(57)【要約】本発明は、１つ以上のＤＮＡ配列決定技術に有用であるヌクレオチドアナログを提供する。１つの態様によれば、本発明は、ヌクレオチドアナログが、成長する核酸鎖、例えば、ＤＮＡ鎖に取り込まれた後に、ヌクレオチドアナログを検出することによって核酸の配列を決定するための方法を提供する。キットであって、（ａ）本発明の式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの個別のヌクレオチドアナログ；および（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｃ）反応緩衝液、（ｄ）天然２’デオキシヌクレオシド三リン酸および必要であれば、（ｅ）切断試薬を備える、キットもまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物：
【化１】
2008526877.tif 000029
であって、ここで：
Ｒ１は、ＯＨ、適切に保護されたヒドロキシル基または水素であり；
Ｒ２は、適切なヒドロキシル保護基、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＮＨ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり；
Ｒ３は、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり、ここでＲ３は、必要に応じてＬ−Ｒ４で置換されており；
Ｒ５は、水素またはチオール保護基であり、そして必要に応じてＬ−Ｒ４で置換されており；
各Ｌは、独立して切断可能なリンカー基であり；そして
各Ｒ４は、独立して検出可能な部分である；
但し：
（ａ）Ｒ１が−ＯＴＢＳであるとき、Ｒ５は、−Ｓ−ピリジン−２−イル以外であり；
（ｂ）Ｒ２がＴＢＤＰＳｉであるとき、Ｒ５は、水素以外であり；そして
（ｃ）Ｒ３またはＲ５のうちの少なくとも１つがＬ−Ｒ４で置換されている、
化合物。
【請求項２】
Ｒ３が、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンまたは２−アミノプリンから選択される核酸塩基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ５が、ジスルフィド、チオエーテル、シリルチオエーテル、チオエステル、チオカーボネートまたはチオカルバメートから選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ５が、−Ｓ−ピリジン−２−イルである、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ２が、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ１が、ＯＨまたは水素である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
前記化合物が、式Ｉａの化合物：
【化２】
2008526877.tif 000030
である、請求項１に記載の化合物であって、ここで：
Ｒ１は、ＯＨ、適切に保護されたヒドロキシル基または水素であり；
Ｒ２は、適切なヒドロキシル保護基、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＮＨ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり；
Ｒ３は、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり；
Ｌは、独立して切断可能なリンカー基であり；そして
Ｒ４は、検出可能な部分である、
化合物。
【請求項８】
前記化合物が、式Ｉｂの化合物：
【化３】
2008526877.tif 000031
である、請求項１に記載の化合物であって、ここで：
Ｒ１は、ＯＨ、適切に保護されたヒドロキシル基または水素であり；
Ｒ２は、適切なヒドロキシル保護基、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＮＨ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり；
Ｒ３は、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり；
Ｔは、酸素、硫黄、ＮＨまたは必要に応じて置換されているフェニルであり；
Ｌは、独立して切断可能なリンカー基であり；そして
Ｒ４は、検出可能な部分である、
化合物。
【請求項９】
前記化合物が、式Ｉｃの化合物：
【化４】
2008526877.tif 000032
である、請求項１に記載の化合物であって、ここで：
Ｗは、Ｏ（Ｃ１〜４脂肪族）またはＳ（Ｃ１〜４脂肪族）であり；
Ｗ’は、Ｃ１〜４脂肪族であり；
Ｒ１は、ＯＨ、適切に保護されたヒドロキシル基または水素であり；
Ｒ２は、適切なヒドロキシル保護基、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＮＨ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり；
Ｒ３は、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり；
Ｌは、切断可能なリンカー基であり；そして
Ｒ４は、検出可能な部分である、
化合物。
【請求項１０】
前記化合物が、式Ｉｄの化合物：
【化５】
2008526877.tif 000033
である、請求項１に記載の化合物であって、ここで：
Ｒ１は、ＯＨ、適切に保護されたヒドロキシル基または水素であり；
Ｒ２は、適切なヒドロキシル保護基、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＮＨ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり；
Ｒ３は、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり、ここでＲ３は、必要に応じてＬ−Ｒ４で置換されており；
各Ｌは、独立して切断可能なリンカー基であり；そして
各Ｒ４は、独立して検出可能な部分である、
化合物。
【請求項１１】
式ＩＩの化合物：
【化６】
2008526877.tif 000034
であって、ここで：
Ｒ１ａは、水素またはチオール保護基であり、そして必要に応じてＬａ−Ｒ４ａで置換されており；
Ｒ２ａは、適切なヒドロキシル保護基、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＮＨ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり；
Ｒ３ａは、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり、ここでＲ３ａは、必要に応じてＬａ−Ｒ４ａで置換されており；
Ｒ５ａは、水素または適切なヒドロキシル保護基であり；
各Ｌａは、独立して切断可能なリンカー基であり；そして
各Ｒ４ａは、独立して検出可能な部分である；
但し：
（ａ）Ｒ３ａまたはＲ１ａのうちの少なくとも１つは、Ｌａ−Ｒ４ａで置換されており；そして
（ｂ）Ｒ５ａがアセチルまたはベンジルのいずれかであるとき、Ｒ１ａは、トリチル以外であり；そして該化合物が
【化７】
2008526877.tif 000035
以外である、
化合物。
【請求項１２】
Ｒ３ａが、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンまたは２−アミノプリンから選択される核酸塩基である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ１ａが、ジスルフィド、チオエーテル、シリルチオエーテル、チオエステル、チオカーボネートまたはチオカルバメートから選択される、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ５が、−Ｓ−ピリジン−２−イルである、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ２が、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒ５ａが、水素である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１７】
前記化合物が、式ＩＩａの化合物：
【化８】
2008526877.tif 000036
である、請求項１１に記載の化合物であって、ここで：
Ｒ２ａは、適切なヒドロキシル保護基、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＮＨ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり；
Ｒ３ａは、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり、ここでＲ３ａは、必要に応じてＬａ−Ｒ４ａで置換されており；
Ｒ５ａは、水素または適切なヒドロキシル保護基であり；
Ｌａは、切断可能なリンカー基であり；そして
Ｒ４ａは、検出可能な部分である、
化合物。
【請求項１８】
前記化合物が、式ＩＩｂの化合物：
【化９】
2008526877.tif 000037
である、請求項１１に記載の化合物であって、ここで：
Ｒ２ａは、適切なヒドロキシル保護基、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＮＨ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり；
Ｒ３ａは、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり、ここでＲ３ａは、必要に応じてＬａ−Ｒ４ａで置換されており；
Ｒ５ａは、水素または適切なヒドロキシル保護基であり；
Ｔａは、酸素、硫黄、ＮＨまたは必要に応じて置換されているフェニルであり；
各Ｌａは、独立して切断可能なリンカー基であり；そして
各Ｒ４ａは、独立して検出可能な部分である、
化合物。
【請求項１９】
前記化合物が、式ＩＩｃの化合物：
【化１０】
2008526877.tif 000038
である、請求項１１に記載の化合物であって、ここで：
Ｗａは、Ｏ（Ｃ１−４脂肪族）またはＳ（Ｃ１−４脂肪族）であり；
Ｗｂは、Ｃ１−４脂肪族であり；
Ｒ２ａは、適切なヒドロキシル保護基、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＮＨ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり；
Ｒ３ａは、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり、ここでＲ３ａは、必要に応じてＬａ−Ｒ４ａで置換されており；
Ｒ５ａは、水素または適切なヒドロキシル保護基であり；
各Ｌａは、独立して切断可能なリンカー基であり；そして
各Ｒ４ａは、独立して検出可能な部分である、
化合物。
【請求項２０】
前記化合物が、式ＩＩｄの化合物：
【化１１】
2008526877.tif 000039
である、請求項１１に記載の化合物であって、ここで：
Ｒ２ａは、適切なヒドロキシル保護基、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＮＨ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり；
Ｒ３ａは、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり、ここでＲ３ａは、Ｌａ−Ｒ４ａで置換されており；
Ｒ５ａは、水素または適切なヒドロキシル保護基であり；
Ｌａは、切断可能なリンカー基であり；そして
Ｒ４ａは、検出可能な部分である、
化合物。
【請求項２１】
式ＩＩＩの化合物：
【化１２】
2008526877.tif 000040
であって、ここで：
Ｒ１ｂは、ＯＨ、適切に保護されたヒドロキシル基または水素であり；
Ｑは、酸素または硫黄であり；
Ｒ６は、適切なヒドロキシル保護基または適切なチオール保護基であり、そして必要に応じてＬｂ−Ｒ４ｂで置換されており；
Ｒ３ｂは、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり、ここでＲ３ｂは、必要に応じてＬｂ−Ｒ４ｂで置換されており；
Ｒ５ｂは、水素または適切なヒドロキシル保護基であり；
各Ｌｂは、独立して切断可能なリンカー基であり；そして
各Ｒ４ｂは、独立して検出可能な部分である；
但し：
（ａ）Ｒ５ｂがＴＢＳであるとき、Ｒ６はアリル以外であり；
（ｂ）Ｑが硫黄であるとき、Ｒ６はｐ−ニトロベンジル以外であり；そして
（ｃ）Ｒ３ｂまたはＲ６のうちの少なくとも１つは、Ｌｂ−Ｒ４ｂで置換されている、
化合物。
【請求項２２】
Ｑが、酸素である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒ６が、エステル、アリルエーテル、エーテル、シリルエーテル、アルキルエーテル、アリールアルキルエーテルまたはアルコキシアルキルエーテルから選択される適切なヒドロキシル保護基である、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒ６が、Ｌｂ−Ｒ４ｂで置換されている、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｑが、硫黄である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２６】
Ｒ６が、ジスルフィド、チオエーテル、シリルチオエーテル、チオエステル、チオカーボネートまたはチオカルバメートから選択される適切なチオール保護基である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項２７】
Ｒ１ｂが、水素またはＯＨである、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２８】
Ｒ５ｂが、水素である、請求項２７に記載の化合物。
【請求項２９】
前記化合物が、式ＩＩＩａの化合物：
【化１３】
2008526877.tif 000041
である、請求項２１に記載の化合物であって、ここで：
Ｒ１ｂは、ＯＨ、適切に保護されたヒドロキシル基または水素であり；
Ｒ３ｂは、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり、ここでＲ３ｂは、必要に応じてＬｂ−Ｒ４ｂで置換されており；
Ｒ５ｂは、水素または適切なヒドロキシル保護基であり；
各Ｌｂは、独立して切断可能なリンカー基であり；そして
各Ｒ４ｂは、独立して検出可能な部分である、
化合物。
【請求項３０】
前記化合物が、式ＩＩＩｂの化合物：
【化１４】
2008526877.tif 000042
である、請求項２１に記載の化合物であって、ここで：
Ｒ１ｂは、ＯＨ、適切に保護されたヒドロキシル基または水素であり；
Ｒ３ｂは、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり、ここでＲ３ｂは、必要に応じてＬｂ−Ｒ４ｂで置換されており；
Ｒ５ｂは、水素または適切なヒドロキシル保護基であり；
各Ｌｂは、独立して切断可能なリンカー基であり；そして
各Ｒ４ｂは、独立して検出可能な部分である、
化合物。
【請求項３１】
前記化合物が、式ＩＩＩｃまたはＩＩＩｃ’の化合物：
【化１５】
2008526877.tif 000043
である、請求項２１に記載の化合物であって、ここで：
各Ｒ１ｂは、独立してＯＨ、適切に保護されたヒドロキシル基または水素であり；
各Ｒ３ｂは、独立して核酸塩基または核酸塩基模倣物であり、ここで各Ｒ３ｂは、必要に応じてＬｂ−Ｒ４ｂで置換されており；
各Ｔｂは、独立してＯ、Ｓ、ＮＨまたは必要に応じて置換されているフェニルであり；
各Ｒ５ｂは、独立して水素または適切なヒドロキシル保護基であり；
各Ｌｂは、独立して切断可能なリンカー基であり；そして
各Ｒ４ｂは、独立して検出可能な部分である、
化合物。
【請求項３２】
式ＩＶの化合物：
【化１６】
2008526877.tif 000044
であって、ここで：
Ｒ１ｃは、ＯＨ、ＳＨ、適切に保護されたヒドロキシル基、適切に保護されたチオール基または水素であり；
Ｑは、酸素または硫黄であり；
Ｕは、普遍的なヌクレオシドアナログであり；
Ｒ２ｃは、適切なヒドロキシル保護基、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＮＨ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり；
Ｒ３ｃは、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり、ここでＲ３ｃは、必要に応じてＬｃ−Ｒ４ｃで置換されており；
各Ｌｃは、独立して切断可能なリンカー基であり；
Ｌｃ’は、切断不可能なリンカー基であり；そして
各Ｒ４ｃは、独立して検出可能な部分である、
化合物。
【請求項３３】
標的一本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）式Ｉの化合物：
【化１７】
2008526877.tif 000045
ここで：
Ｒ１は、ＯＨ、適切に保護されたヒドロキシル基または水素であり；
Ｒ２は、適切なヒドロキシル保護基、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＮＨ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり；
Ｒ３は、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり、ここでＲ３は、必要に応じてＬ−Ｒ４で置換されており；
Ｒ５は、水素またはチオール保護基であり、そして必要に応じてＬ−Ｒ４で置換されており；
各Ｌは、独立して切断可能なリンカー基であり；そして
各Ｒ４は、独立して検出可能な部分である；
但し、Ｒ３またはＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｌ−Ｒ４で置換されている；
式ＩＩの化合物：
【化１８】
2008526877.tif 000046
ここで：
Ｒ１ａは、水素またはチオール保護基であり、そして必要に応じてＬａ−Ｒ４ａで置換されており；
Ｒ２ａは、適切なヒドロキシル保護基、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＮＨ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり；
Ｒ３ａは、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり、ここでＲ３ａは、必要に応じてＬａ−Ｒ４ａで置換されており；
Ｒ５ａは、水素または適切なヒドロキシル保護基であり；
各Ｌａは、独立して切断可能なリンカー基であり；そして
各Ｒ４ａは、独立して検出可能な部分である；
但し、Ｒ３ａまたはＲ１ａのうちの少なくとも１つは、Ｌａ−Ｒ４ａで置換されている；
式ＩＩＩの化合物：
【化１９】
2008526877.tif 000047
ここで：
Ｒ１ｂは、ＯＨ、適切に保護されたヒドロキシル基または水素であり；
Ｑは、酸素または硫黄であり；
Ｒ６は、適切なヒドロキシル保護基または適切なチオール保護基であり、そして必要に応じてＬｂ−Ｒ４ｂで置換されており；
Ｒ３ｂは、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり、ここでＲ３ｂは、必要に応じてＬｂ−Ｒ４ｂで置換されており；
Ｒ５ｂは、水素または適切なヒドロキシル保護基であり；
各Ｌｂは、独立して切断可能なリンカー基であり；そして
各Ｒ４ｂは、独立して検出可能な部分である；
但し、Ｒ３ｂまたはＲ６のうちの少なくとも１つは、Ｌｂ−Ｒ４ｂで置換されている；
または式ＩＶの化合物：
【化２０】
2008526877.tif 000048
ここで：
Ｒ１ｃは、ＯＨ、ＳＨ、適切に保護されたヒドロキシル基、適切に保護されたチオール基または水素であり；
Ｑは、酸素または硫黄であり；
Ｕは、普遍的なヌクレオシドアナログであり；
Ｒ２ｃは、適切なヒドロキシル保護基、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＮＨ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり；
Ｒ３ｃは、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり、ここでＲ３ｃは、必要に応じてＬｃ−Ｒ４ｃで置換されており；
各Ｌｃは、独立して切断可能なリンカー基であり；
Ｌｃ’は、切断不可能なリンカー基であり；そして
各Ｒ４ｃは、独立して検出可能な部分である；
のうちの少なくとも１つを提供する工程であって、ここで該ヌクレオチドの検出可能な標識は、検出により、他のヌクレオチドについて使用される検出可能な標識と識別され得る、工程：
（ｂ）工程（ａ）のヌクレオチドを標的一本鎖ポリヌクレオチドの相補体に取り込む工程；
（ｃ）（ｂ）のヌクレオチドの標識を検出することによって取り込まれたヌクレオチドのタイプを決定する工程；
（ｄ）（ｂ）のヌクレオチドの標識を除去する工程；および
（ｅ）必要に応じて工程（ｂ）〜（ｄ）を１回以上繰り返すことによって、標的一本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定する工程；
を含む、方法。
【請求項３４】
キットであって、
（ａ）式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの個別のヌクレオチドアナログ；および
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、
（ｃ）反応緩衝液、
（ｄ）天然２’デオキシヌクレオシド三リン酸および必要であれば、
（ｅ）切断試薬
を備える、キット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
核酸の配列を決定するための様々な方法が知られており、それらの中でも、ジデオキシ配列決定法、化学分解法および合成による配列決定（すなわち、ミニ配列決定法の複数回反復）が挙げられる。これらの方法のいくつかは、自動化によく適している。このような自動化された配列分析装置は、代表的には形成された生成物の蛍光検出を利用するチェーンターミネーション法に基づく。これらのチェーンターミネーション法は、鋳型にアニールするプライマーの３’ヒドロキシル末端に特異的なヌクレオチドを付加する酵素の能力に基づく。これらの系に、デオキシヌクレオチドおよびジデオキシヌクレオチドが添加され、その中でプライマーが色素標識される。あるいは、加えられるジデオキシヌクレオチドが色素標識される。さらに、色素標識されたデオキシヌクレオチドは、標識されていないジデオキシヌクレオチドと結合体化されて使用され得る。各々の場合において、核酸の塩基対形成の特性は、ヌクレオチド付加の特異性を決定する。生じた色素標識された産物は、次いでポリアクリルアミドゲルで電気泳動により分離され、使用した標識に適した方法によって検出される。
【０００２】
化学分解法とジデオキシチェーンターミネーション法との両方が世界的に使用されているが、関連する多くの不都合点が存在する。例えば、これらの方法は、ゲル電気泳動分離が必要である。さらに、単一のクローンからたった４００〜８００塩基対しか配列決定できないことが典型である。結果として、これらのシステムは、多くの時間と労働力の両方を要し、配列決定の処理量を増大させる試みとして、ゲル分離を必要としない方法が開発されている。
【０００３】
ハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）法は、非特許文献１；非特許文献２、非特許文献３および特許文献１によって提案されている。このタイプのシステムは、核酸配列を決定するために短いオリゴヌクレオチドを使用して、目的のポリヌクレオチドの複数のハイブリダイゼーションから得られる情報を利用する。複数のハイブリダイゼーション反応を同時に実施するため、これらの方法は、配列決定の処理量を増大させる可能性がある。しかしながら、配列を再構築するためには、複数のハイブリダイゼーションから得られるすべてのフラグメントの最も可能性の高い順序を決定するために大規模なコンピュータ検索アルゴリズムが必要となる。
【０００４】
ＳＢＨ方法は、いくつかの点において問題がある。例えば、ハイブリダイゼーションは、目的のオリゴヌクレオチドとポリヌクレオチドとの二重鎖の配列組成物に依存し、ＧＣリッチ領域はＡＴリッチ領域よりも安定である。結果として、ハイブリダイゼーション検出における偽陽性および偽陰性が頻繁に起こり、配列決定を複雑にする。さらに、ポリヌクレオチドの配列は、直接決定されないが、既知のプローブの配列から推測され、このため誤りが生じる可能性が増加する。
【０００５】
可逆的にブロックされたヌクレオチドを使用する代替の配列決定法が、合成による配列決定（ＳＢＳ）として知られている。ＳＢＳは、ヌクレオチドを取り込んで、１回に１塩基の配列を検出することによってＤＮＡ配列を決定する。ＳＢＳを使用して長い核酸を効率的に配列決定するためには、単一のヌクレオチドの取り込みを複数回反復することができることは、利点である。従って、ＳＢＳに基づく方法は、代表的には、成長する核酸の鎖の伸長を妨げる方法を使用する。例えば、さらなるヌクレオチドの取り込みを立体的に妨害する基の使用ならびにプライマーと標的ＤＮＡとの相互作用を妨げない条件下で除去することができる３’−ＯＨ保護基が使用される。同様に、１つ以上のＤＮＡ配列決定技術に有用なヌクレオチドアナログが未だ必要とされている。
【特許文献１】米国特許第５，２０２，２３１号明細書
【非特許文献１】Ｃｒｋｖｅｎｊａｋｏｖ，Ｄｒｍａｎａｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：１１４（１９８９）
【非特許文献２】Ｓｔｒｅｚｏｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１００８９（１９９１）
【非特許文献３】Ｂａｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｂａｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌ．１３５：３０３（１９８８）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の特定の実施形態の詳細な説明）
（１．発明の全体的な説明）
本発明は、核酸の配列を決定するための方法に有用なヌクレオチドアナログを提供する。当業者は、本化合物が、種々の配列決定方法において有用であることを理解するであろう。このような方法は、当業者にすぐに明らかとなり、それらとしては、Ｓａｎｇｅｒ法、化学分解法および合成による配列決定（ＳＢＳ）法などが挙げられる。一定の実施形態において、本化合物は、ＳＢＳ方法において使用される。従って、１つの態様によれば、本発明は、ヌクレオチドアナログが、成長する核酸鎖、例えば、ＤＮＡ鎖に取り込まれた後に、ヌクレオチドアナログを検出することによって核酸の配列を決定するための方法を提供する。
【０００７】
別の実施形態によれば、本発明のヌクレオチドアナログは、まず、成長している核酸鎖、例えば、ＤＮＡ鎖に取り込まれる。ここで前記ヌクレオチドアナログの取り込みは、核酸鎖、例えば、ＤＮＡ鎖の成長を終結させる。次いでこのようにして取り込まれたヌクレオチドアナログは、そのヌクレオチドアナログに存在する特異的な検出可能な部分に適した方法によって検出される。
【０００８】
いくつかの実施形態において、成長している核酸鎖、例えば、ＤＮＡ鎖は、ポリメラーゼに触媒される反応によって合成される。
【０００９】
本発明は、式Ｉの化合物：
【００１０】
【化２１】
2008526877.tif 000002
であって、ここで：
Ｒ１は、ＯＨ、適切に保護されたヒドロキシル基または水素であり；
Ｒ２は、適切なヒドロキシル保護基、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＮＨ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり；
Ｒ３は、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり、ここでＲ３は、必要に応じてＬ−Ｒ４で置換されており；
Ｒ５は、水素またはチオール保護基であり、そしてＬ−Ｒ４で必要に応じて置換されており；
各Ｌは、独立して切断可能なリンカー基であり；そして
各Ｒ４は、独立して検出可能な部分である；
但し：
（ａ）Ｒ１が−ＯＴＢＳであるとき、Ｒ５は、−Ｓ−ピリジン−２−イル以外であり；
（ｂ）Ｒ２がＴＢＤＰＳｉであるとき、Ｒ５は、水素以外であり；そして
（ｃ）Ｒ３またはＲ５のうちの少なくとも１つがＬ−Ｒ４で置換されている、化合物
を提供する。
【００１１】
本発明はまた、式ＩＩの化合物：
【００１２】
【化２２】
2008526877.tif 000003
であって、ここで：
Ｒ１ａは、水素またはチオール保護基であり、そして必要に応じてＬａ−Ｒ４ａで置換されており；
Ｒ２ａは、適切なヒドロキシル保護基、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＮＨ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり；
Ｒ３ａは、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり、ここでＲ３ａは、必要に応じてＬａ−Ｒ４ａで置換されており；
Ｒ５ａは、水素または適切なヒドロキシル保護基であり；
各Ｌａは、独立して切断可能なリンカー基であり；そして
各Ｒ４ａは、独立して検出可能な部分である；
但し：
（ａ）Ｒ３ａまたはＲ１ａのうちの少なくとも１つは、Ｌａ−Ｒ４ａで置換され；そして
（ｂ）Ｒ５ａがアセチルまたはベンジルのいずれかであるとき、Ｒ１ａは、トリチル以外であり；そして前記化合物が
【００１３】
【化２３】
2008526877.tif 000004
以外である、化合物
を提供する。
【００１４】
別の実施形態によれば、本発明は、式ＩＩＩの化合物：
【００１５】
【化２４】
2008526877.tif 000005
であって、ここで：
Ｒ１ｂは、ＯＨ、適切に保護されたヒドロキシル基または水素であり；
Ｑは、酸素または硫黄であり；
Ｒ６は、適切なヒドロキシル保護基または適切なチオール保護基であり、そして必要に応じてＬｂ−Ｒ４ｂで置換されており；
Ｒ３ｂは、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり、ここでＲ３ｂは、必要に応じてＬｂ−Ｒ４ｂで置換されており；
Ｒ５ｂは、水素または適切なヒドロキシル保護基であり；
各Ｌｂは、独立して切断可能なリンカー基であり；そして
各Ｒ４ｂは、独立して検出可能な部分である；
但し：
（ａ）Ｒ５ｂがＴＢＳであるとき、Ｒ６はアリル以外であり；
（ｂ）Ｑが硫黄であるとき、Ｒ６はｐ−ニトロベンジル以外であり；そして
（ｃ）Ｒ３ｂまたはＲ６のうちの少なくとも１つは、Ｌｂ−Ｒ４ｂで置換されている、化合物
を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（２．定義）
本発明の化合物は、上記で概要を説明された化合物を含み、本明細書中に開示される実施形態、実施形態の一部およびその類のものによってさらに説明される。本明細書中で使用されるとき、他に示されない限り以下の定義が適用される。本発明のために、化学元素は、元素周期表、ＣＡＳバージョン、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ、７５ｔｈ  Ｅｄに従って同定される。さらに、有機化学の一般原理は、「Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｔｈｏｍａｓ  Ｓｏｒｒｅｌｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓ，Ｓａｕｓａｌｉｔｏ：１９９９および「Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｅｄ．：Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｂ．  ａｎｄ  Ｍａｒｃｈ，Ｊ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：２００１に記載されている。これらの内容の全体が、本明細書によって参考として援用される。
【００１７】
本明細書中に説明されるように、本発明の化合物は、上記で概要を説明されたものか、または本発明の特定のクラス、サブクラスおよび種によって例示されるような１つ以上の置換基で必要に応じて必要に応じて置換されていてもよい。句「必要に応じて置換されている」は、句「置換されているかまたは置換されていない」と交換可能に使用されることが理解されるであろう。一般に、用語「必要に応じて」に続くかまたは続かない用語「置換されている」は、所与の構造における水素ラジカルと特定の置換基のラジカルとの置換のことをいう。他に示されない限り、必要に応じて置換されている基は、その基のそれぞれの置換可能な位置で置換基を有し得、任意の所与の構造における１つ以上の位置が、特定の基から選択される１つ以上の置換基で置換され得るとき、その置換基は、それぞれの位置において、同じであってもよいし、異なっていてもよい。本発明によって予測される置換基の組み合わせは、好ましくは安定な化合物または化学的に可能な化合物を形成するものである。
【００１８】
用語「安定な」は、本明細書中で使用されるとき、本明細書中で開示される目的の１つ以上のためのそれらの生成、検出および好ましくはそれらの回収、精製および用途を可能にさせる条件に供されたときに、実質的に変化しない化合物のことをいう。いくつかの実施形態において、安定な化合物または化学的に可能な化合物は、少なくとも１週間に亘って水分または他の化学的に反応性の条件が存在しない場合で４０℃以下の温度で維持されるときに実質的に変化しない化合物である。
【００１９】
本明細書中で使用されるとき、用語「検出可能な部分」は、用語「標識」と交換可能に使用され、検出することができる任意の部分、例えば、１次標識および２次標識に関する。１次標識（例えば、放射性同位体（例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓまたは１４Ｃ）、質量タグ（ｍａｓｓ−ｔａｇ）および蛍光部分）は、さらなる改変なしで検出することができるレポーター基を生成するシグナルである。
【００２０】
用語「２次標識」とは、本明細書中で使用されるとき、検出可能なシグナルの生成についての２次的な中間体の存在が必要である、ビオチンおよび様々なタンパク質抗原などの部分のことをいう。ビオチンについては、２次的な中間体としては、ストレプトアビジン−酵素結合体が挙げられ得る。抗原標識については、２次的な中間体としては、抗体−酵素結合体が挙げられ得る。いくつかの蛍光基は、非放射性の蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）のプロセスで別の基にエネルギーを転移し、そしてこの第２の基が、検出されるシグナルを生成するため、２次標識として作用する。
【００２１】
用語「蛍光標識」、「蛍光色素」および「フルオロフォア」は、本明細書中で使用されるとき、既定された励起波長で光エネルギーを吸収し、異なる波長で光エネルギーを放射する部分のことをいう。蛍光標識の例としては：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０）、ＡＭＣＡ、ＡＭＣＡ−Ｓ、ＢＯＤＩＰＹ色素（ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５）、ＣＡＬ色素、カルボキシローダミン６Ｇ、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ、シアニン色素（Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５．５）、ダンシル、Ｄａｐｏｘｙｌ、ジアルキルアミノクマリン、４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシ−フルオレセイン、ＤＭ−ＮＥＲＦ、エオシン、エリスロシン、フルオレセイン、ＦＡＭ、ヒドロキシクマリン、ＩＲ色素（ＩＲＤ４０、ＩＲＤ  ７００、ＩＲＤ  ８００）、ＪＯＥ、リサミンローダミンＢ、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、メトキシクマリン、ナフトフルオレセイン、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５００、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４、カキ（Ｏｙｓｔｅｒ）色素、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＰｙＭＰＯ、ピレン、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、Ｒｈｏｄｏｌ  Ｇｒｅｅｎ、２’，４’，５’，７’−テトラ−ブロモスルホン−フルオレセイン、テトラメチル−ローダミン（ＴＭＲ）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テキサスレッド、テキサスレッド−Ｘが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
本明細書中で使用される用語「クエンチャー」は、接近した位置にある場合、励起した蛍光標識のエネルギーを吸収することができ、そして可視光線の放射なしにそのエネルギーを散逸することができる任意の部分を含む。クエンチャーの例としては、ＤＡＢＣＹＬ（４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸）スクシンイミジルエステル、ジアリールローダミンカルボン酸、スクシンイミジルエステル（ＱＳＹ−７）および４’，５’−ジニトロフルオレセインカルボン酸、スクシンイミジルエステル（ＱＳＹ−３３）（以上のすべてはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから入手可能）、クエンチャー１（Ｑｌ；Ｅｐｏｃｈから入手可能）または「ブラックホールクエンチャー」であるＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２およびＢＨＱ−３（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
用語「質量タグ」は、本明細書中で使用されるとき、質量分析（ＭＳ）検出技術を使用してその質量によって一意的に検出することができる任意の部分のことをいう。質量タグの例としては、エレクトロフォア（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ）放出タグ、例えば、Ｎ−［３−［４’−［（ｐ−メトキシテトラフルオロベンジル）オキシ］フェニル］−３−メチルグリセロニル］イソニペコチン酸、４’−［２，３，５，６−テトラフルオロ−４−（ペンタフルオロフェノキシル）］メチルアセトフェノンおよびそれらの誘導体が挙げられる。これらの質量タグの合成および有用性は、米国特許第４，６５０，７５０号、同第４，７０９，０１６号、同第５，３６０，８１９１号、同第５，５１６，９３１号、同第５，６０２，２７３号、同第５，６０４，１０４号、同第５，６１０，０２０号、同第５，６５０，２７０号および米国仮特許番号６０／２０９，４１５に説明されている。質量タグの他の例としては、ヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド、様々な長さおよび塩基組成物のオリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、オリゴ糖および様々な長さおよびモノマー組成物の他の合成ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。適切な質量範囲（１００〜２０００ダルトン）の中性かつ帯電した多くの様々な有機分子（生体分子または合成化合物）もまた、質量タグとして使用され得る。
【００２４】
用語「電気泳動タグ」または「ｅ−タグ」は、本明細書中で使用されるとき、電気泳動分離技術を使用して電荷と質量の比によって一意的に検出することができる任意の部分のことをいう。このような電気泳動分離技術としては、キャピラリー電気泳動およびシリカ、ガラス、プラスチックまたは他の材料でできた、製造された「チップ」もしくはデバイス（例えば、「配列決定チップ」）においてポリマーもしくはゲルで満たされたマイクロチャネルにおける分離が挙げられる。ｅ−タグの例としては、ＰＣＴ出願ＷＯ０６６６０７Ａ１に説明されているタイプの荷電分子が挙げられ、本明細書中で説明される標識方法を用いてＤＮＡプライマーに結合され得る。
【００２５】
用語「基材」は、本明細書中で使用されるとき、核酸が、基材に接着している別の部分に直接的または共有結合もしくは非共有結合のいずれかを介して結合され得る任意の材料または高分子複合体のことをいう。基材は、代表的には適切な条件下でのその固体性または不溶性によって水溶液から分離することができるが、この特性を有しない重合体の基材、例えばゲルもまた、使用され得る。通常使用される基材の例としては、ガラス面、シリカ面、プラスチック面、金属面、金属コーティングまたは化学コーティングを含む面、膜（例えば、ナイロン、ポリスルホン、シリカ）、マイクロビーズ（例えば、ラテックス、ポリスチレンもしくは他のポリマーまたは磁気ビーズを含む樹脂）、多孔性ポリマーマトリックス（例えば、ポリアクリルアミドゲル、多糖、ポリメタクリレート、熱可逆的ポリマー）、高分子複合体（例えば、タンパク質、多糖）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
用語「脂肪族」または「脂肪族基」は、本明細書中で使用されるとき、完全に飽和しているか、または１つ以上の不飽和の単位を含む、直鎖状（すなわち、分枝していない）もしくは分枝状の、置換されているかもしくは置換されていない炭化水素鎖または完全に飽和しているか、もしくは１つ以上の不飽和の単位を含むが、芳香族ではなく、その分子の残りの部分に結合する単一の点を有する単環式の炭化水素もしくは二環式の炭化水素（本明細書中で「炭素環式化合物」「脂環式」または「シクロアルキル」とも呼ばれる）を意味する。他に特定されない限り、脂肪族基は、１〜２０個の脂肪族炭素原子を含む。いくつかの実施形態において、脂肪族基は、１〜１０個の脂肪族炭素原子を含む。他の実施形態において、脂肪族基は、１〜８個の脂肪族炭素原子を含む。さらに他の実施形態において、脂肪族基は、１〜６個の脂肪族炭素原子を含み、そしてなおも他の実施形態において、脂肪族基は、１〜４個の脂肪族炭素原子を含む。いくつかの実施形態において、「脂環式」（または「炭素環式化合物」または「シクロアルキル」）とは、完全に飽和しているか、または１つ以上の不飽和の単位を含むが、芳香族ではなく、その分子の残りの部分に結合する単一の点を有する、単環式のＣ３〜Ｃ８炭化水素または二環式のＣ８〜Ｃ１２炭化水素のことをいい、ここで前記二環式の環系において任意の個別の環は、３〜７員を有する。適切な脂肪族基としては、直鎖状または分枝状の、置換されているかまたは置換されていない、アルキル、アルケニル、アルキニル基およびそれらの混成体（例えば、（シクロアルキル）アルキル、（シクロアルケニル）アルキルまたは（シクロアルキル）アルケニル）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
用語「複素環」、「ヘテロシクリル」、「複素環式脂肪族」または「複素環式」は、本明細書中で使用されるとき、１つ以上の環員が独立して選択されるヘテロ原子である、非芳香族、単環式、二環式または三環式の環系を意味する。いくつかの実施形態において、「複素環」、「ヘテロシクリル」、「複素環式脂肪族」または「複素環式」基は、３〜１４個の環員を有し、１つ以上の環員は、酸素、硫黄、窒素またはリンから独立して選択されるヘテロ原子であり、そしてその系における各環は、３〜７個の環員を含む。
【００２８】
用語「ヘテロ原子」は、１つ以上の酸素、硫黄、窒素、リンまたはケイ素（窒素、硫黄、リンもしくはケイ素の任意の酸化型；任意の塩基性窒素の四級化型または；複素環式環の置換可能な窒素、例えば、Ｎ（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロリル中のような）、ＮＨ（ピロリジニル中のような）またはＮＲ＋（Ｎ−置換ピロリジニル中のような）を含む）を意味する。
【００２９】
用語「不飽和」とは、本明細書中で使用されるとき、１つ以上の不飽和の単位を有する部分を意味する。
【００３０】
用語「アルコキシ」または「チオアルキル」とは、本明細書中で使用されるとき、酸素（「アルコキシ」）または硫黄（「チオアルキル」）原子を介して主な炭素鎖に結合する、上で定義したようなアルキル基のことをいう。
【００３１】
用語「ハロアルキル」、「ハロアルケニル」および「ハロアルコキシ」とは、１つ以上のハロゲン原子で置換され得る場合の、アルキル、アルケニルまたはアルコキシを意味する。用語「ハロゲン」とは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを意味する。
【００３２】
「アラルキル」、「アラルコキシ」または「アリールオキシアルキル」におけるような単独または長いほうの部分の一部として使用される用語「アリール」は、合計５〜１４個の環員を有する、単環式、二環式および三環式環系のことをいい、ここで、この系における少なくとも１つの環は、芳香族であり、そしてこの環における各環は、３〜７個の環員を含む。用語「アリール」は、用語「アリール環」と交換可能に使用され得る。用語「アリール」はまた、本明細書の以後に定義されるようなヘテロアリール環系のこともいう。
【００３３】
「ヘテロアラルキル」または「ヘテロアリールアルコキシ」におけるような単独または長いほうの部分の一部として使用される用語「ヘテロアリール」は、合計５〜１４個の環員を有する、単環式、二環式および三環式環系のことをいい、ここで、この系における少なくとも１つの環は、芳香族であり、この系における少なくとも１つの環は、１つ以上のヘテロ原子を含み、そしてこの系における各環は、３〜７個の環員を含む。用語「ヘテロアリール」は、用語「ヘテロアリール環」または用語「ヘテロ芳香族」と交換可能に使用され得る。
【００３４】
アリール（アラルキル、アラルコキシ、アリールオキシアルキルなどを含む）基またはヘテロアリール（ヘテロアラルキルおよびヘテロアリールアルコキシなどを含む）基は、１つ以上の置換基を含み得る。アリール基またはヘテロアリール基の不飽和炭素原子上の適切な置換基は、ハロゲン；Ｎ３、ＣＮ、Ｒｏ；ＯＲｏ；ＳＲｏ；１，２−メチレン−ジオキシ；１，２−エチレンジオキシ；必要に応じてＲｏで置換されているフェニル（Ｐｈ）；必要に応じてＲｏで置換されている−Ｏ（Ｐｈ）；必要に応じてＲｏで置換されている（ＣＨ２）１〜２（Ｐｈ）；必要に応じてＲｏで置換されているＣＨ＝ＣＨ（Ｐｈ）；ＮＯ２；ＣＮ；Ｎ（Ｒｏ）２；ＮＲｏＣ（Ｏ）Ｒｏ；ＮＲｏＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｏ）２；ＮＲｏＣＯ２Ｒｏ；−ＮＲｏＮＲｏＣ（Ｏ）Ｒｏ；ＮＲｏＮＲｏＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｏ）２；ＮＲｏＮＲｏＣＯ２Ｒｏ；Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒｏ；Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒｏ；ＣＯ２Ｒｏ；Ｃ（Ｏ）Ｒｏ；Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｏ）２；ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｏ）２；Ｓ（Ｏ）２Ｒｏ；ＳＯ２Ｎ（Ｒｏ）２；Ｓ（Ｏ）Ｒｏ；ＮＲｏＳＯ２Ｎ（Ｒｏ）２；ＮＲｏＳＯ２Ｒｏ；Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒｏ）２；Ｃ（＝ＮＨ）−Ｎ（Ｒｏ）２；または（ＣＨ２）０〜２ＮＨＣ（Ｏ）Ｒｏから選択され、ここで、それぞれ独立して出現するＲｏは、水素、必要に応じて置換されているＣ１〜６脂肪族、置換されていない５〜６員のヘテロアリールもしくは複素環式環、フェニル、Ｏ（Ｐｈ）またはＣＨ２（Ｐｈ）から選択されるか、または上記の定義にもかかわらず、同じ置換基上か、または異なる置換基上で独立して出現する２つのＲｏは、各Ｒｏ基が結合する原子と一緒になって、窒素、酸素または硫黄から独立して選択される０〜４個のヘテロ原子を有する、３〜８員のシクロアルキル環、ヘテロシクリル環、アリール環またはヘテロアリール環を形成する。Ｒｏの脂肪族基上の任意の置換基は、Ｎ３、ＣＮ、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１〜４脂肪族）、Ｎ（Ｃ１〜４脂肪族）２、ハロゲン、Ｃ１〜４脂肪族、ＯＨ、Ｏ（Ｃ１〜４脂肪族）、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２（Ｃ１〜４脂肪族）、Ｏ（ハロＣ１〜４脂肪族）またはハロＣ１〜４脂肪族から選択され、ここで、前述のＲｏのＣ１〜４脂肪族基の各々は、置換されない。
【００３５】
脂肪族基もしくはヘテロ脂肪族基または非芳香族複素環式環は、１つ以上の置換基を含み得る。脂肪族基もしくはヘテロ脂肪族基または非芳香族複素環式環の飽和炭素における適切な置換基は、アリール基またはヘテロアリール基の不飽和炭素について上で列挙したような基から選択され、さらに以下：＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＮＨＲ＊、＝ＮＮ（Ｒ＊）２、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）Ｒ＊、＝ＮＮＨＣＯ２（アルキル）、＝ＮＮＨＳＯ２（アルキル）または＝ＮＲ＊を含み、ここで、各Ｒ＊は、水素または必要に応じて置換されているＣ１〜６脂肪族から独立して選択される。Ｒ＊の脂肪族基における任意の置換基は、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１〜４脂肪族）、Ｎ（Ｃ１〜４脂肪族）２、ハロゲン、Ｃ１〜４脂肪族、ＯＨ、Ｏ（Ｃ１〜４脂肪族）、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２（Ｃ１〜４脂肪族）、Ｏ（ハロＣ１〜４脂肪族）またはハロ（Ｃ１〜４脂肪族）から選択され、ここで、Ｒ＊の前述のＣ１〜４脂肪族基の各々は、置換されない。
【００３６】
非芳香族複素環式環の窒素における任意の置換基は、Ｒ＋、Ｎ（Ｒ＋）２、Ｃ（Ｏ）Ｒ＋、ＣＯ２Ｒ＋、Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ＋、Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ＋、ＳＯ２Ｒ＋、ＳＯ２Ｎ（Ｒ＋）２、Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒ＋）２、Ｃ（＝ＮＨ）−Ｎ（Ｒ＋）２またはＮＲ＋ＳＯ２Ｒ＋から選択され；ここで、Ｒ＋は、水素、必要に応じて置換されているＣ１〜６脂肪族、必要に応じて置換されているフェニル、必要に応じて置換されているＯ（Ｐｈ）、必要に応じて置換されているＣＨ２（Ｐｈ）、必要に応じて置換されている（ＣＨ２）１〜２（Ｐｈ）；必要に応じて置換されているＣＨ＝ＣＨ（Ｐｈ）；あるいは酸素、窒素もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する、置換されていない５〜６員のヘテロアリール環または複素環式環であるか、または上記の定義にもかかわらず、同じ置換基上か、または異なる置換基上で独立して出現する２つのＲ＋は、各Ｒ＋基が結合する原子と一緒になって、窒素、酸素もしくは硫黄から独立して選択される０〜４個のヘテロ原子を有する、３〜８員のシクロアルキル環、ヘテロシクリル環、アリール環またはヘテロアリール環を形成する。Ｒ＋の脂肪族基またはフェニル環上の任意の置換基は、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１〜４脂肪族）、Ｎ（Ｃ１〜４脂肪族）２、ハロゲン、Ｃ１〜４脂肪族、ＯＨ、Ｏ（Ｃ１〜４脂肪族）、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２（Ｃ１〜４脂肪族）、Ｏ（ハロＣ１〜４脂肪族）またはハロ（Ｃ１〜４脂肪族）から選択され、ここで、Ｒ＋の前述のＣ１〜４脂肪族基の各々は、置換されない。
【００３７】
上で定義したように、いくつかの実施形態において、独立して出現する２つのＲｏ（もしくはＲ＋または本明細書中で同様に定義された他の任意の可変のもの）は、変化しうる各々が結合する原子と一緒になって、窒素、酸素または硫黄から独立して選択される０〜４個のヘテロ原子を有する、３〜８員のシクロアルキル環、ヘテロシクリル環、アリール環またはヘテロアリール環を形成する。独立して出現する２つのＲｏ（もしくはＲ＋または本明細書中で同様に定義された任意の他の可変のもの）が、変化しうる各々が結合する原子と一緒になる場合に形成される代表的な環としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ａ）出現する両方のＲｏが、窒素原子と一緒になって、ピペリジン−１−イル基、ピペラジン−１−イル基またはモルフォリン−４−イル基を形成する場合に、同じ原子に結合し、そしてその原子と一緒になって環を形成する、独立して出現する２つのＲｏ（もしくはＲ＋または本明細書中で同様に定義された任意の他の可変のもの）、例えば、Ｎ（Ｒｏ）２；およびｂ）例えば、フェニル基が、２つの出現するＯＲｏ
【００３８】
【化２５】
2008526877.tif 000006
で置換されている場合、これらの２つの出現するＲｏは、それらが結合する酸素原子と一緒になって融合した６員の酸素を含む環
【００３９】
【化２６】
2008526877.tif 000007
を形成する、異なる原子に結合し、そしてそれらの原子の両方と一緒になって環を形成する、独立して出現する２つのＲｏ（もしくはＲ＋または本明細書中で同様に定義された任意の他の可変のもの）。独立して出現する２つのＲｏ（もしくはＲ＋または本明細書中で同様に定義された任意の他の可変のもの）が変化しうる各々が結合する原子と一緒になる場合に、様々な他の環が形成され得ることおよび上で詳述された例は、限定するためのものではないことを意図することが理解されるだろう。
【００４０】
他に述べられない限り、本明細書中で示された構造は、その構造のすべての異性体の型（例えば、鏡像異性体、ジアステレオ異性体および幾何異性体（または配座異性体））；例えば、各不斉中心に対してＲ配置およびＳ配置、（Ｚ）二重結合異性体および（Ｅ）二重結合異性体ならびに（Ｚ）配座異性体および（Ｅ）配座異性体を含むと意味される。従って、本化合物の単一の立体化学異性体ならびに鏡像異性体、ジアステレオ異性体および幾何異性体（または配座異性体）混合物は、本発明の範囲内である。他に述べられない限り、本発明の化合物のすべての互変異性体は、本発明の範囲内である。さらに、他に述べられない限り、本明細書中で示された構造はまた、１つ以上の同位体が多い原子の存在下でのみ異なる化合物を含むと意味される。例えば、ジュウテリウムもしくはトリチウムによる水素の置換または１３Ｃまたは１４Ｃが多い炭素による炭素の置換以外の本構造を有する化合物は、本発明の範囲内である。このような化合物は、例えば、生物学的アッセイにおける分析ツールまたはプローブとして有用である。
【００４１】
本明細書中で使用されるとき、用語「ヌクレオチド」は、窒素塩基（「核酸塩基」）、糖および１つ以上のリン酸基からなる。糖は、ＲＮＡではリボースであり、ＤＮＡではデオキシリボース、すなわち、リボースに存在するヒドロキシル基を有しない糖であると理解されている。ヌクレオチドはまた、糖のＣ−５に結合するヒドロキシル基上で起きるエステル化によるヌクレオシドのリン酸エステルである。ヌクレオチドは、通常、一リン酸、二リン酸または三リン酸である。
【００４２】
本明細書中で使用されるとき、用語「ヌクレオシド」は、ヌクレオチドに構造的に類似しているが、リン酸部分を有しない。
【００４３】
本明細書中で使用されるとき、修飾語句「模倣物」または「普遍的な」を伴わない用語「核酸塩基」は、天然に存在する核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基対を形成する天然核酸塩基または「通常の」核酸塩基といわれる。これらは、プリンまたはピリミジンの誘導体である。プリンは、アデノシン（Ａ）およびグアニジン（Ｇ）であり、そしてピリミジンは、シチジン（Ｃ）およびチミジン（Ｔ）であるか、またはＲＮＡの場合は、ウラシル（Ｕ）である。核酸塩基として、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンおよび２−アミノプリンもまた、含まれる。代表的には、デオキシリボースのＣ−１原子は、ピリミジンのＮ−１またはプリンのＮ−９に結合している。
【００４４】
本明細書中で使用されるとき、用語「核酸塩基模倣物」とは、天然核酸塩基を含まない核酸塩基のことをいい、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ様式で天然核酸塩基の各々によって適切な水素結合、すなわち、塩基対を形成する。Ｓｅｅｌａ  ａｎｄ  Ｄｅｂｅｌａｋ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８：１７、３２２４−３２３２（２０００）を参照のこと。あるいは、このような核酸塩基は、いかなる水素結合も形成しないかもしれないが、二重鎖ＤＮＡにおいて天然核酸塩基と同程度の効率で効率的に納まる。Ｂｅｒｇｅｒ、ｅｔ  ａｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８：１５、２９１１−２９１４（２０００）を参照のこと。核酸塩基模倣物としては、１つ以上の天然核酸塩基と特異的に対を形成するこれらの核酸塩基アナログが挙げられる。一定の実施形態において、核酸塩基模倣物は、Ｃと特異的に対を形成する。他の実施形態において、核酸塩基模倣物は、Ｔと特異的に対を形成する。なおも他の実施形態において、核酸塩基模倣物は、Ａと特異的に対を形成する。さらに他の実施形態において、核酸塩基模倣物は、Ｇと特異的に対を形成する。
【００４５】
（３．代表的な実施形態の説明）
上記で概要を説明したように、本発明は、式Ｉの化合物：
【００４６】
【化２７】
2008526877.tif 000008
であって、ここで：
Ｒ１は、ＯＨ、適切に保護されたヒドロキシル基または水素であり；
Ｒ２は、適切なヒドロキシル保護基、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＮＨ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり；
Ｒ３は、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり、ここでＲ３は、必要に応じてＬ−Ｒ４で置換されており；
Ｒ５は、水素または適切なチオール保護基であり、そして必要に応じてＬ−Ｒ４で置換されており；
各Ｌは、独立して切断可能なリンカー基であり；そして
各Ｒ４は、独立して検出可能な部分である；
但し：Ｒ３およびＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｌ−Ｒ４で置換されている、化合物
を提供する。
【００４７】
一定の実施形態において、式ＩのＲ３基は、Ｌ−Ｒ４で置換されている。他の実施形態において、Ｒ３は、Ｌ−Ｒ４で置換されており、Ｒ５は、Ｌ−Ｒ４を切断するために使用されるのと同じ条件下で除去することができるチオール保護基である。
【００４８】
一定の実施形態において、式ＩのＲ３基は、核酸塩基である。このような核酸塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルが挙げられる。このような核酸塩基としては、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンまたは２−アミノプリンもまた挙げられる。
【００４９】
他の実施形態において、式ＩのＲ３基は、核酸塩基模倣物である。このような核酸塩基模倣物は、当業者に公知であり、それらとしては、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ様式で天然核酸塩基と適切な水素結合、すなわち、塩基対を形成するものが挙げられる。あるいは、このような核酸塩基模倣物は、いかなる水素結合も形成しないかもしれないが、二重鎖ＤＮＡにおいて天然核酸塩基と同程度の効率で効率的に納まる。
【００５０】
上記で概要を説明したように、式ＩのＬ基は、切断可能なリンカー基である。このような基は、一般に当該分野で公知であり、それらとしては、米国特許第６，６６４，０７９号、同第６，６６４，０７９号、同第６，５１１，８０３号、米国出願公開番号２００３１０４４３７、ＷＯ０４／１８４９７およびＷＯ０３／４８３８７（これらの全体が本明細書によって本明細書によって本明細書中に参考として援用される）に記載されている基が挙げられる。Ｒ３が、Ｌ−Ｒ４で置換されているとき、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成がなおも可能である条件で、Ｌ−Ｒ４基は、核酸塩基上の任意の位置で結合され得る。
【００５１】
一定の実施形態において、Ｌは、検出可能なＲ４基に結合するために末端に官能基部分を有する。このような官能基部分は、当業者に明らかであり、利用される特定の検出可能なＲ４基に適したものである。このような官能基部分の例としては、アミノ基、アルデヒド基、ヒドロキシル基、カルボン酸基またはチオール基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
チオール保護基は、当該分野で周知であり、それらとしては、その全体が本明細書中に参考として援用される、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９に詳細に説明されている基が挙げられる。式ＩのＲ５部分の適切なチオール保護基としては、ジスルフィド、チオエーテル、シリルチオエーテル、チオエステル、チオカーボネート、チオカルバメートなどが挙げられるが、これらに限定されない。このような基の例としては、アルキルチオエーテル、ベンジルおよび置換されているベンジルチオエーテル、トリフェニルメチルチオエーテル、トリクロロエトキシカルボニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。一定の実施形態において、式ＩのＲ５部分のチオール保護基は、−Ｓ−ピリジン−２−イルである。
【００５３】
本発明の１つの態様によれば、式ＩのＲ５部分は、例えば、ＡｇＮＯ３、ＨｇＣｌ２などを用いた中性の条件下で除去することができるチオール保護基である。他の中性の条件としては、適切な還元剤を使用する還元が挙げられる。適切な還元剤としては、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエタノール、亜ジチオン酸塩、還元グルタチオン、還元グルタレドキシン、還元チオレドキシン、トリスカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）などの置換されているホスフィンおよび他の任意のペプチドもしくは有機物に基づく還元剤または当業者に公知の他の試薬が挙げられる。本発明の別の態様によれば、式ＩのＲ５部分は、ｐＨが約４〜約９である場合の条件下で切断されるチオール保護基である。本発明のなおも別の態様によれば、式ＩのＲ５部分は、「光切断性」であるチオール保護基である。このような適切なチオール保護基は、当該分野で公知であり、それらとしては、ニトロベンジル基、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）基、トリチル基、−ＣＨ２ＳＣＨ３（ＭＴＭ）、ジメチルメトキシメチルまたは−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−ピリジン−２−イルが挙げられるが、これらに限定されない。適切なヒドロキシル保護基の多くが、本明細書中に説明されるように、チオール保護基としても適当であることを当業者は認識するだろう。
【００５４】
一定の実施形態において、Ｒ２は、適切なヒドロキシル保護基である。ヒドロキシル保護基は、当該分野で周知であり、それらとしては、その全体が本明細書中に参考として援用される、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９に詳細に説明されている基が挙げられる。Ｒ２部分の適切なヒドロキシル保護基の例としては、さらにエステル、アリルエーテル、エーテル、シリルエーテル、アルキルエーテル、アリールアルキルエーテルおよびアルコキシアルキルエーテルが挙げられるが、これらに限定されない。これらのエステルの例としては、ホルメート、アセテート、カルボネートおよびスルホネートが挙げられる。特定の例としては、ホルメート、ベンゾイルホルメート、クロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、３−フェニルプロピオネート、４−オキソペンタノエート、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノエート、ピバロエート（トリメチルアセチル）、クロトネート、４−メトキシ−クロトネート、ベンゾエート、ｐ−ベニルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート、カーボネート（例えば、メチルカーボネート、９−フルオレンイルメチルカーボネート、エチルカーボネート、２，２，２−トリクロロエチルカーボネート、２−（トリメチルシリル）エチルカーボネート、２−（フェニルスルホニル）エチルカーボネート、ビニルカーボネート、アリルカーボネートおよびｐ−ニトロベンジルカーボネート）が挙げられる。このようなシリルエーテルの例としては、トリメチルシリルエーテル、トリエチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジフェニルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテルおよび他のトリアルキルシリルエーテルが挙げられる。アルキルエーテルとしては、メチルエーテル、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、トリチルエーテル、ｔ−ブチルエーテル、アリルエーテルおよびアリルオキシカルボニルエーテルまたは誘導体が挙げられる。アルコキシアルキルエーテルとしては、アセタール（例えば、メトキシメチルエーテル、メチルチオメチルエーテル、（２−メトキシエトキシ）メチルエーテル、ベンジルオキシメチルエーテル、β−（トリメチルシリル）エトキシメチルエーテルおよびテトラヒドロピラニルエーテル）が挙げられる。アリールアルキルエーテルの例としては、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル（ＭＰＭ）、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、Ｏ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ハロベンジルエーテル、２，６−ジクロロベンジルエーテル、ｐ−シアノベンジルエーテル、２−ピコリルエーテルおよび４−ピコリルエーテルが挙げられる。
【００５５】
他の実施形態において、式ＩのＲ２は、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２である。
【００５６】
一定の実施形態において、式ＩのＲ１は、水素である。
【００５７】
他の実施形態において、式ＩのＲ１は、−ＯＨである。
【００５８】
なおも他の実施形態によれば、式ＩのＲ１は、適切に保護されたヒドロキシル基である。このような適切なヒドロキシル基としては、Ｒ２基について上で説明された基が挙げられる。
【００５９】
一定の実施形態において、本発明は、式Ｉａの化合物：
【００６０】
【化２８】
2008526877.tif 000009
ここで：
Ｒ１は、ＯＨ、適切に保護されたヒドロキシル基または水素であり；
Ｒ２は、適切なヒドロキシル保護基、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＮＨ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり；
Ｒ３は、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり；
Ｌは、独立して切断可能なリンカー基であり；そして
Ｒ４は、検出可能な部分である、
を提供する。
【００６１】
一定の実施形態において、式ＩａのＲ３基は、核酸塩基である。このような核酸塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルが挙げられる。このような核酸塩基としては、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンまたは２−アミノプリンもまた挙げられる。
【００６２】
他の実施形態において、式ＩａのＲ３基は、核酸塩基模倣物である。このような核酸塩基模倣物は、当業者に公知であり、それらとしては、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ様式で天然核酸塩基と適切な水素結合、すなわち、塩基対を形成するものが挙げられる。あるいは、このような核酸塩基模倣物は、いかなる水素結合も形成しないかもしれないが、二重鎖ＤＮＡにおいて天然核酸塩基と同程度の効率で効率的に納まる。
【００６３】
上記で概要を説明したように、式ＩａのＬ基は、切断可能なリンカー基である。このような基は、一般に当該分野で公知であり、それらとしては、米国特許第６，６６４，０７９号、同第６，６６４，０７９号、同第６，５１１，８０３号、米国出願公開番号２００３１０４４３７、ＷＯ０４／１８４９７およびＷＯ０３／４８３８７（これらの全体が本明細書によって本明細書中に参考として援用される）に記載されている基が挙げられる。Ｒ３が、Ｌ−Ｒ４で置換されているとき、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成がなおも可能である条件で、Ｌ−Ｒ４基は、核酸塩基上の任意の位置で結合され得る。
【００６４】
一定の実施形態において、Ｌは、検出可能なＲ４基に結合するために末端に官能基部分を有する。このような官能基部分は、当業者に明らかであり、利用される検出可能なＲ４基に適したものである。このような官能基部分の例としては、アミノ基、アルデヒド基、ヒドロキシル基、カルボン酸基またはチオール基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
一定の実施形態において、式ＩａのＲ２基は、適切なヒドロキシル保護基である。ヒドロキシル保護基は、当該分野で周知であり、それらとしては、その全体が本明細書中に参考として援用されるＰｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９に詳細に説明されている基が挙げられる。Ｒ２部分の適切なヒドロキシル保護基の例としては、さらに、エステル、アリルエーテル、エーテル、シリルエーテル、アルキルエーテル、アリールアルキルエーテルおよびアルコキシアルキルエーテルが挙げられるが、これらに限定されない。このようなエステルの例としては、ホルメート、アセテート、カーボネートおよびスルホネートが挙げられる。特定の例としては、ホルメート、ベンゾイルホルメート、クロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、３−フェニルプロピオネート、４−オキソペンタノエート、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノエート、ピバロエート（トリメチルアセチル）、クロトネート、４−メトキシ−クロトネート、ベンゾエート、ｐ−ベニルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート、カーボネート（例えば、メチルカーボネート、９−フルオレンイルメチルカーボネート、エチルカーボネート、２，２，２−トリクロロエチルカーボネート、２−（トリメチルシリル）エチルカーボネート、２−（フェニルスルホニル）エチルカーボネート、ビニルカーボネート、アリルカーボネートおよびｐ−ニトロベンジルカーボネート）が挙げられる。このようなシリルエーテルの例としては、トリメチルシリルエーテル、トリエチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジフェニルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテルおよび他のトリアルキルシリルエーテルが挙げられる。アルキルエーテルとしては、メチルエーテル、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、トリチルエーテル、ｔ−ブチルエーテル、アリルエーテルおよびアリルオキシカルボニルエーテルまたは誘導体が挙げられる。アルコキシアルキルエーテルとしては、アセタール（例えば、メトキシメチルエーテル、メチルチオメチルエーテル、（２−メトキシエトキシ）メチルエーテル、ベンジルオキシメチルエーテル、β−（トリメチルシリル）エトキシメチルエーテルおよびテトラヒドロピラニルエーテル）が挙げられる。アリールアルキルエーテルの例としては、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル（ＭＰＭ）、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、Ｏ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ハロベンジルエーテル、２，６−ジクロロベンジルエーテル、ｐ−シアノベンジルエーテル、２−ピコリルエーテルおよび４−ピコリルエーテルが挙げられる。
【００６６】
他の実施形態において、式ＩａのＲ２は、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２である。
【００６７】
一定の実施形態において、式ＩａのＲ１は、水素である。
【００６８】
他の実施形態において、式ＩａのＲ１は、−ＯＨである。
【００６９】
なおも他の実施形態によれば、式ＩａのＲ１は、適切に保護されたヒドロキシル基である。このような適切なヒドロキシル基としては、Ｒ２基について上で説明された基が挙げられる。
【００７０】
他の実施形態において、本発明は、式Ｉｂの化合物：
【００７１】
【化２９】
2008526877.tif 000010
ここで：
Ｒ１は、ＯＨ、適切に保護されたヒドロキシル基または水素であり；
Ｒ２は、適切なヒドロキシル保護基、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＮＨ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり；
Ｒ３は、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり；
Ｔは、酸素、硫黄、ＮＨまたは必要に応じて置換されているフェニルであり；
Ｌは、独立して切断可能なリンカー基であり；そして
Ｒ４は、検出可能な部分である、
を提供する。
【００７２】
一定の実施形態において、式ＩｂのＲ３基は、核酸塩基である。このような核酸塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルが挙げられる。このような核酸塩基としては、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンまたは２−アミノプリンも挙げられる。
【００７３】
他の実施形態において、式ＩｂのＲ３基は、核酸塩基模倣物である。このような核酸塩基模倣物は、当業者に公知であり、それらとしては、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ様式で天然核酸塩基と適切な水素結合、すなわち、塩基対を形成するものが挙げられる。あるいは、このような核酸塩基模倣物は、いかなる水素結合も形成しないかもしれないが、二重鎖ＤＮＡにおいて天然核酸塩基と同程度の効率で効率的に納まる。
【００７４】
上記で概要を説明したように、式ＩｂのＬ基は、切断可能なリンカー基である。このような基は、一般に当該分野で公知であり、それらとしては、米国特許第６，６６４，０７９号、同第６，６６４，０７９号、同第６，５１１，８０３号、米国出願公開番号２００３１０４４３７、ＷＯ０４／１８４９７およびＷＯ０３／４８３８７（これらの全体が本明細書によって本明細書中に参考として援用される）に説明されている基が挙げられる。Ｒ３がＬ−Ｒ４で置換されているとき、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成がなおも可能である条件で、Ｌ−Ｒ４基は、核酸塩基上の任意の位置で結合され得る。
【００７５】
一定の実施形態において、Ｌは、検出可能なＲ４基に結合するために末端に官能基部分を有する。このような官能基部分は、当業者に明らかであり、利用される特定の検出可能なＲ４基に適したものである。このような官能基部分の例としては、アミノ基、アルデヒド基、ヒドロキシル基、カルボン酸基またはチオール基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
一定の実施形態において、Ｒ２は、適切なヒドロキシル保護基である。ヒドロキシル保護基は、当該分野で周知であり、それらとしては、その全体が本明細書中に参考として援用される、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９に詳細に説明されている基が挙げられる。Ｒ２部分の適切なヒドロキシル保護基の例としては、さらに、エステル、アリルエーテル、エーテル、シリルエーテル、アルキルエーテル、アリールアルキルエーテルおよびアルコキシアルキルエーテルが挙げられるが、これらに限定されない。このようなエステルの例としては、ホルメート、アセテート、カーボネートおよびスルホネートが挙げられる。特定の例としては、ホルメート、ベンゾイルホルメート、クロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、３−フェニルプロピオネート、４−オキソペンタノエート、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノエート、ピバロエート（トリメチルアセチル）、クロトネート、４−メトキシ−クロトネート、ベンゾエート、ｐ−ベニルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート、カーボネート（例えば、メチルカーボネート、９−フルオレンイルメチルカーボネート、エチルカーボネート、２，２，２−トリクロロエチルカーボネート、２−（トリメチルシリル）エチルカーボネート、２−（フェニルスルホニル）エチルカーボネート、ビニルカーボネート、アリルカーボネートおよびｐ−ニトロベンジルカーボネートが挙げられる。このようなシリルエーテルの例としては、トリメチルシリルエーテル、トリエチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジフェニルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテルおよび他のトリアルキルシリルエーテルが挙げられる。アルキルエーテルとしては、メチルエーテル、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、トリチルエーテル、ｔ−ブチルエーテル、アリルエーテルおよびアリルオキシカルボニルエーテルまたは誘導体が挙げられる。アルコキシアルキルエーテルとしては、アセタール（例えば、メトキシメチルエーテル、メチルチオメチルエーテル、（２−メトキシエトキシ）メチルエーテル、ベンジルオキシメチルエーテル、β−（トリメチルシリル）エトキシメチルエーテルおよびテトラヒドロピラニルエーテル）が挙げられる。アリールアルキルエーテルの例としては、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル（ＭＰＭ）、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、Ｏ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ハロベンジルエーテル、２，６−ジクロロベンジルエーテル、ｐ−シアノベンジルエーテル、２−ピコリルエーテルおよび４−ピコリルエーテルが挙げられる。
【００７７】
他の実施形態において、式ＩｂのＲ２は、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２である。
【００７８】
一定の実施形態において、式ＩｂのＲ１は、水素である。
【００７９】
他の実施形態において、式ＩｂのＲ１は、−ＯＨである。
【００８０】
なおも他の実施形態によれば、式ＩｂのＲ１は、適切に保護されたヒドロキシル基である。このような適切なヒドロキシル基としては、Ｒ２基について上で説明した基が挙げられる。
【００８１】
他の実施形態において、本発明は、式Ｉｃの化合物：
【００８２】
【化３０】
2008526877.tif 000011
ここで：
Ｗは、Ｏ（Ｃ１〜４脂肪族）またはＳ（Ｃ１〜４脂肪族）であり；
Ｗ’は、Ｃ１〜４脂肪族；
Ｒ１は、ＯＨ、適切に保護されたヒドロキシル基または水素であり；
Ｒ２は、適切なヒドロキシル保護基、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＮＨ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり；
Ｒ３は、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり；
Ｌは、切断可能なリンカー基であり；そして
Ｒ４は、検出可能な部分である、
を提供する。
【００８３】
１つの態様によれば、本発明は、Ｗが−ＯＣＨ３または−ＳＣＨ３である式Ｉｃの化合物を提供する。別の態様によれば、本発明は、Ｗ’が−ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３などである式Ｉｃの化合物を提供する。
【００８４】
一定の実施形態において、式ＩｃのＲ３基は、核酸塩基である。このような核酸塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルが挙げられる。このような核酸塩基としては、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンまたは２−アミノプリンもまた挙げられる。
【００８５】
他の実施形態において、式ＩｃのＲ３基は、核酸塩基模倣物である。このような核酸塩基模倣物は、当業者に公知であり、それらとしては、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ様式で天然核酸塩基と適切な水素結合、すなわち、塩基対を形成するものが挙げられる。あるいは、このような核酸塩基模倣物は、いかなる水素結合も形成しないかもしれないが、二重鎖ＤＮＡにおいて天然核酸塩基と同程度の効率で効率的に納まる。
【００８６】
上記で概要を説明したように、式ＩｃのＬ基は、切断可能なリンカー基である。このような基は、一般に当該分野で公知であり、それらとしては、米国特許第６，６６４，０７９号、同第６，６６４，０７９号、同第６，５１１，８０３号、米国出願公開番号２００３１０４４３７、ＷＯ０４／１８４９７およびＷＯ０３／４８３８７（これらの全体が本明細書によって本明細書中に参考として援用される）に記載されている基が挙げられる。Ｒ３がＬ−Ｒ４で置換されているとき、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成がなおも可能である条件で、Ｌ−Ｒ４基は、核酸塩基上の任意の位置で結合され得る。
【００８７】
一定の実施形態において、Ｌは、検出可能なＲ４基に結合するために末端に官能基部分を有する。このような官能基部分は、当業者に明らかであり、利用される特定の検出可能なＲ４基に適したものである。このような官能基部分の例としては、アミノ基、アルデヒド基、ヒドロキシル基、カルボン酸基またはチオール基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
一定の実施形態において、式ＩｃのＲ２基は、適切なヒドロキシル保護基である。ヒドロキシル保護基は、当該分野で周知であり、それらとしては、その全体が本明細書中に参考として援用される、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９に詳細に説明されている基が挙げられる。Ｒ２部分の適切なヒドロキシル保護基の例としては、さらに、エステル、アリルエーテル、エーテル、シリルエーテル、アルキルエーテル、アリールアルキルエーテルおよびアルコキシアルキルエーテルが挙げられるが、これらに限定されない。このようなエステルの例としては、ホルメート、アセテート、カーボネートおよびスルホネートが挙げられる。特定の例としては、ホルメート、ベンゾイルホルメート、クロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、３−フェニルプロピオネート、４−オキソペンタノエート、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノエート、ピバロエート（トリメチルアセチル）、クロトネート、４−メトキシ−クロトネート、ベンゾエート、ｐ−ベニルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート、カーボネート（例えば、メチルカーボネート、９−フルオレンイルメチルカーボネート、エチルカーボネート、２，２，２−トリクロロエチルカーボネート、２−（トリメチルシリル）エチルカーボネート、２−（フェニルスルホニル）エチルカーボネート、ビニルカーボネート、アリルカーボネートおよびｐ−ニトロベンジルカーボネート）が挙げられる。このようなシリルエーテルの例としては、トリメチルシリルエーテル、トリエチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジフェニルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテルおよび他のトリアルキルシリルエーテルが挙げられる。アルキルエーテルとしては、メチルエーテル、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、トリチルエーテル、ｔ−ブチルエーテル、アリルエーテルおよびアリルオキシカルボニルエーテルまたは誘導体が挙げられる。アルコキシアルキルエーテルとしては、アセタール（例えば、メトキシメチルエーテル、メチルチオメチルエーテル、（２−メトキシエトキシ）メチルエーテル、ベンジルオキシメチルエーテル、β−（トリメチルシリル）エトキシメチルエーテルおよびテトラヒドロピラニルエーテル）が挙げられる。アリールアルキルエーテルの例としては、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル（ＭＰＭ）、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、Ｏ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ハロベンジルエーテル、２，６−ジクロロベンジルエーテル、ｐ−シアノベンジルエーテル、２−ピコリルエーテルおよび４−ピコリルエーテルが挙げられる。
【００８９】
他の実施形態において、式ＩｃのＲ２は、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２である。
【００９０】
一定の実施形態において、式ＩｃのＲ１は、水素である。
【００９１】
他の実施形態において、式ＩｃのＲ１は、−ＯＨである。
【００９２】
なおも他の実施形態によれば、式ＩｃのＲ１は、適切に保護されたヒドロキシル基である。このような適切なヒドロキシル基としては、Ｒ２基について上で説明した基が挙げられる。
【００９３】
本発明のなおも別の実施形態は、式Ｉｄの化合物：
【００９４】
【化３１】
2008526877.tif 000012
ここで：
Ｒ１は、ＯＨ、適切に保護されたヒドロキシル基または水素であり；
Ｒ２は、適切なヒドロキシル保護基、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＮＨ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり；
Ｒ３は、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり、ここでＲ３は、必要に応じてＬ−Ｒ４で置換されており；
各Ｌは、独立して切断可能なリンカー基であり；そして
各Ｒ４は、独立して検出可能な部分である、
を提供する。
【００９５】
一定の実施形態において、式ＩｄのＲ３基は、Ｌ−Ｒ４で置換されている。
【００９６】
一定の実施形態において、式ＩｄのＲ３基は、核酸塩基である。このような核酸塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルが挙げられる。このような核酸塩基としては、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンまたは２−アミノプリンもまた挙げられる。
【００９７】
他の実施形態において、式ＩｄのＲ３基は、核酸塩基模倣物である。このような核酸塩基模倣物は、当業者に公知であり、それらとしては、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ様式で天然核酸塩基と適切な水素結合、すなわち、塩基対を形成するものが挙げられる。あるいは、このような核酸塩基模倣物は、いかなる水素結合も形成しないかもしれないが、二重鎖ＤＮＡにおいて天然核酸塩基と同程度の効率で効率的に納まる。
【００９８】
上記で概要を説明したように、式ＩｄのＬ基は、存在する場合、切断可能なリンカー基である。このような基は、一般に当該分野で公知であり、それらとしては、米国特許第６，６６４，０７９号、同第６，６６４，０７９号、同第６，５１１，８０３号、米国出願公開２００３１０４４３７、ＷＯ０４／１８４９７およびＷＯ０３／４８３８７（これらの全体が本明細書によって本明細書中に参考として援用される）に記載されている基が挙げられる。Ｒ３が、Ｌ−Ｒ４で置換されているとき、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成がなおも可能である条件で、Ｌ−Ｒ４基は、核酸塩基上の任意の位置で結合され得る。
【００９９】
一定の実施形態において、Ｌは、検出可能なＲ４基に結合するために末端に官能基部分を有する。このような官能基部分は、当業者に明らかであり、特定の利用される検出可能なＲ４基に適したものである。このような官能基部分の例としては、アミノ基、アルデヒド基、ヒドロキシル基、カルボン酸基またはチオール基が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１００】
一定の実施形態において、式ＩｄのＲ２基は、適切なヒドロキシル保護基である。ヒドロキシル保護基は、当該分野で周知であり、それらとしては、その全体が本明細書中に参考として援用される、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９に詳細に説明されている基が挙げられる。Ｒ２部分の適切なヒドロキシル保護基の例としては、さらに、エステル、アリルエーテル、エーテル、シリルエーテル、アルキルエーテル、アリールアルキルエーテルおよびアルコキシアルキルエーテルが挙げられるが、これらに限定されない。このようなエステルの例としては、ホルメート、アセテート、カーボネートおよびスルホネートが挙げられる。特定の例としては、ホルメート、ベンゾイルホルメート、クロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、３−フェニルプロピオネート、４−オキソペンタノエート、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノエート、ピバロエート（トリメチルアセチル）、クロトネート、４−メトキシ−クロトネート、ベンゾエート、ｐ−ベニルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート、カーボネート（例えば、メチルカーボネート、９−フルオレンイルメチルカーボネート、エチルカーボネート、２，２，２−トリクロロエチルカーボネート、２−（トリメチルシリル）エチルカーボネート、２−（フェニルスルホニル）エチルカーボネート、ビニルカーボネート、アリルカーボネートおよびｐ−ニトロベンジルカーボネート）が挙げられる。このようなシリルエーテルの例としては、トリメチルシリルエーテル、トリエチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジフェニルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテルおよび他のトリアルキルシリルエーテルが挙げられる。アルキルエーテルとしては、メチルエーテル、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、トリチルエーテル、ｔ−ブチルエーテル、アリルエーテルおよびアリルオキシカルボニルエーテルまたは誘導体が挙げられる。アルコキシアルキルエーテルとしては、アセタール（例えば、メトキシメチルエーテル、メチルチオメチルエーテル、（２−メトキシエトキシ）メチルエーテル、ベンジルオキシメチルエーテル、β−（トリメチルシリル）エトキシメチルエーテルおよびテトラヒドロピラニルエーテル）が挙げられる。アリールアルキルエーテルの例としては、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル（ＭＰＭ）、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、Ｏ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ハロベンジルエーテル、２，６−ジクロロベンジルエーテル、ｐ−シアノベンジルエーテル、２−ピコリルエーテルおよび４−ピコリルエーテルが挙げられる。
【０１０１】
他の実施形態において、式ＩｄのＲ２は、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２である。
【０１０２】
一定の実施形態において、式ＩｄのＲ１は、水素である。
【０１０３】
他の実施形態において、式ＩｄのＲ１は、−ＯＨである。
【０１０４】
なおも他の実施形態によれば、式ＩｄのＲ１は、適切に保護されたヒドロキシル基である。このような適切なヒドロキシル基としては、Ｒ２基について上で説明された基が挙げられる。
【０１０５】
上記で概要を説明したように、本発明はまた、式ＩＩの化合物：
【０１０６】
【化３２】
2008526877.tif 000013
であって、ここで：
Ｒ１ａは、水素またはチオール保護基であり、そして必要に応じてＬａ−Ｒ４ａで置換されており；
Ｒ２ａは、適切なヒドロキシル保護基、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＮＨ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり；
Ｒ３ａは、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり、ここでＲ３ａは、必要に応じてＬａ−Ｒ４ａで置換されており；
Ｒ５ａは、水素または適切なヒドロキシル保護基であり；
各Ｌａは、独立して切断可能なリンカー基であり；そして
各Ｒ４ａは、独立して検出可能な部分である；
但し：Ｒ１ａまたはＲ３ａのうちの少なくとも１つは、Ｌａ−Ｒ４ａで置換されている、化合物
を提供する。
【０１０７】
一定の実施形態において、式ＩＩのＲ３ａ基は、Ｌａ−Ｒ４ａで置換されている。他の実施形態において、式ＩＩのＲ３ａ基は、Ｌａ−Ｒ４ａで置換されており、Ｒ５ａは、Ｌａ−Ｒ４ａを切断するために使用されるのと同じ条件下で除去することができるチオール保護基である。
【０１０８】
一定の実施形態において、式ＩＩのＲ３ａ基は、核酸塩基である。このような核酸塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルが挙げられる。このような核酸塩基としては、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンまたは２−アミノプリンもまた挙げられる。
【０１０９】
他の実施形態において、式ＩＩのＲ３ａ基は、核酸塩基模倣物である。このような核酸塩基模倣物は、当業者に公知であり、それらとしては、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ様式で天然核酸塩基と適切な水素結合、すなわち、塩基対を形成するものが挙げられる。あるいは、このような核酸塩基模倣物は、いかなる水素結合も形成しないかもしれないが、二重鎖ＤＮＡにおいて天然核酸塩基と同程度の効率で効率的に納まる。
【０１１０】
上記で概要を説明したように、式ＩＩのＬａ基は、切断可能なリンカー基である。このような基は、一般に当該分野で公知であり、それらとしては、米国特許第６，６６４，０７９号、同第６，６６４，０７９号、同第６，５１１，８０３号、米国出願公開番号２００３１０４４３７、ＷＯ０４／１８４９７およびＷＯ０３／４８３８７（これらの全体が本明細書によって本明細書中に参考として援用される）に記載されている基が挙げられる。Ｒ３ａがＬａ−Ｒ４ａで置換されているとき、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成がなおも可能である条件で、Ｌａ−Ｒ４ａ基は、核酸塩基上の任意の位置で結合され得る。
【０１１１】
一定の実施形態において、Ｌａは、検出可能なＲ４ａ部分に結合するために末端に官能基部分を有する。このような官能基部分は、当業者に明らかであり、特定の利用される検出可能なＲ４ａ部分に適したものである。このような官能基部分の例としては、アミノ基、アルデヒド基、ヒドロキシル基、カルボン酸基またはチオール基が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】
チオール保護基は、当該分野で周知であり、それらとしては、その全体が本明細書中に参考として援用される、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９に詳細に説明されている基が挙げられる。式ＩＩのＲ１ａ部分の適切なチオール保護基としては、ジスルフィド、チオエーテル、シリルチオエーテル、チオエステル、チオカーボネート、チオカルバメートなどが挙げられるが、これらに限定されない。このような基の例としては、アルキルチオエーテル、ベンジルおよび置換されているベンジルチオエーテル、トリフェニルメチルチオエーテル、トリクロロエトキシカルボニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。一定の実施形態において、式ＩＩのＲ１ａ部分のチオール保護基は、−Ｓ−Ｓ−ピリジン−２−イルである。
【０１１３】
本発明の１つの態様によれば、式ＩＩのＲ１ａ部分は、例えば、ＡｇＮＯ３、ＨｇＣｌ２などを用いた中性の条件下で除去することができるチオール保護基である。他の中性の条件としては、適切な還元剤を使用する還元が挙げられる。適切な還元剤としては、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエタノール、亜ジチオン酸塩、還元グルタチオン、還元グルタレドキシン、還元チオレドキシン、トリスカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）などの置換されているホスフィンおよび他の任意のペプチドもしくは有機物に基づく還元剤または当業者に公知の他の試薬が挙げられる。本発明の別の態様によれば、式ＩＩのＲ１ａ部分は、ｐＨが約４〜約９である条件下で切断されるチオール保護基である。本発明のなおも別の態様によれば、式ＩＩのＲ１ａ部分は、「光切断性」であるチオール保護基である。このような適切なチオール保護基は、当該分野で公知であり、それらとしては、ニトロベンジル基、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）基、トリチル基、−ＣＨ２ＳＣＨ３（ＭＴＭ）、ジメチルメトキシメチルまたは−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−ピリジン−２−イルが挙げられるが、これらに限定されない。適切なヒドロキシル保護基の多くが、本明細書中に説明されるように、チオール保護基としても適当であることを当業者は理解するだろう。
【０１１４】
一定の実施形態において、式ＩＩのＲ２ａ基は、適切なヒドロキシル保護基である。ヒドロキシル保護基は、当該分野で周知であり、それらとしては、その全体が本明細書中に参考として援用される、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９に詳細に説明される基が挙げられる。Ｒ２部分の適切なヒドロキシル保護基の例としては、さらに、エステル、アリルエーテル、エーテル、シリルエーテル、アルキルエーテル、アリールアルキルエーテルおよびアルコキシアルキルエーテルが挙げられるが、これらに限定されない。このようなエステルの例としては、ホルメート、アセテート、カーボネートおよびスルホネートが挙げられる。特定の例としては、ホルメート、ベンゾイルホルメート、クロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、３−フェニルプロピオネート、４−オキソペンタノエート、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノエート、ピバロエート（トリメチルアセチル）、クロトネート、４−メトキシ−クロトネート、ベンゾエート、ｐ−ベニルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート、カーボネート（例えば、メチルカーボネート、９−フルオレンイルメチルカーボネート、エチルカーボネート、２，２，２−トリクロロエチルカーボネート、２−（トリメチルシリル）エチルカーボネート、２−（フェニルスルホニル）エチルカーボネート、ビニルカーボネート、アリルカーボネートおよびｐ−ニトロベンジルカーボネート）が挙げられる。このようなシリルエーテルの例としては、トリメチルシリルエーテル、トリエチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジフェニルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテルおよび他のトリアルキルシリルエーテルが挙げられる。アルキルエーテルとしては、メチルエーテル、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、トリチルエーテル、ｔ−ブチルエーテル、アリルエーテルおよびアリルオキシカルボニルエーテルまたは誘導体が挙げられる。アルコキシアルキルエーテルとしては、アセタール（例えば、メトキシメチルエーテル、メチルチオメチルエーテル、（２−メトキシエトキシ）メチルエーテル、ベンジルオキシメチルエーテル、β−（トリメチルシリル）エトキシメチルエーテルおよびテトラヒドロピラニルエーテル）が挙げられる。アリールアルキルエーテルの例としては、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル（ＭＰＭ）、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、Ｏ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ハロベンジルエーテル、２，６−ジクロロベンジルエーテル、ｐ−シアノベンジルエーテル、２−ピコリルエーテルおよび４−ピコリルエーテルが挙げられる。
【０１１５】
他の実施形態において、式ＩＩのＲ２ａ基は、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２である。
【０１１６】
一定の実施形態において、式ＩＩのＲ５ａ基は、水素である。
【０１１７】
なおも他の実施形態によれば、式ＩＩのＲ５ａ基は、適切に保護されたヒドロキシル基である。このような適切なヒドロキシル基としては、Ｒ２ａ基について上で説明された基が挙げられる。
【０１１８】
一定の実施形態において、本発明は、式ＩＩａの化合物：
【０１１９】
【化３３】
2008526877.tif 000014
ここで：
Ｒ２ａは、適切なヒドロキシル保護基、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＮＨ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり；
Ｒ３ａは、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり、ここでＲ３ａは、必要に応じてＬａ−Ｒ４ａで置換されており；
Ｒ５ａは、水素または適切なヒドロキシル保護基であり；
Ｌａは、切断可能なリンカー基であり；そして
Ｒ４ａは、検出可能な部分である、
を提供する。
【０１２０】
一定の実施形態において、式ＩＩａのＲ３ａ基は、核酸塩基である。このような核酸塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルが挙げられる。このような核酸塩基としては、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンまたは２−アミノプリンもまた挙げられる。
【０１２１】
他の実施形態において、式ＩＩａのＲ３ａ基は、核酸塩基模倣物である。このような核酸塩基模倣物は、当業者に公知であり、それらとしては、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ様式で天然核酸塩基と適切な水素結合、すなわち、塩基対を形成するものが挙げられる。あるいは、このような核酸塩基模倣物は、いかなる水素結合も形成しないかもしれないが、二重鎖ＤＮＡにおいて天然核酸塩基と同程度の効率で効率的に納まる。
【０１２２】
上記で概要を説明したように、式ＩＩａのＬａ基は、切断可能なリンカー基である。このような基は、一般に当該分野で公知であり、それらとしては、米国特許第６，６６４，０７９号、同第６，６６４，０７９号、同第６，５１１，８０３号、米国出願公開番号２００３１０４４３７、ＷＯ０４／１８４９７およびＷＯ０３／４８３８７（これらの全体が本明細書によって本明細書中に参考として援用される）に記載されている基が挙げられる。Ｒ３ａがＬａ−Ｒ４ａで置換されるとき、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成がなおも可能である条件で、Ｌａ−Ｒ４ａ基は、核酸塩基上の任意の位置で結合され得る。プリン塩基の場合は、リンカーが、プリンもしくは好ましくはデアザプリンアナログの７位、８−改変プリン、Ｎ−６改変アデノシンまたはＮ−２改変グアニンを介して結合している場合が好ましい。ピリミジンについては、シチジン、チミジンまたはウラシルの５位およびシトシンのＮ−４位を介する結合が好ましい。
【０１２３】
一定の実施形態において、Ｌａは、検出可能なＲ４ａ部分に結合するために末端に官能基部分を有する。このような官能基部分は、当業者に明らかであり、特定の利用される検出可能なＲ４ａ部分に適したものである。このような官能基部分の例としては、アミノ基、アルデヒド基、ヒドロキシル基、カルボン酸基またはチオール基が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２４】
一定の実施形態において、式ＩＩａのＲ２ａ基は、適切なヒドロキシル保護基である。ヒドロキシル保護基は、当該分野で周知であり、それらとしては、その全体が本明細書中に参考として援用される、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９に詳細に説明されている基が挙げられる。Ｒ２部分の適切なヒドロキシル保護基の例としては、さらに、エステル、アリルエーテル、エーテル、シリルエーテル、アルキルエーテル、アリールアルキルエーテルおよびアルコキシアルキルエーテルが挙げられるが、これらに限定されない。このようなエステルの例としては、ホルメート、アセテート、カーボネートおよびスルホネートが挙げられる。特定の例としては、ホルメート、ベンゾイルホルメート、クロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、３−フェニルプロピオネート、４−オキソペンタノエート、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノエート、ピバロエート（トリメチルアセチル）、クロトネート、４−メトキシ−クロトネート、ベンゾエート、ｐ−ベニルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート、カーボネート（例えば、メチルカーボネート、９−フルオレンイルメチルカーボネート、エチルカーボネート、２，２，２−トリクロロエチルカーボネート、２−（トリメチルシリル）エチルカーボネート、２−（フェニルスルホニル）エチルカーボネート、ビニルカーボネート、アリルカーボネートおよびｐ−ニトロベンジルカーボネート）が挙げられる。このようなシリルエーテルの例としては、トリメチルシリルエーテル、トリエチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジフェニルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテルおよび他のトリアルキルシリルエーテルが挙げられる。アルキルエーテルとしては、メチルエーテル、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、トリチルエーテル、ｔ−ブチルエーテル、アリルエーテルおよびアリルオキシカルボニルエーテルまたは誘導体が挙げられる。アルコキシアルキルエーテルとしては、アセタール（例えば、メトキシメチルエーテル、メチルチオメチルエーテル、（２−メトキシエトキシ）メチルエーテル、ベンジルオキシメチルエーテル、β−（トリメチルシリル）エトキシメチルエーテルおよびテトラヒドロピラニルエーテル）が挙げられる。アリールアルキルエーテルの例としては、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル（ＭＰＭ）、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、Ｏ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ハロベンジルエーテル、２，６−ジクロロベンジルエーテル、ｐ−シアノベンジルエーテル、２−ピコリルエーテルおよび４−ピコリルエーテルが挙げられる。
【０１２５】
他の実施形態において、式ＩＩａのＲ２ａ基は、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２である。
【０１２６】
一定の実施形態において、式ＩＩａのＲ５ａ基は、水素である。
【０１２７】
なおも他の実施形態によれば、式ＩＩａのＲ５ａ基は、適切に保護されたヒドロキシル基である。このような適切なヒドロキシル基としては、Ｒ２ａ基について上で説明した基が挙げられる。
【０１２８】
一定の実施形態において、本発明は、式ＩＩｂの化合物：
【０１２９】
【化３４】
2008526877.tif 000015
ここで：
Ｒ２ａは、適切なヒドロキシル保護基、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＮＨ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり；
Ｒ３ａは、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり、ここでＲ３ａは、必要に応じてＬａ−Ｒ４ａで置換されており；
Ｒ５ａは、水素または適切なヒドロキシル保護基であり；
Ｔａは、酸素、硫黄、ＮＨまたは必要に応じて置換されているフェニルであり；
各Ｌａは、独立して切断可能なリンカー基であり；そして
各Ｒ４ａは、独立して検出可能な部分である、
を提供する。
【０１３０】
一定の実施形態において、式ＩＩｂのＲ３ａ基は、核酸塩基である。このような核酸塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルが挙げられる。このような核酸塩基としては、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンまたは２−アミノプリンもまた挙げられる。
【０１３１】
他の実施形態において、式ＩＩｂのＲ３ａ基は、核酸塩基模倣物である。このような核酸塩基模倣物は、当業者に公知であり、それらとしては、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ様式で天然核酸塩基と適切な水素結合、すなわち、塩基対を形成するものが挙げられる。あるいは、このような核酸塩基模倣物は、いかなる水素結合も形成しないかもしれないが、二重鎖ＤＮＡにおいて天然核酸塩基と同程度の効率で効率的に納まる。
【０１３２】
上記で概要を説明したように、式ＩＩｂのＬａ基は、切断可能なリンカー基である。このような基は、一般に当該分野で公知であり、それらとしては、米国特許第６，６６４，０７９号、同第６，６６４，０７９号、同第６，５１１，８０３号、米国出願公開番号２００３１０４４３７、ＷＯ０４／１８４９７およびＷＯ０３／４８３８７（これらの全体が本明細書によって本明細書中に参考として援用される）に記載されている基が挙げられる。Ｒ３ａがＬａ−Ｒ４ａで置換されているとき、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成がなおも可能である条件で、Ｌａ−Ｒ４ａ基は、核酸塩基上の任意の位置で結合され得る。
【０１３３】
一定の実施形態において、Ｌａは、検出可能なＲ４ａ部分に結合するために末端に官能基部分を有する。このような官能基部分は、当業者に明らかであり、特定の利用される検出可能なＲ４ａ部分に適したものである。このような官能基部分の例としては、アミノ基、アルデヒド基、ヒドロキシル基、カルボン酸基またはチオール基が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３４】
一定の実施形態において、式ＩＩｂのＲ２ａ基は、適切なヒドロキシル保護基である。ヒドロキシル保護基は、当該分野で周知であり、それらとしては、その全体が本明細書中に参考として援用される、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９に詳細に説明されている基が挙げられる。Ｒ２部分の適切なヒドロキシル保護基の例としては、さらに、エステル、アリルエーテル、エーテル、シリルエーテル、アルキルエーテル、アリールアルキルエーテルおよびアルコキシアルキルエーテルが挙げられるが、これらに限定されない。このようなエステルの例としては、ホルメート、アセテート、カーボネートおよびスルホネートが挙げられる。特定の例としては、ホルメート、ベンゾイルホルメート、クロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、３−フェニルプロピオネート、４−オキソペンタノエート、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノエート、ピバロエート（トリメチルアセチル）、クロトネート、４−メトキシ−クロトネート、ベンゾエート、ｐ−ベニルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート、カーボネート（例えば、メチルカーボネート、９−フルオレンイルメチルカーボネート、エチルカーボネート、２，２，２−トリクロロエチルカーボネート、２−（トリメチルシリル）エチルカーボネート、２−（フェニルスルホニル）エチルカーボネート、ビニルカーボネート、アリルカーボネートおよびｐ−ニトロベンジルカーボネート）が挙げられる。このようなシリルエーテルの例としては、トリメチルシリルエーテル、トリエチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジフェニルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテルおよび他のトリアルキルシリルエーテルが挙げられる。アルキルエーテルとしては、メチルエーテル、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、トリチルエーテル、ｔ−ブチルエーテル、アリルエーテルおよびアリルオキシカルボニルエーテルまたは誘導体が挙げられる。アルコキシアルキルエーテルとしては、アセタール（例えば、メトキシメチルエーテル、メチルチオメチルエーテル、（２−メトキシエトキシ）メチルエーテル、ベンジルオキシメチルエーテル、β−（トリメチルシリル）エトキシメチルエーテルおよびテトラヒドロピラニルエーテル）が挙げられる。アリールアルキルエーテルの例としては、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル（ＭＰＭ）、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、Ｏ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ハロベンジルエーテル、２，６−ジクロロベンジルエーテル、ｐ−シアノベンジルエーテル、２−ピコリルエーテルおよび４−ピコリルエーテルが挙げられる。
【０１３５】
他の実施形態において、式ＩＩｂのＲ２ａ基は、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２である。
【０１３６】
一定の実施形態において、式ＩＩｂのＲ５ａ基は、水素である。
【０１３７】
なおも別の実施形態によれば、式ＩＩｂのＲ５ａ基は、適切に保護されたヒドロキシル基である。このような適切なヒドロキシル基としては、Ｒ２ａ基について上で説明した基が挙げられる。
【０１３８】
本発明はまた、式ＩＩｃの化合物：
【０１３９】
【化３５】
2008526877.tif 000016
ここで：
Ｗａは、Ｏ（Ｃ１〜４脂肪族）またはＳ（Ｃ１〜４脂肪族）であり；
Ｗｂは、Ｃ１〜４脂肪族であり；
Ｒ２ａは、適切なヒドロキシル保護基、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＮＨ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり；
Ｒ３ａは、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり、ここでＲ３ａは、必要に応じてＬａ−Ｒ４ａで置換されており；
Ｒ５ａは、水素または適切なヒドロキシル保護基であり；
各Ｌａは、独立して切断可能なリンカー基であり；そして
各Ｒ４ａは、独立して検出可能な部分である、
を提供する。
【０１４０】
一定の実施形態において、式ＩＩｃのＷａ基は、−ＯＣＨ３または−ＳＣＨ３である。他の実施形態において、式ＩＩｃのＷｂ基は、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３などである。
【０１４１】
一定の実施形態において、式ＩＩｃのＲ３ａ基は、核酸塩基である。このような核酸塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルが挙げられる。このような核酸塩基としては、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンまたは２−アミノプリンもまた挙げられる。
【０１４２】
他の実施形態において、式ＩＩｃのＲ３ａ基は、核酸塩基模倣物である。このような核酸塩基模倣物は、当業者に公知であり、それらとしては、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ様式で天然核酸塩基と適切な水素結合、すなわち、塩基対を形成するものが挙げられる。あるいは、このような核酸塩基模倣物は、いかなる水素結合も形成しないかもしれないが、二重鎖ＤＮＡにおいて天然核酸塩基と同程度の効率で効率的に納まる。
【０１４３】
上記で概要を説明したように、式ＩＩｃのＬａ基は、切断可能なリンカー基である。このような基は、一般に当該分野で公知であり、それらとしては、および米国特許第６，６６４，０７９号、同第６，６６４，０７９号、同第６，５１１，８０３号、米国出願公開番号２００３１０４４３７、ＷＯ０４／１８４９７およびＷＯ０３／４８３８７（これらの全体が本明細書によって本明細書中に参考として援用される）に記載されている基が挙げられる。Ｒ３ａがＬａ−Ｒ４ａで置換されているとき、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成がなおも可能である条件で、Ｌａ−Ｒ４ａ基は、核酸塩基上の任意の位置で結合され得る。
【０１４４】
一定の実施形態において、Ｌａは、検出可能なＲ４ａ部分に結合するために末端に官能基部分を有する。このような官能基部分は、当業者に明らかであり、特定の利用される検出可能なＲ４ａ部分に適したものである。このような官能基部分の例としては、アミノ基、アルデヒド基、ヒドロキシル基、カルボン酸基またはチオール基が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４５】
一定の実施形態において、式ＩＩｃのＲ２ａ基は、適切なヒドロキシル保護基である。ヒドロキシル保護基は、当該分野で周知であり、それらとしては、その全体が本明細書中に参考として援用される、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９に詳細に説明されている基が挙げられる。Ｒ２部分の適切なヒドロキシル保護基の例としては、さらに、エステル、アリルエーテル、エーテル、シリルエーテル、アルキルエーテル、アリールアルキルエーテルおよびアルコキシアルキルエーテルが挙げられるが、これらに限定されない。このようなエステルの例としては、ホルメート、アセテート、カーボネートおよびスルホネートが挙げられる。特定の例としては、ホルメート、ベンゾイルホルメート、クロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、３−フェニルプロピオネート、４−オキソペンタノエート、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノエート、ピバロエート（トリメチルアセチル）、クロトネート、４−メトキシ−クロトネート、ベンゾエート、ｐ−ベニルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート、カーボネート（例えば、メチルカーボネート、９−フルオレンイルメチルカーボネート、エチルカーボネート、２，２，２−トリクロロエチルカーボネート、２−（トリメチルシリル）エチルカーボネート、２−（フェニルスルホニル）エチルカーボネート、ビニルカーボネート、アリルカーボネートおよびｐ−ニトロベンジルカーボネート）が挙げられる。このようなシリルエーテルの例としては、トリメチルシリルエーテル、トリエチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジフェニルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテルおよび他のトリアルキルシリルエーテルが挙げられる。アルキルエーテルとしては、メチルエーテル、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、トリチルエーテル、ｔ−ブチルエーテル、アリルエーテルおよびアリルオキシカルボニルエーテルまたは誘導体が挙げられる。アルコキシアルキルエーテルとしては、アセタール（例えば、メトキシメチルエーテル、メチルチオメチルエーテル、（２−メトキシエトキシ）メチルエーテル、ベンジルオキシメチルエーテル、β−（トリメチルシリル）エトキシメチルエーテルおよびテトラヒドロピラニルエーテル）が挙げられる。アリールアルキルエーテルの例としては、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル（ＭＰＭ）、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、Ｏ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ハロベンジルエーテル、２，６−ジクロロベンジルエーテル、ｐ−シアノベンジルエーテル、２−ピコリルエーテルおよび４−ピコリルエーテルが挙げられる。
【０１４６】
他の実施形態において、式ＩＩｃのＲ２ａは、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２である。
【０１４７】
一定の実施形態において、式ＩＩｃのＲ５ａ基は、水素である。
【０１４８】
なおも他の実施形態によれば、式ＩＩｃのＲ５ａ基は、適切に保護されたヒドロキシル基である。このような適切なヒドロキシル基としては、Ｒ２ａ基について上で説明した基が挙げられる。
【０１４９】
一定の実施形態において、本発明は、式ＩＩｄの化合物：
【０１５０】
【化３６】
2008526877.tif 000017
ここで：
Ｒ２ａは、適切なヒドロキシル保護基、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＮＨ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり；
Ｒ３ａは、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり、ここでＲ３ａは、Ｌａ−Ｒ４ａで置換されており；
Ｒ５ａは、水素または適切なヒドロキシル保護基であり；
Ｌａは、切断可能なリンカー基であり；そして
Ｒ４ａは、検出可能な部分である、
を提供する。
【０１５１】
一定の実施形態において、式ＩＩｄのＲ３ａ基は、核酸塩基である。このような核酸塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルが挙げられる。このような核酸塩基としては、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンまたは２−アミノプリンもまた挙げられる。
【０１５２】
他の実施形態において、式ＩＩｄのＲ３ａ基は、核酸塩基模倣物である。
このような核酸塩基模倣物は、当業者に公知であり、それらとしては、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ様式で天然核酸塩基と適切な水素結合、すなわち、塩基対を形成するものが挙げられる。あるいは、このような核酸塩基模倣物は、いかなる水素結合も形成しないかもしれないが、二重鎖ＤＮＡにおいて天然核酸塩基と同程度の効率で効率的に納まる。
【０１５３】
上記で概要を説明したように、式ＩＩｄのＬａ基は、存在する場合、切断可能なリンカー基である。このような基は、一般に当該分野で公知であり、それらとしては、米国特許第６，６６４，０７９号、同第６，６６４，０７９号、同第６，５１１，８０３号、米国出願公開番号２００３１０４４３７、ＷＯ０４／１８４９７およびＷＯ０３／４８３８７（これらの全体が本明細書によって本明細書中に参考として援用される）に記載されている基が挙げられる。Ｒ３ａがＬａ−Ｒ４ａで置換されているとき、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成がなおも可能である条件で、Ｌａ−Ｒ４ａ基は、核酸塩基上の任意の位置で結合され得る。
【０１５４】
一定の実施形態において、Ｌａは、検出可能なＲ４ａ部分に結合するために末端に官能基部分を有する。このような官能基部分は、当業者に明らかであり、特定の利用される検出可能なＲ４ａ部分に適したものである。このような官能基部分の例としては、アミノ基、アルデヒド基、ヒドロキシル基、カルボン酸基またはチオール基が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５５】
一定の実施形態において、式ＩＩｄのＲ２ａ基は、適切なヒドロキシル保護基である。ヒドロキシル保護基は、当該分野で周知であり、それらとしては、その全体が本明細書中に参考として援用される、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９に詳細に説明されている基が挙げられる。Ｒ２部分の適切なヒドロキシル保護基の例としては、さらに、エステル、アリルエーテル、エーテル、シリルエーテル、アルキルエーテル、アリールアルキルエーテルおよびアルコキシアルキルエーテルが挙げられるが、これらに限定されない。このようなエステルの例としては、ホルメート、アセテート、カーボネートおよびスルホネートが挙げられる。特定の例としては、ホルメート、ベンゾイルホルメート、クロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、３−フェニルプロピオネート、４−オキソペンタノエート、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノエート、ピバロエート（トリメチルアセチル）、クロトネート、４−メトキシ−クロトネート、ベンゾエート、ｐ−ベニルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート、カーボネート（例えば、メチルカーボネート、９−フルオレンイルメチルカーボネート、エチルカーボネート、２，２，２−トリクロロエチルカーボネート、２−（トリメチルシリル）エチルカーボネート、２−（フェニルスルホニル）エチルカーボネート、ビニルカーボネート、アリルカーボネートおよびｐ−ニトロベンジルカーボネート）が挙げられる。このようなシリルエーテルの例としては、トリメチルシリルエーテル、トリエチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジフェニルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテルおよび他のトリアルキルシリルエーテルが挙げられる。アルキルエーテルとしては、メチルエーテル、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、トリチルエーテル、ｔ−ブチルエーテル、アリルエーテルおよびアリルオキシカルボニルエーテルまたは誘導体が挙げられる。アルコキシアルキルエーテルとしては、アセタール（例えば、メトキシメチルエーテル、メチルチオメチルエーテル、（２−メトキシエトキシ）メチルエーテル、ベンジルオキシメチルエーテル、β−（トリメチルシリル）エトキシメチルエーテルおよびテトラヒドロピラニルエーテル）が挙げられる。アリールアルキルエーテルの例としては、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル（ＭＰＭ）、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、Ｏ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ハロベンジルエーテル、２，６−ジクロロベンジルエーテル、ｐ−シアノベンジルエーテル、２−ピコリルエーテルおよび４−ピコリルエーテルが挙げられる。
【０１５６】
他の実施形態において、式ＩＩｄのＲ２ａ基は、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２である。
【０１５７】
一定の実施形態において、式ＩＩｄのＲ５ａ基は、水素である。
【０１５８】
なおも他の実施形態によれば、式ＩＩｄのＲ５ａ基は、適切に保護されたヒドロキシル基である。このような適切なヒドロキシル基としては、Ｒ２ａ基について上で説明した基が挙げられる。
【０１５９】
上記で概要を説明したように、本発明は、式ＩＩＩの化合物：
【０１６０】
【化３７】
2008526877.tif 000018
であって、ここで：
Ｒ１ｂは、ＯＨ、適切に保護されたヒドロキシル基または水素であり；
Ｑは、酸素または硫黄であり；
Ｒ６は、ＱがＯであるとき適切なヒドロキシル保護基であるか、またはＱがＳであるとき適切なチオール保護基であり、そして必要に応じてＬｂ−Ｒ４ｂで置換されており；
Ｒ３ｂは、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり、ここでＲ３ｂは、必要に応じてＬｂ−Ｒ４ｂで置換されており；
Ｒ５ｂは、水素または適切なヒドロキシル保護基であり；
各Ｌｂは、独立して切断可能なリンカー基であり；そして
各Ｒ４ｂは、独立して検出可能な部分である；
但し、Ｒ６またはＲ３ｂのうちの少なくとも１つはＬｂ−Ｒ４ｂで置換されている、化合物
を提供する。
【０１６１】
一定の実施形態において、式ＩＩＩのＲ３ｂ基は、Ｌｂ−Ｒ４ｂで置換されている。他の実施形態において、Ｒ３ｂは、Ｌｂ−Ｒ４ｂで置換されており、Ｒ６は、Ｌｂ−Ｒ４ｂを切断するために使用されるのと同じ条件下で除去することができるヒドロキシル保護基またはチオール保護基である。
【０１６２】
本発明の１つの態様によれば、式ＩＩＩのＱ基は、Ｏである。
【０１６３】
本発明の別の態様によれば、式ＩＩＩのＱ基は、Ｓである。
【０１６４】
一定の実施形態において、式ＩＩＩのＲ３ｂ基は、核酸塩基である。このような核酸塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルが挙げられる。このような核酸塩基としては、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンまたは２−アミノプリンもまた挙げられる。
【０１６５】
他の実施形態において、式ＩＩＩのＲ３ｂ基は、核酸塩基模倣物である。このような核酸塩基模倣物は、当業者に公知であり、それらとしては、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ様式で天然核酸塩基と適切な水素結合、すなわち、塩基対を形成するものが挙げられる。あるいは、このような核酸塩基模倣物は、いかなる水素結合も形成しないかもしれないが、二重鎖ＤＮＡにおいて天然核酸塩基と同程度の効率で効率的に納まる。
【０１６６】
上記で概要を説明したように、式ＩＩＩのＬｂ基は、切断可能なリンカー基である。このような基は、一般に当該分野で公知であり、それらとしては、米国特許第６，６６４，０７９号、同第６，６６４，０７９号、同第６，５１１，８０３号、米国出願公開番号２００３１０４４３７、ＷＯ０４／１８４９７およびＷＯ０３／４８３８７（これらの全体が本明細書によって本明細書中に参考として援用される）に記載されている基が挙げられる。Ｒ３ｂがＬｂ−Ｒ４ｂで置換されているとき、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成がなおも可能である条件で、Ｌｂ−Ｒ４ｂ基は、核酸塩基上の任意の位置で結合され得る。
【０１６７】
一定の実施形態において、Ｌｂは、検出可能なＲ４ｂ部分に結合するために末端に官能基部分を有する。このような官能基部分は、当業者に明らかであり、特定の利用される検出可能なＲ４ｂ部分に適したものである。このような官能基部分の例としては、アミノ基、アルデヒド基、ヒドロキシル基、カルボン酸基またはチオール基が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６８】
チオール保護基は、当該分野で周知であり、それらとしては、その全体が、本明細書中に参考として援用される、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９に詳細に説明されている基が挙げられる。式ＩＩＩのＲ６部分の適切なチオール保護基としては、ジスルフィド、チオエーテル、シリルチオエーテル、チオエステル、チオカーボネート、チオカルバメートなどが挙げられるが、これらに限定されない。このような基の例としては、アルキルチオエーテル、ベンジルチオエーテルおよび置換されているベンジルチオエーテル、トリフェニルメチルチオエーテル、トリクロロエトキシカルボニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。一定の実施形態において、式ＩＩＩのＲ６部分のチオール保護基は、−Ｓ−Ｓ−ピリジン−２−イルである。
【０１６９】
本発明の１つの態様によれば、式ＩＩＩのＲ６部分は、例えば、ＡｇＮＯ３、ＨｇＣｌ２などを用いた中性の条件下で除去することができるチオール保護基である。他の中性の条件としては、適切な還元剤を使用する還元が挙げられる。適切な還元剤としては、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエタノール、亜ジチオン酸塩、還元グルタチオン、還元グルタレドキシン、還元チオレドキシン、トリスカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）などの置換されているホスフィンおよび他の任意のペプチドもしくは有機物に基づく還元剤または当業者に公知の他の試薬が挙げられる。本発明の別の態様によれば、式ＩＩＩのＲ６部分は、ｐＨが約４〜約９である条件下で切断されるチオール保護基である。本発明のなおも別の態様によれば、式ＩＩＩのＲ６部分は、「光切断性」であるチオール保護基である。このような適切なチオール保護基は、当該分野で公知であり、それらとしては、ニトロベンジル基、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）基、トリチル基、−ＣＨ２ＳＣＨ３（ＭＴＭ）、ジメチルメトキシメチルまたは−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−ピリジン−２−イルが挙げられるが、これらに限定されない。適切なヒドロキシル保護基の多くは、本明細書中に説明されるように、チオール保護基としても適当であることを当業者は理解するだろう。
【０１７０】
一定の実施形態において、式ＩＩＩのＲ６基は、適切なヒドロキシル保護基である。ヒドロキシル保護基は、当該分野で周知であり、それらとしては、その全体が本明細書中に参考として援用される、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９に詳細に説明されている基が挙げられる。Ｒ６部分の適切なヒドロキシル保護基の例は、さらに、エステル、アリルエーテル、エーテル、シリルエーテル、アルキルエーテル、アリールアルキルエーテルおよびアルコキシアルキルエーテルが挙げられるが、これらに限定されない。このようなエステルの例としては、ホルメート、アセテート、カーボネートおよびスルホネートが挙げられる。特定の例としては、ホルメート、ベンゾイルホルメート、クロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、３−フェニルプロピオネート、４−オキソペンタノエート、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノエート、ピバロエート（トリメチルアセチル）、クロトネート、４−メトキシ−クロトネート、ベンゾエート、ｐ−ベニルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート、カーボネート（例えば、メチルカーボネート、９−フルオレンイルメチルカーボネート、エチルカーボネート、２，２，２−トリクロロエチルカーボネート、２−（トリメチルシリル）エチルカーボネート、２−（フェニルスルホニル）エチルカーボネート、ビニルカーボネート、アリルカーボネートおよびｐ−ニトロベンジルカーボネート）が挙げられる。このようなシリルエーテルの例としては、トリメチルシリルエーテル、トリエチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジフェニルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテルおよび他のトリアルキルシリルエーテルが挙げられる。アルキルエーテルとしては、メチルエーテル、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、トリチルエーテル、ｔ−ブチルエーテル、アリルエーテルおよびアリルオキシカルボニルエーテルまたは誘導体が挙げられる。アルコキシアルキルエーテルとしては、アセタール（例えば、メトキシメチルエーテル、メチルチオメチルエーテル、（２−メトキシエトキシ）メチルエーテル、ベンジルオキシメチルエーテル、β−（トリメチルシリル）エトキシメチルエーテルおよびテトラヒドロピラニルエーテル）が挙げられる。アリールアルキルエーテルの例としては、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル（ＭＰＭ）、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、Ｏ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ハロベンジルエーテル、２，６−ジクロロベンジルエーテル、ｐ−シアノベンジルエーテル、２−ピコリルエーテルおよび４−ピコリルエーテルが挙げられる。
【０１７１】
一定の実施形態において、式ＩＩＩのＲ１ｂ基は、水素である。
【０１７２】
他の実施形態において、式ＩＩＩのＲ１ｂ基は、−ＯＨである。
【０１７３】
なおも他の実施形態によれば、式ＩＩＩのＲ１ｂは、適切に保護されたヒドロキシル基である。このような適切なヒドロキシル保護基としては、Ｒ６基について上で説明した基が挙げられる。
【０１７４】
一定の実施形態において、式ＩＩＩのＲ５ｂ基は、水素である。
【０１７５】
他の実施形態において、式ＩＩＩのＲ５ｂ基は、適切なヒドロキシル保護基である。このような適切なヒドロキシル保護基としては、Ｒ６基について上で説明した基が挙げられる。
【０１７６】
別の実施形態によれば、本発明は、式ＩＩＩａの化合物：
【０１７７】
【化３８】
2008526877.tif 000019
ここで：
Ｒ１ｂは、ＯＨ、適切に保護されたヒドロキシル基または水素であり；
Ｒ３ｂは、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり、ここでＲ３ｂは、必要に応じてＬｂ−Ｒ４ｂで置換されており；
Ｒ５ｂは、水素または適切なヒドロキシル保護基であり；
各Ｌｂは、独立して切断可能なリンカー基であり；そして
各Ｒ４ｂは、独立して検出可能な部分である、
を提供する。
【０１７８】
一定の実施形態において、式ＩＩＩａのＲ３ｂ基は、核酸塩基である。このような核酸塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルが挙げられる。このような核酸塩基としては、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンまたは２−アミノプリンもまた挙げられる。
【０１７９】
他の実施形態において、式ＩＩＩａのＲ３ｂ基は、核酸塩基模倣物である。このような核酸塩基模倣物は、当業者に公知であり、それらとしては、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ様式で天然核酸塩基と適切な水素結合、すなわち、塩基対を形成するものが挙げられる。あるいは、このような核酸塩基模倣物は、いかなる水素結合も形成しないかもしれないが、二重鎖ＤＮＡにおいて天然核酸塩基と同程度の効率で効率的に納まる。
【０１８０】
上記で概要を説明したように、式ＩＩＩａのＬｂ基は、切断可能なリンカー基である。このような基は、一般に当該分野で公知であり、それらとしては、米国特許第６，６６４，０７９号、同第６，６６４，０７９号、同第６，５１１，８０３号、米国出願公開番号２００３１０４４３７、ＷＯ０４／１８４９７およびＷＯ０３／４８３８７（これらの全体が本明細書によって本明細書中に参考として援用される）に記載されている基が挙げられる。Ｒ３ｂがＬｂ−Ｒ４ｂで置換されているとき、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成がなおも可能である条件で、Ｌｂ−Ｒ４ｂ基は、核酸塩基上の任意の位置で結合され得る。
【０１８１】
一定の実施形態において、Ｌｂは、検出可能なＲ４ｂ部分に結合するために末端に官能基部分を有する。このような官能基部分は、当業者に明らかであり、特定の利用される検出可能なＲ４ｂ部分に適したものである。このような官能基部分の例としては、アミノ基、アルデヒド基、ヒドロキシル基、カルボン酸基またはチオール基が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８２】
一定の実施形態において、式ＩＩＩａのＲ５ｂ基は、適切なヒドロキシル保護基である。ヒドロキシル保護基は、当該分野で周知であり、それらとしては、その全体が本明細書中に参考として援用される、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９に詳細に説明されている基が挙げられる。Ｒ５ｂ基の適切なヒドロキシル保護基の例としては、さらに、エステル、アリルエーテル、エーテル、シリルエーテル、アルキルエーテル、アリールアルキルエーテルおよびアルコキシアルキルエーテルが挙げられるが、これらに限定されない。このようなエステルの例としては、ホルメート、アセテート、カーボネートおよびスルホネートが挙げられる。特定の例としては、ホルメート、ベンゾイルホルメート、クロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、３−フェニルプロピオネート、４−オキソペンタノエート、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノエート、ピバロエート（トリメチルアセチル）、クロトネート、４−メトキシ−クロトネート、ベンゾエート、ｐ−ベニルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート、カーボネート（例えば、メチルカーボネート、９−フルオレンイルメチルカーボネート、エチルカーボネート、２，２，２−トリクロロエチルカーボネート、２−（トリメチルシリル）エチルカーボネート、２−（フェニルスルホニル）エチルカーボネート、ビニルカーボネート、アリルカーボネートおよびｐ−ニトロベンジルカーボネート）が挙げられる。このようなシリルエーテルの例としては、トリメチルシリルエーテル、トリエチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジフェニルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテルおよび他のトリアルキルシリルエーテルが挙げられる。アルキルエーテルとしては、メチルエーテル、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、トリチルエーテル、ｔ−ブチルエーテル、アリルエーテルおよびアリルオキシカルボニルエーテルまたは誘導体が挙げられる。アルコキシアルキルエーテルとしては、アセタール（例えば、メトキシメチルエーテル、メチルチオメチルエーテル、（２−メトキシエトキシ）メチルエーテル、ベンジルオキシメチルエーテル、β−（トリメチルシリル）エトキシメチルエーテルおよびテトラヒドロピラニルエーテル）が挙げられる。アリールアルキルエーテルの例としては、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル（ＭＰＭ）、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、Ｏ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ハロベンジルエーテル、２，６−ジクロロベンジルエーテル、ｐ−シアノベンジルエーテル、２−ピコリルエーテルおよび４−ピコリルエーテルが挙げられる。
【０１８３】
一定の実施形態において、式ＩＩＩａのＲ１ｂ基は、水素である。
【０１８４】
他の実施形態において、式ＩＩＩａのＲ１ｂ基は、−ＯＨである。
【０１８５】
なおも他の実施形態によれば、式ＩＩＩａのＲ１ｂは、適切に保護されたヒドロキシル基である。このような適切なヒドロキシル保護基としては、Ｒ５ｂ基について上で説明した基が挙げられる。
【０１８６】
別の実施形態によれば、本発明は、式ＩＩＩｂの化合物：
【０１８７】
【化３９】
2008526877.tif 000020
ここで：
Ｒ１ｂは、ＯＨ、適切に保護されたヒドロキシル基または水素であり；
Ｒ３ｂは、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり、ここでＲ３ｂは、必要に応じてＬｂ−Ｒ４ｂで置換されており；
Ｒ５ｂは、水素または適切なヒドロキシル保護基であり；
各Ｌｂは、独立して切断可能なリンカー基であり；そして
各Ｒ４ｂは、独立して検出可能な部分である、
を提供する。
【０１８８】
一定の実施形態において、式ＩＩＩｂのＲ３ｂ基は、核酸塩基である。このような核酸塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルが挙げられる。このような核酸塩基としては、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンまたは２−アミノプリンもまた挙げられる。
【０１８９】
他の実施形態において、式ＩＩＩｂのＲ３ｂ基は、核酸塩基模倣物である。このような核酸塩基模倣物は、当業者に公知であり、それらとしては、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ様式で天然核酸塩基と適切な水素結合、すなわち、塩基対を形成するものが挙げられる。あるいは、このような核酸塩基模倣物は、いかなる水素結合も形成しないかもしれないが、二重鎖ＤＮＡにおいて天然核酸塩基と同程度の効率で効率的に納まる。
【０１９０】
上記で概要を説明したように、式ＩＩＩｂのＬｂ基は、切断可能なリンカー基である。このような基は、一般に当該分野で公知であり、それらとしては、米国特許第６，６６４，０７９号、同第６，６６４，０７９号、同第６，５１１，８０３号、米国出願公開番号２００３１０４４３７、ＷＯ０４／１８４９７およびＷＯ０３／４８３８７（これらの全体が本明細書によって本明細書中に参考として援用される）に記載されている基が挙げられる。Ｒ３ｂがＬｂ−Ｒ４ｂで置換されているとき、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成がなおも可能である条件で、Ｌｂ−Ｒ４ｂ基は、核酸塩基上の任意の位置で結合され得る。
【０１９１】
一定の実施形態において、Ｌｂは、検出可能なＲ４ｂ部分に結合するために末端に官能基部分を有する。このような官能基部分は、当業者に明らかであり、特定の利用される検出可能なＲ４ｂ部分に適したものである。このような官能基部分の例としては、アミノ基、アルデヒド基、ヒドロキシル基、カルボン酸基またはチオール基が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９２】
一定の実施形態において、式ＩＩＩｂのＲ５ｂ基は、適切なヒドロキシル保護基である。ヒドロキシル保護基は、当該分野で周知であり、それらとしては、その全体が本明細書中に参考として援用される、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９に詳細に説明されている基が挙げられる。Ｒ５ｂ基の適切なヒドロキシル保護基の例としては、さらに、エステル、アリルエーテル、エーテル、シリルエーテル、アルキルエーテル、アリールアルキルエーテルおよびアルコキシアルキルエーテルが挙げられるが、これらに限定されない。このようなエステルの例としては、ホルメート、アセテート、カーボネートおよびスルホネートが挙げられる。特定の例としては、ホルメート、ベンゾイルホルメート、クロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、３−フェニルプロピオネート、４−オキソペンタノエート、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノエート、ピバロエート（トリメチルアセチル）、クロトネート、４−メトキシ−クロトネート、ベンゾエート、ｐ−ベニルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート、カーボネート（例えば、メチルカーボネート、９−フルオレンイルメチルカーボネート、エチルカーボネート、２，２，２−トリクロロエチルカーボネート、２−（トリメチルシリル）エチルカーボネート、２−（フェニルスルホニル）エチルカーボネート、ビニルカーボネート、アリルカーボネートおよびｐ−ニトロベンジルカーボネート）が挙げられる。このようなシリルエーテルの例としては、トリメチルシリルエーテル、トリエチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジフェニルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテルおよび他のトリアルキルシリルエーテルが挙げられる。アルキルエーテルとしては、メチルエーテル、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、トリチルエーテル、ｔ−ブチルエーテル、アリルエーテルおよびアリルオキシカルボニルエーテルまたは誘導体が挙げられる。アルコキシアルキルエーテルとしては、アセタール（例えば、メトキシメチルエーテル、メチルチオメチルエーテル、（２−メトキシエトキシ）メチルエーテル、ベンジルオキシメチルエーテル、β−（トリメチルシリル）エトキシメチルエーテルおよびテトラヒドロピラニルエーテル）が挙げられる。アリールアルキルエーテルの例としては、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル（ＭＰＭ）、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、Ｏ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ハロベンジルエーテル、２，６−ジクロロベンジルエーテル、ｐ−シアノベンジルエーテル、２−ピコリルエーテルおよび４−ピコリルエーテルが挙げられる。
【０１９３】
一定の実施形態において、式ＩＩＩｂのＲ１ｂ基は、水素である。
【０１９４】
他の実施形態において、式ＩＩＩｂのＲ１ｂ基は、−ＯＨである。
【０１９５】
なおも他の実施形態によれば、式ＩＩＩｂのＲ１ｂは、適切に保護されたヒドロキシル基である。このような適切なヒドロキシル保護基としては、Ｒ５ｂ基について上で説明した基が挙げられる。
【０１９６】
別の実施形態によれば、本発明は、式ＩＩＩｃまたはＩＩＩｃ’の化合物：
【０１９７】
【化４０】
2008526877.tif 000021
ここで：
各Ｒ１ｂは、独立してＯＨ、適切に保護されたヒドロキシル基または水素であり；
各Ｒ３ｂは、独立して核酸塩基または核酸塩基模倣物であり、ここで各Ｒ３ｂは、必要に応じてＬｂ−Ｒ４ｂで置換されており；
各Ｔｂは、独立してＯ、Ｓ、ＮＨまたは必要に応じて置換されているフェニルであり；
各Ｒ５ｂは、独立して水素または適切なヒドロキシル保護基であり；
各Ｌｂは、独立して切断可能なリンカー基であり；そして
各Ｒ４ｂは、独立して検出可能な部分である、
を提供する。
【０１９８】
一定の実施形態において、式ＩＩＩｃおよびＩＩＩｃ’のＲ３ｂ基は、核酸塩基である。このような核酸塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルが挙げられる。このような核酸塩基としては、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンまたは２−アミノプリンもまた挙げられる。
【０１９９】
他の実施形態において、式ＩＩＩｃおよびＩＩＩｃ’のＲ３ｂ基は、核酸塩基模倣物である。このような核酸塩基模倣物は、当業者に公知であり、それらとしては、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ様式で天然核酸塩基と適切な水素結合、すなわち、塩基対を形成するものが挙げられる。あるいは、このような核酸塩基模倣物は、いかなる水素結合も形成しないかもしれないが、二重鎖ＤＮＡにおいて天然核酸塩基と同程度の効率で効率的に納まる。
【０２００】
上記で概要を説明したように、式ＩＩＩｃおよびＩＩＩｃ’のＬｂ基は、切断可能なリンカー基である。このような基は、一般に当該分野で公知であり、それらとしては、米国特許第６，６６４，０７９号、同第６，６６４，０７９号、同第６，５１１，８０３号、米国出願公開番号２００３１０４４３７、ＷＯ０４／１８４９７およびＷＯ０３／４８３８７（これらの全体が本明細書によって本明細書中に参考として援用される）に記載されている基が挙げられる。Ｒ３ｂがＬｂ−Ｒ４ｂで置換されているとき、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成がなおも可能である条件で、Ｌｂ−Ｒ４ｂ基は、核酸塩基上の任意の位置で結合され得る。
【０２０１】
一定の実施形態において、Ｌｂは、検出可能なＲ４ｂ部分に結合するために末端に官能基部分を有する。このような官能基部分は、当業者に明らかであり、特定の利用される検出可能なＲ４ｂ部分に適したものである。このような官能基部分の例としては、アミノ基、アルデヒド基、ヒドロキシル基、カルボン酸基またはチオール基が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０２】
一定の実施形態において、式ＩＩＩｃおよびＩＩＩｃ’のＲ５ｂ基は、適切なヒドロキシル保護基である。ヒドロキシル保護基は、当該分野で周知であり、それらとしては、その全体が本明細書中に参考として援用される、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９に詳細に説明されている基が挙げられる。Ｒ５ｂ基の適切なヒドロキシル保護基の例としては、さらに、エステル、アリルエーテル、エーテル、シリルエーテル、アルキルエーテル、アリールアルキルエーテルおよびアルコキシアルキルエーテルが挙げられるが、これらに限定されない。このようなエステルの例としては、ホルメート、アセテート、カーボネートおよびスルホネートが挙げられる。特定の例としては、ホルメート、ベンゾイルホルメート、クロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、３−フェニルプロピオネート、４−オキソペンタノエート、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノエート、ピバロエート（トリメチルアセチル）、クロトネート、４−メトキシ−クロトネート、ベンゾエート、ｐ−ベニルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート、カーボネート（例えば、メチルカーボネート、９−フルオレンイルメチルカーボネート、エチルカーボネート、２，２，２−トリクロロエチルカーボネート、２−（トリメチルシリル）エチルカーボネート、２−（フェニルスルホニル）エチルカーボネート、ビニルカーボネート、アリルカーボネートおよびｐ−ニトロベンジルカーボネート）が挙げられる。このようなシリルエーテルの例としては、トリメチルシリルエーテル、トリエチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジフェニルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテルおよび他のトリアルキルシリルエーテルが挙げられる。アルキルエーテルとしては、メチルエーテル、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、トリチルエーテル、ｔ−ブチルエーテル、アリルエーテルおよびアリルオキシカルボニルエーテルまたは誘導体が挙げられる。アルコキシアルキルエーテルとしては、アセタール（例えば、メトキシメチルエーテル、メチルチオメチルエーテル、（２−メトキシエトキシ）メチルエーテル、ベンジルオキシメチルエーテル、β−（トリメチルシリル）エトキシメチルエーテルおよびテトラヒドロピラニルエーテル）が挙げられる。アリールアルキルエーテルの例としては、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル（ＭＰＭ）、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、Ｏ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ハロベンジルエーテル、２，６−ジクロロベンジルエーテル、ｐ−シアノベンジルエーテル、２−ピコリルエーテルおよび４−ピコリルエーテルが挙げられる。
【０２０３】
一定の実施形態において、式ＩＩＩｃおよびＩＩＩｃ’のＲ１ｂ基は、水素である。
【０２０４】
他の実施形態において、式ＩＩＩｃおよびＩＩＩｃ’のＲ１ｂ基は、−ＯＨである。
【０２０５】
なおも他の実施形態によれば、式ＩＩＩｃおよびＩＩＩｃ’のＲ１ｂは、適切に保護されたヒドロキシル基である。このような適切なヒドロキシル保護基としては、Ｒ５ｂ基について上で説明した基が挙げられる。
【０２０６】
触媒作用のエディティング（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｅｄｉｔｉｎｇ）は、鋳型上のその次の塩基の位置（ｎ＋１）に相補的な（正しく）入り込むｄＮＴＰの存在下でＤＮＡポリメラーゼによってヌクレオシドの３’ＯＨに（エステル結合、アミド結合またはチオ尿素結合において）結合される置換基が除去されるプロセスである。Ｃａｎａｒｄ，  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，「Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ」９２，１０８５９−１０８６３（１９９５）を参照のこと。不運にも、この特性は、触媒作用のエディティングをすることができる酵素と結合体化した特定のタイプのターミネーターの有用性を制限する。特に、その次のヌクレオチドアナログが酵素−鋳型−プライマー複合体に結合するとき、エディティングが各位置で起きるため、触媒作用のエディティングをすることができる酵素を伴う反応において４つすべてのｄＮＴＰアナログの混合物を使用することができない。しかしながら、このようなターミネーターは、エディティング反応を触媒しないＡＭＶ逆転写酵素などの酵素を用いてなおも使用することができる。
【０２０７】
触媒作用のエディティングの可能性を打開するために、このような触媒作用のエディティングに耐える新規な可逆的ターミネーターが提供される。これらのヌクレオチドアナログは、それらが、プライマー−鋳型複合体のｎ＋１位においてプライマーの３’位での塩基のスタッキングおよび／または普遍的な塩基の対の形成を促進するような方法で切断可能なリンカーに結合される普遍的な窒素塩基部分を含むという特性を共有する。任意の特定の理論に制約されることを望むわけではないが、これはその次の正しいヌクレオシド三リン酸がその位置を占めることを阻止するため、触媒作用のエディティングが起きるのを妨げると考えられる。終結の解除は、結合された標識を含む普遍的なヌクレオシド模倣物を放出し、３’ＯＨあるいは３’Ｓ−化合物が使用される場合は３’ＳＨを再生するリンカーの切断によって達成される。従って、本発明の別の実施形態は、式ＩＶの化合物：
【０２０８】
【化４１】
2008526877.tif 000022
ここで：
Ｒ１ｃは、ＯＨ、ＳＨ、適切に保護されたヒドロキシル基、適切に保護されたチオール基または水素であり；
Ｑは、酸素または硫黄であり；
Ｕは、普遍的なヌクレオシドアナログであり；
Ｒ２ｃは、適切なヒドロキシル保護基、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＮＨ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり；
Ｒ３ｃは、核酸塩基または核酸塩基模倣物であり、ここでＲ３ｃは、必要に応じてＬｃ−Ｒ４ｃで置換されており；
各Ｌｃは、独立して切断可能なリンカー基であり；
Ｌｃ’は、切断不可能なリンカー基であり；そして
各Ｒ４ｃは、独立して検出可能な部分である、
に関する。
【０２０９】
本発明の１つの態様によれば、式ＩＶのＱ基は、酸素である。
【０２１０】
本発明の別の態様によれば、式ＩＶのＱ基は、硫黄である。
【０２１１】
一定の実施形態において、式ＩＶのＲ３ｃ基は、Ｌｃ−Ｒ４ｃで置換されている。
【０２１２】
一定の実施形態において、式ＩＶのＲ３ｃ基は、核酸塩基である。このような核酸塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルが挙げられる。このような核酸塩基としては、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンまたは２−アミノプリンもまた挙げられる。
【０２１３】
他の実施形態において、式ＩＶのＲ３ｃ基は、核酸塩基模倣物である。このような核酸塩基模倣物は、当業者に公知であり、それらとしては、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ様式で天然核酸塩基と適切な水素結合、すなわち、塩基対を形成するものが挙げられる。あるいは、このような核酸塩基模倣物は、いかなる水素結合も形成しないかもしれないが、二重鎖ＤＮＡにおいて天然核酸塩基と同程度の効率で効率的に納まる。
【０２１４】
上記で概要を説明したように、式ＩＶのＬｃ基は、切断可能なリンカー基である。一定の実施形態において、式ＩＶのＬｃ基は、普遍的なヌクレオシドであるＵの５’の位置でＵに結合している。このようなＬｃ基は、一般に当該分野で公知であり、それらとしては、米国特許第６，６６４，０７９号、同第６，６６４，０７９号、同第６，５１１，８０３号、米国出願公開番号２００３１０４４３７、ＷＯ０４／１８４９７およびＷＯ０３／４８３８７（これらの全体が本明細書によって本明細書中に参考として援用される）に記載されている基が挙げられる。Ｒ３ｃがＬｃ−Ｒ４ｃで置換されているとき、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成がなおも可能である条件で、Ｌｃ−Ｒ４ｃ基は、核酸塩基上の任意の位置で結合され得る。
【０２１５】
一定の実施形態において、Ｌｃは、検出可能なＲ４ｃ基に結合するために末端に官能基部分を有する。このような官能基部分は、当業者に明らかであり、特定の利用される検出可能なＲ４ｃ基に適したものである。このような官能基部分の例としては、アミノ基、アルデヒド基、ヒドロキシル基、カルボン酸基またはチオール基が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１６】
他の実施形態において、式ＩＶのＬｃ基は、その分子が、ＤＮＡらせんにおけるｎ＋１位置で普遍的な塩基アナログの対を形成することを可能にする酵素の活性部位において高次構造をとることができるような長さである。ＤＮＡ骨格における糖−リン酸結合によって正常に占められる空間内に適合する立体配置で折り畳むことが可能である限り、リンカーの多くの立体配置が可能である。
【０２１７】
上記で概要を説明したように、式ＩＶのＬｃ’基は、切断不可能なリンカー基である。本発明の１つの態様によれば、式ＩＶのＬｃ１基は、Ｕの３’の位置でＵに結合している。一定の実施形態において、Ｌｃ’は、検出可能なＲ４ｃ基に結合するために末端に官能基部分を有する。このような官能基部分は、当業者に明らかであり、特定の利用される検出可能なＲ４ｃ基に適したものである。このような官能基部分の例としては、アミノ基、アルデヒド基、ヒドロキシル基、カルボン酸基またはチオール基が挙げられるが、これらに限定されない。このようなリンカー基は、鎖の０〜２個のメチレン単位が、必要に応じて、そして独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＮＨＳＯ２−、−ＳＯ２ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（Ｏ）−で置換される、Ｃ１〜８アルキリデン鎖を含む。一定の実施形態において、式ＩＶのＬｃ’基は、Ｒ４ｃに隣接するメチレン単位が−ＮＨＣ（Ｏ）−で置換される、Ｃ１〜６アルキリデン鎖である。
【０２１８】
チオール保護基は、当該分野で周知であり、それらとしては、その全体が本明細書中に参考として援用される、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９に詳細に説明されている基が挙げられる。式ＩＶのＲ１ｃ部分の適切なチオール保護基としては、ジスルフィド、チオエーテル、シリルチオエーテル、チオエステル、チオカーボネート、チオカルバメートなどが挙げられるが、これらに限定されない。このような基の例としては、アルキルチオエーテル、ベンジルチオエーテルおよび置換されているベンジルチオエーテル、トリフェニルメチルチオエーテル、トリクロロエトキシカルボニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。一定の実施形態において、式ＩＶのＲ１ｃ部分のチオール保護基は、−Ｓ−ピリジン−２−イルである。
【０２１９】
本発明の１つの態様によれば、式ＩＶのＲ１ｃ部分は、例えば、ＡｇＮＯ３、ＨｇＣｌ２などを用いた中性の条件下で除去することができるチオール保護基である。他の中性の条件としては、適切な還元剤を使用する還元が挙げられる。適切な還元剤としては、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエタノール、亜ジチオン酸塩、還元グルタチオン、還元グルタレドキシン、還元チオレドキシン，トリスカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）などの置換されているホスフィンおよび他の任意のペプチドもしくは有機物に基づく還元剤または当業者に公知の他の試薬が挙げられる。本発明の別の態様によれば、式ＩＶのＲ１ｃ部分は、ｐＨが約４〜約９である条件下で切断されるチオール保護基である。なおも別の本発明によれば、式ＩＶのＲ１ｃ部分は、「光切断性」であるチオール保護基である。このような適切なチオール保護基は、当該分野で公知であり、それらとしては、ニトロベンジル基、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）基、トリチル基、−ＣＨ２ＳＣＨ３（ＭＴＭ）、ジメチルメトキシメチルまたは−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−ピリジン−２−イルが挙げられるが、これらに限定されない。適切なヒドロキシル保護基の多くが、本明細書中に説明されるように、チオール保護基としても適当であることを当業者は理解するだろう。
【０２２０】
一定の実施形態において、Ｒ２ｃは、適切なヒドロキシル保護基である。ヒドロキシル保護基は、当該分野で周知であり、それらとしては、その全体が本明細書中に参考として援用される、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９に詳細に説明されている基が挙げられる。Ｒ２ｃ部分の適切なヒドロキシル保護基の例としては、さらに、エステル、アリルエーテル、エーテル、シリルエーテル、アルキルエーテル、アリールアルキルエーテルおよびアルコキシアルキルエーテルが挙げられるが、これらに限定されない。このようなエステルの例としては、ホルメート、アセテート、カーボネートおよびスルホネートが挙げられる。特定の例としては、ホルメート、ベンゾイルホルメート、クロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、３−フェニルプロピオネート、４−オキソペンタノエート、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノエート、ピバロエート（トリメチルアセチル）、クロトネート、４−メトキシ−クロトネート、ベンゾエート、ｐ−ベニルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート、カーボネート（例えば、メチルカーボネート、９−フルオレンイルメチルカーボネート、エチルカーボネート、２，２，２−トリクロロエチルカーボネート、２−（トリメチルシリル）エチルカーボネート、２−（フェニルスルホニル）エチルカーボネート、ビニルカーボネート、アリルカーボネートおよびｐ−ニトロベンジルカーボネート）が挙げられる。このようなシリルエーテルの例としては、トリメチルシリルエーテル、トリエチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジフェニルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテルおよび他のトリアルキルシリルエーテルが挙げられる。アルキルエーテルとしては、メチルエーテル、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、トリチルエーテル、ｔ−ブチルエーテル、アリルエーテルおよびアリルオキシカルボニルエーテルまたは誘導体が挙げられる。アルコキシアルキルエーテルとしては、アセタール（例えば、メトキシメチルエーテル、メチルチオメチルエーテル、（２−メトキシエトキシ）メチルエーテル、ベンジルオキシメチルエーテル、β−（トリメチルシリル）エトキシメチルエーテルおよびテトラヒドロピラニルエーテル）が挙げられる。アリールアルキルエーテルの例としては、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル（ＭＰＭ）、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、Ｏ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ハロベンジルエーテル、２，６−ジクロロベンジルエーテル、ｐ−シアノベンジルエーテル、２−ピコリルエーテルおよび４−ピコリルエーテルが挙げられる。
【０２２１】
他の実施形態において、式ＩのＲ２ｃは、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２である。
【０２２２】
一定の実施形態において、式ＩのＲ１ｃは、水素である。
【０２２３】
他の実施形態において、式ＩのＲ１ｃは、−ＯＨである。
【０２２４】
なおも他の実施形態によれば、式ＩのＲ１ｃは、適切に保護されたヒドロキシル基である。このような適切なヒドロキシル基としては、Ｒ２ｃ基について上で説明した基が挙げられる。
【０２２５】
上記で概要を説明したように、式ＩＶのＵ基は、普遍的なヌクレオシドアナログである。一定の実施形態において、Ｕは、ＤＮＡらせんにおいて４つの正準的な核酸塩基のうちの任意のものとスタッキングおよび／または塩基対の形成が可能である普遍的な塩基を含む。
【０２２６】
一定の実施形態において、本発明は、式ＩＶａの化合物：
【０２２７】
【化４２】
2008526877.tif 000023
を提供する。
【０２２８】
（４．用途、方法および組成物）
上で議論したように、本発明は、可逆的にブロックされ、そして必要に応じて標識されたヌクレオチドアナログを提供する。これらのヌクレオチドアナログは、切断可能なリンカー基を介して核酸塩基または核酸塩基模倣物に結合され得る検出可能な部分を有する。あるいは、これらのヌクレオチドアナログは、切断可能なリンカー基を介して３’−ＳＨ保護基または２’−ＳＨ保護基に結合され得る検出可能な部分を有する。なおも別の態様は、切断可能なリンカー基を介してα−リン酸に結合され得る検出可能な部分を有するヌクレオチドアナログを提供する。同様に、これらの化合物は、核酸分子の配列を決定するための任意の方法のほとんどにおいて試薬として有用である。さらに、この化合物は、一般にポリヌクレオチド合成、核酸増幅、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、一塩基多型研究および酵素（例えば、ポリメラーゼ、逆転写酵素、ターミナルトランスフェラーゼまたは他の核酸修飾酵素）を使用する他の技術について使用され得る。本発明は、標識ｄＮＴＰを使用する技術（例えば、配列決定、ニックトランスレーション、ランダムプライマー標識、末端標識（例えば、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いた）、逆転写または核酸増幅）において特に有用である。例えば、本発明の１つの態様は、ヌクレオチドアナログが成長するＤＮＡ鎖に取り込まれた後にヌクレオチドアナログを検出することによって核酸の配列を決定するための方法を提供する。
【０２２９】
別の態様において、本発明は、標的一本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定するための方法を提供する。ここで、その方法は、以下の工程：
（ａ）取り込まれる各ヌクレオチドが、塩基に結合している標識を検出することによって決定される、本発明の相補的なヌクレオチドアナログの連続した取り込みをモニターする工程、および
（ｂ）標識を除去する工程
を含む。
【０２３０】
一定の実施形態において、標識の検出は、標識が除去される前に実施される。
【０２３１】
一定の実施形態において、本発明は、標的一本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定するための方法を提供する。その方法は、以下の工程：
（ａ）前記ヌクレオチドの検出可能な標識が、他のヌクレオチドに対して使用される検出可能な標識からの検出と識別することができる、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶのうちの少なくとも１つの化合物を提供する工程；
（ｂ）工程（ａ）のヌクレオチドを標的一本鎖ポリヌクレオチドの相補物に取り込む工程；
（ｃ）（ｂ）のヌクレオチドの標識を検出することによって、取り込まれたヌクレオチドのタイプを決定する工程；
（ｄ）（ｂ）のヌクレオチドの標識を除去する工程；および
（ｅ）工程（ｂ）〜（ｄ）を必要に応じて１回以上繰り返すことによって、標的一本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定する工程
を含む。
【０２３２】
他の実施形態において、上記の工程（ａ）において、この方法は、各ヌクレオチドが式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの化合物であるヌクレオチドのセットを提供する工程を含む。なおも別の実施形態は、セットに存在する各核酸塩基が異なる検出可能な標識に結合しており、その核酸塩基を標識の検出によって同定することができるヌクレオチドのセットを提供する。
【０２３３】
配列決定反応の間、プライマーおよび標的核酸配列は、特定の配列決定様式でプライマーが標的核酸にアニールするか、またはハイブリダイズするように結合し得る。次いで、ポリメラーゼ酵素、例えばＤＮＡポリメラーゼは、特定の配列様式または鋳型依存性の様式で、プライマーにさらなるヌクレオチドを取り込むために使用され、そのプライマーに付加されるヌクレオチドは、標的核酸に相補的である。例えば、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチドアナログの混合物は、ＤＮＡポリメラーゼが標的配列に相補的である単一のヌクレオチドアナログをプライマーに取り込むのに十分な濃度で配列決定反応に加えられる。ヌクレオチドアナログの取り込みは、使用される標識のタイプに適した任意の公知の方法により検出され得る。
【０２３４】
第２回目または引き続く回のヌクレオチドアナログの取り込みは、３’保護基の脱保護の後に起き得る。さらに、取り込みの各回は、プライマーと標的配列との間のハイブリダイゼーションを妨害することなく完了し得る。脱保護後、３’−ＯＨまたは３’−ＳＨが、ブロックされていない状態になり、ヌクレオチドの取り込みの新たな回に移ることができる状態になる。あるいは、α−リン酸が、ブロックされていない状態になり、生じた鎖が、ヌクレオチドの取り込みの新たな回に移ることできる状態になる。取り込みおよび脱保護の工程は、標的配列の配列決定を完了するために必要に応じて繰り返してもよい。このように、異なるヌクレオチドの取り込みを検出することができるため、個別のヌクレオチドを差別的に標識することは有利であり得る。このような方法は、単回の配列決定反応、自動化された配列決定反応およびアレイに基づく配列決定反応に使用され得る。
【０２３５】
本発明の化合物はまた、オリゴヌクレオチドを合成するために使用され得る。このプロセスにおいて、２’−ＯＨまたは２’−ＳＨは、合成の間、保護される。本化合物を使用するオリゴリボヌクレオチドを合成するための方法は、以下のとおりに進行し得る。第１のヌクレオシドを、公知の方法を使用して固形支持体に結合する。例えば、Ｐｏｎ，Ｒ  Ｔ，「Ｃｈａｐｔｅｒ  １９  Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２０  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ，４６５−４９７，Ｅｄ．Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｗａｔａ，ＮＪ．（１９９３）を参照のこと。２’−ＯＨまたは２’−ＳＨ部分は、本明細書中に説明されるような適切な保護基で保護され得る。５’−ＯＨおよび３’−ＯＨ／ＳＨはまた、公知の方法または本明細書中に記載される方法を使用して必要に応じて保護されると理解される。最初のヌクレオシドが、固形支持体に繋ぎとめられた後、本発明のさらなる化合物を、インターヌクレオチド結合形成についての任意の従来のストラテジーを使用して成長しているオリゴリボヌクレオチドに加える。次いで、完了したオリゴリボヌクレオチドを、使用される特定の保護基に適した手段を使用することによってすべての位置で脱保護する。このような脱保護の手段は、当業者に公知である。
【０２３６】
一定の実施形態において、本発明の配列決定方法は、基材に接着した標的ポリヌクレオチドを用いて実施される。複数の標的ポリヌクレオチドは、リンカー分子を介して基材上に固定化され得るか、または基材材料に接着され得る粒子、例えば、ミクロスフェアに接着され得る。
【０２３７】
ポリヌクレオチドは、ビオチン−アビジン相互作用の使用を含む多くの手段によって基材に接着され得る。基材上にポリヌクレオチドを固定化するための方法は、当該分野で周知であり、それらとしては、リソグラフィー技術および固形支持体上の既定された位置における個別のポリヌクレオチドの「スポッティング」が挙げられる。一定の実施形態において、基材は、固形支持体である。このような固形支持体は、当該分野で公知であり、それらとしては、ガラススライドおよびビーズ、セラミック表面およびケイ素表面ならびにプラスチック材料が挙げられる。微細ビーズ（ミクロスフェア）もまた使用され得、そして同様に公知の手段によって別の固形支持体に接着され得るが、支持体は通常平らな表面である。ミクロスフェアは、任意の適切な大きさ、代表的には直径１００ｎｍ〜１０μｍの範囲であり得る。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、平面のガラス表面などの平面の表面上に直接接着される。接着は、共有結合によってであってもよい。他の実施形態において、使用されるアレイは、例えば、国際出願番号ＷＯ００／０６７７０に開示されているような光学的に分解可能な異なる範囲にポリヌクレオチドを含む単一分子アレイである。
【０２３８】
本発明の配列決定方法は、単一のポリヌクレオチド分子アレイおよび複数のポリヌクレオチド分子アレイ、すなわち、異なる個別のポリヌクレオチド分子のアレイおよび１つの個別のポリヌクレオチド分子の複数のコピーを含む様々な領域のアレイとの両方において実施することができる。単一分子アレイは、各々の個別のポリヌクレオチドを別々に解析することが可能である。
【０２３９】
オリゴヌクレオチドの化学合成は、固形支持体に第１のヌクレオシドモノマーを接着することにより実施され得る。非多孔質固形支持体および多孔質固形支持体ならびに有機固形支持体および無機固形支持体を含む任意の公知の固形支持体を使用することができる。有用な固形支持体としては、ポリスチレン、架橋ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、テフロン（登録商標）、多糖、架橋多糖、シリカおよび様々なガラスが挙げられる。固形支持体にモノマーまたはオリゴヌクレオチドを接着するための従来のリンカーおよび方法が知られている。Ｂｅａｕｃａｇｅ  ＆  Ｉｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４８（１２）：２２２３−２３１１（１９９２）を参照のこと。
【０２４０】
一定の実施形態において、本発明は、以下のもの：（ａ）式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの個別のヌクレオチドアナログ；および（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｃ）反応緩衝液、（ｄ）天然２’デオキシヌクレオシド三リン酸および必要に応じて（ｅ）切断試薬を備えるキットを提供する。キットはまた、合成実験による配列決定を助ける追加の試薬を備えるように編成され得る。このような追加の試薬としては、以下の１つ以上の品目：（ａ）１つ以上の接着されたオリゴヌクレオチドプライマーを備える基材、（ｃ）その基材上でのＤＮＡフラグメントのクローン増幅のための試薬、（ｄ）その基材が複数個のマイクロビーズである場合、クローン増幅されたＤＮＡフラグメントを備えたマイクロビーズのアレイを作製するための試薬、（ｅ）接着されたオリゴヌクレオチドプライマーを含むゲノムＤＮＡフラグメントのライブラリーを作製するための試薬を含み得る。
【実施例】
【０２４１】
本発明の化合物は、類似化合物についての当業者に公知の合成方法および／または擬似合成（ｐｓｅｕｄｏ−ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）方法によって、そして一般スキームおよび以下の調製用の実施例に説明されるようにして一般に調製され得るか、または単離され得る。
【０２４２】
一定の有機出発物質および無機出発物質を、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｌｆａ  ＡｅｓａｒまたはＡｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓから入手し、さらに精製せずに使用した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４３０のＮＨＳエステルを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲから入手した。すべての溶媒は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＨＰＬＣグレードまたは超乾燥（ｕｌｔｒａ−ｄｒｙ）グレードであった。
【０２４３】
ＮＭＲスペクトルを、２００ＭＨｚで作動するＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍまたは２５０ＭＨｚで作動するＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍで記録した。
【０２４４】
融点は、Ｍｅｌ−Ｔｅｍｐキャピラリーシステムから求め、補正していない。
【０２４５】
ＨＰＬＣデータは、２ｍＬ／分の流速で、５分間、１５％アセトニトリル：８５％水から９５％アセトニトリル：０．５％水（どちらの溶媒も０．１％ＴＦＡを含む）の勾配を用いてＺｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ８カラム（５０×４．６ｍｍ）を装着したＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  １１００を使用して取得した。
【０２４６】
ＴＬＣデータは、Ａｎａｌｔｅｃｈ  Ｆ２５０  ０．２５ｍｍシリカプレートを用いて取得した。
【０２４７】
化合物は、Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ製の卓上フラッシュクロマトグラフィーのシリカを使用して精製した。すべての化合物から良好な分析データが得られた。
【０２４８】
（実施例１）
【０２４９】
【化４３】
2008526877.tif 000024
３’−デオキシチミジン−３’−イルメチルジスルフィド５’−三リン酸の合成：Ｃｈａｍｂｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６５，２４９（２０００））の手順に従う５工程で調製された３’−デオキシチミジン−３’−イルメチルジスルフィド（１４５ｍｇ）の溶液を、無水ピリジン（５ｍＬ）から同時蒸発し、無水ジオキサン（１．３５ｍＬ）に溶解した。この溶液に、アルゴン雰囲気下で、２−クロロ−４Ｈ−１，２，３−ジオキサホスホリ−４−オン（５２４μＬ、無水ジオキサン中で１Ｍ）の保存溶液を加えた。１０分間撹拌した後、それをビス（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム）−ピロホスフェート（ＤＭＦ中で０．５Ｍ溶液の１．４ｍＬ）およびトリ−ｎ−ブチルアミン（４７０μＬ）で処理した。１０分間撹拌した後、その反応物を、ヨウ素（１０μＬ、２％ピリジン水溶液中で１％）で処理し、１５分間撹拌した。過剰量のヨウ素をＮａＨＳＯ３（７００μＬ、５％）で処理することによりクエンチし、乾燥するまで蒸発した。その残渣を水（１０ｍＬ）で処理し、３０分間撹拌し、その後、濃縮アンモニア水溶液（２０ｍＬ）で処理し、１時間撹拌し、乾燥するまで蒸発した。その残渣を水に溶解し、０．０５Ｍ  トリエチルアンモニウムジカーボネート中のＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ２５樹脂で充填されたカラムに載せ、そして１Ｍ  ＴＥＡＢに至るまで直線勾配で溶出した。貯蔵した生成物画分を凍結乾燥することにより、標題化合物（６５ｍｇ）が得られた。
【０２５０】
（実施例２）
（蛍光標識を有するＰＥＧリンカーの合成）
（Ａ部）
【０２５１】
【化４４】
2008526877.tif 000025
反応１：［２−（２−ヒドロキシエトキシ）−エチル］−カルバミン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルの合成。ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）中の２−アミノエトキシエタノール（１０ｇｍ、０．０９５ｍｏｌ；Ａｃｒｏｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）の溶液を２５０ｍＬ丸底フラスコに投入した。これにＮ−（９−フルオレンイルメトキシカルボニルオキシ）−スクシンイミド（３３ｇｍ、０．１ｍｏｌ）を加え、その溶液を室温で５時間撹拌した。この溶液を乾燥するまで除去し、ＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、ジカーボネート溶液で抽出、次いでブラインで抽出した。その有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして真空中で蒸発することにより、［２−（２−ヒドロキシエトキシ）−エチル］−カルバミン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルを結晶性固体（２８ｇｍ、９０％）ＨＰＬＣ：９７％として得られた。
【０２５２】
反応２：トルエン−４−スルホン酸２−［２−（３−メチル−２−ビニル−１Ｈ−インデン−１−イルメトキシカルボニルアミノ）−エトキシ］−エチルエステルの合成。［２−（２−ヒドロキシエトキシ）−エチル］−カルバミン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（３３ｇｍ、０．１ｍｏｌ）を１０００ｍＬフラスコに投入し、そしてそのフラスコにアルゴンを流した。その固体を乾燥ピリジン（３００ｍＬ）に溶解し、生じた溶液をアルゴン下、０℃にて氷浴中で撹拌した。その溶液を、ｐ−トルエンスルホニルクロリド（２１．１ｇｍ、０．１１２ｍｏｌ）で処理し、生じた溶液をアルゴン下、０℃で一晩撹拌保存した。溶媒を真空中で除去し、その残渣を酢酸エチルに溶解し、水（２×）、１０％クエン酸（２×）、飽和塩化ナトリウムで洗浄した。その有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発することにより、トルエン−４−スルホン酸２−［２−（３−メチル−２−ビニル−１Ｈ−インデン−１−イルメトキシ−カルボニルアミノ）−エトキシ］−エチルエステルが得られた。これは、ＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘを使用して１：４の比で開始して５００ｇｍシリカで精製し、そして１：１で生成物を溶出した。生成物を含む貯蔵画分を蒸発させて、２８ｇｍの純粋生成物が得られた。それは、ＨＰＬＣにより９８％と評価された。
【０２５３】
反応３：［２−（２−ブロモエトキシ）−エチル］−カルバミン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルの合成。５００ｍＬ丸底フラスコに油浴、還流冷却器、磁性撹拌バーおよび乾燥窒素の供給源を装着した。そのフラスコに窒素を流し、トルエン−４−スルホン酸２−［２−（３−メチル−２−ビニル−１Ｈ−インデン−１−イルメトキシカルボニルアミノ）−エトキシ］−エチルエステル（２５ｇｍ、５２ｍｍｏｌ）を投入して、そしてそれを無水ＴＨＦ（２５０ｍＬ）に溶解した。その清澄溶液を臭化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム（６５ｇｍ、２０２ｍｍｏｌ）で処理した。その混合物を７０℃に加熱し、そして１時間撹拌した。加熱浴を取り外し、反応物を窒素下で一晩撹拌した。その溶液を真空中で濃縮し、その残渣をＥｔＯＡｃ：ヘキサン（２００ｍＬ、１０：１）に溶解した。生じた固体を濾過により除去した。その濾液を水（２×３００ｍＬ）で、次いで飽和ＮａＣｌ（３００ｍＬ）で洗浄した。その有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして真空中で乾燥することにより、［２−（２−ブロモエトキシ）−エチル］−カルバミン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルを淡黄色の固体（２０ｇｍ）として得た。
【０２５４】
反応４：［２−（２−トリチルスルファニル−エトキシ）−エチル］−カルバミン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルの合成。水酸化ナトリウム（３．０８ｇｍ、７７ｍｍｏｌ）の水溶液（３ｍＬ）および無水エタノール（３００ｍＬ）をトリフェニルメチルスルフィド（２１．３ｇｍ）で処理し、生じた混合物を１５分間撹拌した。その濁った混合物を前工程の固体に加え、１５分間撹拌した。次いでそれを油浴で７０℃に加熱した。２時間後、反応物を室温まで冷却し、そして冷凍庫で一晩保存した。生じた混合物を酢酸エチル（５００ｍＬ）に溶解し、濾過し、そして真空中で濃縮することにより、黄色の油状物（３８ｇｍ）が得られた。これを６：１  ヘキサン：酢酸エチルで開始し、次いで２：１とする４５０ｍＬシリカで精製した。生成物を含む画分を貯蔵し、乾燥するまで蒸発することにより、［２−（２−トリチルスルファニル−エトキシ）−エチル］−カルバミン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステルを油状物（１０．５ｇｍ、３５％）として得た。
【０２５５】
反応５：２−（２−トリチルスルファニル−エトキシ）−エチルアミンの合成。窒素下で、無水ＴＨＦ（１００ｍＬ）中の［２−（２−トリチルスルファニル−エトキシ）−エチル］−カルバミン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（９．５ｇｍ、１６．２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液にピペリジン（９４０ｍＬ）で処理した。その溶液を９０分間撹拌し、真空中で濃縮することにより、油性固体が得られた。これをヘキサン中で洗浄し、その溶液をデカントし、乾燥するまで濃縮し、そしてその残渣を、１％トリエチルアミンを含むＣＨ２Ｃｌ２中の５％メタノールの溶離剤を使用してシリカゲルで精製することにより、２−（２−トリチルスルファニル−エトキシ）−エチルアミン（１．６ｇｍ、２９％）が得られた。
【０２５６】
反応６：チオール末端ＰＥＧ色素の合成。
【０２５７】
工程（Ａ）：無水メタノール（５００μＬ）中のＮＨＳ  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４３０（５ｍｇ）の溶液を無水メタノール（２５０μＬ）中の２−（２−トリチルスルファニル−エトキシ）−エチルアミン（３．５ｍｇ）の溶液で処理し、そしてその撹拌溶液をＨＰＬＣによってモニターした。完了後、溶媒を真空中で除去し、その残渣を１ｍＬの１：１メタノール：水に溶解した。これをＳｅｐＰａｋ−Ｃ１８カートリッジにロードし、そして１：１メタノール：水、３：１メタノール：水および１００％メタノールの各１０ｍＬで溶出した。生成物画分を貯蔵し、真空中で蒸発することにより、トリチル保護されたチオール末端ＰＥＧ色素を９０％の収率で得た。
【０２５８】
工程（Ｂ）：Ｐｅａｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、３０、２７３９（１９８９））によって報告された手順を使用し、１当量のトリエチルシランの存在下で、保護された色素リンカーをＣＨ２Ｃｌ２中の５０％トリフルオロ酢酸２ｍＬで処理することによってトリチル基を除去した。
【０２５９】
反応７：活性化ジスルフィドの合成。Ｓｕｎ、ｅｔ  ａｌ、ＲＮＡ、３、１３５２（１９９７）の手順に従って、反応６の遊離チオールを２，２’−ピリジンジスルフィドで処理することによって混合ジスルフィドを調製した。
【０２６０】
（Ｂ部）
【０２６１】
【化４５】
2008526877.tif 000026
反応８：５’−アセチル−５’−（ジメトキシトリチル）−５−［Ｓ−（２，４−ジニトロフェニル）−チオール］−２’−デオキシウリジンの合成。５’−（ジメトキシトリチル）−５−［Ｓ−（２，４−ジニトロフェニル）−チオール］−２’−デオキシウリジン（７．１ｇｍ、Ｍｅｙｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｎｎａ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７，４０１−４１２（１９９６）の手順により調製された）の溶液を無水ピリジン（３０ｍＬ）中に溶解し、そして無水酢酸（０．９２ｍＬ）で処理した。室温で２０時間撹拌した後、その溶液を乾燥するまで蒸発し、その残渣を酢酸エチルに溶解した。これを１０％クエン酸水溶液およびブラインで洗浄した。その有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして乾燥するまで蒸発することにより、固体が得られた。これを、２％トリエチルアミンを含む６：４酢酸エチル：ヘキサンの溶出溶媒を使用してシリカで精製した。生成物を含む画分を貯蔵し、真空中で蒸発することにより、５’−アセチル−５’−（ジメトキシトリチル）−５−［Ｓ−（２，４−ジニトロフェニル）−チオール］−２’−デオキシウリジン（２．５ｇｍ、３３％）が得られた。
【０２６２】
反応９：５’−アセチル−５−［Ｓ−（２，４−ジニトロフェニル）−チオール］−２’−デオキシウリジンの合成。５’−アセチル−５’−（ジメトキシトリチル）−５−［Ｓ−（２，４−ジニトロフェニル）−チオール］−２’−デオキシウリジン（１ｇｍ）のサンプルをＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）中の３％ＴＦＡの溶液で処理し、生じた淡橙色溶液を室温で３０分間撹拌した。その溶媒を蒸発させ、その残渣を新たなＣＨ２Ｃｌ２に溶解した。これを飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして蒸発することにより、固体が得られた。これを６：４  酢酸エチル：ヘキサンを使用してシリカで精製することにより、５’−アセチル−５−［Ｓ−（２，４−ジニトロフェニル）−チオール］−２’−デオキシウリジン（２５０ｍｇ、４１％）が得られた。
【０２６３】
反応１０：５−［Ｓ−（２，４−ジニトロフェニル）−チオール］−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸の合成。この変換は、ＬｕｄｗｉｇおよびＥｃｋｓｔｅｉｎ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５４，６３１−６３５（１９８９））の手順に従って実施した。イオン交換クロマトグラフィーを、トリエチルアンモニウムブロミドの０．０５Ｍから１Ｍの勾配でＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ２５樹脂を用いて実施した。糖およびリン酸試験で陽性を示す画分を貯蔵し、凍結乾燥することにより、そのテトラトリエチルアミン塩としてヌクレオチドが得られた。
【０２６４】
反応１１：５−チオール−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸の合成。Ｓｈａｌｔｉｅｌ（Ｎｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２９，１７８（１９６７）によって報告されている手順を使用して、ＴＥＡＢ緩衝液（ｐＨ８）中のメルカプトエタノールを用いて２，４−ジニトロフェニル基を除去することにより遊離チオールを生成した。
【０２６５】
反応１２：蛍光ヌクレオチドの合成。ＦｕｔａｋｉおよびＫｉｔｉｇａｗａ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｅｓ，３５，１２６７−１２７０（１９９４）の手順に従って、反応７で合成された活性化チオールを、反応１１のチオール生成物と反応させることにより、切断可能なリンカーを有する混合ジスルフィド蛍光性ヌクレオチドが得られた。
【０２６６】
（実施例３）
（スキームＩＩＩ：３’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）チミジン５’−三リン酸の合成）
【０２６７】
【化４６】
2008526877.tif 000027
３’，５’−ビス（Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）チミジン：Ｔｒｏｎｃｈｅｔ，ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ．，２０，１９２７（２００１）によって説明されている手順に従って、１２５０ｍＬ丸底フラスコにアルゴン供給源、撹拌バーおよびマントルヒーターを装着した。そのフラスコにチミジン（１０ｇｍ）を投入した。アルゴン下で、チミジンをピリジン（１００ｍＬ）中に懸濁し、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルクロロシラン（１５．６ｇｍ）で処理した。その混合物を室温で１時間撹拌し、次いで約６５℃に温め、７時間撹拌した。反応物を室温まで冷却し、一晩静置した。生じた淡黄色溶液（その中にいくつかの固体を含む）を水（４．１ｍＬ）で処理し、１５分間撹拌した。その溶媒を蒸発させ、残渣をトルエン（２×５０ｍＬ）で同時蒸発させた。その残渣を冷ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）に溶解し、冷１Ｎ  ＨＣｌで、その後、水および飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして乾燥するまで蒸発することにより、２０ｇｍの白色固体が得られた。これを、３０ｍＬの１０：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃから再結晶化することにより、３’，５’−ビス（Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）チミジン、１５．５ｇｍ（８０％）が得られた。
【０２６８】
３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）チミジン：２５０ｍＬ丸底フラスコに撹拌バーを装着し、そのフラスコに１５．５ｇｍの３’，５’−ビス（Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）チミジンを投入した。これを、ＤＣＭ（１７８ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸：水（１７．９ｍＬ、１０：１ｖ／ｖ）で処理し、その混合物を室温で撹拌した。参考文献に反して、反応を非常にゆっくりと進め、そしてその生成物を過剰に脱シリル化することにより、実質的な量のチミジンを生成させた。０℃まで冷却し、そして飽和炭酸水素ナトリウムで処理することによってその反応を停止した。その溶液を飽和ＮａＣｌで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして蒸発することにより、１５ｇｍの油状物が得られた。これを、ＣＨ２Ｃｌ２およびアセトンの、それぞれ６：１、次いで４：１の比の段階勾配（ｓｔｅｐ−ｇｒａｄｉｅｎｔ）で１５０ｇｍのシリカによるフラッシュクロマトグラフィーにより精製することにより、２．４ｇｍの３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）チミジンが得られた。
【０２６９】
３’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）チミジン５’−三リン酸：５０ｍＬフラスコに撹拌バーおよび乾燥アルゴン供給源を装着した。そのフラスコに３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）チミジン（１０７ｍｇ）を投入した。これを無水ピリジン（６ｍＬ）に溶解し、その溶液を乾燥するまで蒸発した。そのフラスコにアルゴンを流し、残渣を無水ピリジン（３００μＬ）および無水ジオキサン（９００μＬ）、それに続いて無水ジオキサン中の１Ｍ  ２−クロロ−４Ｈ−１，２，３−ジオキサホスホリ−４−オン（３３０μＬ）で処理し、そして反応混合物を１０分間室温で撹拌した。反応混合物を、無水ジメチルホルムアミド（９００μＬ）中のビス（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム）ピロホスフェートとトリ−ｎ−ブチルアミン（３００μＬ）との０．５Ｍ溶液のよく撹拌された混合物で処理し、その混合物を１０分間室温で撹拌した。これを９８：２ピリジン：水の混合物中の１％ヨウ素溶液（６μＬ）で処理し、１５分間撹拌し、そして過剰量のヨウ素を５％ＮａＨＳＯ３（７００μＬ）で処理することによってクエンチし、そしてその溶液を乾燥するまで蒸発した。その残渣を水（３０ｍＬ）で処理し、３０分間撹拌した後、それを濃縮アンモニア水溶液（６０ｍＬ）で処理し、１時間撹拌し、そして乾燥するまで蒸発した。その残渣を水に溶解し、０．０５Ｍ  トリエチルアンモニウムジカーボネート中のＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ２５樹脂を充填したカラムに載せ、そして１Ｍ  ＴＥＡＢに至るまで直線勾配で溶出した。貯蔵した生成物画分を凍結乾燥することにより、標題化合物（５４ｍｇ）が得られた。
【０２７０】
（実施例４）
（チミジン−５’−Ｏ−（１−（Ｓ−（置換）チオ三リン酸）
【０２７１】
【化４７】
2008526877.tif 000028
反応１：３’−Ｏ−アセチル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）チミジンの合成：２５０ｍＬ丸底フラスコに、撹拌バー、乾燥アルゴンの供給源および氷浴を装着した。そのフラスコにチミジン（２４．２ｇｍ）を投入し、そのフラスコにアルゴンを流した。チミジンをピリジン（６０ｍＬ）中に懸濁し、その混合物を０℃まで冷却した。次に、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（１６．６ｇｍ）を一度に加えた。その混合物を３時間撹拌し、室温に温めた。濁った混合物を無水酢酸（１２．２５ｇｍ）で処理し、反応物を室温で１４時間撹拌した。濁った混合物を撹拌しながら水（５００ｍＬ）に注ぐことによって沈殿させた。数分間静置した後、その固体を濾過により単離し、水で洗浄した。その固体をアセトン（２００ｍＬ）について溶解し、生じた清澄溶液を水（６００ｍＬ）に再沈殿させた。生じた沈殿物を濾過により回収し、水ですすぎ、そして約４０℃の真空中で乾燥することにより、３’−Ｏ−アセチル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）チミジン３２ｇｍ（９３％）が得られた。
【０２７２】
反応２：３’−Ｏ−アセチルチミジンの合成：２Ｌ丸底フラスコに、吊り下げ式撹拌機および氷浴を装着した。そのフラスコに３’−Ｏ−アセチル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）チミジン（２００ｇｍ）を投入し、固体をメタノール（１．５Ｌ）で処理した。その混合物を氷浴で冷却し、塩化アセチル（５．９ｇｍ）で処理し、そして反応物を撹拌した。氷浴を１５分後に取り外し、反応物を室温で撹拌し、ＨＰＬＣでモニターした。３時間後、９７％完了し、溶液であった。これを、ｐＨ紙（約３０ｇｍ）を中和するまで固体炭酸水素ナトリウムで処理し、軽く撹拌し、濾過し、そしてその固体を５０ｍＬメタノールで洗浄した。その溶媒を白色固体が現れるまで真空中で濃縮した。約３分の２の溶媒を除去し、生じた固体を濾過により回収し、真空中で乾燥することにより３’−Ｏ−アセチルチミジン、７１．４ｇｍ（５０％）が得られた。
【０２７３】
反応３：チミジン−５’−Ｏ−（１−チオ三リン酸）の合成：ＡｒａｂｓｈａｓｈｉおよびＦｒｅｙ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０４，１５０（１９９４）の方法に実質的に類似した方法による以下の様式によって、標題化合物を調製した。予めピリジン（５ｍＬ）から蒸発された３’−Ｏ−アセチルチミジン（５７０ｍｇ）をアルゴン下でトリエチルホスフェート（７．５ｍＬ）に溶解し、トリ−ｎ−ブチルアミン（５２５μＬ）で処理し、そしてその反応物を０℃まで冷却した。これを塩化チオホスホリル（２０４μＬ）で処理し、そして０℃で１時間撹拌した。トリエチルホスフェート（１９ｍＬ）に溶解したトリ−ｎ−ブチルアンモニウムピロホスフェート（１．２１ｇｍ）の溶液を加え、生じた混合物を室温で３０分間撹拌した。トリエチルアミン（１０．４ｍＬ）を加えることにより、無機リン酸塩を沈殿させた。その混合物を濾過し、そして粗生成物を水（１２５ｍＬ）に溶解し、濃縮アンモニア（２５ｍＬ）で処理した。これを、室温で１時間静置し、そしてアンモニアを真空中で除去した。生じた濃縮物を、トリエチルアンモニウムブロミドの０．０５Ｍから１Ｍの勾配でＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ２５樹脂を用いてイオン交換クロマトグラフィーで精製した。糖およびリン酸試験で陽性を示した画分を貯蔵し、凍結乾燥することにより、そのテトラトリエチルアミン塩である３’−Ｏ−アセチルチミジン−５’−Ｏ−（１−チオ三リン酸）としてヌクレオチドが得られた。
【０２７４】
反応４：チミジン−５’−Ｏ−（１−（Ｓ−（２−ピリジルチオ）チオ三リン酸）の合成：前反応からのチミジン−５’−Ｏ−（１−チオ三リン酸）を１：１メタノール／水の混合物に溶解し、Ａｌｄｒｉｔｈｉｏｌ  ２で処理した。その生成物を上記のようにＩＥＸクロマトグラフィーで精製することにより、生成物１が得られた（スキームを参照のこと）。反応物１と遊離チオールの任意のメンバーとの反応によりジスルフィドとしてさらなる基を結合することができる。
【０２７５】
（実施例５）
（可逆的ターミネーターの評価）
ポリメラーゼ取り込みの効率ならびにそれらの終結効率および可逆性について本発明の可逆的ターミネーターを試験した。その目的のために、キャピラリー電気泳動に基づく鎖シフトアッセイ（Ｃａｐｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｉ  ｂａｓｅｄ  ｓｔｒａｎｄ  ｓｈｉｆｔ  ａｓｓａｙ）を使用した。ゲルシフトアッセイと同様に、その目的は、伸長しなかったフラグメントと比べて１ヌクレオチド伸長したＤＮＡフラグメントのマトリックス中の移動度の差に基づいて伸長したプライマーを観察することである。
【０２７６】
このアッセイは、ＡＢＩ  ３７３０ＸＬ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒにおいて実施した。取り込み効率を試験するために、色素標識されたプライマーを、ストレプトアビジンで被覆された磁気ビーズに接着した５’ビオチンを含む鋳型にアニールさせた。その鋳型は、可逆的に終結している（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ）ヌクレオチドに相補的な一続きの塩基を含む。ＤＮＡポリメラーゼを目的のヌクレオシド三リン酸、ここに可逆的ターミネーターおよび適切な緩衝液の存在下で加えた。その反応物を適切な温度（通常３７℃）で４分間インキュベートし、ＥＤＴＡで停止し、３回洗浄し、脱イオン水に再懸濁し、９５℃に加熱してプライマー−鋳型構造を変性し、磁石上に置いてビーズを濃縮し、そしてその上清を除去した。その上清は、プライマーを含んでおり、次いで、プライマーが伸長したかを決定するために既知のサイズのフラグメントに対して３７３０ＸＬで解析した。伸長していないプライマーの量対伸長したプライマーの量から取り込みの効率を評価した。鋳型が、試験されている、終結しているヌクレオチドに相補的な塩基の一続きを含み、効率的に終結していないヌクレオチドは、プライマーを１ヌクレオチド以上伸長させることができるため、終結の効率は、その次の塩基付加の量から評価され得る。終結しているヌクレオチドがどれくらい可逆的であるかは、終結を解除し、さらなる取り込みを試みることによって評価することができる。そのプロトコールは、以下のとおりである。
【０２７７】
約１０００万ビーズ／μＬの１ミクロンのＤｙｎａｌストレプトアビジンビーズ（ＭｙＯｎｅ）（１００μＬ）を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８（ＴＥ）中で３回洗浄し、次いで３００ｐｍｏｌの５’ビオチン化鋳型オリゴヌクレオチド（オリゴ）を含むＴＥ２００μＬに再懸濁した。ビオチン化鋳型オリゴは、配列決定プライマーに相補的な領域に続いて一続きの５つのアデノシン、次いで様々な塩基の混合物を含むものであった。ビーズ／オリゴ混合物を、回転子上で、室温にて３０分間インキュベートし、磁石を利用してその上清を除去し、ビーズを２００μＬのＴＥで３回洗浄した。ビーズを１００μＬのＴＥに再懸濁した。１０μＬの再懸濁されたビーズを、１００ｐｍｏｌの配列決定プライマーを含むＴＥ９０μＬに加えた。配列決定プライマーは、５’ビオチン化鋳型オリゴの一続きに相補的であり、５個連続したアデノシンの配列決定を可能にする。配列決定プライマーは、５’ＦＡＭ色素で標識されたものであった。プライマー溶液中の鋳型オリゴが接着したビーズを、６５℃で２分間インキュベートし、次いで２分間４０℃に冷却し、続いて４℃で２分間インキュベートすることにより配列決定プライマーをアニールした。過剰なプライマーを洗い流し、ビーズを適切なビーズの濃度で再懸濁した。
【０２７８】
配列決定プライマーがアニールした鋳型オリゴが接着した２００万個のビーズを、反応容量１０μＬ中に例えば１０ＵのＫｌｅｎｏｗ  ｅｘｏ−、適切な量のチミジン（代表的には非改変チミジンが最終濃度約１μＭ）を含む配列決定反応物に加えた。次いでその反応物を３７℃で４分間インキュベートし、最終濃度が５０ｍＭになるようにＥＤＴＡを加えることによって停止した。ビーズを磁石にあて、ＴＥ緩衝液で３回、脱イオン水で１回洗浄し、次いで２０μＬの脱イオンに再懸濁した。再懸濁されたビーズを９５℃に加熱することによってプライマー：鋳型を変性し、プライマーを溶液に放出させた。磁石を用いてビーズを濃縮し、上清を新しいチューブに取り出した。０．５μＬの上清を、９μＬのＨｉＤｉホルムアミドおよび０．５μＬのＡＢＩ  Ｌｉｚ  ＧｅｎｅｓｃａｎサイズマーカーとともにＡＢＩ  ３７３０ＸＬにロードした。代表的な結果を図１Ａ、１Ｂ、２Ａおよび２Ｂに示す。
【０２７９】
（実施例６）
（合成による配列決定）
各ヌクレオチドが、ＤＮＡ鋳型上のアデノシン、グアノシン、シトシンまたはチミジンに相補的な位置で特異的に取り込まれることが可能な４つの可逆的に終結しているヌクレオチドを使用した。可逆的に終結しているヌクレオチドの各々は、特定の光の波長で一意的な検出および同定が可能である異なる蛍光色素で標識されていた。各鋳型に対応する蛍光シグナルを検出および記録できるように、配列決定されるＤＮＡ鋳型を分散し、そしてアレイ上に固定化した。この実施例では、鋳型を直径１ミクロンの磁気ビーズに固定化した。各ビーズは、単一のＤＮＡ分子からのクローン増幅によって得た約１５０，０００コピーのＤＮＡ鋳型を含んでいた。この増幅は、Ｄｒｅｓｓｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１００：８８１７−２２に記載されているようなエマルジョンＰＣＲにより達成された。鋳型構築および増幅プロセスの結果として、各ビーズ上に固定化された各ＤＮＡフラグメントは、配列決定される未知ＤＮＡのすぐ隣に並置された普遍的な配列決定プライマーに相補的な配列を含んでいた。ビーズを顕微鏡用ガラススライド表面上のポリアクリルアミドの薄層に包埋した。これを達成するために、Ｍｉｔｒａ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２０：５５−６５に記載されているように、鋳型が結合したビーズを、５％ポリアクリルアミドゲルを作製するために必要である材料と混合し、そして遮蔽された、シラン結合剤で処理した顕微鏡用スライドに注ぎ、カバーガラスを被せた。重合した後、鋳型含有ビーズを、単一の焦平面かつガラススライド上の特有のｘ、ｙ位置に閉じ込めて、その位置に従って各ビーズの可視化および同定が可能となった。
【０２８０】
蛍光色素（今回は、ＦＡＭ）で標識された普遍的なプライマーを、ビーズに結合した鋳型の約１０倍のモル濃度を達成するのに十分な（ＴＥ溶液中の）プライマーを加えることによって（すなわち、鋳型の総量１０ｐｍｏｌが、ゲル中の結合したビーズ上に存在する場合、１００ｐｍｏｌのプライマーを加えた）ビーズにハイブリダイズさせた。そのスライドを、６５℃で２分間、次いで４０℃で２分間そして４℃で２分間インキュベートすることにより、プライマーをアニールさせた。スライドを３分間ＴＥに浸漬するのを３回行うことによって過剰のプライマーを洗い流した。ＴＥは各回で新しいものにした。適切な光源を用いて顕微鏡でスライドの像を得て、各ビーズに接着している複数個のプライマー−鋳型複合体におけるＦＡＭ標識されたプライマーを可視化した。各ビーズの蛍光履歴（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｈｉｓｔｏｒｙ）を標識された可逆的ターミネーターの段階的な付加後に決定することができるように各ビーズの位置を記録した。すべてのビーズの最初の検出についての代替のプロトコールでは、最初のヌクレオチド付加工程で、配列決定されるＤＮＡに隣接した、１塩基の共通したプライマー結合配列を付加するように配列決定プライマーを設計した（従って、すべてのプライマー−鋳型複合体が同じヌクレオチドを取り込むことから、そのアレイ上のすべてのビーズの位置を検出することができる）。
【０２８１】
各付加サイクルを、以下のとおり達成した。３７℃（または、使用した特定のポリメラーゼにより適した別の温度）でインキュベートしたとき、各プライマー−鋳型複合体の３’末端で単一のヌクレオチドを９５％超完全に付加するために、適切な濃度（代表的には２〜５０マイクロモル濃度）で、４種類の蛍光で標識された可逆的ターミネーターを含む適切な緩衝液に可逆的ターミネーターを取り込むことができるＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩ  Ｋｌｅｎｏｗフラグメントのエキソヌクレアーゼ欠損変異体）を含む溶液を加えることによってプライマーを異なるビーズ上で伸長した。次いで、スライドを３分間ＴＥに浸漬するのを３回行うことによって過剰のプライマーを除去した。ＴＥは各回で新しいものにした。次いで、適切な励起波長および発光波長を使用して顕微鏡でスライドの像を得て、蛍光標識された可逆的ターミネーターの１つを可視化した。このプロセスを適切な励起波長および発光波長で繰り返すことにより、残り３種類の蛍光で標識されたターミネーターの各々を特異的に検出した。伸長したプライマー−鋳型複合体を含んだ各ビーズは、取り込まれた特定の蛍光標識されたターミネーターに対応する波長で４つの検出工程の１つにおいて蛍光を発した。各ビーズに対して付加されたヌクレオチドの性質を記録した。可逆的ターミネーターに結合された蛍光標識が、すべて同じ波長で励起するが、４つのうち各々からの発光波長は異なる波長で検出される代替のプロトコールでは、カラーＣＣＤカメラを使用して４つの発光波長の各々において同時にデータ収集する単一の検出工程を使用した。検出後、スライドを５００ｍＭ  ＤＴＴを含む溶液で５分間洗浄し、次いでＴＥで３分間洗浄するのを３回行うことによって、蛍光標識が取り込まれたヌクレオチドに結合しているリンカーを切断し、放出された分子を洗い流した。切断に使用された条件は、ハイブリダイズされたプライマー−鋳型複合体の完全性を維持する（変性を生じさせない）。ターミネーターの性質に依存して、リンカーの切断はまた、取り込まれたヌクレオチド上に伸長できる３’末端を生成する。可逆的ターミネーターが、異なる切断化学を有する２つのリンカーが（１）蛍光標識を結合するためおよび（２）３’末端への付加を防ぐために使用されるタイプである場合、第２のリンカーの切断を実施するために第２の切断工程を加える。一旦、各プライマー−鋳型複合体における伸長されたプライマーの３’末端に伸長できる末端が生成されると、付加サイクルは、可逆的ターミネーターの新しいアリコートを用いて繰り返された。取り込まれたヌクレオチド上に伸長できる３’末端を再生する可逆的ターミネーターの付加、検出および切断のプロセスを、各ビーズに接着された鋳型の配列を読み取るために複数のサイクル繰り返す。
【０２８２】
本発明者らは、本発明の多くの実施形態を説明したが、本発明者らの基本の実施例が、本発明の化合物および方法を利用する他の実施形態を提供するために変更され得ることは明らかである。そのため、本発明の範囲は、実施例を用いて説明された特定の実施形態ではなく、添付の特許請求の範囲によって定義されることが理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【０２８３】
当業者は、以下に説明される図面が例示の目的のみであることを理解するだろう。これらの図面は、本教示の範囲を制限することを決して意図しない。
【図１Ａ】図１Ａは、プライマーのみのＡＢＩ  ３７３０ＸＬ  ＤＮＡ解析を表す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、５つのＡ’を含む鋳型においてＴヌクレオチドによって伸長したプライマーのＡＢＩ  ３７３０ＸＬ  ＤＮＡ解析を表す。
【図２Ａ】図２Ａは、不完全な終結のＡＢＩ  ３７３０ＸＬ  ＤＮＡ解析を表す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、不完全な伸長のＡＢＩ  ３７３０ＸＬ  ＤＮＡ解析を表す。
【図１Ａ】
2008526877.tif 000049
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
2008526877.tif 000051
【図２Ｂ】
2008526877.tif 000052
【国際調査報告】
2008526877.tif 000053