(57)【要約】  本発明は、特に、揮発性化合物−結合タンパク質（ＢＰ）又はその組成物を用いた、膜結合受容体に対する揮発性化合物の結合及び／又は機能の、インビトロでの同定及び／又は確認方法に関する。加えて、本発明は、揮発性化合物を認識する受容体タンパク質、又は上記化合物のための候補受容体；及び；ＢＰ、複合体又はその組成物を備えたキットに関する。上記キットは、膜結合受容体に対する揮発性化合物の結合及び／又は機能の同定及び／又は確認に使用し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜結合受容体に対する揮発性化合物の結合及び機能を同定及び／又は確認する方法であって：
−  上記受容体のリガンドであり得る化合物を選択し、
−  上記化合物を、揮発性化合物結合タンパク質（ＢＰ）に対する空中吸収によって可溶化して、ＢＰ−リガンド複合体を形成し、
−  上記受容体を発現している細胞上に上記リガンド複合体を適用し、
−  上記受容体の機能的応答を測定し、そして、
−  上記受容体のリガンドを同定し、及び／又は、上記受容体に対する上記化合物の結合及び機能を確認するステップを含む、方法。
【請求項２】
機能的応答が：Ｃａ2+、ｃＡＭＰプール、ＩＰ３、ＧＴＰ、メラニン保有細胞アッセイ及びＭＡＰ−キナーゼからなる群より選択される細胞シグナル伝達分子を試験することにより測定され得るか；又は；機能的応答が、Ｇタンパク質／ＯＲ相互作用、受容体の脱感作を試験することにより測定され得るか；又は；機能的応答が、レポーター系の調節を試験することにより測定され得る、請求項１記載の方法。
【請求項３】
機能的応答が、放射性同位元素、蛍光又は発光法を用いて測定される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
膜結合受容体に対する揮発性化合物の結合を同定及び／又は確認する方法であって：
−  上記受容体のリガンドであり得る化合物を選択し、
−  上記化合物を、揮発性化合物結合タンパク質（ＢＰ）に対する空中吸収によって可溶化して、ＢＰ−リガンド−複合体を形成し、
−  上記受容体を含む細胞膜に、上記リガンド複合体を適用し、
−  上記受容体に対する上記化合物の結合を測定し、そして、
−  上記受容体のリガンドを同定し、及び／又は、上記受容体に対する上記化合物の結合を確認するステップを含む、方法。
【請求項５】
結合が、放射性同位元素、蛍光法（ＦＲＥＴ、偏光）又は発光法（ＢＲＥＴ）を用いて測定される、請求項４項記載の方法。
【請求項６】
上記細胞が異種細胞である、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法；又は細胞膜が、上記受容体を発現している異種細胞から調製される、請求項４記載の方法。
【請求項７】
上記細胞が、嗅上皮、胚細胞、精巣、脾臓、インスリン分泌β細胞、心臓、脳、気管、椎間、肋間、関節軟骨、肝臓、胃、腸表面、胸腺、背部の筋及び冠動脈からなる群より選択される組織から単離された細胞である、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法；又は上記細胞膜が、上記組織から調製される、請求項４記載の方法。
【請求項８】
上記細胞が、上記組織の一つから単離された神経細胞である、請求項７記載の方法；又は上記細胞膜が、上記単離された神経細胞から調製される、請求項４記載の方法。
【請求項９】
膜結合受容体が、Ｇタンパク質共役受容体、イオンチャネル及びチロシンキナーゼ受容体からなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
膜結合受容体が、嗅覚受容体、フェロモン受容体、味覚受容体、及び、揮発性化合物を認識する任意の種類の膜結合受容体からなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
揮発性化合物結合タンパク質（ＢＰ）が、哺乳動物又は昆虫起源である、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
揮発性化合物結合タンパク質（ＢＰ）が、リポカリン、血清アルブミン（ＳＡ）、及び、揮発性化合物を結合する能力を有し、かつ担体として機能して、上記揮発性化合物を膜結合受容体に提示する、タンパク質からなる群より選択される、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
揮発性化合物結合タンパク質が、野生型タンパク質又は変異体タンパク質である、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
揮発性化合物結合タンパク質が、単量体であるか；又はそのホモ二量体若しくはヘテロ二量体、ホモ多量体若しくはヘテロ多量体として存在する、請求項１〜１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
揮発性化合物結合タンパク質が、組成物で存在する、請求項１〜１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
上記組成物が、天然の流体又はその画分である、請求項１５項記載の方法。
【請求項１７】
揮発性化合物結合タンパク質が、リポカリンファミリーのメンバーであり、上記タンパク質は、標準的な超二次構造を有する、請求項１〜１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
スクリーニング法である、請求項１〜１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
ハイスループット法である、請求項１〜１８のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
−  揮発性化合物を認識する膜結合受容体を発現している細胞、又はその膜画分、及び、
−  揮発性化合物−結合タンパク質（ＢＰ）、その複合体又はその組成物
を含むキット。
【請求項２１】
膜結合受容体に対する揮発性化合物の結合及び／又は機能を同定及び／又は確認するための、請求項２０記載のキットの使用。
【請求項２２】
揮発性化合物結合タンパク質又はリポカリンが、臭気物質結合タンパク質（ＯＢＰ）、フェロモン結合タンパク質（ＰＢＰ）、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）、主要尿タンパク質（ＭＵＰ）、アフロディシン及びエブネル腺タンパク質からなる群より選択される、請求項１〜１９のいずれか一項記載の方法、請求項２０記載のキット、及び請求項２１記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、揮発性化合物−結合タンパク質（ＢＰ）又はその組成物を用いた、膜結合受容体に対する揮発性化合物の結合及び／又は機能を、インビトロで同定及び／又は確認する方法に関するものである。加えて、本発明は、揮発性化合物を認識する受容体タンパク質、又は上記化合物のための候補受容体；及び；ＢＰ、その複合体又は組成物を含むキットに関する。上記キットは、膜結合受容体に対する揮発性化合物の結合及び／又は機能を、同定及び／又は確認するために使用し得る。
【背景技術】
【０００２】
揮発性化合物は、任意の源に由来し得る小さい化学物質であり、固体又は液体（有機溶媒又は水のいずれか）に含ませると、室温又は高温で揮発又は蒸発して、空気中、又は蒸気若しくは煙としての排出物に存在するようになる。揮発性有機化合物は、非限定的に、以下の芳香ファミリー：アルデヒド、フルーティライト、フルーティダーク、スウィートアロマティック、バルサミック、アロマティックスパイシー、たばこ、オークモス、革、動物、琥珀、木、針葉樹、ハーブスパイシー、草、緑、柑橘類の一部である臭気物質分子を含み得る。これらの臭気物質分子はまた、非限定的に、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、アルケン、酸化エーテル、フェノール又はアルコール基を有する化合物も含む。これらの臭気物質分子に加えて、ある揮発性化合物は、哺乳動物において、味、ホルモン性行動及び／又はにおい知覚を引き起こすことが周知である。上記化合物は、細胞及び生物、例えば精子、動物及び昆虫等の位置を定める補助となり得る。
【０００３】
においの感覚により、無脊椎動物から哺乳動物に至る生物と環境間での、化学的コミュニケーションが可能となる。数千の臭気物質の知覚及び区別は、嗅覚を介して行われる。このような化学的シグナル伝達は、例えば親類又は仲間を識別し、食物を見つけ、又はテリトリーを認識するために臭気物質化合物に依存する殆どの動物種の社会的挙動を調節し得る。においを嗅ぐ能力は、最初に、嗅上皮内の神経細胞、嗅神経細胞（ＯＳＮ）により決定される。そこで臭気物質分子は、嗅覚受容体としても周知の嗅覚受容体タンパク質（ＯＲ）に結合する。これらＯＲは、Ｇ−タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーのメンバーである。これらは、最大の遺伝子ファミリーによりコード化されている。齧歯類では、１３００もの多数の異なるＯＲ遺伝子が同定されているが、ヒトゲノムでは、約８００のＯＲ遺伝子が同定されている。各嗅神経細胞は、唯一つの種類のＯＲを発現することにより、嗅神経細胞による臭気物質の区別の細胞的基盤を形成していると考えられている。ＯＲは、小胞体内で合成され、輸送され、最終的には、樹状突起の先端の繊毛の細胞表面膜に集中する。同様に、ＯＲは、ＯＳＮの軸索末端に見出される。これらは、軸策をＯＲ特異的な嗅球領域に指向させる役割を果たすと仮定されている。
【０００４】
殆どの哺乳動物は、第二の嗅覚系、鋤鼻系を有する。鋤鼻器官は、鼻腔内に位置し、部分的に鋤鼻覚神経細胞から構成されている。この系は、フェロモン受容体を活性化することによって、フェロモンを検出する役割を有する思われる。しかしながら、フェロモンの検出が、鋤鼻の感覚神経細胞のみを介して行われ、また鋤鼻の感覚神経細胞が、フェロモンのみを検出することを確認する証拠は全く存在しない。フェロモン受容体も７ＴＭタンパク質、であるが、ＯＲスーパーファミリーとは完全に区別される。フェロモン受容体がＧＰＣＲスーパーファミリーの一部であっても、これらの受容体に共役したＧ−タンパク質は、未だ全く同定されていない。今日まで、フェロモン受容体の２つのファミリー：Ｖ１Ｒ及びＶ２Ｒファミリーが挙げられている。これら両方の受容体は、マウス内で（３００を越えて）同定されているが、ヒトでは、Ｖ１Ｒファミリーの５つの受容体のみ同定されている。
【０００５】
味覚もまた、化学的感覚の一部である。味覚は、ヒトにおいて舌及び口蓋上に位置する味覚受容体の活性化に依存している。味覚受容体は、味蕾の味覚受容体細胞（ＴＣＲ）部分内に発現している。これらの細胞は、神経細胞と接触する専門の上皮細胞であり、神経細胞は、次に情報を脳に中継する。それにより、ＯＳＮとは異なり、ＴＣＲは、神経細胞ではない。嗅覚受容体と同様、味覚受容体はＧＰＣＲスーパーファミリーの一部である。今日、２つのファミリー：Ｔ１Ｒ及びＴ２Ｒファミリーが同定されている。ヒトにおいて、ヒトＴ１Ｒファミリーは、３つの受容体、即ちＴ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３から構成されているが、Ｔ２Ｒファミリーは、２５の推定受容体から構成されている。Ｔ２Ｒ受容体は、苦味の検出の役割を担い、単量体として機能すると思われる。しかしながら、Ｔ１Ｒ受容体は、二量体として働くと考えられる。二量体化は、受容体に特異性を付与すると思われる。ヘテロ二量体Ｔ１Ｒ１／Ｔ１Ｒ３は、旨味を検出する一方、ヘテロ二量体Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３は、甘味化合物により活性化される。これら２つのファミリーに加えて、他のタンパク質は、例えば電位チャネルＴＲＭＰ５、旨味受容体として機能し得るｍＧｌｕＲ４、酸味受容体ＡＳＩＣ２、塩味受容体ＥＮａＣ、辛味受容体ＶＮ１、又は冷味受容体ＴＭＰ８等の味覚受容体であると考えられる。
【０００６】
におい、味及びフェロモンは、常に動物及びヒトの個人的な挙動に影響を与えている。したがって、上記知覚の機序を理解することは、非常に重要である。特に最も、影響を与える手段を決定することが重要である。嗅覚、味覚及びフェロモン系は、一リガンド／一受容体規則に従わないことが周知である。文献に、同一受容体を活性化する数個のリガンドが記載されている。したがって、上記感覚系は、おそらく異なる受容体が同一リガンドにより活性化され得、一つの受容体が、異なるリガンドにより調節され得る系の一部である。上記複合体系を解明するために、インビボ様の条件である生理学的条件下で、ＯＲを含む揮発性化合物の結合受容体のみならず、味覚及びフェロモン受容体の試験を可能にする高感度な方法を所有することが重要である。
【０００７】
臭気物質、フェロモン又は味覚化合物が作用し得る数個の受容体が、候補受容体として記載されている。しかしながら、科学者達は、生理学的条件下で上記受容体及び／又はリガンドを正確に試験する方法を全く入手できない事実により妨げされている。事実、文献に記載されている現在のアッセイは、非限定的に、単一細胞カルシウムイメージング、及びプレートリーダーベースのアッセイを含む。上記アッセイにおいて、１０-2モル濃度迄の臭気物質が試験される。これらの条件下では、観察される細胞応答は、非特異的である可能性が非常に高い。生理学的濃度は、１０12未満であるナノ〜フェムトモル付近に存在すると予想されている。
【０００８】
多数の嗅覚受容体（ＯＲ）は、すべての過剰を脱オーファン化する（deorphanising）ための、最適化された方法、好ましくはハイスループット及び高感度スクリーニング法の設定を必要とした。
嗅粘液内に、多数のタンパク質が存在することが見出されている。一例は、ＯＢＰとも称される臭気物質結合タンパク質である。ウシ、ラット及びヤマアラシＯＢＰを含む、多数の哺乳動物種並びに多数の昆虫種由来のＯＢＰは、マイクロモル程度の親和性により、非常に様々な臭気物質に結合することが周知である。嗅覚過程におけるＯＢＰの機能は、尚多大な論争の的となっている。一方では、ＯＢＰは、その高濃度及び臭気物質分子を結合させる能力により、臭気物質を気道から嗅覚受容体へ誘導している可能性がある（Pevsner et al. 1984. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. 82:3050-3054; Pevsner et al. 1988. Science. 241 :336-339 ; Pevsner et al. 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:2383-2387 ; Avanzini et al. 1987. Cell. Tissue Res. 247:461-464 ; Lee et al. 1987. Science. 235:1053-1056 ; Bianchet et al. 1996. Nat. Struct. Biol. 3:934-939, Tegoni et al. 1996. Nat. Struct. Biol. 3:863-867, Pes et al. 1998. Gene. 212:49-55; Briand et al. 2002 Biochemistry. 41 :7241-7252)。他方では、ＯＢＰは、インビボで嗅覚受容体の競合物であり、臭気物質分子を捕捉して更に分解させる証拠が存在している (Boudjelal et al. 1996. Biochem. J. 317:23-27; Tegoni et al. 2000. Biochim. Biophys. Acta. :229-240; Lazar et al. 2002. Biochemistry. 41:11786-117894)。機能的証拠が全く示されていないため、これら２つの仮説の解明は、実行不可能である。数個の記事では、ＯＢＰは、臭気物質の濃度に応じて、両方の能力を有することさえも示唆されている(Matarazzo et al. 2002 Chem. Senses 27:691-701)。ＯＢＰは、リポカリンタンパク質スーパーファミリーの一部である。これらのタンパク質は、可溶な巨大分子と共に、共有結合又は非共有結合複合体を形成する能力によっても特徴付けられる。リポカリンは、哺乳動物又は昆虫の多くの体液中に見出されている。
【０００９】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、高分子量の内因性血漿タンパク質（ＭＷ６７kDa）である。これは、血液輸送系の主な成分であり、脂肪酸（ＦＡ）、ビリルビン、トリプトファン、カルシウム及び他の生理学的に重要な化合物を輸送する。例えば、代謝産物、毒素、薬理学的薬物との結合等の異なる因子は、ＨＳＡ分子の立体構造を変更し得、これは輸送機能障害を引き起こして、数種の病理過程を生じさせる可能性がある。ＨＡＳは、血液系の一部であるため、ヒト身体内で多くの役割を有し、また殆どの組織内に存在する。例えば、ＨＡＳは、固形腫瘍に優位に蓄積されることが周知である。また、Pernollet及び共同研究者は、嗅粘液内の血清アルブミン（ＳＡ）存在を証明した。しかしながら、嗅覚過程におけるＳＡの特定の機能は、全く指定されていない。上記血清アルブミンタンパク質は、ウシ種を含む、ヒト以外の種に見出されている（ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ）。
【００１０】
発明の詳細な説明
上述したように、リガンド／受容体相互作用の試験に使用されている現在の方法は、高濃度の臭気物質を必要とするため、非特異的な細胞応答を誘導する可能性が非常に高い。事実、McGovern et al. (J. Med. Chem. 2002. 45:1712-1722及びJ. Med. Chem. 2003. 46: 4265-4272 )に既に記載されているように、殆どの揮発性化合物が疎水性のため、これらはおそらく高濃度でミセルを形成し、それらの有効性及び特異性を変更する。更に、上記方法は、上記揮発性化合物−結合受容体の細胞膜に対する輸送が不十分であることから、上記受容体の特徴付け及び／又は試験が困難であり、妨げられている。したがって、現時点では、ＯＲを含む数種のみの揮発性化合物−結合受容体の試験が試験され、それらのリガンドが同定され得る。その結果、揮発性リガンドとも称される揮発性化合物の、それらの受容体との相互作用及び受容体に対する効果の試験を可能にする、現存する方法を最適化する必要がある。
【００１１】
本発明は、現在使用されている方法よりも、周知の生理学的条件に非常に近い条件下で、揮発性化合物のそれらの受容体との相互作用を試験できる新規な方法の提供に関する。上記方法は、細胞ベース又は膜ベースの方法であり得る。
【００１２】
先行技術の方法の最適化は、更に揮発性化合物を可溶化して、揮発性化合物−結合タンパク質（ＢＰ）と複合体を形成することに見出し得る。用語「揮発性化合物−結合タンパク質」は、揮発性化合物に結合するタンパク質を意味する。本発明によれば、上記ＢＰは、リポカリン又は血清アルブミン（ＳＡ）であり得る。本発明によれば、リポカリンは、臭気物質結合タンパク質（ＯＢＰ）、フェロモン結合タンパク質（ＰＢＰ）、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）、主要尿タンパク質（ＭＵＰ）、アフロディシン及びエブネル腺タンパク質からなる群より選択され得る。上記リポカイン及び血清アルブミンは、任意の種を起源とし得る。例えば上記リポカリンは、マウス、ラット、ヒト、ウシ、ブタ、ヤマアラシ及びウサギを起源とし得る；上記ＳＡは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、イノシシ（ｂｏａｒ）血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、マウス血清アルブミン、ブタ血清アルブミン及びラット血清アルブミンからなる群より選択され得る。当業者は、タンパク質が揮発性化合物を結合できるか否かを容易に測定し得る。そのような試験の例を、実施例１２に示す。タンパク質がリポカリン又は血清アルブミンファミリーのメンバーであることは、実施例１３及び実施例１４に説明するように測定し得る。
【００１３】
次に、上記ＢＰ複合体を使用して、上記揮発性化合物を認識する公知の又は候補の、ＯＲを含む揮発性−結合−化合物受容体の活性を調節する。
【００１４】
上述したように、現在実施されている方法の不都合の一つは、殆どの揮発性化合物、例えば臭気物質分子が疎水性であり、水性溶液中でミセルを形成することによって、非特異的な細胞応答を誘導する可能性が非常に高いという事実に存在する。本発明は、予期せずに、揮発性化合物結合タンパク質（ＢＰ）、血清アルブミン（ＳＡ）及び臭気物質結合タンパク質（ＯＢＰ）を含む特定の担体分子が、可溶化及び揮発性リガンドのその受容体に対する提示を改善することを見出した。したがって、本発明は、上記担体分子を使用して、揮発性化合物結合受容体のリガンド／受容体相互作用を試験する改善された方法を構成することを提案する。本発明によれば、上記担体タンパク質は、天然に存在する粘液、例えば嗅腔の粘液、若しくはその画分のような組成物中に存在し得、又はより純粋なタンパク質若しくはその組成物として存在し得る。詳細には、本発明は、可溶化及び臭気物質のそれらの受容体への提示において、ＢＰが担体として重要な役割を果たすことを実験的に証明する。しかしながら、臭気物質以外の揮発性化合物を認識する受容体、例えばフェロモン受容体及び味覚受容体等は、同様に挙動し、また上記受容体のリガンドは、類似する化学的性質を有するため、本発明は、嗅覚受容体に関して説明した方法の最適化が、他の揮発性化合物結合受容体のリガンド−受容体相互作用が試験される方法の最適化に適用し得ることを示唆する。味覚受容体のためのＢＰタンパク質は、エブネル腺タンパク質及びＯＢＰであるが、フェロモン結合タンパク質（ＰＢＰ）は、フェロモンの担体であろう。
【００１５】
文献において、臭気物質結合タンパク質（ＯＢＰ）は、臭気物質を結合することが示されている。しかしながら、臭気物質により活性化される嗅覚受容体（ＯＲ）は、ＯＢＰの存在に依存しないことも示されており、このことは、どちらかといえば上記臭気物質によって誘導されるシグナル伝達を制御するレギュレーター分子として関係することを示唆している。現在まで、揮発性−リガンド可溶化、及びその受容体に対する提示に関するＯＢＰの効果の試験を試みた者は存在しない。本発明は、ＯＢＰの役割が、可溶化の向上、及び受容体に対する臭気物質リガンドの提示の向上に存在することを見出した。上記役割は明確であるため、本発明は、上記ＯＢＰ又はその組成物を使用して、嗅覚受容体のリガンド／受容体相互作用を同定及び特徴付ける、インビトロでの方法を改善することを提案する。受容体付近の事象に基づく新規な臭覚機能アッセイを用いて、本発明は、ウシ嗅粘液が臭気物質分子を捕捉し、嗅覚受容体を活性化するそれらの効力を高め得ることを説明する。本発明は、更にＯＢＰ及びＳＡを含有するこの粘液の画分が、担体タンパク質の役割を果たすことを示す。最後に、本発明は、ウシ血清アルブミン単独の溶液が、臭気物質担体タンパク質の役割を果たし得ることを示す。
【００１６】
したがって、本発明は、特に、血清アルブミン（ＳＡ）、より一般的には、揮発性化合物−結合タンパク質（ＢＰ）が、インビトロでのアッセイにおいて、揮発性化合物の、それらの受容体に対する結合のための結合条件を最適化するのに使用し得るという発見に関する。本発明は、ＳＡ及びより一般的にはＢＰが、揮発性化合物をより可溶にして、揮発性化合物結合受容体に関する機能的アッセイ及び結合アッセイに適用し得る複合体を形成することを提案する。
【００１７】
本発明は、例えば嗅覚受容体、味覚受容体及びフェロモン受容体等の、異なる種類の揮発性化合物−結合受容体の試験に適用し得る方法に関する。したがって、本発明の方法は、とりわけ食物産業、健康産業、美容産業、軍隊、衛生機関、探知動物（例えば、薬物、爆発物、事故犠牲者等）を含む産業に使用し得る。例えば、本発明は、どの受容体及びリガンドが、特定の嗅感覚（例えば、知覚したにおい）の役割を担うか否かを同定する体系的方法を提供する。したがって、例えば、特定の反応を遮断することにより（例えば、阻害剤を含む鼻腔内スプレーを介して）、又は特定の相互作用を高めることにより（例えば、所定のリガンドを提供する鼻腔内スプレーにより、又は物体の表面上に所定のリガンドを放出する物質を被覆して）、知覚したにおいを制御し得る。したがって、望ましくないにおいを遮断し、覆い又は変更し（例えば、探知犬は、興味対象の標的のみ嗅ぎ、注意をそらせる他のにおいは全く嗅がないよう処置され得、掃除作業員は、廃棄物のにおいに免疫され得る等）、また所望のにおいを増強することができる。味及びフェロモンの調節の可能性は、多数の局面において多数の用途を見出すであろうことも明らかである。以下のパラグラフにおいて、本発明の方法を詳細に説明する。
【００１８】
本発明の第一の実施態様は、膜結合受容体に対する揮発性化合物の結合及び機能を同定及び／又は確認する方法に関する。上記方法は、
−  上記受容体のリガンドであり得る化合物を選択し、
−  上記化合物を、揮発性化合物結合タンパク質（ＢＰ）に対する空中吸収によって可溶化して、ＢＰ−リガンド−複合体を形成し、
−  上記受容体を発現している細胞上に、上記リガンド複合体を適用し、
−  上記受容体の機能的応答を測定し、そして
−  上記受容体のリガンドを同定し、及び／又は上記受容体に対する上記化合物の結合及び機能を確認するステップを含み得る。
【００１９】
本発明の第二の実施態様は、膜結合受容体に対する揮発性化合物の結合を同定及び／又は確認する方法に関する。上記方法は、
−  上記受容体のリガンドであり得る化合物を選択し、
−  上記化合物を揮発性化合物結合タンパク質（ＢＰ）に対する空中吸収によって可溶化して、ＢＰ−リガンド−複合体を形成し、
−  上記受容体を含む細胞膜に上記リガンド複合体を適用し、
−  上記化合物の上記受容体に対する結合を測定し、そして、
−  上記受容体のリガンドを同定し、及び／又は上記受容体に対する上記化合物の結合を確認するステップを含み得る。
【００２０】
本発明によれば、上述した方法は、揮発性化合物の脱オーファン化及び／又は揮発性化合物を認識する受容体の脱オーファン化に使用し得る。これは、揮発性化合物が異なる受容体を認識し得、また受容体が異なる揮発性化合物により認識される複雑な系を解明する補助となり得る。したがって、一つの揮発性化合物結合受容体を用いて、上記受容体に特異的に結合する一種の又は一セットの揮発性化合物を同定するための複合アッセイを構成し得る。一旦揮発性リガンドが同定されたら、これらのリガンドの一つを使用して、揮発性化合物を認識する周知の、又は候補の異なる受容体のパネルをスクリーニングし得る。代替的に、複合アッセイは、第一に、異なる（候補）揮発性化合物結合受容体に対するリガンドをスクリーニングするように構成し得る。一旦受容体が上記リガンドに結合すると同定されたら、これらの受容体の一つを使用して、異なる揮発性化合物のパネルをスクリーニングし得る。両方の手法において、上記リガンド／受容体相互作用の特異性／選択性を決定し得る。
【００２１】
一つの種内で、ＢＰの異なるサブタイプを見出し得る。文献では、上記異なるＢＰは、異なるリガンド特異性を有し得ることが示唆されている。もしそうであれば、上記特異性は、尚解明される必要がある。したがって、本発明の方法を使用して、揮発性リガンド（の群）に関するＢＰの特異性、及び特定の受容体上のその効果を同定し得る。
【００２２】
ＳＡ及びリポカリンは、揮発性化合物結合受容体のリガンド／受容体結合相互作用に関する担体として、類似する効果を有し得ることが示唆されているが、本発明は、両方の分子が複合体として協働して又は続いて働き得ることを除外しない。
【００２３】
本発明に記載する結合アッセイでは、受容体に対する化合物の結合を測定する一方；機能的アッセイでは、結合のみでなく、試験受容体を正に又は負に調節する分子の能力も測定する。試験受容体を正に調節することによりシグナル伝達経路を活性化する化合物は、上記受容体の（完全又は部分）作動薬と称される。試験受容体を負に調節することにより、シグナル伝達経路を阻害する化合物は、上記受容体の（完全又は部分）拮抗薬又は逆作動薬と称される。化合物は、他の化合物と競合的又は非競合的に挙動し得、これは受容体から上記後者化合物を置き換えるか、又は置き換えないかに依存する。
【００２４】
用語「揮発性分子」又は「揮発性化合物」又は「揮発性剤」又は「揮発性リガンド」は、任意の揮発性化学物質を指す。上記化合物は、生物学的ライブラリー、解析を要する合成化学的ライブラリー方法、及び「一化合物」化学的ライブラリー方法を含む、当該技術分野にて周知のコンビナトリアルライブラリー方法における多数の手法のいずれかを用いて獲得し得る。
【００２５】
受容体に結合する揮発性化合物の能力の試験は、異なる手法を用いて実施し得る。この手法は、例えば、化合物を放射性同位元素に結合させることによって、化合物の結合が、複合体内の標識化合物の検出により測定できるようにして達成し得る。例えば、化合物は、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ又は3Ｈで直接又は間接的に標識され、放射能放出の直接計数又はシンチレーション計数により、放射性同位元素を検出し得る。異なる試験化合物の結合における差は、他の化合物と比較して、どの化合物がより有効に受容体を認識するかを示し得る。代替的に、受容体に対する上記揮発性化合物の結合は、参照化合物の存在下で測定することができる。化合物の、その受容体に対する結合は、複合体及び／又は候補調節因子（modulator）単独の上記受容体への結合を可能にする条件下で、同様に複合体として存在する候補調節因子の存在下及び不在下で、上記受容体を、上記揮発性化合物−結合タンパク質と複合体を形成した参照揮発性化合物と接触させるステップと；上記揮発性化合物−複合体及び／又は候補単独の上記受容体への結合を測定するステップとを含み得、ここで上記候補調節因子の不在下での結合に対する上記候補調節因子の存在下での結合の低下は、上記候補調節因子を、上記受容体の機能を調節する薬剤として同定する。上記の場合において、参照化合物は、標識される。そのような揮発性化合物は、以下の芳香ファミリー：アルデヒド、フルーティライト、フルーティダーク、スウィートアロマティック、バルサミック、アロマティックスパイシー、たばこ、オークモス、革、動物、琥珀、木、針葉樹、ハーブスパイシー、草、緑、柑橘類の一部であり得る。これらの臭気物質分子は、非限定的に、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、アルケン、酸化エーテル、フェノール又はアルコール基を有する化合物も含む。代替的に、担体分子の一つを標識してもよい。
【００２６】
別の手法では、揮発性化合物による受容体の機能的調節を決定する。この手法は、参照化合物の存在下又は不在下で実行し得る。上記化合物による上記受容体の調節は、以下のステップを含み得る。１／受容体を揮発性化合物結合タンパク質と複合体を形成した参照化合物と、同様にそのような複合体として存在する候補調節因子の存在下又は不在下で接触させ；２／上記受容体のシグナル伝達活性を測定し、ここで上記候補調節因子の不在下での活性に対する活性上記候補調節因子の存在下での活性の変化は、上記候補調節因子を、上記受容体の機能を調節する薬剤として同定する。この方法の使用は、拮抗薬、作動薬又は逆作動薬の発見を目的としている。代替的に、揮発性化合物による受容体の機能的調節は、受容体を候補調節因子−ＢＰ複合体と接触させ；上記候補調節因子の存在下で、上記受容体のシグナル伝達活性を測定し；そして、上記候補調節因子の存在下で測定した上記活性を、上記揮発性化合物−結合受容体が参照揮発性化合物に、そのＥＣ50において、接触されているサンプル中で測定した上記活性と比較し、ここで上記候補調節因子は、上記候補調節因子の存在下で測定された上記活性の量が、ＥＣ50において存在する上記参照化合物により誘導される量の少なくとも５０％である場合、上記受容体の機能を調節する薬剤として同定される、ステップを含み得る。結合及び機能的方法の両方の目的は、受容体に結合及び／又は受容体を調節する揮発性薬剤を同定することであり得る。参照分子が全く入手できない場合、本発明の方法は、揮発性化合物結合受容体を脱オーファン化することに使用し得る。
【００２７】
代替的に、機能的応答は、例えばＧＴＰγＳ結合の決定を介して、細胞膜上で試験してもよい。一般に、本発明の結合アッセイに関しては、細胞膜が最も適用される一方、機能的アッセイに関しては、無傷細胞が使用される。
【００２８】
本件を出願する以前に、揮発性化合物結合タンパク質が、揮発性化合物のそれらの受容体に対する結合及び／又は調節にどのように影響し得るかは、明らかでなかった。例えば、Matarazzo et al(2002,Chem. Senses 27: 691-701）によって、臭気物質濃度が低い場合、ＯＢＰは、臭気物質の粘液層中への取り込みに有利に働き得る（p.699,sec column,I.12-15）；しかしながら、リガンド濃度が高い場合、ＯＢＰは、ＯＲ結合部位の飽和を阻止し得ることが示唆された。ＯＢＰは捕捉剤の役割を果たすことも示唆されるため、上記分子は、リガンドのその受容体への結合が、より高い濃度においても測定されるアッセイにおいて、担体分子として全く使用されなかった。これに反して、本発明の概念によれば、上記臭気物質は、受容体のリガンド−活性化を妨害することなく、より高い濃度で使用し得る。上記情報に基づき、リガンド結合を用量応答的に決定する方法を構成し得る。文献において、ＯＲが、ＯＢＰの存在とは独立して、臭気物質により活性化され得ることも示されている。したがって、本発明は、リガンド−ＯＢＰ−ＯＲ、リガンド−ＳＡ−ＯＲ又はリガンド−ＯＢＰ／ＳＡ−ＯＲ複合体の形成が、ＯＲ調節に関して一般的な生理学的関連を有し、揮発性化合物結合受容体の研究のためのインビトロ方法に適用し得ることを初めて示す。本発明はまた、単一細胞Ｃａ2+イメージングを介して、本発明の方法を用いた場合に、シグナルは、文献に通常記載されているような小部分ではなく、ほぼ全試験細胞で測定し得ることも示す。このことは、本発明の方法が、少量スクリーニング法、特にハイスループットスクリーニング法（以下参照）に容易に適用し得ることを示す。
【００２９】
血清アルブミンは、通常、身体の異なる部分に存在するタンパク質である。このタンパク質は、血液の主要な化合物を形成し、また血液は殆どの組織を流れるため、殆どの組織内に見出すことができる。Pernollet及び共同研究者は、血清アルブミンが嗅粘液中に存在することを見出している。しかしながら、それに対する嗅覚機能は全く指定されていない。本発明は、リポカリンの代替分子としての血清アルブミンを提示する。本発明は、ＳＡが、揮発性化合物を可溶化し、かつＯＲを含む揮発性化合物結合受容体に提示する担体タンパク質として挙動することを示唆する。
【００３０】
本発明は、ＯＢＰ及びＳＡが、揮発性化合物をより可溶にし、また担体分子としてのみ働き、ＯＢＰに関して以前に示唆されたような（部分的）捕捉剤としては作用しないという証拠を提供する。したがって、上記分子は、リガンド−結合及び機能的アッセイに使用され得る。本発明において、これに関する実験的証拠は、臭気物質によるＯＲ活性化の検出により提供される。しかしながら、リガンド／受容体認識に関するＯＢＰ及びＳＡの役割は、リガンド及び／又は受容体特異的ではない。したがって、本発明の概念は、他の揮発性−リガンド及び他の受容体認識揮発性化合物に一般化し得る。その結果、本方法が、特定の種類の揮発性化合物結合受容体に制限されるものではないため；上記膜結合受容体は、非限定的に、揮発性化合物を認識するＧタンパク質共役受容体、イオンチャネル及びチロシンキナーゼ受容体からなる群より選択され得る。本発明によれば、膜結合受容体は、嗅覚受容体、フェロモン受容体、味覚受容体、及び、揮発性化合物を認識する任意の種類の膜−結合受容体からなる群より選択され得る。本明細書において使用するように、用語「嗅覚受容体」は、嗅神経細胞から発現した嗅覚受容体を指す。本発明の方法により試験し得る嗅覚受容体の例は、Ｉ７、Ｍ７１、ＭＯＲ２３、ｍＯＲ−ＥＧ、ｍＯＲ−ＥＶ、Ｕ１３１、Ｉ−Ｃ６、Ｉ−Ｄ３、Ｉ−Ｇ７、ｍＯＲ９１２−９３、ＯＲＩ７−４０、ＯＲＩ７−４であり得るが、これらに限定されるものではない。現在までに同定され、本発明の方法に使用し得るヒトＯＲは、Malnic et al. (PNAS. 2004. 101 (8): 2584-2589)に公開されている。上記受容体は、参照により本明細書に含まれる。フェロモン受容体の例は、ｈＶ１ＲＬ１、ｈＶ１ＲＬ２、ｈＶ１ＲＬ３、ｈＶ１ＲＬ４、ｈＶ１ＲＬ５、Ｖ１Ｒ及びＶ２Ｒであり得るが、これらに限定されるものではない。現在までに同定され、本発明の方法に使用し得るフェロモン受容体は、Rodriguez (Horm. Behav, 2004. 46(3):219-230) 及び Matsunami and Amrein (Genome Biol, 2003. 4(7):220）に公開されている。上記受容体は、参照により本明細書に含まれる。味覚受容体の例は、Ｔ２Ｒ、Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３、ＡＳＩＣ２、ＥＮａＣ、ＶＮ１及びＴＭＰ８であり得るが、これらに限定されるものではない。現在までに同定され、本発明の方法に使用し得る味覚受容体は、Scott (Curr. Opin. Neurobiol. 2004. 14(4):423-7)；Clafani A (Appetite 2004. 43(1): 1-3)、 Huang (J. Am. Soc. Nephrol. 2004. 15(7): 1690-9)、Kim et al. (J. Dent. Res. 2004. 83(6):448-53)、 Ugawa (Anat. Sci. Int. 2003. 78(4):205-10)、Bigiani et al. (Prog. Biophys. MoI. Biol. 2003. 83(3): 193-225)及びMatsunami and Amrein (Genome Biol. 2003. 4(7):220) に公開されている。上記受容体は、参照により本明細書に含まれる。
【００３１】
本発明の方法において、揮発性化合物−結合タンパク質（ＢＰ）は、哺乳動物又は昆虫起源であり得る。
【００３２】
更に、本発明によれば、使用する揮発性化合物−結合タンパク質（ＢＰ）は、リポカリン、血清アルブミン（ＳＡ）、及び、揮発性化合物を結合する能力を有し、かつ担体として機能して、上記揮発性化合物を膜結合受容体に提示する任意のタンパク質からなる群より選択され得る。上記リポカリンは、臭気物質結合タンパク質（ＯＢＰ）、フェロモン結合タンパク質（ＰＢＰ）、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）、主要尿タンパク質（ＭＵＰ）、アフロディシン及びエブネル腺タンパク質からなる群より選択され得る。
【００３３】
本明細書において使用するように、用語、臭気物質結合タンパク質（ＯＢＰ）は、野生型ＯＢＰと同一のタンパク質、及び野生型ＯＢＰから定義されるタンパク質（例えば、ＯＢＰの変異体）、又はＯＢＰコード化領域の一部により構成されるキメラタンパク質を包含する。以下のセクションに、特定のポリペプチドを参照する配列を列挙する。本発明のキットの一部を形成し得るため、上記特定のポリペプチドをコードする核酸配列も記載する（以下参照）。
【００３４】
ある実施態様において、ＯＢＰは、野生型ハツカネズミＯＢＰ核酸（ｍＲＮＡ）（表１の配列１）又は野生型ハツカネズミＯＢＰ核酸配列によりコードされたポリペプチド（表１の配列２）である。別の実施態様において、ＯＢＰは、野生型ラットＯＢＰ核酸（ｍＲＮＡ）（表１の配列３、４及び５）又は野生型ラットＯＢＰ核酸配列によりコードされたポリペプチド（表１の配列６、７及び８）である。別の実施態様において、ＯＢＰは、野生型ヒトＯＢＰ核酸（ｍＲＮＡ）（表１の配列９、１０及び１１）又は野生型ヒトＯＢＰ核酸配列によりコードされたポリペプチド（表１の配列１２、１３及び１４）である。別の実施態様において、ＯＢＰは、野生型ウシＯＢＰ核酸（ｍＲＮＡ）又は野生型ウシＯＢＰ核酸配列によりコードされたポリペプチド（表１の配列１５）である。別の実施態様において、ＯＢＰは、野生型ブタＯＢＰ核酸（ｍＲＮＡ）（表１の配列１６）又は野生型ブタＯＢＰ核酸配列によりコードされたポリペプチド（表１の配列１７）である。別の実施態様において、ＯＢＰは、野生型ウサギＯＢＰ核酸（ｍＲＮＡ）又は野生型ウサギＯＢＰ核酸配列によりコードされたポリペプチドである。別の実施態様において、ＯＢＰは、野生型ヤマアラシＯＢＰ核酸（ｍＲＮＡ）又は野生型ヤマアラシＯＢＰ核酸配列によりコードされたポリペプチドである。しかしながら、本発明は、他の種のＯＢＰを除外するものではない。例えば、昆虫は、触覚内で多量のＯＢＰ又はＰＢＰ（フェロモン結合タンパク質）を合成することが公知である。
【００３５】
本明細書において使用するように、用語、血清アルブミン（ＳＡ）は、野生型ＳＡと同一のタンパク質、及び野生型ＳＡから定義されるタンパク質（例えば、ＳＡの変異体）の両方、又はＳＡコード化領域の一部により構成されるキメラポリペプチドを包含する。ある実施態様において、ＳＡは、野生型ウシＳＡ核酸（ｍＲＮＡ）（表１の配列１８）又は野生型ＳＡ核酸配列によりコードされたポリペプチド（表１の配列１９）であるが、これらに限定されるものではない。別の実施態様において、ＳＡは、野生型ヒトＳＡ核酸（ｍＲＮＡ）（表１の配列２０）又は野生型ヒトＳＡ核酸配列によりコードされたポリペプチド（表１の配列２１）であるが、これらに限定されるものではない。別の実施態様において、ＳＡは、野生型ブタＳＡ核酸（ｍＲＮＡ）（表１の配列２２）又は野生型ブタＳＡ核酸配列によりコードされたポリペプチド（表１の配列２３）であるが、これらに限定されるものではない。別の実施態様において、ＳＡは、野生型ウサギＳＡ核酸（ｍＲＮＡ）（表１の配列２４）又は野生型ウサギＳＡ核酸配列によりコードされたポリペプチド（表１の配列２５）であるが、これらに限定されるものではない。別の実施態様において、ＳＡは、野生型マウスＳＡ核酸（ｍＲＮＡ）（表１の配列２６）又は野生型マウスＳＡ核酸配列によりコードされたポリペプチド（表１の配列２７）であるが、これらに限定されるものではない。別の実施態様において、ＳＡは、野生型ラットＳＡ核酸（ｍＲＮＡ）（表１の配列２８）又は野生型ラットＳＡ核酸配列によりコードされたポリペプチド（表１の配列２９）であるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
本明細書において使用するように、用語「エブネル腺タンパク質」は、野生型タンパク質と同一のタンパク質、及び上記野生型タンパク質から定義されるタンパク質（例えば、変異体）の両方、又は上記タンパク質のコード化領域の一部により構成されるキメラポリペプチドを包含する。ある実施態様において、エブネル腺タンパク質は、野生型ウシエブネル腺タンパク質核酸（ｍＲＮＡ）（表１の配列３０）又は野生型エブネル腺タンパク質核酸配列によりコードされたポリペプチド（表１の配列３１）であるが、これらに限定されるものではない。別の実施態様において、エブネル腺タンパク質は、野生型イノシシエブネル腺タンパク質核酸（ｍＲＮＡ）（表１の配列３２）又は野生型イノシシエブネル腺タンパク質核酸配列によりコードされたポリペプチド（表１の配列３３）であるが、これらに限定されるものではない。別の実施態様において、エブネル腺タンパク質は、野生型ヒトエブネル腺タンパク質核酸（ｍＲＮＡ）（表１の配列３４）又は野生型ヒトエブネル腺タンパク質核酸配列によりコードされたポリペプチド（表１の配列３５）であるが、これらに限定されるものではない。
【００３７】
本明細書において使用するように、用語、主要尿タンパク質（ＭＵＰ）は、野生型ＭＵＰタンパク質と同一のタンパク質、及び上記野生型タンパク質から定義されるタンパク質（例えば、変異体）の両方、又は上記タンパク質のコード化領域の一部により構成されるキメラタンパク質を包含する。ある実施態様において、ＭＵＰタンパク質は、野生型マウスＭＵＰ核酸（ｍＲＮＡ）（表１の配列３６）又は野生型マウスＭＵＰ核酸配列によりコードされたポリペプチド（表１の配列３７）であるが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
本明細書において使用するように、用語、フェロモン結合タンパク質（ＰＢＰ）は、野生型ＰＢＰタンパク質と同一のタンパク質、及び上記野生型タンパク質から定義されるタンパク質（例えば、変異体）の両方、又は上記タンパク質のコード化領域の一部により構成されるキメラタンパク質を包含する。ある実施態様において、ＰＢＰは、野生型ヘリコベルパ・アサルト（Helicoverpa assulta）ＰＢＰ核酸（ｍＲＮＡ）（表１の配列３８）又は野生型ヘリコベルパ・アサルトＰＢＰ核酸配列によりコードされたポリペプチド（表１の配列３９）であるが、これらに限定されるものではない。別の実施態様において、ＰＢＰは、野生型Sesamia nonagrioidesＰＢＰ１核酸（ｍＲＮＡ）（表１の配列４０）又は野生型Sesamia nonagrioidesＰＢＰ１核酸配列によりコードされたポリペプチド（表１の配列４１）であるが、これらに限定されるものではない。別の実施態様において、ＰＢＰは、野生型Sesamia nonagrioidesＰＢＰ２核酸（ｍＲＮＡ）（表１の配列４２）又は野生型Sesamia nonagrioidesＰＢＰ２核酸配列によりコードされたポリペプチド（表１の配列４３）であるが、これらに限定されるものではない。別の実施態様において、ＰＢＰは、野生型Spodoptera（ＰＢＰ１核酸（ｍＲＮＡ）（表１の配列４４）又は野生型SpodopteraＰＢＰ１核酸配列によりコードされたポリペプチド（表１の配列４５）であるが、これらに限定されるものではない。別の実施態様において、ＰＢＰは、野生型SpodopteraＰＢＰ２核酸（ｍＲＮＡ）（表１の配列４６）又は野生型SpodopteraＰＢＰ２核酸配列によりコードされたポリペプチド（表１の配列４７）であるが、これらに限定されるものではない。別の実施態様において、ＰＢＰは、野生型ショウジョウバエＰＢＰ核酸（ｍＲＮＡ）（表１の配列４８、５０、５２、５４及び５６）又は野生型ショウジョウバエＰＢＰ核酸配列によりコードされたポリペプチド（表１の配列４９、５１、５３、５５及び５７）であるが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
本発明によれば、揮発性化合物−結合タンパク質は、野生型タンパク質又は変異体タンパク質であり得る。用語「野生型」は、天然に存在するタイプ又はサブタイプを意味する。「野生型」及び「変異体」は、核酸又はアミノ酸配列を指し得る。上記変異体又は変異体核酸若しくはアミノ酸は、上記担体分子が、揮発性リガンドの、その受容体への移動に対して陽性効果を有する限り、７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％、上記した核酸配列又はアミノ酸配列と相同であり得る。ＢＰポリペプチドの変異体形態も、本明細書により詳細に記載するペプチド及びＤＮＡ分子と等価であると想定される。例えば、ロイシン残基のイソロイシン又はバリン残基との単独の置換、アスパラギン酸残基のグルタミン酸残基との置換、スレオニン残基のセリン残基との置換、又はアミノ酸の、構造的に関連したアミノ酸との同様の置換（即ち、保存的変異）は、得られた分子の生物学的活性上に主要な効果を及ぼさないことが想定される。したがって、本発明のある実施態様では、保存的置換を含むＢＰ変異体の使用を提供する。保存的置換は、それらの側鎖において関連するアミノ酸のファミリー内で行われ得る。遺伝子でコードされたアミノ酸は、４つのファミリー：（１）酸性（アスパラギン酸及びグルタミン酸残基）；塩基性（リシン、アルギニン及びヒスチジン残基）；（３）非極性（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン及びトリプトファン残基）；並びに（４）非荷電性極性（アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン及びチロシン残基）に分類し得る。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン残基は、時には、一緒に、芳香族アミノ酸として分類される。同様に、アミノ酸レパートリーは、（１）酸性（アスパラギン酸及びグルタミン酸残基）；塩基性（リシン、アルギニン及びヒスチジン残基）、（３）脂肪族（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン及びスレオニン残基）、ここでセリン及びスレオニンは、場合により別個に脂肪族−ヒドロキシルにグループ分けされ；（４）非極性（フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン残基）；（５）アミド（アスパラギン及びグルタミン残基）；並びに（６）硫黄含有残基（システイン及びメチオニン残基）としてグループ分けされる（例えば、Stryer ed. Biochemistry, pg. 17-21 , 2nd ed, WH Freeman and Co., 1981）。ペプチドのアミノ酸配列の変化が、機能的ポリペプチドを生じるか否かは、野生型タンパク質と同様に機能する変異体の能力を評価することにより、容易に測定し得る。２つ以上の置換を有するポリペプチドは、同様の方法で容易に試験し得る。より希には、変異体は、「非保存的」変化（例えば、グリシンのトリプトファン残基との置換）を含み得る。類似した僅かな変異は、アミノ酸の削除若しくは挿入、又は両方を含み得る。生物学的活性を消失することなく、置換、挿入又は削除し得るアミノ酸残基の決定におけるガイダンスは、コンピュータプログラム（例えば、LASERGENEソフトウエア、 DNASTAR Inc., Madison Wis.）を用いて見出すことができる。以下により詳細に記載するように、変異体は、例えば定向進化のような方法、又は変異体のコンビナトリアルライブラリーを生成する他の技術により作成し得る。本発明の尚別の実施態様において、ＢＰをコードするヌクレオチド配列は、上記配列を変更するよう操作されてもよく、該変更は、遺伝子産物のクローニング、プロセシング、局在化、分泌及び／又は発現の変更を含むが、これらに限定されるものではない。例えば、変異は、当該技術分野にて周知の技術を用いて導入し得る。それらの技術は、新たな制限部位を挿入する部位特異的変異誘発、糖鎖付加パターンの変更、又はコドン選択の変化を含むが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
用語「変異体タンパク質」は、天然に存在するタンパク質配列と比較して、小さいＡＡ変異体を含む（おそらく操作された）タンパク質のみを指すものではなく、例えば融合タンパク質又はその断片等、より大きい変更を含む変異体も指す。例えば、「calix」と称されるドメイン（結合ポケット）は、本目的に使用することができる。上記calixは、考慮されるタンパク質の三次構造から発した配列アセンブリーである。当業者には、ｃａｌｉｘドメインが、タンパク質により異なり得ることが周知である。当業者は、上記三次構造に基づき、各タンパク質についてcalix配列を誘導し得る。例えば、二量体化するＯＢＰは、１つの結合ポケットＯＢＰ−１Ｆ (Nespoulous C, Briand L, Delage MM, Tran V and Pernollet JC 2004. Odorant binding and conformational changes of a rat odorant binding protein. Chem. Senses 29(3): 189-98）、各バレル内に１つ、及び２つのバレルの交差地点で他の１つを有する２つ又は３つもの結合ポケットを有することが示されている（Tegoni M, Ramoni R., Bignetti E, Spinelli S and Cambillau C 1996. Domain swapping create a third putative combining site in bovine odorant binding protein dimmer. Nature Struct. Biol. 3: 934-9）。加えて、ウシラクトグロブリン（lactaglobulin）のcalix配列が、周知である（Qin et al. 1998. FEBS Lett. 438(3):272-8)。加えて、calixは、ＯＢＰから取り出されて他の骨格タンパク質内に配置され、「ＯＢＰ様タンパク質」が編成され得る。前記揮発性化合物−結合タンパク質は、任意の起源を由来とし得、抽出物から精製され、又は該抽出物の一部であり得る。
【００４１】
本発明は、ＢＰと複合体を形成するリガンドの存在下、インビトロで揮発性化合物結合受容体を試験する方法に関する。上記方法において、使用する受容体及びＢＰ（ＳＡ及びリポカリンを含む）は、同一起源であり得る（即ち、ヒト又はウシ）が、本発明は、別の起源（即ち、ウシ）の担体タンパク質を用いた、特定の起源（即ち、ヒト）の受容体の試験を除外するものではない。担体タンパク質としてＳＡ及びリポカリンの両方を使用する場合、上記担体の起源も異なり得る。事実、異なる起源のリポカリンが同様の構造を有するため、提案する方法におけるそれらの効果は、同一であると期待される。
【００４２】
本発明の方法に使用されるＢＰ、特にリポカリン又はＳＡは、当該技術分野にて周知の方法により精製され得る。上記精製方法は、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含むが、これらに限定されるものではない。別の実施態様において、必要に応じてタンパク質再折り畳みステップを使用して、成熟タンパク質の構成を完成させ得る。尚別の実施態様において、最終精製ステップに高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用し得る。ＳＡ及びリポカリンを含むＢＰをコードするヌクレオチドは、ＢＰポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にインフレームで融合され得る。マーカー配列の非限定的な例は、発現のための宿主が細菌の場合、ベクターにより供給され得るヘキサヒスチジンタグであり、これはマーカーに融合されたポリペプチドの精製を提供し、あるいは例えば、マーカー配列は、発現のための宿主に哺乳動物を使用する場合（例えば、ＣＯＳ−７細胞）、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグであり得る。ＨＡタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する（Wilson et al., Cell 37:767 (1984)）。加えて、本発明の方法では、野生型タンパク質に見出される担体特性を尚保有するＢＰの断片、又はその完全長若しくは断片を含む融合物を使用してもよい。
【００４３】
上記したように、揮発性化合物−結合タンパク質は、精製することができる。代替的に、上記タンパク質は、組成物として存在してもよい。本発明によれば、上記組成物は、天然の流体又はその一部であり得る。天然流体は、細胞（血液を含む、動物身体由来の個々の細胞又は腺若しくは組織）から分泌される可能な全流体を意味する。上記流体は、例えば鼻分泌物、呼吸器分泌物、唾液（エブネル腺タンパク質）、尿（主要尿タンパク質、ＭＵＰ）、肝臓分泌物（ＭＵＰ）及び膣分泌物（アフロディシン）であり得るが、ＢＰを見出し得る流体も含み得る。「画分」とは、興味対象の分子を含む組成物の一部を意味する。
【００４４】
本発明によれば、上述した方法で使用する揮発性化合物−結合タンパク質（ＢＰ）は、リポカリンファミリーのメンバーであり得、ここで上記タンパク質は、標準的な（canonical）超二次構造を有する。上記特定の構造は、臭気物質の結合を可能にすることが、以前に示されている。他の揮発性化合物は、リポカリン及びリポカリン様タンパク質に結合する可能性が非常に高い。
【００４５】
本発明の代替的な実施態様において、使用するＢＰポリペプチドは、完全長ＢＰアミノ酸配列又はその一部のいずれかを合成する化学的方法を用いて作成し得る。例えば、ペプチドは、固相法により合成され、樹脂から切断されて、分取高速液体クロマトグラフィーにより精製される（例えば、Creighton, Proteins Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and co, New York N. Y. (1983)参照）。別の実施態様において、合成ペプチド組成物は、アミノ酸分析又は配列決定により確認される（例えば、Creighton、前記参照）。直接ペプチド合成は、様々な固相法を用いて実施され得、また、例えばABI 431Aペプチド合成機（Perkin Elmer）を用いて、製造業者により提供される指示書にしたがって、自動化合成を達成し得る。加えて、ＢＰのアミノ酸配列は、直接合成により変更され得、及び／又は、化学的方法を用いて他の配列と組み合わされて、変異体ポリペプチドが作成される（上記参照）。
【００４６】
本発明によれば、揮発性化合物−結合タンパク質は、その単量体；ホモ二量体又はヘテロ二量体、ホモ多量体又はヘテロ多量体として、担体分子として機能し得る。例えば、ｈＯＢＰは、数種のＯＢＰの様に、中性ｐＨで単量体として存在し得る一方、他は、例えばラット、ブタ及びウシＯＢＰのように二量体として周知である。このように、本発明の方法にしたがって形成されるＢＰリガンド複合体の複雑性は完全に理解されていないため、本発明者等は、上記担体タンパク質が、単量体、二量体又は多量体として働き得ることを除外し得ない。ＯＢＰは、典型的なリポカリン結合ポケットを形成する、リポカリンファミリーに属する。以前に、臭気物質は、その疎水性部分を内側にして、ＯＢＰのβバレルポケットに入ることが示唆された（Briand et al. 2002）。知覚された広範囲の多様な臭気物質を可溶化するには、異なる特異性を有する、相補的な一組のＯＢＰが必要であることも示唆された。ヤマアラシに関して、ＯＢＰ単量体−二量体の平衡状態は、実験的条件に依存するように思われる。
【００４７】
本発明の方法において、機能的応答は：Ｃａ2+、ｃＡＭＰプール、ＩＰ３、ＧＴＰ、メラニン保有細胞アッセイ及びＭＡＰ−キナーゼの群から選択される、細胞シグナル伝達分子を試験することにより測定し得；又は；機能的応答は、Ｇタンパク質／ＯＲ相互作用、受容体の脱感作を試験することにより測定し得；又は；機能的応答は、レポーター系の調節を試験することにより測定し得る。本発明は、揮発性化合物結合受容体又はその変異体をトランスフェクトした天然細胞株又は異種細胞株を、活性に関する化合物のスクリーニング、特にコンビナトリアル化学ライブラリー（例えば、１０４を越える化合物を含むライブラリー）からの化合物のハイスループットスクリーニングに使用することを意図している。ある実施態様において、細胞は、細胞表面受容体の活性化に続くシグナル伝達を監視する、第二メッセンジャーアッセイに使用され得る。別の実施態様において、細胞は、転写／翻訳レベルで細胞応答を監視する、レポーター遺伝子アッセイに使用し得る。第二メッセンジャーアッセイでは、宿主細胞は、好ましくは受容体又は候補をコードするベクターでトランスフェクトされるため、揮発性化合物を認識する。次に、宿主細胞は、リガンド−ＢＰ複合体又は複数の上記複合体（例えば、コンビナトリアルライブラリーから）で処理され、応答の存在又は不在についてアッセイされ得る。コンビナトリアルライブラリー内の少なくとも数種の化合物は、細胞膜において、揮発性化合物結合受容体の作動薬、拮抗薬、活性化因子又は阻害薬として働き得ることが想定される。
【００４８】
ある実施態様において、第二メッセンジャーアッセイは、受容体分子活性化により誘発される蛍光シグナルを測定し、該活性化は、次に膜受容体及びイオンチャネルの刺激による細胞内変化（例えば、Ｃａ2+濃度、膜電位、ｐＨ、ＩＰ３、ｃＡＭＰ、アラキドン酸放出）をもたらす。レポーター分子の例は、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）系（例えば、Ｃｕｏ−脂質及びオキソノール、ＥＤＡＮ／ＤＡＢＣＹＬ）、カルシウム感受性指示薬（例えば、Ｆｌｕｏ−３、ＦＵＲＡ２、ＩＮＤＯ１及びＦＬＵＯ４／ＡＭ、ＢＡＰＴＡ  ＡＭ、Ｃａｌｃｉｕｍ３）、塩化物感受性指示薬（例えば、ＳＰＱ、ＳＰＡ）、カリウム感受性指示薬（例えば、ＰＢＦＩ）、ナトリウム感受性指示薬（例えば、ＳＢＦＩ）、及びｐＨ感受性指示薬（例えば、ＢＣＥＣＦ）を含むが、これらに限定されるものではない。一般に、宿主細胞は、化合物に暴露されるに先だって、指示薬を負荷される。揮発性化合物−ＢＰ複合体を用いた処理による宿主細胞の応答は、蛍光顕微鏡法、共焦点顕微鏡法（例えば、ＦＣＳシステム）、フローサイトメトリー、微小流体素子、ＦＬＩＰＲシステム及びプレートリーディングシステムを含むが、これらに限定されない、当該技術分野にて周知の方法により検出し得る。本発明は、この目的のために、遺伝子−レポーター系（ルシフェラーゼシステムを含む）、ＧＴＰγＳアッセイ、例えばＦＲＥＴ若しくはＢＲＥＴアッセイによるＧタンパク質／ＯＲ相互作用ベースのアッセイ、又はβ２−アレスチンアッセイを含む受容体脱感作を試験するアッセイ、を含む他の方法も使用し得ることに留意する。
【００４９】
上記の数個のパラグラフに言及したように、未知の活性を有する化合物による応答（例えば、蛍光強度の増大）を、好ましくは、公知の作動薬により生成した応答と比較して、公知の作動薬の最大応答のパーセントとして表す。公知の作動薬による最大応答を、１００％応答として定義する。同様に、周知の又は試験拮抗薬を含有するサンプルに、作動薬を加えた後に記録した最大応答は、１００％応答よりも検出可能に低い。
【００５０】
本発明の方法は、レポーター系として設定し得る。用語「レポーター系」は、アッセイされ得るタンパク質をコードする遺伝子を適用する系を意味する。レポーター遺伝子の例は、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ｂ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びホースラディッシュペルオキシダーゼを含むが、これらに限定されるものではない。レポーター遺伝子アッセイは、レポーター遺伝子のコード化配列にスプライシングされた、標的遺伝子（即ち、疾病標的の生物学的発現及び機能を制御する遺伝子）の転写制御配列を含む核酸をコードするベクターをトランスフェクトされた宿主細胞の使用を含むことが好ましい。したがって、標的遺伝子の活性化は、レポーター遺伝子産物の活性化に繋がる。使用し得る代替的なリポーター系は、例えばＣＲＥ−ルシフェラーゼアッセイ、メラニン保有細胞アッセイ又はＭＡＰ−キナーゼアッセイである。ＣＲＥ−ルシフェラーゼアッセイは、以下の原理に基づく：膜受容体が活性化されると、細胞ｃＡＭＰプールが増大する；上記ｃＡＭＰは、レポータータンパク質（この場合は、ルシフェラーゼ）をコードする遺伝子に結合したＣＲＥ（ｃＡＭＰ応答配列）に結合し得る。このように、受容体活性化は、発光シグナルの出現を介して、容易に測定し得る。揮発性化合物結合受容体は、異なるシグナル伝達分子を刺激し得るため、同様のアッセイを構成するために異なる機構を使用することができる。したがって、所定の二次メッセンジャーに対する応答要素を、マーカー遺伝子に結合してもよい。
【００５１】
メラニン保有細胞アッセイは、色ベースのアッセイである。基本的に、このアッセイに使用される細胞は、アフリカツメガエル（Xenopus Laevis）の皮膚に由来する。これら不死化細胞は、暗色色素を含む小器官であるメラノソームを含有していた。アデニル酸シクラーゼ又はホスホリパーゼＣの活性化を誘発する内在性又は組み換えＧＰＣＲの活性化は、メラノソームの拡散及びその細胞の黒ずみに繋がる。代替的に、アデニル酸シクラーゼ又はホスホリパーゼＣを阻害するＧＰＣＲは、細胞の美白化に繋がる。それにより、二次メッセンジャーの濃度を測定する代わりに、細胞の色変化を観察してヒットを容易に特定することができる。この色の変化は、６５０ｎＭの吸収を測定するマイクロプレートリーダー上で、又はビデオイメージングシステム上の試験により、容易に定量化し得る。
【００５２】
ＢＰ複合体内に存在する揮発性化合物が、受容体と相互作用する能力も、いずれの反応体も標識することなく評価し得る。例えば、微少生理計を用いて、ＢＰ複合体内に存在する揮発性化合物の、受容体との相互作用を、化合物、担体分子又は受容体のいずれも標識することなく検出し得る。本明細書において使用するように、微少生理計（例えば、サイトセンター）は、光アドレス電位応答センサ（ＬＡＰＳ）を使用して、細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。この酸性化速度における変化は、揮発性化合物と受容体間の相互作用の指標として使用し得る。代替的に、Biacoreシステムを使用してもよい。Biacore（登録商標）は、サンプル中の物質の定性的又は定量的測定を専用とする、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースのバイオセンサーシステムである。
【００５３】
また別の実施態様において、ＢＰ複合体中に存在する揮発性化合物が、揮発性化合物結合受容体に結合し得るか否かを試験するために、膜ベースのアッセイを使用し得る。細胞フリーアッセイは、試験される受容体と、ＢＰ複合体としての揮発性化合物の反応混合物を、２つの成分が相互作用して結合し、それにより除去及び／又は検出し得る更なる複合体を形成する条件下で調製することを含む。２つの分子間の相互作用は、例えば蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いても検出し得る。フルオロフォア標識は、第一「ドナー」分子が放射する蛍光エネルギーが、第二「アクセプター」分子上の蛍光標識により吸収され、これが次に、吸収したエネルギーにより蛍光を発し得るように選択される。代替的に、「ドナー」タンパク質分子は、単にトリプトファン残基の天然蛍光エネルギーを使用してもよい。標識は、「アクセプター」分子標識が「ドナー」分子標識と異なり得るように、異なる波長の光を放射するよう選択される。標識間のエネルギー移動の効率が、分子を分離する距離に関連するため、分子間の空間的関係が、分子を分離する距離に関係し、分子間の空間的関係が評価され得る。分子間で結合が生じる状況では、アッセイにおいて「アクセプター」分子標識の蛍光放射は、最大であろう。ＦＲＥＴ結合事象は、当該技術分野にて周知の標準的な蛍光検出手段を介して（例えば、蛍光光度計を使用して）都合よく測定し得る。そのような結合はまた、Biacoreシステムにより検出し得るが、蛍光偏光によっても検出し得る。
【００５４】
本願の実施例において、機能的応答は、蛍光的方法を用いて測定される。しかしながら、本発明の方法では、発光法、放射性同位元素又は蛍光法を使用し得る。
【００５５】
本発明の好ましい方法は、２つのステップに分割し得る：１）揮発性化合物を、タンパク質溶液（例えば、嗅粘液等の分泌腺粘液）又は特定の担体タンパク質（例えば、血清アルブミン及び／又はリポカリン等の揮発性化合物結合タンパク質）のいずれかに吸収させることによる、該揮発性化合物の可溶化、２）かように形成された複合体の、上記揮発性化合物を認識する受容体、又は上記化合物を認識し得る候補受容体を発現している細胞上への適用。次に、変換されたシグナルを、Ｆｕｒａ２、Ｆｌｕｏ４（分子プローブ）及びＣａｌｃｉｕｍ３（Applied Biosystem）を含むカルシウム感応性色素を用いたカルシウム流（calcium flux）を測定する従来の蛍光アッセイ、又はエクオリンベースのアッセイ（Euroscreen）及び例えばＣＲＥ−ルシフェラーゼアッセイ（Promega）等のレポーターベースのアッセイを含むいずれかのカルシウム流を測定する発光ベースのアッセイ、又はｃＡＭＰの細胞内プールの評価（TROPIX）のいずれかにより追跡する。単一細胞シグナリングは、単一細胞カルシウムイメージングを用いて測定し得る；一般的なシグナルは、例えばマイクロプレートリーダーを用いて測定し得る。
【００５６】
結合アッセイを用いる際、結合は、放射性同位元素、蛍光法（ＦＲＥＴ、偏光）又は発光法（ＢＲＥＴ）により測定し得る。
【００５７】
以前のパラグラフにて言及したように、本発明による方法に使用する細胞は、異種細胞であり得る；あるいは、本発明による方法に使用する細胞膜は、上記受容体を発現している異種細胞から調製し得る。用語「異種細胞」は、任意の真核生物細胞（例えば、酵母細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞及び昆虫細胞）又は原核生物細胞（例えば、大腸菌等の細菌細胞）を意味する。
【００５８】
代替的に、本発明の方法に使用する細胞は、非限定的に、嗅上皮、胚細胞、精巣、脾臓、インスリン分泌β細胞、心臓、脳、気管、椎間、肋間（intercosa）、関節軟骨、肝臓、胃、腸表面、胸腺、背部の筋及び冠動脈からなる群より選択される組織から単離された細胞であり得る；あるいは、細胞膜を使用する場合、上記細胞膜は、上記組織から調製され得る。ＯＲ発現は、嗅上皮に限定されず、胚細胞、精巣、インスリン分泌β細胞、脾臓、特定の脳領域及び心臓の様な他の組織内にも観察されていることを以前に示している。上記組織において、これらＯＲ受容体の機能は、尚、解明の必要がある。したがって、本発明の方法において上記細胞を使用して、どのリガンドが上記受容体に結合して上記受容体の脱オーファン化をもたらすかを同定し得る。加えて、ヤマアラシＯＢＰの特定の結合部位は、嗅上皮内に見出されているが、例えば気管、椎間、肋間、関節軟骨、肝臓、胃、腸表面、胸腺、背部の筋、心臓及び冠動脈等の任意の他の位置にも見出されている。これら後者の組織に関しても、ＯＢＰの明らかな機能は全く知られていない。ＳＡは、血液中に見出されているため、結果的に身体の殆どの組織内に存在する。このことにより、所定の組織内での特定のＯＲの役割、並びに特定のＯＢＰ及びＳＡ、より一般的にはＢＰの役割を同定する要求が強調される。
【００５９】
より詳細には、本発明の方法に使用する細胞は、上記組織のうちの一つから単離された神経細胞であり得る；あるいは、細胞膜を使用する場合、上記細胞膜は、上記単離された神経細胞から調製され得る。組織からの神経細胞の精製方法は、当該技術分野にて周知である。そのような細胞は、分画遠心法又は親和性（例えば、免疫沈降法）のいずれかにより精製し得る。
【００６０】
本発明の方法は、スクリーニング法であり得る。好ましい実施態様において、本発明の方法は、ハイスループット法であり得る。上記方法において、異なる化学的ファミリーの揮発性化合物を試験し得る。更に、化学的に類似する化合物は、並行設定にて試験し得る。本発明は、揮発性化合物のパネルを容易に試験して、それらの受容体に対する特異性を容易に測定し得ることを示す。
【００６１】
本発明は、更に、揮発性化合物を認識する膜結合受容体を発現している細胞、又はその膜画分、及び、揮発性化合物−結合タンパク質（ＢＰ）、その複合体、又はその組成物を含むキットに関する。本発明によれば、上記ＢＰは、血清アルブミン又はリポカリン（リポカリン様タンパク質又は血清アルブミン様タンパク質）からなる群より選択され得る。上記リポカリンは、臭気物質結合タンパク質（ＯＢＰ）、フェロモン結合タンパク質（ＰＢＰ）、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）、主要尿タンパク質（ＭＵＰ）、アフロディシン及びエブネル腺タンパク質からなる群より選択され得る。上記受容体は、揮発性化合物を認識する候補受容体でもあり得る。
【００６２】
代替的に、本発明によるキットは、揮発性化合物を認識する膜結合受容体、又は例えばリガンド等を認識する候補をコードする核酸配列；及び揮発性化合物−結合タンパク質（ＢＰ）をコードする核酸を含むものとして定義され得る。核酸がキット内に含まれる場合、当業者は、周知の非常に様々な異種システムを用いて、組み換えタンパク質を容易に調製し得る。
【００６３】
更に、上記キットは、揮発性リガンドを認識する膜結合受容体、若しくはその膜画分、又は例えばリガンド等を認識する受容体候補；及び揮発性化合物−結合タンパク質（ＢＰ）をコードする核酸を発現している細胞を含んでもよい。      
【００６４】
本発明による各キットは、更に、膜結合受容体に対する揮発性化合物の結合及び機能を同定又は確認するための、上記キットの使用に関する指示書を含み得る。本明細書において使用するように、上記受容体を試験するための、用語「上記キットを使用するための指示書」は、揮発性化合物を認識する変異体及び野生型受容体、又は上記揮発性化合物のための受容体候補を試験するためのキット内に含まれる試薬の使用に関する指示書を含む。本発明のキット内に存在する核酸は、ベクター又は発現ベクターで存在し得る。用語「ベクター」は、ＤＮＡ断片を、一つの細胞から別の細胞へ移動する核酸分子を指す。用語「発現ベクター」は、特定の宿主生物内において、所望のコード化配列と、コード化配列に操作可能に結合した発現に必要な適切な核酸配列とを含む、組み換えＤＮＡ分子を指す。原核生物において、発現に必要な核酸配列は、通常、多くの場合他の配列と共に、プロモーター、オペレーター（場合による）、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞は、プロモーター、エンハンサー、並びに終結及びポリアデニル化シグナルを使用することが周知である。上記ベクターは、細胞をトランスフェクトする際に使用し得る。トランスフェクションは、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション、電気穿孔法、顕微注入法、リポソーム融合、リポフェクション、原形質融合、レトロウィルス感染及び微粒子銃を含む、当該技術分野にて周知の多様な手段により達成し得る。
【００６５】
本発明はまた、膜結合受容体に対する揮発性化合物の結合及び／又は機能を同定及び／又は確認するための、本発明によるキットの使用について詳細に説明する。例えば「細胞」、「膜結合受容体」、「揮発性化合物」、「ＳＡ」、「ＢＰ」、「画分」、「複合体」及び「組成物」等の用語は、本発明の方法に関して説明されているように解釈するべきである。
【００６６】
本発明による方法、キット又は使用において、揮発性化合物結合タンパク質又はリポカリンは、臭気物質結合タンパク質（ＯＢＰ）、フェロモン結合タンパク質（ＰＢＰ）、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）、主要尿タンパク質（ＭＵＰ）、アフロディシン及びエブネル腺タンパク質からなる群より選択され得る。
【００６７】
別に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語の全ては、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同一の意味を有する。代表的な方法及び材料を以下に記載するが、本発明の実施又は試験に、本明細書に記載するものと同様又は等価な方法及び材料を使用し得る。本明細書に言及する全ての刊行物及び他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。コンフリクトの場合には、定義を含む本明細書が調整する。材料、方法及び実施例は、単なる例示であり限定を意図しない。本発明の他の特徴及び利点は、以下の図面、詳細な説明、及び特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【００６８】
発明の実施するためのモード：
実施例１：材料及び試薬。
本発明に記載した蛍光ベースのアッセイにおけるプレートの読み取りは、ＦＤＳＳシステム（Hammatsu, Japan）上で実施した。本発明に記載した発光ベースのアッセイ（ｃＡＭＰレベル測定）におけるプレートの読み取りは、Fluostar（BMG, Germany）上で実施した。ＢＳＡ脂肪酸フリー及び臭気物質を含む全試薬は、明細書中に別に特定しない限り、Sigmaから購入した。
【００６９】
実施例２：細胞の培養。
ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞を、ＦＢＳで補充したＤＭＥＭ中、５％ＣＯ2及び９０％湿度下にて、３７℃で日常的に増殖させた。機能的アッセイの２日前、細胞を９６ウェルプレート（view-plate, Packard）上にプレーティングし、コンフルエンスに到達させ、培地中で３７℃に保持した。
【００７０】
実施例３：ウシ嗅粘液試料採取。
健康であった死んだ雌牛(Viangro slaughterhouse, Brussels, Belgium）から、ウシ嗅粘液のサンプルを獲得した。ウシ嗅上皮は、鼻腔の最上部内に存在する。雌牛の鼻口部を頭から切り離した後、縦方向に分割して、嗅裂を検証した。次に、嗅粘液を採取した。４０の異なる粘液サンプルのプールを使用して、本発明に記載した実験を行った。
【００７１】
実施例４：ＯＢＰ精製。
プールした嗅粘液を４℃で遠心分離した後、Ｇ２５マトリクス上で脱塩した。溶離緩衝液は、５０mM  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０、２mM  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１mM  ＰＭＳＦ及び１mM  ＤＴＴから構成されていた。次に、ＤＥＡＥマトリクス（Amersham Bioscience）にタンパク質１mgを適用した。ＮａＣｌの傾斜（１０mM〜５００mM）によりタンパク質溶離を実施し、２８０nmで検出した。ＯＢＰ及びＢＳＡ含有画分を、更にＣ１８マトリクス上で分画した。０．１％ギ酸及び４mM酢酸アンモニウムの存在下、アセトニトリルの傾斜（０％〜９０％）によりタンパク質を溶離した。
【００７２】
実施例５：蛍光ベースの機能的アッセイ。
ＳＡ、ＯＢＰ及び／又は嗅粘液を含むＢＰ溶液（濃度は明細書を参照）を、臭気物質の存在下、密閉フラスコ内にて、４℃で１６時間インキュベートした（図３Ａ）。次に、このインキュベートしたＢＰ溶液を、嗅覚受容体発現細胞上の試験複合体として使用した。この複合体と共にインキュベートする前に、細胞を、１ｍＭプロベネシドの存在下、４μM  Ｆｌｕｏ４−ＡＭ（Molecular Probe）と共に１時間インキュベートし、その後Ｆｌｕｏ４−ＡＭフリーＨＢＳＳ緩衝液で濯いだ。ＯＲ発現細胞上に臭気物質−ＢＰ複合体を注入した後、２５℃でHamamatsu Photonics K.K. (Japan) 製のプレートリーダー、ＦＤＳＳ上にて５２０nm（励起３８０nm）で蛍光を測定することにより、カルシウム流を追跡した。
【００７３】
実施例６：本発明者等の新規なアッセイにおけるｃＡＭＰレベルの測定。
上述した蛍光ベースの機能的アッセイの第一ステップと同様に、ＳＡ、ＯＢＰ及び／又は嗅粘液（濃度は、明細書を参照）を含むＢＰ溶液を、臭気物質の存在下、密閉フラスコ内にて、４℃で１６時間インキュベートした（図３Ａ）。次に、この臭気物質−ＢＰ複合体を、培養した細胞に３７℃で２０分間適用した。次に、Tropixキットを用いて、製造業者の手順（Applied Biosystem）にしたがってｃＡＭＰレベルを測定した。
【００７４】
実施例７：ウシ嗅粘液は、そのリガンドにより嗅覚受容体活性化を向上させる。
先行技術において、臭気物質分子は、ＯＢＰの結合ポケットに結合し得ることが示唆されている。しかしながら、これらが尚、嗅覚受容体に接近可能であるか否かの手がかりは全く存在しない。更に、文献には、これら臭気物質分子がＯＢＰによって捕捉され、嗅覚受容体の活性化を防止し得ることが示唆されている。これらの仮説に取り組むために、まず、ウシ嗅粘液が、嗅覚受容体活性化を防止する能力を評価した。
【００７５】
ｈＯＲＬ−４２４、ヒト嗅覚受容体を、ラット嗅上皮（Hunter）由来の細胞株、ＨＥＫ  ２９３Ｔに過剰発現させた。分化した後、ＨＥＫ  ２９３Ｔは、シグナル伝達に必要な伝達タンパク質の全パネルを発現し、カルシウム流によるＯＲ活性化の検出を可能とした（図１）。
【００７６】
増大する量のウシ嗅粘液の存在下、シトロネラルによるｈＯＲＬ−４２４の活性化を、９６ウェルプレートフォーマット内で、蛍光カルシウムトレーサー、ｆｌｕｏ４により追跡した。アッセイ緩衝液にウシ嗅粘液を加えると、シトロネラルによるｈＯＲＬ−４２４活性化の特異的な増大が誘導された（図２Ａ）。受容体活性化は、約９倍向上した（図２Ｂ）。加えて、従来のアッセイでは、ｈＯＲＬ−４２４の最大活性化に到達するために、１０mM迄を必要としたが、嗅粘液をアッセイ緩衝液に加えた場合、０．５mMの低さで十分であった（図２Ｃ）。
【００７７】
このウシ嗅粘液の性質は、他のアッセイフォーマットの異なるＯＲ上でも観察された。図２Ｄ及び図２Ｅは、ｍＯＲ−Ｉ７を過剰発現しているＨＥＫ  ２９３Ｔ上で実施し、オクタナールにより活性化された単一細胞カルシウムイメージングから得られたトレースを示す。このアッセイでは、カルシウムトレーサーとしてＦｕｒａ２を使用した。オクタナールは、粘液の不在下で、ｍＯＲ−Ｉ７の活性化をかすかに誘発したが（図２Ｄ）、粘液の存在下では、正の対照であるＡＴＰの添加後に観察されたものと同様のカルシウム流が観察された（図２Ｅ）。
【００７８】
したがって、図２に示した結果は、従来の機能的アッセイの緩衝液へのウシ嗅粘液の添加が、嗅覚受容体の活性化を特に向上させることを示す。
【００７９】
実施例８：新規な臭覚機能アッセイの開発。
嗅覚の生理学的プロセスに更に接近し、また上述した細胞ベースのアッセイの特異性及び感受性を向上させることを目的として、新規な臭覚機能アッセイを開発した。哺乳動物は、殆ど常時、揮発性臭気物質分子を嗅ぐ。しかしながら、殆どの細胞ベースのアッセイと同様に、上述した細胞ベースのアッセイでは、臭気物質分子は、水性緩衝液中に注入された。このような注入は、リガンドの有効性及び特異性を変更し得るミセルの形成に繋がり得る。したがって、臭気物質の、より良好な可溶化に焦点を合わせた、細胞ベースのアッセイを開発した。要約すれば、ウシ嗅粘液を、臭気物質の存在下、密閉フラスコ内でインキュベートした（図３Ａ）。それにより、流体中に臭気物質が捕捉され、可溶化されるか否かを試験した。その後、その可溶化した臭気物質を、嗅覚受容体を過剰発現している培養細胞上に注入した。次に、蛍光（図３Ｂ及び図３Ｃ）並びに発光カルシウムアッセイを含む従来のアッセイにより、この受容体の活性化を追跡した。
【００８０】
この新規なアッセイに関して、ｍＯＲ−Ｉ７活性化をオクタナールにより評価した。１Ｍオクタナールの溶液０〜１６μlの範囲の増大する量のオクタナールの存在下、一定容積の嗅粘液をインキュベートした。４℃で１６時間インキュベートした後、ｍＯＲ−Ｉ７を過剰発現しているＨＥＫ  ２９３Ｔ上に、ウシ嗅粘液を注入した。Hamamatsu Photonics K.K.(Japan)製のプレートリーダー、ＦＤＳＳ上でＦｌｕｏ４を用いてカルシウム流を追跡した。図３Ｂに示すように、蛍光強度は、ウシ嗅粘液と共にインキュベートした臭気物質の容積と比例していた。この細胞応答は、ｗｔ細胞上に細胞応答が全く観察されなかった為、オクタナールにより活性化したｍＯＲ−Ｉ７に特異的である。更に、緩衝液でインキュベートしたウシ嗅粘液の細胞上への注入後、カルシウム流が全く観察されなかったため、ウシ嗅粘液それ自体は、いかなる非特異的細胞応答も誘発しない（図３Ｂ）。
【００８１】
このアッセイを更に検証するために、同一の手法に従った単一細胞カルシウムイメージングアッセイを実施した（図３Ｃ）。１Ｍオクタナール溶液１６μlの存在下、ウシ嗅粘液を４℃で１６時間インキュベートした。次に、ＯＲ−Ｉ７を過剰発現しているＨＥＫ  ２９３Ｔ上に、ウシ嗅粘液を適用した。Ｆｌｕｏ４カルシウムトレーサーを用いてカルシウム流を追跡し、細胞を倍率４０Ｘにて観察した。実験の終わりに、ＡＴＰ  １mMを正の対照として注入した。上部パネルに、経時変化実験の代表的な領域の写真を示す。この領域から取った２０細胞の蛍光強度の動態解析により、ｍＯＲ−Ｉ７を過剰発現している細胞は、オクタナールと共にインキュベートしたウシ嗅粘液によって活性化されることが示される。これら２０の動態の平均を、下部パネル上に示す。
【００８２】
このように、この新規なアッセイは、臭気物質を効率的に可溶化して、分子の有効性を多大に改善することができる。実際、従来のアッセイでは、ＡＴＰ等の正の対照の注入後に観察された蛍光強度は、臭気物質注入後に観察された蛍光強度と比較して一般に大きい（図２Ｄ及び図２Ｅ）が、単一細胞カルシウムイメージングの結果（図３Ｃ）は、新たに提案されるアッセイでは、臭気物質は、ＡＴＰよりも大きいカルシウム流を誘発することが示される。このような不釣り合いは、従来のアッセイでは決して検出されなかった。また、新規なアッセイは、粘液が単にアッセイ緩衝液に添加されるアッセイと比較して、非常に高い感度をもたらす（図２Ｅ及び図２Ｄを図３Ｃと比較）。この観察は、臭覚機能アッセイにおいて、臭気物質の可溶化が、真に重要なステップであることを示唆する。
【００８３】
実施例９：ＯＢＰ及びＢＳＡを含むウシ嗅粘液画分は、嗅覚受容体活性化を改善する。
図３に示す結果は、ウシ嗅粘液が、臭気物質分子を可溶化し得ることを証明する。本発明は、この性質が、大量のＯＢＰ及び／又はＳＡの存在に起因するものと示唆する。この仮説を試験するために、ウシ嗅粘液を分画して、ウシＯＢＰ（ｂＯＢＰ）を単離した。ＤＥＡＥカラムからの溶離は、６つの主要なピークを生成した。ピーク４及びピーク５は、質量分析により同定して、主にｂＯＢＰ及びＢＳＡを含んでいた（図４Ａ）。これら２つのピークの溶離プロファイルは非常に類似していたため、これらをプールして、画分４と命名した。
【００８４】
画分４の臭気物質可溶化剤としての役割を遂行する能力は、新たに提案するアッセイで評価した。野生型ＨＥＫ  ２９３Ｔ（図５Ｃ）又はｍＯＲ−Ｉ７を過剰発現している（図５Ｂ）ＨＥＫ  ２９３Ｔ上で、３０種の臭気物質分子（図５Ａ）のスクリーニングを実施した。図５Ａに挙げた３０種の異なる臭気物質の１Ｍ溶液１６μlの存在下、画分４を４℃で一夜インキュベートした。比較のために、図５Ｆに、本発明に記載したＣＣＢＳＡを実施する代わりに、臭気物質がアッセイ緩衝液中に直接負荷される際に通常得られるトレースを示す。蛍光色素としてのｆｌｕｏ４を用いて、ＦＤＳＳ（Hamamatsu Photonics K.K., Japan）上で、ｍＯＲ−Ｉ７活性化を追跡した。基本的な実験条件下で活性化は全く検出されなかった（図５Ｆ）が、ｍＯＲ−Ｉ７の潜在的リガンドとして１０種の臭気物質が候補に上がった：ヘプタノール、オクタノール、４（２−メトキシエチル）フェノール、シトロネロール、シトロネラル、オクタナール、シス−６−ノネナール、バニリルアセトン及び２，３ヘプタンジオン（図５Ｄ及び図５Ｅ）。これら臭気物質は、ｍＯＲ−Ｉ７を発現しているＨＥＫ  ２９３Ｔに、野生型対応物の少なくとも一倍以上の活性化をもたらした。これらは、２つのグループに分類され得る。１グループ（図５Ｅ（ａ）〜（ｅ））は、図５Ｅ（ｊ）に示すオルファクトフォア１に適合する分子を集める。これらは、模式的に、６個の炭素により隔てられた２つの電気的に陰性な極から構成されている。別の一グループは、図５Ｅ（ｆ）〜図５（ｉ）に示す分子からなる。これらは全て、図５Ｅ（ｋ）に代表されるオルファクトフォア２で示される、電気的に陰性な基の終端を有する６〜８個の炭素鎖を含む。
【００８５】
実施例１０：ＢＳＡは、新規な臭気物質担体タンパク質である。
実施例９は、新規な細胞ベースの臭覚機能アッセイにおいて、画分４が、臭気物質分子を可溶化し、かつ有効性を高める性質を有することを示した（図５）。しかしながら、この画分４は、２種の主要なタンパク質、ｂＯＢＰ及びＢＳＡを含んでいた。したがって、この手法における上記実施例の結果は、画分４の性質に対するＢＳＡの任意の影響を除外し得ない。したがって、本発明に記載した新規な細胞ベースの臭覚機能アッセイにおいて、ＢＳＡの可溶化能力と、それによる臭気物質の有効性の向上とを試験した。画分４で観察されたＢＳＡ濃度にできる限り接近するため、以下の実験のために、ＢＳＡ濃度を５×１０−６Ｍに設定した（図６Ｇに矢印でマークした）。画分４及び脂肪酸フリーＢＳＡ溶液を、増大する容積の１Ｍオクタナールの存在下、４℃で１６時間インキュベートした。次に、このようにインキュベートした溶液を、ＨＥＫ  ２９３Ｔｗｔ又はｍＯＲ−Ｉ７を過剰発現しているＨＥＫ  ２９３Ｔ上に適用した。プレートリーダー（Hamamatsu Photonics K. K., Japan）上で、蛍光色素としてのｆｌｕｏ４を用いて、カルシウム流を追跡した（図６Ａ〜図６Ｆ）。３００秒間の動態（図６Ａ、図Ｂ１Ｄ及び図６Ｅ）は、ｍＯＲ−Ｉ７を過剰発現しているＨＥＫ  ２９３Ｔにカルシウム流が検出された一方、ｗｔ対応物に蛍光は全く出現しなかったことを示す。また、検出された蛍光の強度は、アッセイに関与した臭気物質の量と比例していた。逆に、最大蛍光への到達に要する時間は、臭気物質の容積が増大すると低下した（図６Ａ及び図６Ｄ）。この現象は、リガンド濃度を増大させて注入した蛍光アッセイにて、通常観察される。
【００８６】
この動態中に検出した蛍光シグナルは、ＢＳＡそれ自体に起因しない。事実、一方で、ＨＥＫ  ２９３Ｔｗｔ内にカルシウム流は検出されなかった。他方で、１０-13〜１０-4Ｍの範囲内の臭気物質フリーＢＳＡ溶液は、任意の蛍光シグナルを誘発しなかった（図６Ｇ）。これらアッセイに使用したＢＳＡ濃度は、上記したように５×１０-6Ｍであった。
【００８７】
画分４又はＢＳＡ溶液により得られた濃度応答曲線は、非常に類似していた（図６Ｃ及び図６Ｆ）。これらの可溶化溶液のいずれかを用いた新しい系において、ｍＯＲ−Ｉ７の最大応答を誘発するには、２０μlもの少量の１Ｍ臭気物質溶液で十分である。
【００８８】
図１に示すように、臭気物質分子の嗅覚受容体に対する結合は、分子事象のカスケードを引き起こす。最も一般に認められている経路は、第一に、第二メッセンジャーは、アデニル酸シクラーゼタイプＩＩＩによって合成されるｃＡＭＰである。したがって、嗅覚受容体活性化を試験する手段は、嗅覚受容体活性化後の細胞ｃＡＭＰプールの変化の評価である。このアッセイは、上述したカルシウム流アッセイと並行して実行され、スクリーニング中に得られたヒットを確認し得ることは注目に値する。
【００８９】
ｍＯＲ−Ｉ７は、３種の臭気物質：オクタナール、ヘプタナール及びシトロネラル（参照）により特異的に活性化されることが周知である。本発明による新規な細胞ベースの臭覚機能アッセイの特異性は、これら３種の臭気物質と、２種の非関連臭気物質、バニリン及びイソ酪酸ピペロニルの注入後のｍＯＲ−Ｉ７活性化にしたがって試験された。嗅覚受容体の活性化は、細胞ｃＡＭＰプールのイムノアッセイにより検出される。ＢＳＡ溶液を、１Ｍ臭気物質溶液１６μlの存在下、４℃で一夜インキュベートした後、ｍＯＲ−Ｉ７を発現しているＨＥＫ  ２９３Ｔに適用した。これら５種の各臭気物質のｍＯＲ−Ｉ７活性化動態を、図６Ｈに示す。可溶化臭気物質との５分間のインキュベーションは、作動薬を非作動薬から区別するに十分であるが、ｃＡＭＰ蓄積は２０分間持続した。図６Ｉに示したヒストグラムは、可溶化臭気物質と共に２０分間インキュベートした後の、細胞ｃＡＭＰプールを表す。文献に記載されているように、本発明者等の新規な細胞ベースの臭覚機能アッセイは、オクタナール、ヘプタナール及びシトロネラルをｍＯＲ−Ｉ７リガンドとして特定した。バニリン及びイソ酪酸ピペロニルは、ｃＡＭＰ合成を誘導せず、したがって、ｍＯＲ−Ｉ７の３種のリガンドに対する関連性のないそれらの構造に基づき、及び文献上で予期されたように、ｍＯＲ−Ｉ７のリガンドではない。総合的に、これらの結果は、ＢＳＡ溶液が、臭気物質分子の可溶化に使用されて、嗅覚受容体の特異的な応答を誘発することを示す。
【００９０】
実施例１１：臭気物質担体タンパク質としてのＢＳＡを用いた新規な臭覚機能アッセイは、臭気物質分子の高感度スクリーニングを可能にする。
臭気物質担体タンパク質としてのＢＳＡを更に確認するために、３０種の臭気物質分子のｍＯＲ−Ｉ７に対する４つの独立したスクリーニングを実施した。ＨＥＫ  ２９３Ｔ内で過剰発現したｍＯＲ−Ｉ７の活性化を、カルシウム流アッセイ（図７Ｂ及び図７Ｃ）、又はｃＡＭＰ合成免疫検出（図７Ｄ）のいずれかにより追跡した。上述したように、ＢＳＡ溶液を、図７Ａに挙げた３０種の臭気物質分子と共に、４℃で一夜インキュベートした。次に、ＢＳＡ溶液を、ｍＯＲ−Ｉ７を発現している培養したＨＥＫ  ２９３Ｔに適用した。蛍光色素としてＦｌｕｏ４を用いたカルシウム流アッセイのためのプレートリーダー（FDSS, Hamamatsu Photonics K.K., Japan），又はｃＡＭＰ合成アッセイのための免疫検出アッセイ（TROPIX, Applied Biosystem）のいずれかで、受容体活性化を追跡した。図７Ｂに、ＦＤＳＳ（Hamamatsu Photonics K.K., Japan)上でのカルシウム流アッセイによる、これら３０種の分子のスクリーニング中に観察された典型的なスクリーンを示す。カルシウム流アッセイを用いた２つの独立したスクリーニングの結果を、図７Ｃに示す。蛍光強度は、正の対照である１００μM  ＡＴＰの注入後に得られたシグナルに対して標準化されている。８種及び７種の臭気物質が、ｍＯＲ−Ｉ７のリガンドとして特定された。これら臭気物質の６種は：１−ヘプタノール、１−オクタノール、シトロネロール、１−オクタナール、１−ヘプタナール、２，３ヘプタンジオンに一致するように思われる。それらは、図７Ｃに表すヒストグラムにて、星印が付されている。
【００９１】
上記したように（図１）、嗅覚受容体の活性化は、ｃＡＭＰ合成を介しても追跡し得る。このアッセイは、ｍＯＲ−Ｉ７を過剰発現しているＨＥＫ  ２９３Ｔ上での３０種の臭気物質分子のスクリーニングに実行された。２つの独立したスクリーニングの結果を、図７Ｄに示す。結果を、アデニル酸シクラーゼの活性化因子である１００μMホルスコリンと共にインキュベートした後に観察された、応答パーセントとして表す。多数の臭気物質が、ｃＡＭＰの合成を誘発した。しかしながら、そのうち１３種のみが、２つのスクリーニング間で一致していた。それらを、図７Ｄにて黒丸で印す。これら１３種の臭気物質の中でも、６種は、実施されたアッセイのいずれかにより行われた４つのスクリーニングによって、ｍＯＲ−Ｉ７の潜在的リガンドとして見出されている。これら６種のリガンドに対する細胞応答を表すバーを、灰色で示す（図７Ｃ及び図７Ｄ）。臭気物質分子の模式図を、図７Ｅに示す。これらの構造を比較すると、共通するバックボーンが明らかになる：アルデヒド及びアルコールを含む電気的に陰性な基の終端を有する脂肪鎖。
【００９２】
画分４を臭気物質担体として用いて実施したスクリーニング中に、これら６種の臭気物質が、ｍＯＲ−Ｉ７のリガンドとして見出されたことは注目に値する（図５）。この観察は、本発明者等の新規な臭覚機能アッセイにおいて、ＢＳＡ溶液が、担体の役割を果たすことを裏付ける。
【００９３】
実施例１２：タンパク質を揮発性化合物結合タンパク質として認め得るか測定するためのアッセイ。
タンパク質が、揮発性化合物に結合するか否かを測定するための、多数の方法が存在する：
１）提案する以下の方法は、試験タンパク質が、揮発性化合物結合タンパク質（ＢＰ）として働くか否かを測定する際に使用し得る。
２）第二に、蛍光偏光は、化合物が候補タンパク質に結合するか否かを検出する際に使用し得る。その場合、蛍光偏光は増大するであろう。揮発性化合物のインキュベーションは、本発明の方法の第一ステップに記載したものと同一条件下で実施し得る。即ち：試験タンパク質の溶液を、揮発性化合物の存在下、密閉フラスコ内にて４℃で１６時間インキュベートする。試験タンパク質溶液を緩衝液単独で置き換えて、同一の実験を実施し得る。蛍光偏光を実施し、２つのサンプルの偏光率を比較し得る。代替的に、同様の実験を実施し得るが、揮発性化合物を試験タンパク質溶液に直接溶解する。
３）第三に、Pemollet及び共同研究者により開発されたアッセイ：揮発性臭気物質結合アッセイ（Eur.J.Biochem 267, 3079-3089,2000.)を使用し得る。基本的に、フルオロフォアは、候補タンパク質に結合する。このフルオロフォアは、非限定的に、ＤＡＵＤＡ、ＤＡＣＡ、ＡＳＡ、１−ＡＭＡ、１，８ＡＮＳ及びＮＰＮであり得る。上記遊離−フルオロフォアの発光スペクトルは、上記タンパク質結合−フルオロフォアとは異なる。発光波長にしたがって、フルオロフォアが遊離又はタンパク質結合であるかを決定し得る。したがって、タンパク質結合−フルオロフォアが、上記複合体のインキュベーションによって揮発性化合物と置き換えられ得る場合、試験タンパク質は、揮発性化合物結合タンパク質として考慮し得る。より詳細には、アッセイは、以下のように実施し得る：第一ステップとして、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中の２μM試験タンパク質溶液、ｐＨ７．５を用いて、フルオロフォア結合実験を実施する。蛍光プローブを１mM原液としての１０％（ｖ／ｖ）メタノールに溶解する。１〜１０μMプローブを試験タンパク質溶液に加え、室温で５分間、更にインキュベートする。第二のステップにおいて、かように形成したフルオロフォア−タンパク質複合体を、揮発性化合物の存在下、密閉フラスコ内にて４℃で１６時間インキュベートする。この最後のステップは、フルオロフォアを揮発性化合物で置き換えることを目的とする。この置き換えは、フルオロフォアの蛍光発光スペクトルのシフトにより検出される。
４）揮発性化合物のインキュベーションは、本発明者等のアッセイの第一ステップに記載されたものと同一の条件下で実施するべきであり、即ち：試験タンパク質の溶液を、揮発性化合物の存在下、密閉フラスコ内にて４℃で１６時間インキュベートする。次に、タンパク質溶液をクロロホルムで抽出し、ガスクロマトグラフィーにより分析する。この実験の対照は、試験タンパク質を可溶化するために使用される緩衝液の単独であり得る。
５）Ｂｉａｃｏｒｅ法も、試験タンパク質と揮発性化合物間の相互作用を検出する手段であり得る。
【００９４】
実施例１３：リポカリンファミリーに属するタンパク質の同定方法。
例えば、臭気物質結合タンパク質（ＯＢＰ）、フェロモン結合タンパク質（ＦＢＰ）、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）、主要尿タンパク質（ＭＵＰ）、アフロディシン及びエブネル腺タンパク質等の、多数のリポカリンタンパク質が同定されている。当業者は、機能的活性又は構造的類似性に基づき、タンパク質がリポカリンファミリーに属するか否かを容易に決定することができる。
【００９５】
例えば、配列類似性の調査は、ＢＬＡＳＴソフトウエアパッケージを用いて実行し得る。同一性及び類似性パーセントは、スコアマトリクスとしてＢＬＯＳＵＭ６２を使用して計算し得る。当該技術分野にて周知のように、２つのポリペプチド間の「類似性」は、一つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換と、第二のポリペプチドの配列とを比較して決定される。更に、「同一性」もまた当該技術分野にて周知であり、これは、これら配列の２つの線（string）間の一致を同定することにより決定される、２つのポリペプチド又は２つのポリヌクレオチド配列の間の配列関連性の程度を意味する。同一性及び類似性の両方は、容易に計算し得る。２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列間の同一性及び類似性を測定する多数の方法が存在するが、用語「同一性」及び「類似性」は、当業者に周知である（Carillo and Lipton,1988）。２つの配列間の同一性又は類似性の測定に通常使用される方法は、非限定的に、（Guide to Huge Computers (Bishop, 1994) 及び Carillo and Lipton (1988)に記載されている方法を含む。同一性を測定する好ましい方法は、試験する２つの配列間の最大一致を与えるよう設計されている。同一性及び類似性を測定する方法は、コンピュータプログラム内に体系化されている。２つの配列間の同一性及び類似性を測定する好ましいコンピュータプログラム方法は、ＧＣＧプログラムパッケージ(Devereux et al., 1984）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ(Altschul et al, 1990）を含むが、これらに限定されるものではない。周知のリポカリンに対して５５％、６０％、６５％、好ましくは７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％、又はより好ましくは９９％の類似性を有するタンパク質は、同一のタンパク質又は遺伝子ファミリーに属するものと考慮し得る。
【００９６】
実施例１４：血清アルブミンファミリーに属するタンパク質の同定方法。
多数の血清アルブミンタンパク質が同定されている（上記参照）。当業者は、機能的活性又は構造的類似性に基づき、タンパク質が、血清アルブミンファミリーに属するか否かを容易に決定し得る。ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列と、周知のＳＡ配列間の類似性及び／又は同一性の同定は、実施例１３にてリポカリン配列に関して言及したように測定し得る。
【００９７】
本発明を、その詳細な説明と併せて説明してきたが、前記の説明は、付随する特許請求の範囲の範囲により定義される本発明を解説することを意図するものであり、本発明の範囲を限定するものではないことを理解するべきである。例えば、上述した実施例に、ｈＯＲＬ−４２４又はｍＯＲ−Ｉ７を過剰発現している異種ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞が使用される。上記受容体は、各々、シトロネラル及びオクタナールにより活性化されることが周知である。上記受容体に関するリガンドは公知であり、上記受容体は、本明細書に記載する方法を開発するために、参照の揮発性化合物結合受容体として選択されている。しかしながら、ＢＰ及び／又はＳＡが、担体分子としてインビトロでのアッセイに使用し得ることは、他のＯＲにも適用し得るため、本発明は、更に、これらの担体分子が、揮発性化合物を認識する可能な全受容体のためのインビトロでの方法に適用し得ることを示唆する。更に、上記受容体が発現しているＨＥＫ  ２９３Ｔは、使用し得る可能な細胞の単なる一例である。加えて、この目的に機能的アッセイが使用されたが、見られた効果は、上記受容体を含む細胞膜を使用したインビトロでのアッセイにも適用し得る。上記実験において、Ｃａ2+及びｃＡＭＰが測定されたが、膜結合受容体は、異なるシグナル伝達分子を刺激し得るため、Ｃａ2+及びｃＡＭＰ以外のシグナル伝達分子の測定も可能である。
【００９８】
明細書中に引用した参考文献の全ては、参照により本明細書に組み入れられる。他の局面、利点及び修正は、特許請求の範囲の範囲内に含まれる。
【００９９】
表１
配列１：野生型ネズミＯＢＰ核酸配列
【表１】
2008529540.tif 000002
【０１００】
配列２：野生型ネズミＯＢＰアミノ酸配列
【表２】
2008529540.tif 000003
【０１０１】
配列３：野生型ラットＯＢＰ核酸配列（１ｆ）
【表３】
2008529540.tif 000004
【０１０２】
配列４：野生型ラットＯＢＰ核酸配列（２Ｂ）
【表４】
2008529540.tif 000005
【０１０３】
配列５：野生型ラットＯＢＰ核酸配列（ＯＢＰ３）
【表５】
2008529540.tif 000006
【０１０４】
配列６：野生型ラットＯＢＰアミノ酸配列（１ｆ）
【表６】
2008529540.tif 000007
【０１０５】
配列７：野生型ラットＯＢＰアミノ酸配列（２Ｂ）
【表７】
2008529540.tif 000008
【０１０６】
配列８：野生型ラットＯＢＰアミノ酸配列（ＯＢＰ３）
【表８】
2008529540.tif 000009
【０１０７】
配列９：野生型ヒトＯＢＰ核酸配列
【表９】
2008529540.tif 000010
【０１０８】
配列１０：野生型ヒトＯＢＰ核酸配列
【表１０】
2008529540.tif 000011
【０１０９】
配列１１：野生型ヒトＯＢＰ核酸配列
【表１１】
2008529540.tif 000012
【０１１０】
配列１２：野生型ヒトＯＢＰアミノ酸配列
【表１２】
2008529540.tif 000013
【０１１１】
配列１３：野生型ヒトＯＢＰアミノ酸配列（２Ｂ）
【表１３】
2008529540.tif 000014
【０１１２】
配列１４：野生型ヒトＯＢＰアミノ酸配列（２Ａ）
【表１４】
2008529540.tif 000015
【０１１３】
配列１５：野生型ウシＯＢＰアミノ酸配列
【表１５】
2008529540.tif 000016
【０１１４】
配列１６：野生型ブタＯＢＰ核酸配列
【表１６】
2008529540.tif 000017
【０１１５】
配列１７：野生型ブタＯＢＰアミノ酸配列
【表１７】
2008529540.tif 000018
【０１１６】
配列１８：野生型ウシアルブミン核酸配列（ALB Bos Taurus 1）
【表１８】
2008529540.tif 000019
【０１１７】
配列１９：野生型ウシアルブミンアミノ酸配列（ALB Bos Taurus 1）
【表１９】
2008529540.tif 000020
【０１１８】
配列２０：野生型ヒトアルブミン核酸配列（ALB Homo Sapiens 1）
【表２０】
2008529540.tif 000021
【０１１９】
配列２１：野生型ヒトアルブミンアミノ酸配列（ALB Homo Sapiens 1）
【表２１】
2008529540.tif 000022
【０１２０】
配列２２：野生型イノシシアルブミン核酸配列（ALB Sus scrofa 1）
【表２２】
2008529540.tif 000023
【０１２１】
配列２３：野生型イノシシアルブミンアミノ酸配列（ALB Sus scrofa 1）
【表２３】
2008529540.tif 000024
【０１２２】
配列２４：野生型ウサギアルブミン核酸配列（ALB Oryctolagus cuniculus 1）
【表２４】
2008529540.tif 000025
【０１２３】
配列２５：野生型ウサギアルブミンアミノ酸配列（ALB Oryctolagus cuniculus 1）
【表２５】
2008529540.tif 000026
【０１２４】
配列２６：野生型マウスアルブミン核酸配列（ALB Mus Musculus 1）
【表２６】
2008529540.tif 000027
【０１２５】
配列２７：野生型マウスアルブミンアミノ酸配列（ALB Mus Musculus 1）
【表２７】
2008529540.tif 000028
【０１２６】
配列２８：野生型ラットアルブミン核酸配列（ALB Rattus Norvegicus 1）
【表２８】
2008529540.tif 000029
【０１２７】
配列２９：野生型ラットアルブミンアミノ酸配列（ALB Rattus Norvegicus 1）
【表２９】
2008529540.tif 000030
【０１２８】
配列３０：Bos taurusエブネル腺小唾液腺タンパク質（C20orf114）、ｍＲＮＡ
【表３０】
2008529540.tif 000031
【０１２９】
配列３１：エブネル腺小唾液腺タンパク質［Bos taurus］
【表３１】
2008529540.tif 000032
【０１３０】
配列３２：Sus scrofaエブネル腺タンパク質ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ
【表３２】
2008529540.tif 000033
【０１３１】
配列３３：エブネル腺タンパク質［Sus scrofa］
【表３３】
2008529540.tif 000034
【０１３２】
配列３４：ヒト推定エブネル腺タンパク質核酸配列（C20orf114）
【表３４】
2008529540.tif 000035
【０１３３】
配列３５：ヒト推定エブネル腺タンパク質アミノ酸配列（C20orf114）
【表３５】
2008529540.tif 000036
【０１３４】
配列３６：Mus musculus主要尿タンパク質１（Ｍｕｐ１）、ｍＲＮＡ
【表３６】
2008529540.tif 000037
【０１３５】
配列３７：主要尿タンパク質１［Mus musculus］
【表３７】
2008529540.tif 000038
【０１３６】
配列３８：ヘリコベルパ・アサルトフェロモン結合タンパク質（ｐｂｐ）ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ
【表３８】
2008529540.tif 000039
【０１３７】
配列３９：フェロモン結合タンパク質［ヘリコベルパ・アサルト］
【表３９】
2008529540.tif 000040
【０１３８】
配列４０：Sesamia nonagrioidesフェロモン結合タンパク質１前駆
【０１３９】
体（ＰＢＰ１）ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ
【表４０】
2008529540.tif 000041
【０１４０】
配列４１：フェロモン結合タンパク質１前駆体［Sesamia nonagrioides］
【表４１】
2008529540.tif 000042
【０１４１】
配列４２：Sesamia nonagrioidesフェロモン結合タンパク質２前駆体（ＰＢＰ２）ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ
【表４２】
2008529540.tif 000043
【０１４２】
配列４３：フェロモン結合タンパク質２前駆体［Sesamia nonagrioides］
【表４３】
2008529540.tif 000044
【０１４３】
配列４４：シロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）フェロモン結合タンパク質１（ＰＢＰ１）ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ
【表４４】
2008529540.tif 000045
【０１４４】
配列４５：フェロモン結合タンパク質１［シロイチモジヨトウ］
【表４５】
2008529540.tif 000046
【０１４５】
配列４６：シロイチモジヨトウフェロモン結合タンパク質２（ＰＢＰ２）ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ
【表４６】
2008529540.tif 000047
【０１４６】
配列４７：フェロモン結合タンパク質２［シロイチモジヨトウ］
【表４７】
2008529540.tif 000048
【０１４７】
配列４８：キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）ＣＧ１０４３６−ＰＡ（Ｐｂｐｒｐ１）ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ
【表４８】
2008529540.tif 000049
【０１４８】
配列４９：ＣＧ１０４３６−ＰＡ［キイロショウジョウバエ］
【表４９】
2008529540.tif 000050
【０１４９】
配列５０：キイロショウジョウバエＣＧ１１４２１−ＰＡ（Ｐｂｐｒｐ３）ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ
【表５０】
2008529540.tif 000051
【０１５０】
配列５１：ＣＧ１１４２１−ＰＡ［キイロショウジョウバエ］
【表５１】
2008529540.tif 000052
【０１５１】
配列５２：キイロショウジョウバエＣＧ１６６８−ＰＡ、アイソフォームＡ（Ｐｂｐｒｐ２）ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ
【表５２】
2008529540.tif 000053
【０１５２】
配列５３：ＣＧ１６６８−ＰＡ、アイソフォームＡ［キイロショウジョウバエ］
【表５３】
2008529540.tif 000054
【０１５３】
配列５４：キイロショウジョウバエＣＧ１１７６−ＰＡ（Ｐｂｐｒｐ４）ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ
【表５４】
2008529540.tif 000055
【０１５４】
配列５５：ＣＧ１１７６−ＰＡ［キイロショウジョウバエ］
【表５５】
2008529540.tif 000056
【０１５５】
配列５６：キイロショウジョウバエＣＧ６６４１−ＰＡ（Ｐｂｐｒｐ５）ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ
【表５６】
2008529540.tif 000057
【０１５６】
配列５７：ＣＧ６６４１−ＰＡ［キイロショウジョウバエ］
【表５７】
2008529540.tif 000058
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】臭気物質分子によるＯＲ活性化により誘発されたシグナル伝達カスケード。詳細は、明細書を参考されたい。
【図２】ウシ嗅粘液は、シトロネラルによりｈＯＲＬ−４２４活性化を増大させる。（Ａ及びＢ）異なる量のウシ嗅粘液の存在下で、ｈＯＲＬ−４２４のシトロネラルによる活性化後、カルシウム測定を実施した。粘液（総タンパク質０〜１０μg）０〜１０μlをアッセイ緩衝液に加えた。蛍光色素としてＦｌｕｏ４を用いて、ＦＤＳＳ（Hamamatsu Photonics K.K. プレートリーダー、 Japan）上でカルシウム流を追跡した。ヒストグラムは、ウシ嗅粘液１０μlの存在又は不在下で観察した蛍光シグナルを示す。（Ｃ）シトロネラルで処理した、ｈＯＲＬ−４２４を過剰発現しているＨＥＫ  ２９３Ｔの濃度応答曲線。灰色四角形は、ウシ嗅粘液の存在下で得られた値を示す。カルシウム流測定は、ＦＤＳＳ（Hamamatsu Photonics K.K. プレートリーダー, Japan）上で実施した。（Ｄ及びＥ）ウシ嗅粘液１０μlの不在下（Ｄ）又は存在下（Ｅ）での、ｍＯＲ−Ｉ７を発現しているＨＥＫ  ２９３Ｔ上の５００μMオクタナール添加後の、単一細胞カルシウムイメージング中に得られたトレース。Ｆｕｒａ２を蛍光色素として使用した。結果は、Ｆ３４０／Ｆ３８０レシオメトリック測定として表される。
【図３】新規な臭覚機能アッセイの開発。（Ａ）本発明による新規なアッセイ、ＣＣＢＳＡの模式図。詳細には、明細書を参照されたい。（Ｂ）ＣＣＢＳＡの、マイクロプレートフォーマット蛍光細胞ベースのアッセイへの適用。増大する容積のオクタナールを、ＣＣＢＳＡ中でインキュベートし、ｍＯＲ−Ｉ７を過剰発現している、又はしていないＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞株に適用した。カルシウムトレーサーとしてのｆｌｕｏ４を用いて、カルシウム流を追跡した。（Ｃ）ＣＣＢＳＡの、単一細胞カルシウムイメージングアッセイへの適用。オクタナールをＣＣＢＳＡ中でインキュベートし、ｍＯＲ−Ｉ７を過剰発現しているＨＥＫ  ２９３Ｔ上に適用した。上部パネルは、カルシウムトレーサーとしてのｆｌｕｏ４を用いて追跡したカルシウム流動態を示す。オクタナールインキュベートしたウシ嗅粘液を５０秒で適用し、正の対照としてのＡＴＰを３１０秒で適用した。この実験では、４０Ｘ対象を用いた。中央部パネルは、上部パネルに表す領域から取り出した２０個の個々の細胞の動態を示す。最後に、２０個のトレースの平均を下部パネルに表す。
【図４】ウシ嗅粘液の分画。（Ａ）ＤＥＡＥ上でのウシ嗅粘液分画中のＯＢＰ及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の共溶離（ピーク４及びピーク５）。タンパク質溶離を２８０nmにて追跡した。囲みは、分画中に検出した６種の異なるピークのプロファイルを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥである。ＯＢＰ及びＢＳＡを質量分析により同定した。（Ｂ）ウシＯＢＰ（ｂＯＢＰ）の精製。ピーク４及びピーク５はプールされ、Ｃ１８上で分画された。タンパク質溶離を２１４nmで追跡した。囲みＳＤＳ−ＰＡＧＥに示すように、ｂＯＢＰ及びＢＳＡを別々に溶離した。また、ｂＯＢＰを２つのピークにて溶離した。ＯＢＰ及びＢＳＡを質量分析により同定した。
【図５−１】ＯＢＰ及びＢＳＡを主に含有するウシ嗅粘液の２つの画分は、本発明によるアッセイにおいて、ｍＯＲ−Ｉ７活性化を増大させる。本発明によるアッセイＣＣＢＳＡを用いた、ＨＥＫ  ２９３Ｔｗｔ又はｍＯＲ−Ｉ７過剰発現ＨＥＫ  ２９３Ｔ上での３０種の臭気物質分子のスクリーニング。このスクリーニングでは、Ｆｌｕｏ４を蛍光色素として使用した。（Ａ）スクリーニングした分子のリスト。（Ｂ及びＣ）は、各々、ＦＤＳＳ（Hamamatsu Photonics K. K., Japan）上で実施したアッセイ中、５２０nmで観察されたＨＥＫ  ２９３Ｔ  ｍＯＲ−Ｉ７及びＨＥＫ  ２９３ＴＷｔに関する動態を示す。（Ｄ）（Ａ）に挙げた異なる臭気物質に対する細胞応答を表すヒストグラム。結果は、１mM  ＡＴＰの注入によって誘発された応答に対する標準化後の、Ｗｔに対するｍＯＲ−Ｉ７の比として表す。（Ｅ）スクリーニング中に得られた異なるヒットの模式図、（ａ）６−シス−ノネナール、（ｂ）シトロネラル、（ｃ）４−（２−メトキシエチル）−フェノール、（ｄ）バニリルアセトン、（ｅ）シトロネロール、（ｆ）２，３ヘプタンジオン、（ｇ）１−オクタナール、（ｈ）１−オクタノール、（ｉ）１−ヘプタノール、（ｊ）オルファクトフォア１及び（ｋ）オルファクトフォア２。（Ｆ）ＦＤＳＳ（Hamamatsu Photonics K. K., Japan）上で実施した古典的なアッセイ中、５２０nmで観察されたＨＥＫ  ２９３ＴｍＯＲ−Ｉ７に関する動態を示す。古典的アッセイは、臭気物質分子をＣＣＢＳＡアッセイに付することなく、アッセイ緩衝液に直接負荷することを意味する。
【図５−２】ＯＢＰ及びＢＳＡを主に含有するウシ嗅粘液の２つの画分は、本発明によるアッセイにおいて、ｍＯＲ−Ｉ７活性化を増大させる。本発明によるアッセイＣＣＢＳＡを用いた、ＨＥＫ  ２９３Ｔｗｔ又はｍＯＲ−Ｉ７過剰発現ＨＥＫ  ２９３Ｔ上での３０種の臭気物質分子のスクリーニング。このスクリーニングでは、Ｆｌｕｏ４を蛍光色素として使用した。（Ａ）スクリーニングした分子のリスト。（Ｂ及びＣ）は、各々、ＦＤＳＳ（Hamamatsu Photonics K. K., Japan）上で実施したアッセイ中、５２０nmで観察されたＨＥＫ  ２９３Ｔ  ｍＯＲ−Ｉ７及びＨＥＫ  ２９３ＴＷｔに関する動態を示す。（Ｄ）（Ａ）に挙げた異なる臭気物質に対する細胞応答を表すヒストグラム。結果は、１mM  ＡＴＰの注入によって誘発された応答に対する標準化後の、Ｗｔに対するｍＯＲ−Ｉ７の比として表す。（Ｅ）スクリーニング中に得られた異なるヒットの模式図、（ａ）６−シス−ノネナール、（ｂ）シトロネラル、（ｃ）４−（２−メトキシエチル）−フェノール、（ｄ）バニリルアセトン、（ｅ）シトロネロール、（ｆ）２，３ヘプタンジオン、（ｇ）１−オクタナール、（ｈ）１−オクタノール、（ｉ）１−ヘプタノール、（ｊ）オルファクトフォア１及び（ｋ）オルファクトフォア２。（Ｆ）ＦＤＳＳ（Hamamatsu Photonics K. K., Japan）上で実施した古典的なアッセイ中、５２０nmで観察されたＨＥＫ  ２９３ＴｍＯＲ−Ｉ７に関する動態を示す。古典的アッセイは、臭気物質分子をＣＣＢＳＡアッセイに付することなく、アッセイ緩衝液に直接負荷することを意味する。
【図６】ＢＳＡは、担体タンパク質である。（Ａ、Ｂ及びＣ）本発明により記載したアッセイにおいて、異なる量のオクタナールと共にインキュベートしたウシ嗅粘液ピーク４及びピーク５によるｍＯＲ−Ｉ７の活性化。（Ｄ、Ｅ及びＦ）本発明者等の新規なアッセイにおいて、異なる量のオクタナールと共にインキュベートしたＢＳＡ溶液によるｍＯＲ−Ｉ７の活性化。パネルＡ及びパネルＤは、ｍＯＲ−Ｉ７を過剰発現しているＨＥＫ  ２９３Ｔの動態を示し、一方、パネルＢ及びパネルＥは、同一条件下でのＨＥＫ  ２９３ＴＷｔの動態を示す。動態は、標準化蛍光強度として表す。（Ｇ）本発明により記載されたアッセイＣＣＢＳＡで用いた濃度において、ＢＳＡそれ自体は、カルシウム流を全く誘発しない。任意の臭気物質の不在下で、増大した量のＢＳＡを用いてＣＣＢＳＡを実施した。結果を、蛍光単位として表す。矢印は、本発明に記載したアッセイにて使用した濃度を特定する。（Ｈ）ｍＯＲ−Ｉ７、オクタナール、ヘプタナール及びシトロネラルの３種の周知のリガンドを含む５種の異なるリガンドとのｍＯＲ−Ｉ７のインキュベーション後の、ｃＡＭＰ合成の動態。ｃＡＭＰ濃度は、イムノアッセイ（TROPIX, Applied Biosystem）により測定した。結果は、ウェル当たりｎＭで表す。（Ｉ）５種の異なるリガンドとの２０分間のインキュベーション後の、合成されたｃＡＭＰの濃度を表すヒストグラム。結果は、ウェル当たりｎＭで表す。
【図７】本発明に記載した細胞ベースの臭覚機能アッセイによる、ＢＳＡを臭気物質担体タンパク質として使用した、ｍＯＲ−Ｉ７を過剰発現しているＨＥＫ  ２９３Ｔに対する３０種の臭気物質分子のスクリーニング。（Ａ）スクリーニングした３０種の臭気物質分子のリスト。（Ｂ）スクリーニング（FDSS, Hamamatsu Photonics K. K., Japan）中、プレートリーダーウィンドウ上で示された代表的なプレートの動態。（Ｃ）ｍＯＲ−Ｉ７活性化は、ＦＤＳＳ（Hamamatsu Photonics K.K., Japan）上でｆｌｕｏ４を蛍光色素として使用して、カルシウム流により追跡した。２つの独立したスクリーニングの結果を示す。これらは、１００μM  ＡＴＰ注入後の細胞応答パーセントで表される。星印で示すバーは、２つの独立したスクリーニングから得られた一致した応答を表す。灰色のバーの意味は、明細書を参照されたい。（Ｄ）ｍＯＲ−Ｉ７活性化は、免疫検出アッセイ（TROPIX, Applied Biosystem）を用いた細胞内ｃＡＭＰ濃度の測定により追跡した。２つの独立したスクリーニングの結果を示す。これらは、１００μMホルスコリンとのインキュベーション後の細胞応答パーセントとして表される。黒丸印で示すバーは、２つの独立したスクリーニングから得られた一致した応答を表す。灰色のバーの意味は、明細書を参照されたい。（Ｅ）異なるスクリーニング中に得られた異なるヒットの模式図、（ａ）シトロネラル、（ｂ）１−オクタナール、（ｃ）１−オクタノール、（ｄ）２，３ヘプタンジオン、（ｅ）１−ヘプタナール、（ｆ）１−ヘプタノール、（ｇ）オルファクトフォア。
【図１】
2008529540.tif 000059
【図２】
2008529540.tif 000060
【図３】
2008529540.tif 000061
【図４】
2008529540.tif 000062
【図５−１】
2008529540.tif 000063
【図５−２】
2008529540.tif 000064
【図６】
2008529540.tif 000065
【図７】
2008529540.tif 000066
【配列表】
2008529540000001.app
【国際調査報告】
2008529540.tif 000067
2008529540.tif 000068
2008529540.tif 000069