(57)【要約】【解決手段】第一及び第二の化学物質間の特異結合を検出するための方法及び装置を説明する。第一のフルオロフォアに関連する第一の化学物質を固定化する。第二の化学物質は、固定化した第一の化学物質との結合を可能にする。第二の化学物質は、第一のフルオロフォアとのＦＲＥＴペアを形成する第二のフルオロフォアであるか、或いは第二のフルオロフォアと結合した状態になる。結合化学物質を、第一または第二のフルオロフォアの何れかの励起周波数での放射に露出し、第一及び第二の化学物質間の特異結合を検出するために、結合化学物質からのＦＲＥＴ蛍光信号の偏光異方性を測定する。ドナーフルオロフォアを含む第一の化学物質とアクセプタフルオロフォアを含む第二の化学物質との間でＦＲＥＴ相互作用が発生しているかを、ドナー及びアクセプタフルオロフォアの波長での同時異方性測定を用いて検出するための手法も開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の化学物質と第二の化学物質との間の特異結合を検出するための方法であって、
第一のフルオロフォアに関連する前記第一の化学物質を固定化する工程と、
前記第二の化学物質を、前記固定化した第一の化学物質と結合可能にする工程であって、前記第二の化学物質は、前記第一のフルオロフォアとのＦＲＥＴペアを形成する、第二のフルオロフォアであるか、または、第二のフルオロフォアと結合した状態になる工程と、
前記結合化学物質を、前記第一または前記第二のフルオロフォアの何れかの励起周波数での放射に露出する工程と、
前記第一及び第二の化学物質間の特異結合を検出するために、前記結合化学物質からのＦＲＥＴ蛍光信号の偏光異方性を測定する工程と、を備える方法。
【請求項２】
更に、前記第一または第二のフルオロフォアの少なくとも一方のドナー発光継続時間を測定する工程を備える、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第一のフルオロフォア及び前記第二のフルオロフォアは、両方とも高い固有異方性を有する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記偏光異方性は、単一の波長で測定される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記第一及び第二の化学物質の少なくとも一方は、生体分子である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記生体分子は、蛋白質である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記第一及び第二のフルオロフォアは、同一（ホモＦＲＥＴ）である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記第一及び第二の化学物質の一方は、蛋白質を含み、前記第一及び第二の化学物質の他方は、核酸を含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
更に、前記第一及び第二の化学物質の少なくとも一方に所定の処理を施す工程を備え、前記第一及び第二の化学物質間の特異結合は、前記所定の処理の結果として前記第一及び第二の化学物質の少なくとも一方が特定の状態になる場合にのみ生じる、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記偏光異方性は、第一の波長と第二の波長とで測定される、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
更に、ＦＲＥＴ相互作用が生じているかを判断するために、前記第一及び第二の波長の前記異方性を比較する工程を備える、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
更に、第一の波長での前記異方性を、前記第二の波長での前記異方性の変化を判断するための基準として使用する工程を備える、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記第一及び第二の波長の前記異方性は、同時に測定される、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
前記第一及び第二の波長の前記異方性は、信号読み出しの際の系統的な測定変化にとって短い時間枠の中で、連続して測定される、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
更に、基準源の偏光異方性を測定する工程を備える、請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
前記基準源は、前記フルオロフォアの一方に対するレーザ励起源である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記基準源は、蛍光のためのレーザ励起源以外の励起源である、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
更に、ＦＲＥＴ相互作用が生じているかを判断するために、前記第一及び第二の波長の前記異方性を、前記基準源の前記異方性と比較する工程を備える、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
更に、前記基準源の前記異方性を、前記第一の波長または前記第二の波長の前記異方性の変化を判断するための基準として使用する工程を備える、請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
前記第一及び第二の波長と前記基準源との前記異方性は、同時に測定される、請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
前記第一及び第二の波長及び基準源の前記異方性は、信号読み出しの際の系統的な測定変化にとって短い時間枠の中で、連続して測定される、請求項１５記載の方法。
【請求項２２】
前記基準源は、測定に使用される基板に印刷または堆積させた蛍光染料のスポットである、請求項１５記載の方法。
【請求項２３】
前記基準源は、測定に使用される基板またはビーズ材料に含浸させたまたは組み込んだ蛍光染料である、請求項１５記載の方法。
【請求項２４】
ドナーフルオロフォアに関連する第一の化学物質とアクセプタフルオロフォアに関連する第二の化学物質との間でＦＲＥＴ相互作用が発生しているかを検出するための方法であって、
前記フルオロフォアの少なくとも一方を、前記ドナーフルオロフォアの励起波長での放射に露出する工程と、
蛍光信号の偏光異方性を、前記ドナーフルオロフォアの発光波長と、前記アクセプタフルオロフォアの発光波長とにおいて測定する工程と、
前記第一及び第二の化学物質間でＦＲＥＴ相互作用が発生しているかを判断するために、前記測定した異方性を比較する工程と、を備える方法。
【請求項２５】
前記ドナー及び前記アクセプタのフルオロフォアは、両方とも高い固有異方性を有する、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記ドナーフルオロフォアの発光波長での前記異方性を使用することは、前記アクセプタフルオロフォアの発光波長の前記異方性の変化を判定または定量化するための内部基準の役割を果たす、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
前記ドナーフルオロフォア及びアクセプタフルオロフォアの前記異方性は、同時に測定される、請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
前記第一及び第二の波長の前記異方性は、信号読み出しの際の系統的な測定変化にとって短い時間枠の中で、連続して測定される、請求項２４記載の方法。
【請求項２９】
前記ドナーフルオロフォアの前記発光波長での前記測定された異方性に対して、前記アクセプタフルオロフォアの前記発光波長での前記測定された異方性が相対的に変化した場合に、ＦＲＥＴ相互作用が生じたと判断される、請求項２４記載の方法。
【請求項３０】
前記第一及び第二の化学物質は、ＦＲＥＴ分析の標的領域に含まれ、前記標的領域は、マイクロビーズと、スポットと、スポット上のスポットと、ビーズと組み合わせたスライド上のスポットと、毛細管に閉じ込めた試料または対象物と、微小流路に閉じ込めた試料または対象物と、ウェルまたは小滴等の液体領域に閉じ込めた細胞の集合またはコロニと、表面または表層上で固定化した細胞の集合またはコロニとのうち一つ以上を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項３１】
前記ドナーフルオロフォアは、シアン蛍光蛋白質であり、前記アクセプタフルオロフォアは、黄色蛍光蛋白質である、請求項２４記載の方法。
【請求項３２】
前記ドナーフルオロフォアは、緑色蛍光蛋白質であり、前記アクセプタフルオロフォアは、赤色蛍光蛋白質である、請求項２４記載の方法。
【請求項３３】
前記第一及び第二の化学物質の少なくとも一方は、ストレプトアビジンを含む、請求項２４記載の方法。
【請求項３４】
前記第一及び第二の化学物質の一方は、前記第一及び第二の化学物質の他方との結合時に立体障害を受ける小分子である、請求項２４記載の方法。
【請求項３５】
前記ドナーフルオロフォアと前記アクセプタフルオロフォアとは同一である、請求項２４記載の方法。
【請求項３６】
ドナーフルオロフォアに関連する第一の化学物質とアクセプタフルオロフォアに関連する第二の化学物質との間でＦＲＥＴ相互作用が発生しているかを検出するための方法であって、
前記フルオロフォアを含有する領域を、前記ドナーフルオロフォアの励起波長での放射に露出する工程と、
蛍光信号の偏光異方性を、前記アクセプタフルオロフォアの発光波長において測定する工程と、
前記フルオロフォアを含有する前記領域における基準信号の波長において偏光異方性を測定する工程と、
前記第一及び第二の化学物質間でＦＲＥＴ相互作用が発生しているかを判断するために、前記測定した異方性を比較する工程と、を備える方法。
【請求項３７】
前記基準信号は、前記ドナーフルオロフォアの蛍光以外の放射を含む、請求項３６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液の高速微量アッセイと、対象物及び細胞に基づく蛍光測定アッセイにおいて使用する、改良された蛍光共鳴エネルギ移動（ＦＲＥＴ）手法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＦＲＥＴは、ドナー及びアクセプタのフルオロフォア間の近接性を示す。ドナーが所定周波数の入射光により励起される時、ドナーが蛍光として通常放出するエネルギの一部は、アクセプタがドナーに十分に近接している場合（通常、殆どのドナーフルオロフォアにおいて約５０オングストローム）、アクセプタへ転送される。アクセプタへ転送されたエネルギの少なくとも一部は、アクセプタの蛍光周波数で放射として放出される。ＦＲＥＴは、出典を明記することで実質上本願明細書の一部とする、「FRET Imaging」（Jares-Erijman, E.A., and Jovin, T.M., Nature Biotechnology, 21(11), (2003), pg 1387-1395）等、様々な文献で説明されている。
【０００３】
本発明の背景におけるもう一つの重要な概念は、異方性である。異方性は、放射が非ランダムに偏光される度合い、即ち、ある偏光配向性が、それに直交する偏光配向性より優勢となる度合いの尺度となる。異方性の高い信号は、強く偏光される（例えば、純粋に直線的に偏光される）。等方性の高い信号は、ランダムな偏光に近くなる。従来の一方法において、異方性（ｒ）は、次の式を用いて計算される。
ｒ＝（ＶＶ−ｇＶＨ）／（ＶＶ＋２ｇＶＨ）
ここでＶＨ及びＶＶは、垂直励起偏光と相対的な水平及び垂直発光偏光であり、ｇは、光学機器の偏光バイアスを補正する。
【０００４】
従来、ＦＲＥＴ分析は、以下の一つ以上の検出に依存する：（１）アクセプタの発光周波数での蛍光の存在、（２）ドナーに対するアクセプタの蛍光強度の割合、及び（３）ドナーの蛍光発光の継続時間。こうした手法には、それぞれに問題がある。例えば、ドナーフルオロフォアを励起するのに使用する周波数に露出した時、アクセプタは、ある程度の自然蛍光を発生させるため、アクセプタの発光周波数での蛍光の存在を検出するだけでは、一般には十分ではない。更に、時間分解ＦＲＥＴ画像化及び分析では、標準的な蛍光画像化及び分析よりも複雑な機器が必要となる。
【０００５】
偏光異方性は、ＦＲＥＴ検出手法として提案されている。ＦＲＥＴアクセプタフルオロフォアが生成する蛍光は、ＦＲＥＴプロセスにより非偏光化され、一般には、ドナーフルオロフォアから直接生成された蛍光に比べ、相対的に低い異方性を有する。したがって、異方性は、ＦＲＥＴの尺度として使用可能であり、故に、ドナー及びアクセプタフルオロフォアに関連する近接性の尺度として使用できる。ホモＦＲＥＴ、または類似フルオロフォア間でのＦＲＥＴにおけるこの手法の使用は、出典を明記することで実質上本願明細書の一部とする、「Imaging molecular interactions in cells by dynamic and static fluorescence anisotropy (fFLIM and emFRET)」（Lidke, D.S., Nagy, P., Barisas, B.G., Heintzmann, R., Post, J.N., Lidke, K.A., Clayton, A.H.A., Arndt-Jovin, D.J. and Jovin T.M., Biochem. Soc. Trans., 31(5) (2003), pg. 1020-1027）において説明されている。
【０００６】
蛍光異方性は、生体細胞におけるＦＲＥＴ検出戦略としても採用できる。「High contrast imaging of fluorescent protein FRET by fluorescence polarization microscopy」（Rizzo, M.A & Piston, D.W., Bophys J, 88 L14-16, 2005）において説明されたように、シアン蛍光蛋白質（ＣＦＰ）の一種であるｍＣｅｒｕｌｅａｎの蛍光異方性は、全波長の発光範囲に渡って約０．３の値を有する。しかしながら、ｍＣｅｒｕｌｅａｎが黄色蛍光蛋白質（ＣＦＰ（ＹＦＰ）の一種であるｍＶｅｎｕｓとのＦＲＥＴペアとなる場合、異方性は、ドナー（即ち、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ）が蛍光を発する時には高い状態を維持し（０．３を僅かに上回る）、アクセプタ（即ち、ｍＶｅｎｕｓ）が蛍光を発する時には約０．１５に低下する。異方性の差は様々な測定結果の間で非常に一貫しているが、差は比較的小さく、通常は、異方性の変化に影響を与え得る未知の要素とキャリブレーション係数とが多数存在するため、実験状況では用途が限られる。したがって、特に、ＦＲＥＴプロセスに関連する異方性変化を測定する、改良され信頼性が向上した方法を有することが望ましい。
【発明の開示】
【０００７】
本発明の一態様は、第一の化学物質と第二の化学物質との間の特異結合を検出するための方法及び装置に関する。第一のフルオロフォアに関連する第一の化学物質は、固定化してよい。第二の化学物質は、固定化した第一の化学物質との結合できるようにする。第二の化学物質は、第一のフルオロフォアとのＦＲＥＴペアを形成する第二のフルオロフォアであるか、或いは第二のフルオロフォアと結合した状態になる。結合化学物質を、第一または第二のフルオロフォアの何れかの励起周波数での放射に露出し、第一及び第二の化学物質間の特異結合を検出するために、結合化学物質からのＦＲＥＴ蛍光信号の偏光異方性を測定する。
【０００８】
有利な実施例は、以下の特徴を一つ以上含むことができる。場合により、異方性に追加して情報を利用し、試料を評価できる。例えば、方法は、第一または第二のフルオロフォアの少なくとも一方のドナー発光継続時間を測定する工程を含んでよい。場合により、方法では、一方または両方のフルオロフォアの相対または絶対強度を測定する。特定の実施形態において、第一及び第二のフルオロフォアは同一である（ホモＦＲＥＴ）。
【０００９】
多数の様々な化学物資が、本発明で使用されると考えられる。こうした化学物質は、小分子と、複合体と、蛋白質及び核酸のような生体分子と、分子の集合と、細胞小器官のような生物学的構造等になり得る。特定の実施形態において、第一及び第二の化学物質の一方は、蛋白質を含み、第一及び第二の化学物質の他方は、核酸を含む。一部の実施形態において、方法は、所定の処理の結果として第一及び第二の化学物質の少なくとも一方が特定の状態（例えば、コンホメーション状態、リン酸化のような化学修飾等）になる場合のみ第一及び第二の化学物質間の特異結合が生じるように、第一及び第二の化学物質の少なくとも一方に対して所定の処理を行う工程を含む。
【００１０】
アッセイの設計に応じて、偏光異方性は、単一の波長または複数の波長で測定し得ることに留意されたい。更に一般的には、フルオロフォアは、異なるものとなる。一部の実施形態において、第一及び第二の波長の異方性は、同時に測定される。一部の実施形態において、第一及び第二の波長の異方性は、信号読み出しの際の系統的な測定変化にとって短い時間枠の中で、連続して測定される。系統的な測定変化の例は、生化学的経路でのカスケード反応における生体分子の遷移である。アッセイは、生体分子の遷移を測定するように設計される。
【００１１】
本発明の別の態様は、ドナーフルオロフォアを含む第一の化学物質とアクセプタフルオロフォアを含む第二の化学物質との間でＦＲＥＴ相互作用が発生しているかを検出するための方法及び装置に関する。化学物質は、第一のフルオロフォアの励起波長での放射に露出する。化学物質からの蛍光信号の偏光異方性は、ドナーフルオロフォアの発光波長と、アクセプタフルオロフォアの発光波長とにおいて測定する。第一及び第二の化学物質間でＦＲＥＴ相互作用が発生しているかを判断するために、測定した異方性を比較する。ドナーフルオロフォアの発光波長での信号の異方性は、アクセプタフルオロフォアの発光波長で測定した異方性を調整するための内部基準を提供し得る。別の実施形態では、アクセプタフルオロフォアの発光波長の異方性を、励起源の放射の異方性、或いは、アッセイ試料において提供される、ＦＲＥＴペアに結合していない別個のフルオロフォアの異方性といった、「外部」基準と比較する。後者の例において、外部基準は、例えば、試料内部にまたは試料に近接して提供された、フルオロフォアのビーズまたはスポットにより提供し得る。
【００１２】
有利な実施例は、以下の特徴を一つ以上含むことができる。特定の実施形態において、ＦＲＥＴ相互作用が発生したと判断されるのは、アクセプタフルオロフォアの発光波長での測定異方性がドナーフルオロフォアの発光波長での測定異方性に対して変化する時である。場合により、ドナーフルオロフォア及びアクセプタフルオロフォアの異方性は、同時に測定される。特定の実施形態において、第一及び第二の波長の異方性は、信号読み出しの際の系統的な測定変化にとって短い時間枠の中で、連続して測定される。
【００１３】
第一及び第二の化学物質は、ＦＲＥＴ分析の標的領域に含み得る。標的領域の例は、マイクロビーズと、スポットと、スポット上のスポットと、ビーズと組み合わせたスライド上のスポットと、毛細管に閉じ込めた試料または対象物と、微小流路に閉じ込めた試料または対象物と、ウェルまたは小滴等の液体領域に閉じ込めた細胞の集合またはコロニと、表面または表層上で固定化した細胞の集合またはコロニとのうち一つ以上を含む。
【００１４】
本発明の方法を使用して、多様な種類の相互作用を比較し得る。一例において、化学物質の少なくとも一つは、他方の化学物質との結合時に何らかのコンホメーションの柔軟性が失われた状態となる小分子である。多様なフルオロフォアの組み合わせを利用し得る。一部の例では、ドナーフルオロフォア及びアクセプタフルオロフォアは同一である。化学物質は、多様な形でフルオロフォアと関連し得る。一例では、抗体−抗原相互作用またはストレプトアビジン−ビオチン相互作用等、従来の結合メカニズムを利用する。
【００１５】
本発明は、以下の利点の一つ以上を含むように実現できる。特異結合を検出するためにＦＲＥＴにおける偏光異方性を利用するアレイに基づくアッセイの使用では、時間に基づく信号の取り込みを必要とせず、アレイに基づくアッセイにおいて二色の異方性測定が行われない限り、複数の波長（ドナー及びアクセプタフルオロフォア発光のもの）での収集を必要としない。更に、広いダイナミックレンジと、高い信号対雑音比とを提供する。本発明のＦＲＥＴに基づくアッセイは、様々な種類のサンドイッチアッセイを含め、基本的には現在利用可能な任意のアッセイにおいて利用できる。アッセイは、生体分子と、化学兵器等の様々な非生体分子とを検出するために利用し得る。従来のアッセイは、各結合相手にそれぞれのフルオロフォアが提供され、一方がドナーフルオロフォアとなり、他方がアクセプタフルオロフォアとなるように簡単に修正される。
【００１６】
本発明の一つ以上の実施形態の詳細は、添付図面及び以下の説明において述べる。本発明の他の特徴及び利点は、説明及び図面と添付特許請求の範囲とから明らかとなろう。
【００１７】
以下、各図面の同様の参照符号は同様の要素を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の一態様によれば、異方性は、特異結合を検出するために、上記のアレイに基づくアッセイ等のアッセイにおけるＦＲＥＴ検出戦略の一部として測定される。本発明の別の態様によれば、本発明は、改良されたＦＲＥＴ検出及び／または定量化のための手法を、一般的には上記のアレイに基づくアッセイにおいて、実現及び使用する方法及び装置を提供する。
【００１９】
改良されたＦＲＥＴ検出手法は、ＦＲＥＴペアにおいてアクセプタとして機能する染料の異方性がＦＲＥＴペアで相互作用していない時に有するものより大幅に低くなるという認識から生じたものである。しかしながら、ＦＲＥＴペアにおいてドナーとして機能する染料は、ＦＲＥＴペアのドナーである時も、ＦＲＥＴペアでドナーとして相互作用していない時も、基本的に同じ異方性を有する。したがって、アクセプタの発光波長領域とドナーの発光波長領域との異方性の比または差を検査することで、ＦＲＥＴ相互作用が生じているかを判断できる。更に、ドナーの発光の異方性は、アクセプタの発光の異方性変化を検出及び／または定量化可能な内部基準の役割も果たせる。特定の実施形態において、本発明による装置では、二種類の波長領域において同時異方性測定を実行できる。これにより、両方の種類の異方性は、他の全てのパラメータを同一に維持した状態で測定され、連続測定を実行した場合のように、パラメータを変化させ得るいかなる不確実性も回避される。更に、装置により、検出時及びその後のデジタル化において、測定及び処理をリアルタイムで実行できる。以下、これを「ストリーミングデータ処理」または「オンザフライ」データ処理と呼ぶ。
【００２０】
以下、本発明の特定の実施形態を詳細に説明し、添付図面に示す。こうした特定の実施形態に関連して本発明を説明するが、本発明を一実施形態に限定するものではないことは理解されよう。以下の説明では、本発明の完全な理解のために、多数の具体的な詳細について述べる。本発明は、こうして具体的な詳細の一部または全部がなくとも実現し得る。また、周知の処理動作は、本発明を不必要に曖昧にしないために詳細な説明を省略する。
【００２１】
特異結合を特定するために、ＦＲＥＴシステムを採用したアレイにおいて異方性を分析するのに適した機器には、様々な種類が存在する。適切な装置の一部の説明は、それぞれ出典を明記することで実質上本願明細書の一部とする以下の文書に記載される：発明者Ｃｒｏｍｗｅｌｌらによる２００４年８月２６日提出の米国特許出願第１０／９２７，７４８号（公開出願番号２００５−００４６８４８−Ａ１、２００５年３月３日公開）「時間依存蛍光測定」、発明者Ｃｒｏｍｗｅｌｌらによる２００４年８月２６日提出の米国特許出願第１０／９２８，４８４号（公開出願番号２００５−００４６８４９−Ａ１、２００５年３月３日公開）「時間依存蛍光の測定」、及び２００５年２月９日提出の米国特許出願第１１／０５５，２４４号「少試料量を走査する方法及び装置」。
【００２２】
図１は、試料における異方性を検出するのに適した装置（１００）の一実施形態の概略図を示す。同等の装置の動作は、上記特許出願で詳細に説明されている。簡単に言うと、並進ステージ（１０２）上に位置する試料を、レーザ（１０１）により、一組の光学素子（１０９）を介して励起する。光学素子は、レーザ（１０１）からの光の焦点を、画像化すべき試料の領域に合わせる。焦点領域は、例えば、マイクロアレイプレート基部の上方に位置する。試料は、マイクロアレイプレートのマイクロウェル底部に付着させた細胞またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合ペアの固定化した構成要素等、蛍光により検査する対象物にできる。
【００２３】
試料から結果的に生じた蛍光は、二組の集光レンズ（１１９）により集光し、二台の検出器（１２１）それぞれに送る。集光レンズ（１１９）は、マイクロアレイプレートのような大きなアレイの走査が可能となるように構成できる。一実施形態において、集光レンズ（１１９）は、試料アレイ基部の一寸法に渡って広がるビームの全範囲を取り込むように設計されたロッドレンズである。集光レンズ（１１９）は、特定のアッセイタイプ用に、こうしたアッセイにおいて発光から必要な特定の情報を取り込むために選択されるような、別の種類のレンズ或いはレンズの集合体を含むこともできる。一部の実施形態では、収集レンズ（１１９）の複数の設定を使用して、集光効率を改善できる。
【００２４】
二組の集光レンズ（１１９）により、放出された蛍光の別個の成分（例えば、別の波長、偏光状態等）の同時集光が可能となる。例えば、第一の偏光フィルタを使用して、第一の偏光の光のみを第一の検出器へ送り、第二の偏光フィルタを使用して、第二の直交する偏光の光のみを第二の検出器へ送ることができる。この構成で収集された信号の相互関係と、検出システムでの検出と、格納信号のその後の操作とにより、単一の検出器では入手できない情報が、信号の改善と併せて生じる。したがって、この装置に由来する情報は、定常状態の異方性となる。更に、蛍光継続時間データを取り込むのに適した検出回路を備えて、装置が構成される場合には、蛍光異方性の時間依存性の挙動の相互関係を測定できる。以下で更に詳細に述べるように、この異方性測定能力は、ＦＲＥＴ測定において重要な情報を提供するのに使用できるという利点を有する。
【００２５】
蛍光の検出器（１２１）への伝達は、例えば、光ファイバまたは光ファイバ束（１２０）により達成できる。一実施形態において、検出器（１２１）は、電気出力信号を生成する、光電子増倍管等の高利得の検出器である。殆どの光ファイバは偏光情報を歪め、光ファイバから出力された光は光ファイバの他端に入力された光と同一の偏光成分を有していないことから、収集光が何れかの光ファイバ（１２０）に入る前には、通常、何らかの偏光フィルタリングが実行されることに留意されたい。図示した実施形態において、検出器からの出力信号は、ＡＤＣ／ＤＳＰ電子機器（１１４）により処理され、コンピュータ（１２４）へ送られ、更に処理される。コンピュータ（１２４）は、信号の強化、平均化、または積算検出システムを利用して、利得及び信号対雑音比（Ｓ／Ｎ）の最適化等の動作を行う。
【００２６】
特定の実施形態において、ＦＲＥＴ検出装置は、非常に単純にすることが可能であり、発光放射の変更状態を測定する装備のみが必要となる。しかしながら、更に複雑な機器を利用して、ＦＲＥＴに関連する追加データを提供し得る。例えば、機器の利用により、蛍光信号の継続時間、特に、時間の関数としての強度及び／または時間の関数としての異方性を測定可能となり得る。通常のシステムにおいて、検出回路は、試料から励起エネルギを取り除いた後、約０．５ナノ秒乃至１０ナノ秒の期間に渡り、発光信号（または波長の異なる複数の発光信号）を記録及び格納可能である。一部の例では、利用するフルオロフォアに応じて、発光信号の測定継続時間は、数百ナノ秒、或いは数マイクロ秒にも成り得る。特定の希土類金属をドープしたフルオロフォアは、ミリ秒の範囲の蛍光継続時間を有する。前述のように、ＦＲＥＴの発現の一つには、ドナー発光継続時間の減少がある。更に、機器の利用により、ドナー及びアクセプタ、或いはアクセプタと公知の異方性を有する他の何らかの基準放射源との両方の周波数での発光放射を同時に取り込む能力を有し得る。これにより、強度比の測定も機器により提供可能となる。上記の装置は、様々な周波数用の冗長収集器を装備してよく、或いは、基準周波数及び信号周波数の放射を交互に取り込む単一の収集システムを利用してもよい。
【００２７】
本明細書の別の部分で更に詳細に説明するように、本発明の特定の実施形態は、基準信号を利用して、ＦＲＥＴ信号、特に、こうした信号の異方性、継続時間、及び／または強度を調整する。多くの場合、基準信号は、例えば、ＦＲＥＴペアのドナーフルオロフォアの発光から取り出した内部基準である。
【００２８】
更に一般的には、測定の内部基準は、信号が測定されている試料中のフルオロフォア（即ち、アクセプタフルオロフォア）に類似する物理及び／または化学特性を有する分子フルオロフォアが提供し得る。この内部基準源は、基準フルオロフォアに存在する物理／化学的相互作用は試料自体においても同じように作用すると推定されることから、望ましい場合が多い。そのため、類似分子の内部基準は、正確な補正済みの内部基準偏光源を提供する。しかしながら、こうした基準信号の使用が有利にならない状況もあり得る。こうした場合、励起源自体（例えば、レーザ）からの信号といった別の基準源は、特に強い信号を提供し、通常の蛍光信号のように多くの波長には分散しないことから、適切な内部基準となる。こうした基準信号は、散乱チャネルにおいて容易に測定可能であり、測定レンズを経由する以外では非偏光化されない。同様に、スポットアレイでは、基準フルオロフォア信号を発見し、増大させ、集中度を高めることができるため、蛍光基準信号は非常に強力になり、測定が容易になる。
【００２９】
外部基準が望ましい別の例は、内部基準の発色団がホモＦＲＥＴを発生させる場合であり、これにより、内部異方性は非偏光化される。この場合、内部基準は、信頼できないか、或いは、集中等の条件により系統的に変化し得る。そのため、この場合、外部基準、特に試料と共に存在する強力な信号を提供するものが、高い信頼性を有し得る。
【００３０】
ＦＲＥＴプロセスの異方性測定結果は、ＥＬＩＳＡ等の従来のアレイに基づくアッセイ、特に高レベルの非特異結合が問題となるものにおいて利用し得るという利点を有する。こうした非特異結合は、対象の特異結合部以外のリガンド上の位置で生じ、分析に干渉するバックグラウンド信号を発生させ得る。例えば、検体種は、固定化した抗体の可変領域ではなく、Ｆｃ領域に付着する場合があり、これにより特異結合が誤って示される。ＦＲＥＴ検出戦略を利用することで、非特異結合は、収集された信号に対する寄与が相対的に小さくなり、したがって、検出に著しく干渉しない。ドナー及びアクセプタフルオロフォアが極めて近接した状態で保持されたアレイ位置（通常は特異結合が生じた位置）のみにおいて、信号が生成される。結果として、ＦＲＥＴに基づくアッセイは、従来のアレイに基づくアッセイに比べ、改良された信号対雑音比を提供できる。しかしながら、アレイに基づく検出手法としてのＦＲＥＴの可能性は、例えば、機器が複雑であることから、実現されていない。本発明の実施形態は、ＦＲＥＴにおける偏光異方性を使用して特異結合を検出する、アレイに基づくアッセイを提供する。
【００３１】
図２乃至６は、本発明の実施例において利用し得る、可能なアッセイ形式の小さなサンプルを提示している。各形式では、対象の結合事象が発生する時にＦＲＥＴペアが形成されるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを利用している。ＦＲＥＴペアの形成は、高スループットの偏光異方性を使用して検出される。
【００３２】
これらの図において提示される例では、ＦＲＥＴ異方性により検出可能な蛋白質−蛋白質相互作用は、残基（例えば、チロシン）がリン酸化される時のみ生じる。こうしたリン酸化は、例えば、細胞内での信号伝達中に発生し得る。各図に示したアッセイは、チロシンのリン酸化が関与する信号経路の一部に対する様々な刺激の影響に関する情報を提供できる。例えば、検査中の特定の処理は、信号経路に関与する蛋白質のチロシンをリン酸化するキナーゼの能力に干渉する可能性があり得る。
【００３３】
当然ながら、本発明は、インタラクトーム（信号経路における相互作用の特徴）または他のいかなるクラスの反応または分子の特徴の検出にも限定されない。本発明のアッセイは、基本的に任意の小寸法の形態または分子の特徴に応用可能である。アッセイ可能な特徴は、蛋白質領域、核酸配列、エピトープ、様々な複合体、トランスクリプトーム、及びインタラクトームを含む。基本的に任意の化学または生化学種または物質の構造的、物理的、及び／または化学的特徴をアッセイ可能である。これには、蛋白質−蛋白質相互作用、蛋白質−核酸相互作用、及び核酸−核酸相互作用が含まれる。蛋白質アレイアッセイの幾つかの例は、出典を明記することで実質上本願明細書の一部とする、Zhu, Bilgin, and Snyder, "Proteomics", Annu. Rev. Biochem. 16 (2003) pages 783-812において説明されている。
【００３４】
図２は、実験条件が特定の形で「餌（ｂａｉｔ）」蛋白質に影響を与えたかを判断するためのアッセイ設計を示す（この例では、リン酸化チロシン）。実験を行う一方法では、二個のｃＤＮＡ構築物をコトランスフェクトした細胞を準備し、一方を第一のフルオロフォア（例えば、ＣＦＰ（シアン蛍光蛋白質））に結合した餌蛋白質とし、他方を第二のフルオロフォア（例えば、ＹＦＰ（黄色蛍光蛋白質））に結合した「獲物（ｐｒｅｙ）」タンパク質とする。当然ながら、付与する蛍光蛋白質は、餌と獲物及び／または検査中の他の細胞成分との間で入れ替えが可能であり、或いは、ｃＤＮＡ構築物により、或いはＦＲＥＴペアのフルオロフォアの取り付けを可能にする別の方法において、修飾可能である。
【００３５】
一般的な実験では、トランスフェクト細胞を検査中の特定の刺激（例えば、薬剤の候補）に接触させ、成長させる。その後、細胞を溶解させ、細胞内容物を、場合によっては初期分離手順を施した後でアッセイする。図２の例において、左側の溶解物は、抗餌捕獲抗体を有する基板に接触させる。別の実施形態では、Ｈｉｓタグを利用して、餌を捕獲する。実験条件により、獲物と結合させる形で餌が修飾された場合（例えば、餌が適切にリン酸化された場合）、捕獲された餌と関連する獲物とは、基板上で極めて近接して有効な形で結合する。結果として、ＦＲＥＴペア、即ち、この例におけるＣＦＰ及びＹＦＰは、共鳴エネルギ移動を可能にするのに十分な近さとなる。偏光異方性検出機器を使用することで、ＦＲＥＴは、上記のように検出できる。異方性の度合いは、餌が検査中の修飾を受けたことを間接的に示す。図２の右側も同様の例を示すが、ここでは、固定化された抗体は、餌ではなく獲物と結合する。最終結果は同じとなり、ＦＲＥＴペアは局所的に固定化され、基板上で検出可能となる。
【００３６】
図３は、同様の実験プロトコル及び関連アッセイを示す。しかしながら、この場合、細胞は、餌フルオロフォアｃＤＮＡ構築物のみによりトランスフェクトしている。実験条件は、同じものを与えてよく、例えば、餌が特定の形で修飾（例えば、リン酸化）されるかどうかに影響する条件を与えてよい。適切な時点で細胞を溶解させ、溶解物は、抗餌抗体を付加した固体基板に接触させる。次に、（１）修飾蛋白質に対する選択性（例えば、リン酸化チロシン残基を有する特定の蛋白質領域に対する選択性）のある抗体と、（２）ＦＲＥＴペア内の餌フルオロフォアのパートナの役割を果たすフルオロフォアとを含む新たな試薬に基板を接触させる。新たな試薬の抗体及びフルオロフォアは、利用可能な多数の連結手法の何れかにより連結し得る。図３にはビオチン−ストレプトアビジンのペアを図示している。
【００３７】
図４は、アッセイにおける別の利用可能な変形を示す。この場合、餌及びフルオロフォアのために、細胞をｃＤＮＡ構築物でトランスフェクトする必要はない。フルオロフォアは、溶解後、できれば付加した抗餌抗体を介して餌自体が基板に付着した後で、餌に付着させる。図示した例では、一般的なドナーフルオロフォアが、別の抗餌抗体を介して餌蛋白質に結合し、図示したサンドイッチ構造を形成している。細胞はトランスフェクトされていないため、フルオロフォアは、生細胞に適合する必要はない。具体的な例において、ＦＲＥＴフルオロフォアペアは、カリフォルニア州カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能なＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６を含む。
【００３８】
図５は、検査中の種が「餌」蛋白質である必要のない、図４に示したアッセイの一般的なバージョンを示している。基本的に、どのような蛋白質その他の種「Ａ」であっても、本発明のアッセイを使用して検出できる。
【００３９】
図６は、対象の特徴（例えば、特定の残基位置のリン酸化チロシン）を、餌−獲物相互作用または抗体−エピトープ相互作用だけでなく、多様な種類の特異結合により検出可能な状況に、図１乃至４のアッセイを拡張可能であることを示している。図示した例において、作用物質「Ｂ」は、「Ａ」のリン酸化残基に結合する。検出試薬は、抗Ｂ抗体に結合したＦＲＥＴフルオロフォアを含む。
【００４０】
上述のように、本発明の特定の態様は、ＦＲＥＴペアにおいてアクセプタとして機能する固有異方性の高い染料（フルオロフォア）の異方性がＦＲＥＴペア内で相互作用していない時に有するものより大幅に低くなるという事実に依存する。しかしながら、ＦＲＥＴペアにおいてドナーとして機能する同じく固有異方性の高い染料は、ＦＲＥＴペアのドナーである時も、ＦＲＥＴペアでドナーとして相互作用していない時も、基本的に同じ異方性を有する。
【００４１】
「高い」固有異方性を備えたフルオロフォアは、強く偏光された放出光を生成することで直線偏光励起光と相互作用する蛍光種であると理解してよい。定量的には、固有異方性の高いフルオロフォアから放出された光は、フルオロフォアの励起周波数の光によりシミュレートした場合、（本文書の背景の項の式を使用して）少なくとも約０．３、更に好ましくは、少なくとも０．４の計算異方性を有する。
【００４２】
次に、本発明の分析方法及びシステムを、光符号化ビーズ及び／または生細胞と共に上記の検出システムを使用する実施形態の一例により説明する。しかしながら、本発明は、ビーズ及び生細胞に限定されず、ＦＲＥＴ分析に適した任意の種類の対象物または対象物の組み合わせを使用できることを認識されたい。こうした対象物またはその組み合わせの例は、マイクロビーズと、スポットと、スポット上のスポットと、ビーズと組み合わせたスライド上のスポットと、毛細管または微小流路に閉じ込めた試料または対象物等を含む。中心となる考え方は、明確に定められた標的領域内に閉じ込めた試料の二種類の波長領域の異方性を同時に測定することと、測定異方性の一方を、標的領域内の試料の他方の測定異方性の変化を検出及び／または定量化するための内部基準として使用することであり、これにより、標的領域内のＦＲＥＴの存在、欠如、及び／または品質の検出を可能にする。本明細書で説明したケースでは、ドナー蛍光を基準として使用したが、アッセイ系に存在する他の非ＦＲＥＴ蛍光分子、更には励起源からの散乱光信号を含め、公知の異方性を備えた他のソースも基準として使用できる。また、固有異方性の高い分子間のホモＦＲＥＴは、ＦＲＥＴ時の異方性の減少を観測することで測定できる。ドナーとアクセプタとが同じ発光周波数を有するホモＦＲＥＴの場合、公知の異方性を備え、試料中に存在する別個の基準発光を、内部基準として使用して、定量化を改善できる。当業者が認識するように、こうした手法は、上記のアレイに基づくアッセイと組み合わせ可能であるという利点を有する。何れの場合も、ホモＦＲＥＴペア、散乱中心等、内部基準用の信号を生成する特徴は、アッセイの結合ペアと共存させる。
【００４３】
次に、蛍光蛋白質を付着させた直径３０マイクロメートルの一組のキャリブレーションビーズを示す図７を参照して、実験例を説明する。蛍光蛋白質は、波長４４０ナノメートル（即ち、本例で利用するＣＦＰドナーの蛍光吸収範囲内）のレーザ光により励起させ、図１の装置を使用して、ビーズからの蛍光を収集した。ビーズセットＡは、ＣＦＰにより標識しており、青色及び黄色チャネルの両方に渡って広範な蛍光を示す。ビーズセットＢは、ＹＦＰフルオロフォアにより標識しており、予想通りに黄色チャネルのみで蛍光を示す。ビーズセットＣは、ＦＲＥＴペア（ＣＦＰ−ＹＦＰ）により標識しており、ドナーからアクセプタへのエネルギ移動のため、黄色チャネルでの蛍光の増大と、青色チャネルでの蛍光の減少とを示す。最後に、ビーズセットＤは、ビーズセットＡ、Ｂ、及びＣの混合物であり、青色及び黄色の両チャネルで蛍光を示す。
【００４４】
図８は、図７のキャリブレーションビーズの強度及び異方性散布プロットを示す。図８の左側のグラフで分かるように、測定黄色強度に対して測定青色強度をプロットする色比プロットでは、ＣＦＰビーズセットをＦＲＥＴビーズセットから分離するのが容易である。図８の右側のグラフは、青色蛍光と黄色蛍光との異方性に関して対応するプロットを示している。異方性のプロットで分かるように、ＣＦＰビーズセットがＦＲＥＴビーズセットから明確に区別されており、異方性がＦＲＥＴの発生を測定するのに有効な特性であることが確認される。更に、図８の異方性プロットからは、黄色蛍光の異方性は、ＣＦＰビーズセットとＦＲＥＴビーズセットとの間で変化するが、青色蛍光の異方性は、両方のケースで同じ状態を保つことが分かる。別の表現をすると、ＣＦＰ及びＦＲＥＴの異方性散布プロットは、水平方向（青色異方性）では基本的に同じ範囲に広がるが、図の垂直方向（黄色異方性）では異なる範囲に広がる。したがって、青色異方性は、黄色い方性の変化を測定するための内部基準として使用できる。上記の装置により二つの異方性を同時に測定できるため、黄色及び青色信号間で共通する何らかの局所的な未知の要素及びキャリブレーション係数が考慮され、これにより、ＦＲＥＴ相互作用を測定するための改良された方法が生じる。
【００４５】
図９及び１０は、それぞれ図８の強度及び異方性散布プロットに対応する棒グラフを示す。図９において、左側の二本の棒は、図７のＣＦＰ及びＦＲＥＴビーズセットで測定された黄色及び青色強度の比（（黄色強度）／（青色強度））を示す。右側の二本の棒は、ビーズセットを同じウェル内に混合物として共に配置した時、即ち、「混合」した時に、強度比が基本的に同じ状態を維持することを示している。更に、両方のケースにおいて、ＦＲＥＴ相互作用の発生がＣＦＰによる非ＦＲＥＴ蛍光から容易に識別されることが、図９から明らかとなる。図１０は、キャリブレーションビーズのＣＦＰ及びＹＦＰでの平均異方性を示している。左側の二本の棒は、青色及び黄色チャネルの両方において、ＣＦＰ異方性が約０．３であり、この実験で提供した他の試料に比べて相対的に高いことを示している。黄色チャネルのＹＦＰ異方性は僅かに低く、これはＹＦＰの低い「固有異方性」によるものと思われ、即ち、ＹＦＰが励起され蛍光を発するメカニズムのために、ＹＦＰは初期状態で低い異方性を有する可能性がある。
【００４６】
最も右側の二本の棒から分かるように、ＦＲＥＴ信号は、青色異方性と黄色異方性との分離の著しい増加を示している。実際、青色異方性が非ＦＲＥＴの例と比べて増加する一方で、ＦＲＥＴの黄色異方性は減少している。ＦＲＥＴ青色異方性の増加は、ＦＲＥＴによりＣＦＰの蛍光継続時間が減少し、結果として、発光周波数の偏光状態にランダム性を持ち込む変化を受ける機会が僅かに減ったことに由来する可能性が高い。言い換えると、ドナーフルオロフォアからの発光は、本来は蛍光放射発光へ向かうはずの一部のエネルギがアクセプタフルオロフォアへ伝達されることで限定され、ドナーから放出された残りのエネルギは高い異方性を有する。ＦＲＥＴ黄色は、ＣＦＰの直接励起（スペクトルの黄色端部におけるＣＦＰによる発光の一部）と、ＹＦＰの直接励起（ＣＦＰを刺激するのに使用される放射による）と、ＦＲＥＴに由来するＹＦＰ発光との組み合わせである。異方性は、これらの成分のそれぞれについて異なるため、最も右側の棒が表すものは、こうした要素のそれぞれにおける異方性の加重平均となる。最初の二要素では、相対的に高い異方性が生じる。そうであっても、ＦＲＥＴ黄色の平均異方性は、図１０の他の平均異方性よりも大幅に低いため、ＦＲＥＴ相互作用の良好なインジケータとなる。
【００４７】
図１１は、ＣＦＰビーズ、ＹＦＰビーズ、及びＦＲＥＴビーズの分離及び混合セットの異方性の差を示す棒グラフである。図１１から分かるように、黄色及び青色異方性の差は、ビーズを一度に一種類ずつ調べても、混合したビーズセットとして調べても、基本的に同じである。更に図１１から分かるように、ＦＲＥＴ相互作用の青色及び黄色異方性には、それぞれＣＦＰ及びＹＦＰより遥かに大きい差が存在するため、ＦＲＥＴ相互作用は、ＣＦＰ及びＹＦＰそれぞれから容易に分離できる。
【００４８】
次に、ＣＦＰ／ＹＦＰトランスフェクション生細胞において、どのようにＦＲＥＴを特定できるかを示す例を提示する。図１２は、ｍＣｅｒ−Ｎ３、ｍＶｅｎｕｓ−Ｃ１、及びＳＣＡＴ３．１（カスパーゼ−３活性に対するＣＦＰ／ＹＦＰ  ＦＲＥＴセンサ）によりトランスフェクトしたＣｏｓ−７細胞の画像を示している。カスパーゼ活性は、細胞の一部の集団におけるアポトーシスのインジケータとして使用し得る。この例において、トランスフェクションは、９６ウェルガラス底プレートで行っており、２４時間に渡って細胞をトランスフェクトした。その後、細胞に波長４４０ナノメートル（ＣＦＰの蛍光刺激周波数）のレーザ光を照射し、図１で説明したシステムの一部の特徴を有する装置を使用して、細胞からの蛍光を収集した。図１２に示したように、細胞ＡはＣＦＰ（Ｃｅｒｕｌｅａｎ）によりトランスフェクトしており、細胞ＢはＹＦＰ（Ｖｅｎｕｓ）によりトランスフェクトしており、細胞ＣはＣＦＰ及びＹＦＰによりコトランスフェクト、即ち、ＣＦＰ及びＹＦＰを別個に、ＦＲＥＴペアとしてではなく追加しており、最後に細胞Ｄは、相互作用する二種類の蛋白質により、それぞれが互いに４０オングストローム以内の距離に位置して、ＦＲＥＴ相互作用が発生可能となるようにトランスフェクトした。ＦＲＥＴ技術は、生体内の内因性カスパーゼ活性の力学及びパターンについて有意義な情報を提供できる。強化シアン蛍光蛋白質（ＥＣＦＰ）を含む組み換えカスパーゼ基板をＦＲＥＴドナーとして使用してよく、強化黄色蛍光蛋白質（ＥＹＦＰ）をＦＲＥＴアクセプタとして、カスパーゼ−３切断配列（ＤＥＶＤ）を含むペプチドにより連結する。こうしたインジケータの開発により、研究者は、単一の細胞レベルにおいて、リアルタイムでのカスパーゼ活性のモニタが可能となる。図１２において分かるように、様々な細胞グループの蛍光パターンは、図７に関して上述したキャリブレーションビーズのものに類似する。しかしながら、ＳＣＡＴセンサの場合には、カスパーゼが活性化するとＦＲＥＴが消滅し、したがってアポトーシスの事象が検知される。ＳＣＡＴ３．１センサとして表現されるＦＲＥＴ相互作用及び信号は、ここではカスパーゼ−３の活性化及び切断の前に示される。
【００４９】
図１３は、図１２の生細胞の強度及び異方性散布プロットを示す。図１３で分かるように、図８のキャリブレーションビーズで得られたプロットと非常に似ている。特に、図１３の右側の異方性散布プロットで分かるように、ＦＲＥＴ異方性は、コトランスフェクション細胞とＣＦＰ細胞との両方から容易に分離できる。
【００５０】
図１４は、図１３のそれぞれの強度プロットに対応する棒グラフを示す。図１０で分かるように、ＦＲＥＴ細胞は、ＣＦＰ及びコトランスフェクション細胞のそれぞれから容易に識別できる。
【００５１】
図１５は、ＣＦＰ／ＹＦＰトランスフェクション細胞の平均異方性を示している。ここでも、結果は、キャリブレーションビーズにより得られた、図１０に図示したものに類似する。ＦＲＥＴ黄色の平均異方性は、図１１の他の平均異方性より大幅に低いため、ＦＲＥＴ相互作用の良好なインジケータとなる。
【００５２】
図１６は、ＣＦＰ細胞、ＹＦＰ細胞、コトランスフェクション細胞、及びＦＲＥＴ細胞の青色及び黄色異方性の差を示す棒グラフである。図１６から分かるように、ＦＲＥＴ細胞の青色及び黄色異方性には、ＣＦＰ細胞、ＹＦＰ細胞、及びコトランスフェクション細胞のそれぞれよりも遥かに大きな差が存在するため、ＦＲＥＴ細胞は、他の細胞からから容易に識別できる。
【００５３】
次に、本発明の特定の処理実施形態のまとめを提示する。図１７では、一部の実施形態において採用し得る動作の幾つかを示すフローチャートを提示している。フローチャートは連続する一連の動作として提示されているが、本発明は、提示した順序に限定されない。更に、説明したように、動作の一部は同時に実行し得る。他の動作は、示したものと逆の順序で実行し得る。
【００５４】
図１７に示したプロセスでは、種Ａ及びＢ間の相互作用に対してアッセイが実行されると仮定する。種Ａ及び種Ｂは、ここでは第一及び第二の化学物質と呼ばれる場合がある。これらの用語は、様々な分子、分子断片、複合体、分子の集合、分子の超構造、細胞小器官を含む細胞成分等を広範に網羅するものとする。多くの生体分子は、化学物質として機能し得る。例には、核酸と、蛋白質及びペプチドと、脂質と、炭水化物と、その組み合わせとが含まれる。指摘したように、本発明の方法及び装置は、第一及び第二の化学物質間の相互作用における変化を測定し得る。こうした変化は、物質間の結合と、物質を含む構造の切断と、一方または両方の物質のコンホメーションの変化（例えば、蛋白質の折り畳み）と、一方または両方の物質の立体障害と、結合、コンホメーション等に影響を与え得る、物質の化学修飾（例えば、リン酸化）と、オリゴマ形成等により発生し得る。
【００５５】
図１７の最上ブロック、動作１７０１に示したように、通常の試料に提供し得る成分には、種Ａに関連するドナーフルオロフォアと、種Ｂに関連するアクセプタフルオロフォアとが含まれる。通常、必ずではないが、試料の成分は、一定期間に渡って（単一の溶液との接触等により）接触状態が維持される。反応の時間分解追跡が望ましい他の実施形態では、ＦＲＥＴについて試料を即座に調査してよい。図１７では、ブロック１７０３が調査を示しており、アッセイを実行するシステムは、ドナーフルオロフォアの蛍光励起波長の範囲内の波長を有する励起放射を提供する。
【００５６】
プロセスの何れかの時点で、システムは、異方性の基準に関連する波長で偏光異方性の尺度を取得する。ブロック１７０５を参照されたい。これには、動作１７０３で付与したものとは異なる波長での励起放射を提供することが伴い得る。しかしながら、多くの実施形態では、単一の励起源、即ちドナーの励起周波数であるもので十分となる。ブロック１７０７に示したように、プロセスは、更に、アクセプタフルオロフォアがＦＲＥＴ中に放射を発する波長で偏光異方性の尺度を取得することを含む。この情報により、システムは、アクセプタの発光波長での異方性の尺度を、異方性基準の波長での異方性の尺度と比較する。ブロック１７０９を参照されたい。この異方性の比較に基づき、プロセスは、種Ａと種Ｂとの間の反応または相互作用を評価する。ブロック１７１１を参照されたい。
【００５７】
このブロック１７０１で述べた相互作用または反応は、通常、種Ａ、種Ｂ、ドナーフルオロフォア、及びアクセプタフルオロフォアが混合その他の形で互いに密接に接触可能となる、小さな、場合によっては閉ざされた範囲等、指定された試料領域において行われる。通常、必ずではないが、試料領域は、マルチウェルプレート上のウェルまたはスポット領域、或いは、流路内の領域である。別の例には、（ａ）組織または器官試料、血流等の原位置分析と、（ｂ）２００５年２月９日提出の米国特許出願第１１／０５５，２４４号（出典を明記することで実質上本願明細書の一部とする）において説明されるような平面回転基板と、（ｃ）細胞、或いは核または細胞質等の細胞内の区画の原位置分析、及び（ｄ）個別の領域または特定の集合体がＦＲＥＴ信号を発生させる特定の相互作用を起こしている可能性のある、細胞コロニ等の細胞の集合体の原位置分析とが含まれる。
【００５８】
上記のように、ドナー及びアクセプタフルオロフォアは、ＦＲＥＴペアを形成可能となるべきである。多数の適切なフルオロフォアペアが、当業者に知られている。上記の蛍光蛋白質ペアの例に加え、ＦＲＥＴペアへの関与に適した他の蛍光物質には、フルオレセインと、ローダミンと、Ｂｏｄｉｐｙファミリの染料（カリフォルニア州カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）と、臭化エチジウムと、蛍光クマリンと、シアニン染料等が含まれる。様々な蛍光蛋白質（通常は、生体内でキメラ融合蛋白質として提供）を利用し得る。これらには、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａサンゴからクロン形成した赤色蛍光蛋白質（ＤｓＲｅｄまたはｄｒＦＰ５８３）と、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）と、ＧＦＰの青色、シアン、及び黄色のバリエーションと、シアン蛍光蛋白質と、黄色蛍光蛋白質とが、幾つかの例として含まれる。
【００５９】
最初にアッセイの成分を一緒にする時には、種Ａ及びＢは、物理的に分離していても、連結していてもかまわない。分離した種は、アッセイ試料内で結合または反応が生じるかを評価するために接触状態にさせる、結合または反応を起こすペアにしてよい。このような場合、アッセイは、アクセプタの発光周波数からの信号において、偏光異方性が相対的に高い状態で開始され得る。しかし、反応が生じた時、或いは生じた場合には、アクセプタの発光による偏光異方性において、検出可能な現象が生じる。別のケースにおいて、種Ａ及びＢが当初連結しており、その後、開裂その他の形で互いに更に分離した状態にする可能性のある条件に晒される場合には、検査中の反応または相互作用により、アクセプタの発光波長で収集した信号において、偏光異方性に検出可能な増加が生じる。
【００６０】
動作１７０３に関して、本明細書で説明したアッセイ用の励起源には、通常、直線偏光、或いは強い偏光が施される。励起源は、ドナーフルオロフォアの励起周波数において、狭い周波数帯域で提供されるが、これは常に必要な訳ではなく、特に、アクセプタフルオロフォアの励起周波数と、ドナー及びアクセプタフルオロフォアの発光周波数とがアクセプタの励起周波数から十分に離れている場合には、その必要はない。励起放射の強度は、考慮中のアッセイの必要に応じて選択される。通常は、強いＦＲＥＴ信号を生成するのに十分な高さだが、種が起こしている反応に干渉するほど高くはない強度を提供することが望まれる。多くのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでは、励起源の強度範囲（試料と相互作用する際のもの―レンズによる損失を考慮する）は、約１×１０3乃至２×１０5ワット／ｃｍ2である。更に一般的には、強度範囲は、約２×１０3乃至２×１０4ワット／ｃｍ2である。
【００６１】
動作１７０５に関して、基準は、試料からの偏光異方性信号のキャリブレーションまたは比較のために提供される。上記のように、ＦＲＥＴ相互作用以外のアッセイの局所的条件は、単独で異方性に影響を与え得る。結果として、異方性の絶対値ではなく、相対値を測定することが好ましい場合がある。基準からの偏光異方性の取得は、本明細書の別の部分で説明したように、即ち、基準信号が偏光された度合いを決定することで達成し得る。通常、これは、一方が励起源の提供する偏光方向に平行で、他方がその方向に垂直である二つの直交する偏光角度で信号を測定することにより求められる。二方向で得られた強度の大きな差が高い異方性を示すのに対し、二方向に渡って得られた、より等しい強度の値は、等方性を示す。ここでも、基準の異方性は、試料のアクセプタフルオロフォアの発光について測定した異方性をキャリブレーションする目的で取得される。
【００６２】
上記のように、基準は、内部基準または外部基準にしてよい。内部基準信号は、通常、ドナーフルオロフォアの発光信号の異方性から求められる。外部基準は、ドナー蛍光発光以外のソースから得られる。上記のように、一例は、ドナーではなく、アクセプタでもない、試料内の基準フルオロフォアからの発光である。こうした基準は、試料格納容器での固定化、試料内のビーズへの提供、溶液中への提供等を行ってよい。外部基準の別の例は、使用中で測定される励起源からの放射であり、例えば、試料から収集された散乱光である。
【００６３】
動作１７０７に関して、アクセプタフルオロフォア発光周波数の偏光異方性は、基準の変更異方性と同じ方法だが異なる波長で測定される。説明したように、検査中の相互作用が種Ａ及びＢを極めて近接した状態にするか、分離させるかに応じて、アクセプタの発光周波数での偏光異方性の減少または増加は、相互作用の形跡となる。
【００６４】
動作１７０９及び１７１１に関して、比較及び評価は、通常、コンピュータ、回路、または特別に構築された論理を使用して行われる。反応または相互作用が生じていることを示すために、試料及び基準間の異方性の差の閾値レベルを使用してよい。また、或いはこれに加えて、反応または相互作用が生じている範囲を示すために、異方性の差の定量値を使用してよい。特定の実施形態において、相対的な異方性の値は、種Ａまたは種Ｂの濃度または効力の示度を提供する。
【００６５】
図１８は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを実行するための一般的な一連の動作を表す別のフローチャートである。最初にブロック１８０１に示したように、種Ａ及び関連するドナーフルオロフォアを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料に提供する。ブロック１８０３に示したように、種Ｂ及び関連するアクセプタフルオロフォアも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料に提供する。動作１８０１及び１８０３を合わせて、アッセイ試料を形成するために、二種類の溶液、即ち、種Ａ及びそのフルオロフォアを含有するものと、種Ｂ及びそのフルオロフォアを含有する別のものとを混合することのみを含んでもよい点に留意されたい。しかしながら、特定の実施形態では、一方または両方のフルオロフォアを別の成分として追加するのが適切である。更に、種Ａ及びＢがカスパーゼ−３または他の生体分子のような連結構造を共に形成する場合、動作１８０１及び１８０３は、単一の動作として実行される。どのように実行されるかに関係なく、動作１８０１及び１８０３は、アッセイ試料を調製することを共に表す。高スループットシステムでは、多くの異なるアッセイ試料を迅速に連続して作成及び調査する。
【００６６】
一部の実施形態では、ＦＲＥＴ相互作用の検査前に、場合により所定の期間に渡って、或いは、上昇させた温度、低酸素等の特定の刺激に触れさせた後で、種とフルオロフォアとの相互作用を必要に応じて可能にする。ブロック１８０５を参照されたい。検査する試料は、調製後、ドナーフルオロフォアの蛍光励起波長の範囲内の波長を有する励起放射に露出することで調査する。ブロック１８０７を参照されたい。
【００６７】
アッセイ試料を励起放射に露出した後、システムは、アクセプタフルオロフォアの蛍光発光の波長での偏光異方性を測定する。ブロック１８０９を参照されたい。説明したように、この情報は、ＦＲＥＴが生じているかを判断するのに使用される。測定された偏光異方性に基づいて、プロセスでは、種Ａ及び種Ｂ間で想定される反応または相互作用が生じたかを評価する。ブロック１８１１を参照されたい。反応が生じたと判断された場合、
本発明の一部の実施形態では、随意的に、反応が生じた度合いを判断する。
【００６８】
本発明の特定の実施形態は、上記の動作を実行するデバイス、システム、または装置に関する。システムは、必要な目的のために特別に構築してよく、或いは、例えば、コンピュータに格納されたコンピュータプログラムにより選択的に起動または構成される、汎用光学機器にしてもよい。上記のプロセスは、特定の光学機器またはコンピューティング装置に本質的に関連するものではない。
【００６９】
以上、本発明の多数の実施例を説明してきたが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変形を施し得ることは理解されよう。例えば、上記説明は、アッセイ用のスポットアレイ及び生細胞形式に重点を置いた。本発明は、もちろん、この形に限定されない。別の例として、固体基板はビーズを含んでもよい。スポットアレイ形式では、用途に応じて、様々な取り込み領域サイズを利用してよい。スポット密度も、用途に応じて変化する。特定の例では、基板は、ウェルを含み、例えば、約５０ｎｌ以下のスポットサイズ等、用途の必要に応じたサイズとする。ウェルまたはスポットのパターンは、バーコード情報等の特定の情報を符号化または提供してよい。特定の応用において、基板は信号経路の中心要素に対して抗体アレイのパターンを提供するように設計される。スポットのパターンは、アッセイまたは信号読み出しの何れかに対する基準測定値または制御信号を生成するために使用される材料を含んでもよく、或いは、単純にアッセイスポットアレイの位置決めデバイス（基準）として使用してよい。したがって、添付特許請求の範囲には他の実施形態が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】本発明によるＦＲＥＴ分析で使用可能な装置の概略ブロック図である。
【図２】本発明の一実施形態による、実験条件が特定の形で「餌」蛋白質に影響を与えたかを判断するためのアッセイ設計を示す図である。
【図３】餌フルオロフォアｃＤＮＡ構築物のみで形質移入した細胞による、図２に示したものと類似する実験プロトコル及び関連アッセイを示す図である。
【図４】図２及び３において提示したアッセイの別の変形を示す図である。
【図５】図４に示したアッセイの一般的バージョンを示す図である。
【図６】特定の結合メカニズムを使用して作用物を検出する図２及び５のアッセイの拡張を示す図である。
【図７】ＦＲＥＴキャリブレーションビーズの様々なセットから青色及び黄色チャネルにおいて取得した強度信号を示す図である
【図８】図７のキャリブレーションビーズの強度及び異方性散布プロットを示す図である。
【図９】図７のキャリブレーションビーズの平均黄色／青色強度比を示す棒グラフである。
【図１０】図７のＣＦＰ／ＹＦＰキャリブレーションビーズの平均異方性を示す棒グラフである。
【図１１】図７のＣＦＰ／ＹＦＰキャリブレーションビーズの異方性の差を示す棒グラフである。
【図１２】形質移入した生細胞の様々なセットから青色及び黄色チャネルにおいて取得した強度信号を示す図である。
【図１３】図１２の細胞の強度及び異方性散布プロットを示す図である。
【図１４】図１２の細胞の平均黄色／青色強度比を示す棒グラフである。
【図１５】図１２のＣＦＰ／ＹＦＰ細胞の平均異方性を示す棒グラフである。
【図１６】図１２のＣＦＰ／ＹＦＰ形質移入細胞の異方性の差を示す棒グラフである。
【図１７】偏光異方性基準を採用した特定の実施形態に関連し得る動作を示すフローチャートである。
【図１８】ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおける偏光異方性を利用する特定の実施形態に関連し得る動作を示すフローチャートである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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