(57)【要約】  本発明は、免疫原性が低減化された非天然変異型Ｃ１ｑスーパーファミリーメンバータンパク質に関するものである。さらに具体的には、本発明は、免疫原性が低減化された変異型アディポネクチンおよびＣＴＲＰ１タンパク質に関するものである。
2008507591.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型アディポネクチンタンパク質（配列番号１）と比べて免疫原性が低減化されている非天然変異型アディポネクチンタンパク質であって、少なくとも２個のアミノ酸修飾を含む変異型タンパク質。
【請求項２】
少なくとも１個のアミノ酸修飾が、アグレトープＡ１（残基１０９−１１７）、アグレトープＡ２（残基１１１−１１９）、アグレトープＡ３（残基１２２−１３０）、アグレトープＡ４（残基１２８−１３６）、アグレトープＡ５（残基１３６−１４４）、アグレトープＡ６（残基１５７−１６５）、アグレトープＡ７（残基１５８−１６６）、アグレトープＡ８（残基１６０−１６８）、アグレトープＡ９（残基１６６−１７４）、アグレトープＡ１０（残基１６７−１７５）、アグレトープＡ１１（残基１７５−１８３）、アグレトープＡ１２（残基１７６−１８４）およびアグレトープ１３（残基２０２−２１０）から成る群に為されている、請求項１記載の変異型タンパク質。
【請求項３】
少なくとも１個の修飾が、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１７、１１９、１２２、１２３、１２４、１２５、１２７、１２８、１３０、１６６、１６７、１６８、１６９、１７１、１７２および１７４位から成る群から選択され、１０９位での可能な修飾が、Ｑ、Ｈ、Ｎ、Ｒ、Ｅ、Ｋ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｔ、Ｓ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、ＭおよびＩから成る群から選択され、１１０位での可能な修飾が、Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｌ、Ｄ、Ａ、Ｅ、Ｔ、Ｓ、Ｐ、Ｙ、Ｈ、Ｆ、Ｇ、Ｍ、ＩおよびＷから成る群から選択され、１１１位での可能な修飾が、Ｐ、Ｎ、Ｈ、Ａ、Ｗ、Ｓ、Ｄ、Ｒ、Ｋ、Ｔ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、およびＶから成る群から選択され、１１２位での可能な修飾が、Ｋ、ＤおよびＧから成る群から選択され、１１３位での可能な修飾がＡであり、１１４位での可能な修飾がＧであり、１１５位での可能な修飾が、Ｙ、ＨおよびＭから成る群から選択され、１１７位での可能な修飾が、Ｔ、ＳおよびＡから成る群から選択され、１１９位での可能な修飾が、Ｑ、Ｋ、Ｅ、Ｔ、Ｓ、Ｒ、Ａ、ＮおよびＤから成る群から選択され、１２２位での可能な修飾が、Ｋ、Ｅ、Ｈ、Ｄ、ＲおよびＱから成る群から選択され、１２３位での可能な修飾が、Ｉ、Ｐ、Ｅ、Ｔ、Ａ、Ｑ、ＳおよびＮから成る群から選択され、１２４位での可能な修飾が、ＥおよびＤから成る群から選択され、１２５位での可能な修飾が、Ｅ、Ｄ、Ｙ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｗ、Ｆ、ＧおよびＰから成る群から選択され、１２７位での可能な修飾が、Ｋ、ＤおよびＧから成る群から選択され、１２８位での可能な修飾が、Ｖ、Ｔ、Ｑ、Ａ、Ｓ、Ｈ、Ｎ、Ｌ、Ｅ、Ｄ、Ｉ、Ｇ、ＫおよびＲから成る群から選択され、１３０位での可能な修飾が、Ｌ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｍ、ＤおよびＡから成る群から選択され、１６６位での可能な修飾が、Ｔ、ＳおよびＡから成る群から選択され、１６７位での可能な修飾が、Ｆ、Ｈ、Ａ、Ｅ、Ｇ、ＤおよびＷから成る群から選択され、１６８位での可能な修飾が、ＡおよびＧから成る群から選択され、１６９位での可能な修飾が、Ａ、Ｅ、ＷおよびＴから成る群から選択され、１７１位での可能な修飾が、Ｔ、Ａ、Ｓ、ＧおよびＮから成る群から選択され、１７２位での可能な修飾が、Ｒ、Ｑ、Ｇ、ＥおよびＤから成る群から選択され、および１７４位での可能な修飾が、ＡおよびＧから成る群から選択される、請求項１記載の変異型タンパク質。
【請求項４】
少なくとも１個の修飾が、１０９、１１０、１１１、１１２、１２２および１６６位から成る群から選択され、１０９位での可能な修飾が、Ｑ、Ｈ、Ｎ、Ｒ、Ｅ、Ｋ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｔ、Ｓ、およびＰから成る群から選択され、１１０位での可能な修飾が、Ｄ、Ａ、Ｅ、Ｔ、Ｓ、Ｐ、ＧおよびＷから成る群から選択され、１１１位での可能な修飾が、Ｐ、Ｎ、Ｈ、Ａ、Ｓ、Ｄ、Ｒ、Ｋ、Ｔ、Ｅ、ＱおよびＧから成る群から選択され、１１２位での可能な修飾がＤであり、１２２位での可能な修飾が、Ｋ、Ｅ、Ｈ、Ｄ、Ｒ、Ｑから成る群から選択され、そして、１６６位での可能な修飾が、Ｔ、ＳおよびＡから成る群から選択される、請求項１記載の変異型タンパク質。
【請求項５】
野生型ＣＲＴＰ−１タンパク質（配列番号２）と比べて免疫原性が低減化されている非天然変異型ＣＴＲＰ１タンパク質であって、少なくとも２個のアミノ酸修飾を含む変異型タンパク質。
【請求項６】
少なくとも１個のアミノ酸修飾が、アグレトープＢ１（残基１５０−１５８）、アグレトープＢ２（残基１７１−１７９）、アグレトープＢ３（残基１７２−１８０）、アグレトープＢ４（残基１７８−１８６）、アグレトープＢ５（残基１８５−１９３）、アグレトープＢ６（残基１８６−１９４）、アグレトープＢ７（残基１８８−１９６）、アグレトープＢ８（残基１９２−２００）、アグレトープＢ９（残基１９３−２０１）、アグレトープＢ１０（残基１９４−２０２）、アグレトープＢ１１（残基２０２−２１０）、アグレトープＢ１２（残基２０８−２１６）、アグレトープＢ１３（残基２０９−２１７）、アグレトープＢ１４（残基２１８−２２６）、アグレトープＢ１５（残基２２０−２２８）、アグレトープＢ１６（残基２３０−２３８）、アグレトープＢ１７（残基２４７−２５５）、アグレトープＢ１８（残基２４８−２５６）、アグレトープＢ１９（残基２６７−２７５）から成る群に加えられる、請求項５記載の変異型タンパク質。
【請求項７】
少なくとも１個の修飾が、１７２、１７４、１７５、１７７、１７８、１８０、２１８、２１９、２２０、２２１、２２３、２２４、２２６、２３０、２３１、２３２、２３３、２３５、２３６、２３８、２４７、２４８、２４９、２５０、２５２、２５３、および２５５位から成る群から選択され、１７２位での可能な修飾が、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、ＳおよびＴから成る群から選択され、１７４位での可能な修飾が、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＷから成る群から選択され、１７５位での可能な修飾が、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、ＰおよびＴから成る群から選択され、１７７位での可能な修飾が、Ｄ、Ｅ、ＧおよびＱから成る群から選択され、１７８位での可能な修飾が、Ｈ、ＫおよびＹから成る群から選択され、１８０位での可能な修飾が、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから成る群から選択され、２１８位での可能な修飾が、Ａ、Ｇ、Ｎ、ＳおよびＴから成る群から選択され、２１９位での可能な修飾が、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＴから成る群から選択され、２２０位での可能な修飾が、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、ＴおよびＶから成る群から選択され、２２１位での可能な修飾が、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＷおよびＹから成る群から選択され、２２３位での可能な修飾が、Ｅ、ＮおよびＱから成る群から選択され、２２４位での可能な修飾が、Ｄ、ＥおよびＧから成る群から選択され、２２６位での可能な修飾が、ＤおよびＥから成る群から選択され、２３０位での可能な修飾が、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｅ、ＱおよびＫから成る群から選択され、２３１位での可能な修飾が、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｅ、Ａ、ＤおよびＧから成る群から選択され、２３２位での可能な修飾が、ＥおよびＤから成る群から選択され、２３３位での可能な修飾が、Ａ、ＰおよびＧから成る群から選択され、２３５位での可能な修飾が、Ｐ、Ｅ、Ａ、Ｔ、ＫおよびＱから成る群から選択され、２３６位での可能な修飾が、Ｅ、Ａ、Ｐ、Ｄ、Ｇ、Ｑ、Ｉ、ＭおよびＨから成る群から選択され、２３８位での可能な修飾が、Ｋ、Ｍ、Ａ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｇ、Ｄ、Ｖ、ＲおよびＥから成る群から選択され、２４７位での可能な修飾が、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｄ、Ｎ、Ｐ、Ｅ、Ｑ、Ｍ、ＫおよびＬから成る群から選択され、２４８位での可能な修飾が、Ｍ、Ａ、Ｓ、Ｔ、ＧおよびＰから成る群から選択され、２４９位での可能な修飾が、Ｋ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ｖ、Ａ、Ｎ、Ｐ、Ｅ、ＤおよびＧから成る群から選択され、２５０位での可能な修飾が、Ｅ、Ｔ、Ｑ、Ｎ、Ｖ、Ｓ、Ａ、Ｋ、ＧおよびＰから成る群から選択され、２５２位での可能な修飾が、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｎ、Ｐ、Ｅ、Ｓ、Ｈ、Ｑ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｗ、ＹおよびＦから成る群から選択され、２５３位での可能な修飾がＥであり、２５５位での可能な修飾が、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、ＨおよびＬから成る群から選択される、請求項５記載の変異型タンパク質。
【請求項８】
少なくとも１個の修飾が、１７２、１７４、１７５、２１８、２１９、２２０、２３０、２３５、２３６、２３８、２４７、２４８、２４９、２５０および２５２位から成る群から選択され、１７２位での可能な修飾が、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、ＳおよびＴから成る群から選択され、１７４位での可能な修飾が、ＤおよびＥから成る群から選択され、１７５位での可能な修飾が、ＥおよびＰから成る群から選択され、２１８位での可能な修飾が、Ａ、Ｇ、Ｎ、ＳおよびＴから成る群から選択され、２１９位での可能な修飾がＤであり、２２０位での可能な修飾がＤであり、２３０位での可能な修飾が、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｅ、ＱおよびＫから成る群から選択され、２３５位での可能な修飾がＥであり、２３６位での可能な修飾がＤであり、２３８位での可能な修飾が、Ｔ、Ｎ、Ｇ、Ｄ、ＲおよびＥから成る群から選択され、２４７位での可能な修飾が、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｄ、Ｎ、Ｐ、Ｅ、ＱおよびＫから成る群から選択され、２４８位での可能な修飾が、Ａ、Ｓ、ＴおよびＰから成る群から選択され、２４９位での可能な修飾が、ＥおよびＤから成る群から選択され、２５０位での可能な修飾が、ＥおよびＰから成る群から選択され、２５２位での可能な修飾が、Ｅ、Ｄ、Ｗ、ＹおよびＦから成る群から選択される、請求項５記載の変異型タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、３５ Ｕ.Ｓ.Ｃ.１１９（ｅ）のもと２００４年５月２１日付け、米国特許出願番号６０／５７３３０１に関する利益を主張しており、これについては出典明示により援用する。
【０００２】
本発明は、免疫原性が低減化された変異型Ｃ１ｑスーパーファミリー（「Ｃ１ｑ ＳＦ」）メンバータンパク質に関するものである。特に、１つまたはそれ以上のヒトクラスＩＩ ＭＨＣ分子との結合能力が低減化されたアディポネクチンおよびＣＴＲＰ１の変異型について報告している。
【背景技術】
【０００３】
免疫原性は、タンパク質治療の開発および利用にとっての大きな障壁である。免疫応答は、一般的には非ヒトタンパク質について最も激しいが、ヒトタンパク質をベースとする治療でさえ免疫原性を示し得る。免疫原性は、異物として認められる物質に対する一連の複雑な応答であり、中和および非中和抗体の産生、免疫複合体の形成、補体活性化、マスト細胞活性化、炎症およびアナフィラキシーを包含し得る。
【０００４】
限定されるわけではないが、タンパク質配列、投与経路および頻度、および患者集団を含む幾つかの因子が、タンパク質の免疫原性に一役買っている。免疫原性は、多くの点でタンパク質治療の効力および安全性に制約を設け得る。効力は、中和抗体の形成により直接低減化され得る。また、中和または非中和抗体への結合により、典型的には血清からの急速なクリアランスが誘導されるため、効力は間接的に減じられ得る。免疫反応が誘導されたとき、深刻な副作用が起こり、死に至ることさえあり得る。中和抗体が内在性タンパク質と交差反応し、その機能を遮断すると、ある特殊な種類の副作用が誘発される。
【０００５】
アディポネクチンは、３０ｋＤａの脂肪細胞補体関連タンパク質（ＡＣＲＰ３０）としても知られる、もっぱら分化脂肪細胞で発現される分泌血清タンパク質である。アディポネクチンおよび補体因子Ｃ１ｑの３サブユニット、シベリアン・チップマンクタンパク質ＨＰ−２０、−２５および−２７、ＣＯＲＳ２６、ＣＴＲＰ−５、およびＧ−タンパク質共役型受容体相互作用性タンパク質の間には強い配列類似性が存在する。アディポネクチン相同体は全て、Ｎ−末端コラーゲンドメイン、次いでＣ−末端球状三量体化ドメインを含む類似モジュラー構造を含む。アディポネクチン球状三量体の結晶構造は、サイトカインのＴＮＦファミリーとの予想外の相同性を示す。一次配列の相同性の欠如にもかかわらず、ＴＮＦ−αおよびアディポネクチン間の構造的特徴は高度保存されている。アディポネクチンおよびＴＮＦ−αは、両方とも鍵となる保存された疎水性残基を介して三量体を形成しており、両方とも１０鎖ゼリーロール折りたたみトポロジーを有し、両方ともベル形状のホモトリマーオリゴマーを形成している。例えば、Scherer et al.、J. Biol. Chem.２７０（４５）：２６７４６−９（１９９５）参照、出典明示により援用する。
【０００６】
代謝試験では、グルコースおよび脂質ホメオスタシスの調節におけるアディポネクチンについての役割が立証された。アディポネクチンは、組織脂肪酸化を促進することによりインシュリン感受性を高め、結果的に循環脂肪酸レベルを下げ、肝臓および筋肉における細胞内トリグリセリド含有率を低下させる。このタンパク質はまた、血管内皮細胞における接着分子の発現およびマクロファージからのサイトカイン産生を抑制するため、アテローム性動脈硬化の初期に起こる炎症プロセスを阻害する。
【０００７】
アディポネクチンは、抗高血糖、抗アテローム発生および抗炎症特性を有すると推定され、２型真性糖尿病、肥満、リポジストロフィー疾患、およびグルコースまたは脂質代謝の調節に関連した他の状態を含む、インシュリン抵抗に関連した疾患の処置における潜在的有用性を有する。アディポネクチンはまた、アテローム性動脈硬化および冠状動脈疾患を含む、心臓血管疾患の予防、並びに筋肉障害および肝臓病の予防および処置において有益であることが証明され得る。例えば、Berg et al. Trends Endocrinol. Metab.１３：８４−８９（２００２）、DiezおよびIglesias Eur. J. Endocrinol. １４８：２９３−３００（２００３）、Xu et al.、J. Clin. Invest.１１２：９１−１００（２００３）、特許国際公開−００１９２３３０、および特許国際公開−０２１００４２７参照、これらは全て出典明示により援用する。
【０００８】
球状および完全長アディポネクチンについての２種の受容体、すなわちＡｄｉｐｏＲ１およびＡｄｉｐｏＲ２が同定された。ＡｄｉｐｏＲ１は骨格筋で極めて多く発現され、ＡｄｉｐｏＲ２は主として肝臓で発現される。これら２種の受容体は、７個の貫膜ドメインを含むが、構造的および機能的にＧ−タンパク質共役型受容体とは異なると予測されている。低分子干渉性ＲＮＡを用いた発現および抑制試験は、これらの受容体が、その高いＡＭＰキナーゼに加えて、脂肪酸酸化およびグルコース取込みに対するアディポネクチンの効果を媒介することを示唆している。
【０００９】
Ｃ１ｑ−ＴＮＦ関連タンパク質１（ＣＴＲＰ１）はまた、ｚｓｉｇ３７およびＣ１ＱＴＮＦ１としても知られており、内皮および血管平滑筋細胞で高度発現され、急性血管損傷部位で暴露されたコラーゲンに結合することが示されている。ＣＴＲＰ１は、コラーゲン誘導血小板活性化の強力な阻害剤であることが見出されており、その局所作用により、血管損傷部位での動脈遮断性血餅の形成を阻止する。ＣＴＲＰ１処置は、心臓発作および卒中に伴う、プラーク破裂の動物モデル、および血管手術、例えば血管形成術のモデルにおいて血流の遮断を阻止することが見出された。血栓性梗塞の阻害に使用される他の薬剤とは異なり、ＣＴＲＰ１は、動物モデルでの試験時に、血液凝固に対する全身的効果をあまり示さなかった。血小板活性化および動脈遮断の阻止において強力な効果を発揮し、その投与により誘導される出血合併症が見かけ上欠如しているため、ＣＴＲＰ１は、冠動脈血管形成術、頚動脈血管内膜切除術および卒中を含む血管損傷に伴う様々な状態の処置における臨床有用性を有し得る。例えば、米国特許第６８０３４５０号、同第６５６６４９９号、および同第６２６５５４４号参照、これらは全て出典明示により援用する。他のＣ１q ＳＦメンバーには、ＣＴＲＰ２、ＣＴＲＰ３、ＣＴＲＰ４、ＣＴＲＰ５、ＣＴＲＰ６およびＣＴＲＰ７がある。Wong et al.、PNAS、１１０巻、２８号：１０３０２−７（２００４）参照、これについては出典明示により援用する。
【００１０】
Ｃ１ｑ ＳＦメンバーは、あらゆるタンパク質と同様、治療薬として使用されたときに望ましくない免疫応答を誘導する可能性を有する。従って、Ｃ１ｑ ＳＦメンバーをベースとする治療薬の開発は、Ｃ１ｑ ＳＦメンバーの潜在的免疫原性を先制的に低減化することにより容易となり得る。タンパク質の免疫原性をモジュレーションする幾つかの方法が開発されている。場合によっては、ポリエチレングリコール付加が、抗体アグレトープへの接近を立体遮断することにより中和抗体を産生している患者の割合を低下させるのが観察されることもある（例えば、Hershfield et al.、PNAS １９９１ ８８：７１８５−７１８９（１９９１）；Bailon et al. Bioconjug. Chem.１２：１９５−２０２（２００１）；He et al. Life Sci. ６５：３５５−３６８（１９９９）参照、全て、出典明示により援用する）。また、凝集体の方が可溶性タンパク質よりも免疫原性が高いことが観察されていることから、タンパク質治療薬の溶解特性を改善する方法により免疫原性も低減化され得る。
【００１１】
免疫原性を低下させるより一般的な方法は、免疫系の刺激を最も担うタンパク質配列および構造中のアグレトープで標的化した突然変異誘発を含む。溶媒露出残基を無作為に置換して、既知中和抗体パネルへの結合親和力を低下させることにより、ある程度の成果は達成された（例えば、Laroche et al. Blood ９６：１４２５−１４３２（２０００）参照、これについては出典明示により援用する）。抗体のレパートリー(能力範囲)は信じ難いほど多様であるため、既知抗体への親和力を低下させる突然変異は、典型的には免疫原性の排除ではなく別の一連の抗体の産生を誘導することになる。しかしながら、場合によっては、タンパク質表面上の疎水性および荷電残基を極性中性残基で置換することにより表面抗原性の低減化が可能なこともある（Meyer et al.、Protein Sci. １０：４９１−５０３（２００１）参照、出典明示により援用する）。
【００１２】
別の方法はＴ細胞活性化を破壊することである。ＭＨＣ分子の多様性としては１０３までの対立遺伝子が含まれるに過ぎないが、抗体レパートリーは約１０８であると推定され、Ｔ細胞受容体レパートリーはそれよりさらに大きいため、ＭＨＣ結合性アグレトープの除去により、かなり扱い易い免疫原性低減化方法がもたらされる。タンパク質配列内のクラスＩＩ ＭＨＣ結合性ペプチドを同定し、除去または修飾することにより、免疫原性の分子基礎は回避され得る。免疫原性の低いタンパク質の生成を目的とする上記アグレトープの排除は、以前に開示されたことがある。例えば、国際公開第９８／５２９７６号、国際公開第０２／０７９２３２号、および国際公開第００／３３１７号参照、これらについては出典明示により援用する。
【００１３】
低減化された免疫原性をもたらすと予測されるＭＨＣ結合性アグレトープにおける突然変異は同定され得るが、ほとんどのアミノ酸置換はエネルギー的に不利である。結果として、上記方法を用いて同定された低免疫原性配列の大多数は、タンパク質の構造および／機能とは適合し得ない。ＭＨＣアグレトープ除去を実現性のある免疫原性低減化方法とするためには、タンパク質の構造、安定性および生物学的活性を維持すべく同時に努力することが非常に重要である。
【００１４】
免疫原性が低減化された新規Ｃ１ｑ ＳＦメンバータンパク質が依然として要望されている。免疫原性が低減化されたＣ１ｑ ＳＦメンバーの変異型は、若干のＣ１ｑ ＳＦメンバー応答状態の処置において使用され得る。
【発明の開示】
【００１５】
上記で概説した目的によると、本発明は、天然Ｃ１ｑ ＳＦメンバータンパク質と比べて免疫原性が低減化された新規Ｃ１ｑ ＳＦメンバータンパク質を提供する。追加的態様において、本発明は、治療に使用するためのＣ１ｑ ＳＦメンバー活性をもつ低免疫原性タンパク質を遺伝子工学的に製造または設計する方法に関するものである。
【００１６】
本発明の態様は、親Ｃ１ｑ ＳＦメンバーに対して１つまたはそれ以上のクラスＩＩ ＭＨＣ対立遺伝子への低い結合親和力を示し、天然Ｃ１ｑ ＳＦメンバーの活性を顕著に維持しているＣ１ｑ ＳＦメンバー変異型である。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は、変異型Ｃ１ｑ ＳＦメンバータンパク質をコードする組換え核酸、発現ベクター、および宿主細胞を提供する。
【００１８】
さらなる態様において、本発明は、変異型Ｃ１ｑ ＳＦメンバータンパク質の製造方法であって、変異型Ｃ１ｑ ＳＦメンバータンパク質の発現に適切な条件下で本発明の宿主細胞を培養することを含む方法を提供する。
【００１９】
さらなる態様において、本発明は、本発明の変異型Ｃ１ｑ ＳＦメンバータンパク質または核酸および医薬用担体を含む医薬組成物を提供する。
【００２０】
さらなる態様において、本発明は、Ｃ１ｑ ＳＦメンバー応答性疾患の予防または処置方法であって、患者に本発明の変異型Ｃ１ｑ ＳＦメンバータンパク質または核酸を投与することを含む方法を提供する。
【００２１】
追加的態様では、本発明は、特に野生型または変異型Ｃ１ｑ ＳＦメンバー治療薬に対して免疫応答を生じると思われる個体を同定するために潜在的患者のクラスＩＩ ＭＨＣハプロタイプをスクリーニングする方法を提供する。
【００２２】
上記で概説した目的によると、本発明は、野生型Ｃ１ｑ ＳＦメンバータンパク質と比べて少なくとも１個のアミノ酸挿入、欠失または置換を伴うアミノ酸配列を含むＣ１ｑ ＳＦメンバー変異型タンパク質を提供する。
【００２３】
図面の簡単な説明
図１は、低免疫原性Ｃ１ｑ ＳＦメンバー誘導体の遺伝子工学的製法を示す。
図２は、ＩＶＶ技術によるＣ１ｑ ＳＦメンバーペプチドまたはタンパク質の免疫原性のインビトロ試験方法を表す図を示す。
【００２４】
発明の詳細な説明
本明細書における「９量体ペプチドフレーム」および文法的均等内容語は、興味の対象であるタンパク質に位置する９アミノ酸の線状配列を意味する。９量体フレームは、１つまたはそれ以上のクラスＩＩ ＭＨＣ対立遺伝子と結合するそれらの性質について分析され得る。本明細書における「対立遺伝子」および文法的均等内容語は、遺伝子のオルターナティブ(もう一つの)形態をいう。具体的には、クラスＩＩ ＭＨＣ分子の場合、対立遺伝子は、ＤＲＡ、ＤＲＢ１、ＤＲＢ３／４／５、ＤＱＡ１、ＤＱＢ１、ＤＰＡ１、およびＤＰＢ１分子の天然配列変異型を全て包含する。本明細書における「ヒット」および文法的均等内容語は、マトリックス方法の場合、所定のペプチドが所定のクラスＩＩ ＭＨＣ対立遺伝子に結合すると予測されることを意味する。好ましい実施態様において、ヒットは、ランダムペプチド配列の結合スコアの上位５％、または３％、または１％内の結合親和力をもつペプチドであると定義される。これに代わる実施態様では、ヒットは、ある閾値を越える結合親和力をもつペプチド、例えば少なくとも１００μＭまたは１０μＭまたは１μＭ親和力でＭＨＣ対立遺伝子に結合すると予測されるペプチドであると定義される。本明細書における「免疫原性」および文法的均等内容語は、限定されるわけではないが、中和および非中和抗体の産生、免疫複合体の形成、補体活性化、マスト細胞活性化、炎症およびアナフィラキシーを含む、免疫応答を誘発するタンパク質の能力を意味する。本明細書における「低減化された免疫原性」および文法的均等内容語は、野生型タンパク質と比べて、免疫系を活性化する能力が低減化されていることを意味する。例えば、変異型タンパク質が、野生型タンパク質よりも低い力価または少ない患者において中和または非中和抗体を誘発する場合、それは「免疫原性が低減化されている」と言われ得る。好ましい実施態様において、中和抗体を産生する確率は、少なくとも５％減じられており、少なくとも５０％または９０％の減少が特に好ましい。そこで、野生型が患者の１０％において免疫応答を生じる場合、免疫原性が低減化された変異型は、９.５％未満の患者において免疫応答を誘発し、さらに５％未満または１％未満が特に好ましい。また、変異型タンパク質が１つまたはそれ以上のＭＨＣ対立遺伝子への結合低下を示す場合、またはそれが親タンパク質に対して少ない割合の患者においてＴ細胞活性化を誘導する場合、それは「免疫原性が低減化されている」と言われ得る。好ましい実施態様では、Ｔ細胞活性化の確率は少なくとも５％減じられており、少なくとも５０％または９０％減少が特に好ましい。本明細書における「マトリックス方法」およびその文法的均等内容語は、ペプチド−ＭＨＣ親和力の算出方法を意味し、その方法では、所定のＭＨＣ対立遺伝子と相互作用する、ペプチドにおける各位置での可能な各残基についてのスコアを含むマトリックスが使用される。所定のペプチド−ＭＨＣ相互作用についての結合スコアは、ペプチドにおける各位置で観察されるアミノ酸についてのマトリックス値を合計することにより得られる。本明細書における「ＭＨＣ結合性アグレトープ」および文法的均等内容語は、適切な親和力で１つまたはそれ以上のクラスＩＩ ＭＨＣ対立遺伝子に結合することにより、ＭＨＣ−ペプチド−Ｔ細胞受容体複合体を形成させ、それに続いてＴ細胞を活性化させ得るペプチドを意味する。ＭＨＣ結合性アグレトープは、少なくとも約９残基を含む線状ペプチド配列である。本明細書で使用されている「親タンパク質」は、後に修飾が加えられることにより変異型タンパク質を生成するタンパク質を意味する。上記親タンパク質は、野生型または天然タンパク質、または天然タンパク質の変異型または遺伝子操作が加えられた型であり得る。「親タンパク質」は、タンパク質それ自体、親タンパク質を含む組成物、またはそれをコード化するアミノ酸配列を指し得る。従って、本明細書で使用されている「親Ｃ１ｑ ＳＦメンバータンパク質」は、修飾が加えられることにより、変異型Ｃ１ｑ ＳＦメンバータンパク質を生成するＣ１ｑ ＳＦメンバータンパク質を意味する。
【００２５】
本明細書における「患者」とは、ヒトおよび他の動物、特に哺乳類および生物体を包含する。すなわち、本方法は、ヒト治療および獣医学適用の両方に適用可能である。好ましい実施態様において、患者は哺乳類であり、そして最も好ましい実施態様において、患者はヒトである。本明細書における「タンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドを包含する、共有結合している少なくとも２個のアミノ酸をいう。タンパク質は、天然アミノ酸およびペプチド結合、または一般的に合成方法により異なる、合成ペプチドミメティック構造、すなわち「類似体」、例えばペプトイド［Simon et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. ８９(２０：９３６７−７１(１９９２))参照］により構成され得る。例えば、ホモ−フェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシンは、本発明の目的にかなうアミノ酸であるとみなされる。「アミノ酸」はまた、アミノ酸残基、例えばプロリンおよびヒドロキシプロリンを包含する。Ｄ−およびＬ−アミノ酸の両方が使用され得る。本明細書における「Ｃ１ｑ ＳＦメンバー応答疾患または状態」および文法的均等内容語は、Ｃｑ１ ＳＦメンバーによる処置から恩恵を被り得る疾患、障害、および状態を包含する。Ｃ１ｑ ＳＦメンバーまたはＣ１ｑ ＳＦメンバーのエンハンサーまたは阻害剤による処置から恩恵を被り得る疾患の例には、インシュリン抵抗に伴う疾患、例えば２型糖尿病、肥満、グルコース寛容減損（ＩＧＴ）、Ｘ症候群、ＨＩＶ−関連リポジストロフィーを含むリポジストロフィー疾患、食欲不振、およびグルコースまたは脂質代謝の調節に関連した他の状態、アテローム性動脈硬化および冠動脈疾患を含む心臓血管疾患、および血管介入後の血管再狭窄があるが、これらに限定されるわけではない。Ｃ１ｑ ＳＦメンバーはまた、筋肉の成長を促進し、筋肉消耗および他の筋肉関連疾患を処置し、肝臓病、および冠動脈血管形成術、頚動脈血管内膜切除術および卒中を含む血管損傷に伴う様々な状態を予防および処置するのにも有益であり得る。本明細書における「処置」は、疾患または障害についての治療的処置、並びに予防的または抑制手段を包含するものとする。すなわち、例えば、疾患の兆候が現われる前に変異型Ｃ１ｑ ＳＦメンバータンパク質を効果的に投与することにより、疾患が処置され得る。別の例として、疾患の臨床発現後に変異型Ｃ１ｑ ＳＦメンバータンパク質を効果的に投与して疾患の症状と闘うことにより、疾患が「処置」され得る。また「処置」には、疾患を根絶するための疾患出現後における変異型Ｃ１ｑ ＳＦメンバータンパク質の投与も包含される。さらに、兆候が現れた後および臨床症状が発現した後の有効な薬剤投与により、臨床症状が減退し、恐らくは疾患が改善され得る場合も、疾患の「処置」に包含される。「処置を必要とする」者には、既に疾患または障害をもつ哺乳類、並びに疾患または障害を予防するべき者を含め、疾患または障害を患う傾向を有する者が含まれる。
【００２６】
本明細書における「変異型Ｃ１ｑ ＳＦメンバー核酸」および文法的均等内容語は、変異型Ｃ１ｑ ＳＦメンバータンパク質をコード化する核酸を意味する。遺伝コードの縮重故に、非常に多数の核酸が、単に変異型Ｃ１ｑ ＳＦメンバーのアミノ酸配列を変えない形で１個またはそれ以上のコドンの配列を修飾することにより生成され得、それらは全て本発明の変異型Ｃ１ｑ ＳＦメンバータンパク質をコード化するものとする。本明細書における「変異型Ｃ１ｑ ＳＦメンバータンパク質」およびその文法的均等内容語は、少なくとも１個のアミノ酸挿入、欠失または置換により野生型または親Ｃ１ｑ ＳＦメンバータンパク質とは異なる非天然Ｃ１ｑ ＳＦメンバータンパク質を意味する。Ｃ１ｑ ＳＦメンバー変異型は、それらがＣ１ｑ ＳＦメンバータンパク質配列の天然に存する対立遺伝子または種間変異と区別される特徴である、予め決定された変異の性質を特徴とする。Ｃ１ｑ ＳＦメンバー変異型は、典型的には天然に存するＣ１ｑ ＳＦメンバーと同等である生物学的活性を呈するか、または別の生物学的特性を有するように特異的に遺伝子操作が加えられている。変異型Ｃ１ｑ ＳＦメンバータンパク質は、Ｎ−末端、Ｃ−末端または内部に挿入、欠失および／または置換を含み得る。好ましい実施態様では、変異型Ｃ１ｑ ＳＦメンバータンパク質は、天然Ｃ１ｑ ＳＦメンバー配列とは異なる少なくとも１個の残基を有し、少なくとも２、３、４または５個の異なる残基がさらに好ましい。変異型Ｃ１ｑＳＦメンバータンパク質は、さらなる修飾、例えば安定性または可溶性を改変するかまたは翻訳後修飾、例えばポリエチレングリコール付加またはグリコシル化を可能にするかまたは阻止する突然変異を含み得る。変異型Ｃ１ｑＳＦメンバータンパク質には、限定されるわけではないが、１個またはそれ以上の側鎖または末端の合成誘導体化、グリコシル化、ポリエチレングリコール付加、環状変更、閉環、タンパク質またはタンパク質ドメインへの融合、およびペプチドタグまたは標識の付加を含む、共翻訳または翻訳後修飾が加えられ得る。本明細書における「野生型またはｗｔ」およびその文法的均等内容語は、自然界で見出され、対立遺伝子変異を含むアミノ酸配列またはヌクレオチド配列、すなわち意図的には修飾が加えられていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。好ましい実施態様において、アディポネクチンの野生型配列は配列番号１であり、ＣＴＲＰ１の野生型配列は配列番号２である。
【００２７】
Ｃ１ｑ ＳＦメンバーにおけるＭＨＣ結合性アグレトープの同定
ＭＨＣ結合ペプチドは、抗原プロセッシングと呼ばれる過程によりタンパク質から得られる。まず、タンパク質は、エンドサイトーシスまたは食作用により抗原提示細胞（ＡＰＣ）へ輸送される。次いで、様々なタンパク質分解酵素が、タンパク質を若干のペプチドに開裂する。次いで、これらのペプチドはクラスＩＩ ＭＨＣ分子へローディングされ得、生成したペプチド−ＭＨＣ複合体は細胞表面へ輸送される。比較的安定したペプチド−ＭＨＣ複合体は、ナイーブＴ細胞の表面に存在するＴ細胞受容体により認識され得る。この認識事象は、免疫応答の開始に必要とされる。従って、安定したペプチド−ＭＨＣ複合体の形成を遮断することは、好ましくない免疫応答の有効な阻止方法である。
【００２８】
ペプチド−ＭＨＣ相互作用の親和力を決定する因子は、生化学的および構造的方法を用いて特性確認されている。ペプチドは、伸長した立体配座でクラスＩＩ ＭＨＣ分子におけるグルーブに沿って結合する。クラスＩＩ ＭＨＣ分子と結合するペプチドは、典型的には約１３〜１８残基長であり、９残基領域は、結合親和力および特異性のほとんどに関与している。ペプチド結合グルーブは、通例Ｐ１からＰ９と呼ばれる「ポケット」へさらに分割され得、各ポケットは、ペプチドにおける特異的残基と相互作用するＭＨＣ残基のセットを含む。若干の多形性残基は、ＭＨＣ分子のペプチド結合グルーブへ向いている。各ＭＨＣ分子のペプチド結合ポケットの各々の内側を占める残基の同一性が、そのペプチド結合特異性を決定する。逆に、ペプチドの配列は、各ＭＨＣ対立遺伝子についてのその親和力を決定する。
【００２９】
タンパク質配列におけるＭＨＣ結合アグレトープの幾つかの同定方法が当分野では周知であり、Ｃ１ｑ ＳＦメンバーにおけるアグレトープを同定するのに使用され得る。配列に基く情報を用いることにより、所定のペプチド−ＭＨＣ相互作用についての結合スコアが決定され得る（例えば、Mallios、Bioinformatics １５：４３２−４３９（１９９９）；Mallios、Bioinformatics １７：９４２−９４８頁（２００１）；Sturniolo et al. Nature Biotech. １７：５５５−５６１（１９９９）参照、全て出典明示により援用する）。所定のペプチドを、所定のＭＨＣ分子のペプチド結合グルーブにコンピューター操作により配置し、相互作用エネルギーを測定する構造に基づいた方法を使用することが可能である（例えば、国際公開９８／５９２４４および国際公開０２／０６９２３２参照、全て出典明示により援用する）。上記方法は「スレッド」方法と称され得る。別法として、純粋な実験方法が使用され得る。例えば、興味の対象であるタンパク質から誘導されたオーバーラップペプチドのセットが、Ｔ細胞活性化および／または免疫応答の他の局面を誘導する能力について実験的に試験され得る。（例えば国際公開０２／７７１８７参照、出典明示により援用する）。
【００３０】
好ましい実施態様において、ＭＨＣ結合傾向スコアは、マトリックス方法を用いてＣ１ｑ ＳＦメンバー配列に沿った各９残基フレームについて計算される（Sturniolo et al.、前出；Marshall et al.、J. Immunol. １５４：５９２７−５９３３（１９９５）、およびHammer et al.、J. Exp. Med. １８０：２３５３−２３５８（１９９４）参照、全て出典明示により援用する）。また、これらの残基の１サブセットのみについてスコアを考えること、または興味の対象である９残基フレームの前後におけるペプチド残基の同一性を考慮することも可能である。マトリックスは、異なるヒトクラスＩＩ ＭＨＣ分子におけるペプチド結合ポケットと相互作用する特異的アミノ酸についての結合スコアを含む。最も好ましい実施態様では、マトリックスにおけるスコアは、実験的ペプチド結合試験から得られる。別の好ましい実施態様では、所定のポケットへ結合する所定のアミノ酸についてのスコアは、ポケットの内側をおおう同一または類似残基をもつ追加対立遺伝子に対し実験的に特性確認された対立遺伝子から外挿される。外挿法により作製されるマトリックスは、「バーチャル・マトリックス」と称される。
【００３１】
好ましい実施態様では、マトリックス方法を用いて、興味の対象である各対立遺伝子に結合する興味の対象である各ペプチドについてのスコアを計算する。次いで、幾つかの方法を用いることにより、所定のペプチドが所定のＭＨＣ対立遺伝子に顕著な親和力で結合するか否かが測定され得る。一実施態様では、興味の対象であるペプチドについての結合スコアを、大きなセットのレファレンスペプチドの結合傾向スコアと比較する。レファレンスペプチドと比べて結合傾向スコアが大きいペプチドは、ＭＨＣと結合すると考えられ、「ヒット」として分類され得る。例えば、結合傾向スコアがその対立遺伝子について可能な結合スコアの最高１％の内にある場合、それは１％閾値での「ヒット」として評点され得る。１つまたはそれ以上の閾値におけるヒットの総数を各ペプチドについて計算する。場合によっては、結合スコアが、予測された結合親和力と直接相関関係を示すこともあり得る。次いで、ヒットは、少なくとも１００μＭまたは１０μＭまたは１μＭ親和力で結合すると予測されるペプチドとして定義され得る。
【００３２】
好ましい実施態様では、０.５％〜１０％の範囲における１つまたはそれ以上の閾値を用いて、タンパク質中の各９量体フレームについてのヒットの数を計算する。特に好ましい実施態様では、１％、３％および５％閾値を用いて、ヒットの数を計算する。
【００３３】
好ましい実施態様では、ＭＨＣ結合アグレトープは、幾つかのクラスＩＩ ＭＨＣ対立遺伝子に結合する９量体フレームとして同定される。特に好ましい実施態様において、ＭＨＣ結合アグレトープは、５％閾値で少なくとも１０個の対立遺伝子および／または１％閾値で少なくとも５個の対立遺伝子と結合すると予測される。上記９量体フレームは、特に多数のヒト集団において免疫応答を誘発すると考えられ得る。
【００３４】
好ましい実施態様において、ＭＨＣ結合アグレトープは、ヒト集団の少なくとも０.０１〜１０％に存在するＭＨＣ対立遺伝子と結合すると予測される。別法として、特異的クラスＩＩ ＭＨＣ対立遺伝子に関連付けられる状態を処置するためには、ＭＨＣ結合アグレトープは、関連性のある患者集団の少なくとも０.０１〜１０％に存在するＭＨＣ対立遺伝子と結合すると予測される。
【００３５】
異なる民族および人種群における種々のＭＨＣ対立遺伝子の有病率に関するデータは、例えばナショナル・マロウ・ドナー・プログラム（ＮＭＰＤ）といったグループにより得られた。例えば、Mignot et al. Am. J. Hum. Genet. 68: 686-699 (2001), Southwood et al. J. Immunol. 160: 3363-3373 (1998), Hurley et al. Bone Marrow Transplantation 25: 136-137 (2000), Sintasath Hum. Immunol. 60: 1001 (1999), Collins et al. Tissue Antigens 55: 48 (2000), Tang et al. Hum. Immunol. 63: 221 (2002), Chen et al. Hum. Immunol. 63: 665 (2002), Tang et al. Hum. Immunol. 61: 820 (2000), Gans et al. Tissue Antigens 59: 364-369, および Baldassarre et al. Tissue Antigens 61: 249-252 (2003)参照、これらについては、全て出典明示により援用する。
【００３６】
好ましい実施態様において、ＭＨＣ結合アグレトープは、高有病率のＭＨＣ対立遺伝子を含むＭＨＣヘテロ二量体について予測される。ＵＳ集団の少なくとも１０％に存在するクラスＩＩ ＭＨＣ対立遺伝子には、ＤＰＡ１*０１０３、ＤＰＡ１*０２０１、ＤＰＢ１*０２０１、ＤＰＢ１*０４０１、ＤＰＢ１*０４０２、ＤＱＡ１*０１０１、ＤＱＡ１*０１０２、ＤＱＡ１*０２０１、ＤＱＡ１*０５０１、ＤＱＢ１*０２０１、ＤＱＢ１*０２０２、ＤＱＢ１*０３０１、ＤＱＢ１*０３０２、ＤＱＢ１*０５０１、ＤＱＢ１*０６０２、ＤＲＡ*０１０１、ＤＲＢ１*０７０１、ＤＲＢ１*１５０１、ＤＲＢ１*０３０１、ＤＲＢ１*０１０１、ＤＲＢ１*１１０１、ＤＲＢ１*１３０１、ＤＲＢ３*０１０１、ＤＲＢ３*０２０２、ＤＲＢ４*０１０１、ＤＲＢ４*０１０３、およびＤＲＢ５*０１０１があるが、これらに限定されるわけではない。
【００３７】
好ましい実施態様では、ＭＨＣ結合アグレトープはまた、中位有病率のＭＨＣ対立遺伝子を含むＭＨＣヘテロ二量体についても予測される。ＵＳ集団の１％〜１０％に存在するクラスＩＩ ＭＨＣ対立遺伝子には、ＤＰＡ１*０１０４、ＤＰＡ１*０３０２、ＤＰＡ１*０３０１、ＤＰＢ１*０１０１、ＤＰＢ１*０２０２、ＤＰＢ１*０３０１、ＤＰＢ１* ０５０１、ＤＰＢ１*０６０１、ＤＰＢ１*０９０１、ＤＰＢ１*１００１、ＤＰＢ１*１１０１、ＤＰＢ１*１３０１、ＤＰＢ１*１４０１、ＤＰＢ１*１５０１、ＤＰＢ１*１７０１、ＤＰＢ１*１９０１、ＤＰＢ１*２００１、ＤＱＡ１*０１０３、ＤＱＡ１*０１０４、ＤＱＡ１*０３０１、ＤＱＡ１*０３０２、ＤＱＡ１*０４０１、ＤＱＢ１*０３０３、ＤＱＢ１*０４０２、ＤＱＢ１*０５０２、ＤＱＢ１*０５０３、ＤＱＢ１*０６０１、ＤＱＢ１*０６０３、ＤＲＢ１*１３０２、ＤＲＢ１*０４０４、ＤＲＢ１*０８０１、ＤＲＢ１*０１０２、ＤＲＢ１*１４０１、ＤＲＢ１*１１０４、ＤＲＢ１*１２０１、ＤＲＢ１*１５０３、ＤＲＢ１*０９０１、ＤＲＢ１*１６０１、ＤＲＢ１*０４０７、ＤＲＢ１*１００１、ＤＲＢ１*１３０３、ＤＲＢ１*０１０３、ＤＲＢ１*１５０２、ＤＲＢ１*０３０２、ＤＲＢ１*０４０５、ＤＲＢ１*０４０２、ＤＲＢ１*１１０２、ＤＲＢ１*０８０３、ＤＲＢ１*０４０８、ＤＲＢ１*１６０２、ＤＲＢ１*０４０３、ＤＲＢ３*０３０１、ＤＲＢ５*０１０２、およびＤＲＢ５*０２０２があるが、これらに限定されるわけではない。
【００３８】
また、ＭＨＣ結合アグレトープは、低有病率対立遺伝子を含むＭＨＣヘテロ二量体についても予測され得る。ヒトおよび他の種におけるＭＨＣ対立遺伝子に関する情報は、例えばＩＭＧＴ／ＨＬＡ配列データベースから入手され得る。
【００３９】
また、ＭＨＣ結合アグレトープは、低有病率対立遺伝子を含むＭＨＣヘテロ二量体についても予測され得る。ヒトおよび他の種におけるＭＨＣ対立遺伝子に関する情報は、例えばＩＭＧＴ／ＨＬＡ配列データベースから入手され得る。
【００４０】
特に好ましい実施態様では、免疫原性スコアは各ペプチドについて測定され、上記スコアは、多くの閾値でヒットである１個またはそれ以上のＭＨＣ対立遺伝子をもつ集団の割合により変化する。例えば、等式
Ｉスコア＝Ｎ（Ｗ１Ｐ１＋Ｗ３Ｐ３＋Ｗ５Ｐ５）
［式中、Ｐ１は１％での集団ヒットのパーセントであり、Ｐ３は３％での集団ヒットのパーセントであり、Ｐ５は５％での集団ヒットのパーセントであり、各Ｗは加重係数であり、Ｎは正規化係数である］
が使用され得る。好ましい実施態様では、Ｗ１＝１０、Ｗ３＝５、Ｗ５＝２、およびＮは、可能なスコアが０〜１００の範囲となるように選択される。この実施態様では、Ｉスコアが１０より大またはそれに等しいアグレトープが好ましく、Ｉスコアが２５より大またはそれに等しいアグレトープが特に好ましい。
【００４１】
さらなる好ましい実施態様では、ＭＨＣ結合アグレトープは、「入れ子状（nested）」アグレトープ内に位置する９量体フレーム、または各々かなりの数の対立遺伝子に結合すると予測されるオーバーラップ９残基フレームとして同定される。上記配列は、特に免疫応答を誘発すると考えられ得る。
【００４２】
好ましいＭＨＣ結合アグレトープは、集団の少なくとも５％に存在するＭＨＣ対立遺伝子に、３％閾値で結合すると予測されるアグレトープである。アディポネクチンにおける好ましいＭＨＣ結合アグレトープには、アグレトープ１：残基１０９−１１７、アグレトープ２：残基１１１−１１９、アグレトープ３：残基１２２−１３０、アグレトープ６：残基１５７−１６５、アグレトープ８：残基１６０−１６８、アグレトープ９：残基１６６−１７４、アグレトープ１１：残基１７５−１８３、アグレトープ１２：残基１７６−１８４、アグレトープ１３：残基２０２−２１０があるが、これらに限定されるわけではない。
【００４３】
特に好ましいＭＨＣ結合アグレトープは、集団の少なくとも１０％に存在するＭＨＣ対立遺伝子に、１％閾値で結合すると予測されるアグレトープである。アディポネクチンにおける特に好ましいＭＨＣ結合アグレトープには、アグレトープ１：残基１０９−１１７、アグレトープ２：残基１１１−１１９、アグレトープ３：残基１２２−１３０、アグレトープ９：残基１６６−１７４があるが、これらに限定されるわけではない。
【００４４】
ＣＴＲＰ１における好ましいＭＨＣ結合アグレトープには、アグレトープ１：残基１５０−１５８、アグレトープ３：残基１７２−１８０、アグレトープ５：残基１８５−１９３、アグレトープ１１：残基２０２−２１０、アグレトープ１３：残基２０９−２１７、アグレトープ１４：残基２１８−２２６、アグレトープ１６：残基２３０−２３８、アグレトープ１７：残基２４７−２５５、アグレトープ１９：残基２６７−２７５があるが、これらに限定されるわけではない。
【００４５】
ＣＴＲＰ１における特に好ましいＭＨＣ結合アグレトープには、アグレトープ３：残基１７２−１８０、アグレトープ１４：残基２１８−２２６、アグレトープ１６：残基２３０−２３８、アグレトープ１７：残基２４７−２５５があるが、これらに限定されるわけではない。
【００４６】
ＭＨＣ結合アグレトープの確認
好ましい実施態様では、上記で予測されたＭＨＣ結合アグレトープの免疫原性は、各予測アグレトープを含むペプチドが免疫応答を誘発し得る範囲を測定することにより実験的に確認される。しかしながら、アグレトープ確認の中間段階を経なくても、アグレトープ予測からアグレトープ排除まで進めることは可能である。
【００４７】
下記でさらに詳しく検討されている幾つかの方法は、アグレトープの実験的確認に使用され得る。例えば、適合したドナーからのナイーブＴ細胞および抗原提示細胞のセットに、興味の対象であるアグレトープを含むペプチドで刺激を加え、Ｔ細胞活性化をモニターすることが可能である。また、まず興味の対象である全タンパク質でＴ細胞に刺激を加え、次いで全タンパク質から誘導されたペプチドで再度刺激を加えることが可能である。アディポネクチンに対して免疫応答を生じる患者から血清を入手できる場合、特異的エピトープに応答する成熟Ｔ細胞を検出することが可能である。好ましい実施態様では、活性化Ｔ細胞によるガンマインターフェロンまたはＩＬ−５産生がエリスポット検定法を用いてモニターされるが、Ｔ細胞活性化または増殖の他の指標、例えばトリチウム化チミジン取り込みまたは他のサイトカインの生産を利用することも可能である。
【００４８】
患者遺伝子型解析およびスクリーニング
ＨＬＡ遺伝子型は、特定自己免疫疾患（例えば、Nepom Clin. Immunol. Immunopathol．６７：Ｓ５０−Ｓ５５（１９９３）参照、出典明示により援用する）および感染症（例えば、Singh et al.、Emerg. Infect. Dis. ３：４１−４９（１９９７）参照、出典明示により援用する）に対する感受性の主たる決定因子である。さらに、個体に存在するＭＨＣ対立遺伝子のセットは、幾つかのワクチンの効力に影響を及ぼし得る（例えば、Cailat-Zucman et al.、Kidney Int. ５３：１６２６−１６３０（１９９８）および Poland et al.、Vaccine ２０：４３０−４３８（２００１）参照、これらについては全て出典明示により援用する）。ＨＬＡ遺伝子型はまた、個体に関して感受性を付与することにより、アディポネクチン治療薬に対する好ましくない免疫応答を誘発し得る。
【００４９】
好ましい実施態様では、アディポネクチンタンパク質に対して免疫応答を誘発する感受性の増加または減少に関連するクラスＩＩ ＭＨＣ対立遺伝子が同定される。例えば、アディポネクチン治療薬で処置された患者を、抗アディポネクチン抗体の存在について試験し、クラスＩＩ ＭＨＣについて遺伝子解析することが可能である。別法として、Ｔ細胞活性化検定法、例えば上記の方法は、若干の遺伝子解析されたドナーから誘導された細胞を用いて実施され得る。アディポネクチン免疫原性に対する感受性を付与する対立遺伝子は、免疫応答を誘発しない者に対し、免疫応答を誘発する者において有意に多く共有されている対立遺伝子として定義され得る。同様に、アディポネクチン免疫原性に対する抵抗性を付与する対立遺伝子は、免疫応答を発する者に対し、免疫応答を発しない者において有意に少なく共有されている対立遺伝子として定義され得る。また、純粋にコンピューター処理技術を使用することにより、どの対立遺伝子がアディポネクチン治療薬を認識すると思われるかを同定することも可能である。
【００５０】
一実施態様において、遺伝子型関連データを用いることにより、アディポネクチン治療に対して免疫応答を発する尤度が特に高いかまたは特に低い患者が同定される。
【００５１】
活性低免疫原性変異型の設計
好ましい実施態様では、上記で決定されたＭＨＣ結合アグレトープを別のアミノ酸配列と置換することにより、免疫原性が低減化または排除された活性変異型アディポネクチンタンパク質を生成する。別法として、ＭＨＣ結合アグレトープに修飾を加えることにより、タンパク質プロセッシング中に開裂され易い１個またはそれ以上の部位が導入される。アグレトープがＭＨＣ分子に結合する前に開裂される場合、それが免疫応答を促すことはできない。限定されるわけではないが、下記に示した方法を含む、構造化された活性配列の同定方法と低免疫原性配列を同定する方法を統括する幾つかの可能な戦略がある。
【００５２】
一実施態様では、上記で同定された１つまたはそれ以上の９量体アグレトープについて、１つまたはそれ以上の可能なオールタネート（代替）９量体配列を、免疫原性並びに構造的および機能的適合性に関して分析する。その結果、好ましいオールタネート９量体配列は、予測免疫原性が低く、構造化され、活性である確率が高い配列として定義される。構造化された活性低免疫原性変異型を含む尤度が最も高い９量体配列のサブセットのみ考慮に入れることが可能である。例えば、高非保存的突然変異または予測免疫原性を高める突然変異を含む配列を考慮に入れることは不必要であり得る。
【００５３】
好ましい実施態様において、各アグレトープの免疫原性の低い変異型は、集団において野生型アグレトープより小さい割合でのＭＨＣ対立遺伝子と結合すると予測される。特に好ましい実施態様において、各アグレトープの低免疫原性変異型は、集団の５％未満に存在するＭＨＣ対立遺伝子に結合すると予測され、その割合は１％または０.１％未満が最も好ましい。
【００５４】
置換マトリックス
別の特に好ましい実施態様では、置換マトリックスまたは他の知識に基いたスコアリング方法を用いることにより、野生型タンパク質の構造および機能を保持していると考えられるオールタネート配列を同定する。上記スコアリング方法を用いることにより、所定の置換または置換のセットがどの程度保存的であるかが定量され得る。たいていの場合、保存的突然変異は、タンパク質の構造および機能をあまり破壊しない（例えば、Bowie et al. Science ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）、BowieおよびSauer Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６：２１５２−２１５６（１９８９）、および Reidhaar-Olson および Sauer Proteins ７：３０６−３１６（１９９０）参照、これらは全て、出典明示により援用する）。しかしながら、非保存的突然変異は、タンパク質構造を不安定にし、活性を低下させ得る（例えば、Lim et al．Biochem.３１：４３２４−４３３３（１９９２）参照、出典明示により援用する）。限定されるわけではないが、ＢＬＯＳＵＭ６２を含む置換マトリックスは、配列および標的構造間の適合性の定量的尺度を提供し、これは非破壊的置換突然変異を予測するのに使用され得る（Topham et al． Prot. Eng.１０：７−２１（１９９７）参照、出典明示により援用する）。置換マトリックスの使用による、特性が改良されたペプチドの設計については既に開示されている。Adenot et al. J. Mol. Graph. Model.１７：２９２−３０９（１９９９）参照、出典明示により援用する。
【００５５】
置換マトリックスには、限定されるわけではないが、ＢＬＯＳＵＭマトリックス（Henikoffおよび Henikoff、Proc. Nat. Acad. Sci. USA ８９：１０９１７（１９９２）、出典明示により援用する）、ＰＡＭマトリックス、デイホフ(Dayhoff)マトリックスなどがある。置換マトリックスの概説については、例えばHenikoff Curr. Opin. Struct. Biol. ６：３５３−３６０（１９９６）参照、出典明示により援用する。また、興味の対象である所定のタンパク質およびその相同体のアラインメントに基づいて置換マトリックスを構築することも可能である。例えば、HenikoffおよびHenikoff Comput. Appl. Biosci.１２：１３５−１４３（１９９６）参照、これについては出典明示により援用する。
【００５６】
好ましい実施態様において、考慮に入れられる置換突然変異の各々は、ゼロまたはそれより高いＢＬＯＳＵＭ６２スコアを有する。このメトリックによると、好ましい置換には、下記のものがあるが、これらに限定されるわけではない。
【表１】
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【００５７】
さらに、９残基ＭＨＣ結合アグレトープについてのオールタネート配列の全ＢＬＯＳＵＭ６２スコアは、野生型９残基アグレトープのＢＬＯＳＵＭ６２スコアと比べたとき、妥当な範囲でのみ減少しているのが好ましい。好ましい実施態様では、変異型９量体のスコアは野生型スコアの少なくとも５０％であり、少なくとも６７％、７５％、８０％または９０％が特に好ましい。
【００５８】
別法として、ＢＬＯＳＵＭスコアの絶対的減少を最小にするオールタネート配列が選択され得る。例えば、各９量体についてのスコア減少は２０未満であるのが好ましく、約１０または約５未満のスコア減少が特に好ましい。正確な値を選択することにより、実験的に扱い易く、また多数の安定した活性低免疫原性変異型を包含するのに十分な多様性を有するオールタネート配列のライブラリーが作製され得る。
【００５９】
好ましい実施態様では、置換突然変異は、実質的に溶媒露出される位置に優先的に導入される。当分野では周知の通り、溶媒露出位置は、典型的にはタンパク質のコアに配置された位置より突然変異の耐容性が高い。
【００６０】
好ましい実施態様では、置換突然変異は、高度保存されていない位置に優先的に導入される。当分野では周知の通り、タンパク質ファミリーのメンバー間で高度に保存されている位置は、タンパク質機能、安定性または構造にとって重要であることが多く、高度保存されていない位置は、多くの場合タンパク質の構造的または機能的特性に大した影響を及ぼすことなく修飾され得る。
【００６１】
アラニン置換
別の実施態様では、アラニン置換が保存的であるか非保存的であるかとは関係無く、１個またはそれ以上のアラニンが置換され得る。当分野では周知の通り、十分なアラニン置換の組込みを利用することにより、分子間相互作用が破壊され得る。
【００６２】
好ましい実施態様において、変異型９量体は、アディポネクチンの構造または機能の維持に特に重大なものとして同定されたかまたはされ得る残基がそれらの野生型同一性を保持するように選択される。別の実施態様では、野生型活性を保持していない変異型アディポネクチンタンパク質の製造が望ましい場合もあり得る。上記の場合、機能にとって重大なもとして同定された残基は、修飾について特異的にターゲッティングされ得る。
【００６３】
ヒトにおける糖尿病および／または低アディポネクチン血症に関連したアディポネクチン残基には、Ｇ８４、Ｇ９０、Ｒ９２、Ｙ１１１、Ｒ１１２およびＩ１６４がある。Ｃ３６（マウスにおけるＣ３９）は、ジスルフィド結合に関与し、六量体および高分子量（ＨＭＷ）多量体の組立に決定的なものであると考えられている。また、残基Ｇ８４およびＧ９０は、ＨＭＷ多量体の形成に関与し、Ｒ１１２、Ｉ１６４およびＹ１５９は、三量体形成に影響を及ぼし得るが、これらの位置での突然変異により、細胞からの分泌が減じられる。六量体およびＨＭＷイソ型は、ＮＨ−κＢ経路を活性化すると報告されているが、三量体はそうではない。オリゴマー状態もまた、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼを活性化する能力に影響を及ぼし得る（Waki et al. J. Biol. Chem. ２７８：４０３５２−４０３６３（２００３）、Tsao et al. J. Biol. Chem. ２７８：５０８１０−５０８１７（２００３）、および Kishida et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. ３０６：２８６−２９２（２００３）参照、これらについては出典明示により援用する）。完全長六量体アディポネクチンではない、球状ドメインは、マウスにおいて筋肉の脂肪酸酸化を促し、体重減少を誘発する（Tomas et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９９：１６３０９−１６３１３（２００２）、Fruebis et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９８：２００５−２０１０（２００１）参照、これらについては出典明示により援用する）。さらに高級オリゴマー形態は、グルコース排出の低下における活性が低いと報告されている（Pajvani et al. J. Biol. Chem. ２７８：９０７３−９０８５（２００３）参照、出典明示により援用する）。アディポネクチンのＨＭＷ形態は、内皮細胞アポトーシスの抑制およびその血管保護活性の付与に関与している（Kobayashi et al. Circ. Res. ９４：ｅ２７−３１（２００４）参照、出典明示により援用する）。コラーゲンドメインにおけるリシンのヒドロキシル化およびグリコシル化（マウス残基６８、７１、８０および１０４）もまた、哺乳類細胞における完全長アディポネクチンのインシュリン感作効果に関与している（Wang et al. J. Biol. Chem. ２７７：１９５２１−１９５２９（２００２）参照、出典明示により援用する）。
【００６４】
タンパク質設計方法
タンパク質設計方法およびＭＨＣアグレトープ同定方法を併用することにより、安定した活性最小免疫原性タンパク質配列が同定され得る（国際公開０３／００６１５４参照、出典明示により援用する）。他の技術を用いて同定された低免疫原性配列のほとんどは治療薬としての機能を果たすだけの十分な活性および安定性を保持し損ねているため、上記方法を組み合わせると、先行の免疫原性低減化技術を凌ぐ著しい利益がもたらされる。
【００６５】
タンパク質設計方法は、非保存的であるかまたは予想外であるにもかかわらず、所望の機能的特性および低免疫原性を付与している突然変異、並びに保存的突然変異を同定し得る。本明細書における非保存的突然変異は、上記表１に含まれていない全ての置換であると定義される。非保存的突然変異はまた、所定の構造的背景では予想されない突然変異、例えばタンパク質表面における疎水性残基への突然変異導入およびタンパク質コアにおける極性残基への突然変異導入を包含する。
【００６６】
さらに、タンパク質設計方法により代償的突然変異が同定され得る。例えば、免疫原性を低下させるべく導入された最初の突然変異導入が安定性または活性をも減少させる場合、タンパク質設計方法を用いることにより、低免疫原性を保持しながらも安定性および活性を回復する機能を果たす１つまたはそれ以上の追加的突然変異が見出され得る。同様に、タンパク質設計方法は、突然変異の１つまたはそれ以上が単独で所望の特性を付与し損ねている場合でさえ、一緒になって免疫原性を低下させ、活性および安定性を保持させる２またはそれ以上の突然変異のセットを同定し得る。
【００６７】
配列を作製および評価する広く多様な方法が知られている。これらには、配列プロファイリング（BowieおよびEisenberg、Science ２５３(５０１６)：１６４−７０（１９９１））、残基対ポテンシャル（Jones、Protein Science ３：５６７−５７４（１９９４））、および回転異性体ライブラリーセレクション（Dahiyat および Mayo、Protein Sci ５（５）：８９５−９０３（１９９６）；Dahiyat および Mayo、Science ２７８（５３３５）：８２−７（１９９７）；Desjarlais および Handel、Protein Science ４：２００６−２０１８（１９９５）；Harbury et al.、PNAS USA ９２（１８）：８４０８−８４１２（１９９５）；Kono et al.、Proteins: Structure, Function and Genetics １９：２４４−２５５（１９９４）；Hellingaおよび Richards、PNAS USA ９１：５８０３−５８０７（１９９４））（これらについては全て、出典明示により援用する）があるが、これらに限定されるわけではない。
【００６８】
プロテイン・デザイン・オートメーション（登録商標）（ＰＤＡ（登録商標））技術
【００６９】
特に好ましい実施態様では、改良されたアディポネクチン変異型の合理的設計が、プロテイン・デザイン・オートメーション（Protein Design Automation）（登録商標）（ＰＤＡ（登録商標））技術を用いることにより達成される。（米国特許第６１８８９６５号、同第６２６９３１２号、同第６４０３３１２号、国際公開９８／４７０８９号およびＵＳＳＮ０９／０５８４５９号、０９／１２７９２６号、６０／１０４６１２号、６０／１５８７００号、０９／４１９３５１号、６０／１８１６３０号、６０／１８６９０４号、０９／４１９３５１号、０９／７８２００４号および０９／９２７７９０号、６０／３４７７７２号、および１０／２１８１０２号；およびＰＣＴ／ＵＳ０１／２１８１０２およびＵＳＳＮ１０／２１８１０２号、ＵＳＳＮ６０／３４５８０５号、ＵＳＳＮ６０／３７３４５３号およびＵＳＳＮ６０／３７４０３５号参照、これらについては全て出典明示により援用する）。
【００７０】
ＰＤＡ（登録商標）技術は、質の高い配列多様性を生み出すコンピューターデザインアルゴリズムを、特性が改良されたタンパク質を発見するための実験的ハイスループットスクリーニングと連結させるものである。コンピューターコンポーネントは、原子レベルスコアリング機能、側鎖回転異性体サンプリング、およびタンパク質配列、構造および機能間の関係を正確に捉えるための進歩した最適化方法を使用する。計算は、タンパク質の三次元構造およびタンパク質の１つまたはそれ以上の特性を最適化する戦略から始まる。次いで、ＰＤＡ（登録商標）技術は、設計用にターゲッティングされた位置に直接関係のある全アミノ酸（所望ならば、非天然アミノ酸を含む）を含む配列空間を探る。これは、許容されたアミノ酸の立体配座状態をサンプリングし、それらを、タンパク質構造を統制する物理的および化学的な力を説明する、パラメーター化され実験的に確認された関数を用いてスコアリングすることにより、達成される。次いで、強力なコンビナトリアル検索アルゴリズムを用いることにより、１０５０配列またはそれ以上を構成し得る最初の配列空間を通して検索し、そして設計基準を満足させると予測される扱い易い数の配列へ迅速に戻る。有用な技術モードは、コンビナトリアル配列設計から優先された最適単一部位置換の選択に及ぶ。ＰＤＡ（登録商標）技術は、重要な医薬および工業用タンパク質を含む非常に多くのシステムに適用されており、タンパク質最適化での成果は立証済みである。
【００７１】
ＰＤＡ（登録商標）は、三次元構造情報を利用する。最も好ましい実施態様では、当分野ではよく知られているＸ線結晶学またはＮＭＲ方法を用いてアディポネクチンの構造を決定する。マウスアディポネクチン球状三量体の結晶構造は、２.１オングストローム解像能まで解明された（Shapiro および Scherer Curr. Biol. ８：３３５−３３８（１９９８）参照、出典明示により援用する）。ヒトアディポネクチンの構造は、当分野では周知のホモロジーモデリング方法を用いて誘導され得る。
【００７２】
好ましい実施態様では、マトリックス法計算の結果を用いることにより、アグレトープ内における９アミノ酸位置のどれが各特定対立遺伝子「ヒット」についての全体的結合傾向に最も寄与しているかを同定する。この解析は、閾値を越える対立遺伝子スコアリングについて、どの位置（Ｐ１〜Ｐ９）が、ＭＨＣ結合親和力に一貫して著しく寄与するアミノ酸により占められるかを考えるものである。次いで、マトリックス法計算を用いることにより、予測された免疫原性を減少または排除する上記位置でのアミノ酸置換を同定し、ＰＤＡ（登録商標）技術を用いることにより、免疫原性が低減化または排除されたオールタネート配列のどれがタンパク質の構造および機能の維持と適合し得るかを測定する。
【００７３】
別の好ましい実施態様では、当業者が各アグレトープにおける残基をまず解析することにより、タンパク質の構造および機能の維持と潜在的に適合し得るオールタネート残基を同定する。次いで、得られた配列のセットをコンピューターによるスクリーニングにかけて、最も免疫原性の低い変異型を同定する。最後に、免疫原性の低い配列の各々を、ＰＤＡ（登録商標）技術タンパク質設計計算法でさらに徹底的に解析することにより、タンパク質構造および機能を維持し、かつ免疫原性を減少させるタンパク質配列を同定する。
【００７４】
別の好ましい実施態様では、アグレトープのＭＨＣ結合親和力に著しく寄与する各残基を解析することにより、タンパク質の構造および機能の維持と適合し得る可能性のあるアミノ酸置換のサブセットを同定する。この段階は、ＰＤＡ（登録商標）計算または当業者による視覚的精査を含む幾つかの方法で遂行され得る。各位置で考慮すべく選択されたアミノ酸の可能な組合せを全て含む配列が生成され得る。マトリックス法計算を用いることにより、各配列の免疫原性が測定され得る。結果を解析することにより、免疫原性が著しく低減化された配列が同定され得る。追加的ＰＤＡ（登録商標）計算法を遂行することにより、免疫原性が最小限の配列のどれがタンパク質の構造および機能の維持と適合し得るかが決定され得る。
【００７５】
別の好ましい実施態様では、ペプチド結合傾向マトリックスから誘導された偽エネルギータームを、ＰＤＡ（登録商標）技術計算法へ直接組込む。この方法では、単一コンピューター操作で活性かつ低免疫原性である配列を選択することが可能である。
【００７６】
免疫原性低減化戦略の組合せ
好ましい実施態様では、複数の方法を用いることにより、望ましい機能的および免疫学的特性をもつ変異型タンパク質が生成される。例えば、置換マトリックスは、ＰＤＡ（登録商標）技術計算と組み合わせて使用され得る。免疫原性低減化戦略には、２００４年１２月３日出願、ＵＳＳＮ１１／００４５９０号に記載されたものがあるが（出典明示により援用する）、これに限定されるわけではない。
【００７７】
好ましい実施態様では、１つまたはそれ以上のクラスＩＩ ＭＨＣ対立遺伝子についての結合親和力が低減化された変異型タンパク質にさらに遺伝子操作を加えることにより、溶解度を改善する。タンパク質凝集は好ましくない免疫応答の一因であり得るため、タンパク質溶解度の増加により免疫原性が低減化され得る。
【００７８】
さらなる好ましい実施態様では、１つまたはそれ以上のクラスＩＩ ＭＨＣ対立遺伝子についての結合親和力が低減化された変異型タンパク質に、ＰＥＧまたは別の分子で誘導体化することによりさらに修飾を加える。当分野では周知の通り、ＰＥＧは、抗体結合を立体化学的に妨害するかまたはタンパク質溶解度を改善することにより、免疫原性を低下させ得る。特に好ましい実施態様では、合理的ポリエチレングリコール付加方法を使用する（２００４年９月３０日出願、ＵＳＳＮ１０／９５６３５２、出典明示により援用する）。好ましい実施態様では、ＰＤＡ（登録商標）技術およびマトリックス法計算を用いることにより、興味の対象であるタンパク質から複数のＭＨＣ結合アグレトープが除去される。
【００７９】
変異型の生成
本発明の変異型アディポネクチンタンパク質およびそれらをコード化する核酸は、当分野で周知の若干の方法を用いて製造され得る。
【００８０】
好ましい実施態様では、アディポネクチン変異型をコード化する核酸は、全遺伝子合成により、または親アディポネクチンタンパク質をコード化する核酸の部位特異的突然変異導入により製造される。鋳型指定ライゲーション、循環的ＰＣＲ、カセット突然変異導入、部位特異的突然変異導入または当分野でよく知られている他の技術を含む方法が使用され得る（例えばStrizhov et al. PNAS ９３：１５０１２−１５０１７（１９９６）、Prodromou および Perl、Prot. Eng. ５：８２７−８２９（１９９２）、Jayaraman および Puccini、Biotechniques １２：３９２−３９８（１９９２）、および Chalmers et al.、Biotechniques ３０：２４９−２５２（２００１）参照、全て、出典明示により援用する）。
【００８１】
好ましい実施態様では、アディポネクチン変異型を適切な発現ベクターへクローニングし、エシェリキア・コリ（E. coli）で発現させる（McDonald, J. R.、Ko, C.、Mismer, D.、Smith, D. J.および Collins, F. Biochim. Biophys. Acta １０９０：７０−８０（１９９１）参照、出典明示により援用する）。別の好ましい実施態様では、アディポネクチン変異型を哺乳類細胞、酵母、バキュロウイルスまたはインビトロ発現系で発現させる。若干の発現系およびそれらの使用方法は、当分野ではよく知られている（Current Protocols in Molecular Biology、Wiley & Sons、および Molecular Cloning‐A Laboratory Manual 第３版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク（２００１）参照、出典明示により援用する）。コドン、適切な発現ベクターおよび適切な宿主細胞の選択は、若干の因子により変化し、必要に応じて容易に最適化され得る。
【００８２】
好ましい実施態様では、アディポネクチン変異型を発現後に精製または単離する。標準精製方法には、電気泳動、分子、免疫学的およびクロマトグラフィー技術、例えばイオン交換、疎水性、アフィニティー、および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー、およびクロマトフォーカシングがある。例えば、アディポネクチン変異型は、標準抗組換えタンパク質抗体カラムを用いて精製され得る。タンパク質濃縮と共に、限外濾過およびダイアフィルトレーション技術も有用である。適切な精製技術における一般的ガイダンスについては、Scopes, R.、Protein Purification、Springer-Verlag、ニューヨーク、第３版（１９９４）参照、これについては出典明示により援用する。必要な精製の程度は所望の用途により異なり、場合によっては、精製が不必要なこともある。
【００８３】
アディポネクチンの発現および精製に関するプロトコールは、細菌（Ouchi et al.、Circulation １００：２４７３−２４７６（１９９９）、Fruebis et al. Proc. Natl. Acad Sci USA 、９８：２００５−２０１０（２００１）、Fruebis et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA  ９８：２００５−２０１０（２００１）、Yamauchi et al. Nat Med ７：９４１−９４６（２００１）、Yamauchi et al. Nat. Med. ７：９４１−９４６（２００１）、Hu et al. Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao（Shanghai）３５：１０２３−１０２８（２００３）参照、全て出典明示により援用する）、および哺乳類系（Berg et al. Nat. Med. ７：９４７−９５３（２００１）、Tsao et al.、J. Biol. Chem. ２７７：２９３５９−２９３６２（２００２）参照、全て出典明示により援用する）について開示されている。
【００８４】
変異型の活性の検定
本発明の変異型アディポネクチンタンパク質は、限定されるわけではないが、本明細書に記載されているものを含む多数の方法のいずれかを用いて活性について試験され得る。アディポネクチン濃度は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定され得る（例えば、Arita et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. ２５７：７９−８３（１９９９）参照、出典明示により援用する）。アテローム動脈硬化プラーク形成に関連したプロセスについて検定するのに使用されるインビトロ方法には、内皮への単球接着、骨髄性分化、マクロファージサイトカイン生産および食作用（Ouchi et al. Circulation １００：２４７３−２４７６（１９９９）、出典明示により援用する）、培養マクロファージにおける脂質蓄積（Ouchi et al. Circulation １０３：１０５７−１０６３（２００１）、出典明示により援用する）、およびヒト大動脈平滑筋細胞の増殖および移動（Arita et al. Circulation １０５：２８９３−２８９８（２００２）、Waki et al. J. Biol. Chem. ２７８：４０３５２−４０３６３（２００３）参照、出典明示により援用する）がある。インシュリン感受性のインビトロ測定方法には、一次肝細胞におけるグルコース産生のインシュリン介在抑制の検定が含まれる（Berg et al. Nat. Med. ７：９４７−９５３（２００１）参照、出典明示により援用する）。インシュリン感受性および脂質代謝についてのインビボ試験は、高脂肪／ショ糖食餌摂取の野生型マウス、ｏｂ／ｏｂ（肥満・糖尿病性）、ＮＯＤ（非肥満・糖尿病性）またはストレプトゾトシン処置マウスを含む様々なマウスモデルを用いて遂行された（Berg et al. Nat. Med. ７：９４７−９５３（２００１）、Fruebis et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９８：２００５−２０１０（２００１）、Yamauchi et al. Nat. Med. ７：９４１−９４６（２００１）参照、これらは全て出典明示により援用する）。測定結果は、体重喪失、血漿グルコース、遊離脂肪酸およびトリグリセリドレベル、および肝臓および筋肉におけるトリグリセリド含有率を含む。
【００８５】
変異型の免疫原性の測定
好ましい実施態様では、アディポネクチン変異型の免疫原性を実験的に測定することにより、変異型が親タンパク質に対して免疫原性が低減化または排除されていることを確認する。
【００８６】
好ましい実施態様では、エクスビボＴ細胞活性化検定法を用いることにより、免疫原性を実験的に定量する。この方法では、抗原提示細胞および適合したドナーからのナイーブＴ細胞を、興味の対象であるペプチドまたは全タンパク質で１回または数回攻撃する。次いで、Ｔ細胞活性化は、若干の方法を用いて、例えばサイトカインの産生をモニターするかまたはトリチウム化チミジンの取込を測定することにより検出され得る。最も好ましい実施態様では、エリスポット検定法を用いてガンマインターフェロン産生をモニターする（Schmittel et al. J. Immunol. Meth. ２４：１７−２４（２０００）参照、出典明示により援用する）。他の適切なＴ細胞検定法には、Meidenbauer et al.、Prostate ４３、８８−１００（２０００）；Schultes, B. C. および Whiteside, T. L.、J. Immunol. Methods ２７９、１−１５（２００３）；および Stickler et al.、J. Immunotherapy、２３、６５４−６６０（２０００）（これらについては、全て出典明示により援用する）に開示されているものがある。
【００８７】
好ましい実施態様では、上記Ｔ細胞活性化検定法に使用されるＰＢＭＣドナーは、アディポネクチン応答疾患についての処置を必要とする患者に共通しているクラスＩＩ ＭＨＣ対立遺伝子を含む。例えば、ほとんどの疾患および障害について、集団において優勢である対立遺伝子の全てを含むドナーを試験するのが望ましい。しかしながら、特異的ＭＨＣ対立遺伝子と関連した疾患または障害については、アディポネクチン応答疾患に対する感受性を付与する対立遺伝子についてフォーカススクリーニングするのがより適切であり得る。
【００８８】
好ましい実施態様では、ＰＢＭＣドナーまたは野生型または変異型アディポネクチンに対して免疫応答を生じる患者のＭＨＣハプロタイプを、応答を発しない患者のＭＨＣハプロタイプと比較する。このデータは、前臨床および臨床試験を実施する際の指針として使用され、また特にアディポネクチン治療薬に対して有利にまたは不利に応答すると思われる患者を同定する際の助けとなり得る。
【００８９】
別の好ましい実施態様では、トランスジェニックマウス系で免疫原性を測定する。例えば、ヒトクラスＩＩ ＭＨＣ分子を完全にまたは部分的に発現するマウスが使用され得る。
【００９０】
別の実施態様では、げっ歯動物および霊長類を含む１種またはそれ以上の動物にアディポネクチン変異型を投与し、抗体形成についてモニターすることにより、免疫原性を試験する。ヒト以外の霊長類におけるＭＨＣ分子の配列およびペプチド結合特異性は、ヒトの配列およびペプチド結合特異性と非常に類似したものであり得るため、特定されたＭＨＣハプロタイプをもつヒト以外の霊長類は特に有用であり得る。同様に、ヒトＭＨＣペプチド結合ドメインを発現する遺伝子操作が加えられたマウスモデルが使用され得る（例えば、Sonderstrup et al. Immunol. Rev. １７２：３３５−３４３（１９９９）および Forsthuber et al. J. Immunol. １６７：１１９−１２５（２００１）参照、全て出典明示により援用する）。
【００９１】
製剤化および患者への投与
本発明の変異型Ｃ１ｑ ＳＦメンバータンパク質および核酸は、一旦製造されると、多数の適用法で使用され得る。好ましい実施態様では、変異型Ｃ１ｑ ＳＦメンバータンパク質を患者に投与することにより、Ｃ１ｑ ＳＦメンバー応答疾患を処置する。
【００９２】
本発明の医薬組成物は、患者への投与に適切な形態で変異型Ｃ１ｑ ＳＦメンバータンパク質を含む。好ましい実施態様では、医薬組成物は、例えば医薬上許容される塩として存在する水溶性形態であり、この場合、前記塩は酸および塩基付加塩の両方を包含するものとする。「医薬上許容される酸付加塩」は、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など、および有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、蓚酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などにより形成された、遊離塩基の生物学的有効性を保持しており、生物学的または他の点で有害なものではない塩類をいう。「医薬上許容される塩基付加塩」は、無機塩基から誘導されたもの、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム塩などを包含する。特に好ましいのは、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウムおよびマグネシウム塩である。医薬上許容される有機非毒性塩基から誘導される塩には、第１級、第２級および第３級アミン、天然置換アミンを含む置換アミン、環状アミンおよび塩基性イオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミンおよびエタノールアミンの塩が含まれる。
【００９３】
医薬組成物はまた、以下のものの１つまたはそれ以上を含み得る：担体タンパク質、例えば血清アルブミン、緩衝液、例えばＮａＯＡｃ、増量剤、例えば微晶性セルロース、乳糖、コーンスターチおよび他の澱粉、結合剤、甘味料および他の調味料、着色剤、およびポリエチレングリコール。添加物は当分野ではよく知られており、様々な製剤で使用される。
【００９４】
医薬組成物の組合せも投与され得る。さらに、組成物は、他の治療薬と組み合わせて投与され得る。
【００９５】
好ましくは滅菌水溶液形態での本発明変異型Ｃ１ｑ ＳＦメンバータンパク質の投与は、限定されるわけではないが、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、経皮、腹腔内、筋肉内、非経口、肺内、膣、直腸または眼内経路を含む様々な方法で実施され得る。場合によっては、例えば、変異型Ｃ１ｑ ＳＦメンバータンパク質は、溶液またはスプレーとして直接適用され得る。導入方法により、医薬組成物は、様々な方法で処方され得る。好ましい実施態様では、治療有効量の変異型Ｃ１ｑ ＳＦメンバータンパク質を、処置を必要とする患者に投与する。本明細書における「治療有効量」とは、投与目的である効果を生み出す用量を意味する。正確な用量は、処置の目的によって異なり、公知技術を用いて当業者により確認され得る。好ましい実施態様では、製剤中における治療活性変異型Ｃ１ｑ ＳＦメンバータンパク質の濃度は、約０.１〜約１００重量％の範囲で変動し得る。別の好ましい実施態様では、変異型Ｃ１ｑ ＳＦメンバータンパク質の濃度は、０.００３〜１.０モルの範囲であり、体重１キログラム当たり０.０３から０.０５、０.１、０.２および０.３ミリモルの用量が好ましい。当分野では周知の通り、変異型Ｃ１ｑ ＳＦメンバータンパク質分解、全身対局所送達、および新たなプロテアーゼ合成の速度についての調整、並びに年齢、体重、全般的健康状態、性別、食餌、投与時間、薬剤相互作用および状態の重症度の把握が必要であり得、これらは当業者であれば常用的実験により確認できるはずである。
【００９６】
別の実施態様では、変異型Ｃ１ｑ ＳＦメンバー核酸が投与され得る。すなわち、「遺伝子治療」方法が使用され得る。この実施態様では、変異型Ｃ１ｑ ＳＦメンバー核酸を患者の細胞で導入することにより、治療有効量の変異型Ｃ１ｑ ＳＦメンバータンパク質のインビボ合成を達成する。変異型Ｃ１ｑ ＳＦメンバー核酸は、限定されるわけではないが、リポソームでのトランスフェクション、ウイルス（典型的にはレトロウイルス）ベクター、およびウイルスコートタンパク質−リポソーム介在トランスフェクションを含む若干の技術を用いて導入され得る（Dzau et al.、Trends in Biotechnology １１：２０５−２１０（１９９３）、出典明示により援用する）。状況によっては、核酸供給源に、標的細胞を標的化する作用物質、例えば細胞表面膜タンパク質または標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上の受容体のリガンドなどを提供することが望ましい場合もある。リポソームを使用する場合、エンドサイトーシスに関連した細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質が、標的化および／または取込みを容易にするのに使用され得、例えば特定細胞タイプに向かうキャプシドタンパク質またはそのフラグメント、循環して内在化されるタンパク質の抗体、細胞内局在を標的化し、細胞内半減期を向上させるタンパク質がある。受容体介在性エンドサイトーシスの技術は、例えばWu et al.、J. Biol. Chem. ２６２：４４２９−４４３２（１９８７）、および Wagner et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. ８７：３４１０−３４１４（１９９０）（これらについては、出典明示により援用する）により報告されている。遺伝子マーキングおよび遺伝子治療プロトコールの概説については、Anderson et al.、Science ２５６：８０８−８１３（１９９２）参照、これについては出典明示により援用する。
【実施例】
【００９７】
実施例１．Ｃ１ｑ ＳＦメンバーにおけるＭＨＣ結合アグレトープの同定
親Ｃ１ｑ ＳＦメンバー配列：アディポネクチン（配列番号１）およびＣＴＲＰ１（配列番号２）を用いて、マトリックス法計算（Sturniolo、前出）を実施した。
【００９８】
各々ＵＳ集団の少なくとも１％に存在する、以下の対立遺伝子についてアグレトープを予測した：ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０１０２、ＤＲＢ１＊０３０１、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０４０２、ＤＲＢ１＊０４０４、ＤＲＢ１＊０４０５、ＤＲＢ１＊０４０８、ＤＲＢ１＊０７０１、ＤＲＢ１＊０８０１、ＤＲＢ１＊１１０１、ＤＲＢ１＊１１０２、ＤＲＢ１＊１１０４、ＤＲＢ１＊１３０１、ＤＲＢ１＊１３０２、ＤＲＢ１＊１５０１、およびＤＲＢ１＊１５０２。
【００９９】
表２．Ｃ１ｑ ＳＦメンバーにおける予測ＭＨＣ結合アグレトープ。Ｉスコア、対立遺伝子の数、および１％、３％および５％閾値での集団ヒットのパーセントが示されている。特に好ましいアグレトープは、１％閾値を用いて、集団の少なくとも１０％に影響することが予測される。
【表２】
2008507591.tif 000004
【０１００】
【表３】
2008507591.tif 000005
【０１０１】
表３．Ｃ１ｑ ＳＦメンバーにおける予測ＭＨＣ結合アグレトープ。１％、３％、５％および１０％カットオフで各対立遺伝子に結合すると予測されるＤＲＢ１対立遺伝子には、それぞれ「１」、「３」、「５」または「１０」が付されている。
【表４】
2008507591.tif 000006
【０１０２】
【表５】
2008507591.tif 000007
【０１０３】
実施例２．Ｃ１ｑ ＳＦメンバーにおけるＭＨＣ結合アグレトープに適切な低免疫原性配列の同定。
【０１０４】
１％閾値を用いて、ＵＳ集団の少なくとも１０％に存在する対立遺伝子に結合すると予測されるＭＨＣ結合アグレトープを解析することにより、適切な低免疫原性変異型を同定した。各アグレトープでは、以下の必要条件でもって、アミノ酸置換の可能な組合せを全て考えた：（１）各置換は、ＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリックスにおいて０またはそれより大きいスコアを有する、（２）各置換は、考えられるＭＨＣ対立遺伝子の少なくとも１個との低下した結合性をもたらし得る、および（３）一旦十分な置換が完全に組込まれることにより、１％閾値での対立遺伝子ヒットが全て阻止されると、その配列に追加的置換は一切付加されない。
【０１０５】
オールタネート配列を、免疫原性および構造適合性について評点した。好ましいオールタネート配列は、１％閾値を用いて上記で試験された１７ＭＨＣ対立遺伝子のいずれかと結合するとは予測されず、野生型スコアの少なくとも８０％である合計ＢＬＯＳＵＭ６２スコアを有する配列であると定義された。
【０１０６】
表４．Ｃ１ｑ ＳＦメンバーの適切な低免疫原性変異型。Ｂ（ｗｔ）は、野生型９量体のＢＬＯＳＵＭ６２スコアであり、Ｉ（ａｌｔ）は、１％閾値でオールタネート９量体と結合すると予測される１個またはそれ以上のＭＨＣ対立遺伝子を含むＵＳ集団のパーセントであって、表４に列挙されている変異型については全て０であり、Ｂ（ａｌｔ）は、オールタネート９量体のＢＬＯＳＵＭ６２スコアである。
【０１０７】
表４．Ａ．ｉ：アディポネクチンアグレトープＡ１（残基１０９−１１７；ＹＶＹＲＳＡＦＳＶ）の適切な低免疫原性変異型；Ｂ（ｗｔ）＝４５。
【表６】
2008507591.tif 000008
【０１０８】
表４．Ａ．ii：アディポネクチンアグレトープＡ２（残基１１１−１１９；ＹＲＳＡＦＳＶＧＬ）の適切な低免疫原性変異型；Ｂ（ｗｔ）＝４４。
【表７】
2008507591.tif 000009
【表８】
2008507591.tif 000010
【０１０９】
【表９】
2008507591.tif 000011
【０１１０】
表４．Ａ．iii：アディポネクチンアグレトープＡ３（残基１２２−１３０；ＹＶＴＩＰＮＭＰＩ）の適切な低免疫原性変異型；Ｂ（ｗｔ）＝４９。
【表１０】
2008507591.tif 000012
【０１１１】
【表１１】
2008507591.tif 000013
【表１２】
2008507591.tif 000014
【０１１２】
表４．Ａ．iv：アディポネクチンアグレトープＡ９（残基１６６−１７４；ＶＹＭＫＤＶＫＶＳ）の適切な低免疫原性変異型；Ｂ（ｗｔ）＝４４。
【表１３】
2008507591.tif 000015
【表１４】
2008507591.tif 000016
【０１１３】
【表１５】
2008507591.tif 000017
【表１６】
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【０１１４】
【表１７】
2008507591.tif 000019
【０１１５】
表４．Ｂ．１.ＣＴＲＰ１アグレトープＢ３（残基１７２−１８０；ＶＮＬＹＤＨＦＮＭ）の適切な低免疫原性変異型；Ｂ（ｗｔ）＝５２。
【表１８】
2008507591.tif 000020
【０１１６】
表４．Ｂ．ii：ＣＴＲＰ１アグレトープＢ１４（残基２１８−２２６；ＶＶＩＬＦＡＱＶＧ）の適切な低免疫原性変異型；Ｂ（ｗｔ）＝４１。
【表１９】
2008507591.tif 000021
【０１１７】
【表２０】
2008507591.tif 000022
【０１１８】
表４．Ｂ．iii：ＣＴＲＰ１アグレトープＢ１６（残基２３０−２３８；ＩＭＱＳＱＳＬＭＬ）の適切な低免疫原性変異型；Ｂ（ｗｔ）＝４０。
【表２１】
2008507591.tif 000023
【０１１９】
表４．Ｂ．iv．ＣＴＲＰ１アグレトープＢ１７（残基２４７−２５５；ＷＶＲＬＹＫＧＥＲ）の適切な低免疫原性変異型；Ｂ（ｗｔ）＝５２。
【表２２】
2008507591.tif 000024
【０１２０】
実施例３．ＰＤＡ（登録商標）技術により測定されたＭＨＣ結合アグレトープについての適切な低免疫原性配列の同定。
【０１２１】
表５．興味の対象であるアグレトープにおける各位置を解析することにより、タンパク質の構造および機能の維持と両立できる可能性のあるアミノ酸置換のサブセットを同定した。ＰＤＡ（登録商標）技術計算を、各９量体アグレトープの各位置について実施し、各位置について適合し得るアミノ酸を記憶させた。これらの計算では、興味の対象である位置の５オングストローム以内にある側鎖については、アミノ酸同一性ではなく、立体配座の変化を許した。次いで、変異型アグレトープを、免疫原性について解析した。野生型９量体アグレトープについてのＰＤＡ（登録商標）エネルギーおよびＩスコア値を、変異型と比較し、低い予測免疫原性および野生型の５.０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以内のＰＤＡ（登録商標）エネルギーをもつ変異型配列のサブセットを示した。下表において、Ｅ（ＰＤＡ）は、野生型に対して比較されたＰＤＡ（登録商標）技術計算を用いて測定されたエネルギーである。Ｉスコア：アンカーは、アグレトープについてのＩスコアであり、Ｉスコア：オーバーラップは、オーバーラップアグレトープの全てに関するＩスコアの合計である。
【０１２２】
表５Ａ．ｉ．アディポネクチンアグレトープＡ１の低免疫原性変異型
【表２３】
2008507591.tif 000025
【表２４】
2008507591.tif 000026
【０１２３】
【表２５】
2008507591.tif 000027
【０１２４】
表５Ａ．ii．アディポネクチンアグレトープＡ２の低免疫原性変異型
【表２６】
2008507591.tif 000028
【０１２５】
表５Ａ．iii．アディポネクチンアグレトープＡ３の低免疫原性変異型
【表２７】
2008507591.tif 000029
【０１２６】
【表２８】
2008507591.tif 000030
【０１２７】
表５Ａ．iv．アディポネクチンアグレトープＡ９の低免疫原性変異型
【表２９】
2008507591.tif 000031
【０１２８】
表５Ｂ．i．ＣＴＲＰ１アグレトープＢ３の低免疫原性変異型
【表３０】
2008507591.tif 000032
【表３１】
2008507591.tif 000033
【０１２９】
【表３２】
2008507591.tif 000034
【０１３０】
表５Ｂ．ii．ＣＴＲＰ１アグレトープＢ１４の低免疫原性変異型
【表３３】
2008507591.tif 000035
【０１３１】
【表３４】
2008507591.tif 000036
【０１３２】
表５Ｂ．iii．ＣＴＲＰ１アグレトープＢ１６の低免疫原性変異型
【表３５】
2008507591.tif 000037
【表３６】
2008507591.tif 000038
【０１３３】
表５Ｂ．iv．ＣＴＲＰ１アグレトープＢ１７の低免疫原性変異型
【表３７】
2008507591.tif 000039
【０１３４】
【表３８】
2008507591.tif 000040
【０１３５】
以上、本発明について説明したが、当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更および追加的実施態様が為されることは容易に理解できるはずである。特許、特許出願（仮出願、実用新案およびＰＣＴ）および出版物を含め、本明細書で引用されている参考文献は全て、出典明示により援用する。
【０１３６】
プロテインデータバンク構造の試験により測定された、Ｃ１ｑ スーパーファミリーメンバーの順序通りの細胞外ドメイン（下線部）について解析を実施した。
【０１３７】
アディポネクチン（配列番号１）
MLLLGAVLLLLALPGHDQETTTQGPGVLLPLPKGACTGWMAGIPGHPGHNGAPGRDGRDGTPGEKGEKGDPGLIGPKGDIGETGVPGAEGPRGFPGIQGRKGEPGEGAYVYRSAFSVGLETYVTIPNMPIRFTKIFYNQQNHYDGSTGKFHCNIPGLYYFAYHITVYMKDVKVSLFKKDKAMLFTYDQYQENNVDQASGSVLLHLEVGDQVWLQVYGEGERNGLYADNDNDSTFTGFLLYHDTN
【０１３８】
ＣＴＲＰ１（配列番号２）
MGSRGQGLLLAYCLLLAFASGLVLSRVPHVQGEQQEWEGTEELPSPPDHAERAEEQHEKYRPSQDQGLPASRCLRCCDPGTSMYPATAVPQINITILKGEKGDRGDRGLQGKYGKTGSAGARGHTGPKGQKGSMGAPGERCKSHYAAFSVGRKKPMHSNHYYQTVIFDTEFVNLYDHFNMFTGKFYCYVPGLYFFSLNVHTWNQKETYLHIMKNEEEVVILFAQVGDRSIMQSQSLMLELREQDQVWVRLYKGERENAIFSEELDTYITFSGYLVKHATEA
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】低免疫原性Ｃ１ｑ ＳＦメンバー誘導体の遺伝子工学的製法を示す。
【図２】ＩＶＶ技術によるＣ１ｑ ＳＦメンバーペプチドまたはタンパク質の免疫原性のインビトロ試験方法を表す図を示す。
【図１】
2008507591.tif 000041
【図２】
2008507591.tif 000042
【手続補正書】
【提出日】平成19年1月19日(2007.1.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008507591000001.app
【国際調査報告】
2008507591.tif 000043
2008507591.tif 000044
2008507591.tif 000045