(57)【要約】  本発明は、発酵技術の分野に関する。具体的には、本発明は、単一の生産生物によって第１及び第２の発酵生産物を生産するための発酵方法であって、第１の生産物が基質より還元された状態であり、且つ第２の発酵生産物が基質より酸化された状態であるが、最終酸化生産物ＣＯ２より酸化されていない状態であり、したがって生物における第１及び第２の生産物の同時合成が、還元力のリサイクルを可能にし、（部分）嫌気性条件下で行われ得る方法に関する。本発明はさらに、第１の発酵生産物が弱アルカリ性化合物であり、第２の発酵生産物が弱酸性化合物である方法にも関する。このような場合、両生産物は、単独の発酵槽で単独の生物によって生産することもでき、又は第１及び第２の生産物はそれぞれ、共発酵される２つの異なる生物によって生産することもできる。共発酵は、２つの発酵槽間での可溶性培地成分の循環を可能にするが、生産生物の細胞の循環を防止するマイクロシーブで連結されている２つの別々の発酵槽で行うことができる。本発明はまた、第１及び第２の発酵生産物が（不溶性）複合体又は塩を形成することができるこのような方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生産生物による基質の第１の発酵生産物及び第２の発酵生産物への変換によって、少なくとも第１の発酵生産物及び少なくとも第２の発酵生産物を生産するための方法であって、
生物が、基質の第１の発酵生産物への変換のための第１の代謝経路及び基質の第２の発酵生産物への変換のための第２の代謝経路を含み、
第１の発酵生産物が基質より還元された状態であり、且つ第２の発酵生産物が基質より酸化された状態であり、
第１及び第２の経路が、生物におけるその同時作用によって、生物における還元力のリサイクルが可能になるという点で相補的であり、
第２の発酵生産物が、最終酸化生産物ＣＯ２及びＨ２Ｏより酸化されていない状態であり、
基質に対する第１及び第２の発酵生産物の合計収率が、Ｃモル基準で少なくとも４０％である上記方法。
【請求項２】
基質の第１及び第２の発酵生産物への変換中、生物が、消費された基質と関係付けられたＯ２／Ｃモル基準で、酸素の量の３０％未満しか消費しない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
基質に対するバイオマス収率が、消費された基質と関係付けられたＣモル基準で、３０％未満である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
第１の発酵生産物が１つより多い化合物を含み、化合物がそれぞれ、基質より還元された状態である、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
第２の発酵生産物が、１つより多い化合物を含み、化合物がそれぞれ、基質より酸化された状態である、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
第１の発酵生産物が、弱アルカリ性化合物又はその塩又はその誘導体であり、第２の発酵生産物が、弱酸性化合物又はその塩又はその誘導体である、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
第１及び第２の発酵生産物が、適用発酵条件下で不溶性複合体又は不溶性塩を形成することができる、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
第１又は第２の代謝経路の少なくとも一部分が、生物に自然には存在せず、活性でない、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
第１又は第２の代謝経路が、生物の遺伝子修飾によって、生物において導入され又は活性化される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
生物が、微生物、又は高等生物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養細胞である、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
第１の生産生物による基質の第１の発酵生産物への変換及び第２の生産生物による基質の第２の発酵生産物への変換によって、少なくとも第１の発酵生産物及び少なくとも第２の発酵生産物を生産するための方法であって、
第１及び第２の生産生物が共発酵され、
第１の発酵生産物が、弱アルカリ性化合物又はその塩又はその誘導体であり、第２の発酵生産物が、弱有機酸又はその塩又はその誘導体である上記方法。
【請求項１２】
第１の生産生物による基質の第１の発酵生産物への変換及び第２の生産生物による基質の第２の発酵生産物への変換によって、少なくとも第１の発酵生産物及び少なくとも第２の発酵生産物を生産するための方法であって、
第１及び第２の生産生物が共発酵され、
第１及び第２の発酵生産物が、適用発酵条件下で不溶性複合体又は不溶性塩を形成することができる上記方法。
【請求項１３】
第１の発酵生産物が、弱アルカリ性化合物又はその塩又はその誘導体であり、第２の発酵生産物が、弱酸性化合物又はその塩又はその誘導体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
第１の生産生物が第１の発酵槽で培養され、第２の生産生物が第２の発酵槽で培養され、
第１及び第２の発酵槽が並列に配置され、マイクロシーブを含む１つ又は複数の連結手段で連結され、
可溶性培地成分が、マイクロシーブを含む連結手段を介して第１及び第２の発酵槽間を循環するが、マイクロシーブが生産生物の循環を防止する、請求項１１から１３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
連結手段をさらに、マイクロシーブによって第１及び第２の発酵槽から分離されている容器に連結する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
容器において、第１及び第２の発酵生産物間での不溶性複合体又は不溶性塩の形成を促進する条件が適用される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
第１及び第２の発酵生産物間での不溶性複合体又は不溶性塩の形成を促進する条件が、
ａ）第１及び第２の発酵槽における温度より低い温度；
ｂ）第１及び第２の発酵槽におけるｐＨと異なるｐＨ；及び
ｃ）第１及び第２の発酵生産物間での不溶性複合体又は不溶性塩の形成を促進するヘルパー分子の濃度
から選択された１つ又は複数の条件である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ヘルパー分子が、金属イオン、又は水混和性有機溶媒である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも２つの異なる発酵容積を含む発酵システムであって、
発酵容積がそれぞれ、少なくとも１つの発酵槽を含み、
異なる発酵容積が、マイクロシーブを含む連結手段を介して連結され、異なる発酵槽容量間での可溶性培地成分の循環が可能になるが、発酵容積間での生産生物の細胞の循環が防止される上記発酵システム。
【請求項２０】
連結手段をさらに、マイクロシーブによって異なる発酵槽容量から分離されている容器に連結する、請求項１９に記載の発酵システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも第１及び第２の発酵生産物を生産するための発酵方法に関する。これらの発酵方法では、基質の変換効率は、還元相当物が生産生物内でリサイクルされるように、それぞれが相互に対して且つ基質に対して特定の酸化状態を有する第１及び第２の発酵生産物を同時生産することによって改善され、それによって、基質のＣＯ２への完全酸化の必要性が低減する。本発明の発酵方法の別の改善は、弱アルカリ性化合物及び弱酸性化合物の同時生産を含み、且つ／又は第１及び第２の発酵生産物は、生産物を効率的に取り出すための（不溶性）複合体又は塩を形成することができる。あり得る改善としては、容積生産性の改善で現れることもある。
【背景技術】
【０００２】
発酵産業では、炭水化物は、一般に原材料、すなわち基質として使用され、通常は、例えばいくつかのアミノ酸の場合と同様に、基質と同じ又はそれより還元された状態を有し、或いは例えば大部分の有機酸の場合と同様に、基質より酸化された状態を有する化合物の発酵生産のための炭素及びエネルギーの供給源である。炭素及びエネルギーの供給源より還元された状態を有する化合物が生産される発酵方法では、生産生物は、かなり大きな還元力が必要である。この還元力は、基質のＣＯ２への完全酸化によって生成される。したがって、基質のかなりの部分がＣＯ２の生産で失われ、方法の全効率が低減する。さらに、基質のＣＯ２への完全酸化では、通常は余剰還元力が生成される。この余剰還元力を、基質のバイオマスへの変換で使用することができ、且つ／又は代謝エネルギーを（ＡＴＰ又はプロトン駆動力の形で）生成するために使用することができる。代謝エネルギーの高い有効性によって、やはりバイオマスの形成が起こる。この基質のバイオマスへの変換は、さらに方法の全効率を低減させる。呼吸するため、生物は大量の酸素を必要とし、大量の熱を生産する。酸素移動容量及び冷却容量は、通常は工業用発酵方法において律速であり、これらの容量をどちらも増大させることは、資本集約的であり、又は発酵槽システムの物理的制約のため不可能である。したがって、当技術分野では、基質の生産物への変換効率が改善され、容積生産効率がより高く、熱発生が低減され、且つ／又は酸素要求量が低減された発酵方法が求められている。本発明の目的は、このような改善された方法を提供することである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、基質の変換効率が向上され、容積生産速度がより高く、熱発生が低減され、且つ／又は酸素要求量が低減された発酵方法に関する。本発明の第１の態様では、これらの改善された発酵諸特性は、生育及び生産物形成のために生物によって必要とされた還元力が基質のＣＯ２への完全酸化によって生成されることを回避し且つ／又は低減することによって実現される。多くの発酵方法では、最終生産物は、最終生産物の生産に使用される基質より還元された状態である。その結果、生物は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、又はＦＡＤＨの形の還元力が必要となる。好気性生物では、還元力は、大いに経済的な価値を有する生産物でないＣＯ２への基質の完全酸化によって生成される。本発明は、基質のＣＯ２への完全酸化を回避し又は低減するが、むしろ基質の酸化状態より高く、同時にＣＯ２の酸化状態より低い酸化状態を有する第２の生産物への基質の不完全酸化によって十分な還元力を生成することを目的とする。これは、部分的に嫌気性とすることができる不完全酸化代謝を生産生物に強制し、又はそれを可能にすることによって実現され得る。多数の細菌、酵母、及び糸状菌は、有機酸を蓄積するそれらの能力によって明らかなように、このような不完全酸化を行うことができる。例えば、有機酸への不完全酸化によって、生物は、ＮＡＤＨ又は他の還元相当物を生成し、これは、例えばアミノ酸などの基質より還元された状態を有する第１の最終生産物に基質（例えば、炭素供給源）を還元するために使用され得る。
【０００４】
したがって、第１の態様では、本発明は、生産生物による基質の第１の発酵生産物及び第２の発酵生産物への変換によって、少なくとも第１の発酵生産物及び少なくとも第２の発酵生産物を生産するための方法であって、生物が、基質の第１の発酵生産物への変換のための第１の代謝経路及び基質の第２の発酵生産物への変換のための第２の代謝経路を含み、第１の発酵生産物が基質より還元された状態であり、且つ第２の発酵生産物が基質より酸化された状態であり、第１及び第２の経路が、生物におけるその同時作用によって、生物における還元力のリサイクルが可能になるという点で相補的であり、第２の発酵生産物が、最終酸化生産物ＣＯ２より酸化されていない状態であり、基質に対する第１及び第２の発酵生産物の合計収率が、それぞれＣモル基準で少なくとも４０％である方法に関する。
【０００５】
本発明の方法は、発酵生産物を生産するための方法であって、発酵生産物が、生物、好ましくは微生物によって生産することができる任意の有用な化合物又は有用な化合物群を意味すると理解される方法である。発酵生産物は、生物の代謝の最終又は中間の代謝産物とすることができる。この代謝は、生物の自然代謝、又は例えばヒトの介入によって生物で改変された非自然代謝とすることができる。したがって、本発明の文脈では、発酵生産物には、例えばモノ−、オリゴ−、及びポリマー炭水化物を含めて、炭水化物、糖、脂質、脂肪酸、アミノ酸、オリゴ−及びポリペプチド、タンパク質、有機酸、ビタミン、中間代謝産物、二次代謝産物、抗生物質、アルカノール、アルコール、ポリオール、アミン、ジアミン、ポリアミンが含まれる。しかし、本発明の文脈では、バイオマス、ＣＯ２、及び通常は熱の形のエネルギーは、「第１の発酵生産物」及び「第２の発酵生産物」という用語から明らかに除外されている。本発明の文脈では、ＣＯ２は有用な生産物とは見なされず、本発明の別の目的は、本発明の発酵方法で生産されたバイオマス及び熱の量を低減することである。
【０００６】
本発明の方法では、基質は、好ましくは生産生物用の炭素及びエネルギーの供給源、好ましくは生物用の唯一の炭素及びエネルギーの供給源である。大部分の工業用発酵では、炭水化物を、生産生物用の炭素及びエネルギーの供給源として使用する。適切な炭水化物の炭素及びエネルギーの供給源は、発酵技術分野で周知であり、これには、例えばグルコース、フルクトース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、サッカロース、マルトース、トレハローズ、マルトデキストリン、セルロース、ヘミセルロース、セロビオース、可溶性デンプン、糖蜜、コーンスターチ、リグニン、リグノセルロースなどが含まれる。本発明では、基質の酸化状態は、第１及び第２の発酵生産物の酸化状態がそれぞれ、それに対して定義される基準点である。しかし、実際には、炭水化物の炭素及びエネルギーの供給源を主に本明細書の実施例で述べる。しかし、本発明は、炭素及びエネルギーの供給源として炭水化物のみ使用することに決して限定されない。適切な非炭水化物の炭素及びエネルギーの供給源には、例えばグリセロール、マンニトール、クエン酸、アルカノール（例えば、メタノール又はエタノール）、ポリオール、脂質、脂肪酸、有機酸、アミン、アミノ酸、ペプチド、アルカン、アルカノアート、ヒドロキシ−アルカノアート、リグニン、及びその誘導体などが含まれる。
【０００７】
本発明の方法では、第１及び第２の発酵生産物の酸化状態は、基質の酸化状態に対して定義される。第１の発酵生産物は、基質と同じ又はそれより還元された状態である。したがって、第１の発酵生産物は、基質の酸化還元電位と同じ又はそれより高い酸化還元電位を有する。逆に、第２の発酵生産物は、基質より酸化された状態であり、第２の発酵生産物で実現されるべき第２の規定は、それが最終酸化生産物ＣＯ２及びＨ２Ｏより酸化されていない状態であることである。したがって、第２の発酵生産物は、基質の酸化還元電位より低い酸化還元電位を有し、第２の発酵生産物は、最終酸化生産物ＣＯ２及びＨ２Ｏの酸化還元電位より高い酸化還元電位を有する。基質、第１及び第２の発酵生産物はそれぞれ、酸化状態が異なる一群の様々な化合物からなることがある（下記も参照のこと）。このような場合、本明細書では、このような一群の化合物の酸化還元電位は平均酸化還元電位／Ｃモルと定義される。
【０００８】
基質の酸化状態、及び１つの生産生物における基質の第１及び第２の発酵生産物への変換のための代謝経路の組合せのそれぞれに対する、第１及び第２の発酵生産物の酸化状態の選択はそれぞれ、第１及び第２の経路の同時作用によって、生物における還元力のリサイクルが可能になる状況を生物に生み出す。したがって、第１及び第２の経路は、第１の経路が通常はＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、又はＦＡＤＨの形の還元力を必要とし、その還元力が最終酸化生産物ＣＯ２及びＨ２Ｏへの完全酸化によってではなく第２の経路によって生成されるという点で相補的である。
【０００９】
本発明の方法の利点は、基質のより少ない量がＣＯ２に変換され、より多い量が第１及び第２の発酵生産物に変換されることである。したがって、本発明の好ましい方法では、基質に対する第１及び第２の発酵生産物の合計生産物収率が、それぞれＣモル基準で少なくとも３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％である。本明細書では、Ｃモル基準での生産物収率（又は基質に対する生産物の収率係数；Ｙｐｓ）は、利用された基質中の炭素原子量当たりの生産された生産物中の炭素原子量を意味すると理解される。本発明の方法では、基質に対する第１及び第２の生産物のＣモル基準での生産物収率は、実質的に互いに等しいことがあるが、大部分の場合、これは真実ではない。したがって、第１及び第２の発酵生産物のＣモル基準での合計生産物収率の少なくとも５１、５２、５５、６０、６５、７０、７５、８０、又は９０％は、第１又は第２の発酵生産物の生産物収率からなる。
【００１０】
本発明の方法では、生産生物は、基質の第１及び第２の発酵生産物への変換中消費された基質と関係付けられたＣモル基準で、酸素の量の３０、２０、１８、１５、１２、１０、８、又は５％未満しか消費しないことが好ましい。本明細書では、利用された基質に対する消費された酸素のＣモル基準での変換係数（Ｃｏｓ）は、消費された基質Ｃモル当たりの使用されたＯ２モルを意味すると理解される。理論的には、本発明の方法を厳密な嫌気性条件下（すなわち、Ｃｏｓ＝０．０）で実施することができ、このような方法は、本発明から排除されない。しかし、好ましい方法では、いくらかの酸素が消費される。このような方法は、部分嫌気性、半嫌気性方法、又は低酸素条件下で実施される微好気性方法と呼ばれることがある。
【００１１】
本発明の方法の別の好ましい実施形態では、利用された基質に対する生産されたバイオマスの収率係数は、３０、２５、２０、１５、１０、５、又は２％未満である。本明細書では、利用された基質に対する生産されたバイオマスの収率係数（Ｙｘｓ）は、利用された基質の量（グラム）に対する生産されたバイオマスの量（乾燥重量グラム）を意味すると理解される。
【００１２】
本発明の方法の一実施形態では、第１の発酵生産物は１つより多い化合物を含む。このような場合、第１の発酵生産物における化合物のＣモル当たりの平均還元状態は、基質のＣモル当たりの平均還元状態より高い。好ましくは、第１の生産物中の化合物がそれぞれ、基質より還元された状態である。同様に、別の実施形態では、第２の発酵生産物は１つより多い化合物を含む。このような第２の発酵生産物中の化合物のＣモル当たりの平均還元状態が基質のＣモル当たりの平均還元状態より低い場合、第２の生産物中の化合物はそれぞれ、基質と同じ又はそれより酸化された状態である。
【００１３】
基質が炭水化物であり、したがってその生産物が炭水化物と同じ又はそれより還元された状態である場合に、本発明の方法で生産される第１の発酵生産物の適切な例としては、例えばリシン、グルタミン酸、ロイシン、トレオニン、トリプトファンなどのアミノ酸；例えばアンピシリン、バシトラシン、セファロスポリン、エリスロマイシン、モネンシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、タイロシン、マクロライド、及びキノロンを含めて、抗生物質；例えば高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含めて、脂質及び脂肪酸；エタノール、プロパノール、及びブタノールなどのアルカノール；１，３−プロパン−ジオール、ブタンジオール、グリセロール、及びキシリトールなどのポリオール；アセトンなどのケトン；アミン、ジアミン、エチレン；カロテノイド、カロテン、アスタキサンチン、リコペン、ルテインなどのイソプレノイド；アクリル酸、コレステロールやエルゴステロールなどのステロール；例えばビタミンＡ、Ｂ２、Ｂ１２、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＫを含めて、ビタミン；及び、例えばオリゴペプチドを含めて、ペプチド、ポリペプチド、例えば工業又は医薬（薬剤）用途を有するタンパク質を含めて、タンパク質が挙げられる。工業用途を有するタンパク質又はポリペプチドの例としては、例えばリパーゼ（例えば、洗浄剤工業で使用される）、プロテアーゼ（とりわけ、洗浄剤工業、醸造などで使用される）、炭水化物分解酵素及び細胞壁分解酵素（果物加工、ワイン製造など又は飼料で使用されるアミラーゼ、グルコシダーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、β−１，３／４−及びβ−１，６−グルカナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、マンナナーゼ、キシラナーゼ、プルラナーゼ、ガラクタナーゼ、エステラーゼなど）、フィターゼ、ホスホリパーゼ、グリコシダーゼ（アミラーゼ、β−グルコシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、ラムノシダーゼ、アピオシダーゼなど）、乳酵素及び生産物（例えば、キモシン、カゼイン）などの酵素、ポリペプチド（例えば、ポリリシンなど、シアノフィシン及びその誘導体）が挙げられる。治療、化粧料、又は診断の用途を有する哺乳類、好ましくはヒトのポリペプチドには、コラーゲン及びゼラチン、インスリン、血清アルブミン（ＨＳＡ）、並びにラクトフェリンが含まれるが、これらに限定されない。
【００１４】
基質が炭水化物であり、したがってその生産物が炭水化物より酸化された状態である場合に、本発明の方法で生産される第２の発酵生産物の適切な例としては、グルカル酸、グルコン酸、グルタル酸、アジピン酸、コハク酸、酒石酸、シュウ酸、酢酸、乳酸、ギ酸、リンゴ酸、マレイン酸、マロン酸、クエン酸、フマル酸、イタコン酸、レブリン酸、キシロン酸、アコニット酸、アスコルビン酸、コウジ酸、及びコメリック酸など、例えば発酵によって生産され得る大部分の有機酸が挙げられる。上記の酸の誘導体及び塩が含まれ、酸の誘導体は、カルボニル基以外の任意の位置で１つ又は複数の置換を有する任意の誘導体とすることができる。
【００１５】
より低い又はより高い酸化状態の炭水化物の基質を使用する場合、生産物はそれぞれ、特定の生産物が新しい基質の酸化還元より高い又は低い酸化還元状態を有するかどうかに応じて、第２の発酵生産物から第１の発酵生産物群に、又はその逆に移動されることを、当業者は理解するであろう。
【００１６】
別の態様では、本発明は、第１の生産生物による基質の第１の発酵生産物への変換及び第２の生産生物による基質の第２の発酵生産物への変換によって、少なくとも第１の発酵生産物及び少なくとも第２の発酵生産物を生産するための方法であって、第１及び第２の生産生物が共発酵され、第１の発酵生産物が、弱アルカリ性化合物又はその塩又はその誘導体であり、第２の発酵生産物が、弱有機酸又はその塩又はその誘導体である方法に関する。
【００１７】
さらに別の態様では、本発明は、第１の生産生物による基質の第１の発酵生産物への変換及び第２の生産生物による基質の第２の発酵生産物への変換によって、少なくとも第１の発酵生産物及び少なくとも第２の発酵生産物を生産するための方法であって、第１及び第２の生産生物が共発酵され、第１及び第２の発酵生産物が、適用発酵条件下で不溶性複合体又は不溶性塩を形成することができる方法に関する。好ましくは、第１及び第２の発酵生産物は、適用発酵条件下で非理想の溶液又は複合体、好ましくは不溶性複合体又は塩、好ましくは不溶性塩を形成することができる。このような条件には、弱アルカリ性又は弱酸性の化合物のそれぞれについて、例えば３Ｍ（３モル／リットル）、２Ｍ、１Ｍ、０．５Ｍ、２５０ｍＭ、１００ｍＭ、５０ｍＭの濃度において、範囲の一端がｐＨ４．０、５．０、又は６．０で、範囲の他端がｐＨ７．０、８．０、又は９．０であるｐＨ範囲がすべての様々な組合せで含まれる。非理想溶液又は（不溶性の）複合体若しくは塩を形成することができる好ましい組合せは、弱酸及び弱アルカリ性化合物の組合せである。（沈殿物を形成しない）非理想溶液又は可溶性複合体の生産は、その後に蒸発による濃縮ステップが意図されている場合、又はバイオマス除去後のステップで、発酵ブロスを、沈殿する複合体の形成が促進されるように処理する場合に好ましい方法とすることができる。溶液で（不溶性）複合体又は塩を形成することができる化合物の組合せのいくつかの例は、当技術分野で記載されている（表３）。しかし、上記の（不溶性）複合体又は塩は、溶液で形成される（不溶性）複合体の構成要素部分をほとんど排他的に含有する単純な化学的環境で形成された。下記に概説する実施例では、適切な実験条件下で、（不溶性）複合体又は塩のいくつかを、複合体発酵ブロスからも形成し単離できることが示されている。
【００１８】
本発明の別の好ましい方法では、沈殿を増強するために、発酵ブロスを、メンブラン（例えば、実施例１、３、４、５、６でも使用された半透過性のマイクロシーブメンブラン）、又は蒸発によって濃縮する。本発明のこれらの方法では、第１及び第２の発酵生産物を全く同一の生物によって生産することができる。或いは、これらを１つより多い生物によって生産することもできる。例えば、第１の発酵生産物を第１の生物によって生産することもでき、第２の発酵生産物を第２の生物によって生産することもできる。このような場合、１つの発酵槽で、第１及び第２の生物を培養することができ、又は少なくとも１つのマイクロシーブをそれぞれが装備している例えば２つのパイプ又はチュービングなどの連結手段で連結されている２つの別々の発酵槽で、生物をそれぞれ培養することができる。この発酵槽配置では、可溶性培地構成要素は、マイクロシーブを含む連結手段を経由して第１及び第２の発酵槽間を循環するが、マイクロシーブによって、生産生物の循環が防止される。したがって、本明細書では、マイクロシーブは、代謝産物及び溶質を自由に通過させるが、細胞を自由に通過させない装置であると理解される。したがって、マイクロシーブは、通常はカットオフ限界が少なくとも１．０、２．０、５．０、１０．０、２０．０、１００、２００、５００、若しくは１０００ｋＤａの、又は孔径／直径が０．１５、０．２２、０．４５、若しくは０．５マイクロメートル以下の（限外）濾過膜又はメンブランである。適切な限外濾過膜及びメンブランは、当業者に公知であり、広く利用可能である。
【００１９】
実施例１は、本発明の文脈で一般に利用することができるマイクロシーブメンブランの応用例を記述する。実施例１では、並列に配置され、このようなマイクロシーブの少なくとも１つをそれぞれが装備している２つのパイプ又はチュービングで連結された２つの発酵槽で、２つの異なる微生物を生育させる。この構築によって、培地しか循環されず、生物が分離されたままである２つ（以上）の発酵槽において、様々な生物の発酵が可能になる。それにもかかわらず、これらの微生物は代謝産物を交換することができ、したがって直接接触することなく連通される。実施例１では、例えば２つの生物の一方は、酸性代謝産物の排出によって培地のｐＨを下降させる傾向があるが、他方の生物は、培地のｐＨを上昇させる傾向がある。通常、これらのｐＨのシフトは、ＮａＯＨなどの塩基又はＨ２ＳＯ４やＨＣｌなどの酸を添加することによって防止される。実施例１では、このようなｐＨ制御は、循環する培地によって省略することができる。場合によっては、これらのマイクロシーブメンブランを、並列に配置された２つ（以上）の発酵槽間の２つの連結チューブ又はパイプの両端に搭載された弁と共に使用することによって、半分離式反応器容積が生じることができ、そこで、酸／塩基（不溶性）複合体又は塩の形成を、金属イオン（Ｍｅ２＋、例えばＣａ２＋）、エタノール、又は（不溶性）複合体若しくは塩の形成を促進する他の任意の分子などのヘルパー分子で促進することができる。選択性は、適切なマイクロシーブメンブランのタイプを選択することによって調整することができる。さらに、連結チューブ又はパイプのうちの１つは、膨張又は沈殿容器を装備することができ、そこにヘルパー分子を、追加のインレットを経由して添加することができ、形成された（不溶性）複合体又は塩を追加のアウトレットから取り出すことができ、したがって発酵中、生産物を常に除去することが可能になる。発酵槽システムにおいてこのような追加の死容積が生じることは、特に嫌気性又は微好気性の方法に適している。２つの発酵槽の一方が別の連結チューブ又はパイプで置換されている場合、マイクロシーブ／沈殿容器構築物を他の発酵槽へのシャントとしても操作できることを、当業者は理解するであろう。したがって、本発明の方法の別の実施形態では、連結手段はさらに、マイクロシーブによって第１及び第２の発酵槽から分離されている容器に連結する。容器では、第１及び第２の発酵生産物間での不溶性複合体又は不溶性塩の形成を促進する条件が適用されることが好ましい。第１及び第２の発酵生産物間で不溶性複合体又は不溶性塩の形成を促進する条件は、下記から選択された１つ又は複数の条件であることが好ましい：
ａ）第１及び第２の発酵槽における温度より低い温度；
ｂ）第１及び第２の発酵槽におけるｐＨと異なるｐＨ；
ｃ）第１及び第２の発酵生産物間での不溶性複合体又は不溶性塩の形成を促進するヘルパー分子の濃度。（好ましいヘルパー分子は、金属イオン又は水混和性有機溶媒である。好ましい水混和性有機溶媒は、任意の比で水と混和することができる溶媒である）；
ｄ）例えば、（好ましくは細胞／バイオマスの除去後に、発酵ブロスの）蒸発によって、第１及び第２の発酵生産物の濃度を増大させること。
【００２０】
したがって、本発明の方法では、発酵生産物である第１又は第２の生産物の１つは、弱有機酸、その塩、又はその誘導体であることが好ましい。本明細書では、弱有機酸は、ｐＫａ値が２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、又は４．８より高い有機酸と定義される。弱酸性化合物は、有機酸、抗生物質、酸性ｐＩを有するタンパク質、アスパラギン酸又はグルタミン酸のようなアミノ酸からなる群から選択されることが好ましい。弱有機酸は、その塩及び誘導体を含めて、上記に列挙する有機酸からなる群から選択されることが好ましい。本発明の方法では同時に、他の発酵生産物、すなわち第２又は第１の生産物は、弱アルカリ性化合物、その塩、又はその誘導体である。本明細書では、弱アルカリ性化合物は、ｐＫｂ値が１１、１０．８、１０．６、１０．４、１０．２、１０．０、９．８、９．６、９．４、９．２、９．０、８．８、又は８．６未満である化合物と定義される。本明細書では、ｐＫｂ値は、−ｌｏｇ１０Ｋｂと定義される（式中、Ｋｂは、［ＢＨ＋］＊［ＯＨ−］を［Ｂ］で除したものと定義される）。弱アルカリ性化合物は、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アルカリ性ｐＩを有するポリペプチド、様々な抗生物質分子、アルカンジアミンからなる群から選択されることが好ましい。
【００２１】
本発明の方法では、好ましくは、第１の代謝経路、第２の代謝経路、又は第１及び第２の両代謝経路の少なくとも一部分は、生物に自然には存在せず、活性でない。好ましくは、第１及び／又は第２の代謝経路を、生物の遺伝子修飾によって、生物に導入し、活性化する。代謝経路を導入し、又は活性化するように、生産生物の遺伝子修飾のための広範囲の技法を当業者は利用できる。技法には、交雑、交配、（種間及び種内の）プロトプラスト融合、及び化学物質（例えば、ＥＭＳ、ＭＭＳ）、放射線（ＵＶ、β線又はγ線）による突然変異誘発など古典的な遺伝子技法、並びに挿入、遺伝子破壊、遺伝子置換、トランスポゾン、アンチセンスＲＮＡ、コサプレッション、クウェリング、又はＲＮＡｉによるより最新の突然変異誘発技法が含まれる。場合によっては、突然変異誘発の後に、例えばハイスループットスクリーニングを使用して所望の修正を加えた変異体を選択することがある。遺伝子修飾は、例えば遺伝子又はｃＤＮＡのクローニング、遺伝子の発現又は不活性化のための核酸構築物の構築、及び核酸構築物を有する生物の形質転換、形質導入、形質移入、感染と、場合によってはその後に続く、上記に記載する所望の修正を加えた形質転換体の選択を含めて、組換えＤＮＡ技法によってもたらされる。所望の遺伝子修飾をもたらすために、上記の技法のいずれかを組み合わせ、且つ／又は１回又は複数回繰り返すことができることを、当業者は理解するであろう。本明細書の実施例には、これらの遺伝子技法の説明のための参考文献が記載されている。
【００２２】
Ｂ．サブチリスの亜種サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８株（分類学（ｔａｘｏｎｏｍｙ）におけるＩＤ：２２４３０８）のゲノム配列全体は、公開されている（Ｋｕｎｓｔら、１９９７；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｔａｘｏｎｏｍｙ／Ｂｒｏｗｓｅｒ／ｗｗｗｔａｘ．ｃｇｉ？ｉｄ＝２２４３０８）が、さらに最近になって、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）（及び２つの他のコリネバクテリウム種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．））のゲノム配列全体が、様々なゲノミクス技法（Ｋｒｏｍｅｒら、（２００４）によって解析されて決定され（Ｉｋｅｄａ及びＮａｋａｇａｗａ，２００３；Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉら、２００３）、標的変異体の生産の関連性が評価されている（Ｏｈｎｉｓｈｉら、２００２）。十分に確立しているプロトプラスト融合技法と、例えば比較又は機能ゲノミクス、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、メタボロミクス、フラックソミクスなどを含めて、さらに最新のゲノミクス（すべてのオミクス手法の集合名詞）を組み合わせて、全く新しい活動が本明細書に設計されており、これは「ゲノミックス（ＧｅｎｏＭｉｘ）」と総称される。本明細書では、この用語は、単独の種又は培養物のために通常使用されるが、プロトプラスト融合生産物にも適用される確立しているすべてのゲノミクス技術の組合せのために使用される。例えば、プロテオミックスは、ハイブリッドタンパク質のスポット又はパターンの２Ｄタンパク質、ソフトウェア、及びＭａｌｄｉ−ＴＯＦ支援集合解析を意味する。同様に、トランスクリプトミックス（ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏＭｉｘ）は、融合物の複合的な転写プロファイルの解析を意味し、フラックソミックス（ＦｌｕｘｏＭｉｘ）は、いずれかの融合パートナーの代謝産物フラックスの組合せの解析を意味する。
【００２３】
本発明の方法では、生産生物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば発酵槽中でその細胞を培養することができる任意の生物とすることができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することができる、植物及び脊椎動物のような高等生物からの細胞、具体的には昆虫及び哺乳類の細胞は、本発明の方法に使用するための生産生物として含まれる。しかし、好ましい生産生物は、細菌、真菌、酵母、藻類、又は原生動物などの微生物である。生産生物としての使用に好ましい細菌には、例えばアシネトバクター種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、コリネ菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、グルコノバクター種（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、グルコノバクター・サブオキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトコッカス・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、メタノコッカス種（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、シュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、ラルストニア種（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐ．）、リゾビウム種（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）、シノリゾビウム・メリロッティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、及びザントモナス種（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）が含まれる。生産生物としての使用に好ましい糸状菌には、例えばアスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、アスペルギリス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）、ペニシリウム・クリゾゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．���、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、及びモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）が含まれる。生産生物としての使用に好ましい酵母には、例えばサッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、クルイベロミセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、及びクリプトコッカス・クルバタス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）が含まれる。生産生物としての使用に好ましい藻類には、例えばクロレラ種（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．）、クロレラ・プロセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）、クリプテコディニウム種（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．）、クリプテコディニウム・コーニー（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ）、ドゥナリエラ種（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓｐ．）、ガルディエリア・スルフラリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ）、モリネラ・マリヌス（Ｍｏｒｉｎｅｌｌａ  ｍａｒｉｎｕｓ）、フォトバクテリウム・プロファンダム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ）、シゾチトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｉｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）、シュワネラ種（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．）、及びトラウストキトリウム種（Ｔｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）が含まれる。
【００２４】
本発明の方法では、生産生物の細胞を、例えば細胞から単離し且つ／又は再構成される溶媒透過性細胞又は酵素系とは対照的に、生存可能な、好ましくは無傷の細胞として培養し又は使用することが好ましい。本明細書では、生細胞は、複製する能力を有する細胞と定義される。
【００２５】
第１の発酵生産物としてリシン、及び第２の発酵生産物としてコハク酸を生産するための好ましい生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である。第１の発酵生産物としてリシン、及び第２の発酵生産物としてグルタミン酸を生産するための好ましい生物は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）である。第１の発酵生産物としてグリセロール、及び第２の発酵生産物としてグルタミン酸を生産するための好ましい生物は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。第１の発酵生産物としてアラニン、及び第２の発酵生産物としてシトラートを生産するための好ましい生物は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）である。第１の発酵生産物として脂肪酸、及び第２の発酵生産物としてオキサラート又はアセタートを生産するための好ましい生物は、クリプトコッカス・クルバタス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）である。第１の発酵生産物としてペニシリンＧやＶなどのβ−ラクタム抗生物質、並びに第２の発酵生産物としてオキサラート及び／又はクエン酸を生産するための好ましい生物は、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属の真菌である。
【００２６】
さらに別の態様では、本発明は、少なくとも２つの異なる発酵容積を含む発酵システムであって、発酵容積がそれぞれ、少なくとも１つの発酵槽を含み、様々な発酵容積が、マイクロシーブを含む連結手段を介して連結され、様々な発酵槽容量間での可溶性培地成分の循環が可能になるが、発酵容積間での生産生物の細胞の循環が防止されるシステムに関する。好ましくは、発酵システムでは、連結手段をさらに、マイクロシーブによって様々な発酵槽容量から分離されている容器に連結する。上記に記載する通り、容器は、発酵生産物の回収、濃縮、及び／又は沈殿のために使用することができる。発酵システムの別の実施形態を、上記に記載しているが、そこにはシステムが使用されている方法が記述されている。
【００２７】
従来の好気性発酵方法に比べて、本発明の方法の利点には、下記が含まれる：
・第１及び第２の発酵生産物構成要素の生産速度のバランスがとれている間は還元相当物が補償されるため、基質効率が向上する。
・酸素要求量及び熱生成が低減し、それによって強力な通気及び大容量の冷却の必要性が回避される結果、ランニングコスト及び投資コストが低下する。さらに、容積生産性を上げることができ、したがって最終生産物の価格に対する投資コストの寄与が低減する。１つの単独の発酵槽における様々な生物の共培養若しくは共発酵、又は１つの生物内での代謝工学により生合成経路を組み合わせることによって、この場合は、２つ以上の発酵生産物を１回の発酵実施で生産することができる（実施例２、３、４、５、６）。
【００２８】
従来の嫌気性発酵方法に比べて、本発明の方法の利点には、下記が含まれる：
・第１及び第２の生産物の形成によって、完全な酸化還元バランスが生じない場合、呼吸によって、余剰還元力が取り除かれる。
・第１及び第２の生産物の形成によって代謝エネルギーが生じない場合、呼吸によって、還元力が代謝エネルギーに変換され得る。
両方の利点によって、より広い生産物スペクトルがもたらされる。
【００２９】
クエン酸のような酸性生産物の発酵生産の最中、発酵ブロスの過剰な酸性化を回避するのに中和が必要である。同じことが、リシンのような塩基性最終生産物の場合も当てはまる。酸性生産物（例えば、グルコン酸）と塩基性生産物（例えば、リシン）の同時発酵生産によって、いくつかの追加の利点がもたらされる：
・酸性又は塩基性のｐＨ制御化合物の添加の必要性が少なく、又は全くなく、おそらくより高い生産速度及び／又は濃度ももたらされる。
・アミノ基及び酸性基を含む分子は会合して、沈殿することができる溶解性が低減された（不溶性）複合体又は塩を形成することができる。したがって、発酵ブロス中の（可溶性）生産物の濃度が低減し、それによって生産物のフィードバック阻害が回避され、より高い容積生産速度が可能になる。
・下流のプロセッシングの最中、酸／塩基（不溶性）複合体又は塩の溶解性が低いことは有利であり得る。というのは、従来の方法によるものより少ないエネルギー及びヘルパー化合物しか１つとしない技法を使用して、２つの複合構成要素を希釈プロセス流のかなり小さい容量から精製することができるからである。
【００３０】
本文献及びその特許請求の範囲では、動詞「含む」及びその活用形は、その単語に続く品目が含まれるが、具体的に記載されていない品目も排除されないことを意味するようにその非限定的な意味で使用される。さらに、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素という言葉は、文脈上から、要素が唯一つしか存在していないことがはっきりしていない限り、１つより多い要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、通常は「少なくとも１つの」を意味する。
【実施例】
【００３１】
（実施例１：リシン生産性コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）及びグルコン酸生産性グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）の変異体の共発酵）
この実施例は、共発酵と呼ばれ、２つの発酵槽におけるＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）とＧ．オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）の２つの細菌種の培養が関与する手順によるリシン及びグルコン酸の同時生産を実証する。ｐＨ制御の必要性を回避するために、２つの発酵槽（Ｃｇの場合、Ａ、Ｇｏの場合、Ｂ）を使用し、そのうちの一方では、塩基性アミノ酸が生産され、他方の発酵槽では、有機酸が生産される。２つの発酵槽は、細胞ではなく、培地及びその構成要素すべてしか通過させない半透過性のマイクロシーブ（全般的な説明においても記述されている）を含むチューブ又はパイプで連結されている。したがって、この方法は、共培養又は共固定化（Ａｉｇｕｏ及びＰｅｉｊｉ、１９９８）に似ているが、この場合、細菌種を混合することをしない。
【００３２】
Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）は、そのリシン生産のため公知である（Ｉｋｅｄａ、２００３）。改善のための生産プロセス及び選択肢を記述する数理モデルが設計されている（Ｅｎｓａｒｉ及びＬｉｍ、２００３）。さらに、相当な量のグルタミン酸（Ｗｉｊａｙａｒａｔｈｎａら、２００１）及びいくつかの他のアミノ酸を形成することができる。グルコン酸過剰生産性株のＧ．オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）を、共発酵実験（グルコン酸生産及び排出）で、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）（リシン生産及び排出）と共に使用した。Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）は通性嫌気性であり、Ｇ．オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）は絶対好気性である。
【００３３】
グルコン酸及びリシンの過剰生産の最中、生産生物又はその共発酵パートナーによって排出された生産物（代謝産物）の消費は防止されるべきである（例えば、Ｌｅｅら、１９９８を参照のこと）。したがって、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）及びＧ．オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）のグルコン酸及びリシン取り込み変異体は、共培養手順に関与するいずれかの種で調製される（例えば、Ｐｏｐｋｉｎ及びＭａａｓ、１９８０；Ｒｅｖｅｌｌｅｓら、２００４を参照のこと）。さらに、グルコン酸オペロン（遺伝子クラスター）、及びグルコン酸代謝に間接的に関与する他の遺伝子は、例えばバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｆｕｊｉｔａ及びＦｕｊｉｔａ、１９８７；Ｆｕｊｉｔａ及びＭｉｗａ、１９９４）及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｉｚｕら、１９９７）を含めて、いくつかの生物で特定されている。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／の追加情報によって、Ｄ−グルコン酸からＤ−６−Ｐ−グルコン酸への変換に関与するグルコン酸分解性酵素、さらに具体的にはグルコン酸キナーゼ遺伝子をコードするＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）とＧ．オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）の両方において、遺伝子を特定、単離、破壊することが可能になる。Ｇ．オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）の利用可能なリシン取り込み変異体は知られていないので、従来のＵＶ突然変異誘発後に、いくつかの候補株が単離される。選択するためには、最少の培地を使用し、唯一の炭素及びエネルギーの供給源としての必須構成要素及びリシンを追加する。続いて、レプリカ平板法を行った後生存していないコロニーをさらに分析する。この方法によって、適切な候補変異体の偶発的単離が可能になるが、方法は、特にその特定のため、及びリシン取り込みに関係していない致死突然変異の発生のため困難である。さらに、工業生産株において、ランダムで無関係な突然変異の蓄積は、望ましくない。したがって、相同組換えによるＧ．オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）におけるリシントランスポーター（ｌｙｓ１）遺伝子のサイレンシングを用いる直接手法も行われる。ｌｙｓ１遺伝子をＧ．オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）から単離するため、ＮＣＢＩウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ、さらに具体的には付録Ｉａに列挙されている生物から、ＢＬＡＳＴ検索及びＰＣＲプライマー設計用の情報を使用した。ベクター構築物及び形質転換手順に関する詳細情報は、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の場合、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｒｅｓｔら、（１９９９）、Ｊａｎｇ及びＢｒｉｔｚ、（２０００）、Ｊａｎｇら、（２００１）、並びにＫｒｅｕｔｚｅｒら、（米国特許出願公開第２００３／０１６２２６９号）によって記載されている通りであり、宿主としてのＤＳＭ  ５７１５株、クローニング及び発現ベクターとしてのプラスミドｐＥＣ７、及びＤＮＡ転移のための電気穿孔法（Ｃｒｅａｖｅｎら、１９９４）を使用する。Ｇ．オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）ＡＴＣＣ  ９９３７株の場合、記載されている通り、クローニング用シャトルベクターとしてのプラスミドｐＢＢＲ１２２（ｍｏｂ  ＣｍｒＫｍ’）、及び電気穿孔法を使用する（Ｆｕｋａｙａら、１９８５；Ｍｏｓｔａｆａら、２００２）。宿主ゲノムへの（相同）組込みを促進し、形質転換効率を改善するために、電気穿孔の前に、１か所切断する制限酵素を用いた制限により、ベクターを直線化する。
【００３４】
得られた組換え物を、サザンブロット解析、ＰＣＲ、及び生理的技法で検査する（生育試験は上記に示す通りである）。
【００３５】
この実施例について全般的な説明で示唆する通り、並列に配置され、半透過性のマイクロシーブ及び両端に弁を装備した２つのパイプで連結され、したがって細胞を混合することなく、２つの発酵槽間での培地の循環が可能になる２つの発酵槽で、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）とＧ．オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）の２つの生物を生育させる。
【００３６】
共発酵の場合、相互連結させた２つの有効容量１Ｌの撹拌槽型反応器（Ａｐｐｌｉｋｏｎ、オランダ  スヒーダム（Ｓｃｈｉｅｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））に対して、個別に終夜前培養したものから２つの細菌種を接種材料として使用する（２＊１００ｍＬ  グルコース及び必要に応じて補完物を含有する最少の培地；組成物を両生物の生育が可能になるように調整する）。
【００３７】
発酵（実験Ａ）中、グルコース濃度、ｄＯ２、ＣＯ２濃度、ｐＨ、撹拌機速度、及びバイオマスなど、必須パラメータすべて、並びに培地と抽出された細胞ペレットの両方におけるリシン及びグルコン酸の濃度を決定する。対照（実験Ｂ）として、発酵実施全体で、２つの発酵槽を連結するパイプの４つの弁をすべて閉じたままにして、同じ実験を繰り返す。実験Ａと同様には、ｐＨは調整されず、したがってＧ．オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）の実施では下がり、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の実施では上がる。グルコースからグルコン酸を合成するには酸素が必要であるので、通気を、撹拌機速度１０００ｒｐｍ及び通気１ｖｖｍで最適に維持する。２４時間後に、発酵を終了する。
【００３８】
結果は、２つの発酵槽間の連結チューブから採取された試料で測定して、共発酵（実験Ａ）中、ｐＨは７．３（初期値）から発酵実施の終わりに６．５にシフトするだけであり、個々の発酵実施（実験Ｂ）では、Ｇ．オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）培養の場合、ｐＨは、ｐＨ３．２に下がる恐れがあり、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の場合、ｐＨ８．９に上がる恐れがあることを示唆している。さらに、おそらく共発酵実験では有害なｐＨシフトがないため、リシン及びグルコン酸の生産性は上昇する。
【００３９】
（実施例２：リシン生産性コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）と酢酸生産性バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の属間プロトプラスト融合；リシンと酢酸の合成経路の組合せ（ゲノミックス（ＧｅｎｏＭｉｘ）））
バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）では、ｐｔａ及びａｃｋＡ遺伝子の生産物、ホスホトランスアセチラーゼ及び酢酸キナーゼは、このグラム陽性菌における炭素代謝の最も大量の副生物の１つである酢酸の生産において重要な役割を果たす（Ｐｒｅｓｅｃａｎら、１９９９）。
【００４０】
この実施例では、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のこの酢酸合成経路とＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）のリシン合成経路を組み合わせるために、属間プロトプラスト融合の技法を使用する。植物及び真菌、また細菌に関しては、親生物又は株の所望の特性を組み合わせるためにプロトプラスト融合技法が広く使用されている。実際、これは、必須ＤＮＡ配列がすべて、融合物中に、少なくとも初期に存在していることが保証されている唯一の人工組換えＤＮＡ技法（従来のＤＮＡ転移技法以外）である。多数の予測不可能な組換え事象は、余分な生合成及び調節ＤＮＡ配列がなくなる恐れがあるその間に起こるものと予想され得るが、どちらかの親の中間表現型を特徴とすることができるかなり安定な状況の例がある。
【００４１】
開発された手順は、Ｇ．オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）（ＡＴＣＣ  ９９３７）及びアセトバクター・メラノゲナス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｍｅｌａｎｏｇｅｎｕｓ）（ＮＣＩＭ２２５９）、エルビニア・ヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）（ＡＴＣＣ  ２１９９８）、シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）（ＮＣＩＭ２０４１）、並びにコリネバクテリウム種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）（ＡＴＣＣ  ３１０９０）（Ｖｅｒｍａら、１９８９）の菌株の場合に非常に有効であった。
【００４２】
ビタミンＣ生産の最後から２番目のステップである、２，５−ジケト−グルコン酸生産性Ｇ．オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）（ＡＴＣＣ  ９９３７）と、２，５−ジケト−グルコン酸を２−ケト−Ｌ−グロン酸に還元することができるコリネバクテリウム種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）（ＡＴＣＣ  ３１０９０）の変異体株との属間プロトプラスト融合によって、生存可能な組換え物が生じた。融合生産物のいくつかは、Ｄ−グルコースを２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換する能力を示したが、変換速度は低かった（Ｖｅｒｍａら、１９９２）。
【００４３】
キシラン及び他の複合多糖を分解する能力を有するＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株と、リシン生産性物であるＣ．アセトアシドフィラム（Ｃ．ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）とのハイブリッドを、プロトプラスト融合で調製した（Ｄｅｂら、１９９０）。結果は、属間遺伝子転移は、これらの２つの重要な細菌属間のプロトプラスト融合によって起こり、融合物のいくつかは、両方の親の有用な特性を受け継いでいることを実証している（Ｄｅｂら、１９９０）。
【００４４】
この実施例では、酢酸及びリシンの取り込み変異体は、それぞれ唯一の炭素及びエネルギーの供給源としての酢酸及びリシンで生育することができないので選択により、リシン生産性Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ  ２１２５３）及び酢酸生産性Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  ６６３３）株のランダムな突然変異誘発によって生産される。Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）は、酢酸を単独の基質として又はグルコースとの共基質として使用できるという十分な証拠があるが、今までのところ、仮定の混合型酢酸／プロピオン酸トランスポーターのための遺伝子は、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ゲノム配列全体において特定されていない（Ｇｅｒｓｔｍｅｉｒら、２００３）。したがって、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の酢酸代謝に関与する遺伝子の抑制性転写調節因子であるｒａｍＢ遺伝子を過剰発現させる（Ｇｅｒｓｔｍｅｉｒ、２００４）。同様に、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）では、リシン取り込み及び排出のための遺伝子は、（実施例１で使用された）Ｇ．オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）におけるｌｙｓ１とは異なり、ゲノム配列全体においてアノテーションされておらず（Ｋｕｎｓｔら、１９９７）、より一般的なアミノ酸Ｃａ２＋／Ｈ＋対向輸送体の一部分であると思われる（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａら、１９８６）。
【００４５】
新規変異体株のＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ  ２１２５３  ａｃｕ（酢酸取り込み抑制性）及びＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ  ６６３３  ｌｙｕ（リシン取り込み抑制性）を、Ｄｅｂら（１９９０）及びＶｅｒｍａら（１９９２）から採用された方法に従って融合実験に使用する。続いて、この実施例では、ＵＶ突然変異誘発をさらに繰り返して行い、余分なＤＮＡ配列及び／又は酵素活性を除去し、ハイスループットスクリーニングプログラム及びゲノミックス（ＧｅｎｏＭｉｘ）技術で最良のリシン及び酢酸生産性細菌融合物株を選択する。
【００４６】
下記のいくつかの基準を使用して、融合物の安定性を、生育及び世代数に応じて調査した：
１−親の表現型を暗示する形態学的特性；
２−融合パートナーの両方の公開ＤＮＡ配列及び／又は酵素活性を認識したプライマー配列を使用して選択された特定ＤＮＡ配列の存在；
３−ＤＮＡ配列の存在又は起こり得る消失をランダムに示す完全なゲノムＡＦＬＰ解析；
４−リシン及び酢酸生産性の持続。
【００４７】
Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）で記載したように、優良株のＣＢＡＦ０３−５５を発酵実験にかける。
【００４８】
結果は、融合物株は、リシンと酢酸の両方を生産することができるが、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ  ２１２５３  ａｃｅでは、微量の酢酸しか検出されないことを示唆している。工業生産生物の融合、続いて突然変異誘発処理を行うことによって、親株の主な塩基性と酸性の生産物の両方について高い生産性を示す新規融合物株を得ることができる。したがって、２つの異なる単一生産物発酵方法を、第１及び第２の発酵生産物の生産が関与する１つの新規方法に組み合わせることによって、容積生産性を上げることができる。
【００４９】
（実施例３：ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）によるリシン及びグルタミン酸の同時生産）
様々なコリネ型細菌は、グルタミン酸やリシンなどのアミノ酸を生産することができる。グルコースからグルタミン酸への変換は還元力を生じ、グルコースからリシンへの変換には還元力が必要である。したがって、微生物による両アミノ酸の同時生産は、高い変換効率及び低い酸素要求量をもたらすはずである。
【００５０】
Ｂ．ラクトファーメンタム（Ｂ．ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）については、（Ｓｈｉｒａｔｓｕｃｈｉら、１９９５；欧州特許出願公開第０７８０４７７号Ａ１、実施例６）によって、グルタミン酸とリシンを同時に生産できることが記載されているが、これは、リシンしか形成されない状況に比べて高い収率をもたらさなかった。両アミノ酸が同時に生産された培養物に酸素制限を加えることによって、方法の効率を上げることができる。さらに、生産されたＬ−リシン及びＬ−グルタミン酸は、溶液でＬ−リシン・Ｌ−グルタミン酸の分子又は複合体として存在するはずであることが示唆された。
【００５１】
本質的に記載されているように（Ｓｈｉｒａｔｓｕｃｈｉら、１９９５；欧州特許出願公開第０７８０４７７号、実施例６）、酸素過剰条件下及び酸素制限下に、Ｂ．ラクトファーメンタム（Ｂ．ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＪ  １２９９３による発酵で、リシン及びグルタミン酸を生産する。酸素過剰条件を、撹拌機速度１０００  ｒｐｍ及び通気１ｖｖｍで維持する。酸素制限条件を、通気０．２ｖｖｍ及び撹拌３００ｒｐｍで維持する。表１に示す結果は、酸素制限を加えることによって、生産物収率が上がり、酸素要求量が下がることを示唆している。さらに、マイクロシーブ及び沈殿装置（全般的な説明で示唆した通り）を使用することによって、リシン・グルタミン酸複合体を含む沈殿物が得られる。
【００５２】
【表１】
2008511318.tif 000002
表１：酸素過剰及び酸素制限下、Ｂ．ラクトファーメンタム（Ｂ．ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）によって形成された生産物の最大濃度
＊代替Ｃ供給源としてビタミン、抗生物質、酵母抽出物などの使用が関与している可能性、及び記載されていない追加の生産物の可能性。
【００５３】
したがって、酸素要求量がより低い方法によって、酸素が律速である工業方法においてより高い生産性がもたらされる。さらに、商業的に興味深い２つの生産物を１回の単一発酵実施で形成することによって、容積生産性が上がる。
【００５４】
（実施例４：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）によるクエン酸及びアラニンの同時生産）
第２の発酵生産物アラニンと共に、クエン酸生産性Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のＭＷ  ｌ３１株（重要でないマーカーｃｓｐＡ１、ｇｏｘＣ１７を有する野生型対照）及びＭＷ  １２９株（ｐｙｒＡ、プラスミドＤＮＡのためのウラシル要求性レシピエント）によって全生産物収率を上げるために、バチルス・スフェリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）アラニンデヒドロゲナーゼ（ａｌａＤ）遺伝子を過剰発現する１組の形質転換体を生成する（Ｈｏｌｓら、１９９９）。このために、プラスミドｐＢＭ２０ａｌａＤからのプロモーターをもたない１．２２ｋｂ  ＳｍａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ＧＰＤＡプロモーター及びターミネーター配列を含むｐＭＴＬ２３系ベクターにクローンし（Ｐｕｎｔら、１９８７）、プラスミドｐＡＮａｌａを得る。このベクターを、ｐｙｒＡ遺伝子との同時形質転換によってＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＭＷ１２９に導入する（Ｒｕｉｊｔｅｒら、１９９７）。ｐＡＮａｌａベクターの様々な複製物を含むいくつかの共形質転換体から、最高のａｌａＤ発現レベルを示す１株（ＡｎｉｇＡＦ１２９−１１株）を選択する。Ｒｕｉｊｔｅｒら（１９９７、２０００）によって記載されているように、野生株と組換え株の並行発酵を下記の通り実施する：有効容量１Ｌの撹拌槽型反応器（Ａｐｐｌｉｋｏｎ、オランダ  スヒーダム（Ｓｃｈｉｅｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））を使用して、クエン酸生産のために最適化された、０．５ｇのＫＨ２ＰＯ４、２．５ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、６．５ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．３ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、及び１４０ｇの脱カチオン化グルコース／Ｌを含有する培地で、菌糸体を３０℃で培養する。発酵開始から、酸素過剰条件を撹拌機速度１０００ｒｐｍ及び通気１ｖｖｍで維持する。第３日目に（対数期の中間部を通して）、酸素制限条件を通気０．２ｖｖｍ及び撹拌３００ｒｐｍで適用する。７日後に、発酵を終了し、分析を行った。
【００５５】
結果は、形質転換体（ＡｎｉｇＡＦ１２９−１１）が、クエン酸、相当な量のアラニン、及び野生型（ＮＷ１３１）より少ない量のバイオマスを生産することを示唆している。さらに、マイクロシーブ及び沈殿装置（全般的な説明で示唆した通り）を使用することによって、アラニン・クエン酸複合体を含む沈殿物が得られる。
【００５６】
クエン酸生産性Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株へのアラニン生合成のための遺伝子の過剰発現によって、酸素が律速である工業方法において第１と第２の発酵生産物（それぞれ、クエン酸及びアラニン）の全生産性が上がる。さらに、商業的に興味深い２つの生産物を１回の単一発酵実施で形成することによって、容積生産性が上がる。
【００５７】
（実施例５：コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）におけるリシン−及びコハク酸−合成経路の遺伝子の協調発現）
コハク酸は、ギ酸、マレイン酸、マレイミド、１，４−ブタンジオール、アスパラギン酸、イタコン酸、コハク酸ジメチル／ジエチル、テトラヒドロフラン、γブチロラクトン、スクシンイミド、無水マレイン酸、アジピン酸、ポリエステル、溶媒などの汎用化学品、及び食品材料、植物成長刺激剤、医薬中間体、バイオリン光体、矯味添加剤、酸味料などの特殊化学品を含めて、多数の派生生産物の重要な中間体である。
【００５８】
ｒｅｃＤＮＡ技術でリシン及びコハク酸の生合成経路の遺伝子の協調発現を実現するために、下記の手法を選択した：
Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）抑制性株における相同コハク酸−合成遺伝子の過剰発現。Ｙｕｋａｗａら（２００３）によって提示された手法に従って、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ  ３１８３１株の乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）遺伝子をノックアウトし、続いてコハク酸代謝に関与する相同遺伝子、すなわちコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｓｓｄｈ）及びコハク酸脱水素酵素（ｓｄｈ）サブユニット遺伝子を過剰発現させる。これらの遺伝子の配列は、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の完全なゲノム受入番号ＮＣ＿００３４５０（コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ  １３０３２）、ｇｉ２３３０８７６５から得られ、ネステッドＰＣＲに続いて、単離する。成功した効率的な形質転換は、単一及び共挿入の挿入型形質転換ベクターを用いたＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）についての場合が記載されている（Ｉｋｅｄａ及びＫａｔｓｕｍａｔａ、１９９８；Ｋｏｔｒｂａら、２００３；Ｋｒｅｕｔｚｅｒら、２００３；Ｋｉｒｃｈｎｅｒ及びＴａｕｃｈ、２００３；Ｔａｕｃｈら、２００３）。宿主としてのＤＳＭ５７１５株、クローニングベクターとしてのプラスミドｐＥＣ７を使用し、ＤＮＡ転移のための複数のインサート及び電気穿孔法が可能になるＫｒｅｕｔｚｅｒらによって使用されたシステム（米国特許出願公開第２００３／０１６２２６９号）を使用する。こうして得られた多数の組換え株を単離し、分析する。優良株（ＣＡＦ０４−２６；ｌｄｈ、ｓｓｄｈ、ｓｄｈ）及び対照株ＡＴＣＣ  ３１８３１を並行発酵実験にかけ、生成物を分析する。
【００５９】
結果は、新規組換え株が、対照株に比べて高い濃度のリシンとコハク酸とを生産することを示唆している。さらに、Ｐｒａｓａｄ及びＶｉｊａｙａｎ（１９９１）によって記載されているように、マイクロシーブ及び沈殿装置（全般的な説明で示唆した通り）を使用することによって、リシン・コハク酸複合体を含む沈殿物が得られる。
【００６０】
したがって、リシンなど還元されているアミノ酸（第１の発酵生産物）及びコハク酸などより酸化されている有機酸（第２の発酵生産物）の協調生合成に重要な遺伝子の過剰発現によって、工業生産方法において第１及び第２の発酵生産物のより高い生産性がもたらされる。さらに、商業的に興味深い２つの生産物を１回の単一発酵実施で形成することによって、容積生産性が上がる。
【００６１】
（実施例６：ペニシリウム・クリゾゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）におけるペニシリン生産経路とシュウ酸生産経路のカップリング）
この実施例は、ペニシリンとシュウ酸の生合成経路のカップリングを利用する。酸素制限されたニトラート依存性の生育中、グルコースのシュウ酸への不完全酸化は、β−ラクタム抗生物質ファミリーのメンバーに還元力をもたらす。排出後、シュウ酸はＣａイオンに複合化し、非可溶性のシュウ酸Ｃａ塩結晶の形成、及びペニシリン収率の上昇がもたらされる。
【００６２】
ここ５０年間にわたって発酵によるβ−ラクタム抗生物質の工業生産は、バイオテクノロジーの顕著な例の１つである。今日、β−ラクタム抗生物質、具体的にはペニシリン及びセファロスポリンは、世界規模の剤形販売が約１５０億ＵＳドルであり、又は抗生物質の全世界市場の約６５％である世界の主要なバイオテクノロジー製品を表す。ここ５０年間にわたって、生産生物Ｐ．クリゾゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）及びアクレモニウム・クリゾゲヌム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）（別名、セファロスポリウム・アクレモニウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ  ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ））の生産性の大幅な改善、並びに改善された発酵技術は、結果的に生産性の向上及び実質的なコスト削減をもたらした。主な発酵生産体は、現在ペニシリンの場合４０〜５０ｇ／Ｌ、及びセファロスポリンＣの場合２０〜２５ｇ／Ｌのハーベストタイターが記録されると推定される。ペニシリンＧ又はペニシリンＶの回収率は、現在＞９０％である。６−アミノペニシラン酸又は７−アミノセファロスポラン酸の化学的及び酵素的な加水分解プロセス技術も、新規酵素技術の場合、高効率（約８０〜９０％）であり、ここ１０年間にわたって大幅なコスト削減をもたらす（Ｅｌａｎｄｅｒ、２００３）。これから、追加のプロセス改善は、本明細書に記載する通り、主に別の株の開発及び発酵方法最適化に期待できることが示唆される。
【００６３】
ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）及びアスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）のような工業用生物を含めて、いくつかの真菌種は、シュウ酸を含めて、いくつかの有機酸を効率的に生産するその能力でよく知られており（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＫｕｉａｃｋ、１９９２；Ｃａｍｅｓｅｌｌｅら、１９９８）、いくつかの生合成遺伝子は、他の真菌においても特定されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／；Ｂａｌｍｆｏｒｔｈ及びＴｈｏｍｓｏｎ、１９８４；Ｍｅｈｔａ及びＤａｔｔａ、１９９１；Ｒｕｉｊｔｅｒら、１９９９；Ｋｅｓａｒｗａｎｉら、２０００；Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、２０００；Ａｚａｍら、２００２を参照のこと）。
【００６４】
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）におけるシュウ酸生合成の細胞質経路についての証拠が提供されている（Ｋｕｂｉｃｅｋら、１９８８）。硝酸で生育する真菌の液体培養によって、相当な量のシュウ酸が生産されるが、アンモニウム含有培地では、シュウ酸は少量しか検出されなかった（Ｇｈａｒｉｅｂ及びＧａｄｄ、１９９９）。外部ｐＨは、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）によるシュウ酸生産を支配する主な要因であると思われる。グルコース酸化酵素抑制型変異体は、培養のｐＨが３以上である限り、相当な量のシュウ酸を生産した。ショ糖・硝酸塩液体培地でＰ．ビライー（Ｐ．ｂｉｌａｉｉ）によって生産された主要な酸性代謝産物は、シュウ酸及びクエン酸であることが判明した。クエン酸生産は、窒素制限条件下で促進され、シュウ酸生産は、炭素制限条件下で促進された。クエン酸は、生育期と定常期とで生産されたが、シュウ酸生産は、定常期にしか起こらなかった（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＫｕｉａｃｋ、１９９２）。しかし、使用する工業用発酵方法条件下で、シュウ酸合成は、ペニシリン生産性と負に相関した（Ｄｉｅｚら、１９８６、Ｒｅｅｄ、１９８７）。したがって、この実施例では、生産方法を、Ｐ．クリゾゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）における生育及びペニシリンＧ生産のための詳細な化学量論モデル（Ｖａｎ  Ｇｕｌｉｋら、２０００）に対して適合させた。このモデルを使用したプライオリ代謝フラックス解析から、ペニシリン生産には、１次代謝経路を通るフラックスの大幅な変化が必要であると思われる。これは、β−ラクタム核の炭素前駆体の生合成、及び主に硫酸還元のためのＮＡＤＰＨに対する要求の増大によってもたらされる。Ｐ．クリゾゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）形質転換及び同時形質転換のための基本的なツール（様々な有性選択マーカーを有するベクターと、形質転換プロトコルの両方）は、利用可能であり（Ｇｒａｅｓｓｌｅら、１９９７；Ｃａｓｑｕｅｉｒｏら、１９９９；Ｔｈｅｉｌｇａａｒｄら、２００１；Ｂａｎｕｅｌｏｓら、２００３）、導入遺伝子安定性は、発酵実施で評価されている（Ｒｅｎｎｏら、１９９０）。
【００６５】
この実施例では、シュウ酸生合成に関与する遺伝子は、いくつかの生物から特定されており（上記に列挙する参考文献、及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／）、その情報は、Ｐ．クリゾゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）（及びＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ））からの相当遺伝子の単離に使用される。
【００６６】
下記をコードする遺伝子を単離し、使用する：１）シュウ酸−ＣｏＡ転移酵素（シュウ酸をコハク酸に変換する）；２）シュウ酸脱炭素酵素（シュウ酸をギ酸に変換する）；３）グリオキシル酸脱水素酵素（シュウ酸をグリオキシル酸から合成する）；４）（Ｓ）−２−ヒドロキシ酸酸化酵素（シュウ酸をグリオキシル酸から合成する）；５）アスコルビン酸２，３−ジオキシゲナーゼ（シュウ酸をアスコルビン酸から合成する）。過剰発現（遺伝子３、４、５）又はノックアウト（遺伝子１、２）を目的とするいくつかの形質転換ベクター構築物であるＰ．クリゾゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）相当物を調製した。
【００６７】
形質転換手順で、ｐｙｒＧ遺伝子におけるフレームシフト突然変異を有するウラシル要求体であるＰ．クリゾゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）５４−１２５５  ｐｙｒＧ（−）株（Ｂａｎｕｅｌｏｓら、２００１）をレシピエント株として使用する。１次形質転換体の選択には、自己複製プラスミドｐＡＭ９Ｌ（ｐｙｒＧ）を使用し、同時形質転換ＤＮＡを含む株の２次優性選択には、ストレプトアロテイチャス・ヒンズスタヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ）からのブレオマイシン／フレオマイシン耐性遺伝子（ｂｌｅ）を真菌プロモーター（アクレモニウム・クリゾゲヌム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）のｃｅｆＥＦ遺伝子プロモーター）の制御下に含む組込みプラスミドｐＥＦ４３を使用する。同時形質転換遺伝子（上記に列挙する１〜５）を、過剰発現の場合（遺伝子３、４、５）、内在性遺伝子特異的プロモーター及びターミネーター配列を含むベクターｐＥＦ４３に、又は遺伝子サイレンシングの場合（１、２、それぞれ約７５０−１０００ｂｐｓを保持している）、構造遺伝子の内部断片しか含んでいない５’−及び３’−欠失変異体にクローンする。遺伝子１及び２の宿主ゲノムへの（相同）組込み並びにサイレンシングを促進するために、電気穿孔の前に、制限酵素（Ｃａｓｑｕｅｉｒｏら、１９９９）で相同なＰ．クリゾゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）配列内を一か所切断して、対応するベクターを直線化する（Ｖａｎ  ｄｅ  Ｒｈｅｅら、１９９６）。
【００６８】
電気穿孔法を使用するショットガン同時形質転換実験で、プラスミドｐＡＭＬ９Ｌ及び５つのｐＥＦ４３−誘導体を一緒に混合する（それぞれ１００ｎｇ）。必要に応じて、５−フルオロ−オロト酸（ＦＯＡ）、ウリジン、及びフレオマイシンをそれぞれ、ツァペック培地に最終濃度１ｍｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、及び３０μｇ／ｍｌで添加する（Ｄｉｅｚら、１９８７）。
【００６９】
ドナーＤＮＡ配列の共挿入物を含有する数個の多重遺伝子導入体を特定し、９６−マイクロウェルプレートで生育し、遺伝子１〜５の存在及び相対的発現、並びにペニシリン及びシュウ酸の存在について、ＲＴ−ＰＣＲで解析した。ｖａｎ  Ｇｕｌｌｉｋら（２０００）によって本質的に記載されているように、マイクロウェルプレートの優良株（ＰＡＦ０３−２４７）を、さらに培地組成物（この実施例では、１００ｇ／Ｌのグルコース）、並びに調製及びケモスタット系、並びに培養物を含む有効容量１Ｌの撹拌槽型反応器（Ａｐｐｌｉｋｏｎ、オランダ  スヒーダム（Ｓｃｈｉｅｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））中での発酵実験にかける。
【００７０】
発酵中、さらに通気によって増強された生育相後に、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、及びＺｎ２＋（Ｍｅ２＋）イオンについて、発酵ブロス中で効率的にシュウ酸及び他の酸のイオンに結合し、したがって反応を最終生産物であるＭｅ−シュウ酸塩及びペニシリンの形成に推進するその能力を試験する。
【００７１】
ＰＡＦ０３−２４７株、及び全くｐＡＭＬ９ＬからのｐｙｒＧ遺伝子だけを含む対照のＰＡＦ０３−９株について、本質的な結果は、（追加の）シュウ酸合成能力が導入されること、及びシュウ酸分解又は代謝回転が、Ｍｅ−又はＣａ−シュウ酸塩として細胞外沈殿することにより助長されて阻害されることによって、ペニシリンとシュウ酸の全生産性がどちらも上がることを実証している。さらに、（全般的な説明で示唆した通り）マイクロシーブ及び沈殿装置を使用することによって、カルシウム−シュウ酸塩沈殿物を得る。
【００７２】
（実施例７：ポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）のカップリング、及び脂肪酸生産酵母クリプトコッカス・クルバタス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）におけるシュウ酸／酢酸の生産）
ＰＵＦＡのヒトの消費は、健康促進効果（例えば、冠疾患及び腸癌の予防）及び乳児の脳の発達と関連している。
【００７３】
（例えば、マッシュルームであるツクリタケ（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ）も属している）担子菌類のグループに属する脂肪酸生産酵母のＣ．クルバタス（Ｃ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）によるＰＵＦＡの生産性を上げるために、還元相当物の協調生産及び消費を発酵プロセス工学によって実現する。ムコール・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）やモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）などの脂質蓄積性真菌では、脂肪酸生合成を制限する重要なステップは、十分な還元相当物の供給であることが示唆されている（Ｒａｔｌｅｄｇｅ、２００２）。他の担子菌類におけるシュウ酸又はギ酸の生産及び排出に関する報告はあるが、Ｃ．クルバタス（Ｃ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）におけるものはまだない。したがって、不完全酸化生産物であるシュウ酸及び酢酸を過剰生産及び排出する追加の能力を、Ｃ．クルバタス（Ｃ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）の発酵方法に導入することに着手した。その後、ＣａＣＯ３を使用して、シュウ酸塩／酢酸塩の混合物を発酵ブロスから取り出し、したがってＣａ−シュウ酸塩／酢酸塩の結晶がシンクとして形成される。
【００７４】
発酵槽Ａ、及び酸素供給を最適に維持する対照発酵実施Ｂで、Ｃ．クルバタス（Ｃ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）ＡＴＣＣ  ２０５０９株を、対数期の中間部における酸素欠乏ステップを含めて、並行発酵実験（Ｍｅｅｓｔｅｒｓら、１９９６）にかける。
【００７５】
発酵開始から、発酵槽Ａ及びＢで共に、酸素過剰条件を、撹拌機速度１０００ｒｐｍ及び通気１ｖｖｍで維持する。２４時間後（対数期の中間部を通して）、酸素制限条件を、発酵槽Ａにのみ通気０．２ｖｖｍ及び撹拌３００ｒｐｍで適用する。７２時間後に、発酵を終了し、分析を行った。
【００７６】
その結果、追加の還元相当物の生成によって、実に脂肪酸の生合成及び蓄積が促進されるのが観察される。発酵槽Ａへのシャントとして使用されているマイクロシーブ／沈殿装置によって、Ｃａ−シュウ酸塩結晶の沈殿及び分離が可能になった。
【００７７】
結果は、酸素移動の低減、その後のシュウ酸塩及び酢酸塩の合成、及び細胞外でのシュウ酸塩及び酢酸塩の除去によって、脂肪酸生産微生物における（長鎖ポリ不飽和）脂肪酸の生産を目的とする工業方法の生産性が促進されることを示唆している。
【００７８】
（実施例８：リシンと乳酸との非理想溶液、塩、又は（不溶性）複合体の形成）
細胞における２つの有機対イオンのカップルの形成には、利点がある。第１に、カップルの形成によって、単一イオンの濃度が下がるので、細胞は高濃度を経験しない。したがって、フィードバック阻害がより少ない。第２に、沈殿又は複合体形成が起こると、より少ない容積の発酵培地での下流のプロセッシングが可能になる。２つの有機対イオンからなる多くの塩は、科学文献に記載されている（表３）。この実験では、リシン（Ｌ−リシン・ＨＣｌを使用する）と乳酸、酢酸、コハク酸、又はクエン酸のカップルを、その複合体形成能力に関して試験する。この実験では、２つの対イオンを有する溶液の伝導率を測定する。等モル比の対イオンを０〜２Ｍの濃度で混合する。２Ｍ  ＫＯＨ中の保存溶液の希釈液を使用することによって、伝導率測定に使用された濃度すべてにおいて、ｐＨを７に設定する。
【００７９】
表２から、Ｌ−リシンと乳酸の溶液の伝導率は、１．０〜１．２Ｍの濃度で最大に到達し、次いで使用された最高濃度（２．０Ｍ）まで下がることが明らかである。これは、より低い構成要素濃度によく似ている相互作用（非理想溶液、複合体形成、結晶化）が生じることを示唆している。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏ状況では、細胞はより低い構成要素濃度を経験するが、その実際の濃度ははるかに高いことがある（実に、＞２Ｍ）。
【００８０】
【表２】
2008511318.tif 000003
表２：リシンと乳酸の等モル溶液の伝導率
【００８１】
リシンと酢酸、リシンとコハク酸、及びリシンとクエン酸の対について、同様な結果が得られる。
【００８２】
複合体は、タンパク質のようなより大きな分子と、κ−カゼイン・乳酸などの短いカルボン酸との間でも形成し得る（Ｏｅｄａ、１９７８）。
参考文献
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２８．Ｉｓｔｕｒｉｚ  Ｔ，Ｃｅｌａｙａ  Ｊ．、「大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）におけるグルコン酸代謝。ｇｎｔＳ遺伝子の補助システム及び性質（Ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｎａｔｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｔｈｅ  ｓｕｂｓｉｄｉａｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｎｔＳ  ｇｅｎｅ）」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３７（１９９７）１０５−１１４．
２９．Ｉｚｕ  Ｈ，Ａｄａｃｈｉ  Ｏ，Ｙａｍａｄａ  Ｍ．、「ｇｎｔＫ遺伝子によってコードされた大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）耐熱性グルコン酸キナーゼの精製及び特性付け（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｔｈｅｒｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｇｌｕｃｏｎｏｋｉｎａｓｅ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｇｎｔＫ  ｇｅｎｅ）」、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３９４（１９９６）１４−１６．
３０．Ｉｚｕ  Ｈ，Ａｄａｃｈｉ  Ｏ，Ｙａｍａｄａ  Ｍ．「グルコン酸取り込み及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）カタボライトに関与するｇｎｔＲＫＵオペロンの遺伝子組成及び転写制御（Ｇｅｎｅ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｎｔＲＫＵ  ｏｐｅｒｏｎ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｇｌｕｃｏｎａｔｅ  ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２６７（１９９７）７７８−７９３．
３１．Ｊａｎｇ  ＫＨ，Ｂｒｉｔｚ  ＭＬ．、「細胞表面変異体を用いて改善されたコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の電気形質転換率（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｕｓｉｎｇ  ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｕｔａｎｔｓ）」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２（２０００）５３９−５４５．
３２．Ｊａｎｇ  ＫＨ，Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ＰＪ，Ｃｈｕｎ  ＵＨ，Ｂｒｉｔｚ  ＭＬ．、「コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）におけるプラスミド形質転換に対する細胞表面バリア特性付け（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ  ｂａｒｒｉｅｒｓ  ｔｏ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）」  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１（２００１）２９４−３０１．
３３．Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉ，Ｊ．，Ｂａｔｈｅ，Ｂ．，Ｂａｒｔｅｌｓ，Ｄ．，Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，Ｎ．，Ｂｏｔｔ，Ｍ．，Ｂｕｒｋｏｖｓｋｉ，Ａ．，Ｄｕｓｃｈ，Ｎ．，Ｅｇｇｅｌｉｎｇ，Ｌ．，Ｅｉｋｍａｎｎｓ，Ｂ．Ｊ．，Ｇａｉｇａｌａｔ，Ｌ．，Ｇｏｅｓｍａｎｎ，Ａ．，Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｍ．，Ｈｕｔｈｍａｃｈｅｒ，Ｋ．，Ｋｒａｍｅｒ，Ｒ．，Ｌｉｎｋｅ，Ｂ．，ＭｃＨａｒｄｙ，Ａ．Ｃ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｆ．，Ｍｏｃｋｅｌ，Ｂ．，Ｐｆｅｆｆｅｒｌｅ，Ｗ．，Ｐｕｈｌｅｒ，Ａ．，Ｒｅｙ，Ｄ．Ａ．，Ｒｕｃｋｅｒｔ，Ｃ，Ｒｕｐｐ，Ｏ．，Ｓａｈｍ，Ｈ．，Ｗｅｎｄｉｓｃｈ，Ｖ．Ｆ．，Ｗｉｅｇｒａｂｅ，Ｉ．，ａｎｄ  Ｔａｕｃｈ，Ａ．、「完全なコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ  １３０３２  ゲノム配列、及びＬ−アスパラギン酸由来アミノ酸及びビタミンの生産に及ぼすその影響（Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌ−ａｓｐａｒｔａｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｖｉｔａｍｉｎｓ）」、Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １０４（２００３）５−２５．
３４．Ｋａｎａｇａｓｕｎｄａｒａｍ  Ｖ，Ｓｃｏｐｅｓ  Ｒ．、「ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）からのグルコノラクトナーゼ（ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ）をコードする遺伝子の単離及び特性付け（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）」、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２９（１９９２）１９８−２００．
３５．Ｋｅｓａｒｗａｎｉ  Ｍ，Ａｚａｍ  Ｍ，Ｎａｔａｒａｊａｎ  Ｋ，Ｍｅｈｔａ  Ａ，Ｄａｔｔａ  Ａ．、「コリビア・ベルティペス（Ｃｏｌｌｙｂｉａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）からのシュウ酸脱炭素酵素。トランスジェニックタバコ及びトマトにおいて真菌感染抵抗性を付与するための分子クローニング及びその過剰発現（Ｏｘａｌａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｃｏｌｌｙｂｉａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｏ  ｃｏｎｆｅｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｆｕｎｇａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｔｏｂａｃｃｏ  ａｎｄ  ｔｏｍａｔｏ）」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５（２０００）７２３０−７２３８；訂正文：Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５（２０００）１５６００．
３６．Ｋｉｒｃｈｎｅｒ  Ｏ，Ｔａｕｃｈ  Ａ．、「アミノ酸生産性細菌コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）における遺伝子工学用ツール（Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０４（２００３）２８７−２９９．
３７．Ｋｏｔｒｂａ  Ｐ，Ｉｎｕｉ  Ｍ，Ｙｕｋａｗａ  Ｈ．、「コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒの酵素ＩＩ又は新規同定β−グルコシドリン酸転移酵素及び利用システムにおける単一のＶ３１７Ａ又はＶ３１７Ｍ置換は、その特異性をセロビオースに拡張する（Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  Ｖ３１７Ａ  ｏｒ  Ｖ３１７Ｍ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ＩＩ  ｏｒ  ｎｅｗｌｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  β−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  Ｒ  ｅｘｔｅｎｄｓ  ｉｔｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ）」、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４９（２００３）１５６９−１５８０．
３８．Ｋｒｅｕｔｚｅｒ  Ｃ，Ｈａｎｓ  Ｓ，Ｒｉｅｐｉｎｇ  Ｍ，Ｍｏｃｋｅｌ  Ｂ，Ｅｇｇｅｌｉｎｇ  Ｌ，Ｓａｈｍ  Ｈ，Ｐａｔｅｋ  Ｍ．、「Ｌ−リシン生産性コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）及びＬ−リシンの調製方法（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）」、米国特許出願公開第２００３／０１６２２６９号．
３９．Ｋｒｏｍｅｒ  ＪＯ，Ｓｏｒｇｅｎｆｒｅｉ  Ｏ，Ｋｌｏｐｐｒｏｇｇｅ  Ｋ，Ｈｅｉｎｚｌｅ  Ｅ，Ｗｉｔｔｍａｎｎ  Ｃ．、「トランスクリプトーム、メタボローム、及びフラックスオームを組み合わせた解析による、リシン生産性コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の徹底調査結果（Ｉｎ−ｄｅｐｔｈ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｌｙｓｉｎｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ，ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ，ａｎｄ  ｆｌｕｘｏｍｅ）」、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６（２００４）１７６９−１７８４．
４０．Ｋｒｏｎｅｍｅｙｅｒ  Ｗ，Ｐｅｅｋｈａｕｓ  Ｎ，Ｋｒａｍｅｒ  Ｒ，Ｓａｈｍ  Ｈ，Ｅｇｇｅｌｉｎｇ  Ｌ．、「コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）のグルタミン酸取り込みシステムをコードするｇｌｕＡＢＣＤクラスターの構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｌｕＡＢＣＤ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｕｐｔａｋｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）」、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７７（１９９５）１１５２−１１５８．
４１．Ｋｕｂｉｃｅｋ  ＣＰ，Ｓｃｈｒｅｆｅｒｌ  ＫＧ，Ｗｏｈｒｅｒ  Ｗ，Ｒｏｈｒ  Ｍ．、「アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）におけるシュウ酸生合成の細胞質経路についての証拠（Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  ｏｘａｌａｔｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）」、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５４（１９８８）６３３−６３７．
４２．Ｋｕｎｓｔ  Ｆ，Ｏｇａｓａｗａｒａ  Ｎ，Ｍｏｓｚｅｒ  Ｉ，Ａｌｂｅｒｔｉｎｉ  ＡＭ，Ａｌｌｏｎｉ  Ｇ，Ａｚｅｖｅｄｏ  Ｖ，Ｂｅｒｔｅｒｏ  ＭＧ，Ｂｅｓｓｉｅｒｅｓ  Ｐ，Ｂｏｌｏｔｉｎ  Ａ，Ｂｏｒｃｈｅｒｔ  Ｓ，Ｂｏｒｒｉｓｓ  Ｒ，Ｂｏｕｒｓｉｅｒ  Ｌ，Ｂｒａｎｓ  Ａ，Ｂｒａｕｎ  Ｍ，Ｂｒｉｇｎｅｌｌ  ＳＣ，Ｂｒｏｎ  Ｓ，Ｂｒｏｕｉｌｌｅｔ  Ｓ，Ｂｒｕｓｃｈｉ  ＣＶ，Ｃａｌｄｗｅｌｌ  Ｂ，Ｃａｐｕａｎｏ  Ｖ，Ｃａｒｔｅｒ  ＮＭ，Ｃｈｏｉ  ＳＫ，Ｃｏｄａｎｉ  ＪＪ，Ｃｏｎｎｅｒｔｏｎ  ＩＦ，Ｄａｎｃｈｉｎ  Ａら、「グラム陽性菌バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の完全なゲノム配列（Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）」．Ｎａｔｕｒｅ．３９０（１９９７）２４９−５６．
４３．Ｌｅｅ  ＨＷ，Ｐａｎ  ＪＧ，Ｌｅｂｅａｕｌｔ  ＪＭ．、「トレオニンによって制限されたコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の連続培養において、補助的炭素供給源としてのグルコナートをグルコースと共に使用することによって向上されたＬ−リシン生産（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｌ−Ｉｙｓｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ−ｌｉｍｉｔｅｄ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｇｌｕｃｏｎａｔｅ  ａｓ  ａ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｃａｒｂｏｎ  ｓｏｕｒｃｅ  ｗｉｔｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）」、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４９（１９９８）９−１５．
４４．Ｌｉｕ  ＳＴ，Ｌｅｅ  ＬＹ，Ｔａｉ  ＣＹ，Ｈｕｎｇ  ＣＨ，Ｃｈａｎｇ  ＹＳ，Ｗｏｌｆｒａｍ  ＪＨ，Ｒｏｇｅｒｓ  Ｒ，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ＡＨ．、「大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１における、グルコン酸生産及び向上されたリン酸塩鉱物可溶化に必要なエルビニア・ヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）遺伝子のクローニング：ヌクレオチド配列、及び補酵素ピロロキノリンキノンの生合成への関与の可能性（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａｎ  Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ  ｇｅｎｅ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ｇｌｕｃｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢｌＯｌ：ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｂａｂｌｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  ｐｙｒｒｏｌｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ  ｑｕｉｎｏｎｅ）」、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７４（１９９２）５８１４−５８１９．
４５．Ｍａｔｏｓ  ＭＶ，Ｃｏｅｌｌｏ  Ｎ．、「コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）非増殖細胞によるＬ−リシン生産（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｎｏｎ  ｇｒｏｗｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）」、Ａｃｔａ  Ｃｉｅｎｔ  Ｖｅｎｅｚ  ５０（１９９９）２３３−２３９．
４６．Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  Ｔ，Ｕｅｄａ  Ｔ，Ｋｕｓａｋａ  Ｉ．、「バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのＣａ２＋／Ｈ＋対向輸送体の精製及び特性付け（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａ２＋／Ｈ＋  ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）」、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５６（１９８６）９５−１００．
４７．Ｍｅｅｓｔｅｒｓ  ＰＡＥＰ，Ｈｕｉｊｂｅｒｔｓ  ＧＮＭ，Ｅｇｇｉｎｋ  Ｇ．、「グリセロールを炭素供給源として使用する脂質蓄積性酵母クリプトコッカス・クルバタス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）の高細胞密度培養（Ｈｉｇｈ  ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｐｉｄ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｇ  ｙｅａｓｔ  Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ  ｕｓｉｎｇ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ａｓ  ａ  ｃａｒｂｏｎ  ｓｏｕｒｃｅ）」、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４５（１９９６）５７５−５７９．
４８．Ｍｅｈｔａ  Ａ，Ｄａｔｔａ  Ａ．、「コリビア・ベルティペス（Ｃｏｌｌｙｂｉａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）からのシュウ酸脱炭素酵素。精製、特性付け、及びｃＤＮＡクローニング（Ｏｘａｌａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｃｏｌｌｙｂｉａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ）」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６６（１９９１）２３５４８−２３５５３．
４９．Ｍｏｓｔａｆａ  ＨＥ，Ｈｅｌｌｅｒ  ＫＪ，Ｇｅｉｓ  Ａ．、「大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ｌａｃＺ及びｌａｃＹ遺伝子のクローニング、並びにグルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）及びアセトバクター・リクエファシエンス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）におけるその発現（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ  ａｎｄ  ｌａｃＹ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ  ａｎｄ  Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）」、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６８（２００２）２６１９−２６２３．
５０．Ｏｅｄａ  Ｍ．、「κ−カゼインの結晶化。ＩＩ。κ−カゼイン−乳酸複合体の結晶（Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  κ−ｃａｓｅｉｎ．ＩＩ  Ｃｒｙｓｔａｌｓ  ｏｆ  κ−ｃａｓｅｉｎ−ｌａｃｔａｔｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ）」、Ｎｉｈｏｎ  Ｊｕｉ  Ｃｈｉｋｕｓａｎ  Ｄａｉｇａｋｕ  Ｋｉｙｏ  ２７（１９７８）１７５−１７７．
５１．Ｏｈｎｉｓｈｉ  Ｊ，Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ  Ｓ，Ｈａｙａｓｈｉ  Ｍ，Ａｎｄｏ  Ｓ，Ｙｏｋｏｉ  Ｈ，Ｏｃｈｉａｉ  Ｋ，Ｉｋｅｄａ  Ｍ．、「新規Ｌ−リシン生産性変異体を生成するためにコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ゲノム情報を使用する新規方法（Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｇｅｎｏｍｅ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ａ  ｎｅｗ  Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｍｕｔａｎｔ）」、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５８（２００２）２１７−２２３．
５２．Ｐａｎｄｅｙ  Ａ，Ｎｉｇａｍ  Ｐ，Ｓｏｃｃｏｌ  ＣＲ，Ｓｏｃｃｏｌ  ＶＴ，Ｓｉｎｇｈ  Ｄ，Ｍｏｈａｎ  Ｒ．、「微生物アミラーゼの進歩（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｍｙｌａｓｅｓ）」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１（２０００）１３５−１５２．
５３．Ｐａｔｅｋ  Ｍ，Ｂｉｌｉｃ  Ｍ，Ｋｒｕｍｂａｃｈ  Ｋ，Ｅｉｋｍａｎｎｓ  Ｂ，Ｓａｈｍ  Ｈ，Ｅｇｇｅｌｉｎｇ  Ｌ．、「Ｌ−リシン合成に関与する２つの酵素をコードするコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）のｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ＯＲＦ４オペロンの同定及び転写解析（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄａｐＢ−ＯＲＦ２−ｄａｐＡ−ＯＲＦ４  ｏｐｅｒｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｗｏ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９（１９９７）１１１３−１１１７．
５４．Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  Ｈ，Ｈｊｏｒｔ  Ｃ，Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｊ．、「アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）におけるオキサロ酢酸加水分解酵素をコードする遺伝子ｏａｈのクローニング及び特性付け（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏａｈ，ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｉｎ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）」、ＭｏＩ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．２６３（２０００）２８１−２８６．
５５．Ｐｏｐｋｉｎ  ＰＳ，Ｍａａｓ  ＷＫ．、「リシン輸送及びリシンデカルボキシラーゼに影響を及ぼす大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）調節性変異（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｌｙｓｉｎｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｌｙｓｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）」、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １４１（１９８０）４８５−４９２．
５６．Ｐｒａｓａｄ  ＧＳ，Ｖｉｊａｙａｎ  Ｍ．、「アミノ酸及びペプチドが関与する結晶質複合体に関するＸ線研究。ＸＸＩＩ。コハク酸とＤＬ−及びＬ−リシンとの複合体のイオン化状態、配座、及び分子凝集の可変性（Ｘ−ｒａｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＸＸＩＩ．Ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ，ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｗｉｔｈ  ＤＬ−ａｎｄ  Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）」、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｂ４７（１９９１）９２７−９３５．
５７．Ｐｒｅｓｅｃａｎ  ＳＥ，Ｇａｌｉｎｉｅｒ  Ａ，Ｌｏｎｇｉｎ  Ｒ，Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ  Ｊ，Ｄａｎｃｈｉｎ  Ａ，Ｇｌａｓｅｒ  Ｐ，Ｍａｒｔｉｎ−Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ  Ｉ．、「バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における炭素流動経路の一部分としてのｐｔａ遺伝子のカタボライト調節（Ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｔａ  ｇｅｎｅ  ａｓ  ｐａｒｔ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｎ  ｆｌｏｗ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）」、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８１（１９９９）６８８９−６８９７．
５８．Ｐｒｏｎｋ  ＪＴ，Ｌｅｖｅｒｉｎｇ  ＰＲ，Ｏｌｉｊｖｅ  Ｗ，Ｖａｎ  Ｄｉｊｋｅｎ  ＪＰ．、「グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）によるグルコン酸生産におけるＮＡＤＰ依存性キノプロテイングルコースデヒドロゲナーゼの役割（Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＮＡＤＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  ｑｕｉｎｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ  ｉｎ  ｇｌｕｃｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）」、Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１（１９８９）１６０−１６４．
５９．Ｐｕｎｔ  ＰＪ，Ｏｌｉｖｅｒ  ＲＰ，Ｄｉｎｇｅｍａｎｓｅ  ＭＡ，Ｐｏｕｗｅｌｓ  ＰＨ，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ  ＣＡ．、「大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）からのハイグロマイシンＢ耐性マーカーに基づくアスペルギルスの形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）」、Ｇｅｎｅ  ５６（１９８７）１１７−１２４．
６０．Ｒａｔｌｅｄｇｅ  Ｃ．、「脂肪酸生産微生物における脂質蓄積の調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ  ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ３０（２００２）１０４７−１０５０．
６１．Ｒｅｎｎｏ  ＤＶ，Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｇ，Ｂｕｌｌ  ＡＴ，Ｈｏｌｔ  Ｇ．、「発酵槽中でのペニシリウム・クリゾゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）形質転換体の遺伝的安定性（Ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ  ｉｎ  ａ  ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ）」、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３４（１９９０）３６４−３６７．
６２．Ｒｅｖｅｌｌｅｓ  Ｏ，Ｅｓｐｉｎｏｓａ−Ｕｒｇｅｌ  Ｍ，Ｍｏｌｉｎ  Ｓ，Ｒａｍｏｓ  ＪＬ．、「リシンカタボリズムに関与するシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）のｄａｖＤＴオペロンは、経路中間体のδ−アミノ吉草酸に応答して誘導される（Ｔｈｅ  ｄａｖＤＴ  Ｏｐｅｒｏｎ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ，Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｌｙｓｉｎｅ  ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ，ｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ｛ｄｅｌｔａ｝−ａｍｉｎｏｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）」、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８６（２００４）３４３９−３４４６．
６３．Ｒｕｉｊｔｅｒ  ＧＪＧ，Ｐａｎｎｅｍａｎ  Ｈ，Ｖｉｓｓｅｒ  Ｊ．、「クエン酸生産性アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）におけるホスホフルクトキナーゼ及びピルビン酸キナーゼの過剰発現（Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏ−ｆｒｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎ  ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）」、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３３４（１９９７）３１７−３２６．
６４．Ｒｕｉｊｔｅｒ  ＧＪＧ，ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｏｎｄｅｒｖｏｏｒｔ  ＰＪ，Ｖｉｓｓｅｒ  Ｊ．、「アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）によるシュウ酸生産：シュウ酸非生産性変異体は、マンガンの存在下、ｐＨ５でクエン酸を生産する（Ｏｘａｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ：ａｎ  ｏｘａｌａｔｅ−ｎｏｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｍｕｔａｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ  ａｔ  ｐＨ  ５  ａｎｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍａｎｇａｎｅｓｅ）」、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４５（１９９９）２５６９−２５７６．
６５．Ｒｕｉｊｔｅｒ  ＧＪＧ，Ｐａｎｎｅｍａｎ  Ｈ，Ｘｕ  Ｄ−Ｂ，Ｖｉｓｓｅｒ  Ｊ．、「アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）クエン酸シンターゼの特性、及びｃｉｔＡ過剰発現のクエン酸生産に及ぼす効果（Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｉｔＡ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）」、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １８４（２０００）３５−４０．
６６．Ｓａｌｕｎｋｅ  ＤＭ，Ｖｉｊａｙａｎ  Ｍ．、「アミノ酸−ビタミン複合体であるリシンパントテン酸塩の結晶構造（Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ−ｖｉｔａｍｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｌｙｓｉｎｅ  ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ）」、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  ７９８（１９８４）１７５−１７９．
６７．Ｓａｒａｓｗａｔｈｉ  ＮＴ，Ｓｉｄｄｈａｒｔｈａ  Ｒ，Ｖｉｊａｙａｎ  Ｍ．、「アミノ酸及びペプチドが関与する結晶質複合体に関するＸ線研究。ＸＬＩ。Ｌ−アルギニン及びＤＬ−リシンのピメリン酸複合体の結晶構造によって明らかにされた凝集及び配座の共有性（Ｘ−ｒａｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＸＬＩ．Ｃｏｍｍｏｎａｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｉｍｅｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ  ａｎｄ  ＤＬ−ｌｙｓｉｎｅ）」、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｂ５９（２００３）６４１−６４６．
６８．Ｓｈｉｒａｔｓｕｃｈｉ  Ｍ，Ｋｕｒｏｎｕｍａ  Ｈ，Ｋａｗａｈａｒａ  Ｙ，Ｙｏｓｈｉｈａｒａ  Ｙ，Ｍｉｗａ  Ｈ，Ｎａｋａｍｏｒｉ  Ｓ．、「ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）株を使用するＬ−リシン及びＬ−グルタミン酸の同時高発酵生産（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ  ａｎｄ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）」、Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ｂｉｏｃｈｅｍ  ５９（１９９５）８３−８６．
６９．Ｔａｕｃｈ  Ａ，Ｐｕｈｌｅｒ  Ａ，Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉ  Ｊ，Ｔｈｉｅｒｂａｃｈ  Ｇ．、「コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）におけるプラスミド、及び比較ゲノミクスによるその分子的分類（Ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ）」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０４（２００３）２７−４０．
７０．Ｔｈｅｉｌｇａａｒｄ  Ｈ，ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  Ｍ，Ｍｕｌｄｅｒ  Ｃ，Ｂｏｖｅｎｂｅｒｇ  Ｒ，Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｊ．、「ペニシリン生合成遺伝子を過剰発現するペニシリウム・クリゾゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）Ｗｉｓ５４−１２５５形質転換体の定量分析（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ  Ｗｉｓ５４−１２５５  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅｓ）」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ７２（２００１）３７９−３８８．
７１．Ｖａｎ  ｄｅ  Ｒｈｅｅ  ＭＤ，Ｍｅｎｄｅｓ  Ｏ，Ｗｅｒｔｅｎ  ＭＷ，Ｈｕｉｚｉｎｇ  ＨＪ，Ｍｏｏｉｂｒｏｅｋ  Ｈ．、「マッシュルームであるツクリタケ（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ）におけるタンデムなエクソ−β−１，３−グルカナーゼ遺伝子を介した高効率な相同組込み（Ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｔａｎｄｅｍ  ｅｘｏ−ｂｅｔａ−１，３−ｇｌｕｃａｎａｓｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｕｓｈｒｏｏｍ，Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ）」、Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．３０（１９９６）１６６−１７３
７２．Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｒｅｓｔ  ＭＥ，Ｌａｎｇｅ  Ｃ，Ｍｏｌｅｎａａｒ  Ｄ．、「電気穿孔後の熱ショックによって、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）と異種プラスミドＤＮＡとの高効率な形質転換が誘導される（Ａ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｗｉｔｈ  ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ）」、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５２（１９９９）５４１−５４５．
７３．Ｖａｎ  Ｇｕｌｉｋ  ＷＭ，ｄｅ  Ｌａａｔ  ＷＴ，Ｖｉｎｋｅ  ＪＬ，Ｈｅｉｊｎｅｎ  ＪＪ．、「ペニシリンＧの生合成の代謝ボトルネックを特定するための代謝フラックス解析の適用（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｆｌｕｘ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｂｏｔｔｌｅｎｅｃｋｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  Ｇ）」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ２０（２０００）６０２−６１８．
７４．Ｖｅｎｋａｔｒａｍａｎ  Ｊ，Ｐｒａｂｕ  ＭＭ，Ｖｉｊａｙａｎ  Ｍ．、「アミノ酸及びペプチドが関与する結晶質複合体に関するＸ線研究。ＸＸＸＩＩ。シュウ酸とＤＬ−及びＬ−リシンとの複合体におけるイオン化状態、化学量論、及び凝集に及ぼすキラリティーの効果（Ｘ−ｒａｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＸＸＸＩＩ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｈｉｒａｌｉｔｙ  ｏｎ  ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ，ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ｏｘａｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｗｉｔｈ  ＤＬ−ａｎｄ  Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ．）」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０（１９９７）７７−８７．
７５．Ｖｅｒｍａ  Ｖ，Ｑａｚｉ  ＧＮ，Ｐａｒｓｈａｄ  Ｒ，Ｃｈｏｐｒａ  ＣＬ．、「２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸生産性細菌及び２−ケト−Ｌ−グロン酸生産性細菌におけるスフェロプラストの高速形成手順（Ａ  ｆａｓｔ  ｓｐｈｅｒｏｐｌａｓｔ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｉｎ  ｓｏｍｅ  ２，５−ｄｉｋｅｔｏ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｔｅ−ａｎｄ  ２−ｋｅｔｏ−Ｌ−ｇｕｌｏｎａｔｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ）」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７（１９８９）４４９−４５２．
７６．Ｖｅｒｍａ  Ｖ，Ｑａｚｉ  ＧＮ，Ｐａｒｓｈａｄ  Ｒ．、「グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）とコリネバクテリウム種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）との属間プロトプラスト融合（Ｉｎｔｅｒｇｅｎｅｒｉｃ  ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ  ｆｕｓｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ  ａｎｄ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）」、Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２６（１９９２）３２７−３３０．
７７．Ｗｉｊａｙａｒａｔｈｎａ  ＣＤ，Ｗａｃｈｉ  Ｍ，Ｎａｇａｉ  Ｋ．、「コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）からのペプチドグリカン合成に関与するｆｔｓＩ及びｍｕｒＥ遺伝子の単離（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｔｓｌ  ａｎｄ  ｍｕｒＥ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ．）」、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５５（２００１）４６６−４７０．
７８．Ｙａｎａｓｅ  Ｈ，Ｍｏｒｉ  Ｎ，Ｍａｓｕｄａ  Ｍ，Ｋｉｔａ  Ｋ，Ｓｈｉｍａｏ  Ｍ，ｋａｔｏ  Ｎ．「アルカリ性培地中、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）ａ−１２によるグルコナートからのピルバート生産（Ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ  ａ−１２  ｆｒｏｍ  ｇｌｕｃｏｎａｔｅ  ｉｎ  ａｎ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｍｅｄｉｕｍ）」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７３（１９９２）２８７−２９１．
付録１
縮重又は特異的ＰＣＲプライマーの設計及びその後の遺伝子単離に使用される、ＮＣＢＩウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚのゲノム情報
１ａ：Ｇ．オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）リシントランスポーター（ｌｙｓ１）遺伝子を単離するのに使用された配列
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／の適用可能な（完全）ゲノム配列をベースとして設計された縮重ＰＣＲプライマーを使用して、遺伝子を単離した：スタフィロコッカス・アウレウスの亜種アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ）Ｎ３１５、ｇｉ２９１６５６１５、ＮＣ＿００２７４５．２；メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）ＭＡＦＦ３０３０９９、ｇｉ１３４７０３２４、ＮＣ＿００２６７８．１；ラクトコッカス・ラクチスの亜種ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）ＩＩ１４０３、ｇｉ１５６７１９８２、ＮＣ＿００２６６２．１；大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２、ｇｉ１６１２７９９、ＮＣ＿０００９１３．１；ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）１３株、ｇｉ１８３０８９８２、ＮＣ＿００３３６６．１；ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）ＮＣＴＣ  １３１２９、ｇｉ３８２３２６４２、ＮＣ＿００２９３５．２；クロストリジウム・アセトブチリクム菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ  ８２４  ｇｉ１５８９３２９８、ＮＣ＿００３０３０．１；大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７、ｇｉ１５８２９２５４、ＮＣ＿００２６９５．１；アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｃ５８株、ｇｉ１５８９００８９、ＮＣ＿００３０６３．１；アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｃ５８株、ｇｉ１５８８７３５９、ＮＣ＿００３０６２．１；シノリゾビウム・メリロッティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）１０２１、ｇｉ１５９６３７５３、ＮＣ＿００３０４７．１；ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＷＣＦＳ１、ｇｉ２８３７６９７４、ＮＣ＿００４５６７．１；シノリゾビウム・メリロッティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）１０２１  プラスミドｐＳｙｍＢ、ｇｉ１６２６３７４８、ＮＣ＿００３０７８．１；シノリゾビウム・メリロッティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）１０２１  プラスミドｐＳｙｍＡ、ｇｉ１６２６２４５３、ＮＣ＿００３０３７．１；コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ  １３０３２、ｇｉ２３３０８７６５、ＮＣ＿００３４５０．２；セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ  １４５７９、ｇｉ３００１８２７８、ＮＣ＿００４７２２．１；肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｒ６、ｇｉ１５９０２０４４、ＮＣ＿００３０９８．１；バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ｇｉ１６０７７０６８、ＮＣ＿０００９６４．１；緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡ０１、ｇｉ１５５９５１９８、ＮＣ＿００２５１６．１。
Ｉｂ：グルコノラクトナーゼ（ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ）遺伝子をＧ．オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）から単離するのに使用された配列
ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）（Ｋａｎａｇａｓｕｎｄａｒａｍ  ａｎｄ  Ｓｃｏｐｅｓ、１９９２）及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／の他の適用可能な（完全）ゲノム配列をベースとして設計された縮重ＰＣＲプライマーを使用して、遺伝子を単離した：メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）ＭＡＦＦ３０３０９９（ｇｉ１３４７０３２４、ＮＣ＿００２６７８．１）、ピレルラ種（Ｐｉｒｅｌｌｕｌａ  ｓｐ．）１（ｇｉ３２４７０６６６、ＮＣ＿００５０２７．１）、ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）ＵＳＤＡ  １１０（ｇｉ２７３７５１１１、ＮＣ＿００４４６３．１）、マルタ熱菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）１６Ｍ  染色体Ｉ（ｇｉ１７９８６２８４、ＮＣ＿００３３１７．１）、ラルストニア・ソラナセアルム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）ＧＭＩ１０００  プラスミドｐＧＭＩ１０００ＭＰ（ｇｉ１７５４８２２１、ＮＣ＿００３２９６．１、サーモプラズマ・ボルカニウム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ）ＧＳＳｌ（ｇｉ１３５４０８３１、ＮＣ＿００２６８９．２）、デイノコッカス・ラジオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）Ｒ１  第１染色体（ｇｉ１５８０５０４２、ＮＣ＿００１２６３．１）、ピアス病菌（Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ）９ａ５ｃ（ｇｉ１５８３６６０５、ＮＣ＿００２４８８．１）、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｃ５８株（ｇｉ１７９３６７１１、ＮＣ＿００３３０５．１）、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｃ５８株（ｇｉ１５８９００８９、ＮＣ＿００３０６３．１）、ストレプトミセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）（ｇｉ３２１４１０９５、ＮＣ＿００３８８８．３）、シノリゾビウム・メリロッティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）１０２１  プラスミドｐＳｙｍＢ（ｇｉ１６２６３７４８、ＮＣ＿００３０７８．１）、シノリゾビウム・メリロッティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）１０２１  プラスミドｐＳｙｍＡ（ｇｉ１６２６２４５３、ＮＣ＿００３０３７．１）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）ＣＧＡ００９（ｇｉ３９９３３０８０、ＮＣ＿００５２９６．１）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）ＲＢ５０（ｇｉ３３５９８９９３、ＮＣ＿００２９２７．３）、トマト斑葉細菌病菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ）ＤＣ３０００株（ｇｉ２８８６７２４３、ＮＣ＿００４５７８．１）、ピアス病菌テメキュラ（Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ  Ｔｅｍｅｃｕｌａ）１（ｇｉ２８１９７９４５、ＮＣ＿００４５５６．１）、ブタ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ）１３３０  染色体ＩＩ（ｇｉ２３４９９７６７、ＮＣ＿００４３１１．１）、かんきつ潰瘍病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ  ｐｖ．ｃｉｔｒｉ）３０６株（ｇｉ２１２４０７７４、ＮＣ＿００３９１９．１）、アブラナ科野菜黒腐病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）ＡＴＣＣ  ３３９１３株（ｇｉ２１２２９４７８、ＮＣ＿００３９０２．１）、カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）ＣＢ１５（ｇｉ１６１２４２５６、ＮＣ＿００２６９６．２）。
１ｃ：グルコン酸キナーゼ遺伝子をＧ．オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）から単離するのに使用された配列
グルコン酸キナーゼ遺伝子をＧ．オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）から単離するのに使用された配列を、Ｆｕｊｉｔａ及びＦｕｊｉｔａ、１９８７；Ｙａｎａｓｅら、１９９２；Ｉｚｕら、１９９４；Ｉｓｔｕｒｉｚ  Ｔ，Ｃｅｌａｙａ  Ｊ．，１９９７からのＤＮＡ配列情報、及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／の他の適用可能な（完全）ゲノム配列を使用して得た：スタフィロコッカス・アウレウスの亜種アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ）Ｎ３１５（ｇｉ２９１６５６１５、ＮＣ＿００２７４５．２）；炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）Ａｍｅｓ  ０５８１株（ｇｉ４７５２５２５４、ＮＣ＿００７５３０．１）；メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）ＭＡＦＦ３０３０９９（ｇｉ１３４７０３２４、ＮＣ＿００２６７８．１）；大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ｇｉ１６１２７９９４、ＮＣ＿０００９１３．１）；フォトラブダス・ルミネセンスの亜種ラウモンディ（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｕｍｏｎｄｉｉ）ＴＴＯ１（ｇｉ３７５２４０３２、ＮＣ＿００５１２６．１）；ウシ型結核菌の亜種ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｂｏｖｉｓ）ＡＦ２１２２／９７（ｇｉ３１７９１１７７、ＮＣ＿００２９４５．３）；ネンジュモ種（Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．）ＰＣＣ  ７１２０（ｇｉ１７２２７４９７、ＮＣ＿００３２７２．１）；ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ｂｉｏｖａｒ  Ｍｅｄｉｅｖａｌｉｓ）９１００１株（ｇｉ４５４３９８６５、ＮＣ＿００５８１０．１）；ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）ＵＳＤＡ  １１０（ｇｉ２７３７５１１１、ＮＣ＿００４４６３．１）；ラルストニア・ソラナセアルム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）ＧＭＩ１０００（ｇｉ１７５４４７１９、ＮＣ＿００３２９５．１）；デイノコッカス・ラジオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）Ｒ１  第１染色体（ｇｉ１５８０５０４２、ＮＣ＿００１２６３．１）；チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉ）ＣＴ１８株（ｇｉ１６７５８９９３、ＮＣ  ００３１９８．１）；スタフィロコッカス・アウレウスの亜種アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ）Ｍｕ５０（ｇｉ１５９２２９９０、ＮＣ＿００２７５８．１）；髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＭＣ５８（ｇｉ１５６７５９４８、ＮＣ＿００３１１２．１）；ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）ＮＣＴＣ  １３１２９（ｇｉ３８２３２６４２、ＮＣ＿００２９３５．２）；ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＮＣＣ２７０５（ｇｉ２３４６４６２８、ＮＣ＿００４３０７．１）；大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７（ｇｉｌ５８２９２５４、ＮＣ＿���０２６９５．１）；グロエオバクター・ビオラセウス（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｏｌａｃｅｕｓ）ＰＣＣ  ７４２１（ｇｉ３７５１９５６９、ＮＣ＿００５１２５．１）；アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｃ５８株（ｇｉ１７９３３９２５、ＮＣ＿００３３０４．１）；アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｃ５８株（ｇｉｌ５８８７３５９、ＮＣ＿００３０６２．１）；ストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）ＭＡ−４６８０（ｇｉ２９８２６５４０、ＮＣ＿００３１５５．２）；ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＷＣＦＳｌ（ｇｉ２８３７６９７４、ＮＣ＿００４５６７．１）；ストレプトミセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）（ｇｉ３２１４１０９５、ＮＣ＿００３８８８．３）；シノリゾビウム・メリロッティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）１０２１  プラスミドｐＳｙｍＢ（ｇｉ１６２６３７４８、ＮＣ＿００３０７８．１）；ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）ＣＧＡ００９（ｇｉ３９９３３０８０、ＮＣ＿００５２９６．１）；ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＬＴ２（ｇｉ１６７６３３９０、ＮＣ＿００３１９７．１）；ビブリオ・ブルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）ＹＪ０１６  染色体Ｉ（ｇｉ３７６７８１８４、ＮＣ＿００５１３９．１）；ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＮＣＣ  ５３３（ｇｉ４２５１８０８４、ＮＣ＿００５３６２．１）；オーシャノバチルス・イヘエンシス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ）ＨＴＥ８３１（ｇｉ２３０９７４５５、ＮＣ＿００４１９３．１）；クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）ＡＴＣＣ  １２４７２（ｇｉ３４４９５４５５、ＮＣ＿００５０８５．１）；シゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）２ａ  ２４５７Ｔ株（ｇｉ３００６１５７１、ＮＣ＿００４７４１．１）；セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ  １４５７９（ｇｉ３００１８２７８、ＮＣ＿００４７２２．１）；チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２（ｇｉ２９１４０５４３、ＮＣ＿００４６３１．１）；トマト斑葉細菌病菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ）ＤＣ３０００株（ｇｉ２８８６７２４３、ＮＣ＿００４５７８．１）；表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）ＡＴＣＣ  １２２２８（ｇｉ２７４６６９１８、ＮＣ＿００４４６１．１）；ビブリオ・ブルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）ＣＭＣＰ６  染色体Ｉ（ｇｉ２７３６３４９０、ＮＣ＿００４４５９．１）；大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）���ＦＴ０７３（ｇｉ２６２４５９１７、ＮＣ＿００４４３１．１）；シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０（ｇｉ２６９８６７４５、ＮＣ＿００２９４７．３）；シゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）２ａ  ３０１株（ｇｉ２４１１１４５０、ＮＣ＿００４３３７．１）；エルシニア・ぺスチス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）ＣＯ９２株（ｇｉ１６１２０３５３、ＮＣ＿００３１４３．１）；髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ａ  Ｚ２４９１株（ｇｉ１５７９３０３４、ＮＣ＿００３１１６．１）；エルシニア・ぺスチス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）ＫＩＭ（ｇｉ２２１２３９２２、ＮＣ＿００４０８８．１）；かんきつ潰瘍病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ  ｐｖ．ｃｉｔｒｉ）３０６株（ｇｉ２１２４０７７４、ＮＣ＿００３９１９．１）；アブラナ科野菜黒腐病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）ＡＴＣＣ  ３３９１３株（ｇｉ２１２２９４７８、ＮＣ＿００３９０２．１）；大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７  ＥＤＬ９３３（ｇｉｌ６４４５２２３、ＮＣ＿００２６５５．２）；緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡ０１（ｇｉｌ５５９５１９８、ＮＣ＿００２５１６．１）；エルトール型Ｏ１コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  Ｏ１  ｂｉｏｖａｒ  ｅｌｔｏｒ）  Ｎ１６９６１株  染色体Ｉ（ｇｉｌ５６４００３２、ＮＣ＿００２５０５．１）；腸炎ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＲＩＭＤ  ２２１０６３３  染色体Ｉ（ｇｉ２８８９６７７４、ＮＣ＿００４６０３．１）；コリネ菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）ＹＳ−３１４（ｇｉ２５０２６５５６、ＮＣ＿００４３６９．１）；スタフィロコッカス・アウレウスの亜種アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ）ＭＷ２（ｇｉ２１２８１７２９、ＮＣ＿００３９２３．１）；シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）染色体Ｉ（ｇｉ１９１１３６７４、ＮＣ＿００３４２４．１）；シノラブディス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）染色体Ｖ（ｇｉ３２９６７５８４、ＮＣ＿００３２８３．３）；シノラブディス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）染色体ＩＩ（ｇｉ２５１６８２５４、ＮＣ  ００３２８０．２）．
１ｄ：シュウ酸生合成、分解（ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）、及び搬出（ｅｘｐｏｒｔ）に関与するＰ．クリゾゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）及びＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）の遺伝子を単離するのに使用された配列
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／の適用可能な（完全）ゲノム配列：ストレプトミセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）、ｇｉ３２１４１０９５、ＮＣ＿００３８８８．３；シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）第１染色体  、ｇｉ４２５９２２６０、ＮＣ＿００３０７０．５；髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ａ  Ｚ２４９１株、ｇｉ１５７９３０３４、ＮＣ＿００３１１６．１；ｍｇａｐ００７ｘＥ１４ｆ．ｂ  イネいもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）Ａｐ  Ｕｎｉ−Ｚａｐ  ＸＲ  Ｌｉｂｒａｒｙ  イネいもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）ｃＤＮＡクローン；シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）第１染色体、ｇｉｌ２０６３４２０、ｇｂＡＥ００５１７２．１；エノキタケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）シュウ酸脱炭素酵素（ＯＸＤＣ）遺伝子、ｇｉ６４６８００５、ｇｂＡＦ２００６８３．１；シュウ酸酸化酵素（ｏｘａｌａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）（ＨｖＯｘＯａ）用のＡＦ２００６８３  オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）ｍＲＮＡ、ｇｉ２２６６６６７、ｅｍｂ、Ｙ１４２０３．１；シュウ酸酸化酵素（ｏｘａｌａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）様タンパク質用のＨＶＹ１４２０３［２２６６６６７］Ｈ．ブルガレ（Ｈ．ｖｕｌｇａｒｅ）ｍＲＮＡ、ｇｉ１０７０３５７、ｅｍｂ、Ｘ９３１７１．１；シュウ酸脱炭素酵素アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｃ５８株  染色体：線状遺伝子ＩＤ：１１３６６４５；シュウ酸脱炭素酵素セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ  １４５７９、遺伝子ＩＤ：１２０４７３２；シュウ酸脱炭素酵素ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）ＵＳＤＡ  １１０、遺伝子ＩＤ：１０４９６０７；シュウ酸脱炭素酵素セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ  １４５７９、遺伝子ＩＤ：１２０３３８０；溶質キャリア２６ファミリー（硫酸トランスポーター）、メンバー１、ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）；硫酸アニオントランスポーター−第１染色体：５；位置：５Ｆ  遺伝子ＩＤ：２３１５８３；α−１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体ホモサピエンス。
付録２
公開された市販のアミノ酸と有機酸との複合体
【表３】
2008511318.tif 000004
表３：文献から検索された塩基性アミノ酸−カルボン酸複合体の例
ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｕｙｅｒｓｇｕｉｄｅｃｈｅｍ．ｉｎｆｏ／ＡｎａｍｅＥｉｎ．ｐｈｐ（化学品及び化学品供給業者のディレクトリ）に、市販の有機塩の例として、アルギニン・酢酸、リシン・酢酸、オルニチン・酢酸、リシン・コハク酸、アルギニン・α−ケトグルタル酸、オルニチン・α−ケトグルタル酸、アルギニン・アスパラギン酸、アルギニン・グルタミン酸、リシン・グルタミン酸、オルニチン・アスパラギン酸がある。
【国際調査報告】
2008511318.tif 000005
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2008511318.tif 000007
2008511318.tif 000008