(57)【要約】本発明は患者における肝臓疾患の状態または進行の診断に補助するための、血清及び血漿のマーカー値を含む複数の血液マーカー値を使用する、診断方法、キット及びシステム、及び、関連するコンピュータ読み取り可能な媒体を提供する。本発明はまた、（１）肝臓疾患の治療において有用な活性成分をスクリーニングするため；（２）肝臓疾患に罹患しやすいか、罹患している患者に対する治療方法の選択に補助するため；及び、（３）患者１人または複数における肝臓疾患の状態または進行をモニタリングする場合に有用な臨床プログラムの設計に補助するための、血清及び血漿のマーカー値を含む血液マーカー値を使用する方法およびシステム、及び関連するコンピュータ読み取り可能な媒体を提供する。
2008502908.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
時点１つ以上において各時点に対する予測子値を測定することにより患者における肝臓疾患の状態または進行の診断を補助することを含む方法であって、予測子値の及び比較データセットの時点１つ以上における比較を用いて患者の肝臓疾患の状態または進行を確認し、そして、比較参照肝組織病理学的及び血液マーカーデータを相関させることにより誘導された線形または非線形関数アルゴリズムに血液マーカー２つ以上及び場合により補助的マーカー１つ以上の値を反映するデータを入力することにより患者の予測子値を計算する上記方法。
【請求項２】
比較データセットが肝臓疾患に関連する数値１つ以上または数値の範囲を含み、そして血液マーカーが血清マーカーである請求項１記載の方法。
【請求項３】
比較データセットが以下の試験、即ち、Ｓｃｈｅｕｅｒ評点（０−４）、変更Ｉｓｈａｋ評点（ＨＡＩ）Ａ−インターフェイス肝炎（０−４）、変更Ｉｓｈａｋ評点（ＨＡＩ）Ｂ−コンフルエント壊死（０−６）、変更Ｉｓｈａｋ評点（ＨＡＩ）Ｃ−斑紋状壊死（０−４）、変更Ｉｓｈａｋ評点（ＨＡＩ）Ｄ−門脈炎症（０−４）及び変更ＨＡＩ評点（Ｉｓｈａｋ評点）（０−６）の１つ以上により決定される値に相当する値を含む請求項３記載の方法。
【請求項４】
血液マーカーがＮ末端プロコラーゲンＩＩＩプロペプチド（ＰＩＩＩＮＰ）、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩ、テネイシン、ラミニン、ヒアルロナン、ＭＭＰ−２、ＴＩＭＰ−１、ＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１複合体、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の少なくとも２つ以上から選択される血清マーカーである請求項１記載の方法。
【請求項５】
血液マーカー２つ以上及び場合により患者体重、性別、年齢及び血清中トランスアミナーゼレベルからなる群から選択される補助的マーカー１つ以上の値を反映するデータを入力することにより予測子値を計算する請求項４記載の方法。
【請求項６】
判別関数分析またはノンパラメトリック回帰分析のいずれかを用いて比較参照肝組織病理学的及び血液マーカーデータを相関付けることにより、線形または非線形の関数アルゴリズムを誘導する請求項１記載の方法。
【請求項７】
比較参照肝組織病理学的及び血液マーカーデータが線維形成または線維溶解を示すデータ、肝臓疾患を示す上昇した血清中のマーカーのレベル、または、他の肝臓疾患の臨床症状を含む請求項６記載の方法。
【請求項８】
比較参照肝組織病理学的及び血液マーカーデータが患者以外の対象１つ以上に対して測定されたデータに基づく請求項７記載の方法。
【請求項９】
比較参照肝組織病理学的及び血液マーカーデータが患者に関連するデータに基づく請求項７記載の方法。
【請求項１０】
比較参照肝組織病理学的及び血液マーカーデータが患者及び患者以外の対象１つ以上に関連するデータに基づく請求項９記載の方法。
【請求項１１】
線形または非線形関数アルゴリズムが下記：
（ａ）対象の第１の群に関する血液マーカー及び組織病理学的データを含むデータセットを編集すること；
（ｂ）判別関数分析、ノンパラメトリック回帰分析、分類ツリー及びニューラルネットワークからなる群から選択される分析方法少なくとも１つの適用を介して編集されたデータセットから線形または非線形の関数アルゴリズムを誘導すること；
（ｃ）工程（ｂ）において誘導されたアルゴリズム内に対象の第２の群に関する血液マーカー値を含むデータを入力することにより、対象の第２の群に関するバリデーション生検評点を計算すること；
（ｄ）対象の第２の群に関する肝組織病理学的評点と工程（ｃ）において計算されたバリデーション生検評点値を比較すること；および、
（ｅ）工程（ｃ）において求められたバリデーション生検評点が対象の第２の群に関する肝組織病理学的評点と臨床的に許容される耐容性の水準内において相関していない場合、以下の操作（ｉ）〜（ｉｉｉ）、即ち、（ｉ）アルゴリズムを、（１）対象の第１の群に関するデータセットを再検討すること、及び（２）分析方法を再検討または変更すること、を含む根拠に基づいて変更すること、（ｉｉ）変更されたアルゴリズム内に対象の第２の群に関する血液マーカー値を含むデータを入力することにより対象の第２の群に関するバリデーション生検評点値を計算すること、（ｉｉｉ）変更されたアルゴリズムを用いて計算されたバリデーション生検評点値が臨床的に許容される耐容性の水準内において対象の第２の群に関する肝組織病理学的評点に相関するかどうかを評価すること、をそのような耐容性が満足されるまで実施すること；
により誘導される請求項１記載の方法。
【請求項１２】
アルゴリズムが判別関数分析またはニューラルネットワークの適用を介して誘導され、そして、血液マーカー値が血清マーカー値である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
患者の予測子値を時点２つ以上において測定する請求項１記載の方法。
【請求項１４】
時点２つ以上において測定された患者の予測子値を患者の肝臓疾患の状態または進行を確認するために比較する請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
患者の予測子値が判別評点であり、１つより多い判別評点を各時点において求め、そして、最高の判別評点が各時点における予測子値として選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
トランスアミナーゼレベルがアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）のレベルを含む請求項５記載の方法。
【請求項１７】
線形または非線形の関数アルゴリズムがニューラルネットワークを用いて誘導される請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
以下の血清マーカー、即ち、Ｎ末端プロコラーゲンＩＩＩプロペプチド（ＰＩＩＩＮＰ）、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩ、テネイシン、ラミニン、ヒアルロナン、ＭＭＰ−２、ＴＩＭＰ−１、ＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１複合体、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の２つ以上に関する濃度値により定義される線形または非線形の関数アルゴリズムを示すデータを含有するデータフィールドを含むデータ構造を自身上に保有するコンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項１９】
線形または非線形の関数アルゴリズムが下記：
（ａ）対象の第１の群に関する血液マーカー及び組織病理学的データを含むデータセットを編集すること；
（ｂ）判別関数分析、ノンパラメトリック回帰分析、分類ツリー及びニューラルネットワークからなる群から選択される分析方法少なくとも１つの適用を介して編集されたデータセットから線形または非線形の関数アルゴリズムを誘導すること；
（ｃ）工程（ｂ）において誘導されたアルゴリズム内に対象の第２の群に関する血液マーカー値を含むデータを入力することにより、対象の第２の群に関するバリデーション生検評点を計算すること；
（ｄ）対象の第２の群に関する肝組織病理学的評点と工程（ｃ）において計算されたバリデーション生検評点値を比較すること；および、
（ｅ）工程（ｃ）において求められたバリデーション生検評点が対象の第２の群に関する肝組織病理学的評点と臨床的に許容される耐容性の水準内において相関していない場合、以下の操作（ｉ）〜（ｉｉｉ）、即ち、（ｉ）アルゴリズムを、（１）対象の第１の群に関するデータセットを再検討すること、及び（２）分析方法を再検討または変更すること、を含む根拠に基づいて変更すること、（ｉｉ）変更されたアルゴリズム内に対象の第２の群に関する血液マーカー値を含むデータを入力することにより対象の第２の群に関するバリデーション生検評点値を計算すること、（ｉｉｉ）変更されたアルゴリズムを用いて計算されたバリデーション生検評点値が臨床的に許容される耐容性の水準内において対象の第２の群に関する肝組織病理学的評点に相関するかどうかを評価すること、をそのような耐容性が満足されるまで実施すること；
により誘導される請求項１８記載のコンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項２０】
マイクロプロセッサにより読み取ってよく、そして、以下の血清マーカー、即ち、Ｎ末端プロコラーゲンＩＩＩプロペプチド（ＰＩＩＩＮＰ）、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩ、テネイシン、ラミニン、ヒアルロナン、ＭＭＰ−２、ＴＩＭＰ−１、ＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１複合体、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の２つ以上に関する濃度値により定義される線形または非線形の関数アルゴリズムを独自に識別するコード少なくとも１つを含む、コンピュータ読み取り可能な媒体中に保存されたデータ構造。
【請求項２１】
マイクロプロセッサにより読み取ってよく、そして、予測子関数及び請求項１に従って予測子関数から誘導された値を独自に識別するコード少なくとも１つを含む、コンピュータ読み取り可能な媒体中に保存されたデータ構造。
【請求項２２】
下記要素：
（ａ）マイクロプロセッサにより読み取ってよく、そして、予測子関数及び請求項１に従って予測子関数から誘導された値を独自に識別するコード少なくとも１つを含む、コンピュータ読み取り可能な媒体中に保存されたデータ構造；及び、
（ｂ）Ｎ末端プロコラーゲンＩＩＩプロペプチド（ＰＩＩＩＮＰ）、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩ、テネイシン、ラミニン、ヒアルロナン、ＭＭＰ−２、ＴＩＭＰ−１及びＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１複合体の少なくとも２つ以上の患者の値を含む患者の診断マーカーに関する値を検出して測定するイムノアッセイ１つ以上、
を含む診断キット。
【請求項２３】
コンピュータ読み取り可能な媒体がＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭまたはデジタルまたはアナログの情報リンクである請求項２２記載の診断キット。
【請求項２４】
予測子関数及び請求項１に従って予測子関数から誘導された値を識別する取扱説明書を含む請求項２２記載の診断キット。
【請求項２５】
下記要素：
（ａ）予測子関数及び請求項１に従って予測子関数から誘導された値を独自に識別する取扱説明書；および、
（ｂ）Ｎ末端プロコラーゲンＩＩＩプロペプチド（ＰＩＩＩＮＰ）、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩ、テネイシン、ラミニン、ヒアルロナン、ＭＭＰ−２、ＴＩＭＰ−１及びＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１複合体の少なくとも２つ以上の患者の値を含む患者の診断マーカーに関する値を検出して測定するイムノアッセイ１つ以上、
を含む診断キット。
【請求項２６】
下記要素：
（ａ）マイクロプロセッサにより読み取ってよく、そして、予測子関数及び請求項１に従って予測子関数から誘導された値を独自に識別するコード少なくとも１つを含む、コンピュータ読み取り可能な媒体中に保存されたデータ構造；及び、
（ｂ）Ｎ末端プロコラーゲンＩＩＩプロペプチド（ＰＩＩＩＮＰ）、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩ、テネイシン、ラミニン、ヒアルロナン、ＭＭＰ−２、ＴＩＭＰ−１及びＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１複合体の少なくとも２つ以上の患者のレベルを含む患者の診断マーカーに関する値を検出して測定するイムノアッセイ１つ以上、
を含む診断システム。
【請求項２７】
システムがポイントオブケアまたはリモートシステムである請求項２６記載のシステム。
【請求項２８】
システムが更にＮ末端プロコラーゲンＩＩＩプロペプチド（ＰＩＩＩＮＰ）、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩ、テネイシン、ラミニン、ヒアルロナン、ＭＭＰ−２、ＴＩＭＰ−１及びＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１複合体の少なくとも２つ以上の患者のレベルを入力するための手段を含む請求項２６記載のシステム。
【請求項２９】
システムがプロセッサ、メモリ、インプット及びディスプレイを含む請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
プロセッサがマイクロプロセッサである請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
請求項１記載の方法により時点１つ以上において測定した患者の予測子２つ以上を評価することにより、患者における肝臓疾患の状態または進行の診断を補助することを含む方法。
【請求項３２】
方法が患者の予測子値に基づいて患者に関する治療経過の選択を補助することを含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
方法が患者の予測子値に基づいて疾患分類の１つ以上への患者の分類を補助することを含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
肝臓疾患に罹患した患者に化合物を投与すること、及び、その後に、請求項１の方法に従って求められた患者の予測子値を評価することを含む肝臓疾患の治療において使用するための化合物を評価することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００４年６月１５日に出願された米国特許出願１０／８６８，４３７の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は患者における肝臓疾患の状態または進行の診断を補助するための、血清及び血漿のマーカー値を含む複数の血液マーカー値を使用する、診断方法、キット及びシステム、及び、関連するコンピュータ読み取り可能な媒体を提供する。
【０００３】
本発明はまた、（１）肝臓疾患の治療において有用な活性成分をスクリーニングするため；（２）肝臓疾患に罹患しやすいか、罹患している患者に対する治療方法の選択を補助するため；及び、（３）患者１人または複数における肝臓疾患の状態または進行をモニタリングする場合に有用な臨床プログラムの設計を補助するための、血清及び血漿のマーカー値を含む血液マーカー値を使用する方法およびシステム、及び関連するコンピュータ読み取り可能な媒体を提供する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
肝臓の進行性の線維性疾患は世界中の主要死亡原因である。肝臓における線維症の発病過程は肝星細胞（脂肪細胞または脂肪貯蔵またはＩｔｏ細胞とも称されている）及び過剰な細胞外マトリックス蛋白を合成分泌する他の肝細胞外マトリックス生成細胞（即ち門脈筋線維芽細胞及び線維芽細胞）の増殖及び活性化に非常に依存している（１）。この過程は全ての病因の肝臓疾患に共通である。慢性ウィルス性Ｂ型及びＣ型肝炎、アルコール性肝臓疾患、非アルコール性肝臓疾患及び自己免疫及び遺伝的な肝臓疾患は全て進行性の肝線維症の共通した最終経路及び最終的な肝硬変の発症を含んでいる。
【０００５】
肝線維症が小節がまだ形成されていない慢性傷害に応答した細胞外マトリックスの可逆的蓄積であるのに対し、肝硬変はこの過程における臨床上重要な段階が関与しており、それは常時ではないが通常は非可逆的であり、マトリックスの肥厚した帯が完全に実質を包囲して小節を形成するものである。肝硬変は肝不全、肝臓がん及び死亡の危険性の増大を伴う。結果として、有効であるためには、如何なる肝臓疾患の治療法も可逆的疾患（線維症）を有する患者を指向すべきであり、それには早期発見及び危険対象のモニタリングが必要である（２）。
【０００６】
肝線維症の診断は通常は肝生検の組織学的分析により行われる。単一の生検は診断、予後及び適切な管理を決定する場合に高度に情報性を有するものである（１Ａ；２Ａ）。肝線維症の検出における代理マーカーの役割は未だ確立されていない。従って、肝生検は現時点では肝線維症の「比較参照−標準物質」の指標と見なされている。
【０００７】
しかしながら生検は高価（３Ａ）であり、痛みを伴い（４Ａ）、出血性または致死性（５Ａ；６Ａ）である。生検の処理は時間を要し、労働集約的である。全てのこれらの理由のため、肝生検の頻繁な反復は、疾患の進行または治療への応答のモニタリングに反復した生検を要することから、患者及び医師にとっても許容できないものと考えられる。
【０００８】
穿刺による生検が少量であること、及び、多くの肝臓疾患が散在性であることから、生検は患者の疾患状態を真に表す結果をもたらさない場合がある（７Ａ）。生検の組織学的分析には経験と技術を要するが、なお主観的であり、観察者内及び観察者間での変動の両方が起こりやすい（８Ａ；９Ａ）。
【０００９】
肝線維症の代理マーカーを発見する必要性は臨床的に大きい。このようなマーカーは生検の代わりに線維症の程度を推定するために使用でき、或いは、これらは線維症の進行または後退、及び、生活習慣の変化、または抗線維症剤、抗ウィルス剤または他の治療への応答をフォローアップするために単一の肝生検と組み合わせて使用できる。理想的には、このようなマーカーは自動化でき、患者への侵襲を殆ど伴わずに反復して実施できるような、正確で再現性のある試験に基づくものである。
【００１０】
マトリックスの合成及び分解の産物、及び、これらの過程に関与する酵素の血清試験は多くの研究において肝線維症の代理マーカーとして検討されている（１０Ａ〜１９Ａ）。これらのマーカーの診断上の性能は、個々の試験の一部は肝硬変の検出において（２０Ａ；２１Ａ）、アルコール性肝臓疾患（ヒアルロン酸）（２２Ａ）または非アルコール性脂肪肝臓疾患（ＮＡＦＬＤ）におけるより軽度の線維症（ＹＫＬ−４０）（２３Ａ）において信頼性を示しているものの、一般的には失望させられるものである。他のマーカーは抗ウィルス療法に起因する肝組織の変化を反映すると報告されている（１１Ａ；２４Ａ；２５Ａ）。
【００１１】
生検及び血清マーカーは異なるもの、即ち肝内の動的過程を特徴付ける血清パラメーターを比較するものであるのに対し、生検は固定された時点における線維症の発現を特徴付けるものである。線維性の組織が形成されていないにも関わらず、肝において高度に活性の線維症の過程が存在する場合がある。これとは対照的に、肝内に線維性組織の大型の集落があるが、線維症の活性は一時的に停止または中断されている場合がある。
【００１２】
別の方法は一定範囲の重症度に渡り線維症を評価することができるアルゴリズムを作成するために多くの血清マーカーを組み合わせることである。慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）（１８Ａ；２６Ａ）及び慢性Ｂ型肝炎において、８０％の陽性予測値（ＰＰＶ）を有する有意な線維症を検出することができる５つのパラメーターが発見されている。しかしながら、これらの方法は患者の約５０％において線維症の重症度を決定できておらず、そしてその後の独立したバリデーションはこれらのマーカーの利用性を疑問視している（非特許文献１）。
【００１３】
以前の試験によれば、細胞外マトリックス蛋白（またはその切断フラグメント）の血清中濃度を用いて肝線維症の重症度及び進行度が評価されることが示唆されている（特許文献１および２）。異なる血清マーカーが検討されており、そして肝生検及び肝臓疾患の重症度との相関が認められている（６）。肝線維症の評価のために使用されているマーカーの一部はＰＩＩＩＮＰ、ラミニン、ヒアルロナン、コラーゲンＩＶ、ＴＩＭＰ−１、テネイシン、ＭＭＰ−２及びフィブロネクチンである。これらのマーカーが測定されており、肝線維症を評価するその能力が示されている。それでもなお、診断の正確さ及び診断マーカーの特異性の何れも十分な臨床上の有用性を持って線維症評点を予測するには不十分である。
【００１４】
マーカーの組み合わせが単純な生物学的指数であるＰＧＡ（プロトロンビン時間（ＰＴ）、血清ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、アポリポ蛋白Ａ１（Ａｐｏ  Ａ１）を含む）の診断上の価値を増大させる試みにおいて使用されており、そして指数ＰＧＡＡ（ＰＧＡ指数にアルファ−２−マクログロブリン（Ａ２Ｍ）を加えたもの）が飲酒者におけるアルコール性肝臓疾患の診断に関して記載されている（７，８）。ＰＧＡ及びＰＧＡＡ指数は単一血清マーカーと組み合わせられているが（９，１０）、このような血清マーカーは肝臓疾患を評価する信頼性のある手段を与えていない。
【００１５】
より最近では、α２−マクログロブリン、α２−グロブリン（またはヘパトグロビン）、γ−グロブリン、アポリポ蛋白−Ａ１、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ及び総ビリルビンが肝線維症の状態を評価するために組み合わせられている（１１）。誘導されたマーカーアルゴリズムは重度または比較的軽度の線維症の発見または除外の何れかのために、線維症スペクトルの最末端において強力な診断性能を示している。アルゴリズムは中等度の線維症を有する患者の発見のための有用な診断ツールとはなっていない。
【００１６】
非特許文献２（「Ｐｉｌｅｔｔｅ」）は肝線維症の組織病理学的評価の目的のための数学的アルゴリズムによる診断マーカーヒアルロネート、プロコラーゲンＩＩＩのＮ末端ペプチド、ラミニン及び他の血清マーカーの相関付けを開示している。Ｐｉｌｅｔｔｅは肝線維症の評価のための最良の形態測定的方法を決定したが、ヒアルロン酸のみを使用したものよりも優れている診断システムまたは方法を得るためにアルゴリズム的にマーカーを組み合わせたわけではない。
【００１７】
非特許文献３（「Ｇｕｅｃｈｏｔ」）は肝臓疾患を評価するための血清マーカーとしてのヒアルロン酸及びＰＩＩＩＮＰの性能の比較評価を行っている。しかしながら、Ｇｕｅｃｈｏｔは２つのマーカーの何れかを単独で使用することよりも優れている肝線維症の血清マーカー系評価法を得るためにヒアルロン酸とＰＩＩＩＮＰの結果を組み合わせる試みは行っていない。
【００１８】
従って、患者における肝臓疾患の状態または進行を調べることを補助するための、肝臓疾患関連血液マーカー、例えば、血漿または血清マーカーの２つ以上を使用する、正確で、再現性があり、コンピュータ実施可能な方法、システム、キット及び媒体が求められている。このような方法、システム、キット及び媒体は危険な生検に患者を付すことなく、２時点以上において、医療従事者が患者の肝臓疾患の状態または進行を確認できるようにする。
【００１９】
更にまた、このような方法、システム、キット及び媒体は、肝臓疾患関連の臨床治験の設計またはモニタリングにおいて、そして、肝臓疾患の治療において有用な薬剤のスクリーニングにおいて有用である。
【特許文献１】米国特許第５，３１６，９１４号明細書
【特許文献２】欧州特許第０２８３７７９号明細書
【非特許文献１】Ｒｏｓｓｉ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４９（３）：４５０−４，２００３  Ｍａｒ．
【非特許文献２】Ｐｉｌｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．３，１９９８，ｐ．４３９−４４６（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，  Ｖｏｌ．１３０，Ｎｏ．７，  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １５，  １９９９（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，  Ｏｈｉｏ，  Ｕ．Ｓ．；ａｂｓｔｒａｃｔ  ｎｏ．７８３８９））
【非特許文献３】Ｇｕｅｃｈｏｔ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｖｏｌ．４２，Ｎｏ．４（Ａｐｒｉｌ  １９９６）ｐｐ．５５８−５６３（ＸＰ００２  １４９４５９  Ｗｉｎｓｔｏｎ；Ｕ．Ｓ．）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
（発明の要旨）
本発明は患者における肝臓疾患の状態または進行の診断を補助するための、血清及び血漿のマーカー値を含む複数の血液マーカー値を使用する、診断方法、キット及びシステム、及び、関連するコンピュータ読み取り可能な媒体を提供する。
【００２１】
本発明はまた、（１）肝臓疾患の治療において有用な活性成分をスクリーニングするため；（２）肝臓疾患に罹患しやすいか、罹患している患者に対する治療方法の選択を補助するため；及び、（３）患者１人または複数における肝臓疾患の状態または進行をモニタリングする場合に有用な臨床プログラムの設計を補助するための、血清及び血漿のマーカー値を含む血液マーカー値を使用する方法およびシステム、及び関連するコンピュータ読み取り可能な媒体を提供する。
【００２２】
本発明はポイントオブケアまたはリモートの肝臓疾患診断を促進し、そして、時点２つ以上において肝臓疾患の状態または進行をモニタリングする場合に医療従事者を支援する。有意義な点は、潜在的に不正確であり危険な肝生検の代替を、本発明が医療意思決定者に提供することである。
【００２３】
本発明は肝臓疾患関連マーカー値２つ以上を利用したコンピュータ実施可能なアルゴリズム法を使用する。本発明の予測値は肝臓疾患の状態または進行をモニターした臨床試験においてバリデーションされている。これらの臨床治験は、分析を独立した時点において実施することにより横断的に、そして分析を２時点以上において実施することにより長期的に本発明をバリデーションしている。
【００２４】
従って本発明は、
（ａ）細胞外マトリックス合成（線維形成）及び細胞外マトリックス分解（線維溶解）の動的過程を測定し；そして、
（ｂ）肝線維症の組織学的評点の予測を介して、線維症の程度および肝組織内で生じている動的変化を反映する結果を得る；
ために使用できる。
【００２５】
本発明は特に肝生検が極めて危険である患者の診断及び治療を補助することにおいて有用である。このような患者は凝固障害に罹患し、生検を避け、或いは専門的組織病理学が利用できない場合がある。更にまた、本発明は遺伝性のヘモクロマトーシス、原発性胆汁性肝硬変及び原発性硬化性胆管炎のような慢性の肝臓疾患に関連した肝線維症を評価するために医療意思決定者により使用できる。更に、本発明は特に、線維症が不均一に分散しており、試料採取の誤りが多大な問題を呈する場合において有用である。
【００２６】
１つの実施形態において、本発明は、時点１つ以上において各時点に対する予測子値を測定することにより患者における肝臓疾患の状態または進行の診断を補助することを含む方法であって、予測子値の及び比較データセットの時点１つ以上における比較を医療意思決定者が用いることにより患者の肝臓疾患の状態または進行を確認し、そして、比較参照肝組織病理学的及び血液マーカー、例えば、血漿または血清のマーカーのデータを相関させることにより誘導された線形または非線形関数アルゴリズムに血液マーカー２つ以上、例えば、血漿または血清マーカー２つ以上、及び場合により補助的マーカー１つ以上に関するデータを入力することにより患者の予測子値を計算する上記方法を提供する。
【００２７】
「比較データセット」とは組織病理学的状態の何れかの定性的または定量的な指標を反映する何れかのデータを含むことができる。１つの実施形態において、比較データセットは組織病理学的状態に関連する１つ以上の数値、または数値の範囲を含むことができる。例えば、比較データセットは種々の整数のセット、例えば、整数０〜５を含んでよく、この場合、これらの６整数の異なる群が異なる肝臓疾患状態に相関してよく、例えば、０〜１が軽度の疾患状態、２〜３が中等度の疾患状態に相関し、そして４〜５が重度の疾患状態に相関してよい。従って、比較データセットは確立された肝生検評点システム、例えば、Ｓｃｈｅｕｅｒ評点システム（０〜４）及び変更組織学的活性（「ＨＡＩ」）の線維症評点（Ｉｓｈａｋ評点）（０〜６）に相関させてよい。
【００２８】
好ましい実施形態においては、血液マーカーはＮ末端プロコラーゲンＩＩＩプロペプチド（ＰＩＩＩＮＰ）、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩ、テネイシン、ラミニン、ヒアルロナン、ＭＭＰ−２、ＴＩＭＰ−１、ＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１複合体、アラニン−アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の少なくとも２つ以上から選択される血清マーカーである。補助的マーカーは、例えば、患者の体重、性別、年齢及びトランスアミナーゼレベルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
本発明の別の実施形態においては、判別関数分析またはノンパラメトリック回帰分析のいずれかを用いて比較参照肝組織病理学的及び血液マーカー、例えば、血漿及び血清のマーカーのデータを相関付けることにより、線形または非線形の関数アルゴリズムを誘導する。比較参照肝組織病理学的及び血液マーカーデータ、例えば、血漿及び血清のマーカーデータは線維形成または線維溶解を示すデータ、上昇した肝臓疾患血清マーカー、または、他の肝臓疾患の臨床症状が挙げられる。
【００３０】
１つの実施形態において、比較参照肝組織学的及び血液マーカーデータ、例えば、血漿及び血清マーカーデータは診断された患者以外の対象１人または複数に関するデータに基づく。別の実施形態においては、比較参照肝組織学的及び血液マーカーデータ、例えば、血漿及び血清マーカーデータは診断された患者から以前に得られたデータに基づいており、そして場合により他の対象１人または複数から得たデータにも基づいている。
【００３１】
１つの実施形態において、線形または非線形関数アルゴリズムは、下記：
（ａ）対象の第１の群に関する血液マーカーデータ、例えば、血漿及び血清マーカー、及び組織病理学的データを含むデータセットを編集すること；
（ｂ）分析方法の適用を介して編集されたデータセットから線形または非線形の関数アルゴリズムを誘導すること；
（ｃ）工程（ｂ）において誘導されたアルゴリズム内に対象の第２の群に関する血液マーカーデータ、例えば、血漿及び血清マーカーデータ値を含むデータを入力することにより第２の群に関するバリデーション生検評点を計算すること；
（ｄ）対象の第２の群に関する肝組織病理学的評点と工程（ｃ）において計算されたバリデーション生検評点値を比較すること；および、
（ｅ）工程（ｃ）において求められたバリデーション生検評点が対象の第２の群に関する肝組織病理学的評点と臨床的に許容される耐容性の水準内において相関していない場合、以下の操作（ｉ）〜（ｉｉｉ）、即ち、（ｉ）アルゴリズムを、（１）対象の第１の群に関するデータセットを再検討すること、及び（２）分析方法を再検討または変更すること、を含む根拠に基づいて変更すること、（ｉｉ）変更されたアルゴリズム内に対象の第２の群に関する血液マーカーデータ、例えば、血漿及び血清マーカーデータ値を含むデータを入力することにより対象の第２の群に関するバリデーション生検評点値を計算すること、（ｉｉｉ）変更されたアルゴリズムを用いて計算されたバリデーション生検評点値が臨床的に許容される耐容性の水準内において対象の第２の群に関する肝組織病理学的評点に相関するかどうかを評価すること、をそのような耐容性が満足されるまで実施すること；
により、比較参照肝組織学的及び血液マーカーデータ、例えば、血漿及び血清マーカーデータを相関付けることにより誘導される。
【００３２】
分析方法は判別関数分析及びノンパラメトリック回帰分析を含む統計学的方法、並びに、分類ツリー及びニューラルネットワークのような方法を包含してよい。
【００３３】
別の実施形態においては、本発明はマイクロプロセッサにより読み取ってよく、そして本明細書に記載した態様において誘導された線形または非線形関数アルゴリズムを独自に識別するコード少なくとも１つを含むコンピュータ読み取り可能な媒体中に保存されたデータ構造を提供する。
【００３４】
別の実施形態においては、下記要素：
（ａ）マイクロプロセッサにより読み取ってよく、そして、本明細書に記載した態様において誘導された線形または非線形関数アルゴリズムを独自に識別するコード少なくとも１つを含むコンピュータ読み取り可能な媒体中に保存されたデータ構造；及び、
（ｂ）患者の血清マーカー値を検出して測定するイムノアッセイ１つ以上、
を含む診断キットを提供する。
【００３５】
別の実施形態においては、本発明は、組成物を投与した患者における肝臓疾患の状態または進行を診断する場合に有用なデータを評価することを含む、組成物が肝臓疾患の治療において有用であるかどうかを決定するためのコンピュータ実施可能な方法及びシステムを提供し、ここで、
（ａ）各時点対する予測子値を時点１つ以上においてアルゴリズム的に求めることにより医療従事者により診断を行い；
（ｂ）予測子値及び比較データセットの時点１つ以上の比較を健康管理業務知恵強者が使用することにより患者の肝臓疾患の状態または進行を確認し；そして、
（ｃ）比較参照肝組織病理学的及び血液マーカー、例えば、血漿または血清マーカーデータを相関させることにより誘導された線形または非線形関数アルゴリズムに血液マーカー、例えば、血漿または血清マーカー２つ以上に関するデータを入力することにより患者の予測子値を計算する。
【００３６】
本発明の上記した方法、システム及びキットはまた、医療従事者により使用されることにより、（１）肝臓疾患に罹患しやすいか、罹患している患者に対する治療方法を決定するため；及び、（２）患者１人または複数における肝臓疾患の状態または進行をモニタリングする場合に有用な臨床プログラムを設計することができる。
【００３７】
本発明のこれら及び他の特徴は本発明の詳細な説明において更に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本明細書においては以下の用語は以下に記載するそれぞれの意味を有する。
【００３９】
「抗体」とは患者の診断用血清マーカーエピトープに結合する何れかの抗体、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体またはそのフラグメントを意味する。モノクローナル及び／またはポリクローナル抗体を本発明の方法及び系において使用してよい。「抗体」または他の同様の用語は本明細書においては、モノクローナルであるかポリクローナルの何れかである全免疫グロブリン、並びにマーカーに特異的に結合する免疫反応性のフラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）が挙げられる。「抗体」という用語はまた結合−蛋白、特にヒアルロン酸結合蛋白（ＨＡＢＰ）も含む。好ましい血清マーカー抗体は上記する通りである。
【００４０】
本発明の試験において使用するヒト液体試料は患者の診断マーカーを含有する何れかの試料、例えば、血液、血清、血漿、尿、痰または気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）または何れかの他の体液であることができる。典型的には、血清または血漿試料を使用する。
【００４１】
本発明において使用する抗体は当該分野でよく知られている手法により調製でき、そして典型的にはマーカー、即ち単離された、天然に存在する蛋白として、組み換え発現蛋白として、または、天然蛋白の抗原部分を呈示する合成ペプチドとしての何れかの試料に対して作成される。第２の抗体を検出基、例えば、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビパーオキシダーゼ、蛍光染料または診断試験において生体分子を検出するために一般的に有用な何れかの他の標識部分にコンジュゲートする。コンジュゲートは当該分野でよく知られている手法で調製する。
【００４２】
「イムノアッセイ」は血清マーカーに結合する抗体に試料を反応させることにより生物学的試料中の患者診断用の血清マーカーの存在を検出するものであり、反応は抗体と血清マーカーとの間の免疫複合体の形成を可能にする時間と条件の下で実施される。次にこのような免疫複合体の定量的測定を行う。
【００４３】
１つの型においては、使用する抗体は血清マーカー、血清マーカーの免疫原性フラグメントまたは抗血清マーカー結合イディオタイプ抗体である免疫原を哺乳類（例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、ブタ等）に投与することにより作製された抗体である。他の有用なイムノアッセイは一般的に血清マーカー結合抗体の使用を特徴とする（それらが上記した免疫原の１つに対して作製されたものであるかどうかに関わらない）。やはり血清マーカーに結合する第２の抗体を使用するサンドイッチイムノアッセイフォーマットを用いてよく、２抗体の一方を固定化し、他方を標識してよい。
【００４４】
好ましいイムノアッセイは標識され第１の抗体に結合する第２の抗体を用いて血清マーカー及び血清マーカー結合抗体との間の固定化複合体を検出する。或いは第２の抗体もまた血清マーカーに結合するサンドイッチフォーマットが第１のバージョンの特徴となる。サンドイッチイムノアッセイの操作法においては、血清マーカー結合抗体は不溶性物質に結合したキャプチャー抗体であることができ、そして、第２の血清マーカー結合抗体は標識抗体であることができる。上記したサンドイッチイムノアッセイの操作法は後に記載する抗体と共に使用できる。
【００４５】
本発明において使用する試験は尿、血漿、血清、腹水またはリンパ液を含む試料中の血液マーカー、例えば、血漿または血清のマーカーを測定するために使用できる。血清マーカーを検出するためのイムノアッセイキットもまた本発明において使用でき、そして血清マーカー結合抗体及び生物学的試料中の血清マーカーへの抗体の結合を測定するための手段を含む。好ましい実施形態においては、キットは上記した第２の抗体または競合する抗原の１つを含む。
【００４６】
「比較データセット」は本明細書において以前に定義した通りである。
【００４７】
「比較参照肝組織病理学的及び血液マーカーデータ」及び「組織病理学的データ」は例えば、線維形成または線維溶解、界面肝炎、壊死、炎症、壊死炎症、上昇した肝臓疾患血清マーカーまたは他の肝臓疾患の臨床兆候を示す血清または血漿のデータが挙げられるが、これらに限定されない。即ち、比較参照肝組織病理学的及び血液マーカーデータは例えば、Ｓｃｈｅｕｅｒ評点（０−４）及びＨＡＩ評点（Ｉｓｈａｋ評点）（０−６）を使用する肝生検試験１つ以上の適用を反映するデータが挙げられるが、これらに限定されない。他の比較参照肝組織病理学的及び血液マーカーデータは変更Ｉｓｈａｋ評点（ＨＡＩ）Ａ−インターフェイス肝炎（０−４）、変更Ｉｓｈａｋ評点（ＨＡＩ）Ｂ−コンフルエント壊死（０−６）、変更Ｉｓｈａｋ評点（ＨＡＩ）Ｃ−斑紋状壊死（０−４）、変更Ｉｓｈａｋ評点（ＨＡＩ）Ｄ−門脈炎症（０−４）に関するものであることができる。
【００４８】
これら及び他の適用可能な評点システムは当該分野でよく知られている。例えば、Ｓｃｈｅｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｌｉｖｅｒ  Ｂｉｏｐｓｙ  Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ”（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ２０００）；Ｓｃｈｅｕｅｒ，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ，１９９１；１３：３７２−３７４；Ｉｓｈａｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１９９５；２２：６９６−６９９を参照できる。アルコール性肝臓疾患のような疾患における線維症のパターンに関して存在している相違点のために、評点システムは非ウィルス性肝臓疾患の症例においては評点を割り付ける目的のために変更する必要がある。
【００４９】
「比較参照肝組織病理学的及び血液マーカーデータ」は全てのこのような変更された評点及び評点システムから求められた値を反映するデータを含む。
【００５０】
比較参照肝組織病理学的及び血液マーカー、例えば、血漿及び血清のマーカーデータはまた例えば、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）のようなトランスアミナーゼの上昇した血清中濃度を反映するデータ、及び、黄疸のような症状の定性的または定量的な評価を含む。
【００５１】
「バリデーション生検評点」とは肝組織病理学的及び血液マーカーデータ値をアルゴリズムに入力することにより求められる値である。
【００５２】
「判別関数分析」とは、どの変数が２つ以上の天然に存在する相互に排他的な群の間を判別するかを決定するために使用される手法である。判別関数分析の根拠となる基本的な考え方は、相互に独立していてもしていなくてもよい予測子変数のセットに関して群が異なっているかどうかを決定すること、及び、次にそれらの変数を使用して群の構成要素資格（ｍｅｍｂｅｒｓｈｉｐ）（例えば、新規症例の）を予測することである。
【００５３】
判別関数分析はカテゴリカルである結果値（２つ以上の相互に排他的な水準）で開始する。モデルは、これらの水準がＡＮＯＶＡ（分散分析）のように連続的またはカテゴリカル（ただし好ましくは連続的）でありえる予測子変数のセットにより判別することができると推定し、そして、ＡＮＯＶＡのように、根拠となる判別関数が線形であると推定する。判別分析は「分配変動」ではない。これは確かに予測子変数のセット内の正規の相関を求めるものであり、そしてこれらの相関を用いて結果変数の全水準に渡る全ての予測子変数の全変動のパーセントを説明する固有関数を構築する。
【００５４】
分析の出力は結果変数の水準に関わらず「判別評点」を発生させる予測子変数の組み合わせを使用する線形判別関数（固有関数）のセットである。総変動のパーセントを各関数に関して呈示する。更にまた、各固有関数について、結果変数の各水準内の予測子変数の組み合わせに基づいて判別評点を与えるＦｉｓｈｅｒの判別関数のセットを作成する。
【００５５】
通常は幾つかの変数を試験で使用することによりどれが群間の判別に寄与するかを調べる。この場合、全分散及び共分散のマトリックスを作成する。同様にプールされた群内の分散及び共分散のマトリックスを作成してよい。群間に有意差（全変数に関して）が有るか無いかを決定するために多変量Ｆ試験によるこれらの２マトリックスの比較を行う。この手続きは多変量分散分析、即ちＭＡＮＯＶＡと同一である。ＭＡＮＯＶＡの場合のように、多変量試験をまず実施し、そして統計学的に有意であれば、次に、変数のどれが群に渡って有意差のある平均を有するかを調べる。
【００５６】
定量的変数１つ以上を含有する観察及び観察の群を定義する分類変数のセットにつき、判別の手続きは群の１つに各観察を分類する判別基準を作成する。どの程度良好に判別基準が「機能する」かを知るために、異なる症例、即ち判別基準を推定するために使用しなかった症例を分類（演繹的）することが必要である。新しい症例の分類のみが判別基準の予測的有効性を評価することができる。
【００５７】
誘導された基準をバリデーションするために、分類を他のデータセットに適用することができる。判別基準を誘導するために使用されたデータセットはトレーニングまたはカリブレーションデータセットまたは患者トレーニングコホートと称される。判別基準の性能をバリデーションするために使用されるデータセットはバリデーションデータセットまたはバリデーションコホートと称される。
【００５８】
判別基準（関数またはアルゴリズム）は一般化自乗距離の尺度を求める。これらの距離はプールされた共分散マトリックスに基づいている。近接性を測定するためにはマハラノビスまたはユークリッドの距離の何れかを使用することができる。これらの距離は、結果水準の群分けを識別するために使用でき、従って変数の水準の可能な減少を測定する。
【００５９】
「プールされた共分散マトリックス」とは分析において各サブ集団に対する共分散マトリックスの成分を加算することにより形成される数的マトリックスである。
【００６０】
「予測子」とは依存または応答変数または「予測子値」を発生させるために関数に適用してよい何れかの変数である。本発明の１つの実施形態においては、予測子値は患者の血液マーカー（例えば、血漿または血清マーカー）１つ以上の判別関数分析を介して求められた判別評点であってよい。例えば、線形モデルは、依存（または応答）変数Ｙと予測子変数のセット、即ちＸの間に、下記：
Ｙ＝ｂ０＋ｂ１Ｘ１＋ｂ２Ｘ２＋．．．．．．＋ｂｋＸｋ
となるような（線形の）関係を特定する。この式において、ｂ０は切片に関する回帰係数であり、そしてｂｉ値はデータから計算された回帰係数（変数１からｋまでに関する）である。
【００６１】
「分類ツリー」は予測子変数１つ以上に関するその測定から得られるカテゴリカル依存変数の分類における症例またはオブジェクトの構成要素資格を予測するために使用する。分類ツリー分析はいわゆるデータマイニングにおいて使用される主要な手法の１つである。分類ツリーの目標はカテゴリカル依存変数に対する応答を予測または説明することであり、そしてそれにより、使用可能な手法は判別分析、クラスター分析、ノンパラメトリック統計および非線形推定のより伝統的な方法において使用される手法と大きく共通している。
【００６２】
分類ツリーの柔軟性はそれらを極めて魅力的な分析の選択肢としているが、これはその使用がより伝統的な方法の排除のために推奨されることを意味するわけではない。実際は、より伝統的な方法の典型的により厳密な理論的及び分散的な予測が適合する場合は、伝統的な方法が好ましい場合がある。しかしながら、予備的な手法として、または、伝統的な方法が失敗した場合の最終救済の手法として、分類ツリーは多くの研究者の見解においては優れているものである。分類ツリーは医薬（診断）、コンピュータサイエンス（データ構造）、植物学（分類）および心理学（決定理論）に至るほど多様な応用分野において広範に使用されている。分類ツリーは容易に図式化できるため、厳密な数的解釈のみが可能である場合よりも解釈が容易になる。
【００６３】
「ニューラルネットワーク」は認知系及び脳の神経機能における学習の（仮説化）過程の後にモデル化される分析手法であり、いわゆる既存データからの学習の過程を実施した後に、新しい観察（特定の変数に関する）を他の観察（同じか他の変数）から予測することができる。ニューラルネットワークはデータマイニング手法の１つである。第１の工程は特定のネットワークアーキテクチャー（各々が特定数の「ニューロン」よりなる特定数の「レイヤー」を含む）を設計することである。ネットワークの大きさ及びストラクチャーは検討される現象の性質（例えば、形式的複雑性）に合致する必要がある。後者は明らかにこの早期の段階において十分わかっていないため、この作業は容易ではなく、複数の「試行と錯誤」を含む場合が多い。
【００６４】
次にニューラルネットワークを「トレーニング」の過程に付す。この相においては、コンピュータメモリは入力（変数）の数に反復過程を適用してネットワークのウエイトを調節することにより、「トレーニング」を実施する対象となる試料データを旨適に予測するニューロンとして機能する。既存データセットからの学習の相の後に、新しいネットワークが準備され、次にそれを使用して予測を作成する。
【００６５】
本発明の１つの実施形態においてニューラルネットワークは１つ以上のパーソナルまたはメインフレームコンピュータまたは治療装置のコンピュータ化された点のメモリを含むことができる。
【００６６】
「コンピュータ」とは特定のコンピュータハードウエアシステム及び特定のソフトウエアオペレーティングシステムの組み合わせを指す。本発明のコンピュータまたはコンピュータ化システムはハンドヘルド（ｈａｎｄｈｅｌｄ）の計算機を含むことができる。有用なハードウエアシステムの例は何れかの型の適当なデータプロセッサを含む。「コンピュータ」という用語はまた例えば、ＤＯＳ、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、ＯＳ／２またはＬｉｎｕｘ（登録商標）のようなオペレーティングシステムを有するパーソナルコンピュータ（ＰＣ）；Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ（登録商標）コンピュータ；オペレーティングシステムとしてのＪＡＶＡ（登録商標）−ＯＳを有するコンピュータ；及びグラフィカルワークステーション、例えば、Ｓｕｎ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）及びＳｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ（登録商標）のコンピュータ、及び何らかのバージョンのＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステムを有する他のコンピュータ、例えば、ＡＩＸ（登録商標）またはＳｕｎ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）のＳＯＬＡＲＩＳ（登録商標）；オペレーティングシステムのシンバージョン、ハンドヘルド装置のようなコントロールスケジューラーを実行するエンベデッドコンピュータ；既知で入手可能なオペレーティングシステムを特徴とする何れかの他の装置；並びに、メモリ内蔵型のデータプロセッサを有する何れかの型の装置が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
本発明はパーソナルコンピュータ上で実行されるコンピュータプログラムのコンピュータ実施可能なインストラクションの一般的な意味において記載されているが、当業者の知るとおり本発明は他のプログラムモジュールとの組み合わせにおいて実施してもよい。一般的にプログラムモジュールは特定のタスクを行うか、特定のアブストラクトデータ型を実施するルーチン、プログラム、コンポーネント及びデータ構造を含む。更にまた当業者の知るとおり、本発明は他のコンピュータシステムの形状、例えば、ハンドヘルド装置、マルチプロセッサーシステム、マイクロプロセッサ系またはプログラム可能なコンシューマーエレクトロニクス、ミニコンピュータ、メインフレームコンピュータ等を用いて実施してもよい。本発明はまた通信ネットワークを介して連絡されたリモートプロセッシング装置によりタスクを実施する分散コンピューティング環境にあってもよい。分散コンピューティング環境においては、プログラムモジュールはローカル及びリモートのメモリ記憶装置の両方に位置してよい。
【００６８】
本発明の実施のための純粋に説明のためのシステムは、プロセッシングユニット、システムメモリ、及び、プロセッシングユニットにシステムメモリを含む種々のシステムコンポーネントを連結させるシステムバスを含む従来のパーソナルコンピュータを含む。システムバスは数種のバスストラクチャー、例えば、メモリーバスまたはメモリーコントローラー、ペリフェラルバス、及び種々の従来のバスアーキテクチャー、例えば、ＰＣＩ、ＶＥＳＡ、マイクロチャンネル、ＩＳＡ及びＥＩＳＡ等の何れかを用いたローカルバスを含む数種のうちの何れかであってよい。システムメモリはリードオンリーメモリー（ＲＯＭ）及びランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）を含む。スタートアップ時のようなパーソナルコンピュータ内のエレメントの間の情報の伝達を支援するベーシックルーチンを含むベーシックインプット／アウトプットシステム（ＢＩＯＳ）をＲＯＭ内に記憶してよい。
【００６９】
パーソナルコンピュータは更に、ハードディスクドライブ、磁気ディスクドライブ、例えば、リムーバブルディスクとの読み書き用、及び光ディスクドライブ、例えば、ＣＤ−ＲＯＭディスク用、または他の光学媒体との読み書き用のものを含む。ハードディスクドライブ、磁気ディスクドライブ及び光ディスクドライブはハードディスクドライブインターフェイス、磁気ディスクドライブインターフェイス及び光ディスクドライブインターフェイスによりそれぞれシステムバスに連結される。ドライブ及びそれらの関連するコンピュータ読み取り可能な媒体は、パーソナルコンピュータ用のデータ、データ構造、コンピュータ実行可能なインストラクション等の持久記憶装置を与えるものである。上記したコンピュータ読み取り可能な媒体の説明はハードディスク、リムーバブル磁気ディスク及びＣＤに言及しているが、当業者の知るとおり、コンピュータにより読み取り可能な他の型の媒体、例えば、磁気カセット、フラッシュメモリーカード、デジタルビデオディスク、Ｂｅｒｎｏｕｌｌｉカートリッジ等もまた例示されるオペレーション環境において使用してよい。
【００７０】
多くのプログラムモジュール、例えば、オペレーティングシステム、１つ以上のアプリケーションプログラム、他のプログラムモジュール及びプログラムデータをドライブのＲＡＭ内に記憶してよい。ユーザーはキーボード及びポインティング装置、例えば、マウスを介してパーソナルコンピュータにコマンド及び情報を入力する。他の入力装置は、マイクロフォン、ジョイスティック、ゲームパッド、サテライトディッシュ、スキャナーなどを含み得る。これらおよびその他の入力装置は、システムバスに連結されたシリアルポートインターフェイスを介してプロセッシングユニットに連結されている場合が多いが、他のインターフェイス、例えば、パラレルポート、ゲームポートまたはユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）により連結されてもよい。モニターまたは他の型のディスプレイ装置もまたビデオアダプターのようなインターフェイスを介してシステムバスに連結される。モニターのほかに、パーソナルコンピュータは典型的にはスピーカー及びプリンターのような他の周辺出力装置（図示せず）を含む。
【００７１】
パーソナルコンピュータはリモートコンピュータのようなリモートコンピュータ１つ以上への論理的連結を用いてネットワーク環境内で作動する。リモートコンピュータはサーバー、ルーター、ピア装置または他の一般的なネットワークノードであってよく、そして典型的にはパーソナルコンピュータに関して記載したエレメントの多くまたは全てを含んでよい。論理的連結はローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）及び広域ネットワーク（ＷＡＮ）を含む。このようなネットワーク環境は事務所内に通常存在するもの、企業全体にわたるコンピュータネットワーク（例えば、病院コンピュータ）、イントラネット及びインターネットである。
【００７２】
ＬＡＮネットワーク環境において使用する場合は、パーソナルコンピュータはネットワークインターフェイスまたはアダプターを介してローカルネットワークに連結できる。ＷＡＮネットワーク環境において使用する場合は、パーソナルコンピュータは典型的にはインターネットのような広域ネットワーク全体にわたる通信を確立するためのモデムまたは他の手段を含む。モデムは内蔵または外付けであってよく、シリアルポートインターフェイスを介してシステムバスに連結する。ネットワーク環境において、パーソナルコンピュータまたはその部分に対して相対的に示されるプログラムモジュールはリモートメモリ記憶装置内に記憶してよい。示されるネットワーク連結は例示に過ぎず、コンピュータ間の通信連結を確立する他の手段も使用してよい。
【００７３】
本発明の１つの純粋に説明のための実施プラットホームはメインメモリ少なくとも８メガバイト及びギガバイトのハードディスクドライブを有するＩＢＭ互換パーソナルコンピュータ上において、ユーザーインターフェイスとしてのＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）及び何れかの種類のデータベース管理ソフトウエア、例えば、Ｐａｒａｄｏｘと共に実施するシステムである。予測機能を実施するアプリケーションソフトウエアは何れかの種類の言語、例えば、Ｃ＋＋で書かれることができ、そして後述するコンピュータ読み取り可能な媒体上に記憶される。ユーザーはコマンド及び患者の診断マーカーを反映する情報をキーボード及びポインティング装置、例えば、マウスを介してパーソナルコンピュータに入力する。
【００７４】
好ましい実施形態において、本発明は予測子関数及び後述するとおり誘導された値を独自に識別するコード少なくとも１つを含むマイクロプロセッサにより読み取られるべきコンピュータ読み取り可能な媒体中に記憶されたデータ構造を提供する。好ましいコンピュータ使用可能な媒体は不揮発性ハードコード型媒体、例えば、リードオンリーメモリー（ＲＯＭ）または消去可能な電気的にプログラムできるリードオンリーメモリー（ＥＥＰＲＯＭ）、記録可能な型の媒体、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスクドライブ及びＣＤ−ＲＯＭ、及び、伝送型の媒体、例えば、デジタル及びアナログの通信リンクを含む。
【００７５】
「データ構造」はエレメント内の関係を反映するオペレーションのセットと共に関連するデータエレメントの集合を包含できる。データ構造はコンピュータのような装置内のデータとその記憶のアロケーションの組織化を反映すると見なすことができる。
【００７６】
即ち、データ構造は待ち行列、スタック、リンクリスト、ヒープ、ディクショナリ及びツリー、または個人の名称及びアドレスのような概念的集団のような、より良好なアルゴリズム効率のための通常はメモリ内の情報の組織化を含む。これはリストの長さまたはサブツリーのノードの数のような冗長な情報を包含してよい。データ構造はディスク上のもののようなデータの大部分へのアクセスが極めて緩徐である場合にも効率的である外部データ構造であってよい。データ構造はアクティブなデータ構造とは対照的な、外部のスレッドまたはプロセスにより変更できるのみのパッシブデータ構造であることができる。アクティブまたは機能的なデータ構造は別の通常はより一般的なデータ構造の外部の挙動を与えるように内部のオペレーションを実施する関連のスレッドまたはプロセスを有する。データ構造はまたその旧バージョンを温存する持続的データ構造であることもでき、即ち、前のバージョンが最新バージョンに追加して照会されてよい。データ構造は同じデータ構造のより小型または単純である例より部分的なる帰納的データ構造であることができる。データ構造はまたアブストラクトデータ型、即ち如何なる特定の実施とも独立して厳密に特定されるデータ値及び関連するオペレーションのセットであることもできる。
【００７７】
データ構造のこれらの例は本明細書に記載する全ての例示的実施形態の場合と同様、説明を目的とするのみであり、限定するものではない。
【００７８】
本発明の診断システムはポイントオブケアにおいて有用なハンドヘルドの装置を含んでよく、または、患者の治療の地点から離れて作動するシステムであってよい。いずれの場合においても、本明細書に記載したアルゴリズムまたは他の分析手法に従って本発明の診断方法を実施するための何れかの有用な言語においてプログラムされている付属ソフトウエアを含むことができる。
【００７９】
「ポイントオブケア試験」とは迅速な時間枠で実施できるリアルタイムの診断試験を指し、これにより実施される試験はこのシステムを使用しない相当する試験よりも速く行われる。ポイントオブケア試験は迅速に、そしてオンサイトで、例えば、医院内、ベッドサイド、緊急検査室、緊急処置室または他のこのような場所において、特に迅速で正確な結果が必要な場合に実施することができる。患者は来院することができるが、そのような来院は必要ではない。ポイントオブケアは例えば、緊急処置室、手術室、病院検査室及び他の臨床実験室、医院、野外、または迅速で正確な結果が望まれる何れかの状況を含む。
【００８０】
「患者」という用語は動物、好ましくは哺乳類、そして最も好ましくはヒトを指す。
【００８１】
「医療従事者（ｈｅａｌｔｈ  ｃａｒｅ  ｐｒｏｖｉｄｅｒ）」または「医療意思決定者（ｈｅａｌｔｈ  ｃａｒｅ  ｄｅｃｉｓｉｏｎ  ｍａｋｅｒ）」とは患者を診断または治療するか、または患者の診断または治療において支援することを認可された何れかの個人を含む。肝臓疾患を治療するための有用な新薬を発見するという意味において、医療従事者は患者を診断または治療するか、または患者の診断または治療において支援することを認可されていない個人であることができる。
【００８２】
「血液マーカー」または「血液マーカー、例えば、血漿または血清マーカー」とは、例えば、血清マーカーＮ末端プロコラーゲンＩＩＩプロペプチド（ＰＩＩＩＮＰ）、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩ、テネイシン、ラミニン、ヒアルロナン、ＭＭＰ−２、ＴＩＭＰ−１及びＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１複合体が挙げられるが、これらに限定されない。「血液マーカー、例えば、血漿または血清マーカー」とは「肝臓疾患血清マーカー遺伝子ポリペプチド」と互換的に使用する。「補助的マーカー」は例えば、体重、性別、年齢及びのトランスアミナーゼ、例えば、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の患者の血清中濃度を含む。
【００８３】
「肝臓疾患」とは肝腺維形成または線維溶解を伴う何れかの疾患を含む。このような疾患は例えば、肝硬変、アルコール性肝臓疾患、脂肪肝、脂肪肝炎、非アルコール性肝臓疾患、例えば、非アルコール性脂肪肝炎、ウィルス感染により生じる肝感染症、例えば、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎の感染症、他の病原体への応答、例えば、住血吸虫症、遺伝性ヘモクロマトーシス、原発性胆汁性肝硬変および原発性硬化性胆管炎、メトトレキセートのような薬剤への反応及び胆管閉塞のような遺伝障害が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
「バリデーションコホートマーカー評点値」とはトレーニングコホートから得られた判別ウエイト及びバリデーションコホートにおける各患者に対するマーカー値の線形組み合わせから誘導された数的評点を意味する。
【００８５】
「患者診断マーカーカットオフ値」とは所定の感度または特異性が達成されるマーカーの組み合わせのマーカー値を意味する。「レシーバーオペレーター特徴曲線−Ｓｃｈｅｕｅｒ変更評点システムバリデーションデータ」：分岐Ｓｃｈｅｕｅｒ評点システムに基づいたバリデーションコホートにおいて生じたデータを用いて作成したレシーバーオペレーター特徴曲線。「レシーバーオペレーター特徴曲線−Ｉｓｈａｋ変更評点システムバリデーションデータ」：分岐Ｉｓｈａｋ評点システムに基づいたバリデーションコホートにおいて生じたデータを用いて作成したレシーバーオペレーター特徴曲線。「陰性予測力」（ＮＰＶ）：所定のカットオフを超えてマーカー値（またはマーカー値のセット）が上昇しない場合の疾患を有さない確率。
【００８６】
「陽性予測値」（「ＰＰＶ」）：所定のカットオフを超えてマーカー値（またはマーカー値のセット）が上昇する場合の疾患を有さない確率。
【００８７】
「レシーバーオペレーター特徴曲線」（「ＲＯＣ」）は患者コホート内及び非患者コホート内のマーカーの感度の分布及び１−特異性値の間の機能的関連のグラフ表示である。
【００８８】
「曲線下面積」（「ＡＵＣ」）はレシーバーオペレーター特徴曲線の下部の面積を示す数である。この数が１に近いほど、多くのマーカー値は疾患及び非疾患のコホートの間を判別する。
【００８９】
「ＭｃＮｅｍａｒカイ自乗検定」（「ＭｃＮｅｍａｒχ２検定」）は２つの相関した割合（共通の分子を有するが異なる分母を有する割合）が相互に有意差があるかどうか調べるために使用される統計学的検定である。
【００９０】
「ノンパラメトリック回帰分析」とは各変数の分布または各変数の推定における誤差に関する推測を殆どまたは全く行わない２変量データに関する直線のフィットを可能にする統計学的手法のセットである。例は、位置のＴｈｅｉｌ推定子、Ｐａｓｓｉｎｇ−Ｂａｂｌｏｋ回帰及びＤｅｍｉｎｇ回帰である。
【００９１】
「カットオフ値」は特定された感度または特異性を定義するマーカー（またはマーカーのセット）の数値である。
【００９２】
肝線維症を評価するための現在の比較参照標準は肝生検である。生検においては、肝から無作為に採取した組織試料を切片化し、これを熟練者が顕微鏡観察する。
【００９３】
肝生検には多くの問題が関わっており、例えば、以下に示す不確実性要因、即ち、肝内の線維症の分布（クラスター線維症の場合は、針は線維症に罹患していない肝の領域をヒットする可能性がある）、試料調製の失敗（例えば、組織材料不足）及び病理学者の主観が関わってくる。更にまた、肝の線維症の状態は通常は評点を用いて説明されるが、多くの異なる、そして恐らくは矛盾した評点システムが存在する（例えば、Ｓｃｈｅｕｅｒ評点、Ｉｓｈａｋ評点等）。例えば、２種の異なる評点システムを用いて異なる２時点において同じ患者の同じ生検試料を２人の独立した病理学者が評点しなければならない場合がある。この場合に２人の病理学者が同じ結果に到達する試験の数は僅か３６％〜４６％の範囲である。
【００９４】
ヌクレオチド配列に関して「等価である」という用語は機能的に等価なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むものと理解される。等価なヌクレオチド配列は１つ以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失により異なる配列、例えば、対立遺伝子変異体を包含し、従って、遺伝子コードの縮重により異なる配列を含む。「等価な」とはまた、血液（例えば、血清）マーカー蛋白の哺乳類相同体のアミノ酸配列に機能的に等価であるが異なるアミノ酸配列、例えば、少なくとも１つ、ただし３０、２０、１０、７、５または３の相違、例えば、置換、付加または欠失を有するアミノ酸配列を指すためにも使用する。
【００９５】
本明細書においては、「肝臓疾患血清マーカー遺伝子」という用語は（１）本明細書に記載する肝臓疾患血清マーカー蛋白を含む肝臓疾患血液（例えば、血清）マーカー蛋白をコードし；そして（２）エクソン及び（場合により）イントロン配列の両方を含むオープンリーディングフレームを伴う核酸を指す。「肝臓疾患血清マーカー遺伝子」はエクソン配列を含むことができるが、場合により例えば、関連または未関連の染色体遺伝子から誘導されるイントロン配列を含んでよい。「イントロン」という用語は蛋白に翻訳されず、一般的にエクソン間に観察される所定の遺伝子内に存在するＤＮＡ配列を指す。遺伝子は更に調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー等を含むことができる。「肝臓疾患血清マーカー遺伝子」は例えば、本明細書に記載する配列番号１〜３に相補、等価または相同であるヌクレオチド配列を含む。
【００９６】
「相同性」、「〜の相同体」、「相同である」または「同一性」または「同様性」とは２ポリペプチド間または２核酸分子間の配列の同様性を指し、同一性はより厳密な比較である。相同性及び同一性は各々、比較目的のためにアラインしてよい各配列内のある位置を比較することにより求めることができる。比較配列内のある位置が同じ塩基またはアミノ酸で占有されている場合、分子はその位置において同一である。核酸配列間の相同性または同様性または同一性の程度は核酸配列により共有される位置における同一またはマッチしたヌクレオチドの数の関数である。
【００９７】
「パーセント同一」という用語は２アミノ酸配列間または２ヌクレオチド配列間の配列の同一性を指す。同一性は比較目的のためにアラインしてよい各配列内のある位置を比較することにより求めることができる。比較配列内の等価な位置が同じ塩基またはアミノ酸で占有されている場合、分子はその位置において同一であり；等価な部位が同じか同様のアミノ酸残基（例えば、立体及び／または電子的な性質において同様）により占有されている場合、分子はその位置において相同（同様）であると称する。相同性、同様性または同一性のパーセントとしての表示は、比較配列により共有される位置における同一または同様のアミノ酸の数の関数を指す。種々のアライメントのアルゴリズム及び／またはプログラム、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＥＮＴＲＥＺを使用してよい。ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴはＧＣＧ配列分析パッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．）の一部として入手可能であり、そして例えば、デフォルト設定で使用できる。ＥＮＴＲＥＺはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．を経て入手可能である。１つの実施形態において、２配列のパーセント同一性はギャップウエイト１でＧＣＧプログラムにより求めることができ、例えば、各アミノ酸ギャップはそれが２配列の間の単一のアミノ酸またはヌクレオチドのミスマッチがあると仮定してウエイトする。配列同一性を求めるための他の手法は当該分野でよく知られている。
【００９８】
本発明において使用する好ましい核酸は肝臓疾患血清マーカー遺伝子の哺乳類相同体の核酸配列に少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％同一であり、そしてより好ましくは９０％、そして更に好ましくは少なくとも９５％同一または相補である配列を有する。本発明で使用する特に好ましい核酸は肝臓疾患血液（例えば、血清）マーカー遺伝子の哺乳類相同体の核酸配列に少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％同一であり、そしてより好ましくは９０％、そして更に好ましくは少なくとも９５％同一または相補である配列を有する。
イムノアッセイ
Ｎ末端プロコラーゲンＩＩＩプロペプチド（ＰＩＩＩＮＰ）、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩ、テネイシン、ラミニン、ヒアルロナン、ＭＭＰ−２、ＴＩＭＰ−１、ＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１複合体を検出し濃度を測定するために血清イムノアッセイを選択した。病歴の間に収集された他の診断マーカーには体重、性別及び年齢、及び、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）のようなトランスアミナーゼのレベルを含めた。
【００９９】
（ＰＩＩＩＮＰ）、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩ、テネイシン、ラミニン、ヒアルロナン、ＭＭＰ−２、ＴＩＭＰ−１、ＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１のレベルはサンドイッチ有無のアッセイを使用することにより測定した。１つの実施形態において、本発明のイムノアッセイの実施はキャプチャー抗体がマーカーのエピトープの１つに特異的に結合するヒト体液試料との２抗体の反応を用いた。異なるエピトープ特異性の第２の抗体はこの複合体を検出するために使用する。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体であるが、ポリクローナル抗体も使用できる。試験に使用する抗体は両方とも分析対象である蛋白に特異的に結合する。
【０１００】
ヒト体液より得た患者の診断マーカーの濃度を測定し、線維症の程度を評価するために方法及び系を誘導した。
【０１０１】
種々の血清マーカーの検出において使用できる抗体を作製するための原料または方法は以下に総括する通りである。
【０１０２】
【化１−１】
2008502908.tif 000003
【０１０３】
【化１−２】
2008502908.tif 000004
【０１０４】
【化２】
2008502908.tif 000005
【０１０５】
【化３】
2008502908.tif 000006
肝線維症の血清マーカーを検出するために使用する抗体対
ＨＡ試験では、ＨＡに対しては抗体が作製されていないため、上記の表で引用した比較参照に従ってウシ鼻軟骨から単離した特異的ＨＡ結合蛋白（ＨＡＢＰ）を使用した。ＨＡは高度に反復した構造を有し、ＨＡ特異的コア蛋白をサンドイッチ試験フォーマットにおいて使用することができる。ＦＩＴＣコンジュゲートコア蛋白をキャプチャーするため、及び検出のために、アルカリホスファターゼで標識したモノクローナル抗ビオチンと組み合わせたビオチニル化コア蛋白を使用した。
【０１０６】
コラーゲンＩＶに関する試験ではＢｉｏｄｅｓｉｇｎより入手したポリクローナル抗体（Ｔ５９１０６Ｒ）（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎカタログ番号Ｔ５９１０６Ｒ）と対にしたＦｕｊｉより入手したモノクローナル抗体（ＩＶ−４Ｈ１２）（アクセッション番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８４７）を使用した。全試験は磁気粒子分離手法を用いた不均一イムノアッセイであった。
【０１０７】
ＰＩＩＩＮＰに関する試験ではＨｏｅｃｈｓｔより入手したモノクローナル抗体（アクセッション番号ＥＣＣＡＣ８７０４２３０８）と対にしたＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９において２００４年５月２４日にブダペスト条約下に寄託したＢａｙｅｒのモノクローナル抗体（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ− ）を使用した。
【０１０８】
コラーゲンＶＩ、ラミニン及びテネイシンの検出のための抗体は上記の表に記載した原料に由来する血清マーカーに相当する抗原を入手し、そして、その抗原を血清マーカーとして用いることにより、後に詳述するハイブリドーマ形成プロトコルに従って作製することができる。
【０１０９】
ＴＩＭＰ−１、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の検出のための抗体は（１）後に詳述するポリヌクレオチド発現プロトコルに従って上記の表に記載したマーカーｍＲＮＡ配列に相補であるＤＮＡ配列を発現することにより、これらのマーカーに対する抗原を製造すること；及び（２）このような抗原を血清マーカーとして使用することにより、後に詳述するハイブリドーマ発生プロトコルに従って作製することができる。
【０１１０】
ハイブリドーマ発生プロトコル及びポリヌクレオチド発現プロトコルにおける引用は後に呈示する引用のセクションにおいて別途列挙する。
ポリヌクレオチドの発現：
図５はヒトＴＩＭＰ１ｍＲＮＡのヌクレオチド配列を示す（配列番号１）。
【０１１１】
図６はヒトＭＭＰ２ｍＲＮＡのヌクレオチド配列を示す（配列番号２）。
【０１１２】
図７はヒトＭＭＰ９ｍＲＮＡのヌクレオチド配列を示す（配列番号３）。
【０１１３】
これら及び他の肝臓疾患血清マーカー遺伝子を発現するためには、挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳に必要なエレメントを含有する発現ベクター内に遺伝子を挿入することができる。肝線維症血清マーカーポリペプチドをコードする配列及び適切な転写及び翻訳の制御エレメントを含有する発現ベクターを構築するためには、当業者に周知の方法を使用することができる。これらの方法としては、インビトロの組み換えＤＮＡ法、合成法及びインビボの遺伝子組み換えが挙げられる。このような手法は例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（３）及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（４）に記載されている。
【０１１４】
種々の発現ベクター／宿主系を用いて肝臓疾患血清マーカーポリペプチドをコードする配列を含有させ、そして発現させることができる。これらには、例えば、組み換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌のような微生物；コウボ発現ベクターで形質転換したコウボ、ウィルス発現ベクター（例えば、バキュロウィルス）を感染させた昆虫細胞、ウィルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウィルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウィルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系、または動物細胞系が包含されるが、これらに限定されない。
【０１１５】
制御エレメントまたは調節配列は、宿主細胞蛋白と相互作用して転写及び翻訳を実施するベクターのエンハンサー、プロモーター、５’及び３’未翻訳領域の領域である。このようなエレメントはその長さ及び特異性において変動することができる。利用されるベクター系及び宿主に応じて、任意の数の適当な転写及び翻訳エレメント、例えば、構成及び誘導プロモーターを使用することができる。例えば、細菌系においてクローニングする場合は、プロモーター、例えば、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等のような誘導プロモーターを使用できる。バキュロウィルスポリヘドリンプロモーターも昆虫細胞において使用できる。植物細胞のゲノム（例えば、ヒートショック、ＲＵＢＩＳＣＯ及び保存蛋白遺伝子）または植物ウィルス（例えば、ウィルスプロモーターまたはリーダー配列）から誘導されたプロモーターまたはエンハンサーをベクターにクローニングすることができる。哺乳類細胞系においては、哺乳類遺伝子由来または哺乳類ウィルス由来のプロモーターが好ましい。「肝線維症遺伝子」ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の複数のコピーを含有する細胞系統を作製することが必要である場合は、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターを適切な選択可能なマーカーと共に使用できる。
細菌及びコウボの発現系
細菌系においては、肝臓疾患血清マーカーポリペプチドのために意図される使用に応じて多くの発現ベクターを選択できる。例えば、抗体の誘導のために大量の肝臓疾患血清マーカーポリペプチドが必要な場合は、容易に精製される融合蛋白の高レベル発現を指向するベクターを使用できる。このようなベクターは例えば、多機能Ｅ．ｃｏｌｉクローニング及び発現ベクター、例えば、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴベクターにおいて、肝臓疾患血清マーカーポリペプチドをコードする配列はハイブリッド蛋白が形成されるようにβ−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔ及びそれに続く７残基に対する配列とインフレームにベクター内にライゲーションすることができる。ｐＩＮベクター［Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，（１７）］またはｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）もまたグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白として外来のポリペプチドを発現するために使用することができる。一般的にこのような融合蛋白は可溶性であり、グルタチオンアガロースビーズへの吸着、その後の遊離グルタチオン存在下の溶離により、容易に溶解細胞から精製することができる。このような系において製造した蛋白は、目的のクローニングされたポリペプチドが随時ＧＳＴ部分から放出されるようにヘパリン、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計することができる。
【０１１６】
コウボであるサッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、アルファ因子、アルコールオキシダーゼ及びＰＧＨのような構成または誘導プロモーターを含有する多くのベクターを使用することができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（４）及びＧｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１８）を参照できる。
植物及び昆虫の発現系
植物発現ベクターを使用する場合は、肝臓疾患血清マーカーポリペプチドをコードする配列の発現は多くのプロモーターの何れかにより駆動することができる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ及び１９Ｓプロモーターのようなウィルスプロモーターを単独またはＴＭＶ由来のオメガリーダー配列と組み合わせて使用できる［Ｔａｋａｍａｔｓｕ，（１９）］。或は、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットのような植物プロモーターまたはヒートショックプロモーターを使用することもできる［Ｃｏｒｕｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９）；Ｂｒｏｇｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２１）；Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２２）］。これらのコンストラクトは直接のＤＮＡ形質転換によるか、または、病原体媒介トランスフェクションにより植物細胞内に導入できる。このような手法は多くの一般的に入手できる論文に記載されている（例えば、Ｈｏｂｂｓ  ｏｒ  Ｍｕｒｒａｙ，  ＭＣＧＲＡＷ  ＨＩＬＬ  ＹＥＡＲＢＯＯＫ  ＯＦ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，（２３））。
【０１１７】
昆虫系もまた肝臓疾患血清マーカーポリペプチドの発現のために使用できる。例えば、１つのこのような系においては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａの核ポリヘドロシスウィルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして使用することにより、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｌａｖａｅにおいて外来性遺伝子を発現させる。肝臓疾患血清マーカーポリペプチドをコードする配列をポリヘドリン遺伝子のようなウィルスの非必須領域内にクローニングし、そしてポリヘドリンプロモーターの制御下に置く。肝臓疾患血清マーカーポリペプチドの挿入が良好に行われれば、ポリヘドリン遺伝子は不活性となり、被覆蛋白を掻いた組み換えウィルスが作製される。次に、内部で肝臓疾患血清マーカーポリペプチドを発現させることができるＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｌａｒｖａｅを感染させるために組み換えウィルスを用いることができる［Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２４）］。
哺乳類発現系
哺乳類宿主細胞中で肝臓疾患血清マーカーポリペプチドを発現するために多くのウィルス系の発現系を使用することができる。例えば、発現ベクターとしてアデノウィルスを使用する場合は、後期プロモーター及びトリパータイトリーダー配列を含むアデノウィルス転写／翻訳複合体内に肝臓疾患血清マーカーポリペプチドをコードする配列をライゲーションすることができる。ウィルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域内の挿入を用いて感染宿主細胞内で肝線維症血清マーカーポリペプチドを発現することができる生存ウィルスを得ることができる［Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ，（２５）］。所望により、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）エンハンサーのような転写エンハンサーを用いて哺乳類宿主細胞内での発現を増大させることができる。
【０１１８】
プラスミド内に含有させて発現させられるものよりも大型のＤＮＡフラグメントを送達するためにヒト人工染色体（ＨＡＣ）を使用することもできる。６Ｍ〜１０ＭのＨＡＣを構築し、そして、従来の送達法（例えば、リポソーム、ポリカチオン性アミノ重合体またはベシクル）を介して細胞に送達する。
【０１１９】
特異的開始シグナルもまた肝臓疾患血清マーカーポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために用いることができる。このようなシグナルはＡＴＧ開始コドン及び隣接する配列を包む。肝臓疾患血清マーカーポリペプチドをコードする配列、その開始コドン及び上流の配列が適切な発現ベクターに挿入された場合、更に別の転写または翻訳制御シグナルは必要ない。しかしながら、コーディング配列またはそのフラグメントのみが挿入された場合、外来性の翻訳制御シグナル（ＡＴＧ開始コドンを含む）を与えなければならない。開始コドンは全インサートの翻訳を確実にするためには正しいリーディングフレーム内に存在しなければならない。外来性の翻訳エレメント及び開始コドンは天然及び合成の両方の種々の起源のものであることができる。発現の効率は使用される特定の細胞系に対して適切であるエンハンサーを含めることにより改善させることができる［Ｓｃｈａｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，（２６）］。
宿主細胞
宿主細胞系統は、所望の態様において、挿入された配列の発現をモジュレートするか、または、発現された肝線維症血清マーカーポリペプチドをプロセシングするその能力に関して選択することができる。このようなポリペプチドの修飾は例えば、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、ホスホリル化、脂質化及びアシル化が挙げられるが、これらに限定されない。ポリペプチドの「プレプロ」型を切断する翻訳後プロセシングもまた正確な挿入、折り畳み及び／または機能を促進するために用いることができる。翻訳後の活性のための特定の細胞内機構及び特徴的機序を有する種々の宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３およびＷＩ３８）がＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ；１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ２０１１０−２２０９）から入手可能であり、そして外来の蛋白の正しい修飾及びプロセシングを確保するために選択することができる。
【０１２０】
安定な発現は組み換え蛋白の長期の高収率の生産のために好ましい。例えば、複製ウィルス起点及び／または内因性発現エレメント及び選択可能なマーカー遺伝子を同じか別のベクター上に含有できる発現ベクターを用いて肝臓疾患血清マーカーポリペプチドを安定に発現する細胞系統を形質転換することができる。ベクターの導入の後、細胞をリッチ化培地中１２日間成育させ、その後選択培地に切り替える。選択マーカーの目的は選択への耐性を付与することであり、その存在により導入された肝線維症血清マーカーポリペプチド遺伝子配列を良好に発現する細胞の成育及び回収が可能となる。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、細胞型に適する組織培養法を用いて増殖させることができる。例えば、Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，（２７）を参照できる。
【０１２１】
何れかの数の選択系を用いて形質転換された細胞系統を回収することができる。これらには例えば、単純疱疹ウィルスチミジンキナーゼ［Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２８）］及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ［Ｌｏｗｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２９）］遺伝子が包含され、これらはそれぞれｔｋ−またはａｐｒｔ−細胞内で使用できる。更にまた、代謝拮抗物質、抗生物質または除草剤耐性を選択基準として使用できる。例えば、ｄｈｆｒはメトトレキセートに対する耐性を与え［Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（３０）］、ｎｐｔはアミノグリコシド、ネオマイシン及びＧ４１８に対する耐性を与え［Ｃｏｌｂｅｒｅ  Ｇａｒａｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（３１）］、そしてａｌｓおよびｐａｔはそれぞれクロルスルフロン及びホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を与える。その他の選択可能な遺伝子も報告されている。例えば、ｔｒｐＢは細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにし、或いは、ｈｉｓＤは細胞がヒスチジンの変わりにヒスチノールを利用できるようにする［Ｈａｒｔｍａｎ＆Ｍｕｌｌｉｇａｎ，（３２）］。アントシアニン、β−グルクロニダーゼ及びその基質ＧＵＳ及びルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリンのような目視可能なマーカーを用いて形質転換体を発見し、そして特定のベクターに起因する一過性または安定な蛋白発現の量を定量することができる［Ｒｈｏｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（３３）］。
発現および遺伝子産物の検出
マーカー遺伝子発現の存在は肝臓疾患血清マーカーポリペプチド遺伝子も存在することを示唆するが、その存在及び発現は確認する必要がある。例えば、肝臓疾患血清マーカーポリペプチドをコードする配列をマーカー遺伝子配列内に挿入する場合、肝臓疾患血清マーカーポリペプチドをコードする配列を含有する形質転換された細胞はマーカー遺伝子の機能の非存在により識別できる。或いは、マーカー遺伝子は単一のプロモーターの制御下に肝線維症血清マーカーポリペプチドをコードする配列と直列に置くことができる。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常は肝線維症血清マーカーポリペプチドの発現を示す。
【０１２２】
或いは、肝臓疾患血清マーカーポリペプチドを含有し、肝線維症血清マーカーポリペプチドを発現する宿主細胞は、当該分野でよく知られている種々の操作法により識別することもできる。これらの操作法は例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション及び蛋白バイオアッセイまたはイムノアッセイの手法であり、これらには核酸または蛋白の検出及び／または定量のための膜、溶液またはチップ系の技術が使用される。例えば、肝臓疾患血清マーカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の存在は、プローブまたはフラグメントまたは肝臓疾患血清マーカーポリペプチドをコードするフラグメントを用いたＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションまたは増幅により検出することができる。核酸増幅系の試験では肝線維症血清マーカーポリペプチドを含有する形質転換体を検出するために肝線維症血清マーカーポリペプチドをコードする配列から選択されたオリゴヌクレオチドを使用する。
【０１２３】
ポリペプチドに特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体の何れかを用いた肝線維症血清マーカーポリペプチドの発現を検出して測定するための種々のプロトコルが当該分野で知られている。例としては、酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。肝臓疾患血清マーカーポリペプチド上の２つの非干渉エピトープに反応性のモノクローナル抗体を用いた２部位モノクローナル系イムノアッセイを使用することができ、または、競合的結合試験を使用することができる。これら及び他の試験はＨａｍｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（３４）及びＭａｄｄｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，（３５）に記載されている。
【０１２４】
広範な種類の標識及びコンジュゲーションの手法が当該分野でよく知られており、そして種々の核酸及びアミノ酸の試験において使用することができる。肝線維症血清マーカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識されたハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを作製するための手段はオリゴ標識、ニック翻訳、末端標識または標識されたヌクレオチドを使用するＰＣＲ増幅を含む。或いは、肝臓疾患血清マーカーポリペプチドをコードする配列をｍＲＮＡプローブの製造のためのベクター内にクローニングすることができる。このようなベクターは当該分野で知られており、市販されており、そして標識されたヌクレオチド及び適切なＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６を添加することによりインビトロでＲＮＡプローブを合成するために使用できる。これらの操作法は種々の市販のキットを用いて実施できる（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＰｒｏｍｅｇａおよびＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）。検出を容易にするために使用できる適当なレポーター分子または標識は放射性核種、酵素および蛍光、ケミルミネセントまたは発色性の物質、並びに基質、コファクター、阻害剤、磁気粒子等を含む。
ポリペプチドの発現及び精製
肝臓疾患血清マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で形質転換した宿主細胞は蛋白の発現及び細胞培養物からの回収に適する条件下に培養できる。形質転換された細胞により生産されたポリペプチドは配列及び／または使用したベクターに応じて分泌されるか、細胞内に保存される。当業者の知るとおり、肝線維症血清マーカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターは原核細胞または真核細胞の膜を介して可溶性の肝線維症血清マーカーポリペプチドの分泌を指向する、または膜結合肝線維症血清マーカーポリペプチドの膜挿入を指向するシグナル配列を含有するように設計することができる。
【０１２５】
上記した通り、他の構築法を用いて肝臓疾患血清マーカーポリペプチドをコードする配列を可溶性蛋白の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合させることができる。このような精製促進ドメインは例えば、金属キレート形成ペプチド、例えば、固定化された金属上の精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール、固定化された免疫グロブリン上の精製を可能にする蛋白Ａドメイン、及び、ＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製系において利用されるドメインが挙げられるが、これらに限定されない（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）。第Ｘａ因子またはエンテロキナーゼに特異的なもののような切断可能なリンカー配列（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を精製ドメインと肝臓疾患血清マーカーポリペプチドの間に包含させることも精製を容易にするために使用することができる。このような発現ベクターの１つは肝臓疾患血清マーカーポリペプチド及びチオレドキシンの前の６ヒスチジン残基またはエンテロキナーゼ切断部位を含有する融合蛋白の発現を可能にする。ヒスチジン残基はＰｏｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，（３６）の記載の通りＩＭＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）による精製を容易にし、エンテロキナーゼ切断部位は融合蛋白からの「肝線維症遺伝子」の精製のための手段を提供する。融合蛋白を含有するベクターはＫｒｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（３７）に開示されている。
化学合成
肝臓疾患血清マーカーポリペプチドをコードする配列は全体または部分的に、当該分野で知られた化学的方法を用いて合成できる（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，（３８）及びＨｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，（３９）。或いは、肝臓疾患血清マーカーポリペプチドそのものを、そのアミノ酸配列を合成するための化学的方法、例えば、固相法を用いた直接ペプチド合成［Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，（４０）及びＲｏｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，（４１）］を用いて製造することができる。蛋白合成は手動または自動で実施できる。自動合成は例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて達成できる。場合により、肝線維症血清マーカーポリペプチドのフラグメントを個別に合成し、化学的方法を用いて組み合わせて完全長の分子を作製することができる。
【０１２６】
新しく合成されたペプチドはその後、分取高速液体クロマトグラフィーにより精製することができる［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，（４２）］。合成の肝臓疾患血清マーカーポリペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定により確認できる（例えば、Ｅｄｍａｎ分解法；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，（４２）参照）。更にまた、肝臓疾患血清マーカーポリペプチドのアミノ酸配列の何れかの部分を、直接の合成の間の改変、及び／または、他の蛋白由来の配列との化学的方法を用いた複合化に付し、変異体ポリペプチドまたは融合蛋白を製造することができる。
ハイブリドーマ形成プロトコル
第Ｉ段階：免疫化
ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（群当たり５匹）を完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）で乳化した上記発見された肝臓疾患血清マーカー（異なる用量）の何れかで腹腔内免疫化し、その後、不完全フロイントアジュバントで乳化した免疫原を３回ブーストする（２週間間隔）。マウスは各ブースト後１週間に放血させ、ＥＬＩＳＡで免疫原に対して滴定する。最高力価を有するマウスを融合用に選択する。
第ＩＩ段階：細胞融合及びハイブリドーマの選択
融合用に選択したマウスを前回の免疫化に使用した抗原と同じ用量でブーストする。ブーストは脾臓摘出及び細胞融合の４日前に行う。抗原調製品はアジュバントを用いることなく腹腔内に与する。
【０１２７】
融合の当日、マウスを屠殺し、脾臓を無菌的に摘出する。脾臓をピンセットで粉砕し、篩を通して整粒する。細胞をＩｓｃｏｖｅ変性Ｅａｇｌｅ培地（ＩＭＤＭ）を用いて２回洗浄し、血球計を用いて計数する。
【０１２８】
マウスミエローマ細胞系統Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３を静置された対数期の培養物から採取し、ＩＭＤＭで洗浄し、血球計を用いて計数する。
【０１２９】
ミエローマ及び脾細胞を１：５比で混合し、遠心分離する。上澄みを廃棄する。試験管底部をたたくことにより細胞ペレットを穏やかに際懸濁する。ＰＥＧ（ＭＷ１４５０）の５０％溶液１ミリリットルを３０秒かけて滴下する。ペレットをピペットを用いて３０秒間穏やかに混合する。得られた細胞懸濁液を更に３０秒間撹乱することなく放置する。ＩＭＤＭ  ５ミリリットルを９０秒間かけて添加し、その後即座に５ｍＬを添加する。得られた細胞懸濁液を５分間未撹乱のまま放置する。細胞懸濁液を遠心分離し、ペレットをＨＡＴ培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．６％２−メルカプトエタノール（０．０４％溶液）、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン及び１０％Ｏｒｉｇｅｎ成長因子を含有するＩＭＤＭ）中に再懸濁する。細胞をミリリットル当たり５Ｅ５個となるように再懸濁する。細胞を９６穴プレートにプレーティングする。２００μＬまたは２Ｅ５個の細胞を各ウェルに添加する。
【０１３０】
プレートを１００％湿度７％ＣＯ２雰囲気下３７°Ｃでインキュベートする。融合後７時間に培地を除去し、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．６％２−メルカプトエタノール保存溶液（０．０４％）、ヒポキサンチン及びチミジンを含有するＩＭＤＭと交換する。典型的には、ハイブリドーマの生育中のコロニーは融合後約７日に顕微鏡で観察される。これらのコロニーは融合後約１０〜１４日に裸眼で目視可能となる。
【０１３１】
融合後１０〜１４日に上澄みを生育中のハイブリドーマコロニーと共にウェルから採取する。上澄みの容量は約１５０〜２００μＬであり、ミリリットル当たり抗体１０〜１００μｇを含有する。この上澄みを、血清のスクリーニングに用いたものと同様の試験を用いて特異的抗体に関して試験する。陽性ハイブリドーマコロニーを９６穴プレートから２４穴プレートに移す。３〜５日後、２４穴プレートの上澄みを試験して特異的抗体の存在を確認する。２４穴プレートの１つのウェルの上澄みの容量は約２ｍＬである、抗体１０〜１００μｇ／ｍＬを含有する。陽性ウェルの細胞をＴ−２５及びＴ−７５フラスコ内で増殖させる。細胞はＴ−７５フラスコ内で凍結する。陽性ウェルの細胞はまた限界希釈によってもクローニングされる。ハイブリドーマ細胞はウェル当たり０．２５個の細胞密度またはウェル４個おきに１個となるように９６穴プレートにプレーティングする。生育中のコロニーはハイブリドーマを最初に選択した場合と同様の試験法を用いて１０〜１４日に試験する。陽性クローンは増殖させて凍結する。
第ＩＩＩ段階：生産
ハイブリドーマ細胞をＴ−１６２フラスコに増殖させ、その後これらをローラーボトルに移して細胞上澄みの生産を行う。細胞が１０％未満の生存となるまで、ローラーボトル中約２週間細胞を成育させる。培養上澄みをこれらのローラーボトルから回収して精製に付す。
イムノアッセイの簡単な説明
全抗体はＢａｙｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏ  １システムのためにフォーマットされた不均質ＥＬＩＳＡ型試験に付した。系は蛍光標識キャプチャー抗体（Ｒ１と記載）及びアルカリホスファターゼ標識タグ抗体（Ｒ２と記載）を使用する。抗体コンジュゲートを生理学的緩衝液に２〜５０ｍｇ／Ｌの濃度で溶解する。免疫反応性試薬を試験すべき抗原を含有する患者試料の固定量と共にインキュベートする。常時、患者の試料をまず反応キュベットにピペッティングし、その３０秒後にＲ１を入れる。Ｒ２は通常はＲ１添加後３０秒〜２０分に添加する。混合物は最大２０分間インキュベートするが、イムノアッセイの他の実施形態ではインキュベーション時間は延長または短縮される。その後、免疫磁気粒子を混合物に添加する。粒子は粒子表面にコンジュゲートした抗フルオレセイン抗体と共にポリアクリルアミドビーズを含有する酸化鉄よりなる。粒子はＢａｙｅｒ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓより市販されている。
【０１３２】
抗原及びＲ１及びＲ２コンジュゲートから形成されたサンドイッチ免疫複合体と共に免疫磁気粒子をインキュベートすると、サンドイッチ免疫複合体は免疫磁気粒子上の抗フルオレセイン抗体によりＲ１抗体のフルオレセイン標識を介してキャプチャーされる。形成された超複合体は外部の磁場により沈殿される。全ての未結合の物質、特にＲ２アルカリホスファターゼコンジュゲートは洗浄により除去される。次に洗浄した複合体をｐ−ニトロフェノールホスフェート溶液に再懸濁する。発色比率は抗原の量に正比例するキュベット内に残存するホスファターゼの量に比例する。定量は、６点検量線及び３乗回帰またはＲｏｄｂａｒｄフィットにより作成した検量線により行う。
（ａ）試験の性能
試験の各々の性能は単独で調べた。感度および特異性、試験間及び試験内の変動、干渉、直線性及び平行性を各イムノアッセイに関して調べた。全ての試験は高い臨床化学の基準に合致していることがわかった。男女の健常者及び１８〜７５歳の年齢範囲に関して得られた結果の範囲は「正常」値を確立するものと決定された。試験はある範囲の病理学的障害を有する対象に適用した。
（ｂ）統計学的バックグラウンド
１，０２１対象における肝線維症の観察試験（「Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ」または「ＥＬＦ」試験）を行い、得られたデータを分析した。使用した肝線維症評点システムは以下の通りである。
−Ｓｃｈｅｕｅｒ評点（０−４）、
−変更Ｉｓｈａｋ評点（ＨＡＩ）Ａ−インターフェイス肝炎（０−４）、
−変更Ｉｓｈａｋ評点（ＨＡＩ）Ｂ−コンフルエント壊死（０−６）、
−変更Ｉｓｈａｋ評点（ＨＡＩ）Ｃ−斑紋状壊死（０−４）、
−変更Ｉｓｈａｋ評点（ＨＡＩ）Ｄ−門脈炎症（０−４）、
−変更ＨＡＩ評点（Ｉｓｈａｋ評点）（０−６）。
【０１３３】
段階的な判別分析を適用し；以下の血清パラメーター関数を相当する評点型への主要な影響を有していたものとして表１に示した。
【０１３４】
【表１−１】
2008502908.tif 000007
【０１３５】
【表１−２】
2008502908.tif 000008
相当する判別分析によれば線形の判別関数が得られ、これを生検評点の計算及び予測に使用した。誘導されたアルゴリズムを各々の既知の評点システム（例えば、Ｓｃｈｅｕｅｒ評点、Ｉｓｈａｋ評点、Ｍｅｔａｖｉｒ評点、Ｌｕｄｗｉｇ評点、ＨＡＩ評点）に適用した。例えば、アルゴリズムを用いて患者の生検評点を予測（例えば、評点０、１、２、３、・・・）するか、または、患者が属する評点群（カテゴリ）（例えば、軽度の線維症；評点０〜１）を予測するために使用できる。
【０１３６】
使用される判別関数はＮ末端プロコラーゲンＩＩＩプロペプチド（ＰＩＩＩＮＰ）、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩ、テネイシン、ラミニン、ヒアルロナン、ＭＭＰ−２、ＴＩＭＰ−１およびＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１複合体並びに患者の年齢、性別及びトランスアミナーゼレベル、最も特徴的にはＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、ＡＳＴ（アスパルテートアミノトランスフェラーゼ）及びＧＬＤＨ（グルタメートデヒドロゲナーゼ）を数的因子、即ちマルチプリケーター及びサマンドまたはその組み合わせと共に列挙したものから得られるマーカーの組み合わせを包含し、そのような数的因子は−１０００〜＋１０００ナノグラム／ｍＬ（ｎｇ／ｍＬ）の値を有する。
【０１３７】
本明細書に記載する値は特段の記載が無い限り、ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍＬ）単位である。当業者であればこのような値を何れかの有用な単位に容易に変換し、相応に本明細書に開示するアルゴリズムにおいて使用する値を変更することができる。
【０１３８】
異なる評点システムを用いて発見された生検評点を予測することは、異なる数的因子と組み合わせられた年齢、性別及びトランスアミナーゼ値とのマーカーＰＩＩＩＮＰ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩ、テネイシン、ラミニン、ヒアルロナン、ＭＭＰ−２、ＴＩＭＰ−１およびＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１の異なる組み合わせを用いる異なるアルゴリズムの開発を要した。
【０１３９】
判別関数は比較すべき組織病理学的評点と同様に多くの異なる関数のアレイとして（アルゴリズム１、２、３、４、５、６、１ｂ、２ｂ、３ｂ、４ｂ、５ｂ、６ｂ参照）または、記号論理学的回帰とも称される場合が多い１つの単一の判別関数（例えば、４ａ、５ａ、６ａ、４ｃ、５ｃ、６ｃ、７、７ａ、８、８ａ、９、１０、１１、１２参照）としてセットアップする。判別関数は計算されたバイオマーカー誘導肝評点を固有にもたらすが、記号論理学的回帰はバイナリ結果を評価するためのツールとして、またはマーカー評点を計算するためのツールとしてのその使用に応じて、１つまたは複数のカットオフ値を必要とする。マーカー評点を得るためには、判別関数は疾患の等級より１減じた数程多くの異なるカットオフ値を必要とする。
【０１４０】
組織病理学的評点を計算するためには、個体の血清マーカーまたは他のパラメーターの結果を等式の各々に代入して判別評点を計算する必要がある。数個の判別関数のセットを使用するモデルにおいては、各関数は異なる評点を表す。代入した値を用いた計算において最高の数的判別評点を与える関数は計算されたバイオマーカー誘導肝臓疾患評点としてのその関連疾患評点を与える。
（ｃ）Ｓｃｈｅｕｅｒ評点に関するアルゴリズム
以下のアルゴリズム１〜６及び４ａ〜６ａはＳｃｈｅｕｅｒ評点システムにより評価された生検と肝臓疾患患者の群の血清マーカー濃度を相関させることにより計算した。全てのアルゴリズムは患者の１群（マーカー発見コホート）からのマーカー結果及び病理評点を用いて誘導し、次に患者の別の群（バリデーションコホート）における生検評点を予測するために使用した（計算評点）。計算された評点は単一の病理学者により求められた評点と（事例Ｂ）、３人の病理学者の統一見解評点と（事例Ｃ）及び全ての病理学者に行き渡る範囲と（事例Ａ）比較した。カッパ値はアルゴリズムの検出力を評価するために計算した。新しい診断方法の検出力（感度、特異性、陽性予測値（ＰＰＶ）、陰性予測値（ＮＰＶ）及びレシーバーオペレーター特異的分析における曲線下面積（ＲＯＣＡＵＣ））を評価するために通常使用される基準を使用できるように、組織学的分析により誘導された肝臓疾患評点及び血清マーカーアルゴリズムから誘導された計算評点を評点０〜１を陰性読み取り値及び評点２〜４を陽性読み取り値（Ｓｃｈｅｕｅｒ評点）とするように２分割した。従って、真陽性、真陰性、擬似陰性及び擬似陽性に関する両方の方法の換算性を評価して、各アルゴリズムの感度、特異性、ＮＰＶ、ＰＰＶ及びＲＯＣＡＵＣを求めた。アルゴリズム４ａ、５ａ、６ａを参照できる。全ての例において、各々の異なるアルゴリズムを評価するための絶対基準として生検の結果を用いた。
アルゴリズムで使用した略記法：
【０１４１】
【化４】
2008502908.tif 000009
【０１４２】
【化５】
2008502908.tif 000010
【０１４３】
【化６】
2008502908.tif 000011
【０１４４】
【化７】
2008502908.tif 000012
【０１４５】
【化８】
2008502908.tif 000013
以下の表２はアルゴリズム１、２及び３の診断性能を示す。カラムＣは所定のアルゴリズムに関する３病理学者の統一見解評点とマーカーに基づく結果の間の比較の結果を報告するものであり；カラムＡは３人の異なる病理学者により報告された評点の範囲とマーカーに基づく結果の間の比較の結果を報告するものであり；カラムＢは試験の中核的な病理学者（単一の病理学者）により報告された評点とマーカーに基づく結果の間の比較の結果を報告するものである。ヒット率はマーカーに基づくアルゴリズム及び病理学者のＳｃｈｅｕｅｒ評点により同一であると報告された評点のパーセントであり；カッパ値は結果群の間の一致を報告するものであり、Ｌ＿カッパ及びＵ＿カッパはカッパ値に関する信頼区間の下限及び上限を示し（９５％ＣＩ）、ＮＰＶは２分割された評点システムに関する陰性予測値であり、ＰＰＶは２分割システムに関する陽性予測値である。
【０１４６】
表３はアルゴリズム４、５及び６の診断性能を示す。カラムＣは所定のアルゴリズムに関する３病理学者の統一見解評点とマーカーに基づく結果の間の比較の結果を報告するものであり；カラムＡは３人の異なる病理学者により報告された評点の範囲とマーカーに基づく結果の間の比較の結果を報告するものであり；カラムＢは試験の中核的な病理学者（単一の病理学者）により報告された評点とマーカーに基づく結果の間の比較の結果を報告するものであり；ヒット率はマーカーに基づくアルゴリズム及び病理学者のＳｃｈｅｕｅｒ評点により同一であると報告された評点のパーセントであり；カッパ値は結果群の間の一致を報告するものであり、Ｌ＿カッパ及びＵ＿カッパはカッパ値に関する信頼区間の下限及び上限を示し（９５％ＣＩ）、ＮＰＶは２分割された評点システムに関する陰性予測値であり、ＰＰＶは２分割システムに関する陽性予測値である。
【０１４７】
【表２】
2008502908.tif 000014
【０１４８】
【表３−１】
2008502908.tif 000015
【０１４９】
【表３−２】
2008502908.tif 000016
（ｄ）Ｉｓｈａｋ評点に関するアルゴリズム 
以下のアルゴリズム１ｂ、２ｂ、３ｂ、４ｂ、５ｂ、６ｂ、４ｃ、５ｃ及び６ｃはＩｓｈａｋ評点システムにより評価された生検と肝臓疾患患者の群の血清マーカー濃度を相関させることにより計算した。
【０１５０】
全てのアルゴリズムは患者の１群（マーカー発見コホート）からのマーカー結果及び病理評点を用いて誘導し、次に患者の別の群（バリデーションコホート）における生検評点を予測するために使用した（計算評点）。計算された評点は、単一の病理学者により求められた評点と（事例Ｂ）、３人の病理学者の統一見解評点と（事例Ｃ）及び全ての病理学者に行き渡る範囲と（事例Ａ）比較した。カッパ値はアルゴリズムの検出力を評価するために計算した。
【０１５１】
新しい診断方法の検出力（感度、特異性、陽性予測値（ＰＰＶ）、陰性予測値（ＮＰＶ）及びレシーバーオペレーター特異的分析における曲線下面積）を評価するために通常使用される基準を使用できるように、組織学的分析により誘導された肝臓疾患評点及び血清マーカーアルゴリズムから誘導された計算評点を評点０〜２を陰性読み取り値及び評点３〜６を陽性読み取り値（Ｉｓｈａｋ評点）とするように２分割した。従って、真陽性、真陰性、擬似陰性及び擬似陽性に関する両方の方法の換算性を評価して、各アルゴリズムの感度、特異性、ＮＰＶ、ＰＰＶ及びＲＯＣＡＵＣを求めた。アルゴリズム４ａ、５ａ、６ａを参照できる。全ての例において、各々の異なるアルゴリズムを評価するための絶対基準として生検の結果を用いた。
【０１５２】
【化９】
2008502908.tif 000017
【０１５３】
【化１０】
2008502908.tif 000018
【０１５４】
【化１１】
2008502908.tif 000019
【０１５５】
【化１２】
2008502908.tif 000020
【０１５６】
【化１３】
2008502908.tif 000021
以下の表４はアルゴリズム１ａ、２ａ及び３ａの診断性能を示す。カラムＣは所定のアルゴリズムに関する３病理学者の統一見解評点とマーカーに基づく結果の間の比較の結果を報告するものであり；カラムＡは３人の異なる病理学者により報告された評点の範囲とマーカーに基づく結果の間の比較の結果を報告するものであり；カラムＢは試験の中核的な病理学者（単一の病理学者）により報告された評点とマーカーに基づく結果の間の比較の結果を報告するものである。ヒット率はマーカーに基づくアルゴリズム及び病理学者のＳｃｈｅｕｅｒ評点により同一であると報告された評点のパーセントである。
【０１５７】
カッパ値は結果群の間の一致を報告するものである。Ｌ＿カッパ及びＵ＿カッパはカッパ値に関する信頼区間の下限及び上限を示し（９５％ＣＩ）、ＮＰＶは２分割された評点システムに関する陰性予測値であり、そしてＰＰＶは２分割システムに関する陽性予測値である。
【０１５８】
【表４】
2008502908.tif 000022
以下の表５はアルゴリズム４ｂ、５ｂ及び６ｂの診断性能を示す。カラムＣは所定のアルゴリズムに関する３病理学者の統一見解評点とマーカーに基づく結果の間の比較の結果を報告するものであり；カラムＡは３人の異なる病理学者により報告された評点の範囲とマーカーに基づく結果の間の比較の結果を報告するものであり；カラムＢは試験の中核的な病理学者（単一の病理学者）により報告された評点とマーカーに基づく結果の間の比較の結果を報告するものであり；ヒット率はマーカーに基づくアルゴリズム及び病理学者のＳｃｈｅｕｅｒ評点により同一であると報告された評点のパーセントであり；カッパ値は結果群の間の一致を報告するものであり、Ｌ＿カッパ及びＵ＿カッパはカッパ値に関する信頼区間の下限及び上限を示し（９５％ＣＩ）、ＮＰＶは２分割された評点システムに関する陰性予測値であり、ＰＰＶは２分割システムに関する陽性予測値である。全ての表において、「バイナリ結果」は、低マーカー評点の群を「陰性」及び高マーカー評点の群を「陽性」と示すマーカー評点の群が形成されることを意味する。この方法を用いて、感度、特異性、ＮＰＶ、ＰＰＶおよびＲＯＣ  ＡＵＣに関する統計学的分析が可能となるバイナリまたは２分割結果を定義することができる。
【０１５９】
【表５−１】
2008502908.tif 000023
【０１６０】
【表５−２】
2008502908.tif 000024
（ｅ）Ｓｃｈｅｕｅｒ評点に関するレシーバーオペレーター特性（ＲＯＣ）曲線
患者をＳｃｈｅｕｅｒ評点に関するカテゴリ無／軽度線維症（評点０〜１）及び中等度／重度線維症（評点２〜４）に分類すること、及び、２分割結果に関するアルゴリズムを計算することにより、以下の結果が得られた。
【０１６１】
【化１４】
2008502908.tif 000025
アルゴリズムを使用してＳｃｈｅｕｅｒ評点に関するカテゴリ無／軽度線維症（評点０〜１）及び中等度／重度線維症（評点２〜４）についてレシーバーオペレーター特性曲線を計算した。計算された評点は単一の病理学者により求められた評点と（事例Ｂ）、３人の病理学者の統一見解評点と（事例Ｃ）及び全ての病理学者に行き渡る範囲と（事例Ａ）比較した。曲線下面積（ＡＵＣ）値が計算されている。
【０１６２】
表６はアルゴリズム７および８の診断性能を示す。カラムＣは所定のアルゴリズムに関する３病理学者の統一見解評点とマーカーに基づく結果の間の比較の結果を報告するものであり；カラムＡは３人の異なる病理学者により報告された評点の範囲とマーカーに基づく結果の間の比較の結果を報告するものであり；カラムＢは試験の中核的な病理学者（単一の病理学者）により報告された評点とマーカーに基づく結果の間の比較の結果を報告するものである。表によれば、「バイナリ結果」は、評点０および１の群を「陰性」及び評点２〜４点の群を「陽性」と示すマーカー評点の群が形成されることを意味する（Ｓｃｈｅｕｅｒ）。ＡＵＣはレシーバーオペレーター特性分析における曲線下面積を意味する。Ｎは検査した対象の数である。
【０１６３】
【表６】
2008502908.tif 000026
（ｆ）Ｉｓｈａｋ評点に関するレシーバーオペレーター特性（ＲＯＣ）曲線
患者をＩｓｈａｋ評点に関するカテゴリ無／軽度線維症（評点０〜２）及び中等度／重度線維症（評点３〜６）に分類すること、及び、２分割結果に関するアルゴリズムを計算することにより、以下の結果が得られた。
【０１６４】
【化１５】
2008502908.tif 000027
アルゴリズムを使用してＩｓｈａｋ評点に関するカテゴリ無／軽度線維症（評点０〜２）及び中等度／重度線維症（評点３〜６）についてレシーバーオペレーター特性曲線を計算した。計算された評点は単一の病理学者により求められた評点と（事例Ｂ）、３人の病理学者の統一見解評点と（事例Ｃ）及び全ての病理学者に行き渡る範囲と（事例Ａ）比較した。表７に示す通り曲線下面積（ＡＵＣ）値が計算されている。
【０１６５】
表７はアルゴリズム７ａ及び８ａの診断性能を示す。カラムＣは所定のアルゴリズムに関する３病理学者の統一見解評点とマーカーに基づく結果の間の比較の結果を報告するものであり；カラムＡは３人の異なる病理学者により報告された評点の範囲とマーカーに基づく結果の間の比較の結果を報告するものであり；カラムＢは試験の中核的な病理学者（単一の病理学者）により報告された評点とマーカーに基づく結果の間の比較の結果を報告するものである。表によれば、「バイナリ結果」は、評点０および２の群を「陰性」及び評点３〜６点の群を「陽性」と示すマーカー評点の群が形成されることを意味する（Ｉｓｈａｋ）。ＡＵＣはレシーバーオペレーター特性分析における曲線下面積を意味する。Ｎは検査した対象の数である。
【０１６６】
【表７】
2008502908.tif 000028
群分けされた評点及び複数のマーカー
肝線維症血清マーカーＰＩＩＩＮＰ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩ、テネイシン、ラミニン、ヒアルロナン、ＭＭＰ−２、ＴＩＭＰ−１およびＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１複合体並びに年齢、性別及びトランスアミナーゼ値もまた、Ｉｓｈａｋ評点を以下の３群、即ち第１群Ｉｓｈａｋ評点０および１；第２群：Ｉｓｈａｋ評点２、３及び４、及び、第３群：Ｉｓｈａｋ評点５及び６に群分けすることにより、無／軽度線維症、中等度線維症および重度線維症の群に患者を層化するために有用である。個々のマーカー、例えば、ヒアルロナン、ＰＩＩＩＮＰ、ＭＭＰ２、コラーゲンＩＶ及びＴＩＭＰ−１は肝線維症の重症度に相関しているが、マーカーの組み合わせが明らかに優れた診断性能を与える。試験のこの特徴は群分けされた評点により評価されたものとして肝線維症の重症度への個々のマーカーの相関を示すが、アルゴリズム９、１０及び１１はアルゴリズムに１つより多いマーカーを組み合わせることにより達成できる改善点を例示している。
ヒアルロン酸
ヒアルロン酸は肝線維症の段階との歴史的に最も良好な関連を示している。ヒアルロン酸に関する判別関数（自然対数単位）は全ての他のアルゴリズムの開発のためにも使用された訓練コホートに対して開発された。判別評点（ＤＨＡ）は以下の通り示される。
【０１６７】
ＤＨＡ＝−３．９７＋１．０１６Ｌｎ（ＨＡ）
生検の読み取り値と比較した場合の判別評点の検討によれば、Ｉｓｈａｋ評点は以下の通り群分けされることが示唆される。
【０１６８】
【化１６】
2008502908.tif 000029
上記した態様でＩｓｈａｋシステムを変更すると以下のトレーニングセットの判別関数が得られた。
【０１６９】
ＤＨＡ＝−３．７０＋０．９９２Ｌｎ（ＨＡ）
全マーカーのバリデーションのために使用されたバリデーションセットから得られたヒアルロン酸マーカーの結果のプロセッシングによれば、このマーカー単独に基づいた３群の明確に区別される分離が示されている。カットオフ値は重度及び中等度の線維症を検出するための８５％感度を達成するために選択した。これらの群を非／軽度線維症群から分離する特異性を計算した。以下の表７ａはカットオフ値をそれぞれの特異性と共に示す。
【０１７０】
【表７ａ】
2008502908.tif 000030
３型プロコラーゲン（ＰＩＩＩＮＰ）のアミノ末端プロペプチド
トレーニングコホートにおいて求めたこのマーカーに関する判別関数は以下の通りである。
【０１７１】
ＤＰＩＩＩＮＰ＝−２．６５７＋１．６４６＊Ｌｎ（ＰＩＩＩＮＰ）
バリデーション群のＰＩＩＩＮＰ濃度から誘導された判別評点を計算すると、群間に明確な分離が存在している。８５％感度水準においてマーカーＰＩＩＩＮＰが無／軽度および中等度各々重度の疾患の間を分離する特異性を以下の表７ｂに示す。
【０１７２】
【表７ｂ】
2008502908.tif 000031
マトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ２）
再度トレーニングコホートにおいて求めたこの試験に関する判別関数は以下の通りである。
【０１７３】
ＤＭＭＰ２＝−１５．０＋２．３５４Ｌｎ（ＭＭＰ２）
バリデーション群のＭＭＰ２濃度から誘導された判別評点を計算すると、群間に明確な分離が存在している。８５％感度水準においてマーカーＭＭＰ２が無／軽度および中等度各々重度の疾患の間を分離する特異性を以下の表７ｃに示す。
【０１７４】
【表７ｃ】
2008502908.tif 000032
コラーゲンＩＶ
再度トレーニングコホートにおいて求めたコラーゲンＩＶに関する判別関数は以下の通りである。
【０１７５】
ＤＣｏｌ４＝−１１．３４１＋２．２７３Ｌｎ（コラーゲンＩＶ）
バリデーション群のコラーゲンＩＶ濃度から誘導された判別評点を計算すると、群間に明確な分離が存在している。８５％感度水準においてマーカーコラーゲンＩＶが無／軽度および中等度各々重度の疾患の間を分離する特異性を以下の表７ｄに示す。
【０１７６】
【表７ｄ】
2008502908.tif 000033
Ｉ型メタロプロテイナーゼ組織阻害剤（ＴＩＭＰ−１）
群分けされたＩｓｈａｋ範疇を有意に判別する唯一の他の単一のマーカーはＴＩＭＰ−１であった。この判別関数は以下の通りである。
【０１７７】
ＤＴＩＭＰ１＝−１３．２８９＋２．０３６＊Ｌｎ（ＴＩＭＰ−１）
バリデーション群のコラーゲンＩＶ濃度から誘導された判別評点を計算すると、群間に明確な分離が存在している。８５％感度水準においてマーカーＴＩＭＰ−１が無／軽度および中等度各々重度の疾患の間を分離する特異性を以下の表７ｅに示す。
【０１７８】
【表７ｅ】
2008502908.tif 000034
（ｈ）複数のマーカー
試験のこの特徴は診断アルゴリズム内に１つより多い血清マーカーを組み合わせることにより達成できる改善点を示している。
【０１７９】
アルゴリズム９はＰＩＩＮＰ及びコラーゲンＩＶを含む。マーカー発見コホートから誘導された判別関数は以下の通りである。
ＤＭ１＝−７．５２２＋１．２１Ｌｎ（コラーゲンＩＶ）＋０．９４７Ｌｎ（ＰＩＩＩＮＰ）
バリデーション群のアルゴリズム９から誘導された判別評点を計算すると、群間に明確な分離が存在している。８５％感度水準においてアルゴリズム９が無／軽度および中等度各々重度の疾患の間を分離する特異性を以下の表７ｆに示す。
【０１８０】
【表７ｆ】
2008502908.tif 000035
2008502908.tif 000036
数値は８５％感度水準において顕著な特異性の増大を示しているが、アルゴリズム９とＰＩＩＩＮＰ単独の特異性を重度疾患に関する比較、即ち相関比例に関するＭｃＮｅｍａｒ試験は増大は０．０５水準では優位でないことを示している。０．０７の厳密なｐは有意性の傾向を示すことに留意しなければならない。アルゴリズム９は全ての単一のマーカーにより誘導されるＩｓｈａｋ評点より高性能であることを示しているが０．１水準では有意であり。中等度疾患軍と比較した特異性には有意な増大は無い。
【０１８１】
アルゴリズム１０
ヒアルロン酸をマーカー発見コホートとともにアルゴリズム９に加えることにより以下の判別関数を得た（アルゴリズム１０）。
ＤＭｏｄｅＩＩＩ＝−６．７０４＋０．７４９Ｌｎ（コラーゲンＩＶ）＋０．６０７Ｌｎ（ヒアルロン酸）＋０．４３６Ｌｎ（ＰＩＩＩＮＰ）
バリデーション群のアルゴリズム１０から誘導された判別評点を計算すると、群間に明確な分離が存在している。８５％感度水準においてアルゴリズム１０が無／軽度および中等度各々重度の疾患の間を分離する特異性を以下の表７ｇに示す。
【０１８２】
【表７ｇ】
2008502908.tif 000037
2008502908.tif 000038
ＭｃＮｅｍａｒχ２は高度に有意であり、アルゴリズム１０がＰＩＩＩＮＰ単独または何れの他の単一のマーカーよりも遥かに優れていることを示している。アルゴリズム１０はまた０．０５有意水準においてアルゴリズム９より優れている。
【０１８３】
アルゴリズム１１（ＰＩＩＩＮＰ、コラーゲンＩＶ、ヒアルロン酸及びＭＭＰ２）
バリデーション群のアルゴリズム１１から誘導された判別評点を計算すると、群間に明確な分離が存在している。８５％感度水準においてアルゴリズム１１により達成される無／軽度および中等度各々重度の疾患の間を分離する特異性を以下の表７ｈに示す。
【０１８４】
【表７ｈ】
2008502908.tif 000039
アルゴリズム１１は各単一のマーカーの結果と比較して８５％感度水準において特異性の改善を示しているが、アルゴリズム１０を超えたアルゴリズム１１の改善は調べた試料サイズでは有意性に到達しておらず、ＭｃＮｅｍａｒχ２＝２．１８、ｐ＝０．１４である。感度に到達していなかった性能の全ての他の改善に関しては、より大きい患者コホートが検討されれば起こる可能性が高いものである。
【０１８５】
２．肝臓疾患の進行の長期にわたるモニタリング
試験開始時及び終了時に採取した肝生検試料を用いて２年間に渡り８５名の患者をモニタリングした。血清は全患者より、そして、試験期間の異なる１〜８時点において採取した。
【０１８６】
マーカー誘導計算病理評点は以下の記号論理学的回帰により計算した。
【０１８７】
【化１７】
2008502908.tif 000040
アルゴリズム１２において、ＣＲＡＴＩＯはコラーゲンＶＩ及びコラーゲンＩＶの血清値の比率を意味する。
【０１８８】
以下の表８は試験バリデーションコホートの患者から得た判別評点（アルゴリズム１２）がどのようにしてその相当する組織病理学的評点の周囲にクラスタリングするかをまとめたものである。
【０１８９】
【表８】
2008502908.tif 000041
個々の評点に対して照会可能とするカットオフ値は、分離すべき相当する判別評点の平均を取ることにより確立した。計算された肝臓疾患評点を使用してノンパラメトリックの回帰を計算することにより傾きを得た（疾患重症度ｖｓ時間；回帰係数のＴｈｅｉｌ推定子）。各傾きに関して定義された信頼変数νを用いて各傾きにつき９５％信頼区間を計算した。νは以下の値を有する。
ν＝傾き＞０であり９５％ＣＩがゼロを含まない場合１（陽性）
傾きに関する９５％ＣＩがゼロを含まない場合０
傾きが負であり９５％ＣＩがゼロを含まない場合−１（陰性）
従って、ωは以下の通り定義した。
ω＝Ｉｓｈａｋ評点が少なくとも２水準減少した場合−１（改善）
Ｉｓｈａｋ評点が±１の場合０（不変）
Ｉｓｈａｋ評点が少なくとも２水準増大した場合１（進行）
これら２つの定義を用いて、８５人の患者の結果について、３ｘ３の換算表をセットアップすることにより表９に示す以下の結果を得た。
【０１９０】
【表９】
2008502908.tif 000042
表９は疾患の進行（病理評価）を有していた１２患者につき、何れの患者も低下した判別評点を有していなかったことを示している。更にまた、疾患の改善を示した患者については、１人のみが正の傾きを有していた。全体として、換算性は０．１水準で有意であり、肝臓疾患の進行及び後退を長期的にモニタリングする血清マーカーに基づくアルゴリズムの能力を照明していた。
多施設（「ＥＬＦ」）試験の別の分析
ＥＬＦ試験において収集されたデータをデータの統計学的分析のための別の方法を用いて再分析した。
【０１９１】
ＥＬＦ試験における本発明の実施形態の性能を２種の広範に許容されている組織学的段階付けシステムと比較した。組織学的段階付けは欠点のある予測に基づいている。第１に全段階付けシステムは、「無」から「肝硬変」への線維症の範囲を示す段階を区別するために生検試料にカテゴリカルな値を病理学者が割り付けることを必要とする。この病理範囲は継続的な変数の評点によりより正確に示されるはずである。第２にＳｃｈｅｕｅｒ及びＩｓｈａｋ組織学的段階付けシステムは両方とも段階間の進行の直線性を予測しているが、４の段階は必ずしも２の段階の二倍悪いわけではないことは広く認識されている。（３０Ａ；３１Ａ）。
【０１９２】
この第２の予測を対象として、本発明の実施形態を用いて線維症のある範囲に渡ってアルゴリズム評点の分布を調べることにより組織学的疾患重症度と共にどのように評点が変動するかを調べた。以前の代理マーカー試験は、専門家の意見及び組織学的段階を経由する進行は直線的であるという予想に基づいて、「無または軽度の線維症」及び「中等度または重度の線維症」を示すものとして捕らえられる２群に組織学的段階を自由に二分化していた。次にこれらの二分化段階を用いて血清マーカー評点に組織学の性能を比較した。
【０１９３】
本分析においては、肝組織学的段階の群分け及びマーカー評点とのその相関に関しては予測を行わなかった。マーカーデータをプロットしたところ、Ｓｃｈｅｕｅｒの段階２及び３、及び、Ｉｓｈａｋの段階３及び４の間の点における組織学段階の二分化に相関した明確な分割の２つの自然な群分けが判明した。データは、これらの段階の変化が疾患の進行における生物学的に有意な通過点を表すことを示している。
【０１９４】
特に９種の血清線維症マーカー及び肝線維症の間の関係を、前に記載したＥＬＦ試験における１３施設において慢性肝臓疾患の検査の部分として得られた１，０２１対象由来の肝生検試料の組織学的検査により調べた。試験への患者の採用は図１に示す通りである。
【０１９５】
ＥＬＦ試験においては、対象は、６ヶ月より長期に渡り持続している異常な生化学的肝機能試験値として定義される慢性肝臓疾患の検査のための肝生検を受ける予定である場合に的確と見なした。更に別の参加基準はインフォームドコンセントを出す能力、１８歳より年長、及び７５歳未満とした。患者はその年齢がこの範囲に属さない場合；リウマチ性、腎または肺の疾患を含む肝線維症以外に関連する何れかの障害を有する場合；心臓血管疾患またはガンを有する場合；代償不全の証拠を伴う進行肝硬変（Ｃｈｉｌｄ−ＰｕｇｈクラスＣ）；アスピリン常用；または肝細胞癌または薬物誘導肝臓疾患を有する場合には試験から除外した。
【０１９６】
採用した１，０２１対象のうち、各診断カテゴリ中の数は慢性Ｃ型肝炎４９６；アルコール性肝臓疾患６４；原発性胆汁性肝硬変または原発性硬化性胆管炎５３；脂肪肝６１；Ｂ型肝炎６１；肝移植後の再発性疾患４８；自己免疫性肝炎４５；ヘモクロマトーシス３２；特発性肝硬変１９；ＢおよびＣ型肝炎４；その他（未知の病因の肉芽腫性疾患および正常者を含む）１３８であった。弾性が試料の６３％に相当し；平均年齢は４４．１歳、標準偏差＝１２．８年、範囲＝１９〜２５歳であった。ＧＡ、ＧＴ、ＧＶまたは体型測定群において対象間の有意差はなかった。
【０１９７】
日常的な血液検査に加えて血清試料も肝生検時に採取し、迅速に処理した。Ｂａｙｅｒ  ＩＭＭＵＮＯ  １ＴＭシステム上で実行するために９種の異なるイムノアッセイを開発した。上記したＢａｙｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏ  １システム用のフォーマットされた異種ＥＬＩＳＡ型試験を使用した。肝線維症に関与する基本的機序の知見に基づいて、分子標的のフルパネルをマトリックスの合成または分解の代理マーカーとして選択した。試験に使用した抗体対及びその入手元は、異なる肝線維症評点の間を判別する変数を決定するための判別関数分析の使用に関する本明細書に記載した考察との関連において前に記載した抗体対及び入手元と同様であった。血清マーカー評点の何れも不明確とは考えられなかった。
【０１９８】
全生検試料は現地において、そして、１人の中核的病理学者（Ａ）により分析された。臨床的詳細または生化学的試料は４５対象において不完全であり、残り９７６生検試料中５５検体は不十分な長さ（＜１２ｍｍ）及び少量過ぎる門脈管のため完全な組織学的分析のためには不十分であると考えられた。生検試料、血清試料及び臨床的詳細は群ＧＡを構成する最終分析の対象となった９２１対象について入手可能であった。
【０１９９】
３人の熟練した肝病理学者が試験に参加した。中核的な病理学者（Ａ）はＳｃｈｅｕｅｒ（２７）及びＩｓｈａｋ（２８）の段階付けシステムを用いて９２１生検試料を評価した。慢性のウィルスまたは免疫性の肝炎以外の条件については、基準の記載の変更を行うことにより線維症（例えば、アルコール性及び非アルコール性の脂肪肝炎、細静脈周囲及び細胞周囲の線維症により置換された門脈及び門脈周囲の線維症）の分布が反映されるようにした。この群はＧＡと標記し、そして試験及びバリデーションセットを誘導することはこの群の試料から行うものとした。病理学者Ａ及びＢは別々の試験において呈示される慢性肝臓疾患の範囲が反映されるスライドの「コーチング」セットを使用することにより、最初はその評点を調和させた後に試験の生検試料を評価した。病理学者ＣはＡ及びＢと同じＩｓｈａｋ及びＳｃｈｅｕｅｒのシステムに関する記載を使用したが、「コーチング」を受けることなく生検試料を段階付けした。病理学者Ａは病理学者Ｂ及びＣにより独立してやはり段階付けされたＧｃと標記される６２０検体の「統一見解セット」を含む全９２１生検試料を再段階付けした。個々の線維症の段階（Ｓｃｈｅｕｅｒ０〜４及びＩｓｈａｋ０〜６）を記録した。
【０２００】
このようにして、４シリーズの段階付けセットを作成した。中核病理学者のものはＲＡ１及びＲＡ２と標記し、病理学者ＢのものはＲＢそして病理学者ＣのものはＲＣとした。これらの段階付けの比較により観察者内変動（ＲＡ１ｖｓＲＡ２）、研究セッティングを反映する「コーチング」された病理学者間の観察者間変動（ＲＡ１ｖｓＲＢ）及び個別に作業を行うが共有の評点システムを使用する熟練肝臓病理学者間の観察者間変動（ＲＡ１ｖｓＲＣおよびＲＢｖｓＲＣ）の検討が可能となる。これらの後者の比較は臨床慣行において関連する状況を正確に反映している。
（ａ）分析手法
血清マーカーを組み合わせたアルゴリズムを誘導するために４００症例（ＧＴ）の群を生検試料のある９２１患者の群から無作為に選択した。マーカーのアルゴリズムへの付加が群間の全体的一般化距離を増大させればそれを含めることによりアルゴリズムを開発した。臨床化学及び血液学的試験の結果もまたこの方法により調べた。旨適アルゴリズムを選択肢、次にそのアルゴリズムの性能を病理学者Ａにより割り付けられた段階付けを用いてバリデーション群（ＧＶ）と標記されるＧＡの５２１生検試料の残余セットにおいてバリデーションした。このアルゴリズムが組織学的な線維症の段階付けの間を区別する能力に関連する性能特性の分析を用いて、より低い組織学的線維症段階付けを有する症例間をより高い段階付けのものから区別するブレークポイントを発見し、これにより肝線維症の真の生物学的進行を反映するバイナリ結果を作成した。この方法は線維症の進行の直線性に関する予測を回避するものである。アルゴリズムの性能の再現性は病理学者ＢおよびＣにより割り付けられた生検試料の段階付けに対抗するその性能を測定することにより評価した。
【０２０１】
体型測定画像分析はＫｏｎｔｒｏｎ画像分析器及びＰｉｃｏ  Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ／Ｆａｓｔ  Ｇｒｅｅｎで８３６検体の適当な生検試料を染色した後に検出された総肝組織の比率として線維症の面積を測定するための実地編集を可能にする相互プログラムを用いて実施した。線維性組織について陽性染色された全切片の比率を各場合につき測定し、平均値を求めた（２０Ａ）。
【０２０２】
適用した統計学的方法はバイナリ群分けされた生検試料の段階に関する分散分析（ＡＮＯＶＡ）、判別式分析及び記号論理学的回帰を使用した。カッパ統計値を計算することにより病理学者間の一致を調べた。感度、特異性、陽性予測地（ＰＰＶ）、陰性予測値（ＮＰＶ）およびバイナリ結果の優勢度をＲＯＣ分析を用いて調べた。全ての分析はＳＰＳＳ（登録商標）ソフトウエアパッケージ（ＳＰＳＳ，Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて実施した。
（ｂ）結果
全ての場合において、Ｓｃｈｅｕｅｒ段階付けに関する病理学者間の一致はＩｓｈａｋ段階付けに関するものを超えていた。病理学者Ａにより割り付けられた段階付けの２セット（ＲＡ１およびＲＡ２）の間の一致の水準は高値であった（カッパ＞０．９（Ｓｃｈｅｕｅｒ）及び０．７６（Ｉｓｈａｋ））。
【０２０３】
試験の主要目的は有意な組織学的線維症を発見する血清マーカーの能力を調べることであった。ＧＴ及びＧＶにおける各マーカーに関する平均、メジアン及び平均の標準誤差（ＳＥＭ）を求めた。多変量ＡＮＯＶＡによれば組み合わせた全てのマーカーに関して群間の差は無かった（ＨｏｔｅｌｌｉｎｇのＴ＝０．０１、Ｆ＝１．１４、ｄｆ１＝９、ｄｆ２＝９１１、ｐ＝０．３３）。関連する個々のｔ検定の検討によれば何れの個々のマーカーに関しても群間に有意差は無かった。カイ自乗検定によれば各群に関し病因論的分割に差は無かった（尤度比カイ自乗＝６．３４、ｄｆ＝６、ｐ＝０．３８）（データ示さず）。
【０２０４】
血清マーカーを組み合わせたアルゴリズムがＧＴ群において生検試料の段階の間を区別する能力を各評点システムについて評価した。
【０２０５】
種々の組み合わせにおいてヒアルロン酸、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩ、ラミニン、プロコラーゲンＩＩＩのアミノ末端ペプチド（ＰＩＩＩＮＰ）、メタロプロテイナーゼ１組織阻害剤（ＴＩＭＰ−１）及びマトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ−２）を組み込んだアルゴリズムを用いた場合も同様の性能特性が観察された。他の血清マーカー、肝機能試験を含む臨床化学試験の結果または血小板数及びプロトロンビン時間を含む血液学的指標を追加してもアルゴリズムの性能は向上しなかった。
【０２０６】
本発明者等は段階の全範囲（Ｓｃｈｅｕｅｒ段階０〜４、Ｉｓｈａｋ段階０〜６）に渡る生検試料群の最大の分離をもたらしたアルゴリズムに関して結果を提示した。全ての同様の組み合わせから得られた結果は、各スケール内の生検試料の段階を２分割できることを示していた。図２ａはＳｃｈｅｕｅｒ段階付けシステムに関する３マーカーの「ベストフィット」モデルに関する累積分布を示す。図２ｂはＩｓｈａｋシステムにおけるモデルに関する累積分布を示す。モデルはヒアルロン酸、プロコラーゲンＩＩＩのアミノ末端ペプチド（ＰＩＩＩＮＰ）、メタロプロテイナーゼ１組織阻害剤（ＴＩＭＰ−１）及び年齢に関する値を含んでいた。これらのアルゴリズムに関する式は以下に示す通りである。
【０２０７】
これらの分析において用いたアルゴリズムに関する式は以下の通りである。
【０２０８】
【化１８】
2008502908.tif 000043
式中、
Ｚ＝−０．１９６・ｌｎ（年齢）＋０．９５９・ｌｎ（ヒアルロン酸）＋０．７６１・ｌｎ（ＰＩＩＩＮＰ）＋０．５３９・ｌｎ（ＴＩＭＰ１）−８．９２
分布を検討したところ、Ｉｓｈａｋ段階３またはＳｃｈｅｕｅｒ段階２において自然分割（ｎａｔｕｒａｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を示していた。これはＳｃｈｅｕｅｒ０〜２、Ｉｓｈａｋ０〜３及びＳｃｈｅｕｅｒ３〜４、Ｉｓｈａｋ４〜６にそれぞれ相当する「無／軽度」及び「中等度／重度」の線維症の２カテゴリを発生させる各システム上の段階（データ示さず）の間の一般化された距離の検討により立証された（図４参照）。記号論理学的回帰を用いて上記モデルに各システムに関する２分割段階付けをフィットさせた。記号論理学的評点は試験（ＧＴ）及びバリデーション（ＧＶ）群の患者に関して得られた。表１０（ａ）は両方の群における各２分割システムに関するＡＵＣを示す。両方のシステムともＡＵＣの項については同一の結果を示す。ＧＶコホートに関してはＡＵＣは０．８０４であり；ＳｃｈｅｕｅｒについてはＳＥ＝０．０２３；ｐ＜０．０００１；９５％ＣＩ＝０．７５８〜０．８５１；ＩｓｈａｋについてはＡＵＣは０．８０４であり；ＳＥ＝０．０２３；ｐ＜０．０００１；９５％ＣＩ＝０．７５８〜０．８５０であった。
【０２０９】
図１について、中央の水平な直線はメジアン、斜線部はメジアンに関する推定９５％ＣＩを示す。末端の線は２５及び７５パーセンタイルである。破線はデータの「許容範囲」を示す。十字及び円は潜在的な「非適格者」を示す。プロットされたデータはＳｃｈｅｕｅｒ段階０〜２及び３〜４の生検試料に関する判別評点の分布を示す。
【０２１０】
特定の慢性肝臓疾患におけるアルゴリズムの性能を評価した。コホートにおける３種の最も一般的な肝障害に関するＡＵＣもＳｃｈｅｕｅｒ及びＩｓｈａｋの段階システムの両方に関して表１０（ａ）及び（ｂ）に示す。データは多様な慢性肝臓疾患を有する患者の全コホートから得られた４００被験（ＧＴ）及び５２１バリデーション（ＧＶ）試料に関する；そしてＣ型肝炎、非アルコール性脂肪肝疾患及びアルコール性肝臓疾患を有する患者に関する、２分割結果（Ｓｃｈｅｕｅｒについては０、１、２；３、４、そしてＩｓｈａｋについては０、１、２、３；４、５、６）を検出する場合のアルゴリズムの性能を示している。レシーバーオペレーター特徴曲線の曲線下面積、標準誤差（ＳＥ）、関連ｐ値及びＡＵＣに関する９５％信頼区間を示す。
【０２１１】
【表１０ａ】
2008502908.tif 000044
2008502908.tif 000045
【０２１２】
【表１０ｂ】
2008502908.tif 000046
Ｓｃｈｅｕｅｒ段階付けシステムを使用した場合、Ｃ型肝炎ではＡＵＣ＝０．７７３；ＳＥ＝０．０３８６；ｐ＜０．０００１；０．６９７〜０．８４８；ＮＡＦＬＤではＡＵＣ＝０．８７０；ＳＥ＝０．１０４；ｐ＜０．０００２；９５％ＣＩ＝０．６６６〜１．０００；アルコール性肝臓疾患（ＡＬＤ）ではＡＵＣ＝０．９４４；ＳＥ＝０．０５５５；ｐ＜０．０００１；９５％ＣＩ＝０．８３６〜１．０００であった。
【０２１３】
表１１ａ及び１１ｂはＩｓｈａｋ（１１ａ）及びＳｃｈｅｕｅｒ（１１ｂ）システムの両方に関する異なる評点閾値におけるバリデーション（ＧＶ）曲線に関する特定の座標を示す。
【０２１４】
【表１１ａ】
2008502908.tif 000047
【０２１５】
【表１１ｂ】
2008502908.tif 000048
ＧＶコホートに関するＲＯＣ曲線の特定の座標は表に示す通りである、感度、特異性、陽性予測値及び陰性予測値はアルゴリズム閾値評点の範囲に対して計算している。更にまた性能特性は、０．１０２のアルゴリズム閾値評点、即ち病理学者Ａにより段階付けされたシリーズにおける有意な線維症の検出において９０％の感度を与えた評点を用いて病理学者ＢおよびＣにより割り付けられた段階付けと比較したアルゴリズムについて示す。データはＩｓｈａｋ段階付け（１２ａ）及びＳｃｈｅｕｅｒ段階付け（１２ｂ）との比較について示す。
【０２１６】
感度及び特異性のほかに、陽性及び陰性の予測値を示す。Ｓｃｈｅｕｅｒ段階３または４の線維症の検出に関する感度は０．１０２の閾値アルゴリズム評点において９０％であり、ＮＰＶ＝９２％であった。特異性は０．８２の閾値評点において９９％であり、ＰＰＶ＝９０％であった。Ｉｓｈａｋ段階４〜６の相当する値は０．１０２の閾値において９０％及び９２％であった。
【０２１７】
アルゴリズムの性能は０．１０２の閾値を用いて他の２病理学者により割り付けられた生検試料の段階との比較により評価した。Ｓｃｈｅｕｅｒ段階３または４の線維症の検出に関する感度は０．１０２の閾値アルゴリズム評点においてＢで８６．７％及びＣで８６．５％であり、それぞれＮＰＶ＝９０．９％及び９１．７％であった。０．１０２の閾値アルゴリズム評点を用いた場合、Ｉｓｈａｋ段階４〜６の相当する値はＢで感度＝８７．９％；ＮＰＶ＝９０．２％であり、Ｃで感度＝８９．３％；ＮＰＶ＝９２．２％であった。
【０２１８】
病理学者Ａにより段階付けされたＧＶコホートにおいて示された３つの最も優勢な慢性肝臓疾患、即ち慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）、非アルコール性脂肪肝臓疾患（ＮＡＦＬＤ）及びアルコール性肝臓疾患（ＡＬＤ）におけるアルゴリズムの性能に関する結果を表１２ａおよび１２ｂに示す。これらの表はＲＯＣ座標、感度、特異性及び陰性及び陽性の予測値を９０％を超える結果を与えるアルゴリズム評点閾値に関して示したものである。
【０２１９】
【表１２ａ】
2008502908.tif 000049
【０２２０】
【表１２ｂ】
2008502908.tif 000050
2008502908.tif 000051
ＧＶコホートに関するＲＯＣ曲線の特定の座標は表に示す通りである、感度、特異性、陽性予測値及び陰性予測値はアルゴリズム閾値評点の範囲に対して計算している。データはＳｃｈｅｕｅｒ段階付け（１２ａ）及びＩｓｈａｋ段階付け（１２ｂ）との比較について示す。各々の場合において、表（ａ）はＳｃｈｅｕｅｒ段階付けを指し、そして（ｂ）はＩｓｈａｋ段階付けを指す。０．０６５の閾値において、Ｉｓｈａｋの線維症段階４〜６については、感度＝１００％、陰性予測値＝１００％であった。
【０２２１】
０．３７５のアルゴリズム評点閾値を用いた線維症段階３または４に関するＳｃｈｅｕｅｒシステムとのＮＡＦＬＤの比較では、感度＝８９％、特異性＝９６％、ＰＰＶ＝８０％及びＮＰＶ＝９８％であった。アルコール性肝臓疾患においては、０．０８７の閾値を用いたＳｃｈｅｕｅｒ線維症段階３または４の検出に関して、感度＝１００％及びＮＰＶ＝１００％であったのに対し、０．４３１の閾値では感度＝９３．３％、特異性＝１００％、ＰＰＶ＝１００％及びＮＰＶ＝８５．７％であった。
【０２２２】
通常は、臨床医学者および病理学者は肝線維症の３カテゴリをＳｃｈｅｕｅｒ段階の０、１；２、３および４に相当する「軽度」、「中等度」及び「重度」の線維症として区別する。軽度から中等度の線維症への線維は疾患の進行の有意な工程として認識される場合が多く、予後及び患者の管理に影響する決定事項に関して重要な画期的なものであることを反映している。従って、データは段階０、１、２及び３、４の間のアルゴリズム判別評点の分布に基づく二分化よりもむしろＳｃｈｅｕｅｒ段階０、１及び２、３、４の間の二分化を用いて分析した。
【０２２３】
結果は性能が同等の水準であることを明らかにした。中等度／重度線維症の検出に関する９０％感度を与える結果をＳｃｈｅｕｅｒ段階０、１：２、３、４（Ａ）及び０、１、２：３、４（Ｂ）の間の二分化に関して以下の表１３に示す。データはまた９０％感度で第４段階の線維症（肝硬変）を検出する能力についても分析した（Ｃ）。
【０２２４】
【表１３】
2008502908.tif 000052
表１３に示すデータは多様な慢性肝臓疾患を有する患者の全コホートから得られた４００被験（ＧＴ）及び５２１バリデーション（ＧＶ）試料に関する２分割結果（ＳｃｈｅｕｅｒについてＡ＝０、１：２〜４、Ｂ＝０、１、２：３、４およびＣ＝０、１、２、３：４）を検出する場合のアルゴリズムの性能を示している。レシーバーオペレーター特徴曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）、関連する標準誤差及び９５％信頼区間のｐ値を含んでいる。線維症の検出に関する感度及び特異性は特定の判別評点閾値（ＤＳＴ）について示す。「Ａ」は中等度及び重度の肝線維症から軽度のものを区別するために従来使用されている２分割を示す。「Ｂ」はコホートにおける評点の分布の分析から誘導された軽度と中等度の線維症の間の区別を示す示唆された２分割である。「Ｃ」は重度の線維症／肝硬変と軽度／中等度の線維症の間の区別を示す。
（ｄ）結論
ＥＬＦ試験の分析は、肝線維症の血清マーカーを組み合わせる本発明の実施形態を用いて９０％の感度で慢性肝臓疾患を有する患者における有意な肝線維症を発見することができることを確認するものであった。本発明は３種の異なる病理学者の評点と比較して同様の水準の感度を与えるものであり、これが種々の状況において同様の正確さで使用することができることを説明している。
【０２２５】
本発明の実施形態は熟練病理学者間の一致、画像分析との一致、個々の線維症マーカーの性能、及び、本発明者等の臨床慣行において遭遇する最も一般的な条件の３つを含む慢性肝臓疾患の範囲を診断する場合の本発明の性能の水準を評価することによりバリデーションされている。
【０２２６】
試験した患者コホートは広範な慢性肝臓疾患に罹患した患者を包含していた。このコホートを評価する場合の本発明の実施形態の性能は、広範な肝障害における線維症の有意な程度を有する患者を発見するためにこれを使用できることを示している。アルゴリズムの閾値評点の変化に伴う感度及び特異性の変化は、使用した試験閾値に応じて、有意な肝線維症の存在尾または非存在の何れかを検出するために、高精度で本発明を使用できることを明らかにしている。
【０２２７】
更にまた、この結果は、進行性の慢性肝臓疾患を有する患者において線維症を防止することを意図する治療介入のモニタリングにおいて本発明が有用であることを示している。肝線維症が可逆的過程であることを認識することは、抗線維症治療の開発において大きな利益をもたらしている。抗線維症薬の評価はその薬効を研究者が測定できるようにする診断試験の使用に依存している。肝生検試料の反復及び頻繁な使用は倫理的も現実的でもなく；生検試料は試料採取の誤り及び解釈の変動を生じさせる場合がある。本発明は新しい抗線維症治療の評価において使用される結果尺度としての組織学的段階の変化を評価するためのより現実的で許容できる代替法を提供する。
【０２２８】
更にまた本発明者等は、疾患の進行またはアルコール摂取の減少のような生活習慣の改変への応答、Ｃ型肝炎またはアルコール性肝臓疾患、および、ＮＡＦＬＤ及びＣ型肝炎における体重減少をモニタリングする場合に有用である。
【０２２９】
上記した結果は、臨床の肝臓分野での慣行において遭遇する３種の最も一般的な状態であるＣ型肝炎、ＮＡＦＬＤ及びアルコール性肝臓疾患の状態及び進行を診断する場合に本発明の実施形態が特に良好に機能することを示している。これらの状態の各々において、適切な試験閾値を選択することにより、９０％を超えるＰＰＶまたはＮＰＶが得られ、これらの疾患を有する患者における有意な線維症の存在を確認または否定するための臨床慣行において本発明が大きな用途を有していることを示している。
【０２３０】
Ｃ型肝炎に関する最近の研究によれば、容易に入手できる生化学的及び血液学的試験を組み合わせた指標に関して同様の水準の性能が報告されている。Ｆｏｒｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２００２；３６；９８６−９９２；Ｗａｉ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３８，５１８−５２６，２００３。これらの試験は線維症が有意になる時点に関する予測を行っており、そして試験セットにおけるデータの分析から線維症の段階的時点を誘導するよりはむしろ、アルゴリズムを誘導するために２変量の記号論理学的回帰を使用していた。
【０２３１】
Ｃ型肝炎の状態または進行の診断において、本発明は抗ウィルス治療の潜在的利点とタイミングを決定するために使用できる。我々の分析によれば、非アルコール性脂肪肝臓疾患を有する患者において、本発明は有意な線維症を有さない比較的良性の脂肪症を有する大多数から有意な線維症の危険性を有する患者の少数を区別するために使用できる（３２Ａ）。
【０２３２】
アルコール性肝臓疾患を有する患者において、本発明者等の結果は、本発明の実施形態が最高水準の性能を有することを示しており、１００％の感度及び特異性が達成されている。
【０２３３】
これらのデータは本発明の実施形態が有意な線維症の危険性を有する患者を発見するため、及び、殆ど肝線維症を有さないアルコール性肝臓疾患患者の大多数を発見するための両方に使用できることを示している。
【０２３４】
【化１９】
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【０２３５】
【化２０】
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【０２３６】
【化２１】
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【０２３７】
【化２２】
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【０２３８】
【化２３】
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【０２３９】
【化２４】
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【０２４０】
【化２５】
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【０２４１】
【化２６】
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【図面の簡単な説明】
【０２４２】
【図１】図１は発明の詳細な説明において参照するＥＬＦ試験における対象の採用及び参加を示すフローチャートである。
【図２ａ】図２ａは判別評点に対する累積ｐ評点のグラフを示し、そして、本発明の方法により確認されるＳｃｈｅｕｅｒ段階評点の累積分布を反映している。図２ｂは判別評点に対する累積ｐ評点のグラフを示し、本発明の方法により確認されるＩｓｈａｋ段階評点の累積分布を反映している。
【図２ｂ】図２ｂは判別評点に対する累積ｐ評点のグラフを示し、そして、本発明の方法により確認されるＳｃｈｅｕｅｒ段階評点の累積分布を反映している。図２ｂは判別評点に対する累積ｐ評点のグラフを示し、本発明の方法により確認されるＩｓｈａｋ段階評点の累積分布を反映している。
【図３ａ】図３ａは本発明に従って求めたレシーバーオペレーター特徴曲線−Ｓｃｈｅｕｅｒ変更評点システムバリデーションデータを示す。図３ｂは本発明に従って求めたレシーバーオペレーター特徴曲線−Ｉｓｈａｋ変更評点システムバリデーションデータを示す。
【図３ｂ】図３ｂは本発明に従って求めたレシーバーオペレーター特徴曲線−Ｓｃｈｅｕｅｒ変更評点システムバリデーションデータを示す。図３ｂは本発明に従って求めたレシーバーオペレーター特徴曲線−Ｉｓｈａｋ変更評点システムバリデーションデータを示す。
【図４】図４はＳｈｅｕｅｒ線維症評点ｖｓ本発明に従って求めた判別評点を示すバリデーションデータセット（Ｇｖ）に対するＢｏｘ及びＷｈｉｓｋｅｒプロットを示す。
【図５】図５はヒトＴＩＭＰ１ｍＲＮＡのヌクレオチド配列を示す（配列番号１）。
【図６−１】図６−１はヒトＭＭＰ２ｍＲＮＡのヌクレオチド配列を示す（配列番号２）。
【図６−２】図６−１の続き。
【図７−１】図７−１はヒトＭＭＰ９ｍＲＮＡのヌクレオチド配列を示す（配列番号３）。
【図７−２】図７−１の続き。
【図１】
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【図２ａ】
2008502908.tif 000062
【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
2008502908.tif 000067
【図６−１】
2008502908.tif 000068
【図６−２】
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【図７−１】
2008502908.tif 000070
【図７−２】
2008502908.tif 000071
【手続補正書】
【提出日】平成18年12月25日(2006.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008502908000001.app
【国際調査報告】
2008502908.tif 000072