(57)【要約】本発明は、治療組成物であって、生物学的に適合するゲルに自己アセンブリするペプチドに対してヒトＰＤＧＦが直接結合されている治療組成物に関する。患者の身体に移植する場合、この組成物は、ＰＤＧＦの緩徐な徐放性をもたらす。この組成物は、心筋梗塞を受けている患者を処置するのに特に有用である。自己アセンブリするペプチドを含む、生物学的に適合性のペプチドメンブレンであって、（ａ）該ペプチドは、１２〜２００アミノ酸長であって、交互の疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸を有し、相補性であり、かつ構造的に適合性であって；そして（ｂ）該自己アセンブリするペプチドの少なくとも０．１％が、ＰＤＧＦに対して直接結合される、ペプチドメンブレンが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己アセンブリするペプチドを含む、生物学的に適合性のペプチドメンブレンであって、
（ａ）該ペプチドは、１２〜２００アミノ酸長であって、交互の疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸を有し、相補性であり、かつ構造的に適合性であって；そして
（ｂ）該自己アセンブリするペプチドの少なくとも０．１％が、ＰＤＧＦに対して直接結合される、
ペプチドメンブレン。
【請求項２】
前記ペプチドが、１２〜２４アミノ酸長であって、該ペプチドの０．５〜１０％がＰＤＧＦに結合される、請求項１に記載の生物学的に適合性のペプチドメンブレン。
【請求項３】
請求項１に記載の生物学的に適合性のペプチドメンブレンを含む、薬学的組成物。
【請求項４】
前記ペプチドが均質である、請求項１に記載の生物学的に適合性のペプチドメンブレン。
【請求項５】
請求項１に記載の生物学的に適合性のペプチドメンブレンであって、前記ペプチドが：
【化１−１】
2008526749.tif 000005
【化１−２】
2008526749.tif 000006
【化１−３】
2008526749.tif 000007
からなる群より選択される、ペプチドメンブレン。
【請求項６】
請求項１に記載の生物学的に適合性のペプチドメンブレンであって、前記ペプチドが均質であり、かつ（ＲＡＲＡＤＡＤＡ）ｎ；（ＡＲＡＲＡＤＡＤ）ｎ；および（ＲＡＤＡＲＡＤＡ）ｎからなる群より選択される構造を有し、ｎ＝２〜１０である、ペプチドメンブレン。
【請求項７】
請求項１に記載の生物学的に適合性のペプチドメンブレンであって、前記ペプチドが均質であり、かつ構造（ＡＥＡＥＡＫＡＫ）ｎを有し、ｎ＝２〜１０である、ペプチドメンブレン。
【請求項８】
生物学的に適合性のペプチドメンブレンを作製する方法であって、ヒトＰＤＧＦと、請求項５に記載のペプチドとを、該ペプチドの自己アセンブリを促進するのに十分である１価金属陽イオンの濃度で、水性媒体中で合わせる工程を包含する、方法。
【請求項９】
前記水性媒体が最初に形成され、次いで前記ペプチドが少なくとも１ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで添加される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチドが、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで添加される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記１価金属陽イオンが少なくとも５ｍＭの濃度である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記１価金属陽イオンが、リチウム；ナトリウム；カリウムからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
自己アセンブリするペプチドおよびヒトＰＤＧＦを薬学的に受容可能な液体媒体中に含む薬学的組成物であって、１価金属陽イオンの濃度が、該ペプチドの自己アセンブリを促進するのに不十分であり、１０００ペプチドごとに少なくとも１個のＰＤＧＦ分子が存在する、薬学的組成物。
【請求項１４】
前記１価金属陽イオン濃度が５ｍＭ未満である、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記自己アセンブリするペプチドが１２〜２４アミノ酸長であって、１００ペプチドごとに少なくとも１個のＰＤＧＦ分子が存在する、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記自己アセンブリするペプチドが均質である、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
前記自己アセンブリするペプチドが、
【化２−１】
2008526749.tif 000008
【化２−２】
2008526749.tif 000009
【化２−３】
2008526749.tif 000010
からなる群より選択される、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
請求項１３に記載の薬学的組成物であって、前記自己アセンブリするペプチドが均質であって、かつ（ＲＡＲＡＤＡＤＡ）ｎ；（ＡＲＡＲＡＤＡＤ）ｎ；および（ＲＡＤＡＲＡＤＡ）ｎからなる群より選択される構造を有し、ｎ＝２〜１０である、薬学的組成物。
【請求項１９】
請求項１３に記載の薬学的組成物であって、前記自己アセンブリするペプチドが均質であり、かつ構造（ＡＥＡＥＡＫＡＫ）ｎを有し、ｎ＝２〜１０である、薬学的組成物。
【請求項２０】
心筋梗塞、創傷、損傷した靭帯、腱もしくは軟骨を有している患者を処置するか、または損傷した神経組織を処置する方法であって、請求項１に記載の生物学的に適合性のメンブレンを、局所的に、または移植によって該患者に投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、２００５年１月４日出願の米国仮出願６０／６４０，９９８号、および２００５年７月２６日出願の同第６０／７０２，３１８号の恩典およびそれに対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、自己アセンブリするペプチドおよび血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）によって形成される治療用メンブレン組成物に関する。このメンブレン／ＰＤＧＦ複合体が、患者の心臓に移植されるかまたは注入されて、遊離ＰＤＧＦの長期の放出が得られる。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
特定のペプチドは、低濃度の１価金属陽イオンの存在下でインキュベートした場合、自己アセンブリし得る（特許文献１；特許文献２）。アセンブリによって、非毒性であって、非免疫原性であって、かつプロテアーゼに対して比較的安定であるゲル状メンブレンの形成が生じる。一旦形成されれば、メンブレンは血清中で安定で、水溶液で、細胞培養培地である。それらは、滅菌条件下で作製され得、細胞の増殖を支持し得、そして動物の身体に移植された場合、緩徐に消化される。それらの特徴によって、メンブレンは、治療剤の送達のためのデバイスとして十分に適切になる。なかでもこのような因子のうち最も有望なのは、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）である。
【０００４】
ＰＤＧＦは、結合組織細胞、線維芽細胞および平滑筋細胞の分裂促進因子である。これは悪性形質転換（ガン化）に対して寄与するとみなされている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）；そして、内皮細胞の増殖を促進することによって、腫瘍増殖を維持するために必要な血管形成に寄与し得る。ＰＤＧＦが、血管形成後にしばしば生じる再狭窄に（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）に、そしていくつかの異なる器官における線維性病変の発達に（非特許文献８）に寄与するという証拠もある。
【０００５】
治療展望から、ＰＤＧＦは、神経組織の成長を促進するのに、そして創傷治癒においてある役割を果たすと考えられる（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）。心筋梗塞後の患者における心臓機能の保存を補助するためにＰＤＧＦが用いられ得るという徴候も存在する。
【特許文献１】米国特許第５，６７０，４８３号明細書
【特許文献２】米国特許第６，５４８，６３０号明細書
【非特許文献１】Ｃｌａｒｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０８：４６４（１９８４）
【非特許文献２】Ｇａｚｉｔら、Ｃｅｌｌ  ３９：８９（１９８４）
【非特許文献３】Ｂｅｃｋｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１３４６（１９９８）
【非特許文献４】Ｓｍｉｔｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４０：６３９（１９９２）
【非特許文献５】Ｆｅｒｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１１２９〜１１３２（１９９１）
【非特許文献６】Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  １３０：４５〜５１（１９９７）
【非特許文献７】Ｊａｗｉｅｎら  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：５０７〜５１１（１９９２）
【非特許文献８】Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，  Ｓｐｏｒｎ  ＆  Ｒｏｂｅｒｔｓ編，１７３〜２６２頁，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ
【非特許文献９】Ｄｅｕｅｌら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６９：１０４６〜１０４９（１９８１）
【非特許文献１０】Ｓｉｅｇｂｈａｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８５：９１６〜９２０（１９９０）
【非特許文献１１】Ｓｍｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８８：８１５９〜８１６３（１９９１）
【非特許文献１２】Ｙｅｈら、Ｃｅｌｌ  ６４：２０９〜２１６（１９９１）
【非特許文献１３】Ｒｏｂｓｏｎら、Ｌａｎｃｅｔ  ３３９：２３〜２５（１９９２）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
薬物送達のために自己アセンブリするペプチドから形成されたメンブレンを用いることに伴う１つの問題は、ペプチドマトリックス中に単に絡めとられた化合物は、メンブレンの高い透過性に起因して移植後に急速に失われる傾向であるということである。本発明は、ＰＤＧＦそして詳細にはＰＤＧＦのＢ鎖が自己アセンブリするペプチドに天然に結合するという発見に基づく。これによって、生物学的なメンブレンが形成され、これは直接結合された固定されたＰＤＧＦを有しており、そしてＰＤＧＦが急速に洗い流されることなくインビボで移植され得る。心筋障害のラットモデルを用いて、ＰＤＧＦ結合したメンブレンは、損傷された心筋に局所的に注入されてもよく、そして冠状動脈結紮の後少なくとも１４日間送達部位で維持される。結果として、心筋細胞の死亡は、減少して、心筋収縮機能が保存される。これによって、ＰＤＧＦを結合されたメンブレンでは、心筋梗塞後の心不全を予防するための有効な方法が得られる。
【０００７】
その第一の局面では、本発明は、自己アセンブリするペプチドから形成される生物学的に適合性のペプチドメンブレンに関する。「生物学的に適合性（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）」という用語は、このメンブレンが非毒性であって、患者に安全に移植され得るということを示す。自己アセンブリするペプチドは、１２〜２００アミノ酸長でなければならず、そして交互になっている疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸を有する。さらに、このペプチドは、相補性でなければならず（すなわち、それらは、お互いとイオン結合または水素結合を形成できなければならない）、かつ構造的に適合性でなければならない（すなわち、結合したペプチド鎖は、それらの長さ全体にわたって約３Åより長くまで変わらないというお互いからの距離を維持しなければならない）。一般には、メンブレンにアセンブルするペプチドのうち少なくとも０．１％、より好ましくは０．５％〜１０％、そしてそれよりさらに好ましくは１〜１０％が、ＰＤＧＦに直接結合しなければならない。本明細書において用いられる場合「直接結合する（ｂｏｕｎｄ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ）」という用語は、ＰＤＧＦとペプチドとの間で分散されるリンカーも他の分子もないということを意味する。この用語はまた、ＰＤＧＦとペプチドとの間のいくつかのタイプの物理的な相互作用（例えば、イオン結合、疎水性相互作用など）であって、それによって、水性媒体中でペプチドからＰＤＧＦが分散することが妨げられる相互作用が存在することを要する。なぜならＰＤＧＦはゲルマトリックス内に単純に絡めとられている場合、分散するからである。
【０００８】
好ましい実施形態では、メンブレンで用いられる自己アセンブリするペプチドは１２〜２４アミノ酸長であって、そのペプチドのうち約４〜８％に結合されたＰＤＧＦを有し、そして均質である。「均質の、均一な（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）」という用語は、この文脈で用いる場合、生物学的に適合性のメンブレンを形成する全てのペプチドが同一であるということを示す。「異質な（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）」という用語は、メンブレンを形成するために用いられる同一でないペプチドをいう。上記のメンブレンに用いられ得る特異的なペプチドとしては以下が挙げられる：
【０００９】
【化３−１】
2008526749.tif 000002
【００１０】
【化３−２】
2008526749.tif 000003
【００１１】
【化３−３】
2008526749.tif 000004
上記で列挙されたペプチドの各々が、繰り返し配列を含むということ、そしてさらなる繰り返しが、それらが自己アセンブリする能力を壊すことなくペプチドの長さに延びるように含まれてもよいということが認識されるべきである。例えば、ペプチドＡＫＡＫＡＥＡＥＡＫＡＫＡＥＡＥ（配列番号１）は、繰り返し配列ＡＫＡＫＡＥＡＥ（配列番号５２）を有し、そして（ＡＫＡＫＡＥＡＥ）ｎ（配列番号５２）として発現され得、ここでｎ＝２である。自己アセンブリし得る、より長いペプチドは、ｎを増大することによって作製され得るが、ただし最終のペプチドのアミノ酸の総数が２００を超えられないという禁止条項がある。好ましいペプチドとは、以下：（ＲＡＲＡＤＡＤＡ）ｎ（配列番号５３）（ＡＲＡＲＡＤＡＤ）ｎ（配列番号８９）、（ＲＡＤＡＲＡＤＡ）ｎ、（配列番号５４）および（ＡＥＡＥＡＫＡＫ）ｎ、（配列番号５５）の繰り返し構造を有するペプチドであって、ここでｎ＝２〜１０である。好ましくは、ｎ＝２〜４であり、さらに好ましくはｎ＝２である。
【００１２】
この方式で発現されて、かつ本発明において有用である他のペプチドは以下である：（ＡＫＡＫＡＥＡＥ）ｎ、（配列番号５２）ここでｎ＝２〜２５；（ＫＡＥＡ）ｎ（配列番号５６）ここでｎ＝３〜５０；（ＥＡＫＡ）ｎ（配列番号５７）ここでｎ＝３〜５０；（ＫＡＥＡ）ｎ（配列番号５８）ここでｎ＝３〜５０；（ＡＥＡＫ）ｎ（配列番号５９）ここでｎ＝３〜５０；（ＡＤＡＤＡＲＡＲ）ｎ（配列番号６０）ここでｎ＝２〜２５；（ＡＲＡＤ）ｎ（配列番号６１）ここでｎ＝３〜５０；（ＤＡＲＡ）ｎ（配列番号６２）ここでｎ＝３〜５０；（ＲＡＤＡ）ｎ（配列番号６３）ここでｎ＝３〜５０；（ＡＤＡＲ）ｎ（配列番号６４）ここでｎ＝３〜５０；（ＡＲＡＤＡＫＡＥ）ｎ（配列番号６５）ここでｎ＝２〜２５；（ＡＫＡＥＡＲＡＤ）ｎ（配列番号６６）ここでｎ＝２〜２５；（ＡＲＡＫＡＤＡＥ）ｎ（配列番号６７）ここでｎ＝２〜２５；（ＫＡＲＡＥＡＤＡ）ｎ（配列番号６８）ここでｎ＝２〜２５；（ＡＱ）ｎここでｎ＝６〜１００；（ＶＱ）ｎここでｎ＝６〜１００；（ＹＱ）ｎここでｎ＝６〜１００；（ＨＱ）ｎここでｎ＝６〜１００；（ＡＮ）ｎここでｎ＝６〜１００；（ＶＮ）ｎここでｎ＝６〜１００；（ＹＮ）ｎここでｎ＝６〜１００；（ＨＮ）ｎここでｎ＝６〜１００；（ＡＮＡＱ）ｎ（配列番号６９）ここでｎ＝３〜５０；（ＡＱＡＮ）ｎ（配列番号７０）ここでｎ＝３〜５０；（ＶＮＶＱ）ｎ（配列番号７１）ここでｎ＝３〜５０；（ＶＱＶＮ）ｎ（配列番号７２）ここでｎ＝３〜５０；（ＹＮＹＱ）ｎ（配列番号７３）ここでｎ＝３〜５０；（ＹＱＹＮ）ｎ（配列番号７４）ここでｎ＝３〜５０；（ＨＮＨＱ）ｎ（配列番号７５）ここでｎ＝３〜５０；（ＨＱＨＮ）ｎ（配列番号７６）ここでｎ＝３〜５０；（ＡＫＡＱＡＤ）ｎ（配列番号７７）ここでｎ＝２〜３３；（ＶＫＶＱＶＤ）ｎ（配列番号７８）ここでｎ＝２〜３３；（ＹＫＹＱＹＤ）ｎ（配列番号７９）ここでｎ＝２〜３３；（ＨＫＨＱＨＤ）ｎ（配列番号８０）ここでｎ＝２〜３３；（ＲＡＲＡＤＡＤＡ）ｎ（配列番号５３）ここでｎ＝２〜２５；（ＲＡＤＡＲＧＤＡ）ｎ（配列番号８１）ここでｎ＝２〜２５；（ＲＡＥＡ）ｎ（配列番号８２）ここでｎ＝３〜５０；（ＫＡＤＡ）ｎ（配列番号８３）ここでｎ＝３〜５０；（ＡＥＡＥＡＨＡＨ）ｎ（配列番号８４）ここでｎ＝２〜２５；（ＦＥＦＥＦＫＦＫ）ｎ（配列番号８５）ここでｎ＝２〜２５；（ＬＥＬＥＬＫＬＫ）ｎ（配列番号８６）ここでｎ＝２〜２５；（ＡＥＡＥＡＫＡＫ）ｎ（配列番号５５）ここでｎ＝２〜２５；（ＡＥＡＥＡＥＡＥＡＫＡＫ）ｎ（配列番号８７）ここでｎ＝１〜１６；（ＫＡＫＡＫＡＫＡＥＡＥＡＥＡＥＡ）ｎ（配列番号４４）ここでｎ＝１〜１２；（ＡＥＡＥＡＥＡＥＡＫＡＫＡＫＡＫ）ｎ（配列番号４５）ここでｎ＝１〜１２；（ＲＡＲＡＲＡＲＡＤＡＤＡＤＡＤＡ）ｎ（配列番号４６）ここでｎ＝１〜１２；（ＡＤＡＤＡＤＡＤＡＲＡＲＡＲＡＲ）ｎ（配列番号４７）ここでｎ＝１〜１２；（ＤＡＤＡＤＡＤＡＲＡＲＡＲＡＲＡ）ｎ（配列番号４８）ここでｎ＝１〜１２；（ＨＥＨＥＨＫＨＫ）ｎ（配列番号８８）ここでｎ＝２〜２５；（ＶＥ）ｎここでｎ＝６〜１００；そして（ＲＦ）ｎここでｎ＝６〜１００。
【００１３】
メンブレンは、自己アセンブリするペプチドから形成され得、次いで患者に投与され得る。あるいは、このペプチドおよびＰＤＧＦは、注射可能な薬学的組成物中に、メンブラン形成を誘導するには低すぎる１価陽イオンの濃度で組み込まれ得る。次いで、これは、インビボでメンブレン形成を誘導するために投与され得る。本発明は、上記のようなＰＤＧＦおよびペプチドを含有する薬学的組成物を包含する。
【００１４】
本発明はまた、本明細書に記載されるようなメンブレンまたは薬学的組成物を用いて患者を処置する方法を包含する。患者は、ＰＤＧＦが有用であることが見出されており、移植が適切である任意の条件のために処置され得る。例えば、メンブレンは、創傷部位に、靭帯、腱もしくは軟骨が損傷されている関節に、またはニューロンが損傷されている部位に、ＰＤＧＦを投与するために用いられ得る。最も好ましい用途は、心筋梗塞を有する患者の処置においてである。この場合、メンブレンは、心筋梗塞のできるだけ直後に心筋に直接注射されなければならない。送達されるＰＤＧＦの総量は、個別に決定されるが、一般には、約１ｎｇ〜５００μｇ、そして好ましくは１０ｎｇ〜１００μｇでなければならない。
【００１５】
別の局面では、本発明は、上記の生物学的に適合性のメンブレンを作製する方法を包含する。これは、自己アセンブリを促進するのに十分な１価金属陽イオンを含む水性媒体中に自己アセンブリするペプチドを組み合わせることによって達成される。好ましくは、金属陽イオンの塩を含む水溶液を最初に形成し、次いでペプチドを、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、そして好ましくは少なくとも１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで添加する。１価金属陽イオンの濃度は、かなり変化し得るが、一般には、少なくとも５ｍＭでなければならない。この陽イオンの上限は、少なくとも３Ｍであるが、ペプチドのアセンブリは、５Ｍ程度の高さの濃度で存在し得る。好ましい陽イオンとしては、リチウム、ナトリウムおよびカリウムが挙げられる。これらは、塩素イオン、酢酸塩およびリン酸塩を含む、任意の薬学的に受容可能な陰イオンと本質的に組み合わせて塩として提供され得る。二価陽イオンの使用は、回避されなければならない。なぜなら、二価陽イオンは、ペプチドアセンブリを妨害すると考えられるからである。同様に、０．１％以上というようなドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のような界面活性剤の濃縮は、一般に回避されなければならない。
【００１６】
ＰＤＧＦは、自己アセンブリの前後のいずれでペプチドと組み合わされてもよい。一般には、最終のアセンブルされたメンブレン中のペプチドの０．１〜１０％がＰＤＧＦを結合しているように、十分なＰＤＧＦが添加されなければならない。しかし、占有され得るペプチドの割合に対する上限は、まだ決定されておらず、そして所望の場合、１０％より多く（例えば、１５％、２５％）が、結合され得る。これらの割合は、ペプチドに対するＰＤＧＦ分子の相対量を表していること、そしてＰＤＧＦがメンブレンを通じて均一に分布されることを意味する必要はないことが理解されるべきである。例えば、「ペプチドのうち１０％がＰＤＧＦに結合される（１０％  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｒｅ  ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ＰＤＧＦ）」という句は、平均して、存在するＰＤＧＦ分子の数およびペプチドの数の知見に基づいてあらゆる１０ペプチドのうちの１つが、結合されることを意味する。特定のペプチドは、結合された２つ以上のＰＤＧＦを有してもよく、そしてその他は、有さなくてもよい。メンブレンがペプチドの結合の前に形成される場合、ＰＤＧＦの分布は、ペプチドがアセンブリの前に結合される場合よりも均一性が低い傾向である。しかし、この非均一性の分布は、メンブレンが移植後にＰＤＧＦを効率的に送達する能力に影響してはならない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、水性媒体中で、ＰＤＧＦ−Ｂが本明細書に記載の自己アセンブリするペプチドに自然に結合し、そして最終的にはそれらが形成するゲル状メンブレンに結合されるという発見に基づく。この状況での「メンブレン（ｍｅｍｂｒａｎｅ）」という用語は、三次元の固体ヒドロゲル構造をさすということが理解されるべきである。この理由のために、これは、適切には「微小環境（ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）」とも呼ばれてもよい。自己アセンブリするペプチドは、両方とも参照によって本明細書に援用される、米国特許第５，６７０，４８３号および同第６，５４８，６３０号に記載されている。本質的には、このペプチドを作製して用いるためにそこに記載される同じ手順は、本発明にあてはまる。しかし、ＰＤＧＦは、メンブレン（またはペプチド）およびＰＤＧＦを水性媒体（例えば、ペプチドの自己アセンブリに必要な成分を含有する、水、生理食塩水または緩衝液）中で単に合わせることによって、自己アセンブリするペプチドにより形成されるメンブレンに対して非共有結合的に結合され得る。平均して、メンブレン内の少なくとも１０％のペプチドがＰＤＧＦに結合され得る（すなわち、１０ペプチドごとに１ＰＤＧＦ分子が結合される）が、上限は、まだ決定されておらず、かなり大量、例えば、２０％、４０％、８０％以上に結合することが可能であり得ると考えられる。
【００１８】
（ペプチドの説明）
自己アセンブリのために用いられるペプチドは、少なくとも１２残基長でなければならず、そして交互の疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸を含む。約２００アミノ酸より長いペプチドでは、溶解度およびメンブレン安定性に関して問題を生じる傾向であり、従って回避されるべきである。理想的には、ペプチドは、約１２〜２４アミノ酸長でなければならない。
【００１９】
自己アセンブリするペプチドは、相補的でなければならない。これは、１つのペプチド上のアミノ酸が、別のペプチド上のアミノ酸とのイオン結合または水素結合を形成できなければならないということを意味する。イオン結合は、酸性のアミノ酸側鎖と塩基性のアミノ酸側鎖との間で形成する。この親水性の塩基性アミノ酸としては、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＨｉｓおよびＯｒｎが挙げられる。親水性の酸性アミノ酸は、ＧｌｕおよびＡｓｐである。イオン結合は、１つのペプチド上の酸性残基と別のペプチド上の塩基性残基との間で形成する。水素結合を形成するアミノ酸は、ＡｓｎおよびＧｌｎである。ペプチドに組み込まれ得る疎水性アミノ酸としては、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＧｌｙが挙げられる。
【００２０】
自己アセンブリするペプチドはまた、「構造的に適合性（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ  ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）」でなければならない。これは、それらのペプチドが結合する場合にお互いの間で本質的に一定の距離を維持しなければならないということを意味する。ペプチド間の距離は、対の各々のアミノ酸の側鎖上の未分岐原子の数の合計をとることによって、各々のイオン結合または水素結合について算出され得る。例えば、リジンは、５つを有し、そしてグルタミン酸は、それらの側鎖上に４つの未分岐の原子を有する。異なるペプチド上のこれらの２つの残基の間の相互作用によって、９つの原子というペプチド間距離が生じる。ＥＡＫの反復する単位のみを含むペプチドでは、イオン対の全てがリジンおよびグルタミン酸を含み、従って一定のペプチド間距離が維持される。従って、これらのペプチドは、構造的に相補的である。ペプチド間距離の変動が２原子以上（約３〜４Å）変化するペプチドは、ゲルを適切に形成しない。例えば、２つの結合したペプチドが、９原子間隔を有するイオン対および７原子間隔を有する他のイオン対を有する場合、構造的な相補性の要件は満たされていない。相補性および構造的な適合性の詳細な考察は、米国特許第米国特許第５，６７０，４８３号および同第６，５４８，６３０号に見出され得る。本明細書において用いられる定義および示される実施例は、本発明に関して等しくあてはまる。
【００２１】
メンブレンは、ペプチドの均質の混合物またはペプチドの異質な混合物のいずれから形成されてもよいということがまた理解されるべきである。「均質な（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）」という用語は、この文脈では、お互いと同一であるペプチドを意味する。「異質な（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）」とは、お互いに対して結合するが、構造的には異なるペプチドを示す。均質なペプチドが用いられるか、または異質なペプチドが用いられるかにかかわらず、アミノ酸の配列、長さ、相補性および構造的適合性に関する要件はあてはまる。さらに、ペプチドの末端残基のカルボキシル基およびアミノ基は、標準的な基を用いて保護されても保護されなくてもよいということが理解されるべきである。
【００２２】
（ペプチドの作製）
本発明の自己アセンブリするペプチドは、標準的なＮ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）化学を用いる固相ペプチド合成、およびｎ−メチルピロリドン化学を用いるサイクルによって作製され得る。一旦、ペプチドが合成されれば、それらは、逆相カラム上での高圧液体クロマトグラフィーのような手順を用いて精製されてもよい。純度はまた、ＨＰＬＣによって評価されてもよく、そして正確な組成物の存在は、アミノ酸分析によって決定され得る。
【００２３】
（メンブレンの形成）
本明細書で記載される自己アセンブリするペプチドは、水中ではメンブレンを形成しないが、低濃度の１価金属陽イオンの存在でアセンブリする。これらの陽イオンの有効性の順序は、Ｌｉ＋＞Ｎａ＋＞Ｋ＋＞Ｃｓ＋である（米国特許第６，５４８，６３０号）。５ｍＭという１価陽イオンの濃度は、ペプチドがアセンブルするために十分であるはずであり、そして５Ｍ程度の高さの濃度が、有効であるはずである。１価陽イオンと会合する陰イオンは、本発明に重要ではなく、そして酢酸塩、塩素イオン、硫酸塩、リン酸塩などであってもよい。ＰＤＧＦ−Ｂは、低塩濃度でペプチドに結合し、そして自己アセンブリを誘導するのに十分な濃度で結合したままとなる。ペプチドはまた、自己アセンブリするペプチドから形成し得、そしてＰＤＧＦは、インビボで見いだされる条件下で結合し得る。従って、メンブレンを移植するだけでなく、結合したＰＤＧＦを有する自己アセンブリするペプチドを移植するか、または自己アセンブリするペプチドおよびＰＤＧＦを同時移植してメンブレンを後で形成させることも可能である。本明細書において用いられる「インプラント、移植物（ｉｍｐｌａｎｔ）」という用語には、注射を含む、処置部位でメンブレンまたはペプチドを導入するための任意の方法を包含する。
【００２４】
ペプチドの最初の濃度は、形成されたメンブレンの最終のサイズおよび厚みに影響する。一般には、ペプチド濃度が高いほど、メンブレン形成の程度は高い。形成は、０．５ｍＭまたは１ｍｇ／ｍｌ程度の低さのペプチド濃度で生じ得る。しかしメンブレンは好ましくは、より良好な取り扱い特徴を促進するために、より高い最初のペプチド濃度、例えば、１０ｍｇ／ｍｌで形成される。全体的に、ペプチド溶液に対して塩を添加するよりも塩溶液にペプチドを添加することによって、メンブレンを形成することが一般にはより良好である。
【００２５】
メンブレンの形成は、ｐＨによって、または温度によって相対的に影響されない。それにもかかわらず、ｐＨは、１２より下で維持されなければならず、そして温度は一般には、４〜９０℃の範囲でなければならない。二価金属陽イオンは１００ｍＭ以上の濃度で不適切なメンブレン形成を生じるので回避されるべきである。同様に、０．１％以上のドデシル硫酸ナトリウムの濃度は、回避されなければならない。
【００２６】
メンブレン形成は、単純な視覚検査によって観察されてもよく、そしてこれは、所望の場合、Ｃｏｎｇｏ  Ｒｅｄのような染色液を添加されてもよい。メンブレンの完全性はまた、染色液の有無で顕微鏡的に観察され得る。
【００２７】
（ＰＤＧＦ）
血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は通常には、ＰＤＧＦ−ＡおよびＰＤＧＦ−Ｂ鎖と命名される、２つの均質であるが異なるペプチドから構成される二量体として存在し、そしてＡＡ、ＡＢおよびＢＢアイソフォームとして存在し得る。他に示されない限り、本明細書において用いられる「ＰＤＧＦ」および「ＰＤＧＦ−Ｂ」という用語は、Ｂ鎖が存在するヒトＰＤＧＦの任意の形態をいい、すなわち、この用語は、Ｂ単量体ならびにＡＢおよびＢＢの二量体を包含する。わずかな変化がＢ鎖の構造に、その機能またはメンブレンに結合する能力を損なうことなく導入され得、そしてメンブレンに対して依然として結合可能であり、かつ正の治療効果を有するＢ鎖の融合タンパク質または誘導体型を形成することが可能であり得ることがまた予想される。ＰＤＧＦの全長アミノ酸配列は、長年にわたって当該分野で公知であって（Ｒａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：２３９２〜２３９６（１９８６）を参照のこと）、そして、とりわけアクセッション番号Ｐ０１１２７として見出され得る。本明細書において用いられるタンパク質は、市販されてもよいし、または当該分野で周知の技術を用いて合成されてもよい。
【００２８】
（薬学的組成物および投薬量）
上記のＰＤＧＦを含有する組成物は、生理食塩水、水、リンゲル溶液および他の因子または賦形剤のようなキャリアを含む薬学的組成物中に組み込まれ得る。剤形は、一般に、移植または注入のために設計されるが、代表的な剤形は、創傷または磨耗の処置で調製物が用いられる場合に用いられ得る。全ての剤形は、当該分野で標準である方法を用いて調製され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版．Ａ．Ｏｓｌｏ．編，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８０）を参照のこと）。
【００２９】
当業者は、臨床医薬において十分確立された方法を用いて個別に投薬量を調節することを期待する。心臓患者に対して適切な量のゲル固定ＰＤＧＦを投与することに関する一般的な手引きは、上記に示される。しかし、言及される量は、単にガイドラインである。なぜなら、現実の用量は、各々の患者に固有の臨床的要因に基づいて担当医によって注意深く選択されて、調節されるからである。最適投薬量は、当該分野で公知の方法によって決定され、そして患者の年齢、疾患状態および他の臨床的な関連の要因のような要因によって影響される。
【実施例】
【００３０】
（Ｉ．序）
本実施例は、内皮細胞による心筋細胞の保護がＰＤＧＦ−ＢＢシグナル伝達を通じるということを実証する。ＰＤＧＦ−ＢＢは、時間依存性の方式および用量依存性の方式で心筋細胞Ａｋｔリン酸化反応を誘導して、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達を介してアポトーシスを予防する。インビトロでＰＤＧＦ−ＢＢに結合する、注射可能な自己アセンブリするペプチドナノファイバーを用いて、心筋へのＰＤＧＦ−ＢＢの徐放性の送達を注射部位で１４日間達成した。９６匹のラットの盲検的でかつ無作為の研究によって、ＰＤＧＦ−ＢＢを有する注射ナノファイバーは、心筋細胞死亡を減少し、そして心筋梗塞後の収縮性機能を保存したが、ナノファイバーもＰＤＧＦ−ＢＢも単独ではそうではなかった。５２匹のラットでの別個の盲検的かつ無作為的な研究によって、ナノファイバーとともに送達されたＰＤＧＦ−ＢＢは、虚血再灌流後に梗塞のサイズを減少させたことが示された。ＰＤＧＦ−ＢＢとナノファイバーとでは、インビボで心筋細胞においてＰＤＧＦＲ−βおよびＡｋｔリン酸化反応を誘導した。これらのデータは、内皮細胞がＰＤＧＦ−ＢＢシグナル伝達を介して心筋細胞を防御すること、そしてこのインビトロの知見が梗塞後の心筋を防御するという有効なインビボ方法に変換され得ることが実証される。さらに、この研究によって、注射可能なナノファイバーは、潜在的な治療利益をともなう、心筋に対するタンパク質の正確かつ徐放性の送達を可能にすることが示される。
【００３１】
（ＩＩ．材料および方法）
（心筋細胞培養）
ラット新生児心筋細胞（１〜２日齢）ならびに成体の心臓内皮細胞および線維芽細胞を、前に記載されたとおり（Ｎａｒｍｏｎｅｖａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１０：９６２（２００４））、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈａｒｌａｎ）から単離した。
【００３２】
（心筋細胞アポトーシスアッセイ）
心筋細胞は、１．４×１０５細胞／ｃｍ２の密度で一晩プレートして、無血清ＤＭＥＭ中で２４時間培養し、次いで１０ｍＭのケレリトリン、１ｍＭのドキソルビシン（両方ともＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから）、または０．２ｍＭのＨ２Ｏ２に加えて１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）に、さらに２４時間、ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）での処置の有無において、供した。培養実験において、心筋細胞のプレートの前に、心臓の内皮細胞または線維芽細胞をコンフルエント未満まで培養した。ＴＵＮＥＬ染色は、ＴＵＮＥＬ染色キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．）を用いて行った。ＤＮＡ断片化実験のために、細胞をトリプシン処理して、８０％エタノールを用いて−２０℃で２時間固定し、０．１ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で３７℃で３０分間インキュベートし、０．１ｍｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて１０分間染色し、次いでフローサイトメトリー（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ  ５００；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）に供した。Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖセル・ソーティング法（ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）は、製造業者の指示に従って、アポトーシスアッセイキット（Ｖｙｂｒａｎｔ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  ＃３；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）を用いて行った。中和抗体のための投薬量は、０．４μｇ／ｍｌの抗ＰＤＧＦ−ＢＢ、２μｇ／ｍｌの抗ＰＤＧＦＲ−β、２μｇ／ｍｌの抗ＰＤＧＦ−ＡＡ、および２０μｇ／ｍｌの抗ＰＤＧＦＲ−αであって、（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓの抗ＰＤＧＦ−ＡＡを除いて、全てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから）、ＰＤＧＦ−ＢＢの投薬量は、他に示さない限り、１０ｎｇ／ｍｌであった。アデノウイルストランスフェクションは、ＦｕｊｉｏおよびＷａｌｓｈ（Ｆｕｊｉｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１６３４９-１６３５４（１９９９））によって以前に記載されたとおりに行った。各々の実験は、三連で行ない、そして種々の初代細胞調製物を用いて少なくとも３回繰り返した。
【００３３】
（ウエスタンブロット分析）
全細胞抽出物を、１：５００希釈で４×サンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）およびプロテイナーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した（１％（重量／容積）ＳＤＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する溶解緩衝液を用いて収集した。以下の抗体を用いた：抗ＰＤＧＦＲ−β（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）、抗−リン−ＰＤＧＦＲ−β、抗Ａｋｔ、抗−リン−Ａｋｔ、抗−リン−ＥＲＫ、抗−リン３８、および抗ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（全てＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ由来）。
【００３４】
（免疫細胞化学）
ＰＤＧＦＲ−β活性化の免疫細胞化学染色のために、抗−リン−ＰＤＧＦＲ−β抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用い上記と同じ方法を用いて、心筋細胞を調製した。
【００３５】
（自己アセンブリするＮＦのタンパク質結合アッセイ）
ＮＦは、前に記載したとおり（Ｎａｒｍｏｎｅｖａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１０：９６２（２００４）調製して、ＰＢＳまたは１００ｎｇのＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＰＤＧＦ−ＢＢ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、ＶＥＧＦ−Ａ、ｂＦＧＦまたはアンギオポイエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）−１（全てＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから）を、ＮＦに包埋した。ＮＦをＰＢＳ（１００μｌ）とともに３７℃で３時間インキュベートした。上清（インキュベーション後ＰＢＳ）を収集して、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイに供した。並行の実験では、実験的な結合条件が平衡であったことを実証するために、同じ量のタンパク質をＰＢＳに添加したが、ＮＦ内には包埋しなかった。
【００３６】
（ＭＩおよびペプチドＮＦの注入）
全ての動物プロトコールは、ｔｈｅｃＨａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ  Ｓｔａｎｄｉｎｇ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌｓによって承認された。ＭＩは、約２５０ｇの雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ  ｒａｔｓ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈａｒｌａｎ）で生成された。要するに、ラットを、ペントバルビタールで麻酔し、続いて、気管内挿管し、心臓を左開胸術によって露出させた。左冠動脈は、心膜切開術後に特定して、左心房付属物の約３ｍｍ下の位置で６−０プロレンで縫合することによって結紮した。ニセの操作のために、縫合を結紮なしで行った。ペプチドＮＦ（ペプチド配列ＡｃＮ−ＲＡＲＡＤＡＤＡＲＡＲＡＤＡＤＡ−ＣＮＨ２（配列番号３５）；ＳｙｎＰｅｐ  Ｃｏｒｐ．より）を、５０または１００ｎｇ／ｍｌのヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）および／または５０ｍＭのＬＹ２９４００２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の有無とともに、２９５ｍＭのスクロースに溶解して、超音波処理して、注射のための１％溶液を生成した。全部で８０μｌの自己アセンブリするペプチドＮＦを、冠動脈結紮の直後に３方向（各々の注射に等しい量）を通じて梗塞した境界領域に注入した（図１）。注入は、動脈結紮後１分以内に完了した。注射後、胸部を閉じて、動物を加熱パッド下で回復させた。ＰＤＧＦ−ＢＢ保持研究（１２０匹の生残ラット）のために、動物を１０分、１日、３日または１４日後に屠殺した。
【００３７】
機能的および組織学的研究（１２６匹の生残ラット）のために、ラットは１日、１４日または２８日後に安楽死させた。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔブロッキング（１６匹の生残ラット）および梗塞サイズ（６４匹の生残ラット）研究のために、心臓を２４時間後に回収した。心筋領域血流研究（３０匹の生残ラット）のためには、心臓を１４日後にマイクロスフェア収集のために回収した。全ての手順は盲検でかつ無作為的な方式で行って、各々のコードした群に少なくとも６匹の動物があった後に、データを分析した。この研究における全体的な外科的死亡率は、５．３％であった（３７６匹のラットのうち２０匹であって、研究コホートについて生残ラット３５６匹）。
【００３８】
（ＥＬＩＳＡ）
インビボのＰＤＧＦ−ＢＢ送達研究のために、心筋タンパク質を、１：２００希釈でプロテイナーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、３００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡおよび０．０２％のＮａＮ３を含有する非還元緩衝液を用いて、注射部位から抽出した。各々の心臓由来の同じ量のタンパク質を、製造業者（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の指示に従って、抗ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ  ＥＬＩＳＡのために三連でロードした。
【００３９】
（蛍光顕微鏡）
固定された心筋部位を脱パラフィン処理して、再水和して、煮沸する１０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）を用いて１０分間、そして１０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて室温で１０分間、前処理して、続いて、リン−ＰＤＧＦＲ−βに対する抗体、切断されたカスパーゼ３（両方ともＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｋｉ６７（Ａｂｃａｍ）、イソレクチン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）、α−ＳＭＡ、トロポミオシン、ビメンチン（全てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに４℃で一晩、次いでＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ結合体化二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）とともにインキュベーションした。次に、切片を抗α−サルコメアのアクチニンまたはトロポミオシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに、続いて種々のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒの二次抗体とともにインキュベートして、種々の蛍光色を得た。ＤＡＰＩでの対比染色後に、切片を装填して、蛍光顕微鏡下で観察した。血管直径測定のために、切片は、イソレクチンまたはα−ＳＭＡを用いて染色して、写真に撮り、そして直径を、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏバージョン４．５（ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を用いて測定した。
【００４０】
（心エコー図法）
心エコー図の取得および分析は、以前に記載されるとおり（Ｌｉｎｄｓｅｙら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０５：７５３〜７５８（２００２））行った。左心室短縮率は、（ＥＤＤ−ＥＳＤ）／ＥＤＤ×１００％と算出され、ここでＥＤＤは、拡張終期径であって、ＥＳＤは収縮終期径である。
【００４１】
（免疫組織化学）
ホルマリン固定された、パラフィン包埋された切片は、前に記載されたとおり免疫組織化学のために調製した（Ｄａｖｉｓら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１１：４４２〜４５０（２００５）；Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８８：Ｈ１８０２〜Ｈ１８０９（２００５））。用いた第一の抗体は、抗リン−ＰＤＧＦＲ−β、抗リン−Ａｋｔ、抗切断カスパーゼ−３（全てＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ由来）、抗好中球（Ｓｅｒｏｔｅｃ）、抗ｍａｃ３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および抗ＢｒｄＵ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．）であった。
【００４２】
（心筋のＩ／Ｒおよび梗塞サイズの測定）
心筋のＩ／Ｒおよび梗塞サイズの測定は、前に記載されたとおり（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８８：Ｈ１８０２〜Ｈ１８０９（２００５））、ラットで行った。虚血時間は、６０分であって、再灌流期間は２４時間であった。全ての手順は、盲検でかつ無作為的な方式で行い、そして各々の群に少なくとも６匹の動物とした。
【００４３】
（ＢｒｄＵプロトコール）
屠殺の２時間前、５０ｍｇ／ｋｇの体重のＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をラットにｉ．ｐ．（腹腔内）注射した。ＢｒｄＵ染色は、Ｇｅａｒｙら（Ｇｅａｒｙら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９１：２９７２〜２９８１（１９９５））に記載される方法を用いて行った。各々の動物由来の小腸の小片を陽性コントロールとして用いた。
【００４４】
（ＤＮＡ合成）
細胞増殖は、前に記載されたとおり（Ｓｃｈｕｌｚｅら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９１：６８９〜６９５（２００２））、ＤＮＡへの［３Ｈ］チミジン取り込みを用いて測定した。
【００４５】
（心筋の局所血流測定）
心筋の局所血流は、改変はあるが、Ｖａｎ  Ｏｏｓｔｅｒｈｏｕｔら（Ｖａｎ  Ｏｏｓｔｅｒｈｏｕｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６９：Ｈ７２５〜Ｈ７３３（１９９５））に記載されたとおり蛍光マイクロスフェアを用いて測定した。要するに、動物にはヘパリン（体重１ｇあたり約２Ｕ）を投与して、麻酔した。左開胸術を介して心臓全体を露出させて、下行大動脈を開放して、双方向性のローリングポンプに接続している回収（ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）カテーテルを挿入した。血液は、左心房への蛍光マイクロスフェアの注入の５秒前に開始して、１〜２ｍｌ／分の速度で２分間吸引した。血液は、２ｍｇのＥＤＴＡを含有する採集試験管に移して、総量を記録した。全部で３０μｌのマイクロスフェア、等量のブルー・グリーンの混合物（１０μｍの直径；３．６×１０４ビーズ）、グリーン（１５μｍの直径；１×１０４ビーズ）およびイエロー・グリーン（１０μｍの直径；３．６×１０４）ビーズ（全てＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．より）を、各々のラットに注射した。動物を注射の２分後に屠殺した。心臓全体を取り出した後、左心室で梗塞した心筋を特定して、回収して、秤量し、４℃で保管した。梗塞していない右心室由来の同様のサイズの心筋をまたコントロールとして回収した。次いで、血液および心筋を４ＮのＫＯＨ（サンプルの容積の３倍より多い）中で、５０℃で一晩消化した。２，０００ｇで１０分間の遠心分離後、マイクロスフェアを含む血小板を０．２５％Ｔｗｅｅｎ−２０、次いで蒸留水を用いて２回洗浄した。その血小板を０．５ｍｌのキシレンで溶解し、次いで５０℃で３時間、間欠的なボルテックスおよび超音波処理をしながらインキュベートした。その上清を収集して、各々のサンプルについて３連で蛍光強度の測定（Ｖｉｃｔｏｒ２；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に供した。心筋領域の血流は、式Ｑｉ＝（Ｑｒｅｆ×Ｆｉ）÷Ｆｒｅｆを用いて算出し、ここでＱｉおよびＱｒｅｆは、それぞれサンプル中の流速および吸引速度であって、ＦｉおよびＦｒｅｆは、心筋サンプル中および参照血液サンプル中の蛍光強度である。質量での正規化後、絶対的な心筋血流を、ミリリットル／分／グラムで表した。
【００４６】
（統計学）
全てのデータは、平均±ＳＥＭとして表す。統計学的相違は、必要に応じて両側スチューデントｔ検定またはＡＮＯＶＡを用いて測定した。群間の相違は、Ｐ＜０．０５で統計的に有意とみなした。
【００４７】
（ＩＩＩ．結果）
（内皮細胞は、ＰＤＧＦ−ＢＢ／ＰＤＧＦＲ−βシグナル伝達を介して心筋細胞生存を促進する）
前の研究によって、内皮細胞は、同時培養において心筋細胞のアポトーシス防止し得ることが実証された（Ｎａｒｍｏｎｅｖａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１０：９６２-９６８（２００４）；Ｋｕｒａｍｏｃｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：５１１４１-５１１４７（２００４））、本発明者らは、知見をさらに検討して、インビボにおける定量的送達のための条件を確立した。新生仔ラットの心筋を、成体の心臓内皮細胞または線維芽細胞とともに同時培養して、ドキソルビシン、ケレリトリンおよびＨ２Ｏ２に加えてＴＮＦ−αを用いる処置を含む３つの異なる方法によって心筋細胞アポトーシスを誘導した。アポトーシスは、インサイチュのＴＵＮＥＬ染色、ヨウ化プロピジウム染色によるＤＮＡ断片化、およびアネキシン−Ｖセル・ソーティングを含む３つの独立したアッセイで定量した。各々のアポトーシス性の刺激を用いて、内皮細胞との同時培養は、心筋細胞のアポトーシスを妨げたが、線維芽細胞との同時培養はアポトーシスを妨げなかった。心筋細胞内皮の同時培養におけるアポトーシスからの心筋細胞の保護は、ＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦＲ−βに対する抗体を中和することによってブロックされたが、ＰＤＧＦ−ＡＡまたはＰＤＧＦＲ−αに対する抗体によってはブロックされず、このことは、内皮細胞由来の心筋細胞保護は、ＰＤＧＦ−ＢＢ／ＰＤＧＦＲ−β経路を通じて生じるということを示した。
【００４８】
（ＰＤＧＦ−ＢＢは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達を介して心筋細胞アポトーシスを妨げる）
心筋細胞アポトーシスにおけるＰＤＧＦ−ＢＢの効果をさらに評価するために、本発明者らは、ＰＤＧＦ−ＢＢの有無による多数の方法によって心筋細胞アポトーシスを誘導して、上記のような３つの独立したアッセイでアポトーシスを定量した。ＰＤＧＦ−ＢＢは、刺激またはアッセイにかかわらず心筋細胞アポトーシスを妨げ、そして用量依存性のアポトーシス効果があり、最適の結果はＰＤＧＦ−ＢＢ濃度が１０ｎｇ／ｍｌ以上であった。ＰＤＧＦ−ＢＢは、ただしＰＤＧＦ−ＡＡは違うが、心筋細胞におけるＰＤＧＦＲ−βおよび下流のキナーゼＡｋｔのリン酸化反応を、用量依存性でかつ時間依存性の方式で誘導したが、５〜６０分でｐ４２／ｐ４４（ＥＲＫ−１／２）も、ｐ３８も、ｊｕｎ  Ｎ−末端キナーゼのどれの有意な活性化も誘導しなかった。リン−ＰＤＧＦＲ−βおよびα−サルコメアのアクチニンの免疫蛍光同時染色によって、ＰＤＧＦ−ＢＢによる分化した心筋細胞におけるＰＤＧＦＲ−βの活性化および内部移行が確認された。ＰＩ３Ｋ特異的なインヒビター（ＬＹ２９４００２）またはドミナントネガティブなＡｋｔアデノウイルスを用いるＡｋｔシグナル伝達のブロッキングは、心筋細胞におけるＰＤＧＦ−ＢＢの生存促進の効果を廃し、これによって、ＰＤＧＦ−ＢＢの心筋細胞保護が、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路を介して生じ得ることが実証される。これらの結果によって、ＰＤＧＦ−ＢＢは、心筋細胞への標的化送達のための可能性のある候補心筋細胞生存因子であることが示される。
【００４９】
（注射可能な自己アセンブリするペプチドＮＦを用いるＰＤＧＦ−ＢＢの徐放性の心筋内送達）
ＰＤＧＦ−ＢＢの制御された心筋内送達のための自己アセンブリするペプチドＮＦ使用の可能性を検討するために、本発明者らは、ペプチドＮＦによるＰＤＧＦ−ＢＢの結合能力を最初に試験した。これらのＮＦは、ペプチドに特異的な結合モチーフを有さないが、それらは両親媒性であって、弱い分子相互作用を通じて他のタンパク質に結合する能力を有する。ＰＤＧＦ−ＢＢ（全部で１００ｎｇ）を、ＮＦで包埋した場合、結合能力はＮＦの１μｇあたり１ｎｇのＰＤＧＦ−ＢＢであった。この結合能力は、インビボで引き続く実験において用いたＮＦの量あたりのＰＤＧＦ−ＢＢの量よりも１０倍高かった（下記）。本発明者らは、全てがＢＳＡよりもペプチドＮＦに有意に良好に結合するＶＥＧＦ−Ａ、ｂＦＧＦおよびアンギオポイエチン−１を含む、他の増殖因子の同様の結合を観察した。
【００５０】
心保護のための心筋への自己アセンブリするペプチドＮＦでのＰＤＧＦ−ＢＢ送達の実現可能性を評価するために、本発明者らは、ラットの心筋へペプチドＮＦとともにＰＤＧＦ−ＢＢを注射した。全ての手順は盲検でかつ無作為的であって、各々の群に少なくとも６匹の動物であった。左冠動脈を結紮して、直後に１％ペプチドＮＦ（ペプチド配列ＡｃＮ−ＲＡＲＡＤＡＤＡＲＡＲＡＤＡＤＡ−ＣＮＨ２（配列番号３５）の直接心筋注射を、ＰＤＧＦ−ＢＢの有無とともに、３つの位置で梗塞した境界領域に行った。注射された領域から抽出されたタンパク質は、ヒトＰＤＧＦ−ＢＢに特異的なＥＬＩＳＡによってアッセイした。ヒトＰＤＧＦ−ＢＢは、ニセの操作のみでも、ＭＩのみでも、ＭＩとＮＦ（ＭＩ＋ＮＦ）のみでも、ラットでは検出不能であった。
【００５１】
ペプチドＮＦの有無とともに４ｎｇのヒトＰＤＧＦ−ＢＢを注射した１０分後、ほとんどのＰＤＧＦ−ＢＢは、両方の群において注射領域で維持された（ペプチドＮＦなしの群では７９．５％±１８．３％、そしてペプチドＮＦありの群では９１．８％±６．４％；Ｐ＞０．０５）。ペプチドＮＦなしでは、ＰＤＧＦ−ＢＢは２４時間後に注射部位から急速に消失し、そしてごくわずかな量のＰＤＧＦ−ＢＢのみが３日後に検出され得る。対照的に、ペプチドＮＦありでは、ＰＤＧＦ−ＢＢは、注射部位で保持された；ＰＤＧＦ−ＢＢの１６．１％±２．４％が１４日後に標的化送達部位で保持された（Ｐ＜０．００１、ＰＤＧＦ−ＢＢとＮＦあり、対ＰＤＧＦ−ＢＢとＮＦなし、１日、３日および１４日時点）。
【００５２】
免疫組織化学染色によって、１４日後に、ＮＦ／ＰＤＧＦ−ＢＢによる注射部位でのＰＤＧＦＲ−βのリン酸化反応が示されたが、ＮＦもしくはＰＤＧＦ−ＢＢ単独、またはニセもしくはＭＩのみでは示されなかった。免疫蛍光の同時染色によって、１４日後、注射領域に隣接する心筋におけるＰＤＧＦＲ−βの持続的な活性化が確認された。さらに、群間のＰＤＧＦＲ−βおよびＡｋｔリン酸化反応における相違をさらに定量的に決定するため、本発明者らは、ウエスタンブロッティングを用いて、注射部位から抽出されたタンパク質を試験して、ＮＦとＰＤＧＦ−ＢＢ（ＮＦ／ＰＤＧＦ−ＢＢ）の注射の１日および１４日後に持続的なＰＤＧＦＲ−βおよびＡｋｔリン酸化反応を見出した。ＰＤＧＦ−ＢＢ単独の注射では、１日後にＰＤＧＦＲ−βおよびＡｋｔリン酸化反応をわずかに誘導したが、両方とも１４日までに消失した。
【００５３】
これらの結果によって、注射可能な自己アセンブリするペプチドＮＦが心筋へＰＤＧＦ−ＢＢを首尾よく送達し得、インビボで心筋細胞におけるＰＤＧＦシグナル伝達経路の長期活性化をもたらすことが実証される。
【００５４】
（ＮＦ／ＰＤＧＦ−ＢＢの注射は、心筋機能を保存する）
心保護のために自己アセンブリするペプチドＮＦ／ＰＤＧＦ−ＢＢを注射することの機能的な効果を検査するために、次に本発明者らは、９６匹のラットで盲検的かつ無作為の研究と行い、ここでは各々の実験群に少なくとも６匹の動物を用いた。ＰＤＧＦ−ＢＢの２つの用量（５０および１００ｎｇ／ｍｌ［Ｐ５０およびＰ１００］）を注射のために選択して、梗塞した心筋の４００ｍｇへＮＦ／ＰＤＧＦ−ＢＢの全部で８０μｌを注射する（３つの異なる注射部位で投与する）ことによって、それぞれ、１０ｎｇ／ｍｌおよび２０ｎｇ／ｍｌという梗塞心筋中の適切なＰＤＧＦ−ＢＢ濃度を送達するように見積もった。
【００５５】
ＭＩの２４時間後、左心室短縮率は、ニセの操作をした心筋と比較して予想どおり減少した（ニセの群での４３．１％±７．７％、対、ＭＩ群での２７．５％±５．６％；Ｐ＜０．０５）、そしてＮＦまたはＰＤＧＦ−ＢＢ単独の注射は、短縮率を有意に改善しなかった。しかし、ＮＦ／Ｐ５０またはＮＦ／Ｐ１００を注射した梗塞した心臓では、短縮率は有意に改善した（それぞれ、４２．７％±７．１％および４３．０％±８．４％；Ｐ＜０．０５、両方対ＭＩまたはＭＩ＋ＮＦについて）．
梗塞の１４日後に、短縮率の改善は、ＮＦ／Ｐ１００を投与された心臓で維持されたが、ＮＦ／Ｐ５０を投与された心臓では維持されず（ニセでは、５０．０％±８．７％、ＭＩ後では、３２．８％±４．２％、ＮＦ／Ｐ５０では３９．６％±７．９％、そしてＮＦ／Ｐ１００では４７．６％±１０．０％；Ｐ＜０．０５、ニセ対ＭＩ、そしてＮＦ／Ｐ１００対ＭＩまたはＭＩ＋ＮＦについて）、このことは、ペプチドＮＦからのＰＤＧＦ−ＢＢの徐放による用量依存性の心保護を示している。梗塞後の短縮率の改善と一致して、ＮＦ／ＰＤＧＦ−ＢＢの注射はまた、心室収縮終期径および心室拡張終期径によって測定した場合、心臓拡張を妨げた（Ｐ＜０．０５）。
【００５６】
トリクロム（三重）染色を用いて、本発明者らは、ＮＦ／ＰＤＧＦ−ＢＢの注射による線維芽細胞の増大は観察せず、このことは、ＮＦ／ＰＤＧＦ−ＢＢの注射が、心臓線維芽細胞を刺激し得ないことを示唆している（Ｐｏｎｔｅｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６３：６７３-６８２（２００３））。
【００５７】
（ＮＦ／ＰＤＧＦ−ＢＢの注射は、心筋細胞アポトーシスを減少させて、梗塞後にＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ活性化を誘導する）
ペプチドＮＦ／ＰＤＧＦ−ＢＢの注射による心臓収縮機能の保存が心筋細胞アポトーシスの予防を伴うか否かに取り組むために、本発明者らは、切断されたカスパーゼ−３およびα−サルコメアのアクチニンの免疫蛍光同時染色を用いて組織を検査した。ペプチドＮＦと５０または１００ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢの注射は、１日後にカスパーゼ−３活性化を劇的に減少したが、ＮＦもＰＤＧＦ−ＢＢも単独では減少させなかった（Ｐ＜０．００１、５０または１００ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢとＮＦ対ＭＩまたはＭＩ＋ＮＦ）。１４日後、ＮＦ／Ｐ１００の注射は、ＮＦ／Ｐ５０の注射よりもアポトーシスを減少させたが、両方の処置ともコントロールに比較してアポトーシスを有意に減少させた（ニセでは、０．５％±０．２％、ＭＩでは１２．８％±１．１％、ＮＦと５０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢでは７．２％±０．８％、Ｐ＜０．０１対ＭＩ；そしてＮＦと１００ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢでは３．１％±０．４％，Ｐ＜０．００１対ＭＩ）。さらに、本発明者らは、ＮＦ／ＰＤＧＦ−ＢＢの注射による心筋におけるＡｋｔの活性化があるが、ただしＮＦまたはＰＤＧＦ−ＢＢ単独の注射の場合は活性化がないことを実証し、これによってこのストラテジーは、インビボで心筋における生存シグナル伝達を誘導することが示される（Ｍａｔｓｕｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０４：３３０〜３３５（２００１）；Ｍａｎｇｉら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１１９５〜１２０１（２００３）；Ｂｏｃｋ−Ｍａｒｑｕｅｔｔｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：４６６〜４７２（２００４））。
【００５８】
ペプチドＮＦ／ＰＤＧＦＢＢにおけるＰＩ３Ｋ−特異的なインヒビターＬＹ２９４００２（５０μＭ）の付加では、本発明者らは、Ａｋｔ活性化がブロックされ、そしてＮＦ／ＰＤＧＦ−ＢＢの注射による短縮率の改善もなくなることを見出しており、このことは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達が、注射ペプチドＮＦ／ＰＤＧＦ−ＢＢの心保護効果においてある役割を果たし得ることを意味する。さらに、複数の心筋細胞が、ＰＤＧＦ−ＢＢを標的し得るので、本発明者らは、ＮＦ／ＰＤＧＦ−ＢＢの注射後に、リン−Ａｋｔおよび細胞特異的なマーカーの免疫蛍光同時染色を用いて、心筋細胞、内皮細胞、ＶＳＭＣおよび線維芽細胞におけるＡｋｔリン酸化反応を検査した。本発明者らは、Ａｋｔリン酸化反応が、注射の１日後および１４日後に心筋細胞で誘導され、そしてまた内皮細胞でも１４日後に誘導されたことを見出した。しかし、本発明者らは、ＶＳＭＣまたは線維芽細胞ではＡｋｔリン酸化反応を検出できなかった。これらの結果によって、心筋細胞は、ＮＦ／ＰＤＧＦ−ＢＢの注射後にＰＤＧＦ−ＢＢの主な標的であることが示される。
【００５９】
（ＮＦ／ＰＤＧＦ−ＢＢの注射は、Ｉ／Ｒ傷害後の梗塞のサイズを減少させる）
ＮＦ／ＰＤＧＦ−ＢＢの注射がまた、虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害から心臓に利点があり得るか否かを検討するために、本発明者らは、５２匹のラットで別の盲検的かつ無作為の実験を行なって、６０分の虚血および２４時間の再灌流後の梗塞のサイズを検査した（ニセおよびＩ／Ｒ単独群ではｎ＝１０；Ｉ／Ｒ＋ＮＦ単独およびＩ／Ｒ＋ＮＦ／ＰＤＧＦ−ＢＢ群ではｎ＝１６）。ＮＦ／Ｐ１００の注射は再灌流２４時間後の心室短縮率を改善したが、ＮＦ単独では改善しなかった（ニセでは、５０．３％±２．０％、Ｉ／Ｒのみでは、３６．１％±２．０％、Ｉ／Ｒ＋ＮＦでは４１．９％±２．４％、そしてＩ／Ｒ＋ＮＦ／ＰＤＧＦ−ＢＢでは５１．３％±２．１％；Ｐ＜０．０５、Ｉ／Ｒ＋ＮＦ／ＰＤＧＦ−ＢＢ、対Ｉ／Ｒのみ、またはＩ／Ｒ＋ＮＦ）。危険な領域の割合によって示した梗塞サイズはまた、ＮＦ／ＰＤＧＦ−ＢＢの注射によって減少した（ニセでは０％、Ｉ／Ｒのみでは４０．０％±２．３％、Ｉ／Ｒ＋ＮＦでは３８．５％±２．２％、そしてＩ／Ｒ＋ＮＦ／ＰＤＧＦ−ＢＢでは２７．８％±２．４％；Ｐ＜０．０１、Ｉ／Ｒ＋ＮＦ／ＰＤＧＦＢＢ、対、Ｉ／Ｒのみ、またはＩ／Ｒ＋ＮＦ）。
【００６０】
予想どおり、左心室の容積率によって提示される、危険な領域は、Ｉ／Ｒのみ、Ｉ／Ｒ＋ＮＦ、そしてＩ／Ｒ＋ＮＦ／ＰＤＧＦ−ＢＢ群で同様であって、このことは、冠動脈結紮の位置が群の間で同様であったことを示す。本発明者らはまた、新規な無作為化されかつ盲検の実験を行なって、梗塞のサイズに対するＰＤＧＦ−ＢＢ単独の効果を研究し（Ｉ／Ｒ単独については６匹のラット、そしてＩ／Ｒ＋ＰＤＧＦ−ＢＢについては６匹のラット）、そしてこれらの２群の間に統計的な相違は観察しなかった（Ｐ＝０．６４５）。まとめると、これらの結果によって、ＮＦ／ＰＤＧＦ−ＢＢの注射は、梗塞およびＩ／Ｒ注射後の心筋機能を保存し得ることが実証される。
【００６１】
（ＮＦ／ＰＤＧＦ−ＢＢの注射は、心筋細胞増殖も新血管新生も、局所血流も、梗塞後炎症も増大しない）
ＰＤＧＦ−ＢＢは、多くの細胞の強力な分裂促進因子であるので、本発明者らは、増殖性細胞を標識するために、ＢｒｄＵおよびＫｉ６７を用いて、梗塞した心筋におけるＰＤＧＦ−ＢＢ送達によって誘導される細胞増殖を研究した。活性細胞増殖は、陽性コントロール、ラット小腸において、ＢｒｄＵ染色によって検出され得る。対照的に、０．５％未満の細胞が、１日、１４日および２８日後に梗塞周囲の心筋中でＢｒｄＵ陽性であって、全ての研究群のうちでＢｒｄＵ陽性細胞の数に相違はなかった。Ｋｉ６７染色を用いて同様の結果が見出された。
【００６２】
興味深い事に、同時染色するＫｉ６７および細胞特異的マーカーによって、細胞増殖が、内皮細胞および線維芽細胞においてのみ生じるが、心筋細胞においてもＶＳＭＣにおいても生じず、そして群間でＫｉ６７陽性細胞の数の相違はなかったことが明らかになった。これらの結果と一致して、［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイを用いて、本発明者らは、ＰＤＧＦ−ＢＢが、培養されたラット心筋細胞でも心臓の線維芽細胞でもＤＮＡ合成を誘導せず、ただしヒト大動脈平滑筋細胞ではＤＮＡ合成を増大したことを見出した。これらの結果によって、ＮＦ／ＰＤＧＦ−ＢＢの注射は、虚血性心筋では細胞増殖を誘導しないことが示唆される。
【００６３】
次いで、本発明者らは、ＮＦ／ＰＤＧＦ−ＢＢの注入が、虚血性心筋の新血管形成を増強できなかったか否かを試験した。なぜなら、本発明者らは、正常な心筋におけるＮＦ単独の注入がＮＦ内の新血管形成をもたらしたことを以前に見出しているからである（Ｄａｖｉｓら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１１：４４２-４５０（２００５））。梗塞周囲の領域における全体的な毛細管（内皮細胞染色）および動脈（ＶＳＭＣ染色）の密度（１ｍｍ２あたりの血管数）は、梗塞の１４日および２８日後に、ＰＤＧＦ−ＢＢの有無において、ＮＦの注射によって変化しなかった。血管の直径はまた、群間で異なった。これらのデータと一致して、蛍光マイクロスフェアを用いて、本発明者らは、心筋における局所血流は梗塞１４日後に減少されたが、ＮＦ／ＰＤＧＦ−ＢＢの注射でも、ＮＦ単独の注射でも、ＰＤＧＦ−ＢＢ単独の注射でも変化しなかったことを見出した。
【００６４】
本発明者らは、また、ＰＤＧＦ−ＢＢの有無においてＮＦの注射が炎症性応答を誘発し得るか否かを検査して、ＮＦの注射なしのＭＩと比較して、注射後に好中球も単球／マクロファージ浸潤の増大もなかったことを見出した。
【００６５】
これらのデータをまとめると、ＮＦ／ＰＤＧＦ−ＢＢ注射による心臓機能の改善は、血液供給の改善から生じるのではないかもしれないということが示唆される。
【００６６】
（ＩＩＩ．考察）
虚血傷害後の心筋細胞の急速な損失を考えれば、心筋細胞生存を促進することは、生存可能な心筋を保存するための有効なストラテジーである。この研究の主な知見は、ＰＤＧＦ−ＢＢが心筋における直接の抗アポトーシス効果を有する内皮分泌型の傍分泌因子であるということ、およびこの生存促進シグナルが、注射可能な自己アセンブリするペプチドＮＦを用いる高度に制御された方式での心保護のために、梗塞された心筋に送達され得るということである。
【００６７】
この結果によって、このストラテジーは、梗塞後早期におけるＰＤＧＦ−ＢＢの送達に極めて有効であることが示され；１４日後でさえ、ＰＤＧＦ−ＢＢの１６％が注射部位で維持されていた。注射後急速に排除されたＰＤＧＦ−ＢＢ単独の注射と比較して、ＮＦ／ＰＤＧＦ−ＢＢ注射で心筋の内部のＰＤＧＦ−ＢＢの維持された送達が達成された。重要な事に、ＮＦ内に包埋されたＰＤＧＦ−ＢＢは、注射の１４日後に生物学的に活性を維持しており、これによって注射領域での心筋の層全体を通じて、そして時には乳頭筋へさえ、心筋におけるＰＤＧＦＲ−β  およびＡｋｔのリン酸化反応が誘導された。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】梗塞が起きた心筋への自己アセンブリするペプチドナノファイバーを用いるＰＤＧＦ−Ｂの標的化送達。ペプチドナノファイバー（ＮＦ）注射による実験的な心筋梗塞（ＭＩ）のラットモデル。ペプチドＮＦは、超音波処理後にゲル状構造を形成し、そして心筋注射後に強固になる。左冠動脈を永続的に結紮して、その後に３つの別の方向から境界領域に８０μｌのペプチドＮＦ注射を続けた。
【図１】
2008526749.tif 000011
【配列表】
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【国際調査報告】
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