(57)【要約】蛍光ｐＨ検出器および該蛍光ｐＨ検出器を用いてｐＨを測定する方法。基板上に固定された蛍光種からの発光を２つ以上の波長において受け入れ、励起光を発するプローブを用いて二酸化炭素濃度またはｐＨなどの試料特性を測定する方法およびシステム。このプローブは、基板上の蛍光種から、例えば、窓により物理的に隔離されている。第１および第２の波長において受け入れた光は、試料特性の測定に使われる。さらに、例えば、半透膜を介して分析対象物質がこの基板に接触することができるように、基板上にチップを具備するようにすることができる。
2008510965.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料のｐＨを測定する方法であって、
（ａ）基板上に固定された蛍光種から物理的に隔離されたプローブから生じる励起光を、前記基板上に固定された前記蛍光種に照射する工程であって、
前記基板上に固定された前記蛍光種が試料と液体連通し、
励起光が前記蛍光種から蛍光発光を生じるのに十分な波長を有し、
前記蛍光種が、第１発光波長で第１発光強度を、第２発光波長で第２発光強度を示し、前記第１および第２の発光強度の比がｐＨに依存する、工程と、
（ｂ）前記試料の前記ｐＨを求めるために前記第１および第２の発光強度を測定する工程と、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記プローブが、前記励起光および前記蛍光発光に対して透明な窓により、前記基板上に固定された前記蛍光種から物理的に隔離される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プローブが１つ以上の光ファイバを具備する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記蛍光種が、ナフトフルオレセイン化合物およびセミナフトローダミン化合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ナフトフルオレセイン化合物が、セミナフトフルオレセイン化合物およびカルボキシナフトフルオレセイン化合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記蛍光種が、５’（および６’）−カルボキシ−３，１０−ジヒドロキシ−スピロ［７Ｈ−ベンゾ［ｃ］キサンテン−７，１’（３’Ｈ）−イソベンゾフラン］−３’−オンおよび２−（２−クロロ−３−ヒドロキシ−９−カルボキシエチル−１０−オキソ−１０Ｈ−ベンゾ［ｃ］キサンテン−７−イル）安息香酸からなる群から選択されるセミナフトフルオレセイン化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
基板上に固定された前記蛍光種が、蛍光種と巨大分子との複合体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記巨大分子がアルブミンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
基板上に固定された前記蛍光種が、セミナフトフルオレセイン／ヒト血清アルブミン複合体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料が血液または血液製品を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料が密封容器内に収納されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ｐＨを測定するシステムであって、
（ａ）第１発光波長において第１発光強度を、そして、第２発光波長において第２発光強度を有する蛍光種を励起する光源と、
（ｂ）前記第１発光強度を測定する第１発光検出器と、
（ｃ）前記第２発光強度を測定する第２発光検出器と、
（ｄ）前記光源から前記蛍光種へ励起光を送る励起光ライトガイドであって、前記光源に近い第１末端部および前記光源から遠い第２末端部を含む、ライトガイドと、
（ｅ）前記蛍光種から前記第１発光検出器へ発光を送る第１発光ライトガイドであって、前記検出器に近い第１末端部および検出器から遠い第２末端部を含む、ライトガイドと、
（ｆ）前記蛍光種から前記第２発光検出器へ発光を送る第２発光ライトガイドであって、前記検出器に近い第１末端部および前記検出器から遠い第２末端部を含む、ライトガイドと、
（ｇ）前記励起光ライトガイド、第１発光ライトガイドおよび第２発光ライトガイドの遠位末端部を格納するプローブと、
（ｈ）前記プローブを受け入れるアセンブリであって、
（ｉ）前記プローブを受け入れるハウジングであって、前記ハウジングは第１端部において前記プローブを受け入れ、前記第２端部において窓で終わるようになっており、前記窓は前記励起光および前記発光に対して透明である、ハウジングと、
（ｉｉ）測定すべき試料から液体を受け入れるようになっており、前記ハウジングの第２端部に可逆的に接続可能なチップ部材と、
（ｉｉｉ）前記チップ部材と前記窓との間に介在する基板上に固定された蛍光種であって、前記基板上に固定された前記蛍光種は、測定中、前記試料と液体連通し、前記窓は前記基板上に固定された前記蛍光種から前記プローブ部材を物理的に隔離している、蛍光種と、
を含む、アセンブリと、
を含む、システム。
【請求項１３】
前記光源が発光ダイオードである、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記第１および第２の検出器が、フォトダイオードである、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１５】
前記励起光ライトガイド、前記第１発光ライトガイド、および第２発光ライトガイドが、光ファイバである、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１６】
前記ハウジングが、前記窓で終わる先細りのチューブを具備する、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１７】
前記蛍光種が、セミナフトフルオレセイン／ヒト血清アルブミン複合体を含む、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１８】
前記チップ部材が、密封容器に穴を開けるためのスパイクを具備する、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１９】
（ａ）第１開放端部および第２閉鎖端部を有するハウジングであって、前記閉鎖端部が、可視光に対して透明な窓を具備する、ハウジングと、
（ｂ）前記ハウジングの窓に露出するようになっており、前記ハウジングの閉鎖端部に可逆的に接続可能なチップ部材と、
（ｃ）前記ハウジングの窓とチップ部材との間に介在する基板上に固定された蛍光種と、
を含む、アセンブリ。
【請求項２０】
前記ハウジングが先細りになっている、請求項１９に記載のアセンブリ。
【請求項２１】
前記チップ部材が密封容器に穴を開けるためのスパイクを具備する、請求項１９に記載のアセンブリ。
【請求項２２】
前記蛍光種がセミナフトフルオレセイン／ヒト血清アルブミン複合体を含む、請求項１９に記載のアセンブリ。
【請求項２３】
請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のアセンブリを具備する、血液バッグまたは血液製品バッグ。
【請求項２４】
アルブミンに共有結合した環境感受性フルオロフォアを含む、複合体。
【請求項２５】
前記環境感受性フルオロフォアが、ｐＨ感受性フルオロフォア、酸素感受性フルオロフォア、核酸感受性フルオロフォア、イオン感受性フルオロフォア、グルコース感受性フルオロフォア、脂質感受性フルオロフォアおよび酵素感受性フルオロフォアからなる群から選択される、請求項２４に記載の複合体。
【請求項２６】
前記環境感受性フルオロフォアが、ナフトフルオレセイン化合物およびセミナフトローダミン化合物からなる群から選択される、請求項２４に記載の複合体。
【請求項２７】
前記環境感受性フルオロフォアが、セミナフトフルオレセイン化合物およびカルボキシナフトフルオレセイン化合物からなる群から選択される、請求項２４に記載の複合体。
【請求項２８】
前記環境感受性フルオロフォアが、５’（および６’）−カルボキシ−３，１０−ジヒドロキシ−スピロ［７Ｈ−ベンゾ［ｃ］キサンテン−７，１’（３’Ｈ）−イソベンゾフラン］−３’−オンおよび２−（２−クロロ−３−ヒドロキシ−９−カルボキシエチル−１０−オキソ−１０Ｈ−ベンゾ［ｃ］キサンテン−７−イル）安息香酸からなる群から選択される、請求項２４に記載の複合体。
【請求項２９】
前記アルブミンが血清アルブミンである、請求項２４に記載の複合体。
【請求項３０】
前記アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項２４に記載の複合体。
【請求項３１】
前記アルブミンが組み換えヒト血清アルブミンである、請求項２４に記載の複合体。
【請求項３２】
前記環境感受性フルオロフォアが、２−（２−クロロ−３−ヒドロキシ−９−カルボキシエチル−１０−オキソ−１０Ｈ−ベンゾ［ｃ］キサンテン−７−イル）安息香酸であり、前記アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項２４に記載の複合体。
【請求項３３】
ナフトフルオレセイン化合物および膜に付着したアルブミンの複合体を含む、膜固定蛍光種。
【請求項３４】
前記膜が微孔膜である、請求項３３に記載の膜固定蛍光種。
【請求項３５】
前記膜が、ニトロセルロース、ニトロセルロースと酢酸セルロースとの混合エステル類、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、およびポリイミドからなる群から選択される、請求項３３に記載の膜固定蛍光種。
【請求項３６】
前記ナフトフルオレセイン化合物が、セミナフトフルオレセイン化合物およびカルボキシナフトフルオレセイン化合物からなる群から選択される、請求項３３に記載の膜固定蛍光種。
【請求項３７】
前記ナフトフルオレセイン化合物が、５’（および６’）−カルボキシ−３，１０−ジヒドロキシ−スピロ［７Ｈ−ベンゾ［ｃ］キサンテン−７，１’（３’Ｈ）−イソベンゾフラン］−３’−オンおよび２−（２−クロロ−３−ヒドロキシ−９−カルボキシエチル−１０−オキソ−１０Ｈ−ベンゾ［ｃ］キサンテン−７−イル）安息香酸からなる群から選択される、請求項３３に記載の膜固定蛍光種。
【請求項３８】
前記アルブミンが血清アルブミンである、請求項３３に記載の膜固定蛍光種。
【請求項３９】
前記アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項３３に記載の膜固定蛍光種。
【請求項４０】
前記アルブミンが組み換えヒト血清アルブミンである、請求項３３に記載の膜固定蛍光種。
【請求項４１】
液体試料中の二酸化炭素濃度を測定する方法であって
（ａ）基板上に固定された蛍光種から物理的に隔離されたプローブから発する励起光を前記基板上に固定された前記蛍光種に照射する工程であって、
前記基板上に固定された前記蛍光種は、液体試料中に存在する二酸化炭素に応じたｐＨを有する溶液と液体連通し、
二酸化炭素に応じたｐＨを有する前記溶液は、選択的透過膜を通して前記液体試料と連通し、
前記励起光が前記蛍光種から蛍光発光するのに十分な波長を有し、
前記蛍光種は、第１発光波長において第１発光強度を、第２発光波長において第２発光強度を示し、第１発光強度と第２発光強度との比はｐＨに依存する、工程と、
（ｂ）ｐＨ応答性を有する前記溶液の前記ｐＨを決めるために前記第１および第２の発光強度を測定する工程と、
（ｃ）前記試料中の前記二酸化炭素濃度へのｐＨ応答性を有する前記溶液の前記ｐＨを相関づける工程と、
を包含する、方法。
【請求項４２】
前記プローブが、前記励起光および前記蛍光発光に対して透明な窓により前記基板上に固定された前記蛍光種から物理的に隔離されている、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記プローブが１つ以上の光ファイバを具備する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記蛍光種が、セミナフトフルオレセイン／ヒト血清アルブミン複合体を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記セミナフトフルオレセインが、５’（および６’）−カルボキシ−３，１０−ジヒドロキシ−スピロ［７Ｈ−ベンゾ［ｃ］キサンテン−７，１’（３’Ｈ）−イソベンゾフラン］−３’−オンおよび２−（２−クロロ−３−ヒドロキシ−９−カルボキシエチル−１０−オキソ−１０Ｈ−ベンゾ［ｃ］キサンテン−７−イル）安息香酸からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記試料が血液または血液製品を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記試料が密封容器内に収納されている、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
液体試料中の二酸化炭素濃度を測定するシステムであって、
（ａ）第１発光波長において第１発光強度を、そして、第２発光波長において第２発光強度を有する蛍光種を励起する光源と、
（ｂ）前記第１発光強度を測定する第１発光検出器と、
（ｃ）前記第２発光強度を測定する第２発光検出器と、
（ｄ）前記光源から前記蛍光種へ励起光を送る励起光ライトガイドであって、前記光源に近い第１末端部および前記光源から遠い第２末端部を含む、ライトガイドと、
（ｅ）前記蛍光種から前記第１発光検出器へ発光を送る第１発光ライトガイドであって、前記検出器に近い第１末端部および検出器から遠い第２末端部を含む、ライトガイドと、
（ｆ）前記蛍光種から前記第２発光検出器へ発光を送る第２発光ライトガイドであって、前記検出器に近い第１末端部および前記検出器から遠い第２末端部を含む、ライトガイドと、
（ｇ）前記励起光ライトガイド、第１発光ライトガイドおよび第２発光ライトガイドの遠位末端部を格納するプローブと、
（ｈ）前記プローブを受け入れるアセンブリであって、
（ｉ）前記プローブを受け入れるハウジングであって、前記ハウジングは第１端部において前記プローブを受け入れ、前記第２端部において窓で終わるようになっており、前記窓は前記励起光および前記発光に対して透明である前記ハウジングと、
（ｉｉ）前記ハウジングの第２端部に可逆的に接続可能なチップ部材であって、前記チップ部材が、液体試料中に存在する二酸化炭素に対してｐＨ応答性を有する溶液を受け入れるチェンバを具備し、
二酸化炭素に対してｐＨ応答性を有する前記溶液が選択的透過膜を介して前記液体試料と液体連通する、前記チップ部材と、
（ｉｉｉ）前記チップ部材と前記窓との間に介在する基板上に固定された蛍光種であって、前記基板上に固定された前記蛍光種は、測定中、二酸化炭素に対してｐＨ応答性を有する前記溶液と液体連通し、
前記窓は、前記基板上に固定された前記蛍光種から前記プローブ部材を物理的に隔離している蛍光種と、
を含む、アセンブリと、
を含む、システム。
【請求項４９】
前記光源が発光ダイオードである、請求項４８に記載のシステム。
【請求項５０】
前記第１および第２の検出器がフォトダイオードである、請求項４８に記載のシステム。
【請求項５１】
前記励起光ライトガイド、前記第１発光ライトガイド、および第２発光ライトガイドが光ファイバである、請求項４８に記載のシステム。
【請求項５２】
前記ハウジングが前記窓で終わる先細りのチューブを具備する、請求項４８に記載のシステム。
【請求項５３】
前記選択的透過膜が二酸化炭素を通す、請求項４８のシステム。
【請求項５４】
前記蛍光種がセミナフトフルオレセイン／ヒト血清アルブミン複合体を含む、請求項４８のシステム。
【請求項５５】
前記チップ部材が、密封容器に穴を開けるためのスパイクを具備する、請求項４８に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、蛍光ｐＨ検出器および該蛍光ｐＨ検出器を用いてｐＨを測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ｐＨを測定する光学センサー（オプトロード）はよく知られている。特定の有機芳香族化合物（フェノールフタレンのような）は、ｐＨによって変色し、固体支持体上に固定し、「ｐＨ試験紙」を形成することができる。このような眼に見える指示体は、簡単に使用することができるが、定量的測定値を与えるものではない。変色を正確に見極めることは困難であり、着色した分析対象物質では試料自体の色により妨害されることがある。蛍光指示体は、光学センサーとしても使われてきた。ｐＨ感受性蛍光染料は、固体支持体上に固定することができ、一般に、単純な変色（吸光度または反射率に基づく）指示薬に比べてより感受性が高い。蛍光指示薬の感度を改善すると、固体支持体を小型化することができ、この指示薬を用いると、血液中のｐＨ値、ＣＯ２およびＯ２の濃度を測定する光ファイバセンサー装置の開発を促進する。
【０００３】
医療分野では、血液のｐＨを正確に測定する必要がある。血液または体液（胸水）のｐＨは、病理学に関連した特定の生理学的反応と関連することがある。血液ガス分析器は、通常の救急救命装置である。貯蔵条件によって、分離血液成分（血漿、血小板）のｐＨは、ドナーから集められる濃縮静脈血から溶解ＣＯ２の放散により急速に変化する。特に血小板は、代謝的に活性であり、２０〜２２℃で貯蔵中に乳酸を生じる。「バフィコート法」により調製された血小板に関する欧州の品質指針は、貯蔵血小板のｐＨは３７℃で６．８〜７．４（２２℃で７．０〜７．６）であることを必要とする。
【０００４】
セミナフトフルオレセイン（ＳＮＡＦＬ）化合物および関連セミナフトローダフルオル（ＳＮＡＲＦ）化合物は、市販のレシオメトリック・フルオル類（ＯＲ（オレゴン州）ＥｕｇｅｎｅのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．；例えば、特許文献１を参照のこと）であり、これらの化合物の合成およびスペクトル特性は説明されている。これらの化合物は、ＬＥＤ光源を用いて効率的に励起することができる長波長吸光度を含む利点を有する。当該の酸／塩基平衡および関連スペクトル特性を下に示す。
【０００５】
【化１】
2008510965.tif 000003
ＳＮＡＦＬ染料のナフトール構造から脱プロトンすると、長波長蛍光発光を有するナフトレート分子が得られる。ｐＫａは、２つの分子種の形が等量にあるｐＨ値である。興味のある他の分子へのＳＮＡＦＬ化合物の結合を可能にする反応性リンカーを有する該ＳＮＡＦＬ化合物も市販されている。
【０００６】
光ファイバｐＨ検出器において使用する固体支持体に「レシオメトリック」染料を固定するために、種々の方法が使われている。カルボキシナフトフルオレセイン（ＣＮＦ）はアミノエチルセルロースに接合し、この物質をポリエステル（Ｍｙｌａｒ）フィルムに糊で接合し、オプトロード用検知膜を作製した。この物質のｐＫａは７．４１であり、フリーＣＮＦ（ｐＫａ７．６２）よりわずかに低い。ガラスカバースリップ上に形成されたゾルゲルガラスにおいてＣＮＦを捕捉するためにテトラエトキシシランを使用することも報告されている。この物質のｐＫａは７．４６であった。９−クロロ置換ＳＮＡＦＬ類似体（ＳＮＡＦＬ−２）はポリビニルアミンと反応し、残りのアミノ基は光架橋剤により架橋させられ、アクリル繊維上にゲル状コーティングを形成する。この光ファイバセンサーのｐＫａは７．１４であり、フリーのＳＮＡＦＬ化合物の公表されたｐＫａ（ｐＫａ約７．７）よりかなり低い。これは、固定された染料の周りの分子環境およびリンカーの構造がｐＨ検出器の性能を変えられることを示している。
【特許文献１】米国特許第４，９４５，１７１号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ｐＨの検出については上で指摘したような進歩がなされているにも関わらず、ｐＨを測定する改善された方法および装置を求めるニーズがある。本発明は、このニーズを満たし、さらに、関連した利点を提供しようとしている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
１つの態様では、本発明は試料のｐＨを測定する方法を提供する。この方法は、血液および血液製品のｐＨの測定において有用である。１つの実施態様では、この方法は、容器に密封された血液または血液製品のｐＨの測定において有用である。１つの実施態様では、この方法は、
（ａ）基板上に固定された該蛍光種から物理的に隔離されたプローブから発する励起光を基板上に固定された該蛍光種に照射する工程であって、基板上に固定された蛍光種は液体中で試料と連通し、励起光は該蛍光種から蛍光発光するのに十分な波長を有し、該蛍光種は、第１発光波長において第１発光強度を、第２発光波長において第２発光強度を示し、第１発光強度と第２発光強度との比はｐＨに依存する工程と、
（ｂ）試料のｐＨを求めるために第１および第２の発光強度を測定する工程と、を含む。
【０００９】
この方法では、このプローブは、基板上に固定された蛍光種から物理的に隔離されている。本明細書で使われている、用語「物理的に隔離された」は、調査しようとしている試料からのプローブの物理的隔離を意味している。励起光を発し、発光を受け取るプローブは、調査しようとしている試料に接触している。本発明の方法では、試料は基板に固定された蛍光種と接触（即ち、液体連通）している。このプローブは、試料から隔離されているが、試料と物理的に接触しないわけではない。試料からプローブの隔離は、図３および５に例示されている。１つの実施態様では、このプローブは、励起光および蛍光発光に対して透明な窓により蛍光種から隔離されている。
【００１０】
１つの実施態様では、該プローブは、１つ以上の光ファイバを具備している。
【００１１】
この方法では、この蛍光種はレシオメトリックな蛍光種である。１つの実施態様では、この蛍光種は、ナフトフルオレセイン化合物とセミナフトローダミン化合物とから選択される。１つの実施態様では、ナフトフルオレセイン化合物は、セミナフトフルオレセイン化合物とカルボキシナフトフルオレセイン化合物とから選択される。１つの実施態様では、セミナフトフルオレセイン化合物は、５’（および６’）−カルボキシ−３，１０−ジヒドロキシ−スピロ［７Ｈ−ベンゾ［ｃ］キサンテン−７，１’（３’Ｈ）−イソベンゾフラン］−３’−オン（本明細書では、「ＳＮＡＦＬ−１」とも呼ばれ，図７Ａを参照のこと）および２−（２−クロロ−３−ヒドロキシ−９−カルボキシエチル−１０−オキソ−１０Ｈ−ベンゾ［ｃ］キサンテン−７−イル）安息香酸（本明細書では、「ＥＢＩＯ−３」とも呼ばれ，図７Ｅを参照のこと）から選択される。
【００１２】
１つの実施態様では、基板上に固定されたこの蛍光種は、蛍光種と巨大分子との複合体を含む。１つの実施態様では、この巨大分子はアルブミンである。１つの実施態様では、この巨大分子は血清アルブミンである。１つの実施態様では、この巨大分子はヒト血清アルブミンである。１つの実施態様では、この巨大分子は組み換えヒト血清アルブミンである。１つの実施態様では、基板上に固定されたこの蛍光種は、ナフトフルオレセイン／血清アルブミン複合体を含む。１つの実施態様では、基板上に固定されたこの蛍光種は、セミナフトフルオレセイン／ヒト血清アルブミン複合体を含む。
【００１３】
上で指摘したように、この方法は、容器に密封された血液または血液製品のｐＨの測定に適している。１つの実施態様では、基板上に固定されたこの蛍光種は、容器のシールを保つ手段により密封容器内に導入される。
【００１４】
本発明の別の態様では、ｐＨを測定するシステムを提供している。１つの実施態様では、このシステムは、
（ａ）第１発光波長において第１発光強度および第２発光波長において第２発光強度を有する蛍光種を励起する光源と、
（ｂ）第１発光強度を測定する第１発光検出器と、
（ｃ）第２発光強度を測定する第２発光検出器と、
（ｄ）光源に近い第１末端部および光源から遠い第２末端部を含み、光源から蛍光種へ励起光を送る励起光ライトガイドと、
（ｅ）蛍光種から第１発光検出器へ発光を送る第１発光ライトガイドであって、検出器に近い第１末端部および検出器から遠い第２末端部を含むライトガイドと、
（ｆ）蛍光種から第２発光検出器へ発光を送る第２発光ライトガイドであって、検出器に近い第１末端部および検出器から遠い第２末端部を含むライトガイドと、
（ｇ）励起光ライトガイド、第１発光ライトガイドおよび第２発光ライトガイドの遠位末端部を格納するプローブと、
（ｈ）アセンブリであって、
（ｉ）プローブを受け入れるハウジングであって、ハウジングは第１端部においてプローブを受け入れ、第２端部において窓で終わるようになっており、窓は励起光および発光に対して透明であるハウジングと、
（ｉｉ）測定すべき試料から液体を受け入れるようになっており、前記ハウジングの第２端部に可逆的に接続可能なチップ部材と、
（ｉｉｉ）チップ部材と窓との間に介在する基板上に固定された蛍光種であって、基板上に固定された蛍光種は測定中前記試料と液体連通し、窓は基板上に固定された蛍光種からプローブ部材を物理的に隔離している蛍光種とを、
含む前記アセンブリとを具備するシステム。
【００１５】
１つの実施態様では、光源は発光ダイオードである。
【００１６】
１つの実施態様では、第１および第２の検出器はフォトダイオードである。
【００１７】
１つの実施態様では、励起光ライトガイド、第１発光ライトガイド、および第２発光ライトガイドは光ファイバである。
【００１８】
１つの実施態様では、ハウジングは窓で終わる先細りのチューブを具備する。
【００１９】
１つの実施態様では、チップ部材は密封容器に穴を開けるスパイクを具備する。
【００２０】
このシステムで有用な蛍光種は、方法について上で指摘された該蛍光種および下でさらに詳細に説明される該蛍光種を含む。１つの実施態様では、この蛍光種は、セミナフトフルオレセイン／ヒト血清アルブミン複合体を含む。
【００２１】
別の態様では、本発明は、基板上に固定された蛍光種を試料内に導入するのに有用なアセンブリを提供する。このアセンブリは、容器内に密封された試料に基板上に固定された蛍光種を導入するのに特に有用である。１つの実施態様では、このアセンブリは、
（ａ）可視光に対して透明な窓を具備する第２閉鎖端部および第１開放端部を有するハウジングと、
（ｂ）ハウジングの窓に露出するように構成され、ハウジングの閉鎖端部に可逆的に接続可能なチップ部材と、
（ｃ）このハウジングの窓とチップ部材との間に介在する基板上に固定された蛍光種と、を含む。
【００２２】
チップ部材は、ハウジングの窓を露出するように構成される。ハウジングの窓をチップ部材の外部環境に露出することにより、ハウジングの窓とチップ部材との間に介在する基板上に固定された蛍光種は、測定すべき試料と液体連通している。
【００２３】
１つの実施態様では、ハウジングは先細りである。１つの実施態様では、チップ部材が密封容器に穴を開けるスパイクを具備する。このアセンブリで有用な蛍光種は、方法について上で指摘された該蛍光種および下でさらに詳細に説明する該蛍光種を含む。１つの実施態様では、この蛍光種は、セミナフトフルオレセイン／ヒト血清アルブミン複合体を含む。
【００２４】
別の態様では、本発明は、上で説明したアセンブリを具備する血液バッグまたは血液製品バッグを提供する。
【００２５】
本発明のさらに別の態様では、環境感受性フルオロフォアタンパク質複合体を提供する。１つの実施態様では、この複合体は、アルブミンに共有結合した環境感受性フルオロフォアを含む。１つの実施態様では、環境感受性フルオロフォアは、ｐＨ感受性フルオロフォア、酸素感受性フルオロフォア、核酸感受性フルオロフォア、イオン感受性フルオロフォア、グルコース感受性フルオロフォア、脂質感受性フルオロフォアまたは酵素感受性フルオロフォアである。
【００２６】
１つの実施態様では、環境感受性フルオロフォアは、ナフトフルオレセイン化合物またはセミナフトローダミン化合物から選択されるｐＨ感受性フルオロフォアである。１つの実施態様では、このナフトフルオレセイン化合物は、セミナフトフルオレセイン化合物またはカルボキシナフトフルオレセイン化合物である。１つの実施態様では、セミナフトフルオレセイン化合物は、５’（および６’）−カルボキシ−３，１０−ジヒドロキシ−スピロ［７Ｈ−ベンゾ［ｃ］キサンテン−７，１’（３’Ｈ）−イソベンゾフラン］−３’−オンまたは２−（２−クロロ−３−ヒドロキシ−９−カルボキシエチル−１０−オキソ−１０Ｈ−ベンゾ［ｃ］キサンテン−７−イル）安息香酸である。
【００２７】
１つの実施態様では、アルブミンは血清アルブミンである。１つの実施態様では、アルブミンはヒト血清アルブミンである。１つの実施態様では、アルブミンは組み換えヒト血清アルブミンである。
【００２８】
１つの実施態様では、環境感受性フルオロフォアは２−（２−クロロ−３−ヒドロキシ−９−カルボキシエチル−１０−オキソ−１０Ｈ−ベンゾ［ｃ］キサンテン−７−イル）安息香酸であり、アルブミンはヒト血清アルブミンである。
【００２９】
上で説明した本発明の方法およびシステムは、特定のフルオロフォアにより与えられた効用に特異的な方法およびシステムを提供する特定の環境感受性フルオロフォアを含むように変更することができることは言うまでもない。
【００３０】
別の態様では、本発明は、基板固定蛍光種を提供する。１つの実施態様では、この基板固定蛍光種は膜固定蛍光種である。１つの実施態様では、この基板固定蛍光種はナフトフルオレセイン化合物と膜に付着したアルブミンとの複合体である。１つの実施態様では、膜は微孔膜である。１つの実施態様では、膜は、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースと酢酸セルロースとの混合エステル類膜、ポリエチレンテレフタレート膜、ポリカーボネート膜、およびポリイミド膜である。
【００３１】
１つの実施態様では、このナフトフルオレセイン化合物は、セミナフトフルオレセイン化合物またはカルボキシナフトフルオレセイン化合物である。１つの実施態様では、このナフトフルオレセイン化合物は、５’（および６’）−カルボキシ−３，１０−ジヒドロキシ−スピロ［７Ｈ−ベンゾ［ｃ］キサンテン−７，１’（３’Ｈ）−イソベンゾフラン］−３’−オンまたは２−（２−クロロ−３−ヒドロキシ−９−カルボキシエチル−１０−オキソ−１０Ｈ−ベンゾ［ｃ］キサンテン−７−イル）安息香酸である。
【００３２】
１つの実施態様では、アルブミンは血清アルブミンである。１つの実施態様では、アルブミンはヒト血清アルブミンである。１つの実施態様では、アルブミンは組み換えヒト血清アルブミンである。
【００３３】
本発明の別の態様では、二酸化炭素を測定する方法を提供している。１つの実施態様では、この方法は、
（ａ）基板上に固定された該蛍光種から物理的に隔離されたプローブから発する該励起光を基板上に固定された該蛍光種に照射する工程であって、基板上に固定された蛍光種は液体試料中に存在する二酸化炭素に応じたｐＨを有する溶液と液体連通し、二酸化炭素に応じたｐＨを有する該溶液は選択的透過膜を通して液体試料と連通し、励起光は該蛍光種から蛍光発光するのに十分な波長を有し、該蛍光種は、第１発光波長において第１発光強度を、第２発光波長において第２発光強度を示し、第１発光強度と第２発光強度との比はｐＨに依存する工程と、
（ｂ）ｐＨ応答性を有する該溶液の該ｐＨを決めるために第１および第２の発光強度を測定する工程と、
（ｃ）試料中の二酸化炭素濃度へのｐＨ応答性を有する該溶液の該ｐＨを相関づける工程と、を含む。
【００３４】
１つの実施態様では、プローブは、励起光および蛍光発光に対して透明な窓により基板上に固定された蛍光種から物理的に隔離されている。１つの実施態様では、このプローブは１つ以上の光ファイバを具備する。
【００３５】
１つの実施態様では、この試料は血液または血液製品を含む。１つの実施態様では、この試料は密封容器内に収納される。１つの実施態様では、基板上に固定されたこの蛍光種は、容器のシールを保つ手段により密封容器内に導入される。
【００３６】
この方法で有用な蛍光種は、ｐＨを測定する方法について上で指摘された該蛍光種および下でさらに詳細に説明される該蛍光種を含む。１つの実施態様では、この蛍光種はセミナフトフルオレセイン／ヒト血清アルブミン複合体を含む。
【００３７】
別の態様では、本発明は二酸化炭素を測定するシステムを提供している。このシステムは、液体試料中の二酸化炭素濃度を測定するのに有用である。このシステムは、
（ａ）第１発光波長において第１発光強度および第２発光波長において第２発光強度を有する、蛍光種を励起する光源と、
（ｂ）第１発光強度を測定する第１発光検出器と、
（ｃ）第２発光強度を測定する第２発光検出器と、
（ｄ）光源に近い第１末端部および光源から遠い第２末端部を含む、光源から蛍光種へ励起光を送る励起光ライトガイドと、
（ｅ）蛍光種から第１発光検出器へ発光を送る第１発光ライトガイドであって、検出器に近い第１末端部および検出器から遠い第２末端部を含むライトガイドと、
（ｆ）蛍光種から第２発光検出器へ発光を送る第２発光ライトガイドであって、検出器に近い第１末端部および検出器から遠い第２末端部を含むライトガイドと、
（ｇ）励起光ライトガイド、第１発光ライトガイドおよび第２発光ライトガイドの遠位末端部を格納するプローブと、
（ｈ）アセンブリが、
（ｉ）該プローブを受け入れるハウジングが、該ハウジングは第１端部において該プローブを受け入れ、前記第２端部において窓で終わるようになっており、該窓は励起光および発光に対して透明である該ハウジングと、
（ｉｉ）ハウジングの第２端部に可逆的に接続可能なチップ部材であって、チップ部材が液体試料中に存在する二酸化炭素に対してｐＨ応答性を有する溶液を受け入れるチェンバを具備し、二酸化炭素に対してｐＨ応答性を有する該溶液が選択的透過膜を通して液体試料と液体連通しているチップ部材と、
（ｉｉｉ）該チップ部材と窓との間に介在する基板上に固定された蛍光種であって、基板上に固定された蛍光種は、測定中二酸化炭素に対してｐＨ応答性を有する該溶液と液体連通し、該窓は、基板上に固定された蛍光種から該プローブ部材を物理的に隔離している蛍光種とを含むプローブを受け入れるアセンブリと、を具備する。
【００３８】
１つの実施態様では、光源が発光ダイオードである。
【００３９】
１つの実施態様では、第１および第２の検出器がフォトダイオードである。
【００４０】
１つの実施態様では、励起光ライトガイド、第１発光ライトガイド、および第２発光ライトガイドが光ファイバである。
【００４１】
１つの実施態様では、ハウジングが窓で終わる先細りのチューブを具備する。
【００４２】
１つの実施態様では、選択的透過膜が二酸化炭素を通すことができる。
【００４３】
１つの実施態様では、チップ部材が密封容器に穴を開けるスパイクを具備する。
【００４４】
この方法で有用な蛍光種は、ｐＨを測定する方法について上で指摘された該蛍光種および下でさらに詳細に説明する該蛍光種を含む。１つの実施態様では、この蛍光種は、セミナフトフルオレセイン／ヒト血清アルブミン複合体を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
発明の詳細な説明
本発明は、ｐＨを測定する方法およびシステムを提供する。この方法およびシステムは、密封容器内に収納された試料のｐＨ測定に適している。
【００４６】
本発明の１つの態様では、ｐＨを測定する方法を提供している。この方法では、ｐＨ依存性の蛍光発光を有する単一の蛍光種からの蛍光発光強度を比較してｐＨ値が得られる。ｐＨ依存性の蛍光発光を有する蛍光種は、第１波長において第１発光強度、第２波長において第２発光強度を有し、第１および第２の発光強度は、この蛍光種の環境におけるｐＨに特有なものである。第１および第２の発光強度の比からｐＨ値が得られる。第１および第２の発光強度を較正すると、強度に基づく参照値（比に関する情報）が得られ、これを用いると蛍光種の環境におけるｐＨ値が得られる。
【００４７】
本発明の方法は、蛍光波長にレシオメトリックな方法である。本明細書で使われている用語「蛍光波長にレシオメトリック」は、第１および第２の波長において、それぞれ、測定された第１および第２の蛍光発光強度を対比させて、ｐＨ情報を得る方法を意味している。
【００４８】
この方法では、ｐＨに依存する蛍光発光を有する蛍光種は、試料と接触している基板上に固定されるので、該蛍光種は試料と接触している。試料と接触している固定蛍光種は試料内に配置されているので、この蛍光種は調査することができる。蛍光測定は、蛍光発光を引き出すのに十分な波長において蛍光種を照射することによりなされ、次いで、蛍光発光を測定する。蛍光種の発光プロフィール（即ち、第１および第２の波長において、それぞれ、測定された第１および第２の蛍光発光強度）はｐＨ依存性があるので、蛍光発光プロフィールを測定すると該蛍光種の環境のｐＨ（即ち、試料のｐＨ）が得られる。
【００４９】
本発明の方法の１つの実施態様では、ｐＨを測定すべき試料は密封容器に収納されている。この方法は、普通の血液貯蔵容器に密封された血液および血液製品のｐＨ測定に適している。
【００５０】
別の実施態様では、ｐＨを測定すべき試料は開放容器に収納されている。本明細書で使われている用語「開放容器」は、密封されていない容器を意味している。この方法は、測定すべき試料が汚染を避ける必要がある場合に適している。この方法では、プローブは浄化および／または消毒し、一度使ったら廃棄する。この方法は、物質を収納する容器が密封されていない（即ち、開放）食品、医薬品、または生物学の研究で使われる物質のｐＨ測定に適している。このような「研究室用」システムは、プローブ上に置かれたチップ（下の説明を参照のこと）を含む。ｐＨは、チップを試料中に浸漬してから測定する。チップは、プローブから外した試料から外し廃棄する。
【００５１】
収納試料のｐＨを測定する方法では、基板固定蛍光種は、試料を容器に入れる前か後に容器に入れる。本明細書で使われている用語「密封容器」は、その収納物が該容器の外部環境に露出されるのを防ぐ容器を意味している。この密封容器は、その収納物が該容器の外側の、例えば、液体および気体と接触するのを防止する。密封容器は、その収納物が該容器から散逸するのも防止する。
【００５２】
この容器は、該容器の１要素として基板固定蛍光種を含むように作ることができる。このような実施態様では、基板固定蛍光種は製造中の容器に組み込まれ、後で試料を入れて、該試料のｐＨを測定することができる容器を提供する。基板固定蛍光種を組み込んでいる容器の製造は、実施例１で説明している。
【００５３】
一方、基板固定蛍光種は、試料を容器内に入れた後に該容器に入れることができる。このような実施態様では、基板固定蛍光種は、まず容器に穴を開け（またはスパイクし）基板固定蛍光種を入れ、次いで、再密封し該基板固定蛍光種と接触している試料を含む密封容器を提供するプロセスにより容器に入れられる。密封容器内に基板固定蛍光種を入れるプロセスは、実施例２で説明する。
【００５４】
上で指摘したように、試料と接触している基板固定蛍光種を含む容器は、調査の前後および調査中に密封する。蛍光種を調べるには、該蛍光種から蛍光発光を生じるのに十分な波長における該蛍光種の励起およびその蛍光発光の測定を必要とする。本発明の方法では、調査は密封容器の窓を通して行う。この蛍光種は、窓を通して照射することにより励起され、該蛍光種からの発光は窓を通して集められる。窓は、密封容器の一部であり、試料と接触している蛍光種の調査を可能にする。この窓は、励起および発光の波長において十分透明であり、この方法による調査を可能にする。基板固定蛍光種は、調査のために窓に十分近接して、即ち、蛍光種を効率的に励起させるために、および該蛍光種からの発光を効率的に集めるために十分近接して、配置する。エピフルオレッセンスを用いる場合は、単一の窓を用いることはいうまでもない。しかし、本発明の他の方法および装置は、１つより多い窓を使用することができる直流または直角光学経路などの他の光学経路を具備することができる。
【００５５】
本発明の方法は、１つの実施態様では、蛍光種からの発光を生じるのに十分な波長において、その発光を測定するために、基板固定蛍光種が密封容器内に試料と共に収納される該基板固定蛍光種への照射を含む。励起光および蛍光発光は密封容器の窓を通過する。１つの実施態様では、この密封容器は、さらに、励起光ライトガイドおよび発光ライトガイドを保持するハウジングを受け入れるポートを具備する。１つの実施態様では、この励起光ライトガイドは、光源から蛍光種へ励起光を送る１つ以上の光ファイバを含む。１つの実施態様では、発光ライトガイドは、蛍光種から光検出器へ発光を送る１つ以上の光ファイバを具備する。ハウジングを受け入れるポートは、調査のために窓に十分近接して、即ち、蛍光種を効率的に励起させるために、および該蛍光種からの発光を効率的に集めるために十分近接して、配置する。
【００５６】
すべての光学的蛍光方法と同様に、本発明の方法は、蛍光種を励起するための光源および該蛍光種の発光を測定するための検出器を具備する。光源、波長選択フィルタ、および検出器は、吸光度およびこの方法で用いる蛍光種の発光プロフィールに基づいて選択する。
【００５７】
適切な光源は、蛍光種から蛍光発光を生じるのに十分な波長および強度において励起エネルギーを提供する。この光源は、比較的幅の広い波長帯励起（例えば、紫外または白色の光源）または比較的幅の狭い波長帯励起（例えば、レーザーまたは発光ダイオード）を提供することができる。励起効率および発光測定を高めるために、光源からの比較的幅の広い波長帯励起光を選択し、蛍光種に適合する回折格子、単色光分光計、またはフィルタを使用して狭めることができる。適切な光源は、タングステンランプ、ハロゲンランプ、キセノンランプ、アークランプ、ＬＥＤ、中空陰極ランプ、およびレーザーを含む。
【００５８】
適切な検出器は、蛍光種の発光波長帯の蛍光発光の強度を検出する。発光測定、蛍光種からの蛍光発光を高めるために、光源は選択し、該蛍光種に適合させるために回折格子、単色光分光計、またはフィルタを使用して狭めることができる。適切な検出器は、蛍光種の発光波長帯に応答するフォトダイオードなどの光電子増倍管および固体検出器を具備している。他の適切な検出器は、光電池、ＰＩＮダイオード、およびアバランシェフォトダイオードである。
【００５９】
フィルタを使用することにより、標的から反射するすべての励起光は検出器に到達する前に除去される。これは、励起および発光の両光学経路においてフィルタを使用することにより達成される。特定の例では、検出器に到達する反射励起光（これは発光よりも桁はずれにはるかに強い）は特定の信号を無力にすることができる。一般に、１０Ｅ５（１０５）またはそれ以上の帯域外の排除が、各フィルタセットにおいて適切である。励起光の低減は、傾斜した窓を使うことによっても達成できるので、反射光は発光検出器から離れる方向にある。しかし、このような光学経路は、フィルタセットと同等の効果はない。
【００６０】
光源からの励起光は、１つ以上の光ファイバなどの光ライトガイドを使用することにより蛍光種の方に向けることができる。同様に、蛍光種からの発光は、１つ以上の光ファイバなどの光ライトガイドを使用することにより検出器の方に向けることができる。
【００６１】
本発明の方法を行う代表的なシステムは、図１Ａに概略示している。図１Ａを参照すると、システム１００はこのシステムの構成要素を制御し、作動させる制御器１１０を具備している。システムの構成要素には、システムコマンドを含む情報を入力するキーパッド１２０、該システムの状態を判断し、ｐＨの測定結果を見るディスプレイ１３０、試料の確認、該システムにより測定するｐＨを含む該システムに情報を入力するバーコード・リーダー１４０、システムの状態およびｐＨの測定結果をプリントするプリンタ１５０、該システムに電力を供給するバッテリ（または壁のプラグおよびパワーアダプタ）１６０、テスト結果および較正データを貯蔵するメモリーデバイス１６５、光学プラットフォーム構成要素にコマンドし、該光学プラットフォームからの信号を処理する信号処理電子部品１７０、励起光源、発光検出器、光ライトガイド、および関連レンズとフィルタとを含む光学プラットフォーム１８０を具備する。光学プラットフォームは、１つ以上の励起光ライトガイドおよび２つ以上の発光ライトガイドを格納するプローブ部材１８５を具備する。図１Ａは、プローブ部材１８５を受け入れるポート２０５を含む密封容器５００も示している。
【００６２】
図１Ｂは、ｐＨを測定する本発明のシステムにおける有用な光学プラットフォームの略図である。図１Ｂを参照すると、光学プラットフォーム１８０は、励起光系２８０、第１発光系３８０、および第２発光系４８０を具備する。励起光系２８０は、光源２８２、平行レンズ２８４、フィルタ２８６、集束レンズ２８８、および励起光ライトガイド２９０を具備している。第１発光系３８０は、検出器３８２、集束レンズ３８４、フィルタ３８６、平行レンズ３８８、および第１発光ライトガイド３９０を具備している。第２発光系４８０は、検出器４８２、集束レンズ４８４、フィルタ４８６、平行レンズ４８８、および第２発光ライトガイド４９０を具備している。励起光ライトガイド２９０、第１発光ライトガイド３９０、および第２発光ライトガイド４９０は、プローブ部材１８５に格納されている。
【００６３】
このシステムの光源は、蛍光種を励起するのに有効である。適切な光源は、発光ダイオード、レーザー、タングステンランプ、ハロゲンランプ、キセノンランプ、アークランプ、ＬＥＤ、および中空陰極ランプを含む。１つの実施態様では、光源は、５００〜５６０ｎｍの範囲の光を放つ発光ダイオードである。本発明のシステムで有用な代表的な発光ダイオードは、ＮＹ（ニューヨーク州）ＬａｔｈａｍのＭａｒｋｔｅｃｈが市販している、極めて輝きのよい緑色のＣｏｔｃｏ５０３シリーズＬＥＤである。
【００６４】
この平行レンズは、光（例えば、光源からの励起光または発光ライトガイドからの第１および第２の発光）を帯域通過フィルタに向けている。適切な平行レンズは、ＢｉｃｏｎｖｅｘガラスレンズおよびＰｌａｎｏ−ｃｏｎｖｅｘガラスレンズを含む。本発明のシステムで有用な代表的な平行レンズは、ＮＪ（ニュージャージー州）ＢａｒｒｉｎｇｔｏｎのＥｄｍｕｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓが市販しているＴｅｃｈ  Ｓｐｅｃ  ＰＣＸレンズである。励起平行レンズは１２×３６（ｍｍ単位の有効焦点距離の直径）であり、第１および第２の発光平行レンズは１２×１８である。
【００６５】
集束レンズは、帯域通過フィルタから励起光ライトガイドまで、または帯域通過フィルタから検出器までの光を集束する。適切な集束レンズは、ＢｉｃｏｎｖｅｘガラスレンズおよびＰｌａｎｏ−ｃｏｎｖｅｘガラスレンズを含む。本発明のシステムで有用な代表的な集束レンズは、ＮＪ（ニュージャージー州）ＢａｒｒｉｎｇｔｏｎのＥｄｍｕｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓが市販しているＴｅｃｈ  Ｓｐｅｃ  ＰＣＸレンズである。励起集束レンズは１２×１８であり、第１および第２の発光集束レンズは１２×１５である。
【００６６】
フィルタは、光学プラットフォームにおいて、送達される光の帯域幅を狭めるために使われる。
【００６７】
適切な励起フィルタは、帯域通過フィルタ、短い波長の光を通過させるフィルタ、長い波長の光を通過させるフィルタ、または長短いずれかの波長の光を通過させるフィルタの組み合わせを含む。１つの実施態様では、このシステムは、約３７０〜５４０ｎｍの範囲の光、即ち短い波長の光を通過させるフィルタを用いる。本発明のシステムで使われる代表的な短い波長の励起光を通過させるフィルタは、ＶＴ（バーモント州）ＢｒａｔｔｌｅｂｏｒｏのＯｍｅｇａ  Ｏｐｔｉｃａｌが市販している５４０ＡＳＰである。
【００６８】
適切な第１発光フィルタは、帯域通過フィルタ、短い波長の光を通過させるフィルタ、長い波長の光を通過させるフィルタ、または長短いずれかの波長の光を通過させるフィルタの組み合わせを含む。１つの実施態様では、帯域通過フィルタは、約５９５〜６０５ｎｍの範囲の光を通過させ、１０ｎｍの半値幅を有する。本発明のシステムで有用な代表的な第１発光帯域通過フィルタは、ＶＴ（バーモント州）ＢｒａｔｔｌｅｂｏｒｏのＯｍｅｇａ  Ｏｐｔｉｃａｌが市販している６００ＤＦ１０である。
【００６９】
適切な第２発光フィルタは、帯域通過フィルタ、短い波長の光を通過させるフィルタ、長い波長の光を通過させるフィルタ、または長短いずれかの波長の光を通過させるフィルタの組み合わせを含む。１つの実施態様では、帯域通過フィルタは、約５６２〜５７３ｎｍの範囲の光を通過させ、１０ｎｍの半値幅を有する。本発明のシステムにおいて有用で代表的な第１発光帯域通過フィルタは、ＶＴ（バーモント州）ＢｒａｔｔｌｅｂｏｒｏのＯｍｅｇａ  Ｏｐｔｉｃａｌが市販している５６８ＤＦ１０である。
【００７０】
励起光ライトガイドは、光源からプローブ部材を通って蛍光種まで励起光を送達する。１つの実施態様では、励起光ライトガイドは、１つ以上の光ファイバを具備している。１つの実施態様では、励起光ライトガイドは単一の光ファイバである。本発明のシステムで有用な代表的光ファイバは、ＮＪ（ニュージャージー州）ＢａｒｒｉｎｇｔｏｎのＥｄｍｕｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓが市販しているＲＯ２−５３４である。
【００７１】
第１および第２の発光ライトガイドは、蛍光種からプローブ部材を通って、それぞれ、第１および第２の発光検出器まで蛍光発光を送達する。
【００７２】
１つの実施態様では、第１発光ライトガイドは、１つ以上の光ファイバを具備している。１つの実施態様では、第１発光ライトガイドは、複数の光ファイバを具備している。１つの実施態様では、第１発光ライトガイドは、４つの光ファイバを具備している。本発明のシステムで有用な代表的光ファイバは、ＮＪ（ニュージャージー州）ＢａｒｒｉｎｇｔｏｎのＥｄｍｕｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓが市販しているＲＯ２−５３３である。
【００７３】
１つの実施態様では、第２発光ライトガイドは、１つ以上の光ファイバを具備している。１つの実施態様では、第２発光ライトガイドは、複数の光ファイバを具備している。１つの実施態様では、第２発光ライトガイドは、４つの光ファイバを具備している。本発明のシステムで有用な代表的光ファイバは、ＮＪ（ニュージャージー州）ＢａｒｒｉｎｇｔｏｎのＥｄｍｕｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓが市販しているＲＯ２−５３３である。
【００７４】
本発明のシステムで有用で適切な光ファイバは、直径０．２〜２ｍｍでガラスまたはプラスチック製の光ファイバである。
【００７５】
このシステムの第１および第２の発光検出器は、蛍光種からの第１および第２の蛍光発光を測定する際に有効である。適切な検出器には、フォトダイオード、ＰＩＮダイオード、および光電子増倍管が含まれる。１つの実施態様では、第１および第２の発光検出器は、４００〜８００ｎｍの範囲で応答するフォトダイオードである。本発明のシステムで有用な代表的フォトダイオードは、ＰＡ（ペンシルバニア州）ＭａｌｖｅｒｎのＶｉｓｈａｙ  Ｉｎｔｅｒｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙが市販しているＢＰＷ３４を含む。
【００７６】
本発明のシステムで有用な励起光および発光のライトガイドを格納している代表的なプローブ部材は、図２にその概要を示している。図２に示したように、光ライトガイドは光ファイバである。図２を参照すると、プローブ部材１８５は、光ライトガイド２９０、複数の第１発光ライトガイド３９０、および複数の第２発光ライトガイド４９０を格納している。図２に示した代表的なプローブ部材には、４つの第１発光ライトガイド３９０、および４つの第２発光ライトガイド４９０がある。４つの第１発光ライトガイドは第１チャネル（例えば、蛍光種からの第１蛍光発光を測定する）であると考えられ、４つの第２発光ライトガイドは第２チャネル（例えば、蛍光種からの第２蛍光発光を測定する）であると考えることができる。例示した代表的プローブ部材では、２セットの繊維の各々からの繊維が中央繊維（２９０）の周りに交互に配置される（即ち、繊維３９０と４９０とが交互に）。この配置は、「ホットスポット」を平坦化するので、第１セットにより集められる光は、第２セットにより集められる光に似ている。
【００７７】
励起光／発光ライトガイドを格納するプローブ部材と密封容器のポートとの間の関係は、図３に概要を説明している。図３を参照すると、プローブ部材１８５はポート２０５を受け入れる。ポート２０５は、蛍光測定に使われる励起光および発光の波長に対して透明である窓２１０を具備している。光ライトガイド２９０から発する励起光は、窓２１０を通過し、本発明の方法の操作において、密封容器２００に収納された試料と接触している蛍光種をその上に固定する基板２２０を調べる。基板２２０を照射すると、基板固定蛍光種の励起および蛍光種からの蛍光発光を生じる結果になる。蛍光種からの発光は、光ライトガイド３９０と４９０とにより受け入れられ、これらのライトガイドを通って、それぞれ、検出器３８２と４８２とに送達される（図１Ｂを参照のこと）。上で指摘したように、蛍光種の第１および第２の発光強度は、試料のｐＨに依存する。
【００７８】
密封容器内に基板固定蛍光種を導入する代表的ポートアセンブリは、図４Ａおよび４Ｂに示している。図４Ａは作製されたポートを示し、図４Ｂはポートアセンブリの分解図である。
【００７９】
図４Ａおよび４Ｂを参照すると、ポートアセンブリ２０２はポート２０５およびチップ２１５を具備している。ポート２０５は、窓２１０で終わり、プローブ部材１８５（図示していない）を受け入れる開口部２１２を有する円筒である。１つの実施態様では、ポート２０５は開口部２１２から窓２１０に向けて先細りになっているので、ポート２０５内へのプローブ部材１８５の挿入の深さはプローブの直径により予め決められる。１つの実施態様では、アセンブリ２０２における１８５の進行の深さは出っ張り（図示していない）により限定される。１つの実施態様では、プローブと膜との間の最適間隔は２ｍｍ以下であった。図２１は、プローブと膜との間の間隔の関数として測定した蛍光強度を示している。ポートに挿入したとき、プローブ部材１８５の面と窓２１０の面とは、ほぼ平行である。ポート２０５とチップ２１５とは適合しているので、ポートとチップとは可逆的に接続することができる。１つの実施態様では、ポート２０５は環状インセット２１４を具備し、チップ２１５はインセット２１４を受け入れる環状リップ２１８により画定された開口部２１６を具備している。この実施態様では、インセット２１４の直径は開口部２１６より小さい。ポートとチップとの間の接続関係は逆に（即ち、インセットを有するチップを受け入れる環状リップをポートが有する）することができることはいうまでもない。リップ２１８は基板２２０を受け入れるベッド２２２を画定し、該基板は、ポート２０５がチップ２１５に接続される時にポートアセンブリ２０２に固定される。チップ２１５は、ベッド２２２に隙間２２４を具備している。隙間２２４は、ポートアセンブリが導入される密封容器に収納された液体試料と基板２２０とを接触させる。チップ２１５は、穴を開けることにより密封容器内にポートアセンブリ２０２を入れやすくする先端２２６で終わる。図４Ｃは、ベッド２２２および隙間２２４を示しているチップ２１５の平面図である。１つの実施態様では、アセンブリは、ＭＡ（マサチューセッツ州）ＰｉｔｔｓｆｉｌｄのＧＥ  Ｐｏｌｙｍｅｒｌａｎｄが市販しているＬｅｘａｎ  ＨＰＳ１  １１２５から作る。
【００８０】
基板固定蛍光種を組み込んでいる代表的な密封容器は、図５Ａおよび５Ｂに示す。図５Ａは、穴を開けて中にポートアセンブリを挿入する密封容器を示している。図５Ｂは、ポートアセンブリを具備するように作られた密封容器を示している。
【００８１】
図５Ａを参照すると、密封容器５００は複数の容器ポート５１０を具備している。ポートアセンブリ２０２（ポート２０５、膜２２０、およびチップ２１５を含む）は、挿入後容器ポート５１０Ａに存在する。容器５００は、ポートアセンブリ２０２の挿入後密封されている。容器ポート５１０Ａは、ポート２０５を密封している。
【００８２】
図５Ｂを参照すると、密封容器５００は複数の容器ポート５１０を具備している。ポートアセンブリ２３２（ポート２０５、膜２２０、およびチップ２１５を含む）は、容器製造後容器ポート５１０Ａに存在する。ポートアセンブリを組み込む代表的な密封容器を製造するプロセスは、実施例１で説明している。
【００８３】
製造中密封容器内に組み込むための有用で代表的なポートアセンブリは、図６に示している。容器製造中組み込むために有用なポートアセンブリは、容器製造において容器に穴を開ける特徴を含む必要がないか、好ましくは含まないことを除いて、図４に示した密封容器内に導入するのに有用なポートアセンブリとほぼ同じである。図６を参照すると、ポートアセンブリ２３２はポート２０５およびチップ２３５を具備している。ポート２０５は、窓２１０で終わり、プローブ部材１８５（図示していない）を受け入れる開口部２１２を有する円筒である。１つの実施態様では、ポート２０５は開口部２１２から窓２１０に向けて先細りになっているので、ポート２０５内へのプローブ部材１８５の挿入の深さはプローブの直径により予め決まる。ポートに挿入したとき、プローブ部材１８５の面と窓２１０の面とはほぼ平行である。ポート２０５とチップ２１５とは適合しているので、ポートとチップとは可逆的に接続することができる。１つの実施態様では、ポート２０５は環状インセット２１４を具備し、チップ２１５はインセット２１４を受け入れる環状リップ２１８により画定された開口部２１６を具備している。この実施態様では、インセット２１４の直径は開口部２１６より小さい。ポートとチップとの間の接続関係は逆に（即ち、インセットを有するチップを受け入れる環状リップをポートが有する）することができることはいうまでもない。リップ２１８は基板２２０を受け入れるベッド２２２を画定し、該基板は、ポート２０５がチップ２３５に接続される時にポートアセンブリ２０２に固定される。チップ２１５は、ベッド２２２に隙間２２４を具備している。隙間２２４は、ポートアセンブリが導入される密封容器に収納された液体試料と基板２２０を接触させる。
【００８４】
ｐＨ依存性の発光を有する蛍光種。ｐＨを測定する本発明の方法およびシステムは、ｐＨ依存性の蛍光発光を有する蛍光種を用いる。該蛍光種は、第１波長において第１発光強度および第２波長において第２発光強度を有し、第１および第２の発光強度は、該蛍光種の環境においてｐＨに特有のものである。第１および第２の発光強度の比からｐＨ値が得られる。蛍光発光は、本明細書で発光波長と呼ばれる帯域ピークを有する波長帯として起きるものと考えられる。
【００８５】
１つの実施態様では、第１波長と第２波長との間の分離は約４０ｎｍ以上である。１つの実施態様では、第１波長と第２波長との間の分離は約３０ｎｍ以上である。１つの実施態様では、第１波長と第２波長との間の分離は約２０ｎｍ以上である。１０ｎｍのＨＢＷフィルタを用いると、分離は約３０ｎｍ以上である。本発明のシステムは、１０Ｅ５以上の発光帯の重なりを除去することにより蛍光信号の分離を達成するのが好ましい。
【００８６】
ｐＨを測定する本発明の方法およびシステムは、特定の蛍光種にも、特定のｐＨ範囲にも限定されない。本発明の方法およびシステムは、励起することができ、蛍光種の発光を測定することができるｐＨ依存特性を有する該蛍光種を用いれば操作可能である。本発明の方法およびシステムにより測定できるｐＨの範囲は、選択することができ、蛍光種のｐＨ依存特性により決めることができる。
【００８７】
上で指摘した蛍光種のｐＨ依存特性に加えて、適切な蛍光種には、基板上にほぼ不可逆的に固定することができるものがある。蛍光種は、基板に共有結合するか、または非共有で結合することができる。
【００８８】
適切なｐＨ依存性の蛍光種には、当該技術分野で周知のものがある。適切なｐＨ依存特性を有する代表的な蛍光種には、ナフトフルオレセイン化合物、セミナフトフルオレセイン化合物（例えば、ＳＮＡＦＬ化合物）、およびセミナフトローダフルオル化合物（例えば、ＳＮＡＲＦ化合物）を含むフルオレセイン誘導体が含まれる。これらの化合物は、血液中の潜在的妨害光を吸収する物質の影響を受け難い該化合物の長波長発光に関連した利点を有する。これらの化合物は、市販のＬＥＤ光源による自身の励起について、該化合物を特に適切にする比較的長波長にも吸光度を有する。適切なｐＨ依存特性を有する別の化合物は、ＨＰＴＳ、即ち８−ヒドロキシ−１，３，６−ピレントリスルホン酸である。この化合物は、望ましいレシオメトリックなｐＨ特性を有するが、強いＬＥＤ光源が市販されていない短波長（４０３ｎｍ）において励起は最適である。本発明の方法およびシステムにおいて有用な代表的ＳＮＡＦＬおよびＳＮＡＲＦ化合物は、米国特許第４，９４５，１７１号で説明されている。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（現在は、ＯＲ（オレゴン州）ＥｕｇｅｎｅのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が、接合可能なカルボン酸結合基を有するＣＮＦ、ＳＮＡＦＬ、ＳＮＡＲＦフルオルを販売している。これについては、例えば、Ｒ．Ｐ．ＨａｕｇｌａｎｄによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（第９版）２１章「ｐＨ指示薬」８２９〜８４７頁を参照のこと。Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（現在は、ＷＡ（ワシントン州）ＢｏｔｈｅｌｌのＮａｎｏｇｅｎ）は、プロパン酸リンカーを有するＥＢＩＯ−３を販売している。Ｗｈｉｔａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９１）１９４，３３０〜３４４）は、多数のＳＮＡＦＬ化合物の合成を示した。Ｗｏｆｂｅｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｉｋｒｏｃｈｉｍ  Ａｃｔａ（１９９２）１０８，１３３−１４１）は、ＣＮＦとアミノセルロースとの複合体の使用について説明した。ＳＮＡＦＬファミリ化合物に関する最も早い文献は、Ｗｈｉｔａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．５３，１９７ａである。ＣＮＦファミリにおける関連染料は、ＶＩＴＡＢＬＵＥ、即ち７．５６のｐＫａを有するスルホンナフトフルオレセイン誘導体（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １０，１５１〜１６４）である。フェノール（ｐＫａ７．４５）に隣接した各炭素に臭素置換基を有するＣＮＦ類似体は、ＣＮＦ（ｐＫａ７．９９）の測定ｐＫａ値より０．５４ｐＫａユニット低いｐＫａを有する。Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．は、これらの化合物について「真の」ｐＫａ値を決めることは困難であることを指摘している。ｐＫａを決める方法は、実施例３で説明している。ＳＮＡＦＬ−１フリー酸（文献ｐＫａ値は約７．８）は、その蛍光ベースの試験で７．６のｐＫａを有する。
【００８９】
本発明の方法およびシステムにおいて有用なセミナフトフルオレセイン化合物（ＳＮＡＦＬ−１およびＥＢＩＯ−３）の構造は下に示す。
【００９０】
【化２】
2008510965.tif 000004
番号付与体系は、リンカー分子が取り付く位置を示している。これらの化合物は、下に説明するようにキャリアタンパク質に接合するのに適したカルボキシレート結合基を有する。接合では、ＳＮＡＦＬ−１の反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル（ＯＲ（オレゴン州）ＥｕｇｅｎｅのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓが市販している）を使用することができる。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のリジン残基への接合により、所望のＳＮＡＦＬ／ＨＳＡ複合体が得られた。ＥＢＩＯ−３のカルボジイミド活性化により、ヒト血清アルブミンに効率的に接合した反応性中間体が得られた。
【００９１】
本発明の方法およびシステムにおいて有用で代表的なナフトフルオレセインおよびセミナフトフルオレセイン化合物は、図７に示している。
【００９２】
ＳＮＡＦＬ化合物は、ＯＲ（オレゴン州）ＥｕｇｅｎｅのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．が市販している。ＳＮＡＦＬ化合物は、公表されている一般的な手順により容易に合成することができる（例えば、米国特許第４，９４５，１７１号を参照のこと）。
【００９３】
代表的な２−クロロ置換ＳＮＡＦＬ化合物の調製を下に示す。
【００９４】
【化３】
2008510965.tif 000005
この化合物は、塩化亜鉛などのルイス酸または脱水性酸触媒の存在下でジ酸置換４−アクリルレゾルシノールと１，６−ジヒドロキシナフタレンとの縮合により作ることができる。
【００９５】
プロピオン酸リンカーを有するＳＮＡＦＬ化合物の調製は、引用により全体が本明細書に援用されている米国特許出願第１１／０２２，０３９号で説明されている。プロピオン酸リンカーを有する代表的なＳＮＡＦＬ化合物である、ＥＢＩＯ−３は、ＷＡ（ワシントン州）ＢｏｔｈｅｌｌのＮａｎｏｇｅｎが市販している。
【００９６】
本発明の方法およびシステムにおいて有用な代表的蛍光種（即ち、ＳＮＡＦＬ−１およびＥＢＩＯ−１）の発光スペクトルをｐＨの関数として、それぞれ、図８および９に示している。図８は、５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液中のＳＮＡＦＬ−１の発光スペクトルをｐＨ（ｐＨ６．０〜１０．０）（５４０ｎｍにおける励起）の関数として示している。図８を参照すると、ｐＨ６〜７における応答は比較的弱い（ｐＫａ＝７．６）。図９は、５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液中のＥＢＩＯ−３の発光スペクトルをｐＨ（ｐＨ６．０〜１０．０）（５４５ｎｍにおける励起）の関数として示している。図９を参照すると、ｐＨ６〜７における応答は比較的良い（ｐＫａ＝６．６）。図７Ａ〜７Ｅに示したＳＮＡＦＬ類似体のスペクトル特性およびｐＫａデータを表１に要約している。
【００９７】
【表１】
2008510965.tif 000006
表１を参照すると、吸光度および発光スペクトルは１０μＭのＳＮＦＬ類似体において得た。吸光度はｐＨ６、８、および１０において測定し、酸性（ｐＨ６）では類似の吸光度の２つの吸収帯が得られ、ｐＨ１０では単一のλｍａｘ（塩基）が得られた。発光スペクトルが交差する波長は、λｉｓｏとして報告している。発光λｍａｘはｐＨ１０にて測定した。ｐＫａは、蛍光発光スペクトルから得た。ＥＢＩＯ−１およびＥＢＩＯ−３は、ｐＨ約６．５における変化に対してより敏感であった。他の類似体は、ｐＨ約８においてより敏感であった。
【００９８】
基板に固定する蛍光種複合体。本発明の方法およびシステムにおいて使用する場合、蛍光種は基板上に固定するので、該蛍光種はｐＨを測定すべき試料に接触している。蛍光種は、基板と強い結合性を有する物質（例えば、巨大分子スペーサ）を使用することにより基板上に固定することができる。このスペーサ物質は、蛍光種の共有結合を可能にし、基板表面への非共有による効果的な固定に必要な大きな表面積を提供する。１つの実施態様では、このスペーサ物質は共有結合を利用できる約４４個のリジン残基を有するヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。ＨＳＡの緻密に充填された分子構造は、バイオ物質に吸着された時に保護効果を有する。他の利点には、蛍光消光の低減、複合フルオロフォアの均一な環境、および組み換え形式（イーストからの）の有効性があるので、感染（ドナーからのＨＳＡの場合のような）の機会はない。ＨＳＡ複合体は、限外ろ過法により容易に浄化され、タンパク質あたりのフルオロフォアの数を決めるための蛍光分析および吸光度により容易に特徴づけられる安定溶液を形成する。
【００９９】
１つの実施態様では、蛍光種は、タンパク質またはタンパク質フラグメントを使用して基板上に固定する。適切なタンパク質には、基板上にほぼ不可逆的に固定することができるタンパク質が含まれる。このタンパク質は、基板に共有結合するか、または非共有で該基板と結合することができる。適切なタンパク質は、蛍光種が該タンパク質にほぼ不可逆的に固定するものとすることができる該タンパク質を含む。この蛍光種は、このタンパク質と共有または非共有で結合することができる。
【０１００】
適切なタンパク質は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、フォン・ヴィレブランド因子、キニノゲン、フィブリノゲン、およびヘモグロビン（鉄を含まない）を含む。適切なタンパク質は、利用可能なリジン残基（フルオロフォアに結合する場合）およびブロット膜に固定効率を可能にするのに十分な分子量を含む。タンパク質内の他の官能基（システィンのような）は、おそらく、適度の反応性を有する固体支持体に共有結合する場合に使われるであろう。
【０１０１】
１つの実施態様では、蛍光種は、多糖類を使用して基板上に固定される。適切な多糖類は、基板上にほぼ不可逆的に固定することができる多糖類を含む。この多糖類は、基板に共有結合するか、または非共有で該基板と結合することができる。適切な多糖類は、蛍光種が該多糖類にほぼ不可逆的に固定するものとすることができる該多糖類を含む。この蛍光種は、この多糖類と共有または非共有で結合することができる。
【０１０２】
適切な多糖類は、デキストラン、アミノデキストラン、ヘパリン、およびレクチンを含む。
【０１０３】
別の実施態様では、蛍光種は、デンドリマ構造を使用して基板上に固定される。適切なデンドリマ構造は、ほぼ不可逆的に基板上に固定されうる該構造を含む。このデンドリマ構造は、基板に共有結合するか、または非共有で該基板と結合することができる。構造のタイプおよびサイズが異なるＰＡＭＡＭデンドリマが市販されている。
【０１０４】
１つの実施態様では、蛍光種はタンパク質に共有結合し、フルオロフォアと多糖類との複合体を形成し、該複合体は基板上に固定することができる。１つの実施態様では、フルオロフォアと多糖類との複合体は非共有で基板に結合する。
【０１０５】
１つの実施態様では、フルオロフォアとタンパク質との複合体は基板上に固定される。１つの実施態様では、蛍光種は、セミナフトフルオレセインであり、タンパク質はヒト血清アルブミンである。１つの実施態様では、セミナフトフルオレセインはＳＮＡＦＬ−１である。ＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡ複合体の調製は、実施例４で説明している。ＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡ複合体の蛍光特性は、実施例５で説明している。１つの実施態様では、セミナフトフルオレセインはＥＢＩＯ−３である。ＥＢＩＯ−３／ＨＳＡ複合体の調製は、実施例６で説明している。ＨＳＡへのＥＢＩＯ−３の結合の概要は図１０に示している。ＥＢＩＯ−３／ＨＳＡ複合体の蛍光特性は、実施例７で説明している。
【０１０６】
本発明の方法およびシステムにおいて有用で代表的なフルオロフォアとタンパク質との複合体（ＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡ、ＨＳＡあたり１．６個のフルオロフォア）のｐＨ（６．０〜１０．０）の関数としての蛍光発光スペクトルは、図１１に示している。
【０１０７】
本発明の方法およびシステムにおいて有用で代表的なフルオロフォアとタンパク質との複合体（ＥＢＩＯ−３／ＨＳＡ、ＨＳＡあたり１．９２個のフルオロフォア）のｐＨ（６．０〜１０．０）の関数としての蛍光発光スペクトルは、図１２に示している。
【０１０８】
フルオロフォアとタンパク質との複合体では、フルオロフォアの最適負荷は、個別のフルオロフォアにより変動する。
【０１０９】
ＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡ複合体では、フルオロフォアの負荷は、ＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡの比が、約０．０１〜約４０の範囲で変動する。フルオロフォア／ＨＳＡの比が、０．０１では低信号であり、４０では蛍光が消光する。１つの実施態様では、ＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡの比は約２である。
【０１１０】
ＥＢＩＯ−３／ＨＳＡ複合体では、フルオロフォアの負荷は、ＥＢＩＯ−３／ＨＳＡの比が、約０．０１〜約４０の範囲で変動する。１つの実施態様では、ＥＢＩＯ−３／ＨＳＡの比は約２である。
【０１１１】
蛍光種を固定するための基板。本発明の方法およびシステムでは、蛍光種は基板上に固定される。上で指摘したように、共有または非共有結合により、あるいは共有または非共有結合により基板上に固定することができる物質（例えば、フルオロフォアとタンパク質との複合体）を使用することにより基板上に直接固定することができる。
【０１１２】
適切な基板は、蛍光種をほぼ不可逆的に固定した。本発明の方法では、適切な基板は、蛍光種と液体試料との接触を妨げず、ｐＨ測定を妨害したり、変えたりすることもない。
【０１１３】
代表的な膜は、ニトロセルロース、ニトロセルロースと酢酸セルロースとの混合エステル類、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリフッ化ビニリデンおよびポリイミドから作られた微孔膜などの膜を含む。この種の物質は、ＮＪ（ニュージャージー州）Ｆｌｏｒｈａｍ  ＰａｒｋのＷｈａｔｍａｎ  Ｓ＆ＳおよびＭＡ（マサチューセッツ州）ＢｉｌｌｅｒｉｃａのＭｉｌｌｉｐｏｒｅが市販している。適切な膜は、微小孔のある構造が、ＯＸＹＰＨＥＮという名称でドイツ、ＤｒｅｓｄｅｎのＯｘｙｐｈｅｎ  Ｇｍｂｈが市販している膜などのイオンビーム侵入により作られる膜を含む。帯電したナイロン表面（Ｎｙｔｒａｎ）も使用することができる。適切な膜は、Ｓｗｅｄｅｎ，ＳｔｏｃｋｈｏｌｍのＡｍｉｃが用いたプロセスなどの、微小孔のある構造が射出成形により作られ、プラスチック内に微小な孔のあるプラスチック膜を含む。種々の気孔サイズがあるニトロセルロースと酢酸セルロースとの混合エステル類の膜上に固定されたＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡのｐＨ７における発光強度は、図２２に示している。
【０１１４】
代表的フルオロフォアタンパク質複合体の膜上への固定は、実施例８および１０で説明している。実施例８は、ＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡ複合体の固定について説明している。実施例９は、固定ＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡ複合体の蛍光特性について説明している。実施例１０は、ＥＢＩＯ−３／ＨＳＡ複合体の固定について説明している。実施例１１は、固定ＥＢＩＯ−３／ＨＳＡ複合体の蛍光特性について説明している。
【０１１５】
実施例９で説明したマイクロウエル分析により測定した、Ｏｘｙｐｈｅｎおよびニトロセルロース上に固定した代表的なフルオロフォアとタンパク質との複合体（ＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡ，３．６：１）の発光スペクトルをｐＨの関数（ｐＨ応答）として、それぞれ、図１３および１４に示している。
【０１１６】
実施例８で説明し、実施例１１で説明したテレスコーピング・チューブ挿入試験により測定した、ニトロセルロース上に固定した代表的なフルオロフォアとタンパク質との複合体（ＥＢＩＯ−３／ＨＳＡ、２．０：１）の発光スペクトルを、ｐＨ（６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、および１０．０）の関数として図１５に示している。ｐＨ６〜８の範囲の場合、６００ｎｍにおける発光が大きく拡大していることは、蛍光対ｐＨの応答が良好であることを示している。
【０１１７】
レシオメトリックにｐＨを測定する方法およびシステム。本発明の方法は蛍光波長にレシオメトリックする方法である。この方法では、第１および第２の蛍光波長で、それぞれ、測定した蛍光種の第１および第２の蛍光発光強度を比例させてｐＨ値に関する情報を得る。第１の発光波長はｐＨと共に変動するが、第２の発光波長はｐＨが変わっても一定であり、蛍光強度の内部コントロールが得られる。１つの実施態様では、測定した比の組み合わせ、第１および第２の発光波長を調べ、その対応するｐＨを決めるために、参照テーブルが使われる。１つの実施態様では、この比の数学関数、第１および第２の発光波長を用いて、得られるｐＨを計算する。
【０１１８】
図１６は、ｐＨを測定するために本発明の方法で用いたデータを示している。テレスコーピング・チューブ挿入試験により測定した、ニトロセルロース上に固定した代表的なフルオロフォアとタンパク質との複合体（ＥＢＩＯ−３／ＨＳＡ、２．０：１）のｐＨ７における発光スペクトルを示す。この設定では、励起帯域フィルタは、ブランクのニトロセルロース・ディスクについて測定したバックグラウンド信号により示した発光領域における励起光を完全に除去することはできなかった。バックグラウンドについて集めたフルスペクトルに、各波長における第１および第２の仮想フィルタの透過率をかけ、得られる曲線の下の面積を計算すると第１および第２の波長の信号が得られる。中心波長および仮想フィルタの帯域幅は、この複合体のレシオメトリックな特性が、興味のある領域のｐＨに対して最強の関係を有するように選択した。
【０１１９】
図１７は、実施例１１で説明したテレスコーピング・チューブ挿入試験により測定した、燐酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、血小板の少ない血漿（ＰＰＰ）、および血小板の多い血漿（ＰＲＰ）に関する本発明の方法の結果を示している。３つの曲線は、測定ｐＨ値と３種類の液体の比との間で最もよく一致する関係を示している。
【０１２０】
図１８は、実施例１１で説明した射出成形したＰＶＣチューブ挿入試験により測定した本発明の方法およびシステムにより得られた３種類の血漿試料のｐＨ測定結果の相関関係を示している。蛍光信号とｐＨとの間の関係は、約０．１ｐＨユニットの精度を有する。
【０１２１】
図１９は、実施例１０で説明した浸出試験により測定した、浸漬法により調製したニトロセルロースと酢酸セルロースとの混合エステル類上の本発明の代表的基板固定フルオロフォア複合体（ＥＢＩＯ−３／ＨＳＡ、２：１）の安定性を示している。浸出のレベルは低く、任意の化合物の毒性レベルよりはるかに低い。
【０１２２】
二酸化炭素の測定。別の態様では、本発明は、液体試料中の二酸化炭素濃度を測定する装置および方法を提供する。この二酸化炭素を測定する方法は、上で説明したｐＨの測定方法およびシステムを利用している。この二酸化炭素を測定する方法および装置では、上で説明した基板固定蛍光種は溶液と接触しており、該溶液のｐＨは二酸化炭素濃度に応答している。基板固定蛍光種に接触していることに加えて、二酸化炭素濃度に応じたｐＨを有するこの溶液は、二酸化炭素濃度を測定すべき液体試料に接触している。二酸化炭素濃度に応じたｐＨを有するこの溶液は、選択的透過膜により二酸化炭素濃度を測定すべき液体試料から隔離されている。この膜は、ガス（例えば、二酸化炭素）を通すが、他の物質（例えば、液体）を通さない。上で説明したｐＨ測定方法を用いると、基板固定蛍光種と接触している二酸化炭素濃度に応じた溶液のｐＨが測定され、その溶液と接触している試料の二酸化炭素濃度と相関づけられる。
【０１２３】
二酸化炭素濃度へのｐＨ応答を有する溶液は、二酸化炭素に対して反応性があり、二酸化炭素濃度に応じた溶液のｐＨを変える薬剤を含む。二酸化炭素に対して反応性があり、薬剤が溶解している溶液のｐＨを変える適切な薬剤は、重炭酸ナトリウムなどの重炭酸塩を含む。
【０１２４】
選択的透過膜は、二酸化炭素濃度に応じたｐＨを有する溶液を二酸化炭素を含む液体試料から隔離する。この膜は、二酸化炭素を通し、液体および他の溶質を通さない。この方法では、液体試料からの二酸化炭素は膜を通って水溶液に入り、それにより二酸化炭素と反応する反応性薬剤は水溶液のｐＨを変える。適切な選択的透過膜には、シリコーンおよびＰＴＦＥから作られる膜がある。
【０１２５】
図２０は、密封容器内の二酸化炭素を測定する本発明の代表的な装置を示している。図２０を参照すると、装置６００は、ポート６２０とチップ６３０とを含むポートアセンブリ６１０を具備している。ポート６２０は、窓６２２で終わり、プローブ部材１８５を受け入れる開口部６２４を有する円筒である。このポートに挿入すると、プローブ部材１８５の面と窓６２２とはほぼ平行である。ポート６２０とチップ６３０とは適合しているので、ポートとチップとは可逆的に接続することができる。固定蛍光種を含む基板６４０は、ポート６２０およびチップ６３０内に固定されている。チップ６３０は、二酸化炭素に応じてｐＨを有する溶液を受け入れるチェンバ６４５を具備している。チェンバ６４５は、窓６２２、チップ６３０、および選択的透過膜６５０により画定されている。チェンバ６４５は、プローブ部材１８５により調べられる基板６４０を具備している。
【０１２６】
二酸化炭素を測定する装置は、固定ＥＢＩＯ−３／ｒＨＳＡ複合体（ｒＨＳＡは組み換えＨＳＡ）を含む膜を用いて上で説明したように組み立てた。ＰＡＲＡＦＩＬＭ  Ｍ、即ちオレフィン・タイプの物質のブレンドの層を、膜の下、チップの方向に入れた。この膜を５ｕｌの３５ｍＭの炭酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて水和し、該膜をＰＡＲＡＦＩＬＭ  Ｍによりアセンブリ内に密封し、試験中は水和したままにした。このアセンブリを配管および「Ｙ」アダプタを用いてガス源に接続することにより１００％二酸化炭素ガスにさらし、圧力を少しずつ下げた。このアセンブリを割り当て時間の間二酸化炭素にさらし、周辺の空気条件に順応させ、反復した。蛍光は、５２５ｎｍにて励起した後、５６８ｎｍおよび６００ｎｍにおいてそれぞれ測定した。結果を下の表２に要約し、二酸化炭素濃度の変化が蛍光の変化に反映し、本発明の蛍光光度の比による方法が二酸化炭素濃度の計算に使えることも証明している。血小板の貯蔵に使われるＰＶＣ貯蔵バッグは少しガスを通すが、二酸化炭素はｐＨの測定に直接関係づけられる。
【０１２７】
【表２】
2008510965.tif 000007
本発明は、デザインした血液貯蔵バッグの試料採取ポートに容易に挿入し、光ファイバをベースにするＬＥＤ光源およびフォトダイオード測定システムを用いて調べることができる蛍光ベースのｐＨ指示器を提供する。この固体システムは、指示染料をヒットする励起光の量を妨害する可能性がある血液中の妨害物質による蛍光信号強度の変動を説明する「レシオメトリック」な較正方法を用いる。蛍光強度の比は、２つの波長、即ち１つは染料の酸性（プロトン化）異性体を検出する波長、１つは塩基性（脱プロトン化）異性体を検出する波長、において測定する。
【０１２８】
血小板の多い血漿用の正確なｐＨ検出器を開発するためには、約６．６のｐＫａを有する化合物が適切で、例えば、ＳＮＡＦＬ化合物の２−クロロ置換体はフェノールのｐＫａを７．６から約６．６へ下げる。これらの化合物の複合体は、種々の固体支持体上に固定し、ｐＨ検知膜を提供することができる。
【０１２９】
本発明は、ｐＨ６．５〜７．５において血小板貯蔵バッグにおけるｐＨを正確に測定する、安価で容易に製造できるｐＨ検知膜を提供する。１つの実施態様では、本発明は、レシオメトリックな２−クロロ置換蛍光化合物のタンパク質複合体（ヒト血清アルブミン）を用いる。フルオロフォア：ＨＳＡの比は、ニトロセルロースブロット膜に固定した場合は、性能が最適であった。膜上で乾燥後、フルオロフォア：ＨＳＡ複合体は、非常に低い浸出速度を有する。この物質のディスクは、血小板貯蔵バッグの試料採取ポート内に挿入するホルダー内で簡単に組み立てられる。蛍光膜物質は、緑のＬＥＤをベースとする蛍光計を用いると良好なｐＨ応答を示した。この方法では、レシオメトリックなｐＨ検出のための２つの発光波長は、所望の６．５という低ｐＨ閾値において約０．１ユニットの精度で適切にフィルタ処理したフォトダイオードを用いて測定する。
【０１３０】
フルオロフォア分子は、種々の環境に対して検知できるようにデザインすることができる。本発明の方法およびシステムは、ｐＨ検知フルオロフォアの使用について説明している。しかし、他の環境は、ｐＨ検知フルオロフォア以外の環境検知フルオロフォアを含むように修正した本発明の方法およびシステムにより調べることができる。分子環境が変化した時に、蛍光特性を変える種々のフルオロフォアが市販されている。例えば、Ｒ．Ｐ．ＨａｕｇｌａｎｄによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（第９版）を参照のこと。プローブはアルブミンまたのタンパク質に結合し、本発明で説明したか、または蛍光をベースとする方法を用いて調査のための基板の調製に用いることができる。環境検知フルオロフォア、システム、および方法の実施例は、次のような実施例を含む。
【０１３１】
核酸検出：核酸結合染料は、ＤＮＡまたはＲＮАの存在下で蛍光特性を変える。
【０１３２】
酵素基板：タンパク質またはペプチドは、蛍光染料および蛍光消光分子で標識付けできるので、プロテアーゼなどの特定の酵素の存在下で蛍光信号が作られる（ＦＲＥＴ検出）。
【０１３３】
脂質のプローブ：親油性染料は、細胞膜または他の脂質の多い分析対象物質の存在下で蛍光特性を変えることができる。
【０１３４】
酸素のプローブ：ｐＨ検出および二酸化炭素検出に加えて、特定の蛍光分子、例えば、トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）ジクロライド（ＲＴＤＰ）は、酸素濃度の変化を検知することができる。
【０１３５】
金属イオンの指示薬：金属を結合する蛍光染料は、特にカルシウム、マグネシウム、亜鉛、ナトリウム、カリウムに結合すると蛍光特性を変えることができる。
【０１３６】
グルコースの検出：ＣｏｎＡなどの特定のレクチン類は、グルコースを結合し、適切に標識を付けたレクチン類はグルコースのプローブとして作ることができる。
【０１３７】
本発明を限定せず、説明のために、次のような実施例を提示する。
【実施例】
【０１３８】
実施例１
代表的な基板固定蛍光種を組み込んでいる容器の製造
図５Ｂを参照すると、密封容器５００はＰＶＣから作られる。ＰＶＣは、多数の添加剤、例えば、可塑剤、安定剤、および潤滑剤と混合する。この処方物は、バッグおよびチューブの製作に用いる。混合ＰＶＣは、この可塑性物質をシートに成形するためにダイを通して押出す。押し出しシートは、細長く切断した後、所望のサイズに切り、溶接セクションに送る。供給および移送用の配管は、類似のＰＶＣコンパウンドを押出して作る。次いで、このチューブは、適切な長さに切り、溶接セクションに送る。注入ポート、針カバー、およびクランプなどの部品は、射出成形により製作する。これらの部品は超音波で浄化し、オーブン中で乾燥する。
【０１３９】
溶接。血液バッグは、高周波溶接技法により作る。標準サイズのＰＶＣシートは、電極の間に置かれ、高電圧の高周波を加えられる。ＰＶＣは、非常に急速に加熱され、電極の間で密封される。注入ポートおよび供給・移送配管は、バッグの適切な位置に置き、溶接して血液バッグシステムの一体部品を形成する。代表的な基板固定蛍光種を組み込んでいる容器を製造する場合（図５Ｂ）は、開口チューブを溶接してポート５１０Ａを得る。このチューブは、着色したＰＶＣから作られ、固定蛍光種を光から保護する。溶接したバッグは最終仕上げする。ポートアセンブリ２３２（図６）は、射出成形したＬｅｘａｎの部品（２０５および２３５）および固定蛍光種を有する直径３．５３ｍｍ（９／６４インチ）のニトロセルロース・ディスク（２２０）から作る。ポートアセンブリは、摩擦かみ合いによりまとめるか、または適所にのりで接着する。ポートアセンブリは、ポート５１０Ａの開口チューブに挿入する。ポートアセンブリは、摩擦かみ合いによりポートに保持するか、または適所にのりで接着する。組み立てたバッグおよびポートアセンブリは消毒し、血小板濃縮物を最終貯蔵するためにラベルを貼る。
【０１４０】
実施例２
代表的な基板固定蛍光種の密封容器内への組み込み
図５Ａを参照すると、密封容器５００は複数の容器ポート５１０を具備している。ポートアセンブリ２０２は、挿入後容器ポート５１０Ａに存在する。ポートアセンブリ２０２（図４Ａ〜４Ｃ）は、射出成形したＬｅｘａｎの部品（２０５および２１５）および固定蛍光種を有する直径３．５３ｍｍ（９／６４インチ）のニトロセルロース・ディスク（２２０）から作る。ポートアセンブリは、摩擦かみ合いによりまとめるか、または適所にのりで接着する。ポートアセンブリは、スパイクチップを用いてシールに穴を開けて隔壁シールを通してポート５１０Ａ内に挿入する。あるいは、別のスパイクツールを用いてシールに予め穴を開けることができる。ポートアセンブリの挿入は、空のバッグまたは血小板を満たしたバッグについて行うことができるが、いずれの場合もバッグの中身の汚染を回避するために無菌の方法を用いる必要がある。ポートアセンブリは、摩擦かみ合いによりポートに保持するか、または適所にのりで接着する。容器５００は、ポート５１０Ａ内にポートアセンブリ２０２を挿入後密封（漏れのない）されている。
【０１４１】
実施例３
代表的ＳＮＡＦＬ類似体の蛍光およびｐＨ特性：ｐＫａの測定
器具の使用。種々のＳＮＡＦＬフリー酸類の蛍光対ｐＨを、Ｏｃｅａｎ  ＯｐｔｉｃｓのＵＳＢ２０００光ファイバおよびタングステンハロゲン光源（部品番号ＨＬ−２０００  ＦＨＳＡ）を用いて比較した。光源は、励起ビームの波長および形を調節することができる直線的に変動するフィルタを備えていた。フルオロフォアの最大吸光度に対するブランク・キュベットを用いて励起波長を調節した（表１を参照のこと）。キュベット・ホルダー（部品番号ＣＵＶ−ＦＬ−ＤＡ）を光源に直接取り付け、光ファイバ・ケーブルが発光を分光計に向けた。各蛍光スペクトルについて励起条件を報告する（指定波長における３０００ｍｓｅｃの照射）。Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓのソフトウエアを用いて、スペクトル・データをパーソナル・コンピュータに集め、種々のスペクトルの重なりを記録した。
【０１４２】
試料の調製。ＳＮＡＦＬ−１は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから小瓶入の１ｍｇのフリーのカルボン酸として購入した。０．３ｍＬのイソプロピルアルコールと０．７ｍＬの水を加えて１ｍｇ／ｍＬの溶液を調製した。ＳＮＡＦＬ−１の分子量（ＭＷ）を４２６として、モル濃度（ＳＮＡＦＬ−１＝２．３５ｍＭ）を計算した。この溶液の４．２５ｕＬを、種々の５０ｍＭ燐酸塩緩衝液を用いて１ｍＬに希釈し、ｐＨ６〜１０の１０マイクロモル濃度の溶液を得た。ＳＮＡＦＬ−２（ＭＷ＝４６０）の１０マイクロモル濃度の溶液は、同様に調製した。ＥＢＩＯ−１（ＭＷ＝５２３）、ＥＢＩＯ−２（ＭＷ＝６２７）、およびＥＢＩＯ−３（ＭＷ＝４８９）は、Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからバルク化合物として得た。１．６ｍｇの各固体粉末を注意深く秤量し、３．２ｍＬの４０％イソプロピルアルコールに溶解し、０．５ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。種々のＳＮＡＦＬおよびＥＢＩＯ化合物について、ｐＨ６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、８．０および１０．０において発光スペクトルを得た。重なり合った蛍光発光スペクトルの例を、図８（ＳＮＡＦＬ−１）および図９（ＥＢＩＯ−３）に示す。すべてのスペクトルは、すべての発光スペクトルが重なる等吸収波長を示した（表１を参照のこと）。これは、上に示したもの（ラクトン、ナフトール、ナフトレート）以外は競合蛍光構造がない理想的なレシオメトリックな性能の特徴である。
【０１４３】
ｐＫａの計算。ｐＫａとして規定されるｐＨにおいて２つの分子種（互変異性体）が同等に表される。ｐＫａに影響を及ぼす可能性のある変数が多数存在し、これらの構造は重なり吸光度を有するので、測定する方法は困難である。したがって、文献からの直接比較はわずかに変動しうる。本明細書に含まれる計算は、ｐＨ１０では、３価アニオンナフトレート構造のみが存在するという仮定に基づいている。発光ピークにおける蛍光強度は、２で割り、交差するｐＨ曲線のｐＨは最も近い２曲線の間の内挿により計算する。２−クロロ置換ＥＢＩＯ化合物のｐＫａは、表１に示した他の類似体より有意に低い。
【０１４４】
実施例４
代表的なフルオロフォアとタンパク質との複合体であるＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡの調製
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、１００ｍｇの凍結乾燥粉末としてＳｉｇｍａ（カタログ＃Ａ−８７６３）から購入した。ＳＮＡＦＬ−１  ＮＨＳエステルは、５および６個の異性体の混合物としてＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから購入した。１ｍＬのｐＨ８．５６の重炭酸ナトリウム（０．１Ｍ）と１０ｍｇ（０．１５マイクロモル）のＨＳＡとの溶液を調製した。１ｍＬ（１．９１マイクロモル）のＮＨＳエステルと０．１ｍＬのジメチルスルホキサイドとの溶液を調製した。このＨＳＡ溶液の０．３ｍＬアリコートを１．６ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移し、種々の提示比のＮＨＳエステル溶液、即ち、チューブ１、１１．８マイクロリッター（５当量）、チューブ２、２３．６マイクロリッター（１０当量）、チューブ３、４７．１マイクロリッター（２０当量）を加えた。深赤色の溶液を激しく撹拌し、暗所で１時間以上放置した。チューブ１からの５：１複合体は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１５を充填した０．５×２０ｃｍのカラムからなるゲルろ過クロマトグラフィおよびｐＨ７．４の燐酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により浄化した。この複合体は、ＰＢＳ中で迅速に動く赤／オレンジ帯として分離し、ＰＢＳを用いて０．７５ｍＬに希釈し、タンパク質複合体の４ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。ほとんどの色は複合体と共に溶出したが、一部の小分子量（オレンジ）の不純物はカラムのトップに残った。このカラムを浄化し、１０：１および２０：１の複合体の精製に再使用した。各々はＰＢＳ中に溶出し、０．７５ｍＬに希釈し、約４ｍｇ／ｍＬ溶液を得た（ＨＳＡ成分に基づいて６０マイクロモル濃度）。赤い溶液は、貯蔵し、冷凍し、光から保護した。各ＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡ複合体の１マイクロモル濃度の溶液を調製し、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＵ６４０Ｂ分光計を用いて紫外−可視スペクトルにより分析した。各スペクトルは、ＳＮＡＦＬ−１複合体の酸形について予想される、ｐＨ７における４９０および５２１ｎｍにおいて最大吸光度を示した。相対吸光度は、ＳＮＡＦＬ：ＨＳＡの種々の提示比の場合に、予想された吸光度の変化を示した。各ＨＳＡ複合体調合品あたりのＳＮＡＦＬ−１の平均負荷をより正確に決めるために、ｐＨ７のＳＮＡＦＬ−１酸（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから入手）の１０マイクロモル濃度の溶液を基準として用いた。この試験を用いると、５：１複合体は４．１フルオル／ＨＳＡを有し、１０：１複合体は６．４フルオル／ＨＳＡを有し、および２０：１複合体は１１．２フルオル／ＨＳＡを有した。
【０１４５】
実施例５
代表的なフルオロフォアとタンパク質との複合体であるＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡの蛍光特性
種々のＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡ複合体およびＳＮＡＦＬ−１フリー酸の蛍光発光を、Ｏｃｅａｎ  ＯｐｔｉｃｓのＵＳＢ２０００光ファイバおよびタングステンハロゲン光源（部品番号ＨＬ−２０００  ＦＨＳＡ）を用いて比較した。光源は、励起ビームの波長および形を調節することができる直線的に変動するフィルタを備えていた。キュベット・ホルダー（部品番号ＣＵＶ−ＦＬ−ＤＡ）を光源に直接取り付け、光ファイバ・ケーブルが発光を分光計に向けた。各蛍光スペクトルについて励起条件を報告する（指定波長における３０００ｍｓｅｃの照射）。Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓのソフトウエアを用いて、スペクトル・データをパーソナル・コンピュータに集め種々のスペクトルの重なりを記録した。ＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡの種々の負荷レベルを比較すると、４．１〜１．６ＳＮＡＦＬ−１分子が同じ蛍光信号を与えることが分かった。負荷がより高いか低い場合は、複合体はより低い信号を与えた。
【０１４６】
燐酸カリウム緩衝液中の１０マイクロモル濃度の溶液について発光スペクトルを得た。励起は５４０ｎｍにおいてなされた。塩基形のＳＮＡＦＬ−１（ｐＨ１０）の場合、発光ピークは６２０ｎｍにおいて認めた。予想通り、６２０ｎｍの蛍光強度は、ｐＨが低下すると低下した。蛍光がすべてのｐＨで一定である５８５ｎｍにおいて等吸収点を認めた。応答は、約ｐＨ８では良好であったが、ｐＨ６〜７の間では弱かった。
【０１４７】
代表的なＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡ複合体（１．６ＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡ）の２．５マイクロモル濃度の溶液で得たスペクトルは、ｐＨ６〜７の間でｐＨ応答が改善されていた（図１１を参照のこと）。Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓのハロゲン光源は、５３２ｎｍの干渉フィルタ（ＮＪ（ニュージャージー州）ＢａｒｒｉｎｇｔｏｎのＥｄｍｕｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓ）を備え、このフィルタが蛍光等吸収点をｐＨ６〜７の間で５７２ｎｍで検出することを可能にした。塩基形のＳＮＡＦＬ−１（ｐＨ１０の曲線を参照のこと）の場合、発光ピークは６２０ｎｍにおいて認めた。予想通り、６２０ｎｍの蛍光強度は、ｐＨが低下すると低下した。フリーＳＮＡＦＬ−１カルボン酸（図８を参照のこと）と比較すると、ＨＳＡ複合体の場合ｐＨ６〜７の間で応答の改善が認められた。蛍光種を含む他の競合分子構造を暗示する、等吸収点波長からのｐＨ８および１０の曲線のレッドシフトが認められた。この非理想的挙動は、蛍光染料とＨＳＡスペーサとの間に、より長いリンカー構造またはより親水性のリンカー構造を用いることにより排除することができる。
【０１４８】
実施例６
代表的なフルオロフォアとタンパク質との複合体であるＥＢＩＯ−３／ＨＳＡの調製
方法Ａ。ＥＤＣ（ＭＯ（ミズーリ州）Ｓｔ  ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）の０．１Ｍの原液は、６．２ｍｇのＥＤＣを０．２ｍＬのＤＭＦおよび０．１２３ｍＬの５０ｍＭの燐酸塩緩衝液（ｐＨ５．８）に溶解して調製した。１．０ｍｇのＥＢＩＯ−３酸（ＷＡ（ワシントン州）ＢｏｔｈｅｌのＮａｎｏｇｅｎ）は、０．１０２ｍＬのＤＭＦに溶解して２０ｍＭの溶液を得た。３．０ｍｇ（０．０４５マイクロモル）のＨＳＡ（ＭＯ（ミズーリ州））のＳｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）は、２つの１．７ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブの各々において、０．３ｍＬのｐＨ８．５の重炭酸ナトリウムに溶解した。０．１ＭのＥＤＣ（０．０４５ｍＬ）は、別々のＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブにおいて、２０ｍＭのＥＢＩＯ−３（０．０４５ｍＬ、０．９マイクロモル）に加え、ＨＳＡチューブの１つに加え、提示比２０：１のＥＢＩＯ−３：ＨＳＡを得た。５：１の提示比は、０．０２２５ｍＬのＥＤＣ（０．１ｍＭ）および０．０２２５ｍＬのＥＢＩＯ−３（２０ｍＭ）の予め混合した溶液を加えることにより他のＨＳＡチューブにおいて用いた。均一な暗赤色ＨＳＡ複合体溶液は、室温で暗所に保管した。２１時間後、ＨＳＡ複合体の各々は、ＳＮＡＦＬ複合体の場合（実施例４）について上で説明したＧ１５  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムで浄化した。一部の未反応ＥＢＩＯ−３酸は、カラムのトップに残った（特に提示比２０：１の場合）が、約０．５ｍＬのｐＨ７．４緩衝液のピンク色の画分として最初に溶出した所望のタンパク質複合体から明確に分離した。浄化した各複合体は、ｐＨ７．４のＰＢＳを用いて０．７５ｍＬに希釈し、４ｍｇ／ｍＬの溶液（０．０６ｍＭ）を得た。赤い溶液は、貯蔵し、冷凍し、光から保護した。各ＥＢＩＯ−３／ＨＳＡ複合体の１マイクロモル濃度の溶液をｐＨ７．４で調製し、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＵ６４０Ｂ分光計を用いて紫外−可視スペクトルにより分析した。フリーＥＢＩＯ−３酸（１０マイクロモル濃度）のスペクトルは、５３４ｎｍに最大吸光度を有し、２０：１の複合体は５３８ｎｍに吸光度を有し、５：１の複合体は５４５ｎｍに最高値を有した。このスペクトルは、ＥＢＩＯ−３：ＨＳＡ提示比が上がると吸光度が予想された増加を示した。標準としてこのＥＢＩＯ−３酸を用いると、２０：１の複合体は５．０７ＥＢＩＯ−３：ＨＳＡを有し、５：１の提示は１．９２ＥＢＩＯ−３：ＨＳＡを有した。結合効率は、実施例４のＳＮＡＦＬ／ＨＳＡ複合体の場合より少し低かった（２０：１複合体は１１．２フルオル／ＨＳＡを有し、５：１の提示は４．１フルオル／ＨＳＡを有した）。ＥＤＣ結合法は、適切に有効であり、再現性がよかった。
【０１４９】
方法Ｂ。ＥＤＣ（ＭＯ（ミズーリ州）Ｓｔ  ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）の０．１Ｍ溶液は、６．０ｍｇのＥＤＣを０．１９４ｍＬのＤＭＦおよび０．１１８ｍＬの５０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解して調製した。３．０ｍｇのＥＢＩＯ−３酸（ＷＡ（ワシントン州）ＢｏｔｈｅｌのＮａｎｏｇｅｎ）は、０．３０６ｍＬのＤＭＦに溶解して２０ｍＭの溶液を得た。これら２つの溶液をＥＢＩＯ−３溶液の容器で合体し、室温で１時間暗所に保存した。イースト（ＵＫ（英国）ＮｏｔｔｉｎｇｈａｍのＤｅｌｔａ  Ｂｉｏｔｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｔｄ．）からの７５．０ｍｇ（１マイクロモル）の液体組み換えＨＳＡ（ｒＨＳＡ）は、１５ｍＬの円錐チューブにおいて７．５ｍＬのｐＨ８．５の重炭酸ナトリウムと混合する。ＥＢＩＯ−３／ＥＤＣ溶液の全部をｒＨＳＡ溶液と合体し、室温暗所に１５〜２０時間保存した。ｒＨＳＡ／ＥＢＩＯ−３複合体は、Ａｍｉｃｏｎ撹拌限外ろ過セルシステムおよびＹＭ１０膜（ＭＡ（マサチューセッツ州）ＲｏｃｋｆｏｒｄのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて浄化する。５０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）を洗浄溶液として用いる。浄化後、この複合体のタンパク質濃度は、ＢＣＡ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（ＩＬ（イリノイ州）ＢｅｄｆｏｒｄのＰｉｅｒｃｅ）を用いて測定する。この複合体のアリコートは、ＢＣＡを用いて測定したアリコートのタンパク質濃度に基づいて５０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて希釈する。複合体の１ｍｇ／ｍｌのアリコート、ＰＢＳ流出液の最後のミリリッター、５０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）のアリコート、およびＥＢ３標準（ＤＭＦ中１５ｍＭのＥＢＩＯ−３溶液および５０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４））のアリコートをＢｉｏ−Ｔｅｋ’ｓ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴプレート・リーダーを用いる吸光度のスキャンにより分析する。このスキャンは、黒い９６のウエルがある透明で平坦なボトム・プレートにおける上述の各試料の３００マイクロリッターについて、４５０ｎｍから６５０ｎｍまでスキャンして行う。これらの最大ピークを記録し、この複合体の純度および品質を決める。
【０１５０】
実施例７
代表的なフルオロフォアとタンパク質との複合体であるＥＢＩＯ−３／ＨＳＡの蛍光特性
実施例６（方法Ａ）において説明したように調製した２つのＥＢＩＯ−３／ＨＳＡ複合体の２．５マイクロモル濃度の溶液について、蛍光スペクトルを得た。これらの複合体は、ｐＨ６〜７において改善されたｐＨ応答を示した（図１２の１．９２ＥＢＩＯ−３／ＨＳＡ複合体の重なり合ったスペクトルを参照のこと）。Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓのハロゲン光源は、５３２ｎｍの干渉フィルタ（ＮＪ（ニュージャージー州）ＢａｒｒｉｎｇｔｏｎのＥｄｍｕｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓ）を備え、これが蛍光等吸収点をｐＨ６〜７の間で約５６５ｎｍにて検出することを可能にした。塩基形のＳＮＡＦＬ−１（赤いトレース、ｐＨ１０）の場合、発光ピークは６０５ｎｍにおいて認めた。予想通り、６０５ｎｍの蛍光強度は、ｐＨが低下すると低下した。ＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡ複合体（図１１を参照のこと）と比較すると、ＥＢＩＯ−３／ＨＳＡ複合体の場合ｐＨ６〜７の間で応答の改善が認められた。蛍光種を含む他の競合分子構造を暗示する、等吸収点波長からのｐＨ８および１０の曲線のレッドシフトを認めたが、ＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡ複合体の場合より度合いが小さかった。
【０１５１】
実施例８
代表的なフルオロフォアとタンパク質との複合体であるＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡの固定
フルオロフォアとタンパク質との複合体およびフルオロフォアと炭水化物との複合体は、次のような一般的方法を用いてニトロセルロースか、または毛細管気孔の膜のいずれかの膜の上に固定した。「固定可能な」リジン残基を有するフルオレセイン標識付デキストランは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから入手した。これらのデキストラン類は、約１０，０００の分子量、複合体あたり１．８個のフルオロフォアおよび２．２個のリジンを有し、商品名「Ｆｌｕｏｒｏ−Ｅｍｅｒａｌｄ」として販売されている。フルオレセイン標識付ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）もＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから入手し、複合体あたり４．５個のフルオルを有した。種々のＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡ複合体は、実施例４で説明した通りに調製した。ニトロセルロース膜は、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  ＳｃｈｎｅｌｌからＰＲＯＴＲＡＮという商品名で入手した。気候直径は０．２ミクロンとされている。ポリエステルフィルムから作った毛細管気孔膜は、種々の気孔サイズのものをＯｘｙｐｈｅｎから入手した。気孔サイズ０．１ミクロンおよび１．０ミクロンの膜を用いてフルオレセイン・デキストラン類を固定するのに成功した。フルオレセイン／デキストラン、フルオレセイン／ＢＳＡおよびＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡ複合体はすべて固定に成功し、ＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡ複合体の蛍光特性は、次に説明するように十分キャラクタイズできた。
【０１５２】
一般的な固定方法。直径０．１ミクロンのＯｘｙｐｈｎ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｄｉｓｃ上のＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡ（２．５ＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡ）。２．５：１のＳＮＡＦＬ−１：ＨＳＡ提示比を有する蛍光ＨＳＡ複合体は、実施例４に説明されている通りに調製し、燐酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）で希釈し、０．０５、０．２、１．０および４ｍｇ／ｍＬの濃度を得た。５マイクロリッターの液滴は、ベンチトップ上に置かれた予め穴を開けた多孔性ディスク（直径１／４インチ）の中心に２０マイクロリッターのピペッタにより塗布した。これらのスポットディスクは、空気乾燥し（約３０分）、別のデシケータ中に一晩置いた。乾燥したディスクを２×１ｍＬのＰＢＳを用いて別のＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ内で洗浄し、１ｍＬのＰＢＳに一晩浸漬した。洗浄したディスクは、ＰＢＳ溶液中で安定であった（３０日後劣化なし）。一方、これらのディスクはデシケータ内で再乾燥し、乾燥貯蔵することができる。湿りまたは乾燥の貯蔵ディスクは同程度の蛍光特性を有した。これらのディスクは蛍光信号を有し、これらの信号は、実施例９で説明した蛍光試験により測定した各ディスクに塗布された標識付巨大分子の濃度に比例した。
【０１５３】
実施例９
代表的な固定フルオロフォアとタンパク質との複合体であるＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡの蛍光特性
光ファイバ分光計を用いた多孔性膜ディスク上の蛍光巨大分子複合体のマイクロウエル試験。実施例８で説明した通りに調製した蛍光ディスクは、実施例５に説明したＯｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓの光ファイバ分光計を用いて蛍光特性について調べた。光源上のキュベットは、光ファイバ反射率プローブにより置換し、該プローブは試料からの発光を受け取り、その発光を分光計に送る単一繊維の周りに包まれた６本の励起繊維を有した。この反射率プローブは、正面にふたのある１２×１２×１８インチのブラックボックス内の穴に通した。このプローブは、該プローブのチップを９６のウエルがあるマイクロウエル・プレート（ボトムの透明なブラックプレート）の下に配置することができる１ｃｍ平方の開口部の下の内側に固定した。このプローブを３０度傾け、プローブチップに入る光を低減した。興味のある蛍光ディスクをウエルのボトムに置き、興味のある３００マイクロリッターの分析対象物質でカバーした。反射率プローブのチップ上に興味のあるディスクを配置するのに十分な時間励起光源を点灯し、次いで、シャッタを閉じ、ディスクを周囲の光から遮蔽するためにプレートを別のボックスでカバーした。特に明記しない限り、３０００ｍｓｅｃの積分時間および３つの平均を用いてデータを集めるためにＯｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓのソフトウエアをセットした。閉じたシャッタを用いてダーク・スペクトルを記録し、試験中にすべてのバックグラウンドを差し引いた測定値を用いた。次いで、シャッタを開き、ディスクの蛍光測定を開始した。コンピュータ・スクリーン上のグラフ・ディスプレイにより、各３０００ｍｓｅｃの積分時間の後にリアルタイムのスペクトルが得られた。必要な３つのスペクトルを得た後（約１０秒）、グラフ・ディスプレイはわずかな変化を示しただけであった。この点で、ディスプレイされたスペクトルのスナップショットを記録し、将来の処理のためにディスクに保存した。シャッタを閉じ、次のマイクロウエル実験をセットアップした。マイクロウエル内の分析対象物質溶液を交換することにより、同じディスクを複数回測定に使える。一方、異なるウエル内の異なるディスクは、反射率プローブ上にマイクロウエル・プレートを再配置することにより測定に使える。
【０１５４】
Ｏｘｙｐｈｅｎディスク上に固定したＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡの蛍光負荷。上で説明したマイクロウエル試験を用いると、Ｏｘｙｐｈｅｎディスク上のＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡの相対的蛍光を比較することができる。ハロゲン光源内の励起フィルタは、５３２ｎｍの波長にセットし、「広く開いた」帯域通過をこの試験の最大感度に配置する。検出器繊維に戻る励起ビームの反射率は、重要であり、フィルタの波長位置は、塩基形のＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡからの蛍光が最大である６２０ｎｍにおいて「最小値」を与えるように調節した。実施例８で説明した種々の濃度のＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡは、上で説明したｐＨ７の燐酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ）中で別々のマイクロウエルにおいて調べた。このスペクトルは、ｐＨ７において４、１、０．２および０．０５ｍｇ／ｍＬ膜の相対蛍光強度を区別する能力があることを示した。すべての信号がバックグラウンドより大きかった。
【０１５５】
ｐＨ７において多孔性Ｏｘｙｐｈｅｎ上に固定された種々の量のＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡ（２．５：１）の相対蛍光強度。フルオロフォアの塩基形の蛍光が最大になる６２０ｎｍにおいて、蛍光強度を測定した。励起は、ＳＮＡＦＬ−１の酸および塩基の両方の形を効果的に励起するハロゲンランプについて広く開いた設定を用いた。源（未修正ディスク）からの反射光は、最低強度のスペクトルを有した。０．０５ｍｇ／ｍＬディスクのスペクトルは、蛍光強度が少し上昇した。０．２ｍｇ／ｍＬディスク、１ｍｇ／ｍＬディスク、および４ｍｇ／ｍＬディスクは、蛍光強度の段階的上昇を示した。種々の膜バッチからの３０日ＰＢＳに浸漬した２つの試料（１ｍｇ／ｍＬ）の蛍光スペクトルは本質的には同じであり、膜負荷はバッチ毎に再現性があり、ＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡ複合体はＰＢＳ溶液中でディスク表面からあまり解離しないことを示した。
【０１５６】
Ｏｘｙｐｈｅｎディスク上に固定したＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡのｐＨに依存する蛍光。上で説明した１ｍｇ／ｍＬのＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡディスクのマイクロウエル試験におけるｐＨに依存する蛍光について調べた。ｐＨ４、５、６、７、８、９、および１０の燐酸カリウム緩衝液において、単一ディスクについて調べた。これらのデータは、これらの膜ディスクは、ｐＨ測定の広いダイナミック・レンジを有するが、ｐＨ＞６においてより敏感な応答を有することを示した。緩衝液交換の間の時間は、５分であり、追加平衡時間後のスペクトルには顕著な変化はなかった。これは、固定ＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡ複合体のｐＨ環境における劇的な変化の場合でも応答時間は早いことを示した。
【０１５７】
ＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡのＯｘｙｐｈｅｎディスクを用いたｐＨの蛍光測定の場合の「クロスオーバー試験」。上で説明したマイクロウエル試験は、これらのディスクの蛍光等吸収特性の調査に用いた。この試験では、Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓのハロゲン光源（部品番号ＨＬ−２０００  ＦＨＳＡ）のシャッタ・アセンブリを取り外し、２個の５３２ｎｍ帯域フィルタ（Ｅｄｍｕｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を特殊なアダプタを用いてキャビティに挿入した。これは、興味のあるスペクトル領域（＞５５０ｎｍ）における反射バックグラウンドを劇的に低減した。示したデータは、ＳＮＡＦＬ：ＨＳＡ（５：１）複合体を用いて調製した４ｍｇ／ｍＬ負荷のディスクの場合のものである。固定タンパク質複合体は、溶液相データに比べて異常なｐＨ対蛍光特性の関係を示した。５７５ｎｍにおける蛍光等吸収点の代わりに、ｐＨが上がると蛍光強度が段階的に上昇した。ｐＨ１０のスペクトルは、予想した６２０ｎｍにピークを示し、ｐＨ４、６、７および８の緩衝液で得た重なり合ったスペクトル曲線と交差した。これらの「クロスオーバーポイント」は、膜環境のｐＨを決める感度のよい試験の根拠として用いた。この試験フォーマットを用いて、３日間３種類の膜ディスクについて調べた。クロスオーバーポイントは、２ｎｍの範囲内で再現性があった。
【０１５８】
４ｍｇ／ｍＬのディスク（３．６：１  ＳＮＡＦＬ−１：ＨＳＡ）は、ｐＨ１０の「クロスオーバー」における段階的な上昇を示した。クロスオーバーは、ｐＨ４では５７９ｎｍにおいて認められた。３個のディスクを３日間調べると、±２ｎｍで同じ結果が得られた。クロスオーバーポイントは、５９２ｎｍ（ｐＨ６）、６００ｎｍ（ｐＨ７ａ，ｂ）、および６１１ｎｍ（ｐＨ８）において認められた。ｐＨ１０における蛍光ピークは、溶液相特性に類似した６２０ｎｍにおいて認められた。
【０１５９】
実施例１０
代表的なフルオロフォアとタンパク質との複合体であるＥＢＩＯ−３／ＨＳＡの固定
スポット固定法。ＥＢＩＯ−３／ＨＳＡ複合体は、２：１の比にて実施例６で説明した通りに調製した。ニトロセルロース膜は、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  ＳｃｈｎｅｌｌからＰＲＯＴＲＡＮという商品名で入手した。これらのディスクは、ＥＢＩＯ−３／ＨＳＡの４ｍｇ／ｍＬの溶液を用いて実施例５で説明した一般的な固定方法と同じ方法で処理した。
【０１６０】
浸漬固定方法。ＥＢＩＯ−３／ＨＳＡ複合体は、２：１の比にて実施例６で説明した通りに調製した。ニトロセルロースエステルの混合物および酢酸セルロースの膜は、製品シリーズＴＦとしてＭｉｌｌｉｐｏｒｅから入手した。ＥＢＩＯ−３／ＨＳＡ複合体は０．２ｍｇ／ｍｌに希釈し、その４５ｍｌを膜の９ｃｍディスクに加える。このディスクを室温で一晩撹拌し、光から保護する。非結合複合体は除去し、このディスクは１時間の洗浄を２回行い、さらに一晩洗浄する。洗浄はすべて撹拌しながら行う。次いで、このディスクをデシケータで乾燥し、乾燥貯蔵した。試験のために、９ｃｍのディスクから小さなディスクを切り取った。
【０１６１】
実施例１１
代表的な固定フルオロフォアとタンパク質との複合体であるＥＢＩＯ−３／ＨＳＡの蛍光特性
光ファイバ分光計を用いた多孔性膜ディスク上の蛍光巨大分子複合体のテレスコーピング・チューブ挿入試験。実施例１０で説明した方法で調製した蛍光ディスクは、蛍光特性を液相ｐＨに関係付けるために、二重の５３２ｎｍフィルタ（Ｅｄｍｕｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびハロゲン光源（部品番号ＨＬ−２０００  ＦＨＳＡ）を備えた、実施例９で説明したＯｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓの光ファイバ分光計を用いて調べた。５／３２インチの膜ディスクのホルダーは、外径４ｍｍおよび５ｍｍのポリスチレン・テレスコーピング・チューブおよび傾斜のついた厚さ０．０１５インのポリスチレン製の窓を用いて作った。傾斜のついた窓を置いたので、該窓はチューブの軸に関して６０度の角度に膜ディスクを保持した。これにより、光ファイバ・プローブをチューブの一端に置き、特定のｐＨの液体と接触している窓の他のサイドでこのディスクを調べることができる。ｐＨ値既知の緩衝液を、テレスコーピング・チューブ挿入物および実施例１０のスポット固定方法により作ったディスクと接触させ、１０００ｍｓｅｃの積分時間と３つの平均値を用いてデータを集めるためにＯｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓのソフトウエア・セットを用いて蛍光発光を記録した。
【０１６２】
未知のｐＨ値を有する液体の場合、５個のテレスコーピング・チューブ挿入物および実施例１０の浸漬固定方法により作ったディスク、５０ｍＬの緩衝液または血漿、および較正ｐＨ電極（ＲＯＳＳ電極／Ｏｒｉｏｎ  ７２０ａメーター）を収納する撹拌および光保護容器を用いて蛍光ディスクのｐＨおよび蛍光応答を調べた。調べた液体からある範囲のｐＨを創り出すために１ＮのＨＣｌまたは１ＭのＮａＯＨの液滴を加えた。１０００ｍｓｅｃの積分時間と３つの平均値について判断するためにＥｘｃｅｌセットにおけるＯｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓのマクロスにより蛍光スペクトルを集めた。モデル化した帯域通過フィルタおよびＥｘｃｅｌにおけるレシオメトリックな方法を用いてこれらのスペクトルを分析し、ＰＢＳ、血小板の少ない血漿および血小板の多い血漿の較正曲線を得た。
【０１６３】
ｐＨ検出器に基づく最適カスタム蛍光を用いて多孔性膜ディスク上の蛍光巨大分子複合体の射出成形したＰＶＣチューブ挿入試験。射出成形したポリカーボネート部品を創り出し、図４に示したように蛍光ｐＨ検出器プローブに蛍光ディスクを固定した。膜は、実施例１０の浸漬固定方法で説明した方法で作り、プラスチック挿入物内で組立てた。長さ１イン、内径３／１６インのＰＶＣチューブは、挿入物のスパイク端部に置いたので、２５０ｕｌの液体をチューブに入れ、パラフィルムでカバーし、二酸化炭素の脱着を遅延させた。第１および第２の波長の蛍光測定を行い、次いで、ｐＨを血液ガス分析器（Ｂａｙｅｒ３４８）により測定した。血漿試料のｐＨは、ｐＨデータの範囲を創り出すためのテレスコーピング・チューブ挿入試験におけるように酸および塩基の添加により調節した。
【０１６４】
本発明の好ましい実施態様が例示され、説明されているが、その中で、本発明の意図および範囲から逸脱することなく種々の変更を行うことができることは言うまでもない。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
本発明の前述の態様および付随する利点は、添付図面と併せて次の詳細な説明を参照することによりよく理解され、容易に評価されるであろう。
【図１Ａ】図１Ａは、本発明のｐＨを測定する代表的システムの略図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明のｐＨを測定するシステムにおいて有用な光学プラットフォームの略図である。
【図２】図２は、本発明のシステムにおいて有用な励起光および発光のライトガイドの代表的ハウジングの略図である。
【図３】図３は、励起光／発光の光ファイバ・ハウジングと密封容器ポートとの間の関係を示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、基板固定蛍光種を密封容器に導入する代表的ポートアセンブリを示し、図４Ａは組み立てたポートを示し、図４Ｂはポートアセンブリの分解図であり、図４Ｃはチップの平面図である。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、基板固定蛍光種を組み込んでいる代表的密封容器を示し、図５Ａは穴開けおよび再封入のプロセスにより基板が導入された密封容器を示し、図５Ｂは容器製造の間に基板を組み込んでいる密封容器を示す。
【図６】図６は、密封容器を製造する際に有用な代表的ポートアセンブリである。
【図７】図７Ａ〜Ｅは、本発明の方法およびシステムにおいて有用な代表的セミナフトフルオレセイン化合物類の構造を示す。
【図８】図８は、本発明の方法およびシステムにおいて有用な代表的蛍光種（ＳＮＡＦＬ−１）の発光スペクトルをｐＨの関数として示す。
【図９】図９は、本発明の方法およびシステムにおいて有用な代表的蛍光種（ＥＢＩＯ−３）の発光スペクトルをｐＨの関数として示す。
【図１０】図１０は、本発明の方法およびシステムにおいて有用な代表的フルオロフォア−タンパク質（ＥＢＩＯ−３／ＨＳＡ）複合体の調製方法の略図である。
【図１１】図１１は、本発明の方法およびシステムにおいて有用な代表的フルオロフォア−タンパク質複合体（ＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡ）の発光スペクトルをｐＨの関数として示す。
【図１２】図１２は、本発明の方法およびシステムにおいて有用な代表的フルオロフォア−タンパク質複合体（ＥＢＩＯ−３／ＨＳＡ）の発光スペクトルをｐＨの関数として示す。
【図１３】図１３は、代表的な基板固定フルオロフォア−タンパク質複合体（ＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡ）の発光スペクトルをｐＨの関数として示す（Ｏｘｙｐｈｅｎ）。
【図１４】図１４は、代表的な基板固定フルオロフォア−タンパク質複合体（ＳＮＡＦＬ−１／ＨＳＡ）の発光スペクトルをｐＨの関数として示す（ニトロセルロース）。
【図１５】図１５は、代表的な基板固定フルオロフォア−タンパク質複合体（ＥＢＩＯ−３／ＨＳＡ）の発光スペクトルをｐＨの関数として示す（ニトロセルロース）。
【図１６】図１６は、ｐＨを測定するために本発明の方法で使われたデータを示す。
【図１７】図１７は、血小板リッチの血漿に関する本発明の方法の結果を示す。
【図１８】図１８は、本発明の方法およびシステムにより得られた血小板リッチの血漿に関するｐＨの相関関係を示す。
【図１９】図１９は、本発明の代表的な基板固定フルオロフォア複合体の安定性を示す。
【図２０】図２０は、密封容器内の二酸化炭素を測定する本発明の代表的装置を示す。
【図２１】図２１は、本発明によるｐＨ測定における蛍光強度に対するプローブの位置の効果を示す。
【図２２】図２２は、本発明によるｐＨ測定における蛍光強度に対する膜の気孔サイズの効果を示す。
【図１Ａ】
2008510965.tif 000008
【図１Ｂ】
2008510965.tif 000009
【図２】
2008510965.tif 000010
【図３】
2008510965.tif 000011
【図４Ａ】
2008510965.tif 000012
【図４Ｂ】
2008510965.tif 000013
【図４Ｃ】
2008510965.tif 000014
【図５Ａ】
2008510965.tif 000015
【図５Ｂ】
2008510965.tif 000016
【図６】
2008510965.tif 000017
【図７Ａ】
2008510965.tif 000018
【図７Ｂ】
2008510965.tif 000019
【図７Ｃ】
2008510965.tif 000020
【図７Ｄ】
2008510965.tif 000021
【図７Ｅ】
2008510965.tif 000022
【図８】
2008510965.tif 000023
【図９】
2008510965.tif 000024
【図１０】
2008510965.tif 000025
【図１１】
2008510965.tif 000026
【図１２】
2008510965.tif 000027
【図１３】
2008510965.tif 000028
【図１４】
2008510965.tif 000029
【図１５】
2008510965.tif 000030
【図１６】
2008510965.tif 000031
【図１７】
2008510965.tif 000032
【図１８】
2008510965.tif 000033
【図１９】
2008510965.tif 000034
【図２０】
2008510965.tif 000035
【図２１】
2008510965.tif 000036
【図２２】
2008510965.tif 000037
【手続補正書】
【提出日】平成18年6月14日(2006.6.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料のｐＨを測定する方法であって、
（ａ）基板上に固定された蛍光種から物理的に隔離されたプローブから生じる励起光を、前記基板上に固定された前記蛍光種に照射する工程であって、
前記基板上に固定された前記蛍光種が試料と液体連通し、
励起光が前記蛍光種から蛍光発光を生じるのに十分な波長を有し、
前記蛍光種が、第１発光波長で第１発光強度を、第２発光波長で第２発光強度を示し、前記第１および第２の発光強度の比がｐＨに依存する、工程と、
（ｂ）前記試料の前記ｐＨを求めるために前記第１および第２の発光強度を測定する工程と、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記プローブが、前記励起光および前記蛍光発光に対して透明な窓により、前記基板上に固定された前記蛍光種から物理的に隔離される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プローブが１つ以上の光ファイバを具備する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記蛍光種が、ナフトフルオレセイン化合物およびセミナフトローダミン化合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ナフトフルオレセイン化合物が、セミナフトフルオレセイン化合物およびカルボキシナフトフルオレセイン化合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記蛍光種が、５’（および６’）−カルボキシ−３，１０−ジヒドロキシ−スピロ［７Ｈ−ベンゾ［ｃ］キサンテン−７，１’（３’Ｈ）−イソベンゾフラン］−３’−オンおよび２−（２−クロロ−３−ヒドロキシ−９−カルボキシエチル−１０−オキソ−１０Ｈ−ベンゾ［ｃ］キサンテン−７−イル）安息香酸からなる群から選択されるセミナフトフルオレセイン化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
基板上に固定された前記蛍光種が、蛍光種と巨大分子との複合体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記巨大分子がアルブミンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
基板上に固定された前記蛍光種が、セミナフトフルオレセイン／ヒト血清アルブミン複合体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料が血液または血液製品を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料が密封容器内に収納されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ｐＨを測定するシステムであって、
（ａ）第１発光波長において第１発光強度を、そして、第２発光波長において第２発光強度を有する蛍光種を励起する光源と、
（ｂ）前記第１発光強度を測定する第１発光検出器と、
（ｃ）前記第２発光強度を測定する第２発光検出器と、
（ｄ）前記光源から前記蛍光種へ励起光を送る励起光ライトガイドであって、前記光源に近い第１末端部および前記光源から遠い第２末端部を含む、ライトガイドと、
（ｅ）前記蛍光種から前記第１発光検出器へ発光を送る第１発光ライトガイドであって、前記検出器に近い第１末端部および検出器から遠い第２末端部を含む、ライトガイドと、
（ｆ）前記蛍光種から前記第２発光検出器へ発光を送る第２発光ライトガイドであって、前記検出器に近い第１末端部および前記検出器から遠い第２末端部を含む、ライトガイドと、
（ｇ）前記励起光ライトガイド、第１発光ライトガイドおよび第２発光ライトガイドの遠位末端部を格納するプローブと、
（ｈ）前記プローブを受け入れるアセンブリであって、
（ｉ）前記プローブを受け入れるハウジングであって、前記ハウジングは第１端部において前記プローブを受け入れ、前記第２端部において窓で終わるようになっており、前記窓は前記励起光および前記発光に対して透明である、ハウジングと、
（ｉｉ）測定すべき試料から液体を受け入れるようになっており、前記ハウジングの第２端部に可逆的に接続可能なチップ部材と、
（ｉｉｉ）前記チップ部材と前記窓との間に介在する基板上に固定された蛍光種であって、前記基板上に固定された前記蛍光種は、測定中、前記試料と液体連通し、前記窓は前記基板上に固定された前記蛍光種から前記プローブ部材を物理的に隔離している、蛍光種と、
を含む、アセンブリと、
を含む、システム。
【請求項１３】
前記光源が発光ダイオードである、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記第１および第２の検出器が、フォトダイオードである、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１５】
前記励起光ライトガイド、前記第１発光ライトガイド、および第２発光ライトガイドが、光ファイバである、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１６】
前記ハウジングが、前記窓で終わる先細りのチューブを具備する、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１７】
前記蛍光種が、セミナフトフルオレセイン／ヒト血清アルブミン複合体を含む、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１８】
前記チップ部材が、密封容器に穴を開けるためのスパイクを具備する、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１９】
（ａ）第１開放端部および第２閉鎖端部を有するハウジングであって、前記閉鎖端部が、可視光に対して透明な窓を具備する、ハウジングと、
（ｂ）前記ハウジングの窓に露出するようになっており、前記ハウジングの閉鎖端部に可逆的に接続可能なチップ部材と、
（ｃ）前記ハウジングの窓とチップ部材との間に介在する基板上に固定された蛍光種と、
を含む、アセンブリ。
【請求項２０】
前記ハウジングが先細りになっている、請求項１９に記載のアセンブリ。
【請求項２１】
前記チップ部材が密封容器に穴を開けるためのスパイクを具備する、請求項１９に記載のアセンブリ。
【請求項２２】
前記蛍光種がセミナフトフルオレセイン／ヒト血清アルブミン複合体を含む、請求項１９に記載のアセンブリ。
【請求項２３】
請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のアセンブリを具備する、血液バッグまたは血液製品バッグ。
【請求項２４】
アルブミンに共有結合した環境感受性フルオロフォアを含む複合体であって、該環境感受性フルオロフォアが、セミナフトローダミン化合物およびセミナフトフルオレセイン化合物からなる群から選択される、複合体。
【請求項２５】
前記環境感受性フルオロフォアが、ｐＨ感受性フルオロフォア、酸素感受性フルオロフォア、核酸感受性フルオロフォア、イオン感受性フルオロフォア、グルコース感受性フルオロフォア、脂質感受性フルオロフォアおよび酵素感受性フルオロフォアからなる群から選択される、請求項２４に記載の複合体。
【請求項２８】
前記環境感受性フルオロフォアが、５’（および６’）−カルボキシ−３，１０−ジヒドロキシ−スピロ［７Ｈ−ベンゾ［ｃ］キサンテン−７，１’（３’Ｈ）−イソベンゾフラン］−３’−オンおよび２−（２−クロロ−３−ヒドロキシ−９−カルボキシエチル−１０−オキソ−１０Ｈ−ベンゾ［ｃ］キサンテン−７−イル）安息香酸からなる群から選択される、請求項２４に記載の複合体。
【請求項２９】
前記アルブミンが血清アルブミンである、請求項２４に記載の複合体。
【請求項３０】
前記アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項２４に記載の複合体。
【請求項３１】
前記アルブミンが組み換えヒト血清アルブミンである、請求項２４に記載の複合体。
【請求項３２】
前記環境感受性フルオロフォアが、２−（２−クロロ−３−ヒドロキシ−９−カルボキシエチル−１０−オキソ−１０Ｈ−ベンゾ［ｃ］キサンテン−７−イル）安息香酸であり、前記アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項２４に記載の複合体。
【請求項３３】
ナフトフルオレセイン化合物および膜に付着したアルブミンの複合体を含む、膜固定蛍光種。
【請求項３４】
前記膜が微孔膜である、請求項３３に記載の膜固定蛍光種。
【請求項３５】
前記膜が、ニトロセルロース、ニトロセルロースと酢酸セルロースとの混合エステル類、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、およびポリイミドからなる群から選択される、請求項３３に記載の膜固定蛍光種。
【請求項３６】
前記ナフトフルオレセイン化合物が、セミナフトフルオレセイン化合物およびカルボキシナフトフルオレセイン化合物からなる群から選択される、請求項３３に記載の膜固定蛍光種。
【請求項３７】
前記ナフトフルオレセイン化合物が、５’（および６’）−カルボキシ−３，１０−ジヒドロキシ−スピロ［７Ｈ−ベンゾ［ｃ］キサンテン−７，１’（３’Ｈ）−イソベンゾフラン］−３’−オンおよび２−（２−クロロ−３−ヒドロキシ−９−カルボキシエチル−１０−オキソ−１０Ｈ−ベンゾ［ｃ］キサンテン−７−イル）安息香酸からなる群から選択される、請求項３３に記載の膜固定蛍光種。
【請求項３８】
前記アルブミンが血清アルブミンである、請求項３３に記載の膜固定蛍光種。
【請求項３９】
前記アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項３３に記載の膜固定蛍光種。
【請求項４０】
前記アルブミンが組み換えヒト血清アルブミンである、請求項３３に記載の膜固定蛍光種。
【請求項４１】
液体試料中の二酸化炭素濃度を測定する方法であって
（ａ）基板上に固定された蛍光種から物理的に隔離されたプローブから発する励起光を前記基板上に固定された前記蛍光種に照射する工程であって、
前記基板上に固定された前記蛍光種は、液体試料中に存在する二酸化炭素に応じたｐＨを有する溶液と液体連通し、
二酸化炭素に応じたｐＨを有する前記溶液は、選択的透過膜を通して前記液体試料と連通し、
前記励起光が前記蛍光種から蛍光発光するのに十分な波長を有し、
前記蛍光種は、第１発光波長において第１発光強度を、第２発光波長において第２発光強度を示し、第１発光強度と第２発光強度との比はｐＨに依存する、工程と、
（ｂ）ｐＨ応答性を有する前記溶液の前記ｐＨを決めるために前記第１および第２の発光強度を測定する工程と、
（ｃ）前記試料中の前記二酸化炭素濃度へのｐＨ応答性を有する前記溶液の前記ｐＨを相関づける工程と、
を包含する、方法。
【請求項４２】
前記プローブが、前記励起光および前記蛍光発光に対して透明な窓により前記基板上に固定された前記蛍光種から物理的に隔離されている、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記プローブが１つ以上の光ファイバを具備する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記蛍光種が、セミナフトフルオレセイン／ヒト血清アルブミン複合体を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記セミナフトフルオレセインが、５’（および６’）−カルボキシ−３，１０−ジヒドロキシ−スピロ［７Ｈ−ベンゾ［ｃ］キサンテン−７，１’（３’Ｈ）−イソベンゾフラン］−３’−オンおよび２−（２−クロロ−３−ヒドロキシ−９−カルボキシエチル−１０−オキソ−１０Ｈ−ベンゾ［ｃ］キサンテン−７−イル）安息香酸からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記試料が血液または血液製品を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記試料が密封容器内に収納されている、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
液体試料中の二酸化炭素濃度を測定するシステムであって、
（ａ）第１発光波長において第１発光強度を、そして、第２発光波長において第２発光強度を有する蛍光種を励起する光源と、
（ｂ）前記第１発光強度を測定する第１発光検出器と、
（ｃ）前記第２発光強度を測定する第２発光検出器と、
（ｄ）前記光源から前記蛍光種へ励起光を送る励起光ライトガイドであって、前記光源に近い第１末端部および前記光源から遠い第２末端部を含む、ライトガイドと、
（ｅ）前記蛍光種から前記第１発光検出器へ発光を送る第１発光ライトガイドであって、前記検出器に近い第１末端部および検出器から遠い第２末端部を含む、ライトガイドと、
（ｆ）前記蛍光種から前記第２発光検出器へ発光を送る第２発光ライトガイドであって、前記検出器に近い第１末端部および前記検出器から遠い第２末端部を含む、ライトガイドと、
（ｇ）前記励起光ライトガイド、第１発光ライトガイドおよび第２発光ライトガイドの遠位末端部を格納するプローブと、
（ｈ）前記プローブを受け入れるアセンブリであって、
（ｉ）前記プローブを受け入れるハウジングであって、前記ハウジングは第１端部において前記プローブを受け入れ、前記第２端部において窓で終わるようになっており、前記窓は前記励起光および前記発光に対して透明である前記ハウジングと、
（ｉｉ）前記ハウジングの第２端部に可逆的に接続可能なチップ部材であって、前記チップ部材が、液体試料中に存在する二酸化炭素に対してｐＨ応答性を有する溶液を受け入れるチェンバを具備し、
二酸化炭素に対してｐＨ応答性を有する前記溶液が選択的透過膜を介して前記液体試料と液体連通する、前記チップ部材と、
（ｉｉｉ）前記チップ部材と前記窓との間に介在する基板上に固定された蛍光種であって、前記基板上に固定された前記蛍光種は、測定中、二酸化炭素に対してｐＨ応答性を有する前記溶液と液体連通し、
前記窓は、前記基板上に固定された前記蛍光種から前記プローブ部材を物理的に隔離している蛍光種と、
を含む、アセンブリと、
を含む、システム。
【請求項４９】
前記光源が発光ダイオードである、請求項４８に記載のシステム。
【請求項５０】
前記第１および第２の検出器がフォトダイオードである、請求項４８に記載のシステム。
【請求項５１】
前記励起光ライトガイド、前記第１発光ライトガイド、および第２発光ライトガイドが光ファイバである、請求項４８に記載のシステム。
【請求項５２】
前記ハウジングが前記窓で終わる先細りのチューブを具備する、請求項４８に記載のシステム。
【請求項５３】
前記選択的透過膜が二酸化炭素を通す、請求項４８のシステム。
【請求項５４】
前記蛍光種がセミナフトフルオレセイン／ヒト血清アルブミン複合体を含む、請求項４８のシステム。
【請求項５５】
前記チップ部材が、密封容器に穴を開けるためのスパイクを具備する、請求項４８に記載のシステム。
【国際調査報告】
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