(57)【要約】式ＩおよびＩＩのアミノ末端ブロック化ペプチドボロナート化合物は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）および他のプロテアーゼを阻害するのに、ならびにＦＡＰにより媒介される障害を治療するのに有用である。哺乳動物細胞におけるこのような障害または関連する病理学的症状のインビトロ、インサイチュおよびインビボでの診断、予防または治療のための、アミノ末端ブロック化ペプチドボロナート化合物、ならびにその立体異性体、互変異性体、溶媒和物および薬学上許容され得る塩の使用方法が開示される。2008545661.tif 000048
2008545661.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉから選択される化合物、ならびにその立体異性体、互変異性体、溶媒和化合物および薬学的に許容され得る塩であって：
【化１】
2008545661.tif 000033
ここで、
Ｘは、Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲ）、ＮＲＣ（＝Ｏ）、ＮＲＣ（＝ＮＲ）、ＯＣ（＝Ｏ）、ＯＣ（＝ＮＲ）、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ）、Ｓ（Ｏ）およびＳ（Ｏ）２であり；
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ２−Ｃ２０複素環、Ｃ３−Ｃ１２炭素環およびＣ６−Ｃ２０アリールから選択され；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ２−Ｃ２０複素環、Ｃ３−Ｃ１２炭素環およびＣ６−Ｃ２０アリールから選択されるか、または、Ｒ１およびＲ２は、Ｃ２−Ｃ２０複素環を形成し；
Ｒ３は、必要に応じて保護されたアミノ酸側鎖であり；
Ｒ４およびＲ５は、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ２−Ｃ２０複素環、Ｃ３−Ｃ１２炭素環、Ｃ６−Ｃ２０アリール、プロドラッグおよび保護基から選択されるか、または、Ｒ４およびＲ５は、一緒になって、Ｃ６−Ｃ２０アリール、Ｃ３−Ｃ１２炭素環、プロドラッグまたは保護基を形成し；
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＯＲ、Ｒ、−Ｃ（＝Ｙ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｙ）ＯＲ、−Ｃ（＝Ｙ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ＋（Ｒ）３、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）Ｎ（Ｒ）２、−ＳＲ、−ＯＣ（＝Ｙ）Ｒ、−ＯＣ（＝Ｙ）ＯＲ、−ＯＣ（＝Ｙ）（Ｎ（Ｒ）２）、−ＯＳ（Ｏ）２（ＯＲ）、−ＯＰ（＝Ｙ）（ＯＲ）２、−ＯＰ（ＯＲ）２、−Ｐ（＝Ｙ）（ＯＲ）２、−Ｐ（＝Ｙ）（ＯＲ）ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ、−Ｓ（Ｏ）（ＯＲ）、−Ｓ（Ｏ）２（ＯＲ）、−ＳＣ（＝Ｙ）Ｒ、−ＳＣ（＝Ｙ）ＯＲおよび−ＳＣ（＝Ｙ）ＮＲ２から選択され；
アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、炭素環および複素環は、それぞれ、必要に応じてかつ独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＯＲ、Ｒ、＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＲ、＝Ｎ＋（Ｏ）（Ｒ）、＝Ｎ（ＯＲ）、＝Ｎ＋（Ｏ）（ＯＲ）、＝Ｎ−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝Ｙ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｙ）ＯＲ、−Ｃ（＝Ｙ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ＋（Ｒ）３、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）Ｎ（Ｒ）２、−ＳＲ、−ＯＣ（＝Ｙ）Ｒ、−ＯＣ（＝Ｙ）ＯＲ、−ＯＣ（＝Ｙ）（Ｎ（Ｒ）２）、−ＯＳ（Ｏ）２（ＯＲ）、−ＯＰ（＝Ｙ）（ＯＲ）２、−ＯＰ（ＯＲ）２、−Ｐ（＝Ｙ）（ＯＲ）２、−Ｐ（＝Ｙ）（ＯＲ）ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ、−Ｓ（Ｏ）（ＯＲ）、−Ｓ（Ｏ）２（ＯＲ）、−ＳＣ（＝Ｙ）Ｒ、−ＳＣ（＝Ｙ）ＯＲおよび−ＳＣ（＝Ｙ）ＮＲ２から選択される１つまたはそれより多い置換基で置換され；
Ｒは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ６−Ｃ２０アリール、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクリルまたは保護基であり；かつ、
Ｙは、独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＲ、Ｎ＋（Ｏ）（Ｒ）、Ｎ（ＯＲ）、Ｎ＋（Ｏ）（ＯＲ）またはＮ−Ｎ（Ｒ）２であるが；
ただし、Ｒ１がメチルでありかつＸがＣ（＝Ｏ）である場合、Ｒ３は、リジンでもアセチルリジンでもなく；Ｒ１がｔｅｒｔ−ブチルでありかつＸがＯＣ（＝Ｏ）である場合、Ｒ３はメチルではない、化合物。
【請求項２】
Ｒ１が、メチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、フェニルおよび２，４，６−トリメチルフェニルから選択され、かつ、ＸがＣ（＝Ｏ）である、請求項１の化合物。
【請求項３】
Ｒ１がＣ１−Ｃ８アルキルまたはＣ６−Ｃ２０アリールであり、かつ、ＸがＳ（Ｏ）２である、請求項１の化合物。
【請求項４】
Ｒ２が、Ｈである、請求項１の化合物。
【請求項５】
Ｒ２が、メチルである、請求項１の化合物。
【請求項６】
Ｒ３が、水素、メチル、イソプロピル、ｎ−プロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｎ−ブチル、ベンジル、ｐ−ヒドロキシベンジル、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＣＨ３、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＨＯ、−（ＣＨ２）４ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＣＨ３、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＨＯ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＮＨ２、２−ピリジルメチル−、３−ピリジルメチル−、４−ピリジルメチル−、フェニル、シクロヘキシル、および以下の構造：
【化２】
2008545661.tif 000034
から選択される、請求項１の化合物。
【請求項７】
Ｒ３が、水素である、請求項１の化合物。
【請求項８】
Ｒ４およびＲ５が、それぞれ水素である、請求項１の化合物。
【請求項９】
Ｒ４およびＲ５が、共に環状ボロナートエステルを形成する、請求項１の化合物。
【請求項１０】
前記環状ボロナートエステルが、ピナンジオール、ピナコールおよびカテコールから選択される、請求項９の化合物。
【請求項１１】
Ｒ３を有する炭素原子が、Ｒ立体配置である、請求項１の化合物。
【請求項１２】
Ｒ３を有する炭素原子が、Ｓ立体配置である、請求項１の化合物。
【請求項１３】
ホウ素原子を有する炭素原子が、Ｒ立体配置である、請求項１の化合物。
【請求項１４】
ホウ素原子を有する炭素原子が、Ｓ立体配置である、請求項１の化合物。
【請求項１５】
Ｒが、トリアルキルシリル、ジアルキルフェニルシリル、安息香酸、ベンジル、ベンジルオキシメチル、メチル、メトキシメチル、トリアリールメチル、フタルイミドおよびテトラヒドロピラニルから選択される保護基である、請求項１の化合物。
【請求項１６】
Ｒ１が、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＯＲ、Ｒ、−Ｃ（＝Ｙ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｙ）ＯＲ、−Ｃ（＝Ｙ）ＮＲ２、−ＮＲ２、−Ｎ＋（Ｒ）３、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）ＮＲ２、−ＳＲ、−ＯＣ（＝Ｙ）Ｒ、−ＯＣ（＝Ｙ）ＯＲ、−ＯＣ（＝Ｙ）ＮＲ２、−ＯＳ（Ｏ）２（ＯＲ）、−ＯＰ（＝Ｙ）（ＯＲ）２、−ＯＰ（ＯＲ）２、−Ｐ（＝Ｙ）（ＯＲ）２、−Ｐ（＝Ｙ）（ＯＲ）ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ、−Ｓ（Ｏ）（ＯＲ）、−Ｓ（Ｏ）２（ＯＲ）、−ＳＣ（＝Ｙ）Ｒ、−ＳＣ（＝Ｙ）ＯＲおよび−ＳＣ（＝Ｙ）ＮＲ２から選択される１つまたはそれより多い置換基で必要に応じて置換されるフェニルである、請求項１の化合物。
【請求項１７】
Ｒ１が、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、３−ピラゾリル、４−ピラゾリル、２−ピロリル、３−ピロリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、３−ピリダジニル、４−ピリダジニル、５−ピリダジニル、２−ピリミジニル、５−ピリミジニル、６−ピリミジニル、２−ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、５−オキサゾリルおよびそれらの置換型から選択されるヘテロシクリルである、請求項１の化合物。
【請求項１８】
ＸがＣ（＝Ｏ）でありかつＲ１２がＨである請求項１の化合物であって、式Ｉａ：
【化３】
2008545661.tif 000035
から選択される、化合物。
【請求項１９】
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１がそれぞれＨである請求項１８の化合物であって、式Ｉｂ：
【化４】
2008545661.tif 000036
から選択される、化合物。
【請求項２０】
以下の構造から選択される、請求項１９の化合物：
【化５】
2008545661.tif 000037
【請求項２１】
以下の構造から選択される、請求項１８の化合物：
【化６】
2008545661.tif 000038
【請求項２２】
以下の構造から選択される、請求項１９の化合物：
【化７】
2008545661.tif 000039
【請求項２３】
以下の構造を有する、請求項１９の化合物：
【化８】
2008545661.tif 000040
【請求項２４】
ＸがＳ（Ｏ）２でありかつＲ１２がＨである請求項１の化合物であって、式Ｉｃ：
【化９】
2008545661.tif 000041
から選択される、化合物。
【請求項２５】
以下の構造から選択される、請求項２４の化合物：
【化１０】
2008545661.tif 000042
【請求項２６】
式ＩＩから選択される化合物、ならびにその立体異性体、互変異性体、溶媒和化合物および薬学的に許容され得る塩：
【化１１】
2008545661.tif 000043
であって、ここで、
Ｚは、
【化１２】
2008545661.tif 000044
であり、
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ２−Ｃ２０複素環、Ｃ３−Ｃ１２炭素環およびＣ６−Ｃ２０アリールから選択され；
各Ｒ２は、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ２−Ｃ２０複素環、Ｃ３−Ｃ１２炭素環およびＣ６−Ｃ２０アリールから選択されるか、またはＲ１およびＲ２はＣ２−Ｃ２０複素環を形成し；
各Ｒ３は、独立して、必要に応じて保護されたアミノ酸側鎖であり；
Ｒ４およびＲ５は、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ２−Ｃ２０複素環、Ｃ３−Ｃ１２炭素環、Ｃ６−Ｃ２０アリール、プロドラッグおよび保護基から選択されるか、または、Ｒ４およびＲ５は、一緒になって、Ｃ６−Ｃ２０アリール、Ｃ３−Ｃ１２炭素環、プロドラッグまたは保護基を形成し；
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＯＲ、Ｒ、−Ｃ（＝Ｙ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｙ）ＯＲ、−Ｃ（＝Ｙ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ＋（Ｒ）３、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）Ｎ（Ｒ）２、−ＳＲ、−ＯＣ（＝Ｙ）Ｒ、−ＯＣ（＝Ｙ）ＯＲ、−ＯＣ（＝Ｙ）（Ｎ（Ｒ）２）、−ＯＳ（Ｏ）２（ＯＲ）、−ＯＰ（＝Ｙ）（ＯＲ）２、−ＯＰ（ＯＲ）２、−Ｐ（＝Ｙ）（ＯＲ）２、−Ｐ（＝Ｙ）（ＯＲ）ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ、−Ｓ（Ｏ）（ＯＲ）、−Ｓ（Ｏ）２（ＯＲ）、−ＳＣ（＝Ｙ）Ｒ、−ＳＣ（＝Ｙ）ＯＲおよび−ＳＣ（＝Ｙ）ＮＲ２から選択され；
Ｒ１３は、独立して、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８アルケニル、Ｃ１−Ｃ８アルキニル、Ｃ６−Ｃ２０アリール、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクリルまたは保護基から選択され；
各アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、炭素環および複素環は、それぞれ、必要に応じてかつ独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＯＲ、Ｒ、＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＲ、＝Ｎ＋（Ｏ）（Ｒ）、＝Ｎ（ＯＲ）、＝Ｎ＋（Ｏ）（ＯＲ）、＝Ｎ−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝Ｙ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｙ）ＯＲ、−Ｃ（＝Ｙ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ＋（Ｒ）３、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）Ｎ（Ｒ）２、−ＳＲ、−ＯＣ（＝Ｙ）Ｒ、−ＯＣ（＝Ｙ）ＯＲ、−ＯＣ（＝Ｙ）（Ｎ（Ｒ）２）、−ＯＳ（Ｏ）２（ＯＲ）、−ＯＰ（＝Ｙ）（ＯＲ）２、−ＯＰ（ＯＲ）２、−Ｐ（＝Ｙ）（ＯＲ）２、−Ｐ（＝Ｙ）（ＯＲ）ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ、−Ｓ（Ｏ）（ＯＲ）、−Ｓ（Ｏ）２（ＯＲ）、−ＳＣ（＝Ｙ）Ｒ、−ＳＣ（＝Ｙ）ＯＲおよび−ＳＣ（＝Ｙ）ＮＲ２から選択される１つまたはそれより多い置換基で置換され；
Ｒは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ６−Ｃ２０アリール、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクリルまたは保護基であり；
Ｙは、独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＲ、Ｎ＋（Ｏ）（Ｒ）、Ｎ（ＯＲ）、Ｎ＋（Ｏ）（ＯＲ）またはＮ−Ｎ（Ｒ）２であり；かつ、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７または８である、化合物。
【請求項２７】
式ＩＩａ
【化１３】
2008545661.tif 000045
から選択される、請求項２６の化合物。
【請求項２８】
Ｒ１がＣ１−Ｃ８アルキルまたはＣ６−Ｃ２０アリールである、請求項２７の化合物。
【請求項２９】
Ｒ２がＨである、請求項２７の化合物。
【請求項３０】
Ｒ２の少なくとも１つがメチルである、請求項２７の化合物。
【請求項３１】
Ｒ４およびＲ５がそれぞれＨである、請求項２７の化合物。
【請求項３２】
以下の構造から選択される、請求項３１の化合物
【化１４】
2008545661.tif 000046
【請求項３３】
式ＩＩｂ：
【化１５】
2008545661.tif 000047
から選択される、請求項２６の化合物。
【請求項３４】
Ｒ１３が、Ｃ１−Ｃ８アルキルまたはＣ６−Ｃ２０アリールである、請求項３３の化合物。
【請求項３５】
各Ｒ２が、Ｈである、請求項３３の化合物。
【請求項３６】
Ｒ４およびＲ５が、それぞれＨである、請求項３３の化合物。
【請求項３７】
請求項１または請求項２６に記載の化合物、および１つまたはそれより多いの薬学的に許容され得る担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項３８】
抗増殖剤、抗炎症剤、免疫調節剤、神経栄養因子、循環器疾患の治療剤、肝疾患の治療剤、抗ウイルス薬、血液障害の治療剤、糖尿病の治療剤または免疫不全障害の治療剤から選択される追加の治療剤をさらに含む、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
ＦＡＰ活性を検出可能に阻害する量の請求項１または請求項２６に記載の化合物、および薬学的に許容され得る担体、アジュバントまたは賦形剤を含む、組成物。
【請求項４０】
ＰＯＰ活性を検出可能に阻害する量の請求項１または請求項２６に記載の化合物、および薬学的に許容され得る担体、アジュバントまたは賦形剤を含む、組成物。
【請求項４１】
癌、卒中、糖尿病、肝腫大、循環器疾患、アルツハイマー病、嚢胞性線維症、ウイルス性疾患、自己免疫疾患、粥状動脈硬化、再狭窄、乾癬、アレルギー性障害、炎症、神経障害、ホルモン関連疾患、臓器移植に付随する症状、免疫不全障害、破壊的骨障害、増殖性障害、感染性疾患、細胞死に付随する症状、トロンビン誘発血小板凝集、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、肝疾患、Ｔ細胞活性化を含む病原的免疫症状および中枢神経系障害から選択される疾患または症状の重症度を、患者において治療または緩和する方法であって、該患者に、請求項３７に記載の組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項４２】
癌の治療を必要とする哺乳動物において癌を治療または予防する方法であって、該哺乳動物に、治療有効量の請求項３７に記載の組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項４３】
前記癌が、乳癌、卵巣癌、頚部癌、前立腺癌、精巣癌、尿生殖器路癌、食道癌、喉頭癌、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、胃癌、皮膚癌、角化棘細胞腫、肺癌、類表皮癌、大細胞癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞癌、肺腺癌、骨癌、結腸癌、腺腫、膵臓癌、腺癌、甲状腺癌、濾胞性癌腫、未分化癌、乳頭癌、精上皮腫、メラノーマ、肉腫、膀胱癌、肝癌および胆管癌、腎癌、骨髄性障害、リンパ性障害、有毛細胞癌、頬側口腔癌および咽頭癌（口腔癌）、唇癌、舌癌、口癌、咽頭癌、小腸癌、結腸直腸癌、大腸癌、直腸癌、脳および中枢神経系の癌、ホジキン病および白血病から選択される、請求項４１の方法。
【請求項４４】
癌を治療するための医薬組成物の製造における、請求項１または請求項２６に記載の化合物の、使用。
【請求項４５】
癌の治療方法であって、請求項３７に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、方法。
【請求項４６】
癌を治療するための薬物の製造における、請求項１または請求項２６に記載の化合物の、使用。
【請求項４７】
過増殖障害を治療するためのキットであって：
ａ）請求項１または請求項２６の化合物を保持する容器；および
ｂ）使用のための指示を有するラベルまたは添付文書
を含む、キット。
【請求項４８】
第２の医薬組成物をさらに含み、該第２の医薬組成物が、抗過増殖活性を有する第２の化合物を含む、請求項４７のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
３７  ＣＦＲ§１．５３（ｂ）の下で出願されたこの本出願は、３５  ＵＳＣ§１１９（ｅ）の下、２００５年５月１９日に出願された米国仮特許出願第６０／６８２９７０号、および２００５年１０月２５日に出願された米国仮特許出願第６０／７３０２９２号の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／６８２９７０号、および米国仮特許出願第６０／７３０２９２号はいずれも、その全体が参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を含むプロリルペプチダーゼの阻害剤であるＮ−ブロックペプチドプロリンボロナート化合物、ならびにこれらの化合物を含む組成物および使用方法に関する。Ｎ−ブロックペプチドプロリンボロナート化合物は、ＦＡＰを阻害するのに、およびＦＡＰによって媒介される障害を治療するのに、有用である。本発明はまた、哺乳動物細胞のインビトロ、インサイチュおよびインビボ診断または治療、あるいは付随する病理学的症状のためのＮ−アシル化ジペプチドプロリンボロナート化合物の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
癌遺伝子および腫瘍細胞内に発生する腫瘍抑制遺伝子の遺伝的変異により引き起こされる初期の腫瘍化の後、癌の病状悪化につながる重要な段階のそれぞれについての固有の性質として腫瘍−宿主相互作用が残る。固形腫瘍の増殖および転移は、結合組織のフレームワークである支持腫瘍間質の補充を必要とする。腫瘍の間質性区画は、血管内皮細胞、線維芽細胞および炎症細胞を含む種々の宿主細胞を含む。これらの宿主由来細胞が腫瘍組織に浸潤し、腫瘍細胞と相互作用し、引き続いて腫瘍細胞により集められて、腫瘍血管新生、増殖および転移を刺激する可溶性および不溶性因子の配列を産生することが次第に認識されつつある。これらの因子は、腫瘍細胞間のクロストークを媒介し、かつ宿主間質細胞を「ハイジャック」する線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ、セプラーゼとしても知られている）と同様に、インテグリンおよび細胞接着分子、細胞外基質メタロプロテイナーゼ誘導物質を含む（Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａ  ２（６）：４２２−４２６）。ほとんどの上皮癌における高度に一貫した形質の腫瘍間質性線維芽細胞は、セリンプロテアーゼファミリーのメンバーであるＦＡＰの誘発物である。腫瘍関連間質細胞は、上皮性腫瘍形成を促進し得るが、このことは、間質性タンパク質が、新規な治療ターゲットを示し得ることを示唆する（Ｂｈｏｗｍｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １５：９７−１０１；Ｊｏｙｃｅ，Ｊ．Ａ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ７：５１３−５２０）。
【０００４】
ＦＡＰは、胚発生において、組織再構築の部位で発現する細胞表面セリンプロテアーゼである。ＦＡＰは、創傷治癒または腫瘍間質における活性化メラニン形成細胞および線維芽細胞以外の成熟体細胞性組織では発現しない。ＦＡＰ発現は、悪性転化の間に、増殖するメラニン細胞の細胞中では特異的に起こらない（Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｍｏｎｔａｇｕｔ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３（３２）：５４３５−５４４６）。ＦＡＰは、プロリルペプチダーゼファミリーに属するが、これは、プロリン残基後にペプチド基質を切断するセリンプロテアーゼを含む（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７（４）：４９６−５０４；Ｓｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  ａｃｔａ  １５５０（２）：１０７−１１６；Ｂｕｓｅｋ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｉｎｔｌ．Ｊｏｕｒ．ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３６：４０８−４２１）。プロリルペプチダーゼファミリーにはまた、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ  ＩＶ；用語ＣＤ２６ともいう）、ＤＰＰ７（ＤＰＰ  ＩＩ；静止細胞プロリンジペプチダーゼ）、ＤＰＰ８、ＤＰＰ９およびプロリルカルボキシペプチダーゼ（ＰＣＰ；アンジオテンシン分解酵素Ｃ）も含まれる。より遠いメンバーには、プロリルオリゴペプチダーゼ（ＰＯＰまたはプロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ）；プロリン酵素切断後；Ｉｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｒａｗｌｉｎｇｓ，Ｗｏｅｓｓｎｅｒ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）２：１８９７−１９００，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ；Ｐｏｌｇａｒ，Ｌ．（２００２）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５９，３４９−３６２）およびアシルアミノアシルペプチダーゼ（ＡＡＰ；アシルペプチドヒドロラーゼ（ＡＰＨ））。プロリンペプチダーゼおよび関連タンパク質は、膜結合型および可溶性のメンバーのいずれも含み、広範囲の発現パターン、組織分布および区画化にわたっている。これらのタンパク質は、ペプチドホルモンによるシグナル伝達の制御に重要な役割を有し、糖尿病、腫瘍学および他の症候の標的を明らかにする。
【０００５】
ＦＡＰ（セプラーゼ）は、ウシ血清から単離され、精製して均一にされ、配列決定された（Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｉｎｔｌ．Ｊｏｕｒ．ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３６（１１）：２３２０−２３３３）。合成ペプチド基質の切断におけるウシＦＡＰのプロテアーゼ活性は：（ｉ）ＦＡＰ中の複数のサブサイトが、酵素−基質結合に関与し、テトラペプチドの存在下で最小のペプチドを切断する；（ｉｉ）プロリン−Ｘ結合に対する高い一次基質特異性が存在する；および（ｉｉｉ）切断しやすい結合のＣ末端における疎水性残基への優先性がある、ことを示唆する。
【０００６】
このことは、ＦＡＰが、ゼラチンおよびＩ型コラーゲンを分解し得るＤＰＰおよびコラーゲン分解性活性の両方を有することにより実証された。良性および悪性皮膚黒色腫におけるＦＡＰの発現および酵素活性が確立されており、腫瘍細胞増殖およびメラノーマ発癌の間の増殖の制御（Ｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｊｏｕｒ．ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １２０（２）：１８２−１８８）、直腸結腸癌（Ｓａｔｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  ｌｅｔｔｅｒｓ  １９９（１）：９１−９８）および乳癌（Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ＆  Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ２０（５）：４５９−４７０）、ならびに乳房、結腸および肺癌（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３６５０５−３６５１２）についてのＦＡＰの可能性のある役割を示す。さらに、ＦＡＰは、肝硬変（Ｌｅｖｉ，ＭＴ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２９：１７６８−１７７８）、線維腫症（Ｓｋｕｂｉｔｚ，ＫＭ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．（２００４）１４３（２）：８９−９８）および関節リウマチにおいて上方制御されるようである。
【０００７】
線維芽細胞活性化タンパク質α（ＦＡＰα）は、培養ヒト線維芽細胞、肉腫および神経外胚葉性腫瘍細胞で発現した細胞表面抗原の血清学的調査の過程で産生したモノクローナル抗体ｍＡｂ  Ｆｌ９を用いて発見された。この抗体は、９５ｋＤａのＦＡＰα糖タンパク質を有する原形質膜を特徴付けて、ＦＡＰをコードするｃＤＮＡを単離し、かつ、種々の正常なおよび新生物のヒト組織のＦＡＰα発現を検討するのに用いられた（Ｐａｒｋ，Ｊｏｈｎ  Ｅ．；Ｒｅｔｔｉｇ，Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｊ．，Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：  Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａｌａｎ  Ｊ．；Ｒａｗｌｉｎｇｓ，Ｎｅｉｌ  Ｄ．；Ｗｏｅｓｓｎｅｒ，Ｊ．Ｆｒｅｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）（２００４）２：１９１３−１９１７，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）。
【０００８】
血球新生による血液細胞の成熟は、サイトカインおよびそのセリンプロテアーゼＣＤ２６／ＤＰＰＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による制御、ならびにＦＡＰ（ＭｃＩｎｔｙｒｅ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ  ２９（９）：８８２−８８６；Ａｊａｍｉ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２（３）：６９４−７０１）による制御を含む。ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰα）は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ｆ１９を用いて最初に同定されたＭｆ９５，０００の細胞表面分子である（Ｒｅｔｔｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，３１１０−３１１４；Ｒｅｔｔｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３，３３２７−３３３５；Ｒｅｔｔｉｇ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｉｎｔｌ．Ｊｏｕｒ．ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ５８（３）：３８５−３９２）。ヒトの２番染色体に局在化するＦＡＰ遺伝子（Ｍａｔｈｅｗ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２５（１）：３３５−３３７）は、マウス、ハムスターおよびアフリカツメガエルを含む種々の種にわたって保存された２２７７ｂｐのオープンリーディングフレームを有する２８１２ｎｔ配列である（Ｓｃａｎｌａｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：５６５７−５６６１；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３６５０５−３６５１２；Ｎｉｅｄｅｒｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４：６５０−６５４）。対応するＦＡＰタンパク質産物は、７５９または７６０のアミノ酸を含み、約８８ｋＤａの概算分子量を有する。一次アミノ酸配列は、ＩＩ型内在性膜タンパク質に相同性であり、これらは、大きくかつ細胞外領域（ＥＣＤ）に対応するカルボキシ末端、疎水性膜貫通領域および短い細胞質側末端により特徴づけられる。ＦＡＰは、多様な種においてジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＤＰＩＶ）に高度に相同性であり、ＤＰＰＩＶに対して６１％のヌクレオチド配列同一性および４８％のアミノ酸配列同一性を有する。ＦＡＰおよびＤＤＰＩＶは、両方ともペプチダーゼ（プロテアーゼ）活性を有するが、生化学的および血清学的考慮は、これらのタンパク質が、それらの合成基質との酵素活性、ならびにそれらのＴリンパ球（ＤＤＰＩＶ誘導体）または反応性間質性線維芽細胞（ＦＡＰ誘導体）の機能活性化（Ｍａｔｈｅｗ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｗ５：３３５−３３７）が有意に異なることを示す。ＦＡＰα  ｃＤＮＡは、広い細胞外領域、膜貫通領域および短い細胞質側末端を有するＩＩ型内在性膜タンパク質をコードする（Ｓｃａｎｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，５６５７−５６６１；米国特許第６８４６９１０号明細書；国際公開第９７／３４９２７号パンフレット；米国特許第５７６７２４２号明細書；米国特許第５５８７２９９号明細書；米国特許第５９６５３７３号明細書）。ＦＡＰαは、ＤＰＰ  ＩＶ（ＤＰＰＩＶ；ＥＣ  ３．４．１４．５）としても知られ、ＤＰＰ活性を有する膜結合型タンパク質であるＴ細胞活性化抗原ＣＤ２６��対して、４８％のアミノ酸配列同一性を有する。ＦＡＰαは、酵素活性を有し、かつ、酵素機能に重要なセリン６２４を有する、セリンプロテアーゼファミリーのメンバーである（国際公開パンフレット第９７／３４９２７号；米国特許第５９６５３７３号）。セプラーゼ（ＦＡＰα）は、ホモ二量体の１７０ｋＤａの一体化膜ゼラチナーゼであり、その発現は、ヒトメラノーマ細胞株ＬＯＸの浸潤度と相関し（Ｐｉｎｅｉｒｏ−Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｊｏｕｒ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１２）：７５９５−７６０１）、かつ、ヒト乳癌のマウスモデルにおける急速な腫瘍増殖を促進する（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：２７１２−２７１６）。ｃＤＮＡの分子クローニングは、６アミノ酸の細胞質側末端を有するＩＩ型内在性膜タンパク質、続いて２０アミノ酸の膜貫通領域および７３４アミノ酸の細胞外領域を予測する推定アミノ酸配列を有するセプラーゼの９７ｋＤａサブユニットをコードする。カルボキシル末端は、非古典的セリンプロテアーゼであるジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）の推定触媒領域に相同性の（６８％同一の）推定触媒領域（約２００アミノ酸）を含む。保存セリンプロテアーゼモチーフＧ−Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ｇは、Ｇ−Ｗ−Ｓ−Ｙ−Ｇとして存在する。しかしながら、ＬＯＸおよび他の株化細胞由来のセプラーゼｃＤＮＡの配列解析により、セプラーゼおよびヒト線維芽細胞活性化タンパク質α（ＦＡＰα）は同じ遺伝子の産物であり、かつ、それらが実質的に同一であることを強く示唆する（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １３６１（１）：１１−１９）。
【０００９】
ＦＡＰαは、多くの組織学的型のヒト上皮癌、治癒創傷の肉芽組織ならびに特定の骨および軟部組織肉腫の悪性細胞における反応性間質性線維芽細胞で、選択的に発現する。正常な成体組織は、一般に、検出可能なＦＡＰαを持っていない（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．５２４：１９７−２０３）が、いくつかの胎性間葉組織は、分子を一過性に発現する。対照的に、共通の型の上皮癌のほとんど（乳癌、非小細胞肺癌および結腸直腸癌の９０％を超える）は、ＦＡＰα反応性の間質性線維芽細胞を含む。これらのＦＡＰα＋線維芽細胞は、新しく形成された腫瘍血管を伴い、腫瘍毛細血管内皮と悪性上皮細胞クラスターの基底側面との間に挿入された別の細胞内コンパートメントを形成する（Ｗｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２（６），１１９３−１２０３）。ＦＡＰα＋間質性線維芽細胞は、原発性および転移性癌で見出されるが、試験された良性および前悪性上皮性病変（乳房および結腸直腸腺腫の線維腺腫）など、まれにしかＦＡＰα＋間質細胞を含まない。正常組織におけるＦＡＰαの制限された分布パターンおよび多くの悪性腫瘍の支持間質におけるその均一な発現に基づき、１３１Ｉ標識ｍＡｂＦｌ９を用いた臨床治験が、転移性結腸腫瘍を有する患者で開始された（Ｔａｎｓｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒ．ｏｆ  Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍ．５１（２）：１７７−１８０）。マウスＦＡＰによる腫瘍増殖の促進、およびＦＡＰの抗体阻害剤による腫瘍増殖の阻害の証拠が、Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２００２）６２：４７６７−４７７２により実証された。ヒトＦＡＰは、ヒト皮膚／重症複合免疫不全マウス乳癌異種移植モデルにおける１３１Ｉ−標識ヒト化抗−ＦＡＰｍＡｂで発現および標的化された（Ｔａｈｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ２（８）：７２９−７３７）。
【００１０】
ＦＡＰαの細胞外領域の高分解能Ｘ線結晶構造は、それらの活性部位におけるＤＰＰ−ＩＶとの差異を明らかにした。ＦＡＰα、Ａ６５７Ｄのジペプチド基質を用いた活性部位変異体の動力学的解析により、遊離のアミノ末端基質についての切断速度が増加したが、対応するＮ−ベンゾイルオキシカルボニル基質が野生型ＦＡＰαに対して減少したことが示された（Ａｅｒｔｇｅｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ａｐｒ；１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｃ５０００９２２００）。
【００１１】
一般的な腫瘍間質マーカーとしてＦＡＰに特異性を有する４つの完全ヒト抗体誘導体（単鎖抗体フラグメント、ｓｃＦｖｓ）を、指向された選択により単離する。重鎖可変領域ライブラリを含む非常に多様なＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＤアイソタイプを、多数のドナーの多様なリンパ器官由来のｃＤＮＡを用いて産生した（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒ．ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６８（６）：１７３０−１７３８）。フレームワーク修飾を有する他の組換え型ＦＡＰ結合タンパク質が発現された（米国特許第６４５５６７７号）。抗体を用いてＦＡＰ活性を完全にブロックする試みは成功しなかったが（Ｃｈｅｎｇ，ｅｔ  ａｌ（２００４）Ａｂｒｏｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ．Ｉｎ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９５ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬ）、ＦＡＰに対して指向されたヒト化モノクローナル抗体であるシブロツヅマブ（Ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）は、癌治療のためにヒトで臨床治験がなされている（Ｋｌｏｆｔ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ  ２２（１）：３９−５２；Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９（５）：１６３９−１６４７；Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９（５）：１５９０−１５９５；Ｈｏｆｈｅｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ（２００３  Ｆｅｂ）Ｏｎｋｏｌｏｇｉｅ  ２６（１）：４４−８）。
【００１２】
ジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ）阻害剤であるアミノボロン酸ジペプチド（タラボスタット（ｔａｌａｂｏｓｔａｔ）、ＰＴ−１００、Ｖａｌ−ｂｏｒｏ−Ｐｒｏ；Ｐｏｉｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）は、造血性組織で、高親和性相互作用により、特定のサイトカインの遺伝子発現を上方制御することが示されたが、これは、線維芽細胞活性化タンパク質に関与するように思われる（米国特許出願公開第２００３／０１５８１１４号；同第２００４／０１５２１９２号；Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６４（１５）：５４７１−５４８０；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０２（５）：１６４１−１６４８）。ＦＡＰはまた、リンパ組織および腫瘍の間質でも発現されるので、ＰＴ−１００はインビトロで腫瘍細胞に対する直接的な細胞毒性効果を有しないが、ＰＴ−１００の腫瘍増殖への影響がマウスにおいてインビボで検討された。ＰＴ−１００のマウスへの経口投与は、線維肉腫、リンパ腫、メラノーマおよびマスト細胞腫株化細胞に由来する同系腫瘍の増殖を緩徐にした。マウスのＰＴ−１００での処置は、周囲の腫瘍間質性線維芽細胞におけるマウスのＦＡＰ発現により特徴づけられる腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖の減弱を結果として生じた（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．４（３）：３５１−６０）。しかしながら、ＰＴ−１００は、ＤＰＰ−８およびＤＰＰ−９もまた抑制するので、ＦＡＰ特異的ではない。さらに、ＰＴ−１００は、Ｎ末端アミンおよびボロナート基の分子内環化による自己不活性化のメカニズムを実証する。非ホジキンリンパ腫および慢性リンパ性白血病などの悪性血液疾患を有する患者における、タラボスタット（ｔａｌａｂｏｓｔａｔ）ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）との組み合わせの安全性および有効性を試験するため、フェーズＩ／ＩＩのヒト臨床研究が開始された。他の阻害剤標的プロリルペプチダーゼには、以下が挙げられる：Ｖａｌ−ＢｏｒｏＰｒｏ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（Ｆｌｅｎｔｋｅ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１５５６−１５５９；Ｃｏｕｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：２０８７−２０９４；Ｓｈｒｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １５：４２５６−４２６０）；Ｎ−アシル−Ｇｌｙ−ＢｏｒｏＰｒｏ化合物（Ｅｄｏｓａｄａ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｊｏｕｒ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．２８１（１１）：７４３７−７４４４）；Ｎ−アルキル−Ｇｌｙ−ＢｏｒｏＰｒｏ化合物（Ｈｕ，ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １５：４２３９−４２４２）；１−（２’アミノアシル）−２−シアノピロリジン化合物（国際公開パンフレット第２００１／０４０１８０号）；およびボロノルロイシン化合物（Ｓｈｒｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １５：４２５６−４２６０）。
【００１３】
ＦＡＰ切断基質であるペプチドプロドラッグは、ＦＡＰの配列選択的切断により、細胞傷害性または細胞分裂停止性の代謝産物に転換されると報告されている（特許文献１；特許文献２；特許文献３；特許文献４；特許文献５）。ペプチドプロリン−ボロナートプロテアーゼ阻害剤が報告されている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；特許文献６；特許文献７；特許文献８；特許文献９；特許文献１０；特許文献１１；特許文献１２）。環状ＢｏｒｏＰｒｏ化合物は、経口投与に有用であると報告されている（特許文献１３）。Ｎ−アセチルリジンプロリンボロナート化合物は、抗菌薬として提唱されている（特許文献１４）。
【特許文献１】米国特許第６，６１３，８７９号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００３／０２１９７９号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００３／０２３２７４２号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００３／００５５０５２号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００２／０１５５５６５号明細書
【特許文献６】米国特許第４，９３５，４９３号明細書
【特許文献７】米国特許第５，２８８，７０７号明細書
【特許文献８】米国特許第５，４６２，９２８号明細書
【特許文献９】米国特許第６，８２５，１６９号明細書
【特許文献１０】国際公開第２００３／０９２６０５号パンフレット
【特許文献１１】米国特許出願公開第２００４／０２２９８２０号明細書
【特許文献１２】国際公開第２００５／０４７２９７号パンフレット
【特許文献１３】米国特許第６，３５５，６１４号明細書
【特許文献１４】米国特許第５，５７４，０１７号明細書
【非特許文献１】Ｂａｃｈｏｖｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｊｏｕｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（７）：３７３８−３７４３
【非特許文献２】Ｆｌｅｎｔｋｅ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：１５５６−１５５９
【非特許文献３】Ｓｎｏｗ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６（２４）：１０８６０−１０８６９
【非特許文献４】Ｃｏｕｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：２０８７−２０９４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
要旨
本発明の化合物は、Ｎ−ブロックジペプチドプロリンボロナート（式Ｉ）化合物およびＮ−ブロックペプチドプロリンボロナート（式ＩＩ）化合物を含む。式ＩおよびＩＩの化合物は、癌などの過増殖性障害の治療に用いられる。
【００１５】
１つの局面では、式ＩおよびＩＩを有する本発明の化合物は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）の阻害剤である。
【００１６】
別の局面では、式ＩおよびＩＩを有する本発明の化合物は、プロリルオリゴペプチダーゼ（ＰＯＰ）の阻害剤である。
【００１７】
本発明の別の局面は、酵素を有効阻害量の式ＩおよびＩＩの化合物またはこれらの化合物を含む組成物と接触させることにより、ＦＡＰ活性を阻害する方法を提供する。
【００１８】
本発明の別の局面は、癌、神経変性、心肥大、疼痛、片頭痛、神経外傷性疾患、肝硬変、線維腫症および関節リウマチなどの過増殖性障害を予防または治療する方法であって、当該治療を必要とする哺乳動物に、治療有効量の本発明の化合物または当該化合物を含む組成物のうちの１つおよび担体または賦形剤を投与することによる、方法である。
【００１９】
本発明の別の局面は、癌を予防または治療する方法であって、当該治療を必要とする哺乳動物に、治療有効量の本発明の化合物の１つを、抗癌性性質を有する１つまたはそれ以上の追加の化合物と組み合わせて投与することによる、方法である。
【００２０】
本発明の別の局面は、過増殖性障害の治療用薬物の製造における式ＩおよびＩＩの化合物の使用である。
【００２１】
本発明の別の局面は、局在化のための画像形成プローブ、およびＦＡＰまたは他のプロリルペプチダーゼ活性の検出を含む。画像形成プローブは、画像形成剤または造影剤に複合体化した式ＩおよびＩＩの化合物を含む。
【００２２】
本発明の別の局面は、製品、すなわち、容器中の式ＩまたはＩＩのプロリンボロナート化合物、および治療を指示する添付文書またはラベルを含むキットである。
【００２３】
本発明の別の局面は、式ＩまたはＩＩのプロリンボロナート化合物の製造方法、合成方法、分離方法および精製方法を含む。
【００２４】
本発明は、以下の代表的な実施例の詳細な説明を、添付の図面、スキームおよび実施例と合わせて参照することにより理解され得る。以下の考察は例示、図解および代表的なものであり、添付の特許請求の範囲のいずれかによって定義される範囲を限定するとみなされるべきではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
（例示的な実施形態の詳細な説明）
本発明の特定の実施例がここで詳細に参照されるが、その例は、添付の構造および式により図解される。本発明は、列挙した実施例と合わせて説明されるが、それらは本発明をそれらの実施態様に限定することを意図しないことが理解されるであろう。一方、本発明は、全ての代替物、改変物および等価物を包含することを意図し、これらは特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内に含まれ得る。
【００２６】
当業者は、本発明に用いられ得るであろう本明細書中に記載された方法および物質と同様のまたは等価の多くの方法および物質を理解するであろう。本発明は、記載された方法および物質にどのようにも制限されない。
定義
別段の定めがない限り、本明細書中で用いる以下の用語および句は、以下の意味を有することを意図する：
「アルキル」は、第１級、第２級および第３級またはスピロ環炭素原子を含む非環式Ｃ１−Ｃ１８炭化水素部分である。アルキル基の例には、例えば、以下のＣ１−Ｃ８炭化水素部分が挙げられる：メチル（Ｍｅ、−ＣＨ３）、エチル（Ｅｔ、−ＣＨ２ＣＨ３）、１−プロピル（ｎ−Ｐｒ、ｎ−プロピル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−プロピル（ｉ−Ｐｒ、ｉ−プロピル、−ＣＨ（ＣＨ３）２）、１−ブチル（ｎ−Ｂｕ、ｎ−ブチル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−メチル−１−プロピル（ｉ−Ｂｕ、ｉ−ブチル、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２−ブチル（ｓ−Ｂｕ、ｓ−ブチル、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、２−メチル−２−プロピル（ｔ−Ｂｕ、ｔ−ブチル、−Ｃ（ＣＨ３）３）、１−ペンチル（ｎ−ペンチル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２）、２−メチル−２−ブチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ３）、３−メチル−２−ブチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２）、３−メチル−ｌ−ブチル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２−メチル−１−ブチル（−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、１−ヘキシル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、２−ヘキシル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−ヘキシル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３））、２−メチル−２−ペンチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、３−メチル−２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）、４−メチル−２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、３−メチル−３−ペンチル（−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）２）、２−メチル−３−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２）、２，３−ジメチル−２−ブチル（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ（ＣＨ３）２）、３，３−ジメチル−２−ブチル（−ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ（ＣＨ３）３、１−ヘプチル、１−オクチル。
【００２７】
「アルケニル」は、少なくとも１つの不飽和の部位、すなわち炭素−炭素ｓｐ２二重結合を有する第１級、第２級および第３級または環状炭素原子を含む非環式Ｃ２−Ｃ１８炭化水素部分である。例には、エチレンまたはビニル（−ＣＨ＝ＣＨ２）、アリル（−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、イソブテニル、５−ヘキセニル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
「アルキニル」は、少なくとも１つの不飽和の部位、すなわち炭素−炭素ｓｐ三重結合を有する第１級、第２級および第３級または環状炭素原子を含む非環式Ｃ２−Ｃ１８炭化水素部分である。例には、アセチレン性（−Ｃ≡ＣＨ）およびプロパルギル（−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
「アルキレン」は、１〜１８個の炭素原子の飽和の、分枝または直鎖または環状炭化水素基であって、親アルカンの同じまたは２つの異なる炭素原子から２つの水素原子を除くことにより誘導される２つの一価基中心を有するものをいう。代表的なアルキレン基には、メチレン（−ＣＨ２−）、１，２−エチル（−ＣＨ２ＣＨ２−）、１，３−プロピル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、１，４−ブチル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
「アルケニレン」は、２〜１８個の炭素原子の不飽和、分枝または直鎖または環状炭化水素基であって、かつ親アルケンの同じまたは２つの異なる炭素原子から２つの水素原子を除くことにより誘導される２つの一価基中心を有するものをいう。代表的なアルケニレン基には、１，２−エチレン（−ＣＨ＝ＣＨ−）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
「アルキニレン」は、２〜１８個の炭素原子の不飽和、分枝または直鎖または環状炭化水素基であって、かつ親アルキンの同じまたは２つの異なる炭素原子から２つの水素原子を除くことにより誘導される２つの一価基中心を有するものをいう。代表的なアルキニレン基には、アセチレン（−Ｃ≡Ｃ−）、−プロパルギル（−ＣＨ２Ｃ≡Ｃ−）、および４−ペンチニル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ≡Ｃ−）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
「炭素環」および「カルボシクリル」は、単環として３〜１２個の炭素原子を有するか、または二環として７〜１２個の炭素原子を有する非芳香族の飽和または不飽和環である。単環式炭素環は、３〜６個の環原子を、さらにより代表的には５または６個の環原子を有する。二環式炭素環は、例えば、ビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］または［６，６］系として配列された７〜１２個の環原子を有するか、またはビシクロ［５，６］または［６，６］系として配列された９または１０個の環原子を有するか、またはビシクロ［２．２．１］ヘプタン、ビシクロ［２．２．２］オクタンおよびビシクロ［３．２．２］ノナンなどの架橋系を有する。単環式炭素環の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、１−シクロペント−１−エニル、ｌ−シクロペント−２−エニル、ｌ−シクロペント−３−エニル、シクロヘキシル、１−シクロヘキシ−１−エニル、１−シクロヘキシ−２−エニル、ｌ−シクロヘキシ−３−エニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、シクロウンデシルおよびシクロドデシルが挙げられる。
「アリール」は、親芳香環系の単独の炭素原子から１個の水素原子を除去して誘導される６〜２０個の炭素原子の一価の芳香族炭化水素基である。いくつかのアリール基は、「Ａｒ」としての例示的構造で表される。アリールは、非芳香族と融合した芳香環または部分的に飽和した環を含む二環式基を含む。代表的なアリール基には、ベンゼン、置換されたベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニル、インデニル、インダニル、１，２−ジヒドロナフタレン、１，２，３，４−テトラヒドロナフチルなどから誘導される基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
「ヘテロアリール」、「ヘテロシクリル」および「複素環」は全て、１つまたはそれ以上の環原子が、ヘテロ原子、例えば、窒素、酸素および硫黄である環系をいう。ヘテロシクリル基は、１〜２０個の炭素原子ならびにＮ、Ｏ、ＰおよびＳから選択される１〜６ヘテロ原子を含む。ヘテロシクリル基は、飽和または不飽和であり得る。ヘテロシクリル基は、芳香族または非芳香族であり得る。複素環は、３〜７環員（２〜６個の炭素原子ならびにＮ、Ｏ、ＰおよびＳから選択される１〜３個のヘテロ原子）を有する単環であり得るか、または７〜１０環員（４〜９個の炭素原子ならびにＮ、Ｏ、ＰおよびＳから選択される１〜３個のヘテロ原子）を有する二環、例えば：ビシクロ［４，５］，［５，５］，［５，６］または［６，６］システムである。複素環は、Ｐａｑｕｅｔｔｅ，Ｌｅｏ  Ａ．；“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”（Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９６８）、特に第１、３、４、６、７および９章；“Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ａ  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ”（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９５０〜現在まで）、特に、１３、１４、１６、１９および２８巻；ならびにＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９６０）８２：５５６６に記載されている。
【００３４】
ヘテロシクリル基の例には、例示のため、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ピリジル、ジヒドロイピリジル（ｄｉｈｙｄｒｏｙｐｙｒｉｄｙｌ）、４−ジアルキルアミノピリジニウム、テトラヒドロピリジル（ピペリジル）、チアゾリル、テトラヒドロチオフェニル、硫黄酸化テトラヒドロチオフェニル、ピリミジニル、フラニル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、テトラゾリル、ベンゾフラニル、チアナフタレニル、インドリル、インドレニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ピペリジニル、４−ピペリドニル、ピロリジニル、２−ピロリドニル、ピロリニル、テトラヒドロフラニル、３−オキソ−テトラヒドロフラニル、３−オキシイミニオ（ｏｘｉｍｉｎｉｏ）テトラヒドロフラニル、ビス−テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、４−オキソ−テトラヒドロピラニル、４−オキシイミノテトラヒドロピラニル、ビス−テトラヒドロピラニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オクタヒドロイソキノリニル、アゾシニル、トリアジニル、６Ｈ−ｌ，２，５−チアジアジニル、２Ｈ，６Ｈ−ｌ，５，２−ジチアジニル、チエニル、チアントレニル、ピラニル、イソベンゾフラニル、クロメニル、キサンテニル、フェノキサチイニル、２Ｈ−ピロリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イソインドリル、３Ｈ−インドリル、ＩＨ−インダゾリル、プリニル、４Ｈ−キノリジニル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、プテリジニル、４ａＨ−カルバゾリル、カルバゾリル、β−カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、ピリミジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フラザニル、フェノキサジニル、イソクロマニル、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペラジニル、インドリニル、イソインドリニル、キヌクリジニル、モルホリニル、オキサゾリジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンズイソキサゾリル、オキシインドリル、ベンゾオキサゾリニルおよびイサチノイル。
【００３５】
例示のためであり限定するものではないが、炭素結合複素環は、ピリジンの２、３、４、５または６位で、ピリダジンの３、４、５または６位で、ピリミジンの２、４、５または６位で、ピラジンの２、３、５または６位で、フラン、テトラヒドロフラン、チオフラン、チオフェン、ピロールまたはテトラヒドロピロールの２、３、４または５位で、オキサゾール、イミダゾールまたはチアゾールの２，４または５位で、イソキサゾール、ピラゾールまたはイソチアゾールの３、４または５位で、アジリジンの２または３位で、アゼチジンの２、３または４位で、キノリンの２、３、４、５、６、７または８位で、あるいはイソキノリンの１、３、４、５、６、７または８位で結合している。さらにより代表的には、炭素結合複素環には、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、５−ピリジル、６−ピリジル、３−ピリダジニル、４−ピリダジニル、５−ピリダジニル、６−ピリダジニル、２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、５−ピリミジニル、６−ピリミジニル、２−ピラジニル、３−ピラジニル、５−ピラジニル、６−ピラジニル、２−チアゾリル、４−チアゾリルまたは５−チアゾリルが挙げられる。
【００３６】
例示のためであり限定するものではないが、窒素結合複素環には、アジリジン、アゼチジン、ピロール、ピロリジン、２−ピロリン、３−ピロリン、イミダゾール、イミダゾリジン、２−イミダゾリン、３−イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、２−ピラゾリン、３−ピラゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドール、インドリン、ｌＨ−インダゾールの１位で、イソインドールまたはイソインドリンの２位で、モルホリンの４位で、およびカルバゾールまたはβ−カルボリンの９位で結合している。さらにより代表的には、窒素結合複素環には、１−アジリジル、１−アゼテジル、１−ピロリル、１−イミダゾリル、１−ピラゾリルおよび１−ピペリジニルが挙げられる。
【００３７】
置換基はまた、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、炭素環、アリールおよびヘテロアリール基の組み合わせ（例えば、シクロプロピルメチル、シクロヘキシルエチル、ベンジルおよびＮ−エチルモルホリノならびにそれらの置換体）でもあり得る。
【００３８】
「置換されたアルキル」、「置換されたアリール」、「置換されたヘテロシクリル」および「置換されたカルボシクリル」は、１つまたはそれ以上の水素原子が、それぞれ独立して置換基で置換された、アルキル、アリール、ヘテロシクリルおよびカルボシクリルのそれぞれを意味する。代表的な置換基には、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＯＲ、Ｒ、＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＲ、＝Ｎ＋（Ｏ）（Ｒ）、＝Ｎ（ＯＲ）、＝Ｎ＋（Ｏ）（ＯＲ）、＝Ｎ−ＮＲ２、−Ｃ（＝Ｙ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｙ）ＯＲ、−Ｃ（＝  Ｙ）ＮＲ２、−ＮＲ２、−Ｎ＋（Ｒ）３、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）ＮＲ２、−ＳＲ、−ＯＣ（＝Ｙ）Ｒ、−ＯＣ（＝Ｙ）ＯＲ、−ＯＣ（＝Ｙ）ＮＲ２、−ＯＳ（Ｏ）２（ＯＲ）、−ＯＰ（＝Ｙ）（ＯＲ）２、−ＯＰ（ＯＲ）２、−Ｐ（＝Ｙ）（ＯＲ）２、−Ｐ（＝Ｙ）（ＯＲ）ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ、−Ｓ（Ｏ）（ＯＲ）、−Ｓ（Ｏ）２（ＯＲ）、−ＳＣ（＝Ｙ）Ｒ、−ＳＣ（＝Ｙ）ＯＲ、＝Ｙおよび−ＳＣ（＝Ｙ）ＮＲ２（式中、各Ｒは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８アルケニル、Ｃ１−Ｃ８アルキニル、Ｃ６−Ｃ２０アリール、Ｃ２−Ｃ２０複素環または保護基であり；かつ、Ｙは、独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＲ、＋Ｎ（Ｏ）（Ｒ）、Ｎ（ＯＲ）、＋Ｎ（Ｏ）（ＯＲ）またはＮ−ＮＲ２である）。上記のアルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン基もまた、同様に置換され得る。
【００３９】
用語「アミノ酸側鎖」には、以下に見出されるような基が挙げられる：（ｉ）アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンなどの、天然に存在するアミノ酸；（ｉｉ）オルニチンおよびシトルリンなどの微量アミノ酸；（ｉｉｉ）天然に存在するアミノ酸の合成類似体および誘導体；ならびに（ｉｖ）それらの全ての鏡像異性体、ジアステレオマー、同位体的濃縮体、同位体的標識体、保護体およびラセミ混合物。
【００４０】
用語「治療する」または「治療」は、治療的処置および予防的なまたは予防的対策の両方をいい、目的は、癌の発症または伝播などの望まれない生理学的変化または障害を防ぐまたは低減することである。本発明の目的のために、有利なまたは望まれる臨床結果には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：検出可能なまたは検出不能な、症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患の症状の安定化（すなわち、悪化しない）、病状進行の遅延または緩徐化、疾患症状の回復または緩和、および寛解（部分的または全体のいずれか）。「治療」はまた、治療を受けなかった場合に予測される生存率に対して生存率を延長することも意味し得る。治療が必要な者には、症状または障害を既に有する者、ならびに症状または障害を有する傾向がある者または症状または障害を予防すべき者が挙げられる。
句「治療有効量」は、（ｉ）特定の疾患、症状または障害を治療または予防する、（ｉｉ）特定の疾患、条件または障害の１つまたはそれ以上の症状を減弱、寛解または除去する、あるいは（ｉｉｉ）本明細書に記載された特定の疾患、症状または障害の１つまたはそれ以上の症状の発症を予防または遅延する、本発明の化合物の量を意味する。癌の場合は、治療有効量の薬物は、癌細胞の数を減少させ得る；腫瘍のサイズを減少し得る；癌細胞の周辺器官への浸潤を阻害し得る（すなわち、ある程度緩徐にし得る、および好ましくは中止し得る）；腫瘍転移を阻害し得る（すなわち、ある程度緩徐にし得る、および好ましくは中止し得る）；腫瘍増殖をある程度阻害し得る；および／または癌に付随する症状の１つまたはそれ以上を緩和し得る。薬物は、増殖を防ぐおよび／または現存する癌細胞を殺し得る程度に、細胞分裂停止性および／または細胞傷害性であり得る。癌の治療については、効力は、例えば、疾患の進行時間（ＴＴＰ）を評価することにより、および／または応答速度（ＲＲ）を決定することにより、測定され得る。
【００４１】
用語「バイオアベイラビリティー」は、患者に投与される薬物の全身的に有効な（すなわち、血液／血漿レベル）の所定の量を意味する。バイオアベイラビリティーは、投与される剤形から全身循環を達成する薬物の時間（速度）および総量（程度）の測定値を指し示す絶対的な用語である。
【００４２】
用語「癌」および「癌性」は、未制御の細胞増殖により代表的に特徴づけられる、哺乳動物における生理的条件をいうかまたは説明する。「腫瘍」は、１つまたはそれ以上の癌性細胞を含む。癌の例には、癌腫，リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病またはリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。このような癌のより詳細な例には、扁平上皮癌（例えば、上皮性扁平細胞癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（「ＮＳＣＬＣ」）を含む肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、胃腸癌を含む胃癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、直腸結腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌腫、腎臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌ならびに頭頚部癌が挙げられる。
【００４３】
本願で用いられる用語「プロドラッグ」は、親薬物と比較して腫瘍細胞への細胞傷害性がより少なく、かつ、より活性な親型に活性化または転換し得る、薬学的に活性な物質の前駆物質または誘導体型をいう。例えば、Ｗｉｌｍａｎ，“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ”  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，１４，ｐｐ．３７５−３８２，６１５ｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｂｅｌｆａｓｔ（１９８６）およびＳｔｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄ．），ｐｐ．２４７−２６７，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）を参照されたい。本発明のプロドラッグには、より活性な細胞傷害性の遊離の薬物に転換され得る、リン酸塩含有プロドラッグ、チオリン酸塩含有プロドラッグ、硫酸塩含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、βラクタム含有プロドラッグ、必要に応じて置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは必要に応じて置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンおよび他の５−フルオロウリジンプロドラッグが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に用いるためのプロドラッグ型に誘導体化され得る細胞障害性薬物の例には、上記したような化学療法剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
「リポソーム」は、薬物（本明細書中に開示されるＮ−アシル化ジペプチドプロリンボロナート阻害剤など、および必要に応じて化学療法剤など）を哺乳動物に送達するのに有用な多様な型の脂質、リン脂質および／または界面活性物質から構成される小さいビヒクルである。リポソームの成分は、一般に、生体膜の脂質配置と同様に、二重層形式で配列されている。
【００４５】
用語「添付文書」は、治療用製品の使用に関する指示、使用、用量、投与、禁忌および／または警告についての情報を含む、治療用製品の市販のパッケージに慣習的に含まれる指示書をいう。
【００４６】
用語「キラルな」は、鏡像パートナーと重ね合わせることができない性質を有する分子をいい、一方、用語「アキラルな」は、鏡像パートナーと重ね合わせることができる分子をいう。
【００４７】
用語「立体異性体」は、同一の化学構造を有するが、空間での原子または基の配置が異なる化合物をいう。
【００４８】
「ジアステレオマー」は、２つまたはそれ以上のキラリティ中心を有する立体異性体であって、その分子が互いに鏡像ではないものをいう。ジアステレオマーは、異なる物性、例えば、融点、沸点、スペクトルの性質および反応性を有する。ジアステレオマーの混合物は、電気泳動法およびクロマトグラフィーなどの高分解能の分析用手順の下で分離され得る。
【００４９】
「鏡像異性体」は、互いの重ね合わせることができない鏡像である化合物の２つの立体異性体をいう。
【００５０】
本明細書中で用いられる立体化学的定義および表現法は、一般に、Ｓ．Ｐ．Ｐａｒｋｅｒ，Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ（１９８４）ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＥｌｉｅｌ，Ｅ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｎ，Ｓ．，“Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４に従う。多くの有機化合物は、光学活性体で存在する、すなわち、それらは、面偏光の面を回転する能力を有する。光学活性な化合物を記載するには、接頭辞Ｄ（ｄ）およびＬ（ｌ）を用いるか、あるいは、ＲおよびＳが、分子のそのキラル中心の周りの絶対配置を表すのに用いられる。接頭辞ｄおよびｌまたは（＋）および（−）は、化合物による面偏光の回転の記号を命名するために用いられ、（−）またはｌは、化合物が左旋性であることを意味する。（＋）またはｄの接頭辞を有する化合物は右旋性である。所定の化学構造については、これらの立体異性体は、それらが互いに鏡像であること以外は同一である。特定の立体異性体は、鏡像異性体とも呼ばれ得、かつ、そのような異性体の混合物は、しばしば、鏡像異性体混合物と呼ばれる。鏡像異性体の５０：５０混合物をラセミ混合物またはラセミ化合物といい、これらは、それらが化学反応またはプロセスにおいて立体選択性または立体特異性を有しない場合に生じ得る。用語「ラセミ混合物」および「ラセミ化合物」は、光学活性を有しない２つの鏡像異性の種の等モルの混合物をいう。
【００５１】
本明細書中で用いられる句「薬学的に許容され得る塩」は、本発明の化合物の薬学的に許容され得る有機塩または無機塩をいう。代表的な塩には、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、二酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸、グルタミン酸、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩およびパモ酸塩（すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸塩））が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容され得る塩は、酢酸イオン、コハク酸イオンまたは他の対イオンなどの他の分子を包含することを含み得る。対イオンは、親化合物上の電荷を安定化する任意の有機または無機部分であり得る。さらに、薬学的に許容され得る塩は、その構造中に１つを超える電荷原子を有し得る。複数の電荷原子が薬剤的に許容され得る塩の部分である場合は、複数の対イオンを有し得る。従って、薬学的に許容され得る塩は、１つまたはそれ以上の電荷原子および／または１つまたはそれ以上の対イオンを有し得る。
【００５２】
「溶媒和化合物」は、１つまたはそれ以上の溶媒分子と本発明の化合物との会合体または複合体をいう。溶媒和化合物を形成する溶媒の例には、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸およびエタノールアミンが挙げられるが、これらに限定されない。用語「水和物」は、溶媒分子が水である複合体をいう。
【００５３】
用語「保護基」または「Ｐｇ」は、他の官能基を化合物に反応させながら、特定の官能基をブロック化または保護するのに一般に用いられる置換基をいう。例えば、「アミノ保護基」は、化合物中のアミノ官能基をブロック化または保護する、アミノ基に付加した置換基をいう。適切なアミノ保護基には、アセチル、トリフルオロアセチル、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢｚ）および９−フルオレニルメチレンオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）が挙げられる。同様に、「ヒドロキシ保護基」は、ヒドロキシ官能基をブロック化または保護するヒドロキシ基の置換基をいう。適切な保護基には、アセチルおよびシリルが挙げられる。「カルボキシ保護基」は、カルボキシ官能基をブロックまたは保護するカルボキシ基の置換基をいう。一般のカルボキシ保護基には、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ２Ｐｈ、シアノエチル、２−（トリメチルシリル）エチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル、２−（ｐ−トルエンスルホニル）エチル、２−（ｐ−ニトロフェニルスルフェニル）エチル、２−（ジフェニルホスフィノ）エチル、ニトロエチルなどが挙げられる。保護基およびそれらの使用の一般的説明については、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１を参照されたい。
【００５４】
用語「動物」は、ヒト（男性または女性）、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコおよびウマ）、食物源の動物、動物園の動物、海洋動物、鳥類および他の類似の動物種をいう。「食用動物」は、ウシ、ブタ、ヒツジおよび家禽類などの食物源の動物をいう。
【００５５】
句「薬学的に許容され得る」は、物質または組成物が、処方物を含む他の成分、および／またはそれを用いて治療される哺乳動物と、化学的におよび／または毒物学的に適合しなければならないことを示す。
用語「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「処置する（ｔｒｅａｔ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、予防的（すなわち、予防的な）療法および対症療法の両方を包含する。
【００５６】
用語「ＢｏｒｏＰｒｏ」は、ピロリジニル環の２位のカルボン酸基［ＣＯＯＨ］がボロニルグループ［Ｂ（ＯＲ４）（ＯＲ５）］で置換され、かつ、以下の構造を有するプロリンの下部構造アナログをいう：
【００５７】
【化１６】
2008545661.tif 000003
（式中、波線は、式ＩおよびＩＩの化合物におけるアミドを形成するカルボニル基に結合する部位を示す）。
アミノ末端ブロックペプチドプロリンボロナート化合物
式ＩおよびＩＩのアミノ末端ブロックペプチドプロリンボロナート化合物は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）および他のプロテアーゼを阻害するのに有用であり、かつ、ＦＡＰにより仲介される障害を治療するのに有用である。
【００５８】
本発明は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）または他のプロテアーゼにより調節される疾患、症状および／または障害の治療に有用な、式Ｉを有するＮ−ブロックジペプチドプロリンボロナート化合物、ならびにその医薬組成物および処方物を提供する。式Ｉの化合物は、ならびにその立体異性体、互変異性体、溶媒和化合物および薬学的に許容され得る塩は、以下を含む：
【００５９】
【化１７】
2008545661.tif 000004
［式中、
Ｘは、Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲ）、ＮＲＣ（＝Ｏ）、ＮＲＣ（＝ＮＲ）、ＯＣ（＝Ｏ）、ＯＣ（＝ＮＲ）、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ）、Ｓ（Ｏ）およびＳ（Ｏ）２であり；
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ２−Ｃ２０複素環、Ｃ３−Ｃ１２炭素環およびＣ６−Ｃ２０アリールから選択され；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ２−Ｃ２０複素環、Ｃ３−Ｃ１２炭素環およびＣ６−Ｃ２０アリールから選択されるか、または、Ｒ１およびＲ２は、Ｃ２−Ｃ２０複素環を形成し；
Ｒ３は、保護されていてもよいアミノ酸側鎖であり；
Ｒ４およびＲ５は、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ２−Ｃ２０複素環、Ｃ３−Ｃ１２炭素環、Ｃ６−Ｃ２０アリール、プロドラッグおよび保護基から選択されるか、または、Ｒ４およびＲ５は、一緒になって、Ｃ６−Ｃ２０アリール、Ｃ３−Ｃ１２炭素環、プロドラッグまたは保護基を形成する；
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＯＲ、Ｒ、−Ｃ（＝Ｙ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｙ）ＯＲ、−Ｃ（＝Ｙ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ＋（Ｒ）３、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）Ｎ（Ｒ）２、−ＳＲ、−ＯＣ（＝Ｙ）Ｒ、−ＯＣ（＝Ｙ）ＯＲ、−ＯＣ（＝Ｙ）（Ｎ（Ｒ）２）、−ＯＳ（Ｏ）２（ＯＲ）、−ＯＰ（＝Ｙ）（ＯＲ）２、−ＯＰ（ＯＲ）２、−Ｐ（＝Ｙ）（ＯＲ）２、−Ｐ（＝Ｙ）（ＯＲ）ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ、−Ｓ（Ｏ）（ＯＲ）、−Ｓ（Ｏ）２（ＯＲ）、−ＳＣ（＝Ｙ）Ｒ、−ＳＣ（＝Ｙ）ＯＲおよび−ＳＣ（＝Ｙ）ＮＲ２から選択され；
アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、炭素環および複素環は、それぞれ、必要に応じてかつ独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＯＲ、Ｒ、＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＲ、＝Ｎ＋（Ｏ）（Ｒ）、＝Ｎ（ＯＲ）、＝Ｎ＋（Ｏ）（ＯＲ）、＝Ｎ−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝Ｙ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｙ）ＯＲ、−Ｃ（＝Ｙ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ＋（Ｒ）３、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）Ｎ（Ｒ）２、−ＳＲ、−ＯＣ（＝Ｙ）Ｒ、−ＯＣ（＝Ｙ）ＯＲ、−ＯＣ（＝Ｙ）（Ｎ（Ｒ）２）、−ＯＳ（Ｏ）２（ＯＲ）、−ＯＰ（＝Ｙ）（ＯＲ）２、−ＯＰ（ＯＲ）２、−Ｐ（＝Ｙ）（ＯＲ）２、−Ｐ（＝Ｙ）（ＯＲ）ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ、−Ｓ（Ｏ）（ＯＲ）、−Ｓ（Ｏ）２（ＯＲ）、−ＳＣ（＝Ｙ）Ｒ、−ＳＣ（＝Ｙ）ＯＲおよび−ＳＣ（＝Ｙ）ＮＲ２から選択される１つまたはそれ以上の置換基で置換され；
Ｒは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ６−Ｃ２０アリール、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクリルまたは保護基であり；かつ、
Ｙは、独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＲ、Ｎ＋（Ｏ）（Ｒ）、Ｎ（ＯＲ）、Ｎ＋（Ｏ）（ＯＲ）またはＮ−Ｎ（Ｒ）２である；
ただし、Ｒ１がメチルでありかつＸがＣ（＝Ｏ）である場合、Ｒ３は、リジンまたはアセチルリジンではなく；Ｒ１がｔｅｒｔ−ブチルでありかつＸがＯＣ（＝Ｏ）である場合、Ｒ３はメチルではない］。
【００６０】
本発明はまた、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）または他のプロテアーゼにより調節される疾患、症状および／または障害の治療に有用な、式ＩＩを有するＮ−ブロックペプチドプロリンボロナート化合物、ならびにその医薬組成物および処方物を提供する。式ＩＩの化合物、ならびにその立体異性体、互変異性体、溶媒和化合物および薬学的に許容され得る塩は、以下を含む：
【００６１】
【化１８】
2008545661.tif 000005
［式中、
Ｚは、
【００６２】
【化１９】
2008545661.tif 000006
であり、
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ２−Ｃ２０複素環、Ｃ３−Ｃ１２炭素環およびＣ６−Ｃ２０アリールから選択され；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ２−Ｃ２０複素環、Ｃ３−Ｃ１２炭素環およびＣ６−Ｃ２０アリールから選択されるか、またはＲ１およびＲ２はＣ２−Ｃ２０複素環を形成し；
Ｒ３は、必要に応じて保護されたアミノ酸側鎖であり；
Ｒ４およびＲ５は、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ２−Ｃ２０複素環、Ｃ３−Ｃ１２炭素環、Ｃ６−Ｃ２０アリール、プロドラッグおよび保護基から選択されるか、または、Ｒ４およびＲ５は、一緒になって、Ｃ６−Ｃ２０アリール、Ｃ３−Ｃ１２炭素環、プロドラッグまたは保護基を形成する；
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＯＲ、Ｒ、−Ｃ（＝Ｙ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｙ）ＯＲ、−Ｃ（＝Ｙ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ＋（Ｒ）３、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）Ｎ（Ｒ）２、−ＳＲ、−ＯＣ（＝Ｙ）Ｒ、−ＯＣ（＝Ｙ）ＯＲ、−ＯＣ（＝Ｙ）（Ｎ（Ｒ）２）、−ＯＳ（Ｏ）２（ＯＲ）、−ＯＰ（＝Ｙ）（ＯＲ）２、−ＯＰ（ＯＲ）２、−Ｐ（＝Ｙ）（ＯＲ）２、−Ｐ（＝Ｙ）（ＯＲ）ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ、−Ｓ（Ｏ）（ＯＲ）、−Ｓ（Ｏ）２（ＯＲ）、−ＳＣ（＝Ｙ）Ｒ、−ＳＣ（＝Ｙ）ＯＲおよび−ＳＣ（＝Ｙ）ＮＲ２から選択され；
Ｒ１３は、独立して、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８アルケニル、Ｃ１−Ｃ８アルキニル、Ｃ６−Ｃ２０アリール、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクリルまたは保護基から選択され；
アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、炭素環および複素環は、それぞれ、必要に応じてかつ独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＯＲ、Ｒ、＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＲ、＝Ｎ＋（Ｏ）（Ｒ）、＝Ｎ（ＯＲ）、＝Ｎ＋（Ｏ）（ＯＲ）、＝Ｎ−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝Ｙ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｙ）ＯＲ、−Ｃ（＝Ｙ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ＋（Ｒ）３、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）Ｎ（Ｒ）２、−ＳＲ、−ＯＣ（＝Ｙ）Ｒ、−ＯＣ（＝Ｙ）ＯＲ、−ＯＣ（＝Ｙ）（Ｎ（Ｒ）２）、−ＯＳ（Ｏ）２（ＯＲ）、−ＯＰ（＝Ｙ）（ＯＲ）２、−ＯＰ（ＯＲ）２、−Ｐ（＝Ｙ）（ＯＲ）２、−Ｐ（＝Ｙ）（ＯＲ）ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ、−Ｓ（Ｏ）（ＯＲ）、−Ｓ（Ｏ）２（ＯＲ）、−ＳＣ（＝Ｙ）Ｒ、−ＳＣ（＝Ｙ）ＯＲおよび−ＳＣ（＝Ｙ）ＮＲ２から選択される１つまたはそれ以上の置換基で置換され；
Ｒは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ６−Ｃ２０アリール、Ｃ１−Ｃ２０ヘテロシクリルまたは保護基であり；
Ｙは、独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＲ、Ｎ＋（Ｏ）（Ｒ）、Ｎ（ＯＲ）、Ｎ＋（Ｏ）（ＯＲ）またはＮ−Ｎ（Ｒ）２であり；かつ、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７または８である］。
【００６３】
式ＩおよびＩＩの化合物について、Ｒは、トリアルキルシリル、ジアルキルフェニルシリル、安息香酸、ベンジル、ベンジルオキシメチル、メチル、メトキシメチル、トリアリールメチル、フタルイミドおよびテトラヒドロピラニルから選択される保護基であり得る。
【００６４】
式ＩおよびＩＩの化合物について、Ｒ１は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、ＯＲ、Ｒ、−Ｃ（＝Ｙ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｙ）ＯＲ、−Ｃ（＝Ｙ）ＮＲ２、−ＮＲ２、−Ｎ＋（Ｒ）３、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｙ）ＮＲ２、−ＳＲ、−ＯＣ（＝Ｙ）Ｒ、−ＯＣ（＝Ｙ）ＯＲ、−ＯＣ（＝Ｙ）ＮＲ２、−ＯＳ（Ｏ）２（ＯＲ）、−ＯＰ（＝Ｙ）（ＯＲ）２、−ＯＰ（ＯＲ）２、−Ｐ（＝Ｙ）（ＯＲ）２、−Ｐ（＝Ｙ）（ＯＲ）ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ、−Ｓ（Ｏ）（ＯＲ）、−Ｓ（Ｏ）２（ＯＲ）、−ＳＣ（＝Ｙ）Ｒ、−ＳＣ（＝Ｙ）ＯＲおよび−ＳＣ（＝Ｙ）ＮＲ２から選択される１つまたはそれ以上の置換基で置換されていてもよいフェニルであり得る。
【００６５】
式ＩおよびＩＩの化合物について、Ｒ１は、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、３−ピラゾリル、４−ピラゾリル、２−ピロリル、３−ピロリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、３−ピリダジニル、４−ピリダジニル、５−ピリダジニル、２−ピリミジニル、５−ピリミジニル、６−ピリミジニル、２−ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、５−オキサゾリルおよびそれらの置換型から選択されるヘテロシクリルであり得る。
【００６６】
式ＩおよびＩＩの化合物について、Ｒ３は、天然に存在するアミノ酸側鎖、ならびに微量アミノ酸およびシトルリンなどの天然に存在しないアミノ酸類似体である。Ｒ３が、水素、メチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ベンジル、ｐ−ヒドロキシベンジル、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＣＨ３、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＨＯ、−（ＣＨ２）４ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＣＨ３、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＨＯ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＮＨ２、２−ピリジルメチル−、３−ピリジルメチル−、４−ピリジルメチル−、フェニル、シクロヘキシル、および以下の構造：  
【００６７】
【化２０】
2008545661.tif 000007
から選択される。
【００６８】
Ｒ３が水素以外である場合、Ｒ３が結合する炭素原子はキラルである。Ｒ３が結合する炭素原子は、それぞれ、独立して、（Ｓ）または（Ｒ）立体配置であるか、あるいはラセミ混合物である。従って、式Ｉの化合物は、鏡像異性的に純粋な、ラセミ体またはジアステレオ異性体であり得る。
【００６９】
代表的な実施例では、アミノ酸側鎖Ｒ３は、アラニン、２−アミノ−２−シクロヘキシル酢酸、２−アミノ−２−フェニル酢酸、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、ノルロイシン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、γアミノ酪酸、α，α−ジメチルγアミノ酪酸、β，β−ジメチルγ−アミノ酪酸、オルニチンおよびシトルリン（Ｃｉｔ）を含む天然および非天然アミノ酸の側鎖から選択される。アミノ酸側鎖Ｒ３は、必要に応じて、側鎖の反応性官能基が保護されたアミノ酸の保護体を含む。保護されたアミノ酸試薬および中間体は周知であり、アセチル、ホルミル、トリフェニルメチル（トリチル）およびモノメトキシトリチル（ＭＭＴ）で保護されたリジンが挙げられる。他の保護されたアミノ酸単位には、トシル基またはニトロ基で保護されたアルギニン、アセチル基またはホルミル基で保護されたオルニチンが挙げられる。
【００７０】
式ＩおよびＩＩの化合物について、Ｒ４およびＲ５は、ピナンジオール、ピナコールまたはカテコール、および以下の構造：
【００７１】
【化２１】
2008545661.tif 000008
を有する環状ボロナートエステルを形成し得る。
【００７２】
式Ｉの化合物の例には、式Ｉａ：
【００７３】
【化２２】
2008545661.tif 000009
（式中、ＸはＣ（＝Ｏ）であり、Ｒ１２はＨである）から選択されるものが挙げられる。代表的な式Ｉａの化合物の例には、式Ｉｂ：
【００７４】
【化２３】
2008545661.tif 000010
（式中、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれＨである）から選択されるものが挙げられる。
【００７５】
代表的な式Ｉｂの化合物は、以下の構造を含む：
【００７６】
【化２４】
2008545661.tif 000011
（式中、Ｒ２およびＲ３はそれぞれＨである）。
【００７７】
代表的な式Ｉｂの化合物は、以下の構造を含む：
【００７８】
【化２５】
2008545661.tif 000012
（式中、Ｒ１およびＲ２は、Ｃ２−Ｃ２０複素環を形成する）。
【００７９】
代表的な式Ｉｂの化合物は、以下の構造を含む：
【００８０】
【化２６】
2008545661.tif 000013
（式中、Ｒ２はメチルであり、Ｒ３はＨである）。
【００８１】
代表的な式Ｉｂの化合物は、以下の構造を含む：
【００８２】
【化２７】
2008545661.tif 000014
。
【００８３】
式Ｉの化合物の例には、式Ｉｃ：
【００８４】
【化２８】
2008545661.tif 000015
から選択されるものが挙げられる。
【００８５】
式Ｉｃの化合物は、以下の構造を含む：
【００８６】
【化２９】
2008545661.tif 000016
。
【００８７】
式ＩＩの化合物の例には、式ＩＩａおよびＩＩｂ：
【００８８】
【化３０】
2008545661.tif 000017
から選択されるものが挙げられる。
【００８９】
式ＩＩａの化合物は、以下の構造を含む：
【００９０】
【化３１】
2008545661.tif 000018
。
【００９１】
Ｎ−ブロックペプチドプロリンボロナート化合物の合成
ペプチド化合物は、当該分野で公知の定法により調製され得、実施例５で考察され得る。プロリンボロナート中間体は、米国特許第４９３５４９３号明細書；米国特許第５４６２９２８号明細書；米国特許第６３５５６１４号明細書；Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０（１０）：２２１１−２２１７；およびＧｉｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃ．Ｒｅｓ．＆  Ｄｅｖ．６：８１４−８１６；Ｃｏｕｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：２０８７−２０９４で確立された方法により、調製され得る。多くの有機ホウ素化合物が商業的に入手可能である（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；Ｂｏｒｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｃ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ，２７７０９）。
【００９２】
Ｎ−アセチル−ｇｌｙ−ボロプロリン５は、ｔｅｒｔ−ブチル  １−ピロリジンカルボン酸（Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−ピロリジン、Ａｌｄｒｉｃｈ）から、図１および実施例６の合成経路に従って調製された。ＴＨＦ中のＮ−ｔ−ＢＯＣ−ピロリジンでｓｅｃ−ブチルリチウムを用いてメタル化した後、トリメチルボレートを添加して、１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロリジン−２−イル−２−ボロン酸１を得た。選択した単独の鏡像異性体（＋）−ピナンジオールでのｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ＭＴＢＥ）中でのホウ酸塩エステル化により、ピナンエステル２（Ｃｏｕｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３５（２９）：５１０９−５１１２；Ｋｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９：１００９−１０１６）を得た。ＢＯＣ基の酸加水分解および選択的結晶化により、（＋）−ピナン  １−ピロリジン−２−イル−２−ボロナート３を得た。３およびＮ−アセチルグリシンをＥＤＣ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）およびＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）を用いてカップリングすることにより、Ｎ−アセチル−ｇｌｙ−ボロプロリン４のピナンホウ酸塩を得る。４を、フェニルボロン酸とホウ酸エステル交換することにより、Ｎ−アセチル−ｇｌｙ−ボロプロリン５を得た。
【００９３】
ペプチドおよび基質の標識化
ペプチドＦＡＰ基質の標識化は、代表的には、適切な反応性染料および複合体化すべきペプチドを、当該分野で周知の方法（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（１９９６）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、両方が可溶であるような適切な溶媒中で混合し、複合体化しなかった出発物質または望ましくない副産物から複合体を分離することにより、行われる。染料複合体は、後に使用するために、乾燥状態でまたは溶液で貯蔵され得る。染料は、染料の他の分子への共有結合のための位置の置換基の１つにおいて、反応性結合基を含み得る。共有結合を形成し得る反応性結合基は、代表的には、アルコール、アルコキシド、アミン、ヒドロキシルアミンおよびチオールなどの、求核性分子と反応し得る求電子性官能基である。反応性結合基の例には、スクシンイミジルエステル、イソチオシアン酸塩、塩化スルホニル、スルホナートエステル、シリルハライド、２，６−ジクロロトリアジニル、ペンタフルオロフェニルエステル、ホスホルアミダイト、マレイミド、ハロアセチル、エポキシド、アルキルハライド、アリルハライド、アルデヒド、ケトン、アシルアジド、無水物およびヨードアセトアミドが挙げられる。代表的な反応性結合基は、染料のカルボキシル置換基のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）である。染料のＮＨＳエステルは、予め形成され、単離され、精製され、かつ／または特徴づけされ得るか、あるいはその場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で形成され、かつペプチドの求核性基などと反応し得る。代表的には、染料のカルボキシル体は、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミドなどのカルボジイミド試薬、あるいは、例えば、ＥＤＣ（Ｎ−エチル−Ｎ’，３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）、ＴＳＴＵ（Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  テトラフルオロボレート、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）またはＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）などのウロニウム試薬、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどの活性化剤のいくつかの組み合わせを用いて反応させて、染料のＮＨＳエステルを得る。他の活性化および縮合試薬には、ＴＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１−１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート）、ＴＦＦＨ（Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラメチルウロニウム  ２−フルオロ−ヘキサフルオロホスフェート）、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリスピロリジノホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェート）、ＥＥＤＱ（２−エトキシ−ｌ−エトキシカルボニル−ｌ，２−ジヒドロ−キノリン）、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）；ＤＩＰＣＤＩ（ジイソプロピルカルボジイミド）、ＭＳＮＴ（ｌ−（メシチレン−２−スルホニル）−３−ニトロ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾ��ル、および例えばトリイソプロピルベンゼンスルホニルハライドなどのアリールスルホニルクロリドが挙げられる。
【００９４】
ＦＲＥＴ対のエネルギー移動染料には、第１の波長で光を吸収し、かつ応答時に励起エネルギーを放射するドナー染料、ドナー染料により放射された励起エネルギーを吸収し、かつ応答において第２の波長で蛍光発光し得るアクセプター染料が挙げられる。染料は、フルオレセイン、ローダミン、ジアゾジアリール型またはシアニンなどの任意の広範な複合体構造のいずれかであり得、その多くは商業的に入手可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。ペプチドは、ペプチドの切断部位の反対側でドナー染料およびアクセプター染料を用いて標識され得る。ペプチド類は、カルボキシル末端、アミノ末端または内部アミノ酸、例えば、システインまたはリジン側鎖で標識され得る（米国特許第５６０５８０９号明細書）。
【００９５】
ペプチド基質は、液相法または固相法により調製され得る。固相法は、代表的な固相ペプチド合成法により、ｔ−ＢＯＣ（Ｇｅｉｓｅｒ，ｅｔ  ａｌ．“Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”  ｉｎ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８８，ｐｐ．１９９−２１８）、またはＦｍｏｃ／ＨＢＴＵ化合物（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｇ．ａｎｄ  Ｎｏｂｌｅ，Ｒ．（１９９０）“Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ”，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３５：１６１−２１４）を用いて、Ｒａｉｎｉｎ  Ｓｙｍｐｈｏｎｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒなどの自動化合成装置（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）、またはＭｏｄｅｌ４３３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）上で、固相樹脂上で合成することを含む。
【００９６】
プロテアーゼ発現および特徴付け
ＤＰＰ−４は、最初に残基３９から開始する可溶性糖タンパク質として、血清中に存在する（Ｄｕｒｉｎｘ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：５６０８−５６１３）。アミノ酸Ｔｈｒ３８から開始する組換え型Ｓｅｒ３９−ＤＰＰ−４および類似の可溶性ＦＡＰ分子が、実施例１に従って発現され、精製される（Ｅｄｏｓａｄａ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｊｏｕｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８１（１１）：７４３７−７４４４、第７４３８頁）。ＦＡＰは、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した場合、９７ｋＤａの見かけ分子量で移動する。ＤＰＰ−４は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件下で、１０５−１１５ｋＤａの分子量で移動する。これらの分子量は、一次アミノ酸配列に基づいて期待される分子量より１５−２０ｋＤａ高く、かつＮ−Ｇｌｙｃａｎａｓｅでの処理により減少するが、このことは、各プロテアーゼがＮ−グリコシル化されていることを示す。各プロテアーゼをさらに特徴づけるために、多角光散乱を、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび干渉計回折測定と組み合わせて用いることにより、溶液中で決定する。ＦＡＰは、主に、標準に対する電気泳動移動度で２００±１５ｋＤａの分子量を有する二量体として存在する。少量の単量体（溶出容積９．０ｍｌ）および多量体（溶出容積＜８．０ｍｌ）のＦＡＰもまた観察された。ＤＰＰ−４の主な溶出ピークは、２２０±１５ｋＤａの分子量を有したが、このことは、二量体の組成を示す。本発明者らの可溶性プロテアーゼ調製物の二量体の性質は、ＦＡＰおよびＤＰＰ−４結晶構造の二量体の組成と一致するが、このことは、それらが構造的に無傷であることを示唆する（Ａｅｒｔｇｅｅｒｔｓ，ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０（２０）：１９４４１−１９４４４；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０（１）：１９−２５；Ｔｈｏｍａ，ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １１：９４７−９５９；Ｅｎｇｅｌ，ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００（９）：５０６３−５０６８；Ａｅｒｔｇｅｅｒｔｓ，ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １３：１−１０）。
【００９７】
ＦＡＰの基質特異性
モデルペプチド基質のＦＡＰによる切断は、ペプチドが、共に共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）する２つの部分、蛍光性レポーターおよび失活剤で標識される場合、検出および定量化され得る。ＦＲＥＴペプチドの切断は、蛍光を遊離する、すなわち、消光を停止するが、これは検出および定量化され得る。レポーターの蛍光は、インタクトなペプチドにおける失活剤部分により、部分的にまたは有意に消光され得る。ペプチドのペプチダーゼまたはプロテアーゼによる切断の際に、検出可能な蛍光の増加が測定され得る（Ｋｎｉｇｈｔ，Ｃ．（１９９５）“Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２４８：１８−３４）。
【００９８】
ＦＡＰの基質特異性は、標識されたペプチド基質を用いて測定された（Ｅｄｏｓａｄａ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｊｏｕｒ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．２８１（１１）：７４３７−７４４４）。図３は、ＦＲＥＴペプチド基質ＲＫ（ダブシル（ｄａｂｃｙｌ））ＴＳ−Ｐ２−ＰＮＱＥＱＥ（エダンス（ｅｄａｎｓ））ＲのＦＡＰによるエンドペプチダーゼ切断の相対的加水分解割合のグラフを示す。Ｐ２部位は、プロリンのＮ末端側にあり、かつ、Ｌ−アミノ酸が異なる：アラニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、リジン、ロイシン、アルギニン、セリン、バリンおよびチロシン（左から）。腫瘍におけるＦＡＰ酵素活性の度合いは、クマリン標識基質を用いる免疫捕捉アッセイにより決定され得る（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．４（３）：３５１−６０；Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：４７６７−４７７２）。
【００９９】
表１は、ＦＡＰが、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）標識ペプチド、ＲＫ（ダブシル）ＴＳ−Ｐ２−ＰＮＱＥＱＥ（エダンス）Ｒを切断することを示し、表中、グリシン、Ｄ−アラニンまたはＤ−セリンはＰ２アミノ酸の位置にあり、ペプチド類は、０．１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含むアッセイ緩衝液中で、リジン（Ｋ）がフルオロフォアエダンス（５−（（２−アミノエチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸、ナトリウム塩）で標識され、かつ、消光剤ダブシル（４−（（４−（ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸）がグルタミン酸（Ｅ）で標識される。
【０１００】
【化３２】
2008545661.tif 000019
【０１０１】
【表１】
2008545661.tif 000020
図３は、ＦＲＥＴペプチド基質であるＲＫ（ダブシル）ＴＳ−Ｐ２−ＰＮＱＥＱＥ（エダンス）ＲのＦＡＰによる相対的加水分解速度のグラフを示す。Ｐ３部位は、グリシン−プロリンのＮ末端側にあり、Ｌ−アミノ酸が異なる：アラニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、リジン、ロイシン、アルギニン、セリン、バリンおよびチロシン（左から）。図３は、モデルＦＲＥＴ標識ペプチドエンドペプチダーゼ基質の切断のＦＡＰ活性は、グリシンがプロリンのＮ末端側に隣接したときに最大であることを示す。
【０１０２】
図４ａは、ＦＲＥＴペプチド基質であるＲＫ（ダブシル）Ｔ−Ｐ３−ＧＰＮＱＥＱＥ（エダンス）ＲのＦＡＰによる相対的加水分解速度のグラフを示す。Ｐ３部位は、グリシン−プロリンのＮ末端側にあり、Ｌ−アミノ酸が異なる：アラニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、ロイシン、リジン、アルギニン、セリン、バリンおよびチロシン（左から）。図４ａは、モデルＦＲＥＴ標識ペプチドエンドペプチダーゼ基質の切断のＦＡＰ活性は、グリシン、セリンまたはスレオニンがグリシン−プロリンのＮ末端側に隣接したときに最大であることを示す。
【０１０３】
図４ｂは、ＦＲＥＴペプチド基質であるＲＫ（ダブシル）−Ｐ４−ＳＧＰＮＱＥＱＥ（エダンス）ＲのＦＡＰによる相対的加水分解速度のグラフを示す。Ｐ４部位は、セリン−プロリンのＮ末端側にあり、Ｌ−アミノ酸が異なる：アラニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、リジン、ロイシン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリンおよびチロシン（左から）。図４ｂは、モデルＦＲＥＴ標識ペプチドエンドペプチダーゼ基質の切断のＦＡＰ活性は、アラニンがセリン−グリシン−プロリンのＮ末端側に隣接したときに最大であることを示す。
【０１０４】
図４ｃは、ＦＲＥＴペプチド基質であるＲＫ（ダブシル）ＴＳＧＰ−Ｐ１’−ＱＥＱＥ（エダンス）ＲのＦＡＰによる相対的加水分解速度のグラフを示すが、ここで、Ｐ１’部位はグリシン−プロリンのＣ末端側にあり、Ｌ−アミノ酸が異なる：アラニン、アスパラギン酸、ヒスチジン、リジン、ロイシン、アスパラギン、アルギニン、セリン、バリンおよびチロシン（左から）。図４ｃは、モデルＦＲＥＴ標識ペプチドエンドペプチダーゼ基質の切断のＦＡＰ活性は、アラニン、アスパラギン、セリンまたはチロシンがセリン−グリシン−プロリンのＣ末端側に隣接したときに最大であることを示す。
【０１０５】
図４ｄは、ＦＲＥＴペプチド基質であるＲＫ（ダブシル）ＴＳＧＰＮ−Ｐ２’−ＥＱＥ（エダンス）ＲのＦＡＰによる相対的加水分解速度のグラフを示すが、ここで、Ｐ２’部位はグリシン−プロリンのＣ末端側にあり、Ｌ−アミノ酸が異なる：アラニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、リジン、ロイシン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリンおよびチロシン（左から）。図４ｄは、モデルＦＲＥＴ標識ペプチドエンドペプチダーゼ基質の切断のＦＡＰ活性は、アラニン、グルタミンまたはセリンがセリン−グリシン−プロリン−アスパラギンのＣ末端側に隣接したときに最大であることを示す。
【０１０６】
ＦＡＰおよびジペプチジルペプチダーゼの示差活性
図２は、ＦＲＥＴ標識ＦＡＰ基質ペプチドであるＲＫ（ダブシル）ＴＳＧＰＮＱＥＱＥ（エダンス）Ｒの、ＦＡＰおよびＤＰＰ−４による加水分解の相対速度のグラフを示す。図２は、ＦＡＰはＦＲＥＴ標識ペプチドなどのエンドペプチダーゼ基質を切断する一方、ＤＰＰ−４は切断しないことを示す。
【０１０７】
クマリン標識ペプチド基質のＦＡＰ切断
種々のＮ−ブロック化Ｃ末端クマリン（ＡＭＣＣ）Ｇｌｙ−Ｐｒｏジペプチド基質６の相対的切断速度を測定した。速度を、ＦＡＰおよびＤＰＰ−４についてＮ−非ブロック化Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣＣに対して正規化した。表２は、Ｎ−ブロック改変体は、ＤＰＰ−４の切断基質ではないが、ＦＡＰにより切断されることを示す。
【０１０８】
【化３３】
2008545661.tif 000021
【０１０９】
【表２】
2008545661.tif 000022
ＦＡＰが他のＮ−置換−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−塩基基質を切断し得るかどうかを検討するため、Ｎ−メチル−、ホルミル−、スクシニル−、ベンジルオキシカルボニル−（Ｚ−）およびビオチニル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣＣ基質６を合成し、ＦＡＰ（３７ｎＭ）およびＤＰＰ−４（６．８ｎＭ）と反応させた。スクシニル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣＣを除き、ＦＡＰは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣＣ加水分解について正規化した速度の３５−１５０％の速度で全てのＮ−置換−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣＣ基質６を切断したが（表２）、このことは、プロテアーゼが、他のＮ末端ブロッキング基を許容することを示す。市販で入手可能なＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣの動力学的解析（表５）は、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＦＣの触媒効率より約３倍低い触媒効率を示し（表４）、これらの結果と一致した。ＦＡＰでは、対照的に、ＤＰＰ−４は、Ｎ−メチル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣＣのみを、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣＣに匹敵する速度で切断した。低速の加水分解がホルミル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣＣ基質で得られたが、１ｍＭまでの濃度では、スクシニル、Ｚ−またはビオチニル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣＣ基質の切断は観察されなかった。このことは、ＤＰＰ−４が、Ｎ−アシル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−塩基基質を許容しないことを示す。ＤＰＰ−４はまた、市販で入手可能なＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣに対してほとんど活性を示さなかった（表５）。
【０１１０】
Ｎ−ブロック化（８）および非ブロック化（７）グリシン−プロリンジペプチド基質のＦＡＰおよびいくつかのジペプチダーゼによる相対切断速度を測定した。表３に示す相対活性は、ジペプチダーゼＤＰＰ−４、ＤＰＰ−７、ＤＰＰ−８およびＤＰＰ−９は非ブロック化基質を好む一方、ＦＡＰはあまり特異的ではなく、７および８を同じ速度で切断することを実証する。
【０１１１】
【化３４】
2008545661.tif 000023
【０１１２】
【表３】
2008545661.tif 000024
ジペプチドプロリン基質のアミノ末端のブロッキング効果を、ＦＡＰおよびＤＰＰ−４による切断において測定した。図６は、多様な濃度における、ブロック化（Ａｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＦＣ  ８）および非ブロック化（グリシン−Ｐｒｏ−ＡＦＣ  ７）ジペプチド基質のＦＡＰおよびＤＰＰ−４による切断速度Ｖ０（ナノモル／秒）のグラフを示す（Ｅｄｏｓａｄａ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｊｏｕｒ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（１１）：７４３７−７４４４、第７４４０頁）。ＡＦＣは、２−（７−アミノ−４−（トリフルオロメチル）−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−イル）アセトアミド（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、クマリン１５１、７−アミド−４−トリフルオロメチルクマリン）である。ＦＡＰは、Ａｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＦＣ８およびＧｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＦＣ７を、かなりの速度で切断する。ＤＰＰ−４は、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＦＣ７を切断するが、Ａｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＦＣ８は切断しない。ブロックの切断（ｋｃａｔ／Ｋｍ）の、ＦＡＰの非ブロック化基質に対する相対速度は、１．１であり、ＤＰＰ−４については約０．００００２である。ＤＰＰ−４は、Ａｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＦＣ８に対してほとんど活性を有しない。
【０１１３】
ＦＡＰおよびＤＰＰ−４による種々のＣ末端クマリンジペプチド基質７−１６の切断（加水分解）速度を測定した（表４および５）。基質のアミノ末端は非ブロック化であり、アミノ酸は表４のように異なった。基質のアミノ末端をブロックし、アミノ酸は表５のように異なった。ジペプチド基質ライブラリについて得られた結果を拡張するために、非ブロック化ジペプチド基質のＦＡＰによる切断について動力学的パラメータを決定した（表４）。基質切断のための触媒効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）は、Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−ＡＦＣで最大であり、次いで、Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−プロリンおよびフェニルＡｌａ−Ｐｒｏ−ＡＦＣであったが、このことは、ジペプチド基質ライブラリの結果と一致した（図５）。各基質についてのミカエリス定数は約２５０μＭであったので、Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−ＡＦＣを除いて、これらの差は、ｋｃａｔ値の差を反映する。観察されたミカエリス定数は、他のＰ２−Ｐｒｏ−ＡＦＣ基質よりも約２．５倍低いので、Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−ＡＦＣ加水分解について観察されたより高い触媒効率は、ｋｃａｔおよびＫｍ効果の両方に起因する。ＦＡＰは、Ｐ２−Ａｌａベースの基質に対して著明に低い活性を示した。Ｇｌｙ−Ａｌａ−ＡＭＣは切断されず、Ｌｙｓ−Ａｌａ−ＡＦＣ切断についての触媒効率は、Ｐ２−Ｐｒｏ−ベースのペプチド類の触媒効率の切断についての触媒効率よりも４００−１０００倍少ないが（表４）、このことは、ＦＡＰがＰ１位のＰｒｏを好むことを示す。Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＡＦＣおよびＧｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＦＣのＤＰＰ−４による切断の動力学的定数を決定した（表４）。Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＡＦＣ加水分解についての触媒効率は、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＦＣについての触媒効率よりも大きく、かつ、ジペプチドライブラリと一致した。著しく、ジペプチド加水分解のＤＰＰ−４による触媒効率は、一貫して、ＦＡＰについて観察されたものより約１００倍高かったが、このことは、ｋｃａｔの増加およびＫｍの減少の両方を反映する。
【０１１４】
【表４】
2008545661.tif 000025
ａ基質の切断は、２３℃にて、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ中、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４で行った
ｂ基質が１ｍＭとなるまで、切断は起こらなかった
【０１１５】
【表５】
2008545661.tif 000026
ａ基質の切断は、２３℃にて、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ中、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４で行った
ｂ一次条件下、３０ｎＭのＦＡＰ、１２５μＭの基質で測定した
ｃ一次条件下、２００ｎＭのＤＰＰ−４、２５０μＭの基質で測定した
ｄ基質が１ｍＭまで、切断は起こらなかった
Ａｃ＝ＣＨ３Ｃ（＝Ｏ）；Ｚ＝ＰｈＣＨ２ＯＣ（＝Ｏ）；ＡＭＣ＝７−アミノ−４−メチルクマリン；ＡＦＣ＝７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン；ＭＮＡ＝４−メトキシ−２−ナフチルアミン
図５は、ＦＡＰ（上部）およびＤＰＰ−４（下部）による、モデルクマリン標識ジペプチド基質であるＰ２−Ｐｒｏ−ＡＭＣＣの相対的加水分解速度のグラフを示す。アミノ末端Ｐ２は、Ｌ−アミノ酸が異なる：アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファンおよびチロシン（左から）。ＡＭＣＣは２−（７−アミノ−４−メチル−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−イル）アセトアミドである。両方の酵素について、モデルジペプチド基質に隣接するアミノ酸は、アミノ末端が非ブロック化である場合、ほとんど効果がなかった。ＦＡＰおよびＤＰＰ−４による他のＰ２−Ｐｒｏ−ＡＭＣＣ基質のＧｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣＣに対する加水分解速度は、以下の表６に含まれる：
【０１１６】
【表６】
2008545661.tif 000027
＊Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣＣに対して正規化した加水分解速度
Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＡＦＣに対するＰ２−Ｐｒｏ−ＡＭＣＣ化合物によるＦＡＰおよびＤＰＰ−４活性の阻害を、表７の種々の濃度のＰ２−Ｐｒｏ−ＡＭＣＣ化合物を用いて測定した。
【０１１７】
【表７】
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Ｎ−ブロック化ジペプチドプロリン基質のアミノ末端でのアミノ酸の変更がＦＡＰによる切断に及ぼす効果を測定した。図７は、モデルクマリン標識ジペプチド基質Ａｃ−Ｐ２−Ｐｒｏ−ＡＦＣのＦＡＰによる相対的加水分解速度のグラフを示す。アミノ末端Ｐ２は、Ｌ−アミノ酸が異なる：アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、ノルロイシン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリンおよびチロシン（左から）。Ａｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＦＣによる切断の速度は、他のものよりもずっと速かった。システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸およびセリン置換改変体は、いくらかの切断活性を示した。ＤＰＰ−４は、図７のＡｃ−Ｐ２−Ｐｒｏ−ＡＦＣ化合物に対して活性を示さなかった。これらのデータは、ＤＰＰ−４が限られたエンドペプチダーゼ活性を有し、かつ、ＦＡＰエンドペプチダーゼ活性がＧｌｙ−Ｐｒｏ−含有基質に制限されることを示唆する。
【０１１８】
図８は、ブロック化（Ａｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＦＣ  ８）および非ブロック化（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＦＣ  ７）ジペプチド基質のキメラプロテアーゼ酵素（ＤＰＰ−４）ＢＰ−（ＦＡＰ）ｃａｔによる切断のグラフを示す。
【０１１９】
不可逆的ジペプチド阻害剤の存在下でのＦＡＰおよびＤＰＰ−４の切断活性を測定した（図９〜１２）。それぞれの経時的研究（図９〜１５）において、プロテアーゼ（ＦＡＰ、ＤＰＰ）および阻害剤化合物を共に４時間インキュベートし、次いで、残存する活性を基質に対してアッセイした。図９は、不可逆的阻害剤Ａｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｃｍｋの存在下における、１０、１００および５００μＭの異なる濃度のＡｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｃｍｋおよびネガティブコントロール（０μＭ）での基質Ｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＡＦＣの切断における組換え型ＦＡＰおよび組換え型ＤＰＰ−４の相対的活性のグラフを示す。ｃｍｋは、クロロメチルケトン−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｃｌである。一方、ＦＡＰの阻害剤濃度依存的な阻害はほぼ完全であり、ＤＰＰ−４はＡｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｃｍｋによって阻害されない。図１０は、不可逆的阻害剤Ａｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｃｍｋでのプレインキュベーション後の組換え型ＦＡＰ（左）および組換え型ＤＰＰ−４（右）の相対的活性による基質Ｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＡＦＣの切断の阻害の時間経過のグラフを示す。一方、ＦＡＰ活性は、阻害剤の存在下で時間依存的であり、ＤＰＰ−４は、Ａｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｃｍｋによって時間依存的に阻害されない。
【０１２０】
テトラペプチド不可逆的阻害剤の存在下でのＦＡＰおよびＤＰＰ−４の切断活性を測定した。図１１は、不可逆的阻害剤アセチル−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｃｍｋ（ＴＳＧＰ−ｃｍｋ）存在下における、１０、１００および５００μＭの異なる濃度のＡｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｃｍｋおよびネガティブコントロール（０μＭ）での基質Ｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＡＦＣの切断における組換え型ＦＡＰおよび組換え型ＤＰＰ−４の相対的活性のグラフを示す。一方、ＦＡＰの阻害剤濃度依存的な阻害はほぼ完全であり、ＤＰＰ−４はＴＳＧＰ−ｃｍｋによって実質的に阻害されない。図１２は、不可逆的阻害剤ＴＳＧＰ−ｃｍｋの存在下での組換え型ＦＡＰ（左）および組換え型ＤＰＰ−４（右）の相対的活性による基質Ｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＡＦＣの切断の阻害の時間経過のグラフを示す。一方、ＦＡＰ活性は、阻害剤の存在下で時間依存的であり、ＤＰＰ−４は、ＴＳＧＰ−ｃｍｋによって時間依存的に阻害されない。
【０１２１】
図１３は、異なる濃度の可逆的阻害剤シクロヘキシルグリシン−２−シアノ−プロリン（ＣＨＣＰ）およびネガティブコントロール（０μＭ）の存在下でのＦＡＰ（上部）およびＤＰＰ−４（下部）によるジペプチドクマリン基質ＡＰ−ＡＦＣの加水分解（切断）のグラフを示す。ＣＨＣＰは、ＤＰＰ−４により阻害剤濃度依存的な切断を示すが、ＦＡＰによっては阻害剤濃度依存的な切断を示さない。
【０１２２】
Ｎ−ブロック化ジペプチドプロリンボロナート化合物のＦＡＰ阻害活性
図１４は、異なる濃度のＦＡＰ阻害剤Ａｃ−Ｇｌｙ−ＢｏｒｏＰｒｏ５の存在下で蛍光（ＲＦＵ、相対的蛍光単位）の放出により測定される組換え型ＦＡＰ（上部）および組換え型ＤＰＰ−４（下部）による基質Ｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＡＦＣ（５μＭ）の切断の時間経過のグラフを示す。ＦＡＰは、マイクロモル以下の濃度のＡｃ−Ｇｌｙ−ＢｏｒｏＰｒｏで容易に反応して、図１４（上部）の進行曲線に示すように、急速に定常状態の阻害レベルに達する。対照的に、ＤＰＰ−４は、阻害のためのより高いＡｃ−Ｇｌｙ−ＢｏｒｏＰｒｏ濃度および定常状態阻害レベル（図１４下部）に達するためのより長い時間を必要とした。阻害剤の非存在下（Ｖ０）でおよび存在下（Ｖｉ）での産物生成の定常状態を、阻害剤濃度に対してＶ０／Ｖｉ−１をプロットすることにより見かけの阻害定数（Ｋｉａｐｐ）を計算するのに用いた。ＦＡＰについては、計算された阻害定数（Ｋｉ）は２３±３ｎＭであり、ＤＰＰ−４については３７７±１８ｎＭであったが（表９）、このことは、Ａｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏモチーフが、ＦＡＰ阻害に対して約１６倍の選択性を提供することを示す。
【０１２３】
ＦＡＰ、ＤＰＰ−４およびＰＯＰによる基質Ｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＡＦＣの切断のいくつかの他のＮ−末端ブロック化Ｇｌｙ−ＢｏｒｏＰｒｏ阻害剤のＫｉ値および選択性を、表８に示す：
【０１２４】
【表８】
2008545661.tif 000029
Ｎ−メシル化Ｇｌｙ−ＢｏｒｏＰｒｏ化合物は、ＦＡＰに対して活性であるが、Ａｃ−Ｇｌｙ−ＢｏｒｏＰｒｏ５よりも選択性が低い。Ｎ−ブロック化トリペプチドＡｃ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＢｏｒｏＰｒｏは、５のように活性でも選択的でもない。
【０１２５】
図１５は、５．０、１．０、０．５、０．１μＭおよびネガティブコントロール（０μＭ）の異なる濃度のＦＡＰ阻害剤Ａｃ−Ｇｌｙ−ＢｏｒｏＰｒｏ５の存在下での残存する相対的酵素活性を測定するために蛍光の放出により測定された、基質Ｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＡＦＣのジペプチジルペプチダーゼ、ＤＰＰ−７（左上）、ＤＰＰ−８（右上）、ＤＰＰ−９（左下）およびＡＰＨ（アセチルペプチド加水分解酵素）（右下）の切断におけるプロテアーゼ阻害容量反応のグラフを示す。これらのプロテアーゼの多くは、遍在性の分布を示す（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ，Ｊ．Ｓ．ａｎｄ  Ｋｏｚａｒｉｃｈ，Ｊ．Ｗ．（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７：４９６−５０４）。Ａｃ−Ｇｌｙ−ＢｏｒｏＰｒｏ５がこれらのプロリルペプチダーゼを阻害するかどうかを確立するために、各プロテアーゼをクローン化し、発現し、アッセイして、ＫｍおよびＫｉ値を決定し、かつそれらの活性をモニターした。際立って、Ａｃ−Ｇｌｙ−ＢｏｒｏＰｒｏ５は、これらのプロリルペプチダーゼを、ＦＡＰ阻害のＫｉ値範囲より約９〜約５４００倍高いＫｉ値範囲で阻害したが、このことは、Ａｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏモチーフが有意なＦＡＰ選択性を提供することを示す。阻害剤５は、これらのジペプチジルペプチダーゼに対する限られた活性のみを有するので、ＦＡＰの選択的阻害剤である（表９）。化合物５は、全長（膜貫通）マウスＦＡＰを、細胞可溶化物中、１１７ｎＭで阻害する。
【０１２６】
【表９】
2008545661.tif 000030
本明細書中に示されるデータは、ＦＡＰを、ジペプチダーゼおよびＧｌｙ−Ｐｒｏの両方の切断エンドペプチダーゼ活性を有するデュアル活性プロテアーゼであると定義する。この基質特異性は、単独でジペプチダーゼとして作用するＤＰＰ−４、−７、−８および−９（Ｍｅｎｔｌｅｉｎ，Ｒ．（１９９９）Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ８５：９−２４；Ａｕｇｕｓｔｙｎｓ，ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：９７１−９９８；Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ，ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７４（４８）：３４０５３−３４０５８；Ａｂｂｏｔｔ，ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：６１４０−６１５０；Ａｊａｍｉ，ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １６７９：１８−２８）ならびにエンドペプチダーゼ活性のみを発揮するＰＯＰ（Ｐｏｌｇａｒ，Ｌ．（２００２）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５９，３４９−３６２）などの、単一の活性プロテアーゼとして作用する他のプロリルペプチダーゼとＦＡＰとを区別する。さらに、ＦＡＰのデュアル活性は、ジペプチダーゼおよびエンドペプチダーゼ活性のいずれも欠くＡＰＨ（Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，２１９４−２１９８）およびＰＣＰ（Ｏｄｙａ，ｅｔ  ａｌ（１９７８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２５３（１７），５９２７−５９３１）とは異なる。ＡＰＨは、Ｎ−アセチルアミノ酸加水分解酵素として作用し、ＰＣＰは、Ｐｒｏ−Ｘカルボキシペプチダーゼとして作用する。従って、ＦＡＰの独特の基質特異性は、他のプロリルペプチダーゼとは異なり、かつ、選択的阻害剤の設計の可能性を提供する。
【０１２７】
ＦＡＰのＮ−アシル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ベースの基質との独特の反応性に基づき、本発明者らは、式ＩおよびＩＩのアミノ末端−ブロック化ペプチドプロリンボロナート化合物を開発した。式Ｉの実施態様であるＡｃ−Ｇｌｙ−ＢｏｒｏＰｒｏ５は、他のプロリルペプチダーゼに対して、ＦＡＰを選択的に阻害する。この選択性プロファイルおよびＡｃ−Ｇｌｙ−ＢｏｒｏＰｒｏ５におけるＮ−アシル結合により、これは、プロリルペプチダーゼを標的とした以下を含む他のボロン酸阻害剤：Ｖａｌ−ＢｏｒｏＰｒｏ化合物（Ｆｌｅｎｔｋｅ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１５５６−１５５９；Ｃｏｕｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：２０８７−２０９４；Ｓｎｏｗ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６（２４）：１０８６０−１０８６９；Ｓｈｒｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １５：４２５６−４２６０）；Ｎ−アルキル−Ｇｌｙ−ＢｏｒｏＰｒｏ化合物（Ｈｕ，ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １５：４２３９−４２４２）；ならびにＢｏｒｏ−ノルロイシン化合物（Ｓｈｒｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １５：４２５６−４２６０）とは区別される。Ｖａｌ−ＢｏｒｏＰｒｏおよびＮ−アルキル−Ｇｌｙ−ＢｏｒｏＰｒｏ阻害剤は、ほとんどのプロリルペプチダーゼを標的とするが、一方、Ｂｏｒｏ−ノルロイシン−ベースの阻害剤は、ＤＰＰ−７を選択的に標的とする。さらに、これらの阻害剤は、遊離のアミンをそれらのＮ末端に含むので、求電子性ホウ素との分子内反応が可能になり、結果として環化および阻害剤の不活性化が生じる。対照的に、アミノ末端ブロック化ペプチドプロリンボロナート化合物のＮ−ブロック化特徴部は、阻害剤のＮ末端をブロックするので、求核性がより低下し、従って、環化する可能性が低い。Ａｃ−ＧＩｙ−ＢｏｒｏＰｒｏは、ＤＰＰ−８およびＤＰＰ−９との乏しい反応性を示す。ＤＰＰ−８およびＤＰＰ−９の選択的阻害は、動物において重篤な毒性を引き起こす（Ｌａｎｋａｓ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５４：２９８８−２９９４）。
【０１２８】
本発明の化合物、式ＩおよびＩＩは、本明細書中に記載の方法により、およびＶｅｎａｌａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ７１：７８３−６９２に記載の方法により、プロリルペプチダーゼ（ＰＯＰ）阻害がアッセイされ得る。
【０１２９】
Ｎ−ブロック化ペプチドプロリンボロナート化合物の投与
本発明のＮ−ブロック化ジペプチドプロリンボロナート化合物、式ＩおよびＩＩは、治療すべき症状に適切な任意の経路により投与され得る。適切な経路には、経口、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、皮内、くも膜下腔内および硬膜外を含む）、経皮、経直腸、経鼻、局所（経頬および舌下を含む）、経腟、腹腔内、肺内および鼻腔内が挙げられる。局所的免疫阻害治療のための、化合物は、灌流または移植前に移植片を阻害剤と接触させることを含む疾患巣内投与により投与され得る。好ましい経路は、例えば、レシピエントの症状により異なり得ることが理解されるであろう。Ｎ−アシル化ジペプチドプロリンボロナート化合物が経口投与される場合、それは、薬学的に許容され得る担体または賦形剤と共に、ピル、カプセル、錠剤などとして処方され得る。Ｎ−アシル化ジペプチドプロリンボロナート化合物が非経口的に投与される場合、それは、以下に詳述するように、薬学的に許容され得る非経口的ビヒクルと共に、単位用量の注射可能な形態に処方され得る。
【０１３０】
Ｎ−アシル化ジペプチドプロリンボロナート化合物の医薬製剤
本発明の化合物は、ＦＡＰにより調節される疾患、症状および／または障害を治療するのに有用である。従って、本発明の実施態様は、医薬組成物、すなわち、治療有効量の本発明の化合物および薬学的に許容され得る賦形剤、希釈液または担体を含む製剤である。
【０１３１】
代表的な製剤は、本発明の化合物と、担体、希釈液または賦形剤とを混合することにより調製される。適切な担体、希釈液および賦形剤は、当業者に周知であり、炭水化物、ワックス、水溶性および／または膨張性重合体、親水性または疎水性物質、ゼラチン、油、溶媒、水などの物質が挙げられる。用いられる特定の担体、希釈液または賦形剤は、本発明の化合物が適用される手段および目的に依存するであろう。溶媒は、一般に、当業者が哺乳動物に投与するのに安全であると認識している溶媒（ＧＲＡＳ）に基づいて選択される。通常、安全な溶媒は、水などの無毒の水性溶媒、および水に可溶性または混和性である他の無毒の溶媒である。適切な水性溶媒には、水、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ３００）など、ならびにそれらの混合物が挙げられる。製剤はまた、薬物（すなわち、本発明の化合物またはその医薬組成物）を簡便に提供するかまたは医薬品（すなわち、医薬）の製造を補助するために、１つまたはそれ以上の緩衝化剤、安定化剤、界面活性剤、湿潤剤、潤滑剤、乳化剤、懸濁剤、保存料、抗酸化剤、不透明化剤、流動促進剤、加工助剤、着色料、甘味料、芳香剤、香味料および他の公知の添加剤を含み得る。
【０１３２】
製剤は、通常の溶解および混合手順を用いて調製され得る。例えば、原料薬物物質（すなわち、本発明の化合物または化合物の安定化形態（例えば、シクロデキストリン誘導体または他の公知の複合体化剤との複合体））を、上述した１つまたはそれ以上の賦形剤の存在下で、適切な溶媒中に溶解する。本発明の化合物は、代表的には、容易に制御可能な薬物の用量を提供し、かつ、患者の所定の投与計画へのコンプライアンスを可能にするための医薬剤形に処方される。
【０１３３】
適用のための医薬組成物（または処方物）は、薬物の投与に用いられる方法によって、種々の方法で包装され得る。一般に、販売用のキットまたは物品は、その中に医薬製剤を適切な剤形で入れた容器を有する。適切な容器は、当業者に周知であり、ボトル（プラスチックおよびガラス）、袋、アンプル、プラスチックバッグ、金属シリンダーなどの材料が挙げられる。容器はまた、パッケージの内容物への無分別な接近を防ぐための不正開封防止装置を含み得る。さらに、容器は、容器の内容物を記載したラベルを含む。ラベルはまた、適切な警告も含み得る。
【０１３４】
治療用の本発明のＮ−アシル化ジペプチドプロリンボロナート化合物の医薬品、処方物は、投与の種々の経路および型のために調製され得る。所望の純度を有するＮ−アシル化ジペプチドプロリンボロナート化合物を、必要に応じて、薬学的に許容され得る希釈液、担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．）と共に、凍結乾燥製剤、粉砕した粉末または水溶液の形態で混合する。製剤は、周囲温度にて、適切なｐＨおよび所望の純度で、生理学上許容され得る担体、すなわち、用いられる用量および濃度でレシピエントに無毒な担体と共に混合することにより行われ得る。製剤のｐＨは、主に、特定の用途および化合物の濃度に依存するが、約３〜約８の範囲内であり得る。酢酸塩緩衝液中ｐＨ５の製剤が、適切な実施態様である。
【０１３５】
本明細書中で用いるための阻害性化合物は、好ましくは無菌である。化合物は、通常、固形組成物として貯蔵されるが、凍結乾燥製剤または水溶液も許容され得る。
【０１３６】
本発明の医薬組成物は、良好な医療実務と一致した様式（すなわち、量、濃度、計画、過程、媒体および投与経路）で処方、投薬および投与されるであろう。この状況で考慮される因子には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床症状、障害の原因、薬剤の送達部位、投与の方法、投与の計画および医学の専門家に公知の他の因子が挙げられる。投与すべき化合物の「治療有効量」は、そのような考慮により支配されるであろうし、かつ、凝固因子が媒介する障害を予防、緩和または治療するのに必要な最小量である。このような量は、好ましくは、宿主に有毒である量に満たないか、または宿主を有意により出血しやすくする量に満たない。
【０１３７】
一般的な提案として、１回の投与当たり非経口的に投与される阻害剤の初期の薬学的有効量は、約０．０１−１００ｍｇ／ｋｇの範囲内、すなわち、一日当たり約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ患者体重であり、用いられる化合物の代表的な初期範囲は、０．３〜１５ｍｇ／ｋｇ／日である。
【０１３８】
許容され得る希釈液、担体、賦形剤および安定剤は、用いられる用量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、以下のものが挙げられる：リン酸、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンなどの抗酸化薬；保存料（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノールアルコール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロへキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖、二糖類および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ならびに／あるいはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤。活性な医薬品成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によるかまたは界面重合によって調製されたマイクロカプセルに封入され得、例えば、コロイド性薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン中のヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルがそれぞれ挙げられる。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【０１３９】
徐放性製剤が調製され得る。徐放性製剤の適切な例には、Ｎ−アシル化ジペプチドプロリンボロナート化合物を含む固形疎水性重合体の半透性マトリックスが挙げられ、当該マトリックスは、成形された物品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリル酸）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３７７３９１９号明細書）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）などの分解性乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸リュープロリドから構成される注射用微粒子）およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸などが挙げられる。
【０１４０】
インビボ投与に用いられる製剤は、無菌でなければならないが、これは無菌濾過膜を通して濾過することにより、容易に達成される。
【０１４１】
製剤には、本明細書中に詳述した投与経路に適切なものが挙げられる。製剤は、簡便には、単位投与形態で提供され得、薬学の分野で周知の方法のいずれかにより調製され得る。技術および製剤は、一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）に見出される。当該方法は、活性成分を、１つまたはそれ以上の補助成分を含む担体と合わせる工程を含む。通常、製剤は、活性成分を、液状担体または精密に分割した固形担体または両方と均一にかつ念入りに合わせ、次いで、必要に応じて製品を成形することにより、調製される。
【０１４２】
経口投与に適切なＮ−アシル化ジペプチドプロリンボロナート化合物の製剤は、それぞれ所定量のＮ−アシル化ジペプチドプロリンボロナート化合物を含むピル、カプセル、カシェまたは錠剤などの個別の単位として調製され得る。
【０１４３】
圧縮錠剤は、粉末または顆粒などの自由に流動する形態の活性成分を、必要に応じて、結合剤、潤滑剤、不活性希釈液、保存料、界面活性剤または分散剤と共に混合し、適切な機械中で圧縮することにより、調製され得る。成形錠剤は、適切な機械中で、不活性液体希釈剤で湿した粉末活性成分の混合物を成形することにより製造され得る。錠剤は、必要に応じて、被覆され得るかまたは分割線をつけられ得、かつ、必要に応じて、当該錠剤からの活性成分の遅延放出または制御放出を提供するように処方される。
【０１４４】
錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性または油性懸濁液、分散性粉末または顆粒、エマルジョン、ハードまたはソフトカプセル（例、ゼラチンカプセル）、シロップまたはエリキシル剤は、経口での使用のために調製され得る。経口での使用を意図したＮ−アシル化ペプチドプロリンボロナート化合物の製剤は、医薬組成物を製造するために当該分野で公知の任意の方法に従って調製され得、そのような組成物は、味の良い製剤を提供するために、１つまたはそれ以上の、甘味料、香味料、着色料および保存剤などの薬剤を含み得る。活性成分を、錠剤の製造に適した無毒の薬学的に許容され得る賦形剤との混合物中に含む錠剤は、許容され得る。賦形剤には、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウム、マンニトール、クロスポビドン、ポリソルベート８０、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、コロイド性二酸化ケイ素、微結晶性セルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、シメチコン、ポリエチレングリコール６０００、ショ糖、炭酸マグネシウム、チタン二酸化物、メチルパラベンおよびポリビニルアルコール。賦形剤はまた、トウモロコシデンプンまたはアルギン酸などの顆粒化剤および崩壊剤；デンプン、ゼラチンまたはアカシアなどの結合剤；およびステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクなどの潤滑剤を含み得る。錠剤は、コーティングされていなくてもよいし、胃腸管中での崩壊および吸着を遅延させるためのカプセル化を含む公知技術によりコーティングされることにより、より長期にわたって持続する作用を提供してもよい。例えば、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートなどの時間遅延物質が、単独でまたはワックスと共に用いられ得る。
【０１４５】
眼または他の外部組織、例えば口および皮膚などの感染症のために、製剤は、好ましくは、活性成分を例えば０．０７５〜２０％ｗ／ｗの量で含む局所用軟膏またはクリームとして塗布される。軟膏に製剤される場合、活性成分は、パラフィン性または水混和性軟膏基剤のいずれかと共に用いられ得る。あるいは、活性成分は、水中油型クリーム基材と共にクリームに処方され得る。
【０１４６】
所望であれば、クリーム基材の水相は、多価アルコール、すなわち、プロピレングリコール、ブタン１，３−ジオール、マンニトール、ソルビトール、グリセロールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ４００が挙げられる）などの２つまたはそれ以上のヒドロキシル基を含むアルコール、ならびにその混合物を含み得る。局所製剤は、望ましくは、活性成分の皮膚または他の患部への吸収または浸透を増強する化合物を含み得る。そのような皮膚浸透増強剤の例には、ジメチルスルホキシドおよび関連アナログが挙げられる。
【０１４７】
本発明のエマルジョンの油相は、公知の成分から、公知の様式で構成され得る。相は乳化剤（またはエマルジョンとして知られる）のみを含み得るが、望ましくは、少なくとも１つの乳化剤と、脂肪または油または脂肪および油の両方との混合物を含む。好ましくは、親水性乳化剤は、安定剤として作用する親油性乳化剤を共に含む。油および脂肪の両方を含むこともまた好ましい。また、乳化剤は、安定剤なしでまたは安定剤と共に、いわゆる乳化ワックスを構成し、ワックスは、油および脂肪と共に、クリーム製剤の油分散相を形成するいわゆる乳化軟膏基剤を構成する。本発明の製剤への使用に適した乳化剤およびエマルジョン安定剤には、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０、Ｓｐａｎ（登録商標）８０、セトステアリルアルコール、ベンジルアルコール、ミリスチルアルコール、グリセリルモノ−ステアレートおよびラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。
【０１４８】
本発明の水性懸濁液は、活性成分を、水性懸濁液の製造に適した賦形剤との混合物中に含む。このような賦形剤には、カルボキシメチルセルロース、クロスカルメロース、ポビドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントおよびアカシアゴムなどの懸濁化剤；天然に存在するホスファチド（例えば、レシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンステアレート）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導された部分エステルとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）が挙げられる。水性懸濁液はまた、１つまたはそれ以上のエチルまたはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ−安息香酸などの保存料、１つまたはそれ以上の着色料、１つまたはそれ以上の香味料および１つまたはそれ以上のスクロースまたはサッカリンなどの甘味料を含み得る。
【０１４９】
Ｎ−アシル化ジペプチドプロリンボロナート化合物の医薬組成物は、無菌の注射可能な水性または油性の懸濁液などの、無菌の注射可能な懸濁液の形態であり得る。この懸濁液は、上記された適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて処方され得る。無菌の注射可能な懸濁液はまた、非毒性の非経口的に許容され得る希釈剤または溶媒、例えば１，３−ブタンジオール中の無菌の注射可能な溶液または懸濁液であり得るか、または凍結乾燥粉末として調製される。用いられ得る許容され得るビヒクルまたは溶媒のなかでも、用いられ得るのは、水、リンゲル溶液および等張性塩化ナトリウム溶液などである。さらに、不揮発性油が、溶媒または懸濁媒体として通常用いられ得る。この目的のために、合成モノ−またはジグリセリドを含む任意の無味無臭の不揮発性油が用いられ得る。さらに、オレイン酸などの脂肪酸も、同様に注射液の調製物に用いられ得る。
【０１５０】
担体物質と併用されて単一の剤形を生じ得る活性成分の量は、治療される宿主および特定の投与様式によって異なるであろう。例えば、ヒトへの経口投与を意図した経時放出製剤は、約１〜１０００ｍｇの活性物質化合物を、全組成の約５〜約９５％で異なり得る（重量：重量）適切かつ簡便な量の担体物質と共に含み得る。医薬組成物は、調製されて、投与のために容易に測定可能な量を提供し得る。例えば、静脈点滴を意図した水溶液は、約３０ｍＬ／時間の速度で適切な体積の注入が起こり得るように、溶液１ミリリットル当たり約３〜５００μｇの活性成分を含み得る。
【０１５１】
非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および意図するレシピエントの血液との等張性を製剤に付与する溶質を含み得る、水性および非水性の滅菌注射溶液；ならびに懸濁剤および濃厚化剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。
【０１５２】
また、眼への局所投与に適した製剤には、活性成分が適切な担体、特に活性成分のための水性溶媒に溶解または懸濁した点眼剤が挙げられる。活性成分は、好ましくは、そのような製剤中に、０．５〜２０％ｗ／ｗ、有利には０．５〜１０％ｗ／ｗ、特に約１．５％ｗ／ｗの濃度で存在する。
【０１５３】
口腔内への局所投与に適した製剤には、活性成分をフレーバー基剤（通常、ショ糖およびアカシアまたはトラガカント）中に含むロゼンジ；活性成分を、ゼラチンおよびグリセリンまたはショ糖およびアカシアなどの不活性基剤中に含むトローチ；ならびに、活性成分を適切な液状担体中に含むマウスウォッシュが挙げられる。
【０１５４】
直腸投与用の製剤は、例えば、カカオバターまたはサリチル酸塩などの適切な基剤を有する坐薬として提供され得る。
【０１５５】
経肺または経鼻投与に適した製剤は、例えば、０．１〜５００ミクロンの範囲内にある粒径（０．５、１、３０ミクロン、３５ミクロンなどのような、増加するミクロンにおいて０．１ミクロンと５００ミクロンとの間の範囲内にある粒径が挙げられる）を有し、これは、肺胞嚢に達するように、鼻の経路からの急速な吸入または口からの吸入により投与される。適切な製剤には、活性成分の水性または油性溶液が挙げられる。エアロゾルまたは乾燥粉末の投与に適した製剤は、定法に従って調製され得、かつ、以下に記載する、ＨＩＶ感染症の治療または予防に従来用いられてきた化合物などの他の治療薬と共に送達され得る。
【０１５６】
経腟投与に適した製剤は、活性成分に加えて、適切であることが当該分野で公知であるような担体を含む、腟坐薬、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、気泡またはスプレー製剤として存在し得る。
【０１５７】
製剤は、単回用量または複数回用量容器、例えば、ピル、封着したアンプル、バイアルおよびブリスター包装などの単回用量または複数回用量容器中にパッケージングされ得る。製剤は、注射のために、使用の直前に、液状担体、例えば水を添加するだけでよい凍結乾燥状態で保存され得る。即時注射溶液および懸濁液は、上記した種類の無菌粉末、顆粒および錠剤から調製される。好ましい単回用量製剤は、本明細書中で上記したまたは適切な割合の、１日量または単位１日準用量の活性成分を含むものである。
【０１５８】
本発明は、さらに、上記で定義した少なくとも１つの活性成分を、その獣医学上の担体と共に含む獣医学的組成物も提供する。獣医学上の担体は、組成物を投与する目的のために有用な物質であり、固体、液体またはガス状物質であり得るか、あるいは不活性であるか、あるいは獣医学の分野で許容され得、かつ活性成分と適合性である固体、液体またはガス状物質であり得る。これらの獣医学組成物は、非経口的に、経口的にまたは任意の他の所望の経路により投与され得る。
【０１５９】
併用療法
本発明のＮ−ブロック化ジペプチドプロリンボロナート化合物は、組み合わせ医薬製剤または併用療法としての投与計画において、抗過増殖性を有するかまたは過増殖障害（例えば癌）の治療に有用な第２の化合物と併用され得る。組み合わせ医薬製剤または投与計画の第２の化合物は、好ましくは、組み合わせのＮ−アシル化ジペプチドプロリンボロナート化合物に対する相補的活性を有するので、互いに不利に影響しない。このような分子は、意図する目的に有効な量で、組み合わせで適切に存在する。
【０１６０】
併用療法は、同時または経時的療法として投与され得る。順に投与される場合、組み合わせは、２回またはそれ以上の投与で投与され得る。併用投与は、別々の処方物または単一の医薬品の処方物およびいずれかの順番の連続した投与を用いる同時投与を含み、好ましくは、両方のまたは全ての活性薬剤がそれらの生物活性を同時に発揮する期間がある。
【０１６１】
上記の同時投与される剤のいずれかについての適切な用量は、現在使用されているものであり、かつ、新しく同定される薬剤および他の化学療法剤または治療の併用作用（相乗作用）により低減され得る。
【０１６２】
併用療法は、「相乗作用」を提供し得、かつ、「相乗効果」、すなわち活性成分が共に使用された場合に達成される効果が、化合物を別々に用いた場合に得られる効果の和よりも大きいことを立証し得る。相乗効果は、活性成分が：（１）同時に処方され、かつ、組み合わせた単回用量製剤で同時に投与または送達される場合に；（２）別々の製剤として、交互にまたは並行して送達される場合に；または（３）いくつかの他の投与計画により、達成され得る。交互療法で送達される場合、相乗効果は、例えば、別々のシリンジでの異なる注射により、経時的に投与または送達される場合に達成され得る。通常、交互療法の間は、有効用量の各活性成分が、経時的に、すなわち連続的に投与され、一方、併用療法では、有効用量の２つまたはそれ以上の活性成分が共に投与される。
【０１６３】
Ｎ−アシル化ジペプチドプロリンボロナート化合物の代謝物
本明細書中に記載のＮ−アシル化ジペプチドプロリンボロナート化合物のインビボ代謝産物もまた、そのような産物が先行技術に対して新規かつ非自明である限り、本発明の範囲内にある。このような産物は、例えば、投与された化合物の酸化、還元、加水分解、アミド化、脱アミド化、エステル化、脱エステル化、酵素的切断などから生じ得る。従って、本発明は、本発明の化合物を、その代謝産物を得るのに十分な時間にわたって哺乳動物と接触させることを含むプロセスにより産生する新規かつ非自明の化合物を含む。
【０１６４】
代謝産物は、代表的には、本発明の化合物の放射標識された（例えば１４Ｃまたは３Ｈ）同位体を調製し、これを検出可能な用量（例えば、約０．５ｍｇ／ｋｇ超）で、ラット、マウス、モルモット、サルなどの動物またはヒトに非経口的に投与し、代謝が起こるのに十分な時間（代表的には、約３０秒〜３０時間）を与え、かつ、その転換産物を、尿、血液または他の生物学的試料から単離することにより、同定される。これらの産物は、容易に単離されるが、なぜなら、それらは標識化されているからである（他のものは、代謝産物中で生存するエピトープを結合し得る抗体の使用により単離される）。代謝産物の構造は、例えば、ＭＳ、ＬＣ／ＭＳまたはＮＭＲ分析などの通常の様式で決定される。通常、代謝産物の分析は、当業者に周知の通常の薬物代謝と同様の方法で行われる。転換産物は、インビボで別の方法で見出されない限り、本発明のＮ−アシル化ジペプチドプロリンボロナート化合物の治療的投与のための診断的アッセイに有用である。
【０１６５】
製品
本発明の他の実施態様では、上記障害の治療に有用な物質を含む製品または「キット」が提供される。製品は、容器、および当該容器上にまたは当該容器に添付されたラベルまたは添付文書を含む。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ブリスター包装などが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から成型され得る。容器は、症状を治療するのに有効なＮ−アシル化ジペプチドプロリンボロナート化合物またはその製剤を有し、かつ、無菌のアクセスポート（例えば、容器は、皮下注射針で貫通可能な栓を有する静脈注射用溶液バッグまたはバイアルであり得る）を有し得る。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本発明のＮ−アシル化ジペプチドプロリンボロナート化合物である。標識または添付文書は、組成物が、癌などの選択された症状を治療するのに用いられることを示す。１つの実施態様では、標識または添付文書は、使用のための指示を含み、かつ、Ｎ−アシル化ジペプチドプロリンボロナート化合物を含む組成物が、過増殖障害を処置するのに用いられ得ることを示す。
【０１６６】
製品は、次のものを含み得る：（ａ）式ＩまたはＩＩのＮ−アシル化ジペプチドプロリンボロナート化合物をその中に含む第１の容器；および（ｂ）第２の医薬製剤をその中に含む第２の容器（ここで、第２の医薬製剤は、抗過増殖活性を有する第２の化合物を含む）。本発明のこの実施態様の製品は、さらに、第１および第２の化合物が、癌などの過増殖障害を有する患者を治療するのに用いられ得ることを示す。あるいは、またはそれに加えて、製品は、さらに、注射（ＢＷＦＩ）用の静菌水、リン酸緩衝食塩水、リンゲル溶液およびブドウ糖溶液などの薬剤的に許容され得る緩衝液を含む第２の（または第３の）容器を含み得る。さらに、それは、他の緩衝液、希釈液、フィルタ、針およびシリンジなどの、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の物質を含み得る。
【実施例】
【０１６７】
実施例
物質−  Ａｌａ−Ｐｒｏ−７−アミノ−トリフルオロメチルクマリン（ＡＦＣ）、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−ＡＦＣ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＦＣ、Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−ＡＦＣ、アセチル（Ａｃ）Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＦＣおよびＬｙｓ−Ａｌａ−ＡＦＣは、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ  ＣＡから得た。ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）、Ｇｌｙ−Ａｌａ−ＡＭＣ、Ａｃ−Ａｌａ−ＡＭＣおよびアミノ酸誘導体は、Ｂａｃｈｅｍ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｒａｎｃｅ  ＣＡから得た。Ｐ２を全てのアミノ酸（システインおよびトリプトファンを除く）に変えたＡｃ−Ｐ２−Ｐｒｏ１−ＡＦＣ基質ライブラリを、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｐｒｏｄｕｃｔによりカスタム合成した。Ｎ−置換Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−７−アミノ−４−メチル−３−カルバモイルクマリン（ＡＭＣＣ）基質およびＰ２−Ｐｒｏ１−ＡＭＣＣ基質ライブラリは、７−アミノ−４−メチル−３−クマリニル酢酸（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．からＡＭＣＡ−Ｈ，０８４４５［１０６５６２−３２−７］；ＭＷ＝２３３．２２として入手可能）を標識化フルオロフォア試薬として用いたこと以外は、実質的にＭａｌｙ，ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：９１０−９１５に記載の通りに調製した。アミノ酸のカップリングおよび樹脂からの切断のために、アセトアミド部分がＰ２−Ｐｒｏ１−ＡＭＣＣ基質のカルボキシル末端で生成するように、７−アミノ−４−メチル−３−クマリニル酢酸をアミン生成ペプチド合成樹脂上に結合させた。Ｎ−アセチル化基質は、樹脂がＫａｉｓｅｒニンヒドリンテスト（Ｓａｒｉｎ，ｅｔ  ａｌ（１９８１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７（１）：１４７−１５７）に陰性となるまで、１０％トリエチルアミン／ジクロロメタン中の無水酢酸を用いてペプチド類を樹脂上で処理することにより、調製した。ホルミル化された基質を、Ｆｉｅｌｄｓ，ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（５）：１３８４−１３８８に記載されるように調製した。Ａｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ボロン酸（ＢｏｒｏＰｒｏ）は、ＶａｌをＡｃ−Ｇｌｙで置き換えて脱保護を不要にしたこと以外は、Ｇｉｂｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．６（６）：８１４−８１６に記載のように合成した。基質および阻害剤を、逆相クロマトグラフィーにより精製し、マトリックス補助レーザー脱離イオン化質量分析法により検証した。Ｎ−グリカナーゼは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから得た。
【０１６８】
実施例１  ＦＡＰ発現および精製
プロテアーゼクローニングおよび発現−  ＤＰＰ−４（アミノ酸３９−７６６）およびＦＡＰ（アミノ酸３８−７６０）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードするｃＤＮＡを、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡライブラリ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により、順方向および逆方向プライマーを有するテンプレートとして産生した：  
【０１６９】
【化３５】
2008545661.tif 000031
【０１７０】
【化３６】
2008545661.tif 000032
ＰＣＲ産物を、ｐＧｅｍＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にＴＡ−クローン化し、かつ、ＤＮＡ配列により確認した。次いで、確認されたｃＤＮＡを、Ｎ末端ＦＬＡＧ−タグ化タンパク質として発現させるため、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）にサブクローン化した。全長ＤＰＰ−７、ＤＰＰ−８、ＤＰＰ−９、ＰＯＰおよびＡＰＨを含むプラスミドをＯｒｉｇｅｎｅから得、かつ、上記各プロテアーゼをコードするｐＦＬＡＧ−ＣＭＶｌ発現構築物を産生するための鋳型として用いた。これらの構築物は、ＤＰＰ−７のアミノ酸２６−４９２、ＤＰＰ−８のアミノ酸２−８８３、ＤＰＰ−９のアミノ酸２−８６４、ＰＯＰのアミノ酸２−７１０およびＡＰＨのアミノ酸２−７３２をコードする。
【０１７１】
タンパク質産生のために、２９３細胞を、リン酸カルシウム、およびＭ２抗ＦＬＡＧ樹脂（Ｓｉｇｍａ）またはＮＴＡニッケル樹脂（Ｑｉａｇｅｎ  Ｃｏ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ  ＣＡ）を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより無血清条件培地から精製したタンパク質を用いて、ＦＡＰ−ＥＣＤまたはＤＰＰ−４−ＥＣＤをコード化するプラスミドに形質移入した。クーマシーブルー染色を用いるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により決定されるように、タンパク質純度は９５％を超えたが、例外的に、ＤＰＰ８は、約７０％の純度を有した。タンパク質濃度を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）法（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）により決定した。代表的な収量は、ＦＡＰについて１ｍｇ／リットル、ＤＰＰ−４について２．５ｍｇ／ｌであった。
【０１７２】
ＨＴ１０８０線維肉腫細胞またはヒト胚性腎臓２９３細胞などのＦＡＰ発現細胞株は、例えば、米国特許出願公開第２００３／００５５０５２号明細書の実施例９および１０またはＰａｒｋ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３６５０５−３６５１２に従った形質移入、およびＦＡＰ特異的ｍＡｂＦ１９（Ｇａｒｉｎ−Ｃｈｅｓａ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７（１８）：７２３５−７２３９）を用いる免疫蛍光法アッセイでのＦＡＰ発現のアッセイにより調製され得る。可溶性組換え型ＦＡＰは、米国特許出願公開第２００３／００５５０５２号明細書の実施例１１により調製され得る。ＦＡＰはまた、組換え型バキュロウイルス発現系を用いるヘキサヒスチジンタグ化タンパク質として昆虫細胞中で産生され得る。ＦＡＰの２つのアイソフォームであるグリコシル化および非グリコシル化ＦＡＰは、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いるＷｅｓｔｅｒｎブロット法およびレクチンクロマトグラフィによる分離により同定された。グリコシル化ＦＡＰは、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ２４（２）：２７４−２８１）を用いてほぼ均一に精製された。ＦＡＰおよび他のプロテアーゼは、Ｎ末端ＦＬＡＧタグを用いて発現され、かつ、抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２アフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）上で精製された。
ゲル濾過クロマトグラフィーおよび光散乱分析
精製されたプロテアーゼ調製物の化学量論を計算するために、各プロテアーゼの分子量を、多角度光散乱をゲル濾過クロマトグラフィーおよび干渉型屈折計と組み合わせて用いることにより測定した。この方法は、タンパク質濃度、屈折率および光散乱度に基づくタンパク質の分子量の正確な決定を可能にする。トリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ；５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中のプロテアーゼ（５０μｇ）を、ＤＡＷＮ  ＥＯＳ  １８−角光散乱検出器（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ  ＣＡ）およびＯＰＴＩＬＡＢ  ＤＳＰ干渉型屈折計（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＦＰＬＣに接続したＳｈｏｄｅｘ  ＫＷ−８０３ゲル濾過カラム（流速０．５ｍｌ／分）に充填した。ＡＳＴＲＡソフトウェアを分子量計算に用いた。
【０１７３】
実施例２  ＦＡＰ活性のインビトロアッセイ
プロテアーゼアッセイ−  プロテアーゼ活性を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ２マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ）を動力学的モードで用いて、連続的にモニタリングした。アッセイを、５０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中、２３℃で行った。異なる蛍光発生基質についての励起／放出波長は、３６０／４６０ｎｍ（ＡＭＣ）、４００／５０５ｎｍ（ＡＦＣ）、３４０／４２５ｎｍ（ＭＮＡ）、３４０／５１０ｎｍ（ＥＤＡＮＳ）および３３７／４２５ｎｍ（Ａｂｓ）であった。適切な蛍光産物の濃度に対する検量線を用いて、相対蛍光単位を、産生した産物のｎｍｏｌに変換した。Ｘ−Ｐｒｏ−ＡＭＣライブラリ中の基質を、５μＭ最終濃度での速度アッセイで用いた。一般に、動力学的定数（ｋｃａｔ、Ｋｍ）は、０．１〜５の範囲のＫｍ値および１０〜３５ｎＭのプロテアーゼ濃度を用いて、初速度（Ｖ０）の測定により決定した。動力学的パラメータを、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを用いて非線形回帰分析によりＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎプロット（Ｖ０対［Ｓ］）から計算し、ｋｃａｔ値を、各プロテアーゼが１００％活性であるとの仮定の下で計算した。
【０１７４】
基質の飽和量が達成できなかった場合、触媒効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）を、偽一次条件下（［Ｓ］＜＜「概算の」Ｋｍ）下で決定し、次いで、式：Ｌｎ［Ｓｔ／Ｓ０］＝−ｋｏｂｓｔ（式中、Ｓｔは時間ｔにおける基質の濃度であり、Ｓ０は初期基質濃度であり、かつ、ｋｏｂｓは、総酵素濃度（ｋｃａｔ／Ｋｍ）×ＥＴに等しい見かけ上の一次基質切断定数である）にフィットさせた（Ｃｏｐｅｌａｎｄ，Ｒ．（２０００）Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ａｎｄ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。Ｌｎ［Ｓｔ／Ｓ０］対時間の直線関係により、プロットの勾配をＥＴで除算することによるｋｃａｔ／Ｋｍの計算が可能になる。
【０１７５】
阻害動態学−  Ａｃ−Ｇｌｙ−ＢｏｒｏＰｒｏによるプロテアーゼの阻害についてのＫｉ値を、強い結合に競合的な阻害剤の解析のための進行曲線の方法を用いて決定した（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．（１９７２）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１２７：３２１−３３３）。簡便には、阻害剤および基質（ＡＰＨについてＡｃ−Ａｌａ−ＡＭＣ、ＰＯＰについてＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣ、およびその他全てについてＡｌａ−Ｐｒｏ−ＡＦＣ）をアッセイ緩衝液中に含む反応混合物に、プロテアーゼを２３℃で添加する。次いで、プロテアーゼ活性は、上記したように、モニター時間依存的阻害に連続的に従った。データを、Ｖ０／Ｖｉ−１対［Ｉ］としてプロットした（式中、Ｖ０は、基質が阻害剤の非存在下で加水分解する場合の速度であり、Ｖｉは、阻害剤の存在下で加水分解する場合の定常速度であり、かつ、［Ｉ］は、Ａｃ−Ｇｌｙ−ＢｏｒｏＰｒｏの濃度である）。Ｖ０／Ｖｉ−１対ＩＩのプロットは直線的であり、見かけ上の阻害定数Ｋａｐｐは、勾配の相関から決定した。Ｋｉ（真の平衡阻害定数）を、以下の関係に従って決定した：  Ｋｉ＝Ｋａｐｐ／（１＋［Ｓ］／Ｋｍ）（式中、［Ｓ］は、アッセイに用いた基質の濃度であり、Ｋｍは、基質切断についてのＭｉｃｈａｅｌｉｓ定数である）（Ｅｄｏｓａｄａ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｊｏｕｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（１１）：７４３７−７４４４、第７４３８頁）。
【０１７６】
Ａｃ−ＧＰ−ｃｍｋおよびＡｃ−ＴＳＧＰ−ｃｍｋを用いる阻害アッセイ
アセチル−ｇｌｙ−ｐｒｏ−クロロメチルケトンおよびアセチル−ｔｈｒｅ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｐｒｏ−ｃｍｋを、Ａｎａｓｐｅｃ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）でカスタム合成した。組換え型ＦＡＰ（１６０ｎＭ）およびＤＰＰ−４（１６０ｎＭ）を、３７℃で、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５、アッセイ緩衝液）中で、Ａｃ−ＧＰ−ｃｍｋまたはＴＳＧＰ−ｃｍｋ（０〜５００μＭ）と反応させた。６時間後、ＡＰ−ＡＦＣ（５０μＭ）に対する残存プロテアーゼ活性を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｍ２プレートリーダーを用い、動力学モード（励起４００ｎＭ、放出５０５ｎＭ）で測定した。阻害データを、阻害剤の非存在下で、プロテアーゼ活性に対する残存活性としてグラフ化した。
【０１７７】
ＦＡＰおよびＤＰＰ−４のｃｍｋベース阻害剤による阻害を、偽一次条件下で検討した。時間の量を増加させるため、プロテアーゼ（１００ｎＭ）を、アッセイ緩衝液中の１０μＭの阻害剤と３７℃で反応させた。次いで、残存するプロテアーゼ活性を、ＡＰ−ＡＦＣ（５０μＭ）を基質として用いて測定した。偽一次速度定数を、Ｌｎ（残存プロテアーゼ活性）の時間に対するプロットの勾配から計算した。阻害の見かけ上の会合定数（ｋａｓｓ）を、関係ｋａｓｓ＝ｋｏｂｓ／［Ｉ］（式中、ｋｏｂｓは偽一次速度定数であり、［Ｉ］は阻害剤濃度である）から決定した。
【０１７８】
実施例３  細胞表面ＦＡＰの阻害
骨髄ＨＳ５間質細胞は、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞ソーティング）により決定されるように、細胞表面ＦＡＰおよびＤＰＰ−４を発現する。これらの細胞を、ＤＭＳＯビヒクルまたはＡｃ−ＧＰ−ｃｍｋ（１００μＭ）を用いて、全３回の用量について１日２回処理した。次いで、細胞を、１ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌおよび１％  ｖ／ｖ  ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む）中に溶解し、細胞残屑を、遠心分離（１０，０００ｇで１０分間）によりペレット化した。可溶化液上清（３５０μｇ）を２μｇの抗ＦＡＰ（自社で産生した）または抗ＤＰＰ−４（クローンＭ−Ａ２６１；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、４℃で一晩インキュベートした。次いで、免疫複合体を、５０μｌのプロテインＡ／Ｇビーズ（Ｐｉｅｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ）を用いて回収した。洗浄後、ＡＰ−ＡＦＣ（２５０μＭ）に対するプロテアーゼ活性を測定した。
【０１７９】
実施例４  Ａｃ−ＧｌｙＢｏｒｏＰｒｏ５によるプロテアーゼ阻害
５によるプロテアーゼの阻害のＫＩ値を、進行曲線の方法を用いて決定した。簡便には、プロテアーゼ（１０〜１００ｎＭ）を、阻害剤５（０〜１０μＭ）および基質ＡＰ−ＡＦＣをアッセイ緩衝液中に含む反応混合物に２３℃で添加した。プロテアーゼ活性を、引き続いて、経時的なＡＦＣ（励起４００ｎｍ／放出５０５ｎｍ）の遊離により、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｍ２プレートリーダーを用いてモニタリングした。データを、Ｖ０／Ｖｉ−１対［Ｉ］としてプロットした（式中、Ｖ０は、基質が阻害剤の非存在下で加水分解する場合の速度であり、Ｖｉは、基質が阻害剤の存在下で加水分解する場合の定常速度であり、［Ｉ］は５の濃度である）。Ｖ０／Ｖｉ−１対［Ｉ］のプロットは直線的であり、観察された阻害定数Ｋｏｂｓは、勾配の逆数から決定された。真の平衡阻害定数であるＫｉは、以下の関係：Ｋｉ＝Ｋｏｂｓ／（１＋［Ｓ］／Ｋｍ）に従って決定した（式中、［Ｓ］はアッセイで用いられた基質の濃度であり、Ｋｍは基質切断のＭｉｃｈａｅｌｉｓ定数である）。
【０１８０】
全長プロテアーゼをコード化するプラスミドは、Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  ＭＤから得た。プロテアーゼＤＰＰ−７、ＤＰＰ−８、ＤＰＰ−９、ＰＯＰ、ＰＣＰおよびＡＰＨを、ＰＣＲ法により増幅し、可溶性分子として発現させるため、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶｌにサブクローン化させた。適切なプロテアーゼ構築物を含むＰＦＬＡＧ−ＣＭＶｌプラスミドを、リン酸カルシウム法により、２９３細胞に形質移入した。形質移入の７２時間後、プロテアーゼを、Ｍ２抗ＦＬＡＧ樹脂（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）を用いて、培養上清から精製した。さらなる洗浄後、プロテアーゼを、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．５）を用いて樹脂上から溶出除去し、すぐに１Ｍトリス（ｐＨ８．０）で中和した。濃縮および適切なアッセイ緩衝液への透析後、プロテアーゼを、インビトロ動力学的解析に用いた。
【０１８１】
実施例５  ＦＲＥＴ標識ペプチド類の合成
ＮＨＳエステル体中の色素をペプチド類に複合体化するための一般的なプロトコルは、水性アセトニトリル中のＮＨＳエステル（アセトニトリルの百分率は、溶解度を達成するための色素の疎水性により決定される）を、水中のペプチド類（または、ペプチド類が疎水性である場合、アセトニトリル水溶液）に溶解することを必要とする。攪拌または振盪しながら、水性重炭酸ナトリウム緩衝液（１Ｍ）を溶液に加えることにより、０．１Ｍの緩衝液濃度を達成する。混合物を、室温で１０分〜３０分振盪する。反応混合物中の粗製ペプチド色素複合体は、逆相ＨＰＬＣにより直接的に精製することができる。
【０１８２】
実施例６  Ｎ−アセチル−Ｇｌｖ−ボロプロリン５の合成
Ｎ−アセチル−ｇｌｙ−ボロプロリン５は、図１の合成経路に従って調製された。ｔｅｒｔ−ブチル  １−ピロリジンカルボキシラート（Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−ピロリジン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）をＴＨＦ中でｓｅｃ−ブチルリチウムでメタル化し、次いで、トリメチルボラートを添加し、水性ＮａＯＨでの反応停止および抽出後、１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロリジン−２−イル−２−ボロン酸１を得た。メチル，ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）中での（１Ｓ，２Ｓ，３Ｒ，５Ｓ）、（＋）−ピナンジオールを用いたホウ酸エステル化により、ホウ酸エステル２を得た。ＢＯＣ保護基の酸加水分解およびイソプロピルアルコール中での選択的結晶化により、（＋）−ピナン  １−ピロリジン−２−イル−２−ボロナート３を得た。３およびＮ−アセチルグリシンのＥＤＣ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）、ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）およびＤｉＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）とのカップリングにより、Ｎ−アセチル−ｇｌｙ−ボロプロリン４のピナンボラートを得た。４をＭＴＢＥおよび水中でのフェニルボロン酸でホウ酸塩交換することにより、Ｎ−アセチル−ｇｌｙ−ボロプロリン５を得た。
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】図１は、ｔｅｒｔ−ブチル  １−ピロリジンカルボキシラートからのＮ−アセチル−ｇｌｙ−ボロプロリン５の例示的な合成経路である。
【図２】図２は、ＦＲＥＴ標識ＦＡＰ基質ペプチドであるＲＫ（ダブシル）ＴＳＧＰＮＱＥＱＥ（エダンス）Ｒの、ＦＡＰおよびＤＰＰ−４による相対的加水分解速度のグラフを示す。
【図３】図３は、ＦＲＥＴペプチド基質であるＲＫ（ダブシル）ＴＳ−Ｐ２−ＰＮＱＥＱＥ（エダンス）ＲのＦＡＰによるエンドペプチダーゼ切断についての相対的加水分解速度のグラフを示す（ここで、Ｐ２部位は、プロリンのＮ末端側にあり、Ｌ−アミノ酸が異なる：アラニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、リジン、ロイシン、アルギニン、セリン、バリンおよびチロシン（左から））。
【図４ａ】図４ａは、ＦＲＥＴペプチド基質であるＲＫ（ダブシル）Ｔ−Ｐ３−ＧＰＮＱＥＱＥ（エダンス）ＲのＦＡＰによる相対的加水分解速度のグラフを示す（ここで、Ｐ３部位は、グリシン−プロリンのＮ末端側にあり、Ｌ−アミノ酸が異なる：アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファンおよびチロシン（左から））。
【図４ｂ】図４ｂは、ＦＲＥＴペプチド基質であるＲＫ（ダブシル）−Ｐ４−ＳＧＰＮＱＥＱＥ（エダンス）ＲのＦＡＰによる相対的加水分解速度のグラフを示す（ここで、Ｐ４部位は、セリン−プロリンのＮ末端側にあり、Ｌ−アミノ酸が異なる：アラニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、リジン、ロイシン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリンおよびチロシン（左から））。
【図４ｃ】図４ｃは、ＦＲＥＴペプチド基質であるＲＫ（ダブシル）ＴＳＧＰ−Ｐ１’−ＱＥＱＥ（エダンス）ＲのＦＡＰによる相対的加水分解速度のグラフを示す（ここで、Ｐ１’部位は、グリシン−プロリンのＣ末端側にあり、Ｌ−アミノ酸が異なる：アラニン、アスパラギン酸、ヒスチジン、リジン、ロイシン、アスパラギン、アルギニン、セリン、バリンおよびチロシン（左から））。
【図４ｄ】図４ｄは、ＦＲＥＴペプチド基質であるＲＫ（ダブシル）ＴＳＧＰＮ−Ｐ２’−ＥＱＥ（エダンス）ＲのＦＡＰによる相対的加水分解速度のグラフを示す（ここで、Ｐ２’部位は、グリシン−プロリンのＣ末端側にあり、Ｌ−アミノ酸が異なる：アラニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、リジン、ロイシン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリンおよびチロシン（左から））。
【図５】図５は、モデルクマリン標識ジペプチド基質であるＰ２−Ｐｒｏ−ＡＭＣＣのＦＡＰによる３７ｎＭ（最大）でのＦＡＰおよび６．８ｎＭ（最小）でのＤＰＰ−４による相対的加水分解速度のグラフを示す（ここで、アミノ末端Ｐ２は、Ｌ−アミノ酸が異なる：アラニン、アスパラギン酸，グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファンおよびチロシン（左から１文字表記で示す））。ＡＭＣＣは、２−（７−アミノ−４−メチル−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−イル）アセトアミドである。
【図６】図６は、３７ｎＭでのＦＡＰによる、１０．５ｎＭのブロック（Ａｃ−Ｇｌｙ−プロリン−ＡＦＣ）でのＤＰＰ−４による、ならびに基質の多様な濃度での非ブロック化（グリシン−プロリン−ＡＦＣ）ジペプチド基質による、ナノモル／秒の切断割合速度Ｖｏを示すグラフである。ＡＦＣは２−（７−アミノ−４−（トリフルオロメチル）−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−イル）アセトアミド（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、クマリン１５１、７−アミド−４−トリフルオロメチルクマリン）である。各値は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。
【図７】図７は、モデルクマリン標識ジペプチド基質であるＡｃ−Ｐ２−プロリン−ＡＦＣのＦＡＰによる相対的加水分解速度のグラフを示す。アミノ末端Ｐ２は、Ｌ−アミノ酸が異なる：アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、ノルロイシン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリンおよびチロシン（左から）。
【図８】図８は、キメラプロテアーゼ酵素である（ＤＰＰ−４）ＢＰ−（ＦＡＰ）ｃａｔによる、ブロック（Ａｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＦＣ）および非ブロック化（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＦＣ）ジペプチド基質の切断のグラフを示す。
【図９】図９は、１０、１００および５００μＭならびにネガティブコントロール（０μＭ）の異なる濃度のＡｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｃｍｋでの不可逆的阻害剤Ａｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｃｍｋの存在下での基質Ｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＡＦＣの切断における組換え型ＦＡＰおよび組換え型ＤＰＰ−４の相対的活性のグラフを示す。ｃｍｋはクロロメチルケトン、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｃ１である。
【図１０】図１０は、不可逆的阻害剤Ａｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｃｍｋの存在下での、組換え型ＦＡＰ（左）および組換え型ＤＰＰ−４（右）による基質Ｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＡＦＣの切断における時間経過のグラフを示す。
【図１１】図１１は、１０、１００および５００μＭならびにネガティブコントロール（０μＭ）の異なる濃度のＡｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｃｍｋでの不可逆的阻害剤Ａｃｅｔｙｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｃｍｋ（ＴＳＧＰ−ｃｍｋ）の存在下での基質Ｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＡＦＣの切断における組換え型ＦＡＰおよび組換え型ＤＰＰ−４の相対的活性のグラフを示す。
【図１２】図１２は、不可逆的阻害剤ＴＳＧＰ−ｃｍｋの存在下での組換え型ＦＡＰ（左）および組換え型ＤＰＰ−４（右）の相対的活性による基質Ｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＡＦＣの切断の時間経過のグラフを示す。
【図１３】図１３は、異なる濃度の阻害剤、シクロヘキシルグリシン−２−シアノ−プロリン（ＣＨＣＰ）およびネガティブコントロール（０μＭ）の存在下でのＦＡＰ（上部）およびＤＰＰ−４（下部）によるジペプチドクマリン基質ＡＰ−ＡＦＣの加水分解（切断）のグラフを示す。
【図１４】図１４は、異なる濃度のＦＡＰ阻害剤Ａｃ−Ｇｌｙ−ＢｏｒｏＰｒｏ５の存在下で蛍光（ＲＦＵ、相対蛍光単位）の遊離により測定される、組換え型ＦＡＰ（上部）および組換え型ＤＰＰ−４（下部）による基質Ｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＡＦＣ（５μＭ）の切断の時間経過のグラフを示す。
【図１５】図１５は、異なる濃度（５．０、１．０、０．５、０．１μＭ）およびネガティブコントロール（０μＭ）のＦＡＰ阻害剤Ａｃ−Ｇｌｙ−ＢｏｒｏＰｒｏの存在下で蛍光の遊離を測定することにより、相対的酵素活性を測定した、ジペプチジルペプチダーゼ、ＤＰＰ−７（左上）、ＤＰＰ−８（右上）、ＤＰＰ−９（左下）およびＡＰＨ（アセチルペプチドヒドロラーゼ）（右下）による基質Ｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＡＦＣの切断の時間経過のグラフを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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