(57)【要約】  （ｉ）試料と、生細胞に感染することのできるウイルスを、当該ウイルスが、任意のそのような生細胞内に感染し複製することができる条件下でインキュベートすること；（ｉｉ）細胞中のウイルスの複製により得られる任意の核酸を検出すること、を含んで成る、試料中の生細胞、例えば細菌細胞を検出するための方法。
2008529548.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）試料と、生細胞に感染することのできるウイルスを、当該ウイルスが、任意のそのような生細胞内に感染し複製することができる条件下でインキュベートすること；
（ｉｉ）細胞中のウイルスの複製により得られる任意の核酸を検出すること、ただし、当該ウイルスが、マーカー配列を含むように改変された改変ウイルスである場合、検出される核酸は、細胞内でのウイルスの複製により独自に産生されたものである、
を含んで成る、試料中の生細胞を検出するための方法。
【請求項２】
段階（ｉｉ）で検出される核酸が、ウイルス自体の中に含まれず、細胞内でのウイルスの複製により独自に産生される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ウイルスがＲＮＡウイルスである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
段階（ｉｉ）において検出される核酸が、細胞中で、ＲＮＡウイルス内のＲＮＡ配列からの逆転写により産生されるｃＤＮＡである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
段階（ｉｉ）の前に、試料をＲＮＡｓｅで処理する、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
ウイルスが天然のＤＮＡ又はＲＮＡウイルスであり、段階（ｉｉ）において検出される核酸がウイルス内で生じ、試料中のこの核酸の量の増大が段階（ｉｉ）で検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ウイルスが、天然のウイルスであり、細胞に特異的である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
段階（ｉｉ）において検出される核酸が、増幅反応を用いて検出される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
段階（ｉｉ）における検出の前に、試料中の任意の無傷細胞を溶解する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
試料が、食品試料又は臨床試料である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
細胞が細菌細胞であり、ウイルスがバクテリオファージである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
細胞が、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、又はストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の特定の細胞を検出するための方法を実施するためのキットであって、ウイルス、及び細胞中でウイルスの複製により得られた核酸を検出するのに必要な１つ以上の試薬を含んで成るが、ただし、ウイルスが、マーカー配列を含むように改変された改変ウイルスである場合、その１つ以上の試薬が、細胞内でのウイルスの複製により独自に産生された核酸を検出するために必要である、前記キット。
【請求項１５】
ウイルスが検出される核酸を含んでおらず、１つ以上の試薬が、細胞内でのウイルスの複製により独自に産生された核酸を検出するために必要である、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
ＲＮＡウイルス、及びＲＮＡウイルス内での配列の逆転写により得られるｃＤＮＡを検出するための１つ以上の試薬を含んで成る、請求項１４又は１５に記載のキット。
【請求項１７】
ウイルスが、検出される核酸を含んで成る天然のＤＮＡ又はＲＮＡウイルスであり、１つ以上の試薬がこの核酸の量の増大を検出するために必要である、請求項１４に記載のキット。
【請求項１８】
１つ以上の試薬が、１組の増幅プライマーを含んで成る、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１９】
汚染ＤＮＡを除去するために処理されたＲＮＡウイルス調製物。
【請求項２０】
ウイルスが、請求項１９に記載のウイルス調製物である、請求項１４〜１６又は１８のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、試料中の生細胞の存在を検出するための方法、及び当該方法における使用のためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌及び他の生物の迅速な検出は、公衆安全の分野において非常に重要である。食品又は飲料が、有害な細菌及び他の微生物、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）０１５７による汚染が存在しないことが必須である食品産業において特に重要である。
【０００３】
潜在的に有害な細菌及び他の生物を迅速に同定し、感染を抑制し、動物又は患者に対して正しい処置を施すことを可能にすることも、獣医及び医療診断の分野において非常に重要である。医薬、化粧品及び獣医用調製物に、有害な汚染物質、例えば細菌が存在しないことも重要である。
【０００４】
いくつかの細菌及び他の微生物に加えて、例えば炭疽菌は、生物兵器剤としての使用の可能性を有する。従って、試料中のそのような生物を迅速に試験することができることは重要である。例えば、炭疽菌胞子の初期の吸入後に有効な処置を施すには６時間しか存在しないと推定されてきた。
【０００５】
細菌及び他の生物を検出するためのいくつかの方法が、現在利用可能である。
【０００６】
例えば、試料中の細菌の存在を検出するために、従来の培養に基づいた方法を用いることができる。しかし、そのような試験において一般的に遭遇する問題は、試料中の生物の濃度が一般的に非常に低いということである。従って、試験を実施する前に相当な時間試料をインキュベートし、生物を検出可能なレベルまで培養することが必要であり得る。この遅延は、公衆衛生が危険である多くの状況において許容できないものであり得る。
【０００７】
或いは、ＰＣＲ及び他の核酸増幅技術は、細菌及び他の生物の存在を検出するための、速くそして高感度なＤＮＡに基づいた手段を提供する。これらの技術は、一般的に、増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた細菌ＤＮＡの検出に頼る。
【０００８】
しかし、ＤＮＡは非常に頑丈な化学種であり、宿主細胞が死んだ場合でも残存することができるので、このような増幅技術に関連する不都合が存在する。
【０００９】
例えば、家禽生産物が病原細菌、例えばサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）で汚染され、その後調理された場合に、食品は安全な状態にされるだろう。従来の培養に基づいた検出方法は、安全であることを示すが、当該方法は実施するのに長い時間を要する。一方、より迅速なＤＮＡの方法は、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＤＮＡは試料中にいまだ存在しているので、間違ったポジティブな結果を示すだろう。
【００１０】
或いは、ＷＯ２００３／０３５８８９は、マーカー配列を含む改変ファージを、生細胞を検出するために用いる技術について記載する。この方法においては、改変ファージは、試験する試料に導入される。生細胞が存在する場合、当該ファージは細胞機構を用いて複製することができ、これはマーカー配列の検出可能な増大をもたらす。
【００１１】
しかし、この技術に関連する不都合が存在する。
【００１２】
第一に、ファージは所望のマーカー配列を含むように具体的に改変されなければならないので、マーカー配列を組み込む必要性は、試験の複雑性を必然的に増大させる。従って、このような改変ファージは、このような試験のコスト及び複雑性を増大させるだろう。
【００１３】
更に、マーカー配列は試験する試料に添加されるので、ファージ中のその存在により、試料中のこのマーカー配列の量の任意の増大を定量的に検出する必要がある。これは、偽陽性結果が発生しないことを確実にするために、インキュベーション期間を十分長くする必要があることを意味する。
【００１４】
従って、潜在的な生物的危険性のための信用できる試験方法であって、容易に操作することができ、低いレベルの偽陽性又は偽陰性結果を確実に有する方法を提供する必要性が存在する。
【発明の開示】
【００１５】
従って、本発明は、
（ｉ）試料と、生細胞に感染することのできるウイルスを、当該ウイルスが、任意のそのような生細胞内に感染し複製することができる条件下でインキュベートすること；
（ｉｉ）細胞中のウイルスの複製により得られる任意の核酸を検出すること、
を含んで成る、試料中の生細胞を検出するための方法を提供する。
【００１６】
具体的にウイルスの複製により得られた核酸を検出することにより、死細胞と単純に比較して、試料中に存在する生細胞が存在することを決定することができる。
【００１７】
特定の実施態様において、本発明は、
（ｉ）試料と、生細胞に感染することのできるウイルスを、当該ウイルスが、任意のそのような生細胞内に感染し複製することができる条件下でインキュベートすること；
（ｉｉ）細胞中のウイルスの複製により得られる任意の核酸を検出すること、ただし、当該ウイルスが、マーカー配列を含むように改変された改変ウイルスである場合、検出される核酸は、細胞内でのウイルスの複製により独自に産生されたものである、
を含んで成る、試料中の生細胞を検出するための方法を提供する。
【００１８】
任意の生細胞が段階（ｉ）の間に感染されることを確実にするために、それらをプレコンディショニング段階（例えば、ウイルスの添加前に、それらを、例えば２．５〜４．５時間の適切な期間、例えば３７℃〜４２℃のインキュベーション温度にする）にかけることができる。これは、例えば免疫磁気分離法のような貯蔵又は単離手順の結果として、試料がストレスを受けたバクテリアを含む場合に、特に必要であり得る。その後、それらは、感染といくらかの複製が生じるのを可能にする一定の期間、インキュベーション温度にとどめることができる。
【００１９】
用いるウイルスは、一本鎖（ｓｓ）又は二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ又はＤＮＡウイルスであることができる。
【００２０】
段階（ｉｉ）で検出される核酸は、ウイルスそれ自体の中で発生する。この場合、試料中に存在するこの核酸の量の増大を定量的に検出する必要がある。この方法は、マーカー配列を含むようにウイルスを改変する必要がないので、ＷＯ０３／０３５８８９に記載されたものより有利である。
【００２１】
しかしながら、好ましくは、段階（ｉｉ）で検出される核酸は、ウイルス自体の中に含まれないが、細胞内でウイルスの複製により独自に産生される。これは、生細胞がウイルスの産生に利用されるので、この特定の配列を有する任意の核酸の検出は、試料中の生細胞の存在の指標であることを意味する。
【００２２】
ウイルスは、野生型ウイルス又は改変ウイルスのいずれかであることができる。ウイルスがマーカー配列を含むように改変された改変ウイルスである場合、検出される核酸は、細胞内におけるウイルスの複製により独自に産生されるものである。
【００２３】
特定の実施態様において、ウイルスは、任意のマーカー配列、例えば標的繰り返し配列を含むように改変されていない。
【００２４】
しかしながら、ウイルスは、他の目的、例えばウイルスの感染性又は特異性を増大させるために改変することができる。このようなウイルスは商業的に入手可能であり、従って、この方法の複雑性やコストを顕著に増大させることなく、天然のウイルスを超える利点を提供することができ、或いはそれらは従来の組み換え方法を用いて作り出すことができる。
【００２５】
選択される検出オプションは、用いる特定のウイルスに依存するだろう。
【００２６】
具体的な実施態様において、ウイルスは、ＲＮＡウイルス、特に一本鎖ＲＮＡウイルスである。
【００２７】
具体的な好ましい一本鎖ＲＮＡウイルスは、クラスＶＩのＲＮＡウイルスであり、これはシングルポジティブＲＮＡ鎖を含んで成る。これらのウイルスは、逆転写と呼ばれる方法を用いて、それらのＲＮＡを相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換する。ＲＮＡのｃＤＮＡへの変換は、ウイルスの宿主細胞内の複製を可能にする。
【００２８】
しかしながら、上記の段階（ｉｉ）で産生されたｃＤＮＡの検出は、感染され、ウイルス感染を維持することのできる生細胞が、試料中に存在するという指標を提供する。
【００２９】
逆転写を実施するのに必要な逆転写酵素は、ビリオン中にしばしば存在する酵素であり、従って、ウイルスは、この必須の酵素を提供するのに宿主細胞に頼る必要はない。しかし、宿主は、ウイルスが、宿主細胞内で感染し、複製することができるように、多くの他の因子を提供しなければならない。
【００３０】
例えば、ウイルスの宿主細胞への内在化は、表面タンパク質及びウイルスが相互作用しなければならない細胞膜などの宿主因子を必要とする。更に、逆転写は、ウイルスＲＮＡからｃＤＮＡを形成するのに必要なｄＮＴＰ基質を含む安定な環境を必要とする。
【００３１】
宿主細胞が生きておらず、従って上記のもののような追加因子を産生しない場合、ウイルスは宿主細胞内に感染し複製することができないので、例えば増幅反応の標的を形成し得る検出可能なＤＮＡを産生しない。
【００３２】
宿主細胞が生きている場合、ＲＮＡウイルスは、宿主細胞内に感染、複製し、検出可能なｃＤＮＡを産生することができるだろう。宿主細胞が生きていない場合、ウイルスは宿主細胞に感染し、そして／或いはその中で複製することができないので、ｃＤＮＡは検出されないだろう。
【００３３】
本発明のこの実施態様においては、段階（ｉ）において、十分長い時間試料をインキュベートし、少なくとも１つのｃＤＮＡが宿主細胞により産生されることを確実にすることだけが必要である。その後、それは、ＰＣＲなどの従来の増幅反応を用いて検出することができる。しかしながら、多コピーを産生するのに十分に長い時間のインキュベーションを実施することもできる。一般的に、３０分〜１時間の期間のインキュベーションは、検出可能な核酸を産生するのに十分であるだろう。
【００３４】
或いは、ウイルスは、クラスＶのウイルスなどのシングルネガティブ鎖ＲＮＡ分子を含んで成ることができる。生きた宿主細胞を感染させると、当該細胞は、相補的なポジティブＲＮＡ鎖、具体的にはｍＲＮＡ鎖を産生するだろう。しかしながら、上記のとおり、この工程は、感染細胞の安定な環境においてのみ生じ得る。このように産生されたポジティブＲＮＡ鎖は、その後、例えば従来の逆転写ＰＣＲ反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて検出することができる。
【００３５】
好ましくは、検出は、ＲＴ段階においてシングルプライマーを用いて実施され、単一の相補的ＤＮＡ分子のみが産生される。
【００３６】
具体的な実施態様において、このｃＤＮＡは、その後、ｃＤＮＡ内の領域を増幅するように設計された、従来のＰＣＲ増幅により検出される。この増幅の前のＲＮＡ鎖の消化は、汚染を最小にするのを確実にするために好ましい。
【００３７】
或いは、ウイルス核酸自体の量の増大は、生細胞の存在の指標として用いることができる。これは、ウイルスの複製は、生細胞内でのみ起こり得ることによる。この実施態様において、検出される核酸は、レポーター配列以外であり、好ましくは野生型の配列である。
【００３８】
例えば、ウイルスが、ＤＮＡウイルス、例えば一本鎖クラスＩＩウイルス、又は二本鎖クラスＩウイルスである場合、一般的に、試料中に具体的に生細胞が存在していることを決定するためには、感染後のＤＮＡの全体的な増大を検出する必要があるだろう。これは様々な方法で実施され得るが、おそらくは、定量的ＰＣＲ試験、例えばＴＡＱＭＡＮ（登録商標）試験などを用いてＤＮＡを増幅するのが最も便利である。
【００３９】
ウイルスがＲＮＡウイルスである場合、ＲＮＡの増大は、例えばＲＴ−ＰＣＲを用いて検出される必要があり得る。
【００４０】
本発明の方法において試験される試料は、任意の試料であることができ、それは原核生物細胞及び／又は下等真核細胞及び／又は高等真核細胞を含む疑いがあるか、或いは含むことが知られている。
【００４１】
本発明の範囲内に含まれる試料の例としては、食品試料、ヒト又は動物の体液又は組織の試料、特に臨床試料、医薬、化粧品又は獣医用調製物、又は薬剤、植物試料、土壌試料、空気試料、水試料及び細胞培養試料が挙げられる。最も好ましくは、試料は食品試料である。
【００４２】
本発明のこの方法は、ウイルスが感染することのできる任意の細胞の生きた例の検出に適用することができる。これらは、原核細胞又は真核細胞を含む。この細胞は、例えば細菌などの微生物であることができる。検出することのできる細菌の具体的な例としては、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、又はストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）が挙げられる。
【００４３】
或いは、細胞は、小さな生物、例えば昆虫、植物又は真菌の中に含まれ得る。
【００４４】
或いは、それらは、細胞又は細胞株、例えば哺乳動物細胞株、植物及び真菌細胞株の中に存在し得る。細胞株中の生細胞の検出は、例えば医薬試薬又は他の試薬のスクリーニングの際、或いは生物学的分析の際にしばしば実施され、本明細書中に記載の方法は、この関係において有用であり得る。
【００４５】
この方法は、例えば、抗生物質により特定の細菌感染に対して処置された患者からの細胞含有試料を分析する際に特に有用であり得る。これらの患者から得た適切な試料は、本明細書中に記載の方法により試験し、抗生物質処置が効果的であるか否かを決定することができる。
【００４６】
ウイルスは、野生型ウイルス又は組み換えウイルスであることができる。細胞が生きている場合、ウイルスは、それに感染し、ポジティブＲＮＡの場合には、１つのｃＤＮＡを産生することにより、或いは他の場合には、より多くのＲＮＡ、特にｍＲＮＡを産生することにより複製することができる。改変ウイルスの場合、例えば、細胞内のウイルスの複製において独自に産生される導入されたマーカー配列の相補的配列の検出は、生細胞の存在の明確な指標を提供することができる。適切なマーカー配列としては、抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
【００４７】
上記の方法は、ウイルスにより感染され得る任意のタイプの細胞の生存性の検出に用いることができるという点で、その性質において一般的である。例えば、試料が、生きたＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に対して試験する必要がある場合、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）０１５７細胞を感染させることのできる任意のウイルスを用いることができる。
【００４８】
いくつかの試料、例えばミルク又は土壌試料の場合、存在する細菌又は他の細胞のタイプの数は、非常に多い。このような試料中の特定のタイプの細胞の生存性の試験は、当然のことながら困難である。しかしながら、本発明の好ましい実施態様において、用いるウイルスは、細胞のタイプに特異的であり、生きた形態でその存在が調査される。言い換えれば、この実施態様において、用いるウイルスは、調査中の細胞タイプの中でのみ感染し複製することができなければならない。
【００４９】
例えば、既知の大腸菌ファージは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ（Ａｂｅｒｄｅｅｎ、ＵＫ、ＮＣＩＭＢ  １０３５９）から入手可能である。Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｐａｔｅｕｒ（Ｓａｎｏｆｉ）Ｗａｔｆｏｒｄ  ＵＫから入手可能なＦｅｌｉｘ０１ファージは、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株、特にサルモネラ・ニューポート（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｎｅｗｐｏｒｔ）に感染することができる。
【００５０】
この好ましい実施態様においては、試験される細胞が存在し生きていれば、どんなに多くの他のタイプの細菌又は他の細胞が存在していても、用いる具体的なウイルスは、検出可能な核酸のみを産生するだろう。これは、試験される細胞が、それらの生きた形態での存在が決定され得る前に単離される必要がないことを、有利に意味する。
【００５１】
ウイルスは、個々に又は多特異的混合物として用いることができ、ここで、１つ以上の細胞の生存性が求められる。後者の場合、多数の核酸配列、例えばｃＤＮＡ配列（個々のウイルスの各特性）の検出が、その後実施される。
【００５２】
ウイルスの感染及び複製周期は、しばしば、感染細胞の破裂及びその内容物の放出をもたらすだろう。この場合には、細胞を積極的に溶解又は均質化することなく、上記の方法の段階（ｉｉ）で検出される核酸が観察される。しかしながら、試料中の任意の細胞の溶解又は均質化は、必要であれば、段階（ｉｉ）の前に実施することができる。
【００５３】
溶解又は均質化は、任意の従来の方法を用いて、例えば９４℃まで加熱することにより、超音波処理により、或いは洗剤などの溶解剤の添加により実施することができる。
【００５４】
好ましい実施態様において、例えばウイルスにより産生されるｃＤＮＡ又は複製ＲＮＡから得られたＤＮＡを段階（ｉｉ）で検出する場合、これは、好ましくは、増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて達成される。この場合、周知のプライマー、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、及び緩衝液試薬を含む試薬を、段階（ｉ）の最後において、必要であれば細胞の溶解の後に添加し、その後通常の熱サイクルにかけて、存在する任意の標的ＤＮＡを増幅する。
【００５５】
次いで、増幅産物を、ゲル電気泳動法のような通常の方法を用いて検出し、その後色素を用いて視覚化することができる。
【００５６】
好ましくは、増幅産物が、その進行とともに、検出可能なシグナル、特に可視シグナル、例えば蛍光シグナルを生み出す方法において、増幅反応を実施する。そのようなシグナルを生み出す多くの試験形式が、当業界において知られている。それらは、蛍光エネルギー移動（ＦＥＴ）、特に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が起こるように準備された試薬、例えばＤＮＡ結合剤、例えばＤＮＡ中に挿入されるとより強く放射線、特に蛍光放射線を放射する挿入色素、並びにプローブ及び蛍光標識を含むプライマーを用いることができる。
【００５７】
２つの一般的に用いられるタイプのＦＥＴ又はＦＲＥＴプローブが存在し、それらはドナーをアクセプタから分離するために核酸プローブの加水分解を利用し、そしてそれらはドナーとアクセプタ分子の空間的関係を変えるためにハイブリダイゼーションを利用する。
【００５８】
加水分解プローブは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとして市販されている。これらは、ドナー及びアクセプタ分子で標識されたＤＮＡオリゴヌクレオチドから成る。このプローブは、ＰＣＲ産物の一本鎖上の特定の領域に結合するように設計されている。ＰＣＲプライマーのこの鎖へのアニーリングの後に、Ｔａｑ酵素は、５’から３’へのポリメラーゼ活性によりＤＮＡを伸長する。Ｔａｑ酵素は、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性も示す。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、それらがＴａｑ伸長を開始するのを防ぐためにリン酸化により３’末端が保護されている。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが生成鎖にハイブリダイズすると、伸長するＴａｑ分子はプローブも加水分解することができ、検出の基礎としてドナーをアクセプタから解放する。シグナルは、この場合、累積し、遊離したドナー及びアクセプタ分子の濃度は、増幅反応の各サイクルと共に増大する。
【００５９】
ハイブリダイゼーション・プローブは、多くの形態において利用可能である。分子標識は、相補的な５’及び３’配列を有するオリゴヌクレオチドであり、それらはヘアピンループを形成する。末端の蛍光標識は、ヘアピン構造が形成された場合、ＦＲＥＴが生じるように近接している。分子標識の相補的配列へのハイブリダイゼーションの後に、蛍光標識は分離し、そのためＦＲＥＴは起こらず、これは検出の基礎を形成する。
【００６０】
標識オリゴヌクレオチドのペアを用いることもできる。これらは、ＰＣＲ産物の鎖上で近接してハイブリダイズし、ＦＲＥＴが生じることができるようにドナーとアクセプタを一緒にする。促進されたＦＲＥＴは、検出の基礎である。このタイプの変異形は、標識増幅プライマーを１つの近接プローブと共に用いることを含む。
【００６１】
それらが生じるような、増幅反応を検出する他の方法が知られているが、これらの任意のものを用いることができる。このような方法の具体的な例は、例えばＷＯ９９／２８５００、英国特許ＮＯ．２，３３８，３０１、ＷＯ９９／２８５０１及びＷＯ９９／４２６１１に記載されている。
【００６２】
ＷＯ９９／２８５００は、試料中の標的核酸配列の存在を検出するための非常に成功した試験について記載する。この方法においては、ＤＮＡ二本鎖結合剤及び標的配列に特異的なプローブを、試料に添加する。このプローブは、ＤＮＡ二本鎖結合剤からの蛍光を吸収することのできる、又はＤＮＡ二本鎖結合剤へ蛍光エネルギーを提供することのできる反応性分子を含んで成る。その後、この混合物を、標的核酸が増幅する増幅反応にかけ、増幅工程の間又は後のいずれかにおいて、プローブが標的配列にハイブリダイズする条件を誘導する。試料からの蛍光を観察する。
【００６３】
この試験の代わりの方法（これは、プローブ上で蛍光標識からの蛍光エネルギーを吸収することができるが、可視光を放射しないＤＮＡ二本鎖結合剤を利用する）は、同時係属の英国特許出願Ｎｏ．２２３５６３．８に記載されている。これらの試験はいずれも、標的ｃＤＮＡ配列を検出するのに、本発明の方法との関係で用いることができる。
【００６４】
これらの試験の多くは、当業界で周知なように定量的な方法、例えば増幅反応の各サイクルの間に少なくとも１回増幅混合物からのシグナルを測定することにより実施することができる。
【００６５】
この方法において反応を実施することにより、試料中に存在する核酸の量を決定することができる。これは、元の試料中の生細胞の量に関連し得るか、或いはそれは、生細胞中のウイルス複製の結果としての核酸の量の増大を測定するのに用いることができる。
【００６６】
上記のとおり、検出される具体的な核酸は、任意の特徴的な配列であることができ、それは生細胞のウイルス感染の結果として産生又は複製される。単一の特異的なウイルスを、この試験において用いる場合、これは、ウイルス由来の任意の配列、又はその調製の間に組み換えウイルス中に導入された任意の他の配列であることができる。ウイルスが、マーカー配列を含むように改変された改変ウイルスである場合、核酸は、細胞内でのウイルスの複製により独自に産生されたものである。
【００６７】
この方法において、ウイルスの多特異的混合物を用いる場合、試料中の具体的タイプの細胞が生きているかを決定するために、用いる各ウイルスから転写された特徴的配列である核酸配列を測定する必要がある。従って、この場合、細胞内でのウイルスの複製により独自に産生され、用いる各ウイルス中に具体的に導入されたマーカー配列に対応する配列を検出することが望まれ得る。
【００６８】
この場合において、検出される配列がＤＮＡ配列である場合、異なるシグナル試薬又はシステムを用いる多重ＰＣＲ反応を用いて、産生される様々な配列を検出することができる。これは、例えば異なる標識（異なる波長の蛍光を発する標識）を用いて、増幅反応において用いられるプローブ又はプライマーを標識することにより達成され得る。例えばそれぞれの異なる波長の各標識からのシグナルの検討は、波長が重複している場合には、必要であれば適切なシグナル分解能を用いて、実施される。
【００６９】
本発明の方法において、検出される核酸がウイルス自体の中に存在する場合、生細胞の存在を示すのに用いることができるのは、核酸の量の増大のみである。従って、段階（ｉｉ）においては、核酸配列の濃度の任意の増加を検出するために、試料を試験する。標的核酸配列の量の増大は、試料中の生きた宿主細胞の存在の指標である。一方、標的核酸配列の量が増大しないことは、試験した試料中に生きた宿主細胞が存在しないという事実の指標である。
【００７０】
この実施態様において、インキュベーションの前に、ウイルスの試料への添加により形成される混合物から試料を抽出し、この抽出した試料中の核酸の量を試験して、比較のためにベースラインを提供することが所望され得る。追加の抽出試料は、代わりに或いは更に、インキュベーションの任意の時点において取ることができる。
【００７１】
最も好ましくは、インキュベーションの前及び後に存在する核酸の量を、適切な方法により測定する。例えば、ＤＮＡ濃度は、定量的増幅反応、例えば定量的ＰＣＲを用いて検出することができるが、増幅を伴わないＤＮＡを検出するための他の方法も用いることができる。ＲＮＡ濃度は、必要であれば、生成されたＤＮＡを検出するためのＰＣＲ反応と組み合わせて、ＲＴ−ＰＣＲを用いて検出することができる。
【００７２】
インキュベーション前の試料とインキュベーション後の試料は、結果を直接的に比較することができるように、同一の方法で処理しなければならない。最も好ましくは、水コントロールも用いる。
【００７３】
本発明の更なる側面は、上記の方法を実施するためのキットを提供する。キットは、ウイルス、及び核酸を検出するのに必要な１つ以上の試薬を適切に含む。
【００７４】
好ましい実施態様において、キットは、ウイルス、及び細胞中でウイルスの複製により得られた核酸を検出するのに必要な１つ以上の試薬を含むが、ただし、ウイルスが、マーカー配列を含むように改変された改変ウイルスである場合、その１つ以上の試薬は、細胞内でのウイルスの複製により独自に産生された核酸を検出するために必要である。
【００７５】
最も好ましくは、ウイルスはバクテリオファージであるが、試験する細胞の性質に依存して、下等及び／又は高等真核細胞に感染することのできる他のＤＮＡ又はＲＮＡウイルスを用いることができる。
【００７６】
用いるウイルスがＲＮＡウイルスである場合、これは、段階（ｉ）の前に少なくとも部分的に、好ましくは完全に汚染ＤＮＡが精製される。このようなウイルスは、本発明の更なる側面を形成する。
【００７７】
適切には、キットは、ＲＮＡウイルス、及び当該ＲＮＡウイルス内での配列の逆転写により得られるｃＤＮＡを検出する１つ以上の試薬を含んで成ることができる。最も好ましくは、１つ以上の試薬は、ＲＮＡウイルス内での配列の逆転写により得られる任意のｃＤＮＡに特異的な１組のプライマーを含んで成る。
【００７８】
或いは、キットは、ＤＮＡウイルス、及び定量的にＤＮＡを検出するのに適した１つ以上の試薬を含んで成ることができる。最も好ましくは、１つ以上の試薬は、ウイルス中のＤＮＡ配列に特異的な１組のプライマーを含んで成る。
【００７９】
或いは、キットは、ＲＮＡを検出するためのＲＴ−ＰＣＲ反応を実施するのに必要とされる、プライマーなどの試薬を含んで成る。
【００８０】
キットの有力な追加の要素は、核酸配列の検出における使用に適した他の試薬を含んで成る。特に、キットは、上記の方法用いて産生された任意の核酸の検出において用いる挿入色素又はプローブを含んで成ることができる。
【００８１】
プライマーは、適切には、増幅産物が直接的に検出可能な方法で標識することができる。例えば、それらは、蛍光又は上記の他の標識を含むことができる。
【００８２】
更に又は代わりに、キットは、増幅産物に特異的で、産物の検出を助けるために標識されたプローブを含んで成ることができる。それらは、単独又は二重に標識された加水分解又はハイブリダイゼーション・プローブを含んで成ることができる。適切な場合には、それらは、挿入色素又は他のＤＮＡ二本鎖結合剤を含むことができ、それらは検出系の要素を形成する。
【００８３】
本発明は、添付の線図を参照して実施例により具体的に記載する。
【実施例】
【００８４】
実施例１
図１で示された実施態様において、一本鎖ネガティブゲノムを有する、クラスＶのウイルス調製物を、試料に適用する。
【００８５】
試料は、任意の適切な試料であることができるが、ブロス又はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の細菌抽出物を含んで成ることができ、ここで、細菌はストレスを加えられておらず、従って感染に対して感受性が強い。試料は、必要であれば希釈され、例えばそれらは６×１０6〜２×１０3細胞ｍｌ-1を含むことができる。
【００８６】
適切には、ウイルス調製物は、例えばＤＮＡａｓｅ酵素を用いた処理により、汚染ＤＮＡを除去するために前もって処理される。それらは、遠心分離により精製することもでき、例えば１０10ｍｌ-1のファージ力価の形成のために、例えば緩衝化ペプトン水（ＢＰＷ）中に再懸濁する。
【００８７】
次いで、これらの調製物（例えば、約２０μｌのファージ）を添加して、その後３０秒間穏やかに混合する。その後、適切には、混合物を５分間置いておき、ファージ付着を促進する。
【００８８】
適切には、その後、インキュベーションは、例えば３７℃の湯浴において３０分間実施し、その間培養液を穏やかに撹拌することができる。
【００８９】
この期間に、ファージは生細胞（説明したように）に感染し、ポジティブＲＮＡの多コピーが、それらの細胞内で産生される。
【００９０】
この手順の終わりに、必要であれば、細胞を９４℃まで加熱することにより、細胞を溶解し、得られた混合物をＲＴ−ＰＣＲにかけて、ポジティブＲＮＡから相補的ＤＮＡ配列を生成する。適切には、これは、ポジティブＲＮＡに特異的な単一のプライマーを用いて実施される。
【００９１】
マウス逆転写酵素又はＡＭＶ反応における典型的な条件の例は、以下のとおりである：
【表１】
2008529548.tif 000003
【００９２】
ＲＮＡｓｅによる生成物の処理は、ＲＮＡテンプレートを消化して、ｃＤＮＡのみを残し、これは、通常のＰＣＲ反応を用いて増幅し、検出することができる。
【００９３】
これらの全ての段階は迅速であり、従って、生細胞を検出する迅速な試験を提供する。
【００９４】
実施例２
鎖選択的なＭＳ２のＲＴ−ＰＣＲ実験
この実験は、鎖指向性（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ＲＴ−ＰＣＲを用いてｃＤＮＡが産生及び検出されることを示すために実施した。具体的には、この実験は、ＭＳ２バクテリオファージにおける、鎖特異的な２段階のＲＴ−ＰＣＲを調べた。ｃＤＮＡは、フォワードプライマーとリバースプライマーを別々に用いて、そして双方を組み合わせて用いて作製した。１つのタイプのＲＮＡのみがＭＳ２中に存在するので、１つのプライマーのみ（例えば、フォワード又はリバース）が、ＰＣＲにおいて増幅するであろうＤＮＡを産生すると予測された。
【００９５】
方法
実験で用いるプライマー及びプローブ配列を、表１に示す。双方のプライマーをＤＥＰＣ処理水で希釈し、１０μＭの濃度とした。プローブも、２μＭまで希釈した。第一のプローブを０．１×ＴＥで希釈し、第二のプローブをＤＥＰＣ処理水で希釈した。
【００９６】
【表２】
2008529548.tif 000004
【００９７】
ＲＴ−段階に関して、３つの反応混合物を、表２の試薬濃度を用いて調製した：
【表３】
2008529548.tif 000005
【００９８】
ＲＴ反応混合物を、ＥＤＰＣ処理水を用いて７１μｌとした。次いで、８μｌのＭＳ２（４×１０9／ｍｌの濃度）を各チューブに添加した。試料を混合し、２つのチューブにそれぞれ３５μｌを含むように分けて、９０℃で１０分間変性した。その後、チューブを氷上に置き、０．５μｌのＲＴ酵素ＭＭｕＬＶ（６０ユニット／μＬ、ｌｏｔ＃ １７３）を、各チューブに添加した。試料を穏やかに混合し、ｃＤＮＡの転写のために、４８℃の湯浴中に３０分間置いた。
【００９９】
以下の試験試料を、ＰＣＲ分析のために重複して調製した：
ＤＥＰＣ処理Ｈ2Ｏ、ネガティブコントロール（ｎｔｃ）
フォワードプライマーを用いて作製した、４×１０倍の希釈系列のｃＤＮＡ
リバースプライマーを用いて作製した、４×１０倍の希釈系列のｃＤＮＡ
両方のプライマーを用いて作製した、３×１０倍の希釈系列のｃＤＮＡ
ＭＳ２の精製ＤＮＡ産物  １：１０００希釈、ポジティブコントロール。
【０１００】
ＰＣＲ反応混合物を、Ｃｏｒｂｅｔｔロボットを用いて調製した。各反応における試薬の濃度を、表３に示す。
【０１０１】
【表４】
2008529548.tif 000006
【０１０２】
ＰＣＲ混合物（１８μｌ）を、２μｌの試験試料と共に、ライトサイクラーのキャピラリーに添加した。キャピラリーをキャップし、３０００ｒｐｍで短時間回転させた。
【０１０３】
以下のプログラムを、ライトサイクラー１．０（Ｒｏｃｈｅ）において実施した：
【表５】
2008529548.tif 000007
【０１０４】
ライトサイクラーのデータ分析プログラムを用いて、データを分析した。
【０１０５】
結果を、図２〜５に示す。
図２は、全ての試験試料に対する結果を示す。
図３は、フォワードプライマーを含む試験試料に対する結果を示す。
図４は、リバースプライマーを含む試験試料に対する結果を示す。
図５は、両方のプライマーを含む試験試料に対する結果を示す。
【０１０６】
結果の概要：
フォワードプライマーの使用は、ＰＣＲにおける検出に対して不十分なｃＤＮＡを生じさせた。しかし、リバースプライマーは、ＰＣＲにおける検出に対して十分なｃＤＮＡを産生した。両方のプライマーを用いた場合、ｃＤＮＡはより高い効率で増幅され、ＰＣＲ増幅においてより早くに検出された。
【０１０７】
従って、ＲＮＡの逆転写により独自に産生されたｃＤＮＡは、鎖指向性ＲＴ−ＰＣＲを用いて特異的に検出できることが実証された。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】図１は、本発明の検出方法を略図により示す。
【図２】図２は、本明細書中の実施例２における、全ての試験試料に対する増幅曲線を示す。
【図３】図３は、フォワードプライマーを用いた任意のｃＤＮＡの増幅の試みの結果を示し、どの試験試料も増幅ｃＤＮＡを生成しないことを示す。
【図４】図４は、リバースプライマーを用いた任意のｃＤＮＡの増幅の結果を示し、ニート（ｎｅａｔ）、１：１０、１：１００及び１：１０００の試験試料のそれぞれに対して、サイクル数約２５、２９、３２及び３４において、増幅が検出されたことを示す。
【図５】図５は、フォワードプライマー及びリバースプライマーの両方を用いたｃＤＮＡの増幅の結果を示し、ニート（ｎｅａｔ）、１：１０及び１：１００の試験試料のそれぞれに対して、サイクル数約２０、２３、２７おいて、増幅が検出されたことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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