(57)【要約】  本発明は、レーザ顕微解剖方法及びレーザ顕微解剖用の装置に関する。平坦な支持体に装着される生物サンプルからの切断部は、閉じた切断ラインに沿ってレーザパルスによって切り取られる。レーザパルスと切断線とを決定するパラメータは、レーザパルスに対し同期し、閉じた切断線に沿って連続的に修正される。光軸上に配置されかつレーザパルス及び切断線のパラメータを決定するすべての要素は、中央計算ユニットに接続される。
2008544240.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ顕微解剖方法であって、該方法により、平坦な支持体に装着される生物試料から閉じた切断線に沿ってレーザのレーザパルスによって解剖用試料が切り取られるレーザ顕微解剖方法において、前記レーザパルスと前記切断線とを決定するパラメータが、前記閉じた切断線に沿って前記レーザパルスと同期して連続的に変更されることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記閉じた切断線に沿った前記パラメータの連続的な変化に関する変数が、画像処理によって獲得されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記パラメータが、前記試料の厚さと、前記試料支持体の斜めの位置と、前記試料の組織と、前記試料の染色とを含むことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記レーザパルスと前記切断線とを決定する前記パラメータが、前記閉じた切断線の閉鎖部の前でのみ連続的に変更されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記パラメータが中央処理装置によって決定されること、及び前記中央処理装置が光学系の個々の要素に制御信号を供給することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記レーザパルスが前記生物試料にぶつかる前に前記光学系を横断し、前記レーザパルスの前記パラメータが開口、減衰、前記切断線の前記個々のレーザ点の密度及び前記レーザパルスの焦点位置に関して変更されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記開口及び減衰器が同時に変更されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記開口及び減衰器の変更が、最高の切断速度のレーザパルスと同期して実行されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記切断線の内部の前記個々のレーザ点の密度が、前記それぞれのレーザ出力及び前記試料の局所特性に関して適合されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
光軸（１０）を規定する少なくとも１つの対物レンズ（９）と、該対物レンズを介して前記光軸に沿って試料（４）に向けられ、かつ閉じた切断線を描くレーザビームを放出するパルスレーザ（６）とを有する顕微鏡（１）を備えるレーザ顕微解剖用の装置において、前記レーザパルス及び前記切断線の前記パラメータを決定する前記光軸に配置されたすべての要素が、中央処理装置に接続されることを特徴とする、装置。
【請求項１１】
画像処理によって、前記中央処理装置が、前記要素の相関調整を介して前記閉じた切断線に沿って前記パラメータの連続的な変化を達成することを特徴とする、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記中央処理装置が、前記閉じた切断線の閉鎖部の前でのみ、前記レーザパルスと前記切断線とを決定する前記パラメータを連続的に変更することを特徴とする、請求項１０に記載の装置。
【請求項１３】
前記レーザパルス及び前記切断線の前記パラメータを決定する前記要素が、Ｘ／Ｙ変位ユニットと、開口ユニットと、減衰器ユニットと、合焦ユニットと、ＵＶレーザと、偏向ユニットとを備えて構成されることを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１４】
前記中央処理装置が、適切な調整信号を前記要素に供給することを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１５】
スライダを備えるユーザインタフェースを生成するモニタが設けられ、前記スライダにより、前記閉じた切断線の閉鎖部の前で前記パラメータの連続的な変化を決定することができることを特徴とする、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１６】
前記Ｘ／Ｙ変位ユニットが、Ｘ／Ｙステージと制御ユニットとを備えることを特徴とする、請求項１３に記載の装置。
【請求項１７】
前記開口ユニットが、調整可能なピンホール絞り又はアイリス絞りと、制御ユニットとを備えることを特徴とする、請求項１３に記載の装置。
【請求項１８】
前記減衰器ユニットがフィルタと制御ユニットとを備えることを特徴とする、請求項１３に記載の装置。
【請求項１９】
前記ＵＶレーザが処理装置と直接接続されることを特徴とする、請求項１３に記載の装置。
【請求項２０】
前記偏向ユニットが、一対のウェッジプレートと制御ユニットとを備えることを特徴とする、請求項１３に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ顕微解剖方法であって、この方法により、解剖用試料が、平坦な支持体に装着される生物試料から閉じた切断線に沿ってレーザのレーザパルスによって切り取られるレーザ顕微解剖方法に関する。
【０００２】
さらに、本発明は、光軸を規定する少なくとも１つの対物レンズを有する顕微鏡を備えるレーザ顕微解剖用の装置に関する。さらに、対物レンズを介して光軸に沿って試料に向けられ、閉じた切断線を描くレーザビームを放出するパルスレーザが設けられる。
【背景技術】
【０００３】
生物学及び医学の分野において、顕微解剖は、微小片、いわゆる解剖用試料が、合焦レーザビームによって一般に平らな試料（例えば、細胞、培養細胞又は組織部）から切り取られる方法を指す。生物試料は、レーザ切断するために平坦な支持体、例えばガラス試料スライド又は高分子フィルムに装着される。解剖用試料は、切断後、さらなる生物学的又は医学的（例えば、組織学的）検査のために利用できる。
【０００４】
レーザ顕微解剖用のこのような方法は、非特許文献１に記載されている。生物試料は、試料スライドの下側に装着される。生物試料が意味するものは、試料スライドに引き付けられていた細胞培養である。これらの細胞の基材における永続的な接着を防止するために、試料と試料スライドとの間の接着の低減を行うシリコンコーティングの試料スライドが使用される。試料スライドは、パルス化されたヘリウムネオンレーザが結合される正立顕微鏡に位置する。レーザビームは生物試料に合焦される。対象の試料領域、解剖用試料は、合焦されたレーザビームによるレーザパルスによって作製された切断孔を並列させることによって、閉じた切断線に沿って切り取られる。切断は、この場合、公知のレーザ除去の原則に基づいており、すなわち、個々のレーザパルスは、試料材料を「蒸発させる」プラズマを切断線で生成する。この場合、最後のレーザパルスは、解剖用試料を周囲の生物試料から分離し、そのようにして、試料スライドからの解剖用試料の必要な緩めを行う。次に、解剖用試料は、重力の作用下で落下し、収集容器に捕捉され、さらなる検査に送られる。
【０００５】
特許文献１は、この方法のさらなる発展形態を記載している。この場合、検査すべき及び対象の試料領域が切り取られるべき試料は、非常に薄いプラスチックフィルムで調製される。これらのプラスチックフィルムの厚さは、１〜２μｍのオーダである。材料として、ＰＥＴフィルム及びＰＥＮフィルムが挙げられる。試料は、パルスレーザが結合される顕微鏡に装填される。切断線が切断部の終了点に向かって完全に閉じられず、狭く同時に安定したウェブが終了点に留まるレーザ顕微解剖用の方法が、記載されている。これにより、対象の試料領域を有するフィルムが外に揺動されて、焦点面の外側に捻られることが防止される。ウェブが切断される前に、レーザビームの開口は、顕微鏡の観察開口を変更することなく絞りによって拡大される。レーザビームの切断幅は、拡大されたレーザ開口によって拡大される。同時に、レーザビームの焦点の位置は、変更なしに、試料に対し同一の位置に保持される。次に、残りのウェブは、拡張されたレーザ開口で、最後の合焦された切断レーザパルスにより切断される。切断の終了時、試料は、重力の作用下で落下して、収集容器に収集される。しかし、最後のレーザパルスの前に切断線を停止すること、及び切断線が最後のレーザパルスで終了する前にレーザ開口用の絞りに切り換えることが装置に関し複雑であり、かつ時間を浪費させることが、全体的に明らかになった。同様に、適切な残りのウェブを固定して、適合するレーザ開口を割り当てることが、使用者にとってそれほど簡単でないことが分かり、このように、解剖用試料は時に完全に自由に調製されず、切断を繰り返さなければならない。
【０００６】
さらに、両方の方法の場合、装置設定（光学系、レーザパラメータ、焦点位置等）が変更されない場合、順次切り取られた解剖用試料は、収集装置に落下するときに横方向に異なる範囲に流れ出すことが観測されている。この収集装置は、例えば、市場で通常ＰＣＲチューブと称される試料チューブであることができる。この結果、解剖用試料は、チューブの底部に落下する代わりにＰＣＲチューブの内壁に横方向に付着する。この場合、それらを検査することは難しく、このことは、使用者、例えば病理学者にとって、切り取られた解剖用試料のさらなる処理前に相当の作業ステップをもたらす。
【０００７】
したがって、特許文献２は、試料の対象の試料領域のレーザ顕微解剖用の方法を提案しており、この方法では、パルスレーザビームのレーザパルスが同様に試料に合焦され、またこの方法の場合、切断を完成する最後のレーザパルスで切除された質量は、プラズマから解剖用試料に伝達されるエネルギを最大にするように、最後の切断レーザパルスの切断幅に適合されかつ最適化される。しかし、最後のレーザパルスの前で切断線を停止することは、この場合も、使用者にとって時間を浪費すると感じられる。
【０００８】
特許文献３は、同様に、生物試料の選択領域が切り取られる顕微解剖用の方法を開示している。試料スライドに装着された試料は、ｘ−ｙ座標面で移動可能なステージに位置する。レーザビームは、顕微鏡内に結合され、ｘ−ｙステージは、このレーザビームが対象の試料領域を中心に適切に閉じた切断線を描くように適切に移動される。したがって、対象の生物学的材料は、生物試料から分離される。しかし、ｘ−ｙステージの制御は、機械的に複雑であり、また生物学的材料を試料の残りから分離するために、レーザビームがｘ−ｙ面で適切に制御される場合ほど正確でない。
【特許文献１】独国特許発明第１００４３５０６Ｃ１号明細書
【特許文献２】独国特許第１０３４６４５８号明細書
【特許文献３】米国特許第６，７７３，９０３号明細書
【非特許文献１】Ｇ．イゼンブルグ（G. Isenberg）、Ｗ．ビルザー（W. Bilser）、Ｗ．マイアー・ルーゲ（W. Meier-Ruge）、Ｅ．レミー（E. Remy）、ジャーナル・オブ・マイクロスコピー（Journal of Microscopy）、１０７巻、１９７６年５月、１９−２４ページによる「レーザ顕微解剖による細胞手術：準備方法」という題の論文
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の目的は、困難な試料調製の場合においても、従来よりも改良された切断結果を伴う、より快適かつ迅速な態様で解剖用試料の切り取りを可能にするレーザ顕微解剖の方法を特定することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この目的は、請求項１の特徴を有するレーザ顕微解剖方法によって達成される。
【００１１】
本発明の別の目的は、使用者が所望の解剖用試料を正確に、迅速また確実に獲得できるレーザ顕微解剖用の装置を特定することである。この場合、解剖用試料の獲得は、それぞれの試料調製と無関係である。
【００１２】
この目的は、請求項１０の特徴を有するレーザ顕微解剖用の装置によって達成される。
【００１３】
本発明のレーザ顕微解剖方法の場合、解剖用試料は、生物試料からレーザビームのレーザパルスによって切り取られる。この場合、レーザビームは、閉じた切断線に沿って案内される。試料それ自体は、平坦な支持体に装着される。解剖用試料が切り取られる間、レーザパルスと切断線とを決定するパラメータは、閉じた切断線に沿って連続的に変更される。
【００１４】
閉じた切断線に沿ったパラメータの連続的な変化は、画像処理によって決定される。閉じた切断線に沿ったパラメータの連続的な変化に関する変数は、画像処理によって獲得される。これらのパラメータは、例えば、試料厚さ、試料の組織、試料内部の染色の分布等である。
【００１５】
同様に、レーザパルスと閉じた切断線とを決定するパラメータは、閉じた切断線の閉鎖部（closure）の前でのみ連続的に変更されることが考えられる。パラメータは、試料の残りの切断中、一定に留まる。
【００１６】
閉じた切断線の閉鎖部の前で連続的な変化を決定するパラメータを変更するために、ユーザインタフェースにスライダを使用することができる。
【００１７】
パラメータは中央処理装置によって決定され、中央処理装置は、光学系の個々の要素に対応する制御信号を供給する。
【００１８】
レーザパルスは生物試料にぶつかる前に光学系を横断し、レーザパルスのパラメータは、開口、減衰、切断線の個々のレーザ点の密度及びレーザパルスの焦点位置に関して変更される。
【００１９】
開口及び減衰器は同時に変更される。開口及び減衰器の変更は、レーザパルスと同期して実行され、これによって、最高の切断速度が達成される。開口の変更は、ピンホール絞り又はアイリス絞りによって実施することができる。
【００２０】
切断線の内部の個々のレーザ点の密度は、それぞれのレーザ出力及び試料の局所特性に関して適合させることができる。
【００２１】
本発明のレーザ顕微解剖用の装置は、光軸を規定する少なくとも１つの対物レンズを有する顕微鏡を備える。同様に、対物レンズを介して光軸に沿って試料に向けられるレーザビームを放出するパルスレーザが設けられる。レーザビームは、試料の上に閉じた切断線を描き、これによって、試料の選択された領域を周囲の生物材料の残部から分離する。レーザパルス及び切断線のパラメータを決定する光軸に配置されたすべての要素は、中央処理装置に接続される。  
【００２２】
画像処理によって、中央処理装置は、個々の要素の相関調整を介して、閉じた切断線に沿ってパラメータの連続的な変化を達成する。
【００２３】
この場合、同様に、中央処理装置は、閉じた切断線の閉鎖部の前でのみ、レーザパルスと切断線とを決定するパラメータを連続的に変更するように使用することができる。
【００２４】
レーザパルス及び切断線のパラメータを決定する要素は、Ｘ／Ｙ変位ユニットと、開口ユニットと、減衰器ユニットと、合焦ユニットと、ＵＶレーザと、偏向ユニットである。この場合の中央処理装置は、適切な調整信号をそれぞれの要素に供給する。
【００２５】
同様に、レーザ顕微解剖用の装置にモニタが接続され、このモニタで、使用者にユーザインタフェースが表示される。ユーザインタフェースは、閉じた切断線の閉鎖部の前でパラメータの連続的な変化を決定できるスライダを構成する。この場合の中央処理装置は、開口及び減衰器を同時に変更する。
【００２６】
本発明の別の有利な改良は、この場合、従属請求項から理解することができる。
【００２７】
図面を参照して、本発明について以下により正確に説明する。
【００２８】
図では、同一の要素は同一の参照番号によって示される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
図１は、定置のレーザビームにより作動する顕微解剖用の装置と、装置に対し移動される試料４とを示している。装置は、モータによって移動できるｘ−ｙステージ２を有する顕微鏡１を備える。ｘ−ｙステージ２は、検査及び／又は切断されるべき試料４が装着される試料保持器３を受容するように機能する。同様に、照明系５が設けられ、これにより、使用者は、接眼レンズ１２を介して試料４を目視観測できる。試料４を切断するために、顕微鏡の光軸１０内に結合されるレーザビーム２２が設けられる。レーザ２２によって生成されたレーザビーム３１は、切断のために試料４に合焦される。ｘ−ｙステージ２は、所望の切断線が生成されるようにｘ−ｙステージ２を移動させる制御ユニット１５に接続される。次に、適切な試料部分が、レーザビーム３１と試料４との間の相対運動によって、所望の切断線で試料から切断される。図１に示した顕微鏡は、照明系５が顕微鏡スタンド８でｘ−ｙステージ２及び試料４の下に配置される透過光顕微鏡である。顕微鏡１は、ｘ−ｙステージ２と試料４の上に配置される少なくとも１つの対物レンズ９を備える。対物レンズは、照明系５の光軸と整列される光軸１０を規定する。この記載した配置では、試料４は透過光照明を用いて観測される。レーザ切断はまた、同様に倒立顕微鏡を用いて実行でき、この場合、照明系５はｘ−ｙステージ２の上方に配置され、かつ少なくとも１つの対物レンズがｘ−ｙステージ２の下に配置される。照明系５から放出される光は、試料４を有するｘ−ｙステージ２に配置された試料保持器３に、コンデンサ１１の下から向けられる。試料４を透過する光は、顕微鏡１の対物レンズ９に進む。顕微鏡の内部では、光はレンズ（図示せず）及び鏡を介して少なくとも一つの接眼レンズ１２に送られる。同様に、顕微鏡１に、対物レンズの倍率の関数として試料４の画像部分を記録するカメラ１７が接続される。カメラによって記録された画像データは処理装置１６に送られ、処理装置の部分は、記録された試料領域の画像を使用者に表示できるモニタ１８に接続される。同様に、カメラと処理装置との間に制御ユニット１５が間挿される。レーザ２２から放出されるレーザビーム３１は、例えば、ダイクロミック分割器などのビームスプリッタ１３を介して顕微鏡のビーム路１０内に結合される。レーザビーム３１が顕微鏡１のビーム路内に結合される前に、レーザビーム３１は、いくつかの要素１４、１６および１９が設けられる光学系を横断する。光学系の第１の要素は、制御ユニット１５に接続される開口ユニット１４であり、制御ユニットの部分は次に処理装置１６に接続される。開口ユニット１４は、アイリス絞り、又はいくつかの異なるピンホール絞りからの選択を備えることができる。光学系３０の第２の要素１９は、合焦ユニット１９であり、合焦ユニットの部分は、処理装置１６に同様に接続される制御ユニット１５に同様に接続される。合焦ユニット１９は、主に、可視スペクトル領域で主に補正される顕微鏡１の対物レンズ９の紫外線における異なる焦点位置を釣り合わせるために使用される。代わりに、合焦ユニット１９を使用して、切断操作中に、レーザ焦点の焦点位置の、特定の焦点位置又は連続的な変更を選択することもできる。光学系３０の第３の要素１６は減衰器ユニット１６である。同様に、減衰器ユニット１６は別個の制御ユニット１５に接続され、次に、制御ユニットは処理装置に接続される。レーザビーム３１は、光学系３０に導入されるＵＶレーザ２２によって生成される。同様に、ＵＶレーザ２２は処理装置１６に接続される。
【００３０】
減衰器ユニット１６の角度位置は変更でき、減衰は干渉の原理に基づく。開口ユニット１４、合焦ユニット１９及び減衰器ユニット１６のすべては、個々の制御ユニット１５からの制御信号によって、それらの位置及び／又は寸法を変更することができる。この場合、変更はモータによって実行される。開口ユニット１４、合焦ユニット１９又は減衰器ユニット１６は、個々の制御ユニット１５に接続され、制御ユニットの部分は、個々のフィードバック線１５ａを介して処理装置１６に接続される。開口ユニット１４、合焦ユニット１９及び減衰器ユニット１６は、この場合、互いに独立して調整することができる。開口ユニット１４及び減衰器ユニット１６の独立調整により、組み合わせて、最大のダイナミックレンジ（試料内のレーザ出力の変化幅）が得られ、また領域の深さ、分解能及び出力密度などの変数に、独立して適切に干渉することができる。試料４は、光学系３０内に結合されかつビームスプリッタを介して顕微鏡１のビーム路１０内に反射されるレーザビーム３１を使用して、個々のレーザパルスによって切断される。しかし、本発明の目的のために最適な切断結果には、開口ユニット１４、減衰器ユニット１６及び合焦ユニット１９のすべての変更とのレーザパルスの同期が必要とされ、またｘ−ｙステージ２の移動を考慮する必要がある。
【００３１】
図２は、レーザ顕微解剖用の装置を示しており、この装置の場合、ｘ−ｙステージは定置であり、またレーザビームは、試料４から任意の所望の形状の解剖用試料を切断するために、光学系３０に同様に配置される偏向ユニット４０によって適切に偏向される。この配置では、ｘ−ｙステージ２は、切断操作中に移動できない。レーザ２２から放出されるレーザビームの方向に進んでみた場合、光学系３０内の配置は、最初に減衰器ユニット１６、次に合焦ユニット１９、次に開口ユニット１４、最後に偏向ユニット４０である。偏向ユニット４０は、個々の制御ユニット１５に接続され、制御ユニットの部分は、フィードバック線１５ａを介して処理装置１６に接続される。偏向ユニット４０は、一対のウェッジプレートから構成され、ウェッジプレートは、レーザビームが、試料の上で、切り取られた解剖用試料が最後に有するように意図される所望の形状を描くように、処理装置１６と関連して制御ユニット１５によって適切に変位させられることができる。図１に関係する説明で既述したように、光学系３０のすべての要素の各々は、フィードバック線１５ａを介して処理装置１６に接続される個々の制御ユニット１５に接続される。
【００３２】
図３は、従来技術による解剖用試料用の切断方法の場合に使用されるようなパラメータの組を示している。切断長さが横座標にパーセントでプロットされている。この場合、０パーセントは切断の始まりを意味し、１００パーセントは切断の終わりを意味する。個々のパラメータ値は、切断長さの関数として任意の単位で縦座標３３にプロットされている。例えば、焦点３４、点間隔３５、減衰器３６及び開口３７などのすべてのパラメータは、切断長さ全体にわたって一定である。減衰器３６及び開口３７の相互作用に起因する合計出力３８は、したがって、切断長さ全体にわたって同様に一定である。
【００３３】
図４は、同様に、従来技術による解剖用試料の切断処理中のパラメータの組み合わせを示している。切断長さは、同様に、横座標４１にパーセントでプロットされ、パラメータの値は任意の単位で縦座標４２に示されている。焦点４３、点間隔４４、減衰器４５及び開口４６は、ほぼ切断長さ全体にわたって一定である。図３で既述したように、減衰器４５のパラメータ及び開口４６のパラメータにより合計出力４７が得られ、合計出力４７はしたがって同様に切断線の終了点の少し前まで一定である。切断長さ又は切断線の終了点の少し前で、系は、開口４６のパラメータが変更される短い休止を挿入する。したがって、開口は、切断線の終了点の前で拡大される。したがって、このように、合計出力も変化し、したがって合計出力も、より大きな開口のためより大きくなる。他のパラメータ例えば減衰器４５及び焦点４３などは、この場合一定に留まる。
【００３４】
図５は、切断長さ全体にわたって連続的に変化する１組のパラメータを示している。切断長さは、横座標５０にパーセントでプロットされ、個々のパラメータの連続的に変化する値は縦座標５１にプロットされている。図５から理解できるように、焦点５２のパラメータ、点間隔５３、減衰器５４、開口５５、したがって合計出力５６も、切断長さ全体にわたって変化する。試料の斜めの位置を釣り合わせるために、あるいは試料の異なる厚さに焦点を適合させるために、焦点の位置の変更が必要である。同様に、焦点の変更により、切断操作又は切断線の生成中に特定のｚ位置又はレーザ焦点のｚ位置の連続的な変更を選択できる。切断線は、個々のレーザパルスの並列によって生成される。この場合、点が互いに触れ、これによって、試料４の残りから解剖用試料を分離する切断線を生成することが重要である。図５に示したように、このため、切断線の内部の個々のレーザパルスの点間隔を同様に変更できる。点間隔の変化は、個々のレーザパルスの直径が切断線の生成中に変化できることを意味する。開口５５と減衰器５４との相互作用により、同様に、レーザパルスによって試料４に入力される連続的に変化する合計出力５６が得られる。図５に説明した例では、合計出力５６、開口５５、減衰器５４、点間隔５３、ならびに焦点５２の変数は、最適化された切削速度と関連して可能な限り確実な切り離しを達成するために、レーザパルスで連続的にかつ同期して変更される。これらのパラメータの推定値は、例えば、スペクトル領域全体又は特定のスペクトル領域又はカラーチャネルの光学密度を評価することによって、また方法を試料材料に対し「較正する」ことによって、すなわち、さもなければ使用されなかった試料の切断試験によって決定することができる。この場合、減衰器及び開口絞りの異なる設定によって同一の合計レーザ出力を達成し、したがって、切断線の部分に応じて、例えば（ａ）又は（ｂ）で、領域（小さな開口）の深さ又は焦点（大きな開口）の出力密度を選択的に最適化する追加の可能性がある。様々な焦点位置における顕微鏡画像のコントラストの評価を介して、光軸に対する標本の可能な曲率及び一般的な傾斜も決定することができ（ｃ）、またレーザパルスと同時に、したがって切断速度を低減することなく、提案した本発明の範囲内で変更できる。次に、所定の切断曲線ｌとｌｉに沿った試料材料の切断特性の推定値は、例えば、スペクトル領域全体又は特定のスペクトル領域又はカラーチャネルの光学密度ｄを評価することによって、あるいは他の方法により、任意に決定することができる。このように推定された光学密度ｄに基づき、試料材料又は支持材料ｘの種類に関する使用者データと共に、合計レーザ出力Ｐ（以下参照）、開口Ａ、減衰器Ｋ、点密度Ｄ、適切ならば、ｌに沿った焦点位置ｚなどの切断パラメータのプロフィールが、引き続く切断処理のために決定されかつ記憶される。この場合、少数の所定の単一のパラメータ関数（Ｐ，Ｄ，ｚ）＝ｆｘ（ｄ）又は（Ａ，Ｋ，Ｄ，ｚ）＝ｆｘ（ｄ）が、操作を簡略化するためにも考えられる。代わりに、方法を試料材料に対し「較正する」ことによって、すなわち、さもなければ使用されなかった試料４の部分の切断試験によって、最善の切断パラメータを決定することもできる。
【００３５】
光軸１０に対する標本又は試料４の可能な曲率及び一般的な傾斜も、様々な焦点位置における顕微鏡画像のコントラストを評価することによって決定し、またレーザパルスと同時に、したがって切断速度を低減することなく、提案した本発明の範囲内で変更できる。
【００３６】
図６は、いくつかのパラメータが切断線の終了点の少し前で連続的に変更される状態を示している。切断長さは、横座標６０にパーセントでプロットされ、個々のパラメータの値は縦座標６１に任意の値で示されている。変化するパラメータは、焦点６２、点間隔６３、減衰器６４、開口６５及び合計出力６６である。この場合、焦点６２は、切断線全体にわたって一定に留まるか、あるいは切断線全体にわたって連続的に変化することができる。終端の切断線の約６０パーセントから始まって、点間隔６３、減衰器６４、開口６５、したがって合計出力６６などの残りのパラメータの値は連続的に増加する。パラメータの前述の値は、切断線の６０パーセントまで一定である。この結果、試料材料又は支持体の残りからの解剖用試料の確実な分離は、切断線の終了点の前の試料４に作用する合計出力の連続的な増加によって達成される。図６に示したパラメータ設定の場合、切断線に沿った切断パラメータの明示的な決定は省略されている。高い「全体的な」切断速度と関連して解剖用試料の可能な限り確実な分離が追求される。切断曲線で省略される部分はなく、予定より早い下降、又は応力によって引き起こされる焦点位置からの解剖用試料の設定を最小にするために、レーザ出力（又は開口及び減衰器）及び点間隔が、切断曲線の終了領域で連続的に増大されている。これらの変化は、切断線に沿ったレーザ出力及び点間隔のプロフィールを規定するクラスｘの単一パラメータの関数によって示されている。ｘの選択は、典型的な（公知の又は以前に決定された）材料特性に基づき、又はある種類の「較正」によって実行することができる。代わりに、又は追加して、設定、下降、傾斜、又は上方摺動及び接着などのそれぞれの材料が干渉効果に関しいかに重要であるかを記述し、次に、例えば、合計レーザ出力（又は開口及び減衰器）及び切断線の終了点に向かう関連の点密度の変化を規定する追加の設定変数を介して、正しい関数クラスｘの選択に干渉することが使用者にとって有用であることが分かっている。このように、使用者は、可能な限り簡単に、一方で重要でない試料材料と、他方で分離することが困難な試料材料とを識別して、切断処理を対応して適合させることができる。
【００３７】
図６の単純化した例では、光学密度ｄが切断線ｌに沿って決定されずまた使用されず、最適化されたパラメータプロフィール（Ｐ，Ｄ）＝ｇｘ（ｌ）又は（Ａ，Ｋ，Ｄ，ｚ）＝ｇｘ（ｌ）が決定され、この場合、さらに上に既述したように、切断線ｌの可能な限り大きな部分にわたる可能な限り薄い両方の切断、及びｌの重要な終了点領域における可能な限り確実な分離を達成するために、ｇｘは再び、特に終了点に向かう切断線ｌに沿ったパラメータのプロフィールを記述する単一パラメータの関数のクラスである。ｘの選択は、図５に関係する説明で既述したように、典型的な（公知の又は以前に決定された）材料特性に基づき、又は再びある種類の「較正」によって実行することができる。代わりに、又は追加して、傾斜、上方摺動、接着又は上方曲げなどの上述の干渉効果に関しいかに重要であるかを記述し、次に、例えば、合計レーザ出力Ｐ（又はＡとＫ）及び切断線の終了点に向かう関連の点密度Ｄの変化を規定する追加の設定変数を介して、正しい関数クラスｇｘの選択に干渉することが使用者にとって有用であることが分かっている。このように、使用者は、可能な限り簡単に、一方で重要でない試料材料と、他方で分離することが困難な試料材料とを識別して、切断処理を対応して最適化することができる。
【００３８】
図６に記載した切断方法では、光軸に対する標本の可能な曲率及び一般的な傾斜を決定し、同時に切断速度を低減することなくレーザパルスを補正するために、様々な焦点位置における顕微鏡画像のコントラスト評価を使用することも任意に可能である。
【００３９】
図７は、切断線７０を示しており、その内部に、試料４に対するレーザパルスのパラメータの組み合わせが変化する領域が設けられる。本発明の実施形態において、切断線７０は、４つの領域７１、７２、７３と７４に分割される。このように、例えば、切断は、領域７１及び領域７３で一定のパラメータで行われる。領域７２及び領域７４では、切断線を生成するためのパラメータは連続的に変化する。使用者は、マウス（図示せず）を使用して、モニタ１８の試料４の画像に所望の切断線ｌを直接マークするか、あるいは、適切ならば、使用者は大まかに検索領域を規定し、画像検出器が、試料４の所定の領域の１つ以上の／すべての切断線ｌｉを完全に自動的に決定する。
【００４０】
図８は、切断線８０を生成するための別の実施形態を示している。切断線は、図８の８１によって示される開始点を有する。切断線８１の開始点は切断線８３の終了点と一致する。切断線の開始点８１から進んで、切断は、切断線の位置８２まで一定のパラメータで実行される。一定のパラメータは、切断線の開始点８１と位置８２との間の切断線に適用される。次に、パラメータは、位置８２と切断線のそれぞれの開始点又は終了点８１との間で、連続的に変更されるか又は高められる。このように、完成した切断線の約６０パーセントの後に、早くても、切断パラメータを切断線の終了点まで連続的に変更することが開始される。切断処理中、切断線の平均幅は数μｍである。
【００４１】
図９は、開口及び減衰器を同時に変更する場合の総合効率を示している。制御値は、任意の単位で横座標９０にプロットされている。強度は、対数単位で縦座標９１に示されている。可能な限り大きなダイナミックレンジを達成するために、開口及び減衰器の同時の変更が必要である。減衰器及び開口の制御を組み合わせることにより、出力設定の場合の分解能が高められる。通常、絞り段階は、開口に関し大まかにのみ対数的に段階付けられる。１つの絞り段階は、＞３０パーセントの強度の変化に対応する。減衰器は、それと対照的に、７パーセントよりも優れた（より小さな微小段階が可能）分解能で設定することができる。高いダイナミクス（約１：２０００の合計ダイナミクス）は、７％よりも優れた分解能（０．９２８で１００段階）と関連して、開口及び減衰器の同時制御の組み合わせによって達成することができる。減衰器の変化９２は、図９の別個の段階で示されている。開口の変化９３は、同様に図９の別個の段階で示されており、開口の設定の場合の段階は、上に既述のように減衰器の設定の場合よりも大きい。開口及び減衰器の制御の組み合わせから得られる強度の総合効率が、曲線９４に示されている。曲線９４は、総合効率の強度の上昇において周期的な上昇を示していることが理解される。切断操作中、レーザビーム３１の開口Ａ及び減衰器Ｋの両方は任意に変更される。ただし、ＡとＫとの組み合わせのすべてが、実際に独立していたり、所定の用途にとって重要なわけではない。原則として、ＡとＫとのいくつかの組み合わせがあり、これらのすべては試料内に同一の合計出力入力Ｐをもたらし、また写真撮影と同様に、絞りＢと露光時間ｔとの多くの組み合わせにより、フィルムの同一の露光がもたらされる。Ａが開口直径の対数を示し、Ｋが減衰器の透過の対数を示す場合、単純にＰ＝Ａ＋Ｋ（Ｐも対数単位）であり、これによって、ＡとＫの（無限に）多くの値が同一の和Ｐを導くことができることが明らかである。しかし、写真撮影と同様に、平均出力入力Ｐ（写真の平均露光）が同一である場合でも、最終結果がまったく異なることがあり得ることも当てはまる。写真撮影では、これらの特性は、いわゆる「プログラムオートマチック」によって考慮され、すなわち、Ｂとｔの値は、特定のスキームで有用な露光範囲にわたって変更され、また用途に応じて、例えば、最大の被写界深度が望ましいか、あるいは最小の視野移動が望ましいかに関し、それぞれのスキームが変更されるか又は適合される。「プログラムオートマチック」の構想、すなわち、ＡとＫが共に変更されるスキームは、今や、本明細書に記載した方法及びレーザ顕微解剖の出力制御を改良するための関連の装置と共に使用することができる。
【００４２】
開口ストッパ及び減衰器のみにより達成できるダイナミクス範囲は、実際には約７０：１の値に又は特定の場合に３０：１の値に制限される。しかし、最適な切断品質は、典型的に、比較的大きな範囲にわたって総合効率の変更を必要とする。非常に大きな出力変更はまた、レーザパルスと同期して同時に開口ストッパ及び減衰器を変更することによって、速度の損失なしに実施することができるが、この理由は、個々の構成要素の調整通路が、開口ストッパ及び減衰器のみにより変更がもっぱら実施されなければならない場合よりも小さいからであり、全体的に２０００：１のダイナミクス範囲が結局のところ達成される。
【００４３】
最も単純な場合（図９参照）、開口及び減衰器は、この大きなダイナミック範囲を実施するために制御値の所定の範囲にわたって単調に変更される。しかし、ある状況では、これは、等しくない大きさの出力をもたらす（上に既述のように）。したがって、実施例の減衰器のより微細な段階付けは、おおまかに段階付けられた開口に対し利用できない。
【００４４】
図１０は、同様に、減衰器及び開口の総合効率の組み合わせを示している。この場合、制御値は、任意の単位で横座標１００にプロットされている。次に、強度は、対数単位で縦座標１０１にプロットされている。曲線９２は減衰器の変化を示している。この場合、減衰器は、別個の段階で連続的に上昇して変更されない。したがって、減衰器は、最初に、強度が２段階で上昇し、第３の段階で再び低下するように変更される。このスキームは、減衰器の調整全体のために継続される。図９にすでに示したように、開口は別個の段階で変更される。変化する開口と変化する減衰器との組み合わせから得られる総合効率が、曲線９４に示されている。強度は連続的に段階的に上昇し、段階の各々は等しく大きいことを理解すべきである。したがって、総合効率の準連続的な上昇という言葉を用いることができる。さらに、減衰器及び開口の調整の適切な組み合わせにより、実質的により微細な段階で調整できる総合効率をもたらすことができる。全体範囲≒２０００：１にわたる総合効率の単調指数変化は、この場合簡単な例（図９）で生じる誤差を補償する減衰器の最適化された制御により、減衰器のより微細な段階付けを維持することによって実施することができる。
【００４５】
図１１は、結果として得られる切断線１１２、１１３と１１４を示しており、開口ストッパ及び減衰器は、図１０に記載した方法を使用して共通に調整されている。切断線１１２、１１３と１１４の各々は、この場合、開口絞り及び減衰器からの異なる組のパラメータを用いて切断される。すべての切断線１１２、１１３と１１４は、切断幅１１５の連続的な増加を示している。切断線１１２、１１３と１１４の各々は、図１０で説明した方法による開口ストッパ及び減衰器の調整のため、切断幅１１５の急激な増加を示さない。切断線１１２、１１３又は１１４の終了点の切断幅は、約１０μｍ〜５０μｍである。出力値の微細補正の可能性のため、アイリス絞りの代わりにピンホール絞りの使用も、完全に有利であることが示されている。アイリス絞りは、原則として、開口値の変化が連続的に行われ、したがって、調整中にピンホール絞りの所定の開口の間の空間にぶつかるレーザパルスの「危険性」はなく、このようにレーザパルスが遮断される利点を有する。それに反して、ピンホール絞りの開口値はより正確に規定され、またピンホール絞りは、より小さくかつより計量の構造であることができ、この結果、調整は数ミリ秒のみで済み、したがって、レーザパルス間の待機時間に完全に実行することができる。
【００４６】
図１２は、例えば、４０：１のダイナミックレンジを有する減衰器と、同一のダイナミックレンジの開口絞りとの可能な組み合わせの制限を示している。この場合、減衰器及び開口ストッパは、０〜１００の制御値にわたって、累積曲線Ｇによる４０２：１、すなわち１６００：１の合計出力の強力な指数変化が行われるように、同時に制御される。
【００４７】
同様に図９と図１０で実施される最も単純でかつ最も普遍的な例では、減衰器及び開口ストッパの両方は、制御値の範囲全体にわたって一定の勾配ＥとＦの曲線に従って同一に変更される。したがって、特定の設定値に特別な優先性は与えられない。
【００４８】
しかし、可能な限り大きな被写界深度を保証するために、及び／又は可能な限り小さな切断光学系の収差を保証するためにも、例えば、可能な限り大きな制御値の範囲にわたって開口値を可能な限り低く維持することも合理的であり得る。逆に、特別な基材のために可能な限り高い空間（横方向及び軸方向）分解能を保証し、また焦点における可能な限り高い出力密度（焦点個所の範囲が開口の増大と共に減少することによって、出力密度が偏って上昇する！）を同時に保証するために、可能な限り大きな開口を優先することも合理的であり得る。これらの例は、例えば、ＨとＩなどの制御曲線の対に対応し、ここで、第１の例では、ｌは開口に関し、Ｈは減衰器に関し、また第２の場合はその逆である。
【００４９】
一般的な場合、所定の目的の範囲内で制御するために、平行四辺形ＡＢＣＤのＡ〜Ｄに完全に走り、かつ対になって（又はそれと等価の方法で、それらの和は特定の制御値について所定の値Ｇをもたらす）線Ａ〜Ｄに対し対称的に位置するすべての対（またこれらのみ！）の曲線が可能であることが発見されている。
【００５０】
減衰器及び開口の制御曲線が図１３に示されており、これらの曲線は、曲率の単調変化を有するプロフィールのみに確かに限定されず、（ほぼ）一定値の反転点及び領域も可能である。このように、例えば、例えば３０（Ｌ）の制御値の周りの可能な限り大きな範囲にわたって、プロフィールＫに従って可能な限り一定の開口を保証する必要があり得る。上記の考察によれば、Ａ−Ｄに対する対称から又はＧの和条件から、減衰器に割り当てられる制御曲線Ｊを直接導出することが可能である。
【００５１】
特に図１０による誤差補正が利用される場合、開口ストッパＡ及び減衰器Ｋの制御の組み合わせは、設定される減衰器値Ｋの高い精度を必要とする。残念ながら、使用した減衰器は、典型的に、傾斜角アルファに基づき、最大と最小を有する変位したｃｏｓ形状の特性Ｋ＝ｆ０×ｃｏｓ（ｆ１＋ｆ２×アルファ）＋１＋ｆ３（ｆ０〜ｆ３は個々のパラメータである）をほぼ示し、及び所望の単調指数形態Ｋ＝ｇ０×ｅｘｐ（−ｇ１×アルファ）を示していない。
【００５２】
したがって、本発明の目的のために精度を保証するために、個々の減衰器のフィッドパラメータ（fid parameters）（４つ以上）、又は十分に小さな分散の場合、減衰器の製造バッチの平均パラメータが決定され（図１４参照）、レーザヘッドの記憶領域に記憶される。フィッド関数（fid function）を反転することによって、次に、所定の制御値から関連の傾斜角を決定し、このように、減衰器の特性を「線形化する」ことができる（図１５参照）。例えば、特定の例では、制御値の３つのレベルは１．２５のファクタ（指数特性）と一致することが必要であり得る。この結果、ｌｏｇ１０（強度）∝−０．０３２３×制御値の強度の指数特性が得られる。
【００５３】
切断速度を最適化するために、計算及び移動が時間的に「ずらして」実行され、すなわち、個々の構成要素（開口ユニット１４、減衰器ユニット１６、合焦ユニット１９、及び偏向ユニット４０又はｘ−ｙステージ２）が新しい位置を探しているか、あるいは所望のレーザ周波数の所定の期間の終了が待機されている間に、それぞれそれに続く位置について時間を浪費する計算が実施されている。次に、フィードバックにより、すべての構成要素がそれらの所望の位置に達し、また（ＡＮＤ）レーザパルスの所定の待機時間が終了したことが伝えられると、レーザトリガが解放されて、位置決め命令が次のショット位置について直ちに伝送される。
【００５４】
一例として、図１６は、切断線を生成するためのプログラムループの概略図を示しており、次のように実行される。
１）すでに計算された最後の角度位置（α、β）に移動するように、偏向ユニット４０のウェッジプレートに対する命令、
２）現在の点間隔Ｄに基づく次のショット座標（ｘ、ｙ）の計算、
３）偏向ユニット４０のウェッジプレートの角度位置（α、β）へのこれらのショット座標の変換（概して、最も時間浪費的）、
４）すべての構成要素がそれらの所望の位置に達し、またレーザの選択された期間が終了するまで待機、
５）レーザトリガの解放及び期間用カウンタのリセット、
６）点間隔（ｄｘ、ｄｙ）、出力Ｐの新しい値、それらからの開口Ａ及び減衰器Ｋの値、適切ならば、焦点位置Ｆの計算、
７）新しい位置に移動するように、開口絞り、減衰器及び焦点モータに対する命令、
８）切断曲線の終端点にまだ達しなかった場合、１）に戻る。
【００５５】
順序を開始するために、切断曲線の第１の点の角度位置（α、β）は、すでに計算されていなければならず、また開口Ａ、減衰器Ｋ及び焦点位置Ｆは、切断曲線の開始点について初期位置内に移動されていなければならない。
【００５６】
図６に示した切断方法の場合、本発明の目的のために、切断線の終了点における最後のレーザショットの位置を監視し、適切ならば、修正して介入することが有利である。最大レーザ出力によるレーザ顕微解剖中、可能な限り確実な分離を保証するために、解剖用試料の可能な限り大きな領域が除去されるように、切断曲線が閉じる前に、最後のレーザパルスを常に直接位置決めすべきである。最後のショットが切断線の開始点からあまりに遠く離れて設定される場合、解剖用試料が掛かったまま残される危険性があり、これに対し、最後の点があまりにも近く設定される場合、解剖用試料が所望のように切断されず、（頻繁に観測されるように）焦点面から「回って出て」、したがって、最後のショットに「アクセスできなくなる」危険性がある。
【００５７】
しかし、一般に使用者によって任意に固定される切断曲線の全長は、特に点間隔が拡張モードで一定に留まらない場合、点間隔の適切な倍数であることは希である。したがって、本発明の本質は、切断操作の開始前に、この最後のパルスの選択した切断パラメータから得られる位置を計算すること、及び切断曲線又は切断線の干渉する不連続又はギャップを生じることなく、パラメータの僅かな変更によって最後のパルスの有利な位置を強制することである。
【００５８】
レーザパルスと同期してレーザ出力パラメータ（開口及び減衰器）を変更することにより、著しく高い切断速度が供給される。これにより、多くのサブ領域の自動切断と関連して処理量を同様に最大にするプラスの副効果が得られる。
【００５９】
点密度をそれぞれのレーザ出力及び試料の局所特性に適合させることによって、個々のレーザショットによる切断部の生成を保証することができる。これにより、解剖用試料が掛かったまま残されること、傾けられること等が防止されるか又は回避される。パルス伝送の最適化はまた、対象の領域の分離と関連して達成することができる。
【００６０】
開口及び減衰器の同時の変更により、可能な限り大きなダイナミックレンジが達成される。
【００６１】
減衰器及び開口ストッパの制御を組み合わせることにより、出力設定における分解能が高められる。
【００６２】
試料の特定の特性（利用可能なダイナミックレンジ内）は、特定のスキームを使用して開口と減衰器とを介して有効なレーザ出力を変更することによって最適に考慮することができる。
【００６３】
減衰器Ｋの「線形化」は、レーザヘッドに記憶された個々の較正曲線によって達成される。これによって、傾斜した干渉フィルタの典型的にｃｏｓ形状の特性が、正確に指数のプロフィールに変換される。
【００６４】
さらに、切断処理の最適なパラメータの決定は、前もって試料の「較正領域」で、又は切断中の切断結果の進行する自動的な光学式監視下で、画像解析から実行することができる。適切ならば、最適に分離されなかった試料の領域を自動的に再切断するか又は新たに切断することができる。
【００６５】
図１７は、閉じた切断線の閉鎖部の前のパラメータの連続的な変化が、少なくとも１つのスライダ１７１、１７２、１７３によって設定されるユーザインタフェース１７０の部分図を示している。ユーザインタフェース１７０は、モニタ１８によってユーザに表示される。第１のスライダ１７１は、試料にぶつかるレーザパルスの合計出力を設定するために使用することができる。既述したように、合計出力は、減衰器及び開口の調整の適切な組み合わせから得られる。第２のスライダ１７２は、切断線が試料に作られるべき速度を設定するために使用することができる。この場合、レーザパルスの繰返し速度は、スライダに従って設定される。第３のスライダ１７３は、切断線の終了点でパラメータをどの程度強く変更すべきかを設定するために使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】定置のレーザビームによるレーザ切断用の装置の図面である。
【図２】可動レーザビームによるレーザ切断用の装置の図面である。
【図３】パラメータが切断線の終了点まで一定に留まる従来技術によるパラメータ構成の図面である。
【図４】パラメータが試料の完全な切り取りの終了の前に突然変更される従来技術によるパラメータ構成の図面である。
【図５】閉じた切断線に沿ったパラメータの連続的な変化を示した図面である。
【図６】切断線の終了の前のパラメータの連続的な変化を示した図面である。
【図７】パラメータが切断線全体の推移にわたって連続的に変更される切断線の概略図である。
【図８】パラメータが切断線の終了の前に変更されない切断線の概略図である。
【図９】開口Ａ及び減衰器Ｋの変更の総合効率の図面である。
【図１０】開口Ａ及び減衰器Ｋの変更から最適化された総合効率の図面である。
【図１１】開口絞り及び減衰器が共通に調整された切断線の図面である。
【図１２】一例として、４０：１のダイナミックレンジを有する減衰器と、同一のダイナミックレンジの開口絞りとの可能な組み合わせの制限を示した図面である。
【図１３】一例として、単調曲率変化を有するプロフィールのみに全く制限されない減衰器及び開口の制御曲線を示した図面である。
【図１４】減衰器の角度位置の関数としての典型的な較正曲線を示した図面である。
【図１５】所定の制御値からの減衰器の特性の線形化を示した図面である。
【図１６】一例として、切断線を発生するためのプログラムループの概略図である。
【図１７】閉じた切断線の閉鎖部の前のパラメータの連続的な変化がスライダによって設定されるユーザインタフェースの部分のディスプレイの図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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