(57)【要約】本発明は、個体の細胞にアンジオテンシン-(1-7)、またはその機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体を送達する段階を含む、新生内膜の形成を防止および/または低下させる方法を提供し、それによってアンジオテンシン-(1-7)、またはその機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体を放出する手段を含む送達媒体が使用される。本発明はまた、新生内膜の形成を防止および/または低下させるための送達媒体に関し、本送達媒体は、アンジオテンシン-(1-7)、またはその機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体を放出する手段を含む移植可能装置を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体の細胞にアンジオテンシン-(1-7)、またはその機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体を送達する段階を含む、新生内膜の形成を防止および/または低下させる方法であって、それによってアンジオテンシン-(1-7)、またはその機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体を放出する手段を含む送達媒体が使用される、方法。
【請求項２】
細胞が、少なくとも正常な状況下で血液と直接接触していない細胞を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
細胞が筋細胞である、請求項2記載の方法。
【請求項４】
筋細胞が、心筋細胞または骨格筋細胞である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
細胞が平滑筋細胞であり、好ましくは心臓の圧負荷および/もしくは心筋梗塞を患っているかまたはそのリスクがある個体の心臓内にある、請求項4記載の方法。
【請求項６】
細胞が、骨髄細胞および/または骨髄細胞由来の細胞である、請求項1または2記載の方法。
【請求項７】
送達媒体が、核酸送達媒体、ならびにアンジオテンシン-(1-7)、またはその機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体をコードする少なくとも一つの配列を含む核酸の放出を可能にする手段を含み、かつ送達媒体が核酸送達担体をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
核酸送達媒体が、さらなる血管新生促進因子をコードする少なくとも一つの配列をさらに含む、請求項7記載の方法。
【請求項９】
血管新生促進因子が、VEGF、bFGF、アンジオポイエチン-1、一酸化窒素生成を促進することが可能なタンパク質をコードする核酸、およびそれらの機能性類似体または誘導体である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも一つの配列の発現が、シグナルによって調節される、請求項7〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
シグナルが酸素圧によって提供される、請求項10記載の送達媒体。
【請求項１２】
核酸送達担体が、リポソームもしくはウィルス粒子、またはそれらの機能性類似体もしくは誘導体を含む、請求項7〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
核酸送達担体が、セムリキ森林ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターを含む、請求項8記載の方法。
【請求項１４】
送達媒体が移植可能装置を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
アンジオテンシン-(1-7)、またはその機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体を放出する手段が、移植可能装置上にコーティングされた層を含み、層はアンジオテンシン-(1-7)、またはその機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体を含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
移植可能装置がステントを含む、請求項14または15記載の方法。
【請求項１７】
新生内膜の形成を防止および/または低下させるための、アンジオテンシン-(1-7)、またはその機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体の使用。
【請求項１８】
新生内膜の形成を防止および/または低下させるための、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法の使用、または請求項1〜16のいずれか一項に定義される送達媒体。
【請求項１９】
新生内膜の形成を防止および/または低下させるための薬剤の調製のための、請求項1〜16のいずれか一項に定義される送達媒体の使用。
【請求項２０】
新生内膜の形成を防止および/または低下させるための薬剤の調製のための、アンジオテンシン-(1-7)、またはその機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体の使用。
【請求項２１】
アンジオテンシン-(1-7)、またはその機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体を放出する手段を含む移植可能装置を含む、新生内膜の形成を防止および/または低下させるための送達媒体。
【請求項２２】
手段が、移植可能装置上にコーティングされた層を含み、層はアンジオテンシン-(1-7)、またはその機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体を含む、請求項21記載の送達媒体。
【請求項２３】
移植可能装置がステントを含む、請求項14記載の方法。
【請求項２４】
個体の細胞にアンジオテンシン-(1-7)、またはその機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体を送達する段階を含む、血管壁肥大を防止および/または低下させる方法であって、それによってアンジオテンシン-(1-7)、またはその機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体を放出する手段を含む送達媒体が使用される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新生内膜の形成を防止および/または低下させるための方法、これを確立するための送達媒体の使用、ならびにそのような送達媒体に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
高血圧および高コレステロール血症は、西洋世界においてヒトの健康に対する主要な危険因子のうちの2つであり、これらの状態は、アテローム性動脈硬化症につながり得る。アテローム性動脈硬化症は結果として、慢性心不全、狭心症、間欠性跛行、または末梢虚血および心筋虚血のような多くの重篤な心血管疾患になり得る。アテローム性動脈硬化症の少なくとも初期の状態は、内皮機能不全によって特徴付けられる。内皮機能不全は、冠状動脈の収縮を引き起こし、かつ高血圧および高コレステロール血症の両方において役割を担う。それは、病変が肉眼で明白に見える前であっても、アテローム性動脈硬化症につながる反応のカスケードにおける最初の測定可能な段階の1つである。多くの治療が、内皮機能不全を逆行させ、かつ新しい血管の形成(血管新生)を刺激する可能性を評価するために検討された。例としては、コレステロール低下およびACE-阻害である。
【０００３】
食事における経口L-アルギニン補充が、内皮機能不全患者の血管新生を改善するための治療的な戦略であり得ることが示唆されてきた。
【０００４】
血管新生が、多数のサイトカイン(TNF-αおよびE-セレクチンのような)、ならびにbFGF(塩基性線維芽細胞成長因子)、VEGF(血管内皮増殖因子)、およびTGF-βを含む血管形成因子によって仲介されることが十分証明されている。bFGFおよびVEGFはどちらも、成人組織において血管新生の重要な制御因子である。これらの成長因子の内皮細胞表面上に存在する受容体への結合をはじめとして、それらは選択的に内皮細胞の増殖を刺激する。
【０００５】
一酸化窒素(NO)がこのプロセスにおいて役割を担うことが示されてきた。本来内皮由来弛緩因子として同定されたNOは、重要な内皮血管作動性因子である。
【０００６】
NO、ならびにbFGFおよびVEGFのような血管形成因子の両方が内皮機能において重要な役割を担う一方、それらの作用の正確な様式は知られていない。一方で、bFGFおよびVEGFのような血管形成因子のレベルは、内皮機能不全を患っている患者において増加する。一方で、血管内皮機能不全における一酸化窒素の放出は、多くの場合減少する。この減少した放出が、冠状動脈の収縮を引き起こし、したがって心臓病に寄与し得る。内皮機能不全を患っている患者は、新しい側副血管形成を増大する治療、および/または血管拡張を増大する治療から恩恵を得ることができると仮定される。
【０００７】
多くの実験的な遺伝子療法は、内皮機能不全を患っている患者において、VEGFまたはbFGFの添加を介する、血管新生の刺激に集中している。これらの実験的療法がいくらかの効果を有し得るにも関わらず、治療によって誘導された血管新生のレベルは低く、あったとしても引き起こされる血流の回復または強化は遅い。血管新生の誘導は、特に心臓関連疾患に関連することが考えられる。減少した血流は、心臓より他の大部分の組織を極度に衰弱させ、さらに心筋における減少した血流は生命に脅威となる。
【０００８】
心臓組織は、それぞれ心筋細胞および非筋細胞からなるおよそ2つの区画を含む。心筋細胞は、分裂する能力を失った高度に分化した細胞であり、拡張(いわゆる肥大)によってのみ適応し得る。非筋細胞区画は、線維芽細胞、マクロファージ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞、心内膜細胞のような細胞、および細胞外マトリックスからなる。非筋細胞区画の拡張は、細胞分裂およびマトリックス沈着によって達成され得る。
【０００９】
正常な発生および成長の間、ならびに激しい運動に応答する生理的拡張は、両方の区画の等しい増大によって特徴付けられる。結果として、全体の心筋収縮性は増大する。対照的に、圧力/容量過負荷または心筋梗塞に応答した心筋適応は、特徴的に正常な心筋構築を妨げ、結果として細胞外マトリックスの相対的な増加および毛細血管密度の減少をもたらす1、2。毛細血管の相対的な欠損は次に虚血の発生に対する引金となり、それは長期の心臓機能の劣化につながる。
【００１０】
RAS(レニン アンジオテンシン システム)は、心血管性ホメオスタシスのための最も重要な調節系の一つとして考えられている。それは、血圧調節において、および心筋と同様に血管壁における成長プロセスにおいて中心的な役割を担う3、4。内皮細胞に豊富に存在する重要な酵素であるアンジオテンシン変換酵素(ACE)は、Ang IIを活性化し、かつブラジキニン(BK)を不活性化する。Ang IからACEによって形成されるAng IIは、BKが強力な血管拡張因子である一方、AT1受容体上で作用する場合、血管収縮物質および増殖因子である。BKは、デカペプチドのC末端からのジペプチドPhe-ArgおよびSer-Proの配列の除去を介してACEによって分解される。Ang II形成におけるそれらの阻害作用に加えて、内在性BKの蓄積(および強化)は、ACE-阻害物質がそれらの効果を発揮する他のメカニズムとなり得る5。
【００１１】
肥大した心筋に対するACE-阻害物質の有益な作用は、動物およびヒト研究において広範囲に記載されてきた3。ACE-阻害物質による処置は、症状を緩和するだけでなく、心不全患者の生存も改善する4。Ang IIは、筋細胞、線維芽細胞および血管平滑筋細胞(VSMC)に対する強力な成長因子である。細胞レベルで、多数のメカニズムが役割を担う。発癌遺伝子およびサイクリン6の次に、細胞周期調節ホメオボックス遺伝子による干渉が重要であり得る。Ang IIは、成長停止ホメオボックス(gax)のような細胞周期停止遺伝子のダウンレギュレーションによって、不必要なVSMC増殖を促進する7。本文脈において、gaxを伴う遺伝子導入がブタのステント内再狭窄を緩和することは興味深い8。
【００１２】
細胞増殖に対するBKの作用は、十分に記載されていない。BKがプロスタグランジンおよびNO依存性メカニズムによって、繊維芽細胞およびVSMC増殖を減少させることが示唆されてきた。したがって、上記全てを考慮すると、心筋梗塞後に見出されるような(心臓の)ACE活性のアップレギュレーションが、心筋の好ましくないリモデリング：心筋細胞肥厚、増大されたマトリックス、および新血管新生または血管新生の相対的な欠損に寄与することは驚くことでない。
【００１３】
既存の血管ネットワーク由来の新しい毛細血管の出芽である血管新生は、心臓において正常条件下ではめったに生じない。Ang IIが血管形成因子として記載されてきた一方9、10、同時に血管新生促進活性を発揮するとしてACE-阻害物質もまた記載されてきた11〜14。これは矛盾しているようであるが、VSMC上のAng IIの作用を刺激し、強力な血管形成因子であるVEGF(AT1受容体によって媒介される)が生産および放出されることによって説明され得る15。
【００１４】
すでに言及されたように、ACE阻害は、Ang II形成だけでなく、BKの分解にも干渉する。BKがBK1受容体16を介した血管新生を刺激し、かつAng IIが内皮細胞(EC)増殖のAT2-受容体15媒介阻害を介した血管新生を阻害することから、ACE阻害の両方の作用は、それ自体血管形成推進性であり得る。したがって、RAS干渉は、二重相乗効果を有し得る。一方では肥厚および細胞外マトリックス形成の減少、ならびに他方では血管新生の刺激。本発明において、一方では、おそらく心筋および血管発育不全のような低下した特定の成長プロセスの間の相乗作用のため、ならびに他方では心筋の血管新生を刺激することによって、循環するアンジオテンシンペプチドのメンバーであるAng(1-7)よるRAS干渉が、心不全を予防することが見出された。したがって、これらの特定の作用に関してさらにRASの特異的な構成要素を同定することは、有望であろう。
【発明の開示】
【００１５】
発明の概要
本発明は、そのレベルがACE-阻害後増大されるように見える、循環アンジオテンシンペプチドのメンバーであるヘプタペプチドAng(1-7)が、RASの内在性阻害物質として機能するという概念を利用する。本発明者らは、Ang-(l-7)(アンジオテンシン-(l-7))が、Ang ＩおよびIIの血管収縮作用に拮抗することを示す。Ang-(l-7)が、ブラジキニンB2受容体媒介血管拡張を増強し、ラットにおいて抗高血圧作用を示し、かつ培養されたラットVSMC増殖を阻害することが示された。重要なことには、Ang(l-7)がさらに心臓のNO放出を引き起こすため、直接血管拡張を介して、および間接的にNO媒介血管新生の刺激を介しての両方で、遺伝子療法設定におけるAng(l-7)の適用が、結果として改良された心筋の潅流をもたらす。
【００１６】
動物および細胞培養研究は、Ang-(l-7)がACE活性を阻害し、AT1受容体に拮抗し、BK誘導血管拡張を増強し、かつAng-(l-7)受容体を介してNO放出を刺激することを示す20〜22、23〜25。これは、Ang-(1-7)が、多種多様なメカニズムを介した、レニン-アンジオテンシン システムの内在性カウンタープレーヤー(counterplayer)であるという概念につながる26。本発明は、Ang-(l-7)の特質を利用し、上記の区画間の平衡を回復し、かつ心筋構築を正規化するために、局所的な成長プロセスを調節し、かつNOおよびVEGFのような他の公知の増殖モジュレータと比較する。この目的のために、新しく開発された遺伝子導入ベクターは、これらのモジュレーター物質の特異的かつ局在化した過剰発現を、関心対象の部位で誘導するために用いられる。
【００１７】
薬物溶出ステントの開発における最近の進展は、ステント移植後の再狭窄率の低下をもたらしてきた。ラパマイシンおよびパクリタキセルでコーティングされたステントは、ステント術後に持続性の平滑筋細胞増殖を阻害する。しかしながら、最近これらのステントのいくつかの潜在的な欠点が明らかになった。パクリタキセル溶出ステントは再内皮化の遅延を示し、かつラパマイシンは内皮細胞増殖を阻害する。結果として、抗再狭窄療法の改良は、必須なものとして残る。特に、再狭窄を予防するための、再内皮化による血管壁の正常な生態の修復は、特別な配慮に値する。アンジオテンシン-(l-7)の使用もまた、内膜新生の形成に対して直接の作用を有することが現在見出されている。
【００１８】
したがって、本発明は、個体の細胞にアンジオテンシン-(1-7)、またはその機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体を送達する段階を含む、新生内膜の形成を防止および/または低下させる方法に関し、それによってアンジオテンシン-(1-7)、またはその機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体を放出する手段を含む送達媒体が使用される。
【００１９】
本発明は、個体内に移植された移植可能装置周辺で内膜新生の形成を防止および/または低下させるために特に魅力的である。そのような移植可能装置は、ステント、カテーテル、透析目的のポンプ、および経皮血管形成術を実施するためのバルーンを含むが、特にステントである。
【００２０】
したがって、アンジオテンシン-(1-7)、またはその機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体は、移植可能装置を取り囲む内膜に放出されかつ送達され得る。送達は、局所的様式または全身性様式において行われ得る。前者の様式において、移植可能装置は、アンジオテンシン-(1-7)、またはその機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体を放出するための手段を含む。アンジオテンシン-(1-7)、またはその機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体を放出および送達する適した全身性の方法は、丸剤、タブレット、カプセル剤、注射、カテーテル、ポンプ、スプレー、輸液バッグ、ならびに経腸および非経口栄養法を介して投与する段階を含む。
【００２１】
本発明の文脈において、個体の細胞は、成人および/または始原細胞を含む。
【００２２】
好ましい態様において、核酸送達媒体が用いられ、かつその手段は、アンジオテンシン-(1-7)、またはその機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体をコードする少なくとも一つの配列を含む核酸の放出を可能にし、かつ送達媒体は核酸送達担体をさらに含む。
【００２３】
本発明において、アンジオテンシン-(l-7)の機能性類似体は、アンジオテンシン-(l-9)/Ang-(l-9)またはアンジオテンシン-(3-7)である。Ang-(l-7)様Ang-(l-9)はAce阻害物質であり(Kokonen et al. Circulation 1997, 95:1455-1463)、かつ両方のアンジオテンシンは、ブラジキニン受容体を再感作する(Marcic et al. Hypertension, 1999, 33, 835-843)ことから、Ang-(l-7)ならびに/またはAng-(1-9)の機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体は、心筋の血管新生を刺激する活性との組み合わせで、同様の心肥大を阻害および/または予防する活性を、必ずしも量ではなく、同じように含む(in kind not necessarily in amount)。他方では、Ang-(l-7)のいくつかの生物学的機能は、Ang-(3-7)への変換から生じ得、後者はその特定の(まだ同定されていない)機能の最終的な媒介物質である。
【００２４】
本発明においてアンジオテンシン-(l-7)に言及する場合、本言及はアンジオテンシン1-7の機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体を含む。冠状動脈における内因性の血管拡張作用を有することから、アンジオテンシン-(l-7)は有効である。さらに、Ang-(l-7)は、ACE阻害物質、および好ましくないAT1受容体の拮抗物質である。さらに、アンジオテンシン-(l-7)は、血管収縮を阻害するプロスタサイクリンの放出を刺激する。好ましい態様において、該核酸送達媒体は、さらなる血管新生促進因子をコードする少なくとも一つの配列をさらに含む。これらは、VEGF、bFGF、アンジオポイエチン-1、一酸化窒素生成を促進することが可能なタンパク質をコードする核酸、およびそれらの機能性類似体または誘導体の群から適切に選択され得る。驚くべきことに、特定の状況下で、血管形成作用を増強および/または誘導することにおいて相乗効果が得られることが見出された。該さらなる血管新生促進因子は、該核酸送達媒体によって提供される、または他の方法において提供される配列によって供給され得る。それらは、形質導入された細胞、または形質導入された細胞を取り囲む近傍の細胞によってもまた提供され得る。好ましい態様において、該配列の少なくとも一つの発現は、シグナルによって調節される。好ましくは、該シグナルは細胞内の酸素圧によって提供される。好ましくは、該酸素圧シグナルは、低酸素誘導因子lαプロモーターによって、異なる発現へと翻訳される。RASが多くの心血管疾患において活性化されることを考えれば、ACEをコードする遺伝子、およびアンジオテンシン受容体をコードする遺伝子のプロモーターもまた好ましい。そのようなプロモーターの利点は、RAS-阻害物質(アンジオテンシン1-7)の転写が、好ましくないRAS成分の転写の活性化の際に引き起こされることである。そのようなメカニズムは、その必要がある場合、主にアンジオテンシン-(l-7)の生成を可能し、したがって少なくとも部分的に、関連した細胞に標的化した発現のための他の制御メカニズムを除去する。
【００２５】
本発明の他の局面において、該核酸送達媒体は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼをコードする配列をさらに含み得、したがって増強および/または誘導された血管新生のレベルを調節するためのさらなる方法を提供する。該レベルは、ガンシクロビルの添加を介して少なくとも部分的に減少され得、新しく形成される血管部分における分裂細胞を少なくとも部分的に死滅させるだけでなく、形質導入された細胞もまた少なくとも部分的に死滅させ、それによって、一酸化窒素および/またはさらに血管新生促進因子の供給を制限する。
【００２６】
核酸送達担体は、リポソームまたはウイルス粒子のような任意の核酸送達担体であり得る。本発明の好ましい態様において、該核酸送達担体は、好ましくはSFV DNA、アデノウイルスベクターDNA、および/またはアデノ随伴ウイルスベクターDNAの少なくとも必須の部分を含む、セムリキ森林ウイルス(SFV)ベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターを含む。好ましくは、核酸送達媒体は、筋細胞に対する少なくとも部分的な組織指向性と共に提供された。好ましくは、核酸送達媒体は、少なくとも部分的に肝細胞に対する組織指向性を喪失していた。好ましくは、該組織指向性は、サブグループBアデノウイルスの繊維タンパク質の部分を決定する組織指向性を介して、少なくとも一部を提供または喪失された。好ましいサブグループBアデノウイルスは、アデノウイルス16である。
【００２７】
本発明はまた、新生内膜の形成を防止および/または低下させるための送達媒体に関し、本送達媒体は、アンジオテンシン-(1-7)、またはその機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体を放出する手段を含む移植可能装置を含む。このように、アンジオテンシン-(1-7)、またはその機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体は、移植可能装置を取り囲む組織に局所的に放出されかつ送達され得る。適した移植可能装置は、ステント、カテーテル、透析目的のポンプ、および経皮血管形成術を実施するためのバルーンを含む。
【００２８】
好ましくは、アンジオテンシン-(1-7)、またはその機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体を放出する手段は、移植可能装置上にコーティングされた層を含み、層はアンジオテンシン-(1-7)、またはその機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体を含む。好ましくは、移植可能装置はステントを含む。
【００２９】
本発明の好ましい態様において、移植可能装置はステントである。このため、本発明は、アンジオテンシン-(1-7)、またはその機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体を含む層でコーティングされたステントにもまた関連する。
【００３０】
本発明は、アンジオテンシン-(1-7)、またはその機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体を放出するための手段を含む送達媒体を、インビボまたはインビトロ、好ましくはインビボで、個体の細胞、好ましくは哺乳動物の細胞、より好ましくはヒトの細胞に提供する段階を含む、内膜新生の形成を防止および/または減少させるための方法を提供する。別の局面において、本発明は、アンジオテンシン-(1-7)、またはその機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体を放出するための手段を含む送達媒体を、インビボまたはインビトロ、好ましくはインビボで、個体の細胞、好ましくは哺乳動物の細胞、より好ましくはヒトの細胞に提供する段階を含む、少なくとも部分的に肥厚を減少させる方法を提供する。別の局面において、本発明は、アンジオテンシン-(1-7)、またはその機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体を放出するための手段を含む送達媒体を、インビボまたはインビトロ、好ましくはインビボで、個体の細胞、好ましくは哺乳動物の細胞、より好ましくはヒトの細胞に提供する段階を含む、内膜新生を増強および/または誘導する方法を提供する。
【００３１】
好ましくは、送達媒体は核酸送達媒体を含み、かつその手段がアンジオテンシン-(1-7)、またはその機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体をコードする少なくとも一つの配列を含む核酸の放出を可能にする。
【００３２】
前述のように、該方法は、少なくとも一つのさらなる血管新生促進因子、またはその部分、もしくは誘導体、もしくは機能性類似体による相乗的様式で、血管新生を増強および/または誘導するための方法であり得る。好ましくは、該血管新生作用を増強および/または誘導することは、少なくとも部分的に可逆性である。好ましくは、該作用は、酸素圧の増大を介して、もしくはガンシクロビルもしくはその機能性類似体を有する該細胞を提供することを介して、またはその両方によって、少なくとも部分的に逆行させられる。本発明の好ましい局面において、正常な状況下で血液と直接接触していない細胞が少なくとも形質導入される。この利点は、このような方法で、処置が少なくとも部分的に作用の局在化を促進することである。好ましくは、血液と直接接触していない該細胞は、筋細胞であり、好ましくは心筋細胞または骨格筋細胞、より好ましくは平滑筋細胞である。しかしながら、本発明の特定の態様において、筋細胞はまた、血液と直接接触し得る。この点に関して非常に好ましい細胞は、心臓の圧負荷および/もしくは心筋梗塞を患っているかまたはそのリスクがある個体の心臓内に位置する。または、該細胞は、心臓または血管始原細胞であり得、それらはインビトロ培養されるかまたは生体内に存在するかのいずれかであり、かつアンジオテンシン-(l-7)もしくは誘導体ペプチドを発現する核酸、またはペプチド自体によって処理され得る。実行可能な場合、本発明の核酸送達媒体を細胞に提供する好ましい手段は、カテーテル、好ましくは浸透カテーテル(EP 97200330.5)である。アンジオテンシン-(l-7)が非常に誘引的に送達され得る細胞の他の型は、骨髄細胞および/または幹細胞のような骨髄細胞由来細胞である。骨髄細胞および/または骨髄細胞由来細胞が血液と直接接触し得る、またはし得ないことが認められる。本発明の核酸送達媒体を細胞に提供する他の好ましい方法において、該細胞は、心膜送達を介して、好ましくはいわゆるパーデューサー(perducer)によって、該核酸送達媒体を提供される。
【００３３】
本発明は、個体の細胞にアンジオテンシン-(1-7)、またはその機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体を送達する段階を含む、血管壁肥大を防止および/または低下させる方法に関し、それによってアンジオテンシン-(1-7)、またはその機能性部分、誘導体、および/もしくは類似体を放出する手段を含む送達媒体が使用される。上記のような送達装置のいずれかが、この目的のために用いられ得る。
【００３４】
本発明は、ここで下記の非制限的な実施例により説明される。
【００３５】
実施例
動物プロトコル
体重450〜520 gの28匹のオスウィスターラット(Harlan, Horst, Netherlands)は、O2、N2O、およびイソフルラン(Abbot B.V., Hoofddorp, Netherlands)によって麻酔された。予め封入した2.5×9 mm BeStent(商標)2(Medtronic-Bakken Research, Maastricht, the Netherlands)は、前述したように腹大動脈内に移植され、または偽手術が実施された35。その後、28日間持続する0.25μl/hのポンプ流量を有する浸透圧ミニポンプ(Model 2004, Alzet, Charles River Nederland, Maastricht, Netherlands)が、頸静脈内のカテーテルを介した薬物送達のために、皮下に移植された。ステント挿入されたラットは、アンジオテンシン-(l-7)(Bachem, Weil am Rhein, Germany)(24μg/kg/h)(n＝7)、または生理食塩水(0.25μl/h)(n＝10)を与えられた。偽手術をしたラットは、生理食塩水注入(n＝6)を受けた。本方法によって、およそ917.8±194.1 pmol/1のAng-(l-7)血漿レベルに到達する。この濃度で、Ang-(l-7)は、Mas受容体に結合し、その後機能的作用を有する。5匹のラットが、大動脈の破裂のため手術中に死亡した。28日後に、動物は麻酔され、かつ500IUによって静脈内にヘパリン処置された(Leo Pharma B.V., Breda, Netherlands)。腹大動脈は、その後収集され、固定され、メタクリル酸メチル内に包埋され、切断され、かつ組織学分析のために染色された。内皮機能は、単離された胸大動脈輪において試験された。
【００３６】
これらの実験は、the Animal Care and Use Committee of the University of Groningenによって承認され、かつ「Guide for the Care and Use of Laboratory Animals」に従って実施された。
【００３７】
組織学
組織形態計測学的分析は、エラスチカ・ワンギーソン染色した切片上で、各ステントの近位、中間、および遠位部分の測定によって実施された。新生内膜形成を評価するために、外弾性薄膜(EEL)、内弾性薄膜(IEL)、および管腔内の領域は、デジタル形態計測法を用いて測定された。新生内膜領域、中膜領域、管腔領域、および狭窄の割合が算出された。
【００３８】
Schwartz et al.およびKornowski et al.によって記載されるように、外傷および炎症スコアが評価された。簡潔には、各ストラット(strut)は、外傷または炎症の重症度に依存して、0〜3の公称スコアが割り当てられた。平均スコアは、スコアの合計をストラットの数で除算することによって算出した。全体の細胞密度および多形核白血球密度は、ヘマトキシリン-エオシン染色切片において×400拡大率で決定され、かつ×100/mm2として表された。各ステントに対する単一測定値を評価するために、近位、中間、および遠位性部分の平均値が算出された。
【００３９】
単離された大動脈輪による器官槽研究
大動脈周囲組織は大動脈から除去され、およそ2mmの輪が切断された。輪は、14 nMのプレロードで、37℃でNaCl(120.4)、KCl、(5.9)、CaCl2(2.5)、MgCl2(1.2)、NaH2PO4(1.2)、グルコース(11.5)、NaHCO3,(25.0)を含む(mM)クレブス液(pH 7.5)を含む器官槽において、等圧の変位変換器に接続され、かつ95％O2、および5％CO2によって連続的にガスが供給された。安定化後、標準洗浄が実施される間、輪は、生存度に関してフェニレフリン(1 mM)による刺激作用によって検査された。
【００４０】
輪は洗浄され、かつ再安定化された。輪のセットは、フェニレフリン(1 mM)によって前収縮された。内皮依存性血管拡張は、メタコリンの蓄積用量(10 nM〜10 mM)によって評価された。その後、輪は、内皮非依存性血管拡張因子亜硝酸ナトリウム(10 mM)によって最大限に拡張された。薬物は、Sigma-Aldrich, Steinheim, Germanyから購入された。
【００４１】
統計学的手法
データは、平均値±平均値の標準誤差(SEM)として表される。グループ間の統計分析は、スチューデントt検定によって実施された。グループ間の用量反応曲線の相違は、非球面性のためのグリーンハウス・ガイザー修正を用いて、反復測定のためのANOVAによって試験された。p＝0.05の値は、統計学的に有意であるとみなされた。統計分析のために、SPSSソフトウェア(Chicago, USA)が使われた。
【００４２】
結果
組織学解析
全てのステント挿入された動物において、内膜新生は、組織学分析が実施された28日後には存在した。組織形態計測的測定は、表1において示される。IEL領域として表されるステント拡張は、生理食塩水およびAng-(l-7)処置群において同等であった。したがって、平均の外傷スコアもまた、グループ間の相違を示さなかった。さらに、相違は、中膜領域において観察されなかった。新生内膜厚、新生内膜領域、および狭窄の割合は、Ang-(l-7)処置群において、それぞれ21％、27％、および26％著しく減少した。生理食塩水およびAng-(l-7)処置動物のステント挿入された腹大動脈の代表的な顕微鏡写真は、図1において示される。
【００４３】
組織学的測定は、表2において示される。Ang-(l-7)処置群の中膜における細胞密度は、対照群と比較して減少した。内膜新生における細胞密度の相違は、観察されなかった。表面接着性白血球の数はAng-(l-7)群において減少するように見え、有意水準にほぼ到達した(p＝0.06)。浸潤された炎症細胞を表す、多形核白血球の新生内膜密度および平均の炎症スコアは、グループ間で異ならなかった。
【００４４】
内皮機能
ラット腹大動脈内ステント移植、およびその後のAng-(l-7)注入の内皮機能に対する効果は、胸大動脈輪において検討された。本発明者らは、フェニレフリン前収縮輪に対するメタコリンの内皮依存性血管拡張作用を調査した(図2A)。フェニレフリンによる収縮は、偽、対照、およびAng-(l-7)群において同様だった(それぞれ、329±26、297±20、および254±29μm。偽 対 対照およびAng-(l-7)について、それぞれ、P＝1.00およびp＝0.20)。ステント術は、疑似処置動物と比較して、内皮依存性弛緩において、13％の有意な減少をもたらした。Ang-(l-7)処置群において、本発明者らは、生理食塩水処置群と比較して、メタコリンに対する血管拡張性反応における21％の有意な改善を認めた。Ang-(1-7)群における血管拡張性反応は、疑似動物における反応を上回るようだったが、これは有意ではなかった(p＝0.952)(図2A)。内皮非依存性血管拡張因子亜硝酸ナトリウムによる弛緩は、疑似、対照、およびAng-(l-7)群において同等であった(図2B)。
【００４５】
考察
実施例において、ラットステント術モデルにおける新生内膜形成に対するAng-(l-7)注入の効果が示される。Ang-(l-7)処置後の、新生内膜厚、新生内膜領域、および狭窄の割合における有意な減少は、それぞれ21％、27％、および26％観察された。さらに、Ang-(l-7)投与後の内皮依存性弛緩のステント誘導障害の減衰が見出された。Ang-(l-7)処置は、大動脈輪における内皮依存性弛緩の39％の改善をもたらした。内皮依存性弛緩における相違は観察されなかった。これらの結果は、内皮機能の強い改善を示す。
【００４６】
ステント移植の後の再狭窄は、血管壁への深い外傷、および脱内皮化(deendothelialization)の後、限局性血栓形成、炎症、および平滑筋細胞増殖に続いて起こる。血栓形成および平滑筋細胞増殖は、Ang-(l-7)によって減少する。さらに、Ang-(l-7)注入は、ラット頸動脈における血管損傷後、新生内膜形成および平滑筋細胞増殖を減少させる。Ang-(l-7)は、ステント術後、新生内膜形成を阻害する。
【００４７】
これらの結果は、ラット腹大動脈におけるステント移植後のAng-(l-7)処置が、内皮機能の改善と併せて、新生内膜形成の減衰をもたらすことを示す。Ang-(l-7)は、現在入手可能な強力な抗増殖性の薬物溶出ステントの重要な代替物であり得る。 
【００４８】
（表１）組織形態計測的測定
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IELは内弾性薄膜を示す。 
【００４９】
（表２）組織学測定
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【００５０】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ステント挿入されたラット腹大動脈のヘマトキシリン-エオシン染色切片の顕微鏡写真を示す。AおよびB：対照ラット由来の大動脈(それぞれ、×40および×400)。CおよびD：Ang-(l-7)処置ラット由来の大動脈(それぞれ、×40および×400)。
【図２】図2Aおよび2Bは、内皮依存性(A)および内皮非依存性拡張(B)に対する、ステント術ならびにAng-(l-7)処置の効果を示す。A.フェニレフリン前収縮大動脈輪のメタコリンに対する濃度-反応曲線。p＝0.009 対偽、およびp＝0.001 対Ang-(l-7)処置。B.フェニレフリン前収縮大動脈輪の亜硝酸ナトリウム(10 mM)による拡張。偽 対 対照およびAng-(l-7)について、P＝1.00。PEは、フェニレフリンを示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【国際調査報告】
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