(57)【要約】  本発明は、特に糖尿病モデルにおける創傷治癒の改善におけるＨＭＧＢ１の役割を記載する。グリシルリチンの効果、糖尿病患者の皮膚及び線維芽細胞におけるＨＭＧＢ１の低下した発現、糖尿病マウスの皮膚におけるＲＡＧＥの蓄積、並びに正常及び糖尿病のヒト細胞に対するＨＭＧＢ１の化学誘導効果に基づく他の証拠は、特に糖尿病患者における創傷の治癒に特異的に向けられた医薬の調製のために、ＨＭＧＢ１が有利に利用できることを示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
創傷治癒のための医薬の調製のための、ＨＭＧＢ１またはその薬理学的に活性な類似体若しくは誘導体の使用。
【請求項２】
糖尿病患者の創傷治癒のための医薬の調製のための、ＨＭＧＢ１またはその薬理学的に活性な類似体若しくは誘導体の使用。
【請求項３】
創傷治癒に有効であるが炎症を誘導しない量のＨＭＧＢ１またはその活性な類似体若しくは誘導体、並びに希釈液及び／または皮膚軟化剤及び／またはアジュバント及び／または賦形剤を含む、請求項１または２に記載の使用のための製薬組成物。
【請求項４】
局所的使用のための、請求項３に記載の製薬組成物。
【請求項５】
更に別の薬理学的な活性化合物を含む、請求項３に記載の製薬組成物。
【請求項６】
前記薬理学的な活性化合物が抗炎症性化合物である、請求項５に記載の製薬組成物。
【請求項７】
請求項３から６のいずれか一項に記載の製薬組成物と固体の支持体とを必須に含む医薬パッチ。
【請求項８】
化粧品製品の調製のための、ＨＭＧＢ１またはその薬理学的に活性な類似体若しくは誘導体の使用。
【請求項９】
美容的に有効であるが炎症を誘導しない量のＨＭＧＢ１またはその活性な類似体若しくは誘導体、並びに希釈液及び／または皮膚軟化剤及び／またはアジュバント及び／または賦形剤を含む化粧品製剤。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
慢性の潰瘍及び損傷組織の修復は、主な健康の問題を占める。従来の治療アプローチは、慢性の潰瘍における十分な治癒を保障するのには十分でなく、再発が頻繁に生じる。創傷治癒は、数多くの細胞タイプの総合的な相互作用に関与し、炎症、増殖、及び再構築の三段階によって特徴付けられる（非特許文献１）。これらの現象は、線維芽細胞増殖因子ファミリー（ＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦアルファ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子ＢＢ（ＰＤＧＦ ＢＢ）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、単球化学誘導タンパク質１（ＭＣＰ−１）を含む数多くの増殖因子及びサイトカインによって刺激される（非特許文献２）。
【０００２】
糖尿病では、創傷治癒の段階を脱調節化する数多くの証拠が存在し、創傷への炎症性細胞の化学走性の減少が、有効な創傷修復のための重要な増殖因子の利用可能性の低減を導く。更に、抹消血管疾患の最終的な共存と共に、過剰なプロテアーゼの活性と増大した微生物の負荷が、糖尿病患者における創傷治癒を妨げる。
【０００３】
ＨＭＧＢ１は、炎症前サイトカインに応答して単球−マクロファージから、及び壊死細胞から放出される新たなサイトカインである（非特許文献６−８）。細胞外ＨＭＧＢ１は、血管接着分子の発現、並びにサイトカイン（ＴＮＦアルファ）及びケモカイン（ＩＬ８及びＭＣＰ−１）の分泌を増大することにより、内皮細胞における炎症前応答を誘導する（非特許文献９）。ＨＭＧＢ１の効果は、イムノグロブリンスーパーファミリーのマルチリガンドレセプターである、進化したグリケーション産物に対するレセプター（ＲＡＧＥ）への結合によって介在されることが、いくつかの一連の証拠により明らかとなっている。最近、ＨＭＧＢ１及びそのレセプターＲＡＧＥが、平滑筋細胞及び血管会合性幹細胞（血管間芽細胞）の移動及び増殖を誘導することが示されている（非特許文献１０，１１）。国際特許出願WO2004/004763は、特に心筋及び骨格筋の組織損傷の治療におけるＨＭＧＢ１の使用を開示している。しかしながらこの出願は、損傷の修復が必須の関連性を有する糖尿病患者におけるＨＭＧＢ１の有利な使用に関するいずれの証拠も提供していない。更に、前記分子の炎症性活性を考慮して、創傷治癒のためにＨＭＧＢ１を試験することは、当該技術分野で示唆されていない。
【特許文献１】WO2004/004763
【非特許文献１】Martin, P. (1997) Science 276, 75-81
【非特許文献２】Gillitzer, R. & Goebeler, M. (2001) J Leukoc Biol 69, 513-21
【非特許文献３】Doxey, D.L., Ng, M.C., Dill, R.E. & Iacopino, A.M. (1995) Life Sci 57, 1111-23
【非特許文献４】Shaw, J.E. & Boulton, A.J. (1997) Diabates 46 Suppl 2, S58-61
【非特許文献５】Werner, S., Breeden, M., Hubner, G., Greenhalgh, D.G. & Longaker, M.T. (1994) J Invest Dermatol 103, 469-73
【非特許文献６】Andersson, U., Wang, H., Palmblad, K., Aveberger, A.C., Bloom, O., Erlandsson-Harris, H., Janson, A., Kokkola, R., Zhang, M., Yang, H. & Tracey, K.J. (2000) J Exp Med 192, 565-70
【非特許文献７】Scaffidi, P., Misteli, T. & Bianchi, M.E. (2002) Nature 418, 191-5
【非特許文献８】Wang, H., Vishnubhakat, J.M., Bloom, O., Zhang, M., Ombrellino, M., Sama, A. & Tracey, K.J. (1999) Surgery 126, 389-92
【非特許文献９】Fiuza, C., Bustin, M., Talwar, S., Tropea, M., Gerstenberger, E., Shelhamer, J.H. & Suffredini, A.F. (2003) Blood 101, 2652-60
【非特許文献１０】Degryse, B., Bonaldi, T., Scaffidi, P., Muller, S., Resnati, M., Sanvito, F., Arrigoni, G. & Bianchi, M.E. (2001) J Cell Biol 152, 1197-206
【非特許文献１１】Palumbo, R., Sampaolesi, M., De Marchis, F., Tonlorenzi, R., Colombetti, S., Mondino, A., Cossu, G. & Bianchi, M.E. (2004) J Cell Biol 164, 441-9, Epub 2004 Jan 26
【非特許文献１２】Sakamoto, R., Okano, M, Takena, H. & Ohtsuki, K. (2001) Biol Pharm Bull 24, 906-11
【非特許文献１３】Muller S, Bianchi ME, Knapp S, Termodynamics of HMGB1 interaction with duplex DNA. Biochemistry. 2001; 40: 10254-61
【非特許文献１４】Boukamp P, Petrussevska RT, Breitkreutz D, Hornung J, Markham A & Fusenig NE. J. Cell Biol. 1988; 106: 761-771
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明では、本出願人は以下の事柄を見出した：
ｉ）ＨＭＧＢ１が、特に糖尿病の動物モデルにおいて創傷治癒を改善する；
ｉｉ）ＨＭＧＢ１インヒビターであるグリシルリチンが、正常なマウスにおける創傷治癒を低減する；
ｉｉｉ）ＨＭＧＢ１が、糖尿病マウスの皮膚及び糖尿病患者の線維芽細胞において低下して発現される；
ｉｖ）ＨＭＧＢ１レセプターであるＲＡＧＥが、糖尿病マウスの皮膚において蓄積する；及び
ｖ）ＨＭＧＢ１が、ヒトの正常な及び糖尿病の線維芽細胞及びケラチノサイトに対して化学誘導効果を有する。それ故前記分子は、特に糖尿病患者のための創傷治癒に特異的に向けられた医薬の調製のために有利に利用できる。 
【課題を解決するための手段】
【０００５】
かくして本発明の一つの目的は、創傷治癒のための医薬の調製のための、ＨＭＧＢ１またはその薬理学的に活性な類似体若しくは誘導体の使用である。本発明では、創傷治癒は、潰瘍、静脈潰瘍、圧潰瘍、火傷治癒、及びいずれかの他の創傷ケア処理を含む。
【０００６】
本発明の組成物は、適当な濃度、投与、及び投与量形態を選択することにより調製されて良い。好ましい投与形態は、オイル、軟膏、スプレーフォーム、クリーム、並びに局所的使用のための医薬パッチとしての固体の支持体上を含む。適切な希釈液、皮膚軟化剤、アジュバント、賦形剤、並びに任意にマルチドラッグ組成物を得るための他の薬理学的な活性化合物が利用される。好ましい薬理学的な活性化合物は抗炎症剤である。本発明の組成物はまた、例えば抗老化クリームまたは漿液のような再生製品の調製のために化粧品分野でも利用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、添付の図面を参考にして、非制限的な実施例によりここで記載されよう。
【実施例】
【０００８】
材料と方法
動物の創傷モデル
雄のＣＤ１マウスをCharles River (Calco, LC, Italy)から得た。５日の連続期間１．２ｍｇ／３０ｇの体重／日でのストレプトゾトシン(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)の腹膜内注射により、マウスを糖尿病とした。７日後血糖値を測定し、２００から４００ｍｇ／ｄｌの血糖値を有する動物を更なる研究のために選択した。２．５％Avertin(１００％Avertin：１０ｇの２,２,２−トリブロモエチルアルコールと１０ｍｌのｔｅｒｔ−アミルアルコール、Sigma)の腹膜内注射でマウスに麻酔をかけた。その背面を毛髪がないように刈り取り、３．５ｍｍの直径の十分な厚みの創傷を生検パンチで形成した。
【０００９】
薬剤処理
創傷形成直後で、２０μｌの塩水溶液中の２００ｎｇ、４００ｎｇ、または８００ｎの純粋タンパク質（非特許文献１３）を注射することにより、創傷領域に直接ＨＭＧＢ１処理を実施した。コントロール群は創傷に２０μｌの塩水溶液を受けた。グリシルリチン、ＧＬ（非特許文献１２）を、創傷形成後第０〜１４日目に二日おきに創傷領域に局所投与した。各投与で使用された濃度は、３０μｌのＰＢＳ中に２５０μｇ／マウスであった。コントロールマウスはビヒクル（ＰＢＳ）を受けた。
【００１０】
マウスにおける創傷閉塞速度の測定
創傷形成後第０，３，５，６，７，１０，及び１４日目で動物の写真を撮影した。画像をデジタル加工し、ＫＳ３００システム(Zeiss, Jena GmbH, Germany)を使用して創傷の領域を計算した。各サンプルについて、創傷閉塞のパーセンテージを割合として計算した：
（１−各時点での創傷領域／時間０での創傷）×１００
【００１１】
時間０は創傷形成直後の時点である。各群は６から１０の動物を含んだ。結果は平均±標準誤差として表される。二つの測定値の統計的な有意性は、ペアリングしないスチューデントｔ検定によって評価された。
【００１２】
マウスとヒトの皮膚の免疫組織学的分析
ヒトの皮膚の生検とマウスの皮膚組織から得られた切片（３μｍの厚み）を脱パラフィン化し、マイクロウェーブでの短時間の処理の後、ＰＢＳですすぎ、０．０３％Ｈ２Ｏ２を含むメタノールの溶液で２０分間室温でインキュベートし、５％ＢＳＡ中の１０％ウサギまたはヤギ血清で１時間ブロックし、ウサギポリクローナル抗ＨＭＧＢ１抗体（１μｇ／ｍｌBD Pharmingen)で４℃で一晩インキュベートした。ビオチン化二次抗体（７．５μｇ／ｍｌ、Vector Laboratories）とアビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体（ABC Elite Kit, Vector Laboratories）とのインキュベーションで、ＨＭＧＢ１の検出を実施した。０．１Ｍ ＰＢＳ中の０．０５％の３−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）と０．０１％Ｈ２Ｏ２との溶液における１０分間の処理により染色を視覚化した。核を同定するために切片をヘマトキシリンで濃縮した。
【００１３】
マウス及びヒトサンプルのウエスタンブロット分析
摘出した創傷、内転骨格筋、または培養線維芽細胞を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ４０、１％デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ、１０％グリセロール、及びプロテアーゼインヒビターを含むＲＩＰＡバッファーに溶解した。等量の全細胞タンパク質（１００μｇ／レーン）を、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分解し、ニトロセルロース膜（Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK）にトランスファーした。特異的抗体（１μｇ／ｍｌ抗ＨＭＧＢ１；０,４μｇ／ｍｌ抗ＲＡＧＥ、及び０．１μｇ／ｍｌ抗アルファ−チューブリンＭＡｂ）、その後セイヨウワサビペルオキシダーゼ接合二次抗体で膜をプローブし、化学発光ベースの検出システム（ECL, Amersham Pharmacia Biotech）によって発色した。
【００１４】
患者の生検
Local Ethical Committeeの承認とインフォームドコンセントへのサインの後、局所麻酔下での外科的切開部の先端から、通常の手術を受けている正常な患者とＩＩ型糖尿病患者の両者から生検を得た（ｎ＝４）。同様に、糖尿病患者における足部潰瘍病変の先端からも生検を得た（ｎ＝２）。
【００１５】
ヒト線維芽細胞の単離と培養
線維芽細胞の単離のため、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ, Euroclone Inc., Milan, Italy）、２０ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（Gibco BRL, Paisley, UK）を含む６ｍｍの直径の組織培養皿に生検を蒔いた。７−１０日後に体外培養物から線維芽細胞が増殖し始め、３−５週以内にコンフルエントとなり、化学走性アッセイのため２−３世代で使用した。
【００１６】
ケラチノサイトの培養
Ｈａｃａｔヒト細胞を、非特許文献１４にしたがって得た。
【００１７】
化学走性アッセイ
げっ歯類コラーゲンタイプＩＶ(Costar Scientific Corporation, Cambridge, MA, USA)で被覆された８μｍの孔サイズのポリカーボネートフィルター(Costar Scientific Corporation, Cambridge, MA, USA)を使用して、４８のマイクロウェルの化学走性チェンバー(Neuroprobe, Cabin John, MD)で化学走性を実施した。
【００１８】
各チェンバーの下部の区画を、０．１％ＢＳＡを含む２８μｌのＤＭＥＭで満たした。２００ｎｇ／ｍｌの濃度でＨＭＧＢ１を添加し、ＰＤＧＦ（１５ｎｇ／ｍｌ）とＢＳＡをそれぞれ移動のネガティブ及びポジティブコントロールとして使用した。上部の区画の各ウェルは、ヒト線維芽細胞またはケラチノサイト（０．４×１０６細胞／ｍｌ）のそれぞれを含む、０．１％ＢＳＡを有する５０μｌのＤＭＥＭで満たした。各時点で三重に実施した。５％ＣＯ２の湿った雰囲気下で３７℃で４時間後、化学走性アッセイを停止し、フィルター上の細胞を固定し、Diff Quik (Dade AG, Dudingen, Switzerland)を使用して染色した。フィルターの上部表面の５のランダムな視野の細胞を４０倍の倍率でカウントし、（化学誘導剤の存在下で移動した細胞数）／（０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭに応答して移動した細胞数）による計算で移動指数を算出した。
【００１９】
結果
正常及び糖尿病のマウスにおける創傷治癒に対するＨＭＧＢ１の効果
創傷治癒に対するＨＭＧＢ１の役割を試験するために、正常及び糖尿病のＣＤ１マウスの背面に十分な厚みの裂傷を形成した。創傷形成の直後に裂傷の周辺にＨＭＧＢ１を注射した。創傷形成後の各種の時点で撮影した画像（代表例は図２Ａに示されている）のデジタル加工を通じて創傷領域の分析を実施した。創傷治癒の速度を閉塞のパーセンテージとして表す。図１に示されるように、ＨＭＧＢ１処理は正常のＣＤ１マウスにおいて創傷閉塞を増大した。非処理ＣＤ１マウスとＨＭＧＢ１処理ＣＤ１マウスの間の差異は、処理後５日目で有意であった（ｐ＜０．０３）。ＨＭＧＢ１処理群における増大した創傷閉塞に向けた傾向は、第３〜１０日目で評価された全ての時点で観察され、ＨＭＧＢ１処理マウスにおける創傷閉塞の改善を示した（図１）。同様に創傷形成の３日後で、塩水で処理されたマウスのコントロールと比較して、糖尿病マウスにおいてＨＭＧＢ１処理は有意に創傷閉塞を増大した：コントロールマウス；２４．６±１４％：ＨＭＧＢ１処理マウス（ｎ＝１０、ｐ＜０．０３）；４７．５±１５．８％。この効果は、第５日目（６６．５±１３％対５１±１６．７％；ｐ＜０．０２）、第６日目（７２．２±９％対６５．９±１２．２％；ｐ＜０．０３）で持続した（図２Ａ、Ｂ）。完全な創傷閉塞は両群で第１４日目に明らかであった。
【００２０】
創傷形成の３日後で、より高い投与量（２０μｌ中に４００ｎｇ）のＨＭＧＢ１が、より低投与量（２００ｎｇ）と比較してより大きな創傷閉塞を誘導したことを本出願人は見出した（図２Ｃ）。８００ｎｇで投与したＨＭＧＢ１は、２００ｎｇの投与量と同じ効果を生じた（図１Ｃ）。興味深いことに、正常及び糖尿病マウスを比較すると、糖尿病のＨＭＧＢ１処理マウスは、正常なＨＭＧＢ１処理ＣＤ１マウスより好適に治癒したことを本出願人は見出した（図３）。創傷形成の３日後で、創傷閉塞のパーセンテージは、ＨＭＧＢ１処理糖尿病マウス；４７．５±１５．８％であるのに対し、ＨＭＧＢ１処理正常マウス；３０．５±８．５％（ｐ＜０．０１）で、塩水処理正常マウス；２３．５±１１．２％（ｐ＜０．００３）であった（図３）。
【００２１】
正常及び糖尿病マウスにおける創傷閉塞に対するＨＭＧＢ１インヒビター、グリシルリチンの効果
創傷閉塞に対するＧＬ（非特許文献１２）の効果を、正常及び糖尿病マウスで試験した。創傷形成後第０〜１４日で二日ごとにマウスの全裂傷に局所的にＧＬを投与した。コントロールマウスはビヒクル（ＰＢＳ）を受けた（図４Ａ、Ｂ）。ＧＬの投与は創傷閉塞の低下を示したことを観察した（図４Ａ，Ｂ）。第３日目で、ＰＢＳ及びＧＬ処理マウスにおいて、創傷の初期サイズのそれぞれ２３±２％及び１５±３．５％まで創傷領域は減少した。コントロール及びＧＬ処理マウスの間の創傷閉塞の差異は、第５日目で５５．２±３％対３８．７±６％、第６日目で７４．２±２．４％対６１．２±５．９％、及び第７日目で８３．２４±１．７％対７３．３±４．５％（それぞれコントロール対ＧＬ処理群）まで減少した創傷領域で統計的に有意となった。（図４）。
【００２２】
図５に報告されている通り、グリシルリチン（創傷形成直後の創傷領域に一回の投与量で２５０μｇ）は、糖尿病マウスにおいて創傷閉塞を有意には変更せず、ＨＭＧＢ１が糖尿病マウスの創傷において自発的に放出されていないことを示唆した。
【００２３】
正常及び糖尿病のマウスの皮膚におけるＨＭＧＢ１の局在
糖尿病ＣＤ１マウスの背面に形成した十分な厚みの裂傷から得たサンプルに対して、免疫組織学的分析を実施した。正常及び糖尿病のマウスの皮膚から得た真皮及び上皮細胞の核において、ＨＭＧＢ１を検出した。創傷形成後５日で、正常及び糖尿病の皮膚の両者における全ての細胞タイプの細胞質において、ＨＭＧＢ１が局在した（図６Ａ）。
【００２４】
正常及び糖尿病マウスの皮膚におけるＨＭＧＢ１及びそのレセプター（ＲＡＧＥ）の発現
ウエスタンブロット分析により、０日目で正常及び糖尿病のＣＤ１マウスの間でＨＭＧＢ１レベルにおける有意な差異は明らかではなかった。対照的に、皮膚のパンチングの３〜７日目で、正常なマウスから得た皮膚と比較して、糖尿病のマウスから得た皮膚において、より低いレベルのＨＭＧＢ１が検出された（図６Ｂ）。０日目で正常な皮膚と比較して糖尿病の皮膚において、ＲＡＧＥの発現はより高く、創傷形成後３及び５日目で糖尿病の皮膚のマウスで強く蓄積した（図６Ｂ）。興味深いことに、ＲＡＧＥの蓄積は、糖尿病マウスの骨格筋組織では存在しなかった（図７）。
【００２５】
正常及び糖尿病患者の創傷形成皮膚におけるＨＭＧＢ１の局在と発現
正常及び糖尿病の患者から得た皮膚生検において、ＨＭＧＢ１の分布を分析した。正常及び糖尿病のマウスの皮膚で観察されたものと同様に、正常及び糖尿病のヒトの皮膚の間でＨＭＧＢ１の分布は同様であり、上皮及び真皮細胞の両者の核に制限されていることが、免疫組織学的分析により明らかにされた（図８Ａ）。ＨＭＧＢ１の分布が慢性の非治癒創傷で改変されるかを調べるために、ヒトの糖尿病患者の潰瘍の先端から皮膚生検を採取した。非治癒潰瘍では、上皮及び真皮細胞の両者の細胞質にＨＭＧＢ１は局在した。
【００２６】
次いで、全細胞皮膚抽出物、並びに正常及び糖尿病のヒトの皮膚から得た線維芽細胞のＨＭＧＢ１含量を、ウエスタンブロット分析により評価した。同様なレベルのＨＭＧＢ１が、ヒトの正常及び糖尿病細胞皮膚抽出物で検出された。しかしながら、ヒトの糖尿病線維芽細胞においては、ＨＭＧＢ１含量が有意に減少した。
【００２７】
ヒト繊維芽細胞及びケラチノサイト移動に対するＨＭＧＢ１の効果
創傷内へのケラチノサイト及び線維芽細胞の移動の迅速な誘導は、組織修復のために必要である。ヒトケラチノサイトおよび線維芽細胞の移動が、マルチウェル化学走性チェンバーにおいてＨＭＧＢ１に応答して改変されるかどうかを本出願人は調べた。この実験の実験条件下では、正常及び糖尿病の線維芽細胞（図９Ａ，Ｂ）並びにケラチノサイト（ＨａＣａｔ細胞系、図９Ｃ）において、２００ｎｇ／ｍｌの濃度でＨＭＧＢ１が化学誘導効果を示した。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、正常なＣＤ１マウスにおける創傷治癒に対するＨＭＧＢ１の効果を示すグラフである。マウスは、塩水溶液または２００ｎｇのＨＭＧＢ１を含む２０μｌの溶液を創傷領域に直接受け取った。方法のセクションに示されたように創傷形成後の第０、３、５、６、７、１０、１４日目で、創傷閉塞のパーセンテージを計算した。データは平均±ＳＥＭであり、群当たりｎ＝１０のマウスである。ＨＭＧＢ１（２００ｎｇ）で処理されたマウスの創傷閉塞のパーセントは、第５日目で塩水で処理されたマウスにおけるものより有意に高かった。*ｐ＜０．０３対塩水処理群。二つの測定値の間の統計的な有意性は、ペアリングしないスチューデントｔ検定によって評価した。
【図２】図２は、糖尿病ＣＤ１マウスにおける創傷治癒に対するＨＭＧＢ１の効果を示す図である。５日の連続期間ストレプトゾトシン（１．２ｍｇ／マウス／日）の腹膜内注射により、マウスを糖尿病とした。マウスは、塩水またはＨＭＧＢ１（２００ｎｇ）溶液を創傷領域に直接受け取った。（Ａ）創傷形成後の第０（創傷形成直後）〜６日目で写真を撮影した。（Ｂ）方法のセクションに示されたように創傷形成後の第０、３、５、６、７、１０、１４日目で、創傷閉塞のパーセンテージを計算した。データは平均±ＳＥＭであり、群当たりｎ＝６のマウスである。ＨＭＧＢ１（２００ｎｇ）で処理された糖尿病マウスの治癒速度は、塩水で処理された糖尿病マウスにおけるものより有意に高かった。*ｐ＜０．０３対塩水処理群。二つの測定値の間の統計的な有意性は、ペアリングしないスチューデントｔ検定によって評価した。（Ｃ）糖尿病マウスにおける創傷閉塞に対するＨＭＧＢ１（２００，４００，及び８００ｎｇ）の濃度増大の効果。方法のセクションに示されたように創傷形成後の第０、３、５、６、７、１０、１４日目で、創傷閉塞のパーセンテージを計算した。データは平均±ＳＥＭであり、群当たりｎ＝１０のマウスである。*ｐ＜０．０５及び+ｐ＜０．０５はそれぞれ対塩水処理群及びＨＭＧＢ１ ２００ｎｇ。
【図３】図３は、正常及び糖尿病ＣＤ１マウスにおける創傷治癒に対するＨＭＧＢ１の効果を比較するグラフである。５日の連続期間ストレプトゾトシン（１．２ｍｇ／マウス／日）の腹膜内注射により、マウスを糖尿病とした。マウスは、塩水またはＨＭＧＢ１（２００ｎｇ）溶液を創傷領域に直接受け取った。方法のセクションに示されたように創傷形成後の第０、３、５、６、７、１０、１４日目で、創傷閉塞のパーセンテージを計算した。データは平均±ＳＥＭであり、群当たりｎ＝１０のマウスである。*ｐ＜０．０１対全ての処理；#ＨＭＧＢ１及び糖尿病ＨＭＧＢ１対塩水ｐ＜０．０５。
【図４】図４は、正常ＣＤ１マウスにおける創傷治癒に対するグリシルリチンの効果を示す図である。マウスは、塩水またはグリシルリチン（３０μｌのＰＢＳ中に２５０μｇ／マウス）溶液を創傷領域に直接受け取った。（Ａ）創傷形成後の第０（創傷形成直後）〜７日目で写真を撮影した。（Ｂ）方法のセクションに示されたように創傷形成後の第０、３、５、６、７、１０、１４日目で、創傷閉塞のパーセンテージを計算した。データは平均±ＳＥＭであり、群当たりｎ＝１０のマウスである。グリシルリチンで処理された糖尿病マウスの治癒速度は、塩水で処理されたマウスにおけるものより有意に高かった。*ｐ＜０．０５対グリシルリチン処理群。統計的な有意性は、ペアリングしないスチューデントｔ検定によって評価した。
【図５】図５は、糖尿病ＣＤ１マウスにおける創傷治癒に対するグリシルリチンの効果を示すグラフである。５日の連続期間ストレプトゾトシン（１．２ｍｇ／マウス／日）の腹膜内注射により、マウスを糖尿病とした。マウスは、塩水またはグリシルリチン（３０μｌのＰＢＳ中に２５０μｇ／マウス）溶液を創傷領域に直接受け取った。方法のセクションに示されたように創傷形成後の第０、３、５、６、７、１０、１４日目で、創傷閉塞のパーセンテージを計算した。データは平均±ＳＥＭであり、群当たりｎ＝９のマウスである。二つの群の間で統計的な有意性は観察されなかった。
【図６】図６は、正常及び糖尿病ＣＤ１マウスの創傷形成皮膚におけるＨＭＧＢ１の局在と発現を示す図である。５日の連続期間ストレプトゾトシン（１．２ｍｇ／マウス／日）の腹膜内注射により、マウスを糖尿病とした。創傷形成前（左図）及び創傷形成後第５日目（右図）の、正常及び糖尿病（ｄｂ）マウス皮膚におけるＨＭＧＢ１免疫組織学的分析。（Ｂ）創傷形成後第０，３，５，及び７日目の正常及び糖尿病マウス皮膚におけるＨＭＧＢ１及びＲＡＧＥのウエスタンブロット分析。同じフィルターをα−チューブリンＭａｂでプローブし、タンパク質濃度を標準化した。
【図７】図７は、２月齢の正常及び糖尿病ＣＤ１マウスの骨格筋及び皮膚におけるＨＭＧＢ１及びＲＡＧＥウエスタンブロット分析を示す図である。５日の連続期間ストレプトゾトシン（１．２ｍｇ／マウス／日）の腹膜内注射により、マウスを糖尿病とした。同じフィルターをα−チューブリンＭａｂでプローブし、タンパク質濃度を標準化した。
【図８】図８は、糖尿病患者の正常及び創傷形成皮膚におけるＨＭＧＢ１の局在及び発現を示す図である。（Ａ）正常なヒトの皮膚（左図）、糖尿病の皮膚（中央図）、及び糖尿病性潰瘍の皮膚（右図）におけるＨＭＧＢ１免疫組織学的分析。（Ｂ）正常（Ｎ）及び糖尿病（Ｄ）の皮膚及び線維芽細胞におけるＨＭＧＢ１ウエスタンブロット分析。同じフィルターをα−チューブリンＭａｂでプローブし、タンパク質濃度を標準化した。
【図９】図９は、ヒト線維芽細胞及びケラチノサイトの移動に対するＨＭＧＢ１の効果を示す図である。正常（Ａ）及び糖尿病（Ｂ）の線維芽細胞をヒトの生検から得た。０．４×１０６細胞／ｍｌを、修飾Boydenチェンバーの上部区画に配置した。ＨＭＧＢ１（２００ｎｇ／ｍｌ）またはＰＤＧＦ（１５ｎｇ／ｍｌ）を下部区画に添加し、３７℃で６時間インキュベートした。（Ｃ）Ｈａｃａｔ細胞をＡＴＣＣから得て、（Ａ−Ｂ）に記載されたように移動実験を実施した。Giemsa溶液での染色後、５のランダムな顕微鏡視野（４０×）で核をカウントすることにより、移動した細胞を定量した。データは移動指数（ＨＭＧＢ１またはＰＤＧＦの不存在下での移動した細胞の数に対する移動した細胞の数の倍の増大）を表し、三重で実施した少なくとも４の独立の実験の平均±ＳＤである。統計的な有意性は、ペアリングしないスチューデントｔ検定によって評価した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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