(57)【要約】  本発明は、免疫グロブリンに関し、特にヒトインターロイキン１３（ｈＩＬ−１３）に特異的に結合する抗体に関する。本発明の抗体は、ｈＩＬ−１３とヒトＩＬ−１３受容体との相互作用の変調に応答性のある様々な疾患または障害の治療に用い得る。このような疾患には、重篤な喘息、アトピー性皮膚炎、ＣＯＰＤおよび様々な線維性疾患が含まれる。前記抗体を含む医薬組成物および製造方法も開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｈＩＬ−１３と特異的に結合し、その活性を中和する、治療用抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
ｈＩＬ−１３と特異的に結合し、ｈＩＬ−１３とｈＩＬ−１３Ｒの間の相互作用を変調（例えば、阻害または遮断）する、治療用抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
ｈＩＬ−１３と特異的に結合し、ｈＩＬ−１３とｈＩＬ−１３Ｒの間の相互作用を変調（例えば、阻害または遮断）し、次のＣＤＲＨ３：配列番号３を含む、治療用抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
ｈＩＬ−１３と特異的に結合し、ｈＩＬ−１３とｈＩＬ−１３Ｒの間の相互作用を変調する、治療用抗体またはその抗原結合断片であって、以下のＣＤＲ：
ＣＤＲＨ１：配列番号１
ＣＤＲＨ２：配列番号２
ＣＤＲＨ３：配列番号３
ＣＤＲＬ１：配列番号４
ＣＤＲＬ２：配列番号５
ＣＤＲＬ３：配列番号６
を含む、抗体またはその断片。
【請求項５】
配列番号９の配列番号８４に示されるエピトープと特異的に結合し、ｈＩＬ−１３とｈＩＬ−１３Ｒの間の相互作用を変調する、治療用抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
抗体が配列番号９の残基１０３ないし１０７（両端を含めて）の間で結合する、請求項５記載の治療用抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
抗体のｈＩＬ−１３との結合が配列番号９の位置１０７にあるアルギニン残基の存在によるところの、請求項６記載の治療用抗体または抗原結合断片。
【請求項８】
配列番号９の位置１０７にあるアルギニン残基のアラニン残基との置換が、配列番号９の位置１０７での置換が無いとした場合の抗体およびその抗原結合断片と配列番号９の間の結合と比較して、該抗体とｈＩＬ−１３の間の結合の喪失をもたらすところの、請求項７記載の治療用抗体または抗原結合断片。
【請求項９】
抗体が無傷の抗体であるところの、上記したいずれかの請求項に記載の治療用抗体または抗原結合断片。
【請求項１０】
抗体がラット、マウス、霊長類（例えば、カニクイザル、旧世界ザルもしくは大型猿人類）またはヒト由来であるところの、請求項９記載の治療用抗体または抗原結合断片。
【請求項１１】
抗体がヒト化またはキメラ抗体であるところの、請求項１ないし８のいずれか一項に記載の治療用抗体。
【請求項１２】
抗体がヒト定常領域を含むところの、請求項９ないし１１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
抗体がＩｇＧアイソタイプの定常領域を含むところの、請求項１２記載の抗体。
【請求項１４】
抗体がＩｇＧ１またはＩｇＧ４であるところの、請求項１３記載の抗体。
【請求項１５】
配列番号７のＶＨドメインおよび配列番号８のＶＬドメインを含む、請求項１０記載のネズミ抗体。
【請求項１６】
配列番号１１のＶＨドメインおよび配列番号１５のＶＬドメインを含む、請求項１１記載のヒト化抗体。
【請求項１７】
配列番号１２のＶＨドメインおよび配列番号１５のＶＬドメインを含む、請求項１１記載のヒト化抗体。
【請求項１８】
配列番号１３のＶＨドメインおよび配列番号１５のＶＬドメインを含む、請求項１１記載のヒト化抗体。
【請求項１９】
配列番号１４のＶＨドメインおよび配列番号１５のＶＬドメインを含む、請求項１１記載のヒト化抗体。
【請求項２０】
配列番号１１のＶＨドメインおよび配列番号１６のＶＬドメインを含む、請求項１１記載のヒト化抗体。
【請求項２１】
配列番号１２のＶＨドメインおよび配列番号１６のＶＬドメインを含む、請求項１１記載のヒト化抗体。
【請求項２２】
配列番号１３のＶＨドメインおよび配列番号１６のＶＬドメインを含む、請求項１１記載のヒト化抗体。
【請求項２３】
配列番号１４のＶＨドメインおよび配列番号１６のＶＬドメインを含む、請求項１１記載のヒト化抗体。
【請求項２４】
ＩｇＧアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４）のヒト定常領域をさらに含む、請求項１６ないし２３のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
【請求項２５】
配列番号１８の重鎖および配列番号２２の軽鎖を含む、ヒト化抗体。
【請求項２６】
配列番号１９の重鎖および配列番号２２の軽鎖を含む、ヒト化抗体。
【請求項２７】
配列番号２０の重鎖および配列番号２２の軽鎖を含む、ヒト化抗体。
【請求項２８】
配列番号２１の重鎖および配列番号２２の軽鎖を含む、ヒト化抗体。
【請求項２９】
配列番号１８の重鎖および配列番号２３の軽鎖を含む、ヒト化抗体。
【請求項３０】
配列番号１９の重鎖および配列番号２３の軽鎖を含む、ヒト化抗体。
【請求項３１】
配列番号２０の重鎖および配列番号２３の軽鎖を含む、ヒト化抗体。
【請求項３２】
配列番号２１の重鎖および配列番号２３の軽鎖を含む、ヒト化抗体。
【請求項３３】
ｈＩＬ−１３と特異的に結合するヒト化治療用抗体またはその抗原結合断片であって、ＣＤＲＨ３（配列番号３）を含み、配列番号１、２、４、５および６のＣＤＲをさらに含んでもよく、ヒトアクセプター重鎖フレームワーク領域の１９、３８、７３および８１からなる群から選択された残基およびヒトアクセプター軽鎖フレームワークの位置８５の残基が、ＣＤＲＨ３が誘導されるドナー抗体フレームワーク中に見つかる対応する残基で置換されている、抗体またはその断片。
【請求項３４】
ｈＩＬ−１３と特異的に結合するヒト化治療用抗体またはその抗原結合断片であって、ＣＤＲＨ３（配列番号３）を含み、配列番号１、２、４、５および６のＣＤＲをさらに含んでもよく、ヒト重鎖フレームワークが以下の残基（またはその同類置換基）の１つもしくは複数（例えば、すべて）を含み：
位置      残基
３９      Ｉ
２０      Ｒ
７４      Ｔ
８１      Ｒ
ヒト軽鎖が：
位置      残基
８５      Ｖ
を含む、抗体またはその断片。
【請求項３５】
断片がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニ抗体、ミニボディ、単離されたＶＨ、単離されたＶＬであるところの、上記した請求項のいずれかに記載の抗原結合断片。
【請求項３６】
抗体がＡＤＣＣおよび／または補体活性化を減少させるように変異Ｆｃ領域を含む、請求項１２ないし１４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３７】
上記した請求項のいずれかに記載の抗体とｈＩＬ−１３との結合を競合的に阻害する、治療用抗体。
【請求項３８】
第１および第２のベクターを含む形質転換またはトランスフェクトされた組換え宿主細胞であって、第１のベクターが上記のいずれかの請求項に記載の抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、該第２のベクターが上記のいずれかの請求項に記載の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む、組換え宿主細胞。
【請求項３９】
第１のベクターが配列番号７のポリヌクレオチドを含み、第２のベクターが配列番号８のポリヌクレオチドを含む、請求項３８記載の宿主細胞。
【請求項４０】
第１のベクターが配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含み、第２のベクターが配列番号１５、配列番号１６、配列番号３６、配列番号３７からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む、請求項３８記載の宿主細胞。
【請求項４１】
細胞が真核生物由来である、請求項３８ないし４０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項４２】
細胞が哺乳動物由来である、請求項４１記載の宿主細胞。
【請求項４３】
細胞がＣＨＯまたはＮＳ０である、請求項４１または４２記載の宿主細胞。
【請求項４４】
請求項１ないし３７のいずれか一項に記載の治療用抗体の製法であって、請求項３８ないし４３のいずれか一項に記載の宿主細胞を無血清培地にて培養する工程を含む、方法。
【請求項４５】
抗体が宿主により培地に分泌される、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
抗体がさらに、該抗体を含有する培地に対して、少なくとも９５％またはそれ以上（例えば、９８％またはそれ以上）まで精製されている、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
請求項１ないし３７のいずれか一項に記載の治療用抗体またはその抗原結合断片と、医薬上許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項４８】
請求項４７に記載の組成物と、使用説明書とを含む、部材のキット。
【請求項４９】
喘息に罹患しているヒト患者を治療する方法であって、治療上有効量の請求項１ないし３７の治療用抗体を投与する工程を含む、方法。
【請求項５０】
患者がアレルギー喘息に罹患している、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
患者が重篤な喘息に罹患している、請求項４９記載の方法。
【請求項５２】
患者が困難な喘息に罹患している、請求項４９記載の方法。
【請求項５３】
患者がもろい喘息に罹患している、請求項４９記載の方法。
【請求項５４】
患者が夜間喘息、月経前喘息、ステロイド耐性喘息、ステロイド依存性喘息、アスピリン誘導性喘息、成人発症喘息、小児喘息に罹患している、請求項４９記載の方法。
【請求項５５】
コルチコステロイドでの治療が困難な喘息性症状に罹患しているヒト患者を治療する方法であって、該患者に治療上有効量の請求項１ないし３７のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片を投与する工程を含む、方法。
【請求項５６】
ヒト患者における急性喘息発作を予防する方法であって、該患者に治療上有効量の請求項１ないし３７に記載の抗体を投与する工程を含む、方法。
【請求項５７】
ヒト患者における急性喘息発作の頻度を減少させ、および／またはその作用を和らげる方法であって、該患者に治療上有効量の請求項１ないし３７のいずれか一項に記載の抗体を投与する工程を含む、方法。
【請求項５８】
アトピー性皮膚炎、アレルギー鼻炎、クローン病、ＣＯＰＤ、線維症、全身性進行性硬化症、肝線維症、肝肉芽腫、住血吸虫症、リーシュマニア症、ホジキン病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病などの細胞周期調節疾患からなる群より選択される疾患または障害に罹患しているヒト患者の治療方法。
【請求項５９】
アレルギー喘息、重篤な喘息、困難な喘息、もろい喘息、夜間喘息、月経前喘息、ステロイド耐性喘息、ステロイド依存性喘息、アスピリン誘導性喘息、成人発症喘息、小児喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー鼻炎、クローン病、ＣＯＰＤ、突発性肺線維症などの線維疾患または障害、全身性進行性硬化症、肝線維症、肝肉芽腫、住血吸虫症、リーシュマニア症、ホジキン病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病などの細胞周期調節疾患からなる群より選択される疾患または障害を治療するための医薬の製造における、請求項１ないし３７のいずれか一項に記載の治療用抗体またはその抗原結合断片の使用。
【請求項６０】
ｈＩＬ−１３とｈＩＬ−１３Ｒの間の結合を阻害する、請求項１ないし３７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６１】
ｈＩＬ−１３とｈＩＬ−１３Ｒの間の結合を遮断する、請求項６０記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６２】
ｈＩＬ−１３と特異的に結合し、ｈＩＬ−１３とｈＩＬ−１３Ｒの間の相互作用を変調（例えば、阻害または遮断）し、配列番号９のＫＫＬＦＲエピトープに結合する、治療用抗体。
【請求項６３】
ｈＩＬ−１３に特異的に結合し、ｈＩＬ−１３とｈＩＬ−１３Ｒとの相互作用を変調（例えば、阻害または遮断する）し、１．４×１０−４ないし８．２２×１０−５秒−１の範囲の解離定数ｋｏｆｆ（例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭによって測定）を有する治療用抗体。
【請求項６４】
配列番号３のＣＤＲＨ３を含む、請求項６３記載の治療用抗体。
【請求項６５】
さらに、配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２、配列番号４のＣＤＲＬ１、配列番号５のＣＤＲＬ２および配列番号６のＣＤＲＬ３を含む、請求項６４記載の治療用抗体。
【請求項６６】
ヒト化抗体である、請求項６５記載の治療用抗体。
【請求項６７】
アレルギー喘息、重篤な喘息、困難な喘息、もろい喘息、夜間喘息、月経前喘息、ステロイド耐性喘息、ステロイド依存性喘息、アスピリン誘導性喘息、成人発症喘息、小児喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー鼻炎、クローン病、ＣＯＰＤ、突発性肺線維症などの線維疾患または障害、全身性進行性硬化症、肝線維症、肝肉芽腫、住血吸虫症、リーシュマニア症、ホジキン病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病などの細胞周期調節疾患からなる群より選択される疾患または障害に罹患しているヒト患者を治療する方法であって、治療上有効量の請求項１ないし３７のいずれか一項に記載の抗体、および治療上有効量の抗−ＩＬ−４モノクローナル抗体を投与することを含む、方法。
【請求項６８】
抗−ＩＬ−４モノクローナル抗体が、請求項１ないし３７のいずれか一項に記載の抗体と、同時に、連続的に、あるいは別々に投与される、請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
抗−ＩＬ−４抗体がパソコリズマブである、請求項６７または６８記載の方法。
【請求項７０】
アレルギー喘息、重篤な喘息、困難な喘息、もろい喘息、夜間喘息、月経前喘息、ステロイド耐性喘息、ステロイド依存性喘息、アスピリン誘導性喘息、成人発症喘息、小児喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー鼻炎、クローン病、ＣＯＰＤ、突発性肺線維症などの線維疾患または障害、全身性進行性硬化症、肝線維症、肝肉芽腫、住血吸虫症、リーシュマニア症、ホジキン病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病などの細胞周期調節疾患からなる群より選択される疾患または障害を治療するための医薬の製造における、請求項１ないし３７のいずれか一項に記載の抗体およびパソコリズマブなどの抗−ＩＬ−４モノクローナル抗体の使用。
【請求項７１】
アレルギー喘息、重篤な喘息、困難な喘息、もろい喘息、夜間喘息、月経前喘息、ステロイド耐性喘息、ステロイド依存性喘息、アスピリン誘導性喘息、成人発症喘息、小児喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー鼻炎、クローン病、ＣＯＰＤ、突発性肺線維症などの線維疾患または障害、全身性進行性硬化症、肝線維症、肝肉芽腫、住血吸虫症、リーシュマニア症、ホジキン病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病などの細胞周期調節疾患からなる群より選択される疾患または障害を治療するための部材のキットの製造における、請求項１ないし３７のいずれか一項に記載の抗体ならびにパソコリズマブなどの抗−ＩＬ−４モノクローナル抗体の使用。
【請求項７２】
請求項１ないし３７のいずれか一項に記載の抗体および医薬上許容される担体を含む第１の医薬組成物と、パソコリズマブなどの抗−ＩＬ−４モノクローナル抗体および医薬上許容される担体を含む第２の医薬組成物とを含み、使用説明書を含んでいてもよい、部材のキット。
【請求項７３】
請求項１ないし３７のいずれか一項に記載の第１の抗体と、パソコリズマブなどの抗−ＩＬ−４抗体である第２の抗体と、医薬上許容される担体とを含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）および具体的にはヒトＩＬ−１３（ｈＩＬ−１３）に特異的に結合する免疫グロブリンに関する。本発明の一実施形態は、ｈＩＬ−１３に特異的に結合する抗体に関する。本発明はまた、前記免疫グロブリンを用いた疾患または障害の治療方法、前記免疫グロブリンを含む医薬組成物および製造方法にも関する。本発明の他の態様は以下の説明から明らかとなろう。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）
ＩＬ−１３とは、炎症性サイトカインの産生を阻害するＴ細胞由来サイトカインとして最初に記載された、１２ｋＤａの分泌サイトカインである。構造的研究により、これは２つのジスルフィド結合によって保持された４−ヘリックス束配置を有することが示されている。ＩＬ−１３は４つの潜在的なグリコシル化部位を有するが、ラット肺由来のネイティブＩＬ−１３の解析により、グリコシル化されていない分子として産生されることが示されている。ＮＳＯおよびＣＯＳ−７細胞からのヒトＩＬ−１３の発現によりこの観察が確認されている（Ｅｉｓｅｎｍｅｓｓｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２００１、３１０（１）：２３１〜２４１；Ｍｏｙら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、２００１、３１０（１）：２１９〜２３０；Ｃａｎｎｏｎ−Ｃａｒｌｓｏｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、１９９８、１２（２）：２３９〜２４８）。
【０００３】
ＩＬ−１３とは、活性Ｔｈ２細胞、肥満細胞、好塩基球、樹状細胞、ケラチノサイトおよびＮＫＴ細胞を含めた様々な細胞種によって産生される多面発現性サイトカインである。また、Ｔｈ０、Ｔｈ１、ＣＤ８および未処置のＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞によっても産生され得る。ＩＬ−１３はＩＬ４と部分的に重複する免疫調節性活性を有しており、この重複性はＩＬ４およびＩＬ−１３の受容体中の共有の構成成分によって説明し得る。ＩＬ−１３は、ＩＬ４ＲαおよびＩＬ−１３Ｒα１の鎖からなるヘテロ二量体であるＩＩ型ＩＬ４受容体を介してシグナル伝達を行う。ＩＬ−１３Ｒα１はＩＬ−１３と低い親和性（Ｋｄ＝２〜１０ｎＭ）で結合するが、ＩＬ４Ｒαと対になった場合に高い親和性（Ｋｄ＝４００ｐＭ）で結合して、シグナル伝達を行う機能的なＩＬ−１３受容体を形成し（ヒト受容体は本明細書中で「ｈＩＬ−１３Ｒ」と呼ぶ）、その結果、ＪＡＫ／ＳＴＡＴおよびＩＲＳ−１／ＩＲＳ−２経路の活性化がもたらされる。さらなるＩＬ−１３受容体鎖（ＩＬ−１３Ｒα２）も特徴づけられており、これは高い親和性（Ｋｄ＝２５０ｐＭ）でＩＬ−１３と結合するがシグナル伝達を行わず、むしろ囮受容体として役割を果たすと考えられている。ＩＬ−１３に対する機能的な受容体は、気道上皮、平滑筋、肥満細胞、好酸球、好塩基球、Ｂ細胞、線維芽細胞、単球およびマクロファージを含めた幅広い細胞上で発現される。Ｔ細胞はＩＬ−１３に対する機能的な受容体を有さない（Ｈｉｌｔｏｎら、ＰＮＡＳ、１９９６、９３（１）：４９７〜５０１；Ｃａｐｕｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９６、２７１（２８）：１６９２１〜１６９２６；Ｈｅｒｓｈｅｙ  ＧＫ、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００３、１１１（４）：６７７〜６９０）。
【０００４】
ＩＬ−１３およびＩＬ−４どちらも、アレルギー関連の炎症を促進し、細菌、ウイルスおよび細胞内病原体に起因する炎症を抑制することによって、免疫ならびに炎症反応を変更する役割を果たす。ＩＬ−１３の主な生物学的効果には、Ｂ細胞増殖の誘発およびＩｇＥへのアイソタイプスイッチの調節；Ｂ細胞および単球上におけるＭＨＣ  ＩＩおよびＣＤ２３の発現の誘発；内皮細胞上のＶＣＡＭ−１のアップレギュレーション；ケモカイン産生の調節；肥満細胞、好酸球および好中球の機能の活性化、ならびに単球およびマクロファージ集団における炎症誘発性遺伝子の発現の阻害が含まれる。ＩＬ−１３はＴ細胞に対して増殖性効果をまったく有さない。したがって、ＩＬ４とは異なり、ＩＬ−１３はＣＤ４Ｔ細胞からＴｈ２型細胞への最初の分化に重要であるとは見受けられず、むしろアレルギー性炎症のエフェクター相に重要であると見受けられる（ＭｃＫｅｎｚｉｅら、ＰＮＡＳ、１９９３、９０（８）：３７３５〜３７３９；Ｗｙｎｎ  ＴＡ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００３、２１：４２５〜４５６）。
【０００５】
ＩＬ−１３と喘息
喘息とは、下気道の炎症によって引き起こされ、再発性の呼吸障害によって特徴づけられている、慢性肺疾患である。患者の気道は敏感であり、かつ症状がない場合にも常にある程度の腫大または炎症を起こしている。炎症は気道の狭小化をもたらし、肺からの空気の流入および流出を減少させて呼吸を困難にし、喘鳴、胸苦しさおよび咳嗽をもたらす。喘息は、アレルゲン（たとえば埃ダニ、花粉、カビ）、刺激因子（たとえば煙、有害ガス、悪臭）、呼吸器感染症、運動および乾燥した天候に対する過敏が引き金となる。この引き金が気道を刺激し、気道の内側が腫大してさらに炎症を起こし、その後、粘液が気道を詰まらせ、呼吸が困難かつストレスとなって喘息の症状が現れるまで気道の周りの筋肉が締め付けられる。
【０００６】
動物モデルおよび患者から、喘息の炎症および他の病状が空中アレルゲンおよび他の刺激に対するＴｈ２応答の調節不全によって駆動されているという有力な証拠がある（Ｂｕｓｓｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．、１９９５、１５２（１）：３８８〜３９３）。具体的には、ＩＬ−１３は、気道過敏症、好酸球増加症、杯細胞異形成および粘液過剰分泌を含めた肺における様々な細胞応答を駆動する主要なエフェクターサイトカインであると考えられている。
【０００７】
喘息におけるＩＬ−１３の役割の臨床上の証拠
ＩＬ−１３をコードしている遺伝子は染色体５ｑ３１上に位置する。この領域はＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９およびＧＭ−ＣＳＦをコードしている遺伝子も含んでおり、喘息と関連づけられている。喘息およびアトピーに関連づけられているＩＬ−１３の遺伝的変異がプロモーターおよびコード領域の両方で見つかっている（Ｖｅｒｃｅｌｌｉ  Ｄ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００２、２（５）：３８９〜３９３）。コード変異であるＱ１３０ＩＬ−１３（本明細書中で「Ｑ１３０ＩＬ−１３」と呼ぶ）の機能的な研究のデータが利用可能である。第４エクソン中に見つかる＋２０４４のＧからＡへの一塩基多型（ＳＮＰ）は、位置１３０におけるアルギニンからグルタミンへの置換をもたらす（Ｑ１３０ＩＬ−１３）。また、配列番号９ではこれは位置１１０に相当し、ここでは成熟ヒトＩＬ−１３アミノ酸配列の先頭にある最初の「Ｇ」アミノ酸残基が位置１であることに留意されたい。この変異は、日本人およびヨーロッパ人の集団において喘息、ＩｇＥレベルの上昇ならびにアトピー性皮膚炎に関連していることが判明している。Ｑ１３０ＩＬ−１３は、野生型ＩＬ−１３と比較して安定性が増強されていると考えられている。また、これはＩＬ−１３Ｒα２囮受容体に対する親和性が僅かに低く、これらの観察と一貫して、Ｑ１３０ＩＬ−１３変異においてホモ接合性の患者では非ホモ接合性患者と比較して血清ＩＬ−１３レベル中央値が高かった。これらの結果は、Ｑ１３０ＩＬ−１３がＩＬ−１３の局所濃度および全身濃度に影響を与える可能性があることを示している（Ｋａｚｕｈｉｋｏら、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００２、１０９（６）：９８０〜９８７）。
【０００８】
アトピー性喘息および非アトピー性喘息のどちらにおいてもＩＬ−１３レベルの上昇が測定されている。一研究では、正常な対照患者の平均血清ＩＬ−１３レベル８ｐｇ／ｍｌに対して、喘息患者では５０ｐｇ／ｍｌが測定された（Ｌｅｅら、Ｊ．Ａｓｔｈｍａ、２００１、３８（８）：６６５〜６７１）。また、ＩＬ−１３レベルの増加は、血漿、細気管支肺胞洗浄液、肺生検試料および痰においても測定されている（Ｂｅｒｒｙら、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００４、１１４（５）：１１０６〜１１０９；Ｋｒｏｅｇｅｌら、Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．、１９９６、９（５）：８９９〜９０４；Ｈｕａｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９５、１５５（５）：２６８８〜２６９４；Ｈｕｍｂｅｒｔら、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７、９９（５）：６５７〜６６５）。
【０００９】
喘息におけるＩＬ−１３の関与のｉｎ  ｖｉｖｏでの証拠
いくつかの研究が、アレルギー性喘息の急性および慢性のマウスモデルのどちらについても、病状を駆動する重要なエフェクターとしてのＩＬ−１３の役割を定義している。これらのモデルでは、マウスＩＬ−１３の生物活性を中和するために高親和性のＩＬ−１３受容体（ＩＬ−１３Ｒα２）または抗ＩＬ−１３ポリクローナル抗体を用いた。アレルゲン投与時におけるＩＬ−１３の遮断により、ＯＶＡ誘発性の気道過敏症、好酸球増加症および杯細胞異形成が完全に阻害された。対照的に、感作後およびアレルゲン投与期中でのＩＬ−４に対する抗体の投与は、喘息の表現型を部分的にのみ軽減させた。したがって、外来性のＩＬ−４およびＩＬ−１３はどちらも喘息様の表現型を誘発する能力を有するが、ＩＬ−１３のエフェクター活性がＩＬ−４よりも優れているように見受けられる。これらのデータは免疫誘発におけるＩＬ−４の主な役割を示唆しており（特にＴｈ２細胞の発生および気道への動員ならびにＩｇＥの産生について）、一方でＩＬ−１３は気道過敏症、粘液の過剰産生および細胞炎症を含めた様々なエフェクター結果に主に従事していると考えられる（Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８、２８２：２２５８〜２２６１；Ｇｒｕｎｉｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８、２８２：２２６１〜２２６３；Ｔａｕｂｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００２、１６９：６４８２〜６４８９；Ｂｌｅａｓｅ  ａｔ  ａｌ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００１、１６６（８）：５２１９〜５２２４）。
【００１０】
補足実験では、トランスジェニックマウスにおける過剰発現によって、またはＩＬ−１３タンパク質を野生型マウスの気管に滴下することによって、肺のＩＬ−１３レベルを上昇させた。どちらの設定においても、喘息様の特徴、すなわちコリン作動性の刺激に対する非特異的な気道過敏症、肺好酸球増加症、上皮細胞肥大症、粘液細胞化生、上皮下線維症、気道閉塞およびシャルコー−ライデン様結晶が誘発された。さらに、ＩＬ−１３は肺においてマトリックスメタロプロテイナーゼおよびカテプシンプロテアーゼの強力な刺激因子であり、その結果として気腫性の変化ならびに粘液異形成がもたらされることが判明した。したがって、ＩＬ−１３は喘息およびＣＯＰＤ疾患の表現型のどちらにおいても重要なエフェクター分子である可能性がある（Ｚｈｕら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９９、１０３（６）：７７９〜７８８；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２０００、１０６（９）：１０８１〜１０９３）。
【００１１】
これらのデータは、ＩＬ−１３活性が、妥当性がよく確認された動物モデルにおいてアレルギー性喘息の主要な臨床特徴および病理特徴のうちのいくつかを生じさせるのに必要かつ十分であることを示している。
【００１２】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）
ＣＯＰＤとは、気腫および慢性気管支炎を含めたいくつかの臨床症候群を包含する一般的な用語である。症状は喘息に類似しており、同じ薬物を用いてＣＯＰＤを治療することができる。ＣＯＰＤは、慢性の進行性かつ主として不可逆的な空気流閉塞によって特徴づけられている。疾患過程における個人の貢献は未知であるが、喫煙が症例の９０％を引き起こすと考えられている。症状には咳嗽、慢性気管支炎、息切れおよび呼吸器感染症が含まれる。この疾患は最終的には重篤な身体障害および死をもたらす。慢性気管支炎は、２年間にわたって少なくとも３カ月間ほぼ毎日、他に説明のつかない咳または痰が出る病歴をもつ患者に診断される。肺気腫は、気腔の異常な永久肥大および肺胞壁の破壊によって特徴づけられている。
【００１３】
ＩＬ−１３はＣＯＰＤの発生に役割を果たし得る。ＣＯＰＤを発生するヒト喫煙者は肺実質中に多くの炎症細胞型（好中球、マクロファージ、好酸球）を有する。したがって、ＩＬ−１３は、気腫の進行のモデリングを行うための炎症誘発性のＴｈ２サイトカインである。Ｚｈｅｎｇらは、ＩＬ−１３の過剰発現をＩＬ−１３トランスジェニックマウスの気道上皮の標的とした。これらの動物は気道および肺実質の炎症ならびに気腫を発生した。また、動物は慢性気管支炎を暗示する粘液異形成も発生した（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２０００、１０６（９）：１０８１〜１０９３）。
【００１４】
アレルギー性喘息に関連するＩＬ−１３プロモーターの多型性（−１０５５のＣからＴ）も、健康な対照と比較してＣＯＰＤ患者で頻度が高いことが報告されている。これは、ＣＯＰＤを発生する危険性の増強におけるＩＬ−１３プロモーターの多型性の機能的な役割を示唆している（Ｋｒａａｎら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２００２、３：４３６〜４３９）。さらに、無症候の喫煙者と比較して慢性気管支炎に罹患した喫煙者でＩＬ−１３およびＩＬ−４陽性細胞数の増加が観察された（Ｍｉｏｔｔｏら、Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐ．Ｊ．、２００３、２２：６０２〜６０８）。しかし、重篤な気腫患者の肺中のＩＬ−１３発現レベルを評価するための最近の研究では、ＩＬ−１３レベルと疾患との間に関連性が見つからなかった（Ｂｏｕｔｔｅｎら、Ｔｈｏｒａｘ、２００４、５９：８５０〜８５４）。
【００１５】
アトピー性皮膚炎およびアレルギー性鼻炎を含めたアレルギー性疾患
ＩＬ−１３は、アトピー性鼻炎およびアトピー性皮膚炎などのアトピー性障害にも関与するとみなされている。アレルギー性鼻炎は米国において最も一般的なアトピー性疾患であり、成人の２５％までおよび４０％を超える子供が冒されていると推定されている。アレルギー性鼻炎と喘息との間には密接な関係が存在する。どちらの状態も共通の免疫病理学および病態生理学を共有しており、これらは鼻ならびに気管支組織中の好酸球およびＴｈ２リンパ球が役割を果たす類似した免疫プロセスを有する。Ｔｈ２サイトカイン、特にＩＬ−４およびＩＬ−５の過剰産生は、アレルギー性疾患の病因の基礎であると考えられている。ＩＬ−１３はいくつかの特徴およびエフェクター機能をＩＬ−４と共有しており、これが、ＩＬ−４およびＩＬ−１３受容体の使用の機能重複、細胞内シグナル伝達構成成分、ならびに遺伝子構成とあいまって、ヒトの即時型過敏症をｉｎ  ｖｉｖｏで促進または維持することにおけるＩＬ−１３の役割の抗しがたい（間接的ではあるが）証拠を提供する。これは、季節性アレルギー性鼻炎を有するアトピーの対象が、Ａｇ依存性であるがポリクローナルではない活性化に応答して有意に強力なＩＬ−１３応答を示したことを実証した、Ｌｉらによって確証されている（Ｌｉら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８；１６１：７００７）。
【００１６】
アトピー性皮膚炎とは、一般的な、慢性の、再発性の、高度に掻痒性の炎症性皮膚疾患である。アトピー性皮膚炎患者の病変皮膚は、炎症性のＴ細胞浸潤によって組織学的に特徴づけられており、これは、急性期にはＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３の発現の優勢と関連している（Ｓｉｍｏｎら、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００４；１１４：８８７；Ｈａｍｉｄら、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６；９８：２２５）。さらに、Ｔａｚａｗａらは、ＩＬ−１３ｍＲＮＡがアトピー性皮膚炎患者の亜急性および慢性の皮膚病変において有意にアップレギュレーションされていることを実証した（ＩＬ−４はされない）（Ｔａｚａｗａら、Ａｒｃｈ  Ｄｅｒｍ  Ｒｅｓ、２００４；２９６：４５９）。循環ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を発現するＩＬ−１３の頻度も、このような患者において有意に上昇している（Ａｌｅｋｓｚａら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ、２００２；１４７；１１３５）。この増大したＩＬ−１３活性は、血清ＩｇＥレベルの上昇をもたらし、したがってアトピー性皮膚炎の病因に貢献すると考えられている。さらに、新生児ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−１３の産生の増加は、のちにアレルギー性疾患、特にアトピー性皮膚炎を発生する危険性の高い新生児を同定するための有用なマーカーである（Ｏｈｓｈｉｍａら、Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｒｅｓ、２００２；５１：１９５）。アトピー性皮膚炎の病因学におけるＩＬ−１３の重要性のさらなる証拠はＳｉｍｏｎらによって提供されている（Ｓｉｍｏｎら、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００４；１１４：８８７）；タクロリムス軟膏（サイトカイン産生の細胞内シグナル伝達経路を阻害する免疫抑制薬）を用いた局所的治療の結果、アトピー性皮膚病変の有意な臨床的かつ組織学的な改善、およびそれに付随してＩＬ−１３を含めたＴｈ２サイトカインの局所的発現の有意な減少がもたらされた。さらに、ＩＬ−１３Ｒα１（ＩＬ−４Ｒαと共にＩＬ−１３に対する機能的な受容体を形成する細胞表面タンパク質）は、アトピー性皮膚炎患者の皮膚の基底上ケラチノサイト上で過剰発現されることが示されており、ＩＬ−１３はＩＬ−１３Ｒα１のｍＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏでアップレギュレーションすることができた（Ｗｏｎｇｐｉｙａｂｏｖｏｒｎら、Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００３；３３：３１）。
【００１７】
これらのデータは集合的に、ＩＬ−１３モノクローナル抗体を含めたＩＬ−１３を標的としたインターベンションがヒトアレルギー性疾患の治療に有効な手法を提供し得ることを示している。
【００１８】
食道好酸球増加症
食道における好酸球の蓄積は、胃食道逆流症、好酸球性食道炎、好酸球性胃腸炎、および寄生虫感染を含めた多様な疾患に罹患している患者における一般的な医学的問題である。食道の好酸球増加症はアレルギー性応答に関連しており、マウスに空中アレルゲンを繰り返して投与することによりアレルギー性気道炎症と食道好酸球増加症との間に関連性が確立された。Ｔｈ２細胞は、炎症経路およびエフェクター経路を直接ならびに間接的に活性化させる、ＩＬ−４およびＩＬ−１３を含めたサイトカインのアレイを分泌することによって好酸球関連炎症を誘発させると考えられている。ＩＬ−１３は、Ｔｈ２細胞によって大量に産生され、アレルギー性疾患の複数の特徴（たとえばＩｇＥの産生、粘液の過剰産生、好酸球の動員および生存、ならびに気道過敏症を調節するので、特に重要であると考えられる。好酸球は、好酸球性炎症反応においてｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、およびｉｎ  ｖｉｖｏ条件下でＧＭ−ＣＳＦならびに／またはＩＬ−５に曝したのちに機能的に活性のあるＩＬ−１３を産生することができる。（Ｓｃｈｍｉｄ−Ｇｒｅｎｄｅｌｍｅｉｅｒ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００２、１６９：１０２１〜１０２７）。気管内投与によって野生型、ＳＴＡＴ−６、エオタキシン−１またはＩＬ−５欠損のマウスの肺にデリバリーを行ったＩＬ−１３により、ＩＬ−１３によって始動された肺炎症が食道好酸球増加症の発生に関連していることが確立された（Ｍｉｓｈｒａら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ、２００３；１２５：１４１９）。総合すると、これらのデータは食道好酸球増加症におけるＩＬ−１３の役割の証拠を提供する。
【００１９】
腫瘍学の指標
別の重要な関心領域は、特定の種類の腫瘍の増殖を阻害するようにＩＬ−１３またはＩＬ−１３受容体を標的化することである。１型Ｔ細胞媒介性の宿主防御は最適な腫瘍拒絶をｉｎ  ｖｉｖｏで媒介すると考えられており、Ｔｈ２型応答へのずれが腫瘍拒絶の遮断および／または腫瘍再発の促進に貢献し得る（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８；１６０：５８６９）。移植可能な腫瘍細胞系を用いたいくつかの動物研究は、Ｓｔａｔ６、ＩＬ−４、およびＩＬ−１３（部分的にＮＫＴ細胞によって産生される）が腫瘍拒絶を阻害する能力を有することを実証することによってこの概念を支持している（Ｔｅｒａｂｅら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０００；１：５１５；Ｋａｃｈａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０００；１６５：６０２４〜２８；Ｏｓｔｒａｎｄ−Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０００；１６５：６０１５）。Ｓｔａｔ−６の非存在下における強力な抗腫瘍活性は、腫瘍特異的なＩＦＮｇ産生およびＣＴＬ活性の増強によるものと考えられていた。さらに、ＮＫＴ細胞の損失は、腫瘍再発の増加を伴ってＩＬ−１３産生を減少させることが示されており、これは、部分的にＮＫＴ細胞によって産生されたＩＬ−１３が免疫監視に重要であることを示している（Ｔｅｒａｂｅら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０００；１：５１５）。したがって、これらの発見は、ＩＬ−１３阻害剤またはＩＬ−１３ｍＡｂを含めた新規ＩＬ−１３拮抗剤が、腫瘍細胞に対する免疫応答のダウンレギュレーションにおいてＩＬ−１３が果たす負の調節を妨げることによって癌の免疫治療剤として有効であり得ることを示唆している。
【００２０】
Ｔｈ１型関連抗腫瘍の防御をブーストすることに加えて、ＩＬ−１３阻害剤はまた、腫瘍細胞の増殖をより直接的に遮断し得る。たとえば、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）およびホジキン病では、ＩＬ−１３はアポトーシスを遮断するか、または腫瘍細胞増殖を促進する（Ｃｈａｏｕｃｈｉら、Ｂｌｏｏｄ、１９９６；８７：１０２２；Ｋａｐｐら、Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．、１９９９；１８９：１９３９）。Ｂ−ＣＬＬとは、Ｂリンパ球に由来する臨床的に不均一な疾患であり、白血病細胞におけるアポトーシス欠陥に関与する。ＩＬ−１３は直接的な成長因子として作用するとは考えられていないが、腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏの自発性アポトーシスから保護し（Ｃｈａｏｕｃｈｉら、Ｂｌｏｏｄ、１９９６；８７：１０２２；Ｌａｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９；１６２：７８）、新生細胞の死を予防することによってＢ−ＣＬＬに貢献し得る。
【００２１】
ホジキン病とは、主に若年成人が冒され、米国において年間約７，５００件が計上されているリンパ腫の一種である。この癌は大きな多核ホジキン／リード−シュテルンベルク細胞（Ｈ／ＲＳ）の存在によって特徴づけられている。大多数の場合、悪性細胞集団はＢ細胞から生じる。いくつかのホジキン病由来細胞系およびホジキンリンパ腫患者から採取したリンパ節組織は、ＩＬ−１３および／またはＩＬ−１３受容体を過剰発現する。（Ｋａｐｐら、Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．、１９９９；１８９：１９３９、Ｂｉｌｌａｒｄら、Ｅｕｒ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ、１９９７；８：１９；Ｓｋｉｎｎｉｄｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、２００１；９７：２５０；Ｏｓｈｉｍａら、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００１；２１１：３７）。抗ＩＬ−１３ｍＡｂまたはＩＬ−１３拮抗剤の中和は、用量依存性の様式でＨ／ＲＳ細胞の増殖を阻害することが示されている（Ｋａｐｐら、Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．、１９９９；１８９：１９３９；Ｏｓｈｉｍａら、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００１；２１１：３７）。同様に、ホジキン病由来細胞系を移植したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの可溶性ＩＬ−１３Ｒａ２囮受容体のデリバリーにより腫瘍の発症および増殖が遅延し、生存が増強され、これは、ＩＬ−１３の中和によりホジキンリンパ腫の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで抑制することができることを実証している（Ｔｒｉｅｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４；６４：３２７１）。集合的に、これらの研究はＩＬ−１３が自己分泌様式でＨ／ＲＳ細胞の増殖を刺激することを示している（Ｋａｐｐら、Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．、１９９９；１８９：１９３９；Ｏｈｓｈｉｍａら、Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２００１；３８：３６８）。
【００２２】
したがって、ＩＬ−１３の中和は、腫瘍細胞の増殖を阻害すると同時に抗腫瘍防御を増強させることによって、ホジキン病および他のＢ細胞関連癌の魅力的かつ有効な治療を表す可能性がある。
【００２３】
炎症性腸疾患
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の病因においてＩＬ−１３が役割を果たしている可能性がある。炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎、クローン病および不定大腸炎として臨床上分類されたいくつかの疾患を含む。その主な徴候は、腸管粘膜中のＴｈ１およびＴｈ２リンパ球の活性化の不均衡を伴った、誇大な免疫応答による慢性腸炎である。これは、クローン病（Ｂａｍｉａｓら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ、２００５；１２８：６５７）および潰瘍性大腸炎（Ｈｅｌｌｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２００２；１７：６２９）の動物モデルで実証されている。ＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃの投与によるＩＬ−１３の中和は、ヒト潰瘍性大腸炎のネズミＴｈ２モデルにおいて大腸炎を予防した（Ｈｅｌｌｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２００２；１７：６２９）。さらに、このモデルではＩＬ−１３の産生はＩＬ−４のそれに迅速に取って代わり、ＩＬ−１３の産生はＮＫＴ細胞の刺激によって誘発することができ、これは、組織損傷が上皮細胞に対するＩＬ−１３の毒性活性の結果であり得ることを示唆している。これらの発見を支持するヒトでのデータがある程度存在する：潰瘍性大腸炎に罹患している患者由来のＩＬ−１３陽性直腸生検標本の頻度は炎症性および非炎症性の対照対象よりも有意に高く、非急性潰瘍性大腸炎よりもより高率のＩＬ−４およびＩＬ−１３の発現が急性潰瘍性大腸炎で観察された（Ｉｎｏｕｅら、Ａｍ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ、１９９９；９４：２４４１）。さらに、Ａｋｉｄｏらは、クローン病患者の腸部分由来の外筋層の免疫活性の特徴づけを行い、ＩＬ−４およびＩＬ−１３がＳＴＡＴ−６経路によって腸平滑筋細胞の高収縮性を媒介することを見出した。著者らは、この経路がクローン病において腸の筋肉の高収縮性に貢献している可能性があると結論づけた（Ａｋｉｈｏら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２００５；２８８：６１９）。
【００２４】
したがって、ＩＬ−１３ｍＡｂは、場合によっては他のサイトカインに向けられた分子と組み合わせて、ＩＢＤの進行を停止または遅延させる手法を提供し得る。
【００２５】
乾癬および乾癬関節炎
乾癬とは、ケラチノサイトの過剰増殖、および表皮ケラチノサイトの表現型に影響を与えることができる様々なサイトカインを産生する、活性Ｔ細胞を含めた免疫細胞性浸潤物によって特徴づけられた慢性皮膚疾患である。ＣＤｗ６０とは、乾癬皮膚の乾癬性基底および基底上ケラチノサイトの表面上でアップレギュレーションされる炭水化物保有分子である。乾癬病変由来のＴ細胞から分泌されたＩＬ−４およびＩＬ−１３は、ケラチノサイト上におけるＣＤｗ６０の発現の強力なアップレギュレーションを行うことが示されており（Ｓｋｏｖら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、１９９７；１５：６７５）、一方で、インターフェロン−γは培養ケラチノサイト上におけるＩＬ−４／ＩＬ−１３媒介のＣＤｗ６０の誘発を遮断した（Ｈｕａｎｇら、Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ、２００１；１１６：３０５）。したがって、乾癬表皮ケラチノサイト上におけるＣＤｗ６０の発現は、病変内の活性Ｔ細胞によって分泌されたＩＬ−１３によって少なくとも部分的に誘発されると考えられている。さらに、一緒になってＩＬ−１３の受容体複合体を形成する細胞表面タンパク質であるＩＬ−１３Ｒα１およびＩＬ−４Ｒαは、乾癬を有する患者および有さない患者由来の皮膚生検では異なって発現され（Ｃａｎｃｉｎｏ−Ｄｉａｚら、Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ、２００２；１１９：１１１４；Ｗｏｎｇｐｉｙａｂｏｖｏｒｎら、Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００３；３３：３１）、ＩＬ−１３はｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験により、ＩＬ−１３Ｒα１の発現のアップレギュレーションを行うことができることが実証された（ＩＬ−４はできない）（Ｗｏｎｇｐｉｙａｂｏｖｏｒｎら、Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００３；３３：３１）。ＩＬ−１３は様々な細胞種に対して効果を有するので、これらの研究はＩＬ−１３受容体が乾癬の初期炎症プロセスにおいて役割を果たしている可能性を示唆している。
【００２６】
乾癬関節炎は、炎症誘発性および抗炎症性のサイトカインのどちらによっても媒介される滑膜炎によって特徴づけられている。関節炎の様々な形態におけるＩＬ−１３の役割は、関心が高まっている。Ｓｐａｄａｒｏらは、乾癬関節炎および関節リウマチに罹患している患者の潤滑液中のＩＬ−１３レベルが骨関節炎に罹患している患者よりも有意に高いことを観察した。さらに、ＩＬ−１３の潤滑液レベルは乾癬関節炎に罹患している患者の血清中のレベルよりも有意に高く、ＩＬ−１３の潤滑液／血清比は関節リウマチ群よりも乾癬関節炎群で顕著に高く、これは、乾癬関節炎に罹患している患者の滑膜組織中で局所的に産生されたＩＬ−１３の潜在的な役割を示唆している（Ｓｐａｄａｒｏら、Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ、２００２；６１：１７４）。
【００２７】
他の病態におけるＩＬ−１３の潜在的な役割
急性移植片対宿主疾患とは、幹細胞移植後の病的状態および死亡の深刻な原因であり、ドナーとレシピエントとのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）不適合性の度合いに直接関連している。Ｊｏｒｄａｎらは、ＩＬ−１３を血縁関係のない非適合ＭＬＲ（混合リンパ球反応；最初のＨＬＡタイピング後にドナー選択の微調整を行うためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ）間に豊富に産生される典型的なＴｈ２サイトカインとして最初に同定した（Ｊｏｒｄａｎら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ；２００２；２６０：１）。同じグループがのちに、ドナーＴ細胞によるＩＬ−１３産生が、血縁関係のないドナー幹細胞移植後の急性移植片対宿主疾患（ａＧＶＨＤ）に予測的であることを示した（Ｊｏｒｄａｎら、Ｂｌｏｏｄ、２００４；１０３：７１７）。幹細胞移植後に重篤なＩＩＩ級ａＧＶＨＤに罹患したすべての患者は、非常に高い移植前ＩＬ−１３応答を生じたドナーを持っており、これによりＩＬ−１３レベルとａＧＶＨＤとの間に有意な関連性が実証され、ａＧＶＨＤに関連する病状の一部に対してＩＬ−１３が直接の原因であり得る可能性が高まっている。したがって、ＩＬ−１３の特異的遮断に基づいた治療が幹細胞移植後のａＧＶＨＤの治療に有用であり得る。
【００２８】
糖尿病性腎症は、西欧諸国において末期腎臓病の主な原因の１つである。１型糖尿病による腎症の発生率は減少しつつあるが、２型の真性糖尿病が現在、米国、日本および欧州において最も一般的なただ１つの腎不全の原因である。さらに、この患者群は、心血管イベントによって引き起こされる非常に高い死亡率により、維持透析に関して予後が非常に悪い。現在、血行動態、代謝および構造の変化は絡み合っていることがますます明らかとなり、様々な酵素、転写因子および成長因子がこの疾患の病因に役割を果たすことが同定されている。特に、ＴＧＦ−βは腎肥大の発生および細胞外基質構成成分の蓄積に重要であり、腎臓中でのコラーゲン形成の媒介に中心的なサイトカインであるとみなされている（Ｃｏｏｐｅｒ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、２００１；４４：１９５７；Ｗｏｌｆ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、２００４；３４（１２）：７８５）。実験系およびヒト糖尿病性腎症では、ＴＧＦ−１の生物活性が増加し、糖尿病マウスへのＴＧＦ−β１抗体の投与により腎機能の改善がもたらされ、細胞外基質の蓄積が減少した。最近、肺線維症のトランスジェニックマウスモデルにおいて、ＴＧＦ−β１およびコラーゲン沈着の産生および活性化を調節することによってＩＬ−１３がその効果を少なくとも部分的に媒介することが示されており（Ｌｅｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２００１；１９４：８０９；Ｚｈｕら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９９；１０３：７７９）、これによりＩＬ−１３とＴＧＦ−βとの間に直接的な機能的関連が確立されている。したがって、糖尿病の腎臓においてＴＧＦ−ｂ１活性を調節するＩＬ−１３の同様な役割を想像することができ、ＩＬ−１３を標的としたインターベンションが糖尿病性腎症の管理において役割を有する潜在性が存在する。
【００２９】
線維状態
肺線維症とは、肺の不適切かつ有害な瘢痕状態であり、身体障害およびしばしば死をもたらす。この用語には、明確に異なる病因、病状および治療に対する応答を有する様々な異なる病状が包含される。一部の例では、線維症の原因は同定されている。原因には、（１）アスベストもしくはケイ素などのプロフィブロティック材料または超硬合金粉の吸入（２）線維症をもたらす、患者が特異体質の免疫学的応答を有する有機物質の吸入（たとえば農夫肺）（３）ニトロフラントイン、アミオダロンおよびメトトレキサートなどの薬物（４）全身性硬化症または関節リウマチなどの全身性炎症性疾患との関連が含まれる。
【００３０】
しかし、多くの場合、原因または根底にある病態は同定されていない。このような患者の多くは特発性肺線維症（ＩＰＦ）と診断されている。これは比較的稀な病態である（有病率２０／１０００００）。診断は、同定されている原因が存在しないことと、特定の放射線学的および病理学的特徴、特にＣＴまたは肺生検の蜂巣化との組合せに基づいている。この疾患は通常、年配の患者（＞５０）で見られ、多くの場合、死をもたらす容赦ない進行性肺機能障害の経路をたどり、その生存期間中央値は２〜５年と見積もられている。さらに、患者は長い年月にわたって進行する非常に不快な息切れの経験をする。このことは、最初は身体活動を制限するが、数カ月間に及び得る末期には、患者は安静時にも息切れをし、さらに酸素依存性である。
【００３１】
現在、この疾患の満足できる治療は存在しない。現在の治療は、一般に副腎皮質ステロイドおよびアザチオプリンなどの免疫抑制剤の形態をとる。しかし、副腎皮質ステロイドは患者の多くで無効であり得、その副作用により状況が悪化し得る。最近の大きな研究で生存の向上傾向が示されたインターフェロンγおよびペルフェニドン（ｐｅｒｆｅｎｉｄｏｎｅ）を含めた数多くの潜在的な治療が調査中である。
【００３２】
ＩＬ−１３およびＴｈ２の表現型に関連するサイトカインが組織修復における線維症の過程に関与しているという証拠が存在する（Ｗｙｎｎ  ＴＡ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００４、４：５８３〜５９４；Ｊａｋｕｂｚｉｃｋら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、２００４、１６４（６）：１９８９〜２００１；Ｊａｋｕｂｚｉｃｋら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．、２００４、３０（３）：３３９〜３４９；Ｊａｋｕｂｚｉｃｋら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．、２００４、５７：４７７〜４８６）。ＩＬ−１３およびＩＬ−４は様々な線維状態に関連づけられている。住血吸虫によって誘発される肝線維症はＩＬ−１３依存性であると考えられており、ＩＬ−１３が強皮症の病因に関与しているという制限された証拠が存在する（Ｈａｓｅｇａｗａら、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．、１９９７、２４：３２８〜３３２；Ｒｉｃｃｉｅｒｉら、Ｃｌｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．、２００３、２２：１０２〜１０６）。
【００３３】
肺線維症に関して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究により、ＩＬ−１３が繊維形成性の表現型を促進することが示されている。動物研究により、線維症の人工誘発モデルにおいてＩＬ−１３発現レベルが上昇すること、およびＩＬ−１３を排除することによって線維症を軽減できることが示されている。
【００３４】
ＩＬ−１３はプロフィブロティック表現型を促進する。細胞レベルでは、ＩＬ−１３が線維症を促進し得るいくつかの機構が存在する。シグナル経路およびこれら様々な機構の重要性は明確でない。
【００３５】
ＩＬ−１３は線維芽細胞に作用してコラーゲンの産生およびその分解の阻害をどちらも促進し、それにより繊維性の表現型を有利にするという証拠が存在する。皮膚線維芽細胞はＩＬ−１３受容体を保有しており、培養皮膚線維芽細胞をＩＬ−１３に曝すことによってコラーゲン産生のアップレギュレーションがもたらされる（Ｏｒｉｅｎｔｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、２０００、２９２：９８８〜９９４）。また、ＩＬ−４も、類似しているがより一過性の効果を有する。ヒト肺線維芽細胞系（ＩＣＩＧ７）はＩＩ型ＩＬ−４受容体を発現する（Ｊｉｎｎｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２００４、２７９：４１７８３〜４１７９１）。これらの細胞をＩＬ−１３に曝すことにより、様々な炎症性かつプロフィブロティックなメディエーター、すなわちＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＶＣＡＭβ１インテグリンの分泌が促進される（Ｄｏｕｃｅｔら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８、１０（１０）：１４２１〜１４３３）。
【００３６】
ＩＬ−１３は、皮膚線維芽細胞によるＩＬ−１ａ誘発性のマトリックスメタロプロテイナーゼ１および３タンパク質の産生を阻害し、これはＥＣ基質の分解を軽減させる傾向がある（Ｏｒｉｅｎｔｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、２０００、２９２：９８８〜９９４）。ＩＬ−１３は、喘息気道の生検によって得たヒト線維芽細胞に対してＴＧＦ−βと相乗的に作用して、メタロプロテイナーゼ１の組織阻害剤（ＴＩＭＰ−１）の発現を促進する。細胞外基質の分解はマトリックスメタロプロテイナーゼによって行われ、これはＴＩＭＰ−１によって阻害される。したがって、ＩＬ−１３のこの作用は、基質の分解を軽減させる傾向にある（Ｚｈｏｕら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２００５、２８８：Ｃ４３５〜Ｃ４４２）。
【００３７】
トランスジェニックマウスにおけるＩＬ−１３の過剰発現は、上皮下線維症、上皮細胞肥大、杯細胞肥大症、結晶沈着（酸性哺乳動物キチナーゼ）、気道過敏症、間質性線維症、２型細胞肥大および界面活性物質蓄積をもたらす（Ｚｈｕら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９９、１０３（６）：７７９〜７８８）。
【００３８】
マウスの様々な株はブレオマイシン誘発性肺線維症に対して異なる感受性を有する。感受性のあるＣ５７Ｂ１／６Ｊマウスは、ブレオマイシンに応答してＩＬ−１３、ＩＬ−１３ＲαおよびＩＬ−４（ならびにＴＧＦβ、ＴＮＦＲαおよびＩＬ１Ｒ）の迅速なアップレギュレーションを示す。感受性のないＢＡＬＢ／ｃマウスはＩＬ−１３のアップレギュレーションを示さない。
【００３９】
Ｂｅｌｐｅｒｉｏら（Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２００２、２７：４１９〜４２７）は、マウスブレオマイシン線維症モデルにおいてＩＬ−１３、ＩＬ−４およびＣＣケモカインＣ１０の発現ならびに役割を研究した。ＩＬ−１３およびＩＬ−４のどちらにおける肺組織レベルも、ブレオマイシンに応答して増加した。ポリクローナル抗ＩＬ−１３抗体を用いたＩＬ−１３の事前中和により、肺のヒドロキシプロリンレベルによって評価した、ブレオマイシンに応答した肺線維症が有意に軽減された。同モデルにおけるＩＬ−４の発現の増加にもかかわらず、ＩＬ−４の中和は肺線維症に影響を与えなかった。
【００４０】
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＦＩＴＣによって誘発させた急性肺線維症の別のモデルでは、ＩＬ−１３が存在しないこと（ノックアウト中）は肺線維症に対する保護を示したが、ＩＬ−４はそうではなかった。ＩＬ−１３ノックアウトでは、ＩＬ−４のノックアウトでは追加の保護が存在しなかった（Ｋｏｌｏｄｓｉｃｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００４、１７２：４０６８〜４０７６）。ＩＬ−１３が存在しないことの保護効果は、肺への細胞動員の差異によるものではない：すべてのノックアウトおよびＢＡＬＢ／ｃにおいて、動員された全細胞数が類似しており、最初の炎症性構成成分は影響を受けていないと考えられる。好酸球の動員はＢＡＬＢ／ｃと比較してＩＬ−４およびＩＬ−１３ノックアウトにおいて低いが、ＩＬ−４−／−が線維症に対して保護されていなかったので、このことで線維症の差異を説明することはできない。恐らく驚くべきことに、ＩＬ１０、ＭＣＰ−１、γインターフェロン、ＴＧＦ−ｉを含めたＩＬ−１３＋／＋と−／−とでサイトカインのレベルに差異はなかった。さらに、同数の線維芽細胞がＦＩＴＣ後の様々な動物の肺から単離されたが、ＩＬ−１３−／−マウスでは、コラーゲンＩの産生が減少している。これは、ＩＬ−１３の損失は単に炎症反応を予防するだけでなく、むしろより具体的な抗線維性の役割を有することを示している。ＩＬ−１３がＴＧＦ−ｉを介してその線維性の効果を発揮する可能性があることが示唆されている（Ｌｅｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２００１、１９４：８０９〜８２１）。しかし、このＦＩＴＣモデルでは、ＴＧＦ−ｉの発現はＩＬ−１３ノックアウトマウスで軽減されていなかった。
【００４１】
インターロイキン４は、どちらも同じ受容体を介して作用するのでＩＬ−１３と同様の効果を発揮することが予測される。ＩＬ−４は、ブレオマイシン誘発性肺線維症に罹患しているマウスの肺において有意にアップレギュレーションされている（Ｇｈａｒａｅｅ−Ｋｅｒｍａｎｉら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、２００１、１５：１３８〜１４７）。しかし、ＩＬ−４を過剰発現するＣ５７ＢＬ６／Ｊマウス、ＩＬ−４ノックアウトおよび野生型においてブレオマイシン誘発性肺線維症の比較を行うことによっては、Ｉｚｂｉｃｋｉら（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ、２００２、２８３（５）：Ｌ１１１０〜Ｌ１１１６）はＩＬ−４が肺線維症に関与しているという証拠を見出さなかった。線維症はＩＬ−４ノックアウトで軽減されておらず、ＩＬ−４を過剰発現するマウスでは線維症のレベルが増加していた。
【００４２】
ＩＬ−１３のＢＡＬサイトカインレベルは、肺線維症の様々な形態に罹患している患者において有意に上昇しているが、相当なばらつきがある。ＩＬ−１３の発現は、肺線維症に罹患している患者から得た肺胞マクロファージ中で有意にアップレギュレーションされている。
【００４３】
最も強力な臨床上の証拠は、ミシガン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ）の研究によってもたらされる。Ｊａｋｕｂｚｉｃｋおよびその同僚は、肺線維症に罹患している患者由来の外科肺生検においてＩＬ−１３およびＩＬ−４ならびにその受容体の遺伝子発現について研究を行っている。ＩＬ−１３の遺伝子発現は、ＩＰＦに冒された肺由来の標本で、正常な肺または他の肺線維状態由来の標本においてよりも顕著に高かった。ＩＰＦ／ＵＩＰに罹患している患者から培養した線維芽細胞は、正常な肺または肺線維症の他の形態に罹患している患者由来の生検から得た組織および線維芽細胞と比較して、より高いＩＬ−１３およびＩＬ−４受容体の発現を示す。具体的には、おそらくは疾患活動の中心点である線維芽細胞の病巣が、これらの受容体に対して特に強力に染色される（Ｊａｋｕｂｚｉｃｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００３、１７１：２６８４〜２６９３；Ｊａｋｕｂｚｉｃｋら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、２００３、１６２：１４７５〜１４８６；Ｊａｋｕｂｚｉｃｋら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、２００４、１６４（６）：１９８９〜２００１；Ｊａｋｕｂｚｉｃｋら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．、２００４、３０（３）：３３９〜３４９；Ｊａｋｕｂｚｉｃｋら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．、２００４、５７：４７７〜４８６）。
【００４４】
一般的にはＴｈ２サイトカイン、具体的にはＩＬ−１３がプロフィブロティック表現型を促進するという良好なｉｎ  ｖｉｔｒｏの証拠が存在する。少なくとも２つの動物モデルにおいて、ＩＬ−１３を排除することによって化学的に誘発させた線維症を軽減させることができることが示されている（遺伝子ノックアウトにおいて、または抗ＩＬ−１３抗体によって）。一部の証拠は、肺線維症の促進においてＩＬ−１３がＩＬ−４よりも重要であることを示している。肺線維症におけるＩＬ−１３の役割の臨床上の証拠は、ＩＬ−１３およびその受容体はＩＰＦに罹患している患者の肺において無調節であることを示唆している。
【００４５】
住血吸虫症誘発性の肝線維症を含めた様々な線維状態の治療ならびに肺線維症の様々な形態（たとえばＩＰＦ［他の箇所で記述］、強皮症）におけるＩＬ−１３に基づいた治療の重要な役割を示唆するデータが増加している。
【００４６】
ＩＬ−４およびＩＬ−１３を阻害した実験により、ＩＬ−１３がいくつかのモデルにおいて線維症の優性エフェクターサイトカインであることが独立に同定された（Ｃｈｉａｒａｍｏｎｔｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９９；１０４：７７７〜７８５；Ｂｌｅａｓｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００１；１６６：５２１９；Ｋｕｍａｒら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ、２００２；３２：１１０４）。住血吸虫症では、卵誘発性の炎症反応はＩＬ−１３の遮断によって影響を受けなかったが、ＩＬ−４の継続的かつ減少していない産生にもかかわらず、慢性的に感染した動物においてコラーゲン沈着が８５％を超えて減少した（Ｃｈｉａｒａｍｏｎｔｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９９；１０４：７７７；Ｃｈｉａｒａｍｏｎｔｅら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２００１；３４：２７３）。
【００４７】
ｈＩＬ−１３のアミノ酸配列を配列番号９として記載する。（これは成熟タンパク質配列である、すなわち、シグナル配列は存在しない）。
【００４８】
ｈＩＬ−１３をコードしているｃＤＮＡを配列番号１０に記載する。（これは成熟タンパク質配列のＤＮＡ配列である、すなわち、シグナル配列は存在しない）。
【００４９】
本明細書中で開示するすべての特許および参考文献（本出願が優先権を主張するすべての特許出願を含む）は、明白にかつその全体で本明細書中に参考として組み込まれている。
【００５０】
最近、喘息を治療するためにＩＬ−１３に対する免疫応答を生じさせるワクチンが記載されている（国際公開公報ＷＯ０２／０７０７１１号）。環境アレルゲンに対する皮膚の感作におけるＩＬ−１３の役割も、最近記載されている（Ｈｅｒｒｉｃｋら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００３、１７０：２４８８〜２４９５）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００５１】
本発明は、とりわけ、６Ａ１と呼ばれる抗体を提供する。以下に示すように、ｈＩＬ−１３と結合する６Ａ１は、配列番号９の位置１０７におけるアルギニンの存在に依存していると考えられる。配列番号９の位置１０７のアルギニンは、ｈＩＬ−１３／ｈＩＬ−１３Ｒの相互作用に関与する重要な残基であると報告されている。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊ．ＰおよびＤｅｂｉｎｓｋｉ  Ｗ（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、第２４巻、第４２号、ページ２９９４４〜２９９５０は、「ｈＩＬ１３α−ヘリックスＡ中の位置１３および１６のグルタミン酸、ならびにヘリックスＣ中の位置６６および６９のアルギニンおよびセリン、ならびにヘリックスＤ中の位置１０９のアルギニンは、その特異的突然変異により機能現象の損失および／または獲得がもたされたので、生物学的シグナル伝達の誘発に重要であることが判明した。」と記述している（要約および開示全体参照）。本発明者らがこの論文の著者らとは異なる番号づけ手法を採用したために、この論文の位置１０９のアルギニンは本明細書の配列番号９の１０７に相当する。したがって、ｈＩＬ−１３と結合する６Ａ１は、ｈＩＬ−１３／ｈＩＬ−１３Ｒの相互作用、したがってＩＬ−１３経路の生物学的シグナル伝達に重要であると既に同定されたｈＩＬ−１３上の残基の１つを含む。
【課題を解決するための手段】
【００５２】
したがって、本発明は、ｈＩＬ−１３に特異的に結合し、かつｈＩＬ−１３の活性を中和する治療用抗体またはその抗原結合断片を提供する。たとえば以下の表Ａを参照されたい。
【００５３】
本発明の抗体およびその抗原結合断片に関して本明細書にわたって用いる用語「特異的に結合する」とは、抗体がｈＩＬ−１３と結合し、他のヒトタンパク質、具体的にはヒトＩＬ−４とは結合しないまたは結合が有意でないことを意味する。しかし、この用語は、本発明の抗体がカニクイザルＩＬ−１３とも交差反応性を有し得るという事実を排除しない。
【００５４】
本発明の別の態様では、ｈＩＬ−１３に特異的に結合し、ｈＩＬ−１３とｈＩＬ−１３Ｒとの相互作用を変調し（たとえば阻害または遮断する）、治療用抗体またはその抗原結合断片を提供する。このような阻害には、それだけには限定されないが、競合的阻害が含まれる。特定の実施形態では、本発明の抗体は、少なくともｈＩＬ−１３とｈＩＬ−１３Ｒとの相互作用を阻害するが、ｈＩｌ−１３とｈＩＬ−１３Ｒとの相互作用も遮断してｈＩＬ−１３／ｈＩＬ−１３Ｒのシグナル伝達経路のデカップリングを行い得る。
【００５５】
別の態様では、ｈＩＬ−１３に特異的に結合し、配列番号３に記載の配列を有するＣＤＲＨ３を含む治療用抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００５６】
本発明の別の態様では、ｈＩＬ−１３に特異的に結合し、配列番号３に記載の配列の変異体であるＣＤＲＨ３を含む治療用抗体またはその抗原結合断片であって、前記変異体の前記ＣＤＲＨ３内の１つもしくは２つの残基が配列番号３中の対応する位置の残基と異なる治療用抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００５７】
本発明の別の態様では、ｈＩＬ−１３に特異的に結合し、以下のＣＤＲを含む治療用抗体またはその抗原結合断片を提供する：
ＣＤＲＨ１：配列番号１
ＣＤＲＨ２：配列番号２
ＣＤＲＨ３：配列番号３
ＣＤＲＬ１：配列番号４
ＣＤＲＬ２：配列番号５
ＣＤＲＬ３：配列番号６
【００５８】
本明細書にわたって、抗体配列中にアミノ酸残基はＫａｂａｔのスキームに従って番号付けを行っている。同様に、用語「ＣＤＲ」、「ＣＤＲＬ１」、「ＣＤＲＬ２」、「ＣＤＲＬ３」、「ＣＤＲＨ１」、「ＣＤＲＨ２」、「ＣＤＲＨ３」はＫａｂａｔら；免疫学的に興味深いタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）ＮＩＨ、１９８７に記載のＫａｂａｔの番号付け方式に従う。「ＣＤＲＨ１」とは、ＣＤＲＨ１のＫａｂａｔの定義（残基３１〜３５Ｂ）およびＫａｂａｔ２６〜３２を含むＣｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９）；免疫グロブリン超可変領域のコンホメーション（Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ）；Ｎａｔｕｒｅ、３４２、ページ８７７〜８８３）によるＣＤＲＨ１の定義がどちらも含まれる配列ストレッチと理解される。したがって、以下により本発明によるＣＤＲを定義する：
ＣＤＲ：残基
ＣＤＲＨ１：２６〜３５Ｂ
ＣＤＲＨ２：５０〜６５
ＣＤＲＨ３：９５〜１０２
ＣＤＲＬ１：２４〜３４
ＣＤＲＬ２：５０〜５６
ＣＤＲＬ３：８９〜９７
【００５９】
本発明の別の態様では、配列番号７に記載の配列を有するＶＨドメインおよび配列番号８に記載の配列を有するＶＬドメインを含む治療用抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００６０】
本発明の別の態様では、配列番号７あるいは１１、１２、１３、１４を含む（またはそれから本質的になる、もしくはそれからなる）抗体の単離したＶＨドメインを提供する。
【００６１】
本発明の別の態様では、配列番号７もしくは１１、１２、１３、１４からなる群から選択されたＶＨドメインを含む治療用抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００６２】
本発明の別の態様では、配列番号３のＣＤＲＨ３を含む治療用抗体とｈＩＬ−１３との結合を競合的に阻害する、治療用抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００６３】
本発明の別の態様では、配列番号１、２、３、４、５および６のＣＤＲを含む治療用抗体とｈＩＬ−１３との結合を競合的に阻害する、治療用抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００６４】
本発明の別の態様では、配列番号１８の重鎖および配列番号２２の軽鎖を含む治療用抗体とｈＩＬ−１３との結合を競合的に阻害する、治療用抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００６５】
本発明によれば、ヒト化治療用抗体であって、配列番号１１、１２、１３、１４からなる群から選択されたＶＨドメインおよび配列番号１５、１６からなる群から選択されたＶＬドメインを含む抗体を提供する。
【００６６】
本発明の別の態様では、ｈＩＬ−１３とｈＩＬ−１３Ｒとの相互作用の変調に応答性のある疾患または障害（喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎など）に冒されたヒト患者の治療方法であって、前記患者に本明細書中に記載の治療用抗体またはその抗原結合断片を治療上有効な量で投与する工程を含む方法を提供する。
【００６７】
ｈＩＬ−１３とｈＩＬ−１３Ｒとの相互作用の変調に応答性のある疾患または障害を治療するための医薬品の製造における本発明の抗体の使用も提供する。
【００６８】
本発明の別の態様では、ヒトＩＬ−１３に特異的に結合する治療用抗体であって、配列番号９の残基９７〜１０８でヒトＩＬ−１３に特異的に結合する抗体を提供する。以下に開示する結果に基づいて当業者には明らかなように、「配列番号９の残基９７〜１０８」とは位置９７および１０８を含む。
【００６９】
本発明の別の態様では、配列番号３のＣＤＲＨ３を有する治療用抗体とヒトＩＬ−１３との結合を競合的に阻害する治療用抗体を提供し（配列番号１８の重鎖および配列番号２２の軽鎖を含む治療用抗体など）、競合抗体は配列番号９の残基９７〜１０８でヒトＩＬ−１３に特異的に結合する。
【００７０】
本発明の別の態様では、配列番号９の残基１０３〜１０７（両端を含めて）でヒトＩＬ−１３に特異的に結合し、ｈＩＬ−１３とｈＩＬ−１３Ｒとの相互作用を変調する（たとえば阻害または遮断する）治療用抗体を提供する。
【００７１】
本発明の一実施形態では、配列番号９の残基１０３〜１０７でｈＩＬ−１３に特異的に結合し、ｈＩＬ−１３とｈＩＬ−１３Ｒとの相互作用を変調する（たとえば阻害または遮断する）複数のモノクローナル治療用抗体（典型的にはヒトまたはヒト化抗体である）、および医薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００７２】
本発明の別の実施形態では、配列番号９の残基１０３〜１０７でｈＩＬ−１３に特異的に結合し、ｈＩＬ−１３とｈＩＬ−１３Ｒとの相互作用を変調する（たとえば阻害または遮断する）治療用抗体の産生方法であって、無血清培養培地中で、第１および第２のベクターを含む組換え宿主細胞を培養する工程（前記第１のベクターは前記抗体の重鎖をコードしているポリヌクレオチドを含み、前記第２のベクターは前記抗体の軽鎖をコードしているポリヌクレオチドを含む）を含む方法を提供する。以下の結果に基づいて当業者には明らかなように、「配列番号９の１０３〜１０７」とは、位置１０３および１０７を含む。
【００７３】
本発明の別の実施形態では、配列番号９の残基９７〜１０８でｈＩＬ−１３に特異的に結合し、ｈＩＬ−１３とｈＩＬ−１３Ｒとの相互作用を変調する（たとえば阻害または遮断する）治療用抗体の産生方法であって、無血清培養培地中で、第１および第２のベクターを含む組換え宿主細胞を培養する工程（前記第１のベクターは前記抗体の重鎖をコードしているポリヌクレオチドを含み、前記第２のベクターは前記抗体の軽鎖をコードしているポリヌクレオチドを含む）を含む方法を提供する。
【００７４】
本発明の別の実施形態では、ｈＩＬ−１３に結合し、ｈＩＬ−１３とｈＩＬ−１３Ｒとの相互作用を変調する（たとえば阻害または遮断する）無傷の治療用抗体であって、配列番号９の残基１０７と相互作用する抗体を提供する。
【００７５】
本発明の別の実施形態では、ｈＩＬ−１３に結合し、ｈＩＬ−１３とｈＩＬ−１３Ｒとの相互作用を変調する（たとえば阻害または遮断する）無傷の治療用抗体であって、前記治療用抗体とｈＩｌ−１３との結合が配列番号９の位置１０７におけるアルギニン残基の存在に依存する（または正に相関する）抗体を提供する。
【００７６】
別の実施形態では、ｈＩＬ−１３に特異的に結合し、ｈＩＬ−１３とｈＩＬ−１３Ｒとの相互作用を変調し（たとえば阻害または遮断する）、１．４×１０−４〜８．２２×１０−５秒−１の範囲の解離定数ｋｏｆｆ（たとえばＢｉａｃｏｒｅ（商標）によって測定）を有する治療用抗体を提供する。このような抗体は配列番号３のＣＤＲＨ３またはその変異体を含んでいてもよく、また、配列番号３またはその変異体に加えて配列番号１、２、４、５および６も含んでいてよい。
【００７７】
別の実施形態では、ｈＩＬ−１３に特異的に結合し、ｈＩＬ−１３とｈＩＬ−１３Ｒとの相互作用を変調する（たとえば阻害または遮断する）抗体であって、配列番号３のＣＤＲＨ３ならびに所望により配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２、配列番号４のＣＤＲＬ１、配列番号５のＣＤＲＬ２および配列番号６のＣＤＲＬ３のそれぞれをさらに含み、前記抗体はカニクイザルＩＬ−１３（ｃＩＬ−１３）との交差反応性も有する抗体を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７８】
１．抗体の構造
１．１  無傷の抗体
無傷の抗体には、少なくとも２つの重鎖および２つの軽鎖を含むヘテロ多量体の糖タンパク質が含まれる。ＩｇＭを除いては、無傷の抗体は通常約１５０Ｋｄａのヘテロ四量体の糖タンパク質であり、２つの同一の軽鎖（Ｌ）および２つの同一の重鎖（Ｈ）からなる。典型的には、それぞれの軽鎖が１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結されているが、様々な免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間でジスルフィド結合の数は変化する。それぞれの重鎖および軽鎖は鎖内ジスルフィド橋も有する。それぞれの重鎖は一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、いくつかの定常領域がそれに続く。それぞれの軽鎖はその他方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）および定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の第１の定常領域とアラインメントされており、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインとアラインメントされている。ほとんどの脊椎動物種由来の抗体の軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列に基づいてκおよびλと呼ばれる２種類のうちの１種に割り当てることができる。その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、ヒト抗体を５つの異なるクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに割り当てることができる。ＩｇＧおよびＩｇＡは、サブクラス、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４；ならびにＩｇＡ１およびＩｇＡ２へとさらに再分割することができる。マウスおよびラットで種変異体が存在し、少なくともＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂを有する。抗体の可変ドメインにより抗体に結合特異性が与えられ、特定の領域が相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる特定の可変性を表示する。可変領域のより保存された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。無傷の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ３つのＣＤＲによって結合した４つのＦＲを含む。それぞれの鎖内のＣＤＲはＦＲ領域によって近接して結合されており、他の鎖からのＣＤＲと一緒になって抗体の抗原結合部位の形成に貢献する。定常領域は抗体の抗原への結合に直接関与していないが、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）、Ｆｃγ受容体への結合を介した貪食、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を介した半減期／クリアランス速度および補体カスケードのＣ１ｑ構成成分を介した補体依存性細胞傷害などへの参加の様々なエフェクター機能を示す。
【００７９】
したがって、一実施形態では、本発明者らは、ｈＩＬ−１３に特異的に結合し、ｈＩＬ−１３とｈＩＬ−１３Ｒとの相互作用を変調する（たとえば阻害または遮断する）無傷の治療用抗体を提供する。無傷の治療用抗体は上述の任意のアイソタイプまたはそのサブクラスの定常領域を含んでいてよい。一実施形態では、抗体はＩｇＧアイソタイプ、特にＩｇＧ１のものである。抗体は、ラット、マウス、ウサギ、霊長類またはヒトであり得る。典型的な一実施形態では、抗体は霊長類（カニクイザル、旧世界ザルもしくは大型猿人類など、たとえば国際公開公報ＷＯ９９／５５３６９号、国際公開公報ＷＯ９３／０２１０８号を  参照）またはヒトである。
【００８０】
別の実施形態では、配列番号３のＣＤＲＨ３を含む単離した無傷の治療用抗体を提供する。別の実施形態では、配列番号１、２、３、４、５および６のＣＤＲを有する可変領域を含む無傷の治療用抗体を提供する。
【００８１】
別の実施形態では、配列番号７の配列を有するＶＨドメインおよび配列番号８の配列のＶＬドメインを含む、単離したネズミの無傷の治療用抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００８２】
１．１．２  ヒト抗体
ヒト抗体は、当業者に知られているいくつかの方法によって産生し得る。ヒト抗体は、ヒト骨髄腫またはマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系を用いたハイブリドーマ方法によって作製することができる。Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３３、３００１、（１９８４）およびＢｒｏｄｅｕｒ、モノクローナル抗体の産生技術および応用（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ページ５１〜６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ、１９８７）を参照されたい。別法として、ファージライブラリまたはトランスジェニックマウスの使用が含まれ、これらはどちらもヒトＶ領域レパートリーを利用する（Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ、（１９９４）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２、４３３〜４５５、Ｇｒｅｅｎ  ＬＬ（１９９９）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２３１、１１〜２３参照）。
【００８３】
トランスジェニックマウスのいくつかの株が現在利用可能であり、そのマウス免疫グロブリン座位がヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントによって置き換えられている（Ｔｏｍｉｚｕｋａ  Ｋ、（２０００）ＰＮＡＳ、９７、７２２〜７２７；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  Ｄ．Ｍ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４、８４５〜８５１、Ｍｅｎｄｅｚ  ＭＪ、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１５、１４６〜１５６参照）。抗原チャレンジの際に、このようなマウスは、そこから目的の抗体を選択することができるヒト抗体のレパートリーを作製する能力を有する。特に注目すべきは、ヒトリンパ球を照射したマウス内に移植するＴｒｉｍｅｒａ（商標）システム（Ｅｒｅｎ  Ｒら、（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、９３：１５４〜１６１参照）、ヒト（または他の種）のリンパ球を大量にプールしたｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗体産生手順に有効に通し、次いでデコンビュレートを行い、限界希釈および選択の手順を行う選択リンパ球抗体システム（ＳＬＡＭ、Ｂａｂｃｏｏｋら、ＰＮＡＳ、（１９９６）９３：７８４３〜７８４８参照）、ならびにＸｅｎｏｍｏｕｓｅ  ＩＩ（商標）（Ａｂｇｅｎｉｘ  Ｉｎｃ）である。代替手法はＭｏｒｐｈｏｔｅｃ  ＩｎｃからＭｏｒｐｈｏｄｏｍａ（商標）技術を用いて利用可能である。
【００８４】
ファージディスプレイ技術を用いてヒト抗体（およびその断片）を産生することができる。ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ；Ｎａｔｕｒｅ、３４８、５５２〜５５３（１９９０）およびＧｒｉｆｆｉｔｈｓ  ＡＤら（１９９４）ＥＭＢＯ、１３：３２４５〜３２６０参照。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、Ｍ１３またはｆｄなどの糸状バクテリオファージの主または副のタンパク質遺伝子外被のいずれか内にインフレームでクローニングし、（通常はヘルパーファージの援助を受けて）ファージ粒子の表面上の機能的な抗体断片として表示させる。抗体の機能特性に基づいた選択の結果、それらの特性を示す抗体をコードしている遺伝子の選択がもたらされる。ファージディスプレイ技術を用いて、上述の疾患もしくは障害に冒された個体または免疫化していないヒトドナーから採取したヒトＢ細胞より作製したライブラリから抗原特異的抗体を選択することができる（Ｍａｒｋｓ；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．、２２２、５８１〜５９７、１９９１参照）。Ｆｃドメインを含む無傷のヒト抗体を所望する場合は、ファージディスプレイに由来する断片を所望の定常領域を含む哺乳動物発現ベクター内に再クローニングし、安定した発現細胞系を確立する必要がある。
【００８５】
親和性成熟の技術（Ｍａｒｋｓ；Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌ、１０、７７９〜７８３（１９９２））を用いて結合親和性を改善させてもよく、ＨおよびＬ鎖Ｖ領域を天然に存在する変異体で逐次的に置き換え、改善された結合親和性に基づいて選択を行うことによって、一次ヒト抗体の親和性を改善させる。「エピトープインプリンティング」などのこの技術の変形も、現在利用可能である。国際公開公報ＷＯ９３／０６２１３号参照。また、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２１、２２６５〜２２６６ （１９９３）も参照。
【００８６】
したがって、別の実施形態では、ｈＩＬ−１３に特異的に結合し、ｈＩＬ−１３とｈＩＬ−１３Ｒとの相互作用を変調し（たとえば阻害もしくは遮断する）、単離したヒトの無傷の治療用抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００８７】
別の態様では、ｈＩＬ−１３に特異的に結合し、ｈＩＬ−１３とｈＩＬ−１３Ｒとの相互作用を変調し（たとえば阻害もしくは遮断する）、配列番号３のＣＤＲＨ３を含む単離したヒトの無傷の治療用抗体またはその抗原結合断片を提供する。別の態様では、上記で定義した配列番号１、２、３、４、５および６のＣＤＲを有する可変領域を含む、単離したヒトの無傷の治療用抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００８８】
１．２  キメラ抗体およびヒト化抗体
ヒトの疾患または障害の治療における無傷の非ヒト抗体の使用には、現在はよく確立されている免疫原性の問題、すなわち、患者の免疫系が非ヒトの無傷の抗体を非自己と認識して中和応答を開始し得るという潜在性が付随する。これは、非ヒト抗体をヒト患者に複数回投与した際に特に明らかである。これらの問題を克服するために様々な技術が長年にわたって開発されており、一般に、免疫化した動物、たとえばマウス、ラットまたはウサギから非ヒト抗体を得る相対的な容易さを保つ一方で、無傷の抗体中の非ヒトアミノ酸配列の組成を減少させることを含む。概して、これを達成するために２つの手法が用いられている。第１の手法はキメラ抗体であり、これは一般に、ヒト定常領域と融合した非ヒト（たとえばマウスなどのげっ歯類）可変ドメインを含む。抗体の抗原結合部位は可変領域内に局在しているので、キメラ抗体は抗原に対するその結合親和性を保つがヒト定常領域のエフェクター機能を獲得し、したがって、上述のものなどのエフェクター機能を行うことができる。キメラ抗体は、典型的には組換えＤＮＡ方法を用いて産生する。抗体をコードしているＤＮＡ（たとえばｃＤＮＡ）を単離し、従来の手順を用いて配列決定を行う（たとえば、本発明の抗体のＨおよびＬ鎖をコードしている遺伝子、たとえば上述の配列番号１、２、３、４、５および６をコードしているＤＮＡに特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによる）。ハイブリドーマ細胞がこのようなＤＮＡの典型的な源の役割を果たす。単離したのち、ＤＮＡを発現ベクター内に入れ、その後、これをそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞または骨髄腫細胞などの宿主細胞内に形質移入させて抗体の合成を得る。ＤＮＡは、ヒトＬ鎖およびＨ鎖のコード配列を対応する非ヒト（たとえばネズミ）ＨおよびＬ定常領域で置換することによって修飾し得るたとえばＭｏｒｒｉｓｏｎ；ＰＮＡＳ、８１、６８５１（１９８４）参照。
【００８９】
第２の手法は、可変領域をヒト化することによって抗体の非ヒト含有量を減らす、ヒト化抗体の産生を含む。ヒト化の２つの技術が人気を得ている。第１の技術はＣＤＲ移植によるヒト化である。ＣＤＲは抗体のＮ末端近くにループを構築し、ここで、フレームワーク領域によって提供される骨格中に載せられた表面が形成される。抗体の抗原結合特異性は、主にそのＣＤＲ表面のトポグラフィーおよび化学的特徴によって定義づけられる。立ち代って、これらの特徴は個々のＣＤＲのコンホメーション、ＣＤＲの相対的配置、ならびにＣＤＲを構成する残基の側鎖の性質および配置によって決定される。免疫原性の大幅な減少は、非ヒト（たとえばネズミ）抗体（「ドナー」抗体）のＣＤＲのみをヒトフレームワーク（「アクセプターフレームワーク」）および定常領域上に移植することによって達成することができる（Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ、３２１、５２２〜５２５およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎ  Ｍら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９、１５３４〜１５３６参照）。しかし、ＣＤＲ移植は本質的には抗原結合特性の完全な保持をもたらさない可能性があり、しばしば、有意な抗原−結合親和性を回復させる場合は、ヒト化分子中でドナー抗体の一部のフレームワーク残基（時折「逆突然変異」と呼ばれる）を保存する必要があることが判明している（Ｑｕｅｅｎ  Ｃら（１９８９）ＰＮＡＳ、８６、１０、０２９〜１０、０３３、Ｃｏ，Ｍら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ、３５１、５０１〜５０２参照）。この場合、ヒトフレームワーク（ＦＲ）を提供するために、非ヒトドナー抗体に対して最も高い配列相同性を示すヒトＶ領域をデータベースから選択する。ヒトＦＲの選択はヒトコンセンサスまたは個別のヒト抗体のどちらかからも行うことができる。必要な場合は、ドナー抗体の主要残基をヒトアクセプターフレームワーク内に置換して入れ、ＣＤＲのコンホメーションを保存する。抗体のコンピュータモデリングを用いてこのような構造的に重要な残基の同定を補助し得る。国際公開公報ＷＯ９９／４８５２３号参照。
【００９０】
別法として、ヒト化は「ベニアリング」工程によって達成され得る。独特なヒトおよびネズミ免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変領域の統計的解析により、曝された残基の正確なパターンがヒト抗体とネズミ抗体とでは異なり、ほとんどの個別の表面位置が少数の異なる残基に対して強い優先傾向を有することが明らかとなった（Ｐａｄｌａｎ  Ｅ．Ａ．ら；（１９９１）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８、４８９〜４９８およびＰｅｄｅｒｓｅｎ  Ｊ．Ｔ．ら（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２３５；９５９〜９７３参照）。したがって、そのフレームワーク領域中の、ヒト抗体中に通常見つかるものとは異なる曝された残基を置き換えることによって、非ヒトＦｖの免疫原性を軽減させることが可能である。タンパク質の抗原性は表面接近性と相関している可能性があるので、マウス可変領域をヒト免疫系に「不可視」にさせるには表面残基を置き換えることで十分であり得る（Ｍａｒｋ  Ｇ．Ｅ．ら（１９９４）、実験薬理学の手引き（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）、第１１３号：モノクローナル抗体の薬理学（Ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ページ１０５〜１３４も参照）。このヒト化手順は、抗体の表面のみを変更し、支持残基はそのままであるので「ベニアリング」と呼ばれる。
【００９１】
したがって、本発明の別の実施形態は、ヒト定常領域（ＩｇＧアイソタイプ、たとえばＩｇＧ１のものであり得る）と融合した非ヒト（たとえばげっ歯類）可変ドメインを含むキメラ治療用抗体であって、ｈＩＬ−１３に特異的に結合し、ｈＩＬ−１３とｈＩＬ−１３Ｒとの相互作用を変調する（たとえば阻害または遮断する）抗体を提供する。
【００９２】
別の実施形態では、非ヒト（たとえばげっ歯類）可変領域およびヒト定常領域（ＩｇＧアイソタイプ、たとえばＩｇＧ１のものであり得る）を含むキメラ治療用抗体であって、ｈＩＬ−１３に特異的に結合し、配列番号３のＣＤＲＨ３をさらに含む抗体を提供する。このような抗体は、ＩｇＧアイソタイプ、たとえばＩｇＧ１のヒト定常領域をさらに含み得る。
【００９３】
別の実施形態では、非ヒト（たとえばげっ歯類）可変領域およびヒト定常領域（ＩｇＧアイソタイプ、たとえばＩｇＧ１のものであり得る）を含むキメラ治療用抗体であって、ｈＩＬ−１３に特異的に結合し、配列番号１、２、３、４、５および６のＣＤＲを有する抗体がある。
【００９４】
別の実施形態では、配列番号７のＶＨドメインおよび配列番号８のＶＬドメインならびにＩｇＧアイソタイプ、たとえばＩｇＧ１のヒト定常領域を含むキメラ治療用抗体であって、ｈＩＬ−１３に特異的に結合し、ｈＩＬ−１３とｈＩＬ−１３Ｒとの相互作用を変調する（たとえば阻害または遮断する）抗体を提供する。
【００９５】
別の実施形態では、ｈＩＬ−１３に特異的に結合し、ｈＩＬ−１３とｈＩＬ−１３Ｒとの相互作用を変調する（たとえば阻害または遮断する）、ヒト化治療用抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００９６】
別の実施形態では、ｈＩＬ−１３に特異的に結合し、配列番号３のＣＤＲＨ３を含む、ヒト化治療用抗体またはその抗原結合断片を提供する。このような抗体は、ＩｇＧアイソタイプ、たとえばＩｇＧ１のヒト定常領域を含み得る。
【００９７】
別の実施形態では、ｈＩＬ−１３に特異的に結合し、配列番号１、２、３、４、５および６のＣＤＲを含む、ヒト化治療用抗体またはその抗原結合断片を提供する。このような抗体は、ＩｇＧアイソタイプ、たとえばＩｇＧ１のヒト定常領域を含み得る。
【００９８】
本発明によれば、配列番号１１、１２、１３、１４の群から選択されるＶＨドメインおよび配列番号１５、１６の群から選択されるＶＬドメインを含むヒト化治療用抗体を提供する。このような抗体は、ＩｇＧアイソタイプ、たとえばＩｇＧ１のヒト定常領域を含み得る。
【００９９】
別の実施形態では、配列番号１１のＶＨドメインおよび配列番号１５のＶＬドメインを含むヒト化治療用抗体を提供する。
【０１００】
別の実施形態では、配列番号１２のＶＨドメインおよび配列番号１５のＶＬドメインを含むヒト化治療用抗体を提供する。
【０１０１】
別の実施形態では、配列番号１３のＶＨドメインおよび配列番号１５のＶＬドメインを含むヒト化治療用抗体を提供する。
【０１０２】
別の実施形態では、配列番号１４のＶＨドメインおよび配列番号１５のＶＬドメインを含むヒト化治療用抗体を提供する。
【０１０３】
別の実施形態では、配列番号１１のＶＨドメインおよび配列番号１６のＶＬドメインを含むヒト化治療用抗体を提供する。
【０１０４】
別の実施形態では、配列番号１２のＶＨドメインおよび配列番号１６のＶＬドメインを含むヒト化治療用抗体を提供する。
【０１０５】
別の実施形態では、配列番号１３のＶＨドメインおよび配列番号１６のＶＬドメインを含むヒト化治療用抗体を提供する。
【０１０６】
別の実施形態では、配列番号１４のＶＨドメインおよび配列番号１６のＶＬドメインを含むヒト化治療用抗体を提供する。
【０１０７】
本発明の別の実施形態では、ｈＩＬ−１３に特異的に結合するヒト化治療用抗体またはその抗原結合断片であって、ＣＤＲＨ３（配列番号３）を含み、所望により配列番号１、２、４、５および６のＣＤＲをさらに含み、ヒトアクセプター重鎖フレームワーク領域の１９、３８、７３および８１からなる群から選択された残基およびヒトアクセプター軽鎖フレームワークの位置８５の残基が、ＣＤＲＨ３が由来するドナー抗体フレームワーク中に見つかる対応する残基で置換されている抗体またはその断片を提供する。
【０１０８】
当業者には、用語「由来する」とは、材料の物理的起源である意味の源を定義するだけでなく、材料と（一次アミノ酸配列に関して）構造的に同一であるが、参照源から派生しない材料も定義することを意図することが明らかであろう。したがって、「ＣＤＲＨ３が由来するドナー抗体中に見つかる残基」とは、必ずしもドナー抗体から精製したものである必要はない。
【０１０９】
別の実施形態では、ｈＩＬ−１３に特異的に結合するヒト化治療用抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号３のＣＤＲＨ３を含み、所望により配列番号１、２、４、５および６のＣＤＲをさらに含み、ヒト重鎖フレームワークが以下の残基（もしくはその同類置換基）の１つもしくは複数（たとえばすべて）を含み：
位置  残基
３８  Ｉ
１９  Ｒ
７３  Ｔ
８１  Ｒ
ヒト軽鎖が：
位置  残基
８５  Ｖ
を含む、抗体またはその断片を提供する。
【０１１０】
特定のアミノ酸置換が「保存的」であるとみなされることは、当分野で周知である。アミノ酸は共通側鎖の特性に基づいてグループに分けられており、本発明の抗体もしくはその抗原結合断片の結合親和性をすべてまたは実質的にすべて保つ、グループ内の置換は保存的置換とみなされる。以下の表を参照されたい：
【０１１１】
【表１】
2008511542.tif 000002
【０１１２】
本発明によれば、配列番号１８、１９、２０、２１からなる群から選択された重鎖および配列番号２２、２３からなる群から選択された軽鎖を含む、ヒト化治療用抗体を提供する。
【０１１３】
本発明の一実施形態では、配列番号１８の重鎖および配列番号２２の軽鎖を含むｈＩＬ−１３に特異的に結合するヒト化治療用抗体を提供する。
【０１１４】
本発明の一実施形態では、配列番号１９の重鎖および配列番号２２の軽鎖を含むｈＩＬ−１３に特異的に結合するヒト化治療用抗体を提供する。
【０１１５】
本発明の一実施形態では、配列番号２０の重鎖および配列番号２２の軽鎖を含むｈＩＬ−１３に特異的に結合するヒト化治療用抗体を提供する。
【０１１６】
本発明の一実施形態では、配列番号２１の重鎖および配列番号２２の軽鎖を含むｈＩＬ−１３に特異的に結合するヒト化治療用抗体を提供する。
【０１１７】
本発明の一実施形態では、配列番号１８の重鎖および配列番号２３の軽鎖を含むｈＩＬ−１３に特異的に結合するヒト化治療用抗体を提供する。
【０１１８】
本発明の一実施形態では、配列番号１９の重鎖および配列番号２３の軽鎖を含むｈＩＬ−１３に特異的に結合するヒト化治療用抗体を提供する。
【０１１９】
本発明の一実施形態では、配列番号２０の重鎖および配列番号２３の軽鎖を含むｈＩＬ−１３に特異的に結合するヒト化治療用抗体を提供する。
【０１２０】
本発明の一実施形態では、配列番号２１の重鎖および配列番号２３の軽鎖を含むｈＩＬ−１３に特異的に結合するヒト化治療用抗体を提供する。
【０１２１】
１．３  二重特異性抗体
二重特異性抗体とは、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。このような抗体を作製する方法は当分野で知られている。従来より、二重特異性抗体の組換え産生は２つの免疫グロブリンＨ鎖−Ｌ鎖対の同時発現に基づいており、２つのＨ鎖は異なる結合特異性を有するＭｉｌｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３０５、５３７〜５３９（１９８３）、国際公開公報ＷＯ９３／０８８２９号およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ、１０、１９９１、３６５５〜３６５９参照。ＨおよびＬ鎖のランダムな取り揃えにより、１０種の異なる抗体構造の潜在的な混合物が生じ、そのうち１種のみが所望の結合特異性を有する。代替手法は、少なくともヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３領域の一部を含む重鎖定常領域に対して所望の結合特異性を有する可変ドメインを融合させることを含む。軽鎖結合に必要な部位を含むＣＨ１領域を融合体の少なくとも１つの中に存在させることが好ましい。このような融合体をコードしているＤＮＡ、および所望する場合はＬ鎖を、個別の発現ベクター内に挿入し、その後、適切な宿主生物内に同時形質移入する。しかし、２つまたは３つの鎖すべてのコード配列を１つの発現ベクター内に挿入することも可能である。１つの好ましい手法では、二重特異性抗体は、一方のアームに第１の結合特異性を有するＨ鎖、および他方のアームに第２の結合特異性をもたらすＨ−Ｌ鎖対からなる。国際公開公報ＷＯ９４／０４６９０号参照。また、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１、２１０、１９８６も参照。
【０１２２】
本発明の一実施形態では、二重特異性治療用抗体であって、前記抗体の少なくとも１つの結合特異性がｈＩＬ−１３に対するものであり、ｈＩＬ−１３とＩＬ−１３Ｒとの相互作用を変調する（たとえば阻害または遮断する）抗体を提供する。このような抗体は、ＩｇＧアイソタイプ、たとえばＩｇＧ１のヒト定常領域をさらに含み得る。一部の実施形態では、二重特異性治療用抗体は、ｈＩＬ−１３に対する第１の結合特異性を有し、ｈＩＬ−１３とｈＩＬ−１３Ｒとの相互作用を変調し（たとえば阻害または遮断する）、また、ｈＩＬ−４に対する第２の結合特異性を有し、ｈＩＬ−４とｈＩＬ−４の受容体との相互作用を変調する（たとえば阻害または遮断する）。
【０１２３】
本発明の一実施形態では、二重特異性治療用抗体であって、前記抗体の少なくとも１つの結合特異性はｈＩＬ−１３に対するものであり、配列番号３のＣＤＲＨ３を含む抗体を提供する。このような抗体は、ＩｇＧアイソタイプ、たとえばＩｇＧ１のヒト定常領域をさらに含み得る。
【０１２４】
本発明の一実施形態では、二重特異性治療用抗体であって、前記抗体の少なくとも１つの結合特異性はｈＩＬ−１３に対するものであり、少なくとも配列番号１、２、３、４、５および６のＣＤＲを含む抗体を提供する。このような抗体は、ＩｇＧアイソタイプ、たとえばＩｇＧ１のヒト定常領域をさらに含み得る。
【０１２５】
１．４  抗体断片
本発明の特定の実施形態では、ｈＩＬ−１３とｈＩＬ−１３Ｒとの相互作用を変調する治療用抗体断片を提供する。このような断片は、上述の抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＳｃＦｖ断片などの、無傷の抗体および／またはヒト化抗体および／またはキメラ抗体の機能的な抗体結合断片であり得る。従来、このような断片はたとえばパパイン消化による無傷の抗体のタンパク質分解性消化は産生されているが（たとえば、国際公開公報ＷＯ９４／２９３４８号参照）、組換えによって形質転換させた宿主細胞から直接産生し得る。ＳｃＦｖの産生には、Ｂｉｒｄら；（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２、４２３〜４２６を参照されたい。さらに、下に記述する様々な操作技術を用いて抗体断片を産生し得る。
【０１２６】
Ｆｖ断片は、その２つの鎖の相互作用エネルギーがＦａｂ断片よりも低いと考えられる。ＶＨおよびＶＬドメインの会合を安定化するために、これらはペプチド（Ｂｉｒｄら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２、４２３〜４２６、Ｈｕｓｔｏｎら、ＰＮＡＳ、８５、５８７９〜５８８３）、ジスルフィド橋（Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒら、（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９、１３６２〜１３６７）および「ノブインホール（ｋｎｏｂ  ｉｎ  ｈｏｌｅ）」突然変異（Ｚｈｕら（１９９７）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．、６、７８１〜７８８）で連結されている。ＳｃＦｖ断片は当業者に周知の方法によって産生することができる。Ｗｈｉｔｌｏｗら（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｃｏｍｐａｎｉｇｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、２、９７〜１０５およびＨｕｓｔｏｎら（１９９３）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１０、１９５〜２１７参照。ＳｃＦｖは大腸菌などの細菌細胞中で産生し得るが、真核細胞中で産生することがより好ましい。ＳｃＦｖの１つの不利点は、産物が一価性であり多価結合による結合力の増強が妨げられること、およびその短い半減期である。これらの問題を克服する試みには、追加のＣ末端システインを含むＳｃＦＶから化学的カップリングによって産生した（Ａｄａｍｓら（１９９３）Ｃａｎ．Ｒｅｓ、５３、４０２６〜４０３４およびＭｃＣａｒｔｎｅｙら（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、８、３０１〜３１４）、または非対合Ｃ末端システイン残基を含むＳｃＦｖの自発性の部位特異的な二量体化によって産生した（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら（１９９５）Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓ、２６、１８７〜２０４参照）二価（ＳｃＦｖ’）２が含まれる。あるいは、ＳｃＦｖは、ペプチドリンカーを３〜１２残基に短縮して「二重特異性抗体」を形成させることによって、多量体を形成させることができる。Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、ＰＮＡＳ、（１９９３）、９０、６４４４〜６４４８参照。リンカーをさらに縮小することによりＳｃＦＶ三量体（「三重特異性抗体」、Ｋｏｒｔｔら（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ、１０、４２３〜４３３参照）および四量体（「四重特異性抗体」、Ｌｅ  Ｇａｌｌら（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、４５３、１６４〜１６８参照）をもたらすことができる。また、二価ＳｃＦＶ分子の構築は、タンパク質二量体化モチーフと遺伝子融合させて「ミニ抗体」（Ｐａｃｋら（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１、１５７９〜１５８４参照）および「ミニボディー」（Ｈｕら（１９９６）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５６、３０５５〜３０６１参照）を形成させることによっても達成することができる。ＳｃＦｖ−Ｓｃ−Ｆｖタンデム（（ＳｃＦＶ）２）は、第３のペプチドリンカーによって２つのＳｃＦｖ単位を連結させることによっても産生し得る。Ｋｕｒｕｃｚら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｏｌ．、１５４、４５７６〜４５８２参照。二重特異性の二重特異性抗体は、１つの抗体のＶＨドメインが短いリンカーによって別の抗体のＶＬドメインに結合されたことからなる、２つの単鎖融合産物の非共有結合によって産生することができる。Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら（１９９８）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ、７７、７６３〜７７２参��。このような二重特異性の二重特異性抗体の安定性は、上述のようにジスルフィド橋もしくは「ノブインホール」突然変異を導入することによって、または二重ハイブリッドＳｃＦｖ断片がペプチドリンカーによって結合されている単鎖二重特異性抗体（ＳｃＤｂ）を形成させることによって、増強することができる。Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２２６、１７９〜１８８参照。四価の二重特異性分子は、たとえばヒンジ領域を介してＳｃＦｖ断片をＩｇＧ分子のＣＨ３ドメインまたはＦａｂ断片に融合させることによって利用可能である。Ｃｏｌｏｍａら（１９９７） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５、１５９〜１６３参照。あるいは、四価の二重特異性分子が二重特異性の単鎖二重特異性抗体の融合によって作製されている（Ａｌｔら、（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、４５４、９０〜９４参照。また、より小さな四価の二重特異性分子は、ヘリックス−ループ−ヘリックスモチーフを含むリンカーを用いたＳｃＦｖ−ＳｃＦｖタンデムの二量体化（ＤｉＢｉミニ抗体、Ｍｕｌｌｅｒら（１９９８）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、４３２、４５〜４９参照）または４つの抗体可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）を含む単鎖分子の分子内対合を妨げる配向の二量体化（タンデム二重特異性抗体、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９３、４１〜５６参照）によっても形成することができる。二重特異性のＦ（ａｂ’）２断片は、Ｆａｂ’断片の化学的カップリングまたはロイシンジッパーを介したヘテロ二量体化によって作製することができる（Ｓｈａｌａｂｙら、（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７５、２１７〜２２５およびＫｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８、１５４７〜１５５３参照）。また、単離されたＶＨおよびＶＬドメイン（Ｄｏｍａｎｔｉｓ  ｐｌｃ）も利用可能である。ＵＳ６，２４８，５１６；ＵＳ６，２９１，１５８；ＵＳ６，１７２，１９７参照。
【０１２７】
一実施形態では、ｈＩＬ−１３に特異的に結合し、ｈＩＬ−１３とｈＩＬ−１３Ｒとの相互作用を変調する（たとえば阻害または遮断する）、治療用抗体断片（たとえばＳｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２）または上述のように操作した抗体断片を提供する。治療用抗体断片は、典型的には、配列番号３の配列を有するＣＤＲＨ３を、所望により配列番号１、２、４、５および６に記載の配列を有するＣＤＲと共に含む。
【０１２８】
１．５  ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体も本発明の一実施形態を形成する。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の便利な架橋結合方法を用いて形成された２つの共有結合された抗体からなる。たとえばＵＳ４，６７６，９８０参照。
【０１２９】
１．６  他の修飾
抗体のＦｃ領域と様々なＦｃ受容体（ＦｃγＲ）との相互作用は、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体の固定、貪食および抗体の半減期／クリアランスを含めた、抗体のエフェクター機能を媒介すると考えられている。本発明の抗体のＦｃ領域に対する様々な修飾は、所望する特性に応じて実施し得る。たとえば、そうでなければ溶解性の抗体を非溶解性にするためのＦｃ領域中の特異的突然変異は、ＥＰ０６２９  ２４０Ｂ１およびＥＰ０３０７  ４３４Ｂ２に詳述されており、また、血清半減期を増加させるために救助（ｓａｌｖａｇｅ）受容体結合エピトープを抗体内に取り込ませてもよい。ＵＳ５，７３９，２７７参照。現在認識されているヒトＦｃγ受容体は５つ存在し、それらはＦｃγＲ（Ｉ）、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａおよび新生児ＦｃＲｎである。Ｓｈｉｅｌｄｓら、（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７６、６５９１〜６６０４は、ＩｇＧ１残基の共通の組がすべてのＦｃγＲの結合に関与しているが、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩはこの共通の組以外に異なった部位を利用することを実証した。ＩｇＧ１残基の１つのグループは、アラニンに変更した場合にすべてのＦｃγＲに対する結合が軽減された。これらはＰｒｏ−２３８、Ａｓｐ−２６５、Ａｓｐ−２７０、Ａｓｎ−２９７およびＰｒｏ−２３９である。これらはすべてＩｇＧのＣＨ２ドメイン中にあり、ＣＨ１およびＣＨ２を連結するヒンジ付近に密集している。ＦｃγＲＩは結合にＩｇＧ１残基の共通の組のみを利用するが、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩは共通の組に加えて、異なる残基とも相互作用する。一部の残基の変更では、ＦｃγＲＩＩ（たとえばＡｒｇ−２９２）またはＦｃγＲＩＩＩ（たとえばＧｌｕ−２９３）への結合のみが軽減された。一部の変異体ではＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩに対して結合の改善が示されたが、他の受容体に対する結合は影響を受けなかった（たとえばＳｅｒ−２６７ＡｌａによりＦｃγＲＩＩに対する結合が改善されたが、ＦｃγＲＩＩＩに対する結合は影響を受けなかった）。他の変異体ではＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩに対する結合の改善が示されたが、他の受容体に対する結合が軽減された（たとえばＳｅｒ−２９８ＡｌａによりＦｃγＲＩＩＩに対する結合が改善され、ＦｃγＲＩＩに対する結合は影響を受けなかった）。ＦｃγＲＩＩＩａでは、最良の結合のＩｇＧ１変異体はＳｅｒ−２９８、Ｇｌｕ−３３３およびＬｙｓ−３３４におけるアラニン置換の組合せを有していた。新生児ＦｃＲｎ受容体は、抗体クリアランスおよび組織にわたる経細胞輸送のどちらにも関与していると考えられている（Ｊｕｎｇｈａｎｓ  Ｒ．Ｐ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ、１６．２９〜５７およびＧｈｅｔｉｅら（２０００）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１８、７３９〜７６６参照）。ヒトＦｃＲｎと直接相互作用すると決定されたヒトＩｇＧ１残基には、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４およびＨｉｓ４３５が含まれる。本セクション中に記載のこれらのうちの任意の位置における転換は、血清半減期の増加および／または本発明の抗体のエフェクター特性の変更を可能にし得る。
【０１３０】
他の修飾には、本発明の抗体のグリコシル化変異体が含まれる。その定常領域内の保存された位置における抗体のグリコシル化は、抗体の機能、特に上述のものなどのエフェクター機能に大きな影響を与えることが知られている。たとえば、Ｂｏｙｄら（１９９６）、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３２、１３１１〜１３１８を参照されたい。１つもしくは複数の炭水化物部分が付加、置換、欠失または修飾されている、本発明の治療用抗体またはその抗原結合断片のグリコシル化変異体が意図されている。アスパラギン−Ｘ−セリンまたはアスパラギン−Ｘ−スレオニンモチーフの導入は炭素水和物部分の酵素的付着の潜在的な部位をもたらすので、抗体のグリコシル化の操作に用い得る。Ｒａｊｕら（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４０、８８６８〜８８７６では、ＴＮＦＲ−ＩｇＧイムノアドヘシンの末端シアリル化は、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼおよび／またはα，２，３シアリルトランスフェラーゼを用いた再ガラクトシル化および／または再シアリル化の工程によって増加させた。末端シアリル化の増加により免疫グロブリンの半減期が増加すると考えられている。ほとんどの糖タンパク質と共通して、抗体は典型的には糖型の混合物として産生される。この混合は、抗体を真核細胞、特に哺乳動物細胞中で産生させた場合に特に明らかである。定義された糖型を作製するために様々な方法が開発されている。Ｚｈａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、（２００４）、３０３、３７１、Ｓｅａｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、（２００１）２９１、２３４４、Ｗａｃｋｅｒら（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９８、１７９０、Ｄａｖｉｓら（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、１０２、５７９、Ｈａｎｇら（２００１）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ、３４、７２７参照。したがって、本発明は、定義された数（たとえば７以下、たとえば２つもしくは単一などの５以下）の糖型の前記抗体またはその抗原結合断片を含む、本明細書中に記載の複数の治療用（モノクローナル）抗体（これはＩｇＧアイソタイプ、たとえばＩｇＧ１のものであり得る）を意図する。
【０１３１】
本発明のさらなる実施形態には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコールもしくはポリオキシアルキレンなどの非タンパク質ポリマーとカップリングした本発明の治療用抗体またはその抗原結合断片が含まれる。タンパク質とＰＥＧとのコンジュゲーションは、タンパク質の半減期を増加させるため、ならびにタンパク質の抗原性および免疫原性を軽減させるための確立された技術である。様々な分子量および形（直鎖状または分枝鎖状）を用いたＰＥＧ化の使用が無傷の抗体およびＦａｂ’断片について調査されている。Ｋｏｕｍｅｎｉｓ  Ｉ．Ｌ．ら（２０００）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．、１９８：８３〜９５参照。
【０１３２】
２．競合抗体
本発明はまた、ｈＩＬ−１３に特異的に結合して、配列番号３のＣＤＲＨ３を含む本発明の治療用抗体もしくはその抗原結合断片のｈＩＬ−１３への結合、および／または配列番号１、２、３、４、５および６のＣＤＲを含む治療用抗体もしくはその抗原結合断片のｈＩＬ−１３への結合を競合的に阻害する、抗体ならびに抗体の抗原結合断片も意図する。一部の実施形態では、治療用抗体は配列番号７のＶＨドメインおよび配列番号８のＶＬドメインを含むネズミ抗体である。このような競合抗体は、配列番号１、２、３、４、５および６のＣＤＲを含む治療用抗体によって結合されるものと同じ、それに重複する、または空間的に隣接するｈＩＬ−１３のエピトープに結合する。競合抗体または抗体断片は、等モル濃度において、少なくとも２５％の阻害、典型的には３５％以上、より典型的には少なくとも５０％の阻害を示す。
【０１３３】
したがって、本発明の一実施形態では、候補抗体または抗体断片が本明細書中に記載した競合抗体であるかどうかを決定するための、候補抗体または抗体断片のスクリーニング方法であって、
【０１３４】
（ａ）候補抗体または抗体断片を、配列番号３のＣＤＲＨ３を含み、所望により配列番号１、２、４、５および６のＣＤＲをさらに含む治療用抗体（配列番号７のＶＨドメインおよび配列番号８のＶＬドメインを有するネズミ治療用抗体、もしくは配列番号１８の重鎖および配列番号２２の軽鎖を有するヒト化治療用抗体、もしくは配列番号１９の重鎖および配列番号２３の軽鎖を有するヒト化治療用抗体など）またはその抗原結合断片と共にインキュベーションする工程と；
【０１３５】
（ｂ）工程（ａ）の候補抗体またはその抗体断片が、治療用抗体またはその抗原結合断片のｈＩＬ−１３への結合を競合的に阻害するかどうかを決定する工程と
の工程を含む方法を提供する。
【０１３６】
また、配列番号１、２、３、４、５および６に記載の配列を有するＣＤＲを含む治療用抗体もしくはその抗原結合断片の結合を競合的に阻害する、競合抗体またはその抗原結合断片も提供する。
【０１３７】
別の実施形態では、配列番号１８の重鎖および配列番号２２の軽鎖を含む本発明の、治療用抗体のｈＩＬ−１３への結合を競合的に阻害する、競合抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０１３８】
競合抗体またはその抗原結合断片は、上記抗体構造のうちの任意のものであり得る。たとえば、競合抗体は、霊長類もしくはヒトの無傷の抗体、またはヒト化抗体、好ましくはＩｇＧアイソタイプ、たとえばＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４のものであり得る。競合抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＳｃＦｖなどであり得る。競合抗体は、本明細書中に開示した方法に従って産生し得る。
【０１３９】
３．産生方法
本発明の抗体はポリクローナル集団として産生し得るが、モノクローナル集団として（すなわち、特異的な抗原結合部位に向けられた同一抗体の実質的に均一な集団として）産生することがより好ましい。当業者には、もちろん、集団とは複数の抗体実体を意味することが明らかであろう。本発明の抗体は、ヤギ（Ｐｏｌｌｏｃｋら（１９９９）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２３１：１４７〜１５７参照）、ニワトリ（Ｍｏｒｒｏｗ  ＫＪＪ（２０００）Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ、２０：１〜５５参照、マウス（Ｐｏｌｌｏｃｋら参照）または植物（Ｄｏｒａｎ  ＰＭ、（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１、１９９〜２０４、Ｍａ  ＪＫ−Ｃ（１９９８）、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、４；６０１〜６０６、Ｂａｅｚ  Ｊら、ＢｉｏＰｈａｒｍ、（２０００）１３：５０〜５４、Ｓｔｏｇｅｒ  Ｅら；（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４２：５８３〜５９０参照）などのトランスジェニック生物中で産生させ得る。また、化学合成によって抗体を合成してもよい。しかし、本発明の抗体は、典型的には当業者に周知の組換え細胞培養技術を用いて産生する。抗体をコードしているポリヌクレオチドを単離し、プラスミドなどの複製可能なベクター内に導入してさらにクローニング（増幅）または発現させる。特に宿主細胞がＣＨＯまたはＮＳ０である場合（以下参照）、１つの有用な発現系はグルタミン酸合成酵素系（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓから販売されているものなど）である。抗体をコードしているポリヌクレオチドは、従来の手順（たとえばオリゴヌクレオチドプローブ）を用いて容易に単離され、配列決定を行う。使用し得るベクターには、プラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾン、プラスミドが典型的な具体化であるミニ染色体が含まれる。一般に、このようなベクターにはさらに、発現を促進するために軽鎖および／または重鎖ポリヌクレオチドに動作可能に連結されたシグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーターならびに転写停止配列が含まれる。軽鎖および重鎖をコードしているポリヌクレオチドは、個別のベクター内に挿入して同一宿主細胞内に形質移入させてもよく、または、所望する場合は重鎖および軽鎖をどちらも同一ベクター内に挿入して宿主細胞内に形質移入させることができる。したがって、本発明の一態様によれば、本発明の治療用抗体もしくはその抗原結合断片の軽鎖および／または重鎖をコードしているベクターの構築工程であって、ベクター内に、本発明の治療用抗体の軽鎖および／または重鎖のどちらかをコードしているポリヌクレオチドを挿入することを含む方法を提供する。
【０１４０】
本発明の他の態様では、配列番号２４として記載した配列を有するネズミＶＨドメインをコードしているポリヌクレオチドを提供する。
【０１４１】
本発明の別の態様では、配列番号２５として記載した配列を有するネズミＶＬドメインをコードしているポリヌクレオチドを提供する。
【０１４２】
別の実施形態では、配列番号２６、２７、２８、２９からなる群から選択された配列を有するＶＨドメインコードしているポリヌクレトチドを提供する。
【０１４３】
別の実施形態では、配列番号３０、３１からなる群から選択された配列を有するＶＬドメインをコードしているポリヌクレトチドを提供する。
【０１４４】
本発明によれば、本発明の重鎖をコードしている、配列番号３２、３３、３４、３５からなる群から選択されたポリヌクレオチドを提供する。
【０１４５】
本発明によれば、本発明の軽鎖をコードしている、配列番号３６、３７からなる群から選択されたポリヌクレオチドを提供する。
【０１４６】
当業者には、遺伝暗号の重複性により、本明細書中に開示したものの代替となるポリヌクレオチドも、本発明のポリペプチドをコードしており利用可能であることが直ちに明らかであろう。
【０１４７】
３．１  シグナル配列
本発明の抗体は、成熟タンパク質のＮ末端に特異的切断部位を有する異種シグナル配列を有する融合タンパク質として産生し得る。シグナル配列は宿主細胞によって認識およびプロセッシングされるべきである。原核宿主細胞には、シグナル配列はアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーであり得る。酵母分泌には、シグナル配列は酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダーまたは酸ホスファターゼリーダーであり得る。たとえば国際公開公報ＷＯ９０／１３６４６号参照。哺乳動物細胞系では、単純ヘルペスｇＤシグナルなどのウイルス分泌リーダーおよびネイティブ免疫グロブリンシグナル配列が利用可能である。典型的には、シグナル配列は、本発明の抗体をコードしているＤＮＡに、読み枠中でライゲーションさせる。
【０１４８】
３．２  複製起点
複製起点は当分野で周知であり、ｐＢＲ３２２がほとんどのグラム陰性細菌に適しており、２μプラスミドがほとんどの酵母に適しており、ＳＶ４０などの様々なウイルス、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶがほとんどの哺乳動物細胞に適している。一般に、哺乳動物発現ベクターには複製起点の構成成分は必要ないが、初期プロモーターを含むのでＳＶ４０を用いてもよい。
【０１４９】
３．３  選択マーカー
典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、たとえばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を与える、あるいは（ｂ）栄養要求性欠乏を補完するまたは複合培地中で利用可能でない栄養素を供給する、タンパク質をコードしている。選択スキームは、宿主細胞の増殖を停止させることを含み得る。本発明の治療用抗体をコードしている遺伝子を用いて形質転換が成功している細胞は、選択マーカーによって与えられた、たとえば薬物耐性によって生存する。別の例はいわゆるＤＨＦＲ選択マーカーであり、メトトレキサートの存在下で形質転換体を培養する。典型的な実施形態では、目的の外来遺伝子のコピー数を増幅させるために、徐々に増加する量のメトトレキサートの存在下で細胞を培養する。ＣＨＯ細胞がＤＨＦＲ選択に特に有用な細胞系である。さらなる例はグルタミン酸合成酵素発現系（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）である。酵母で用いるための適切な選択遺伝子はｔｒｐ１遺伝子である。Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ、２８２、３８、１９７９参照。
【０１５０】
３．４  プロモーター
本発明の抗体の発現に適したプロモーターを、抗体をコードしているＤＮＡ／ポリヌクレオチドに動作可能に連結させる。原核宿主用のプロモーターには、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファンならびにＴａｃなどのハイブリッドプロモーターが含まれる。酵母細胞中での発現に適したプロモーターには、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素、たとえばエノラーゼ、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸脱炭酸酵素、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース６リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼおよびグルコキナーゼが含まれる。誘導性酵母プロモーターには、アルコール脱水素酵素２、イソチトクロームＣ、酸ホスファターゼ、メタロチオネインおよび窒素代謝またはマルトース／ガラクトース利用を担っている酵素が含まれる。
【０１５１】
哺乳動物細胞系中での発現用のプロモーターには、ポリオーマ、鶏痘およびアデノウイルス（たとえばアデノウイルス２）などのウイルスプロモーター、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（具体的には前初期遺伝子プロモーター）、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、アクチン、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターならびに初期および後期シミアンウイルス４０が含まれる。もちろん、プロモーターの選択は発現に用いる宿主細胞との適切な適合性に基づいている。したがって、一実施形態では、ＲＳＶおよび／またはＳＶ４０および／またはＣＭＶプロモーター、本発明の軽鎖Ｖ領域（ＶＬ）をコードしているＤＮＡ、κＣ領域をネオマイシンおよびアンピシリン耐性の選択マーカーと共に含む第１のプラスミド、ならびにＲＳＶまたはＳＶ４０プロモーター、本発明の重鎖Ｖ領域（ＶＨ）をコードしているＤＮＡ、γ１定常領域をコードしているＤＮＡ、ＤＨＦＲおよびアンピシリン耐性マーカーを含む第２のプラスミドを提供する。
【０１５２】
３．５  エンハンサー要素
適切な場合、たとえば高等真核生物中での発現には、ベクター内でプロモーター要素に動作可能に連結したエンハンサー要素を用い得る。適切な哺乳動物エンハンサー配列には、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテインおよびインスリン由来のエンハンサー要素が含まれる。あるいは、ＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリーマエンハンサー、バキュロウイルスエンハンサーまたはネズミＩｇＧ２ａ座位などの、真核細胞ウイルス由来のエンハンサー要素を用い得る（国際公開公報ＷＯ０４／００９８２３号参照）。エンハンサーは、ベクターのプロモーターよりも上流の部位に位置することが好ましい。
【０１５３】
３．６  宿主細胞
本発明の抗体をコードしているベクターをクローニングまたは発現させるための適切な宿主細胞は、原核細胞、酵母または高等真核細胞である。適切な原核細胞には、真正細菌、たとえば、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、たとえば大腸菌（たとえばＡＴＣＣ３１，４４６；３１，５３７；２７，３２５）などの腸内細菌科、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラプロテウス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、たとえばネズミチフス菌、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、たとえばセラチアマルセスキャンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）および赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ならびに枯草菌（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびリケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）などの桿菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）（ＤＤ２６６  ７１０参照）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）などのシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ならびにストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が含まれる。酵母宿主細胞のうち、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイヴェロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）（たとえばＡＴＣＣ１６，０４５；１２，４２４；２４１７８；５６，５００）、ヤロウィア（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ４０２，２２６）、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  Ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ１８３，０７０、またＰｅｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１０８（２００４）１８５〜１９２も参照）、カンジダ属、トリコデルマリーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ２４４、２３４）、ペニシリン属、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）ならびに偽巣性コウジ菌（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびクロカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）などのアスペルギルス属の宿主も意図される。
【０１５４】
原核および酵母宿主細胞は本発明に具体的に意図されるが、本発明宿主細胞は高等真核細胞であることが好ましい。適切な高等真核宿主細胞には、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０）ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）、ヒト胚性腎臓系２９３、仔ハムスター腎細胞（ＢＨＫ）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ．１６３２）、ＢＨＫ５７０（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１０３１４）、２９３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ（たとえばＣＨＯ−Ｋ１、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１、ＤＧ４４などのＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞系（Ｕｒｌａｕｂら、（１９８６）Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１２、５５５〜５５６参照））、特に懸濁培養に適応させたＣＨＯ細胞系、マウスセルトリ細胞、サル腎細胞、アフリカミドリザル腎細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ＨＥＬＡ細胞、イヌ科動物腎細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）、ヒト肺細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）、Ｈｅｐ  Ｇ２および骨髄腫またはリンパ腫細胞、たとえばＮＳ０（ＵＳ５，８０７，７１５参照）、Ｓｐ２／０、Ｙ０などの哺乳動物細胞が含まれる。
【０１５５】
したがって、本発明の一実施形態では、本明細書中に記載した治療用抗体またはその抗原結合断片の重鎖および／もしくは軽鎖をコードしているベクターを含む、安定に形質転換した宿主細胞を提供する。好ましくは、このような宿主細胞は、軽鎖をコードしている第１のベクターおよび前記重鎖をコードしている第２のベクターを含む。
【０１５６】
細菌発酵
細菌系は、抗体断片の発現に特に適している。このような断片は、細胞内またはペリプラズマ内に局在している。当業者に知られている方法に従って不溶性のペリプラズムタンパク質を抽出し、再折畳みを行って活性タンパク質を形成することができる。Ｓａｎｃｈｅｚら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７２、１３〜２０およびＣｕｐｉｔ  ＰＭら（１９９９）Ｌｅｔｔ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２９、２７３〜２７７参照。
【０１５７】
３．７  細胞培養方法
本発明の治療用抗体またはその抗原結合断片をコードしているベクターで形質転換した宿主細胞を、当業者に知られている任意の方法によって培養し得る。宿主細胞はスピナーフラスコ、ローラーボトルまたは中空繊維系で培養し得るが、大規模生産には、懸濁培養用に特に攪拌タンクの反応器を用いることが好ましい。好ましくは、攪拌タンクはたとえばスパージャー、バッフルまたは低剪断の羽根を用いた通気に適応している。気泡塔およびエアリフト反応器には、空気または酸素の気泡を用いた直接通気を用い得る。宿主細胞を無血清培養培地中で培養する場合は、通気過程の結果としての細胞損傷を防ぐために培地にプルロニックＦ−６８などの細胞保護剤を添加することが好ましい。宿主細胞の特徴に応じて、足場依存性の細胞系の増殖基質としてマイクロキャリアを用いてもよく、または細胞を懸濁培養に適応させてもよい（これは典型的である）。宿主細胞、特に無脊椎動物宿主細胞の培養では、流加培養、反復バッチ処理（Ｄｒａｐｅａｕら（１９９４）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 、１５：１０３〜１０９参照）、延長バッチ処理または灌流培養などの様々な動作モードを利用し得る。組換えによって形質転換させた哺乳動物宿主細胞は、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）などの血清を含有する培地中で培養し得るが、宿主細胞は、Ｋｅｅｎら（１９９５）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１７：１５３〜１６３に開示されているもの、または必要な場合はグルコースなどのエネルギー源および組換えインスリンなどの合成成長因子を添加したＰｒｏＣＨＯ−ＣＤＭもしくはＵｌｔｒａＣＨＯ（商標）（Ｃａｍｂｒｅｘ、米国ニュージャージー）などの市販の培地などの、血清を含まない合成培地中で培養することが好ましい。宿主細胞の無血清培養は、これらの細胞が無血清条件下で増殖することに適応していることを要する可能性がある。１つの適応手法は、このような宿主細胞を血清含有培地中で培養し、宿主細胞が無血清条件に適応することを学ぶように、培地の８０％を無血清培地用の培地で繰り返して交換することである（たとえば、Ｓｃｈａｒｆｅｎｂｅｒｇ  Ｋら（１９９５）、動物細胞技術：２１世紀に向けた開発（Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｔｈｅ  ２１ｓｔ  ｃｅｎｔｕｒｙ）（Ｂｅｕｖｅｒｙ  Ｅ．Ｃ．ら編）、ページ６１９〜６２３、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ参照）。
【０１５８】
培地中に分泌された本発明の抗体を回収し、様々な技術を用いて精製して、意図する使用に適した精製の度合を提供し得る。たとえば、ヒト患者を治療するための本発明の治療用抗体の使用は、典型的には（粗培地と比較して）少なくとも９５％の純度、より典型的には９８％もしくは９９％またはそれ以上の純度が義務づけられている。最初の例では、培養培地からの細胞細片を典型的には遠心分離を用いて除去し、次いで、たとえば微量濾過、限外濾過および／またはデプスフィルターを用いて上清の清澄化工程を行う。透析およびゲル電気泳動ならびにヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、アフィニティークロマトグラフィー（所望によりポリヒスチジンなどの親和性タグづけシステムを含む）および／または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ、ＵＳ５，４２９，７４６参照）などのクロマトグラフィー技術等の様々な他の技術が利用可能である。一実施形態では、本発明の抗体は、様々な清澄化工程ののち、タンパク質ＡまたはＧアフィニティークロマトグラフィーを用いて捕捉し、次いでイオン交換および／またはＨＡクロマトグラフィー、陰イオンもしくは陽イオン交換、サイズ排除クロマトグラフィーならびに硫酸アンモニウム沈殿などのさらなるクロマトグラフィー工程を行う。典型的には、様々なウイルス除去工程も用いる（たとえば、たとえばＤＶ−２０フィルターを用いたナノ濾過）。これらの様々な工程ののち、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ以上、たとえば１００ｍｇ／ｍｌ以上の本発明の抗体またはその抗原結合断片を含む精製した（好ましくはモノクローナル）調製物が提供され、したがって本発明の一実施形態が形成される。適切なことに、このような調製物は本発明の形態の凝集した形態を実質的に含まない。
【０１５９】
４．医薬組成物
上述の本発明の抗体の精製した調製物（特にモノクローナル調製物）は、アトピー性疾患、たとえば喘息、アレルギー性鼻炎、ＣＯＰＤなどのヒトの疾患および障害の治療に用いるために、医薬組成物中に取り込ませ得る。典型的には、このような組成物は、許容される医薬の実施において知られており指示されている、医薬上許容される担体を含む。たとえば、レミントンの医薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第１６版、（１９８０）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．参照。このような担体の例には、適切な緩衝液で５〜８の範囲のｐＨに緩衝した、生理食塩水、リンガー溶液またはデキストロース溶液などの滅菌した担体が含まれる。注射（たとえば静脈内、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内もしくは門脈内）または持続注入用の医薬組成物は、適切に、目に見える粒子状物質を含まず、０．１ｎｇ〜１００ｍｇの抗体、好ましくは５ｍｇ〜２５ｍｇの抗体を含み得る。このような医薬組成物の調製方法は当業者に周知である。一実施形態では、医薬組成物は、０．１ｎｇ〜１００ｍｇの本発明の治療用抗体を単位剤形中に、所望により使用説明書と共に含む。本発明の医薬組成物は、当業者に周知または明らかな方法に従って投与前に再構成するために、凍結乾燥（凍結乾燥）し得る。本発明の実施形態がＩｇＧ１アイソタイプを有する本発明の抗体を含む場合は、クエン酸塩（たとえばクエン酸ナトリウム）もしくはＥＤＴＡなどの銅のキレート剤またはヒスチジンを医薬組成物に加えて、このアイソタイプの抗体の銅媒介性の分解の度合を軽減させ得る。ＥＰ０６１２２５１参照。抗ｈＩＬ−１３治療は、経口、吸入、局所的（たとえば、眼内、鼻腔内、直腸、皮膚上の創傷内）に与え得る。
【０１６０】
本発明の抗体を投与するための有効な用量および治療レジームは、一般に経験的に決定され、患者の年齢、重量および健康状態ならびに治療する疾患または障害などの因子に依存する。このような因子は担当医の権限内にある。適切な用量を選択するための指針は、たとえばＳｍｉｔｈら（１９７７）ヒトの診断および治療における抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ）、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク中に見つけ得る、一般には１ｍｇ〜１０００ｍｇである。
【０１６１】
治療する疾患または障害に応じて（特に喘息）、本発明の抗体を治療上有効な量で含む医薬組成物は、有効量の、抗炎症剤（たとえば副腎皮質ステロイドまたはＮＳＡＩＤ）、抗コリン剤（特にＭ１／Ｍ２／＜３受容体拮抗剤）、β２アドレナリン受容体作用剤、抗感染剤（たとえば抗生物質、抗ウイルス剤）、抗ヒスタミン、ＰＤＥ４阻害剤などの別の医薬品と共に、同時に、個別に、または逐次的に用い得る。β２アドレナリン受容体作用剤の例には、サルメテロール、サルブタモール、フォルモテロール、サルメファモール、フェノテロール、テルブタリンが含まれる。好ましい長時間作用性β２アドレナリン受容体作用剤には、国際公開公報ＷＯ０２／６６４２２号Ａ、国際公開公報ＷＯ０２／２７０４９０号、国際公開公報ＷＯ０２／０７６９３３号、国際公開公報ＷＯ０３／０２４４３９号および国際公開公報ＷＯ０３／０７２５３９号に記載のものが含まれる。適切な副腎皮質ステロイドには、メチルプレドニソロン、プレドニソロン、デキサメタゾン、プロピオン酸フルチカゾン、６α，９α−ジフルオロ−１７α−［（２−フラニルカルボニル）オキシ］−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソ−アンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステル、６α，９α−ジフルオロ−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソ−１７α−プロピオニルオキシ−アンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−（２−オキソ−テトラヒドロ−フラン−３Ｓ−イル）エステル、ベクロメタゾンエステル（たとえば１７−プロピオン酸エステルまたは１７，２１−ジプロピオン酸エステル）、ブデソニド、フルニソリド、モメタゾンエステル（たとえばフロ酸エステル）、トリアムシノロンアセトニド、ロフレポニド（ｒｏｆｌｅｐｏｎｉｄｅ）、シクレソニド（１６α，１７−［［（Ｒ）−シクロヘキシルメチレン］ビス（オキシ）］−１１β，２１−ジヒドロキシ−プレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン）、プロピオン酸ブチキソコート（ｂｕｔｉｘｏｃｏｒｔ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、ＲＰＲ−１０６５４１、およびＳＴ−１２６が含まれる。好ましい副腎皮質ステロイドには、プロピオン酸フルチカゾン、６α，９α−ジフルオロ−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−１７α−［（４−メチル−１，３−チアゾール−５−カルボニル）オキシ］−３−オキソ−アンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステルおよび６α，９α−ジフルオロ−１７α−［（２−フラニルカルボニル）オキシ］−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソ−アンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステル、より好ましくは６α，９α−ジフルオロ−１７α−［（２−フラニルカルボニル）オキシ］−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソ−アンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステルが含まれる。
【０１６２】
転写活性化よりも転写抑制に対して選択性を有し得、組合せ療法において有用であり得る糖質コルチコイド作用性を有する非ステロイド化合物には、以下の特許に包含されるものが含まれる：国際公開公報ＷＯ０３／０８２８２７号、国際公開公報ＷＯ０１／１０１４３号、国際公開公報ＷＯ９８／５４１５９号、国際公開公報ＷＯ０４／００５２２９号、国際公開公報ＷＯ０４／００９０１６号、国際公開公報ＷＯ０４／００９０１７号、国際公開公報ＷＯ０４／０１８４２９号、国際公開公報ＷＯ０３／１０４１９５号、国際公開公報ＷＯ０３／０８２７８７号、国際公開公報ＷＯ０３／０８２２８０号、国際公開公報ＷＯ０３／０５９８９９号、国際公開公報ＷＯ０３／１０１９３２号、国際公開公報ＷＯ０２／０２５６５号、国際公開公報ＷＯ０１／１６１２８号、国際公開公報ＷＯ００／６６５９０号、国際公開公報ＷＯ０３／０８６２９４号、国際公開公報ＷＯ０４／０２６２４８号、国際公開公報ＷＯ０３／０６１６５１号、国際公開公報ＷＯ０３／０８２７７号。
【０１６３】
適切な抗炎症剤には、非ステロイド抗炎症性薬（ＮＳＡＩＤ）が含まれる。
【０１６４】
適切なＮＳＡＩＤには、クロモグリク酸ナトリウム、ネドクロミルナトリウム、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤（たとえばテオフィリン、ＰＤＥ４阻害剤またはＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤混合物）、ロイコトリエン拮抗剤、ロイコトリエン合成の阻害剤（たとえばモンテルカスト）、ｉＮＯＳ阻害剤、トリプターゼおよびエラスターゼ阻害剤、β−２インテグリン拮抗剤およびアデノシン受容体作用剤もしくは拮抗剤（たとえばアデノシン２ａ作用剤）、サイトカイン拮抗剤（たとえばＣＣＲ３拮抗剤などのケモカイン拮抗剤）もしくはサイトカイン合成の阻害剤、または５−リポキシゲナーセ阻害剤が含まれる。適切な他のβ２−アドレナリン受容体作用剤には、サルメテロール（たとえばキシナホ酸塩として）、サルブタモール（たとえば硫酸塩または遊離塩基として）、フォルモテロール（たとえばフマル酸塩として）、フェノテロールまたはテルブタリンおよびその塩が含まれる。ｉＮＯＳ（誘導型一酸化窒素合成酵素阻害剤）は経口投与用であることが好ましい。適切なｉＮＯＳ阻害剤には、国際公開公報ＷＯ９３／１３０５５号、国際公開公報ＷＯ９８／３０５３７号、国際公開公報ＷＯ０２／５００２１号、国際公開公報ＷＯ９５／３４５３４号および国際公開公報ＷＯ９９／６２８７５号に開示されているものが含まれる。適切なＣＣＲ３阻害剤には、国際公開公報ＷＯ０２／２６７２２号に開示されているものが含まれる。
【０１６５】
特に興味深いのは、ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤と組み合わせた本発明の抗体の使用である。本発明のこの態様に有用なＰＤＥ４に特異的な阻害剤は、ＰＤＥ４酵素を阻害することが知られている、またはＰＤＥ４阻害剤として作用することが判明している任意の化合物であって、ＰＤＥ４のみの阻害剤であり、ＰＤＥ４と共にＰＤＥ３およびＰＤＥ５などのＰＤＥファミリーの他のメンバーを阻害する化合物ではない化合物であり得る。
【０１６６】
目的化合物には、シス−４−シアノ−４−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシフェニル）シクロヘキサン−１−カルボン酸、２−カルボメトキシ−４−シアノ−４−（３−シクロプロピルメトキシ−４−ジフルオロメトキシフェニル）シクロヘキサン−１−オンおよびシス−［４−シアノ−４−（３−シクロプロピルメトキシ−４−ジフルオロメトキシフェニル）シクロヘキサン−１−オール］が含まれる。また、１９９６年９月０３日発行の米国特許第５，５５２，４３８号に記載のシス−４−シアノ−４−［３−（シクロペンチルオキシ）−４−メトキシフェニル］シクロヘキサン−１−カルボン酸（シロミラストとしても知られる）およびその塩、エステル、プロドラッグまたは物理的形態；この特許および開示される化合物は、全体で参考として本明細書中に組み込まれる。
【０１６７】
ＥｌｂｉｏｎのＡＷＤ−１２−２８１（Ｈｏｆｇｅｎ，Ｎ．ら、１５ｔｈ  ＥＦＭＣ  Ｉｎｔ  Ｓｙｍｐ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ（９月６〜１０日、エジンバラ）１９９８、要旨集ページ９８；ＣＡＳ参照番号２４７５８４０２０−９）；ＮＣＳ−６１３と命名された９−ベンジルアデニン誘導体（ＩＮＳＥＲＭ）；ＣｈｉｒｏｓｃｉｅｎｃｅおよびＳｃｈｅｒｉｎｇ−ＰｌｏｕｇｈのＤ−４４１８；ＣＩ−１０１８として同定された、Ｐｆｉｚｅｒに帰属するベンゾジアゼピンＰＤＥ４阻害剤（ＰＤ−１６８７８７）；国際公開公報ＷＯ９９／１６７６６号にＫｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏによって開示されているベンゾジオキソール誘導体；Ｋｙｏｗａ  ＨａｋｋｏのＫ−３４；ＮａｐｐのＶ−１１２９４Ａ（Ｌａｎｄｅｌｌｓ，Ｌ．Ｊ．ら、Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐ  Ｊ、［Ａｎｎｕ  Ｃｏｎｇ  Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐ  Ｓｏｃ（９月１９〜２３日、ジュネーブ）１９９８］ １９９８、１２（補遺２８）：要旨集ページ２３９３）；Ｂｙｋ−Ｇｕｌｄｅｎのロフルミラスト（ＣＡＳ参照番号１６２４０１−３２−３）およびフタルアジノン（その開示が本明細書中に参考として組み込まれている国際公開公報ＷＯ９９／４７５０５号）；Ｂｙｋ−Ｇｕｌｄｅｎ、現在はＡｌｔａｎａによって調製および公開されているＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤混合物である、プマフェントリン（Ｐｕｍａｆｅｎｔｒｉｎｅ）、（−）−ｐ−［（４ａＲ＊，１０ｂＳ＊）−９−エトキシ−１，２，３，４，４ａ，１０ｂ−ヘキサヒドロ−８−メトキシ−２−メチルベンゾ［ｃ］［１，６］ナフチリジン−６−イル］−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルベンズアミド；Ａｌｍｉｒａｌｌ−Ｐｒｏｄｅｓｆａｒｍａにより開発中のアロフィリン（ａｒｏｆｙｌｌｉｎｅ）；ＶｅｒｎａｌｉｓのＶＭ５５４／ＵＭ５６５；またはＴ−４４０（Ｔａｎａｂｅ  Ｓｅｉｙａｋｕ；Ｆｕｊｉ，Ｋ．ら、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ、１９９８、２８４（１）：１６２）、ならびにＴ２５８５。
【０１６８】
さらなる目的化合物は、公開国際特許出願の国際公開公報ＷＯ０４／０２４７２８号（Ｇｌａｘｏ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ）、ＰＣＴ／ＥＰ２００３／０１４８６７号（Ｇｌａｘｏ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ）およびＰＣＴ／ＥＰ２００４／００５４９４号（Ｇｌａｘｏ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ）に開示されている。
【０１６９】
適切な抗コリン剤は、ムスカリン受容体の位置で拮抗剤として作用する化合物、具体的にはＭ１またはＭ３受容体の拮抗剤である化合物、Ｍ１／Ｍ３またはＭ２／Ｍ３の二重拮抗剤、Ｍ１／Ｍ２／Ｍ３受容体の受容体または汎用拮抗剤である。吸入によって投与する例示的な化合物には、イプラトロピウム（たとえば臭化物として、ＣＡＳ２２２５４−２４−６、商品名Ａｔｒｏｖｅｎｔの下で販売）、オキシトロピウム（たとえば臭化物として、ＣＡＳ３０２８６−７５−０）およびチオトロピウム（たとえば臭化物として、ＣＡＳ１３６３１０−９３−５、商品名Ｓｐｉｒｉｖａの下で販売）が含まれる。また、レバトロパン酸（たとえば臭化水素酸塩として、ＣＡＳ２６２５８６−７９−８）および国際公開公報ＷＯ０１／０４１１８号に開示されているＬＡＳ−３４２７３も興味が持たれている。経口投与用の例示的な化合物には、ピレンゼピン（ＣＡＳ２８７９７−６１−７）、ダリフェナシン（ＣＡＳ１３３０９９−０４−４、または臭化水素酸塩ではＣＡＳ１３３０９９−０７−７、商品名Ｅｎａｂｌｅｘの下で販売）、オキシブチニン（ＣＡＳ５６３３−２０−５、商品名Ｄｉｔｒｏｐａｎの下で販売）、テロジリン（ＣＡＳ１５７９３−４０−５）、トルテロジン（ＣＡＳ１２４９３７−５１−５、または酒石酸塩ではＣＡＳ１２４９３７−５２−６、商品名Ｄｅｔｒｏｌの下で販売）、オチロニウム（たとえば臭化物として、ＣＡＳ２６０９５−５９−０、商品名Ｓｐａｓｍｏｍｅｎの下で販売）、塩化トロスピウム（ＣＡＳ１０４０５−０２−４）およびソリフェナシン（ＣＡＳ２４２４７８−３７−１、またはコハク酸塩ではＣＡＳ２４２４７８−３８−２、ＹＭ−９０５としても知られ、商品名Ｖｅｓｉｃａｒｅの下で販売）が含まれる。
【０１７０】
他の適切な抗コリン剤には、米国特許出願第６０／４８７９８１号に開示されている式（ＸＸＩ）の化合物が含まれる：
【０１７１】
【化１】
2008511542.tif 000003
【０１７２】
［式中、トロパン環に付着したアルキル鎖の好ましい配向は内向きであり；
Ｒ３１およびＲ３２は、独立して、好ましくは１〜６個の炭素原子を有する直鎖状または分枝鎖状低級アルキル基、５〜６個の炭素原子を有するシクロアルキル基、６〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキル−アルキル、４個の炭素原子を超えないアルキル基で置換された２−チエニル、２−ピリジル、フェニル、４個の炭素原子を超えないアルキル基で置換されたフェニル、および４個の炭素原子を超えないアルコキシ基で置換されたフェニルからなる群から選択され；
Ｘ−は、Ｎ原子の陽性電荷に関連する陰イオンを表す。
Ｘ−は、それだけには限定されないが、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸、ベンゼンスルホン酸、およびトルエンスルホン酸であってよく、
たとえば以下のものが含まれる：
（３−ｅｎｄｏ）−３−（２，２−ジ−２−チエニルエテニル）−８，８−ジメチル−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタンブロミド；
（３−ｅｎｄｏ）−３−（２，２−ジフェニルエテニル）−８，８−ジメチル−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタンブロマイド；
（３−ｅｎｄｏ）−３−（２，２−ジフェニルエテニル）−８，８−ジメチル−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタン４−メチルベンゼンスルホネート；
（３−ｅｎｄｏ）−８，８−ジメチル−３−［２−フェニル−２−（２−チエニル）エテニル］−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタンブロマイド；および／または
（３−ｅｎｄｏ）−８，８−ジメチル−３−［２−フェニル−２−（２−ピリジニル）エテニル］−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタンブロマイド。］。
【０１７３】
さらなる適切な抗コリン剤には、米国特許出願第６０／５１１００９号に開示されている式（ＸＸＩＩ）または（ＸＸＩＩＩ）の化合物が含まれる：
【０１７４】
【化２】
2008511542.tif 000004
【０１７５】
［式中、
示したＨ原子は外部位置にあり；
Ｒ４１−Ｎ原子の陽性電荷に関連する陰イオンを表す。
Ｒ１−は、それだけには限定されないが塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸、ベンゼンスルホン酸およびトルエンスルホン酸であってよく；
Ｒ４２およびＲ４３は、独立して、直鎖状または分枝鎖状低級アルキル基（好ましくは１〜６個の炭素原子を有する）、シクロアルキル基（５〜６個の炭素原子を有する）、シクロアルキル−アルキル（６〜１０個の炭素原子を有する）、ヘテロシクロアルキル（５〜６個の炭素原子を有する）および異種原子としてＮまたはＯ、ヘテロシクロアルキル−アルキル（６〜１０個の炭素原子を有する）および異種原子としてＮまたはＯ、アリール、所望により置換されたアリール、ヘテロアリール、ならびに所望により置換されたヘテロアリールからなる群から選択され；
Ｒ４４は、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ１２）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ７）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（Ｃ３〜Ｃ１２）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（Ｃ３〜Ｃ７）ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−アリール、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−ヘテロアリール、−ＯＲ４５、−ＣＨ２ＯＲ４５、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＣＨ２Ｏ（ＣＯ）Ｒ４６、−ＣＯ２Ｒ４７、−ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ４７）ＳＯ２Ｒ４５、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ４７）（Ｒ４８）、−ＣＯＮ（Ｒ４７）（Ｒ４８）、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ４８）ＣＯ（Ｒ４６）、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ４８）ＳＯ２（Ｒ４６）、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ４８）ＣＯ２（Ｒ４５）、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ４８）ＣＯＮＨ（Ｒ４７）からなる群から選択され；
Ｒ４５は、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（Ｃ３〜Ｃ１２）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（Ｃ３〜Ｃ７）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−アリール、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−ヘテロアリールからなる群から選択され；
Ｒ４６は、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ１２）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ７）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（Ｃ３〜Ｃ１２）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（Ｃ３〜Ｃ７）ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−アリール、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−ヘテロアリールからなる群から選択され；
Ｒ４７およびＲ４８は、独立して、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ１２）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ７）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（Ｃ３〜Ｃ１２）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（Ｃ３〜Ｃ７）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−アリール、および（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−ヘテロアリールからなる群から選択され、たとえば以下のものが含まれる：
（Ｅｎｄｏ）−３−（２−メトキシ−２，２−ジ−チオフェン−２−イル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタンヨージド；
３−（（Ｅｎｄｏ）−８−メチル−８−アザビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピオニトリル；
（Ｅｎｄｏ）−８−メチル−３−（２，２，２−トリフェニル−エチル）−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクタン；
３−（（Ｅｎｄｏ）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピオンアミド；
３−（（Ｅｎｄｏ）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピオン酸；
（Ｅｎｄｏ）−３−（２−シアノ−２，２−ジフェニル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタンヨージド；
（Ｅｎｄｏ）−３−（２−シアノ−２，２−ジフェニル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタンブロマイド；
３−（（Ｅｎｄｏ）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロパン−１−オール；
Ｎ−ベンジル−３−（（ｅｎｄｏ）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピオンアミド；
（Ｅｎｄｏ）−３−（２−カルバモイル−２，２−ジフェニル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタンヨージド；
１−ベンジル−３−［３−（（ｅｎｄｏ）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピル］−尿素；
１−エチル−３−［３−（（ｅｎｄｏ）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピル］−尿素；
Ｎ−［３−（（Ｅｎｄｏ）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピル］−アセトアミド；
Ｎ−［３−（（Ｅｎｄｏ）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピル］−ベンズアミド；
３−（（Ｅｎｄｏ）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジ−チオフェン−２−イル−プロピオニトリル；
（Ｅｎｄｏ）−３−（２−シアノ−２，２−ジ−チオフェン−２−イル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタンヨージド；
Ｎ−［３−（（Ｅｎｄｏ）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピル］−ベンゼンスルホンアミド；
［３−（（Ｅｎｄｏ）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピル］−尿素；
Ｎ−［３−（（Ｅｎｄｏ）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピル］−メタンスルホンアミド；および／または
（Ｅｎｄｏ）−３−｛２，２−ジフェニル−３−［（１−フェニル−メタノイル）−アミノ］−プロピル｝−８，８−ジメチル−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタンブロマイド。］。
【０１７６】
本発明に有用なより好ましい化合物には、
（Ｅｎｄｏ）−３−（２−メトキシ−２，２−ジ−チオフェン−２−イル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタンヨージド；
（Ｅｎｄｏ）−３−（２−シアノ−２，２−ジフェニル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタンヨージド；
（Ｅｎｄｏ）−３−（２−シアノ−２，２−ジフェニル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタンブロマイド；
（Ｅｎｄｏ）−３−（２−カルバモイル−２，２−ジフェニル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタンヨージド；
（Ｅｎｄｏ）−３−（２−シアノ−２，２−ジ−チオフェン−２−イル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタンヨージド；および／または
（Ｅｎｄｏ）−３−｛２，２−ジフェニル−３−［（１−フェニル−メタノイル）−アミノ］−プロピル｝−８，８−ジメチル−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタンブロマイド
が含まれる。
【０１７７】
適切な抗ヒスタミン（Ｈ１−受容体拮抗剤とも呼ばれる）には、Ｈ１−受容体を阻害し、ヒトでの使用が安全である、数々の既知の拮抗剤の任意の１つまたは複数が含まれる。第一世代拮抗剤には、エタノールアミン、エチレンジアミン、およびアルキルアミンの誘導体、たとえばジフェニルヒドラミン、ピリラミン、クレマスチン、クロロフェニラミンが含まれる。非鎮痛性である第二世代拮抗剤には、ロラチジン、デスロラチジン（ｄｅｓｌｏｒａｔｉｄｉｎｅ）、テルフェナジン、アステミゾール、アクリバスチン、アゼラスチン、レボセチリジン、フェキソフェナジンおよびセチリジンが含まれる。
【０１７８】
好ましい抗ヒスタミンの例には、ロラチジン、デスロラチジン、フェキソフェナジンおよびセチリジンが含まれる。
【０１７９】
意図される他の組合せには、抗ＩＬ−４剤（たとえばパソコリズマブ（ｐａｓｃｏｌｉｚｕｍａｂ）などの抗ＩＬ−４抗体）および／または抗ＩＬ−５剤（たとえばメポリズマブなどの抗ＩＬ−５抗体）および／または抗ＩｇＥ剤（オマリズマブ（Ｘｏｌａｉｒ（商標））もしくはタリズマブなどのたとえば抗ＩｇＥ抗体）と組み合わせた本発明の抗体の使用が含まれる。
【０１８０】
便利なことに、本発明の抗体またはその抗原結合断片の一部分のキットを、このような別の医薬品、および所望により使用説明書と共に含む医薬組成物も、本発明によって意図される。
【０１８１】
本発明はさらに、ｈＩＬ−１３とｈＩＬ−１３Ｒとの相互作用の変調に対して応答性を有する疾患の治療で用いるための本明細書中に記載したモノクローナル治療用抗体またはその抗原結合断片を治療上有効な量で含む医薬組成物を意図する。
【０１８２】
本発明によれば、配列番号１１、１２、１３、１４からなる群から選択されたＶＨドメインおよび配列番号１５、１６からなる群から選択されたＶＬドメインを含むモノクローナルヒト化治療用抗体を治療上有効な量で含む医薬組成物を提供する。
【０１８３】
本発明によれば、配列番号１８、１９、２０、２１からなる群から選択された重鎖および配列番号２２、２３からなる群から選択された軽鎖を含むモノクローナル治療用抗体を含む医薬組成物を提供する。
【０１８４】
本発明によれば、配列番号１８の重鎖および配列番号２２の軽鎖ならびに医薬上許容される担体を含むモノクローナル治療用抗体を含む医薬組成物を提供する。
【０１８５】
本発明によれば、配列番号１８の重鎖および配列番号２２の軽鎖ならびに医薬上許容される担体を含む（またはそれから本質的になる）モノクローナル抗体を含む医薬組成物を提供する。
【０１８６】
本発明によれば、医薬上許容される担体ならびに配列番号１８の重鎖および配列番号２２の軽鎖を含む治療用抗体のモノクローナル集団を治療上有効な量で含む医薬組成物を提供する。
【０１８７】
５．臨床的使用
本発明の抗体は、アトピー性疾患／障害および慢性炎症性疾患／障害の治療に使用し得る。特に興味深いのは、アレルギー性喘息、特に重篤な喘息（すなわち副腎皮質ステロイドの全身投与を含めた現在の治療に無応答の喘息；Ｂｕｓｓｅ  ＷＷら、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０００、１０６：１０３３〜１０４２参照）、「困難な」喘息（処方された吸入ステロイドの最大推奨用量にもかかわらず制御の達成に至らないことによって特徴づけられる喘息の表現型として定義される、Ｂａｒｎｅｓ  ＰＪ（１９９８）、Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ、１２：１２０８〜１２１８）、「もろい」喘息（高用量の吸入ステロイドにもかかわらず広い最大呼気流量（ＰＥＦ）の変動を維持している、重篤かつ不安定喘息に罹患している患者のサブグループを定義する、Ａｙｒｅｓ  ＪＧら（１９９８）Ｔｈｏｒａｘ、５８：３１５〜３２１参照）、夜間喘息、月経前喘息、ステロイド耐性喘息（Ｗｏｏｄｃｏｃｋ  ＡＪ（１９９３）Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ、６：７４３〜７４７参照）、ステロイド依存性喘息（高用量の経口ステロイドでのみ制御することができる喘息と定義される）、アスピリン誘導性喘息、成人発症喘息、小児喘息などの喘息の治療におけるその使用である。本発明の抗体は、急性の喘息の発症（喘息状態）を予防する、その頻度を減らす、またはその影響を緩和させるために用い得る。また、本発明の抗体は、喘息の治療に用いられる他の医薬品の必要な投薬を減らすため（投与量または投薬頻度のいずれに関しても）にも用い得る。たとえば、本発明の抗体は、副腎皮質ステロイド治療などの喘息のステロイド治療に必要な投薬を減らすために用い得る（「ステロイド節約」）。本発明の抗体を用いて治療し得る他の疾患または障害には、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、クローン病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、好酸球性食道炎、特発性肺線維症などの線維性疾患または障害、進行性全身性硬化症（強皮症）、肝線維症、肝肉芽腫、住血吸虫症、リーシュマニア症、および細胞周期調節疾患、たとえばホジキン病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病が含まれる。本発明の抗体を用いて治療し得るさらなる疾患または障害は、上記の背景技術セクションに詳述されている。
【０１８８】
本発明の一実施形態では、副腎皮質ステロイドを用いた治療に不応性である喘息状態に冒されたヒト患者の治療方法であって、前記患者に治療上有効な量の本発明の抗体を投与する工程を含む方法を提供する。
【０１８９】
別の実施形態では、患者に治療上有効な量の本発明の抗体を投与する工程を含む、ヒト患者において急性の喘息発作を予防する方法を提供する。
【０１９０】
別の実施形態では、患者に治療上有効な量の本発明の抗体を投与する工程を含む、ヒト患者において急性の喘息発作の頻度を軽減させるおよび／またはその影響を緩和させる方法を提供する。
【０１９１】
本発明の別の実施形態では、患者に治療上有効な量の本発明の抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、ヒト患者において炎症性および／またはアレルギー性傷害のあとにＴヘルパー細胞の応答をＴｈ１型の応答に偏らせる方法を提供する。
【０１９２】
本発明の別の実施形態では、Ｑ１３０ｈＩＬ−１３変異体を有する、重篤な喘息などの喘息に冒されているヒト患者を治療する方法であって、前記患者に治療上有効な量の本発明の抗体またはその抗原結合断片を投与する工程を含む方法を提供する。
【０１９３】
本発明を主にヒトの疾患または障害の治療に関して記述したが、本発明は非ヒト哺乳動物の類似した疾患または障害の治療においても用途を有し得る。
【０１９４】
以降、本発明を例のみとして記載する。
【実施例】
【０１９５】
１．モノクローナル抗体の産生およびマウスモノクローナル抗体６Ａ１の特徴づけ
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、一般にＥ  ＨａｒｌｏｗおよびＤ  Ｌａｎｅ、抗体  実験室の手引き（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８に記載の方法に従って、ハイブリドーマ細胞によって産生される。マウス骨髄腫細胞と標的抗原で免疫化したマウス由来のＢリンパ球との融合の結果。ハイブリドーマ細胞は骨髄腫融合パートナーによって不死化される一方で、抗体を産生する能力がＢリンパ球によって提供される。
【０１９６】
それぞれ２μｇの大腸菌由来の組換えヒトＩＬ−１３（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号ＣＨ−０１３）に腹腔内注射を行うことによって、５匹のＳＪＬマウスの免疫化を行った。マウスにおいて高力価の抗ヒトＩＬ−１３抗体免疫応答を発生させるために免疫化計画を用いた。６４日間にわたる５回の免疫化ののち、マウスを選り抜き、脾臓細胞を収穫した。３匹のマウスの脾臓細胞を取り出し、ＰＥＧ１５００（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用いてＢリンパ球をＰ３Ｘ細胞由来のマウス骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを作製した。限界希釈によって個々のハイブリドーマ細胞系のクローニングを行った（Ｅ  ＨａｒｌｏｗおよびＤ  Ｌａｎｅ、上記）。単一のコロニーを含むウェルを顕微鏡で同定し、上清を活性について試験した。最も活性のあるクローンからの細胞を、冷凍保存、抗体産生などのために拡張した。
【０１９７】
最初に、ハイブリドーマの上清を、大腸菌で発現させた、組換えｄｅｔ−１でタグ付けしたヒトＩＬ−１３タンパク質（所内で作製）に対する結合活性について、サンドイッチアッセイ様式でスクリーニングを行った。これらの陽性物の二次スクリーニングは、ｄｅｔ−１でタグ付けしたヒトＩＬ−１３タンパク質に対する結合を検出するためのＢＩＡｃｏｒｅ（商標）方法を用いて完了した。その後、これらのハイブリドーマからの試料を、大腸菌で発現させた組換えヒトＩＬ−１３（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号ＣＨ−０１３）の生物活性を中和する能力について、ＴＦ−１細胞バイオアッセイで試験した。
【０１９８】
ヒトＩＬ−１３中和バイオアッセイから同定された６つの陽性を限界希釈によってローニングして、安定したモノクローナル細胞系を作製した。無血清条件下で細胞工場において増殖させたこれらのハイブリドーマからの免疫グロブリンを、固定タンパク質Ａカラムを用いて精製した。その後、以下のアッセイ系でこれらの精製したｍＡｂの再スクリーニングを行った；
【０１９９】
−大腸菌で発現させた組換えヒトＩＬ−１３への結合（サンドイッチＥＬＩＳＡ様式で）
−大腸菌で発現させた、組換えｄｅｔ−１でタグ付けしたヒトＩＬ−１３の、両方のＩＬ−１３受容体鎖への結合の阻害（サンドイッチＥＬＩＳＡ様式で）
−大腸菌で発現させたヒトまたはカニクイザルの組換えＩＬ−１３の中和（ＴＦ−１細胞バイオアッセイで）
−哺乳動物で発現させたヒトＩＬ−１３の中和（ＴＦ−１細胞バイオアッセイで）
−大腸菌で発現させた組換えＱ１３０ヒトＩＬ−１３変異体の中和（ＴＦ−１細胞バイオアッセイで）
−抗ＩＬ−４ＥＬＩＳＡにおけるヒトＩＬ−４に対するｍＡｂ交差反応性の評価、およびＩＬ５中和バイオアッセイにおけるヒトＩＬ５に対するｍＡｂ交差反応性の評価による、ヒトＩＬ−１３への結合の特異性
−ヒトＩＬ−１３に対する結合親和性測定値のＢＩＡｃｏｒｅ（商標）解析
【０２００】
モノクローナル抗体６Ａ１は、ヒトおよびカニクイザルＩＬ−１３の生物活性をどちらも中和する抗体として同定された。以下の解析は、これらのアッセイにおけるモノクローナル抗体６Ａ１のプロフィールを記載している。
【０２０１】
１．１  大腸菌で発現させた組換えヒトＩＬ−１３への結合
６Ａ１はサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて大腸菌で発現させた組換えヒトＩＬ−１３を結合し、方法は実質的にセクション７に記載したとおりである。図１参照。
【０２０２】
１．２  ＥＬＩＳＡ様式での、大腸菌で発現させた、組換えｄｅｔ−１でタグ付けしたヒトＩＬ−１３の、ＩＬ−１３Ｒα１およびＩＬ−１３Ｒα２に対する結合の阻害
６Ａ１は、大腸菌で発現させた、組換えｄｅｔ−１でタグ付けしたヒトＩＬ−１３の、両方のヒトＩＬ−１３受容体鎖への結合を阻害した。さらに、これは市販の抗ヒトＩＬ−１３ポリクローナルおよび抗ヒトＩＬ−１３モノクローナル抗体試薬（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから供給）よりも有効に結合を阻害した。モノクローナル抗体６Ａ１による、ヒトＩＬ−１３Ｒα１に対するヒトＩＬ−１３の結合の阻害について、０．１６５μｇ／ｍｌのＩＣ５０値が計算された。モノクローナル抗体６Ａ１による、ヒトＩＬ−１３Ｒα２に対するヒトＩＬ−１３の結合の阻害について、０．０５６μｇ／ｍｌのＩＣ５０値が計算された。図２Ａおよび２Ｂ参照。無関係の特異性の対照ＩｇＧは、検出可能な活性を有さなかった。
【０２０３】
１．３  ＴＦ−１細胞増殖バイオアッセイにおける、大腸菌で発現させた組換えヒトおよびカニクイザルＩＬ−１３の中和
ＴＦ−１細胞は、ヒトＩＬ−１３およびカニクイザルＩＬ−１３に応答して増殖することができる。ヒトおよびカニクイザルＩＬ−１３誘発性のＴＦ−１細胞増殖に対する抗ＩＬ−１３ｍＡｂの中和能を評価するためにバイオアッセイを開発した。６Ａ１は、ＴＦ−１細胞バイオアッセイにおいて組換えヒトおよびカニクイザルＩＬ−１３のどちらの生物活性も中和した。さらに、これは市販の抗ヒトＩＬ−１３ポリクローナルおよび抗ヒトＩＬ−１３モノクローナル抗体試薬（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから供給）よりも強力に、ヒトおよびカニクイザルＩＬ−１３をどちらも中和した。図３参照。
【０２０４】
モノクローナル抗体６Ａ１によるＴＦ−１細胞バイオアッセイにおいて、５ｎｇ／ｍｌの大腸菌で発現させた組換えヒトＩＬ−１３の生物活性の中和について０．０７８３μｇ／ｍｌの平均ＮＤ５０値が計算された。モノクローナル抗体６Ａ１によるＴＦ−１細胞バイオアッセイにおいて、５ｎｇ／ｍｌの大腸菌で発現させた組換えカニクイザルＩＬ−１３の生物活性の中和について０．０４μｇ／ｍｌのＮＤ５０値が計算された。［ＮＤ５０（中和用量）値とは、一定濃度のＩＬ−１３に応答してＴＦ−１細胞増殖を５０％減少させるために必要なモノクローナル抗体の濃度である］。
【０２０５】
１．４  ＴＦ−１細胞増殖バイオアッセイにおける哺乳動物で発現させた（ＣＨＯ細胞）ヒトＩＬ−１３の中和
ＣＨＯ細胞から発現させたヒトＩＬ−１３に対するモノクローナル抗体６Ａ１の中和能をＴＦ−１細胞増殖アッセイで評価した。ＮＤ５０値によって測定すると、６Ａ１は、哺乳動物で発現させたヒトＩＬ−１３を、市販の抗ヒトＩＬ−１３ポリクローナル試薬よりも強力に中和した。モノクローナル抗体６Ａ１によるＴＦ−１細胞バイオアッセイにおいて、〜５０ｎｇ／ｍｌの哺乳動物で発現させたヒトＩＬ−１３の中和について０．０３７μｇ／ｍｌのＮＤ５０値が計算された。図４参照。
【０２０６】
１．５  ＴＦ−１細胞増殖バイオアッセイにおける組換えＱ１３０ヒトＩＬ−１３変異体の中和
大腸菌で発現させた組換えＱ１３０ヒトＩＬ−１３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００−１３Ａ）に対するモノクローナル抗体６Ａ１の中和能をＴＦ−１細胞増殖アッセイで評価した。６Ａ１は、Ｑ１３０ヒトＩＬ−１３を、市販の抗ヒトＩＬ−１３ポリクローナル試薬よりも強力に中和した。モノクローナル抗体６Ａ１によるＴＦ−１細胞バイオアッセイにおいて、６０ｎｇ／ｍｌのＱ１３０ヒトＩＬ−１３の生物活性について０．１１μｇ／ｍｌのＮＤ５０値が計算された。図５参照。
【０２０７】
１．６  ヒトＩＬ−１３への結合に対する特異性
ヒトＩＬ−４は構造的にも機能的にもヒトＩＬ−１３と最も同一性を共有しているので、ヒトＩＬ−１３に対するモノクローナル抗体６Ａ１の特異性をヒトＩＬ−４結合ＥＬＩＳＡで評価した。６Ａ１は大腸菌で発現させた組換えヒトＩＬ−４と検出可能に結合せず、これは、ヒトＩＬ−１３に対するこのモノクローナル抗体の高レベルの特異性を示している。さらに、６Ａ１は、ＴＦ−１細胞バイオアッセイにおいて大腸菌で発現させた組換えヒトＩＬ５の生物活性を検出可能に交差中和しなかった。図６および７参照。
【０２０８】
１．７  ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）解析
組換えヒトおよびカニクイザルＩＬ−１３に対する６Ａ１の親和性をＢＩＡｃｏｒｅ（商標）解析によって評価した。表１参照。
【０２０９】
【表２】
2008511542.tif 000005
【０２１０】
これらのデータは、６Ａ１がヒトおよびカニクイザルＩＬ−１３のどちらに対しても親和性を有することを示している。［２つの異なるヒトＩＬ−１３試料（どちらも大腸菌で産生）をこの解析に用いた。ＩＬ−１３は大腸菌内で産生させた場合に実質的に不溶性であるが、溶解させ、その後ｉｎ  ｖｉｔｒｏで再折畳みを行うことができる。２つの再折畳みを行ったＩＬ−１３試料の品質の差により、これらのヒトＩＬ−１３試料のそれぞれの結合親和性の差が説明され得る］。
【０２１１】
２．クローン６Ａ１の可変領域のクローニング
全ＲＮＡをクローン６Ａ１ハイブリドーマ細胞から抽出し、ネズミリーダー配列および事前に決定したアイソタイプ（ＩｇＧ１／κ）に従った抗体定常領域に特異的なプライマーを使用した逆転写によって、重ならびに軽可変ドメインのｃＤＮＡを作製した。その後、配列決定のために可変重および軽ドメインのｃＤＮＡをベクターｐＣＲ２．１内にクローニングした。
【０２１２】
２．１  ＲＮＡ抽出
ＰｒｏｍｅｇａのＳＶ全ＲＮＡ単離システムを用いて、製造者の指示に従って、ハイブリドーマクローン６Ａ１の約１０６個の細胞のペレットから、全ＲＮＡを抽出した。
【０２１３】
２．２  逆転写
ネズミリーダー配列およびネズミＩｇＧ１／κ定常領域に特異的なプライマーを使用して、ＲＮＡを逆転写して可変重および軽ドメインのｃＤＮＡを作製した。用いたプライマー混合物は、Ｊｏｎｅｓ  ＳＴおよびＢｅｎｄｉｇ  ＭＭ、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：８８〜８９（１９９１）に記載されている。
【０２１４】
ネズミＶＨおよびＶＬリーダー配列順方向プライマーのプールを５０μＭで調製した。ネズミＩｇＧ１およびκ定常領域逆方向プライマーの溶液も５０μＭで調製した。
【０２１５】
２．３  逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
可変重および軽領域をコードしているＲＮＡの逆転写は、ＰｒｏｍｅｇａのＡｃｃｅｓｓ  ＲＴ−ＰＣＲシステムを用いて、製造者の指示に従って、２つ組で実施した。ＶＨおよびＶＬ順方向および逆方向プライマーは上述のとおりである。
【０２１６】
２．４  ＲＴ−ＰＣＲ産物のゲル精製
ＲＴ−ＰＣＲ（２×ＶＨおよび２×ＶＬ）の産物を、ゲルローディング溶液中で０．０１％臭化エチジウムを含む調製用１％アガロースゲルに載せ、ＴＡＥ緩衝液中で１００Ｖ、１時間流し、Ｖ領域のバンドを切除した。ＶＨおよびＶＬバンドの同定を可能にするために、１００ｂｐ  ＤＮＡラダーもゲル上に流した。
【０２１７】
ＱｉａｇｅｎのＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ゲル抽出キットを用いて、製造者の指示に従って、ＤＮＡ断片をゲルから抽出および精製した。
【０２１８】
２．５  ライゲーション
ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＴＡクローニングキットを用いて、製造者の指示に従って、精製したＲＴ−ＰＣＲ断片（２×ＶＨおよび２×ＶＬ）をｐＣＲ２．１ベクター内にクローニングした。
【０２１９】
２．６  形質転換
ライゲーションしたプラスミドをＴＡクローニングキットの指示書に従ってＴＯＰ１０Ｆ’細胞内に形質転換させた。５０μｌおよび２００μｌの形質転換細胞を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ−寒天プレートに広げ、８μｌの５００ｍＭのＩＰＴＧ溶液およびＤＭＦ中の１６μｌの５０ｍｇ／ｍｌ×−Ｇａｌ溶液でコーティングした。プレートを終夜３７℃でインキュベーションを行った。
【０２２０】
２．７  配列決定
コロニーを選択し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加した５ｍｌのＬＢ培地中で、終夜３７℃で培養した。
【０２２１】
Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いて、製造者の指示に従って、６Ａ１のＶＨおよびＶＬドメインを含むｐＣＲ２．１プラスミドを抽出および精製した。プライマーＴ７、Ｍ１３順方向およびＭ１３逆方向を用いてＶＨおよびＶＬドメインの配列決定を行った。
【０２２２】
６Ａ１のＶＨの領域のアミノ酸配列（２回のＲＴ−ＰＣＲ反応からの１０個のクローンの一致）：
配列番号７
【０２２３】
６Ａ１のＶＬの領域のアミノ酸配列（２回のＲＴ−ＰＣＲ反応からの１０個のクローンの一致）：
配列番号８
【０２２４】
３．キメラ抗体
親ネズミＶ領域からなるキメラ抗体（セクション２．７に記載）をヒトＩｇＧ１／ｋ野生型Ｃ領域上に移植した。これは、正しいネズミＶ領域のクローニングを確認するため、およびヒト化構築体を試験する際の参照として用いるように設計した。キメラ抗体をＣＨＯ細胞中で発現させ、精製し、ＥＬＩＳＡによってヒトＩＬ−１３への結合を試験した。
【０２２５】
３．１  ＰＣＲ増幅
クローニングしたネズミＶ領域をＰＣＲによって増幅して、哺乳動物発現ベクター内へのクローニングに必要な制限部位、すなわちＲｌｄおよびＲｌｎを導入した。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｅＩ部位は、ＶＨドメインの枠となり、ヒトγ１野生型Ｃ領域を含む修飾したＲｌｄベクター内へのクローニングを可能にするように設計した。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｉＷＩ部位は、ＶＬドメインの枠となり、ヒトκＣ領域を含む修飾したＲｌｎベクター内へのクローニングを可能にするように設計した。
【０２２６】
ＶＨ順方向プライマー：
【化３】
2008511542.tif 000006
ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に下線を引き、コザック配列を太字で示した。
【０２２７】
ＶＨ逆方向プライマー：
5'-GAT GGA CTA GTG TTC CTT GAC CCC AGT A -3'（配列番号８７）
ＳｐｅＩ制限部位に下線を引いた。
【０２２８】
ＶＬ順方向プライマー：
【化４】
2008511542.tif 000007
ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に下線を引き、コザック配列を太字で示した。
【０２２９】
ＶＬ逆方向プライマー：
5'-GAT GCG TAC GTT TGA TTT CCA GCT TGG TGC C-3'（配列番号８９）
ＢｓｉＷＩ制限部位に下線を引いた
【０２３０】
【表３】
2008511542.tif 000008
【０２３１】
プライマー１：ＶＨまたはＶＬ順方向プライマー
プライマー２：ＶＨまたはＶＬ逆方向プライマー
【０２３２】
精製したプラスミド：Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ（２００×に希釈）によって精製したｐＣＲ２．１ＶＨまたはＶＬプラスミド
【０２３３】
【表４】
2008511542.tif 000009
【０２３４】
３．２  哺乳動物発現ベクター内へのクローニング
ＱｉａｇｅｎのＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キットを用いて、製造者の指示に従って、ＰＣＲ産物を精製した。
【０２３５】
ＶＨＰＣＲ産物およびＲｌｄ  ｈＣγ１ｗｔ哺乳動物発現ベクターをＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｅＩで消化した：
【表５】
2008511542.tif 000010
【０２３６】
ＤＮＡ：精製したＶＨ  ＰＣＲ産物またはＲｌｄ  ｈＣγ１ｗｔベクター（０．２５ｍｇ／ｍｌ）
２時間３７℃でインキュベーションを行った。
【０２３７】
ＶＬＰＣＲ産物およびＲｌｎ  ｈＣκ哺乳動物発現ベクターをＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｉＷＩで消化した：
【表６】
2008511542.tif 000011
【０２３８】
ＤＮＡ：精製したＶＬ  ＰＣＲ産物またはＲｌｎ  ｈＣκベクター（０．２５ｍｇ／ｍｌ）
２時間３７℃でインキュベーションを行った。２μｌのＢｓｉＷＩ（ＮＥＢ）を加え、２時間５５℃でインキュベーションを行った。
【０２３９】
制限消化の産物をゲルローディング溶液中で０．０１％臭化エチジウムを含む調製用１％アガロースゲル上に載せ、ＴＡＥ緩衝液中で１００Ｖ、１時間流し、ＲｌｄおよびＲｌｎベクターならびにＶＨおよびＶＬＰＣＲ断片のバンドを切除した。ＶＨ、ＶＬおよびベクターのバンドの同定を可能にするために、１００ｂｐ  ＤＮＡラダーもゲルに流した。ＱｉａｇｅｎのＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて、製造者の指示に従って、ＤＮＡをゲルから抽出および精製した。
【０２４０】
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｅＩで消化したＶＨＰＣＲ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｅＩで消化したＲｌｄ  ｈＣγ１ｗｔベクター内にライゲーションした。ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｉＷＩで消化したＶＬＰＣＲ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｉＷＩで消化したＲｌｎ  ｈＣκベクター内にライゲーションした。ライゲーションは、ＰｒｏｍｅｇａのＬｉｇａＦａｓｔ迅速ＤＮＡライゲーションシステムを用いて、製造者の指示に従って実施し、以下を得た：
【０２４１】
ＶＨ：ベクター：Ｒｌｄ  ｈＣγ１ｗｔ、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｅＩで消化
挿入物：ＶＨＰＣＲ断片、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｅＩで消化
【０２４２】
ＶＬ：ベクター：Ｒｌｎ  ｈＣκ、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｉＷＩで消化
挿入物：ＶＬＰＣＲ断片、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｉＷＩで消化
【０２４３】
ライゲーションさせた産物をＤＨ５αコンピテント細胞内に形質転換させた。２００μｌのＤＨ５αのバイアルを氷上で解凍した。５０μｌのアリコートを形質転換チューブ中で調製した。２μｌのライゲーション混合物を加え、ピペットチップを用いて穏やかに混合し、次いで表情で３０分間インキュベーションを行った。混合物を４５秒間４２℃で、振盪せずにインキュベーションを行った。その後、これを氷上に２分間移した。４５０μｌのＳＯＣ培地を加え、チューブを１時間３７℃で、振盪インキュベーター上でインキュベーションを行った。１００μｌの培養物を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬ−寒天プレート上に広げ、終夜３７℃でインキュベーションを行った。
【０２４４】
３．３  配列決定
ＶＨおよびＶＬクローンを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加した５ｍｌのＬＢ培地中で終夜、３７℃で培養した。ＱｉａｇｅｎのＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いて、製造者の指示に従って、ＶＨおよびＶＬドメインをそれぞれ含むＲｌｄおよびＲｌｎプラスミドを抽出ならびに精製した。Ｒｌｄベクター中の順方向プライマーならびにヒトＣγ１領域中のシグナル配列および逆方向プライマーを用いて、ＶＨ領域の配列決定を行った。
【０２４５】
Ｒｌｎベクター中の順方向プライマーならびにヒトＣκ領域中のシグナル配列および逆方向プライマーを用いて、ＶＬ領域の配列決定を行った。正しいＶＨおよびＶＬ配列を有するクローンを同定し、ＣＨＯ細胞中での発現のためにプラスミドを調製した。
【０２４６】
３．４  ＣＨＯ細胞中でのキメラ抗体の発現
６Ａ１のＶＨおよびＶＬドメインをそれぞれ含むＲｌｄおよびＲｌｎプラスミドをＣＨＯ細胞内に一過的に同時形質移入させ、発現させた。産生されたキメラ抗体を、タンパク質Ａセファロースのアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養物の上清から精製した。
【０２４７】
３．４．１  プラスミドの精製
Ｒｌｄ−６Ａ１ＶＨおよびＲｌｎ−６Ａ１ＶＬプラスミドを含むＤＨ５α細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加した５ｍｌのＬＢ培地中、８時間３７℃で、振盪インキュベーター内で培養した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加した２００ｍｌのＬＢ培地に１ｍｌの１日培養物を接種し、振盪インキュベーター内で終夜、３７℃でインキュベーションを行った。ＱｉａｇｅｎのＱＩＡｆｉｌｔｅｒプラスミドＭａｘｉキットを用いて、製造者の指示に従って、プラスミドを抽出および精製した。エタノールペレットを２００μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁させ、ストック溶液の１００倍希釈を行ったあとの２６０ｎｍにおける吸光度によってプラスミドの濃度を測定した。
【０２４８】
３．４．２  形質移入
Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗウシ胎児血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＧｌｕｔａｍａｘ−１添加ダルベッコＭＥＭ（ＤＭＥＭ）培地中、４×１７５ｃｍ２のＢＤファルコン組織培養物フラスコ内で、３７℃でＣＨＯ細胞をコンフルエントになるまで培養した。
【０２４９】
各フラスコについて、５０ｍｌのファルコンチューブ内で以下を加えて混合した：
８ｍｌのＧｌｕｔａｍａｘ−１を含むＯｐｔｉｍｅｍ  １
２０μｇのＲｌｄ−６Ａ１ＶＨ精製プラスミド
２０μｇのＲｌｎ−６Ａ１ＶＬ精製プラスミド
２４０μｌのボルテックス下のＴｒａｎｓＦａｓｔ形質移入試薬
【０２５０】
混合物を１０〜１５分間、ＲＴでインキュベーションを行った。ＤＭＥＭ培地をフラスコから除去し、その後、混合物のボルテックスを行い、フラスコに加えた。混合物を３７℃、１時間でインキュベーションを行った。３２ｍｌのＯｐｔｉｍｅｍをフラスコに加え、３７℃で４８〜７２時間インキュベーションを行った。
【０２５１】
３．４．３  キメラ抗体の精製
すべての１７５ｃｍ２フラスコからの培地をプールし、ＭＳＥ  Ｍｉｓｔｒａｌ２０００で１５００ｒｐｍ、３分間遠心分離し、上清を５００ｍＬフィルターシステム０．２２μｍＣＡに通した。Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェアを用いて、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒで清澄にした上清から抗体を精製した。用いたカラムは、１ｍｌのＨｉＴｒａｐ  ｒタンパク質ＡセファロースＦＦであった。流速は１ｍｌ／分であった。
【０２５２】
カラムを１０ＣＶのダルベッコＰＢＳで平衡化し、その後、ポンプＡによって清澄にした上清を載せた。カラムを２０ＣＶのダルベッコＰＢＳで洗浄し、ポンプＡを洗浄して液を廃棄し、上清の完全な排除を確実にするために、さらに１０ＣＶのダルベッコＰＢＳをカラムに通した。
【０２５３】
抗体を１０ＣＶのＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  ＩｇＧ溶出緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）で溶出させ、１００μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｚｍａ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０の中和緩衝液を含む１ｍｌ画分で採取した。カラムを５ＣＶのダルベッコＰＢＳで再度平衡化した。
【０２５４】
溶出液画分中の抗体は、２８０ｎｍにおける吸光度を１０倍容量のＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  ＩｇＧ溶出緩衝液＋１倍容量の１Ｍ  Ｔｒｉｚｍａ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を含むブランク溶液に対して読み取ることによって定量し、十分な量の純粋な抗体を有する画分をプールし、１００μｌのアリコートで、−２０℃で保存した。
【０２５５】
３．４．４  キメラ抗体の解析
上清および精製した６Ａ１キメラ抗体（６Ａ１ｃ）を、ヒトおよびカニクイザルＩＬ−１３の結合ＥＬＩＳＡで解析した。
【０２５６】
キメラ６Ａ１モノクローナル抗体で一過的に形質移入したＣＨＯ細胞からの上清は、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、大腸菌で発現させた組換えヒトおよびカニクイザルＩＬ−１３をどちらも結合した。精製した抗体も、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、大腸菌で発現させた組換えヒトおよびカニクイザルＩＬ−１３をどちらも結合した（データ示さず）。図８参照。
【０２５７】
カニクイザルＩＬ−１３のアミノ酸配列およびｃＤＮＡ配列（シグナル配列を含む）は、それぞれ配列番号９０および９１として記載する。
【０２５８】
これらの結果により、正しい６Ａ１可変領域のクローニングが成功し、ヒトおよびカニクイザルＩＬ−１３をどちらも結合する能力を有する抗原結合キメラ抗体が産生されたことが確認された。
【０２５９】
４．クローン６Ａ１のヒト化
４．１  ヒト化戦略
４．１．１  マウスデータベースの検索
ペプチドデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋ）を検索することによって、６Ａ１のＶＨアミノ酸配列に対して最も高い相同性を有する１２個のマウス配列およびＶＬアミノ酸配列に対して最も高い相同性を有する１１個のマウス配列を同定した。
【０２６０】
６Ａ１のＶＨアミノ酸配列を、データベース検索からの１２個のマウス配列すべてと比較し、以下のフレームワーク残基が有意であると同定された：
【表７】
2008511542.tif 000012
【０２６１】
位置は、Ｋａｂａｔ他の番号付け方式に従う。
【０２６２】
６Ａ１のＶＬアミノ酸配列を、データベース検索からの１１個のマウス配列すべてと比較し、どのフレームワーク残基も有意であると同定されなかった。
【０２６３】
４．１．２．ヒトデータベースの検索
ペプチドデータベースでＥａｓｙＢｌａｓｔを用いて、６Ａ１のＶＨおよびＶＬフレームワークに対して最も高い相同性を有するヒトフレームワーク配列を同定した。
【０２６４】
６Ａ１のＶＨについて１組のヒト配列が同定され、その中で以下のフレームワークがヒト化のために選択された：
配列番号９２
【０２６５】
以下のフレームワーク残基が親和性を回復するために潜在的に重要であると同定され、逆突然変異を行う必要があり得る：
【表８】
2008511542.tif 000013
【０２６６】
異なる逆突然変異を有する４つのヒト化ＶＨ構築体を設計し、１つは上述のＣＤＲの定義に従った直鎖状の移植であり（Ａ１）、他は様々な逆突然変異を有する（Ａ２、Ａ３、Ａ４）。
【０２６７】
したがって
Ａ２はＡ１＋Ｒ３８Ｉであり、
Ａ３はＡ２＋Ｅ７３Ｔであり、
Ａ４はＡ３＋Ｋ１９Ｒ＋Ｅ８１Ｒである。
【０２６８】
６Ａ１のＶＬについて１組のヒト配列が同定され、その中で以下のフレームワークがヒト化のために選択された：
配列番号９３
【０２６９】
以下の残基が親和性を回復するために潜在的に重要であると同定され、逆突然変異を行う必要があり得る：
位置（Ｋａｂａｔ＃）  マウス６Ａ１のＶＬ  ヒトＶＬ
８５                  Ｖ                  Ｉ
【０２７０】
２つの構築体を設計し、一方は直鎖状の移植であり（Ｌ１）、他方は逆突然変異を有する（Ｌ２）（すなわちＬ１＋Ｉ８５Ｖ）。
【０２７１】
ヒト化ＶＨ構築体Ａ１：
配列番号１１
ヒト化ＶＨ構築体Ａ２：
配列番号１２
ヒト化ＶＨ構築体Ａ３：
配列番号１３
ヒト化ＶＨ構築体Ａ４：
配列番号１４
ヒト化ＶＬ構築体Ｌ１：
配列番号１５
ヒト化ＶＬ構築体Ｌ２：
配列番号１６
【０２７２】
４．２  ６Ａ１のヒト化
ＲｌｄおよびＲｌｎ哺乳動物発現ベクター内にクローニングするための制限部位ならびにヒトシグナル配列を含めた重複するオリゴヌクレオチドの積み重ねによって、ヒト化ＶＨおよびＶＬ構築体を新規に調製した。ヒトγ１野生型定常領域を含むＲｌｄ内へのクローニングのために、ヒトシグナル配列を含むＶＨドメインの枠となるようにＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｅＩ制限部位を導入した。ヒトκ定常領域を含むＲｌｎ内へのクローニングのために、ヒトシグナル配列を含むＶＬドメインの枠となるようにＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｉＷＩ制限部位を導入した。
【０２７３】
ヒトシグナル配列：配列番号１７
【０２７４】
４つのヒト化ＶＨ構築体および２つのヒト化ＶＬ構築体を設計した。この結果、８つの異なる重鎖−軽鎖の組合せが生じる。
【０２７５】
約１８塩基の重複を有する約６０塩基長の約１０個のオリゴヌクレオチドを、積み重ね用に設計した。
【０２７６】
４．２．１  オリゴヌクレオチドの積み重ね
オリゴヌクレオチドのプール溶液を、５μｌの各オリゴストック溶液から１００μＭで調製した。重複オリゴヌクレオチドの積み重ねによるヒト化ＶＨおよびＶＬ遺伝子の合成を、一般的にＳｔｅｍｍｅｒ  ＷＰら（１９９５）Ｇｅｎｅ、１６４（１）：４９〜５３に従って、Ｅｒｔｌ  ＰＦら（２００３）Ｍｅｔｈｏｄｓ、３１：１９９〜２０６に記載のソフトウェアを用いて、実施した。
【０２７７】
【表９】
2008511542.tif 000014
【０２７８】
【表１０】
2008511542.tif 000015
【０２７９】
４．２．１．２  代表的な回復ＰＣＲ
プライマー１および２が、アセンブリＰＣＲで用いた最初の上部および下部のオリゴヌクレオチドであった。回復ＣＲは、完全なＶ遺伝子の増幅を可能にする。
【０２８０】
【表１１】
2008511542.tif 000016
【０２８１】
【表１２】
2008511542.tif 000017
【０２８２】
ＱｉａｇｅｎのＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キットを用いて、製造者の指示に従って、回復ＰＣＲの産物を精製した。
【０２８３】
４．２．２  制限消化
セクション３で同様に記載したように、ヒト化６Ａ１のＶＨ構築体Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４をＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｅＩで消化し、ヒト化６Ａ１のＶＬ構築体Ｌ１、Ｌ２をＨｉｎｄ−ＩＩＩ−ＢｓｉＷＩで消化した。
【０２８４】
４．２．３  ゲル精製
セクション３と同様に制限消化の産物を精製した。
【０２８５】
４．２．４  ライゲーション
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｅＩで消化した６Ａ１ヒト化ＶＨ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｅＩで消化したＲｌｄ  ｈＣγ１ｗｔベクター内にライゲーションした。
【０２８６】
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｉＷＩで消化した６Ａ１ヒト化ＶＬ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｉＷＩで消化したＲｌｎ  ｈＣκベクター内にライゲーションした。
【０２８７】
ライゲーションは、ＰｒｏｍｅｇａのＬｉｇａＦａｓｔ迅速ＤＮＡライゲーションシステムを用いて、製造者の指示に従って実施した。
【０２８８】
４．２．５  形質転換
セクション３で既に記載した方法と同様。
【０２８９】
４．２．６  代表的な配列決定方法
各反応プレートからのコロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加した５ｍｌのＬＢ培地中、終夜３７℃で培養した。ＱｉａｇｅｎのＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いて、製造者の指示に従ってプラスミドを抽出および精製し、セクション３で既に記載したプライマーを用いて配列決定を行った。正しいヒト化ＶＨおよびＶＬ配列を有するクローンを同定し、ＣＨＯ細胞中での発現のためにプラスミドを調製した。
【０２９０】
５．ヒト化抗体の発現および特徴づけ
４つのヒト化ＶＨ構築体（Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４）ならびに２つのヒト化ＶＬ構築体（Ｌ１およびＬ２）をＲｌｄ  ｈＣγ１ｗｔおよびＲｌｎ  ｈＣκ哺乳動物発現ベクターにおいて調製した。８つのプラスミド重鎖−軽鎖の組合せ（Ａ１Ｌ１、Ａ１Ｌ２、Ａ２Ｌ１、Ａ２Ｌ２、Ａ３Ｌ１、Ａ３Ｌ２、Ａ４Ｌ１、Ａ４Ｌ２）をＣＨＯ細胞内に一過的に同時形質移入させ、小規模で発現させて８つの異なるヒト化抗体を得た。ＣＨＯ細胞の上清中で産生された抗体をヒトＩＬ−１３結合ＥＬＩＳＡで解析した。
【０２９１】
５．１  代表的なプラスミド精製方法
上述のプラスミドの１つを含むＤＨ５α細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加した５ｍｌのＬＢ培地中、８時間３７℃で、振盪インキュベーター内で培養した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加した２００ｍｌのＬＢ培地に１ｍｌの１日培養物を接種し、振盪インキュベーター内で終夜、３７℃でインキュベーションを行った。ＱｉａｇｅｎのＱＩＡｆｉｌｔｅｒプラスミドＭａｘｉキットを用いて、製造者の指示に従って、プラスミドを抽出および精製した。エタノールペレットを２００μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁させ、ストック溶液の１００倍希釈を行ったあとの２６０ｎｍにおける吸光度によってプラスミドの濃度を測定した。
【０２９２】
５．２  代表的な形質移入方法
Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ３５０６  ６−ウェルプレートの９個のウェルに１０６個のＣＨＯ細胞を播種し、Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗウシ胎児血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＧｌｕｔａｍａｘ−１添加ダルベッコＭＥＭ（ＤＭＥＭ）培地中、３７℃で終夜培養した。
【０２９３】
各ウェルについて、それぞれの形質移入が異なる軽鎖と重鎖の組合せを含むように以下を５ｍｌのＢｉｊｏｕ中で加えた：
１ｍｌのＧｌｕｔａｍａｘ−１を含むＯｐｔｉｍｅｍ  １
５μｇのヒト化ＶＨ保有プラスミド
５μｇのヒト化ＶＬ保有プラスミド
３０μｇのボルテックス下のＴｒａｎｓＦａｓｔ形質移入試薬
【０２９４】
インキュベーションは１０〜１５分間室温で行った。ＤＭＥＭ培地をウェルから除去し、その後、ボルテックス混合し、適切なウェルに加えた。インキュベーションは３７℃で１時間行った。各ウェルに２ｍｌのＯｐｔｉｍｅｍを加え、３７℃で４８〜７２時間インキュベーションを行った。
【０２９５】
５．３  ヒト化抗体の解析
各ウェルからの培地を回収し、１３０００ｒｐｍで１分間、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５４１５Ｒベンチ遠心分離機で遠心分離を行い、上清を０．２μｍのＰａｌｌ  Ａｃｒｏｄｉｓｃ  ２５ｍｍシリンジフィルターに通した。ＥＬＩＳＡにおいて、細胞の上清をヒトＩＬ−１３への結合について評価した。８つのヒト化抗体すべてが、ヒトＩＬ−１３結合ＥＬＩＳＡにおいて６Ａ１キメラ抗体と同様のプロフィールでヒトＩＬ−１３と結合した。図９参照。
【０２９６】
ヒト化抗体Ｌ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１を発現のスケールアップ、精製、およびさらなる解析のために選択した。
【０２９７】
６．ヒト化抗ヒトＩＬ−１３抗体Ｌ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１の評価
６．１  ヒトおよびカニクイザルＩＬ−１３結合ＥＬＩＳＡにおける活性
Ｌ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１はスケールアップからの作製が成功し、ＥＬＩＳＡによって、大腸菌で発現させたヒトおよびカニクイザルＩＬ−１３に対する結合を評価した。図１０ａおよび１０ｂならびに表Ｂ参照。
【０２９８】
【表１３】
2008511542.tif 000018
【０２９９】
Ｌ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１はどちらも、大腸菌で発現させたヒトおよびカニクイザルＩＬ−１３に同様のプロフィールで結合した。ＥＣ５０値（エクセルの「Ｒｏｂｏｓａｇｅ」曲線当てはめ機能を用いて作成）により、結合活性がキメラ６Ａ１  ｍＡｂ標準に非常に類似していることが示された。
【０３００】
６．２  ネイティブ（ＰＢＭＣ由来）ヒトＩＬ−１３への結合におけるＬ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１の評価
抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で刺激したＣＤ４＋Ｔｈ２細胞からの上清（ヒトＰＢＭＣ培養物から生じる）を用いて、キメラ６Ａ１  ｍＡｂ、Ｌ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１の、ネイティブ（ＰＢＭＣ由来）ヒトＩＬ−１３への結合を評価した。ＥＬＩＳＡでは、３つの抗体すべてが、Ｔｈ２細胞上清において、親６Ａ１  ｍＡｂと非常に類似した性能でネイティブヒトＩＬ−１３と結合した。図１１参照。
【０３０１】
さらに、Ｔｈ２細胞の上清中に存在するネイティブヒトＩＬ−１３のレベルを決定するために、市販の試薬を用いて検量線を作成した。３つの抗体すべておよび市販の抗ヒトＩＬ−１３ｍＡｂで、Ｔｈ２上清試料において等量のＩＬ−１３が検出された。以下の表２参照。
【０３０２】
【表１４】
2008511542.tif 000019
【０３０３】
６．３  ＩＬ−１３受容体結合ＥＬＩＳＡにおける、ヒトＩＬ−１３に対するＬ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１の阻害活性
６Ａ１親マウスｍＡｂ、キメラ６Ａ１、Ｌ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１を、競合ＥＬＩＳＡにおいて、ヒトＩＬ−１３のＩＬ−１３Ｒα１およびＩＬ−１３Ｒα２の鎖に対する結合を阻害する能力について評価した。図１２ａおよび１２ｂならびに以下の表３参照。
【０３０４】
【表１５】
2008511542.tif 000020
【０３０５】
すべての抗体が、大腸菌で発現させたｄｅｔ−１でタグ付けしたヒトＩＬ−１３のヒトＩＬ−１３Ｒα１に対する結合を同様のプロフィールで阻害した。同様に、すべての抗体が、大腸菌で発現させたｄｅｔ−１でタグ付けしたヒトＩＬ−１３のヒトＩＬ−１３Ｒα２に対する結合を阻害したが、このアッセイではＬ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１の効力が一部低下していた（ＩＣ５０値はエクセルの「Ｒｏｂｏｓａｇｅ」曲線当てはめ機能を用いて作成した）。
【０３０６】
６．４  Ｌ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１のヒトＩＬ−１３への結合の親和性評価
ヒトＩＬ−１３に対するＬ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１の結合動力学を、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）システムを用いて評価した。用いた方法には以下のセクション７を参照されたい。
【０３０７】
解析１：
ヒトおよびカニクイザルＩＬ−１３（大腸菌で発現させたタンパク質）のどちらについても完了した。引用したＫＤ値は、５つの異なるＩＬ−１３濃度曲線（３つ組で行った）の平均である。この解析では質量移動問題が明らかであり、改変した実験プロトコル（この問題を訂正するため）を解析４（質量移動問題が存在しない）で完了したことに注目されたい。表４参照。
【０３０８】
【表１６】
2008511542.tif 000021
【０３０９】
解析２：
ヒトＩＬ−１３（大腸菌で発現させたタンパク質）のＬ１＋Ａ１に対する結合について完了した。表５参照。
【０３１０】
【表１７】
2008511542.tif 000022
【０３１１】
解析３：
１６量体のビオチン標識したヒトＩＬ−１３、ペプチド数２４について完了した（親ｍＡｂ  ６Ａ１の直鎖状結合エピトープとして同定、セクション６．７参照）。ペプチドリガンドへの結合について得られた絶対ＫＤ値が全タンパク質標的への結合において見られるものと全く異なることに注目されたい。しかし、キメラ６Ａ１とＬ１＋Ａ１との間に約３倍の親和性の低下を示す点で、このデータは全タンパク質のデータおよびＩＬ−１３中和データ（ＴＦ−１バイオアッセイ）と矛盾がないと考えられている。表６参照。
【０３１２】
【表１８】
2008511542.tif 000023
【０３１３】
解析４：
ヒトおよびカニクイザルＩＬ−１３（大腸菌で発現させたタンパク質）のどちらについても完了。引用したＫＤ値は、５つの異なるＩＬ−１３濃度曲線（３つ組で行った）の平均である。このデータ組では質量移動問題が見られないことに注目されたい。表７参照。
【０３１４】
【表１９】
2008511542.tif 000024
【０３１５】
結果は、ヒト化構築体Ｌ１＋Ａ１とＬ２＋Ａ１とで有意な差が存在しないことを示している。
【０３１６】
Ｌ１＋Ａ１は、約１６８ｐＭのヒトＩＬ−１３に対する親和性を示している。動力学は、例外的に遅いオフ速度によって支配されており、これは抗体の有意な中和活性から予測されるものである。会合定数ｋｏｎのデータは一貫して６×１０５Ｍ−１ｓ−１付近である。解離定数ｋｏｆｆの推定値にはよりばらつきがあり、１．４×１０−４〜８．２２×１０−５ｓ−１の範囲にわたり、遅いオフ速度の正確な定量を得ることの技術的な挑戦を反映している。
【０３１７】
６．５  ＩＬ−１３中和バイオアッセイにおけるＬ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１の活性
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＴＦ−１細胞バイオアッセイにおいて、６Ａ１親マウスｍＡｂ、キメラ６Ａ１、Ｌ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１をＩＬ−１３中和活性について評価した（このバイオアッセイが、ＩＬ−１３の生物活性を評価するため、および市販の抗ＩＬ−１３抗体の中和能を評価するための業界標準である）。大腸菌で発現させたヒトＩＬ−１３、大腸菌で発現させたカニクイザルＩＬ−１３、大腸菌で発現させたＱ１３０ヒトＩＬ−１３（喘息関連変異体）、および哺乳動物ＣＨＯ細胞で発現させたヒトＩＬ−１３を含めたいくつかのＩＬ−１３変異体をこのアッセイで評価した（注記：Ｔｈ２細胞上清はＴＦ−１細胞を増殖させることができる他のサイトカインも含むので、この試料中のネイティブヒトＩＬ−１３はこのバイオアッセイで用いることができない）。図１３ａ、１３ｂ、１３ｃおよび１３ｄ参照。
【０３１８】
試験したすべての抗体が、このバイオアッセイ系のすべてのＩＬ−１３変異体の生物活性を中和した；各ＩＬ−１３変異体に対する各抗体の中和能を決定し、ＮＤ５０値として表した。表８参照
【０３１９】
【表２０】
2008511542.tif 000025
【０３２０】
注記：このアッセイにおいてＴＦ−１細胞を同程度増殖させるために異なる量の各ＩＬ−１３変異体が必要であるため、１つの特定の抗体によって生じたＮＤ５０値を用いた各ＩＬ−１３変異体にわたって比較することが望ましい可能性がある。しかし、各抗体によって生じたＮＤ５０値を単一のＩＬ−１３変異体について比較することは妥当である。
【０３２１】
一般に、親６Ａ１  ｍＡｂおよびキメラ６Ａ１によって達成された中和レベルは同様であり、親ｍＡｂとキメラとの間に検出可能な効力の損失は示されなかった。しかし、Ｌ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１の効力は、親６Ａ１  ｍＡｂおよびキメラ６Ａ１のどちらにおいても、試験したそれぞれ個別のＩＬ−１３変異体で平均して約３〜４倍、測定可能に低下していた。これらのデータはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）評価から得られたものと一致している。
【０３２２】
６．６  ヒトＩＬ−１３への結合に対するＬ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１の特異性
ヒトＩＬ−１３に対するＬ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１の特異性は、結合ＥＬＩＳＡにおけるヒトＩＬ−４およびヒトＧＭ−ＣＳＦに対する交差反応性の潜在性の解析によって評価した。図１４ａおよび１４ｂ参照。
【０３２３】
これらのｍＡｂはＩＬ−１３に対する結合に特異的であることが判明しており、３０μｇ／ｍｌまでのｍＡｂ濃度でヒトＩＬ−４またはヒトＧＭ−ＣＳＦに対する交差反応性が存在しない。さらに、これらのｍＡｂはＩＬ５バイオアッセイにおいてヒトＩＬ５の生物活性を交差中和しなかった。図１４ｃ参照。
【０３２４】
６．７  ビオチン標識したペプチドを用いた６Ａ１のエピトープマッピング
ヒトＩＬ−１３およびカニクイザルＩＬ−１３タンパク質を変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流した。マウスｍＡｂ  ６Ａ１を用いたウエスタンブロッティングにより、ヒト（大腸菌で発現させた、所内）およびカニクイザル（大腸菌で発現させた、所内）ＩＬ−１３タンパク質のどちらにおいても予想された大きさのバンドが検出された。恐らくは技術的故障により、６Ａ１ではｈＩＬ−１３（大腸菌で発現させた、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が検出されなかった。この解析は、ｍＡｂ  ６Ａ１がヒトおよびカニクイザルＩＬ−１３配列内の直鎖状ペプチドエピトープを認識したことを示唆している（データ示さず）。
【０３２５】
ビオチン標識した１６量体ペプチドのオフセット４は、ヒトおよびカニクイザルＩＬ−１３のどちらもの上のｍＡｂ  ６Ａ１によって認識されたＢ細胞エピトープの位置をマッピングするために合成した。ＥＬＩＳＡ方法を用いて固定したビオチン標識したペプチドと親ｍＡｂ  ６Ａ１との結合を検出した。
【０３２６】
１６量体のカスタム設計したペプチドの詳細：８８×１６量体、オフセット４（Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ、オーストラリアにより供給）。
【０３２７】
様式：ペプチド２５＆４４＝ビオチン−ＳＧＳＧ−ペプチド−酸
ペプチド２〜２４＆２７〜４３＝ビオチン−ＳＧＳＧ−ペプチド−アミド
【０３２８】
【表２１】
2008511542.tif 000026
【０３２９】
実施例：このアッセイのために設定された典型的な９６ウェルプレート
【表２２】
2008511542.tif 000027
【０３３０】
ＮＢ：数字は各ウェル中のペプチドを示す
括弧内の数字は対照抗体の希釈係数を示す
【０３３１】
９６ウェルの４９０ｎｍでの吸光度
【表２３】
2008511542.tif 000028
【０３３２】
この結果（数回の試みの１つ）は、以下に示すようにペプチド２４、２５、４３および４４（ならびに陽性対照ペプチド）の陽性結果に相関している。図１５参照。すべての試みは、ペプチド２４、２５、４３および４４が陽性であったことを実証している。
【０３３３】
【化５】
2008511542.tif 000029
【０３３４】
ペプチド２４および２５はｈＩＬ−１３に由来する。ペプチド４３および４４はｃｙｎｏＩＬ−１３に由来する。
【０３３５】
さらに、キメラ６Ａ１、Ｌ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１  ｍＡｂは、ヒトおよびカニクイザルＩＬ−１３の両方において、すべてＣ末端領域で同じ直鎖状エピトープに結合している（キメラ６Ａ１、Ｌ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１  ｍＡｂのデータは示さず）。
【０３３６】
要約すると、ＥＬＩＳＡの結果は、親マウスｍＡｂ  ６Ａ１、キメラ６Ａ１、Ｌ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１  ｍＡｂがすべてヒトＩＬ−１３タンパク質由来の以下の配列内で結合したことを示している：
DLLLHLKKLFRE（配列番号８４）
【０３３７】
さらにカニクイザルＩＬ−１３タンパク質由来の以下の配列内：
【化６】
2008511542.tif 000030
【０３３８】
ＮＢ：太字はヒトＩＬ−１３とカニクイザルＩＬ−１３相同分子種との残基の差異を示す。
【０３３９】
したがって、親マウスｍＡｂ  ６Ａ１、キメラ６Ａ１、Ｌ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１  ｍＡｂは、配列番号９の残基９７〜１０８でヒトＩＬ−１３に免疫特異的に結合すると定められた。
【０３４０】
６．８  ビオチン標識したペプチドを用いた６Ａ１のエピトープ精細マッピング
ｍＡｂ  ６Ａ１の結合エピトープは、ヒトＩＬ−１３への結合にはＫＤＬＬＬＨＬＫＫＬＦＲＥＧ、カニクイザルＩＬ−１３への結合にはＫＤＬＬＶＨＬＫＫＬＦＲＥＧに基づいたペプチド組を用いて決定した。ｍＡｂ  ６Ａ１の正確な直鎖状結合エピトープを定義するために、これら親ペプチド配列（すなわちＫＤＬＬＬＨＬＫＫＬＦＲＥＧまたはＫＤＬＬＶＨＬＫＫＬＦＲＥＧ）のＮまたはＣ末端のどちらかから１個のアミノ酸が逐次的に取り除かれるようにペプチドをオーダーした。
【０３４１】
固定したビオチン標識したペプチドの、親ｍＡｂ  ６Ａ１への結合を検出するためにＥＬＩＳＡ方法を用いた。
【０３４２】
ペプチドの識別番号（４１３〜４４７）および対応する配列を以下に示す。
【０３４３】
ペプチド配列：
【表２４】
2008511542.tif 000031
【０３４４】
実施例：このアッセイために設定した９６ウェルプレート
【表２５】
2008511542.tif 000032
ＮＢ：数字は各ウェル中のペプチドを示す
【０３４５】
９６ウェルの４９０ｎｍでの吸光度
【表２６】
2008511542.tif 000033
【０３４６】
図１６ａおよび１６ｂ参照。結果は、親ｍＡｂ  ６Ａ１がヒトＩＬ−１３およびカニクイザルＩＬ−１３相同分子種の両方のＣ末端領域中の直鎖状アミノ酸エピトープＫＫＬＦＲに結合することを示している。
【０３４７】
さらに、キメラ６Ａ１、Ｌ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１  ｍＡｂは、ヒトＩＬ−１３において、すべてＣ末端領域で同じ直鎖状エピトープ（すなわちＫＫＬＦＲ）に結合している（キメラ６Ａ１、Ｌ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１  ｍＡｂのデータは示さず）。次いで、親ｍＡｂ  ６Ａ１がカニクイザルＩＬ−１３中で同じエピトープに結合したことが示された。
【０３４８】
要約すると、ＥＬＩＳＡの結果は、親マウスｍＡｂ  ６Ａ１、キメラ６Ａ１、Ｌ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１  ｍＡｂがすべてヒトＩＬ−１３タンパク質由来の以下の配列内で結合したことを示した：ＫＫＬＦＲ
【０３４９】
６．９  ビオチン標識したペプチドを用いた６Ａ１結合エピトープのアラニン走査
ＩＬ−１３とｍＡｂ  ６Ａ１との相互作用に関与している特定の主要残基を同定するために、ＫＫＬＦＲ結合エピトープ（すなわちＱＦＶＫＤＬＬＬＨＬＫＫＬＦＲＥＧＲＦＮ）を含む親ペプチド配列を用いたアラニン走査手法を採用した。この解析には、ＫＫＬＦＲエピトープ中のそれぞれのアミノ酸（およびこのエピトープを直接縁取るアミノ酸のそれぞれ）の位置で１個のアミノ酸がアラニン残基で逐次的に置換されているように、ペプチドを作製した（ＡｎａＳｐｅｃ  Ｉｎｃから供給）。
【０３５０】
固定したビオチン標識したペプチドの、親ｍＡｂ  ６Ａ１およびＬ１＋Ａ１への結合を検出するためにＥＬＩＳＡ方法を用いた。
【０３５１】
この解析用に作製したペプチドおよび対応するペプチドの識別番号を以下に示す：
【表２７】
2008511542.tif 000034
【０３５２】
結果：４９０ｎｍでの吸光度
平均試験結果（ｎ＝２）。
【０３５３】
親（ネズミ）６Ａ１  ｍＡｂ：
【表２８】
2008511542.tif 000035
【０３５４】
Ｌ１＋Ａ１：
【表２９】
2008511542.tif 000036
【０３５５】
図１７ａおよび１７ｂ参照。
【０３５６】
これらのデータは、ｍＡｂ  ６Ａ１またはＬ１＋Ａ１とヒトＩＬ−１３との相互作用に関与している主要なアミノ酸残基は位置１０７のアルギニン（Ｒ）および位置１０３のリシン（Ｋ）であることを示唆している。
【０３５７】
ｍＡｂの希釈範囲にわたってこの効果を確認するために、６Ａ１およびＬ１＋Ａ１  ｍＡｂを用いて一定の濃度範囲でこの解析を繰り返した。
【０３５８】
親マウスｍＡｂ  ６Ａ１（図１７ｃ）およびヒト化候補Ｌ１＋Ａ１（図１７ｄ）を、様々な濃度におけるアラニン走査ペプチド（配列番号１２９、１３１〜１３５）への結合についてアッセイを行った。ペプチドを２つの９６ウェルプレートに分割しなければならなかったので、アラニン置換を含まない親配列ペプチド（配列番号１２９）のアッセイを両プレートで行い、したがって１つのグラフに２つの結果が示される。これは、プレート間の大きなばらつきが存在するかどうかを決定するためであり、どちらの事例でも明白なばらつきは存在しなかった。
【０３５９】
置換Ｋ１０３Ａ、Ｌ１０５ＡおよびＦ１０６Ａを含むペプチド（それぞれ配列番号１３１、１３３および１３４、残基番号は配列番号９に記載のとおり）は、親ペプチド（配列番号１２９）と非常に類似したｍＡｂへの結合を示したので、これらの残基は６Ａ１／Ｌ１＋Ａ１とＩＬ−１３との結合に重要でない。しかし、置換Ｋ１０４ＡおよびＲ１０７Ａを含むペプチド（それぞれ配列番号１３２および１３５、残基番号は配列番号９に記載のとおり）は、親ペプチド（配列番号１２９）と比較して特により低い濃度で低減した６Ａ１／Ｌ１＋Ａ１の結合を示し、これは、これらの残基が６Ａ１／Ｌ１＋Ａ１とＩＬ−１３との最適な結合に重要であることを示している。
【０３６０】
図１７ｃおよび１７ｄを参照されたい。
【０３６１】
これらのデータは、親（すなわちネズミ）６Ａ１またはＬ１＋Ａ１とヒトＩＬ−１３との相互作用に関与している主要なアミノ酸残基は配列番号９の位置１０７のアルギニン（Ｒ）および位置１０３のリシン（Ｋ）であることを示している。
【０３６２】
セクション７．−材料および方法
以下のセクションでは、必要に応じて以下の材料および方法を用いた。これらは代表的な材料および方法である。繰り返し実験中では材料および方法の軽微な変化が生じている可能性がある。
【０３６３】
材料
ＳＶ全ＲＮＡ単離システム：Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｚ３１００
Ａｃｃｅｓｓ  ＲＴ−ＰＣＲシステム：Ｐｒｏｍｅｇａ  Ａ１２５０
ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット：Ｑｉａｇｅｎ  ２８７０４
ゲルローディング溶液：Ｓｉｇｍａ  Ｇ７６５４
アガロース：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １５５１０−０１９
臭化エチジウム：Ｓｉｇｍａ  Ｅ１５１０
ＴＡＥ緩衝液：所内
１００ｂｐ  ＤＮＡラダー：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｎ３２３１Ｓ
ＴＡクローニングキット：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ４５−００４６
ＴＯＰ１０Ｆ’細胞：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ４４−０３００
Ｌ−寒天＋１００μｇ／ｍｌのアンピシリン：所内
Ｘ−Ｇａｌ、ＤＭＦ中に５０ｍｇ／ｍｌ：Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｖ３９４Ａ
ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
１０×ＰＣＲ緩衝液：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
Ｅ−Ｇｅｌ１．２％アガロース：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇ５０１８０１
ＬＢ培地＋１００μｇ／ｍｌのアンピシリン：所内
ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット：Ｑｉａｇｅｎ  ２７１０６
ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キット：Ｑｉａｇｅｎ  ２８００４
ＮＥ緩衝液２  １０×濃度：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｂ７００２Ｓ
精製したＢＳＡ  １００×濃度：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｂ９００１Ｓ
ＢｓｉＷＩ：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｒ０５５３Ｌ
ＨｉｎｄＩＩＩ：Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｒ６０４Ａ
ＳｐｅＩ：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｒ０１３３Ｓ
ＬｉｇａＦａｓｔ迅速ＤＮＡライゲーションシステム：Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍ８２２５
ＭＡＸ効率ＤＨ５α化学的にコンピテントな細胞：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １８２５８−０１２
ＳＯＣ培地：所内
ＱＩＡｆｉｌｔｅｒプラスミドＭａｘｉキット：Ｑｉａｇｅｎ  １２２６３
Ｇｌｕｔａｍａｘ−１添加ダルベッコＭＥＭ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ３１９６６−０２１
Ｇｌｕｔａｍａｘ−１を含むＯｐｔｉｍｅｍ  １：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ５１９８５−０２６
ＴｒａｎｓＦａｓｔ形質移入試薬：Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ２４３１
１ｍｌのＨｉＴｒａｐ  ｒタンパク質ＡセファロースＦＦ：Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  １７−５０７９−０１
ダルベッコＰＢＳ：Ｓｉｇｍａ  Ｄ８５３７
ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  ＩｇＧ溶出緩衝液：Ｐｉｅｒｃｅ  ２１００９
１Ｍ  Ｔｒｉｚｍａ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０：Ｓｉｇｍａ  Ｔ２６９４
ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ：Ｑｉａｇｅｎ  １０１６８１６
ＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ  ＰＣＲ緩衝液：Ｑｉａｇｅｎ  １０１６９６１
【０３６４】
７．１．ヒトまたはカニクイザルＩＬ−１３結合ＥＬＩＳＡ
このアッセイは、抗体とヒトまたはカニクイザルＩＬ−１３との結合を検出するＥＬＩＳＡについて記載する。これはサンドイッチＥＬＩＳＡ様式である。
【０３６５】
７．１．１  材料
１．Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ１Ｆ９６Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、４−３９４５４Ａ）
２．ヒトＩＬ−１３（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＣＨ１−０１３）
３．カニクイザルＩＬ−１３（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈｋｌｉｎｅ製）
４．ヤギ抗ヒトＩＬ−１３ポリクローナル抗体（Ｒ＋Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＡＦ−２１３−ＮＡ）
５．抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ−６０２９）
６．抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ−９３０９）
７．炭酸／炭酸水素緩衝液（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ｃ−３０４１）
８．ＴＢＳＴ［トリス緩衝生理食塩水（６．０６ｇのトリス＋８．０６ｇのＮａＣｌ＋０．２ｇのＫＣｌ＋Ｈ２０  １Ｌまで）＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０］
９．ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ−７０３０）
１０．ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ−９１８７）
１１．硫酸
【０３６６】
７．１．２  方法
１．ブロッキング溶液は３％ＢＳＡ＋ＴＢＳＴである
２．洗浄溶液はＴＢＳＴである
３．「Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ」ＥＬＩＳＡプレートを、５０ｕｌの炭酸／炭酸水素緩衝液（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ｃ−３０４１、製造者の指示に従って作製した）中の５ｕｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩＬ−１３ポリクローナル抗体（Ｒ＋Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＡＦ−２１３−ＮＡ。製造者の指示に従って５００ｕｇ／ｍｌのストック濃度で作製し、アリコートで−２０Ｃで保存した）でコーティングし、プレートシーラーで覆い、終夜４℃でインキュベーションを行う。
４．１００ｕｌの３％ＢＳＡ／ＴＢＳＴでブロッキングし、ｒｔｐで１時間インキュベーションを行う。
５．ＴＢＳＴで３回洗浄する（１回の洗浄あたり少なくとも２００ｕｌの洗浄溶液／ウェル）。
６．２０ｎｇ／ウェル（５０ｕｌの容量で）ヒトＩＬ−１３（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号ＣＨ１−０１３。製造者の指示に従って１００ｎｇ／ｕｌのストック濃度で作製、アリコートで−２０Ｃで保存した）または２０ｎｇ／ウェルのカニクイザルＩＬ−１３をブロッキング溶液中で加え、室温で１時間インキュベーションを行う。
７．ＴＢＳＴで３回洗浄する。
８．５０ｕｌの抗体試料（必要な場合は終点力価データを得るために滴定する）をブロッキング溶液中で加え、ｒｔｐで１時間インキュベーションを行う。
９．ＴＢＳＴで３回洗浄する。
１０．６Ａ１キメラ抗体またはヒト化抗体には、５０ｕｌ／ウェルの抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ−６０２９）を１／２０００希釈でブロッキング溶液中、１時間ｒｔｐで用いて、結合を検出する。６Ａ１マウスモノクローナル抗体には、５０ｕｌ／ウェルの抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ−９３０９）を１／１０００希釈でブロッキング溶液中、１時間ｒｔｐで用いて、結合を検出する。
１１．ＴＢＳＴで３回洗浄する。
１２．１００ｕｌのＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ−９１８７。製造者の指示に従って作製した）で展開させ、５０ｕｌの３Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で停止させ、４９０ｎｍの吸光度で読み取る。展開時間は〜１２分間である。
【０３６７】
７．２．ヒトＩＬ−１３のヒトＩＬ−１３Ｒα１鎖への結合のＥＬＩＳＡ
このＥＬＩＳＡでは、抗体がヒトＩＬ−１３のヒトＩＬ−１３Ｒα１鎖への結合を阻害できるかどうかを決定する。
【０３６８】
７．２．１  材料
１．Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ１Ｆ９６Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、４−３９４５４Ａ）
２．ヒトＩＬ−１３Ｒα１−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１４６−ＩＲ）
３．Ｄｅｔ−１でタグ付けしたヒトＩＬ−１３（所内で作製）
４．ビオチン標識した抗ヒトＩＬ−１３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＢＡＦ２１３）
５．ストレプトアビジン−ＨＲＰ
６．炭酸／炭酸水素緩衝液（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ｃ−３０４１）
７．ＴＢＳＴ［トリス緩衝生理食塩水（６．０６ｇのトリス＋８．０６ｇのＮａＣｌ＋０．２ｇのＫＣｌ＋Ｈ２０  １Ｌまで）＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０］
８．ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ−７０３０）
９．ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ−９１８７）
１０．硫酸
【０３６９】
７．２．２  方法
１．ブロッキング溶液は３％ＢＳＡ＋ＴＢＳＴである
２．洗浄溶液はＴＢＳＴである
３．「Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ」ＥＬＩＳＡプレートを、炭酸／炭酸水素緩衝液中の５０ｕｌの５ｎｇ／ｕｌのヒトＩＬ−１３Ｒα１−Ｆｃでコーティングする。プレートシーラーで覆い、終夜４℃でインキュベーションを行う。
４．１００ｕｌの３％ＢＳＡ／ＴＢＳＴでブロッキングし、ｒｔｐで１時間インキュベーションを行う。
５．ＴＢＳＴで３回洗浄する（１回の洗浄あたり少なくとも２００ｕｌの洗浄溶液／ウェル）。
６．全容量５０ｕｌで、０．０４ｎｇ／ｕｌのｄｅｔ−１でタグ付けしたヒトＩＬ−１３をブロッキング溶液中の抗体試料（滴定済）とともに、３０分間プレインキュベーションを行う。プレインキュベーションを行った試料を受容体でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに加え、室温で１時間インキュベーションを行う。
７．ＴＢＳＴで３回洗浄する
８．１ｕｇ／ｍｌに希釈した５０ｕｌ／ウェルのビオチン標識した抗ヒトＩＬ−１３を用いて、結合したすべてのヒトＩＬ−１３を検出する。１時間室温でインキュベーションを行う
９．ＴＢＳＴで３回洗浄する
１０．５０ｕｌ／ウェルのストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲートを１／１０００希釈で加える。１時間室温でインキュベーションを行う。
１１．ＴＢＳＴで３回洗浄する
１２．１００ｕｌ／ウェルのＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ−９１８７。製造者の指示に従って作製した）で展開させ、５０ｕｌ／ウェルの３Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で停止させ、４９０ｎｍの吸光度で読み取る。展開時間は〜２分間。
【０３７０】
７．３．ヒトＩＬ−１３のヒトＩＬ−１３Ｒα２鎖への結合のＥＬＩＳＡ
このＥＬＩＳＡでは、抗体がヒトＩＬ−１３のヒトＩＬ−１３Ｒα２鎖への結合を阻害できるかどうかを決定する。
【０３７１】
７．３．１  材料
１．Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ１Ｆ９６Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、４−３９４５４Ａ）
２．抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ−３３８２）
３．ヒトＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号６１４−ＩＲ）
４．Ｄｅｔ−１でタグ付けしたヒトＩＬ−１３（所内で作製）
５．ビオチン標識した抗ヒトＩＬ−１３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＢＡＦ２１３）
６．ストレプトアビジン−ＨＲＰ
７．炭酸／炭酸水素緩衝液（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ｃ−３０４１）
８．ＴＢＳＴ［トリス緩衝生理食塩水（６．０６ｇのトリス＋８．０６ｇのＮａＣｌ＋０．２ｇのＫＣｌ＋Ｈ２０  １Ｌまで）＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０］
９．ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ−７０３０）
１０．ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ−９１８７）
１１．硫酸
【０３７２】
７．３．２  方法
１．ブロッキング溶液は３％ＢＳＡ＋ＴＢＳＴである
２．洗浄溶液はＴＢＳＴである
３．「Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ」ＥＬＩＳＡプレートを、１／１０００に希釈した炭酸／炭酸水素緩衝液中の５０ｕｌの抗ヒトＩｇＧでコーティングする。プレートシーラーで覆い、終夜４℃でインキュベーションを行う。
４．１００ｕｌの３％ＢＳＡ／ＴＢＳＴでブロッキングし、ｒｔｐで１時間インキュベーションを行う。
５．ＴＢＳＴで３回洗浄する（１回の洗浄あたり少なくとも２００ｕｌの洗浄溶液／ウェル）。
６．５０ｕｌ／ウェルの１ｕｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃをブロッキング溶液中で加える。プレートシーラーで覆い、室温で１時間インキュベーションを行う。
７．ＴＢＳＴで３回洗浄する
８．全容量５０ｕｌで、０．００４ｎｇ／ｕｌのｄｅｔ−１でタグ付けしたヒトＩＬ−１３をブロッキング溶液中の抗体試料（滴定済）とともに、３０分間プレインキュベーションを行う。プレインキュベーションを行った試料を受容体でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに加え、室温で１時間インキュベーションを行う。
９．ＴＢＳＴで３回洗浄する
１０．１ｕｇ／ｍｌに希釈した５０ｕｌ／ウェルのビオチン標識した抗ヒトＩＬ−１３を用いて、結合したすべてのヒトＩＬ−１３を検出する。１時間室温でインキュベーションを行う。
１１．ＴＢＳＴで３回洗浄する
１２．５０ｕｌ／ウェルのストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲートを１／１０００希釈で加える。１時間室温でインキュベーションを行う。
１３．ＴＢＳＴで３回洗浄する
１４．１００ｕｌ／ウェルのＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ−９１８７。製造者の指示に従って作製した）で展開させ、５０ｕｌ／ウェルの３Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で停止させ、４９０ｎｍの吸光度で読み取る。展開時間は〜２分間である。
【０３７３】
７．４．ＩＬ−１３中和バイオアッセイ（ＴＦ−１細胞増殖アッセイ）
これは、抗ＩＬ−１３抗体の中和能の決定に用いることができるＩＬ−１３バイオアッセイである。以下に記載する方法では、組換えヒトまたはカニクイザルＩＬ−１３を用いる。哺乳動物で発現させたヒトＩＬ−１３またはＱ１３０ヒトＩＬ−１３変異体もこのアッセイで用いることができる。（ＴＦ−１細胞もヒトＩＬ５に応答して増殖する。このアッセイを用いてヒトＩＬ５生物活性に対する６Ａ１の中和能も評価した）。
【０３７４】
７．４．１  材料
１．ＴＦ−１細胞系（所内で得た）
２．９６ウェル組織培養プレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
３．ヒトＩＬ−１３（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号ＣＨ１−０１３）
４．ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６非放射性細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ４０００）
【０３７５】
７．４．２  方法
１．ＴＦ−１細胞バイオアッセイにおいて組換えヒトまたはカニクイザルＩＬ−１３の生物活性を中和する抗ヒトＩＬ−１３ｍＡｂの能力を測定する方法（所内で得たＴＦ−１細胞系、ＡＴＣＣ版ではない）。
２．このアッセイは無菌的な９６ウェル組織培養プレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、無菌条件下で行う。すべての試験は３つ組で行う。
３．１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１３（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号ＣＨ１−０１３。製造者の指示に従って、無菌技術を用いて、クラス２組織培養フード内でストック濃度１００ｎｇ／ｕｌで構成し、小アリコートで−２０Ｃで保存する）または１０ｎｇ／ｍｌのｃｙｎｏＩＬ−１３（ＣＡから所内で得た）を、様々な希釈率の抗ヒトＩＬ−１３ｍＡｂと共に（６ｕｇ／ｍｌから３倍希釈で０．０２５ｕｇ／ｍｌまで希釈）、全容量５０ｕｌで１時間、３７Ｃでプレインキュベーションを行う。また、ＩＬ−１３が存在するが抗ヒトＩＬ−１３ｍＡｂを有さない陽性対照ウェルも含める。さらに、陰性対照ウェルはＩＬ−１３を有さず、抗ヒトＩＬ−１３ｍＡｂも存在しない。このプレインキュベーションには、無菌的な低タンパク質結合性の丸底９６ウェルプレートを用いる。（ＩＬ−１３および抗ヒトＩＬ−１３ｍＡｂの濃度は細胞を加える後の段階で半分になることに注目されたい）。
４．５０ｕｌのＴＦ−１細胞を２×１０５／ｍｌで、無菌的な９６ウェル組織培養プレート中にプレートアウトする。１時間のプレインキュベーションののち、ＩＬ−１３および抗ヒトＩＬ−１３ｍＡｂ試料を細胞に加える。様々な抗ヒトＩＬ−１３ｍＡｂ希釈、組換えＩＬ−１３およびＴＦ−１細胞を含む最終的な１００ｕｌのアッセイ容量を、３７℃で〜７０時間、加湿ＣＯ２インキュベーター内でインキュベーションを行った。
５．〜６６時間後に、無菌的であり、細菌汚染が起こっていないことを確認するためにウェルの走査を行う。
６．１５ｕｌのフィルター滅菌したＭＴＴ基質／ウェル（カタログ番号Ｇ４０００、Ｐｒｏｍｅｇａ。製造者の指示に従って作製した）を加え、最終的な４時間のインキュベーションを行う。
７．１００ｕｌの停止溶液（ＭＴＴキットに提供される）を用いて反応を停止させて、代謝された青色ホルマザン産物を溶解させる。少なくとも２時間静置し、その後、ピペットで吸ったり吐いたりして結晶の溶解を手助けする。あるいは、プレートシーラーで覆い、４Ｃで終夜静置し、その後、翌日ピペットで吸ったり吐いたりする（ピペット操作に関してはこちらの方が容易である）
８．各ウェルの溶液の吸光度を、９６ウェルプレートリーダーで５７０ｎｍの波長で読み取る。
９．抗ヒトＩＬ−１３ｍＡｂがヒトまたはカニクイザルＩＬ−１３の生物活性を中和する能力は、定義した量のヒトまたはカニクイザルＩＬ−１３（５ｎｇ／ｍｌ）の生物活性を５０％中和するために必要な、抗ヒトＩＬ−１３ｍＡｂの濃度として表される（＝ＮＤ５０）。必要な濃度は低ければ低いほど、中和能は強力である。
【０３７６】
実施例：このアッセイのために設定した９６ウェルプレート
【表３０】
2008511542.tif 000037
【０３７７】
７．５．ヒトＩＬ−４結合ＥＬＩＳＡ
このアッセイでは、抗体とヒトＩＬ−４との結合を検出するＥＬＩＳＡについて記載する。これはサンドイッチＥＬＩＳＡ様式である。
【０３７８】
７．５．１  材料
１．Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ１Ｆ９６Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、４−３９４５４Ａ）
２．ヒトＩＬ−４（Ｒ＋Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号）
３．ヤギ抗ヒトＩＬ−４ポリクローナル抗体（Ｒ＋Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＡＦ−２０４−ＮＡ）
４．ビオチン標識したラット抗ヒトＩＬ−４モノクローナル抗体（ＢＤ／Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号）
５．抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｄａｋｏ、カタログ番号Ｐ０２６０）
６．抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ−９３０９）
７．炭酸／炭酸水素緩衝液（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ｃ−３０４１）
８．ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）
９．ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ−７０３０）
１０．ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ−９１８７）
１１．硫酸
【０３７９】
７．５．２  方法
１．ブロッキング溶液はＰＢＳＴ中３％のＢＳＡである
２．洗浄溶液はＰＢＳＴである
３．「Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ」ＥＬＩＳＡプレートを、炭酸／炭酸水素緩衝液中５０ｕｌの５ｕｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩＬ−４ポリクローナル抗体（Ｒ＋Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＡＦ−２０４−ＮＡ。製造者の指示に従って５００ｕｇ／ｍｌのストック濃度で作製し、アリコートで−２０Ｃで保存した）でコーティングし（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ｃ−３０４１、製造者の指示に従って作製した）、プレートシーラーで覆い、終夜４℃でインキュベーションを行う。
４．１００ｕｌの３％ＢＳＡ／ＰＢＳＴでブロッキングし、室温圧力（ｒｔｐ）で１時間インキュベーションを行う。
５．ＰＢＳＴで３回洗浄する（１回の洗浄あたり少なくとも２００ｕｌの洗浄溶液／ウェル）。
６．１ｎｇ／ｍｌ（５０ｕｌの容量で）ヒトＩＬ−４をブロッキング溶液中で加え、室温で１時間インキュベーションを行う。
７．ＰＢＳＴで３回洗浄する。
８．５０ｕｌの抗体試料（必要な場合は終点力価データを得るために滴定する）をブロッキング溶液中で加え、ｒｔｐで１時間インキュベーションを行う。ヒトＩＬ−４との結合の陽性対照として、ビオチン標識した抗ヒトＩＬ−４モノクローナル抗体（滴定済）を用いる。
９．ＰＢＳＴで３回洗浄する。
１０．６Ａ１マウスモノクローナル抗体には、５０ｕｌ／ウェルの抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ−９３０９）を１／１０００希釈でブロッキング溶液中、１時間ｒｔｐで用いて、結合を検出する。６Ａ１キメラ抗体またはヒト化抗体には、５０ｕｌ／ウェルの抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ−６０２９）を１／２０００希釈でブロッキング溶液中、１時間ｒｔｐで用いて、結合を検出する。陽性対照には、ビオチン標識したラット抗ヒトＩＬ−４モノクローナル抗体を用い、ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート抗体を用いて検出する。（あるいは、抗マウスＨＲＰ抗体、Ｐ０２６０によって、６Ａ１およびビオチン標識したラット抗ヒトＩＬ−４モノクローナル抗体がどちらも検出される）。
１１．ＰＢＳＴで３回洗浄する。
１２．１００ｕｌのＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ−９１８７。製造者の指示に従って作製した）で展開させ、５０ｕｌの３Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で停止させ、４９０ｎｍの吸光度で読み取る。
【０３８０】
７．６．エピトープマッピングＥＬＩＳＡ
このアッセイでは、マウスｍＡｂ  ６Ａ１とヒトまたはカニクイザルＩＬ−１３ペプチドとの結合を検出するＥＬＩＳＡについて記載する。
【０３８１】
７．６．１  材料
１．Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ１Ｆ９６Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、４−３９４５４Ａ）
２．ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（著作権）ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２１１２５）
３．ＰＢＳＴ（リン酸緩衝生理食塩水＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）
４．ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ−７０３０）
５．ヒトおよびカニクイザルＩＬ−１３の１６量体ペプチド、オフセット＝４（Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓカスタム注文）
６．陽性および陰性対照の２０量体ペプチド（Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓのカスタム注文から供給）
７．６Ａ１  ＭＡｂ
８．対照Ａｂ（Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓのカスタム注文から供給）
９．ウサギ抗マウスＩｇ  ＨＲＰコンジュゲート（ＤＡＫＯ、コード番号Ｐ０２６０）
１０．ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ−９１８７）
１１．３Ｍの硫酸
【０３８２】
７．６．２  方法
１．ブロッキング溶液は３％ＢＳＡ＋ＰＢＳＴである。
２．洗浄溶液はＰＢＳＴである。
３．ＰＢＳＴを希釈剤として用いて、「Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ」ＥＬＩＳＡプレートを、１００μｌの５μｇ／ｍｌのＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（著作権）ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２１１２５、製造者の指示に従って１ｍｇ／ｍｌのストック濃度で作製し、アリコートで＋４℃で保存した）でコーティングする。溶液を乾燥させるために終夜３７℃でインキュベーションを行う。
４．２００μｌの３％ＢＳＡ／ＰＢＳＴでブロッキングする。プレートシーラーを加え、ｒｔｐで１時間インキュベーションを行う。
５．ＰＢＳＴで３回洗浄する（１回の洗浄あたり少なくとも２００μｌの洗浄溶液／ウェル）。
６．２つ組でかつＰＢＳＴを希釈剤として用いて、１００μｌ／ウェル（対照ウェル以外）の１，０００倍希釈の各ペプチド（製造者の指示に従って２００μｌの４０％アセトニトリル６０％水に溶解し、その後、同じ溶媒で１０倍希釈にアリコート分割し、−２０℃で保存した）を加えた。
７．対照ウェルに、２つ組でかつＰＢＳＴを希釈剤として用いて、１００μｌ／ウェルの１０倍希釈の対照ペプチド（製造者の指示に従って１ｍｌの４０％アセトニトリル６０％水に溶解し、−２０℃で保存した）を加えた。プレートシーラーを加え、ｒｔｐで１時間、振盪台上でインキュベーションを行う。
８．ＰＢＳＴで３回洗浄する（１回の洗浄あたり少なくとも２００μｌの洗浄溶液／ウェル）。
９．１００μｌ／ウェル（対照ウェル以外）の１．５０６μｇ／ｍｌのマウスｍＡｂをＰＢＳＴ中で加える。
１０．対照ウェルのみに、１００μｌ／ウェルの４、１６および３２倍希釈の対照抗体（製造者によって供給されたとおりに使用し、−２０℃で保存した）を、ＰＢＳＴを希釈剤として用いて加える。プレートシーラーを加え、ｒｔｐ（室温および室内圧力）で１時間、振盪台上でインキュベーションを行う。
１１．ＰＢＳＴで３回洗浄する（１回の洗浄あたり少なくとも２００μｌの洗浄溶液／ウェル）。
１２．１００μｌ／ウェルの２，０００倍希釈のウサギ抗マウスＩｇ  ＨＲＰ−コンジュゲート（ＤＡＫＯ、コード番号Ｐ０２６０、供給されたとおりに使用し、＋４℃で保存した）を、ＰＢＳＴを希釈剤として用いて加える。プレートシーラーを加え、ｒｔｐで１時間、振盪台上でインキュベーションを行う。
１３．ＰＢＳＴで３回洗浄する（１回の洗浄あたり少なくとも２００μｌの洗浄溶液／ウェル）。
１４．１００μｌのＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ−９１８７。製造者の指示に従って作製した）で展開させ、５０μｌの３Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で停止させ、４９０ｎｍの吸光度で読み取る。展開時間は〜１０分間である。
【０３８３】
７．７．エピトープ精細マッピングＥＬＩＳＡ
このアッセイでは、ｍＡｂ  ６Ａ１とヒトまたはカニクイザルＩＬ−１３ペプチドとの結合を検出するＥＬＩＳＡについて記載する。
【０３８４】
７．７．１  材料
１．Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ１Ｆ９６Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、４−３９４５４Ａ）
２．ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（著作権）ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２１１２５）
３．ＰＢＳＴ（リン酸緩衝生理食塩水＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）
４．ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ−７０３０）
５．ヒトおよびカニクイザルＩＬ−１３パーシャルウィンドウネットペプチド（一度にＮ末端およびＣ末端の両方から１個のアミノ酸によって切断された１４量体；Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓカスタム注文）
６．陽性対照の１６量体ペプチド（以前のＭｉｍｏｔｏｐｅｓカスタム注文により供給）
７．６Ａ１  ｍＡｂ（所内で作製）
８．ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＦＣ特異的）ＨＲＰコンジュゲート抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａ−９３０９）
９．ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ−９１８７）
１０．３Ｍ硫酸
【０３８５】
７．７．２  方法
１．ブロッキング溶液は３％ＢＳＡ＋ＰＢＳＴである。
２．洗浄溶液はＰＢＳＴである。
３．「Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ」ＥＬＩＳＡプレートを、超純水（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２１１２５、製造者の指示に従ってストック濃度１ｍｇ／ｍｌで構成し、＋４℃で保存した）中の１００μｌの５μｇ／ｍｌのＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（著作権）ストレプトアビジンでコーティングする。終夜＋３７℃でインキュベーションを行う。
４．２００μｌのＰＢＳＴ中３％のＢＳＡでブロッキングする。プレートシーラーを加え、終夜＋４℃でインキュベーションを行う。
５．ＰＢＳＴで３回洗浄する（１回の洗浄あたり少なくとも２００μｌの洗浄溶液／ウェル）。
６．２つ組でかつＰＢＳＴ中３％のＢＳＡを希釈剤として用いて、１００μｌ／ウェルの１，０００倍希釈の各ペプチド（製造者の指示に従って２００μｌの４０％アセトニトリル６０％水に溶解し、−２０℃で保存した）を加える。プレートシーラーを加え、振盪台上で、室温で１時間インキュベーションを行う。
７．ＰＢＳＴで３回洗浄する（１回の洗浄あたり少なくとも２００μｌの洗浄溶液／ウェル）。
８．ＰＢＳＴ中３％のＢＳＡで希釈した１００μｌ／ウェルの３μｇ／ｍｌの６Ａ１を加える。プレートシーラーを加え、振盪台上で、室温で１時間インキュベーションを行う。
９．ＰＢＳＴで３回洗浄する（１回の洗浄あたり少なくとも２００μｌの洗浄溶液／ウェル）。
１０．１００μｌ／ウェルの１，０００倍希釈のヤギ抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ−コンジュゲート抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａ−９３０９、供給されたとおりに使用し、＋４℃で保存した）を、ＰＢＳＴ中３％のＢＳＡを希釈剤として用いて加える。プレートシーラーを加え、振盪台上で、室温で１時間インキュベーションを行う。
１１．ＰＢＳＴで３回洗浄する（１回の洗浄あたり少なくとも２００μｌの洗浄溶液／ウェル）。
１２．１００μｌのＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ−９１８７。製造者の指示に従って作製した）で展開させ、５０μｌの３Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で停止させ、４９０ｎｍの吸光度で読み取る。展開時間は〜１０分間である。
【０３８６】
７．８  ＩＬ１３抗体対完全長ＩＬ１３におけるＢｉａｃｏｒｅ（商標）方法のヒト化構築体
動力学解析は、抗体捕捉方法を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００機器で行った。手短に述べると、キメラ６Ａ１およびヒト化抗体の構築体にはタンパク質Ａ捕捉を用い、親ネズミ６Ａ１抗体では、Ｂｉａｃｏｒｅから供給された抗マウスＦｃ抗体によって捕捉を行った。
【０３８７】
手短に述べると、方法は以下のとおりである。Ｂｉａｃｏｒｅの標準プロトコルに従い、Ｂｉａｃｏｒｅの第一級アミンカップリングキットに供給される試薬を用いて、第一級アミンカップリングによって捕捉リガンドをＣＭ５バイオセンサーチップに固定した。この方法は、５０ｍＭのＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＮＨＳ）および２００ｍＭのＮ−エチル−Ｎ’−ジメチルアミノプロピルカルボナイド（ＥＤＣ）の溶液を表面に通過させることによってＣＭ５センサー表面の活性化を含む。その後、捕捉リガンド（酢酸緩衝液ｐＨ５またはｐＨ４．５に溶解）を活性センサー表面にカップリングさせ、その後、依然として活性のあるすべてのエステルを１Ｍの塩酸エタノールアミン、ｐＨ８．５を注入することによってブロッキングした。
【０３８８】
その後、ヒトまたはマウス由来であったに応じて候補抗体をタンパク質Ａまたは抗マウスＦｃ抗体表面上に通過させ、捕捉した。安定した結合シグナルが見られたのち、様々な定義した濃度でＩＬ１３を捕捉した抗体表面上に通過させた。その結果生じた結合曲線をＢｉａｃｏｒｅ解析ソフトウェアＢＩＡｅｖａｌ  ｖ４．１で解析して動力学を決定した。実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を用いて実施した。
【０３８９】
７．８．１  ＩＬ−１３抗体対ペプチドのＢｉａｃｏｒｅ（商標）方法
抗体と固定したＩＬ−１３ペプチドとの直接結合を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００機器で動力学の解析を行った。手短に述べると、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＳＡ（ストレプアビジン）バイオセンサーチップを用いてＩＬ−１３ビオチン標識したペプチドを捕捉した。その後、様々な濃度で抗体をセンサー表面上に通過させた。その結果生じた結合曲線をＢｉａｃｏｒｅ解析ソフトウェアＢＩＡｅｖａｌ４．１で解析して動力学を決定した。実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を用いて実施した。
【０３９０】
８．カニクイザル喘息モデルにおけるＬ１＋Ａ１ヒト化抗ＩＬ−１３ｍＡｂの有効性。
このセクションは仮説的である。
【０３９１】
カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）におけるブタ回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）誘発性の（Ａ．ｓｕｕｍ）肺気管支収縮のモデルは、ヒトの喘息の非臨床モデルとして、またはそれに関連すると認識されている（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  Ｒら、Ｔｒａｎｓ．Ａｓｓｏｃ．Ａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ、１９８０、９３：３１７〜３２５；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  Ｒら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１９８３、１０１：８６４〜８７２）。
【０３９２】
このモデルでは、喘息応答を誘発させるために、Ａ．ｓｕｕｍに対して生まれつきの肺感受性を有する動物を噴霧化したＡ．ｓｕｕｍに曝す。この喘息応答は、気道応答性亢進（ＡＨＲ）、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中で測定された細胞浸潤および血清ＩｇＥレベルを測定することによって特徴づけることができる。実験方法は、Ｍａｕｓｅｒ  Ｐら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．、１９９５、２０４：４６７〜４７２およびＥｖａｎｏｆｆ  Ｈら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１９９２、２１：３９によって以前に記述されているものと類似している。
【０３９３】
この研究では、Ａ．ｓｕｕｍ抗原の特定の用量に対して陽性の気管支収縮剤応答性を有すると実証された、侵入用に事前に選択した３０匹の動物を用いる。
【０３９４】
Ａ．ｓｕｕｍを、各動物の最適な応答用量（ＯＲＤ）で投与する。これは、エアロゾル吸入（噴霧器を用いて１５回の呼吸にわたって与える単一用量）によって少なくとも４０％のＲＬ（肺抵抗）の増加および少なくとも３５％のＣＤＹＮ（ダイナミックコンプライアンス）の減少をもたらす、事前に決定したＡ．ｓｕｕｍの用量である。
【０３９５】
この研究は２段階で行う。第１段階では、Ａ．ｓｕｕｍ抗原の投与（９日目および１０日目、Ａ．ｓｕｕｍを各動物に最適な事前に決定した用量でエアロゾル吸入によって投与する）の前（１日目のベースライン肺機能評価）および後（１１日目）に、静脈内（ｉ／ｖ）ヒスタミンチャレンジ（すなわち、ベースラインを少なくとも３０％超えるＲＬの増加を誘導するために十分なヒスタミンの用量（ＰＣ３０））に応答してＡＨＲを評価する。
【０３９６】
第２段階は、動物に抗体を用いた治療を与える以外は第１段階と同一であり（以下参照）、各抗体は、ｉ／ｖインフュージョンによって３回の約３０ｍｇ／ｋｇの用量として１日目、５日目および９日目に投与する。
【０３９７】
グループ１（ｎ＝１２）：Ｌ１＋Ａ１（ヒト化抗ＩＬ−１３ｍＡｂ、配列番号１８および配列番号２２）
グループ２（ｎ＝１２）：Ｌ１＋Ａ１（ヒト化抗ＩＬ−１３ｍＡｂ、３０ｍｇ／ｋｇ）およびパソコリズマブ（ヒト化抗ＩＬ４  ｍＡｂ、３０ｍｇ／ｋｇ）
グループ３（ｎ＝６）：ビヒクル単独の陰性対照治療
【０３９８】
第１段階および第２段階からのＡＨＲの読取値は、Ｂｕｘｃｏ肺力学系を用いて、ヒスタミンに応答した圧力および空気流の読取値、すなわち肺抵抗（ＲＬ）およびダイナミックコンプライアンス（ＣＤＹＮ）を採ることによって計算する。Ａ．ｓｕｕｍ抗原チャレンジ後［肺抵抗（ＲＬ）およびダイナミックコンプライアンス（ＣＤＹＮ）］と比較したベースラインからの最大変化率を第１段階および第２段階、すなわち抗体治療を行ったまたは行わない場合について比較し、これらのデータを用いてＡＨＲ表現型を評価する。
【０３９９】
さらに、第１段階および第２段階の１日目および１１日目にＢＡＬ試料を採取して、細胞浸潤、具体的には好酸球増加症を測定する。ＩｇＥレベルを監視するために血清試料も採取する。
【０４００】
【表３１】
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【図面の簡単な説明】
【０４０１】
【図１】高い濃度での（at increasing concentration）モノクローナル抗体６Ａ１と、組換えイー・コリ発現のヒトＩＬ−１３との結合を説明するサンドウィッチエライザを示す。
【図２ａ】組換えイー・コリ発現のヒトＩＬ−１３のヒトＩＬ−１３受容体α１鎖との結合を阻害する、高い濃度でのモノクローナル抗体６Ａ１の能力を説明するエライザを示す。
【図２ｂ】組換えイー・コリ発現のヒトＩＬ−１３のヒトＩＬ−１３受容体α２鎖との結合を阻害する、高い濃度でのモノクローナル抗体６Ａ１の能力を説明するエライザを示す。
【図３】ＴＦ−１細胞増殖アッセイにて組換えイー・コリ発現のヒトおよびカニクイザルの生物活性を阻害する、高い濃度での６Ａ１の能力を説明する中和アッセイを示す。
【図４】ＴＦ−１細胞増殖アッセイにて哺乳動物発現の（ＣＨＯ細胞）ヒトＩＬ−１３の生物活性を阻害する、高い濃度での６Ａ１の能力を説明する中和アッセイを示す。
【図５】ＴＦ−１細胞増殖アッセイにて組換えイー・コリ発現のＱ１３０ヒトＩＬ−１３の生物活性を阻害する、高い濃度での６Ａ１の能力を説明する中和アッセイを示す。
【図６】６Ａ１が組換えイー・コリ発現のヒトＩＬ−４と結合しないことを説明するサンドウィッチエライザを示す。
【図７】６Ａ１がＴＦ−１細胞増殖アッセイにて組換えイー・コリ発現のヒトＩＬ−５の生物活性を阻害しないことを説明するＩＬ−５中和アッセイを示す。
【図８】高い濃度での、キメラ６Ａ１ｍＡｂと、組換えイー・コリ発現のヒトＩＬ−１３およびカニクイザルＩＬ−１３との結合を説明するサンドウィッチエライザを示す。
【図９】高い濃度での、８種のヒト化抗−ヒトＩＬ−１３ｍＡｂと、組換えイー・コリ発現のヒトＩＬ−１３との結合を説明するサンドウィッチエライザを示す。
【図１０ａ】高い濃度での、キメラ６Ａ１、Ｌ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１と、組換えイー・コリ発現のヒトＩＬ−１３との結合を説明するサンドウィッチエライザを示す。
【図１０ｂ】高い濃度での、キメラ６Ａ１、Ｌ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１と、組換えイー・コリ発現のカニクイザルＩＬ−１３との結合を説明するサンドウィッチエライザを示す。
【図１１】高い濃度での、キメラ６Ａ１ｍＡｂ、Ｌ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１と、ネイティブヒトＩＬ−１３との結合を説明するサンドウィッチエライザを示す。
【図１２ａ】組換えイー・コリ発現のヒトＩＬ−１３のヒトＩＬ−１３受容体α１鎖との結合を阻害する、高い濃度でのモノクローナル抗体６Ａ１、キメラ６Ａ１、Ｌ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１の能力を説明するエライザを示す。
【図１２ｂ】組換えイー・コリ発現のヒトＩＬ−１３のヒトＩＬ−１３受容体α２鎖との結合を阻害する、高い濃度でのモノクローナル抗体６Ａ１、キメラ６Ａ１、Ｌ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１の能力を説明するエライザを示す。
【図１３ａ】ＴＦ−１細胞増殖アッセイにて組換えイー・コリ発現のヒトＩＬ−１３の生物活性を阻害する、高い濃度での６Ａ１、キメラ６Ａ１、Ｌ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１の能力を説明する中和アッセイを示す。
【図１３ｂ】ＴＦ−１細胞増殖アッセイにて組換えイー・コリ発現のカニクイザルＩＬ−１３の生物活性を阻害する、高い濃度での６Ａ１、キメラ６Ａ１、Ｌ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１の能力を説明する中和アッセイを示す。
【図１３ｃ】ＴＦ−１細胞増殖アッセイにて組換えイー・コリ発現のＱ１３０ヒトＩＬ−１３の生物活性を阻害する、高い濃度での６Ａ１、キメラ６Ａ１、Ｌ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１の能力を説明する中和アッセイを示す。
【図１３ｄ】ＴＦ−１細胞増殖アッセイにて哺乳動物発現の（ＣＨＯ細胞）ヒトＩＬ−１３の生物活性を阻害する、高い濃度での６Ａ１、キメラ６Ａ１、Ｌ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１の能力を説明する中和アッセイを示す。
【図１４ａ】６Ａ１、キメラ６Ａ１、Ｌ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１が組換えイー・コリ発現のヒトＩＬ−４と結合しないことを説明するサンドウィッチエライザを示す。
【図１４ｂ】６Ａ１、キメラ６Ａ１、Ｌ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１が組換えイー・コリ発現のヒトＧＭ−ＣＳＦと結合しないことを説明するサンドウィッチエライザを示す。
【図１４ｃ】６Ａ１、キメラ６Ａ１、Ｌ１＋Ａ１およびＬ２＋Ａ１がＴＦ−１細胞増殖アッセイにて組換えイー・コリ発現のヒトＩＬ−５の生物活性を阻害しないことを説明するＩＬ−５中和アッセイを示す。
【図１５】ヒトおよびカニクイザルＩＬ−１３にある６Ａ１についての結合エピトープを決定するためのエピトープ地図作製を示す。
【図１６ａ】ヒトＩＬ−１３にある６Ａ１の精密な（fine）結合特異性を同定するためのエピトープ地図作製エライザを示す。
【図１６ｂ】カニクイザルＩＬ−１３にある６Ａ１の精密な（fine）結合特異性を同定するためのエピトープ地図作製エライザを示す。
【図１７ａ】６Ａ１がヒトＩＬ−１３に結合するのに必要とされる鍵となるアミノ酸残基を測定するためのエピトープ地図作製エライザを示す。
【図１７ｂ】Ｌ１＋Ａ１がヒトＩＬ−１３に結合するのに必要とされる鍵となるアミノ酸残基を測定するためのエピトープ地図作製エライザを示す。
【図１７ｃ】親（ネズミ）６Ａ１（図１７ｃ）およびヒト化Ｌ１−Ａ１抗体についてアラニンのスキャン分析を説明するグラフを示す。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１３ｄ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１５】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
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【図１７ｄ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年6月12日(2007.6.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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