発明の範囲内である。好ましくは、第1ストレッチ上の空間的な修飾パターンは、第1ストレッチ上の修飾ヌクレオチド群が第2ストレッチ上の非修飾ヌクレオチド群と向き合い、逆もまたそうなるように、シフトさせる。しかし、パターンが厳密にアライニングさせる、すなわち第1ストレッチ上の修飾ヌクレオチド群が第2ストレッチ上の非修飾ヌクレオチド群と向き合い、またすなわち第1ストレッチ上の非修飾ヌクレオチド群が第2ストレッチ上の非修飾ヌクレオチド群と向き合うようにすることもまた本発明の範囲内である。第1ストレッチ上と第2ストレッチ上の空間的な修飾パターンが互いにシフトし合って、一方のストレッチ上の修飾ヌクレオチド群の最初の部分だけが他方のストレッチ上の非修飾群の一部分と向き合い、該修飾ヌクレオチド群の2番目の部分は別の修飾ヌクレオチド群と向き合うようにすることもなお本発明の範囲内である。本発明の核酸の(両)ストレッチの空間的修飾パターンに関する開示が本発明の核酸の(両)ストランドにも当てはまることは本発明の範囲内である。しかし、該核酸のストレッチは空間的修飾パターンを含み、ストランドはそうしたストレッチと開示のような単数または複数のオーバーハングとを含むのが好ましい。オーバーハングはアンチセンスストランドかセンスストランドかまたは両ストランドの3'末端のリン酸基であるのが特に好ましく、アンチセンス、センス両ストランドの3'末端のリン酸基であるのがなお好ましい。さらになお好ましい実施形態では、該リン酸基は本願で定義するようなリン酸基である。
【０２００】
本発明による核酸が第1および第2ストランドを結合するリンカーを示すこともまた本発明の範囲内である。そうしたリンカーは好ましくは高分子である。該高分子は合成物でも天然物でもよい。合成リンカーとしてはPEGまたはポリヌクレオチドなどが考えられる。そうしたリンカーは第1ストレッチの第2ストレッチ上への完全なまたは部分的な折り畳みおよびその逆を、可能にするように設計するのが好ましい。
【０２０１】
最後に、本発明による核酸が合成物、化学合成物、単離物、または天然由来物たとえば組み換え技術の産物であることは本発明の範囲内である。本発明による任意の核酸の調製に関連して、本願で開示するような修飾は本発明による各核酸の調製前・中・後に導入しうることは技術上周知である。
【０２０２】
本発明によるベクターは本発明による核酸を含む。また、該ベクターは、該核酸の誘導、発現および転写を周知のように細胞選択的に調節するための要素を含んでもよい。該プラスミドは異種遺伝物質たとえば本発明による核酸の転写を調節するためのプロモーターを含んでもよいし、そうしたプロモーターは選択的転写を可能にする構成的、誘導的いずれのプロモーターでもよい。必要な転写レベルの達成に必要とされる可能性のあるエンハンサーを随意に含めてもよい。エンハンサーは一般に任意の非転写DNA配列であり、コード配列に隣接的に、すなわちシスに、作用して、プロモーターによって指示される基本転写レベルを変化させる。そうしたコンストラクトの発現は技術上周知であり、たとえば本発明による核酸の第1、第2ストランドおよび第1、第2ストレッチに対応するタンデムコンストラクトを用意する、それぞれに別々のプロモーターを設ける、といった方法で可能になる。
【０２０３】
本発明による核酸の製作または発現、好ましくはin vivo発現、なお好ましくは本発明による核酸を必要とする患者体内での発現に際しては、そうした製作または発現に発現ベクター特に哺乳動物発現ベクターを使用するのが好ましい。発現ベクターは技術上周知であり、好ましくはプラスミド、コスミド、ウイルス発現系を含む。好ましいウイルス発現系の非限定的な例はアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスなどである。
細胞または組織にベクターを導入する方法は技術上周知である。そうした方法の概説は次の資料に求めることができる: Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989, 1992)またはAusubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)。
【０２０４】
好適な方法は特にトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、および組み換えウイルスベクターによる感染などである。本発明に関連して、ベクターのもう1つの特徴は一実施形態ではプロモーターや調節因子などのような発現制限機構であるが、そうした機構は所期の細胞型に対して特異的であり、従って所期の発現を可能にするようなバックグラウンドが与えられて初めて本発明による核酸の発現を許容する。
さらなる態様では、本発明は本発明による核酸および/または本発明によるベクターを、含む医薬組成物
【０２０５】
製薬上許容しうる担体、希釈剤または補助薬または他の基剤と共に含む医薬組成物に関する。そうした担体、希釈剤、補助薬または基剤は不活性かつ無害であるのが好ましい。該医薬組成物はその様々な実施形態において、多様な投与形態に適合させる。そうした投与形態はの例は全身および局所投与、それに経口、皮下、非経口、静脈内、動脈内、筋内、腹腔内、鼻内およびintrategral投与などである。
【０２０６】
当業者には自明であろうが、該医薬組成物および各核酸、ベクターの量はそれぞれ、個別患者の病態、投与部位および方法、投与スケジュール、患者の年齢、性別、体重および医師が把握しているその他の因子に依存しよう。従って、医薬としての予防および/または治療有効量はそうした技術上周知の因子によって決まる。好ましくは、該有効量は病態の改善に限られる改善の実現、または当業者が適正な基準として設けている症状および他指標の回復、改善または解消の促進に有効である。
【０２０７】
好ましい実施形態では、本発明による医薬組成物は他の薬理活性化合物を含んでもよい。好ましくは、そうした他の薬理活性化合物は細胞内細胞送達の取り込みを可能にする化合物、エンドソーム放出を可能にする化合物、循環時間の延長を可能にする化合物、内皮細胞または病変細胞への誘導を可能にする化合物を含む群より選択される。エンドソーム放出用の好ましい化合物はクロロキン、およびATP依存性H+ポンプ阻害剤である。
医薬組成物は好ましくは、単回投与または頻回投与用に調製する。
【０２０８】
本発明による医薬組成物は、血管系の好ましくない発生または増殖に関連する任意の疾患、および本願開示の任意の疾患および病態に使用することができる。好ましくは、その種の疾患は腫瘍疾患である。腫瘍疾患のなかでは次の腫瘍が最も好ましい: 子宮内膜がん、大腸がん、神経膠腫、子宮内膜がん、腺がん、子宮内膜増殖症、Cowden症候群、遺伝性非ポリポーシス大腸がん、Li-Fraumene症候群、乳-卵巣がん、前立腺がん(Ali, I. U., Journal of the National Cancer Institute, Vol. 92, no. 11, Jun. 7, 2000, page 861-863)、Bannayan-Zonana症候群、LDD (Lhermitte-Duklos症候群) (Macleod, K., supra)、Cow疾患(CD)やBannayan-Ruvalcaba-Rily症候群(BRR)を含む過誤腫-大頭疾患、皮膚粘膜病変(trichilemmonmasなど)、大頭症、知的障害、胃腸過誤腫、脂肪腫、甲状腺腫、乳房線維嚢胞病、小脳異形成性神経節細胞腫、それに乳房および甲状腺悪性腫瘍(Vazquez, F., Sellers, W.R., supra)。
【０２０９】
本発明による医薬組成物による治療の対象となる腫瘍疾患は好ましくは晩期腫瘍疾患であるものとする。別の実施形態では、腫瘍疾患は腫瘍抑制因子陰性の細胞に関係するが、より好ましくは該腫瘍抑制因子はPTENである。
【０２１０】
本発明による医薬組成物は、本願で開示するような疾患を予防および/または治療する方法に使用することもできるが、該方法は開示の任意の疾患のための、む本発明による核酸、本発明によるベクター、または本発明による医薬組成物または薬剤の投与を含む。
さらなる態様では、本発明はRTP801の抑制特にRTP801機能の抑制に好適な核酸を設計またはスクリーニングする方法に関する。該方法は本願開示の核酸配列の使用およびそうした核酸配列の好適なアッセイによる評価を含む。そうしたアッセイは技術上周知であり、また本願の実施例などでも開示する。さらなるステップでは2本鎖核酸を、好ましくは本願開示の設計原則に従って、設計するが、該核酸はRTP801を、好ましくはRNA干渉などのような転写後遺伝子サイレンシング機構などとの関連で、抑制するのに適する。こうして得られた、すなわち設計またはスクリーニングされた核酸はそれぞれのアッセイで評価し、結果を、すなわち本発明による核酸と新たに設計またはスクリーニングされた核酸の作用を、比較する。安定性か効果の点で、またその両方の点で優る場合には、新設計またはスクリーニング核酸のほうがより好適とするのが好ましい。該方法は本発明による核酸を出発点として使用する場合に特に有効であろう。従って、新核酸分子を開示の原則に基づいて設計するが、その場合にRTP801 mRNA上の標的配列を、本発明による核酸に対応するRTP801 mRNA上の標的配列に対してわずかにシフトさせることも本発明の範囲内である。好ましくは、新核酸は少なくとも単数または複数ヌクレオチド分だけ、標的mRNA上のストレッチに対して、RTP801をコードするmRNAの5'または3'方向にシフトさせる。しかし、このシフトが両方向に同時に起こることも本発明の範囲内であり、それは出発点となった本発明による核酸を新核酸が組み込むことを意味する。本発明による、出発点としての核酸の伸張が3'末端側か5'末端側に偏ることもまた本発明の範囲内である。そうした偏りがある場合には、新核酸の3'末端側か5'末端側のどちらかがより長くなる、つまり伸張幅がより大きくなる。センスストランドおよび/またはセンスストランドの3'末端側か5'末端側のどちらかを伸張して新核酸分子を生成させる場合には、次のような一連のステップが一般に適用される。RTP801 mRNAの5'末端側にシフトさせる場合には、アンチセンスストランドの3'末端側をRTP801 mRNAの5'末端のシフト幅にあたるヌクレオチド個数分だけ伸張させる必要がある。こうして新核酸のアンチセンスストランドの3'末端側に付加されることになるヌクレオチドは、出発点としての本発明による核酸に対応するRTP801 mRNA上の標的配列の5'末端の後続ヌクレオチドに対して相補性を有する。同じ操作はセンスストランドに対しても行わなければならない。しかし、センスストランドに対して付加されるヌクレオチドは、アンチセンスストランドの3'末端に新たに付加されるヌクレオチドに対応する、すなわち相補性を有する必要がある。これは、それらがセンスストランドの5'末端に付加されなければならないことを意味する。しかし、後者の、センスストランド上のステップが必要となるのは、アンチセンスストランドとは別にセンスストランドもまたシフトさせる必要がある場合に限られる。それは本発明の好ましい実施態様の場合にほかならない。このシフトの幅は当業者次第であるが、このシフトは、新核酸もまた、本願開示の核酸分子が示すような少なくとも14ヌクレオチドの、好ましくは14連続ヌクレオチドのストレッチを含むように行うのが好ましい。
【０２１１】
本願開示の任意の核酸の合成は技術上周知である。そうした合成は特にBeaucage S.L. and Iyer R.P., Tetrahedron 1992;48:2223-2311; Beaucage S.L. and Iyer R.P., Tetrahedron 1993;49:6123-6194およびCaruthers M.H. et al., Methods Enzymol. 1987;154:287-313などに記載されており、チオアートの合成はEckstein F., Ann. Rev. Biochem. 1985;54:367-402などに記載されており、RNA分子の合成はSproat B., in Humana Press 2005 Edited by Herdewijn P.; Kap. 2:17-31に記載されており、また各下流工程はPingould A. et al., in IRL Press 1989 Edited by Oliver R.W.A.; Kap. 7:183-208やSproat B.(前掲)に記載されている。
【０２１２】
RTP801対応のsiRNAはRTP801の既知配列(配列番号1)に基づき開示のような技術上周知の方法を使用して作製することができるし、また開示のような種々の修飾により安定化させることができる。詳しくは実施例9を参照。
【０２１３】
さらに本願開示の本発明の方法に関連して、該方法に追加のRNA分子を使用してもよい。たとえば本発明の抑制的RNA分子の例はTable A〜Cに記載の配列中に存在する少なくとも7〜10連続ヌクレオチドのストレッチを含むのが好ましい1本鎖オリゴリボヌクレオチドであり、該オリゴリボヌクレオチドは細胞内複合体によって認識される特定コンフォメーションの2本鎖領域を形成する(および/または含む)ことができるが、そうした複合体による認識は、対応する内在性遺伝子およびそうしたRNA分子をコードするDNA分子を抑制することのできる低分子量のRNAへと該オリゴリボヌクレオチドを分解させる結果となる。前記の対応する内在性遺伝子は好ましくは801遺伝子であるが、追加的にVEGF遺伝子および/またはVEGFR-1遺伝子でもよい。本発明はまた、前記の1本鎖オリゴリボヌクレオチドを担体好ましくは製薬上許容しうる担体中に含む組成物を提供する。
【０２１４】
また、本発明は本願開示の諸々の病態特に脈絡膜血管新生に関係する病態に対応した併用療法を提供する。該併用療法では、RTP801、VEGFR両遺伝子を抑制して治療対象疾患の症状の緩和を図る。これらの遺伝子はsiRNA類または(アプタマー抗体を含む)抗体類または両方の組み合わせを使用して抑制してもよい。従って本発明はまた、RTP801阻害剤とVEGFまたはVEGFR-1阻害剤とを含む新規な医薬組成物を提供するが、該RTP801阻害剤は好ましくはsiRNAより好ましくはTable A〜Cに記載のsiRNA特にTable AのsiRNA番号14、22、23、25、27、39、41、42、49および50であり、またVEGF/VEGFR-1阻害剤は随意に抗体またはアプタマーである。薬剤の調製への該化合物(すなわちRTP801 siRNAとVEGF抗体または本願開示の他の組み合わせ例)の併用もまた本発明の一部である。
【０２１５】
従って、RTP801 siRNAたとえばTable A〜Cに記載のsiRNA特にTable AのsiRNA番号14、22、23、25、27、39、41、42、49および50は、VEGFまたはVEGFR-1(VEGF受容体1)を標的とする薬剤と併せて投与してもよい。そうした薬剤はすでに市販されているかまたは種々の承認段階を迎えているが、種々のメカニズムで作用する。抗体および抗体断片たとえばラニビズマブ(ranibizumab)(商品名Lucentis; Genentech社)は放出VEGFに付着してVEGFの活性受容体への結合をを阻害する。リガンド/抗体に似た働きをするアプタマー(商品名Macugen; Eyetech/Pfizer。湿潤型AMD用として最近、FDAの承認を得た)もまた有力候補である。Macugenは細胞外VEGFと結合してその活性を遮断する。これらの薬剤は硝子体内注射により局所投与される。抗VEGF siRNA系化合物[たとえばAcuityのCand5 (VEGF阻害剤)またはSIRNAの027 (VEGFR-1阻害剤)]もまた使用できる。また、低分子アミノステロールSqualamine(Genera)は全身投与型であるが、内皮細胞内のシグナル伝達に関わるVEGFや他の増殖因子を阻害するなど血管新生プロセスを多面的に妨げると報告されている。
【０２１６】
RTP801阻害剤好ましくはsiRNAと前記VEGF/VEGFR-1阻害剤の併用投与は、単剤療法の場合の投与量がどうであれ単剤療法よりも併用療法のほうがより有効であるという相乗効果をもたらしうる。この相乗効果は実施例6で詳述するように、本願譲受人による予備試験結果からも裏付けられる。
RTP801は異なる作用機序を有し、またVEGF-VEGFR阻害剤と潜在的に相乗的である。あるRTP801 KOマウス研究報告は、VEGF mRNAの眼内発現はWTマウスと同程度に高いにも関わらず、KOマウスには生体保護の表現型が存続することを示している。本願譲受人の追加の予備試験データは、網膜病変の治療ではRTP801の阻害がVEGF-VEGFR調節軸の阻害と相乗的であるとの可能性を示す。本願発明人は適切な実験の中で、AMDモデルへのRTP801阻害剤siRNAの投与(実施例6を参照)がRTP801自体の抑制を招くだけでなくMCP1(マクロファージ走化性因子)の発現抑制にもつながることを見出した。従って、RTP801の阻害は同時に抗血管新生、神経保護および抗炎症の効果をも及ぼす。
【０２１７】
本発明との関連では、本願開示の任意のsiRNA分子、または内在性細胞内複合体(たとえばDICER。前記を参照)によるプロセッシングを受けて本願開示のsiRNA分子を形成するような任意の長い2本鎖RNA分子(一般に鎖長が25〜500ヌクレオチド)、または本願開示のsiRNA分子を含む分子が本願開示の疾患または障害の治療に使用することができる。
【０２１８】
本発明の分子および組成物による治療が可能な追加の障害は各種の脈絡膜血管新生(CNV)であり、CNVは湿潤型AMDだけでなく、他の眼病変たとえば眼ヒストプラスマ症、血管線条、ブルッフ膜破裂、近視性変性、眼腫瘍、ある種の網膜変性疾患などでも起こる。
本発明の追加の態様は、アポトーシス関連疾患の治療法を提供する。無統制の病変細胞増殖に関連する疾患または障害たとえばがん、乾癬、自己免疫疾患などの治療法、さらには虚血や適正血流障害に関連する疾患たとえば心筋梗塞(MI)や脳卒中の治療法もまた提供される。「がん」または「腫瘍」は無統制に増殖する異常細胞塊をいう。これらの用語は、良性または悪性の原発性腫瘍と体内の他部位に広がった続発性腫瘍または転移を含む。がんタイプの疾患例は腺がん(乳、結腸、肺など)、白血病(B細胞白血病など)、リンパ腫(B細胞リンパ腫など)、芽細胞腫(たとえば神経芽細胞腫)、それに黒色腫などである。
【０２１９】
本発明はまた、単数または複数の本発明化合物を担体好ましくは製薬上許容可能な担体中に含む組成物を提供する。この組成物は異なる遺伝子に対応する複数のsiRNAまたは同じ遺伝子に対応する異なるsiRNAの混合体を含んでもよい。RTP801遺伝子に対応するsiRNAとVEGF遺伝子および/またはVEGF-R1遺伝子に対応するsiRNAとを含む組成物が想定される。
【０２２０】
本発明の別の化合物は前記の本発明化合物(構造A)を単数または複数の本発明化合物(構造A)に共有または非共有結合させて含む。この化合物は担体好ましくは製薬上許容可能な担体に混ぜて送達し、細胞内で内在性細胞複合体によるプロセッシングを受けて単数または複数の本発明siRNAを生成するようにしてもよい。本発明の別の化合物は前記の本発明化合物(構造A)を別の遺伝子特にVEGF遺伝子および/またはVEGF-R1遺伝子に対応するsiRNAに共有または非共有結合させて含む。
【０２２１】
本発明はまた、RTP801阻害剤好ましくはsiRNAを前記VEGF/VEGFR-1阻害剤のいずれかに化学(共有または非共有)結合させてなる新規化合物を含む。想定される特定の化合物は、siRNA RTP801阻害剤をVEGFまたはVEGF受容体-1に対する抗体に共有結合させたものである。そうした新規化合物の生産方法は技術上周知である。
本発明はまた、複数のsiRNAを含むタンデム2本鎖構造を含むが、該2本鎖構造は細胞内プロセッシングを受けて複数の異なるsiRNAを生成し、そのうちの1つは801を阻害し、もう1つはVEGF/VEGFR-1を阻害する。関連態様では、本発明はまた、複数のsiRNAを含むタンデム2本鎖構造を含むが、該2本鎖構造は細胞内で分解され、いずれも801を阻害する複数の異なるsiRNAを生成する。
【０２２２】
特に、単数または複数のステム・ループ構造を含む長いオリゴヌクレオチド(鎖長は一般におよそ80〜500ヌクレオチド)はステム領域に本発明のオリゴヌクレオチド配列を含むが、担体好ましくは製薬上許容可能な担体に混ぜて送達され、また細胞内で内在性細胞複合体(前述のDROSHAやDICERなど)によるプロセッシングを受けて単数または複数の、より短い2本鎖構造(siRNA)を、すなわち本発明のオリゴヌクレオチドを、生成するものと見込まれる。この長いオリゴヌクレオチドはタンデムshRNAコンストラクトと呼ぶことができる。この長いオリゴヌクレオチドは単数または複数のステム・ループ構造を含む1本鎖オリゴヌクレオチドであり、各ステム領域は801遺伝子のセンスおよび対応するアンチセンスsiRNA配列を含むものと見込まれる。特に、このオリゴヌクレオチドはTable A〜Cに示されるセンスおよびアンチセンスsiRNA配列を含むものと見込まれる。あるいは、このタンデムshRNAコンストラクトは801遺伝子のセンスおよび対応するアンチセンスsiRNA配列に加えて別の遺伝子たとえばVEGFまたはVEGF-R1遺伝子などのセンスおよび対応するアンチセンスsiRNA配列を含んでもよい。
【０２２３】
前述のように、RTP801阻害剤のsiRNAは医薬組成物の主有効成分でもよいし、複数のsiRNA(または複数のsiRNAをコードする/内因的に産生する分子であって、複数のsiRNAをコードする分子の混合体であるか、単数および/または複数のタンデム分子であるかを問わない)を含有する医薬組成物の有効成分の1つでもよいが、その場合、該医薬組成物はさらに、単数または複数の追加遺伝子を標的とする単数または複数の追加siRNA分子からなる。RTP801と該追加遺伝子の同時阻害はおそらく、下記による本願開示の疾患治療に相加または相乗効果をもたらすであろう:
【０２２４】
急性腎不全(ARF)または他の微小血管障害: ARF治療用の医薬組成物は次の化合物の組み合わせからなってもよい: 1) RTP801 siRNAとp53 siRNAのダイマー; 2)RTP801およびFas siRNAダイマー; 3)RTP801およびBax siRNAダイマー; 4)p53およびFas siRNAダイマー; 5) RTP801およびBax siRNAダイマー; 6) RTP801およびNoxa siRNAダイマー; 7) RTP801およびPuma siRNAダイマー; 8) RTP801(REDD1)およびRTP801L (REDD2) siRNAダイマー; 9) RTP801 siRNA、Fas siRNA、およびのRTP801L siRNA、p53 siRNA、Bax siRNA、Noxa siRNAまたはPuma siRNAのいずれか一化合物で形成されるトリマーまたはポリマー(すなわち3つのsiRNAをコードするタンデム分子)。
【０２２５】
黄斑変性症(MD)、糖尿病網膜症(DR)、脊髄損傷: MD、DRおよび脊髄損傷治療用の医薬組成物は次の化合物の組み合わせからなってもよい: 1) RTP801 siRNAとVEGF siRNA、VEGF-R1 siRNA、VEGF-R2 siRNA、PKCbeta siRNA、MCP1 siRNA、eNOS siRNA、KLF2 siRNA、RTP801L siRNAのずれか一化合物との組み合わせ(物理的混合体またはタンデム分子); 2) RTP801 siRNAと前記リストの複数siRNAとの組み合わせ(3つのsiRNAをコードする物理的混合体またはタンデム分子、またはそれらの組み合わせ)。
【０２２６】
COPDおよび呼吸器障害: 呼吸器障害治療用の医薬組成物は次の化合物の組み合わせからなってもよい: RTP801 siRNAと次のうちの単数または複数の遺伝子を標的にするsiRNAとの組み合わせ: エラスターゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、ホスホリパーゼ、キャスパーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、およびセラミドシンターゼ。
またRTP801 siRNAまたはRTP801 siRNAを含むまたはコードする任意の核酸分子は抗体に(共有または非共有)結合させて、下記による本願開示の疾患治療のターゲティング効率を高めるようにすることもできる:
ARF: 抗Fas抗体(好ましくは中和抗体)。
MD、RD、脊髄損傷: 抗Fas抗体、抗MCP1抗体、抗VEGFR1抗体および抗VEGFR2抗体。これらの抗体は好ましくは中和抗体である。
【０２２７】
本願開示のsiRNA配列を(核酸修飾を適宜加えて)含む任意の分子たとえばアンチセンスDNA分子は特に好ましいので、対応するsiRNAと同様に、本願開示の諸々の用途および方法に使用してもよい。
本発明はまた、本願開示の疾患などのような疾患の患者を治療する方法であって、該患者を治療するために該患者に前記組成物または化合物を治療有効量投与するステップを含む方法を包含する。
【０２２８】
用語「アンチセンス」(AS)または「アンチセンス断片」は、対応する遺伝子(この場合はRTP801)の内在性ゲノムコピーの発現を低下させる活性すなわちアンチセンス阻害活性を有する(デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの混合体を含む)ポリヌクレオチド断片を意味する。RTP801 ASポリヌクレオチドは、十分な鎖長と配列番号1に示すRTP801遺伝子配列内に存在する配列に対する相同性とを有する配列をもつ連続配列を含むため、該遺伝子とハイブリダイズすることができる。ASの配列は標的の関心mRNAと相補性を有しRNA:AS 2本鎖を形成するように設計する。この2本鎖形成は関連mRNAのプロセッシング、スプライシング、輸送または翻訳を防ぐことができる。そのうえ、ある種のASヌクレオチド配列はその標的mRNAとハイブリダイズすると、細胞RNase H活性を誘発し、その結果としてmRNAの分解を招くことができる[Calabretta et al, 1996: Antisense strategies in the treatment of luekemias(白血病のアンチセンス療法). Semin Oncol. 23(1):78-87]。その場合には、RNase Hは該2本鎖のRNA成分を開裂させることになり、ASをポテンシャル的に解離して、標的RNAの追加分子とのさらなるハイブリダイゼーションに向かわせることができる。追加の作用モードはASとゲノムDNAとの相互作用に由来するが、この相互作用は転写的に不活性でありうるトリプルヘリックスを形成する。特定AS断片は、本願開示のRTP801の特定断片をコードするDNAのASである。
【０２２９】
アンチセンス(AS)技術の主な特徴とその治療面の可能性は数多くの概説で取り上げられてきた[Wright & Anazodo, 1995. Antisense Molecules and Their Potential For The Treatment Of Cancer and AIDS(アンチセンス分子とそのがん・AIDS治療面の可能性). Cancer J. 8:185-189]。この技術の化学、細胞、治療の各側面についてはそれぞれ次のような概説がある: 化学: [Crooke, 1995. Progress in antisense therapeutics(アンチセンス療法の前進), Hematol. Pathol. 2:59; Uhlmann and Peyman, 1990. Antisense Oligonucleotides: A New Therapeutic Principle(アンチセンス・オリゴヌクレオチド: 新治療原理). Chem Rev 90(4):543-584]、細胞: [Wagner, 1994. Gene inhibition using antisense oligodeoxynucleotides(アンチセンス・オリゴでオキシヌクレオチドの使用による遺伝子阻害). Nature 372-333]、および治療: [Hanania, et al. 1995. Recent advances in application of gene therapy to human disease(ヒト疾患への遺伝子治療応用の最近の前進). Am J. Med. 99:537; Scanlon et al. 1995. Oligonucleotides-mediated modulation of mammalian gene expression(哺乳動物の遺伝子発現のオリゴヌクレオチド媒介調節). FASEB J. 9:1288; Gewirtz, 1993. Oligodeoxynucleotide-mediated therapeutics for human leukemias(ヒト白血病のオリゴデオキシヌクレオチド媒介療法), Stem Cells Dayt. 11:96]。
【０２３０】
特定遺伝子の発現へのアンチセンス干渉は合成ASオリゴヌクレオチド配列を使用して行うことができる[Lefebvre-d’Hellencourt et al. 1995. Immunomodulation by cytokine antisense oligonucleotides(サイトカイン・アンチセンスオリゴヌクレオチドによる免疫調節). Eur. Cytokine Netw. 6:7; Agrawal, 1996. Antisense oligonucletides: towards clinical trials(アンチセンスオリゴヌクレオチド: 臨床試験に向けて), TIBTECH, 14:376; Lev-Lehman et al. 1997. Antisense Oligomers in vitro and in vivo(in vitroとin vivoのアンチセンスオリゴマー). In Antisense Therapeutics, A. Cohen and S. Smicek, eds (Plenum Press, New York)]。ASオリゴヌクレオチド配列は、標的の関心mRNAと相補性を有しRNA:AS 2本鎖を形成するように設計する。この2本鎖形成は関連mRNAのプロセッシング、スプライシング、輸送または翻訳を防ぐことができる。そのうえ、ある種のASヌクレオチド配列はその標的mRNAとハイブリダイズすると、細胞RNase H活性を誘発し、その結果としてmRNAの分解を招くことができる[Calabretta et al, 1996: Antisense strategies in the treatment of luekemias(白血病のアンチセンス療法). Semin Oncol. 23:78]。その場合には、RNase Hは該2本鎖のRNA成分を開裂させることになり、ASをポテンシャル的に解離して、標的RNAの追加分子とのさらなるハイブリダイゼーションに向かわせることができる。追加の作用モードはASとゲノムDNAとの相互作用に由来するが、この相互作用は転写的に不活性でありうるトリプルヘリックスを形成する。
【０２３１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドに対応する配列標的セグメントは、該配列が、その相補性鋳型とのオリゴヌクレオチド2本鎖形成にとって重要な相応のエネルギー関連特性を示し、また低い自己二量体化または自己相補性ポテンシャルを示すように、選択する(Anazodo et al. 1996)。たとえばコンピュータープログラムのOLIGO(Primer Analysis Software, version 3.4)を使用すれば、アンチセンス配列の融解温度、自由エネルギー特性を割り出し、また自己二量体化および自己相補性ポテンシャルを推計することができる。同プログラムはこれらの2パラメーター(自己量体化および自己相補性ポテンシャル)の定性的な推定を可能にし、「ポテンシャルなし」または「若干のポテンシャル」または「基本的に完全なポテンシャル」という指標を示してくれる。このプログラムを使用して、これらのパラメーターで「ポテンシャルなし」と推定される標的セグメントを大まかに選択する。しかし、「若干のポテンシャル」を有するセグメントも使用可能である。この選択では技術上周知のパラメーターの均衡を使用する。さらに、オリゴヌクレオチドも必要に応じて選択し、類似体置換が機能に実質的な影響を及ぼさないようにする。
【０２３２】
ホスホロチオアート型アンチセンスオリゴヌクレオチドは通常、動物で効果があり十分な薬効学的半減期を示す濃度では有意の毒性を示さない[Agrawal, 1996. Antisense oligonucletides: towards clinical trials(アンチセンスオリゴヌクレオチド: 臨床試験に向けて), TIBTECH, 14:376]し、またヌクレアーゼ耐性である。アンチセンスによって誘導される細胞発生関連の機能喪失表現型はグリア繊維性酸性タンパク質(GFAP)、ニワトリの蓋板形成[Galileo et al. 1991. J. Cell. Biol., 112:1285]、および神経外胚葉培養における細胞不均質性(コロニー形成能、腫瘍原性および接着性に違いのある上皮細胞vs.神経芽細胞)の維持に関与するN-mycタンパク質で示されてきた[Rosolen et al., 1990. Cancer Res. 50:6316; Whitesell et al. 1991. Episome-generated N-myc antisense RNA restricts the differentiation potential of primitive neurorectodermal cell lines(エピソーム生成型のN-mycアンチセンスRNAは原始神経外胚葉細胞系の分化能を制限する). Mol. Cell. Biol. 11:1360]。繊維芽細胞増殖能と血管新生能を有する塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)をアンチセンスオリゴヌクレオチドで阻害すると、グリオーマ細胞の増殖が飽和的かつ特異的に80%も抑制された[Morrison, 1991. Suppression of basic fibroblast growth factor expression by antisense oligonucleotides inhibits the growth of transformed human astrocytes(塩基性繊維芽細胞増殖因子の発現のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる抑制は形質転換ヒト星状細胞の増殖を阻害する). Biol. Chem. 266:728]。アンチセンスオリゴヌクレオチドは疎水性であるため、リン脂質膜と十分に相互作用する[Akhter et al. 1991. Interactions of antisense DNA oligonucleotide analogs with phospholipid membranes (liposomes)(アンチセンスDNAオリゴヌクレオチド類似体のリン脂質膜(リポソーム)との相互作用), Nuc. Res. 19:5551-5559]。アンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞原形質膜との相互作用の後、生細胞内へと能動的に(または受動的に)輸送される[Loke et al, 1989. Characterization of oligonucleotide transport into living cells(生細胞内へのオリゴヌクレオチド輸送の解析). PNAS USA 86:3474]が、そこでは特異的受容体が絡むと予言されている飽和機構が働く[Yakubov et al. 1989. PNAS USA 86:6454]。
【０２３３】
「リボザイム」は、RNA触媒能を有し(Cechの概論を参照)標的RNAの特定部位を開裂させるRNA分子である。
本発明では、RTP801 mRNAを開裂させるリボザイムはRTP801阻害剤として使用してよい。これは、アンチセンス療法が化学量論的理由から制限される場合には[Sarver et al. 1990. Gene Regulation and Aids, pp. 305-325]、必要となろう。その場合にはRTP801配列のターゲティングにリボザイムを使用することができる。1個のリボザイムによって開裂されるRNA分子の数は化学量論的な予測数を上回る[Hampe and Triz, 1989; Uhlenbeck, 1987]。
【０２３４】
リボザイムはRNAのホスホジエステル結合の開裂を触媒する。これまでに、いくつかのリボザイム構造ファミリーが同定されている。たとえばグループＩイントロン、RNase P、肝炎デルタウイルス型リボザイム、ハンマーヘッド型リボザイム、およびタバコ輪斑ウイルスサテライトRNA(sTRSV)のネガティブストランドに由来するヘアピン型リボザイムなどである[Sullivan, 1994; 米国特許第5,225,347号明細書 columns 4-5]。最後の2ファミリーはウイロイドとウイルソイドに由来するが、そこではリボザイムはローリングサークル型のDNA複製時に形成されるオリゴマーからモノマーを分離すると考えれている(Symons, 1989 and 1992)。ハンマーヘッド型とヘアピン型のリボザイムモチーフは、遺伝子治療mRNAのトランス開裂に最も一般的に適している(Suullivan, 1994)。本発明に使用するリボザイムのタイプは技術上周知の要領で選択する。ヘアピン型リボザイムは好ましいタイプであるが、現在臨床試験が進められている。一般に、リボザイムは鎖長が30〜100ヌクレオチドである。リボザイム送達はAS断片および/またはsiRNA分子の送達に類似する。
【０２３５】
本発明に使用する諸々のポリヌクレオチドは治療薬としての特性を改善するための修飾を受けてもよい。ポリヌクレオチドの治療薬としての特性を改善するには、ヌクレオチドの修飾または類似体を導入することができる。期待される改善の例はヌクレアーゼ耐性の向上および/または細胞透過性の向上などである。ヌクレアーゼ耐性は、必要なら、ASポリヌクレオチド、siRNA、cDNAおよび/またはリボザイムの生理活性を妨げないような技術上周知の任意の方法により、使用および送達の方法に必要とされる通りに、もたらされる(Iyer et al. 1990; Eckstein, 1985; Spitzer and Eckstein, 1988; Woolf et al. 1990; Shaw et al. 1991)。ヌクレアーゼ耐性の向上を目的にオリゴヌクレオチドに加えることができる修飾の例はリン酸骨格中のヘテロ原子のリンまたは酸素の修飾である。これにはメチルリン酸、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、およびモルホリノオリゴマーの作製が含まれ。一実施形態では、ヌクレアーゼ耐性の向上は、4〜6個の3'ヌクレオチド塩基の間を連結するホスホロチオアート結合を設けることにより、もたらされる。あるいはホスホロチオアート結合はすべてのヌクレオチド塩基を連結する。技術上周知の他の修飾を使用して、生理活性は維持したまま、ヌクレアーゼに対する安定性を大幅高めるようにしてもよい。
【０２３６】
本発明では、ポリヌクレオチドの諸々の類似体または修飾を、そうした類似体または修飾が該ポリヌクレオチドの機能をあまり損なわない限りで、採用してもよい。ヌクレオチドは天然塩基または合成修飾塩基から選択することができる。天然塩基の例はアデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルなどである。修飾ヌクレオチド塩基の例はイノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、6-メチル-、2-プロピルおよび他アルキル-アデニン、5-ハロウラシル、5-ハロシトシン、6-アザシトシン、6-アザチミン、シュードウラシル、4-チオウラシル、8-ハロアデニン、8-アミノアデニン、8-チオールアデニン、8-チオールアルキルアデニン、8-ヒドロキシルアデニンおよび他の8-置換アデニン、8-ハログアニン、8-アミノグアニン、8-チオールグアニン、8-チオアルキルグアニン、8-ヒドロキシルグアニンおよび他の置換グアニン、他のアザ-およびデアザ-アデニン、他のアザ-およびデアザ-グアニン、5-トリフルオロメチルウラシルおよび5-トリフルオロシトシンなどである。
【０２３７】
また、ヌクレオチドの構造を根本的に変化させ、治療薬または実験薬として、よりふさわしい形にしたポリヌクレオチド類似体を調製することもできる。ヌクレオチド類似体の例はペプチド核酸(PNA)であり、そこではDNA(またRNA)のデオキシリボース(またはリボース)リン酸骨格が、ペプチドで見られるものに類似したポリアミド骨格に置き換わる。PNAは酵素による分解への耐性があり、またin vitroおよびin vivo寿命が長くなることが示されている。さらに、PNAはDNA相補鎖との結び付きがDNA分子よりも強いこともすでに示されている。こうした所見はPNAストランドとDNAストランドの間には電荷斥力が存在しないことに由来する。オリゴヌクレオチドに加えることができる他の修飾の例はポリマー骨格、環状骨格または非環状骨格などである。
【０２３８】
本発明に使用するポリペプチドは修飾随意に化学修飾しその治療活性を高かめるようにしてもよい。「化学修飾」は該ポリペプチドに関しては、そのアミノ酸残基のうち少なくとも1つが自然過程たとえばプロセッシングまたは他の翻訳後修飾により、または技術上周知の化学修飾法により、修飾されることをいう。周知の一般的な修飾の非限定な例はアセチル化、アシル化、アミド化、ADPリボシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、脂質または脂質誘導体の共有結合付加、メチル化、ミリスチル化、PEG化、プレニル化、リン酸化、ユビキチン化等の過程である。
可能なポリペプチド修飾の追加例(核酸配列の変異に由来するものなど)は次のとおりである:
【０２３９】
「同類置換」はあるクラスのアミノ酸の同クラスのアミノ酸による置換であるが、そうしたクラスはアミノ酸側鎖の物理化学的特性の共通性と天然相同ポリペプチドに見られる高置換頻度(たとえば標準Dayhoff頻度交換マトリックスまたはBLOSUMマトリックスによって決まる頻度)に基づく。アミノ酸側鎖は一般に次の6クラスに分類される:クラスＩ(Cys);クラスII(Ser、Thr、Pro、Ala、Gly)；クラスIII (Asn、Asp、Glu、Gln); クラスIV(His、Arg、Lys); クラスＶ(Ile、Val、Leu、Met); クラスVI(Phe、Tyr、Trp)。たとえばAspの他のクラスIII アミノ酸(Asp、GlnまたはGlu)による置換は同類置換である。
【０２４０】
「非同類置換」はあるクラスのアミノ酸の別クラスのアミノ酸による置換をいう。たとえばクラスIIアミノ酸AspのクラスIII アミノ酸(Asp、Asn、GluまたはGln)による置換。
「欠失」はヌクレオチドまたはアミノ酸配列内の変異であって、単数または複数のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が欠けている変異をいう。
「挿入」または「付加」はヌクレオチドまたはアミノ酸配列内の変異であって、天然配列と比較して単数または複数のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が追加されたことに由来する変異をいう。
【０２４１】
「置換」は単数または複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の、それぞれ異なるヌクレオチドまたはアミノ酸による置き換えをいう。置換はアミノ酸配列の場合は同類置換か非同類置換のいずれかである。
本発明の追加の実施形態では、RTP801ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを、患者の黄斑変性症の診断または検出に使用する。検出方法は一般に患者由来の試料中のRTP801 mRNAまたはRTP801ポリペプチドの検査を含もう。
「検出」は疾患の検出をいう。この用語は疾患の素因または疾患の重篤度の検出をいう場合もある。
【０２４２】
「相同体/相同性」は本願では、相同性が少なくとも約70%、好ましくは少なくとも約75%、有利には少なくとも約80%、さらに有利には少なくとも約90%、さらになお有利には少なくとも約95%たとえば少なくとも約97%、約98%、約99%、さらには約100%であることを意味する。本発明では、これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドもまた前記のポリヌクレオチドおよびポリペプチドと同じ要領で使用しうるものとする。
または/さらに、配列の「相同性」は、2つの配列のうちの短いほうの配列内のヌクレオチドまたはアミノ酸残基数で同一ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の位置数を割った値をいう場合もある。この場合、2配列のアラインメントにはWilbur and Lipman[(1983) Proc. Natl. Acad Sci. USA 80: 726]アルゴリズムを使用することができる。たとえばウインドウサイズ20ヌクレオチド、ワード長4ヌクレオチドおよびギャップペナルティー4を使用して、配列データのコンピューター援用解析を、アラインメントを含めて、市販プログラム(たとえばIntelligenetics（登録商標） Suite; Intelligenetics Inc., CA)により行うことができる。RNA配列がDNA配列と類似する、または同一性または相同性を有すると言う場合、DNA配列中のチミジン(T)はRNA配列中のウラシル(U)に等しいとみなされる。本発明の範囲内のRNA配列はDNA配列またはその相補体から、DNA配列中のチミジン(T)をウラシル(U)で置換することにより誘導することができる。
【０２４３】
さらに/または、アミノ酸配列の類似性または相同性はたとえば検索ソフトのBlastP (Altschul et al. Nucl. Acids Res. 25:3389-3402)を使用して求めることができる(NCBIのサイトで利用可能)。以下の参考文献は2ポリペプチド間のアミノ酸残基の相対的な同一性または相同性を比較するためのアルゴリズムを示してくれる; さらに/または、前記に関連して、これらの文献中の教示は%相同性を求める場合にも役立つ: Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489; Smith et al. (1983) Nucl. Acid Res. 11:2205-2220; Devereux et al. (1984) Nucl. Acid Res. 12:387-395; Feng et al. (1987) J. Molec. Evol. 25:351-360; Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153; Thompson et al. (1994) Nucl. Acid Res. 22:4673-4680.
【０２４４】
「少なくともX%の相同性を有する」は2アミノ酸またはヌクレオチド配列に関しては、両配列の最適アラインメント形での両配列間の同一残基のパーセンテージをいう。従って、90%のアミノ鎖配列同一性は最適アラインメント下の複数ポリペプチド配列について90%のアミノ酸が同一であることを意味する。
【０２４５】
本発明の追加の実施形態は、有効成分としての治療有効量のRTP801阻害剤と製薬上許容しうる担体とを含む医薬組成物に関する。該阻害剤は生物学的阻害剤、有機分子、化学分子などでもよいが、該医薬組成物は図1(配列番号1)に示す配列のアンチセンス配列である配列を有する連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであるRTP801阻害剤を含んでもよい。さらに、RTP801阻害剤はこれらのポリヌクレオチドを含むベクターでもよい。また、RTP801阻害剤は、図2(配列番号2)に示す4〜25アミノ酸を含むエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体、またはRTP801遺伝子のmRNAを標的にするRNA分子たとえばsiRNA分子(随意にTable A〜Cに示すsiRNA特にTable AのsiRNA番号22、23、25、27、39、41、42、49および50)またはリボザイムでもよい。
【０２４６】
該医薬組成物の有効成分は、本発明の実施に必要とされるヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドまたは然るべき配列および/またはリボザイムに対して同じ効果を有することが判明しているその断片を含んでもよい。本願開示の有効成分の組み合わせも、アンチセンス配列の組み合わせを含めて、使用可能である。
【０２４７】
本発明の追加の実施形態は、脊髄疾患または損傷患者の回復を促進するための薬剤の調製への治療有効用量のRTP801阻害剤の使用を提供する。一実施形態では、該阻害剤は好ましくはsiRNAである。別の実施形態では、該阻害剤は好ましくは本願開示の構造Aである。
以上、本発明を分かりやすく説明してきたが、使用した用語は説明が目的であって、限定が目的ではないものとする。
明らかに、以上の教示に照らして多数の変更や変形が本発明には可能である。従って、本発明は添付の特許請求の範囲内で、明細書の形態とは別の形態で実施することも可能である。
【０２４８】
米国特許出願明細書を含む種々の出版物は本願では終始、執筆者と暦年、および番号により参照される。これらの出版物、特許および特許出願明細書は、本願に関する分野の技術水準を十分に明らかにする意味で、その全体が参照によりここに開示される。
【実施例】
【０２４９】
当業者は以上の説明に依拠すれば、造作なく本発明を十二分に利用することができると思われる。従って、以下の好ましい実施形態の具体例は単に説明が目的であって、請求の範囲に記載されている発明を何ら限定するものではない。
本願で特に開示してはいない技術上周知の一般的な標準分子生物学プロトコールはSambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989, 1992)とAusubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1988)にほぼ集約されている。
【０２５０】
本願で特に開示してはいない技術上周知の一般的な標準有機合成プロトコールは(多様な編集者による)Organic synthesis: Vol.1-19, J. Wiley, New York (1941-2003); Gewert et al. Organic synthesis workbook, Wiley-VCH, Weinheim (2000); Smith & March, Advanced Organic Chemistry, Wiley-Interscience; 5th edtion(2001)にほぼ集約されている。
【０２５１】
本願で特に開示してはいない技術上周知の一般的な標準医薬化学的方法は、多彩な執筆者・編集者によるシリーズ“Comprehensive Medicinal Chemistry”(Pergamon Press)にほぼ集約されている。
明細書、特許請求の範囲および/または図面で開示している本発明の特徴は、個別にも、任意の組合せとしても、本発明を様々な形態で実施するうえで重要であろう。
【０２５２】
実施例１
一般材料/方法
実施例1〜5では、特に断らない限り次の材料と方法を使用した。
細胞培養
第1ヒト細胞系すなわちHeLa細胞(American Type Culture Collection)は次の要領で培養した: HeLa細胞(American Type Culture Collection)はCzauderna F et al. (Czauderna, F．, Fetcher, M., Aygun, H., Arnold, W., Klippel, A., Giese, K. & Kaufmann, J.(2003). Nucleic Acids Res, 31, 670-82)に記載の要領で培養した。
第2ヒト細胞系はヒト・ケラチノサイト細胞系であり、次の要領で培養した: ヒト・ケラチノサイトは10% FCS添加ダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)により37℃で培養した。
マウス細胞株はB16V(American Type Culture Collection)であり、10% FCS添加ダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)により37℃で培養した。培養条件はMethods Find Exp Clin Pharmacol. 1997 May; 19(4):231-9の記載に従った。
いずれの場合にも、細胞は約50,000個/ウェルの密度で開示のような実験にかけ、本発明による2本鎖核酸を20nMで添加し、そこで2本鎖核酸が1μg/mlの脂質試薬を使用して複合体化されるようにした。
【０２５３】
低酸素症様状態の誘発
低酸素症様状態を誘発するために、細胞を次の要領でCoCl2処理した: siRNAトランスフェクションを10cm平板(30〜50%コンフルエンシー)上で、Czauderna et al., 2003およびKretschmer et al., 2003の要領で行った。要するに、予め調製しておいた10x濃縮GB-脂質複合体/無血清培地を完全培地中の細胞に加えることにより、siRNAをトランスフェクトした。全トランスフェクション容量は10mlであった。特に断らない限り、最終脂質濃度は1.0μg/mlであり、最終siRNA濃度は20nMであった。低酸素応答の誘発は、溶解24時間前に、CoCl2 (100μM)を組織培養培地に直接加えて行った。
【０２５４】
細胞抽出液の調製と免疫ブロッティング
細胞抽出液の調製と免疫ブロット分析は、基本的にKlippel et al.(Klippel, A., Escobedo, M.A., Wachowicz, M.S., Apell, G., Brown, T.W., Giedlin, M.A., Kavanaugh, W.M. & Williams, L.T. (1998). Mol Cell Biol, 18, 5699-711; Klippel, A., Reinahrd, C., Kavanaugh, W.M., Apell, G., Escobedo, M.A. & Williams, L.T. (1996). Mol Cell Biol, 16, 4117-27)の要領で行った。全長RTP801に対するポリクローナル抗体はpET19-b発現ベクター(Merck Biosciences GmbH, Schwalbach, Germany)を入れた組み換えRTP801タンパク質産生菌でウサギを免疫して生成させた。マウス・モノクローナル抗p110aおよび抗p85抗体は前掲Klippel et al.で開示されている。
【０２５５】
実施例２
第1ヒト細胞系でのRTP801発現抑制
種々の2本鎖核酸を調製した。それらの相対位置を、mRNAおよびCDS、それにヒトRTP801コード核酸(データバンク・アクセッションno. NM_019058) 内のヒトSNPとの関係で図3に示す。実施例1に記載の要領で、第1ヒト細胞系を該2本鎖核酸と接触させた。低酸素症様状態の誘発と該2本鎖核酸による処理の後、細胞を溶解し、細胞溶解液を免疫ブロッティングにかけた。PI3キナーゼの触媒ユニットであるp110aと、p85をローディング対照として使用した。RTP801ポリクローナル抗体を使用して可視化したRTP801バンドの強度は個別2本鎖核酸のRTP801発現レベル抑制活性の尺度である。
該2本鎖核酸を各々修飾して、2'O-Me基がアンチセンスストランドの第1、第3、第5、第7、第9、第11、第13、第15、第17および第19ヌクレオチド上に存在するようにし、また同じ修飾すなわち2'O-Me基がセンスストランドの第2、第4、第6、第8、第10、第12、第14、第16および第18ヌクレオチド上に存在するようにした。また、本発明によるこれらの特定の核酸では、第1ストレッチは第1ストランドと同じであり、また第2ストレッチは第2ストランドと同じであり、またこれらの核酸は平滑末端でもある。
【０２５６】
実験は2回行ったが、その結果を図4A-Hに実験1、実験2として個別に示した。
図4A-H中の表記h、hr、hmrは、対応する2本鎖核酸がRTP801 mRNAのうちヒトRTP mRNAに対して特異的である区間(h)、ヒト+ラットRTP mRNAに対して特異的である区間(hr)、ヒト+マウス+ラットRTP mRNAに対して特異的である区間(hmr)に、それぞれ対応するよう設計されていることを示す。no.40.1の2本鎖核酸は陽性対照として、また非処理細胞(UT+)は陰性対照として、それぞれ使用した。
これらの実験結果から、次の2本鎖核酸がRTP801発現の抑制に特に有効であると判明した: no. 14、no. 15、no. 20、no. 21、no. 22、no. 23、no. 24、no. 25、no. 27、no. 39、no. 40、no. 41、no. 42、no. 43、no. 44、no. 49およびno. 50 (Table A参照)。
【０２５７】
実施例３
第2ヒト細胞系でのRTP801発現抑制
実施例2と同様の実験を実施例1で述べた第2ヒト細胞系に対しても行った。結果は図5A-Fのとおりである。
これらの図から推測されるように、実施例の実験で得られた結果がこの第2ヒト細胞系による実験でも裏付けられた。
【０２５８】
実施例４
RTP801特異的2本鎖核酸の遺伝子量効果
この実験ではRTP801特異的2本鎖核酸の遺伝子量効果(dosage effect)を調べた。
その目的のために、HeLa細胞を実施例2および3の場合と同様に処理した。その場合の2本鎖核酸/培養ブロス濃度は10nM、5nMおよび1nMであった。陽性対照として2本鎖核酸no.40.1を使用し、陰性対象として非処理細胞(UT+)を使用した。結果は実施例2および3の場合と同じであった。使用した2本鎖核酸は具体的には、RTP801 mRNA上のヒト、マウスおよびラット共有ストレッチに対応する内部参照番号14、22、23および27の2本鎖核酸、それにRTP801 mRNA上の、ヒトRTP801に対して特異的なストレッチに対応する内部参照番号39および42の2本鎖核酸であった。
結果を図6A-Cに示す。これらの図からは、RTP801に対して特異的な2本鎖核酸の効果は明らかに濃度依存的であることが見て取れるが、内部参照番号1、15、20、21、24、40、41、43、44、22、23、27、39、42、40.1、44.1および14の、好ましくは22、23、27、39、42、40.1および44.1の、より好ましくは14、23および27の核酸分子、また好ましくは実施例で開示するような特定の修飾パターンを有する各核酸分子は特に有効である。
【０２５９】
実施例５
RTP801特異的2本鎖核酸の種特異性
本発明による2本鎖核酸を、RTP801 mRNA上の、種々の種を通じて同じであるかまたは種によって異なるストレッチに対応させて設計した。RTP801特異的2本鎖核酸の種特異性の有無を試験するため、ヒト、マウスおよびラットRTP801 mRNA間で保存されているRTP801 mRNAストレッチに対応する内部参照番号14、22、23および27の2本鎖核酸と、ヒトRTP801 mRNAに対して特異的なRTP801 mRNAストレッチに対応する、すなわちマウスまたはラットでは存在しないストレッチに対応する、内部参照番号39および42の2本鎖核酸とを、RTP801抑制能の点から、実施例1および2で述べたものと同じ方法/測定値を用いて、比較した。
【０２６０】
使用した2本鎖核酸は原理的にはどれもヒトmRNAに対して活性を有し、また先行実施例でも示したように、RTP801の発現を抑制する効果もあるものの、マウス細胞系を使用した場合には、マウスRTP801 mRNAに対しても特異的である2本鎖核酸に限って、すなわち番号14、22、23および27の2本鎖核酸に限って、RTP801の発現を効果的に抑制した。
この結果から、1種または数種に対して特異的であるようなRTP801対応2本鎖核酸の設計は可能であると結論しうる。これはまったく同じ分子の、動物モデルとヒトへの使用を可能にする。
【０２６１】
実施例６
黄斑変性症に関連する実験モデル、方法および結果
脈絡膜血管新生(CNV)の動物モデルを使用して本発明の化合物を試験した。湿潤型AMDの特徴的な状態であるCNVをレーザー処置により動物モデルに誘発させる。
A)  マウスモデル
脈絡膜血管新生(CNV)の誘発
湿潤型AMDの特徴的な状態であるCNVを、薬物グループ割り付けに対して遮蔽された単一の個人により第0日に行われる各マウスの両眼に対するレーザー光凝固術(532nm、200mW、100ms、75μm)(OcuLight GL, Iridex, Mountain View, CA)によって、誘発させた。レーザースポットは視神経の周りに標準的なやり方で、スリットランプ伝送システムとコンタクトレンズとしてのカバースリップとを使用して、当てた。
【０２６２】
処置群
次の(雄性6〜8週齢)マウス群にCNVを誘発させた:
(1)12×WTマウス;
(2)12×RTP801ノックアウト(KO)マウス;
(3)12×WTマウス−合成安定化活性抗RTP801 siRNA (REDD14)を一方の眼に、また不活性抗RTP801 siRNA (REDD8、陰性対照)を他方の眼に、それぞれ0.25μgずつ第0日と第7日に注射;
(4)12×WTマウス−合成安定化活性抗RTP801 siRNA (REDD14)を一方の眼に、また不活性抗GFP siRNA (陰性対照)を他方の眼に、それぞれ0.25μgずつ第0日と第7日に注射;
(5)12×WTマウス−合成安定化活性抗RTP801 siRNA (REDD14)を一方の眼に、またPBS (陰性対照)を他方の眼に、それぞれ0.1μgずつ第0日と第7日に注射;
(6)12×WTマウス−合成安定化活性抗RTP801 siRNA (REDD14)を一方の眼に、またPBS (陰性対照)を他方の眼に、それぞれ0.01μgずつ第0日と第7日に注射。
各マウスの両眼をレーザー処置した。注射容量は2μlであった。
【０２６３】
評価
1.  実験は第14日に終了した。評価のため、眼球を摘出し、4%パラホルムアルデヒドにより30分間、4℃で固定化処理した。感覚網膜を剥がして視神経から切断した。残ったRPE-脈絡膜-強膜複合体をImmu-Mount (Vectashield封入剤; Vector)でフラットマウントし、カバーガラスをかけた。フラットマウントを走査型レーザー共焦点顕微鏡(TSC SP, Leica, Germany)で観察した。血管はブルーArレーザーによる励起で可視化した。RPE-脈絡膜-強膜複合体から水平光学切片(1μmステップ)を得た。病変部につながる周囲の脈絡膜血管網を同定しうる最深共焦点面を、病変の底部と判断した。レーザー処置領域内とこの基準面の表層部の血管はすべてCNVと判定した。各切片の画像をデジタル保存した。CNV関連蛍光面積を、Leica TCS SPソフトウェア使用のコンピューター化画像分析により求めた。各水平切片の全蛍光面積の総和をCNV体積の指数として用いた。
2.  別のWTマウス(5眼/群)を使用して、(siRNA処理のない場合とある場合の)CNV中のRTP801 mRNAの発現を(他のAMD関連遺伝子の発現と共に)評価した。これにはRPE/脈絡膜または神経網膜から抽出したRNAに対するリアルタイムPCRを用いた。
【０２６４】
結果
1.  CNV誘発後の血管漏出はRTP801 KOマウスのほうがWTマウスと比較して30%も低かった; 図8参照。
2.  合成安定化RTP801 siRNA (REDD14)は用量依存的なCNV体積の減少を誘発した。用量0.25ug/眼のREDD14 (Table 1の配列番号14; 配列番号16(センス)および66(アンチセンス))ではPBS注射眼に比して最高〜70%の阻害が実現した。同じ用量では、陰性対照siRNAであるREDD8と抗GFP siRNAはそれぞれ27%、33%のCNV体積の減少を示したにすぎず、REDD14が優れた効能だけでなく作用の特異性をも誇ることが裏付けられた。
【０２６５】
B)  非ヒト霊長類モデル
CNVの誘発
研究には8頭の雄性カニクイザル(Macaca fascicularis) (2〜6年齢)を使用した。阻害剤投与の前に、両眼の黄斑周囲レーザー処置により脈絡膜血管新生(CNV)を誘発させた。レーザー[OcuLight GL (532nm) Laser Photo-coagulqtor with IRIS Medical（登録商標） Portable Slit Lamp Adaptor]で黄斑に9つの病変を設けた。レーザースポットは左眼と右眼で鏡像対称となるように配置した。レーザーパラメーターの近似値は次のとおりであった: スポット径50-100μm; レーザー出力300-700mW; 照射時間0.1秒。
【０２６６】
処置
レーザー処置の直後に、全動物の両眼に単回の硝子体内注射をした。左眼には350ugの合成安定化RTP801 siRNA(マウス実験に用いたものと同じ)を、最終容量50ulとして注射し、対側眼には50ulのPBS(基剤)を投与した。
【０２６７】
評価
1.  動物はすべて摂食量検査と体重測定を毎日受けた。
2.  2頭のサルはCNV誘発の第6日に安楽死させた。その眼球を摘出し、後極を平坦にした。次いで、中心窩を切り出し、脈絡膜と神経網膜に分離し、液体窒素で(全動物につき)別々に凍結させ、後のRNA抽出やリアルタイムPCRによるRTP801発現評価への使用に備えた。
3.  フルオレセイン血管造影を実験前と、CNV誘発後の第1週、第2週および第3週の終わりに、それぞれ行った。写真は眼底カメラ(TRC-50EX Retina Camera)で撮影した。画像の取得にはTOPCON IMAGEnet（登録商標）システムを使用した。フルオレセイン色素(10%フルオレセインナトリウム、約0.1ml/kg)は血管アクセスポートから注入した。色素注入後、動脈相、初期動静脈相およびいくつかの後期動静脈相を含む数時点で写真を撮影し、血管新生の評価とCNV病変関連のフルオレセイン漏出のモニタリングを行うようにした。このフルオレセイン血管造影図の解釈と分析は2人の眼科医が独立に行った。
血管新生(NV)は早期血管造影図で評価し、各スポットを次の方式に従って等級付けした:
0    -NVの兆候なし
0.5  -疑わしいスポット
1    -「ホット」スポット
2    -レーザー熱傷内にNV
3    -歴然としたNV
漏出は次の方式に従って評価した:
0    -漏出なし
0.5  -疑わしいスポット
1    -歴然とした小スポット漏出
2    -時間と共に増大する漏出
3    -前回の境界よりも(歴然と)大きくなった漏出
【０２６８】
加えて、各スポットのスポット径も形態計測を用いて早期と後期の血管造影図で比較し、また漏出の増大に由来するスポット径の拡大を計算した。
4.  Epic 2000網膜電位計を使用して、Ganzfield装置の使用などを含むSierra’s SOPおよび本実験専用のSOPに従って、実験前と第3週の終わりに、網膜電位図(ERG)を記録した。表形式ERGデータは一人の動物眼科医が評価した。
実験はCNV誘発後第21日で終了した。眼を含む臓器と組織を対象に肉眼的な剖検と組織学的検査を行った。
【０２６９】
結果
1.  CNV誘発後第6日にリアルタイムPCRで測定した結果では、RTP801 siRNAはレーザー処置動物のRPE/脈絡膜におけるRTP801の発現を低下させた(図10参照)。
2.  個々のサルの両眼間の、漏出と血管新生に関するスポット等級の比較から、RTP801 siRNAを注射した眼では対照と比較して、これらの病理学的な特徴がどちらも弱まると判明した(漏出結果については図11を、血管新生結果については図12を、それぞれ参照)。
3.  漏出または血管新生に関して臨床的に重要な高い等級(2および3)が付くスポットの総数をすべてのsiRNA注射眼とすべてのPBS注射眼で比較すると、siRNA注射眼のほうがやはり影響が小さかった(図13、a+b参照)。
4.  漏出および血管新生スポットに関する総合的な等級付けデータを統計的に評価した。siRNA注射と対照注射の間の差異の存在を、対照右眼の平均スポット順位(R)とsiRNA注射左眼の平均スポット順位(L)の間のデルタ(デルタ=R-L)を計算することにより分析すした。この差異の有意性を、ノンパラメトリックな統計的検定手法であるWilcoxon符号付順位検定(Wilcoxon signed ranks test)−片側検定−を用いて計算した。異なる相(初期動脈、動静脈、および後期静脈)の血管図を週(第1週、第2週、第3週)ごとに分析した。
【０２７０】
次のTable 1は、各群について漏出順位の0との差異の有意性(片側検定)を示す(p値<0.05は下線で強調)。後期相血管図の第2週と第3週には左眼(siRNA注射)で右眼(プラセボ注射)と比較した場合の漏出順位の有意の低下が認められた。
【０２７１】
【表２】
2008510019.tif 000003
【０２７２】
後期相の血管図は通常、漏出パラメーターの評価に使用される。
次のTable 2は各群について血管新生(NV)順位の0との差異の有意性(片側検定)を示す(p値<0.05は下線で強調)。
【０２７３】
【表３】
2008510019.tif 000004
【０２７４】
第2週と第3週の初期相に、また第2週の動静脈相に、左眼で右眼に対するNV順位の有意の低下が認められた。
初期相の血管図は通常、血管新生パラメーターの評価に使用される。
【０２７５】
5.  初期(動脈相)血管図と後期(静脈相)血管図の間で起こる漏出に起因するスポット面積の増大を定量的、形態学的評価により、このパラメーターはriSNA注射眼(左眼、OS)内のレーザースポットでは対照(右眼、OD)と比べて有意に低下することが判明した。2例を図14に示す。図のグラフは動物#3315および3300の左眼と右眼ではどのスポットも面積が相対的に増加(%)していることを示す。
加えて、以上の実験を通じて抗RTP-801 siRNAは網膜電位図(ERG)にも、眼の組織像にも、また他の臓器・系の構造と機能にも、何ら悪影響を及ぼさなかったことが注目される。
【０２７６】
以上の実験および結果をまめると:
1.  湿潤型加齢黄斑変性(湿潤型AMD)CNVのレーザー誘発モデルにおけるRTP801発現の遺伝的(RTP801-/-)、治療的siRNA阻害はどちらもCNV体積を有意に減少させた。
2.  マウスおよび非ヒト霊長類モデルでは肯定的な結果が得られた。
3.  サルの病理学的およびERG検査では、眼でも他の臓器または系でもsiRNA媒介毒性は何ら認められなかった。
【０２７７】
C)  ETP801 siRNA (REDD14)と抗VEGF抗体の併用療法の有効性
CNVを伴う疾患の治療におけるETP801 siRNA (REDD14)と抗VEGF抗体の併用療法の有効性を前記のCNVマウスで試験した。
【０２７８】
A)CNV体積研究
レーザー損傷後の第3週の脈絡膜血管新生(CNV)体積を前述のように共焦点蛍光顕微鏡を使用して計算した(Sakurai et al. IOVS 2003;44:3578-85; Sakurai et al. IOVS 2003; 44: 2743-2749)。
前の研究では、抗VEGF-A抗体(Ab)がCNV体積を用量依存的に減少させることが判明した。REDD14+VEGF-A Ab併用研究ではVEGF-A Ab用量1ngを選択した。この用量は中間的な阻害効果を示したからである。VEGF-A Ab (1ng)はCNV体積を26±6%減少させた。
REDD14+VEGF-A抗体(Ab)研究の主な所見は次のとおりである:
・REDD14の低用量(0.05μg)の追加はCNV低下幅をVEGF-A Ab単独の場合よりも27±4%拡大させた。
・REDD14を高用量(0.25μg)の追加はCNV低下幅をVEGF-A Ab単独の場合よりも55±3%拡大させた。
【０２７９】
B)CNV漏出研究
実験1
この実験はマウスのレーザー誘発CNV(脈絡膜血管新生)モデルにおけるVEGF+RTP801阻害の潜在的な治療相加または相乗効果を特定することが目的であった。
【０２８０】
材料:
・   REDD14 (RTP801 siRNA)
・   REDD8 (陰性対照)
・   抗VEGF抗体
・   非特異的IgG (陰性対照)
CNVを第0日に前述の要領で誘発した。試験材料を第0日と第7日に対象動物に注射した。
結果の評価を第1週、第2週、第3週の蛍光血管図と第3週のCNV体積測定にによって行った。試験群は10眼からなった。
【０２８１】
実験群の内訳:
・   VEGF Ab 0.5ng/眼
・   VEGF Ab 1ng/眼
・   VEGF Ab 2ng/眼
・   VEGF Ab 4ng/眼
・   REDD14 0.05ug/眼
・   REDD14 0.1ug/眼
・   REDD14 0.25ug/眼
・   REDD14 0.05ug/眼+ VEGF Ab 1ng/眼
・   REDD14 0.1ug/眼+ VEGF Ab 1ng/眼
・   REDD14 0.25ug/眼+ VEGF Ab 1ng/眼
【０２８２】
対照群の内訳
・   PBS
・   非特異的IgG 2ng/眼
・   REDD8 0.1ug/眼
・   REDD8 0.1ug/眼+ VEGF Ab 1ng/眼
【０２８３】
結果
以上の実験の結果が図23〜24である。これらの結果は、VEGF AbとREDD14の同時硝子体内投与が、等級4スポット出現の減少と等級1スポット出現の増加によって表されるような、脈絡膜血管新生と脈絡膜血管漏出の増進的、用量依存的阻害をもたらすことを示す。血管図の等級付けには、公開済みの半定量的等級付け(1-4)方式(Sakurai et al. IOVS 2003; 44:2743-2749)を改変して用いた。等級1病変は一貫して非形成すなわち完全予防に相当するとみなす。等級4病変は病理学的に有意すなわち要治療の病変に相当するとみなす。VEGF-A Ab (1ng)は等級4病変/眼を38±8%減らし、また等級1病変/眼を66±43%増やした。
REDD14+VEGF-A Ab併用療法の血管漏出に対する効果の研究の主な所見は次のとおりである:
・REDD14の低用量(0.05μg)の追加は等級4病変出現の減少幅をVEGF-A Ab単独の場合よりも66±12%拡大させた。
・REDD14を高用量(0.25μg)の追加は等級4病変出現の減少幅をVEGF-A Ab単独の場合よりも60±12%拡大させた。
・REDD14を高用量(0.25μg)の追加は等級1病変出現の増加幅をVEGF-A Ab単独の場合の2倍(100±34%)にした。
【０２８４】
実験2
この実験はRPEと神経網膜での遺伝子発現に対するREDD14の作用を研究することが目的であった。
実験方案
群:
・   PBS
・   REDD14 0.25mg
群のサイズは5眼とした。第0日に前述の要領でレーザー処置によりCNVを誘発した。試験材料の注射も第0日に行った。効果の評価を第0日と第5日に、RPEと神経網膜での遺伝子発現のqPCR分析で行った。
【０２８５】
結果
以上の実験の結果が図25である。これらの結果はREDD14の投与が次のような効果をもたらしたことを示している:
・RPEと神経網膜の両方でのRTP801発現の、対ベースライン比〜40%抑制(図26参照);
・神経網膜でのPEDF発現の、対ベースライン比〜70%促進(注: PBS注射眼では、PEDFの発現が対ベースライン比40%の抑制となっている);
・RPEでのVEGF164発現の、対ベースライン比〜40%抑制(注: PBS注射眼では、VEGFの発現が対ベースライン比20%の抑制となっている);
・RPE/神経網膜でのMCP1発現の〜50%抑制(図26参照)。
【０２８６】
両実験からの一般的な結論:
・RTP801とVEGFの同時阻害は脈絡膜血管新生と新生血管漏出に対する阻害効果を増進した。
・REDD14によるRTP801発現阻害はCNVモデルでPEDFの抑制を防ぐだけでなく、その発現を対ベースライン比で増進する効果もある。
・RTP801発現の阻害はそれと同時にMCP1の抑制ともなり、ひいては抗炎症作用につながる。
・理論に縛られることなく、VEGFとRTP801の同時阻害という協調作用の根底にはREDD14によるPEDF発現の促進があるかもしれない。(注: PEDFは周知の抗血管新生/神経保護因子である。)
・理論に縛られることなく、VEGFとRTP801の同時阻害という協調作用の根底にはREDD14によるMCP1発現の抑制があるかもしれない。(注: MCP1はAMDの発症に関与する周知の抗炎症ケモカインである。)
【０２８７】
本発明の方法の試験に使用してもよい追加のAMDモデル:
Ccl-2またはCcr-2欠損動物: これらタンパク質はいずれかが欠損するとAMDの主症状のいくつの発現を招く。これらのタンパク質を欠損した動物は本発明の方法の試験に使用することができる。
AMD動物モデルに関しては、詳しくはChader, Vision Reserch 42 (2002) 393-399; Ambati et al. Nature Medicine 9(11) (2003) 1390-1397; Tolentino et al. Retina 24 (2004) 132-138.を参照。
【０２８８】
D)  REDD14抗RTP801 siRNAの各ストランドに3'リン酸基を有するタイプと3'リン酸基を欠くタイプ(REDD14NP)のレーザー誘発CNVモデルでの活性比較
この実験は一般に前述の要領で実行し評価した。各マウス(12頭/群)の一方の眼にREDD14 siRNAを、他方の眼にREDD14NP siRNAを、それぞれ0.25ugずつ注射した。
結果
両siRNAとも等しくCNV体積を効果的に減少させた(図27)。
【０２８９】
実施例７
COPDと肺気腫に関連するモデルと結果
本発明の化合物を次の点および動物モデルで試験した:
*  タバコ煙誘発肺気腫モデル: タバコ煙への長期的な接触は数種の動物特にマウス、モルモットなどに肺気腫を引き起こす。
*  肺気腫の引き金としての肺プロテアーゼ活性。
*  肺気腫VEGFR阻害モデル。
*  げっ歯類でのヒト好中球/膵エラスターゼの気管支注入。
*  NMP(マトリックスメタロプロテアーゼ)誘発肺気腫。
*  炎症誘発性肺気腫。
【０２９０】
また、遺伝子的な手法(TSK変異マウスの創出など)で肺気腫モデルを生成させてもよいし、また既知の肺気腫感受性修飾因子たとえば肺損傷、肺胞形成不全、低酸素症、グルココルチコイド処理および栄養摂取などにより肺気腫性動物を生成させてもよい。
【０２９１】
A.  マウス(RTP801 KOマウス)肺気腫モデルでの発症へのRTP801欠損の影響の評価
(1)タバコ煙(CS)誘発性炎症およびアポトーシスをRTP801 KOおよびWTの各4月齢雄性マウス×5に引き起こす。マウスを(前掲Rangasamy et al.に記載の要領で)強烈なCSに7日間接触させる。前記VEGFR阻害実験に由来するKOおよびWT非処置マウスはこの実験でも非処置対照群として役立てられる。次いで肺を、アガロースの注入により膨らませ、固定化し、パラフィンで包埋し、酸化ストレスのKOマウスへの影響次の点からを評価する:
a)肺切片中の8-オキソ-dGの免疫組織化学的局在および定量;
b)肺切片中の活性キャスパーゼの、特異抗体の使用による免疫組織化学的局在および定量、またはTUNEL陽性細胞の数の定量的評価;
c)肺組織抽出液中のセラミド濃度の測定;
d)肺組織抽出液中のキャスパーゼ活性の測定。
【０２９２】
(2)KOマウスの長期喫煙
KO雄性マウス、年齢適合WT雄性マウス各6頭を、強烈なタバコ煙に(1日5時間、都合)6か月間接触させた。次いでマウスを犠牲にし、横隔膜直径(肺気腫発症のパラメーター)を形態学的に評価した。
【０２９３】
B.  マウス肺気腫モデルでの疾患進行へのRTP801欠損の影響の評価−RTP801不活性化siRNAの肺内送達により内因性RTP801を阻害することによる
C57BL6マウス2群各10頭を7日間タバコ煙(CS)に接触させてCS誘発性炎症を誘発した。群1: CS+対照siRNA  (REDD8) siRNA注入; 群2: CS+RTP801 siRNA(REDD14)注入。対照群のマウスはいずれかのタイプのsiRNAを注入したが、ルームエアコン下に置いた。前記KOマウス実験の場合と同じ要領でマウスを評価した。
【０２９４】
方法
タバコ煙(CS)への接触
タバコ煙への接触は、2R4F標準紙巻タバコ(1本あたりニコチン2.45mg; 購入先:Tobacco Research Institite, University of Kentucky, Lexington, KY, USA)を喫煙機(Model TE-10, Teague Enterprises, Davis, CA, USA)で燃焼させて行う(7時間/日、7日/週)。燃焼条件は吸煙時間2秒、吸煙頻度1分間に1回で、合計8回、タバコ煙流量は1.05L/分で、吸煙容量は35cm3/1吸いとする。喫煙機は1度に5本の紙巻タバコを燃焼させて副流煙(89%)と主流煙(11%)の混合煙が生じるように調節した。室内雰囲気は総浮遊粒子と一酸化炭素の濃度がそれぞれ90mg/m23、350ppmとなるようモニターした。
【０２９５】
形態学的・形態計測的分析
マウスはCS接触またはRTP発現プラスミド注入後、ハロタンで麻酔し、肺を0.5%低融点アガロースの、25cm定水柱圧による注入で膨らませ、10%緩衝ホルマリンで固定化し、パラフィンで包埋する。肺切片(5μm)をヘマトキシリンとエオシンで染色する。Image Pro Plusソフトウェア(Media Cybernetics, Silver Spring MD, USA)使用のコンピューター援用形態計測により平均肺胞径、肺胞長、および平均肺胞隔壁間距離を求める。各群の肺切片はコード化し、代表的な画像(15画像/肺切片)を、スライド識別情報から遮蔽された調査員がNikon E800顕微鏡、20Xレンズで取得する。
【０２９６】
気管支肺胞洗浄(BAL)と表現型検査
マウスはCS接触またはRTP発現プラスミド注入後、ペントバルビタールナトリウムで麻酔する。BAL液をマウス肺から回収し、遠心分離し(500g@4℃)、細胞ペレットをリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁させる。洗浄液中の総細胞数を求め、2×104細胞をスライドガラス上に細胞遠心装置(Shandon Southern Products, Pittsburgh, PA, USA)で塗抹し、Wright-Giemsa染色を施す。300細胞を対象に標準細胞学手法により細胞分画を行う。
【０２９７】
肺でアポトーシスを起こした肺胞細胞集団の同定
肺でアポトーシスを起こした種々の肺胞細胞型を同定するために、室内空気(RA)マウス由来およびCS接触マウス由来の肺切片で、活性キャスパーゼ3の免疫組織化学的染色試験を行う。アポトーシスを起こしたII型肺上皮細胞を同定するために、活性キャスパーゼ3標識後に、肺切片をまず抗マウス海面活性タンパク質C(SpC)抗体と、次いで抗ウサギTexas red抗体と、それぞれインキュベートする。アポトーシスを起こした内皮細胞は肺切片をまず抗マウスCD31抗体と、次いでビオチン化ウサギ抗マウス2次抗体と、それぞれハイブリダイズさせることにより同定される。該肺切片をPBSで洗浄し、次いでストレプトアビジン-Texas red複合体とインキュベートさせる。肺でアポトーシスを起こしたマクロファージの同定は、肺切片をまずラット抗マウスMac-3抗体と、次いで抗ラットTexas red抗体と、それぞれインキュベートして行う。最後にDAPIをすべての肺切片に加え、5分間インキュベートし、洗浄し、Vectashield HardSet封入剤で封入する。DAPIとフルオレセインは330-380nmおよび465-495nmでそれぞれ可視化する。肺切片画像はNikon E800顕微鏡、40Xレンズで取得する。
【０２９８】
活性キャスパーゼ3の免疫組織化学的局在
抗活性キャスパーゼ3抗体を用いて活性キャスパーゼ3の免疫組織化学的染色試験を行い、活性キャスパーゼ3陽性細胞を、Image Pro Plusプログラムを使用してマクロで計数する。計数値は、ここで肺胞長といいμm単位で表示する肺胞輪郭の合計により正規化する。肺胞長は平均肺胞隔壁間距離とは逆相関する。すなわち肺胞中隔の破壊が進むと、全肺胞長すなわち全肺胞中隔長が小さくなるため、平均肺胞隔壁間距離は大きくなる。
【０２９９】
キャスパーゼ3活性試験
肺組織抽出液中のキャスパーゼ3/7活性を、蛍光分析法によりメーカーの説明書に従って測定する。瞬間凍結した肺組織(n=3/群)をアッセイバッファーでホモジナイズ処理し、次いで超音波破砕と遠心分離(800×g)を行った。核と細胞残屑を除去した後、上清(300μgタンパク質)を親蛍光基質と室温で11時間インキュベートし、Typhoon蛍光イメージャー(Amersham Bioscience, Inc., Piscataway, NJ, USA)で蛍光強度を測定した。結果を特異的カスパーゼ-3基質開裂速度として、全タンパク質濃度で正規化したカスパーゼ3酵素活性単位で表示する。アッセイ標準(0-4 U)として活性組み換えキャスパーゼ3を使用した。基質を欠く組織溶解液、アッセイバッファー単体、およびキャスパーゼ-3阻害剤添加組織溶解液を陰性対照として使用した。
【０３００】
8-オキソ-dGの免疫組織化学的局在
8-オキソ-dGの免疫組織化学的局在および定量のために、CS接触またはRTP発現プラスミド注入後のマウスに由来する肺切片を抗8-オキソ-dG抗体とインキュベートし、マウス抗体使用のInnoGenexTM Iso-IHC DABキットで染色する。8-オキソ-dG陽性細胞をマクロにより(Image Pro Plusを使用して)計数し、計数値は前述のように肺胞長で正規化する。
【０３０１】
プラスミドDNAのマウス肺への注入
RTP発現および対照ベクターのプラスミドDNAを内毒素フリーのDNA単離キットで調製した。50ugのプラスミドDNAを滅菌ペルフルオロカーボンと混ぜて気管内注入する。ペルフルオロカーボンの酸素運搬特性はこうした容量の注入を十分に耐えられるものにし、またその物理化学的特質は気管内注入した場合のきわめて効率的な遠位肺送達を可能にする。マウスは短時間のハロタン吸入により麻酔し、鉗子で舌をそっと前に引き出し舌根から気管に先丸の血管カテーテルでペルフルオロカーボン溶液を注入する。
【０３０２】
siRNAのマウス肺への注入
Ketamine/xylazine(115/22mg/kg)の腹腔内注射でマウスを麻酔する。50μgのsiRNAを50μlの0.9%NaClに混ぜたものを10μlずつ連続5回鼻内注入する。鼻内注入が終了したら、マウスの頭を仰向けに1分間維持して注入液が確実に内部に流れ込むようにする。
詳しくは次の文献を参照: Rangasamy T, Cho C Y, Thimmulappa, R K, Zhen L, Srisuma S S, Kensler T W, Yamamoto M, Petrache I, Tuder R M, Biswal S. Genetic ablation of Nrf2 enhances susceptibility to cigarette smoke-iduced emphysema in mice(マウスのタバコ煙誘発気腫への感受性を高めるNrf2遺伝子の破壊). Submitted to Journal of Clinincal Investigation; Yasunori Kasahara, Rubin M. Tuder, Carlyne D. Cool, David A. Lynch, Sonia C. Flores, and Norbert F. Voelkel. Endothelial Cell Death and Decreased Expression of Vascular Endothelial Growth Factor and Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 in Emphysema(肺気腫における内皮細胞死と血管内皮細胞増殖因子/血管内皮細胞増殖因子受容体2の発現低下). Am J Respir Crit Care Med Vol 163. pp 737-744, 2001; Yasunori Kasahara, Rubin M. Tuder, Laimute Taraseviciene-Stewart, Timothy D. Le Cras, Steven Abman, Peter K. Hirth, Johannes Waltenberger, and Norbert F. Voelkel. Inhibition of VEGF receptors causes lung cell apoptosis and emphysema(VEGF受容体の阻害は肺細胞アポトーシスと気腫を引き起こす). J. Clin. Invest. 106:1311-1319 (2000); また次の概論をも参照: Robin M. Tuder, Sharon McGrath and Enid Neptune, The pathological mechanisms of emphysema models: what do they have in common?(肺気腫モデルの発症機序: 共通性は何か), Pulmonary Pharmacology & Therpaeutics 2002.
【０３０３】
結果
1.  RTP801発現プラスミドの注入はマウス肺に肺気腫様の表現型をもたらすが、それは(1)BAL液中の細胞数の増加(図15a); (2)肺中隔細胞アポトーシス(図15b)および肺胞径の拡大(図15c)から明白である。
2.  RTP801 siRNA (REDD14)の注入は肺でのRTP801発現の低下を招く(図17b)。
3.  RTP801 KOマウスは、CS接触後の6か月間、肺気腫の発症から保護されるが、それは肺胞径の拡大が見られなかったことから明らかである(図18)。
4.  RTP801 KOマウスは、CS誘発性炎症の発症から保護されるが、それはCS接触1週間後の、炎症性BAL細胞数の減少から明らかである(図16, a-b)。
5.  RTP801 KOマウスは、肺切片の活性化キャスパーゼ試験から明らかなようにCS誘発性の肺中隔細胞アポトーシスから保護される(図16c)。
6.  REDD14注入マウスはCS誘発性炎症の発症から保護されるが、それはCS接触1週間後の、炎症性BAL細胞数の減少から明らかである(図17a)。
7.  REDD14注入マウスはCS誘発性の肺中隔細胞アポトーシスから保護されるが、それは肺切片の活性化キャスパーゼ試験から、また肺組織抽出液の抗活性化キャスパーゼ3抗体による免疫ブロッティングからも、明らかである(図17c)。
【０３０４】
実施例８
微小血管障害に関連するモデルと結果
本発明の化合物を、以下開示する多様な微小血管障害の動物モデルで試験した。
1.  糖尿病網膜症
RTP801はin vitroで神経細胞のアポトーシスと活性酸素種の生成を促進する。本願発明者はまた、未熟児網膜症(ROP)モデルに仕立てられたTP801ノックアウト(KO)マウスでは病理的血管新生(NV)が、低酸素状態下で、VEGFの上昇にもかかわらず減少するのに対して、この遺伝子の欠損は生理的な新生児網膜NVには影響しないことに気づいた。さらに、このモデルではRTP801の欠損は低酸素神経細胞アポトーシスや高酸素血管閉塞からの保護にもなった。
【０３０５】
実験1
8週齢のRTP801 KOおよびC57/129sv野生型(WT)同腹マウスにSTZ腹腔内注射により糖尿病を誘発した。4週間後、左眼より、1時間の暗順応後にERG(single white flash, 1.4×104 ftc, 5 ms)を取った。両眼でエバンスブルーアルブミン(EBA)透過法によりRVPを評価した。
【０３０６】
結果
糖尿病(DM)WTおよびDM KOの間に血糖値の差はなく(459±109対513±76 mg/dl)、非糖尿病(NDM) WTおよびKOの間にも血糖値の差はなかった(130±10対135±31 mg/dl)。RVPはNDM WT群で(21.5±18.8 μL/g/hr, n=9, p= 0.055)であるのに対してDM WT群では(51.2±37.9 μL/g/hr, n=8)と138%も上昇した。一方、DM WTマウスと比較してDM KOではRVPが(9.5±8.5 μL/g/hr, n=6, p= 0.023)で80%低下し、糖尿病誘発RVPが140%低下する結果となった。DM WTマウスではNDM WTと比較して、ERGの律動様小波潜時(oscillatory potential implicit times)の延長が見られた(p<0.05)が、その幅はOP2(11%)、OP3(12%)、OP4(14%)、それにB波(23%)であった。A波はほぼ無変化であった。これらの変化はDM KOマウスではNDM KOマウスと比較してOP3とOP4で〜100%、B波で65%、それぞれ正規化した。
【０３０７】
結論：
RTP801のノックアウトはマウスの糖尿病誘発性RVPおよびERG異常を緩和するが、これはこの低酸素誘導性遺伝子が初期糖尿病網膜疾患の発症に大きく関わっている可能性があることを示唆する。
【０３０８】
実験2
RTP801 KOマウスと遺伝的背景をマッチングした対照WTマウスに糖尿病を誘発させた。加えて、C57B16マウスにも糖尿病を誘発させたが、これは後に抗RTP801および対照siRNAの硝子体内注射に使用した。糖尿病を誘発させるためマウスにストレプトゾトシン(STZ) 90mg/kg/dを2日間、終夜絶食後に注射した。実験期間中、動物の生理をモニターして、血糖値、体重およびヘマトクリット値を記録した。基剤注射マウスを対照とした。適当なマウスを1ugのREDD14抗RTP801 siRNAまたは1ugの抗GFP対照siRNAの硝子体内注射により処置した。siRNAは実験期間中2回、最初のSTZ注射日にあたる第0日とSTZ注射後の第14日に、それぞれ注射した。
糖尿病継続4週間後の動物についてエバンスブルー(EB)色素法で網膜血管の漏出を計測した。マウスにはEB計測の24時間前にカテーテルを挿入した。各マウスの両眼の網膜透過性を標準エバンスブルー・プロトコールに従って計測した。
【０３０９】
結果
1.  RTP801 KO糖尿病マウスでは野生型の糖尿病マウスに比べて網膜血管漏出が70%減少した(図20参照)。
2.  RTP801のノックアウトはマウスのERG異常を正常化する: DM WTマウスでは、NDM WTと比較して、ERGの律動様小波潜時の延長が見られた(p<0.05)が、その幅はOP2(11%)、OP3(12%)、OP4(14%)、それにB波(23%)であった。A波はほぼ無変化であった。これらの変化はDM KOマウスではNDM KOマウスと比較してOP3とOP4で〜100%、B波で65%、それぞれ正規化した(図21参照)。
3.  KOマウスの結果と同様にして、REDD14 抗RTP801 siRNAを硝子体内に注射した糖尿病マウスでは、対照の抗GFP siRNAを硝子体内に注射した糖尿病マウスと比べて、網膜血管漏出が50%減少した(図22参照)。
【０３１０】
2.  未熟児網膜症
実験動物を低酸素および低酸素状態にさらして未熟児網膜症を誘発し、次いで網膜に対する効果を試験した。RTP801 KOマウスは未熟児網膜症から保護され、RTP801阻害の保護的効果を立証する結果になった。
【０３１１】
3.  マウスで左冠動脈前下行枝の短期および長期結紮により心筋梗塞を誘発した。結果: RTP801 KOマウスでの梗塞24時間後の血中TnTおよびCPK-MBの低下と梗塞28日後の心エコー図(駆出分画)の改善。
【０３１２】
4.  微小血管虚血状態
虚血状態を評価するための動物モデルの例:
1.閉鎖性頭部外傷(CHI): 実験的TBI(外傷性脳損傷)により神経学的/神経代謝カスケードに寄与する一連の事象を生み出すが、それらは行動障害の度合いと関連する。CHIは麻酔下に、正中前頭面の左半球側を覆うむき出しの頭蓋上に、所定の高さから錘を自由落下させて(Chen et al, J. Neurotrauma 13, 557, 1996)誘発する。
2.一過性中大脳動脈閉塞(MCAO): 成獣雄性Sprague Dawleyラット(体重300〜370g)に90〜120分の一時的な局所虚血を引き起こす。使用する方法はintraluminal suture MCAOである(Longa et al, Stroke, 30, 84, 1984; Dogan et al, J. Neurochem. 72, 765, 1999)。要するに、ポリ-L-リシンで被覆した3-0ナイロン縫合糸を右内頸動脈(ICA)に、外頸動脈の切開部経由で挿入し、右MCA(中大脳動脈)起始部まで(20〜23 mm)押し込み、90〜120分後、ナイロン縫合糸を引き抜き、切開創を閉じ、ラットを回復させるという方法である。
3.永久中大脳動脈閉塞(MCAO): 閉塞は永久的であり、MCA電気凝固法で片側的に誘発させる。どららの方法も同側の大脳皮質の局所脳虚血を招くが、対側部位はインタクトのままである(対照)。左MCAをTamura A, et al. J. Cereb Blood Flow Metab. 1981; 1:53-60でラットに関して記載されているような側頭頭蓋局部切開術により露出させる。該MCAとそのレンズ核線状体分枝(lenticulostriatal branch)を、嗅索内側縁の近位で閉塞する。創傷を縫合し、動物を26〜28℃に温めた室内のホームケージに戻す。動物の体温は自動サーモスタットで常時維持する。
【０３１３】
5.  急性腎不全(ARF)
ARF治療用の活性siRNAの試験は、敗血症誘発型のARFまたは虚血-再潅流誘発型のARFのいずれで行ってもよい。
1.敗血症誘発型ARF
敗血症誘発型ARF については2つの予測動物モデルが開示されている[Miyaji T, Hu X, Yuen PS, Muramatsu Y, Iyer S, Hewitt SM, Star RA, 2003, Ethyl pyruvate decreses sepsis-induced acute renal failure and multiple organ damage in aged mice(ピルビン酸エチルは高齢マウスの敗血症誘発型ARFと多発性臓器障害を軽減する),Kidney Int. Nov; 64(5): 1620-31] 。これらの2モデルはマウス好ましくは高齢マウスでのリポ多糖投与および盲腸結紮破裂である。
【０３１４】
2. 虚血-再潅流誘発型ARF
この予測動物モデルはKelly KJ, Plotkin Z, Vulgamott SL, Dagher PC, 2003 January, P53 mediates the apoptotic response to GTP depletion after renal ischemia-reperfusion : protective role of a p53 inhibitor(腎虚血-再潅流後のGTP枯渇に対するアポトーシス反応を媒介するp53: p53阻害剤の保護的役割), J Am Soc Nephrol.;14(1) :128-38で開示されている。
【０３１５】
ラットに腎虚血-再潅流障害を誘発した。これには、45分間にわたる両側腎動脈遮断とその後の遮断解除による24時間の再潅流を用いた。遮断2時間前と遮断30分後に、250μgのREDD14またはGFP siRNA(陰性対照)を頸静脈に注射した。追加の250μgのsiRNAは遮断の4時間後と8時間後に尾静脈から投与した。抗GFP siRNAは陰性対照とした。ARFの進行を術前と術後24時間の血清クレアチニン濃度の測定によりモニターした。実験の終わりに、ラットに留置大腿部カテーテルから温PBSとそれに続く4%パラホルムアルデヒドを潅流した。左腎を摘除し、4%パラホルムアルデヒドに漬けて保存し、後の組織学的分析に備えた。急性腎不全はしばしば血清クレアチニン濃度の、ベースラインからの急激な上昇と定義される。血清クレアチニンの少なくとも0.5mg/dLまたは44.2μmol/Lの上昇は急性腎不全の兆候とみなされる。血清クレアチニンはARF誘導手術前のゼロ時点と手術24時間後に測定した。
【０３１６】
ラット腎内のsiRNA分布を調べるために、糖残基に交互O-Me修飾を有するCy3-標識19-マー平滑末端siRNA分子(2mg/kg)を3〜5分間iv投与した後、2光子共焦点顕微鏡を用いてin vivoイメージングを行った。この共焦点顕微鏡分析により、腎内のsiRNAの大半は近位尿細管細胞のエンドソーム区画に集中していることが判明した。エンドソーム内と細胞質内の両siRNA蛍光は投与直後の2時間は比較的安定していたが、24時間後には消失した。
図19から明らかなように、45分間にわたる腎両側動脈遮断処置(PBS処置)後に血清クレアチニン濃度は10倍も高まった。RTP801 siRNA(REDD14、配列番号16および66)の4回の注射(遮断前2時間と遮断30分後、4時間後、8時間後)は血清クレアチニン濃度を有意に(p<0.02)40%も引き下げた。これらの結果は、RTP801 siRNAが腎組織を、虚血-再潅流障害の影響から保護し、従ってARFの重篤度を緩和することを示唆する。
【０３１７】
実施例９
siRNAの調製
プロプライエタリーアルゴリズムとRTP801遺伝子の既知配列(配列番号1)を使用して、多数の潜在的siRNAの配列を生成した。本願の明細に従うsiRNA分子は基本的に本願開示の要領で調製した。
本発明のsiRNAはリボ核酸(またはデオキシリボ核酸)からなるオリゴヌクレオチドの合成技術として周知の任意の方法で合成することができる。たとえば市販の合成機(特にApplied Biosystems社製品)が使用可能であ離、本願開示の配列に従ってオリゴヌクレオチドが合成される。重複する化学合成断片対を技術上周知(たとえば米国特許第6,121,426号明細書)の方法でライゲートすることもできる。ストランドを別々に合成し、次いで互いにアニールし、生じた2本鎖siRNAを(一方のストランドが過剰だったために)アニールしなかった1本鎖オリゴヌクレオチドからHPLCで分離する。本発明のsiRNAまたはsiRNA断片に関しては、そうした配列を複数合成し連結して本発明への使用が可能なようにするできる。
【０３１８】
本発明のsiRNA分子は技術上周知の方法で、たとえばUsman et al. 1987, J. Am. Chem. Soc., 109, 7845; Scaringe et al. 1990, Nucleic Acids Res. 18, 5433; Wincott et al. 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684; Wincott et al, 1997, Methods Mol. Bio., 74, 59で開示されている方法で、合成してもよいし、また一般的な核酸保護およびカップリング基たとえば5'末端ジメトキシトリチルや3'末端ホスホロアミダイトを使用してもよい。修飾(たとえば2’-O-Me付加)ヌクレオチドや非修飾ヌクレオチドは必要に応じて組み込む。
【０３１９】
あるいは、本発明の核酸分子は別々に合成し、合成後にたとえばライゲーションなどで(Moore et al. 1992, Science 256, 9923; Draper et al. 国際公開第WO 93/23569号パンフレット; Shabarova et al. 1991, Nucleic Acids Research 19, 4247; Bellon et al. 1997, Nucleosides & Nucleotides, 16, 951; Bellon et al. 1997, Bioconjugate Chem. 8,204)、あるいは合成および/または脱保護後のハイブリダイゼーションで、結合させてもよい。
【０３２０】
本発明のsiRNA分子はまた、米国特許出願公開第US2004/0019001号(McSwiggen)明細書で開示されているようなタンデム合成法で合成してもよい。両siRNAストランドを開裂性リンカーで仕切られた単一の連続オリゴヌクレオチド断片またはストランドとして合成し、後にこのリンカー部で切断して別々のsiRNA断片またはストランドとし、それらのハイブリダイゼーションと精製により2本鎖のsiRNAとする方法である。リンカーはポリヌクレオチドリンカーでも非ヌクレオチドリンカーでもよい。詳しくは国際公開第WO  2004/015107号(ATUGEN)パンフレットを参照。
【０３２１】
前述のように、Table A(以下)のsiRNAは糖が1つおきに2'-O-Me修飾を受ける、すなわちヌクレオチドが交互に修飾を有するように構築した。これの好ましい実施形態では、siRNAの一方のストランド上の修飾ヌクレオチドは番号が1、3、5、7、9、11、13、15、17および19であり、対向ストランドでは修飾ヌクレオチドの番号は2、4、6、8、10、12、14、16および18である。こうしてこれらのsiRNAは前述のように2'-O-Me修飾を交互に有する平滑末端の19-マーRNA分子である。Table 2〜3(以下)のsiRNAもまた同様に構築される; Table BのsiRNAは2'-O-Me修飾を交互に有する平滑末端の19-マーRNA分子であり、またTable CのsiRNAは2'-O-Me修飾を交互に有する平滑末端の21-マーRNA分子である。
【０３２２】
Table AはRTP801遺伝子向けに生成、合成される多様な新規siRNAを示す。最後の2欄は新規分子の活性を調べるために行った実験の結果を示す。要するに、HeLaまたはHeCat細胞に試験対象の特異的な新規siRNAをトランスフェクトした。次にRTP801ポリペプチドの発現をウェスタンブロット法で、RTP801ポリペプチドに対する抗体を使用して、測定した。Table Aの右手側2欄の“-”は、不活性または低活性分子である(RTP801遺伝子の発現をほとんど阻害しない)ことを示し、また“+”は(RTP801遺伝子発現の)阻害活性を若干有することを意味し、また“++”などはさらに高い活性を有することを示す。本願開示の任意のsiRNA分子は、特にTable Aに示す活性分子は新規であり、本発明の一部とみなされる。
【０３２３】
【表４】
2008510019.tif 000005
【０３２４】
【表５】
2008510019.tif 000006
【０３２５】
Table AのsiRNA番号1〜50のセンスストランドはそれぞれ配列番号3〜52を有し、またsiRNA番号1〜50のアンチセンスストランドはそれぞれ配列番号53〜102を有する。REDD14と命名されている分子は配列番号16(センスストランド)および66(アンチセンスストランド)を有する。
【０３２６】
【表６】
2008510019.tif 000007
【０３２７】
【表７】
2008510019.tif 000008
【０３２８】
Table BのsiRNA番号51〜122のセンスストランドはそれぞれ配列番号103〜174を有し、またsiRNA番号51〜122のアンチセンスストランドはそれぞれ配列番号175〜246を有する。
【０３２９】
【表８】
2008510019.tif 000009
【０３３０】
【表９】
2008510019.tif 000010
【０３３１】
Table CのsiRNA番号123〜171のセンスストランドはそれぞれ配列番号247〜295を有し、またsiRNA番号123〜171のアンチセンスストランドはそれぞれ配列番号296〜344を有する。
【０３３２】
実施例１０
薬理作用と薬物送達
本発明のヌクレオチド配列は直接、またはウイルス/非ウイルスベクターに入れて、送達することができる。直接送達の場合には、該配列は一般にヌクレアーゼ耐性にする。あるいは該配列は発現カセットまたはコンストラクトに組み込んで、標的細胞内で発現するようにしてもよい。一般に該コンストラクトは適正な調節配列またはプロモーターを含み、以って標的細胞内で該配列が発現しうるようになる。
【０３３３】
本発明の化合物または医薬組成物の投与投薬は優良医療規範に沿って、個別患者の病態、対象疾患、投与部位および方法、投与スケジュール、患者の年齢、性別、体重および医師が把握しているその他の因子を考慮して行われる。
【０３３４】
従って、ここでの目的のための医薬としての「有効量」はそうした技術上周知の因子によって決まる。該有効量は生存率向上、回復促進、または症状の緩和または解消、および当業者が適切な判定基準として選ぶような他の指標を非限定的に含む改善を患者または患者の生理系に実現するうえで有効な医薬化合物または組成物の量をいう。
治療は一般に疾患過程の期間、薬物の有効性、および治療対象患者・患畜の種に応じた期間を要する。一般に、ヒトが治療対象であれば、マウス等の例示的な実験動物よりも治療は長引く。
【０３３５】
本発明の化合物は任意慣用の投与経路で投与することができる。該化合物はそのままの形で、または製薬上許容しうる塩として、投与してもよいし、また単体で投与しても、有効成分として製薬上許容しうる担体、溶媒、希釈剤、添加物、補助薬および基剤と混合して投与してもよい。該化合物は経口、皮下または非経口たとえば静脈内、動脈内、筋内、腹腔内、鼻内およびくも膜下法、さらには注入法で、投与してもよい。該化合物のインプラントもまた有効である。液剤を注射用に、たとえば皮下、経皮、静脈内、筋内、くも膜下等の非経口投与経路用に、調製してもよい。液剤の例は水溶液(±有機共溶媒)、水性または油性懸濁液、食用油および類似の製薬用基剤とのエマルジョンなどである。加えて、場合によっては本発明の新規治療用組成物は鼻内用などのエアゾルとして調製してもよい。対象患者(患畜)は温血動物であり、特に人間などの哺乳動物である。製薬上許容しうる担体、溶媒、希釈剤、添加物、補助薬および基剤、それにインプラント担体は一般に、本発明の有効成分とは反応しない不活性、無害の固体または液体増量剤、希釈剤またはカプセル材をいう。
【０３３６】
本発明の化合物を非経口投与する場合、該化合物は一般に単位量注射形態(溶液、懸濁液、エマルジョン)に製剤する。注射に適した製剤は滅菌溶液または分散体、および還元して滅菌注射溶液または分散体とする滅菌粉末などである。担体は溶媒または分散媒などであり、それらはたとえば水、エタノール、ポリオール(たとえばグリセロール、ポリエチレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど)、それらの適当な混合物、および植物油を含有する。
【０３３７】
適正な流動性はたとえばレシチンなどのコーティングの使用により、分散体の場合には所要粒径の維持により、また界面活性剤の使用により、維持することができる。非水性基剤たとえば綿実油、ごま油、オリーブ油、大豆油、トウモロコシ油、ひまわり油、または落花生油、およびエステルたとえばミリスチン酸イソプロピルなどもまた化合物の組成物用の溶媒系として使用してもよい。加えて、該組成物の安定性、滅菌性および等張性を高めるための種々の添加物たとえば抗菌性保存剤、抗酸化剤、抗酸化剤、キレート剤およびバッファーなどを添加してもよい。微生物の活動の防止は種々の抗菌/抗真菌剤たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって確実にすることができる。多くの場合、等張剤たとえば砂糖、塩化ナトリウムなどを使用するのが望ましい。注射製剤の吸収時間の延長は吸収遅延剤たとえばモノステアリン酸アルミニウムやゼラチンの使用によって実現することができる。しかし、本発明によれば、使用する基剤、希釈剤または添加物は該化合物と適合しなければならない。
【０３３８】
滅菌注射液は本発明の実施に使用される化合物を所要量の適正溶媒に、必要に応じて種々の他成分と共に混合して調製することができる。
本発明の製剤は、任意の適合性担体たとえば種々の基剤、補助剤、添加物および希釈剤などを含む注射製剤として投与することができる; または本発明に使用される化合物は患者に、非経口的に、徐放性皮下インプラントの形で、または誘導送達系たとえばモノクローナル抗体、ベクター誘導送達、イオン泳動法、ポリマーマトリックス、リポソーム、微小カプセルなどの形で投与することができる。本発明に有用な送達システムの例は米国特許第5,225,182号; 第5,169,383号; 第5,167,616; 第4,959,217; 第4,925,678; 第4,487,603号; 第4,486,194号; 第4,447,233号; 第4,447,224号; 第4,439,196号; および第4,475,196号の各明細書で開示されている。その他のインプラント、送達系および分子も多数が技術上周知である。
【０３３９】
本発明に使用される化合物の製剤は患者に経口投与することができる。化合物を錠剤、懸濁液、溶液、エマルジョン、カプセル剤、散剤、シロップ剤などとして投与する慣用の方法が使える。該製剤を経口で、または静脈注射で、送達し、生理活性を維持するような周知の方法が好ましい。一実施形態では、本発明の化合物は最初、静脈内注射で投与して血中濃度を好適な水準まで高め、次いで経口投与でその水準を維持する。もちろん前述のように、患者の状態次第で他の投与形態も採用可能である。
一般に、ヒトでは該化合物の活性日用量は1ng/kg〜約20-100mg/kg-体重、好ましくは約0.01mg〜約2-10 mg/kg-体重であり、1日1回または2回または3回以上の投与で、期間1〜2週間以上、好ましくは24〜48時間とするか、または1〜2週間以上にわたる連続注入とする。
【０３４０】
本発明の化合物の眼への投与
本発明の化合物は眼に局所投与するか、または注射たとえば硝子体内注射、網膜下注射または両側注射で投与することができる。本発明の化合物の投与についての詳細はTolentino et al., Retina 24 (2004) 132-138; Reich et al., Molecular vision 9 (2003) 210-216に求めることができる。
【０３４１】
本発明の化合物の肺への投与
本発明の医薬組成物は好ましくはこれらの組成物/化合物を含むエアゾルの吸入により、または該化合物の鼻内または気管内注入により、肺に投与する。加えて、該組成物はPFC液たとえばperflubronを含んでもよいし、また該組成物は本発明の化合物とポリエチレンイミン(PEI)との複合体として調製してもよい。
医薬組成物の肺への送達に関する詳細については、Weiss et al., Human gene therapy 10:2287-2293 (1999); Densmore et al., Molecular therapy 1:180-188 (1999); Gautam et al., Molecular therapy 3:551-556 (2001);およびShahiwala & Misra, AAPS PharmSciTech 5 (2004)を参照。加えて、siRNA吸入製剤が米国特許出願第2004/0063654号(Davis et el.)明細書で開示されている。
【０３４２】
本発明の化合物の送達効率を高めるような追加製剤には、非処方化合物、コレステロールに共有結合させた化合物、および誘導用抗体に結合させた化合物などがある。Song et al., Antibody mediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell-surface receptors(siRNAの細胞表面受容体経由のin vivo送達を媒介する抗体), Nat Biotechnol. 2005 June; 23(6):709-17.
【図面の簡単な説明】
【０３４３】
【図１】図1  RTP801遺伝子のコード配列(配列番号1);
【図２】図2  RTP801ポリペプチドのアミノ酸配列(配列番号2);
【図３】図3  ヒト(hu)特異的であるかまたはヒト+マウス+ラット(hmr)特異的である種々の核酸分子のエクソン、CDS、hu SNPおよび位置を示す図;
【図４−１】本発明による種々の2本鎖核酸を第1ヒト細胞系に適用して得られたウェスタンブロット分析結果を示すパネル。実験は2回行った(実験1、実験2という)。p110aとp85の発現レベルをローディング対照として示す。RTP801バンドの強度(密度)が、使用した特定2本鎖核酸の阻害活性の尺度である;
【図４−２】本発明による種々の2本鎖核酸を第1ヒト細胞系に適用して得られたウェスタンブロット分析結果を示すパネル。実験は2回行った(実験1、実験2という)。p110aとp85の発現レベルをローディング対照として示す。RTP801バンドの強度(密度)が、使用した特定2本鎖核酸の阻害活性の尺度である;
【図４−３】本発明による種々の2本鎖核酸を第1ヒト細胞系に適用して得られたウェスタンブロット分析結果を示すパネル。実験は2回行った(実験1、実験2という)。p110aとp85の発現レベルをローディング対照として示す。RTP801バンドの強度(密度)が、使用した特定2本鎖核酸の阻害活性の尺度である;
【図５−１】本発明による種々の2本鎖核酸を第2ヒト細胞系に適用して得られたウェスタンブロット分析結果を示すパネル。実験は2回行った(実験1、実験2という)。p110aとp85の発現レベルをローディング対照として示す。RTP801バンドの密度が、使用した特定2本鎖核酸の阻害活性の尺度である;
【図５−２】本発明による種々の2本鎖核酸を第2ヒト細胞系に適用して得られたウェスタンブロット分析結果を示すパネル。実験は2回行った(実験1、実験2という)。p110aとp85の発現レベルをローディング対照として示す。RTP801バンドの密度が、使用した特定2本鎖核酸の阻害活性の尺度である;
【図６】図6A-C  本発明による種々の2本鎖核酸を第1ヒト細胞系に、種々の濃度で、すなわち10nM(6A)、5nM(6B)および1nM(6C)で、適用して得られたウェスタンブロット分析結果を示すパネル。実験は2回行った(実験1、実験2という)。p110aとp85の発現レベルをローディング対照として示す。RTP801バンドの密度が、使用した特定2本鎖核酸の阻害活性の尺度である;
【図７】図7  本発明による種々の2本鎖核酸をマウス細胞系に適用して得られたウェスタンブロット分析結果を示すパネル。実験は2回行った(実験1、実験2という)。p110aとp85の発現レベルをローディング対照として示す。RTP801バンドの密度が、使用した特定2本鎖核酸の阻害活性の尺度である;
【図８】図8  マウスAMDモデル系での実験の結果;
【図９】図9  マウスAMDモデル系での追加実験の結果;
【図１０】図10  非ヒト霊長類AMDモデル系での実験の結果;
【図１１】図11A-B  非ヒト霊長類AMDモデル系での追加実験の結果;
【図１２】図12A-B  非ヒト霊長類AMDモデル系でのさらなる追加実験の結果;
【図１３】図13A-B  非ヒト霊長類AMDモデル系で得られた実験結果の分析;
【図１４】図14  非ヒト霊長類AMDモデル系で得られた実験結果の追加的な分析;
【図１５】図15A-C  RTP801発現プラスミドのマウスへの気管内注入を伴う実験の結果;
【図１６】図16A-C  RTP801 KOマウスとWTマウスでの短期(7日)喫煙(CS)モデルの結果;
【図１７】図17A-C  活性抗RTP801(RDD14)および対照(REDD8) siRNAを注入したWTマウスでの短期喫煙モデルの結果;
【図１８】図18  RTP801 KOマウスでの長期CSモデル実験の結果;
【図１９】図19  マウスARFモデル系での実験結果;
【図２０】図20  マウス糖尿病網膜症モデル系での実験結果;
【図２１】図21  マウス糖尿病網膜症モデル系での追加実験の結果;
【図２２】図22  マウス糖尿病網膜症モデル系でのさらなる追加実験の結果;
【図２３】図23  マウスCNVモデル系でのRTP801/VEGF複合阻害実験の結果;
【図２４】図24  マウスCNVモデル系での追加RTP801/VEGF複合阻害実験の結果;
【図２５】図25  RPE(網膜色素上皮)および神経網膜での遺伝子発現に対するRTP801 siRNAの効果を調べる実験の結果;
【図２６】図26A-B  RPEおよび神経網膜での遺伝子発現に対するRTP801 siRNAの効果を調べる実験の追加結果;
【図２７】図27  RT801NPがRTP801と同様の活性を有することを示す実験結果。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2008510019.tif 000042
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