(57)【要約】  本発明は、ＦＫ７７８物質に結合することが可能な抗体、ＦＫ７７８物質に対する抗体を利用する高感度イムノアッセイ法、およびＦＫ７７８物質の濃度を測定するための試験キットに関する。本発明の１つの局面において、ＦＫ７７８物質についての高感度イムノアッセイ方法が提供され、この方法は、ＦＫ７７８物質に結合可能な抗体を固定化する工程、サンプル中に含まれるＦＫ７７８物質と検出可能な物質によって標識されたＦＫ７７８物質とを、該固定化された抗体と競合的に反応させる工程、および、該固定化された抗体に結合された該標識された物質を検出する工程を包含することを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＫ７７８物質に結合可能な抗体。
【請求項２】
ポリクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記ポリクローナル抗体のクラスがＩｇＧである、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
ＦＫ７７８物質に結合可能な抗体を産生する動物由来の細胞とミエローマ細胞との間の細胞融合から得られたハイブリドーマ細胞系によって産生されるモノクローナル抗体である、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
ＦＫ７７８物質に結合可能な抗体を産生する前記細胞が、脾臓細胞系である、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
前記動物がマウスである、請求項５または６に記載の抗体。
【請求項８】
前記モノクローナル抗体のクラスがＩｇＧである、請求項４、５、６または７に記載の抗体。
【請求項９】
ＦＫ７７８物質についての高感度イムノアッセイ方法であって、ＦＫ７７８物質に結合可能な抗体を固定化する工程、サンプル中に含まれるＦＫ７７８物質と検出可能な物質によって標識されたＦＫ７７８物質とを、該固定化された抗体と競合的に反応させる工程、および、該固定化された抗体に結合された該標識された物質を検出する工程を包含する、方法。
【請求項１０】
ＦＫ７７８物質についての高感度イムノアッセイ方法であって、ＦＫ７７８物質に結合可能な第１抗体および該第１抗体に結合可能な固定化された第２抗体とを使用し、サンプル中に含まれるＦＫ７７８物質と検出可能な物質によって標識されたＦＫ７７８物質とを、該第１抗体と競合的に反応させる工程、および、該第２抗体に結合された該第１抗体に結合されている、該標識されたＦＫ７７８物質を検出する工程を包含する、方法。
【請求項１１】
ＦＫ７７８物質についての高感度イムノアッセイ方法であって、第１の検出可能な物質によって標識された、ＦＫ７７８物質に結合可能な第１抗体と、第２の検出可能な物質によって標識されたＦＫ７７８物質と、該第２の検出可能な物質に結合可能な固定化された第２抗体とを使用し、サンプル中に含まれるＦＫ７７８物質と該第２の検出可能な物質によって標識されたＦＫ７７８とを、該第１抗体と競合的に反応させる工程、および、該標識されたＦＫ７７８物質に結合された該第１抗体を検出する工程であって、該標識されたＦＫ７７８物質の該第２の検出可能な物質が該第２抗体に結合されている、工程を包含する、方法。
【請求項１２】
前記第１抗体がポリクローナル抗体である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の高感度イムノアッセイ方法。
【請求項１３】
前記第１抗体がモノクローナル抗体である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の高感度イムノアッセイ方法。
【請求項１４】
前記第２抗体がプレート上に固定化されている、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の高感度イムノアッセイ方法。
【請求項１５】
サンプル中のＦＫ７７８物質の量をアッセイするための試験キットであって、ＦＫ７７８物質に結合可能な抗体と、検出可能な物質によって標識されたＦＫ７７８物質とを備える、試験キット。
【請求項１６】
ＦＫ７７８物質に結合可能な前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１５に記載の試験キット。
【請求項１７】
標準として既知量のＦＫ７７８物質をさらに備える、請求項１５または１６に記載の試験キット。
【請求項１８】
請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の試験キットであって、ＦＫ７７８物質に結合可能な前記抗体に結合することが可能な抗体、または、前記ＦＫ７７８物質を標識している前記検出可能な物質に結合することが可能な抗体をさらに備える、試験キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な抗体、高感度イムノアッセイ方法、および、該方法を実施するための試験キットに関する。より詳細には、本発明は、ＦＫ７７８物質に結合可能な抗体、ＦＫ７７８物質に対する抗体を使用する高感度イムノアッセイ方法、および、ＦＫ７７８物質の濃度を測定するための試験キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＦＫ７７８物質は、活性レフルノミド代謝産物Ａ７７１７２６から誘導され、高い免疫抑制作用を有する。本化合物は以下の構造式を有することが知られている（ＰＣＴ／ＪＰ０３／０４７２２）：
ＦＫ７７８
【化１】
2008504212.tif 000002
【０００３】
ＦＫ７７８物質は、非常に少ない用量で、非常に効力のある免疫抑制活性を示す。それ故、移植（例えば、臓器移植）の際の拒絶反応を効果的かつ継続的に抑制するために、生体への投与後の本化合物の血中濃度についての高感度かつベッドサイドモニタリングを可能にする、単純かつ容易な技術が必要とされる。このようなモニタリングのためには、非常に低い濃度の本化合物についての正確かつ実用的な測定のための技術を確立することが、非常に重要であると考えられる。
【０００４】
生体サンプル等に含まれている少量の低分子物質をアッセイするための現在までに使用されている方法としては、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ラジオイムノアッセイおよび酵素イムノアッセイなどが挙げられる。
【０００５】
しかし、これらの方法は、ある種の点（例えば、（１）その手順が複雑である、および（２）大型の装置が必要とされる）において都合のよいものではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ＦＫ７７８物質を単純かつ容易な様式で測定するための物質およびシステムを開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の問題を解決するための徹底的な研究の結果として、本発明者らはＦＫ７７８物質に結合可能な抗体を得ることに成功した。次いで、本発明者らは、該抗体の免疫学的アッセイ方法における有効性を調査し、該抗体がＦＫ７７８物質の測定のための試薬として非常に有用であることを見出した。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明においては、ＦＫ７７８物質に結合可能な抗体、ＦＫ７７８物質に対する抗体を使用する高感度イムノアッセイ方法、および、ＦＫ７７８物質の濃度を測定するための試験キットが提供される。
【０００９】
以下において、本発明をさらに詳述する。
【００１０】
（Ｉ）  ＦＫ７７８物質に結合可能な抗体
上記の抗体としては、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が挙げられる。
【００１１】
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を得るための免疫原としては、上記のＦＫ７７８、および、以下のようなＦＫ７７８の誘導体が挙げられる：
ＦＲ２７０５３１（ＦＫ７７８−オキシヘキサン酸ペンタフルオロフェニルエステル）：
【化２】
2008504212.tif 000003
ＦＲ２６７４７１（ＦＫ７７８−オキシヘキサン酸）：
【化３】
2008504212.tif 000004
ＦＲ２６６８３１（ＦＫ７７８−グルタール酸）：
【化４】
2008504212.tif 000005
ＦＲ２７１７６４（Ｍ−ＩＩＩ）：
【化５】
2008504212.tif 000006
【００１２】
ポリクローナル抗体は、そのＨ鎖（重鎖）に従って、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥのようなクラスに分類され得、さらに各クラスのサブクラスに分類され得る。これらは、ＦＫ７７８物質に結合可能であれば、いずれのクラスであってもよい。特に好ましいクラスは、ＩｇＧである。
【００１３】
ポリクローナル抗体は、上記のような免疫原で動物を免疫することによって得られた抗血清から精製される。
【００１４】
免疫工程は、通常の方法によって行なわれる。
【００１５】
免疫される動物種に関しては、特に制限はない。一般に、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、ヤギ等が使用される。免疫原として機能する物質は、一般に、その免疫原性が増大され得るように、ウシ血清アルブミン（本明細書中以降、ＢＳＡと称する）、ウシサイログルブリン、ゼラチンまたはヘモシアニンのようなキャリアとの結合体の形態で使用される。ＢＳＡとのこのような結合体（ＢＳＡ−免疫原結合体）は、例えば、免疫原物質をジカルボン酸（例えば、コハク酸）のハーフエステルに変換し、次いで、該ハーフエステルを縮合剤（例えば、ジクロロヘキシルカルボジイミド）の存在下でＮ−ヒドロキシスクシンイミド等と反応させ、そして、得られた活性化されたエステルをＢＳＡとさらに反応させることによって取得され得る。
【００１６】
ポリクローナル抗体は、このようにして得られた抗血清から従来の手段（例えば、硫酸アンモニウム等での塩析、遠心分離、透析およびカラムクロマトグラフィー）によって精製される。
【００１７】
モノクローナル抗体は、ポリクローナル抗体の場合と同様に、そのＨ鎖に従って分類され得るが、ＦＫ７７８物質に結合可能である限り、任意のタイプのモノクローナル抗体が使用され得る。特に好ましいクラスは、ＩｇＧである。
【００１８】
モノクローナル抗体は、一般に、細胞融合およびクローニングの技術によって産生される。モノクローナル抗体はまた、遺伝子工学技術を使用することによっても産生され得る。
【００１９】
細胞融合工程に使用される抗体産生細胞（例えば、ＦＫ７７８物質に結合可能な抗体を産生する細胞）は、増大された免疫原性を有する免疫原物質（例えば、ＢＳＡ−ＦＲ２７０５３１物質結合体）で免疫された動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ）の、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球である。免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞またはリンパ球等に対して免疫原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞もまた、使用され得る。後者の手順を使用する場合には、ヒト由来の抗体産生細胞を調製することも可能である。抗体産生細胞およびミエローマ細胞は、それらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものでもよいが、好ましくは、同じ動物種起源のものである。
【００２０】
細胞融合技術を使用するモノクローナル抗体産生は、通常の方法（例えば、コーラーおよびミルスタイン（Kohler & Milstein）［Nature、１９７５年、第２５６巻、ｐ．４９５］の主要な方法）によって行なわれる。
【００２１】
特に好ましい実施形態において、ハイブリドーマは、ＢＳＡ−ＦＲ２７０５３１物質結合体で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、そしてスクリーニングして、ＦＫ７７８物質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが得られる。該ハイブリドーマはマウスの腹腔内で増殖され、ＦＫ７７８物質に結合可能なモノクローナル抗体が、マウスの腹水から得られる。
【００２２】
（ＩＩ）  ＦＫ７７８物質に対する抗体を利用した高感度かつ実用的なイムノアッセイ法
種々の免疫アッセイにおいて、ＦＫ７７８物質に結合可能な本発明の抗体を使用して、サンプル中のＦＫ７７８物質を高感度で単純かつ容易な様式で検出し得る。このような免疫アッセイとしては、競合法（直接法および間接法）、サンドイッチ法、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（アボット・ラボラトリー（Abbott Laboratory））およびＡｘＳＹＮ（アボット・ラボラトリー）のような自動分析器によるイムノアッセイ、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、化学発光イムノアッセイなど（これらの全ては当該分野で公知である）が挙げられる。
【００２３】
以下の方法は、サンプル中のＦＫ７７８物質をアッセイするための方法の例であって、本発明が以下の方法に限定されることは意図されない。
【００２４】
（ｉ）  競合法（直接法）
直接的なイムノアッセイ法は、ＦＫ７７８物質に結合可能な抗体を固定化し、サンプル中に含まれるＦＫ７７８物質と検出可能な物質によって標識されたＦＫ７７８物質とを、該固定化された抗体と競合的に反応させ、そして、該固定化された抗体に結合された該標識されたＦＫ７７８物質を検出することによって行なわれる。
【００２５】
ＦＫ７７８物質に結合可能な抗体は、本発明の第１の局面（Ｉ）において記載された抗体である。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方が使用され得るが、高い特異性を有すること、および、製造ロット間に特異性の差がないことから、モノクローナル抗体が、より好ましい。固定化のための固相として利用可能な材料は、例えば、プレート（免疫学的用途のためのプレートなど）、ビーズ（免疫学的用途のためのビーズなど）、磁性微粒子、ポリスチレンボールおよび試験管である。単純な操作という観点からは、免疫学用プレートおよび磁性微粒子が好ましい。
【００２６】
ＦＫ７７８物質を標識するための検出可能な物質の例としては、当業者に公知の種々の物質、例えば、種々の酵素、蛍光物質、発光物質および放射性物質、が挙げられる。適切な酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、マレートデヒドロゲナーゼおよびウレアーゼが挙げられる。これらの中でも、ペルオキシダーゼ（本明細書中以降、ＰＯＤと称する）が、好ましい酵素である。適切な蛍光物質としては、例えば、フルオレセインおよびフルオレセインイソチオシアネートが挙げられる。適切な発光物質としては、アクリジニウム、１，２−ジオキセタン、ルミナールおよびこれらの誘導体が挙げられる。アクリジニウムおよびその誘導体が好ましい。
【００２７】
検出可能な物質は、当該分野で公知の技術を使用して、ＦＫ７７８物質に対し直接的に、または、介在物（例えば、当該分野で公知のリンカー）を介して間接的に、結合または結合体化され得る。
【００２８】
例えば、酵素標識されたＦＫ７７８物質は、従来の方法によって調製され得る。例えば、カップリング剤を使用する場合、上記の本発明の第１の局面（Ｉ）において記載されるような、ジカルボン酸（例えば、コハク酸）とのＦＫ７７８物質のハーフエステルを、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド等と反応させ、得られた該ハーフエステルの活性化されたエステルを、標識目的に使用可能な酵素（例えば、ＰＯＤ）と反応させる。固定化された抗体に結合された、酵素標識された物質は、従来の様式で酵素の活性を測定することによって検出され得る。標識として使用される酵素がＰＯＤである場合、固定化された抗体に結合されたＰＯＤは、ｏ−フェニレンジアミンおよび過酸化水素の酵素基質溶液を用い、基質の酸化に起因する発色の程度を光学密度として測定することによって、アッセイされ得る。発色の程度は、固定化された抗体に結合されたＰＯＤ標識ＦＫ７７８物質の量に比例する。
【００２９】
あるいは、アクリジニウムエステルおよびアクリジニウム（Ｎ−スルフォニル）カルボキサミド標識のような発光化学物質が、ＦＫ７７８物質に対して標識される。固定化された抗体へ結合された発光化学物質は、従来の様式で化学発光を測定することによって検出される。この方法は、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（アボット・ラボラトリー）のような自動分析器によるイムノアッセイに使用され得る。
【００３０】
この直接法は、非常に低い濃度のＦＫ７７８物質を、単純かつ容易な様式で、定量的かつ定性的にアッセイし得る。
【００３１】
（ｉｉ）  競合的方法（間接法）
間接的なイムノアッセイ法は、アッセイされる試験物質（例えば、ＦＫ７７８物質）に結合することが可能な第１抗体と、該第１抗体に結合することが可能な固定化された第２抗体とを使用し、サンプル中に含まれる試験物質と検出可能な物質によって標識された同じ試験物質とを、該第１抗体と競合的に反応させ、そして、第２抗体へ結合された第１抗体に結合されている、該標識された試験物質を検出することによって行なわれる。
【００３２】
この間接的な方法は、ペプチド、ステロイド、プロスタグランジン、ポリサッカリド、および大環状化合物のような、種々の物質をアッセイし得、そして、大環状化合物、より具体的には、ＦＫ７７８物質の濃度測定において特に有用である。
【００３３】
第１抗体は、試験物質に結合することが可能である限り、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、高い特異性を有すこと、および、製造ロット間でその特異性に差がないことから、好ましくは、モノクローナル抗体である。この第１抗体は、上記の本発明の第１の局面（Ｉ）において記載された様式と同じ様式で調製される。試験物質がＦＫ７７８物質である場合、上記の本発明の第１の局面（Ｉ）に記載される抗体が有用である。
【００３４】
第１抗体に結合可能な第２抗体として有用であるのは、第１抗体を用いて従来の方法によって調製された抗体、第１抗体を免疫原とした同じ種の抗体、または市販の抗体でもよい。いずれにせよ、第１抗体と試験物質との間の抗原−抗体反応を妨害せず、第１抗体に結合することが可能であれば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれもが使用され得る。第１抗体がウサギから得られたＩｇＧクラスの抗体である場合、第２抗体としてヤギ抗ウサギＩｇＧを使用することが好ましい。第１抗体がマウスから得られたＩｇＧクラスの抗体である場合、ウサギ抗マウスＩｇＧを使用することが好ましい。
【００３５】
あるいは、間接的なイムノアッセイ方法は、第１の検出可能な物質によって標識された、アッセイされる試験物質（例えば、ＦＫ７７８物質）に結合可能な第１抗体と、第２の検出可能な物質によって標識された試験物質と、該第２の検出可能な物質に結合可能な固定化された第２抗体とを使用して実施される（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴアッセイ）。この場合、サンプル中の試験物質の量は、サンプル中に含まれる試験物質と、第２の検出可能な物質によって標識された同じ試験物質とを、該第１抗体と競合的に反応させ、そして、該第２の検出可能な物質が該固定化された第２抗体へ結合されている、該標識された試験物質に結合された、該標識された第１抗体を検出することによって測定されることが可能である。
【００３６】
固定化のための固相、試験物質または第１抗体を標識するための検出可能な物質、および標識物質を検出する方法は、上記直接法（ｉ）におけるものと同様である。好ましい実施形態において、第１の検出可能な物質はアクリジニウムであり、第２の検出可能な物質はフルオレセインであり、第２抗体は抗ＦＩＴＣ抗体である。
【００３７】
この間接法が用いられる場合、試験物質の検出限界は、固定化された第２抗体の量に対する第１抗体の量を調整することによって変更可能である。従って、非常に低い濃度のＦＫ７７８物質が、高感度で、単純かつ容易な様式で、定量的かつ定性的にアッセイされ得る。
【００３８】
（ＩＩＩ）試験キット
本発明の試験キットは、ＦＫ７７８物質の検出のためのキットであって、ＦＫ７７８物質に結合可能な抗体および検出可能な物質により標識されたＦＫ７７８物質を備える。
【００３９】
「ＦＫ７７８物質に結合可能な抗体」は、前記の本発明の第一の局面（Ｉ）に記載されるようなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であるが、好ましくは、モノクローナル抗体である。該抗体は、固定状態または溶液状態で供給し得る。
【００４０】
「検出可能な物質により標識されたＦＫ７７８物質」は、上記に記載の物質である。この標識されたＦＫ７７８物質もまた、固定状態または溶液状態で供給し得る。
【００４１】
本発明の試験キットは、本発明の高感度イムノアッセイを実施する際に利用可能な、他の成分を備えてもよい。例えば、これらの他の成分としては、定量的測定のための標準としての既知量のＦＫ７７８物質、ＦＫ７７８抗体に結合可能な抗体、およびＦＫ７７８物質を標識している検出可能な物質に結合可能な抗体が挙げられる。ＦＫ７７８物質を標識している検出可能な物質が酵素である場合、本発明のキットは該酵素の基質をさらに備えてもよい。
【実施例】
【００４２】
（方法）
（免疫原として使用されるＦＫ７７８誘導体の合成）
ＦＫ７７８物質に結合可能な抗体を産生するために、免疫原として使用する以下の４つのＦＫ７７８誘導体を合成した。各誘導体のための合成スキームを、以下に示す。
【００４３】
１）ペンタフルオロフェニル６−（４−｛［（２Ｚ）−２−シアノ−３−ヒドロキシ−２−ヘプテン−６−イノイル］アミノ｝フェノキシ）ヘキサノエート（ＦＲ２７０５３１）の合成スキーム
６−（４−｛［（２Ｚ）−２−シアノ−３−ヒドロキシ−２−ヘプテン−６−イノイル］アミノ｝フェノキシ）ヘキサン酸（５０ｍｇ）（合成スキームに関しては以下を参照）、Ｃ6Ｆ5ＯＨ（３７ｍｇ）、および１，４−ジオキサン（１ｍＬ）の混合物に対し、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（４１ｍｇ）を添加した。この混合物を周囲温度において一晩撹拌した。
この混合物をＣＨＣｌ3で希釈し、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（溶出；２５：１  ＣＨＣｌ3−ＭｅＯＨ）により精製し、生成物を得た。この生成物をジイソプロピルエーテル（４ｍＬ）中に懸濁し、超音波処理し、そして濾過して、ペンタフルオロフェニル６−（４−｛［（２Ｚ）−２−シアノ−３−ヒドロキシ−２−ヘプテン−６−イノイル］アミノ｝フェノキシ）ヘキサノエート（６８ｍｇ、９３％）を得た。
【００４４】
２）  ６−（４−｛［（２Ｚ）−２−シアノ−３−ヒドロキシ−２−ヘプテン−６−イノイル］アミノ｝フェノキシ）ヘキサン酸（ＦＲ２６７４７１）の合成スキーム
ｉ）  エチル６−（４−ニトロフェノキシ）ヘキサノエートの調製
エチル６−ブロモヘキサノエート（東京化成工業株式会社（Tokyo kasei Kogyo Co., Ltd.））（５．０ｇ）、４−ニトロフェノール（３．４３ｇ）、Ｋ2ＣＯ3（３．４１ｇ）およびＤＭＦ（２５ｍＬ）の混合物を、６０℃において４時間撹拌した。
冷却後、この混合物をＥｔＯＡｃと水との間に分配した。有機層を分離し、１Ｎ  ＮａＯＨ（３回）、水およびブラインで連続的に洗浄し、無水ＭｇＳＯ4上で乾燥し、真空中で濃縮した。得られた沈殿物を、ｎ−ヘキサン（５０ｍＬ）中に懸濁し、この懸濁液を超音波処理し、氷浴中で冷却し、濾過してエチル６−（4−ニトロフェノキシ）ヘキサノエート（５．７ｇ、９０％）を得た。
【００４５】
ｉｉ）  エチル６−（４−アミノフェノキシ）ヘキサノエートの調製
エチル６−（４−ニトロフェノキシ）ヘキサノエート（５．５ｇ）、１０％  Ｐｄ／Ｃ（５０％湿重量、０．５５ｇ）、ＥｔＯＨ（５５ｍＬ）、およびＴＨＦ（５５ｍＬ）の混合物を、１気圧のＨ2下に周囲温度において３時間撹拌した。
触媒を濾過して除去し、濾液を真空中で濃縮した。残渣をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（溶出；１００：１  ＣＨＣｌ3−ＭｅＯＨ）により精製し、エチル６−（４−アミノフェノキシ）ヘキサノエート（４．０ｇ、８１％）を得た。
【００４６】
ｉｉｉ）  エチル６−｛４−［（シアノアセチル）アミノ］フェノキシ｝ヘキサノエートの調製
シアノ酢酸（２．０ｇ）を、トルエン（２４ｍＬ）中でＰＣｌ5（５．０９ｇ）により活性化した。この活性化された酸の溶液に対し、エチル６−（4−アミノフェノキシ）ヘキサノエート（４．１ｇ）およびＥｔ3Ｎ（１．６４ｇ）を添加し、混合物を周囲温度において１時間撹拌した。
混合物を水に注入し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を分離して、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（勾配溶出；ＣＨＣｌ3−ＭｅＯＨ  １００：１〜５０：１）により精製されて生成物を得た。この生成物を、ＥｔＯＡｃ（４ｍＬ）およびジイソプロピルエーテル（１ｍＬ）の溶媒混合物から再結晶化し、エチル６−｛４−［（シアノアセチル）アミノ］フェノキシ｝ヘキサノエート（０．２８ｇ、３９％）を得た。
【００４７】
ｉｖ）  エチル６−（４−｛［（２Ｚ）−２−シアノ−３−ヒドロキシ−２−ヘプテン−６−イノイル］アミノ｝フェノキシ）ヘキサノエートの調製
エチル６−｛４−［（シアノアセチル）アミノ］フェノキシ｝ヘキサノエート（２．２ｇ）、ＨＯ2Ｃ（ＣＨ2）2Ｃ≡ＣＨ（８１３ｍｇ）、Ｋ2ＣＯ3（２．２９ｇ）、およびＴＨＦ（１８ｍＬ）の混合物を、５０℃において半時間撹拌した。この混合物に、ＴＨＦ（４．４ｍＬ）中のＣｌＣＯ2iＰｒ（１．１９ｇ）の溶液を滴下した。
混合物を水に注入し、ＥｔＯＡｃで２回抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（勾配溶出；ＣＨＣｌ3−１％  ＮＨＯＨ／ＭｅＯＨ  ５０：１〜２０：１〜１０：１）により精製し、エチル６−（４−｛［（２Ｚ）−２−シアノ−３−ヒドロキシ−２−ヘプテン−６−イノイル］アミノ｝フェノキシ）ヘキサノエート（０．８１ｇ、２９％）を得た。
【００４８】
ｖ）  ６−（４−｛［（２Ｚ）−２−シアノ−３−ヒドロキシ−２−ヘプテン−６−イノイル］アミノ｝フェノキシ）ヘキサン酸の調製
エチル６−（４−｛［（２Ｚ）−２−シアノ−３−ヒドロキシ−２−ヘプテン−６−イノイル］アミノ｝フェノキシ）ヘキサノエート（０．８０ｇ）およびＥｔＯＨ（２ｍＬ）の混合物に対し、４Ｎ  ＮａＯＨ（２ｍＬ）の溶液を添加した。混合物を周囲温度で一晩撹拌した。
混合物を真空中で濃縮し、残渣を水（２０ｍＬ）中に溶解した。溶液を氷浴中で冷却し、濃ＨＣｌ（１ｍＬ）で酸性化した。得られた懸濁液を水（２５ｍＬ）で希釈し、周囲温度において半時間撹拌した。沈殿物を収集し、真空中で乾燥し、ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）から再結晶化して、６−（４−｛［（２Ｚ）−２−シアノ−３−ヒドロキシ−２−ヘプテン−６−イノイル］アミノ｝フェノキシ）ヘキサン酸（０．４８ｇ、６４％）を得た。
【００４９】
３）  （５Ｚ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−７−オキソ−７−｛［４−（トリフルオロメチル）フェニル］アミノ｝−５−ヘプテン酸（ＦＲ２６６８３１）の合成スキーム
ｉ）  ２−シアノ−Ｎ−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］アセトアミドの調製
シアノ酢酸（７６．５ｇ）を、トルエン（９００ｍＬ）中でＰＣｌ5（１９４．３ｇ）により活性化した。この活性化された酸の溶液に、［４−（トリフルオロメチル）フェニル］アミン（東京化成工業株式会社（Tokyo kasei Kogyo Co., Ltd.））（１００ｇ）およびＥｔ3Ｎ（６２．７ｇ）を添加した。この反応混合物に、水（６００ｍＬ）を添加し、２−シアノ−Ｎ−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］アセトアミドを結晶化した。沈殿物を濾過により集め、水（１００ｍＬ）およびメタノール（５０ｍＬ）で洗浄し、次いで、真空中で乾燥した（１２１ｇ、８６％）。
【００５０】
ｉｉ）  エチル（５Ｚ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−７−オキソ−７−｛［４−（トリフルオロメチル）フェニル］アミノ｝−５−ヘプテノエートの調製
２−シアノ−Ｎ−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］アセトアミド（２．０ｇ）およびＴＨＦ（８０ｍＬ）の混合物に、ＮａＨ（７７１ｍｇ）を１０℃以下で分割添加した。この混合物を周囲温度で２．５時間撹拌した。混合物に、ＴＨＦ（８ｍＬ）中のＣｌＣＯ（ＣＨ2）3ＣＯ2Ｅｔ（１．８８ｇ）溶液を滴下し、その間に内部温度は３０℃に上昇した。添加後、混合物を周囲温度において１時間撹拌した。
混合物を水に注入し、ＥｔＯＡｃで２回抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（勾配溶出；２５：１  ＣＨＣｌ3−ＭｅＯＨ〜１００：４：１  ＣＨＣｌ3−ＭｅＯＨ−ＨＣＯ2Ｈ）により精製して生成物を与た。この生成物をＥｔＯＨ（２０ｍＬ）から再結晶化し、エチル（５Ｚ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−７−オキソ−７−｛［４−（トリフルオロメチル）フェニル］アミノ｝−５−ヘプテノエート（０．９５ｇ、２９％）を得た。
【００５１】
ｉｉｉ）  （５Ｚ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−７−オキソ−７−｛［４−（トリフルオロメチル）フェニル］アミノ｝−５−ヘプテン酸の調製
（５Ｚ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−７−オキソ−７−｛［４−（トリフルオロメチル）フェニル］アミノ｝−５−ヘプテノエート（０．９５ｇ）およびＥｔＯＨ（２．５ｍＬ）の混合物に、４Ｎ  ＮａＯＨ（４ｍＬ）の溶液を添加した。混合物を周囲温度において１０分間撹拌した。
混合物を真空中で濃縮し、残渣を水（１０ｍＬ）に溶解させた。溶液を氷浴中で冷却し、濃ＨＣｌ（３ｍＬ）で酸性化した。得られた懸濁液を水（２０ｍＬ）で希釈し、周囲温度において半時間撹拌した。沈殿物を収集し、真空中で乾燥し、ＥｔＯＨから再結晶化して、（５Ｚ）−６−シアノ−５−ヒドロキシ−７−オキソ−７−｛［４−（トリフルオロメチル）フェニル］アミノ｝−５−ヘプテン酸（０．７５ｇ、８５％）を得た。
【００５２】
４）  （２Ｚ）−２−シアノ−３，５−ジヒドロキシ−Ｎ−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−２−ヘプテン−６−イナミド（ＦＲ２７１７６４）の合成スキーム
ｉ）  ２−シアノ−３−オキソ−Ｎ−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］ブタンアミドの調製
２−シアノ−Ｎ−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］アセトアミド（７０ｇ）、ＡｃＯＨ（２２．１１ｇ）、Ｋ2ＣＯ3（１０１．７６ｇ）、およびＴＨＦ（５６０ｍＬ）の混合物を、５０℃において半時間撹拌した。混合物に対し、ＴＨＦ（７０ｍＬ）中のＣｌＣＯ2iＰｒ（５２．６４ｇ）の溶液を滴下した。
冷却後、混合物に水（４２０ｍＬ）を添加した。混合物を１７．５％  ＨＣｌ（２１０ｍＬ）の添加により酸性化した。混合物にＰｈＭｅ（３１５ｍＬ）を添加し、周囲温度において１５分間撹拌した。得られた沈殿物を収集し、乾燥して、２−シアノ−３−オキソ−Ｎ−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］ブタンアミド（５２．４ｇ、６３％）を得た。
【００５３】
ｉｉ）  （２Ｚ）−２−シアノ−３，５−ジヒドロキシ−Ｎ−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−７−（トリメチルシリル）−２−ヘプテン−６−イナミドの調製
ヘキサン（２５ｍＬ）中のｎ−ＢｕＬｉの２．４Ｍ溶液を、−５０℃に冷却した。この溶液に、ＴＨＦ（２００ｍＬ）中の２−シアノ−３−オキソ−Ｎ−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］ブタンアミド（５．０ｇ）の溶液を、半時間にわたり滴下した。滴下中、内部温度を約−５０℃で維持した。添加後、混合物を−５０℃で半時間撹拌した。混合物に、ＴＨＦ（５ｍＬ）中のＯＨＣ−Ｃ≡Ｃ−ＴＭＳ（２．３４ｇ）の溶液を、半時間にわたり滴下した。滴下中、内部温度は約−５０℃に維持した。添加後、混合物を半時間にわたって撹拌し、その時点で内部温度は−３０℃に達した。
この反応混合物を漏斗に移して、１Ｍクエン酸（１２０ｍＬ）の冷溶液へ、１０℃以下で滴下した（混合物のｐＨは３．５に達した）。
混合物をＥｔＯＡｃで１回抽出し、抽出物をブラインで洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（勾配溶出；ｎ−ヘキサン−アセトン  ２：１〜１：１）により精製し、（２Ｚ）−２−シアノ−３，５−ジヒドロキシ−Ｎ−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−７−（トリメチルシリル）−２−ヘプテン−６−イナミド（２．８ｇ、３８％）を得た。
【００５４】
ｉｉｉ）  （２Ｚ）−２−シアノ−３，５−ジヒドロキシ−Ｎ−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−２−ヘプテン−６−イナミドの調製
ＭｅＯＨ（６９ｍＬ）中の（２Ｚ）−２−シアノ−３，５−ジヒドロキシ−Ｎ−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−７−（トリメチルシリル）−２−ヘプテン−６−イナミド（２．３ｇ）の溶液に、Ｋ2ＣＯ3（４．８１ｇ）を添加し、混合物を周囲温度において４０分間撹拌した。
反応混合物を真空中で濃縮し、残渣に１Ｍ  クエン酸（７０ｍＬ）を添加した。混合物をＥｔＯＡｃで１回抽出し、抽出物をブラインで洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（勾配溶出；ｎ−ヘキサン−アセトン  ２：１〜３：２）により精製し、生成物を得た。生成物を熱ＥｔＯＨ（４ｍＬ）中に溶解し、撹拌しながらジイソプロピルエーテル（８ｍＬ）で希釈した。周囲温度まで冷却させた後、混合物をジイソプロピルエーテル（４ｍＬ）でさらに希釈し、氷浴中で寝かせた。懸濁液を濾過して、（２Ｚ）−２−シアノ−３，５−ジヒドロキシ−Ｎ−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−２−ヘプテン−６−イナミド（０．５１ｇ、２７％）を得た。
【００５５】
（ＦＫ７７８物質に対する高力価抗体を得るための免疫原の選択）
ＦＫ７７８に対する選択的な抗体を得るために、ウシサイログロブリン（シグマ・アルドリッチ・コープ（Sigma-Aldrich Corp.））と結合体化した２種類の免疫原（ＦＲ２６７４７１およびＦＲ２６６８３１）を、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）（ディフコ（Difco））と混合し、過免疫Ｂａｌｂ／ｃマウスに免疫した。４回の免疫後、血清中でのＦＲ２６７４７１−ＢＳＡまたはＦＲ２６６８３１−ＢＳＡに対する抗体の力価を、酵素免疫測定法によって測定した。残念なことに、両方の免疫原に関する力価は、ＦＫ７７８に対する選択的イムノアッセイ法を確立するには充分ではなかった。この２つの免疫原よりも高い力価を有する免疫原を得るために、別のタイプの免疫原ＦＲ２７０５３１を合成した。同様の方法で７回免疫後、ＦＲ２７０５３１からの力価は改善され、ＦＲ２６７４７１およびＦＲ２６６８３１の力価よりも高かった。従って、本発明者らは、ＦＲ２７０５３１を、ＦＫ７７８に対する抗体を産生するための免疫原として、またＦＲ２６７４７１およびＦＲ２６６８３１を、ＦＫ７７８物質に特異的に結合するＦＫ７７８抗体を選択するためのポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして使用した。
【００５６】
１．免疫原の調製
ＦＲ２７０５３１をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に２１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させた。ウシサイログロブリンを０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中に５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させた。３００μＬのＦＲ２７０５３１溶液を、１．７６ｍＬのウシサイログロブリン溶液と混合し、室温で１時間撹拌した。次いで、この混合物を、ＰＢＳに対して透析し、免疫原として使用した。
【００５７】
２．ハイブリドーマスクリーニングのための結合体の調製
０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中に５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマ・アルドリッチ・コープ）を、キャリアタンパク質として使用した。ＦＲ２６７４７１およびＦＲ２６６８３１を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に、それぞれ、２１ｍｇ／ｍＬおよび１７ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させた。ウシサイログロブリンを、０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中に５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させた。
【００５８】
４８μＬのＦＲ２６７４７１溶液を、８２μＬのＢＳＡ溶液と混合し、次いで、室温で１時間撹拌した。次いで、混合物をＰＢＳに対し透析し、ＥＬＩＳＡ用の抗原として使用した。
【００５９】
１００μＬのＦＲ２６６８３１溶液を、３１μＬのＤＣＣ溶液（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中１００ｍｇ／ｍＬのＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド溶液）（和光純薬工業株式会社（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.））と１：３のモル比で混合し、室温で３０分間撹拌した。次いで、混合物を、１７μＬのＮＨＳ溶液（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中１００ｍｇ／ｍＬのＮ，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド溶液）（和光純薬工業株式会社）と１：３のモル比で混合し、室温で１時間撹拌した。混合物のｐＨを、６０μＬの０．１Ｎ  ＨＣｌにより３．０に調整した。室温で１時間の撹拌後、混合物のｐＨを１１０μＬの０．１Ｎ  ＮａＯＨで６．０〜７．０に調整した。次いで、３１８μＬの混合物を６５０μＬのＢＳＡ溶液と１００：１のモル比で混合し、室温で３時間撹拌した。混合物をＰＢＳに対して透析し、ＥＬＩＳＡ用の抗原として使用した。
【００６０】
３．モノクローナル抗体産生
１）免疫
上記のように調製した免疫原ＦＲ２７０５３１を、フロイント完全アジュバントと混合し、次いで、５０μg／マウスの免疫原を、４匹のマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に、週１回皮下注射した。５回の免疫後、血液サンプルを採集し、血清中でのＦＲ２６７４７１−ＢＳＡまたはＦＲ２６６８３１−ＢＳＡに対する抗体の力価を、以下に詳細に記載する、抗原コート酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定した（表１）。免疫をさらに２回繰り返し、血液サンプルを採集し、抗体の力価を再度測定した（表２）。
【００６１】
２）融合
単回の追加免疫後、脾臓細胞（８．５×１０8細胞）を採集し、ポリエチレングリコール媒介細胞融合技術により、Ｘ６３−Ａｇ８−６５３細胞と融合し、３３枚の９６ウェルプレートに播種した。
【００６２】
３）ハイブリドーマのスクリーニング
３７℃で９日間の培養後、ハイブリドーマ細胞を、陽性プレートとしてＦＲ２６７４７１−ＢＳＡを、陰性プレートとしてＦＲ２６６８３３１−ＢＳＡを用いたＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。４９個のウェルからの細胞が、ＦＲ２６７４７１特異的ｍＡｂを産生し（表３中、Ｎｏ．１〜４９として示されている）、８５個のウェルからの細胞が、ＦＲ２６７４７１およびＦＲ２６６８３１の両方に対するｍＡｂを産生した（表３中、Ｎｏ．５０〜１３４として示されている）。
【００６３】
これらの抗体を、ＢＳＡに対する交差反応性について試験した。４９ウェルからの細胞が、ＦＲ２６７４７１特異的ｍＡｂを産生し（表４中、Ｎｏ．１〜４９として示されている）、１１ウェルからの細胞が、ＦＲ２６７４７１およびＦＲ２６６８３１の両方に対する交差反応性のｍＡｂを産生した（表４中、Ｎｏ．５４、５５、５７、６５、７２、８１、８３、１０８、１１８、１２２および１３２として示されている）。
【００６４】
５日間の培養後、抗体を、ＦＲ２６７４７１−ＢＳＡに対する反応性が外因的に添加したＦＫ７７８と競合的であるか否かについて決定するために試験し、８つのクローンを選択した（Ｎｏ．７、９、１４、１８、２０、２４、２８、３１、表５）。
【００６５】
４）限界希釈
細胞を、限界希釈、および、それに続くＥＬＩＳＡスクリーニングによってクローニングした。３つのクローン（例えば、Ｎｏ．７Ａ、７Ｂ、および７Ｃとして示されている）を、各々のクローンＮｏ．７、９、１４、１８、２０、２４、２８、３１について選択した（表６の全２４のクローン）。次いで、各々のＮｏ．Ａクローンをサブクローニングした。３つのクローンをＮｏ．Ａサブクローンから選択した（例えば、表７中、Ｎｏ．７Ａ１、７Ａ２、および７Ａ３として示されている）。これらを各々２４ウェルプレートの４つのウェル中で培養し、凍結し、保存した。
【００６６】
（抗原コート酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いた免疫血清中での免疫原に対する力価の測定）
マイクロタイタープレート（９６ウェル；グライナー（Greiner））を、ＦＲ２６７４７１−ＢＳＡまたはＦＲ２６６８３１−ＢＳＡ（各ウェル当たり５０μＬ；０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）中、１μg／ｍＬ）で、４℃で一晩コートし、次いで、０．０５％  ＮａＮ3を含有する、ＰＢＳ中０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ブロッキング緩衝液と称する）２００μＬでブロックした。抗血清を希釈緩衝液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ中１％ＢＳＡ）で連続的に希釈し、次いで、抗原がコートされた９６ウェルプレートへ添加した。３７℃で３０分間のインキュベーション後、各ウェルを洗浄緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で洗浄した。５０μＬの１２５ｎｇ／ｍＬ西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ヤギＩｇＧ  Ｆａｂ’抗体（ＩＢＬ）を、各ウェルへ添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。洗浄緩衝液による洗浄後、Ｋ2ＨＰＯ4−クエン酸緩衝液（ｐＨ５．１）中の４００μg／ｍＬ  ｏ−ＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン、シグマ）（基質緩衝液）１００μＬを、各ウェルに添加し、暗中で室温において１５分間インキュベートした。発色を、１００μＬの停止溶液（１Ｎ  Ｈ2ＳＯ4）を添加して停止させた。４９０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）を、各ウェルについて測定した。測定した抗血清の力価を、４９０ｎｍで０．２  ＯＤ以上を示す希釈率として定義した。
【００６７】
（ＦＫ７７８を用いた各ハイブリドーマの競合試験のためのプロトコール）
各ハイブリドーマからの５０μＬの培養上清を、交差反応性の測定のために、５０μＬのＦＫ７７８またはＦＲ２７１７６４溶液と混合し、または混合せずに、４℃において一晩インキュベートした。５０μＬの混合物をＦＲ２６７４７１−ＢＳＡプレートへ添加し、次いで、３７℃で３０分間インキュベートした。５０μＬの抗マウスＩｇＧヤギＦａｂ’−ＨＲＰ結合体を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。Ｋ2ＨＰＯ4−クエン酸緩衝液（ｐＨ５．１）中の４００μg／ｍＬ  ｏ−ＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン、シグマ）（基質緩衝液）１００μＬを、各ウェルに添加し、暗中にて室温で１５分間インキュベートした。発色を、１００μＬの停止溶液（１Ｎ  Ｈ2ＳＯ4）を添加して停止させた。４９０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）を、各ウェルについて測定した。
【００６８】
（結果）
１．５回免疫および７回免疫後の血清の力価
５回の免疫後、抗血清を採集し、抗体の力価を測定した。４匹のマウスは６４００倍（×６４００）の力価を示した（表１）。さらなる２回の免疫後、抗血清の力価は１２８００倍（×１２８００）または２５６００倍（×２５６００）に上昇した（表２）。
（表１  ＦＲ２６７４７１またはＦＲ２６６８３１に対する５回免疫後の血清の力価）
【００６９】
【表１】
2008504212.tif 000007
【００７０】
（表２  ＦＲ２６７４７１またはＦＲ２６６８３１に対する７回免疫後の血清の力価）
【表２】
2008504212.tif 000008
【００７１】
２．ハイブリドーマの一次スクリーニング
ハイブリドーマ細胞を、陽性プレートとしてＦＲ２６７４７１−ＢＳＡを、陰性プレートとしてＦＲ２６６８３１−ＢＳＡを用いたＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。４９ウェルからの細胞が、ＦＲ２６７４７１特異的ｍＡｂを産生し（Ｎｏ．１〜４９）、８５ウェルからの細胞が、ＦＲ２６７４７１およびＦＲ２６６８３１の両方に対するｍＡｂを産生した（Ｎｏ．５０〜１３４）（表３）。
【００７２】
（表３  ＦＲ２６７４７１またはＦＲ２６７４７１およびＦＲ２６６８３１の両方に対するｍＡｂを産生するハイブリドーマの一次スクリーニングの４９０ｎｍ  ＯＤ値）
【表３】
2008504212.tif 000009
Ｐｏｓ：ＦＫ７７８（ＦＲ２６７４７１）−ＢＳＡプレート
Ｐｏｓ：ＦＫ７７８（ＦＲ２６６８３１）−ＢＳＡプレート
ＲＯ：範囲外
Ｎｏ．１−４９のハイブリドーマ細胞はＦＲ２６７４７１特異的ｍＡｂを産生する。
Ｎｏ．５０−１３４のハイブリドーマ細胞はＦＲ２６７４７１およびＦＲ２６６８３１の両方に対するｍＡｂを産生する。
【００７３】
３．ハイブリドーマの特異性および交差反応性
一次スクリーニングの後、ハイブリドーマをＢＳＡに対する交差反応性について試験した。４９ウェルからの細胞が、ＦＲ２６７４７１特異的ｍＡｂを産生し（Ｎｏ．１〜４９）、１１ウェルからの細胞が、ＦＲ２６７４７１およびＦＲ２６６８３１の両方に対する交差反応性のｍＡｂを産生した（Ｎｏ．５４〜１３２）（表４）。
【００７４】
（表４  陽性プレート、陰性プレートおよびＢＳＡプレートに対する選択されたハイブリドーマの４９０ｎｍ  ＯＤ値）
【表４】
2008504212.tif 000010
Ｐｏｓ：ＦＫ７７８（ＦＲ２６７４７１）−ＢＳＡプレート
Ｐｏｓ：ＦＫ７７８（ＦＲ２６６８３１）−ＢＳＡプレート
ＢＳＡ：ＢＳＡプレート
ＲＯ：範囲外
Ｎｏ．１−４９のハイブリドーマ細胞はＦＲ２６７４７１特異的ｍＡｂを産生する。
Ｎｏ．５４、５５、５７、６５、７２、８１、８３、１０８、１１８、１２２および１３２のハイブリドーマ細胞はＦＲ２６７４７１およびＦＲ２６６８３１の両方に対するｍＡｂを産生する。
【００７５】
４．ＦＫ７７８を用いた各ハイブリドーマの競合試験
抗体を、ＦＲ２６７４７１−ＢＳＡに対する反応性、および、外因的に添加したＦＫ７７８との競合について試験した。この試験から、８つのｍＡｂを選択した（Ｎｏ．７、９、１４、１８、２０、２４、２８、３１、表５）。
【００７６】
（表５  ＦＫ７７８を使用した各ハイブリドーマについての競合試験の４９０ｎｍ  ＯＤ値）
【表５】
2008504212.tif 000011
Ｎｏ．１−４９のハイブリドーマ細胞はＦＲ２６７４７１特異的ｍＡｂを産生する。
Ｎｏ．５４、５５、５７、６５、７２、８１、８３、１０８、１１８、１２２および１３２のハイブリドーマ細胞はＦＲ２６７４７１およびＦＲ２６６８３１の両方に対するｍＡｂを産生する。
ＦＫ７７８と競合した８つの選択したハイブリドーマ（Ｎｏ．７、９、１４、１８、２０、２４、２８および３１）に下線を付す。
【００７７】
５．一次限界希釈
一次限界希釈の後、３つのクローン（Ｎｏ．Ａ、ＢおよびＣと示す）を選択した（表６）。
【００７８】
（表６  ＦＫ７７８を使用した各ハイブリドーマについての競合試験から選択されたクローンの限界希釈の４９０ｎｍ  ＯＤ値）
【表６】
2008504212.tif 000012
Ｐｏｓ：ＦＫ７７８（ＦＲ２６７４７１）−ＢＳＡプレート
Ｐｏｓ：ＦＫ７７８（ＦＲ２６６８３１）−ＢＳＡプレート
ＲＯ：範囲外
【００７９】
６．二次限界希釈
Ｎｏ．Ａクローンをサブクローニングした。３つのサブクローンが得られた（Ｎｏ．１、２および３と示す）。これらのクローンを、各クローンについて、２４ウェルプレートの４つのウェルで培養し、凍結し、保存した（表７）。細胞保存培地（Cell Stock Media）（ＩＢＬ  Ｎｏ．３４００１）（ＩＢＬ培地Ｉ（Media I）（ＩＢＬ  Ｎｏ．３３２０１）中、１０％ＤＭＳＯおよび３０％ＦＢＳを含有）を使用した。
【００８０】
７．活性代謝物ＦＲ２７１７６４の交差反応性
８つのＮｏ．Ａ１クローンを、ＦＲ２６７４７１−ＢＳＡに対する反応性、および、外因的に添加したＦＫ７７８またはＦＲ２７１７６４との競合について試験した（表８）。ＥＣ５０値を、非線形回帰分析プログラムＷＩＮＮＯＮＬＩＮ（ファーサイト社（Pharsight Co., Ltd.））を用いた、等式１で定義された阻害効果シグモイドＥｍａｘモデルに対する数値フィッティングにより、濃度−応答結合曲線から推定した。
【数１】
2008504212.tif 000013
【００８１】
各クローンについてのＦＲ２７１７６４の交差反応性を、以下の等式２において示される、ＦＫ７７８とＦＲ２７１７６４との間のＥＣ５０値の比較から推定した（表９）。
【数２】
2008504212.tif 000014
【００８２】
３つのクローン７Ａ１、２０Ａ１および９Ａ１についてのＦＲ２７１７６４交差反応性は、それぞれ、１０％、３％および２７％であった（図１〜３）。
【００８３】
（表８  ＦＲ２６７４７１−ＢＳＡに対する反応性および外因的に添加したＦＫ７７８またはＦＲ２７１７６４との競合について試験した希釈サブクローンのＢ／Ｂ０値）
【表８】
2008504212.tif 000015
【００８４】
（表９  ＦＲ２７１７６４（ＦＫ７７８の活性代謝物、Ｍ３）の交差反応性）
【表９】
2008504212.tif 000016
【００８５】
（マウス腹水からのｍＡｂの精製）
１．腹水の収集
３０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに、０．２ｍＬ／マウスのプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン、Ｔ７６４０、シグマ）を腹腔内に注射し、その後、３週間にわたり採血した。ハイブリドーマ（クローン７Ａ１、２０Ａ１、９Ａ１）を、１０％ウシ胎仔血清を補充したＴＩＬ培地（Ｎｏ．３３６１２、ＩＢＬ）中で培養し、収集し、プリスタン注射したマウスの腹腔内へ注射した（２×１０7細胞／ｍＬ×０．５ｍＬ／マウス）。ハイブリドーマの注射後、マウスを１０〜１２日間採血した。腹部の膨張後、腹水を採取し、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、−２０℃で保存した。腹水量は、７Ａ１および２０Ａ１では５０ｍＬ、９Ａ１では２５ｍＬであった。
【００８６】
２．腹水からのｍＡｂの精製
ｍＡｂを、ＨｉＴｒａｐプロテインＡ−ＨＰカラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテック（Amersham Pharmacia Biotech）、スウェーデン、ウプサラ）を用いたアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。腹水を２容量の結合緩衝液（３Ｍ  ＮａＣｌ含有１．５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．９））で希釈し、１０カラム容量の結合緩衝液で平衡化したＨｉＴｒａｐプロテインＡ−ＨＰカラム上へアプライした。結合緩衝液での洗浄後、抗体を溶出緩衝液（０．１Ｍ  コハク酸緩衝液（ｐＨ４．０））で溶出した。抗体含有画分を、シームレス・セルロース・チュービング（Seamless Cellulose Tubing）（ＭＷＣＯ；１４，０００、三光純薬（Sanko Junyaku）、日本）を用いて、１００容量のＣａ2+およびＭｇ2+非含有ダルベッコ（Dalbecco）リン酸緩衝食塩水（Ｄ−ＰＢＳ、Ｎｏ．３３２７３、ＩＢＬ）に対して透析し（２回交換）、−２０℃に保存した。
【００８７】
３．ｍＡｂの濃度および純度の推定
各ｍＡｂの濃度を、２８０ｎｍの吸光度により（ＩｇＭについて、ε＝１．３８（０．１％，１ｃｍ）およびＭｒ＝１５００００）測定した。
【００８８】
２８０ｎｍの吸光度を１．３８で除した値が、抗体濃度（ｍｇ／ｍＬ）である。７Ａ１、９Ａ１および２０Ａ１の濃度は、それぞれ、２．２３ｍｇ／ｍＬ、２．５８ｍｇ／ｍＬおよび２．６３ｍｇ／ｍＬであった。
【００８９】
各ｍＡｂの純度を、スーパーデックス（Superdex）２００カラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク、スウェーデン、ウプサラ）によるゲル濾過クロマトグラフィーを用いて測定した。ｍＡｂ溶液の１００μＬのアリコートを、Ｄ−ＰＢＳで平衡化したスーパーデックス２００カラムへアプライし、流速０．７５ｍＬ／分で５０分間流し、２８０ｎｍの吸光度によってモニターした。ＩｇＧ分画のピーク領域のパーセンテージは、ユニコーン（UNICORN）ソフトウェア（アマシャム・ファルマシア・バイオテク、スウェーデン、ウプサラ）を用いて計算し、各ｍＡｂについて純度を推定した。７Ａ１、９Ａ１および２０Ａ１の純度は、それぞれ、９６．８４％、９７．５０％および８０．３２％であった。
【００９０】
（７Ａ、９Ａおよび２０Ａクローンのアイソタイプ）
これらのｍＡｂのアイソタイプは、ＩｇＧ（１）重鎖およびκ軽鎖として同定された。
【００９１】
（結果）
過免疫ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ｍＡｂの産生に使用した。マウスを７回免疫し、その後最終の追加免疫を行い、脾臓細胞を収集し、ＰＥＧの存在下でＸ６３−Ａｇ８−６５３ミエローマ細胞と融合させた。ＦＫ７７８物質と高力価で結合可能な抗体を分泌しているハイブリドーマ細胞株を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって選択し、次いで、限界希釈を用いてサブクローニングした。抗ＦＫ７７８  ｍＡｂを産生している３つのマウスハイブリドーマを得て、これらのクローンを７Ａ１、９Ａ１および２０Ａ１と命名した。ハイブリドーマ７Ａ１、９Ａ１および２０Ａ１（各識別表示：マウス−マウスハイブリドーマＦＫ７７８−７Ａ１、マウス−マウスハイブリドーマＦＫ７７８−９Ａ１およびマウス−マウスハイブリドーマＦＫ７７８−２０Ａ１）を、それぞれ、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２６０、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２６１およびＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２６２として、２００５年２月２３日付けで、国立産業技術総合研究所（National Institute of Advanced Industrial Science and Technology （ＡＩＳＴ））の特許生物寄託センター（Patent Organism Depository Center）（３０５−８５６６  茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター中央第６）に寄託した。これらのｍＡｂのアイソタイプは、ＩｇＧ（１）重鎖およびカッパ軽鎖として同定した。高純度のｍＡｂを、アフィニティクロマトグラフィーによって得た。ｍＡｂの純度分析を、ゲル濾過クロマトグラフィーによって行った。ｍＡｂの濃度を、ＩｇＧについてのε＝１．３８（０．１％，１ｃｍ）およびＭｒ＝１５００００を用いて、２８０ｎｍの吸光度により測定した。７Ａ１、９Ａ１および２０Ａ１の純度は、各々９６．８４％、９７．５０％および８０．３２％であり、濃度は、各々２．２３ｍｇ／ｍＬ、２．５８ｍｇ／ｍＬおよび２．６３ｍｇ／ｍＬであった。３つのクローン７Ａ１、２０Ａ１および９Ａ１についてのＦＲ２７１７６４の交差反応性は、各々１０％、３％、２７％であった。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】図１は、ＦＲ２７１７６４−ＢＳＡへのモノクローナル抗体７Ａの結合に対する、ＦＫ７７８およびＦＲ２７１７６４の阻害効果の濃度−応答曲線を示す。
【図２】図２は、ＦＲ２７１７６４−ＢＳＡへのモノクローナル抗体９Ａの結合に対する、ＦＫ７７８およびＦＲ２７１７６４の阻害効果の濃度−応答曲線を示す。
【図３】図３は、ＦＲ２７１７６４−ＢＳＡへのモノクローナル抗体２０Ａの結合に対する、ＦＫ７７８およびＦＲ２７１７６４の阻害効果の濃度−応答曲線を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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