(57)【要約】  機能的なヒト塩味受容体、およびヒトの塩味覚の刺激をシミュレートする細胞系アッセイが開示される。また、塩味覚の増強物質または修飾物質を同定する方法、およびこれらの物質を含有する食品が開示される。塩濃度が著しく低下した、所望の風味特性を有する食品を製造する方法が開示される。このような食品は、多くの状況において顕著な健康上の効用を発揮し、それによって大きな健康上の利益をもたらすことができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えＤＮＡ分子を含有する細胞における機能的ナトリウムイオンチャネルであって、
組換えＤＮＡ分子が、ｈＣＡＰ１、ｈＣＡＰ３、ＥＮａＣ−α、ＥＮａＣ−β、ＥＮａＣ−γおよびＥＮａＣ−δからなる遺伝子の群より選択される遺伝子を有する機能的ナトリウムイオンチャネル。
【請求項２】
組換えＤＮＡ分子がさらに、ｈＣＡＰ１、ｈＣＡＰ３、ＥＮａＣ−α、ＥＮａＣ−β、ＥＮａＣ−γおよびＥＮａＣ−δからなる遺伝子の群より選択される少なくとも２つの遺伝子を有する、請求項１に記載の機能的ナトリウムイオンチャネル。
【請求項３】
組換えＤＮＡ分子がさらに、ｈＣＡＰ１、ｈＣＡＰ３、ＥＮａＣ−α、ＥＮａＣ−β、ＥＮａＣ−γおよびＥＮａＣ−δからなる遺伝子の群より選択される少なくとも３つの遺伝子を有する、請求項１に記載の機能的ナトリウムイオンチャネル。
【請求項４】
組換えＤＮＡ分子がさらに、ｈＣＡＰ１、ｈＣＡＰ３、ＥＮａＣ−α、ＥＮａＣ−β、ＥＮａＣ−γおよびＥＮａＣ−δからなる遺伝子の群より選択される少なくとも４つの遺伝子を有する、請求項１に記載の機能的ナトリウムイオンチャネル。
【請求項５】
組換えＤＮＡ分子がさらに、ｈＣＡＰ１、ｈＣＡＰ３、ＥＮａＣ−α、ＥＮａＣ−β、ＥＮａＣ−γおよびＥＮａＣ−δからなる遺伝子の群より選択される少なくとも５つの遺伝子を有する、請求項１に記載の機能的ナトリウムイオンチャネル。
【請求項６】
組換えＤＮＡ分子が、ｈＣＡＰ１、ｈＣＡＰ３、ＥＮａＣ−α、ＥＮａＣ−β、ＥＮａＣ−γおよびＥＮａＣ−δを有する、請求項１に記載の機能的ナトリウムイオンチャネル。
【請求項７】
ｈＣＡＰ１、ｈＣＡＰ３、ＥＮａＣ−α、ＥＮａＣ−β、ＥＮａＣ−γおよびＥＮａＣ−δからなる遺伝子の群より選択される少なくとも２つの遺伝子を有する組換えＤＮＡ分子を含有する細胞。
【請求項８】
真核細胞である、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
ヒトの塩味覚の刺激をシミュレートするアッセイであって、
ｈＣＡＰ３を発現し、機能的ナトリウムイオンチャネルを生成する細胞を、化合物と共にインキュベートするステップと、
前記細胞のイオンフラックスを測定するステップと、
を含むアッセイ。
【請求項１０】
ｈＣＡＰ１および／またはｈＣＡＰ３を発現する前記細胞がさらに、発現されるｈＣＡＰ１および／またはｈＣＡＰ３を有する機能的ナトリウムイオンチャネルを含有する、請求項９に記載のアッセイ。
【請求項１１】
ｈＣＡＰ１またはｈＣＡＰ３が組換えＤＮＡ分子上で発現される、請求項９に記載のアッセイ。
【請求項１２】
前記細胞をプロテアーゼで処理し、当該塩味覚アッセイにおいて使用する、請求項９に記載のアッセイ。
【請求項１３】
塩味覚の修飾物質を同定する方法であって、
組換えＤＮＡ分子由来のｈＣＡＰ１またはｈＣＡＰ３を発現し、機能的ナトリウムイオンチャネルを生成する細胞を得るステップと、
前記細胞を化合物と共にインキュベートするステップと、
前記細胞のナトリウムイオンフラックスを測定するステップと、
を含む方法。
【請求項１４】
食品を調製する方法であって、
組換えＤＮＡ分子由来のｈＣＡＰ１またはｈＣＡＰ３を発現し、機能的ナトリウムイオンチャネルを生成する細胞を得るステップと、
前記細胞を、摂取可能な化合物と共にインキュベートして、当該化合物が前記細胞のナトリウムイオンフラックスを変化させるかどうかを判定するステップと、
前記化合物を食品に添加するステップと、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
[0001]  塩味覚は、部分的に上皮性ナトリウムチャネル（ＥＮａＣ）によって媒介されると考えられている。古典的なＥＮａＣナトリウムチャネルモデル系は腎細胞に由来し、３つのタンパク質サブユニット、ＥＮａＣ−α、ＥＮａＣ−βおよびＥＮａＣ−γからなる。腎臓の機能的なＥＮａＣイオンチャネルは、α２βγヘテロ四量体として存在すると考えられている。第四のタンパク質サブユニットであるＥＮａＣ−δが同定されているが、その機能は依然として知られていない。
【０００２】
[0002]  マウス腎臓に由来するＥＮａＣの感度は、幾つかのチャネル活性化プロテアーゼ（ｍＣＡＰ１、ｍＣＡＰ２およびｍＣＡＰ３）によって増強される。これらのプロテアーゼは、ＥＮａＣと同じ組織（例えば、腎臓、肺、結腸、小腸および胃の組織）で発現され、チャネルが開状態のコンホメーションを取る時間を増加させることによって、イオンチャネルを活性化させると考えられている。
【０００３】
[0003]  腎臓のＥＮａＣは、利尿薬のアミロライド（Ｎ−アミジノ−３，５−ジアミノ−６−クロロピラジンカルボキサミド）によって阻害される。ＥＮａＣが塩味覚に関与する主要なイオンチャネルであるとすれば、アミロライドは塩味覚を阻害すると予想されるが、実際、アミロライドの影響はげっ歯動物において著明に観察される。しかしながら、この影響は、ヒトでは一部にしか認められず、異なる受容体または異なる受容体構造の存在が示唆される。
【０００４】
[0004]  したがって、ヒトの塩味覚に関与するナトリウムチャネルを同定および調製する必要性が、当技術分野において依然として存在する。そのような系を使用すれば、塩味の知覚を増強または阻害する化合物を同定することができるであろう。
【発明の概要】
【０００５】
[0005]  本発明は、ヒトの機能的な塩味受容体、およびヒトの塩味覚の刺激をシミュレートする細胞系アッセイを提供する。本発明はさらに、塩味覚の増強物質または修飾物質の同定、およびそれらを含有する食品を提供する。本発明はまた、所望の風味特性を保持する食品の製造を提供するが、当該食品は、塩濃度が著しく低下したものである。このような食品は、多くの状況において顕著な健康上の効用を発揮することができる。
【０００６】
[0006]  一実施形態において、本発明は、ヒトの塩味覚の刺激をシミュレートするアッセイを含む。細胞のナトリウムイオンフラックスを検出する方法は知られているが、これらを利用して、種々の未知化合物の存在下のナトリウムフラックスを測定して、これらの化合物のいずれが塩味の知覚に影響するかを確認することができる。
【０００７】
[0007]  一実施形態において、本発明は、ヒトの塩味覚の刺激をシミュレートするアッセイであって、機能的ナトリウムイオンチャネルを発現する細胞を利用するアッセイを提供する。
【０００８】
[0008]  一実施形態において、本発明は、ヒトの塩味覚の刺激をシミュレートするアッセイであって、組換えＤＮＡ分子由来の機能的ナトリウムイオンチャネルを発現する細胞を利用するアッセイを提供する。
【０００９】
[0009]  本発明はまた、細胞を化合物と共にインキュベートし、細胞のナトリウムイオンチャネルを介したナトリウムイオンフラックスを測定して、塩味覚の修飾物質を同定する方法を提供する。
【００１０】
[0010]  本発明はさらに、上述の塩味覚の修飾物質を同定すること、これらの修飾物質のうち、細胞のナトリウムイオンチャネルを介したナトリウムイオンフラックスを増大させるものを同定すること、および当該化合物を食品に添加することによって、食品を調製する方法を提供する。
【００１１】
[0011]  一実施形態において、本発明は、ＥＮａＣ−α、ＥＮａＣ−β、ＥＮａＣ−γまたはＥＮａＣ−δの遺伝子を有し、さらに、ｈＣＡＰ１またはｈＣＡＰ３の遺伝子を有する組換えＤＮＡ分子を提供する。
【００１２】
[0012]  本発明の他の特徴および利点は、以下の発明の詳細な説明に記載されているか、あるいはそれから明らかである。
【発明の詳細な説明】
【００１３】
[0015]  本発明は、ヒト味覚細胞ライブラリーにおける、ｍＣＡＰ１およびｍＣＡＰ３のヒト相当物が発見され、これらのプロテアーゼの発現が、ＥＮａＣにより媒介されるヒトの塩味の知覚に関与することが示されたことに基づくものである。これらのプロテアーゼをＥＮａＣサブユニットと共発現させることにより、受容体複合体の生理的に修正された成熟およびプロセシングが可能となり、細胞系アッセイにおけるＥＮａＣの修正された機能が得られる。
【００１４】
[0016]  Ｖｕａｇｎｉａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．に記載された（Ｖｕａｇｎｉａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．の図１Ｂ参照）、ｍＣＡＰ１、ｍＣＡＰ２およびｍＣＡＰ３のヒト相当物のｃＤＮＡの配列は、配列データベースから得た。配列を以下に記載する。
【００１５】
[0017]  配列は以下の通りである。
・マウスＣＡＰ１のヒト相当物は、ＰＲＯＳＴＡＳＩＮまたはホモサピエンスプロテアーゼ、セリン８（ＰＲＳＳ８）と呼ばれている（アクセッション番号：ＮＭ＿００２７７３）。
・マウスＣＡＰ２のヒト相当物は、ＴＭＰＲＳＳ４、ＴＭＰＲＳＳ３またはＭＴＳＰ２と呼ばれ、２つの転写変異体が存在する（変異体１のアクセッション番号：ＮＭ＿０１９８９４、変異体２のアクセッション番号：ＮＭ＿１８３２４７）。変異体２は、変異体１と比較して、５’コード領域中のインフレームの選択的スプライス部位を使用し、３’コード領域中のエクソンを欠いている。生成するタンパク質（アイソフォーム２）は、アイソフォーム１と比較して、短く、また、Ｎ末端およびＣ末端が異なる。
・マウスＣＡＰ３のヒト相当物は、ＭＴ−ＳＰ１、ＨＡＩ、ＭＴＳＰ１、ＳＮＣ１９、ＭＴＳＰ１、ＴＡＤＧ−１５またはＰＲＳＳ１４と呼ばれている（アクセッション番号：ＮＭ＿０２１９７８）。
【００１６】
[0018]  本出願のために、ｍＣＡＰ１〜３のヒト相当物を、それぞれｈＣＡＰ１〜３と呼ぶ。
【００１７】
[0019]  ３’非翻訳領域の最末端に対応する領域にアニールするオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマー対を、当該プライマー対が、ｃＤＮＡからのみならず、ゲノムＤＮＡからも産物を増幅させることができるように設計した。オリゴヌクレオチドプライマー対を、下記表１に示す。
【００１８】
【表１】
2008529987.tif 000002
【００１９】
[0020]  鋳型としてヒトゲノムＤＮＡを用いて、標準的な方法によってＰＣＲ条件を最適化した。鋳型としてゲノムＤＮＡを用いると、ｈＣＡＰ１〜３用のプライマー対はいずれも、予想どおりの大きさの産物を増幅させた。
【００２０】
[0021]  ヒト味覚細胞ライブラリーは、Ｉｌｅｇｅｍｓ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．（提出済）に記載されている。ライブラリー内に含まれる最大断片を増幅させるために、最適化された条件下で、３’遺伝子特異的プライマーをＴ７またはＳＰ６ベクタープライマーと共に用いて、ヒト味覚細胞のｃＤＮＡライブラリーをプローブした。味覚細胞ライブラリーを用いたＰＣＲ反応の産物は、アガロースゲル電気泳動によって分離した。
【００２１】
[0022]  ヒト味覚細胞のｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲ増幅は、ヒトＣＡＰプロテアーゼについて行った。ｈＣＡＰ１およびｈＣＡＰ３について、予想どおりの大きさの産物が得られた。これらのＰＣＲ産物をゲルから抽出し、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙにクローニングし、塩基配列を決定した。得られた配列は、対応するｈＣＡＰのｃＤＮＡの配列と一致し、ｈＣＡＰ１およびｈＣＡＰ３がヒト味覚細胞中で発現されることが示された。チャネル活性化プロテアーゼの活性を用いると、新規なＥＮａＣ構造を同定・作製することができるだけでなく、修正された機能を有する塩味受容体を作製することができる。
【００２２】
[0023]  以上より、ｈＣＡＰ１およびｈＣＡＰ３、および／またはＥＮａＣ−α、ＥＮａＣ−β、ＥＮａＣ−γおよびＥＮａＣ−δ、を有する組換えＤＮＡ発現カセットを、標準的な方法を用いて作製することができ、また、標準的な方法によって、真核細胞を含む種々の細胞中で発現させることができる。ヒトＥＮａＣナトリウムチャネルおよびＣＡＰプロテアーゼを発現する新規な細胞を、塩味の知覚に関する既知の細胞アッセイにおいて使用することができる。真核細胞を用いる異種発現系は、ＥＮａＣおよびＣＡＰプロテアーゼを発現するように設計する。プロテアーゼにより、ＥＮａＣは味覚関連構造に確実に加工される。あるいは、この加工は、正常なＥＮａＣ発現細胞を外部からプロテアーゼで処理することによって行うことができる。準備が整えば、ナトリウム流入ポテンシャル（塩味覚増強ポテンシャルに相当）に関する被験化合物の存在下で、既知の方法によって、細胞を用いてナトリウム流入を測定する。このアッセイは、塩味覚を増強または阻害する化合物の同定をもたらす。このような化合物を食品に含有させて、広範な塩濃度で、適切な風味を維持することができる。
【００２３】
[0024]  本明細書に記載した本発明の好適な実施形態に対する様々な改変および修飾が当業者に明らかであることは理解されるはずである。そのような改変および修飾は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、また、意図された本発明の有利性を減縮させることなく行うことができる。したがって、そのような改変および修飾は、添付の特許請求の範囲によって保護されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＥＮａＣに作用して、その開状態のコンホメーションを増大させることによって、ナトリウムフラックスの向上をもたらすＣＡＰの概略図である。Ｈ、ＤおよびＳは、プロテアーゼ活性部位中のアミノ酸を表す。
【図２】ｈＣＡＰ１〜３（配列番号１〜６）およびベクター対照プライマーを用いた、ヒトの非味覚組織のｃＤＮＡライブラリー（ＮＴ）および味覚細胞のｃＤＮＡライブラリー（Ｔ）のＰＣＲ増幅産物の１．２％アガロースゲルを示す図である。レーン２〜７は、ＰＣＲ反応用の鋳型として、左から右に、水、非味覚組織ライブラリーのＤＮＡ、および味覚細胞ライブラリーのＤＮＡを有する。レーン１：左、１μｇ１００ｂｐのラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、右、μｇ１Ｋｂのラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；レーン２：ｈＣＡＰ１（配列番号３）およびＴ７ベクタープライマー；レーン３：ｈＣＡＰ２（配列番号３）およびＴ７ベクタープライマー；レーン４：ｈＣＡＰ３（配列番号５）およびＴ７ベクタープライマー；レーン５：ｈＣＡＰ１（配列番号２）およびＳＰ６ベクタープライマー；レーン６：ｈＣＡＰ２（配列番号４）およびＳＰ６ベクタープライマー；レーン７：プライマーｈＣＡＰ３（配列番号６）およびＳＰ６ベクタープライマー。
【配列表】
2008529987000001.app
【国際調査報告】
2008529987.tif 000003
2008529987.tif 000004
2008529987.tif 000005