(57)【要約】  本発明は、γ−セクレターゼ活性を決定するための改善されたプロセス、本プロセスの個々の構成要素、および、本プロセスの使用に関する。本発明は、γ−セクレターゼ活性を決定するため、および、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼを検出するための、改善されたプロセスに関する；本プロセスの特定の実施形態は、一方では、γ−セクレターゼ、または、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質もしくはγ−セクレターゼ様のプロテイナーゼをコードするｃＤＮＡの同定プロセスに関し、一方では、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼの活性を阻害することができる物質の同定プロセスに関する。このような物質は、例えばアルツハイマー病の治療のための医薬活性化合物として用いることができるために特に重要である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ−セクレターゼの活性を検出するプロセスであって、
Ａ．以下：
ａ）アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号１）を含むタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、
ｂ）第一のヌクレオチド配列の５’末端における、シグナルペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、
ｃ）プロモーター、および、
ｄ）場合により、さらなるコードおよび／または非コードヌクレオチド配列；
を含み、融合タンパク質をコードするトランスジーンを用いる、
Ｂ．トランスジーンを細胞に組み込ませ、融合タンパク質を発現させ；
Ｃ．配列番号１のアミノ酸配列内で、融合タンパク質を細胞に存在するγ−セクレターゼによって切断し、それにより、アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号２）を含む第一の部分タンパク質と、アミノ酸配列ＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号３）を含む第二の部分タンパク質を形成させ、そして、
Ｄ．第一の部分タンパク質および／または第二の部分タンパク質を検出し、
融合タンパク質は、配列番号１の他には、エンドまたはエキソサイトーシスおよび／またはプロテアーゼ切断部位のためのシグナルとして作用する１種またはそれ以上のペプチドを含まない
ことを特徴とする、上記プロセス。
【請求項２】
γ−セクレターゼの活性を検出するプロセスであって、
Ａ．以下：
ａ）アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号１）を含むタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、
ｂ）第一のヌクレオチド配列の５’末端における、シグナルペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、
ｃ）プロモーター、および、
ｄ）場合により、さらなるコードおよび／または非コードヌクレオチド配列；
の成分を含み、融合タンパク質をコードするトランスジーンを用いる、
Ｂ．トランスジーンを細胞に組み込ませ、融合タンパク質を発現させ；
Ｃ．配列番号１のアミノ酸配列内で、融合タンパク質を細胞に存在するγ−セクレターゼによって切断し、それにより、アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号２）を含む第一の部分タンパク質と、アミノ酸配列ＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号３）を含む第二の部分タンパク質を形成させ、そして、
Ｄ．第二の部分タンパク質の量を測定し、形成された第二の部分タンパク質の量からγ−セクレターゼの活性を測定し、
ここにおいて、融合タンパク質は、配列番号１の他には、エンドまたはエキソサイトーシスおよび／またはプロテアーゼ切断部位のためのシグナルとして作用する１種またはそれ以上のペプチドを含まないことを特徴とする、上記プロセス。
【請求項３】
ペプチドモチーフは、カスパーゼ切断部位である、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
第一のヌクレオチド配列は、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）またはその部分をコードし、ペプチドは、ＮＰＴＹおよび／またはＶＥＶＤである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５】
第一のヌクレオチド配列は、配列番号４のアミノ酸配列から得られたタンパク質をコードする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６】
第二のヌクレオチド配列は、ヒトＡＰＰのシグナルペプチド（配列番号５）、ＳＵＣ２のシグナルペプチド（配列番号１２）、または、ＢＭ４０のシグナルペプチド（配列番号１３）をコードする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項７】
シグナルペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項８】
プロモーターは、哺乳動物細胞、Ｃ．エレガンス、酵母またはショウジョウバエにおける発現のためのプロモーターである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項９】
プロモーターは、ＣＭＶ、ＨＳＶ  ＴＫ、ＲＳＶ、ＳＶ４０、ＬＴＲ、ｕｎｃ１１９、ｕｎｃ５４、ｈｓｐ１６−２、Ｇ0Ａ１、ｓｅｌ−１２、ＡＤＨ１、ＧＡＬ１、ＭＥＴ３、ＭＥＴ２５、ＭＴ、Ａｃ５またはＤｓ４７プロモーターである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１０】
細胞は、真核細胞である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１１】
細胞は、ヒト細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１２】
細胞は、非ヒト細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１３】
細胞は、ＨｅＬａ、２９３、Ｈ４、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、Ｈ９、Ｃｏｓ、ＣＨＯ、Ｎ２Ａ、ＳＬ−２または酵母細胞である、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
細胞は、Ｃ．エレガンスの細胞である、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１５】
細胞は、トランスジェニックＣ．エレガンスの構成成分である、請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１６】
細胞は、サッカロミセス・セレビジエの細胞である、請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１７】
融合タンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１８】
さらなるコードヌクレオチド配列は、第一のヌクレオチド配列の３’末端に位置する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１９】
さらなるコードヌクレオチド配列は、第一の部分タンパク質と第二の部分タンパク質との融合タンパク質として発現され、第二の部分タンパク質の検出に用いることができるタンパク質をコードする、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２０】
さらなるコードヌクレオチド配列は、ＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインを含むタンパク質をコードする、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２１】
さらなるコードヌクレオチド配列は、ＧＡＬ４結合ドメインと、ＶＰ１６の転写活性化ドメイン（ＧＡＬ４−ＶＰ１６）とからなるタンパク質をコードする、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２２】
細胞は、レポータープラスミドとコトランスフェクションされており、レポータープラスミドは、レポーター遺伝子を調節可能なプロモーターの制御下に含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２３】
調節可能なプロモーターは、転写活性化ドメインによって活性化可能である、請求項２２に記載のプロセス。
【請求項２４】
レポータープラスミドは、ＥＧＦＰ（強化緑色蛍光タンパク質）、Ｕｒａ３、Ｈｉｓ３またはＬａｃＺに関するレポーター遺伝子をコードし、調節可能なプロモーターは、ＧＡＬ４結合部位と、ＨＩＶの最小プロモーターを含む、請求項２３に記載のプロセス。
【請求項２５】
トランスジーンは、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２０、または、配列番号２２をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２６】
トランスジーンは、ベクター中に存在する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２７】
組換えベクターは、ｐｃＤＮＡ３．１＋である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２８】
細胞中で内因性のγ−セクレターゼ活性が検出されない、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２９】
細胞は、ｃＤＮＡライブラリーを用いてコトランスフェクションされる、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項３０】
ヒトもしくは非ヒト組織、または、ヒトもしくは非ヒト細胞から製造されたｃＤＮＡは、ｃＤＮＡライブラリーに存在する、請求項２９に記載のプロセス。
【請求項３１】
ａ）γ−セクレターゼの活性が検出可能な細胞を同定し、そして
ｂ）この細胞からγ−セクレターゼをコードするｃＤＮＡを単離する、
γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼをコードするｃＤＮＡを同定するための、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載のプロセスの使用。
【請求項３２】
ａ）アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号１）を含むタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、
ｂ）第一のヌクレオチド配列の５’末端における、シグナルペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、
ｃ）プロモーター、および、
ｄ）第一のヌクレオチド配列の３’末端における、ＤＮＡ結合ドメイン、および、転写活性化ドメインをコードする少なくとも１つのさらなるヌクレオチド配列
を含む、トランスジーン。
【請求項３３】
第一のヌクレオチド配列は、ＡＰＰまたはＡＰＰの部分をコードする、請求項３２に記載のトランスジーン。
【請求項３４】
トランスジーンは、配列番号１４をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項３２または３３に記載のトランスジーン。
【請求項３５】
請求項３２〜３４のいずれか一項に記載のトランスジーンを含むベクター。
【請求項３６】
ベクターは、ベクターｐＤＢＴｒｐまたはｐｃＤＮＡ３．１＋である、請求項３５に記載のベクター。
【請求項３７】
細胞が、請求項３５または３６に記載のベクターでトランスフェクションされる、トランスジェニック細胞の製造プロセス。
【請求項３８】
請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のトランスジーンは、Ｃ．エレガンスの性腺にマイクロインジェクションされる、トランスジェニックＣ．エレガンスの生産プロセス。
【請求項３９】
請求項３２〜３４のいずれか一項に記載のトランスジーンを含む細胞。
【請求項４０】
請求項３２〜３４のいずれか一項に記載のトランスジーンを含む、トランスジェニックＣ．エレガンス。
【請求項４１】
請求項３２〜３４のいずれか一項に記載のトランスジーンを含む酵母細胞。
【請求項４２】
ａ）請求項３２〜３４のいずれか一項に記載のトランスジーン；
ｂ）ｃＤＮＡライブラリー、および、
ｃ）レポータープラスミド、
を含む細胞。
【請求項４３】
γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼをコードするｃＤＮＡを同定するための、請求項４２に記載の細胞の使用。
【請求項４４】
１）請求項４２に記載の細胞を製造し、そして、
２）第二の部分タンパク質が形成されているかどうかを決定する、
γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼのｃＤＮＡを同定するプロセス。
【請求項４５】
γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼの活性の阻害剤を同定するためのプロセスにおける、請求項４２に記載の細胞の使用。
【請求項４６】
γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼの活性を阻害する物質の同定プロセスであって：
Ａ．トランスジェニック非ヒト生物またはトランスジェニック細胞を製造する工程、ここにおいて、トランスジェニック非ヒト生物またはトランスジェニック細胞は、以下の成分：
ａ）アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号１）を含むタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、
ｂ）第一のヌクレオチド配列の５’末端における、シグナルペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、
ｃ）プロモーター、および
ｄ）場合により、さらなる非コードおよび／またはコードヌクレオチド配列；
を有するトランスジーンを含み、
トランスジェニック非ヒト生物またはトランスジェニック細胞は、タンパク質結合部位、最小プロモーターおよびレポーター遺伝子、および、場合により、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼをコードするｃＤＮＡを有するレポータープラスミドを含み、
ここにおいて、トランスジェニック非ヒト生物またはトランスジェニック細胞は、トランスジーンを発現し、場合により、ｃＤＮＡによってコードされたγ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼを発現する；
Ｂ．トランスジェニック非ヒト生物またはトランスジェニック細胞を、調べようとする物質とインキュベートする工程、および、
Ｃ．第二の部分タンパク質の量を測定する工程、
を含む、上記プロセス。
【請求項４７】
γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼの活性を阻害する物質の同定プロセスであって、
Ａ．以下の成分：
ａ）アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号１）を含むタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、
ｂ）第一のヌクレオチド配列の５’末端における、シグナルペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、
ｃ）プロモーター、および
ｄ）場合により、さらなるコードおよび／または非コードヌクレオチド配列；
を含むトランスジーンを用いる、
Ｂ．このトランスジーンおよびレポータープラスミド、ならびに、場合により、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼをコードするｃＤＮＡを細胞に組み込ませ、調査しようとする物質の存在下で、トランスジーンによってコードされた融合タンパク質、および、場合により、ｃＤＮＡによってコードされたγ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼを発現させ、
Ｃ．融合タンパク質が、
ａ）切断され、その結果として、アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号２）を含む第一の部分タンパク質と、アミノ酸配列ＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号３）を含む第二の部分タンパク質が形成され、または、
ｂ）細胞に存在するγ−セクレターゼによって配列番号１のアミノ酸配列内で切断されず、その結果として、検出可能な量の第一および／または第二の部分タンパク質が形成されない、
Ｄ．第二の部分タンパク質の量を測定する、
上記プロセス。
【請求項４８】
γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼの活性を阻害する物質を同定するプロセスであって、調べようとする物質の存在下で、シグナルペプチドおよび配列番号１を含む融合タンパク質をコードするトランスジーンを発現させ、調べようとする物質の、形成された第二の部分タンパク質の量に対する効果を測定し、第二の部分タンパク質は、アミノ酸配列ＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号３）を含む、上記プロセス。
【請求項４９】
請求項４６〜４８のいずれか一項に記載のプロセスによって同定された、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼの阻害剤。
【請求項５０】
請求項４６〜４８のいずれか一項に記載のプロセスにおいて、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼの活性を阻害する医薬活性化合物を含む医薬組成物。
【請求項５１】
請求項４６〜４８のいずれか一項に記載のプロセス、および、それにより同定された医薬活性化合物の製剤化を含む、医薬組成物を製造するプロセス。
【請求項５２】
ａ）請求項４６〜４８のいずれか一項に記載のプロセス、および、
ｂ）同定された医薬活性化合物を、製薬上不活性の無機および／または有機性の賦形剤と混合すること、
を含む、医薬の製造方法。
【請求項５３】
請求項１〜５２のいずれか一項に記載のトランスジーン、ベクターまたは細胞を含む、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼの活性を検出するための試験キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γ−セクレターゼ活性を決定するための改善されたプロセス、本プロセスの各構成要素および本プロセスの使用に関する。本発明は、ＷＯ００／３４５１１Ａ２の教示に基づいており、従って、ＷＯ００／３４５１１Ａ２の内容は、参照により本発明の開示に含まれるものとする。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、細胞レベルでの大脳辺縁系および大脳皮質におけるニューロンの大量の消失を伴う脳の神経変性疾患である。罹患した脳領域では、分子レベルでタンパク質の沈着（いわゆるプラーク）が検出できるが、これはアルツハイマー病に必須の特徴である。これらプラークにおいて最も高い頻度で発生するタンパク質は、４０〜４２個のアミノ酸からなるペプチドであり、これはＡβ-ペプチドという。このＡβ-ペプチドは、６９５〜７７０個のアミノ酸からなる相当大きいタンパク質、いわゆるアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）の切断産物である。
【０００３】
ＡＰＰは、まず第一に脂質二重層を横断する内在性膜貫通タンパク質である。このタンパク質の大きい部分のほとんどは細胞外にあり、より短いＣ末端ドメインはサイトゾルに向いている（図１）。図１において、Ａβ−ペプチドは暗灰色で示される。Ａβ−ペプチドの約３分の２は細胞外ドメイン由来であり、約３分の１はＡＰＰの膜貫通ドメイン由来である。
【０００４】
膜貫通型ＡＰＰのほかにも、アミロイド前駆タンパク質の分泌された形態を検出することができ、これは、ＡＰＰの大きい外部ドメインからなり、ＡＰＰｓｅｃ（「分泌型ＡＰＰ」）と称される。ＡＰＰｓｅｃは、ＡＰＰをα−セクレターゼによってタンパク質分解的に切断することによって形成される。タンパク質分解的切断は、Ａβ−ペプチドのアミノ酸配列内にあるＡＰＰのアミノ酸配列の部位（Ａβ−ペプチドのアミノ酸残基１６の後）中で起こる。従って、α−セクレターゼによるＡＰＰのタンパク質分解は、Ａβ−ペプチドの形成を排除する。
【０００５】
従って、Ａβ−ペプチドはＡＰＰから代替のプロセシング経路でのみ形成される。このプロセシング経路には、さらに２種のプロテアーゼが関与していると考えられており、そのうち１種のプロテアーゼは、β−セクレターゼといい、ＡＰＰにおいてＡβ−ペプチドのＮ末端で切断を行うものであり、第二のプロテアーゼは、γ−セクレターゼといい、Ａβ−ペプチドのＣ末端を放出する（Ｋａｎｇ，Ｊ．等，Ｎａｔｕｒｅ，３２５，７３３）（図１）。
【０００６】
特に、アルツハイマー病を調査するという観点で、例えばセクレターゼ、または、セクレターゼ調節およびＡβ−ペプチド形成に関与する因子を同定するためには、セクレターゼ（α−セクレターゼ、β−セクレターゼ、γ−セクレターゼ）についてさらに研究することは極めて興味深い（Ｗｏｌｆｅ，Ｍ．Ｓ．（２００１年），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４４（１３），２０３９〜２０６０）。β−セクレターゼ、特にγ−セクレターゼを阻害することによって、Ａβ生産を減少させることができ、一方で、α−セクレターゼを活性化することによって、ＡＰＰｓｅｃへのＡＰＰのプロセシングを増加させることができ、その結果、同時にＡβ−ペプチド形成を減少させるだろう。このような研究の過程で発見されたトランスジェニックＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）が、ドイツ特許出願ＤＥ１９８４９０７３Ａ１に記載されている。
【０００７】
アルツハイマー病の発症において重要な要素はＡβ−ペプチド（Ａβ）であるという指摘が多数ある。特に、細胞培養中でのＡβ−線維の神経毒性が推察されている（Ｙａｎｋｎｅｒ，Ｂ．Ａ．等，（１９９０年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８７，９０２０）。ダウン症候群の患者では、追加のコピー中にＡＰＰをコードする遺伝子が存在し、わずか３０歳でもアルツハイマー病の神経病理学的な特徴が生じる。この場合、ＡＰＰの過剰発現によりＡβ−ペプチドへの変換の増加が起こると考えられる（Ｒｕｍｂｌｅ，Ｂ．等，（１９８９年），Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２０，１４４６）。
【０００８】
おそらく、Ａβ−ペプチドの中心的な役割の最も強い表われは、家族性アルツハイマー病である。この場合、突然変異は、βおよびγ−セクレターゼ切断部位の領域周辺のＡＰＰ遺伝子に、または、２種のさらなるＡＤ関連遺伝子（プレセニリン）に見出され、それにより細胞培養中でＡβ−ペプチド生産の顕著な増加が起こる（Ｓｃｈｅｕｎｅｒ，Ｄ．等，（１９９６年），Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２，８６４）。多数の指摘によれば、まず第一に、ＡＰＰが、そのプロセシング中にβ−セクレターゼによってＡβ−ペプチドに切断され、それにより、後にγ−セクレターゼの基質として用いられるようになる。それゆえに、γ−セクレターゼは、Ａβ−ペプチドの形成において重要な役割を有する（Ｗｏｌｆｅ，Ｍ．Ｓ．（２００１年），ｌｏｃ．ｃｉｔ）。
【０００９】
一般的に、Ａβ−ペプチドの検出は、わずかな量のＡＰＰしか変換されないために難しい（Ｓｉｍｏｎｓ  Ｍ，等，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（１９９６年）１；１６（３）：８９９〜９０８）。その上、Ａβ−ペプチドは、約４ｋＤａの極めて小さいフラグメントであり、その疎水性の特徴のために自己凝集する強い傾向がある。従って、Ａβ−ペプチドは、生理学的な条件下で容易に沈殿し（Ｈｉｌｂｉｃｈ，Ｃ．等，（１９９１年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１８，１４９）、その沈殿した形態は、検出に使用することができない。
【００１０】
真核細胞におけるＡβ−ペプチドの検出は、免疫生物学的な方法によって行われ、例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降反応およびウェスタンブロッティングが挙げられる（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｎ．等，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９４年，２７，２６４（５１６３）１３３６；Ｈａａｓｓ，Ｃ．等，（１９９２年）Ｎａｔｕｒｅ，３５９，３２２）。さらに、ＰＳ１（プレセニリン１）を含む精製膜分画からγ−セクレターゼ活性を測定するためのインビトロでの分析法が、Ｗｏｌｆｅ等（１９９９年）により記載されている。これらのプロセスは、適切な抗体とのインキュベーション工程、適切な細胞培養物またはモデル生物（例えばＣ．エレガンス）から得られた細胞を破壊する工程を含むために相当時間がかかる。前記方法は、自動化分析システム、例えば、γ−セクレターゼの活性を特異的に阻害または減少させる化合物を同定するためのハイスループットスクリーニングに不適切である。一つには、これは、γ−セクレターゼ活性は、タンパク質のアセンブリに依存し、これまで、複雑な膜脂質環境でのみ活性とされているためである（Ｍａｔｔｓｏｎ，（２００３年）Ｎａｔｕｒｅ  ４２２，３８５）。
【００１１】
さらに、γ−セクレターゼの活性は、γ−セクレターゼ活性の決定と、Ａβ−ペプチドの検出によるγ−セクレターゼの検出のためのプロセスを記載したＷＯ００／３４５１１Ａ２の教示に従って証明することができる。ＷＯ００／３４５１１Ａ２のプロセスは、融合タンパク質をコードするトランスジーンを利用しており、このトランスジーンは、γ−セクレターゼの酵素的な標的部位としてのアミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号１）、５’末端におけるシグナルペプチド（ＳＰ）、プロモーター、および、場合により、さらなるコードおよび／または非コードヌクレオチド配列を含み、これは前記融合タンパク質を発現させるために細胞に組み込まれている。
【００１２】
上記融合タンパク質が細胞に存在するγ−セクレターゼによって特異的に切断される場合、アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号２）を含む第一の部分タンパク質が形成され、アミノ酸配列ＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号３）を含む第二の部分タンパク質が形成される。その後、前記第一および／または第二の部分タンパク質が、例えば適切なレポーターの使用によって検出され、このようなレポーターとしては、例えば、第一および／または第二の部分タンパク質にカップリングされた転写活性化因子の放出によって活性化されるレポーター遺伝子が挙げられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
Ａβ−ペプチドの検出に伴う既知の問題のために、本発明の課題は、本発明の分析法におけるシグナル／ノイズ比を改善するために、例えば、バックグラウンドシグナルを減少させること、および／または、シグナル特異性を増加させることによってＷＯ００／３４５１１Ａ２のプロセスを改善することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
驚くべきことに、ＷＯ００／３４５１１Ａ２に係るプロセスにおいて、非特異的なプロテアーゼ活性による第一および／または第二の部分タンパク質の非特異的な放出を減少させるすることによってシグナル／ノイズ比を改善することが可能である。これは、例えば、ＷＯ００／３４５１１Ａ２の融合ペプチドにおいて、γ−セクレターゼ切断部位以外のあらゆるプロテアーゼ切断部位のその他の配列／モチーフ、および／または、内在化の配列を排除／回避することによって達成される。それゆえに、本発明は、γ−セクレターゼ活性を測定するため、および、γ−セクレターゼ活性を有するタンパク質を検出するための改善されたプロセスに関する。
【００１５】
本プロセスの特定の実施形態は、γ−セクレターゼの同定、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼをコードするｃＤＮＡの同定プロセスに関し、さらに、γ−セクレターゼ活性を有するタンパク質の活性を調節することができる（例えば、減少させるか、または阻害する）医薬活性化合物の同定プロセスに関する。このような物質が製薬上許容でき、アルツハイマー病の治療に適している場合、特に興味深い。
【００１６】
本発明は、γ−セクレターゼを検出するプロセスに関し、本プロセスにおいて、
１．以下の成分を含む、融合タンパク質をコードするトランスジーンを用い：
ａ）アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号１）を含むタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、
ｂ）第一のヌクレオチド配列の５’末端における、シグナルペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、
ｃ）プロモーター、および、
ｄ）場合により、さらなるコードおよび／または非コードヌクレオチド配列；
２．前記トランスジーンを細胞に組み込み、融合タンパク質を発現させ；
３．配列番号１のアミノ酸配列内で、前記融合タンパク質を細胞に存在するγ−セクレターゼによって切断し、それにより、アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号２）を含む第一の部分タンパク質と、アミノ酸配列ＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号３）を含む第二の部分タンパク質を形成させ、および、
４．第一の部分タンパク質および／または第二の部分タンパク質を検出し、ここにおいて、前記融合タンパク質は、配列番号１の他には、エンドまたはエキソサイトーシスおよび／またはプロテアーゼ切断部位のためのシグナルとして作用する１種またはそれ以上のペプチドを含まない。
【００１７】
好ましくは、前記プロセスにおいて、前記融合タンパク質は、配列番号１以外には、エンドまたはエキソサイトーシスおよびプロテアーゼ切断部位のためのシグナルとして作用する１またはそれ以上のペプチド（すなわち、配列番号１を除くあらゆるペプチド）を含まない。
【００１８】
本発明はまた、γ−セクレターゼの活性を検出するプロセスに関し、本プロセスにおいて、
１．融合タンパク質をコードするトランスジーンを製造するか、または、用い、前記トランスジーンは、以下の成分を含む：
ａ）アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号１）を含むタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、
ｂ）第一のヌクレオチド配列の５’末端における、シグナルペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、
ｃ）プロモーター、および、
ｄ）場合により、さらなるコードおよび／または非コードヌクレオチド配列；
２．前記トランスジーンを細胞に組み込み、融合タンパク質を発現させ；
３．配列番号１のアミノ酸配列内で、前記融合タンパク質を細胞に存在するγ−セクレターゼによって切断し、それにより、アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号２）を含む第一の部分タンパク質と、アミノ酸配列ＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号３）を含む第二の部分タンパク質を形成させ；
４．第二の部分タンパク質の量を測定し、形成された第二の部分タンパク質の量からγ−セクレターゼの活性を測定し、
ここにおいて、前記融合タンパク質は、配列番号１の他には、エンドまたはエキソサイトーシスおよび／またはプロテアーゼ切断部位のためのシグナルとして作用する１種またはそれ以上のペプチドを含まない。
【００１９】
本発明に係るプロセス（「Ａβ−ペプチドのスクリーニング分析法」、「γ−セクレターゼ分析法」）は、γ−セクレターゼ（γ−セクレターゼ活性を有するタンパク質）、または、γ−セクレターゼの活性のインビボでの検出に適しており、本プロセスを普遍的に、例えばハイスループットスクリーニング（「ＨＴＳ」）分析法にも使用することが可能になる。本プロセスは、上述した従来の検出プロセスの欠点がなく、特に、面倒な単離および検出工程を回避でき、γ−セクレターゼ活性の特異的なシグナルが顕著に改善される。より特異的なシグナルは、バックグラウンドシグナルが顕著に減少させ、非特異的プロテアーゼの作用による第一および第二の部分タンパク質放出をそれぞれ減少、回避させることによって達成される。
【００２０】
本発明に係るプロセスの必須の構成要素は、Ｃ末端ＡＰＰフラグメントであり、これは、γ−セクレターゼによって２種のフラグメントに切断され、その一方は、第一の部分タンパク質であり、アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号２）を含み、他方は、第二の部分タンパク質であり、アミノ酸配列ＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号３）を含み、このアミノ酸配列ＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号３）を含む第二の部分タンパク質は、細胞のサイトゾルに拡散する（図２）。この第二の部分タンパク質は、細胞のサイトゾルで容易に検出することができ、例えば、転写活性化因子（ＴＡＦ）を含む融合タンパク質として、レポーター遺伝子の支援により検出することができ；これは、γ−セクレターゼの存在の検出ツールとして、または、γ−セクレターゼ活性の定量化のために役立つ。γ−セクレターゼ切断部位は、ＡＰＰの膜貫通ドメインに位置する（Ｋａｎｇ，Ｊ．等，（１９８７年）Ｎａｔｕｒｅ，３２５，７３３）。ＡＰＰ膜貫通ドメインは、アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ40ＩＡ42ＴＶＩＶＩＴＬＶＭＬを有する。γ−セクレターゼは、Ｖ40、Ａ42またはＴ43の後で切断する。細胞培養中で真核細胞によって生産されたＡβ−ペプチドは、培養上清に分泌される。
【００２１】
適切なレポーターシステム（例えば、ＴＡＦおよび対応するレポーター遺伝子）を用いて、第二の部分タンパク質の放出によりレポータータンパク質の発現が活性化され、これらは真核細胞中で検出できる。レポータータンパク質の検出によって、ＡＰＰ中でγ−セクレターゼによる切断が起こったことを実証することができる。結果として、γ−セクレターゼまたはγ−セクレターゼの活性を定性的および／または定量的に測定できる。
【００２２】
プロセスの構成要素は、以下のように、より詳細に特徴付けることができる：
第一のヌクレオチド配列は、配列番号１を含むアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）またはその部分をコードしており、ここにおいて、前記ＡＰＰまたはその部分は、エンドまたはエキソサイトーシスおよび／またはプロテアーゼ切断部位のためのシグナルとして作用するいかなるペプチドモチーフも含まない。好ましくは、前記第一のヌクレオチド配列は、配列番号１を含むアミノ酸配列を含むタンパク質、例えば配列番号６または配列番号１４をコードする。さらなる実施形態において、第一のヌクレオチド配列は、配列番号１以外の、エンドまたはエキソサイトーシスおよび／またはプロテアーゼ切断部位のためのシグナルとして作用するペプチドモチーフをコードしないようにするため、短縮化されたＡＰＰ、または、改変されたＡＰＰをコードし、これらは例えば部位特異的変異誘発によって得ることができる。さらなる他の実施形態において、前記第一のヌクレオチド配列によってコードされた前記ＡＰＰまたはそれらの部分は、ヒト、マウスのＡＰＰ（例えば、ＡＰＬＰ１またはＡＰＬＰ２）由来のタンパク質である。
【００２３】
第二のヌクレオチド配列は、好ましくは、あらゆる適切なシグナルペプチド（「ＳＰ」）をコードする。このようなシグナルペプチドとしては、例えば、配列番号５（ヒトＡＰＰのＳＰ）、配列番号１２（酵母ＳＵＣ２のＳＰ，「ＳＰ２」）、または、配列番号１３（ＢＭ４０のＳＰ，「ＳＰ３」）に係るＳＰ、または、既知のその他のあらゆるシグナルペプチド、例えばＨｅｉｊｎｅ等（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８６年），１４（ｌｌ）４６８３〜４６９０）に記載されているシグナルペプチドが挙げられる。
【００２４】
プロモーターとして、あらゆる適切な調節可能なプロモーターまたは構成的プロモーターを用いることができる。このようなプロモーターとしては、例えば、哺乳動物細胞、Ｃ．エレガンス、酵母、またはショウジョウバエにおける発現に適切なものが可能である。哺乳動物細胞に適切なプロモーターとしては、例えばＣＭＶ、ＨＳＶ  ＴＫ、ＳＶ４０、ＬＴＲ（いずれもクロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ハイデルベルグ，ドイツ）、および、ＲＳＶ（例えばインビトロジェンTMライフテクノロジーズ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎTMＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），ＮＶ  Ｌｅｅｋ，オランダ）が挙げられる。Ｃ．エレガンスに用いることができるプロモーターとしては、例えば、ｕｎｃ−１１９、ｕｎｃ−５４、ｈｓｐ１６−２、ｇｏａ−１およびｓｅｌ−１２が挙げられる。酵母における発現には、プロモーターＡＤＨ１（構成性）（Ｖｌｃｋｏｖａ等（１９９４年）Ｇｅｎｅ，２５（５），４７２〜４）、ＧＡＬ１（条件付で誘導型）（Ｓｅｌｌｅｃｋ等（１９８７年）Ｎａｔｕｒｅ  ３２５，１７３〜７）、ＭＥＴ３（条件付）（Ｃｈｅｒｅｓｔ等（１９８７年）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２１０，３０７〜１３）、および、ＭＥＴ２５（例えば、Ｋｅｒｊａｎ等（１９８６年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４（２０），７８６１〜７１を参照）が適切である。ショウジョウバエにおいては、例えば、プロモーターＭＴ（メタロチオネイン）、Ａｃ５またはＤｓ４７（全てインビトロジェンTMライフテクノロジーズ）を用いることが可能である。
【００２５】
好ましくは、本プロセスには真核細胞、例えばヒト細胞または非ヒト細胞、例えばサル、ハムスター、マウス、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュまたは酵母が用いられる。例えば、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、Ｈ４、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、Ｈ９、Ｃｏｓ、ＣＨＯ、Ｎ２Ａ、ＳＬ−２またはサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の細胞を用いることができる。本発明の特定の実施形態において、Ｃ．エレガンスの細胞が用いられる。このような細胞は、トランスジェニック非ヒト動物の構成成分であってもよい。特定の実施形態において、トランスジェニック細胞は、トランスジェニックＣ．エレガンスの構成成分が可能である。特に、本発明は、例えば、ＭａＶ２０３株（インビトロジェンTMライフテクノロジーズ，ロックビル，メリーランド州，米国）、または、ＥＧＹ４８（オリジーン・テクノロジーズ社（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．），ロックビル，メリーランド州，米国）由来の酵母細胞を用いたプロセスに関する。
【００２６】
上記トランスジーンは、融合タンパク質をコードする；これは、第一および第二のヌクレオチド配列、および、場合により、さらなるヌクレオチド配列によってコードされた部分タンパク質で構成される。従って、このような融合タンパク質は、第一の部分タンパク質および第二の部分タンパク質、ならびに、場合により、さらなる部分タンパク質を含む。しかしながら、上記融合タンパク質は、配列番号１以外のエンドまたはエキソサイトーシスおよび／またはプロテアーゼ切断部位のためのシグナルとして作用するいかなるペプチドモチーフも含まないことが重要である。
【００２７】
既知のプロテアーゼ切断部位は、当業者であれば、プロテアーゼデータベース、例えばＭＥＲＯＰＳ（Ｒａｗｌｉｎｇｓ等（２００２年）ＭＥＲＯＰＳ：ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｄａｔａｂａｓｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０，３４３〜３４６）から知ることができる。
【００２８】
好ましくは、本発明に係る融合タンパク質は、プロテアーゼ切断部位、すなわちカスパーゼ切断部位、例えば（ＩＶＬ）ＥｘＤ、特にＶＥＶＡ、ＶＥＶＤを含まず、他の実施形態において、本発明に係る融合タンパク質は、さらに、エンドまたはエキソサイトーシスのためのシグナルペプチド、すなわちＡＰＰ内在化のためのシグナル、例えばＮｐｘＹまたはＤｉ−ロイシン、特にＮＰＴＹを含まない。
【００２９】
特定の一実施形態において、上記融合タンパク質は、配列番号１４のアミノ酸配列を有する。配列番号１以外に、前記融合タンパク質は、エンドまたはエキソサイトーシス（例えばＡＰＰ内在化シグナル）および／またはプロテアーゼ（例えばカスパーゼ）切断部位のシグナルとして作用するいかなる（１またはそれ以上の）追加のペプチドモチーフも含まない。
【００３０】
本プロセスにおいて、特に、配列番号１５（ＳＰＣ５５ＧＶ  ＴＡＧ）に記載のヌクレオチド配列を有するトランスジーンを用いることができる。本プロセスの特に好ましい実施形態において、このようなトランスジーンは、ベクター中に存在する。この本発明の特定の実施形態はまた、ＳＰ−Ｃ５５−Ｇａｌ４−ＶＰ１６（すなわちＳＰＣ５５ＧＶ）とも称される。この場合、ＡＰＰのシグナルペプチド、ＡＰＰのＣ５５フラグメント、ＧＡＬ４およびＶＰ１６からなる融合タンパク質が発現される。この膜貫通ドメインに位置するタンパク質が、Ｃ５５フラグメント内で切断され、第二の部分タンパク質、すなわちＣ５５フラグメントの一部、ＧＡＬ４およびＶＰ１６を含む融合タンパク質の一部が、レポータープラスミドを用いて検出される。
【００３１】
トランスジーンコンストラクトＳＰＣ５５ＧＶのほかに、他のレポーターコンストラクトも考えられ、例えば、転写活性化ドメインを、ＳＰＣ５５の膜貫通ドメインと細胞質内のドメインの間に挿入することができ、または、タグ（Ｔａｇ）（例えばＭＹＣ、ＦＬＡＧ）を、ＮおよびＣ末端に、および、ＳＰＣ５５の膜貫通ドメインと細胞質内ドメインとの間に挿入することができる。
【００３２】
例えば、第二の部分タンパク質の検出に用いることができるタンパク質が、さらなるコードヌクレオチド配列にコードされていてもよい。従って、さらなるコードヌクレオチド配列は第一のヌクレオチド配列の３’末端に位置することが好ましい。さらなるコードヌクレオチド配列は、例えば、キメラタンパク質、または、その他の多数のドメインで構成されたタンパク質、例えば、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含むタンパク質をコードする。本発明の特定の実施形態において、さらなるコードヌクレオチド配列は、ＧＡＬ４結合ドメイン、および、ＶＰ１６の転写活性化ドメイン（ＧＡＬ４−ＶＰ１６，「ＧＶ」）、および、さらなる部分タンパク質からなる、好ましくは続いて配列番号７のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。酵母細胞において、さらなる部分タンパク質はまた、ＬｅｘＡ結合ドメイン（例えばＬｅｘＡ−ＶＰ１６）を含んでいてもよい。このさらなる部分タンパク質は、特に、酵母の細胞株ＥＧＹ４８が用いられるプロセスに適している。
【００３３】
特に、本発明は、レポータープラスミドがコトランスフェクションされた細胞が用いられるプロセスに関する。このようなレポータープラスミドは、調節可能なプロモーターの制御下にレポーター遺伝子を含む。例えば、このようなレポーター遺伝子は、ＧＦＰおよびその誘導体、例えばＥＧＦＰ（強化緑色蛍光タンパク質）、ＥＢＦＰ、ＥＹＦＰ、ｄ２ＥＧＦＰ、ＧＦＰｕｖまたはルシフェラーゼ（例えばプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ），マンハイム，ドイツ）、ＣＡＴ（例えばプロメガ）、ＳＥＡＰ（例えばクロンテック）、βＧａｌ（例えばクロンテック）、サンゴ礁由来蛍光タンパク質（ＲＣＦＰ，クロンテック）、または、アポトーシス誘導因子、例えばＦａｓ、ＴＮＦ−Ｒ１、デスドメインおよび相同体（Ｔａｒｔａｇｌｉａ等（１９９３年）Ｃｅｌｌ  ７４，８４５〜５３）、ｃｅｄ３、ｃｅｄ４、ｃｅｄ９をコードしていてもよい。調節可能なプロモーターとして、レポータープラスミドは、例えば、ＨＩＶの最小プロモーター、ＣＤ４プロモーターまたはｍｅｃ７プロモーターと組み合わせたＧＡＬ４結合部位のような、最小プロモーターを含んでもよい。適切な調節プロモーターの選択は、用いられる転写活性化ドメインに依存する。
【００３４】
本発明の特定の実施形態は、用いられる細胞が酵母細胞であるプロセスの実施に関する。本発明の特別な実施形態において、ＭＥＴ−２５プロモーターが統合されている酵母発現ベクターｐＤＢＴｒｐ（インビトロジェンTMライフテクノロジーズ，オランダ，カタログ番号１０８３５０２３）（配列番号１０）の代用として、異なるプロモーター（例えば誘導型ＧＡＬ１−プロモーター、構成的に活性なＡＤＨ１プロモーター）や、異なる選択マーカー（ＡＤＥ、ＬＥＵ、ＴＲＰ、ＨＩＳ、ＬＹＳ、ＰＨＥ）を含むその他多数の発現ベクターが、選択可能である。
【００３５】
本発明の特定の実施形態は、ＧＡＬ４−またはＬｅｘＡ−誘導型レポーター遺伝子をそれらのゲノムに安定して組み込まれている酵母細胞、または染色体外に含む酵母細胞のいずれかの使用に関する。これら実施形態において、好ましくは、酵母ＭａＶ２０３株（インビトロジェンTMライフテクノロジーズ社，ロックビル，メリーランド州，米国）、または、ＥＧＹ４８（オリジーン・ライフテクノロジーズ社，ロックビル，メリーランド州，米国）が用いられる。
【００３６】
本プロセスの特定の実施形態は、さらなる組換えベクターでさらにトランスフェクションされた細胞の使用に関する。好ましくは、これら実施形態で用いられる細胞は、内因性γ−セクレターゼ、または、内因性γ−セクレターゼ活性をまったく含まないか、またはほとんど含んでおらず、上述のプロセスでは検出不可能である。この細胞は、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼをコードするヌクレオチド配列（好ましくはｃＤＮＡ）を含むさらなるベクターで形質転換して用いることができる。例えば、ｃＤＮＡライブラリーを用いることができる。次に、この本プロセスの実施形態を用いて、特に、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、もしくは、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼ、または、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、もしくは、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼをコードするｃＤＮＡを同定することができる。γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼを検索できるｃＤＮＡライブラリーは、あらゆる生物の細胞または組織、例えば、Ｂ細胞、ニューロン、グリア細胞、海馬、全脳、胎盤、腎臓から製造することができる。好ましくは、上記ｃＤＮＡは、脊椎動物（例えばハムスター、ラット、マウス、イヌ、サル、ヒト）、特にヒト細胞またはヒト組織から製造される。
【００３７】
トランスフェクション前はγ−セクレターゼ活性を示さないが、ｃＤＮＡライブラリーでトランスフェクションした後にγ−セクレターゼ活性を示す細胞の場合、その細胞に存在するｃＤＮＡは、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼをコードしている。この挙動を示す細胞から、このようなｃＤＮＡを既知のプロセスで単離し、さらに、既知の方法で解析することができる。
【００３８】
本発明はまた、融合タンパク質をコードするトランスジーンに関し、このようなトランスジーンは、以下の成分を含む：
ａ）アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴＶＭＴＬＶＭＬ（配列番号１）を含むタンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、
ｂ）第一のヌクレオチド配列の５’末端における、シグナルペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、
ｃ）プロモーター、および、
ｄ）第一のヌクレオチド配列の３’末端における、少なくとも１つのさらなるヌクレオチド配列、ここにおいて、前記ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ結合ドメイン、および、転写活性化ドメインをコードしており、
前記融合タンパク質は、配列番号１以外のエンドまたはエキソサイトーシスおよび／またはプロテアーゼ切断部位のためのシグナルとして作用する１種またはそれ以上のペプチドを含まない。
【００３９】
好ましくは、第一のヌクレオチド配列は、ＡＰＰまたはそれらの部分をコードしており、配列番号１以外のエンドまたはエキソサイトーシスおよび／またはプロテアーゼ切断部位のためのシグナルとして作用するさらなるペプチドモチーフを含まない。上記トランスジーンは、例えば、配列番号１５のヌクレオチド配列を有していてもよい。上記トランスジーンは、適切なベクター（例えばｐｃＤＮＡ３．１＋またはｐＤＢＴｒｐ）中に存在していてもよい。
【００４０】
本発明の他の実施形態は、トランスジェニック細胞を生産するための、本発明のトランスジーンおよび／またはベクターの使用に関するプロセスであり、場合により、前記トランスジェニック細胞を用いて、インビボでのレポーター生物として適切な非ヒト生物の構成成分とすることができる。例えば、前記トランスジーンおよび／またはベクターを、トランスジェニックＣ．エレガンスの生産に用いることができる。他の実施形態において、前記トランスジーンおよび／またはベクターは、トランスジェニック酵母細胞、例えば、Ｓ．セレビジエの生産に用いられる。
【００４１】
本発明はまた、トランスジェニック非ヒト生物の製造プロセス、例えばトランスジェニックＣ．エレガンスの製造プロセスに関し、ここにおいて、前記トランスジーンを含む前記トランスジーンおよび／またはベクターは、生物の性腺、例えばＣ．エレガンスの性腺にマイクロインジェクションされる。本発明はまた、本発明に係るトランスジーンを含む細胞、および、前記トランスジーンを含むトランスジェニックＣ．エレガンスに関する。本発明はまた、本発明の前記トランスジーン（好ましくは適切なベクター中に存在する）を含む細胞、特に酵母細胞に関する。さらに、本発明は、特に、本発明に係るトランスジーンおよびｃＤＮＡライブラリーを含む細胞、好ましくは酵母細胞に関し、これらはそれぞれ、ｃＤＮＡ発現ライブラリー（ｃＤＮＡライブラリー）の対象物として適している。
【００４２】
本発明は、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼをコードするｃＤＮＡ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質をコードするｃＤＮＡ、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼをコードするｃＤＮＡ、または、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、もしくは、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼの活性を決定または同定するためのプロセスにおける前記トランスジェニックまたは組換え細胞、好ましくは酵母またはＣ．エレガンスの細胞の使用、γ−セクレターゼ（γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼ）の活性の阻害剤を同定するプロセスにおける前記細胞の使用、および、それらのプロセスに関する。
【００４３】
特に、本発明は、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼの活性を調節する（すなわち阻害する、減少させる、増加させる、または、改変する）物質（エフェクター）を同定するプロセスに関し、本プロセスは、以下の工程を含む：
１．トランスジェニック非ヒト生物（例えばトランスジェニックＣ．エレガンスもしくはサッカロミセス・セレビジエ）、または、トランスジェニック細胞を製造する工程、ここにおいて、前記トランスジェニック非ヒト生物またはトランスジェニック細胞は、本発明に係るトランスジーンを含み、
前記トランスジェニック非ヒト生物またはトランスジェニック細胞は、レポータープラスミドをさらに含み、前記レポータープラスミドは、タンパク質結合部位、最小プロモーターおよびレポーター遺伝子を有し、および
場合により、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼをコードするｃＤＮＡを有し、
ここにおいて、前記トランスジェニック非ヒト生物またはトランスジェニック細胞は、前記トランスジーンを発現し、場合により、前記ｃＤＮＡによってコードされたγ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼを発現する；
２．前記トランスジェニック非ヒト生物またはトランスジェニック細胞を、調べようとする試験物質とインキュベートする工程；および、
３．第二の部分タンパク質の量を検出する工程。
【００４４】
本発明はまた、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼのエフェクターを同定するプロセスに関し、本プロセスにおいて、
１．本発明に係るトランスジーンを製造する／用いる；
２．γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼをコードする前記トランスジーンおよびレポータープラスミド、および、場合によりｃＤＮＡを、細胞のゲノムに組み込み、前記トランスジーンによってコードされた融合タンパク質、および、場合により、前記ｃＤＮＡによってコードされたγ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼを、調べようとする物質の存在下で発現させる；
３．前記融合タンパク質は、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列内で、前記細胞中に存在するγ−セクレターゼによって切断され、それにより、
ｂ）アミノ酸配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号２）を含む第一の部分タンパク質と、アミノ酸配列ＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号３）を含む第二の部分タンパク質が形成される；および、
４．前記第二の部分タンパク質を定性的または定量的に測定する。
【００４５】
本発明はまた、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼの活性を阻害する物質を同定するプロセスに関し、本プロセスにおいて、シグナルペプチドと配列番号１を含むタンパク質をコードするトランスジーンを、調べようとする物質とレポータープラスミドの存在下で発現させ、形成された第二の部分タンパク質の量に対する調べようとする物質の効果を測定し、ここにおいて、第二の部分タンパク質は、アミノ酸配列ＶＩＶＩＴＬＶＭＬ（配列番号３）を含む。
【００４６】
本発明はまた、本発明のプロセスによって同定された、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼの阻害剤に関する。
【００４７】
特に、本プロセスは、例えば、Ｃ５５−Ｇａｌ４−ＶＰ１６システム（すなわち、Ｃ５５、ＧＡＬ４およびＶＰ１６からなる融合タンパク質、または、対応する融合タンパク質をコードする核酸を用いて）と共に、以下の目的で用いることができる：
１．γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼの活性の同定および測定（定性的および／または定量的）。
【００４８】
２．異なる組織、細胞および生物または種における、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼの同定。γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼをコードする関連するｃＤＮＡの同定および単離、ならびに、そのｃＤＮＡのさらなる使用。
【００４９】
３．免疫生物学的な方法を用いない、例えば酵母細胞（例えばサッカロミセス・セレビジエ）、Ｃ．エレガンスまたは細胞培養中でのインビボでのスクリーニング、それにより、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼの活性を測定することができる。
【００５０】
４．物質を同定および特徴付けするための本発明のプロセスの使用であって、このような物質としては、例えば、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼの酵素的または生物学的活性を調節する薬理学的な活性化合物、例えばγ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼのエフェクター（阻害剤、活性化剤、モジュレーター）が挙げられる。特に、このプロセスを、ＨＴＳ（ハイスループットスクリーニング）で用いることができる。ＨＴＳ分析システムの使用によって、アルツハイマー病の治療および／または予防的治療に用いることができる物質を同定することができる。
【００５１】
５．アルツハイマー病という観点での、例えば、突然変異したＡＰＰまたはそれらのフラグメント、または、膜貫通型のプロテアーゼの機能のより深い理解を促進するための研究。
【００５２】
６．上述の融合タンパク質／トランスジーン（例えばＳＰ−Ｃ５５−Ｇａｌ４−ＶＰ１６中のＣ５５）は、本発明に係る他のフラグメントで置き換えることができ、本プロセスを用いて、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼ、その活性および調節を調べることができる。
【００５３】
本発明の他の実施形態は、本発明に係るプロセスによって同定された、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼの活性を阻害する医薬活性化合物を含む医薬組成物である。
【００５４】
本発明のさらなる実施形態は、本発明のプロセス、および、前記同定された医薬活性化合物を製剤化することを含む、医薬組成物を製造するプロセスである。
【００５５】
本発明のさらなる実施形態は、ａ）本発明に係るプロセス、および、ｂ）同定された医薬活性化合物を、製薬上不活性の無機および／または有機性の賦形剤と混合することを含む、製薬を製造するプロセスである。
【００５６】
加えて、本発明のさらに他の実施形態は、γ−セクレターゼ、γ−セクレターゼのサブユニットタンパク質、または、γ−セクレターゼ様のプロテイナーゼの活性を検出するための試験キットであって、本キットは、本発明に係るトランスジーン、ベクターまたは細胞を含む。
【００５７】
図１：図１は、アミロイド前駆タンパク質（アイソフォームＡＰＰ６９５、および、アイソフォームＡＰＰ７７０またはＡＰＰ７５１）、および、セクレターゼ切断産物を示す。
図２：図２は、本プロセスが基づく原理を模式的に示す：Ｎ末端におけるγ−セクレターゼ切断部位；膜貫通ドメインにおけるγ−セクレターゼ切断部位；Ｃ１００＝ＡＰＰのＣ１００フラグメント；ＧＡＬ４−ＶＰ１６＝ＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化ドメイン（ＤＮＡ結合ドメイン、および、転写活性化因子からなる）であり、レポータープラスミドのＤＮＡにおけるタンパク質結合ドメインに結合する。
図３：発現プラスミドのＳＰ−Ｃ１００−ＧＡＬ４−ＶＰ１６の構築：ａａ＝アミノ酸；制限切断部位ＳａｃＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩは、プラスミド上の切断部位の位置を示す。
図４：発現プラスミドのｐＤＢＴｒｐ−ＭＥＴ２５−ＳＰ−Ｃ１００−ＧＡＬ４−ＶＰ１６：酵母中でトランスジーンを発現させるための発現プラスミドの構築。
【００５８】
以下の実施例は、本発明を説明するものとし、発明の概念を限定するものではない。
【実施例】
【００５９】
実施例１：ＳＰ−Ｃ１００−ＧＡＬ４／ＶＰ１６を含む発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１＋の構築
上記プラスミドは、ＡＰＰのＣ末端の１００個のアミノ酸残基（Ｃ１００）に融合したＡＰＰシグナルペプチド（ＳＰ）をコードする。Ｃ１００は、Ａβ−ペプチドのＮ末端から始まり、ＡＰＰのＣ末端で終わる。Ｃ１００は、Ａβ−ペプチドを放出するために、γ−セクレターゼでさらに切断されなければならない。
ＧＡＬ４／ＶＰ１６（配列番号７）を、ＳＰ−Ｃ１００のＣ末端（配列番号６）に融合させた。ＧＡＬ４／ＶＰ１６は、酵母の転写活性化因子ＧＡＬ４の第一の１４７個のアミノ酸残基、および、ＶＰ１６の７８個のＣ末端のアミノ酸残基、単純疱疹ウイルス由来の転写活性化因子を含む。融合タンパク質として、ＧＡＬ４フラグメントは、ＤＮＡと結合する機能を担っており、ＶＰ１６フラグメント  は、転写を活性化する（Ｓａｄｏｗｓｋｉ等，１９８８年）。
ｐｃＤＮＡ３．１＋（インビトロジェンTMライフテクノロジーズ，オランダ，カタログ番号Ｖ７９０２０）は、プラスミドベクターとして役立つ。
【００６０】
実施例２：レポータープラスミドｐＧＬ２−ＭＲＧ５−ＥＧＦＰの構築
哺乳動物細胞レポータープラスミドｐＧＬ２−ＭＲＧ５では、ｐＧＬ２（プロメガ）において、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）コアプロモーター（Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ等，１９９４年）上流に５つのＧＡＬ４のＤＮＡ結合部位を含むｐＭＲＧ５由来のＤＮＡフラグメント（Ｉｋｅｄａ等，１９９８年）が、ｐＧＬ２のルシフェラーゼのレポーター遺伝子の上流に挿入されている。細胞培養中でのより簡単な検出のために、ルシフェラーゼのレポーター遺伝子を、ベクターｐＥＧＦＰ−Ｎ１（クロンテック・ラボラトリーズ，ハイデルベルグ）から得られたＥＧＦＰ（強化緑色蛍光タンパク質）遺伝子で置き換えた。
【００６１】
実施例３：ヒト神経芽腫細胞へのコトランスフェクション
ヒト神経芽腫細胞ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２２６６）を、実施例１および２の両方のプラスミドでコトランスフェクションし、次に、顕微鏡でＥＧＦＰを励起する、波長４８０ｎｍの光の照射下で解析した。強い緑色蛍光を示すＥＧＦＰ発現細胞を検出することができた。この緑色蛍光がレポータープラスミドによるＥＧＦＰの発現に特異的に依存していることを確認するために、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をレポータープラスミドｐＧＬ２−ＭＲＧ５−ＥＧＦＰのみでトランスフェクションした。これら細胞において、緑色蛍光は検出できなかった。この発現はＧＡＬ４−ＶＰ１６によって活性化されたが、これは、タンパク質分解によるＳＰ−Ｃ１００−ＧＡＬ４／ＶＰ１６のＣ末端からのＧＡＬ４／ＶＰ１６の放出を前提としている。
【００６２】
実施例４：ｃＤＮＡライブラリーで、γ−セクレターゼ活性をコードするｃＤＮＡを検出するためのＣ１００−Ｇａｌ４／ＶＰ１６システムの使用
ＳＰ−Ｃ１００−Ｇａｌ４／ＶＰ１６を、ＭＥＴ２５プロモーターの制御下で、ＡＤＨプロモーターとＧＡＬ４ＤＢドメイン（ＣＹＨ２遺伝子とマルチクローニング部位の間に位置する）を含むｐＤＢＴｒｐの部分を、ＳＰ−Ｃ１００−Ｇａｌ４−ＶＰ１６の上流にｐ４１５ＭＥＴ２５（Ｍｕｍｂｅｒｇ等，１９９４年）由来のＭＥＴ２５プロモーターを含むＤＮＡフラグメントで置き換えることにより、酵母発現ベクターｐＤＢＴｒｐ（インビトロジェンTMライフテクノロジーズ，オランダ，カタログ番号１０８３５０２３）中にクローニングした。酵母ＭａＶ２０３株（インビトロジェンTMライフテクノロジーズ）を、このコンストラクトで形質転換した。ＭａＶ２０３は遺伝子組換えにより改変されており、３つのＧＡＬ４誘導型レポーター遺伝子（ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、ｌａｃＺ）を含み、これらは安定してゲノムに組み込まれている（Ｖｉｄａｌ等，１９９６年）。ＭａＶ２０３中で、タンパク質分解により、ＳＰ−Ｃ１００−Ｇａｌ４−ＶＰ１６タンパク質からＧＡＬ４／ＶＰ１６ドメインが放出され、それにより、ＵＲＡ３およびＨＩＳ３の読み出しが活性化され、ウラシルまたはヒスチジンが欠失したプレート上で増殖した。
ＭａＶ２０３中でＳＰ−Ｃ１００−Ｇａｌ４−ＶＰ１６ｃＤＮＡの発現ではレポーターの低い活性のみが生じ、このインビボでの機能的な分析システムが、ｃＤＮＡライブラリーにおけるγ−セクレターゼに関するｃＤＮＡのスクリーニングおよびその発現の検出に適するようになった。
【００６３】
実施例５：ヒトＢ細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによるγ−セクレターゼの同定
ヒトＢ細胞ｃＤＮＡライブラリー（ＡＴＣＣ８７２８６；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，マナサス，バージニア州，米国；Ｅｌｌｅｄｇｅ等，１９９１年）を、γ−セクレターゼ活性を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡに関してスクリーニングするために、実施例４の組換えＭａＶ２０３酵母株を用いた。あるいは、酵母発現ベクターｐ４１５−ＭＥＴ２５（Ｍｕｍｂｅｒｇ等，１９９４年）またはｐ４１５−ＡＤＨ１（Ｍｕｍｂｅｒｇ等，１９９５年）に組み込まれたヒト海馬のｃＤＮＡライブラリーも、γ−セクレターゼまたはγ−セクレターゼ様の活性を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡに関するスクリーニングのために用いることができる。
【００６４】
実施例６：ＳＰ２−Ｃ１００およびＳＰ２−Ｃ１００−ＧＡＬ４／ＶＰ１６のクローニング
ＳＰ−Ｃ１００−ＧＡＬ４／ＶＰ１６（実施例１で記載した通り）のヒトシグナルペプチドに関するコード領域を、酵母ＳＵＣ２遺伝子（ＳＰ２；配列番号１２）から得られたシグナルペプチドで置き換え、ＳＰ２−Ｃ１００−ＧＡＬ４／ＶＰ１６（配列番号１９）をコードするコンストラクトが得られた。
ＳＵＣ２−シグナルペプチドのコード配列（配列番号１２）を含む５’−プライマーと、天然の停止コドン相当する３’−プライマー（Ｋａｎｇ等，（１９８７年））を用いて、Ｃ１００の成熟型（シグナル配列を含まない、配列番号４を参照）のコード領域を増幅することによって、ＳＰ２−Ｃ１００を構築した。シグナルペプチドの交換を容易にするために、プライマーＥＨ４７（配列番号２３）とＥＨ４９（配列番号２４）を、得られたＰＣＲ産物が、シグナルペプチドと成熟ペプチドのコード領域を連結する新たなＮｈｅＩ部位を含むように設計した。
【００６５】
ＥＨ４７：５’-ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＣＴＴＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＴＣＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＴＧＣＡＧＣＣＡＡＡＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧＣＧＣＴＡＧＣＴＧＡＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＣＧＡＣＡＴＧＡＣ−３’
ＥＨ４９：５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＡＧＧＣＧＣＣＧＴＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＴＣＡＡＡＧＡＡＣ−３’
【００６６】
ＳＰ２−Ｃ１００のＣ１００フラグメントを切り出し、それをＣ１００−ＧＡＬ４／ＶＰ１６で置き換えるために、ＳＰ２−Ｃ１００−ＧＡＬ４／ＶＰ１６を、ＥｃｏＲＩでの切断により得た。
このフラグメントを、実施例４に記載した通りに、ＭＥＴ２５プロモーターを含む酵母発現ベクターｐＤＢＴｒｐ（インビトロジェンTMライフテクノロジーズ，オランダ，カタログ番号１０８３５０２３）にクローニングした。
【００６７】
実施例７：ＳＰ２−Ｃ−ＧＡＬ４／ＶＰ１６−１００のクローニング
コンストラクトＳＰ２−Ｃ−ＧＡＬ４／ＶＰ１６−１００（配列番号１７）を得るために、３つの独立したＰＣＲ反応を、以下のプライマーの使用によって行った：
ＥＨ５３：５’−ＡＣＴＡＴＡＴＣＴＡＧＡＡＴＧＣＴＴＴＴＧＣ−３’
ＥＨ５４：５’−ＴＴＣＧＡＴＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＡＧＣＴＴＧＣＣＡＧＡＴＣＴＡＣＣＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＡＡ−３’
ＥＨ５５：５’−ＴＴＧＧＴＧＡＴＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＧＧＴＡＧＡＴＣＴＧＧＣＡＡＧＣＴＡＣＴＧＴＣＴＴＣＴＡＴＣＧＡＡ−３’
ＥＨ５６：５’−ＡＴＧＡＴＧＡＡＴＧＧＡＴＧＴＧＴＡＣＴＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＡＣＣＣＣＣＡＣＣＧＴＡＣＴＣＧＴＣＡＡＴＴ−３’
ＥＨ５７：５’−ＡＡＴＴＧＡＣＧＡＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＧＧＴＡＣＴＡＧＴＧＧＣＣＡＧＴＡＣＡＣＡＴＣＣＡＴＴＣＡＴＣＡＴ−３’
ＥＨ５９：５’−ＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＴＡＴＣＧＡＡＴＴＣ−３’。
【００６８】
１）ＰＣＲ産物に、ＧＡＬ４／ＶＰ１６コード領域とオーバーラップする３’−フランキング領域も含まれるような方法で、テンプレートとしてＳＰ２−Ｃ１００を用い、プライマーＥＨ５３（配列番号２５）とＥＨ５４（配列番号２６）を用いることによってＣ１００の細胞外ドメインと膜貫通ドメインを増幅した。
２）ＳＰ２−Ｃ１００の両端に対応する５’−および３’−フランキング領域を有するコード領域を増幅するために、プライマーＥＨ５５（配列番号２７）とＥＨ５６（配列番号２８）、および、ＤＮＡテンプレートとしてＧＡＬ４／ＶＰ１６を用いて、ＰＣＲ反応を行った。
３）プライマーＥＨ５７（配列番号２９）とＥＨ５９（配列番号３０）を用いるすることによって、Ｃ１００の細胞質内のドメインをコードするＳＰ２−Ｃ１００の３’−セグメントを増幅し、ＧＡＬ４／ＶＰ１６コード領域の５’−オーバーラップを得た。得られたＰＣＲ産物（約２００ｂｐ、７２０ｂｐ、および、１００ｂｐ）を精製し、ＳＰ２−Ｃ１００の５’−および３’末端に相当するＥＨ５３とＥＨ５９の存在下での最終的なＰＣＲに用いた。
【００６９】
約１０００ｂｐの最終ＰＣＲ産物を、実施例４に記載した通りに、ＭＥＴ２５プロモーターを含むｐＤＢＴｒｐ（インビトロジェンTMライフテクノロジーズ，オランダ，カタログ番号１０８３５０２３）由来の酵母発現ベクターにクローニングした。
【００７０】
実施例８：ＳＰ３−Ｃ１００、ＳＰ３−Ｃ１００−ＧＡＬ４／ＶＰ１６、および、ＳＰ３−Ｃ−ＧＡＬ４／ＶＰ１６−１００のクローニング
哺乳動物細胞系中でＳＰ３−Ｃ１００、ＳＰ３−Ｃ１００−ＧＡＬ４／ＶＰ１６（配列番号２１）、および、ＳＰ３−Ｃ−ＧＡＬ４／ＶＰ１６−１００（配列番号３２）を発現させるのための３種のプラスミドベクターを作るために、Ｃ１００、Ｃ１００−ＧＡＬ４／ＶＰ１６またはＣ−ＧＡＬ４／ＶＰ１６−１００のいずれかを、実施例６または７の酵母発現ベクターから、ＢＭ４０シグナルペプチド（ＳＰ３；配列番号１３）のコード領域を含む哺乳動物発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ（インビトロジェン，カタログ番号Ｖ７５０２０）にサブクローニングした。Ｃ１００、Ｃ１００−ＧＡＬ４／ＶＰ１６、または、Ｃ−ＧＡＬ４／ＶＰ１６−１００のコード領域を、実施例６に記載したＳＰ３コード領域の唯一のＮｈｅＩ制限部位に、フレーム内でライゲートした。
【００７１】
実施例９：酵母におけるＣ１００−ＧＡＬ４／ＶＰ１６発現の改良
形質転換された酵母からの粗溶解産物中で、異なるコンストラクトの発現レベルを定量した結果、ＳＰ−Ｃ１００−ＧＡＬ４／ＶＰ１６の発現は、酵母ＳＵＣ２シグナルペプチドとの融合体をコードするベクターで形質転換された酵母細胞からの溶解産物と比較して極めて低いことが明らかになった。例えば、ＳＰ２−Ｃ１００−ＧＡＬ４／ＶＰ１６の発現により、期待したサイズの特異的なバンドの強い発現がみられた。しかしながら、免疫ブロッティングにより、より高い電気泳動移動度を有するバンドも検出することができ、これは、酵母において組換えタンパク質が非特異的に分解されていることを示していた。このタンパク質の安定性は、ＧＡＬ４／ＶＰ１６ドメインを、Ｃ１００のγ−セクレターゼ切断部位の近傍でフレーム内に挿入したＣ−ＧＡＬ４／ＶＰ１６−１００の場合に改善された（以下を参照）。両方の融合タンパク質は、ＧＡＬ４／ＶＰ１６を含まずＣ１００をコードするコンストラクトと同等の発現レベルを得たが、これは、２種の異なるＣ１００とＧＡＬ４／ＶＰ１６との融合は、タンパク質発現を妨害しないことを示していた。
【００７２】
実施例１０：酵母におけるバックグラウンドの改善
シグナルペプチドの交換によるＣ１００−ＧＡＬ４／ＶＰ１６発現の増加は、酵母株ＭａＶ２０３における、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３およびｌａｃＺレポーターシステムの非特異的な活性化の大きな増加と関連していた。酵母はγ−セクレターゼ活性がないため、これは、細胞のプロテアーゼによるＣ１００−ＧＡＬ４／ＶＰ１６の非特異的プロセシングと、活性なＧＡＬ４／ＶＰ１６の放出による可能性が最も高い。
γ−セクレターゼ切断部位の近傍へＧＡＬ４／ＶＰ１６ドメインを移動することによって、Ｃ１００のの膜貫通ドメインと、ＧＡＬ４／ＶＰ１６ドメインのアミノ末端との間の部位での、Ｃ１００−ＧＡＬ４／ＶＰ１６で検出された非特異的なタンパク質分解的切断を実質的に除去した。
レポーターシステムのＧＡＬ４／ＶＰ１６依存性の活性化を試験することによって、ＭａＶ２０３での様々なコンストラクトの切断を試験した。
ＭａＶ２０３のＳＰ−Ｃ１００−ＧＡＬ４／ＶＰ１６での形質転換により、Ｕｒａ+、Ｈｉｓ-の表現型が示された（実施例４を参照）。ＳＰシグナルペプチドをＳＰ２ペプチドで置き換えること（ＳＰ２−Ｃ１００−ＧＡＬ４／ＶＰ１６を得る）によって発現レベルが増加することにより、全ての読み出しが、全長ＧＡＬ４タンパク質（プラスミドｐＣＬ１によってコードされた；クロンテック・ラボラトリーズ）を構成的に発現するポジティブコントロールのＭａＶ２０３で検出されたレベルと同様のレベルまで強く活性化された。
それに対して、ＳＰ２−Ｃ１００−ＧＡＬ４／ＶＰ１６に匹敵するレベルでＳＰ２−Ｃ−ＧＡＬ４／ＶＰ１６−１００を発現するＭａＶ２０３細胞は、Ｕｒａ-、Ｈｉｓ+の表現型を示し、空のベクターコントロールで形質転換されたＭａＶ２０３も同様であった。
従って、酵母では、ＳＰ２−Ｃ−ＧＡＬ４／ＶＰ１６−１００を高度に発現させることができるが、それでもなおＧＡＬ４依存性レポーターの極めて低い非特異的な活性化を示した。ＳＰ２−Ｃ−ＧＡＬ４／ＶＰ１６−１００タンパク質の高いレベルの発現、それにあわせて非特異的な切断／レポーター活性化の低いバックグラウンドは、驚異的に最適化されたシグナル／ノイズ比を有する読み出しシステムの必要条件である。
【００７３】
実施例１１：哺乳動物細胞における、γ−セクレターゼによるＳＰ３−Ｃ−ＧＡＬ４／ＶＰ１６−１００のプロセシング
哺乳動物細胞で発現されたＳＰ３−Ｃ−ＧＡＬ４／ＶＰ１６−１００タンパク質は、γ−セクレターゼ活性によって正確にプロセシングされることを実証するために、ＳＰ３−Ｃ−ＧＡＬ４／ＶＰ１６−１００を、γ−セクレターゼ活性を内因的に発現することがわかっている哺乳動物細胞にトランスフェクションした（Ｈａａｓｓ等，１９９２年）。哺乳動物細胞での発現のために、実施例８に記載している通りに、ＳＰ２−Ｃ−ＧＡＬ４／ＶＰ１６−１００中のシグナルペプチドを、高いレベルの発現で知られている基底膜タンパク質ＢＭ４０から得られた哺乳動物のシグナルペプチド（ＳＰ３；配列番号１３）で置き換えた。γ−セクレターゼのプロセシングを、培地へのＡβの分泌を定量することによってモニターした。分泌されたＡβを、モノクローナル抗体６Ｅ１０と、ビオチン化した４Ｇ８をそれぞれ捕獲および検出抗体として用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによって検出した（セネテックＰＬＣ（Ｓｅｎｅｔｅｋ  ＰＬＣ），ナパ，カリフォルニア州，米国；Ｋｉｍ等，１９９０年を参照）。
ＳＰ３−Ｃ１００でトランスフェクションした後に、空のベクターコントロールと比較して、Ａβ分泌の８倍の増加を観察した。ＳＰ３−Ｃ１００−ＧＡＬ４／ＶＰ１６またはＳＰ３−Ｃ−ＧＡＬ４／ＶＰ１６−１００でトランスフェクションされた細胞は、同様の量のＡβを分泌し、これは、Ｃ末端もＧＡＬ４／ＶＰ１６の膜近傍の融合も、γ−セクレターゼによるタンパク質分解のプロセシングを妨害しないことを示していた。
【００７４】
実施例１２：哺乳動物細胞で発現されるＣ−Ｇａｌ４／ＶＰ１６−１００によるＧＡＬ４／ＶＰ１６依存性レポーター遺伝子の転写活性化
γ−セクレターゼによるＣ１００−ＧＡＬ４／ＶＰ１６とＣ−ＧＡＬ４／ＶＰ１６−１００のプロセシングによって、Ｃ１００のフランキング部分から、ＧＡＬ４／ＶＰ１６と、追加のアミノ酸を含むポリペプチドが放出された。ＳＰ３−Ｃ１００−ＧＡＬ４／ＶＰ１６及びＳＰ３−Ｃ−ＧＡＬ４／ＶＰ１６−１００を、実施例２に記載した、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）コアプロモーター上流の５つのＧＡＬ４のＤＮＡ結合部位及びＥＧＦＰをコードするｃＤＮＡを含む哺乳動物のレポータープラスミドｐＧＬ２−ＭＲＧ５−ＥＧＦＰ（Ｉｋｅｄａ等，１９９８年）と共にコトランスフェクションした。ｐＧＬ２−ＭＲＧ５−ＥＧＦＰ及びＧＡＬ４／ＶＰ１６を含む融合体をコトランスフェクションすることにより、いずれの場合も、ＧＦＰ陽性細胞が生じた。
【００７５】
実施例１３：哺乳動物の発現プラスミドＳＰ３−Ｃ５５−ＧＡＬ４／ＶＰ１６の構築：
ＡＰＰのＣ１００配列とＧＡＬ４／ＶＰ１６を含むコンストラクトは、γ−セクレターゼの切断部位と、カスパーゼ様プロテアーゼの切断部位の両方を含む。非特異的なカスパーゼ様活性が、ＳＰ３−Ｃ１００−ＧＡＬ４／ＶＰ１６を本来のγ−セクレターゼ部位とＧＡＬ４／ＶＰ１６ドメインとの間で切断し、ＧＡＬ４／ＶＰ１６を放出して、哺乳動物細胞におけるレポーターシステムを活性化する可能性を回避するために、ＳＰ３−Ｃ１００−ＧＡＬ４／ＶＰ１６に含まれる、ＡＰＰの細胞質内のドメインをコードする、Ｃ１００の４５個のアミノ酸からなるＣ末端セグメントを削除した。また、Ｃ１００のＣ末端の４５個のアミノ酸を除去することによって、細胞質膜に挿入された後のＡＰＰのエンドサイトーシスを指示するＡＰＰのＣ末端における「内在化シグナル」ペプチドも除去される。
従って、哺乳動物の発現プラスミドＳＰ３−Ｃ５５−ＧＡＬ４／ＶＰ１６は、ＢＭ４０シグナルペプチド（配列番号１３）、ＡＰＰ−Ｃ１００のＮ末端の５５個のアミノ酸残基（Ｃ５５；配列番号６）、および、ＧＡＬ４／ＶＰ１６を含む。Ｃ５５は、Ａβ−ペプチドのＮ末端で始まり、ＡＰＰの膜貫通ドメインで終わる。ＳＰ３−Ｃ５５−ＧＡＬ４／ＶＰ１６タンパク質において、γ−セクレターゼの切断部位のみが存在する。Ｃ５５はγ−セクレターゼ切断部位を含み、Ａβ−ペプチドとＧＡＬ４／ＶＰ１６を放出するためにはγ−セクレターゼによって切断されなければならない。その上、ＳＰ３−Ｃ５５−ＧＡＬ４／ＶＰ１６には細胞内の内在化シグナルペプチドが存在しないために、細胞質膜結合型のＣ５５−ＧＡＬ４／ＶＰ１６の切断を触媒するγ−セクレターゼのみが、Ａβ−ペプチドを放出し、レポーターシステムのＧＡＬ４／ＶＰ１６依存性転写を活性化すると予想される。
ＧＡＬ４／ＶＰ１６配列の後に停止コドン（ＴＡＧ）を導入することによって、ベクターＳＰ３−Ｃ−ＧＡＬ４／ＶＰ１６−１００から発現プラスミドを得た。これは、ＤＮＡテンプレートとしてＳＰ３−Ｃ−ＧＡＬ４／ＶＰ１６−１００を用い、ＧＡＬ４／ＶＰ１６の唯一のＨｐａＩ部位の上流の５’−プライマー、および、ＧＡＬ４／ＶＰ１６のオープンリーディングフレームのＣ末端にＴＡＧ停止コドン（下線で示す）と、ＣｌａＩ制限部位を導入する３’−プライマー（５’−ＣＣＡＴＣＧＡＴＴＴＴＣＴＡＡＣＣＣＣＣＡＣＣＧＴＡ−３’；配列番号３１）を用いたＰＣＲによって生成したＤＮＡフラグメントで、ＳＰ３−Ｃ−ＧＡＬ４／ＶＰ１６−１００のＨｐａＩ−ＣｌａＩフラグメントを置き換えることによって行われた。
【００７６】
実施例１４：安定にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞
ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓細胞系（ＡＴＣＣ））を、プラスミドＳＰ３−Ｃ５５−ＧＡＬ４／ＶＰ１６と、ルシフェラーゼレポータープラスミドＰＧＬ２−ＭＲＧ５（実施例２に記載した）でコトランスフェクションした。その後、ネオマイシン耐性クローンを選択するために、４００μｇ／ｍｌのゲネチシン（ギブコＢＲＬ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ））とインキュベートことによって安定な細胞系を選択し、その後、ＳＰ３−Ｃ５５−ＧＡＬ４／ＶＰ１６とルシフェラーゼの安定な発現に関して特徴付けられた。
【００７７】
実施例１５：ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクション
マルチウェル１２プレートで、ＨＥＫ２９３細胞を、ＳＰ３−Ｃ５５−ＧＡＬ４／ＶＰ１６ベクター（０．０３μｇ）と、ｐＧＬ２−ＭＲＧ５ルシフェラーゼレポーターベクター（１μｇ）でコトランスフェクションした。
化合物のＤＰＡＴ（エラン・ファーマシューティカルズ（Ｅｌａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）製；Ｄｏｖｅｙ等，２００１年）、および、Ｌ−６８５，４５８（メルク・ファーマシューティカルズ（Ｍｅｒｃｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）製；Ｓｈｅａｒｍａｎ等，２０００年）は、いずれも既知のγ−セクレターゼ阻害剤であり、用量依存性でルシフェラーゼ活性とＡβ生産を阻害し、それぞれ１４ｎＭ（ＤＡＰＴ）、１９ｎＭ（Ｌ−６８５，４５８）のＩＣ50を示した。
ブライト−グロー（Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ）ルシフェラーゼ分析キット（プロメガ）で、ルシフェラーゼ活性を定量した。細胞培地中のＡβを、ＥＬＩＳＡで、実施例１１に記載した抗体４Ｇ８および６Ｅ１０（セネテック製）を用いて定量した。これら抗体は、Ａβ−ペプチドのアミノ酸１７〜２４（４Ｇ８）、および、１〜１７（６Ｅ１０）に特異的である。
一過性トランスフェクション実験において、免疫沈降反応と免疫ブロッティングによってもＡβが同定された。両方の方法により、Ａβ−ペプチドに相当する４ｋＤａのバンドが同定された。
【００７８】
実施例１６：安定なトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞の薬理学的な特徴付け
実施例１４に従って、ＳＰ３−Ｃ５５−ＧＡＬ４／ＶＰ１６とＭＲＧ５−ルシフェラーゼコンストラクトの両方を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞のクローンを同定した。この細胞のクローンを用いて、ＤＡＰＴ（エラン・ファーマシューティカルズ製；Ｄｏｖｅｙ等，２００１年）と、Ｌ−６８５，４５８（メルク・ファーマシューティカルズ製；Ｓｈｅａｒｍａｎ等，２０００年）に対する、安定してトランスフェクションされた哺乳動物細胞の分析システムの応答性を試験した。両方の化合物は、用量依存性でルシフェラーゼ活性の阻害を示し（２４時間の処理）、ＩＣ50は、それぞれ２３０ｎＭ（ＤＡＰＴ）、および、１３０ｎＭ（Ｌ−６８５，４５８）であった。
【００７９】
実施例１７：γ−セクレターゼの阻害剤の同定
γ−セクレターゼ阻害剤を同定するために、安定して二重にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞（実施例１４を参照）を、マルチウェル９６プレート中で、分析中の濃度が１０μＭまたはそれ未満の調査中の化合物（例えば化合物ライブラリースクリーニング）の存在下でインキュベートし、２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ分析システムキット（プロメガ）、ブライト−グロールシフェラーゼ分析キット（プロメガ）、または、ルシフェラーゼ定量化のためのその他のあらゆる方法を用いてルシフェラーゼ活性を定量することができる。ルシフェラーゼ活性の減少は、γ−セクレターゼ活性の減少を示す。
【００８０】
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Yankner et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9020.
【００８１】
一般的な組換えＤＮＡの研究について：
Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY
【００８２】
酵母の研究について（ＤＮＡ形質転換）：
Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith,
J. A., and Struhl, K. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, pp. 13.7.1-13.7.2, Greene Publishing Associates/Wiley-Interscience, New York
【００８３】
Ｃ．エレガンスの研究について（トランスジェニック）：
Mello, C. and Fire, A. (1995) DNA transformation. In: Epstein, H.F. and Shakes, D.C., ed. Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. Methods in Cell Biology, Vol. 48. Academic Press, San Diego, CA, pp. 451-482.
【００８４】
配列番号１（APPフラグメント）
GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML
【００８５】
配列番号２（APPフラグメント（第一の部分タンパク質））
GAIIGLMVGGVV
【００８６】
配列番号３（APPフラグメント（第二の部分タンパク質））
VIVITLVML
【００８７】
配列番号４（C100フラグメント）
LDAEFRHDSG YEVHHQKLVF FAEDVGSNKG AIIGLMVGGV VIATVIVITL
VMLKKKQYTS IHHGVVEVDA AVTPEERHLS KMQQNGYENP TYKFFEQMQN
【００８８】
配列番号５（ヒトAPPのシグナルペプチド(SP））
MLPGLALFLL AAWTARA
【００８９】
配列番号６(C55フラグメント）
LDA EFRHDSGYEV HHQKLVFFAE DVGSNKGAII
GLMVGGVVIA TVIVITLVML KK
【００９０】
配列番号７(GAL4-VP16)
MKLLSSIEQA CDICRLKKLK CSKEKPKCAK CLKNNWECRY SPKTKRSPLT
RAHLTEVESR LERLEQLFLL IFPREDLDMI LKMDSLQDIK ALLTGLFVQD
NVNKDAVTDR LASVETDMPL TLRQHRISAT SSSEESSNKG QRQLTVSPEF
PGIWAPPTDV SLGDELHLDG EDVAMAHADA LDDFDLDMLG DGDSPGPGFT
PHDSAPYGAL DMADFEFEQM FTDALGIDEY GG
【００９１】
配列番号８(SP-C100-GAL4-VP16)
GGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTAC
GGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTC
ATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACC
CCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAAT
GGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTA
TTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTT
GGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTG
GATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACC
GCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTA
ATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTCACAGCTAGCGCA CTCGGTGCCCCGCGCAGGGTCGCGATGCTGCCCGGTTTGGCACTGTTCCTGCTGGCCGCCTGGACGGCTCGGGCGCTGGATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTTCATCATCAAAAATTGGTGTTCTTTGCAGAAGATGTGGGTTCAAACAAAGGTGCAATCATTGGACTCATGGTGGGCGGTGTTGTCATAGCGACAGTGATCGTCATCACCTTGGTGATGCTGAAGAAGAAACAGTACACATCCATTCATCATGGTGTGGTGGAGGTTGACGCCGCTGTCACCCCAGAGGAGCGCCACCTGTCCAAGATGCAGCAGAACGGCTACGAAAATCCAACCTACAAGTTCTTTGAGCAGATGCAGAACGCGCGGGGTACCCCGGCG ATGAAGC TACTGTCTTC TATCGAACAA GCATGCGATA TTTGCCGACT TAAAAAGCTC AAGTGCTCCA AAGAAAAACC GAAGTGCGCC AAGTGTCTGA AGAACAACTG GGAGTGTCGC TACTCTCCCA AAACCAAAAG GTCTCCGCTG ACTAGGGCAC ATCTGACAGA AGTGGAATCA AGGCTAGAAA GACTGGAACA GCTATTTCTA CTGATTTTTC CTCGAGAAGA CCTTGACATG
ATTTTGAAAA TGGATTCTTT ACAGGATATA AAAGCATTGT TAACAGGATT ATTTGTACAA GATAATGTGA ATAAAGATGC CGTCACAGAT AGATTGGCTT CAGTGGAGAC TGATATGCCT CTAACATTGA GACAGCATAG AATAAGTGCG ACATCATCAT CGGAAGAGAG TAGTAACAAA GGTCAAAGAC AGTTGACTGT ATCG CCGGAATTCCCGGGGATCTGGGC CCCCCCGAC CGATGTCAGC CTGGGGGACG AGCTCCACTT AGACGGCGAG GACGTGGCGA TGGCGCATGC CGACGCGCTA GACGATTTCG ATCTGGACAT GTTGGGGGAC GGGGATTCCC CGGGGCCGGG ATTTACCCCC CACGACTCCG CCCCCTACGG CGCTCTGGAT ATGGCCGACT TCGAGTTTGA GCAGATGTTT ACCGATGCCC TTGGAATTGA CGAGTACGGT GGGTAG
【００９２】
配列番号９（ヒトAPP）
AGTTTCCTCG GCAGCGGTAG GCGAGAGCAC GCGGAGGAGC GTGCGCGGGG GCCCCGGGAG
ACGGCGGCGG TGGCGGCGCG GGCAGAGCAA GGACGCGGCG GATCCCACTC GCACAGCAGC
GCACTCGGTG CCCCGCGCAG GGTCGCGATG CTGCCCGGTT TGGCACTGCT CCTGCTGGCC
GCCTGGACGG CTCGGGCGCT GGAGGTACCC ACTGATGGTA ATGCTGGCCT GCTGGCTGAA
CCCCAGATTG CCATGTTCTG TGGCAGACTG AACATGCACA TGAATGTCCA GAATGGGAAG
TGGGATTCAG ATCCATCAGG GACCAAAACC TGCATTGATA CCAAGGAAGG CATCCTGCAG
TATTGCCAAG AAGTCTACCC TGAACTGCAG ATCACCAATG TGGTAGAAGC CAACCAACCA
GTGACCATCC AGAACTGGTG CAAGCGGGGC CGCAAGCAGT GCAAGACCCA TCCCCACTTT
GTGATTCCCT ACCGCTGCTT AGTTGGTGAG TTTGTAAGTG ATGCCCTTCT CGTTCCTGAC
AAGTGCAAAT TCTTACACCA GGAGAGGATG GATGTTTGCG AAACTCATCT TCACTGGCAC
ACCGTCGCCA AAGAGACATG CAGTGAGAAG AGTACCAACT TGCATGACTA CGGCATGTTG
CTGCCCTGCG GAATTGACAA GTTCCGAGGG GTAGAGTTTG TGTGTTGCCC ACTGGCTGAA
GAAAGTGACA ATGTGGATTC TGCTGATGCG GAGGAGGATG ACTCGGATGT CTGGTGGGGC
GGAGCAGACA CAGACTATGC AGATGGGAGT GAAGACAAAG TAGTAGAAGT AGCAGAGGAG
GAAGAAGTGG CTGAGGTGGA AGAAGAAGAA GCCGATGATG ACGAGGACGA TGAGGATGGT
GATGAGGTAG AGGAAGAGGC TGAGGAACCC TACGAAGAAG CCACAGAGAG AACCACCAGC
ATTGCCACCA CCACCACCAC CACCACAGAG TCTGTGGAAG AGGTGGTTCG AGTTCCTACA
ACAGCAGCCA GTACCCCTGA TGCCGTTGAC AAGTATCTCG AGACACCTGG GGATGAGAAT
GAACATGCCC ATTTCCAGAA AGCCAAAGAG AGGCTTGAGG CCAAGCACCG AGAGAGAATG
TCCCAGGTCA TGAGAGAATG GGAAGAGGCA GAACGTCAAG CAAAGAACTT GCCTAAAGCT
GATAAGAAGG CAGTTATCCA GCATTTCCAG GAGAAAGTGG AATCTTTGGA ACAGGAAGCA
GCCAACGAGA GACAGCAGCT GGTGGAGACA CACATGGCCA GAGTGGAAGC CATGCTCAAT
GACCGCCGCC GCCTGGCCCT GGAGAACTAC ATCACCGCTC TGCAGGCTGT TCCTCCTCGG
CCTCGTCACG TGTTCAATAT GCTAAAGAAG TATGTCCGCG CAGAACAGAA GGACAGACAG
CACACCCTAA AGCATTTCGA GCATGTGCGC ATGGTGGATC CCAAGAAAGC CGCTCAGATC
CGGTCCCAGG TTATGACACA CCTCCGTGTG ATTTATGAGC GCATGAATCA GTCTCTCTCC
CTGCTCTACA ACGTGCCTGC AGTGGCCGAG GAGATTCAGG ATGAAGTTGA TGAGCTGCTT
CAGAAAGAGC AAAACTATTC AGATGACGTC TTGGCCAACA TGATTAGTGA ACCAAGGATC
AGTTACGGAA ACGATGCTCT CATGCCATCT TTGACCGAAA CGAAAACCAC CGTGGAGCTC
CTTCCCGTGA ATGGAGAGTT CAGCCTGGAC GATCTCCAGC CGTGGCATTC TTTTGGGGCT
GACTCTGTGC CAGCCAACAC AGAAAACGAA GTTGAGCCTG TTGATGCCCG CCCTGCTGCC
GACCGAGGAC TGACCACTCG ACCAGGTTCT GGGTTGACAA ATATCAAGAC GGAGGAGATC
TCTGAAGTGA AGATGGATGC AGAATTCCGA CATGACTCAG GATATGAAGT TCATCATCAA
AAATTGGTGT TCTTTGCAGA AGATGTGGGT TCAAACAAAG GTGCAATCAT TGGACTCATG
GTGGGCGGTG TTGTCATAGC GACAGTGATC GTCATCACCT TGGTGATGCT GAAGAAGAAA
CAGTACACAT CCATTCATCA TGGTGTGGTG GAGGTTGACG CCGCTGTCAC CCCAGAGGAG
CGCCACCTGT CCAAGATGCA GCAGAACGGC TACGAAAATC CAACCTACAA GTTCTTTGAG
CAGATGCAGA ACTAGACCCC CGCCACAGCA GCCTCTGAAG TTGGACAGCA AAACCATTGC
TTCACTACCC ATCGGTGTCC ATTTATAGAA TAATGTGGGA AGAAACAAAC CCGTTTTATG
ATTTACTCAT TATCGCCTTT TGACAGCTGT GCTGTAACAC AAGTAGATGC CTGAACTTGA
ATTAATCCAC ACATCAGTAA TGTATTCTAT CTCTCTTTAC ATTTTGGTCT CTATACTACA
TTATTAATGG GTTTTGTGTA CTGTAAAGAA TTTAGCTGTA TCAAACTAGT GCATGAATAG
ATTCTCTCCT GATTATTTAT CACATAGCCC CTTAGCCAGT TGTATATTAT TCTTGTGGTT
TGTGACCCAA TTAAGTCCTA CTTTACATAT GCTTTAAGAA TCGATGGGGG ATGCTTCATG
TGAACGTGGG AGTTCAGCTG CTTCTCTTGC CTAAGTATTC CTTTCCTGAT CACTATGCAT
TTTAAAGTTA AACATTTTTA AGTATTTCAG ATGCTTTAGA GAGATTTTTT TTCCATGACT
GCATTTTACT GTACAGATTG CTGCTTCTGC TATATTTGTG ATATAGGAAT TAAGAGGATA
CACACGTTTG TTTCTTCGTG CCTGTTTTAT GTGCACACAT TAGGCATTGA GACTTCAAGC
TTTTCTTTTT TTGTCCACGT ATCTTTGGGT CTTTGATAAA GAAAAGAATC CCTGTTCATT
GTAAGCACTT TTACGGGGCG GGTGGGGAGG GGTGCTCTGC TGGTCTTCAA TTACCAAGAA
TTCTCCAAAA CAATTTTCTG CAGGATGATT GTACAGAATC ATTGCTTATG ACATGATCGC
TTTCTACACT GTATTACATA AATAAATTAA ATAAAATAAC CCCGGGCAAG ACTTTTCTTT
GAAGGATGAC TACAGACATT AAATAATCGA AGTAATTTTG GGTGGGGAGA AGAGGCAGAT
TCAATTTTCT TTAACCAGTC TGAAGTTTCA TTTATGATAC AAAAGAAGAT GAAAATGGAA
GTGGCAATAT AAGGGGATGA GGAAGGCATG CCTGGACAAA CCCTTCTTTT AAGATGTGTC
TTCAATTTGT ATAAAATGGT GTTTTCATGT AAATAAATAC ATTCTTGGAG GAGC
【００９３】
配列番号１０（組換えプラスミドpDBTrp-MET25-SP-C100-GAL4-VP16)
ACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGGACGGATCGCTTGCCTGTAACTTACACGCGCCTCGTATCTTTTAATGATGGAATAATTTGGGAATTTACTCTGTGTTTATTTATTTTTATGTTTTGTATTTGGATTTTAGAAAGTAAATAAAGAAGGTAGAAGAGTTACGGAATGAAGAAAAAAAAATAAACAAAGGTTTAAAAAATTTCAACAAAAAGCGTACTTTACATATATATTTATTAGACAAGAAAAGCAGATTAAATAGATATACATTCGATTAACGATAAGTAAAATGTAAAATCACAGGATTTTCGTGTGTGGTCTTCTACACAGACAAGATGAAACAATTCGGCATTAATACCTGAGAGCAGGAAGAGCAAGATAAAAGGTAGTATTTGTTGGCGATCCCCCTAGAGTCTTTTACATCTTCGGAAAACAAAAACTATTTTTTCTTTAATTTCTTTTTTTACTTTCTATTTTTAATTTATATATTTATATTAAAAAATTTAAATTATAATTATTTTTATAGCACGTGATGAAAAGGACCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATCTGCAGCTCTGGCCCGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTGGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTTTCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCGCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATACGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGAATTGGTTAATTGGTTGTAACACTGGCAGAGCATTACGCTGACTTGACGGGACGGCGCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGGAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCCGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTACCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCCTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGGAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGTACCGATCCCGAGCTTTGCAAATTAAAGCCTTCGAGCGTCCCAAAACCTTCTCAAGCAAGGTTTTCAGTATAATGTTACATGCGTACACGCGTCTGTACAGAAAAAAAAGAAAAATTTGAAATATAAATAACGTTCTTAATACTAACATAACTATAAAAAAATAAATAGGGACCTAGACTTCAGGTTGTCTAACTCCTTCCTTTTCGGTTAGAGCGGATGTGGGGGGAGGGCGTGAATGTAAGCGTGACATAACTAATTACATGATATCGACAAAGGAAAAGGGGCCTGTTTACTCACAGGCTTTTTTCAAGTAGGTAATTAAGTCGTTTCTGTCTTTTTCCTTCTTCAACCCACCAAAGGCCATCTTGGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATAGAAATAATACAGAAGTAGATGTTGAATTAGATTAAACTGAAGATATATAATTTATTGGAAAATACATAGAGCTTTTTGTTGATGCGCTTAAGCGATCAATTCAACAACACCACCAGCAGCTCTGATTTTTTCTTCAGCCAACTTGGAGACGAATCTAGCTTTGACGATAACTGGAACATTTGGAATTCTACCCTTACCCAAGATCTTACCGTAACCGGCTGCCAAAGTGTCAATAACTGGAGCAGTTTCCTTAGAAGCAGATTTCAAGTATTGGTCTCTCTTGTCTTCTGGGATCAATGTCCACAATTTGTCCAAGTTCAAGACTGGCTTCCAGAAATGAGCTTGTTGCTTGTGGAAGTATCTCATACCAACCTTACCGAAATAACCTGGATGGTATTTATCCATGTTAATTCTGTGGTGATGTTGACCACCGGCCATACCTCTACCACCGGGGTGCTTTCTGTGCTTACCGATACGACCTTTACCGGCTGAGACGTGACCTCTGTGCTTTCTAGTCTTAGTGAATCTGGAAGGCATTCTTGATTAGTTGGATGATTGTTCTGGGATTTAATGCAAAAATCACTTAAGAAGGAAAATCAACGGAGAAAGCAAACGCCATCTTAAATATACGGGATACAGATGAAAGGGTTTGAACCTATCTGGAAAATAGCATTAAACAAGCGAAAAACTGCGAGGAAAATTGTTTGCGTCTCTGCGGGCTATTCACGCGCCAGAGGAAAATAGGAAAAATAACAGGGCATTAGAAAAATAATTTTGATTTTGGTAATGTGTGGGTCCTGGTGTACAGATGTTACATTGGTTACAGTACTCTTGTTTTTGCTGTGTTTTTCGATGAATCTCCAAAATGGTTGTTAGCACATGGAAGAGTCACCGATGCTAAGTTATCTCTATGTAAGCTACGTGGCGTGACTTTTGATGAAGCCGCACAAGAGATACAGGATTGGCAACTGCAAATAGAATCTGGGGATCCCCCCTCGACGGATGCAAGGGTTCGAATCCCTTAGCTCTCATTATTTTTTGCTTTTTCTCTTGAG.GTSGTCACATGATCGCAAAATGGCAAATGGCACGTGAAGCTGTCGATATTGGGGAACTGTGGTGGTTGGCAAATGACTAATTAAGTTAGTCAAGGCGCCATCCTCATGAAAACTGTGTAACATAATAACCGAAGTGTCGAAAAGGTGGCACCTTGTCCAATTGAACACGCTCGATGAAAAAAATAAGATATATATAAGGTTAAGTAAAGCGTCTGTTAGAAAGGAAGTTTTTCCTTTTTCTTGCTCTCTTGTCTTTTCATCTACTATTTCCTTCGTGTAATACAGGGTCGTCAGATACATAGATACAATTCTATTACCCCCATCCATACATCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTCACAGCTAGCGCACTCGGTGCCCCGCGCAGGGTCGCGATGCTGCCCGGTTTGGCACTGTTCCTGCTGGCCGCCTGGACGGCTCGGGCGCTGGATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTTCATCATCAAAAATTGGTGTTCTTTGCAGAAGATGTGGGTTCAAACAAAGGTGCAATCATTGGACTCATGGTGGGCGGTGTTGTCATAGCGACAGTGATCGTCATCACCTTGGTGATGCTGAAGAAGAAACAGTACACATCCATTCATCATGGTGTGGTGGAGGTTGACGCCGCTGTCACCCCAGAGGAGCGCCACCTGTCCAAGATGCAGCAGAACGGCTACGAAAATCCAACCTACAAGTTCTTTGAGCAGATGCAGAACGCGCGGGGTACCCCGGCGATGAAGCTACTGTCTTCTATCGAACAAGCATGCGATATTTGCCGACTTAAAAAGCTCAAGTGCTCCAAAGAAAAACCGAAGTGCGCCAAGTGTCTGAAGAACAACTGGGAGTGTCGCTACTCTCCCAAAACCAAAAGGTCTCCGCTGACTAGGGCACATCTGACAGAAGTGGAATCAAGGCTAGAAAGACTGGAACAGCTATTTCTACTGATTTTTCCTCGAGAAGACCTTGACATGATTTTGAAAATGGATTCTTTACAGGATATAAAAGCATTGTTAACAGGATTATTTGTACAAGATAATGTGAATAAAGATGCCGTCACAGATAGATTGGCTTCAGTGGAGACTGATATGCCTCTAACATTGAGACAGCATAGAATAAGTGCGACATCATCATCGGAAGAGAGTAGTAACAAAGGTCAAAGACAGTTGACTGTATCGCCGGAATTCCCGGGGATCTGGGCCCCCCCGACCGATGTCAGCCTGGGGGACGAGCTCCACTTAGACGGCGAGGACGTGGCGATGGCGCATGCCGACGCGCTAGACGATTTCGATCTGGACATGTTGGGGGACGGGGATTCCCCGGGGCCGGGATTTACCCCCCACGACTCCGCCCCCTACGGCGCTCTGGATATGGCCGACTTCGAGTTTGAGCAGATGTTTACCGATGCCCTTGGAATTGACGAGTACGGTGGGTAGGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGACCCCGGGTGCTAGCAAGGCCTTGTGGCCAGCCATGGCAACTAGTGCGGCCGCTAAGTAAGTAAGACGTCGAGCTCTAAGTAAGTAACGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTTTGGACTTCTTCGCCAGAGGTTTGGTCAAGTCTCCAATCAAGGTTGTCGGCTTGTCTACCTTGCCAGAAATTTACGAAAAGATGGAAAAGGGTCAAATCGTTGGTAGATACGTTGTTGACACTTCTAAATAAGCGAATTTCTTATGATTTATGATTTTTATTATTAAATAAGTTATAAAAAAAATAAGTGTATACAAATTTTAAAGTGACTCTTAGGTTTTAAAACGAAAATTCTTGTTCTTGAGTAACTCTTTCCTGTAGGTCAGGTTGCTTTCTCAGGTATAGCATGAGGTCGCTCTTATTGACCACACCTCTACCGGCATGCCGAGCAAATGCCTGCAAATCGCTCCCCATTTCACCCAATTGTAGATATGCTAACTCCAGCAATGAGTTGATGAATCTCGGTGTGTATTTTATGTCCTCAGAGGACAATACCTGTTGTAATCGTTCTTCCACACGGATCCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCAGGCAAGTGCACAAACAATACTTAAATAAATACTACTCAGTAATAACCTATTTCTTAGCATTTTTGACGAAATTTGCTATTTTGTTAGAGTCTTTTACACCATTTGTCTCCACACCTCCGCTTACATCAACACCAATAACGCCATTTAATCTAAGCGCATCACCAACATTTTCTGGCGTCAGTCCACCAGCTAACATAAAATGTAAGCTTTCGGGGCTCTCTTGCCTTCCAACCCAGTCAGAAATCGAGTTCCAATCCAAAAGTTCACCTGTCCCACCTGCTTCTGAATCAAACAAGGGAATAAACGAATGAGGTTTCTGTGAAGCTGCACTGAGTAGTATGTTGCAGTCTTTTGGAAATACGAGTCTTTTAATAACTGGCAAACCGAGGAACTCTTGGTATTCTTGCCACGACTCATCTCCATGCAGTTGGACGATATCAATGCCGTAATCATTGACCAGAGCCAAAACATCCTCCTTAGGTTGATTACGAAACACGCCAACCAAGTATTTCGGAGTGCCTGAACTATTTTTATATGCTTTTACAAGACTTGAAATTTTCCTTGCAATAACCGGGTCAATTGTTCTCTTTCTATTGGGCACACATATAATACCCAGCAAGTCAGCATCGGAATCTAGAGCACATTCTGCGGCCTCTGTGCTCTGCAAGCCGCAAACTTTCACCAATGGACCAGAACTACCTGTGAAATTAATAACAGACATACTCCAAGCTGCCTTTGTGTGCTTAATCACGTATACTCACGTGCTCAATAGTCACCAATGCCCTCCCTCTTGGCCCTCTCCTTTTCTTTTTTCGACCGAATTAATTCTTAATCGGCAAAAAAAGAAAAGCTCCGGATCAAGATTGTACGTAAGGTGACAAGCTATTTTTCAATAAAGAATATCTTCCACTACTGCCATCTGGCGTCATAACTGCAAAGTACACATATATTACGATGCTGTCTATTAAATGCTTCCTATATTATATATATAGTAATGTCGTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGA
【００９４】
配列番号１１（SP-C100-GAL4-VP16融合タンパク質）
MLPGLALFLL AAWTARALDA EFRHDSGYEV HHQKLVFFAE DVGSNKGAII
GLMVGGVVIA TVIVITLVML KKKQYTSIHH GVVEVDAAVT PEERHLSKMQ
QNGYENPTYK FFEQMQNARG TPAMKLLSSI EQACDICRLK KLKCSKEKPK
CAKCLKNNWE CRYSPKTKRS PLTRAHLTEV ESRLERLEQL FLLIFPREDL
DMILKMDSLQ DIKALLTGLF VQDNVNKDAV TDRLASVETD MPLTLRQHRI
SATSSSEESS NKGQRQLTVS PEFPGIWAPP TDVSLGDELH LDGEDVAMAH
ADALDDFDLD MLGDGDSPGP GFTPHDSAPY GALDMADFEF EQMFTDALGI
DEY GG
【００９５】
配列番号１２（酵母SUC2遺伝子のシグナルペプチド(SP2））
MLLRAFLFLLAGFAAKISAALA
【００９６】
配列番号１３（哺乳動物の基底膜タンパク質BM40のシグナルペプチド(SP3)）
MRAWIFFLLCLAGRALA
【００９７】
配列番号１４(SP-C55-GAL4-VP16)
MLPGLALFLL AAWTARALDA EFRHDSGYEV HHQKLVFFAE DVGSNKGAII
GLMVGGVVIA TVIVITLVML KKKGRSGKLL SSIEQACDIC RLKKLKCSKE
KPKCAKCLKN NWECRYSPKT KRSPLTRAHL TEVESRLERL EQLFLLIFPR
EDLDMILKMD SLQDIKALLT GLFVQDNVNK DAVTDRLASV ETDMPLTLRQ
HRISATSSSE ESSNKGQRQL TVSPEFPGIW APPTDVSLGD ELHLDGEDVA
MAHADALDDF DLDMLGDGDS PGPGFTPHDS APYGALDMAD FEFEQMFTDA
LGIDEYGG
【００９８】
配列番号１５(SP-C55-GAL4/VP16-TAG)
1 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 
61 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 
121 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 
181 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 
241 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 
301 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 
361 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 
421 attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 
481 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 
541 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 
601 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 
661 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 
721 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 
781 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 
841 ctgcttaact ggcttatcga aattaatacg actcactata gggagaccca agcttctgcc 
901 tgccgcctgc ctgcctgcca ctgagggttc ccagcaccat gagggcctgg atcttctttc 
961 tcctttgcct ggccgggagg gctctggcag ccccgctagc tgatgcagaa ttccgacatg 
1021 actcaggata tgaagttcat catcaaaaat tggtgttctt tgcagaagat gtgggttcaa
1081 acaaaggtgc aatcattgga ctcatggtgg gcggtgttgt catagcgaca gtgatcgtca
1141 tcaccttggt gatgctgaag aagaaaggta gatctggcaa gctactgtct tctatcgaac
1201 aagcatgcga tatttgccga cttaaaaagc tcaagtgctc caaagaaaaa ccgaagtgcg
1261 ccaagtgtct gaagaacaac tgggagtgtc gctactctcc caaaaccaaa aggtctccgc
1321 tgactagggc acatctgaca gaagtggaat caaggctaga aagactggaa cagctatttc
1381 tactgatttt tcctcgagaa gaccttgaca tgattttgaa aatggattct ttacaggata
1441 taaaagcatt gttaacagga ttatttgtac aagataatgt gaataaagat gccgtcacag
1501 atagattggc ttcagtggag actgatatgc ctctaacatt gagacagcat agaataagtg
1561 cgacatcatc atcggaagag agtagtaaca aaggtcaaag acagttgact gtatcgccgg
1621 aattcccggg gatctgggcc cccccgaccg atgtcagcct gggggacgag ctccacttag
1681 acggcgagga cgtggcgatg gcgcatgccg acgcgctaga cgatttcgat ctggacatgt
1741 tgggggacgg ggattccccg ggtccgggat ttacccccca cgactccgcc ccctacggcg
1801 ctctggatat ggccgacttc gagtttgagc agatgtttac cgatgccctt ggaattgacg
1861 agtacggtgg gggttagaaa atcgataccg tcgaggccgc tcgagcatgc atctagaggg
1921 ccctattcta tagtgtcacc taaatgctag agctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc
1981 tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc
2041 cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg
2101 tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa
2161 tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggaacca gctggggctc gaggggggat
2221 ccccacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg
2281 accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc
2341 gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg gcatcccttt agggttccga
2401 tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt
2461 gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat
2521 agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat
2581 ttataaggga ttttggggat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa
2641 tttaacgcga attttaacaa aatattaacg tttacaattt aaatatttgc ttatacaatc
2701 ttcctgtttt tggggctttt ctgattatca accggggtgg gtaccgagct cgaattctgt
2761 ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc cccaggcagg cagaagtatg
2821 caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca
2881 ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact
2941 ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta
3001 atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag
3061 tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc tcccgggagc ttggatatcc
3121 attttcggat ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga
3181 ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa
3241 cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt
3301 ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg
3361 ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa
3421 gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac
3481 cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt
3541 gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact
3601 cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg
3661 ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg
3721 acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc
3781 atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt
3841 gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc
3901 gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgagcg
3961 ggactctggg gttcgaaatg accgaccaag cgacgcccaa cctgccatca cgagatttcg
4021 attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat cgttttccgg gacgccggct
4081 ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt cgcccacccc aacttgttta
4141 ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat
4201 ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct
4261 ggatcccgtc gacctcgaga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa
4321 ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg
4381 gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca
4441 gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg
4501 tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg
4561 gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg
4621 ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa
4681 ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg
4741 acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc
4801 tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc
4861 ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcaatgctca cgctgtaggt atctcagttc
4921 ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg
4981 ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc
5041 actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga
5101 gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc
5161 tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac
5221 caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg
5281 atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc
5341 acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa
5401 ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta
5461 ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt
5521 tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag
5581 tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca
5641 gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc
5701 tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt
5761 tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag
5821 ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt
5881 tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat
5941 ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt
6001 gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc
6061 ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat
6121 cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag
6181 ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt
6241 ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg
6301 gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta
6361 ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc
6421 gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtc
【００９９】
配列番号１６（組換えプラスミドpDBTrp-MET25-SP-C-Gal4/VP16-100)
1 gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 
61 cttaggacgg atcgcttgcc tgtaacttac acgcgcctcg tatcttttaa tgatggaata 
121 atttgggaat ttactctgtg tttatttatt tttatgtttt gtatttggat tttagaaagt 
181 aaataaagaa ggtagaagag ttacggaatg aagaaaaaaa aataaacaaa ggtttaaaaa 
241 atttcaacaa aaagcgtact ttacatatat atttattaga caagaaaagc agattaaata 
301 gatatacatt cgattaacga taagtaaaat gtaaaatcac aggattttcg tgtgtggtct 
361 tctacacaga caagatgaaa caattcggca ttaatacctg agagcaggaa gagcaagata 
421 aaaggtagta tttgttggcg atccccctag agtcttttac atcttcggaa aacaaaaact 
481 attttttctt taatttcttt ttttactttc tatttttaat ttatatattt atattaaaaa 
541 atttaaatta taattatttt tatagcacgt gatgaaaagg acccaggtgg cacttttcgg 
601 ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg 
661 ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatctg cagctctggc ccgtgtctca 
721 aaatctctga tgttacattg cacaagataa aaatatatca tcatgaacaa taaaactgtc 
781 tgcttacata aacagtaata caaggggtgt tatgagccat attcaacggg aaacgtcttg 
841 ctggaggccg cgattaaatt ccaacatgga tgctgattta tatgggtata aatgggctcg 
901 cgataatgtc gggcaatcag gtgcgacaat ctttcgattg tatgggaagc ccgatgcgcc 
961 agagttgttt ctgaaacatg gcaaaggtag cgttgccaat gatgttacag atgagatggt 
1021 cagactaaac tggctgacgg aatttatgcc tcttccgacc atcaagcatt ttatccgtac
1081 tcctgatgat gcatggttac tcaccactgc gatccgcggg aaaacagcat tccaggtatt
1141 agaagaatat cctgattcag gtgaaaatat tgttgatgcg ctggcagtgt tcctgcgccg
1201 gttgcattcg attcctgttt gtaattgtcc ttttaacagc gatcgcgtat ttcgtctcgc
1261 tcaggcgcaa tcacgaatga ataacggttt ggttgatgcg agtgattttg atgacgagcg
1321 taatggctgg cctgttgaac aagtctggaa agaaatgcat acgcttttgc cattctcacc
1381 ggattcagtc gtcactcatg gtgatttctc acttgataac cttatttttg acgaggggaa
1441 attaataggt tgtattgatg ttggacgagt cggaatcgca gaccgatacc aggatcttgc
1501 catcctatgg aactgcctcg gtgagttttc tccttcatta cagaaacggc tttttcaaaa
1561 atatggtatt gataatcctg atatgaataa attgcagttt catttgatgc tcgatgagtt
1621 tttctaatca gaattggtta attggttgta acactggcag agcattacgc tgacttgacg
1681 ggacggcgca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc
1741 gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg
1801 caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact
1861 ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg
1921 tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg
1981 ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac
2041 tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca
2101 cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagcattga
2161 gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc
2221 ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca ggggggaacg cctggtatct ttatagtcct
2281 gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggccg
2341 agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct
2401 tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc
2461 tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc
2521 gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat
2581 taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt
2641 aatgtgagtt acctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcct
2701 atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat
2761 tacgccaagc tcggaattaa ccctcactaa agggaacaaa agctggtacc gatcccgagc
2821 tttgcaaatt aaagccttcg agcgtcccaa aaccttctca agcaaggttt tcagtataat
2881 gttacatgcg tacacgcgtc tgtacagaaa aaaaagaaaa atttgaaata taaataacgt
2941 tcttaatact aacataacta taaaaaaata aatagggacc tagacttcag gttgtctaac
3001 tccttccttt tcggttagag cggatgtggg gggagggcgt gaatgtaagc gtgacataac
3061 taattacatg atatcgacaa aggaaaaggg gcctgtttac tcacaggctt ttttcaagta
3121 ggtaattaag tcgtttctgt ctttttcctt cttcaaccca ccaaaggcca tcttggtact
3181 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt
3241 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttcatagaa ataatacaga agtagatgtt
3301 gaattagatt aaactgaaga tatataattt attggaaaat acatagagct ttttgttgat
3361 gcgcttaagc gatcaattca acaacaccac cagcagctct gattttttct tcagccaact
3421 tggagacgaa tctagctttg acgataactg gaacatttgg aattctaccc ttacccaaga
3481 tcttaccgta accggctgcc aaagtgtcaa taactggagc agtttcctta gaagcagatt
3541 tcaagtattg gtctctcttg tcttctggga tcaatgtcca caatttgtcc aagttcaaga
3601 ctggcttcca gaaatgagct tgttgcttgt ggaagtatct cataccaacc ttaccgaaat
3661 aacctggatg gtatttatcc atgttaattc tgtggtgatg ttgaccaccg gccatacctc
3721 taccaccggg gtgctttctg tgcttaccga tacgaccttt accggctgag acgtgacctc
3781 tgtgctttct agtcttagtg aatctggaag gcattcttga ttagttggat gattgttctg
3841 ggatttaatg caaaaatcac ttaagaagga aaatcaacgg agaaagcaaa cgccatctta
3901 aatatacggg atacagatga aagggtttga acctatctgg aaaatagcat taaacaagcg
3961 aaaaactgcg aggaaaattg tttgcgtctc tgcgggctat tcacgcgcca gaggaaaata
4021 ggaaaaataa cagggcatta gaaaaataat tttgattttg gtaatgtgtg ggtcctggtg
4081 tacagatgtt acattggtta cagtactctt gtttttgctg tgtttttcga tgaatctcca
4141 aaatggttgt tagcacatgg aagagtcacc gatgctaagt tatctctatg taagctacgt
4201 ggcgtgactt ttgatgaagc cgcacaagag atacaggatt ggcaactgca aatagaatct
4261 ggggatcccc cctcgacgga tgcaagggtt cgaatccctt agctctcatt attttttgct
4321 ttttctcttg aggtcacatg atcgcaaaat ggcaaatggc acgtgaagct gtcgatattg
4381 gggaactgtg gtggttggca aatgactaat taagttagtc aaggcgccat cctcatgaaa
4441 actgtgtaac ataataaccg aagtgtcgaa aaggtggcac cttgtccaat tgaacacgct
4501 cgatgaaaaa aataagatat atataaggtt aagtaaagcg tctgttagaa aggaagtttt
4561 tcctttttct tgctctcttg tcttttcatc tactatttcc ttcgtgtaat acagggtcgt
4621 cagatacata gatacaattc tattaccccc atccatactc tagaatgctt ttgcgagctt
4681 tccttttcct cttggctggt tttgcagcca aaatatctgc agcgctagct gatgcagaat
4741 tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt gcagaagatg
4801 tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac tcatggtggg cggtgttgtc atagcgacag
4861 tgatcgtcat caccttggtg atgctgaaga agaaaggtag atctggcaag ctactgtctt
4921 ctatcgaaca agcatgcgat atttgccgac ttaaaaagct caagtgctcc aaagaaaaac
4981 cgaagtgcgc caagtgtctg aagaacaact gggagtgtcg ctactctccc aaaaccaaaa
5041 ggtctccgct gactagggca catctgacag aagtggaatc aaggctagaa agactggaac
5101 agctatttct actgattttt cctcgagaag accttgacat gattttgaaa atggattctt
5161 tacaggatat aaaagcattg ttaacaggat tatttgtaca agataatgtg aataaagatg
5221 ccgtcacaga tagattggct tcagtggaga ctgatatgcc tctaacattg agacagcata
5281 gaataagtgc gacatcatca tcggaagaga gtagtaacaa aggtcaaaga cagttgactg
5341 tatcgccgga attcccgggg atctgggccc ccccgaccga tgtcagcctg ggggacgagc
5401 tccacttaga cggcgaggac gtggcgatgg cgcatgccga cgcgctagac gatttcgatc
5461 tggacatgtt gggggacggg gattccccgg gtccgggatt taccccccac gactccgccc
5521 cctacggcgc tctggatatg gccgacttcg agtttgagca gatgtttacc gatgcccttg
5581 gaattgacga gtacggtggg ggtactagtg gccagtacac atccattcat catggtgtgg
5641 tggaggttga cgccgctgtc accccagagg agcgccacct gtccaagatg cagcagaacg
5701 gctacgaaaa tccaacctac aagttctttg agcagatgca gaacggcgcc tagggatccc
5761 ccgggctgca ggaattcgat atcaagctta tcgataccgt cgaccccggg tgctagcaag
5821 gccttgtggc cagccatggc aactagtgcg gccgctaagt aagtaagacg tcgagctcta
5881 agtaagtaac ggccgccacc gcggtggagc tttggacttc ttcgccagag gtttggtcaa
5941 gtctccaatc aaggttgtcg gcttgtctac cttgccagaa atttacgaaa agatggaaaa
6001 gggtcaaatc gttggtagat acgttgttga cacttctaaa taagcgaatt tcttatgatt
6061 tatgattttt attattaaat aagttataaa aaaaataagt gtatacaaat tttaaagtga
6121 ctcttaggtt ttaaaacgaa aattcttgtt cttgagtaac tctttcctgt aggtcaggtt
6181 gctttctcag gtatagcatg aggtcgctct tattgaccac acctctaccg gcatgccgag
6241 caaatgcctg caaatcgctc cccatttcac ccaattgtag atatgctaac tccagcaatg
6301 agttgatgaa tctcggtgtg tattttatgt cctcagagga caatacctgt tgtaatcgtt
6361 cttccacacg gatcccaatt cgccctatag tgagtcgtat tacaattcac tggccgtcgt
6421 tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca
6481 tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca
6541 gttgcgcagc ctgaatggcg aatggacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt
6601 gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc
6661 gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg
6721 gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat
6781 tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg
6841 ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct
6901 atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa
6961 aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca aaatattaac gtttacaatt
7021 tcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc aggcaagtgc
7081 acaaacaata cttaaataaa tactactcag taataaccta tttcttagca tttttgacga
7141 aatttgctat tttgttagag tcttttacac catttgtctc cacacctccg cttacatcaa
7201 caccaataac gccatttaat ctaagcgcat caccaacatt ttctggcgtc agtccaccag
7261 ctaacataaa atgtaagctt tcggggctct cttgccttcc aacccagtca gaaatcgagt
7321 tccaatccaa aagttcacct gtcccacctg cttctgaatc aaacaaggga ataaacgaat
7381 gaggtttctg tgaagctgca ctgagtagta tgttgcagtc ttttggaaat acgagtcttt
7441 taataactgg caaaccgagg aactcttggt attcttgcca cgactcatct ccatgcagtt
7501 ggacgatatc aatgccgtaa tcattgacca gagccaaaac atcctcctta ggttgattac
7561 gaaacacgcc aaccaagtat ttcggagtgc ctgaactatt tttatatgct tttacaagac
7621 ttgaaatttt ccttgcaata accgggtcaa ttgttctctt tctattgggc acacatataa
7681 tacccagcaa gtcagcatcg gaatctagag cacattctgc ggcctctgtg ctctgcaagc
7741 cgcaaacttt caccaatgga ccagaactac ctgtgaaatt aataacagac atactccaag
7801 ctgcctttgt gtgcttaatc acgtatactc acgtgctcaa tagtcaccaa tgccctccct
7861 cttggccctc tccttttctt ttttcgaccg aattaattct taatcggcaa aaaaagaaaa
7921 gctccggatc aagattgtac gtaaggtgac aagctatttt tcaataaaga atatcttcca
7981 ctactgccat ctggcgtcat aactgcaaag tacacatata ttacgatgct gtctattaaa
8041 tgcttcctat attatatata tagtaatgtc gtttatggtg cactctcagt acaatctgct
8101 ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac
8161 gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca
8221 tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcga
【０１００】
配列番号１７(SP2-C-GAL4/VP16-100)
atgcttttgcgagctttccttttcctcttggctggttttgcagccaaaatatctgcagcgctagctgatgcagaattccgacatgactcaggatatgaagttcatcatcaaaaattggtgttctttgcagaagatgtgggttcaaacaaaggtgcaatcattggactcatggtgggcggtgttgtcatagcgacagtgatcgtcatcaccttggtgatgctgaagaagaaaggtagatctggcaagctactgtcttctatcgaacaagcatgcgatatttgccgacttaaaaagctcaagtgctccaaagaaaaaccgaagtgcgccaagtgtctgaagaacaactgggagtgtcgctactctcccaaaaccaaaaggtctccgctgactagggcacatctgacagaagtggaatcaaggctagaaagactggaacagctatttctactgatttttcctcgagaagaccttgacatgattttgaaaatggattctttacaggatataaaagcattgttaacaggattatttgtacaagataatgtgaataaagatgccgtcacagatagattggcttcagtggagactgatatgcctctaacattgagacagcatagaataagtgcgacatcatcatcggaagagagtagtaacaaaggtcaaagacagttgactgtatcgccggaattcccggggatctgggcccccccgaccgatgtcagcctgggggacgagctccacttagacggcgaggacgtggcgatggcgcatgccgacgcgctagacgatttcgatctggacatgttgggggacggggattccccggggccgggatttaccccccacgactccgccccctacggcgctctggatatggccgacttcgagtttgagcagatgtttaccgatgcccttggaattgacgagtacggtgggggtactagtggccagtacacatccattcatcatggtgtggtggaggttgacgccgctgtcaccccagaggagcgccacctgtccaagatgcagcagaacggctacgaaaatccaacctacaagttctttgagcagatgcagaacggcgcctag
【０１０１】
配列番号１８(SP2-C-GAL4/VP16-100)
mllraflfllagfaakisaaladaefrhdsgyevhhqklvffaedvgsnkgaiiglmvggvviatvivitlvmlkkkgrsgkllssieqacdicrlkklkcskekpkcakclknnwecryspktkrspltrahltevesrlerleqlfllifpredldmilkmdslqdikalltglfvqdnvnkdavtdrlasvetdmpltlrqhrisatssseessnkgqrqltvspefpgiwapptdvslgdelhldgedvamahadalddfdldmlgdgdspgpgftphdsapygaldmadfefeqmftdalgideygggtsgqytsihhgvvevdaavtpeerhlskmqqngyenptykffeqmqnga*
【０１０２】
配列番号１９(SP2-C100-GAL4/VP16) 
atgcttttgcgagctttccttttcctcttggctggttttgcagccaaaatatctgcagcgctagctgatgcagaattccgacatgactcaggatatgaagttcatcatcaaaaattggtgttctttgcagaagatgtgggttcaaacaaaggtgcaatcattggactcatggtgggcggtgttgtcatagcgacagtgatcgtcatcaccttggtgatgctgaagaagaaacagtacacatccattcatcatggtgtggtggaggttgacgccgctgtcaccccagaggagcgccacctgtccaagatgcagcagaacggctacgaaaatccaacctacaagttctttgagcagatgcagaacgcgcggggtaccccggcgatgaagctactgtcttctatcgaacaagcatgcgatatttgccgacttaaaaagctcaagtgctccaaagaaaaaccgaagtgcgccaagtgtctgaagaacaactgggagtgtcgctactctcccaaaaccaaaaggtctccgctgactagggcacatctgacagaagtggaatcaaggctagaaagactggaacagctatttctactgatttttcctcgagaagaccttgacatgattttgaaaatggattctttacaggatataaaagcattgttaacaggattatttgtacaagataatgtgaataaagatgccgtcacagatagattggcttcagtggagactgatatgcctctaacattgagacagcatagaataagtgcgacatcatcatcggaagagagtagtaacaaaggtcaaagacagttgactgtatcgccggaattcccggggatctgggcccccccgaccgatgtcagcctgggggacgagctccacttagacggcgaggacgtggcgatggcgcatgccgacgcgctagacgatttcgatctggacatgttgggggacggggattccccgggtccgggatttaccccccacgactccgccccctacggcgctctggatatggccgacttcgagtttgagcagatgtttaccgatgcccttggaattgacgagtacggtgggtag
【０１０３】
配列番号２０(SP2-C100-GAL4/VP16)
mllraflfllagfaakisaaladaefrhdsgyevhhqklvffaedvgsnkgaiiglmvggvviatvivitlvmlkkkqytsihhgvvevdaavtpeerhlskmqqngyenptykffeqmqnargtpamkllssieqacdicrlkklkcskekpkcakclknnwecryspktkrspltrahltevesrlerleqlfllifpredldmilkmdslqdikalltglfvqdnvnkdavtdrlasvetdmpltlrqhrisatssseessnkgqrqltvspefpgiwapptdvslgdelhldgedvamahadalddfdldmlgdgdspgpgftphdsapygaldmadfefeqmftdalgideygg
【０１０４】
配列番号２１(SP3-C100-GAL4/VP16)
atgagggcctggatcttctttctcctttgcctggccgggagggctctggcagccccgctagctgatgcagaattccgacatgactcaggatatgaagttcatcatcaaaaattggtgttctttgcagaagatgtgggttcaaacaaaggtgcaatcattggactcatggtgggcggtgttgtcatagcgacagtgatcgtcatcaccttggtgatgctgaagaagaaacagtacacatccattcatcatggtgtggtggaggttgacgccgctgtcaccccagaggagcgccacctgtccaagatgcagcagaacggctacgaaaatccaacctacaagttctttgagcagatgcagaacgcgcggggtaccccggcgatgaagctactgtcttctatcgaacaagcatgcgatatttgccgacttaaaaagctcaagtgctccaaagaaaaaccgaagtgcgccaagtgtctgaagaacaactgggagtgtcgctactctcccaaaaccaaaaggtctccgctgactagggcacatctgacagaagtggaatcaaggctagaaagactggaacagctatttctactgatttttcctcgagaagaccttgacatgattttgaaaatggattctttacaggatataaaagcattgttaacaggattatttgtacaagataatgtgaataaagatgccgtcacagatagattggcttcagtggagactgatatgcctctaacattgagacagcatagaataagtgcgacatcatcatcggaagagagtagtaacaaaggtcaaagacagttgactgtatcgccggaattcccggggatctgggcccccccgaccgatgtcagcctgggggacgagctccacttagacggcgaggacgtggcgatggcgcatgccgacgcgctagacgatttcgatctggacatgttgggggacggggattccccgggtccgggatttaccccccacgactccgccccctacggcgctctggatatggccgacttcgagtttgagcagatgtttaccgatgcccttggaattgacgagtacggtggg
【０１０５】
配列番号２２(SP3-C100-GAL4/VP16)
mrawiffllclagralaapladaefrhdsgyevhhqklvffaedvgsnkgaiiglmvggvviatvivitlvmlkkkqytsihhgvvevdaavtpeerhlskmqqngyenptykffeqmqnargtpamkllssieqacdicrlkklkcskekpkcakclknnwecryspktkrspltrahltevesrlerleqlfllifpredldmilkmdslqdikalltglfvqdnvnkdavtdrlasvetdmpltlrqhrisatssseessnkgqrqltvspefpgiwapptdvslgdelhldgedvamahadalddfdldmlgdgdspgpgftphdsapygaldmadfefeqmftdalgideygg
【０１０６】
配列番号２３（プライマーEH47)
GCTCTAGAATGCTTTTGCAAGCTTTCCTTTTCCTTTTGGCTGGTTTTGC AGCC AAAATATCTGCAGCGCTAGCTGATGCAGAATTCCGACATGAC
【０１０７】
配列番号２４（プライマーEH49)
CGGGATCCCTAGGCGCCGTTCTGCATCTGCTCAAAGAAC
【０１０８】
配列番号２５（プライマーEH53)
ACTATATCTAGAATGCTTTTGC
【０１０９】
配列番号２６（プライマーEH54)
TTCGATAGAAGACAGTAGCTTGCCAGATCTACCTTTCTTCTTCAGCATC ACCAA
【０１１０】
配列番号２７（プライマーEH55)
TTGGTGATGCTGAAGAAGAAAGGTAGATCTGGCAAGCTACTGTCTTCT ATCGAA
【０１１１】
配列番号２８（プライマーEH56)
ATGATGAATGGATGTGTACTGGCCACTAGTACCCCCACCGTACTCGTC AATT
【０１１２】
配列番号２９（プライマーEH57)
AATTGACGAGTACGGTGGGGGTACTAGTGGCCAGTACACATCCATTC ATCAT
【０１１３】
配列番号３０（プライマーEH59)
CGATAAGCTTGATATCGAATTC
【０１１４】
配列番号３１（プライマーC55-3')
CCATCGATTTTCTAACCCCCACCGTA
【０１１５】
配列番号３２（プラスミドSP3-C-GAL4/VP16-100)
gacggatcgggagatctcccgatcccctatggtcgactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttaactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagcttctgcctgccgcctgcctgcctgccactgagggttcccagcaccatgagggcctggatcttctttctcctttgcctggccgggagggctctggcagccccgctagctgatgcagaattccgacatgactcaggatatgaagttcatcatcaaaaattggtgttctttgcagaagatgtgggttcaaacaaaggtgcaatcattggactcatggtgggcggtgttgtcatagcgacagtgatcgtcatcaccttggtgatgctgaagaagaaaggtagatctggcaagctactgtcttctatcgaacaagcatgcgatatttgccgacttaaaaagctcaagtgctccaaagaaaaaccgaagtgcgccaagtgtctgaagaacaactgggagtgtcgctactctcccaaaaccaaaaggtctccgctgactagggcacatctgacagaagtggaatcaaggctagaaagactggaacagctatttctactgatttttcctcgagaagaccttgacatgattttgaaaatggattctttacaggatataaaagcattgttaacaggattatttgtacaagataatgtgaataaagatgccgtcacagatagattggcttcagtggagactgatatgcctctaacattgagacagcatagaataagtgcgacatcatcatcggaagagagtagtaacaaaggtcaaagacagttgactgtatcgccggaattcccggggatctgggcccccccgaccgatgtcagcctgggggacgagctccacttagacggcgaggacgtggcgatggcgcatgccgacgcgctagacgatttcgatctggacatgttgggggacggggattccccggggccgggatttaccccccacgactccgccccctacggcgctctggatatggccgacttcgagtttgagcagatgtttaccgatgcccttggaattgacgagtacggtgggggtactagtggccagtacacatccattcatcatggtgtggtggaggttgacgccgctgtcaccccagaggagcgccacctgtccaagatgcagcagaacggctacgaaaatccaacctacaagttctttgagcagatgcagaacggcgcctagggatcccccgggctgcaggaattcgatatcaagcttatcgataccgtcgaggccgctcgagcatgcatctagagggccctattctatagtgtcacctaaatgctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggaaccagctggggctcgaggggggatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcggggcatccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttggggatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttaaatatttgcttatacaatcttcctgtttttggggcttttctgattatcaaccggggtgggtaccgagctcgaattctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccaggcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctcccgggagcttggatatccattttcggatctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccccaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggatcccgtcgacctcgagagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtc
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】アミロイド前駆タンパク質（アイソフォームＡＰＰ６９５、および、アイソフォームＡＰＰ７７０またはＡＰＰ７５１）、および、セクレターゼ切断産物を示す。
【図２】本プロセスが基づく原理を模式的に示す。
【図３】発現プラスミドのＳＰ−Ｃ１００−ＧＡＬ４−ＶＰ１６の構築である。
【図４】発現プラスミドのｐＤＢＴｒｐ−ＭＥＴ２５−ＳＰ−Ｃ１００−ＧＡＬ４−ＶＰ１６である。
【図１】
2008502302.tif 000002
【図２】
2008502302.tif 000003
【図３】
2008502302.tif 000004
【図４】
2008502302.tif 000005
【配列表】
2008502302000001.xml
【国際調査報告】
2008502302.tif 000037
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2008502302.tif 000039
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