(57)【要約】  アデノウイルス血清型はそれらの天然指向性において異なる。アデノウイルスの種々の血清型は、少なくともそれらのカプシドタンパク質（例えば、ペントンベースおよびヘキソンタンパク質）、細胞結合をもたらすタンパク質（例えば、ファイバータンパク質）およびアデノウイルスの複製に関与するタンパク質において異なることが判明している。指向性およびカプシドタンパク質における血清型間のこの相違は、カプシドタンパク質の修飾によりアデノウイルス指向性を改変することを目的とした多くの研究努力につながっている。本発明は、カプシドタンパク質の修飾のそのような要件を回避するものであり、本発明は、希有アデノウイルス血清型である血清型２６の組換え複製欠損型アデノウイルス、および該代替的組換えアデノウイルスの製造方法を提供する。また、異種遺伝子の運搬および発現のために組換えアデノウイルスを使用する手段を提供する。
2008538894.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも部分的にＥ１において欠失しておりＥ１活性を欠く血清型２６の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項２】
異種核酸を含む、請求項１記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項３】
Ｅ４遺伝子またはＥ４遺伝子のセグメント（代替的血清型のオープンリーディングフレーム６（「ＯＲＦ６」）を含むもの）を含む、請求項１記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項４】
該代替的血清型がアデノウイルス血清型５である、請求項３記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項５】
ａ）関心のあるタンパク質または抗原をコードする核酸、
ｂ）ａ）の核酸に機能しうる様態で連結された異種プロモーター、および
ｃ）転写終結配列
を含む遺伝子発現カセットを含む、請求項２記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項６】
該異種核酸が、ヒト宿主における発現に関して最適化されたコドンを含む、請求項５記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項７】
該異種核酸がＨＩＶ−１抗原をコードしている、請求項２記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項８】
該異種核酸が、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、ＮｅｆまたはＰｏｌよりなる群から選ばれる少なくとも１つの抗原をコードしている、請求項７記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項９】
請求項２記載の組換えアデノウイルスベクターを含んでなる細胞の集団。
【請求項１０】
請求項３記載の組換えアデノウイルスベクターを含んでなる細胞の集団。
【請求項１１】
（ａ）請求項２記載の組換えアデノウイルスベクターを細胞の集団内にトランスフェクトし、
（ｂ）生じた組換え複製欠損型アデノウイルスを回収することを含んでなる、組換え複製欠損型アデノウイルス粒子の製造方法。
【請求項１２】
（ａ）請求項３記載の組換えアデノウイルスベクターを細胞の集団内にトランスフェクトし、
（ｂ）生じた組換え複製欠損型アデノウイルスを回収することを含んでなる、組換え複製欠損型アデノウイルス粒子の製造方法。
【請求項１３】
請求項１１記載の製造方法により回収された、精製された組換え複製欠損型アデノウイルス粒子。
【請求項１４】
請求項１２記載の製造方法により回収された、精製された組換え複製欠損型アデノウイルス粒子。
【請求項１５】
請求項１３記載の精製された組換えアデノウイルス粒子を含んでなる組成物。
【請求項１６】
請求項１４記載の精製された組換えアデノウイルス粒子を含んでなる組成物。
【請求項１７】
生理的に許容される担体を含む、請求項１５記載の組成物。
【請求項１８】
生理的に許容される担体を含む、請求項１６記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１５記載の組成物を個体に投与することを含んでなる、関心のあるタンパク質または抗原をコードする異種核酸の運搬および発現のための方法。
【請求項２０】
投与の前または後に、関心のあるタンパク質または抗原をコードする異種核酸の投与を異なるベクターで行う、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
異なるベクターが、異なる血清型のアデノウイルスである、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
請求項１７記載の組成物を個体に投与することを含んでなり、該異種核酸が、抗原をコードする核酸を含む、該個体において該抗原に対する免疫応答を生成させるための方法。
【請求項２３】
該異種核酸が、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、ＮｅｆまたはＰｏｌよりなる群から選ばれる少なくとも１つの抗原をコードしている、請求項２２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アデノウイルス血清型２６ベクター、核酸およびそれにより製造されたウイルスに関する。
【背景技術】
【０００２】
アデノウイルスは、いくつかの鳥類および哺乳類宿主において同定されている非外包性正二十面体ウイルスである（Ｈｏｍｅら，１９５９  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：８４−８６；Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９０  Ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編，ｐｐｓ．１６７９−１７２１）。最初のヒトアデノウイルス（Ａｄ）は４０年以上前に分離された。それ以来、種々の哺乳類種に感染する１００を超える異なるアデノウイルス血清型が分離されており、それらのうちの５１個はヒト由来である（Ｓｔｒａｕｓ，１９８４，Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｈ．Ｇｉｎｓｂｅｒｇ編，ｐｐｓ．４５１−４９８，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｓ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｉｅｒｈｏｌｚｅｒら，１９８８  Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５８：８０４−８１３；ＳｃｈｎｕｒおよびＤｏｎｄｅｒｏ，１９９３，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ；３６：７９−８３；Ｄｅ  Ｊｏｎｇら，ｌ９９９  Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７：３９４０−５）。ラットおよびアカゲザル赤血球の赤血球凝集特性、ＤＮＡ相同性、制限酵素切断パターン、Ｇ＋Ｃ含量比および腫瘍原性を含む多数の生化学的、化学的、免疫学的および構造的基準に基づき、ヒト血清型は６つの亜属（Ａ〜Ｆ）に分類されている（Ｓｔｒａｕｓ，前掲；Ｈｏｒｗｉｔｚ，前掲）。
【０００３】
アデノウイルスは異種遺伝子の運搬および発現のための魅力的な標的である。アデノウイルスは多種多様な細胞（分裂細胞および非分裂細胞）に感染する能力を有し、非常に効率的にそのＤＮＡを感染宿主細胞内に導入する。アデノウイルスが免疫適格性個体における重篤なヒト病理に関連していることは見出されていない。該ウイルスはそのＤＮＡを宿主細胞内に非常に効率的に導入し、多種多様な細胞に感染しうる。さらに、該ウイルスは、高いウイルス力価で大量に産生されうる。アデノウイルスゲノムは非常に詳細に特徴づけられており、約３０，０００〜４５，０００塩基対の直鎖状二本鎖ＤＮＡ分子よりなる。さらに、いくつかの異なる血清型が存在するにもかかわらず、種々の血清型の間にはいくらかの全般的な保存性が見出される。
【０００４】
遺伝子運搬ビヒクルとしてのアデノウイルスの利用における安全性は、該ウイルスゲノムの必須初期領域１（「Ｅ１」）の欠失／修飾により該ウイルスを複製欠損型にして該ウイルスのＥ１活性を欠損（または実質的に欠損）させて意図される宿主／ワクチン内での複製を不能にすることにより増強されうる。例えば、Ｂｒｏｄｙら，１９９４  Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．，７１６：９０−１０１を参照されたい。さらに、Ｅ１以外のアデノウイルス遺伝子の欠失（例えば、Ｅ２、Ｅ３および／またはＥ４におけるもの）は、異種遺伝子担持のための、より大きな容量を有するアデノウイルスベクターを与える。現在のところ、亜群Ｃの２つの良く特徴づけられたアデノウイルス血清型、すなわち、血清型５（「Ａｄ５」）および２（「Ａｄ２」）が、最も広範に使用されている遺伝子運搬ベクターを構成する。
【０００５】
アデノベクターの使用にまつわる１つの懸念は、該ウイルス自体により惹起され及び該ウイルス自体に対する細胞性および体液性免疫応答の可能性に関するものである（Ｃｈｉｒｍｕｌｅら，１９９９  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：１５７４−１５８３）。ベクターの初期投与に伴う免疫応答は有利でありうるが（Ｚｈａｎｇら，２００１  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．３：６９７−７０７）、該ベクターを再投与した場合には（ブースター免疫化；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら，１９９６  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１５４−１６２；Ｃｈｉｒｍｕｌｅら，１９９９  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：４４８−４５５）、全身レベルのアデノウイルス特異的中和抗体の生成は、劣悪なトランスダクションを引き起こしうる。本発明者ら自身の疫学的研究からの科学的文献およびデータは、北米のほとんどの人々が抗Ａｄ５中和抗体価を有し、約３分の１が比較的高い力価（＞２００）を有することを示唆している。世界の他の地域は、典型的には、抗Ａｄ５抗体の、より高い頻度およびレベルを示す。ヒトにおけるそのような自然アデノウイルス感染から生じたこれら及び他のアデノウイルス血清型に対する血清特異的抗体は、アデノベクターによる異種ポリペプチドの投与に対する応答の度合に影響を及ぼしうる（Ｃｈｉｒｍｕｌｅら，１９９９  Ｇｅｎｅ  Ｔｌｉｅｒ．６：１５７４−１５８３）。したがって、血清型がアデノウイルス血清型２および５ほどは広まっていない場合には特に、遺伝子導入ベクターとして、代替的アデノウイルス血清型に基づくアデノウイルスベクターを開発することが必要とされている。
【０００６】
亜群Ｄアデノウイルスであるアデノウイルス血清型２６は１９６１年に最初に分離され、１９６３年に承認参考株として確立された（Ｌ．Ｒｏｓｅｎら，１９６１  Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１０７：４３４−４３７；Ｈ．Ｇ．Ｐｅｒｅｉｒａら，１９６３  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０：６１３−６２０）。参考ウマ抗血清において決定された４６個の他のヒトアデノウイルスに対するその抗原関連性が考察されている（Ｊ．Ｃ．Ｈｉｅｒｈｏｌｚｅｒら，１９９１  Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１２１：１７９−１９７）。Ａｄ２６に関しては、いくつかの配列情報が公開されている。Ａｄ２６ヘキソンタンパク質の部分配列（１１２９および９１６ｂｐ）がＴａｋｅｕｃｈｉら，１９９９  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３７：３３９２−３３９４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０２３５５４）およびＳｈｉｍａｄａら，２００４  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１５７７−１５８４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０９９３６０）に開示されている。Ａｄ２６のウイルス関連ＲＮＡ領域の配列ならびに末端前（ｐｒｅ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）タンパク質および５２／５５Ｋタンパク質の部分配列（５２１ｂｐ）がＭａ  ＆  Ｍａｔｔｈｅｗｓ，１９９６  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５０８３−５０９９およびＧｅｎＢａｎｋ（アクセッション番号Ｕ５２５４６）に開示されている。
【０００７】
ワクチンおよび遺伝子治療の分野は、代替的アデノウイルス血清型、特に、ヒト集団において十分には示されていないＡｄ２６のような血清型に関する更なる知見から、大きな利益を得るであろう。特に関心が持たれるのは、代替的アデノウイルス血清型に基づく組換えアデノウイルスベクター、およびそのような組換えアデノウイルスベクターの入手手段である。当技術分野におけるこの要求は、アデノウイルス血清型２６に基づく組換えアデノウイルスベクターに関する本出願の開示により満たされる。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明は、希有（ｒａｒｅ）アデノウイルス血清型である血清型２６の組換え複製欠損型アデノウイルスベクター、および該代替的血清型に基づく組換えアデノウイルスの製造方法に関する。また、異種遺伝子の運搬および発現において該組換えアデノウイルスベクターを使用する手段を提供する。本明細書中では更に、調節配列に機能しうる形で連結された１以上のトランスジーン（異種遺伝子）を含む、血清型２６の組換え複製欠損型アデノウイルスベクターを開示する。そのような組換えアデノウイルス血清型２６ベクターの、宿主への投与は、単独での投与であるか或いは組合せ法および／または初回−追加抗原刺激法であるかには無関係に、取り込まれたトランスジーンの効率的な発現をもたらし、投与された特定の抗原を特異的に認識しうる免疫応答を効果的に誘導する。本明細書に記載の組換えウイルスは、より広くヒト集団で見出される傾向にあるアデノウイルス血清型（例えば、Ａｄ５およびＡｄ２）に対する既存免疫を逃れる先天的能力を有する。したがって、そのような組換えアデノウイルスの使用は、関心のある特定の異種核酸を発現させるための改良手段となる。
【０００９】
発明の詳細な説明
希有アデノウイルス血清型は、より一般に用いられるアデノウイルス血清型（例えば、アデノウイルス血清型２および５）と比較して固有の利点を有する。なぜなら、それによる異種遺伝子の効率的な標的部位運搬および発現は既存免疫によっては制限されないと考えられるからである。また、異なるアデノウイルス血清型は、それらの異なるキャプシド構造を有するため、異なる指向性を示し、したがって、異なる組織を標的化する可能性をもたらし、それがワクチンまたは遺伝子治療目的に用いられた場合には、おそらく、より優れた免疫応答の惹起をもたらすであろう。しかし、これらの希有アデノウイルス血清型は、複製欠損型にされると、典型的には、増殖およびレスキューが困難となり、したがって、現在のところ十分には特徴づけられていない。
【００１０】
本出願人は、最近、１つのそのような希有複製欠損型代替的血清型であるアデノウイルス血清型２６（亜群Ｄアデノウイルス）をレスキューし増殖させることに成功した。本出願人は、本明細書中に、異種トランスジーンの運搬および発現においてこれらのアデノウイルスが有効に機能することを示す。
【００１１】
したがって、本発明は、遺伝子治療またはワクチン接種プロトコールにおける使用に適した血清型２６の組換えアデノウイルスベクターに関する。本明細書中にはアデノウイルス血清型２６の核酸配列（配列番号１）が図１Ａ−１〜１Ａ−１１に示されているが、当業者に理解されるとおり、アデノウイルス血清型２６の任意の機能的ホモログまたは異なる株が本発明の実施形態を構成し、本発明のベクター、方法および組成物において使用されうる。Ａｄ２６配列内の配列変異は本出願人により認識されている。したがって、配列変異を有するＡｄ２６ベクターは本発明の実施形態として包含される。以下は、Ａｄ２６内で見出されうる配列変異の具体例のいくつかである（配列番号１に基づく塩基対番号）：（１）塩基対５９７２は“Ｇ”ではなく“Ｔ”；（２）塩基対７６３２は“Ａ”ではなく“Ｇ”；（３）塩基対７６６８は“Ｔ”ではなく“Ｇ”；（４）塩基対１１０９５は“Ｃ”ではなく“Ｇ”；（５）塩基対１１５６０は“Ａ”ではなく“Ｇ”；（６）塩基対１２２１５は“Ａ”ではなく“Ｇ”；（７）塩基対１２２９６は“Ｇ”ではなく“Ｔ”；（８）塩基対１２３２０は“Ｔ”ではなく“Ｇ”；（９）塩基対１２３５７は“Ｔ”ではなく“Ｃ”；（１０）塩基対１２３９２は“Ｔ”ではなく“Ｃ”；（１１）塩基対１２４３７は“Ａ”ではなく“Ｇ”；（１２）塩基対１２４７０は“Ｇ”ではなく“Ａ”；（１３）塩基対１２５３９は“Ｔ”ではなく“Ｃ”；（１４）塩基対１２６０８は“Ｔ”ではなく“Ｇ”；（１５）塩基対１２７３４は“Ｔ”ではなく“Ｃ”；（１６）塩基対１２７６４は“Ｇ”ではなく“Ａ”；（１７）塩基対１２７６７は“Ｃ”ではなく“Ｔ”；（１８）塩基対１２７９４は“Ｃ”ではなく“Ｔ”；（１９）塩基対１２８４２は“Ｃ”ではなく“Ｔ”；（２０）塩基対１２８７９は“Ｔ”ではなく“Ｃ”；（２１）塩基対１３０３８は“Ａ”ではなく“Ｇ”；（２２）塩基対１３０８５−１３０８８は“ＧＡＧＧ”ではなく“ＣＣＧＣ”；（２３）塩基対１３０９４は“Ｃ”ではなく“Ａ”；（２４）塩基対１３２１６は“Ｃ”ではなく“Ｔ”；（２５）塩基対１３４４８は“Ａ”ではなく“Ｇ”；（２６）塩基対１５２９７は“Ｃ”ではなく“Ｔ”；（２７）塩基対１５３００は“Ｔ”ではなく“Ｃ”；（２８）塩基対１６２２６は“Ｃ”ではなく“Ａ”；（２９）塩基対１６２３７は“Ｃ”ではなく“Ｇ”；（３０）塩基対１６３７９は“Ａ”ではなく“Ｇ”；（３１）塩基対１６８９７は“Ｔ”ではなく“Ｃ”；（３２）塩基対１９６２６は“Ａ”ではなく“Ｃ”；（３３）塩基対１９６６２は“Ｔ”ではなく“Ｃ”；（３４）塩基対１９６６５は“Ａ”ではなく“Ｃ”；（３５）塩基対１９６６９は“Ｔ”ではなく“Ｃ”；（３６）塩基対１９７８５は“Ａ”ではなく“Ｃ”；（３７）塩基対１９８４８は“Ｔ”ではなく“Ｃ”；（３８）塩基対１９８５１は“Ｃ”ではなく“Ｔ”；（３９）塩基対１９８５７は“Ｃ”ではなく“Ｔ”；（４０）塩基対２０２０５は“Ｇ”ではなく“Ａ”；（４１）塩基対２０２５３は“Ｔ”ではなく“Ｃ”；（４２）塩基対２０２７７は“Ｃ”ではなく“Ｇ”；（４３）塩基対２１５９８は“Ａ”ではなく“Ｇ”；（４４）塩基対２１６０１は“Ａ”ではなく“Ｇ”；（４５）塩基対２１７５７は“Ｇ”ではなく“Ａ”；（４６）塩基対２１６８８は“Ｔ”ではなく“Ｇ”；（４７）塩基対２１７９０は“Ａ”ではなく“Ｇ”；（４８）塩基対２２１７６は“Ｔ”ではなく“Ｇ”；（４９）塩基対２２５１８と２２５１９との間に３塩基対（ＴＴＣ）の付加；（５０）塩基対２２５６７は“Ｔ”ではなく“Ｃ”；（５１）塩基対２２５７１は“Ｇ”ではなく“Ａ”；（５２）塩基対２２５８２と２２５８３との間に６塩基対（ＧＧＣＡＧＴ）の付加；（５３）塩基対２２５９７は“Ｃ”ではなく“Ｔ”；（５４）塩基対２２６０５は“Ｇ”ではなく“Ｃ”；（５５）塩基対２２７４８は“Ｃ”ではなく“Ｔ”；（５６）塩基対２３２０６は“Ａ”ではなく“Ｇ”；（５７）塩基対２６５３６は“Ｇ”ではなく“Ａ”；および（５８）塩基対３０２１７−３０２３１は欠失。
【００１２】
当業者は、本明細書中に開示されている配列情報が与えられれば、アデノウイルス血清型２６配列の他の変異体を更に特定することが可能である。血清型の分類は当技術分野において十分に理解されている。アデノウイルス血清型は、当技術分野においては、ラットおよびアカゲザル赤血球の赤血球凝集特性、ＤＮＡ相同性、制限酵素切断パターン、Ｇ＋Ｃ含量比および腫瘍原性を含む（これらに限定されるものではない）当技術分野において認識されている多数の生物学的、化学的、免疫学的および構造的基準により区別されている（Ｓｔｒａｕｓ，前掲；Ｈｏｒｗｉｔｚ，前掲）。与えられた血清型は、ウイルスＤＮＡの制限マッピング、ウイルスＤＮＡの移動度の分析、電気泳動後のＳＤＳポリアクリルアミドゲル上のビリオンポリペプチドの移動度の分析、血清型を定める配列を含有する特にキャプシド遺伝子（例えば、ヘキソン）からの既知配列との配列情報の比較、およびＡＴＣＣから入手可能な特定の血清型に関する参考血清との配列の比較を含む（これらに限定されるものではない）多数の方法により特定されうる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるアデノウイルス血清型の分類はＷａｄｅｌｌら，１９８０  Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３５４：１６−４２において考察されている。制限マッピングによるアデノウイルス血清型の分類はＷａｄｅｌｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１０：１９１−２２０において考察されている。
【００１３】
本発明のアデノウイルス血清型２６ベクターは、少なくとも部分的にＥ１における欠失／修飾を有し、生じるウイルスはＥ１活性を欠いていて（または実質的に欠いていて）、意図される宿主において該ベクターは複製不能となる。好ましくは、Ｅ１領域は完全に欠失または不活性化している。該アデノウイルスはＥ３および他の初期領域における追加的な欠失を含有しうるが、Ｅ２および／またはＥ４が欠失している場合には、組換え複製欠損型アデノウイルスベクターを作製するためにはＥ２および／またはＥ４相補細胞系を要するかもしれない。
【００１４】
本発明の方法で有用なアデノウイルスベクターは、Ｇｒａｈａｍ  ＆  Ｐｒｅｖｅｃ，１９９１  Ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，（Ｍｕｒｒａｙ，ＥＪ．編），ｐ．１０９；およびＨｉｔｔら，１９９７“Ｈｕｍａｎ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４０：１３７−２０６に概説されているような良く知られた技術を用いて構築することが可能である。
【００１５】
本明細書に記載の組換えアデノウイルスの増殖およびレスキューに使用するＥ１相補細胞系は、該ウイルスが複製するのに不可欠な要素を供与すべきであり、該要素は、該細胞の遺伝物質内にコードされていても、あるいはトランスで与えられてもよい。さらに、該Ｅ１相補細胞系および該ベクターは、該ベクターの核酸と該細胞系の核酸との間の相同組換えを可能にして複製可能ウイルス（または複製可能アデノウイルス「ＲＣＡ」）を与えうる重複要素を含有しないことが好ましい。本発明の方法での使用に適したアデノウイルスを得るためには、適当なＥ１および任意の他の重要な欠失領域を発現しうる任意の細胞系を使用することが可能であるが、増殖細胞は、網膜または腎臓に由来するヒト細胞である場合が多い。胚細胞、例えば羊膜細胞はＥ１相補性細胞系の作製に特に適していることが示されている。いくつかの細胞系が入手可能であり、これらには、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）（ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０）、９１１、２９３およびＥ１  Ａ５４９が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞系は、ＷＯ  ９７／００３２６（１９９７年１月３日付け公開）および発行された米国特許第６，０３３，９０８号に記載されている。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）は、複製欠損型（ＦＧ）アデノウイルスの産生を相補するが相同組換えによる複製可能アデノウイルスの産生を妨げるよう設計されたＥ１遺伝子セグメントで形質導入された初代ヒト網膜芽細胞細胞系である。２９３細胞はＧｒａｈａｍら，１９７７７  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２に記載されている。非Ｃ群アデノウイルスベクターの増殖およびレスキューのためには、増殖しているウイルスにおいて欠失したＥ１領域に対して相補性であるＥ１領域を発現する細胞系を使用することが可能である。例えば、組換えＡｄ２６Ｅ１欠失ベクターの増殖に適した細胞の具体例はアデノウイルス２６または別のＤ群血清型の初期領域１（Ｅ１）を発現する。あるいは、同一血清型に由来するＥ１およびＥ４の領域を発現する細胞系を使用することが可能である。例えば、米国特許第６，２７０，９９６号を参照されたい。もう１つの代替手段は、入手可能なＥ１発現細胞系（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）、Ａ５４９または２９３）において非Ｃ群アデノウイルスを増殖させることであろう。この後者の方法は、増殖させるアデノウイルス内への、決定的に重要なＥ４領域の取り込みを含む。その決定的に重要なＥ４領域は、該相補性細胞系のＥ１遺伝子産物（特にＥ１Ｂ  ５５Ｋ領域）のものと同じ又は非常に類似した血清型のウイルスに固有のものであり、典型的には、少なくともＥ４オープンリーディングフレーム６（「ＯＲＦ６」）を含む。２００４年３月４日付け公開のＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２６１４５を参照されたい。当業者は、本発明の方法に有用な組換え複製欠損型アデノウイルスの製造に適した多数の他の方法を容易に理解し行うことが可能である。どのような手段を用いたとしても、ウイルス製造後、ウイルスを精製し、製剤化し、宿主への投与の前に保存することが可能である。
【００１６】
血清型２６の組換え複製欠損型アデノウイルスを製造するためのそのような方法は本発明の一部とみなされる。特に、そのような方法は、（１）血清型２６の組換え複製欠損型アデノウイルスベクターを適当なアデノウイルスＥ１相補性細胞内に導入し、（２）ウイルス粒子を産生させることを含む。そのようにして産生されたウイルス粒子、および本発明の組換え複製欠損型アデノウイルス血清型２６ベクターを含む宿主細胞は、本発明の追加的な態様を構成する。「単離された宿主細胞」は、本明細書中では、トランスジェニックヒトを含まない細胞の集団と定義される。
【００１７】
本発明のアデノウイルスベクターは、より一般に使用されるアデノウイルス血清型を介した投与または再投与を個体の免疫応答が実際に妨げる場合に特に、異種ポリペプチドの発現の実施に非常に好適である。したがって、本発明の特定の実施形態は、関心のあるポリペプチドをコードする異種核酸を含む、血清型２６の組換え複製欠損型アデノウイルスベクターである。発現される核酸はＤＮＡおよび／またはＲＮＡであることが可能であり、二本鎖または一本鎖でありうる。該核酸は、Ｅ１と平行（ベクターバックボーンに対して５’から３’へ転写される）または逆平行（ベクターバックボーンに対して３’から５’へ転写される）の配向に挿入されうる。該核酸は、所望の宿主（例えば、哺乳類宿主）内での発現のためにコドンが最適化されうる。該異種核酸は発現カセットの形態でありうる。遺伝子発現カセットは、（ａ）関心のあるタンパク質または抗原をコードする核酸、（ｂ）該タンパク質／抗原をコードする核酸に機能しうる形で連結された異種プロモーター、および（ｃ）転写終結シグナルを含有しうる。
【００１８】
特定の実施形態においては、該異種プロモーターは真核生物ＲＮＡポリメラーゼにより認識される。本発明での使用に適したプロモーターの一例は、最初期ヒトサイトメガロウイルスプロモーターである（Ｃｈａｐｍａｎら，１９９１  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：３９７９−３９８６）。本発明で使用されうるプロモーターの更なる例としては、強力免疫グロブリンプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、マウスＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ＳＶ４０初期／後期プロモーターおよびβアクチンプロモーターが挙げられるが、意図される宿主内で該異種核酸の発現を引き起こしうる任意のプロモーターが本発明の方法において使用されうると当業者に認識されうる。該プロモーターは、Ｔｅｔオペレーター配列のような調節可能配列を含みうる。転写および発現の調節の可能性をもたらすこのような配列は、遺伝子転写の抑制／モジュレーションが望まれる場合に有用である。アデノウイルス遺伝子発現カセットは転写終結配列を含むことが可能であり、その具体例としては、ウシ成長ホルモン終結／ポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）または以下のとおりに定められる４９ヌクレオチド長の短い合成ポリＡシグナル（ＳＰＡ）が挙げられる：ＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧ（配列番号５）。リーダーまたはシグナルペプチドをトランスジーン内に含有させることも可能である。特定の実施形態においては、リーダーは組織特異的プラスミノーゲンアクチベータータンパク質ｔＰＡに由来する。
【００１９】
関心のある異種核酸は、典型的には、免疫原性および／または治療用タンパク質をコードする。好ましい治療用タンパク質としては、投与後に個々の宿主において何らかの測定可能な治療利益をもたらすものが挙げられる。好ましい免疫原性タンパク質としては、個体において防御性および／または有益な免疫応答を惹起しうるタンパク質が挙げられる。本明細書中に例示されている本発明の特定の実施形態は、開示されているベクター、方法および組成物による、代表的な免疫原性タンパク質（ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｎｅｆおよび／またはＰｏｌ）をコードする核酸の運搬であるが、治療用または免疫原性タンパク質をコードする任意の遺伝子が、本明細書中に開示されている方法に従い使用されることが可能であり、本発明の重要な実施形態を構成する。本発明のベクター、方法および組成物は、存在／機能が或る与えられた宿主において所望の効果［特に、前記のいずれかの特定の核酸、タンパク質、抗原、断片または活性の存在または非存在に関連した、それらにより生じる、（正または負に）引き起こされる、悪化する又は修飾される種々の状態の治療／改変／修飾において有用な治療用／免疫原性効果］をもたらす任意のポリペプチドの運搬を行うために使用することが可能である。アデノウイルス血清型２６ベクターは有意なレベルのｇａｇ特異的Ｔ細胞を誘導することが判明した（図５）。さらに、該結果は、開示されているベクターでの免疫化がＨＩＶ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の両方を惹起しうることを示した（図６）。これらの結果は、血清型５のアデノウイルスベクターと共に初回−追加法においてＡｄ２６を使用した場合に特に顕著であった。
【００２０】
したがって、本発明の１つの態様は、ＨＩＶ抗原／タンパク質をコードする異種核酸を保持するアデノウイルス血清型２６に基づくベクター、ベクター組成物およびそれらの使用方法に関する。ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）は後天性免疫不全症候群（エイズ）および関連障害の原因因子である。ＨＩＶはレトロウイルス科のＲＮＡウイルスであり、全レトロウイルスの５’ＬＴＲ−ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ−ＬＴＲ  ３’体制を示す。ＨＩＶの組込み形態はプロウイルスとして公知であり、約９．８Ｋｂ長である。該ウイルスゲノムの各末端は、長末端反復配列（ＬＴＲ）として公知のフランキング配列を含有する。
【００２１】
ＨＩＶ抗原／タンパク質をコードする異種核酸は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２、株Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｏ、ＩＩＩＢ、ＬＡＶ、ＳＦ２、ＣＭ２３５およびＵＳ４を含む（これらに限定されるものではない）任意のＨＩＶ株に由来しうる。例えば、Ｍｙｅｒｓら編，“Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＤＤＳ：１９９５（Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  ＮＭ  ９７５４５）を参照されたい。本明細書中に開示されている方法での使用に適したもう１つのＨＩＶ株はＨＩＶ株ＣＡＭ−１である（Ｍｙｅｒｓら編，“Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ”：１９９５，ＩＩＡ３−ＩＩＡ１９）。この遺伝子はクレードＢ（北米／欧州）配列のコンセンサスアミノ酸配列に酷似している。ＨＩＶ遺伝子配列は種々のクレードのＨＩＶ−１に基づくことが可能であり、その具体例としては、クレードＡ、ＢおよびＣが挙げられる。多数のＨＩＶ株の遺伝子の配列がＧｅｎＢａｎｋから公に入手可能であり、ＨＩＶの一次（ｐｒｉｍａｒｙ）野外分離体は、これらの株を入手可能にするようＱｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に委託しているＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（ＮＩＡＩＤ）から入手可能である。また、株は、Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ），Ｇｅｎｅｖａ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄからも入手可能である。
【００２２】
ＨＩＶ遺伝子は少なくとも９つのタンパク質をコードしており、以下の３つのクラスに分けられる：主要構造タンパク質（Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖ）、調節タンパク質（ＴａｔおよびＲｅｖ）および補助タンパク質（Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、ＶｉｆおよびＮｅｆ）。ｇａｇ遺伝子は、未スプライシングウイルスｍＲＮＡから発現される５５キロダルトン（ｋＤａ）の前駆体タンパク質（ｐ５５）をコードしており、ｐｏｌ遺伝子の産物であるＨＩＶプロテアーゼによりタンパク質分解的にプロセシングされる。成熟ｐ５５タンパク質産物はｐ１７（マトリックス）、ｐ２４（カプシド）、ｐ９（ヌクレオカプシド）およびｐ６である。ｐｏｌ遺伝子は、ウイルス複製に必要なタンパク質、すなわち、プロテアーゼ（Ｐｒｏ、Ｐ１０）、逆転写酵素（ＲＴ、Ｐ５０）、インテグラーゼ（ＩＮ、ｐ３１）およびＲＮアーゼＨ（ＲＮアーゼ、ｐ１５）の活性をコードしている。これらのウイルスタンパク質はＧａｇまたはＧａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質（リボソームフレームシフトにより産生される）として発現される。ついで該５５ｋＤａおよび１６０ｋＤａ  ｇａｇｐｏｌ前駆体タンパク質は、それらの成熟産物へと、ウイルスによりコードされるプロテアーゼによりタンパク質分解的にプロセシングされる。ｎｅｆ遺伝子は、ＣＤ４発現のダウンレギュレーション、Ｔ細胞活性の阻害およびＨＩＶ感染性の刺激のようないくつかの活性を有することが示されている初期補助ＨＩＶタンパク質（Ｎｅｆ）をコードしている。ｅｎｖ遺伝子は、１６０キロダルトン（ｋＤａ）の前駆体（ｇｐ１６０）として翻訳されるウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードしている。ついで、該前駆体は細胞プロテアーゼにより切断されて、外部の１２０ｋＤａエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ１２０）および膜貫通型４１ｋＤａエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ４１）を与える。ｇｐ１２０およびｇｐ４１は会合したままであり、ウイルス粒子上およびＨＩＶ感染細胞の表面上に提示される。ｔａｔ遺伝子は、ＨＩＶ複製に必須の転写トランスアクチベーターであるＲＮＡ結合タンパク質であるＴａｔタンパク質の、長い形態および短い形態をコードしている。ｒｅｖ遺伝子は、ＲＮＡ結合タンパク質である１３ｋＤａのＲｅｖタンパク質をコードしている。Ｒｅｖタンパク質は、Ｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ）と称されるウイルスＲＮＡの領域に結合する。Ｒｅｖタンパク質は核から細胞質への未スプライシングウイルスＲＮＡの転移を促進する。Ｒｅｖタンパク質は、ＨＩＶ後期遺伝子発現、そしてＨＩＶ複製に必要である。
【００２３】
本発明の方法および組成物においては、任意のＨＩＶ抗原をコードする核酸（それらの具体例には、前記遺伝子、それらの活性および／もしくは免疫原性断片をコードする核酸、ならびに／または前記のいずれかの修飾体／誘導体が含まれるが、これらに限定されるものではない）を使用することが可能である。本発明は、コドン最適化ＨＩＶ  ｇａｇ（コドン最適化完全長（「ＦＬ」）ＧａｇおよびｔＰＡ−Ｇａｇ融合タンパク質のｐ５５形態を含むが、何らこれらに限定されるものではない）、ＨＩＶ  ｐｏｌ、ＨＩＶ  ｎｅｆ、ＨＩＶ  ｅｎｖ、ＨＩＶ  ｔａｔ、ＨＩＶ  ｒｅｖおよび免疫学的に関連する修飾体／誘導体を含むＨＩＶ抗原をコードする核酸の種々のコドン最適化形態をも含む。本明細書中に例示されている実施形態は、コドン最適化Ｎｅｆ抗原、コドン最適化ｐ５５  Ｇａｇ抗原およびコドン最適化Ｐｏｌ抗原をコードする核酸を使用する。コドン最適化ＨＩＶ−１  ｇａｇ遺伝子は２００１年１月１１日付け公開のＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ００／１８３３２（ＷＯ  ０１／０２６０７）に開示されている。コドン最適化ＨＩＶ−１  ｅｎｖ遺伝子は、それぞれ１９９７年８月２８日付け公開（ＷＯ  ９７／３１１１５）および１９９７年１２月２４日付け公開（ＷＯ  ９７／４８３７０）のＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／０２２９４およびＰＣＴ／ＵＳ９７／１０５１７に開示されている。コドン最適化ＨＩＶ−１  ｐｏｌ遺伝子は、２０００年１２月２１日付け出願の米国特許出願第０９／７４５，２２１号および同様に２０００年１２月２１日付け出願のＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ００／３４７２４に開示されている。コドン最適化ＨＩＶ−１  ｎｅｆ遺伝子は、２０００年１２月１５日付け出願の米国特許出願第０９／７３８，７８２号および同様に２０００年１２月１５日付け出願のＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ００／３４１６２に開示されている。特定のＨＩＶ抗原またはその免疫学的に関連した部分もしくは修飾体／誘導体をコードする適当なヌクレオチド配列（限定的なものではないが、前記のものを含む）を選択することは当業者の認識範囲内に十分に含まれる。本明細書中で定義されるとおり、「免疫学的に関連」、「免疫原性」または「抗原性」は、（１）ウイルス抗原に関しては、該タンパク質が、投与されると、該ウイルスの増殖および／もしくは広がりを遅延させるのに並びに／又は個体内のウイルス負荷を減少させるのに十分な個体内における測定可能な免疫応答を惹起しうること、あるいは（２）ヌクレオチド配列に関しては、該配列が、前記の能力を有するタンパク質をコードしうることを意味する。さらに、当業者は、所望の結果をもたらしうるタンパク質、抗原、誘導体または断片をコードする任意の核酸（コドン最適化されていてもされていなくてもよい配列）が本発明の方法および組成物において有用であると理解することが可能である。
【００２４】
本発明のベクター、方法および組成物において使用しうるコドン最適化ｇａｇ遺伝子の一例は、２００１年１月１１日付け公開のＰＣＴ／ＵＳ００／１８３３２に開示されているものである（図７、配列番号３を参照されたい）。該配列はＨＩＶ−１株ＣＡＭ−１に由来し、完全長ｐ５５  ｇａｇをコードしている。ＨＩＶ−１株ＣＡＭ−１のｇａｇ遺伝子を選択したのは、それがクレードＢ（北米／欧州）配列のコンセンサスアミノ酸配列（Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  ＨＩＶデータベース）に酷似しているからである。該配列は、インビボ哺乳類発現を最高にするためにヒトにとって好ましい（「ヒト化」）コドンが組込まれるよう設計した（Ｌａｔｈｅ，１９８５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８３：１−１２）。
【００２５】
逆転写酵素（または、ポリメラーゼおよびＲＮアーゼＨ活性よりなるＲＴ）およびインテグラーゼ（ＩＮ）のコード配列を含む種々の合成ｐｏｌオープンリーディングフレームがＰＣＴ／ＵＳ００／３４７２４に開示されている。それにおけるタンパク質配列は、ＩＩＩＢのクローン分離体であるＨｘｂ２ｒに基づいている。この配列はコンセンサスクレードＢ配列に最も近く、８４８個中僅か１６個が非同一残基であることが示されている（Ｋｏｒｂｅｒら，１９９８，Ｈｕｍａｎ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ，Ｎｅｗ  Ｍｅｘｉｃｏ）。
【００２６】
本発明のこの態様の特定の実施形態は、ｗｔ−ｐｏｌ構築物（本明細書中、「ｗｔ−ｐｏｌ」または「ｗｔ−ｐｏｌ（コドン最適化）」と称される）をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含むベクターに関する。この場合、プロテアーゼ（ＰＲ）活性をコードする配列が欠失していて、ＲＴ（逆転写酵素およびＲＮアーゼＨ活性）およびＩＮインテグラーゼ活性をコードする最適化「野生型」配列が残されている。このタンパク質をコードするＤＮＡ分子は本明細書中では配列番号６（図９Ａ−１〜図９Ａ−２）として開示されており、オープンリーディングフレームはヌクレオチド１０−１２の開始Ｍｅｔ残基からヌクレオチド２５６０−２５６２の終止コドンまでに含有される。野生型ｐｏｌ構築物（配列番号７；図１０Ａ−１〜１０Ａ−２）のオープンリーディングフレームは８５０アミノ酸を含有する。
【００２７】
他の特定の実施形態は、最適化ＨＩＶ−１  ｐｏｌを含むベクターに関する。この場合、プロテアーゼ活性をコードする野生型配列の部分の欠失に加えて、発現されるタンパク質のＨＩＶ−１  ｐｏｌ（ＲＴ−ＲＨ−ＩＮ）活性に有害な、活性部位残基の突然変異の組合せが導入されている。したがって、本発明は、少なくとも部分的に、好ましくは実質的にＲＴ、ＲＮアーゼおよび／またはＩＮ活性を阻止する突然変異を含有する、ＰＲ活性をコードする配列を欠くＨＩＶ−１  ｐｏｌを含むアデノウイルスベクターに関する。本明細書中に開示する方法および組成物において有用なアデノウイルスベクター構築物の一部または一群であるＨＩＶ  ｐｏｌ突然変異体の１つのタイプには、発現されるタンパク質のＲＴ、ＲＮアーゼおよび／またはＩＮ領域内の活性部位を有効に改変してＨＩＶ−１  ＰｏｌのＲＴ、ＲＮアーゼＨおよび／またはＩＮ機能の酵素活性の実質的な低下をもたらす点突然変異を引き起こす少なくとも１つのヌクレオチド置換を含む突然変異核酸分子が含まれうるが、これらに限定されるものではない。本発明のこの部分の特定の実施形態においては、ＨＩＶ−１  ＤＮＡ  ｐｏｌ構築物は、ＲＴ、ＲＮアーゼＨおよびＩＮ活性を有効に阻止する、Ｐｏｌコード領域内の突然変異を含有する。特定のＨＩＶ−１  ｐｏｌ含有構築物は、ＰｏｌのＲＴ、ＲＮアーゼＨおよびＩＮドメインの活性部位を改変して各活性を少なくとも実質的に阻止する少なくとも１つの点突然変異を含有する。そのようなＨＩＶ  Ｐｏｌ突然変異体は、十中八九、それぞれＲＴ、ＲＮアーゼＨおよびＩＮ活性をもたらす各触媒ドメインの内部または周囲に少なくとも１つの点突然変異を含む。この目的のために、特定の実施形態は、ＰＲ、ＲＴ、ＲＮアーゼまたはＩＮ活性を有さない不活性化Ｐｏｌタンパク質（ＩＡ  Ｐｏｌ：配列番号８；図１１Ａ−１〜１１Ａ−３）を与える９個のコドン置換突然変異をコード核酸が含み、３個のそのような点突然変異がＲＴ、ＲＮアーゼおよびＩＮ触媒ドメインのそれぞれにおいて存在する、ＨＩＶ−１  ｐｏｌを含むアデノウイルスベクターに関する。したがって、意図される１つの例示においては、以下の表１に示す９個すべての突然変異を含有する、ＩＡ−Ｐｏｌをコードする核酸分子を適当な様態で含むアデノウイルスベクター構築物を使用する。置換のための更なるアミノ酸残基は、ＰｏｌのＲＮアーゼドメイン内に位置するＡｓｐ５５１である。本明細書に開示されている突然変異の任意の組合せが適している可能性があり、したがって、本発明のベクター、方法および組成物において使用されうる。付加および欠失突然変異が意図され、本発明の範囲内に含まれるが、好ましい突然変異は、野生型アミノ酸から代替的アミノ酸残基への置換をもたらす点突然変異である。
【００２８】
【表１】
2008538894.tif 000003
【００２９】
ＨＩＶ−１  Ｐｏｌの活性部位の内部および周辺のエピトープを改変する可能性を減少させるために、本発明のＩＡｐｏｌ突然変異アデノウイルスベクター構築物内に点突然変異を組込むことが好ましい。この目的のために、配列番号８（図１１Ａ−１〜１１Ａ−３）は、本明細書中で「ＩＡｐｏｌ」と称される、表１に示す９個の突然変異に加えてコドン最適化ｐｏｌをコードするヌクレオチド配列を開示する。
【００３０】
ｐｏｌを含むアデノウイルスベクターの具体例の１つにおいては（表１を参照されたい）、ポリメラーゼの三つ組触媒基（すなわち、Ａｓｐ１１２、Ａｓｐ１８７およびＡｓｐ１８８）を含むすべての残基をアラニン（Ａｌａ）残基で置換することが可能である（Ｌａｒｄｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  １９８７，３２７：７１６−７１７；Ｌａｒｄｅｒら，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９８９，８６：４８０３−４８０７）。ＲＮアーゼＨ活性を阻止するために、Ａｓｐ４４５、Ｇｌｕ４８０およびＡｓｐ５００において３個の追加的な突然変異を組込むことが可能であり、各残基はそれぞれＡｌａ残基で置換される（Ｄａｖｉｅｓら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：，８８−９５；Ｓｃｈａｔｚら，１９８９，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２５７：３１１−３１４；Ｍｉｚｒａｈｉら，１９９０，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１８：ｐｐ．５３５９−５３５３）。ＨＩＶ  ｐｏｌインテグラーゼの機能はＡｓｐ６２６、Ａｓｐ６７８およびＧｌｕ７１４における３個の突然変異により阻止されうる。この場合もまた、これらの残基のそれぞれがＡｌａ残基で置換されうる（Ｗｉｓｋｅｒｃｈｅｎら，１９９５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：３７６−３８６；Ｌｅａｖｉｔｔら，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２１１３−２１１９）。配列番号８のアミノ酸残基Ｐｒｏ３はＲＴ遺伝子の出発点を示す。ＩＡ−Ｐｏｌの完全なアミノ酸配列は本明細書中に配列番号８として開示されており、図１１Ａ−１〜図１１Ａ−３に示されている。
【００３１】
突然変異の任意の組合せが適している可能性があり、したがって、単独で、他の異種遺伝子と共に、組合せ法で、および／または初回−追加法の一部として投与される本明細書中に開示されているアデノウイルスＨＩＶ構築物、方法および組成物において使用されうると理解されるであろう。例えば、それぞれ逆転写酵素、ＲＮアーゼＨおよびインテグラーゼコード領域内の３個の残基のうちの２個だけを突然変異させる一方で、これらの酵素活性を尚も阻止することが可能であろう。
【００３２】
本発明のもう１つの主題は、真核生物輸送シグナルペプチドまたはリーダーペプチド（例えば、免疫グロブリンリーダーペプチドのような高発現哺乳類タンパク質において見出されるもの）を含むコドン最適化ＨＩＶ−１  Ｐｏｌを含むアデノウイルスベクター構築物を使用する方法、ベクターおよび組成物である。任意の機能性リーダーペプチドが効力に関して試験されうる。それぞれのＤＮＡは公知の組換えＤＮＡ法により修飾されうる。代替手段においては、前記のとおり、リーダー／シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を、関心のあるＰｏｌタンパク質のオープンリーディングフレームを収容するＤＮＡベクター内に挿入することが可能である。クローニング法には無関係に、最終産物は、関心のある修飾ＨＩＶ−１  Ｐｏｌタンパク質（リーダーペプチドを含有するＨＩＶ−１  Ｐｏｌタンパク質が含まれるが、これに限定されるものではない）をコードするヌクレオチド配列と共に有効な遺伝子発現のためのベクター成分を含むベクター構築物である。
【００３３】
本明細書中に開示されている遺伝子配列の設計は、インビボ哺乳類発現を最高にするための、該配列内の各アミノ酸残基に関する、ヒトにとって好ましい（「ヒト化」）コドンの使用を含む（Ｌａｔｈｅ，１９８５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８３：１−１２）。配列番号６および８におけるコドン使用を調べることにより理解されうるとおり、哺乳類における最適化のための以下のコドン使用が好ましい：Ｍｅｔ（ＡＴＧ）、Ｇｌｙ（ＧＧＣ）、Ｌｙｓ（ＡＡＧ）、Ｔｒｐ（ＴＧＧ）、Ｓｅｒ（ＴＣＣ）、Ａｒｇ（ＡＧＧ）、Ｖａｌ（ＧＴＧ）、Ｐｒｏ（ＣＣＣ）、Ｔｈｒ（ＡＣＣ）、Ｇｌｕ（ＧＡＧ）；Ｌｅｕ（ＣＴＧ）、Ｈｉｓ（ＣＡＣ）、Ｉｌｅ（ＡＴＣ）、Ａｓｎ（ＡＡＣ）、Ｃｙｓ（ＴＧＣ）、Ａｌａ（ＧＣＣ）、Ｇｌｎ（ＣＡＧ）、Ｐｈｅ（ＴＴＣ）およびＴｙｒ（ＴＡＣ）。哺乳類（ヒト）コドン最適化に関する更なる考察のためには、ＷＯ  ９７／３１１１５（ＰＣＴ／ＵＳ９７／０２２９４）を参照されたい。当業者は別形態のコドン最適化を使用することが可能であり、あるいは本発明の範囲内のＨＩＶワクチン構築物を作製する場合にはこの工程を省略することが可能であると意図される。したがって、本発明はまた、コドン最適化されていない又は部分的にコドン最適化された形態の核酸分子およびＨＩＶタンパク質の種々の野生型および修飾形態をコードする関連組換えアデノウイルスＨＩＶ構築物を含む／使用するベクター、方法および組成物に関する。しかし、これらの構築物のコドン最適化は本発明の好ましい実施形態を構成する。
【００３４】
本発明における特定の実施形態において有用なＨＩＶ−１  ｎｅｆおよびＨＩＶ−１  ｎｅｆ修飾体のコドン最適化形態は、２０００年１２月１５日付け出願の米国特許出願第０９／７３８，７８２号および同様に２０００年１２月１５日付け出願のＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ００／３４１６２に見出されうる。特定のコドン最適化ｎｅｆおよびｎｅｆ修飾体は、ヒトのような哺乳類系における発現に関してコドンが最適化されている、ＨＩＶ−１  ｊｒｆｌ分離体に由来するＨＩＶ−１  Ｎｅｆをコードする核酸に関する。このタンパク質をコードするＤＮＡ分子は本明細書中の配列番号１０（図１２）に開示されており、一方、発現されるオープンリーディングフレームは本明細書中に配列番号１１として開示されている。図１４Ａ−１〜１４Ａ−２は、ＨＩＶ−ｎｅｆのオープンリーディングフレームを含むコドン最適化ヌクレオチドと野生型との比較を示す。配列番号１０のオープンリーディングフレームはヌクレオチド１２−１４の開始メチオニン残基およびヌクレオチド６６０−６６２の「ＴＡＡ」終止コドンを含む。配列番号１０のオープンリーディングフレームは、コドン最適化ＤＮＡワクチンベクターの使用により発現される２１６アミノ酸のＨＩＶ−１  Ｎｅｆタンパク質を与える。その２１６アミノ酸のＨＩＶ−１  Ｎｅｆ（ｊｒｆｌ）タンパク質は本明細書中に配列番号１１；図１３として開示されている。本発明におけるもう１つの実施形態を構成する修飾ｎｅｆ最適化コード領域は、アミノ末端ミリスチル部位における修飾（Ｇｌｙ−２からＡｌａ−２へ）およびＬｅｕ−１７４−Ｌｅｕ−１７５ジロイシンモチーフからＡｌａ−１７４−Ａｌａ−１７５への置換をオープンリーディングフレームがコードしている、本明細書中にｏｐｔ  ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）として記載されている、最適化ＨＩＶ−１  Ｎｅｆをコードする核酸分子に関する。このタンパク質をコードするＤＮＡ分子は本明細書中に配列番号１３として開示されており、一方、発現されるオープンリーディングフレームは本明細書中に配列番号１４として開示されている。本発明の実施形態の１つを構成する更にもう１つの修飾ｎｅｆ最適化コード領域は、アミノ末端ミリスチル化部位における修飾（Ｇｌｙ−２からＡｌａ−２へ）をオープンリーディングフレームがコードしている、本明細書中にｏｐｔ  ｎｅｆ（Ｇ２Ａ）として記載されている、最適化ＨＩＶ−１  Ｎｅｆをコードする核酸分子に関する。このタンパク質をコードするＤＮＡ分子は本明細書中に配列番号１５として開示されており、一方、発現されるオープンリーディングフレームは本明細書中に配列番号１６として開示されている。
【００３５】
ＨＩＶ−１  Ｎｅｆは、Ｇｌｙ−２のミリスチル化により宿主細胞細胞膜の内側表面に結合している２１６アミノ酸の細胞質ゾルタンパク質である（Ｆｒａｎｃｈｉｎｉら，１９８６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５５：５９３−５９９）。考えられうるＮｅｆ機能の全てが解明されているわけではないが、内側細胞膜へのＮｅｆの正しい輸送は、ＨＩＶ−１の生活環の初期を促進するよう宿主細胞内環境を改変することにより、および後代ウイルス粒子の感染力を増強することにより、ウイルス複製を促進することが明らかになっている。本発明の１つの態様においては、本発明の方法、ベクターおよび組成物は、発現されるタンパク質のアミノ末端領域がリーダーペプチドを含有するよう異種リーダーペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するよう修飾されたコドン最適化ｎｅｆ配列を含むアデノウイルスベクターを使用する。真核細胞を特徴づける機能の多様性は、それらの膜境界部の構造分化に基づく。これらの構造を生成し維持するためには、小胞体内のそれらの合成部位から細胞全体にわたる所定の目的地へタンパク質が輸送されなけらばならない。このためには、主要輸送経路へのアクセスポイントに位置する経路選択をもたらす分子装置により認識されるソーティングシグナルを輸送タンパク質が提示する必要がある。ほとんどのタンパク質のソーティング決定は、それらがそれらの生合成経路を通過する際に１回だけ行われる必要がある。なぜなら、それらがそれらの機能を遂行する細胞位置であるそれらの最終目的地がそれらの永久的な存在部位となるからである。細胞内完全性の維持は、部分的には、タンパク質の選択的ソーティングおよびその正しい目的地への適切な輸送に基づく。「アドレス・ラベル（宛先標識）」として作用しうるタンパク質においては、一定の配列モチーフが存在する。多数のソーティングシグナルは膜タンパク質の細胞質ドメインに会合していることが見出されている。ＣＴＬ応答の有効な誘導は、しばしば、抗原の持続的高レベル内因性発現を要する。ミリスチル化による膜会合はほとんどのＮｅｆ機能のための必須要件であるため、グリシンからアラニンへの変化、ジロイシンモチーフの変化および／またはリーダー配列での置換によりミリスチル化を欠く突然変異体は機能的に欠損しており、したがって、ＨＩＶ−１ワクチン成分として使用する場合に、野生型Ｎｅｆと比べて改良された安全性プロファイルを有するであろう。
【００３６】
したがって、特定の実施形態においては、該ヌクレオチド配列は、関心のあるリーダーまたはシグナルペプチドを含むよう修飾されている。これは公知の組換えＤＮＡ法により達成されうる。代替法においては、前記のとおり、関心のあるＮｅｆタンパク質のオープンリーディングフレームを収容するＤＮＡベクター内にヌクレオチド配列の挿入を行うことが可能である。
【００３７】
該タンパク質のカルボキシ領域内のジロイシンモチーフと共にＧｌｙ−２のミリスチル化が、エンドサイトーシスを介したＣＤ４のＮｅｆ誘導性ダウンレギュレーションに必須であることが示されている（Ａｉｋｅｎら，１９９４，Ｃｅｌｌ  １６：８５３−８６４）。また、Ｎｅｆ発現はエンドサイトーシスを介したＭＨＣＩのダウンレギュレーションを促進することも示されている（Ｓｃｈｗａｒｔｚら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２（３）：３３８−３４２）。本発明は、輸送および／または機能特性において改変された修飾Ｎｅｆタンパク質をコードする配列を含むアデノウイルスベクター、ならびに本発明の方法および組成物におけるその使用を含む。本発明のアデノウイルスベクターＨＩＶ構築物内に導入される修飾には、アミノ末端リーダーペプチドを含む修飾Ｎｅｆタンパク質の発現をもたらすｎｅｆオープンリーディングフレームに対する付加、欠失または置換、アミノ末端ミリスチル化部位の修飾または欠失、および感染宿主細胞内での機能を改変する、Ｎｅｆタンパク質内のジロイシンモチーフの修飾または欠失が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
本明細書中に開示されている方法および組成物において使用する組換えアデノウイルス構築物は、アミノ末端ミリスチル化部位の修飾（Ｇｌｙ−２からＡｌａ−２へ）およびＬｅｕ１７４−Ｌｅｕ−１７５ジロイシンモチーフからＡｌａ−１７４−Ａｌａ−１７５への置換を有する最適化ＨＩＶ−１  Ｎｅｆをコードする配列を含みうる。このオープンリーディングフレームは本明細書中にｏｐｔ  ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）として記載されており、配列番号１３として開示されており、これはヌクレオチド１２−１４の開始メチオニン残基およびヌクレオチド６６０−６６２の「ＴＡＡ」終止コドンを含む。前記修飾を有するＨＩＶ−１  ｊｒｆｌ  ｎｅｆ遺伝子のこのコドン最適化形態のヌクレオチド配列は本明細書中に配列番号１３；図１５として開示されている。配列番号１３のオープンリーディングフレームは、本明細書中に配列番号１４；図１６として開示されているＮｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）をコードしている。
【００３９】
本明細書中に開示されている方法および組成物において使用するもう１つの組換えアデノウイルス構築物は、アミノ末端ミリスチル化部位の修飾（Ｇｌｙ−２からＡｌａ−２へ）を有する最適化ＨＩＶ−１  Ｎｅｆをコードする配列を含みうる。このオープンリーディングフレームは本明細書中にｏｐｔ  ｎｅｆ（Ｇ２Ａ）として記載されており、配列番号１６として開示されており、これはヌクレオチド１２−１４の開始メチオニン残基およびヌクレオチド６６０−６６２の「ＴＡＡ」終止コドンを含む。前記修飾を有するＨＩＶ−１  ｊｒｆｌ  ｎｅｆ遺伝子のこのコドン最適化形態のヌクレオチド配列は本明細書中に配列番号１５；図１７として開示されている。配列番号１５のオープンリーディングフレームは、本明細書中に配列番号１６；図１８として開示されているＮｅｆ（Ｇ２Ａ）をコードしている。
【００４０】
図１９はｎｅｆおよびｎｅｆ誘導体の概要図を示す。Ｎｅｆ誘導体に含まれるアミノ酸残基が示されている。グリシン２ならびにロイシン１７４および１７５は、それぞれミリスチル化およびジロイシンモチーフに関与する部位である。
【００４１】
本発明の方法および組成物において有用なアデノウイルスベクターは１以上のＨＩＶ遺伝子／コード核酸を含みうる。２以上のＨＩＶ遺伝子、それらの誘導体または修飾体を含む少なくとも１つの組換えアデノウイルスベクターの投与が予想され、本明細書中に例示されている。２以上のＨＩＶ遺伝子は少なくとも１つの組換えアデノウイルスベクター構築物上で発現されることが可能であり、および／または２以上のＨＩＶ遺伝子は２以上の構築物にわたって発現されることが可能である。したがって、本発明は、宿主免疫を回避／迂回し多価ＨＩＶ遺伝子投与（その具体例には、（１）ＧａｇおよびＮｅｆポリペプチド、（２）ＧａｇおよびＰｏｌポリペプチド、（３）ＰｏｌおよびＮｅｆポリペプチド、ならびに（４）Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＮｅｆポリペプチドをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクターの投与が含まれるが、これらに限定されるものではない）を達成するために本発明の方法および組成物を使用する可能性をもたらす。
【００４２】
複数の遺伝子／コード核酸を、複数のオープンリーディングフレームを含むプレ・アデノウイルスプラスミドの作製のための適当なシャトルプラスミド内に連結することが可能である。複数の遺伝子／コード核酸のためのオープンリーディングフレームは、異なるプロモーターおよび転写終結配列に、機能しうる様態で連結されうる。他の実施形態においては、該オープンリーディングフレームは、単一のプロモーターに、機能しうる様態で連結されることが可能であり、該オープンリーディングフレームは、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ；ＷＯ  ９５／２４４８５に開示されているとおり）により、または複数のオープンリーディングフレームの転写が単一のプロモーターから切断されるの可能にする適当な代替物により、機能しうる様態で連結される。ある実施形態においては、該オープンリーディングフレームは、逐次的（ｓｔｅｐｗｉｓｅ）ＰＣＲまたは２つのオープンリーディングフレームを互いに融合するための適当な代替法により互いに融合されうる。本発明での使用に適した種々の組合せ投与計画が、２００２年３月２１日付け公開のＰＣＴ／ＵＳ０１／２８８６１に開示されている。
【００４３】
本明細書の多価ベクターは、それに含有されるＨＩＶ抗原に特異的な細胞性免疫応答の惹起におけるその使用方法と同様に、本発明の重要な態様を構成する。種々の融合／多価構築物に想到しそれらを有効に使用することは当業者の認識範囲に十分に含まれる。
【００４４】
本発明は、本発明の組換えアデノウイルス血清型２６ベクターを個体に投与することを含む、（１）個体において治療応答をもたらすための、および（２）免疫応答を誘導する（細胞性免疫応答を誘導する）ための方法を含む。本発明の１つの態様は、関心のある抗原を発現する組換えアデノウイルス血清型２６ビヒクルを投与することを含む、１以上の抗原（細菌、ウイルス（例えば、ＨＩＶ）またはその他（例えば、癌））に対する増強された免疫応答を生成させるための方法である。より頻繁に現れるアデノウイルス血清型（例えば、Ａｄ２およびＡｄ５）に対する既存免疫が、与えられた宿主において存在する場合に特に、この方法における組換えＡｄ２６ベクターの投与は細胞性免疫応答の改善をもたらす。この改善されたワクチン投与方法の効果は、これまでに未感染の個体に対する、より低い伝染率（または発生率）（すなわち、予防的用途）、および／または、感染個体内のウイルス／細菌／外来因子のレベルの減少（すなわち、治療的用途）であるはずである。ＨＩＶ適応症に関しては、この改善されたワクチン投与方法の効果は、これまでに未感染の個体に対する、より低い伝染率（すなわち、予防的用途）、および／または、感染個体内のウイルス負荷のレベルの減少によるＨＩＶ−１感染の無症候期の延長（すなわち、治療的用途）にあるはずである。該組換えＡｄ２６ベクターの投与、細胞内運搬および発現は宿主ＣＴＬおよびＴｈ応答を惹起する。
【００４５】
したがって、本発明は、ウイルス（例えば、ＨＩＶ）、細菌または他の因子に対する暴露後の感染の確立を妨げるための有効な免疫予防をもたらすための、あるいは有益な長期的結果を伴って、より低いウイルス／細菌／その他の負荷の確立をもたらすための感染軽減のための感染後治療用ワクチンとしての、組換えＡｄ２６ウイルスベクター（または、本明細書中でワクチンと称されるその免疫原性組成物）の投与に関する方法に関する。
【００４６】
本発明の組換えアデノウイルス血清型２６ベクターは、単独投与の対象を構成することが可能であり、あるいはより広い初回／追加型の投与計画の一部でありうる。初回−追加投与計画においては、異なるウイルス（異なるウイルス血清型および種々の起源のウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない）、ウイルスベクター／タンパク質の組合せ、ならびにウイルスおよびポリヌクレオチド投与の組合せを用いることが可能である。このような方法では、まず、あるビヒクル（例えば、ウイルスビヒクル、精製および／または組換えタンパク質、あるいはコード核酸）を使用してタンパク質／抗原／誘導体／修飾体の初回用量を個体に投与する。通常、複数回、典型的には１〜４回の初回抗原刺激を用いるが、より多数回を用いることも可能である。該初回用量は免疫応答を有効に初回刺激して、後に循環免疫系において該タンパク質／抗原が同一のものと確認されると、該免疫応答は該宿主内で該タンパク質／抗原を直ちに認識し応答しうる。ある程度の期間の後、既に投与されたタンパク質／抗原、その誘導体または修飾体の少なくとも１つの追加用量を該個体に投与する（ウイルスビヒクル／タンパク質／核酸により投与する）。初回抗原刺激と追加抗原刺激との間の期間の長さは典型的には約４ヶ月〜１年の様々な長さでありうるが、当業者に認識されるとおり他の時間枠を用いることも可能である。また、フォローアップまたは追加投与を、選択された時間間隔で反復することが可能である。混合様式の初回および追加接種法は、既存の抗ベクター免疫が存在する場合に特に、増強された免疫応答をもたらすであろう。
【００４７】
初回−追加投与計画において本明細書中に開示されているベクターと共に使用する代替的投与ビヒクル（ウイルス／核酸／タンパク質の場合）の選択は、この場合の実施の成功に決定的に重要なものではない。細胞性および／または体液性応答が惹起されるのに十分なレベルまで抗原を運搬しうる（または該抗原の発現をもたらしうる）任意のビヒクルが、ここに開示されている初回または追加投与を行うのに十分なものであるはずである。適当なウイルスビヒクルには、限定的なものではないがアデノウイルス血清型５、６、２４、３４および３５（例えば、２００１年１月１１日付け公開のＰＣＴ／ＵＳ００／１８３３２（Ａｄ５）；２００２年３月２１日付け公開のＰＣＴ／ＵＳ０１／２８８６１（Ａｄ５）；２００３年４月１７日付け公開のＰＣＴ／ＵＳ０２／３２５１２（Ａｄ６）；２００４年３月４日付け公開のＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２６１４５（Ａｄ２４、Ａｄ３４）；２０００年１１月２３日付け公開のＰＣＴ／ＮＬ００／００３２５（Ａｄ３５）を参照されたい）を含む種々の血清型のアデノウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。あるいは、該アデノウイルス投与の後または前に、多様な起源のウイルスビヒクルの投与を行うことが可能である。種々のウイルスビヒクルの具体例には、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」；例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉら，１９８７  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１；Ｓａｍｕｌｓｋｉら，１９８９  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８を参照されたい）；レトロウイルス（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，１９９０  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：５−１４；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照されたい）；ポックスウイルス（複製欠損型ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣおよびＭＶＡベクターが含まれるが、これらに限定されるものではない；例えば、Ｐａｎｉｃａｌｉ  ＆  Ｐａｏｌｅｔｔｉ，１９８２  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：４９２７−３１；Ｎａｋａｎｏら，１９８２  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：１５９３−１５９６；Ｐｉｃｃｉｎｉら，Ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５３：５４５−６３（Ｗｕ  ＆  Ｇｒｏｓｓｍａｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）；Ｓｕｔｔｅｒら，１９９４  Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：１０３２−４０；Ｗｙａｔｔら，１９９６  Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：１４５１−８；ならびに米国特許第４，６０３，１１２号、第４，７６９，３３０号、第４，７２２，８４８号、第４，６０３，１１２号、第５，１１０，５８７号、第５，１７４，９９３号および第５，１８５，１４６号を参照されたい）；ならびにアルファウイルス（例えば、ＷＯ  ９２／１０５７８；ＷＯ  ９４／２１７９２；ＷＯ  ９５／０７９９４；ならびに米国特許第５，０９１，３０９号および第５，２１７，８７９号を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＨＩＶ抗原の運搬のためにアデノウイルスおよびポックスウイルスベクターを使用する初回−追加法は、２００３年９月１８日付け公開の国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／０７５１１に記載されている。前記の免疫法の代替手段は、アデノウイルス初回および／または追加投与と共にポリヌクレオチド投与（「裸ＤＮＡ」または促進ポリヌクレオチド運搬が含まれるが、これらに限定されるものではない）を用いることであろう。例えば、Ｗｏｌｆｆら，１９９０  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５ならびに以下の特許公開：米国特許第５，５８０，８５９号、第５，５８９，４６６号、第５，７３９，１１８号、第５，７３６，５２４号、第５，６７９，６４７号、ＷＯ  ９０／１１０９２およびＷＯ  ９８／０４７２０を参照されたい。もう１つの代替手段は、アデノウイルスと共に初回−追加法での精製／組換えタンパク質の投与を用いることであろう。
【００４８】
本発明の組換えアデノウイルスベクターが投与されうる可能な宿主／被ワクチン接種者／個体には、霊長類ならびに特にヒトおよび非ヒト霊長類が含まれ、商業的または家畜獣医学的に重要な任意の非ヒト哺乳類が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４９】
本発明の方法および組成物により投与されるワクチン組成物を包含する（これらに限定されるものではない）アデノウイルスベクターの組成物は、単独で、またはウイルスに基づく若しくはウイルスに基づかない他のＤＮＡ／タンパク質ワクチンと組合せて投与されうる。それらはまた、より広い治療計画の一部として投与されうる。したがって、本発明は、開示されているアデノウイルス構築物が他の療法［他の抗微生物（例えば、抗ウイルス、抗細菌）剤での治療が含まれるが、これらに限定されるものではない］と共に投与される場合を包含する。いずれの具体的な抗微生物剤も、本明細書に開示されている方法の実施の成功に決定的に重要なものではない。例えば、該抗微生物剤は、抗体、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチドまたは小分子に基づく／由来することが可能である。個体における微生物の複製／広がり／負荷を有効に軽減する任意の抗微生物剤が、本明細書に記載の用途には十分なものである。
【００５０】
抗ウイルス剤はウイルスの機能／生活環に拮抗し、該ウイルスの適切な生活環に必須のタンパク質／機能を標的とし、その効果はインビボまたはインビトロアッセイにより容易に判定されうる。特定のウイルスタンパク質を標的とするいくつかの代表的な抗ウイルス剤としては、プロテアーゼインヒビター、逆転写酵素インヒビター（ヌクレオシド類似体、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビターおよびヌクレオチド類似体が含まれる）およびインテグラーゼインヒビターが挙げられる。プロテアーゼインヒビターには、例えば、インディナビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ）／ＣＲＩＸＩＶＡＮ（登録商標）、リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ）／ＮＯＲＶＩＲ（登録商標）、サキナビル（ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ）／ＦＯＲＴＯＶＡＳＥ（登録商標）、ネルフィナビル（ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ）／ＶＩＲＡＣＥＰＴ（登録商標）、アンプレナビル（ａｍｐｒｅｎａｖｉｒ）／ＡＧＥＮＥＲＡＳＥ（登録商標）、ロピナビル（ｌｏｐｉｎａｖｉｒ）およびリトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ）／ＫＡＬＥＴＲＡ（登録商標）が含まれる。逆転写酵素インヒビターには、例えば、（１）ヌクレオシド類似体、例えばジドブジン（ｚｉｄｏｖｕｄｉｎｅ）／ＲＥＴＲＯＶＩＲ（登録商標）（ＡＺＴ）、ジダノシン（ｄｉｄａｎｏｓｉｎｅ）／ＶＩＤＥＸ（登録商標）（ｄｄＩ）、サルシタビン（ｚａｌｃｉｔａｂｉｎｅ）／ＨＴＶＩＤ（登録商標）（ｄｄＣ）、スタブジン（ｓｔａｖｕｄｉｎｅ）／ＺＥＲＩＴ（登録商標）（ｄ４Ｔ）、ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）／ＥＰＩＶＩＲ（登録商標）（３ＴＣ）、アバカビル（ａｂａｃａｖｉｒ）／ＺＩＡＧＥＮ（登録商標）（ＡＢＣ）、（２）非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、例えばネビラピン（ｎｅｖｉｒａｐｉｎｅ）／ＶＩＲＡＭＵＮＥ（登録商標）（ＮＶＰ）、デラビルジン（ｄｅｌａｖｉｒｄｉｎｅ）／ＲＥＳＣＲＩＰＴＯＲ（登録商標）（ＤＬＶ）、エファビレンズ（ｅｆａｖｉｒｅｎｚ）／ＳＵＳＴＩＶＡ（登録商標）（ＥＦＶ）、および（３）ヌクレオチド類似体、例えばテノフォビル（ｔｅｎｏｆｏｖｉｒ）ＤＦ／ＶＩＲＥＡＤ（登録商標）（ＴＤＦ）が含まれる。インテグラーゼインヒビターには、例えば、２００３年３月２０日付け公開の米国特許出願公開番号ＵＳ２００３／００５５０７１および国際出願ＷＯ  ０３／０３５０７７に開示されている分子が含まれる。示されている抗ウイルス剤はウイルス／ウイルスタンパク質の機能、例えば調節タンパク質ｔａｔまたはｒｅｖとそれぞれトランス活性化応答領域（「ＴＡＲ」）またはｒｅｖ応答要素（「ＲＲＥ」）との相互作用をも標的としうる。抗ウイルス剤は、好ましくは、プロテアーゼインヒビター、逆転写酵素のインヒビターおよびインテグラーゼインヒビターよりなるクラスの化合物から選ばれる。好ましくは、個体に投与される抗ウイルス剤は、有効な抗ウイルス療法剤［例えば、高活性抗レトロウイルス療法（「ＨＡＡＲＴ」）（ウイルスプロテアーゼおよび逆転写酵素のインヒビターのカクテルを意味するものとして当技術分野で一般に用いられる用語）において使用されるもの］の何らかの組合せである。
【００５１】
本発明は、微生物感染の治療に有用な任意の医薬組成物と共に使用されうる、と当業者は理解することが可能である。抗微生物剤は、典型的には、当技術分野で報告されているそれらの通常の投与量範囲および投与計画（例えば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，５４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，２０００に記載されている投与量が含まれる）で投与される。
【００５２】
該組換えウイルスベクターを含む組成物は、バッファー、正常食塩水またはリン酸緩衝食塩水、スクロース、他の塩およびポリソルベートを包含する（これらに限定されるものではない）生理的に許容される成分を含有しうる。特定の実施形態においては、該ウイルス粒子はＡ１９５製剤化バッファー中で製剤化される。ある実施形態においては、該製剤は、２．５〜１０ｍＭ  ＴＲＩＳバッファー、好ましくは約５ｍＭ  ＴＲＩＳバッファー；２５〜１００ｍＭ  ＮａＣｌ、好ましくは約７５ｍＭ  ＮａＣｌ；２．５〜１０％  スクロース、好ましくは約５％  スクロース；０．０１〜２ｍＭ  ＭｇＣｌ２；および０．００１％〜０．０１％  ポリソルベート８０（植物由来）を含有する。ｐＨは、約７．０〜９．０の範囲、好ましくは約８．０であるべきである。当業者は、他の通常のワクチン賦形剤も該製剤中で使用されうると理解するであろう。特定の実施形態においては、該製剤は、５ｍＭ  ＴＲＩＳ、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ポリソルベート８０をｐＨ８．０で含有する。これは、ガラス表面へのウイルスの吸着の可能性を最小限に抑えウイルス安定性にとって最適に近いｐＨおよび二価陽イオン組成を有する。それは筋肉注射の際に組織刺激を引き起こさない。それは、好ましくは、使用まで凍結される。
【００５３】
ワクチン被接種者に導入されるワクチン組成物中のウイルス粒子の量は、使用する転写および翻訳プロモーターの強度ならびに発現遺伝子産物の免疫原性に左右されるであろう。一般には、アデノウイルスベクター当たり１×１０７〜１×１０１２粒子、好ましくは約１×１０１０〜１×１０１１粒子の免疫学的または予防的に有効な用量を筋肉組織内に直接投与する。皮下注射、皮内導入、皮膚を介した圧入（ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）および他の投与様式、例えば腹腔内、静脈内または吸入運搬も意図される。
【００５４】
免疫応答を増強または拡張しうる追加的な物質（例えば、種々のサイトカイン、インターロイキン）を本発明のウイルスベクターの非経口導入と同時に又はその後で投与することも本発明において想定され、有利でありうる。
【００５５】
本明細書に記載されている投与の利益は、（１）比較しうる又はより広い個体集団が組換えアデノウイルスベクターで成功裏に免疫化／治療されること、および（２）免疫化の場合に、これまでに未感染の個体に対する、より低い伝染率（または発生率）（すなわち、予防的用途）、および／または、感染個体内のウイルス／細菌／外来因子のレベルの抑制（すなわち、治療的用途）であるはずである。
【００５６】
以下の非限定的な実施例は本発明の実施を更に詳しく例示するために記載されている。
【実施例１】
【００５７】
ｐＡｄ２６ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６の構築
ｐＡｄ２６ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６（既存のＣ群／Ａｄ５  Ｅ１相補性細胞系における効率的な増殖を可能にするためにＡｄ５  Ｏｒｆ６で置換されたＥ１欠失およびＥ４欠失を含有するＡｄ２６前（ｐｒｅ）Ａｄプラスミド）を構築するために、細菌複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を含有するプラスミド配列により分離されたＡｄ２６ゲノム（図１Ａ−１〜１Ａ−１１を参照されたい）の右（ｂｐ３１９５２−３２３３８およびｂｐ３４６８７−３５１４６）および左（ｂｐ４−４６２およびｂｐ３３６９−３８０２）末端からの配列を含有するＡｄ２６  ＩＴＲカセットを構築した。該４セグメントをＰＣＲにより作製し、ｐＮＥＢ１９３内に逐次的にクローニングしてｐＮＥＢＡｄ２６−４ａを得た。次に、Ａｄ５  Ｏｒｆ６オープンリーディングフレームをＰＣＲにより作製し、Ａｄ２６  ｂｐ３２３３８と３４６８７との間にクローニングしてｐＮＥＢＡｄ２６−４ａＡｄ５Ｏｒｆ６（ＩＴＲカセット）を得た。ＰＮＥＢ１９３は、細菌複製起点、アンピシリン耐性遺伝子、および該ＰＣＲ産物が導入されるマルチクローニング部位を含有する一般に使用される商業的に入手可能なクローニングプラスミド（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ｃａｔ＃Ｎ３０５１Ｓ）である。ＩＴＲカセットは、Ａｄ２６  ｂｐ４６３−３３６８のＥ１配列の欠失を含有し、該欠失内、およびＡｄ５  Ｏｒｆ６がＥ４平行配向で導入されたＡｄ２６  ｂｐ３２３３９−３４６８６のＥ４欠失内に唯一のＳｗａＩ制限部位が位置する。この構築物においては、Ａｄ５Ｏｒｆ６の発現はＡｄ２６  Ｅ４プロモーターにより駆動される。ＩＴＲカセット内のＡｄ２６配列（ｂｐ３１９５２−３２３３８およびｂｐ３３６９−３８０２）は、ＢＪ５１８３細菌内への共形質転換後に細菌組換えが生じうる、精製Ａｄ２６ウイルスＤＮＡに対する相同性の領域を与えた（図２）。また、ＩＴＲカセットは、消化により該プラスミド配列から組換えＡｄ２６ゲノムが遊離される、ウイルスＩＴＲの末端に位置する唯一の制限酵素部位（ＰｍｅＩ）を含有するよう設計した。潜在的クローンを制限分析によりスクリーニングし、１つのクローンをｐＡｄ２６ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６として選択した。前（ｐｒｅ）アデノウイルスプラスミドｐＡｄ２６ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６は、ｂｐ３２３３８とｂｐ３４６８６との間にクローニングされたＡｄ５  Ｏｒｆ６と共にｂｐ４−４６２、ｂｐ３３６９−ｂｐ３２３３８およびｂｐ３４６８７−ｂｐ３５１４６にＡｄ２６配列を含有する。このプラスミドを完全に配列決定した（図３Ａ−１〜３Ａ−９を参照されたい）。前記説明におけるｂｐ番号は、Ａｄ２６およびＡｄ５のどちらに関しても、ｗｔ配列に基づく。
【実施例２】
【００５８】
ｐＡｄ２６ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６内へのＨＩＶ−１  ｇａｇおよびＳＥＡＰトランスジーンの挿入
ｇａｇまたはＳＥＡＰ発現カセット（それぞれ図８および２０を参照されたい）をｐＡｄ２６ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６のＥ１領域内に導入するために、再び細菌組換えを利用した。１）ヒトサイトメガロウイルスの最初期遺伝子プロモーター、２）ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）ｇａｇ（株ＣＡＭ−１；１５２６ｂｐ）遺伝子のコード配列、および３）ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列よりなるＨＩＶ  ｇａｇ発現カセットを、Ａｄ２６シャトルプラスミドｐＮＥＢＡｄ２６−２（前記Ａｄ２６  ＩＴＲカセットの前駆体）内のＥ１欠失内にクローニングして、ｐＮＥＢＡｄ２６ＣＭＶｇａｇＢＧＨｐＡを得た。ｐＮＥＢＡｄ２６−２は、Ｅ１欠失を定める、該ゲノムの左末端からのＡｄ２６配列（ｂｐ４−４６２およびｂｐ３３６９−３８０２）を含有する。該ｇａｇ発現カセットを、予め構築されたプラスミドから得、ｂｐ４６２−３３６９のＥ１欠失内にＥ１平行配向でクローニングした。該ｇａｇトランスジーンを含有するシャトルベクターを消化して、Ａｄ２６  ｂｐ４−４６２およびｂｐ３３６９−３８０２に隣接するｇａｇ発現カセットよりなるＤＮＡ断片を得、該断片をアガロースゲル上の電気泳動後に精製した。該シャトルベクター断片とｐＡｄ２６ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６（ＳｗａＩでの消化によりＥ１領域において線状化されている）とでのＢＪ５１８３細菌の共形質転換は、相同組換えにより、Ａｄ２６  ｇａｇ含有前アデノウイルスプラスミドｐＡｄ２６ΔＥ１ｇａｇΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６を与えた。潜在的クローンを制限分析によりスクリーニングした。
【００５９】
同様の方法を用いて、ＳＥＡＰ発現カセットを含有するＡｄ２６前Ａｄプラスミドを作製した。この場合、１）ヒトサイトメガロウイルスの最初期遺伝子プロモーター、２）ヒト胎盤ＳＥＡＰ遺伝子のコード配列、および３）ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列よりなるＳＥＡＰ発現カセットを、Ａｄ２６シャトルプラスミドｐＮＥＢＡｄ２６−２内のＥ１欠失内にクローニングして、ｐＮＥＢＡｄ２６ＣＭＶＳＥＡＰＢＧＨｐＡを得た。ついで該トランスジーンを、ｇａｇトランスジーンに関して前記で説明されているとおりに、ｐＡｄ２６ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６内への組換えに付した。
【実施例３】
【００６０】
ウイルス内へのｐＡｄ２６ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６、ｐＡｄ２６ΔＥ１ｇａｇΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６およびｐＡｄ２６ΔＥ１ＳＥＡＰΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６のレスキュー
前アデノウイルスプラスミドｐＡｄ２６ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６、ｐＡｄ２６ΔＥ１ｇａｇΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６およびｐＡｄ２６ΔＥ１ＳＥＡＰΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６をウイルス内にレスキューするために、該プラスミドをそれぞれＰｍｅＩで消化し、リン酸カルシウム共沈技術（Ｃｅｌｌ  Ｐｈｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）を用いてＴ−２５フラスコ内のＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内にトランスフェクトした。ＰｍｅＩ消化は該プラスミド配列から該ウイルスゲノムを遊離して、細胞進入後にウイルス複製を引き起こさせる。トランスフェクションの約７〜１０日後、完全な細胞変性効果（ＣＰＥ）が認められたら、感染細胞および培地を回収し、３回、凍結／解凍し、遠心分離により細胞残渣をペレット化した。ついで該細胞ライセートを使用して、Ｔ−２２５フラスコ内のＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞に８０〜９０％のコンフルエンスで感染させた。ＣＰＥに達したら、感染細胞および培地を回収し、３回、凍結／解凍し、遠心分離により細胞残渣をペレット化した。ついで清澄化細胞ライセートを使用して、２層のＮＵＮＣ細胞ファクトリー（ｆａｃｔｏｒｙ）のＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞に感染させた。完全なＣＰＥの後、該ウイルスをＣｓＣｌ密度勾配上の超遠心分離により精製した。レスキューされたウイルスの遺伝的構造を確認するために、プロナーゼ処理およびそれに続くフェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈殿により、ウイルスＤＮＡを抽出した。ついでウイルスＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、クレノウフラグメントで処理して、該制限断片をＰ３３−ｄＡＴＰで末端標識した。ついで該末端標識制限断片をゲル電気泳動によりサイズ分画し、オートラジオグラフィーにより可視化した。該消化産物を、それが由来する（標識前にＰｍｅ１／ＨｉｎｄＩＩＩで消化された）対応する前アデノウイルスプラスミドの消化産物と比較した。予想サイズが観察され、このことは、該ウイルスが成功裏にレスキューされたことを示している。
【実施例４】
【００６１】
ｐＭＲＫＡｄ２６ΔＥ１ΔＥ３ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６の構築
Ａｄ２６に基づく本発明者らのベクターのクローニング容量を増加させるために、初期領域３（「Ｅ３」）を欠失させて前ＡｄプラスミドｐＡｄ２６ΔＥｌΔＥ３ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６を得た。ｐＡｄ２６ΔＥｌΔＥ３ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６（Ｅ１欠失、Ｅ３欠失、およびＡｄ５  Ｏｒｆ６で置換されたＥ４欠失を含有するＡｄ２６前Ａｄプラスミド）を構築するために、所望のＥ３欠失（ｂｐ２６１１６−２６５８５およびｂｐ３０３１３−ｂｐ３０７４４）を定める配列を含有するＡｄ２６  Ｅ３シャトルカセットを構築した。該２セグメントをＰＣＲにより作製し、ｐＮＥＢ１９３内に逐次的にクローニングしてｐＮＥＢＡｄ２６Ｅ３−２を得た。該Ｅ３シャトルカセットは、Ａｄ２６  ｂｐ２６５８６−ｂｐ３０３１２のＥ３配列の欠失を含有し、該欠失内に唯一のＰａｃＩ制限部位が位置する。該Ｅ３シャトルカセットを消化して、Ｅ３欠失を定めるＡｄ２６  ＤＮＡを遊離させ、該断片をアガロースゲル上の電気泳動後に精製した。該シャトルベクター断片とｐＡｄ２６ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６（ＰｓｉＩでの消化によりＥ３領域において線状化されている）とでのＢＪ５１８３細菌の共形質転換は、相同組換えにより、Ａｄ２６前アデノウイルスプラスミドｐＡｄ２６ΔＥ１ΔＥ３ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６を与えた（図４）。潜在的クローンを制限分析によりスクリーニングし、１つのクローンをｐＡｄ２６ΔＥ１ΔＥ３ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６として選択した。前アデノウイルスプラスミドｐＡｄ２６ΔＥ１ΔＥ３ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６は、ｂｐ３２３３８とｂｐ３４６８６との間にクローニングされたＡｄ５  Ｏｒｆ６と共にｂｐ４−４６２、ｂｐ３３６９−ｂｐ２６５８５、ｂｐ３０３１３−３２３３８およびｂｐ３４６８７−ｂｐ３５１４６にＡｄ２６配列を含有する。前記説明におけるｂｐ番号は、Ａｄ２６およびＡｄ５のどちらに関しても、ｗｔ配列に基づく。
【実施例５】
【００６２】
インビボ研究
Ａ．免疫化
３頭のアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ）のコホートを１０∧８ｖｐまたは１０∧１０ｖｐのＡｄ２６ΔＥ１ｇａｇΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６のいずれかで免疫化した（第０、４週）。該動物に追加抗原刺激のための低用量のＭＲＫＡｄ５ｇａｇ（１０∧７ｖｐ；２００２年３月２１日付け公開のＰＣＴ／ＵＳ０１／２８８６１に開示されているｐＭＲＫＡｄ５ｇａｇ）を第２７週に投与した。第３のコホートには１０∧８ｖｐ  ＭＲＫＡｄ５ｇａｇでの初回免疫化およびそれに続く１０∧１０ｖｐ  Ａｄ２６ΔＥ１ｇａｇΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６での追加抗原刺激を行った。アカゲザルは体重３〜１０ｋｇであった。すべての場合において、各ワクチンの全用量を１ｍＬのバッファーに懸濁させた。該サルを麻酔（ケタミン／キシラジン）し、ツベルクリンシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用して該ワクチンを０．５ｍＬのアリコートで両方の三角筋に筋肉内（「ｉ．ｍ．」）投与した。標準的なプロトコールに従い血漿および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）サンプルを集めた。
【００６３】
Ｂ．ＥＬＩＳＰＯＴおよびＩＣＳアッセイ
９６ウェル平底プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）を１μｇ／ウェルの抗ガンマインターフェロン（ＩＦＮγ）ｍＡｂ  ＭＤ−１（Ｕ−Ｃｙｔｅｃｈ−ＢＶ）で４℃で一晩コートした。ついで該プレートをＰＢＳで３回洗浄し、Ｒ１０培地（ＲＰＭＩ，０．０５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタマート、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０％  ウシ胎児血清）で３７℃で２時間ブロッキングした。該培地を該プレートから廃棄し、新鮮に単離されたＰＢＭＣを１〜４×１０５細胞／ウェルで加えた。該細胞をｇａｇペプチドプール（ペプチド当たり４μｇ／ｍＬ）の非存在下（模擬）または存在下で刺激した。該プールは、４ａａだけ変化した１５−ａａのペプチドよりなり（Ｓｙｎｐｅｐ，ＣＡ）、全ＨＩＶ−１  ＣＡＭ１  ｇａｇ配列から構築した。ついで該細胞を３７℃、５％  ＣＯ２で２０〜２４時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）で６回洗浄し、１００μＬ／ウェルの１：４００希釈度の抗ＩＦＮγポリクローナルビオチン化検出抗体溶液（Ｕ−Ｃｙｔｅｃ−ＢＶ）を加え、該プレートを３７℃で一晩インキュベートした。該プレートをＰＢＳＴで６回洗浄した。ＮＢＴ／ＢＣＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）中で１０分間インキュベートすることにより発色させた。スポットを解剖用顕微鏡下で計数し、１×１０６  ＰＢＭＣに対して正規化した。
【００６４】
ＩＦＮγ産生の細胞内染色（ＩＣＳ）を、既に確立されているプロトコール（Ｃａｓｉｍｉｒｏら，２００３  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：６３０５−６３１３）に従い行った。
【００６５】
図５は、ＩＦＮγ  ＥＬＩｓｐｏｔアッセイにより測定したｇａｇ特異的Ｔ細胞の模擬補正レベルを表形式で列挙する。
【００６６】
Ｃ．結果
Ａｄ２６に基づくワクチンベクターは１０∧１０ｖｐの用量レベルでｇａｇ特異的Ｔ細胞を有効に感作することが可能であった。ＭＲＫＡｄ５ｇａｇで感作された動物は、最初の投与の後で、４００  ＳＦＣ／１０∧６  ＰＢＭＣより大きな応答を示した。これらの結果は、該Ａｄ２６が、ＨＩＶ特異的免疫を誘導するための有効なベクターであることを示している。１つの場合には、該ベクターは、低い有効量のＭＲＫＡｄ５ｇａｇを使用して有意に追加抗原刺激される動物においてｇａｇ特異的Ｔ細胞を感作することが可能である。群１では、ｇａｇ特異的Ｔ細胞のレベルは追加抗原刺激前の値から５〜２０倍増加した。また、ＭＲＫＡｄ５ｇａｇベクターで初回抗原刺激することにより惹起されるＨＩＶ特異的免疫を追加抗原刺激するために、該Ａｄ６ベクター自体を使用することも可能である（図６、群３）。
【００６７】
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によるｇａｇ特異的免疫のＴ細胞サブセットの分析は、該Ａｄ２６ベクターが細胞傷害性応答およびヘルパー応答の両方を惹起しうることを示した。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１Ａ−１】図１Ａ−１〜１Ａ−１１はアデノウイルス血清型２６の核酸配列（配列番号１）を示す。Ａｄ２６の、入手可能なＡＴＣＣ産物番号は以下のとおりである：ＶＲ１１０４、ＶＲ−１１０４ＡＳ／ＲＢ、ＶＲ−１１０４ＰＩ／ＲＢおよびＶＲ−２２４。
【図１Ａ−２】図１Ａ−１〜１Ａ−１１はアデノウイルス血清型２６の核酸配列（配列番号１）を示す。Ａｄ２６の、入手可能なＡＴＣＣ産物番号は以下のとおりである：ＶＲ１１０４、ＶＲ−１１０４ＡＳ／ＲＢ、ＶＲ−１１０４ＰＩ／ＲＢおよびＶＲ−２２４。
【図１Ａ−３】図１Ａ−１〜１Ａ−１１はアデノウイルス血清型２６の核酸配列（配列番号１）を示す。Ａｄ２６の、入手可能なＡＴＣＣ産物番号は以下のとおりである：ＶＲ１１０４、ＶＲ−１１０４ＡＳ／ＲＢ、ＶＲ−１１０４ＰＩ／ＲＢおよびＶＲ−２２４。
【図１Ａ−４】図１Ａ−１〜１Ａ−１１はアデノウイルス血清型２６の核酸配列（配列番号１）を示す。Ａｄ２６の、入手可能なＡＴＣＣ産物番号は以下のとおりである：ＶＲ１１０４、ＶＲ−１１０４ＡＳ／ＲＢ、ＶＲ−１１０４ＰＩ／ＲＢおよびＶＲ−２２４。
【図１Ａ−５】図１Ａ−１〜１Ａ−１１はアデノウイルス血清型２６の核酸配列（配列番号１）を示す。Ａｄ２６の、入手可能なＡＴＣＣ産物番号は以下のとおりである：ＶＲ１１０４、ＶＲ−１１０４ＡＳ／ＲＢ、ＶＲ−１１０４ＰＩ／ＲＢおよびＶＲ−２２４。
【図１Ａ−６】図１Ａ−１〜１Ａ−１１はアデノウイルス血清型２６の核酸配列（配列番号１）を示す。Ａｄ２６の、入手可能なＡＴＣＣ産物番号は以下のとおりである：ＶＲ１１０４、ＶＲ−１１０４ＡＳ／ＲＢ、ＶＲ−１１０４ＰＩ／ＲＢおよびＶＲ−２２４。
【図１Ａ−７】図１Ａ−１〜１Ａ−１１はアデノウイルス血清型２６の核酸配列（配列番号１）を示す。Ａｄ２６の、入手可能なＡＴＣＣ産物番号は以下のとおりである：ＶＲ１１０４、ＶＲ−１１０４ＡＳ／ＲＢ、ＶＲ−１１０４ＰＩ／ＲＢおよびＶＲ−２２４。
【図１Ａ−８】図１Ａ−１〜１Ａ−１１はアデノウイルス血清型２６の核酸配列（配列番号１）を示す。Ａｄ２６の、入手可能なＡＴＣＣ産物番号は以下のとおりである：ＶＲ１１０４、ＶＲ−１１０４ＡＳ／ＲＢ、ＶＲ−１１０４ＰＩ／ＲＢおよびＶＲ−２２４。
【図１Ａ−９】図１Ａ−１〜１Ａ−１１はアデノウイルス血清型２６の核酸配列（配列番号１）を示す。Ａｄ２６の、入手可能なＡＴＣＣ産物番号は以下のとおりである：ＶＲ１１０４、ＶＲ−１１０４ＡＳ／ＲＢ、ＶＲ−１１０４ＰＩ／ＲＢおよびＶＲ−２２４。
【図１Ａ−１０】図１Ａ−１〜１Ａ−１１はアデノウイルス血清型２６の核酸配列（配列番号１）を示す。Ａｄ２６の、入手可能なＡＴＣＣ産物番号は以下のとおりである：ＶＲ１１０４、ＶＲ−１１０４ＡＳ／ＲＢ、ＶＲ−１１０４ＰＩ／ＲＢおよびＶＲ−２２４。
【図１Ａ−１１】図１Ａ−１〜１Ａ−１１はアデノウイルス血清型２６の核酸配列（配列番号１）を示す。Ａｄ２６の、入手可能なＡＴＣＣ産物番号は以下のとおりである：ＶＲ１１０４、ＶＲ−１１０４ＡＳ／ＲＢ、ＶＲ−１１０４ＰＩ／ＲＢおよびＶＲ−２２４。
【図２】図２は、ｐＡｄ２６ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６を回収するために用いる相同組換え法を示す。
【図３Ａ−１】図３Ａ−１〜３Ａ−９はｐＡｄ２６ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６の核酸配列（配列番号２）を示す。
【図３Ａ−２】図３Ａ−１〜３Ａ−９はｐＡｄ２６ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６の核酸配列（配列番号２）を示す。
【図３Ａ−３】図３Ａ−１〜３Ａ−９はｐＡｄ２６ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６の核酸配列（配列番号２）を示す。
【図３Ａ−４】図３Ａ−１〜３Ａ−９はｐＡｄ２６ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６の核酸配列（配列番号２）を示す。
【図３Ａ−５】図３Ａ−１〜３Ａ−９はｐＡｄ２６ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６の核酸配列（配列番号２）を示す。
【図３Ａ−６】図３Ａ−１〜３Ａ−９はｐＡｄ２６ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６の核酸配列（配列番号２）を示す。
【図３Ａ−７】図３Ａ−１〜３Ａ−９はｐＡｄ２６ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６の核酸配列（配列番号２）を示す。
【図３Ａ−８】図３Ａ−１〜３Ａ−９はｐＡｄ２６ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６の核酸配列（配列番号２）を示す。
【図３Ａ−９】図３Ａ−１〜３Ａ−９はｐＡｄ２６ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６の核酸配列（配列番号２）を示す。
【図４】図４は、ｐＡｄ２６ΔＥ１ΔＥ３ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６を回収するために用いる相同組換え法を示す。
【図５】図５は、初回−追加ワクチン接種法においてｐＡｄ２６ΔＥ１ｇａｇΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６およびＭＲＫＡｄ５ｇａｇベクターを使用してマカクにおいて誘導されたＧａｇ特異的Ｔ細胞応答のレベルを、表形式で示す。値は、百万個のＰＢＭＣ当たりのＩＦＮγ分泌細胞の、模擬値を差し引いた数を表す。ｗｋ：週。
【図６】図６は、第８週における、Ａｄ２６で免疫化されたマカクにおける百万個のリンパ球当たりのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｇａｇ特異的Ｔ細胞の数を表形式で示す。
【図７】図７は最適化ヒトＨＩＶ−１  ｇａｇオープンリーディングフレームの核酸配列（配列番号３）を示す。
【図８】図８は、ｇａｇ発現カセットをコードする核酸配列（配列番号４）を示す。この図の種々の領域は以下のとおりである。（１）ヒトサイトメガロウイルスの最初期遺伝子プロモーター領域をコードする核酸配列の第１の下線付きセグメント。（２）下線無しの小文字の第１のセグメント。このＤＮＡセグメントは簡便な制限酵素部位を含有する。（３）ＨＩＶ−１  ｇａｇのコード配列を含有する大文字の領域。（４）下線無しの小文字の第２のセグメント。このＤＮＡセグメントは簡便な制限酵素部位を含有する。（５）第２の下線付きセグメント。このセグメントは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列をコードする核酸配列を含有する。
【図９Ａ−１】図９Ａ−１〜９Ａ−２はコドン最適化ｗｔ−ｐｏｌ配列を示す。ここで、プロテアーゼ（ＰＲ）活性をコードする配列は欠失しており、ＲＴ（逆転写酵素およびＲＮアーゼＨ活性）およびＩＮインテグラーゼ活性をコードするコドン最適化「野生型」配列（配列番号６）が残されている。オープンリーディングフレームはヌクレオチド１０−１２の開始Ｍｅｔ残基で始まり、ヌクレオチド２５６０−２５６２の終止コドンで終わる。
【図９Ａ−２】図９Ａ−１〜９Ａ−２はコドン最適化ｗｔ−ｐｏｌ配列を示す。ここで、プロテアーゼ（ＰＲ）活性をコードする配列は欠失しており、ＲＴ（逆転写酵素およびＲＮアーゼＨ活性）およびＩＮインテグラーゼ活性をコードするコドン最適化「野生型」配列（配列番号６）が残されている。オープンリーディングフレームはヌクレオチド１０−１２の開始Ｍｅｔ残基で始まり、ヌクレオチド２５６０−２５６２の終止コドンで終わる。
【図１０Ａ−１】図１０Ａ−１〜１０Ａ−２は、配列番号６として開示されている野生型ｐｏｌ構築物のオープンリーディングフレーム（配列番号７）を示す。
【図１０Ａ−２】図１０Ａ−１〜１０Ａ−２は、配列番号６として開示されている野生型ｐｏｌ構築物のオープンリーディングフレーム（配列番号７）を示す。
【図１１Ａ−１】図１１Ａ−１〜１１Ａ−３はＩＡ−Ｐｏｌのヌクレオチド（配列番号８）およびアミノ酸配列（配列番号９）を示す。下線付きコドンおよびアミノ酸は、本明細書中の表１に列挙する突然変異を示す。
【図１１Ａ−２】図１１Ａ−１〜１１Ａ−３はＩＡ−Ｐｏｌのヌクレオチド（配列番号８）およびアミノ酸配列（配列番号９）を示す。下線付きコドンおよびアミノ酸は、本明細書中の表１に列挙する突然変異を示す。
【図１１Ａ−３】図１１Ａ−１〜１１Ａ−３はＩＡ−Ｐｏｌのヌクレオチド（配列番号８）およびアミノ酸配列（配列番号９）を示す。下線付きコドンおよびアミノ酸は、本明細書中の表１に列挙する突然変異を示す。
【図１２】図１２はＨＩＶ−１  ｊｒｆｌ  ｎｅｆのコドン最適化形態（配列番号１０）を示す。オープンリーディングフレームはヌクレオチド１２−１４の開始メチオニン残基で始まり、ヌクレオチド６６０−６６２の「ＴＡＡ」終止コドンで終わる。
【図１３】図１３はコドン最適化ＨＩＶ  ｊｒｆｌ  Ｎｅｆのオープンリーディングフレーム（配列番号１１）を示す。
【図１４Ａ−１】図１４Ａ−１〜１４Ａ−２は野生型ｎｅｆ（ｊｒｆｌ）とコドン最適化ｎｅｆとの間のヌクレオチド配列比較を示す。ｊｒｆｌ分離体からの野生型ｎｅｆ遺伝子は、２１６アミノ酸のポリペプチドをコードしうる６４８ヌクレオチドよりなる。ＷＴ，野生型配列（配列番号１２）；ｏｐｔ，コドン最適化配列（配列番号１０内に含有される）。Ｎｅｆアミノ酸配列は１文字の記号で示されている（配列番号１１）。
【図１４Ａ−２】図１４Ａ−１〜１４Ａ−２は野生型ｎｅｆ（ｊｒｆｌ）とコドン最適化ｎｅｆとの間のヌクレオチド配列比較を示す。ｊｒｆｌ分離体からの野生型ｎｅｆ遺伝子は、２１６アミノ酸のポリペプチドをコードしうる６４８ヌクレオチドよりなる。ＷＴ，野生型配列（配列番号１２）；ｏｐｔ，コドン最適化配列（配列番号１０内に含有される）。Ｎｅｆアミノ酸配列は１文字の記号で示されている（配列番号１１）。
【図１５】図１５は、最適化ＨＩＶ−１  Ｎｅｆをコードする核酸（本明細書中では「ｏｐｔ  ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）」；配列番号１３）を示し、ここで、オープンリーディングフレームは、アミノ末端ミリスチル化部位における修飾（Ｇｌｙ−２からＡｌａ−２へ）およびＬｅｕ−１７４−Ｌｅｕ−１７５ジロイシンモチーフからＡｌａ−１７４−Ａｌａ−１７５への置換をコードしている。オープンリーディングフレームはヌクレオチド１２−１４の開始メチオニン残基で始まり、ヌクレオチド６６０−６６２の「ＴＡＡ」終止コドンで終わる。
【図１６】図１６はｏｐｔ  ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）のオープンリーディングフレーム（配列番号１４）を示す。
【図１７】図１７は、最適化ＨＩＶ−１  Ｎｅｆをコードする核酸（本明細書中では「ｏｐｔ  ｎｅｆ（Ｇ２Ａ）」；配列番号１５）を示し、ここで、オープンリーディングフレームはヌクレオチド１２−１４の開始メチオニン残基で始まり、ヌクレオチド６６０−６６２の「ＴＡＡ」終止コドンで終わる。
【図１８】図１８はｏｐｔ  ｎｅｆ（Ｇ２Ａ）のオープンリーディングフレーム（配列番号１６）を示す。
【図１９】図１９はｎｅｆおよびｎｅｆ誘導体の概要図を示す。Ｎｅｆ誘導体に含まれるアミノ酸残基が示されている。グリシン２ならびにロイシン１７４および１７５は、それぞれミリスチル化およびジロイシンモチーフに関与する部位である。
【図２０】図２０は、ＳＥＡＰ発現カセットをコードする核酸配列（配列番号１７）を示す。この図の種々の領域は以下のとおりである。（１）ヒトサイトメガロウイルスの最初期遺伝子プロモーター領域をコードする核酸配列の第１の下線付きセグメント。（２）下線無しの小文字の第１のセグメント。このＤＮＡセグメントは簡便な制限酵素部位を含有する。（３）ヒト胎盤ＳＥＡＰ遺伝子のコード配列を含有する大文字の領域。（４）下線無しの小文字の第２のセグメント。このＤＮＡセグメントは簡便な制限酵素部位を含有する。（５）第２の下線付きセグメント。このセグメントは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列をコードする核酸配列を含有する。
【図１Ａ−１】
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【図１Ａ−２】
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【図１Ａ−３】
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【図１Ａ−４】
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【図１Ａ−５】
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【図１Ａ−６】
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【図１Ａ−７】
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【図１Ａ−８】
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【図１Ａ−９】
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【図１Ａ−１０】
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【図１Ａ−１１】
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【図２】
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【図３Ａ−１】
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【図３Ａ−２】
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【図３Ａ−３】
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【図３Ａ−４】
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【図３Ａ−５】
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【図３Ａ−６】
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【図３Ａ−７】
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【図３Ａ−８】
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【図３Ａ−９】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ−１】
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【図９Ａ−２】
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【図１０Ａ−１】
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【図１０Ａ−２】
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【図１１Ａ−１】
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【図１１Ａ−２】
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【図１１Ａ−３】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ−１】
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【図１４Ａ−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年7月17日(2008.7.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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