(57)【要約】ＤＣ−ＳＩＧＮに対する抗体が開示され、この抗体は樹状細胞とＴ細胞との相互作用を調節し得る。いくつかの実施形態において、この抗体は、樹状細胞とＴ細胞との相互作用を阻害する。他の実施形態において、この抗体は、樹状細胞中に内在化され、かつＴ細胞に提示されるペプチドと組み合わされ、それによってこのペプチドに対して免疫応答を生じる。いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、ウイルス結合、ウイルス感染およびウイルス伝播を遮断することについて有用であり得る。
2008504222.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む抗体であって、ここで、該抗体は、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮに結合する、抗体。
【請求項２】
前記抗体に付着するペプチドをさらに含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記ペプチドが抗原を含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗原が癌抗原を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
請求項３に記載の抗体を含むワクチン。
【請求項６】
請求項４に記載の抗体を含むワクチン。
【請求項７】
請求項１に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
【請求項８】
前記抗体が、ヒト化抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体が、ｓｃＦｖである、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
ＳＮＤＧＹＹＳ（配列番号４７）；ＲＹＹＬＧＶＤ（配列番号４８）；ＤＤＳＧＲＦＰ（配列番号４９）；ＹＧＹＡＶＤＹ（配列番号５０）、ＹＹＧＩＹＶＤＹ（配列番号５１）、ＦＬＶＹ（配列番号５２）、ＮＦＧＩＬＧＹ（配列番号５３）、ＹＰＮＡＬＤＹ（配列番号５４）およびＧＬＫＳＦＹＡＭＤＨ（配列番号５５）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むヒトＤＣ−ＳＩＧＮに結合する、抗体。
【請求項１１】
前記アミノ酸配列が、前記抗体の重鎖ＣＤＲ３中に現れる、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
ＱＨＦＷＮＴＰＷＴ（配列番号４５）；ＱＱＧＨＴＬＰＹＴ（配列番号４６）；ＱＱＧＫＴＬＰＷＴ（配列番号５６）、ＱＱＧＮＴＬＰＰＴ（配列番号５７）、ＱＱＨＹＩＴＰＬＴ（配列番号５８）、ＱＱＹＧＮＬＰＹＴ（配列番号５９）、ＱＱＹＹＳＴＰＲＴ（配列番号６０）、ＧＱＳＹＮＹＰＰＴ（配列番号６１）およびＷＱＤＴＨＦＰＨＶ（配列番号６２）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むヒトＤＣ−ＳＩＧＮに結合する、抗体。
【請求項１３】
前記アミノ酸配列が、前記抗体の軽鎖ＣＤＲ３中に現れる、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
ＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞およびＩＣＡＭ発現細胞の相互作用に干渉するための方法であって、該方法は、請求項１に記載の抗体の免疫調節有効量を被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１５】
免疫応答を生成するための方法であって、該方法は、請求項２に記載の抗体の免疫調節有効量を被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１６】
ＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞およびＩＣＡＭ発現細胞の相互作用に干渉するための方法であって、該方法は、請求項１０に記載の抗体の免疫調節有効量を被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１７】
ＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞およびＩＣＡＭ発現細胞の相互作用に干渉するための方法であって、該方法は、請求項１２に記載の抗体の免疫調節有効量を被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１８】
抗原をＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞に送達するための方法であって、該方法は、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む抗体に、該抗原を付着させる工程を包含し、ここで、該抗体は、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮに結合する、方法。
【請求項１９】
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む細胞上のＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体であって、該抗体は、ＨＩＶ、ＨＣＶ、エボラウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ＣＭＶ、シンドビスウイルスおよびデングウイルスからなる群より選択されるウイルスの、該細胞への結合を有効に遮断し得る、抗体。
【請求項２０】
前記抗体がまたＬ−ＳＩＧＮに結合する、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２１】
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む細胞上のＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体であって、該抗体は、ＨＩＶ、ＨＣＶ、エボラウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ＣＭＶ、シンドビスウイルスおよびデングウイルスからなる群より選択されるウイルスによる該細胞の感染を有効に遮断し得る、抗体。
【請求項２２】
前記抗体がまたＬ−ＳＩＧＮに結合する、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む細胞上のＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体であって、該抗体は、ＨＩＶ、ＨＣＶ、エボラウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ＣＭＶ、シンドビスウイルスおよびデングウイルスからなる群より選択されるウイルスの、該細胞から別の細胞への伝播を有効に遮断し得る、抗体。
【請求項２４】
前記抗体がまたＬ−ＳＩＧＮに結合する、請求項２３に記載の抗体。
【請求項２５】
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む細胞上のＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体であって、該抗体は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  Ｂｏｖｉｓからなる群より選択される細菌の、該細胞への結合を有効に遮断し得る、抗体。
【請求項２６】
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む細胞上のＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体であって、該抗体は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  Ｂｏｖｉｓからなる群より選択される細菌による該細胞の感染を有効に遮断し得る、抗体。
【請求項２７】
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む細胞上のＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体であって、該抗体は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  Ｂｏｖｉｓからなる群より選択される細菌の、該細胞から別の細胞への伝播を有効に遮断し得る、抗体。
【請求項２８】
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む細胞上のＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体であって、該抗体は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｐｉｆａｎｏｉおよびＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉからなる群より選択される寄生生物の、該細胞への結合を有効に遮断し得る、抗体。
【請求項２９】
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む細胞上のＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体であって、該抗体は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｐｉｆａｎｏｉおよびＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉからなる群より選択される寄生生物による該細胞の感染を有効に遮断し得る、抗体。
【請求項３０】
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む細胞上のＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体であって、該抗体は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｐｉｆａｎｏｉおよびＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉからなる群より選択される寄生生物の、該細胞から別の細胞への伝播を有効に遮断し得る、抗体。
【請求項３１】
ＤＣ−ＳＩＧＮ発現の増加によって特徴付けられる腫瘍に対する診断剤であって、該診断剤は、ＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体を含む、診断剤。
【請求項３２】
請求項３１の診断剤を含む、診断キット。
【請求項３３】
癌を診断するための方法であって、該方法は：
癌を有している疑いのある被験体から組織サンプルを得る工程：および
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体と、該組織サンプルが結合する程度を決定する工程を包含し、
ここで、対応する正常組織と比較して、結合の程度の増加が、癌の存在を示す、
方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、ここで、前記決定する工程が、ＤＣ−ＳＩＧＮの存在について染色する工程を包含する、方法。
【請求項３５】
ＤＣ−ＳＩＧＮ発現の増加によって特徴付けられる癌を処置するための治療剤であって、該治療剤は、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体を含む、治療剤。
【請求項３６】
癌を処置するための方法であって、該方法は、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体を含む、癌細胞を死滅させる量の組成物を被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３７】
前記ＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体が、癌細胞の抗体依存性細胞性細胞傷害を誘導する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体が、癌細胞の補体依存性細胞傷害を誘導する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体が、ＤＣ−ＳＩＧＮ発現癌細胞を介する免疫系の負の調節を防ぐ、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗体が毒素に融合される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗体が高エネルギー放射線エミッターに融合される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
炎症性疾患を処置するための方法であって、該方法は、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体を含む、樹状細胞を死滅させる量の組成物を被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４３】
前記ＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体が、樹状細胞の抗体依存性細胞性細胞傷害を誘導する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体が、樹状細胞の補体依存性細胞傷害を誘導する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体が、ＤＣ−ＳＩＧＮ発現樹状細胞を介する免疫系の負の調節を防ぐ、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記抗体が毒素に融合される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記抗体が高エネルギー放射線エミッターに融合される、請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００３年１２月１５日出願の米国仮特許出願番号第６０／５２９，５１７号に対する優先権を主張し、この仮特許出願の開示の全体が、本明細書において援用される。
【０００２】
（技術分野）
本開示は、動物において免疫応答を調節する（例えば、増加または減少させる）ことに有用な組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
樹状細胞（ＤＣ）は、プロフェッショナルな抗原提示細胞であり、抗原を末梢組織において捕捉し、そして所属リンパ節（ｄｒａｉｎｉｎｇ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ）および脾臓のＴ細胞領域へリンパ液または血液を介して移動する。これらは、処理された抗原をナイーブＴ細胞へ提示し、抗原特異性一次Ｔ細胞応答を開始する。ＤＣは、休止Ｔ細胞と相互作用しそして休止Ｔ細胞を活性化するそれらの能力において独特である。
【０００４】
ナイーブＴ細胞は、高発現のＩＣＡＭ−３によって特徴付けられ、このＩＣＡＭ−３は、ＩｇＧ超遺伝子ファミリーのメンバーであり、そして活性化後に急速にダウンレギュレートされる（非特許文献１）。
【０００５】
Ｃ型レクチンは、広範囲の生物学的機能を有するカルシウム依存性炭水化物結合タンパク質であり、その機能の多くは免疫に関連している。近年、新規のＩＣＡＭ−３結合Ｃ型レクチン（インテグリンでないものを捕捉するＤＣ特異性ＩＣＡＭ−３またはＤＣ−ＳＩＧＮとして公知である）が見出された。ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＤＣ上で発現され、そして樹状細胞とナイーブＴ細胞上のＩＣＡＭ−３との間の接着を媒介するように見られ、そしてＤＣ誘導Ｔ細胞の増殖について不可欠であるように見られる（非特許文献２；非特許文献３）。ＤＣ−ＳＩＧＮへの抗体の結合は、内在化をもたらし得る（非特許文献４）。
【０００６】
特許文献１（その内容が本明細書において参考として援用されている）は、例えば、ＤＣ−ＳＩＧＮに対して特異的である抗体を使用することによって、Ｔ細胞上のレセプターと樹状細胞上のＤＣ−ＳＩＧＮとの相互作用を防ぐことにより、免疫応答が阻害され得るかまたは防がれ得ることを開示する。あるいは、抗原に対する免疫応答は、抗原を樹状細胞上のＤＣ−ＳＩＧＮに結合することによって増強され得、それゆえ、抗原に加えてＤＣ−ＳＩＧＮが、樹状細胞によって取りあげられ、そして処理され、そしてＴ細胞に提示される。
【０００７】
ＤＣ−Ｔ細胞クラスタリングおよびＴ細胞の応答の開始におけるその顕著な役割の他に、ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＤＣの感染、ならびに、その後のウイルス（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ−１、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、エボラウイルス、ＳＡＲＳウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シンドビスウイルス、およびデングウイルス）；細菌（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎａｅ、およびミコバクテリア属の細菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭ．ｂｏｖｉｓが挙げられる））；酵母（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）；および寄生生物（例えば、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｐｉｆａｎｏｉおよびＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ）のＴ細胞への伝播に関与する主要なレセプターである。
【０００８】
免疫監視細胞としての体表面におけるＤＣの位置に起因して、ＤＣは粘膜に曝露した後にこれらのウイルスによって感染される最初の細胞であり、それゆえ、これらのウイルスによってもたらされる疾患の免疫性の病因において重要な役割を果たすと考えられる。現在、一般的に、これらのウイルス（例えば、ＨＩＶ）が、リンパ節中へ進入し、そしてＣＤ４＋Ｔ細胞へのアクセスを獲得するために、ＤＣの正常な輸送プロセスを変換すると考えられている。例えば、ＨＩＶ−１によるＤＣの増殖的感染が、何人かの研究者によって報告されており（非特許文献５；非特許文献６）、そして実質的な証拠は、インビトロでＨＩＶ−１でパルス化されたＤＣが、Ｔ細胞と同時培養される場合に強力な感染を誘導し得ることを示す（非特許文献７）。類似のシナリオがＨＩＶに感染した個体に起こるか否か未だはっきりしないが、ＤＣからＴ細胞へのＨＩＶ−１伝播は、ＡＩＤＳにおいて観察されたＣＤ４＋Ｔ細胞の減少に寄与し得る。したがって、これらのウイルス（例えば、ＨＩＶ−１）および休止Ｔ細胞は、ＤＣと相互作用するために、類似の高度に発現されたレセプターを利用する。
【特許文献１】国際公開第００／６３２５１号パンフレット
【非特許文献１】Ｖａｚｅｕｘら、「Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＩＣＡＭ−Ｒ」、Ｎａｔｕｒｅ、１９９２年、３６０号、ｐ．４８５−４８８
【非特許文献２】Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＣ−ＳＩＧＮ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩＣＡＭ−３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ」、Ｃｅｌｌ、２０００年、１００巻、５号、ｐ．５７５−５８５
【非特許文献３】Ｓｔｅｉｎｍａｎ，「ＤＣ−ＳＩＧＮ：Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｓｏｍｅ  ｍｙｓｔｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ」、Ｃｅｌｌ、２０００年、１００巻、５号、ｐ．４９１−４９４
【非特許文献４】Ｅｎｇｅｒｉｎｇら、「Ｔｈｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＤＣ−ＳＩＧＮ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｓ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｆｏｒ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ」、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００２年、１６８号、ｐ．２１１８
【非特許文献５】Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、１９９８年、７２巻、４号、ｐ．２７３３−７
【非特許文献６】Ｂｌａｕｖｅｌｔら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、１９９７年、３巻、１２号、ｐ．１３６９−７５
【非特許文献７】Ｃａｍｅｒｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９２年、２５７巻、５０６８号、ｐ．３８３−７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
動物において免疫応答を増加または減少させることに有用な特定の組成物が、依然として所望される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（要旨）
本開示は、新規の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体に関し、この抗体は、動物の免疫応答を調節するのに有用であり得る。
【００１１】
１つの実施形態において、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体は、ＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞とＩＣＡＭ発現細胞との相互作用に干渉する。より具体的には、この実施形態において、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体は、樹状細胞の表面のＣ型レクチンレセプターの、Ｔ細胞の表面のＩＣＡＭレセプターへの接着を減少する。この付着を調節することによって、樹状細胞−Ｔ細胞相互作用が影響され得る。そのような相互作用としては、クラスター形成、および抗原提示、ならびに、その上に依存する一次Ｔ細胞応答が挙げられ、免疫応答の調節をもたらす。
【００１２】
別の実施形態において、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体は、ＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞の移動に影響を及ぼす。
【００１３】
別の実施形態において、本開示の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体は、アゴニストとして作用し、それによって、動物においてＴ細胞の応答を促進し得る。
【００１４】
別の実施形態において、本開示の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体はまた、特定のペプチド（特に、抗原）に対する免疫応答を促進するために使用され得る。そのような場合において、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体はペプチドに付着され、そしてこの２つの組み合わせが動物に投与される。この抗体はそのペプチドを樹状細胞に導き、この樹状細胞は、このペプチドを内在化し、次いで、樹状細胞表面のペプチドをＴ細胞に提示し、それによってこのペプチドに対する免疫応答を生じる。この場合において、この抗体は、ワクチン（癌ワクチンを含む）として有用であり得る。
【００１５】
さらに別の実施形態において、本開示の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体は、ＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞に対する毒素で標識され得る。次いで、毒素で標識された抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体の投与は、ＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞のレベルを減少させるために利用され得、いくつかの例において、この細胞は、例えば、自己免疫疾患の処置において有用であり得る。
【００１６】
別の実施形態において、本開示の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体は、ウイルス（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ−１、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、エボラウイルス、ＳＡＲＳウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シンドビスウイルス、およびデングウイルス）；細菌（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎａｅ、およびミコバクテリア属の細菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭ．ｂｏｖｉｓが挙げられる））；酵母（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）；および寄生生物（例えば、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｐｉｆａｎｏｉおよびＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ）による樹状細胞の感染を阻害する。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体は、上に参照されたウイルスによって引き起こされる疾患に対するワクチンとして利用され得る。さらなる実施形態において、本開示の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体は、ＨＩＶ感染および類似の免疫系の障害の処置において、ならびに、移植後の移植片に対する免疫応答を調節するために使用され得る。
【００１８】
本開示の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体はまた、ＤＣ−ＳＩＧＮ発現と関連する腫瘍型のための通常の診断法として利用され得、そしていくつかの実施形態において、診断キットの一部として提供され得る。
【００１９】
本開示の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体はまた、ＤＣ−ＳＩＧＮ発現と関連する癌および腫瘍型の処置のための治療法として利用され得る。
【００２０】
いくつかの実施形態において、本開示の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体は、ヒト化抗体であり得る。他の実施形態において、本開示の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体は、ｓｃＦｖであり得る。
【００２１】
さらに他の実施形態において、本開示の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体はまた、Ｌ−ＳＩＧＮに結合し得る。
【００２２】
本開示のさらなる実施形態は、組成物を使用し、そして／または上に記載されたような方法を包含する、予防技術および診断技術に関する。薬学的に受容可能なキャリア中に本開示の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体を含む組成物もまた、提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本開示は、ＤＣ−ＳＩＧＮに対して指向された抗体が、樹状細胞とＴ細胞との相互作用を調節し得るという知見に基づく。概して、本開示の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体は、ＤＣ−ＳＩＧＮまたはその天然の改変体またはその等価物に結合、接着し（好ましくは可逆的様式において）、またはＤＣ−ＳＩＧＮまたはその天然の改変体またはその等価物に対するリガンドとして役立ち得る。いくつかの実施形態において、本開示の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体はまた、Ｌ−ＳＩＧＮに結合し得る。
【００２４】
ＤＣ−ＳＩＧＮのアミノ酸配列は公知であり、そして、例えば、国際公開第００／６３２５１号の配列番号１および図９に示されるように報告される。
【００２５】
本開示に従って、抗ＣＤ−ＳＩＧＮ抗体は、好ましくは、ＤＣ−ＳＩＧＮかまたはＤＣ−ＳＩＧＮの部分、フラグメントもしくはエピトープに対して指向される抗体を含む。本明細書において使用される場合、用語、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体および単鎖抗体、ならびに、フラグメント（Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｃ）およびＦａｂ発現ライブラリを含む。そのようなＤＣ−ＳＩＧＮに対する抗体は、本明細書の以下に記載されるように、またはそれ自体公知である任意の他の様式（例えば、国際公開第９５／３２７３４号、同第９６／２３８８２号、同第９８／０２４５６号、同第９８／４１６３３号および／または同第９８／４９３０６号に記載されるようなもの）において得られ得る。
【００２６】
例えば、ポリクローナル抗体は、適切な宿主（例えば、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ラット、ブタまたはマウス）をＤＣ−ＳＩＧＮまたはその免疫原性部分、そのフラグメントまたはその融合物を用いて、必要に応じて、免疫原性キャリア（例えば、ウシ血清アルブミン）および／またはアジュバント（例えば、フロイントアジュバント、サポニン、ＩＳＣＯＭ、水酸化アルミニウムまたは類似のミネラルゲル、またはキーホールリンペットへモシアニン、または類似の表面活性物質）の使用と共に、免疫することによって得られ得る。ＤＣ−ＳＩＧＮに対する免疫応答が生じた後（通常１〜７日以内）、それ自体公知の様式において、この抗体は、免疫された動物から採取された血液または血清から単離され得、この様式は、公知の免疫アッセイ技術を使用して、所望の特性（すなわち、特異性）を有する抗体についてスクリーニングする工程を必要に応じて包含し得、このことについては、国際公開第９６／２３８８２号を再度参照のこと。
【００２７】
培養中の連続した細胞株（ハイブリドーマを含む）および上に引用された参考文献に本質的には記載される類似の技術を再度使用して、モノクローナル抗体は、産生され得る。さらなる局面において、本開示は、ＤＣ−ＳＩＧＮに対する抗体（好ましくはモノクローナル抗体）を産生する細胞株（例えば、ハイブリドーマ）を提供する。
【００２８】
１つの実施形態において、本開示の抗体は、軽鎖を含む。本明細書において使用される場合、「軽鎖」とは、１つの可変ドメイン（ＶＬ）および１つの定常ドメイン（ＣＬ）またはそれらのフラグメントからなる抗体分子のより小さいポリペプチドを意味する。別の実施形態において、その抗体の一部は、重鎖を含む。本明細書において使用される場合、「重鎖」とは、１つの可変ドメイン（ＶＨ）および３つまたは４つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）またはそれらのフラグメントからなる抗体分子のより大きいポリペプチドを意味する。
【００２９】
別の実施形態において、上記抗体は、抗体のＦａｂ部分を含む。本明細書において使用される場合、「Ｆａｂ」とは、１つの軽鎖および重鎖の一部からなる免疫グロブリンの一価の抗原結合フラグメントを意味する。それは、短期間のパパイン消化によってかまたは組換え方法によって得られ得る。別の実施形態において、抗体の一部は、抗体のＦ（ａｂ’）２部分を含む。本明細書において使用される場合、「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」とは、両方の軽鎖と両方の重鎖の部分からなる免疫グロブリンの二価の抗原結合フラグメントを意味する。それは、短期間のペプシン消化かまたは組換え方法によって得られ得る。他の実施形態において、抗体は、Ｆａｂ’フラグメントであり得る。例えば、Ｆａｂ発現ライブラリは、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：１２７５（１９８９）の方法によって得られ得る。
【００３０】
さらに、「ヒト化」抗体は、例えば、国際公開第９８／４９３０６号に記載されるように使用され得る。本明細書において使用される場合、「ヒト化」抗体とは、ＣＤＲの外側のアミノ酸が、対応するヒト免疫グロブリン分子由来のアミノ酸で置換される抗体である。「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」とは、抗体の可変ドメインにおけるアミノ酸が高度に変動する配列を意味する。米国特許番号第５，２２５，５３９号は、ヒト化抗体の産生のための１つのアプローチを記載する。組換えＤＮＡ技術がヒト化抗体を産生するために使用され得、ここで、１つの免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲが、異なる特異性を有する免疫グロブリン由来のＣＤＲで置換され、それゆえ、そのヒト化抗体は、所望の標的を認識するが、ヒト被験体の免疫系によっては顕著な方法で認識されない。具体的には、部位指向性の突然変異誘発が、ＣＤＲをそのフレームワーク上に接ぐために使用される。
【００３１】
抗体をヒト化するための他のアプローチが、米国特許番号第５，５８５，０８９号および同第５，６９３，７６１号および国際公開第９０／０７８６１号パンフレット中に記載される。これらの抗体は、１つ以上のＣＤＲ、およびドナー免疫グロブリン由来のさらなるアミノ酸、および受容しているヒト免疫グロブリン由来のフレームワーク領域を有する。具体的には、これらの特許文献は、ヒト免疫グロブリンフレームワーク領域および定常領域と、マウスモノクローナル抗体のＣＤＲを組み合わせることによってレセプターへ結合するヒト化抗体の調製を記載する。ヒトフレームワーク領域は、マウス配列との相同性を最大にするように選択され得る。コンピューターモデルが、フレームワーク領域におけるアミノ酸を同定するために使用され得、これらのアミノ酸は、ＣＤＲまたは特異的抗原と相互作用すると考えられ、次いで、マウスアミノ酸はヒト化抗体を作製するためにこれらの位置にて使用され得る。
【００３２】
１つの実施形態において、上記抗体は、抗体の１つ以上のＣＤＲドメインを含む。別の実施形態において、本開示において利用される抗体は、配列番号４５、配列番号４６、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２のアミノ酸配列からなる群より選択される、少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を有するヒト化抗体である。さらに別の実施形態において、本開示において利用される抗体は、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４および配列番号５５のアミノ酸配列からなる群より選択される、少なくとも１つのＣＤＲを含む重鎖可変領域を有するヒト化抗体である。
【００３３】
本開示の新規の抗体は、広範囲の適用可能性を有する（すなわち、本明細書において開示される薬学的用途／治療上の用途の他に）ことが認識される。本開示のさらに別の局面を形成するこれらの適用のいくつかは、当業者にとって本明細書の開示から明らかである。
【００３４】
いったん得られた場合、上に記載された抗体は、動物に投与され得る。１つの実施形態において、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体は動物（特に、ヒトまたは別の哺乳動物）において免疫応答を減少させる。ＤＣ−ＳＩＧＮへ結合することによって、この抗体は、ＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞とＩＣＡＭ発現細胞との間の相互作用（例えば、樹状細胞とＴ細胞との間の相互作用）を妨げる。より具体的には、ＤＣ−ＳＩＧＮに対する抗体は、ＤＣ−ＳＩＧＮとＴ細胞の表面のＩＣＡＭレセプターとの間の接着に干渉することによって樹状細胞とＴ細胞との間の接着を減少させる。
【００３５】
本明細書において使用される場合、「ＩＣＡＭレセプター」とは、ＩＣＡＭ−２レセプターとＩＣＡＭ−３レセプターとの両方（特に、ＩＣＡＭ−３レセプター）を意味する。
【００３６】
樹状細胞へのＴ細胞の接着を干渉することによって、ＤＣ−ＳＩＧＮに対する抗体の使用は、樹状細胞−Ｔ細胞クラスタリング、Ｔ細胞活性化、および樹状細胞とＴ細胞との間の接触に依存する他の相互作用を影響する。これらの他の相互作用は、直接的な細胞同士の接触または樹状細胞とＴ細胞との密接な近接の両方を含む。
【００３７】
そのようなさらなる相互作用としては、免疫応答を生じることに関与するプロセス（特に、そのような応答の始めの段階の間（例えば、一次感作／Ｔリンパ球の活性化、すなわち、抗原および／またはＴ細胞に対するＭＨＣ結合ペプチドの提示、およびＴ細胞の同時刺激））、が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、そのような相互作用としては、化学的シグナル伝達、エンドサイトーシスおよび経上皮輸送のようなプロセスが挙げられる。一般の樹状細胞−Ｔ細胞相互作用の考察について（全てのその相互作用は本開示の組成物によって影響を及ぼされ得る）、以下の考察、ならびに、国際公開第９５／３２７３４号および国際公開第９６／２３８８２号を参照のこと。
【００３８】
この抗体は、ＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞に対する毒素で標識され得ることもまた企図される。次いで、毒素で標識された抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体の投与は、ＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞のレベルを減少させるために利用され得、いくつかの例において、例えば、自己免疫疾患、癌または炎症性疾患の処置において、有益であり得る。この様式において、この抗体はまた、インビボでＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞を死滅させるかまたは除去するために利用され得る。このことは、そのような処置を必要とする被験体に細胞傷害性薬物（例えば、毒素または放射線放出化合物）へ結合する抗体を投与する工程を包含する。抗体はＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞（例えば、癌細胞または樹状細胞）を認識するので、抗体が結合する任意のそのような細胞は破壊される。この抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体がまたＬ−ＳＩＧＮにもある程度結合すると示されたので、この抗体は、Ｌ−ＳＩＧＮ発現細胞を死滅させるために使用され得ることもまた企図される。１つの実施形態において、本開示に基づいて癌を処置する方法は、癌細胞に結合する毒素を有する癌細胞を死滅させるのに有効な量の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体を癌患者へ投与する工程を包含する。別の実施形態において、本開示に基づいて炎症性疾患を処置する方法は、樹状細胞に結合する毒素を有する樹状細胞を死滅させる有効量の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体を炎症性疾患を罹患する患者へ投与する工程を包含する。
【００３９】
さらに、本開示の抗体は、樹状細胞からＴ細胞への物質（例えば、化学物質、シグナル伝達因子（例えば、ケモカインおよび／またはインターロイキンなど）ならびに、特に、ウイルス粒子（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ−１、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、エボラウイルス、ＳＡＲＳウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シンドビスウイルス、およびデングウイルス））の移動を防ぐかまたは減少するために使用され得る。この方法において、本開示の抗体を使用することによって、樹状細胞へのウイルス粒子の始めの接着が阻害され得るだけでなく、樹状細胞からＴ細胞へのウイルス感染の蔓延もまた阻害され得る。
【００４０】
本開示の抗体は、樹状細胞のウイルス感染を防ぐために使用され得るだけでなく、樹状細胞が感染された後のＴ細胞へのウイルス感染の蔓延を減少させるためにも使用され得、それによって疾患の進行を遅らせ得る。この抗体はまた、Ｔ細胞の活性化を防ぎ、阻害し、または少なくとも遅延させ、そしてそれによってウイルス疾患（例えば、ＨＩＶ）の開始および／または進行を遅らせるために使用され得る。
【００４１】
それゆえ、本開示の抗体は、樹状細胞の免疫調節能力に影響を及ぼすために；樹状細胞媒介性（一次）Ｔ細胞応答を調節（特に、減少させる）ために、そして／または概して免疫系に影響を及ぼす（特に、阻害する）ために使用され得る。この抗体は、免疫系の障害を予防および／または処置するために、ならびに、移植拒絶を予防するために使用され得る。
【００４２】
いくつかのさらなる適用としては、特異的な抗原に対して免疫応答を予防するかまたは阻害すること；耐性を誘導すること；免疫療法；免疫抑制（すなわち、移植拒絶を予防すること）；自己免疫疾患（例えば、甲状腺炎、慢性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、多発性硬化症および自己免疫糖尿病の処置）；ならびにアレルギーの予防または処置が挙げられる。
【００４３】
本開示の抗体は、インビトロならびにインビボの両方での使用のために、非常に有用な診断手段および研究手段を構成する。適用可能な非限定的分野としては、樹状細胞およびそれらの機能および相互作用の研究；免疫系の研究；細胞、組織または生物学的液体（例えば、滑液組織）および皮膚組織／皮膚細胞における、樹状細胞および／またはＣ型レクチンの検出；ならびに、生物学的プロセスまたは疾患機構（例えば、癌および自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチが挙げられる））における、樹状細胞が果たす役割の研究が挙げられる。
【００４４】
本開示の抗体は、組織中もしくは組織上または細胞全体中もしくは細胞全体上のＤＣ−ＳＩＧＮの存在を検出するために（そしてそれによってＤＣ−ＳＩＧＮの発現を決定する）、ならびに、他の生物学的サンプル（例えば、細胞フラグメント）中のまたは細胞調製物中のＤＣ−ＳＩＧＮの存在を検出するために使用され得る。したがって、得られた情報は、次いで、本開示の方法または組成物が、そのような組織または細胞に適用され得るかを決定するために使用され得る。本開示の抗体はまた、例えば、生物学的サンプル（生物学的液体（例えば、血液、血漿またはリンパ液）；組織サンプルまたは細胞サンプル（例えば、骨髄、皮膚組織、腫瘍組織など）；または細胞培養または培養媒体）中で／から樹状細胞を（定性的におよび／または定量的に）検出、単離、精製および／または産生するために使用され得る。検出は、適切なアッセイによってなされ得る。
【００４５】
アッセイは、抗体の分析についてそれ自体公知の様式において使用され得る（例えば、競合的阻害アッセイまたはＥＬＩＳＡ型免疫アッセイ）。例えば、抗体は、顕微鏡技術、細胞選別技術（このような技術としては、フローサイトメトリーおよび蛍光活性化細胞分離（ＦＡＣＳ）が挙げられる）、固体支持体および／または検出可能な標識またはマーカーに基づく技術（これらは抗体に付着され得る）、（常）磁性ビーズに基づく技術、あるいは、抗体が使用され得る当業者に公知の任意の他の検出技術またはアッセイ技術と組み合わせて使用され得る。本開示の抗体の他に、本開示のさらなる局面を形成する、抗体ベースのアッセイならびに操作などについて公知のさらなる構成要素を含み得る。
【００４６】
本開示の抗体を使用することによって、樹状細胞はまた、より高い収量および高度の特異性で、単離されそして産生され得る。そのような方法において、抗体は、抗体を使用する生物学的液体から細胞の採取、単離および／または精製についてそれ自体公知の様式で使用され得る。
【００４７】
本開示の抗体が使用され得る方法および公知の技術のさらなる説明について、一般的な教科書（例えば、Ｓｉｔｅｓら、「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、第８版、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ（１９９４）；Ｒｏｉｔｔら、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、第２版、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ（１９９４））に参照され、それらの内容は、本明細書において参考として援用される。Ｊａｎｅｗａｙ−Ｔｒａｖｅｒｓによって記載された：「Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ」第３版の全般的な参照の第２．７節から第２．１７節に記述されるような、その文献に包含される抗体および技術の一般の用途について、特に参照のこと。
【００４８】
本開示はさらに、ＨＩＶ感染の予防または処置のための方法に関連し、この方法は、ＨＩＶ感染患者またはＨＩＶに感染する危険のある人に、樹状細胞の表面のＤＣ−ＳＩＧＮに結合するかまたは結合し得る化合物を、樹状細胞へのＨＩＶの接着が阻害されるような量で投与する工程を包含する。この抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体がまたある程度Ｌ−ＳＩＧＮにも結合することが示されたので、この抗体がその表面にＬ−ＳＩＧＮを有する細胞のウイルス感染を予防するために使用され得ることも企図される。
【００４９】
また、本開示はさらに、ウイルス感染の処置のための方法に関連し、この方法は、感染した患者にＤＣ−ＳＩＧＮに結合するかまたは結合し得る化合物を、感染した樹状細胞から感染していないＴ細胞へのウイルスの移動が阻害されるような量で投与する工程を包含する。
【００５０】
別の局面において、抗原またはその１つ以上の抗原部分を樹状細胞にＤＣ−ＳＩＧＮに結合し得る形態で提示することによって、動物（例えば、ヒトまたは別の哺乳動物）において特定のペプチド（すなわち、抗原または抗原の組み合わせ）に対する免疫応答を調節し、そして特に生じ、増加そして／または促進するために、本開示の抗体が使用される。この様式において提示された抗原は内在化され（すなわち、これらは、樹状細胞に侵入する）、次いで、その表面の抗原をＴ細胞へ提示し、それによって、この抗原に対する免疫応答を引き起こす。
【００５１】
樹状細胞への提示に関して、句「ＤＣ−ＳＩＧＮに結合し得る形態」とは、概して、抗原または抗原フラグメントが上に記載された抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体に付着されることを意味される。この付着は、共有結合、リガンド−リガンドの相互作用、錯体化、ライゲーション、タンパク質の融合（例えば、その融合の発現を通して）、または任意の他の種類の物理的もしくは化学的相互作用、あるいは抗原が抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体と併せて樹状細胞へ提示されることを可能にする結合によってなされ得る。
【００５２】
抗原は、免疫応答が得られ得る、任意の抗原またはその任意の部分またはそのフラグメントであり得る。好ましくは、任意のそのような部分またはフラグメントは、それ自体が免疫応答を誘発し得るようなものである（例えば、エピトープ）。しかし、これは必要とされてはいない；これらのフラグメントは、本開示の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体への付着によって増加した特異性または親和性を有する樹状細胞へ指向され、免疫応答を通常誘発し得ないフラグメントは、本明細書において記載される抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体と併せて使用される場合、免疫応答を提供し得るからである。また、概して、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体と組み合わせて抗原を使用することは、抗原の能力を増加し得る、すなわち、投与された抗原の１単位につき、より高い免疫応答またはより強い免疫応答を提供し得る。この方法において、抗原は、より低い投与量において投与され得、そしてそれでも十分な免疫応答を提供し得る。
【００５３】
適切な抗原の例としては、癌抗原（このような癌抗原としては、ｇｐ１００、ｇ２５０、ｐ５３、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＭＡＲＴ  １、チロシナーゼ関連タンパク質１１およびチロシナーゼ関連タンパク質が挙げられる）である；これらの全ては、その抗原を含むかまたは発現する腫瘍細胞に対して免疫応答を生じるために使用され得る。本開示において使用され得る他の種類の抗原は、感染疾患（例えば、インフルエンザ、おたふくかぜ、麻疹、風疹、ジフテリア、破傷風、微生物（例えば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（例えば、ｂ型）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｐｏｌｙｏｍｙｌｅｔｕｓ、インフルエンザウイルスおよび肺炎球菌）による感染に起因する疾患、および概してワクチンが開発され得るかまたは予想され得る任意の他の感染または疾患（寄生生物、原生動物および／またはウイルス感染（例えば、ＨＩＶおよび疱疹）がまた挙げられる））に対するワクチン中に使用される本質的に全ての抗原を含む。血清またはワクチンを提供するために、本開示の化合物はさらに、それ自体公知の他の抗原と組み合わされ得る。
【００５４】
それゆえ、本開示のこの局面は、１）抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体および２）そこへ付着した抗原またはそのフラグメント、またはその部分の組み合わせを含む組成物に関連する。この２つの組み合わせは、動物（特にヒトまたは別の哺乳動物）において上記抗原に対する免疫応答を調節する（特に、生じる、増加させるおよび／または促進する）ための組成物において利用され得る。この技術は、癌ワクチンにおいて特に有利であり得る。
【００５５】
上の組み合わせは、複合体、化学物質または化学実体、または融合タンパク質もしくはタンパク質構造の形態であり得、そして当業者に公知の様式における組成物として処方されそして投与され得る。したがって、一度得られた場合、ペプチドと組み合わせたＤＣ−ＳＩＧＮに対する上記抗体は、宿主動物に投与され、Ｔ細胞の応答をブーストし、したがってその宿主動物の免疫応答を増加させ得る。
【００５６】
さらなる局面において、本開示は、動物（特に、ヒトまたは別の哺乳動物）において免疫応答を調節するための方法に関し、この方法は、その動物に、本明細書において「抗体／ペプチド構築物」と呼ばれるペプチドと組み合わせてＤＣ−ＳＩＧＮに対する抗体を、好ましくは本明細書において記載されるような組成物の形態で、免疫応答を変更または改変するのに十分な量で投与する工程を包含する。好ましくは、この方法は、上記ペプチドに対する免疫応答を生じる。
【００５７】
本開示に基づく投与のための組成物は、それらの意図された効果に関わらず、１つ以上の上述の抗ＣＤ−ＳＩＧＮ抗体または他の化合物と組み合わせたそのような抗体を含み得る。いくつかの実施形態において、抗体は、マンノース、フコースまたは他の炭水化物、レクチンおよび／または抗生物質（例えば、プリダマイシンＡ）と処方され得、それによって相乗効果が得られ得る。
【００５８】
例えば、いくつかの実施形態において、本開示の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体または抗体／ペプチド構築物は、感染因子（ウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、エボラウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ＣＭＶ、シンドビスウイルス、およびデングウイルス）；細菌（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎａｅ、およびミコバクテリア属の細菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭ．ｂｏｖｉｓが挙げられる））；酵母（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）；および寄生生物（例えば、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｐｉｆａｎｏｉおよびＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ）が挙げられるが、これらに限定されない）の結合、感染、および伝播を遮断するために利用され得る。いくつかの実施形態において、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体はまた、Ｌ−ＳＩＧＮに結合し、この抗体は、上に記載された感染因子の結合、感染、および伝播を遮断することに有用であり得る。
【００５９】
したがって、本開示の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体または抗体／ペプチド構築物は、既存のウイルス感染または細菌感染を有する被験体動物（例えば、ヒト）を処置するために利用され得る。代替的に、本開示の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体または抗体／ペプチド構築物は、被験体動物（例えば、ヒト）のウイルスによる感染を予防するためにワクチン中に含まれ得る。
【００６０】
本開示の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体または抗体／ペプチド構築物はまた、ＤＣ−ＳＩＧＮ発現と関連する腫瘍型のための通常の診断法として利用され得る。例えば、癌サンプルにおけるＤＣ−ＳＩＧＮのアップレギュレーションは、免疫系のアップレギュレーションが免疫系による圧力の下でのみ起こると予期されるので、癌が免疫系に曝露されたか否かを評価する診断手段のための根拠として利用され得る。当業者に公知の方法（免疫組織化学および／またはＦＡＣＳ分析を含む）を使用して、腫瘍生検が、本開示の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体または抗体／ペプチド構築物に曝露され得、次いで、結合した抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体の存在について分析され得、この抗体がＤＣ−ＳＩＧＮ発現と関連する癌の指標となる。いくつかの実施形態において、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体または抗体／ペプチド構築物は、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する癌の存在を決定するための診断キットの一部として提供され得る。
【００６１】
本開示の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体または抗体／ペプチド構築物はまた、ＤＣ−ＳＩＧＮ発現の増加によって特徴付けられる癌の処置のための治療法としても利用され得る。１つの実施形態において、本開示の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体または抗体／ペプチド構築物は、腫瘍細胞のＡＤＣＣ（抗体依存性の細胞性細胞傷害性）またはＣＤＣ（補体依存性細胞傷害性）を誘導し、それによってこの細胞を死滅させる。
【００６２】
この抗体はまた、インビボで癌細胞を死滅させるかまたは除去するために利用され得る。このことは、そのような処置を必要とする被験体に細胞傷害性薬物へ結合する抗体を投与することに関与する。この抗体は癌細胞を認識するので、抗体が結合する任意のそのような細胞は破壊される。
【００６３】
本開示の抗体は、種々の細胞傷害性化合物を送達するために使用され得る。任意の細胞傷害性化合物は、この抗体と融合され得る。この融合は、化学的にまたは遺伝子的に達成され得る（例えば、１つの融合された分子としての発現を介して）。この細胞傷害性化合物は、生物学的分子（例えば、ポリペプチド）または低分子であり得る。当業者が理解するように、低分子については化学的融合が使用され、他方で、生物学的化合物については、化学的融合または遺伝子的融合が使用され得る。
【００６４】
本開示の抗体は、種々の細胞傷害性薬物（治療薬；放射線を放出する化合物；植物、真菌または細菌起源の分子；生物学的タンパク質；およびそれらの混合物が挙げられる）を送達するために使用され得る。細胞傷害性薬物は、細胞内で作用する細胞傷害性薬物（例えば、短距離の放射線エミッター（例えば、短距離の高エネルギーα−エミッターが挙げられる））であり得る。酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントは、例えば、ジフテリア毒素Ａフラグメント、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来の）体外毒素Ａ、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α−サクリン、特定のＡｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、特定のＤｉａｎｔｈｉｎタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、Ｍｏｒｏｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａインヒビター、クルシン、クロチン、Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン、マイトギリン（ｍｉｔｏｇｉｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）およびエノマイシンによって例示される。免疫毒素の酵素的に活性なポリペプチドを調製するための手順は、本明細書によって参考として援用される国際公開第８４／０３５０８号および同第８５／０３５０８号中に記載される。特定の細胞傷害性部分は、例えば、アドリアマイシン、クロラムブシル、ダウノマイシン、メトトレキサート、ネオカルジノスタチンおよび白金に由来する。
【００６５】
細胞傷害性剤と抗体を結合体化するための手順は、既に記載されている。
【００６６】
あるいは、上記抗体は、高エネルギー放射線エミッター（例えば、放射性同位元素（例えば、１３１Ｉ、γ−エミッター））と連結され得、このγ−エミッターは、腫瘍部位にて局在化される場合、いくつかの細胞の大きさ（ｄｉａｍｅｔｅｒ）の死滅をもたらす。例えば、本明細書において参考として援用される、Ｓ．Ｅ．Ｏｒｄｅｒ，「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒ．Ｗ．Ｂａｌｄｗｉｎら、（編）、ｐｐ．３０３−３１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）を参照のこと。他の適切な放射性同位元素としては、α−エミッター（例えば、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉおよび２１１Ａｔ）およびβ−エミッター（例えば、１８６Ｒｅおよび９０Ｙ）が挙げられる。前立腺癌は比較的放射線感受性の腫瘍であるので、放射線治療は前立腺癌と関連して特に効果的であると予期される。
【００６７】
別の実施形態において、本開示の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体または抗体／ペプチド構築物は、ＤＣ−ＳＩＧＮに結合しそしてＤＣ−ＳＩＧＮ発現癌細胞を介する免疫系の負の調節を妨げることによって、腫瘍を処置するための治療法として利用され得る。この負の調節を妨げることによって、この免疫系は癌細胞を根絶するように進行し得る。
【００６８】
上の処置の効能は、当業者に公知の方法（異種移植片モデルを含む）を利用して、確認され得る。
【００６９】
癌療法として利用される本開示に基づく抗体または抗体／ペプチド構築物はまた、任意の他の免疫調節治療（例えば、癌ワクチン、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＣＤ２５またはシクロホスファミド）と組み合わされ、癌治療における増加した治療の効能を達成し得る。
【００７０】
本開示の組成物はまた、処置される状態に依存して、公知の同時阻害性化合物（例えば、抗ＬＦ３Ａ）；ならびに、それ自体公知である他の活性成分を、含み得るかまたは組み合わせて使用され得る。例えば、本開示の組成物は、免疫抑制剤（すなわち、移植拒絶を防ぐために）、免疫調節剤、抗生物質、自己抗原またはアレルゲン（例えば、国際公開第９５／３２３４号または同第９６／２３８８２号に記載される）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）および抗ウイルス剤（例えば、抗ＨＩＶ剤）およびＣＤ４インヒビター（ＣＤ４指向性抗体（例えば、Ｌｅｕ−３Ａ）を含む）との組み合わせで処方され得るかまたは使用され得、それによって相乗効果がまた得られ得る。
【００７１】
本開示の組成物は、公知のキャリアおよび／またはアジュバントを使用して処方され得、それ自体公知の薬学的形態（例えば、錠剤、カプセル、粉末、凍結乾燥調製物、注射溶液など）を好ましくは単位投与形態において提供する。抗体のそのような薬学的処方物、それらの用途および投与（１回の投与形態または複数の投与形態）、ならびに、キャリア、賦形剤、アジュバントおよび／または処方剤は、概して当該分野において公知であり、そして例えば、国際公開第９３／０１８２０号、同第９５／３２７３４号、同第９６／２３８８２号、同第９８／０２４５６号、同第９８／４１６３３号および／または同第９８／４９３０６号（特許文献の各々の内容は、本明細書において参考として援用される）中に記載される。さらに、この処方物は、国際公開第９３／０１８２０号中に記載されるようなリポソームの形態であり得る。
【００７２】
本開示の組成物はさらに、例えば、バイアル、ボトル、子袋（ｓａｃｈｅｔ）、ブリスターなどの中に；必要に応じて、関連する患者の情報を載せたチラシおよび／または使用のための指示書とともに、パッケージ化され得る。
【００７３】
上の方法の全てにおいて、使用される化合物／組成物は、治療有効量で投与され、この用語については、国際公開第９３／０１８２０号、同第９５／３２７３４号および／または同第９６／２３８８２号（これらの特許文献の内容は、本明細書において参考として援用される）を一般的に参照のこと。投与は１回の投与であり得るが、好ましくは、１日以上、１週間以上、１ヶ月以上にわたって実行される複数の用量投与レジメンの一部である。
【００７４】
本開示に従うキットは、凍結された抗体または凍結乾燥された抗体を含み、それぞれ、解凍（必要に応じて、さらなる希釈が続く）によって、または（好ましくは緩衝化された）液体ビヒクル中での懸濁によって再構成される。このキットはまた、緩衝液および／または賦形剤溶液（液体形態または凍結形態で）、あるいは水で再構成される緩衝粉末調製物および／または賦形剤粉末調製物を、治療としての施術のために適切な処方物を生成するために上記抗体と混ぜる目的で含み得る。したがって、好ましくは、キット中に提供される所定の量の熱、水、または溶液の添加がインビボでの使用またはインビトロでの使用のために効果的であるように十分な濃度およびｐＨの処方物をもたらすような濃度において、この抗体を含むキットが、凍結され、凍結乾燥され、予め希釈され、または予め混ぜられる。好ましくは、そのようなキットはまた、治療法としての抗体組成物を再構成しそして使用するための説明書を含む。このキットはまた、再構成された活性組成物のための２つ以上の構成要素を含む。例えば、第一の構成要素は抗体を含み得、そして第二の構成要素は二官能性のキレートまたは治療剤（例えば、放射性核種）を含み得、抗体と混ぜ合わされる場合、それとともに、共役系を形成する。上に述べられた緩衝液、賦形剤、および他の構成要素は、別個にまたはそのキットとともに販売され得る。
【００７５】
さらに、本開示はＤＣ−ＳＩＧＮに対する抗体に関して本明細書において記載されるが、他の、概して類似のＣ型レクチン（ＤＣ−ＳＩＧＮの天然の改変体を含む）もまた樹状細胞上に存在得、そして／または樹状細胞−Ｔ細胞相互作用に関与し得ることを排除しない。そのような改変体は、ＤＣ−ＳＩＧＮと通常高程度のアミノ酸相同性（８０％超える〜９０％を超える）を有し、そして／またはＤＣ−ＳＩＧＮと機能的に同等である。したがって、いくつかの場合において、本開示の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体はまた、そのような改変体と結合し、それによってＤＣ−ＳＩＧＮに関して上に記載されたようにＤＣ−Ｔ細胞相互作用を変更し得る。
【００７６】
以下の非限定的な実施例は、本開示を説明するために提供される。
【実施例】
【００７７】
（実施例１）
（ライブラリの構築）
マウスを、５００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−４および８００Ｕ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦで６日間一次の血液のリンパ球を成熟させることによって得られた未成熟な樹状細胞で免疫した。３回の免疫後、その脾臓を採取しそしてＴＲＩ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）中でホモジナイズした。全ＲＮＡを製造者の説明書に従って単離した。メッセンジャーＲＮＡを、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して精製した。第一鎖ｃＤＮＡを、製造者のプロトコルに従いＲＴ−ＰＣＲのためのＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して合成した。第一鎖ｃＤＮＡを、別々のチューブにおいてオリゴヌクレオチド（ＩｇＧ１についてｍＣＧｌＸｃｍ  Ｉ、ＩｇＧ２ａについてｍＣＧ２ａｓＢｓａＪ  Ｉおよびκ軽鎖についてｍＣＫＨｐａ  Ｉ）と混ぜ、そしてＸｃｍ  Ｉ（ＩｇＧ１について）、ＢｓａＪ  Ｉ（ＩｇＧ２ａについて）およびＨｐａ  Ｉ（κ軽鎖について）で消化した。これらのオリゴヌクレオチドの配列を、以下に示す：
【００７８】
【化１】
2008504222.tif 000003
第一鎖ｃＤＮＡの質および完全な消化を、消化部位に対して外部と内部との両方にアニーリングしたプライマーを使用してＰＣＲで確認した。
【００７９】
第二鎖ｃＤＮＡ合成を、重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子のフレームワーク１領域、制限酵素部位、およびハイブリダイズしていない所定の配列にハイブリダイズした部分を有するプライマーを使用して実行した。第二鎖合成を、９４℃を５秒間、５６℃を１０秒間、そして６８℃を２分間からなる２０サイクルについて繰り返した。
【００８０】
このサイクルの最後に、伸長反応のためのオリゴヌクレオチド（ＴＭＸ２４ｍＣＧＩｎｏｅｒ、ＴＭＸ２４ｍＣＧ２ａｎｏｅｒ、およびＴＭＸ２４ｍＣＫｎｏｅｒ）を氷上で添加し、そして合成ｃＤＮＡをさらにこれらのオリゴヌクレオチドを９４℃１分間そして６８℃にて２分間インキュベートすることによってこれらのオリゴヌクレオチドに沿って伸長した。伸長反応のために使用したオリゴヌクレオチドは、抗体遺伝子の定常領域、制限酵素部位、およびハイブリダイズしていない所定の配列にハイブリダイズした部分を有した。このオリゴヌクレオチドのまさに３’末端におけるヌクレオチドは、ハイブリダイズしておらず、そして３つの３’末端のヌクレオチドをホスホルチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｔｈｉｏａｔｅ）および３’末端の２’ＯＭｅリンクしたプロピル基で改変し、これは、合成された第二鎖ｃＤＮＡに沿った伸長を防ぎ、そしてエキソヌクレアーゼ活性およびエンドヌクレアーゼ活性に対して防御した。これらのオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
【００８１】
【化２】
2008504222.tif 000004
伸長反応が完了した後、次いで、この反応物を４℃に冷却し、そしてＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）によって清浄した。
【００８２】
次いで、一回のプライマー増幅を、プライマー（ＴＭＸ２４ｍＨおよびＴＭＸ２４ｍＫ）を使用して実行し、このプライマーは、第二鎖ｃＤＮＡ合成用のプライマーのために使用した、同じ所定の配列を有し、そして伸長反応のためのオリゴヌクレオチドを有した。１回の増幅のためのプライマーの配列を、それらが公知のマウス遺伝子と有意な相同性を有さないように選択し、その配列は以下のとおりである：
【００８３】
【化３】
2008504222.tif 000005
増幅生成物を、ＰＣＲ精製キットで精製し、そしてＸｈｏ  Ｉ  Ｂｌｎ  Ｉ（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ）およびＸｂａ  Ｉ／ＢｓｐＥ  Ｉ（κ軽鎖）で消化し、そしてＰＡＸ３１３ｍ／ｈＧベクター中にクローニングした。
【００８４】
（実施例２）
（パニング）
ＩｇＧ  １ライブラリおよびＩｇＧ２ａライブラリを、組換えヒトＤＣ−ＳＩＧＮ−Ｆｃ上で分けた。ファージ（１０１２）を、抗ヒトＦｃ抗体によって捕捉された１μｇ／ｍｌ  ＤＣ−ＳＩＧＮでコーティングされた９６ウェルプレートの２つのウェル中でインキュベートした。３７℃のインキュベーションの２時間後、このウェルをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で、１周目のパニングについては３回、２周目のパニングについては５回、そして３周目のパニングについては１０回洗浄し、洗浄の間に５分間の間隔を有した。結合したファージを、ｐＨ  ２．２にて１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む０．１Ｍ  ＨＣＬで溶出した。赤血球ロゼット（ＥＲ）細胞を、溶出液で感染させ、そしてイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）およびヘルパーファージの添加の前に２時間カルビシリンおよびテトラサイクリンの存在下で培養した。２時間後、カナマイシンを添加し、そしてこの細胞を一晩成長させた。次の日、培養物を遠心分離し、そしてファージをポリエチレングリコール／塩化ナトリウム（ＰＥＧ／ＮａＣＩ）を使用して上清から沈降させた。
【００８５】
（実施例３）
（固相ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡプレートを、一晩室温にて２μｇ／ｍｌの抗ヒトＦｃでＰＢＳ中でコーティングした。０．０５％  Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳによる洗浄の３周目後に、このプレートを、１％  ＢＳＡを含むＰＢＳでブロックした。３７℃にて１時間後、プレートを３回洗浄し、そして２時間５００ｎｇ／ｍｌ組み換え型ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ−Ｆｃタンパク質でインキュベートした。一晩１μｇ／ｍｌカルビシリンを含むＳＢ中で成長させたクローンからの培養上清を、２時間添加した。３回の洗浄後、結合した抗体を、アルカリホスファターゼ共役抗マウスＦａｂ’２抗体を用いて検出し、その後ＳｉｇｍａＳ基質を添加した。発色を、プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してＯＤ  ４０５にて検出した。
【００８６】
ＩｇＧ２ａライブラリについて、４７／２９１のクローンが、ＢＳＡを超えるＤＣ−ＳＩＧＮへのシグナルの４〜１３倍の増加を示した。ＩｇＧ  １ライブラリは、スクリーニングし選別されたものから２２／２４０のクローンを産生し、そのうち３つがＤＣ−ＳＩＧＮに対する強いシグナルを表し、これはＢＳＡシグナルよりも２３倍強かった。各ライブラリの９６ウェルプレートについての代表的な例を、図１に示す。
【００８７】
ＤＣ−ＳＩＧＮに対するシグナルを示しているクローンを、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ（Ｌ−ＳＩＧＮ）（非常に関連しているタンパク質）とのそれらの反応性について調査した。ＤＣ−ＳＩＧＮＤの代わりにＬ−ＳＩＧＮをプレート上にコーティングしたことを除いて、ＤＣ−ＳＩＧＮ  ＥＬＩＳＡに類似するＥＬＩＳＡを実行した。図２に示されるように、ＩｇＧ１ライブラリ由来のクローンは、ＤＣ−ＳＩＧＮに対して高度に特異的であった。概して、ＩｇＧ２ａライブラリ由来のクローンはより弱いシグナルを示し、そしていくつかのクローンはＬ−ＳＩＧＮと交差反応した。
【００８８】
（実施例４）
（ＦＡＣＳ分析）
組換えＤＣ−ＳＩＧＮと反応するクローンもまた細胞表面のＤＣ−ＳＩＧＮを認識したことを立証するために、未成熟な樹状細胞を目的のクローンの培養上清でインキュベートし、そして２０分間氷上でＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３を含むＰＢＳ）を用いて１：１に希釈した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、そして抗体が結合する細胞表面をＰＥ結合体化抗マウスＩｇＧ抗体で検出した。サンプルを、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析した。いくつかの代表的なサンプルについての結果を、図３に示す。図３に見られるように、全てのサンプルが未成熟な樹状細胞上のタンパク質を認識した。
【００８９】
（実施例５）
（配列）
固相ＥＬＩＳＡにおいて正のシグナルを生じる各ライブラリからの１６のクローン由来のＤＮＡを、単離しそしてＲｅｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）へ配列決定のために提出した。得られた配列を、図４ａ〜４ｃに示す。独特の配列のみを示す。図４ａに示すように、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮに結合する特に有用な軽鎖ＣＤＲ３領域は、以下の配列の１つを有する：ＱＨＦＷＮＴＰＷＴ（配列番号４５）；またはＱＱＧＨＴＬＰＹＴ（配列番号４６）。図４ｂに示すように、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮに結合する特に有用な重鎖ＣＤＲ３領域は、以下の配列の１つを有する：ＳＮＤＧＹＹＳ（配列番号４７）；ＲＹＹＬＧＶＤ（配列番号４８）；またはＤＤＳＧＲＦＰ（配列番号４９）。
【００９０】
図４ｃに示すように、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮに結合する抗体の重鎖ＣＤＲ３領域もまた、以下のアミノ酸配列の１つを有し得る：ＹＧＹＡＶＤＹ（配列番号５０）；ＹＹＧＩＹＶＤＹ（配列番号５１）；ＦＬＶＹ（配列番号５２）；ＮＦＧＩＬＧＹ（配列番号５３）；ＹＰＮＡＬＤＹ（配列番号５４）；またはＧＬＫＳＦＹＡＭＤＨ（配列番号５５）。図４ｃにもまた示されるように、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮに結合する抗体の軽鎖ＣＤＲ３領域もまた、以下のアミノ酸配列の１つを有し得る：ＱＱＧＫＴＬＰＷＴ（配列番号５６）；ＱＱＧＮＴＬＰＰＴ（配列番号５７）；ＱＱＨＹＩＴＰＬＴ（配列番号５８）；ＱＱＹＧＮＬＰＹＴ（配列番号５９）；ＱＱＹＹＳＴＰＲＴ（配列番号６０）；ＧＱＳＹＮＹＰＰＴ（配列番号６１）；またはＷＱＤＴＨＦＰＨＶ（配列番号６２）。
【００９１】
（実施例６）
（競合ＥＬＩＳＡ）
ＤＣ−ＳＩＧＮと反応するクローンがＡＺＮ−Ｄ１（国際公開第００／６３２５１号に記載される公知の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体）と異なるエピトープを認識するか否かを決定するために、競合ＥＬＩＳＡを実行した。プレートを、上に記載されたように組換えヒトＤＣ−ＳＩＧＮでコーティングした。１μｇ／ｍｌ  ＡＺＮ−Ｄ１の存在下で、培養上清を種々の濃度にて添加した。ＡＺＮ−Ｄ１の結合を、アルカリホスファターゼ結合体化抗マウスＦｃ抗体を使用し、その後ＳｉｇｍａＳ基質によって検出した。発色を、プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してＯＤ  ４０５にて検出した。シグナルの損失は、ＦａｂおよびＡＺＮ−Ｄ１が同じエピトープについて競合することを示した。図５に示すように、ＩｇＧ１ライブライクローンについて、クローン１Ｇ４、クローン２Ｈ７およびクローン２Ｂ８と弱い競合が存在するのみであった（２Ｈ７および２Ｂ８は、同一の配列を有することが判明した）。ＩｇＧ２ａライブラリクローンについて、クローン２、クローン４、クローン５、クローン６、クローン７、クローン８、クローン９、クローン１１、クローン１２、クローン１３、クローン１４およびクローン１５は競合せず、これらはＡＺＮ−Ｄ１と非常に異なるエピトープを認識したことを示した。ある程度の競合を示しているクローンについて、認識されたエピトープは、まだやや異なり得るが、上記抗体によって遮断されるほどＡＺＮ−Ｄ１のエピトープに十分類似していた。
【００９２】
（実施例７）
（ＩＣＡＭ−３／ＤＣ−ＳＩＧＮビーズアッセイ）
抗体がＤＣ−ＳＩＧＮとのＩＣＡＭ−３の相互作用を遮断するか否かを決定するために、選択したクローンを使用して、蛍光ビーズアッセイを実行した。カルボキシレート改変ＴｒａｎｓＦｌｕｏｒＳｐｈｅｒｅｓ（４８８／６４５ｎｍ、１．０μｍ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲ製）を、ストレプトアビジンでコーティングしたビーズをビオチン化したヤギ抗ヒト抗Ｆｃ  Ｆ（ａｂ）２で２時間３７℃にてＰＢＳ、０．５％  ＢＳＡ中でインキュベートすることによって、ＩＣＡＭ−１  ＦｃおよびＩＣＡＭ−３  Ｆｃタンパク質（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮから得た）でコーティングした。このビーズを洗浄し、そしてＩＣＡＭ−３  Ｆｃ融合タンパク質（２５０ｎｇ／ｍＬ）で一晩４℃にてインキュベートした。ＩＣＡＭでコーティングしたビーズへの接着のために、ＤＣ−ＳＩＧＮトランスフェクトされたＫ５６２細胞（５×１０６／ｍｌ）を、Ｔｒｉｓ−ナトリウム−ＢＳＡ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５％  ＢＳＡ）中に再懸濁した。５万の細胞を、ＤＣ−ＳＩＧＮ−ＳＩＧＮ  Ｆａｂ（２０μｇ／ｍＬ）を伴ってかまたは伴わずに、１０分間室温でＶ型底の９６−ウェルプレート中で予めインキュベートした。このＩＣＡＭでコーティングしたビーズ（２０ビーズ／細胞）を添加し、そしてこの懸濁液を３０分間３７℃にてインキュベートした。洗浄後、細胞を、Ｔｒｉｓ−ナトリウム−ＢＳＡ緩衝液中に再懸濁した。ＤＣ−ＳＩＧＮでトランスフェクトされたＫ５６２細胞のＩＣＡＭ媒介性接着を、ＦＬ−３のフローサイトメトリーによって測定した。図６に示されるように、クローン２Ｈ１、クローン２Ｂ８およびクローン３Ｅ１は、ＡＺＮＤ１と匹敵する、ＤＣ−ＳＩＧＮへのＩＣＡＭ結合の強い阻害を示した。
【００９３】
（実施例８）
（ウイルス結合を遮断し得る抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体の選択）
ウイルスの進入を遮断し得る抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体の選択を、Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら、（１９９９）、「Ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  Ｂ−ｌｉｎｅａｇｅ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ」Ｂｌｏｏｄ  ９４：７５４によって記載されるように蛍光ビーズアッセイによって達成する。簡潔にいうと、５万のＫ５６２／ＤＣ−ＳＩＧＮでトランスフェクトされた細胞を、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ  Ｆａｂ（２０μｇ／ｍＬ）を伴ってかまたは伴わずに１０分間室温にてＶ型底の９６−ウェルプレート中で予めインキュベートする。ウイルスエンベロープタンパク質（例えば、ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２またはＨＩＶ  ｇｐ１２０）でコーティングした蛍光ビーズ（２０ビーズ／細胞）を添加し、そしてその懸濁液をさらに３０分間３７℃にてインキュベートする。洗浄後、この細胞を、Ｔｒｉｓ−ナトリウム−ＢＳＡ緩衝液中で再懸濁する。ウイルスでコーティングされたビーズの、Ｋ５６２／ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞に対する抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体によって遮断される程度を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して測定する。抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体の非存在下でウイルスビーズ（ネガティブコントロール）に結合した細胞の割合を１００に設定し、そして抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体の存在下での結合の減少を％遮断として表す。
【００９４】
（実施例９）
（ウイルスの進入の遮断）
上の実施例８における抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体の選択後、ウイルスの進入を遮断するこれら抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体の容量を試験する。ＤＣ−ＳＩＧＮトランスフェクトされたＫ−５６２細胞を、目的のエンベロープタンパク質を発現するレポーターウイルスの添加前にまたはウイルス＋ドナーもしくはウイルス−ドナー由来の適当な血清を添加する場合に、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体で３０分間予めインキュベートする。３７℃におけるインキュベーションの１時間後、細胞をＰＢＳで５回洗浄し、そしてウイルスＲＮＡをＱｉａｇｅｎのウイルスＲＮＡミニスピンキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して、細胞から抽出する。したがって、得られたウイルスＲＮＡを、Ｇａｒｄｎｅｒら（Ｇａｒｄｎｅｒら、（２００３）「Ｌ−ＳＩＧＮ（ＣＤ  ２０９Ｌ）ｉｓ  ａ  ｌｉｖｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１００巻、４４９８頁）の手順に従ってＲＴ−ＰＣＲによって増幅し、そしてサザンブロットを実行する。
【００９５】
（実施例１０）
（ウイルス伝播の予防）
実施例８で同定された抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体がレセプター陽性内皮細胞からヒトＴ細胞またはヒト肝臓細胞のいずれかへのウイルスの転移を防ぎ得るか否かを試験するために、Ｋ５６２／ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞または新たに単離されたヒト肝臓洞様毛細血管内皮細胞（ＤＣ−ＳＩＧＮ＋）または樹状細胞（ＤＣ−ＳＩＧＮ＋）を、実施例８の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体で３０分間インキュベートし、その後、ルシフェラーゼあるいは目的のエンベロープタンパク質（例えば、ＨＣＶ−Ｅ２、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、エボラ（Ａｌｖａｒｅｚら（２００２）「Ｃ−ｔｙｐｅ  ｌｅｃｔｉｎｓ  ＤＣ−ＳＩＧＮ  ａｎｄ  Ｌ−ＳＩＧＮ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｎｔｒｙ  ｂｙ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｃｉｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｔｒａｎｓ」、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６：６８４１）またはシンドビス（Ｋｌｉｍｓｔｒａら（２００３）「ＤＣ−ＳＩＧＮ  ａｎｄ  Ｌ−ＳＩＧＮ  ｃａｎ  ａｃｔ  ａｓ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｍｏｓｑｕｉｔｏ  ｃｅｌｌ−ａｎｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ」、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７：１２０２２）を発現する緑色蛍光タンパク質レポーターウイルスを添加する。培養媒体で洗浄後、細胞をＴ細胞（Ｃ８１６６）またはヒト肝臓細胞（Ｈｕｈ−７）で同時培養する。レポーターウイルス伝播を、標的細胞溶解物におけるルシフェラーゼ活性（相対的に小さい単位）を測定することによってか、または標的細胞（例えば、Ｔ細胞上のＣＤ３）上で適切な表面マーカーの２倍の染色と組み合わせたＧＦＰ陽性標的細胞のフローサイトメトリー分析によってかのいずれかで評価する。
【００９６】
（実施例１１）
（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの感染の遮断における抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体の役割の評価）
マンノシル化されたリポアラビノマンナン（ＭａｎＬＡＭ）（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの表面に存在する炭水化物が豊富な構造）が、ＤＣ−ＳＩＧＮと相互作用するように報告されている（Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら、（２００３）「Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｔａｒｇｅｔ  ＤＣ−ＳＩＧＮ  ｔｏ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９７：７）。ＭａｎＬＡＭに対する高い抗体力価を、ヒト型結核菌を有する人々中に観察し、そして受動的防御実験において細菌量を減少することを示した（Ｈａｍａｓｕｒら、（２００４）「Ａ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｌｉｐｏａｒａｂｉｎｏｍａｎｎａｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｆ（ａｂ’）ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｐｒｏｌｏｎｇ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ」、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３８：３０）。ミコバクテリアの結合と感染とを、高い親和性でＭａｎＬＡＭに結合し得る抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体を使用して阻害する。細菌（例えば、Ｍ．ｂｏｖｉｓおよびＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の系統を、Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら（２００３）（前出）に詳述されるようにフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識する。Ｋ５６２／ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞を、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体（５０μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、ＦＩＴＣ結合体化細菌と１：２０の比でインキュベートする。抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体による遮断（蛍光の減少）の程度を、フローサイトメトリー分析によって決定する。
【００９７】
（実施例１２）
（ＨＩＶ感染した肝臓を有する移植患者の処置）
ウイルス伝播を予防する場合、ＤＣ−ＳＩＧＮに対する抗体をドナーが潜在的にＨＣＶ感染を有する移植の設定において使用し得る。これを試験するために、緩やかなＨＣＶ−感染ヒトドナーの肝臓を、健康なＨＬＡが適合するヒトドナー由来の一次血液リンパ球の注射とともに、免疫欠損マウス（例えば、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）中に移植する。マウスを、１〜６ヶ月の期間にわたって抗体で処置する。移植の１〜６ヵ月後、このマウスを安楽死させ、そして肝臓中のＨＣＶ感染の程度を評価する。また、Ｔ細胞をＰＣＲによってウイルスによる感染について調査する。
【００９８】
（実施例１３）
（ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する癌型の同定）
悪性組織およびマッチングする正常組織を収集し、そしてパラホルムアルデヒド中で固定するか、またはＯＣＴで素早く凍結する。切片をマイクロトームを使用して調製し、そしてこの切片を、ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体を直接的に使用するか、または適切な蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣ）に結合体化した抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体を使用することによってか、あるいは二次蛍光色素を結合体化した抗マウスＩｇＧを使用するかのいずれかで、ＤＣ−ＳＩＧＮの存在について染色する。正常組織の染色よりも有意に強い悪性組織についての染色結果は、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する癌型の指標である。
【００９９】
次いで、これらのＤＣ−ＳＩＧＮを発現する癌型について市販されている細胞株を得、ＤＣ−ＳＩＧＮの存在をＦＡＣＳ分析により評価した。簡単に述べると、１，０００，０００個の細胞を、１％  ＢＳＡおよび０．１％  ＮａＮ３を含有するＰＢＳ中で１μｇの抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体と共にインキュベートする。３０分間のインキュベーション後、この細胞を洗浄し、そしてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析する前に、蛍光色素を結合体化した抗マウスＩｇＧと共に、さらに３０分間インキュベートする。
【０１００】
（実施例１４）
（抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体の治療用途）
（直接的な細胞の死滅）
上記の実施例１３のように一旦ＤＣ−ＳＩＧＮ発現腫瘍型を同定し、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体を、それらのＡＤＣＣまたはＣＤＣを誘導する能力についてインビトロで試験する。ＡＤＣＣを評価するために、標的細胞（腫瘍細胞）を、まず５１Ｃｒで標識する。次いで、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体を１〜５０μｇの間の濃度で添加し、そしてＰＢＭＣによる標的細胞の溶解を１：１０〜１：１００のエフェクター対標的の比で４時間後に決定する。ＣＤＣを評価するために、腫瘍細胞を、ヒト補体および抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体と共にインキュベートする。細胞の死滅を、死細胞にのみ入り得、生細胞には入り得ない試薬であるヨウ化プロピジウムの添加後にＦＡＣＳ分析により評価する。ＡＤＣＣもＣＤＣも誘導しない抗体については、任意の放射線標識または毒性試薬が、抗体に結合体化したままである。
【０１０１】
裸の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体または結合体化した抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体のいずれかの、腫瘍成長停止能を、異種移植モデルにおいて評価する。簡単に述べると、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する腫瘍細胞を、皮下注入、腹腔内注入または静脈内注入する。動物をコントロールまたは抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体のいずれかで処置する。腫瘍成長を、皮下処置については大きさによって測定し、腹腔内処置または静脈内処置については生存時間によって測定する。抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体処置群における腫瘍成長がコントロール群に比べて３０％より多く減少した場合、この抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体は癌治療として利用され得る。
【０１０２】
（免疫系と癌細胞との負の調節的相互作用の遮断）
免疫細胞とＤＣ−ＳＩＧＮの相互作用を遮断する抗体を、実施例８に記載されるように蛍光ビーズアッセイを使用して同定する。抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体を、ＤＣ−ＳＩＧＮ発現癌細胞を介する免疫系の負の制御を妨げることによって、免疫系が癌細胞を根絶可能であることに関して、それらの治療有用性について評価する。
【０１０３】
ＤＣ−ＳＩＧＮ発現腫瘍細胞を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤのような免疫欠損マウス内に、皮下移植、腹腔内移植または静脈内移植する。マウスに、健康なドナー由来の２，０００，０００個のＰＢＭＣ（またはそれ自身が腫瘍を拒絶するには足りない、任意の数のＰＢＭＣ）もまた、受容させる。抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体の存在下または非存在下での腫瘍成長を、コントロール抗体と比較する。腫瘍成長を、皮下処置については大きさによって測定し、全身性の腫瘍については生存時間によって測定する。抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体処置群における腫瘍成長がコントロール群に比べて３０％より多く減少した場合、この抗体は癌治療として利用され得る。
【０１０４】
本明細書中に開示される実施形態に対し、種々の改変がなされ得ることが理解される。例えば、当業者は、本明細書中に開示される特定の配列が、その抗体または抗体フラグメントの機能性に必ずしも有害に影響すること無く、わずかに変更され得ることを理解する。例えば、抗体配列中の一つまたは複数のアミノ酸の置換は、その抗体またはフラグメントの機能性を破壊することなく頻繁になされ得る。したがって、本明細書中に記載される特定の抗体に対して７０％より高い相同性の程度を有する抗体は、本開示の範囲内であることが理解されるべきである。特に有用な実施形態において、本明細書中に記載される特定の抗体に対して約８０％より高い相同性を有する抗体が企図される。他の有用な実施形態において、本明細書中に記載される特定の抗体に対して約９０％より高い相同性を有する抗体が企図される。ゆえに、上の説明は、制限するものと解釈するべきではないが、単に好ましい実施形態の例示として解釈するべきである。当業者は、本開示の範囲および精神の範囲内の他の改変を予想する。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、本開示に基づくインビトロでの実験結果のグラフ描写であり、それぞれ、ＩｇＧ１クローンおよびＩｇＧ２ａクローンの、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮとの反応性を示している。
【図２】図２は、本開示に基づくインビトロでの実験結果のグラフ描写であり、ＩｇＧ１クローンおよびＩｇＧ２ａクローンの、ヒトＬ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮとの反応性を示している。
【図３】図３は、本開示に基づく実験において得られた３つのクローンのＦＡＣＳ分析の結果のグラフ描写であり、樹状細胞の表面のＤＣ−ＳＩＧＮとのクローンの反応性を示している。
【図４ａ】図４ａ〜図４ｃは、ＤＣ−ＳＩＧＮと反応する本開示に基づく実験において得られた重鎖クローンおよび軽鎖クローンのアミノ酸配列を提供する。
【図４ｂ】図４ａ〜図４ｃは、ＤＣ−ＳＩＧＮと反応する本開示に基づく実験において得られた重鎖クローンおよび軽鎖クローンのアミノ酸配列を提供する。
【図４ｃ】図４ａ〜図４ｃは、ＤＣ−ＳＩＧＮと反応する本開示に基づく実験において得られた重鎖クローンおよび軽鎖クローンのアミノ酸配列を提供する。
【図５】図５Ａ〜図５Ｂは、本開示の１つの実施形態に基づくインビトロでの実験結果のグラフ描写であり、それぞれ、ＩｇＧ１クローンおよびＩｇＧ２ａクローンの反応性を示し、ＤＣ−ＳＩＧＮへの結合についてＡＺＮ−Ｄｌと競合している。
【図６】図６は、本開示の１つの実施形態に基づくインビトロでの実験結果のグラフ描写であり、特定のＩｇＧ１クローンによる、ＤＣ−ＳＩＧＮへのＩＣＡＭ結合の強い阻害を示している。
【図１】
2008504222.tif 000006
【図２】
2008504222.tif 000007
【図３】
2008504222.tif 000008
【図４ａ】
2008504222.tif 000009
【図４ｂ】
2008504222.tif 000010
【図４ｃ】
2008504222.tif 000011
【図５】
2008504222.tif 000012
【図６】
2008504222.tif 000013
【配列表】
2008504222000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年11月29日(2007.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む抗体であって、
ここで、該抗体は、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮに結合する、抗体。
【請求項２】
前記抗体に付着するペプチドをさらに含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記ペプチドが抗原を含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗原が癌抗原を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
請求項３に記載の抗体を含むワクチン。
【請求項６】
請求項４に記載の抗体を含むワクチン。
【請求項７】
請求項１に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
【請求項８】
前記抗体が、ヒト化抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体が、ｓｃＦｖである、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
ＳＮＤＧＹＹＳ（配列番号４７）；ＲＹＹＬＧＶＤ（配列番号４８）；ＤＤＳＧＲＦＰ（配列番号４９）；ＹＧＹＡＶＤＹ（配列番号５０）、ＹＹＧＩＹＶＤＹ（配列番号５１）、ＦＬＶＹ（配列番号５２）、ＮＦＧＩＬＧＹ（配列番号５３）、ＹＰＮＡＬＤＹ（配列番号５４）およびＧＬＫＳＦＹＡＭＤＨ（配列番号５５）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、
ヒトＤＣ−ＳＩＧＮに結合する抗体。
【請求項１１】
前記アミノ酸配列が、前記抗体の重鎖ＣＤＲ３中に現れる、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
ＱＨＦＷＮＴＰＷＴ（配列番号４５）；ＱＱＧＨＴＬＰＹＴ（配列番号４６）；ＱＱＧＫＴＬＰＷＴ（配列番号５６）、ＱＱＧＮＴＬＰＰＴ（配列番号５７）、ＱＱＨＹＩＴＰＬＴ（配列番号５８）、ＱＱＹＧＮＬＰＹＴ（配列番号５９）、ＱＱＹＹＳＴＰＲＴ（配列番号６０）、ＧＱＳＹＮＹＰＰＴ（配列番号６１）およびＷＱＤＴＨＦＰＨＶ（配列番号６２）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、
ヒトＤＣ−ＳＩＧＮに結合する抗体。
【請求項１３】
前記アミノ酸配列が、前記抗体の軽鎖ＣＤＲ３中に現れる、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
ＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞とＩＣＡＭ発現細胞との相互作用を妨げるための組成物であって、該組成物は、
請求項１に記載の抗体
を含む、組成物。
【請求項１５】
免疫応答を生成するための組成物であって、該組成物は、
請求項２に記載の抗体
を含む、組成物。
【請求項１６】
ＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞とＩＣＡＭ発現細胞との相互作用を妨げるための組成物であって、該組成物は、
請求項１０に記載の抗体
を含む、組成物。
【請求項１７】
ＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞とＩＣＡＭ発現細胞との相互作用を妨げるための組成物であって、該組成物は、
請求項１２に記載の抗体
を含む、組成物。
【請求項１８】
抗原をＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞に送達するための方法であって、該方法は、
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む抗体に、該抗原を付着させる工程
を包含し、ここで、該抗体は、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮに結合する、方法。
【請求項１９】
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、細胞上のＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体であって、
該抗体は、ＨＩＶ、ＨＣＶ、エボラウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ＣＭＶ、シンドビスウイルスおよびデングウイルスからなる群より選択されるウイルスの、該細胞への結合を有効に遮断し得る、抗体。
【請求項２０】
前記抗体がまたＬ−ＳＩＧＮに結合する、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２１】
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、細胞上のＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体であって、
該抗体は、ＨＩＶ、ＨＣＶ、エボラウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ＣＭＶ、シンドビスウイルスおよびデングウイルスからなる群より選択されるウイルスによる該細胞の感染を有効に遮断し得る、抗体。
【請求項２２】
前記抗体がまたＬ−ＳＩＧＮに結合する、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、細胞上のＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体であって、
該抗体は、ＨＩＶ、ＨＣＶ、エボラウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ＣＭＶ、シンドビスウイルスおよびデングウイルスからなる群より選択されるウイルスの、該細胞から別の細胞への伝播を有効に遮断し得る、抗体。
【請求項２４】
前記抗体がまたＬ−ＳＩＧＮに結合する、請求項２３に記載の抗体。
【請求項２５】
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、細胞上のＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体であって、
該抗体は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  Ｂｏｖｉｓからなる群より選択される細菌の、該細胞への結合を有効に遮断し得る、抗体。
【請求項２６】
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む細胞上のＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体であって、
該抗体は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  Ｂｏｖｉｓからなる群より選択される細菌による該細胞の感染を有効に遮断し得る、抗体。
【請求項２７】
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、細胞上のＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体であって、
該抗体は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  Ｂｏｖｉｓからなる群より選択される細菌の、該細胞から別の細胞への伝播を有効に遮断し得る、抗体。
【請求項２８】
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、細胞上のＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体であって、
該抗体は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｐｉｆａｎｏｉおよびＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉからなる群より選択される寄生生物の、該細胞への結合を有効に遮断し得る、抗体。
【請求項２９】
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、細胞上のＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体であって、
該抗体は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｐｉｆａｎｏｉおよびＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉからなる群より選択される寄生生物による該細胞の感染を有効に遮断し得る、抗体。
【請求項３０】
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、細胞上のＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体であって、
該抗体は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｐｉｆａｎｏｉおよびＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉからなる群より選択される寄生生物の、該細胞から別の細胞への伝播を有効に遮断し得る、抗体。
【請求項３１】
ＤＣ−ＳＩＧＮ発現の増加によって特徴付けられる腫瘍に対する診断剤であって、該診断剤は、
ＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体
を含む、診断剤。
【請求項３２】
請求項３１の診断剤を含む、診断キット。
【請求項３３】
癌を診断することを支援するための方法であって、該方法は：
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体に、癌を有している疑いのある被験体から得た組織サンプルが結合する程度を決定する工程
を包含し、
ここで、対応する正常組織と比較して、結合の程度の増加が、癌の存在を示す、
方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、ここで、前記決定する工程が、ＤＣ−ＳＩＧＮの存在について染色する工程を包含する、方法。
【請求項３５】
ＤＣ−ＳＩＧＮ発現の増加によって特徴付けられる癌を処置するための治療剤であって、該治療剤は、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体を含む、治療剤。
【請求項３６】
癌を処置するための組成物であって、該組成物は、
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する、ＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体
を含む、組成物。
【請求項３７】
前記ＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体が、癌細胞の抗体依存性細胞性細胞傷害を誘導することを特徴とする、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記ＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体が、癌細胞の補体依存性細胞傷害を誘導することを特徴とする、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３９】
前記ＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体が、ＤＣ−ＳＩＧＮ発現癌細胞を介する免疫系の負の調節を防ぐことを特徴とする、請求項３６に記載の組成物。
【請求項４０】
前記抗体が毒素に融合されていることを特徴とする、請求項３６に記載の組成物。
【請求項４１】
前記抗体が高エネルギー放射線エミッターに融合されていることを特徴とする、請求項３６に記載の組成物。
【請求項４２】
炎症性疾患を処置するための組成物であって、該組成物は、
配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する、ＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体
を含む、組成物。
【請求項４３】
前記ＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体が、樹状細胞の抗体依存性細胞性細胞傷害を誘導することを特徴とする、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体が、樹状細胞の補体依存性細胞傷害を誘導することを特徴とする、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４５】
前記ＤＣ−ＳＩＧＮレセプターを認識する抗体が、ＤＣ−ＳＩＧＮ発現樹状細胞を介する免疫系の負の調節を防ぐことを特徴とする、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４６】
前記抗体が毒素に融合されていることを特徴とする、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４７】
前記抗体が高エネルギー放射線エミッターに融合されていることを特徴とする、請求項４２に記載の組成物。
【国際調査報告】
2008504222.tif 000014