(57)【要約】  ＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰファミリーのタンパク質の新規なメンバー（ＲＡＥＴ１Ｇ）を同定および特性決定し、これが高親和性でＵＬ１６およびＮＫＧ２Ｄ受容体に結合することを示す。ＲＡＥＴ１Ｇは、正常組織では限られた発現を示すが、腫瘍では高レベルで発現し、そして癌細胞では異なった様式でスプライシングされて可溶性タンパク質を産生するようである。ＲＡＥＴ１Ｇはまた、セリアック病のような炎症性疾患においてアップレギュレーションされる。ＲＡＥＴ１Ｇは癌状態および炎症性疾患をはじめとする疾患状態に対する新規なマーカーとして用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
図１または図２のアミノ酸配列に対して少なくとも８７％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする、単離核酸。
【請求項２】
前記ポリペプチドが図１のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の単離核酸。
【請求項３】
前記ポリペプチドが図２のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の単離核酸。
【請求項４】
前記ポリペプチドがＵＬ１６および／またはＮＫＧ２Ｄ受容体に結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離核酸。
【請求項５】
図３または図４のヌクレオチド配列との少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有してなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離核酸。
【請求項６】
ストリンジェントな条件下で図３もしくは図４に示す核酸配列またはその相補体とハイブリダイズする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離核酸。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸によりコードされる、単離ポリペプチド。
【請求項８】
少なくとも１１０アミノ酸からなり、ＵＬ１６および／またはＮＫＧ２Ｄ受容体に結合することができる、請求項７に記載の単離ポリペプチドの断片である、単離ポリペプチド。
【請求項９】
ポリペプチド、非ペプチジル化合物、細胞またはウイルス粒子である機能性部分とコンジュゲートした、請求項７または８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１０】
前記機能性部分が細胞毒性活性または結合活性を有する、請求項９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸を含んでなる組換えベクター。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の異種核酸または請求項１１に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項１３】
細菌細胞または真核細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
以下のステップ：
（ａ）  好適な発現システムにおいて請求項１〜６のいずれか１項に記載のＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドをコードする核酸からの発現を引き起こし、それによりＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドを組換え的に産生させるステップ；および
（ｂ）  ＲＡＥＴ１Ｇ活性について、該組換え産生ポリペプチドを試験するステップ
を含む、ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドの生成方法。
【請求項１５】
請求項７〜１０のいずれか１項に記載のＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドに特異的に結合する、単離抗体。
【請求項１６】
個体から取得したサンプル中のＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドの存在または量を確認するステップ
を含む、個体における疾患状態の特定方法。
【請求項１７】
前記状態が癌状態である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記状態が炎症性疾患である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記炎症性疾患がセリアック病である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドが可溶性である、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記可溶性ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドが図１のアミノ酸配列からなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドが図２のアミノ酸配列からなる、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記サンプルを請求項１５に記載の抗体と接触させることにより前記ポリペプチドの存在または量を確認する、請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
個体から取得したサンプル中のＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドをコードする核酸の存在または量を確認するステップ
を含む、個体における疾患状態の特定方法。
【請求項２５】
前記状態が癌状態である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記状態が炎症性疾患である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記炎症性疾患がセリアック病である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸が可溶性ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドをコードする、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記核酸が図４のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸が図３のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記サンプルが、上皮細胞および／または上皮由来細胞を含んでなる、請求項１７または２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記上皮細胞または上皮由来細胞が、腎臓、肝臓、肺、食道、卵巣、皮膚および／または子宮由来である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドのモジュレーターの取得および／または特定方法であって、以下のステップ：
（ａ）  ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドと試験化合物とを接触させるステップ；および
（ｂ）  ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドと試験化合物との相互作用を測定するステップ
を含む、上記方法。
【請求項３４】
ＲＡＥＴ１ＧとＵＬ１６および／もしくはＮＫＧ２Ｄとの相互作用をモジュレートする化合物の取得および／または特定方法であって、以下のステップ：
（ａ）  試験化合物の存在下に、ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドと、ＵＬ１６またはＮＫＧ２Ｄポリペプチドとを接触させるステップ；および
（ｂ）  試験化合物の添加の前後での、ＵＬ１６またはＮＫＧ２ＤポリペプチドとＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドとの間の相互作用を測定するステップ
を含む、上記方法。
【請求項３５】
試験化合物をＲＡＥＴ１Ｇ活性のモジュレーターとして特定するステップを含む、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
試験化合物を単離および／または精製するステップを含む、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記試験化合物を合成および／または製造するステップを含む、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
製薬上の特性を最適化するために試験化合物を修飾するステップを含む、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
試験化合物を製薬上許容される賦形剤、ビヒクルまたは担体と共に医薬組成物に製剤化するステップを含む、請求項３３〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
請求項７〜１０のいずれか１項に記載のＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドもしくはその断片、または請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸もしくはその断片、または請求項１５に記載の抗体を、製薬上許容される賦形剤、ビヒクルまたは担体と共に医薬組成物に製剤化するステップを含む、医薬組成物の製造方法。
【請求項４１】
請求項３３〜３８のいずれか１項に記載の方法により得られる、ＲＡＥＴ１Ｇ活性のモジュレーター。
【請求項４２】
ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドのペプチド断片を含んでなる、請求項４１に記載のＲＡＥＴ１Ｇ活性のモジュレーター。
【請求項４３】
ヒトまたは動物身体の治療における使用のための、請求項７〜１０のいずれか１項に記載のＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドもしくはその断片、または請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸もしくはその断片、請求項１５に記載の抗体または請求項２６もしくは請求項４２に記載のモジュレーター。
【請求項４４】
ＲＡＥＴ１Ｇに媒介される状態にある個体の治療のための医薬の製造における、請求項７〜１０のいずれか１項に記載のＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドもしくはその断片、または請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸もしくはその断片、請求項１５に記載の抗体または請求項４１もしくは請求項４２に記載のモジュレーターの使用。
【請求項４５】
前記状態が、病原体感染症、癌状態および免疫障害からなる群より選択される、請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
ＲＡＥＴ１Ｇにより媒介される状態を有する個体の治療方法であって、請求項７〜１０のいずれか１項に記載のＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドもしくはその断片、または請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸もしくはその断片、請求項１５に記載の抗体または請求項４１もしくは請求項４２に記載のモジュレーターを個体に投与するステップを含む、上記方法。
【請求項４７】
前記状態が、病原体感染症、癌状態および免疫障害からなる群より選択される、請求項４６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞表面受容体ＮＫＧ２ＤおよびウイルスリガンドＵＬ１６と相互作用するタンパク質リガンドに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型レクチン様受容体ＮＫＧ２Ｄには、マウスおよびヒトの両方で、多数の確定されたＭＨＣクラスＩ関連リガンドがある。マウスリガンドとしては、レチノイン酸早期転写産物１（Ｒａｅ−１）ファミリー、副組織適合抗原Ｈ６０、および最近同定されたＭＵＬＴ１が挙げられる（Cerwenkaら、(2000) Immunity 12, 721-727; Diefenbachら、(2000) Nat. Immunol. 1, 119-126; Carayannopoulosら(2002), J. Immunol 169, 4079-4083）。ヒトリガンドとしては、ＭＨＣクラスＩ鎖関連遺伝子ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ（Bauerら(1999) Science 285, 727-729）ならびにＵＬ１６結合性タンパク質ＵＬＢＰファミリー（Cosmanら(2001) Immunity 14, 123-133）が挙げられる。
【０００３】
ＭＩＣタンパク質は古典的ＭＨＣクラスＩ分子のものと構造的に類似する３個のαドメインを有するが、ペプチドとは結合せず、β２マイクログロブリンと会合することもない。Ｈ６０、ＵＬＢＰ１〜３およびＲａｅ−１ファミリーはＭＨＣ様α１α２ドメインのみを有している。ヒトＵＬＢＰおよびマウスＲａｅ−１タンパク質は、これらは膜貫通（ＴＭ）領域を所有するのではなく、膜にＧＰＩアンカーで係留される点で、その他のＮＫＧ２Ｄリガンドとは異なる。
【０００４】
ＮＫＧ２Ｄはホモダイマーとして細胞表面に存在する。多様なリガンドはＮＫＧ２Ｄ結合部位内の５個の保存された「ホットスポット」のみに結合する（McFarlandら、Immunity (2003) 19, 803-812; McFarlandら、Structure (2003) 11, 411-422）。ＮＫＧ２ＤはＮＫ細胞だけに限定されず、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、および活性化されたマクロファージ上でも発現する（Jamieson ら(2002) Immunity 17, 19-29）。
【０００５】
ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現についてはあまり分かっていない。ＭＩＣは上皮起源の腫瘍上に発現することが多く（Grohら(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 6879-6884）、また腫瘍上のＮＫＧ２Ｄリガンドのアップレギュレーションは悪性腫瘍細胞の免疫認識および排除の機構の１つであるものと見られる。ＮＫＧ２Ｄ依存性ナチュラルキラー細胞細胞毒性に対する腫瘍の感受性の研究から、ナチュラルキラー細胞媒介細胞毒性におけるＮＫＧ２Ｄの関与は、各種の組織型の標的細胞腫瘍上でのＭＩＣＡおよびＵＬＢＰの発現ならびに表面密度と厳密に相関することが示されている（Pendeら(2002)Cancer Res., 62, 6178-6186）。マウスモデルでは、ＮＫＧ２Ｄリガンドでトランスフェクトした移植腫瘍細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて強力な抗腫瘍免疫および腫瘍細胞の拒絶を引き起こした（Diefenbachら(2000) Nat. Immunol. 1, 119-126; Cerwenkaら(2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 11521-11526; Diefenbachら(2001) Nature 413, 165-171; Girardiら(2001) Science 294, 605-609）。ＮＫＧ２Ｄリガンドは、サイトメガロウイルス（Grohら(2001) Immunol. 2, 255-260）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）（Dasら(2001) Immunity 15, 83-93）および大腸菌（Tiengら(2002) Proc. Natl. Acac. Sci. 99, 2977-2982）をはじめとする病原体に対する免疫応答においても働くと見られる。
【０００６】
非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスでは、ＮＫ細胞機能はＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現によって傷害される（Ogasawaraら、(2003) Immunity 18, 41-51）。関節リウマチでは、ＮＫＧ２Ｄ受容体の、そのリガンドとの相互作用が傷害される（Grohら、(2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 9452-9457）。
【０００７】
ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）によるＵｎｉｑｕｅ Ｌｏｎｇ（ＵＬ）１６糖タンパク質の発現は、ｈＣＭＶがＮＫＧ２Ｄのそのリガンドとの結合を妨害することによって免疫認識を回避するメカニズムであると見られる（Cosmanら(2001) Immunity 14, 123-133; Welteら(2003) Eur. J. Immunol. 33, 194-203）。すべてのヒトＭＩＣおよびＵＬＢＰタンパク質が標的となるわけではない。ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、およびＵＬＢＰ２はＵＬ１６に結合するが、ＭＩＣＡおよびＵＬＢＰ３は結合しない。同様に、各種のマウスリガンドがＮＫＧ２Ｄに対して多様な親和性を有する（Carayannopoulosら(2002) J. Immunol. 169, 4079-4083; O'Callaghanら(2001) Immunity 15, 201-211; Carayannopoulosら(2002) Eur. J. Immunol. 32, 597-605）。ＭＩＣおよびＵＬＢＰタンパク質は種々の系統の細胞上で互いに独立に発現することができ、このことは重複しない機能とも相容れるものである（Pendeら(2002)Cancer Res. 62, 6178-6186）。
【０００８】
多数のＵＬＢＰ関連遺伝子（「ＲＡＥ１様転写産物」（ＲＡＥＴ１））が染色体６ｐ２４．２−ｑ２５．３上のクラスター中に同定されている（Radosavljevicら(2002) Genomics 79, 114-123）。このクラスターはＵＬＢＰ１〜３とは異なる、ＲＡＥＴ１Ｅなどのいくつかの新規な遺伝子を含んでいる（ＵＳ２００３／０１９５３３７）。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／０１９５３３７号明細書
【非特許文献１】Cerwenkaら, (2000) Immunity 12, 721-727
【非特許文献２】Diefenbachら, (2000) Nat. Immunol. 1, 119-126
【非特許文献３】Carayannopoulosら, (2002), J. Immunol 169, 4079-4083
【非特許文献４】Bauerら, (1999) Science 285, 727-729
【非特許文献５】Cosmanら, (2001) Immunity 14, 123-133
【非特許文献６】McFarlandら, (2003) Immunity 19, 803-812
【非特許文献７】McFarlandら, (2003) Structure 11, 411-422
【非特許文献８】Jamiesonら, (2002) Immunity 17, 19-29
【非特許文献９】Grohら, (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 6879-6884
【非特許文献１０】Pendeら, (2002) Cancer Res. 62, 6178-6186
【非特許文献１１】Cerwenkaら, (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 11521-11526
【非特許文献１２】Diefenbachら, (2001) Nature 413, 165-171
【非特許文献１３】Girardiら, (2001) Science 294, 605-609
【非特許文献１４】Grohら, (2001) Immunol. 2, 255-260
【非特許文献１５】Dasら, (2001) Immunity 15, 83-93
【非特許文献１６】Tiengら, (2002) Proc. Natl. Acac. Sci. 99, 2977-2982
【非特許文献１７】Ogasawaraら, (2003) Immunity 18, 41-51
【非特許文献１８】Grohら, (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 9452-9457
【非特許文献１９】Welteら, (2003) Eur. J. Immunol. 33, 194-203
【非特許文献２０】O'Callaghanら, (2001) Immunity 15, 201-211
【非特許文献２１】Carayannopoulosら, (2002) Eur. J. Immunol. 32, 597-605
【非特許文献２２】Radosavljevicら, (2002) Genomics 79, 114-123
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、「ＲＡＥＴ１Ｇ」と命名された、ＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰファミリーのタンパク質の新規なメンバーの同定および特性決定に関する。ＲＡＥＴ１Ｇは本明細書中で、現在までに報告されているどのＵＬＢＰファミリータンパク質よりも顕著に高い親和性でＵＬ１６およびＮＫＧ２Ｄ受容体と結合することが示される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一態様では、図１もしくは図２のアミノ酸配列と少なくとも８７％の配列同一性または少なくとも８７％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含んでなるか、あるいは当該配列からなるポリペプチドをコードする、単離された核酸が提供される。
【００１１】
図１のアミノ酸配列（ＲＡＥＴＧ１）はデータベース番号ＡＡＯ２２２３８．１、ＧＩ：３７７２８０２６のものであり、これはデータベース番号ＡＹ１７２５７９．１、ＧＩ：３７７２８０２５の配列によってコードされる。
【００１２】
図２のアミノ酸配列（ＲＡＥＴＧ２）はデータベース番号ＡＡＯ２２２３９．１、ＧＩ：３７７２８０２８のものであり、これはデータベース番号ＡＹ１７２５８０．１、ＧＩ：３７７２８０２７の配列によってコードされる。
【００１３】
前記ポリペプチドは図１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性もしくは類似性、少なくとも９５％の配列同一性もしくは類似性、または少なくとも９８％の配列同一性もしくは類似性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいは当該配列からなっていてもよい。一部の好ましい実施形態では、該ポリペプチドは図１および／もしくは図２のアミノ酸配列を含むかまたは当該配列からなる。
【００１４】
好ましくは、該ポリペプチドは１種以上のＲＡＥＴ１Ｇ機能を有する。例えば、該ポリペプチドは、好ましくは高親和性（すなわち、３６０ｎＭ以下）で、ＵＬ１６（コード配列 ＡＹ２９７４４５、ＡＹ２９７４４５．１、ＧＩ：３１６１６６０８；タンパク質配列 ＡＡＰ５５７２１；ＡＡＰ５５７２１．１；ＧＩ：３１６１６６０９）および／またはＮＫＧ２Ｄ（コード配列 ＡＦ４６１８１１、ＡＦ４６１８１１．１、ＧＩ：１８１８２６７９；タンパク質配列 ＡＡＬ６５２３３、ＡＡＬ６５２３３．１、ＧＩ：１８１８２６８０）と結合する。
【００１５】
本明細書に記載する単離された核酸は、図３もしくは図４の核酸配列と約８５％を超える、約９０％を超える、または約９５％を超える配列同一性を共有していてもよい。
【００１６】
該核酸は図３もしくは図４に示す配列を含むかまたは該配列からなっていてもよいし、示された配列の突然変異体、変異体、誘導体または対立遺伝子であってもよい。該配列は変更（示された配列の１個または数個のヌクレオチドについての１ヵ所または数ヶ所の付加、挿入、欠失および置換）によって、示されたものとは異なっていてもよい。核酸配列の変更の結果、遺伝的コードより明らかであるように、タンパク質レベルでのアミノ酸の変更を生じるか、または生じない場合がある。
【００１７】
例えば、核酸は、図３または図４に示される配列とは異なるが、それでも同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を含み得る。
【００１８】
配列同一性については以下にさらに詳細に記載する。
【００１９】
本発明の核酸は図３および／または図４に示す配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか、あるいは図３および／または図４に示す配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする相補体を有するものでもよい。好適な条件とは、例えば約８０〜９０％同一な配列に対して、０．２５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ ７．２、６．５％ ＳＤＳ、１０％デキストランスルフェート中、４２℃で一晩のハイブリダイゼーションおよび０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中、５５℃での最終洗浄を含む。約９０％を超える同一性の配列に対しては、好適な条件とは、０．２５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ ７．２、６．５％ ＳＤＳ、１０％デキストランスルフェート中、６５℃で一晩のハイブリダイゼーションおよび０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中、６０℃での最終洗浄を含む。好ましくは、核酸は上記のようなＲＡＥＴ１Ｇ活性を有するポリペプチドをコードする。
【００２０】
本発明はまた、本明細書に記載する核酸配列の断片、例えば図３もしくは図４のヌクレオチド配列の断片をも包含する。好適な断片は、８９１ヌクレオチド未満、例えば１０、２０、３０、４０または５０ヌクレオチドから８００、８７０、８８０または８９１ヌクレオチドからなっていてもよい。こうした断片は下記のようなＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドをコードするか、またはオリゴヌクレオチドプローブもしくはプライマーとして有用であり得る。
【００２１】
本発明の別の態様では、上記の核酸配列の１つ、例えば図３もしくは４の核酸配列によってコードされる、単離されたＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドが提供される。
【００２２】
ポリペプチドは図１および／もしくは図２に示すアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなるか、あるいはそれらの変異体、対立遺伝子、誘導体もしくは突然変異体でもよい。
【００２３】
本明細書に記載するＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドの変異体、対立遺伝子、誘導体もしくは突然変異体としては、例えば該タンパク質をコードする核酸の操作により、または該タンパク質自体の変化により、該タンパク質のアミノ酸配列を変えることによって変更されたポリペプチドが挙げられる。このような本来のアミノ酸配列の誘導体は、１個または数個のアミノ酸についての１ヵ所または数ヶ所の挿入、付加、欠失もしくは置換を含み得るが、これが該ポリペプチドの定性的活性（例えば該ポリペプチドのＵＬ１６受容体および／またはＮＫＧ２Ｄ受容体との結合性）を根本的に変化させないものであり得る。
【００２４】
変異体、対立遺伝子、誘導体もしくは突然変異体は、図１の配列との約８７％を超える、約９０％を超える、または約９５％を超える配列同一性を共有するアミノ酸配列を含み得る。該配列は図１および／または図２のアミノ酸配列との約８７％を超える、または約９０％を超える、配列類似性を共有するものでもよい。好ましくは、ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドのアミノ酸配列変異体、対立遺伝子、誘導体または突然変異体はＵＬ１６受容体および／またはＮＫＧ２Ｄ受容体に対する結合親和性を保持しているものである。
【００２５】
配列類似性および同一性は、通常はアルゴリズムＧＡＰ（Genetics Computer Group, Madison, WI）に準拠して規定される。ＧＡＰではＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して、２つの完全配列をアライメントし、このとき一致数を最大にし、かつギャップの数を最少にする。一般的には、デフォルトのパラメータを使用し、ギャップ生成ペナルティ＝１２、ギャップ伸長ペナルティ＝４とする。
【００２６】
ＧＡＰの使用が好ましいが、例えば以下の他のアルゴリズムを使用してもよい：ＢＬＡＳＴ（Altschulら(1990) J. Mol. Biol. 215, 405-410の方法を使用）、ＦＡＳＴＡ（Pearson and Lipman(1988) Proc. Natl. Acad. USA 85, 2444-2448の方法を使用）、またはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Smith and Waterman (1981) J. Mol Biol. 147, 195-197）、あるいはＡｌｔｓｃｈｕｌら(1990、上掲)のＴＢＬＡＳＴＮプログラム。これらは一般的にデフォルトのパラメータを利用する。特に、ｐｓｉ−Ｂｌａｓｔアルゴリズム（Nucl. Acids Res. (1997) 25, 3389-3402）を使用することができる。配列同一性および類似性は、ＧｅｎｏｍｅｑｕｅｓｔＴＭソフトウェア（Gene-IT, Worcester MA USA）を使用して判定することもできる。
【００２７】
類似性とは「保存的変異」、すなわち、イソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンなどの疎水性残基同士の置換、またはアルギニンとリジン、グルタミン酸とアスパラギン酸、もしくはグルタミンとアスパラギンなどの、極性残基同士の置換を許容するものである。当該アミノ酸配列変異体は、１アミノ酸、２、３、４、５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０、もしくは５０アミノ酸を超える挿入、付加、置換または欠失によって、本明細書に記載の確かめられたポリペプチド配列と異なっていてもよい。
【００２８】
配列の比較は、文脈上それ以外を指定する場合を除き、本明細書に記載する対応する配列の全長にわたって行う。
【００２９】
ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドには、完全長ポリペプチド（例えば図１および／または図２の全長配列）よりも少ないアミノ酸残基からなるポリペプチド断片が包含される。このような断片は、少なくとも１１０アミノ酸、より好ましくは少なくとも１６０アミノ酸、より好ましくは少なくとも２００アミノ酸、より好ましくは少なくとも２５０アミノ酸、より好ましくは少なくとも２９７アミノ酸からなっていてもよい。このような断片は２９７アミノ酸以下、または２５０アミノ酸以下、または１６０アミノ酸以下、または１１０アミノ酸以下からなっていてもよい。
【００３０】
好ましくは、本明細書に記載するポリペプチドは、図１または図２の配列中の少なくとも残基８３から２０２に相当するα１およびα２ドメインを含んでなる。
【００３１】
該ポリペプチドはまた、図１もしくは図２の配列中の少なくとも残基２２７−２４２に相当する膜貫通ドメイン、および／または図１もしくは図２の配列中の少なくとも残基２４３−２９７もしくはそれ未満に相当する細胞質ドメインを含むことができる。
【００３２】
本明細書に記載するポリペプチドはさらに、図１または図２のアミノ酸配列の位置１６３に相当する位置にプロリン残基を含むことができる。
【００３３】
本出願では、アミノ酸残基を、図１の配列中のそれらの位置を参照して記載する。その他のＲＡＥＴ１Ｇポリペプチド中の対応する残基は、各ポリペプチドのアミノ酸配列に差異があるので、異なる位置および数である場合があることが理解されるであろう。これらの差異は、例えば、Ｎ末端ドメインの長さの変動によって起こり得る。ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチド中の対応する残基は、それらの全体としての配列の前後関係により、ならびにα１およびα２ドメインとの関係でのそれらの位置によって、容易に認識し得るものである。
【００３４】
本明細書に記載するポリペプチドは可溶性または不溶性であり、例えばポリペプチドは膜にアンカーされているか、または膜内にあってもよい。
【００３５】
好ましくは、ポリペプチドはＲＡＥＴ１Ｇの機能を有し、ＵＬ１６受容体および／またはＮＫＧ２Ｄ受容体と高親和性で結合する。ＲＡＥＴ１ＧポリペプチドのＵＬ１６および／またはＮＫＧ２Ｄ受容体に対する親和性は、例えば表面プラズモン共鳴をはじめとする、種々の標準的な技法のいずれによっても決定することができる。
【００３６】
受容体との高親和性結合とは一般的に、マイクロモル未満の親和性での結合である。中程度〜低親和性結合とは一般的に、マイクロモルまたは数十マイクロモルの親和性での結合である。
【００３７】
本明細書に記載するＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドは、ＮＫＧ２Ｄに対する親和性が１．６８μＭであるＵＬＢＰ１などの、他のＮＫＧ２Ｄリガンドの結合親和性に匹敵するか、より好ましくはそれよりも高い親和性で結合する。
【００３８】
ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドはまた、ＲＡＥＴ１Ｇ配列に対して異種性の付加的なアミノ酸残基を含んでいてもよい。例えば、上記のＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドが融合タンパク質の一部として含まれていて、この場合に異種アミノ酸残基によってこの融合タンパク質がＵＬ１６および／またはＮＫＧ２Ｄ受容体との結合親和性の他に機能を有することができるようになっていてもよい。例えば、この付加的な機能が所望の性質をもたらすか、または所望の性質を有する作用因子が該融合タンパク質と協働することを可能にする。
【００３９】
一部の実施形態では、ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドをコンジュゲートとして機能性部分に化学的に連結させてもよい。ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドとコンジュゲートさせることができる機能性部分としては、ポリペプチド、非ペプチジル化合物、細胞およびウイルス粒子が挙げられる。機能性部分は、例えば細胞毒性活性または結合活性を有していてもよい。
【００４０】
当業者であれば、本明細書に記載した技法および当該技術分野で周知のその他の技法を使用して、例えばコードする核酸からの発現によって、大量のポリペプチドおよびペプチドを産生させることができる。
【００４１】
ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドの生成方法は以下のステップを含む：
（ａ）  ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドをコードする核酸からの発現を引き起こし、それによりＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドを組換え的に産生させるステップ；および
（ｂ）  ＲＡＥＴ１Ｇ活性について組み換え産生ポリペプチドを試験するステップ。
【００４２】
好適な核酸配列としては、上記のＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドをコードする核酸配列が含まれる。
【００４３】
ポリペプチドは、コードする核酸からの発現による産生（これについては以下を参照のこと）後に、（例えば抗体などを使用して）単離および／または精製することができる。こうして、ポリペプチドを、（これが天然に存在するポリペプチドならば）天然に結合している不純物を含まないかまたは実質的に含まないで、提供することができる。ポリペプチドは、その他のポリペプチドを含まないか実質的に含まないで提供することができる。
【００４４】
ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドの精製を容易にするために、融合ポリペプチドを作製することができる。例えば、６個のヒスチジン残基を組換えタンパク質のＮ末端またはＣ末端のいずれかに組み込む。このようなヒスチジンタグは、ニッケルまたはコバルトのいずれかの金属イオンを含有する市販のカラム（Clontech, Palo Alto, CA, USA）を使用することによるタンパク質の精製のために使用することができる。
【００４５】
組換え産生させたポリペプチドを単離し、かつ／あるいは、ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドをこの受容体とともにインキュベート、および表面プラズモン共鳴を使用した結合親和性の定量によるＵＬ１６受容体および／またはＮＫＧ２Ｄ受容体との結合親和性の測定によって、ＲＡＥＴ１Ｇ活性について試験することができる。
【００４６】
上記の単離された核酸、例えばＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドをコードする核酸を、ベクター中に含めることができる。好適なベクターとして、プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および適当なその他の配列などの適切な調節配列を含むものを選定するか、またはそのように構築することができる。ベクターは適宜、プラスミド、ウイルス、例えばファージもしくはファージミドとすることができる。さらなる詳細については例えば以下を参照されたい：Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 第２版, Sambrook ら、1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press。例えば核酸構築物の調製、突然変異誘発、シーケンシング、細胞中へのＤＮＡの導入および遺伝子発現における核酸の操作、ならびにタンパク質の分析についての多くの公知の技法およびプロトコールが、以下に詳細に記載されている：Current Protocols in Molecular Biology, Ausubelら編, John  Wiley & Sons, 1992。
【００４７】
多岐にわたる各種宿主細胞中でのポリペプチドのクローニングおよび発現のためのシステムが周知である。好適な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物および酵母などの真核細胞、ならびにバキュロウイルスシステムが挙げられる。異種ポリペプチドの発現のための当該技術分野で利用可能な哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、仔ハムスター腎細胞、ＣＯＳ細胞およびその他多くが挙げられる。一般的な好ましい細菌宿主は大腸菌である。
【００４８】
本発明の別の態様では、上記のＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドをコードする異種核酸を含有する宿主細胞が提供される。
【００４９】
宿主細胞、特に癌細胞である宿主細胞は、例えば宿主生物中での癌細胞に対する免疫応答を刺激することにより、癌状態の治療に有用であるものと見られる。
【００５０】
核酸を宿主細胞のゲノム（例えば染色体）中に組み込むことができる。組み込みは、標準的な技法により、ゲノムとの組換えを促す配列を含めることによって、促進することができる。核酸は細胞内の染色体外ベクター上にあってもよい。
【００５１】
宿主細胞中への核酸の導入は、（特にｉｎ ｖｉｔｒｏ導入について）限定するものではないが一般的に「形質転換」と称されるものであるが、これにはあらゆる利用可能な技法を使用することができる。真核細胞については、好適な技法としては以下ものが挙げられる：リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、およびレトロウイルスその他のウイルス（例えばワクシニアもしくは昆虫細胞用のバキュロウイルス）を使用する形質導入。細菌細胞については、好適な技法として、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーションおよびバクテリオファージを使用するトランスフェクションが挙げられる。
【００５２】
当該技術分野で周知のように、目的の核酸を含有するクローンを特定する際に、抗生物質耐性または感受性遺伝子などのマーカー遺伝子を使用することができる。
【００５３】
導入の後、例えば宿主細胞（これらの細胞は形質転換された細胞の子孫である可能性が高いが、実際に形質転換された細胞も含まれる）を、該遺伝子を発現する条件下で培養することによって、該核酸の発現が引き起こされるかまたは可能となり、それによりコードされたポリペプチドが産生される。該ポリペプチドが適切なシグナルリーダーペプチドと組み合わせて発現される場合は、細胞から培養培地中に分泌される場合がある。
【００５４】
発現による産生後、ポリペプチドを場合に応じて宿主細胞および／または培地から単離し、かつ／あるいは精製し、ＲＡＥＴ１Ｇ活性について試験し、その後所望によって、例えば１種以上の別の成分を含有する組成物、１種以上の製薬上許容される賦形剤、ビヒクルまたは担体を含有する医薬組成物などの製剤化において使用することができる（例えば以下を参照のこと）。
【００５５】
他の実施形態では、例えば細胞表面で発現したポリペプチドを含んでなる宿主細胞を単離および／または精製し、そして例えば癌もしくは他のＲＡＥＴ１Ｇが媒介する状態の治療のための医薬組成物に製剤化することができる。
【００５６】
本発明の別の態様では、ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体が提供される。
【００５７】
抗体は、当該技術分野で標準的な技法を使用して取得することができる。抗体の生成方法には、該タンパク質またはその断片によって哺乳動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジまたはサル）を免疫することが含まれる。抗体は免疫した動物から当該技術分野で既知の多様な技法のいずれかを使用して取得し、かつ好ましくは対象となる抗原への抗体の結合性を使用して、スクリーニングすることができる。例えばウエスタンブロッティング法または免疫沈降を使用することができる（Armitageら、(1992) Nature 357, 80-82）。動物からの抗体および／または抗体産生細胞の単離には、その動物を屠殺するステップを伴う場合がある。
【００５８】
ペプチドによる哺乳動物の免疫の別法または補助法として、発現させた免疫グロブリン可変性ドメインの組換え産生ライブラリーから、例えば表面に機能的免疫グロブリン結合ドメインを呈示するラムダバクテリオファージまたは繊維状バクテリオファージを使用して、あるタンパク質に特異的な抗体を取得することができる。例えばＷＯ９２／０１０４７を参照されたい。ライブラリーはそのタンパク質（または断片）のいずれによっても免疫されたことがない生物から取得した配列から構築した、ナイーブな（naive）ものでもよく、あるいは目的の抗原に曝露した生物から取得した配列を使用して構築したものでもよい。
【００５９】
本発明の抗体は多数の方法で修飾することができる。実際、用語「抗体」は、必要な特異性がある結合ドメインを有するどんな結合性物質をも包含するものと解釈すべきである。例えば、本発明は、抗体断片、抗体の誘導体、機能的等価物および相同体を包含し、合成分子、および抗原もしくはエピトープとの結合が可能になるようにその形状が抗体のものを模倣している分子も含まれる。
【００６０】
ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドに特異的に結合する抗体は、例えば、個体が癌などの疾病状態にあるかどうかを判定するのに有用である。
【００６１】
本明細書で、ＲＡＥＴ１Ｇは正常組織では限られた発現を示すが、腫瘍、特に上皮由来の腫瘍では高レベルでの発現を示すことが明らかにされている。したがって、ＲＡＥＴ１Ｇは腫瘍の診断および進行度判断において腫瘍細胞マーカーとして有用であると見られる。
【００６２】
本明細書に提示するデータから、セリアック病ではＲＡＥＴ１Ｇの発現が小腸中で増大していることが示される。ＲＡＥＴ１Ｇの発現はクローン病などのその他の腸の炎症性疾患でも増大するようである。
【００６３】
個体での癌状態または炎症性疾患の特定方法は以下のステップを含む：
個体から取得したサンプル中のＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドの発現を判定するステップ。
【００６４】
対照と比較して試験サンプル中で増大したＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドの発現は、個体が該状態または疾患を有することの指標となり得る。
【００６５】
ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドの発現は、サンプル中のＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドの存在または量を確認することによって判定することができる。
【００６６】
本明細書中で、癌細胞はＲＡＥＴ１Ｇ転写産物を異なる様式でスプライシングして、末端切断されたＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドを産生するが、これはＲＡＥＴ１Ｇの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠損している（すなわち可溶性ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドである）ことが示される。
【００６７】
個体での癌状態の特定方法は以下のステップを含む：
個体から取得したサンプル中の可溶性ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドの発現を判定するステップ。
【００６８】
対照と比較して試験サンプル中で増大した可溶性ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドの発現は、個体が該状態または疾患を有することの指標となり得る。
【００６９】
可溶性ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドの発現は、サンプル中の可溶性ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドの存在または量を確認することによって判定することができる。
【００７０】
好適な対照は当業者に周知であり、例えば、健康な個体から取得したサンプルが挙げられる。健康な個体から取得したサンプルは、該状態を特定しようとしている個体とは別の個体から取得してもよいし、または同一の個体から異なる時点で取得したサンプルでもよい。
【００７１】
癌状態としては、例えばＴ細胞白血病などの白血病状態、または上皮癌が含まれるが、上皮癌としては、腎臓、肝臓、肺、食道、卵巣（漿液性癌）、皮膚の癌、子宮の内膜性癌および／または子宮の扁平上皮癌が挙げられる。炎症性疾患としてはセリアック病またはクローン病が挙げられる。
【００７２】
ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドの存在または量は、サンプルを本明細書に記載の抗体と接触させることによって、直接的に決定することができる。
【００７３】
可溶性ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドは、完全長ＲＡＥＴ１Ｇ配列のアミノ酸１−２１３を含んでなるかまたは該アミノ酸からなる。
【００７４】
サンプルは、例えば疾患または悪性腫瘍が疑われる組織由来の組織生検サンプルであるか、あるいは例えば血液、血清または血漿由来の生物学的液体サンプルである。生物学的サンプルは、場合によっては、抗体と接触させる前に濃縮および／または単離された細胞を含んでなる。
【００７５】
サンプル上での抗体の反応性は任意の適切な手段によって判定することができる。個々のレポーター分子によるタグ付けが、可能なものの１つである。レポーター分子は検出可能な、かつ好ましくは測定可能なシグナルを直接的または間接的に生成する。レポーター分子の連結は直接的または間接的なもので、例えばペプチド結合を介した共有結合、または非共有結合でもよい。ペプチド結合を介した連結は、抗体およびレポーター分子をコードする遺伝子融合物の組換え発現の結果であり得る。結合性を判定する様式は本発明の主眼ではなく、当業者はその好みおよび一般的知識にしたがって好適な様式を選択することができる。
【００７６】
例えば、抗体のＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドとの結合を判定および／または定量するためには、例えばＨＰＬＣまたはＥＬＩＳＡをはじめとする、種々の通常用いられる技法が利用可能である。
【００７７】
本明細書に記載する抗体は、本明細書に記載する方法を使用して個体の癌状態を検出するためのキットの成分にもなる。
【００７８】
他の実施形態では、サンプル中の可溶性ＲＡＥＴ１Ｇをコードする核酸のレベルを測定することによって、間接的に可溶性ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドの発現を判定することができる。
【００７９】
個体での癌状態を特定する方法は、以下のステップを含む：
個体から取得したサンプル中の可溶性ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドをコードする核酸の存在または量を確認するステップ。
【００８０】
可溶性ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドをコードする核酸は、図１のアミノ酸配列のＲＡＥＴ１Ｇ配列をコードする核酸を包含する。好適な核酸は例えば、図３の配列を含んでなるかまたは該配列からなるもの、あるいはそれらの対立遺伝子もしくは変異体である。
【００８１】
核酸、特にＲＮＡの存在もしくは量は、例えばＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロッティングをはじめとする、任意の都合のよい技法によって確認することができる。
【００８２】
本発明はまた、ＲＡＥＴ１Ｇのモジュレーターおよび／またはこれとＵＬ１６および／もしくはＮＫＧ２Ｄ受容体との相互作用のモジュレーター（例えばインヒビター）を取得するか、あるいは特定するための方法における、本明細書中に記載のＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドの使用をも包含する。
【００８３】
ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドのモジュレーターを取得および／または特定するための方法は：
（ａ）  ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドと試験化合物とを接触させるステップ；および
（ｂ）  ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドと試験化合物との相互作用を測定するステップ
を含む。
【００８４】
他の実施形態では、ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドのモジュレーターを取得および／または特定するための方法は：
（ａ）  試験化合物の存在下に、ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドと、ＵＬ１６またはＮＫＧ２Ｄポリペプチドとを接触させるステップ；および
（ｂ）  ＵＬ１６またはＮＫＧ２ＤポリペプチドとＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドとの間の相互作用を測定するステップ
を含む。
【００８５】
試験化合物の存在下および非存在下で、相互作用または結合性を測定することができる。試験化合物の非存在下と比較しての試験化合物の存在下での相互作用または結合性における差は、該試験化合物がＲＡＥＴ１Ｇ活性のモジュレーターであることの指標となる。
【００８６】
ポリペプチドを、該ポリペプチドが試験化合物の非存在下で互いに相互作用または結合する条件で、接触させてもよい。ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドはその反応培地中、単離された形態でもよいが、細胞膜上に含まれていてもよい。
【００８７】
本明細書に記載するＲＡＥＴ１Ｇモジュレーターを取得または特定するための方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ細胞ベースアッセイでも、ｉｎ ｖｉｔｒｏ非細胞ベースアッセイでもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイでは、ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドを単離し、固体の支持体上に固定するか、膜上に含ませる場合がある。ｉｎ ｖｉｖｏアッセイのための好適な細胞タイプとしては、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＣＯＳ細胞などの哺乳動物細胞が挙げられる。
【００８８】
本明細書に記載する方法の厳密な形式は、当業者が日常用いる技能および知識を使用して変更することができる。
【００８９】
本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイのためには、完全長ＲＡＥＴ１Ｇ、ＵＬ１６またはＮＫＧ２Ｄポリペプチドの全体を使用する必要はない。当業者に公知のいずれかの好適な方法により、完全長タンパク質の活性を保持する本明細書に記載のポリペプチド断片を作製して、そして使用することができる。
【００９０】
例えば、ＲＡＥＴ１ＧポリペプチドまたはＵＬ１６とＮＫＧ２Ｄ受容体の一方もしくは両方を固体支持体に固相化し、その後他方と接触させることによって、結合親和性をｉｎ ｖｉｔｒｏで研究することができる。結合親和性は、次に表面プラズモン共鳴などの標準的な技法によって測定することができる。ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドまたは受容体を検出可能な標識で標識してもよい。好適な検出可能な標識としては３５Ｓ−メチオニンが挙げられ、これを組換え産生ペプチドおよびポリペプチドに取り込ませることができる。組換え産生させるペプチドおよびポリペプチドは、抗体で標識することが可能なエピトープを含有する融合タンパク質として発現させることもできる。
【００９１】
本明細書に記載する方法を、例えば酵母または哺乳動物細胞株などの細胞株中、ｉｎ ｖｉｖｏで実施することができる。この場合、当該ポリペプチドまたはペプチドを、該細胞中に導入された１種以上のベクターから発現させる。
【００９２】
試験化合物がＲＡＥＴ１ＧポリペプチドとＵＬ１６もしくはＮＫＧ２Ｄポリペプチドとの間の相互作用をモジュレートする能力は、いわゆるツーハイブリッドアッセイを使用して測定することができる。例えば、場合に応じて、ＲＡＥＴ１ＧポリペプチドまたはＵＬ１６もしくはＮＫＧ２Ｄポリペプチドの断片を含有するポリペプチドまたはペプチド、あるいは開示したそれらのペプチジルアナログまたは変異体を、酵母転写因子ＧＡＬ４のものなどの核酸結合性ドメインと融合させることができる。ＧＡＬ４転写因子は２つの機能性ドメインを含んでなる。これらのドメインとは、ＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４ＤＢＤ）およびＧＡＬ４転写活性化ドメイン（ＧＡＬ４ＴＡＤ）である。一方のポリペプチドまたはペプチドをこれらのドメインの一方に融合させ、そして他方のポリペプチドまたはペプチドを対応する相手方に融合させることによって、対象となる２つのポリペプチドまたはペプチドが相互作用する場合にのみ、機能的ＧＡＬ４転写因子が復元される。こうして、ポリペプチドまたはペプチドの相互作用を、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合サイト（該レポーター遺伝子の転写を活性化させることができる）に連結可能なレポーター遺伝子の使用によって、測定することができる。このアッセイ形式は以下の文献に記載されている：Fields and Song, 1989, Nature 340; 245-246。このタイプのアッセイ形式は、哺乳動物細胞および酵母の両方で使用することができる。
【００９３】
核酸結合性ドメインと転写活性化ドメインの他の組み合わせが当該技術分野で利用可能であるが、ＬｅｘＡのＤＮＡ結合ドメインとＶＰ６０転写活性化ドメインなどが好ましい。
【００９４】
一部の実施形態では、ＲＡＥＴ１Ｇ、ＵＬ１６もしくはＮＫＧ２Ｄポリペプチドまたはペプチドを（例えば）ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインとの融合物として用い、そしてその相手方、（例えば）ＵＬ１６、ＮＫＧ２ＤもしくはＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドまたはペプチドを（例えば）ＶＰ６０との融合物として使用し、そして第３の発現カセットを含める。これは別個の発現ベクター上のものでもよく、ここから、ペプチド、あるいは多様かつ／またはランダムな配列のペプチドのライブラリーを発現させることができる。レポーター遺伝子発現の低下（例えばβガラクトシダーゼの場合、青色の減弱）は、（例えば）ＲＡＥＴ１Ｇ／受容体の相互作用を阻止するペプチドの存在の結果である。なぜならば、βガラクトシダーゼ遺伝子の転写活性化には相互作用が必要とされるからである。試験物質がペプチジルではなく、前記第３の発現カセット内のコード核酸から発現しない場合は、外因性にもたらされる試験物質を用いる同様のシステムを使用することができる。
【００９５】
ツーハイブリッドアッセイを使用して２つのポリペプチドまたはペプチド間の相互作用を妨害する物質を探索する場合には、酵母細胞ではなく、哺乳動物細胞を使用するのが好ましいようである。この場合も同一の原理があてはまり、また適切な方法は当業者に周知である。
【００９６】
ＲＡＥＴ１Ｇ、ＵＬ１６および／またはＮＫＧ２Ｄポリペプチドはある細胞または種々の細胞群の上および／または中に存在していてよい。これは例えば形質転換によって細胞中に導入された１以上の発現ベクターから該ポリペプチドを発現させることによって、達成することができる。
【００９７】
好適なＵＬ１６ポリペプチドとしては、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ＵＬ１６（登録番号ＡＹ２９７４４５）またはその変異体、相同体、突然変異体、対立遺伝子もしくは誘導体が挙げられる。ＵＬ１６の変異体、対立遺伝子、誘導体、相同体、または突然変異体は、ＨＣＭＶ ＵＬ１６の配列との約７０％を超える、約８０％を超える、約９０％を超える、または約９５％を超える配列同一性を有する配列からなるものとすることができる。
【００９８】
好適なＮＫＧ２Ｄ受容体としては、ヒトＮＫＧ２Ｄ受容体（登録番号ＡＦ４８１８１１）またはその変異体、相同体、突然変異体、対立遺伝子もしくは誘導体が挙げられる。ＮＫＧ２Ｄの変異体、対立遺伝子、誘導体、相同体、または突然変異体は、ヒトＮＫ細胞ＮＫＧ２Ｄ受容体の配列と約７０％を超える、約８０％を超える、約９０％を超える、または約９５％を超える配列同一性を有する配列からなるものとすることができる。
【００９９】
本発明のアッセイに添加することができる試験物質または化合物の量は、通常、使用する化合物のタイプに応じて試行錯誤によって決定されるであろう。典型的には、約０．００１ｎＭから１ｍＭまたはそれより大きな濃度、例えば０．０１ｎＭ〜１００μＭ、例えば０．１〜５０μＭ、約１０μＭなどの推定上のインヒビター化合物を使用することができる。細胞ベースのアッセイを使用する場合、試験物質または化合物はＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドに到達できるように、望ましくは膜透過性である。
【０１００】
試験化合物は薬物スクリーニングプログラムで使用される天然または合成化合物とすることができる。特性決定されているか特性決定されていない数種類の成分を含有する植物抽出物を使用することもできる。
【０１０１】
コンビナトリアルライブラリー技術（Schultz, (1996) Biotechnol. Prog. 12, 729-743）では、ポリペプチドの活性をモジュレートする能力について、潜在的に膨大な数の異なる物質を試験するための、効率的な方法が提供されている。
【０１０２】
試験化合物の１つのクラスを、ＲＡＥＴ１Ｇ、ＵＬ１６および／またはＮＫＧ２Ｄポリペプチドから誘導することができる。５〜４０アミノ酸、例えば６〜１０アミノ酸の膜透過性ペプチド断片を、かかる相互作用または活性をモジュレートするそれらの能力について試験することができる。
【０１０３】
ペプチドは、十分確立された、標準的な液相、または好ましくは固相ペプチド合成方法にしたがって、完全または部分的に化学合成によって生成することもできる。一般的な説明については、広く入手可能である（例えば以下のものを参照のこと：J.M. Stewart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 第２版, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984）, in M. Bodanzsky and A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984）; および Applied Biosystems 430A Users Manual, ABI Inc., Foster City, California）。ペプチドは溶液中で、液相方法によるか、または固相、液相および溶液化学のいずれかの組み合わせにより調製することができる。例えば、最初に各々のペプチド部分を完成させ、次に、所望かつ適切ならば存在する保護基の除去後、各々の炭酸もしくはスルホン酸またはそれらの反応性誘導体の反応によって残基Ｘを導入することによる。ペプチドのモジュレーター特性は、Ｃ末端への以下の基の１つの付加によって強化することができる：クロロメチルケトン、アルデヒドおよびボロン酸。これらの基はセリン、システインおよびトレオニンプロテアーゼのための遷移状態アナログである。ペプチド断片のＮ末端をカルボベンジルでブロックすることによって、アミノペプチダーゼを阻害し、安定性を改善することができる（Proteolytic Enzymes, 第２版, R. Beynon and J. Bond編, Oxford University Press 2001）。
【０１０４】
特定の分子形状、サイズおよび荷電特性を有する潜在的インヒビター化合物を提供するために、他のモジュレーター化合物候補を、ポリペプチドまたはペプチド断片の三次元構造のモデリングおよび理論的薬物設計の使用に基づくものとしてもよい。これについて以下にさらに詳細に記載する。
【０１０５】
ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドに対する抗体は別のクラスの推定上のモジュレーター化合物を形成することができる。候補抗体を特性決定し、それらの結合領域を決定して、相互作用のモジュレーションを担う単鎖抗体およびそのフラグメントを提供することができる。
【０１０６】
上記の方法を使用して化合物を同定後、該化合物を単離し、かつ／または合成することができる。
【０１０７】
ＲＡＥＴ１Ｇおよび／またはＵＬ１６もしくはＮＫＧ２Ｄなどの受容体と相互作用し、かつ／あるいはＲＡＥＴ１Ｇの活性をモジュレートする能力を有するとして、１種以上の一次スクリーニングを用いて（例えば無細胞系で）特定された薬物について、さらに１種以上の二次スクリーニングを用いて評価または研究することができる。例えば生物学的活性を、ＮＫ細胞の細胞毒性アッセイで試験することができる。ＲＡＥＴ１Ｇの活性をモジュレートすることが見出された試験化合物を、ＮＫ細胞の細胞毒性を阻害する活性について試験することができる。
【０１０８】
上記の通りに化合物を特定した後、方法として、製薬上の特性を最適化するための化合物の修飾がさらに含まれる場合がある。
【０１０９】
生物学的に活性であるとして特定された「リード」化合物の修飾は製薬の開発のための公知のアプローチであり、活性化合物の合成が困難または高価であるか、あるいは特定の投与方法には不適当である場合（例えば、ペプチドは消化管内でプロテアーゼによって迅速に分解される傾向にあるので、経口組成物のための活性成分としてはあまり好適でない）には、望ましいものである。標的とする特性について多数の分子をランダムにスクリーニングすることを回避するため、公知の活性化合物の（例えば模倣体を製造するための）修飾を使用することができる。
【０１１０】
製薬上の特性を最適化するための「リード」化合物の修飾は、通常いくつかのステップを含む。最初に、標的特性を確認するのに決定的かつ／または重要な、その化合物の特定の部分を決定する。ペプチドの場合、これは、該ペプチド内のアミノ酸残基の体系的変換により、例えば個々の残基を順に置換することにより実施することができる。該化合物の活性領域を構成するこれらの部分または残基は、「薬理作用団」として知られている。
【０１１１】
薬理作用団が明らかになった後、その構造を、一連の情報源（例えば分光分析、Ｘ線回折データおよびＮＭＲ）からのデータを使用し、例えば立体化学構造、結合性、サイズおよび／または荷電などの物理学的性質にしたがってモデル化する。
【０１１２】
このモデル化プロセスでは、コンピュータ解析、類似性マッピング（原子間の結合ではなく、薬理作用団の荷電および／または体積をモデル化するもの）その他の技法を使用することができる。
【０１１３】
このアプローチの変法では、リガンドおよびその結合相手の三次構造をモデル化する。これは、そのリガンドおよび／または結合相手が結合時にコンホメーションを変化させる場合に特に有用であり、これによりリード化合物の最適化の際に該モデルがこれを考慮に入れることが可能になる。
【０１１４】
次に薬理作用団を模倣する化学基をグラフトすることが可能な鋳型分子を選択する。鋳型分子およびそれにグラフトする化学基は、リード化合物の生物学的活性を維持したままで、修飾化合物が合成し易く、おそらく薬理学的に許容され、かつｉｎ ｖｉｖｏで分解しないものとなるように、都合よく選択することができる。このアプローチによって見出された修飾化合物をその後スクリーニングして、それらが標的特性を持つかどうか、またはそれをどの程度まで発揮するかを明らかにすることができる。修飾化合物にはリード化合物のミメティクスも含まれる。
【０１１５】
次に、さらに最適化または修飾を実施することによって、ｉｎ ｖｉｖｏまたは臨床試験のための１種以上の最終化合物に到達することができる。
【０１１６】
試験化合物を製造するか、かつ／または医薬、医薬組成物もしくは薬物などの組成物の調製（すなわち製造または製剤化）において使用することができる。これらは、例えば本明細書で別記する目的のいずれかのために、個体に投与することができる。
【０１１７】
本発明の方法には、前記試験化合物を以下に記載する製薬上許容される賦形剤、ビヒクルまたは担体とともに医薬組成物中に製剤化することが含まれる。
【０１１８】
本発明の別の態様では、以下のステップを含む医薬組成物の製造方法が提供される：
ｉ）本明細書に記載の方法を使用して、ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドの活性をモジュレートする化合物を特定するステップ；および
ｉｉ）特定された化合物を製薬上許容される担体と混合するステップ。
【０１１９】
組成物と製薬上許容される担体との製剤化については以下にさらに記載する。
【０１２０】
本発明の別の態様では、例えばＲＡＥＴ１Ｇに媒介される状態の治療のための医薬組成物の調製方法が提供され、該方法は以下のステップを含む：
ｉ）ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである化合物を特定するステップ；
ｉｉ）特定された化合物を合成するステップ；および
ｉｉｉ）該化合物を医薬組成物中に組み込むステップ。
【０１２１】
特定された化合物は、通常用いられる化学的合成方法論を使用して合成することができる。合成経路の開発および最適化の方法は当業者に周知である。
【０１２２】
化合物は上記のようにして修飾および／または最適化することができる。
【０１２３】
化合物の医薬組成物への組み込みには、合成された化合物と製薬上許容される担体または賦形剤を混合することが含まれる。
【０１２４】
本発明の別の態様では、本明細書に記載する方法によって単離および／または取得される、ＲＡＥＴ１Ｇ活性のモジュレーター（例えばインヒビター）またはかかるモジュレーターを含んでなる組成物が提供される。
【０１２５】
好適なモジュレーターとしては、上記のような低分子量化学物質、ペプチド断片、抗体またはミメティクスが挙げられる。
【０１２６】
本発明の別の態様では、本明細書に記載のモジュレーターおよび製薬上許容される賦形剤、ビヒクルもしくは担体を含んでなる医薬組成物が提供される。
【０１２７】
本発明の別の態様では、ヒトまたは動物身体の治療における使用のための、上記のようなＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドもしくはその断片、またはＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドもしくはその断片をコードする核酸、あるいは抗体、細胞またはモジュレーターが提供される。
【０１２８】
本発明の別の態様では、ＲＡＥＴ１Ｇにより媒介される障害を有する個体の治療用の組成物の製造における、ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドもしくはその断片、ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドもしくはその断片をコードする核酸、本明細書に記載の抗体、本明細書に記載の宿主細胞、または本明細書に記載の方法によって取得されるモジュレーターの使用が提供される。
【０１２９】
ＲＡＥＴ１Ｇにより媒介される障害としては、病原体感染症、癌状態または免疫障害が挙げられる。
【０１３０】
病原体感染症としては、結核菌もしくは大腸菌感染症などの細菌感染症、またはヒトサイトメガロウイルス感染症などのウイルス感染症が挙げられる。
【０１３１】
癌状態としては、肺癌、消化管癌、腸癌、結腸癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、肝臓癌、腎臓癌、膀胱癌、膵臓癌、脳腫瘍、肉腫、骨肉腫、カポジ肉腫、黒色腫、リンパ腫または白血病が挙げられる。
【０１３２】
免疫系の状態としては、セリアック病、関節リウマチ、狼蒼、強皮症、シェーグレン症候群および多発性硬化症などの自己免疫疾患、糖尿病、または炎症性腸症候群、潰瘍性大腸炎およびクローン病などの炎症性腸疾患が挙げられる。拒絶を低減または防止することもまた、移植手術を受けた患者にとっては有用である。
【０１３３】
個体に与えるものが本発明の細胞、ポリペプチド、抗体、ペプチド、核酸分子、小分子または医薬として有用なその他の化合物のいずれであっても、投与は好ましくは「予防上有効量」または「治療上有効量」（場合に応じる、ただし、予防は治療とみなすこともできる）とし、この量は個体に利益を与えるのに十分なものである。投与する実際の量、ならびに投与の速度および経時変化は、治療する対象の性質および重篤度によって変わるであろう。治療の処方、例えば投与量その他の決定は一般的実務者その他の医師の責任の範囲内である。
【０１３４】
組成物は、治療対象の状態に応じて、単独で、または他の治療と組み合わせて同時もしくは順次的に、投与することができる。
【０１３５】
本発明の医薬組成物、および本発明にしたがった使用のための医薬組成物は、活性成分に加えて、製薬上許容される賦形剤、担体、バッファー、安定剤その他の当業者に周知の物質を含有しうる。かかる物質は無毒でなければならず、また活性成分の効力を妨害するものであってはならない。担体その他の物質の厳密な性質は投与経路によって変わるであろう。投与経路は、経口、または注射（例えば経皮、皮下もしくは静脈注射）によるものであり得る。
【０１３６】
経口投与用の医薬組成物は錠剤、カプセル、粉末または液状形態とすることができる。錠剤にはゼラチンなどの固体担体またはアジュバントを含有させることができる。液状医薬組成物には一般的に水、石油、動物もしくは植物油、鉱物油または合成油などの液状担体を含有する。生理食塩溶液、デキストロースその他の糖類溶液またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールを含有させることもできる。
【０１３７】
静脈内、皮膚もしくは皮下注射、または患部への注射については、活性成分はパイロジェンフリーであり、かつ好適なｐＨ、等張性および安定性を有する、非経口的に許容される水溶液の形態とする。当業者は、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、または乳酸加リンゲル注射液などの等張ビヒクルを使用して、好適な溶液を調製する能力が十分ある。必要に応じて、防腐剤、安定剤、バッファー、抗酸化剤および／またはその他の添加剤を含有させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１３８】
ここで本発明の態様を、例として、限定を含まず、以下に説明する添付図面および実験例を参照して説明する。当業者にはこれ以外の態様および実施形態が明らかであろう。本明細書中に示すすべての文献は参照により本明細書中に組み入れるものとする。
【０１３９】
図１は、ＲＡＥＴ１Ｇ２ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
図２は、ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドのアミノ酸配列を示す。 
図３は、ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドの完全長アミノ酸配列をコードする核酸配列を示す（コード配列（ＣＤＳ）ヌクレオチド６９−１０７２）。 
図４は、図１に示した配列のアミノ酸残基１−２１４からなる、オルタナティブスプライシングを受けたＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドをコードする核酸配列を示す（コード配列はｎｔ１−６４２）。 
図５は、染色体６ｑ２４．２−ｑ２５．３上のＲＡＥＴ１クラスター中の発現遺伝子の配置を示す。 
図６は、マウスおよびヒトＮＫＧ２Ｄリガンドの系統樹を示す。マウスリガンドは接頭字「ｍ」によって特定される。 
図７は、ＲＡＥＴ１Ｇ、ＵＬＢＰ２、ＲＡＥＴ１Ｅ、およびＵＬＢＰ３の配列アライメントを示す。推定上のＴＭ領域は太字とし、シグナルペプチド配列には下線を付してある。記号は以下を表す：提案上のαヘリクス（黒色円筒）、３１０ヘリクス（灰色円筒）およびβストランド（灰色矢印）。 
図８は、ＲＡＥＴ１ＧおよびＲＡＥＴ１Ｇ２のエクソン構造を示す。 
図９は、ＣＯＳ−７細胞中のＲＡＥＴ１タンパク質の細胞表面発現を示す。左から右へ：擬トランスフェクト細胞、ＵＬＢＰ２、ＲＡＥＴ１ＧおよびＲＡＥＴ１Ｅトランスフェクト細胞。上段パネルではＦＩＴＣアイソタイプ対照で、下段パネルでは抗ｆｌａｇ抗体で染色されている。 
図１０は、抗ｆｌａｇ抗体で染色したトランスフェクト細胞を表示するヒストグラムを示す：細胞のみ（黒色実線）、ＵＬＢＰ２（灰色実線）、ＲＡＥＴ１Ｇ（灰色点線）およびＲＡＥＴ１Ｅ（黒色点線）。 
図１１は、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ細胞と、ＣＯＳ−７細胞で表面発現したＲＡＥＴ１との結合性を示す。左から右へ：擬トランスフェクト細胞、ＵＬＢＰ２、ＲＡＥＴ１ＧおよびＲＡＥＴ１Ｅトランスフェクト細胞。上段パネルではＦＩＴＣアイソタイプ対照で、下段パネルではＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−抗ヒトＦｃ−ＦＩＴＣで染色されている。 
図１２は、ＮＫＧ２Ｄで染色したトランスフェクト細胞を表示するヒストグラムを示す：細胞のみ（黒色実線）、ＵＬＢＰ２（灰色実線）、ＲＡＥＴ１Ｇ（灰色点線）およびＲＡＥＴ１Ｅ（黒色点線）。 
図１３は、新規ＲＡＥＴ１分子でトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の、異なるエフェクター：標的比での比溶解％を示す。トランスフェクト細胞を、ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫＧ２Ｄ＋ヒトナチュラルキラーリンパ球（黒色四角）またはＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫＧ２Ｄ＋ヒトナチュラルキラーリンパ球およびＮＫＧ２Ｄ特異的モノクローナル抗体（白色円）のいずれかとともにインキュベートした。ＲＡＥＴ１Ｅ、最上段パネル；ＲＡＥＴ１Ｇ、中段パネル；ベクターのみ、下段パネル。 
図１４は、速度論的解析で使用したＢＩＡＣｏｒｅプロットを示す。パネル１および２は、示した希釈率での、ＮＫＧ２Ｄ−ＦｃへのＲＡＥＴ１ＧおよびＲＡＥＴ１Ｅそれぞれの結合性を示す。パネル３および４は、ＵＬ１６−ＦｃへのＲＡＥＴ１ＧおよびＲＡＥＴ１Ｅの結合性を示す。
【０１４０】
表１は、ヒトＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰタンパク質のＮＫＧ２ＤおよびＵＬ１６との結合性についての、速度論的結合性データを示す。 
表２は、マウスおよびヒトＮＫＧ２Ｄリガンドについての公開されたデータのまとめを示す。 
表３は、組織マイクロアレイの組成を示す。ドナーサンプルの数をカッコ内に示す。 
表４は、腫瘍組織でのＲＡＥＴ１Ｇ染色の分布を示す。
【実施例】
【０１４１】
実験
材料および方法
ＵＬＢＰファミリーの分子クローニング
ＥＳＴ配列（ＡＷ５１０７３７、ＢＥ７１１１１２、ＢＦ５１３８６１）およびゲノムＤＮＡ（コンティグ  ＮＴ＿０２３４５１．１０）のアライメントによって、ＲＡＥＴ１Ｇの５’末端を予測した。予測された配列は２つのＩＭＡＧＥクローン（３０７０７３０および２９１１８５５）とマッチした。ＩＭＡＧＥクローン３０７０７３０は末端切断された３’末端を有し、停止コドンを欠いていた。ＥＳＴ ＡＡ５８３８６０から正しい３’末端を予測し、ＰＣＲによって確認した。Ｓｉｇｎａｌ ＰＶ１．１を用いてシグナルペプチドを予測し、予測した膜貫通領域をＴＭｐｒｅｄによって検出した（K. Hofmann & W. Stoffel (1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374,166）。エクソン構造を、ＧＣＧプログラム（Wisconsin package）ｖｅｒｓｉｏｎ １０．３を用いて解析した。
【０１４２】
ＲＡＥＴ１Ｌ（ＮＭ＿１３０９００．１）、ＲＡＥＴ１Ｅ（ＡＹ１７６３１７）、ＲＡＥＴ１Ｇ（ＡＹ１７２５７９）、ＵＬＢＰ１（ＮＭ＿０２２５２１８．１）、ＵＬＢＰ２（ＮＭ＿０２５２１７．２）、ＵＬＢＰ３（ＮＭ＿０２４５１８．１）、ＭＩＣＡ（ＢＣ０１６９２９）、ＭＩＣＢ（ＮＭ＿００５９２２．１）およびＭＵＬＴ１（ＡＫ０２０７８４）の全体的アミノ酸配列または局部ドメインに基づき、ＣｌｕｓｔａｌＷ（Higgins Dら (1994) Nucleic acids Res. 22:4673-4680）およびＰｉｌｅＵｐを使用して、アライメントを実施した。プログラムＭＥＧＡ ｖｅｒｓｉｏｎ２．１（Kumar, S.ら (2001). Bioinformatics, 17, 1244-5）によって、ＵＰＧＭＡ（相加平均による単純グループ対比法）系統樹を構築した。１回について１０００サンプルに基づくブートストラップ検定によって、分枝の正当性を評価した。
【０１４３】
Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅクローンコレクション（HGMP, Hinxton, Cambs, UK）から以下のクローンを取得した：ＲＡＥＴ１Ｇ: ＩＭＡＧＥ番号３０７０７３０、２９１１８５５、ＲＡＥＴ１Ｅ：３４６４６３７、ＵＬＢＰ２：４７４７１２６（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＢＦ５１３８６１、ＡＷ ５１０７３７、ＢＥ５４５４０１、ＢＧ６７５５９０）。
【０１４４】
ＢｉｇＤｙｅおよびＡＢＩ３７７シーケンサーを使用して、ＤＮＡシーケンシングを実施した。分析にはＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｎａｖｉｇａｔｏｒソフトウェアを使用した。完全長受容体構築物をＦｌａｇエピトープ融合物としてベクターｐ３ＸＦＬＡＧ−ＣＭＶＴＭ−９（Sigma）中にクローニングした。Ｔｏｐｏクローニングキット（Invitrogen）および製造元の説明書を使用して、ＰＣＲ断片のＴｏｐｏクローニングを実施した。
【０１４５】
ＲＴ−ＰＣＲ
組織分布を決定するために使用したＰＣＲプライマー：
１Ｇ      Ｆｏｒ      ５’  ＡＧＣＣＣＣＧＣＧＴＴＣＣＴＴＣＴＡ
Ｒｅｖ      ５’  ＴＧＴＡＴＡＣＡＡＧＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＣ
１Ｅ      Ｆｏｒ      ５’  ＴＡＴＣＣＣＴＧＡＣＴＴＣＴＡＧＣＣＣＴ
Ｒｅｖ      ５’  ＧＣＣＡＣＴＣＡＣＣＡＴＴＴＴＧＣＣＡＣ
ＧＡＰＤＨ  Ｆｏｒ      ５’  ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ
Ｒｅｖ      ５’  ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ
【０１４６】
細胞株ＲＮＡについては以前に記載されたようにして作製した（Allcockら、(2003) Eur. J. Immunol. 33, 567-577）。産物の予測サイズは以下の通りである：ＲＡＥＴ１Ｇについて９３５ｂｐ、ＲＡＥＴ１Ｇ２について８３５ｂｐ、およびＲＡＥＴ１Ｅについて８１０ｂｐ。各ｃＤＮＡについて対照反応としてＧＡＰＤＨを使用した。
【０１４７】
トランスフェクションおよびフローサイトメトリー
リポフェクトアミン２０００（Invitrogen）および製造元の標準的プロトコールを使用して、ＣＶ−１細胞およびＭＤＣＫ細胞への一過性トランスフェクションを実施した。続いて、細胞増殖培地に１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Gibco）を添加することによるＧ４１８耐性細胞の選別によって、ＭＤＣＫおよびＣＶ１細胞の安定発現細胞株を得た。
【０１４８】
Ｂｅｃｔｏｎ ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ装置でフローサイトメトリーを実施した。完全長受容体の検出は、ＦＩＴＣとコンジュゲート化したＦＬＡＧ（登録商標）エピトープに対するモノクローナル抗体（Sigma）により行った。ＮＫＧ２Ｄの結合性の検出は、ヒトＦｃ融合物により、抗ヒトＩｇＧ ＦＩＴＣコンジュゲート化ポリクローナル抗体（Dako）を使用して行った。
【０１４９】
ＮＫ細胞の細胞毒性アッセイ
単核細胞の標準的Ｆｉｃｏｌｌ単離を使用して末梢血からヒトナチュラルキラー（ＮＫ）リンパ球を単離し、続いて抗ＣＤ３−ＦＩＴＣおよび抗ＣＤ５６−ＣｙＣｈｒｏｍｅ（Becton Dickinson UK）モノクローナル抗体で染色した。染色された細胞をＭｏＦｌｏセルソーター（Cytomation）で分析し、ＣＤ３−ＣＤ５６＋リンパ球集団を単離した。これらの細胞を、ペニシリンおよびストレプトマイシン、１０％ヒトＡＢ血清ならびに１００Ｕ／ｍｌ組換えインターロイキン−２を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で、３７℃、５％ＣＯ２にて３日間、インキュベートした。フローサイトメトリー分析で、このＮＫ細胞のポリクローナル集団が一様にＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫＧ２Ｄ＋であることが証明された。
【０１５０】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ非放射性細胞毒性アッセイ（Sheehyら、(2001) J. Imunological Methods 249, 99-110）によって、新規ヒトＲＡＥＴ１分子がナチュラルキラー細胞媒介溶解を誘発する能力を評価した。自発的放出を測定するために、標識した標的細胞のみの４ウェルを設け、各標識標的細胞について、エフェクターと標的の種々の比率で２組ずつ評価した。モノクローナル抗体のブロッキングのために、ＮＫＧ２Ｄ特異的モノクローナル抗体の存在下でＮＫ細胞エフェクターを３０分間室温でインキュベートした後、標識した標的細胞を添加した。次に、エフェクターと標的細胞の各比率についての比溶解パーセントを、比溶解％＝１００−残存％を使用して算出した。
【０１５１】
組換えタンパク質の生成
ＵＬＢＰおよびＲＡＥＴ１Ｅ／Ｇの細胞外ドメインの可溶性組換え型を６−ヒスチジンＮ末端融合物として産生させた。これらは、ｐＧＭＴ７（Vales-Gomez ら、(1999) EMBO J. 18, 4250-4260）から誘導したベクターであるｐＴ７Ｈｉｓを使用して、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）中の封入体として生成し、６Ｍグアニジン塩酸塩で不溶性タンパク質を抽出した。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Qiagen）を使用し、ＰＢＳに連続希釈した後、ＰＢＳ＋２５０ｍＭイミダゾールを使用して溶出させることによって、精製およびｉｎ ｓｉｔｕ再フォールディングを実施した。リン酸カルシウムトランスフェクションを使用して、２９３Ｔ細胞からＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ融合タンパク質を生成した。融合はｐＣＤＮＡ３．０において、ヒトＩｇＧ１ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインに対してＣ末端で行った。ＵＬ１６Ｆｃ融合物は、ＳｉｇｎａｌｐＩｇｐｌｕｓ（Sigma）中、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２−ＣＨ３に対するＮ末端融合物として生成した。プロテインＡセファロース（登録商標）（Pharmacia）を使用して、組換えタンパク質を精製した。すべての場合において、溶出したタンパク質を、粗粒ゲルろ過マトリックス（ＰＤ１０カラム、Pharmacia）を通過させることによって、ＰＢＳに移した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析で、発現したＦｃ融合物の完全性を確認した。Ｌａｅｍｍｌｉのプロトコールに基づく１２％アクリルアミドゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、Ｈｉｓタグ付きタンパク質のＭＷおよび純度を確認した。ウエスタンブロッティングは、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐメンブレン（Milllipore）へのウェットブロットトランスファーとして実施した。検出では抗ヒト−ＦｃＨＲＰコンジュゲート化抗体（Dako）を使用した。
【０１５２】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
ＢＩＡＣｏｒｅ２０００装置でＳＰＲを実施した。ランニングバッファー、センサーチップおよび表面カップリング試薬はＢＩＡＣｏｒｅのものとした。ＮＨＳ／ＥＤＣ化学反応を使用して、抗ヒトＩｇＧ（Dako）をＣＭ５表面にカップリングさせた。次にこの表面を、Ｆｃ融合によりＮＫＧ２ＤおよびＵＬ１６結合のために使用した。１．５μｇのＮＫＧ２ＤもしくはＵＬ１６−Ｆｃ融合物、またはＦｃ−非融合対照を抗ＩｇＧに結合させた後、サンプルを２０μｌ／分で注入した。表面の再生には１０ｍＭ ＨＣｌ ５μｌを使用した。各ＵＬＢＰの希釈系列をＮＫＧ２Ｄ、ＵＬ１６およびＦｃ対照に適用し、結合のレベルを測定した。各測定のために、ＮＫＧ２Ｄ、ＵＬ１６およびＵＬＢＰ／ＲＡＥＴ１タンパク質についてそれぞれ２つの別個のバッチを使用したが、各バッチから同等のデータが得られた。ＢＩＡＥｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．１ソフトウェアを使用して、速度論的解析を実施した。各ＮＫＧ２Ｄリガンド希釈系列について、解離速度計測および統合グローバルフィッティングを実行した。
【０１５３】
抗体の製造
ＲＡＥＴ１Ｇに対するポリクローナル抗体を、該タンパク質の細胞質ドメインの一部分に相当する２種類のペプチドを使用して、ウサギで生起させた。ペプチドは以下のものである：
（ｉ）  ＣＮＮＧＡＡＲＹＳＥＰＬＱＶＳＩＳ；  および
（ｉｉ）  ＣＳＨＧＨＨＰＱＳＬＱＰＰＰＨＰＰ
【０１５４】
ペプチドを製造し、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ（University of Southampton, UK）のオボアルブミンにカップリングさせた。Ｈａｒｌａｎ Ｓｅｒａｌａｂｓ（Place, UK）から入手したウサギにおいて、オボアルブミンと別々にカップリングさせた両方のペプチドの組み合わせを使用して、抗血清を生起させた。カプリル酸／硫酸アンモニウム沈殿法によって、このポリクローナル抗体を精製した。
【０１５５】
モノクローナル抗体を取得するため、６−Ｈｉｓタグ付き組換えＲＡＥＴ１Ｇを使用して、マウスを免疫した。免疫クールの経過後、マウス脾臓の融合体からハイブリドーマクローンを取得した。これらのクローンを最初にＥＬＩＳＡによって活性についてスクリーニングした。次にこれらを、ウエスタンブロットによる免疫源の検出能力について、スロットブロットによってスクリーニングした。最初のクローニングステップからＲＡＥＴ１Ｇに対する優良な抗血清が得られ、これはＥＬＩＳＡにより良好な応答をもたらし、かつＫ５６２（赤白血病）およびＨＴ１０８０（線維肉腫）細胞株由来の溶解物についてのウエスタンブロットにより５０ｋＤａ（ＲＡＥＴ１Ｇの予想分子量）のバンドを示すものである。このことは、この抗体の特異性を示している。
【０１５６】
免疫組織化学
２種類のパラフィンワックス組織マイクロアレイ（Kononen J. ら、Nat Med 1998; 4:844-847）上で、免疫組織化学試験を実施した。第１は、指示通りの組織選択を使用して調製し（Simon R.ら、Biotechniques 2004;36: 98-105）、各ホルマリン固定ドナー組織からの２×０．６ｍｍ直径のコアをレシピエントアレイに移した。大部分が正常組織である該マイクロアレイは、表３に列挙するように、１７２個のドナーサンプルからの合計３４２個のコアを含むものとした。すべてのサンプルは、Ｌｏｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの倫理認証を得て、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｐｌｃから取得した。腫瘍中のＲＡＥＴ１Ｇ抗体の組織分布を評価するため、３５種類の上皮癌サンプル（表３）からの１ｍｍのコアを含んでなる、市販のパラホルムアルデヒド固定組織マイクロアレイ（Petagen Inc、販売コードＡ２０１（１））の切片も免疫染色した。
【０１５７】
小腸内でのＲＡＥＴ１Ｇ抗体の組織分布を評価するため、１０種類の結腸および小腸サンプルからの１ｍｍのコアを含んでなる市販のパラホルムアルデヒド固定組織マイクロアレイ（Petagen Inc、販売コードＡ２０１（１））の切片も免疫染色した。
【０１５８】
Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＤｉｓｃｏｖｅｒｙＴＭシステムを使用して、自動化免疫組織化学試験を実施した。切片を脱ワックスし、低強度細胞コンディショナー１（Ｔｒｉｓホウ酸／ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で前処理し、その後１０μｇ／ｍｌのウサギ抗ＲＡＥＴ１Ｇ抗体中、３７℃で２０分間、インキュベートした。検出のため、アビジン／ビオチンブロッキングの後、１／１００に希釈したビオチン化ヤギ抗ウサギ（DakoCytomation）を用いて３７℃で８分間処理した。次にストレプトアビジン／ビオチン／ペルオキシダーゼキット（Ventana, ＤＡＢ ＭＡＰＴＭ）を使用して、ビオチン化抗体を検出した。自動化ヘマトキシリンカウンター染色後、手動脱水洗浄および樹脂性マウント材にマウントすることで、プロトコールを完了した。
【０１５９】
各免疫組織化学試験中、対照を含めた。組織コアの抗原性維持を確認するため、陽性対照として抗リゾチームおよび抗ビメンチン抗体を使用した。これらの対照はすべての組織コアにおいて陽性染色を示した。組織中に存在するいずれの染色像も検出試薬の非特異的相互作用によるものでないことを確認するため、スライドをＲＡＥＴ１Ｇ抗体無しでも処理した。
【０１６０】
Ａｒｉｏｌ ＳＬ−５０自動画像キャプチャーおよびシステム（Applied Imaging Inc）を使用し、×２０対物レンズを使用して、染色した組織マイクロアレイの画像を自動的に取得した。
【０１６１】
結果
ＲＡＥＴ１ＧはＴＭ領域を有する
当初の分析では、ＵＬＢＰ／ＲＡＥＴクラスターにはＧＰＩ連結分子をコードする６個の発現遺伝子が予想された（Radosavljevic ら、(2002) Genomics 79, 114-123）。本発明者らはこれらの配列の詳細な解析を実施し、ＲＡＥＴ１ＥおよびＲＡＥＴ１Ｇ中に潜在的なＴＭ領域を同定した。ＲＡＥＴ１Ｅ、ＲＡＥＴ１ＧおよびＵＬＢＰ２をコードする遺伝子（それぞれＲＡＥＴ１Ｅ、ＲＡＥＴ１ＧおよびＲＡＥＴ１Ｈ）をさらに解析し、保存されたエクソン構造を明らかにした。ここで、エクソン１はシグナルペプチドおよびタンパク質の開始部分をコードし、エクソン２および３はα１およびα２ドメインを包含し、そしてエクソン４は疎水性配列をコードしていた。ＵＬＢＰの場合は、このエクソンはＧＰＩアンカー領域および３’ＵＴＲをコードしていたが、ＲＡＥＴ１ＧおよびＲＡＥＴ１Ｅの両者では、該配列がＴＭ、および短い細胞質領域（ＣＹＴ）に合致した。ＲＡＥＴ１Ｇ中のエクソン５は推定上の細胞質ドメインの残りをコードしていた。ＲＡＥＴ１Ｈ中の同等のエクソンはサイレントであった。
【０１６２】
発現遺伝子産物の配列を解明するため、本発明者らはＲＡＥＴ１ＥおよびＲＡＥＴ１Ｇに相当するクローンを完全にシーケンシングした（Radosavljevicら(2002) Genomics 79, 114-123）。本発明者らは、ＲＡＥＴ１Ｇが最初の４つのエクソンにわたってＵＬＢＰ２と非常に類似していることを確認した。そのアミノ酸配列と既存のマウスおよびヒトＮＫＧ２Ｄリガンドのものとの比較により、ＲＡＥＴ１ＧがＵＬＢＰ２と最も密接に関連性があることが示された（全体で８５％の類似性）。α１およびα２ドメインで、最高レベルのアミノ酸（ａａ）同一性があった。その他の翻訳配列はＴＭおよび１００ａａＣＹＴをコードしていた（図７）。同様に、ＲＡＥＴ１Ｅ配列の解析では、これが２つのαドメイン、次に疎水性ＴＭ、続いて２０アミノ酸の細胞質ドメインをコードすることが示された。ＲＡＥＴ１Ｅはこのクラスターで最も相違しているメンバーであり、その他のリガンドとは＜４３％の同一性を共有するが、一方ＵＬＢＰ１〜３は互いに５５〜６０％までの同一性を共有していた。Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓサーバー（EBI, Hinxton, UK）を使用するＣｌｕｓｔａｌＷアライメントと、その後のＵＬＢＰ３の既知の結晶構造との比較を実施することによって、保存されたアミノ酸配列をα１およびα２ドメインの主要な構造エレメントとアライメントした。ＵＬＢＰ３の主要構造の特徴をタンパク質配列のアライメント中で強調表示している（図７）。
【０１６３】
ＲＡＥＴ１Ｇと同様に、マウスＮＫＧ２ＤリガンドであるＭＵＬＴ１も長いＣＹＴを有していた。この２つのタンパク質の細胞質領域間では顕著な配列類似性は見られなかった。ＲＡＥＴ１Ｇの細胞質ドメインは、ＢＬＡＳＴまたはＰｒｏｓｉｔｅによって検索した場合には、いずれのタンパク質またはドメインとも相同性を示さなかった。本発明者らはＲＡＥＴ１ＥおよびＲＡＥＴ１ＧのＣＹＴ領域中の公知のシグナル伝達モチーフを検索した。典型的な免疫チロシンインヒビターモチーフ（ＩＴＩＭ）または免疫チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）は同定されなかった。ＲＡＥＴ１Ｇの細胞質ドメイン中にプロリンに富むＰｘＰｘｘＰ領域があり、これは共通ＳＨ３キナーゼ結合性モチーフに相当する（Kay ら、(2000) FASEB J. 14, 231-241）。この下流に、ＭＩＣＡの側底部ターゲティングに寄与しているものと類似した２組の疎水性残基があった（Suemizu ら、(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 2971-2976）。
【０１６４】
図６はマウスおよびヒトリガンドの系統樹を示す。ヒトおよびマウスＮＫＧ２Ｄは約６０％同一であるが、それらのリガンドは２５〜３５％の同一性を示し、実質的に異なっている。したがって、ＧＰＩアンカー型またはＴＭ領域などいくつかの類似な特徴は示すものの、実質的な重複および変異は、マウスとヒト間の種別形成後に起こっている。
【０１６５】
ＲＡＥＴ１Ｇのオルタナティブスプライシング
ＩＭＡＧＥクローン２９１１８５５の配列は、エクソン４の開始部分での１００ｂｐの欠失以外は、ＲＡＥＴ１Ｇと同一線形であった。この配置は、第２の潜在的スプライシング開始点を３’側に１００ｂｐ移動しているこの境界でのオルタナティブスプライシングに合致するものである。ＲＡＥＴ１Ｇのこの欠失型の翻訳により、該オルタナティブスプライシングがフレームシフトおよびタンパク質配列の早すぎる終結をもたらすことが示された。フレームシフトの結果、ＴＭ領域前での終結が引き起こされるため、この末端切断型タンパク質は可溶性であると予測される。このスプライス型をＲＡＥＴ１Ｇ２と命名し、そのオルタナティブ配列の終結部を図７中のＲＡＥＴ１Ｇの配列の下に示す。ＲＡＥＴ１ＧおよびＲＡＥＴ１Ｇ２についてのエクソン構造を図８に示す。
【０１６６】
ＲＡＥＴ１Ｇ／１Ｇ２およびＲＡＥＴ１Ｅの発現パターン
ＲＡＥＴ１Ｇ／１Ｇ２およびＲＡＥＴ１Ｅの発現プロフィルを確かめるため、特異的なＰＣＲプライマーを設計した。いくつかの腫瘍細胞株はＲＡＥＴ１ＥまたはＲＡＥＴ１Ｇに対するｍＲＮＡを含有しており、該遺伝子は別系統の細胞中でそれぞれ独立して発現していた。これはＭＩＣＡおよびＭＩＣＢとは対照的である。その場合は、発現は上皮起源の細胞に限定されているものと見られ、これらが互いに独立に発現するかどうかは不明である（Bahramら(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 6259-6263; Groh ら、(1998) Science 279, 1737-1740）。Ｔ細胞白血病由来株であるＨＳＢ−２は末端切断型ＲＡＥＴ１Ｇ転写産物を発現していた。Ｔｏｐｏクローニングを使用して、このｃＤＮＡ産物をクローニングしたが、シーケンシングを行うと、これはＩＭＡＧＥクローン２９１１８５５中のスプライス型であるＲＡＥＴ１Ｇ２と同一であった。可溶性タンパク質をコードするスプライス変異体の発現は、腫瘍のＮＫ細胞およびＴ細胞認識の傷害における可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドの役割を提案すれば、重要である可能性がある（Groh ら、(2002) Nature 419, 734-738）。試験した限定された範囲の正常ヒト組織はＲＡＥＴ１Ｅ、またはスプライス型のＲＡＥＴ１Ｇ２の発現を示さなかった。ＲＡＥＴ１Ｇは結腸では強く発現していたが、スクリーニングしたその他の組織中では発現していなかった。喉頭ｃＤＮＡライブラリーからも、ＲＡＥＴ１ＧとマッチするＥＳＴが同定された。
【０１６７】
ＲＡＥＴ１Ｇ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現
２０種類の正常ヒト組織のパネルについてのＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＲＡＥＴ１Ｇ ｍＲＮＡが結腸のみで検出されたが、これは正常ヒト組織中でのこの遺伝子の限られた発現に合致するものである。
【０１６８】
ＲＡＥＴ１Ｇタンパク質の発現について調べるために、そのＣＹＴ由来のペプチドに対してポリクローナル抗体を生起させた。この試薬は細胞溶解物のウエスタンブロット分析によって、特異的であることが示された。ＲＡＥＴ１ＥまたはＲＡＥＴ１ＧのいずれかでトランスフェクトしたＫ５６２細胞、Ｒａｊｉ細胞、およびＣＶ１細胞の溶解物をプローブした。Ｋ５６２細胞およびそのＲＡＥＴ１Ｇトランスフェクト産物については予測される分子量である５０ＫＤａ（グリコシル化されたもの）に相当するバンドが得られたが、その他の細胞株では得られなかった。これは上記の細胞株からのＲＴ−ＰＣＲデータと相関する。したがって、完全長ＲＡＥＴ１Ｇ転写産物は、その著しく長いＣＹＴを含めて、成熟タンパク質に翻訳されることが可能である。
【０１６９】
免疫組織化学試験による正常組織内のＲＡＥＴ１Ｇの分布
正常上皮細胞タイプの限定された集団において、ＲＡＥＴ１Ｇ抗体の結合性が見られた。腎臓では、５つのドナーサンプルの１つにおいて、腎尿細管の少数に強い点状の染色像が観察され、同時にその他のいくつかの細管では一様でより弱い細胞質染色像が見られた。後者の染色像は試験抗体を除外した対照中、およびその他の腎サンプル中でも観察されたため、非特異的なものである。甲状腺の全サンプルでは一部の濾胞内層細胞中に中程度の染色強度の一様な細胞質染色像が存在したが、結腸では、５サンプルのうちの２つのみで強い点状染色像が観察され、このことは、ＲＡＥＴ１Ｇ発現は個体間で差異があるらしいことを示している。下垂体前葉では、この領域が完全に再現されていた４サンプルで内分泌細胞の強い一様な細胞質染色像が観察された。残りの下垂体サンプルは主として中間部からの組織で構成されていた。この組織は染色されなかったが、散在する下垂体前葉由来の内分泌細胞は強い細胞質染色像を示した。甲状腺、結腸および下垂体では、試験抗体を除外した対照プレパラートでは染色が観察されず、このことは染色が特異的であったことを示している。これらのデータはｍＲＮＡ分布に一致するものであり、正常な生理状態での該分子の非常に限られた発現を意味している。
【０１７０】
腫瘍中のＲＡＥＴ１Ｇ発現
腫瘍サンプルでは、上皮染色像のより広範囲の分布が観察された（表４）。試験抗体を除外して処理したサンプル中では同等の染色像のなんらの徴候も見られなかったため、この染色像は特異的なものと考えられる。ＲＡＥＴ１Ｇの発現を示した腫瘍としては以下が含まれた：結腸、肺、直腸および胃の腺癌；肺、食道、皮膚および子宮の扁平上皮癌、子宮の内膜性癌、甲状腺の濾胞癌、肝臓の肝細胞癌および胆管癌、腎細胞癌、ならびに卵巣の粘液性癌および漿液性癌。これらの腫瘍のいくつかでは、全サンプルが染色の徴候を示したが、その他では、一部のサンプルのみが染色された。染色の数、強度および分布も、陽性サンプル間で差異があった。
【０１７１】
腫瘍サンプル内での染色像の分布は特に注目された。扁平上皮癌サンプルでは、一様な細胞質染色パターンが観察された。このタイプの染色像は肝細胞癌サンプルの１つおよび卵巣の漿液性癌でも観察された。その他の陽性染色腫瘍中では、局所的で主として点状の細胞染色像が記録された。結腸および直腸の腺癌、肝細胞癌（１サンプル）、肝臓の胆管癌、卵巣の粘液性癌、腎細胞癌、甲状腺の濾胞癌および子宮の内膜性癌では、この染色像は頂端部にあるか（apical）、または腫瘍細胞の辺縁部に存在した。肺および胃の腺癌では、この染色像は細胞質小胞の境界部に伴っていたが、直腸腺癌では、細胞破片または腫瘍腺の内腔に存在する分泌タンパク質も染色された。子宮扁平上皮癌の１サンプルでは、細胞間染色像のみが観察された。
【０１７２】
セリアック病でのＲＡＥＴ１Ｇ発現
セリアック病は、患者自身の腸上皮に対するＴ細胞性免疫応答によってもたらされる、比較的一般的な自己免疫状態である。最近になってＮＫＧ２Ｄがセリアック病での絨毛萎縮に関連付けられ（Hueら、2004）、ここで、腸内リンパ球がＮＫＧ２Ｄを介して上皮細胞を死滅させ得ることが示されている。本発明者らのＲＡＥＴ１Ｇに対するポリクローナル血清を使用して、正常対照の小腸の上皮細胞でのその発現を、セリアック病患者のものとの直接的な比較において調べた。
【０１７３】
健康な小腸サンプルでは、いくらかの低レベルな点状染色像が観察され、これによりＲＡＥＴ１Ｇの細胞内分布が明らかに示された。セリアック病の個体由来のサンプルでは、細胞の細胞質全体、そしておそらくは細胞表面にも、より強い染色像が観察された。このことは、ＲＡＥＴ１Ｇがセリアック病個体の小腸の細胞中でアップレギュレートされていることを示し、また活発なセリアック病患者の絨毛萎縮におけるＲＡＥＴ１Ｇ／ＮＫＧ２Ｄ相互作用の役割についての示唆を与えるものである。したがって、ＲＡＥＴ１Ｇはセリアック病の病変組織の単なるマーカーではなく、組織ダメージの直接の原因であるものと思われる。
【０１７４】
細胞表面で発現したＲＡＥＴ１ＥおよびＲＡＥＴ１ＧはＮＫＧ２Ｄと結合する
ＲＡＥＴ１Ｅ、ＲＡＥＴ１ＧおよびＵＬＢＰ２に対する完全長ｃＤＮＡを、Ｎ末端にＦｌａｇタグを付けた融合タンパク質としてクローニングした。ＣＶ−１細胞の一過性トランスフェクションにおいてこれらは細胞表面に到達し、そしてフローサイトメトリーで抗Ｆｌａｇ抗体を用いて検出された（図９および図１０）。フローサイトメトリーによると、組換え可溶性Ｆｃ融合タンパク質として発現したＮＫＧ２Ｄは、ＵＬＢＰ２、ＲＡＥＴ１ＧおよびＲＡＥＴ１Ｅで一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞に結合した（図１１および図１２）。
【０１７５】
ＲＡＥＴ１ＥおよびＲＡＥＴ１ＧはＮＫＧ２Ｄを介してＮＫ細胞の細胞毒性を誘発することができる
ＣＯＳ−７細胞中で発現したＲＡＥＴ１ＥおよびＲＡＥＴ１Ｇは、ＮＫ細胞による細胞毒性を引き起こした。ＮＫＧ２Ｄ抗体は完全にこの活性をブロックする。２種類のリガンドと非トランスフェクト細胞とについての相対的死滅データを図１３に示す。
【０１７６】
ＵＬＢＰファミリーとＮＫＧ２ＤおよびＵＬ１６との結合相互作用
ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＲＡＥＴ１ＥおよびＲＡＥＴ１Ｇの組換え可溶性型を、ＮＫＧ２Ｄとの結合性について、ＢＩＡＣｏｒｅ２０００装置を使用した表面プラズモン共鳴によって分析した。同様に、組換えＵＬＢＰ１、ＲＡＥＴ１ＥおよびＲＡＥＴ１Ｇの結合性をＵＬ１６に対しても測定した。各ＵＬＢＰタンパク質の希釈系列を、抗ヒトＩｇＧ表面に結合させたＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ、ＵＬ１６−ＦｃまたはＦｃ融合体対照に通した。最少の結合性はＦｃ対照表面で見られた。速度論的グローバルフィッティング解析に使用した曲線の例を図１４に示し、速度論的パラメータを表１に示す。表２はマウスおよびヒトリガンドについて他者が以前に測定したパラメータを示している（Radaev ら、(2002) J. Immunol. 169, 6279-6285; O'Callaghan ら、(2001) Immunity 15, 201-211; Carayannopoulosら(2002) Eur. J. Immunol. 32, 597-605; Carayannopoulosら(2002) J. Immunol. 169, 4079-4083）。
【０１７７】
表１に示すデータは、Ｆｃ融合およびｈｉｓタグ付きタンパク質の両方について、少なくとも２回の反復実験と、少なくとも２種の別個の発現から導いたものである。バッチ間の変動はほとんど見られず、表１のすべての速度論的データおよび親和性データは再現性があった。
【０１７８】
ヒトおよびマウスリガンドの相補物内の親和性の範囲は同程度であり、類似するパターンにしたがう。ＧＰＩと連結したマウスリガンドであるＲａｅ１α〜δは、膜貫通ドメインを有するリガンドであるＨ６０およびＭＵＬＴ１よりも、顕著に低い親和性を有する（表２）。同様に、３種類のヒトＧＰＩアンカー型ＵＬＢＰは、ＮＫＧ２Ｄに対して、ＭＩＣＡよりも、またＴＭアンカー型ＲＡＥＴ１ＥおよびＲＡＥＴ１Ｇ分子よりも、低い親和性を有する。
【０１７９】
ＲＡＥＴ１ＥおよびＲＡＥＴ１ＧはＮＫＧ２Ｄに対して他のヒトＮＫＧ２Ｄリガンドよりも高い親和性を有し、それぞれ３９ｎＭおよび３５６ｎＭであった。ＵＬ１６は、試験した３種類のヒトリガンドに対して、変動性はあるものの高親和性で結合したが、ＲＡＥＴ１ＧはＵＬ１６に対して、ＲＡＥＴ１ＥまたはＵＬＢＰ１のいずれよりも著しく高い親和性を有し、また結合速度（on-rate）も大きく、ＫＤはそれぞれ５０４ｎＭおよび２４３ｎＭに比較して、７５．６ｎＭであった。
【０１８０】
配列類似性を共有してはいるが、ＵＬＢＰ／ＲＡＥＴ１遺伝子は、それらの共通する受容体に対する親和性について大きな多様性を示す。ＵＬＢＰ２およびＲＡＥＴ１Ｇはαドメインにおいて９３％のアミノ酸類似性を有するが、これらがＮＫＧ２Ｄと２０倍も異なる親和性で結合することは注意を引く。二者の間での注目すべき差異の１つは、ＵＬＢＰ２に比較してＲＡＥＴ１Ｇでは、α２ドメインのヘリックスの開始点である１６３位で、アラニンがプロリンに置換されていることである。
【０１８１】
ＭＩＣ＋腫瘍を有する患者の血清中の可溶性ＭＩＣの存在は、リンパ球の表面ＮＫＧ２Ｄの減少と関連付けられ、このことは、ＮＫＧ２Ｄを保有するＮＫおよびＴ細胞の応答性を傷害することによる免疫回避の経路であり得る（Pende D.ら(2002)Cancer Res. 62 6178-86）。ＭＩＣＡはメタロプロテアーゼによる切断によって腫瘍の細胞表面から消失することが提唱されており（Salih ら、(2002) J. Immunol. 169, 4098-4102）、ＴＭ含有リガンドであるＲＡＥＴ１Ｇの場合もこれがあてはまると考えられる。Ｔ細胞白血病株ＨＳＢ−２中に検出されたＲＡＥＴ１Ｇの可溶性スプライス型も同様の役割を有すると見られる。
【０１８２】
本明細書および以前の研究（Cosman ら、(2001) Immunity 14, 123-133; Pendeら、(2002)Cancer Res. 62, 6178-6186）で示されたＵＬＢＰ／ＲＡＥＴ遺伝子の発現パターンは、１個の標的細胞上にＮＫＧ２Ｄに対する複数のリガンドが発現し得ることを示している。それらのリガンドは明らかに、独立に発現することも可能である。該データは、別種の組織上で別種のＮＫＧ２Ｄリガンドが発現することと矛盾がない。ＭＩＣ産物は一般的に上皮細胞で発現する。ＵＬＢＰ／ＲＡＥＴ１は上皮細胞で発現することができるが、非上皮起源の細胞株でも発現し、このことは例えばリンパ系悪性腫瘍およびリンパ球に感染するウイルスに対する免疫応答における、ＭＩＣＡ／Ｂとは別個の役割についての論理的根拠を提供するものである。本発明者らは、ＮＫＧ２Ｄに対するヒトＵＬＢＰ／ＲＡＥＴ１タンパク質の親和性には顕著な多様性があるが、２つのグループを形成することを示す。マウスデータに関しては、ＧＰＩアンカー型タンパク質はＮＫＧ２Ｄに対して中程度から低い親和性を有するが、ＲＡＥＴ１ＧなどのＣＹＴドメインを所有するリガンドは高い親和性を有する。大きな結合速度で駆動される高親和性は、感染の早期シグナルが必要な場合に重要であると見られる。この場合、感染細胞に対処するためには、会合する受容体との迅速な結合がその除去のために必須である。
【０１８３】
ＲＡＥＴ１Ｇは側底面にターゲティングされるようであり、ここでその高速結合性および高親和性が細菌の攻撃に対しての第一線での良好な指標となり得る。腸の上皮表面などの極性細胞層では、ＮＫＧ２Ｄリガンドのアンカー手段の差異が、同一の細胞内での分布の差異、可能なシグナル伝達経路の差異、したがってリンパ球にとっての異なる利用性をもたらす。細胞上のリガンドの分布が、細菌の攻撃、形質転換、またはリンパ球の働きを変え得るであろう。別々の組織および細胞ドメインにおけるＮＫＧ２Ｄリガンドの相対的分布は、ＮＫＧ２Ｄが介在する免疫認識を理解する上での土台を成すものと見られる。
【０１８４】
ＲＡＥＴ１ＧはＵＬ１６の標的であることが示されたが、ＵＬ１６は、ＮＫＧ２Ｄ認識をブロックすることによってウイルス免疫回避を推進する分子であることが提案されている。ＵＬＢＰ１およびＲＡＥＴ１Ｇの両方が、ＮＫＧ２Ｄに対するよりも高い親和性で、かつ非常に大きな結合高速を有してＵＬ１６と結合した。ＲＡＥＴ１Ｇは最も高い親和性のＵＬ１６結合物質であり、ＵＬ１６に対する結合速度はＮＫＧ２Ｄに対するよりも１０倍速い。このことは、低濃度でのウイルスタンパク質への結合能力の増強をもたらすものと見られる。ＲＡＥＴ１ＧのＵＬ１６に対する高速結合および高親和性は、その病原体認識分子としての潜在性を示唆する。この分子が担持するユニークなＣＹＴ尾部は、細胞内でのシグナルを伝達して病原体に対する応答に関与する他の分子をモジュレートする潜在能力を提供する。これは、それ自体のシグナル伝達能力についての事実と共に記載された、最初のＮＫＧ２Ｄリガンドである。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【図面の簡単な説明】
【０１８５】
【図１】ＲＡＥＴ１Ｇ２ポリペプチドのアミノ酸配列である。
【図２】ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドのアミノ酸配列である。
【図３】ＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドの完全長アミノ酸配列をコードする核酸配列である（コード配列（ＣＤＳ）ヌクレオチド６９−１０７２）。
【図４】図１に示した配列のアミノ酸残基１−２１４からなる、オルタナティブスプライシングを受けたＲＡＥＴ１Ｇポリペプチドをコードする核酸配列である（コード配列はｎｔ１−６４２）。
【図５】染色体６ｑ２４．２−ｑ２５．３上のＲＡＥＴ１クラスター中の発現遺伝子の配置を示す模式図である。
【図６】マウスおよびヒトＮＫＧ２Ｄリガンドの系統樹である。
【図７】ＲＡＥＴ１Ｇ、ＵＬＢＰ２、ＲＡＥＴ１Ｅ、およびＵＬＢＰ３の配列アライメントである。
【図８】ＲＡＥＴ１ＧおよびＲＡＥＴ１Ｇ２のエクソン構造を示す模式図である。
【図９】ＣＯＳ−７細胞中のＲＡＥＴ１タンパク質の細胞表面発現を示すグラフである。
【図１０】抗ｆｌａｇ抗体で染色したトランスフェクト細胞を表示するヒストグラムである。
【図１１】ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ細胞と、ＣＯＳ−７細胞で表面発現したＲＡＥＴ１との結合性を示すグラフである。
【図１２】ＮＫＧ２Ｄで染色したトランスフェクト細胞を表示するヒストグラムである。
【図１３】新規ＲＡＥＴ１分子でトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の、異なるエフェクター：標的比での比溶解％を示すグラフである。
【図１４】速度論的解析で使用したＢＩＡＣｏｒｅプロットである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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