(57)【要約】  エストロゲン受容体リガンド、エストロゲン受容体ポリペプチド／リガンド複合体、エストロゲン受容体ポリペプチド／リガンド複合体の結晶、ならびに関連方法およびソフトウェアシステムが開示される。
2008527045.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エストロゲン受容体ポリペプチド；および
少なくとも２つの縮合環を含む縮合環系を有するリガンドであって、少なくとも２つの縮合環のうちの少なくとも１つは少なくとも１つの窒素を含むリガンド
を含む、結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項２】
エストロゲン受容体ポリペプチド；および
少なくとも２つの縮合環を含む縮合環系を有するリガンドであって、少なくとも２つの縮合環のうちの少なくとも１つは少なくとも２つのヘテロ原子を含むリガンド
を含む、結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項３】
少なくとも２つのヘテロ原子のうちの少なくとも１つが窒素である、請求項２の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項４】
エストロゲン受容体ポリペプチド；および
リガンド；
を含む、結晶化ポリペプチド−リガンド複合体であって、該リガンドがＮＦκＢの転写活性を抑制し、マウスもしくはヒトの子宮組織の増殖を促進しない、結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項５】
該リガンドが、少なくとも２つの縮合環を包含する縮合環系を有し、少なくとも２つの縮合環のうちの少なくとも１つが少なくとも１つの窒素を含む、請求項４の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項６】
該リガンドが、少なくとも２つの縮合環を包含する縮合環系を有し、少なくとも２つの縮合環のうちの少なくとも１つが少なくとも２つのヘテロ原子を含む、請求項４の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項７】
少なくとも２つの縮合環のうちの１つが置換アリール基である、請求項１ないし３、５もしくは６のいずれか１項の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項８】
置換アリール基が、ハロ置換基、もしくはさらにハロで置換されたアルキル置換基を含む、請求項７の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項９】
該リガンドがインダゾールを含む、請求項１ないし６のいずれか１項の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１０】
該リガンドが４−（インダゾール−３−イル）−フェノールを含む、請求項９の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１１】
該リガンドが３つの縮合環を含む、請求項１ないし８のいずれか１項の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１２】
該リガンドがフェナントリジンを含む、請求項１、４もしくは５のいずれか１項の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１３】
該リガンドがヒドロキシル置換基、メルカプト置換基、もしくはアミノ置換基を含む、請求項１ないし１２のいずれか１項の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１４】
該リガンドが構造：
【化１】
2008527045.tif 000146
［式中、Ａ、Ｂ、およびＣは環系を表し、ＢおよびＣは縮合環であり、Ｌはリンカー部分であり、Ｘはヒドロキシル置換基、メルカプト置換基、もしくはアミノ置換基であり、Ｙは、１０個以下の炭素を含む炭素鎖である］
を有する、請求項１もしくは請求項４の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１５】
リガンドが構造：
【化２】
2008527045.tif 000147
［式中、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤは環系を表し、Ｌはリンカー部分であり、Ｘはヒドロキシル置換基、メルカプト置換基、もしくはアミノ置換基であり、ここで、
（ａ）ＢはＣに縮合し、ＣはＤに縮合するか、もしくは
（ｂ）ＣとＤは各々、Ｂに縮合する］
を有する、請求項１もしくは請求項４の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１６】
該リガンドが構造：
【化３】
2008527045.tif 000148
を有する化合物１であるか、あるいは構造：
【化４】
2008527045.tif 000149
を有する化合物２である、請求項１もしくは請求項４の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１７】
空間群Ｃ２を有する、請求項１もしくは請求項４の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１８】
格子定数ａ＝１０４．８０３Å、ｂ＝５４．１２４Å、ｃ＝９７．１０２Å、およびβ＝１１３．６６８゜を有する、請求項１７の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項１９】
格子定数ａ＝１０５．１２８Å、ｂ＝５２．９２７Å、ｃ＝９５．５３４Å、およびβ＝１１３．２４７゜を有する、請求項１７の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項２０】
エストロゲン受容体ポリペプチドがリガンド結合ドメインを含む、請求項１ないし１９のいずれか１項の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項２１】
リガンドがリガンド結合ドメインに結合される、請求項２０の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項２２】
エストロゲン受容体ポリペプチドが哺乳類由来である、請求項１ないし２１のいずれか１項の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項２３】
エストロゲン受容体ポリペプチドがヒト由来である、請求項２２の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項２４】
エストロゲン受容体ポリペプチドが非哺乳類由来である、請求項１ないし２１のいずれか１項の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項２５】
エストロゲン受容体ポリペプチドが配列番号１に定義されるようなアミノ酸３０１−５５４を含む、請求項１ないし２１のいずれか１項の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項２６】
複合体が少なくとも約３．５Åの分解能までＸ線を回折可能である、請求項１ないし２５のいずれか１項の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項２７】
エストロゲン受容体ポリペプチドがＥＲアルファポリペプチドである、請求項１ないし２６のいずれか１項の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項２８】
複合体が表９もしくは表１０の構造座標を含み、アルファ炭素原子の±２乗平均偏差が１．５Å以下である、請求項１６の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項２９】
リガンドが配列番号１のアミノ酸位置で定義されるＥＲアルファポリペプチドのＧｌｕ３５３と相互作用する、請求項２７の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項３０】
リガンドが配列番号１のアミノ酸位置で定義されるエストロゲン受容体ポリペプチドのＧｌｕ３５３およびＡｒｇ３９４と相互作用する、請求項２７の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項３１】
リガンドがエストロゲン受容体ポリペプチドに結合する、請求項１ないし３０のいずれか１項の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項３２】
リガンドが抗炎症作用を有する、請求項１ないし３１のいずれか１項の結晶化ポリペプチド−リガンド複合体。
【請求項３３】
エストロゲン受容体ポリペプチド；および
少なくとも２つの縮合環を包含する縮合環系を有するリガンドであって、少なくとも２つの縮合環のうちの少なくとも１つが少なくとも１つの窒素を含むリガンド
を含む結晶を包含する組成物。
【請求項３４】
エストロゲン受容体ポリペプチド；および
少なくとも２つの縮合環を包含する縮合環系を有するリガンドであって、少なくとも２つの縮合環のうちの少なくとも１つが少なくとも２つのヘテロ原子を含むリガンド
を含む結晶を包含する組成物。
【請求項３５】
エストロゲン受容体ポリペプチド；および
ＮＦκＢの転写活性を抑制し、マウスもしくはヒトの子宮組織の増殖を促進しないリガンド
を含む結晶を包含する組成物。
【請求項３６】
該リガンドがエストロゲン受容体ポリペプチドに結合する、請求項３３ないし３５のいずれか１項の組成物。
【請求項３７】
エストロゲン受容体ポリペプチドがエストロゲン受容体アルファポリペプチドである、請求項３６の組成物。
【請求項３８】
リガンドに結合するエストロゲン受容体ポリペプチドを含む複合体の３次元モデルを用いてエストロゲン受容体ポリペプチドと相互作用する薬剤を設計することを含む方法であって、
該リガンドが少なくとも２つの縮合環を含む縮合環系を有し、少なくとも２つの縮合環のうちの少なくとも１つが少なくとも１つの窒素を含む方法。
【請求項３９】
リガンドに結合するエストロゲン受容体ポリペプチドを含む複合体の３次元モデルを用いてエストロゲン受容体ポリペプチドと相互作用する薬剤を設計することを含む方法であって、
該リガンドが少なくとも２つの縮合環を含む縮合環系を有し、少なくとも２つの縮合環のうちの少なくとも１つが少なくとも２つのヘテロ原子を含む方法。
【請求項４０】
リガンドに結合するエストロゲン受容体ポリペプチドを含む複合体の３次元モデルを用いてエストロゲン受容体ポリペプチドと相互作用する薬剤を設計することを含む方法であって、
該リガンドがＮＦκＢ転写活性を抑制し、マウスもしくは子宮組織の増殖を促進しない方法。
【請求項４１】
エストロゲン受容体ポリペプチドがＥＲアルファポリペプチドである、請求項３８ないし４０のいずれか１項の方法。
【請求項４２】
３次元モデルがエストロゲン受容体ポリペプチドのリガンド結合ドメインを含む、請求項３８ないし４１のいずれか１項の方法。
【請求項４３】
３次元モデルがエストロゲン受容体ポリペプチド原子の構造座標を含む、請求項３８ないし４２の方法。
【請求項４４】
構造座標が実験的に決定された座標である、請求項４３の方法。
【請求項４５】
３次元モデルがリガンドの構造座標を含む、請求項３８ないし４４のいずれか１項の方法。
【請求項４６】
該モデルのリガンドを変更することをさらに含む、請求項４５の方法。
【請求項４７】
リガンドを変更することがリガンドの構造座標を変えることを含む、請求項４６の方法。
【請求項４８】
リガンドを変更することがリガンドの化学構造を変えることを含む、請求項４６の方法。
【請求項４９】
３次元モデルが配列番号１のアミノ酸位置で定義されるようなエストロゲン受容体ポリペプチドのアミノ酸Ｇｌｕ３５３、Ａｒｇ３９４、Ｐｈｅ４０４、Ｍｅｔ４２１、およびＨｉｓ５２４の原子から成る群から選択される原子の構造座標を含む、請求項３８ないし４８のいずれか１項の方法。
【請求項５０】
エストロゲン受容体ポリペプチドの原子と薬剤の原子の間の距離を算出することをさらに含む、請求項３８ないし４９のいずれか１項の方法。
【請求項５１】
リガンドとエストロゲン受容体ポリペプチド間の相互作用と、薬剤とエストロゲン受容体ポリペプチド間の予測相互作用を比較することをさらに含む、請求項３８ないし５１のいずれか１項の方法。
【請求項５２】
エストロゲン受容体ポリペプチドを包含する組成物を提供することをさらに含む、請求項３８ないし５１のいずれか１項の方法。
【請求項５３】
該組成物がエストロゲン受容体ポリペプチドと相互作用する薬剤を含む、請求項５２の方法。
【請求項５４】
エストロゲン受容体ポリペプチドと薬剤の相互作用を実験的に調べることをさらに含む、請求項５３の方法。
【請求項５５】
エストロゲン受容体ポリペプチドと薬剤の相互作用を、エストロゲン受容体ポリペプチドと第２の薬剤の相互作用と比較することをさらに含む、請求項５４の方法。
【請求項５６】
エストロゲン受容体ポリペプチドの３次元モデルを用いてエストロゲン受容体ポリペプチドと相互作用する薬剤を設計することを含む方法。
【請求項５７】
エストロゲン受容体ポリペプチドがエストロゲン受容体アルファポリペプチドである、請求項５６の方法。
【請求項５８】
該３次元モデルがエストロゲン受容体ポリペプチドに結合したリガンドを含む、請求項５６もしくは５７の方法であって、
該リガンドが少なくとも２つの縮合環を含む縮合環系を有し、少なくとも２つの縮合環のうちの少なくとも１つが少なくとも１つの窒素を包含する方法。
【請求項５９】
該リガンドがインダゾール誘導体である、請求項５８の方法。
【請求項６０】
該３次元モデルがリガンド原子の構造座標を含む、請求項５８もしくは５９の方法。
【請求項６１】
該３次元モデルがエストロゲン受容体ポリペプチドに結合されるリガンドを含む請求項５６もしくは５７の方法であって、
該リガンドが、少なくとも２つの縮合環を含む縮合環系を有し、少なくとも２つの縮合環のうちの１つが少なくとも２つのヘテロ原子を包含する方法。
【請求項６２】
３次元モデルがエストロゲン受容体ポリペプチドに結合されるリガンドを含む請求項５６ないし６１のいずれか１項の方法であって、
該リガンドがＮＦκＢの転写活性を抑制し、マウスもしくは子宮組織の増殖を促進しない方法。
【請求項６３】
該３次元モデルがエストロゲン受容体ポリペプチドのリガンド結合ドメインを含む、請求項５６ないし６２のいずれか１項の方法。
【請求項６４】
該薬剤がＮＦκＢの転写活性を抑制する、請求項５６ないし６３のいずれか１項の方法。
【請求項６５】
該３次元モデルがエストロゲン受容体ポリペプチド原子の構造座標を含む、請求項５６ないし６４のいずれか１項の方法。
【請求項６６】
該構造座標が実験的に調べられた座標である、請求項６５の方法。
【請求項６７】
該構造座標が表９もしくは表１０のものであり、アルファ炭素原子の±２乗平均偏差が１．５Å以下である、請求項６６の方法。
【請求項６８】
該３次元モデルが、配列番号１のアミノ酸位置で定義されるエストロゲン受容体ポリペプチドのアミノ酸Ｇｌｕ３５３、Ａｒｇ３９４、Ｐｈｅ４０４、Ｍｅｔ４２１、およびＨｉｓ５２４の原子から成る群から選択される原子の構造座標を含む、請求項５６ないし６６のいずれか１項の方法。
【請求項６９】
エストロゲン受容体ポリペプチドを含む結晶複合体の３次元構造の合理的な薬物デザインを行うことで薬剤を選択すること；
エストロゲン受容体ポリペプチドと薬剤を接触させること；次いで
エストロゲン受容体ポリペプチドに結合する薬剤の能力を検出すること
を含む方法。
【請求項７０】
エストロゲン受容体ポリペプチドがＥＲアルファポリペプチドである、請求項６９の方法。
【請求項７１】
該薬剤がコンピューターモデリングを介して選別される、請求項６９もしくは７０の方法。
【請求項７２】
該薬剤を合成することをさらに含む、請求項６９ないし７１のいずれか１項の方法。
【請求項７３】
ＮＦκＢの転写活性を抑制する薬剤の能力を検出することをさらに含む、請求項７２の方法。
【請求項７４】
Ｉｎ  ｖｉｖｏにおける炎症を抑制もしくは軽減する薬剤の能力を検出することをさらに含む、請求項７２の方法。
【請求項７５】
エストロゲン受容体ポリペプチドと薬剤を含む補助結晶複合体を得ること；
補助結晶複合体の３次元構造を調べること；
補助結晶複合体の３次元構造を有する合理的な薬物デザインを行うことによって第２の薬剤を選別すること；
エストロゲン受容体ポリペプチドと第２の薬剤を接触させること；次いで
エストロゲン受容体ポリペプチドに結合する第２の薬剤の能力を検出すること
をさらに含む、請求項７２ないし７４のいずれか１項の方法。
【請求項７６】
第２の薬剤がコンピューターモデリングを介して選択される、請求項７５の方法。
【請求項７７】
第２の薬剤を合成することをさらに含む、請求項７５もしくは７６の方法。
【請求項７８】
ＮＦκＢの転写活性を抑制する第２の薬剤の能力を検出することをさらに含む、請求項７７の方法。
【請求項７９】
Ｉｎ  ｖｉｖｏにおける炎症を抑制もしくは軽減する第２の薬剤の能力を検出することをさらに含む、請求項７７の方法。
【請求項８０】
リガンドとエストロゲン受容体ポリペプチドを接触させて組成物を形成し；次いで
組成物を結晶化させて、リガンドがエストロゲン受容体ポリペプチドに結合している結晶複合体を形成すること
を含む方法であって、
該リガンドが少なくとも２つの縮合環を含む縮合環系を有し、少なくとも２つの縮合環のうちの少なくとも１つが少なくとも１つの窒素を包含し、
該結晶複合体が少なくとも約３．５Åの分解能までＸ線を回折可能である、方法。
【請求項８１】
エストロゲン受容体ポリペプチドがＥＲアルファポリペプチドである、請求項８０の方法。
【請求項８２】
ハンギングドロップ蒸気拡散の使用を含む、請求項８０もしくは８１の方法。
【請求項８３】
該リガンドがＮＦκＢの転写活性を抑制可能である、請求項８０ないし８２のいずれか１項の方法。
【請求項８４】
該リガンドがｉｎ  ｖｉｖｏにおける炎症を抑制もしくは軽減可能である、請求項８０ないし８３のいずれか１項の方法。
【請求項８５】
リガンドが、構造：
【化５】
2008527045.tif 000150
を有する化合物１であるか、もしくは、構造：
【化６】
2008527045.tif 000151
を有する化合物２である、請求項８０ないし８４のいずれか１項の方法。
【請求項８６】
リガンドとエストロゲン受容体ポリペプチドを接触させて組成物を形成し；次いで
組成物を結晶化させて、リガンドがエストロゲン受容体ポリペプチドに結合している結晶複合体を形成すること
を含む方法であって、
該リガンドが、少なくとも２つの縮合環を含む縮合環系を有し、少なくとも２つの縮合環のうちの少なくとも１つが少なくとも２つのヘテロ原子を包含し、
該結晶複合体が少なくとも約３．５Åの分解能までＸ線を回折可能である方法。
【請求項８７】
エストロゲン受容体ポリペプチドがエストロゲン受容体アルファポリペプチドである、請求項８６の方法。
【請求項８８】
リガンドとエストロゲン受容体ポリペプチドを接触させて組成物を形成し；次いで
組成物を結晶化させて、リガンドがエストロゲン受容体ポリペプチドに結合している結晶複合体を形成すること
を含む方法であって、
該リガンドが、ＮＦκＢの転写活性を抑制し、マウスもしくは子宮組織の増殖を促進せず、
該結晶複合体が少なくとも約３．５Åの分解能までＸ線を回折可能である方法。
【請求項８９】
エストロゲン受容体ポリペプチドがエストロゲン受容体アルファポリペプチドである、請求項８８の方法。
【請求項９０】
コンピューターシステムに：
リガンドに結合するエストロゲン受容体ポリペプチドの構造に関する情報を受容させ；
候補薬剤に関する情報を受容させ；そして
エストロゲン受容体ポリペプチドに対する候補薬剤の結合特性を決定させる
指令を含む、ソフトウェアシステムであって、
該リガンドが、少なくとも２つの縮合環を含む縮合環系を有し、少なくとも２つの縮合環のうちの少なくとも１つが少なくとも１つの窒素を包含し、
該決定が、リガンドに結合するエストロゲン受容体ポリペプチドの構造に関連する情報、および候補薬剤に関連する情報に基づくものである、ソフトウェアシステム。
【請求項９１】
コンピューターシステムに：
リガンドに結合するエストロゲン受容体ポリペプチドの構造に関する情報を受容させ；
候補薬剤に関連する情報を受容させ；そして
エストロゲン受容体ポリペプチドに対する候補薬剤の結合特性を決定させる
指令を含む、ソフトウェアシステムであって、
該リガンドが、少なくとも２つの縮合環を含む縮合環系を有し、少なくとも２つの縮合環のうちの少なくとも１つが少なくとも２つのヘテロ原子を包含し、
該決定が、リガンドに結合するエストロゲン受容体ポリペプチドの構造に関連する情報、および候補薬剤に関連する情報に基づくものである、ソフトウェアシステム。
【請求項９２】
コンピューターシステムに：
リガンドに結合されるエストロゲン受容体ポリペプチドの構造に関連する情報を受容させ；
候補薬剤に関連する情報を受容させ；そして
エストロゲン受容体ポリペプチドに対する候補薬剤の結合特性を決定させる
指令を含む、ソフトウェアシステムであって、
該リガンドが、ＮＦκＢの転写活性を抑制し、マウスもしくは子宮組織の増殖を促進せず、
該決定が、リガンドに結合するエストロゲン受容体ポリペプチドの構造に関連する情報、および候補薬剤に関連する情報に基づくものである、ソフトウェアシステム。
【請求項９３】
１つ以上のプロセッサで実行される場合に、１つ以上のプロセッサに：
リガンドに結合するエストロゲン受容体ポリペプチドを含む複合体の構造に関連する情報を受容させ；
候補薬剤に関連する情報を受容させ；そして
エストロゲン受容体ポリペプチドに対する候補薬剤の結合特性を決定させる
記録された複数の指令を有するコンピューター可読媒体を搭載するコンピュータープログラムであって、
ここで、該リガンドが、少なくとも２つの縮合環を含む縮合環系を有し、少なくとも２つの縮合環のうちの少なくとも１つが少なくとも１つの窒素を包含し、
該決定が、リガンドに結合するエストロゲン受容体ポリペプチドの構造に関連する情報、および候補薬剤に関連する情報に基づくものである、コンピュータープログラム。
【請求項９４】
１つ以上のプロセッサで実行される場合に、１つ以上のプロセッサに：
リガンドに結合するエストロゲン受容体ポリペプチドを含む複合体の構造に関する情報を受容させ；
候補薬剤に関する情報を受容させ；そして
エストロゲン受容体ポリペプチドに対する候補薬剤の結合特性を決定させる
記録された複数の指令を有するコンピューター可読媒体を搭載するコンピュータープログラムであって、
ここで、該リガンドが、少なくとも２つの縮合環を含む縮合環系を有し、少なくとも２つの縮合環のうちの少なくとも１つが少なくとも２つのヘテロ原子を包含し、
該決定が、リガンドに結合するエストロゲン受容体ポリペプチドの構造に関連する情報、および候補薬剤に関連する情報に基づくものである、コンピュータープログラム。
【請求項９５】
１つ以上のプロセッサで実行される場合に、１つ以上のプロセッサに：
リガンドに結合するエストロゲン受容体ポリペプチドを含む複合体の構造に関する情報を受容させ；
候補薬剤に関する情報を受容させ；そして
エストロゲン受容体ポリペプチドに対する候補薬剤の結合特性を決定させる
記録された複数の指令を有するコンピューター可読媒体を搭載するコンピュータープログラムであって、
ここで、該リガンドがＮＦκＢの転写活性を抑制し、マウスもしくは子宮組織の増殖を促進せず、
該決定が、リガンドに結合するエストロゲン受容体ポリペプチドの構造に関連する情報、および候補薬剤に関連する情報に基づくものである、コンピュータープログラム。
【請求項９６】
リガンドに結合するエストロゲン受容体ポリペプチドを含む複合体の構造に関連する情報を受容し；次いで
候補薬剤とＥＲアルファポリペプチドの結合特性をモデリングすること
を含む方法であって、
該リガンドが、少なくとも２つの縮合環を含む縮合環系を有し、少なくとも２つの縮合環のうちの少なくとも１つが少なくとも１つの窒素を包含し、
該方法がソフトウェアシステムで実行される方法。
【請求項９７】
リガンドに結合するエストロゲン受容体ポリペプチドを含む複合体の構造に関連する情報を受容し；次いで
候補薬剤とＥＲアルファポリペプチドの結合特性をモデリングすること
を含む方法であって、
該リガンドが、少なくとも２つの縮合環を含む縮合環系を有し、少なくとも２つの縮合環のうちの少なくとも１つが少なくとも２つのヘテロ原子を包含し、
該方法がソフトウェアシステムで実行される方法。
【請求項９８】
リガンドに結合するエストロゲン受容体ポリペプチドを含む複合体の構造に関連する情報を受容し；次いで
候補薬剤とＥＲアルファポリペプチドの結合特性をモデリングすること
を含む方法であって、
該リガンドがＮＦκＢの転写活性を抑制し、マウスもしくは子宮組織の増殖を促進せず、
該方法がソフトウェアシステムで実行される方法。
【請求項９９】
１つ以上のプロセッサで実行される場合に、１つ以上のプロセッサに：
リガンドに結合するエストロゲン受容体ポリペプチドを含む複合体の構造に関連する情報を受容させ；そして
候補薬剤とエストロゲン受容体ポリペプチドの結合特性をモデルさせる
記録された複数の指令を有するコンピューター可読媒体を搭載するコンピュータープログラムであって、
該リガンドが少なくとも２つの縮合環を含む縮合環系を有し、少なくとも２つの縮合環のうちの少なくとも１つが少なくとも１つの窒素を包含するものである、コンピュータープログラム。
【請求項１００】
１つ以上のプロセッサで実行される場合に、１つ以上のプロセッサに：
リガンドに結合するエストロゲン受容体ポリペプチドを含む複合体の構造に関連する情報を受容させ；そして
候補薬剤とエストロゲン受容体ポリペプチドの結合特性をモデルさせる
記録された複数の指令を有するコンピューター可読媒体を搭載するコンピュータープログラムであって、
該リガンドが、少なくとも２つの縮合環を含む縮合環系を有し、少なくとも２つの縮合環のうちの少なくとも１つが少なくとも２つのヘテロ原子を包含するものである、コンピュータープログラム。
【請求項１０１】
１つ以上のプロセッサで実行される場合、１つ以上のプロセッサに：
リガンドに結合するエストロゲン受容体ポリペプチドを含む複合体の構造に関連する情報を受容させ；そして
候補薬剤とエストロゲン受容体ポリペプチドの結合特性をモデルさせる
記録された複数の指令を有するコンピューター可読媒体を搭載するコンピュータープログラムであって、
該リガンドが、ＮＦκＢの転写活性を抑制し、マウスもしくは子宮組織の増殖を促進しないものである、コンピュータープログラム。
【請求項１０２】
コンピューターシステムに：
リガンドに結合するエストロゲン受容体ポリペプチドを含む複合体の構造に関連する情報を受容させ；そして
候補薬剤とエストロゲン受容体ポリペプチドの結合特性をモデルさせる
指令を含むソフトウェアシステムであって、
該リガンドが、少なくとも２つの縮合環を含む縮合環系を有し、少なくとも２つの縮合環のうちの少なくとも１つが少なくとも１つの窒素を包含するものである、ソフトウェアシステム。
【請求項１０３】
コンピューターシステムに：
リガンドに結合するエストロゲン受容体ポリペプチドを含む複合体の構造に関連する情報を受容させ；そして
候補薬剤とエストロゲン受容体ポリペプチドの結合特性をモデルさせる
指令を含むソフトウェアシステムであって、
該リガンドが、少なくとも２つの縮合環を含む縮合環系を有し、少なくとも２つの縮合環のうちの少なくとも１つが少なくとも２つのヘテロ原子を包含するものである、ソフトウェアシステム。
【請求項１０４】
コンピューターシステムに：
リガンドに結合するエストロゲン受容体ポリペプチドを含む複合体の構造に関連する情報を受容させ；そして
候補薬剤とのエストロゲン受容体ポリペプチドの結合特性をモデルさせる
指令を含むソフトウェアシステムであって、
該リガンドが、ＮＦκＢの転写活性を抑制し、マウスもしくは子宮組織の増殖を促進しないものである、ソフトウェアシステム。
【請求項１０５】
合理的な薬物デザインを用いてＥＲアルファ活性を調節可能な薬剤を選別し；次いで
患者に薬剤の治療上有効な量を投与すること
を含む、患者のＥＲアルファ活性を調節する方法。
【請求項１０６】
該薬剤がＮＦκＢ活性を抑制可能である、請求項１０５の方法。
【請求項１０７】
該薬剤がｉｎ  ｖｉｖｏにおける炎症を抑制もしくは軽減可能である、請求項１０５の方法。
【請求項１０８】
該合理的な薬物デザインが、ＥＲアルファポリペプチドを包含する結晶複合体の３次元構造を使用することを含む、請求項１０５の方法。
【請求項１０９】
結晶複合体がリガンドをさらに含む請求項１０８の方法であって、
該リガンドが、少なくとも２つの縮合環を含む縮合環系を有し、少なくとも２つの縮合環のうちの少なくとも１つが少なくとも１つの窒素を包含する方法。
【請求項１１０】
結晶複合体がリガンドをさらに含む請求項１０８の方法であって、
該リガンドが、少なくとも２つの縮合環を含む縮合環系を有し、少なくとも２つの縮合環のうちの少なくとも１つが少なくとも２つのヘテロ原子を包含する方法。
【請求項１１１】
結晶複合体がリガンドをさらに含む、請求項１０８の方法であって、
該リガンドがＮＦκＢの転写活性を抑制し、マウスもしくは子宮組織の増殖を促進しない方法。
【請求項１１２】
合理的な薬物デザインを用いてＥＲアルファ活性を有効にし得る薬剤を選別すること；次いで
それを必要とする患者に該薬剤の治療上有効な量を投与すること
を含む、ＥＲアルファ活性に関連する状態にかかっている患者を処置する方法。
【請求項１１３】
患者がＥＲアルファ活性に関連する状態になりやすいことを調べること；
ＥＲアルファ活性をもたらすことが可能である薬剤を選別する合理的な薬物デザインを使用すること；次いで
患者に該薬剤の治療上有効な量を投与すること
を含む、ＥＲアルファ活性に関連する状態にかかりやすい患者を予防的に処置する方法。
【請求項１１４】
該薬剤がＮＦκＢの転写活性を抑制可能である、請求項１１２もしくは１１３の方法。
【請求項１１５】
該状態が炎症疾患である、請求項１１２もしくは１１３の方法。
【請求項１１６】
該炎症疾患が関節疾患である、請求項１１５の方法。
【請求項１１７】
該関節疾患が関節リウマチである、請求項１１６の方法。
【請求項１１８】
ＥＲアルファ活性に関連する状態を処置もしくは予防する医薬品の製造において、ＥＲアルファ活性に効果をもたらし得る合理的な薬物デザインによって選別される薬剤の使用。
【請求項１１９】
該薬剤がＮＦκＢの転写活性を抑制可能である、請求項１１８の使用。
【請求項１２０】
該状態が炎症疾患である、請求項１１８の使用。
【請求項１２１】
該炎症疾患が関節疾患である、請求項１２０の使用。
【請求項１２２】
該関節疾患が関節リウマチである、請求項１２１の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エストロゲン受容体リガンド、エストロゲン受容体ポリペプチド／リガンド複合体、エストロゲン受容体ポリペプチド／リガンド複合体の結晶、および関連方法とソフトウェアシステムに関する。
【０００２】
（関連出願）
本出願は、出典明示により本明細書に一体化させた２００５年１月１９日提出の米国仮出願第６０／６４４，８９７号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００３】
１７β−エストラジオール（Ｅ２）は、様々な生物学的な過程を調節するステロイドホルモンである。Ｅ２の生理的な効果の多くは、エストロゲン受容体アルファとエストロゲン受容体ベータなどのエストロゲン受容体（ＥＲｓ）によって媒介される。エストロゲン受容体とＥ２の相互作用は、受容体の活性化を引き起こし、細胞質から核への移行を生じ、転写アクチベーターとして機能し得る。
【０００４】
Ｅ２は、エストロゲン受容体アルファ（ＥＲアルファ）との相互作用を介して、生殖組織を含む異なる組織の分化と維持を調節する。Ｅ２はまた、ＩＬ−１β誘発のＮＦ−κＢレポーター活性およびエストロゲン受容体依存性のＩＬ−６発現を抑制できる。この作用は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＥ２の抗炎症作用と相互に関連する。
【発明の開示】
【０００５】
（要約）
一の態様では、本発明は、エストロゲン受容体ポリペプチドおよび縮合環系を有するリガンドを包含する結晶化ポリペプチド−リガンド複合体を特徴とする。該縮合環系は、少なくとも２つの縮合環を含み、そのうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの窒素を包含する。
【０００６】
別の態様では、本発明は、エストロゲン受容体ポリペプチドおよびリガンドを含む結晶化ポリペプチド−リガンド複合体を特徴とし、該リガンドは、少なくとも２つの縮合環を有し、縮合環の少なくとも１つは、少なくとも２つのヘテロ原子を含む縮合環系を有する。
【０００７】
さらなる態様では、本発明は、エストロゲン受容体ポリペプチドとリガンドを含む結晶化ポリペプチド−リガンド複合体を特徴とする。該リガンドは、ＮＦκＢ転写活性を抑制し、マウスもしくはヒトの子宮組織の増殖を促進しない。
【０００８】
別の態様では、本発明は、結晶を含む組成物を特徴とする。該結晶は、エストロゲン受容体ポリペプチド、およびリガンドを含み、該リガンドは、少なくとも２つの縮合環を含み、そのうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの窒素を含む縮合環系を有する。
【０００９】
別の態様では、本発明は、エストロゲン受容体ポリペプチドおよび縮合環系を有するリガンドを含む結晶を含む組成物を特徴とする。該縮合環系は、少なくとも２つの縮合環を包含し、そのうちの少なくとも１つは少なくとも２つのヘテロ原子を含む。
【００１０】
別の態様では、本発明は、エストロゲン受容体ポリペプチドおよびリガンドを含む結晶を含む組成物を特徴とする。該リガンドは、ＮＦκＢ転写活性を抑制し、マウスもしくはヒトの子宮組織の増殖を促進しない。
【００１１】
別の態様では、本発明は、複合体の３次元モデルを用いてエストロゲン受容体ポリペプチドと相互作用する薬剤を設計することを含む方法を特徴とする。該複合体は、リガンドに結合したエストロゲン受容体ポリペプチドを含み、エストロゲン受容体ポリペプチドに結合した該リガンドは、少なくとも２つの縮合環を含む縮合環系を有する。少なくとも２つの縮合環のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの窒素を含む。
【００１２】
別の態様では、本発明は、複合体の３次元モデルを用いてエストロゲン受容体ポリペプチドと相互作用する薬剤を設計することを含む方法を特徴とする。該複合体は、リガンドに結合したエストロゲン受容体ポリペプチドを含み、エストロゲン受容体ポリペプチドに結合した該リガンドは、少なくとも２つの縮合環を含む縮合環系を有する。少なくとも２つの縮合環のうちの少なくとも１つは、少なくとも２つのヘテロ原子を含む。
【００１３】
別の態様では、本発明は、複合体の３次元モデルを用いてエストロゲン受容体ポリペプチドと相互作用する薬剤を設計することを含む方法を特徴とする。該複合体は、リガンドに結合したエストロゲン受容体ポリペプチドを含み、エストロゲン受容体ポリペプチドに結合した該リガンドは、ＮＦκＢ転写活性を抑制し、マウスもしくは子宮組織の増殖を促進しない。
【００１４】
別の態様では、本発明は、エストロゲン受容体ポリペプチドの３次元モデルを用いて、エストロゲン受容体ポリペプチドと相互作用する薬剤を設計することを含む方法を特徴とする。
【００１５】
別の態様では、本発明は、エストロゲン受容体ポリペプチドを含む結晶複合体の３次構造を用いて、合理的な薬物デザインを行うことにより薬剤を選択することを含む方法を特徴とする。該方法は、エストロゲン受容体ポリペプチドと薬剤を接触させ、エストロゲン受容体ポリペプチドに結合する薬剤の能力を検出することを含む。
【００１６】
別の態様では、本発明は、組成物を形成するリガンドとエストロゲン受容体ポリペプチドを接触させ、該リガンドがエストロゲン受容体ポリペプチドに結合した結晶複合体を形成する組成物を結晶化することを含む方法を特徴とする。該リガンドは、少なくとも２つの縮合環を含み、そのうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの窒素を含む縮合環系を有する。該結晶複合体は少なくとも約３．５Åの分解能までＸ線を回折する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、リガンドとエストロゲン受容体ポリペプチドを接触させて組成物を形成し、次いで、組成物を結晶化させて、リガンドがエストロゲン受容体ポリペプチドに結合している結晶複合体を形成することを含む方法を特徴とする。該リガンドは、少なくとも２つの縮合環を含み、そのうちの少なくとも１つは、少なくとも２つのヘテロ原子を含む縮合環系を有する。該結晶複合体は少なくとも約３．５Åの分解能までＸ線を回折する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、リガンドとエストロゲン受容体ポリペプチドを接触させて組成物を形成し、次いで、組成物を結晶化させて、リガンドがエストロゲン受容体ポリペプチドに結合している結晶複合体を形成することを含む方法を特徴とする。該リガンドは、ＮＦκＢ転写活性を抑制し、マウスもしくはヒトの子宮組織の増殖を促進しない。該結晶複合体は少なくとも約３．５Åの分解能までＸ線を回折する。
【００１９】
さらに別の態様では、本発明は、コンピューターシステムに、リガンドに結合したエストロゲン受容体ポリペプチドの構造に関連する情報および候補薬剤に関連する情報を受容させる指令を含むソフトウェアシステムを特徴とする。この情報から、該コンピューターシステムは、エストロゲン受容体ポリペプチドへの候補薬剤の結合特性を調べることができる。エストロゲン受容体ポリペプチドに結合したリガンドは、少なくとも２つの縮合環を含み、そのうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの窒素を含む縮合環系を有する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、コンピューターシステムに、リガンドに結合したエストロゲン受容体ポリペプチドの構造に関連する情報および候補薬剤に関連する情報を受容させる指令を含むソフトウェアシステムを特徴とする。この情報から、該コンピューターシステムは、エストロゲン受容体ポリペプチドへの候補薬剤の結合特性を調べることができる。エストロゲン受容体ポリペプチドに結合したリガンドは、少なくとも２つの縮合環を含み、そのうちの少なくとも１つは、少なくとも２つのヘテロ原子を含む縮合環系を有する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、コンピューターシステムに、リガンドに結合したエストロゲン受容体ポリペプチドの構造に関連する情報および候補薬剤に関連する情報を受容させる指令を含むソフトウェアシステムを特徴とする。この情報から、該コンピューターシステムは、エストロゲン受容体ポリペプチドへの候補薬剤の結合特性を調べることができる。エストロゲン受容体ポリペプチドに結合したリガンドは、ＮＦκＢ転写活性を抑制し、マウスもしくは子宮組織の増殖を促進しない。
【００２２】
別の態様では、本発明は、複数の指令が記録されるコンピューター可読媒体を搭載するコンピュータープログラムを特徴とする。該指令が１つ以上のプロセッサにより実行される場合、１つ以上のプロセッサは、リガンドに結合したエストロゲン受容体ポリペプチドを含む複合体の構造に関する情報および候補薬剤に関する情報を受容する。この情報から、１つ以上のプロセッサは、エストロゲン受容体ポリペプチドへの候補薬剤の結合特性を調べる。エストロゲン受容体ポリペプチドに結合したリガンドは、少なくとも２つの縮合環を含み、そのうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの窒素を含む縮合環系を有する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、複数の指令が記録されるコンピューター可読媒体を搭載するコンピュータープログラムを特徴とする。該指令が１つ以上のプロセッサにより実行される場合、１つ以上のプロセッサは、リガンドに結合したエストロゲン受容体ポリペプチドを含む複合体の構造に関する情報および候補薬剤に関する情報を受容する。この情報から、１つ以上のプロセッサは、エストロゲン受容体ポリペプチドへの候補薬剤の結合特性を調べる。エストロゲン受容体ポリペプチドに結合したリガンドは、少なくとも２つの縮合環を含み、そのうちの少なくとも１つは、少なくとも２つのヘテロ原子を含む縮合環系を有する。
【００２４】
別の態様では、本発明は、複数の指令が記録されるコンピューター可読媒体を搭載するコンピュータープログラムを特徴とする。該指令が１つ以上のプロセッサにより実行される場合、１つ以上のプロセッサは、リガンドに結合したエストロゲン受容体ポリペプチドを含む複合体の構造に関する情報および候補薬剤に関する情報を受容する。この情報から、１つ以上のプロセッサは、エストロゲン受容体ポリペプチドへの候補薬剤の結合特性を調べる。エストロゲン受容体ポリペプチドに結合したリガンドは、ＮＦκＢ転写活性を抑制し、マウスもしくは子宮組織の増殖を促進しない。
【００２５】
一の態様では、本発明は、リガンドに結合したエストロゲン受容体ポリペプチドを含む複合体の構造に関する情報を受容し、候補薬剤とＥＲアルファポリペプチドの結合特性をモデルすることを含む方法を特徴とする。エストロゲン受容体ポリペプチドに結合した該リガンドは、少なくとも２つの縮合環を含み、そのうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの窒素を含む縮合環系を有する。該方法はソフトウェアシステムによって実行される。
【００２６】
一の態様では、本発明は、リガンドに結合したエストロゲン受容体ポリペプチドを含む複合体の構造に関する情報を受容し、候補薬剤とＥＲアルファポリペプチドの結合特性をモデルすることを含む方法を特徴とする。エストロゲン受容体ポリペプチドに結合した該リガンドは、少なくとも２つの縮合環を含み、そのうちの少なくとも１つは、少なくとも２つのヘテロ原子を含む縮合環系を有する。さらに、該方法はソフトウェアシステムによって実行される。
【００２７】
一の態様では、本発明は、リガンドに結合したエストロゲン受容体ポリペプチドを含む複合体の構造に関する情報を受容し、候補薬剤とＥＲアルファポリペプチドの結合特性をモデルすることを含む方法を特徴とする。エストロゲン受容体ポリペプチドに結合した該リガンドは、ＮＦκＢ転写活性を抑制し、マウスもしくは子宮組織の増殖を促進しない。該方法はソフトウェアシステムによって実行される。
【００２８】
別の態様では、本発明は、複数の指令が記録されるコンピューター可読媒体を搭載するコンピュータープログラムを特徴とする。該指令が１つ以上のプロセッサにより実行される場合、１つ以上のプロセッサは、リガンドに結合したエストロゲン受容体ポリペプチドを含む複合体の構造に関する情報を受容し、候補薬剤とエストロゲン受容体ポリペプチドの結合特性をモデルする。エストロゲン受容体ポリペプチドに結合したリガンドは、少なくとも２つの縮合環を含み、そのうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの窒素を含む縮合環系を有する。
【００２９】
別の態様では、本発明は、複数の指令が記録されるコンピューター可読媒体を搭載するコンピュータープログラムを特徴とする。該指令が１つ以上のプロセッサにより実行される場合、１つ以上のプロセッサは、リガンドに結合したエストロゲン受容体ポリペプチドを含む複合体の構造に関する情報を受容し、候補薬剤とエストロゲン受容体ポリペプチドの結合特性をモデルする。エストロゲン受容体ポリペプチドに結合したリガンドは、少なくとも２つの縮合環を含み、そのうちの少なくとも１つは、少なくとも２つのヘテロ原子を含む縮合環系を有する。
【００３０】
別の態様では、本発明は、複数の指令が記録されるコンピューター可読媒体を搭載するコンピュータープログラムを特徴とする。該指令が１つ以上のプロセッサにより実行される場合、１つ以上のプロセッサは、リガンドに結合したエストロゲン受容体ポリペプチドを含む複合体の構造に関する情報を受容し、候補薬剤とエストロゲン受容体ポリペプチドの結合特性をモデルする。該リガンドはＮＦκＢ転写活性を抑制し、マウスもしくは子宮組織の増殖を促進しない。
【００３１】
別の態様では、本発明は、コンピューターシステムに、リガンドに結合したエストロゲン受容体ポリペプチドを含む複合体の構造に関連する情報を受容させ、候補薬剤とエストロゲン受容体ポリペプチドの結合特性をモデルさせる指令を含むソフトウェアシステムを特徴とする。エストロゲン受容体ポリペプチドに結合した該リガンドは、少なくとも２つの縮合環を含み、そのうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの窒素を含む縮合環系を有する。
【００３２】
別の態様では、本発明は、コンピューターシステムに、リガンドに結合したエストロゲン受容体ポリペプチドを含む複合体の構造に関連する情報を受容させ、候補薬剤とエストロゲン受容体ポリペプチドの結合特性をモデルさせる指令を含むソフトウェアシステムを特徴とする。エストロゲン受容体ポリペプチドに結合した該リガンドは、少なくとも２つの縮合環を含み、そのうちの少なくとも１つは、少なくとも２つのヘテロ原子を含む縮合環系を有する。
【００３３】
別の態様では、本発明は、コンピューターシステムに、リガンドに結合したエストロゲン受容体ポリペプチドを含む複合体の構造に関連する情報を受容し、候補薬剤とエストロゲン受容体ポリペプチドの結合特性をモデルすることを引き起こす指令を含むソフトウェアシステムを特徴とする。該リガンドは、ＮＦκＢ転写活性を抑制し、マウスもしくは子宮組織の増殖を促進しない。
【００３４】
別の態様では、本発明は、患者のＥＲアルファ活性を調節する方法を特徴とする。該方法は、合理的な薬物デザインを用いてＥＲアルファ活性を調節可能な薬剤を選択するし、患者に該薬剤の治療上有効な量を投与することを含む。
【００３５】
別の態様では、本発明は、ＥＲアルファ活性に関連する状態にかかっている患者を治療する方法を特徴とする。該方法は、合理的な薬物デザインを用いてＥＲアルファ活性を調節可能な薬剤を選択し、患者に該薬剤の治療上有効な量を投与することを含む。
【００３６】
別の態様では、本発明は、ＥＲアルファ活性に関連する状態になりやすい患者を予防的に治療する方法を特徴とする。該方法は、患者がＥＲアルファ活性に関連する状態になりやすいことを調べ、合理的な薬物デザインを用いてＥＲアルファ活性に効果をもたらし得る薬剤を選択し、患者に該薬剤の治療上有効な量を投与することを含む。
【００３７】
本発明の１つ以上の具体例の詳細が、以下に添付した図面と明細書に記載される。本発明の他の特徴、目的および効果は、明細書と図面、および特許請求の範囲から明らかであろう。
【００３８】
（図面の簡単な説明）
図１は、化合物１、化合物２もしくは１７β−エストラジオールの代表的なリガンドと複合体を形成したＥＲアルファ二量体の構造を表すリボン図である。構造へリックスは、「Ｈ２」、「Ｈ３」、等で特定される。構造シートはＳ１およびＳ２で示される。
【００３９】
図２は、ＥＲアルファに結合される１７β−エストラジオールと化合物１の構造を比較する棒状モデル（ｓｔｉｃｋ  ｍｏｄｅｌ）である。
【００４０】
図３は、ＥＲアルファに結合される１７β−エストラジオールと化合物２の構造を比較する棒状モデルである。
【００４１】
図４は、ＥＲアルファに結合されるラロキシフェンと化合物１の構造を比較する棒状モデルである。丸括弧は、化合物１とラロキシフェンがＥＲアルファに結合される時のへリックス１２（Ｈ１２）の位置を示す。
【００４２】
図５は、ビヒクル、１７α−エチニルエストラジオール（ＥＥ）、もしくは化合物２に対する子宮の重量（ｍｇ）の比較を表すグラフである。
【００４３】
図６は、ヒトＥＲアルファ受容体（配列番号１）のアミノ酸配列である。結晶化に用いられる配列（ＥＲアルファリガンド結合ドメイン）は下線で示される。
【００４４】
様々な図面における類似参照記号は類似要素を示す。
【００４５】
（詳細な説明）
非ステロイドホルモンの化合物１（ＩＵＰＡＣ名：４−［１−アリル−７−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−インダゾール−３−イル］ベンゼン−１，３−ジオール）および化合物２（ＩＵＰＡＣ名：４−［（８−フルオロ−６−メチルフェナントリジン−５（６Ｈ）−イル）スルホニル］フェノール）の各々に結合したヒトエストロゲン受容体アルファのリガンド結合ドメイン（ＥＲアルファ−ＬＢＤ）の構造がＸ線結晶解析によって決定され、本明細書に記載される。図１は、化合物１、化合物２、もしくは天然受容体リガンド、１７β−エストラジオール（Ｅ２）の代表的なリガンドと複合体を形成されるＥＲアルファ二量体の構造を表すリボン図である。図２および図３は、ＥＲアルファ−ＬＢＤへの化合物１と化合物２各々の結合およびＥ２の結合の間の比較を表す棒状図である。リボン図と棒状図は、ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤに結合される化合物１もしくは化合物２の三次構造が、ＥＲアルファ−ＬＢＤに結合したＥ２の三次構造に類似することを示す。それゆえ、ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ／化合物１複合体およびヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ／化合物２複合体の結晶構造（下記の表９と表１０各々を参照）は、例えば、ＥＲアルファ−ＬＢＤとも相互作用できる非ステロイドリガンドなどの他のリガンドを設計もしくは特定するのに有用であり得ると考えられる。
【００４６】
化合物１の化学構造は、
【化１】
2008527045.tif 000003
により与えられる。
【００４７】
化合物２の化学構造は、
【化２】
2008527045.tif 000004
により与えられる。
【００４８】
Ｅ２と同様に、化合物１および化合物２はＥＲアルファに結合し、核因子−カッパＢ（ＮＦκＢ）−誘発炎症現象を抑制可能である。しかし、Ｅ２と異なり、ＥＲアルファへの化合物１もしくは化合物２の結合は女性化効果を促進しない。例えば、化合物１もしくは化合物２の投与は、子宮もしくは乳房組織の増殖を促進しない。
【００４９】
一般的に、化合物１もしくは化合物２に結合したヒトＥＲアルファ−ＬＢＤの複合体は、所望するように調製され得る。いくつかの具体例では、かかる複合体は以下のように調製され得る。ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤはＤＮＡプラスミドから発現される。該発現は誘導性プロモーターのごときプロモーターにより促進され得る。ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ｍｙｃ、ＨＡ、ヘクサヒスチジン、もしくはＦＬＡＧタグのごとき適するタグの付いた融合タンパク質として発現され得る。該タグは細胞からのヒトＥＲアルファ−ＬＢＤの単離を促進し得る。融合タンパク質は、ポリペプチドとタグの間の部位もしくはその近傍のごとき該融合タンパク質の改変プロテアーゼ部位において切断され得る。切断と精製後、該ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤは化合物１もしくは化合物２と接触され得る。例えば、該ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤが精製前（例、ポリペプチドタグの切断前）に化合物１もしくは化合物２と混合され得るか、又は該ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤが精製後に２つの化合物のどちらかと混合され得る。いくつかの具体例では、化合物１もしくは化合物２は、精製前および再度精製後に該ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤと混合され得る。特定の具体例では、ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤの構造は、リガンドの非存在下で評価され得る。
【００５０】
ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤおよび化合物１もしくは化合物２の化合物は、ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ／化合物１複合体もしくはヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ／化合物２複合体のスペクトルデータを収集するため、これら２つの複合体のどちらかのＮＭＲデータを収集するため、またはこれら２つの複合体のどちらかの結晶を育成するため、に溶液中で一緒にされ得る。例えば、ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ／化合物１複合体もしくはヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ／化合物２複合体は、塩（例、ナトリウム塩）、ポリマー（例、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、および／もしくは有機溶媒の存在下で結晶化され得る。結晶は、例えば、シッティングもしくはハンギングドロップ蒸気拡散法のごとき様々な方法により育成され得る。一般に、結晶化は、約４℃から約６０℃まで（例、約４℃、約１５℃、約１８℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３２℃、約３５℃、約３７℃のごとき約４℃から約４５℃まで）の温度で実施され得る。
【００５１】
一般に、化合物１もしくは化合物２に結合したヒトＥＲアルファ−ＬＢＤの結晶は、約３．５Å以下（例、約３．２Å以下、約３．０Å以下、約２．５Å以下、約２．４Å以下、約２．３Å以下、約２．２Å以下、約２．１Å以下、約２．０Å以下、約１．９Å以下、約１．８Å以下、約１．７Å以下、約１．６Å以下、約１．５Å以下、約１．４Å以下）の分解能までＸ線を回帰できる。いくつかの具体例では、化合物１もしくは化合物２に結合したヒトＥＲアルファ−ＬＢＤの結晶は、約１．７Åから約２．５Åまで（例、化合物１に結合したＥＲアルファ−ＬＢＤの結晶は約２．４ÅまでＸ線を回帰できる）の分解能でＸ線を回帰できる。
【００５２】
一の具体例では、化合物１に結合したヒトＥＲアルファ−ＬＢＤの結晶は、格子定数ａ＝１０４．８０Å、ｂ＝５４．１２Å、ｃ＝９７．１０Å、α＝γ＝９０°、β＝１１３．６７°を有する空間群Ｃ２に属する。別の具体例では、化合物２に結合したヒトＥＲアルファ−ＬＢＤの結晶は、格子定数ａ＝１０４．８０Å、ｂ＝５４．１２Å、ｃ＝９７．１０Å、α＝γ＝９０°、β＝１１３．６７°を有する空間群Ｃ２に属する。該空間群は結晶の対称全てを意味し、点対称および空間対称を含む。特定の具体例では、化合物１もしくは化合物２に結合したヒトＥＲアルファ−ＬＢＤの結晶は、非対称単位のヒトＥＲアルファ−ＬＢＤの２つの分子を含み得る。非対称単位は、結晶構造が空間群の対称操作を利用することによって生じ得る最小単位である。結晶は、一般に非対称単位上の空間群対称操作により決められるモチーフ、および結晶格子を介在するモチーフの翻訳物から構成される。
【００５３】
結晶を描写する構造データは、例えば、Ｘ線回折によって得られことができる。Ｘ線回折データは、様々な源、Ｘ線波長および検出器によって採集され得る。いくつかの具体例では、回転陽極およびシンクロトロン放射源（カリフォルニア州、バークレイのＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＬＳ）、もしくはイリノイ州、アルゴンのＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＰＳ））がＸ線源として使用され得る。特定の具体例では、回折データを作成するＸ線は、約０．５Åから約１．６Åまで（例、約０．７Å、約０．９Å、約１．０Å、約１．１Å、約１．３Å、約１．４Å、約１．５Å、約１．６Å）の波長であり得る。いくつかの具体例では、面積検出器および／もしくは荷電結合デバイス（ＣＣＤｓ）が検出器として使用され得る。
【００５４】
化合物１もしくは化合物２に結合したヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ複合体の結晶のＸ線回折データは、該複合体中の原子の構造座標を得ることに使用され得る。該構造座標は、複合体中の他原子との関連における３次元空間の原子の局在を表すデカルト座標である。例えば、表９と表１０に記載される構造座標は、各々、化合物１もしくは化合物２に結合したヒトＥＲアルファ−ＬＢＤの結晶複合体の構造座標である。これらの構造座標は、相互に関連するヒトＥＲアルファ−ＬＢＤの原子局在、化合物１もしくは化合物２の原子に関連するヒトＥＲアルファ−ＬＢＤの原子局在、ならびに相互に関連する化合物１もしくは化合物２の原子局在を表す。該複合体の構造座標は、反転あるいは整数加算もしくは引算のごとき数学的操作により修正され得る。このように、構造座標は相対的座標である。例えば、化合物１もしくは化合物２に結合したＥＲアルファ−ＬＢＤの原子局在を表す構造座標は、表９および１０各々の実際のｘ、ｙ、およびｚ座標により特に限定されない。
【００５５】
化合物１もしくは化合物２に結合したヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ複合体の構造座標は、該複合体、該複合体の断片、ＥＲアルファ−ＬＢＤもしくはＥＲアルファ−ＬＢＤの断片の描写（２次元描写もしくは３次元描写）から導き出されて使用され得る。かかる描写は、例えば、ポリペプチド活性部位の視覚化、識別化および特性化を含む多くの応用に有用であり得る。特定の具体例では、３次元描写は、表９もしくは表１０によるヒトＥＲアルファ−炭素原子の構造座標を含み得るもので、アミノ酸のアルファ炭素原子からの２乗平均（ｒｍｓ）偏差は約１．５Å以下（例えば、約１．０Å以下、約０．５Å以下）である。ＲＭＳ偏差は、平均値からの偏差の２乗の算術平均の平方根であり、構造座標からの偏差または変化を表現するやり方である。アミノ酸の保存置換（下記の議論を参照）は、記述された標準偏差内の構造座標を有する分子描写の結果となり得る。例えば、保存アミノ酸置換によりお互いに異なるポリペプチドの２つの分子モデルは、約１．５Å以下（例、約１．０Å以下、約０．５Å以下）のごとき記述された標準偏差内の骨格原子座標を有し得る。ポリペプチドの骨格原子は、アルファ炭素（ＣαもしくはＣＡ）原子、カルボニル炭素（Ｃ）原子、およびアミド窒素（Ｎ）原子を含む。
【００５６】
様々なソフトウェアプログラムは、化合物１もしくは化合物２に結合したヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ複合体、あるいはこれら複合体のうちの１つの断片、の描写を得るための一連の構造座標のグラフィック描写を可能にする。一般に、かかる描写は、（相対的および／もしくは絶対的な）構造座標、もしくは特徴間の距離もしくは角度のような構造座標由来の情報を正確に反映すべきである。いくつかの具体例では、該描写は立体２次元図のごとき２次元図である。特定の具体例では、該描写はインタラクティブ（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ）立体２次元画像のごときインタラクティブ２次元画像である。インタラクティブ２次元画像は、例えば、回転させて、ポリペプチド、ポリペプチドの断片、複合体および／もしくは複合体の断片の異なる面を示すことが可能なコンピューター画像であり得る。いくつかの具体例では、該描写は３次元描写である。例として、３次元モデルは分子構造の物理的なモデル（例、球と棒状モデル）であり得る。別の例として、３次元描写は分子構造のグラフィック描写（例、コンピューター画像上に表される図面もしくは図）であり得る。２次元描写が、例えば、遠近法、陰影法の使用、あるいは観察者により近接する特徴による観察者からより離れた特徴の隠蔽のごとき３次元情報を反映する場合には、２次元グラフィック描写（例、図面）は３次元描写に一致し得る。いくつかの具体例では、描写は１つ以上のレベルでモデルされ得る。例として、３次元描写が化合物１もしくは化合物２に結合したヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ複合体のごときポリペプチドを含む場合、該ポリペプチドは、１次構造（アミノ酸配列）、２次構造（例、α−へリックスとβ−シート）、３次構造（全体の折りたたみ）、および４次構造（オリゴマー形成）のごとき１つ以上の相違なるレベルの構造で表され得る。描写は異なるレベルの詳細を含み得る。例えば、該描写は、原子位置を特定することなくタンパク質の２次構造特性の相対的な局在を含み得るだろう。より詳細な描写は、例えば、原子の位置を含み得るだろう。
【００５７】
いくつかの具体例では、描写は、化合物１もしくは化合物２に結合したヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ複合体の原子の構造座標に付加する情報を含み得る。例えば、描写は、溶媒接触可能表面の形態、モデル原子のファンデルワールス半径、および溶媒のファンデルワールス半径（例、水）に関する情報を提供できる。描写に由来し得る他の特性は、例えば、静電電位、巨大分子内の空隙もしくはポケットの局在、ならびに水素結合と塩橋の局在を含む。
【００５８】
ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤと相互作用する薬剤は、ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤもしくはその断片の描写、又は化合物１もしくは化合物２に結合したヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ複合体あるいはこれら複合体のどちらか一方の断片を使用することを含む方法により同定もしくは設計され得る。典型的な描写タイプは、上記で議論される描写を含む。いくつかの具体例では、該描写は、類似ポリペプチド、ポリペプチド断片、複合体もしくは複合体断片であり得る。該描写と相互作用する候補薬剤は、該描写と候補薬剤とのコンピューター適合解析を行うことにより設計もしくは同定され得る。一般に、薬剤は分子である。薬剤の例は、ポリペプチド、核酸（ＤＮＡとＲＮＡを含む）、ステロイドおよび非ステロイド有機化合物を含む。ポリペプチド（例、ＥＲアルファポリペプチド）と相互作用する薬剤は、ポリペプチドと一時的もしくは安定的に相互作用できる。該相互作用は、例えば、水素結合、静電気力、疎水性相互作用、およびファンデルワールス相互作用を含む、本明細書に特筆されるいずれかの力により介在され得る。
【００５９】
上記に記載した通り、Ｘ線結晶解析は、化合物１もしくは化合物２に結合したヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ複合体の構造座標を得るために使用され得る。しかし、かかる構造座標はＮＭＲ技術を含む他技術を用いて得られ得る。さらなる構造情報は、スペクトル技術（例、旋光分散（ＯＲＤ）、円二色性（ＣＤ））、ホモロジーモデリング、およびコンピューターによる方法（例、分子力学からのデータを含み得るコンピューターによる方法、動力学アッセイからのデータを含むコンピューターによる方法）から得られ得る。
【００６０】
いくつかの具体例では、Ｘ線回折データは、化合物１もしくは化合物２に結合したヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ複合体あるいはそれらの断片の電子密度マップを構築するために使用され得、該電子密度マップは、化合物１もしくは化合物２に結合したヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ複合体あるいはそれらの断片の描写（例、２次元描写、３次元描写）を導き出すために使用され得る。電子密度マップの創作は、典型的にはＸ線分散位相に関する情報の使用に関連する。位相情報は、電子密度マップの構築を完成させるために、例えば、回折データもしくは補助回折実験のどちらかから抽出され得る。Ｘ線回折データから位相を算出する方法は、例えば、多波長異常散乱（ＭＡＤ）、多重重原子同型置換法（ＭＩＲ）、異常分散を考慮した多重同型置換法（ＭＩＲＡＳ）、異常分散効果を利用した単一重原子同形置換法（ＳＩＲＡＳ）、逆格子空間溶媒平坦化（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｓｐａｃｅ  ｆｌａｔｔｅｎｉｎｇ）、分子置換もしくはこれらのいずれかの組み合わせを含む。該位相の決定により、電子密度マップが構築され得る。該電子密度マップは、該電子密度マップとともに既知のポリペプチドもしくは既知の複合体（例、リガンドに結合したポリペプチドを包含する複合体）の３次元モデルを配列することによって複合体もしくはその断片の描写を作成することに使用され得る。例えば、ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ／化合物１複合体もしくはヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ／化合物２複合体に対応する電子密度マップは、アゴニスト（例、ジエチルスチルベストロール（タンパク質データバンク同定番号２ｅｒｄ））のごとき別の化合物と複合体を形成するヒトＥＲアルファ−ＬＢＤに対応する電子密度マップと並べられ得る。他の具体例では、ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ／化合物１複合体もしくはヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ／化合物２複合体は、天然リガンド１７β−エストラジオール（タンパク質データバンク同定番号１ａ５２）もしくは４−ヒドロキシタモキシフェン（タンパク質データバンク同定番号３ｅｒｔ）のごときアンタゴニストと複合体を形成するヒトＥＲアルファ−ＬＢＤに対応する電子密度マップと配列され得る。
【００６１】
該配列工程は、算出された電子密度マップが既知のポリペプチドもしくは既知の複合体のモデルと異なる程度を示す比較モデルをもたらす。該比較モデルは、次に１サイクル以上（例、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクル、１０サイクル）で精密化されることにより、より適した電子密度マップが作成される。ＣＮＳ（Ｂｒｕｎｇｅｒら，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５４：９０５−９２１，１９９８）のごときソフトウェアプログラムが使用されることにより、該モデルが精密化され得る。比較モデルの適合性は、例えば、Ｒｗｏｒｋ値もしくはＲｆｒｅｅ値によって測定され得る。より小さい値のＲｗｏｒｋもしくはＲｆｒｅｅは、一般的により適することを示す。比較モデルの不整合は、修正された比較モデルおよび低Ｒｗｏｒｋ値もしくは低Ｒｆｒｅｅ値を提供するように調整され得る。該調整は、ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ、化合物１もしくは化合物２、既知ポリペプチドおよび／もしくは既知の複合体に関する情報（例、配列情報）に基づいて行われ得る。例として、リガンドに結合したポリペプチドの既知複合体モデルが用いられる具体例では、調節は、化合物１もしくは化合物２と既知複合体中のリガンドを置換することを含む。別の例として、特定の具体例において、調節は、ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ中の対応部位のアミノ酸と既知ポリペプチド中のアミノ酸を置換することを含み得る。修正された比較モデルの調整が電子密度マップに対するベストフィットを満足する場合、生じるモデルは、Ｘ線データが得られたポリペプチドもしくは複合体（ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ／化合物１複合体もしくはヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ／化合物２複合体）を説明するために調べられるモデルであり得る。かかる工程の方法は、例えば、ＣａｒｔｅｒとＳｗｅｅｔら編，「Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ」ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２７７，Ｐａｒｔ  Ｂ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７、その中の項目、例えば、ＪｏｎｅｓとＫｊｅｌｄｇａａｒｄ，「Ｅｌｅｃｔｒｏｎ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｍａｐ  Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ，」ｐ．１７３、およびＫｌｅｙｗｅｇｔとＪｏｎｅｓ，「Ｍｏｄｅｌ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，」ｐ．２０８．に開示される。
【００６２】
上記の議論は、複合体の結晶に対応する新規に算出された電子密度マップと、既知ポリペプチドもしくは既知複合体の３次元モデルを配列することによって複合体の描写を得る方法である。このモデリング工程に用いられ得る１つの調整は、化合物１もしくは化合物２と既知複合体の描写の化合物を置換することを含む。
【００６３】
コンピューターのごときマシーンは、該マシーンに接続された画面上で構造座標のグラフィック描写を作成できるプログラムと一緒に、化合物１もしくは化合物２に結合したヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ複合体の構造座標を有するメモリーにプログラムされ得る。代替的もしくは付加的に、ソフトウェアシステムが設計および／もしくは利用されることにより、構造座標が受容および記録され得る。該ソフトウェアシステムは、構造座標のグラフィック描写を作成可能であり得る。該ソフトウェアシステムはまた、外部データベースにアクセスすることにより、ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤと同様の構造特性の化合物（例、ポリペプチド）を同定し、および／もしくはヒトＥＲアルファ−ＬＢＤと相互作用するような候補薬剤とされ得る特性の１つ以上の候補薬剤を同定することができる。
【００６４】
構造データを含むメモリーもしくはかかるデータを含むソフトウェアシステムを有するマシーンは、ＥＲアルファアゴニストおよび／もしくはＥＲアルファアンタゴニストの合理的デザインもしくは選択に役に立ち得る。例えば、化合物１もしくは化合物２に結合したヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ複合体に関する薬剤の能力の評価、あるいはＥＲアルファ−ＬＢＤに対する構造もしくは配列のホモロジーに関連する化合物もしくはタンパク質のモデリング、に有用であり得る。本明細書で使用されるように、アゴニストは、少なくとも１つのＥ２の活性を模倣もしくは上昇する化合物を意味し、アンタゴニストは、少なくとも１つのＥ２の活性を抑制するか、もしくはＥ２の相反する活性を有する化合物を意味する。１つの化合物がある局面ではアゴニスト、別の局面ではアンタゴニストとして作用し得るか、もしくはある化合物がある局面ではアゴニストもしくはアンタゴニストとして作用し、別の局面では効果を有し得ない（陽性もしくは陰性どちらの効果もない）可能性がある。例えば、化合物１もしくは化合物２のような化合物は、エストロゲン受容体依存性ＮＦκＢ誘導炎症現象を抑制することによりＥＲアルファ−ＬＢＤのアゴニストとして機能でき、また、乳房もしくは子宮組織の増殖を促進するなどのエストロゲン受容体依存性女性化現象を抑制することによりアンタゴニストとしても機能できる。代替的に、化合物１もしくは化合物２のような化合物は、エストロゲン受容体依存性ＮＦκＢ誘導炎症現象の抑制に関してＥＲアルファ−ＬＢＤの作用を模倣することによりアゴニストとして作用し（模倣によるとは、該化合物が同一もしくは同一に近い作用を有することを意味する）、エストロゲン受容体依存性女性化現象に関して効果を有し得ない（陽性もしくは陰性どちらの効果もない）。
【００６５】
該マシーンは、化合物１もしくは化合物２に結合したヒトＥＲアルファ−ＬＢＤの複合体、あるいはそれらの断片の描写（例、２次元描写、３次元描写）を作成可能である。ソフトウェアシステムは、例えば、該マシーンにかかる情報を作成することを引き起こす。該マシーンは、マシーン可読データをコードされたデータ記録材料を包含するマシーン可読データ記録媒体を含み得る。該マシーン可読データは、化合物１もしくは化合物２に結合したヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ複合体、あるいはそれらの断片の原子の構造座標を含み得る。マシーン可読記録メディア（例、データ記録材料）は、例えば、慣用的なハードドライブ、フローピーディスク、ＤＡＴテープ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、ならびに他の磁気性、磁気光学、光学、およびマシーン（例、コンピューター）との使用に用いられ得る他のメディアを含む。該マシーンはまた、マシーン可読データを加工するための指令を記録するワーキングメモリ、ならびにワーキングメモリおよびマシーン可読データを所望する３次元描写に加工するためのマシーン可読データ記録媒体にカップルされた中央演算処理装置（ＣＰＵ）を有する。画面は、使用者にとって視覚可能であるようにＣＰＵに接続され得る。従って、データ使用用の指令をプログラムされたマシーンが使用される場合（例、本明細書で記述される１つ以上の種類のプログラムが搭載されたコンピューター）、該マシーンは、本明細書に記述されるいずれのポリペプチド、ポリペプチド断片、複合体、もしくは複合体断片のグラフィック描写（２次元グラフィック描写、３次元グラフィック描写）を表示することができる。
【００６６】
画面（例、コンピューター画面）は、化合物１もしくは化合物２に結合したヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ複合体、あるいはこれらの複合体のどちらかの断片の描写を表わすことが可能である。使用者は描写を調べることができ、該描写から得られた情報を用いて、化合物１もしくは化合物２以外の薬剤を含む複合体もしくはその断片のモデルを作成し得る。該モデルは、例えば、ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ／化合物１複合体もしくはヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ／化合物２複合体の既存の描写を変更することにより作成され得る。選択的に、該使用者は、化合物１もしくは化合物２に結合したヒトＥＲアルファ−ＬＢＤの描写上に薬剤の３次元モデルを重ね合わせることが可能である。該薬剤は、ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤのアゴニスト（例、候補アゴニスト）もしくはヒトＥＲアルファ−ＬＢＤのアンタゴニスト（例、候補アンタゴニスト）であり得る。いくつかの具体例では、該薬剤は既知の化合物もしくは化合物の断片であり得る。特定の具体例では、該薬剤は未知の化合物、もしくは未知の化合物断片であり得る。
【００６７】
該薬剤が活性部位の形を補完する形を有することが所望され得る。該薬剤の原子とＥＲアルファポリペプチドの原子間の好ましい距離もしくは距離の範囲があり得る。好ましい距離より長い距離は、薬剤と活性部位（例、ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ）間の弱い相互作用に関連するかもしれない。好ましい距離より短い距離は、薬剤とポリペプチド間の相互作用を弱め得る斥力に関連するかもしれない。原子間距離が非常に短い場合に立体的衝突が生じ得る。２つの原子局在が相互に不適切に近似する場合、例えば、２つの原子がそれらのファンデルワールス半径の合計より短い距離で離れる場合、立体的衝突が生じる。立体的衝突が存在する場合、使用者は、立体的衝突が軽減されるまでＥＲアルファポリペプチドに対する薬剤の位置を調節可能である（例、薬剤の剛体並進もしくは剛体回転）。該使用者は、立体的衝突を軽減するために、薬剤近くにおける薬剤の立体配座もしくはＥＲアルファポリペプチドの立体配座を調節可能である。立体的衝突はまた、薬剤の構造を変更すること、例えば、芳香環などの「巨大な基」からメチル基もしくはヒドロキシル基などのより小さな基への変更、あるいは固定性の基から柔軟性の基への変更など、立体的衝突を形成しない立体配座に修正することにより除去され得る。静電気力もまた、薬剤とリガンド結合ドメイン間の相互作用に影響し得る。例えば、静電気の特性は、薬剤とＥＲアルファポリペプチド間の相互作用を弱め得る斥力に関連し得る。静電気の斥力は、薬剤の帯電を変更すること、例えば、正に帯電した基を中性の基に置換することで緩和され得る。
【００６８】
化合物１もしくは化合物２およびヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ間の結合の強さに影響を及ぼす力は、ポリペプチド／薬剤モデルで評価され得る。これらは、例えば、水素結合、静電気力、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、双極子間相互作用、π−スタッキング（ｓｔａｃｋｉｎｇ）力、および陽イオン−π相互作用を含み得る。該使用者は、水素結合に適する距離と角度に適合した水素結合供与体／受容体の組み合わせを記載することによりこれらの力を視覚的に評価できる。該評価に基づいて、使用者はモデルを変更することでＥＲアルファポリペプチドと薬剤間のより好ましい相互作用を見出すことができる。モデルを変更することは、例えば、アミノ酸側鎖の立体配座もしくは骨格二面角を変更することにより、化学構造を変更することなくポリペプチドの３次元構造を変化させることを含み得る。該モデルを変更することは、上記に記述されるように、薬剤の位置もしくは立体配座を変更することを含み得る。モデルを変更することはまた、例えば、基を置換、付加、もしくは除去することにより薬剤の化学構造を変更することを含み得る。例えば、ＥＲアルファポリペプチド上の水素結合供与体が薬剤上の水素結合供与体の近接に局在する場合、使用者は薬剤上の水素結合供与体を水素結合受容体に置換可能である。
【００６９】
薬剤とＥＲアルファポリペプチドの相対的な局在、もしくはそれらの立体配座は、ＥＲアルファポリペプチドに対する特定の薬剤の最適な結合形状を見出すために調整され得る。最適な結合形状は、例えば、好ましい水素結合の距離と角度、最大の静電気引力、最小の静電気斥力、水性環境からの疎水性分子の隔離、および立体的衝突の不在で特徴付けられる。最適な形状は、ＥＲアルファポリペプチド／薬剤複合体用の可能な形状のファミリーの最低算出エネルギーを有し得る。最適な形状は、例えば、分子力学もしくは分子動力学の計算を通して調べられ得る。
【００７０】
異なる結合薬剤を有する化合物１もしくは化合物２に結合したヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ複合体の一連の描写が作成され得る。スコアは描写ごとに計算され得る。該スコアは、例えば、ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤと薬剤間の予想される相互作用の強さを記述可能である。該スコアは、結合の強さに影響する上記に記述される因子の１つを反映し得る。該スコアは１つ以上の因子を反映する総計スコアであり得る。異なる薬剤はこれらのスコアに従って位置付けられ得る。
【００７１】
薬剤のデザイン工程は、マシーンにより自動化された方法で行われ得る。例えば、ＥＲアルファ−ＬＢＤの描写は、候補薬剤の描写と一緒にマシーンにプログラムされ得る。該マシーンは活性部位への候補薬剤各々の最適な形状を見出し、スコアを計算して一連の薬剤のうちのどれがヒトＥＲアルファ−ＬＢＤと最も強く相互作用かを決定し得る。
【００７２】
ソフトウェアシステムは、これらの工程を容易にするために設計および／もしくは実行され得る。描写を作成するか、もしくは適する解析を実行するために使用されるソフトウェアシステム（例、コンピュータープログラム）は、例えば、Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、サンディエゴ）からのＭＣＳＳ，Ｌｕｄｉ，ＱＵＡＮＴＡ，Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ，Ｃｅｒｉｕｓ２，ＣＨＡＲＭｍ，およびＭｏｄｅｌｅｒ；ＴＲＩＰＯＳ，Ｉｎｃ．（ミズーリ州、セントルイス）からのＳＹＢＹＬ，Ｕｎｉｔｙ，ＦｌｅＸＸ，およびＬＥＡＰＦＲＯＧ；ＡＵＴＯＤＯＣＫ（カリフォルニア州、ラ・ホーヤのＳｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ＧＲＩＤ（英国、オックスフォードのオックスフォード大学）；ＤＯＣＫ（カリフォルニア州、サンフランシスコのカリフォルニア大学）；ならびにＦｌｏ＋とＦｌｏ９９（ニュージャージー州、モリスタウンシップのＴｈｉｓｔｌｅｓｏｆｔ）を含む。他の有用なプログラムは、Ｏｐｅｎｅｙｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ニューメキシコ州、サンタフェ）からのＲＯＣＳ，ＺＡＰ，ＦＲＥＤ，Ｖｉｄａ，およびＳｚｙｂｋｉ；Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ（オレゴン州、ポートランド）からのＭａｅｓｔｒｏ，Ｍａｃｒｏｍｏｄｅｌ，およびＧｌｉｄｅ、ＬＬＣ；ＭＯＥ（ケベック州、モントリオールのＣｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ)、Ａｌｌｅｇｒｏｗ（マサチューセッツ州、ボストンのＢｏｓｔｏｎ  Ｄｅ  Ｎｏｖｏ）、ならびにＧＯＬＤ（Ｊｏｎｅｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４５：４３−５３，１９９５）を含む。構造座標はまた、ＭＯＬＳＣＲＩＰＴ，ＲＡＳＴＥＲ３Ｄ，もしくはＰｙＭＯＬ（Ｋｒａｕｌｉｓ，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２４：９４６−９５０，１９９１；ＢａｃｏｎとＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈ．６：２１９−２２０，１９９８；ＤｅＬａｎｏ，Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（２００２）カリフォルニア州、サンカルロスのＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＥＲアルファポリペプチドの３次元構造を視覚化するために使用され得る。
【００７３】
適するデータベースをスクリーニングすることにより選択され得る薬剤は、例えば、適するソフトウェアシステムと一緒に未結合ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤの立体的配座と帯電電位を解析することによりｄｅ  ｎｏｖｏで設計され、および／もしくはプロゲステロン受容体もしくは他のホルモン受容体の既知リガンドの特性を用いて設計され得る。該方法は、ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤのアゴニストもしくはアンタゴニストを設計もしくは選択するために使用され得る。ソフトウェアシステムは、データベース検索および／もしくは薬剤の選択とデザインを容易にするために設計および／もしくは実行され得る。
【００７４】
薬剤が設計もしくは特定されると、生成もしくは合成され、さらにヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ作用の効果が評価され得る。例えば、該薬剤は、ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤと接触されて、ポリペプチド活性上の薬剤の効果を測定することにより評価され得る。薬剤を評価する方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて行われる活性アッセイを含み得る。活性アッセイは、例えば、細胞に基づいたアッセイであり得る。ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ上の薬剤作用によって、薬剤はヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ活性のアゴニストもしくはアンタゴニストのどちらかとして作用可能である。薬剤はまた、ポリペプチドに対するプロゲステロンの結合を阻害するか否かを調べるために、プロゲステロンの存在下でポリペプチドと接触され得る。同定された薬剤に結合されるヒトＥＲアルファ−ＬＢＤを含む結晶が育成され、構造はＸ線結晶解析により調べられ得る。第２の薬剤は、ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤと第１の薬剤との相互作用に基づいて設計もしくは同定され得る。
【００７５】
様々な分子解析および合理的な薬物デザイン技術は、例えば、米国特許第５，８３４，２２８号、第５，９３９，５２８号、および第５，８５６，１１６号、ならびにＷＯ９９／０９１４８として公開されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１６８７９号でさらに開示される。
【００７６】
特定の具体例が記述されている一方で、他の具体例もまた実施される。
【００７７】
例として、ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤおよび化合物１もしくは化合物２に関する具体例が記述されている一方で、本明細書の記載は、エストロゲン受容体ポリペプチドと縮合環のうちの少なくとも１つがヘテロ原子を含む少なくとも２つの縮合環を有するリガンドに、より一般的に指向される。
【００７８】
エストロゲン受容体ポリペプチドは、ＥＲアルファポリペプチドのアイソフォームの全長アミノ酸配列を含む、全長の成熟ポリペプチドであり得る。アイソフォームは一次構造において異なる数種類の多形態のタンパク質のいずれかである。
【００７９】
エストロゲン受容体ポリペプチドは、リガンド結合ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、タンパク質相互作用ドメイン（例、活性化ドメイン）、もしくはそれらの組み合わせなどのＥＲアルファ断片であり得る。
【００８０】
エストロゲン受容体ポリペプチドは活性部位を有し得る。一般に、活性部位は、リガンド結合部位、またはリン酸化、グリコシル化、アルキル化、アシル化、もしくは他の共有結合的修飾の部位を含み得る。リガンド結合部位は、リガンドとの相互作用による活性に影響し得る結合の実際の部位に近接もしくは隣接する補助的な結合部位を含み得る。エストロゲン受容体ポリペプチドの活性部位は、配列番号１のアミノ酸（図６）を含み得る。例えば、ＥＲアルファ−ポリペプチドの活性部位は、配列番号１のアミノ酸位置により定義されるような、アミノ酸Ｇｌｕ３５３、Ａｒｇ３９４、Ｐｈｅ４０４、Ｍｅｔ４２１、Ｌｅｕ４２５、およびＨｉｓ５２４のうちの１つ以上を含み得る。
【００８１】
ＥＲアルファポリペプチドアミノ酸の番号付けは、本明細書で説明される番号付けと異なり、ＥＲアルファポリペプチドの配列は、同一の３次元構造を生じる特定の保存アミノ酸置換を含み得る。例えば、ＥＲアルファ−ＬＢＤの番号付けは図６で記載される番号と異なり、ＥＲアルファ−ＬＢＤの配列は保存アミノ酸置換を含むが、表９と表１０の座標で定義され、図１−４で表されるような同一の構造を生じ得る。他のアイソフォームもしくは類似物における対応アミノ酸と保存置換は、関連アミノ酸配列の視覚調査、もしくは市販のホモロジーソフトウェアプログラム（例、ＭＯＤＥＬＬＡＲ、カリフォルニア州、サンディエゴのＭＳＩ）を用いて容易に同定される。
【００８２】
類似物は保存アミノ酸置換を有するポリペプチドである。保存置換は、類似の極性、類似の立体配列、あるいは同一クラスの類似性（例、疎水性、酸性もしくは塩基性）を伴って１つのアミノ酸から別のアミノ酸に置換することを含み得、分子置換解析および／もしくはホモロジーモデリングに関するものと同様に、ポリペプチド（例、ＥＲアルファ−ＬＢＤ）と相互作用する薬剤の同定と設計に関してＥＲアルファポリペプチドの三次構造に対する重要でない影響を伴う置換を含む。
【００８３】
ＥＲアルファポリペプチドなどのエストロゲン受容体ポリペプチドは、非哺乳類もしくは哺乳類を起源とし得る。哺乳類のエストロゲン受容体ポリペプチドは、例えば、ヒトを起源とし得る。典型的な非ヒト哺乳類は、非ヒト霊長類（サルもしくは類人猿など）、マウス、ラット、ヤギ、雌ウシ、雄ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、イノシシ、ラッコ、ネコ、およびイヌを含む。典型的な非哺乳類は、ニワトリ、シチメンチョウ、エビ、ワニおよび魚を含む。
【００８４】
別の例として、具体例においては、化合物１もしくは化合物２がリガンドであるとして記述されている一方で、より一般的には、他の化合物もまたリガンドとして使用され得る。例えば、結晶複合体の構造に由来する、化合物１に結合したヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ、もしくは化合物２に結合したヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ、の描写に基づいて、理論に制約されることを望むことなく、化合物１のＡ環のヒドロキシル基は、（配列番号１のアミノ酸位置により規定されるような）ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤのＧｌｕ３５３とＡｒｇ３９４の側鎖、およびこれら２つのアミノ酸間に位置する保存された水分子、と水素結合を形成する；化合物２のＡ環のヒドロキシル基は、ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤのＧｌｕ３５３の側鎖、およびＧｌｕ３５３とＡｒｇ３９４間に位置する保存された水分子と水素結合を形成するが、Ａｒｇ３９４と相互作用し得ない；化合物１と化合物２のフェニル基は、Ｐｈｅ４０４と相互作用し、ＥＲアルファ−ＬＢＤ結合ポケットのこの領域のパイ−エッジスタッキングに貢献する；化合物１および化合物２は、Ｈｉｓ５２４、Ｌｅｕ４２５、およびＭｅｔ４２１あるいはＥＲアルファと間接的に相互作用する；化合物１のインダゾール基および化合物２のフェナントリジン基は、結合ポケットと疎水性相互作用を形成する；ならびに化合物１のアリル基と化合物２のフェナントロリン基は、Ｍｅｔ４２１領域におけるＥＲアルファ−ＬＢＤの結合ポケットに深く入り込む：と考えられる。
【００８５】
この情報に基づき、理論に制約されることを所望することなく、ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤとの１つ以上の類似相互作用を有し得る他の化合物はまた、ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤのリガンドとして作用可能であり得る。かかる化合物は、構造：
【化３】
2008527045.tif 000005
(i)
もしくは
【化４】
2008527045.tif 000006
(ii)
を有し、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは環系を表し；化合物（ｉ）のＢとＣは縮合環であり；化合物（ｉｉ）のＢ、Ｃ、およびＤは縮合環であり；Ｌはリンカー部分であり、Ｘは置換基である。化合物（ｉ）のＹは１０個以下の炭素原子の炭素鎖を含む。化合物（ｉｉ）のＢ／Ｃ／Ｄ環系において、環Ｂは環Ｃに、環Ｃは環Ｄに結合され、あるいは環Ｃと環Ｄは各々、環Ｂに結合される。
【００８６】
一般に、化合物（ｉ）と（ｉｉ）の環Ａ、Ｂ、およびＣ、ならびに化合物（ｉｉ）の環Ｄは各々、少なくとも４個の原子（例、５個の原子、６個の原子、７個の原子、８個の原子、９個の原子、１０個の原子、１１個の原子、１２個の原子、１３個の原子、１４個の原子）から独立して形成される。環Ａ、Ｂ、Ｃおよび／もしくはＤの１個以上の原子（例、１個の原子、２個の原子、３個の原子、４個の原子）は、独立してヘテロ原子（例、Ｎ、Ｓ、Ｏ）であり得る。例えば、いくつかの具体例では、環Ｂは１個もしくは２個の窒素原子を含み得る。化合物（ｉ）では、Ｂ環とＣ環はインダゾールを形成可能である。化合物（ｉｉ）では、Ｂ、ＣおよびＤ環はフェナントリジンを形成可能である。いくつかの具体例では、環Ａはフェ二ル、チオフェン、ピロール、もしくはメチルピロールであり得る。一般に、Ｘは、ヒドロキシ置換基、アミノ置換基、シアノ置換基、ニトロ置換基、メルカプト置換基、チオール置換基、アミド置換基、もしくはオキソ置換基であり得る。Ａ環上のＸの位置は変更できる。例えば、Ａ環がフェノールである場合、Ｘはパラ位もしくはメタ位であり得る。２番目の置換基はＡ環上のいずれかの位置を占め得る。２番目の置換基は、例えば、ヒドロキシ置換基、アミノ置換基、シアノ置換基、ニトロ置換基、メルカプト置換基、チオール置換基、アミド置換基、オキソ置換基、もしくはハロゲン（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）であり得る。
【００８７】
いくつかの具体例では、Ａ環は別の環と結合して二環構造を形成し得る。
【００８８】
いくつかの具体例では、化合物（ｉ）と（ｉｉ）の環Ａ、Ｂ、およびＣ、ならびに化合物（ｉｉ）の環Ｄは各々、１個以上（１個、２個、３個、４個）の置換基（例えば、水素結合、疎水性相互作用および／もしくは静電気的相互作用などのヒトＥＲアルファ−ＬＢＤとの好ましい相互作用を提供する１個以上の置換基）を独立して含み得る。いくつかの具体例では、置換基自身はヒトＥＲアルファ−ＬＢＤとの水素結合供与体もしくは受容体であり得る一方で、他の具体例では、該置換基は水などの１つ以上の溶媒分子を介してヒトＥＲアルファ−ＬＢＤの一部分と水素結合を形成し得る。
【００８９】
化合物（ｉ）のＢ／Ｃ縮合環系および化合物（ｉｉ）のＢ／Ｃ／Ｄ縮合環系は、Ｍｅｔ４２１、Ｈｉｓ５２４、およびＬｅｕ４２５の領域においてＥＲアルファポリペプチドと疎水性相互作用を形成し得る。選択的に、縮合環系はＭｅｔ４２１と直接的もしくは間接的に相互作用でき、該相互作用は環のうちの１つのヘテロ原子もしくは環のうちの１つの置換基によって介在され得る。化合物（ｉ）と（ii）の環Ｂと環Ｃ、および化合物（ｉｉ）の環Ｄ上の置換基は疎水性であり得る。化合物（ｉ）のＢ／Ｃ環系の環上、および特に化合物（ｉ）の環Ｃ上の置換基（Ｙ）は、１０個より多い炭素原子を含まず、化合物（ｉｉ）のＢ／Ｃ／Ｄ環系の環上の置換基は５個より多い炭素原子を含まない。
【００９０】
一般に、Ｌは直接的な化学結合であり得るか、もしくはＬは、例えば、スルホニル部分、アルキル部分、アルケニル部分、アルキニル部分、エーテル部分、チオエーテル部分、アミド部分、もしくはカルボニル部分などの化学的な部分から形成され得る。いくつかの具体例では、Ｌは複数の部分から形成され得る（例、アルキル部分に結合されたスルホニル部分）。
【００９１】
上記に記述される特性を有するリガンドが化合物１もしくは化合物２に類似する生理的な効果を有し得ると考えられる。例えば、該リガンドは核因子−カッパＢ（ＮＦκＢ）−誘導炎症現象を抑制できるが、天然ＥＲアルファリガンド１７β−エストラジオールの特性である女性化効果を有し得ない。
【００９２】
以下の実施例は例示であり、限定することを意図されない。
【実施例】
【００９３】
実施例１．４−［１−アリル−７−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−インダゾール−３−イル］ベンゼン−１，３−ジオール（化合物１）の合成。
工程１：１−アリル−３−（２，４−ジメトキシフェニル）−７−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−インダゾールの合成。
ピリジン中の（２−フルオロ−３−置換−フェニル）（４−メトキシ−２−置換−フェニル）メタノン（１当量）、ヒドラジン水和物（１０当量）およびＤＭＡＰ（１当量）の溶液を１００℃で２４−４８時間加熱した。冷却した反応混合物をＥｔＯＡｃおよび１Ｎ  ＨＣｌで分離した。有機相をブラインで洗浄し、（Ｎａ２ＳＯ４で）乾燥させた。生じた残渣をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して中間物３−（４−メトキシフェニル）−７−置換−１−１Ｈ−インダゾールを得た。
【００９４】
ＤＭＦ中の中間物３−（２，４−メトキシフェニル）−７−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール（０．５２ｇ、１．６ｍｍｏｌ）の溶液に水素化ナトリウム（油中で６０％、０．０６５ｇ、１．６ｍｍｏｌ）を添加した。ガス発生が停止した後、臭化アリル（０．１３８ｍＬ、１．６ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を５０℃の環境で一晩撹拌させた。冷却反応混合物をＥｔＯＡｃと１Ｎ  ＨＣｌで分離した。有機相をブラインで洗浄し、（Ｎａ２ＳＯ４で）乾燥させた。生じた残渣を、メチル−ｔ−ブチルエーテル／ヘキサン（勾配溶離１：９から１：１）と一緒に１０ｍＬ／分の速度でシリカゲルカラム１５０Ｘ１２ｍｍ（Ｂｉｏｔａｇｅ）を通すフラッシュクロマトグラフィーもしくはＨＰＬＣクロマトグラフィーにより精製して白色固体として１−アリル−３−（２，４−ジメトキシフェニル）−７−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−インダゾール（０．２６ｇ）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ３．７３  （ｓ，３Ｈ），３．８０（ｓ，３Ｈ），４．８５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５及び１４．６５），５．１（ｍ，３Ｈ），５．９７−６．０５（ｍ，１Ｈ），６．３９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３２および６．１４），６．６４（ｓ，１Ｈ），７．２５（ｔ，１Ｈ），７．３５（ｄ，１Ｈ），７．８５−７．８７（ｍ，２Ｈ））。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ３６３［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００９５】
工程２：４−［１−アリル−７−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−インダゾール−３−イル］ベンゼン−１，３−ジオール
−７８℃で１．０ｍＬのシクロヘキセン含有ＣＨ２Ｃｌ２中の１−アリル−３−（２，４−ジメトキシフェニル）−７−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−インダゾールを三臭化ホウ素（０．１３６ｍＬ、１．４ｍｍｏｌ）で処理し、常温までゆっくり温めた。反応物をＣＨ３ＯＨの滴下によって急冷して冷却反応物とした。溶媒を減圧除去し、残渣をＥｔＯＡｃと１Ｎ  ＨＣｌで分離した。有機相をブラインで洗浄し、（Ｎａ２ＳＯ４で）乾燥させた。溶媒の減圧除去は粗成物をもたらした。結晶化もしくは水脱活性化シリカゲルを介するフラッシュクロマトグラフィーによって純粋な生成物を得た。０．０６６ｇのサンプルを白色固体として得た。
【００９６】
ＨＰＬＣ保持時間を以下の条件を用いて得た：
カラム：  Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ａｑｕａｓｉｌ  Ｃ１８（５０ｘ２ｍｍ、５ｕ）、
溶媒系：  Ａ：９５％  １０ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ／５％  アセトニトリル
Ｂ：９５％  アセトニトリル  ５％  １０ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ、
勾配：  ０−１５分間で０％Ｂから１００％Ｂまで
流量：  ０．８ｍＬ／分
検出：  ＵＶ（様々な波長）
【００９７】
生成物の特性
融点：１１４−１１５℃；
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ４．８７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．３７および１７．１０Ｈｚ），５．３１−５．０８（ｍ，３Ｈ），６．０１−６．０８（ｍ，Ｈ），６．３９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４４および８．４０Ｈｚ），６．４６（ｓ，１Ｈ），７．３０（ｔ，１Ｈ），３．７８（ｄ，１Ｈ），７．８５−７．８７（ｍ，１Ｈ），８．１４−８．１９（ｍ，１Ｈ），９．５９（ｂｒｏａｄ  ｓ，１Ｈ），９．８２（ｂｒｏａｄ  ｓ，１Ｈ）
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ３３５［Ｍ＋Ｈ］＋。
Ｃ１７Ｈ１３Ｆ３Ｎ２Ｏ２の解析計算値：  Ｃ：６１．０８，Ｈ：３．９２，Ｎ：８．３８；実測値：Ｃ：６１．０２，Ｈ：３．７６，Ｎ：８．２８。
【００９８】
実施例２．化合物１はマウスにおける抗リウマチ作用を有する
化合物１をＨＡＥＣＴ−１細胞（不死化させたヒト大動脈内皮細胞系統）のアッセイでテストした。ＨＡＥＣＴ−１細胞に、２つのプラスミド、すなわちヒトＥＲアルファ遺伝子を発現するプラスミドとレポーター遺伝子ＮＦκＢ−ルシフェラーゼを発現するプラスミドをトランスフェクトした。レポーター遺伝子のプロモーターには、３コピーの主要適合組織抗原クラスＩプロモーターのＮＦκＢ結合部位を含めた。次に細胞をＩＬ−１ｂｅｔａおよび化合物１と１６−１８時間処理した。ＮＦκＢの転写レベルは、ルシフェラーゼの存在量に直接的に比例した。古典的なエストロゲン活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＥＲ介在の遺伝子発現およびクレアチンキナーゼ（ＣＫ）活性の不足によって特徴付けられる。化合物１はＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーターの発現を１７β−エストラジオールと同程度まで抑制した。該化合物はクレアチンキナーゼのレベルに効果を生じなかった。
【００９９】
古典的なエストロゲン活性は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける子宮の増殖促進により特徴付けられる。Ｉｎ  ｖｉｖｏにおける化合物１の効果をアッセイするため、Ｃ５７／ＢＬ／６マウスに高脂肪の飼料を５週間与えた。ＮＦκＢ標的遺伝子ＭＨＣ、ＶＣＡＭ−１、ＲＡＮＴＥＳ、およびＴＮＦ−アルファの発現をＴＡＣ−Ｍａｎアッセイによって測定した。マウスに１０もしくは５ｍｇ／ｋｇ／日の割合で化合物１を５週間与えた場合に、４つの遺伝子全ての発現を抑制した（表１）。
【０１００】
表１、ＮＦκＢ標的遺伝子発現における１７α−エチニルエストラジオールと化合物１の効果
【表１】
2008527045.tif 000007
ａ発現のパーセント抑制
ｂ０．０１ｍｇ／ｋｇ／日の割合でＥＥを与えたことによる抑制と比較された発現のパーセント抑制
化合物１は表１に記述されるマウスにおいて子宮の湿重量の増加を引き起こさなかった。
【０１０１】
アジュバント誘発関節炎（ＡＩＡ）の疾患モデルにおいて、化合物１は濃度依存的な経口投与により有効であることが見出された。ラットにフロインド完全アジュバント（ＣＦＡ）を注射し、足根関節の滑膜炎をモニターした。注射後８日目からマウスに化合物１を経口で２週間処置した。足根関節は、１もしくは０．３ｍｇ／ｋｇ／日の用量で６日後において正常に回復した。０．１ｍｇ／ｋｇ／日の用量が活性であることは、表２の組織学的なスコアで示される（後述の表４も参照）。
表２．化合物１と経口で２週間処理されたアジュバント誘発関節炎にかかっている動物の足根関節の滑膜炎の組織学的なスコア
【表２】
2008527045.tif 000008
【０１０２】
実施例３．４−［（８−フルオロ−６−メチルフェナントリジン−５（６Ｈ）−イル）スルホニル］フェノール（化合物２）の合成
工程１：Ｎ−（４’−フルオロビフェニル−２−イル）アセトアミド
テトラヒドロフラン（１．５Ｌ）中の２−ヨードアニリン（３２．６ｇ、１４９ｍｍｏｌ）と４−フルオロフェニルボロン酸（２０．８ｇ、１４９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液を、ジクロロメタン（２．２０ｇ、２．６９ｍｍｏｌ）および５Ｎ  水酸化ナトリウム（６０ｍＬ）と一緒に［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）複合体と窒素雰囲気下で処理した。反応混合物を還流下で１２時間加熱し、室温まで冷却し、溶媒を減圧除去した。残渣を酢酸エチル（２５０ｍＬ）に溶解し、飽和させた水性塩化ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）で抽出した。水相を酢酸エチルでさらに抽出した（２ｘ５０ｍＬ）。一緒にした有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧濃縮して茶色の油状物を得た。茶色の油状物を酢酸エチル−ヘキサン（１：４）の混合物で溶離して、シリカゲルの短カラムを通して濾過した。溶媒の減圧蒸発後、ジクロロメタン（７５ｍＬ）中の粗成物４’−フルオロ−ビフェニル−２−イルアミンの溶液をピリジン（２７．７ｍＬ、３４３ｍｍｏｌ）、無水酢酸（１５．５ｍＬ、１６４ｍｍｏｌ）、および４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン）ピリジン（０．５５ｇ、４．５ｍｍｏｌ）で処理した。室温で１２時間撹拌後、反応物を飽和水性塩化アンモニウム溶液（２５０ｍＬ）で急冷した。分離させた水相をジクロロメタンで抽出し（３ｘ７５ｍＬ）、一緒にした有機相を０．１Ｎ  塩酸溶液（２ｘ５０ｍＬ）、および飽和水性重炭酸ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）で連続的に洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧濃縮して２番目の茶色の油状物を得た。トルエンを添加して減圧除去した後（３ｘ）、生じた茶色の固体を酢酸エチル−ヘキサンから結晶化させて所望する生成物である最初のクロップ（１９．０ｇ）を得た。母液を酢酸エチル−ヘキサン（１：４）で溶離して、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより濃縮および精製して２番目のクロップ（５．０ｇ）を得た。
【０１０３】
一緒にしたクロップを均一な無色の結晶固体（２４．０ｇ、７０％）として表題化合物を得た。
融点：  １２３−１２４℃；
ＭＳ［（＋ＥＳＩ），ｍ／ｚ］：  ２３０［Ｍ＋Ｈ］＋；
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：  ９．２４（ｓ，１Ｈ），７．４４−７．２３（ｍ，８Ｈ），１．８７（ｓ，３Ｈ）；
Ｃ１４Ｈ１２ＦＮＯの解析計算値:  Ｃ，７３．３５；Ｈ，５．２８；Ｎ，６．１１．  実測値：Ｃ，７３．０９；Ｈ，５．２０；Ｎ，５．８９。
【０１０４】
工程２：８−フルオロ−６−メチルフェナントリジン
Ｎ−（４’−フルオロビフェニル−２−イル）アセトアミド（１８．５ｇ、８０．７ｍｍｏｌ）をポリリン酸（２５０ｇ）と混合し、激しい撹拌とともに１２０℃で４８時間加熱した。高温の反応混合物を氷上に注ぎ、均一になるまで激しく撹拌した。ｐＨが８以上になるまで水酸化アンモニウム（２８−３０％、水性）を添加した。白い沈殿物を濾過し、酢酸エチル（２５０ｍＬ）に溶解し、再度濾過した。一緒にした濾過物を飽和水性塩化ナトリウム溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧蒸発させて茶色の固体を得た。茶色の固体を酢酸エチル−ヘキサンの混合物から結晶化により精製して白色の結晶固体（１５．９ｇ、９４％）として表題化合物を得た。
融点：９２−９３℃；
ＭＳ［（＋ＥＳＩ），ｍ／ｚ］：２１２［Ｍ＋Ｈ］＋；
１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．６３（ｄｄ，Ｊ＝９．０，５．４Ｈｚ，１Ｈ），８．４９（ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．０Ｈｚ，１Ｈ），８．１０（ｄｄ，Ｊ＝８．１，１．１Ｈｚ，１Ｈ），７．８４（ｄｄ，Ｊ＝９．６，２．６Ｈｚ，１Ｈ），７．７１（ｍ，１Ｈ），７．６５−７．５７（ｍ，２Ｈ），３．０１（ｓ，３Ｈ）；
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：８．８９（ｄｄ，Ｊ＝９．１，５．６Ｈｚ，１Ｈ），８．７０（ｄｄ，Ｊ＝８．１，１．３Ｈｚ，１Ｈ），８．０５（ｄｄ，Ｊ＝１０．１，２．５Ｈｚ，１Ｈ），７．９７（ｄｄ，Ｊ＝８．１，１．３Ｈｚ，１Ｈ），７．８０（ｍ，１Ｈ），７．７０（ｍ，１Ｈ），７．６３（ｍ，１Ｈ），３．０１（ｓ，３Ｈ）；
Ｃ１４Ｈ１０ＦＮ・０．１０Ｈ２Ｏの解析計算値：Ｃ，７８．９３；Ｈ，４．８３；Ｎ，６．５７。実測値：Ｃ，７８．９０；Ｈ，４．５７；Ｎ，６．５８。
【０１０５】
工程３：４−（クロロスルホニル）フェニルエチルカルボナート
１．２５Ｎ  水酸化ナトリウム水溶液（１７０ｍＬ、２１３ｍｍｏｌ）中の４−ヒドロキシベンゼンスルホン酸ナトリウム二水和物（５０．０ｇ、２１５ｍｍｏｌ）の溶液にクロロギ酸エチル（２０．６ｍＬ、２１５ｍｍｏｌ）で滴下処理した。反応混合物を室温で１２時間撹拌した。混合物を０℃まで冷却後、反応条件下で形成された白色沈殿物を濾過した。固体を７０℃で減圧乾燥させた。白色固体（４０．０ｇ）をトルエン中（３５０ｍＬ）で懸濁させ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（６．０ｍＬ）と塩化チオニル（２２．０ｍＬ、２９８ｍｍｏｌ）で処理し、生じた混合物を１００℃で１２時間加熱した。室温まで冷却後、反応混合物を珪藻土に通して濾過した。濾過物を減圧濃縮し、生じた油状物を静置によって固体化させた。固体化させた油状物を酢酸エチル−ヘキサン（１：４）に溶解して、シリカゲルの短カラムを通して濾過し、溶媒を減圧除去して白色固体（３４．８ｇ、６１％）として塩化スルホニルを得た。
融点：  ７４−７６℃；
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：７．６０（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），７．１４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．２３（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．２６（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ）。
【０１０６】
工程４：エチル４−［（８−フルオロ−６−メチルフェナントリジン−５（６Ｈ）−イル）スルホニル］フェニルカルボナート
テトラヒドロフラン（１５２ｍＬ）中の８−フルオロ−６−メチルフェナントリジン（８．００ｇ、３７．９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液を新鮮な粉砕された水素化ホウ素ナトリウム（７．１６ｇ、１８９ｍｍｏｌ）で処理した。トリフルオロ酢酸（１１．７ｍＬ、１５２ｍｍｏｌ）を適切な速度の液滴により添加してガス発生と発熱反応状態を調節した。トリフルオロ酢酸の添加が完了した後、異種性の反応混合物を、反応物が室温になるまで撹拌し、次に１４時間再加熱によって還流させた。室温まで冷却後、飽和水性重炭酸ナトリウム水溶液（２５０ｍＬ）をゆっくり添加した。混合物をグラスウールのプラグを通して濾過し、ジエチルエーテルで抽出した（４ｘ７５ｍＬ）。一緒にした有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧濃縮して薄茶ペーストとしてジヒドロフェナントリジンを得た。ジクロロメタン（３８ｍＬ）中の粗成物ジヒドロフェナントリジンの溶液をトリエチルアミン（３１．７ｍＬ、２２７ｍｍｏｌ）と４−（クロロスルホニル）フェニルエチルカルボナート（１２．０ｇ、４５．３ｍｍｏｌ）で処理し、室温で１４時間撹拌した。反応物を０．１Ｎ  水酸化ナトリウム（１５０ｍＬ）で急冷し、ジクロロメタンで抽出した（６ｘ５０ｍＬ）。一緒にした有機抽出物を２Ｎ  塩酸溶液で洗浄し（２ｘ４０ｍＬ）、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧濃縮して粘性茶色油状物を得た。茶色油状物をヘキサン（２５ｍＬ）と練和して薄茶固体を得た。薄茶の固体を酢酸エチル−ヘキサンの混合物から結晶化により精製して所望する生成物の最初のクロップを得た。母液を減圧濃縮し、酢酸エチル−ヘキサン（１：４）で溶離して、シリカゲルのプラグを介した濾過により精製して２番目のクロップを得た。一緒にしたクロップから白色結晶固体（１５．２ｇ、９１％）として表題化合物を得た。
融点：  １３６−１３８℃；
ＭＳ［（＋ＥＳＩ），ｍ／ｚ］：４４２［Ｍ＋Ｈ］＋；
１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：７．７７（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．６３（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．４８−７．３９（ｍ，３Ｈ），７．１９（ｄｄ，Ｊ＝９．０，２．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０９（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），６．９８（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），６．９３（ｔｄ，Ｊ＝８．７，２．６Ｈｚ，１Ｈ），５．４８（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ），４．２１（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ,２Ｈ），１．２５（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），１．１５（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）；
Ｃ２３Ｈ２０ＦＮＯ５Ｓの解析計算値：Ｃ，６２．５７；Ｈ，４．５７；Ｎ，３．１７。実測値：Ｃ，６２．５１；Ｈ，４．４７；Ｎ，２．９６。
【０１０７】
工程５：４−［（８−フルオロ−６−メチルフェナントリジン−５（６Ｈ）−イル）スルホニル］フェノール
メタノール（５．０ｍＬ）中のエチル４−［（８−フルオロ−６−メチルフェナントリジン−５（６Ｈ）−イル）スルホニル］フェニルカルボナート（０．４５ｇ、１．０２ｍｍｏｌ）の溶液を１Ｎ  水酸化ナトリウム（５．１ｍＬ）水溶液で処理し、７５℃で１４時間加熱した。室温まで冷却後、メタノールを減圧蒸発させた。生じた混合水溶液を１Ｎ  塩酸水溶液で酸性にし、飽和水性塩化ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）で希釈し、ジクロロメタンで抽出した（５ｘ１５ｍＬ）。一緒にした有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧濃縮して白色固体を得た。固体物を酢酸エチルで溶離したシリカゲルの短カラムを介した濾過によって精製して均一な白色結晶固体（０．３４ｇ、８９％）として表題化合物を得た。
融点：  １８８℃；
ＭＳ［（−ＥＳＩ），ｍ／ｚ］：３６８［Ｍ−Ｈ］−；
１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１０．２４（ｂｒｓ，１Ｈ），７．７６（ｄｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１．５，１Ｈ），７．６０（ｄｄ，Ｊ＝７．８，１．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５２（ｄｄ，Ｊ＝８．７，５．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４１（ｍ，１Ｈ），７．３７（ｍ，１Ｈ），７．１７（ｄｄ，Ｊ＝９．２，２．７Ｈｚ，１Ｈ），６．９６（ｔｄ，Ｊ＝８．７，２．７Ｈｚ，１Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ)，６．３８（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），５．４１（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ），１．１３（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）；
Ｃ２０Ｈ１６ＦＮＯ３Ｓの解析計算値：Ｃ，６５．０３；Ｈ，４．３７；Ｎ，３．７９。実測値：Ｃ，６４．７７；Ｈ，４．３１；Ｎ，３．７６。
【０１０８】
実施例４．化合物２は抗リウマチ作用を有する。
８−１０週齢の４２匹の雄ルイスラットを標準的な施設の操作手順で飼育した。それらに不断の餌と水による標準的な管理を行った。各動物を計画群を示すケージカードおよび動物番号により識別した。各ラット番号を尻尾上に消えないインクマーカーでマークした。フロイント完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ−Ｃｏｍｐｌｅｔｅ）（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して関節炎を誘導した。各ｍＬには、加熱滅菌されて乾燥された１ｍｇの結核菌、０．８５ｍＬのミネラルオイルおよび０．１５ｍＬのマニーデモノオレート（ｍａｎｎｉｄｅ  ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ）（ロット番号０８４Ｈ８８００）を包含した。
【０１０９】
ラット尻尾の付け根に０．１ｍＬのフロイント完全アジュバントを皮内注射した。これらの動物を６匹のラットを含む７つの群に無作為に分けた。これらの群に、ビヒクル（２％  Ｔｗｅｅｎ８０、０．５％  メチルセルロース）、または１．０ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、もしくは０．１ｍｇ／ｋｇの化合物２を経口により毎日与えた。アジュバント注射後８日からこれらのラットに処置を開始した。
【０１１０】
関節炎の重症の程度を以下の疾患指標に関して毎日モニターした：後肢の紅斑、後肢の膨張、関節の圧痛、および動作と姿勢。０から３の整数スケールを用いて紅斑（０＝正常の肢、１＝軽度の紅斑、２＝中程度の紅斑、３＝重度の紅斑）と膨張（０＝正常の肢、１＝軽度の膨張、２＝中程度の膨張、３＝後肢の重度な膨張）のレベルを数値化した。１日あたりの最大スコアは１２である（表３）。
表３．肢の膨張における化合物２の効果
【表３】
2008527045.tif 000009
【０１１１】
Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  Ｓｕｐｅｒ分散分析（カリフォルニア州、バークレイのＡｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，  Ｉｎｃ．）を用いて統計解析を行った。目的の全てのパラメーターを群間のダンカンの新多範囲事後検定を伴う分散分析の条件下にした。データを平均±標準偏差（ＳＤ）として表し、ｐ＜０．０５の場合に差異を有意と判断した。
【０１１２】
関節のスコアについては、各化合物の濃度応答実験の結果を表３で表す。化合物２による処置後に肢の膨張と紅化の減少を観察した。これらは濃度応答性であると示唆された。ビヒクル処理ラットが肢の膨張と紅化を伴う重症の関節炎であることは明らかであった。
【０１１３】
研究の終了時点のラットをＣＯ２により安楽死させ、後肢を解剖で除去し、１０％の緩衝化ホルマリンで固定し、足根関節を脱灰し、パラフィンで包埋した。組織切片をヘマトキシリンとエオシン染色あるいはサフラニンＯ−ファストグリーン（Ｓａｆｆｒａｎｉｎ  Ｏ−Ｆａｓｔ  Ｇｒｅｅｎ）染色で染色した。
【０１１４】
試験者が処理群に左右されないためにスライドを符号化した。足根関節由来の滑膜組織を、滑膜の肥厚、炎症細胞の浸潤、およびパンヌス形成に基づいて評価した（表４を参照）。関節軟骨と骨をマンキンの組織学的グレーディングシステムを用いて評価した。滑膜軟骨の生化学的異常および代謝の異常を骨関節炎のヒトの腰由来のものと同様にして評価した（Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ（ＡＭ）５３Ａ：１５２−１５３を参照）（表５）。
表４．滑膜炎スコア
【表４】
2008527045.tif 000010
表５．マンキンスコア
【表５】
2008527045.tif 000011
【０１１５】
以下の表６と表７で表すように、化合物の処置後に滑膜と軟骨両方のスコア改善が観察された。化合物２はテストされた全ての濃度（下は０．１ｍｇ／ｋｇまで）で滑膜と軟骨のスコア全体を有意に改善した。これは、該化合物が関節炎治療の重要な要素である疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）として機能し得ることを示す。
【表６】
2008527045.tif 000012
ａ平均±標準偏差
＊有意＜ビヒクル
＃有意＜化合物２、０．１ｍｇ／ｋｇ
ｔ有意＜化合物２、０．１ｍｇ／ｋｇ
【表７】
2008527045.tif 000013
ａ平均±標準偏差
＊有意＜ビヒクル
＃有意＜化合物２、０．１ｍｇ／ｋｇ
ｔ有意＜化合物２、０．１ｍｇ／ｋｇ
【０１１６】
コラーゲン誘導関節炎モデルにおける評価
関節炎がＩＩ型コラーゲンに対して産生されるモノクローナル抗体とリポ多糖（ＬＰＳ）により誘導された、６−８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて化合物２を評価した。動物に０日目で合計４ｍｇ／マウスとなる４つの異なるｍＡｂの組み合わせで静脈内投与し、続いて７２時間（３日）後に２５ｍｇのＬＰＳの静脈内投与を行った。３日目のＬＰＳ投与１時間後に、テスト化合物を経口のより１日１回１５日間与えた。各動物において、０、５、７、１０、１４および１７日目に両後肢体積の増加を水セル（１２ｍｍ平方）による足容積測定装置を用いて測定した。後肢浮腫の３０％以上の減少を有意と判断した。
【０１１７】
化合物２は、２．５ｍｇ／ｋｇで経口投与される場合、実験を通じて脚の浮腫の３０％以上を有意に抑制した。
【０１１８】
実施例５．化合物２は子宮の湿重量に影響しない
化合物の選択性を示す対照として、化合物２を、２．０％  Ｔｗｅｅｎ８０（ｗ／ｖ）／０．５％メチルセルロース（ｗ／ｖ）のビヒクルに５０ｍｇ／ｋｇの濃度で未成熟雌ラット（ｎ＝６／処理）に経口で与えた。動物を強制飼養により１日１回３日間処置した。４日目（最後の投薬後２４時間）の安楽死の後に子宮を除去し、残存する脂肪と腸間膜をはぎ取って重量を測定した。化合物の用量（５０ｍｇ／ｋｇ）は上記実験の効果のある用量より５００倍高かった。図５のグラフで示されるように、１．５ｍｇ／ｋｇ（ＥＣ８０）で与えられた１７α−エチニルエストラジオール（ＥＥ）が子宮の重量を有意に促進する一方で、化合物２は子宮の湿重量の増加を示さなかった。
【０１１９】
実施例６：ＥＲアルファ−ＬＢＤ／化合物１とＥＲアルファ−ＬＢＤ／化合物２の結晶構造を調べた。
ヒトＥＲアルファ−ＬＢＤ（図６）をｐＥＴ１６ｂ発現ベクター（ウィスコンシン州、マディソンのＮｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）にクローン化し、タンパク質をＢｉｏｓｔａｔ  Ｃ−１０バイオリアクター（ペンシルベニア州、アレンタウンのＢ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）における大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３−ＲＰ細胞（カリフォルニア州、ラ・ホーヤのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）の高密度培養により過剰発現させた。培養液を１．０ｍＭ  ＩＰＴＧ（最終濃度）によって３７℃で３時間誘導した。細胞ペレットを−８０℃でストックする前に液体窒素で急速凍結した。
【０１２０】
細胞ペレットを１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび４ｍＭ  ＤＴＴの緩衝液中で再懸濁した。細胞懸濁液をミクロフルイダイザー（Ｍｏｄｅｌ  １１０Ｙ、マサチューセッツ州、ニュートンのＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｃｏｒｐｔ）に５回通して分離した。４℃で３０分間遠心（１３，０００ｘｇ）後、ペレットを同一緩衝液中の４Ｍ  尿素で抽出した。遠心後、尿素抽出物をエストラジオール−セファロース高速流動カラムに適用した。最初にカラムを前記緩衝液中の１Ｍ  尿素で洗浄し、次に、１）５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、７００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１ｍＭ  ＤＴＴ；２）１０％  ジメチルホルムアミド中の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、２５０ｍＭ  ＮａＳＣＮ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１ｍＭ  ＤＴＴ；ならびに３）１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で連続的に洗浄した。ＥＲアルファ−ＬＢＤがまだエストラジオール−アフィニティーカラムに結合されている間に、カラムを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ中の５ｍＭ  ヨード酢酸、ｐＨ８．０、４℃で一晩平衡化して、カルボキシメチル化を行った。カルボキシメチル化されたＥＲアルファＬＢＤをＮａＳＣＮ含有緩衝液中のリガンドと一緒に溶離した。異なるリガンド含有の溶離緩衝液は、１００μＭ  １７β−エストラジオール、または２００μＭ  化合物１もしくは２００μＭ  化合物２を含有した。リガンド結合受容体の存在をＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べた。リガンド結合ＥＲアルファ−ＬＢＤを含む画分をプールし、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅにより濃縮した。リガンド結合ＥＲアルファ−ＬＢＤを含む濃縮溶液を、５０ｍＭ  重炭酸アンモニウム、ｐＨ７．５で平衡化されたＢｉｏＲａｄの使い捨て脱塩カラムで脱塩し、結晶化試験に使用した。
【０１２１】
リガンドと複合体を形成したＥＲアルファ−ＬＢＤの結晶化条件を、Ｈａｍｐｔｏｎの結晶化スクリーン（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｃｒｅｅｎ）（カリフォルニア州、アリソ・ヴィージョのＨａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて調べた。１回のスクリーンにおいて、３ｍｌのタンパク質溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を３ｍｌの沈殿剤（２０％  ＰＥＧ３３５０、０．１５Ｍ  塩化リチウム、ｐＨ７．５で０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、および４％  ベンズアミジン塩酸）と混合し、１８℃で１ｍｌの沈殿溶液に対して平衡化した。結晶は３日後に出現し始め、最大０．３ｘ０．２ｘ０．０８ｍｍ３の大きさまで育成した。
【０１２２】
３０．０−２．４Åにおける分解能データをＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＬＳ）（カリフォルニア州、バークレイ）のＱｕａｎｔｕｍ  ４  ＣＣＤ面積検出器（ａｒｅａ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を用いて収集した。データを−１３０℃で収集し、ＤＥＮＺＯとＳＣＡＬＥＰＡＣＫ（ＯｔｗｉｎｏｗｓｋｉとＭｉｎｏｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７６：３０７−３２６，１９９７）を用いて処理した。ＥＲアルファ／化合物１とＥＲアルファ／化合物２両方の共結晶は、非対称単位あたり２分子を有する空間群２に属する。
【０１２３】
ＥＲアルファ分子は、ＡｍｏＲｅ（Ｎａｖａｚａ，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ａ５０：１５７−１６３，１９９４）による回旋と翻訳の研究における２ｅｒｄ．ｐｄｂ（Ｓｈｉａｕら，Ｃｅｌｌ  ９５：９２７−３７，１９９８）由来の２量体モデルを用いて位置付けられる。構造のリファインメントを３０から２．４Åまでの分解能全てのデータを用いてＣＮＳ（Ｂｒｕｎｇｅｒら，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５４：９０５−９２１，１９９８）により実行した。両構造において、リガンドの位置とヘリックス１２の位置を３Ｆｏ−２ＦｃとＦｏ−Ｆｃ電子密度マップを使用して同定した。再構築、最小化、および個々のＢ因子リファインメントのサイクル後、ＲｗｏｒｋとＲｆｒｅｅ因子は、ＥＲアルファ−ＬＢＤ／化合物１複合体構造において２４．１％と２７．５％まで、およびＥＲアルファ−ＬＢＤ／化合物２複合体構造において２６．７％と３０．５％まで収束した。最終モデルは、２コピーのタンパク質（残基３０７−５４６、そのうち、残基３３３−３４０、４５９−４７１および５２８−５３５を無秩序であるために除いた）、２つのリガンド、および水分子を含む。表８はデータ収集パラメーターと結果を集約する。
【表８】
2008527045.tif 000014
【表９】
2008527045.tif 000015
【０１２４】
化合物１および化合物２に結合したＥＲアルファ−ＬＢＤの結晶構造の構造座標をそれぞれ表９と表１０に表す。表において、「＃」の列は、座標が寄与される各原子にインデックスを割り当てる。「名」の列は、原子のタイプを示し、「残基」の列は、原子が属するアミノ酸残基のタイプを示す。「鎖」は、原子が属するポリペプチドを示す。「残基＃」は、原子の残基数を与える。例えば、表９の一行目の原子番号１はＬｅｕ３０６のβ炭素（ＣＢ）である。ｘ、ｙ、およびｚの構造座標を各々、Ｘ、Ｙ、およびＺの列で与える。「ｏｃｃ」の列は、原子が占める占有率（１．００＝全て占有）を表し、「Ｂ」の列は、Å２単位におけるＢ因子（もしくは温度因子）を提供する。表９における結合化合物１の座標を、残基の列の項目「９１６」で表示し、表１０における結合化合物２の座標を、残基の列の項目「１３２」で表示する。水は「ＨＯＨ」による表９と１０で表示される。
【０１２５】
化合物１および化合物２と複合体を形成したＥＲアルファの全体構造は、以前に報告されたＥＲアルファ構造（Ｂｒｚｏｚｏｗｓｋｉら，Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：７５３−８，１９９７）と非常に類似する。逆平行α−へリックスと短β−リボンの三層から形成される（図１）。両構造において、リガンドは、へリックスＨ３、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ１１の側鎖、および鎖Ｓ１により形成される疎水性空洞内に配置される。非結晶学的二量体は、へリックスＨ１０とＨ１１によって形成される広い接触面を有する。Ｎ末端の５つの残基（Ｈ１）およびＨ１１とＨ１２を結ぶループは電子密度マップでは観察できない。
【０１２６】
図２と図３は、化合物１と化合物２およびＥＲアルファの天然リガンド、１７β−エストラジオールの結合様式における類似性と相違性を示す。全ての共構造において、リガンドは、それらのフェノールがＧｌｕ３５３の塩橋および空洞の一端の構造的に保存された水分子と水素結合を形成するような様式で配置される。化合物１はまた、空洞の先端近傍のＡｒｇ３９４塩橋と水素結合を形成する。しかし、へリックスＨ１１の近傍では、化合物１のトリフルオロメチル基と化合物２のフルオロ基がＨｉｓ５２４を直接指し示すにもかかわらず、化合物１と化合物２はＨｉｓ５２４のイミダゾール側鎖に結合する水素を欠落する。リガンドとの疎水性相互作用に関するアミノ酸残基の立体配座は、その他の点では、ＥＲアルファ／１７β−エストラジオール複合体で確かめられた立体配座に近い。
【０１２７】
ＥＲアルファ／ラロキシフェン構造との比較（図４）は、Ｈ１２の適正な組立とＮＲ−ボックス結合を立体的に阻害するラロキシフェンと異なり、化合物１と化合物２の結合様式が明確な直接的な立体障害が全くないことを表す。それにもかかわらず、へリックスＨ１２はリガンド結合部位上の特徴的な位置から離され、共アクチベーターのペプチド結合部位を占める。それゆえ、構造の観点から、これらの２つのリガンドがＨ１２を誘導してアンタゴニストに類似した位置を利用すると示唆される。
【０１２８】
【表１０】
2008527045.tif 000016
【０１２９】
【表１１】
2008527045.tif 000017
【０１３０】
【表１２】
2008527045.tif 000018
【０１３１】
【表１３】
2008527045.tif 000019
【０１３２】
【表１４】
2008527045.tif 000020
【０１３３】
【表１５】
2008527045.tif 000021
【０１３４】
【表１６】
2008527045.tif 000022
【０１３５】
【表１７】
2008527045.tif 000023
【０１３６】
【表１８】
2008527045.tif 000024
【０１３７】
【表１９】
2008527045.tif 000025
【０１３８】
【表２０】
2008527045.tif 000026
【０１３９】
【表２１】
2008527045.tif 000027
【０１４０】
【表２２】
2008527045.tif 000028
【０１４１】
【表２３】
2008527045.tif 000029
【０１４２】
【表２４】
2008527045.tif 000030
【０１４３】
【表２５】
2008527045.tif 000031
【０１４４】
【表２６】
2008527045.tif 000032
【０１４５】
【表２７】
2008527045.tif 000033
【０１４６】
【表２８】
2008527045.tif 000034
【０１４７】
【表２９】
2008527045.tif 000035
【０１４８】
【表３０】
2008527045.tif 000036
【０１４９】
【表３１】
2008527045.tif 000037
【０１５０】
【表３２】
2008527045.tif 000038
【０１５１】
【表３３】
2008527045.tif 000039
【０１５２】
【表３４】
2008527045.tif 000040
【０１５３】
【表３５】
2008527045.tif 000041
【０１５４】
【表３６】
2008527045.tif 000042
【０１５５】
【表３７】
2008527045.tif 000043
【０１５６】
【表３８】
2008527045.tif 000044
【０１５７】
【表３９】
2008527045.tif 000045
【０１５８】
【表４０】
2008527045.tif 000046
【０１５９】
【表４１】
2008527045.tif 000047
【０１６０】
【表４２】
2008527045.tif 000048
【０１６１】
【表４３】
2008527045.tif 000049
【０１６２】
【表４４】
2008527045.tif 000050
【０１６３】
【表４５】
2008527045.tif 000051
【０１６４】
【表４６】
2008527045.tif 000052
【０１６５】
【表４７】
2008527045.tif 000053
【０１６６】
【表４８】
2008527045.tif 000054
【０１６７】
【表４９】
2008527045.tif 000055
【０１６８】
【表５０】
2008527045.tif 000056
【０１６９】
【表５１】
2008527045.tif 000057
【０１７０】
【表５２】
2008527045.tif 000058
【０１７１】
【表５３】
2008527045.tif 000059
【０１７２】
【表５４】
2008527045.tif 000060
【０１７３】
【表５５】
2008527045.tif 000061
【０１７４】
【表５６】
2008527045.tif 000062
【０１７５】
【表５７】
2008527045.tif 000063
【０１７６】
【表５８】
2008527045.tif 000064
【０１７７】
【表５９】
2008527045.tif 000065
【０１７８】
【表６０】
2008527045.tif 000066
【０１７９】
【表６１】
2008527045.tif 000067
【０１８０】
【表６２】
2008527045.tif 000068
【０１８１】
【表６３】
2008527045.tif 000069
【０１８２】
【表６４】
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【０１８３】
【表６５】
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【０１８４】
【表６６】
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【０１８５】
【表６７】
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【０１８６】
【表６８】
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【０１８７】
【表６９】
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【０１８８】
【表７０】
2008527045.tif 000076
【０１８９】
【表７１】
2008527045.tif 000077
【０１９０】
【表７２】
2008527045.tif 000078
【０１９１】
【表７３】
2008527045.tif 000079
【０１９２】
【表７４】
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【０１９３】
【表７５】
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【０１９４】
【表７６】
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【０１９５】
【表７７】
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【０１９６】
【表７８】
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【０１９７】
【表７９】
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【０１９８】
【表８０】
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【０１９９】
【表８１】
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【０２００】
【表８２】
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【０２０１】
【表８３】
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【０２０２】
【表８４】
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【０２０３】
【表８５】
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【０２０４】
【表８６】
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【０２０５】
【表８７】
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【０２０６】
【表８８】
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【０２０７】
【表８９】
2008527045.tif 000095
【０２０８】
【表９０】
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【０２０９】
【表９１】
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【０２１０】
【表９２】
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【０２１１】
【表９３】
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【０２１２】
【表９４】
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【０２１３】
【表９５】
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【０２１４】
【表９６】
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【０２１５】
【表９７】
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【０２１６】
【表９８】
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【０２１７】
【表９９】
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【０２１８】
【表１００】
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【０２１９】
【表１０１】
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【０２２０】
【表１０２】
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【０２２１】
【表１０３】
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【０２２２】
【表１０４】
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【０２２３】
【表１０５】
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【０２２４】
【表１０６】
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【０２２５】
【表１０７】
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【０２２６】
【表１０８】
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【０２２７】
【表１０９】
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【０２２８】
【表１１０】
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【０２２９】
【表１１１】
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【０２３０】
【表１１２】
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【０２３１】
【表１１３】
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【０２３２】
【表１１４】
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【０２３３】
【表１１５】
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【０２３４】
【表１１６】
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【０２３５】
【表１１７】
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【０２３６】
【表１１８】
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【０２３７】
【表１１９】
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【０２３８】
【表１２０】
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【０２３９】
【表１２１】
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【０２４０】
【表１２２】
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【０２４１】
【表１２３】
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【０２４２】
【表１２４】
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【０２４３】
【表１２５】
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【０２４４】
【表１２６】
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【０２４５】
【表１２７】
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【０２４６】
【表１２８】
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【０２４７】
【表１２９】
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【０２４８】
【表１３０】
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【０２４９】
【表１３１】
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【０２５０】
【表１３２】
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【０２５１】
【表１３３】
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【０２５２】
【表１３４】
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【０２５３】
【表１３５】
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【０２５４】
【表１３６】
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【０２５５】
【表１３７】
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【０２５６】
【表１３８】
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【０２５７】
【表１３９】
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【０２５８】
他の具体例は特許請求の範囲にある。
【図面の簡単な説明】
【０２５９】
【図１】化合物１、化合物２もしくは１７β−エストラジオールの代表的なリガンドとの複合体であるＥＲアルファ二量体の構造を表すリボン図である。構造へリックスは、「Ｈ２」、「Ｈ３」、等で表される。構造シートはＳ１およびＳ２によって示される。
【図２】ＥＲアルファに結合される１７β−エストラジオールと化合物１の構造を比較する棒状モデル（ｓｔｉｃｋ  ｍｏｄｅｌ）である。
【図３】ＥＲアルファに結合される１７β−エストラジオールと化合物２の構造を比較する棒状モデルである。
【図４】ＥＲアルファに結合されるラロキシフェンと化合物１の構造を比較する棒状モデルである。丸括弧は、化合物１とラロキシフェンがＥＲアルファに結合される時のへリックス１２（Ｈ１２）の位置を示す。
【図５】ビヒクル、１７α−エチニルエストラジオール（ＥＥ）、もしくは化合物２に対する子宮の重量（ｍｇ）の比較を表すグラフである。
【図６】ヒトＥＲアルファ受容体（配列番号１）のアミノ酸配列である。結晶化に用いられる配列（ＥＲアルファリガンド結合ドメイン）は下線で示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年9月18日(2007.9.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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