(57)【要約】マイクロアレイに基づく一塩基多型、配列決定、および遺伝子発現アッセイ方法が開示される。具体的には、ハイブリダイズ条件下で、複数のタグ付加標的および複数の検出配列を含むハイブリダイズ溶液に、マイクロアレイを接触させることにより、複数のハイブリダイズした構造が形成されるマイクロアレイデバイスを用いた方法が開示される。各ハイブリダイズした構造の検出配列は、伸長ライゲーション溶液および伸長ライゲーション条件を用いて伸長される。伸長の後、プローブの末端ヌクレオチドがハイブリダイズしたタグ付加標的に相補的であれば、プローブへの伸長した配列のライゲーションが起こる。非結合材料は、洗浄溶液および洗浄方法の使用により除去される。どのプローブが検出配列にライゲーションしたかによって、タグ付加標的の標的ヌクレオチドおよび標的配列が判定される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、マイクロアレイに基づく、一塩基多型、配列決定、および遺伝子発現アッセイ方法:
(a)複数のプローブを有するマイクロアレイを提供する工程; 
(b) マイクロアレイ上に複数のハイブリダイズした構造を形成させる工程、ここで、各ハイブリダイズした構造は、マイクロアレイをハイブリダイズ条件下で、複数のタグ付加標的および複数の検出配列を含むハイブリダイズ溶液と接触させることにより形成され、ここで各ハイブリダイズした構造は１つのプローブおよび１つの検出配列にハイブリダイズした１つのタグ付加標的を含む;
(c)各ハイブリダイズした構造を伸長ライゲーション溶液を用いて伸長させる工程;
(d)標的ヌクレオチドに相補的な末端ヌクレオチドを有する各ハイブリダイズした構造を伸長ライゲーション溶液を用いてライゲーションする工程;
(e)マイクロアレイを洗浄溶液を用いて洗浄することにより非結合材料を除去する工程;および、
(f)ライゲーションを有するハイブリダイズした構造から標的ヌクレオチドおよびハイブリダイズした配列を同定する工程。
【請求項２】
複数のプローブが、プローブ DNA、プローブ RNA、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項 1の方法。
【請求項３】
複数のプローブがスペーサーによりマイクロアレイに結合している、請求項 1の方法。
【請求項４】
複数のタグ付加標的が、タグ付加標的 DNA、タグ付加標的 RNA、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項 1の方法。
【請求項５】
タグ付加標的 DNAがcDNAである、請求項 3の方法。
【請求項６】
タグ付加標的 RNAが mRNAである、請求項 3の方法。
【請求項７】
複数のタグ付加標的が最初に増幅される、請求項 1の方法。
【請求項８】
複数の検出配列が、検出配列 DNA、検出配列 RNA、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項 1の方法。
【請求項９】
複数の検出配列が蛍光タグを有する、請求項 1の方法。
【請求項１０】
複数のタグ付加標的および複数のプローブがハイブリダイズさせた場合におよそ５未満の内部ミスマッチを有し、複数のタグ付加標的および複数の検出配列がハイブリダイズさせた場合におよそ５未満の内部ミスマッチを有する、請求項 1の方法。
【請求項１１】
ハイブリダイズ溶液が、1 X T4 リガーゼバッファーを含むバッファー溶液中に複数のタグ付加標的および複数の検出配列を含み、ハイブリダイズ条件がおよそ 45℃でおよそ１時間を含む、請求項 1の方法。
【請求項１２】
伸長ライゲーション溶液が、水、バッファー、三リン酸混合物、ポリメラーゼ、およびリガーゼを含む処方を含む、請求項 1の方法。 
【請求項１３】
ポリメラーゼが、DNA ポリメラーゼおよびRNA ポリメラーゼ、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項 12の方法。
【請求項１４】
ポリメラーゼが、Taq ポリメラーゼストッフェルフラグメント、逆転写酵素、大腸菌 DNA ポリメラーゼ、クレノウ断片ポリメラーゼ、T7 RNA ポリメラーゼ、T3 RNA ポリメラーゼ、ウイルスレプリカーゼおよびSP6 RNA ポリメラーゼ、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項 12の方法。
【請求項１５】
バッファーが、T4 DNA リガーゼバッファーおよびT4 RNA リガーゼバッファー、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項 12の方法。
【請求項１６】
リガーゼが、大腸菌 DNA リガーゼ、T4 DNA リガーゼ、およびT4 RNA リガーゼ、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項 12の方法。
【請求項１７】
三リン酸混合物がdNTPおよびrNTPからなる群から選択される、請求項 12の方法。
【請求項１８】
以下を含む、マイクロアレイに基づく、一塩基多型、配列決定、および遺伝子発現アッセイ方法: 
(a)複数のプローブ DNAを有するマイクロアレイを提供する工程; 
(b)マイクロアレイ上に複数のハイブリダイズした構造 DNAを形成させる工程、ここで、各ハイブリダイズした構造 DNAは、マイクロアレイをハイブリダイズ条件下で、複数のタグ付加標的 DNAおよび複数の検出配列 DNAを含むハイブリダイズ溶液と接触させることにより形成され、ここで各ハイブリダイズした構造 DNAは１つのプローブ DNAおよび１つの検出配列 DNAにハイブリダイズした１つのタグ付加標的 DNAを含む;
(c)各ハイブリダイズした構造 DNAを伸長ライゲーション溶液を用いて伸長させる工程;
(d)標的ヌクレオチド DNAに相補的な末端ヌクレオチド DNAを有する各ハイブリダイズした構造 DNAを伸長ライゲーション溶液を用いてライゲーションする工程;
(e)マイクロアレイを洗浄溶液を用いて洗浄することにより非結合材料を除去する工程;および、
(f)ライゲーションを有するハイブリダイズした構造から標的ヌクレオチド DNAおよびハイブリダイズした配列 DNAを同定する工程。
【請求項１９】
複数のプローブ DNAがスペーサーによってマイクロアレイに結合している、請求項 18の方法。
【請求項２０】
タグ付加標的 DNAが cDNAである、請求項 18の方法。
【請求項２１】
タグ付加標的 DNAが最初に増幅される、請求項 18の方法。
【請求項２２】
増幅が PCRによる、請求項 21の方法。
【請求項２３】
複数の検出配列 DNAが蛍光タグを有する、請求項 18の方法。
【請求項２４】
複数のタグ付加標的 DNAおよび複数のプローブ DNAがハイブリダイズさせた場合に５未満の内部ミスマッチを有し、複数のタグ付加標的 DNAおよび複数の検出配列 DNAがハイブリダイズさせた場合におよそ５未満の内部ミスマッチを有する、請求項 18の方法。
【請求項２５】
ハイブリダイズ溶液が1 X T4 リガーゼバッファーを含むバッファー溶液中に複数のタグ付加標的 DNAおよび複数の検出配列 DNAを含み、ハイブリダイズ条件がおよそ 45℃でおよそ １時間を含む、請求項 18の方法。
【請求項２６】
伸長ライゲーション溶液が、水、バッファー、dNTP、ポリメラーゼ、およびリガーゼを含む処方を含む、請求項 18の方法。
【請求項２７】
ポリメラーゼが DNA ポリメラーゼである、請求項 26の方法。
【請求項２８】
DNA ポリメラーゼが、Taq ポリメラーゼストッフェルフラグメント、逆転写酵素、大腸菌ポリメラーゼ、およびクレノウ断片ポリメラーゼ、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項 27の方法。
【請求項２９】
バッファーが大腸菌リガーゼバッファーを含み、リガーゼが大腸菌リガーゼを含む、請求項 26の方法。
【請求項３０】
バッファーがT4 リガーゼバッファーを含み、リガーゼがT4 DNA リガーゼを含む、請求項 34の方法。
【請求項３１】
複数のプローブ DNAが複数のマッチプローブ DNAおよび複数のミスマッチプローブ DNAを含み、複数のハイブリダイズした構造 DNAが複数のマッチ構造および複数のミスマッチ構造を含む、請求項 18の方法。
【請求項３２】
複数のプローブ DNAが複数のセットプローブを含み、複数のハイブリダイズした構造 DNAが複数のセット構造を含む、請求項 18の方法。
【請求項３３】
複数のプローブ DNAが複数の連続配列プローブを含み、複数のハイブリダイズした構造 DNAが複数の連続配列構造を含む、請求項 18の方法。
【請求項３４】
複数のプローブ DNAが複数の遺伝子発現プローブを含み、複数のハイブリダイズした構造 DNAが複数の遺伝子発現構造を含む、請求項 18の方法。
【請求項３５】
以下を含む、マイクロアレイに基づく、一塩基多型、配列決定、および遺伝子発現アッセイ方法: 
(a)複数のプローブ DNAを有するマイクロアレイを提供する工程; 
(b)マイクロアレイ上に複数のハイブリダイズした構造 DNA/RNAを形成させる工程、ここで各ハイブリダイズした構造 DNA/RNAは、マイクロアレイをハイブリダイズ条件下で、複数のタグ付加標的 RNAおよび複数の検出配列 DNAを含むハイブリダイズ溶液に接触させることにより形成され、ここで各ハイブリダイズした構造 DNA/RNA は１つのプローブ DNAおよび１つの検出配列 DNAにハイブリダイズした１つのタグ付加標的 RNAを含む;
(c)伸長ライゲーション溶液および伸長ライゲーション条件を用いて各ハイブリダイズした構造 DNA/RNAを伸長させる工程;
(d)標的ヌクレオチド RNAに相補的な末端ヌクレオチド DNAを有する各ハイブリダイズした構造 DNA/RNAを伸長ライゲーション溶液および伸長ライゲーション条件を用いてライゲーションする工程;
(e)マイクロアレイを洗浄溶液および洗浄方法を用いて洗浄することにより非結合材料を除去する工程;および、
(f)ライゲーションを有するハイブリダイズした構造から標的ヌクレオチド RNAおよびハイブリダイズした配列 RNAを同定する工程。
【請求項３６】
複数のプローブがスペーサーによりマイクロアレイに結合している請求項 35の方法。
【請求項３７】
タグ付加標的 RNAが mRNAである、請求項 35の方法。
【請求項３８】
複数の検出配列 DNAが蛍光タグを有する、請求項 35の方法。
【請求項３９】
複数のタグ付加標的 RNAおよび複数のプローブ DNAがハイブリダイズさせた場合に５未満の内部ミスマッチを有し、複数のタグ付加標的 RNAおよび複数の検出配列 DNAがハイブリダイズさせた場合におよそ５未満の内部ミスマッチを有する、請求項 35の方法。
【請求項４０】
ハイブリダイズ溶液が、1 X T4 リガーゼバッファーを含むバッファー溶液中に複数のタグ付加標的 RNAおよび複数の検出配列 DNAを含み、ハイブリダイズ条件がおよそ 45℃でおよそ１時間を含む、請求項 35の方法。
【請求項４１】
伸長ライゲーション溶液が、水、バッファー、dNTP、ポリメラーゼを含む、請求項 35の方法。
【請求項４２】
ポリメラーゼが逆転写酵素である、請求項 41の方法。
【請求項４３】
バッファーが大腸菌リガーゼバッファーを含み、リガーゼが大腸菌リガーゼを含む、請求項 41の方法。
【請求項４４】
バッファーがT4 リガーゼバッファーを含み、リガーゼがT4 DNA リガーゼを含む、請求項 41の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、いずれもマイクロアレイデバイスを用いた、一塩基多型(SNPs)の判定、目的の遺伝子または配列の配列決定、および遺伝子発現のための方法を提供する。より具体的には、本発明は、マイクロアレイデバイス上の核酸配列のハイブリダイゼーション、伸長、およびライゲーションのための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
マイクロアレイは、薬理学および生化学の研究および発見において重要な分析リサーチツールとなっている。マイクロアレイは、固体表面上の点の小型化したアレイである。表面は平面状であることもある。生体分子を含む分子が、マイクロアレイ上の特定の付着点にて付着またはインサイチュで(in situ)合成されうる。付着点は通常、行と列の形式にあるが、その他の形式が用いられることもある。マイクロアレイの利点は、数千ではないにしろ、数百もの実験を並行して行うことができる能力を提供することである。かかる並列処理を用いると、逐次の実験と比較して、化学構造のわずかな変動が顕著な生化学的効果をもたらしうる、分子構造と生理機能との間の関係の調査の有効性を増すことができる。マイクロアレイは様々な形式において利用でき、様々な表面化学特性を有する。かかる相違の結果、マイクロアレイ上に分子を付着または合成するためのアプローチも様々となる。表面化学における相違は、あらかじめ合成した化学種の付着を受ける表面の提供またはインサイチュでの化学種の合成のための調製方法における相違を導く。その名前が示唆するように、マイクロアレイ上の付着点はマイクロメータースケールであり、一般に1100μmである。
【０００３】
マイクロアレイを用いる研究は主に、デオキシリボ核酸 (DNA)およびリボ核酸 (RNA)に関連する領域、例えば、ゲノミクス、細胞遺伝子発現、一塩基多型 (SNP)、ゲノムDNA 検出およびバリデーション、機能的ゲノミクス、およびプロテオミクスに焦点が当てられている (Wilgenbus and Lichter、J. Mol. Med. 77:761、1999; Ashfari et al.、Cancer Res. 59:4759、1999; Kurian et al.、J. Pathol. 187:267、1999; Hacia、Nature Genetics 21 suppl.:42、1999; Hacia et al.、Mol. Psychiatry 3:483、1998; および Johnson、Curr. Biol. 26:R171、1998.)。DNA/RNA 研究のためのマイクロアレイに加えて、マイクロアレイは、ペプチド(２以上の結合した天然または合成アミノ酸)、低分子 (例えば、医薬用化合物)、オリゴマーおよびポリマーに関する研究に利用できる。
【０００４】
DNA 関連分子のマイクロアレイを調製する方法は非常に多く存在する。DNA 関連分子には、ネイティブまたはクローニングされた DNAおよび合成DNAが含まれる。合成の、比較的短い一本鎖 DNAまたはRNA 鎖が一般にオリゴヌクレオチド(オリゴ)と称され、これは、オリゴデオキシリボヌクレオチドと同義である。マイクロアレイの調製方法には以下のものが含まれる: (1)スポッティングロボットを用いた、調製した平面上への溶液のスポッティング; (2)インクジェットまたはその他の印刷技術を介した印刷試薬による、および、通常のホスホラミダイト化学を用いたインサイチュ合成; (3)脱保護のために電気化学的に生成した酸を用いる、および通常のホスホラミダイト化学を用いるインサイチュ並行合成; (4)マスクレス光生成酸(photo-generated acid)(PGA)に制御されるインサイチュ合成および通常のホスホラミダイト化学の使用; (5)感光性保護基(PLPG)の光切断を用いるマスクで導かれる(mask-directed)インサイチュ並行合成; (6) PLPGおよびデジタルフォトリソグラフィーを用いるマスクレスインサイチュ並行合成;および(7)オリゴの沈着のための電場誘引/反発。
【０００５】
インサイチュオリゴ合成のためのフォトリソグラフィー技術はFodor et al.の米国特許第5,445,934号およびそれから優先権を主張するさらなる特許において開示されている。電場誘引/反発マイクロアレイは、Hollis et al.の米国特許第5,653,939号およびHeller et al. の米国特許第5,929,208号に開示されている。電気化学的非ブロック化（deblocking）を用いるインサイチュオリゴ合成のための電極マイクロアレイは、Montgomery、米国特許第6,093,302、6,280,595および6,444,111号 (それぞれMontgomery I、II、および III)に開示されており、これらは引用により本明細書に含める。アレイ上ではなく隣接表面における、電気化学的非ブロック化を用いるインサイチュオリゴ合成のための線形電極の平行な列を有する異なるアレイ（マイクロアレイではない)が、Southern、米国特許第5,667,667号に開示されている。オリゴマイクロアレイ合成の概説は: Gao et al.、Biopolymers 73:579、2004に提供されている。
【０００６】
Montgomery I、II、およびIIIに開示されている電気化学的合成マイクロアレイは、行と列の形式にて複数の微小電極を有する半導体チップに基づいている。このチップの設計では、Complementary Metal Oxide Semiconductor (CMOS) 技術を用いてアレイ内の個々の微小電極を選択および制御するために平行にアドレス指定された微小電極の高密度アレイを作成している。各電極にて適当な反応基を提供するために、マイクロアレイは多孔性マトリックス材料で被覆されている。生体分子およびその他の分子は、多孔性マトリックス上の電極のいずれかにおいて合成されうる。電極は、電極に隣接する、小さい、規定された「仮想フラスコ」領域または体積におけるpHを変化させる電気化学的試薬(具体的には酸性プロトン)を生じさせる電圧または電流をかけることによって「スイッチオン」される。電気化学的に生成した試薬は、DNA またはその他のオリゴマーまたはポリマー物質の合成を続けさせるために保護基を除去する。pHは、酸性試薬が電極から遠くに離れる能力が自然拡散および緩衝によって制限されているために電極の近くにおいてのみ低下する。
【０００７】
一塩基多型(SNPs)の同定の問題はマイクロアレイの使用により解決されうる。ヒトゲノムに存在すると評価されているSNPsは1000万を超えるということを考慮すると、マイクロアレイは、SNPsをより迅速に同定する機会を提供しうる (The International HapMap Consortium、The International HapMap Project、Nature、426:789-796、2003)。多くのSNPsは、クローン病、毛細血管拡張性運動失調、およびアルツハイマー病を含む遺伝病と直接または間接的に関連している。
【０００８】
例えばクローン病を考慮すると、患者のなかには、疾患に対する感受性の上昇と関連する数個の遺伝子のうち１以上において遺伝子変異を有するものがいることが示されている。かかる関連遺伝子には、CARD15/NOD2 遺伝子および MDR1遺伝子が含まれる(Helio et al.、Gut 52:558-562 2003; Newman et al.、Am. J. Gastroenterol. 99:306-315 2004;および Brant et al.、Am. J. Hum. Genet. 73:1282-1292、2003)。
【０００９】
さらに、毛細血管拡張性運動失調変異 (ATM) 遺伝子における突然変異が、リンパ腫および毛細血管拡張性運動失調に関連していることが示されており、これは、小脳および神経運動変性症および免疫不全に特徴づけられる(Fang et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:5372-5377、2003;およびHacia et al.、Genome Research 8:1245-1258 1998)。
【００１０】
ゲノム中の突然変異を検出する能力は、より特異的な診断および治療ならびにあるヒトが遺伝的に関連のある疾患に罹患しやすいか否かの予測を可能とする。かかる予測は、遺伝病の家族歴がある場合に特に重要であり得る。遺伝子変異 (即ち、遺伝病に対する傾向) の検出は、SNPsを検出するためのいくつかの技術を用いてなされてきた。かかる技術には以下が含まれる：(1) オリゴヌクレオチドマイクロアレイに基づくハイブリダイゼーション方法、(2) 酵素的方法、および (3) 質量分析 (Kirk et al.、Nucleics Acid Res. 30:3295-3311 2002; Kwok、Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:235-258、2001; Jenkins & Gibson、Comp. Funct. Genom. 3:57-66 2002;および Shi、Clinical Chemistry 47:164-172 2001)。
【００１１】
SNPのオリゴヌクレオチドマイクロアレイに基づくハイブリダイゼーション方法が、以前に特徴決定されたSNPのスクリーニングとSNPの発見の両方に用いられてきた (Hacia、Nature Genetics Supplement 21:42-47 1999)。マイクロアレイハイブリダイゼーション方法において、シグナル獲得方法またはシグナル喪失方法のいずれかが用いられている。シグナルは特定のプローブに結合した蛍光タグから生じる。シグナル獲得方法において、興味のある配列変化に対して相補的部分を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて分析される。プローブに対するハイブリダイゼーションシグナルの獲得は参照サンプルに対するものとして測定される。ハイブリダイゼーションシグナル喪失方法において、ハイブリダイゼーションシグナルの喪失は野生型配列に相補的な完全に一致するプローブを用いて分析される。プローブに対するハイブリダイゼーションシグナルの喪失は参照サンプルに対するものとして測定される。 
【００１２】
ハイブリダイゼーション方法には正確にSNPsを検出する能力を制限する固有の困難性がある。かかる制限としては、例えば、以下が挙げられる： (1)ホモ接合性突然変異と比較してのヘテロ接合性塩基変化の間の相違を検出する能力が不十分である、(2)ヘアピンおよびG-リッチ配列などの分子内および分子間構造を検出する能力が不十分である、および(3) G/C-リッチ配列とA/T-リッチ配列との融解温度の相違によりG/C-リッチ配列とA/T-リッチ配列におけるSNPsを同時に局在決定する能力が不十分である。融解温度における相違は、 G/C-リッチ配列について最適以下のハイブリダイゼーション条件をA/T-リッチ配列の検出において使用しなければならないこと、または、A/T-リッチプローブを、ハイブリダイゼーション条件を同じにするためにその長さを上昇させなければならないことのいずれかをもたらす。長さの上昇は、A/T-リッチ配列においてSNPを検出する能力を低下させる。高いハイブリダイゼーションストリンジェンシーの結果、該ハイブリダイゼーション方法は調査するDNA の65%のみにしか高い正確性を提供しない(Patil et al.、Science、294:1719-1723 2001)。
【００１３】
酵素的方法 (ヌクレオチド伸長、切断、またはライゲーション)もSNP 検出に用いられてきた(ミスマッチ識別)。かかる手順には、プライマー伸長またはミニ配列決定および、ハイブリダイゼーション鋳型としてゲノム配列を用いる配列特異的プライマーに対するプローブのライゲーションが含まれる(例えば、Broude et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3072-3076 1994; Dubiley et al.、Nucleic Acids Research 25:2259-2265 1997; O'Meara et al.、Nucleic Acids Research 30:e75、1-8 2002;および Rickert et al.、Analytical Biochemistry 330:288-297 2004を参照)。プライマー伸長、またはミニ配列決定は、ポリメラーゼおよび蛍光 ddNTPsまたは1 ddNTPおよび3 dNTPのいずれかの存在下での特異的プライマーの一本鎖増幅ゲノムDNA上での伸長を伴う技術である。検出はゲルまたはキャピラリー配列決定またはMALDI/TOFによって達成される (Kirk et al.、Nucleic Acids Research 30:3295-3311 2002)。
【００１４】
ライゲーション反応では、一般に、２つの隣接するプライマーがゲノム由来標的にアニーリングする必要がある。上流プライマーは一般に5’末端に標識を含む。3' ヌクレオチドは目的SNPの逆となるよう設計される。3' ヌクレオチドが標的と完全な一致を形成する場合、(標識を有する)プライマーはリガーゼにより下流プライマーと共有結合される。検出はマイクロアレイ上の蛍光表示またはMALDI/TOFによって行われる (Kirk et al.、Nuclic Acids Research 30:3295-3311 2002; Zhong et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:11559-11564 2003; Iannone et al.、Cytometry 39:131-140 2000; Chen et al.、Genome Research 8:449-556 1998;および Consolandi et al.、Hum Mutat. 24:428-434 2004)。この手順の一つの欠点はスクリーニングするべきSNPsに対する標識化された特異的プライマーの使用のコストである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、マイクロアレイデバイス上でのSNP、配列決定、および遺伝子発現アッセイ方法を提供することにより、マイクロアレイ SNP ハイブリダイゼーション方法および酵素方法の制限を克服するものである。本発明の方法は、標識化共通オリゴヌクレオチドの使用によるコスト的に有利な戦略とライゲーションの感受性および特異性を組み合わせるものである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の概要
本発明は、マイクロアレイに基づく、一塩基多型、配列決定、および遺伝子発現アッセイ方法を提供する。本発明の方法においては以下を含む：(1)複数のオリゴヌクレオチドプローブが結合したマイクロアレイデバイスを提供する工程、ここで、各プローブは標的ヌクレオチドに相補的な末端ヌクレオチドを有する; (2)マイクロアレイ上に複数のハイブリダイズした構造を形成させる工程、ここで各ハイブリダイズした構造は、マイクロアレイをハイブリダイズ条件下で複数のタグ付加標的および複数の検出配列を含むハイブリダイズ溶液と接触させることによって形成する、ここで各ハイブリダイズした構造は、１つのプローブおよび１つの検出配列にハイブリダイズした１つのタグ付加標的を含む; (3)伸長ライゲーション溶液を用いて各ハイブリダイズした構造を伸長させる工程; (4)マイクロアレイを洗浄することにより非結合材料を除去する工程;および(5)ライゲーションを有するハイブリダイズした構造から標的ヌクレオチドおよびハイブリダイズした配列を同定する工程。
【００１７】
好ましくは、複数のオリゴヌクレオチドプローブが結合しているマイクロアレイデバイスは以下からなる群から選択される方法により作られる：オリゴヌクレオチドを直接マイクロアレイに様々なコンピュータ印刷技術によってスポッティングする方法 (例えば、インクジェット印刷)およびマイクロアレイ上でインサイチュで各オリゴヌクレオチドを合成する方法。より好ましくは、マイクロアレイは、電極アレイデバイスであり、ここで複数のプローブが、インサイチュで電極マイクロアレイ上で電気化学的技術を用いて合成される。好ましくは、複数のプローブは、プローブ DNAおよびプローブ RNA、およびそれらの組合せからなる群から選択される。好ましくは、複数のプローブは、マイクロアレイにスペーサーを介して結合している。
【００１８】
複数のタグ付加標的は、タグ付加標的 DNAおよびタグ付加標的 RNA、およびそれらの組合せからなる群から選択される。タグ付加標的 DNAはcDNAであり得る。タグ付加標的 RNAはmRNAであり得る。複数のタグ付加標的はまず増幅させてもよい。好ましくは、増幅はPCRによって行う。
【００１９】
複数の検出配列は、検出配列 DNAおよび検出配列 RNA、およびそれらの組合せからなる群から選択される。好ましくは、複数の検出配列は蛍光タグを有する。 
【００２０】
好ましくは、複数のタグ付加標的および複数のプローブはハイブリダイズさせた場合におよそ５未満の内部ミスマッチを有する。好ましくは、複数のタグ付加標的および複数の検出配列はハイブリダイズさせた場合に約５未満の内部ミスマッチを有する。好ましくは、ハイブリダイズ溶液は、1 X T4 リガーゼバッファーを含むバッファー溶液中に複数のタグ付加標的および複数の検出配列を含む。好ましくは、ハイブリダイズ条件は、およそ１時間のおよそ 45℃を含む。好ましくは、伸長ライゲーション溶液は、水、バッファー、三リン酸混合物、ポリメラーゼ、およびリガーゼを含む。好ましくは、伸長ライゲーション条件は、およそ 37℃でおよそ １時間の伸長ライゲーション溶液に曝したマイクロアレイのインキュベーションを含む。
【００２１】
ポリメラーゼは、DNA ポリメラーゼおよびRNA ポリメラーゼ、およびそれらの組合せからなる群から選択される。好ましくは、ポリメラーゼは、Taq ポリメラーゼストッフェル(Stoffel)フラグメント、逆転写酵素、大腸菌 DNA ポリメラーゼ、クレノウ断片ポリメラーゼ、T7 RNA ポリメラーゼ、T3 RNA ポリメラーゼ、ウイルスレプリカーゼ、SP6 RNA ポリメラーゼ、およびそれらの組合せからなる群から選択される。好ましくは、バッファーは、T4 DNA リガーゼバッファーおよびT4 RNA リガーゼバッファー、およびそれらの組合せからなる群から選択される。好ましくは、リガーゼは、大腸菌 DNA リガーゼ、T4 DNA リガーゼ、およびT4 RNA リガーゼ、およびそれらの組合せからなる群から選択される。好ましくは、三リン酸混合物はdNTPおよびrNTPからなる群から選択される。
【００２２】
好ましくは、洗浄溶液は、バッファー溶液および塩基溶液からなる群から選択される。好ましくは、バッファーは、 Tris バッファーまたはリン酸バッファーである。好ましくは、塩基溶液は水酸化ナトリウム水溶液である。好ましくは、洗浄方法は、およそ 室温からおよそ 70℃の温度で洗浄溶液にマイクロアレイを曝すことを含む。
【００２３】
本発明はさらに、以下を含む、マイクロアレイに基づく一塩基多型、配列決定および遺伝子発現アッセイ方法を提供する：(1)その上の規定された位置に複数のオリゴヌクレオチドプローブ配列を有するマイクロアレイデバイスを提供する工程; (2)複数のハイブリダイズした構造 DNAを形成させる工程、ここで各ハイブリダイズした構造 DNAはマイクロアレイデバイスをハイブリダイズ条件下で複数のタグ付加標的 DNA 配列および複数の検出配列 DNAを含むハイブリダイズ溶液に接触させることにより形成する、ここで各ハイブリダイズした構造 DNAは、１つのオリゴヌクレオチドプローブ DNAおよび１つの検出配列 DNAにハイブリダイズした１つのタグ付加標的 DNAを含む; (3)伸長ライゲーション溶液および伸長ライゲーション条件を用いて各ハイブリダイズした構造 DNAを伸長させる工程; (4)標的ヌクレオチド DNAに相補的な末端ヌクレオチド DNAを有する各ハイブリダイズした構造 DNAを伸長ライゲーション溶液および伸長ライゲーション条件を用いてライゲーションする工程; (4)マイクロアレイデバイスを洗浄溶液を用いて洗浄することにより非結合材料を除去する工程;および (5)ライゲーションを有するハイブリダイズした構造から標的ヌクレオチド DNAおよびハイブリダイズした配列 DNAを同定する工程。
【００２４】
好ましくは、複数のオリゴヌクレオチドプローブが結合しているマイクロアレイデバイスは以下からなる群から選択される方法により作られる：オリゴヌクレオチドを直接マイクロアレイに様々なコンピュータ印刷技術 (例えば、インクジェット印刷) を用いてスポッティングする方法および各オリゴヌクレオチドをインサイチュでマイクロアレイ上で合成する方法。好ましくは、複数のプローブ DNAはスペーサーを介してマイクロアレイに結合している。好ましくは、マイクロアレイは電極マイクロアレイであり、ここで複数のプローブがインサイチュで電極マイクロアレイ上で合成される。タグ付加標的 DNAはcDNAであり得る。タグ付加標的 DNAはまず増幅させてもよい。好ましくは、増幅は PCRによって行う。好ましくは、複数の検出配列 DNAは蛍光タグを有する。好ましくは、複数のタグ付加標的 DNAおよび複数のプローブ DNAはハイブリダイズさせた場合に５未満の内部ミスマッチを有する。好ましくは、複数のタグ付加標的 DNAおよび複数の検出配列 DNAはハイブリダイズさせた場合におよそ５未満の内部ミスマッチを有する。
【００２５】
好ましくは、ハイブリダイズ溶液は、1 X T4 リガーゼ バッファーを含むバッファー溶液中に複数のタグ付加標的 DNAおよび複数の検出配列 DNAを含む。好ましくは、ハイブリダイズ条件は、およそ 45℃でのおよそ１時間を含む。好ましくは、伸長ライゲーション溶液は、水、バッファー、dNTP、ポリメラーゼ、およびリガーゼを含む。好ましくは、伸長ライゲーション条件は、伸長ライゲーション溶液に曝されたマイクロアレイのおよそ 37℃でのおよそ １時間のインキュベーションを含む。ポリメラーゼはDNA ポリメラーゼである。好ましくは、DNA ポリメラーゼは、 Taq ポリメラーゼストッフェル(Stoffel)フラグメント、逆転写酵素、大腸菌ポリメラーゼ、および、クレノウ断片ポリメラーゼ、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００２６】
好ましくは、バッファーは、大腸菌リガーゼバッファーを含み、リガーゼは大腸菌リガーゼを含む。あるいは、バッファーはT4 リガーゼバッファーを含み、リガーゼはT4 DNA リガーゼを含む。好ましくは、洗浄溶液は、バッファー溶液および塩基溶液からなる群から選択される。好ましくは、バッファーは Tris バッファーまたはリン酸バッファーである。好ましくは、塩基溶液は水酸化ナトリウム水溶液である。好ましくは、洗浄方法は、およそ 室温からおよそ 70℃の温度で洗浄溶液にマイクロアレイを曝すことを含む。
【００２７】
別の態様において、複数のプローブ DNAは、複数の マッチプローブ DNAおよび複数のミスマッチプローブ DNAを含み、複数のハイブリダイズした構造 DNAは、複数のマッチ構造および複数のミスマッチ構造を含む。別の態様において、複数のプローブ DNAは複数の セットプローブを含み、複数のハイブリダイズした構造 DNAは複数のセット構造を含む。別の態様において、複数のプローブ DNAは複数の連続配列プローブを含み、複数のハイブリダイズした構造 DNAは複数の連続配列構造を含む。別の態様において、複数のプローブ DNAは、複数の遺伝子発現プローブを含み、複数のハイブリダイズした構造 DNAは、複数の遺伝子発現構造を含む。
【００２８】
本発明はさらに、以下を含むマイクロアレイに基づく一塩基多型、配列決定方法、および遺伝子発現アッセイ方法を提供する：(1)複数のオリゴヌクレオチドプローブ DNA 配列を有するマイクロアレイデバイスを提供する工程; (2)マイクロアレイデバイス上に複数のハイブリダイズした構造 DNA/RNAを形成させる工程、ここで各ハイブリダイズした構造 DNA/RNAは、マイクロアレイデバイスを、ハイブリダイズ条件下で、複数のタグ付加標的 RNAおよび複数の検出配列 DNAを含むハイブリダイズ溶液に接触させることにより形成され、ここで各ハイブリダイズした構造 DNA/RNAは、１つのプローブ DNA および１つの検出配列 DNAにハイブリダイズした１つのタグ付加標的 RNAを含む; (3)各ハイブリダイズした構造 DNA/RNAを伸長ライゲーション溶液および伸長ライゲーション条件を用いて伸長させる工程; (4) 標的ヌクレオチド RNAに相補的な末端ヌクレオチド DNAを有する各ハイブリダイズした構造 DNA/RNAを伸長ライゲーション溶液を用いてライゲーションさせる工程; (5)マイクロアレイデバイスを洗浄溶液を用いて洗浄することにより非結合材料を除去する工程; および、(6) ライゲーションを有するハイブリダイズした構造から標的ヌクレオチド RNAおよびハイブリダイズした配列 RNAを同定する工程。
【００２９】
好ましくは、複数のオリゴヌクレオチドプローブが結合しているマイクロアレイデバイスは以下からなる群から選択される方法により作られる：オリゴヌクレオチドを直接マイクロアレイに様々なコンピュータ印刷技術(例えば、インクジェット印刷)によってスポッティングする方法および各オリゴヌクレオチドをインサイチュでマイクロアレイ上で合成する方法。好ましくは、複数のプローブはマイクロアレイにスペーサーを介して結合している。好ましくは、マイクロアレイは電極マイクロアレイであり、ここで複数のプローブがインサイチュで電極マイクロアレイ上で合成される。タグ付加標的 RNAはmRNAであり得る。好ましくは、複数の検出配列 DNAは蛍光タグを有する。好ましくは、複数のタグ付加標的 RNAおよび複数のプローブ DNA はハイブリダイズさせた場合に５未満の内部ミスマッチを有する。好ましくは、複数のタグ付加標的 RNAおよび複数の検出配列 DNAはハイブリダイズさせた場合におよそ５未満の内部ミスマッチを有する。
【００３０】
好ましくは、ハイブリダイズ溶液は、1 X T4 リガーゼバッファーを含むバッファー溶液中に複数のタグ付加標的 RNA および複数の検出配列 DNAを含み、ハイブリダイズ条件はおよそ 45℃でおよそ １時間を含む。 
【００３１】
好ましくは、伸長ライゲーション溶液は、水、バッファー、dNTP、ポリメラーゼ、およびリガーゼを含む。好ましくは、伸長ライゲーション条件は、伸長ライゲーション溶液に曝されたマイクロアレイのおよそ 37℃でのおよそ １時間のインキュベーションを含む。好ましくは、ポリメラーゼは逆転写酵素である。好ましくは、バッファーは大腸菌リガーゼバッファーを含み、リガーゼは大腸菌リガーゼを含む。あるいは、バッファーはT4 リガーゼバッファーを含み、リガーゼはT4 DNA リガーゼを含む。好ましくは、洗浄溶液は、バッファー溶液および塩基溶液からなる群から選択される。好ましくは、バッファーはTris バッファーまたはリン酸バッファーである。好ましくは、塩基溶液は水酸化ナトリウム水溶液である。好ましくは、洗浄方法は、マイクロアレイを洗浄溶液におよそ 室温からおよそ 70℃の温度で曝すことを含む。 
【００３２】
図面の簡単な説明
図 1A-1Fは、本発明の SNP アッセイ方法についての一連の工程を示す。具体的には、図 1Aは、プローブ DNAの付加の前のマイクロアレイの模式図である。 図 1Bは、マッチプローブ DNAおよびミスマッチプローブ DNAを有するマイクロアレイの模式図である。図 1Cは、各プローブにハイブリダイズしてハイブリダイズした構造 DNAを形成するタグ付加標的 DNA および検出配列 DNAを有するマイクロアレイの模式図である。図 1D は、末端ヌクレオチド DNAが標的ヌクレオチド DNAに相補的である場合のライゲーションを示す模式図である。図 1Eは、ライゲーションしていない検出配列 DNA およびタグ付加標的 DNAを洗浄除去した後のマイクロアレイを示す模式図である。図 1Fは、検出配列 DNAをプローブ DNAにライゲーションして有するマイクロアレイ位置での検出可能シグナル、例えば、蛍光 シグナルを示す模式図である。
【００３３】
図2Aおよび2Bは、PCR 増幅方法および標的 DNAを有するゲノムDNAからのタグ付加標的 DNAの単離を示す模式図である。
【００３４】
図 3は、タグ付加標的、蛍光 (Cy3) 標識を有する検出配列、およびプローブの模式図である。
【００３５】
図4Aおよび4Bは、本発明の SNP 方法を示す模式図であり、ここで、異なる末端ヌクレオチドを有する４つの同一のプローブが存在する。
【００３６】
図 5は、鎖の上の各位置についてのプローブを設計することにより、鎖に沿ってSNPまたは突然変異を位置づけるためのDNA 鎖の配列決定を示す模式図である。
【００３７】
図 6は、内部SNPを検出するためのハイブリダイゼーションを用いたSNP 検出と比較した、本発明のマイクロアレイに基づく SNPアッセイの棒グラフ比較である。データは、突然変異を有さない患者 #4のATM 遺伝子のものである。運動失調の症状を有さない患者 #4からのゲノムDNAを、４つの既知のSNPの領域を単離するために設計された４つのプライマーセットを用いて増幅した。マイクロアレイデバイス上のプローブは、予測融解温度 (TM)がおよそ 50℃となるよう設計した。
【００３８】
図 7は、図 6に示す棒グラフ比較の拡大図である。図 7は、本発明の末端SNPアッセイと内部SNP ハイブリダイゼーションとを比較する。１０ヌクレオチドスペーサーを電極マイクロアレイへのプローブ DNAの結合に用いた。野生型または非修飾を第一の棒に示し、SNPは第二の棒であり、最後の二つの棒はナンセンス突然変異である。
【００３９】
図 8は、一定融解温度 (TM; 左側パネル)に調整したプローブ DNAを比較する棒グラフであり、G/C含量 (右側パネル)のパーセンテージとプローブ DNA長 (棒上の数)との間の反比例関係を示す。したがって、G/C含量の高いプローブ DNAは短く(内部 7327について15 ヌクレオチド)、A/T含量が高いプローブ DNAは比較的長い (内部 8266について28 ヌクレオチド)。特定のハイブリダイゼーション条件下で、より長いプローブ DNAはハイブリダイゼーションのみによってミスマッチを識別しない。
【００４０】
図 9は、残基 103C>TにてATM 遺伝子 SNPを有する患者 #1 からのゲノムDNAに対する多重 SNPアッセイ (４つのタグ付加標的 DNA)からの結果を示す棒グラフである。垂直の棒は８連の平均を示し、垂線は±標準偏差を示す。４つのプローブの各連における第一のプローブ DNA は野生型である。第二のプローブ DNAはSNPである。 第三のプローブ DNAおよび第四のプローブ DNAはナンセンス突然変異である。電極マイクロアレイおよび目的配列の間に5、10、または15 ヌクレオチドスペーサーを含めた結果も示す。各SNPについての目的配列を表すプローブは下に箱を示し、各プローブについての末端ヌクレオチドは各グラフの上に示す。
【００４１】
図 10は、残基7327C>T および 7926A>CにATM 遺伝子 SNPを有する患者 #2からのゲノムDNAに対する多重 SNPアッセイ (４つのタグ付加標的 DNA) の結果を示す棒グラフである。垂直の棒は８連の平均を示し、垂線は±標準偏差を示す。４つのプローブの各連における第一のプローブ DNAは野生型である。第二のプローブ DNAはSNPである。第三のプローブ DNA および第四のプローブ DNAはナンセンス突然変異である。電極マイクロアレイと目的配列との間に5、10、または15 ヌクレオチドスペーサーを含めた結果も示す。各SNPについての目的配列を表すプローブは下に箱を示し、各プローブについての末端ヌクレオチドは各グラフの上に示す。
【００４２】
図 11は、残基 8266A>TにATM 遺伝子 SNPを有する患者 #3からのゲノムDNAに対する多重 SNPアッセイ (４つのタグ付加標的 DNA) の結果を示す棒グラフである。垂直の棒は８連の平均を示し、垂線は±標準偏差を示す。４つのプローブの各連における第一のプローブ DNAは野生型である。第二のプローブ DNAはSNPである。 第三のプローブ DNAおよび第四のプローブ DNA はナンセンス突然変異である。電極マイクロアレイと目的配列との間に5、10、または15 ヌクレオチドスペーサーを含めた結果も示す。各SNPについての目的配列を表すプローブは下に箱を示し、各プローブについての末端ヌクレオチドは各グラフの上に示す。
【００４３】
図 12は、ATM 遺伝子 SNP 残基を有さない患者 #4 からのゲノムDNAに対する多重 SNPアッセイ (４つのタグ付加標的 DNA) の結果を示す棒グラフである。垂直の棒は８連の平均を示し、垂線は±標準偏差を示す。４つのプローブの各連における第一のプローブ DNAは野生型である。第二のプローブ DNAはSNPである。 第三のプローブ DNAおよび第四のプローブ DNA はナンセンス突然変異である。電極マイクロアレイと目的配列との間に5、10、または15 ヌクレオチドスペーサーを含めた結果も示す。
【００４４】
発明の詳細な説明
定義
本明細書において用いる場合、「オリゴマー」という用語は、相対分子量が中程度の分子であって、その構造が、より低い相対分子量の分子に実際または概念的に由来する少数の複数の単位を必須に含む分子を意味する。１または数個の単位を除いた場合にその性質が有意に変化する場合、分子は中程度の相対分子量を有するとみなされる。分子の一部または全部が中程度の相対分子量を有し、より低い相対分子量の分子に実際または概念的に由来する少数の複数の単位を必須に含む場合、それはオリゴマー性またはオリゴマーとして形容詞的に記載されうる。オリゴマーは典型的には１つのタイプのモノマー(mer.)から構成される。好ましいオリゴマーは、オリゴヌクレオチドである。
【００４５】
「コオリゴマー」という用語は、２種以上のモノマーに由来するオリゴマーを意味する。オリゴマーという用語は、コオリゴマーを含む。オリゴマーの例として、デオキシアデニル酸 (A)、デオキシシチジル酸 (C)、デオキシグアニル酸 (G)、およびデオキシチミジル酸 (T) 単位からなり、以下の配列、AGCTGCTATAからなる一本鎖 DNA 分子はコオリゴマーであり、10-T 単位からなる一本鎖 DNA 分子はオリゴマーである;しかし、その両方がオリゴマーと称される。
【００４６】
「モノマー」または「mer」という用語は、重合を経て、高分子、例えば、オリゴマー、コオリゴマー、ポリマー、またはコポリマーの必須構造の構成単位として寄与することができる分子を意味する。モノマーの例としては、A、C、G、T/U、アデニル酸、グアニル酸、シチジル酸、ウリジル酸、アミノ酸、塩化ビニル、およびその他のビニル類が挙げられる。
【００４７】
「ポリマー」という用語は、高分子から構成される物質であって、その構造が、実際または概念的に低い相対分子量の分子に由来する単位の多重反復を必須に含む高い相対分子量の分子を意味する。多くの場合において、特に合成ポリマーについて、１または数個の単位の付加または除去が分子の特性に無視できる効果しか有さない場合、分子は高い相対分子量を有するとみなされ得る。性質が分子構造の微細な詳細に重大に依存する特定の高分子の場合にはこの説明は当てはまらない。分子の一部または全部が高い相対分子量を有し、低い相対分子量の分子に実際または概念的に由来する単位の多重反復を必須に含む場合、それは高分子またはポリマー性、あるいは形容詞的にポリマーとして記載されうる。
【００４８】
「コポリマー」という用語は、２種以上のモノマーに由来するポリマーを意味する。２つのモノマー種の共重合によって得られるコポリマーはバイ(bi)ポリマーと称されることがあり、３つのモノマーから得られるものはター(ter)ポリマー、４つのモノマーから得られるものはクォーター(quater)ポリマー等と称されることがある。ポリマーという用語には、コポリマーが含まれる。
【００４９】
「ポリエチレングリコール」(PEG)という用語は、共通の繰り返しエチレングリコール単位 [--CH2--CH2--O--]nからなる鎖を有する有機化合物を意味する。PEGは典型的には、可動性、親水性、酵素に安定、および生物学的に不活性である長鎖有機ポリマーであるが、水中ではイオン電荷を有さない。一般に、PEGは２つの分類に分けることが出来る。第一に、1000から20,000以上の範囲の分子量を有するポリマー性 PEGがある。第二に、1000未満の分子量を有するPEG-様鎖がある。ポリマー性PEGは生体複合体(bioconjugate)に用いられており、多数の概論が、このリンカー部分の様々な分子への付着について記載している。PEGはリンカーとして用いられており、短いPEG-様リンカーは以下の２つのタイプに分けることが出来る：ホモ-[X--(CH2--CH2--O)n]--Xおよびヘテロ二官能性 [X--(CH2--CH2--O)n]--Y スペーサー。
【００５０】
「PEG 誘導体」という用語は、PEGの共通の繰り返し単位を有するエチレングリコール誘導体を意味する。PEG 誘導体の例としては、ジエチレングリコール (DEG)、テトラエチレングリコール (TEG)、一級アミノ基を有するポリエチレングリコール、ジ(エチレングリコール) モノアリルエーテル、ジ(エチレングリコール) モノトシレート、トリ(エチレングリコール) モノアリルエーテル、トリ(エチレングリコール) モノトシレート、トリ(エチレングリコール) モノベンジルエーテル、トリ(エチレングリコール) モノトリチルエーテル、トリ(エチレングリコール) モノクロロモノメチルエーテル、トリ(エチレングリコール) モノトシル モノアリルエーテル、トリ(エチレングリコール) モノアリル モノメチルエーテル、テトラ(エチレングリコール) モノアリルエーテル、テトラ(エチレングリコール) モノメチルエーテル、テトラ(エチレングリコール) モノトシル モノアリルエーテル、テトラ(エチレングリコール) モノトシレート、テトラ(エチレングリコール) モノベンジルエーテル、テトラ(エチレングリコール) モノトリチルエーテル、テトラ(エチレングリコール) モノ 1-ヘキセニルエーテル、テトラ(エチレングリコール) モノ 1-ヘプテニルエーテル、テトラ(エチレングリコール) モノ 1-オクテニルエーテル、テトラ(エチレングリコール) モノ 1-デセニルエーテル、テトラ(エチレングリコール) モノ 1-ウンデセニルエーテル、ペンタ(エチレングリコール) モノメチルエーテル、ペンタ(エチレングリコール) モノアリル モノメチルエーテル、ペンタ(エチレングリコール) モノトシル モノメチルエーテル、ペンタ(エチレングリコール) モノトシル モノアリルエーテル、ヘキサ(エチレングリコール) モノアリルエーテル、ヘキサ(エチレングリコール) モノメチルエーテル、ヘキサ(エチレングリコール) モノベンジルエーテル、ヘキサ(エチレングリコール) モノトリチルエーテル、ヘキサ(エチレングリコール) モノ 1-ヘキセニルエーテル、ヘキサ(エチレングリコール) モノ 1-ヘプテニルエーテル、ヘキサ(エチレングリコール) モノ 1-オクテニルエーテル、ヘキサ(エチレングリコール) モノ 1-デセニルエーテル、ヘキサ(エチレングリコール) モノ 1-ウンデセニルエーテル、ヘキサ(エチレングリコール) モノ 4-ベンゾフェノニル モノ 1-ウンデセニルエーテル、ヘプタ(エチレングリコール) モノアリルエーテル、ヘプタ(エチレングリコール) モノメチルエーテル、ヘプタ(エチレングリコール) モノトシル モノメチルエーテル、ヘプタ(エチレングリコール) モノアリル モノメチルエーテル、オクタ(エチレングリコール) モノアリルエーテル、オクタ(エチレングリコール) モノトシレート、オクタ(エチレングリコール) モノトシル モノアリルエーテル、ウンデカ(エチレングリコール) モノメチルエーテル、ウンデカ(エチレングリコール) モノアリル モノメチルエーテル、ウンデカ(エチレングリコール) モノトシル モノメチルエーテル、ウンデカ(エチレングリコール) モノアリルエーテル、オクタデカ(エチレングリコール) モノアリルエーテル、オクタ(エチレングリコール)、デカ(エチレングリコール)、ドデカ(エチレングリコール)、テトラデカ(エチレングリコール)、ヘキサデカ(エチレングリコール)、オクタデカ(エチレングリコール)、ベンゾフェノン-4-ヘキ���(エチレングリコール) アリルエーテル、ベンゾフェノン-4-ヘキサ(エチレングリコール) ヘキセニルエーテル、ベンゾフェノン-4-ヘキサ(エチレングリコール) オクテニルエーテル、ベンゾフェノン-4-ヘキサ(エチレングリコール) デセニルエーテル、ベンゾフェノン-4-ヘキサ(エチレングリコール) ウンデセニルエーテル、4-フルオロベンゾフェノン-4’-ヘキサ(エチレングリコール) アリルエーテル、4-フルオロベンゾフェノン-4’-ヘキサ(エチレングリコール) ウンデセニルエーテル、4-ヒドロキシベンゾフェノン-4’-ヘキサ(エチレングリコール) アリルエーテル、4-ヒドロキシベンゾフェノン-4’-ヘキサ(エチレングリコール) ウンデセニルエーテル、4-ヒドロキシベンゾフェノン-4’-テトラ(エチレングリコール) アリルエーテル、4-ヒドロキシベンゾフェノン-4’-テトラ(エチレングリコール) ウンデセニルエーテル、4-モルホリノベンゾフェノン-4’-ヘキサ(エチレングリコール) アリルエーテル、4-モルホリノベンゾフェノン-4’-ヘキサ(エチレングリコール) ウンデセニルエーテル、4-モルホリノベンゾフェノン-4’-テトラ(エチレングリコール) アリルエーテル、および4-モルホリノベンゾフェノン-4’-テトラ(エチレングリコール) ウンデセニルエーテルが挙げられる。
【００５１】
「一塩基多型」(SNP)という用語は、一本鎖 DNA 配列におけるデオキシヌクレオチドの異なるデオキシヌクレオチドによる置換を意味する。かかる置換は一般に一塩基置換と称され、ここで塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンである。それぞれのデオキシヌクレオチドは、デオキシアデニル酸、デオキシグアニル酸、デオキシシチジル酸、およびデオキシチミジル酸である。塩基およびデオキシヌクレオチドはそれぞれA、G、C、およびTと表される。SNPが特定の遺伝性疾患と関連している場合、置換の前に存在するデオキシヌクレオチドが正常または野生型デオキシヌクレオチドとみなされ、置換されたデオキシヌクレオチドはSNPまたは突然変異とみなされる。例えば、DNA 配列 atatgcact [配列番号1]が正常であるとみなされ、最初のAが遺伝子配列において1番とされる場合、DNA 配列 atattcact [配列番号2] は、遺伝子配列の第一位置においてGからTへの置換を有するとみなされる。この用語はまた、RNA 鎖、例えば、ウイルス RNA上の突然変異も含む。複製DNA (cDNA)がRNA 鎖およびそれに付随する突然変異を表すのに用いられ得る。cDNAは、目的のRNAから逆転写酵素を用いて作られる。
【００５２】
「野生型」という用語は、家畜化・栽培された株、天然の突然変異、または実験室的突然変異とは対照的に天然に優勢にみられる場合の生物の形態を意味する。例えば、野生型遺伝子の部分はatatgccgt [配列番号3]であり得、4T>C 「突然変異」は atacgccgt [配列番号4]となろう。野生型および突然変異という用語は、DNA およびRNAに基づく生物を包含する。 
【００５３】
「マイクロアレイ」という用語は、DNAまたはその他の化学種をその上に載せる位置を有する固体基体を意味する。載せることには、インサイチュ合成およびあらかじめ合成した材料のスポッティングが含まれる。この用語には電極マイクロアレイが含まれ、この場合位置は電極である。一本鎖 DNAまたはRNA またはその他の化学種を個々の電極上にインサイチュで合成することが出来る。マイクロアレイは表面上の点の小型化されたアレイである。表面は一般に平面状である。生体分子などの分子がその点に結合するかその点でインサイチュで合成されうる。付着点は通常行と列の形式である。その他の形式を用いることも出来る。マイクロアレイは様々な形式で利用でき、様々な表面化学特性を有する。異なる形式および表面特性は、分子の付着または合成の異なるアプローチを導く。マイクロアレイ表面化学における相違は調製方法における相違を導く。マイクロアレイ上の付着点はマイクロメータースケールであり、一般に 1100μmである。
【００５４】
「反応性表面」という用語は、物理的結合、および化学結合、およびそれらの組合せにより反応性表面に化学種を「付着」させる化学的官能基を有する固体表面を意味する。化学結合には、ファンデルワールス力 (分散力および双極子力)、電子供与体・受容体相互作用、金属配位/錯体形成、共有結合、またはそれらの組合せが含まれる。反応性表面の例としては、これらに限定されないが、水酸基、アミン基、またはチオール基を有する表面に結合した化学種が含まれる。反応性表面は多孔性であり得る。
【００５５】
「DNA」という用語は、一本鎖または二本鎖構造としてのデオキシリボ核酸を意味する。
【００５６】
「RNA」という用語は、一本鎖または二本鎖構造としてのリボ核酸を意味する。
【００５７】
「ヌクレオチド」という用語は、１つのDNA 単位 (A、C、G、T)または１つのRNA 単位 (A、C、G、U)を意味する。
【００５８】
「標的 DNA」という用語は、目的の選択された遺伝子またはゲノム配列からのDNA 配列を意味する。遺伝子という用語には、遺伝子 (RNA)の3' 非翻訳領域 (UTR)が含まれる。3' UTRは、遺伝子の存在についての代用(代理(surrogate))である。標的 DNAは増幅されうる。増幅はポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)によってなされうる。標的 DNAはRNA 配列から作られた複製DNA (cDNA)であり得る。cDNAは PCRによって増幅されうる。
【００５９】
「標的 RNA」という用語は、目的の選択された遺伝子またはゲノム配列からのRNA 配列を意味する。遺伝子という用語には遺伝子の3' 非翻訳領域 (UTR)も含まれる。3' UTRは、遺伝子の存在についての代用である。標的 RNAはそれに結合した同定用タグを有していてもよい。 
【００６０】
「標的」という用語は、標的 DNAおよび標的 RNA、およびそれらの組合せからなる群から選択される用語により定義される。
【００６１】
「タグ付加標的 DNA」という用語は、一本鎖の標的 DNAを意味する。タグのDNA 配列は知られている。タグはPCRの際に結合させてもよいし、その他の手段によって結合させてもよい。DNA 配列の3’末端におけるヌクレオチドの配列を知ることが、タグを構成するのに十分である。既知の配列はおよそ 10以上のヌクレオチドであり得る。RNA 配列から得られた複製DNA (cDNA)もタグ付加標的という用語に含まれる。
【００６２】
「タグ付加標的 RNA」という用語は、一本鎖の標的 RNAを意味する。タグのRNA 配列は知られている。タグは標的に固有のもの、例えば、 RNA 鎖の3’末端付近のポリアデニル酸であってもよい。メッセンジャー RNA (mRNA)はタグ付加標的 RNAという用語に含まれる。mRNAの長さはおよそ 50〜1000 ヌクレオチド長であり得る。タグ付加標的 RNAはまずcDNAを作るよりもむしろ直接ハイブリダイズ溶液中で用いられる。図 3を参照すると、タグ付加標的 300はmRNAであり得、タグ付加標的の３プライム末端 303上のタグとして作用するポリアデニル酸を有する。検出配列 310 は標識 312に加えて、mRNA 300上のポリアデニル酸にハイブリダイズするポリデオキシチミジル酸またはポリウリジル酸 314を含みうる。標識 312 は任意である。
【００６３】
「タグ付加標的」という用語は、タグ付加標的 DNAおよびタグ付加標的 RNA、およびそれらの組合せからなる群から選択される用語により規定される
【００６４】
「プローブ DNA」という用語は、一本鎖 DNA 配列を意味する。プローブ DNAの配列は既知である。プローブ DNAはマイクロアレイ上にあり、インサイチュ合成またはスポッティングにより結合している。マイクロアレイ上には２タイプ以上のプローブ DNAが存在しうる。プローブ DNAは 一般におよそ 100 ヌクレオチド未満である。プローブ DNAはマイクロアレイに結合しているスペーサーに所望により結合していてもよい。スペーサーは、ヌクレオチドに基づくスペーサー、PEG スペーサー、またはその他のタイプのスペーサーであり得る。
【００６５】
「プローブ RNA」という用語は、一本鎖 RNA 配列を意味する。プローブ RNAの配列は既知である。プローブ RNAはマイクロアレイ上にあり、インサイチュ合成またはスポッティングにより結合している。マイクロアレイ上には２タイプ以上のプローブ RNAが存在しうる。プローブ RNAは一般に およそ 100 ヌクレオチド未満である。プローブ RNAは、マイクロアレイに結合しているスペーサーに所望により結合していてもよい。スペーサーは、ヌクレオチドに基づくスペーサー、PEG スペーサー、またはその他のタイプのスペーサーであり得る。
【００６６】
「プローブ」という用語は、プローブ DNA、プローブ RNA、およびそれらの組合せからなる群から選択される用語により規定される。
【００６７】
「末端ヌクレオチド DNA」という用語は、マイクロアレイにその3’末端にて結合しているプローブ DNAの5’末端におけるヌクレオチドを意味する。
【００６８】
「末端ヌクレオチド RNA」という用語は、マイクロアレイにその3’末端にて結合しているプローブ RNAの5’末端におけるヌクレオチドを意味する。
【００６９】
「末端ヌクレオチド」という用語は、末端ヌクレオチド DNA および末端ヌクレオチド RNA、およびそれらの組合せからなる群から選択される用語により規定される。
【００７０】
「標的ヌクレオチド DNA」という用語は、末端ヌクレオチド DNAの逆に対合しているタグ付加標的 DNA上のヌクレオチドを意味する。
【００７１】
「標的ヌクレオチド RNA」という用語は、末端ヌクレオチド RNAの逆に対合しているタグ付加標的 RNA上のヌクレオチドを意味する。
【００７２】
「標的ヌクレオチド」という用語は、標的ヌクレオチド DNA および標的ヌクレオチド RNA、およびそれらの組合せからなる群から選択される用語により規定される。
【００７３】
「検出配列 DNA」という用語は、タグ付加標的の部分上の配列に実質的に相補的な一本鎖 DNA 配列を意味する。検出配列 DNAはその5’末端上に標識、例えば、蛍光標識を有していてもよく、それによって、マイクロアレイ上のプローブへのライゲーションを介してマイクロアレイに結合した場合にマイクロアレイ上に検出配列 DNAが観察されるようになる。
【００７４】
「検出配列相補的 DNA」という用語は、検出配列に相補的なタグ付加標的 DNA 上の配列を意味する。検出配列相補的 DNAは、実質的にタグ付加標的 DNAの3’半分にある。 
【００７５】
「検出配列 RNA」という用語は、タグ付加標的の部分上の配列に実質的に相補的な一本鎖 RNA 配列を意味する。検出配列 RNAはその5’末端に標識、例えば、蛍光標識を有していてもよく、それによってマイクロアレイ上のプローブへのライゲーションを介してマイクロアレイに結合した場合に検出配列 RNAのマイクロアレイ上での観察が可能となる。
【００７６】
「検出配列相補的 RNA」という用語は、検出配列に相補的なタグ付加標的 RNA 上の配列を意味する。検出配列相補的 RNAは実質的にタグ付加標的 RNAの3’半分にある。
【００７７】
「検出配列」という用語は、検出配列 DNA、検出配列 RNA、およびそれらの組合せからなる群から選択される用語により規定される。検出配列が標識を有さない場合、その後の検出工程には、プローブへの検出配列 DNAのライゲーションを有するマイクロアレイ位置の位置決定が必要となる。検出配列相補鎖と同じ配列を有するヌクレオチドおよび標識は、プローブにライゲーションした検出配列へのハイブリダイズに利用でき、洗浄後も残る。
【００７８】
「検出配列相補的」という用語は、検出配列相補的 DNAおよび検出配列相補的 RNA、およびそれらの組合せからなる群から選択される用語により規定される。
【００７９】
「ハイブリダイズした配列 DNA」という用語は、プローブにハイブリダイズするタグ付加標的 DNA上の配列を意味する。
【００８０】
「ハイブリダイズした配列 RNA」という用語は、プローブにハイブリダイズするタグ付加標的 RNA上の配列を意味する。
【００８１】
「ハイブリダイズした配列」という用語は、ハイブリダイズした配列 DNAおよびハイブリダイズした配列 RNA、およびそれらの組合せからなる群から選択される用語により規定される。
【００８２】
「ハイブリダイズした構造 DNA」という用語は、二本鎖DNA 構造を意味する。ハイブリダイズした構造 DNAは、プローブ DNAにハイブリダイズしたタグ付加標的 DNAおよびタグ付加標的 DNAにハイブリダイズした検出配列 DNAを含む。タグ付加標的 DNA がプローブ DNAにハイブリダイズし、検出配列 DNAがタグ付加標的 DNAにハイブリダイズした後、検出配列 DNAは伸長される。検出配列 DNAは、末端ヌクレオチド DNA が標的ヌクレオチド DNAに相補的であれば、プローブ DNAにライゲーションされる。
【００８３】
「ハイブリダイズした構造 RNA」という用語は、二本鎖RNA 構造を意味する。ハイブリダイズした構造 RNAは、プローブ RNAにハイブリダイズしたタグ付加標的 RNAおよびタグ付加標的 RNA にハイブリダイズした検出配列 RNAを含む。タグ付加標的 RNA がプローブ RNAにハイブリダイズし、検出配列 RNAがタグ付加標的 RNAにハイブリダイズした後、検出配列 RNAは伸長される。検出配列 RNA は、末端ヌクレオチド RNA が標的ヌクレオチド RNAに相補的であればプローブ RNAにライゲーションされる。
【００８４】
「ハイブリダイズした構造 DNA/RNA」という用語は、ハイブリダイズしたDNA およびRNA鎖を含む二本鎖構造を意味する。ハイブリダイズした構造 DNA/RNAは、プローブにハイブリダイズしたタグ付加標的およびタグ付加標的にハイブリダイズした検出配列を含む。タグ付加標的がプローブにハイブリダイズし、検出配列がタグ付加標的にハイブリダイズした後、検出配列は伸長される。検出配列は、末端ヌクレオチドが標的ヌクレオチドに相補的であれば、プローブにライゲーションされる。
【００８５】
「ハイブリダイズした構造」という用語は、ハイブリダイズした構造 DNA、ハイブリダイズした構造 RNA、およびハイブリダイズした構造 DNA/RNA、およびそれらの組合せからなる群から選択される用語により規定される。
【００８６】
「非結合材料」という用語は、マイクロアレイ表面に結合していない材料を意味する。非結合材料には、プローブにハイブリダイズしたタグ付加標的およびプローブにライゲーションしていない検出配列が含まれる。
【００８７】
「マッチプローブ」という用語は、ハイブリダイズした配列 DNAに実質的に相補的である特別に設計された配列を有する一本鎖 DNAを意味する。 マッチプローブは、マイクロアレイに既知の位置にて結合している。マッチプローブの相補的部分は「マッチ配列」である。マッチプローブは一般に、ハイブリダイズした配列 DNAとのミスマッチをおよそ ４塩基以下有する。マッチプローブの末端ヌクレオチド DNAは、ライゲーションを可能にするためにハイブリダイズさせた場合にタグ付加標的 DNAの標的ヌクレオチド DNAに相補的でなければならない。マッチプローブは「プローブ DNA」という用語に含まれる。
【００８８】
「ミスマッチプローブ」という用語は、ハイブリダイズした配列 DNAに実質的に相補的な特別に設計された配列を有する一本鎖 DNAを意味する。ミスマッチプローブはマイクロアレイに既知の位置にて結合している。ミスマッチプローブの相補的部分は「ミスマッチ配列」である。ミスマッチプローブは一般に、タグ付加標的 DNA にハイブリダイズした場合におよそ ４塩基以下のミスマッチを有する。ミスマッチプローブの末端ヌクレオチド DNAは、ハイブリダイズさせた場合にライゲーションを防ぐためにタグ付加標的 DNAの標的ヌクレオチド DNAに相補的であってはならない。ミスマッチプローブおよびマッチプローブは末端ヌクレオチド DNAを除いては同じ塩基配列を有する。ミスマッチプローブは「プローブ DNA」という用語に含まれる。
【００８９】
「マッチ構造」という用語は二本鎖DNA 構造を意味し、ここで、マイクロアレイに結合したマッチプローブがタグ付加標的 DNAにハイブリダイズしており、 検出配列 DNAがタグ付加標的 DNAにハイブリダイズしている。「マッチ構造」は、「ハイブリダイズした構造 DNA」という用語に含まれる。
【００９０】
「ミスマッチ構造」という用語は二本鎖DNA 構造を意味し、ここでマイクロアレイに結合したミスマッチプローブがタグ付加標的 DNAにハイブリダイズしており、検出配列 DNAがタグ付加標的 DNAにハイブリダイズしている。「ミスマッチ構造」は、 「ハイブリダイズした構造 DNA」という用語に含まれる。
【００９１】
「セットプローブ」という用語は、末端ヌクレオチドが４つのヌクレオチドの一つ、即ち、A、C、G、またはTである以外は同一であるおよそ ３から４つのプローブを意味する。したがって、各プローブについて末端ヌクレオチド DNA以外はほぼ同一であるおよそ ３から４つのプローブが存在する。「セットプローブ」は「プローブ DNA」という用語に含まれる。
【００９２】
「セット構造」という用語は二本鎖DNA 構造を意味する。各セット構造は、セットプローブの１つにハイブリダイズしたタグ付加標的 DNA およびタグ付加標的 DNAの検出配列相補的 DNAにハイブリダイズした検出配列 DNAを含む。タグ付加標的 DNAが セットプローブにハイブリダイズし、検出配列 DNAがタグ付加標的 DNAにハイブリダイズした後、検出配列が伸長される。検出配列 DNAは、末端ヌクレオチド DNAが標的ヌクレオチド DNAに相補的である場合、セットプローブの１つにライゲーションする。「セット構造」は「ハイブリダイズした構造 DNA」という用語に含まれる。
【００９３】
「連続配列プローブ」という用語は、プローブの末端塩基として配列における目的の各塩基を表す配列の長さにそって一度に１以上の塩基単位をステップすることにより目的DNA配列全体に広がるプローブである。図 5は、例示的配列の連続配列プローブについて選択された配列の模式図である。図 5を参照すると、連続相補的プローブ、502、510、520、530、540は、目的配列 500に沿って１回に１塩基ステップすることにより得られる。プローブは相補的配列 501に基づく。その他のステップサイズを用いることが出来、例えば、１回に5塩基を用いてもよい。各連続相補的プローブは、末端配列以外は同一な付随するプローブを有する。例えば、プローブ 502はプローブ 502に付随するプローブ 504、506、508を有する。プローブはタグ付加標的の相補鎖である。目的配列に沿った各塩基において、末端ヌクレオチドが A、C、G、または Tである以外は同一な４つのプローブがあり、それによって目的配列に沿った各位置での標的上の塩基の決定が可能となる。４つ未満のプローブを各塩基に用いることも出来る。連続配列プローブは「プローブ DNA」という用語に含まれる。
【００９４】
「連続配列構造」という用語は、連続配列プローブ、タグ付加標的、および検出配列の間に形成されるハイブリダイズした構造を含む。検出配列は、末端ヌクレオチドが標的ヌクレオチドに相補的である場合、伸長され、連続配列構造におけるプローブにライゲーションされる。連続配列構造は、「ハイブリダイズした構造 DNA」という用語に含まれる。
【００９５】
「遺伝子発現プローブ」という用語は、目的遺伝子または目的遺伝子についての代用(surrogate)である配列、例えば、3' UTR内の配列に相補的となるよう設計された配列を有するプローブを意味する。特定のゲノムまたは配列中の目的遺伝子と同じだけの遺伝子発現プローブが存在しうる。遺伝子発現プローブは「プローブ DNA」という用語に含まれる。
【００９６】
「遺伝子発現構造」という用語は、二本鎖DNA 構造を意味する。各遺伝子発現構造は、遺伝子発現プローブの１つにハイブリダイズしたタグ付加標的およびタグ付加標的の検出配列相補鎖にハイブリダイズした検出配列を含む。タグ付加標的が遺伝子発現プローブにハイブリダイズし、検出配列がタグ付加標的にハイブリダイズした後、検出配列は伸長され、末端ヌクレオチドがハイブリダイズした配列上のその対に対する相補的塩基であれば、遺伝子発現プローブにライゲーションされる。ライゲーションの程度がタグ付加標的における遺伝子発現の程度の尺度である。
【００９７】
「dNTP」という用語は、デオキシアデニン三リン酸 (dATP)、デオキシシトシン三リン酸 (dCTP)、デオキシグアニン三リン酸 (dGTP)、およびデオキシチミン三リン酸 (dTTP)のデオキシヌクレオチド三リン酸混合物の溶液を意味する。
【００９８】
「rNTP」という用語は、アデニン三リン酸 (rATP)、シトシン三リン酸 (rCTP)、グアニン三リン酸 (rGTP)およびウラシル三リン酸 (rUTP)のヌクレオチド三リン酸混合物の溶液を意味する。
【００９９】
「三リン酸混合物」という用語は、dNTPおよびrNTPを含む。
【０１００】
本発明は、マイクロアレイ上での、SNP、配列決定、および遺伝子発現アッセイ方法を提供する。複数のプローブをマイクロアレイ上に有するマイクロアレイが提供される。複数のハイブリダイズした構造がマイクロアレイ上で形成される。各ハイブリダイズした構造は、マイクロアレイを、ハイブリダイズ条件下で、複数のタグ付加標的および複数の検出配列を含むハイブリダイズ溶液に接触させることにより形成される。各ハイブリダイズした構造は１つのプローブおよび１つの検出配列にハイブリダイズした１つのタグ付加標的を含む。各ハイブリダイズした構造は、伸長ライゲーション溶液および伸長ライゲーション条件を用いて伸長される。標的ヌクレオチドに相補的な末端ヌクレオチドを有する各ハイブリダイズした構造は、伸長ライゲーション溶液および伸長ライゲーション条件を用いてライゲーションされる。非結合材料は、洗浄溶液および洗浄方法を用いてマイクロアレイを洗浄することにより除去される。標的ヌクレオチドおよびハイブリダイズした配列が、ライゲーションを有するハイブリダイズした構造から同定される。
【０１０１】
好ましい態様において、検出配列は標識を有する。標識は、検出配列がプローブにライゲーションしたマイクロアレイスポットの同定を提供する。好ましくは、標識は蛍光標識である。標識を有する位置は、マイクロアレイの蛍光イメージングにより同定される。その他の標識も用いることが出来、かかる標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、レーザー、または化学的手段により検出可能であり得る。 
【０１０２】
別の態様において、検出配列は標識を有さない。同定は、洗浄後の、標識された材料のマイクロアレイへの添加を含む。一つの態様において、検出配列相補鎖に実質的に同一である配列および標識、例えば、蛍光標識を有するオリゴヌクレオチドを有する溶液が、マイクロアレイと接触される。配列は洗浄後に残っている検出配列にハイブリダイズする。残っている検出配列は、プローブにライゲーションしたものである。ハイブリダイゼーション溶液は、オリゴヌクレオチドを検出配列にハイブリダイズさせるのに用いる。オリゴヌクレオチドの濃度は1 μMである。いずれの標準的ハイブリダイゼーションバッファーも、ハイブリダイゼーションに好適なバッファーである。例えば、3X SSPE (EDTAを含むリン酸緩衝食塩水)または 3X SSC (クエン酸緩衝食塩水)が好適なバッファーである。オリゴヌクレオチドを有する溶液がマイクロアレイハイブリダイゼーションチャンバーに添加され、およそ 30℃〜55℃でおよそ 0.5〜1.5 時間インキュベートされる。好ましくは、インキュベーションはおよそ 45℃でおよそ 1 時間である。標識を有するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを有するマイクロアレイ位置は、マイクロアレイの蛍光イメージングにより同定される。
【０１０３】
本発明の一つの態様において、標的は目的のゲノムから選択される。標的配列は、PCR および好適なプライマーまたはその他の好適な方法を用いて増幅される。プライマーの１つは再増幅および検出のための共通タグを含む。増幅の際に添加される共通タグは、プライマー伸長のための鋳型および標識されたプライマーハイブリダイゼーションのためのアンチセンス配列を提供する。増幅の後、合わせられた一本鎖 PCR産物および標識された共通プライマーはマイクロアレイ上でハイブリダイズする。１ステップの伸長およびライゲーション反応が行われ、それは、DNA リガーゼ、例えば、大腸菌 DNA リガーゼおよびポリメラーゼ、例えば、 Taqストッフェル(Stoffel)フラグメントまたは逆転写酵素を用いて達成することが出来る。この組合せ反応のための酵素は狭く規定された特性を有さなければならない。第一に、ポリメラーゼは、鎖置換またはエキソヌクレアーゼ活性を有してはならない。第二に、リガーゼはミスマッチを識別できなくてはならない。最後の洗浄ステップはライゲーションしていない材料を除去し、SNP、配列、または遺伝子発現の判定を可能にする。好ましい態様において、室温での 0.1 M水酸化ナトリウムが、非結合材料の除去のためのマイクロアレイの洗浄に用いられる。
【０１０４】
本発明の別の態様において、RNA 標的配列がDNA 標的配列の代わりに標的配列から選択される。DNA 標的配列についての方法において用いられるようにPCRの前に、cDNA をRNA 標的配列から逆転写酵素を用いて作る。標的配列および２つのプライマーがPCR またはその他の好適な方法を用いて増幅される。プライマーの１つは、再増幅および検出のための共通タグを含む。増幅の際に添加される、共通タグは、プライマー伸長のための鋳型および標識されたプライマーハイブリダイゼーションのためのアンチセンス配列を提供する。増幅の後、合わされた一本鎖 PCR産物および標識された共通プライマーはマイクロアレイ上でハイブリダイズする。１ステップの伸長およびライゲーション反応が行われ、これはDNA リガーゼ、例えば、大腸菌 DNA リガーゼおよびポリメラーゼ、例えば、Taq ストッフェル(Stoffel)フラグメントまたは逆転写酵素を用いて達成できる。この組合せ反応のための酵素は狭く規定された特性を有さなければならない。第一に、ポリメラーゼは、鎖置換またはエキソヌクレアーゼ活性を有してはならない。第二に、リガーゼは、ミスマッチを識別することができなければならない。最後の65℃の水洗浄ステップによりライゲーションしていない標識が除去され、SNP、配列、または遺伝子発現の判定が可能となる。好ましい態様において、室温で0.1 Mの水酸化ナトリウムが、非結合材料の除去のためのマイクロアレイの洗浄に用いられる。
【０１０５】
本発明の１つの態様を図1Aから1Fに、一連のステップの後のマイクロアレイの部分の模式図として示す。図 1A は、複数の位置 102、104 およびプローブの付着のための反応性表面 106を有するマイクロアレイ 100の断面の模式図である。反応性表面 106は、アレイ全体または位置102、104のみを被覆しうる。
【０１０６】
図 1Bを参照すると、複数のマッチプローブ 108が、マイクロアレイ 100上の少なくとも１つのマッチ位置 102上の160に位置し、複数のミスマッチプローブ119が、マイクロアレイ 100上の少なくとも１つの ミスマッチ 位置 104上の160に位置している。マッチプローブ108は、マッチ3’末端 117、マッチ5’末端 112、およびマッチ末端ヌクレオチド 118をマッチ5’末端 112上に有する。マッチ末端ヌクレオチド 118はマッチ5’末端 112上の最後のヌクレオチドである。ミスマッチプローブ119は、ミスマッチ 3’末端 127、ミスマッチ 5’末端 122、およびミスマッチ 5’末端 122上にミスマッチ末端ヌクレオチド 128を有する。ミスマッチ末端ヌクレオチド 128は、ミスマッチ 5’末端 122上の最後のヌクレオチドである。マッチ3’末端 117およびミスマッチ 3’末端 127は、反応性表面 106にそれぞれ位置102、104にて マイクロアレイ 100に結合している付着末端 110を有する任意のスペーサー 116に結合している。
【０１０７】
マッチプローブ108およびミスマッチプローブ119 は、マッチ末端ヌクレオチド 118がミスマッチ末端ヌクレオチド 128と異なる以外は同じであるヌクレオチド 配列 114、124を有する。マッチ末端ヌクレオチド 118 は野生型または突然変異型であり得る。マッチ末端ヌクレオチドが野生型である場合、ミスマッチ末端ヌクレオチドは突然変異型である。マッチ末端ヌクレオチドが突然変異型である場合、ミスマッチ末端ヌクレオチドは野生型である。
【０１０８】
好ましくは、マイクロアレイは電極マイクロアレイである。好ましくは、マッチプローブ108およびミスマッチプローブ119は、電極マイクロアレイ上でインサイチュで合成される。好ましくはマッチプローブ108およびミスマッチプローブ119のインサイチュ合成は、標準的ホスホラミダイト化学および電気化学的非ブロック化を用いて行われる。好ましくは、プローブはおよそ 5からおよそ 100 ヌクレオチド長である。より好ましくは、プローブはおよそ 10からおよそ 50 ヌクレオチド長である。もっとも好ましくは、プローブはおよそ 15からおよそ 30 ヌクレオチド長である。
【０１０９】
好ましくは、マッチおよびミスマッチプローブ108、119は、およそ 1〜 50 ヌクレオチドを有するスペーサー 116に結合している。より好ましくは、スペーサー 116はおよそ 3〜25 ヌクレオチドを有する。もっとも好ましくは、スペーサー 116は、およそ 5〜 15 ヌクレオチドを有する。しかし、スペーサーは本発明を実施するために必須ではない。スペーサーを用いずに結合しているプローブも本発明の範囲内である。理論に拘束されることなく、スペーサーはおそらくは、タグ付加標的のプローブへのハイブリダイゼーションのためにタグ付加標的のプローブへのより良好な近接を提供するであろう。DNA以外の化学種から構成されるスペーサーも本発明の範囲内である。かかる好適なスペーサーの例としては、これらに限定されないが、 修飾DNA、RNA、修飾RNA、ペプチド、ポリエチレングリコール(PEG)、およびPEG 誘導体、およびそれらの組合せが挙げられる。本発明の実施のためにマイクロアレイにDNAを付着させるためのスペーサーとして好適ないずれの化学種も本発明の範囲内である。
【０１１０】
図 1Cを参照すると、任意のスペーサー 116によりマイクロアレイ 100上にマッチプローブ108およびミスマッチプローブ119を配置した後、タグ付加標的 DNA 130 および検出配列 DNA 144の付加により、図 1Cに示すように複数のマッチ構造156が少なくとも１つのマッチ位置 102上に形成され、複数のミスマッチ構造158が少なくとも１つのミスマッチ位置 104上に形成される。複数のマッチ構造 156および複数のミスマッチ構造158は、マイクロアレイ 100をハイブリダイズ条件下で複数のタグ付加標的 DNA 130および複数の検出配列 DNA 144を含むハイブリダイズ溶液に接触させることにより形成される。
【０１１１】
ハイブリダイズ条件は、ストリンジェンシーと呼ばれる溶液のパラメーターに依存する。ストリンジェンシーには、温度、塩の含量およびバランス、および界面活性剤含量ならびにその他のパラメーターが含まれる。ストリンジェンシーの制御により、ハイブリダイゼーションの程度の制御が可能となる。例えば、より低い温度では、一本鎖オリゴヌクレオチドは別の一本鎖オリゴヌクレオチドへの結合のより高い可能性を有し、一方より高い温度では、他の条件をすべて同じにすると結合の可能性は低くなる。好ましい態様において、ストリンジェンシーは、検出配列とタグ付加標的との間およびタグ付加標的とプローブとの間のハイブリダイゼーションが起こるように選択する。
【０１１２】
好ましくは、多くともおよそ 3〜4のミスマッチがハイブリダイズする鎖の間に存在する。より好ましくは、多くとも１つのミスマッチがタグ付加標的 DNAとミスマッチプローブとの間に存在し、ここでミスマッチはミスマッチプローブの末端ヌクレオチド DNAに位置する。より好ましくは、タグ付加標的 DNAとマッチプローブとの間にミスマッチは存在しない。好ましくは、ハイブリダイズ溶液はバッファー溶液中に複数のタグ付加標的 DNAおよび複数の検出配列 DNAを含む。好ましくは、バッファー溶液は、1 X T4 リガーゼバッファーである。
【０１１３】
複数のタグ付加標的 DNA 130のそれぞれは、標的 3’末端 134、標的 5’末端 132、マッチプローブ114に実質的に相補的なマッチ配列 137および検出配列 DNA 144に実質的に相補的な検出配列相補的 DNA 138を有する。マッチ配列 137は標的ヌクレオチド DNA 142を有し、ここに、タグ付加標的 DNAが一塩基多型を有する場合は一塩基多型が位置する。タグ付加標的 DNA 130は、タグ付加標的 DNA 3’末端 134 に向かって検出配列相補的 DNA 138を、そしてタグ付加標的 DNA 5’末端 132に向かってマッチ配列 137を有する。検出配列 DNA 144は、5' 検出末端 148および3' 伸長末端 152を有する。5' 検出末端はタグまたは標識 150を有する。好ましくは、タグ 150は、蛍光 (Cy3) タグである。しかし、いずれの蛍光タグも好適である。その他のタグを用いることも出来る。好ましくは、検出配列相補的 DNA 138はT7-に基づくオリゴヌクレオチド [配列番号5または配列番号6]である。
【０１１４】
複数のマッチ構造156のそれぞれは、複数のマッチプローブ108の１つにハイブリダイズした複数のタグ付加標的 DNA 130の１つおよび複数のタグ付加標的 DNA130の１つにハイブリダイズした複数の検出配列 DNA 144の１つを含む。マッチ末端ヌクレオチド 118 がタグ付加標的 DNA 130の標的ヌクレオチド DNA 142に対合し相補的となるようにハイブリダイゼーションが起こる。複数のマッチ構造156のそれぞれはマッチプローブ108のマッチ5’末端 112に面した検出配列 DNA 144の 3' 伸長末端 152を有する。
【０１１５】
複数のミスマッチ構造 158のそれぞれは、複数のミスマッチプローブ119の１つにハイブリダイズした複数のタグ付加標的 DNA 130 の１つおよび複数のタグ付加標的 DNA 130の１つにハイブリダイズした複数の検出配列 DNA 144の１つを含む。ミスマッチ末端ヌクレオチド 128がタグ付加標的 DNA 130の標的ヌクレオチド 142に対合するが、相補的ではないようにハイブリダイゼーションが起こる。複数のミスマッチ構造158のそれぞれは、ミスマッチプローブ119のマッチ5’末端 122に面した検出配列 144の3' 伸長末端 152を有する。各マッチ構造 156および各ミスマッチ構造 158 は、ハイブリダイズしていない一本鎖配列 140を有する。
【０１１６】
各マッチ構造 156および各ミスマッチ構造 158 は、非ハイブリダイズテイル 136を有していてもよい。非ハイブリダイズテイル 136が存在するか否かは、タグ付加標的 DNA 130 のどの部分が、SNPがタグ付加標的 DNA 130に存在するか否かを判定するための特定の実験の目的であるかに依存する。目的のタグ付加標的 DNA 130 の配列が標的 5’末端 132を含む場合、マッチプローブ108 は標的 5’末端 132を含む配列に相補的となるため、非ハイブリダイズテイル 136 は存在しない。非ハイブリダイズテイル 136 の長さは、タグ付加標的 DNA 130 のどの配列がプローブにハイブリダイズしているかに依存する。
【０１１７】
図 1Dを参照すると、マッチ構造 156およびミスマッチ構造 158の形成の後、マイクロアレイ 100 を伸長ライゲーション条件下で伸長ライゲーション溶液に接触させる。好ましくは、伸長ライゲーション溶液は、ポリメラーゼ、リガーゼ、dNTP(dATP、dCTP、dGTP、およびdTTPのデオキシヌクレオチド三リン酸混合物)およびバッファーの混合物を含む。好ましくは、伸長ライゲーション条件は温度およそ 37℃で１時間を含む。 かかる条件下で、各マッチ構造 3' 伸長末端 152が、複数のマッチ構造 156のマッチ構造 5' プライム末端 112 に向かって伸長し、そして、各マッチ構造 156の１つのヌクレオチド配列 140にハイブリダイズした伸長配列 170が形成される。マッチ末端ヌクレオチド 118は、複数のマッチ構造 156の伸長配列 170にライゲーションする。さらに、かかる条件下で、各ミスマッチ構造 3' 伸長末端 152は、複数のミスマッチ構造 158のミスマッチ構造 5’末端 122に向かって伸長し、そして、各ミスマッチ構造 158の１つのヌクレオチド配列 140 にハイブリダイズした伸長配列 170が形成される。ミスマッチ末端ヌクレオチド 128は伸長配列 170の複数のミスマッチ構造 158のミスマッチ 末端ヌクレオチド 128へのライゲーションを妨げる。というのは、標的ヌクレオチド 142はミスマッチ末端ヌクレオチド 128に相補的ではないからである。
【０１１８】
図 1Eを参照すると、マッチ構造 156におけるライゲーションおよびミスマッチ構造 156における非ライゲーションの後、非結合材料が洗浄溶液および洗浄方法を用いてマイクロアレイ 100を洗浄することにより除去される。洗浄溶液はバッファー溶液および塩基溶液からなる群から選択される。好ましくは、バッファーはTris バッファーまたはリン酸バッファーであるが、その他のバッファーも好適である。好ましくは、リン酸バッファーは、pHがおよそ 7〜7.5のリン酸緩衝食塩水 (PBS)である。好ましくは、Tris バッファーは、pH がおよそ 7〜7.5のTris-HClである。好ましくは、PBS バッファーは0.05 X PBS バッファーである。好ましくは、塩基溶液は水酸化ナトリウム水溶液である。好ましくは、塩基の濃度はおよそ 0.01〜 5 Mである。より好ましくは、塩基濃度はおよそ 0.05〜 1 Mである。もっとも好ましくは、塩基濃度はおよそ 0.1 M 水酸化ナトリウムである。洗浄方法は、マイクロアレイを洗浄溶液におよそ 室温からおよそ 70℃の温度で曝すことを含む。好ましくは、洗浄方法は、十分に非結合材料が除去されてマイクロアレイの正確な読みが可能となるまでおよそ室温で塩基を有する洗浄溶液にマイクロアレイを曝すことを含む。一般に、およそ３回の洗浄が十分である。複数のミスマッチ構造 158の検出配列144は実質的に除去され、複数のマッチ構造のマッチプローブにライゲーションした検出配列144は実質的に除去されない。マッチ構造 156およびミスマッチ構造 158のタグ付加標的130は除去されうる。しかし、本発明は、マッチ構造 156 およびミスマッチ構造 158からのタグ付加標的 DNA 130の除去は必要とはしない。
【０１１９】
図 1Fを参照すると、洗浄の後、マイクロアレイは、マッチ構造が位置するマイクロアレイ位置を決定するために調べられる。マッチ構造の位置は検出配列 144上のタグ 150によって決定される。というのは、検出配列 DNA 144はマッチプローブ108にライゲーションしているからである。マッチ位置はタグ 150を有し、ミスマッチ位置はタグ 150を有さないため、マッチ位置は高い読みを有する一方、ミスマッチ位置は低い読みを有する。高い読みはマッチ末端ヌクレオチド 118を同定し、それを用いて標的ヌクレオチド 142が同定される。というのは、マッチ末端ヌクレオチド 118と標的ヌクレオチド DNA 142は互いに相補的であるからである。標的ヌクレオチド DNA 142はマッチ末端ヌクレオチド 118により同定される。というのは、マッチ末端ヌクレオチドは既知であるからである。標的ヌクレオチド DNA 142は既知の一塩基多型と比較されて複数のタグ付加標的130が既知の一塩基多型を有しているか否かを判定されうる。あるいは、標的ヌクレオチドは配列における塩基の同定に用いられる。あるいは、標的ヌクレオチドは遺伝子発現の同定に用いられる。
【０１２０】
好ましい態様において、タグ付加標的 DNA 130 (図 1C)はゲノムDNAの部分のポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 増幅によって得られる。ゲノムDNAはSNPがゲノムDNAに存在するならば少なくとも１つの目的SNPをその上に位置して有する。あるいは、ゲノムDNAは同定すべき配列である。あるいは、ゲノムDNAは遺伝子発現の程度を調べるべき目的遺伝子である。図2Aおよび2Bを参照すると、標的 ゲノムDNA 200が選択される。相補鎖 204を有する標的 DNA 202が選択される。標的 DNA 202 および相補鎖 204 は、タグ付加特異的フォワードプライマー 208 および特異的リバースプライマー 214を用いて第一段階 PCR 増幅 206によって増幅される。タグ付加特異的フォワードプライマー 208はタグ 210およびフォワードプライマー 212を有する。第一段階 PCR産物216は、タグ相補鎖 220 および標的 202を有するタグ付加標的 DNA 222を有する。さらに、産物 216はタグ 210および標的の相補鎖204を有するタグ付加標的 DNAの相補鎖218を有する。
【０１２１】
第二段階 PCR 224を用いてビオチンタグ 226を導入する。特異的リバースプライマー 214 およびビオチンタグ付加特異的フォワードプライマー 228を第二段階に用いる。フォワードプライマーは、プライマー 207に結合したビオチンタグ 226を有し、これはタグ 210 と同じDNA 配列であるが任意のDNA 伸長 227を有する。第二段階 PCR産物228は、相補的タグ 220を有するタグ付加標的 DNA 222、任意のDNA 伸長の任意の相補鎖229および標的 202を有する。さらに、産物 228は任意のDNA 伸長 227を有するタグ 210を有するタグ付加標的 DNAの相補鎖230、標的相補鎖 204、およびタグ 210に結合したビオチンタグ 226を有する。次の工程において、ストレプトアビジンを有する磁気ビーズ232が添加されて、ビオチン 226がビーズ 236に付着し、こうして 増幅DNA 二本鎖 222、234が固着される。タグ付加標的 DNA 222はNaOH 238を用いて溶出することによって回収される。タグ付加標的 DNA 222は溶出され、相補鎖は磁気ビーズ 236 にビオチン 226を介して結合したまま残る。
【０１２２】
図 3を参照すると、プローブ 320、任意のスペーサー 324および末端ヌクレオチド 322を結合して有しているマイクロアレイが、標的 304および相補的 タグ 302を有するタグ付加標的 300と、蛍光色素 (Cy3) 312およびタグ 314を含む検出配列 310とを組み合わせて含む溶液に曝される。
【０１２３】
図 1Bを参照すると、マッチ末端ヌクレオチド 118は、野生型または突然変異型と相補的であり得る。マッチ末端ヌクレオチド 118が野生型と相補的である場合、ミスマッチ末端ヌクレオチド 128は突然変異型に相補的である。というのは標的ヌクレオチド 142は野生型に対するマッチを有し、標的は突然変異を有さないからである。一方、マッチ末端 118が突然変異型である場合、ミスマッチ末端ヌクレオチド 128は野生型である。というのは、標的は突然変異型に対するマッチを有し、標的は突然変異を有するからである。
【０１２４】
本発明の別の態様において、マッチプローブ108およびミスマッチプローブ119はあらかじめ合成されて、マイクロアレイ上に配置される。好適な配置方法としては、これらに限定されないが、以下が含まれる：(1)スポッティングロボットを用いた調製された平面への溶液のスポッティング、および、 (2) 電場誘引/反発沈着。好ましくは、プローブはインサイチュで電極マイクロアレイ上で合成される。
【０１２５】
本発明の別の態様において、マッチプローブ108およびミスマッチプローブ119は電極マイクロアレイの使用を必要としない方法を用いてその上にインサイチュで合成される。かかる好適なインサイチュ合成方法としては、これらに限定されないが、以下が含まれる：(1)インクジェットまたはその他の印刷技術を介した印刷試薬によるインサイチュ合成および標準的ホスホラミダイト化学の使用、(2)マスクレス光生成酸 (PGA)制御インサイチュ合成および標準的ホスホラミダイト化学の使用、(3) 感光性保護基 (PLPG)の光切断を利用するマスクで導かれるインサイチュ並行合成、および、(4) PLPG およびデジタルフォトリソグラフィーを用いるマスクレスインサイチュ並行合成。
【０１２６】
本発明の別の態様において、複数のマッチプローブ108のみがマイクロアレイ 100上の少なくとも１つのマッチ位置 102上に配置される。末端ヌクレオチド 118は標的相補鎖 142を同定するために用いられる。標的相補鎖 142が突然変異している場合、標的は目的SNPを有する。標的相補鎖 142が野生型である場合、標的は目的SNPを有さない。
【０１２７】
本発明の別の態様において、ミスマッチプローブ119のみがマイクロアレイ 100上の少なくとも１つのミスマッチ位置 104上に配置される。末端ヌクレオチド 128 は標的ヌクレオチド 142の除去工程による同定に用いられる。検出配列 DNA 310は、標的ヌクレオチド 142と末端ヌクレオチド 128が相補的でない場合ライゲーションしないので、標的ヌクレオチド 142は、標的ヌクレオチド 142に対して相補的でない末端ヌクレオチド 128により同定されうる。例えば、標的ヌクレオチド 142がAである場合、末端ヌクレオチド128 A、C、およびGはライゲーションを妨げるため標的ヌクレオチド 117は、除去工程によりAであると同定され得る。
【０１２８】
好ましくは、標的およびプローブは５未満の内部ミスマッチを有し、標的およびプローブは５未満の内部ミスマッチを有する。好ましくは、伸長ライゲーション溶液は、水、大腸菌リガーゼバッファー、dNTP、Taq ポリメラーゼストッフェル(Stoffel)フラグメント、および大腸菌リガーゼを含む。より好ましくは、伸長ライゲーション溶液は、およそ 155μlの水、およそ80μlの １０倍濃縮大腸菌リガーゼバッファー、およそ3μlの10mM dNTP、およそ2μlの Taq ポリメラーゼストッフェル(Stoffel)フラグメント、およびおよそ2 μlの 大腸菌リガーゼを含む。 好ましくは、伸長ライゲーション条件は、伸長ライゲーション溶液に曝されたマイクロアレイのおよそ 37℃でのおよそ １時間のインキュベーションを含む。
【０１２９】
洗浄溶液は、バッファー溶液および塩基溶液からなる群から選択される。好ましくは、バッファーは、Tris バッファーまたはリン酸バッファーであるが、その他のバッファーも好適である。好ましくは、リン酸バッファーは、pHがおよそ 7〜7.5のリン酸緩衝食塩水 (PBS)である。好ましくは、Tris バッファーは、pHがおよそ7〜7.5のTris-HClである。好ましくは、PBS バッファーは、0.05 X PBS バッファーである。好ましくは、塩基溶液は水酸化ナトリウム水溶液である。好ましくは、塩基の濃度はおよそ 0.01〜 5 Mである。より好ましくは、塩基濃度はおよそ 0.05〜 1 Mである。もっとも好ましくは、塩基濃度はおよそ 0.1 M 水酸化ナトリウムである。洗浄方法は、マイクロアレイを洗浄溶液におよそ 室温からおよそ 70℃の温度で曝すことを含む。好ましくは、洗浄方法は、マイクロアレイを塩基を有する洗浄溶液におよそ室温で、マイクロアレイの正確な読みが得られるのに十分に非結合材料が除去されるまで曝すことを含む。一般に、およそ３回の洗浄が十分である。
【０１３０】
本発明の別の態様において、図 1Aを参照すると、さらなるマイクロアレイ位置を、位置102、104と組み合わせて用いることが出来る。例えば、野生型がAであり、突然変異型 が Cである場合、位置102、104をプローブ上の末端ヌクレオチドとしてTおよびGを有するように用いることが出来る。突然変異がCまたは Gであり得る場合、さらなる位置は、C 末端ヌクレオチドを有するプローブを有するように用いることが出来る。突然変異 がC、G、またはTであり得る場合、２つのさらなる位置を用いることが出来、ここで、さらなる位置はプローブ上の末端ヌクレオチドとしてC およびAを有する。したがって、異なる末端ヌクレオチドを有するプローブを有する４までの位置を、タグ付加標的の標的ヌクレオチドを決定するために用いることが出来る。
【０１３１】
図 4Aを参照すると、本発明の一つの態様において、マイクロアレイに基づく、一塩基多型、配列決定、および遺伝子発現アッセイ方法は、４タイプのプローブ DNAを有するマイクロアレイを提供することおよび、タグ付加標的 DNAおよび検出配列 DNAを使用することを含む。プローブ DNAは、マイクロアレイ 400上のA-位置 402上に複数の A-プローブ410を、マイクロアレイ 400上のC-位置 404上に複数の C-プローブ420を、マイクロアレイ 400上のG-位置 406上に複数の G-プローブ430を、そしてマイクロアレイ 400上のT-位置 408上に複数の T-プローブ 440を含む。A-プローブ410 は、 A-3’末端 414、A-5’末端 412、およびA-5’末端 412上にデオキシアデニル酸 418を有する。C-プローブ420は、C-3’末端 424、C-5’末端 422、およびC-5’末端 422上にデオキシシチジル酸 428を有する。G-プローブ430は、 G-3’末端 434、G-5’末端 432、およびG-5’末端 432上にデオキシグアニル酸 438を有する。T-プローブ 440 は、T-3’末端 444、T-5’末端 442、およびT-5’末端 442上にデオキシチミジル酸 448を有する。A-3’末端 414、C-3’末端 424、G-3’末端 434、T-3’末端 444はマイクロアレイに結合している。A-プローブ 410、C-プローブ420、G-プローブ430、およびT-プローブ440は、A-5’末端 412上のデオキシアデニル酸 418、C-5’末端 422上のデオキシシチジル酸428、 G-5’末端 432上のデオキシグアニル酸 438、およびT-5’末端 442上のデオキシチミジル酸 448を除いてはほぼ同一である。各プローブは任意のスペーサー 416、426、436、446を有するように示されている。
【０１３２】
図1C、3、4A、および4Bを参照すると、各プローブ 410、420、430、440は、タグ付加標的 DNA 300との5 塩基対未満のミスマッチを有するDNA 配列 419、429、439、449を有する。少なくとも１つの A-位置 402上の複数の A-構造450、少なくとも１つの C-位置 404上の複数の C-構造452、少なくとも１つの G-位置 406上の複数の G-構造 454、少なくとも１つの T-位置 408上の複数の T-構造456 はマイクロアレイ 400にインサイチュ合成またはスポッティングにより配置している。A-構造 450、C-構造 452、G-構造 454、およびT-構造 456 は、マイクロアレイ 400をハイブリダイズ条件下で複数のタグ付加標的 DNA 300 および複数の検出配列 DNA 310を含むハイブリダイズ溶液に接触させることにより形成される。複数のタグ付加標的 DNA 130、300 のそれぞれは、標的 3’末端 134、標的 5’末端 132、検出配列 DNA 310、144に実質的に相補的な検出配列相補的 DNA 138、およびA-プローブ419、C-プローブ429、G-プローブ 439、およびT-プローブ449に実質的に相補的な標的配列 DNA 137、304を有する。標的配列 137、304は、標的ゲノムにおける位置に対応する標的ヌクレオチド 142を有する。検出配列相補的 DNA 138は標的 3’末端 134上にあり、マッチ配列 137は標的 5’末端 132上にある。検出配列 144は、 5' 検出末端 148 および3' 伸長末端 152を有する。
【０１３３】
各A-構造は、１つのA-プローブにハイブリダイズし１つの検出配列 DNAにハイブリダイズした１つのタグ付加標的 DNAを含む。A-5’末端上のデオキシアデニル酸は、標的ヌクレオチドと塩基対形成する。複数の A-構造のそれぞれは、A-プローブのA-5’末端に面した検出配列 DNAの3' 伸長末端を有しており、A-構造 3'伸長末端およびA-構造 5’末端を提供している (図 4B、450)。
【０１３４】
各C-構造は、１つのC-プローブにハイブリダイズし、１つの検出配列 DNA にハイブリダイズした１つのタグ付加標的 DNAを含む。C-5’末端上のデオキシシチジル酸は標的ヌクレオチドと塩基対形成している。複数の C-構造のそれぞれは、C-プローブのC-5’末端に面した検出配列 DNA の3' 伸長末端を有しており、C-構造 3'伸長末端およびC-構造 5’末端を提供している(図 4B、452)。
【０１３５】
各G-構造は、１つのG-プローブにハイブリダイズし、１つの検出配列 DNAにハイブリダイズした１つのタグ付加標的 DNAを含む。G-5’末端上のデオキシグアニル酸は標的ヌクレオチドと塩基対形成している。複数の G-構造のそれぞれはG-プローブのG-5’末端に面した検出配列 DNAの3' 伸長末端を有しており、G-構造 3'伸長末端およびG-構造 5’末端を提供している (図 4B、454)。
【０１３６】
各T-構造は、１つのT-プローブにハイブリダイズし１つの検出配列 DNAにハイブリダイズした１つのタグ付加標的 DNAを含む。T-5’末端上のデオキシチミジル酸は標的ヌクレオチドと塩基対形成している。複数の T-構造のそれぞれは、T-プローブのT-5’末端に面した検出配列 DNAの3' 伸長末端を有しており、T-構造 3'伸長末端およびT-構造 5’末端を提供している(図 4B、456)。
【０１３７】
マイクロアレイは伸長ライゲーション溶液と伸長ライゲーション条件下で接触され、その結果、 各 A-構造 3' 伸長末端は、複数の A-構造のA-構造 5’末端に向かって伸長し、各 C-構造 3' 伸長末端は、複数の C-構造のC-構造 5’末端に向かって伸長し、各 G-構造 3' 伸長末端は、複数の G-構造のG-構造 5’末端に向かって伸長し、そして、各 T-構造 3' 伸長末端は、複数の T-構造のT-構造 5’末端に向かって伸長する。伸長の後、A-伸長した検出配列が A-構造 5’末端に隣接して形成され; C-伸長した検出配列が C-構造 5’末端に隣接して形成され; G-伸長した検出配列がG-構造 5’末端に隣接して形成され; T-伸長した検出配列が T-構造 5’末端に隣接して形成される(図 1D、170)。
【０１３８】
標的ヌクレオチド DNAに相補的な末端ヌクレオチド DNA を有する各 A-構造は、A-伸長した検出配列 DNA の A-構造 5’末端へのライゲーションを有する。標的ヌクレオチド DNAに相補的な末端ヌクレオチド DNAを有する各 C-構造は、C-伸長した検出配列 DNAの C-構造 5’末端へのライゲーションを有する。標的ヌクレオチド DNAに相補的な末端ヌクレオチド DNA を有する各 G-構造は、G-伸長した検出配列 DNAの G-構造 5’末端へのライゲーションを有する。標的ヌクレオチド DNA に相補的な末端ヌクレオチド DNA を有する各 T-構造は、T-伸長した検出配列 DNAの T-構造 5’末端へのライゲーションを有する。
【０１３９】
非結合材料は、洗浄溶液および洗浄方法を用いてマイクロアレイを洗浄することにより除かれる。ライゲーションしていないA-伸長した検出配列 DNA、C-伸長した検出配列 DNA、G-伸長した検出配列 DNA、および T-伸長した検出配列 DNAは除去される。ライゲーションしたA-伸長した検出配列 DNA、C-伸長した検出配列 DNA、G-伸長した検出配列 DNA、およびT-伸長した検出配列 DNAは除去されない。A-位置、C-位置、G-位置、および T-位置の１つが高い読みを有し、A-位置、C-位置、G-位置、およびT-位置の３つは低い読みを有する。高い読みの位置は、相補的末端ヌクレオチド DNAを有する標的ヌクレオチド DNAを有するマイクロアレイ上の位置に対応する。低い読みは、非相補的末端ヌクレオチド DNAを有する標的ヌクレオチド DNAを有するマイクロアレイ上の位置に対応する。末端ヌクレオチド DNAは既知であり、標的ヌクレオチドの同定に用いられる。標的ヌクレオチドが同定された後、標的ヌクレオチドを既知の一塩基多型と比較して、標的が一塩基多型を有するか否かを判定することが出来る。あるいは、標的ヌクレオチドおよびプローブ DNAを、遺伝子発現の同定に用いることが出来る。
【０１４０】
４つのプローブ 410、420、430、440を有するマイクロアレイを調製する方法は、マッチおよびミスマッチプローブ108、119を有する方法について開示したものと同様である。ハイブリダイゼーション溶液および方法は、マッチおよびミスマッチプローブを有する方法について開示したものと同様である。伸長ライゲーション溶液および方法は、 マッチおよびミスマッチプローブを有する方法について開示したものと同様である。洗浄溶液および方法はマッチおよびミスマッチプローブを有する方法について開示したものと同様である。
【０１４１】
図 5を参照すると、本発明の別の態様において、マイクロアレイに基づく、一塩基多型、配列決定、および遺伝子発現アッセイ方法が提供される。標的 500は、標的上の目的の領域に沿って各塩基についての４つのプローブを含む連続配列プローブを調製することによって配列決定される。プローブは相補的配列 501に基づく。標的 500 の最初の５塩基が各塩基についての４つのプローブを有することが示されている。この最初の塩基、Aについて、４つのプローブ 502、504、506、508が任意のスペーサーを有して、マイクロアレイ 501に結合していることが示されている。第２の塩基、Tについて、４つのプローブ 510、512、514、516が任意のスペーサーを有してマイクロアレイ 501に結合していることが示されている。第３塩基、Tについて、４つのプローブ 520、522、524、526が任意のスペーサーを有してマイクロアレイ 501に結合していることが示されている。第４塩基、Aについて、４つのプローブ 530、532、534、536が任意のスペーサーを有してマイクロアレイ 501に結合していることが示されている。第５塩基、Tについて、４つのプローブ540、542、544、546が任意のスペーサーを有してマイクロアレイ 501に結合していることが示されている。プローブ長は15 塩基として示されている。プローブ長はおよそ 5からおよそ 100 ヌクレオチドである。
【０１４２】
連続配列プローブおよび検出配列 DNAにハイブリダイズする タグ付加標的は複数の連続配列構造を形成する。複数の連続配列構造は伸長ライゲーション溶液および伸長ライゲーション条件を用いて伸長される。標的ヌクレオチドに相補的な末端ヌクレオチドを有する複数の連続配列構造は、伸長ライゲーション溶液および伸長ライゲーション条件を用いてライゲーションされる。非結合材料は洗浄溶液および洗浄方法を用いて除去される。タグ付加標的の標的ヌクレオチドが決定され、これによって連続配列プローブから標的の配列が提供される。
【０１４３】
別の態様において、タグ付加標的は、タグ付加標的 RNA、検出配列 DNAを含む検出配列および、プローブ DNAを含むプローブを含む。好ましくは、タグ付加標的 RNAは mRNAを含む。mRNAは、パラフィン包埋されたRNAから得たものであってよい。プローブ DNAはマイクロアレイ上に位置する。プローブ DNAはマイクロアレイ上にスポッティングされうる。プローブDNAはインサイチュでマイクロアレイ上で合成され得る。好ましくは、プローブ DNAはインサイチュで電極マイクロアレイ上で合成される。好ましくは、検出配列 DNAは蛍光タグを有する。好ましくは、タグ付加標的 RNAおよびプローブ DNA はハイブリダイズさせた場合に５未満の内部ミスマッチを有し、タグ付加標的 RNAおよび検出配列 DNAはハイブリダイズさせた場合におよそ５未満の内部ミスマッチを有する。
【０１４４】
タグ付加標的 RNAおよび検出配列 DNAは、ハイブリダイズ溶液およびハイブリダイズ方法を用いてプローブ DNAを有するマイクロアレイ上でハイブリダイズして、ハイブリダイズした構造 DNA/RNAを形成する。好ましくは、ハイブリダイズ溶液は、複数のタグ付加標的 RNA および複数の検出配列 DNAを、T4 リガーゼ バッファーを含むバッファー溶液中に含む。好ましくは、ハイブリダイズ方法は、マイクロアレイをハイブリダイズ溶液におよそ 45℃でおよそ１時間曝すことを含む。
【０１４５】
１ステップの伸長およびライゲーション反応が、伸長ライゲーション溶液および方法を用いて行われる。伸長ライゲーション溶液は、水、バッファー、dNTP、ポリメラーゼ、およびリガーゼを含む。方法は溶液に曝されたマイクロアレイのおよそ 37℃でおよそ １時間のインキュベーションを含む。ポリメラーゼはDNA ポリメラーゼである。好ましくは、DNA ポリメラーゼは逆転写酵素である。好ましくは、バッファーは大腸菌リガーゼバッファーを含む。好ましくは、リガーゼは大腸菌リガーゼを含む。あるいは、バッファーはT4 リガーゼバッファーを含み、リガーゼはT4 DNA リガーゼを含む。非結合材料は洗浄により除去される。洗浄溶液はバッファー溶液および塩基溶液からなる群から選択される。好ましくは、バッファーは、Tris バッファーまたはリン酸バッファーであるが、その他のバッファーも好適である。好ましくは、リン酸バッファーはpHがおよそ 7〜7.5のリン酸緩衝食塩水 (PBS)である。好ましくは、Tris バッファーはpHがおよそ 7〜7.5のTris-HClである。好ましくは、PBS バッファーは0.05 X PBS バッファーである。好ましくは、塩基溶液は水酸化ナトリウム水溶液である。好ましくは、塩基の濃度はおよそ 0.01〜 5 Mである。より好ましくは、塩基濃度はおよそ 0.05〜 1 Mである。もっとも好ましくは、塩基濃度はおよそ 0.1 M 水酸化ナトリウムである。洗浄方法は、マイクロアレイを洗浄溶液におよそ室温からおよそ 70℃の温度で曝すことを含む。好ましくは、洗浄方法は、塩基を有する洗浄溶液にマイクロアレイを、およそ室温でマイクロアレイの正確な読みが可能になるのに十分に非結合材料が除去されるまで曝すことを含む。一般に、およそ３回の洗浄が十分である。
【０１４６】
以下の実施例は本発明を単に説明、例示および明確にするために提供するものであり、本発明の範囲または用途を制限するものではない。
【０１４７】
実施例 1
マイクロアレイに基づくSNPアッセイを目的ゲノムからタグ付加標的 DNA、ヒト毛細血管拡張性運動失調変異 (ATM) 遺伝子を調製することにより電極マイクロアレイ上で行った。４つの既知の突然変異を、よく特徴決定された 市販の 全ゲノムDNA サンプルからのヒト ATM 遺伝子において検出した。サンプルは、Coriell Cell Repositories から得、以下を含むものであった: (1) 患者 #1、NA02052; (2) 患者 #2、NA11261; (3) 患者 #3、NA03189;および(4) 患者 #4 (正常)、NA13069。患者 #1 DNAは、ATM 遺伝子においてヌクレオチド位置 103 に１つの突然変異を含んでいた(C→T); 患者 #2 DNAはATM 遺伝子においてヌクレオチド位置 7327 (C→T) および 7926 (A → C)に２つの突然変異を含んでいた; 患者 #3 DNA はATM 遺伝子においてヌクレオチド位置 8266 (A → T)に１つの突然変異を含んでいた;そして患者 #4はATM 遺伝子において突然変異を含んでいなかった。予測突然変異の位置を有する各患者の遺伝子の部分を選択し、突然変異が存在する各位置についての各患者サンプルのためのタグ付加標的 DNAの産生のためのPCR 増幅の鋳型として用いた。
【０１４８】
各患者からの全ゲノムDNAサンプルを、各突然変異部位のためのタグ付加標的 DNAの溶液の調製のための２段階 PCR 方法に供した。したがって各患者サンプルについて、４つの別々の２段階 PCR 調製を行って、突然変異が起こりうる４つの位置のそれぞれにおける各患者のためのタグ付加標的 DNA を得た。患者 #1 サンプルについては、標的 DNAのDNA 配列は配列番号7、8、9、および10、ならびにそれらの相補鎖から構成された。患者 #2 サンプルについては、標的 DNAのDNA 配列は配列番号11、12、13、および10、ならびにそれらの相補鎖から構成された。患者 #3 サンプルについては、標的 DNAのDNA 配列は配列番号11、8、9、および14、ならびにそれらの相補鎖から構成された。患者 #4 サンプルについては、標的 DNAのDNA 配列は配列番号11、8、9、および10、ならびにそれらの相補鎖から構成された。
【０１４９】
第一PCR段階において、以下を含むPCR 溶液を作成した：67 μlの 精製水 (Ambion Molecular Grade)、10 μlの 10 X ポリメラーゼバッファー (New England BioLabs、Inc.、#B9004S)、10 μlの ジメチルスルホキシド、1 μlのTaq DNA ポリメラーゼ (New England BioLabs、Inc.、#M0267S)、3 μlの10 mM dNTPミックス (New England BioLabs、Inc.、#N0447S)、2 μlの 10 μM タグ付加特異的フォワードプライマー (Integrated DNA Technologies、Inc.)、2 μlの10 μM 特異的リバースプライマー (Integrated DNA Technologies、Inc.)、および5 μlのゲノムDNA（20 ng/μl）。使用したフォワードプライマーは以下の通りであった: ATM 位置 103について配列番号31; ATM 位置 7327について配列番号33; ATM 位置 7926について配列番号35;およびATM 位置 8266について配列番号37。 使用したリバースプライマーは以下の通りであった: ATM 位置 103について配列番号32; ATM 位置 7327について配列番号34; ATM 位置 7926について配列番号36;およびATM 位置 8266について配列番号38。
【０１５０】
反応条件は5 分94℃の変性、および30 サイクルの増幅から構成され、ここで各サイクルは、30 秒94℃の変性、30秒55℃のアニーリングおよび30 秒72℃の伸長から構成された。最終伸長を10 分72℃で行って反応を完了した。PCR 溶液を次いでおよそ 0℃またはそれよりわずかに低い温度で第二PCR段階に供するまで保存した; しかし、いくつかのサンプルは保存せずに直接使用し、いくつかのサンプルは凍結して長期間保存した。各患者についての第一段階 PCR からのPCR産物は以下の通りであった: 患者 #1  位置 103 配列番号15 およびその相補鎖、位置 7327 配列番号16 およびその相補鎖、位置 7926 配列番号17 およびその相補鎖、および位置 8266 配列番号18 およびその相補鎖; 患者 #2  位置 103 配列番号19 およびその相補鎖、位置 7327 配列番号20 およびその相補鎖、位置 7926 配列番号21 およびその相補鎖、および位置 8266 配列番号18 およびその相補鎖; 患者 #3  位置 103 配列番号19 およびその相補鎖、位置 7327 配列番号16 およびその相補鎖、位置 7926 配列番号17 およびその相補鎖、および位置 8266 配列番号22 およびその相補鎖; そして患者 #4  位置 103 配列番号19 およびその相補鎖、位置 7327 配列番号16 およびその相補鎖、位置 7926 配列番号17 およびその相補鎖、および位置 8266 配列番号18 およびその相補鎖。
【０１５１】
第二PCR段階において、67 μlの 精製水、10 μlの 10 X ポリメラーゼバッファー、10 μlのジメチルスルホキシド、1 μlの Taq DNA ポリメラーゼ、3 μlの10 mM dNTPミックス、2 μlの10 μM ビオチン化 T7 共通フォワードプライマー、2 μlの10 μM 特異的リバースプライマー、および 5 μlの段階 1からの増幅産物(Qiagen QIAquick ヌクレオチド除去キット (#28306)で清浄にされて、第一段階からのプライマーが除去されている）を含むPCR 溶液を作った。４つのすべてのATM 位置について用いたビオチン化 フォワードプライマーは配列番号39であった。用いたリバースプライマーは以下の通りであった: ATM 位置 103には配列番号32; ATM 位置 7327には配列番号34; ATM 位置 7926には配列番号36;および ATM 位置 8266 には配列番号38を用いた。
【０１５２】
反応条件は5 分94℃の変性および40 サイクルの増幅から構成され、ここで各サイクルは30 秒94℃の変性、30 秒55℃のアニーリングおよび30 秒72℃の伸長から構成された。最終伸長は10 分72℃で行って反応を完了した。PCR 溶液を次いでおよそ 0℃またはそれよりわずかに低い温度で保存した; しかし、いくつかのサンプルは保存せずに直接用い、いくつかのサンプルは凍結して長期保存した。その結果得られた産物をQiagen QIAquick ヌクレオチド除去キット (#28306)で精製し、100 μlの精製水で溶出した。
【０１５３】
100μlのストレプトアビジン磁気ビーズ (New England Biolabs #S1420S)を2 X PBSを用いて３回洗浄した。上記からの清浄となったPCR産物を10 X PBSの添加により2 X PBSとし、磁気ビーズと混合して室温で15 分インキュベートした。この混合物を6000 RPMで1 分微量遠心管中で遠心分離し、次いでビーズを2 X PBSで２回洗浄した。最後の洗浄溶液を除去した後、20 μlの0.1 M NaOH 溶液をビーズと混合し、室温で10 分インキュベートした。ビーズを次いで6000 RPMで遠心分離し、上清をタグ付加標的 DNAを含んでいるため取っておき、それをNaOHで溶出した。20μlの 0.1 M NaOHを再びビーズと混合し、10 分インキュベートした。最後に、ビーズを遠心分離した;上清を先の20 μlに添加した;溶液を20 μlの 0.2 M HClおよび7 μlの 10 X PBSで中和した。再び、タグ付加標的 DNAをQiagen QIAquick ヌクレオチド除去キット (#28306)で精製し、100 μlの精製水 (Ambion)で溶出した。
【０１５４】
第二段階 PCRからの清浄した後の各患者についてのPCR産物はタグ付加標的 DNAを含んでおり、以下の通りであった: 患者 #1  位置 103 配列番号23 およびその相補鎖、位置 7327 配列番号24 およびその相補鎖、位置 7926 配列番号25 およびその相補鎖、および位置 8266 配列番号26 およびその相補鎖; 患者 #2  位置 103 配列番号27 およびその相補鎖、位置 7327 配列番号28 およびその相補鎖、位置 7926 配列番号29 およびその相補鎖、および位置 8266 配列番号26 およびその相補鎖; 患者 #3  位置 103 配列番号27 およびその相補鎖、位置 7327 配列番号24 およびその相補鎖、位置 7926 配列番号25 およびその相補鎖、および位置 8266 配列番号30 およびその相補鎖; そして患者 #4  位置 103 配列番号27 およびその相補鎖、位置 7327 配列番号24 およびその相補鎖、位置 7926 配列番号25 およびその相補鎖、および位置 8266 配列番号26 およびその相補鎖。第二段階 PCRからの各配列は任意の追加の検出配列相補的 DNA [配列番号75 およびその相補鎖]が5’末端に結合している他は第一段階 PCRからの配列と同一であった。
【０１５５】
プローブ DNAをマイクロアレイデバイス上で合成し、5' リン酸を有さなかった。プローブ DNA を、20 μlの 10 X PNK バッファー、2.0 μlの 100 mM rATP (Promega、rATP、#E6011,)および 3 μl (40 単位) のPNKを有する175 μlの 精製水 (Ambion)中のT4 ポリヌクレオチドキナーゼ (PNK)の溶液を用いてリン酸化した。混合物をマイクロアレイスライドに添加し、スライドをリン酸化が完了するまで30 分37℃でインキュベートした。電極マイクロアレイ上のプローブ DNAは予測融解温度 (TM)がおよそ 50℃となるように設計した。各SNP 位置についてのプローブ DNA 配列は以下の通りであった: SNP 位置 103 配列番号40、SNP 位置 7327 配列番号42、SNP 位置 7926 配列番号44およびSNP 位置 8266 配列番号46。本発明とハイブリダイゼーション方法とを比較するために、プローブをプローブ上の末端ではなくプローブの内部にSNP を有するようマイクロアレイデバイス上に合成した。各SNP 位置についての内部プローブ配列は以下の通りであった: SNP 位置 103 配列番号41、SNP 位置 7327 配列番号43、SNP 位置 7926 配列番号45、および SNP 位置 8266 配列番号47。
【０１５６】
5、10および15 ヌクレオチド長の任意のDNA スペーサーを、その上に異なるプローブを有する異なる電極位置について用いた。5ヌクレオチド スペーサーは配列番号48; 10ヌクレオチド スペーサーは配列番号49; 15ヌクレオチド スペーサーは配列番号50であった。任意の5ヌクレオチドスペーサーを有する各SNP 位置についてのプローブ DNA 配列は以下の通りであった: SNP 位置 103 配列番号51、SNP 位置 7327 配列番号53、SNP 位置 7926 配列番号55、およびSNP 位置 8266 配列番号57。任意の5 ヌクレオチドスペーサーを有する各SNP 位置についての内部 プローブ 配列は以下の通りであった: SNP 位置 103 配列番号52、SNP 位置 7327 配列番号54、SNP 位置 7926 配列番号56、および SNP 位置 8266 配列番号58。
【０１５７】
任意の10 ヌクレオチド スペーサーを有する各SNP 位置についてのプローブ DNA 配列は以下の通りであった: SNP 位置 103 配列番号59、SNP 位置 7327 配列番号61、SNP 位置 7926 配列番号63、およびSNP 位置 8266 配列番号65。任意の10 ヌクレオチド スペーサーを有する各SNP 位置についての内部 プローブ 配列は以下の通りであった: SNP 位置 103 配列番号60、SNP 位置 7327 配列番号62、SNP 位置 7926 配列番号64、およびSNP 位置 8266 配列番号66。
【０１５８】
任意の15 ヌクレオチド スペーサーを有する各SNP 位置についてのプローブ DNA 配列は以下の通りであった: SNP 位置 103 配列番号67、SNP 位置 7327 配列番号69、SNP 位置 7926 配列番号71、およびSNP 位置 8266 配列番号73。任意の15 ヌクレオチド スペーサーを有する各SNP 位置についての内部 プローブ 配列は以下の通りであった: SNP 位置 103 配列番号68、SNP 位置 7327 配列番号70、SNP 位置 7926 配列番号72、およびSNP 位置 8266 配列番号74。
【０１５９】
タグ付加標的 DNAを有する各溶液を95℃に15 分加熱し、氷上において保存した。各患者について、各SNP 位置に対応するタグ付加標的 DNAを合わせて１つの溶液にした後、各患者について別々の電極マイクロアレイと接触させた。10xT4 リガーゼ バッファーを合わせた溶液に添加し、溶液を1 Xにし、検出配列 DNA を1 μMの濃度で添加した。この混合物をスライドハイブリダイゼーションチャンバーに添加し、各患者についてのタグ付加標的 DNAのプローブ DNAへの、および検出配列 DNAのタグ付加標的 DNAへのハイブリダイゼーションのために45℃で 1 時間インキュベートした。各電極アレイの半分を本発明による末端SNPアッセイに用い、 半分を内部SNP ハイブリダイゼーションアッセイに用いて、本発明の末端SNPアッセイと比較した。
【０１６０】
各電極マイクロアレイを2 X PBSで２回洗浄した後、155 μlの 精製水 (Ambion)、18 μlの 10 X 大腸菌 リガーゼ バッファー (New England Biolabs、Inc.,)、3 μlの 10 mM dNTP、2 μl(20 単位)のTaq ポリメラーゼストッフェル(Stoffel)フラグメント (Applied Biosystems、Amplitaq DNA ポリメラーゼ、ストッフェル(Stoffel)フラグメント、# N8080038; 逆転写酵素、例えば、 Invitrogen SuperScript II 逆転写酵素 #18064014を用いることも出来る)および2 μl(20 単位)の大腸菌 リガーゼ (New England BioLabs、Inc. #M0205L) の混合物を電極マイクロアレイに添加し、37℃で1 時間インキュベートした。最後に、各マイクロアレイを0.05 X PBSで65℃で5回洗浄し、マイクロアレイスライドスキャナー/リーダーで観察した。
【０１６１】
SNPアッセイの結果を図6-13に示す。図 6は、内部SNPを検出するハイブリダイゼーションを用いるSNP 検出と比較した本発明のマイクロアレイに基づくSNPアッセイの棒グラフ 比較である。データは突然変異を有さない患者 #4のATM 遺伝子のものである。棒61-64、77-80、および93-96は、28 ヌクレオチド長であるA/T-リッチプローブ(28.6% G/C)に対する非差別的標的ハイブリダイゼーションを示し、棒 53-56、69-72、および85-88は、15 ヌクレオチド長のみのG/C-リッチプローブ(60% G/C)に対する選択的標的ハイブリダイゼーションを表す。一方、分析したすべての標的についてのすべての予測配列は、本発明の組合せ伸長/ライゲーション末端SNPアッセイによって正確に判定された。数を示した棒は非修飾、予測ゲノム配列を表し、次の3つの 数を示していない棒は、予測/潜在的 SNP、次いで２つのナンセンス突然変異を表す。棒は８連の平均を示し、線は ±１標準偏差を示す。棒97 (5 ヌクレオチドスペーサー)および98 (10 ヌクレオチドスペーサー)は、洗浄の完全性および合成プローブ DNAの質についての対照を表す。
【０１６２】
図6および7を参照すると、本発明のマイクロアレイに基づく SNPアッセイ(末端SNPアッセイ)は 従来のハイブリダイゼーション アッセイ (内部SNP ハイブリダイゼーションアッセイ) よりも改良されている。というのは本発明はSNPが存在するかを識別することが出来る一方、従来のハイブリダイゼーションアッセイはすべての条件下でSNPが存在するかを識別できないからである。標準的ハイブリダイゼーションアッセイの感受性の低下はプローブ配列組成に起因し、それはA/T-リッチであり、長さを標準的融解温度 (TM)に調節すると、GC-リッチ配列を有するプローブよりも長くなり、内部ミスマッチを含む場合であっても特定の温度でプローブにハイブリダイズするようになるからである。図 6 および図 7の右側パネルは、棒 61-64 (5 nt スペーサー)、77-80 (10 nt スペーサー)、および93-96 (nt スペーサー)の重なりによって示されるように内部SNP 方法に伴う問題を示している。図 8に示すようにTMをおよそ 50℃に調整した場合に、棒 61-64、77-80、および93-96によって表されるA/T-リッチプローブは 28 nt 長であるのに対し、棒53-56、69-72、および85-88によって表されるG/C-リッチ プローブ、はたった15 ヌクレオチド 長である。
【０１６３】
プローブに一定温度、この場合45℃でタグ付加標的がハイブリダイズした場合、突然変異はG/C-リッチプローブにおいて識別できたが、A/T-リッチプローブでは識別できなかった。末端SNPアッセイはTM (融解温度)がおよそ標準化されている限りプローブ配列の長さによって影響を受けない。本発明のマイクロアレイに基づくアッセイはまた、標識化オリゴヌクレオチドがプローブに隣接する標的配列にアニーリングし、リガーゼがマッチとミスマッチとの識別に用いられる、従来のライゲーション SNPアッセイよりも改善されている。従来のアッセイは各SNPについて新規な標識化オリゴヌクレオチドを必要とするが、本発明によるアプローチでは標識されていない特有のオリゴヌクレオチドを用いる。すべての標識化オリゴヌクレオチド、ビオチンまたは蛍光はすべてのアッセイについて共通である。これによって、比較的安価な非標識化プライマーによりサンプル ゲノムDNAからの標的配列の増幅が可能となり、共通の標識されたプライマー (ビオチン化または蛍光)を利用する再増幅ステップが可能となる。
【０１６４】
図 8を参照すると、一定融解温度 (TM; 左側パネル)に調節されたDNA プローブは、G/C含量のパーセンテージ(右側パネル)とプローブ長(棒上の数) の間の反比例関係を示す。したがって、G/C含量の高いプローブは短くなり (内部 7327について15 nt)、一方、A/T含量の高いプローブは比較的長くなり(内部 8266について28 nt)、特定のハイブリダイゼーション条件下ではハイブリダイゼーションのみによってはミスマッチを識別できなくなる。
【０１６５】
図9 〜12は、４名の患者のそれぞれについてのSNPデータを表す棒グラフを提供する。任意のヌクレオチドスペーサーをすべてのプローブについて用い、長さは5、10または15 ヌクレオチドであった[配列番号51、52、および53]。各患者についての４つのSNP 位置を各図に示す。縦軸は相対蛍光であり、横軸は各SNPについてのそれぞれのプローブの末端 DNAについての任意数である。棒は８つの電極位置の平均を示し、エラーバーは、８つの電極位置の標準偏差を表す。４つのプローブの各連における第一のプローブは野生型である。第二のプローブはSNPである。第三および第四のプローブはナンセンス突然変異である。5、10、または15 ヌクレオチドスペーサーを電極マイクロアレイと目的配列との間に含めた結果も示す。各SNPについての目的配列を表すプローブは下に箱を示し、各プローブについての末端ヌクレオチドは各グラフの上に示す。
【０１６６】
図 9は患者 #1についてのものであり、位置 103におけるSNP (C>T)が、棒上の星印で示すように各スペーサー長において検出されることを示す。図 10は患者 #2 についてのものであり、位置7327および7926での２つのSNP (C>T; A>C)が棒上の星印で示すように各スペーサー長において検出されることを示す。図 11は患者 #3についてのものであり、位置 8266におけるSNP (A>T)が棒上の星印で示すように各スペーサー長において検出されることを示す。図 12は患者 #4についてのものであり、SNPは検出されていない。すべての場合において、予測 SNP が検出された。患者 #1は103 C ＞T 突然変異についてホモ接合性であり、その他の3の潜在的突然変異部位については正常であることが判明し; 患者 #2は 7327 C＞ T 突然変異および7926 A＞C 突然変異についてヘテロ接合性であることが判明し;患者 #3は、8266 A ＞T 突然変異部位についてヘテロ接合性でありその他の部位については正常であることが判明した。予測されたように、正常ドナー 4 はすべての調べた潜在的 SNP部位について野生型配列を示した。
【０１６７】
実施例 2
この実施例は、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ上の遺伝子発現の分析を提供する。この方法はmRNA上の標識の使用を必要とせずにハイブリダイゼーション 研究におけるメッセンジャー RNA (mRNA) の直接の使用を提供する。というのはそれはポリデオキシアデニル酸を天然の標識またはタグとしてその3’末端に有するからである。mRNAはタグ付加標的である。プローブをインサイチュ電気化学的合成によりマイクロアレイに結合させる。プローブを174 μl精製水、20 μlPNK バッファー、2 μlの100 mM rATP、および 4 μlのPNKの混合物を含むキナーゼ溶液を用いてリン酸化する。溶液はマイクロアレイと接触され、溶液と接触させたまま30 分37℃でインキュベートされる。
【０１６８】
マイクロアレイ上でのプローブへのmRNAのハイブリダイゼーションのためのmRNA 溶液を調製するために、mRNAを精製水に添加し、70℃で10 分インキュベートする。インキュベーションの後、mRNA 溶液を氷上におく。mRNA 溶液に10 X T4 リガーゼ バッファーを添加して終濃度を1 X T4 リガーゼ バッファーとし (160 μlの mRNA 中18 μl 10 X バッファー) (New England Biolabs)および、2 μlの 標識化オリゴヌクレオチド dT-30-mer (検出配列)を終濃度およそ 1 μMで添加する。標識は蛍光標識、例えば、Cy3またはCy5である。このmRNAと標識化オリゴヌクレオチド混合物をプローブを有するマイクロアレイのハイブリダイゼーションチャンバーに添加し、1〜 18時間40〜 45℃でインキュベートする。あるいは標識化dT-30-mer オリゴヌクレオチドを mRNAのプローブへのハイブリダイゼーションのステップの後のさらなるステップとしてmRNA 溶液から別々に添加する。別々に添加した場合、標識化オリゴヌクレオチドを40℃で30 分インキュベートして標識化オリゴヌクレオチドのmRNAへのハイブリダイゼーションを可能とする。
【０１６９】
mRNAのプローブへの、そして標識化オリゴヌクレオチドのmRNAへのハイブリダイゼーションの後、T4 リガーゼを伸長ライゲーション溶液に用いた場合はマイクロアレイを1 X T4 リガーゼ バッファーで洗浄する。あるいは、大腸菌リガーゼを伸長ライゲーション溶液に用いた場合はマイクロアレイを1 X 大腸菌リガーゼバッファーで洗浄する。伸長/ライゲーション溶液はマイクロアレイと接触され、標識化オリゴヌクレオチドがプローブの末端塩基へと伸長 し、プローブ上の末端塩基がハイブリダイズしたmRNAの塩基と相補的であればプローブに標識化オリゴヌクレオチドがライゲーションする。伸長ライゲーション溶液は154 μlの 精製水、18 μlの大腸菌 リガーゼバッファー、4 μlの10 mM dNTPミックス、2 μlの SuperScript II 逆転写酵素 (Invitrogen)、および2 μlの 大腸菌 DNA リガーゼから構成される。あるいは、伸長ライゲーション溶液は154 μlの 精製水、18 μlの T4 リガーゼ バッファー、4 μlの 10 mM dNTPミックス、2 μlの SuperScript II 逆転写酵素 (Invitrogen)、および2 μlの T4 DNA リガーゼから構成される。伸長ライゲーション溶液はマイクロアレイと接触され、1 時間37℃でインキュベートされる。インキュベーションの後、マイクロアレイを精製水を用いて70℃で５回洗浄する。あるいは、マイクロアレイを 0.1 N NaOHを用いて室温で２回洗浄するかまたは伸長してライゲーションしていない標識化オリゴヌクレオチド dT-30-mer (検出配列)が除かれるまで洗浄する。洗浄の後、マイクロアレイを蛍光イメージング装置に入れて適切な波長で蛍光標識をスキャンする。Cy3は波長 595 nmでスキャンする。Cy5は波長 685 nmでスキャンする。洗浄は実質的に、適切なプローブに伸長およびライゲーションステップにより標識が ライゲーションした場合を除いてはmRNA (標的)および標識化オリゴヌクレオチド dT-30-mer (検出配列)を除去する。
【０１７０】
実施例 3
この実施例において、本発明の方法をトリインフルエンザウイルスサンプルのH5 遺伝子の再配列決定に用いた。サンプルをインフルエンザワクチンの生産に用いられる発現プラスミドインサートから得た。発現プラスミドインサートの再配列決定の目的は、正しいワクチン生産を確保するためワクチン生産の間のバキュロウイルス 発現の均一性をモニターするための本発明の使用を実証することであった。
【０１７１】
プローブは目的の配列領域の再配列決定のために設計した。この実施例のプローブ設計は、 H5 配列の600 ヌクレオチドをカバーしていた (121-720)。この特定の配列領域は血球凝集素受容体の優性抗体エピトープをコードしている。マイクロアレイは配列の各塩基について５つの複製を含んでいた。標的 DNA (プラスミドインサートの増幅から得た)の配列決定アレイへのアニーリングの後、DNA ポリメラーゼ およびリガーゼを含む混合物を用いて、一本鎖標的 DNAを鋳型として用いる標識された共通プライマーの伸長を行った。伸長したプライマーを次いで標的配列とマッチしたプローブにライゲーションさせた。水酸化ナトリウム洗浄(0.1 M)を用いてライゲーションしていないシグナルをすべて除去し、アレイをスキャンした後、蛍光強度データをパーソナルコンピュータ上の表計算ソフトウエアプログラムに移した。配列情報を目的配列をカバーする１つのヌクレオチドによってタイルされた４つのプローブの各セットから最も高いシグナルを正しい塩基と関連づけるために設計したルーチンによって抽出した。
【０１７２】
再配列決定データはH5 配列に対して97%の配列同一性を提供した。間違えの領域は質の悪いハイブリダイゼーションを有したプローブセットに対応し、それはプローブおよび標的の二次構造にしばしば起因する。二次構造の問題はアッセイを行う前に予測できる;しかし問題は簡単に避けられるものではない。第二のアレイ設計を作成した。このマイクロアレイからの再配列決定データは、本発明の方法は、H5 配列に対して99%のマッチを提供することを示した。
【０１７３】
実施例 4
この実施例において、突然変異についてスクリーニングし、内部ミスマッチによる標準的熱ハイブリダイゼーションを用いた配列決定と本発明の方法を比較するために、ヒト HERG 遺伝子 エキソン 10 を再配列決定するのに本発明のマイクロアレイ方法を用いた。プローブをヒト HERG 遺伝子 エキソン 10に対して設計し、マイクロアレイ上で合成した。標的 DNA (ヒトゲノムDNAから増幅)の配列決定アレイへのアニーリングの後、DNA ポリメラーゼおよびリガーゼを含む混合物を用いて、標識された共通プライマーを一本鎖標的 DNAを鋳型として用いて伸長させた。伸長させたプライマーを次いで標的配列とマッチしたプローブにライゲーションした。水酸化ナトリウム洗浄(0.1 M)を用いてライゲーションしていないシグナルをすべて除去し、アレイをスキャンした後、蛍光強度データをパーソナルコンピュータ上の表計算ソフトウエアプログラムに移した。配列情報を、目的配列をカバーする１つのヌクレオチドによってタイルされた４つのプローブの各セットからの最も高いシグナルを用いて正しい塩基と関連づけるように設計したルーチンにより抽出した。酵素に基づく配列決定方法は、HERG エキソン 10 配列について平均正確度97.8% (２つのマイクロアレイ)を提供した。熱的方法はHERG エキソン 10について平均正確度95.4%(２つのマイクロアレイ)を提供した。
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１】図 1A-1Fは、本発明の SNP アッセイ方法についての一連の工程を示す。具体的には、図 1Aは、プローブ DNAの付加の前のマイクロアレイの模式図である。 図 1Bは、マッチプローブ DNAおよびミスマッチプローブ DNAを有するマイクロアレイの模式図である。図 1Cは、各プローブにハイブリダイズしてハイブリダイズした構造 DNAを形成するタグ付加標的 DNA および検出配列 DNAを有するマイクロアレイの模式図である。図 1D は、末端ヌクレオチド DNAが標的ヌクレオチド DNAに相補的である場合のライゲーションを示す模式図である。図 1Eは、ライゲーションしていない検出配列 DNA およびタグ付加標的 DNAを洗浄除去した後のマイクロアレイを示す模式図である。図 1Fは、検出配列 DNAをプローブ DNAにライゲーションして有するマイクロアレイ位置での検出可能シグナル、例えば、蛍光 シグナルを示す模式図である。
【図２】図2Aおよび2Bは、PCR 増幅方法および標的 DNAを有するゲノムDNAからのタグ付加標的 DNAの単離を示す模式図である。
【図３】図 3は、タグ付加標的、蛍光 (Cy3) 標識を有する検出配列、およびプローブの模式図である。
【図４】図4Aおよび4Bは、本発明の SNP 方法を示す模式図であり、ここで、異なる末端ヌクレオチドを有する４つの同一のプローブが存在する。
【図５】図 5は、鎖の上の各位置についてのプローブを設計することにより、鎖に沿ってSNPまたは突然変異を位置づけるためのDNA 鎖の配列決定を示す模式図である。
【図６】図 6は、内部SNPを検出するためのハイブリダイゼーションを用いたSNP 検出と比較した、本発明のマイクロアレイに基づく SNPアッセイの棒グラフ比較である。データは、突然変異を有さない患者 #4のATM 遺伝子のものである。運動失調の症状を有さない患者 #4からのゲノムDNAを、４つの既知のSNPの領域を単離するために設計された４つのプライマーセットを用いて増幅した。マイクロアレイデバイス上のプローブは、予測融解温度 (TM)がおよそ 50℃となるよう設計した。
【図７】図 7は、図 6に示す棒グラフ比較の拡大図である。図 7は、本発明の末端SNPアッセイと内部SNP ハイブリダイゼーションとを比較する。１０ヌクレオチドスペーサーを電極マイクロアレイへのプローブ DNAの結合に用いた。野生型または非修飾を第一の棒に示し、SNPは第二の棒であり、最後の二つの棒はナンセンス突然変異である。
【図８】図 8は、一定融解温度 (TM; 左側パネル)に調整したプローブ DNAを比較する棒グラフであり、G/C含量 (右側パネル)のパーセンテージとプローブ DNA長 (棒上の数)との間の反比例関係を示す。したがって、G/C含量の高いプローブ DNAは短く(内部 7327について15 ヌクレオチド)、A/T含量が高いプローブ DNAは比較的長い (内部 8266について28 ヌクレオチド)。特定のハイブリダイゼーション条件下で、より長いプローブ DNAはハイブリダイゼーションのみによってミスマッチを識別しない。
【図９】図 9は、残基 103C>TにてATM 遺伝子 SNPを有する患者 #1 からのゲノムDNAに対する多重 SNPアッセイ (４つのタグ付加標的 DNA)からの結果を示す棒グラフである。垂直の棒は８連の平均を示し、垂線は±標準偏差を示す。４つのプローブの各連における第一のプローブ DNA は野生型である。第二のプローブ DNAはSNPである。 第三のプローブ DNAおよび第四のプローブ DNAはナンセンス突然変異である。電極マイクロアレイおよび目的配列の間に5、10、または15 ヌクレオチドスペーサーを含めた結果も示す。各SNPについての目的配列を表すプローブは下に箱を示し、各プローブについての末端ヌクレオチドは各グラフの上に示す。
【図１０】図 10は、残基7327C>T および 7926A>CにATM 遺伝子 SNPを有する患者 #2からのゲノムDNAに対する多重 SNPアッセイ (４つのタグ付加標的 DNA) の結果を示す棒グラフである。垂直の棒は８連の平均を示し、垂線は±標準偏差を示す。４つのプローブの各連における第一のプローブ DNAは野生型である。第二のプローブ DNAはSNPである。第三のプローブ DNA および第四のプローブ DNAはナンセンス突然変異である。電極マイクロアレイと目的配列との間に5、10、または15 ヌクレオチドスペーサーを含めた結果も示す。各SNPについての目的配列を表すプローブは下に箱を示し、各プローブについての末端ヌクレオチドは各グラフの上に示す。
【図１１】図 11は、残基 8266A>TにATM 遺伝子 SNPを有する患者 #3からのゲノムDNAに対する多重 SNPアッセイ (４つのタグ付加標的 DNA) の結果を示す棒グラフである。垂直の棒は８連の平均を示し、垂線は±標準偏差を示す。４つのプローブの各連における第一のプローブ DNAは野生型である。第二のプローブ DNAはSNPである。 第三のプローブ DNAおよび第四のプローブ DNA はナンセンス突然変異である。電極マイクロアレイと目的配列との間に5、10、または15 ヌクレオチドスペーサーを含めた結果も示す。各SNPについての目的配列を表すプローブは下に箱を示し、各プローブについての末端ヌクレオチドは各グラフの上に示す。
【図１２】図 12は、ATM 遺伝子 SNP 残基を有さない患者 #4 からのゲノムDNAに対する多重 SNPアッセイ (４つのタグ付加標的 DNA) の結果を示す棒グラフである。垂直の棒は８連の平均を示し、垂線は±標準偏差を示す。４つのプローブの各連における第一のプローブ DNAは野生型である。第二のプローブ DNAはSNPである。 第三のプローブ DNAおよび第四のプローブ DNA はナンセンス突然変異である。電極マイクロアレイと目的配列との間に5、10、または15 ヌクレオチドスペーサーを含めた結果も示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年12月20日(2007.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008538507000001.app
【国際調査報告】
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