(57)【要約】  本発明は、悪性腫瘍および乳癌の予測、診断、予後、予防、および治療のための新規な組成物、方法、および使用を提供する。本発明はさらに、正常な「健康」組織に対して、乳癌患者の乳房組織で差次的に発現される遺伝子に関する。化学療法に反応する可能性の高い患者を同定するための、差次的に発現されている遺伝子も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗癌化学療法に対する反応を検査する方法であって、
（ｉ）化学療法スケジュールの開始後に腫瘍性病変から採取された生検試料中における、配列番号１から配列番号６５によってコードされる遺伝子の群に含まれる少なくとも１、５、１０、２０、４０、６５の遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（ｉｉ）前記発現レベルを基準発現レベルと比較する工程、
を含み、それによって、抗癌化学療法に対する反応を検査する方法。
【請求項２】
抗癌化学療法に対する反応をｅｘ  ｖｉｖｏで検査する方法であって、
（ｉ）化学療法スケジュールを開始する前に、腫瘍性病変から採取された生検試料にｅｘ  ｖｉｖｏで化学療法を施す工程、
（ｉｉ）前記生検試料中における、配列番号１から配列番号６５によってコードされる遺伝子の群に含まれる少なくとも１、５、１０、２０、４０、６５の遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（ｉｉｉ）前記発現レベルを基準発現レベルと比較する工程、
を含み、それによって、抗癌化学療法に対する反応をｅｘ  ｖｉｖｏで検査する方法。
【請求項３】
前記反応の検査が、化学療法の成功の見込みの予測である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
化学療法の成功が、腫瘍塊の減少として理解される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記腫瘍性病変が、乳癌または卵巣癌である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記化学療法が、
（ｉ）細胞増殖に作用する、および／または、
（ｉｉ）細胞生存に作用する、および／または、
（ｉｉｉ）細胞運動性に作用する、
請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記化学療法がアントラサイクリンベースの化学療法である、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記アントラサイクリンベースの化学療法が、エピルビシンまたはドキソルビシンベースの化学療法である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
予測アルゴリズムが使用される、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記予測アルゴリズムが、
（ｉ）サポートベクターマシンアルゴリズム、または
（ｉｉ）ｋ−最近傍アルゴリズム、または
（ｉｉｉ）部分最少判別アルゴリズム
である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
発現レベルが、
（ｉ）ハイブリダイゼーションベースの方法を用いて、あるいは
（ｉｉ）アレイ状のプローブを使用したハイブリダイゼーションベースの方法を用いて、あるいは
（ｉｉｉ）個別に標識されたプローブを使用したハイブリダイゼーションベースの方法を用いて、あるいは
（ｉｖ）リアルタイムＰＣＲによって、あるいは
（ｖ）ポリペプチド、タンパク質、またはその誘導体の発現を評価することによって、あるいは
（ｖｉ）ポリペプチド、タンパク質、またはその誘導体の量を評価することによって
決定される、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
患者のために個別に最適化された抗癌治療を選択する方法であって、請求項１または２または３に記載の方法を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍性疾患の治療結果（例えば治療に対する腫瘍反応）の予測、診断、予後、予防、および治療のための方法および組成物に関する。本発明の方法は、抗癌化学療法を開始した後に差次的に発現される６５のヒト遺伝子の発現レベルの測定に基づいている。
【０００２】
本発明の方法および組成物は、乳癌の検査で最も有用であるが、他のタイプの癌の検査でも有用である。
【背景技術】
【０００３】
癌は、心臓血管疾患に次いで、米国で２番目に多い死亡原因である。米国人の３人のうち１人は、一生の間に癌になるであろう。そして、米国人の４人のうち１人は、癌によって死亡するであろう。より詳細には、米国のみでも毎年、約４万人の女性が乳癌によって生命を奪われ、約２０万人の女性が乳癌であると診断されている。通常、腫瘍は、腫瘍サイズ、浸潤状態、リンパ節の関与、転移、病理組織学、免疫組織学マーカー、および分子マーカーなどの様々なパラメータに基づいて分類される（ＷＨＯ。疾患の国際分類法（１）；ＳａｂｉｎおよびＷｉｔｔｅｋｉｎｄ、１９９７年（２））。
【０００４】
手術後の体系的なアジュバント治療によって、手術可能な原発乳癌を有する患者における疾患の再発および死亡の危険性が低下することは、確固として確立されている事実である。これに代わる治療概念として、ネオアジュバント療法すなわち初期全身療法（ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ）（ＰＳＴ）を、より大きな手術不能な乳癌を有する患者または乳房保存手術に関心がある患者に提供することができる（９１）。一般に、ＰＳＴは、標準的なアジュバント治療に優る生存上の利点を与えないが、病理学的に確認された完全奏効（ＣＲ）を有する患者を同定する可能性がある。ＰＳＴに対するこの臨床応答は、生存率の改善と関連しており（９２）、ＰＳＴ治療を受けた患者の約１４％に与える大きな利益を反映している。念入りなＰＳＴを計画する研究によって、初期の遺伝子発現変化が臨床応答に有意に関連していることが実証された（９４）。ＰＳＴ（化学療法の所与の組合せ）を受けても利益を得ないであろう患者を、第１ラウンドの治療の後（例えば、薬物をｉ．ｖ．投与した数時間後）に同定することによって、患者の健康を改善するために処方計画を変える機会が得られるであろう。
【０００５】
一般に、所与のコホートにおけるすべての患者が同一の治療を受けるが、その多くは、治療成功に至らないであろう。腫瘍反応を反映するバイオマーカーは、長期結果の敏感な短期的代用マーカーとして機能しうる。そのようなバイオマーカーの使用は、個々の患者にとって、化学療法をより効果的なものとし、非反応性の腫瘍である場合に、早期の処方計画の変更を可能にするであろう。
【０００６】
個々の乳癌患者に最適な臨床治療コースを開発するために多くの努力がなされたが、特定の治療に対する個体の反応を予測することには、ごくわずかな進展しか得られなかった。通常、そのような予測は、腫瘍の病期および段階、エストロゲン受容体（ＥＲ）およびプロゲステロン受容体（ＰｇＲ）の状態、成長速度、ＨＥＲ２／ｎｅｕおよびｐ５３発癌遺伝子の過剰発現などの標準的臨床パラメータに基づく（７８）。しかし、アジュバント内分泌化学療法の結果予測との、ＥＲおよび／またはＰｇＲ遺伝子発現の関連性に関する証拠は、未だに議論の余地がある。乳癌患者のＥＲおよびＰｇＲ遺伝子発現のレベルが、後続のアジュバント化学療法とは独立に、予後に重要であることが、複数の研究によって示されている。理論上の観点からは、乳癌を有する患者の治療反応が、ＥＲ／ＰｇＲの状態から独立しているとは予測されない。予後における、受容体発現の影響が、他のパラメータ、例えばＥＲＢＢ２受容体の影響に依存している可能性の方が高い。従来の生物学技法を用いてそのような因子を見出そうとしても、これらの分析はすべて一度に１つの遺伝子について調査するものなので、問題を起こす。
【０００７】
研究者は、マーカー遺伝子発現の相違に基づいた、腫瘍の分類にますます注意を集めており、また、１試料中の何千もの遺伝子の発現レベルを同時に定量測定するのに、ＤＮＡマイクロアレイ技術は非常に有用となっている。これまでに、この技術は、癌組織、例えば乳房腫瘍の分類［（３）、（７９〜８３）］、転移および患者の結果の予測［（４］、（８４〜８６）］、ならびに化学療法に対する腫瘍反応［（８７〜９０）］に適用されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしそれにもかかわらず、依然として、化学療法が、乳癌を有する患者、特にそれの元の部位から転移した癌を有する患者に提供される治療計画のかなめである［Ｐｅｒｅｚ、１９９９年、（５）］。乳癌の治療で活性が実証されている化学療法薬がいくつかあり、最適な薬物および処方計画を決定するための研究が絶え間なく試みられている。しかし、別々の患者は、同じ治療計画に異なった反応をする傾向がある。現在、特定の治療に対する個体反応は、以前の臨床試験のデータに基づいて、統計的にのみ評価することができる。依然として、全身化学療法から利益を得ない患者が多数いる。特に、乳癌は、攻撃性および治療反応が極めて不均一である。それらは、増殖特性およびいくつかの薬物に対する感受性に影響を与える、異なった遺伝子変異および差異を含有している。各腫瘍の分子フィンガープリントの同定は、それゆえ、特に攻撃的な腫瘍を有する患者、または特定の有益な治療による処置を必要とする患者を分離する助けとなりうるであろう。遺伝子学に関する研究、および治療に対する反応に関連した研究が成熟するにつれ、標準手法は、疑いなく、より個人化されるであろう。これは、医師が、最適な結果を確実にするために、腫瘍の遺伝子プロファイルに適合した特定の処方計画を提供するのを可能にする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、抗癌化学療法を開始する前の腫瘍組織または他の基準発現レベルと比較して、抗癌化学療法を開始した後の腫瘍組織で、６５のヒト遺伝子が差次的に発現されるという予想外の新知見に基づいている。化学療法を開始した後で、化学療法に反応している患者で、６５の遺伝子それぞれの発現が増強し、一方、化学療法に反応していない患者では、化学療法を開始した後に発現が減少した（すなわちその逆となった）ことが見出された。したがって、これら６５の遺伝子のうちの１つまたはいくつが、抗癌化学療法を開始した後に差次的に発現されていることは、適用された様式の化学療法に患者が反応する可能性があるかどうかに関する貴重な情報を提供することが見出された。
【００１０】
本発明は、さらに、抗癌化学療法を開始する前の腫瘍組織または他の基準発現レベルと比較して、抗癌化学療法を開始した後の腫瘍組織で差次的に発現される６５のヒト遺伝子に関する。
【００１１】
本発明は、患者における抗癌化学療法を開始する前後に、６５のヒト遺伝子の群のうち１つまたはいくつかの遺伝子の差次的発現を測定することによって、抗癌化学療法に対する患者の反応を検査する方法にも関する。前記反応の検査は、化学療法を開始した直後に行うことができる。この段階では、まだ、腫瘍サイズを測定するなどの他の方法によって、化学療法に対する患者の反応に関する必要情報を提供することができない。
【００１２】
したがって、本発明は、適用された様式の化学療法が患者の健康に有益である可能性が高いか否か、および／または、適用された様式の化学療法を維持するべきか、改変すべきか−抗癌化学療法を開始した後すぐに−判定する手段を提供する。
【００１３】
本発明は、腫瘍性病変の臨床挙動の改変をもたらす、腫瘍組織で差次的に発現される６５のヒト遺伝子の同定に関する。これら６５の遺伝子の差次的発現は、人体の特定の組織において特異的な腫瘍性病変に限定されない。
【００１４】
化学療法薬に対する反応として発現変化が起こる遺伝子は、その治療をモニターするマーカーとしてさらに働き、臨床成果と相関する場合、そのような遺伝子は、有効性に関するバイオマーカーとしても働きうる。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態では、これら６５の遺伝子の発現が変化する腫瘍性病変は、ヒト乳癌である。この癌は、女性に限定されるものではなく、男性でも診断および分析されることがある。
【００１６】
本発明は、乳癌の診断、病期分類、予後、モニタリング、および治療のための様々な方法、試薬、およびキットに関する。本明細書で使用される場合、「乳癌」には、それらの組織学的な由来（例えば、管、小葉、髄様、および混成由来）にかかわらず、癌腫（例えば、上皮内癌、浸潤癌、転移性癌）、前悪性状態、および新形態変化が含まれる。本発明の組成物、方法、およびキットは、患者試料における、単一または複数（例えば、２、５、１０、または５０以上）の遺伝子（以下「マーカー遺伝子」、表１の配列番号１から６５に記載、それらによってコードされる各ポリペプチド配列は配列番号６６から１３０に列挙、表１も参照）のｍＲＮＡ発現のレベルと、対照の対象（例えば、乳癌のないヒト対象）から得た試料におけるマーカー遺伝子の平均発現レベルとを比較することを含む。
【００１７】
本発明はさらに、所与の乳癌治療に対する、臨床的に測定可能な腫瘍治療反応を予測するための様々な組成物、方法、試薬、およびキットに関する。本発明の組成物、方法、およびキットは、未分類の患者試料における単一または複数（例えば、２、５、１０、または５０以上）の乳癌マーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルと、施された乳癌治療に対して異なった強度で反応する患者を含むサンプルコホートにおける、マーカー遺伝子の平均発現レベルとを比較することを含む。本発明の好ましい実施形態では、アントラサイクリンベースの化学療法（例えば、エピルビシンまたはドキソルビシンを用いた多剤化学療法）による介入に反応する者と反応しない者とを識別するために、マーカー遺伝子の特異的発現を利用することができる。
【００１８】
さらに好ましい実施形態では、ｍＲＮＡ発現の対照レベルは、いくつかの（例えば、２、３、４、５、８、１０、１２、１５、２０、３０、または５０人）の、対照の対象から得た試料におけるマーカー遺伝子の平均発現レベルである。これらの対照の対象も、乳癌を患っており、かつそれらの臨床プロファイルによって分類されたものであってよく、必ずしもそれら個々の発現プロファイルよって分類されている必要はない。
【００１９】
以下に詳述する通り、対照レベルと比較した際の、患者試料における１つまたは複数のマーカー遺伝子（マーカー遺伝子のセット）の発現レベルの有意な変化は、患者における乳癌の状態と、化学療法に対する応答性とに関する重要な情報を提供する。本発明の組成物、方法、およびキットでは、周知の乳癌マーカー遺伝子（例えば、ＣＥＡ、マンマグロビン、またはＣＡ１５−３）と組み合わせて、表１に記載のマーカー遺伝子を使用できる。
【００２０】
本発明によれば、下記の状態、すなわち、ステージ０乳癌患者、ステージＩ乳癌患者、ステージＩＩ乳癌患者、ステージＩＩＩ乳癌患者、ステージＩＶ乳癌患者、グレードＩ乳癌患者、グレードＩＩ乳癌患者、グレードＩＩＩ乳癌患者、悪性乳癌患者、乳房原発癌、ならびに他のすべてのタイプの乳房関連の癌、悪性腫瘍、および形質転換の患者のいずれかに関する、本発明の組成物、方法、およびキットの陽性適中率が少なくとも約１０％、好ましくは約２５％、より好ましくは約５０％、そして、最も好ましくは約９０％となるように、マーカー遺伝子およびマーカー遺伝子セットが選択される。
【００２１】
上記マーカー遺伝子発現の検出は、乳癌患者の１次病変、２次病変、または転移病変における検出に限定されるものではなく、乳癌細胞に冒されたリンパ節、または局部的に沈着（例えば、骨髄、肝臓、腎臓）しているか患者身体全体に自在に浮遊している微小残存病変細胞における検出でもよい。
【００２２】
本発明の組成物、方法、試薬、およびキットの一実施形態では、分析される試料が、吸引もしくは穿刺によって、切除によって、あるいは生検細胞物質もしくは切除細胞物質を得る他の任意の外科的方法によって採取された腫瘍性病変から得られた組織物質である。本発明の組成物、方法、およびキットの一実施形態では、上記試料が、患者から得られた細胞を含む。これらの細胞は、例えば、乳頭吸引、管洗浄、または細針生検によって収集された乳房細胞「塗抹」標本中、あるいは誘発性もしくは自発性の乳頭分泌物から得られた乳房細胞塗抹標本中に見出されるものでよい。別の実施形態では、上記試料が体液である。そのような体液には、例えば、血液、リンパ液、腹水、婦人科的体液、または尿が含まれるが、これらの体液に限定されない。
【００２３】
本発明の組成物、方法、およびキットでは、遺伝子発現の測定は、いかなる特定の方法にも限定されず、また、ｍＲＮＡの検出に限定されるものでもない。試料中のマーカー遺伝子の存在および／または発現レベルは、例えば、下記のものを測定および／または定量化することによって評価することができる。
１）表１中のマーカー遺伝子（配列番号１から６５）によってコードされるタンパク質、または配列番号６６から１３０から選択されたポリペプチドを含むタンパク質、または上記タンパク質のプロセシングまたは分解によって生成されたポリペプチド（例えば、上記のタンパク質またはポリペプチドに特異的に結合する抗体、抗体誘導体、または抗体断片などの試薬を使用）
２）表１中のマーカー遺伝子（配列番号１から６５）によってコードされるタンパク質、または配列番号６６から１３０から選択されたポリペプチドを含むポリペプチドによって直接的（すなわち触媒された）または間接的に産生された代謝産物
３）表１中のマーカー遺伝子によってコードされるＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ）、または上記ＲＮＡ転写物の断片（例えば、上記試料から得られたＲＮＡ転写物、または上記転写産物から調製されたｃＤＮＡの混合物を、選択された位置で基質に固定された、表１に記載の１つまたは複数のマーカー遺伝子の配列を含む核酸を有する基質と接触させることによって）。これらの遺伝子のｍＲＮＡ発現は、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社（米国特許第５５５６７５２号）または他の製造会社提供のＤＮＡマイクロアレイを用いて検出することができる。さらに別の実施形態では、Ｌｕｍｉｎｅｘ社提供のもの（国際公開第９７／１４０２８号）など、ビーズベースの直接蛍光測定技法を用いて、これらの遺伝子の発現を検出することができる。
【００２４】
一態様では、本発明は、患者が乳癌を患っているかどうかを評価するための組成物、方法、およびキットを提供する（例えば、特に乳癌を発症する危険が高い患者（例えば、家族に乳癌の病歴を有する患者、および変異体型の発癌遺伝子を有すると同定された患者）における、新規の検出もしくは「スクリーニング」、再発の検出、または反応試験）。この目的では、上記の組成物、方法、およびキットは、
ａ）患者試料中の単一または複数のマーカー遺伝子の発現レベル、および
ｂ）乳癌を有しない対照の対象における、上記マーカー遺伝子の正常な発現レベル
を比較することを含み、上記マーカー遺伝子の少なくとも１つ（例えば、２、５、１０、または５０以上）は、表１のマーカー遺伝子から選択されたものである。
【００２５】
患者試料中の、選択されたマーカー遺伝子（例えば、２、５、１０、または５０以上）の発現レベルが、各マーカー遺伝子の正常な発現レベルと比較して有意に増大していること、および減少していることが、患者が乳癌を患っていることの指標となる。
【００２６】
本発明の組成物、方法、およびキットは、悪性腫瘍の進行または転帰を予後診断するのにも有用である。この目的では、上記の組成物、方法、およびキットは、
ａ）患者試料中の単一または複数のマーカー遺伝子の発現レベル、および
ｂ）これらのマーカー遺伝子の発現の対照パターン
を比較することを含み、上記マーカー遺伝子の少なくとも１つ（例えば、２、５、１０、または５０以上）は、表１のマーカー遺伝子から選択されたものである。
【００２７】
本発明の組成物、方法、およびキットは、特定の化学療法に反応しない患者を同定するのに特に有用である。この目的では、上記の組成物、方法、およびキットは、
ａ）患者試料中の単一または複数のマーカー遺伝子の発現レベル、および
ｂ）対照の対象における上記マーカー遺伝子の発現レベル
を比較することを含み、上記マーカー遺伝子の少なくとも１つ（例えば、２、５、１０、または５０以上）は、表１のマーカー遺伝子から選択されたものである。対照の対象は、乳癌を患っていないものであっても、特定の化学療法に対するそれらの臨床反応によって同定および分類されたものであってもよい。
【００２８】
別の態様では、本発明は、患者の乳癌を抑制するための、治療の効力を評価する組成物、方法、およびキットを提供する。この組成物、方法、およびキットは、
ａ）患者になんらかの治療を施す前に患者から得られた第１の試料における単一またはマーカー遺伝子の発現、および
ｂ）上記治療を少なくとも１用量施した後で患者から得られた第２の試料におけるマーカー遺伝子の発現
を比較することを含み、上記マーカー遺伝子の少なくとも１つは、表１中に記載のマーカー遺伝子から選択されたものである。
【００２９】
この組成物、方法、およびキットにおいて、「治療」とは、限定されるものではないが、化学療法、抗ホルモン療法、指向性抗体療法、放射線療法、および組織、例えば乳房腫瘍の外科的除去を含めた、乳癌を処置するための治療でありうると理解されよう。したがって、本発明の組成物、方法、およびキットは、治療前、治療中、および治療後に患者を評価するため、例えば全身腫瘍組織量の減少を評価するために用いることができる。
【００３０】
さらに別の態様では、本発明は、患者における乳癌の進行をモニターするための組成物、方法、およびキットを提供する。この組成物、方法、およびキットは、
ａ）第１の時点の患者試料における、単一または複数のマーカー遺伝子の発現を検出する工程、
ｂ）その後の時点で工程ａ）を反復する工程、
ｃ）工程ａ）および工程ｂ）で検出された各マーカー遺伝子の発現レベルを比較し、それによって、患者における乳癌の進行をモニターする工程、および
を含み、上記マーカー遺伝子の少なくとも１つは、表１中に記載のマーカー遺伝子から選択されたものである。
【００３１】
別の態様では、本発明は、患者の乳癌を抑制するための治療計画（例えば、化学療法試薬の種類）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで選択するための組成物、方法、およびキットを提供する。この組成物、方法、およびキットは、
ａ）癌細胞を含む試料を患者から取得する工程、
ｂ）様々な試験組成物の存在下に上記試料のアリコートを別々に維持する工程、
ｃ）各アリコートにおける、表１に記載のマーカー遺伝子から選択された単一または複数のマーカー遺伝子の発現を比較する工程、
ｄ）その試験組成物を含有するアリコートにおいて、他の試験組成物を含有するアリコートにおける各マーカー遺伝子の発現レベルと比較して、配列番号１から４６の遺伝子のより低い発現レベルを誘導する、および／または配列番号４７から６５の遺伝子のより高い発現レベルを誘導する、前記試験組成物の１つを選択する工程
を含む。
【００３２】
本発明は、さらに、特定の生物学的または化学的化合物の発癌能を評価する組成物、方法、およびキットを提供する。この組成物、方法、およびキットは、
ａ）乳房細胞の別々のアリコートを、試験化合物の存在下および非存在下に維持する工程、および
ｂ）上記アリコートそれぞれにおける、単一または複数のマーカー遺伝子の発現を比較する工程
を含み、上記遺伝子の少なくとも１つは、表１中に記載のマーカー遺伝子から選択されたものである。その試験化合物の非存在下に維持されたアリコートにおける各マーカー遺伝子の発現レベルと比較した、その試験化合物の存在下に維持された（すなわち曝露された）アリコートにおける、配列番号１から４６の遺伝子の発現レベルの有意な増大、および／または配列番号４７から６５の遺伝子の有意な減少が、上記試験化合物に乳房発癌能があることの指標となる。
【００３３】
本発明は、さらに、乳癌を患っている患者を治療する組成物、方法、およびキットを提供する。この組成物、方法、キットは、表１中に記載のマーカー遺伝子のポリヌクレオチド配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを患者の細胞に提供することを含む。
【００３４】
本発明は、さらに、乳癌を発症する危険性を有する患者における乳癌細胞を抑制する組成物、方法、およびキットを提供する。この組成物、方法、およびキットは、表１に記載のマーカー遺伝子の発現を抑制することを含む。
【００３５】
さらに別の実施形態では、本発明は、配列番号６６から１３０までから選択されたポリペプチドを含むポリペプチドの活性を調節する薬剤を得るためのスクリーニングを行うための組成物、方法、およびキットを提供する。試験化合物を特定のポリペプチドと接触させる。上記ポリペプチドへの上記試験化合物の結合を検出する。それによって、上記ポリペプチドに結合する試験化合物を、悪性腫瘍、より詳細には乳癌を治療するための可能性ある治療薬として同定する。
【００３６】
本発明の別の実施形態では、配列番号６６から１３０までから選択されたポリペプチドを含むポリペプチドの活性を調節する薬剤を得るためのスクリーニングの別の組成物、方法、およびキットを提供する。試験化合物を特定のポリペプチドと接触させる。上記ポリペプチドによって媒介された生物活性を検出する。上記生物活性を低下させる試験化合物を、それによって、悪性腫瘍、特に乳癌において特定のポリペプチドの活性を低下させる可能性ある治療薬として同定する。上記生物活性を増大させる試験化合物を、それによって、悪性腫瘍、特に乳癌における、特定のポリペプチドの活性を増大させる可能性ある治療薬として同定する。
【００３７】
したがって、本発明は、配列番号６６から１３０を有するポリペプチドの１つから選択されたポリペプチドを提供する。例えば、配列番号６６から１３０までから選択されたポリペプチドを含むポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、活性化因子、補活性化因子、ならびに抑制因子などの調節因子または変調因子として作用しうる化合物を同定するのに使用できる。したがって、本発明は、悪性腫瘍、より詳細には乳癌における、配列番号６６から１３０までから選択されたポリペプチドを含むポリペプチドを調節する試薬、組成物、方法、およびキットを提供する。上記制御は、上方制御でも、下方制御でもよい。表１（配列番号１から６５）に記載のポリヌクレオチドの発現、安定性、もしくは量、または配列番号６６から１３０までから選択されたポリペプチドを含むポリペプチドの活性を調節する試薬は、タンパク質、ペプチド、ペプチドミメティック、核酸、核酸類似体（例えば、ペプチド核酸、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ））、または小分子でありうる。配列番号１から６５まで（表１に記載）から選択されたポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの発現、安定性、もしくは量、または配列番号６６から１３０（表１）までから選択されたポリペプチドを含むポリペプチドの活性を調節する組成物、方法、およびキットは、遺伝子置換治療、アンチセンス、リボザイム、および三本鎖核酸アプローチでありうる。
【００３８】
本発明は、さらに、患者が乳癌を患っているかどうかを評価するのに有用な抗体を産生する単離ハイブリドーマを作製する組成物、方法、およびキットを提供する。上記組成物、方法、およびキットは、表１中に記載のマーカー遺伝子によってコードされるタンパク質、または上記タンパク質のポリペプチド断片を単離する工程と、単離されたタンパク質またはポリペプチド断片を用いて哺乳類を免疫化する工程と、免疫化された哺乳類から脾細胞を単離する工程と、単離された脾細胞を不死化細胞株と融合させてハイブリドーマを形成させる工程と、個々のハイブリドーマを上記タンパク質またはポリペプチド断片に特異的に結合する抗体の産生についてスクリーニングして、そのハイブリドーマを単離する工程とを含む。本発明には、この方法によって産生された抗体も含まれる。そのような抗体は、悪性腫瘍、より詳細には乳癌の予測、予防、診断、予後、および治療に使用される、配列番号６６から１３０まで（表１に記載）から選択されたポリペプチドを含む完全長または部分ポリペプチドに特異的に結合する。
【００３９】
本発明のさらに別の態様は、患者の悪性腫瘍、より詳細には乳癌を処置するための医薬の製造における、配列番号１から６５までから選択されたポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、または配列番号６６から１３０まで（表１に記載）から選択されたポリペプチドを含むポリペプチドに特異的に結合する試薬の使用である。
【００４０】
さらに別の実施形態は、悪性腫瘍、詳細には乳癌を処置するための医薬の製造における、配列番号６６から１３０まで（表１に記載）から選択されたポリペプチドを含むポリペプチドの活性もしくは安定性、または配列番号１から６５まで（表１）から選択されたポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの発現、量、もしくは安定性を変調させる試薬の使用である。
【００４１】
本発明のさらに別の態様は、配列番号１から６５まで（表１）から選択されたポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、または配列番号６６から１３０までから選択されたポリペプチドを含むポリペプチドに特異的に結合する試薬と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。
【００４２】
本発明のさらに別の実施形態は、配列番号１から６５までから選択されたポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する配列を含み、かつ表１に各ポリヌクレオチドについて示されるのと同じ生物機能を示すポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、または配列番号６６から１３０までから選択されたポリペプチドを含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。本発明で有用な医薬組成物は、さらに、配列番号１から６５までから選択されたポリヌクレオチドを含むポリペプチド、またはその断片、抗体、もしくは抗体断片を含む融合タンパク質を含みうる。
【００４３】
本発明は、様々なキットも提供する。そのようなキットは、表１に記載のマーカー遺伝子から選択された単一または複数の遺伝子の発現を評価するための試薬を含む。
【００４４】
一態様では、本発明は、患者が乳癌を患っているかどうかを評価するためのキットを提供する。
【００４５】
別の態様では、本発明は、患者の乳癌を抑制するための複数の化合物のそれぞれの適性を評価するためのキットを提供する。このキットは、表１中に記載のマーカー遺伝子の発現を評価するための試薬を含む。キットは、複数の化合物を含んでもよい。
【００４６】
別の態様では、本発明は、乳癌細胞の存在を評価するためのキットを提供する。このキットは、表１中に記載のマーカー遺伝子によってコードされるタンパク質、または上記タンパク質のポリペプチド断片に特異的に結合する抗体を含む。キットは、表１中に記載のマーカー遺伝子セットの各マーカー遺伝子によってコードされるタンパク質に特異的に結合する複数の抗体を含んでもよい。
【００４７】
さらに別の態様では、本発明は、乳癌細胞の存在を評価するためのキットを提供し、このキットは核酸プローブを含む。このプローブは、表１中に記載のマーカー遺伝子のＲＮＡ転写物、または上記転写産物のｃＤＮＡに特異的にハイブリッド形成する。このキットは、複数のプローブを含んでもよく、上記プローブのそれぞれは、表２に記載のマーカー遺伝子セットにあるマーカー遺伝子の１つのＲＮＡ転写物に特異的にハイブリッド形成する。
【００４８】
本発明の組成物、方法、またはキットは、既知な乳癌マーカー遺伝子を含めた既知な癌マーカー遺伝子を含みうることが理解されよう。これらの組成物、方法、およびキットは、乳癌以外の癌を同定するのにも使用できることがさらに理解されよう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
定義
「差次的発現」または「発現」は、本明細書で使用される場合、腫瘍細胞の異なった発生、異なった遺伝的背景、および／または組織環境に対する腫瘍の反応に応じた、遺伝子の発現パターンにおける定量的な相違と、定性的な相違との両方を意味する。差次的に発現される遺伝子は、「マーカー遺伝子」および／または「標的遺伝子」となりうる。本明細書に開示する差次的に発現される遺伝子の発現パターンは、乳癌の予後評価または診断評価の一部として利用できる。
【００５０】
「発現パターン」という用語は、例えば、基準遺伝子（例えばハウスキーパー遺伝子）または計算された平均発現値（例えばＤＮＡチップ分析）と比較された遺伝子発現の測定レベルを意味する。パターンは、２つの遺伝子の比較に限定されず、むしろ、基準遺伝子またはサンプルに対する複数の遺伝子の多重比較に関するものである。特定の「発現のパターン」は、以下に開示するいくつかの遺伝子の比較および測定によっても生じ、また決定され、かつこれらの転写物のお互いに対する相対量を提示する場合がある。
【００５１】
あるいは、本明細書に開示する差次的に発現される遺伝子は、乳癌処置用の試薬および化合物、これらの試薬および化合物の使用、ならびに治療の方法を同定する方法で使用できる。遺伝子の差次的調節は、特定の癌細胞型またはクローンに限定されず、むしろ、癌細胞、筋肉細胞、ストロマ細胞、結合組織細胞、他の上皮細胞、内皮細胞、および血管、ならびに免疫系の細胞（例えば、リンパ球、マクロファージ、キラー細胞）の相互作用を表す。
【００５２】
「生物学的活性」、「生物活性」、「活性」、および「生物学的機能」は互換的に使用されるが、これらは本明細書では、ポリペプチド（その天然または変性型の立体配座にあるもの）またはそれの任意の断片によってｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接的または間接的に行使されるエフェクター機能または抗原機能を意味する。生物学的活性には、ポリペプチドへの結合、他のタンパク質もしくは分子への結合、酵素活性、シグナル伝達、ＤＮＡ結合タンパク質としての活性、転写調節因子としての活性、損傷したＤＮＡに結合する能力などが含まれるが、これらに限定されない。生物活性は、対象のポリペプチドに直接的に影響を与えることによって加減できる。あるいは、生物活性は、ポリペプチドのレベルを加減することによって、すなわち対応する遺伝子の発現を加減することなどによって、改変することができる。
【００５３】
「マーカー」または「バイオマーカー」という用語は、その存在または濃度を検出することができ、かつ、それらを疾患状態などの既知な状態と相関させることができる生物学的分子、例えば、核酸、ペプチド、ホルモンなどを指す。
【００５４】
「マーカー遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、その発現パターンを、悪性腫瘍または乳癌の評価における予測過程、予後判定過程、または診断過程の一部として利用できるか、あるいは、悪性腫瘍、詳細には乳癌の治療または予防に有用な化合物を同定する方法に利用できる、差次的に発現される遺伝子を指す。マーカー遺伝子は、標的遺伝子としての特性も有する場合がある。
【００５５】
「標的遺伝子」は、本明細書で使用される場合、それによって、標的遺伝子発現または標的遺伝子産物活性のレベルを加減することが、悪性腫瘍、詳細には乳癌の症候を改善するように作用しうるようにして乳癌に関連した差次的に発現される遺伝子を指す。標的遺伝子は、マーカー遺伝子としての特性も有する場合がある。
【００５６】
「腫瘍性病変」、「腫瘍性疾患」、または「腫瘍」という用語は、それらの組織学的な由来（例えば、管、小葉、髄様、および混成由来）にかかわらず、癌腫（例えば、上皮内癌、浸潤癌、転移性癌）、前悪性状態、および腫瘍性変化を含めた癌組織を指す。「癌」という用語は、患部組織または細胞集合のいかなるステージ、グレード、組織形態学的特徴、侵襲性、または悪性度にも限定されない。詳細には、ステージ０乳癌、ステージＩ乳癌、ステージＩＩ乳癌、ステージＩＩＩ乳癌、ステージＩＶ乳癌、グレードＩ乳癌、グレードＩＩ乳癌、グレードＩＩＩ乳癌、悪性乳癌、乳房原発癌、ならびに他のすべてのタイプの乳房関連の癌、悪性腫瘍、および形質転換が含まれる。「腫瘍性病変」、「腫瘍性疾患」、「腫瘍」、または「癌」という用語は、いかなる組織または細胞型にも限定されない。それらには、癌患者の１次病変、２次病変、または転移病変が含まれ、また、癌細胞に冒されたリンパ節、または局部的に沈着（例えば、骨髄、肝臓、腎臓）しているか患者身体全体に自在に浮遊している微小残存病変細胞も含まれる。
【００５７】
さらに、「腫瘍性疾患の状態を特徴付けること」という用語は、以下の状態、すなわち、腫瘍のタイプ、組織形態学的外観、外部のシグナル（例えば、ホルモン、成長因子）への依存性、侵襲性、運動性、ＴＮＭ（２）などによる状態、悪性度、転移能、および所与の治療に対する反応性のうちの１つまたは複数の測定および評価に関するが、これらに限定されない。
【００５８】
「生物試料」という用語は、本明細書で使用される場合、生物または生物の構成要素（例えば細胞）から得られた試料を指す。試料は、いかなる生物組織のものでも、あるいは体液のものでもよい。試料は、多くの場合、患者から得られた試料である「臨床標本」であろう。そのような試料には、痰、血液、血球（例えば白血球）、組織試料もしくは細針生検試料、細胞含有体液、浮遊核酸、尿、腹腔液、および胸水、あるいはそれらから得られた細胞が含まれるが、これらに限定されない。生物試料には、組織学的な目的で採取された凍結切片または固定切片などの組織切片も含まれる場合がある。分析される生物試料は、吸引もしくは穿刺によって、切除によって、あるいは生検細胞物質もしくは切除細胞物質を得る他の任意の外科的方法によって採取された腫瘍性病変から得られた組織物質である。そのような生物試料は、患者から得られた細胞も含みうる。これらの細胞は、例えば、乳頭吸引、管洗浄、または細針生検によって収集された乳房細胞「塗抹」標本中、あるいは誘発性もしくは自発性の乳頭分泌物から得られた乳房細胞塗抹標本中に見出されるものでよい。別の実施形態では、上記試料が体液である。そのような体液には、例えば、血液、リンパ液、腹水、婦人科的体液、または尿が含まれるが、これらの体液に限定されない。
【００５９】
「治療様式」、「治療モード」、「処方計画」、または「化学療法計画」という用語、および「治療計画」という用語は、癌治療のための抗腫瘍および／もしくは免疫刺激性および／もしくは血球増殖性の薬剤、ならびに／または放射線療法、ならびに／または高熱療法、ならびに／または全身低体温法の逐次投与または同時投与を意味する。これらの投与は、アジュバントおよび／またはネオアジュバントモードで行うことができる。そのような「プロトコル」の組成は、単剤の用量、投与の時間枠、および特定の治療ウィンドウ内での投与の頻度が様々である。現在、様々な薬物および／または物理的方法の様々な組合せと、様々なスケジュールとが調査中である。
【００６０】
「アレイ」または「マトリックス」は、装置上でのアドレス可能な位置すなわち「アドレス」の配置を意味する。それらの位置は、２次元配列、３次元アレイ、または他のマトリックスフォーマットで配置することができる。それらの位置の数は、数箇所から少なくとも数十万にまで及ぶことがある。最も重要なことは、各位置が完全に独立した反応位置を表すことである。アレイには、核酸アレイ、タンパク質アレイ、および抗体アレイが含まれるが、これらに限定されない。「核酸アレイ」は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または遺伝子のさらに大きな部分などの核酸プローブを含有するアレイを指す。アレイ上の核酸は一本鎖であることが好ましい。プローブがオリゴヌクレオチドであるアレイは、「オリゴヌクレオチドアレイ」または「オリゴヌクレオチドチップ」と呼ばれる。「マイクロアレイ」は、本明細書では「バイオチップ」または「生物学的チップ」とも呼ばれ、個別の領域の密度が少なくとも約１００／ｃｍ２、好ましくは少なくとも約１０００／ｃｍ２である複数の領域のアレイである。マイクロアレイ中の領域は、典型的な寸法、例えば直径が約１０〜２５０μｍの範囲にあり、アレイ中の他の領域とは、ほぼ同じ距離離れている。「タンパク質アレイ」は、非変性形態にあるか、もしくは変性した、ポリペプチドプローブまたはタンパク質プローブを含有するアレイを指す。「抗体アレイ」は、抗体を含有するアレイを指し、上記抗体には、モノクローナル抗体（例えばマウス由来のもの）、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはファージ抗体および一本鎖抗体、ならびにこれらの抗体由来の断片が含まれるが、これらに限定されない。
【００６１】
「アゴニスト」という用語は、本明細書で使用される場合、タンパク質の生物活性を模倣または上方制御（例えば増強または増補）する薬剤を指すものとする。アゴニストは、野生型タンパク質、または、野生型タンパク質の少なくとも１つの生物活性を有するその誘導体でありうる。アゴニストは、遺伝子の発現を上方制御する化合物、またはタンパク質の少なくとも１つの生物活性を増強する化合物である可能性もある。アゴニストは、別の分子、例えば標的ペプチドまたは標的核酸との、ポリペプチドの相互作用を増強する化合物である可能性もある。
【００６２】
「アンタゴニスト」という用語は、本明細書で使用される場合、タンパク質の少なくとも１つの生物活性を下方制御（例えば抑制または阻害）する薬剤を指すものとする。アンタゴニストは、タンパク質と、別の分子、例えば、標的ペプチド、リガンド、または酵素基質との相互作用を抑制または低減する化合物でありうる。アンタゴニストは、遺伝子の発現を下方制御する化合物、または発現されタンパク質の存在量を減少させる化合物である可能性もある。
【００６３】
「小分子」は、本明細書で使用される場合、分子量が約５ｋＤ未満、最も好ましくは約４ｋＤ未満である組成物を指すものとする。小分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメティック、糖質、脂質、または他の有機分子（炭素を含有する）、または無機分子でありうる。多くの薬品会社は、生物活性を加減する化合物を同定するための本発明の任意のアッセイを用いてスクリーニングすることができる、化学物質および／または生物物質の混合物の大規模なライブラリーを有する。上記生物物質は、真菌、細菌、または藻類の抽出物であることが多い。
【００６４】
「加減された」または「加減」または「調節された」または「調節」、および「差次的に調節された」という用語は、本明細書で使用される場合、上方制御（すなわち活性化または刺激（例えば、アゴニスト作用または増強）による）と、下方制御［すなわち阻害または抑制（例えば、アンタゴニスト作用、低減、または抑制による）］との両方を意味する。
【００６５】
「転写調節ユニット」は、開始シグナル、エンハンサー、プロモーターなど、それらが作用可能に連結しているタンパク質コード配列の転写を誘導または制御するＤＮＡ配列を指す。好ましい実施形態では、上記遺伝子の１つの転写が、発現が意図されている細胞型における組換え遺伝子の発現を制御するプロモーター配列（または他の転写制御配列）の制御下にある。組換え遺伝子は、そのポリペプチドの、天然に存在する形態の転写を制御する転写制御配列と同じ転写制御配列の制御下に置くことも、異なった転写制御配列の制御下に置くこともできるということも理解されよう。
【００６６】
「誘導体」という用語は、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の化学修飾を意味する。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば、アルキル、アシル、またはアミノ基による水素の置換が含まれうる。誘導体ポリヌクレオチドは、天然分子の少なくとも１つの生物学的または免疫学的機能を保持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドは、それが由来するポリペプチドの少なくとも１つの生物学的または免疫学的機能を保持する、グリコシル化、ペグ化、または任意の同様な過程によって修飾されたものである。「誘導体」という用語は、さらに、ポリペプチド配列またはタンパク質のリン酸化形態も意味する。
【００６７】
「ヌクレオチド類似体」という用語は、天然に存在するヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドとは異なる少なくとも１つの特徴を有するが、天然に存在するヌクレオチドそれぞれの機能的特徴（例えば、塩基対合、ハイブリダイゼーション、コード情報）を示し、かつ前記組成物用に使用できるオリゴマーまたは重合体を指す。ヌクレオチド類似体は、天然に存在しない塩基または重合体骨格から構成されたものでありえ、その例には、ＬＮＡ、ＰＮＡ、およびモルフォリノがある。ヌクレオチド類似体は、天然に存在するそれの対応物または等価物とは異なった少なくとも１つの分子を有する。
【００６８】
「乳癌遺伝子」は、本明細書で使用される場合、配列番号１から６５（表１に記載）のポリヌクレオチド、ならびにそれらの誘導体、断片、類似体、および相同体と、それらによってコードされるポリペプチド（配列番号６６から１３０、表１を参照）、ならびに、それらの誘導体、断片、類似体、および相同体と、表１から３に開示された情報を用いて、当技術分野で周知の標準的な技法によって誘導または同定できる対応するゲノム転写ユニットとを指す。配列番号１から６５のポリヌクレオチド配列および配列番号６６から１３０のポリペプチドの遺伝子名および基準配列を、表１に示す。
【００６９】
「染色体領域」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞遺伝学マーカーまたは他の遺伝学マーカー、例えば、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、一塩基多型（ＳＮＰ）、発現配列タグ（ＥＳＴ）、塩基配列タグ部位（ＳＴＳ）、ミクロサテライト、可変縦列配列数（ＶＮＩＲ）、および遺伝子などによって定義できる染色体上の連続したＤＮＡ領域を指す。通常、染色体領域は、最大２メガ塩基（ＭＢ）まで、最大４ＭＢまで、最大６ＭＢまで、最大８ＭＢまで、最大１０ＭＢまで、最大２０ＭＢまで、またはより多くのＭＢからなる。
【００７０】
「キット」という用語は、本明細書で使用される場合、本発明で開示する少なくとも１つのマーカー遺伝子、詳細には表１に記載の遺伝子の発現を特異的に検出するための少なくとも１種類の試薬、例えばプローブを含む任意の製品（例えば診断用または研究用製品）を意味し、それらの製品は、本発明の方法を実施するための１ユニットとして販売、配付、および／または販売促進される。配列番号６６から１３０までから選択されたポリペプチドを含むマーカー遺伝子産物それぞれの存在、安定性、活性、複雑さを検出する試薬（例えばイムノアッセイ）も、上記キットの構成要素と考えることができる。加えて、本発明で開示する核酸およびタンパク質検出のいかなる組合せも、キットと考えられる。
【００７１】
本発明は、ポリヌクレオチド配列およびそれによってコードされるタンパク質と、上記ポリヌクレオチド配列に由来するプローブ、コードされるタンパク質に対する抗体、ならびに、悪性腫瘍、詳細には乳癌を有する個体、またはその危険がある個体の予測、予防、診断、予後判定、および治療用の使用とを提供する。本明細書に開示されている配列は、乳癌から得た試料中で差次的に発現されていることが判明しているものである。
【００７２】
本発明は、乳癌の臨床的エビデンスを有する患者の腫瘍生検中で差次的に調節（上方または下方制御）されている６５の遺伝子の同定に基づいている。これらの遺伝子のいくつかの同時発現を特性分析することによって、乳癌における新たな役割を同定した。遺伝子名、データベースアクセッション番号（遺伝子名（Ｇｅｎｅｎａｍｅ）、記号（Ｓｙｍｂｏｌ）、および参照配列（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ））、ならびにコードされるタンパク質の推定上または既知の機能を、表１に示す。
【００７３】
本発明は、下記の方法に関する。
【００７４】
１．抗癌化学療法に対する反応を（好ましくはｅｘ  ｖｉｖｏで）検査する方法であって、
（ｉ）化学療法スケジュールの開始後に腫瘍性病変から採取された生検試料中における、配列番号１から配列番号６５によってコードされる遺伝子の群に含まれる少なくとも１、５、１０、２０、４０、６５の遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（ｉｉ）前記発現レベルを基準発現レベルと比較する工程、
を含み、それによって、抗癌化学療法に対する反応を検査する方法。
【００７５】
本発明は、抗癌化学療法に対する反応を（好ましくはｅｘ  ｖｉｖｏで）検査する方法であって、
（ｉ）化学療法スケジュールの開始前に腫瘍性病変から採取された生検試料中における、配列番号１から配列番号６５によってコードされる遺伝子の群に含まれる少なくとも１、５、１０、２０、４０、６５の遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（ｉｉ）前記発現レベルを基準発現レベルと比較する工程、
を含み、それによって、抗癌化学療法に対する反応を検査する方法にも関する。
【００７６】
２．抗癌化学療法に対する反応をｅｘ  ｖｉｖｏで検査する方法であって、
（ｉ）化学療法スケジュールを開始する前に、腫瘍性病変から採取された生検試料にｅｘ  ｖｉｖｏで化学療法を施す工程、
（ｉｉ）前記生検試料中における、配列番号１から配列番号６５によってコードされる遺伝子の群に含まれる少なくとも１、５、１０、２０、４０、６５の遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（ｉｉｉ）前記発現レベルを基準発現レベルと比較する工程、
を含み、それによって、抗癌化学療法に対する反応をｅｘ  ｖｉｖｏで検査する方法。
【００７７】
発現レベルの測定は、発現レベルの定量化および／または発現レベルの純粋に定性的な判定を含みうる。
【００７８】
当業者には、遺伝子の発現を測定するために、前記遺伝子の部分および断片を、特異的なものとして使用できることが明らかである。
【００７９】
本発明は、上述の通りであるが、工程（ｉ）および（ｉｉ）で発現レベルのパターンが測定および比較される、抗癌化学療法に対する反応を検査する方法にも関する。単一遺伝子の「発現レベルのパターン」は、適切な方法で測定されたその遺伝子の発現レベルと理解するべきである。
【００８０】
本発明は、上述の通りであるが配列番号１から配列番号６５までに記載の配列の相同体である配列を使用する、抗癌化学療法に対する反応を検査する方法にも関する。好ましい相同体は、元の配列に対して８０％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有する。上記相同体は、元の分子が有するものと同じ生物活性および／または機能を依然として有していることが好ましい。
【００８１】
あるヌクレオチド配列への言及が、前記ヌクレオチド配列によってコードされる関連タンパク質配列への言及を含むことが意図されているのは、当業者に明白なことである。
【００８２】
第１の配列の、第２の配列に対する「％同一性」、「同一性のパーセント」は、本発明の意味する範囲内では、下記の通りに計算された％同一性を意味する。最初に、２つの配列間の最適全域アラインメントを、以下のコマンドラインシンタクス、すなわち、．／ｃｌｕｓｔａｌｗ  −ｉｎｆｉｌｅ＝．／ｉｎｆｉｌｅ．ｔｘｔ  −ｏｕｔｐｕｔ＝  −ｏｕｔｏｒｄｅｒ＝ａｌｉｇｎｅｄ  −ｐｗｍａｔｒｉｘ＝ｇｏｎｎｅｔ  −ｐｗｄｎａｍａｔｒｉｘ＝ｃｌｕｓｔａｌｗ  −ｐｗｇａｐｏｐｅｎ＝１０．０  −ｐｗｇａｐｅｘｔ＝０．１  −ｍａｔｒｉｘ＝ｇｏｎｎｅｔ  −ｇａｐｏｐｅｎ＝１０．０  −ｇａｐｅｘｔ＝０．０５  −ｇａｐｄｉｓｔ＝８  −ｈｇａｐｒｅｓｉｄｕｅｓ＝ＧＰＳＮＤＱＥＲＫ  −ｍａｘｄｉｖ＝４０を適用して、ＣＬＵＳＴＡＬＷアルゴリズム［Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＤ、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧ、Ｇｉｂｓｏｎ  ＴＪ、１９９４年、「ＣｌｕｓｔａｌＷ：Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｈｏｉｃｅ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２２：４６７３−４６８０］、バージョン１．８を用いて決定する。ＣＬＵＳＴＡＬＷアルゴリズムの実行は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ含めた、インターネット上の多数のサイトで容易に利用できる。その後、アラインメント中の一致数を、アラインメントされたそれぞれの位置で同一なヌクレオチド（またはアミノ酸残基）の数を数えることによって決定する。最後に、２つの配列のうち長い方のヌクレオチド（またはアミノ酸残基）数で、一致総数を割り、１００を掛けて、第１の配列の、第２の配列に対する％同一性を計算する。
【００８３】
３．前記反応の検査が、化学療法の成功の見込みの予測である、上記第１点または第２点の方法。
【００８４】
４．化学療法の成功が、腫瘍塊の減少として理解される、上記第３点の方法。
【００８５】
５．前記腫瘍性病変が、乳癌または卵巣癌である、上記第１点から第４点までのいずれかの方法。
【００８６】
６．前記化学療法が、
（ｉ）細胞増殖に作用する、および／または
（ｉｉ）細胞生存に作用する、および／または
（ｉｉｉ）細胞運動性に作用する、
上記第１点から第５点までのいずれかの方法。
【００８７】
７．前記化学療法がアントラサイクリンベースの化学療法である、上記第１点から第６点までの任意の方法。
【００８８】
８．前記アントラサイクリンベースの化学療法が、エピルビシンまたはドキソルビシンベースの化学療法である、上記第７点の方法。
【００８９】
９．予測アルゴリズムが使用される、上記第１点から第８点までのいずれかの方法。
【００９０】
予測的アルゴリズムは、データ分析分野の当業者には周知なものであり、上記技術分野で知られているいかなる種類の予測的アルゴリズムも該当すると理解するべきである。そのようなアルゴリズムの好ましい例は、例えば、実施例４に開示するＳＶＭアルゴリズム、ｋ−最近傍分析（Ｋ−Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｂｏｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）、または線形判別分析（Ｌｉｎｅａｒ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）である。
【００９１】
１０．前記予測アルゴリズムが、
（ｉ）サポートベクターマシンアルゴリズム、または
（ｉｉ）ｋ−最近傍アルゴリズム、または
（ｉｉｉ）部分最少判別アルゴリズム
である、上記第９点の方法。
【００９２】
１１．発現レベルが、
（ｉ）ハイブリダイゼーションベースの方法を用いて、あるいは
（ｉｉ）アレイ状のプローブを使用したハイブリダイゼーションベースの方法を用いて、あるいは
（ｉｉｉ）個別に標識されたプローブを使用したハイブリダイゼーションベースの方法を用いて、あるいは
（ｉｖ）リアルタイムＰＣＲによって、あるいは
（ｖ）ポリペプチド、タンパク質、またはその誘導体の発現を評価することによって、あるいは
（ｖｉ）ポリペプチド、タンパク質、またはその誘導体の量を評価することによって、
決定される、上記第１点から第１０点までのいずれかの方法。
【００９３】
１２．患者のために個別に最適化された抗癌治療を選択する方法であって、請求項１または２または３に記載の方法を含む方法。
【００９４】
「個人化された癌治療」または「個別に最適化された抗癌治療」という用語は、本明細書で使用される場合、癌を有するすべての人が、それらの患者の体格および癌の分子レパートリーに関して他の患者と明らかに異なっていることの観察を意味する。異なるものとして分析および分子分類された患者腫瘍は、次に、患者の癌への化学療法薬の取り込みが最大となるような治療または治療の組合せのタイプに基づいて個人化された治療を受ける。これによって、１つのタイプの化学療法または複数の化学療法の異なった組合せを必要とする可能性のある個々の患者の選択が可能となる。そのような「個人化された癌治療」を、投与スケジュール、薬物濃度、治療順序、および補助的介入（例えば免疫刺激）の添加に反映させることができる。
【００９５】
実験手順および設定
本発明は、エピルビシン／シクロホスファミド（ＥＣ）またはエピルビシン／タキソール（ＥＴ）処置が与える、第１サイクルの化学療法剤処置の後の時点での主要な乳癌における遺伝子発現への影響の同定と、非反応対象／反応対象を同定するための、これらの発現パターンの使用とに関する。
【００９６】
シクロホスファミドおよびエピルビシンは、進行した転移性乳癌の一般的な治療である。さらに、エピルビシン治療の利点は、作用様式クラスが同じで、かつより頻繁に使用されているドキソルビシン（アドリアマイシン）とは対照的に、アントラサイクリン誘導の心毒性が臨床的に自明になる蓄積量がより高いことである。タキサンは、乳癌を治療するための薬物一式の中でも重要な化学療法薬であることが速やかに確立されている。２５対の処置前後生検対における発現プロファイルが、低密度ｃＤＮＡアレイ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）によって、そしてオリゴヌクレオチドマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）の使用によって得られている。
【００９７】
スチューデントのｔ検定を適用することによって２５対のデータを分析したところ、発明者らは、乳房腫瘍治療後に不明確に刺激される遺伝子がごくわずかであることを見出した。さらにいくつか多くの遺伝子が、分析された患者のうち少なくとも一部で、処置の２４時間後に上方／または下方制御されていることが見出された。その後の分類のための識別的最少遺伝子セットを開発するために、データセットに部分最少判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）およびステップダウン順列（ｓｔｅｐ−ｄｏｗｎ  ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）法を適用した。ＰＬＳ−ＤＡは、データセット全体からの約２５の転写産物に基づいて、処置前後の試料を識別することができる。
【００９８】
処置後の試料では、４７９の遺伝子が上方制御されていることが判明した。これらの遺伝子の主要な範疇には、コラーゲン、エラスチン、フィラミンなどの細胞骨格／構造タンパク質、線維芽細胞因子、および受容体、細胞接着／細胞外マトリックスならびにいくつかの増殖停止タンパク質、およびＤＮＡ損傷誘導タンパク質（例えば、ＧＡＳ６、ＧＡＤＤ４５Ｂ）が含まれる。抑制された遺伝子は、リボソームタンパク質、ヌクレオチドおよびタンパク質合成、プロセシング、転写因子、ならびにいくつかの発癌遺伝子（例えば、ｃ−ｍｙｃ、Ｋ−ｒａｓ、ｂｃｌ−２）のグループなど、いくつかの主要グループに細分することができよう。
【００９９】
ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１発現プロファイルに類似した発現をする遺伝子を同定するために、ｋ−平均クラスタリング分析を行った。
【０１００】
治療によって発現が誘導される遺伝子を同定するために、２５人の患者の処置前および処置後乳癌生検試料のプロフィールを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＡｔｌａｓ（商標）ヒト癌１．２低密度ｃＤＮＡアレイを用いて取得した。
【０１０１】
発明者は、５０の生検試料を、５０の試料のうち少なくとも６つにおいて平均レベルで発現されていると得点付けされた２４９の遺伝子について測定されたそれらの類似性に基づいて分類するために階層的クラスタリングアルゴリズム［（６５、６６）］を用いた。これらの分析に基づいて、以下の観測を行うことができた。第１に、９０％を超える事例において、処置前後生検対が共にクラスタリングされた。これは、同じ腫瘍から得られた組織試料の発現パターンが、別の患者から得られる個体間分散によって観測されるものより、保存性の強い発現パターンを示すことを反映している。第２に、異なった腫瘍間では、発現パターンが有意に異なっていた。第３に、腫瘍試料は、階層的クラスタリングによって、それらのＥＲ状態にかかわらず表４に提示する３つ主要なサブクラスに細分される。
【０１０２】
２次元元遺伝子クラスタリングによって分析された発現データは、類似の発現レベルを有する遺伝子が縦軸上に共に分類され、腫瘍試料が、それらの全域的発現プロファイルに従って横軸上にクラスタリングされている。
【０１０３】
性質検査および予備選択された２４９の遺伝子は、遺伝子発現に相関性がある個別のクラスターを形成した。１つのクラスター内の遺伝子は、内皮細胞およびＢリンパ球で代表的な遺伝子の発現を反映した。これは、腫瘍組織内へのリンパ球浸潤の可能性を示す。第２の遺伝子クラスターは、ＭＹＣ、ＶＥＧＦ、およびＭＹＢなどの発癌遺伝子および成長因子からなる。さらに別のクラスターは、遺伝子ｖ−ｅｒｂ−ｂ２／ＨＥＲ２、ケラチン１９、１８を含み、これらは、ある種の乳房腫瘍で別々に発現されていることも知られている。第４のクラスターは、ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１およびＭＩＣ１（前立腺分化因子）と相関した発現を有する遺伝子のグループを含んでいる。第５の際だった遺伝子クラスターは、細胞周期制御および細胞増殖に関与する遺伝子である。これら５つの部分集団の遺伝子は、所与の薬物による影響の結果である主要な発現現象を反映するものである。
【０１０４】
発明者らはさらに、２５対の乳癌試料のうち１０対の遺伝子発現を、２２２８４配列のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社オリゴヌクレオチドマイクロアレイへの、抽出されたＲＮＡのハイブリダイゼーションを用いて分析した。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のアレイを用いた実験で以前に使用した、同じ全ＲＮＡのアリコートをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のアレイで分析した。チップ表面にハイブリッド形成する４９０６の転写産物の発現は、すべての生検試料で信頼性をもって検出された。製造会社の分析ソフトウェアであるＭＡＳ５．０と、すべての対試料で用いた精度管理シグナル「ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｃａｌｌ」とによれば、１０対のうち少なくとも１対で、１５１２２の転写産物を検出することができ、７１６１の転写産物を検出することができなかった（実施例４を参照）。
【０１０５】
１０対の処置前後癌生検対における遺伝子発現の教師なし解析を、ＨＧ−１３３Ａ  ＧｅｎｅＣｈｉｐの全内容物である６９８０配列の精度検査済み遺伝子セットに基づいて行った。精度管理および遺伝子の選択は、個々のアレイにおけるシグナル強度レベルと、信頼できる検出とに基づいて行った。階層的クラスターアルゴリズムによって、以前に観測されたものを除いて、１０人の患者すべての処置前および処置後生検を順序づけた。これは、フィルターアレイから選択された２４９の遺伝子とは対照的に、より多数の配列がこの分析に用いられたことによる可能性がある。このように遺伝子、ならびに推定上の細胞機序および経路の被覆率が高いことによって、共にクラスタリングされる試料対の率が高くなっている。
【０１０６】
差次的発現遺伝子の同定。処置前および処置後試料で差次的に発現された転写産物を同定するために、対応のあるｔ検定を用いた。２４９の発現遺伝子を選択した後、ＥＣもしくはＥＴ治療下において高頻度で発現の増強または減少を示した１９遺伝子のグループを同定さした（スチューデントのｔ検定、Ｐ＜０．０５）。表３は、両方の治療群に関して、化学療法の最初の２４ｈ以内に多数の試料対において、＞１．８または＜０．６の比率でかなり差次的に調節されていた遺伝子を示す。調節された転写産物の変化倍率の範囲は広く、これはおそらく患者間の多様性を反映したものである。すべての処置後試料の９５％超で、サイクリン依存性キナーゼ抑制因子１（ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）および前立腺分化因子（ＭＩＣ−１）の２つの遺伝子が上方制御されていた。
【０１０７】
遺伝子発現への処置の影響を同定するために、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社ＧｅｎｅＣｈｉｐシステムを用いて得られた発現データで同じ分析を行ったところ、高頻度で調節されている３７遺伝子のグループを同定した（表３）。フィルターアレイへの遺伝子のハイブリダイゼーションで得られたデータでも見られたように、処置後試料中では、ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１およびＭＩＣ−１が最も顕著に上方制御されていた。しかし、ＭＩＣ−１で検出された相対シグナル強度は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のアレイよりＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のシステムで低かった。
【０１０８】
患者の疾病転帰の予測を取り扱った以前の出版物とは異なり、発明者らは、処置直後に発現レベルが変化するであろう遺伝子を、患者の反応に関する追加情報を分析に適用せずに同定することを目指した。この研究用には、本発明者らは、処置開始直後の発現の相違を選択した。増殖、ＤＮＡ修復、およびアポトーシスなどの重要な細胞過程は、化学療法に曝露した後、最大４８時間までの間に起こることが多い［（１０１、１０２）］。
【０１０９】
それにもかかわらず、適切な統計的分析によって、治療前後の生検で差次的に発現されている遺伝子を同定することができ、反応性の腫瘍と、非反応性の腫瘍とが区別される。
【０１１０】
本発明の一部である生物学的に重要な遺伝子
表１に記載の遺伝子の一部は、生物学的細胞過程を表すものであり、類似した遺伝子調節を特徴とする。以下の例に限定されるものではないが、例として、表１にあるいくつかの特徴的な遺伝子について、以下により詳細に記述する。
【０１１１】
ＥＲＣＣ１
ＥＲＣＣ１は、「チャイニーズハムスターにおける修復障害を補完する除去修復」を表すものとしてそのように命名された。色素性乾皮症細胞のように、様々なＤＮＡ損傷試薬に感受性であって、ＤＮＡ修復初期の切断過程に障害がある変異型チャイニーズハムスター卵巣細胞に、下記のＤＮＡ媒介遺伝子導入を行った。この結果得られた形質転換体は、ＤＮＡ損傷試薬に対して正常な耐性を示し、独立した形質転換体は、ヒトＤＮＡ修復遺伝子に関連した共通のセットのヒトＤＮＡ配列を示した。ホモ接合変異体ネズミは、出産時に発育停止し、離乳前に肝不全で死亡した。ｐ５３レベルの上昇が、肝臓、脳、および腎臓で検出された。これは、ＤＮＡ損傷をモニターするという、ｐ５３の推定上の役割を支持する。ＥＲＣＣ１遺伝子は、いかなる特定の疾病との関連も見出されておらず、必須であることが間接的に推定されているのみであった。ＸＰＡ、ＥＲＣＣ１、およびＥＲＣＣ４は、損傷認識および開裂活性の両方に関与する三重複合体を形成するタンパク質である。
【０１１２】
ＭＳＨ６（ＧＴＢＰ）
このミスマッチ結合因子は、１００−ｋＤのＭＳＨ２と、ＧＴＢＰ（Ｇ／Ｔ結合タンパク質を表す）と呼ばれる１６０−ｋＤのポリペプチドとのヘテロ二量体の一部である。配列分析は、ＧＴＢＰがＭｕｔＳ相同体ファミリーの新メンバーであると認識した。両タンパク質とも、ミスマッチ特異的な結合に必要であり、これは、いずれかのタンパク質を欠失した腫瘍由来細胞系は、ミスマッチ結合活性も欠失しているという新知見と一致した結果である。ＭｕｔＳタンパク質のすべての相同体は、約１５０アミノ酸の強く保存された領域を含有している。アデニンヌクレオチドに結合するヘリックス−ターン−ヘリックス領域と、Ｗａｌｋｅｒ−Ａモチーフと呼ばれるマグネシウム結合性モチーフとを包含する。ＭｕｔＳ分子のこの部分は、ＡＴＰアーゼ活性を有する。ＭＳＨ２−ＭＳＨ６複合体は、ＡＤＰ結合型であるときに「ｏｎ」（ミスマッチヌクレオチドに結合する）であり、ＡＴＰ結合型であるときに「ｏｆｆ」である。ＡＴＰ加水分解の結果、ミスマッチ結合の回復がもたらされ、一方、ＡＤＰからＡＴＰへの置換の結果、ミスマッチ解離がもたらされる。人々は、ＢＲＣＡＩが、大きな多サブユニットタンパク質、腫瘍抑制因子複合体、ＤＮＡ損傷センサー、およびシグナルトランスデューサの部分であることを見出した。彼らはこの複合体を、「ＢＲＣＡ１関連ゲノム監視複合体」にちなんでＢＡＳＣと命名した。
【０１１３】
子宮内膜癌は、米国で最も一般的な婦人科悪性腫瘍であり、遺伝性非ポリポーシス結直腸癌（ＨＮＰＣＣ）における最も頻繁な結腸外腫瘍である。散発性の子宮内膜癌は通常、ＭＬＨ１プロモーターのメチル化に関連したミクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を示す。生殖系列ＭＳＨ６変異は、ＨＮＰＣＣではまれであるが、子宮内膜癌を患っている複数の構成員を有するいくつかの家族で報告されている。ＭＳＨ２の変異による遺伝性非ポリポーシス結直腸癌の形態をタイプ１（ＨＮＰＣＣ１）；ＭＬＨ１によるものをタイプ２（ＨＮＰＣＣ２）；ＰＭＳ１の変異によるものをタイプ３（ＨＮＰＣＣ３）；ＰＭＳ２の変異によるものをタイプ４（ＨＮＰＣＣ４）；そして、ＭＳＨ６（ＧＴＢＰ）の変異によるものをタイプ５（ＨＮＰＣＣ５）と呼ぶことをここで提案する。
【０１１４】
ＤＤＢ２
ヒト細胞では、紫外線によって誘導されたＤＮＡ損傷の効率的な全域ゲノム修復に、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子を必要とする。ＤＤＢ２（ｐ４８）遺伝子は、紫外線損傷ＤＮＡ結合活性の発現に必要であり、この活性を欠く色素性乾皮症グループＥ細胞のサブセット、すなわちＤＤＢ陰性ＸＰＥでは、変異によってこの遺伝子が破壊されている。ｐ４８ｍＲＮＡレベルは、基底レベルのｐ５３発現に強く依存しており、ＤＮＡ損傷後には、ｐ５３依存的な様式でさらに増強される。さらに、ｐ５３−／−細胞のように、色素性乾皮症グループＥ細胞は、全域的なゲノム修復が欠失している。これらの結果によって、ｐ５３とヌクレオチド除去修復装置との連結部としてｐ４８が同定された。ｐ４８による形質移入は、ハムスター細胞にＵＶ−ＤＤＢを付与し、ゲノムＤＮＡおよび発現遺伝子の非転写鎖からのシクロブタンピリミジン二量体（ＣＰＤ）の除去を促進した。ｐ４８の発現は、非転写から生じたＵＶ誘発性の変異を抑制したが、細胞のＵＶ感受性には影響を与えなかった。結果は、ＤＮＡ修復におけるｐ４８の役割を確定し、変異誘発におけるＣＰＤの重要性を実証し、そして、ヒトにおける癌感受性をよりよく反映させるのに、齧歯動物モデルをどのように改善できるか示唆した。
【０１１５】
ＭＧＭＴ
Ｏ（６）−アルキルグアニンは、ＤＮＡ複製中にチミンと対合するため傾向を有するため、単純なアルキル化変異原によって誘導される、ＤＮＡにおける主要な変異原性および発癌性損傷となっている。ＤＮＡ中のこの付加物は、広範に分布する独特な修復タンパク質であるＯ（６）−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．１．１．６３）によって除去される。このタンパク質は、真の酵素とは異なり、化学量論的２次元反応でアルキル基を損傷部位から受容する。メチル受容残基はシステインである。
【０１１６】
腫瘍ＤＮＡ中のＭＧＭＴプロモーターを、メチル化に特異的なＰＣＲアッセイによって分析し、ＭＧＭＴプロモーターのメチル化がアルキル化剤に対する神経膠腫の反応性に関係するかどうか判定した。ＭＧＭＴプロモーターは、４７人の患者のうちの１９人（４０％）の神経膠腫でメチル化されていた。この新知見は、腫瘍の退縮、ならびに総合的および無疾患の延命と関連している。それは、年齢、ステージ、腫瘍悪性度、または実施状態から独立した、さらに強い予後予測因子であった。
【０１１７】
ポリヌクレオチド
「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドは、一本鎖でも、二本鎖でもよく、「乳癌遺伝子」ポリペプチドのコード配列またはコード配列の相補鎖を含む。ヒト「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする縮重ヌクレオチド配列、ならびに、配列番号１から６５のヌクレオチド配列に少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、好ましくは約７５、９０、９６、または９８％同一な相同ヌクレオチド配列も、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドである。２つのポリヌクレオチド配列間のパーセント配列同一性は、ＦＡＳＴＡアルゴリズムを利用するＡＬＩＧＮなどのコンピュータプログラムを使用して、ギャップ開始ペナルティを−１２、ギャップ伸長ペナルティを−２とするアフィンギャップ探索を用いて決定する。生物学的に活性な「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドの相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子、種相同体、および変種も、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドである。
【０１１８】
ポリヌクレオチドの調製
膜成分、タンパク質、および脂質などの他の細胞成分を含まない天然存在の「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドを単離することができる。ポリヌクレオチドは、細胞に生成させて、標準的な核酸精製技法を用いて単離することも、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの増幅技法を用いて、あるいは自動合成機を用いることによって合成することもできる。ポリヌクレオチドを単離する方法は、日常的なものであり、当技術分野で既知である。単離「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドを得るために、ポリヌクレオチドを得るためのいかなる技法も用いることができる。例えば、「乳癌遺伝子」ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド断片を単離するのに、制限酵素およびプローブを用いることができる。単離ポリヌクレオチドは、少なくとも７０％、８０％、または９０％の割合で他の分子を含まない調製物中にあるものである。
【０１１９】
「乳癌遺伝子」ｃＤＮＡ分子は、鋳型として「乳癌遺伝子」ｍＲＮＡを使用し、標準的な分子生物学技法を用いて生成できる。ｍＲＮＡ単離に反する選択を行わないいかなるＲＮＡ単離技法も、ＲＮＡ試料の精製に利用できる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年（６）；およびＡｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら１９８９年（７）を参照。これら両方を参照により全体として本明細書に援用する。さらに、例えば、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．の１工程ＲＮＡ単離法（１９８９年、米国特許第４８４３１５５号）などの当業者に周知の技法を用いて、大量の組織試料を容易に処理することができる。この開示を参照により全体として本明細書に援用する。
【０１２０】
その後、当技術分野で知られている分子生物学技法、およびＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年（６）などのマニュアルに開示されているものを用いて、「乳癌遺伝子」ｃＤＮＡ分子を複製することができる。ヒトゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれかを鋳型として使用し、ＰＣＲなどの増幅技法は用いて、追加コピーの本発明のポリヌクレオチドを得ることができる。
【０１２１】
別法として、合成化学技法を用いて「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドを合成することもできる。遺伝暗号の縮重によって、「乳癌遺伝子」ポリペプチドまたは生物学的に活性なその変種をコードする代替のヌクレオチド配列の合成が可能となる。
【０１２２】
差次的発現の同定
収集されたＲＮＡ試料中にある、差次的に発現された遺伝子によって産生されたＲＮＡを代表する転写産物は、当業者に周知な様々な方法を利用して同定することができる。差次的に発現された遺伝子に由来するポリヌクレオチド配列を同定するのに、例えば、差次的スクリーニング［Ｔｅｄｄｅｒ，Ｔ．Ｆ．ら、１９８８年（８）］、サブトラクティブハイブリダイゼーション［Ｈｅｄｒｉｃｋ，Ｓ．Ｍ．ら、１９８４年（９）］、そして、好ましくはディファレンシャルディスプレイ（Ｌｉａｎｇ，Ｐ．、およびＰａｒｄｅｅ，Ａ．Ｂ．、１９９３年、米国特許第５２６２３１１号、この開示を参照により全体として本明細書に援用する）を利用することができる。
【０１２３】
差次的スクリーニングでは、ｃＤＮＡライブラリーのデュプリケートスクリーニングを行い、その際、ライブラリーの一方のコピーは、ある細胞型のｍＲＮＡ集団に対応する全細胞ｃＤＮＡプローブでスクリーニングし、ｃＤＮＡライブラリーのデュプリケートコピーは、第２の細胞型のｍＲＮＡ集団に対応する総ｃＤＮＡプローブでスクリーニングする。例えば、一方のｃＤＮＡプローブは、対照の対象から得られた細胞型の全細胞ｃＤＮＡプローブに対応するものでよく、第２のｃＤＮＡプローブは、実験対象に由来する同一細胞型の全細胞ｃＤＮＡプローブに対応するものでよい。一方のプローブにはハイブリッド形成するが、もう一方のプローブにはハイブリッド形成しないクローンは、実験対象対、対照の対象において、対象の細胞型で差次的に発現された遺伝子に由来するクローンを代表するものである可能性がある。
【０１２４】
サブトラクティブハイブリダイゼーション技法では、通常、２種類の異なった源、例えば対照組織および実験組織から採取されたｍＲＮＡの単離と、ｍＲＮＡまたは単離されたｍＲＮＡから逆転写された一本鎖ｃＤＮＡのハイブリダイゼーションと、ハイブリッド形成し、したがって、二本鎖になっている配列すべての除去とを行う。残っているハイブリッド形成していない一本鎖ｃＤＮＡは、２つのｍＲＮＡ源で差次的に発現されている遺伝子に由来するクローンを代表するものである可能性がある。そのような一本鎖のｃＤＮＡは、その後、差次的に発現された遺伝子に由来するクローンを含むライブラリーを構築するための出発物質として使用される。
【０１２５】
ディファレンシャルディスプレイ技法は、周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；実験的な実施形態は、Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．Ｂ．、１９８７年、米国特許第４６８３２０２号に記載されている）を利用した、差次的に発現された遺伝子に由来する配列の同定を可能にする手順を意味する。最初に、当業者に周知の標準的な技法を用いて、単離されたＲＮＡを一本鎖ｃＤＮＡに逆転写する。逆転写酵素反応用のプライマーには、オリゴｄＴ含有プライマー、好ましくは、以下に記述する逆方向プライマータイプのオリゴヌクレオチドが含まれうるが、これらに限定されない。次に、この技法は、以下に記載のものなど、任意の所与の細胞内に存在するＲＮＡ転写物のランダムな部分集団を表すクローンの増幅を可能にするＰＣＲプライマー対を用いる。異なったプライマー対を利用することで、細胞内に存在するｍＲＮＡ転写物それぞれの増幅を可能にする。そのように増幅された転写産物の中から、差次的に発現遺伝子から産生された転写産物を同定することが可能である。
【０１２６】
上記プライマー対の逆方向オリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端に、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テール、またはｍＲＮＡポリ（Ａ）テールから逆転写されたｃＤＮＡの相補鎖にハイブリッド形成するオリゴｄＴヌクレオチド領域を含有するものでもよく、このオリゴｄＴ領域は好ましくは長さ１１ヌクレオチドである。第２に、逆方向プライマーは、その特異性を増強するために、その３’末端に１または複数、好ましくは２ヌクレオチドの追加ヌクレオチドを含有するものでありうる。対象の試料中に存在するｍＲＮＡ由来の配列のうち、そのようなプライマーにハイブリッド形成するものは、統計的に一部のもののみであろうから、ヌクレオチドを追加することで、上記プライマーによって、対象の試料中に存在するｍＲＮＡ由来の配列の一部のみを増幅することが可能となる。これは、増幅された配列を表す各バンドのより正確かつ完全な可視化と、特性付けとを可能にする点で好ましい。
【０１２７】
順方向プライマーは、対象の組織に由来するｃＤＮＡ配列にハイブリッド形成する能力を有することが統計的に予測されるヌクレオチド配列を含有したものでよい。このヌクレオチド配列は恣意的な配列でよく、順方向オリゴヌクレオチドプライマーの長さは、約９から約１３ヌクレオチドまでの範囲でよく、約１０ヌクレオチドが好ましい。恣意的なプライマー配列は、増幅される部分ｃＤＮＡの長さを可変的なものとし、そのため、標準的な変性シークエンシングゲル電気泳動の使用によって、異なったクローンを分離するのを可能にする。ＰＣＲ反応条件は、増幅される産物の収率および特異性が最適となるように選択するべきであり、加えて、標準的なゲル電気泳動技法を用いて分離できる長さの増幅産物を生成するように選択するべきである。そのような反応条件は当業者に周知であり、重要な反応パラメータには、上述の通り、例えばオリゴヌクレオチドプライマーの長さおよびヌクレオチド配列、ならびにアニーリング工程および伸長工程の温度および反応時間が含まれる。２つの異なった細胞型のｍＲＮＡの逆転写過程および増幅の結果生じるクローンのパターンは、シークエンシングゲル電気泳動を介して提示され、比較される。２つのバンドパターンの相違が、差次的に発現されている可能性のある遺伝子を示す。
【０１２８】
完全長ｃＤＮＡを求めてスクリーニングする場合、比較的大きなｃＤＮＡを含むように、サイズ選択されたライブラリーを用いることが好ましい。無作為プライマーでプライミングされたライブラリーは、遺伝子の５’領域を含有する配列をより多く含有しているであろうという点で望ましい。オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーによって完全長ｃＤＮＡが産生されない状況では、無作為プライマーでプライミングされたライブラリーの使用が特に望ましいであろう。ゲノムライブラリーは、５’非転写調節領域にまで配列を伸長させるのに有用でありうる。
【０１２９】
ＰＣＲまたはシークエンシング産物のヌクレオチド配列を分析または確認するのに、市販の毛細管電気泳動系を用いることができる。例えば、電気泳動分離用の流動可能重合体、レーザーによって活性化される４種類の異なった蛍光色素（各ヌクレオチドあたり種類）、および電荷結合素子カメラによる放射波長の検出を利用して、毛細管シーケンシングを行うことができる。出力／光度は、適切なソフトウェア（例えば、ＡＢＩ社のＧＥＮＯＴＹＰＥＲおよびＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社のＳｅｑｕｅｎｃｅ  ＮＡＶＩＧＡＴＯＲ）を用いて電気シグナルに変換することができ、試料の添加からコンピュータ解析および電子データ表示までの全過程を、コンピュータ制御させることができる。毛細管電気泳動は、小さなＤＮＡ片のシーケンシングに特に好ましく、そのような小片は、特定の試料中では限定された量で存在している可能性がある。
【０１３０】
差次的に発現されている可能性のある遺伝子配列が、例えば上述のものなど、大量処理技法で同定されれば、推定上差次的に発現されている遺伝子の差次的発現の実証を行うべきである。実証は、例えば、ノーザン分析および／またはＲＴ−ＰＣＲなどの周知の技法を介して実現できる。実証の際に、差次的に発現されている遺伝子をさらに特徴付けることができ、下記に論じる通り、標的および／またはマーカー遺伝子として同定することができる。
【０１３１】
また、例えばディファレンシャルディスプレイ法を介して得られた、差次的に発現されている遺伝子の増幅配列を、対応遺伝子の完全長クローンを単離するのに使用することができる。対応遺伝子の完全長コード部分は、当技術分野で周知の分子生物学的技法によって、過度の実験をしないでも容易に単離することができる。例えば、差次的に発現、増幅、および単離された断片を標識して、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに用いることができる。別法として、この標識された断片を、ゲノムライブラリーをスクリーニングするのに用いることもできる。
【０１３２】
当業者に周知な標準的な技法を用いて、同定された遺伝子によって産生されたｍＲＮＡの生体内分布の分析を行うことができる。そのような技法には、例えば、ノーザン分析およびＲＴ−ＰＣＲが含まれうる。そのような分析は、同定された遺伝子が、乳癌に寄与すると予測された組織で発現されているかどうかに関する情報を提供する。そのような分析は、定常状態ｍＲＮＡ調節に関する定量的情報を提供し、同定された遺伝子のうちのいずれが、高レベルの調節を、好ましくは乳癌に寄与すると予測される可能性のある組織で示すかに関するデータを生じる可能性がある。
【０１３３】
そのような分析は、所与の組織に由来する特定の細胞型の単離された細胞集団で行ってもよい。加えて、標準的なｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術を用いて、所与の組織内のいずれの細胞が、同定された遺伝子を発現するかに関する情報を得ることができる。そのような分析は、組織内の細胞の部分集団のみが乳癌に関連している考えられる場合、同定された遺伝子の、乳癌に関連した生物機能に関する情報を提供する可能性がある。
【０１３４】
ポリヌクレオチドの伸長
完全長遺伝子配列の同定およびクローニングを行う手順の一実施形態では、標準的手続きに従って、適切な組織または細胞源からＲＮＡを単離することができる。その後、増幅される断片に対応する、上記ｍＲＮＡに相補的な第１鎖合成のプライミング用のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＲＮＡの逆転写過程反応を行うことができる。このプライマーは、上記ｍＲＮＡに対して逆平行なので、伸長はｍＲＮＡの５’末端に向かって続くであろう。その後、この結果生じるＲＮＡハイブリッドに、標準的なターミナルトランスフェラーゼ反応を用いて、グアニンで「テール」を付けることができる。ハイブリッドをＲＮアーゼＨによって消化することができ、その後、ポリＣプライマーを用いて第２鎖合成用のプライミングを行うことができる。２つのプライマーを使用し、ＰＣＲを用いて、遺伝子の５’部分を増幅する。その後、得られた配列を単離し、事前に単離された配列と組換えを行って、本発明の差次的に発現される遺伝子の完全長ｃＤＮＡを生成させる。クローニング戦略および組換えＤＮＡ技法の概観に関しては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（６）；およびＡｕｓｕｂｅｌら（７）を参照のこと。
【０１３５】
様々なＰＣＲベースの方法を用いて、本明細書に開示するポリヌクレオチド配列を伸長させ、プロモーターおよび調節エレメントなどの上流配列を検出することができる。例えば、制限部位ＰＣＲは、万能プライマーを用いて、既知な遺伝子座に隣接する未知配列を回収する［Ｓａｒｋａｒ、１９９３年（１０）］。最初に、リンカー配列に対するプライマーと、既知な領域に特異的なプライマーとの存在下でゲノムＤＮＡを増幅する。増幅された配列を、次に、同一なリンカープライマーと、第１のものの内部に対する別の特異的プライマーを用いて第２ラウンドのＰＣＲを行う。各ラウンドのＰＣＲ産物を、適切なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写し、逆転写酵素を用いて配列決定する。
【０１３６】
既知領域に基づいた多岐にわたるプライマーを用いて、配列を増幅または伸長するのに、インバースＰＣＲを用いることもできる［Ｔｒｉｇｌｉａら、１９８８年（１１）］。プライマーは、例えば、ＯＬＩＧＯ４．０６プライマー分析ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国ミネソタ州Ｐｌｙｍｏｕｔｈ所在）などの市販されているソフトウェアを用いて、例えば、長さが２２３０ヌクレオチドになるように、ＧＣ含量が５０％以上となるように、そして、温度約６８〜７２℃で標的配列にアニールするように、設計することができる。この方法では、いくつかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知領域内で、適当な断片を生成させる。その後、分子内の連結によってこの断片を環状化し、ＰＣＲ鋳型として用いる。
【０１３７】
使用できる別の方法は捕捉ＰＣＲであり、これは、既知なヒト配列および酵母人工染色体ＤＮＡに隣接したＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を行うものである［Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍら、１９９１年（１２）］。この方法では、ＰＣＲを行う前に、遺伝子操作された二本鎖配列をＤＮＡ分子の未知断片中に配置するために、多重制限酵素消化および連結も用いることができる。
【０１３８】
加えて、ゲノムＤＮＡ歩行を行うのに、ＰＣＲ、ネステッドプライマー、およびＰＲＯＭＯＴＥＲＦＩＮＤＥＲライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、米国カリフォルニア州Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ所在）を用いることができる（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、米国カリフォルニア州Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ所在）。この過程は、ライブラリーをスクリーニングする必要性を回避し、イントロン／エキソン接合部を見出すのに有用である。
【０１３９】
同定された遺伝子の配列は、標準的な技法を用いて遺伝地図、例えば、マウス［ＣｏｐｅｌａｎｄおよびＪｅｎｋｉｎｓ、１９９１年（１３）］、ヒト遺伝地図［Ｃｏｈｅｎら、１９９３年（１４）］における遺伝子の位置を決定するのに使用することができる。そのようなマッピング情報は、例えば、既知な遺伝的乳癌傾向がマッピングされている遺伝領域の近くにマッピングされる遺伝子を同定することなどによって、疾病に対するその遺伝子の重要性に関する情報を生み出す可能性がある。
【０１４０】
ポリヌクレオチド変種および相同体またはスプライス変種の同定
上述した「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドの変種および相同体も「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドである。相同体「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチド配列は、通常、当技術分野で知られている通り、候補ポリヌクレオチドを既知な「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリッド形成させることによって同定することができる。例えば以下の洗浄条件、すなわち、２×ＳＳＣ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．１％ＳＤＳ、室温で２回各３０分間；その後、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０ＥＣ１回３０分間；その後、２×ＳＳＣ、室温で２回１０分間を用いて、最大約２５〜３０％までの塩基対ミスマッチを含有している相同体配列を同定することができる。より好ましくは、相同体ポリヌクレオチド鎖は、１５〜２５％の塩基対ミスマッチを含有し、さらにより好ましくは５〜１５％の塩基対ミスマッチを含有する。
【０１４１】
本明細書に開示する「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドの種相同体も、適当なプローブまたはプライマーを作製し、マウス、サル、または酵母など、他の種に由来するｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドのヒト変種は、例えば、ヒトｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることによって同定できる。相同性が１％減る毎に、二本鎖ＤＮＡのＴｍが１〜１．５℃低下することがよく知られている［Ｂｏｎｎｅｒら、１９７３年（１５）］。したがって、配列番号１から６５の配列のうち１つのヌクレオチド配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチドと、推定上の相同体「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドをハイブリッド形成させて、試験ハイブリッドを形成させることによって、ヒト「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドの変種または他の種の「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドを同定することができる。試験ハイブリッドの融解温度を、完全に相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むハイブリッドの融解温度と比較して、試験ハイブリッド中の塩基対ミスマッチの数またはパーセントを計算する。
【０１４２】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件および／または洗浄条件に従って、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドまたはそれらの相補鎖にハイブリッド形成するヌクレオチド配列も「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドである。ストリンジェントな洗浄条件は周知であり、当技術分野で理解されており、また、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（６）に開示されている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、通常、研究対象のハイブリッドについて計算されたＴｍの１２から２０℃低い温度および塩濃度の組合せを選択するべきである。配列番号１から６５の配列のうちの１つのヌクレオチド配列またはその相補配列を有する「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドと、それらのヌクレオチド配列の１つに少なくとも約５０、好ましくは約７５、９０、９６、または９８％同一なポリヌクレオチド配列との間のハイブリッドのＴｍは、例えば、下記の方程式、すなわち、
Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／ｌ）
を用いて計算することができ、式中、ｌ＝ハイブリッドの長さ（塩基対）である［ＢｏｌｔｏｎおよびＭｃＣａｒｔｈｙ、１９６２年（１６）］。
【０１４３】
ストリンジェントな洗浄条件には、例えば、４×ＳＳＣ、６５℃、または５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、２８℃、または０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃が含まれる。高度にストリンジェントな洗浄条件には、例えば、０．２×ＳＳＣ、６５℃が含まれる。
【０１４４】
同定された遺伝子の生物学的機能は、適切なｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムを利用することによって、より直接的に評価することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏシステムには、天然の乳癌体質を示す動物システム、または限定されるものではないが発癌遺伝子の過剰発現を含めたそのような症候を示すように遺伝子操作されている動物システム（例えば、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｒａｓ、ｒａｆ、またはＥＧＦＲ）悪性腫瘍マウスが含まれうるが、これらに限定されない。
【０１４５】
スプライス変種は、同じゲノム領域に由来し、同じプレｍＲＮＡによってコードされており、相同性探索に関して上述したハイブリダイゼーション条件によって同定することができる。同じプレ転写産物のスプライス変種によってコードされる変種タンパク質の特異的な特徴は、相違している可能性があり、これらも、開示した通りにアッセイすることができる。したがって、配列番号１から６５の配列のうちの１つのヌクレオチド配列または相補配列を有する「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドは、配列全体の部分が相違している可能性がある。スプライシングイベントの予測と、プレｍＲＮＡ中の、使用されるアクセプターおよびドナー部位の同定とをコンピュータ化（例えば、ＧＲＡＩＬまたはＧｅｎｏｍｅＳＣＡＮソフトウェアパッケージ）し、それらを当業者によるＰＣＲ法によって確認することができる。
【０１４６】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列である。細胞内に導入されれば、相補的なヌクレオチドは、細胞によって産生される天然の配列と結合して複合体を形成し、転写または翻訳のいずれかを遮断する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも６ヌクレオチドであることが好ましいが、長さが少なくとも７、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ヌクレオチド以上であってもよい。さらに長い配列も使用できる。アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、細胞内の「乳癌遺伝子」遺伝子産物のレベルを改変するために、上述の通り、ＤＮＡコンストラクト中に用意して、細胞に導入することができる。
【０１４７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ、米国特許第５７１４３３１号に記載）、ロック核酸（ＬＮＡ；国際公開第９９／１２８２６号に記載）、またはこれらの組合せでありうる。オリゴヌクレオチドは、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロアミデート、リン酸エステル、カルバメート、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、カルボネート、およびリン酸トリエステルなどの非ホスホジエステルヌクレオチド間連結で、１つのヌクレオチドの５’末端を、別のヌクレオチドの３’末端と共有結合させることによって、手操作で合成することも、自動合成機によって合成することもできる［Ｂｒｏｗｎ、１９９４年（４６）］。
【０１４８】
「乳癌遺伝子」の対照、５’、または調節領域と二本鎖形成するであろうアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することによって、「乳癌遺伝子」発現の改変を行うことができる。転写開始部位、例えば開始部位から−１０の位置と＋１０の位置との間に由来するオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、「三重らせん」塩基対形成法を用いて抑制を行うこともできる。三重らせん対合は、ポリメラーゼ、転写因子、またはシャペロンの結合に十分な開離を起こす二重らせんの能力の抑制を引き起こすので有用である。三重鎖ＤＮＡを用いた治療上の進歩は、文献［Ｇｅｅら、１９９４年（４７）］に記載されている。転写産物がリボソームに結合するのを阻止することによって、ｍＲＮＡの翻訳を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチドも設計できる。
【０１４９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドと、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドの相補配列との間の複合体形成を成立させるのに、正確な相補性は必要でない。隣接する「乳癌遺伝子」ヌクレオチドに相補的でない連続したヌクレオチドストレッチによってそれぞれ分離されている、例えば２、３、４、または５本以上の、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドに正確に相補的な連続したヌクレオチドストレッチを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、「乳癌遺伝子」ｍＲＮＡに対する十分な標的特異性を提供できる。相補的な連続したヌクレオチドストレッチは、それぞれ、長さが少なくとも４、５、６、７、または８ヌクレオチド以上であることが好ましい。相補的でない介在配列は、長さが１、２、３、または４ヌクレオチドであることが好ましい。当業者ならば、１対のアンチセンス−センス対あたりの融点の計算を用いて、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドと特定の「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチド配列との間で許容されるミスマッチの程度を容易に決定することができる。
【０１５０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾は、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドにハイブリッド形成するそれらの能力に影響を与えずに行うことができる。これらの修飾は、アンチセンス分子の内部におけるものであることも、その一端または両端におけるものであることもある。例えば、アミノ基と末端リボースとの間に様々な数の炭素残基コレステリルまたはジアミン部分を付加することによって、ヌクレオチド間リン酸結合を修飾することができる。リボースの代替であるアラビノース、または３’水酸基もしくは５’リン酸基が置換されている３’，５’置換オリゴヌクレオチドなど、修飾塩基および／または糖も、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド中で用いることができる。これらの修飾オリゴヌクレオチドは、当技術分野で周知の方法で調製することができる［Ｕｈｌｍａｎｎら、２０００年（４８）］。
【０１５１】
リボザイム
リボザイムは、触媒能を有するＲＮＡ分子である［ＣｏｕｔｕｒｅおよびＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ、１９９６年（４９）］。リボザイムは、当技術分野で知られている通り、ＲＮＡ配列を切断することによって、遺伝子機能を抑制するのに用いることができる（例えば、Ｈａｓｅｌｏｆｆら、米国特許第５６４１６７３号）。リボザイムの作用機構は、相補的な標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的ハイブリッド形成と、それに続くヌクレオチド鎖切断とが関与するものである。それらの例には、特定のヌクレオチド配列の特異的かつ効率的なヌクレオチド鎖切断を触媒できる遺伝子操作されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子が含まれる。
【０１５２】
「乳癌遺伝子」ゲノム遺伝子座から転写されたｍＲＮＡに特異的に結合するリボザイムを生成させるのに、「乳癌遺伝子」の転写配列を用いることができる。高い配列特異性でトランスに他のＲＮＡ分子を切断できるリボザイムを設計および構築する方法が当技術分野で開発され、記載されている［Ｈａｓｅｌｏｆｆら、１９８８年（５０）］。例えば、リボザイム中に別個な「ハイブリダイゼーション」領域を構築することによって、特定のＲＮＡを、リボザイムの切断活性の標的とすることができる。ハイブリダイゼーション領域は、標的ＲＮＡに相補的な配列を含有し、したがって、標的と特異的にハイブリッド形成する［例えば、Ｇｅｒｌａｃｈら、欧州特許第０３２１２０１号参照］。
【０１５３】
以下の配列、すなわちＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣを含めたリボザイム切断部位を求めて標的分子をスキャンすることによって、「乳癌遺伝子」ＲＮＡ標的内の特定のリボザイム切断部位を同定することができる。それが同定されたならば、切断部位を含有する標的ＲＮＡ領域に対応する１５から２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、標的を作用不能にしうる２次構造特性に関して評価することができる。候補「乳癌遺伝子」のＲＮＡ標的の適性も、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへの接触性を試験することによって、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイを用いて、評価することができる。標的のハイブリダイゼーション配列の親和性を増強するために、より長い相補配列を用いることもできる。リボザイムのハイブリッド形成領域および切断領域は、相補的な領域を介して標的ＲＮＡにハイブリッド形成する際にリボザイムの触媒領域が標的を切断できるように一体化させることができる。
【０１５４】
リボザイムは、ＤＮＡコンストラクトの一部として細胞に導入することができる。微量注入、リポソーム媒介形質移入、エレクトロポレーション、またはリン酸カルシウム沈殿などの機械的方法を用いて、リボザイムを含有するＤＮＡコンストラクトを、「乳癌遺伝子」発現の低減が望ましい細胞内に導入することができる。別法として、細胞がＤＮＡコンストラクトを安定的に保持することが望ましい場合には、当技術分野で知られている通り、コンストラクトをプラスミド上に供給し、別々なエレメントとして、あるいは細胞ゲノム中に組み込んで維持することができる。リボザイムをコードするＤＮＡコンストラクトは、細胞内におけるリボザイムの転写を制御するために、プロモーターエレメント、エンハンサー、またはＵＡＳエレメント、および転写ターミネーターシグナルなどの転写制御エレメントを含むことができる。
【０１５５】
Ｈａｓｅｌｏｆｆら、米国特許第５６４１６７３号で教示されている通り、標的遺伝子の発現を誘導する因子に反応してリボザイム発現が起こるように、リボザイムを遺伝子操作することができる。追加のレベルの調節を提供して、それによって、リボザイムおよび標的遺伝子の両方が細胞内に導入されたときのみにｍＲＮＡ破壊が起こるように、リボザイムを遺伝子操作することができる。
【０１５６】
ポリペプチド
本発明による「乳癌遺伝子」ポリペプチドは、配列番号６６から１３０までから選択されたポリペプチド、または配列番号１から６５のポリヌクレオチド配列のいずれかによってコードされるポリペプチド、ならびにその誘導体、断片、類似体、および相同体を含む。したがって、本発明の「乳癌遺伝子」ポリペプチドは、「乳癌遺伝子」ポリペプチドのすべてまたは一部を含む部分、完全長、または融合タンパク質でありうる。
【０１５７】
タンパク質精製
「乳癌遺伝子」ポリペプチドは、「乳癌遺伝子」発現コンストラクトで形質移入された宿主細胞を含めた、対応するタンパク質を発現する任意の細胞から精製することができる。精製された「乳癌遺伝子」ポリペプチドは、特定のタンパク質、糖質、または脂質など、細胞内で通常は「乳癌遺伝子」ポリペプチドに随伴している他の化合物から、当技術分野で周知な方法を用いて分離されている。そのような方法には、サイズ排除クロマトグラフィー、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および調製用ゲル電気泳動が含まれるが、これらに限定されない。精製された「乳癌遺伝子」ポリペプチドの調製物は、純度が少なくとも８０％であり、上記調製物は、好ましくは、純度が９０％、９５％、または９９％である。調製物の純度は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動など、当技術分野で知られている任意の方法で評価することができる。
【０１５８】
ポリペプチドの取得
「乳癌遺伝子」ポリペプチドは、例えば、ヒト細胞から精製することによって、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドの発現によって、あるいは直接的化学合成によって得ることができる。
【０１５９】
生物学的に活性な変種
生物学的に活性な「乳癌遺伝子」ポリペプチド変種、すなわち「乳癌遺伝子」活性を保持するポリペプチド変種も、「乳癌遺伝子」ポリペプチドと考えることができる。天然に存在または非存在の「乳癌遺伝子」ポリペプチド変種は、配列番号６６から１３０のポリペプチドのアミノ酸配列、または配列番号１から６５のポリヌクレオチドのいずれか、もしくはその断片によってコードされるポリペプチドのいずれに少なくとも約６０、６５、または７０％、好ましくは７５、８０、８５、９０、９２、９４、９６、または９８％同一なアミノ酸配列を有する。
【０１６０】
パーセント同一性の差異は、例えば、アミノ酸置換、挿入、または欠失によるものでありうる。アミノ酸置換は、１対１のアミノ酸置換として定義する。置換されたアミノ酸が、類似した構造的および／または化学的特性を有する場合、それらの性質が保存される。イソロイシンもしくはバリンによるロイシンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換、またはセリンによるトレオニンの置換が保存的置換の例である。
【０１６１】
アミノ酸挿入またはアミノ酸欠失は、アミノ酸配列への、あるいはアミノ酸配列内の変化である。それらは、通常、約１から５アミノ酸の範囲にある。「乳癌遺伝子」ポリペプチドの生物学的または免疫学的活性を損なわずに、どのアミノ酸残基を置換、挿入、または除去できるかを決定する際の手引きは、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアなどの当技術分野で周知のコンピュータプログラムを用いて得ることができる。アミノ酸変化の結果、生物学的に活性な「乳癌遺伝子」ポリペプチドが生じるかどうかは、例えば下記の特定の実施例に記載する「乳癌遺伝子」活性のアッセイによって容易に判定することができる。より大きな挿入または欠失も、選択的スプライシングによって起こりうる。タンパク質の主要活性に変化を与えずに、タンパク質ドメインを挿入または除去することができる。
【０１６２】
融合タンパク質
融合タンパク質は、「乳癌遺伝子」ポリペプチドアミノ酸配列に対する抗体を産生させる際、および様々なアッセイシステムで使用する際に有用である。例えば、「乳癌遺伝子」ポリペプチドの部分と相互作用するタンパク質を同定するのに、融合タンパク質を用いることができる。この目的には、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、または、酵母二重ハイブリッド法もしくはファージディスプレイシステムなどの、ライブラリーベースのタンパク質間相互作用アッセイを用いることができる。そのような方法は当技術分野で周知であり、また、それらを薬物スクリーニングとして用いることもできる。
【０１６３】
「乳癌遺伝子」ポリペプチド融合タンパク質は、ペプチド結合によって１つに融合した２つのポリペプチドセグメントを含む。第１のポリペプチドセグメントは、配列番号１から６５のうちのいずれかのポリヌクレオチド配列、または、上述したものなど、生物学的に活性な変種によってコードされる少なくとも２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、または７５０の連続したアミノ酸からなるアミノ酸配列を含む。第１のポリペプチドセグメントは、完全長の「乳癌遺伝子」も含みうる。
【０１６４】
第２のポリペプチドセグメントは、完全長タンパク質でも、タンパク質断片でもよい。融合タンパク質の構築に一般的に使用されているタンパク質には、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含めた自己蛍光タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）が含まれる。さらに、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグを含めたエピトープタグが融合タンパク質コンストラクト中で使用されている。他の融合コンストラクトには、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓタグ、Ｌｅｘ  ａ  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合体、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン融合体、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合体が含まれうる。異種部分から「乳癌遺伝子」ポリペプチドを切断および精製できるように、「乳癌遺伝子」ポリペプチドコード配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含有するように融合タンパク質を構築することもできる。
【０１６５】
融合タンパク質は、当技術分野で知られている通り、化学的合成できる。融合タンパク質は、２つのポリペプチドセグメントを共有結合によって連結させるか、分子生物学分野の標準的手順によって産生させることが好ましい。組換えＤＮＡ法を用いて、例えば、配列番号１から６５のポリヌクレオチド配列のいずれかから選択されたコード配列を、第２のポリペプチドセグメントをコードするヌクレオチドと共に適切なリーディングフレーム中に含むＤＮＡコンストラクトを作製し、このＤＮＡコンストラクトを、当技術分野で知られている通り、宿主細胞内で発現することによって、融合タンパク質を調製することができる。融合タンパク質を構築するためのキットは、Ｐｒｏｍｅｇａ社（米国ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ所在）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（米国カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ所在）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社（米国カリフォルニア州Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（米国カリフォルニア州Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社（ＭＩＣ；米国マサチューセッツ州Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ）、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（カナダＭｏｎｔｒｅａｌ；１−８８８−ＤＮＡ−ＫＩＴＳ）などの会社から多数販売されている。
【０１６６】
種相同体の同定
ヒト「乳癌遺伝子」ポリペプチドの種相同体は、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチド（下に記載）を用いて、マウス、サル、または酵母など、他の種に由来するｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングするのに適したプローブまたはプライマーを作製し、「乳癌遺伝子」ポリペプチドの相同体をコードするｃＤＮＡを同定し、当技術分野で知られている通り、ｃＤＮＡを発現することによって取得できる。
【０１６７】
ポリヌクレオチドの発現
「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドを発現させるために、上記ポリヌクレオチドを、挿入コード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有する発現ベクターに挿入することができる。当業者に周知の方法は用いて、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列と、適切な転写および翻訳制御エレメントとを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技法、合成技法、およびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子組換えが含まれる。そのような技法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（６）、およびＡｕｓｕｂｅｌら（７）に記載されている。
【０１６８】
「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列を含有および発現させるために、様々な発現ベクター／宿主系を用いることができる。これらには、組換え体のバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、プラスミドＤＮＡ発現ベクター、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞システム、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ；またはタバコモザイク病ウイルス（ＴＭＶ））、または細菌発現ベクター（例えばＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞システム、あるいは動物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６９】
制御エレメントまたは調節配列は、ベクターのエンハンサー領域、プロモーター領域、ならびに５’および３’の非翻訳領域であって、それらの領域が宿主細胞タンパク質と相互作用して転写および翻訳を行う。そのようなエレメントの強度および特異性は様々でありうる。利用するベクターシステムおよび宿主に応じて、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターを含めた、様々な適当な転写エレメントおよび翻訳エレメントを用いることができる。例えば、細菌システムにクローニングする場合には、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、米国カリフォルニア州所在）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）のハイブリッドｌａｃＺプロモーターなどの誘導性プロモーターを用いることができる。昆虫細胞では、バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターを用いることができる。植物細胞のゲノムに由来するプロモーターもしくはエンハンサー（例えば、熱ショック、ＲＵＢＩＳＣＯ、および貯蔵タンパク質遺伝子）、または植物ウイルスに由来するもの（例えば、ウイルスのプロモーターまたはリーダー配列）を、ベクターにクローニングすることができる。哺乳類細胞システムでは、哺乳類遺伝子または哺乳類ウイルスからのプロモーターが望ましい。「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を複数コピー含有する細胞系の作製が必要である場合には、適当な選択的マーカーを有する、ＳＶ４０ベースまたはＥＢＶベースのベクターを用いることができる。
【０１７０】
細菌性および酵母発現系
細菌システムでは、「乳癌遺伝子」ポリペプチドに意図されている使用に応じて、発現ベクターの数を選択することができる。例えば、抗体を誘導するのに大量の「乳癌遺伝子」ポリペプチドが必要である場合、容易に精製される融合タンパク質の高レベル発現を指示するベクターを用いることができる。そのようなベクターには、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）などの多機能大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローニングおよび発現ベクターが含まれるが、これらに限定されない。ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴベクターでは、ハイブリッドタンパク質が産生されるように、アミノ末端のＭｅｔとそれに続く７残基のβ−ガラクトシダーゼとをコードする配列とインフレームとなるように「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列をベクター中に連結することができる。ｐＩＮベクター［Ｖａｎ  ＨｅｅｋｅおよびＳｃｈｕｓｔｅｒ（７５）］またはｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社、米国ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）も、外来のポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現するのに使用できる。一般的には、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させて、それに続いて、遊離グルタチオンの存在下で溶出させることによって、溶解した細胞から容易に精製することができる。そのようなシステムで生成されたタンパク質は、クローニングした注目のポリペプチドをＧＳＴ部分から自在に放出できるように、ヘパリン、トロンビン、または第Ｘａ因子のプロテアーゼ切断部位を含むように設計することができる。
【０１７１】
出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）では、アルファ因子、アルコール酸化酵素、およびＰＧＨなど、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含有する多数のベクターを用いることができる。概説には、Ａｕｓｕｂｅｌら（７）を参照のこと。
【０１７２】
植物および昆虫発現系
植物発現ベクターを使用する場合、多数のプロモーターのいずれかによって、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列を発現させることができる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターおよび１９Ｓプロモーターなどのウイルスプロモーターを、単独で、あるいはＴＭＶのオメガリーダー配列と組み合わせて用いることができる［Ｔａｋａｍａｔｓｕ、１９８７年（２２）］。別法として、ＲＵＢＩＳＣＯのスモールサブユニットまたはヒートショックプロモーターなどの植物プロモーターを用いることができる［Ｗｉｎｔｅｒら、１９９１年（２３）］。直接的なＤＮＡ形質転換によって、あるいは病原体の媒介による形質移入によって、コンストラクトをこれらの植物細胞内に導入することができる。そのような技法は、一般に閲覧可能な概説に記載されている。
【０１７３】
昆虫システムも、「乳癌遺伝子」ポリペプチドを発現するのに使用できる。例えば、そのようなシステムの１つでは、外来遺伝子をヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞またはイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）幼虫で発現するのに、オートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして用いる。ポリヘドリン遺伝子など、このウイルスの非必須領域に「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列をクローニングし、それをポリヘドリンプロモーターの制御下に置くことができる。「乳癌遺伝子」ポリペプチドの挿入に成功すれば、ポリヘドリン遺伝子を不活性化して、コートタンパク質を欠失した組換え体ウイルスを生成するであろう。その後、「乳癌遺伝子」ポリペプチドを発現させることのできるヨトウガ細胞またはイラクサギンウワバ幼虫を感染させるのに、この組換え体ウイルスを使用することができる［Ｅｎｇｅｌｈａｒｄら、１９９４年（２４）］。
【０１７４】
哺乳類発現系
多数のウイルスベースの発現系が、哺乳類宿主細胞内で「乳癌遺伝子」ポリペプチドを発現させるのに使用できる。例えば、アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、後期プロモーターおよびトリパータイトリーダー配列を含むアデノウイルス転写／翻訳複合体に、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列を連結することができる。このウイルスゲノムの非必須領域であるＥ１またはＥ３領域への挿入を用いて、感染した宿主細胞で「乳癌遺伝子」ポリペプチドを発現できる生存ウイルスを取得することができる［ＬｏｇａｎおよびＳｈｅｎｋ、１９８４年（２５）］。望ましい場合には、哺乳類宿主細胞での発現を増強するのに、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いることもできる。
【０１７５】
プラスミドで含有および発現させることのできるものより大きなＤＮＡ断片を送達させるために、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）を利用することもできる。６Ｍから１０ＭのＨＡＣを構築し、従来の送達方法（例えば、リポソーム、ポリカチオンアミノ重合体、またはベシクル）を用いて細胞に送達する。
【０１７６】
「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を実現するために、特異的な開始シグナルを用いることもできる。そのようなシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列と、その開始コドンおよび上流配列とを適切な発現ベクターに挿入する場合、それら他には、いかなる転写制御シグナルも、あるいは翻訳制御シグナルも必要としないであろう。しかし、コード配列またはその断片のみを挿入する場合には、外来性の翻訳調節シグナル（ＡＴＧ開始コドンを含む）を提供するべきである。開始コドンは、挿入配列全体の翻訳を確実にするために、正しいリーディングフレームにあるべきである。外来性の翻訳エレメントおよび開始コドンは、様々な由来のものでよく、天然のものでも、合成のものでもよい。使用される特定の細胞システムに適したエンハンサーを包含させることによって、発現の効率を強化することができる［Ｓｃｈａｒｆら、１９９４年（２６）］。
【０１７７】
宿主細胞
挿入配列の発現を加減する能力、または発現された「乳癌遺伝子」ポリペプチドを望ましい様式でプロセシングする能力によって、宿主細胞系を選択することができる。そのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が含まれるが、これらに限定されない。「プレプロ」型のポリペプチドを切断する翻訳後プロセシングも、正しい挿入、折りたたみ、および／または機能を促進するのに使用できる。翻訳後活性の特定の細胞機構および独特なメカニズムを有する様々な宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、およびＷＩ３８）は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国バージニア州（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９）所在）から入手することができ、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングが確実となるように選択することができる。
【０１７８】
組換え体タンパク質の長期的かつ高収率の生産には、安定的発現が好ましい。例えば、「乳癌遺伝子」を安定的に発現する細胞系は、ウイルスの複製起点および／または内在性発現エレメントと、選択的マーカー遺伝子とを、同一または別個のベクター上に含有するであろう発現ベクターを用いて形質転換することができる。ベクターを導入した後、培地を選択培地に切り換える前に、細胞を濃縮培地中で１２日間増殖させることができる。選択的マーカーの目的は、選択に抵抗性を付与することであり、それが存在することによって、導入された「乳癌遺伝子」配列の発現に成功した細胞の増殖および回収を可能にする。安定的に形質転換された細胞の抵抗性クローンは、その細胞型に適した組織培養技法を用いて増殖させることができる［Ｆｒｅｓｈｎｅｙら、１９８６年（２７）］。
【０１７９】
任意の数の選択系を、形質転換細胞系を回収するのに使用することができる。限定されるものではないが、これらには、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ［Ｗｉｇｌｅｒら、１９７７年（２８）］およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ［Ｌｏｗｙら、１９８０年（２９）］遺伝子が含まれ、これらはそれぞれ、ｔｋ−細胞またはａｐｒｔ−細胞で用いることができる。また、代謝拮抗物質、抗生物質、もしくは除草剤抵抗も、選択の基礎として用いることができる。例えば、ｄｈｆｒはメトトレキサートに対する抵抗性を付与し［Ｗｉｇｌｅｒら、１９８０年（３０）］、ｎｐｔはアミノグルコシド、ネオマイシン、およびＧ４１８に対する抵抗性を付与し［Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、１９８１年（３１）］、ａｌｓおよびｐａｔはそれぞれ、クロルスルフロンおよびフォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼに対する抵抗性を付与する。他の選択可能な遺伝子、例えば、ｔｒｐＢまたはｈｉｓＤが記載されており、ｔｒｐＢは、トリプトファンの代わりに、細胞によるインドールの利用を可能にし、ｈｉｓＤは、ヒスチジンの代わりに、細胞によるヒスチノール（ｈｉｓｔｉｎｏｌ）の利用を可能にする［ＨａｒｔｍａｎおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、１９８８年（３２）］。アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質ＧＵＳ、ならびにルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンなどの可視マーカーを、形質変換体の同定、および特定のベクターシステムに起因する一時的または安定的タンパク質発現の定量化に使用することができる［Ｒｈｏｄｅｓら、１９９５年（３３）］。
【０１８０】
発現および遺伝子産物の検出
マーカー遺伝子発現の存在は、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドも存在していることを示唆するが、その存在および発現を確認する必要がある場合もある。例えば、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列をマーカー遺伝子配列中に挿入する場合、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列を含有する形質転換細胞を、マーカー遺伝子機能の不在によって同定することができる。別法として、マーカー遺伝子を、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列と直列させ、単一のプロモーターの制御下に配置することもできる。誘導または選択に反応したマーカー遺伝子の発現は、通常、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドの発現も示す。
【０１８１】
別法として、当業者に知られている様々な手順によって、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドを含有する宿主細胞および「乳癌遺伝子」ポリペプチドを発現する宿主細胞を同定することもできる。これらの手順には、ポリヌクレオチドまたはタンパク質を検出および／または定量するための、膜、溶液、またはチップベースの技法を含めた、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションと、タンパク質のバイオアッセイ技法またはイムノアッセイ技法とが含まれるが、これらに限定されない。例えば、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の存在は、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのプローブまたは断片を用いた、ＤＮＡ−ＤＮＡもしくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション、または増幅によって検出することができる。核酸増幅ベースのアッセイは、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列から選択されたオリゴヌクレオチドを使用して、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドを含有する形質転換体を検出するものである。
【０１８２】
「乳癌遺伝子」ポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いて、上記ポリペプチドの発現を検出および測定するための様々なプロトコルが当技術分野で知られている。それらの例には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）が含まれる。「乳癌遺伝子」ポリペプチド上の２箇所の非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用したモノクローナルベースの２部位（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ）イムノアッセイを用いることも、競合結合アッセイを用いることもできる。これらおよび他のアッセイは、Ｈａｍｐｔｏｎら（３４）に記載されている。
【０１８３】
広範な標識技法および結合技法が当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイでそれらを用いることができる。「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関連した配列の検出に用いる標識ハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプローブを生成する方法には、オリゴ標識、ニックトランスレーション法、末端標識法、または標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅が含まれる。別法として、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列をベクターにクローニングして、ｍＲＮＡプローブを産生することもできる。そのようなベクターは、当技術分野で知られており、市販されており、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６などの適切なＲＮＡポリメラーゼと、標識されたヌクレオチドとを添加することによって、ＲＮＡプローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成するのに使用できる。これらの手順は、様々な市販キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｐｒｏｍｅｇａ社、およびＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社）を用いて実施できる。適当なレポーター分子、すなわち、検出を容易にするのに使用できる標識には、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、または色素生成物質が含まれ、さらに補因子、抑制物質、磁性粒子、および同様のものも含まれる。
【０１８４】
ポリペプチドの発現および精製
「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、タンパク質の発現、および細胞培養からのタンパク質の回収に適した条件下で培養することができる。形質転換細胞によって生成されたポリペプチドは、使用された配列および／またはベクターに応じて、分泌される場合も、細胞膜内でソーティングされる場合もある。当業者ならば理解するであろうが、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターは、原核細胞または真核細胞の細胞膜を通した可溶性「乳癌遺伝子」ポリペプチドの分泌を指示するシグナル配列、または膜結合型「乳癌遺伝子」ポリペプチドの膜への挿入を指示するシグナル配列を含有するように設計することができる。
【０１８５】
上記に論じた通り、他の構築を用いて、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードする配列を連結することもできる。精製を容易にするそのようなドメインには、固定化された金属上での精製を可能にするヒスチジントリプトファンモジュールなどの金属キレート化ペプチド、固定化された免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、および、ＦＬＡＧＳ伸長／親和性精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ社、米国ワシントン州Ｓｅａｔｔｌｅ所在）で使用されるドメインが含まれるが、これらに限定されない。精製を容易にするために、精製用ドメインと「乳癌遺伝子」ポリペプチドとの間にＸａ因子またはエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ所在）に特異的なものなど、切断可能なリンカー配列を包含させることもできる。そのような発現ベクターの１つは、「乳癌遺伝子」ポリペプチドと、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位に先行する６ヒスチジン残基をコードする核酸とを含有する融合タンパク質の発現を提供するものである。ヒスチジン残基は、ＩＭＡＣ（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｍｅｔａｌ  ｉｏｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による精製を容易にし［Ｐｏｒａｔｈら、１９９２年（３５）］、エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質から「乳癌遺伝子」ポリペプチドを精製する方法を提供する。融合タンパク質を含有するベクターは、Ｋｒｏｌｌら（３６）に開示されている。
【０１８６】
化学合成
「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードしている配列は、当技術分野で周知の化学的方法を用いて、全体として、あるいは部分的に合成することができる［Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら（３７）参照］。別法として、固相技法を用いた直接的ペプチド合成など、アミノ酸配列を合成する化学的方法を用いて、「乳癌遺伝子」ポリペプチド自体を生成させることもできる［Ｐｏｒａｔｈら、１９９２年（３５）］。タンパク質合成は、手動の技法によっても、自動化によっても実施できる。自動化による合成は、例えばＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａペプチドシンセサイザー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を用いて実現できる。所望により、化学的方法を用いて「乳癌遺伝子」ポリペプチドの断片を別々に合成し、結合させて完全長分子を産生することもできる。
【０１８７】
新たに合成されたペプチドは、調製用高速液体クロマトグラフィーによって実質的に精製することができる［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、１９８３年（３９）］。合成された「乳癌遺伝子」ポリペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシング（例えばエドマン分解手順）によって確認することができる。加えて、「乳癌遺伝子」ポリペプチドのアミノ酸配列における任意の部分を直接合成中に改変すること、および／または化学的方法を用いて他のタンパク質に由来した配列と結合させ、変種ポリペプチドまたは融合タンパク質を産生させることが可能である。
【０１８８】
改変ポリペプチドの産生
当業者ならば理解するであろうが、天然に存在しないコドンを有する、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の産生が有利である場合がる。例えば、タンパク質発現の速度を増加させるために、あるいは天然に存在する配列から産生される転写産物の半減期より長い半減期など、望ましい特性を有するＲＮＡ転写物を産生させるために、特定の原核細胞宿主または真核細胞宿主によって好まれているコドンを選択することができる。
【０１８９】
様々な理由から、当技術分野で一般的に知られている方法を用いて、本明細書に開示するヌクレオチド配列を遺伝子操作して、「乳癌遺伝子」配列をコードするポリペプチドの改変を行うことができる。そのような改変には、ポリペプチドまたはｍＲＮＡ産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を変化させる改変が含まれるが、これらに限定されない。ヌクレオチド配列の遺伝子操作を行うのに、遺伝子断片および合成オリゴヌクレオチドのランダム断片化およびＰＣＲ再集合によるＤＮＡシャッフリングを用いることができる。例えば、部位特異的変異導入は用いて、新規の制限部位の挿入、グリコシル化パターンの改変、コドン使用頻度の変更、スプライス変種の産生、変異の導入などを行うことができる。
【０１９０】
予測、診断、および予後判定アッセイ
本発明は、開示の悪性腫瘍バイオマーカー、詳細には乳癌バイオマーカー、すなわち、配列番号１から６５のポリヌクレオチド配列のうちのいずれかを含む開示のポリヌクレオチドマーカー、および／またはそれによってコードされるポリペプチドマーカー、あるいは配列番号６６から１３０のポリペプチド配列のいずれかを含むポリペプチドマーカーを検出することによって、対象が悪性腫瘍、詳細には乳癌を発症する危険にあるかどうかを判定するための組成物、方法、およびキットを提供する。
【０１９１】
臨床適用では、本明細書に同定されたバイオマーカーの存在および／または不在に関して、生物試料をスクリーニングすることができる。そのような試料は、例えば、穿刺生検、外科的切除試料、または血清、細針乳頭吸引液、および尿などの体液である。例えば、これらの方法には、所望によりクリオスタットでの薄切によって分画され、疾患細胞が全細胞集団の約８０％にまで濃縮されている生検の取得が含まれる。特定の実施形態では、当技術分野で周知の技法を用いて、これらの試料から抽出されたポリヌクレオチドを増幅することができる。検出された選択標識の発現レベルは、統計的に有効な疾患試料群と、健常試料群とで比較されるであろう。
【０１９２】
一実施形態では、上記組成物、方法、およびキットは、ノーザンブロット分析、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、免疫沈降反応、ウェスタンブロットハイブリダイゼーション、または免疫組織化学などによって、対象における、開示のマーカーのｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルが異常であるかどうかを判定することを含む。本発明によれば、対象から細胞を取得し、開示のバイオマーカー、タンパク質、またはｍＲＮＡレベルを測定して、健康な対象におけるこれらのマーカーのレベルと比較する。バイオマーカーポリペプチドまたはｍＲＮＡのレベルが異常であれば、それは乳癌などの悪性腫瘍を示している可能性が高い。
【０１９３】
別の実施形態では、上記組成物、方法、およびキットは、サザンブロット分析、ドットブロット分析、蛍光もしくは比色分析、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、比較ゲノムハイブリダイゼーション、または定量的ＰＣＲなどによって、対象における前記遺伝子ＤＮＡまたは前記ゲノム座のＤＮＡ含有量が異常であるかどうか判定することを含む。通常、これらのアッセイは、代表的なゲノム領域に由来するプローブの使用を含む。これらのプローブは、前記ゲノム領域、詳細には、前記遺伝子もしくはゲノム領域の遺伝子内もしくは遺伝子間領域、または前記領域に対する相補的もしくは類似の配列の少なくとも部分を含有している。プローブは、ハイブリダイゼーションによって標的領域に結合できるヌクレオチド配列または類似した機能の配列（例えば、ＰＮＡ、モルフィリノオリゴマー）からなるものでありうる。一般に、前記患者試料中で改変されたゲノム領域を、影響を受けていない対照試料（同一または別の患者から得た正常な組織、影響を受けていない周囲の組織、末梢血）と比較するか、あるいは前記改変を受けておらず、したがって、内部対照として働きうる同一試料のゲノム領域と比較する。好ましい一実施形態では、同じ染色体上に位置する領域を使用する。別法では、ゴノソム領域および／または試料中で量が可変的な特定の領域を使用する。好ましい一実施形態では、ＤＮＡ含量、構造、組成、または改変を別のゲノム領域内のものと比較する。特に好ましい方法は、前記試料のＤＮＡ含量を検出する方法であり、この方法では、標的領域の量が増幅および／または欠失によって改変されている。別の実施形態では、前記試料中の細胞に臨床的側面で影響を与えるか、あるいは病気にさせる多型（例えば一塩基多型または変異）の存在に関して、標的領域を分析する。それらの多型は、診断、予後判定、または、治療上の価値がある。前記臨床的側面に関して、前記試料の特徴的挙動をもたらすハプロタイプを定義するのに、配列変異の同定を用いることが好ましい。
【０１９４】
一実施形態では、悪性腫瘍、詳細には乳癌の予測、診断、または予後判定のための上記組成物、方法、およびキットが、生物試料中の、
（ａ）配列番号１から６５のポリヌクレオチドから選択されたポリヌクレオチド、
（ｂ）（ａ）で特定したポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリッド形成し、表１の配列それぞれに特定したものと同じ生物学的機能を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号６６から１３０のポリペプチドに特定したものと同じ生物学的機能を示すポリペプチドをコードする遺伝暗号を作製したため、その配列が、（ａ）および（ｂ）で特定したポリヌクレオチドから逸脱しているポリヌクレオチド、
（ｄ）表１中の配列それぞれに特定したものと同じ生物学的機能を示すポリペプチドをコードし、（ａ）から（ｃ）までに特定したポリヌクレオチド配列の特定の断片、誘導体、または対立遺伝子変異を表すポリヌクレオチド
の検出によって行われ、（ａ）から（ｄ）までに特定された任意のポリヌクレオチドまたは類似体オリゴマーを、生物試料中のポリヌクレオチド物質にハイブリッド形成させて、それによって、ハイブリダイゼーション複合体を形成させる工程と、前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程とを含む。
【０１９５】
別の実施形態では、悪性腫瘍の予測、診断、または予後判定の方法を上述の通りに行うが、その際、ハイブリダイゼーションを行う前に、生物試料中のポリヌクレオチド物質を増幅する。
【０１９６】
別の実施形態では、悪性腫瘍、詳細には乳癌の予測、診断、または予後判定の方法が、
（ａ）配列番号６６から１３０のポリヌクレオチドから選択されたポリヌクレオチド、
（ｂ）（ａ）で特定したポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリッド形成し、表１の配列それぞれに特定したものと同じ生物学的機能を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）表１中の配列それぞれに特定したものと同じ生物学的機能を示すポリペプチドをコードする遺伝暗号を作製したため、その配列が、（ａ）および（ｂ）で特定したポリヌクレオチドから逸脱しているポリヌクレオチド、
（ｄ）表１中の配列それぞれに特定したものと同じ生物学的機能を示すポリペプチドをコードし、（ａ）から（ｃ）までに特定したポリヌクレオチド配列の特定の断片、誘導体、または対立遺伝子変異を表すポリヌクレオチド、
（ｅ）（ａ）から（ｄ）までに特定されたポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド、
（ｆ）配列番号６６から１３０のうちの任意ポリペプチドを含むポリペプチド、
（ｇ）
の検出によって行われ、（ａ）から（ｄ）までに特定されたポリヌクレオチド、または（ｅ）に特定したポリペプチドと特異的に相互作用する試薬に生物試料を接触させる工程を含む。
【０１９７】
１．ＤＮＡアレイ技法
一態様では、本発明は、ポリヌクレオチドプローブが、組織化されたアレイとしてＤＮＡチップ上に固定されている方法も提供する。リソグラフィーを含めた様々な方法によって、オリゴヌクレオチドを固体支持体に結合させることができる。例えば、チップは最大４１００００までのオリゴヌクレオチドを保持できる（ＧｅｎｅＣｈｉｐ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）。本発明は、単一チップ上にポリヌクレオチドマーカーのアレイを提供することによって試験の信頼度を増大させているので、乳癌などの悪性腫瘍に関する利用可能な試験より有意に優れた利点を提供する。
【０１９８】
この方法には、生物試料の取得を含み、上記生物試料は、罹患者の生検、および血清、尿、血清、または細胞を含有する液体（例えば微細針吸引液に由来するもの）などの体液の使用でありうる。罹患者の生検は、所望により、疾患細胞が全細胞集団の約８０％に濃縮されるようにクリオスタット薄切によって分画される。その後、ＤＮＡまたはＲＮＡを抽出し、増幅し、ＤＮＡチップを用いて分析して、マーカーポリヌクレオチド配列が存在するか、存在しないか判定する。一実施形態では、ポリヌクレオチドプローブを基質上に２次元元行列、すなわちアレイの形態にスポットする。ポリヌクレオチドの試料は標識して、その後、上記プローブにハイブリッド形成させることができる。プローブポリヌクレオチドに結合した標識試料ポリヌクレオチドを含む二本鎖ポリヌクレオチドは、試料中にある結合しなかった部分が洗い流された後に検出できる。
【０１９９】
プローブポリヌクレオチドは、ガラス、ニトロセルロースなどを含めた基質上にスポットすることができる。プローブは、共有結合によって、あるいは、疎水性相互作用などの非特異的な相互作用によって基質に結合させることができる。試料ポリヌクレオチドは、放射性標識、蛍光色素、発色団などを用いて標識することができる。アレイを構築する技法、これらのアレイを使用する方法は、欧州特許第０７９９８９７号、国際公開第９７／２９２１２号、国際公開第９７／２７３１７号、欧州特許第０７８５２８０号、国際公開第９７／０２３５７号、米国特許第５５９３８３９号、米国特許第５５７８８３２号、欧州特許第０７２８５２０号、米国特許第５５９９６９５号、欧州特許第０７２１０１６号、米国特許第５５５６７５２号、国際公開第９５／２２０５８号、および米国特許第５６３１７３４号に記載されている。さらに、アレイは、遺伝子の差次的発現を検査するのに用いることができ、また、遺伝子機能を測定するのに用いることができる。例えば、これらのポリヌクレオチド配列のいずれかが、例えば正常細胞と疾患細胞との間で差次的に発現されているかどうかを確認するのに、このポリヌクレオチド配列のアレイを用いることができる。疾患試料中の特定のメッセージの発現が高く、対応する正常な試料でこれが観測されない場合、それは乳癌特異的なタンパク質を示している可能性がある。
【０２００】
したがって、一態様では、本発明は、配列番号１から６５のポリヌクレオチド配列に特異的なプローブとプライマーを提供する。
【０２０１】
一実施形態では、上記組成物、方法、およびキットは、患者から得た組織中に悪性癌、詳細には乳癌細胞が存在するかどうか決定するための、ポリヌクレオチドプローブの使用を含む。詳細には、上記方法は、
１）配列番号１から６５のポリヌクレオチドから選択されたポリヌクレオチドのコード配列の一部に相補的な長さが少なくとも１２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは２５ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも４０ヌクレオチド、そして、最大、上記コード配列のすべてもしくはほとんどすべてまでのヌクレオチド配列またはそれに相補的な配列を含むポリヌクレオチドプローブを準備する工程と、
２）悪性腫瘍を有する患者から組織試料を取得する工程と、
３）悪性腫瘍をもたない患者からの第２の組織試料を準備する工程と、
４）上記ポリヌクレオチドプローブを、前記１および第２の組織試料それぞれのＲＮＡとストリンジェントな条件下で接触させる（例えば、ノーザンブロットまたはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイで）工程と、
５）（ａ）第１の組織試料のＲＮＡとの上記プローブのハイブリダイゼーション量と、（ｂ）第２の組織試料のＲＮＡとのプローブのハイブリダイゼーションの量とを比較する工程と
を含み、この方法では、第２の組織試料のＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量と比較して、第１の組織試料のＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量に統計的な有意の差異がある場合、それは第１の組織試料における悪性腫瘍、詳細には乳癌の存在を示す。
【０２０２】
２．データ分析
基準発現レベル、例えば、乳癌の疾患細胞または正常な対応細胞における発現レベルと、１つまたは複数の「乳癌遺伝子」の発現レベルとの比較は、コンピュータシステムを用いて行うことが好ましい。一実施形態では、２つの細胞で発現レベルを取得し、これら２セットの発現レベルを、比較用のコンピュータシステムに導入する。好ましい一実施形態では、コンピュータシステムに既に存在しているか、後でコンピュータシステムに導入するコンピュータ読み込み可能な形態の値と比較するために、１セットの発現レベルをコンピュータシステムに導入する。
【０２０３】
一態様では、本発明は、本発明の遺伝子発現プロフィールデータ、または疾患細胞における、少なくとも１つの「乳癌遺伝子」の発現レベルに対応する値のコンピュータの読み込み可能な形態を提供する。この値は、実験、例えば、マイクロアレイ分析から得られたｍＲＮＡ発現レベルでもよい。この値は、多数の条件、例えばＧＡＰＤＨの下で、多数の細胞で発現が一定である基準遺伝子と比較して正規化されたｍＲＮＡレベルでもよい。他の実施形態では、コンピュータ内にある値が、異なった試料間の正規または非正規のｍＲＮＡレベルの比率または相違である。
【０２０４】
遺伝子発現プロフィールデータは、Ｅｘｃｅｌの表など、表の形態のものでよい。データは単独のものでも、より大きなデータベース、例えば他の発現プロフィールを含むものの一部でもよい。例えば、本発明の発現プロフィールデータは、公開データベースの一部でもよい。コンピュータの読み込み可能な形態はコンピュータ内に存在できる。別の実施形態では、本発明は、遺伝子発現プロフィールデータを表示するコンピュータを提供する。
【０２０５】
一実施形態では、本発明は、第１の細胞、例えば対象の細胞における、１つまたは複数の「乳癌遺伝子」の発現レベルと、第２の細胞における発現レベルとの間にある類似性を判定する方法を提供し、この方法は、第１の細胞における１つまたは複数の「乳癌遺伝子」の発現レベルを取得する工程と、第２の細胞における１つまたは複数の「乳癌遺伝子」の発現レベルに対応する値を含む記録を含有するデータベースと、比較用に選択された１つまたは複数の値を、コンピュータ内に保存されているデータと共に受容できるプロセッサー命令、例えばユーザインタフェースとを含むコンピュータにこれらの値を入力する工程とを含む。上記コンピュータは、さらに、比較データを線図もしくは図表または他のタイプの出力に変換する手段を含むものでもよい。
【０２０６】
別の実施形態では、複数の細胞から取得した基準発現レベルを有する１つまたは複数のデータベースを含むコンピュータシステムに、「乳癌遺伝子」の発現レベルを表す値を入力される。例えば、上記コンピュータは、疾患細胞および正常細胞の発現データを含む。命令がコンピュータに与えられ、コンピュータは、コンピュータ内にあるデータと、入力されたデータを比較し、入力されたデータが、正常細胞のデータまたは疾患細胞のデータのいずれにより類似しているかを判定することができる。
【０２０７】
別の実施形態では、コンピュータが、乳癌の異なったステージにある対象の細胞における発現レベルの値を含み、コンピュータは、保存されているデータと、コンピュータに入力された発現データを比較することができ、対象の乳癌のステージを判定するなど、コンピュータ内の発現プロフィールのどれに、入力されたデータが最も類似しているかを示す結果を産生する。
【０２０８】
さらに別の実施形態では、コンピュータ内の基準発現プロフィールが、乳癌の治療に使用されている薬物で、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで処置された、１つまたは複数の対象の乳癌の細胞から得られた発現プロフィールである。上記薬物でｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで処理された、対象の細胞の発現データを入力することによって、コンピュータは、入力されたデータをコンピュータ内のデータと比較するように命令され、コンピュータに入力された発現データが、上記薬物に反応している対象の細胞のデータにより類似しているか、あるいは薬物に反応していない対象の細胞のデータにより類似しているかを示す結果を提供する。したがって、その結果は、対象がその薬物を用いた治療に反応する可能性が高いか、あるいはそれに反応する可能性が低いかを示すものである。
【０２０９】
一実施形態では、本発明は、１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現データを受容する手段と、前記１つまたは複数の遺伝子それぞれから得られた遺伝子発現データを、共通の基準フレームと比較する手段と、比較の結果を表示する手段とを含むシステムを提供する。このシステムは、さらに、データをクラスタリングさせる手段を含んでもよい。
【０２１０】
本発明の一実施形態では、主成分分析（ＰＣＡ）または部分的最少２乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）などの統計的分析を発現データに適用する。ＰＬＳ−ＤＡは、観測（試料）よりはるかに多数の変数（遺伝子）を考慮に入れなければならない場合に優れている。発明者らは、小さな個別の遺伝子セットを審査して、化学療法前および化学療法後の試料を分離するＰＬＳの識別能を評価する、加えて、発明者らは、対試料および２つの処置条件を分離する主要成分の同定を用いて、古典的なＰＣＡアルゴリズムに挑戦した。
【０２１１】
発明者らは、２５の腫瘍試料すべての発現データをＰＣＡおよびＰＬＳ−ＤＡ分析で用いた。第１の反復レベルのＰＬＳ−ＤＡ分析は、以前に階層クラスタリング分析で使用した、確実に発現されている２４９の遺伝子すべてを用いて行った。分析の途上で、両方のＰＬＳ成分を用いて１．８を超えるＶＩＰ（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）を有するというカットオフ基準を満たした遺伝子を選択した。ＳＩＭＣＡ−Ｐ分析ソフトウェアを用いて行った第２反復のＰＬＳ−ＤＡでは、過適合したシステムの作動を回避するため、１．８の閾値を超えるＶＩＰを有する遺伝子（ｎ＝２５）のみを個別に再分析した（遺伝子を表Ｘに示す）。
【０２１２】
以前に記述した遺伝子の統計的抽出に関しては、クラス定義の問題が２に限定されている（９８）ので、単純なｔ検定の使用が絶対的に適切であるが、ＰＬＳ−ＤＡに用いたＶＩＰ評価基準の方が汎用的であり、かつ識別能が高い。データの正規分布は標準的なパラメトリックｔ検定のみに通用する仮定であるが、ＰＬＳ−ＤＡは、データが正規分布していないという問題によって妨害されない。これは、本研究のように比較的少ない数の標本を操作する場合には非常に重要である。
【０２１３】
ＰＣＡでは、化学療法前および化学療法後の全試料が混成的に分散するが、それらは、ＰＬＳ−ＤＡによって明確な領域に分類される。さらに、汎用性を試験するために、並びかえ検定を行った。既存のモデルが、最も予測力の高い選択肢であるかどうか点検する原則として、Ｙ軸切片がＲ２＜０．３かつＱ２＜０．０５となるべきである。Ｒ２線が水平に近い場合には、この試験は、モデルが過適合していることを示す（９９）。並びかえ分析は、現在のモデルが最も高い予測力があることを明らかにした。したがって、化学療法の実施によって個々の試料対それぞれの内部で引き起こされた変化を、ＰＬＳ解析の使用によって同定することが可能であった。しかし、患者に応じて絶対値が異なることは明白である。表３に記載のＶＩＰ値は、選択された２５の遺伝子を伴うモデルに対応し、最適化されていないモデルで得られるものより低い値を示しているが、これは、既に報告されている現象である（１００）。
【０２１４】
別の実施形態では、本発明は、遺伝子発現データを分析するコンピュータプログラムを提供し、このコンピュータプログラムは、（ｉ）複数の遺伝子の遺伝子発現データを入力として受容するコンピュータコードと、（ｉｉ）前記複数の遺伝子それぞれから得られた前記遺伝子発現データを共通の基準フレームと比較するコンピュータコードとを含む。
【０２１５】
本発明は、（ｉ）クエリー細胞における、乳癌に特徴的な１つまたは複数の遺伝子の発現レベルに対応する複数の値を、１つまたは複数の基準細胞の基準発現または発現プロフィールデータおよび細胞型のアノテーションを含む記録を含むデータベースと比較する工程と、（ｉｉ）クエリー細胞がどの細胞に最も類似しているかを、発現プロフィールの類似性に基づいて示す工程とを実行するプログラム命令を含有する機械読み取り可能またはコンピュータ読み込み可能な媒体も提供する。基準細胞は、乳癌の異なったステージにある対象から得られた細胞でよい。基準細胞は、特定の薬物療法に対して反応性または非反応性の対象から得られた細胞でもよく、所望により、上記薬物と共にｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでインキュベートすることができる。
【０２１６】
基準細胞は、いくつかの異なった処置に対して反応性または非反応性の対象から得られた細胞でもよく、コンピュータシステムが、その対象に好ましい処置を示す。したがって、本発明は、乳癌を有する患者の治療を選択する方法を提供し、この方法は、（ｉ）患者の疾患細胞における、乳癌に特徴的な１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを提供する工程と、（ｉｉ）複数の基準プロフィールを提供する工程であって、基準プロフィールのそれぞれが治療に関連しており、対象の発現プロフィールおよび各基準プロフィールが複数の値を有し、上記値のそれぞれが、乳癌に特徴的な遺伝子の発現レベルを表す工程と、（ｉｉｉ）対象の発現プロフィールに最も類似した基準プロフィールを選択し、それによって、前記患者の治療を選択する工程とを含む。好ましい実施形態では、コンピュータによって工程（ｉｉｉ）が実行される。最も類似した基準プロフィールは、対応する発現データに関連した重み値を用いて、複数の比較値に重みづけすることによって選択できる。
【０２１７】
２つの生物試料におけるｍＲＮＡの相対量は、摂動およびその測定規模（すなわち、試験されるｍＲＮＡの２つの供給源で存在量が異なる）として、あるいは無摂動（すなわち、相対的量が同じである）として記録できる。様々な実施形態で、２つのＲＮＡ供給源相互の相違の係数が少なくとも約２５％（一方の供給源からのＲＮＡが、もう一方の供給源からのＲＮＡより２５％多い）、より通常には約５０％、より頻繁には２（２倍多い）、３（３倍多い）、または５（５倍多い）である場合、その相違を摂動として記録する。コンピュータによって、摂動を計算および発現比較に用いることができる。
【０２１８】
摂動を陽性または陰性として認識するのに加えて、摂動の規模を測定すると有利である。これは、上述の通り、差次的標識に使用された２つの蛍光色素の発光の比率を計算することによって、あるいは、当業者に容易に明らかになる類似の方法によって実行できる。
【０２１９】
コンピュータの読み込み可能な媒体は、さらに、乳癌のステージまたは乳癌の治療に関する記述子へのポインタを含んでもよい。
【０２２０】
演算には、ハードウェアまたはハードウェアおよびソフトウェア；コンピュータプログラムによって指示される、本明細書で詳細に特定されているオペレーションを行う、プログラムされたコンピュータの論理回路または他の構成要素；または本明細書に記載した特定の様式でコンピュータを機能させるコンピュータプログラムを表す実行可能な命令でコードされたコンピュータメモリーによって実施される、本発明のシステムのコンテクスト内にある遺伝子発現データを受容する手段、遺伝子発現データを比較する手段、表示の手段、正規化の手段、およびクラスタリングの手段が、本明細書に記載の各機能を備えた、プログラムされたコンピュータと関与しうる。
【０２２１】
本発明のシステムおよび方法は、ＭＳ−ＤＯＳまたはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓを実行するＩＢＭ互換のパーソナルコンピュータを含めた様々なシステムに適用できることを当業者は理解するであろう。
【０２２２】
コンピュータは、外部構成要素に連結された内部構成要素を有してもよい。内部構成要素は、メインメモリーに相互接続されたプロセッサーエレメントを含んでもよい。コンピュータシステムは、２００ＭＨｚまたはより大きなクロックレートのＩｎｔｅｌ  Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）ベースのプロセッサーであって、３２ＭＢ以上のメインメモリーを備えたものでよい。外部構成要素は大容量記憶装置を含んでもよく、それは、１つまたは複数のハードディスク（これは、通常、プロセッサーおよびメモリーと共に包装されている）でありうる。そのようなハードディスクは、通常、１ＧＢ、またはさらに大きな記憶容量のものである。他の外部構成要素には、入力装置と共にユーザインタフェース装置が含まれ、ユーザインタフェース装置はモニターでよく、入力装置は、「マウス」、または他のグラフィック入力装置、および／またはキーボードでよい。印刷装置もコンピュータに装着することができる。
【０２２３】
通常、コンピュータシステムは、ネットワークリンクにも連結される。ネットワークリンクは、他の局在コンピュータシステム、遠隔コンピュータシステム、またはインターネットなどの広域通信網へのイーサネットリンクの部分でありうる。このネットワークリンクは、他のコンピュータシステムとデータおよびプロセシングタスクを共有するコンピュータシステムを可能にする。
【０２２４】
このシステムの演算中に、いくつかのソフトウェア構成要素がメモリーにロードされる。それらには、当技術分野で標準的なものも、本発明に特別なものもある。これらのソフトウェア構成要素は、本発明の方法に従って、集合的にコンピュータシステムを機能させる。これらのソフトウェア構成要素は、通常、大容量記憶装置に保存される。ソフトウェア構成要素はオペレーティングシステムを表し、オペレーティングシステムは、コンピュータシステムとそのネットワーク相互接続を管理する役割を有する。このオペレーティングシステムは、例えば、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ９５、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ９８、またはＷｉｎｄｏｗｓ  ＮＴなど、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社のＷｉｎｄｏｗｓファミリーのものでよい。ソフトウェア構成要素は、本発明に特異的な方法を実施するプログラムを補助する、このシステム上に都合良く存在する共通言語および機能を表す。本発明の解折法をプログラムするのに、多数の高レベルまたは低レベルのコンピュータ言語が使用できる。命令は、実行時間中に解釈されても、またはコンパイルされてもよい。好ましい言語には、Ｃ／Ｃ＋＋、およびＪａｖａ（登録商標）が含まれる。本発明の方法は、数学ソフトウェアパッケージでプログラムするのが最も好ましい。数学ソフトウェアパッケージは、記号による方程式の入力と、使用されるアルゴリズムを含めたプロセシングの高レベルな特異化を可能にし、それによって、個々の方程式またはアルゴリズムを手続きによってプログラムする必要性からユーザを解放する。そのようなパッケージには、Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ社（米国マサチューセッツ州Ｎａｔｉｃｋ所在）のＭａｔｌａｂ、Ｗｏｌｆｒａｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（米国イリノイ州Ｃｈａｍｐａｉｇｎ所在）のＭａｔｈｅｍａｔｉｃａ、Ｍａｔｈ  Ｓｏｆｔ社のＳ−Ｐｌｕｓ（米国マサチューセッツ州Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ所在）が含まれる。したがって、ソフトウェア構成要素は、手続き型言語または記号パッケージでプログラムされた本発明の解折法を表す。好ましい一実施形態では、コンピュータシステムが、乳癌に特徴的な１つまたは複数の遺伝子の発現のレベルを表す値を含むデータベースも含有する。データベースは、様々な細胞における、乳癌に特徴的な遺伝子の１つまたは複数の発現プロフィールを含有しうる。
【０２２５】
例示的実施態様では、本発明の方法を実施するのに、ユーザは発現プロファイルデータを最初にコンピュータシステムにロードする。これらのデータは、モニターとキーボードとからユーザによって直接入力することも、ネットワーク結合によって連結された他のコンピュータシステムから入力することも、ＣＤ−ＲＯＭもしくはフロッピィディスクなどのリムーバブル記憶媒体から入力することも、ネットワークを通して入力することもできる。次に、ユーザは、例えば、同時変動する遺伝子群にクラスタリングして、比較工程を実行する発現プロフィール分析ソフトウェアの実行を引き起こす。
【０２２６】
別の例示的実施態様では、米国特許第６２０３９８７号に記載の方法を用いて発現プロフィールを比較する。ユーザは、最初に、発現プロフィールデータをコンピュータシステムにロードする。Ｇｅｎｅｓｅｔプロフィール定義を、記憶媒体または遠隔コンピュータから、好ましくは動的ｇｅｎｅｓｅｔデータベースシステムからネットワークを介してメモリーにロードする。次に、ユーザは、発現プロフィールを投影発現プロフィールに変換する工程を行う投影ソフトウェアの実行を引き起こす。その後、投影発現プロファイルを表示する。
【０２２７】
さらに別の例示的実施態様では、ユーザは、最初に投影プロフィールをメモリーに導く。その後、ユーザは、メモリーへの基準プロフィールのローディングを引き起こす。次に、ユーザは、プロフィールを客観的に比較する工程を行う比較ソフトウェアの実行を引き起こす。
【０２２８】
３．変種ポリヌクレオチド配列の検出
さらに別の実施形態では、本発明は、配列番号１から６５のポリヌクレオチドのいずれによってコードされるポリペプチドのいずれか１つの異常な活性に関連した、悪性腫瘍、例えば乳癌を発症する素因など、対象が疾患を発症する危険にあるかどうか判定する方法を提供し、ポリペプチドの異常な活性が、
（ｉ）マーカーポリペプチドをコードする遺伝子の完全性に影響を与える改変、または
（ｉｉ）コードしているポリヌクレオチドの誤発現
のうちの少なくとも１つを特徴とする遺伝的損傷の存在もしくは不在を検出することによって特徴付けられる。
【０２２９】
そのような遺伝的損傷は、例えば、
Ｉ．ポリヌクレオチド配列からの１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、
ＩＩ．ポリヌクレオチド配列への１つまたは複数のヌクレオチドの付加、
ＩＩＩ．ポリヌクレオチド配列の１つまたは複数のヌクレオチドの置換、
ＩＶ．ポリヌクレオチド配列の大規模染色体再配列、
Ｖ．ポリヌクレオチド配列のｍＲＮＡ転写物レベルの大規模な改変、
ＶＩ．ゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異常など、ポリヌクレオチド配列の修飾異常、
ＶＩＩ．遺伝子のｍＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、
ＶＩＩＩ．マーカーポリペプチドの非野生型レベル、
ＩＸ．遺伝子のアレル消失、
Ｘ．マーカーポリペプチドの不適切な翻訳後修飾
のうちの少なくとも１つの存在を確かめることによって検出できる。
【０２３０】
本発明は、コードしているポリヌクレオチド配列中の変異を検出するアッセイ技法を提供する。これらの方法には、配列分析、サザンブロットハイブリダイゼーション、制限酵素部位マッピングを用いた方法、ならびに分析されているポリヌクレオチドとプローブとの間のヌクレオチド対合の不在の検出を用いた方法が含まれるが、これらに限定されない。
【０２３１】
特定の疾患または障害、例えば遺伝病または遺伝障害は、特定の遺伝子の多型領域における特定のアレルの変種に関連しているが、それらが必ず変異型タンパク質をコードしているわけではない。したがって、対象における、遺伝子の多型領域での特定のアレル変種の存在は、対象が特定の疾患または障害を発症しやすくする可能性がある。個体集団で遺伝子のヌクレオチド配列を決定することによって、遺伝子内の多型領域を同定することができる。多型領域が同定されたならば、個体、例えば、乳癌など、特定の疾患を発症した個体の特定の集団を研究することによって、特定の疾患との関連を判定することができる。多型領域は遺伝子の任意の領域、例えば、エキソン、エキソンのコード領域または非コード領域、イントロン、およびプロモーター領域に位置することができる。
【０２３２】
例示的実施形態では、ある遺伝子またはその自然発生変異体のセンスまたはアンチセンス配列、あるいは対象の遺伝子またはその自然発生変異体に自然状態で連結している５’もしくは３’隣接配列またはイントロン配列にハイブリッド形成できるヌクレオチド配列の領域を含有するポリヌクレオチドプローブを含むポリヌクレオチド組成物を提供する。細胞のポリヌクレオチドを、ハイブリダイゼーションに接触可能にし、プローブを、試料のポリヌクレオチドと接触させ、試料ポリヌクレオチドへのプローブのハイブリダイゼーションを検出する。欠失、置換などを含めたゲノムレベルまたはｍＲＮＡレベルのいずれかにおける損傷またはアレル変種を検出するのに、また、ｍＲＮＡ転写物のレベルを決定するのに、そのような技法を用いることができる。
【０２３３】
好ましい検出法は、変異または多型部位とのオーバーラップを有し、かつ変異または多型領域を囲む約５、１０、２０、２５、または３０ヌクレオチドを有するプローブを用いたアレル特異的ハイブリダイゼーションである。本発明の好ましい一実施形態では、アレル変種に特異的にハイブリッド形成ができるいくつかのプローブを、固相担体、例えば「チップ」に付着させる。オリゴヌクレオチドを含むこれらのチップを用いた変異検出分析は、「ＤＮＡプローブアレイ」とも呼ばれ、例えばＣｒｏｎｉｎら（４０）に記載されている。一実施形態では、１つのチップが、ある遺伝子の少なくとも１箇所の多型領域にあるすべてのアレルの変種を含む。その後、この固相担体を、試験ポリヌクレオチドと接触させ、特定のプローブへのハイブリダイゼーションを検出する。したがって、単純なハイブリダイゼーション実験で、１つまたは複数の遺伝子の多数のアレル変種のアイデンティティーを同定することができる。
【０２３４】
特定の実施形態では、損傷部位の検出が、アンカーＰＣＲもしくはＲＡＣＥ−ＰＣＲなどのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４６８３１９５号および第４６８３２０２号参照）、あるいは代わりにリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）［Ｌａｎｄｅｇｒａｎら、１９８８年（４１）］におけるプローブ／プライマーの利用を含む。これらのうち後者は、遺伝子内の点突然変異を検出するのに有用な場合がある［Ａｂｒａｖａｙａら、１９９５年（４２）］。単に例示的である実施形態では、上記方法は、（ｉ）患者から細胞の試料を収集する工程と、（ｉｉ）試料の細胞からポリヌクレオチド（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡ、または両方）を単離する工程と、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチド（存在している場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こるような条件下で、ポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリッド形成する１つまたは複数のプライマーと、ポリヌクレオチド試料を接触させる工程と、（ｉｖ）増幅産物の存在または不在を検出するか、あるいは増幅産物のサイズを検出して、その長さを対照試料と比較する工程とを含む。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、変異を検出するのに使用される、本明細書に記載の任意の技法と併せて、予備的な増幅工程として使用するのに望ましいと予測される。
【０２３５】
代替の増幅法には、３ＳＲ（ｓｅｌｆ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）［Ｇｕａｔｅｌｌｉ，Ｊ．Ｃ．ら、１９９０年（４３）］、転写増幅システム［Ｋｗｏｈ，Ｄ．Ｙ．ら、１９８９年（４４）］、Ｑ−βレプリカーゼ［Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍら、１９８８年（４５）］、または、当業者に周知の技法を用いた増幅分子の検出を後で行う任意の他のポリヌクレオチド増幅法が含まれる。これらの検出法は、ポリヌクレオチド分子が非常に少ない数で存在している場合に、そのような分子を検出するのに特に有用である。
【０２３６】
本発明の好ましい一実施形態では、制限酵素切断パターンの変化によって、試料細胞からの遺伝子の中の変異、またはそのアレル変種を同定する。例えば、試料ＤＮＡおよび対照ＤＮＡを単離し、増幅し（所望により）、１つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼで消化し、断片の長さをゲル電気泳動によって測定する。さらに、配列特異的なリボザイム（例えば米国特許第５４９８５３１号参照）を使用して、リボザイム切断部位の発生または減失によって特定の変異の存在を検査することができる。
【０２３７】
４．ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
一態様では、上記方法は、配列番号１から６５のポリヌクレオチド配列のいずれかから選択された配列またはその相補配列を含む所与のマーカーポリヌクレオチドに由来するプローブを用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含む。上記方法は、標識されたハイブリダイゼーションプローブを、悪性腫瘍、詳細には乳癌を有する可能性のある患者から得られた所与のタイプの組織、ならびに悪性腫瘍をもたない人の正常な組織の試料と接触させる工程と、プローブによる患者組織の標識が、正常組織の標識の程度とは有意に異なっている（例えば、係数が少なくとも２、係数が少なくとも５、係数が少なくとも２０、または係数が少なくとも５０）かどうかを判定する工程とを含む。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、組織中の前記細胞の核にあるＤＮＡに対して行っても、転写活性を染色するために、細胞質中のｍＲＮＡに対して行ってもよい。
【０２３８】
ポリペプチドの検出
本発明は、さらに対象から得られた細胞試料が、異常な量のマーカーポリペプチドを保持しているかどうか判定する方法提供し、この方法は、（ａ）対象から細胞試料を取得する工程と、（ｂ）そのように取得された試料中にあるマーカーポリペプチドの量を測定する工程と、（ｃ）そのように測定されたマーカーポリペプチドの量を、既知な標準物質と比較し、それによって、対象から取得された細胞試料が、異常な量のマーカーポリペプチドを保持しているかどうか判定する工程とを含む。そのようなマーカーポリペプチドは、免疫組織化学アッセイ、ドットブロット分析、ＥＬＩＳＡ、および同様のものによって検出できる。
【０２３９】
抗体
当技術分野で知られているいかなるタイプの抗体も、「乳癌遺伝子」ポリペプチドのエピトープに特異的に結合するように生成することができる。本明細書で使用される場合、抗体には、「乳癌遺伝子」ポリペプチドのエピトープに結合できる完全な免疫グロブリン分子と、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖなどのその断片とが含まれる。エピトープを形成するには、通常、連続した少なくとも６、８、１０、または１２アミノ酸が必要である。しかし、不連続のアミノ酸が関与するエピトープは、より多くのアミノ酸、例えば少なくとも１５、２５、または５０アミノ酸を必要としうる。
【０２４０】
「乳癌遺伝子」ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する抗体は、治療、ならびにウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学アッセイ、免疫沈降反応、または当技術分野で知られている他の免疫化学アッセイなどの免疫化学アッセイに用いることができる。様々なイムノアッセイは用いて、望ましい特異性を有する抗体を同定することができる。競合的結合またはイムノラジオメトリックアッセイを行うための、多数のプロトコルが当技術分野で周知である。そのようなイムノアッセイは、通常、免疫原と、この免疫原に特異的に結合する抗体との間の複合体形成を測定するものである。
【０２４１】
通常、「乳癌遺伝子」ポリペプチドに特異的に結合する抗体は、免疫化学アッセイで使用した際に、他のタンパク質を用いて生じる検出シグナルよりも少なくとも５、１０、または２０倍高い検出シグナルを生じるものである。「乳癌遺伝子」ポリペプチドに特異的に結合する抗体は、免疫化学アッセイで他のタンパク質を検出せず、さらに、溶液から「乳癌遺伝子」ポリペプチドを免疫沈降できるものが好ましい。
【０２４２】
「乳癌遺伝子」ポリペプチドは、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、またはヒトなどの哺乳類を免疫化して、ポリクローナル抗体を産生させるのに用いることができる。望ましい場合には、ウシ血清アルブミン、チログロブリン、およびスカシガイヘモシアニンなどの担体タンパク質に「乳癌遺伝子」ポリペプチドを結合させることができる。免疫応答を増強するのに、宿主種に応じて様々なアジュバントを用いることができる。そのようなアジュバントには、フロイントのアジュバント、鉱物ゲル（例えば、酸化アルミニウム三水和物）、および界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、スカシガイヘモシアニン、およびジニトロフェノール）が含まれるが、これらに限定されない。ヒトで使用されているアジュバントの中では、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｉ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびコリネバクテリウム−パルヴムが特に有用である。
【０２４３】
「乳癌遺伝子」ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体は、培養中の継代細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技法を用いて調製できる。これらの技法には、ハイブリドーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法、およびＥＢＶハイブリドーマ技法が含まれるが、これらに限定されない［Ｋｏｈｌｅｒら、１９８５年（５１）］。
【０２４４】
加えて、適切な抗原特異性および生物活性を有する分子を得るために、キメラ抗体の産生するために開発された技法、およびヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシングを用いることができる［Ｔａｋｅｄａら、１９８５年（５２）］。抗体を治療に用いる場合、その抗体に対して患者が免疫応答を開始するのを防止するために、モノクローナル抗体および他の抗体をヒト化することもできる。そのような抗体は、治療で直接使用されるように、配列がヒト抗体に十分類似しているものでもよく、あるいは、いくつかの主要残基の改変を必要とする場合もある。齧歯動物の抗体とヒト配列との間の配列相違は、個々の残基の部位特異的変異誘発によって、ヒト配列中の残基と異なっている残基を置換することによってあるいは、相補性決定領域全体の移植によって最小にすることができる。別法として、英国特許第２１８８６３８号に記載の組換え法を用いて、ヒト化抗体を産生させることもできる。「乳癌遺伝子」ポリペプチドに特異的に結合する抗体は、米国特許第５５６５３３２号に開示されている通り、部分的または完全にヒト化された抗原結合部位を含有できる。
【０２４５】
別法として、当技術分野で知られている方法を用いて、一本鎖抗体の産生に関して記載されている技法を適合させることによって、「乳癌遺伝子」ポリペプチドに特異的に結合する一本鎖抗体を産生させることができる。ランダムなコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーからの鎖シャッフリンブによって、関連した特異性を有するが、イディオタイプ組成の異なった抗体を生成させることができる［Ｂｕｒｔｏｎ、１９９１年（５３）］。
【０２４６】
一本鎖抗体は、ハイブリドーマｃＤＮＡを鋳型として使用し、ＰＣＲなどのＤＮＡ増幅法を用いて構築することもできる［Ｔｈｉｒｉｏｎら、１９９６年（５４）］。一本鎖抗体は、単一特異性または二重特異性にすることができ、二価または４価にすることができる。４価の二重特異性一本鎖抗体の構築は、例えば、ＣｏｌｏｍａおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ（５５）に教示されており、２価の二重特異性一本鎖抗体の構築は、ＭａｌｌｅｎｄｅｒおよびＶｏｓｓ（５６）に教示されている。
【０２４７】
一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列は、手操作または自動のヌクレオチド合成を用いて構築し、標準的な組換えＤＮＡ法を用いて発現コンストラクトにクローニングし、下記の通り、コード配列を発現する細胞の中に導入することができる。別法として、例えば線維状ファージ技術を用いて、一本鎖抗体を直接産生させることもできる［Ｖｅｒｈａａｒら、１９９５年（５７）］。
【０２４８】
「乳癌遺伝子」ポリペプチドに特異的に結合する抗体は、リンパ球集団でｉｎ  ｖｉｖｏ産生を誘導することによっても、あるいは文献に開示されている通り、免疫グロブリンライブラリーまたは高特異性結合試薬のパネルをスクリーニングすることによっても産生できる［ｏｒｌａｎｄｉら、１９８９年（５８）］。
【０２４９】
他のタイプの抗体も構築でき、本発明の方法で治療に使用することができる。例えば、国際公開第９３／０３１５１号に開示されている通り、キメラ抗体を構築することができる。国際公開第９４／１３８０４号に記載の抗体など、免疫グロブリンに由来する多価、多重特異性の結合タンパク質も、調製することができる。
【０２５０】
本発明によると抗体は、当技術分野で周知の方法によって精製することができる。例えば、「乳癌遺伝子」ポリペプチドが結合しているカラムに抗体を通すことによって、抗体を親和性精製することができる。結合した抗体は、その後、高塩濃度の緩衝液を用いてカラムから溶出することができる。
【０２５１】
イムノアッセイは、細胞試料中のタンパク質レベルを定量化するのに一般的に使用されており、他の多数のイムノアッセイ技法が当技術分野で知られている。本発明は、特定のアッセイ手順に限定されず、それゆえに、ホモジーニアスな手順およびヘテロジーニアスな手順の両方を包含するものである。本発明に従って実施できる例示的イムノアッセイには、蛍光偏光免疫測定法（ＦＰＩＡ）、蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＴＡ）、比濁抑制イムノアッセイ（ＮＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が含まれる。指示体部分または標識基を対象の抗体に結合でき、上記方法の様々な使用の必要性を満たすように選択する。そのような必要性は、しばしば、アッセイ機器や適合する免疫検定法手順の利用可能性によって支配される。上述の様々なイムノアッセイを行う際に用いるべき一般技法は当業者に知られている。
【０２５２】
特定の試料中にある特定のタンパク質、タンパク質断片、または改変タンパク質のレベルを定量化する他の方法は、フローサイトメトリー法に基づいたものである。フローサイトメトリーは、蛍光色素標識されたタンパク質特異抗体を用いて、あるいは、未標識の抗体を蛍光色素標識された２次抗体と組み合わせて細胞内タンパク質と同様に、細胞表面でのタンパク質の同定を可能にする。上述のフローサイトメトリーアッセイを行う際に用いるべき一般技法は当業者に知られている。同じ原則に基づいた特別な方法が、微粒子ベースのフローサイトメトリーである。正確な量の蛍光色素と、特定の抗体で微粒子ビーズを標識する。そのような技法は、Ｌｕｍｉｎｅｘ社、国際公開第９７／１４０２８号によって提供されている。別の実施形態では、特定の試料中にある特定のタンパク質もしくはタンパク質断片、または改変タンパク質のレベルを、２Ｄゲル電気泳動および／または質量分析によって測定できる。タンパク質の性質、配列、分子質量、および電荷量の決定が、１検出工程で実現できる。ＭＡＬＤＩ、ＴｏＦ、またはこれらの組合せとして当業者に知られている方法で、質量分析を行うことができる。
【０２５３】
別の実施形態では、患者の生物体液（例えば血液または尿）中にある、コードされる産物、すなわち、配列番号１〜６５のポリヌクレオチド配列またはその相補配列のいずれかにコードされる産物のレベルを、その患者の細胞内にあるマーカーポリヌクレオチド配列の発現レベルをモニターすることによって決定することができる。そのような方法は、生物体液の試料を患者から取得する工程と、上記試料（または上記試料からのタンパク質）を、コードされるマーカーポリペプチドに特異的な抗体と接触させる工程と、抗体による免疫複合体形成の量を測定する工程とを含み、免疫複合体形成の量が、試料中のマーカーにコードされる産物のレベルを示す。この測定は、正常な個体から採取された対照試料、あるいは事前または事後的に同じ人から取得された１つまたは複数の試料中の同じ抗体による免疫複合体形成の量と比較した場合に特に有益である。
【０２５４】
別の実施形態では、細胞中に存在しているマーカーポリペプチドの量を測定するのに上記方法を使用することができ、次に、これを障害の進行、例えば、プラーク形成と相関させることができる。マーカーポリペプチドのレベルは、プラーク関連細胞になりつつあるか、またはなりやすい細胞を、細胞の試料が含有しているかどうか評価するのに予測的に使用することができる。マーカーポリペプチドレベルの観測は、例えば、さらに厳密な治療を使用するかに関する決定に利用できる。
【０２５５】
上述の通り、本発明の一態様は、患者から単離された細胞との関連において、マーカーポリペプチドレベルが試料細胞で有意に減少しているかどうか決定するための診断アッセイに関する。「有意に減少している」という用語は、類似した組織起源の正常細胞と比較して、上記細胞が保持しているマーカーポリペプチドの細胞量が減少している細胞表現型を意味する。例えば、細胞は、正常な対照細胞の約５０％未満、２５％未満、１０％未満、または５％未満のマーカーポリペプチドを有する。詳細には、上記アッセイは、試験細胞のマーカーポリペプチドのレベルを評価し、好ましくは、測定されたレベルを、少なくとも１種類の対照細胞、例えば、正常細胞および／または表現型が知られている形質転換細胞で検出されたマーカーポリペプチドと比較する。
【０２５６】
本発明に特に重要なのが、正常または異常なマーカーポリペプチドレベルに関連している細胞の数によって測定される、マーカーポリペプチドのレベルを定量化する能力である。その後、特定のマーカーポリペプチド表現型を有する細胞の数を患者の予後と相関させることができる。本発明の一実施形態では、マーカーポリペプチドのレベルが異常に高いか、あるいは低いことが判明している、生検中の細胞のパーセンテージとして、損傷部位のマーカーポリペプチド表現型が決定される。そのような発現は、免疫組織化学アッセイ、ドットブロット分析、およびＥＬＩＳＡなどによって検出できる。
【０２５７】
免疫組織化学
組織試料を採用している場合、マーカーポリペプチド表現型を有する細胞数を測定するのに、免疫組織化学染色を用いることができる。そのような染色には、生検または他の組織試料から組織の多重ブロックを取り出し、プロテアーゼＫまたはペプシンなどの薬剤を用いてタンパク分解性の加水分解を施す。特定の実施形態では、試料細胞から核分画を単離して、核分画中のマーカーポリペプチドのレベルを検出することが望ましい場合もある。
【０２５８】
組織試料は、ホルマリン、グルタルアルデヒド、メタノールなどの試薬で処理することによって固定する。その後、マーカーポリペプチドに対する結合特異性を有する抗体、好ましくはモノクローナル抗体と共に、試料をインキュベートする。この抗体は、後で結合を検出するための標識に結合しているものでもよい。試料は、免疫複合体の形成に十分な時間インキュベートする。抗体の結合を、この抗体に結合している標識を利用して検出する。抗体が標識されていない場合には、標識された第２の抗体、例えば、抗マーカーポリペプチド抗体のアイソタイプに特異的な抗体を利用してもよい。利用できる標識の例には、放射性核種、蛍光、化学発光、および酵素が含まれる。
【０２５９】
酵素を採用した場合、その酵素の基質を試料に添加して、有色または蛍光の産物を生成させることができる。結合体で使用するのに適した酵素の例には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、および同様のものが含まれる。市販されていない場合には、そのような抗体酵素結合体は、当業者に知られている技法によって容易に産生される。
【０２６０】
一実施形態では、上記アッセイをドットブロットアッセイとして行う。組織試料を採用した場合、所定の数の細胞から産生された無細胞抽出物中のマーカーポリペプチドの量を相関させることによって、単一細胞に随伴しているマーカーポリペプチドの平均量の測定が可能となるので、ドットブロットアッセイには特別の適用がある。
【０２６１】
さらに別の実施形態では、本発明は、配列番号１〜６５のポリヌクレオチド配列のいずれかにコードされる、本発明のマーカーポリペプチドに対して産生された抗体のパネルの使用を企図する。抗体のそのようなパネルは、乳癌に関する信頼できる診断プローブとして使用できる。本発明のアッセイは、細胞、例えばマクロファージを含有する生検試料を、１つまたは複数のコードされる産物に対する抗体のパネルと接触させて、マーカーポリペプチドの存在または不在を判定する工程を含む。
【０２６２】
本発明の診断方法は、治療の追跡調査としても利用でき、例えば、マーカーポリペプチドレベルの定量化が、現在または以前に採用した、悪性腫瘍、詳細には乳癌の治療の有効性、そして患者の予後に対するこれらの治療の影響を示すものでありうる。
【０２６３】
上述の診断アッセイは、予後判定アッセイとして使用されるように適合させることもできる。そのような適用は、悪性腫瘍の場合、プラーク生成の進行における特徴的なステージで起こるイベントに対する本発明のアッセイの感受性を利用するものである。例えば、所与のマーカー遺伝子は、極めて早いステージ、おそらく、細胞が泡沫細胞へと発展する前に上方または下方制御される可能性があり、一方、別のマーカー遺伝子は、はるかに後のステージでのみ特徴的に上方または下方調節される可能性がある。そのような方法は、試験細胞のｍＲＮＡを、悪性腫瘍進行の異なったステージの乳癌組織細胞で、異なった特徴的レベルで発現する所与のマーカーポリヌクレオチドから得られたポリヌクレオチドプローブと接触させる工程と、上記細胞のｍＲＮＡへの上記プローブのハイブリダイゼーションの概算量を測定する工程とを含むものでありえ、そのような量が、上記細胞内の上記遺伝子の発現レベルに関する指標であり、したがって、上記細胞の疾病進行のステージに関する指標であるか、別法として、上記試験細胞のタンパク質と接触した所与のマーカーポリヌクレオチドの遺伝子産物に特異的な抗体を用いて、アッセイを実施することができる。一連のそのような試験は、特定の腫瘍性病変の存在を開示するのみでなく、臨床医が、その疾患に最も適した治療方法を選択し、さらに、その治療が成功する見込みを予測するのも可能にするであろう。
【０２６４】
本発明の方法は、所与の乳癌体質の臨床経過を追跡するのにも使用できる。例えば、本発明のアッセイを、患者から得た血液試料に適用することができ、患者の乳癌治療を行った後に、別の血液試料を採取し、試験を繰り返す。効果的治療は、乳癌組織細胞に特徴的な、示された差次的発現の除去をもたらし、おそらく、正常レベルに近づくか、それをしのぐことさえあるであろう。
【０２６５】
ポリペプチド活性
一態様では、本発明は、１つまたは複数の「乳癌遺伝子」ポリペプチドの活性を加減する可能性ある治療薬をスクリーニングする方法を提供し、それによって、悪性腫瘍、詳細には乳癌を有しているか、その危険がある対象において、悪性腫瘍も、乳癌もなく、その危険もないが、治療薬で処置されていない対象におけるあるポリペプチドの活性と比較して、「乳癌遺伝子」の上方制御の結果として、上記ポリペプチドの活性が増強された場合には、上記治療物質は、ポリペプチド活性を低下させるであろう。同様に、悪性腫瘍、詳細には乳癌を有しているか、その危険がある対象において、悪性腫瘍も、乳癌もなく、その危険もないが、治療薬で処置されていない対象における同じポリペプチドの活性と比較して、「乳癌遺伝子」の下方制御の結果として、上記ポリペプチドの活性が低減された場合には、上記治療物質は、ポリペプチド活性を増大させるであろう。
【０２６６】
表１または３に示す「乳癌遺伝子」ポリペプチドの活性は、当業者に知られている任意の方法、および特定のポリペプチドによって示されたタイプの活性に対して特別の方法によって測定できる。特定のポリヌクレオチドの活性を測定するのに使用できる特異的なアッセイの例を以下に示す。
【０２６７】
ａ）イオンチャンネル
イオンチャンネルは、電気シグナル伝達、膜貫通シグナル伝達、および電解質添加溶質輸送に関与する膜貫通タンパク質である。膜脂質二重層を貫通する高分子孔を形成することによって、イオンチャンネルは、透過性イオンの電気化学ポテンシャル勾配によって駆動する、特定のイオン種の流動の原因となっている。単一分子レベルでは、個々のチャンネルが、「開口」状態（イオン伝導）と「閉鎖」（非伝導）状態との間で立体配座転移を行っている（「ゲート開閉」）。単一チャンネルの典型的な開口は、数ミリ秒持続し、その結果、１０−９〜１０−１２アンペアの範囲の基本膜貫通電流を生じる。チャンネル開閉は、神経伝達物質および細胞内セカンドメッセンジャー（「リガンド依存性チャンネル」）または膜電位（「電位依存性チャンネル」）などの様々な化学的および／または生物物理学的パラメータによって制御されている。イオンチャンネルは、それらのイオン選択性、ゲート開閉特性、ならびにホルモンおよび薬物による調節によって、機能的に特徴付けられている。シグナル伝達および輸送過程におけるそれらの中心的役割のために、イオンチャンネルは、様々な病態生理学的設定での、薬理学的治療学の理想的な標的となっている。
【０２６８】
一実施形態では、「乳癌遺伝子」がイオンチャンネルをコードしたものでありうる。一実施形態では、本発明は、「乳癌遺伝子」ポリペプチドのチャンネル活性の可能性ある活性化因子または抑制因子をスクリーニングする方法を提供する。イオンチャンネルと相互作用して、それらの活性を抑制または促進する化合物を得るためのスクリーニングは、生細胞における（１）結合アッセイおよび（２）機能アッセイに基づいたものでありうる［Ｈｉｌｌｅ（７４）］。
【０２６９】
１．リガンド依存性チャンネル、例えば、向イオン性神経伝達物質／ホルモン受容体用には、化合物と標識されたリガンドとの間の競合によって、標的への結合を検出するように、アッセイを設計することができる。
【０２７０】
２．イオンチャンネル機能は、生細胞内で機能的に試験することができる。標的タンパク質は、適切なレポーター細胞で内因的に発現されているものか、または組換え導入されたものである。チャンネル活性は、標的活性によって引き起こされたか、加減された（２．１）透過性イオンの濃度変化（Ｃａ２＋イオンが最も顕著）によって、（２．２）膜内外電位差勾配の変化によって、そして（２．３）細胞反応（例えば、レポーター遺伝子の発現、神経伝達物質の分泌）を測定することによってモニターできる。
【０２７１】
２．１  チャンネル活性は膜貫通イオン流動をもたらす。このように活性化されたイオンチャンネルは、その結果生じる細胞内イオン濃度の変化によって、ルミネッセンスまたは蛍光指示体を使用してモニターすることができる。ダイナミックレンジが広く、適当な指示体が利用可能であるため、これは特に細胞内Ｃａ２＋イオン濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）の変化に適用される。［Ｃａ２＋］ｉは、例えば、エクオリンルミネッセンスまたは蛍光色素技術（例えば、Ｆｌｕｏ−３、Ｉｎｄｏ−１、Ｆｕｒａ−２の使用）によって、測定することができる。標的チャンネル自体を通るＣａ２＋流動を直接測定するか、あるいは、標的チャンネルの調節が膜電位に影響を与え、それによって同時発現されている電位依存性Ｃａ２＋チャンネルの活性に影響を与える細胞アッセイを設計することができる。
【０２７２】
２．２  イオンチャンネル電流は、電気膜電位（Ｖｍ）の変化をもたらし、それは、電位差測定蛍光プローブを用いて、直接モニターすることができる。これらの荷電指示体（例えば、陰イオンオキソノール色素ＤｉＢＡＣ４（３））は、電位変化に反応して細胞外コンパートメントと細胞内コンパートメントとの間で再分布する。平衡分布は、ネルンスト式に支配されている。したがって、膜電位の変化は、それに随伴した細胞蛍光の変化をもたらす。繰り返すが、Ｖｍの変化は、標的イオンチャンネルの活性によって直接引き起こされるかもしれないし、あるいは、同じ細胞で同時発現されたチャンネルによるシグナルの増幅および／または延長を介して引き起こされるかもしれない。
【０２７３】
２．３  標的チャンネル活性は、直接的に、あるいは追加のＣａ２＋チャンネルの活性化を通して細胞Ｃａ２＋流入を引き起こすことができる（２．１を参照）。この結果生じた細胞内Ｃａ２＋シグナルは、様々な細胞反応、例えば、分泌または遺伝子転写を調節する。したがって、標的発現細胞からの既知なホルモン／伝達物質の分泌をモニターすることによって、あるいはＣａ２＋反応性プロモーターエレメント（例えば、環状ＡＭＰ／Ｃａ２＋反応性エレメント；ＣＲＥ）によって制御されているレポーター遺伝子（例えばルシフェラーゼ）の発現を介して標的チャンネルの変化を検出することができる。
【０２７４】
ｂ）ＤＮＡ結合タンパク質および転写因子
一実施形態では、「乳癌遺伝子」が、ＤＮＡ結合タンパク質または転写因子をコードしたものでありうる。例えば、ＤＮＡ結合タンパク質または転写因子が、特定のプロモーターに連結された試験配列の転写を開始する能力を測定するプロモーターアッセイによって、そのようなＤＮＡ結合タンパク質または転写因子の活性を測定することができる。一実施形態では、本発明は、そのようなＤＮＡ結合タンパク質または転写因子の活性を調節する能力のあるものを得るために、上記転写因子に反応性であるプロモーターによって調節される試験遺伝子の発現変化を測定することによって、試験化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【０２７５】
プロモーターアッセイ
プロモーターアッセイは、対象の遺伝子（例えば甲状腺ホルモン）によって調節されたプロモーターの制御下にあるルシフェラーゼ遺伝子によって安定的に形質移入されたヒト肝細胞癌細胞ＨｅｐＧ２を用いてセットアップした。ベクター２ｘＩＲＯｌｕｃが形質移入に用いられた。ベクター２ｘＩＲＯｌｕｃは、ｔｋ最小プロモーターおよびルシフェラーゼ遺伝子の前に、８ｂｐのスペーサーで分離された１２ｂｐの逆パリンドローム２つからなる甲状腺ホルモン反応性エレメント（ＴＲＥ）を有する。試験培養は、９６ウェルプレート中で、グルタミン、トリシン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、インシュリン、セレン、およびトランスフェリンで補足した無血清イーグル最小必須培地に播種し、１０％ＣＯ２、３７℃の加湿雰囲気中で培養した。４８時間インキュベーションした後、試験化合物または基準化合物の系列希釈（例えばＬ−Ｔ３、Ｌ−Ｔ４）と、適切な場合、同時刺激物質（最終濃度１ｎＭ）とを細胞培養に添加し、最適な期間（例えば、さらに４〜７２時間）インキュベーションを継続した。その後、ＴｒｉｔｏｎＸ１００およびルシフェリンを含有する緩衝液を添加することによって、細胞を溶解させＴ３または他の化合物によってルシフェラーゼのルミネッセンスを誘導し、ルミノメータで測定した。試験化合物の各濃度あたり、４つの複製を試験した。Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃソフトウェアの使用によって、各試験化合物のＥＣ５０値を計算した。
【０２７６】
スクリーニング法
本発明は、「乳癌遺伝子」ポリペプチドまたは「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドに結合するか、その活性を調節する試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。試験化合物は、「乳癌遺伝子」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合するものが好ましい。試験化合物は、「乳癌遺伝子」活性を、試験化合物の不在時と比較して、少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％低減または増強するものがより好ましい。
【０２７７】
試験化合物
試験化合物は、当技術分野で既に知られている薬物でも、以前にはいかなる薬理活性があるかも知られていなかった化合物でもよい。上記化合物は、天然に存在のものでも、実験室で設計されたものでもよい。それらは、微生物、動物、または植物から単離することができ、また、組換えによって産生するか、あるいは当技術分野で知られている化学的方法によって合成することができる。望ましい場合、試験化合物は、限定されるものではないが、生物学的ライブラリー、空間的にアドレス可能な平行固相ライブラリーまたは溶液相ライブラリー、デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー方法、１ビーズ１化合物ライブラリー法、およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリー法を含めた、当技術分野で知られている多数のコンビナトリアルライブラリー法のうちの任意のものを用いて取得することができる。生物学的ライブラリーアプローチは、ポリペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ポリペプチド、非ペプチド性オリゴマー、または化合物の小分子ライブラリーに適用可能である［概説には、Ｌａｍ、１９９７年（５９）を参照］。
【０２７８】
分子ライブラリーを合成する方法は、当技術分野で周知である［例えば、Ｇａｌｌｏｐら、１９９４年（６０）参照］。化合物のライブラリーは溶液中［例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、１９９２年（６１）］、ビーズ［Ｌａｍ、１９９１年（６２）］、ＤＮＡチップ［Ｆｏｄｏｒ、１９９３年（６３）］、細菌または胞子（Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５２２３４０９号）、プラスミド［Ｃｕｌｌら、１９９２年（６４）］、またはファージ［ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、１９９０年（６５）］に提示することができる。
【０２７９】
ハイスループットスクリーニング
「乳癌遺伝子」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する能力のあるもの、あるいは「乳癌遺伝子」活性または「乳癌遺伝子」発現に影響を与える能力のあるものを求めて、ハイスループットスクリーニングを用いて、試験化合物をスクリーニングすることができる。ハイスループットスクリーニングを用いることで、多数の個別の化合物を平行して試験することができ、そのため、多数の試験化合物を迅速にスクリーニングすることができる。最も広範に確立している技法は、９６ウェル、３８４ウェル、または１５３６ウェルマイクロタイタープレートを利用するものである。マイクロタイタープレートのウェルは、通常、５から５００μｌの範囲のアッセイ容積を必要とする。プレートに加えて、マイクロウェルフォーマットに適合した多数の測定器、物質、ピペッター、ロボティクス、プレート洗浄機、およびプレートリーダーが市販されている。
【０２８０】
別法として、フリーフォーマットアッセイ、または試料間に物的障壁をもたないアッセイを用いることができる。例えば、色素細胞（メラニン細胞）を用いた単純ホモジーナスアッセイである、コンビナトリアルペプチドライブラリーのアッセイがＪａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら（６６）によって記述されている。細胞を、培養皿の中のアガロースの下に配置し、その後、コンビナトリアル化合物を保持するビーズをアガロースの表面に配置する。コンビナトリアル化合物がビーズから部分的に放出される。化合物が局部的にゲルマトリックス中に拡散する際に、活性化合物が細胞の色を変えるので、活性化合物を暗色の色素領域として可視化することができる。
【０２８１】
フリーフォーマットアッセイの別の例が、Ｃｈｅｌｓｋｙ（６７）によって記述されている。Ｃｈｅｌｓｋｙは、炭酸脱水酵素の単純ホモジーナス酵素アッセイをアガロースゲル中に配置し、ゲル中の酵素がゲル全体の色変化を引き起こすようにした。その後、フォトリンカーを介してコンビナトリアル化合物を保持するビーズをゲル内部で配置し、ＵＶ光によって、化合物を部分的に放出させた。酵素を抑制した化合物は、変色が他より少ない局部的抑制領域として観察された。
【０２８２】
別の例では、寒天中で増殖している癌細胞に対する細胞傷害効果を有するコンビナトリアルライブラリー化合物がスクリーニングされた［Ｓａｌｍｏｎら、１９９６年（６８）］。
【０２８３】
別のハイスループットスクリーニング法が、Ｂｅｕｔｅｌら、米国特許第５９７６８１３号に記載されている。この方法では、試験試料が多孔質マトリックス中に配置される。その後、１つまたは複数のアッセイ成分を、ゲル、プラスチックシート、フィルター、または操作が容易な他の形態の固体支持体などのマトリックスの内部、頭頂部、または底部に配置する。多孔質マトリックスに試料が導入されるときには、それらは十分ゆっくりと拡散し、そのため、多くの試験試料を同時に操作せずにアッセイを実施できる。
【０２８４】
結合アッセイ
結合アッセイでは、試験化合物が小分子であることが好ましく、例えば、酵素のＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位、または「乳癌遺伝子」ポリペプチドの活性部位に結合して、その位置を占め、それによって、正常な生物活性が阻止される。そのような小分子の例には、小ペプチドまたはペプチド様分子が含まれるが、これらに限定されない。
【０２８５】
結合アッセイでは、試験化合物または「乳癌遺伝子」ポリペプチドのいずれかが、蛍光、放射性同位体、化学発光、またはホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、もしくはルシフェラーゼなどの酵素標識など、検出可能な標識を含んだものでありうる。その後、例えば、シンチレーションカウンティングによる放射線放出の直接計測によって、あるいは適切な基質から検出可能な産物への変換の測定によって、「乳癌遺伝子」ポリペプチドに結合した試験化合物の検出を行うことができる。
【０２８６】
別法として、相互作用物をいずれも標識せずに、「乳癌遺伝子」ポリペプチドへの試験化合物の結合を測定することができる。例えば、「乳癌遺伝子」ポリペプチドとの試験化合物の結合を検出するのに、ミクロフィジオメーターは用いることができる。ミクロフィジオメーター（例えば、ＣｙｔｏｓｅｎｓｏｒＪ）は、細胞がその環境を酸性化する速度を、ＬＡＰＳ（ｌｉｇｈｔ−ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ  ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｅｎｓｏｒ）を用いて測定する分析装置である。この酸性化速度の変化を、試験化合物と「乳癌遺伝子」ポリペプチドとの相互作用の指標として用いることができる［ＭｃＣｏｎｎｅｌｌら、１９９２年（６９）］。
【０２８７】
試験化合物が「乳癌遺伝子」ポリペプチドに結合する能力の測定は、リアルタイムＢＩＡ（Ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）などの技術を用いて実現することもできる［Ｓｚａｂｏら、１９９５年（７０）］。ＢＩＡは、生物特異性相互作用を、いずれの相互作用物も標識せずに、リアルタイムで研究するための技術である（例えばＢｌＡｃｏｒｅ（商標））。光学的現象である表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の変化を、生物分子間のリアルタイム反応の指標として用いることができる。
【０２８８】
本発明の別の態様では、「乳癌遺伝子」ポリペプチドと結合または相互作用し、その活性を加減する他のタンパク質を同定するために、「乳癌遺伝子」ポリペプチドを、２ハイブリッドアッセイまたは３ハイブリッドアッセイにおける「ベイトタンパク質」として用いることができる［例えば、米国特許第５２８３３１７号；Ｂｒｅｎｔ、国際公開第９４／１０３００号］。
【０２８９】
２ハイブリッドシステムは、ほとんどの転写因子が別々のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインからなり、モジュールとしての性質を有することに基づいている。簡潔には、このアッセイは、２つの異なったＤＮＡコンストラクトを利用する。例えば、一方のコンストラクトでは、「乳癌遺伝子」ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、既知な転写因子（例えばＧＡＬ４）のＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドに融合することができる。もう一方のコンストラクトでは、未同定のタンパク質（「プレイ」または「試料」）をコードするＤＮＡ配列を、既知な転写因子の活性化ドメインをコードするポリヌクレオチドに融合することができる。「ベイト」タンパク質と「プレイ」タンパク質とがｉｎ  ｖｉｖｏで相互作用して、タンパク質依存性の複合体を形成できた場合には、転写因子のＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとが近接する。この近接が、上記転写因子に対する反応性を有する転写調節部位に作用可能に連結したレポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現を検出することができ、それによって、機能的な転写因子を含有する細胞コロニーを単離し、「乳癌遺伝子」ポリペプチドと相互作用するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を取得するために使用することができる。
【０２９０】
「乳癌遺伝子」ポリペプチド（もしくはポリヌクレオチド）または試験化合物のいずれかを固定して、一方または両方の相互作用物における非結合型からの結合型の分離を促進し、さらにアッセイの自動化を容易にするのが望ましい場合もある。したがって、「乳癌遺伝子」ポリペプチド（もしくはポリヌクレオチド）または試験化合物のいずれかを固体支持体に結合することができる。適当な固体支持体には、ガラスもしくはプラスチック製スライド、組織培養プレート、マイクロタイターウェル、チューブ、シリコンチップ、またはビーズなどの粒子（ラテックス、ポリスチレン、またはガラスビーズが含まれるが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。「乳癌遺伝子」ポリペプチド（もしくはポリヌクレオチド）または試験化合物を固体支持体に結合するのに、共有結合性および非共有結合、受動吸収、あるいはそれぞれ上記ポリペプチド（もしくはポリヌクレオチド）または試験化合物と、固体支持体とに結合した１対の結合部分の使用を含めた、当技術分野で知られているいかなる方法を用いてもよい。試験化合物は、個々の試験化合物の位置を追跡することができるように、アレイの固体支持体に結合していることが好ましい。「乳癌遺伝子」ポリペプチド（もしくはポリヌクレオチド）への試験化合物の結合は、反応体を含有するのに適したいかなる容器中で行ってもよい。そのような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微量遠心チューブが含まれる。
【０２９１】
一実施形態では、「乳癌遺伝子」ポリペプチドは、「乳癌遺伝子」ポリペプチドが固形支持体に結合するのを可能にするドメインを含む融合タンパク質である。例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、米国ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ所在）またはグルタチオン誘導体化されたマイクロタイタープレートに吸着させることができ、次に、これを試験化合物、または試験化合物および非吸着の「乳癌遺伝子」ポリペプチドに結合させ；混合物を複合体形成に貢献する条件（例えば、生理的条件の塩濃度およびｐＨ）下でインキュベートする。インキュベーションの後に、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄し、いかなる非結合の構成要素も除去する。相互作用物の結合の測定は、上述の通り、直接的に行うことも、間接的に行うこともできる。別法では、結合を測定する前に、複合体を固体支持体から分離することができる。
【０２９２】
タンパク質またはポリヌクレオチドを固体支持体上に固定する他の技法も、本発明のスクリーニングアッセイで用いることができる。例えば、「乳癌遺伝子」ポリペプチド（もしくはポリヌクレオチド）または試験化合物のいずれかを、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を利用して、固定することができる。ビオチン化された「乳癌遺伝子」ポリペプチド（もしくはポリヌクレオチド）または試験化合物は、当技術分野で周知の技法（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、米国イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ所在）を用いてビオチンＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシサクシニミド）から調製し、ストレプトアビジンでコーティングされた９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）のウェルに固定することができる。別法では、「乳癌遺伝子」ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または試験化合物に特異的に結合するが、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位や「乳癌遺伝子」ポリペプチドの活性部位など、所望の結合部位を妨害しない抗体を誘導体化して、プレートのウェルに結合することができる。非結合の標的またはタンパク質を、抗体結合によってウェル内に捕捉することができる。
【０２９３】
そのような複合体を検出する方法には、ＧＳＴで固定された複合体に関して上述したものに加えて、「乳癌遺伝子」ポリペプチドまたは試験化合物に特異的に結合する抗体を用いた複合体の免疫検出、「乳癌遺伝子」ポリペプチドの活性の検出に依存した酵素結合アッセイ、および非還元条件下でのＳＤＳゲル電気泳働が含まれる。
【０２９４】
「乳癌遺伝子」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する試験化合物を得るためのスクリーニングも、無傷細胞中で行うことができる。「乳癌遺伝子」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含むいかなる細胞も、細胞ベースのアッセイシステムで用いることができる。「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドは、細胞内に自然発生するものでも、上述のものなどの技法を用いて導入したものでもよい。「乳癌遺伝子」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドへの試験化合物の結合は、上述の通り測定される。
【０２９５】
遺伝子発現の改変
別の実施形態では、「乳癌遺伝子」の発現を増強または減少させる試験化合物を同定する。以下に記載する適切な発現試験システム、または細胞システムで、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドを試験化合物と接触させ、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドのＲＮＡまたはポリペプチド産物の発現を測定する。試験化合物の存在下における、適当なｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルを、試験化合物の非存在下におけるｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルと比較する。その後、この比較に基づいて、上記試験化合物を発現の調節因子として同定することができる。例えば、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、試験化合物の存在下で、非存在下より大きい場合には、この試験化合物が、そのｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現の刺激物質または促進因子として同定される。その代わりに、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、試験化合物の存在下で、非存在下より少ない場合には、この試験化合物は、そのｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現の抑制物質として同定される。
【０２９６】
細胞における「乳癌遺伝子」ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルは、当技術分野で周知の、ｍＲＮＡまたはポリペプチドを検出する方法で測定することができる。定性的方法も、定量的方法も使用できる。「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドのポリペプチド産物の存在を、例えば、免疫化学法、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット法、免疫組織化学などを含めた当技術分野で知られている様々な技法を用いて測定することができる。別法として、ポリペプチド合成を細胞培養でｉｎ  ｖｉｖｏで測定するか、あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系で、「乳癌遺伝子」ポリペプチドへの標識アミノ酸の取込みを検出することによって測定することができる。
【０２９７】
無細胞アッセイシステムまたは無傷細胞内で、そのようなスクリーニングを実施することができる。「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドを発現するいかなる細胞も、細胞ベースのアッセイシステムで用いることができる。「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチドは、細胞内に自然発生するものでも、上述のものなどの技法を用いて導入したものでもよい。初代培養、またはＣＨＯもしくはヒト胚腎臓２９３細胞などの樹立細胞系のいずれかを使用することができる。
【０２９８】
治療の適用および方法
乳癌を治療する療法は、主として、細胞増殖、細胞増殖、または血管新生に介入する効果的な化学療法薬を当てにしていた。ゲノミクス主導の分子標的同定の到来によって、悪性腫瘍患者、詳細には乳癌患者に、より安全で、より効果的な治療を提供するであろう治療介入に用いる、乳癌に特異的な新規の標的を同定する可能性が開かれた。したがって、新たに発見された乳癌関連遺伝子、およびそれらの産物を、革新的な治療を開発するツールとして用いることができる。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ受容体キナーゼの同定は、上述した通り、特定の部分集団の腫よう患者を治療する新規の刺激的な機会を提示する。上記に概説したいずれの生理過程で重要な役割を演じている遺伝子も、乳癌標的として特徴付けることができる。ゲノミクスで同定された遺伝子または遺伝子断片は、機能的な組換え体タンパク質を産生させるために１つまたは複数の異種発現系で容易に発現させることができる。これらのタンパク質の生化学的性質に関して、それらをｉｎ  ｖｉｔｒｏで特性分析し、ハイスループット分子スクリーニングプログラムでそれらの生化学活性の化学調節因子を同定するツールとして使用する。このようにして、標的遺伝子発現またはタンパク質活性の調節因子を同定し、それに続いて、細胞疾患モデルおよびｉｎ  ｖｉｖｏ疾患モデルで治療活性を試験することができる。生体モデルでの反復試行によるリード化合物の最適化、ならびに詳細な薬物動態学および毒物分析が、医薬品開発、およびそれに続くヒトでの試験の基礎を形成する。
【０２９９】
本発明は、さらに、上述したスクリーニングアッセイによって同定された新規な薬剤の使用に関する。したがって、適切な動物モデルで、本明細書に記載の通りに同定された試験化合物の使用も、本発明に包含される。例えば、本明細書に記載の通りに同定された薬剤（例えば、調節薬、アンチセンスポリヌクレオチド分子、特異抗体、リボザイム、またはヒト「乳癌遺伝子」ポリペプチド結合分子）を動物モデルで使用して、そのような薬剤を用いた治療の有効性、毒性、または副作用を決定することができる。別法では、本明細書に記載の通りに同定された薬剤を動物モデルで使用して、そのような薬剤の作用機序を決定することができる。さらに、本発明は、上述のスクリーニングアッセイによって、本明細書に記載の治療用に同定された新規の薬剤の使用にも関する。
【０３００】
ヒト「乳癌遺伝子」の活性に影響を与える試薬は、ヒト「乳癌遺伝子」の活性を低減または増強するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかでヒト細胞に投与することができる。上記試薬は、ヒト「乳癌遺伝子」の発現産物に結合することが好ましい。発現産物がタンパク質である場合、上記試薬は抗体であることが好ましい。ヒト細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで処置するために、体から取り出した幹細胞の調製物に抗体を添加することができる。その後、当技術分野で知られているように、クローン増殖を行い、あるいは行わずに、上記細胞を、同一または別の人体で置換することができる。
【０３０１】
一実施形態では、リポソームを用いて上記試薬を送達する。リポソームは、それが投与された動物で、少なくとも約３０分間、より好ましくは少なくとも約１時間、さらにより好ましくは少なくとも約２４時間安定していることが好ましい。リポソームは、ヒトなどの動物における特定の部位を標的にして、試薬、特にポリヌクレオチドを送達することのできる脂質組成を含む。リポソームの脂質組成は、肺、肝臓、脾臓、心臓、脳、リンパ節、および皮膚など、動物の特定の臓器を標的にできるものであることが好ましい。
【０３０２】
本発明で有用なリポソームは、その内容物を細胞に送達するために、標的細胞の原形質膜と融合できる脂質組成を含む。好ましくは、リポソームのトランスフェクション効率は、約１０６の細胞に送達されたリポソーム１６ｎｍｏｌあたりＤＮＡ約０．５μｇであり、より好ましくは、約１０６の細胞に送達されたリポソーム１６ｎｍｏｌあたりＤＮＡ約１．０μｇであり、さらに好ましくは、約１０６の細胞に送達されたリポソーム１６ｎｍｏｌあたりＤＮＡ約２．０μｇである。リポソームは、直径が、好ましくは約１００〜５００ｎｍ、より好ましくは約１５０〜４５０ｎｍ、さらにより好ましくは約２００〜４００ｎｍである。
【０３０３】
本発明での使用に適したリポソームには、例えば、当業者に知られている遺伝子送達法で通常使用されているリポソームが含まれる。より好ましいリポソームには、ポリカチオン脂質組成を有するリポソームおよび／またはポリエチレングリコールに結合したコレステロールバックボーンを有するリポソームが含まれる。所望により、リポソームは、リポソームの外部表面に露出した細胞特異的なリガンドなど、特定の細胞型を標的として、そのリポソームを送達できる化合物を含む。
【０３０４】
当技術分野で標準的な方法を用いて、リポソームを、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムなどの試薬と複合体形成させることができる（例えば米国特許第５７０５１５１号を参照）。好ましくは、約０．１μｇから約１０μｇのポリヌクレオチドを約８ｎｍｏｌのリポソームと混合し、より好ましくは、約０．５μｇから約５μｇのポリヌクレオチドを約８ｎｍｏｌのリポソームと混合し、さらに好ましくは、約１．０μｇのポリヌクレオチドを約８ｎｍｏｌのリポソームと混合する。
【０３０５】
別の実施形態では、受容体に媒介された指向性送達を用いて、抗体を特定の組織にｉｎ  ｖｉｖｏ送達することができる。受容体に媒介されたＤＮＡ送達技法は、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓら、１９９３年（７１）；Ｃｈｉｏｕら、１９９４年（７２）で教示されている。
【０３０６】
治療上有効な用量の決定
治療上有効な用量の決定は、当業者の能力の範疇にある。治療上有効な用量は、治療上有効な用量の非存在下で存在するそのヒトの「乳癌遺伝子」活性と比較して、ヒト「乳癌遺伝子」活性を増強または低減する活性成分の量を指す。
【０３０７】
いかなる化合物でも、治療上有効な用量は、最初に、細胞培養アッセイまたは動物モデル、通常はマウス、ウサギ、イヌ、またはブタで推算することができる。動物モデルは、適切な濃度領域および投与経路を決定するのにも使用できる。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量および投与経路を決定するのに用いることができる。
【０３０８】
治療効率および治療毒性、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％で治療上有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％に対して致死である用量）を、細胞培養または実験動物標準的な製薬手順によって決定することができる。毒性効果をもつ用量と、治療効果をもつ用量との比が治療係数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０という比率として計算できる。
【０３０９】
大きな治療係数を示す医薬組成物が好まれる。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒトに使用するための用量の範囲を公式化するのに使用される。そのような組成物に含有されている用量は、毒性がまったく伴わないかほとんど伴わない、ＥＤ５０を含めた循環濃度の範囲にあることが好ましい。用量は、使用される剤形、患者の感受性、および投与経路に応じて、この範囲内で変化しうる。
【０３１０】
正確な用量は、開業医が、治療を必要とする対象に関する因子に照らして決定するだろう。用量および投与は、十分なレベルの活性成分を提供するように、あるいは所望の効果が維持されるように調整する。考慮に入れることのできる因子には、疾患状態の重度、対象の健康全般、対象の年齢、重さ、および性別、食餌、投与の時間および頻度、複合製剤、反応感受性、および治療に対する許容度／反応が含まれる。持続性医薬組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、３〜４日に１回、毎週、または２週間に１回に投与することができる。
【０３１１】
正常な用量は、投与経路によって、０．１から１００００μｇまで、最大１ｇの全量まで変動しうる。特定の用量および送達の方法に関する手びきは、文献に提供されており、当技術分野の開業医には概ね利用可能である。ヌクレオチドには、当業者は、タンパク質およびそれらの抑制物質とは異なった処方を用いるであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、部位などに特異的であろう。
【０３１２】
試薬が一本鎖抗体である場合、抗体をコードするポリヌクレオチドを構築し、限定されるものではないが、トランスフェリン−ポリカチオン媒介のＤＮＡ輸送、裸または被包性の核酸を用いた形質移入、リポソーム媒介の細胞融合、ＤＮＡコーティングされたラテックスビーズの細胞内導入、プロトプラスト融合法、ウイルス感染、エレクトロポレーション、遺伝子銃ＤＥＦまたはカルシウムリン酸媒介の形質移入を含めた、十分に確立されている技法を用いてｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで細胞内に導入することができる。
【０３１３】
抗体の効果的なｉｎ  ｖｉｖｏ用量は、約５μｇから約５０μｇ／ｋｇ患者体重、約５０μｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇから約５００μｇ／ｋｇ、および約２００から約２５０μｇ／ｋｇ患者体重の範囲にある。一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドの投与に効果的な  ｉｎ  ｖｉｖｏ用量は、約１００ｎｇから約２００ｎｇ、５００ｎｇから約５０ｍｇ、約１μｇから約２ｍｇ、約５μｇから約５００μｇ、約２０μｇから約１００μｇのＤＮＡの範囲にある
【０３１４】
発現産物がｍＲＮＡである場合、試薬は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムであることが好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを発現するポリヌクレオチドは、上述の通りの様々な方法によって、細胞に導入することができる。
【０３１５】
好ましくは、試薬は、「乳癌遺伝子」の遺伝子の発現、または「乳癌遺伝子」ポリペプチドの活性を、試薬の非存在時と比較して少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％減少させる。「乳癌遺伝子」の遺伝子の発現レベルまたは「乳癌遺伝子」ポリペプチドの活性を低下させるために選択された機構の有効性の評価は、「乳癌遺伝子」特異的なｍＲＮＡへのヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、「乳癌遺伝子」ポリペプチドの免疫学的検出、または「乳癌遺伝子」活性の測定など、当技術分野で周知の方法を用いて行うことができる。
【０３１６】
上述の実施形態のいずれにおいても、任意の本発明の医薬組成物を、他の治療薬と併せて投与することができる。併用療法で使用するのに適した薬剤の選択は、従来の製薬原則に従って、当業者が行うことができる。治療薬の組合せは、相乗効果的に作用して、上述の様々な障害の治療または予防に影響を与える場合がある。このアプローチを用いることで、各薬剤の用量が少なくても治療効率を実現できる場合があり、それによって、有害な副作用の可能性を低減することができる。
【０３１７】
上述した治療方法はいずれも、例えば、鳥、およびイヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウサギ、サル、および最も好ましくはヒトなどの哺乳類を含めた、そのような治療を必要としている任意の対象に適用することができる。
【０３１８】
この開示で引用したすべての特許および特許出願を、参照により明確に本明細書に組み込む。上記の開示は、本発明をおおまかに説明するものである。以下に示す特定の実施例を参照することによって、より完全な理解を得ることができるが、以下の実施例は、例示のみを目的として示すものであって、本発明の範囲の限定を意図したものではない。
【０３１９】
医薬組成物
本発明は、治療効果を実現するために、患者に投与することのできる医薬組成物も提供する。本発明の医薬組成物は、例えば「乳癌遺伝子」ポリペプチド、「乳癌遺伝子」ポリヌクレオチド、リボザイム、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド、「乳癌遺伝子」ポリペプチドに特異的に結合する抗体、「乳癌遺伝子」ポリペプチド活性のミメティック、アゴニスト、アンタゴニスト、または抑制因子を含むものでありうる。上記組成物は、単独で投与することも、あるいは、限定されるものではないが、食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、および水を含めた、任意の無菌かつ生体適合性の薬学的担体中で投与できる安定化化合物などの少なくとも１つの他の薬剤と併せて投与することもできる。上記組成物は、単独で患者に投与することも、あるいは、他の薬剤、薬物、またはホルモンと併せて投与することもできる。
【０３２０】
活性成分に加えて、これらの医薬組成物は、活性化合物から薬学的に使用できる調製物への加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む適当な薬学的に許容される担体を含有することができる。本発明の医薬組成物は、限定されるものではないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、鞘内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、非経口、局所、舌下、または直腸経路を含めた様々な経路で投与することができる。経口投与用の医薬組成物は、当技術分野で周知の薬学的に許容される担体を用いて、経口投与に適した用量で処方することができる。そのような担体は、医薬組成物を、患者が摂食するための錠剤、丸剤、糖剤、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液、および同様のものとして処方するのを可能にする。
【０３２１】
経口使用に用いる製剤は、活性化合物を固体の賦形剤と併せ、所望により、得られた混合物を粉砕し、必要に応じて適当な補助剤を添加した後、粒剤の混合物を処理して、錠剤または糖剤コアを得ることを通して製剤できる。適当な添加剤は、ラクトース、ショ糖、マンニトール、またはソルビトールを含めた糖；とうもろこし、コムギ、米、じゃがいも、または他の植物からのデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルローズナトリウムなどのセルロース；アラビアゴムおよびトラガントを含めたゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質などの、糖質またはタンパク質の賦形剤である。望ましい場合には、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはそれらの塩（アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤または溶解剤を添加することができる。
【０３２２】
糖剤コアは、高濃度糖溶液などの適当な剤皮と併せて使用でき、剤皮は、さらにアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン粉末、ラッカー溶液、ならびに適当な有機溶剤または溶剤混合物も含有することがある。製品識別のために、あるいは活性成分の量、すなわち用量を特徴付けるために、染料または顔料を錠剤または糖剤剤皮に添加することができる。
【０３２３】
経口摂取できる医薬製剤には、ゼラチンでできたプッシュフィットカプセル剤と、ゼラチン、およびグリセロールまたはソルビトールなどの剤皮でできた密封軟カプセル剤とが含まれる。プッシュフィットカプセル剤は、ラクトースまたはデンプンなどの充填剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および、所望により安定化剤と混合された活性成分を含有したものでありうる。軟カプセル剤では、安定化剤の存在下または非存在下に、脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコールなどの適当な液体中に、活性化合物を溶解または懸濁させることができる。
【０３２４】
非経口投与に適した医薬製剤は、水溶液中に、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液、または生理緩衝食塩水などの生理的に適合した緩衝液中に処方することができる。水溶液注入懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなど、懸濁液の粘性を増強する物質を含有できる。さらに、活性化合物の懸濁液は、適当な油性注入懸濁液として調製することができる。適当な親油性溶媒または媒体には、ゴマ油などの脂肪油、または、オレイン酸エチル、トリグリセリド、もしくはリポソームなどの合成脂肪酸エステルが含まれる。非脂質のポリカチオンアミノ重合体も、送達に使用できる。所望により、懸濁液も、高濃度溶液の調製を可能にするため、適当な安定化剤、または化合物の溶解性を増大させる薬剤を含有することができる。局所投与または鼻腔投与には、透過されるべき特定の障壁に適した浸透剤が製剤中で使用される。そのような浸透剤は概ね当技術分野で知られている。
【０３２５】
本発明の医薬組成物は、当技術分野で知られている方法で、例えば、従来の混合、溶解、粉砕、糖剤生成、研和、乳化、封入、捕捉、または凍結乾燥処理によって製造することができる。上記医薬組成物は、塩として提供することができ、限定されるものではないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを含めた、多数の酸を用いて形成させることができる。塩は、対応する自由塩基形態より、水性溶媒中または他のプロトン溶媒中でより可溶性である傾向がある。他の場合には、１５０ｍＭヒスチジン、０．１％２％ショ糖、および２７％のマンニトール、ｐＨ範囲４．５〜５．５の一部もしくは全部を含有しうる、凍結乾燥された粉末薬が、好ましい調製物となる場合があり、これを、使用の前に緩衝剤で配合する。
【０３２６】
製剤および投与の技法に関するより詳細な説明は、「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ」（７３）の最新版に見出すことができる。医薬組成物を調製した後は、それらを適当な容器に入れ、適用される状態の治療用に標識することができる。そのような標識には、投与の量、頻度、および方法が含まれるであろう。
【０３２７】
乳癌に関与している遺伝子を同定する戦略の１つは、非疾患に対して、あるいは治療反応状態のコンテクストにおいて、疾患に関連している状態下で、差次的に発現されている遺伝子を検出することである。以下の小区分で、そのような差次的に発現されている遺伝子を検出するのに使用することができた多くの実験システムについて記述する。概して、これらの実験システムは、少なくとも１つの実験的対照条件に加えて、少なくとも１つの実験条件を含んでおり、その実験条件では、対象または試料が、乳癌に関連した方法で処置され、対照条件下では、そのような疾患に関連した処置が欠失しているか、もしくはそのような処置に反応しない。差次的に発現されている遺伝子は、以下に記述する通り、実験条件と、対照条件との間の遺伝子発現パターンを比較することによって検出される。
【０３２８】
そのような実験の１つを用いることによって、特定の遺伝子が同定されたならば、別の実験でその発現を研究することによって、その発現パターンはさらに特徴付けることができ、それらの新知見を、独立した技法によって確認することができる。そのような複数の実験の使用は、乳癌およびその治療における特定の遺伝子の役割と相対的重要度とを識別するのに有用でありうる。乳癌患者から得られた細胞の遺伝子発現パターンを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養モデルの発現パターンと比較する混用アプローチは、乳癌の発症および／または進行に関与している経路に関して実質的なヒントを与えることができる。それは、耐性進展または特定の治療薬（例えば化学療法薬）に対する非感受性におけるそのような遺伝子の役割を解明することもできる。
【０３２９】
悪性腫瘍および特に乳癌に関与する、差次的に発現されている遺伝子の同定に利用できるこれらの実験の中には、シグナル伝達に関与する遺伝子を分析するために設計された実験もある。そのような実験は、細胞の増殖に関与する遺伝子を同定するのに役立つかもしれない。
【０３３０】
以下は、乳癌に関与する遺伝子を同定するために記載された方法である。そのような遺伝子は、それらの正常、すなわち非乳癌状態の発現と比較して、乳癌状態において、あるいは臨床知見に基づいた実験的操作の際に差次的に発現されている遺伝子を表す。そのような差次的に発現されている遺伝子は、「標的」および／または「マーカー」遺伝子を表す。そのような差次的に発現されている遺伝子をさらに特徴付ける方法と、それらを標的および／またはマーカー遺伝子として同定する方法とを以下に示す。
【０３３１】
別法として、乳癌状態対正常状態、または対照条件対実験条件下で、差次的に発現された遺伝子の発現が改変、すなわち、定量的に増強または減少されている場合がある。乳癌状態対正常状態、または対照条件対実験条件下で、発現が相違している程度は、例えば下記に記載のディファレンシャルディスプレイ技法などの標準的な特性化技法で可視化するのに十分に大きければ、それのみでよい。それによって発現の相違を可視化しうる他のそのような標準的な特性化技術には、当業者に周知のものである定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびノーザン分析が含まれるが、これらに限定されない。
【０３３２】
上述の実験に加えて、データの評価および分類、ならびに対照試料のコンテクストでそれまで分類されていない生物試料の反応予測に使用できるアルゴリズムおよび統計的分析を以下は記載する。以下に記載する予測的アルゴリズムおよび方程式は、個々の癌を細分するそれらの能力を既に示している。
【実施例１】
【０３３３】
臨床標本の取り出しおよび核酸の単離
ネオアジュバントエピルビシン／シクロホスファミド（ＥＣ）またはエピルビシン／タキソール（ＥＴ）治療（表４）を行った原発乳癌に罹患している患者を分析に選択した。ネオアジュバント化学療法は、短い静脈内点滴でのエピルビシン９０ｍｇ  ｍ２  １日、および短い静脈内点滴でのシクロホスファミド６００ｍｇ  ｍ２  １日またはタキソール１７５ｍｇ  ｍ２  １日から構成されていた。研究要件は、参加者らが、連続コア生検を受け入れることができ、かつ手術前の最初の治療行為としてＥＣまたはＥＴ化学療法で治療する、未治療の原発乳癌疾患を罹患していることであった。原発性腫瘍の連続コア生検を治療前および最初の一連のネオアジュバント化学療法の開始から２４時間後に行った。生検は、Ｂａｒｄ（登録商標）Ｍａｇｎｕｍ生検針（ＢＩＰ  ＧｍｂＨ、ドイツＴｕｅｒｋｅｎｆｅｌｄ）を備えたＢａｒｄ（登録商標）ＭＡＧＮＵＭ（商標）生検装置（Ｃ．Ｒ．Ｂａｒｄ，Ｉｎｃ．、米国Ｃｏｖｉｎｇｔｏｎ）を用いて、局所麻酔下の領域から得た。連続生検は、９０°の角度を用いて明確な腫瘍領域およびさらなる皮膚進入部位から採取した。試料中に高いパーセンテージの腫瘍材料が存在することを確実にするためにこの手法を採った。すべての生検試料を液体窒素中で瞬間冷凍し、さらなる加工時まで−８０℃で保管した。腫瘍標本からのヘマトキシリン／エオシン染色した切片を検査して、腫瘍細胞、良性上皮、間質、およびリンパ球の相対量を評価した。ＥＲ、ＰｇＲ、ｋｉ−６７、ｐ５３、ｃｅｒｂＢ２／ＨＥＲ２ｎｅｕなどの標準の臨床パラメータは、本研究室において生物組織化学的および／または免疫組織化学的方法を用いて日常的に定義されている（表４）。
【０３３４】
組織標本からの全ＲＮＡをグアニジン−イソチオシアネート方法によって抽出し、次いでフェノール／クロロホルム抽出を行い、Ａｔｌａｓ（商標）Ｐｕｒｅ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ドイツＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）の推奨されたプロトコルを用いてＤＮａｓｅ処理を行った。ＵＶ分光光度法（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ  ＥＣＯＭ６１２２、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ、ドイツＨａｍｂｕｒｇ）を用いて全ＲＮＡを定量し、品質および完全性は０．５μｇの単離したＲＮＡを１％ホルムアミドアガロースゲル上で電気泳動することによって確認した。さらに、ＲＮＡ標本は、製造者の指示に従った、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ、ドイツＢｏｅｂｌｉｎｇｅｎ）を用いたＬａｂＣｈｉｐ上でのミクロキャピラリー電気泳動によって分析した。
【実施例２】
【０３３５】
定量的動力学的ＲＴ−ＰＣＲを利用した発現プロファイリング
定量的ＰＣＲ方法による遺伝子発現の詳細な分析には、目的のゲノム領域に隣接するプライマーおよびそれの間にハイブリダイズする蛍光標識したプローブを利用する。ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、米国カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）のＰＲＩＳＭ７７００Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを、蛍光レポーター色素および消光色素の両方で標識したオリゴヌクレオチドからなる蛍光プローブの技術と共に用いることで、このような発現の測定を行うことができる。プローブに特異的な産物の増幅はプローブの切断を引き起こし、レポーターの蛍光の増加が生じる。プライマーおよびプローブはＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを用いて選択され、主にコード配列の３’領域中または３’非翻訳領域中に局在する。すべてのプライマー対は、従来のＰＣＲ反応およびゲル電気泳動によって特異性について確認した。試料ＲＮＡの量を標準化するために、ＧＡＰＤＨを参照として選択し、これは、分析した試料中で制御に差がなかったからである。生体試料中の遺伝子のこのような発現分析を行うために、２５μｌの１００μＭストック溶液「上流プライマー」、２５μｌの１００μＭストック溶液「下流プライマー」を、１２．５μｌの１００μＭストック溶液ＴａｑＭａｎ−プローブ（ＦＡＭ／Ｔａｍｒａ）と混合し、蒸留水で５００μｌに調節することによって、それぞれのプライマー／プローブを調製した（プライマー／プローブミックス）。各反応について、１．２５μｌの患者試料のｃＤＮＡを、８．７５μｌのヌクレアーゼを含まない水と混合し、９６ウェルのＯｐｔｉｃａｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ第４３０６７３７号）の１つのウェルに加えた。その後、１．５μｌの上述のプライマー／プローブミックス、１２．５μｌのＴａｑ  Ｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ−ＰＣＲミックス（２×）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ第４３１８１５７号）および１μｌの水を加えた。９６ウェルプレートを８Ｃａｐｓ／Ｓｔｒｉｐｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ第４３２３０３２号）で閉じ、３分間遠心分離した。ＰＣＲ反応の測定は、製造者の指示に従って、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（第２０１１４号）のＴａｑＭａｎ７９００ＨＴを用いて、適切な条件下（５０℃で２分間、９５℃で１０分間、９５℃で０．１５分間、６０℃で１分間；４０サイクル）で行った。これまでに未分類の生物学的試料を測定する前に、対照実験、例えば細胞系、健康な対照試料、定義された治療応答の試料を用いて実験条件の標準化を行うことができる。
【０３３６】
ＴａｑＭａｎ妥当性確認実験を行い、これにより標的および対照の増幅の効率がほぼ同等であることが示された。これは、当業者に知られている比較ΔΔＣＴ方法による遺伝子発現の相対定量の必須条件である。したがって、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのソフトウェアＳＤＳ２．０を、それぞれの指示書に従って使用することができる。その後、統計ソフトウェアパッケージ（ＳＡＳ）の適切なソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（商標））を用いてＣＴ値をさらに分析する。
【０３３７】
Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒによって提供される上述の技術と共に、ＲＴ−ＰＣＲ反応のリアルタイム検出が可能な、Ｒｏｃｈｅ  Ｉｎｃ．のＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（商標）またはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．のｉＣｙｃｌｅｒなどの他の技術手段を使用し得る。
【実施例３】
【０３３８】
ＤＮＡマイクロアレイを利用した発現プロファイリング
発現プロファイリングは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイ技法を用いて実施することができる。ｍＲＮＡがこのようなＤＮＡアレイまたはＤＮＡチップにハイブリダイゼーションすることによって、アレイの特定の位置におけるシグナル強度による各転写物の発現値を同定することが可能となる。通常、これらのＤＮＡアレイはｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはサブクローニングしたＤＮＡ断片をスポッティングすることによって作製する。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ技法の場合、約４００，０００個の個別のオリゴヌクレオチド配列をケイ素ウエハーの表面上の個別の位置で合成した。オリゴマーの最小の長さは１２個のヌクレオチド、好ましくは２５個のヌクレオチドまたは調査中の転写物の完全長である。また、発現プロファイリングは、ナイロンまたはニトロセルロース膜に結合したＤＮＡもしくはオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによっても実施し得る。ハイブリダイゼーションから生じるシグナルの検出は、比色的、蛍光的、電気化学的、電気的、光学的、または放射性の読取りによって得られ得る。アレイの構成の詳細な説明は上記および引用した他の特許文献中に言及されている。分析する染色体領域における定量的および定性的変化を決定するためには、このようなゲノム変化を含むと疑われる腫瘍組織由来のＲＮＡを、全トランスクリプトームの発現プロフィールに基づいて良性組織（例えば上皮乳房組織、または顕微解剖した乳管組織）から抽出したＲＮＡと比較しなければならない。軽微な変更を行ったが、試料の調製プロトコルはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ発現分析手引き（カリフォルニア州Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ）に従った。腫瘍もしくは良性組織、生検、細胞単離物または体液を含む細胞からの全ＲＮＡの抽出および単離はＴＲＩｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）ならびにＯｌｉｇｏｔｅｘ  ｍＲＮＡ  Ｍｉｄｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツＨｉｌｄｅｎ）を用いて行うことができ、濃度を１ｍｇ／ｍｌにするためにエタノール沈殿工程を実施すべきである。５〜１０ｍｇのｍＲＮＡを用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって二本鎖ｃＤＮＡを作製する。第１鎖ｃＤＮＡの合成はＴ７−（ｄＴ２４）オリゴヌクレオチドを用いて開始させた。フェノール／クロロホルムでｃＤＮＡを抽出し、エタノールで１ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで沈殿させることができる。生じたｃＤＮＡから、Ｅｎｚｏ（Ｅｎｚｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、ニューヨーク州Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写キットを用いてｃＲＮＡを合成することができる。同じ工程内で、ｃＲＮＡをビオチンヌクレオチドＢｉｏ−１１−ＣＴＰおよびＢｉｏ−１６−ＵＴＰ（Ｅｎｚｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、ニューヨーク州Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ）で標識することができる。標識およびクリーンアップ後（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ（ドイツ）、ｃＲＮＡを適切な断片化緩衝液（例えば、４０ｍＭのトリス−酢酸、ｐＨ８．１、１００ｍＭのＫＯＡｃ、３０ｍＭのＭｇＯＡｃ、９４℃で３５分間）中で断片化すべきである。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコルのように、��片化されたｃＲＮＡをそれぞれ約４０，０００個のプロービングした転写物を含むＨＧ＿Ｕ１３３アレイＡおよびＢ上で、２４時間、６０ｒｐｍで、４５℃のハイブリダイゼーションオーブン内でハイブリダイゼーションさせるべきである。ハイブリダイゼーション工程ののち、チップの表面を洗浄して、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｓｔａｔｉｏｎ内においてストレプトアビジンフィコエリスリン（ＳＡＰＥ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ、オレゴン州Ｅｕｇｅｎｅ）で染色しなければならない。染色を増強するために、第２の標識工程を導入することができ、これは推奨されるが強制的ではない。ここでは、ＳＡＰＥ溶液を２回、抗ストレプトアビジンビオチン標識した抗体と共に加えるべきである。プローブアレイへのハイブリダイゼーションは、蛍光定量スキャン（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｇｅｎｅ  Ａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ；Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）によって検出し得る。
【０３３９】
ハイブリダイゼーションおよびスキャンののち、品質管理のためにマイクロアレイ画像を分析することができ、主要なチップの欠陥またはハイブリダイゼーションシグナルの異常を探す。したがって、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  ＭＡＳ５．０ソフトウェアまたは他のマイクロアレイ画像分析ソフトウェアのいずれかを利用することができる。１次データ分析は製造者によって提供されたソフトウェアによって実施するべきである。
【０３４０】
遺伝子分析の場合、本発明の一実施形態では、１次データをさらなる生物情報学的手段および追加のフィルター基準によって分析した。生物情報学的分析を以下に詳述する。
【実施例４】
【０３４１】
発現プロファイリング実験からのデータ分析
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ測定技法（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ発現分析手引き、カリフォルニア州Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ）によれば、１つのチップにおける１回の遺伝子発現測定により平均差値およびアブソリュートコールが得られる。それぞれのチップは、遺伝子またはｃＤＮＡクローンあたり１６〜２０個のオリゴヌクレオチドプローブ対を含む。これらのプローブ対には、完全にマッチした組およびミスマッチの組が含まれ、これらはどちらも、各プローブ対の強度の差の指標である平均差値、すなわち発現値の計算に必要であり、これは、ミスマッチの強度を完全マッチの強度から引き算することによって計算する。これは、プローブ対間におけるハイブリダイゼーションのばらつきおよび蛍光強度に影響を与える可能性がある他のハイブリダイゼーション人工産物を考慮に入れている。平均差は、その遺伝子の発現値表すと考えられる数値である。アブソリュートコールは、「Ａ」（存在しない）、「Ｍ」（境界値）、または「Ｐ」（存在する）の値をとることができ、１回のハイブリダイゼーションの品質を表す。本発明者らは、平均差によって与えられた定量的情報およびアブソリュートコールによって与えられた定性的情報をどちらも用いて、乳癌を有する個体由来の生体試料対正常集団由来の生体試料において差次的に発現される遺伝子を同定した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ以外の他のアルゴリズムでは、比較により、同じ発現値および発現差を表す異なる数値が得られた。
【０３４２】
正常集団と比較した、乳癌群の１つにおける差次的発現Ｅは以下のように計算する。乳癌集団のｎ個の平均差値ｄ１、ｄ２、．．．、ｄｎおよび正常固体集団のｍ個の平均差値ｃ１、ｃ２、．．．、ｃｍを仮定した場合、以下の式によって計算する：
【数１】
2008502326.tif 000002
【０３４３】
１つもしくは複数のｉおよびｊの値においてｄｊ＜５０またはｃｉ＜５０である場合は、これら特定の値ｃｉおよび／またはｄｊは、「人工的な」発現値５０に設定する。これらの特定のＥの計算により、ＴａｑＭａｎの結果との正しい結果が可能となる。
【０３４４】
Ｅ≧表２に示した最小限の変化因子であり、かつ乳癌集団において「Ｐ」に等しいアブソリュートコールの数値がｎ／２よりも大きい場合、遺伝子は乳癌対正常において上方制御されたと言われる。表３の最小限の倍数変化因子を、所定の化学療法に応答する患者集団（ＣＲ）、投与した化学療法に応答しない患者集団（ＮＣ）または腫瘍の病的徴候を有さない組織（ＮＢ）について与える。１を超える倍数変化は、第１の名称の組織試料における遺伝子発現の、第２のものと比較した増加をいう。この制御因子は平均値であり、個別に異なり得る。ここでは、クラスター分析または主成分分析について表１に記載した６５個の遺伝子すべての合わせたプロフィールが、このような試料の分類群を示す。
【０３４５】
差次的に制御された遺伝子の最終的なリストは、乳癌を有する個体由来の生体試料対正常集団由来の生体試料におけるすべての上方制御された遺伝子およびすべての下方制御された遺伝子からなるか、または個別の応答パターンからなる。最後に、定量的なリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、このリストに記載されている診断上または製薬上の用途に興味深い遺伝子の妥当性確認を行った（実施例２参照）。
【実施例５】
【０３４６】
単一の患者の経時的研究におけるＥＣに制御された遺伝子の同定
化学療法ののちに差次的に発現される遺伝子を同定するために、各遺伝子について最初の化学療法治療の開始後のそれぞれの時点で信頼スコア（ＣＳ）を計算することができる。Ｊｅｌｉｎｋｓｙ他（９７）によって報告された方法を一部改変して使用することができる。ＣＳとは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘソフトウェアによって定義される倍数変化（ＦＣ）、発現レベル（ＥＬ）、および現在のコール（ＰＣ）について与えられた個々のスコアの合計と定義される。各遺伝子についてそれぞれの時点で未治療の対照に対して倍数変化が定義される。ＦＣのスコアは、上方制御された遺伝子では変化の倍数が２以上、または下方制御された遺伝子では０．５以下の場合５であり、上方制御された遺伝子では倍数変化が１．５を超えるか、または下方制御された遺伝子では０．６６未満の場合これは２であり、上方制御または下方制御された遺伝子のそれぞれで倍数変化が１．５未満または０．６６以上の場合これは−０．５である。ＥＬスコアは、各遺伝子のスケーリングした強度（各ＧｅｎｅＣｈｉｐの平均強度を標的強度１００に全体的にスケーリングする）に基づいて決定する。その結果、ＥＬスコアは、シグナル強度が１０，０００を超える場合は３に設定し、強度が５００を超える場合は２であり、５００〜５０の発現レベルの遺伝子では０であり、強度が５０以下の場合は−０．５である。ＰＣスコアは、５つの試料すべて中に遺伝子が存在する場合（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘソフトウェアによって定義）は５であり、遺伝子が４つの試料中に存在する場合は４であり、遺伝子が５つのうち３つの試料中に存在する場合は３であり、遺伝子が５つのうち少なくとも２つの試料中に存在する場合は２であり、遺伝子が４つのうち１つの試料中にしか存在しない場合は１であり、遺伝子が存在しない場合は０である。このスコア付けに基づくと、いずれの遺伝子についても可能な最大のＣＳは３５である。本発明者らは、ＣＳが２７以上の場合に遺伝子が化学療法治療の下で制御されているとみなした。
【実施例６】
【０３４７】
強力な適中力を有する化学療法（Ｅ／ＣおよびＥ／Ｔ）ののちに差次的に発現される遺伝子の同定
最初の化学療法サイクルののちに差次的発現を示し、かつ応答しない腫瘍組織からの応答とは区別され、かつ実施例７に記載の予測アルゴリズムに利用することができる遺伝子を同定するために、以下の分析を行うことができる。
【０３４８】
適用可能なすべての化学療法後の試料の、訓練組および試験組への分割。訓練組内では、試料をその臨床転帰（ＣＲまたはＮＣ）に基づいて２つの群に分割する。すべての統計の同定から、スチューデントｔ検定、またはウェルチ検定（表２に示した２２，０００個の要素すべてに基づいたｐ値）によって遺伝子が有意に変化した。両検定においてｐ値＜０．０５を有する、または合わせたランクが２２００未満のすべての遺伝子の単離（最も高い１０％の画分）。差次的発現用の、対合した化学療法前の試料中の同じ遺伝子組の分析。化学療法前の試料において弁別力を有さない遺伝子の同定。これらの遺伝子は、薬物の作用に基づいた生物学的プロセスを説明している。ＮＣおよびＣＲ試料について表２に示した、一般的な乳癌試料におけるこの遺伝子の発現の中央値に関して最も高い平均倍数変化を有する遺伝子の選択。遺伝子のさらなる選択は、ＣＲおよびＮＣの個々の群を参照することによって化学療法前の試料と比較して化学療法後の試料で最も高い倍数変化（ＦＣ）を同定することによって、行うことができる。化学療法前の群のＮＣ対ＣＲの倍数変化は、表２に記載のように＜２であるべきである。
【実施例７】
【０３４９】
サポートベクターマシーンおよびクラス予測を用いた差次的遺伝子発現パターンの分析
サポートベクターマシーン（ＳＶＭ）は、２クラスまたは複数クラスのパターン認識によく適している（Ｖａｐｎｉｋ、１９９５（７６）；Ｂｕｒｇｅｓ、１９９８（７７）。
【０３５０】
２クラスの分類の問題には（例えば腫瘍組織対非腫瘍組織、または治療応答性対非応答性）、一組の試料、すなわち、一連のインプットベクター
【数２】
2008502326.tif 000003
を想定し、これは対応する標識
ｙｉ∈｛＋１，−１｝（ｉ＝１、２、．．．、ｍ）
を有する。
【０３５１】
ここでは、＋１および−１は２つのクラスを示す。現在の腫瘍状態または治療剤に対する起こり得る応答を説明するために表１もしくは２からのマーカー遺伝子の遺伝子発現パターンを分類するため、インプットベクターの大きさは、オリゴヌクレオチドアレイ上に存在する異なるオリゴヌクレオチドの種類またはそのサブセットの数に等しく、それぞれのインプットベクターの単位は１つの特異的なオリゴヌクレオチドの種類のハイブリダイゼーション値を表す。
【０３５２】
目的は、将来の試料を誤分類する確率をわずかに有する利用可能な試料から、２成分の分類指標を構築するか、または決定関数を導くことである。
【０３５３】
ＳＶＭは、以下の考えを実行している。これは、以下のインプットベクター
【数３】
2008502326.tif 000004
を高次元の特徴空間
【数４】
2008502326.tif 000005
へとマッピングして最適分離超平面（ＯＳＨ）を構築し、これは境界、すなわち空間Ｈ内の超平面と各クラスの最も近いデータ点との距離を最大にする。特徴空間中の陽性の例を陰性の例から分離することができるもののうちからＯＳＨを選択することによって、ＳＶＭは過剰適合を回避している。
【０３５４】
異なるマッピングにより異なるＳＶＶが構築される。マッピング
【数５】
2008502326.tif 000006
は、核関数
【数６】
2008502326.tif 000007
によって行い、これは、空間Ｈにおける内積を定義している。
【０３５５】
ＳＶＭによって実行される決定関数は、以下のように書くことができ（Ｂｕｒｇｅｓ、１９９８（７７）：
【数７】
2008502326.tif 000008
式中、係数αｉは、以下の凸２次計画（ＱＰ）問題を解くことによって得ることができる：
【数８】
2008502326.tif 000009
を最大化し、以下の式に供する：０≦αｉ≦Ｃ（式３）
および
【数９】
2008502326.tif 000010
【０３５６】
規則性パラメータＣ（式３）は、境界と誤分類のエラーとのトレードオフを制御する。
【数１０】
2008502326.tif 000011
は、対応するαｉ＞０の場合にのみサポートベクターと呼ばれる。
【０３５７】
本実施例中で用いた核関数のうち２つは以下の通りであり、
【数１１】
2008502326.tif 000012
【数１２】
2008502326.tif 000013
前者（式４）はｄ次の多項式核関数と呼ばれ、ｄ＝１の場合に最終的に直線関数に戻り、後者（式５）はラジアル基本関数（Ｒａｄｉａｌ  Ｂａｓｉｓ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、ＲＢＦ）核関数と呼ばれる。
【０３５８】
処置のデータ組について、１つのＳＶＭを特定するためには核関数および規則性パラメータＣだけを選択すればよい。ＳＶＭは多くの魅力的な特徴を有する。例えば、ＱＰ問題の解は全体的に最適化されているが、神経回路網では、勾配に基づいた訓練アルゴリズムは極小値を見つけることのみを保証する。さらに、ＳＶＭは大きな特徴空間を取り扱うことができ、境界を制御することによって過剰適合を有効に回避することができ（上述参照）、情報の点、すなわち、サポートベクターなどからなる小さなサブセットを自動的に同定することができる。
【０３５９】
遺伝子発現データに基づいた生体試料の分類、ひいては新生物性病変の同定および治療剤に対するそのような病変の応答は、複数クラス分類の問題である。クラス数ｋは腫瘍サブクラスの数（例えば組織学的特徴、ＴＮＭ段階、グレード、ホルモン状態）に等しく、予測する、すなわち訓練データ組中に存在する、特定の治療剤に対する応答のサブグループ（例えば病理学的に確認された完全な寛解、良好な寛解、部分的な寛解、または寛解なし、ならびに進行性の疾患）に等しい。本試料組における異なるクラスの数が限定されているので、本発明者らは、複数分類を一連の２成分分類に減らすことによって複数クラス分類を取り扱うことに決定した。ｋ個のクラス分類には、ｋ個のＳＶＭを構築した。ｉ個目のＳＶＭを、陽性標識を有するｉ個目のクラス内の全試料および陰性標識を有する他のすべての試料を用いて訓練する。最後に、未知の試料を、最も高い出力値を有するＳＶＭに対応するクラスに分類する。この方法を用いて、表１に示すように差次的に発現されるマーカー遺伝子の遺伝子発現パターンの予測／分類システムを構築する。
【０３６０】
マイクロアレイハイブリダイゼーション実験またはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって生じた各データ点は（実施例２および３参照）、分析した試料中に存在するｍＲＮＡのコピー数に対応し、かつこれによって決定される、すなわち、ポリヌクレオチドアレイ上のｎ個のオリゴヌクレオチドの種類を用いた実験からは、一連のｎ個の発現レベル値が得られる。これらのｎ値は、典型的には、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅによる「ｃｅｌファイル」の分析または上述のソフトウェアの結果であるメトリクスファイルに記憶される。一連のｍ個のメトリクスファイルからのデータ（ｍ個の発現分析を表す）を用いて発現マトリクスを構築し、ここでは、１回の実験においてｍ列のそれぞれがｎ個の要素の発現ベクターからなる。ｍ回の実験の発現値を正規化するために、ｘｉｊを、遺伝子ｊ（そのｍＲＮＡはマイクロアレイ上に存在するオリゴヌクレオチドの種類ｊ’とハイブリダイズするか、または有効なΔΔＣＴ強度を与える）発現レベルａｉｊの対数の合計であり、発現ベクター
【数１３】
2008502326.tif 000014
がユークリッド長１を有するように正規化したものと定義した：
【数１４】
2008502326.tif 000015
【０３６１】
初期解析は、実施例２および３に記載のように、２００００要素の発現ベクターの組を用いて１１回の実験を実施した（訓練組で６回の実験および試験組で５回）。
【０３６２】
１１回の実験が３つの異なる応答クラスおよび２つの異なる腫瘍状態を表すという知識、ならびに腫瘍および非腫瘍組織の情報を用いて、本発明者らは、これらの応答クラスおよび病状を認識するために上述のＳＶＭを訓練組で訓練した。試験組を用いて予測の精度を評価した。ここで、本発明者らは「１個抜き」法を利用した交差妥当化を行い、より厳密な試験には４〜５倍の妥当性確認（２５％抜き）をｎ回反復して行った（ｎ＞１０，０００）。
【０３６３】
このような交差妥当化および分類実験において、表から選択したマーカー遺伝子のサブセットの適中力を以下の親和性レベルで試験した：
【表１】
2008502326.tif 000016
【表２】
2008502326.tif 000017
【０３６４】
Ｘで示した応答は、示したように、分析してその応答を予測した５つの試験組試料を表す。１つの患者試料（Ｐ３９＿後）では予測により新しいクラスＰＲ（部分応答）がもたらされたが、他のすべての試料は正しく分類された。
【０３６５】
【表３】
2008502326.tif 000018
【表４】
2008502326.tif 000019
【表５】
2008502326.tif 000020
【表６】
2008502326.tif 000021
【０３６６】
【表７】
2008502326.tif 000022
【表８】
2008502326.tif 000023
【０３６７】
【表９】
2008502326.tif 000024
【表１０】
2008502326.tif 000025
【表１１】
2008502326.tif 000026
【０３６８】
【表１２】
2008502326.tif 000027
【表１３】
2008502326.tif 000028
【０３６９】
文献
特許文献
米国特許第4843155号    Chomczynski, P.
米国特許第526231号    Liang, P., and Pardee, A. B., 1993
米国特許第4683202号    Mullis, K. B., 1987
米国特許第5593839号
米国特許第5578832号
米国特許第5556752号
米国特許第5631734号
米国特許第5599695号
米国特許第468195号
米国特許第5498,531号
米国特許第5714331号
米国特許第5641673号    Haseloff et al., 
米国特許第5223409号    Lander, E., 
米国特許第5976813号    Beutel et al.
米国特許第5283317号
米国特許第6203987号
WO 97/29212
WO 97/27317
WO 95/22058
WO 99/12826
WO 97/02357 
WO 94/13804 
WO 94/10300
EP 0 785 280
EP 0 799 897
EP 0 728 520
EP 0 721 016
EP 0 321 201
GB2188638B
他の文献
(1)            Publications cited:WHO. International Classification of Diseases, 10th edition (ICD-10). WHO 
(2)            Sabin, L.H., Wittekind, C. (eds): TNM Classification of Malignant Tumors. Wiley, New York, 1997
(3)            Sorlie et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Sep 11;98(19):10869-74 (3); 
(4)            van ’t Veer et al., Nature. 2002 Jan 31;415(6871):530-6. (4).
(5)            Perez, E.A.: Current Managment of Metastatic Breast Cancer. Semin. Oncol., 1999; 26 (Suppl.12): 1-10
(6)            Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d ed., 1989
(7)            Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley ＆ Sons, New York, N.Y., 1989.
(8)            Tedder, T. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:208-212, 1988
(9)            Hedrick, S. M. et al., Nature 308:149-153, 1984 
(10)          Sarkar, PCR Methods Applic. 2, 318-322, 1993
(11)          Triglia et al., Nucleic Acids Res. 16, 81-86, 1988
(12)          Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1, 111-119, 1991
(13)          Copeland ＆ Jenkins, Trends in Genetics 7: 113-118, 1991
(14)          Cohen, et al., Nature 366: 698-701, 1993
(15)          Bonner et al., J. Mol. Biol. 81, 123 1973
(16)          Bolton and McCarthy, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 48, 1390 1962
(17)          Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603, 1986,
(18)          Henikoff ＆ Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1992
(19)          Pearson ＆ Lipman, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 85:2444, 1988
(20)          Needleman ＆ Wunsch, J. Mol. Biol.48:444, 1970
(21)          Sellers, SIAM J. Appl. Math.Xno:787, 1974
(22)          Takamatsu, EMBO J. 6, 307-311, 1987
(23)          Winter et al., Results Probl. Cell Differ. 17, 85-105, 1991
(24)          Engelhard et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 91, 3224-3227, 1994
(25)          Logan ＆ Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 3655-3659, 1984
(26)          Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20, 125-162, 1994
(27)          Freshney R.I., ed., ANIMAL CELL CULTURE , 1986
(28)          Wigler et al., Cell 11, 223-232, 1977
(29)          Lowy et al., Cell 22, 817-823, 1980
(30)          Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 3567-3570, 1980
(31)          Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150, 114, 1981
(32)          Hartman ＆ Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 8047-8051, 1988
(33)          Rhodes et al., Methods Mol. Biol. 55, 121-131, 1995
(34)          Hampton et al., SEROLOGICAL METHODS: A LABORATORY MANUAL, APS Press, St. Paul, Minn., 1990
(35)          Porath et al., Prot. Exp. Purif. 3, Xno3-281, 1992
(36)          Kroll et al., DNA Cell Biol. 12, 441-453, 1993
(37)          Caruthers et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, 1980
(38)          Roberge et al., Science Xno9, 202-204, 1995
(39)            Creighton, PROTEINS: STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, WH and Co., New York, N.Y., 1983
(40)          Cronin et al., Human Mutation 7:244, 1996
(41)          Landegran et al., Science 241:1077 1080, 1988
(42)          Abravaya et al., Nuc Acid Res 23:675 682, 1995
(43)          Guatelli, J.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874 1878, 1990
(44)          Kwoh, D.Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173 1177, 1989
(45)          Lizardi, P.M. et al., Bio/Technology 6:1197, 1988
(46)          Brown, Meth. Mol. Biol. 20, 18, 1994 
(47)            Gee et al., in Huber ＆ Carr, MOLECULAR AND IMMUNOLOGIC APPROACHES, Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y., 1994
(48)          Uhlmann et al., Tetrahedron. Lett. 215, 3539-3542, 1987
(49)          Couture ＆ Stinchcomb, Trends Genet. 12, 510-515, 1996
(50)          Haseloff et al. Nature 334, 585-591, 1988
(51)          Kohler et al., Nature 256, 495-497, 1985
(52)          Takeda et al., Nature 314, 452-454, 1985
(53)          Burton, Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 11120-11123, 1991
(54)          Thirion et al., Eur. J. Cancer Prev. 5, 507-11, 1996
(55)          Coloma ＆ Morrison, Nat. Biotechnol. 15, 159-63, 1997
(56)          Mallender ＆ Voss, J. Biol. Chem. Xno9, 199-206, 1994
(57)          Verhaar et al., Int. J. Cancer 61, 497-501, 1995
(58)          Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 3833-3837, 1989
(59)          Lam, Anticancer Drug Des. 12, 145, 1997
(60)          Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994
(61)          Houghten, BioTechniques 13, 412-421, 1992
(62)          Lam, Nature 354, 8284, 1991
(63)          Fodor, Nature 364, 555-556, 1993
(64)          Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1865-1869, 1992
(65)          Scott ＆ Smith, Science 249, 386-390, 1990
(66)          Jayawickreme et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 19, 1614-1618, 1994
(67)          Chelsky, Strategies for Screening Combinatorial Libraries 1995
(68)          Salmon et al., Molecular Diversity 2, 57-63, 1996
(69)          McConnell et al., Science 257, 1906-1912, 1992
(70)          Szabo et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 699-705, 1995
(71)          Findeis et al. Trends in Biotechnol. 11, 202-205, 1993
(72)          Chiou et al., GENE THERAPEUTICS: METHODS AND APPLICATIONS OF DIRECT GENE TRANSFER J.A. Wolff, ed., 1994
(73)          REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES Maack Publishing Co., Easton, Pa.
(74)          Hille, Excitable Membranes, Sunderland, MA, Sinauer Associates, Inc.
(75)          Van Heeke ＆ Schuster, J. Biol. Chem. 264, 5503-5509, 1989
(76)          Vapnik, The Nature of Statistical Learning Theory, 1995, Springer, New York
(77)          Burges, Data Mining and Knowledge Discovery, 2(2):955-974, 1998
(78)          Faneyte et al., Br J Cancer, 88:406-412, 2003.
(79)          Perou et al., Nature, 406:747-752. 2000.
(80)          Sorlie et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 100:8418-8423, 
(81)          Pusztai et al., Clin Cancer Res., 9:2406-2415, 2003.
(82)          Ahr et al., J. Pathol., 195:312-320, 2001.
(83)          Martin et al., Cancer Res., 60:2232-2238, 2000.
(84)          van de Rijn et al., Am J Pathol., 161:1991-1996, 2002.
(85)          Huang et al., Lancet, 361:1590-1596, 2003.
(86)          West et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 98:11462-11467, 2001
(87)          van de Vijver et al., N Engl J Med. 347:1999-2009, 2002.
(88)          Sotiriou et al.,Breast Cancer Res., 4:R3, Epub 2002 Mar 20.
(89)          Chang et al., Lancet, 362:362-369, 2003.
(90)          Korn et al., Br J Cancer, 86:1093-1096, 2002.
(91)          Fisher et al., J Clin Oncol., 15:2483-2493, 1997.
(92)          Fisher et al., J Clin Oncol., 16:2672-2685, 1998.
(93)          Makris et al.,  Ann Oncol., 9:1179-1184, 1998.
(94)          Chang et al., Cancer, 89:2145-2152, 2000.
(95)          Quackenbush, Nature, 2:418-427, 2001.
(96)          Eisen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14863-14868, 1998. 
(97)          Jelinsky et al., Endocrinology, 144:701-710, 2003.
(98)          Nguyen et al., Bioinformatics, 18:1216-1226, 2002.
(99)          UMETRICS Academy. Multivariate data analysis and modelling, 378p., 2002.
(100)        Tenenhaus, M. La regression PLS. Editions Technip, Paris, 1998.
(101)        Parton et al., Clin Cancer Res., 8:2100-2108, 2002.
(102)        Ellis et al., Breast Cancer Res Treat., 48:107-116, 1998.
【配列表】
2008502326000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年1月30日(2007.1.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008502326000001.app
【国際調査報告】
2008502326.tif 000169
2008502326.tif 000170
2008502326.tif 000171
2008502326.tif 000172
2008502326.tif 000173