(57)【要約】  本発明は、支持マトリックス内に封入された多能性ＥＳ細胞を提供するステップと支持マトリックス構造体を形成するステップと、維持培地中の３次元培養で封入された細胞を維持するステップと、さらに、任意の分化培地中で封入された細胞を３次元培養で分化させるステップとを含む細胞培養の方法に関する。本発明は、さらに、封入された細胞の使用を組み入れるスクリーニング方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）支持マトリックス内に封入されたヒト胚幹（ＥＳ）細胞を提供するステップと、支持マトリックス構造体を形成するステップと、
（ｂ）封入された細胞を維持培地中の３次元培養で維持するステップによる維持培養と
を含む、細胞培養の方法。
【請求項２】
前記維持培養が、フィーダー細胞の非存在下およびフィーダー細胞馴化培地の非存在下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞の分化に適した条件で、前記封入された細胞を分化培地中の３次元培養で分化させるステップをさらに含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記維持するステップと分化させるステップとが同一の容器中で行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
分化のための刺激が与えられる、請求項３または請求項４に記載の方法。
【請求項６】
分化のための前記刺激が胚様体形成のための刺激を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
胚様体形成のための前記刺激が、分化を抑制する物質の除去、または分化を抑制する物質への曝露の減少；及び／又は、胚様体形成を促進する物質の添加、または胚様体形成を促進する物質への曝露の増加である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
外胚葉、内胚葉または中胚葉系統への分化のための刺激が与えられる、請求項３〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
中胚葉の骨格系統への分化のための刺激が与えられる、請求項３〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
骨形成細胞への分化または軟骨形成細胞への分化のための刺激が与えられる、請求項３〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）支持マトリックス内に封入された単一のＥＳ細胞または複数のＥＳ細胞を提供するステップと、支持マトリックス構造体を形成するステップと、
（ｂ）ＥＳ細胞の維持に適した条件で、前記封入された細胞を維持培地中の３次元培養で維持するステップによる維持培養と、
（ｃ）骨形成細胞への分化に適した条件で、前記封入された細胞を分化培地中の３次元培養で分化させるステップによる、骨形成細胞への分化と
を含む、細胞培養の方法。
【請求項１２】
前記封入された細胞の骨形成細胞への分化が、
（ｉ）前記封入されたＥＳ細胞を分化培地中の３次元培養でインキュベートするステップと、胚様体形成のための刺激を与えるステップと、次に、
（ｉｉ）（ｉ）で産生された前記封入された細胞を分化培地中でインキュベートするステップと、骨形成細胞への分化のための刺激を与えるステップと
を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記封入された細胞の骨形成細胞への分化が、
（ｉ）前記封入されたＥＳ細胞を分化培地中の３次元培養でインキュベートするステップと、次に
（ｉｉ）（ｉ）で産生された前記封入された細胞を分化培地中でインキュベートするステップと、骨形成細胞への分化のための刺激を与えるステップと
を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記封入された細胞の骨形成細胞への分化が、前記封入されたＥＳ細胞を分化培地中でインキュベートするステップと、骨形成細胞への分化のための刺激を与えるステップとを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＥＳ細胞が、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、イヌ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、魚類、げっ歯類、マウス、または鳥類起源のものである、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
各支持マトリックス構造体内に複数の細胞が封入されて提供される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
各支持マトリックス構造体内に単一の細胞が封入されて提供される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ａ）において、複数の支持マトリックス構造体が提供される、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記支持マトリックス構造体がビーズの形態である、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
細胞の維持および／または分化への試験刺激の効果を評価するための、支持マトリックス内に封入されたヒトＥＳ細胞の使用。
【請求項２１】
細胞の維持および／または分化への培地および／または条件の効果を評価するための、支持マトリックス内に封入されたヒトＥＳ細胞の使用。
【請求項２２】
試験化合物の存在下で前記封入された細胞を維持培地中でインキュベートするステップと、細胞の維持および／または分化への試験化合物の効果を評価するステップとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞の維持および／または分化に適した培地および条件において、試験刺激の存在下で前記封入された細胞をインキュベートするステップと、細胞分化への試験刺激の効果を評価するステップとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
試験培地および／または試験条件の存在下で、前記封入された細胞をインキュベートするステップと、細胞の維持および／または分化への前記試験培地および／または試験条件の効果を評価するステップとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞に試験刺激を与え、該細胞の維持および／または分化への試験刺激の効果を評価する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（ａ）において、各支持マトリックス構造体内に複数の細胞が封入される、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ステップ（ａ）において、各支持マトリックス構造体内に単一の細胞が封入される、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
封入された細胞が一連の培養容器に提供される、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記一連の培養容器がマルチウェルまたはマルチチューブアレイである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ａ）において、複数の封入された細胞が各培養容器に提供される、請求項２２〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ステップ（ａ）において、複数の支持マトリックス構造体が各培養容器に提供される、請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ステップ（ａ）において、単一の封入された細胞が各培養容器に存在している、請求項２２〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記支持マトリックス構造体がビーズの形態である、請求項２２〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
細胞維持および／または分化への前記効果が、顕微鏡検査、ステップに特異的な抗原または複数の抗原の検出、および遺伝子発現の検出からなる群から選択される１以上の方法により評価される、請求項２０〜３３のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項３５】
前記支持マトリックスがヒドロゲルからなるまたはヒドロゲルを含む、請求項１〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記支持マトリックスがアルギン酸からなるかまたはアルギン酸を含む、請求項１〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記支持マトリックスがゼラチンをさらに含む、請求項３６または請求項３７に記載の方法。
【請求項３８】
前記支持マトリックスが、ゼラチン、ラミニン、バイオガラス（商標）、ヒドロキシアパタイト、細胞外マトリックス、細胞外マトリックスタンパク質、増殖因子；別の細胞培養からの抽出物、骨芽細胞培養からの抽出物を含む群から選択される１以上の物質をさらに含む、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記封入された細胞を凍結させるステップをさらに含む、請求項１〜３８のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項４０】
前記支持マトリックスからの細胞の分離をさらに含む、請求項１〜１９または３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法により得られた細胞。
【請求項４２】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法により得ることができる、または得られた封入された細胞。
【請求項４３】
請求項１に記載の方法により得られる封入されたヒトＥＳ細胞。
【請求項４４】
請求項３〜１９のいずれか一項に記載の方法により得られた、封入された複能性細胞。
【請求項４５】
請求項３〜１９のいずれか一項に記載の方法により得ることができる、または得られた、封入された骨形成細胞、軟骨形成細胞または心筋芽細胞。
【請求項４６】
請求項３〜１９のいずれか一項に記載の方法により得ることができる、または得られた、封入された最終分化細胞。
【請求項４７】
請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の封入された細胞、または請求項４１に記載の細胞の薬剤としての使用。
【請求項４８】
請求項４５に記載の封入された骨形成細胞の、骨の再構築を必要とする疾患または状態の治療のための薬剤としての使用。
【請求項４９】
請求項４５に記載の封入された骨形成細胞の、骨粗鬆症、骨折（bone breaks）、骨折（bone fractures）、骨がん、骨がん腫、骨形成不全症、パジェット病、線維性骨異形成症、聴力損失に関連する骨疾患、低ホスファターゼ血症、骨髄腫骨疾患、大理石骨病、骨の使いすぎ障害、骨のスポーツ障害、歯周病（歯肉疾患）、および再建手術（治療のための顎顔面外科手術、または美容整形など）から選択される、疾患または状態の治療のための薬剤としての使用。
【請求項５０】
請求項４５に記載の封入された軟骨形成細胞の、関節炎、軟骨疾患もしくは軟骨障害、軟骨修復、美容再建手術；関節リウマチおよび変形性関節炎から選択される疾患または状態の治療のための薬剤としての使用。
【請求項５１】
請求項４５に記載の封入された骨形成細胞の、骨の再構築を必要とする疾患または状態の治療のための薬剤の製造における使用。
【請求項５２】
請求項４５に記載の封入された骨形成細胞の、骨粗鬆症、骨折（bone breaks）、骨折（bone fractures）、骨癌、骨がん腫、骨形成不全症、パジェット病、線維性骨異形成症、聴力損失に関連する骨疾患、低ホスファターゼ血症、骨髄腫骨疾患、大理石骨病、骨の使いすぎ障害、骨のスポーツ障害、および歯周病（歯肉疾患）から選択される、疾患または状態の治療のための薬剤の製造における使用。
【請求項５３】
請求項４５に記載の封入された軟骨形成細胞の、関節炎、軟骨疾患もしくは軟骨障害、軟骨修復、再建手術；美容再建手術、関節リウマチおよび変形性関節炎から選択される疾患または状態の治療のための薬剤の製造における使用。
【請求項５４】
請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の、封入された細胞の被験体への投与を含む、被験体の治療方法。
【請求項５５】
請求項４５に記載の封入された骨形成細胞の被験体への投与を含む、骨の再構築を必要とする疾患または状態の治療方法
【請求項５６】
請求項４５に記載の封入された骨形成細胞の投与を含む、骨粗鬆症；骨折（bone breaks）、骨折（bone fractures）；骨癌、骨がん腫、骨形成不全症、パジェット病、線維性骨異形成症、聴力損失に関連する骨疾患、低ホスファターゼ血症、骨髄腫骨疾患、大理石骨病；骨の使いすぎ障害、骨のスポーツ障害、および歯周病（歯肉疾患）から選択される疾患または状態の治療方法。
【請求項５７】
請求項４５に記載の封入された細胞の被験体への投与を含む、関節炎、軟骨疾患もしくは軟骨障害、軟骨修復、関節リウマチおよび変形性関節炎から選択される、疾患または状態の治療方法。
【請求項５８】
請求項４５に記載の封入された細胞の被験体への投与を含む、治療的手術または美容整形から選択される再建手術の方法。
【請求項５９】
請求項４５に記載の封入された骨形成細胞または軟骨形成細胞の被験体への投与を含む、治療的手術または美容整形から選択される再建手術の方法。
【請求項６０】
請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の封入された細胞と、製薬的に許容可能な担体または希釈液とを含む医薬組成物。
【請求項６１】
注射による投与、または内視鏡検査による投与のために処方される、請求項６０に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の封入された細胞に由来する骨組織または軟骨組織。
【請求項６３】
請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の封入された細胞が播種された、または封入された細胞を含浸させた細胞足場。
【請求項６４】
請求項６２または請求項６３に記載の医薬組成物を含有する、シリンジなどの充填済みの投与装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性（pluripotent）細胞を培養して細胞の制御された自己再生を促進する方法に関する。本発明はさらに、多能性細胞から同種の細胞集団を拡大し、分化させるための統合された方法を提供する。さらに、本発明は、多能性細胞、例えば胚幹細胞の成長および分化に影響を及ぼす条件、培地および刺激を同定するためのスクリーニング法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
用語「幹細胞」とは、複数の組織種の細胞を生じさせることができる細胞をいう。異なる種類の幹細胞が存在する。単一の全能性細胞は、精子が卵を受精させる時に形成され、この全能性細胞は生物全体を形成する能力を有する。受精後数時間以内に、この細胞は同一の全能性細胞へと分裂する。受精から約４日後および数サイクルの細胞分裂の後、これらの全能性幹細胞は特殊化し始める。全能性細胞がさらに特殊化されると、次にそれらは「多能性」と呼ばれる。多能性細胞は体のあらゆる細胞種へ分化することができるが、胎盤、または胎児の発育に必要な支持組織を生じさせることはできない。多能性細胞の分化のための能力は「完全（total）」ではないため、そのような細胞は「全能性」とは呼ばれず、これらは胚でもない。多能性幹細胞はさらに特殊化されて複能性（multipotent）幹細胞となり、複能性幹細胞は特定の機能に特殊化された特定の系統の細胞へと分化する。複能性細胞は、それらの由来する組織に見出される細胞種へ分化することができる。例えば、血液幹細胞は、赤血球、白血球および血小板にのみ分化することができる。
【０００３】
多能性幹細胞、例えば胚幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞および複能性幹細胞（臍帯幹細胞および成体幹細胞など）は、それらの自己再生能力および可塑性の能力のために組織工学での使用が提案されている強力な手段である。多能性幹細胞（ＥＳ細胞など）を誘導して中胚葉、外胚葉および内胚葉細胞系統の複能性細胞へインビトロで分化させることができる。中胚葉系統の細胞、例えば骨芽細胞、軟骨細胞および心筋細胞は、それぞれ骨形成用添加剤、軟骨形成用添加剤、および筋原性用添加剤の影響を受けて生成される。現在、多能性幹細胞（ＥＳ細胞など）、および複能性細胞の医薬における使用は、組織様構造の形成に関する知識が不十分であること、さらに、異なる細胞系統へ自発的に分化する傾向があることにより、制限されている（実際に、この多系統への分化可能性は異所性組織形成のリスクを表し得る）。臨床使用のためには、高い純度の同種細胞集団が必要である。
【０００４】
有効な多能性細胞を用いる臨床治療のための必要条件は、関連する臨床適用に適切な数の細胞を供給することである。未分化の胚幹細胞は、鍵となる分化細胞種の生成のための有望な供給源である；しかし、多くの未分化細胞集団にとって、現在の培養法は増殖に適していないか、または有用な収量の分化細胞を供給しない。
【０００５】
ヒトＥＳ（ｈＥＳ）細胞を維持するための現在の方法は、ｈＥＳ細胞の増殖を可能にし、自発的な分化を防ぐために、フィーダー層、フィーダー馴化培地の使用、またはヒトもしくは動物細胞抽出物の培地での供給を必要とする。そのような方法は、その後、ヒトでの治療において細胞を使用することが計画されている場合には適さない。ｈＥＳ細胞の臨床適用には、動物の生成物の非存在下で、標準化され、十分に調節された環境（疾患伝達のリスクを排除するためのいわゆる「異物フリー」の培養環境）で細胞を培養する方法を必要とする。さらに、ｈＥＳ細胞治療薬がフィーダー細胞またはそれに由来する汚染物質で汚染されるリスクを排除するために、フィーダー細胞または支持細胞の非存在下でｈＥＳ細胞を培養する方法が必要とされる。理想的には、十分な数のｈＥＳ細胞を産生する方法は、標準化され、制御しうるものであるべきである。そのような方法は今まで利用可能でなかった上に、伝統的な方法を用いるｈＥＳ細胞の単離および維持は高度な技術を要する方法であって臨床適用に適さない（１）。従って、ｈＥＳ細胞の増殖のための、さらに、必要に応じてその後の分化のための、改良された培養法を開発する必要性がある。
【０００６】
未分化のマウス胚幹細胞（ｍＥＳ）からさらに分化した細胞種への移行を達成するための方法は既知である。しかし、プロセスが細分化された既存の２次元プレートまたはフラスコによる（高い維持費を伴う）培養プロトコールを用いることは、試料に破壊的な影響を与え、結果が極めて一定しない可能性がある。
【０００７】
伝統的に、２次元培養での胚幹細胞培養プロトコールは３つの明確に区別できる段階を伴い、最初にＥＳの維持（すなわち、自己再生（増殖とも呼ばれる）して幹細胞コロニーを形成する）、次に胚様体（ＥＢ）形成につながる初期分化、そして次にさらなる系統特異的な分化である。各段階は熟練した操作および発生ステップに特異的なプロトコールを必要とする。
【０００８】
ＥＳの維持のため、初めはＥＳ細胞を単離してフィーダー層で共培養した。その後、フィーダー層の代わりに馴化培地を使用できることが見出され（２；３）、ｍＥＳ細胞に対して、ＬＩＦ（フィーダーから分泌される栄養素）が、精製された形態で供給されると多能性を維持できることが見出された（４）。
【０００９】
ＥＳ細胞の多能性の評価は、オクタマー結合因子３／４（Ｏｃｔ−４として既知）の発現をモニターすることにより行われる。Ｏｃｔ−４は、初期胚、生殖系列細胞、ならびに未分化のＥＣ（胚性癌腫）、ＥＧ、およびＥＳ細胞に限定されているＰｉｔ−Ｏｃｔ−Ｕｎｃ（ＰＯＵ）ファミリー転写調節因子である（５）。内部細胞塊（ＩＣＭ）の細胞の多能性の能力の発達のためにはインビボでのＯｃｔ−４発現が必要とされ（６）、インビトロではＯｃｔ−４発現は多能性の維持のために化学静力学的に（chemostatically）制御される（７）。
【００１０】
伝統的な分化法において、内部細胞塊（ＩＣＭ）由来の胚幹細胞は、胚様体（ＥＢ）が形成される段階を経て、様々な細胞種へと分化する。胚様体形成、すなわちＥＳ細胞の初期分化は、様々な刺激、例えばフィーダー細胞の除去、ＬＩＦ（マウスＥＳ細胞に対して）への曝露の除去、またはフィーダー馴化培地への曝露の除去により開始させることができる。胎生期癌（ＥＣ）細胞のために開発された胚様体（ＥＢ）懸濁法（８）は、３つの胚葉、中胚葉、外胚葉および内胚葉の全ての形成により、着床後の胚性組織に類似する多分化構造の形成をもたらす（９）。懸濁培養で２〜４日以内に、外胚葉がＩＣＭの表面に形成され、「単層ＥＢ（simple EB）」と呼ばれる構造を生む。分化の４日前後には、基底層を有する円柱上皮が発生し、中心の空洞が形成される。これらの構造は「嚢胞ＥＢ」と呼ばれ、インビトロでの培養を継続すると、内胚葉細胞および中胚葉細胞が出現する（１０）。
【００１１】
外胚葉細胞は多能性であり、神経組織、上皮および歯組織へ分化することができる。内胚葉細胞は多能性であり、消化管、気道および内分泌腺へ分化することができる。中胚葉細胞は多能性であり、造血系統および骨格系統へ分化することができる（骨格系統には心筋芽細胞（cardiomyogenic cell）、軟骨形成細胞および骨形成細胞が含まれる）。中胚葉では、心原性の分化が最初のかつ優勢な分化プロセスであることが知られている。心原性の分化は、その他の分化プロセス、例えば軟骨形成細胞への分化および骨形成細胞への分化を抑止し、遅らせる可能性があると考えられている。
【００１２】
インビボで形成された線維性骨の形態学的特徴、超微細構造的特徴および生化学的特徴を提示するミネラル化した小結節のインビトロでの形成である、骨形成細胞への分化は、２次元培養での機能的な骨芽細胞の分化により達成されたものである。しかし、フラスコおよびウェルプレートで行われる２次元培養は、それらの細胞外マトリックスを骨の細胞外マトリックスに似た構造に組織かすることのできる程度に、少数の細胞しか分化させることができない（１１〜１３）。さらに、２次元培養は、細分化されていて、大きな労力を要し、関連する様々な培養ステップの間に操作者の「判断」を必要とする。
【００１３】
インビボで形成される軟骨細胞の形態学的特徴、超微細構造的特徴および生化学的特徴を提示する軟骨小結節のインビトロでの形成である軟骨形成細胞への分化は、培養における機能的な軟骨細胞の分化により達成されたものである。近年、ＥＳＣの軟骨形成系統へのインビトロでの分化を誘導するための多くの試みがなされている。様々な軟骨形成のための添加剤、例えばＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４（Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＢＭＰ−２  ａｎｄ  ＢＭＰ−４  Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．９２，１９３−２０５）、ＴＧＦ−ｂ３（Ｋａｗａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）．Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  Ｂｏｎｅ  ３６，７５８−７６９．）、デキサメタゾン（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）．Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．９３，４５４−４６２．）などが胚様体（ＥＢ）の分化の間に添加された場合に、それらの添加剤により、ＥＳＣの軟骨形成細胞への分化が誘導されたことが報告されている。異なるアプローチとして、ＩＧＦ−Ｉ、ＴＧＦ−ｂ３、ＢＭＰ−４およびＰＤＧＦを供給することにより、ＦＡＣＳで選別された中胚葉の前駆細胞に由来するＥＢ培養において、肉眼で見える軟骨形成が達成されたことが報告されている  （Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）．Ｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｏｄｅｒｍａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１６，２０１５−２０２８．）。しかし、ＥＳＣの軟骨形成細胞への分化のための多数の成功したアプローチにも関わらず、これらの確立された方法はＥＢの形成を必要とする。ＥＳＣからの軟骨形成は、これまで２次元培養系で行われてきた。ＥＳＣを軟骨組織工学に使用するためには、統合されていて、操作者の判断を必要としない３次元培養系において、インビトロで軟骨形成系統への分化を方向付けるための明確かつ効率的なプロトコールを開発することが不可避である。
【００１４】
伝統的にＥＳの維持、培養および分化に用いられる２次元法などの静置培養は、混合しないこと、制御オプションが乏しいこと、および頻繁な供給が必要であることなどのいくつかの制限を受ける。細胞を２次元で培養する実験は（２次元では細胞外マトリックスとその他の細胞との正常な３次元の関係がゆがめられる）、不規則な細胞行動をもたらし、従って誤った結論を生む可能性がある。攪拌懸濁液培養系は、特定のステップおよび種類の幹細胞の生存力および代謝回転に影響を及ぼし得る、拡張性および相対的な簡便さという魅力的な利点をもたらす（１４）。しかし、懸濁細胞の攪拌培養では、細胞の損傷は攪拌に起因するかくはん力および剪断力による結果であり得る。バイオリアクターを培養細胞に用いるプロセスが、３次元環境で細胞の増殖を可能にする、制御された培養条件とともに、動的培養系を提供するために開発されている。より自然な３次元環境での細胞相互作用の分析は、生物の生活環境に近い条件をもたらすことを約束する（１５；１６）。ｈＥＳＣ培養にバイオリアクターを使用することは既に文書に記載され、動的な３次元条件が、ＥＳ細胞を培養して胚様体を形成するのに適した環境をもたらすといういくつかの予備的な証拠が提供されている（１７）。
【００１５】
Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（１８）は、１９６０年代に先駆けてバイオカプセル化を行い、Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ（１９）が、糖尿病を治すために、最終的にラットへの移植のために異種移植片を埋め込んだ細胞を封入した。アルギン酸封入の使用は主に成体細胞に制限されている。Ｍａｇｙａｒ  ｅｔ  ａｌ（２０）は、マウスＥＳ細胞を１．１％アルギン酸マイクロビーズに封入し、組織培養皿で、２次元で、すなわち静置培養で培養した。この結果、「円盤状の」コロニーが形成され、それはビーズ内でさらに分化して嚢胞状のＥＢを生じ、その後自発的に拍動する領域を含有するＥＢを生じた。Ｍａｇｙａｒ  ｅｔ  ａｌ．がＥＳＣを１．６％のアルギン酸マイクロビーズに封入し、３次元で培養した時、嚢胞状のＥＢがビーズ内で形成されないように、桑実胚のような段階で分化が阻害されることが見出された；しかし、ＥＳ細胞コロニーがビーズから放出されて２次元で培養された場合、それらは拍動する心筋細胞を含む嚢胞状のＥＢへとさらに分化することができた。ｍＥＳ細胞からＥＢを生成するためにマウスＥＳ細胞のアルギン酸ビーズ内への封入が試みられたが、十分な軟骨形成細胞への分化をもたらすことはできなかった（２１）。アルギン酸ビーズに封入された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、硝子軟骨をもたらす軟骨形成細胞への分化を達成するために、静置フラスコ培養に細胞ビーズを入れること、および成長培地で覆うことによって３次元で培養されているが、ＭＳＣの増殖能力がアルギン酸培養中で阻害されることが見出された（２２）。軟骨形成細胞への分化は、アルギン酸またはアガロースヒドロゲルに播種されたヒト脂肪由来の成体幹（ｈＡＤＡＳ）細胞を用いる３次元培養において、さらに多孔性のゼラチン足場（Ｓｕｒｇｉｆｏａｍ）において実証されている（３２）。
【００１６】
幹細胞からの分化細胞の大量生産は、ＥＳ培養における様々な段階の統合を必要とする。多能性細胞（ＥＳ細胞など）から分化した細胞および組織を形成するための現在の方法は、細分化されていて、大きな労力を要し、高レベルの訓練を必要とする（それは必然的に操作者ごとに異なる変動性をもたらす）；また、そのような方法はインビボに存在する３次元環境をシミュレートしていない２次元培養で行われる。現在の維持培養の方法および分化の方法が臨床的に関連する細胞数を産生できないので、これは臨床適用には満足ではない。
【００１７】
従って、幹細胞培養のための、幹細胞、例えば胚幹細胞の増殖および統合された増殖および分化のための、改良された方法に対する必要性が存在する。そのような方法は、未分化の多能性細胞の効率的な維持成長および分化のために、ならびに部分的に分化した外胚葉、中胚葉および内胚葉系統の複能性細胞のさらなる分化のために必要である。臨床的骨組織工学の適用のため、「骨の小結節」（骨様組織）またはその他の組織種の形成を達成するための方法に対して必要性がある。本発明によれば、これは支持マトリックスに封入された単一の細胞または複数の細胞を用いて３次元培養で達成することができる。
【００１８】
単一の細胞、またはクローンの培養、ならびに、単一のクローンのその後の増殖および分化を「クローン性（clonality）」という。クローンに由来するＥＳ細胞は、マウスに移植された場合、インビボで分化することが示されているが、今までインビトロで単一の未分化ＥＳ細胞を培養しようとする試みは不成功に終わっている（２３；２４）。報告されたこれらの研究では、単一の細胞培養は２次元で行われ、細胞は成熟細胞へ最終分化しなかった。
【００１９】
現在、個々の多能性細胞または複能性細胞への細胞培養環境の効果をスクリーニングするために利用可能な方法はない。従って、個々の細胞への、細胞培養条件、培地および試験化合物（合成化学物質または天然由来物質など、例えば馴化培地、増殖因子）の効果を確認する方法に対する要望がある。さらに、多数のそのようなスクリーニング実験を同時に行う能力があれば、多数のプロセスの変数（化学物質、濃度、組合せ）のマススクリーニングが可能となる。
【発明の開示】
【００２０】
本発明は、
（ａ）支持マトリックス内に封入されたヒト胚幹（ＥＳ）細胞を提供するステップと、支持マトリックス構造体を形成するステップと、および
（ｂ）封入された細胞を維持培地中の３次元培養で維持するステップによる維持培養と
を含む、細胞培養の方法を提供する。
【００２１】
本発明の培養法では、ＥＳ細胞は、支持マトリックス構造体内に封入された複数の個々の細胞および／または細胞の凝集体として、あるいはクローン増殖のために支持マトリックス構造体内に封入された単一の細胞として提供され得る。
【００２２】
支持マトリックス構造体内の細胞の数を増加させるための（すなわち、細胞が細胞分裂により自己再生を行う増殖）細胞の維持成長のための維持培地の選択は、使用する細胞の種類およびそれらの成長のための要件によって決まる。細胞の成長を支持するものであれば（理想的にはミネラルを含むか細胞を分化させない）、どのような培地も本発明の方法の維持培地としての使用に適している。種々の適当な維持培地が当分野で既知である。
【００２３】
好ましい実施形態では、維持培養は、フィーダー細胞、馴化培地または維持培地中のヒトもしくは動物細胞抽出物への曝露を伴わない。従って維持培養は、フィーダー細胞の非存在下およびフィーダー細胞馴化培地の非存在下で行われる。
【００２４】
ｈＥＳ細胞を培養する現在の方法は、未分化状態のｈＥＳ細胞の維持を支持するためにフィーダー細胞を用いるか、または馴化培地を用いるかのいずれかを必要とする（１）。さらに、現在の方法では、自発的に分化したｈＥＳ細胞を取り除くために、細胞は定期的な継代を必要とする。さらに、培養条件は、結果として生じるｈＥＳ細胞を臨床治療薬として用いるなら、疾患伝達のリスクを有する動物に由来する生成物を必要とする可能性がある。研究者らは、治療適用のために十分な数のｈＥＳ細胞またはそれらの分化誘導体を供給するために大量生産に従うｈＥＳ細胞の維持および増殖のための方法を開発するために努力している。本発明者らは、驚くべきことに、初期の着床前胚の物理的環境を複製すると思われる、さらに、未分化の状態で封入されたｈＥＳ細胞の長期培養を継代の必要なく可能にする、単純なプロセスを開発した。驚くべきことに、本発明者らは、本発明の方法を用いて、フィーダー細胞の非存在下で、馴化していない培地中で、最大１３０日間、ｈＥＳ細胞を未分化の状態で維持することができることを見出した。本発明者らは、本発明に記載の方法においてｈＥＳを封入する支持マトリックスにより提供される物理的環境が、フィーダー細胞による支持または馴化培地への曝露の要件を否定するものと仮定している。本発明の方法は、治療適用のためのｈＥＳ細胞の産生のための標準化、制御および産生拡大がされやすい。
【００２５】
ヒトＥＳ細胞に適した維持培地としては、２０％ｖ／ｖ  ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）ＳＲ、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸溶液（全てＧｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ提供）、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｄｏｒｓｅｔ，ＵＫ）および４ｎｇ／ｍｌのヒト組換え型塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−２）（１５７  ａａ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｏｘｏｎ，ＵＫ）を補給したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地が挙げられる。４ｎｇ／ｍｌのヒト組換え型塩基性線維芽細胞増殖因子（ｈｒｂＦＧＦ）を補給したＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ  ＡＢ，Ｋｕｎｇｓｂａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ．ｃｏｍ）もｈＥＳ細胞を培養するために適した培地である。これらの培地の双方は通常フィーダー細胞とともに用いられるが、細胞が（カプセル）封入されている本発明の培養法では、これらの培地はフィーダー層と併用せずに使用することができる。封入されていないｈＥＳ細胞のフィーダーを含まない培養は、馴化培地およびさらなる増殖因子を用いれば可能である。しかし、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ（２００５）（２５）は、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）ＳＲを含有する馴化していない培地が、封入されていないｈＥＳ細胞において、ＢＭＰシグナル伝達活性をＭＥＦ馴化培地よりも大いに活性化させることを示した。従って、封入されていないｈＥＳ細胞のフィーダーを含まない維持のために定義されている培地は今のところ利用できない。
【００２６】
フィーダーを含まない環境での、特定の細胞シグナル伝達分子を用いる、封入されていないｈＥＳ細胞の維持は、比較的短い期間に関してのみ達成されている（Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１０，５５−６３）。驚くべきことに、本発明の方法では、特定のシグナル伝達分子は、ｈＥＳ細胞を未分化状態で維持するために必要とされない。それにもかかわらず、そのような研究を継続して未分化状態のｈＥＳ細胞の維持および増殖を改良させる分子を同定したところ、封入されたｈＥＳ細胞培養のためのインビトロ環境をさらに向上させるために、本発明の方法で用いることができる。
【００２７】
本発明の方法では、封入されたＥＳ細胞を馴化していない培地中で成長させることができる。封入されていないｈＥＳ細胞の維持のために現在用いられている様々な培地および増殖因子の組合せの詳細は（１）に概説されている。これらの培地は、フィーダー細胞を含まず、培地を馴化させる必要のない本発明の方法に用いることができるか、または本発明の方法での使用に適合し得る。
【００２８】
好ましい態様では、本発明は、
（ａ）支持マトリックス内に封入されたヒトＥＳ細胞を提供するステップと、支持マトリックス構造体を形成するステップと、
（ｂ）細胞維持に適した条件で、封入された細胞を維持培地中の３次元培養で維持するステップによる維持培養と、その後、
（ｃ）細胞の分化に適した条件で、封入された細胞を分化培地中の３次元培養で分化させるステップと
を含む、細胞培養の方法を提供する。
【００２９】
多能性ｈＥＳ細胞の分化のための分化培地の選択は、使用する細胞の種類、それらの成長のための要件および分化に必要な刺激によって決まる。分化を支持するものであれば、どのような培地も本発明の方法の分化培地としての使用に適している。実際に、分化培地は維持培地の組成と似ていてよいが、分化培地は、分化を抑制するために維持培地中に含まれる物質を含有しない。ｈＥＳ細胞に適した分化培地としては、培地［α改変イーグル培地（αＭＥＭ）、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清、１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン］が挙げられる。分化培地は、分化のための刺激、例えば増殖因子を維持培地へ添加することにより作成してもよい。
【００３０】
封入された多能性細胞または封入された複能性細胞の３次元培養での維持および／または分化に適した条件としては、用いる細胞種の（例えばＥＳ細胞培養のための）標準培養条件が挙げられ、適した条件にはＥＳ細胞の維持培地および／または分化培地、ならびに環境条件（３７℃および５％のＣＯ2など）の使用が含まれる。
【００３１】
維持（増殖）および／または分化のための本発明の方法を用いてコロニーまたは組織形成は３次元培養で行われ、この３次元培養は静止した状態、例えば組織培養プレート中、または懸濁液中（例えばフラスコまたはバイオリアクター中）であってよい。３次元培養では、条件がインビボの状態の物理的環境により近づくにつれて、組織化された構造および多数の細胞を形成することができる。３次元培養では、細胞は３次元で成長する。
【００３２】
本発明の細胞培養法を行うために適切な３次元懸濁培養条件は、低剪断、高混合の「動的」環境を用いて達成することができる。この環境により十分な栄養分およびガスが、用いられる支持マトリックス構造体へ浸透することが可能となる。３次元培養のための低剪断、高混合の動的環境をもたらすために適したバイオリアクター系としては、ＮＡＳＡ  ＨＡＲＶバイオリアクター（Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ，ＵＳＡ）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｐａｃｅ  Ａｇｅｎｃｙ  バイオリアクター（Ｆｏｋｋｅｒ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、ＲＷＶバイオリアクター（Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ，ＵＳＡ）あるいはその他の模擬微小重力または潅流系、例えばエアリフトバイオリアクターが挙げられる。骨形成細胞への分化を含む方法には、ＮＡＳＡ  ＨＡＲＶバイオリアクターが適している。
【００３３】
維持および分化の方法は、維持および分化ステップが順次単一の、すなわち同一の容器中で行われる、統合された方法として適切に行われる。維持および分化の方法が統合された方法は、フラスコまたはバイオリアクター中の懸濁培養で適切に行われる。維持成長期には、封入された多能性ＥＳ細胞が分裂し、細胞数が増加して、細胞のコロニーが支持マトリックス構造体中に形成され、次に、封入された細胞は全て３次元マトリックス構造体中で分化して、さらに分化した細胞または最終分化細胞を形成する。本発明の方法では、さらに分化した細胞または最終分化細胞はその後維持され、細胞の分裂が可能となるため細胞数が増加し、細胞のコロニーが支持マトリックス構造体内に形成される。
【００３４】
完全に統合されたプロセスを使用することにより、主要な細胞シグナル伝達分子を培地に添加するか、または培地から減らすことにより誘発される時限的な、制御された分化を通じて、未分化細胞増殖からの連続的移行が可能となる。本発明の方法を用いることで細胞の取り扱い要件が減り、細胞生存力に影響を与える可能性のある汚染物質および環境への細胞の曝露が抑えられる。さらに、リアルタイムに細胞培養条件をモニタリングすることにより、臨床生成物に必要な基準の開発が可能となる。
【００３５】
細胞系統の中には、特に分化が抑制されないような条件である場合に、維持成長中の細胞分裂サイクルの後に自発的な分化をするものがある。細胞分化に適した条件は、多能性ＥＳ細胞の複能性細胞への分化のための刺激を含んでよい。ＥＳ細胞の複能性細胞への分化のための刺激は、胚様体形成のための刺激、例えば分化を抑制する物質の除去、または分化を抑制する物質への曝露の減少；及び／又は、胚様体形成を促進する物質の添加、または胚様体形成を促進する物質への曝露の増加であってよい。細胞の分化に適した条件は、複能性細胞のさらなる分化のための刺激を含んでよい。例えば、その刺激は、ＥＳ細胞の分化のための刺激の前、同時、または後に与えてよい。分化を伴う本発明の方法は胚様体形成のための刺激を与えずに行ってもよく、その代わりに、分化に適した条件は、例えば外胚葉、中胚葉および内胚葉系統への分化のための刺激を単に含んでよい。
【００３６】
分化のための刺激は、外胚葉、中胚葉および内胚葉系統への分化のための刺激であってよい。適した刺激は下記のように当分野で既知であり、例えば参照文献（１）において考察されている。
【００３７】
好ましくは、分化のための刺激は、中胚葉の骨格系統細胞への分化のための刺激、例えば骨形成細胞への分化または軟骨形成細胞への分化のための刺激である。
【００３８】
骨形成細胞への分化のための刺激は、培地に供給される添加剤、例えば１以上のアスコルビン酸、β−グリセロホスホスファートまたはデキサメタゾンであってよい。
【００３９】
軟骨形成細胞への分化のための刺激は、培地に供給される添加剤、例えばモノチオグリセロール（ＭＴＧ）およびＩＧＦ−１、ＴＧＦβ１、ＢＭＰ２またはＢＭＰ４であってよい。
【００４０】
維持および分化ステップの持続期間は、培養された細胞の種類および細胞培養の目的によって決まる。本発明者らは、本発明の方法を用いて、従来法で多能性を維持するために用いられているフィーダー細胞または馴化培地の非存在下で、封入されたヒトＥＳ細胞を未分化のまま１３０日間維持することができることを実証した。維持培養では、封入されたｈＥＳ細胞を最大１３０日または所望であればそれ以上の期間培養して未分化細胞の数を増加させることが望ましい。従って、本発明は、封入されたｈＥＳ細胞の長期間、例えば８日以上の期間、例えば、約１４日、２１日、２８日、３５日、４２日、４９日、５６日、最大１３０日およびそれを越える期間の維持培養に用いることのできる方法を提供する。
【００４１】
統合された維持および分化法において、ステップ（ｂ）における封入された細胞の初期の維持培養は、細胞クラスターが形成されるために十分な期間、例えば１〜６日間、好ましくは２〜５日間、最も好ましくは、３日間または４日間である。分化培養は４０日間までできる。本発明の培養法の中には、ＥＢ形成のための刺激の存在下での初期分化期間、続いて複能性細胞の、一段と分化した細胞系統への（例えば骨芽細胞または軟骨細胞への）分化のための刺激の存在下でのさらなる分化期間を含むものがある。適切には、初期分化期間は３〜７日間であり、好ましくは４〜６日間であり、最も好ましくは約５日間である。さらなる分化が行われる場合、さらなる分化期間は一般に１４〜２８日間、適切には約２０〜２２日間、例えば２１日間である。
【００４２】
本発明の方法による封入されたＥＳ細胞の骨形成細胞への分化のため、初期維持期間は一般に２〜４日間、例えば３日間である。初期分化期間は４〜６日間、例えば５日間であり、さらなる分化期間は１４〜２８日間、例えば２０日、２１日または２２日間である。これらの培養時間は、一般的に骨誘導および３次元骨形成を達成するために適している。
【００４３】
分化ステップを含む本発明の方法を用いて、封入された複能性細胞を、最終分化細胞などのより分化した細胞へ分化させることができる。複能性細胞の、より分化した細胞、または最終分化細胞への分化は、複能性細胞をさらに分化させるための刺激を含む細胞分化のための条件を用いて適切に達成される。
【００４４】
また、本発明の方法は、例えば同種のコロニーまたは組織を得るための、支持マトリックス内に封入された単一の細胞のインビトロでの維持および／または分化に用いることができる。従って、本発明の方法のいくつかの実施形態では、ステップ（ａ）での支持マトリックス構造体は、単一のＥＳ細胞が支持マトリックス内に封入されて支持マトリックス構造体を形成するものである。
【００４５】
ＥＳ細胞は、支持マトリックス中に封入されて、単一の細胞を含有する支持マトリックス構造体（ビーズなど）をもたらし得る。封入された単一の細胞は、次に成長して細胞コロニーとなり、任意のＥＢ構造を形成し、部分的に分化した細胞は最終的に所望の細胞系統へと分化し得る。これは、臨床使用のための純粋な同種の細胞集団をもたらすために有用なクローンに由来する細胞集団を得るために有用である。また、これはＥＳ細胞の３次元胚様体形成、細胞分裂の検査、または、単一の多能性細胞への微小環境の影響の調査を可能にするので、スクリーニング目的のためにも有用である。また、単一のＥＳの分化した成熟細胞種への分化も調査することができ、従ってＥＳ細胞のインビトロでの多能性の潜在能力を実証する。
【００４６】
あるいは、ステップ（ａ）において複数の細胞が支持マトリックス構造体内に封入されて提供される。これらは複数個の単一の細胞、または細胞凝集体（すなわち凝集塊／コロニー）またはそれらの混合物として存在し得る。これらの態様は、例えば、組織工学に適用する目的、研究目的、または臨床使用目的のための大量の分化細胞の生成に特に有用であるが、スクリーニング目的のためにも用いることができる。
【００４７】
一般に、本発明の細胞培養法では、ステップ（ａ）において複数の支持マトリックス構造体が提供される。
【００４８】
本発明は、ＥＳの維持、任意のＥＢ形成、および分化のための統合された３次元培養法を提供する。ＥＳに由来する中胚葉細胞は、心筋芽の刺激、軟骨形成の刺激、または骨形成の刺激の影響下で、それぞれ心筋芽細胞、軟骨形成細胞または骨形成細胞へ分化することができる。
【００４９】
本発明の方法を用いて、骨形成細胞への分化が３次元培養で達成され、その結果「骨の小結節（bone nodule）」（骨様組織）の形成がもたらされるか、または臨床骨組織工学適用のためのその他の組織種を３次元培養で得ることができる。本発明の方法は、培養系の自動化に適合させることができ、分化細胞を生成させるための低い維持費の高効率系をもたらす。例えば、これらの方法は、ｍＥＳ細胞またはｈＥＳ（ヒト胚幹）細胞からの心筋芽細胞、軟骨形成細胞または骨形成細胞の産生に用いることができる。
【００５０】
従って、別の実施形態では、本発明の培養法はＥＳ細胞の骨形成細胞への分化に特に有用であり、特に好ましい細胞培養の方法は、
（ａ）支持マトリックス内に封入された単一のＥＳ細胞または複数のＥＳ細胞を提供するステップと、支持マトリックス構造体を形成するステップと、
（ｂ）ＥＳ細胞の維持に適した条件で、封入された細胞を維持培地中の３次元培養で維持するステップと、
（ｃ）骨形成細胞への分化に適した条件で、封入された細胞を分化培地中の３次元培養で分化させるステップによる骨形成細胞への分化と
を含む。
【００５１】
ＥＳ細胞は、マウスもしくはヒトＥＳ細胞であることが好ましいが、本発明の骨形成細胞への分化の方法は、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、イヌ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、魚類、げっ歯類、マウス、または鳥類起源のＥＳ細胞に適用できる。
【００５２】
好ましい支持マトリックスはアルギン酸を含み、アルギン酸とゼラチンを含むものが特に好ましい。支持マトリックス構造体は、ビーズの形態であることが好ましい。本発明の方法は静的な懸濁培養で行うことができるが、例えばＮＡＳＡ  ＨＡＲＶバイオリアクターなどのバイオリアクターによりもたらされる、低剪断、高混合の動的環境で行うことが好ましい。
【００５３】
ＥＳ細胞を２次元で培養するために通常用いられる維持培地は、上記のその他の培地のように、本発明の方法での使用に適している。適した条件は３７℃、５％のＣＯ2である。維持培養は、１〜６日間、好ましくは２〜４日間、より好ましくは約３日間行われる。
【００５４】
封入された細胞の骨形成細胞への分化は、
（ｉ）封入されたＥＳ細胞を分化培地中の３次元培養でインキュベートするステップと、胚様体形成のための刺激を与えるステップと、その後、
（ｉｉ）（ｉ）で作成した封入された細胞を分化培地中でインキュベートするステップと、骨形成細胞への分化のための刺激を与えるステップと
によって適切に行われる。
【００５５】
分化培地は、例えば、２次元培養でのＥＳ細胞の骨形成細胞への分化に通常使用される任意の培地であってよい。胚様体形成およびその後の骨形成細胞への分化に適した条件に用いられる分化培地は異なっていてよい。マウス細胞にとって胚様体形成のための刺激はＬＩＦに対する曝露を取り除くこと、または、維持ステップが共培養として行われている場合には、ＬＩＦを分泌する細胞に対する曝露を取り除くことであり得る。
【００５６】
骨の小結節を形成するための骨形成細胞への分化には、ステップ（ｉ）のインキュベートは、一般に約１〜６日間、好ましくは約２〜５日間、最も好ましくは約３日または４日間行われ、ステップ（ｉｉ）のインキュベートは、一般に２１〜２８日間、好ましくは２０〜２２日間、例えば２１日間行われる。
【００５７】
本発明の分化の方法では、胚様体形成ステップは必ずしも必要でない。従って、いくつかの実施形態では、胚様体形成のための刺激への曝露が省略される。本態様では封入された細胞の骨形成細胞への分化は
（ｉ）封入されたＥＳ細胞を分化培地中の３次元培養でインキュベートするステップと、その後
（ｉｉ）（ｉ）で作成した封入された細胞を分化培地中でインキュベートするステップと、骨形成細胞への分化のための刺激を与えるステップと
によって適切に行われる。
【００５８】
適切には、ＥＳ細胞は、ステップ（ｉ）において約１〜６日間、好ましくは約２〜５日間、最も好ましくは約３日または４日間分化培地に曝露され、その後ステップ（ｉｉ）において骨形成細胞への分化のための刺激を与えられ、インキュベートは一般に２１〜２８日間、好ましくは２０〜２２日間、例えば２１日間行われる。
【００５９】
あるいは、封入された細胞の骨形成細胞への分化を、分化培地中で、封入された細胞をインキュベートするステップと、骨形成細胞への分化のための刺激を与えるステップとにより行ってもよい。
【００６０】
この場合、細胞は、分化培地中で、２１〜２８日間の骨形成細胞への分化のための刺激の存在下でインキュベートしてよい。
【００６１】
既知の骨形成細胞への分化のインビトロ誘導物質を、好ましくは、ステップ（ｉｉ）で複能性細胞をさらに分化させるために用いることができる。手短に言えば、血清、アスコルビン酸塩（アスコルビン酸）、またはＬ−アスコルビン酸−２−リン酸（長時間作用するアスコルビン酸類似体）、β−グリセロリン酸、およびデキサメタゾンが、骨形成細胞への分化のインビトロ誘導物質として作用するとして各々既知である。現在の技術では、血清、アスコルビン酸、およびデキサメタゾンは小結節形成の絶対条件であるのに対し、β−グリセロリン酸はミネラル化を促進または増強する（２６）。骨芽細胞に特異的な唯一の形態学的特徴は、ミネラル化した細胞外マトリックスの形態で細胞の外側に位置していることである。インビトロでの骨の小結節形成は、３つのステップ：（ｉ）増殖、（ｉｉ）ＥＣＭ分泌／成熟および（ｉｉｉ）ミネラル化に細分される。
【００６２】
本発明の方法は、特定の分化細胞種の産生のために工業的なプロセス規模で運用することができる。例えば、骨の形成は、アルギン酸またはアルギン酸に基づくビーズ中に封入されたｈＥＳ細胞で出発し、バイオリアクターで培養を行って達成することができる。この自動化され、統合されたプロセスは、先行技術の２次元法および３次元法と比較して、効率的で制御が容易であり、骨組織形成に要する時間を有意に減少させる。
【００６３】
ＥＳ細胞の支持マトリックス中の（例えばビーズを形成するための）カプセル封入は、ＥＳ細胞の維持、分化（任意のＥＢ形成による分化）、およびさらなる分化（例えば骨形成細胞への分化）を助長する環境をもたらす。本発明の方法は、プロセスの自動化、制御、最適化、および強化を許容し、臨床的に関連する数の細胞、例えば臨床適用に必要な骨形成細胞の産生を可能にする。
【００６４】
本発明の骨形成方法は、任意の起源の多能性細胞、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、イヌ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、魚類、げっ歯類、マウス、または鳥類起源の多能性細胞に適用できる。
【００６５】
ｈＥＳ細胞の維持のための本発明の方法は、細胞環境（培養条件、培地、試験刺激、化合物）の維持成長および／または分化への効果を評価するためのスクリーニング方法を提供するように適合させることができる。従って、本発明は、試験化合物または刺激の細胞維持および／または分化への効果を評価するための、支持マトリックス内に封入されたｈＥＳ細胞の使用を提供する。本発明はさらになお、細胞維持および／または分化への培地および／または条件の効果を評価するための、支持マトリックス内に封入されたｈＥＳ細胞の使用を提供する。
【００６６】
また、
（ａ）支持マトリックス内に封入されたｈＥＳ細胞を提供するステップと、支持マトリックス構造体を形成するステップと、
（ｂ）試験化合物の存在下、封入されたｈＥＳ細胞を維持培地中でインキュベートするステップと、
（ｃ）試験化合物のｈＥＳ細胞の維持および／または分化への効果を評価するステップと
を含む、ｈＥＳ細胞の維持および／または分化を調節することのできる化合物を同定する方法が提供される。
【００６７】
本発明のスクリーニング方法を用いると、多能性細胞または複能性細胞の分化を抑制することにより細胞維持を促進する化合物を同定すること、および、分化を促進する化合物を同定することが可能である。試験化合物、または化合物の混合物は、自然に産生されるか、または化学的に合成されてよい。
【００６８】
さらに、
（ａ）支持マトリックス内に封入されたｈＥＳ細胞を提供するステップと、支持マトリックス構造体を形成するステップと、
（ｂ）細胞維持および／または分化に適した培地および条件で、試験刺激の存在下で封入されたｈＥＳ細胞をインキュベートするステップと、
（ｃ）試験刺激のｈＥＳ細胞の分化の効果を評価するステップと
を含む、ｈＥＳ細胞分化を調節することのできる刺激を同定する方法が提供される。
【００６９】
本発明の方法を用いると、分化を抑制または促進する刺激、例えば化合物および／または条件を同定することが可能である。
【００７０】
さらなる態様において、本発明は、
（ａ）支持マトリックス内に封入されたｈＥＳ細胞を提供するステップと支持マトリックス構造体を形成するステップと、
（ｂ）試験培地および／または試験条件の存在下で、封入されたｈＥＳ細胞をインキュベートするステップと、
（ｃ）試験培地および／または試験条件のｈＥＳ細胞の維持および／または分化への効果を評価するステップと
を含む、培地および／または培養条件のｈＥＳ細胞の維持および／または分化への効果を評価する方法を提供する。
【００７１】
本発明の方法は、細胞の維持、分化の抑制、または分化の促進を強化するための培養条件の最適化に有用である。本発明の評価方法では、任意の細胞を試験化合物／刺激の存在下でインキュベートし、試験化合物／刺激の細胞の維持および／または分化への効果を評価することができる。
【００７２】
スクリーニング法は、ステップ（ａ）において複数の細胞が各支持マトリックス構造体内に封入されるように、または、ステップ（ａ）において単一の細胞が各支持マトリックス構造体内に封入されるように行うことができる。
【００７３】
本発明の好ましいスクリーニング法では、封入された単一の細胞は、例えば、各ビーズが単一の細胞（ＥＳ細胞など）を含有するビーズの形態で用いられる。単一の細胞を含有するビーズを個別に、適切には複数のウェルプレート（アレイ形式、例えば９６ウェルプレートなどの複数のウェルプレートであってよい）またはマイクロバイオリアクター中で培養することによる。複数のスクリーニングを同時に行って、培地および条件を評価および最適化し、化学的に合成した化合物、様々な増殖因子、細胞外マトリックスタンパク質などを細胞の成長および分化へそれらが有する効果についてスクリーニングすることが可能である。
【００７４】
スクリーニング法は、封入された細胞が培養容器のアレイ中に、例えばマルチウェルまたはマルチチャンバーアレイに提供されるように設定することができる。ステップ（ａ）では、複数の封入された細胞は各々の培養容器に存在することが好ましいが、これは複数の細胞を含有する単一の支持マトリックス構造体（例えばビーズ）を提供することにより達成される。または、ステップ（ａ）において、複数の支持マトリックス構造体を各々の培養容器中に提供することにより達成されることがより好ましい。この２番目のアプローチでは、各支持マトリックス構造体（例えばビーズ）には単一の細胞または複数の細胞を含有することができる。別のスクリーニング法では封入された１個の細胞が各培養容器に存在する。
【００７５】
本明細書に記載される方法を用いると、単一のｈＥＳ細胞を制御された環境で迅速に培養することができる。このことは、多くの異なる培養環境を並行して、または同じ培養環境の多くの異なる細胞種を並行してハイスループットスクリーニングすることを可能にする。適切には各々が単一のｈＥＳ細胞を含有する５〜２０個のビーズを、単一の培養容器、例えばマルチウェルプレートの１つのウェルに提供することができる。ビーズ内の単一の細胞は隣接するビーズ内に封入された単一の細胞と直接接触しないため、各ビーズは個別の成長環境を構成する。複数のビーズを単一のウェルに設置することにより、各ビーズが同一の条件に曝されることになるので、タイムスタディ分析を行うことができる。マルチウェルプレートで培養することにより、複数条件のスクリーニングが可能となり、結果の統計分析を容易にする。ロボット工学の使用によりプロセスの自動化を（例えば培養物へ栄養を供給することにより）促進することができる。単一の細胞のビーズ内へのカプセル封入は、個々の培養物が供給または他の操作中に乱されないことを確保する。
【００７６】
本発明のスクリーニング法は、培養容器中での２次元培養（静置または懸濁液）で行うことも、またはバイオリアクター、例えばＨＡＲＶバイオリアクター中での３次元培養で行うこともできる。マイクロチャネルを有するマイクロバイオリアクターを用いることにより、３次元培養の一定な潅流供給が可能となり、さらにより複雑なスクリーニング実験および自動化を容易にする。本発明のスクリーニング法は、ハイスループット形式で行うことができる。
【００７７】
本発明のスクリーニングの使用またはスクリーニング法に従って、試験化合物、試験刺激、培地および／または条件の細胞維持および／または分化への効果を、顕微鏡検査、発生ステップに特異的な抗原の検出、および遺伝子発現レベルの検出（例えばＲＴ−ＰＣＲによるか、またはＤＮＡもしくはＲＮＡマイクロアレイを用いる）からなる群から選択される１以上の方法により評価することができる。
【００７８】
カプセル封入に利用される支持マトリックスは透過性であり、栄養分、代謝産物、および増殖因子の拡散および物質輸送が可能である。支持マトリックス内に封入された細胞は、ビーズ（例えば一般的に球形のビーズ）の形態で提供され得る。「封入された」とは、細胞が支持マトリックスの内部に完全に埋め込まれていることを意味する。容積に対する面積（例えば表面積）比が、栄養分、代謝産物、サイトカインなどが容易にビーズへ／から拡散してビーズ内に埋め込まれた細胞に到達することができるようであれば、ビーズの形状は特に関係がない。
【００７９】
支持マトリックス構造体（例えばビーズ）は、培養期間中、無傷のままである支持マトリックス剤から構成されることが特に好ましい（培養期間は維持のためには３〜４ヶ月以上であり得ってよい。または骨形成細胞への分化培養法の場合のように最大３０〜４０日間であり得る）。支持マトリックス内に封入された細胞は、３次元培養容器（ＲＷＶバイオリアクター（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＵＳＡ）またはその他の模擬微小重力もしくは潅流バイオリアクターなど）に入れ、維持培地および／または分化培地中で長期間有意な損傷なくインキュベートすることができる。
【００８０】
好ましくは、支持マトリックス剤は、水素材料からなるかまたは水素材料を含み、例えばアガロースもしくはアルギン酸などのゲル形成ポリ糖類である（一般に約０．５〜約２％ｗ／ｖの範囲、好ましくは約０．８〜約１．５％ｗ／ｖ、より好ましくは約０．９〜１．２％ｖ／ｖで含む）。マトリックスはアルギン酸のみからなってもよいし、ゼラチンなどの構成物質をさらに含んでもよい（一般に約０．０５〜約１％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０８〜約０．５％ｖ／ｖで含む）。ゼラチンの包含は、均一なビーズ径の産生を助け、構造の完全性を維持するのに役立つ。このことは、アルギン酸ヒドロゲルが、長期培養の後にＣａ2+陽イオンを失い、そのことがビーズの構造上の完全性を弱めるために重要である。アルギン酸支持マトリックスビーズ中にゼラチンを包含することは、細胞を介した収縮および足場材料の充填を可能にする。
【００８１】
アルギン酸は、褐色の海藻から抽出された水溶性の直鎖状多糖類であり、１−４結合のα−Ｌ−グルクロン酸とβ−Ｄ−マンヌロン酸残基との交互のブロックからなる。アルギン酸は、大部分の２価および多価の陽イオンでゲルを形成するが、Ｃａ2+が最も広く用いられている。カルシウム陽イオンは、Ｇブロック間の鎖間結合に関与し、ゲルの形態中に３次元のネットワークを生み出す。Ｇブロック間の結合域は、「エッグボックスモデル」と称されることが多い（２７）。
【００８２】
適切には、ビーズの形態のアルギン酸およびアルギン酸に基づく支持マトリックス（例えばアルギン酸とゼラチンのビーズ）は、用いる培養条件でその完全性を維持しているため、本発明の方法での使用に特に適していることが見出された。
【００８３】
支持マトリックスは、種々のシグナル（ラミニン、コラーゲン、または増殖因子など）で改変して所望の細胞挙動を高めることができる。従って、支持マトリックスは、ラミニン、バイオガラス（商標）、ヒドロキシアパタイト、細胞外マトリックス、細胞外マトリックスタンパク質、増殖因子を含む群から選択される１以上の物質；別の細胞培養抽出物、および骨形成細胞への分化のために、骨芽細胞培養抽出物を含み得る。
【００８４】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、２次元培養においてＥＳ細胞の骨形成細胞への分化を達成するための刺激として用いられている（Ｈａｕｓｅｍａｎｎ  ＆  Ｐａｕｋｅｎ，２００３，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ  ｏｎ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ，１０th  Ａｎｎｕａｌ  Ｕｎｄｅｒｇｒａｄｕａｔｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｏｓｔｅｒ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ａｒｉｚｏｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ｈｔｔｐ：／／ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ａｓｕ．ｅｄｕ／ｕｂｅｐ２００３／ｐａｒｔｉｃｉｐａｎｔｓ／ｈａｕｓｍａｎｎ）。ＥＳ細胞などの多能性幹細胞の分化を刺激する多数の増殖因子、例えば、中胚葉形成および骨形成も強化する骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１６  （１０）：２０１５．（ｈｔｔｐ：／／ｊｃｓ．ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｒｅｐｒｉｎｔ／１１６／１０／２０１５）；中胚葉形成を刺激するレチノイン酸、中胚葉を刺激して骨前駆細胞を分化させるソニックヘッジホッグなどのヘッジホッグタンパク質、ならびに骨誘導を刺激する骨形態形成タンパク質ＢＭＰ１〜３および５〜９、が当分野で既知である。
【００８５】
アルギン酸カルシウムまたはアルギン酸カルシウムに基づく支持マトリックスは、骨形成培養および分化に好ましい。カルシウムイオンはビーズの形成の際にキレート化剤として用いられ、骨形成のミネラル化を助ける局所的なカルシウム源をもたらし得る。
【００８６】
ゼラチンを支持マトリックス剤として含むアルギン酸を封入して支持マトリックス構造体を形成する（例えばビーズを形成する）ために使用することは、単一の細胞を封入して、１個のビーズに単一の細胞を含むビーズを形成し、次に培養してコロニーを形成する方法において特に好ましい。
【００８７】
適切には、単一の細胞を含有するビーズは、直径約２０〜１５０ミクロン、好ましくは約４０〜約１００ミクロンである。複数の細胞を含有するビーズは一般に直径約２．０〜約２．５ミリメートル、好ましくは約２．３ミリメートルである。
【００８８】
本発明のいくつかの態様では、用いる支持マトリックスがトリプシン処理を用いずに容易に溶けて細胞を放出できることが好ましい。支持マトリックスを除去して細胞を分離させることが望ましい場合には、クエン酸ナトリウムおよび塩化ナトリウム溶液を用いて容易に溶けるヒドロゲルマトリックス、例えばアルギン酸およびアルギン酸に基づくマトリックスが好ましい。
【００８９】
細胞は、得られた封入された細胞（例えば骨形成細胞）を、封入の材料から細胞を回収する必要なく被験患者に直接投与できるように、生体適合性材料に封入することができる。この目的のため、アルギン酸材料は生体適合性であり、アルギン酸はＦＤＡ認可されているので、アルギン酸またはアルギン酸に基づく支持マトリックスを用いて細胞を封入することが好ましい。封入された細胞、および特にアルギン酸またはアルギン酸に基づく材料に封入された細胞は、例えば注射または内視鏡により直接患者へ投与することができる。
【００９０】
本発明の方法または使用は、保存用に、封入された細胞を凍結するステップをさらに含んでよい。封入された細胞は、標準的なプロトコールを用いて乾燥させることができ、その細胞を培養する維持培地または分化培地中で凍結させてもよい。封入された細胞を凍結させるために適した方法は、Ｓｔｅｎｓｖａａｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １３  （１）：３５−４４に記載されるような緩慢凍結手順を用いるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の凍結保存を含む。
【００９１】
本発明の方法は、細胞の支持マトリックスからの分離をさらに含んでよい。従って、本発明はこのようにして得られた細胞を提供する。アルギン酸またはアルギン酸に基づくマトリックスを封入に用いる場合、細胞の分離はアルギン酸の溶解により達成される。そのような穏やかな溶解方法は、標準的な酵素法、例えば長期培養において細胞の挙動に影響を及ぼし得るトリプシン処理と比較して有利であり得る。
【００９２】
また、本発明は、本発明の細胞培養法により得られる、または得られた封入された細胞を提供する；封入された細胞は、複能性である（例えば骨形成細胞、軟骨形成細胞または心筋芽細胞である）か、あるいは、最終分化していてよい（例えば成熟骨芽細胞または軟骨細胞）。
【００９３】
さらに、本発明の封入された細胞の薬剤としての使用が提供される。本発明の方法により得られる封入された骨形成細胞は、骨の再構築、例えば治療のための顎顔面外科手術、または美容整形において有用である。また、本発明は、封入された骨形成細胞の、骨粗鬆症、骨折（bone breaks）、骨折（bone fractures）、骨癌、骨がん腫、骨形成不全症、パジェット病、線維性骨異形成症、聴力損失に関連する骨疾患、低ホスファターゼ血症、骨髄腫骨疾患、大理石骨病、骨の使いすぎ障害、骨のスポーツ障害、および歯周病（歯肉疾患）から選択される、疾患または状態の治療のための薬剤としての使用を提供する。
【００９４】
さらに、本発明の封入された軟骨形成細胞の、関節炎、軟骨疾患もしくは軟骨障害、軟骨修復、美容のための再建手術から選択される疾患または状態の治療のための薬剤としての使用が提供される。軟骨疾患には、慢性関節リウマチおよび特に関節軟骨の骨関節炎が含まれる；疾患には、先天性欠損症または遺伝的欠損症（例えば鼻腔および鼻中隔の軟骨の顔面の再建による治療を必要とするもの）が含まれる。
【００９５】
またさらに、例えば骨粗鬆症、骨折（bone breaks）、骨折（bone fractures）、骨癌、骨がん腫、骨形成不全症、パジェット病、線維性骨異形成症、聴力損失に関連する骨疾患、低ホスファターゼ血症、骨髄腫骨疾患、大理石骨病、骨の使いすぎ障害、骨のスポーツ障害、および歯周病（歯肉疾患）から選択される、骨の再構築を必要とする疾患または状態の治療のための薬剤の製造における、本発明の封入された骨形成細胞の使用が提供される。
【００９６】
加えて、関節炎、軟骨疾患もしくは軟骨障害、軟骨修復、再建手術、美容のための再建手術、関節リウマチおよび変形性関節炎から選択される疾患もしくは障害の治療のための薬剤の製造における、封入された軟骨形成細胞の使用が提供される。
【００９７】
さらなる態様では、本発明は、本発明の封入された細胞の投与を含む、被験体を治療する方法を提供する。本発明の封入された骨形成細胞は、骨の再構築を必要とする疾患または状態、骨粗鬆症；骨折（bone breaks）、骨折（bone fractures）；骨癌、骨がん腫、骨形成不全症、パジェット病、線維性骨異形成症、聴力損失に関連する骨疾患、低ホスファターゼ血症、骨髄腫骨疾患、大理石骨病；骨の使いすぎ障害、骨のスポーツ障害、および歯周病（歯肉疾患）を治療するために被験体へ投与され得る。本発明の封入された軟骨形成細胞は、関節炎、軟骨疾患もしくは軟骨障害、軟骨修復、関節リウマチおよび変形性関節炎から選択される疾患または状態を治療するために被験体へ投与され得る。
【００９８】
また、本発明は、封入された細胞、好ましくは本発明の封入された骨形成細胞または軟骨形成細胞の投与を含む、治療的手術または美容整形であり得る再建手術の方法を提供する。
【００９９】
本発明の封入された細胞は、封入された細胞と、製薬的に許容可能な担体または希釈液とを含む医薬組成物を提供するために処方され得る。医薬組成物は、注射または内視鏡による投与用に処方されることが好ましい。
【０１００】
また、細胞足場上または細胞足場中に適切に提供された、本発明の封入された細胞に由来する骨または軟骨組織も本発明の範囲内にある。封入された細胞は細胞足場上に播種および／または細胞足場に含浸させることができ、次に細胞足場を移植して身体のインサイチューで細胞を成長させることができる。そのような足場は骨および軟骨組織再建手術に特に有用である。
【実施例】
【０１０１】
実施例１：アルギン酸ビーズ中のヒトＥＳＣの封入
１．１細胞培養
１．１．１フィーダー層
一次マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）
手短に言えば、スケジュールＩの屠殺により雌マウス（Ｓｗｉｓｓ系ＭＦ１）をマウスの妊娠１３日に犠牲にした。次に胚を取り出し、内臓を取り除いた。トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（カルシウムまたはマグネシウムを含まない０．１Ｍ  ＰＢＳ中、０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ；Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）中で胚屠殺体を細かく刻み、培養フラスコ中の１０％ｖ／ｖ熱失活ＦＢＳ、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを補給した高グルコースＤＭＥＭ（全てＧｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ製）に播種した。細胞がコンフルエントに達したら、線維芽細胞を回収し、６０％ｖ／ｖ高グルコースＤＭＥＭ、２０％ｖ／ｖ熱失活ＦＢＳ（全てＧｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ製）および２０％ｖ／ｖジメチルスルホキシド  Ｈｙｂｒｉ−Ｍａｘ（登録商標）（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｄｏｒｓｅｔ，ＵＫ）を含有するＭＥＦ凍結培地中で凍結させた。ｈＥＳＣを培養するためには、ＭＥＦは３回または４回以下の継代が好ましい。
【０１０２】
解凍したＭＥＦ細胞を、ペニシリンおよびストレプトマイシンを除く上述の同一の培地のゼラチンコートされた培養表面で成長させた。ＭＥＦ細胞を、フィーダー層として用いる前にマイトマイシンＣで有糸分裂的に失活させた。失活させた細胞を次にトリプシン処理し（カルシウムまたはマグネシウムを含まない０．１Ｍ  ＰＢＳ中、０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ；Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）、凍結させるか、またはｈＥＳＣ成長のフィーダー層として６ウェルプレートに移した。ＭＥＦ凍結培地中でＭＥＦを凍結させた（２０００年７月、ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ，Ｍａｄｉｓｏｎのプロトコール）。
【０１０３】
ヒト胚幹細胞の培養
１．１．２．１未分化細胞の培養
失活させた一次ＭＥＦ細胞を、未分化ヒトＥＳ細胞を解凍する少なくとも１日前に上記の培地に播種した。次の日、未分化ヒトＨ１細胞（ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ）を完全に解凍し、ＭＥＦ細胞に播種し、供給業者の提案するプロトコールを用いて細胞を未分化状態で成長させた。培地は、２０％ｖ／ｖ  ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）ＳＲ、２ｍＭ  L−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸溶液（全てＧｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ製）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｄｏｒｓｅｔ，ＵＫ）および４ｎｇ／ｍｌヒト組換え型塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−２）（１５７  ａａ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｏｘｏｎ，ＵＫ）を補給したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地からなった。２日に１回細胞に供給した。
【０１０４】
これらの細胞の成長率は、マウスＥＳＣのものよりも非常に遅かった。失活させたＭＥＦ細胞が培養中で７〜１０日後に死滅したので、７〜１０日おきにｈＥＳＣを新しいフィーダー層に移動させた。細胞を解凍した後、サブコンフルエントな培養ウェルを得て、細胞を分割するまでに約４〜６週かかる。細胞はコロニーの中にいた時だけ成長し、その未分化状態を維持した。単一の細胞は成長しなかった。時々自発的な分化を起こしたコロニーもあった。
【０１０５】
１．２アルギン酸ビーズ中のｈＥＳＣの封入
１．２．１カプセル封入方法
４〜５日目の未分化のｈＥＳＣをトリプシン処理し、１．１％  （ｗ／ｖ）低粘度アルギン酸*（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）および０．１％  （ｖ／ｖ）ブタゼラチン（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）（全てＰＢＳ、ｐＨ７．４に溶解した）溶液中に室温で再懸濁した。低粘度アルギン酸は、主に１−４結合の無水−β−Ｄ−マンヌロン酸残基からなるコロイド状の、親水性の直鎖ポリウロン酸である。Ｐｈａｒｍａｃｉａ蠕動ポンプ［Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＫ（モデルＰ−１）］、流速×２０、落高３０ｍｍ［（チューブはオートクレーブした後１Ｍ  ＮａＯＨで３０分間滅菌し、滅菌ＰＢＳで３回洗浄した）］で細胞−ゲル溶液を蠕動ポンプに通し、２５ゲージ針（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＫ）を用いて、室温の滅菌ＣａＣｌ2溶液［蒸留水中１００ｍＭ  塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）および１０ｍＭ  Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）、ｐＨ７．４］に滴下した。ゲル状の細胞−ゲル溶液は直ちにＣａＣｌ2溶液と接触し、球状のビーズを形成した（膨潤後の直径２．３ｍｍ）。ビーズは、室温にて６〜１０分間穏やかに攪拌したＣａＣｌ2溶液中に残った。ビーズをＰＢＳ中で３回洗浄し、維持培地に入れた。
【０１０６】
アルギン酸ビーズに封入された未分化ｈＥＳＣを、ｈＥＳＣ維持培地である、２０％ｖ／ｖ  ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）ＳＲ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸溶液（全てＧｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ製）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｄｏｒｓｅｔ，ＵＫ）および４ｎｇ／ｍｌヒト組換え型塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−２）（１５７  ａａ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｏｘｏｎ，ＵＫ）を補給したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で培養した。成長のための条件は加湿インキュベーター中、３７℃、５％  ＣＯ2であり、静的条件下、標準的な組織培養プラスチック皿でビーズを培養した。３〜４日おきに細胞に供給した。何らかの構造および形態の変化を評価し、カラーＣｏｏｌＰｉｘ  ９５０  デジタルカメラ（Ｎｉｋｏｎ，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ−ｕｐｏｎ−Ｔｈａｍｅｓ，ＵＫ）の付属する倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｓｏｕｔｈａｌｌ，ＵＫ）を用いて記録した。ビーズはｈＥＳＣの凝集体と単一のｈＥＳＣの双方を含有し、ビーズ内の単一のｈＥＳＣ細胞はコロニーを形成した。
【０１０７】
維持培養の１３０日後、ビーズをＰＢＳ中で２回洗浄し、細胞／コロニーを放出するために溶解した。
【０１０８】
１．２．２アルギン酸ビーズの溶解
滅菌脱重合バッファーを用いてビーズを溶解し、［（Ｃａ2+−枯渇）（５０ｍＭ  クエン酸三ナトリウム二水和物（Ｆｌｕｋａ，ＵＫ）、７７ｍＭ  塩化ナトリウム（ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｓｕｐｐｌｉｅｓ，ＵＫ）および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）］（２０）を、１５〜２０分間穏やかに攪拌しながらＰＢＳ洗浄したビーズに添加した。溶液を４００ｇで１０分間遠心分離し、ペレットをＰＢＳで洗浄し、再び３００ｇで３分間遠心分離した。
【０１０９】
１．３組織学
１．３．１パラフィン包埋
ビーズからの１３０日齢のヒトＥＳＣ凝集体を室温にて１時間４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、短期または長期保存のために０．１％アジ化ナトリウム中に保存した（４℃）。脱水処理の前に、ｈＥＳＣ凝集体を１５分間ＰＢＳ中に置いた。次に、ｈＥＳＣ凝集体を逐次的な一連の濃度が次第に増加していくエタノールにとり、全ての水を除去した。次に、エタノールをキシレンの原液で完全に置換してエタノールのあらゆる痕跡を除去した。次に、キシレンを室温にて一晩パラフィン飽和キシレンで置換した。パラフィン飽和キシレン中のｈＥＳＣ凝集体を次に、２０分間オーブン（６０℃）に入れた。次に、キシレンを完全に液体パラフィンに置き換えた。次に、試料を包埋し、分割し（４μｍ）、室温にて一晩放置してＶｅｃｔａｂｏｎｄｅｄ（商標）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＫ）ガラススライドに接着させた。
【０１１０】
１．３．２免疫細胞化学
パラフィンワックスを、キシレン、濃度を低減させたエタノール、そして次に水道水中の浸漬により切片から除去した。次に、切片をクエン酸三ナトリウム二水和物バッファー（１０ｍＭ、ｐＨ６．０）中に浸漬しながらオートクレーブし、抗原を取り出すために冷却し乾燥させた。次に、一次希釈液として、ＰＢＳ中の０．０５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ）、０．０１％（ｗ／ｖ）ＮａＮ3（Ｓｉｇｍａ）中で室温にて３０分間３％（ｖ／ｖ）ブロッキングヤギまたはウサギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともに試料をインキュベートした。
【０１１１】
免疫蛍光染色のため、ＥＳＣマーカー試料キット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；カタログ番号ＳＣＲ００２）を製造業者のプロトコールに従って用いた。使用したモノクローナル抗体は、抗ＳＳＥＡ−４、抗ＴＲＡ−１−６０および抗ＴＲＡ−１−８１（キットに含まれている）である。Ｏｃｔ−４抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）には、試料を一次希釈液（１：３００）に希釈した一次抗体とともに４℃にて一晩インキュベートした後２回洗浄し、ＰＢＳ中０．０５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡからなる二次希釈液に希釈した二次抗体（ヤギ抗ウサギ  １：３００）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）とともに暗所にて室温で１時間インキュベートした。その後、試料をＰＢＳ中で２回洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（商標）を用いてマウントした。調製物をＩＸ７０蛍光倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｓｏｕｔｈａｌｌ，ＵＫ）で観察した。
【０１１２】
１．３．２．１ネガティブコントロール
ネガティブコントロール試料は、間接的な２層の蛍光標識などで用いられているならば二次抗体のバックグラウンド蛍光のチェックのために、一次抗体を除外することにより得ることができる。次に、ポジティブ試料をこれらのデータに関して正確に解釈することができる。ネガティブコントロールを用いて、蛍光ヒストグラムでのマーカーの位置決めをしてネガティブ集団の正確な位置の同定を可能にし、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の細胞表面抗原との非特異的結合の量を推定する。
【０１１３】
ポジティブコントロール
ポジティブコントロールには、ｈＥＳＣをＭＥＦで成長させ、ＥＳＣマーカーキットを用いて免疫染色した。ポジティブコントロールを用いて、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の細胞表面抗原との特異的結合をポジティブ試料上で同定した。
【０１１４】
ＲＮＡ抽出および逆転写
全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＫ）およびＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，ＵＫ）を製造業者の説明書に従って用いて、アルギン酸ビーズ中に形成された１７５日および２６０日のｈＥＳ細胞凝集体から抽出した。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＫ）を用いて１μｇの全ＲＮＡから最終容積２０μｌのｃＤＮＡを合成した。オリゴ（ｄｔ）20を用いてＲＴ反応を刺激し、それによって遺伝子特異的なプライマーの異なる位置で同じｃＤＮＡをＰＣＲ増幅することが可能となった。ｃＤＮＡ鋳型の非存在下でネガティブコントロールを行った。Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ２ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫ）を用いてプライマーを設計した。
【０１１５】
ＲＴ−ＰＣＲ配列は以下の通りであった。
【０１１６】
【表１】
2008538276.tif 000002
【０１１７】
ハウスキーピングｍＲＮＡに関して、ＥＳ細胞培養を分化させる際にＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの方が他のハウスキーピングｍＲＮＡ配列より安定していることが見出されたので、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を用いた。他のヒトＤＮＡおよびｃＤＮＡ配列に対するプライマーアニーリング部位およびアンプリコン配列の類似性をＢＬＡＳＴでチェックした（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）。対になったプライマーアニーリング部位、およびアンプリコン配列が標的ヒト配列に特有のものであることが見出された。
【０１１８】
５０μｌのＰＣＲ反応混合物中の、ＭｇＣｌ2およびｄＮＴＰの最終濃度は、それぞれ３ｍＭおよび１０ｍＭであった。Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（登録商標）ｅｐ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でＤＮＡ増幅を行った。二本鎖ＤＮＡ変性およびＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼの活性化を９４℃にて１０分間実施し、続いて９４℃にて４０サイクルの鋳型変性（５秒）、５５℃にてプライマーアニーリング（Ｏｃｔ４およびＧＡＰＤＨに関して；Ｎａｎｏｇに関して５５℃）および７２℃にてプライマー伸張（３０秒）を実施した。ＰＣＲ産物を３％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで分離し、臭化エチジウム蛍光により視覚化し、生成物のサイズを、１００ｂｐラダー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて概算した。
【０１１９】
臭化エチジウム染色したゲルのデジタル画像を、コンピュータに接続された封入フラットベッド紫外線スキャナーおよびＣＣＤカメラからなるＦｌｕｏｒ−Ｓ  ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＵＫ）を用いて捕捉した。個別バンドの検出およびバックグラウンドノイズの除去を可能にし、遺伝子特異的増幅産物だけに起因する強度を得ることのできる、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＵＫ）を用いて画像を解析した。
【０１２０】
ＲＴ−ＰＣＲ分析（図７）は１７５日および２６０日の双方のｈＥＳ細胞凝集体での多能性マーカー、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇｓの発現を示す。レーンＡは１７５日齢のｈＥＳ細胞凝集体、レーンＢは２６０日齢のｈＥＳ細胞凝集体、レーンＣはネガティブコントロールである。ＧＡＰＤＨ発現を内部対照として用いた。これらの結果は、ｈＥＳ細胞の多能性が、継代せずに１００日を越える期間、ｈＥＳ細胞凝集体になお維持されていることを証明する。また、これらの結果は多能性マーカーについての前の免疫細胞化学的知見を支持する。
【０１２１】
結論および考察
得られた結果は、ｈＥＳ細胞がフィーダー細胞の非存在下およびフィーダー細胞馴化培地の非存在下で少なくとも１３０日間未分化状態で維持される能力を証明する。ｈＥＳ細胞カプセル封入のプロセスは、そのようなフィーダー細胞による支持の必要性をなくす物理的環境をもたらす。開発されたプロセスは、マウスＥＳ細胞の培養に用いられる方法に匹敵する方法を用いてｈＥＳ細胞の培養を可能にする。ｈＥＳのためにここに開発された培養手順は、マウスＥＳ細胞を用いて現在有効なプロトコールに基づくｈＥＳ分化プロトコールを可能にするものであり、それは、そのような実験に十分な数の未分化ＥＳ細胞を利用できないことに起因してｈＥＳ細胞で研究されてこなかったものである。開発されたｈＥＳ細胞培養系は、ｈＥＳ細胞を用いる治療薬の開発のための、標準化された、調節可能な培養系に価値のあるプラットフォームを提供する。
【０１２２】
実施例２：単一のｍＥＳ細胞の分化
単一のｍＥＳ細胞をヒドロゲルビーズ（直径４０〜１００μｍ）内に封入し、維持培地、Ｍ２［ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン（全てｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＫ提供）、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）および１０００単位／ｍＬのＥｓｇｒｏ（商標）（ＬＩＦ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＵＫ）］中で１０日間成長させた。１０日前後で、単一のＥＳ細胞は分裂を起こして小さな細胞コロニーを形成した（図８）。これらの細胞は、確立された系統特異的シグナルでの刺激によって異なる系統の成熟細胞へ分化させるようにすることができる。例えば、骨形成細胞への分化の場合、後に記載するプロトコールに従う。
【０１２３】
実施例３：比較法、伝統的な２次元ｍＥＳ細胞の日常的維持および継代（参照文献番号２および３）
Ｅ１４Ｔｇ２ａマウス胚幹（ｍＥＳ）細胞系統を、３７℃および５％のＣＯ2（ｈ３７／５）に設定された加湿インキュベーター中の０．１％ゼラチンコート組織培養プラスチック上で日常的に継代した。未分化ｍＥＳ細胞（＜ｐ２０）を２日または３日おきに継代し、新鮮なＭ２培地［ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン（全てｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＫ提供）、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）および１０００単位／ｍＬ  Ｅｓｇｒｏ（商標）（ＬＩＦ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＵＫ）］を毎日供給した。ｍＥＳ細胞を切り離すため、所望の量のトリプシン−エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）（ＴＥ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＫ）を、培地の吸引および予熱ＰＢＳでの単一回洗浄後、ｍＥＳ細胞に３〜５分間投与した（ｈ３７／５）。
【０１２４】
２次元ＥＢ形成
胚様体形成は懸濁培養の前にｍＥＳ細胞を注意深く調製することを必要とし、文書で十分に裏付けられている（８；９；２４；２８〜３０）。しかし、懸濁の前の正確な条件の経験的な決定を、Ｅ１４Ｔｇ２ａ細胞系統を用いてここに確立した。単層培養中の細胞は約８０％集密的（confluent）であるべきであり、培養の２日目または３日目であるべきであり、形態的な未分化の分化に対する比が非常に高くなくてはならない。ｍＥＳ細胞は通常トリプシン処理されるが、５分のトリプシン処理をしなくても、２〜３分後に１００〜２００個の細胞の凝集塊が目に見えた。次に、細胞を３００ｇで３分間、室温にて（２２℃、（ＲＴ））遠心分離した。Ｍ２培地での成長の２日または３日後、コンフルエントなＴ７５フラスコは、一般的に約５〜７×１０6細胞をもたらし、それを３０ｍＬのＭ１培地［α改変イーグル培地（αＭＥＭ）、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン］に再懸濁し、直径９０ｍｍの細菌学的品質等級の２枚のペトリ皿（Ｂｉｂｂｙ  Ｓｔｅｒｉｌｉｎ，ＵＫ）に均一に分配した。単一の細胞懸濁液または数千個の細胞からなる大きな凝集塊が間違った３次元凝集をもたらすので、１０〜２０個の細胞の群れは本発明の方法による正確なＥＢ形成に必須である。必須増殖因子（例えばＬ−グルタミン）が枯渇するようになり、有毒代謝物（例えばアンモニア）が堆積し始めたので、ＥＢ形成（ｈ３７／５）の３日目に培地が交換された。培養５日目に、ＥＢを細菌学的プレートからの吸引により回収し、６６ｇで４分間遠心分離した。培地を吸引し、予熱したＰＢＳと交換して微量の血清を洗い落とした。細胞を再び６６ｇで４分間遠心分離し、ＰＢＳを吸引した。３〜５分間洗浄した後、１ｍＬのＴＥをＥＢに添加した（ｈ３７／５）。次に、予熱したＭ１培地（１ｍＬ）を添加して、トリプシン処理を停止させ、細胞を骨小結節形成アッセイのための単一の細胞懸濁液として所望の培地に再懸濁した。
【０１２５】
２次元骨小結節アッセイ
既に記載したように（３１）、標準的な骨小結節形成アッセイを、８日目から２９日目まで、βａｄｅｘ［１０ｍＭのβ−グリセロリン酸塩、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸および１μＭ（いずれも終濃度）のデキサメタゾン］を継続的に補給したＭ１培地を用いて行った。脱凝集したＥＢ（ｄＥＢ）を、２日または３日おきに組織培養プラスチックもしくはガラススライド上の培地交換を行って２１日間培養した（ｈ３７／５）。ｄＥＢのプレーティング密度は１ｃｍ2あたり５．２０８×１０3細胞であり、細胞２５個につき培地１μＬであった。
【０１２６】
実施例４：ｍＥＳアルギン酸ビーズ封入
未分化マウスＥＳＣ（ｍＥＳＣ）を、１．１％（ｗ／ｖ）低粘度アルギン酸および０．１％（ｖ／ｖ）ブタゼラチンヒドロゲルビーズ（ｄ＝２．３ｍｍ）に封入した。ビーズ１個に１０，０００個のｍＥＳＣを含有する、約６００個のビーズを５０ｍＬの水平アスペクト比血管（ＨＡＲＶ）バイオリアクターで培養した。バイオリアクター培養は回転速度１７．５ｒｐｍに設定し、白血病阻害因子（ＬＩＦ）を含有する維持培地で３日間培養し、それを次に、５日間、ＥＢ形成培地に交換した後、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸塩（５０μｇ／ｍＬ）、β−グリセロリン酸塩（１０ｍＭ）およびデキサメタゾン（１μＭ）を含有する骨形成培地でさらに２１日間培養した。培養２９日後、ビーズあたりの細胞数の８４倍の増加が観察され、アルギン酸ビーズ中にミネラル化したマトリックスが形成された。ｖｏｎ  ＫｏｓｓａおよびアリザリンレッドＳ染色、アルカリ性ホスファターゼ活性、オステオカルシンのための免疫細胞化学、ＯＢ−カドヘリンおよびＩ型コラーゲン、ＲＴ−ＰＣＲおよびマイクロコンピュータ断層撮影法（マイクロＣＴ）により骨形成を評価した。これらの知見は、臨床適用の可能性のあるｍＥＳＣから、３次元（３Ｄ）でミネラル化した組織を再現可能な方法で産生するための、単純かつ統合されたバイオプロセスを提供する。
【０１２７】
材料および方法
マウスＥＳＣ培養および胚様体形成
Ｅ１４Ｔｇ２ａ細胞の培養およびＥＢの形成を、既に記載されるように行った（３２）。手短に言えば、未分化ｍＥＳＣ（＜ｐ２０）を２〜３日おきに継代し、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＣＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００単位／ｍＬのペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）、および１０００単位／ｍＬのＬＩＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｃｈａｎｄｌｅｒｓ  Ｆｏｒｄ，ＵＫ）を補給した「ダルベッコ改変イーグル培地」（ＤＭＥＭ；ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）からなる維持培地を毎日供給した。ＥＢを分断し、凝集塊（１０〜２０個の細胞）を、α改変イーグル培地（αＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００単位／ｍＬ  ペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からなるＥＢ分化培地に懸濁状態で５日間入れた。
【０１２８】
ミネラル化した組織および骨小結節アッセイ
既に記載したように（１３）、５０μｇ／ｍＬのＬ−アスコルビン酸−２−リン酸塩（Ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭのβ−グリセロリン酸塩（Ｓｉｇｍａ）、および１μＭのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）を補給したα−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、３７℃および５％のＣＯ2で維持される組織培養プラスチックまたはガラススライドで８日〜２９日まで培養し、ミネラル化した組織の形成を行った。プレーティング密度は５．２×１０3細胞／ｃｍ2であり、２日または３日おきに培地を交換した。
【０１２９】
カプセル封入およびバイオリアクター培養
未分化ｍＥＳＣを滅菌１．１％（ｗ／ｖ）低粘度アルギン酸（Ｓｉｇｍａ）、０．１％（ｖ／ｖ）ブタゼラチン（Ｓｉｇｍａ）、リン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）中に１．５６×１０6細胞／ｍＬで懸濁した。細胞−ゲル溶液を蠕動ポンプ（モデルＰ−１；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）に通し、２５ゲージ針を用いて３０ｍｍから１００ｍＭ  ＣａＣｌ2、１０ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ；ｐＨ７．４）（全てＳｉｇｍａ製）の滅菌溶液に滴下した。室温にて６〜１０分間のゲル化の間に生じたビーズは球形であった（膨潤後の直径＝２．３ｍｍ）。封入されたｍＥＳＣを、５０ｍＬの水平アスペクト比血管バイオリアクター（Ｃｅｌｌｏｎ，Ｂｅｒｅｌｄａｎｇｅ，ＬＵＸ）中の維持培地中で毎日培地交換をして３日間培養した。各リアクターには６００個のビーズが含有され、培養の０〜２１日目は１７．５ｒｐｍで、培養の２２〜２９日目は２０ｒｐｍで回転させた。回転速度を上げてアルギン酸ビーズ中のミネラル化した組織の形成を補い、その結果ビーズが重くなった。３日目から８日目まで、バイオリアクター培養にＥＢ分化培地（前述の通り、αＭＥＭ）が供給され、その培地は６日目に補充され、続いて以前に記載したように８日目に骨形成添加剤を加えて骨形成誘導された（２〜３日おきに補充された）。
【０１３０】
生細胞／死細胞アッセイ
懸濁した細胞またはアルギン酸ビーズを、ＰＢＳ中４μＭのＥｔｈＤ−１および２μＭのカルセインＡＭ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに、暗所で室温にて３０分間インキュベートし、続いてＰＢＳ洗浄した。死細胞をネガティブコントロールとして用いた。
【０１３１】
細胞試料の処理
ガラス製Ｆｌａｓｋｅｔｔｅスライド（Ｎａｌｇｅｎｅ，Ｈｅｒｅｆｏｒｄ，ＵＫ）で成長させた対照２次元細胞培養を２０分間４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ；ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ）中で固定し、ＰＢＳ中で洗浄した。アルギン酸ビーズを室温にて３０分間４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ；ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）で固定し、パラフィンで包埋する前に次第に濃度が増加するエタノール、続いてキシレン（ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ）で脱水した。包埋した試料をＶｅｃｔａｂｏｎｄ（商標）コートされたガラススライド（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｏｒｔｏｎ  Ｓｏｕｔｈｇａｔｅ，ＵＫ）上で連続的に分割した（４μｍ）。免疫細胞化学のため、加熱により抗原を取り出す前に、脱水した切片を１０ｍＭクエン酸三ナトリウム二水和物バッファー（ｐＨ６．０；Ｓｉｇｍａ）に浸漬した。Ｂａｌｂ／ｃマウス骨をアルギン酸ビーズと同じ方法で処理し、対照として用いた。
【０１３２】
組織学
アルギン酸ビーズ中で成長させた細胞の水和した２次元細胞培養または脱パラフィン処理した切片の組織学を、従来のヘマトキシリン／エオシン染色に従って調査した。
【０１３３】
アリザリンレッドＳおよびｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色
水和した２次元細胞培養およびパラフィン切片を、別の場所に記載されるように（３３）、アリザリンレッドＳまたはｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色のいずれかで染色した。Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色した切片をヌクレアーファーストレッドで対比染色し、連続的に脱水し、キシレン中で洗浄し、ＤＰＸにマウントした。Ｂａｌｂ／ｃマウス骨を対照として用い、アルギン酸ビーズと同じ方法で処理した。
【０１３４】
免疫細胞化学
水和した２次元細胞培養またはパラフィン切片を１０ｍＭのクエン酸三ナトリウム二水和物バッファー（ｐＨ６．０；Ｓｉｇｍａ）に浸漬し、オートクレーブして抗原を取り出し、続いて室温にて４５分のインキュベーションを０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ）とともに行った。表１に列挙されるように、試料を順次：ａ）室温にて３０分間、一次希釈液としてＰＢＳ中、０．０５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ）、０．０１％（ｗ／ｖ）ＮａＮ3（Ｓｉｇｍａ）中で３％（ｖ／ｖ）ブロッキングヤギまたはウサギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともに；ｂ）４℃にて一晩、一次希釈液に希釈した幹細胞および骨芽細胞の一連のマーカーに対する一次抗体とともに；ｃ）暗所で室温にて１時間、二次希釈液［ＰＢＳ中０．０５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ］に希釈した二次抗体とともにインキュベートした。次に、試料をＰＢＳで洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（商標）を用いて、１．５μｇ／ｍＬの４’，６ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともにマウントした。Ｂａｌｂ／ｃマウス骨を対照として用い、アルギン酸ビーズと同じ方法で処理した。
【０１３５】
逆転写ＰＣＲ
全ＲＮＡを、全ＲＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｌｔｄ，Ｃｒａｗｌｅｙ，ＵＫ）を用いて抽出した。１μｇの全ＲＮＡ、ランダムプライマー、およびＲＮａｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＫ）を含むＡＭＶ逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡ合成を行った。ＰＣＲ反応バッファーは、１×Ａｍｐｌｉｔａｑ  Ｇｏｌｄ  Ｂｕｆｆｅｒ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２００μＭ  ｄＮＴＰ、１．２５単位のＡｍｐｌｉｔａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）、および各々５００ｎＭのプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で構成された。既に記載されるように（３２）、ＲＴ−ＰＣＲ分析を（２０μＬから）２μＬのｃＤＮＡを用いて行った；プライマー配列は表１に列挙されている。ＭＣ−３Ｔ３−Ｅ１細胞を用いるポジティブコントロールを骨形成培地で１０日間培養した。ネガティブコントロールのために逆転写酵素を除去した。
【０１３６】
【表２】
2008538276.tif 000003
【０１３７】
ＭＴＳアッセイ
【０１３８】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ，ＵＫ）を用いて培養期間中の代謝活性を評価した。フラスコ培養（２次元）で成長したｍＥＳＣまたはアルギン酸ビーズに封入された（３次元）ｍＥＳＣの既知の数を用いて標準曲線を作成した。ネガティブコントロール（細胞を含まない）も行った。全てのアッセイは３つの別々の時に２回ずつ行い、各アッセイについて測定値を４重にとった。手短に言えば、２次元で培養したｍＥＳＣを、２４ウェルプレート中で、４０μＬのＭＴＳ試薬を加えた２００μＬのフェノールレッドを含まない維持培地で３７℃にて２時間インキュベートした。５０μＬの１０％（ｖ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の添加によって２次元反応のみが停止した。同様に、無作為に３個のアルギン酸ビーズを選択し、２４ウェルプレートの個別のウェルに入れ、３００μＬのフェノールレッドを含まない維持培地および６０μＬのＭＴＳ試薬とともに３７℃にて４時間インキュベートした。各反応物から１００μＬを９６ウェルプレートのウェルに移し、ＭＲＸ  ＩＩプレートリーダー（Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇ，ＵＫ）を用いて４５０ｎｍで測定した。
【０１３９】
ＤＮＡの定量
プロテイナーゼＫで消化された試料の全ＤＮＡ含量を、アルギン酸ビーズ中の細胞数を評価する間接的な方法として、ＤＮＡ特異的染料のＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８（Ｓｉｇｍａ）を用いて、測定した。手短に言えば、ビーズを室温にて２０分間脱重合バッファー（２０）に溶かし、４００ｇで１０分間の遠心分離後に細胞ペレットを回収し、続いてＰＢＳで洗浄した。ペレットを液体窒素中で瞬間冷凍し、分析まで−８０℃で保存した。ＤＮＡ分析のため、ペレットを、５０μｇ／ｍＬ  プロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ）を含有する１００ｍＭのリン酸水素二カリウム（Ｓｉｇｍａ）溶液中で３７℃にて一晩消化した。プロテイナーゼＫの熱不活化および１２，０００ｇで１０分間の遠心分離の後、１００μＬの上清を１００μＬのＨｏｅｓｃｈｔ  ３３２５８溶液（２μｇ／ｍＬ）と混合した。最後に、１００μＬのアリコートを、ＭＦＸマイクロタイタープレート蛍光光度計（Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて３６５ｎｍで始まる励起波長および４６０ｎｍの蛍光で測定した。高度に重合した仔ウシ胸腺ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）を用いて較正曲線を作成した。試料は、培養の０日目および２９日目に行われた３回の独立した実験で２組用いた。
【０１４０】
ミネラル化のアリザリンレッド定量分析
封入されたｍＥＳＣのミネラル化のアリザリンレッドＳ（ＡＲＳ）アッセイを、Ｇｒｅｇｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．の方法（３４）を適合させて培養を通して定量した。手短に言えば、１００個のビーズを１０％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドで３０分間固定し、２０分間脱重合バッファー（２０）に溶かした。４００ｇで１０分間の遠心分離により細胞ペレットを回収し、次に、２次元培養と同一の方法で染色した。
【０１４１】
アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰａｓｅ）活性
フラスコ培養で、または封入されたアルギン酸ビーズ（ｎ＝６）中で培養されたｍＥＳＣのアルカリ性ホスファターゼ活性を、細胞またはビーズを１５０μＬのアルカリ性ホスファターゼバッファー（ｐＮＰＰ；Ｓｉｇｍａ）および１５０μＬのρ−ニトロフェノールリン酸溶液とともに暗所で３７℃にて３０分間インキュベートすることにより測定した。各ウェルに１００μＬの０．５Ｎ  ＮａＯＨ溶液を添加して反応を停止させ、各反応物から１００μＬを９６ウェルプレートのウェルに移し、ＭＲＸ  ＩＩプレートリーダー（Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて４１０ｎｍで測定した。
【０１４２】
画像化
ＣｏｏｌＰｉｘ  ９５０デジタルカメラ（Ｎｉｋｏｎ，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ−ｕｐｏｎ−Ｔｈａｍｅｓ，ＵＫ）を備えたＩＸ７０倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｓｏｕｔｈａｌｌ，ＵＫ）またはＡｘｉｏｃａｍ（Ｚｅｉｓｓ）を備えたＢＸ６０  直立型（Ｏｌｙｍｐｕｓ）顕微鏡を用いて画像を捉えた。画像の人工的な強調は行わなかった。しかし、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ７．０を用いて画像を切り取った。生細胞／死細胞染色した試料を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＭＲＣ６００共焦点顕微鏡（Ｂｉｏ−Ｒａｄ／Ｚｅｉｓｓ，Ｗｅｌｗｙｎ−Ｇａｒｄｅｎ−Ｃｉｔｙ，ＵＫ）を用いて調製の３０分以内に画像化し、ＣＯＭＯＳソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＵＫ）を用いて処理した。
【０１４３】
マイクロＣＴ
アルギン酸ビーズ内に形成された３次元のミネラル化した凝集体を再構築するために、７０ｋＶ、１６０μＡに設定し、それに従って較正されたｐｈｏｅｎｉｘ｜ｘ−ｒａｙ  ｖ｜ｔｏｍｅ｜ｘ  コンピュータ断層撮影機（Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｘ−ｒａｙ  ３Ｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｆａｒｅｈａｍ，ＵＫ）を用いてマイクロＣＴ解析を行った。１つの検出器を用いて、３６０°回転して画像を撮影し、各切片は６．７５μｍ離れていた。本来はＳｉｅｍｅｎｓ，Ｇｅｒｍａｎｙにより開発されたＳｉｘｔｏｓソフトウェアを用いて、３次元再構築物を作成した。封入された細胞を含まないアルギン酸ビーズのネガティブコントロールおよびＢａｌｂ／ｃマウス仔骨片のポジティブコントロールを用いた。
【０１４４】
統計分析
結果を、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表し、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて分析した。統計的有意性をＰ＜０．０５とした。
【０１４５】
結果
アルギン酸ヒドロゲルに封入され、ＨＡＲＶバイオリアクターで培養されたｍＥＳＣからの３次元ミネラル化組織を、形態学的に、表現型的に（表面および分子）、かつ機能的に（ミネラル化の程度）評価した。対照として、本発明者らは、骨形成細胞への分化が起こったことを確認するために（データは示さず）既に示された結果（３１）を反復して、フラスコ（２次元）培養での骨小結節形成の伝統的なプロトコールに従ってｍＥＳＣを培養した。
【０１４６】
封入されたｍＥＳＣの形態学的特徴
分散した未分化ｍＥＳＣを、平均径２．３ｍｍのアルギン酸ヒドロゲルビーズ内に封入した（ビーズ１個あたり細胞約１０，０００個）。維持培地での培養の３日後、アルギン酸ビーズ内で最初に分散しているｍＥＳＣは、直径２０〜５０μｍの４〜１０個の細胞からなるコロニーを形成した（図１ａ）。これらのコロニーは球形、円盤状または紡錘状であり、ビーズの周囲に均一に分布していたが、稀にビーズ表面のすぐ外側の近くに位置していた（図１ａ）。３日目にＬＩＦを除去し、ＥＢ形成培地で５日間培養した後、大部分のコロニーの外見は均一であり、アルギン酸マトリックス内の別個の「ポケット」の細胞数および全体のサイズは増加しているように見え（図１ｂ）、コロニーのサイズは直径５０〜４００μｍの範囲であった。培養の２２日目までに、コロニーは非常に密集していた。大きなコロニーの大部分はビーズの中心に向かって位置し（図１ｃ）、細胞物質を何ら含まない区域が辺縁に見られた。培養の２９日後、コロニーの直径は５００μｍより大きかった。
【０１４７】
細胞の成長および代謝活性
封入されたｍＥＳＣの細胞生存力は、コロニーの大きさが増してゆくにつれて、培養時間に伴って顕著に低下することはなかった。３日目に、赤血球の不足に示されるように、限られた細胞死の跡があった（図２）。しかし、大多数の細胞は、別個の生細胞コロニーを形成し始めた。コロニーサイズは培養時間が長くなるとともに大きくなるが、コロニーの数は、培養の最初の３週間は生存力が非常に高いという事実にもかかわらず顕著に増加しなかった（図２）。最後に、培養の２９日後、生細胞コロニーは、２２日よりも大きな数ではっきりと眼に見え、また、培養の初期よりも大きくなっていた。０日目の、単一のビーズ中のＤＮＡの量を測定することにより評価した、代謝的に活性な未分化ｍＥＳＣのビーズ１個あたりの数は、ビーズあたり細胞１０，２８７±２２８個であることが見出された（平均値±ＳＥ；ｎ＝２、各複製について１５０個のビーズを測定）。ＨＡＲＶバイオリアクター中の培養の２９日後、ビーズあたり細胞８５９，７１６±１３，４９２個（平均値±ＳＥ；ｎ＝６）であり、培養の開始から８４倍増加したことが示された。代謝活性の変化は、培養のステップ、用いる培地の種類および供給の時期に関係するものと思われる。０日目から３日目まで、ビーズを維持培地で培養し、ビーズあたりの代謝活性は変化していないままであった（図２）。３日目に維持培地をＥＢ形成培地と交換し、図２に示されるように、ビーズあたりの代謝活性に有意な増加（ｐ＜０．０５）が観察された。８日目に分化培地を導入し、ビーズあたりの代謝活性は１５日目までにかなり低下し、図２に示されるように、ようやく２９日目までに実質的に増大した（ｐ＜０．０５）。しかし、培養の２９日目までにアルギン酸ビーズ内の細胞数が８４倍に増加したことに起因して、細胞あたりの代謝活性は増大しなかった。
【０１４８】
ＡＬＰａｓｅ活性およびミネラル化の量を、骨形成培地での骨形成期間（培養の１５〜２９日目）中の骨形成細胞への分化の指標として用いた。ＡＬＰａｓｅ活性は、培養の１５〜２９日目の間に３倍低下した（ｐ＜０．０５）（図２）。対照的に、ビーズあたりのミネラル化の量（４１０ｎｍでの吸光度に基づく）は、図２に示されるように、１５日目の０．００２１±０．０００３から２９日目の０．０９９９±０．００３５（平均値±ＳＥ）へ大幅に増加した（ｐ＜０．０５）。吸光度の測定値をビーズにより規準化したが、実際の測定値は、測定値あたり１００個のビーズのミネラル化した含量を用いて行った。
【０１４９】
未分化ｍＥＳＣおよびＥＢの特徴づけ
維持培地での培養の最初の３日間の、封入されたｍＥＳＣによる未分化の表現型の保持を、培養の３日目にＯｃｔ−４（核内）およびＣＤ９（表面）の発現により確認した（図３ａ〜ｃ）。さらに、ＥＢ形成ステップの間に、封入されたｍＥＳＣは８日目に中胚葉のマーカーであるＦｌｋ−１の発現を示した（図３ｄ）。
【０１５０】
３次元ミネラル化組織形成
アルギン酸ヒドロゲル中で封入されたｍＥＳＣから形成された３次元ミネラル化組織を、アルギン酸ビーズの連続する切片を調べることにより培養の骨形成ステップ（１５〜２９日）の間に広範囲にわたって特徴付けた。図４ａ〜ｈは、濃いアリザリンレッドＳおよびｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色によって示すように、３次元ミネラル化組織がアルギン酸ビーズ内で早くも２２日目に著しく形成され、２９日までにさらに発達したことを実証する。明らかなように、試料には切片全体に広がるミネラル化した組織の大部分が含有されていた。培養の２２日目〜２９日目の間に染色の強さの変化を観察した。具体的に言えば、骨形成の中間ステップで（２２日目）、アリザリンレッドＳで染色した組織は均一な赤色であったが（図４ｃ〜ｄ）、マウス骨ポジティブコントロール（図４ａ〜ｂ）に見出される赤／黒の強度には届かなかった。さらに、２２日目の試料には幅５０〜１００μｍのミネラル化した範囲を含む、直径１００〜３００μｍの範囲の組織が含有された。対照的に、ヘマトキシリン／エオシン染色が示すように（図４ｅ〜ｆ）、骨形成期間の終わりに（２９日）、アルギン酸ビーズにはより大きな組織の凝集が含まれた。最も大きな組織切片の大きさは５００×５００μｍを上回った。形成された組織の特定の領域は壊死しているかに見えたが、生存染色で判定されるように、大部分は一様に生存していた（図２）。その上、生じた組織はビーズの中心を占有する傾向があり、円柱状の細胞の縁で高度に整えられていた（図４ｅ）。最終的に、２９日目に（図４ｇ〜ｈ）、形成されたミネラル化組織は、ポジティブコントロールに見られる赤／黒アリザリンレッドＳ染色強度を達成した（図４ａ〜ｂ）。
【０１５１】
また、アルギン酸ヒドロゲルにおけるミネラル化組織形成も、免疫細胞化学によって骨特異的マーカーであるＯＢ−カドヘリン、Ｉ型コラーゲンおよびオステオカルシンの発現を評価することにより調査した。骨芽細胞を識別する（３５）ＯＢ−カドヘリンの発現は、培養の１５日目、２２日目および２９日目に検出され（図４ｉ〜ｋ）、形成された組織の大きな切片全体にわたって広範に分布していた。染色の大部分は、細胞が円柱状に組織化されている組織の境界部分に限定されていた。オステオカルシン染色は、ＯＢ−カドヘリンポジティブ染色の同じ組織試料のミネラル化した切片の辺縁で検出された。（図４ｍ）。最後に、マウス骨ポジティブコントロールと比較して低いレベルではあるが、Ｉ型コラーゲンも検出され、２９日目にようやく目に見えた（図４ｐ）。これは、用いるポリクローナル抗体の感受性が低いことに起因する可能性があり得る。免疫細胞化学反応の結果を遺伝子発現の分析により確認した。具体的に言えば、ＲＴ−ＰＣＲにより、ビーズ内で１５日目、２２日目および２９日目にＣｂｆａ−１およびＩ型コラーゲンの発現が実証された（図５）。一時的な胚型である（２１）ＩＩＡ型コラーゲンおよびオステオカルシンの発現は１５日目、２２日目および２９日目に見出された。２９日目のビーズ内のオステオカルシン発現は、ポジティブコントロール（ＭＣ−３Ｔ３−Ｅ１細胞）と類似の強度であるように思われた。
【０１５２】
組織のミネラル化をマイクロＣＴ解析により評価した。維持培地中に置かれた、封入されたｍＥＳＣを含まないアルギン酸ビーズからなるネガティブコントロールのマイクロＣＴ画像は、非常にコントラストの小さい画像をもたらし、Ｘ線を減衰させることのできる高密度物質が存在していないことを示した（図６）。対照的に、アルギン酸ビーズ内でｍＥＳＣから形成されたミネラル化した組織は適当なコントラストをもたらした。密集した骨凝集の他に、アルギン酸ビーズの表面の「クラスト（crust）」も、１５日目、２２日目（データは示さず）および２９日目のアルギン酸ビーズの辺縁の輪郭を表すマイクロＣＴで検出された（図６）。ビーズのクラストには、低いレベルの高密度物質（紫色）およびミネラル化した骨凝集体が（ビーズ自体の内部に）含有され、骨凝集体の中核からの距離が増加するにつれて減衰が減少している、それらの中心（黄色）の高レベルな減衰を示した。マウス大腿骨のポジティブコントロールを画像化してミネラル化の程度を比較した（図６）。無作為に選択されたアルギン酸ビーズの完全な走査を行うことにより、アルギン酸ビーズ内のミネラル化した組織領域の３次元の再構築がもたらされた。１５日目に、ミネラル化した組織凝集体は目に見えなかったが、２２日までに１４個の別個の直径５０μｍ未満の小さな凝集体が見えた。しかし、２９日目に、５０〜２５０μｍのサイズ範囲の４４±７（平均値±ＳＥ；ｎ＝２）のミネラル化した組織凝集体が存在した（図６）。これらのミネラル化した凝集体は、図４に見られるように軟組織で周りを囲まれ、図６（赤色矢印）でミネラル化した凝集の周りを囲んでいる暗い領域として微かに認識することができる。
【０１５３】
考察
胚幹細胞培養は、訓練を積んだ操作者と操作者に依存する判断を必要とする細分化された方法であるので、維持に手がかかることが妨げになる。現在、ＥＳＣは組織培養プラスチックで単層として培養され、培養がバッチ型であること、使用者が頻繁に介入すること、さらに培養域が迅速に消耗するという理由から微小環境で変動を受けやすい。近年、他者もまた、伝統的なＥＳＣ培養の問題点を強調し、統合的な解決方法を提供した（３６）。この報告書において、本発明者らは、干渉および培養操作の必要のないＨＡＲＶバイオリアクターを用いる統合された方法で、未分化ｍＥＳＣがアルギン酸ビーズ中で３次元ミネラル化組織を形成する、新規なバイオプロセスを実証する。
【０１５４】
ｍＥＳＣ培養の維持ステップの間、ＬＩＦの存在により達成される多能性および細胞生存力を維持することが必須である（４）。従って、ＬＩＦが、「半固体」であると考えられ、それらのカルシウム分布と多糖ブロックの配置の双方において異質であるアルギン酸ビーズへ確実に浸透することが非常に重要であった。カルシウムおよびアルギン酸の勾配はビーズ中に存在し、表面のクラスト（最大濃度）からビーズの中心（ゲル化の弱い区域）へと広がっている（３７）。これらの濃度勾配は、なぜコロニーがビーズのクラストから５００μｍに成長すると思われるのかを説明する。例えば、調製されたアルギン酸ビーズは、分子量６８ｋＤａのタンパク質に浸透性であり（３８）、ＬＩＦの拡散を容易に可能にするものであった（３９；４０）。６００個のビーズからなる各バッチを、塩化カルシウム溶液中での６〜１０分間のゲル化により作成した。アルギン酸のゲル化は、カルシウムおよびアルギン酸が互いに一定の構成境界の方へ拡散して、安定した構造、つまりＣａ++−アルギン酸ゲルネットワークを形成する反応拡散プロセスである。ビーズの表面クラストは常に形成され（全てのビーズが無傷で残っていることから）、従って、塩化カルシウム溶液に触れる時間の短いビーズはカルシウム−アルギン酸勾配を形成する時間が短く、ビーズの中心部により大きな弱いゲル化区域を有する（３７）と仮定することが理に適っていると思われる。
【０１５５】
ＥＢ形成培地中で５日間の培養の後、アルギン酸ビーズ中のコロニーサイズは劇的に増大し、場合によっては直径４００μｍに達したが、生存力には何ら有意な低下はなかった。コロニーは、成長に対してより伝導力を有することが報告されているビーズ内の別個の「ポケット」で均一に成長した（３７）。本発明者らが未分化ｍＥＳＣを封入し、伝統的な懸濁法を用いてＥＢを形成しなかったにもかかわらず、培養の３日目〜８日目の間のＦｌｋ−１抗原の発現は中胚葉の発達を確認した（２３；４１）。
【０１５６】
骨形成の間の早期に（１５日目）ＯＢ−カドヘリンが発現したことは、３次元培養での骨芽細胞の存在を示した（４２）。これらの骨芽細胞は、１５日目に生存していて（エステラーゼ活性）、かつ代謝的に活性であった（デヒドロゲナーゼ活性）。代謝活性は培養時期の間、変動した。骨形成細胞への分化の開始時（８日目）、ビーズあたりの代謝活性は高かったが、１５日目に低くなった。これはＡＬＰａｓｅ活性が最高レベルであったが、ミネラル化がほぼ最低であったこと関連がある。骨形成が進行するにつれて（１５日目〜２９日目）、他の骨芽細胞分化および成長のモデルに見られるように、ＡＬＰａｓｅ活性（ビーズあたりの）の低下およびミネラル化の増加が観察された（４３）。骨格組織でのＡＬＰａｓｅ活性は、その他の機能の中でも、局所の無機リン酸塩レベルを増加させ、ヒドロキシアパタイト結晶の成長の阻害剤を破壊し、さらにリン酸塩輸送に役立つと考えられる（４４）。骨形成の後半部分は、骨芽細胞が分泌されたマトリックス内に閉じ込められ、それらの資源をミネラル化へ転用するためにそれらの代謝活性を劇的に低下させるステップであり得る。２２日目および２９日目のＡＬＰａｓｅ活性の低下、ミネラル化の増加、および細胞あたりの低い代謝活性は、この期間中の細胞の表現型が成熟した骨芽細胞のものであり得ることを示唆する。このことは、骨形成の終わりまでに（２９日目に）、オステオカルシン、ＯＢ−カドヘリンおよびＩ型コラーゲンタンパク質が検出されたという事実によってさらに実証される。Ｓｈｉｍｋｏ  ｅｔ  ａｌ（４５）は、ｍＥＳＣがＥＢ形成をせずに骨に分化するように誘導し、その結果ミネラル化がもたらされたが、彼ら自身が認めるように、従来型の骨形成と見なされなかった。彼らはオステオカルシンとＩ型コラーゲンの双方の産生が遅延し、ＡＬＰａｓｅ活性が通常の骨形成と一致しなかったことを報告した。対照的に、本発明者らのデータは、ＡＬＰａｓｅのレベル低下および骨特異的タンパク質の発現に示されるように、ＯＢ−カドヘリンについては早くても１５日目に、従来型の３次元骨形成が起こることを実証する。
【０１５７】
オステオカルシンの発現は胚性骨において一時的なものであるが、それは成体骨で最も豊富なタンパク質のうちの１つであり、カルシウム依存的にヒドロキシアパタイトと結合する（４６；４７）。線維性骨は、不規則なコラーゲン線維の束、大きく多数の骨細胞、および不規則に分散するパッチに起こる、遅延型の無秩序なカルシウム沈着を特徴とする（４８）。本研究において、２２日目と２９日目の両日にオステオカルシンが３次元組織凝集体の環および縁に存在することは、マイクロＣＴの結果に一致する。これらの所見は、アルギン酸ビーズ中のミネラル化した組織がアパタイト結晶の凝縮（骨の発達）により、さらに場合によっては類骨前方の前縁で（成体層状骨）形成されることを示唆する。本発明者らのデータから、細胞が主に増殖能を有する骨芽細胞であったこと（４９）およびヒドロキシアパタイトが沈着していたことが推論される。複能性を有する前駆細胞から成熟骨細胞への分化の後には増殖、細胞外マトリックスの発達およびミネラル化ステップが続き、多少のアポトーシスが成熟小結節に見られることが認められている（５０）。
【０１５８】
ＲＴ−ＰＣＲ分析により、骨形成のエンドポイントで、Ｃｂｆａ−１、Ｉ型コラーゲン、およびオステオカルシンを発現する、有糸分裂的に活性のある、成熟骨芽細胞の明白な表現型を有する、最終分化し、ミネラル化した骨組織の存在をさらに確認した（４９；５１）。胚のＩＩ型コラーゲン（スプライス変異体Ａ）の発現は、ｍＥＳＣの骨形成細胞への分化の間は正常であり（２１；５２）、同様に、オステオカルシンの発現も既に骨形成細胞への分化の７日目から２１日目（本研究の１５日目から２９日目に相当する）に報告されている（５３）。成熟ＩＩ型コラーゲン（スプライス変異体Ｂ）の発現が全くないことは、成体軟骨が存在せず、骨組織が主にＩ型コラーゲンからなることを示している。
【０１５９】
本発明の方法をｈＥＳＣに適用すると、ｈＥＳＣの臨床での実現をもたらす可能性がある。具体的に言えば、海綿骨移植片に３〜４ｍｍの溶解を修復する必要のある腰部の脊椎分離症などの外科手術には（５４）、１０，０００個のＥＳＣから４４±７（平均値±ＳＥ、ｎ＝２）個のミネラル化した凝集体を含有する単一のアルギン酸ビーズ（直径＝２．３ｍｍ）が、そのような欠陥を修復するために十分な材料を提供し得る。さらに、ミネラル化した組織を充填したアルギン酸ヒドロゲルを欠陥部分に直接注射することも可能である（５５〜５７）。本発明の方法は、伝統的なＥＳＣ培養の魅力的かつ有益な代替法を提供し、臨床適用のための大規模の３次元組織を提供することの障害を取り除く。手短に言えば、本発明者らは、操作者の介入によるところを最低限にし、再現性のある結果が得られ、スケールアップおよびオンラインモニタリングを受け入れやすい、未分化ｍＥＳＣからの３次元ミネラル化組織の生成のための、単純な、統合された方法を提示する。
【０１６０】
実施例５：封入された細胞の凍結保存
Ｓｔｅｎｓｖａａｇ  ｅｔ  ａｌ（２００４）に記載される方法を用いて（５９）、凍結手順の前にＤＭＳＯ濃度を徐々に増加させた。クリオチューブをさらに−７．５ｄ℃まで過冷却して核とした。その後、試料を０．２５℃／分の速度で冷却し、液体窒素中に保存した。共焦点顕微鏡定量化（ＣＬＳＭ）技術およびＮＩＴＳアッセイを用いて封入された細胞の生存力を評価した。
【０１６１】
［参考文献リスト］
【表３Ａ】
2008538276.tif 000004
【表３Ｂ】
2008538276.tif 000005
【表３Ｃ】
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【表３Ｄ】
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【表３Ｅ】
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【表３Ｆ】
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【表３Ｇ】
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【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１．２】Ｏｃｔ４の抗体で染色した免疫蛍光  １３０日パラフィン包埋／切片ｈＥＳＣ凝集体は、Ｏｃｔ−４ポジティブの免疫染色を示した。（挿入図−ネガティブコントロールおよびポジティブコントロール）
【図３．４】抗ＴＲＡ−１−８１で染色した免疫蛍光  １３０日パラフィン包埋／切片ｈＥＳＣ凝集体の免疫染色はこの抗体に対する強い免疫活性を提示し、多能性が保持されていることを示す。（挿入図−ネガティブコントロールおよびポジティブコントロール）
【図５．６】抗ＳＳＥＡ−４で染色した免疫蛍光  未分化ｈＥＳＣ凝集体は、ＳＳＥＡ−４抗体ポジティブの免疫染色を示した。（挿入図−ネガティブコントロールおよびポジティブコントロール）
【図７】ＲＴ−ＰＣＲ分析  ＲＴ−ＰＣＲ分析は、多能性マーカーの発現を示す。１７５日および２６０日の双方でのＯｃｔ４およびＮａｎｏｇのｈＥＳ細胞凝集体。レーンＡは１７５日齢のｈＥＳ細胞凝集体、レーンＢは２６０日齢のｈＥＳ細胞凝集体、レーンＣはネガティブコントロールである。ＧＡＰＤＨ発現を内部対照として用いた。
【図８】Ｍ２培地中での静的３次元培養で１０日間、ヒドロゲル１．１％ｗ／ｖアルギン酸、０．１％ｖ／ｖゼラチンビーズ内に封入された単一のｍＥＳ細胞の成長。スケールバーは５０μｍである。単一のＥＳ細胞は分裂を起こし、１０日前後で小さな細胞のコロニーが形成される。
【図９】統合された維持および骨形成細胞への分化戦略の模式図。ステップは、  ａ）アルギン酸とゼラチンマイクロビーズ中への未分化ｍＥＳＣの封入および３次元バイオリアクターへの導入；  ｂ）ｍＥＳ細胞数を増加させ、適した細胞クラスターを形成して３次元の多重前駆細胞（multiprogenitors）の形成を可能にするための、維持培地（Ｍ２）での３日間の培養；  ｃ）ＥＢ形成培地（Ｍ１）での５日間の培養；  ｄ）骨誘導および３次元骨形成を可能にするための骨形成培地（Buttery）での２１日間の培養であった。
【図１０】アルギン酸ビーズ中の組織形態。アルギン酸ビーズはその球形の形状を保ち、細胞クラスター形成が明らかとなる：（ａ）３日目（スケールバーの長さ＝１０００μｍ）；（ｂ）７日目（スケールバーの長さ＝５００μｍ）；（ｃ）２１日目（スケールバーの長さ＝５００μｍ）。ヘマトキシリン／エオシン染色した様々な時点でのヒドロゲルの薄片は組織の発達を示す：（ｄ）３日目（スケールバーの長さ＝２０μｍ）；（ｅ）８日目（スケールバーの長さ＝２０μｍ）；（ｆ）２２日目（スケールバーの長さ＝２０μｍ）。
【図１１】生細胞／死細胞染色（緑色は生細胞を示し、赤色は死細胞を示す；スケールバーの長さ＝１００μｍ）により証明されるアルギン酸ビーズ内部の細胞生存力（挿入図）。３次元培養でのビーズごとの生化学的能力を、代謝活性についてＭＴＳアッセイ（黒三角；ｎ＝２４）およびアルカリ性ホスファターゼアッセイ（黒丸；ｎ＝６）を用いて、さらにミネラル化した組織形成についてアリザリンレッドによる定量化（黒四角；ｎ＝６）を用いて評価した。エラーバーは標準誤差を表す。*／＃  有意な増加／減少（ｐ＜０．０５）。
【図１２】封入されたｍＥＳＣの特性決定。免疫細胞化学的方法により、３日目の未分化状態の維持：（ａ）ＤＡＰＩ（青色）およびＣＤ９（赤色）、（ｂ）ＤＡＰＩ（青色）、（ｃ）Ｏｃｔ−４（緑色）を確認する。３次元培養がＥＢ形成培地（３〜８日目）中で成長した場合、中胚葉組織の生成は８日目に明らかとなった：（ｄ）ＤＡＰＩ（青色）およびＦｌｋ−１（緑色）。挿入図は組織培養プラスチックで（２次元）培養したｍＥＳＣから得たネガティブコントロールを表す。スケールバーの長さ＝２０μｍ。
【図１３】ミネラル化した組織形成の特性決定。（ａ）Ｂａｌｂ／ｃマウス骨アリザリンレッドＳポジティブコントロールおよび（ｂ）Ｂａｌｂ／ｃマウスｖｏｎ  Ｋｏｓｓａポジティブコントロール。２２日目のアルギン酸ビーズ中のミネラル化した組織形成が、（ｃ）アリザリンレッドＳおよび（ｄ）ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色により証明された。アルギン酸ビーズの中央部分のヘマトキシリン／エオシン染色は、２９日目にヒドロゲルの中心での組織形成を明らかにした（ｅ〜ｆ）。２９日目の骨形成のための同じ切片の検査は、アリザリンレッドＳ（ｇ）およびｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ（ｈ）に対してさらに顕著な染色を示した。２９日目に免疫細胞化学的方法により、最終分化した骨芽細胞の存在を確認した：（ｉ）ＤＡＰＩ（青色）で染色し、オステオカルシン（緑色）について免疫染色した２９日目の切片であり、挿入図（ｊ）は同様に染色したＢａｌｂ／ｃマウスの骨ネガティブコントロールを示す；（ｋ）高い倍率でＤＡＰＩ（青色）染色し、オステオカルシン（緑色）について免疫染色した２９日目の切片であり、挿入図（ｌ）はＢａｌｂ／ｃマウス骨ポジティブコントロールを示す；（ｍ）ＤＡＰＩ（青色）で染色し、ＯＢ−カドヘリン（緑色）について免疫染色した２９日目の切片であり、挿入図は（ｎ）Ｂａｌｂ／ｃマウス骨ポジティブコントロールおよび（ｏ）Ｂａｌｂ／ｃマウス骨ネガティブコントロールを示す；（ｐ）ＤＡＰＩ（青色）で染色し、コラーゲン−Ｉ（緑色）について免疫染色した２９日目の切片であり、挿入図は（ｑ）Ｂａｌｂ／ｃマウス骨ポジティブコントロールおよび（ｒ）Ｂａｌｂ／ｃマウス骨ネガティブコントロールを示す。スケールバーの長さは、（ａ〜ｆ）について１００μｍであり、（ｇ〜ｊ）について２０μｍである。
【図１４】骨形成期間中の１５日目（ｄ１５）、２２日目（ｄ２２）、および２９日目（ｄ２９）の骨形成マーカーの遺伝子発現解析。Ｌ＝１００ｂｐ  ＤＮＡラダー。ＲＴ−ｖｅ＝ＧａｐＤＨプライマーを含む、２９日目の逆転写酵素の非存在下でのＲＴ−ネガティブコントロール。−ｖｅ＝ＧａｐＤＨプライマーとともに、鋳型の代わりに水を用いるＰＣＲネガティブコントロール。＋ｖｅ＝骨形成培地で１０日間培養したＭＣ−３Ｔ３−Ｅ１細胞を用いるポジティブコントロール。
【図１５】マイクロコンピュータ断層撮影法（マイクロＣＴ）を用いる組織ミネラル化の評価。アルギン酸ビーズを、２９日目に骨凝集体のミネラル化の程度について評価した。（ａ〜ｂ）擬似色、２９日目の、無作為に選択された単一のアルギン酸ビーズの３次元部分の再構築。挿入図は、Ｂａｌｂ／ｃマウス大腿骨を用いる擬似色ポジティブコントロールを表す。擬似色画像の色度は、最高（黄色）から紫色へ、そして最低（黒色）へ減衰するレベルを示し、それぞれ硬組織から軟組織を表す。（ｃ）は、２９日目のアルギン酸ビーズのグレースケール透過画像を示す（赤色の矢印は、ミネラル化した凝集体を取り巻く軟組織を示す）。挿入図は細胞を含まないアルギン酸ビーズを用いるネガティブコントロールのグレースケール透過画像を示す（破線はビーズの縁を示す）。（ｄ）擬似色、２９日目のアルギン酸ビーズの２次元断面図。スケールバーの長さ＝１００μｍ。
【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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