(57)【要約】  本発明は、試料中のメチル化標的核酸を増幅し、その一方で不活性化することによって非メチル化標的核酸の増幅を回避する方法に関する。これは、標的核酸の亜硫酸水素塩処理後の制限酵素消化によって達成される。本発明はさらに、非メチル化標的核酸の増幅を回避し、その一方で試料中のメチル化標的核酸を増幅するための制限酵素の使用および本発明に従う方法を実施するためのキットに関する。
2008511298.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のメチル化標的核酸を増幅し、その一方で非メチル化標的核酸の増幅を回避し、それによってメチル化標的核酸が制限酵素の認識核酸配列中にメチルシトシン塩基を有するヌクレオチドを含む方法であって、ここで認識核酸配列が増幅された反応産物中にあり、該方法は、以下の工程：
（ａ）試料中のメチル化標的核酸中の非メチル化シトシン塩基をウラシル塩基に転換し、その一方でメチルシトシン塩基を転換しない工程；
（ｂ）非メチル化標的核酸を消化する制限酵素を試料に添加し、それによってメチル化標的核酸が、制限酵素によって消化されない工程；
（ｃ）制限酵素を不活性化する工程；
（ｄ）メチル化標的核酸を増幅する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
認識核酸配列中のメチルシトシン塩基を有するヌクレオチドが３’側でグアニン塩基を有するヌクレオチドと隣接し、それによってグアニン塩基を有するヌクレオチドが認識核酸配列の一部であるかまたはその一部でない、請求項１記載の方法。
【請求項３】
非メチル化標的核酸が、偶然にまたは随意に、試料中に存在するかまたは試料に導入される、請求項１または２いずれか記載の方法。
【請求項４】
非メチル化標的核酸が、請求項１〜３いずれか記載の方法の工程ａ）の前、工程ａ）の間もしくは工程ａ）の後または請求項１〜３いずれか記載の方法の工程ｂ）の前もしくは工程ｂ）の間に、偶然にまたは随意に、試料中に存在するかまたは試料に導入される、請求項１〜３いずれか記載の方法。
【請求項５】
制限酵素がメチル化感受性制限酵素である、請求項１〜４いずれか記載の方法。
【請求項６】
制限酵素が、制限酵素Acl I、BsiW I、BspD I、Bst BI、BstU I、Cla I、HpyCH4 IV、Mlu I、Nru I、Pvu I、SnaB Iおよびこれらのイソシゾマーからなる群から選択されるかまたは制限酵素BsmF I、BstZ I、Dpn II、Eci I、EcoR I、EcoR V、Hpa I、Mbo I、Ple I、Pme I、Rsa I、Sal I、Sau3A Iおよびこれらのイソシゾマーからなる群から選択される、請求項１〜５いずれか記載の方法。
【請求項７】
制限酵素が工程ｃ）において熱的に不活性化される、請求項１〜６いずれか記載の方法。
【請求項８】
前記不活性化工程ｃ）および前記増幅工程ｄ）が同じ工程において実施される、請求項１〜７いずれか記載の方法。
【請求項９】
増幅工程ｄ）における使用のための増幅試薬および制限酵素が増幅工程ｄ）の前に試料と合わせられる、請求項１〜８いずれか記載の方法。
【請求項１０】
前記増幅工程ｄ）における使用のための増幅試薬および制限酵素が混合物として試料と合わせられる、請求項１〜９いずれか記載の方法。
【請求項１１】
増幅試薬がヌクレオチド、１対のプライマー、オリゴヌクレオチド、プローブまたはＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項１〜１０いずれか記載の方法。
【請求項１２】
増幅工程ｄ）の後のまたは増幅工程ｄ）と同時の、試料中の標的核酸の存在または量の指示として該増幅工程において生成された任意の増幅産物を検出する工程をさらに包含する、請求項１〜１１いずれか記載の方法。
【請求項１３】
工程ａ）において試料中の亜硫酸イオンの存在が試料中のメチル化標的核酸中の非メチル化シトシン塩基をウラシル塩基に転換する、請求項１〜１２いずれか記載の方法。
【請求項１４】
工程ａ）が以下のサブ工程
ａ１）メチル化標的核酸を含む試料を亜硫酸イオンを含む溶液と混合する工程；
ａ２）工程ａ１）において得られたメチル化標的核酸および亜硫酸イオンを含む溶液をインキュベートし、それによって標的核酸を脱アミノ化する工程、
ａ３）アルカリ条件下で脱アミノ化核酸をインキュベートし、それによって脱アミノ化核酸が脱スルホン化される工程、
ａ４）脱アミノ化核酸を脱塩する工程
を包含する、請求項１〜１３いずれか記載の方法。
【請求項１５】
亜硫酸イオンの濃度が０．１〜８Ｍ、好ましくは２〜８Ｍである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
工程ａ１）およびａ２）における溶液のｐＨが酸性範囲、好ましくは４．５〜６．５の間であることによって特徴付けられる、請求項１〜１５いずれか記載の方法。
【請求項１７】
工程ａ２）およびａ３）におけるインキュベーション温度が０℃〜９０℃の間、好ましくは１８℃〜９０℃の間であることによって特徴付けられる、請求項１〜１６いずれか記載の方法。
【請求項１８】
工程ａ２）におけるインキュベーション時間が３０分〜４８時間の間、好ましくは２４時間であることによって特徴付けられる、請求項１〜１７いずれか記載の方法。
【請求項１９】
工程ａ３）がアルカリ溶液もしくはバッファ、好ましくは水酸化物、好ましくは水酸化ナトリウムを含む溶液、またはエタノール、塩化ナトリウムおよび水酸化ナトリウムを含む溶液、好ましくは３８％（体積／体積）エタノール、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  ＮａＯＨを含む溶液を添加することによって実施されるということによって特徴付けられる、請求項１〜１８いずれか記載の方法。
【請求項２０】
工程ａ３）のインキュベーション時間が５分〜６０分の間であることによって特徴付けられる、請求項１４〜１９いずれか記載の方法。
【請求項２１】
脱アミノ化工程ａ２）、脱スルホン化工程ａ３）および／または脱塩工程ａ４）が実施され、その一方で、標的核酸がガラス表面を含む固相に結合されることによって特徴付けられる、請求項１４〜２０いずれか記載の方法。
【請求項２２】
第１および第２の試料それぞれにおいて標的核酸を増幅するための第１および第２の核酸増幅プロセスを含む連続的な標的核酸増幅プロセスにおいて汚染を制御するための方法であって、該方法は、請求項１〜２１のいずれかに記載の第２の試料中の標的核酸について第２の増幅プロセスを実施する工程の前に、第１の試料中の標的核酸配列について第１の核酸増幅プロセスを実施する工程を包含する、方法。
【請求項２３】
メチル化標的核酸を含む試料中の非メチル化標的核酸を消化し、それによってメチル化標的核酸中の非メチル化シトシン塩基のウラシル塩基への転換をし、一方でメチルシトシンの非転換をする間に、非メチル化標的核酸が試料中に存在しなかった、制限酵素の使用。
【請求項２４】
制限酵素、亜硫酸イオンを含む化合物およびガラス表面を含む固相を含むキット。
【請求項２５】
制限酵素、亜硫酸イオンを含む化合物、ガラス表面を含む固相、１対のプライマー、プローブおよびＤＮＡポリメラーゼならびに随意に別のオリゴヌクレオチドを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、試料中のメチル化標的核酸を増幅し、一方で不活性化による非メチル化標的核酸の増幅を回避する方法に関する。これは、標的核酸の亜硫酸水素塩処理後の制限酵素消化によって達成される。本発明はさらに、非メチル化標的核酸の増幅を回避し、一方で試料中のメチル化標的核酸を増幅するための制限酵素の使用および本発明に従う方法を行なうためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
遺伝子は、全哺乳動物ゲノムの小さな部分のみを構成し、非コード化デオキシリボ核酸（DNA）の圧倒的なバックグラウンドの存在下における発現の正確な制御は、その調節のための実質的な問題を呈示する。イントロン、繰り返し要素、および潜在的に活性な転移因子を含む非コード化DNAは、長期間のサイレンシングのための有効な機構を必要とする。哺乳動物は、かかるサイレンシングを補助するDNA−タンパク質相互作用を変更するための遺伝性のメカニズムを提供するようにシトシンメチル化によって与えられる可能性を利用すると思われる。DNAメチル化は、哺乳動物の発生には不可欠であり；老化および癌の間に潜在的な役割を果たす。遺伝子発現の制御におけるメチル化の関与および刷り込み遺伝子を印付ける後成的修飾は、十分に確立されている。哺乳動物において、メチル化は、シトシン残基のみ、より具体的にはグアノシン残基に隣接するシトシン残基、即ち、CG配列のみで生じる。DNAメチル化部位の検出およびマッピングは、所定の配列がメチル化されているかどうかを示す分子シグナルを理解するために必須な工程である。
【０００３】
これは現在、5−メチル−シトシンの検出についてFrommer, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 1827-1831で記載される、いわゆる亜硫酸水素塩方法によって達成される。5−メチルシトシンのマッピングをする亜硫酸水素塩方法は、亜硫酸水素ナトリウムがシトシンと反応するが、5−メチル−シトシンとは反応しないか、あるいはわずかに反応する効果を用いる。シトシンは亜硫酸水素塩と反応して、アルカリ条件下でウラシルに脱スルホン化され得るスルホン化ウラシルを生じる脱アミノ化する傾向のあるスルホン化シトシン反応中間体を形成する。ウラシルは、抽出物シトシンとは異なる、チミンの塩基対挙動を有し、一方で5−メチルシトシンはシトシンの塩基対挙動を有することは常識である。これによって、例えば、亜硫酸水素塩ゲノムシークエンス（Grigg, G., and Clark, S., Bioessays 16 (1994)431-436; Grigg, G.W., DNA Seq. 6 (1996) 189-198）, US 5,786,146に開示されるメチル化特異的PCR(MSP)またはPCR反応のブロッキングプローブの使用（WO2002/072880）による、メチル化または非メチル化シトシンの区別が可能になる。Oakeley, E.J.,(Pharmacology & Therapeutics 84 (1999) 389-400 DNAメチル化分析：現在の方法論の概説）は、現在のDNAメチル化分析の方法論を概説している。
【０００４】
5-メチル-デオキシシトシンおよびデオキシシトシンの亜硫酸水素塩修飾の一般的な研究を行なう、亜硫酸水素塩反応の特定の側面を扱う様々な文書がある（Benyajati, C., et al., Nucleic Acids Res. 8 (1980) 5649-5667）。Olek, A. et al., Nucleic Acids Res. 24 (1996) 5064-5066は、亜硫酸水素塩塩基シークエンスの方法を開示し、それによって亜硫酸水素塩処理および続くPCR工程が、アガロースビーズ中に封埋された物質について行なわれる。Clark, S. J., et al., Nucleic Acids Res. 22(1994) 2990-2997によって開示される亜硫酸水素塩方法において、試料は脱アミノ化後に脱塩される。Raizis, A.M., et al., Anal. Biochem. 226(1995) 161-166は、鋳型の分解を最小化する亜硫酸水素塩方法の５-メチルシトシンのマッピングを開示する。彼らはpH、温度、および反応時間の影響を調査している。同様な研究が、Grunau, C., et al., Nucleic Acids Res. 29 (2001) E65-5またはWarnecke, P.M., et al., Methods 27 (2002)101-107によって行なわれている。亜硫酸水素塩混合物中のさらなる異なった成分が、WO 01/98528またはPaulin, R. et al., Nucleic Acids Res. 26(1998) 5009-5010によって開示されている。亜硫酸水素塩処理後のさらなる亜硫酸水素塩工程およびPCRがWO 02/31186に開示される。Komiyama, M., およびOshima, S., Tetrahedron Letters 35 (1994)8185-8188は、オリゴデオキシリボヌクレオチド中でシトシンの亜硫酸水素塩誘導脱アミノ化の触媒を研究している。特定の亜硫酸水素塩プロトコールがWO 2004/067545によって開示される。様々な亜硫酸水素塩ゲノムシークエンス方法がFeil, R., et al., Nucleic Acids Res. 22(1994) 695-696によって開示され、それによってゲノムDNAは脱アミノ化後にガラスビーズに結合され、洗浄される。溶出後の核酸は脱スルホン化される。EP 1 394 173は、亜硫酸水素塩方法を開示し、それによってDNAは固相のガラス表面に結合する。亜硫酸水素塩処理を行なうキットは、Serologicals Corporation, Norcross, GA, USA,によって配布されるIntergenから市販され、例えばCpGenomeTM DNA 修飾キットである。
【０００５】
U.S.Pat. No.4,683,202に記載されるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)はまた、メチル化核酸の分析の分野で使用される。この方法は、核酸が高濃縮された分析物に限定されている核酸試験に利用可能な程度にまで、最小濃度で存在する分析物の核酸、例えば、HCVの核酸を増幅することが可能でもある。しかし、増幅が行なわれる実験室は、その間に、試料が以前の増幅（交差汚染）由来の核酸を有する環境で汚染されるので、低濃縮された核酸を実際に少しも含まない試料中での試験が偽陽性の結果となる程、増幅された核酸で既に強く汚染されている。高い感受性の増幅を基にした核酸試験が、最小の汚染でさえの検出を可能にし、したがって試料中の分析物の存在をまねる（偽陽性結果）。
【０００６】
EP-A-0 401 037は、記載された欠陥を部分的に補修する方法を記載している。この方法において、検出されるべき核酸中に天然には存在しないモノヌクレオチドが、増幅中に各分析物の核酸の増幅物に取り込まれる。次の増幅が行なわれる前に、用いられる試薬と共に試料は、より初期の増幅由来の全ての導入された増幅物が酵素分解される前処理に供される。ウラシル-N-グリコシラーゼ(UNG)は、分解試薬の例であり、dUTPは、増幅物のための修飾構成単位の例である。代替的な方法は、ウラシルを含むモノヌクレオチドの代わりにウラシルを含むプライマーを利用する。より初期に生じた増幅物上のプライマー結合部位が分解される、かかる方法が、EP-A-0 415 755に記載されている。
【０００７】
この汚染除去方法のメカニズムは、酵素で分解されるウラシル含有増幅物の特異的な認識に基づく。増幅反応の調製において、UNGは試料に添加され、通常既に増幅のために必要な全ての試薬を含むマスターミックスと一緒である。前記分解反応が、次の増幅前の短いインキュベーション工程中で行われる。反応混合物が次に約40℃より高い温度に加熱される場合、UNGが不活性化される。UNGが増幅中に蓄積する新規合成DNAを分解しないことを確実にするためには、これが必要である。
【０００８】
この型の反応に用いられる混合物の汚染除去についての更なる方法を開示するいくつかの文書がある。Klaschik, S. et al.(Molecular Biotechnology 22(2002) 231-242. リアルタイムPCRによる低濃度の細菌16S DNAを検出する試薬のための異なる汚染除去方法の比較)は、他の方法と比較して制限酵素切断を用いる汚染除去方法の比較を開示する。メチル化特異的切断はなく、亜硫酸水素塩方法との組み合わせでもない。制限酵素消化ではなく、DNAse消化のみが、効果的であると考えられた。Abravaya, K. et al. (Lee, H.H. et al. (Ed.),Nucleic Acid Amplification Technologies 1997, 125-133. アンプリコン汚染を回避する戦略)は、DNA増幅手順における汚染DNAによる持ち越し汚染を防ぐために開発された技術を概説する。該概説は、エンドヌクレアーゼを用いる前増幅汚染除去を含むが、亜硫酸水素塩修飾またはメチル化検出におけるその使用の開示がない。US 5,683,896は、核酸の汚染および増幅反応を調節する別のプロセスを開示する。US 2004/0005555は、汚染除去されたPCRアッセイにおけるユニバサール16S rRNAプライマーを用いる、伝染性心内膜炎のリスクがある救急患者における菌血症の検出を開示する。全てのPCR試薬に存在するバックグラウンドDNAは、プライマーセットではなく、アンプリコンにおいて多くの消化部位を有する制限エンドヌクレアーゼAluI消化を用いて排除される。制限酵素AluI酵素は、Taqポリメラーゼではなく、AluIを不活性化する温度まで加熱することで不活性化される。該方法は、亜硫酸水素塩方法と組み合わせて開示されず、標的DNAが存在する場合には用いられ得ない。DeFilippes, F.M. (Biotechniques 10 (1991) 26-30. ポリメラーゼ連鎖反応の汚染除去)は、汚染をまねるための鋳型DNAの改変PCR混合物への添加を開示する。鋳型DNAは、制限酵素消化で不活性化された。制限酵素の不活性化後に、更なるDNA鋳型、バッファおよびTaq ポリメラーゼが、反応に添加され、PCRが進行した。この方法の限界が議論されている。亜硫酸水素塩処理または制限酵素消化の開示はない。
【０００９】
いくつかの文書は、メチル化核酸の検出の分野における亜硫酸水素塩技術および制限酵素切断の一般的な組み合わせを記載する。Sadri, R. et al.(Nucleic Acids Res. 24 (1996) 5058-5059, 亜硫酸水素塩修飾で作製された新規の制限酵素部位を用いたDNAメチル化の迅速な分析)は、DNAの亜硫酸水素塩処理および次の増幅を開示する。制限酵素部位の変化が検出される。Velinov, M. et al.(Methods in Molecular Biology 217 (2003) 209-216, プラーダー-ヴィリ症候群／アンゲルマン症候群の診断のためのPCRを基にした戦略)は、増幅された、亜硫酸水素塩処理DNAのメチル化特異的消化を用いたPCRに基づくメチル化試験を開示する。Velinov, M. et al. (Molecular Genetics and Metabolism 69 (2000) 81-83.ゲノムDNAの亜硫酸水素塩修飾後の制限分析を用いたプラーダー-ヴィリおよびアンゲルマン症候群のPCRに基づく診断の可能性)は、増幅された、亜硫酸水素塩処理DNAのメチル化特異的消化を用いたPCRに基づくメチル化試験を開示する。Xiong, Z. et al. (Nucleic Acids Res. 25 (1997) 2532-2534. COBRA:感受性および定量的DNAメチル化アッセイ)は、亜硫酸水素ナトリウム処理DNAのPCR産物においてメチル化依存性配列差異を明らかにするために制限酵素消化を使用する。WO2003/000926は、亜硫酸水素塩処理DNAおよび次の増幅を開示する。その後、増幅物は制限エンドヌクレアーゼで消化される。消化されたDNAの酵素耐性画分は、次に更なるPCRで増幅される。これら全ての文書において、制限酵素切断はPCR増幅後に行なわれる。
【００１０】
いくつかの他の文書は、亜硫酸水素塩方法と関連する制限酵素消化を記載する。Fojtova, M. et al.(Plant Science 160(2001) 585-593.高等植物におけるプラスチドゲノムのシトシンメチル化。事実または人工産物か)は、EcoRII制限処理されたDNA差異で行なわれる亜硫酸水素塩ゲノムシークエンスを開示する。制限酵素消化は、亜硫酸水素塩処理の前に行なう。Clark, S.J. et al.(Ed. G.R: Taylor, Laboratory Methods for the Detection of Mutations and Polymorphisms in DNA(1997)151-162, Publisher CRC, Boca Raton, Fla)は、ゲノムDNAにおけるシトシンメチル化の研究について利用可能な現在の方法を概説する。制限酵素消化および亜硫酸水素塩方法は、WO2003/064701に独立に類似して記載される。Jang, K.-H. et al. (J. Microbiology and Biotechnology 11 (2001) 819-824. コリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutamicum)およびレビバクテリウムフラバム(Brevibacterium flavum)における亜硫酸水素塩DNA誘導およびシークエンスを用いるメチル化シチジンを含む配列の同定)は、DNAの亜硫酸水素塩処理および次の増幅、十分に転換されていないDNAを除去する制限酵素消化、ならびに別の回の増幅を開示する。次に、DNA配列が決定される。
【００１１】
他の文書は、メチル化の分析のための制限酵素消化の使用を記載する。Kaneda, S.A. et al. (Molecular Medicine 39 (2002)824-832)は、制限酵素消化を含むDNAメチル化の分析のための種々の方法を概説する。WO2003/027259は、マウスにおける疾患と関連するDNAメチル化を検出するアッセイおよび診断におけるその使用を開示する。DNAメチル化の程度を検出する技術は、メチル化されていないが一方でメチル化されるDNAのメチル化部位を余地として残す、メチル化部位で切断することで生じる試験試料のDNA断片を内含する。該方法は、亜硫酸水素塩方法と組み合わせて使用されない。Moore, T. (Methods in Molecular Biology 181 (2002) 193-203. メチル化感受性制限酵素を用いるサザン分析)は、亜硫酸水素塩方法との組み合わせではないが、メチル化感受性制限酵素およびサザン解析の使用を開示する。EP 0 976 835は、亜硫酸水素塩方法との組み合わせでは使用されない増幅断片長多型を用いた核酸メチル化の検出を開示する。Pogribny, I. et al.(Biochem. Biophys. Res. Commun. 262(1999)624-628.全体的なDNAにおけるおよびCpGアイランド内の異常メチル化パターンの迅速な検出のための感受性のある新規な方法)は、DNA切断後の5'−グアニンの突出部を残し、放射性同位元素標識の[3H]dCTPを用いた次の単一ヌクレオチド伸張を有する、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼの使用を基にした方法を開示する。該方法は、亜硫酸水素塩方法またはPCR増幅と組み合わされない。Kupper, D. et al. (Biotechniques 23 (1997) 843-847. オリゴヌクレオチド模倣物を用いてイソシゾマーMspI/HpaIIによるDNA CpG メチル化プロファイルの信頼性のある検出)は、亜硫酸水素塩方法との組み合わせではなく、イソシゾマー性制限エンドヌクレアーゼMspI/HpaIIによってCpGメチル化を検出するプロトコールを開示する。Watts, G.S. et al. (Nucleic Acids Res. 23 (1995) 4740-4741. 制限酵素イソシゾマーを用いた5-メチルシトシンの差異の検出：完全消化のための内在性調節)は、亜硫酸水素塩方法との組み合わせではなく、メチル化感受性イソシゾマー様MspI/HpaIIで切断されたゲノムDNAのサザンブロット解析を開示する。Chang, S. et al.(Plant Molecular Biology Reporter 10 (1992) 362-366. 部位特異的メチル化を検出する制限に続くPCR増幅)は、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによって認識される部位でのDNAメチル化のための試験の手順を開示する。該手順は、標的DNAが消化後にインタクトである場合にのみ、PCRによって2つのプライマー間での配列が増幅されるという仮定を基にしている。該方法は、亜硫酸水素塩方法との組み合わせで使用されない。Szyf, M. et al. (Nucleic Acids Res. 10 (1982) 7247-7259. DNAメチル化の生物学的役割についての研究: V - 大腸菌(E.coli)DNAメチル化のパターン)は、亜硫酸水素塩方法との組み合わせではなく、制限酵素DpnIを用いた新しく複製されるDNAにおけるGATC部位のメチル化の状態を分析することを開示する。Youssoufian, H. et al.(J. Mol. Biol. 150(1981) 133-136). 制限エンドヌクレアーゼSmaIおよびXmaIを用いる真核生物DNAにおけるメチル化配列の検出)は、メチル感受性で特定のCpG部位を消化するか、あるいは消化しないかのいずれかである2つのイソシゾマーを開示する。制限酵素は亜硫酸水素塩方法との組み合わせでは使用されない。Cedar, H. et al.(Nucleic Acids Res. 6(1979)2125-2132. 制限酵素MspIの使用によるDNAのメチル化シトシンの直接検出)は、亜硫酸水素塩方法と���組み合わせではなく、MspI/HpaII制限酵素および次のゲル分析を用いたCCGG部位のメチル化の状態の分析を開示する。
【００１２】
発明の概要
ウラシル-N-グリコシラーゼを用いることで、PCR混合物の汚染除去のために広く用いられる方法は、シトシン塩基からウラシル塩基を生じる亜硫酸水素塩方法と共に用いられ得ない。それゆえに、汚染核酸の検出による偽陽性結果を回避するためにメチル化核酸の検出の分野におけるPCR混合物の汚染除去に使用され得る方法を提供する必要がある。
【００１３】
それゆえに、本発明の目的は、間違った結果を導き得るDNAの亜硫酸水素塩処理後の非メチル化標的核酸の消化をする方法を提供することである。より詳細には、本発明の態様は、試料中のメチル化標的核酸を増幅し、一方で非メチル化標的核酸の増幅を回避し、それによってメチル化標的核酸は、制限酵素の認識核酸配列においてメチルシトシン塩基を有するヌクレオチドを含む方法であり、ここで認識核酸配列は、増幅反応産物中にあり、該方法は、
(a)試料中のメチル化標的核酸の非メチル化シトシン塩基をウラシル塩基に転換し、一方でメチルシトシン塩基を転換しない工程；
(b)非メチル化標的核酸を消化する制限酵素を試料に添加し、それによってメチル化標的核酸は制限酵素で消化されない工程；
(c)制限酵素を不活性化する工程；および
(d)メチル化標的核酸を増幅する工程
を含む。
【００１４】
別の態様において、本発明は、第一および第二の試料それぞれにおいて標的核酸を増幅する第一および第二の核酸増幅過程を含む、連続的な標的核酸増幅プロセスにおける汚染を調節する方法に関し、本発明に従う第二の試料中の標的核酸について第二の増幅プロセスを実行する前に第一の試料中の標的核酸配列について第一の核酸増幅プロセスを実行する工程を含む。
【００１５】
本発明の別の態様において、制限酵素は、メチル化標的核酸において非メチル化シトシン塩基のウラシル塩基への転換をし、一方でメチルシトシンを転換しない間、試料中に存在しなかったメチル化標的核酸を含む試料中の非メチル化標的核酸を消化するために用いられる。
【００１６】
本発明の別の態様において、制限酵素は、試料中に存在する非メチル化標的核酸の増幅を回避し、一方で試料中に存在するメチル化標的核酸を増幅するために用いられる。
【００１７】
本発明の別の態様において、制限酵素、亜硫酸イオンを含む化合物およびガラス表面を含む固相を含むキットが提供される。
【００１８】
本発明の別の態様において、制限酵素、亜硫酸イオンを含む化合物、ガラス表面を含む固相、１対のプライマー、プローブおよびDNAポリメラーゼを含むキットが提供される。
【００１９】
「核酸」は、当業者に公知な「ヌクレオチド」の高分子化合物である。分析されるべき、即ち、試料中のその存在、非存在または量が決定されるべき試料中の「核酸」を示すために本明細書中で用いる。それゆえに、言い換えれば、「核酸」は標的であり、それゆえに「標的核酸」としても示され得る。例えば、血液が、ヒト免疫不全ウイルスを含むかどうかを決定しなければならない場合、「標的核酸」は、ヒト免疫不全ウイルスの核酸またはより具体的には決定される核酸配列、即ち、塩基アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンの順序である。「標的核酸」は、本発明の文脈においてより具体的には、CpG部位のメチル化シトシン塩基を含み得るゲノムDNAである。「亜硫酸水素塩処理」後のゲノムDNAの核酸配列は、非メチル化塩基がウラシル塩基に転換される場合、メチル化に依存して変化し、変化した核酸配列が決定される。
【００２０】
本発明に従う「メチル化標的核酸」は、制限酵素、特に本発明で使用される制限酵素、より具体的には方法の工程(b)で選択または使用される制限酵素の認識核酸配列においてメチル化シトシン塩基を有する（亜硫酸水素塩処理後の）ヌクレオチドを含む標的核酸である。本発明に従う「非メチル化標的核酸」は、制限酵素、特に本発明で使用される制限酵素、より具体的には方法の工程(b)で選択または使用される制限酵素の認識核酸配列において（非メチル化）シトシン塩基を有するヌクレオチドを含む「標的核酸」である。本発明によって理解されるように、「非メチル化標的核酸」は、制限酵素、特に本発明で使用される制限酵素、より具体的には方法の工程（b)で選択または使用される制限酵素の認識核酸配列においてではなく、メチルシトシン塩基を有するヌクレオチドも含み得る。「非メチル化標的核酸」の核酸配列は「メチル化標的核酸」と同一であり、前記核酸分子は、相補的な核酸への水素結合に影響するのではなく、1つのシトシン塩基または複数のシトシン塩基のメチル化においてのみ異なる。本発明に従う「非メチル化標的核酸」は、試料を不純にするか、あるいは試料を汚染する「汚染核酸」または「汚染標的核酸」である。偽結果を生じ得るような該方法の増幅工程において、それは存在すべきではない。
【００２１】
当該分野で公知のように、「ヌクレオシド」は、塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は通常、複素環式塩基である。かかる複素環式塩基の最も一般的な２つの種類は、プリンおよびピリミジンであり、より詳細にはアデニン（A）、グアニン（G）、チミン（T）またはシトシン（C）塩基である。ウラシル塩基は天然で、リボ核酸中に含まれる。別の天然に存在する塩基は、5-メチル-シトシンまたはメチルシトシンであり、塩基の芳香環の5位置でメチル基で置換されるシトシンである。
【００２２】
「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基を更に含む「ヌクレオシド」である。ペントフラノシル糖を含む「ヌクレオシド」について、リン酸基は、糖の2’、3’または5’ヒドロキシル部分のいずれかに結合され得る。「ヌクレオチド」は、「オリゴヌクレオチド」、より一般的に本明細書中に「オリゴマー化合物」と示されるもの、または「ポリヌクレオチド」、より一般的に本明細書中に「高分子化合物」と示されるものの「単量体単位」である。その代わりの別の一般的表現は、デオキシリボ核酸（DNA）およびリボ核酸（RNA）である。
【００２３】
本発明に従う「オリゴマー化合物」は、「ヌクレオチド」のみまたは「非天然化合物」（以下参照）、より具体的には「修飾ヌクレオチド」（もしくは「ヌクレオチドアナログ」）または「非ヌクレオチド化合物」のみまたはその組み合わせであり得る「単量体単位」からなる化合物である。「オリゴヌクレオチド」および「修飾オリゴヌクレオチド」（もしくは「オリゴヌクレオチドアナログ」）は、本発明の文脈における「オリゴマー化合物」のサブグループである。
【００２４】
本発明の文脈において、用語「オリゴヌクレオチド」とは、「単量体単位」としての複数の「ヌクレオチド」から形成された「ポリヌクレオチド」のことをいい、即ち、「オリゴヌクレオチド」は、「単量体単位」を有するリボ核酸（RNA）またはデオキシリボ核酸（DNA）の「オリゴマー化合物」または「高分子化合物」の特定のサブグループに属する。リン酸基は、一般に「オリゴヌクレオチド」のヌクレオシド間骨格を形成することをいう。RNAおよびDNAの正常な結合または骨格は3’〜5’のホスホジエステル結合である。
【００２５】
本発明に従う「オリゴヌクレオチド」および「修飾オリゴヌクレオチド」（以下参照）は、当該分野で主に記載されるように合成され得、当業者にとって公知であり得る。特定配列のオリゴマー化合物を調製する方法は、当該分野で公知であり、例えば、クローニングおよび適切な配列の制限ならびに直接の化学合成を含む。化学合成方法としては、例えば、Narang, S.A., et al., Methods Enzymol. 68 (1979)90-98によって記載されるホスホトリエステル方法、Brown, E.L., et al., Methods Enzymol. 68 (1979)109-151によって開示されるホスホジエステル方法、Beaucage, S.L., and Caruthers, M.H., Tetrahedron Lett. 22(1981) 1859-1862に開示されるホスホロアミダイト方法、Garegg, P.J., et al., Chem. Scr. 25 (1985)280-282に開示されるH-ホスホネート方法およびUS4,458,066に開示される固体支持体方法が挙げられ得る。
【００２６】
前記記載のように、「核酸」ならびに「標的核酸」は、当業者に公知である「ヌクレオチド」の高分子化合物である。分析されるべき、即ち、試料中のその存在、非存在または量が決定されるべき試料中の「核酸」を示すために本明細書中に用いられる。
【００２７】
用語「プライマー」は、当業者に公知のように、本明細書中で使用され、鋳型依存性DNAポリメラーゼでDNA合成を「プライム」し得る、主に「オリゴヌクレオチド」に対する「オリゴマー化合物」のことをいうが、「修飾オリゴヌクレオチド」もいい、即ち、例えば、オリゴヌクレオチドの3’末端は、遊離3’-OH基を提供し、そこで更なる「ヌクレオチド」は3’〜5’ホスホジエステル結合を確立する鋳型依存性DNAポリメラーゼによって結合され得、それによってデオキシヌクレオシド三リン酸が使用され、ピロリン酸が放出される。それゆえに、意図された機能を除いて、本発明に従う「プライマー」、「オリゴヌクレオチド」または「プローブ」の間との基本的な差異はない。
【００２８】
用語「プローブ」は、設計または選択によって、予め規定された特異的な（即ち、優先的に）ストリンジェンシー下での、「標的核酸」へのハイブリダイズを可能にする特定のヌクレオチド配列を含む合成的にまたは生物学的に生成された核酸（DNAまたはRNA）のことをいう。「プローブ」は、検出を不明確にし得る望ましくない物質から分離され得るために、標的核酸を「捕捉」することを意味する「捕捉プローブ」として同定され得る。分離が一度成し遂げられれば、捕捉された「標的核酸」の検出が、適当な手順を用いて、達成され得る。「捕捉プローブ」はしばしばすでに、固相に結合されている。そのために、特定の例示は、マイクロアレイ状況であり、ここで多数の「捕捉プローフ゛」は、標識されたcRNAまたはcDNAを「捕捉」する「固相」に結合される。
【００２９】
本発明に従う用語「亜硫酸水素塩反応」、「亜硫酸水素塩処理」または「亜硫酸水素塩方法」は、好ましくは、亜硫酸イオンの存在で、核酸における1つのシトシン塩基、特に複数のシトシン塩基の、1つのウラシル塩基または複数のウラシル塩基への転換反応を意味し、それによって好ましくは5−メチル-シトシン塩基が有意に転換されない。メチル化シトシンの検出のためのこの反応は、Frommer et al., 上掲およびGrigg and Clark上掲によって詳細に記載される。亜硫酸水素塩反応は、脱アミノ化工程および脱スルホン化工程を含む（図１参照；Grigg and Clark；上掲）。5-メチル-シトシン塩基は有意に転換されないという記載によって、（非メチル化）シトシン塩基を唯一および排他的に転換することを意図する（Frommer et al,上掲）が、少ない割合の5-メチル-シトシン塩基が、ウラシルに転換されることを除外し得ないという事実を考慮するだけである。
【００３０】
用語「メチル−シトシン塩基」、「メチルシトシン塩基」、「メチル化シトシン塩基」および「5-メチル-シトシン塩基」は、本出願を通じて相互変換可能に用いられ、シトシン塩基の誘導体を示し、ここでメチル基がシトシン環のC5原子に結合する。シトシン塩基を図１の左部分に示す。用語「非メチル化シトシン塩基」は非誘導シトシン塩基を示し、ここでメチル基は「メチル-シトシン塩基」とは対照的に、シトシン環のC5原子に結合しない。
【００３１】
「制限酵素」は、デオキシリボ核酸（DNA）分子における特定のヌクレオチドまたは核酸配列を認識し、かつ特定の部位で2重鎖DNAを切断し得るエンドヌクレアーゼ（制限エンドヌクレアーゼ）である。本発明に従うと、「制限酵素の認識核酸配列」は、制限酵素によって認識される特定の核酸配列である。制限酵素は、4〜8ヌクレオチド長の短い特定DNA配列を認識し、この配列内の部位でDNAを切断する。本開示の文脈において、制限酵素は、種々の制限酵素認識部位に対応する部位でDNA分子を切断するために用いられ得る。細菌は、100を超える異なるDNA配列を認識および切断する、400を超えるかかる酵素を含む。イソシゾマー（isoschizomer, isoschisomere, isoschizomere）は、異なる供給源から単離されるが、同じ認識部位でDNA分子を切断するいくつかの制限酵素またはエンドヌクレアーゼの1つである。
【００３２】
DNAの「消化」とは、DNAにおける特定の配列のみに作用する制限酵素を用いたDNAの触媒「切断」のことをいう。本明細書中で用いられる種々の制限酵素は、市販され、当業者に公知であるようにその反応条件、補助因子および他の要件が用いられる。
【００３３】
用語「制限部位」とは、制限酵素の作用を明示するために必要である「認識（核酸）配列」または「制限核酸配列」のことをいい、触媒切断の部位を含む。酵素（例えば、制限酵素）がポリヌクレオチドまたは核酸を「切断」するように言及される場合、制限酵素がポリヌクレオチドまたは核酸の切断を触媒または容易にすることを意味することが理解される。
【００３４】
発明の詳細な説明
当該分野の範囲内である、分子生物学および核酸化学の従来技術は、文献に説明される。例えば、Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, Gait, M.J., ed., 1984;Nucleic Acid Hybridization, Hames, B.D., and Higgins, S.J., eds., 1984; および一連の、Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.を参照、全ては参照によって本明細書中に援用される。全ての特許、特許出願、ならびに本明細書中で記載した、上掲および後掲の両方の刊行物は、参照によって本明細書中に援用される。
【００３５】
本発明の態様において、方法は、間違った結果となり得、それゆえに一般に汚染核酸または汚染として認められ得るDNAの亜硫酸水素塩処理後の非メチル化標的核酸を消化する、亜硫酸水素塩処理後の制限酵素消化を行なうことで非メチル化標的核酸の増幅を回避する（または阻害もしくは防止する）ために提供される。試料の潜在的な汚染は遍在し、方法のどの工程でもあり得、回避することが困難で、多様な供給源に由来し得る（方法の具体的調査についての図2および3参照）。亜硫酸水素塩反応は、非メチル化シトシン塩基がウラシル塩基に転換され、一方で5-メチルシトシン塩基は転換されない工程である。
【００３６】
図2および3から、非メチル化標的核酸は亜硫酸水素塩反応の前、後またはその間に導入され得ることは明らかとなる。非メチル化標的核酸が亜硫酸水素塩工程に存在する場合、非メチル化シトシン塩基はウラシル塩基に転換され、核酸配列が変化し、核酸増幅または制限消化に対して敏感に反応しない。結果として、プライマーおよびプローブが、配列特異的であって、当業者によって選択され、偽結果にならない場合、増幅を阻害しない。従って、全ての非メチル化シトシン塩基がウラシル塩基に転換される場合、亜硫酸水素塩反応自体がすでに、亜硫酸水素塩反応の間に存在する以前に増幅された標的核酸の汚染除去である。結果として、亜硫酸水素塩工程は、試料中のメチル化標的核酸および非メチル化標的核酸中の非メチル化シトシン塩基をウラシル塩基に一般的に転換し、一方で制限酵素の認識核酸配列中のメチルシトシン塩基またはメチルシトシン塩基を転換せず、ここで認識核酸配列は、増幅反応産物中にある。
【００３７】
亜硫酸水素塩処理後に存在する非メチル化標的核酸のための第一の供給源は、亜硫酸水素塩処理後に試料中に偶然に導入された非メチル化標的核酸であり得、例えば、以前の（独立した）メチル化標的核酸の増幅反応物に由来する。非メチル化シトシンは通常、非メチル化増幅反応産物または一般的に非メチル化標的核酸、即ち、非メチル化コピーの（元々の）メチル化標的核酸を産生する増幅反応において使用されるので、この標的核酸はメチル化シトシン塩基を含まない。非メチル化標的核酸の核酸配列、即ち、メチル化標的核酸の増幅産物は、メチル化標的核酸と同一であり、前記核酸（分子）のみが、相補的な核酸への水素結合に影響しないシトシン塩基のメチル化において異なる。非メチル化標的核酸は、本発明に従う制限酵素の認識配列においてメチルシトシン塩基を有するヌクレオチドを含まない。
【００３８】
「汚染核酸」または「非メチル化標的核酸」のための第二の可能性のある供給源は、他の供給源由来の試料またはより具体的にはかかる核酸を含むヒト患者であり得、分析される試料に対して空間的に近接して調製される。
【００３９】
本発明に従う「汚染核酸」または「非メチル化標的核酸」の第三の供給源は、亜硫酸水素塩処理で十分に転換されていない「標的核酸」であり得、即ち、制限酵素、特に方法の工程(b)において選択または使用される制限酵素の認識核酸配列においてシトシン塩基を有するヌクレオチドを含むが、制限酵素の認識核酸配列にはないメチルシトシン塩基を有するヌクレオチドを含み得る。本発明に従うと、それはより一般的にメチルシトシン塩基を含む標的核酸であるが、より具体的には本発明に従う方法の工程(b)において使用される制限酵素の認識核酸配列にはないメチルシトシン塩基を含み、本発明に従う方法の工程(b)において使用される制限酵素の認識核酸配列における（非メチル化）シトシン塩基を含む標的核酸であるとはいえ、これもまた、「汚染核酸」である。本発明に従うと、これは非メチル化標的核酸であると理解される。
【００４０】
汚染核酸の第4の供給源は、亜硫酸水素塩処理の間には存在し、且つ亜硫酸水素塩処理の間には十分に転換されなかった、即ち、制限酵素、特に、方法の工程(b)において選択または使用された制限酵素の認識核酸配列における非メチル化シトシン塩基がウラシル塩基に転換されなかった、他の以前の（独立した）メチル化標的核酸の増幅反応物由来の非メチル化標的核酸であり得る。即ち、それは制限酵素、特に方法の工程(b)において選択または使用された制限酵素の認識核酸配列における（非メチル化）シトシン塩基を有する亜硫酸水素塩処理後のヌクレオチドを含む。
【００４１】
それゆえに、本発明の態様は、試料中のメチル化標的核酸を増幅し、一方で非メチル化標的核酸の増幅を回避し、それによってメチル化標的核酸は、制限酵素の認識核酸配列においてメチルシトシン塩基を有するヌクレオチドを含み、ここで認識核酸配列は増幅反応産物中にある方法を提供することであり、該方法は好ましくは以下の順序において、
(a)試料中のメチル化標的核酸における非メチル化シトシン塩基をウラシル塩基に転換し、一方でメチルシトシン塩基を転換しない工程；
(b)非メチル化標的核酸を消化する制限酵素を試料に添加し、それによってメチル化標的核酸は制限酵素で消化されない工程；
(c)制限酵素を不活性化する工程；および
(d)メチル化標的核酸を増幅する工程、
を含む。
【００４２】
好ましくは、本発明に従う方法は、特定の工程からなる。
【００４３】
上記記載のように、例えば、以前に十分に転換されていない増幅標的核酸、即ち、ウラシル塩基に転換されなかったシトシン塩基を含む増幅標的核酸は、偽結果ならびに亜硫酸水素塩工程の間に試料中には存在しない非メチル化標的核酸を導き得る。これらの種は次に、添加された制限酵素で消化され、即ち、試料に添加された制限酵素は、本発明に従う方法の工程（a）における試料中に存在しない非メチル化標的核酸または本発明に従う方法の工程（a）における転換されなかった制限酵素の認識核酸配列においてシトシン塩基を有するヌクレオチドを含む非メチル化標的核酸を消化し、それによってメチル化標的核酸は制限酵素で消化されない。
【００４４】
それゆえに、本発明の態様は、試料中のメチル化標的核酸を増幅し、一方で非メチル化標的核酸の増幅を回避し、それによってメチル化標的核酸は、制限酵素の認識核酸配列においてメチルシトシン塩基を有するヌクレオチドを含み、ここで認識核酸配列は、増幅反応産物中にある方法を提供することであり、該方法は以下の順序において、
(a)試料中のメチル化標的核酸および非メチル化標的核酸における非メチル化シトシン塩基をウラシル塩基に転換し、一方でメチルシトシン塩基を転換しない工程；
(b)工程(a)において試料に存在しない非メチル化標的核酸または
工程(a)において転換されなかった制限酵素の認識核酸配列においてシトシン塩基を有する複数のヌクレオチドまたは1つのヌクレオチドを含む非メチル化標的核酸を消化する制限酵素を試料に添加し、それによってメチル化標的核酸は、制限酵素で消化されない工程；
(c)制限酵素を不活性化する工程；ならびに
(d)メチル化標的核酸を増幅する工程、
を含む。
【００４５】
好ましくは、本発明に従う方法は、特定の工程からなる。
【００４６】
非メチル化標的核酸は、好ましくは、亜硫酸水素塩処理、即ち、本発明に従う方法の工程(a)の前、その間もしくは後で、または制限酵素消化、即ち、本発明に従う方法の工程(b)の前もしくはその間で、偶然にまたは任意に試料に存在するか、あるいは試料中に導入される。
【００４７】
それゆえに、本発明のなお別の態様において、方法は、試料中のメチル化標的核酸を増幅し、一方で任意に試料に存在するか、あるいは任意に試料に導入される非メチル化標的核酸または汚染核酸の増幅を回避するために提供され、該方法は、以下の順序において、
(a)試料中のメチル化標的核酸および非メチル化標的核酸における非メチル化シトシン塩基をウラシル塩基に転換し、一方でメチルシトシン塩基を転換しない工程；
(b)試料に任意に存在するか、あるいは試料に任意で偶然に導入される非メチル化標的核酸を消化する制限酵素を試料に添加し、それによってメチル化標的核酸は、制限酵素で消化されない工程；
(c)制限酵素を不活性化する工程；ならびに
(d)メチル化標的核酸を増幅する工程、
を含む。
【００４８】
好ましくは、本発明に従う方法は、特定の工程からなる。
【００４９】
本発明に従う方法において、メチル化標的核酸は、制限酵素の認識核酸配列においてメチルシトシン塩基を有するヌクレオチドを含み、ここで認識核酸配列は、増幅反応産物中にある。非メチル化標的核酸は、制限酵素の認識核酸配列においてシトシン塩基を有するヌクレオチドを含む（ここで認識核酸配列は、増幅反応産物中にある）。
【００５０】
例えば、亜硫酸水素塩反応の主なパラメーターを開示する、Frommer et al., 上掲またはGrigg and Clark,上掲を参照することで、当業者は、亜硫酸水素塩反応、即ち、本発明に従う方法の工程(a)をいかに行なうかを知っている。Grunau et al., 上掲から、どんなバリエーションの亜硫酸水素塩方法が可能であるか当業者には公知である。DNA分解に影響する脱アミノ化効率およびパラメーターに対するインキュベーション時間および温度の影響が開示される。要するに、脱アミノ化工程において、亜硫酸イオンを含むバッファおよび任意にグアニジニウムイオンとしてのカオトロピック試薬または尿素、およびアルコールとしての更なる試薬、またはヒドロキノンとしての安定剤が用いられ、pHは酸性の範囲内である。亜硫酸水素塩の濃度は0.1〜8M亜硫酸水素塩であり、好ましくは0.1〜6M、より好ましくは0.1〜5.5Mであり、カオトロピック試薬の濃度は1〜8Mであり、それによって一般に好ましくはグアニジニウム塩、より好ましくはEP 3027754.5に記載の亜硫酸水素グアニジニウムを用い、pHは酸性の範囲内であり、好ましくは4.5〜6.5であり、温度は0℃〜90℃であり、好ましくは室温（25℃）〜90℃であり、反応時間は30分〜24時間もしくは48時間またはさらに長いが、好ましくは1時間〜24時間である。
【００５１】
脱スルホン化工程は、例えば、水素化物、例えば、水酸化ナトリウムのみを含む溶液、またはエタノール、塩化ナトリウムおよび水酸化ナトリウムを含む溶液（例えば、38％EtOH, 100mM NaCl, 200mM NaOH）としてのアルカリ性溶液またはバッファを添加し、かつ室温または高めの温度で数分間、好ましくは5分〜60分の間インキュベートすることで行なわれる。核酸の脱塩は、WO 96/41811、EP 1 394 173における亜硫酸水素塩反応について具体的に記載される磁性ガラス粒子を用いて行われ得る。Serologicals Corporation, Norcross, GA, USAによって配布され、Intergenから市販されるキット、例えばCpGenomeTMDNA modification kitを用いることも可能である。
【００５２】
それゆえに、本発明の好ましい態様において、方法の工程(a)において、試料中の亜硫酸イオンの存在によって、試料中のメチル化標的核酸における非メチル化シトシン塩基をウラシル塩基に転換する方法が提供される。より好ましくは、該方法は、工程(a)において、a1)メチル化標的核酸を含む試料を、亜硫酸イオンを含む溶液と混合する工程；a2)メチル化標的核酸および亜硫酸イオンを含む工程a1)で得られた溶液をインキュベートし、それによって標的核酸が脱アミノ化される工程、a3)アルカリ条件下で脱アミノ化核酸をインキュベートし、それによって脱アミノ化核酸が脱スルホン化される工程、ならびにa4)脱アミノ化核酸を脱塩する工程のサブ工程を含む。亜硫酸イオンの濃度は、好ましくは0.1〜8M、より好ましくは0.1〜6.25M、0.1〜6M、より好ましくは2〜6Mである。工程a1)およびa2)における溶液のpHは、好ましくは酸性の範囲であり、より好ましくは4.5〜6.5である。工程a2)およびa3)におけるインキュベーション温度は、好ましくは0℃〜90℃であり、好ましくは18℃〜90℃である。工程a2)におけるインキュベーション時間は、好ましくは30分〜48時間であり、より好ましくは24時間である。好ましくは、工程a3)は、アルカリ性溶液またはバッファを添加することで行なわれ、より好ましくは水酸化物を含む溶液、最も好ましくは水酸化ナトリウム、またはエタノール、塩化ナトリウムおよび水酸化ナトリウムを含む溶液、最も好ましくは、38％（体積/体積）エタノール、100mM NaCl、200mM NaOHを含む溶液である。工程a3)におけるインキュベーション時間は、好ましくは5分〜60分である。
【００５３】
本発明の好ましい態様において、WO 2004/067545に記載されるインキュベーションパラメーターが用いられ得、ここで核酸は70〜90℃の温度で1.5〜3.5時間の間溶液中でインキュベートされ、それによって溶液中の亜硫酸水素塩の濃度は3M〜6.25Mであり、溶液のpH値は、5.0〜6.0であり、核酸は脱アミノ化される。
【００５４】
別の好ましい態様において、亜硫酸水素塩反応は、EP 1 394 173に開示されるような固相結合DNAに結合される。好ましくは固相は、ガラスを含む固相であり、より好ましくはガラス繊維または磁性ガラス粒子（MGP）である。それゆえに、本発明の好ましい態様において、脱アミノ化工程a2)、脱スルホン化工程a3)および／または脱塩工程a4)が行われ、一方で標的核酸がガラス表面を含む固相に結合される。
【００５５】
本発明の態様において、メチル化標的核酸は、デオキシリボ核酸（DNA）であり、特にゲノムDNA、即ち、生物のゲノム中に発見され、生存のために必要な情報として子孫へ受け継がれるDNAまたは核酸である。該句はプラスミド内で発見されるような、他の型のDNA間を区別するために用いられる。核酸の供給源は、真核生物または原核生物、好ましくは脊椎動物由来、特に、哺乳動物由来、最も好ましくは動物またはヒト由来であり得る。
【００５６】
本発明の態様において、核酸は、例えば、固相（例えば、WO 96/41811またはWO 01/37291またはRoche Diagnostic, Mannheim Germanyから入手可能なMagNAPure(登録商標)Systemを参照）または当業者に公知の他の方法（例えば、Sambrook, J., et al., In: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold   Spring Harbor, NY; and Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology,1987, J.Wiley and Sons, NY, または例えば、Qiagen, Hilden Germanyから入手可能な市販のDNA単離キットを参照）を用いて生物学的試料から得られる。生物学的試料は、例えば、白血球のようなヒトおよび動物細胞としての多細胞生物由来の細胞、ならびにハプテン、抗原、抗体および核酸、血液血漿、脳の液体、唾液、便、生検標本、骨髄、口腔洗浄物、血液血清、組織、尿またはその混合物のような免疫学的に活性な低分子化合物および高分子化合物を含む。本発明の好ましい態様において、生物学的試料はヒトまたは動物の体由来の体液である。生物学的試料は、血液、血液血漿、血液血清または尿であり得る。核酸を含む生物学的試料は、溶解され、核酸および他の成分を含む生物学的化合物の混合物を作製する。生物学的試料を溶解する手順は、当業者に公知であり、天然における化学的、酵素的または物理的であり得る。これらの手順の組み合わせは、同様に適用し得る。例えば、溶解物は、超音波、高圧力、せん断力、アルカリ、界面活性剤もしくはカオトロピック生理食塩溶液、またはプロテアーゼもしくはリパーゼを用いて行なわれ得る。核酸を得るための溶解手順について、特別の参照が、Sambrook, J., et al., In: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY;およびAusubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology,1987, J.Wiley and Sons, NYにされている。次に核酸が、記載された方法および固相を用いて溶解混合物から単離され、次に亜硫酸水素塩処理に供され得る。カオトロピック試薬はまた、細胞を溶解するために用いて、核酸と他の生物学的物質との間での混合物を調製する（例えば、Sambrook, J., et al.(1989)またはEP 0 389 063参照）。その後にガラスまたはシリカを含む物質が添加され得、精製効果が、これらの条件下で、即ち、特定の濃度のカオトロピック薬剤、より高濃度の有機溶媒の存在下においてまたは酸性条件下で、ガラス表面を有する物質と結合するDNAまたはRNAの挙動から生じる。択一的な方法が同様に用いられ得る。
【００５７】
制限酵素の消化工程は好ましくは、例えば、Sambrook, J., et al., In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press， Cold Spring Harbor, New York (1989)によって記載されるようにまたは例えば、New England Biolabs, Beverly, MA, USA, Fermentas, Vilnius, LithuaniaあるいはRoche Diagnostic GmbH, Mannheim Germanyであり得る製造者の記載によって行なう。より詳細に、条件は、耐熱性酵素について室温（25℃）〜65℃まであり得、製造者に従う塩濃度および酵素濃度の下で好ましくは約37℃で、約5分〜24時間、好ましくは5分〜6時間、より好ましくは2〜4時間であり得る。分析の目的のために、典型的に1μｇのDNA断片が、約20μlのバッファ溶液中の約2ユニットの酵素と共に用いられる。他の目的のためのDNA断片を単離する目的のために、典型的に5〜50マイクログラムのDNAがより大きな体積における20〜250ユニットの酵素で消化される。最も好ましくは、インキュベーション時間および塩条件としての条件、酵素濃度およびDNA量が製造者の推奨に従って用いられることである。
【００５８】
本発明の態様において、制限酵素は、好ましくはメチル化感受性制限酵素であり、すなわち、制限酵素による核酸の切断または消化は、好ましくは全ての部位での部分的または完全なメチル化によってあるいは言い換えると制限酵素の認識核酸配列内の５−メチル−シトシン塩基を含むヌクレオチドの存在によって、（好ましくは完全に）ブロックまたは阻害される。なお言い換えると、ジヌクレオチドＣｐＧは、制限酵素の認識核酸配列の一部であるかまたはその中に含まれ、制限酵素の認識核酸配列内のジヌクレオチドＣｐＧ中の５−メチル−シトシン塩基を含むヌクレオチドの存在は、核酸を切断または消化する制限酵素の活性のブロックまたは阻害、好ましくは完全なブロックまたは阻害を導くか、あるいはジヌクレオチドＣｐＧは、制限酵素の認識核酸配列の一部であるかまたはその中に含まれ、制限酵素の認識核酸配列内のジヌクレオチドＣｐＧ中に５−メチル−シトシン塩基を含むヌクレオチドの存在は、制限酵素による核酸の切断または消化をブロックまたは阻害、好ましくは完全にブロックまたは阻害する。
【００５９】
好ましくは、認識核酸配列におけるメチルシトシン塩基を有するヌクレオチドには、３’側にグアニン塩基を有するヌクレオチドが隣接し、それによってグアニン塩基を有するヌクレオチドは、認識核酸配列の一部である、すなわち、ジヌクレオチドＣｐＧは、制限酵素の認識核酸配列に位置するかまたはその中に含まれる。従って、制限酵素は、好ましくは、制限酵素Acl I、BsiW I、BspD I、Bst BI、BstU I、Cla I、HpyCH4 IV、Mlu I、Nru I、Pvu IおよびSnaB Iからなる群から選択される。あるいは、上記された制限酵素のイソシゾマーもまた使用され得る。従って、制限酵素は、好ましくは、制限酵素Acl I、BsiW I、BspD I、Bst BI、BstU I、Cla I、HpyCH4 IV、Mlu I、Nru I、Pvu I、SnaB Iおよびこれらのイソシゾマーからなる群より選択される。
【００６０】
別の好ましい態様において、制限酵素の認識核酸配列におけるメチルシトシン塩基を有するヌクレオチドには、３’側にグアニン塩基を有するヌクレオチドが隣接し、それによってグアニン塩基を有するヌクレオチドは、制限酵素の認識核酸配列の一部ではなくまたはそれに含まれない（がそれに直接隣接する）。従って、別の態様において、制限酵素による核酸の切断は、制限酵素の認識核酸配列と重なっているＣＧジヌクレオチドを有する部位でのみブロックされるかまたは損なわれる。従って、それは、制限酵素BsmF I、BstZ I、Dpn II、Eci I、EcoR I、EcoR V、Hpa I、Mbo I、Ple I、Pme I、Rsa I、Sal IおよびSau3A Iからなる群から選択される。あるいは、上記される制限酵素のイソシゾマーもまた使用され得る。従って、制限酵素は、好ましくは制限酵素BsmF I、BstZ I、Dpn II、Eci I、EcoR I、EcoR V、Hpa I、Mbo I、Ple I、Pme I、Rsa I、Sal I、Sau3A Iおよびこれらのイソシゾマーからなる群から選択される。
【００６１】
本発明の好ましい態様において、制限酵素は、本発明に従う方法の工程ｃ）において熱的に不活性化される、すなわち、温度が上げられ、制限酵素は制限酵素の熱変性によって不活性化される。本発明に従う方法における不活性化工程ｃ）および増幅工程ｄ）は、好ましくは同じ工程において実施される。
【００６２】
本発明に従う方法において、増幅工程ｄ）における使用のための増幅試薬および制限酵素は、増幅工程ｄ）の前に試料と合わせられる。これは、別々にまたは一緒になされ得る。従って、本発明の好ましい態様において、該増幅工程ｄ）における使用のための増幅試薬および制限酵素は、混合物として試料と合わせられる。増幅試薬は、ヌクレオチド、１対のプライマー、オリゴヌクレオチド、プローブまたはＤＮＡポリメラーゼを含む。それは、標識され得る他のオリゴヌクレオチドも含み得る。プローブは、特にTaqMan（登録商標）(WO 92/02638および対応する米国特許US 5,210,015, US 5,804,375, US 5,487,972)またはLightCycler（登録商標）装置(例えば、US 6,174,670を参照)において適用される形式において容易に使用され得る方法で標識され得る。
【００６３】
本発明の好ましい態様において、核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅される(PCR; EP 0 201 184, EP-A-0 200 362, US 4,683,202)。増幅法はまた、リガーゼ連鎖反応(LCR, Wu, D.Y.およびWallace, R.B., Genomics 4 (1989) 560-569ならびにBarany, F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 189-193)；ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応(Barany, F., PCR Methods Appl. 1 (1991) 5-16)；Ｇａｐ−ＬＣＲ(PCT特許公開No. WO90/01069)；修復連鎖反応（Repair Chain Reaction）(欧州特許公開No. EP439,182 A2)；３ＳＲ(Kwoh, D.Y.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 1173-1177; Guatelli, J.C.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 1874-1878; PCT特許公開No. WO 92/0880A)およびＮＡＳＢＡ(米国特許No. US5,130,238)であり得る。さらに、鎖置換型増幅（ＳＤＡ）、転写媒介型増幅(transcription mediated amplification)（ＴＭＡ）、およびＱβ増幅(概説のために、例えばWhelen, A.C.およびPersing, D.H., Annu. Rev. Microbiol. 50 (1996) 349-373; Abramson, R.D.およびMyers, T.W., Curr. Opin. Biotechnol. 4 (1993) 41-47を参照)がある。本発明に従う特に好ましい増幅方法は、亜硫酸水素塩処理およびアリール特異的ＰＣＲ(例えば、US 5,137,806, US 5,595,890, US5,639,611を参照)を組み合わせたUS 5,786,146に開示されるメチル化特異的ＰＣＲ法（ＭＳＰ）またはＰＣＲ反応におけるブロッキングプローブのプライマーとの組み合わせ(WO2002/072880)である。
【００６４】
好ましい態様において、方法は、増幅された核酸を検出する工程をさらに包含し得る。増幅された核酸は、当業者に公知の標準的な分析方法および例えば、Sambrook, J.ら、Molecular Cloning, Cold Spring Harbor University Press (1989), Lottspeich and Zorbas, in 「Bioanalytik」(1998), L. a. Zorbas編, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, GermanyまたはAusubel, F.ら、「Current protocols in molecular biology」(1994), F.Ausubel, R. Brent and K. R.E.編、Wiley & Sons Verlag, New Yorkに記載される方法によって決定または検出され得る。標的核酸が検出される前のさらなる精製工程、例えば沈殿工程がまた存在し得る。検出方法は、二重鎖ＤＮＡにインターカレートし、その後その蛍光を変化する臭化エチジウムのような特定の色素の結合またはインターカレーティングを含み得るが、これに限定されない。精製された核酸はまた、制限消化の後、随意に電気泳動的方法によって分離され、その後可視化され得る。特定の配列へのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（hybridisation）およびその後のハイブリッドの検出を活用するプローブベースのアッセイもまた存在する。当業者に公知のさらなる工程の後、標的核酸を配列決定することもまた可能である。他の方法は、特定のプローブが結合され、相補的配列が結合した場合シグナルを生じるシリコンチップへ多様な核酸配列を加える。
【００６５】
本発明の特に好ましい態様において、核酸は、増幅の間、蛍光の強度を測定することによって検出される。この方法は、リアルタイム蛍光のモニタリングを必然的に伴う。蛍光強度の測定による同時の増幅および検出を活用する特に好ましい方法は、WO 92/02638および対応する米国特許US 5,210,015, US 5,804,375, US 5,487,972に開示されるTaqMan（登録商標）法である。この方法は、シグナルを発生するポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を活用する。詳細には、核酸は、標的核酸の１つの領域に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドおよび同じ標的核酸鎖の第２の領域に相補的な配列を含むが第１のオリゴヌクレオチドによって規定される核酸配列を含まない標識オリゴヌクレオチドと試料を接触させ、ハイブリダイゼーション条件の間に二重鎖の混合物を生成する工程であって、ここで該二重鎖が第１のオリゴヌクレオチドの３’末端が標識オリゴヌクレオチドの５’末端に近接するように第１のオリゴヌクレオチドおよび標識オリゴヌクレオチドにアニールする標的核酸を含む、工程を包含するプロセスによって検出される。次いで、この混合物は、ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性によってアニールされた標識オリゴヌクレオチドを切断し、標識フラグメントを放出することを可能にするのに十分な条件下で５’→３’ヌクレアーゼ活性を有するテンプレート依存性核酸ポリメラーゼで処理される。標識オリゴヌクレオチドの加水分解によって生成されたシグナルは、検出および／または測定される。ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術は、形成され検出可能にされるべき固相結合反応複合体の必要を排除する。より一般的な用語において、本発明に従う方法の増幅および／または検出反応は、均一溶液相（homogeneous solution-phase）アッセイである。さらに好ましい方法は、LightCycler（登録商標）装置に使用される形式である（例えば、US 6,174,670を参照)。US 6,331,393に記載されるような、亜硫酸水素塩処理、メチル化特異的プローブの存在下でのメチル化特異的プライマーを用いる増幅または用いない増幅およびリアルタイム蛍光検出の使用は、特に好ましい。
【００６６】
従って、本発明の好ましい態様において、増幅工程ｄ）の後のまたは増幅工程ｄ）と同時の、試料中の標的核酸の存在または量の指示として該増幅工程において生成された任意の増幅産物を検出する工程をさらに包含する、本発明に従う方法が提供される。
【００６７】
本発明の好ましい態様において、方法は自動化される、すなわち、方法は、例えば、WO 99/16781に記載されるように自動化され得るプロセスを実施する。自動化され得るプロセスは、プロセスの工程が、外部コントロールまたはヒトによる影響がほとんどなくまたは全くなく操作され得る装置または機械を用いて実施されることに適していることを意味する。自動化される方法は、自動化され得る方法の工程が、外部コントロールまたはヒトによる影響がほとんどなくまたは全くなく操作され得る装置または機械を用いて実施されることを意味する。方法のための調製工程のみが人手によってなされなければならないかもしれない、例えば、保存容器は充填され正しい位置に置かれなければならない、試料の選択はヒトによってなされなければならない、当業者に公知のさらなる工程、例えば、制御コンピューターの操作。装置または機械は、例えば自動的に液体を添加し、試料を混合し、または特定の温度でインキュベーション工程を実施し得る。典型的には、かかる機械または装置は、単一の工程および命令が特定されるプログラムを実施するコンピューターによって制御されるロボットである。本発明の好ましい態様において、方法はハイスループット形式にあり、すなわち自動化された方法がハイスループット形式で実施され、このことは、方法および使用される機械または装置が短い時間での試料のハイスループットに最適化されることを意味する。
【００６８】
好ましくは本発明に従う方法は、診断分析もしくは生体分析のためにまたは特定のメチル化パターンの存在についてのヒトもしくは動物体でさえ由来の組織もしくは体液のスクリーニングのための診断において使用される。さらに、本発明に従う方法は、核酸中のメチル化部位の検出のスピード、正確さまたは感度を増大するために使用される。
【００６９】
本発明に従って第２の試料中の標的核酸について第２の増幅プロセスを実施する工程の前に第１の試料中の標的核酸配列について第１の核酸増幅プロセスを実施する工程を含む、第１および第２の試料それぞれにおいて標的核酸を増幅するための第１および第２の核酸増幅プロセスを含む連続的な標的核酸増幅プロセスにおいて汚染を制御するための方法を提供することは、本発明の好ましい態様である。
【００７０】
本発明の別の態様において、制限酵素は、メチル化標的核酸を含む試料中の非メチル化標的核酸を消化するために使用され、それによってメチル化標的核酸中の非メチル化シトシン塩基のウラシル塩基への転換をし、一方でメチルシトシンの非転換をする間に非メチル化標的核酸が試料中に存在しなかった。制限酵素は、好ましくはメチル化感受性制限酵素であり、好ましくは上記される群から選択される。
【００７１】
当該分野で公知のかかるキットは、例えば、９６もしくは３８４ウェル形式のマイクロタイタープレートまたは例えば、Eppendorf, Hamburg, Germanyによって製造されるただの普通の反応チューブのような増幅手順の間使用され得るプラスチック製品および本発明に従う方法を実施するための他の全ての試薬をさらに含む。
【００７２】
別の好ましい態様において、制限酵素、亜硫酸イオンを含む化合物およびガラス表面を含む固相を含むキットの部品が提供される。別の態様において、制限酵素、亜硫酸イオンを含む化合物、ガラス表面を含む固相、１対のプライマー、プローブおよびＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは、例えばＴａｑポリメラーゼのような熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含むキットが提供される。亜硫酸水素イオンを含む化合物は、例えば、亜硫酸水素ナトリウムまたは他の亜硫酸水素アルカリ（alkaline bisulfite）である。制限酵素は、好ましくはメチル化感受性制限酵素であり、好ましくは上記される群から選択される。本発明に従うキットはまた、WO2002/072880に記載される方法に従って使用され得る別のオリゴヌクレオチドもまた含み得る。本発明に従うプローブは、随意に当業者に公知の色素で標識され得る。
【００７３】
本発明の別の態様において、キットは、上記されるような固相上で亜硫酸水素塩反応を実施するためにもまた使用され得る、核酸を単離するための試薬を含む。従って、キットは、核酸に対して親和性を有する材料を含み得、好ましくは核酸に対して親和性を有する材料は、シリカ表面を有する材料を含む。好ましくは、シリカ表面を有する材料は、ガラスである。最も好ましくは、核酸に対する親和性を有する材料は、WO96/41811またはWO01/37291に記載されるような磁性ガラス粒子を含む組成物である。キットは、さらにまたはその上、例えば、細胞の溶解を可能にするカオトロピック薬剤、界面活性剤もしくはアルコールまたはこれらの混合物を含む溶解バッファおよび不必要なタンパク質を消化するためのプロテアーゼ、例えばプロテイナーゼＫを別に含み得る。本発明に従うキットのこれらの成分は、チューブまたは保存容器内に別々に提供され得る。成分の性質に依存して、これらは、単一のチューブまたは保存容器中にさえ提供され得る。キットは、さらにまたはその上、ＤＮＡまたはＲＮＡが結合される場合、磁性ガラス粒子の洗浄工程に適切な洗浄溶液を含み得る。この洗浄溶液は、緩衝化溶液中のエタノールおよび／もしくはカオトロピック薬剤または酸性ｐＨであり上記されるようなエタノールおよび／もしくはカオトロピック薬剤を含まない溶液を含み得る。しばしば、洗浄溶液または他の溶液は、使用の前に希釈されなければならないストック溶液として提供される。キットはさらにまたはその上、磁性ガラス粒子に結合したＤＮＡまたはＲＮＡを溶出するための溶出液または溶出バッファ、すなわち溶液もしくはバッファ（例えば、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）あるいは純水を含み得る。さらに、核酸、すなわちＤＮＡまたはＲＮＡの精製プロセスのために使用され得るさらなる試薬または緩衝化溶液がまた、存在し得る。
【００７４】
以下の実施例、参照、配列表および図面は、本発明の理解を補助するために提供され、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示される。改変が本発明の精神から逸脱することなく示される手順においてなされ得ることが理解される。
【００７５】
（実施例）
（実施例１）
制限酵素消化によるアンプリコンの汚染除去（ｄｅｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）
背景：
亜硫酸水素塩反応が作用し、非メチル化シトシンをウラシルに転換するという事実はポリメラーゼ連鎖反応によって示され得、それによって非メチル化シトシンがウラシルに転換される核酸配列の領域に特異的なプライマーが使用される、すなわちプライマー中の塩基アデニンが非メチル化シトシンからの亜硫酸水素塩反応生成物であるウラシルの反対側である。不完全な転換の場合、プライマーは、プライマー中のアデニン塩基とマッチしないシトシンが存在するのでこの領域にハイブリダイズし得ない。これは、ＰＣＲ産物が得られないという効果を有する。
【００７６】
迅速なポリメラーゼ連鎖反応を実施するための改善された方法は、例えば、US 6,174,670に開示され、LightCycler（登録商標）装置(Roche, Mannheim, Germany)において使用される。この方法において、２つの標識が蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を行い得るように、２つの標識されたプローブは増幅物（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｅ）依存性様式で非常に近くに来得る。それによって増幅物の量は、特定の波長の放出光の強度と相関する。従って、この特定のＰＣＲ法は、非メチル化シトシンの完全な転換が得られたかどうかを適切なプローブおよびプライマーを使用して分析するために使用され得る。しかし、当業者は、他の方法が同様にこの評価のために使用され得ることを知っている。蛍光測定は、反応においてサイクルの初期の間に得られる初期蛍光測定、すなわちバックグラウンド蛍光によって割ることで標準化され、その一方で、サイクル間の蛍光測定は、相対的に一定であるように見える。初期蛍光測定について選択されたサイクル数は、比較される全ての反応について同じであり、その結果、全ての測定は、同じ反応サイクルに比較して増加を示す。ポリメラーゼ連鎖反応増幅の初期サイクルにおいて、標的分子の数は、幾何学的方程式Ｎｉ＝Ｎ０×（１＋Ｅ）ｉによって記載され得、ここで、Ｎ０＝反応の開始時の標的分子の数、Ｎｉ＝ｉ番目サイクル終了時の標的分子の数、Ｅ＝増幅の効率（０＝＜Ｅ＝＜１）である。この増幅の幾何学的増殖期の間、特定の閾値（ＣＴまたはＣＰあるいは交差点（crossing point））に到達するために必要とされるサイクルの数は、（１＋Ｅ）の対数に逆比例する。従って、ＣＴまたはＣＰ値は、反応の間の比較を可能にする反応効率の基準を示す。反応がより少ないサイクルで閾値に到達することを意味するＣＴまたはＣＰ値の減少は、反応効率の上昇を示す。増幅産物の増加が反応蛍光における増加を測定することによってモニターされる場合、蛍光が任意の蛍光レベル（ＡＦＬ）を超過するまで実施される増幅サイクルの数として本明細書中にＣＴまたはＣＰは規定される。反応動力学が増幅の幾何学的増殖期の間に測定されるように、ベースライン蛍光レベルに近いが測定された蛍光におけるランダムな変動の範囲より大きいＡＦＬが選択された。後のサイクルの増幅された生成物の蓄積は反応を阻害し、結局反応プラトーに導く。１．５のＡＦＬが全ての反応について選択された。ＰＣＲ増幅が別個のサイクルからなり、蛍光測定が１サイクルあたり１回実施されるので、測定された蛍光は、典型的に単一のサイクルにおいてＡＦＬより下からＡＦＬより上まで増加する。測定の正確さを改善するために、本明細書中でＣＴもしくはＣＰ値または交差点といわれるＡＦＬ閾値に到達するためのサイクルの「正確な」数は、サイクル間で蛍光測定を内挿することによって計算された。
【００７７】
詳細な説明：
精製されたアンプリコン−ＤＮＡを、メチル化特異的制限酵素の混合物で消化した。HighPure PCR産物精製キットRoche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germanyを用いた精製の後、１０μｌの消化されたＤＮＡを製造業者の説明書に従ってLightCycler（登録商標）装置、Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany上でリアルタイム動力学的ＰＣＲにおいて再増幅した。消化されないが同様にプロセスされたＤＮＡをコントロールとして使用した。
【００７８】
精製されたアンプリコン−ＤＮＡの生成：
メチル化されたヒトゲノムＤＮＡ(Serologicals Corporation, Norcross, GA, USAからのCpGENOMETM UNIVERSAL METHYLATED DNA)を亜硫酸水素塩処理(例えば、Zymo research, Orange, CA, USAからのEZ DNA Methylation Kitを使用して)し、LightCycler（登録商標） FastStart DNA Master Hybridization Probes Kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)を使用して増幅した。以下のプライマー／プローブセットをLightCycler装置(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)上で使用した：
2008511298.tif 000003
。
【００７９】
マスターミックス組成物は、以下の通りであった：
【表１】
2008511298.tif 000004
。
【００８０】
使用されたＰＣＲプロフィール：
【表２】
2008511298.tif 000005
。
【００８１】
アンプリコン(Serologicals Corporation, Norcross, GA, USAからのCpGENOMETM UNIVERSAL METHYLATED DNAキットからのメチル化ヒトゲノムDNA)の配列は以下の通りであり、亜硫酸水素塩処理標的には存在するがアンプリコンにはもはや存在しないＰＣＲ前にメチル化されるＣｐＧ部位を、大文字で示し、残りを小文字で示し；使用される酵素の認識部位に下線を引く：
2008511298.tif 000006
。
【００８２】
得られたアンプリコン−ＤＮＡを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０および安定化試薬として２０μｇ／ｍｌのポリ（ｄＡ）中に１:１０６で希釈し、アリコートにし、さらなる実験のために−２０℃で保存した。
【００８３】
アンプリコン−ＤＮＡの制限酵素消化：
上記由来の３０μｌのアンプリコン希釈物に、１μｌの制限酵素HpyCH04 IV (制限部位A/CGT)およびBstU1 (制限部位CG/CG) (両方の酵素は、New England Biolabs, Beverly, MA, USAからである)ならびに５μｌの１０×インキュベーションバッファ１を添加し、水を５０μｌまで添加した。混合物を３７℃で１時間インキュベートし、その後、Thermomixer中で６０℃でさらに１時間インキュベーションした。インキュベーションの後、混合物をHighPure PCR Product Purification Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)を使用して精製し、溶出体積は４０μｌであった。
【００８４】
消化されたアンプリコン−ＤＮＡの再増幅：
１０μｌの精製され消化されたアンプリコン−ＤＮＡを「精製されたアンプリコン−ＤＮＡの生成」のもとに上記されたのと同じＰＣＲを使用して再増幅した。コントロールとして制限酵素のみを省いた並行サンプルを使用した（各トリプリケート）。
【００８５】
結果：
【表３】
2008511298.tif 000007
発達曲線（growth curve）を図４に示す。
【００８６】
消化されないＤＮＡから消化されたＤＮＡへの約１０のｃｐ値の変化は、９９％を超える非メチル化アンプリコン−ＤＮＡが制限酵素によって消化されたことを示す。
【００８７】
（実施例２：）
制限酵素消化の特異性
実験の設計：
メチル化ＤＮＡをＢｓｔＵ１で消化し、上記のように増幅した；消化されないメチル化ＤＮＡをコントロールとして使用した。
【００８８】
結果：
【表４】
2008511298.tif 000008
【００８９】
消化されたメチル化ＤＮＡおよび消化されないメチル化ＤＮＡのｃｐ値の平均値は同等であり；このことはメチル化ＤＮＡが制限酵素消化によって影響されないことを示す。
【００９０】
（参照の一覧）
【表５】
2008511298.tif 000009
【表６】
2008511298.tif 000010
【表７】
2008511298.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１は、亜硫酸水素塩法の工程である。
【図２】図２は、図３のようなさらなる増幅反応物を汚染する（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ）増幅された反応生成物を導き得る、メチル化標的核酸および非メチル化標的核酸の亜硫酸水素塩処理後の増幅反応の例である。
【図３】図３は、亜硫酸水素塩反応生成物およびその消化を概略的に示す、メチル化標的核酸および非メチル化標的核酸の亜硫酸水素塩処理の後の増幅反応物の汚染除去の例である。
【図４】図４は、実施例「消化されたアンプリコン−ＤＮＡの再増幅」についてのシグナル発達曲線である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年4月25日(2006.4.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のメチル化標的核酸を増幅し、その一方で非メチル化標的核酸の増幅を回避し、それによってメチル化標的核酸が制限酵素の認識核酸配列中にメチルシトシン塩基を有するヌクレオチドを含む方法であって、ここで認識核酸配列が増幅された反応産物中にあり、該方法は、以下の工程：
（ａ）試料中のメチル化標的核酸および非メチル化標的核酸中の非メチル化シトシン塩基をウラシル塩基に転換し、その一方でメチルシトシン塩基を転換しない工程；
（ｂ）工程ａ）において試料中に存在しなかった非メチル化標的核酸または工程ａ）において転換されなかった、制限酵素の認識核酸配列中のシトシン塩基を含む複数のヌクレオチドもしくは１つのヌクレオチドを含む非メチル化標的核酸を消化する制限酵素を試料に添加し、それによってメチル化標的核酸が、制限酵素によって消化されない工程；
（ｃ）制限酵素を不活性化する工程；
（ｄ）メチル化標的核酸を増幅する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
認識核酸配列中のメチルシトシン塩基を有するヌクレオチドが３’側でグアニン塩基を有するヌクレオチドと隣接し、それによってグアニン塩基を有するヌクレオチドが認識核酸配列の一部であるかまたはその一部でない、請求項１記載の方法。
【請求項３】
非メチル化標的核酸が、偶然にまたは随意に、試料中に存在するかまたは試料に導入される、請求項１または２いずれか記載の方法。
【請求項４】
非メチル化標的核酸が、請求項１〜３いずれか記載の方法の工程ａ）の前、工程ａ）の間もしくは工程ａ）の後または請求項１〜３いずれか記載の方法の工程ｂ）の前もしくは工程ｂ）の間に、偶然にまたは随意に、試料中に存在するかまたは試料に導入される、請求項１〜３いずれか記載の方法。
【請求項５】
制限酵素がメチル化感受性制限酵素である、請求項１〜４いずれか記載の方法。
【請求項６】
制限酵素が、制限酵素Acl I、BsiW I、BspD I、Bst BI、BstU I、ClaI、HpyCH4 IV、Mlu I、Nru I、Pvu I、SnaB Iおよびこれらのイソシゾマーからなる群から選択されるかまたは制限酵素BsmF I、BstZ I、DpnII、Eci I、EcoR I、EcoR V、Hpa I、MboI、Ple I、Pme I、Rsa I、Sal I、Sau3A Iおよびこれらのイソシゾマーからなる群から選択される、請求項１〜５いずれか記載の方法。
【請求項７】
制限酵素が工程ｃ）において熱的に不活性化される、請求項１〜６いずれか記載の方法。
【請求項８】
前記不活性化工程ｃ）および前記増幅工程ｄ）が同じ工程において実施される、請求項１〜７いずれか記載の方法。
【請求項９】
増幅工程ｄ）における使用のための増幅試薬および制限酵素が増幅工程ｄ）の前に試料と合わせられる、請求項１〜８いずれか記載の方法。
【請求項１０】
前記増幅工程ｄ）における使用のための増幅試薬および制限酵素が混合物として試料と合わせられる、請求項１〜９いずれか記載の方法。
【請求項１１】
増幅試薬がヌクレオチド、１対のプライマー、オリゴヌクレオチド、プローブまたはＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項１〜１０いずれか記載の方法。
【請求項１２】
増幅工程ｄ）の後のまたは増幅工程ｄ）と同時の、試料中の標的核酸の存在または量の指示として該増幅工程において生成された任意の増幅産物を検出する工程をさらに包含する、請求項１〜１１いずれか記載の方法。
【請求項１３】
工程ａ）において試料中の亜硫酸イオンの存在が試料中のメチル化標的核酸中の非メチル化シトシン塩基をウラシル塩基に転換する、請求項１〜１２いずれか記載の方法。
【請求項１４】
工程ａ）が以下のサブ工程
ａ１）メチル化標的核酸を含む試料を亜硫酸イオンを含む溶液と混合する工程；
ａ２）工程ａ１）において得られたメチル化標的核酸および亜硫酸イオンを含む溶液をインキュベートし、それによって標的核酸を脱アミノ化する工程、
ａ３）アルカリ条件下で脱アミノ化核酸をインキュベートし、それによって脱アミノ化核酸が脱スルホン化される工程、
ａ４）脱アミノ化核酸を脱塩する工程
を包含する、請求項１〜１３いずれか記載の方法。
【請求項１５】
亜硫酸イオンの濃度が０．１〜８Ｍ、好ましくは２〜８Ｍである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
工程ａ１）およびａ２）における溶液のｐＨが酸性範囲、好ましくは４．５〜６．５の間であることによって特徴付けられる、請求項１〜１５いずれか記載の方法。
【請求項１７】
工程ａ２）およびａ３）におけるインキュベーション温度が０℃〜９０℃の間、好ましくは１８℃〜９０℃の間であることによって特徴付けられる、請求項１〜１６いずれか記載の方法。
【請求項１８】
工程ａ２）におけるインキュベーション時間が３０分〜４８時間の間、好ましくは２４時間であることによって特徴付けられる、請求項１〜１７いずれか記載の方法。
【請求項１９】
工程ａ３）がアルカリ溶液もしくはバッファ、好ましくは水酸化物、好ましくは水酸化ナトリウムを含む溶液、またはエタノール、塩化ナトリウムおよび水酸化ナトリウムを含む溶液、好ましくは３８％（体積／体積）エタノール、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  ＮａＯＨを含む溶液を添加することによって実施されるということによって特徴付けられる、請求項１〜１８いずれか記載の方法。
【請求項２０】
工程ａ３）のインキュベーション時間が５分〜６０分の間であることによって特徴付けられる、請求項１４〜１９いずれか記載の方法。
【請求項２１】
脱アミノ化工程ａ２）、脱スルホン化工程ａ３）および／または脱塩工程ａ４）が実施され、その一方で、標的核酸がガラス表面を含む固相に結合されることによって特徴付けられる、請求項１４〜２０いずれか記載の方法。
【請求項２２】
第１および第２の試料それぞれにおいて標的核酸を増幅するための第１および第２の核酸増幅プロセスを含む連続的な標的核酸増幅プロセスにおいて汚染を制御するための方法であって、該方法は、請求項１〜２１のいずれかに記載の第２の試料中の標的核酸について第２の増幅プロセスを実施する工程の前に、第１の試料中の標的核酸配列について第１の核酸増幅プロセスを実施する工程を包含する、方法。
【請求項２３】
亜硫酸水素塩処理メチル化標的核酸を含む試料中の亜硫酸水素塩非処理非メチル化標的核酸を消化するための、制限酵素の使用。
【国際調査報告】
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