(57)【要約】本発明は、アポトーシス細胞に対する免疫反応を増強する方法を提供し、該方法は、微生物抗原に特異的に結合する特異的結合要素を投与することを含む。また、このような抗体を含む医薬組成物、及びアポトーシス細胞に対する免疫反応を増強する能力のある特異的結合要素を同定するためのアッセイ法を提供する。また、アポトーシス細胞の細胞内抗原に結合する抗体を使用する癌の治療方法を説明する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポトーシス細胞に対する免疫反応を増強する方法であって、前記方法は、微生物抗原に特異的に結合する特異的結合要素を投与することを含む方法。
【請求項２】
微生物抗原に特異的に結合する特異的結合要素又は前記特異的結合要素をコードする核酸、の治療上有効な量を、それを必要とする対象に投与することを含む、癌の治療方法。
【請求項３】
アポトーシス細胞に対する免疫反応を増強する能力のある抗体を同定するためのアッセイ方法であって、
前記アッセイ方法は、
（ａ）微生物抗原に対する結合特異性を有する特異的結合要素をアポトーシス細胞と接触させるステップと、
（ｂ）特異的結合要素のアポトーシス細胞との交差反応性の有無を判定するステップと、を含み、
特異的結合要素のアポトーシス細胞との交差反応性の存在は、前記アポトーシス細胞に対する免疫反応を増強する能力を示す、アッセイ方法。
【請求項４】
前記方法は、
（ｉ）アポトーシス細胞、及び、アポトーシス細胞と交差反応性を示すことがステップ（ｂ）で判定された特異的結合要素、並びに、
（ｉｉ）自然免疫細胞、並びに、自然免疫細胞における、免疫賦活反応の誘導、例えば炎症反応の誘導、及び／又は、免疫抑制反応の抑制、例えば抗炎症反応の抑制、
を共に備えるステップ（ｃ）を含む、請求項３に記載のアッセイ方法。
【請求項５】
前記自然免疫細胞は、マクロファージである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
アポトーシス細胞に対する免疫反応を増強する能力のある特異的結合要素を同定するためのアッセイ方法であって、
前記アッセイ方法は、
（ａ）微生物抗原に対する結合特異性を有する特異的結合要素を提供するステップと、
（ｂ）前記特異的結合要素、アポトーシス細胞及びマクロファージを接触させるステップと、
（ｃ）マクロファージにおける、免疫賦活反応の誘導、例えば炎症反応の誘導、及び／又は、免疫抑制反応の抑制、例えば抗炎症反応の抑制、を判定するステップと、を含み、
免疫賦活反応の存在及び／又は免疫抑制反応の抑制は、前記アポトーシス細胞に対する免疫反応を増強する能力を示している、アッセイ方法。
【請求項７】
抗体が結合するアポトーシス細胞のエピトープを同定するステップ（ｄ）をさらに含む、請求項４、請求項５又は請求項６に記載のアッセイ方法。
【請求項８】
前記特異的結合要素は、アポトーシス細胞のエピトープと交差反応性を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記特異的結合要素は、ＣＤ１４と結合するリガンドに対して結合特異性を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＣＤ１４と結合するリガンドは、ＬＰＳ、リポテイコ酸、ペプチドグリカン、又はリポアラビノマンナンリガンドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記特異的結合要素は、ｍＡｂ  ｗｎｌ  ２２２−５（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．、ケンブリッジ、英国）、ｍＡｂ  １５１７４（ＱＥＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア州９２１２７）、ｍＡｂ  １５３０６（ＱＥＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア州９２１２７）、ｍＡｂ  １５３０８（ＱＥＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア州９２１２７）、ｍＡｂ  ９８３（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．、チャンドラースフォード、ハンプシャー州、英国）、ｍＡｂ  ９９５（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．、チャンドラースフォード、ハンプシャー州、英国）、ｍＡｂ  ７５６（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．、チャンドラースフォード、ハンプシャー州、英国）、又はｍＡｂ  ７４６  ＭＡＢ  ８５９８（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．、チャンドラースフォード、ハンプシャー州、英国）である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
癌治療用医薬の調製における、
（ｉ）微生物抗原に特異的に結合する特異的結合要素、又は
（ｉｉ）前記特異的結合要素をコードする核酸、
の使用。
【請求項１３】
癌治療に使用するための、微生物抗原に特異的に結合する特異的結合要素、又は（ｉｉ）前記特異的結合要素をコードする核酸。
【請求項１４】
癌治療用医薬組成物であって、
前記組成物は、
微生物抗原に特異的に結合する特異的結合要素、又は前記特異的結合要素をコードする核酸、を含む、組成物。
【請求項１５】
前記特異的結合要素は、アポトーシス細胞のエピトープと交差反応性を有する、
請求項１１に記載の使用、請求項１２に記載の特異的結合要素、又は請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記特異的結合要素は、ＣＤ１４と結合するリガンドに対する結合特異性を有する、
請求項１５に記載の使用、特異的結合要素、又は組成物。
【請求項１７】
前記ＣＤ１４と結合するリガンドは、ＬＰＳ、リポテイコ酸、ペプチドグリカン、又はリポアラビノマンナンリガンドである、請求項１６に記載の使用、特異的結合要素、又は組成物。
【請求項１８】
前記特異的結合要素は、ｍＡｂ  ｗｎｌ  ２２２−５（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．、ケンブリッジ、英国）、ｍＡｂ  １５１７４（ＱＥＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア州９２１２７）、ｍＡｂ  １５３０６（ＱＥＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア州９２１２７）、ｍＡｂ  １５３０８（ＱＥＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア州９２１２７）、ｍＡｂ  ９８３（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．、チャンドラースフォード、ハンプシャー州、英国）、ｍＡｂ  ９９５（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．、チャンドラースフォード、ハンプシャー州、英国）、ｍＡｂ  ７５６（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．、チャンドラースフォード、ハンプシャー州、英国）、又はｍＡｂ  ７４６  ＭＡＢ  ８５９８（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．、チャンドラースフォード、ハンプシャー州、英国）である、請求項１２若しくは請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の使用、請求項１３若しくは請求項１５〜１７のいずれか一項の特異的結合要素、又は請求項１４若しくは請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
アポトーシス細胞に対する免疫反応を増強する方法であって、
前記方法は、細胞内抗原に特異的に結合する特異的結合要素を投与することを含む、方法。
【請求項２０】
癌の治療方法であって、
前記方法は、
アポトーシス細胞の細胞内抗原に特異的に結合する特異的結合要素の治療上有効な量を、それを必要とする対象に対して投与することを含む、治療方法。
【請求項２１】
癌治療用医薬の調製における、
（ｉ）アポトーシス細胞の細胞内抗体に特異的に結合する特異的結合要素、又は、
（ｉｉ）前記特異的結合要素をコードする核酸、
の使用。
【請求項２２】
癌治療に使用するための、アポトーシス細胞の細胞内抗原に特異的に結合する特異的結合要素。
【請求項２３】
癌治療用医薬組成物であって、
前記組成物は、
アポトーシス細胞の細胞内抗体に特異的に結合する特異的結合要素を含む、組成物。
【請求項２４】
前記特異的結合要素は、アクチン又はホスファチジルセリンに対する結合特異性を有する、請求項１９若しくは２０のいずれか一項に記載の方法、請求項２１に記載の使用、請求項２２に記載の特異的結合要素、又は請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
生物試料におけるアポトーシス細胞の存在を診断する方法であって、
前記方法は、
（ａ）微生物抗原に特異的に結合する特異的結合要素と生物試料を接触させるステップと、
（ｂ）生物試料中の細胞に対する特異的結合要素の結合の存在を判定するステップと、を含み、
生物試料中の細胞に対する特異的結合要素の結合の存在は、被結合細胞がアポトーシスを受けていることを示す、方法。
【請求項２６】
患者における癌の進行をモニターする方法であって、
（ａ）最初の時点における患者からの生物試料を、微生物抗原に特異的に結合する特異的結合要素と接触させるステップと、
（ｂ）結合薬剤に結合した特異的結合要素の量を試料中で検出するステップと、
（ｃ）その後の時点における患者から得られた生物試料を使用して、ステップ（ａ）及び（ｂ）を繰り返すステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で検出された結合要素の量を、ステップ（ｂ）で検出された量と比較し、そのことから患者における癌の進行をモニターするステップと、
を含む方法。
【請求項２７】
組織中でのアポトーシス細胞の存在をｉｎ  ｖｉｖｏで検出する方法であって、
前記方法は、
（ａ）微生物抗原に特異的に結合する特異的結合要素と、前記組織とをｉｎ  ｖｉｖｏで接触させるステップと、
（ｂ）組織中の細胞に対する特異的結合要素の結合の存在を判定するステップと、
を含み、
組織中の細胞に対する特異的結合要素の結合の存在は、被結合細胞がアポトーシス性であることを示している、方法。
【請求項２８】
患者における癌の進行をモニターする方法であって、
（ａ）最初の時点で、組織を、微生物抗原に特異的に結合する特異的結合要素とｉｎ  ｖｉｖｏで接触させるステップと、
（ｂ）組織に結合した特異的結合要素の量を検出するステップと、
（ｃ）その後の時点で、ステップ（ａ）及び（ｂ）を繰り返すステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で検出された結合要素の量を、ステップ（ｂ）で検出された量と比較し、そのことから患者における癌の進行をモニターするステップと、
を含む方法。
【請求項２９】
前記特異的結合要素は、ｍＡｂ  ｗｎｌ  ２２２−５（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．、ケンブリッジ、英国）、ｍＡｂ  １５１７４（ＱＥＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア州９２１２７）、ｍＡｂ  １５３０６（ＱＥＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア州９２１２７）、ｍＡｂ  １５３０８（ＱＥＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア州９２１２７）、ｍＡｂ  ９８３（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．、チャンドラースフォード、ハンプシャー州、英国）、ｍＡｂ  ９９５（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．、チャンドラースフォード、ハンプシャー州、英国）、ｍＡｂ  ７５６（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．、チャンドラースフォード、ハンプシャー州、英国）、又はｍＡｂ  ７４６  ＭＡＢ  ８５９８（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．、チャンドラースフォード、ハンプシャー州、英国）である、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
癌を診断するための診断用製剤の調製における、
（ｉ）アポトーシス細胞の細胞内抗体に特異的に結合する特異的結合要素、又は、
（ｉｉ）前記特異的結合要素をコードする核酸、
の使用。
【請求項３１】
癌を診断するための診断用キットであって、
前記キットは、
（ｉ）アポトーシス細胞の細胞内抗体に特異的に結合する特異的結合要素、又は、
（ｉｉ）前記特異的結合要素をコードする核酸、
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特異的結合要素、及び治療におけるその使用に関する。詳細には、本発明は微生物リガンドに結合する特異的結合要素、及びこのような特異的結合要素の疾患、例えば、腫瘍性疾患の治療における使用に関する。
【発明の背景】
【０００２】
マクロファージの重要な機能は、通常は抗炎症及び免疫抑制の双方である機構によってアポトーシスを受けている細胞の貪食である［Ｈｅｎｓｏｎ、２００１年；Ｓａｖｉｌ、２００２年］。そのほとんどがバーキットリンパ腫（ＢＬ）であり、様々な程度がその他のＮＨＬ類（例えば、免疫芽細胞性リンパ腫、末梢−Ｔ及び末梢−Ｂリンパ芽球性リンパ腫及び胸腺腫［Ｂｅｒａｒｄ、１９６９年；Ｈａｒｒｉｓ、１９９５年；ｖａｎ  Ｍｅｙｅｌ、１９９８年；Ｈｏｒｉ、２００１年；Ｚｅｎｇｅｒ、２００２年］）に入る、特定の範疇の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）では、腫瘍細胞のアポトーシスは、比較的高率で発現し、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）（又は、この文脈では「ｓｔａｒｒｙ  ｓｋｙ」マクロファージと記載される場合が多い）は、死滅腫瘍細胞を効率的に貪食するように思われる［Ｂｅｒａｒｄ、１９６９年；Ｈａｒｒｉｓ、１９９５年；Ｈｏｒｉ，２００１年］。このような場合、アポトーシス細胞は、抗腫瘍免疫反応を強力に弱める可能性があると考えられる。公表された証拠は、この概念（アポトーシスリンパ腫細胞は免疫原性に乏しく、アポトーシスリンパ腫細胞でパルス化されたマクロファージはｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍性Ｔ−細胞の免疫性を活性化できない）を支持している［Ｒｏｎｃｈｅｔｔｉ、１９９９年］。
【発明の概要】
【０００３】
本発明者らは、驚くべきことに、微生物リガンドに対する抗体は、アポトーシス細胞に結合することができ、アポトーシス細胞に対するマクロファージの応答を、抗炎症／免疫抑制反応から炎症促進／免疫賦活反応に切り替えることができることを明らかにした。さらに、本発明者らは、このような抗体がｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍の増殖をかなり減速又は停止させることができることを明らかにした。
【０００４】
したがって、本発明の第１の態様により、アポトーシス細胞に対する免疫反応を増強する方法が提供され、該方法は、微生物抗原に特異的に結合する特定の結合要素を投与することを含む。
【０００５】
抗微生物抗体がアポトーシス細胞に対する免疫反応を増強できることが証明されたため、癌の治療におけるこのような抗体の使用が始めて促進される。
【０００６】
したがって、本発明の第２の態様では、微生物抗原に特異的に結合する特異的結合要素又は該特異的結合要素をコードする核酸、の治療上有効な量を、それを必要とする対象に対して投与することを含む、癌の治療法が提供される。
【０００７】
本出願の文脈で、対象は、任意の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトでよい。
【０００８】
第３の態様では、癌治療用医薬の調製における、微生物抗原に特異的に結合する（ｉ）特異的結合要素又は（ｉｉ）該特異的結合要素をコードする核酸の使用が提供される。
【０００９】
第４の態様では、癌治療で使用するための、微生物抗原に特異的に結合する（ｉ）特異的結合要素又は（ｉｉ）該特異的結合要素をコードする核酸が提供される。
【００１０】
本発明は、また、第５の態様で、癌を治療するための医薬組成物が提供され、該組成物は、微生物抗原に特異的に結合する特異的結合要素又は該特異的結合要素をコードする核酸を含む。
【００１１】
また、微生物リガンドに対する抗体がアポトーシス細胞に結合できることの証明は、アポトーシス細胞の同定におけるこのような抗体の使用を始めて可能にする。したがって、アポトーシス細胞の同定におけるこのような抗体の診断薬剤としての使用は、本発明に包含される。
【００１２】
したがって、本発明の第６の態様で、生物試料中でのアポトーシス細胞の存在を診断する方法が提供され、該方法は、
（ａ）微生物抗原に特異的に結合する特異的結合要素と生物試料を接触させるステップと、
（ｂ）生物試料中の細胞に対する特異的結合要素の結合の存在を判定するステップと、
を含み、生物試料中の細胞に対する特異的結合要素の結合が存在することは、被結合細胞がアポトーシス性あることを示している。
【００１３】
このようなアッセイは、例えば、治療に対する組織の応答をモニターするのに利用できる。いくつかの癌は、高レベルのアポトーシス細胞と関連している。したがって、本発明の第７の態様では、患者の癌の進行をモニターする方法が提供され、該方法は、
（ａ）最初の時点で、患者からの生物試料を微生物抗原に特異的に結合する特異的結合要素と接触させるステップと、
（ｂ）結合薬剤に結合している特異的結合要素の量を試料中で検出するステップと、
（ｃ）次の時点で、患者から得られた生物試料を使用してステップ（ａ）及び（ｂ）を繰り返すステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で検出された結合要素の量をステップ（ｂ）で検出された量と比較し、かつ、それに基づいて患者の癌の進行をモニターするステップとを含む。
【００１４】
本発明の第６及び第７の態様では、任意の適切な生物試料を使用できる。このような試料は、任意の組織に由来するものでよく、例えば、生検試料でよい。
【００１５】
ある種の診断アッセイは、腫瘍上で直接的にｉｎ  ｖｉｖｏで実施できる。したがって、本発明の第８の態様では、組織中でのアポトーシス細胞の存在をｉｎ  ｖｉｖｏで検出する方法が提供され、該方法は、
（ａ）微生物抗原に特異的に結合する特異的結合要素と該組織をｉｎ  ｖｉｖｏで接触させるステップと、
（ｂ）特異的結合要素の該組織細胞への結合の存在を判定するステップと、
を含み、該組織の細胞に対する特異的結合要素の結合の存在は、被結合細胞がアポトーシス性であることを示している。
【００１６】
アッセイを使用して癌細胞の存在を判定できる。腫瘍細胞におけるアポトーシス細胞の量の変化は、腫瘍の増殖を示している場合がある。いくつかのその他の癌において、変化は癌の縮退を示している場合がある。
【００１７】
また、本発明は、治療に対する応答をｉｎ  ｖｉｖｏでモニターするのに使用できる。したがって、本発明は、さらに第９の態様で、患者における癌の進行をモニターする方法を提供し、該方法は、
（ａ）最初の時点で、組織を、微生物抗原に特異的に結合する特異的結合要素とｉｎ  ｖｉｖｏで接触させるステップと、
（ｂ）組織に結合した特異的結合要素の量を検出するステップと、
（ｃ）後の時点で、ステップ（ａ）及び（ｂ）を繰り返すステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で検出された結合要素の量をステップ（ｂ）で検出された量と比較し、それに基づいて患者における癌の進行をモニターするステップとを含む。
【００１８】
特異的結合要素の結合は、当技術分野で周知の任意方法を利用して直接的又は間接的に検出できる。例えば、抗体は、レポーター基を介して検出できる。この方法は、抗体を、ラジオアイソトープ、常磁性標識、エコー発生リポソーム、又は、画像化法による検出が可能でかつ宿主中に静脈注射で注入できるその他の適切な薬剤に連結することを含むことができる。適切な時間後に、診断目的に対して全身を、又は頸動脈などの特定部位を局所的に画像化し、治療方法に対する宿主の応答を定量的方式で評価できる。
【００１９】
このような結合薬剤は、組織学的応用でも使用できる。別法として、このような応用では、ポリヌクレオチドプローブを使用できる。
【００２０】
本発明の方法で使用できる適切な特異的結合要素には、微生物リガンドに対する結合特異性を有し、アポトーシス細胞のエピトープと交差反応性を有する任意の特異的結合要素が含まれる。
【００２１】
本発明の一実施形態において、特異的結合要素は、ｍＡｂ  ｗｎｌ  ２２２−５（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．、ケンブリッジ、英国）、ｍＡｂ  １５１７４（ＱＥＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア州９２１２７）、ｍＡｂ  １５３０６（ＱＥＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア州９２１２７）、ｍＡｂ  １５３０８（ＱＥＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア州９２１２７）、ｍＡｂ  ９８３（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．、チャンドラースフォード、ハンプシャー州、英国）、ｍＡｂ  ９９５（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．、チャンドラースフォード、ハンプシャー州、英国）、ｍＡｂ  ７５６（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．、チャンドラースフォード、ハンプシャー州、英国）、又はｍＡｂ  ７４６  ＭＡＢ  ８５９８（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．、チャンドラースフォード、ハンプシャー州、英国）から選択される。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態において、特異的結合要素は、ＣＤ１４と結合するリガンドに対する結合特異性を有する。ＣＤ１４の適切なリガンドとしては、ＬＰＳ、リポテイコ酸、ペプチドグリカン及びリポアラビノマンナンを挙げることができる。特に好ましい実施形態において、ＣＤ１４と結合するリガンドは、細菌のリポ多糖エンドトキシン、ＬＳＰである。
【００２３】
例えば、本発明で使用するための好ましい特異的結合要素は、ＬＰＳに対する結合特異性を有するｍＡｂ  ｗｎ１  ２２２−５（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．、ケンブリッジ、英国）である。
【００２４】
本発明で使用するための他の好ましい特異的結合要素は、ＬＰＳに対する結合特異性を有するｍＡｂ  １５１７４（ＱＥＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア州９２１２７）である。
【００２５】
本発明で使用するための他の好ましい特異的結合要素は、ＬＰＳに対する結合特異性を有するｍＡｂ  １５３０６（ＱＥＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア州９２１２７）である。
【００２６】
本発明で使用するための特に好ましい特異的結合要素は、ＬＰＳに対して結合特異性を有するｍＡｂ  １５３０８（ＱＥＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア州９２１２７）である。後記の実施例に記載するように、本発明者らは、この抗体がアポトーシス細胞のラミニン結合タンパク質（ＬＢＰ）と交差反応性を有していてもよい証拠を有する。さらに、該抗体がマクロファージの炎症反応を誘導することが明らかにされた。したがって、本発明のさらなる好ましい実施形態において、特異的結合要素は、ラミニン結合タンパク質（ＬＢＰ）に対する結合特異性を有する。このような抗体がアポトーシス細胞に結合し、免疫賦活反応を誘導することが立証されたことは、ＬＢＰが細胞内分子であると考えられるという点でさらなる驚きがある。当技術分野の一般的コンセンサスは、アポトーシス細胞はその細胞が漏出性になる前にマクロファージによって除去されると述べているので、細胞内抗原を標的としている抗体が、マクロファージを抗炎症から炎症促進モードに切り替えることができることは驚きである。なんらかの１つの理論に拘束されるものではないが、ＬＢＰを、アポトーシス細胞中で外在化できると考えられる。さらに又は代わりに、細胞は、除去される前に漏出性になること、及び抗体がＬＢＰ標的を細胞内で結合することが可能である。
【００２７】
アポトーシス細胞中のこのような細胞内抗原を抗体で結合できるという発見は、その他の細胞内抗原を使用して、アポトーシス細胞を標的にすることができることを示唆している。
【００２８】
したがって、本発明の第１０の態様では、アポトーシス細胞に対する免疫反応を増強する方法が提供され、該方法は、細胞内抗原に特異的に結合する特異的結合要素を投与することを含む。
【００２９】
前述の抗微生物抗体に関して、細胞内抗原に対する結合特異性を有する抗体は、癌の治療方法で使用できる。
【００３０】
したがって、本発明の第１１の態様では、癌の治療方法が提供され、該方法は、アポトーシス細胞の細胞内抗原に特異的に結合する特異的結合要素の治療上有効な量を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【００３１】
第１２の態様では、癌治療用医薬の調製における、（ｉ）アポトーシス細胞の細胞内抗体に特異的に結合する特異的結合要素、又は（ｉｉ）該特異的結合要素をコードする核酸の使用が提供される。
【００３２】
第１３の態様では、癌治療に使用するための、アポトーシス細胞の細胞内抗原に特異的に結合する特異的結合要素が提供される。
【００３３】
また、本発明は、本発明の第１４の態様として、癌治療用医薬組成物が提供され、該組成物は、アポトーシス細胞の細胞内抗原に特異的に結合する特異的結合要素を含む。
【００３４】
本発明の第１０、１１、１２、１３及び１４の態様で使用するのに適切な特異的結合要素は、必ずしも微生物抗原と交差反応性である必要はない。本発明のこれらの態様で使用するのに適切な特異的結合要素としては、アクチン、ホスファチジルセリン、その他の細胞骨格成分又はアネキシンＩなど、細胞内抗体に対する結合特異性を有する特異的結合要素が含まれる。
【００３５】
さらに、本発明は、アポトーシス細胞に対する免疫反応を増強するのに使用することができ、癌治療に場合によっては使用できるさらなる薬剤例えば抗体を確認するためのアッセイ法を提供する。
【００３６】
したがって、本発明の第１５の態様では、アポトーシス細胞に対する免疫反応を増強する能力のある抗体を同定するためのアッセイ方法が提供され、該アッセイ方法は、
ａ）微生物抗原に対する結合特異性を有する特異的結合要素をアポトーシス細胞と接触させるステップと、
ｂ）特異的結合要素とアポトーシス細胞との交差反応性の有無を判定するステップと、
を含み、特異的結合要素のアポトーシス細胞との交差反応性の存在は、該アポトーシス細胞に対する免疫反応を増強する能力を示している。
【００３７】
本発明の第１６の態様の好ましい実施形態で、本発明のアッセイ方法は、アポトーシス細胞、及びアポトーシス細胞と交差反応性を示すことがステップ（ｂ）で判定された特異的結合要素、並びに、（ｉｉ）自然免疫細胞、並びに、自然免疫細胞における、免疫賦活反応の誘導、例えば炎症反応の誘導、及び／又は免疫抑制反応の抑制、例えば抗炎症反応の抑制、を判定すること、を共に備えるさらなるステップ（ｃ）を含むことができる。
【００３８】
任意の適切な自然免疫細胞を使用できる。例えば、自然免疫細胞は、マクロファージ、好中球又は樹状細胞でよい。一実施形態において、自然免疫細胞はマクロファージである。
【００３９】
本発明の第１７の態様では、アポトーシス細胞に対する免疫反応を増強する能力のある特異的結合要素を同定するためのアッセイ方法が提供され、該アッセイ方法は、
（ａ）微生物抗原に対する結合特異性を有する特異的結合要素を提供するステップと、
（ｂ）微生物抗原に対する結合特異性を有する該特異的結合要素をアポトーシス細胞及びマクロファージと接触させるステップと、
（ｃ）マクロファージにおける、免疫賦活反応の誘導、例えば炎症反応の誘導、及び／又は、免疫抑制反応の抑制、例えば抗炎症反応の抑制、を判定するステップと、
を含み、免疫賦活反応の存在及び／又は免疫抑制反応の抑制は、該アポトーシス細胞に対する免疫反応を増強する能力を示している。
【００４０】
本発明の第１６及び１７の態様のアッセイ法は、抗体が結合する、アポトーシス細胞のエピトープを同定するステップ（ｄ）をさらに含むことができる。
【詳細な説明】
【００４１】
特異的結合要素
本明細書中で使用する場合、「結合要素」は、互いに対して結合特異性を有する一対の構造に属する要素である。結合要素は、天然由来でもよいし、あるいは全合成又は部分合成で製造してもよい。本発明の、及び本発明で使用するための結合要素は、微生物抗原及び／又は細胞内抗原に結合できる任意の部分でよいが、とりわけ、本発明は、抗原−抗体型反応に関する。したがって、本発明で使用するための特異的結合要素としては、例えば、微生物抗原例えばＬＰＳ抗原と相互作用することができ、かつアポトーシス細胞の抗原、例えばＣＤ１４のリガンドと交差反応が可能なバクテリオファージ受容体を挙げることができる。
【００４２】
抗体
本発明の文脈で、「抗体」は、免疫グロブリン又はその部分、あるいは抗体結合ドメインであるか、あるいはそれと同一である結合ドメインを含む任意のポリペプチドを指すものと理解されたい。抗体としては、限定はしないが、ポリクロナール、モノクロナール、単一特異的、多重特異的抗体及びそのフラグメント、並びに他のポリペプチドに融合した免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ抗体が挙げられる。
【００４３】
完全な抗体は、重鎖及び軽鎖からなる免疫グロブリン分子から構成され、各鎖は、それぞれＶＨ及びＶＬと呼ばれる可変領域をもつ。可変領域は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ、超可変領域としても知られている）及び４つのフレームワーク領域（ＦＲ）又は骨格からなる。ＣＤＲは、完全な抗原分子と相補的立体構造を形成し、抗体の特異性を決定する。
【００４４】
抗体のフラグメントは、完全な抗体の結合能力を保持し、完全な抗体の代わりに使用できる。したがって、本発明の目的に関し、文脈が別のことを要求しない限り、用語「抗体」は、抗体フラグメントを包含すると解されるべきである。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ｛ａｂ’｝２、Ｆｄ、ｄＡｂ、及びＦｖフラグメント、ｓｃＦｖ、二重特異性ｓｃＦｖ、二重特異性抗体断片（ｄｉａｂｏｄｙ）、リニア−抗体（米国特許第５，６４１，８７０号パンフレット；Ｚａｐａｔａらの論文、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ８（１０）巻、１０５７〜１０６２頁、１９９５年）、１本鎖抗体分子、及び抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が含まれる。
【００４５】
Ｆａｂフラグメントは、全Ｌ鎖（ＶＬ及びＣＬ）並びにＶＨ及びＣＨ１からなる。Ｆａｂ’フラグメントは、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、抗体ヒンジ部からの１つ又は複数のシステインを含むさらなる少数の残基を有することによってＦａｂフラグメントと相違する。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ジスルフィドで連結された２つのＦａｂフラグメントからなる。
【００４６】
Ｆｄフラグメントは、ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる。
【００４７】
Ｆｖフラグメントは、単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインを含む。
【００４８】
１本鎖Ｆｖフラグメントは、ｓｃＦｖが抗体結合部位を生成することを可能にするリンカーによって連結されたＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体フラグメントである（「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、２６９〜３１５頁（１９９４年）中のＰｌｕｃｋｔｈｕｍの論文を参照のこと）。
【００４９】
二重特異性抗体断片（ｄｉａｂｏｄｙ）は、Ｖドメインの鎖内ではなく鎖間の対が完成し、結果として多価フラグメント、すなわち２つの抗体結合部位を有するフラグメントが生じるように、ＶＨとＶＬドメインの間の短いリンカー（約５〜１０残基）を用いてｓｃＦｖフラグメントを構築することによって調製される小型の抗体フラグメントである（例えば、欧州特許第４０４０９７号パンフレット、国際公開第９３／１１１６１号パンフレット、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒらの論文、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻、６４４４〜６４４８頁（１９９３年）を参照されたい）。
【００５０】
さらに、個々のＣＤＲもフラグメントに包含される。
【００５１】
前述のように、本発明は、本明細書に記載した通りの抗体、ＶＨ、ＶＬ及びそれらのＣＤＲのような特定配列の使用に限定されるものではなく、（ｉ）微生物抗原に対する特異性を維持しかつアポトーシス細胞のエピトープとの交差反応性を示し、かつ／又は（ｉｉ）アポトーシス細胞の細胞内抗原に対する結合特異性を維持するそれらの変形体に及ぶ。したがって、１つ又は複数のアミノ酸残基が修飾されているＣＤＲのアミノ酸配列も、ＣＤＲ配列として使用できる。ＣＤＲ変形体のアミノ酸配列中の修飾されたアミノ酸残基は、全ＣＤＲ中の好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下、最も好ましくは１０％以下である。このような変形体は、本出願の教示及び当技術分野で周知の技術を使用して提供できる。該ＣＤＲは、抗体の重鎖又は軽鎖配列又はその部分を含むフレームムワーク構造の中に持ち込むことができる。好ましくは、このようなＣＤＲは、自然に発現するＶＨ及びＶＬドメイン中のＣＤＲの位置に相当する場所に配置される。このようなＣＤＲの位置は、Ｋａｂａｔらによる「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、米国厚生省、公衆衛生局、国立衛生研究所、ＮＩＨ刊行番号９１−３２４２、１９９１年、及びオンラインｈｔｔｐ：／／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ．に記載されているように決定される。
【００５２】
さらに、修飾は、代わりに又は追加して、可変領域のフレームワーク領域に対してなされる。フレームワーク領域におけるこのような変更は、安定性を向上させ、抗体の免疫原性を低下させることができる。
【００５３】
したがって、本発明で使用できるこのような変形体には、抗体のフラグメント、あるいは、少なくとも５〜７個の隣接アミノ酸、多くは少なくとも約７〜９個の隣接アミノ酸、典型的には少なくとも約９〜１３個の隣接アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２０〜３０個以上の隣接アミノ酸、最も好ましくは少なくとも約３０〜４０個以上の連続アミノ酸からなるアミノ酸残基の区間を含むポリペプチドのフラグメントが含まれる。
【００５４】
変形体又は本発明での使用には、タンパク質のアミノ酸配列を変更することによって、例えば、タンパク質をコードする核酸を操作することによって、又はタンパク質自体を改変することによって修飾された抗体又はポリペプチドを含めることができる。天然のアミノ酸配列のこのような誘導体は、好ましくは、アポトーシス細胞のオプソニン化活性を有するペプチドを提供すると同時に、１つ又は複数のアミノ酸の挿入、追加、削除及び／又は置換を必要とする場合がある。好ましくは、このような誘導体は、２５個以下のアミノ酸、より好ましくは１５個以下、さらにより好ましくは１０個以下、より好ましくは４個以下、最も好ましくは１又は２個のアミノ酸だけの挿入、追加、削除及び／又は置換を必要とする。
【００５５】
使用できるモノクロナール抗体には、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来する又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体に対応する配列と同一又は相同であり、一方、鎖の残余が、他の種に由来する又は他の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体、並びに、それらが所望の生物学的活性を示す限り、このような抗体のフラグメントが含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号パンフレット、及びＭｏｒｒｉｓｏｎらの論文、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻、６８５１〜６８５５頁（１９８４年）を参照されたい）。ここで重要なキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）由来の可変ドメイン抗原結合配列、及びヒトの定常領域配列を含む「霊長類化」抗体が含まれる。
【００５６】
用語「抗体」には、「ヒト化」された抗体が含まれる。ヒト化抗体を作製する方法は当技術分野で周知である。方法は、例えば、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号パンフレットに記載されている。ヒト化抗体は、モノクロナール抗体の超可変領域及びヒト抗体の定常領域を有する改変抗体でよい。したがって、結合要素は、ヒトの定常領域を含むことができる。
【００５７】
超可変領域以外の可変領域は、ヒト抗体の可変領域に由来してもよいし、かつ／又はｍＡｂ  １５３０８などのモノクロナール抗体に由来してもよい。このような場合、全可変領域が、モノクロナール抗体ｍＡｂ  １５３０８由来でよく、該抗体は、キメラ化されているといわれる。キメラ化抗体の作製方法は当技術分野で周知である。このような方法には、例えば、Ｂｏｓｓ（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）による及びＣａｂｉｌｌｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）による米国特許に記載されている方法が含まれる。それぞれ、米国特許第４，８１６，３９７号及び第４，８１６，５６７号パンフレットを参照されたい）。
【００５８】
本発明の好ましい実施形態において、結合要素は、ラミニン結合タンパク質に結合する。
【００５９】
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列のパーセント同一性は、最適比較の目的のために配列を一直線に並べること（例えば、配列との最良整合のため最初の配列にギャップを導入できる）及び対応する位置でアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較することによって判定できる。「最良整合」は、最も高いパーセント同一性をもたらす２つの配列の整合である。パーセント同一性は、比較される配列中の同一アミノ酸残基又はヌクレオチドの数で判定される（すなわち、％同一性＝同一位置／位置総数×１００）。
【００６０】
２つの配列間のパーセント同一性判定は、当業者に周知の数理アルゴリズムを利用して達成することができる。２つの配列を比較するための数理アルゴリズムの例が、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌの論文（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻、５８７３〜５８７７頁のように修正されたＫａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌの論文（１９９０年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７巻、２２６４〜２２６８頁のアルゴリズムである。Ａｌｔｓｃｈｕｌらの論文（１９９０年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５巻、４０３〜４１０頁のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムは、このようなアルゴリズムを組み込んでいる。ＢＬＡＳＴのヌクレオシド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、ワード長＝１２）を用いて実施し、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴのタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、ワード長＝３）を用いて実施し、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のギャップ化整合を得るために、ギャップ化ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌらの論文（１９９７年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５巻、３３８９〜３４０２頁に記載されているように利用できる。別法として、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用して分子間の距離関係を検出する反復検索を実行できる（同上）。ＢＬＡＳＴ、ギャップ化ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォールトパラメーター（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）を使用できる。ｈｔｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい）。
【００６１】
配列を比較するのに利用される数理アルゴリズムの他の例が、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム、ＣＡＢＩＯＳ（１９８９年）である。ＧＣＧ配列整合ソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）は、このようなアルゴリズムを組み込んでいる。当技術分野で周知のその他の配列解析用アルゴリズムには、Ｔｏｒｅｌｌｉｓ及びＲｏｂｏｔｔｉの論文（１９９４年）、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、１０巻、３〜５頁に記載されているようなＡＤＶＡＮＣＥ及びＡＤＡＭ、並びにＰｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの論文（１９８８年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５巻、２４４４〜８頁に記載されているＦＡＳＴＡが含まれる。ＦＡＳＴの中で、ｋｔｕｐは、検索の感度及び速度を設定する制御オプションである。
【００６２】
高度の配列一致性が存在する場合、アミノ酸配列に存在する相違は比較的少ない。したがって、例えば、相違は、恐らく２０未満、１０未満又は５未満であろう。
【００６３】
結合要素の作製
本発明の及び本発明で使用するための特異的結合要素は、天然に又は合成的に任意の適切な手段で作製できる。このような方法としては、例えば、従来からのハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの論文（１９７５年）、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻、４９５〜４９９頁）、組換えＤＮＡ技術（例えば米国特許第４，８１６，５６７号パンフレットを参照のこと）、又は抗体ライブラリーを使用するファージディスプレイ技術（Ｃｌａｃｋｓｏｎらの論文（１９９１年）、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻、６２４〜６２８頁、及びＭａｒｋｓらの論文（１９９２年）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻、７７９〜７８３頁を参照のこと）を挙げることができる。その他の抗体産生技術は、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｈａｒｌｏｗら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年に記載されている。
【００６４】
従来からのハイブリドーマ技術は、典型的には、抗原に結合する能力のあるリンパ球の産生を誘発するために、マウス又はその他の動物を抗原で免疫化することを含む。リンパ球を、単離し、ミエローマ細胞系と融合させてハイブリドーマ細胞を形成し、次いで親のミエローマ細胞の増殖を阻止するが抗体産生細胞の増殖を可能にする条件でハイブリドーマ細胞を培養する。ハイブリドーマを、産生される抗体の結合特異性を変更する可能性がある又は可能性がない遺伝子突然変異にかけてもよい。合成抗体は、当技術分野で周知の技術を使用して作製できる（例えば、Ｋｎａｐｐｉｋらの論文、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００年）、２９６巻、５７〜８６頁、及びＫｒｅｂｓらの論文、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．（２００１年）２１５４、６７〜８４頁を参照のこと）。
【００６５】
改変は、当技術分野で周知の任意の適切な技術を使用して、結合要素のＶＨ、ＶＬ又はＣＤＲ中で、あるいは実際上、ＦＲでなされることができる。例えば、可変ＶＨ及び／又はＶＬドメインは、ＣＤＲ例えばＣＤＲ３をこのようなＣＤＲを欠くＶＨ又はＶＬドメイン中に挿入することによって生成することができる。Ｍａｒｋｓらの論文（１９９２年）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻、７７９〜７８３頁には、ＣＤＲ３を欠くＶＨ可変ドメインのレパトアを作製し、次いで特定抗体のＣＤＲ３と組み合わせて、新規なＶＨ領域を生成するシャッフリング技術が記載されている。類似の技術を使用して、ＣＤＲ由来の配列を含む新規なＶＨ及びＶＬドメインを生成できる。
【００６６】
本発明の変形抗体を生成する代わりの技術は、例えば、エラープローンＰＣＲ（Ｇｒａｍらの論文（１９９２年）、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．８９巻、３５７６〜３５８０頁参照）を使用する、ＶＨ又はＶＬドメインをコードしている遺伝子のランダム突然変異生成を含むことができる。追加して又は代わりに、ＣＤＲを、例えば、Ｂａｒｂａｓらの論文（１９９１年）、ＰＮＡＳ、３８０９〜３８１３頁、及びＳｃｉｅｒの論文（１９９６年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３巻、５５１〜５６７頁に記載の分子進化法を使用して、突然変異生成に対して標的化できる。
【００６７】
このような変形体を生成し、抗体及びフラグメントを、微生物抗原、アポトーシス細胞又は細胞内抗原への結合について試験できる。
【００６８】
本発明の及び本発明で使用するための抗体は、さらなる改変を含むことができる。例えば、抗体を、グリコシル化、ＰＥＧ化、又はアルブミン若しくは非タンパク質ポリマーに連結できる。
【００６９】
本発明の及び本発明で使用するための抗体は標識できる。使用できる標識としては、放射性標識、酵素標識（西洋ワサビペルオキシダーゼ、又はアルカリホスファターゼなど）又はビオチンを挙げることができる。
【００７０】
核酸
本発明の及び本発明で使用するための核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含むことができる。核酸は、組換え、合成、又は当業者が利用できる標準的技術を使用するクローニングを含む任意の手段によって製造できる。
【００７１】
核酸は、任意の適切なベクター中に挿入することができる。本発明の核酸を含むベクターは、本発明のさらなる態様を形成する。一実施形態において、ベクターは発現ベクターであり、核酸は、宿主細胞中で核酸の発現を提供する能力のある制御配列に操作可能に連結される。各種のベクターを使用できる。例えば、適切なベクターとしては、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルスなど）、酵母ベクター、ファージ、染色体、人工染色体、プラスミド、又はコスミドＤＮＡを挙げることができる。
【００７２】
ベクターを使用して本発明の核酸を宿主細胞内に導入できる。本発明の核酸を発現させるために、広範な種類の宿主細胞を使用できる。本発明で使用するのに適切な宿主細胞は、原核又は真核細胞でよい。それらには、細菌（例えば、大腸菌）、酵母、昆虫細胞及び哺乳動物細胞が含まれる。使用できる哺乳動物細胞系には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳＯマウスメラノーマ細胞、サル及びヒト細胞系、並びにそれらの誘導体などが含まれる。
【００７３】
遺伝子産物の発現を調節し、遺伝子産物を修飾し、かつ／又は特異的に処理する宿主細胞株を使用できる。このような処理には、グリコシル化、ユビキチン化、ジスルフィド結合形成及び一般的な翻訳後修飾を含めることができる。
【００７４】
本発明者らは、ある種の微生物抗原、例えば微生物のＣＤ１４リガンド（例えば、１５３０８）に対する抗体がアポトーシス細胞の抗原と交差反応性であること、並びに、このような抗体及びそのフラグメント及び誘導体を癌治療剤として使用して腫瘍細胞を免疫系の攻撃に対して敏感にすることができることを明らかにした。
【００７５】
結合要素は、単独で又は１種又は複数のさらなる薬剤と組み合わせて投与できる。したがって、本発明は、さらに、微生物抗原に結合し、かつ、アポトーシス細胞の抗原と交差反応性である特異的結合要素、及び癌治療において同時的、分割的又は逐次的使用のための組合せ製剤としての有効薬剤を含む製品を提供する。有効薬剤としては、本発明の結合要素と相乗的に効果を発揮できるドキソルビシン、タキソール、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、ロイコボリン、イリノテカン、マイトマイシンＣ、オキサリプラチン、ラルチトレキシド、タモキシフェン及びシスプラチンを始めとする化学療法剤を挙げることができる。その他の有効薬剤としては、適切な投与量の、非ステロイド性抗炎症剤（例えば、アスピリン、パラセタモール、イブプロフェン又はケトプロフェン）あるいはモルヒネのようなアヘン薬などの疼痛緩和剤、あるいは制吐剤を挙げることができる。さらなる実施形態において、有効薬剤は、さらなる結合要素でよい。したがって、好ましい実施形態において、結合要素は、１種又は複数のさらなる結合要素と組み合わせて投与できる。このような結合要素としては、限定はしないが、抗ＣＤ２０抗体、例えばリツキサン（リツキシマブ）（Ｂｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ（ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国）；抗ＶＥＧＦ抗体、例えばアバスチン（ベバシズマブ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、カリフォルニア州、米国）／Ｒｏｃｈｅ（バーゼル、スイス国）；抗ＣＤ１７１Ａ抗体、例えばパノレックス（エドレコロマブ）Ｃｅｎｔｏｃｏｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ、ペンシルバニア州、米国）／Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ（Ｕｘｂｒｉｄｇｅ、英国）；抗ＣＥＡ抗イディオタイプｍＡｂ、例えばシーバック、Ｔｉｔａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、カルホルニア州、米国）；抗ＥＧＦＲ抗体、例えばエルビタックス（セツキシマブ）、ＩｍＣｌｏｎｅ（ニューヨーク、米国／Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ（ニューヨーク、米国／Ｍｅｒｃｋ、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ニュージャージー州、米国）；抗ＨＭＦＧ抗イディオタイプｍＡｂ、例えばトリアブ、Ｔｉｔａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、カリフォルニア州、米国）；抗ＥＧＦＲ抗体、例えばＡＢＸ−ＥＦＧ、Ａｂｇｅｎｉｘ（Ｆｒｅｍｏｎｔ、カルホルニア州、米国）／Ａｍｇｅｎ  Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、カリフォルニア州）及び／又は抗ＨＥＲ２抗体、例えばヘルセプチン、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、カリフォルニア州、米国）を挙げることができる。
【００７６】
好ましくは、有効薬剤は、結合要素と相乗効果を発揮して細胞殺傷を増強する。本発明の結合要素は、検出可能な標識を所持することができる。
【００７７】
治療
「治療」には、ヒト又は非ヒト動物に有益である可能性のある任意の治療法が含まれる。治療は、既存の状態に関するものでもよいし、予防的でもよい（予防的治療）。治療には、治療、緩和又は予防効果を含めることができる。
【００７８】
「癌の治療」には、癌の増殖により惹起される状態の治療が含まれ、新生物増殖又は癌腫の治療が含まれる。本発明のシステムによって治療できる癌腫の例は、例えば、骨原生及び軟組織肉腫を始めとする肉腫、癌種、例えば乳、肺、膀胱、甲状腺、前立腺、結腸、直腸、膵臓、胃、肝臓、子宮、子宮頸部及び卵巣癌腫、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫を始めとするリンパ腫、神経芽細胞種、黒色腫、骨髄腫、ウィルムス腫瘍、及び急性リンパ芽球性白血病及び急性骨髄芽球性白血病を始めとする白血病、神経膠腫及び網膜芽細胞種である。
【００７９】
本発明の組成物及び方法は、既存の癌の治療に、及び初回治療又は手術の後の癌再発の予防に、特に有用である。
【００８０】
投与
本発明の及び本発明で使用するための結合要素は、単独で投与できるが、好ましくは、意図する投与経路に応じて選択される適切な医薬用賦形剤、希釈剤又は担体を一般には含有する医薬組成物として投与される。
【００８１】
本発明の及び本発明で使用するための結合要素は、治療を必要とする患者に対して、任意の適切な経路を経由して投与できる。正確な用量は、該要素の正確な本質（例えば、全抗体、フラグメント又は二重特異性抗体断片）、及び該要素に結合する任意の検出可能な標識の性質を含むいくつかの要因によって決まる。
【００８２】
いくつかの適切な投与経路には、（限定はしないが）経口、直腸内、経鼻、局所（口内及び舌下を含む）、経膣、又は非経口（皮下、筋内、静脈内、皮内、鞘内及び硬膜外を含む）投与が含まれる。静脈内投与が好ましい。
【００８３】
カテーテル又はその他の外科的挿管を通した送達も想定できるが、注射（静脈内）が、組成物の治療的投与のための最も重要な経路であると考えられる。粉末製剤から再構成した液体製剤も利用できる。
【００８４】
静脈内注射、又は疼痛部位での注射の場合、有効成分は、パイロジェンを含まず、適切なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口で許容される水溶液の形態である。当業者は、例えば、塩化ナトリウム液、リンガー液、乳酸加リンガー液などの等張性ビヒクルを使用する適切な溶液を十分調製できる。必要であれば、保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤、及び／又はその他の添加剤を含めることができる。
【００８５】
経口投与用の医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末又は液体の形態でよい。錠剤は、ゼラチンなどの固体担体、又はアジュバントを含むことができる。液状の医薬組成物は、一般に、水、石油系、動物性又は植物性油、鉱油又は合成油などの液状担体を含む。生理食塩水、デキストロース又はその他の糖溶液、あるいはエチレングリコール、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなどのグリコール類を含めることができる。
【００８６】
また、組成物は、ミクロスフェア、リポソーム、血液を含む特定の組織中に設置されたその他の微小粒子送達系又は徐放性製剤を介して投与できる。徐放性担体の適切な例には、分配される物品の形態の半透性高分子マトリックス、例えば座剤又はマイクロカプセルが含まれる。植込み可能な又はマイクロカプセルの徐放性マトリックスには、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号パンフレット、欧州特許出願公開第Ａ−００５８４８１号パンフレット）、Ｌ−グルタミン酸とＬ−グルタミン酸エチルの共重合体が含まれる（Ｓｉｄｍａｎらの論文、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、２２（１）巻、５４７〜５５６頁、１９８５年）、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）又は酢酸ビニルエチレン（Ｌａｎｇｅｒらの論文、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５巻、１６７〜２７７頁、１９８１年、及びＬａｎｇｅｒの論文、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２巻、９８〜１０５頁、１９８２年）。ポリペプチドを含むリポソームは、周知の方法で調製される（独国特許出願公開第３，２１８，１２１Ａ号パンフレット；Ｅｐｓｔｅｉｎらの論文、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８２巻、３６８８〜３６９２頁、１９８５年；Ｈｗａｎｇらの論文、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、７７巻、４０３０〜４０３４頁、１９８０年；欧州特許出願公開第Ａ−００５２５２２号、第Ａ−００３６６７６号、第Ａ−００８８０４６号、第Ａ−０１４３９４９号、第Ａ−０１４２５４１号パンフレット、特開昭第５８−１１８０８号パンフレット、米国特許第４，４８５，０４５号、及び第４，５４４，５４５号パンフレット）。通常、リポソームは小さな（約２００〜８００オングストローム）単膜型であり、その脂質含有量はコレステロールが約３０％を超え、選択される比率はポリペプチドの漏出の最適速度を目標に調節される。
【００８７】
上述の技術及び実験計画、及び本発明により使用できるその他の技術及び実験計画の例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１６版、Ｏｓｌｏ，Ａ編集、１９８０年、の中に見出すことができる。
【００８８】
組成物は、腫瘍部位又はその他の希望する部位に対して局所的に投与することができ、あるいは、腫瘍又はその他の細胞を標的にする方式で送達できる。抗体又は細胞特異的リガンドなどのターゲッティング系を使用することによって、ターゲッティング療法を使用して有効薬剤を特定タイプの細胞により特異的に送達できる。ターゲッティングは、様々な理由に対して、例えば、該薬剤が、別の方法では許容できないほど有毒である場合、別の方法では余りにも多い投与量を必要とする場合、又は別の方法では標的細胞に進入できない場合に望ましい。
【００８９】
用量
組成物は、好ましくは、個人に対して「治療上有効な量」（個人に利益を示すのに十分である量）で投与される。投与される実際の量、及び投与の速度及び時間経過は、治療されるものの性質及び重症度によって左右される。治療の処方、例えば投与量などの決定は、最終的には一般臨床医及びその他の医師の責任、裁量範囲にあり、典型的には、治療すべき障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、及び臨床医に周知のその他要因を考慮に入れる。
【００９０】
最適用量は、例えば、年齢、性、体重、治療される状態の重症度、投与される有効成分、及び投与経路を含むいくつかの要因に基づいて医師が決定できる。一般に、受容体の飽和を可能にするポリペプチド及び抗体の血漿中濃度が望ましい。濃度は、約０．１ｎＭの過剰で通常は十分である。例えば、１００ｍｇ／ｍ２の抗体用量は、約８日間の間約２０ｎＭの血漿中濃度を提供する。
【００９１】
おおよその指針として、抗体の用量は、毎週１０〜３００ｍｇ／ｍ２の量で与えることができる。血漿濃度を最適濃度又は過剰に維持するために、等価な用量の抗体フラグメントを、より頻繁な間隔で使用すべきである。
【００９２】
アッセイ
本発明は、さらに、さらなる薬剤、例えばアポトーシス細胞に対する免疫反応を増強するのに使用することができ、かつ癌治療に任意選択で使用できる抗体を同定するためのアッセイ法を提供する。
【００９３】
したがって、本発明のさらなる態様では、特異的結合要素、例えば、アポトーシス細胞に対する免疫反応を増強する能力のある抗体を同定するアッセイ方法が提供され、該アッセイ方法は、
ａ）微生物抗原に対して結合特異性を有する特異的結合要素をアポトーシス細胞と接触させるステップと、
ｃ）特異的結合要素のアポトーシス細胞との交差反応性の存在又は不在を判定するステップとを含み、特異的結合要素のアポトーシス細胞との交差反応性の存在は、該アポトーシス細胞に対する免疫反応を増強する能力を示している。
【００９４】
好ましい実施形態において、本発明のアッセイ方法は、（ｉ）アポトーシス細胞、及びアポトーシス細胞と交差反応性を有することがステップ（ｂ）で判定された抗体、並びに（ｉｉ）マクロファージ、並びに、マクロファージにおける、免疫賦活反応、例えば炎症反応、及び／又は免疫抑制反応の抑制、を判定すること、を共に備えるさらなるステップ（ｃ）を含むことができる。
【００９５】
本発明のさらなる態様では、アポトーシス細胞に対する免疫反応を増強する能力のある特異的結合要素を同定するアッセイ方法が提供され、該アッセイ方法は、
（ａ）微生物抗原に対する結合特異性を有する特異的結合要素を提供するステップと、
（ｂ）微生物抗原に対する結合特異性を有する該特異的結合要素をアポトーシス細胞及びマクロファージと接触させるステップと、
（ｃ）マクロファージにおける、免疫賦活反応の誘導、例えば炎症反応の誘導、及び／又は、免疫抑制反応の抑制、例えば抗炎症反応の抑制の抑制、を判定するステップと、を含み、免疫賦活反応の存在及び／又は免疫抑制反応の抑制は、該アポトーシス細胞に対する免疫反応を増強する能力を示している。
【００９６】
本発明のこれら態様のアッセイは、交差反応性を示し、かつ／又は免疫抑制反応を誘導し、かつ／又は免疫抑制反応を抑制する候補薬剤を選択するステップ（ｄ）、及び任意選択で、特異的結合要素が結合するアポトーシス細胞のエピトープを同定するステップ（ｅ）をさらに含むことができる。
【００９７】
本発明は、さらに、微生物抗原に対する結合特異性をそれぞれ有する抗体のライブラリーをアポトーシス細胞のエピトープに結合する能力についてスクリーニングするステップを含むスクリーニング方法を提供する。
【００９８】
本発明のアッセイは、それによって多数の候補薬剤を試験する選抜試験である。したがって、当業者にとって周知である、化合物をスクリーニングするための任意の適切な技術を使用できる。該選抜試験は、ハイスループットの選抜試験でよい。例えば、国際公開第８４／０３５６４号パンフレットには、多数のペプチドを固体基板上で合成し、薬剤と反応させ、洗浄する方法が記載されている。捕捉されたものを検出する。
【００９９】
例えば、種々の微生物分子、例えば、ＬＰＳ、リポテイコ酸、ペプチドグリカン及びリポアラビノマンナンを始めとする、ＣＤ１４−リガンドとして機能することが知られている微生物分子（Ｇｒｅｇｏｒｙ、１９９９年；Ｄｚｉａｒｓｋｉ、２０００年）に対する抗体のパネル（例えば、商業的供給源から得られる）を、後述の動物モデルにおけるリンパ腫細胞系のそれを含む、生存及びアポトーシス性ヒト及びネズミのリンパ腫細胞系に対してスクリーニングできる。
【０１００】
抗体の交差反応性は、当技術分野で周知の適切な任意の方法を使用して評価できる。交差反応性は、アポトーシスの異なった段階（原形質膜の完全性消失の前後）で評価することができ、特に、細胞表面対細胞内成分に対する反応性に特別の注意を払うことができる。後者の場合、アポトーシス細胞との反応性を、透過性にした生存細胞の反応性と比較できる。マクロファージは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、死んだアポトーシス細胞を形質膜の完全性の消失と時を同じくして優先的に認識するので、マクロファージパターン認識受容体は、表面成分に加え、アポトーシス細胞の内部構造と十分相互作用できることに留意されたい［Ｄｅｖｉｔｔ、２００３年］。
【０１０１】
正常又は悪性の一次細胞及び細胞系（例えば、一次ヒト悪性リンパ腫及び白血病細胞）を慎重に染色すると、抗体のアポトーシス腫瘍細胞に対する任意の優先的結合を評価することが可能になる。
【０１０２】
これらの初期選抜試験からのアポトーシス細胞反応性抗体を、さらなる研究のために選択できる。
【０１０３】
強力なアポトーシス反応性を示す抗体をプローブとして使用して、アポトーシス細胞によって示される交差反応性エピトープを所持する分子を同定できる。
【０１０４】
例えば、抗体反応性タンパク質は、免疫沈降法／イムノブロッティングで単離され、質量分光分析にかけられる。抗体反応性の確認は、細胞中に過剰発現し溶解性分子として生じた候補タンパク質の組換え形態を使用して調べることができる。利用できるなら、同定された宿主分子に対するさらなる抗体も、アポトーシス細胞との反応性について試験することができ、適切なら以下のさらなる調査に含めることができる。
【０１０５】
同定された宿主分子のアポトーシス細胞除去機構に対する関連性を判定するために、多様な方法を採用できる。すなわち、例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントとして調製されたこれらの構造に対する利用可能な抗体を、標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアッセイを使用して、アポトーシス細胞とマクロファージとの相互作用を抑制するそれらの能力について試験できる。これらのタンパク質の溶解性組換え形態を同様に試験できる。交差反応性宿主タンパク質の多くが、ＣＤ１４−リガンドであるとの仮説を立てているので、これらのタンパク質を結合している抗体が、溶解性ＣＤ１４とアポトーシス細胞との相互作用を記載のように抑制するか否かを判定できる［Ｄｅｖｉｔｔ、２００４年］。確立された安定なトランスフェクタント細胞系に膜固定ＣＤ１４、又はＥＬＩＳＡを基礎にした方法での溶解性ＣＤ１４を使用して、候補タンパク質が、溶解性形態でＣＤ１４と直接相互作用できる程度を確認できる。
【０１０６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのマクロファージの応答
特異的結合要素、例えば、上で概略を述べた研究から選択された抗体を、アポトーシスリンパ腫細胞に対するマクロファージの反応性をより大きな免疫賦活反応に切り替える、例えば、抗炎症反応から炎症反応に切り替えるような、アポトーシスリンパ腫細胞をオプソニン化するそれらの能力について最初に試験できる。例えば、アポトーシスヒトＢＬ及びネズミλ−ＭＹＣリンパ腫細胞［Ｋｏｖａｌｃｈｕｋ、２０００年］の、選択されたパネルからのネズミＩｇＧ抗体でのオプソニン化を試験できる。
【０１０７】
特異的結合要素が免疫賦活反応を誘導する（新たな応答の誘導又は現存する応答の増強を含むと解するべきである）能力、及び特異的結合要素が免疫抑制反応を抑制する（現存する応答の完全抑制又は部分的抑制を含むと解するべきである）能力は、当技術分野で周知の任意の方法を使用して試験できる。例えば、特異的結合要素は、被評価マクロファージにおける炎症応答を活性化するそれらの能力について、アラキドン酸代謝産物、Ｈ２Ｏ２、及び炎症促進性サイトカイン（ＴＮＦ−αなど）を始めとする種々の分子を測定することによって試験できる。免疫抑制反応の抑制は、例えば、抗炎症性サイトカインの産生低下、例えばＴＧＦ−β、ＩＬ−１０などの中の１つ又は複数を測定することによって評価できる。
【０１０８】
オプソニン化されたこのような細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏでのマクロファージの腫瘍破壊活性を活性化するか否かを判定することもできる。比較は、（１）アポトーシス細胞関連分子パターン（ＡＣＡＭＰ）を同定し、さらにアポトーシス細胞とマクロファージ／ＣＤ１４の間の相互作用を遮断する能力が判明しているオプソニン化している抗体、及び（２）ＡＣＡＭＰを同定するがそのような拮抗活性を有さないそれらの抗体の間で行うことができる。また、比較は、本研究から得られる抗体と２つの入手可能なさらなるネズミＩｇＧ  ｍＡｂ［１つはホスファチジルセリン（Ｕｐｓｔａｔｅ）を、もう１つはアポトーシス細胞上のアネキシンＩ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を特定する］との間で行われる。結局、選択されたｍＡｂパネルから得られるＩｇＧ抗体カクテル混合物でオプソニン化されたアポトーシス細胞のマクロファージ応答性に対する効果も判定できる。
【０１０９】
選択された抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの治療活性
マクロファージの免疫促進及び／又は腫瘍破壊効果を活性化する強力な能力、及び／又は免疫抑制効果を抑制する能力を示す特異的結合要素、例えば、抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ研究、例えば、マウスにおける抗リンパ腫療法の研究を使用してさらに試験できる。例えば、使用できるモデルには、移植されたヒトＢＬ又はＳＣＩＤマウスのネズミλ−ＭＹＣリンパ腫、並びに免疫担当動物における自然又は移植ネズミのλ−ＭＹＣリンパ腫が含まれる。これらのモデルにより、抗体療法を仲介することにおける自然及び適応免疫系の相互的役割を評価することが可能になる。動物に治療用抗体の候補（適切なら、それらのカクテル混合物を含む）を注入し、続いて、腫瘍の進展並びに腫瘍増殖の遅延及び寛解を調べる。縮退腫瘍の組織学的分析を使用して腫瘍のリンパ球浸潤及びＴＡＭ表現型の変化を調べることができる。抗腫瘍ＣＴＬ応答の及びＴＡＭの細胞傷害活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定は、詳細な機構的免疫学的研究（例えば、樹状細胞の活性化を含む）の序章と解することもできる。最適な抗体投与量及び投与方式は、経験的に決定できる。
【０１１０】
本発明は、微生物抗原に対して特異的でかつアポトーシス細胞のエピトープと交差反応性のある抗体が、該エピトープへの結合に関して試験薬剤と特異的に競合する、競合薬剤スクリーニングアッセイの使用を想定している。
【０１１１】
本発明は、薬剤、本発明のスクリーニング方法で同定された薬剤、抗体など、及び癌治療用医薬の製造におけるそれらの使用も想定している。
【０１１２】
本発明の各態様の好ましい特徴は、必要な変更を加えて他の態様のそれぞれに対してと同様である。
【０１１３】
これより、次の非制限的実施例の中で本発明をさらに説明する。付属の図面を参照する。
【０１１４】
実施例１
５種の市販抗ＬＰＳ抗体のパネルを、アポトーシス細胞との交差反応性について試験した。アポトーシスＭｕｔｕ  Ｉ  ＢＬ細胞を、指定されたパネルの抗ＬＰＳ  ｍＡｂで染色し、ｍＡｂ１５３０８について図１に示すように分析した。
【０１１５】
簡潔には、間接免疫蛍光法によって、ヒトのＢＬ系Ｍｕｔｕ  Ｉ及びネズミの胸腺腫系Ａ１．１のフローサイトメトリー分析を抗体（例えば、図１に示した例では抗ＬＰＳ  ｍＡｂ  １５３０８（ＩｇＧ３））で標識して行った。Ｍｕｔｕ  Ｉ細胞は、イオノマイシンでアポトーシスを受けるように誘導され、Ａ１．１細胞は自然アポトーシスを受けた。右側のパネルは、記載したようにＲ１（アポトーシス）及びＲ２（生存）区域に分かれる細胞を数える光散乱のドットプロットを示している［Ｄｉｖｅ、１９９２年］。左及び中央の画面は、それぞれアポトーシス及び生存区域での細胞の蛍光ヒストグラムを示す。
【０１１６】
試験した市販の抗体についての結果を表１Ａ及び１Ｂに要約する。表１Ａで試験した４種の抗体は、ヒト及びネズミのリンパ腫細胞系を含むアポトーシス細胞と反応することが判った。表１Ｂに示した８種の抗体のパネル中で、試験した抗体の５種は、ヒト及びネズミのリンパ腫細胞系と反応することが判った。
【０１１７】
【表１】
2008510681.tif 000002
【０１１８】
【表２】
2008510681.tif 000003
【０１１９】
ｍＡｂ１５３０８をさらに試験した。ヒトＢＬ細胞溶解物と抗ＬＰＳ  ｍＡｂ１５３０８との反応性を試験した結果を図２に示す。Ｍｕｔｕ  Ｉ  ＢＬ細胞（アポトーシス及び生存細胞の混合物）を溶解し、１０％ポリアクリルアミドＳＤＳゲルで電気泳動を行い、指示ｍＡｂと共にＰＶＤＦ膜上にブロットした。上の画面では全細胞溶解物を示す。下の画面では溶解物を逐次遠心により１，０００ｇペレット（Ｎ）、２７，０００ｇペレット（Ｐ１）、１００，０００ｇペレット（Ｐ２）及び残りの上清液（Ｓ）に分画した。
【０１２０】
ｍＡｂを用いて図２のように生じたバンドを、ポリアクリルアミドゲルから削り取り、トリプシン消化産物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光法で分析した（図３）。得られたペプチド集団をＳｗｉｓｓＰｒｏｔ及びＭＡＳＣＯＴデータベース検索にかけた。下の画面は、データベース質問検索からの出力を要約しており、ｍＡｂ  １５３０８と反応性のあるタンパク質をラミニン結合タンパク質として明確に同定している。合致したペプチドは、赤色の下線で示したように総タンパク質の５８％に及ぶ。
【０１２１】
したがって、生化学的分析（図２、３）は、ｍＡｂ  １５３０８がラミニン−結合タンパク質、リボソーム生物発生に関与していることが知られている多機能性タンパク質を、形質膜発現、細胞外マトリックスへの細胞接着を介して特定できる［Ｋａｚｍｉｎ、２００３年］。したがって、ラミニン結合タンパク質は、原型ＰＡＭＰ、ＬＰＳと交差反応性を持つ候補ＡＣＡＭＰを代表する。
【０１２２】
実施例２  １５３０８抗体は、生存及びアポトーシスの双方内で見出される細胞内エピトープに結合する
図４に示すように、１５３０８抗体は、共焦点顕微鏡法で判定されるように、生存及びアポトーシスの双方で見出される細胞内エピトープに結合する。ヒトのＢ細胞リンパ腫細胞系、Ｍｕｔｕ  １を、アポトーシスを受けるようにイオノマイシンで１６時間処理した（Ａ〜Ｇ）。抗ＬＰＳ抗体、１５３０８の結合は、ａｌｅｘａＦｌｏｕｒ−４８８で標識したヤギの抗マウス第二抗体を用いて検出された（緑、Ｄ及びＢ）。
細胞は、核酸の可視化のため、及び膜の完全性の尺度として、不透過性染料ＴＯ−ＰＲＯ−３で対比染色した（青色、Ｂ及びＣ）。
生存細胞は、まったく染色されなかった（下方の細胞、Ａ）。対照的に、イソタイプに合致した対照抗体（γ３）は、アポトーシス細胞の染色を示さなかった（Ｅ、Ｆ及びＧ）。
固定され及び透過性にされた場合（ｉｎｔｒａｓｔａｉｎ（商標）、ＤＡＫＯ）、Ｍｕｔｕ  １細胞は、１５３０８抗体で細胞質染色も示す（Ｈ）。生存細胞は、大きな丸い核（開いた矢印）を示し、一方、アポトーシス細胞の核は縮重される（閉じた矢印）。
【０１２３】
実施例３  透過性にしたアポトーシス及び生存リンパ腫細胞の双方における１５３０８エピトープ発現のレベル
ヒトのＢ細胞リンパ腫細胞系、Ｎｕｔｕ  １をイオノマイシンで１６時間処理するか（誘導）、あるいは処理しないままにした（生存）。
次いで、細胞を、固定化しかつ透過性にするか（ｉｎｔｒａｓｔａｉｎ（商標）、ＤＡＫＯを使用）あるいはそのまま放置した。抗体１５３０８が細胞に結合する能力を、フローサイトメトリーで分析した。ガンマー３イソタイプマウスモノクロナール抗体（γ３）での染色を負の対照と同様に実施した。結果を図５に示す。
集団内で、細胞を光散乱特性を基準にして生存又はアポトーシス細胞として画定した；アポトーシス（Ｒ１）、生存（Ｒ２）。
透過性化処理の結果として１５３０８及びイソタイプ抗体の双方に対して蛍光の軽微な減少が観察された［青色（ｂ）対赤色（ｒ）ヒストグラム、Ｒ２］。透過性にしたアポトーシス及び生存リパ腫細胞の双方における、同等レベルの１５３０８エピトープ発現。
【０１２４】
実施例４  アポトーシスリンパ腫細胞上のそのエピトープへの結合における抗ＬＰＳ抗体１５３０８の感受性の判定
ヒトのＢ細胞リンパ腫細胞系、Ｍｕｔｕ  １をイオノマイシンで１６時間処理した。抗体１５３０８が細胞を結合する能力をフローサイトメトリーで分析した。ガンマー３イソタイプマウスモノクロナール抗体（γ３）での染色を負の対照と同濃度で実施した。
結合された抗体を、ＦＩＴＣで標識したヤギの抗マウス第二抗体で検出した。結果を図６に示す。
【０１２５】
値は、第一抗体（「Ａｂ」）を細胞とインキュベートした濃度を表す（μｇ／ｍｌ）。第一抗体とインキュベートする間、細胞は２．５×１０６／ｍｌの密度であった。
【０１２６】
実施例５  付着細胞系における抗ＬＰＳ抗体、１５３０８の結合
細胞内免疫蛍光法のための準備では、ヒトの肺上皮細胞系、Ａ５４９を、カバーガラス上、３％パラホルムアルデヒドで固定し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過性とした。細胞を、１５３０８抗体及びチューブリン抗体で二重標識した（Ａ）。１５３０８抗体の分布を、ａｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８で標識した第二抗体で二次染色することによって可視化した（緑色）。微小管の分布を、抗β−チューブリン抗体で、続いてａｌｅｘａＦｌｏｕｒ−５６８で標識した第二抗体によって検出した（赤色）。共存を評価するために、微小管及び１５３０８の画像を重ね合わせた（金色状）。アクチンフィラメントからの明瞭な局在化を明らかにするために、細胞を、１５３０８抗体（緑色）及びａｌｅｘａＦｌｕｏｒ−５６８（赤色）で標識したファロイジンで二重標識した（Ｅ）。結果を図７に示す。結果は、抗ＬＰＳ抗体、１５３０８の結合は、付着細胞系の微小管と特異的に局在することを示している。
【０１２７】
実施例６  アポトーシス中のヒトリンパ腫細胞の表面上への１５３０８エピトープの出現
ヒトのＢ細胞リンパ腫細胞系、Ｍｕｔｕ  １をイオノマイシンで１６時間処理した。集団内で、様々な死滅段階の細胞を、光散乱特性に基づいて初期（Ｒ１）、中間期（Ｒ２）、後期（Ｒ３）に区別した。膜の完全性の尺度としてヨウ化プロピジウム（ＰＩ）での染色を使用した。１５３０８エピトープの出現をＦＩＴＣで標識したヤギの抗マウス第二抗体で染色して分析した。負対照として、ガンマー３イソタイプマウスモノクロナール抗体（γ３）での染色を含めた。結果を図８に示す。各象限内の細胞のパーセンテージを示す。右下隅のパーセンテージは、１５３０８の存在、ＰＩの不在のアポトーシス細胞を表す。図に示したように、アポソーシス中に、ヒトのリンパ腫細胞の表面に１５３０８エピトープが現われる。
【０１２８】
実施例７  共焦点顕微鏡法で判定すると、１５３０８エピトープはヒトのアポトーシスリンパ腫細胞の表面に露出される。
ヒトのＢ細胞リンパ腫細胞系、Ｍｕｔｕ  １を、アポトーシスを受けるようにイオノマイシンで１６時間処理した。抗ＬＰＳ抗体、１５３０８の結合を、ａｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８（緑色）で標識したヤギの抗マウス第二抗体を用いて検出した。処理中の膜の完全性の尺度として、及び１５３０８抗体が細胞表面露出分子に代わって細胞内エピトープを結合する可能性を排除するために、すべての試料にＰＩ（赤色）を含めた。結果を図９に示す。Ａ及びＢに示したように、１５３０８抗体は、若干のアポトーシス細胞の細胞表面を染色し（閉じた矢印）、一方、第二ネクローシス細胞（開いた矢印）はＰＩでの核染色及び細胞質染色を示した。Ｃでは、１５３０８による表面蛍光染色の異なる平面を示す。図は、共焦点顕微鏡法で判定すると、１５３０８エピトープがヒトのアポトーシスリンパ腫細胞の表面に露出されることを示している。
【０１２９】
実施例８  共焦点顕微鏡法で判定した場合の、ヒトのアポトーシス乳癌腫表面の１５３０８反応性及びＰＳの共存
培養した細胞系、ＭＣＦ−７をエトポシド（１００μＭ）で４８時間処理し、１５３０８エピトープ及びＰＳの共存を調べた。図１０に示したのは、ａｌｅｘａＦｌｕｏｒ−５６８（赤色）で標識したヤギの抗マウス第二抗体で可視化された１５３０８エピトープ、アネキシンＶ−ビオチンで可視化されたＰＳ、及びａｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８（緑色）で標識したストレプトアビジンの共焦点蛍光画像である。
・  １５３０８エピトープ及びＰＳは泡状突起様構造を含む領域に局在している（Ａ及びＢ）。
・  単一のＺ−断面画像で泡状突起表面（無色正方形Ｃ）の染色を示す接写図（Ｅ、Ｆ及びＧ）
・  明野（Ｂ及びＤ）
・  共存のための二重励起（Ａ、Ｃ及びＧ）
【０１３０】
ホスファチジルセリン（ＰＳ）は、通常、細胞膜の内側だけに存在するので、これらの結果は、変化が細胞膜の外側で起こったことを立証している。何らかの１つの理論に結合されるものではないが、結果は、膜の外側表面でのホスファチジルセリンの出現が１５３０８エピトープを膜の外側表面に露出する上で重要であると考えられることを示唆している。
【０１３１】
実施例９  光学及び蛍光顕微鏡で観察すると、１５３０８エピトープは、ヒトのアポトーシス乳癌腫細胞の表面泡状突起に局在する。
培養した細胞系、ＭＣＦ−７をエトポシド（１００μＭ）で４８時間処理し、１５３０８エピトープの表面分布を調べた。図１１に示したのは、明野下での細胞単層（Ａ）又はａｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８（緑色）で標識したヤギの抗マウス二次抗体によって可視化された１５３０８エピトープの蛍光画像である。
【０１３２】
実施例１０  １５３０８抗体で結合されたアポトーシス細胞は、マクロファージの炎症反応を誘導する。
マクロファージを、ＣＤ４０Ｌ又は抗ＬＰＳ  ｍＡｂの単独であるいはアポトーシス好中球の存在下で処理した。結果を図１２に示す。ＣＤ４０Ｌは、アポトーシス好中球（ＮＰ）で抑制されるＴＮＦ産生のわずかな増加を刺激したが、１５３０８での好中球のオプソニン化は、マクロファージによるＴＮＦ産生を著しく誘導した。したがって、１５３０８ｌ抗体で結合されたアポトーシス細胞は、マクロファージでの炎症反応を誘導する。
【０１３３】
実施例１１  抗ＬＰＳ抗体１５３０８及び１５１７４のマウス一次アポトーシス細胞への結合
胸腺を、マウスから採取し、２枚の凍結スライドガラスの間に挟み込んで分離した。単一細胞懸濁液を、２５μｇ／ｍｌのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）で、一晩インキュベートすることによりアポトーシスを誘発した。次いで、細胞を、間接免疫蛍光法を使用して染色し、当業者に周知のフローサイトメトリーで分析した。抗ＬＰＳ  Ａｂ１５３０８、抗ＬＰＤ  Ａｂ１５１７４及び第二抗体の単独での染色結果を図１４に示し、抗微生物Ａｂｓがアポトーシス細胞に結合できるさらなる証拠を提供する。これは、抗微生物Ａｂｓがマウスの一次細胞に結合できることの最初の証拠である。この結合は、多分、治療上の利益を示すＡｂｓに対して本質的に必須なものであろう。
【０１３４】
実施例１２  抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ試験
動物モデルは、適応及び自然抗腫瘍免疫反応の相対的重要性の評価を可能にする、免疫担当性及び免疫不全性動物の双方を包含する。
【０１３５】
図解１３に要約したように、次の腫瘍を、前述のｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究から選択されたモノクロナール抗体との処理に供する。選ばれた腫瘍は、マクロファージの浸潤と共に構成性アポトーシスを示す腫瘍である。
【０１３６】
１．自然γ−Ｍｙｃ腫瘍（組織学的には高率のアポトーシス及び多数のｓｔａａｒｙ−ｓｋｙマクロファージを伴うバーキット様腫瘍）［Ｋｏｖａｌｃｈｕｋ、２０００年］；
２．γ−Ｍｙｃ細胞系の同系移植（既に利用可能な系）；
３．λ−Ｍｙｃ細胞系のＳＣＩＤ又はヌードマウスへの移植；
４．ヒトＢＬ系のＳＣＩＤ又はヌードマウスへの移植（これらの腫瘍は、頻繁なアポトーシス細胞及び宿主のｓｔａａｒｙ−ｓｋｙマクロファージの効果的回復を伴う組織学的にヒトＢＬに酷似している。）
【０１３７】
腫瘍が検出可能ならすぐに、選択された抗体／抗体混合物を、全身又は腫瘍内経路を介して投与する（以下を参照）。腫瘍の及び正常組織のアポトーシス細胞への抗体の局在を組織学的に評価する。腫瘍移植法（上記の２〜４）は、容易にモニターできるだけでなく腫瘍内抗体投与に直ちに敏感に反応する皮下腫瘍に主として焦点を合わせている。
【０１３８】
腫瘍縮退を惹起する抗体の効力は、直接腫瘍測定によって評価される。基礎をなす機構に関する予備的観察は、組織学的材料についてｉｎ  ｓｉｔｕで（例えば、炎症浸潤物、マクロファージ活性化の評価）、及び単離免疫細胞集団についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。抗腫瘍免疫反応は、最初に脾臓からのＴ−富化リンパ球を使用して、あるいは腫瘍細胞に応答してｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖するそれらの能力について標準的方法を用いて試験されるリンパ節を排液して特徴付けられる。このような応答性Ｔ−細胞集団内の細胞傷害性Ｔ−細胞活性を、５１Ｃｒ−標識腫瘍標的と対照して評価する。治療腫瘍からのＴＡＭの細胞傷害活性も、腫瘍標的と対照して試験する。抗体誘発腫瘍縮退がない場合には、前述の機構的研究が、原因（例えば、ＴＡＭの炎症促進活性の欠如）を調べる上で非常に貴重である。
【０１３９】
実施例１３  ｍＡｂ１５１７４又はＰＢＳの腫瘍内注入の腫瘍増殖に対する影響
１０７のＢＬ２細胞を、ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎより供給）中にＰＢＳの２００μＬ体積で皮下注射した。
腫瘍の出現をモニターし、二次元で測定した。矢印で示したように、腫瘍にＰＢＳ（担体）又はＰＢＳ中のｍＡｂ１５１７４を直接注射した。体積で５０μＬを腹膜内に注射した。ｍＡｂ  １５１７４は、ＱＥＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能な抗ＬＰＳ  Ａｂである。内務省の方針に従って動物を屠殺するまでの後続する日数の間、腫瘍の大きさを追跡する。ｍＡｂ  １５１７４を１回注射すると、腫瘍増殖に対してＰＢＳ注射では観察されない著しい効果を示した。動物＃ｅ２１において、１回の注射後に腫瘍増殖が停止した。ＮＢ−マウス＃ｅ１７に対する注射は、Ａｂの若干の漏出を伴って不十分であった。これは、その後、完全な注入を受けた動物＃ｅ２１で観察される程度の応答を示さなかった。それにもかかわらず、＃ｅ２１と同様、＃ｅ１７は１回の注射後に腫瘍増殖速度の著しい低下を示す。複数注射は、腫瘍増殖の低下／停止の延長をもたらすはずであり、縮退を引き起こす可能性もある。
【０１４０】
本明細書中で言及されるすべての文書を参照により本明細書に組み込む。記載した本発明の実施形態に対する種々の修正形態及び変形形態は、当業者にとって本発明の範囲及び精神から逸脱することなしに明らかであろう。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して説明してきたが、特許請求される発明は、このような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないと解されるべきである。実際、当業者にとって明白である、本発明を実施に関して記載した方式の種々の修正形態は、本発明に包含されると解釈される。
【参考文献】
【０１４１】
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【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】ヒト及びマウスのアポトーシスリンパ腫と抗ＬＰＳ  ｍＡｂ１５３０８との交差反応性を示す図である。
【図２】ヒトのＢＬ細胞溶解物と抗ＬＰＳ  ｍＡｂ１５３０８との反応性を示す図である。
【図３】ｍＡｂ１５３０８を用いて図２で生じたバンドのマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＰ）質量分光法を示す図である。
【図４】共焦点顕微鏡法で判定した場合の、１５３０８抗体のヒトＢ細胞リンパ腫細胞系、Ｍｕｔｕ  １に対する結合を示す図である。
【図５】抗体１５３０８が、固定され、透過性にされた（ｉｎｔｒａｓｔａｉｎ（商標）、ＤＡＫＯを使用）又は自然のままの細胞を結合する能力のフローサイトメトリーによる分析を示す図である。
【図６】アポトーシスリンパ腫細胞上でのそのエピトープに対する結合における抗ＬＰＳ抗体１５３０８の感受性の測定結果を示す図である。
【図７】付着細胞系における抗ＬＰＳ抗体、１５３０８の結合を示す図である。
【図８】抗体ｍＡｂ１５３０８で標識された各種段階のアポトーシスＭｕｔｕ  １細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図９】ヒトのアポトーシスリンパ腫細胞の共焦点顕微鏡写真を示す図であり、１５３０８エピトープが細胞の表面に露出されていることを示している。
【図１０】ａｌｅｘａＦｌｕｏｒ−５６８（赤）で標識されたヤギの抗マウス第二抗体で可視化された１５３０８エピトープの、ａｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８（緑）で標識されたストレプトアビジンで可視化されたビオチン化−ＰＳの共焦点蛍光画像を示す図である。
【図１１】１５３０８エピトープの明野下（Ａ）又は蛍光画像（Ｂ）を示す図である。
【図１２】ｍＡｂ１５３０８の存在又は不存在下でのアポトーシス細胞に応答したマクロファージ中のＴＮＦ−α産生をモニターするＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図である。
【図１３】ｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルを概略的に示している図である。
【図１４】抗微生物抗体で染色したマウスの一次胸腺細胞から得られたフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図１５】ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖に対する、ｍＡｂ１５１７４又はＰＢＳの腫瘍内注入の効果を示す図である。
【図１】
2008510681.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2008510681.tif 000013
【図１１】
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【図１２】
2008510681.tif 000015
【図１３】
2008510681.tif 000016
【図１４】
2008510681.tif 000017
【図１５】
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【国際調査報告】
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