(57)【要約】【課題】  架橋多糖類クロマトグラフィーマトリックスの製造方法の提供。【解決手段】  本発明の架橋多糖類クロマトグラフィーマトリックスの製造方法は、水酸基の一部が求核攻撃に非感受性の基で置換されたゲル化性多糖類の水溶液を製造し、置換多糖類溶液の実質的に球形の液滴を製造し、置換多糖類溶液のゲルを形成し、ゲルを架橋することを含む。本発明はさらに、上述の通り製造したマトリックスを充填したクロマトグラフィーカラム、並びにそのタンパク質精製などへの使用に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋多糖類系クロマトグラフィーマトリックスの製造方法であって、
（ａ）水酸基の少なくとも一部が求核攻撃に非感受性の基で置換された１種以上のゲル化性多糖類の水溶液を準備する工程、
（ｂ）置換多糖類溶液の実質的に球形の液滴を準備する工程、
（ｃ）置換多糖類溶液のゲルを形成する工程、及び、
（ｄ）ゲルを架橋する工程
を含んでなる方法。
【請求項２】
架橋多糖類系クロマトグラフィーマトリックスの製造方法であって、
（ａ）１種以上のゲル化性多糖類の水溶液を準備し、水溶液中の多糖類の水酸基の少なくとも一部を求核攻撃に非感受性の基で置換する工程、
（ｂ）置換多糖類溶液の実質的に球形の液滴を準備する工程、
（ｃ）置換多糖類溶液のゲルを形成する工程、及び、
（ｄ）ゲルを架橋する工程
を含んでなる方法。
【請求項３】
求核攻撃に非感受性の基がエーテル、エステル、アミド及びキサンテートからなる群から選択される、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
架橋多糖類系クロマトグラフィーマトリックスの製造方法であって、
（ａ）水酸基の一部がアリル化された１種以上のゲル化性多糖類の水溶液を準備する工程、
（ｂ）置換多糖類溶液の実質的に球形の液滴を準備する工程、
（ｃ）置換多糖類溶液のゲルを形成する工程、及び、
（ｄ）ゲルを架橋する工程であって、その際に工程（ａ）のアリル基が関与しない工程
を含んでなる方法。
【請求項５】
工程（ａ）のアリル基を、工程（ｃ）の前に転化又は除去する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ゲル化性多糖類が、アリル基に加えて、求核攻撃に非感受性の基で置換された水酸基を含む、請求項４又は請求項５記載の方法。
【請求項７】
請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の工程を含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
溶解した置換多糖類を有機溶媒中で乳化する、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
ゲル化の前に、ポロゲンを添加する、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
多糖類を水溶液が加熱によって準備され、ゲルが温度を下げることによって形成される、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
多糖類がアガロースである、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
多糖類のゲル化温度が対応する非置換多糖類のゲル化温度よりも１℃以上低い、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
架橋工程が架橋剤を添加することを含む、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
架橋後に求核攻撃に非感受性の基を開裂する、請求項１乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
求核攻撃に非感受性の基が加水分解によって開裂するエステル基である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
架橋後に、ゲル化した多糖類の水酸基にクロマトグラフィーリガンドを結合させる後工程を含む、請求項１乃至請求項１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
ゲル化した多糖類のアリル基にクロマトグラフィーリガンドを結合させる後工程を含む、請求項１乃至請求項１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
実質的に無菌の架橋多糖類系クロマトグラフィーマトリックスの製造方法であって、
（ａ）１種以上のゲル化性多糖類の水溶液を準備する工程、
（ｂ）置換多糖類溶液の実質的に球形の液滴を準備する工程、
（ｃ）置換多糖類溶液のゲルを形成する工程、
（ｄ）ゲルを架橋する工程、
（ｅ）架橋ゲルをクロマトグラフィーカラムに充填する工程、及び、
（ｆ）充填カラムを放射線、蒸気又はオートクレーブで滅菌する工程
を含んでなる方法。
【請求項１９】
請求項１乃至請求項１８のいずれか１項記載の方法に続いて、得られた架橋クロマトグラフィーマトリックスをクロマトグラフィーカラムに充填した後、滅菌することを含んでなる、実質的に無菌のクロマトグラフィーカラムを得る方法。
【請求項２０】
工程（ｂ）を、置換多糖類溶液の多糖類メンブランを準備する工程で置き換える、請求項１乃至請求項１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
請求項２０記載の方法に続いて、メンブランを滅菌することを含む、実質的に無菌の多糖類メンブランを形成する方法。
【請求項２２】
請求項１乃至請求項２１のいずれか１項記載の方法で製造された、実質的に球形の粒子からなる多孔質架橋多糖類系クロマトグラフィーマトリックス。
【請求項２３】
前記粒子における、１１０ｋＤのデキストランのＫａｖが約０．５以上である、請求項２２記載のクロマトグラフィーマトリックス。
【請求項２４】
請求項１乃至請求項１８のいずれか１項又は請求項２２又は請求項２３記載のクロマトグラフィーマトリックスを充填してなるクロマトグラフィーカラム。
【請求項２５】
目標化合物を液体から精製、単離又は除去するための、請求項２２又は請求項２３記載のクロマトグラフィーマトリックスの使用。
【請求項２６】
１１０ｋＤのデキストランに対して約０．５以上のＫａｖを示す実質的に球形の粒子からなるマトリックスに、約３００ｃｍ／ｈ以上の流速で液体を流す、請求項２５記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子のような目標化合物の分離及び精製に関するものであり、具体的には、クロマトグラフィーマトリックス及びその新規製造方法に関する。本発明は、液体クロマトグラフィーにおけるかかるマトリックスの使用及びマトリックスを充填したクロマトグラフィーカラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジー分野での近年の進歩から、タンパク質のような生物学的及び生化学的物質の一段と迅速で正確な回収、精製・解析技術が求められている。かかる技術としてよく使用されているのは電気泳動とクロマトグラフィーである。
【０００３】
電気泳動では、電場中での泳動によって荷電粒子を分離する。具体的には、試料をアガロース又はポリアクリルアミドゲルスラブのような軟らかい固体支持媒体上に乗せ、正に荷電した陽極と負に荷電した陰極の二つの電極間に配置する。電流のスイッチを入れると、試料の各成分が、その正味電荷と分子量によって決まる特有の速度で泳動する。うまく機能する電気泳動ゲルの主な特性の一つはその融点であり、泳動した目標化合物を個々のゲルスポットから抽出する能力に影響を与える。そのため、通常は低融点ゲルが好ましい。未変性アガロースが電気泳動用のゲルとして常用されているが、いくつかの問題点が指摘されている。例えば、未変性アガロースの粗い細孔構造は、大きな高分子の分離には優れているものの、小さな分子については低分子量のアガロースを調製しなければならない。これは一般にゲルのアガロース含量を増加させることによってなされるが、それに伴って溶液の粘性が高くなり、ゲルを流し込むのが難しくなる。上記その他の問題を解決するため、修飾アガロースが電気泳動用ゲルとして提案されている。
【０００４】
電気泳動については、電気泳動又は拡散相互作用のみならず増粘剤としても有用なアガロース又は寒天化合物に関する米国特許第３９５６２７３号（Ｇｕｉｓｅｌｅｙ）で論じられている。上記化合物は、未変性材料に比べてゲル化温度及び融点を低下させるとともに透明性を高めるため、アルキル及びアルケニル基で修飾される。具体的には、寒天又はアガロースをまず強アルカリ中に溶解した後、適当な試薬を添加して修飾する。エピクロロヒドリンのような二官能性試薬を使用してもよいが、架橋が防止される条件下でしか使用できない。
【０００５】
電気泳動については、流し込みに有効な粘度に下げるのに十分な程度まで誘導体化し解重合したアガロースのような多糖類ヒドロゲルを含む電気泳動分離ゲル組成物に関する米国特許第５１４３６４６号（Ｎｏｃｈｕｍｓｏｎら）でも論じられている。この米国特許に開示された組成物はいかなる架橋剤も重合剤も必要としない。
【０００６】
さらに、米国特許第５５４１２５５号（Ｋｏｚｕｌｉｃ）は、電気泳動用ゲルに関するものであり、具体的には架橋線状多糖類に関する。このゲルは、多糖類を水のような溶媒に溶解し、荷電しておらず水と接触しても荷電しない架橋剤を添加し、混合物を静穏状態でインキュベートして、多糖類と架橋剤を反応させるとともに生成物をゲル化してスラブとすることによって得られる。米国特許第５５４１２５５号によれば、従来技術の電気泳動ゲルは水によって再溶解できるが、米国特許第５５４１２５５号の発明は水に不溶性のゲルを提供する。こうした特性は、架橋とゲル化を同時に行うとともに、架橋剤／多糖類比を高めることによって得られる。
【０００７】
クロマトグラフィーでは、２つの互いに非混和性の相を接触させる。具体的には、目標化合物を移動相に導入して、固定相と接触させる。目標化合物は、移動相によって系内を運搬される際に固定相と移動相の間で一連の相互作用を受ける。相互作用には、試料中の成分の理化学的性質の差が利用される。液体クロマトグラフィーでは、適当な緩衝液と適宜混合される液体試料が移動相をなし、分離マトリックスとしても知られる固定相と接触する。通常、マトリックスは担体にリガンドを結合したものからなり、リガンドは目標と相互作用できる基である。
【０００８】
分離マトリックスは、一般に、シリカのような無機材料又は合成若しくは天然ポリマーのような有機材料からなる担体をベースとする。スチレンとジビニルベンゼンからなるもののような合成ポリマーは、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）及び逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）のようにある程度の疎水性を示す担体に用いられることが多い。さらに、合成ポリマーはその流動特性の点で天然ポリマーよりも好ましいことがあり、一般に使用される天然ポリマーの担体よりも剛性及び耐圧性に優れることが多いので有利なことがある。
【０００９】
天然ポリマーは通常はアガロースのような多糖類であり、何十年もの間分離マトリックスの担体として用いられてきた。水酸基が存在するため天然ポリマーの表面は通常は親水性であり、基本的にタンパク質との非特異的相互作用を生じない。天然ポリマーのもう一つの利点は、ヒト体内用の医薬又は診断用分子の精製において特に重要であるが、それらが無毒であることである。アガロースは高温で水に溶解させることができ、次いである温度（ゲル化点）に冷却すると多孔質ゲルを形成する。ゲルは加熱するとある温度（融点）で再び溶解するが、その温度は通常はゲル化温度よりもはるかに高い。ゲル化では、多糖類ポリマーのヘリックス−ヘリックス凝集が起こり、しばしば物理的架橋と呼ばれる。目標の質量輸送速度及び目標と相互作用する面積を最適化するため、担体の多孔度を高めることが望まれることが多いが、これはアガロース濃度を変えることで達成される。ただし、考慮すべきもう一つの基本パラメーターは担体の流動特性である。マトリックスは一般に粒子（球形又は非球形）の充填ベッドの形態で使用される。ベッドに移動相を流す際、ベッドの背圧は主に粒子間の隙間の流路によって制御される。低い流速では、粒子は非圧縮性とみなせるので、背圧は流速と共に直線的に増加し、その傾きは粒径に依存する。流速を高めると、静水圧下で粒子が変形し始め、隙間の流路径が減少して背圧が急激に増大する。マトリックスの剛性に応じて、ある流速でベッドが崩壊し、クロマトグラフィーシステムで自動的にスイッチが切られない限り、背圧が限りなく増加する。アガロースの剛性及び流動特性を向上させるため、アガロースを架橋することが多い。かかる架橋は水酸基間で起こり、エピクロロヒドリンなどで達成できる。
【００１０】
米国特許第４９７３６８３号（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ）は、多孔質多糖類ゲルの架橋に関するものであり、具体的には、多孔質多糖類ゲルの非特異的相互作用を最小限に抑制しながら剛性を高める方法に関する。この方法は、アガロースゲルと、ハロゲン基又はエポキシド基のような反応性基と二重結合とを含む「単官能性」と記載された試薬を準備することを含む。上記試薬をその反応性基を介してゲルに結合し、次いでエポキシド又はハロヒドリンで二重結合を活性化してアガロースの水酸基と反応させ、架橋を形成する。
【００１１】
米国特許第５１３５６５０号（Ｈｊｅｒｔｅｎら）は、高圧縮性のアガロースビーズのようなクロマトグラフィー固定相粒子に関するものであり、ＨＰＬＣ用に十分な剛性を有し、溶質が入り込めない程度の非多孔質である。具体的には、かかるビーズは多孔質アガロースビーズを出発材料とし、これを有機溶媒と接触させて多孔度を崩壊させ、しかる後、崩壊した細孔内のビーズ表面を架橋して細孔を崩壊した状態に固定することによって製造される。ビーズは、別法として、細孔表面にグラフトする重合性材料で細孔を満たし、グラフト重合を行うことによって製造される。この米国特許記載の発明の一つの利点は、同じ固定相が高圧でも有効で、しかも低圧でも使用できることである。
【００１２】
米国特許第６６０２９９０号（Ｂｅｒｇ）は、多糖類の溶液に二官能性架橋剤を添加して、その活性部位を介して多糖類の水酸基に結合させる多孔質架橋多糖類ゲルの製造方法に関する。次いで溶液から多糖類ゲルを形成した後、架橋剤の不活性部位を活性化して、ゲルの架橋を行う。つまり、架橋剤を多糖類ゲルに添加する前述の方法とは対照的に、架橋剤は多糖類溶液に導入される。二官能性架橋剤は、一つの活性部位（つまりハロゲン化物及びエポキシドのように多糖類の水酸基と反応し得る基）と一つの不活性部位（つまりアリル基のように、活性部位が反応する条件下では反応しない基）とを含む。このように、二官能性架橋剤は、米国特許第４９７３６８３号（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ）で用いられる「単官能性試薬」に相当する。得られたゲルからなる粒子は、高い流速及び背圧に耐える能力が向上している。米国特許第６６０２９９０号の方法の短所は、架橋剤の活性化に臭素が必要とされることである。
【００１３】
最後に、米国特許第５９９８６０６号（Ｇｒａｎｄｉｃｓ）は、マトリックスの架橋と官能化を同時に行うクロマトグラフィー媒体の合成方法に関する。具体的には、高分子炭水化物マトリックスの表面に付与した二重結合を金属触媒存在下で活性化して、マトリックスを架橋し、ハロヒドリン、カルボキシル基又はスルホネート基で官能化する。二重結合は、活性化試薬との接触によってマトリックス表面に形成され、活性化試薬はハロゲン原子又はエポキシドと二重結合とを含む。このように、米国特許第５９９８６０６号の活性化試薬は、米国特許第４９７３６８３号の単官能性試薬及び米国特許第６６０２９９０号の二官能性架橋剤に相当する。
【特許文献１】米国特許第３９５６２７３号明細書
【特許文献２】米国特許第５１４３６４６号明細書
【特許文献３】米国特許第５５４１２５５号明細書
【特許文献４】米国特許第４９７３６８３号明細書
【特許文献５】米国特許第５１３５６５０号明細書
【特許文献６】米国特許第６６０２９９０号明細書
【特許文献７】米国特許第５９９８６０６号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
そこで、架橋多糖類分離マトリックの製造に利用できる技術は多数存在するが、用途毎にマトリックスに対する要件が異なるので、当技術分野では代替法に対するニーズが依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の一つの態様では、剛性架橋多糖類系クロマトグラフィーマトリックスの製造方法を提供する。
【００１６】
本発明の別の態様では、高度に多孔質の架橋多糖類系クロマトグラフィーマトリックスの製造方法を提供する。
【００１７】
本発明の詳細な態様では、様々な材料及び／又は出発材料を利用した剛性架橋多糖類系クロマトグラフィーマトリックスの製造方法を提供する。特定の態様では、臭素のようなハロゲンを使用しない方法を提供する。
【００１８】
本発明のさらに別の態様では、高い流速及び／又は背圧に耐え得る架橋多糖類粒子からなるクロマトグラフィーマトリックスを提供する。
【００１９】
さらに別の態様では、架橋多糖類系マトリックスを含むディスポーザルシステムを提供する。粒子又はメンブレンを充填したクロマトグラフィーカラムを備える本発明のディスポーザルシステムは実質的に滅菌されており、プロセスに組み込む際に必要とされる備品を備えていてもよい。
【００２０】
上記その他の目的は、各請求項に記載の構成によって達成される。本発明のその他の目的及び利点は、以下の詳細な説明から明らかとなろう。
【００２１】
定義
分離「マトリックス」という用語は、本明細書では、多孔質又は非多孔質固体担体にリガンドを結合させた材料をいう。クロマトグラフィーの分野では、マトリックスは樹脂又は媒体をいうこともある。
【００２２】
「目標化合物」という用語は、本明細書では、あるプロセスの目標とされる化合物その他の物質を意味する。
【００２３】
「リガンド」という用語は、本明細書では、通常の意味、つまり、目標化合物と相互作用することができる化学物質をいい、例えばイオン交換プロセスにおいて反対荷電の目標化合物と相互作用できる荷電基などをいう。
【００２４】
Ｋａｖは、（Ｖｅ−Ｖ０）／（Ｖｔ−Ｖ０）として定義されるゲル濾過（サイズ排除クロマトグラフィー）パラメーターである。式中、Ｖｅは被験分子のピーク溶出体積であり、Ｖ０はカラムの排除体積であり、Ｖｔは全ベッド体積である。Ｋａｖは、特定の被験分子に接近し得る固定相体積分率の指標である。
【００２５】
Ｋａｖ  ＤＸは、デキストラン分子に対するＫａｖである。実施例では、分子量１１０ｋＤ、５００ｋＤ及び１０００ｋＤのデキストランを使用した。
【００２６】
本明細書で「ゲル化温度」ともいう「ゲル化点」という用語は、溶液中のポリマーが物理的に相互作用して固形ゲルを形成する温度をいう。
【００２７】
「ゲル化性」という用語は、本明細書では、物理的ゲルを形成することができることをいう。
【００２８】
本明細書で用いる「架橋剤」という用語には、ポリマー間で架橋鎖を形成することができる化学物質だけでなく、γ線照射及び電子衝撃のように、適当な試薬の存在下でポリマー鎖を架橋することができる作用因子も包含する。
【００２９】
「実質的に滅菌」という用語は、本明細書では、微生物の生菌が実質的に存在しないことをいう。
【００３０】
「滅菌」という用語は、本明細書では、微生物の生菌が存在しない状態にするプロセスをいう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明の第一の態様は、架橋多糖類系クロマトグラフィーマトリックスの製造方法であって、
（ａ）水酸基の少なくとも一部が求核攻撃に非感受性の基で置換された１種以上のゲル化性多糖類の水溶液を準備する工程、
（ｂ）置換多糖類溶液の実質的に球形の液滴を準備する工程、
（ｃ）置換多糖類溶液のゲルを形成する工程、及び、
（ｄ）ゲルを架橋する工程
を含んでなる方法を提供する。
【００３２】
特定の実施形態では、上記の方法は、
（ａ）１種以上のゲル化性多糖類の水溶液を準備し、水溶液中の多糖類の水酸基の少なくとも一部を求核攻撃に非感受性の基で置換する工程、
（ｂ）置換多糖類溶液の実質的に球形の液滴を準備する工程、
（ｃ）置換多糖類溶液のゲルを形成する工程、及び、
（ｄ）ゲルを架橋する工程
を含む。
【００３３】
上述の方法において、「求核攻撃に非感受性」とは、置換後の多糖類で得られる基の性質をいう。
【００３４】
そこで、第一の実施形態では、出発材料は予め置換しておいた多糖類であるが、特定の実施形態では、本発明はさらに多糖類の水酸基を置換する工程を含む。当業者に公知の通り、利用可能な水酸基は多糖類のあらゆる表面に存在し、置換基は細孔の表面及びマトリックスの外表面に存在する。具体的には、準備される多糖類は、求核攻撃に非感受性の基で置換されている。従って、かかる基は水酸基との反応性を有していないので、本明細書では「非反応性基」又は単に置換基ともいう。これとは逆の種類の基つまり「反応性」の基は、求電子性基、又は例えばアリル基（容易にエポキシド化される）、エポキシド、ハロヒドリン、α，β−不飽和カルボニル（これらはすべて水酸基と容易に反応する）のように求電子性基へと容易に変換される基である。非反応性基の使用によって、置換ポリマーの安定性が向上し、後段の架橋工程の制御が容易となる。本発明において置換多糖類の水酸基は約１０％、例えば約５％、特に約２％をなす。そこで、一実施形態では、置換される水酸基は１〜２０％、例えば２〜１０％、特に２〜５％をなす。
【００３５】
本発明の方法の一実施形態では、非反応性置換基は、エーテル、エステル、アミド及びキサンテートからなる群から選択される。一実施形態では、多糖類に存在する置換基は、例えば、アルキルエーテル（例えば、メチル、エチル、プロピル及びブチルエーテル）のようなエーテル、ヒドロキシプロピル及びヒドロキシブチルエーテルのようなヒドロキシルエーテル、グリセロール、オリゴグリセロール、オリゴエチレングリコール又はこれらのいずれかのポリエーテルである。好適な実施形態では、多糖類の水酸基の一部はヒドロキシエチルエーテル基で置換される。
【００３６】
別の実施形態では、多糖類に存在する非反応性置換基は、アルキルエステル及びヒドロキシルアルキルエステルのようなエステルである。
【００３７】
さらに別の実施形態では、多糖類に存在する非反応性置換基は、カルバミド又はカルバミド誘導体のようなアミドである。
【００３８】
さらに別の実施形態では、多糖類に存在する非反応性置換基は、キサンテート塩又はキサンテートエステルである。
【００３９】
予め置換された多糖類は、例えばＣａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社（米国）から市販されている。本発明の最良の実施形態では、置換多糖類はヒドロキシエチルアガロースである。多糖類の様々な修飾法が当業者に知られており、例えば置換多糖類からなる電気泳動ゲルに関する米国特許第３９５６２７３号などを参照されたい。米国特許第３９５６２７３号に記載されている通り、多糖類を置換するとそのゲル化温度が下がるが、これは生成物の細孔構造を妨げて、結合力が弱まると予想される。しかし、本発明では、対照的に、本発明の方法で製造したクロマトグラフィーマトリックスは、非置換多糖類から製造した対応架橋生成物よりも向上した流動特性を示す（以下の実施例参照）。
【００４０】
こうして得たゲルの架橋は、多糖類の水酸基と反応する架橋剤の添加など、当技術分野で周知のいずれかの方法で行えばよい。
【００４１】
第一の実施形態では、架橋は、例えば上掲の米国特許第４９７３６８３号に記載の通り、エポキシドのような反応性基とアリル基のような活性化できる基とを含む架橋剤を用いた周知の二段階プロセスである。
【００４２】
別の実施形態では、架橋は、２つの反応性基を含む架橋剤を添加する一段階プロセスで実施される。そのため、この実施形態では架橋剤を活性化する必要がない。
【００４３】
これらに有用な慣用架橋剤の例としては、例えばイソシアネート、エポキシド、メチロール化合物、ハロヒドリン、ハロゲン化アルキル又はマイケル付加受容体（ビニルスルホンなど）が挙げられる。本方法に有用な架橋剤は、市販元から容易に入手できる。
【００４４】
周知の通り、架橋剤の活性化可能な基を活性化するためγ線照射又は電子衝撃を用いることができる。特定の実施形態では、γ線照射又は電子衝撃を用いて多糖類ポリマーを架橋させる。
【００４５】
一実施形態では、非反応性置換基つまり求核攻撃に非感受性の基を、架橋後に開裂させる。かかる基の開裂法が基の性状に依存することは明らかであり、個々の事例に応じて適当な条件を選択することは当業者が容易になし得る。好適な実施形態では、非反応性置換基はエステル基であり、後で加水分解によって開裂させる。次いで、多糖類の利用可能な水酸基をさらに官能化して所望の種類のクロマトグラフィーマトリックスとしてもよく、これについては後述する。
【００４６】
本発明の方法における多糖類の非反応性置換基の主な役割は、実施例に示す通り流動特性の向上した架橋ゲルを多糖類溶液から形成することであるが、非反応性置換基は、追加の官能化にも使用できる。好適な実施形態では、非反応性置換基も置換されていない水酸基も官能化される。かかる官能化で、荷電基を与えてイオン交換マトリックスとしたり、生物的親和性を示す基を与えてアフィニティーマトリックスとしたり、キレート基を与えて固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）マトリックスとしたり、或いは疎水性基を与えて疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）マトリックスとすることができる。特定の実施形態では、官能基は、第四級アンモニウム（Ｑ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、ジエチルアミノプロピル（ＡＮＸ）、スルホプロピル（ＳＰ）及びカルボキシメチル（ＣＭ）基からなる群から選択されるイオン交換リガンドである。別の実施形態では、非反応性置換基は後段でのクロマトグラフィーリガンドの結合に用いられる。この実施形態では、置換基は好適にはエーテル基である。かかる官能基を担体に結合させる方法は当業者に周知であり、置換基のアリル化の前処理工程を含んでいてもよく、慣用の試薬及び条件を用いればよい。（例えば、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｇｒｅｇ  Ｔ．  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，  Ａ．  Ｋｒｉｓｈｎａ  Ｍａｌｌｉａ  ａｎｄ  Ｐａｕｌ  Ｋ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ＩＮＣ，  １９９２参照）。特定の実施形態では、例えば目標物質との疎水性相互作用をもたらすことなどによって、非反応性置換基がリガンドをなす。かかるＨＩＣクロマトグラフィーでは、置換基の例としてアルキルエーテル基が挙げられる。
【００４７】
特定の実施形態では、上述のリガンド結合に先立って、リガンドをゲル表面から離隔する基を多糖類に結合させる。かかる離隔基は、エクステンダ、フレキシブルアーム、テンタクルなどとして知られており、線状でも枝分れであってもよい。多糖類系マトリックスに適した慣用の親水性エクステンダはデキストランであり、様々な分子量のものが市販されている。周知の方法で本発明のクロマトグラフィーマトリックスにエクステンダを介してリガンドを結合させることは当業者が容易になし得る。さらに、クロマトグラフィーマトリックスは刺激応答性ポリマーからなるものでもよく、光、磁場、温度、ｐＨのような物理的刺激によって物理化学変化を起こすことが知られているポリマーであり、例えば米国特許第６６４１７３５号（財団法人化学技術戦略推進機構）を参照されたい。周知の通り、かかる変化を利用して、リガンドの結合力及び／又はリガンドからの脱離に影響を与えたり、改善することができる。
【００４８】
さらに、多糖類ポリマーに各種官能基を結合することによって多糖類のゲル化点を変更できることが当技術分野で周知である。そこで、特定の実施形態では、多糖類のゲル化点を変化させるため、多糖類の非反応性置換基を官能化する。官能化では、上述したような周知の基を付加すればよい。この目的のため、非反応性置換基及び残りの非置換水酸基のいずれか又は両方を官能化し得る。本発明による修飾で得られるアガロースのような多糖類ゲルのいかなる新規の形態も本発明に包含される。
【００４９】
多糖類は、
アガロース、寒天、セルロース、デキストラン、ペクチン、デンプン、キトサン、コンニャク、カードラン、カラギーナン、ジェラン及びアルギン酸塩からなる群から選択できる。本発明の方法の好適な実施形態では、多糖類はアガロースである。これに関して、「アガロース」という用語には、本発明の方法によって剛性の向上したゲルを与えることができるあらゆるアガロース誘導体又は変性アガロースが包含される。特定の実施形態では、本発明の方法では上述の２種以上の多糖類の混合物を利用する。
【００５０】
特定の実施形態では、多糖類の融点及び／又はゲル化温度は、対応する非置換多糖類よりも約１℃以上低い。
【００５１】
本発明の別の態様は、架橋多糖類系クロマトグラフィーマトリックスの製造方法であって、
（ａ）水酸基の一部がアリル化された１種以上のゲル化性多糖類の水溶液を準備する工程、
（ｂ）置換多糖類溶液の実質的に球形の液滴を準備する工程、
（ｃ）置換多糖類溶液のゲルを形成する工程、及び、
（ｄ）ゲルを架橋する工程であって、その際に工程（ａ）のアリル基が関与しない工程
を含んでなる方法である。
【００５２】
そこで、当業者には明らかであろうが、架橋は、工程（ａ）でアリル化されなかった水酸基を利用して、好ましくは上述の適当な架橋剤との反応によって行われる。水酸基の「一部」という用語は、本明細書では「すべてではない幾らか」を意味する。上述の架橋法は、この実施形態にも等しく適用できる。工程（ｄ）をもっぱらゲルの架橋の目的で行うことよって、従来法で架橋したマトリックスよりも剛性の向上したクロマトグラフィーマトリックスが得られるという上述の利点が得られる。
【００５３】
従って、この態様は、二官能性架橋剤を多糖類の溶液に添加し、その活性部位を介して多糖類の水酸基と結合させる米国特許第６６０２９９０号（Ｂｅｒｇ）に記載の方法とは異なる。米国特許第６６０２９９０号から明らかな通り、二官能性架橋剤は例えばアリル基である。
【００５４】
しかし、本発明のこの態様では、ゲル化前に付加されるアリル基はゲルの架橋には用いられれない。その代わり、アリル基は好適には架橋後に水酸基のような親水性基に転化される。例えば、アリル基を架橋後に別途、例えばチオグリセロール又はメルカプトエタノールとの反応で水酸基へとすることによって除去してもよい。かかる反応は、ラジカル条件下での付加反応であり、当業者が容易になし得る周知の反応である。
【００５５】
別の実施形態では、ゲル化前に多糖類に付加され、後段の架橋に利用されないアリル基は、非反応性置換基に関して上述した通り、官能化してもよい。
【００５６】
本発明の方法の特定の実施形態では、ゲル化性多糖類は、アリル基以外に、求核攻撃に非感受性の基で置換された水酸基を含む。
【００５７】
このように、本発明に共通した概念は、液滴形成及びゲル化の前に、基を多糖類に付加し、その付加基の存在によって、その基を付加せずに製造した対応生成物とは異なる特性をもつ最終生成物を得ることである。上述の態様から明らかな通り、かかる基は、求核攻撃に非感受性の基、アリル基又はこれらの組合せである。
【００５８】
本発明の方法の一実施形態では、クロマトグラフィーマトリックスは本質的に球状の多孔質粒子からなる。粒子の平均粒径は、直径１０〜３００μｍ、好ましくは３０〜２００μｍ、さらに好ましくは４５〜１６５μｍ、例えば約４５μｍである。かかる多孔質多糖類担体は、逆懸濁ゲル化法（Ｓ  Ｈｊｅｒｔｅｎ：Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７９（２），３９３−３９８（１９６４））のような常法で当業者が容易に製造し得る。例えば、アガロースの製造に際しては、本質的に球形の多糖類溶液の液滴を得るには、まず各多糖類の融点を超える温度でアガロースを水性溶媒（水）その他の慣用溶媒に溶解又は分散させる。必要に応じて、生成物を所望の多孔度にするため、ポロゲンを添加してもよい。非置換多糖類の場合、次いで上述の置換を行う。溶解した置換多糖類を次いでトルエン又はヘプタンのような慣用有機溶媒と撹拌下で乳化した後、温度を多糖類のゲル化点未満（例えば室温）に下げる。こうして生成した粒子を洗浄して痕跡量の溶媒を除去し、上述の通り架橋すればよい。このように、本発明の方法の一実施形態では、溶解した置換多糖類を有機溶媒中で乳化する。別の実施形態では、本質的に球形の多糖類溶液の液滴は、米国特許第６２４８２６８号（ＦＭＣ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に記載の通り、水性媒体中の熱ゲル化性ポリマーの組成物を大気中に噴霧し、大気中で噴霧組成物をゲル化させることによって得られる。上記米国特許の開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。特定の実施形態では、多糖類の水溶液は加熱によって得られ、ゲルは温度を下げることによって形成される。
【００５９】
本発明の方法の一実施形態では、適当な孔径を得るため、ゲル化前にポロゲンを添加する。適当なポロゲンは当業者に周知である。本明細書では、クロマトグラフィーマトリックスは約９０％以上の多孔度を呈し、例えば約９４％、特に約９６％の多孔度を呈する。
【００６０】
本発明は、架橋多糖類系クロマトグラフィーマトリックスを充填して実質的に滅菌したカラムを得る方法も包含する。具体的には、この方法は、
（ａ）１種以上のゲル化性多糖類の水溶液を準備する工程、
（ｂ）置換多糖類溶液の実質的に球形の液滴を準備する工程、
（ｃ）置換多糖類溶液のゲルを形成する工程、
（ｄ）ゲルを架橋する工程、
（ｅ）架橋ゲルをクロマトグラフィーカラムに充填する工程、及び、
（ｆ）充填カラムを放射線、蒸気又はオートクレーブで滅菌する工程
を含んでなる。
【００６１】
特定の実施形態では、本発明の方法は、本発明で得た架橋クロマトグラフィーマトリックスをクロマトグラフィーカラムに充填する工程を含む。一実施形態では、充填カラムを滅菌処理に付す。別の実施形態では、本発明の方法は、多糖類クロマトグラフィーマトリックスを別途滅菌し、無菌的に組み立てて滅菌充填カラムを得ることからなる。この態様のクロマトグラフィーカラムは、一般にディスポーザルカラム又は「使い捨てクロマトグラフィーカラム」として周知のものであり、医薬及び／又は診断用製品に特に好適である。なお、「使い捨て」という用語は、１回又は限られた回数（例えば１〜３回）の使用を意味する。
【００６２】
別の実施形態では、本発明の方法において、工程（ｂ）を、多糖類メンブランを準備する工程で置き換える。特定の実施形態では、メンブランは滅菌され、使い捨てクロマトグラフィーに適している。
【００６３】
本発明の第二の態様は、上述の通り製造したクロマトグラフィーマトリックスに関する。一実施形態では、クロマトグラフィーマトリックスは実質的に球形の粒子を含み、１１０ｋＤａのデキストランに対するＫａｖ値が約０．４以上、好ましくは０．５超である。
【００６４】
別の実施形態では、クロマトグラフィーマトリックスはメンブレン又はフィルターからなる。さらに別の実施形態では、クロマトグラフィーマトリックスはモノリスからなる。別の実施形態では、クロマトグラフィーマトリックスは表面、チップ、ファイバーなどからなる。
【００６５】
特定の態様では、本発明のクロマトグラフィーマトリックスは、上記の工程（ａ）〜（ｆ）で製造される。
【００６６】
本発明の第三の態様は、上述の通り製造したマトリックスを充填したクロマトグラフィーカラムに関する。好適な実施形態では、カラムは、生体適合性プラスチック（例えばポリプロピレン）又はガラスのような慣用材料から作られる。カラムは実験室規模に適したサイズのものでも、大規模精製に適したサイズのものでもよい。特定の実施形態では、本発明に係るカラムはルアーアダプタ、チューブコネクタ及びドームナットを備える。そこで、本発明は、上述のクロマトグラフィーマトリックスを充填したクロマトグラフィーカラムと、１種以上の緩衝液と、目標化合物の精製に関する使用説明書とを、別々の区画に備えたキットも包含する。本発明は、カラム又は容器内の粒子の流動ベッドの形態、回分容器の形態、或いはメンブラン又はチップのような表面に塗工した形態など、その他のあらゆる形態に含まれるクロマトグラフィーマトリックスも包含する。
【００６７】
以上から明らかな通り、一実施形態では、本発明の方法では、実質的に滅菌された充填クロマトグラフィーカラムが得られる。例えば、特定の実施形態に係るクロマトグラフィーカラムはディスポーザル又は使い捨ての形態であり、実質的に滅菌されている。滅菌又は実質的に滅菌された形態は、純度が決定的重要性をもつ医薬品の精製のように医薬産業でのプロセスに特に好適である。
【００６８】
別の実施形態は、本発明のクロマトグラフィーカラムを備えるキットに関する。キットは、充填クロマトグラフィーカラム、チューブ類及び緩衝液を備えていてもよい。キットは実質的に無菌の形態であってもよく、部品が予め組み立てられていてもよい。
【００６９】
目標化合物は、ペプチド、受容体や抗体のようなタンパク質、ＤＮＡ（例えばプラスミド）、ＲＮＡ及びオリゴヌクレオチドのような核酸、ウイルス、プリオン、原核細胞又は真核細胞のような細胞、炭水化物、その他薬剤候補のような有機分子からなる群から選択されるいかなる生物学的化合物でもよい。特定の実施形態では、目標化合物は診断マーカーである。そこで、クロマトグラフィーマトリックスを用いて精製される目標化合物は、例えばタンパク質及び抗体医薬のような医薬化合物、抗原又は診断用抗体のような診断化合物、並びに治療に用いられる幹細胞のような細胞であってもよい。
【００７０】
本発明の最後の態様は、液体から１種以上の目標化合物を精製、単離又は除去するための、上述の通り製造したクロマトグラフィーマトリックスの使用である。そこで、この態様は、上述の液体クロマトグラフィー法であって、本発明のクロマトグラフィーマトリックスに目標化合物を吸着させる工程と、適宜、目標物質を選択的脱着させる後工程（一般に勾配溶出として知られる）とを含む方法である。必要に応じて、吸着と溶出の間に１回以上の洗浄工程を設ける。或いは、本使用は、目標化合物のリターデーションにも応用でき、この場合、その他の成分とは異なり、目標化合物が選択的にカラムに捕捉される。この場合、カラムの再利用のため再生する場合を除いて、目標を放出するための溶出工程を行う必要はない。
【００７１】
クロマトグラフィーの分野で周知の通り、充填ベッドでの圧力損失は、特に大量分取用クロマトグラフィーカラムの操作で大きな問題となりかねない。充填ベッドの形状及びアスペクト比のような因子だけでなく、クロマトグラフィーマトリックスの流動特性も圧力損失に影響を与える。本発明で製造したアガロースクロマトグラフィーマトリックスは、慣用法で製造した対応マトリックスよりも流速を格段に増大できることが本発明で明らかとなった。そこで、本発明の使用の一実施形態では、１１０ｋＤのデキストランに対して約０．４以上のＫａｖを示す実質的に球形の粒子からなるマトリックスに、約３００ｃｍ／ｈ以上の流速で液体を流す。
【００７２】
本発明の別の態様は、食品産業で用いられる目標化合物の精製及び／又は単離のための、クロマトグラフィーマトリックスの使用である。この使用には、例えば乳清からの乳タンパク質の精製などが挙げられる。従来のクロマトグラフィーマトリックスに比べ、本発明のクロマトグラフィーマトリックスの使用に伴う利点は、剛性の向上であり、そのため経済的な流速つまりコスト面で一般に必要とされる大量の取扱いができることである。
【００７３】
本発明で得られるクロマトグラフィーマトリックスのその他の具体的用途は、プロセス流体からウイルス又はプリオンのような少量の夾雑物を除去することである。この実施形態では、クロマトグラフィーマトリックスは粒子でもメンブランでもよく、好ましくは使用済みマトリックスを夾雑物と共に安全に廃棄できる使い捨て型のものである。
【００７４】
最後に、一実施形態では、本発明の方法で製造されるマトリックスは、細胞培養の支持体として用いられる。好適な実施形態では、支持体は実質的に球形の担体粒子の形態であり、懸濁培養又は表面への固定化のいずれにも適している。かかる培養細胞は、例えば細胞療法の治療スキームにおける医薬物質として使用できる。マトリックスのその他の用途は、生体触媒を製造するための酵素の固定化である。
【実施例】
【００７５】
以下の実施例は例示を目的とするものにすぎず、特許請求の範囲で規定される本発明の技術的範囲を限定するものではない。本明細書で引用する文献の開示内容はすべて援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【００７６】
材料／調査した単位
エピクロロヒドリン
水素化ホウ素ナトリウム
硫酸ナトリウム。
【００７７】
方法
実施例１：架橋アガロースビーズの製造
７ｇのヒドロキシエチルアガロース（ＮｕＳｉｅｖｅ（商標）ＧＴＧ、Ｃａｍｂｒｅｘ社製）を、沸騰水浴中で３０分間撹拌しながら２００ｍｌの蒸留水に溶解させた。この溶液を、３００ｍｌトルエン中の２ｇトリグリセロールジイソステアレート（Ｐｒｉｓｏｒｉｎｅ（商標）３７００、Ｕｎｉｑｅｍａ社製）の溶液の入った６０℃に保温した１．５Ｌ平底ガラス容器に仕込んだ。仕込の際の撹拌速度（４０ｍｍのタービン型撹拌機）は４００ｒｐｍとし、次いで２０分間６５０ｒｐｍ、２０分間８００ｒｐｍに順次高めた。次いで、３０分かけて６０℃から２０℃まで容器を冷却することによって、ヒドロキシエチルアガロースの液滴をゲル化させた。１Ｌのエタノールを添加し、容器内容物を１５分間撹拌し、静置して沈殿させた。上清をデカントし、Ｇ３ガラス濾過器でビーズをエタノール及び水を洗浄した。Ｍａｌｖｅｒｎ−Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ光回折計で測定して、回収ビーズのモード径は９９μｍであった。
【００７８】
得られたビーズ２８５ｇをフラスコに添加し、二枚刃撹拌機を用いて２００ｒｐｍで撹拌した。１３７ｇの硫酸ナトリウムを添加し、２００ｒｐｍで撹拌しながら５０℃に加熱することによって溶解させた。５０℃の目標温度に達した後も、撹拌を３０分間続けた。５０％ＮａＯＨを１０．７ｍｌ添加し、次いで０．４ｇの水素化ホウ素ナトリウムを添加した。次いで、５４ｍｌの５０％ＮａＯＨ及び８０ｍｌのエピクロロヒドリンをＤｏｓｉｍａｔ（商標）ポンプを用いて７時間添加した（流加速度：５０％ＮａＯＨ：０．１２９ｍｌ／分、エピクロロヒドリン：０．１９０ｍｌ／分）。次いで、反応混合物を５０℃で一晩２００ｒｐｍで撹拌した。次いで、ゲルスラリーを６０％酢酸を用いてｐＨ５．１に中和し、ガラス濾過器でゲルを水洗した。最後に、ビーズを４０〜１６０μｍの篩で分級した。
【００７９】
実施例２：架橋アガロースビーズの製造
ゲル状の置換アガロースからなるビーズを実施例１と同様に製造した。
【００８０】
ビーズを、次いで、温度を常に７０℃に維持した点を除いて、実施例１と同じ手順で架橋した。
【００８１】
実施例３：圧力−流れ性能
上述の通り得たビーズをＨＲ５／５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ））に充填し、Ｐ−９００ポンプ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ））に接続した。５０％のエタノール溶液をポンプで０．５ｍｌ／分の初期流速でカラムに流した。劇的な背圧上昇が観察されるまで流速を３０秒毎に０．５ｍｌ／分ずつ段階的に増加させた。圧力上昇前の最高流速をそのゲルの最大流速とした。結果を以下の表１に示す。
【００８２】
実施例４：多孔度の測定:
ビーズをＨＲ１０カラムに充填してベッド高さ１５ｃｍとした。カラムを、ＬＣＣ  Ｐｌｕｓ／ＦＰＬＣ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒ、Ｐ−５００ポンプ及びＭＶ−７  ＵＶ−Ｍ検出器を備えたＦＰＬＣシステムに取り付けた。着色デキストラン試料（０．１％溶液、０．２ｍｌ）を注入し、流速０．２ｍｌ／分（１５ｃｍ／時間）の０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）の均一溶媒で溶出した。対照として、カラムにＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社（スウェーデン国ウプサラ））を充填し、同様に評価した。結果を以下の表１に示す。
【００８３】
結果
【００８４】
【表１】
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本発明の方法で製造したビーズは、対照のアガロースマトリックスＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４ＦＦよりも大きな細孔を有し、流速を格段に高めることができる。
【国際調査報告】
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2008513771.tif 000005
2008513771.tif 000006
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