(57)【要約】体液中を循環するＤＮＡの検出方法。癌を患う被験者、または癌発生の危険性がある被験者を特定する工程と、被験者から体液試料を得る工程と、試料中の循環ＤＮＡの完全性を測定する工程とを備え、循環ＤＮＡが試料から精製されない方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液中の循環ＤＮＡ検出の方法であり、
癌を患う被験者、または癌発生の危険性がある被験者を特定する工程と、
前記被験者からの体液試料を得る工程と、
前記試料中の循環ＤＮＡの配列の完全性を測定する工程とを備え、
前記循環ＤＮＡが前記試料から精製されない方法。
【請求項２】
請求項１の方法において、前記体液が血清または血漿である方法。
【請求項３】
請求項１の方法において、前記循環ＤＮＡが該循環ＤＮＡの配列の完全性の指標となるＤＮＡマーカー反復配列を含む方法。
【請求項４】
請求項３の方法において、前記循環ＤＮＡが短鎖散在反復配列（ＳＩＮＥ）、長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）、またはその両方を含む方法。
【請求項５】
請求項１の方法において、前記循環ＤＮＡの配列の完全性が定量的リアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって測定される方法。
【請求項６】
請求項１の方法において、前記癌が乳癌、結腸直腸癌、膨大部癌、メラノーマ、または前立腺癌である方法。
【請求項７】
請求項１の方法において、前記循環ＤＮＡの配列の完全性が、循環ＤＮＡ総量、癌細胞から放出された循環ＤＮＡ量、癌細胞から放出された循環ＤＮＡ量の循環ＤＮＡ総量に対する比、またはそれらの組合せによって示される方法。
【請求項８】
請求項７の方法において、前記循環ＤＮＡ総量がＡＬＵ１１５の量で示され、前記癌細胞から放出された循環ＤＮＡ量がＡＬＵ２４７の量またはＬＩＮＥ１  ２９７の量で示され、前記癌細胞から放出された循環ＤＮＡの循環ＤＮＡ総量に対する比が前記ＡＬＵ２４７の量の前記ＡＬＵ１１５の量に対する比で示される方法。
【請求項９】
体液中の循環ＤＮＡ検出の方法であり、
体液試料から循環ＤＮＡを得る工程と、
試料中の前記循環ＤＮＡの配列の完全性およびメチル化の完全性の組合せを検出する工程とを備える方法。
【請求項１０】
請求項９の方法において、前記体液試料が、癌を患っていると特定された被験者、または癌発生の危険性があると特定された被験者に由来する方法。
【請求項１１】
請求項１０の方法において、前記癌が乳癌、結腸直腸癌、膨大部癌、メラノーマ、または前立腺癌である方法。
【請求項１２】
請求項９の方法において、前記循環ＤＮＡがＬＩＮＥ配列を含む方法。
【請求項１３】
請求項１２の方法において、前記循環ＤＮＡがＬＩＮＥ１  ２９７を含む方法。
【請求項１４】
請求項９の方法において、前記循環ＤＮＡのメチル化の完全性が循環ＤＮＡの非メチル化状態によって示される方法。
【請求項１５】
請求項１４の方法において、前記循環ＤＮＡの非メチル化状態がＬＩＮＥ１配列の非メチル化状態によって示される方法。
【請求項１６】
請求項９の方法において、前記体液が血清または血漿である方法。
【請求項１７】
請求項９の方法において、前記循環ＤＮＡの配列の完全性がｑＰＣＲによって検出される方法。
【請求項１８】
請求項９の方法において、前記循環ＤＮＡのメチル化の完全性が、メチル化された対立遺伝子の定量的解析（ＱＡＭＡ）によって検出される方法。
【請求項１９】
癌の診断、予後診断、および治療のための方法であり、
体液試料から循環ＤＮＡを得る工程と、
ＬＩＮＥ配列をマーカーとして用いて前記試料中の循環ＤＮＡのメチル化の完全性を検出する工程と、
癌の診断、予後診断、および治療における前記循環ＤＮＡのメチル化の完全性を応用する工程とを備える方法。
【請求項２０】
請求項１９の方法において、前記ＬＩＮＥ配列がＬＩＮＥ１である方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（財源）
本発明は、一部がナショナル・キャンサー・インスティチュート（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（Ｐ０１  ＣＡ  ２９６０５およびＰ０１  ＣＡ  １２５８２）からの助成金により支援されて行われたものである。従って、アメリカ合衆国政府は権利の一部を有する。
（関連出願）
本出願は、内容全体を参照して本明細書に組み入れられる、２００５年５月２７日に出願された米国特許仮出願第６０／６８５，１４８号明細書に対する優先権を請求する。
【０００２】
本発明は、癌一般に関する。更に具体的には、本発明は癌の診断、予後診断、および治療のためのマーカーとしての遊離循環ＤＮＡの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
腫瘍再発の代用マーカーとしてのゲノムバイオマーカーの使用は高悪性度腫瘍の性質決定を可能にすることができるが、特にアッセイの感度、予防診断の実用性、および連続的試料採取方法の改良が必要である。血液検査は、最低限の侵襲性であり、費用効果が高く、且つ頻繁な分析に適しているというこれらの基準に取り組んでいる。腫瘍細胞は、血液などの体液中にＤＮＡを放出することが示されている（１−１１）。その結果、腫瘍が放出したＤＮＡは、ＤＮＡ抽出およびＰＣＲ試験により同定されることができる。無細胞の血漿・血清中のＤＮＡバイオマーカーの存在が研究されてきたにもかかわらず、腫瘍生物学との関連性は不明である。機能的腫瘍生物学に関連することができる、さらに強力なアッセイおよび遺伝子型マーカーを開発する必要がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、体液中の遊離循環ＤＮＡをバイオマーカーとして用いる、癌の診断、予後診断、および治療のための方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一実施態様において、本発明は体液中の循環ＤＮＡ検出の方法を特徴とする。当該方法は、癌を患っている被験者、または癌発生の危険性がある被験者の特定、被験者からの体液試料の採取、および試料中の循環ＤＮＡ配列の完全性の測定を備え、当該循環ＤＮＡは試料から精製されていない。
【０００６】
「体液試料から精製されていないＤＮＡ」とは、体液試料から（例えば、遠心および／または濾過で）細胞を排除する処理、および（例えば、プロテイナーゼＫ消化で）タンパク質を排除する処理を行っただけで、試料からＤＮＡを精製するための更なる処置を行っていないことを意味する。
【０００７】
一実施形態において、循環ＤＮＡは、該循環ＤＮＡの配列の完全性の指標となる反復ＤＮＡマーカー配列を含む。「反復ＤＮＡ配列」とは、生物のゲノム中にＤＮＡの配列の複数のコピーが存在することを意味する。
【０００８】
循環ＤＮＡの完全性とは、配列の完全性とメチル化の完全性とを含む循環ＤＮＡの総体を意味する。配列の完全性とは配列の完備性を意味し、例えば循環ＤＮＡの総量（即ち、アポトーシス細胞から放出された循環ＤＮＡの総量と癌細胞から放出された循環ＤＮＡの総量）、癌細胞から放出された循環ＤＮＡの量、または癌細胞から放出された循環ＤＮＡの量の循環ＤＮＡの総量に対する割合を示す場合もある。メチル化の完全性とは、配列のメチル化の完全性を意味し、例えば、循環ＤＮＡのメチル化状態、非メチル化状態、またはその両方を表す場合もある。
【０００９】
一実施形態において、循環ＤＮＡの総量はＡＬＵ１１５の量で示され、癌細胞から放出された循環ＤＮＡの量はＡＬＵ２４７またはＬＩＮＥ１  ２９７の量で示され、癌細胞から放出された循環ＤＮＡ量の循環ＤＮＡの総量に対する割合はＡＬＵ２４７の量のＡＬＵ１１５の量に対する割合で示される。
【００１０】
別の実施態様において、本発明は、体液試料から循環ＤＮＡを得る工程と、試料中の循環ＤＮＡの配列の完全性とメチル化の完全性との組合せを検出する工程とを備える、体液中の循環ＤＮＡを検出する方法を特徴とする。
【００１１】
一実施形態において、循環ＤＮＡのメチル化の完全性は、循環ＤＮＡの非メチル化状態で示される。具体的には、循環ＤＮＡの非メチル化状態は、ＬＩＮＥ１配列の非メチル化状態で示される場合もある。
【００１２】
本発明は、癌の診断、予後診断、および治療の方法も提供する。この方法は、体液試料から循環ＤＮＡを得る工程と、マーカーとしてＬＩＮＥ配列を用いて試料中の循環ＤＮＡのメチル化の完全性を検出する工程と、癌の診断、予後診断、および治療における循環ＤＮＡのメチル化の完全性を応用する工程とを備える。
【００１３】
一部の実施形態においては、体液試料は癌を患っていると特定された被験者、または癌発生の恐れがあると特定された被験者に由来する。
本発明の方法において、体液試料は、例えば血清、血漿、尿、唾液、骨髄、リンパ液、涙液、漿液、腹水、胸膜液、乳管液、胃液、または膵液でもよい。癌は、例えば乳癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、膨大部癌（ＰＡＣ）、メラノーマ、前立腺癌（ＰＣａ）、胃癌、白血病・リンパ腫、腎細胞癌、肝細胞癌、神経由来腫瘍、頭頸部癌、肺癌、または肉腫でもよい。
【００１４】
循環ＤＮＡの配列の完全性は、例えば、定量的リアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、マイクロアレイ、ブロッティングによるプローブ、またはＥＬＩＳＡのようなゲル電気泳動に基づく比色検出法、化学発光法、デジタル検出法、および質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を用いて検出されてもよい。循環ＤＮＡのメチル化の完全性は、例えば、メチル化対立遺伝子の定量分析、ｑＰＣＲ、ゲル電気泳動、マイクロアレイ、質量分析法、デジタル検出法、または比色に基づく方法を用いて検出および定量されてもよい。
【００１５】
一部の実施形態では、循環ＤＮＡは、ＡＬＵのような短鎖散在反復配列（ＳＩＮＥ）、ＬＩＮＥ１のような長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）、またはこれらの組合せを含んでもよい。具体的には、循環ＤＮＡは、ＡＬＵ１１５、ＡＬＵ２４７、ＬＩＮＥ１  ２９７、またはこれらの組み合わせを含んでもよい。
【００１６】
ＡＬＵ１１５は、順方向プライマーの５’−ＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＧＧＡＧＴＴＣＧＡＧ−３’と逆方向プライマーの５’−ＣＣＣＧＡＧＴＡＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡ−３’とを用いてヒトゲノム中のＡＬＵ反復配列を増幅することによって得られる単位複製配列である。ＡＬＵ１１５のサイズは１１５塩基対である。
【００１７】
ＡＬＵ２４７は、順方向プライマーの５’−ＧＴＧＧＣＴＣＡＣＧＣＣＴＧＴＡＡＴＣ−３’と逆方向プライマーの５’−ＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧ−３’とを用いてヒトゲノム中のＡＬＵ反復配列を増幅することによって得られる単位複製配列である。ＡＬＵ２４７のサイズは２４７塩基対である。
【００１８】
ＬＩＮＥ１  ２９７は、順方向プライマーの５’−ＣＡＧＡＴＣＡＡＣＧＡＧＡＣＡＧＡＡＡＧＴＣＡ−３’と逆方向プライマーの５’−ＴＴＣＣＣＴＣＴＡＣＡＣＡＣＴＧＣＴＴＴＧＡ−３’とを用いてヒトゲノム中のＬＩＮＥ１反復配列を増幅することによって得られる単位複製配列である。ＬＩＮＥ１  ２９７のサイズは２９７塩基対である。
【００１９】
一実施形態において、メチル化ＬＩＮＥ１は、順方向プライマーの５’−ＧＴＣＧＡＡＴＡＧＧＡＡＴＡＧＴＴＴＣＧＧ−３’と逆方向プライマーの５’−ＡＣＴＣＣＣＴＡＡＣＣＣＣＴＴＡＣＧＣＴ−３’とを用いて検出および定量され、非メチル化ＬＩＮＥ１は、順方向プライマーの５’−ＧＴＴＧＡＡＴＡＧＧＡＡＴＡＧＴＴＴＴＧＧＴＴＴ−３’と逆方向プライマーの５’−ＡＣＴＣＣＣＴＡＡＣＣＣＣＴＴＡＣＡＣＴＴ−３’を用いて検出および定量される。
【００２０】
本発明は、癌の診断、予後診断、および治療のための簡単で強力な、高感度のハイスループットな方法を提供する。本発明の前記およびその他の特徴とそれを得る方法、あるいは用いる方法は、添付の図面を合わせ含む以下の説明を参照することでより明らかになり、最もよく理解されるだろう。これらの図面は本発明の典型的な実施形態を表現し、従って本発明の範囲を制限するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、少なくとも一部は血清中におけるＡＬＵ繰り返し配列とＬＩＮＥ１繰り返し配列とが、癌の診断、予後診断、および治療のための簡便で強力な、高感度のハイスループットな方法におけるマーカーとして利用可能であるという予期せぬ発見に基づいている。
【００２２】
体液中を循環する無細胞ＤＮＡは、悪性腫瘍の分子バイオマーカーである。アポトーシス細胞から放出された、均一に切断されたＤＮＡと異なり、壊死、身体的な死、分泌、または破損が原因で癌細胞から放出されたＤＮＡのサイズは様々である。更に、循環ＤＮＡのメチル化パターンの変化が癌の発生に役割を果たしていることが見いだされている。従って、循環ＤＮＡの配列の完全性およびメチル化の完全性は、癌の検出および管理に臨床的に有用である。
【００２３】
従って、本発明は体液中の循環ＤＮＡの検出方法を提供する。当該方法は、癌を患っている被験者、または癌発生の危険性がある被験者を特定する工程と、被験者から体液試料を得る工程と、試料中の循環ＤＮＡの配列の完全性を測定する工程とを備え、循環ＤＮＡは試料から精製されていない。
【００２４】
本願で用いられる場合、「被験者」とは、ヒト、または例えば霊長類（特に高等霊長類）、ヒツジ、犬、齧歯類（例えば、マウスまたはラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、および牛などといった全ての脊椎動物を含む動物を示す。好適な実施形態では、被験者はヒトである。別の実施形態では、被験者は実験動物、または疾患モデルとして適切な動物である。
【００２５】
本発明の方法は、疾患の臨床的証拠の有無にかかわらず、癌を患っている被験者、または癌発生の危険性がある被験者を特定する工程を含む。例えば、当該方法のための被験者は、癌の家族歴を有する被験者、手術前の癌患者、あるいは手術後の癌患者でもよい。被験者の特定は、被験者または医療従事者の判断である可能性がある。主観的（例えば、意見）または客観的（例えば、テストまたは診断法によって測定可能）である可能性もある。
【００２６】
体液試料は、癌細胞によって放出される遊離循環ＤＮＡが存在する可能性がある、任意の体液を含む。当該体液の例は、血液（血清／血漿）、骨髄（血清／血漿）、脳脊髄液、腹腔液、胸膜液、リンパ液、腹水、漿液、痰、涙液、便、尿、唾液、乳管液、胃液、および膵液を制限することなく含む。体液は、当技術分野に知られる任意の標準的方法を用いて採取されてもよい。
【００２７】
体液からの循環ＤＮＡの精製は、ＤＮＡの損失と、体液中に存在する細胞から放出されたＤＮＡによる混入とを引き起こす可能性がある。これは通常、より長い処理時間、複雑な処理方法、より高い費用、および感受性、特異性、一貫性の低下を招く。本発明の方法は、不要な精製段階を排除することによってこれらの問題を克服する。下記の実施例で述べるように、例えば遠心および／または濾過によって、潜在的な混入細胞を体液中から除くことができる。循環ＤＮＡの検出を妨げる可能性があるタンパク質を、例えばプロテアーゼＫ消化によって除去することができる。最低限の処理が行われた試料を、次に更なる精製無しに循環ＤＮＡの検出に用いることができる。
【００２８】
あるいは、循環ＤＮＡを体液からの細胞とタンパク質の除去後、当技術分野で知られる任意の方法を用いて更に精製することもできる。例えば、循環ＤＮＡをフェノールで抽出し、アルコールで沈殿させ、水溶液中に溶解させることも可能である。
【００２９】
循環ＤＮＡは、例えばｑＰＣＲ、マイクロアレイ、ブロッティングまたはゲル電気泳動によるプローブ、ＥＬＩＳＡなどの比色検出アッセイ、化学発光法、デジタル検出法、および質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）といった、当技術分野でよく知られる数多くの方法で検出および定量されることができる。好適な実施形態では、ＰＣＲ産物のルーチンの信頼できる定量を可能にするためにｑＰＣＲが採用されている。
【００３０】
一実施形態では、ｑＰＣＲに蛍光プローブが用いられる。蛍光プローブは、レポーター蛍光色素とクエンチャー色素との両方が結合したオリゴヌクレオチドである。プローブが無傷でいる間、クエンチャーの近傍ではレポーター色素が発する蛍光が非常に減少する。ＰＣＲの伸長段階の間、標的配列が存在していればプローブはプライマー部位の一つの下流にアニーリングし、このプライマーが伸長する際にＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって開裂する。プローブのこの開裂は、レポーター色素をクエンチャー色素から分離し、レポーター色素のシグナルが増大する。開裂は標的鎖からプローブを除去し、テンプレート鎖の端まで伸長が続くようにする。各サイクルで各プローブから更にレポーター色素分子が開裂し、生じた単位複製配列の量に比例した蛍光強度の増大をもたらす。
【００３１】
ｑＰＣＲのための機器、例えばＡＢＩ  ＰＲＩＺＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍが市販されている。試験試料中の標的の量の定量は、ＣＴ（閾値サイクル数）の測定と、試料中の標的の開始コピー数の測定との標準曲線を用いることで行われる。
【００３２】
方法の感度は、反復的なＤＮＡ配列を循環ＤＮＡ配列の完全性を示すマーカーとして用いる場合に上昇する。例えば、霊長類特異的ＡＬＵ配列（約３００ｂｐ）のＳＩＮＥは最も豊富で反復的なＤＮＡ配列であり、ヒトゲノムの＞１０％の割合を占める一方、ＬＩＮＥ１（＞６ｋｂ）はヒトゲノムの約１７％に相当する。下記の実施例に示したように、遊離循環ＤＮＡをＡＬＵ反復配列についてｑＰＣＲで定量した場合、血清中のＤＮＡ０．０１ｐｇの感度を達成することができる。
【００３３】
健康な被験者では、遊離循環ＤＮＡの主な源はアポトーシス細胞である。アポトーシス細胞は通常、１２０−２００ｂｐの長さのＤＮＡ断片を放出する。対照的に、癌細胞から放出されるＤＮＡのサイズは様々である。循環ＤＮＡの配列の完全性を、癌細胞から放出された循環ＤＮＡの量に関連する任意の数学的表現で示すことができる。例えば、循環ＤＮＡの配列の完全性は循環ＤＮＡの量、癌細胞から放出された循環ＤＮＡの量、癌細胞から放出された循環ＤＮＡの量の循環ＤＮＡの総量に対する割合で表現されることができる。
【００３４】
一実施形態では、ｑＰＣＲで循環ＤＮＡの総量を評価するために、アポトーシス細胞と非アポトーシス死を遂げつつある癌細胞との両方から放出されたＤＮＡ中の断片の増幅に使用することができるようにプライマーが設計される。一般的には、単位複製配列のサイズは１２０−２００ｂｐの範囲である。小さい断片ほど、体液からより迅速に除去される。その一方、アポトーシス細胞ではなく、癌細胞から放出された循環ＤＮＡの量を評価するために、アポトーシス細胞によって生じたＤＮＡには存在せず、癌細胞によって生じたＤＮＡに存在する断片を増幅するようにプライマーが選択される。このような断片のサイズは一般的に、２２０−４００ｂｐの範囲である。
【００３５】
また、体液試料から循環ＤＮＡを得る工程と、試料中の循環ＤＮＡ配列の完全性とメチル化の完全性との組合せを検出する工程とを備える、体液中の循環ＤＮＡを検出する方法も本発明の範囲である。任意で、当該方法は、体液の供給源となる被験者である、癌を患っている患者、または癌発生の危険性がある患者を特定する工程を備える。
【００３６】
循環ＤＮＡの配列の完全性は（体液からの精製の有無に関わらず）、上述の方法をふくむ当技術分野で知られる様々な方法を用いて検出および定量されることができる。
体液からの循環ＤＮＡ抽出方法と、配列のメチル化／非メチル化状態の検出の方法とは、当技術分野でよく知られている。例えば、循環ＤＮＡは体液から前記のように抽出されることができる。配列のメチル化／非メチル化状態は、例えば、ＱＡＭＡ、メチル化特異的ＰＣＲ、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ法（ＣＯＢＲＡ）、ピロシーケンス法、ｑＰＣＲ、ゲル電気泳動、マイクロアレイ、質量分析法、デジタル検出法、または比色に基づく方法で検出および定量されることができる。好適な実施形態では、単一反応で同時に増幅したメチル化対立遺伝子および非メチル化対立遺伝子の相対的定量にＱＡＭＡが用いられる。
【００３７】
一実施形態において、ＤＮＡは変性して亜硫酸水素で処理され、メチル化されたシトシンではなく、非メチル化シトシンをウラシルに転換する。亜硫酸水素修飾後、メチル化対立遺伝子はヌクレオチド配列内の全てのＣｐＧ位置で非メチル化対立遺伝子と異なっている。プライマーは、亜硫酸水素転換した標的配列のアンチセンス鎖を増幅するように設計される。ＣｐＧジヌクレオチドを欠くプライマー結合部位、ひいてはメチル化対立遺伝子および非メチル化対立遺伝子は、一つのプライマー対で同じ反応で増幅することができる。メチル化の識別は、一方はメチル化アリルに特異的に結合し、もう一方は非メチル化対立遺伝子に特異的に結合する、二つの別々に標識した内部マイナー・グルーブ・バインダー（ＭＧＢ）ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブのハイブリダイゼーションの間に起こる。それぞれの標的部位に結合したプローブは、ＰＣＲの間にＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性により開裂し、メチル化対立遺伝子および非メチル化対立遺伝子の増幅は別々にモニターされる。ＰＣＲの間に放出されたそれぞれの蛍光色素の量は、ｑＰＣＲシステムによって測定され、生じたそれぞれのＰＣＲ産物の量に正比例する。メチル化対立遺伝子および非メチル化対立遺伝子の定量は、標準曲線との比較で行われる。
【００３８】
循環ＤＮＡのメチル化の完全性は、非メチル化対立遺伝子の量に関する任意の数学的表現によって示される。例えば、循環ＤＮＡのメチル化の完全性は、非メチル化対立遺伝子の量、または非メチル化対立遺伝子の量のメチル化対立遺伝子の量に対する割合によって表現されることができる。
【００３９】
当該方法の感度は、反復的なＤＮＡ配列を循環ＤＮＡのメチル化の完全性を示すマーカーとして利用した場合に増大する。ＬＩＮＥ１は、非コード反復配列として特に適したマーカーである。好適な実施形態では、循環ＤＮＡのメチル化の完全性は特定のサイズの非メチル化ＬＩＮＥ１のみを評価することによって測定される。
【００４０】
体液中の循環ＤＮＡのメチル化の完全性と癌のパラメーターとの関連が認められた場合、本発明の上述の方法は癌の診断、予後診断、および治療に利用されることができる。このような関連を、例えば文献から、利用可能なデータの解析によって、または以下の実施例に述べる研究を通じて確認することができる。例えば、一実施形態において、体液試料は健康なコントロールおよび癌患者から、あるいは異なるカテゴリーの癌患者から採取される。循環ＤＮＡの完全性は、例えば上述の方法を用いて評価される。コントロールおよび患者、または異なるカテゴリーの患者の結果が比較される。もし循環ＤＮＡの完全性が、コントロールおよび患者、または異なるカテゴリーの患者で有意に異なるなら、循環ＤＮＡの完全性を癌の検出と管理のためのマーカーとして利用されることができる。一般的に、癌細胞から放出された循環ＤＮＡの量／割合の高さ、および／または体液中の非メチル化循環ＤＮＡの量／割合の高さは、進行性の癌と関連がある。
【００４１】
以下の実施例は、癌の存在、癌のステージ、原発性腫瘍のサイズ、リンパ管浸潤、リンパ節転移、および術後の再発を含む、血清中の循環ＤＮＡの完全性と関連するいくつかの癌パラメーターを提供する。
【００４２】
具体的には、乳癌において、血清ＡＬＵ１１５−ｑＰＣＲ値はＡＪＣＣステージＩＩおよびＩＩＩの癌患者で健康な女性よりも有意に高く、血清ＡＬＵ２４７−ｑＰＣＲ値はステージＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶの癌患者で健康な女性よりも有意に高く、血清（ＡＬＵ２４７−ｑＰＣＲ値）／（ＡＬＵ１１５−ｑＰＣＲ値）比はステージＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶの癌患者で健康な女性よりも有意に高い。浸潤性の原発性乳癌の患者では、血清（ＡＬＵ２４７−ｑＰＣＲ値）／（ＡＬＵ１１５−ｑＰＣＲ値）比および原発腫瘍のサイズは、有意に相関する。原発性乳癌の患者では、リンパ管浸潤（ＬＶＩ）陽性の癌患者はＬＶＩ陰性の癌患者よりも血清（ＡＬＵ２４７−ｑＰＣＲ値）／（ＡＬＵ１１５−ｑＰＣＲ値）比が有意に高い。原発性乳癌の患者では、リンパ節（ＬＮ）転移の患者はＬＮ転移が無い患者よりも血清（ＡＬＵ２４７−ｑＰＣＲ値）／（ＡＬＵ１１５−ｑＰＣＲ値）比が有意に高い。血清（ＡＬＵ２４７−ｑＰＣＲ値）／（ＡＬＵ１１５−ｑＰＣＲ値）比は、顕著なＬＮ転移の手術前予測の判断材料である。微小転移（ｐＮ１ｍｉ）の患者は、ＬＮ陰性の患者よりも血清（ＡＬＵ２４７−ｑＰＣＲ値）／（ＡＬＵ１１５−ｑＰＣＲ値）比が有意に高い。更に、乳癌の術後再発の患者は、ステージＩＩＩまたはＩＶの原発性乳癌の患者および血清（ＡＬＵ２４７−ｑＰＣＲ値）／（ＡＬＵ１１５−ｑＰＣＲ値）比が同等であり、また、健康な女性よりも高い。また、血清ＬＩＮＥ１  ２９７−ｑＰＣＲ値は、正常群よりも乳癌の患者で、ＬＮ陰性群よりＬＮ陽性群で、Ｔ０からＴ１群よりもＴ２からＴ４群で、またはステージ０からＩよりもステージＩＩＩの癌で有意に高い。
【００４３】
ＣＲＣでは、ステージＩ／ＩＩおよびＩＩＩ／ＩＶのＣＲＣ患者の血清ＡＬＵ１１５−ｑＰＣＲ値は、正常ボランティアよりも有意に高い。ステージＩ／ＩＩおよびＩＩＩ／ＩＶのＣＲＣ患者の血清（ＡＬＵ２４７−ｑＰＣＲ値）／（ＡＬＵ１１５−ｑＰＣＲ値）比も、正常ボランティアより有意に高い。
【００４４】
ＰＡＣでは、ステージＩ／ＩＩおよびＩＩＩ／ＩＶのＰＡＣ患者の血清（ＡＬＵ２４７−ｑＰＣＲ値）／（ＡＬＵ１１５−ｑＰＣＲ値）比も、正常ボランティアより有意に高い。
【００４５】
メラノーマでは、ＡＪＣＣステージ０／Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶのメラノーマ患者の血清ＡＬＵ２４７−ｑＰＣＲ値は、正常コントロールよりも有意に高い。血清（ＡＬＵ２４７−ｑＰＣＲ値）／（ＡＬＵ１１５−ｑＰＣＲ値）比は、疾患の進行とともに上昇する。一方、ステージＩの血清（ＡＬＵ２４７−ｑＰＣＲ値）／（ＡＬＵ１１５−ｑＰＣＲ値）比は正常コントロールとほぼ同じであり、ステージＩＩとＩＩＩは正常コントロールより高い。ステージＩＶのメラノーマ患者は、有意に高い血清（ＡＬＵ２４７−ｑＰＣＲ値）／（ＡＬＵ１１５−ｑＰＣＲ値）比を示す。
【００４６】
前立腺癌（ＰＣａ）では、ＡＪＣＣステージＩＶのＰＣａ患者の血清ＡＬＵ２４７−ｑＰＣＲ値および血清ＬＩＮＥ１  ２９７−ｑＰＣＲ値は、正常男性より優位に高い。ＡＪＣＣステージＩＩ−ＩＶのＰＣａ患者の血清ｕＬＩＮＥ１値も、正常男性より優位に高い。
【００４７】
本発明は、バイオマーカーとして体液中の遊離循環ＤＮＡを用いる、癌の診断、予後診断、および治療のための方法を提供する。これらの方法は、上述の方法を用いる体液中の循環ＤＮＡの完全性の測定を伴う。
【００４８】
例えば一実施形態では、本発明の診断方法は、上述の方法を用いて、癌が疑われる被験者に由来する体液試料中の循環ＤＮＡ完全性を測定する工程を備える。試料中の循環ＤＮＡの完全性は癌の存在の指標である。例えば、血清ＡＬＵ１１５−ｑＰＣＲ値が乳癌の可能性がある患者で健康な女性よりも高い場合、患者は乳癌を患っている可能性がある。
【００４９】
また本発明は、上述の方法を用いて、体液中の循環ＤＮＡの完全性をモニターすることによって被験者の癌の進行をモニターする方法も提供する。循環ＤＮＡの完全性の変化は癌の進行を示す。例えば、メラノーマ患者の血清ＡＬＵ２４７−ｑＰＣＲ値の上昇は、癌の進行を示す。この方法は、治療中に腫瘍の緩解と治療への反応を評価するためだけでなく、診断および治療後の疾患再発に対する個人のモニターに採用されることもできる。
【００５０】
本発明の予後診断の方法の一実施形態は、局所リンパ節転移、特に微小転移（不顕性疾患）の積極性の予測を伴う。当該方法は、上述の方法を用いて、癌患者に由来する体液試料中の循環ＤＮＡの完全性を測定する工程を備える。試料中の循環ＤＮＡの完全性は、局所リンパ節転移、特に微小転移の積極性の可能性の指標になる。例えば、手術前に原発性乳癌患者から採取した血清（ＡＬＵ２４７−ｑＰＣＲ値）／（ＡＬＵ１１５−ｑＰＣＲ値）比がＬＶＩ陰性及び／またはＬＮ陰性コントロールより高い場合、患者は微小転移を伴う局所リンパ節転移の発症がある可能性が高い。
【００５１】
更に、本発明は癌治療の反応の予測手段を提供する。例えば、本発明は被験者の手術後の癌再発の可能性を予測する方法を提供する。当該方法は、上述の方法を用いて、被験者に由来する体液試料中の循環ＤＮＡの完全性を測定する工程を備える。試料中の循環ＤＮＡの完全性は、被験者の癌再発の可能性の指標となる。例えば、手術後の乳癌患者の血清（ＡＬＵ２４７−ｑＰＣＲ値）／（ＡＬＵ１１５−ｑＰＣＲ値）比がステージＩＩＩまたはＩＶの原発性乳癌患者と同等であり、健康な女性より高い場合、患者は再発する可能性が高い。
【００５２】
本発明は更に、癌治療の効果を評価する方法を提供する。治療を癌患者に施し、被験者に由来する体液試料中の循環ＤＮＡの完全性を、上述の方法を用いて測定する。試料中の循環ＤＮＡの完全性は、治療効果が良好か乏しいかの指標となる。試料中の循環ＤＮＡの完全性は、被験者に治療を行う前に測定した値、または健康な被験者から得た値などのコントロールの値と比較されてもよい。一般的に、癌細胞から放出された循環ＤＮＡの量／割合の減少、および／または非メチル化循環ＤＮＡの量／割合の減少は治療が良好であることを示し、一方、癌細胞から放出された循環ＤＮＡの量／割合の増加、および／または非メチル化循環ＤＮＡの量／割合の増加は、治療が役に立たないことを示す。
【００５３】
また、本発明は癌を治療する化合物特定のための方法でもある。当該方法は、試験化合物の被験者に投与する工程と、上述の方法を用いる、被験者に由来する体液試料中の循環ＤＮＡの完全性を測定する工程とを備える。試料中の循環ＤＮＡの完全性は、化合物が癌治療の候補であるかどうかの指標になる。試料中の循環ＤＮＡの完全性は、試験化合物を被験者に投与する前に測定した値、または健康な被験者から得た値と比較されることもできる。一般的に、癌細胞から放出された循環ＤＮＡの量／割合、および／または非メチル化循環ＤＮＡの量／割合が低い場合には、試験化合物が癌治療の候補として見なされる。試験化合物は、当技術分野で知られた数多くの任意のアプローチを用いて得られる。例えば、米国特許出願第６，４６２，１８７号明細書を参照のこと。このように同定された化合物は、癌治療のための医薬組成に組み込まれることもできる。
【００５４】
更に、本発明は、癌治療のための方法を提供する。当該方法は、癌を患う被験者、あるいは癌発生の危険性がある被験者を特定する工程と、被験者に有効量の本発明の化合物を投与する工程とを備える。「治療」とは、疾患、疾患の症状、疾患の二次的な疾患状態、または疾患になり易い傾向の治療、緩和、軽減、矯正、予防、または改善を目的とする、被験者への物質の投与と定義される。「有効量」とは、治療された被験者に医薬的に望ましい結果をもたらすことができる化合物の量である。医薬的に望ましい結果は、客観的（即ち、あるテストまたはマーカーで測定可能である）、または主観的（即ち、被験者が効果の徴候を示すか、効果を感じる）である可能性がある。
【００５５】
本発明によって提供される癌の診断、予後診断、および治療のための一つの方法は、上述のように、体液試料からの循環ＤＮＡを得る工程と、マーカーとしてＬＩＮＥ配列（例えばＬＩＮＥ１）を用いる試料中の循環ＤＮＡのメチル化の完全性を検出する工程と、癌の診断、予後診断、および治療において循環ＤＮＡのメチル化の完全性を応用する工程とを備える。
【００５６】
体液中の循環ＤＮＡの完全性の指標となるマーカーは、特異性の違い、感度の違い、疾患のステージの違い、人種または性別の違い、あるいは地理的分布の違いでの至適な機能を達成するために本発明の方法に組み合わされることができる。マーカーの組合せは、疾患の進行に対して治療方法の効果に特に感度が良くなるように開発されることもできる。例えば、本発明のマーカーの組合せは、ＡＬＵ配列の完全性のマーカー、ＬＩＮＥ１配列の完全性のマーカー、およびＬＩＮＥ１メチル化の完全性のマーカーからなる群の任意の二つのメンバー、または三つ全てのメンバーを含んでもよい。下記の実施例に示すように、ＡＬＵ、ＬＩＮＥ１、ｕＬＩＮＥ１の組合せと、ＡＬＵ２４７およびｕＬＩＮＥ１の組合せとの両方とも、各個別のマーカーと比較して特異性の上昇を示している。
【００５７】
次の実施例は本発明の範囲を制限する意図ではなく、説明することを意図している。当該実施例は使用される可能性がある典型的な実施例ではあるが、当業者に知られたその他の方法が代わりに使用される可能性もある。実際、通常の技量の当業者は、本明細書に示す方法に基づいて、過度の実験無しに更なる実施形態を容易に構想して作り出すことができる。本明細書に引用した全ての文献は、その全体を参照して本明細書に組み入れる。
【００５８】
実施例Ｉ−血漿中より高い血清中の遊離循環ＤＮＡの量は、主に分離の間に混入した外来ＤＮＡに起因するわけではない。
（序文）
遊離循環ＤＮＡは、悪性腫瘍およびその他の疾患のバイオマーカーとして近年熱心に研究されてきた（４、１２−１８）。遊離循環ＤＮＡは通常、血清または血漿から得られる。これらの二つの供給源の間の最も顕著な違いは、血漿中の血小板はもちろん、凝固因子とそれに関連するタンパク質の存在である。いくつかの報告は、遊離循環ＤＮＡの量は血清に比べて血漿で顕著に低いことを示しているが（１９−２１）、この観察結果の理由はまだ論争中である（２０、２２）。血漿からの精製の間にＤＮＡが失われ血清からは失われないのであれば、血清ＤＮＡをバイオマーカーとして利用するのがより効果的である。しかし、全血から血清を分離する際に白血球またはその他の供給源からの外来ＤＮＡが図らずも血清に放出された場合には、血清ＤＮＡの使用は混入したＤＮＡに由来する誤った結果を引き起こすだろう。考えられる別の説明は、全血からの分離の際のＤＮＡの不均等な分配であり、この場合、血清ＤＮＡの使用は感度が上昇するだろう。
【００５９】
血清中で観察されたＤＮＡ量がなぜ血漿より多いのかを解明するため、同じ血液からＤＮＡの損失の可能性がないように同時に分離した血清と血漿中のＤＮＡ量を精密に定量した。発明者らが用いた方法は、ヒトゲノム中で最も豊富な（１．４ｘ１０６コピー）反復配列であるＡＬＵ反復配列の定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）であった（２３）。ＡＬＵ−ｑＰＣＲはＤＮＡ精製を行わずに最低限の処理を行った血清／血漿をテンプレートとして用いるのに十分に感度がよかった。
【００６０】
（材料と方法）
血液試料および血清／血漿の分離
２００５年に、ジョン・ウェイン癌研究所（Ｊｏｈｎ  Ｗａｙｎｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＪＷＣＩ）の臨床データベースから、乳癌（ｎ＝１２）、結腸直腸癌（ｎ＝８）、甲状腺癌（ｎ＝２）、および甲状腺腫（ｎ＝２）の患者２４人を無作為に選択した。全て患者がセントジョンズヘルスセンター（Ｓａｉｎｔ  Ｊｏｈｎ’ｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）およびＪＷＣＩの施設内倫理委員会（ＩＲＢ）委員会により示されたガイダンスに従った血液採取を承諾した。ＣＯＲＶＡＣ血清分離チューブ（シャーウッド−デイビス・アンド・ゲックス社（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ−Ｄａｖｉｓ＆Ｇｅｃｋ）［米国ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）所在］）中に１０ｍｌの血液を採取し、血清用に以下のように６時間以内に処理した：試料を遠心（１，０００ｘｇ、１５分）で分離し、潜在的な混入細胞を除去するために１３ｍｍの血清フィルター（フィッシャー・サイエンティフィック社（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）［米国ペンシルベニア州ピッツバーグ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ）所在］）で濾過した。同時に、血漿の単離のために、同様の方法で更に１０ｍｌの血液をクエン酸ナトリウムチューブ（ベクトン・ディクソン社（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）［米国ニュージャージー州フランクリンレイクス（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ）所在］）中に入れて採取した。
【００６１】
遊離循環ＤＮＡの定量
ＤＮＡ定量の感度を最大化するために、ヒトゲノム中で最も豊富な反復配列であるＡＬＵ配列をｑＰＣＲの標的として用いた。プライマーセットは、ＡＬＵのコンセンサス配列を増幅し、１１５ｂｐのサイズの単位複製配列を生じるように設計した。順方向プライマーの配列は、５’−ＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＧＧＡＧＴＴＣＧＡＧ−３’、逆方向プライマーの配列は、５’−ＣＣＣＧＡＧＴＡＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡ−３’であった。
【００６２】
ヒトの血清および血漿は、テンプレートＤＮＡまたはＤＮＡポリメラーゼに結合するタンパク質といったＰＣＲ反応を妨害する数多くの物質を含んでいる。従って、阻害因子を排除するために最低限の処理を行った血清／血漿を用いた。２０μｌの各血清／血漿試料を、２．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２０μｌの調製溶液と混合した。この混合液を１６μｇのプロテアーゼＫ（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）［米国カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）所在］）で、５０℃において４０分間消化し、９５℃で５分間の熱不活化後、１６０μｌのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で希釈した。１０，０００ｘｇで５分間の遠心後、０．１μｌ相当の量の血清／血漿を含む１μｌの上清を精製せずにＡＬＵ−ｑＰＣＲのテンプレートとして用いた。
【００６３】
各ＡＬＵ−ｑＰＣＲの反応混合液を、５ｍＭのＭｇ２＋を含む全反応用量の２０μｌ中、テンプレート、０．２μＭの順方向と逆方向のプライマー、１ユニットのｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）［米国カリフォルニア州ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）所在］）、０．０２μｌの蛍光キャリブレーション色素（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））、および１ｘ濃度のＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（モレキュラープルーブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）［米国オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ）所在］）で構成した。リアルタイムＰＣＲ増幅を、ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を用いて、９５℃で１０分間のＤＮＡポリメラーゼのプレサイクル熱活性化後、９５℃で３０秒の変性、６４℃で３０秒のアニーリング、および７２℃で３０秒の伸長の３５サイクルで行った。健康なボランティアの末梢血から得た精製したＤＮＡの連続希釈（１０ｎｇから０．０１ｐｇ）による標準曲線で、各試料中のＤＮＡの絶対的な当量を決定した。陰性コントロール（テンプレート無し）を各反応プレートで行った。ＰＣＲ産物を、産物のサイズとＰＣＲの特異性を確認するために２％アガロースゲル上で電気泳動した（図１Ａ）。
【００６４】
処理を行った血清／血漿におけるＡＬＵ−ｑＰＣＲへの阻害物質の影響を評価するため、健康なボランティアの末梢リンパ球から得た既知の量（１０ｎｇ）の精製ＤＮＡを二人の患者の血清／血漿ＡＬＵ−ｑＰＣＲの反応混合液と混合して定量した。テンプレートの血清／血漿中のＤＮＡ量をｑＰＣＲの結果から引いた。
【００６５】
統計解析
血清対血漿のＤＮＡ量を、対応のあるｔ−検定とデミング回帰分析により評価した。統計パッケージのＳＡＳ  ＪＭＰ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０．１（エスエーエス・インスチチュートインコーポレイテッド社（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．）［米国ノースカロライナ州ケアリー（Ｃａｒｙ）所在］）およびＥＰ  Ｓｕｉｔｅ  ９Ａ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．ａ（２４）（マーケムアソシエーツインコーポレイテッド社（ＭａｒＣｈｅｍ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）［米国マサチューセッツ州コンコード（Ｃｏｎｃｏｒｄ）所在］）を用い、Ｐ値＜０．０５（両側検定）を有意であると定義した。
【００６６】
（結果）
ＡＬＵ−ｑＰＣＲの感度および直線性
ＡＬＵ−ｑＰＣＲは、１０ｎｇから０．０１ｐｇまでの範囲にわたって９７％のＰＣＲ効率で直線性があり、回帰係数０．９９９の標準曲線が連続希釈したゲノムＤＮＡ二組の平均から得られた（図１Ｂ）。従って、血清／血漿の定量の下限は０．１ｐｇ／μｌであった。
【００６７】
血清／血漿中のＡＬＵ−ｑＰＣＲ因子に対する阻害効果の評価
２組の１０ｎｇの精製ＤＮＡの３回繰り返したＡＬＵ−ｑＰＣＲの結果は、血清で１０．２±１．８ｎｇであり、血漿で９．８±１．２ｎｇ（平均±標準偏差）であった。血清または血漿による有意な阻害効果は認められなかった。
【００６８】
ＡＬＵ−ｑＰＣＲによる血清および血漿中のＤＮＡ量
ＡＬＵ−ｑＰＣＲによる血清および血漿試料のＤＮＡ濃度はそれぞれ、９３０±７１０ｐｇ／μｌおよび１８０±１５０ｐｇ／μｌ（平均±標準偏差）であった（図２）。検体の各ペアのＤＮＡの血清：血漿比は、比が３２であった１対を除いて、正規分布に従った（平均：７．１、標準偏差：４．２）（図３）。従ってこのアウトライアーを、血清ＤＮＡ量の過大評価を避けるために以後の統計解析からは除外した。血清は血漿よりも有意に多い量のＤＮＡを含んでいた（Ｐ＜０．０００１、対応のあるｔ−検定）。
【００６９】
血清および血漿中の濃度分配を基準化するために、平方根変数変換の後にデミング回帰分析を行った（血漿ＤＮＡが０の時の血清ＤＮＡの切片値が必要なため、対数変換を適用できなかった）。デミング回帰分析は、血清中のＤＮＡ量および血漿中のＤＮＡ量の間に正の相関関係を示した（Ｒ＝０．７２とＰ＝０．０００２）。血漿ＤＮＡが０の時の回帰直線の切片値は８．７（９５％  ＣＩ、２．８−１４．５）であった（図４）。従って、推定された血漿ＤＮＡとは独立の血清中の外来ＤＮＡの量は、７６ｐｇ／μｌ（９５％  ＣＩ、７．８−２１０）で平均血清総ＤＮＡ量のわずか８．２％（９５％  ＣＩ、０．８％−２３％）に相当した。各ｑＰＣＲ血清値から７６ｐｇ／μｌを引いた後、血清は、対の血清より平均で６．１±３．５（平均±標準偏差）倍高いＤＮＡ濃度であった。この値は過去の報告の値と一致した（１９、２１）。
【００７０】
（考察）
いくつかの報告が、遊離循環ＤＮＡは血清よりも血漿中で少ないことを示しているが、この観察結果の背後にある理由を究明した報告はない。もっともらしい仮説は、血清の分離中に破裂した白血球が血清中にＤＮＡを放出した可能性があるという、血清ＤＮＡ濃度が白血球数と相関するという知見（２０）に基づく仮説である。血清では血漿より約４−６倍ＤＮＡが豊富であることから（１９、２１）、この説明は、血清中のＤＮＡの大部分が外来であり、従って、血清は良好なバイオマーカーにはなり得ないことを意味する。しかし、血清の臨床的な利用が過去の複数の研究で明確に示され（４、１２、１４、１７−１８）、このような仮説は事実に反すると考え、全血からの分離の際の不均等なＤＮＡ分配が原因である可能性があると仮説を立てた。
【００７１】
血清と血漿の間のＤＮＡ濃度の関係を研究しようとする試みはいずれも、低量のＤＮＡの扱いの難しさと、血清または血漿からのＤＮＡ精製の複雑さとに阻まれてきた。少量の血清および血漿試料中の正確なＤＮＡ定量は今まで非常に困難であった。血清／血漿ＤＮＡの定量に一般的に用いられる方法である、マイクロプレートリーダーによるＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（モレキュラープルーブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ））アッセイの感度の予備的な評価は、直線範囲の実用的な下限は、血清／血漿でおよそ２０ｐｇ／μｌであることを示した。これは主に、光検出器からのバックグラウンドノイズによる。このアッセイは、血漿ＤＮＡ、特に健康な個人からの試料中のＤＮＡの正確な評価には感度が不十分である。更に、血漿または血清中のＤＮＡは高度に切断されているため（２５）、精製プロセスの際のＤＮＡの回収は通常不完全であり、抽出方法の効率に依存する。従って、最初にＤＮＡを精製せずに血清と血漿中のＤＮＡを正確に定量するためのＡＬＵ反復配列を用いる高感度の方法を確立した。霊長類特異的なＡＬＵは、ヒトゲノム中で最も豊富な反復配列であり、ゲノム当たりのコピー数は約１４０万である（２３、２６−２７）。アポトーシス細胞から放出されるＤＮＡの大部分はアポトーシスの間の切断プロセスによって１８５−２００ｂｐの長さに切断されているため（２５）、ＡＬＵ反復配列中の１１５ｂｐの単位複製配列に対するプライマーセットを設計した。この方法は、単一細胞中のゲノムの約１／３００コピーに相当するわずか０．０１ｇのＤＮＡを高い直線性で正確に定量するに十分高い感度を達成した。結果として、必要なテンプレートＤＮＡが少量であるために、遊離循環ＤＮＡを血清／血漿からの精製無しで正確に定量することを可能にした。この定量方法は、尿道癌患者の尿、または唾液腺癌患者の唾液などの他の体液でのＤＮＡ測定のための臨床応用の可能性がある。
【００７２】
発明者らのＡＬＵ−ｑＰＣＲ手法はＤＮＡ精製の必要性を排除したため、血漿中のＤＮＡが低濃度であるのは、血漿からＤＮＡを精製する際にＤＮＡが失われる結果ではないことが証明された。更に、発明者らの結果は、血清ＤＮＡと血漿ＤＮＡの間の顕著な正の回帰を示し、推定された血清中の外来ＤＮＡの量は総血清ＤＮＡのわずか８．２％であった。従って、血清中の過剰量のＤＮＡが、血清の分離の際に白血球やその他の供給源から放出された外来ＤＮＡに主に由来する訳ではないことも示された。結果として、血清ＤＮＡおよび血漿ＤＮＡの濃度の違いに関して最もありそうな説明は、全血からの分離の際のＤＮＡの不均等なＤＮＡの分配である。推定された、この血清ＤＮＡの血漿ＤＮＡに対する倍率に基づき、血清は血漿の６．１倍量のＤＮＡを含む。これは、陰イオンであるＤＮＡと、やはり強力に陰イオンであり、血漿のみに存在する血小板との間の静電気力の結果である可能性がある。
【００７３】
結論として、血清は血漿の約６倍量の遊離循環ＤＮＡを含む。血液中で分離の段階で破壊された細胞からのＤＮＡといった外来ＤＮＡは、血清および血漿の間の差を説明するには比較的重要ではない。最も可能性がある説明は、全血からの分離の際のＤＮＡの不均等な分配である。発明者らは、血清はバイオマーカーとして循環している疾患に関連するＤＮＡにとってより良い検体の供給源であると提言する。
【００７４】
実施例ＩＩ−血清中の遊離循環ＤＮＡの完全性による乳癌進行の予測
（序論）
乳癌は米国の女性の癌による死亡を引き起こす第二位の原因であり、２００５年の女性の新規の癌症例の１／３を占める（２８）。乳癌患者にとっての最も重要な予後指標は、腋窩リンパ節（ＬＮ）転移である（２９）。癌のサイズが比較的大きい場合には、身体検査と、超音波検査またはコンピュータ断層撮影といった画像診断法とは、ＬＮ転移の効果的な検出法である。しかし、局所リンパ節転移または遠隔転移を予測的に検出できる、臨床的に確立された血液検査はない。従って、乳癌のＬＮ転移を検出するための手術前に適用可能な血液検査の開発が臨床的に望まれている。
【００７５】
腫瘍関連の無細胞ＤＮＡの血中の循環は、悪性腫瘍の検出と予後診断のための有望な分子バイオマーカーの候補である（４、１７−１８、３０）。血清中または血漿中に検出される循環ＤＮＡの絶対濃度は、乳癌の存在（３１）および予後（３２）に関連してきた。循環ＤＮＡで検出された腫瘍抑制遺伝子のメチル化に予後診断の可能性が有ることが示されている（３３−３６）。近年、短鎖ＤＮＡに対する長鎖ＤＮＡの割合として測定される循環ＤＮＡの完全性が、婦人科癌および乳癌で正常の個人より高いことが示された（３７）。アポトーシス細胞は通常、長さが１８５−２００ｂｐのＤＮＡ断片を放出する（２５）。この均一に切断されたＤＮＡは、アポトーシスの際のプログラムされた酵素的切断プロセスによって生じる（３８）。健康な個人では、遊離循環ＤＮＡの主要な供給源はアポトーシス細胞である。対照的に、悪性腫瘍の病的細胞死はアポトーシスだけでなく、壊死、自食作用、あるいは分裂死とも異なることから、悪性腫瘍細胞から放出されるＤＮＡのサイズは様々である（３９）。従って、長鎖ＤＮＡ断片濃度の上昇は、血中の悪性腫瘍ＤＮＡ検出のための良いマーカーである可能性がある（４０）。しかし、血中の遊離循環ＤＮＡの定量は、微量な循環ＤＮＡの取扱いが困難であることから実質的に利用されていなかった。
【００７６】
近年、発明者らは、血清ＤＮＡの完全性を直接的に測定する簡便で強力な、高感度のハイスループットな方法を開発した。本アッセイでは、ＤＮＡ断片のサイズに依存する定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を、血清０．１μｌ中に含まれるＤＮＡの定量に用いた。ｑＰＣＲの標的はＡＬＵ反復ＤＮＡ配列である。ＡＬＵ反復配列は、ゲノム当たり１４０万コピーのヒトゲノム中で最も豊富な配列である（２３、２６）。ＡＬＵ配列は短鎖散在反復配列（ＳＩＮＥ）であり、一般的に３００ヌクレオチドの長さであり、ヒトゲノムの１０％以上を占める（４１）。本アッセイでは、血清テンプレートによる障害が少ないことから、血清からのＤＮＡ精製は不要である。ＤＮＡの完全性は、短鎖ＤＮＡに対する長鎖ＤＮＡの割合として計算され、ＡＬＵ反復配列に対する二つのプライマーセット（１１５ｂｐと２４７ｂｐ）でのｑＰＣＲにより定量される。このアプローチを適用するに当たり、発明者らは、血清ＤＮＡの完全性の評価は乳癌における局所ＬＮ転移の手術前の予測に有用であることを示した。また発明者らは、血清ＤＮＡの完全性も米国対癌合同委員会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ）（ＡＪＣＣ）の乳癌ステージ分類の進行と直接的相関関係があることを示した。
【００７７】
（材料と方法）
血清試料、臨床、病理学的情報
健康な女性５１人および手術前のＡＪＣＣステージ０−ＩＶの原発性乳癌の女性８３人（ステージ０：８人、ステージＩ：２４人、ステージＩＩ：２７人、ステージＩＩＩ：２１人、ステージＩＶ：３人）の血清試料を評価した。血液を原発性乳癌の手術前に採取した。ステージ分けは、ステージ０−ＩＩＩは手術後の組織病理学的所見に基づき、ステージＩＶは画像診断を用いた。全患者を、２０００年−２００５年の間に米国カリフォルニア州サンタモニカ（Ｓａｎｔａ  Ｍｏｎｉｃａ）にあるジョイス・アイゼンバーグ・キーファー・乳癌センター（Ｊｏｙｃｅ  Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  Ｋｅｅｆｅｒ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃｅｎｔｅｒ）およびセントジョンズヘルスセンターのエンジェルス・クリニック（Ａｎｇｅｌｅｓ  Ｃｌｉｎｉｃ  ａｔ  Ｓａｉｎｔ  Ｊｏｈｎ’ｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）を訪れた患者のなかから、データベース・コーディネーターによって選択した。本研究の全患者は、セントジョンズヘルスセンター（Ｓａｉｎｔ  Ｊｏｈｎ’ｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）とＪＷＣＩ施設内倫理委員会が示したガイドラインに従った同意を示した。
【００７８】
直接的ｑＰＣＲのための血清の調製
１０ｍｌの血液を、凝固活性化剤およびバリアゲルが入ったＣＯＲＶＡＣ血清分離チューブ（シャーウッド−デイビス・アンド・ゲックス社（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ−Ｄａｖｉｓ＆Ｇｅｃｋ）［米国ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）所在］）中に採取し、４℃で保存し、以下のように６時間以内に処理した。血液を遠心（１，０００ｘｇ、１５分）で分離し、考えられる、混入している細胞を除去するために１３ｍｍの血清フィルター（フィッシャー・サイエンティフィック社（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）［米国ペンシルベニア州ピッツバーグ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ）所在］）を通した。血清を直ちに−８０℃で凍結保存した。ｑＰＣＲの結果を無効にする可能性があるテンプレートＤＮＡまたはＤＮＡポリメラーゼに結合するタンパク質を不活性化または除去するために、２０μｌの各血清試料を、２．５％のＴｗｅｅｎ−２０、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２０μｌの調製バッファーと混合した。これを１６μｇのプロテイナーゼＫ溶液（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）［米国カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）所在］）で、５０℃において２０分間消化し、その後、９５℃で５分の熱不活化と不溶化を行った。その後１０，０００ｘｇで５分間の遠心の後、０．２μｌの上清を各ＰＣＲ反応のテンプレートとして用いた。
【００７９】
ＡＬＵ反復配列の定量的ＰＣＲ
高感度のＤＮＡ定量を達成するために、ＡＬＵのコンセンサス配列を増幅するプライマーセットを利用する、新規のｑＰＣＲアッセイを利用した（図６Ａ）。ＡＬＵのコンセンサス配列を増幅する二組のプライマーセットを設計した。１１５ｂｐの単位複製配列用のプライマーセットは（アポトーシスによって切断された）短鎖ＤＮＡ断片と長鎖ＤＮＡ断片との両方を増幅するが、一方、２４７ｂｐの単位複製配列用のプライマーセット（ＡＬＵ２４７）は長鎖ＤＮＡ断片のみを増幅する（図６Ｂ）。ＡＬＵ１１５プライマーの配列は、順方向：５’−ＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＧＧＡＧＴＴＣＧＡＧ−３’と逆方向：５’−ＣＣＣＧＡＧＴＡＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡ−３’であり、ＡＬＵ２４７プライマーの配列は、順方向：５’−ＧＴＧＧＣＴＣＡＣＧＣＣＴＧＴＡＡＴＣ−３’と逆方向：５’−ＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧ−３’であった。ＡＬＵ１１５−ｑＰＣＲの結果は遊離血清ＤＮＡの総量を示し、ＡＬＵ１１５プライマーは循環ＤＮＡの大部分の分画を増幅することができる。ＡＬＵ２４７−ｑＰＣＲの結果は、非アポトーシス細胞、つまり組織病理学的に分類された死細胞から放出されたＤＮＡの量を示す。ＤＮＡの完全性は、ｑＰＣＲの結果の比（ＡＬＵ２４７−ｑＰＣＲ／ＡＬＵ１１５−ｑＰＣＲ）として計算される。ＡＬＵ１１５のアニーリング部位はＡＬＵ２４７のアニーリング部位内にあるため、ｑＰＣＲ比（ＤＮＡの完全性）は、テンプレートＤＮＡが切断されていない場合には１．０であり、全てのテンプレートＤＮＡが２４７ｂｐ未満の断片に完全に切断された場合には０．０である。
【００８０】
ｑＰＣＲ反応を上述のように行った。全てのｑＰＣＲアッセイを、検体の識別情報無しに盲検法で行った。３回繰り返した反応から平均値を計算した。
統計解析
健康な女性および乳癌の各ステージの患者の平均値を、ダネット多重比較を用いて比較した。二つの群の間の平均値を、スチューデントｔ−検定を用いて比較した。ＡＪＣＣステージおよび血清ＤＮＡの完全性の間の傾向を特定するためにスピアマンr係数を用いた。臨床病理学的特性および血清ＤＮＡの完全性のＬＮ転移に対する影響を、多変量解析のための名義ロジスティック回帰モデルを用いて評価し、単変量解析（Ｐ＜０．１０）により示された変数を入れた。血清ＤＮＡの完全性の平均の、患者の年齢および腫瘍の臨床病理学的情報における依存関係の可能性の評価に線形回帰および多重線形回帰を用いた。統計解析を行うに当たっては統計パッケージのＳＡＳ  ＪＭＰ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０．１（エスエーエス・インスチチュートインコーポレイテッド社（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．）［米国ノースカロライナ州ケアリー（Ｃａｒｙ）所在］）を用い、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析には、ＭｅｄＣａｌｃ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ８．０（メドカルク・ソフトウェア（ＭｅｄＣａｌｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）［ベルギー、マリアケルク（Ｍａｒｉａｋｅｒｋｅ）所在］）を用いた。Ｐ値＜０．０５（両側検定）を有意と見なした。
【００８１】
（結果）
原発性乳癌の臨床的および病理学的特徴
健康な女性５１人の平均年齢は４５±１４（標準偏差）歳であり、原発性乳癌の患者８３人の平均年齢は５８±１２歳であった。表１は、手術前に血清を採取した乳癌患者のＡＪＣＣステージおよび組織病理学的特徴を示す。ステージ０の全ての癌は非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）で、患者の平均年齢は５９±１１（標準偏差）歳であり、腫瘍の平均サイズは２．５±１．９（標準偏差）ｃｍであった。局所ＬＮ転移の患者４２人のうち、１０人は孤立微小転移（ｐＮ１ｍｉ、サイズ≦２ｍｍ）があった。
【００８２】
【表１】
2008545418.tif 000002
2008545418.tif 000003
原発性乳癌の血清中循環ＤＮＡおよびＡＪＣＣステージ
手術前に血液を採取した患者の血清中の循環ＤＮＡを、血清ＤＮＡの濃度および完全性で評価した。ＡＬＵ１１５−ｑＰＣＲ値は、血清ＤＮＡの絶対総量を表す。血清ＤＮＡの絶対濃度が指数分布にフィットしたため、各値に対数変換を適用した。健康な女性と、ステージ０、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶの乳癌患者とにおいて、対数変換したＡＬＵ１１５−ｑＰＣＲ値の平均はそれぞれ２．４３±０．１０（標準誤差）、２．８８±０．１６、２．４９±０．０８、２．７７±０．０６、２．８９±０．１３、３．０２±０．１１（ｐｇ／μｌのｌｏｇ１０）であった。これらの平均値は、ステージＩＩおよびＩＩＩで健康な女性より有意に高かった（それぞれＰ＝０．０１、およびＰ＜０．０００１）。ステージＩＶの癌における上昇傾向が観察されたが顕著ではなかった。
【００８３】
ＡＬＵ２４７−ｑＰＣＲ値は、おそらく非アポトーシス死細胞から放出された血清ＤＮＡの長鎖断片の絶対量を表す。健康な女性と、ステージ０、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶの乳癌患者とにおいて、対数変換したＡＬＵ２４７−ｑＰＣＲ値の平均はそれぞれ１．５３±０．０９、２．０５±０．２０、１．５４±０．１１、２．０１±０．０８、２．３０±０．１５、２．５５±０．１２（ｐｇ／μｌのｌｏｇ１０）であった。これらの平均は、ステージＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶで健康な女性より有意に高かった（それぞれＰ＝０．００２、Ｐ＜０．０００１、およびＰ＝０．０１４）。
【００８４】
総血清ＤＮＡ中の長鎖ＤＮＡ断片の割合を示す血清ＤＮＡの完全性を、各試料の（ＡＬＵ２４７−ｑＰＣＲ値）／（ＡＬＵ１１５−ｑＰＣＲ値）として計算した。健康な女性とステージ０、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶの乳癌患者において、血清ＤＮＡの完全性の平均値はそれぞれ、０．１３±０．０１（標準誤差）、０．１６±０．０２、０．１２±０．０１、０．２１±０．０２、０．２９±０．０３、０．３５±０．０４であった。これらの平均は、ステージＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶの乳癌患者において明確な特徴的な差があり、健康な女性より有意に高かった（それぞれＰ＝０．００５、Ｐ＜０．０００１、およびＰ＝０．００２）（図７Ａ）。
【００８５】
ＡＬＵ１１５−ｑＰＣＲ値およびＡＬＵ２４７−ｑＰＣＲ値は、ＡＪＣＣステージにつれて増加する傾向を示した。しかし、血清ＤＮＡの完全性もＡＪＣＣステージに従った更に顕著な増加を示した。ＡＪＣＣステージのＡＬＵ１１５−ｑＰＣＲ値とＡＬＵ２４７−ｑＰＣＲ値とのスピアマンr係数、および血清ＤＮＡの完全性はそれぞれ０．２２（Ｐ＝０．０４）、０．３９（Ｐ＝０．０００３）、および０．５４（Ｐ＜０．０００１）であった。血清ＤＮＡの完全性は最も高い相関係数を示したため、腫瘍進行をより良く表現していた。健康な女性からＡＪＣＣステージＩＩ−ＩＶの乳癌患者（Ｎ＝５１）を識別するための血清ＤＮＡの完全性のＲＯＣ曲線は、０．７９（９５％  ＣＩ、０．７０−０．８６）の曲線下面積（ＡＵＣ）であった（図７Ｂ）。特異性を８０％に設定した場合、検出感度は６９％であり、血清ＤＮＡの完全性のカットオフ値は０．１７であった。
【００８６】
原発性乳癌の血清ＤＮＡの完全性および病理学的特徴
血清ＤＮＡの完全性は、健康な女性（Ｐ＝０．１８、一変量回帰モデル）および乳癌患者（Ｐ＝０．２０、ＡＪＣＣステージとの多重回帰モデル）の年齢に依存しなかった。年齢は血清ＤＮＡの完全性の交絡因子ではなかった。浸潤性原発性乳癌の患者７５人では、血清ＤＮＡの完全性および原発腫瘍のサイズは顕著に関連した（Ｒ＝０．４８、Ｐ＜０．０００１）（図８）。リンパ管浸潤（ＬＶＩ）が組織病理検査で見いだされた原発性乳癌の患者８２人では、３４例のＬＶＩ陽性腫瘍および４８例のＬＶＩ陰性腫瘍における血清ＤＮＡの完全性の平均はそれぞれ０．２５±０．０２（標準誤差）および０．１７±０．０２であった。１症例の原発腫瘍のＬＶＩは得られなかった。ＬＶＩ陽性の癌患者は、ＬＶＩ陰性の癌患者より有意に高い血清ＤＮＡの完全性の平均であった（Ｐ＜０．０００１）（図９）。原発性乳癌の患者８３人では、ＬＮ転移陽性の４２人およびＬＮ転移陰性の４１人の血清ＤＮＡの完全性の平均はそれぞれ０．２７±０．０２および０．１４±０．０２であった。ＬＮ転移の患者は、ＬＮ転移がない患者よりも血清ＤＮＡの完全性の平均が有意に高かった（Ｐ＜０．０００１）（図１０Ａ）。ＬＮ転移がない患者から局所ＬＮ転移患者を識別するための血清ＤＮＡの完全性の解析ＲＯＣ曲線では、ＡＵＣが０．８１（９５％  ＣＩ、０．７２−０．８９）であった（図１０Ｂ）。特異性を８０％に設定した場合、ＬＮ転移予測のための検出感度は７４％であり、血清ＤＮＡの完全性のカットオフ値は０．１８であった。
【００８７】
ＬＮ転移状態の多変量ロジスティック解析を、年齢、腫瘍サイズ、組織学的悪性度、ＬＶＩ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、ＨＥＲ２レベル、および血清ＤＮＡの完全性からの段階的な変数選択で行った。ＬＶＩ（Ｐ＜０．０００１）および血清ＤＮＡの完全性（Ｐ＝０．０００２）は、ＬＮ転移に対して有意であった。血清ＤＮＡの完全性は、ＬＮ転移の唯一顕著な手術前の前兆であった。
【００８８】
微小転移（ｐＮ１ｍｉ）の患者１０人は、血清ＤＮＡの完全性の平均が０．２５±０．０２（標準誤差）であり、ＬＮ陰性の患者よりも顕著に高かった（Ｐ＜０．０００１）。この違いは、血清ＤＮＡの完全性はリンパ節微小転移の血清バイオマーカーとして臨床的な実用性があり得ることを示唆する。
【００８９】
（考察）
研究は様々なタイプの癌患者の血清または血漿における、様々は形の遊離循環ＤＮＡ濃度の上昇を示している（１２、４２−４４）。悪性腫瘍用の分子バイオマーカーとしての循環ＤＮＡは、対立遺伝子不均衡、遺伝子のメチル化、および遺伝子変異の形での検出が可能である（４５）。最近、膵臓癌患者の無細胞血漿ＤＮＡの長さが健康なコントロールより長いことが示された（２５）。別の研究は、特定の遺伝子の４００ｂｐおよび１００ｂｐのｑＰＣＲ閾値から計算した循環ＤＮＡの完全性は、婦人科癌および乳癌検出用の分子バイオマーカーである可能性があることを示した（３７）。腫瘍を通る直接のリンパ液の流れまたは血流は様々な腫瘍細胞を散布することができ、死んだ腫瘍細胞から血流に放出されるＤＮＡの拡散を促進することから、悪性腫瘍からの血流へのＤＮＡの放出はＬＶＩにより促進されると推測される。結果として、循環ＤＮＡは、腫瘍の進行および腫瘍の生物学的悪性度を示す腫瘍細胞の代謝回転速度と直接的に関係する可能性がある。従って、循環ＤＮＡの完全性には、乳癌の進行およびＬＮ転移を検出する予後診断上の重要な実用性があると仮定した。
【００９０】
血清中の循環ＤＮＡの完全性を高感度で再現性良く測定するため、ＡＬＵ反復配列に対して新しく開発されたｑＰＣＲを用いた。ＡＬＵ−ｑＰＣＲアッセイは血清を直接テンプレートとして用いることから、ＤＮＡ精製の過程に関連する人為的な影響を排除する。ＡＬＵ１１５およびＡＬＵ２４７のプライマーセットを用いる直接的ｑＰＣＲは、高い直線性でわずか０．０１ｐｇの少量ＤＮＡ（単一細胞中のゲノムの約１／３００に相当）を検出した。このような高感度はテンプレートの必要な体積を最低限にし、ひいては血清中の物質により引き起こされる阻害を無視できるほど小さくする（４６）。阻害の影響は、同じテンプレート血清と試薬（プライマーを除く）を使うほぼ同一の二つのｑＰＣＲアッセイの割合であるＤＮＡの完全性の計算によって更に減少する。血清の分離の際に、操作に起因する細胞の溶解が長鎖ＤＮＡ断片を血清に放出し、ＤＮＡの完全性を上げる可能性がある。従って、残っている混入細胞を血清から除去するためにフィルターを用いた。報告によれば、血液を２４時間以内に処理しなかった場合には、血清ＤＮＡ濃度は自発的な細胞溶解によって上昇するが（１９）、採血後、室温で８時間の保存は分離プロトコルで血清ＤＮＡ濃度の顕著な上昇を引き起こさなかった。従って、血液を採取後６時間以内に処理した。対となる血漿試料と比較した様々な腫瘍の患者由来の血清試料２４例の予備的な評価では、発明者らのプロトコルでは血清中の総ＤＮＡのわずか８．２％が外来であった（４８）。更に、直接的ＡＬＵ−ｑＰＣＲのテンプレートとしての血清使用は、血漿を使うよりより安定で再現性があった。従って、本研究においてＤＮＡ完全性評価の試料供給源として血清を用いた。
【００９１】
血清ＤＮＡの絶対濃度は癌の存在の前兆になり得ることが示されている（３１−３２）。本研究での結果は、ＡＬＵ１１５−ｑＰＣＲ値として測定した血清ＤＮＡの絶対濃度が、ＡＪＣＣステージＩＩおよびＩＩＩの乳癌患者で平均して上昇することを示した。また一方、血清ＤＮＡの完全性は血清ＤＮＡの絶対濃度よりも腫瘍の進行との相関係数が高いことを見いだした。従って、血清ＤＮＡの完全性は乳癌の進行のより良い代表物であると考えられた。
【００９２】
患者のＤＮＡのクリアランス速度は、血清ＤＮＡの絶対濃度に直接的に寄与する。対照的に、長鎖および短鎖ＤＮＡ断片はともに同じように影響を受けるだろうことから、ＤＮＡの完全性の値に著しく影響することはない。更に、ＤＮＡがどのように放出されたかを反映しないＤＮＡの絶対濃度と対照的に、ＤＮＡの完全性は非アポトーシス細胞死の相対量を特異的に示す。従って、ＤＮＡの完全性は腫瘍の細胞死の指標になる可能性があり、また腫瘍の検出と進行の有望なバイオマーカーである可能性もある。
【００９３】
本研究では、血清ＤＮＡの完全性の平均は、ＬＶＩ陽性腫瘍の患者で有意に高かった。更に、血清ＤＮＡの完全性は、ＬＮ転移の非常に著しい予測値であった。微小転移癌の患者でさえも、血清ＤＮＡの完全性は健康な女性より有意に高い値を示し、この指標はＬＮ転移の初期ステージで上昇することを示している。対照的に、ＤＣＩＳ患者の血清ＤＮＡの完全性の平均は上昇せず、健康な女性と同様であった。これらの知見は、血清ＤＮＡの完全性の平均が局所的な疾患拡大の可能性がある乳癌患者の手術前評価に有用である可能性があることを示唆している。
【００９４】
手術後の再発の監視バイオマーカーとしての血清ＤＮＡの完全性の利用を評価するために、更に乳癌の術後再発した女性１５人の評価を行った。これらの患者の血清ＤＮＡの完全性の平均は０．３０±０．０３（標準誤差）であり、ステージＩＩＩまたはＩＶの乳癌患者と同等であり、健康な女性の平均値より高かった。この予備的知見は、術後再発の監視での血清ＤＮＡの完全性の利用の可能性を示した。
【００９５】
要約すると、血清ＤＮＡの完全性の平均は、健康な女性から採取した血清よりも、進行性ステージの乳癌の患者から採取した血清で高かった。血清ＤＮＡの完全性の評価は、ＡＪＣＣステージＩＩ−ＩＶの原発性乳癌の検出に特異性８０％で６９％の感度を達成し、原発性乳癌のＬＮ転移の検出に特異性８０％で７４％の感度を達成した。腫瘍に関連する循環ＤＮＡを指数化するこの迅速で低侵襲性のアプローチは、ＬＮ転移のスクリーニング・ツールとして、また手術前の予測に見込みがある。
【００９６】
実施例ＩＩＩ−結腸直腸癌と膨大部癌の患者の血清における遊離循環ＤＮＡの完全性上昇：ＡＬＵ反復配列に対する直接的な定量的ＰＣＲ
（序文）
結腸直腸癌（ＣＲＣ）および膨大部癌（ＰＡＣ；ｐｅｒｉａｍｐｕｌｌａｒｙ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）は、米国における１９９５−２０００年の間の癌に関連する死亡原因のそれぞれ第三位と四位であった（２８）。更に、進行ＣＲＣの癌の死亡率は不満の残るものであり、全ての癌のなかで膵臓癌の死亡率が最も悪い。膵臓癌患者の約８０％は切除不可能な疾患があり、５年生存率がわずか４％という結果である（２８）。予後および治療の改善の要は、悪性腫瘍の初期診断である。しかし、大部分のＣＲＣとＰＡＣは無症候性で、初期ステージで症状を生じるのは稀である。消化管癌のための、例えば癌胎児性抗原（ＣＥＡ）またはＣＡ１９−９といった従来の腫瘍マーカーによるスクリーニングは、検出が安定せず、また良性疾患でも上昇することから効率に限界があった（４９−５０）。従って、広く応用可能な高感度のスクリーニング・ツールの開発が臨床的に望まれている。
【００９７】
血清または血漿中の遊離循環ＤＮＡは、悪性腫瘍の診断および予後診断のためのバイオマーカーとして提案されてきた（４、１７−１８）。近年、長鎖対短鎖のＤＮＡ断片の相対的な増加によって測定された、血漿でのＤＮＡの完全性の上昇が婦人科癌および乳癌の存在を予測可能であると報告された（３７）。その報告では、血漿ＤＮＡの完全性の値は、特定の遺伝子の二つの単位複製配列（４００ｂｐと１００ｂｐ）に対する定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって評価された閾値サイクル数から得られた。その前提は、壊死性の悪性腫瘍細胞から放出されるＤＮＡは様々なサイズであるが、一方、アポトーシス細胞から放出されたＤＮＡは１８５−２００ｂｐに均一に切断されているということである（２５）。健康な個人では遊離循環ＤＮＡの主な供給源はアポトーシス細胞であることから、圧倒的多数の長鎖ＤＮＡ断片は悪性腫瘍検出のマーカーになり得る（４０）。しかし、遊離循環ＤＮＡの完全性は、感度と特異性が確認されていないことから臨床利用にはまだ実用的でない。考えられる制限は、ＤＮＡの収量を減少させる、血清または血漿からのＤＮＡの精製である可能性がある。ＤＮＡの損失は断片のサイズに逆に依存する可能性があり、ＤＮＡの完全性の値に影響する。
【００９８】
最近、発明者らは、血清中の遊離循環ＤＮＡの完全性を測定するための、簡便で強力な、高感度でハイスループットな方法を開発した。この方法は、０．１μｌの体積に相当する血清をＤＮＡ精製無しにテンプレートとしてＡＬＵ反復配列に対する定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を利用する。ＡＬＵはヒトゲノム中で最も豊富な反復配列であり、ゲノム当たり約１４０万コピーである（２３、２６）。ＡＬＵ配列は一般的に、３００ヌクレオチドの長さの短鎖散在反復配列（ＳＩＮＥ）であり、ヒトゲノムの１０％以上の割合を占める（４１）。ＡＬＵ因子は、レトロポジション過程でＲＮＡポリメラーゼＩＩＩに由来する転写を介して進化を通じてゲノム中で増加する（２７、５１）。従って、適切に設計したプライマーセットによるＡＬＵ反復配列のｑＰＣＲでは、ＤＮＡ測定のサイズ依存性の感度が劇的に上昇する可能性がある。このＣＲＣとＰＡＣの試験的研究で、この方法を詳細に述べ、高感度の腫瘍バイオマーカーとしての血清ＤＮＡの完全性の実用性を証明する。
【００９９】
（材料と方法）
血清試料と臨床病理学的情報
ＣＲＣ患者３２人、ＰＡＣ患者１９人、健康なボランティア５１人からの血清試料を評価した。ＰＡＣは膵管腺癌１５例、膨大部癌２例、細葉細胞癌１例、および十二指腸癌１例を含んだ。血液を治療介入の前に採取した。患者を、ＪＷＣＩとＵＣＬＡで１９９７年から２００５年までに治療された患者に基づいてデータベース・コーディネーターにより選択された。本研究の全患者は、ＪＷＣＩとＵＣＬＡの施設内倫理委員会（ＩＲＢ）により示されたガイドラインに従って承諾を得た。３２人のＣＲＣ患者のうち、３人がＡＪＣＣステージＩの疾患であり、１４人がステージＩＩであり、６人がステージＩＩＩであり、９人がステージＩＶであった。１９人のＰＡＣ患者のうち、２人がＡＪＣＣステージＩの疾患であり、９人がステージＩＩであり、１人がステージＩＩＩであり、７人がステージＩＶであった。ステージ分けは、術後の摘出した癌の病理的知見、または摘出不可能な癌の画像診断に基づいた。臨床病理学的データを、全患者に対するＩＲＢの承認後に入手した。
【０１００】
ＡＬＵ反復配列の定量的ＰＣＲ（ＡＬＵ−ｑＰＣＲ）
本研究でのＡＬＵ−ｑＰＣＲの標的は、ヒトＡＬＵ散在反復配列のコンセンサス配列であった（図１１Ａ）。上述のように、ＡＬＵ１１５とＡＬＵ２４７の二組のプライマーセットをＡＬＵ−ｑＰＣＲ反応に用いた。
【０１０１】
ｑＰＣＲ反応を上述のように行った。全てのｑＰＣＲアッセイを、盲検法の方法で検体の識別情報無しに実施し、３回繰り返した反応から平均値を計算した。ＰＣＲ産物を、産物のサイズとＰＣＲの特異性を確認するために２％のアガロースゲルで電気泳動した。
【０１０２】
ＤＮＡの完全性を、二つのプライマーセットを用いたｑＰＣＲ結果の比、Ｑ１１５とＱ２４７をそれぞれＡＬＵ１１５とＡＬＵ２４７プライマーを用いたＡＬＵ−ｑＰＣＲの結果としてのＱ２４７／Ｑ１１５として計算した。
【０１０３】
血清の調製および直接的ＡＬＵ−ｑＰＣＲ
血清の調製を上述のように行った。
ＡＬＵ−ｑＰＣＲの評価
本研究で用いたＡＬＵ−ｑＰＣＲ法は新しく開発されたため、最初に精製したＤＮＡ、または血清をテンプレートとして、ＡＬＵ−ｑＰＣＲ自体の性能を評価した。
【０１０４】
ＡＬＵ１１５またはＡＬＵ２４７プライマーによるＡＬＵ−ｑＰＣＲの感度と直線性を、連続希釈した既知の量の健康なボランティアの末梢血白血球（ＰＢＬ）から得た精製ＤＮＡを用いて評価した。更に、血清ＤＮＡに対するＡＬＵ１１５プライマーを用いたＡＬＵ−ｑＰＣＲの結果を、二重鎖ＤＮＡ定量用の高感度の蛍光核酸色素ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（モレキュラープルーブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ））試薬の結果と比較した。正常ボランティア１５人およびＰＡＣ患者８人（評価セット）の血清ＤＮＡを従来の手法で次のように抽出して精製した。既に述べられたように、分離および濾過した５００μｌの血清を４００μｇのプロテイナーゼＫ溶液（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ））で１％ＳＤＳとともに消化し、ＤＮＡをフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールおよびエタノール沈殿によって精製した（１８）。
【０１０５】
ＡＬＵ１１５およびＡＬＵ２４７プライマーを用いた直接的ＡＬＵ−ｑＰＣＲの再現性を、０．１μｌの体積に相当する各評価セットの各血清を用いて、３回繰り返した反応によって評価した。
【０１０６】
直接的ＡＬＵ−ｑＰＣＲに対する血清中の物質の阻害効果も評価した。１０ｎｇの精製したＰＢＬ  ＤＮＡ（Ｐ）、０．１μｌ相当の体積の血清（Ｓ）、およびその混合物（Ｐ＋Ｓ）を含む試料を評価セットの各血清に対して調製した。（Ｐ）、（Ｓ）、および（Ｐ＋Ｓ）中のＤＮＡ量を、ＡＬＵ１１５とＡＬＵ２４７プライマーを用いたＡＬＵ−ｑＰＣＲにより別々に定量した。ＡＬＵ−ｑＰＣＲに対する血清阻害効果を以下のように計算した。ＡＬＵ１１５プライマーについては１．０−（Ｑ１１５（Ｐ＋Ｓ）−Ｑ１１５（Ｓ））／Ｑ１１５（Ｐ）、ＡＬＵ２４７プライマーについては１．０−（Ｑ２４７（Ｐ＋Ｓ）−Ｑ２４７（Ｓ））／Ｑ２４７（Ｐ）で、Ｑ１１５（ｘ）とＱ２４７（ｘ）はそれぞれＡＬＵ１１５とＡＬＵ２４７プライマーを用いた試料ｘについてのＡＬＵ−ｑＰＣＲ結果である。ＤＮＡの完全性に対する血清の阻害効果を以下のように計算した：１．０−（Ｑ２４７（Ｐ＋Ｓ）−Ｑ２４７（Ｓ））／（Ｑ１１５（Ｐ＋Ｓ）−Ｑ１１５（Ｓ））。
【０１０７】
統計解析
血清ＤＮＡの絶対濃度または完全性と臨床病理学的特徴との比較を、ダネット多重比較を用いて評価した。評価の識別能力を評価するために、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析を用いた。統計解析を行うに当たっては統計パッケージのＳＡＳ  ＪＭＰ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０．１（エスエーエス・インスチチュートインコーポレイテッド社（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．）［米国ノースカロライナ州ケアリー（Ｃａｒｙ）所在］）を用いた。Ｐ値＜０．０５（両側検定）を有意と見なした。
【０１０８】
（結果）
ＡＬＵ−ｑＰＣＲの感度、直線性、および再現性
長さに依存したＤＮＡ定量法としてのＡＬＵ−ｑＰＣＲの性能を評価するために、精製したゲノムＤＮＡを用いてＡＬＵ−ｑＰＣＲの感度、直線性、および再現性を試験した。
【０１０９】
算出されたテンプレートＤＮＡ断片の長さに対するＡＬＵ−ｑＰＣＲの相対効率を図１１Ｂに示した。実線はＡＬＵ１１５プライマーセットを用いたＡＬＵ−ｑＰＣＲの推定効率を示し、＜１１５ｂｐで０％であり、１１５０ｂｐで９０％であり、点線はＡＬＵ２４７プライマーセットを用いたＡＬＵ−ｑＰＣＲの推定効率を示し、＜２４７ｂｐで０％であり、２４７０ｂｐで９０％であった。結果として、アポトーシス過程によるＤＮＡ開裂の長さをカバーする１１５ｂｐから２４７ｂｐの間のＤＮＡ断片がＡＬＵ１１５プライマーで増幅できたが、ＡＬＵ２４７プライマーでは増幅できなかった。
【０１１０】
健康なボランティアのＰＢＬから得たゲノムＤＮＡの連続希釈（１０ｎｇから０．０１ｐｇ）に対する、ＡＬＵ１１５またはＡＬＵ２４７プライマーを用いたＡＬＵ−ｑＰＣＲの閾値サイクル数を図１２Ａに示す。両方のプライマーセットで、１０６の範囲にわたって直線性が維持され、対数回帰直線はＡＬＵ１１５プライマーがＲ＝０．９９８であり、ＡＬＵ２４７プライマーがＲ＝０．９９９であり、感度は単一細胞中のゲノムの約１／３００に相当するわずか０．０１ｐｇ程度の少量であった。ＡＬＵ１１５およびＡＬＵ２４７プライマーセットの１０、１、０．１、０．０１ｐｇのゲノムＤＮＡテンプレートに対する、２８サイクルの温度サイクルによるＰＣＲ産物の電気泳動によるアガロースゲル像は、主要な異常バンド無しに標的配列が特異的に増幅されたことを確認した（図１２Ｂ）。
【０１１１】
ＡＬＵ−ｑＰＣＲの感度も、正常ボランティア１５人およびＰＡＣ患者８人由来の臨床試料を用いて評価した（図１３）。評価セットの各血清検体５００μｌから精製したＤＮＡの量を、抽出した総ＤＮＡの１／１０量を使ったＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイと、抽出した総ＤＮＡのわずか１／５０００量を用いたＡＬＵ１１５プライマーによるＡＬＵ−ｑＰＣＲの二つの方法で測定した。健康なボランティア由来の大部分で血清試料は、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイで正確な定量を行うにはＤＮＡの量が少なすぎた。対照的に、ＡＬＵ−ｑＰＣＲは血清のＤＮＡ定量に十分な感度と直線性があった。比較的高い血清ＤＮＡ濃度を示し検体のＡＬＵ−ｑＰＣＲの結果は、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイと１：１の直線性を示した（図１３）。
【０１１２】
直接的ＡＬＵ−ｑＰＣＲの再現性を、評価セットの各血清検体の０．１μｌに相当する用量を用いて３回繰り返した反応で評価した。ＡＬＵ１１５プライマーとＡＬＵ２４７プライマーに対する複製の変動係数（ＣＶ）の中央値はそれぞれわずか０．０９（四分位範囲ＩＱＲ：０．０７−０．１４）および０．１７（ＩＱＲ：０．０８−０．２４）であった。これらのＣＶ値は、その他の遺伝子に特異的なプライマーによるｑＰＣＲの値に相当する。
【０１１３】
直接的ＡＬＵ−ｑＰＣＲに対する血清の阻害効果
テンプレートとして直接的ＡＬＵ−ｑＰＣＲに用いた未精製の血清ＤＮＡが反応効率を阻害し得るため、ＡＬＵ−ｑＰＣＲに血清の阻害効果をテストした。
【０１１４】
ＡＬＵ１１５プライマーとＡＬＵ２４７プライマーによるＡＬＵ−ｑＰＣＲに対する血清の阻害効果の中央値はそれぞれ０．０９（ＩＱＲ：０．０３−０．２０）および０．２４（ＩＱＲ：０．０９−０．３７）であった。ＤＮＡの完全性に対する阻害効果の中央値は０．１２（ＩＱＲ：０．０８−０．１８）であった。ＡＬＵ−ｑＰＣＲの高感度がＡＬＵ−ｑＰＣＲのための血清テンプレートの必要性を減少させたので、血清の阻害効果は限定された。
【０１１５】
血清ＤＮＡの絶対濃度および完全性
正常ボランティア：男性１８人、女性３３人からなる正常ボランティア５１人の平均年齢は４８±１１（標準偏差）歳であった。正常ボランティアにおける血清ＤＮＡの平均絶対濃度は０．３４±０．２５（標準誤差）ｎｇ／μｌであった。血清ＤＮＡの完全性の平均は０．１３±０．０１であった。正常ボランティアにおける血清ＤＮＡの絶対濃度および完全性は、性別および年齢とは独立していた。
【０１１６】
ＣＲＣ患者：男性１９人、女性１２人からなるＣＲＣ患者３２人の平均年齢は６６±１４（標準偏差）歳であった。ステージＩ／ＩＩとステージＩＩＩ／ＩＶとのＣＲＣ患者の血清ＤＮＡの平均絶対濃度はそれぞれ１．６３±０．４３と１．７３±０．４５ｎｇ／μｌであり、正常ボランティアの値より有意に高かった（それぞれ、Ｐ＝０．００６とＰ＝０．００４）（図１４Ａ）。血清ＤＮＡの絶対濃度で健康なボランティアからＣＲＣ患者を識別するためのＲＯＣ曲線では、曲線下面積が０．７５であった（図１４Ｂ）。ステージＩ／ＩＩとステージＩＩＩ／ＩＶとのＣＲＣ患者の血清ＤＮＡの完全性の平均はそれぞれ０．２２±０．０２および０．２２±０．０２であり、正常ボランティアより有意に高かった（それぞれ、Ｐ＝０．００２とＰ＝０．００６）（図１５Ａ）。血清ＤＮＡの完全性で健康なボランティアからＣＲＣ患者を識別するためのＲＯＣ曲線では、曲線下面積が０．７８であった（図１５Ｂ）。血清ＤＮＡの完全性および血清ＤＮＡの絶対濃度のＲＯＣ曲線は類似しており、ＣＲＣの検出に関して血清ＤＮＡの完全性が血清ＤＮＡの絶対濃度と同等である可能性を示している。
【０１１７】
ＰＡＣ患者：男性１２人、女性７人からなるＰＡＣ患者１９人の平均年齢は６８±９（標準偏差）歳であった。ステージＩ／ＩＩとステージＩＩＩ／ＩＶとのＰＡＣ患者の血清ＤＮＡの平均絶対濃度はそれぞれ０．８４±０．５３および０．６６±０．６２ｎｇ／μｌであった。癌患者の値と正常ボランティアの値との有意差はなかった（それぞれ、Ｐ＝０．８５とＰ＝０．９）（図１６Ａ）。血清ＤＮＡの絶対濃度で健康なボランティアからＰＡＣ患者を識別するためのＲＯＣ曲線では、ＡＵＣがわずか０．５９であった（図１６Ｂ）。ステージＩ／ＩＩとステージＩＩＩ／ＩＶとのＰＡＣ患者の血清ＤＮＡの完全性の平均はそれぞれ０．２２±０．０３および０．３０±０．０３ｎｇ／μｌであり、正常ボランティアの値より有意に高かった（それぞれ、Ｐ＝０．０２２とＰ＜０．０００１）（図１７Ａ）。血清ＤＮＡの完全性でＰＡＣ患者を正常ボランティアから識別するためのＲＯＣ曲線では、ＡＵＣが０．８０であった（図１７Ｂ）。これは、血清ＤＮＡの絶対濃度のＡＵＣより高く、ＰＡＣの検出に関して血清ＤＮＡの完全性が血清ＤＮＡの絶対濃度より有用であることを示している。
【０１１８】
（考察）
血清／血漿中の遊離循環ＤＮＡは、死んだ腫瘍細胞から放出されるＤＮＡを含むため、癌の有望なバイオマーカーである。Ｋ−ｒａｓといった癌特異的な体細胞の遺伝子変異の検出がＣＲＣ患者または膵臓癌患者の血清／血漿で示されてきた（６、５２−５３）。血清／血漿の遊離循環ＤＮＡの絶対濃度の定量による癌の検出は、複数の文献でも報告されている（１６，４２−４４）。血漿ＤＮＡの完全性は婦人科癌および乳癌の存在の予後指標であることが報告された（３７）。
【０１１９】
上記の指標のうち、発明者らは、ＤＮＡの完全性は癌細胞死を示す可能性があり、従って、癌の存在または進行に対する広く応用可能なバイオマーカーになり得ると考えた。しかし、血清／血漿中の非常に低濃度のＤＮＡを扱う難しさが技術的に実用化を阻んできた。ＤＮＡの精製過程でＤＮＡが損失し、これが遊離循環ＤＮＡの評価において問題になっている。更に、血清／血漿ＤＮＡの回収率はＤＮＡ断片のサイズに依存しており、ＤＮＡの完全性の重要な変動因子となっている。これらの問題を克服するため、血清中のＤＮＡの絶対量および完全性を直接測定するために、ＡＬＵ−ｑＰＣＲ法を開発した。
【０１２０】
ＡＬＵは最も豊富な配列であるため（２３，２６）、ＡＬＵ−ｑＰＣＲは血清の直接評価に十分な高感度がある。直接的ＡＬＵ−ｑＰＣＲにおけるＤＮＡ精製の除外は、血清中の短鎖および長鎖のＤＮＡ断片の比を安定化した。また、各反応プレートの連続希釈したゲノムＤＮＡに対して同時に行ったｑＰＣＲで得た標準曲線は、反応プレート間のＡＬＵ−ｑＰＣＲの結果の変動を最小限にした。またＤＮＡ精製の除外は、スクリーニング・ツールの実現の上で重要な要因である、評価のための試薬と労働コストを減らした。将来の大規模な評価のために、直接的ＡＬＵ−ｑＰＣＲはロボットによる自動化に容易に応用可能である。この評価には非常に少量の血清が必要なので、スクリーニング・ツールとしての利用に適合可能である。
【０１２１】
遊離循環ＤＮＡの濃度は、血清では血漿の４−６倍高い（１９、２１、４８）。この差は分離の際に混入した外来ＤＮＡを反応するものではないため、疾患に関連する血清は循環ＤＮＡのより良い供給源検体である（４８）。しかし、血清の分離の際に末梢血リンパ球の細胞溶解が人為的なＤＮＡの完全性の上昇を引き起こす可能性がある。血清ＤＮＡの上昇は、採血後のオーバーナイトの凝固で観察されたと報告されている（１９）。従って、血液を採血後６時間以内に処理した。
【０１２２】
この試験的研究で示されたように、血清ＤＮＡの完全性は、ＲＯＣ曲線で示されたように、ＣＲＣとＰＡＣ検出のための臨床的に有用なバイオマーカーである。血清ＤＮＡの完全性は、限局性のＣＲＣとＰＡＣでさえ著しく上昇する。従って、悪性腫瘍疾患の集団検診に有用である可能性がある。しかし、どの壊死細胞または機械的に破壊された細胞も長鎖ＤＮＡ断片を放出するため、負傷（５４）、急性炎症、または梗塞などの非腫瘍性疾患の患者は血清／血漿ＤＮＡの完全性が高い可能性がある。妊娠は、母胎の血流中の胎児性ＤＮＡのために偽陽性の原因となる可能性がある（５５）。このような条件が、悪性腫瘍のためのスクリーニング・ツールとしてのアッセイの除外基準になる可能性がある。
【０１２３】
血清ＤＮＡの絶対濃度は、この試験的研究ではＣＲＣの予測の判断材料となる値であったが、ＰＡＣではそうならなかった。従って、血清ＤＮＡの完全性は血清ＤＮＡの絶対濃度よりもより良いバイオマーカーであると考えられる。しかし本研究では、進行癌の一部の症例に由来する血清は、より低い血清ＤＮＡの完全性をもたらしたＡＬＵ１１５プライマーを用いたＡＬＵ−ｑＰＣＲで非常に高い値を示した。このような例では、血清ＤＮＡの完全性より血清ＤＮＡの絶対量がより良い血清バイオマーカーである可能性がある。従って、血清ＤＮＡの絶対濃度と完全性の複合指標は、癌検出の偽陰性を減らす可能性がある。
【０１２４】
結腸直腸癌は米国における癌に関連する死亡の第三位の原因である（２８）。死亡率を低下させ、生存者を増加させる方法は、スクリーニング計画の実施からもたらされた。スクリーニングと診断方法を提供するため、患者は侵襲的で比較的費用がかかる検査である大腸内視鏡検査をするようしばしば求められる（５６）。その後の手術による介入は生存率の改善をもたらしてきた（５７）。これらの方法にも関わらず、過度に高い割合の初期ステージのＣＲＣ患者（１５−２０％）が局所的再発や遠隔再発を患う（２８）。監視はＣＥＡ、大腸内視鏡検査、および放射線画像の使用を義務づけている。このようなフォローアップは費用がかかり、手術後の患者の圧倒的多数に対して費用効率的でない（５８）。ＤＮＡの完全性にはスクリーニングおよび監視の助けになる可能性がある。
【０１２５】
膨大部癌、特に膵臓癌は、アメリカの癌に関連する死亡の４番目に一般的な原因である（２８）。２００５年の膵臓癌の新規症例、推定３２，１９０例のうち、８０−９０％の患者が臨床的に明らかな転移疾患、または切除不能の証拠となるＸ線像を示す（２８）。残念ながら、膵臓癌に対する効果的なスクリーニング・プログラムは開発されておらず、患者はしばしば偶然、あるいは症状が生じた後に検出される。簡便で安価なスクリーニング方法であるＤＮＡの完全性は、より積極的なＸ線検査を開始する推進力をもたらす可能性がある。こういった幸運にも初期に診断された人達には、外科的切除が唯一の治癒の望みをもたらす。厳密な外科技術および組織病理学的診断の順守にもかかわらず、患者の８０％までが初期の局所領域での再発をおこす（５９−６０）。従って、ＤＮＡの完全性を手術後の監視ツールとしても利用することができる。
【０１２６】
結論として、直接的ＡＬＵ−ｑＰＣＲは、血清中の遊離循環ＤＮＡの完全性を測定する、臨床利用のための簡便で強力な、高感度のハイスループットな方法である。ＤＮＡ精製段階の排除は、技術的な人工物と試薬および労働のコストを減らした。血清ＤＮＡの完全性はＣＲＣおよびＰＡＣの患者において有意に上昇した。血清ＤＮＡの完全性はＣＲＣおよびＰＡＣ検出の有望なバイオマーカーである。直接的ＡＬＵ−ｑＰＣＲの高感度は、他のヒト体液中のＤＮＡ濃度またはＤＮＡの完全性の測定に応用し得る可能性を示唆している。
【０１２７】
実施例ＩＶ−ステージＩＶのメラノーマ患者における循環ＤＮＡのＤＮＡの完全性の上昇
（材料と方法）
血清試料および臨床病理学的情報
健康なボランティア６５人とＡＪＣＣステージ０からＩＶのメラノーマ患者８３人の末梢血から分離した血清中の遊離循環ＤＮＡの濃度を評価した。施設内倫理委員会の承認とセントジョンズヘルスセンター（Ｓａｉｎｔ  Ｊｏｈｎ’ｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）およびジョン・ウェイン癌研究所（Ｊｏｈｎ  Ｗａｙｎｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）合同委員会からの組織病理学的立証を本研究の開始前に得た。
【０１２８】
直接的ｑＰＣＲのための血清の調製
血清を、上述のように、ＣＯＲＶＡＣ血清分離チューブ中に採取した血液１０ｍｌから分離し、採血後２−６時間以内に処理を行った。
【０１２９】
ＡＬＵ反復配列のｑＰＣＲ
ＡＬＵ１１５およびＡＬＵ２４７のｑＰＣＲには、前述のように二組のプライマーセットを用いた。ＤＮＡの完全性は、（ＡＬＵ２４７プライマーによるｑＰＣＲ結果）／（ＡＬＵ１１５プライマーによるｑＰＣＲ結果）として計算した。
【０１３０】
ｑＰＣＲの反応を、ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）［米国カリフォルニア州ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）所在］）で行った。各直接的ｑＰＣＲの反応液を、０．１μｌに相当する処理済みの血清、０．２μＭの順方向および逆方向プライマー、１ｕのｉＴａｑＤＡＮポリメラーゼ（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））、０．０１μｌのフルオレセイン・キャリブレーション色素（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））、および１ｘ濃度のＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（モレキュラープルーブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）［米国オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ）所在］）で構成した。評価セットには、０．２５μｌの血清から抽出したＤＮＡをテンプレートとして用いた。リアルタイムＰＣＲ増幅を、５ｍＭのＭｇ２＋を含む２０μｌの反応体積で、９５℃で１０分のＤＮＡポリメラーゼの活性化後、９５℃で３０秒、６４℃で３０秒、７２℃で３０秒の３５サイクルで実施した。各試料中の絶対的等価ＤＮＡ量を、連続希釈した（１０ｎｇから０．０１ｐｇ）健康なボランティアの末梢血から得たゲノムＤＮＡの標準曲線を用いて決定した。テンプレートを含まない陰性コントロールを各反応プレートで行った。全ての試料を、試料の認識情報の事前知識無しに盲検法の方法で解析した。全てのｑＰＣＲ反応を３回繰り返して平均値を計算し、その後の解析に用いた。
【０１３１】
統計解析
ＤＮＡの完全性と臨床病理学的特徴との関係を、一変量解析のためのウイルコクソンの順位和検定と多変量解析のためのロジスティック回帰モデルを用いて評価した。正常コントロールとその他の群との比較にダネット多重比較を用いた。ＡＪＣＣステージと、ｑＰＣＲ結果またはＤＮＡの完全性との傾向の検出にスピアマンρ係数を用いた。一変量解析で示唆された（Ｐ＜０．１０）変数に多変量解析を適用した。統計解析を行うに当たっては、統計パッケージのＳＡＳ  ＪＭＰ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０．１（エスエーエス・インスチチュートインコーポレイテッド社（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．）［米国ノースカロライナ州ケアリー（Ｃａｒｙ）所在］）を用いた。Ｐ値＜０．０５（両側検定）を有意と見なした。
【０１３２】
（結果）
血清中の長鎖／短鎖循環ＤＮＡの量
血清中の長鎖ＤＮＡ断片の量は非アポトーシス細胞死によって放出されたＤＮＡを表すため、ＡＬＵ２４７−ｑＰＣＲでこれを定量した。正常コントロールと、ＡＪＣＣステージ０／Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶのメラノーマとにおける長鎖ＤＮＡ断片の指数変化値の平均（ｐｇ／μｌ）はそれぞれ１．４０±０．０８、２．１８±０．１６、２．２２±０．１９、２．３７±０．２２、および２．４７±０．０９であった（平均±標準誤差）（図１８Ａ）。ＡＪＣＣステージ０／Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶのメラノーマには、正常コントロールより有意に多い長鎖ＤＮＡ断片があった（それぞれＰ＜０．０００１、Ｐ＜０．０００１、Ｐ＜０．０００１、およびＰ＜０．０００１）。長鎖ＤＮＡ断片の量に照らしたステージ０−ＩＩＩのメラノーマおよびステージＩＶのメラノーマの存在についての受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線では、曲線下面積（ＡＵＣ）がそれぞれ０．８７と０．８９であった（図１８Ｂおよび１８Ｃ）。
【０１３３】
循環ＤＮＡにおけるＤＮＡの完全性
長鎖ＤＮＡ断片の相対量を評価するため、各試料のＤＮＡの完全性を（ＤＮＡの完全性）＝（ＡＬＵ２４７のｑＰＣＲ結果）／（ＡＬＵ１１５のｑＰＣＲ結果）として計算した。正常コントロールとＡＪＣＣステージ０／Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶのメラノーマとにおけるＤＮＡの完全性の平均値はそれぞれ０．１３±０．０１、０．１２±０．０２、０．１６±０．０２、０．１９±０．０３、および０．２２±０．０２であった（平均±標準誤差）（図１９Ａ）。メラノーマ患者では、ＤＮＡの完全性は疾患の進行とともに上昇した（スピアマンのr＝０．４７、Ｐ＜０．０００１）。ステージＩのＤＮＡの完全性は正常コントロールとほぼ同じであり、ステージＩＩおよびＩＩＩはより高いＤＮＡの完全性の値を示す傾向があった。ステージＩＶのメラノーマ患者は、有意に高いＤＮＡの完全性の値を示した（Ｐ＜０．０００１）。長鎖ＤＮＡの量によるメラノーマの存在についての受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線では、曲線下面積（ＡＵＣ）が０．８２であった（図１９Ｂ）。
【０１３４】
（考察）
ＡＬＵ２４７−ｑＰＣＲで定量化した長鎖ＤＮＡの量は、健康な個人では見られない非アポトーシス細胞から放出されたＤＮＡを表す。従って、これは、悪性腫瘍などの特定の種類の疾患検出のための有望なバイオマーカーである。対照的に、ＡＬＵ１１５のｑＰＣＲ（短鎖ＤＮＡ断片）の結果は循環ＤＮＡの総量を表し、アポトーシス細胞および非アポトーシス細胞の両方から放出されるＤＮＡを含む。従って、この値は異常状況のみでなく、基礎代謝率といったドナーの生命状態にも影響される可能性がある。短鎖ＤＮＡ断片に対する長鎖ＤＮＡ断片の比であるＤＮＡの完全性は、体内の全細胞死に対する非アポトーシス細胞死の相対量を表す。
【０１３５】
メラノーマ患者の循環ＤＮＡを評価した過去の研究では、ＤＮＡ量の定量にはいくつかの方法が用いられた。通常、血清からのＤＮＡの回収率およびＤＮＡサイズの分布は抽出方法に非常に依存する。例えば、ＤＮＡ親和性カラム法は通常、１００−２００ｂｐ未満の短いＤＮＡ断片を失う。従って、アポトーシス細胞からのＤＮＡ放出の定量は、カラム法では不正確である。また、ＤＮＡの定量は利用可能なＤＮＡ量に制限があると困難である。特定の遺伝子の遺伝子座の定量的ＰＣＲを利用する最近の方法が高感度を達成したが、癌細胞の対立遺伝子不均衡が結果に影響する可能性があり、従ってその結果は不正確である可能性がある。これらの問題を解決するため、ＡＬＵ反復配列に対する直接的ｑＰＣＲの新しい方法を開発した。ＡＬＵ反復配列はヒトゲノム中に広く分布するため、これらのコピー数は染色体が不安定な悪性腫瘍細胞においてさえ一定である。更に、高コピー数が劇的にＰＣＲの効率を向上させ、反応に必要なテンプレートは非常に少ない。結果として、血清０．１μｌでＤＮＡの定量には十分であり、ＤＮＡ抽出をせずにテンプレートとして直接血清を使用するＰＣＲが可能になる。血清中の阻害物質の影響を考慮しても、依然、ｑＰＣＲの結果は変動無しにプロットに直線性を示した。阻害物質に起因するｑＰＣＲ値の誤差は、ｑＰＣＲ自体の誤差限界以下であるため無視することができる。更に、単位複製配列サイズがそれぞれ１１５ｂｐおよび２４７ｂｐの二組のプライマーセットを利用することで、循環ＤＮＡのサイズ分配が正確に測定可能である。従って、発明者らの新しい方法、ＡＬＵ反復配列に対する直接的ｑＰＣＲは、患者の循環ＤＮＡの評価に望ましいと考えている。
【０１３６】
メラノーマ患者では、疾患のステージとは無関係に、血清中の長鎖ＤＮＡ断片の量が有意に高かった。ステージＩメラノーマの腫瘍サイズは小さく、上昇した血清ＤＮＡは腫瘍細胞からのみ放出されたとは考えにくい。メラノーマ患者は、高濃度の循環ＤＮＡを示す体質的な特徴を有する可能性があるが、その機構を解明するには更なる研究が必要である。その理由にかかわらず、血清中の長鎖ＤＮＡ断片の量は、悪性メラノーマ用の良い診断用バイオマーカーであることが示された。
【０１３７】
対照的に、ステージＩのメラノーマ患者では、正常コントロールと同程度のＤＮＡの完全性の値であった。これは、循環ＤＮＡがアポトーシス細胞から放出される短鎖ＤＮＡ断片が主体であることを意味する。しかし、ステージＩＶのメラノーマ患者は、正常コントロールよりも有意に高いＤＮＡの完全性を示し、非アポトーシス細胞から放出されたＤＮＡの割合が進行したステージのメラノーマではより高いことを示している。この現象は合理的に説明することができる。一つの理由は、進行したメラノーマでは、低血管性転移集団で低酸素壊死が生じる可能性があるというものである。別の理由は、転移集団または血流に落ちたメラノーマ細胞が、ナチュラルキラー細胞などの免疫細胞に攻撃されて破壊され、ＤＮＡを放出したというものである。従って、細胞死の違いを示すＤＮＡの完全性は、進行性メラノーマを検出する有望なバイオマーカーである。これは、メラノーマ患者の手術後フォローアップの定期健診で有用である。
【０１３８】
結論として、発明者らは、検出下限がヒトゲノムの１／３００コピーに相当するＤＮＡわずか０．０１ｐｇである高感度のＤＮＡ定量方法を開発した。その結果、正確で再現性が良好な遊離循環ＤＮＡの定量がもたらされた。この新しい方法を用いて、悪性腫瘍患者に由来する血清は長鎖ＤＮＡ断片の量、またはＤＮＡの完全性が健康な個人に由来する血清より高いという事実に基づく、メラノーマ検出の方法を確立した。手術前のメラノーマ患者から採取した血清の遡及的評価は、長鎖ＤＮＡ断片の量が初期ステージまたは進行したステージのメラノーマの検出マーカーとして有用であることを明らかにした。ＤＮＡの完全性は、メラノーマ患者でステージに関連して上昇した。ステージＩＶのメラノーマ患者では有意に高く、メラノーマ再発の検出マーカーとして有用であった。このＤＮＡ指標を測定する安価な方法は、定期健診、または手術後のフォローアップでの実用的なメラノーマ検出ツールとして可能性がある
実施例Ｖ−ＬＩＮＥ１および非メチル化ＬＩＮＥ１
（序文）
発明者らは、前立腺癌（ＰＣａ）の診断および予後診断マーカーとして、無細胞血液（血清）中の遺伝子型マーカーを検出する新しい超高感度アッセイを開発した。発明者らは、高感度で有益なＰＣＲマルチマーカーアッセイを用いて、様々な癌の種類において、腫瘍特異的な二重、および三重鎖ＤＮＡが血清／血漿中に検出可能であることを示した（２−５、３６）。これらの研究は、腫瘍特異的ＤＮＡは腫瘍組織中のみで評価できるという考えに基づく従来のパラダイムを破壊する。血清／血漿中の循環ＤＮＡの予測上の役割が発明者らの研究室で初めて示され、その後、他でも確認された（３）。発明者らは、血清／血漿中のｍＲＮＡとＤＮＡマーカーを評価するマルチマーカーによるアプローチは腫瘍の不均一性を対象とする単一のマーカーよりもより効率的であることを示した（１、３−４、３６、６３−６４）。
【０１３９】
ＰＳＡ（前立腺特異抗原）ｍＲＮＡマーカーを用いた血液中の循環するＰＣａ腫瘍細胞の分子的検出に関する研究は、研究室間で結果に一貫性がなく問題となった。循環ＤＮＡの検出は、ハイスループットな定量的な実用性の可能性がある、より安定なバイオマーカーを提供する。循環ＤＮＡバイオマーカーには、マイクロサテライト、プロモーター領域のメチル化、および遺伝子変異といったいくつかの主要な種類がある。これらのアッセイのいくつかは現在、他の癌で有効性が認められている。しかし、ＰＣａではそれらのアッセイは有効性が限られている。様々な癌患者の血液を評価するために、特定のゲノム以上に対する個別のアッセイが当研究室で開発され、ステージ、臨床的病理、予後、および疾患の再発と相関することが示された（１、３−４、３６）。ＰＣａでは、血清中の特異的ＬＯＨ（ヘテロ接合性消失）マーカーの頻度が必ずしも腫瘍組織中の頻度と一致せず、血清バイオマーカーとしてＬＯＨの使用に歯止めをかけた。有用でない結果（つまり、同型接合性）が、更にＰＣａに対するＬＯＨマーカーアッセイを制限した。特定の一つの遺伝子に対する単一の腫瘍マーカーを使用する際に問題になる腫瘍内、腫瘍外の不均一性に加えて、前立腺腫瘍発生の多病巣性に関する証拠がある（６４−６７）。進行中のＰＣａでプロモーター領域のメチル化が特定の腫瘍関連遺伝子に観察されたが（６５、６８−７１）、ＰＣａの進行の初期および後期ステージにおける様々なメチル化率と血中の全体的に乏しい検出によって、血清／血漿中のこれらのバイオマーカーの検出は限られた。腫瘍の不均一性や表現型に著しく影響されない、一貫性があるＰＣａの遺伝子型の血清マーカーが必要である。
【０１４０】
血中への腫瘍ＤＮＡの放出メカニズムは、まだ不明である。癌細胞は、アポトーシスに関連したメカニズムに屈してＤＮＡ断片を放出すると考えられている。ロら（Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．）（９−１０）は、鼻咽腔癌患者の血清／血漿中に放出されたＥＢＶ（エプスタイン・バー・ウイルス）のＤＮＡが、放射線療法で誘導された腫瘍細胞死を反映すること、また初期再発が治療後、腫瘍に関連したＤＮＡの残存濃度の中央値が高いことで特徴づけられることを示した。これらの研究は、循環している腫瘍由来のＤＮＡの検出の予後変数として、また放射線療法などの様々な治療モダリティへの腫瘍の反応を監視するためのツールとしての可能性を示す（１０）。これらの研究は、放射線のインビボ作用を分子レベルで理解するための新しいアプローチを開拓した。ＤＮＡマーカーは、放射線療法に対するＰＣａの反応性の代用として開発される可能性がある。腫瘍関連ＤＮＡマーカーは、放射線療法の間の腫瘍細胞死の動態を監視するのに役立つ可能性がある。外科的なステージ分類は、患者の疾患状態を評価する依然として最も正確な方法である。手術の前後の血液の評価は、血中の腫瘍関連ＤＮＡの存在に対する相対的な疾患の負担を評価する類のない機会をもたらす。仮説は、腫瘍を除去した場合、（手術前に）血清の腫瘍関連ＤＮＡが陽性である患者は、血清の腫瘍関連ＤＮＡが減少するか除去されるだろうというものである。発明者らは、血清の腫瘍関連ＤＮＡの完全性に対する、手術単独、および放射線療法の併用における影響を調査する。
【０１４１】
ここで述べられたＤＮＡバイオマーカーアッセイは、腫瘍の発生および進行に起因するＤＮＡの完全性の産物を活用する類のないアプローチをもたらす。発明者らの戦略は、ヒトゲノムの特異的な反復配列をゲノムバイオマーカーとして用いられるというものである。特に、ＰＣａの検出および腫瘍進行の判断に対するこれらのゲノムバイオマーカーの完全性を利用する。発明者らは、腫瘍の不均一性に対処する、より高感度のアッセイを開発するためにマルチマーカー戦略を採用する。
【０１４２】
ヒトゲノムの大部分は、大きな断片の重複、散在性のトランスポゾン由来の反復、およびタンデム反復などの反復配列で構成される（２７，７２−７３）。これらの反復配列は、コード配列と調節配列内とその間に散在している。ヒトゲノムの＞５０％が、ＳＩＮＥ（短鎖散在反復配列）およびＬＩＮＥ１（長鎖散在反復配列１）などを含む転移性因子に由来すると推定される。これらの転移性因子のうち、ＳＩＮＥである霊長類特異的なＡＬＵ配列はヒトゲノムの＞１０％の割合を占め、最も豊富である（７２−７５）。非コード領域であるＡＬＵは、ＡＬＵエンドヌクレアーゼ認識配列５’−ＡＧ／ＣＴ−３’で特徴付けられる、短く（約３００ｂｐ）ＧＣリッチな非自律因子である。ＬＩＮＥ１は、５’−末端が切断されてＲＮＡに転写され得る、ｃＤＮＡに逆転写され得る、あるいはｃＤＮＡとしてゲノムに再統合可能な、長く（＞６ｋｂ）ＧＣに乏しい配列として存在する。これらはヒトゲノムの約１７％の割合を占め、クラスＩＩレトロ・トランスポゾンと呼ばれる。ＬＩＮＥ１は遺伝子発現を調節する分子レオスタットとして機能する可能性がある（１３、７６−７７）。ＡＬＵの３’−末端はＬＩＮＥ１の遺伝子転移に必要である（７３、７８）。発明者らは、血清中のＬＩＮＥ１とＡＬＵの完全性（サイズ）が循環ＤＮＡとして検出可能であり、従って、血清バイオマーカーとなる可能性があることを見いだした。血清中の循環ＤＮＡの完全性は、非アポトーシス死の指標となる可能性がある。壊死性悪性腫瘍細胞から放出されたＤＮＡのサイズが様々である一方、アポトーシス細胞から放出されたＤＮＡは１２０−２００ｂｐに均一に切断されている。健康な個人では遊離循環ＤＮＡの主要な供給源はアポトーシス細胞であることから、圧倒的多数のＤＮＡの長鎖断片は悪性腫瘍細胞のマーカーである（４、３６）。ＳＩＮＥやＬＩＮＥ１などのゲノムの反復配列は、腫瘍細胞によって放出されるＤＮＡの優れた供給源である。しかし、遊離循環ＤＮＡ反復配列の完全性は、特異的で高感度の定量アッセイが無かったために、過去に実用化されてこなかった。主要な問題は、血清／血漿から高収量のＤＮＡが得られないことである。当研究室は、ゲノム反復配列に対する直接的血清アッセイの開発に成功した。
【０１４３】
ＬＩＮＥ１の別の重要な側面は、ＬＩＮＥ１プロモーター領域のＣｐＧアイランド部位のメチル化が、転写の不活性化およびＬＩＮＥ１因子のレトロ遺伝子転位の抑制の維持に重要であることである（７７、７９−８０）。一般的な正常組織では、ＬＩＮＥ１プロモーター領域のＣｐＧアイランドは高度にメチル化されており、脱メチル化はＬＩＮＥ１因子の転写を引き起こす（７７、７９−８０）。ＬＩＮＥ１のレトロ遺伝子転位は、プロモーター領域の隣に位置した場合に腫瘍抑制遺伝子の不活化、または癌遺伝子の活性化を引き起こす可能性がある。発明者らが胃癌および結腸直腸癌で最近示したように、ゲノム配列の低メチル化表現型が染色体の不安定化と癌の進行と関連することが示されている（７１、８０−８１）。非メチル化ＬＩＮＥ１（ｕＬＩＮＥ１）プロモーター領域は価値あるバイオマーカーである可能性があり、全染色体上のこれらの配置が腫瘍の不均一性に起因する問題を克服している可能性がある。発明者らは、腫瘍進行の代用としてｕＬＩＮＥ１を検出するアッセイを開発し、侵襲性の強い腫瘍では遺伝的な不安定性が上昇して低メチル化レベルがより高い。
【０１４４】
近年、発明者らは、血清中の遊離循環ＤＮＡを評価するための、簡便で強力な、高感度でハイスループットな方法を開発した。発明者らは、ＤＮＡ反復配列のタイプ（ＧＣリッチ対低ＧＣ）を活用し、ＰＣａ患者の血清中のＡＬＵとＬＩＮＥ１の完全性を評価する非常に高感度のＤＮＡマーカーアッセイを至適化し有効性を立証している（４１、８２−８３）。更に、これらの非メチル化マーカーが血清中に豊富であり、腫瘍細胞から放出する際に無傷なままであるため、ｕＬＩＮＥ１を評価する。これは、腫瘍の遺伝的不安定性を評価するための血清中の価値ある代理マーカーである。これらの血清中の特異的ＤＮＡマーカーの検出は同時に、患者にとって侵襲性が強いか致死的になりそうな進行性の腫瘍患者の特定に用いることもできる。最初の計画は、単独、またＰＳＡなどの既知の予後診断要因との併用でのこれらのＤＮＡバイオマーカーの有効性を究明することである。
【０１４５】
ＰＣａ治療の成功を決定する主要な制限は、余病および腫瘍の進行の評価の正確性である。患者のリスクと治療への反応の評価を向上させるために、血清ＰＳＡを越える新しいマーカーが必要とされるのは明らかである。およそ、病理学的に臓器に限定された疾患がある男性の約３０％が、原発巣の治療成功にもかかわらず早期再発を経験する。更に、病理学的に臓器に限定された病巣がある男性の約５０％が、手術の時点でステージが過小評価であったことが認められている（６１−６２）。患者のステージ過小評価の問題は主要な懸案事項であり、繰り返し評価が可能な別の非侵襲的方法でのより良い取り組みが必要である。
【０１４６】
（結果）
ＰＣａ血清中に循環しているＡＬＵ、ＬＩＮＥ１、ｕＬＩＮＥ１といった反復配列の断片検出の実現可能性が近年、当研究室で示された。発明者らは、腫瘍の進行と共にこれらのゲノムバイオマーカーがＰＣａ患者の血清で増加することを示唆するために試験的研究を実施した。研究はリスクが高かったが、もし成功すればＰＣａの進行の診断およびモニターにおける従来のパラダイムを破壊することになる。発明者らは、三つ全てのゲノムバイオマーカーを開発した。
【０１４７】
血清／血漿中の循環ＤＮＡの検出、および癌患者における、その予後診断上の役割
当研究室は、癌患者の血清における循環ＤＮＡの検出、予後診断上の重要性、および予測のための利用に関わる翻訳の研究を他に先駆けて行ってきた。発明者らは、血清／血漿からのＤＮＡの再現性が高い単離方法を開発し（４、１７、３６、４８、８４）、治療前、治療中、治療後のＤＮＡのモニターの有用性を示してきた（５、３６）。循環ＤＮＡバイオマーカーは、腫瘍の遺伝的変化を腫瘍のサンプリング無しに連続的にモニターする類のない機会をもたらす。当研究室は、複数のＤＮＡマーカーの利用は、単一マーカーよりもはるかに効果的であることを示した（１、５）。
【０１４８】
ＰＣａ患者の血清におけるＬＯＨに対するマイクロサテラト解析
以前、発明者らは、ＰＣａ患者の血清中のいくつかのＬＯＨマーカーを、キャピラリー・アレイ電気泳動法（ＣＡＥ）を用いて検出した。第９、１０、１６、および１８番染色体上の４つのマーカーを用いて、ＡＪＣＣステージＩ−ＩＶのＰＣａ患者の血清中においてＬＯＨのためのマイクロサテラト・マーカーを検出した。正常で健康な男性ドナーの血清（ｎ＝２５）ではマーカーは検出されなかった。ステージＩおよびＩＩの情報価値のある患者８人の血清では２例（２５％）がＬＯＨ陽性であり、ステージＩＩＩおよびＩＶでは３１％がＬＯＨ陽性であった。全ての患者が、情報価値があるわけではなかったためにアッセイは特定のマイクロサテラト・マーカーに限定される。更に、このアッセイは定量的でなかった。発明者らは、ＣＡＥを用いて、ＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ、およびＲＡＲｂｅｔａ２といった様々な遺伝子のＣｐＧプロモーター領域およびその他の調節因子のメチル化を評価するためのアッセイも開発した。ＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ、およびＲＡＲｂｅｔａ２は、ＰＣａ組織においてプロモーター領域のＣｐＧ部位でしばしばメチル化される。ＰＣａ患者の血清についての予備的な結果は、ステージＩおよびＩＩの患者はメチル化したマーカーを示さない一方、テストを行ったステージＩＩＩおよびＩＶの患者１６人の５０％はメチル化したマーカーを示した。至適な遺伝子の組合せは不明であり、腫瘍の＞９０％でメチル化した個別のマーカーを検出できなかった。マイクロサテライトおよびメチル化マーカーのもう一つの主要な問題は、初期ステージの疾患での相対頻度の低さである。にもかかわらず、腫瘍に関連した循環ＤＮＡはＰＣａ患者の血液中では検出可能であり、正常のドナーでは検出することができず、疾患の進行と相関関係があった。血清ＤＮＡバイオマーカーアッセイの感度を向上させるために、更に一貫性があるＤＮＡマーカーのセットが必要である。発明者らは、上述の問題に取り組むために、ＡＬＵおよびＬＩＮＥ１といった非コードＤＮＡ反復配列を用いることを提案する。
【０１４９】
前立腺癌患者の血清におけるＡＬＵ反復配列検出のための直接的ｑＰＣＲアッセイ
最近、発明者らは、ＡＬＵ断片のサイズの違いを評価するために、血清中のＤＮＡの完全性を評価する直接的定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイを開発した。直接的アッセイは、事前のＤＮＡ抽出無しのＰＣＲで可能になる。開発は成功し、＞２００人の癌患者および＞１００人の正常ドナーについて評価を行った。
【０１５０】
循環ＤＮＡアッセイのための血液をｔｉｇｅｒチューブに採取し、２−４時間以内に処理した。ｔｉｇｅｒチューブを遠心して血清を回収し、無関係な細胞を除去するために濾過（１０ｕポア）した。濾過した血清（５０μｌ）を、プロテイナーゼＫ（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ））を含む混合液および特定のＰＣＲ調製バッファーと混合する。ボルテックス後、試料を５０℃で２０分間インキュベートしてタンパク質を消化させる。その後直ちに試料を９５℃において５分間インキュベートしてタンパク質を変性させ、次に室温で遠心する。最後に、上清を除去してｑＰＣＲの前にＴＥバッファー（ｐＨ８．０）で希釈する。
【０１５１】
本研究のために、発明者らは、血清の長鎖ＤＮＡ断片が壊死性腫瘍細胞から放出されて放出前には切断されず、一方、正常なアポトーシス細胞から放出されたＤＮＡは１２０−２００ｂｐの断片に切断されることを解明した。より長いＤＮＡ片を検出するため、ＡＬＵ配列の２４７ｂｐの単位複製配列を増幅するプライマーを用いた。１１５ｂｐの単位複製配列を増幅することで、切断された断片およびより短い断片の両方を検出するために、その他のプライマーを作成した。ＰＣＲ反応を、ｑＰＣＲ検出システム（ＡＢＩ  ７９００ＨＴ）を用いて行った。試料を３回繰り返して実施し、ＤＮＡの標準を２回繰り返して実施する。標準は、連続希釈した既知の濃度のＡＬＵ配列から成る。コントロールとして、ＤＮＡの完全性が既知である陽性３検体、正常ドナー３検体（異なるレベルのＡＬＵ）を各プレート上で実施する。
【０１５２】
予備的研究では、発明者らは、ＰＣａ患者および正常な健康なドナーにおけるＡＬＵ２４７に対する直接的ｑＰＣＲを実施した。結果は非常に有望であり、実用可能性、感度、および臨床利用のアプローチの可能性を示していた。正常で健康な男性ドナー（＞４０歳）に対してＡＪＣＣステージＩＶのＰＣａ患者（ｎ＝４３）を比較して、ＰＣａ患者において有意に高いＡＬＵ２４７のコピー数を示した（Ｐ＜０．００１、図２０Ａ）。ＲＯＣ（受信者動作特性）のプロットでは、曲線下面積（ＡＵＣ）は０．８３であった（図２０Ｂ）。
【０１５３】
ＰＣａ患者の血清におけるＬＩＮＥ１反復配列の検出
ＬＩＮＥ１  ２９７の長い断片を評価するための直接的ｑＰＣＲアッセイを開発した（図２０Ｃ）。ＰＣＲ産物のサイズは、非アポトーシス的な、腫瘍細胞の放出によると思われるＤＮＡ断片の完全性を示している。至適な検出と情報価値のあるサイズを決定するために、ＡＬＵと同様の方法で様々な断片サイズも評価した。血清をＡＬＵ−ｑＰＣＲ用の上述のように調製した。ＡＪＣＣステージＩＶの患者（ｎ＝４３）と比較して、正常で健康な男性ドナー（＞４０歳以上）は、ＬＩＮＥ１の有意に低いコピー数を示した（Ｐ＜０．００５）。ＲＯＣのプロットでは、ＡＵＣは０．７２であった。アッセイは試験的研究において非常に有望であり、臨床的利用の可能性を示した。
【０１５４】
前立腺癌患者の血清におけるｕＬＩＮＥ１の検出
予備的研究において、半定量的ＣＡＥにより、メチル化およびｕＬＩＮＥ１を評価した。過去に述べたように（３６）、５００ｕｌの血清からＤＮＡを抽出し、亜硫酸水素ナトリウム修飾に供した。この過程は現在では改変され、ＤＮＡの収量を向上させ時間を短縮するためにＱｕｉａｇｅｎ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて効率化した。
【０１５５】
ＬＩＮＥ１のメチル化状態は、ＬＩＮＥ１プロモーター領域のメチル化ＤＮＡ配列または非メチル化ＤＮＡ配列を増幅するように特異的に設計した、二組の蛍光標識プライマーセットを用いて評価した。亜硫酸水素修飾したＤＮＡをＡｍｐｌｉＴａｑでのＰＣＲ増幅に供した。ＰＣＲ増幅を、３５サイクルを用いて行った。過去に述べたように（８４）、亜硫酸水素ナトリウム修飾したリンパ球ＤＮＡ、およびｐｈｉ−２９ＤＮＡポリメラーゼで正常ＤＮＡから合成した一般的な非メチル化コントロールが非メチル化の陽性コントロールとしての役割を果たした。無修飾のリンパ球ＤＮＡを、メチル化反応および非メチル化反応の陰性コントロールとして用いた。ＳｓｓＩメチラーゼ処理したリンパ球ＤＮＡを、メチル化の陽性コントロールとして用いた。ＰＣＲ産物を、ＣＡＥ（ＣＥＱ  ８０００ＸＬ、ベックマン・コールター社（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｉｎｃ．））を用いて視覚化した。各試料からのメチル化産物および非メチル化産物を、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＷｅｌｌＲＥＤ色素標識したホスホラミダイトで標識した順方向プライマーを用いて増幅させて評価した。メチル化した配列特異的順方向プライマーをＤ４ｐａ色素で標識し、非メチル化した配列特異的順方向プライマーをＤ３ａ色素で標識した。各マーカーを、メチル化コントロールおよび非メチル化コントロールで至適化した。非メチル化ＤＮＡに特異的に相当するｂｐサイズのピークを示すこれらの試料のみをｕＬＩＮＥ１と見なした（図２１Ａ）。ＡＪＣＣステージＩＶのＰＣａ患者（ｎ＝２７）対正常で健康な男性ドナー（ｎ＝２３）の試験的解析において、ステージＩＶの患者の血清でｕＬＩＮＥ１の値が有意に高かった（Ｐ＝０．００６）（図２１Ｂおよび２１Ｃ）。予後予測値は０．８１であった。ＡＪＣＣステージＩＩ−ＩＶのＰＣａ患者（ｎ＝４７）対正常ドナー（ｎ＝２３）の比較では有意な差（Ｐ＝０．０３５）があり、予後予測値は０．８５であった。予備的な結果は有望であり、ｕＬＩＮＥ１はＰＣａのバイオマーカーとして利用可能であることを示唆した。ＬＩＮＥ１、ＡＬＵ、およびｕＬＩＮＥ１を同時に評価した場合、０．９２のＡＵＣが認められた。ｕＬＩＮＥ１およびＡＬＵ２４７の組合せでは、０．９１１のＡＵＣを得た（ｎ＝３０）。これらの試験的解析は、三つのＤＮＡバイオマーカーの組合せの臨床利用の可能性を示している。
【０１５６】
最近、発明者らは、同一対立遺伝子のメチル化産物および非メチル化産物の定量のためのＱＡＭＡ（メチル化対立遺伝子の定量的解析）アッセイを開発した（図２１Ｂと２１Ｃ）。アッセイは、マイナー・グルーブ・バインダー（ＭＧＢ）手法（ＡＢＩ）によるＴａｑＭａｎプローブを用いるｑＰＣＲに基づき、亜硫酸水素処理したＤＮＡ（８５）を用いる。ＭｅｔｈｙｌＬｉｇｈｔアッセイよりも顕著な優位性があった（８３）。メチル化対立遺伝子と非メチル化対立遺伝子の両方を同じ反応（図２１Ｃ）で検出することができ、それぞれの標準曲線で各定量することができる（図２１Ｂ）。図２１Ｃは、メチル化および非メチル化したゲノム反復配列の解析の例を示す。アッセイは、ＣｐＧジヌクレオチド多型を識別することができ、最低限のアッセイ間変動で評価することができる。
【０１５７】
乳癌患者の血清におけるＬＩＮＥ１の検出
長鎖ＤＮＡ断片の絶対量を、正常群および乳癌群でＬＩＮＥ１  ２９７プライマーセットによるｑＰＣＲで定量した。ＬＩＮＥ１  ２９７のｑＰＣＲ値は、乳癌患者で正常群より有意に高く（図２６）、リンパ節（ＬＮ）陽性群でＬＮ陰性群より有意に高く（図２７）、Ｔ２からＴ４群でＴ０からＴ１群より有意に高く（図２８）、ステージＩＩＩの癌でステージ０からＩの癌より有意に高かった（図２９）。
【０１５８】
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【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】ヒトＡＬＵ散在反復配列のコンセンサス配列。１１５ｂｐ単位複製配列のプライマーを四角で囲って示す。
【図２Ａ】ゲル電気泳動による、２８サイクルのｑＰＣＲの熱サイクルでの１０、１、０．１、０．０１ｐｇ（それぞれ、レーン１、２、３、４）のゲノムＤＮＡテンプレートに対するＡＬＵプライマーのＰＣＲ産物。ＭＭ：分子量マーカー。
【図２Ｂ】連続的に希釈した健康なボランティアの末梢血リンパ球から得たゲノムＤＮＡ（１０ｎｇから０．０１ｐｇ）を、ＡＬＵ−ｑＰＣＲにより定量した。直線性は１０６の範囲で維持され、感度は、単一細胞のゲノムの約１／３００コピーに相当する０．０１ｐｇ程度の低量であった。
【図３】血清中（Ａ）および血漿中（Ｂ）のＤＮＡのｑＰＣＲによるＡＬＵの定量。血清および血漿試料中のＤＮＡ濃度はそれぞれ９７０±７３０ｐｇ／μｌと１８０±１５０ｐｇ／μｌ（平均±標準偏差）であった。
【図４】数組の検体における血清：血漿のＤＮＡ濃度比の分配。３２（＊）の割合を示したアウトライアー対を除く、全ての検体に近似させた正規分布曲線を重ね合わせた。
【図５】血清と血漿のＤＮＡ濃度の散布図およびＤＮＡ濃度の分配を標準化するための平方根変数変換後のデミング回帰。実線で示したデミング回帰モデルは、（血清ＤＮＡ）０．５＝１．６×（血漿ＤＮＡ）０．５＋８．７であった。（血漿ＤＮＡ）＝０での血清ＤＮＡ軸の切片値は、７６（９５％  ＣＩ、７．８−２１０）ｐｇ／μｌであった。点線は、血清と血漿の間で同一の線を示す。
【図６Ａ】ＡＬＵ１１５プライマー（１１５ｂｐの単位複製配列）を四角の囲み、ＡＬＵ２４７（２４７ｂｐの単位複製配列）を実線下線で示した、ヒト長鎖ＡＬＵ散在反復配列のコンセンサス配列。
【図６Ｂ】ＤＮＡの長さに関して計算したＤＮＡ定量化の相対的効率。実線で示した算出されたＡＬＵ１１５プライマーの効率は＜１１５ｂｐで０％であり、１１５０ｂｐで９０％である。点線で示したＡＬＵ２４７プライマーは＜２４７ｂｐで０％であり、２４７０ｂｐで９０％である。点を付した領域は、アポトーシス細胞から放出されるＤＮＡのサイズを示す。
【図７Ａ】健康な女性（Ｎ＝５１）、および手術前のＡＪＣＣステージ０−ＩＶ（それぞれＮ＝８、２４、２７、２１、３）の乳癌患者由来の血清中のＤＮＡの完全性。右側のバーは平均±標準誤差（平均の標準誤差）の値を示す。血清ＤＮＡの完全性は、ＡＪＣＣステージとともに上昇した（スピアマンｐ＝０．５４、Ｐ＜０．０００１）。血清ＤＮＡの完全性は、健康な女性よりも手術前のＡＪＣＣステージＩＩ−ＩＶの患者で有意に高かった。
【図７Ｂ】血清ＤＮＡの完全性によって健康な女性からＡＪＣＣステージＩＩ−ＩＶの乳癌患者を識別するためのＲＯＣ曲線。ＡＵＣは０．７９（９５％  ＣＩ、０．７０−０．８６）である。
【図８】７５の浸潤性原発性癌の血清ＤＮＡの完全性および腫瘍サイズは有意に関連した（Ｒ＝０．４８、Ｐ＜０．０００１）。非浸潤性の腫瘍（非浸潤性乳管癌８症例）は、この解析に含めなかった。
【図９】評価可能な原発性乳癌の患者８２人における、血清ＤＮＡの完全性およびリンパ管浸潤状態。
【図１０Ａ】リンパ節転移の患者４２人およびリンパ節転移のない患者４１人における、血清ＤＮＡの完全性およびリンパ節転移。
【図１０Ｂ】血清ＤＮＡの完全性によりリンパ節転移患者を識別するためのＲＯＣ曲線。ＡＵＣは０．８１（９５％  ＣＩ、０．７２−０．８９）である。
【図１１Ａ】散在したヒトＡＬＵ反復配列のコンセンサス配列。ＡＬＵ１１５プライマー（１１５ｂｐの単位複製配列）を四角で囲い、ＡＬＵ２４７プライマー（２４７ｂｐの単位複製配列）に下線を引いた。
【図１１Ｂ】ＤＮＡの長さに関して計算したＤＮＡ定量化の相対的効率。実線で示した、算出されたＡＬＵ１１５プライマーの効率は＜１１５ｂｐで０％であり、１１５０ｂｐで９０％である。点線で示したＡＬＵ２４７プライマーは＜２４７ｂｐで０％であり、２４７０ｂｐで９０％である。アポトーシス細胞から放出されるＤＮＡのサイズを矢印で示す。
【図１２Ａ】血清ＤＮＡのＡＬＵ−ｑＰＣＲの感度および直線性。連続希釈したゲノムＤＮＡ（１０ｎｇから０．０１ｐｇ）を、ＡＬＵ１１５またはＡＬＵ２４７プライマーを用いたｑＰＣＲで定量した。直線性は１０６の範囲で維持され、感度は０．０１ｐｇ程度の低量であった。
【図１２Ｂ】２８サイクルのｑＰＣＲによる１０、１、０．１、０．０１ｐｇのＡＬＵ１１５およびＡＬＵ２４７プライマーのゲノムＤＮＡテンプレートのＰＣＲ産物のアガロースゲル像（それぞれ、ＡＬＵ１１５：レーン１、２、３、４、ＡＬＵ２４７：レーン５、６、７、８）。ＭＭ：分子量マーカー。
【図１３】正常ボランティア１５人およびＰＡＣ患者８人の血清５００μｌから、ＤＮＡを従来の方法で抽出および精製し、ＤＮＡ量を、ＡＬＵ１１５プライマーを用いたＡＬＵ−ｑＰＣＲとＰｉｃｏＧｒｅｅｎ法で定量した。精製ＤＮＡの総量の１／１０および１／５０００（血清体積５０μｌと０．１μｌに相当）をそれぞれ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ法およびＡＬＵ−ｑＰＣＲ法による各定量に用いた。縦軸上の黒い三角は、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ法の下限を示す。点線の斜線は、下限がないとした場合の二つの方法の想定される適合線を示す。
【図１４Ａ】正常ボランティアとステージＩ／ＩＩおよびステージＩＩＩ／ＩＶのＣＲＣ患者との血清中の遊離循環ＤＮＡの絶対濃度と、試料の平均を示す平均ダイヤモンドと９５％の信頼区間。ステージＩ／ＩＩおよびステージＩＩＩ／ＩＶのＣＲＣ患者は血清ＤＮＡの絶対濃度が有意に高かった（それぞれ、Ｐ＝０．００６とＰ＝０．００４）。
【図１４Ｂ】ステージＩ−ＩＶのＣＲＣ患者を健康なボランティアと識別するためのＲＯＣ曲では、ＡＵＣが０．７５であった。特異性０．９０での感度は０．４１であった。
【図１５Ａ】正常ボランティアとステージＩ／ＩＩおよびステージＩＩＩ／ＩＶのＣＲＣ患者との血清中の遊離循環ＤＮＡの完全性と、試料の平均を示す平均ダイヤモンドと９５％の信頼区間。ステージＩ／ＩＩおよびステージＩＩＩ／ＩＶのＣＲＣ患者は血清ＤＮＡの完全性が有意に高かった（それぞれ、Ｐ＝０．００２とＰ＝０．００６）。
【図１５Ｂ】ステージＩ−ＩＶのＣＲＣ患者を健康なボランティアと識別するためのＲＯＣ曲線では、ＡＵＣが０．７８であった。特異性０．９０での感度は０．５６であった。
【図１６Ａ】正常ボランティアとステージＩ／ＩＩおよびステージＩＩＩ／ＩＶのＰＡＣ患者との血清中の遊離循環ＤＮＡの絶対濃度と、試料の平均を示す平均ダイヤモンドと９５％の信頼区間。ステージＩ／ＩＩおよびステージＩＩＩ／ＩＶのＰＡＣ患者において、血清ＤＮＡの絶対濃度の有意な上昇は認められなかった。
【図１６Ｂ】ステージＩ−ＩＶのＰＡＣ患者を健康なボランティアと識別するためのＲＯＣ曲線では、ＡＵＣが０．５９であった。特異性０．９０での感度は０．３１であった。
【図１７Ａ】正常ボランティアとステージＩ／ＩＩおよびステージＩＩＩ／ＩＶのＰＡＣ患者との血清中の遊離循環ＤＮＡの完全性と、試料の平均を示す平均ダイヤモンドと９５％の信頼区間。ステージＩ／ＩＩおよびステージＩＩＩ／ＩＶのＰＡＣ患者は血清ＤＮＡの完全性が有意に高かった（それぞれ、Ｐ＝０．０２２とＰ＝０．０００１）。
【図１７Ｂ】ステージＩ−ＩＶのＰＡＣ患者を健康なボランティアから識別するためのＲＯＣ曲線では、ＡＵＣが０．８０であった。特異性０．９０での感度は０．５８であった。
【図１８Ａ】ＡＬＵ２４７プライマーセットを用いたｑＰＣＲにより定量した、正常とＡＪＣＣステージ０／Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶメラノーマにおけるＤＮＡ絶対量。
【図１８Ｂ】ＡＬＵ２４７  ｑＰＣＲにより正常個人（ｎ＝６５）からステージ０−ＩＩＩメラノーマ（ｎ＝３４）を検出のためのＲＯＣ曲線。ＡＵＣは０．８７であった。
【図１８Ｃ】ＡＬＵ２４７  ｑＰＣＲにより正常個人（ｎ＝６５）からステージＩＶメラノーマ（ｎ＝４９）を検出のためのＲＯＣ曲線。ＡＵＣは０．８９であった。
【図１９Ａ】ＡＪＣＣステージ０／Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶメラノーマにおけるＤＮＡの完全性値。
【図１９Ｂ】ＤＮＡの完全性により正常個人（ｎ＝６５）からステージ０−ＩＩＩメラノーマ（ｎ＝４９）を検出のためのＲＯＣ曲線。ＡＵＣは０．８２であった。
【図２０Ａ】ＡＬＵ２４７プライマーセットを用いたｑＰＣＲにより定量した、正常群（年齢＞４０歳）とＡＪＣＣステージＩＶ前立腺癌患者とにおける長鎖ＤＮＡ断片の絶対量。ステージＩＶの癌におけるＡＬＵ２４７のｑＰＣＲ値は、正常群より有意に高かった（Ｐ＜０．０００１）。
【図２０Ｂ】ＡＬＵ２４７の量で正常コントロールからステージＩＶ前立腺癌識別のためのＲＯＣ曲線。（ＡＵＣ＝０．８２５６）。
【図２０Ｃ】ＬＩＮＥ１  ２９７のｑＰＣＲ解析の標準曲線。
【図２１Ａ】典型的なキャピラリー・アレイ電気泳動（ＣＡＥ）解析：前立腺癌患者の血清におけるメチル化ＬＩＮＥ１および非メチル化ＬＩＮＥ１の検出。
【図２１Ｂ】メチル化ＬＩＮＥ１および非メチル化ＬＩＮＥ１（ｕＬＩＮＥ１）の定量解析の感度を示すＱＡＭＡアッセイのための標準曲線プロット。
【図２１Ｃ】ｕＬＩＮＥ１およびメチル化ＬＩＮＥ１のＱＡＭＡアッセイ解析曲線：サイクル閾値のカットオフ値を決定するためのサイクルプロット
【図２２Ａ】ＬＩＮＥ２９７プライマーセットを用いたｑＰＣＲにより定量した、正常群（年齢＞４０歳）とステージＩＶ前立腺癌患者とにおける長鎖ＤＮＡ断片の絶対量。ステージＩＶの癌におけるＬＩＮＥ２９７のｑＰＣＲ値は、正常群より有意に高かった（Ｐ＜０．００４８）。
【図２２Ｂ】ＬＩＮＥ２９７の量で正常コントロールからステージＩＶ前立腺癌を識別するためのＲＯＣ曲線（ＡＵＣ＝０．７２１１）。
【図２３】正常群（ｎ＝２３）と前立腺癌患者群（ｎ＝４７）との非メチル化ＬＩＮＥ１検出比。非メチル化ＬＩＮＥ１は、正常群より前立腺癌患者群で有意に高かった（Ｐ＝０．０３５、陽性予測値＝０．８５）。
【図２４】正常群（ｎ＝２３）とステージＩＶの前立腺癌患者群（ｎ＝２７）との非メチル化ＬＩＮＥ１検出比。非メチル化ＬＩＮＥ１は、正常群よりステージＩＶの前立腺癌患者群で有意に高かった（Ｐ＝０．０６２、ＰＰＶ＝０．８１、ＮＰＶ＝０．５９）。
【図２５Ａ】ＡＬＵ２４７の量とＬＩＮＥ２９７の量の組合せによる正常コントロールから前立腺癌を識別するためのＲＯＣ曲線（ｎ＝６６、ＡＵＣ＝０．８３７）。
【図２５Ｂ】３つのマーカー（ＡＬＵ２４７の量とＬＩＮＥ２９７の量、非メチル化ＬＩＮＥ２９７の検出）の組合せによる正常コントロールから前立腺癌を識別するためのＲＯＣ曲線。ＡＵＣは０．９１２に向上した。
【図２６】ＬＩＮＥ２９７プライマーセットを用いたｑＰＣＲにより定量した、正常群（女性、ｎ＝２９）と乳癌群（ｎ＝４５）とにおける長鎖ＤＮＡ断片の絶対量。乳癌患者におけるＬＩＮＥ２９７のｑＰＣＲ値は、正常群より有意に高かった（Ｐ＝０．０４５）。
【図２７】ＬＩＮＥ２９７プライマーセットを用いたｑＰＣＲにより定量した、乳癌患者のリンパ節陰性群（ｎ＝２７）とリンパ節陽性群（ｎ＝１８）とにおける長鎖ＤＮＡ断片の絶対量。リンパ節陽性患者のＬＩＮＥ２９７のｑＰＣＲ値は、リンパ節陰性患者より有意に高かった（Ｐ＝０．０４５）。
【図２８】ＬＩＮＥ２９７プライマーセットを用いたｑＰＣＲにより定量した、乳癌患者のＴ０からＴ１群（ｎ＝２７）と、Ｔ２からＴ４群（ｎ＝１８）とにおける長鎖ＤＮＡ断片の絶対量。Ｔ２からＴ４の患者におけるＬＩＮＥ２９７のｑＰＣＲ値は、Ｔ０からＴ１の患者より有意に高かった（Ｐ＝０．０４７５）。
【図２９】ＬＩＮＥ２９７プライマーセットを用いたｑＰＣＲにより定量した、ＡＪＣＣステージ０−ＩＩＩの乳癌（ｎ＝４５）における長鎖ＤＮＡ断片の絶対量。ステージＩＩＩの癌患者におけるＬＩＮＥ２９７のｑＰＣＲ値は、ステージ０からＩより有意に高かった（Ｐ＝０．０１５）。
【図３０】異なるＡＪＣＣステージの乳癌の典型的なＬＩＮＥ１のコピー数。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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