(57)【要約】【課題】鎮痛効果を有するプロバイオティクス細菌の菌株を提供すること。【解決手段】胃腸の鎮痛を目的としてヒト又は動物に投与する担体を調製するために、ラクトバチルス  アシドフィラスの少なくとも一つの菌株を使用すること。更に、そのための微生物を選択する、以下の段階を含む方法：ｉ）試験微生物を準備し、少なくとも一つの上皮細胞と接触させる段階、及び、ｉｉ）少なくとも一つの上皮細胞のオピオイド受容体及び／又はカンナビノイド受容体の発現を検出する段階。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃腸の鎮痛を目的としてヒト又は動物に投与する担体の調製のための、少なくとも一つのラクトバチルス  アシドフィラスの菌株の使用。
【請求項２】
前記ラクトバチルス  アシドフィラスの菌株がＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ−４７９７及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＦＭ菌株からなる群から選択される、請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記鎮痛がオピオイド受容体及び／又はカンナビノイド受容体を経てなされる、請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
投与される前記担体が薬学的に許容できる担体又は食品である、請求項１乃至３のいずれか一項記載の使用。
【請求項５】
投与される前記担体が動物又は植物由来の乳製品である、請求項１乃至４のいずれか一項記載の使用。
【請求項６】
以下の段階を含む、胃腸の鎮痛を目的としてヒト又は動物に投与する担体の調製用の微生物を選別する方法：
ｉ）  少なくとも一つの上皮細胞を試験微生物と接触させる段階、
ｉｉ）  少なくとも一つの前記上皮細胞においてオピオイド受容体及び／又はカンナビノイド受容体の発現を検出する段階。
【請求項７】
工程ｉ）又はｉｉ）における少なくとも一つの上皮細胞が、ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３８細胞株又はＣａｃｏ−２細胞株に由来する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
工程ｉｉ）が、μオピオイド受容体及び／又はＣＢ１受容体及び／又はＣＢ２受容体を検出することによって行われる、請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
工程ｉｉ）が、オピオイド受容体及び／又はカンナビノイド受容体のメッセンジャーＲＮＡの発現を検出することによって行われる、請求項６乃至８のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胃腸の鎮痛を目的としてヒト又は動物に投与する担体を調製するための、少なくとも一つのラクトバチルス  アシドフィラスの菌株の使用に関する。微生物、特に細菌において、幾つかのものは免疫系に好ましい影響を及ぼし、特に乳酸菌及びビフィドバクテリウム属細菌は、「プロバイオティクス」細菌又は菌株と呼ばれる。
【背景技術】
【０００２】
通常、プロバイオティクス細菌又は菌株とは、生きたまま摂取され、宿主の健康又は生理機能に対して有益な効果を与える非病原の微生物を意味する。これらのプロバイオティクス菌株は一般に、上部の消化管を通過する間は生存できる。それらは非病原性、非毒性であり、また一方では消化管内の定住フローラとの生態学的相互作用により、また一方では「ＧＡＬＴ」（消化管関連のリンパ組織）を介して免疫系好ましい影響を与えるその能力により、健康上有益な効果を発揮する。プロバイオティクスの定義によると、充分な菌数が存在する場合には、これらの細菌は生きた状態で腸内を移行できるが、しかしながら、それらは腸のバリアを通過できないため、それらの主要な効果はルーメン側及び／又は胃腸管の壁において発揮される。それにより、その投与期間の間、定住フローラの一部が形成される。このコロニー形成（又は一時的なコロニー形成）によって、プロバイオティクス細菌は、例えばフローラに存在する潜在的に病原性の微生物の抑制や、腸内の免疫系との相互作用により、有益効果を発揮できる。
【０００３】
特に乳製品において最も良く使用されるプロバイオティクス菌株は、主にラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、ビフィドバクテリウム属及びサッカロミセス属の細菌及び酵母である。これらの細菌において知られているプロバイオティクス効果には、ラクトース耐性、胃腸及び泌尿器の感染症の予防又は治療効果の改善、癌の予防、血液コレステロールレベルの減少が例として挙げられる。しかしながら、重要なことは、上記の属の全ての菌株が個々に上記の効果を有するわけではなく、ごく一部だけが有し、ゆえに慎重に選別しなければならないことである。
【０００４】
当該分野の技術者の要求を満たすためには、菌株又は菌株の混合物を発見することが必要であり、それは、胃腸のレベルでの炎症であって、しばしば痛みとなる腸の不快感（特に過敏性腸症候群（ＩＢＳ））、又は、特に大腸炎又は下痢の間、胃腸のレベルで経験される痛みを緩和するのに効果的であり、またそのための手段を提供するものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
すなわち、本発明が解決する課題は、鎮痛効果を有するプロバイオティクス細菌の菌株を提供することである。
【０００６】
そのため、本発明において、胃腸の鎮痛を目的としてヒト又は動物に投与される担体の調製における、少なくとも一つのラクトバチルス  アシドフィラスの菌株の使用が提案される。
【０００７】
本発明ではまた、胃腸の鎮痛を目的としてヒト又は動物に投与される担体を調製するための微生物を選択する、以下の段階を含む方法が提案される。
ｉ）試験微生物を準備し、少なくとも一つの上皮細胞と接触させる段階、及び
ｉｉ）少なくとも一つの上皮細胞のオピオイド受容体及び／又はカンナビノイド受容体の発現を検出する段階。
【０００８】
本発明は、明白であり、かつ利用可能な菌株の範囲を拡大する長所を提案する意味で有効である。
【０００９】
本発明はそのほかにも、胃腸の治療又は予防の目的に使用可能なであるという効果がある。
【００１０】
本発明は、それが胃腸の治療又は予防目的でヒト又は動物に投与されるときに特に有効であり、特に、過敏性腸症候群の場合若しくは炎症性反応によって生じる痛みの場合に経験される痛みの減少、又は、腸の炎症の調節に有効である。
【００１１】
本発明はまた、治療又は予防目的でヒト又は動物に投与されたとき、分泌及び消化機能を調節することで腸の輸送の制御を可能にするため、有用である。
【００１２】
本発明にはまた、薬学的に許容できる担体又は食品に組み込まれたときもその全ての機能が保持されるという効果がある。
【００１３】
本発明の他の効果及び特性は、以下の説明及び実施例（単なる具体例に過ぎず、本発明を限定しない）の記載により明確になると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、胃腸の鎮痛の目的でヒト又は動物に投与される担体を調製するための、少なくとも一つのラクトバチルス  アシドフィラスの菌株の使用に関する。
【００１５】
本発明において使用するラクトバチルス  アシドフィラスは、グラム陽性の菌株である。好ましくは、乳酸の産生を生じさせるホモ発酵代謝型の、カタラーゼ陰性菌株である。本発明において使用されるラクトバチルス  アシドフィラスはまた、他の微生物に対して活性を有するバクテリオシン（例えばラクタシン）を産生できる。
【００１６】
好ましくは、ペプシンに対する良好な耐性を有し、酸性ｐＨ条件下で、パンクレアチンに対する良好な耐性を有し、また胆汁酸塩に対する良好な許容度を示すラクトバチルス  アシドフィラスである。
【００１７】
好ましくは、「疎水性」と称されるラクトバチルス  アシドフィラス、すなわち、極性又は無極性の疎水性有機溶媒（例えばｎ−デカン、クロロホルム、ヘキサデカン又はキシレン）に対する強い親和性を有するものが使用される。本発明において好ましいラクトバチルス  アシドフィラス菌株は、ラクトバチルス  アシドフィラスＰＴＡ−４７９７及びラクトバチルス  アシドフィラスＮＣＦＭである。ラクトバチルス  アシドフィラスの中で、ラクトバチルス  アシドフィラスＰＴＡ−４７９７菌株は、Ｒｈｏｄｉａ  Ｃｈｉｍｉｅ（２６、ｑｕａｉ  Ａｌｐｈｏｎｓｅ  Ｌｅ  Ｇａｌｌｏ、９２  ５１２  ＢＯＵＬＯＧＮＥ−ＢＩＬＬＡＮＣＯＵＲＴ  Ｃｅｄｅｘ、フランス）によって、ブタペスト条約に従い、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（登録番号ＰＴＡ−４７９７として登録）に寄託されている。この菌株は、国際公開第２００４／０５２４６２号パンフレットにおいて開示されている。
【００１８】
本発明における使用法の技術的範囲内において、胃腸の鎮痛は、オピオイド受容体及び／又はカンナビノイド受容体を介して好適に行われる。上記のオピオイド受容体は、δ、Ｋ及びμの合計３つが存在する。それらは、７回膜貫通ヘリックスを有する、Ｇ蛋白質結合受容体スーパーファミリーに属する。受容体の細胞内側の一部はＧ蛋白質と接触してそれと連結し、使用されるアゴニストのタイプ（主にタンパク質Ｇαｉ３＞Ｇαｉ２＞Ｇαｉ１）に応じて変化できる。
【００１９】
オピオイド受容体（特にμ受容体）は、幾つかの機能を有する。主なものは鎮痛作用であり、ヘマト髄膜のバリアを通過するこの受容体に特異的なβ−エンドルフィン又はモルヒネ型のアゴニストの使用により示される。消化管におけるこの受容体の第２の機能は、分泌及び消化機能を阻害することによって腸への輸送を減少させることである。最後に、オピオイド受容体は、腸の炎症の調節にも関与している。
【００２０】
μオピオイド受容体は、中枢神経系のみならず末梢神経にも存在する。その存在は、人体の大部分の主要器官、例えば脾臓、肝臓、腎臓、小腸及び大腸、特に、粘膜下及び腸間膜のニューロンにおける腸の神経系、並びに、インビトロではリンパ球、単球／マクロファージ及び上皮細胞において検出されている
【００２１】
カンナビノイド受容体（ＣＢ１及びＣＢ２と呼ばれる）は、７回膜貫通ヘリックスからなる、Ｇ蛋白質結合受容体スーパーファミリーに属する。それらは基本的に、ＣＢ１は中枢及び末梢神経系において、及びＣＢ２は免疫反応細胞において発現する。ヒトにおいては、これらのカンナビノイド受容体に対する２つの内因性リガンドが存在し、それは腸の上皮細胞において内生的に産生される。
【００２２】
腸の神経系にて発現されるカンナビノイド受容体ＣＢ１は、胃及び小腸の蠕動の低下、及び胃液分泌阻害の原因となりうる。カンナビノイド受容体によるその他の抗下痢作用及び制癌作用も推定される。
【００２３】
本発明の使用法の技術的範囲内において、胃腸の鎮痛は、好ましくはμオピオイド受容体及び／又はＣＢ１受容体及び／又はＣＢ２受容体によりなされる。
【００２４】
本発明の使用において使用される担体は、好ましくは薬学的に許容できる担体又は食品である。
【００２５】
薬学的に許容できる担体とは、とりわけ、圧縮錠剤、錠剤、カプセル、軟膏、坐薬又は可飲溶液の形態の担体を意味する。
【００２６】
好ましくは、本発明において使用される担体は、食品（例えば乳に基づく補助食品、飲料又は粉末）である。好ましくは、動物又は植物由来の乳製品である。
【００２７】
乳製品とは、動物及び／又は植物由来の乳液を含む媒体を意味する。動物由来の乳液は、ウシ、ヒツジ、ヤギ又はバッファロー由来の乳であってよい。植物由来の乳液は、本発明にて使用可能な植物由来のいかなる発酵可能な物質であってよく、特に大豆、米又は穀類に由来するものである。
【００２８】
より好ましくは、本発明において使用される担体は、発酵乳又はヒト用に調整された乳である。
【００２９】
本発明の担体の調製に用いるラクトバチルス  アシドフィラスの菌株は、細菌懸濁液の形態でも、前後に凍結させても、濃縮形態でも、乾燥、凍結乾燥又は冷凍形態のいずれの形態でも調製できる。どの形態を用いる場合でも、菌株を凍結できる。
【００３０】
本発明による担体の調製に用いるラクトバチルス  アシドフィラスの菌株は、その乾燥又は凍結乾燥の間に他の添加物を添加してもよい。
【００３１】
本発明にて用いるラクトバチルス  アシドフィラスの菌株は、１０６〜１０１２細菌／ｇ担体のＣＦＵ、特に１０８〜１０１２細菌／ｇ担体のＣＦＵで含まれてもよい。ＣＦＵは、「コロニー形成単位」を表す。「ｇ担体」とは、好ましくは食品又は薬学的に許容できる担体を意味し、好ましくは凍結乾燥形態においては１０９〜１０１２ＣＦＵ／ｇである。
【００３２】
本発明の担体の調製に用いるラクトバチルス  アシドフィラスの菌株は、乳酸菌と混合された形態であってもよい。本発明において適切と考えられる乳細菌には、通常の農業、食品又は医薬産業にて使用される全ての乳酸菌が含まれる。
【００３３】
大まかには、最も良く使用され、発酵物に存在する乳細菌としては、ラクトコッカス属、ストレプトコッカス属、ラクトバチルス属、ロイコノストック属、ペディオコッカス属、ビフィドバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、カルノバクテリウム属、エンテロコッカス属、ミクロコッカス属、バゴコッカス属、スタフィロコッカス属、バチルス属、コクリア属、アルスロバクター属、プロプリオニバクテリウム属及びコリネバクテリウム属のものが挙げられる。これらの乳酸菌を、単独で又は混合して使用する。なお、このリストは網羅的なものではない。
【００３４】
本発明はまた、胃腸の鎮痛を目的としてヒト又は動物に投与する担体の調製に用いる微生物を選択する、以下の段階を含む方法に関する。
ｉ）試験対象の微生物を準備し、少なくとも一つの上皮細胞と接触させ、
ｉｉ）少なくとも一つの上皮細胞におけるオピオイド受容体及び／又はカンナビノイド受容体の発現を検出する。
【００３５】
段階ｉ）又はｉｉ）において使用する上皮細胞は、好ましくはＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３８細胞株由来（通常ＨＴ−２９と称する）又はＣａｃｏ−２細胞株由来である。これらは、大腸癌由来の細胞株である。それらは、ヒトの手術時に得られる生検標本における細胞を用いて単離、精製できる。段階ｉ）は、好ましくは少なくとも一つの上皮細胞による試験において、１０８〜１０１２ＣＦＵの微生物を使用して行われる。接触時間は、段階ｉ）の間、０時間から２４時間で変化させることができ、好ましくは３時間である。
【００３６】
通常、段階ｉ）における細胞の接触は、当業者に公知の、常温で、調整された大気及び無菌性状況の下で実施され、インビトロにおける上皮細胞培養条件下で行われる。
【００３７】
本発明の段階ｉｉ）における選別工程は、好ましくはμオピオイド受容体（ＭＯＲ）及び／又はＣＢ１受容体及び／又はＣＢ２受容体の発現の検出により行われる。典型的には、一つの受容体のみ（ＭＯＲ単独、ＣＢ１受容体単独又はＣＢ２受容体単独）の発現を検出できる。あるいは、２つの受容体（ＭＯＲ及びＣＢ１受容体；ＭＯＲ及びＣＢ２受容体；ＣＢ１受容体及びＣＢ２受容体）の発現を検出することもできる。あるいは、３つの受容体（ＭＯＲ、ＣＢ１受容体及びＣＢ２受容体）の発現を検出することもできる。
【００３８】
本発明の段階ｉｉ）における選別工程は、好ましくは、例えば定量的ＰＣＲなどのＰＣＲによるオピオイド受容体及び／又はカンナビノイド受容体のメッセンジャーＲＮＡの発現、並びに任意にそのレベルの検出、又は免疫組織化学的に検出することにより行われる。当業者に公知のｍＲＮＡの検出法、及びその測定法を用いてもよい。
【実施例１】
【００３９】
以下の実施例において、本発明の非限定的な例を示す。
１／  上皮細胞の調製：
【００４０】
大腸癌細胞株ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３８）を、５％のＣＯ２条件下、３７℃にて、それぞれ２０％及び１０％の子牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で培養した。ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３８細胞株を、幾つかの試験微生物菌株と１、３、４、８、１８又は２４時間接触させた。ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３８上皮細胞をその後回収し、液体窒素に浸漬し、μオピオイド受容体及び／又はカンナビノイド受容体のｍＲＮＡ及びタンパク質を定量化に供した。
【００４１】
２／  μオピオイド受容体及び／又はカンナビノイド受容体のメッセンジャーＲＮＡの検出及び定量化：
リアルタイムＰＣＲ：
培養組織の上皮細胞の全ＲＮＡを、カラム抽出キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社製）を用いて分離した。端的には、細胞を１％のβ−メルカプトエタノールを含む溶解バッファーに懸濁し、その後第一のカラムを通過させ、全ての細胞残渣を除去した。ＤＮＡｓｅ処理後、ＲＮＡを相補ＤＮＡに逆転写し、更にμオピオイド受容体又はカンナビノイド受容体に特異的なプライマーを使用し、６０℃のハイブリダイゼーション温度でリアルタイムＰＣＲ（ＡＢＰｒｉｓｍ  ７０００、パーキン社）によって増幅した。
【００４２】
−μオピオイド受容体（ＭＯＲ）
センス：ＡＴｇＣＣＡｇＴｇＣＴＣＡＴＣＡＴＴＡＣ；
アンチセンス：ｇＡＴＣＣＴＴＣｇＡＡｇＡＴＴＣＣＴｇＴＣＣＴ；
−また、対照遺伝子として、β−アクチン
センス：ＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＴｇＴｇＣＣＣＡＴＣＴＡＣｇＡ；
アンチセンス：ＣＡｇＣｇｇＡＡＣＣｇＣＴＣＡＴＴｇＣＣＡＡＴｇ）；
−カンナビノイド受容体
ＣＢ１センス：ＣＣＴ  ＡＧＡ  ＴＧＧ  ＣＣＴ  ＴＧＣ  ＡＧＡ  ＴＡＣ  Ｃ；
ＣＢ１アンチセンス：ＴＧＴ  ＣＡＴ  ＴＴＧ  ＡＧＣ  ＣＣＡ  ＣＧＴ  ＡＣＡ  Ｇ；
ＣＢ２センス：ＧＣＴ  ＡＡＧ  ＴＧＣ  ＣＣＴ  ＧＧＡ  ＧＡＡ  ＣＧＴ；
ＣＢ２アンチセンス：ＴＣＡ  ＧＣＣ  ＣＣＡ  ＧＣＣ  ＡＡＧ  ＣＴ。
【００４３】
３／  結果：
結果を、図１から３に示す。結果を、標的遺伝子（β−アクチン）／μオピオイド（ＭＯＲ）受容体及び／又はカンナビノイド受容体（ＣＢ１、ＣＢ２）の比率で表した。μオピオイド受容体及び／又はカンナビノイド受容体は、ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３８上皮細胞において発現していた（図１〜３）。
【００４４】
ラクトバチルス属のような若干の微生物では、μオピオイド受容体及び／又はカンナビノイド受容体のｍＲＮＡ発現の誘導が可能である。
【００４５】
結果は、培養組織中の上皮細胞における、μオピオイド受容体及び／又はカンナビノイド受容体の顕著な誘導を示した。
【００４６】
この誘導は、特に菌株ラクトバチルス  アシドフィラスにおいて強く表れた。
【００４７】
図１及び２は、ラクトバチルス  アシドフィラスと上皮細胞との３時間のインキュベート後、ｍＲＮＡのベースの発現量において、約１０００倍の増加がμオピオイド受容体（図１）及びＣＢ１（図２）にて観察されたことを示す。
【００４８】
図３は、ラクトバチルス  アシドフィラスと上皮細胞との３時間のインキュベート後、ｍＲＮＡのベースの発現量において、約１００倍の増加がＣＢ２受容体（図３）にて観察されたことを示す。
【００４９】
一方、大腸菌菌株との共存（図１）においては、μオピオイド受容体の誘導が検出されなかった。ラクトバチルス  アシドフィラス菌株によるオピオイド受容体及び／又はカンナビノイド受容体の誘導は、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αの場合と同じオーダーであった。
【実施例２】
【００５０】
１／  材料及び方法。
菌株
本発明のラクトバチルス  アシドフィラスＮＣＦＭ菌株を、３７℃で一晩、ｄｅＭａｎ、Ｒｏｇｏｓａ、Ｓｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）培地（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で嫌気培養した。対数増殖期の細菌をインビトロ実験に使用した。培養液を動物に接種する前に、グラム染色により純度を解析した。
【００５１】
動物及び試験感染
動物実験は、政府のガイドラインに従い、パスツール研究所（リール）の公認の機関において行った。Ｂａｌｂ／ｃマウスをケージ当たり５匹収容し、１２時間の光周期にて、標準のマウス餌料及び水道水を自由に摂取させた。一日に一度、１４日間、１０９ＣＦＵのラクトバチルス  アシドフィラス菌株（０．５％のＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース、Ｓｉｇｍａ社）中に再懸濁）を強制的に動物の胃に供給した。動物を、頚椎脱臼によって屠殺した。全ての結腸を動物から切除し、２つのパーツに分割した。一つのパーツを一晩、４％のパラホルムアルデヒド酸で固定し、パラフィン包埋した。第二の結腸のパーツを、μオピオイド受容体（ＭＯＲ）、カンナビノイド受容体（ＣＢ１及びＣＢ２）、及び炎症性サイトカインＴＮＦα、ＫＣ、及びＩＬ−１βｍＲＮＡの定量化に用いた。
【００５２】
ＴＮＢＳ結腸炎の誘導及び試験計画
ＭＯＲの発現が炎症により制御されるとの知見（Ｐｈｉｌｉｐｐｅ  Ｄら、ＪＣＩ  ２００３；Ｐｏｌ  Ｏら、Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００１；Ｐｏｌ  Ｏら、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００４）より、ＴＮＢＳによって誘導された結腸炎を陽性コントロールとして用いた。動物実験は、政府のガイドラインに従い、パスツール研究所（リール）の公認の機関において行った。動物をケージ当たり５匹収容し、標準のマウス餌料及び水道水を自由に摂取させた。結腸炎誘導の際、マウスを９０〜１２０分間麻酔にかけ、０．９％のＮａＣｌと１００％のエタノールの１：１混合液中に溶解させたＴＮＢＳ（４０μＬ、１５０ｍｇ／ｋｇ）を直腸内投与した。コントロールのマウスの場合、０．９％のＮａＣｌと１００％のエタノールの１：１混合液又は生理食塩水を、同じ方法で投与した。動物をＴＮＢＳ投与の４日後に屠殺した。
【００５３】
定量的リアルタイムＰＣＲ
Ｒｎｅａｓｙキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社製、ウルト、フランス）を使用し、メーカーの指示に従い、全ＲＮＡを全結腸組織から単離した。分光光度法を用い、ＲＮＡを定量した。ＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅＩ（ロシュダイアグノスティック社、インディアナポリス、イリノイ、米国）２０〜５０ユニットを用い、３０分間３７℃処理の後、オリゴ−ｄＴプライマー（ロシュダイアグノスティック社、インディアナポリス、イリノイ、米国）を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。ＧｅｎｅＡｍｐ  Ａｂｉｐｒｉｓｍ  ７０００（Ａｐｐｌｅｒａ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、フランス）を用い、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｅｒａ社製Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、フランス）を使用し、特異的なマウスオリゴヌクレオチド（表１を参照）によりｍＲＮＡを定量した。各アッセイにおいて、検量された、鋳型を含まないコントロールを含めた。各サンプルにつき、三回試験を行った。ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ色素の強度を、Ａｂｉｐｒｉｓｍ  ７０００  ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｅｒａ社製、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、フランス）を使用して解析した。
全ての結果は、影響のないハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンにより標準化した。
【表１】
2008513411.tif 000002
【００５４】
ＭＯＲ−ＣＢ１−ＣＢ２の免疫組織化学法
ラクトバチルス  アシドフィラス菌株を投与されたマウス結腸のパラフィン切片を作製し、免疫組織化学法を行った。無処置の動物をコントロールとして用いた。０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳにおいて４℃で５分間浸透処理を行った後、切片を１．５％のヤギ正常血清にて１５分、及びブロッキングバッファー（ミルク中１％ＢＳＡ）にて１５分インキュベートし、抗体の非特異的吸着を最小化した。その後組織を室温で２〜１２時間、ＣＢ１（１：２００、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、アナーバー、米国）、又はＣＢ２（１：１０、Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社、サンアントニオ、米国）、又はＭＯＲ（１：５００、Ｄｉａｓｏｒｉｎ社、アントニー、フランス）と反応するウサギポリクローナル一次抗体とインキュベートした。その後切片を、Ａｌｅｘａ  ４８８  ヤギ抗ウサギＩｇＧのＦＩＴＣ蛍光色素（１：１００希釈、Ｄａｋｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｔｒａｐｐｅｓ、フランス）とのコンジュゲートと、室温で１時間インキュベートした。各工程の間、切片を０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳにより５分間ずつ二回洗浄した。その後スライドをＨｏｅｓｃｈｔ溶液（０．１２５ｍｇ／ｍＬ）で対比染色し、顕微鏡検査に供した。陰性コントロールの場合、特異抗体の代わりに正常ウサギ血清による染色を行った。蛍光顕微鏡（ライカ社、Ｂｅｎｓｈｅｉｍ、ドイツ）を用い、免疫蛍光を観察した。ＭＯＲ、ＣＢ１及びＣＢ２における免疫反応した上皮細胞の数を、５箇所の強拡大視野（ＨＰＦ）において計数し、１００個の上皮細胞当たりの個数として表した。
【００５５】
結果を図４から１３に示す。
【００５６】
２週にわたるラクトバチルス  アシドフィラスの投与（１日当たり１０９ＣＦＵ）後、結腸においてＭＯＲ  ｍＲＮＡ発現が無処置の動物（ｐ＜０．０５）と比較し２４倍増加していることが明らかとなった。ラクトバチルス  アシドフィラス菌株によるＭＯＲ  ｍＲＮＡの誘導は、陽性コントロールとして準備した、ＴＮＢＳ誘導された結腸炎における２倍の誘導と比較し、より顕著であった（図４）。
【００５７】
翻訳のレベルでの、特に結腸上皮細胞におけるＭＯＲ、ＣＢ１及びＣＢ２の誘導を評価するため、特にこれらの受容体と反応する抗体を使用し、免疫組織化学法を行った。ラクトバチルス  アシドフィラス菌株を投与されたマウスにおいて、全ての切片において、ＭＯＲ（６０±１０％対５±３％）、ＣＢ１（６０±８％対２０±４％）又はＣＢ２（４０±７％対２０±５％）に関して染色された上皮細胞の数は、コントロールのマウス（図８から１３）と比較し顕著に多かった。管腔内細菌（図８から１３）と接触した場合、主に上皮表面に存在する上皮細胞において局所的に緑色の染色が観察された。第一抗体を省略した、又は無関係な抗体を使用したコントロールでは陰性だった。
【００５８】
ラクトバチルス  アシドフィラス誘導による結腸上皮細胞におけるＭＯＲ、ＣＢ１及びＣＢ２の発現が、マウスの機能上重要か否かを評価するため、無処置のマウス及び１４日間ラクトバチルス  アシドフィラス菌株の投与を受けたマウスにおける、数種類の炎症性サイトカインのｍＲＮＡ濃度を比較した。コントロールと比較し、炎症性サイトカインＴＮＦα、ＫＣ及びＩＬ−ｌβのｍＲＮＡ濃度の５０％以上の発現減少が、ラクトバチルス  アシドフィラスを処理された動物において観察されたことから、ラクトバチルス  アシドフィラス菌株が、少なくとも部分的に、上皮細胞におけるＭＯＲ、ＣＢ１及びＣＢ２の過剰発現によるマウス結腸の炎症性サイトカインの生理的発現を減少させることを示唆する。
【００５９】
１／  材料及び方法
インビトロにて、結腸上皮細胞のＨＴ−２９又はＣａｃｏ−２を、数種のプロバイオティクス又は細菌（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（ＮＣＦＭ）、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ（ＵＣＣ１１８）、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ（ＬＰＣ３７）、共生大腸菌、付着性浸潤性大腸菌（ＬＦ８２））（１００細菌／細胞）と０〜６時間インキュベートした。プロバイオティクスによるμオピオイド受容体（ＭＯＲ）及びカンナビノイド受容体（ＣＢ１及びＣＢ２）の発現誘導におけるＮＦκＢ経路の役割を、特異的な抑制物質（カフェイン酸フェネチルエステル（ＣＡＰＥ））を用いてＨＴ−２９細胞を前処理することにより試験した。ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍＬ、２時間）（Ｇ共役タンパク質の発現誘導源）を陽性コントロールに使用した。インビトロで受容体（ＭＯＲ１、ＣＢ１及びＣＢ２受容体）の発現誘導に最も効果的なプロバイオティクスを選別した後、プロバイオティクスを１０９ＣＦＵにて１５日間Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝１０）に経口投与し、インビボ試験を行った。マウスの上皮細胞及び結腸におけるＭＯＲ、ＣＢ１及びＣＢ２の発現を、リアルタイムＰＣＲ及び免疫組織化学により解析した。炎症性サイトカイン（ＴＮＦα、ＫＣ及びＩＬ−１β）のｍＲＮＡを、マウス結腸のリアルタイムＰＣＲにより解析した。
【００６０】
Ｌ．アシドフィラス及びＬ．サリヴァウスのみ、培養開始後わずか１時間の時点で、上皮細胞において強力なＭＯＲ発現を急速に誘導しうることが解明された。この発現誘導は、ＴＮＦα誘導細胞において観察された発現誘導と類似していた。ＣＢ１（８４８±１８０対２２９±５５、ｐ＜０．０５）及びＣＢ２（１４９８±３３３対３４１±１６３、ｐ＜０．０１）に関しては、Ｌ．アシドフィラスのみがこれらの受容体の発現を誘導した。ＣＡＰＥによるＮＦκＢ経路の阻害により、Ｌ．アシドフィラスで刺激された上皮細胞によるＭＯＲの発現の変動が誘導されなかった。インビボにおいて、Ｌ．アシドフィラスの投与により、結腸のレベルでＭＯＲ  ｍＲＮＡ（２４±０．７５、ｐ＜０．０１）の発現が強力に誘導された。免疫組織化学による解析より、Ｌ．アシドフィラスを投与された動物の結腸細胞におけるインビボでのＭＯＲ、ＣＢ１及びＣＢ２発現の誘導が確認された。これらの受容体の誘導は、結腸での炎症性サイトカイン発現の少なくとも５０％の減少と関連していた。
【００６１】
Ｌ．アシドフィラスは、インビトロでの上皮細胞、及びインビボでの結腸における、ＭＯＲ、ＣＢ１及びＣＢ２の発現を最も効率的に誘導する菌株であった。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】４種の微生物による刺激の間、ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３８上皮細胞において発現される、μオピオイド受容体のメッセンジャーＲＮＡ発現の動態を、時間ごとに表すグラフである。
【図２】３種の微生物による刺激の間、ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３８上皮細胞において発現される、ＣＢ１受容体のメッセンジャーＲＮＡ発現の動態を、時間ごとに表すグラフである。
【図３】３種の微生物による刺激の間、ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３８上皮細胞において発現される、ＣＢ２受容体のメッセンジャーＲＮＡ発現の動態を、時間ごとに表すグラフである。
【図４】異なる条件下でのＭＯＲ  ｍＲＮＡの発現を表すグラフである。
【図５】未処理マウス及びＬ．アシドフィラス処理マウスにおける、結腸ＴＮＦαのｍＲＮＡ発現を表すグラフである。
【図６】未処理マウス及びＬ．アシドフィラス処理マウスにおける、結腸ＫＣのｍＲＮＡ発現を表すグラフである。
【図７】未処理マウス及びＬ．アシドフィラス処理マウスにおける、結腸ＩＬ−１βのｍＲＮＡ発現を表すグラフである。
【図８】上皮細胞の免疫染色の写真である。
【図９】免疫染色された上皮細胞のパーセンテージを表すグラフである。
【図１０】上皮細胞の免疫染色の写真である。
【図１１】免疫染色された上皮細胞のパーセンテージを表すグラフである。
【図１２】上皮細胞の免疫染色の写真である。
【図１３】免疫染色された上皮細胞のパーセンテージを表すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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