(57)【要約】  本発明は、臨床的に重要なＡＢＯ遺伝子及びＲＨＤ遺伝子の領域の同時増幅を可能にする一連のＰＣＲプライマーに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マルチプレックスＰＣＲによるＲＨＤ遺伝子型解析の方法であって、被験者由来のＲＨＤ遺伝子核酸を、以下の表に示すプライマー対（該プライマー対は表中に示される全配列又は大文字で示される配列を含む）：１と２；３と４又は４Ａ；５と６；７と８又は８Ａ；９、９Ａ、１０、１０Ａ又は１０Ｂと１１又は１１Ａ；１２と１３；１４又は１４Ａと１５又は１５Ａ；１６と１７；１８と１９；３０と３１の１対又は複数対と接触させること、及び前記ＲＨＤ遺伝子核酸を増幅させることを含む方法。
【表１】
2008513036.tif 000023
【請求項２】
前記ＲＨＤ遺伝子核酸を、以下のプライマー対：１と２；３と４；５と６；７と８；９又は１０と１１；１２と１３；１４と１５；及び１８と１９の１対又は複数対と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＨＤ遺伝子核酸を、以下のプライマー対：１と２；３と４；５と６；７と８；９又は１０と１１；１２と１３；１４と１５；及び１８と１９と接触させる、請求項２に記
載の方法。
【請求項４】
前記ＲＨＤ遺伝子核酸を、以下のプライマー対：１と２；３と４Ａ；５と６；７と８Ａ；９Ａ、１０Ａ又は１０Ｂと１１Ａ；１２と１３；１４Ａと１５Ａ；１６と１７；及び１８と１９の１対又は複数対と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＲＨＤ遺伝子核酸を、以下のプライマー対：１と２；３と４Ａ；５と６；７と８Ａ；９Ａ、１０Ａ又は１０Ｂと１１Ａ；１２と１３；１４Ａと１５Ａ；１６と１７；及び１８と１９と接触させる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＨＤ遺伝子核酸を、以下のプライマー対：１と２；３と４又は４Ａ；５と６；７と８又は８Ａ；９、９Ａ、１０、１０Ａ又は１０Ｂと１１又は１１Ａ；１２と１３；１４又は１４Ａと１５又は１５Ａ；１６と１７；１８と１９；及び３０と３１と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＨＤ遺伝子のエキソン１〜７及びエキソン９を増幅させる、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項８】
前記ＲＨＤ遺伝子のエキソン１〜１０を増幅させる、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
部分的な弱いＲＨＤバリアントを増幅させる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
マルチプレックスＰＣＲによるＲＨＤ遺伝子型解析の方法であって、被験者由来のＲＨＤ遺伝子核酸を、以下の表に示すプライマー（該プライマーは表中に示される全配列又は大文字で示される配列を含む）の少なくとも１つと接触させること、及び前記ＲＨＤ遺伝子核酸を増幅させることを含む方法。
【表２】
2008513036.tif 000024
【請求項１１】
前記ＲＨＤ遺伝子核酸を以下のプライマー対：１と２；３と４又は４Ａ；５と６；７と８又は８Ａ；９、９Ａ、１０、１０Ａ又は１０Ｂと１１又は１１Ａ；１２と１３；１４又は１４Ａと１５又は１５Ａ；１６と１７；１８と１９；及び３０と３１の１対又は複数対と接触させることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＲＨＤ遺伝子核酸を以下のプライマー対：１と２；３と４；５と６；７と８；９又は１０と１１；１２と１３；１４と１５；及び１８と１９の１対又は複数対と接触させることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＲＨＤ遺伝子核酸を以下のプライマー対：１と２；３と４Ａ；５と６；７と８Ａ；９Ａ、１０Ａ又は１０Ｂと１１Ａ；１２と１３；１４Ａと１５Ａ；１６と１７；１８と１９；及び３０と３１の１対又は複数対と接触させることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
マルチプレックスＰＣＲによるＡＢＯ遺伝子型解析の方法であって、被験者由来のＡＢＯ遺伝子核酸を、以下の表に示すプライマー対（該プライマー対は表中に示される全配列又は大文字で示される配列を含む）：２０と２１；２２と２３；２４又は２４Ａと２５；２６と２７及び２８と２９の１対又は複数対と接触させること、及び前記ＡＢＯ遺伝子核酸を増幅させることを含む方法。
【表３】
2008513036.tif 000025
【請求項１５】
前記ＡＢＯ遺伝子核酸を、以下のプライマー対：２０と２１；２２と２３；２４と２５；２６と２７及び２８と２９の１対又は複数対と接触させる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＡＢＯ遺伝子核酸を、以下のプライマー対：２０と２１；２２と２３；２４と２５；２６と２７及び２８と２９と接触させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＡＢＯ遺伝子核酸を、以下のプライマー対：２０と２１；２２と２３；２４Ａと２５；２６と２７及び２８と２９の１対又は複数対と接触させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＡＢＯ遺伝子核酸を、以下のプライマー対：２０と２１；２２と２３；２４Ａと２５；２６と２７及び２８と２９と接触させる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
マルチプレックスＰＣＲによるＡＢＯ遺伝子型解析の方法であって、被験者由来のＡＢＯ遺伝子核酸を、以下の表に示すプライマー（該プライマーは表中に示される全配列又は大文字で示される配列を含む）から選択される少なくとも１つのプライマーと接触させること、及び前記ＡＢＯ遺伝子核酸を増幅させることを含む方法。
【表４】
2008513036.tif 000026
【請求項２０】
前記ＡＢＯ遺伝子のエキソン２、４、６及び７を増幅させる、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
まれなＡＢＯ変異型を増幅させる、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
マルチプレックスＰＣＲによるＡＢＯ遺伝子型解析及びＲＨＤ遺伝子型解析の方法であって、被験者由来のＡＢＯ遺伝子核酸及びＲＨＤ遺伝子核酸を以下の表に示すプライマー対（該プライマー対は表中に示される全配列又は大文字で示される配列を含む）：１と２；３と４又は４Ａ；５と６；７と８又は８Ａ；９、９Ａ、１０、１０Ａ又は１０Ｂと１１又は１１Ａ；１２と１３；１４又は１４Ａと１５又は１５Ａ；１８と１９；２０と２１；２２と２３；２４又は２４Ａと２５；２６と２７；２８と２９；及び３０と３１の１対又は複数対と接触させること、及び前記ＲＨＤ遺伝子核酸及び前記ＡＢＯ遺伝子核酸を増幅させることを含む方法。
【表５】
2008513036.tif 000027
【請求項２３】
前記ＡＢＯ遺伝子核酸及び前記ＲＨＤ遺伝子核酸を、以下のプライマー対：１と２；３と４；５と６；７と８；９又は１０と１１；１２と１３；１４と１５；１８と１９；２０と２１；２２と２３；２４と２５；２６と２７；２８と２９；及び３０と３１の１対又は複数対と接触させる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＡＢＯ遺伝子核酸及び前記ＲＨＤ遺伝子核酸を、以下のプライマー対：１と２；３
と４；５と６；７と８；９又は１０と１１；１２と１３；１４と１５；１８と１９；２０と２１；２２と２３；２４と２５；２６と２７；２８と２９；及び３０と３１と接触させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＡＢＯ遺伝子核酸及び前記ＲＨＤ遺伝子核酸を、以下のプライマー対：１と２；３と４Ａ；５と６；７と８Ａ；９Ａ、１０、１０Ａ又は１０Ｂと１１Ａ；１２と１３；１４Ａと１５Ａ；１６と１７；１８と１９；２０と２１；２２と２３；２４Ａと２５；２６と２７；２８と２９；及び３０と３１と接触させる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＡＢＯ遺伝子核酸及び前記ＲＨＤ遺伝子核酸を、以下のプライマー対：１と２；３と４Ａ；５と６；７と８Ａ；９Ａ、１０、１０Ａ又は１０Ｂと１１Ａ；１２と１３；１４Ａと１５Ａ；１６と１７；１８と１９；２０と２１；２２と２３；２４Ａと２５；２６と２７；２８と２９；及び３０と３１の１対又は複数対と接触させる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
マルチプレックスＰＣＲによるＡＢＯ遺伝子型解析及びＲＨＤ遺伝子型解析の方法であって、被験者由来のＡＢＯ遺伝子核酸及びＲＨＤ遺伝子核酸を以下の表に示すプライマー（該プライマーは表中に示される全配列又は大文字で示される配列を含む）の１つ又は複数と接触させること、及び前記ＲＨＤ遺伝子核酸及び前記ＡＢＯ遺伝子核酸を増幅させることを含む方法。
【表６】
2008513036.tif 000028
【請求項２８】
他の血液遺伝子に関するマルチプレックスＰＣＲ反応を同時に、連続して、又は別々に行う、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＭＰＸ  ＰＣＲ反応が、ＡＢＯ／ＭＮＳ／Ｐ１／ＲＨ／ＬＵ（Ｌｕｔｈｅｒａｎ）／ＫＥ（Ｋｅｌｌ）／ＬＥ（Ｌｅｗｉｓ）／ＦＹ（Ｄｕｆｆｙ）／ＪＫ（Ｋｉｄｄ）／ＤＩ（Ｄｉｅｇｏ）／ＹＴ（Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ）／ＸＧ／ＳＣ（Ｓｃｉａｎｎａ）／ＤＯ（Ｄｏｍｂｒｏｃｋ）／ＣＯ（Ｃｏｌｔｏｎ）／ＬＷ／ＣＨ／ＲＧ（Ｃｈｉｄｏ／Ｒｏｄｇｅｒｓ）／Ｈｈ／ＸＫ／ＧＥ（Ｇｅｒｂｉｃｈ）／ＣＲＯＭ（Ｃｒｏｍｅｒ）／ＫＮ（Ｋｎｏｐｓ）／ＩＮ（Ｉｎｄｉａｎ）／ＯＫ／ＲＡＰＨ／ＪＭＨ（ＪｏｈｎＭｉｌｔｏｎＨａｇｅｎ）／ＩＧＮＴ／Ｐ及び／又はＧＩＬ系及び／又は、既知であるか、又はこれから既知になる任意の他の血液型系に関連する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記血液がｅｘ  ｖｉｖｏである、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸がゲノムＤＮＡである、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
アニーリング温度が５４〜６３℃である、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記アニーリング温度が約５７℃である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記アニーリング温度が約６０℃である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記増幅される遺伝子核酸を、検出されるべき配列に特異的な核酸プローブにハイブリダイズさせる、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記核酸プローブをアレイに配置させる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
固体の基材上で行われるように調整される、請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記核酸プローブを遺伝子チップに付着させる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
少なくとも１つのプライマーを機能的バリアントに置換させる、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
以下の表に示されるＰＣＲプライマーであって、該プライマーが表に示される全配列又は大文字で示される配列、又はこれらの機能的バリアントを含むＰＣＲプライマー。
【表７】
2008513036.tif 000029
【請求項４１】
ＰＣＲ反応における請求項４０に記載のＰＣＲプライマーの使用。
【請求項４２】
遺伝子型解析の方法における請求項４０に記載のＰＣＲプライマーの使用。
【請求項４３】
請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法で製造される１つ又は複数のＰＣＲ産物の同定を可能にする、複数のプローブ配列が付着した遺伝子チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子解析の分野に関する。より詳細には、本発明は血液型解析を行うための被験者の遺伝子型の研究に関する。
【背景技術】
【０００２】
［背景］
血液型の判定は、現在は比較的限られた臨床的に重要な血液型に関する血清学的手法を使用して行われる。近年の進歩として、分子遺伝学的手法を使用した血液型の判定が挙げられるが、これらは限定された状況、例えば、血清学的検査のための胎児の血液を採取が危険である出産前判定、又は患者／ドナーの血液の混合により血清学的検査が困難であるような複数の輸血を受けた患者の血液型判定において使用されているに過ぎない。
【０００３】
現在のところ、分子遺伝型に基づいた技術に限界があること、及び現在の血清学的試験方法のコストが比較的安いことから、大規模な血液型の遺伝子型決定法は行われていない。しかし、血液型血清学には重大な欠点がある。例えば、幾つかの血液型の抗原特異性を試験するのに利用可能な試薬の数は限られているか、又はこのような試薬は存在しない可能性がある。結果として、全ての血液型の抗原を決まった方法で試験することはできない。このことは、血液のレシピエントが、提供された赤血球で運ばれる抗原に対して免疫化するという基本的な同種免疫反応をもたらす可能性がある。全ての血液ドナーの血液型の遺伝子型決定法によって、より包括的な血液試験がもたらされ、同種免疫及びそれに続く輸血反応の発生を減少させることができる。
【０００４】
ＡＢＯ血液型は全てのヒト血液型で最も重要なものであり、ＡＢＯ不適合血液を輸血すると、死に至ることもある即時的な輸血反応を引き起こす可能性がある。これは、血液型Ａ、Ｂ及びＯの個体がその血清中に予め抗Ａ及び／又は抗Ｂを有しており（細菌の炭水化物抗原に対して作られた）、それが、自身の赤血球上に見られない赤血球Ａ抗原及び／又は赤血球Ｂ抗原と交差反応するからである。ＡＢＯ適合性は、輸血に関連する疾病及び死亡の主な原因であり、全ての血液ドナー及び血液、血液製剤又は固形臓器の移植を受ける患者は、これらのＡＢＯ状態が判定されなければいけない。
【０００５】
赤血球の血清学が、輸血治療に用いられるヒトの赤血球のＡＢＯ状態を判定するのに日常的に利用される。血清学的手法が広く、且つ安価で利用されているにも関わらず、ＡＢＯ遺伝子型決定法は、通常の輸血において利用される場合がある。まれなＡ対立遺伝子及びＢ対立遺伝子は、両方の一連の抗原の発現を低減する（例えば、Ａ３、Ｂ３、Ａel、Ｂel、Ａx、及びＢx）。これらのまれなバリアントは、通常の自動化されたＡＢＯ型分類法では分類ができない可能性があり、これらの幾つかは血液型Ｏとして分類される。これらの対立遺伝子の多くがハイブリッドＡＢＯ遺伝子型によるものであり、分子遺伝学的手法を使用することによってのみ分類することができる。分子遺伝学的手法による血液型分類が赤血球血清学に対する最新の代替方法になるには、ＡＢＯ遺伝子型に対するロバスト検定を開発及び利用する必要がある（Olsson, 2001, Blood, 98, 1584-1593）。
【０００６】
ＡＢＯ組織血液型系のＡ抗原及びＢ抗原は、９番染色体上のＡＢＯ遺伝子座でコードされたグリコシルトランスフェラーゼによって合成される。まず、Ａグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を単離、クローン化して、シーケンシングした(Clausen他, 1990, J. Biol. Chem., 265, 1139-1145、及びYamamoto他, 1990, Nature, 345, 229-233)。配列解析によって、４１ｋＤａのタンパク質に対応する１０６２ｂｐのコード領域が明らかになった。続いてこのコード領域は７つのエキソンにわたって分布すること(Yamam
oto他, 1995, Glycobiology, 5, 51-58、及びBennett他, 1995, Biochem. Biophys. Res.
Commun., 211, 347)、更にこの遺伝子が９ｑ３４上の約２０ｋｂの領域に及ぶことが示された。コンセンサスコード配列はＡ１０１対立遺伝子であり、グリコシルトランスフェラーゼの特異性及び有効性に影響を与える全ての多型がこの対立遺伝子の突然変異型であると考えられる。
【０００７】
コードされるグリコシルトランスフェラーゼの特異性及び／又は有効性に影響を与える突然変異の大半は、エキソン６及びエキソン７で起こる。しかし、これより前のエキソンに幾つかの重要な突然変異が存在する(Chester & Olsson, 2001, Trans. Med. Rev., 11,
295-313)。主要な対立遺伝子をコードする突然変異を表１に示す。
【０００８】
【表１】
2008513036.tif 000002
【０００９】
Ｒｈ系は最も多型のある血液型系であり、輸血において非常に重要である。Ｒｈ系は溶血性輸血反応、新生児の溶血性疾患及び自己免疫性溶血性貧血に関与する。Ｒｈ系では、異なるが、高い相同性を持つ２つの遺伝子が存在する。１つの遺伝子（ＲＨＤ）はＤポリペプチドをコードし、もう１つ（ＲＨＣＥ）はＣｃＥｅポリペプチドをコードする。ＲＨＤは、最も強い血液型免疫原としてＤ抗原を有する。ＲＨＤ遺伝子の欠失又は他の遺伝子の改変により、この抗原は全集団（即ちＲｈ陰性の表現型）のうち比較的大部分には存在しない。ＲＨＣＥが４つの対立形質で存在し、それぞれの対立遺伝子がＣｅ、ｃｅ、ｃＥの中の２つの抗原の発現の組み合わせを決定する（ＲＨＣＥは４つの対立遺伝子の総称である）。
【００１０】
マルチプレックス（ＭＰＸ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、よく知られたＰＣＲ法の変形であり、同じ増幅反応で異なるプライマー対を用いる。これが血液型の解析に使用されてきた。Ｒｈ  Ｄ配列の増幅のためのＭＰＸ  ＰＣＲプライマーは、以前から製造されている。（Avent N D他, Blood, 1997, 89, 2568-77)は、ＲＨＤのイントロン４及び３’末端の非コード領域の増幅に基づいたマルチプレックスＲＨＤ遺伝子型決定試験を開示している。その後、６つの更なるＲＨＤ遺伝子プライマー配列がＭＰＸ  ＰＣＲにおける使用のために製造されている(Maaskant-van Wijk P A他, Transfusion, 38, November/December, 1998, 1015-1021)。本開示では、ＲＨＤ遺伝子の様々なエキソンを増幅させるようにプライマーを設計した。また、ＲＨＤ試験がＲＨＤ遺伝子の非コード領域（即ちイントロン）に依存するべきではないこと、及びこの手法が出産前のＲＨ遺伝子型決定法において非常に価値がある可能性を持つことも示されている。Wagner他(Blood, 1999, 93, 385-393)は、比較的大きなＰＣＲ産物を増幅するためのプライマーを伴う、通常のＰＣＲに基づいた方法を開示している。この増幅された産物の大きさのために、ＰＣＲプライマーをマルチプレックスＰＣＲ法に使用することができない。
【発明の開示】
【００１１】
本発明者らは、血液型の遺伝子型解析、特にＲＨＤ遺伝子型解析及びＡＢＯ遺伝子型解析に使用するマルチプレックスＰＣＲで使用することができるプライマーを作製した。このプライマーを、ＭＰＸ  ＰＣＲで用いるのに適切な大きさの断片（この場合、このプライマーは１３１５ｂｐ未満である）を増幅させるために同定、選択して、また機能性を有するものを選択した。すなわち選択されたプライマーは、目的の断片の増幅を良好にし、目的の断片に対して特異的である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
［発明の概要］
本発明の第１の態様によれば、マルチプレックスＰＣＲによるＲＨＤ遺伝子型解析の方法が提供され、この方法は被験者由来のＲＨＤ遺伝子核酸を以下の表（表２）に示すプライマー対（該プライマー対は表中で示される全配列又は大文字で示される配列を含み得る）：１と２；３と４又は４Ａ；５と６；７と８又は８Ａ；９、９Ａ、１０、１０Ａ又は１０Ｂと１１又は１１Ａ；１２と１３；１４又は１４Ａと１５又は１５Ａ；１６と１７；１８と１９；及び３０と３１の１対又は複数対と接触させること、及びＲＨＤ遺伝子核酸を増幅させることを含む方法である。
【００１３】
【表２】
2008513036.tif 000003
【００１４】
この表で示されるそれぞれのプライマーは、５’末端のＭＡＰＨタグ（小文字で示されるプライマー配列の初めの１８ヌクレオチド）と遺伝子特異的な配列（大文字で示される）とを含む。このＭＡＰＨタグは核酸の増幅を促進するために使用される。具体的には、このプライマーを使用してＲＨＤ遺伝子核酸をＰＣＲ増幅させると、この配列を更に増幅するためにＭＡＰＨタグに対するプライマー（３２及び３３）が使用される。両方の増幅過程を同時に行うことが好ましい。当業者に理解されるように、ＲＨＤ遺伝子核酸を増幅するために、５’末端のＭＡＰＨタグのないプライマー（大文字のみの配列で示されるプライマー配列）を本発明の方法に使用することができる。他にも、このプライマー配列はこの表で示されるＭＡＰＨタグとは異なるタグ配列を含むことができる。
【００１５】
本発明の方法では、臨床的に非常に重要なＲＨＤ遺伝子のエキソン１〜１０の１０ヵ所の領域を同時に増幅することが可能なので有利である。これには、臨床的に重要な部分的な弱いＤバリアントを含む既知のＲＨＤ対立遺伝子のほとんどが含まれる。特に、これには、Gassner C, Doescher A, Drnovsek TD, Rozman P, Eicher NI, Legler TJ, Lukin S,
Garritsen H, Kleinrath T, Egger B, Ehling R, Kormoczi GF, Kilga-Nogler S, Schoenitzer D, Petershofen EK著「Presence of RHD in serologically D-, C/E+ individuals: a European multicenter study」(Transfusion, 2005, 45(4), 527-538)に記載されているＤｅｌ表現型をもたらす突然変異が存在するエキソン１０が含まれる。この方法は、より包括的でさえある血液試験を可能にし、同種免疫及びそれに続く輸血反応の発生の低減をもたらすはずである。
【００１６】
また、本方法は、ＤＶ及びＤＶＩ表現型を含むハイブリッドＲＨＤ−ＲＨＣＥ遺伝子によってもたらされる、幾つかの共通の部分を有するＤ表現型を区別することができるという点で有利である。これらの表現型は、増幅により予測される断片を欠いている。ＤＶＩ表現型は比較的一般的であり、西欧出身者４０００人に１人の割合で発生する。ＤＶ表現型に関する少なくとも８つの異なる遺伝的塩基、及びＤＶＩ表現型に関する少なくとも４つの異なる遺伝的塩基が存在する。全ての既知のＤＶ表現型を、ＭＰＸ産物のその後の更なる解析に続いて区別することができる。ＤＶＩ表現型の個体は多くのＤエピトープを欠失していて、輸血又は妊娠によってＲＨＤ抗原に対して同種免疫化する可能性がある。英国では、ＤＶＩの母親は同種免疫を避けるために抗Ｄ抗体を受けるので、意図的にＤ陰性に分類される。しかし、ＤＶＩ表現型の血液ドナーをＤ陰性に分類する場合、この血液は「本当の」Ｄ陰性個体に輸血され、同種免疫化を引き起こす可能性がある。本発明の試験を使用した遺伝子型決定法はＤＶＩの個体を同定し、Ｄ陰性個体への輸血のためにＤＶＩの個体をドナー集団から除外することができる。
【００１７】
この方法は、成人のドナー被験者の解析に使用することができるという点で、更に有利である。これは、頻繁に輸血を受ける被験者、例えば、鎌状赤血球貧血症の被験者に関して重要である。
【００１８】
ＤＨＡＲ表現型は、ＲＨＣＥのエキソン５がＲＨＤに置換されたハイブリッドＲＨＣＥ−ＲＨＤ遺伝子に関連する(Beckers E A他, Br J Haematol., 1996, Mar, 92(3), 751-7)。ＤＨＡＲ赤血球は少ないが、かなりの数のＤエピトープを発現する。従来の血清学的手法を使用すると、これらの個体はＲｈ  Ｄ陰性と分類され、Ｄ陰性の個体に輸血される可能性がある。これらの個体が免疫化する可能性がある。ＤＨＡＲは非常にまれな血液型である。本発明の試験は、ＤＨＡＲ表現型の検出を可能にする。
【００１９】
この方法で使用される少なくとも１つのプライマーは、増幅産物の検出を可能にするために標識することが好ましい。好適な標識が当業者には既知である。例えば、プライマーの１つを６−ＦＡＭで標識することが望ましい。
【００２０】
本発明のこの態様及び続く態様で使用される核酸は、血液に限定されず、頬のスメア、尿、羊水等の任意の適切なソースに由来し得る。核酸は血液由来であることが好ましい。
【００２１】
血液を任意の既知の様式、例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏで用いることができる。特に、本発明の方法は個体、例えば、血液輸血を必要とする患者から直接採取した血液、又は個体へ輸血される血液サンプル、例えば、献血からの血液で行うことができる。
【００２２】
核酸はＤＮＡであることが好ましく、ゲノムＤＮＡであることが最も好ましい。
【００２３】
アニーリング温度は５４〜６３℃であり得る。アニーリング温度は約６０℃であること
が好ましい。アニーリング温度は６０℃であることが最も好ましい。
【００２４】
本発明の方法は、他のＭＰＸ  ＰＣＲ法と組み合わせて、他の血液型遺伝子の遺伝子型を決定することができる。例えば、本発明の方法は、ＡＢＯ／ＭＮＳ／Ｐ１／ＲＨＣＥ／ＬＵ（Ｌｕｔｈｅｒａｎ）／ＫＥ（Ｋｅｌｌ）／ＬＥ（Ｌｅｗｉｓ）／ＦＹ（Ｄｕｆｆｙ）／ＪＫ（Ｋｉｄｄ）／ＤＩ（Ｄｉｅｇｏ）／ＹＴ（Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ）／ＸＧ／ＳＣ（Ｓｃｉａｎｎａ）／ＤＯ（Ｄｏｍｂｒｏｃｋ）／ＣＯ（Ｃｏｌｔｏｎ）／ＬＷ／ＣＨ／ＲＧ（Ｃｈｉｄｏ／Ｒｏｄｇｅｒｓ）／Ｈｈ／ＸＫ／ＧＥ（Ｇｅｒｂｉｃｈ）／ＣＲＯＭ（Ｃｒｏｍｅｒ）／ＫＮ（Ｋｎｏｐｓ）／ＩＮ（Ｉｎｄｉａｎ）／ＯＫ／ＲＡＰＨ／ＪＭＨ（ＪｏｈｎＭｉｌｔｏｎＨａｇｅｎ）／ＩＧＮＴ／Ｐ及び／又はＧＩＬ系及び／又は既知であるか、これから既知になる任意の他の血液型系に関連するＭＰＸ  ＰＣＲと組み合わせることができる。
【００２５】
本発明の方法で増幅された核酸は任意の適切な方法を使用して検出することができる。例えば、検出対象の配列に特異的である適切な核酸プローブで、増幅した核酸をハイブリダイズすることができる。適切な核酸プローブを遺伝子チップ等の形で提供することができる。好ましくはこの遺伝子チップには、他の血液型の遺伝子型決定法に特異的な核酸に対してハイブリダイズする核酸プローブが含まれる。
【００２６】
本発明の好ましい方法では、ＲＨＤ遺伝子核酸を、以下のプライマー対：１と２；３と４；５と６；７と８；９又は１０と１１；１２と１３；１４と１５；及び１８と１９の１対又は複数対、好ましくはこれらのプライマー対全てと接触させる。
【００２７】
代替的な好ましい実施の形態では、ＲＨＤ遺伝子核酸を、以下のプライマー対：１と２；３と４Ａ；５と６；７と８Ａ；９Ａ、１０Ａ又は１０Ｂと１１Ａ；１２と１３；１４Ａと１５Ａ；１６と１７；１８と１９；及び３０と３１の１対又は複数対、好ましくはこれらのプライマー対全てと接触させる。
【００２８】
最も好ましくは、ＲＨＤ遺伝子核酸を、以下のプライマー対：１と２；３と４又は４Ａ；５と６；７と８又は８Ａ；９、９Ａ、１０、１０Ａ又は１０Ｂと１１又は１１Ａ；１２と１３；１４又は１４Ａと１５又は１５Ａ；１６と１７；１８と１９；及び３０と３１の全てと接触させる。
【００２９】
本発明の第２の態様によれば、マルチプレックスＰＣＲによるＲＨＤ遺伝子型解析の方法が提供され、この方法は被験者の血液由来のＲＨＤ遺伝子核酸を、以下の表（表２Ａ）から選択される少なくとも１つのプライマー（該プライマーは表中で示される全配列又は大文字で示される配列を含むことができる）と接触させること、及びＲＨＤ遺伝子核酸を増幅させることを含む方法である。
【００３０】
【表３】
2008513036.tif 000004
【００３１】
当業者に理解されるように、増幅のために一対のプライマーを使用することが必要である。両方のプライマーは表２Ａから選択されるか、又はプライマーの１つを表２Ａから選択して、任意の適切な第２のプライマー、例えば、表２のプライマー又は任意の他の適切なプライマーと共に使用することができる。このプライマー対は単独又は任意の他のプライマーと共に使用することができる。好ましくは、この方法は、ＲＨＤ遺伝子核酸を以下のプライマー対：１と２；３と４又は４Ａ；５と６；７と８又は８Ａ；９、９Ａ、１０、１０Ａ又は１０Ｂと１１又は１１Ａ；１２と１３；１４又は１４Ａと１５又は１５Ａ；１６と１７；１８と１９；及び３０と３１の１対又は複数対と接触させることを含む。
【００３２】
代替的な好ましい実施形態では、この方法は、ＲＨＤ遺伝子核酸を以下のプライマー対：１と２；５と６；１０と１１；１２と１３；１４、１５、１８及び１９の１対又は複数対と接触させることを含む。
【００３３】
更に代替的な好ましい実施形態では、この方法は、ＲＨＤ遺伝子核酸を以下のプライマー対：１と２；３と４Ａ；５と６；７と８Ａ；９Ａ、１０Ａ又は１０Ｂと１１Ａ；１２と１３；１４Ａと１５Ａ；１６と１７；１８と１９；及び３０と３１の１対又は複数対と接触させることを含む。
【００３４】
本発明のこの方法及びこれに続く方法では、プライマー対を単独又は組み合わせて使用して、例えば、対象となるエキソンの１つ、幾つか又は全てを増幅させることができる。
【００３５】
本発明の第１の態様で上記されるように、表２で示されたそれぞれのプライマーは、５’末端のＭＡＰＨタグ（小文字で示されるプライマー配列の初めの１８ヌクレオチド）と遺伝子特異的な配列とを含む。当業者に理解されるように、ＲＨＤ遺伝子核酸を増幅するために、５’末端のＭＡＰＨタグのないプライマー（大文字のみの配列で示されるプライマー配列）を本発明の方法に使用することができる。代替的には、このプライマー配列はこの表で示されたＭＡＰＨタグとは異なるタグ配列を含むことができる。
【００３６】
本発明の第３の態様によれば、マルチプレックスＰＣＲによるＡＢＯ遺伝子型解析の方法が提供され、この方法は被験者由来のＡＢＯ遺伝子核酸を以下の表（表３）に示される以下のプライマー対（該プライマー対は表中に示される全配列又は大文字で示される配列を含む）：２０と２１；２２と２３；２４又は２４Ａと２５；２６と２７；及び２８と２９の１対又は複数対と接触させること、及びＡＢＯ遺伝子核酸を増幅させることを含む方法である。
【００３７】
【表４】
2008513036.tif 000005
【００３８】
ＡＢＯ遺伝子核酸を上述した全てのプライマー対と接触させることが好ましい。
【００３９】
表３で示されたそれぞれのプライマーは、５’末端のＭＡＰＨタグ（小文字で示されるプライマー配列の初めの１８ヌクレオチド）と遺伝子特異的な配列（大文字で示される）とを含む。このＭＡＰＨタグは核酸の増幅を促進するために使用される。具体的には、このプライマーを使用してＡＢＯ遺伝子核酸をＰＣＲ増幅させると、この配列を更に増幅するためにＭＡＰＨタグに対するプライマーが使用される。両方の増幅過程を同時に行うことが好ましい。当業者に理解されるように、ＡＢＯ遺伝子核酸を増幅するために、５’末端のＭＡＰＨタグのないプライマー（大文字のみの配列で示されるプライマー配列）を本発明の方法に使用することができる。他にも、このプライマー配列はこの表で示されるＭＡＰＨタグとは異なるタグ配列を含むことができる。
【００４０】
対立遺伝子の特異性が、既存の対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって決定されるような遺伝子特異的な様式で、これらのプライマーはＡＢＯエキソン２、４、６及び７を増幅する。遺伝子特異的であるが、対立遺伝子特異的ではないように、これらのプライマー配列は任意の既知のＡＢＯヌクレオチド多型を意図的に除外するために選択される。このプライマーセットによるＡＢＯ遺伝子の増幅が、全ての既知のＡＢＯバリアントの配列特異的なオリゴヌクレオチドプローブによる同定を可能に
する。
【００４１】
血液を任意の既知の様式、例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏで用いることができる。特に、本発明の方法は個体、例えば、輸血を必要とする患者から直接採取した血液、又は個体へ輸血される血液サンプル、例えば、献血からの血液で行うことができる。
【００４２】
核酸はＤＮＡであることが好ましく、ゲノムＤＮＡであることがより好ましい。
【００４３】
アニーリング温度は５４〜６３℃であり得る。アニーリング温度は約５７℃であることが好ましい。アニーリング温度は５７℃であることが最も好ましい。
【００４４】
本発明の第３の態様の方法は、他の血液型遺伝子の遺伝子型を決定するために他のＭＰＸ  ＰＣＲ法と組み合わせることができる。例えば本発明の方法は、ＲＨＤ／／ＭＮＳ／Ｐ１／ＲＨＣＥ／ＬＵ（Ｌｕｔｈｅｒａｎ）／ＫＥ（Ｋｅｌｌ）／ＬＥ（Ｌｅｗｉｓ）／ＦＹ（Ｄｕｆｆｙ）／ＪＫ（Ｋｉｄｄ）／ＤＩ（Ｄｉｅｇｏ）／ＹＴ（Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ）／ＸＧ／ＳＣ（Ｓｃｉａｎｎａ）／ＤＯ（Ｄｏｍｂｒｏｃｋ）／ＣＯ（Ｃｏｌｔｏｎ）／ＬＷ／ＣＨ／ＲＧ（Ｃｈｉｄｏ／Ｒｏｄｇｅｒｓ）／Ｈｈ／ＸＫ／ＧＥ（Ｇｅｒｂｉｃｈ）／ＣＲＯＭ（Ｃｒｏｍｅｒ）／ＫＮ（Ｋｎｏｐｓ）／ＩＮ（Ｉｎｄｉａｎ）／ＯＫ／ＲＡＰＨ／ＪＭＨ（ＪｏｈｎＭｉｌｔｏｎＨａｇｅｎ）／ＩＧＮＴ／Ｐ及び／又はＧＩＬ系及び／又は既知であるか、これから既知になる任意の他の血液型系に関連するＭＰＸ  ＰＣＲと組み合わせることができる。
【００４５】
本発明の第３の態様の方法によって増幅された核酸は、上記のように検出することができる。
【００４６】
好ましくは、この方法は、被験者の血液由来のＡＢＯ遺伝子核酸を以下のプライマー対：２０と２１；２２と２３；２４と２５；２６と２７；及び２８と２９の１対又は複数対、好ましくは全てと接触させることを含む。
【００４７】
代替的には、この方法は、被験者の血液由来のＡＢＯ遺伝子核酸を以下のプライマー対：２０と２１；２２と２３；２４Ａと２５；２６と２７；及び２８と２９の１対又は複数対、好ましくは全てと接触させることを含む。
【００４８】
本発明の第４の態様によれば、マルチプレックスＰＣＲによるＡＢＯ遺伝子型解析の方法が提供され、この方法は被験者の血液由来のＡＢＯ遺伝子核酸を以下の表（表３）から選択される少なくとも１つのプライマー（該プライマー対は表中に示される全配列又は大文字で示される配列を含む）と接触させること、及びＡＢＯ遺伝子核酸を増幅させることを含む方法である。
【００４９】
【表５】
2008513036.tif 000006
【００５０】
当業者に理解されるように、増幅のために一対のプライマーを使用することが必要である。両方のプライマーは表３から選択されるか、又はプライマーの１つを表３から選択して、任意の適切な第２のプライマーと共に使用することができる。このプライマー対を単独又は任意の他のプライマーと共に使用することができる。好ましくは、この方法は、ＡＢＯ遺伝子核酸を以下のプライマー対：２０と２１；２２と２３；２４又は２４Ａと２５；２６と２７；及び２８と２９の１対又は複数対と接触させることを含む。
【００５１】
好ましい一つの実施形態では、本方法は、ＡＢＯ遺伝子核酸を以下のプライマー対：２０と２１；２２と２３；２４と２５；２６と２７；及び２８と２９の１対又は複数対と接触させることを含む。
【００５２】
代替的な実施形態では、本方法は、ＡＢＯ遺伝子核酸を以下のプライマー対：２０と２１；２２と２３；２４Ａと２５；２６と２７；及び２８と２９の１対又は複数対と接触させることを含む。
【００５３】
本発明の第５の態様によれば、マルチプレックスＰＣＲによるＡＢＯ遺伝子型解析及びＲＨＤ遺伝子型解析の方法が提供され、この方法は被験者由来のＡＢＯ遺伝子核酸及びＲＨＤ遺伝子核酸を以下の表（表４）に示す以下のプライマー対（該プライマー対は表中に示される全配列又は大文字で示される配列を含む）：１と２；３と４又は４Ａ；５と６；７と８又は８Ａ；９、９Ａ、１０、１０Ａ又は１０Ｂと１１又は１１Ａ；１２と１３；１４又は１４Ａと１５と１５Ａ；１６と１７；１８と１９；２０と２１；２２と２３；２４又は２４Ａと２５；２６と２７；２８と２９；及び３０と３１の１対又は複数対と接触させること、及びＲＨＤ遺伝子核酸及びＡＢＯ遺伝子核酸を増幅させることを含む方法である。
【００５４】
【表６】
2008513036.tif 000007
【００５５】
核酸を上述した全てのプライマー対と接触させることが好ましい。
【００５６】
本発明の上述した態様で示されるように、表４で示されたそれぞれのプライマーは、５’末端のＭＡＰＨタグ（小文字で示されるプライマー配列の初めの１８ヌクレオチド）と遺伝子特異的な配列（大文字で示される）とを含む。当業者に理解されるように、ＲＨＤ遺伝子核酸及びＡＢＯ遺伝子核酸を増幅させるために、５’末端のＭＡＰＨタグのないプライマー（大文字のみの配列で示されるプライマー配列）を本発明の方法に使用することができる。代替的には、このプライマー配列は表４で示されたＭＡＰＨタグとは異なるタグ配列を含むことができる。
【００５７】
好ましくは、この方法は、ＡＢＯ遺伝子核酸及びＲＨＤ遺伝子核酸を以下のプライマー対：１と２；３と４；５と６；７と８；９又は１０と１１；１２と１３；１４と１５；１８と１９；２０と２１；２２と２３；２４と２５；２６と２７；及び２８と２９の１対又
は複数対、好ましくは全てと接触させることを含む。
【００５８】
代替的には、この方法は、ＡＢＯ遺伝子核酸及びＲＨＤ遺伝子核酸を以下のプライマー対：１と２；３と４；５と６；７と８Ａ；９Ａ、１０Ａ又は１０Ｂと１１Ａ；１２と１３；１４Ａと１５Ａ；１６と１７；１８と１９；２０と２１；２２と２３；２４Ａと２５；２６と２７；２８と２９；及び３０と３１の１対又は複数対、好ましくは全てと接触させることを含む。
【００５９】
血液を任意の既知の様式、例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏで用いることができる。特に、本発明の方法は個体、例えば、輸血を必要とする患者から直接採取した血液、又は個体へ輸血される血液サンプル、例えば、献血からの血液で行うことができる。
【００６０】
核酸はＤＮＡであることが好ましく、ゲノムＤＮＡであることが更に好ましい。
【００６１】
アニーリング温度は５４〜６３℃であり得る。アニーリング温度は約６０℃又は約５７℃であることが好ましい。アニーリング温度は６０℃であることが最も好ましい。
【００６２】
本発明の第５の態様の方法は、他の血液型遺伝子の遺伝子型を決定するために、他のＭＰＸ  ＰＣＲ法と組み合わせることができる。例えば、本発明の方法は、ＭＮＳ／Ｐ１／ＲＨＣＥ／ＬＵ（Ｌｕｔｈｅｒａｎ）／ＫＥ（Ｋｅｌｌ）／ＬＥ（Ｌｅｗｉｓ）／ＦＹ（Ｄｕｆｆｙ）／ＪＫ（Ｋｉｄｄ）／ＤＩ（Ｄｉｅｇｏ）／ＹＴ（Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ）／ＸＧ／ＳＣ（Ｓｃｉａｎｎａ）／ＤＯ（Ｄｏｍｂｒｏｃｋ）／ＣＯ（Ｃｏｌｔｏｎ）／ＬＷ／ＣＨ／ＲＧ（Ｃｈｉｄｏ／Ｒｏｄｇｅｒｓ）／Ｈｈ／ＸＫ／ＧＥ（Ｇｅｒｂｉｃｈ）／ＣＲＯＭ（Ｃｒｏｍｅｒ）／ＫＮ（Ｋｎｏｐｓ）／ＩＮ（Ｉｎｄｉａｎ）／ＯＫ／ＲＡＰＨ／ＪＭＨ（ＪｏｈｎＭｉｌｔｏｎＨａｇｅｎ）／ＩＧＮＴ／Ｐ及び／又はＧＩＬ系及び／又は、既知であるか、これから既知になる任意の他の血液型系に関連するＭＰＸ  ＰＣＲと組み合わせることができる。
【００６３】
本発明の第５の態様の方法によって増幅させた核酸を上記のように検出することができる。
【００６４】
本発明の第６の態様によれば、マルチプレックスＰＣＲによるＡＢＯ遺伝子型解析及びＲＨＤ遺伝子型解析の方法が提供され、この方法は被験者の血液由来のＡＢＯ遺伝子核酸及びＲＨＤ遺伝子核酸を以下の表（表４Ａ）に示すプライマー（該プライマーは表中に示される全配列または大文字で示される配列を含む）の１つ又は複数と接触させること、及びＲＨＤ遺伝子核酸及びＡＢＯ遺伝子核酸を増幅させることを含む方法である。
【００６５】
【表７】
2008513036.tif 000008
【００６６】
当業者に理解されるように、増幅のために一対のプライマーを使用することが必要である。両方のプライマーを表４Ａから選択されるか、又はプライマーの１つを表４Ａから選択して、任意の適切な第２のプライマー、例えば、表４のプライマー又は任意の他の適切なプライマーと共に使用することができる。このプライマー対を単独又は任意の他のプライマーと共に使用することができる。
【００６７】
好ましくは、この方法は、ＡＢＯ遺伝子核酸及びＲＨＤ遺伝子核酸を以下のプライマー対：１と２；３と４；５と６；７と８；９又は１０と１１；１２と１３；１４と１５；１８と１９；２０と２１；２２と２３；２４と２５；２６と２７；及び２８と２９の１対又は複数対と接触させることを含む。
【００６８】
代替的には、この方法は、ＡＢＯ遺伝子核酸及びＲＨＤ遺伝子核酸を以下のプライマー対：１と２；３と４；５と６；７と８Ａ；９Ａ、１０Ａ又は１０Ｂと１１Ａ；１２と１３；１４Ａと１５Ａ；１８と１９；２０と２１；２２と２３；２４Ａと２５；２６と２７；２８と２９；及び３０と３１の１対又は複数対と接触させることを含む。
【００６９】
本発明の第７の態様によれば、１つ又は複数の以下のＰＣＲプライマーが提供され、このプライマーがこの表で示される全配列又は大文字で示される配列を含み得る。
【００７０】
【表８】
2008513036.tif 000009
【００７１】
上記に示されるように、表４Ａで示されたそれぞれのプライマーは、５’末端のＭＡＰＨタグ（小文字で示されるプライマー配列の初めの１８ヌクレオチド）と遺伝子特異的な配列（大文字で示される）とを含む。本発明はまた、上記の表４Ａに示された５’末端のＭＡＰＨタグのない１つ又は複数のプライマー（大文字のみの配列で示されるプライマー配列）を提供する。このようなプライマーは、ＲＨＤ遺伝子核酸及びＡＢＯ遺伝子核酸を増幅させるのに使用することができる。当業者に理解されるように、表４Ａに大文字で示されたプライマー配列を、異なるタグ配列のような更なる配列の付加によって修飾することができる。
【００７２】
本発明によるプライマーは、上記のＭＡＰＨタグの有無に関わらず使用することができる。このタグがない場合、プライマーは以下の配列を有する。
【００７３】
【表９】
2008513036.tif 000010
【００７４】
本発明のプライマーを任意の方法で使用することができる。特に、このプライマー配列をプローブとして、又はプライマーとして使用することができる。好ましくは、このプライマーは、遺伝子型解析、特に血液型解析、特にＲＨＤ及び／又はＡＢＯ遺伝子型解析の方法で使用される。
【００７５】
使用にあたって、本発明の方法で示されるように、プライマーは対で使用する。好ましいプライマー対は以下の通りである：
１と２；
３と４又は４Ａ；
５と６；
７と８又は８Ａ；
９、９Ａ、１０、１０Ａ又は１０Ｂと１１又は１１Ａ；
１２と１３；
１４又は１４Ａと１５又は１５Ａ；
１６と１７；
１８と１９；
２０と２１；
２２と２３；
２４又は２４Ａと２５；
２６と２７；
２８と２９；及び
３０と３１。
【００７６】
プライマーは簡単に検出できるように標識化される。
【００７７】
本発明のプライマー及び本発明の方法で使用されるプライマーは、当業者によって変更されてもよい。例えば、このプライマーの長さを変えてもよい。これにより、プライマーのＴmの変化がもたらされる。これにより、ＰＣＲ反応のアニーリング温度に影響を及ぼし得る。このプライマーの長さは、プライマーのＴm値が７０℃未満になるように、選択することができる。
【００７８】
塩基の置換は、ＰＣＲ反応のＲＨＤ特異性に影響を与えずに、プライマーの５’末端で行うことができる。
【００７９】
プライマーの二本鎖化に対するΔＧ値が−１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満であることが好ましい。
【００８０】
本発明の第７の態様によるプライマー及び本発明の既出の態様で使用されるプライマーは、切断、又は認識される配列の更なる部分を含むように伸長、又は認識される配列に沿ってプライマー配列を動かすことによって修飾することができる。同様に、１つ又は複数、好ましくは５つ以下、より好ましくは３つ以下、更により好ましくは２つ以下のヌクレオチドを変更することによって、プライマーをわずかに修飾することができる。得られたプライマーは、機能的バリアント、すなわち同様の配列に特異的な元のプライマーのバリアントとして知られていて、これは本発明の一部を構成する。
【００８１】
本発明の第８の態様によれば、上記の方法によって製造される１つ又は複数のＰＣＲ産物の同定を可能にする、複数の付着したプローブ配列を有する遺伝子チップが提供される。好ましくは、遺伝子チップは、上記の方法を使用することによって製造される全ての可能な限りのＰＣＲ産物の検出を可能にするのに十分なプローブ配列を含む。
【００８２】
当業者に理解されるように、本発明の方法を任意の他の遺伝子型決定法と組み合わせて行うことができる。例えば、ＲＨＤ遺伝子及びＡＢＯ遺伝子の遺伝子型を決定する方法は、他の血液遺伝子、又は任意の他の遺伝子の遺伝子型を決定する方法と組み合わせることができる。全ての遺伝子型決定法は、マルチプレックスＰＣＲを使用して行うことが好ましい。一連のプライマーを使用して、遺伝子型を決定したい特異的なヌクレオチド配列を増幅させることが特に好ましい。使用したプライマーは全て、タグ配列に特異的なプライマーを使用した全てのヌクレオチド配列の続く増幅を可能にする同様の５’末端のタグ配
列を有することが好ましい。
【００８３】
添付の図１〜図１１を参照して本発明による方法及びプライマーを以下に例示としてのみ記載する。
【実施例】
【００８４】
ＲＨＤプライマー設計
ＲＨＤを含めたエキソン１〜１０のエキソン配列が、本発明のＲＨＤのＭＰＸ  ＰＣＲによって増幅されることを確認するために、プライマーを設計又は選択した。ＲＨＤプライマーの位置設計を図１に示す。ＲＨＤプライマーを図３に示す。
【００８５】
プライマーの設計はＯｌｉｇｏ  ｖ６．０プライマー設計ソフトウェア(Molecular Biology Insights, Inc.)を使用して行った。Ｏｌｉｇｏ  ｖ６．０ソフトウェアは、収集したプライマー配列を電子的にマルチプレックスすることを可能にする。すなわち、プライマー間の不一致の検出及び起こり得るプライマー二量体形成の確認を可能にする。プライマーが自己二量体化することが見出されるか、又はプライマーがマルチプレックスの大半の他のプライマーと不適合であることが見出された場合、プライマーを再設計した。プライマー配列対が適合するように、すなわちプライマー二量体形成が制限されることが確認されるように、プライマー配列対を選択した。プライマーのＴm値が７０℃未満になるように、プライマーの長さを選択した。
【００８６】
最大１００％の率をそれぞれのプライマーに与え、プライマー二量体形成の確認もするウェブベースのプログラムであるＮｅｔＰｒｉｍｅｒ(PREMIER Biosoft International)を使用して、プライマーの評価も行った。ＮｅｔＰｒｉｍｅｒの結果から、最も高い率のプライマーを選択すること、及びＯｌｉｇｏ  ｖ６．０ＭＰＸの結果から、最も多くの数の他のプライマーに適合したプライマーを選択することを組み合わせて、マルチプレックスのためのプライマーを選択した。
【００８７】
増幅させた領域にＲＨＤ遺伝子を検出するための既知の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）が含まれることを確認するために、プライマーを設計した。このことは一般的に、プライマー位置が当該エキソンの周りのイントロン配列に位置しているということを意味していた。ＲＨＤ遺伝子のＳＮＰ位置は、密接に関係しているＲＨＣＥ遺伝子の配列データと一致させたＲＨＤ配列データ（イントロン及びエキソン）とともに、この遺伝子の配列データ上にマッピングされた。遺伝子チップと組み合わせたＭＰＸ  ＰＣＲによって、バリアントＲＨＤ対立遺伝子を検出する。
【００８８】
ＲＨＤのエキソン１〜１０のプライマーの例を図２に示す。ＲＨＤ遺伝子の特異性を確認するために、ＲＨＤのＭＰＸのプライマーをＲＨＣＥ配列に対して確認した。
【００８９】
図２Ａは、エキソン１（イタリック体で示される）に関するＲＨＤ配列及びＲＨＣＥ配列のアラインメントを示す。このエキソンにおける２つの遺伝子間の違いに下線が施されている。３つのＳＮＰの位置を示す（二重線）。
ＳＮＰ              対立遺伝子
Ｃ８Ｇ              弱いＤ型３
Ｇ４８Ａ            ＲＨＤ  Ｗ１６Ｘ（ＲＨＤ陰性の対立遺伝子）
Ｃ１２１Ｔ          ＲＨＤ  Ｑ４１Ｘ（ＲＨＤ陰性の対立遺伝子）
【００９０】
プライマー配列位置（１０１Ｆ、１９８Ｒ）を太字で示す（ＭＡＰＨタグがない）。
【００９１】
同様に、図２Ｂ〜図２Ｋは、ＲＨＤ及びＲＨＣＥの配列、並びにＳＮＰ及びエキソン２
〜１０のプライマーを示す。
【００９２】
エキソン２の先頭のフォワードプライマーは、ＲＨＣ並びにＲＨＤからの増幅が見出されたため、プライマー配列をLegler, T J他(Transfusion Medicine, 2001, 11, 383-388)で開示されるものに変えた。ＲＨＤ特異性を達成するために、エキソン２に対して全部で１０個の異なるプライマーを試みた。塩基変化がこの配列に導入されている場合には、エキソン２に対して６つのプライマーを試みた。このプライマーがエキソン２の産物を少量しか増幅しなかったが、この配列変化によってＲＨＤ特異性がもたらされなかったため、これらのことを試験した。
【００９３】
プライマーの大半が３’にＲＨＤ特異的な末端を有するが、２つのプライマーがＲＨＤ配列及びＲＨＣＥ配列に相補的である（エキソン２のリバースプライマー及びエキソン８のリバースプライマー）。エキソン５のフォワードプライマーは、ＲＨＣＥには挿入があるが、ＲＨＤにはない配列領域に及んでいる。
【００９４】
エキソン４及びエキソン５に対しては、これまでに公開されたリバースプライマー配列を使用することができる(Maaskant-van Wijk他, Transfusion, 38, 1015-1021, 1998)。
【００９５】
ＡＢＯプライマー設計
ＡＢＯプライマーを図５Ａに示す。ＡＢＯ遺伝子のエキソン２、４、６及び７を増幅させるようにプライマーを設計した。１つの設計では、マルチプレックス反応における最適な増幅のために、４００ｂｐ以下のＰＣＲ産物が望まれ、２つの部分、つまり７Ａ及び７Ｂで、エキソン７を増幅させるようにプライマーが選択された。断片７Ｂは、４６１塩基対の長さであるが、記載した条件下で容易に増幅され、このＤＮＡ配列内の全ての既知の対立遺伝子バリアントを包含することが必要とされる。エキソンにおける全ての既知の突然変異型を包含するようにプライマー対を設計し、イントロンの非可変領域に置いた。対立遺伝子を決定する突然変異を図５Ｂで太字で示し、この遺伝子のコード配列における突然変異の位置を上付き文字を付したヌクレオチド数で示した。最初の設計に続いて、イントロン５の多型がプライマーｉｎｔ５−４４Ｆにおいて見出された。他のイントロン５遺伝子に特異的なプライマーを同定し、この試験ではｉｎｔ５−３６７Ｆに置換された（図９Ａ及び図９Ｂを参照）。マイクロアレイの目的は、遺伝子特異的なＰＣＲ産物と結合し、ＡＢＯ特異的で、エキソン特異的なプライマーの選択という本発明者の目標であった特異的なオリゴヌクレオチドプローブによって、対立遺伝子の特異性を決定することである。
【００９６】
プライマー配列をｄｅ  ｎｏｖｏで設計した。Ｏｌｉｇｏ  ｖ６．０プライマー設計ソフトウェアを使用して、全てのプライマー対を確認して、溶融温度、起こり得るプライマー二量体形成及びヘアピン形成を評価した。溶融温度が約６０℃になるように、プライマーの長さを選択した。プライマーの配列を以下の表に示す。
【００９７】
【表１０】
2008513036.tif 000011
【００９８】
マルチプレックスＰＣＲによる血液のＲＨＤ遺伝子解析
ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉキット(Qiagen Ltd.)を使用してゲノムＤＮＡを成人の末梢血液から採取した。２６０ｎｍでの吸光度を測定することで、それぞれのサンプルのゲノムＤＮＡの量を定量した。標準ゲノムＤＮＡサンプルを使用して、マルチプレックスＰＣＲの信頼性を評価した。
Ｒ１Ｒ１＝ＣＤｅ／ＣＤｅ
Ｒ２Ｒ２＝ｃＤＥ／ｃＤＥ
ｒｒ＝ｃｄｅ／ｃｄｅ
ｒ’ｒ＝Ｃｄｅ／ｃｄｅ
ｒ’’ｒ＝ｃｄＥ／ｃｄｅ
Ｒ０ｒ＝ｃＤｅ／ｃｄｅ
【００９９】
ＰＣＲ混合物２５μｌは、以下の表の通り構成される。
【０１００】
【表１１】
2008513036.tif 000012
【０１０１】
プライマーは、Operon Biotechnologies(旧Qiagen)製であった。適切なプライマー混合物を図４に示す。図４に示されたプライマー混合物は目安であり、使用する様々なプライ
マー対の比を変えることにより、プライマー混合物を様々に変更することができる。
【０１０２】
マルチプレックス増幅及びプローブハイブリダイゼーション（ＭＡＰＨ）でタグ付けされたＰＣＲプライマーを使用して、５’末端のＭＡＰＨタグ及び３’末端の遺伝子特異的な断片を有する「ハイブリッド」ＰＣＲプライマーを作製することにより、遺伝子断片をマルチプレックス増幅させる。ＰＣＲの初期段階では、これらのハイブリッドプライマーによって遺伝子断片を増幅させる。ＰＣＲ混合物には、ハイブリッドプライマーによって増幅されたそれぞれのＰＣＲ産物を増幅させるＭＡＰＨフォワードプライマー及びＭＡＰＨリバースプライマーが含まれる。これにより、マルチプレックス反応を同調させることができ、最大２０個の遺伝子断片をこの様式で増幅させることができる。フランキング配列を含むＭＡＰＨの修飾は、White他(White, S他, Am. J. Hum. Genet. 2002, Aug, 71(2), 365-74)によって開示されていて、これは、「ＭＡＰＨフォワード」及び「ＭＡＰＨリバース」と表される（図３）。このフランキング配列は、Sanquin製であった。
【０１０３】
増幅プロトコルは、以下の通りであった。
【０１０４】
【表１２】
2008513036.tif 000013
【０１０５】
これは、Qiagenによって詳述されたプロトコルをマルチプレックスＰＣＲ緩衝液キットに適用したものである。変性時間を延ばし、選択されたアニーリング温度は所定の範囲（５７〜６３℃）の真ん中であり、サイクル数は所定の範囲（３０〜４５サイクル）の真ん中である。
【０１０６】
ＤＨＡＲゲノムＤＮＡサンプルは、ＲＨＤのイントロン４ではなくＲＨＣＥのイントロン４を有する。エキソン５のフォワードプライマーの位置により、ＭＰＸプライマーの元のセットでは、ＤＨＡＲサンプルのエキソン５産物は増幅されない。従って、本発明者等はＲＨＣＥ特異的な領域のイントロン４におけるＡｌｕ配列の５’末端のフォワードプライマーを設計している。このプライマーは、エキソン５（ＲＨＤ特異的）のリバースプライマーと適合する。
【０１０７】
マルチプレックスＰＣＲによる血液のＡＢＯ遺伝子解析
ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉキット(Qiagen Ltd.)、又は改変された塩析手法(Miller他, Nuc. Ac. Res., 1988, 16 1215)によって、成人の末梢血液からゲノムＤＮＡを採取した。ＤＮＡ濃度を２６０ｎｍでの分光光度法によって測定し、１００ｎｇ／μＬに希釈した。増幅させるために、様々な一般的なＡＢＯ血液型のサンプルを選択した。
【０１０８】
【表１３】
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【０１０９】
ＡＢＯプライマー混合物は、以下の通りであった。
【０１１０】
【表１４】
2008513036.tif 000015
【０１１１】
以下の条件下、ＰＥ９７００サーマルサイクラー又はＰＥ２７００サーマルサイクラー(Perkin Elmer/Cetus, Norwalk, CT)のいずれかによって０．２ｍＬＰＣＲチューブで、増幅を行った。
【０１１２】
【表１５】
2008513036.tif 000016
【０１１３】
３％アガロースゲル（自家調製した）又は５〜２０％ポリアクリルアミドゲル(Novex Gels, Invitrogen, Inc.)のいずれかでそれぞれの反応物１０μＬを泳動させることによって、増幅した産物を評価した。代表的なゲルを図７に示すが、これは、増幅反応の強い特性を示す。７００ｂｐ以上の薄いバンドは、予測される、遺伝子特異性が高い断片の増幅レベルが低いことを示す。
【０１１４】
代替的な実施例では、以下の混合物を使用した。
【０１１５】
【表１６】
2008513036.tif 000017
【０１１６】
上記の反応で使用したストックＡＢＯプライマー混合物を以下のように調製した。
【０１１７】
【表１７】
2008513036.tif 000018
【０１１８】
本実施例で使用したプライマー、増幅された領域及び得られたゲルを図９Ａ、図９Ｂ及び図１０で示す。
【０１１９】
マルチプレックスＰＣＲによる血液のＲＨＤ遺伝子解析及びＡＢＯ遺伝子解析
ゲノムＤＮＡを単離し、上記のように定量した。使用したプライマー混合物は、別々のＲＨＤのＭＰＸ  ＰＣＲ及びＡＢＯのＭＰＸ  ＰＣＲで示されたものであった。しかし、以下の反応混合物の設定により、この反応におけるプライマーの最終濃度は、上記で詳述したものと異なっていた。
【０１２０】
ＰＣＲ混合物２５μｌの構成は、以下の表の通りであった。
【０１２１】
【表１８】
2008513036.tif 000019
【０１２２】
以下のプログラムを使用したことを除いて、上記と同様にＰＣＲ増幅反応を行った。
【０１２３】
【表１９】
2008513036.tif 000020
【０１２４】
上記と同様に、増幅した産物を評価した。代表的なゲルを図８に示し、これは、増幅反応の強い特性を示す。
【０１２５】
代替的な実施例では、以下の混合物を使用した。
【０１２６】
【表２０】
2008513036.tif 000021
【０１２７】
【表２１】
2008513036.tif 000022
【０１２８】
マルチプレックスＰＣＲの結果
ＭＰＸ  ＰＣＲは、必要な全ての産物を増幅させる。これらの産物は図６（ＲＨＤ遺伝子増幅産物）及び図７（ＡＢＯ遺伝子増幅産物）で示されるように、ゲル電気泳動法によって視覚化される。代替的には、キャピラリーマイクロシーケンサー(Applied Biosystems製)を使用するＧｅｎｅＳｃａｎ（登録商標）解析ソフトウェア(Applied Biosystems製)によって、この産物を可視化することができる。またこの産物をシーケンシングして、正しいアンプリコンが増幅されていることを確認する。
【０１２９】
アンプリコン及びこのアンプリコンが由来するＲＨＤエキソンのそれぞれの大きさを図６の左側に示す。図６では、「ｇＤＮＡ」は、ゲノムＤＮＡを意味する。ＲＨＤのＲ0Har遺伝子バリアント（ＤＨＡＲ）のエキソン５に特異的な産物も強調されている。この産物は、通常のＤ陽性サンプル及びＤ陰性サンプルからは得られない。プライマー対はまた、別々に試験され、ＲＨＤ特異性を確認する。
【０１３０】
図７では、それぞれのアンプリコンが由来するＡＢＯエキソンをこの図の右側に示す。エキソン４は１５１ｂｐであり、エキソン２は２１７ｂｐであり、エキソン６は２６３ｂｐであり、エキソン７Ａは３７１ｂｐであり、エキソン７Ｂは４６１ｂｐである。この図の左側の数字は、ＤＮＡマーカーのバンドの大きさを示す。
【０１３１】
図８では、それぞれのアンプリコンが由来するＲＨＤエキソン及びＡＢＯエキソンをこの図の右側に示す。この図の左側の数字は、ＤＮＡマーカーのバンドの大きさを示す。
【０１３２】
増幅した核酸をハイブリダイズして、遺伝子チップ等のアレイで更にシーケンシングすることができる。
【０１３３】
ＭＰＸ  ＰＣＲの条件は本明細書中に記載されているが、当業者には、任意の適切なＭＰＸ  ＰＣＲ条件を使用することができることを留意されたい。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】ＲＨＤプライマーの位置設計を示す図である。
【図２Ａ】本発明のＲＨＤのＭＰＸ  ＰＣＲ法におけるエキソン１の増幅のためのＲＨＤプライマーを示す図である。
【図２Ｂ−１】本発明のＲＨＤのＭＰＸ  ＰＣＲ法におけるエキソン２の増幅のためのＲＨＤプライマーを示す図である。
【図２Ｂ−２】図２Ｂの続き
【図２Ｃ】本発明のＲＨＤのＭＰＸ  ＰＣＲ法におけるエキソン３の増幅のためのＲＨＤプライマーを示す図である。
【図２Ｄ】本発明のＲＨＤのＭＰＸ  ＰＣＲ法におけるエキソン４の増幅のためのＲＨＤプライマーを示す図である。
【図２Ｅ−１】本発明のＲＨＤのＭＰＸ  ＰＣＲ法におけるエキソン５の増幅のためのＲＨＤプライマーを示す図である。
【図２Ｅ−２】図２Ｅの続き
【図２Ｆ】本発明のＲＨＤのＭＰＸ  ＰＣＲ法におけるエキソン６の増幅のためのＲＨＤプライマーを示す図である。
【図２Ｇ】本発明のＲＨＤのＭＰＸ  ＰＣＲ法におけるエキソン７の増幅のためのＲＨＤプライマーを示す図である。
【図２Ｈ】本発明のＲＨＤのＭＰＸ  ＰＣＲ法におけるエキソン７の代替的なプライマーの増幅のためのＲＨＤプライマーを示す図である。
【図２Ｉ】本発明のＲＨＤのＭＰＸ  ＰＣＲ法におけるエキソン８の増幅のためのＲＨＤプライマーを示す図である。
【図２Ｊ】本発明のＲＨＤのＭＰＸ  ＰＣＲ法におけるエキソン９の増幅のためのＲＨＤプライマーを示す図である。
【図２Ｋ】本発明のＲＨＤのＭＰＸ  ＰＣＲ法におけるエキソン１０の増幅のためのＲＨＤプライマーを示す図である。
【図３】本発明のＲＨＤプライマー配列を示す図である。
【図４】本発明の方法で使用されるＲＨＤプライマー混合物を示す図である。
【図５Ａ】本発明のＡＢＯプライマー配列を示す図である。
【図５Ｂ】ＡＢＯ遺伝子配列におけるプライマー位置を示す図である。斜線掛けした文字は遺伝子特異的なプライマー配列を示し、小文字はイントロン配列を示し、大文字はエキソン配列を示し、太文字は重要な対立遺伝子で識別されるヌクレオチドを示す。数字はＡＢＯ遺伝子がコードする配列におけるヌクレオチドの数を示す。Ａl対立遺伝子配列はコンセンサス配列であり、この図で示される。
【図６】エキソン８に対するプライマー対を含む本発明のＲＨＤのＭＰＸ  ＰＣＲ反応由来のＲＨＤ遺伝子増幅産物のゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図７】本発明のＡＢＯのＭＰＸ  ＰＣＲ反応由来のＡＢＯ遺伝子増幅産物のゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図８】エキソン８に対するプライマー対を含む本発明のＲＨＤ及びＡＢＯのＭＰＸ  ＰＣＲ反応由来のＲＨＤ遺伝子増幅産物及びＡＢＯ遺伝子増幅産物のゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図９Ａ】本発明の代替的なＡＢＯプライマー配列を示す図である。
【図９Ｂ】ＡＢＯ遺伝子配列におけるプライマー位置を示す図である。斜線掛けした文字は遺伝子特異的なプライマー配列を示し、小文字はイントロン配列を示し、大文字はエキソン配列を示し、太文字は重要な対立遺伝子で識別されるヌクレオチドを示す。数字はＡＢＯ遺伝子がコードする配列におけるヌクレオチドの数を示す。Ａl対立遺伝子配列はコンセンサス配列であり、この図で示される。
【図１０】本発明のＡＢＯのＭＰＸ  ＰＣＲ反応由来のＡＢＯ遺伝子増幅産物のゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図１１】エキソン８に対するプライマー対を含む本発明のＲＨＤのＭＰＸ  ＰＣＲ反応由来のＲＨＤ遺伝子増幅産物のゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図１２】本発明のプライマーを示す図である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ−１】
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【図２Ｂ−２】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ−１】
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【図２Ｅ−２】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
2008513036.tif 000051
【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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