(57)【要約】【解決課題】Ｘａｎｉｆｏｌｉａ−Ｙまたは−Ｙ３、−Ｙ１、−Ｙ２、−Ｙ８、−Ｙ９、および−Ｙ１０と指定する化合物などの新規の化合物、及びその抗癌活性に関わる。【解決手段】これらの化合物は、ムクロジ科の植物（ブンカンカなど）または他の天然供給源もしくは天然産物から得ることができる。本発明の化合物を、化学合成することもできる。【選択図】図１
2008513360.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（５）：
【化１】
2008513360.tif 000046
（式中、Ｒ１は、Ｈ、アセチル基、チグロイル基、セネシオイル基、２〜５個の炭素を含む酸、糖部分、またはラムノースを含み、ここで、前記糖部分またはラムノースは、アンゲロイル基、アセチル基、チグロイル基、セネシオイル基、および２〜５個の炭素を含む酸からなる群から選択される少なくとも２つの基を含み、Ｒ2は、Ｈ、アセチル基、チグロイル基、セネシオイル基、２〜５個の炭素を含む酸、糖部分、またはラムノースを含み、ここで、前記糖部分またはラムノースは、アンゲロイル基、アセチル基、チグロイル基、セネシオイル基、および２〜５個の炭素を含む酸からなる群から選択される少なくとも２つの基を含み、Ｒ4は、ＣＨ2ＯＲ6またはＣＯＯＲ6を含み、Ｒ6は、Ｈ、アンゲロイル基、アセチル基、チグロイル基、セネシオイル基、または２〜５個の炭素を含む酸であり、ここで、化合物の炭素２３位、２４位、２５位、２６位、２９位、３０位は、独立して、ＣＨ3、ＣＨ2ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、アルキル基、アセチル基を含み、Ｒ5は、Ｈまたは糖部分を含み、ここで、前記糖部分は、グルコース、ガラクトース、ラムノース、アラビノース、キシロース、アルズロン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸、またはこれらの誘導体もしくは組み合わせを含む）
を有する化合物、またはその塩、エステル、代謝産物。
【請求項２】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ6のうちの１つは、アンゲロイル基または５個の炭素を有する酸を含み、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ6の残りの２つのうちの少なくとも１つは、アンゲロイル基、アセチル基、チグロイル基、セネシオイル基、または２〜５個の炭素を含む酸を含むか、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ6のうちの少なくとも１つは、糖部分またはラムノースを含み、ここで、前記糖部分またはラムノースは、アンゲロイル基、アセチル基、チグロイル基、セネシオイル基、および２〜５個の炭素を含む酸からなる群から選択される少なくとも２つの基を含むか、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ6のうちの少なくとも２は、アンゲロイル基または５個の炭素を有する酸を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
以下の式（１）：
【化２】
2008513360.tif 000047
（式中、Ｒ1はアンゲロイル基を含み、Ｒ2はアンゲロイル基を含み、Ｒ3は、ＯＨまたはＨを含み、Ｒ4は、ＣＨ3またはＣＨ2ＯＨを含み、Ｒ7はＨを含み、Ｒ5はグルコースまたはガラクトースを含み、Ｒ6はアラビノースを含む）
有する化合物、またはその塩、エステル、
（２）：
【化３】
2008513360.tif 000048
（式中、Ｒ1はアンゲロイル基を含み、Ｒ2はアンゲロイル基を含み、Ｒ3は、ＡｃまたはＨを含み、Ｒ4は、ＡｃまたはＨを含み、Ｒ5は、ＣＨ3またはＣＨ2ＯＨを含む）
有する化合物、またはその塩、エステル、
（３）：
【化４】
2008513360.tif 000049
（式中、Ｒ1はアンゲロイル基を含み、Ｒ2はアンゲロイル基を含み、Ｒ3は、ＯＨまたはＨを含み、Ｒ4は、ＣＨ3またはＣＨ2ＯＨを含み、Ｒ6は、ＡｃまたはＨを含み、Ｒ５は糖部分を含み、ここで、前記糖部分は、少なくとも１つの糖（すなわち、グルコース、ガラクトース、ラムノース、アラビノース、キシロース、アルズロン酸、グルクロン酸、またはガラクツロン酸）またはこれらの誘導体もしくは組み合わせを含む）
有する化合物、またはその塩、エステル、
または（４）：
【化５】
2008513360.tif 000050
（式中、
2008513360.tif 000051
Ｓ１〜Ｓ４は、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、またはＳ４を示し、Ｒ1はアンゲロイル基を含み、Ｒ2はアンゲロイル基を含み、Ｒ3は、ＡｃまたはＨを含み、Ｒ4は、ＨまたはＯＨを含み、Ｒ6は、ＡｃまたはＨを含み、Ｒ7は、ＣＨ3またはＣＨ2ＯＨを含み、Ｒ5は糖部分を含み、ここで、前記糖部分は、少なくとも１つの糖（すなわち、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ラムノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、アルズロン酸、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−ガラクツロン酸）またはこれらの誘導体もしくは組み合わせを含む）
有する化合物、またはその塩、エステル。
【請求項４】
以下の構造：
（ａ）
【化７】
2008513360.tif 000052
（式中、Ｒ1はアンゲロイル基を含み、Ｒ2はアンゲロイル基を含むか、Ｒ1およびＲ2は、アンゲロイル基、アセチル基、チグロイル基、セネシオイル基、または２〜５個の炭素を含む酸を含み、前記構造は糖部分を含み、ここで、前記糖部分は、少なくとも１つの糖（すなわち、グルコース、ガラクトース、ラムノース、アラビノース、キシロース、アルズロン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸）またはこれらの誘導体もしくは組み合わせを含むか、前記構造は、糖部分の生物機能を果たすことができる化合物、
（ｂ）
【化８】
2008513360.tif 000053
または
【化９】
2008513360.tif 000054
（式中、Ｒ1はアンゲロイル基を含み、Ｒ2はアンゲロイル基を含む）、
または
（ｃ）
【化１０】
2008513360.tif 000055
（式中、Ｒ1はアンゲロイル基を含み、Ｒ2はアンゲロイル基を含む）を含む）
を有する、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
以下の構造：
（ａ）構造（Ｙ３）：
【化１１】
2008513360.tif 000056
（すなわち、化学名：３−Ｏ−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−α−Ｌ−アラビノフラノシル（１→３）−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１，２２−Ｏ−ジアンゲロイル−３β，１５α，１６α，２１β，２２α，２８−ヘキサヒドロキシオレアン−１２−エンまたはＸａｎｉｆｏｌｉａ−Ｙ）
を含む化合物、
（ｂ）構造（Ｙ１）：
【化１２】
2008513360.tif 000057
（すなわち、化学名：３−Ｏ−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−α−Ｌ−アラビノフラノシル（１→３）−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１−Ｏ−（３，４−ジアンゲロイル）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−２２−Ｏ−アセチル−３β，１６α，２１β，２２α，２８−ペンタヒドロキシオレアン−１２−エン、Ｙ１、またはＸａｎｉｆｏｌｉａ−Ｙ１）
を含む化合物、
（ｃ）構造（Ｙ２）：
【化１３】
2008513360.tif 000058
（すなわち、化学名：３−Ｏ−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→２）］−α−Ｌ−アラビノフラノシル（１→３）−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１，２２−Ｏ−ジアンゲロイル−３β，１５α，１６α，２１β，２２α，２４β，２８−ヘプタヒドロキシオレアン−１２−エンまたはＸａｎｉｆｏｌｉａ−Ｙ２）
を含む化合物、
（ｄ）構造（Ｙ８）：
【化１４】
2008513360.tif 000059
（すなわち、化学名：３−Ｏ−［β−グルコピラノシル（１→２）］−α−アラビノフラノシル（１→３）−β−グルクロノピラノシル−２１，２２−Ｏ−ジアンゲロイル−３β，１６α，２１β，２２α，２４β，２８−ヘキサヒドロキシオレアン−１２−エンまたはＸａｎｉｆｏｌｉａ−Ｙ８）
を含む化合物、
（ｅ）構造（Ｙ９）：
【化１５】
2008513360.tif 000060
（すなわち、化学名：３−Ｏ−［β−ガラクトピラノシル（１→２）］−α−アラビノフラノシル（１→３）−β−グルクロノピラノシル−２１−Ｏ−（３，４−ジアンゲロイル）−α−ラムノピラノシル−２８−Ｏ−アセチル−３β，１６α，２１β，２２α，２８−ペンタヒドロキシオレアン−１２−エンまたはＸａｎｉｆｏｌｉａ−Ｙ９）
を含む化合物、
（ｆ）構造（Ｙ１０）：
【化１６】
2008513360.tif 000061
（すなわち、化学名：３−Ｏ−［β−ガラクトピラノシル（１→２）］−α−アラビノフラノシル（１→３）−β−グルクロノピラノシル−２１，２２−Ｏ−ジアンゲロイル−３β，１６α，２１β，２２α，２８−ペンタヒドロキシオレアン−１２−エンまたはＸａｎｉｆｏｌｉａ−Ｙ１０）
を含む化合物、
（ｇ）化合物の化学構造（Ｘ）：
【化１７】
2008513360.tif 000062
（すなわち、化学名：３−Ｏ−｛［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−［α−Ｌ−アラビノフラノシル（１→３）］−β−Ｄ−グルクロノピラノシドブチルエステル｝−２１−Ｏ−アセチル−２２−Ｏ−アンゲロイル−３β，１６α，２１β，２２α，２８−ペンタヒドロキシオレアン−１２−エン）
を含む化合物
を含む、請求項１、請求項２、請求項３、または請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
トリテルペン骨格を含み、前記トリテルペン骨格が、２１β位または２２α位のいずれかまたは２１β位および２２α位の両方でアンゲロイル基または糖部分とアシル化し、ここで、前記糖部分中の少なくとも１つの糖が前記糖のＣ３位およびＣ４位に結合したアンゲロイル基を含み、ここで、前記トリテルペン骨格が糖部分を含み、ここで、前記糖部分は、少なくとも１つの糖（すなわち、グルコース、ガラクトース、ラムノース、アラビノース、キシロース、アルズロン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸）またはこれらの誘導体もしくは組み合わせを含む、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
塩形態である、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
その構造が合成されているか天然供給源から単離されている、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
薬物または健康食品としての請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
腫瘍細胞または癌細胞の成長を阻害するための薬物として、治療有効量の請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の化合物を含む組成物。
【請求項１１】
前記癌が、乳癌、白血球の癌（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｃａｎｃｅｒ）、肝臓癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、皮膚癌、骨肉種、または脳腫瘍であり、特には、卵巣癌である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
癌の阻害、ウイルス、ＨＩＶ、真菌、または細菌の阻害、脳の老化の防止、記憶の改善、脳機能の改善、夜尿症、頻尿、尿失禁、認知症、アルツハイマー病、自閉症、脳外傷、パーキンソン病、または脳機能障害に起因する他の疾患の治癒、関節炎、リウマチ、循環不良、動脈硬化、レイノー症候群、狭心症、心疾患、冠状動脈性心疾患、頭痛、めまい、腎臓障害、脳血管障害の治療、ＮＦ−κＢ活性化の阻害、脳浮腫、重症急性呼吸器症候群、ウイルス性呼吸器疾患、慢性静脈不全、高血圧、慢性静脈疾患、抗浮腫疾患（ａｎｔｉ−ｏｅｄｅｍａｔｏｕｓ）、抗炎症性疾患（ａｎｔｉ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）、血液様疾患（ｈａｅｍｏｎｈｏｉｄ）、末梢浮腫形成（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｃｅｄｅｍａ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、静脈瘤疾患、インフルエンザ、外傷後浮腫、および術後腫脹の治療、疼痛症状の軽減、エタノール吸収の阻害、血餅形成の減少、血糖値の低下、アドレノコルチコトロピンおよびコルチコステロンレベルの調節、ＡＣＴＨ、ＰＧＦ２の放出、５−ＨＴまたはヒスタミンに対する拮抗作用の調節、組織ムコポリサッカリドの異化の軽減、性交不能症、早漏、または糖尿病の治療のための請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の化合物を含む組成物。
【請求項１３】
少なくとも２つの隣接アンゲロイル基、５個の炭素を含む酸、少なくとも２個の炭素を含む酸、またはアンゲロイル基の生物活性として機能する官能基を含む化合物、サポンゲニン（ｓａｐｏｎｇｅｎｉｎ）、またはトリテルペンを含む、癌の阻害またはウイルスの阻害のための請求項１〜請求項６に記載の組成物。
【請求項１４】
前記２つのアンゲロイル基がトランス位で側鎖中に存在するか、前記２つのアンゲロイル基がシス位で側鎖中に存在するか、前記２つのアンゲロイル基が構造のトランス位またはシス位の代わりの位置の炭素の側鎖中に存在する、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
トリテルペン骨格またはサポンゲニン骨格を含む化合物であって、前記骨格が糖部分を含み、ここで、前記糖部分が、グルコース、ガラクトース、ラムノース、アラビノース、キシロース、アルズロン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸、またはこれらの組み合わせを含み、ここで、前記骨格が、骨格に結合した５個の炭素を含む酸、アンゲロイル基、チグロイル基、セネシオイル基、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される２つの基を含み、ここで、これらの２つの側鎖基によって抗癌活性または抗ウイルス活性が得られる、化合物。
【請求項１６】
ジアンゲロイル基を含む化合物であって、前記ジアンゲロイル基が、構造に結合し、前記ジアンゲロイル基の存在によって抗癌活性または抗ウイルス活性が得られる、化合物。
【請求項１７】
ブンカンカまたはムクロジ科由来の植物から化合物を単離する方法であって、
（ａ）ブンカンカまたは植物粉末を有機溶媒で抽出して有機抽出物を得る工程と、ここで、前記粉末が、ハーブまたは植物の皮、枝、幹、葉、核種、根、樹皮、または種子の殻から調製されていることと、
（ｂ）前記有機抽出物を回収する工程と、
（ｃ）前記有機抽出物を還流して第２の抽出物を得る工程と、
（ｄ）前記第２の抽出物から有機溶媒を除去する工程と、
（ｅ）前記第２の抽出物を乾燥および滅菌して粗抽出粉末を得る工程と、
（ｆ）シリカゲル、Ｃ１８、または他の等価な固相材料を使用したＨＰＬＣおよびＦＰＬＣクロマトグラフィを使用して、前記粗抽出粉末を成分に分画する工程と、
（ｇ）２０７ｎｍまたは２５４ｎｍの吸収波長をモニタリングする工程と、
（ｈ）前記粗抽出粉末の生物活性成分を同定する工程と、
（ｉ）ＦＰＬＣを使用して前記粗抽出粉末の生物活性成分を精製して、生物活性成分の画分を得る工程と、
（ｊ）分離ＨＰＬＣを使用して前記生物活性成分の画分から化合物を単離する工程と
を含む、方法。
【請求項１８】
図１８、１９、２０、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３１、３２、３３、３６、３７、３８、４０、４１、４２、４５、４６、４８、４９、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５８、または５９に示すＮＭＲスペクトルデータを含む、あるいはここで図１７、２３、２８、３５、３９、または４３に示される請求項１７に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブンカンカおよびムクロジ科由来の植物から得ることができる新規の抗腫瘍化合物に関する。
本出願は、２００５年３月１７日に出願された米国特許出願番号１１／１３１，５５１号の一部継続出願、２００５年４月２７日に出願された米国特許出願番号１１／１１７，７６０号の一部継続出願、２００５年２月１４日に出願された米国特許出願番号１０／９０６，３０３号の一部継続出願、２００４年１２月２３日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／４３４６５号の一部継続出願（２００４年１０月８日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／３３３５９号の一部継続出願であり、２００３年１２月２３日に出願された米国特許出願番号６０／５３２，１０１号および２００３年１０月９日に出願された６０／５０９，８５１号の利益を主張し、２００４年１０月８日に出願された米国特許出願番号６０／６１７，３７９号、２００４年９月２７日に出願された６０／６１３，８１１号、２００４年９月７日に出願された６０／６０７，８５８号、２００５年４月２７日に出願された６０／６７５，２８２号、および２００５年４月２７日に出願された６０／６７５，２８４号の利益を主張する）である。これらの上記出願の内容は、その全体が、本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
本出願を通して、種々の刊行物が参照されている。これらの刊行物の開示は、本発明が属する分野の状況をより完全に説明するために、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【背景技術】
【０００３】
文冠果（Ｗｅｎｇｕａｎｇｕｏ）は、ムクロジ科の種である。その学名はブンカンカ（Ｘａｎｔｈｏｃｅｒａｓ  ｓｏｒｂｉｆｏｌｉａ  Ｂｕｎｇｅ）である。ブンカンカは、一般的な中国名である。他の名称には、Ｗｅｎｇｕａｎｎｇｕｏ、Ｗｅｎｇｕａｎｍｕ、Ｗｅｎｇｕａｎｈｕａ、Ｘｉｌａｃｅｄｅｎｇ、Ｇｏｌｄｅｎｈｏｍ、およびＹｅｌｌｏｗｈｏｒｎがある。文冠果は、中国の遼寧、吉林、河北、山東、江蘇、河南、山西、陝西、甘粛、寧夏、および内蒙古に生息する。その種子、葉、および花は食用であり、何世紀にもわたって民間薬または伝統薬として使用されてきた。その枝および幹も、民間薬または伝統薬として使用されている。本発明のより詳細な情報および背景または関連分野については、２００４年１０月８日に出願された国際ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／３３３５９号の１頁２５〜３８行目および２００５年２月１４日に出願された米国特許出願番号１０／９０６，３０３号を参照のこと。これらの先願の内容は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０００４】
Ｙｉｎｇｊｉｅ  Ｃｈｅｎ，Ｔａｄａｈｉｒｏ  Ｔａｋｅｄａ  および  Ｙｕｋｉｏ  Ｏｇｉｈａｒａは、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ  ３３（４）１３８７−１３９４（１９８５）で、ブンカンカについての研究を記載している。Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｖ．Ｓａｐｏｎｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｆｒｕｉｔｓ  ｏｆ  Ｘａｎｔｈｏｃｅｒａｓ  ｓｏｒｂｉｆｏｌｉａを参照のこと。４つの新規のサポニン化合物が、ブンカンカの果実から単離された。これらの構造は、ブンカンカサポニンＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤである。Ｙｉｎｇｊｉｅ  Ｃｈｅｎ，Ｔａｄａｈｉｒｏ  Ｔａｋｅｄａ  および  Ｙｕｋｉｏ  Ｏｇｉｈａｒａは、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ  ３３（３）１０４３−１０４８（１９８５）で、ブンカンカに注目した別の研究を記載している。Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＩＶ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｐｒｏｓａｐｏｇｅｎｉｎを参照のこと。Ｙｉｎｇｊｉｅ  Ｃｈｅｎ，Ｔａｄａｈｉｒｏ  Ｔａｋｅｄａ  および  Ｙｕｋｉｏ  Ｏｇｉｈａｒａ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ  ３３（１）１２７−  １３４（１９８５）は、ブンカンカについてのさらに別の研究を記載している。Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＩＩＩ．Ｍｉｎｏｒ  Ｐｒｏｓａｐｏｇｅｎｉｎｓ  Ｓａｐｏｎｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｆｒｕｉｔｓ  ｏｆ  Ｘａｎｔｈｏｃｅｒａｓ  ｓｏｒｂｉｆｏｌｉａ  Ｂｕｎｇｅを参照のこと。サポニン化合物に注目した他の研究には、以下が含まれる：Ｌａｕｒｅｎｃｅ  Ｖｏｕｔｑｕｅｎｎｅ，Ｃｅｃｉｌｅ  Ｋｏｋｏｕｇａｎ．Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ  Ｌａｖａｕｄ，ｌｓａｂｅｌｌｅ  Ｐｏｕｎｙ，Ｍａｒｃ  Ｌｉｔａｕｄｏｎ．’Ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ  ｓａｐｏｎｉｎｓ  ａｎｄ  Ａｃｙｌａｔｅｄ  ｐｒｏｓａｐｏｇｅｎｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｈａｒｐｕｌｌｉａ  ａｕｓｔｒｏ−  ｃａｌｅｄｏｎｉｃａ．"  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５９（２００２）８２５−８３２．Ｌａｕｒｅｎｃｅ  Ｖｏｕｔｑｕｅｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．"Ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃ  ａｃｙｌａｔｅｄ  ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｌ  ｓａｐｏｎｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｈａｒｐｕｌｌｉａ  ａｕｓｔｒｏ−ｃａｌｅｄｏｎｉｃａ"  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６６（２００５）８２５−８３５．Ｚｈｏｎｇ  Ｊａｉｎｇ，Ｊｅａｎ−ｆｒａｎｃｏｉｓ  Ｇａｌｌａｒｄ，Ｍａｒｉｅ−Ｔｈｅｒｅｓｅ  Ａｄｅｌｉｎｅ，Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｄｕｍｏｎｔｅｔ，Ｍａｉ  Ｖａｎ  Ｔｒｉ，Ｔｈｉｅｒｒｙ  Ｓｅｖｅｎｅｔ，および  Ｍａｒｙ  Ｐａｉｓ  "Ｓｉｘ  Ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｎｏｉｄ  Ｓａｐｏｎｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｍａｅｓａ  ｌａｘｉｆｌｏｒａ．"  Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．（１９９９），６２，８７３−８７６．Ｙｏｕｎｇ  Ｓｅｏ，Ｊｏｈｎ  Ｍ．Ｂｅｒｇｅｒ，Ｊｅｎｎｉｎｅ  Ｈｏｃｈ，Ｋｉｍ  Ｍ  Ｎｅｄｄｅｒｍａｎｎ，ｌｓｉａ  Ｂｕｒｓｕｋｅｒ，Ｓｔｅｖｅｎ  Ｗ．Ｍａｍｂｅｒ  および  Ｄａｖｉｄ  Ｇ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ．"Ａ  ｎｅｗ  Ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅ  Ｓａｐｏｎｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｐｉｔｔｏｓｐｏｒｕｍ  ｖｉｒｉｄｉｆｌｏｒｕｍ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｍａｄａｇａｓｃａｒ  Ｒａｉｎｆｏｒｅｓｔ  "．Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．２００２，６５，６５−６８．Ｘｉｕ−Ｗｅｉ  Ｙａｎｇ，Ｊｉｎｇ  Ｚｈａｏ，Ｘｕｅ−Ｈｕｉ  Ｌｕｉ，Ｃｈａｏ−Ｍｅｉ  Ｍａ，Ｍａｓａｏ  Ｈａｔｔｏｒｉ，および  Ｌｉ  Ｈｅ  Ｚｈａｎｇ  "Ａｎｔｉ−  ＨＩＶ−１  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ  Ｓａｐｏｎｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｓｅｅｄｓ  ｏｆ  Ａｅｓｃｕｌｕｓ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ．"  Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．（１９９９），６２，１５１０−１５１３．Ｙｉ  Ｌｕ，Ｔａｔｓｕｙａ  Ｕｍｅｄａ，Ａｋｉｈｉｔｏ  Ｙａｇｉ，Ｋａｎｚｏ  Ｓａｋａｔａ，Ｔｉｒｔｈａｎｋａｒ  Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ，Ｄ．Ｋ．Ｇａｎｇｕｌｙ，Ｓｅｃｉｏｎ  Ｓａｒｍａ．"Ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ  Ｓａｐｏｎｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｒｏｏｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｅａ  ｐｌａｎｔ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  ｖａｒ．Ａｓｓａｍｉｃａ）．"  Ｐｈｙｔｏｃｈｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５３（２０００）９４１−９４６．Ｓａｎｄｒａ  Ａｐｅｒｓ，Ｔｅｓｓ  Ｅ．Ｄｅ  Ｂｒｕｙｎｅ，Ｍａｇｄａ  Ｃｌａｅｙｓ，Ａｒｎｏｌｄ  Ｊ．Ｖｉｌｅｔｉｎｃｋ，Ｌｕｃ  Ａ．Ｃ．Ｐｉｅｔｅｒｓ．"Ｎｅｗ  ａｃｙｌａｔｅｄ  ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ  ｓａｐｏｎｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｍａｅｓａ  ｌａｃｅｃｅｏｌａｔａ．"  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５２（１９９９）１１２１−１１３１．Ｉｌａｒｉａ  Ｄ’Ａｃｑｕａｒｉｃａ，Ｍａｒｉａ  Ｃｒｉｓｔｉｎａ，Ｄｉ  Ｇｉｏｖａｎｎｉ，Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ  Ｇａｓｐａｒｒｉｎｉ，Ｄｏｍｅｎｉｃｏ  Ｍｉｓｉｔｉ，Ｃｌａｕｄｉｏ  Ｄ’  Ａｒｒｉｇｏ，Ｎｉｃｏｌｉｎａ  Ｆａｇｎａｎｏ，Ｄｅｃｉｍｏ  Ｇｕａｍｉｅｒｉ，Ｇｉｏｖａｎｎｉ  ｌａｃｏｎｏ，Ｇｉｕｓｅｐｐｅ  Ｂｉｆｕｌｃｏ  および  Ｒａｆｆａｅｌｅ  Ｒｉｃｃｉｏ．"Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｕｒ  ｎｅｗ  ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ  ｅｓｔｅｒｓａｐｏｎｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｆｒｕｉｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｉｔｔｏｓｐｏｒｕｍｔｏｂｉｒａ  ＡＩＴ．  ５８（２００２）１０１２７−１０１３６。上記引例の内容が、本明細書中で参考として援用される。
【０００５】
しかし、これらの引例は、腫瘍細胞または癌細胞の成長を阻害することができる本発明の化合物と同一の構造を有するサポニン化合物を開示していない。
【０００６】
癌細胞は、以下の２つの性質によって定義される：（１）正常な細胞分裂の制限を無視して再生すること、および（２）通常は他の細胞のために用意してあるテリトリーに侵入し、コロニーを形成すること。癌は、その発達に１つから多数の遺伝子の変異を必要とし、癌が生じる組織型および細胞型によって分類される。上皮細胞から生じる癌を癌腫といい、結合組織または筋細胞から生じる癌を肉腫という。さらに、白血病と呼ばれる癌が存在し、これは、造血細胞に由来する。癌は、中枢神経系の細胞からも発生し得る。
【０００７】
卵巣癌は、女性の癌による死亡の５番目の原因であり、婦人科悪性腫瘍由来の主な死因である。米国では、一生涯で卵巣癌を発症する可能性は１．４〜２．５％（すなわち、４０〜６０人の女性に１人）である。高齢の女性が最もリスクが高い。５５歳と７４歳との間の女性の半分以上が、卵巣癌で死亡しており、３５歳と５４歳との間の女性の約１／４が卵巣癌で死亡している。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｅｄｌｉｎｅｐｌｕｓ／ｅｎｃｙ／ａｒｔｉｃｌｅ／０００８８９．ｈｔｍ．のＭｅｄｌｉｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒを参照のこと。
【０００８】
卵巣癌は、多数の理由のために死に至る危険性が偏って高い。第１に、症状があいまい且つ非特異的であるので、女性および医師がこの症状の原因をより一般的な容態によるものと考える。癌と診断されるまでに、腫瘍はしばしば卵巣外に拡大している。また、卵巣癌は、悪性細胞が噴出し、子宮、膀胱、腸、および腸壁の内層（網）に頻繁に埋め込まれる。これらの細胞は、癌と疑われる前でさえも新規の腫瘍を形成し始めることが可能である。第２に、卵巣癌のための費用効果のあるスクリーニング試験は存在しないので、５０％を超える卵巣癌の女性が、疾患が進行した段階で診断を受ける。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の目的は、ブンカンカまたは植物から抽出されるか、化学合成または生化学的に合成された、卵巣癌に対して実質的有効性を有する化合物および／または組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明のこれらおよび他の目的にしたがって、本発明の簡単な要旨を示す。本発明のいくつかの態様を強調および提起することを目的として以下の要旨でいくらか簡略化および省略することができるが、本発明の範囲を制限しない。当業者が本発明の概念を実施および使用するのに適切な好ましい例示的実施形態の詳細な説明を、後の節に記載する。
【００１１】
本発明は、図１に示す構造（Ｙ１、Ｙ２、Ｙ（すなわちＹ３）、Ｙ８、Ｙ９、Ｙ１０）の６つの新規の化合物を提供する。本明細書中で使用される、「構造Ｙ」は、「構造Ｙ３」ともいう。
【化１】
2008513360.tif 000003
【００１２】
これらの化合物の式、化学名、および一般名を、以下の表１に示す。
【００１３】
【表１】
2008513360.tif 000004
【００１４】
上記の６つの化合物（Ｙ、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ８、Ｙ９、およびＹ１０）は、抗癌効果を有する。これらの化合物は、ヒト卵巣癌細胞および他の癌細胞の成長を阻害する。図２、３、および４を参照のこと。
【００１５】
共通サブ構造を、本発明の生物活性化合物（Ｙ、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ８、Ｙ９、およびＹ１０）から誘導するか、同定した。本発明の化合物のコンセンサスサブ構造は、隣接炭素上に存在するジアンゲロイル基である。例えば、構造Ｙ、Ｙ２、Ｙ８、およびＹ１０では、ジアンゲロイル基は、トリテルペン骨格の２１βおよび２２αに存在する。図５を参照のこと。Ｙ１およびＹ９の構造について、ジアンゲロイル基は、糖環のＣ３およびＣ４に存在する。図６を参照のこと。１つの実施形態では、本発明の生物活性化合物（Ｙ、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ８、Ｙ９、およびＹ１０）のジアンゲロイル基は、構造の隣接炭素中にトランス位で存在する。図７を参照のこと。別の実施形態では、糖部分または糖鎖は、トリテルペンのＣ３に存在する。さらなる実施形態では、糖部分または糖鎖は、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ラムノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、アルズロン酸、Ｄ−グルクロン酸、およびＤ−ガラクツロン酸からなる群から選択される。
【００１６】
本発明の６つの化合物の構造と機能との関係に関する研究により、トリテルペンのＣ１５およびＣ２４に存在する官能基の変更または置換が抗癌活性に影響を与えないことが示された。本発明の化合物（Ｙ、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ８、Ｙ９、およびＹ１０）は、腫瘍成長の阻害活性を有する。図２、３、および４を参照のこと。図８、９、１０、１１、１２、および１３に記載のように、化合物を、ＦＰＬＣおよびＨＰＬＣを含むクロマトグラフィ精製過程によって調製する。本出願に記載の手順を使用して、化合物Ｙを精製する。図１１Ａは、化合物ＹのＮＭＲピークを示す。図２および図１４の化合物は、精製された化合物Ｙが元の抽出物（ＩＣ５０＝２５μｇ／ｍｌ）の１０倍の効力（ＩＣ５０＝１．５μｇ／ｍｌ）を有することを示す。化合物Ｙはまた、卵巣癌に対して高い選択性を有する。図１５を参照のこと。
【００１７】
精製された化合物Ｙ１、Ｙ２、Ｙ８、Ｙ９、およびＹ１０はまた、ヒト癌細胞に対する阻害活性を示し、卵巣癌に対してより高い効力を示す。図３および４を参照のこと。化合物Ｙｓを含む植物抽出物はまた、ヒト癌細胞に体して阻害活性を示す。例えば、１１種のヒト癌細胞株について研究を行い、本発明の植物抽出物は、卵巣癌のより高い効力を示す。異なる癌細胞株の間の本発明の植物抽出物の活性の比較については、図１４、１５、および１６、ならびに表３を参照のこと。本明細書中で使用される「Ｙｓ」または「化合物Ｙｓ」を使用して、化合物Ｙ（すなわちＹ３）、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ８、Ｙ９、Ｙ１０、または本発明のブンカンカ抽出物から得ることができる他の生物活性化合物を示す。
【００１８】
本発明は、癌成長を阻害することができるブンカンカの抽出物を提供する。癌には、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、白血球の癌（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｃａｎｃｅｒ）、および骨肉種が含まれるが、これらに限定されない。癌に対して有効性を示すことが示された本発明の化合物を、ブンカンカと呼ばれる植物から単離するか、化学合成するか、他の生物供給源（ムクロジ科由来の植物が含まれる）から抽出することができる。
【００１９】
本発明は、文冠果の皮、葉、枝または幹、種子の殻、根、および樹皮からの生物活性化合物の精製過程を提供する。文冠果の異なる部位由来の本発明の生物活性化合物の抽出を、個別または同時に行うことができる。本発明は、さらに、本発明の生物活性化合物を得る方法を開示する。サポニン化合物に加えて、本発明の抽出物は、ポリサッカリド、タンパク質、グリコシド、フラボノイド、クマリン抽出物、アルカロイド抽出物、有機酸抽出物、タンニン、および他の生物化生化合物も含む。本発明の抽出物から得ることができるサポニン化合物を調査し、癌成長に対する阻害活性を有することが示された。
【００２０】
本発明の化合物、抽出物、または組成物は、多数の細胞経路（細胞の受容体または成分（Ｇタンパク質受容体、Ｆａｓタンパク質、受容体チロシンキナーゼ、マイトジェン、マイトジェン受容体など）が含まれる）を調節することができる。本発明の化合物を、ブンカンカと呼ばれる植物から単離するか、化学合成するか、他の生物供給源（ムクロジ科由来の植物が含まれる）から抽出することができる。
【００２１】
本発明は、ブンカンカから得ることができ、且つ癌成長を阻害することができる化合物（構造Ｙ、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ８、Ｙ９、およびＹ１０の化合物が含まれる）を提供する。１つの実施形態では、癌には、膀胱癌、子宮頸癌、前立腺癌、肺癌、乳癌、白血球の癌、結腸癌、肝臓癌、骨肉種、脳腫瘍、および卵巣癌が含まれるが、これらに限定されない。本発明は、化合物の炭素２１および炭素２２に側鎖を含むオレアネントリテルペノイドサポニン化合物であって、側鎖がアンゲロイル基を含む、化合物を提供する。１つの実施形態では、化合物は、１つまたは複数の糖を含み、糖のＣ３およびＣ４がアンゲロイル基とアシル化している。本発明は、トリテルペン骨格およびジアンゲロイル基を含むトリテルペノイドサポニン化合物であって、１つのアンゲロイル基がトリテルペン骨格の２１βに結合し、１つのアンゲロイル基がトリテルペン骨格の２２αに結合し、ジアンゲロイル基の存在によって抗癌活性が得られる、化合物を提供する。本発明は、トリテルペン骨格および糖部分（すなわち、ラムノース）を含むトリテルペノイドサポニン化合物であって、糖部分（すなわち、ラムノース）がトリテルペン骨格に結合し、糖部分（すなわち、ラムノース）がジアンゲロイル基をさらに含み、ジアンゲロイル基の存在によって抗癌活性が得られる、化合物を提供する。本発明は、トリテルペン骨格を含むトリテルペノイドサポニン化合物であって、トリテルペン骨格が、２１β位または２２α位のいずれかまたは２１β位および２２α位の両方で糖部分または糖鎖とアシル化し、糖部分または糖鎖中の少なくとも１つの糖が糖のＣ３位およびＣ４位に結合したアンゲロイル基を含む、化合物を提供する。１つの実施形態では、２つのアンゲロイル基がトランス位で構造上に存在し、ジアンゲロイル基の存在によって抗癌活性が得られる。１つの実施形態では、２つのアンゲロイル基がトランス位で構造上の隣接炭素中に存在し、ジアンゲロイル基の存在によって抗癌活性が得られる。本発明は、上記化合物の塩を提供する。本発明は、有効量の上記化合物および薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。
【００２２】
本発明は、適量の有機溶媒でブンカンカを適切な時間抽出して抽出物を得る工程と、抽出物中の生物活性化合物を同定する工程と、ＦＰＬＣを使用して抽出物中の生物活性化合物を精製して生物活性化合物画分を得る工程と、分離ＨＰＬＣを使用して生物活性成分の画分から精製された各生物活性化合物を単離する工程とを含む、ブンカンカから化合物を単離する方法を提供する。本発明は、プロトンＮＭＲ、カーボンＮＭＲ、異核間多量子相関（Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）（ＨＭＱＣ）、異核間多数結合相関（Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｂｏｎｄ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）（ＨＭＢＣ）、ＮＯＥＳＹ、およびＣＯＳＹの二次元ＮＭＲ由来のＮＭＲスペクトルデータ、ならびにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよびＥＳＩ−ＭＳ由来のマススペクトルデータによって検証された構造を有する化合物を提供する。
【００２３】
本発明は、癌に有効な化合物およびその誘導体を提供する。本発明の化合物または組成物は、種々の細胞経路（成分または受容体（Ｇタンパク質受容体、Ｆａｓタンパク質、チロシンキナーゼの受容体、マイトジェン、マイトジェン受容体、ＴＧＦβ−ｓｍａｄ、ＦＧＦ、ＦＧＦ−βおよびＴＧＦ−α、ｒａｓ−ＧＴＰアーゼ−ＭＡＰキナーゼ、ｊｕｎ−ｆｏｓ、Ｓｒｃ−ｆｙｎ、Ｊａｋ−Ｊｎｋ−ＳＴＡＴ、ＢＭＰ、Ｗｎｔ、またはｍｙｃ細胞増殖など）が含まれるが、これらに限定されない）を調節することができる。ブンカンカ由来の本発明の化合物および組成物はまた、細胞死に関連する成分および受容体を調節することができ、細胞死のプログラムまたは経路を（再）活性化することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、式（１）：
【化２】
2008513360.tif 000005
（式中、Ｒ1はアンゲロイル基を示し、Ｒ2はアンゲロイル基を示し、Ｒ3は、ＯＨまたはＨを示し、Ｒ4は、ＣＨ3またはＣＨ2ＯＨを示し、Ｒ7はＨ示し、Ｒ5はＤ−グルコースまたはＤ−ガラクトースを示し、Ｒ6はＬ−アラビノースを示す）の化合物、またはその塩、エステル、もしくは誘導体から選択される化合物を提供する。
【００２５】
本発明は、式（２）：
【化３】
2008513360.tif 000006
（式中、Ｒ1はアンゲロイル基を示し、Ｒ2はアンゲロイル基を示し、Ｒ3は、ＡｃまたはＨを示し、Ｒ4は、ＨまたはＡｃを示し、Ｒ5は、ＣＨ3またはＣＨ2ＯＨを示す）の化合物、またはその塩、エステル、もしくは誘導体から選択される化合物を提供する。
【００２６】
本発明は、式（３）：
【化４】
2008513360.tif 000007
（式中、Ｒ1はアンゲロイル基を示し、Ｒ2はアンゲロイル基を示し、Ｒ3は、ＯＨまたはＨを示し、Ｒ4は、ＣＨ3、ＣＨ2ＯＨ、アルキル基、またはこれらの誘導体示し、Ｒ6は、ＡｃまたはＨを示し、Ｒ５は糖部分を示し、ここで、糖部分は、少なくとも１つの糖（すなわち、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ラムノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、アルズロン酸、Ｄ−グルクロン酸、またはＤ−ガラクツロン酸）またはこれらの誘導体もしくは組み合わせを含む）の化合物、またはその塩、エステル、もしくは誘導体から選択される化合物を提供する。１つの実施形態では、Ｒ5は、糖部分の機能を果たすことができる化合物を示す。別の実施形態では、糖部分は、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、またはこれらの組み合わせを含む。
【００２７】
本発明は、式（３Ａ）：
【化５】
2008513360.tif 000008
（式中、Ｒ1はアンゲロイル基を示し、Ｒ2はアンゲロイル基を示し、Ｒ3は、ＯＨまたはＨを示し、化合物の炭素２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２９位、３０位は、独立して、ＣＨ3、ＣＨ2ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、アルキル基、アセチル基、または誘導体を含み、Ｒ6は、ＡｃまたはＨを示し、Ｒ5は糖部分を示し、ここで、糖部分は、少なくとも１つの糖（すなわち、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ラムノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、アルズロン酸、Ｄ−グルクロン酸、またはＤ−ガラクツロン酸）またはこれらの誘導体もしくは組み合わせを含む）の化合物、またはその塩、エステル、もしくは誘導体から選択される化合物を提供する。１つの実施形態では、Ｒ５は、糖部分の機能を果たすことができる化合物を示す。別の実施形態では、糖部分は、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルコース、および／もしくはＤ−ガラクトース、またはこれらの組み合わせを含む。さらなる実施形態では、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ6のうちの任意の２つはアンゲロイル基であるか、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ6のうちの任意の１つは、糖部分に結合しており、ここで、アンゲロイル基は、モノサッカリドの隣接炭素に結合している。さらなる実施形態では、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ6は、アンゲロイル基、アセチル基、チグロイル基、セネシオイル基、２〜５個の炭素を含む酸、またはこれらの組み合わせを含む。さらなる実施形態では、Ｒ1、Ｒ2、またはＲ6のうちの少なくとも１つは、糖部分（すなわち、ラムノース）に結合し、ここで、糖部分（すなわち、ラムノース）は、２つのアンゲロイル基、アセチル基、チグロイル基、セネシオイル基、２〜５個の炭素を含む酸、またはこれらの組み合わせを含む。
【００２８】
本発明は、式（４）：
【化６】
2008513360.tif 000009
（式中、
【化７】
2008513360.tif 000010
Ｓ１〜Ｓ４は、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、またはＳ４であり、Ｒ１はアンゲロイル基を示し、Ｒ2はアンゲロイル基を示し、Ｒ3は、ＡｃまたはＨを示し、Ｒ4は、ＨまたはＯＨを示し、Ｒ6は、ＡｃまたはＨを示し、Ｒ7は、ＣＨ3、ＣＨ2ＯＨ、アルキル基、またはこれらの誘導体を示し、Ｒ5は、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ラムノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、アルズロン酸、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−ガラクツロン酸、およびこれらの誘導体からなる群から選択される糖部分または糖鎖を示す）またはこれらの誘導体もしくは組み合わせを含む）の化合物、またはその塩、エステル、もしくは誘導体から選択される化合物を提供する。１つの実施形態では、Ｒ1はアンゲロイル基を示し、Ｒ2はアンゲロイル基を示し、Ｒ3は、ＡｃまたはＯＨを示し、Ｒ4は、ＨまたはＯＨを示し、化合物の炭素２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２９位、３０位は、独立して、ＣＨ3、ＣＨ2ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、アルキル基、アセチル基、または誘導体を含み、Ｒ5は糖部分を示し、ここで、糖部分は、少なくとも１つの糖（すなわち、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ラムノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、アルズロン酸、Ｄ−グルクロン酸、またはＤ−ガラクツロン酸）またはこれらの誘導体もしくは組み合わせを含む。１つの実施形態では、Ｒ5は、糖部分の機能を果たすことができる化合物を示す。別の実施形態では、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ6は、アンゲロイル基、アセチル基、チグロイル基、セネシオイル基、２〜５個の炭素を含む酸を含む。さらなる実施形態では、糖部分は、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルコース、もしくは／およびＤ−ガラクトース、またはこれらの組み合わせを含む。
【００２９】
本発明は、式（５）：
【化８】
2008513360.tif 000011
（式中、Ｒ1およびＲ2はアンゲロイル基を示し、Ｒ3は、ＨまたはＯＨを示し、Ｒ4はＣＨ2ＯＲ6を示し、ここで、Ｒ6はＨであり、Ｒ5は、少なくとも１つの糖部分またはその誘導体を示す）の化合物、またはその塩、エステル、もしくは誘導体から選択される化合物を提供する。１つの実施形態では、Ｒ1およびＲ2はアンゲロイル基を示し、Ｒ3は、ＨまたはＯＨを示し、Ｒ4はＣＯＯＲ6を示し、ここで、Ｒ6はＨであり、Ｒ5は、少なくとも１つの糖部分またはその誘導体を示す。１つの実施形態では、Ｒ1はＨを示し、Ｒ2はアンゲロイル基を示し、Ｒ3は、ＨまたはＯＨを示し、Ｒ4はＣＨ2ＯＲ6またはＣＯＯＲ6を示し、ここで、Ｒ6はアンゲロイル基であり、Ｒ5は、少なくとも１つの糖部分またはその誘導体を示す。別の実施形態では、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ6のうちの少なくとも２つは、アンゲロイル基または５個の炭素を含む酸を含み、Ｒ3は、ＨまたはＯＨを示し、Ｒ4はＣＨ2ＯＲ6またはＣＯＯＲ6を示し、ここで、Ｒ6はアンゲロイル基であり、Ｒ5は、少なくとも１つの糖部分またはその誘導体を示す。さらなる実施形態では、Ｒ1またはＲ2のうちの少なくとも１つのアンゲロイルは、アセチル基、チグロイル基、セネシオイル基、または２〜５個の炭素を含む酸に置換されており、Ｒ3は、ＨまたはＯＨを示し、Ｒ4はＣＨ2ＯＲ6またはＣＯＯＲ6を示し、ここで、Ｒ6はアンゲロイル基であり、Ｒ5は、少なくとも１つの糖部分またはその誘導体を示す。さらなる実施形態では、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ6のうちの少なくとも１つは、少なくとも２つのアンゲロイルは、アセチル基、チグロイル基、セネシオイル基、２〜５個の炭素を含む酸、またはこれらの組み合わせを含む糖部分（すなわち、ラムノース）である。さらなる実施形態では、化合物の炭素２３位、２４位、２５位、２６位、２９位、３０位は、独立して、ＣＨ3、ＣＨ2ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、アルキル基、アセチル基、またはこれらの誘導体を含む。さらなる実施形態では、グルコース、ラクトース、またはアラビノースを含む糖部分を示す。さらなる実施形態では、Ｒ5は糖部分を示し、ここで、糖部分は、少なくとも１つの糖（すなわち、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ラムノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、アルズロン酸、Ｄ−グルクロン酸、またはＤ−ガラクツロン酸）またはこれらの誘導体もしくは組み合わせを含む。１つの実施形態では、Ｒ5は、糖部分の機能を果たすことができる化合物を示す。さらなる実施形態では、Ｒ5はＨを示す。さらなる実施形態では、Ｒ4は、Ｈ、ＯＨ、またはＣＨ３を示す。
【００３０】
上記化合物の任意の基の置換、欠失、および／または付加は、本出願の教示に基づいて、当業者に明らかであろう。さらなる実施形態では、本発明の化合物中の基の置換、欠失、および／または付加は、化合物の生物機能に実質的に影響を与えない。さらなる実施形態では、アンゲロイル基は、構造上にトランス位で存在する。
【００３１】
本発明は、以下の構造：
【化９】
2008513360.tif 000012
（式中、Ｒ1はアンゲロイル基を示し、Ｒ2はアンゲロイル基を示す）を含む化合物を提供する。１つの実施形態では、ジアンゲロイル基は、トランス位でアシル化されている。別の実施形態では、ジアンゲロイル基は、隣接炭素上にトランス位でアシル化されている。さらなる実施形態では、ジアンゲロイル基は、構造中でアシル化されている。さらなる実施形態では、Ｒ1、Ｒ2は、アンゲロイル基、チグロイル基、セネシオイル基、２〜５個の炭素を含む酸、またはこれらの組み合わせを含む。さらなる実施形態では、化合物は、少なくとも２つのアンゲロイル基、チグロイル基、セネシオイル基、２〜５個の炭素を含む酸、またはこれらの組み合わせを含む。さらなる実施形態では、化合物は、糖部分をさらに含む。さらなる実施形態では、糖部分は、グルコース、ガラクトース、アラビノース、またはこれらの組み合わせを含む。さらなる実施形態では、糖部分は、少なくとも１つの糖（すなわち、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ラムノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、アルズロン酸、Ｄ−グルクロン酸、またはＤ−ガラクツロン酸）またはこれらの誘導体もしくは組み合わせを含む。さらなる実施形態では、構造Ａ、Ｂ、またはＣは、糖部分の機能を果たすことができる化合物を含む。上記化合物の任意の基の置換、欠失、および／または付加は、本出願の教示に基づいて、当業者に明らかであろう。さらなる実施形態では、本発明の化合物中の基の置換、欠失、および／または付加は、化合物の生物機能に実質的に影響を与えない。さらなる実施形態では、アンゲロイル基は、構造上にトランス位で存在する。
【００３２】
本発明は、側鎖がトランス位で隣接炭素に存在する、アンゲロイル基を含む少なくとも２つの側鎖を含む化合物を含む癌の治療またはウイルスの阻害のための組成物を提供する。１つの実施形態では、側鎖は、シス位で代わりの炭素に存在する。１つの実施形態では、側鎖は、トランス位で代わりの炭素に存在する。１つの実施形態では、側鎖は、非隣接炭素中にシス位またはトランス位で存在する。１つの実施形態では、側鎖は、糖部分の機能を果たすことができる官能基を含む。
【００３３】
本発明は、上記化合物を含む腫瘍細胞成長を阻害するための組成物を提供する。１つの実施形態では、組成物は、適切なキャリアを含む。別の実施形態では、組成物は、薬学的に適切なキャリアを含む。本発明は、被験体に有効量の上記組成物を投与する工程を含む、被験体の卵巣癌を治療する方法を提供する。
【００３４】
本発明は、ブンカンカまたはムクロジ科由来の植物から化合物を単離する方法であって、（ａ）ブンカンカまたは植物粉末を有機溶媒で抽出して有機抽出物を得る工程と、（ｂ）有機抽出物を回収する工程と、（ｃ）有機抽出物を還流して第２の抽出物を得る工程と、（ｄ）第２の抽出物から有機溶媒を除去する工程と、（ｅ）第２の抽出物を乾燥および滅菌して粗抽出粉末を得る工程と、（ｆ）シリカゲル、Ｃ１８、または他の等価な固相材料を使用したＨＰＬＣおよびＦＰＬＣクロマトグラフィを使用して、粗抽出粉末を成分に分画する工程と、（ｇ）２０７ｎｍまたは２５４ｎｍの吸収波長をモニタリングする工程と、（ｈ）粗抽出粉末の生物活性成分を同定する工程と、（ｉ）ＦＰＬＣを使用して粗抽出粉末の１つまたは複数の生物活性成分を精製して、１つまたは複数の生物活性成分の画分を得る工程と、（ｊ）分離ＨＰＬＣを使用して生物活性成分の所望の画分を単離する工程とを含む方法を提供する。
【００３５】
化合物Ｙ（すなわちＹ３）
本発明は、式Ｃ57Ｈ88Ｏ23および化学名３−Ｏ−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−α−Ｌ−アラビノフラノシル（１→３）−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１，２２−Ｏ−ジアンゲロイル−３β，１５α，１６α，２１β，２２α，２８−ヘキサヒドロキシオレアン−１２−エン（Ｘａｎｉｆｏｌｉａ−Ｙとしても公知）を有する以下の構造を含む化合物（すなわち、図１７を参照のこと）を提供する。本化合物を、ブンカンカまたはムクロジ科由来の植物から得ることができる。
【化１０】
2008513360.tif 000013
【００３６】
本化合物は、アグリコンのＣ−３に結合したトリサッカリド鎖ならびにＣ−２１およびＣ−２２でアシル化した２つのアンゲロイル基を含むオレアネントリテルペノイドサポニンに属する。本化合物は、抗癌活性を有する。本構造の配置は、スペクトルデータ（すなわち、Ｈ−ＮＭＲ、二次元ＮＭＲ（ＨＭＢＣ、ＨＭＱＣ）、およびＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＥＭＳ））によって支持されている。したがって、本化合物は、図１８〜２２または表５．１に示す固有性を有する。
【００３７】
化合物Ｙ１
本発明は、式Ｃ65Ｈ100Ｏ27および化学名３−Ｏ−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−α−Ｌ−アラビノフラノシル（１→３）−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１−Ｏ−（３，４−ジアンゲロイル）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−２２−Ｏ−アセチル−３β，１６α，２１β，２２α，２８−ペンタヒドロキシオレアン−１２−エン（Ｘａｎｉｆｏｌｉａ−Ｙ１としても公知）を有する以下の構造を含む別の化合物（すなわち、図２３を参照のこと）を提供する。
【化１１】
2008513360.tif 000014
【００３８】
本化合物は、骨格のＣ−３にトリサッカリド鎖およびＣ−２１にモノサッカリド部分を含み、２つのアンゲロイル基がＣ−３位およびＣ−４位でアシル化されている、ビスデスモジディック（ｂｉｓｄｅｓｍｏｓｉｄｉｃ）ポリヒドロキシオレアネントリテルペノイドサポニンである。本化合物は、抗癌活性を有する。本構造の配置は、スペクトルデータ（すなわち、Ｈ−ＮＭＲ、二次元ＮＭＲ（ＨＭＢＣ、ＨＭＱＣ、ＣＯＳＹ）、およびＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ））によって支持されている。したがって、本化合物は、図２４〜２７に示す固有性を有する。
【００３９】
化合物Ｙ２
本発明は、式Ｃ57Ｈ88Ｏ24および化学名３−Ｏ−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→２）］−α−Ｌ−アラビノフラノシル（１→３）−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１，２２−Ｏ−ジアンゲロイル−３β，１５α，１６α，２１β，２２α，２４β，２８−ヘプタヒドロキシオレアン−１２−エン（Ｘａｎｉｆｏｌｉａ−Ｙ２としても公知）を有する以下の構造を含む第３の化合物（すなわち、図２８を参照のこと）を提供する。
【化１２】
2008513360.tif 000015
【００４０】
本化合物（Ｙ２）は、トリテルペン、糖部分、および骨格に結合したアンゲロイル基を含むサポニンに属する。アンゲロイル基は、Ｃ２１位およびＣ２２位で骨格に結合している。本化合物は、抗癌活性を有する。本構造の配置は、スペクトルデータ（すなわち、Ｈ−ＮＭＲ、Ｃ−ＮＭＲ、二次元ＮＭＲ（ＨＭＢＣ、ＨＭＱＣ、ＣＯＳＹ）、およびＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ））によって支持されている。したがって、本化合物は、図２９〜３４に示す固有性を有する。
【００４１】
化合物Ｙ８
本発明は、第４の活性化合物Ｙ８を提供し、構造を、一次元ＮＭＲ、二次元ＮＭＲ、およびＭＳ分析によって測定した。化合物は、式Ｃ57Ｈ87Ｏ23および化学名３−Ｏ−［β−グルコピラノシル（１→２）］−α−アラビノフラノシル（１→３）−β−グルクロノピラノシル−２１，２２−Ｏ−ジアンゲロイル−３β，１６α，２１β，２２α，２４β，２８−ヘキサヒドロキシオレアン−１２−エン（Ｘａｎｉｆｏｌｉａ−Ｙ８としても公知）を有する以下の構造を含む。
【化１３】
2008513360.tif 000016
【００４２】
本構造の配置は、スペクトルデータ（すなわち、Ｈ−ＮＭＲ、Ｃ１３−ＮＭＲ、および二次元ＮＭＲ（ＨＭＱＣ）によって支持されている。したがって、本化合物は、図３６〜３８に示す固有性を有する。
【００４３】
化合物Ｙ９
本発明は、第５の活性化合物Ｙ９を提供し、構造を、一次元ＮＭＲ、二次元ＮＭＲ、およびＭＳ分析によって測定した。化合物は、化学名３−Ｏ−［β−ガラクトピラノシル（１→２）］−α−アラビノフラノシル（１→３）−β−グルクロノピラノシル−２１−Ｏ−（３，４−ジアンゲロイル）−α−ラムノピラノシル−２８−Ｏ−アセチル−３β，１６α，２１β，２２α，２８−ペンタヒドロキシオレアン−１２−エン（Ｘａｎｉｆｏｌｉａ−Ｙ９としても公知）を有する以下の構造（すなわち、図３９を参照のこと）を含む。
【化１４】
2008513360.tif 000017
【００４４】
本構造の配置は、スペクトルデータ（すなわち、Ｈ−ＮＭＲ、二次元ＮＭＲ（ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣ）によって支持されている。したがって、本化合物は、図４０〜４２に示す固有性を有する。
【００４５】
化合物Ｙ１０
本発明は、第６の活性化合物Ｙ１０を提供し、構造を、一次元ＮＭＲ、二次元ＮＭＲ、およびＭＳ分析によって測定した。化合物は、式Ｃ57Ｈ87Ｏ22および化学名３−Ｏ−［β−ガラクトピラノシル（１→２）］−α−アラビノフラノシル（１→３）−β−グルクロノピラノシル−２１，２２−Ｏ−ジアンゲロイル−３β，１６α，２１β，２２α，２８−ペンタヒドロキシオレアン−１２−エン（Ｘａｎｉｆｏｌｉａ−Ｙ１０としても公知）を有する以下の構造（すなわち、図４３を参照のこと）を含む。
【化１５】
2008513360.tif 000018
【００４６】
本構造の配置は、スペクトルデータ（すなわち、Ｈ−ＮＭＲ、Ｃ１３−ＮＭＲ、および二次元ＮＭＲ（ＨＭＱＣ）によって支持されている。したがって、本化合物は、図４４〜４６に示す固有性を有する。
【００４７】
本発明は、トリテルペンまたはサポゲニンがアンゲロイル基とＣ２１および２２でアシル化している、糖部分およびトリテルペンまたはサポゲニンを含む化合物を提供する。１つの実施形態では、トリテルペンまたはサポゲニンは、２つのアンゲロイル基を含む糖部分と炭素２１および／または２２でアシル化されている。別の実施形態では、化合物は、１つまたは複数の糖を含む。別の実施形態では、化合物は、少なくとも２つのアンゲロイル基を含む。さらなる実施形態では、糖部分は、少なくとも１つの糖（すなわち、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ラムノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、アルズロン酸、Ｄ−グルクロン酸、またはＤ−ガラクツロン酸）またはこれらの誘導体もしくは組み合わせを含む。さらなる実施形態では、糖部分の機能を果たすことができる化合物は、トリテルペンまたはサポゲニンに結合している。さらなる実施形態では、アンゲロイル基を、チグロイル基、セネシオイル基、２〜５個の炭素を含む酸、またはこれらの組み合わせと置換することができる。上記化合物の任意の基の置換、欠失、および／または付加は、本出願の教示に基づいて、当業者に明らかであろう。さらなる実施形態では、本発明の化合物中の基の置換、欠失、および／または付加は、化合物の生物機能に実質的に影響を与えない。さらなる実施形態では、アンゲロイル基は、構造上にトランス位で存在する。さらなる実施形態では、アンゲロイル基は、構造上に隣接トランス位で存在する。
【００４８】
抗癌活性を有するブンカンカから得た抽出物を開示する。本発明の抽出物の抗癌活性を測定するための実験は、１１種のヒト器官に由来するヒト細胞株（ＨＴＢ−９（膀胱）、ＨｅＬａ−Ｓ３（頸部）、ＤＵ１４５（前立腺）、Ｈ４６０（肺）、ＭＣＦ−７（乳房）、Ｋ５６２（白血球）、ＨＣＴ１１６（結腸）、ＨｅｐＧ２（肝臓）、Ｕ２ＯＳ（骨）、Ｔ９８Ｇ（脳）、およびＯＶＣＡＲ−３（卵巣））を使用する。本発明の抽出物に対する１１種の細胞株の反応を、以下の４つの群に分類することができる：（Ａ）最高の感受性：卵巣（図１４を参照のこと）、（Ｂ）感受性：膀胱、骨、（Ｃ）半感受性：前立腺、白血球、肝臓、乳房、および脳、（Ｄ）最も低い感受性：結腸、子宮頸管、および肺。図１６Ａ、Ｂ、Ｃを参照のこと。各ＩＣ５０値を、表３．１に列挙する。
【００４９】
【表２】
2008513360.tif 000019
【００５０】
ブンカンカの活性化合物を同定するために、ブンカンカの抽出物を、ＦＰＬＣ（中高圧液体クロマトグラフィ）およびＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）によって分離した。ＦＰＬＣ手順（すなわち、例えば、図９を参照のこと）およびＨＰＬＣ（すなわち、図８を参照のこと）によって複数の画分が得られた。図８に示すように、ＨＰＬＣによる画分の分析により、抽出物が２６の同定可能な画分（ａ〜ｚと名付けた）を含むことが示された。これらの画分の抗癌活性を、ＭＴＴアッセイによって測定した。
【００５１】
ＨＰＬＣ（すなわち、例えば、図８を参照のこと）における画分Ｙに対応するＦＰＬＣ画分５９６２（すなわち、例えば、図１０を参照のこと）は、抗癌活性を有する。化合物Ｙを、画分Ｙから精製することができる。画分５９６２を、４つの成分にさらに分離し、これらを、Ｙ１〜Ｙ４と名付けた。図１１を参照のこと。化合物Ｙ１〜Ｙ４を、画分５９６２から精製することができる。画分６３６５を、５〜６つの成分にさらに分離し、これらはＹ５〜Ｙ１０と名付けた。図１２を参照のこと。化合物Ｙ５〜Ｙ１０を、画分６３６５から精製することができる。化合物Ｙ（すなわち、Ｙ３）、Ｙ１、およびＹ２は、強い抗腫瘍活性を示し（すなわち、例えば、図２〜３を参照のこと）、したがって、これらを単離および精製した。同様に、化合物Ｙ８、Ｙ９、およびＹ１０も、強い抗腫瘍活性を示し（すなわち、例えば、図を参照のこと）、したがって、これらを単離および精製した。図１３を参照のこと。したがって、これらの活性化合物（すなわち、Ｙ、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ８、Ｙ９、およびＹ１０）の構造およびその使用は、本発明の主題である。
【００５２】
卵巣癌細胞に体する本発明の化合物の阻害効果を、ＭＴＴアッセイを使用して評価した。化合物Ｙは、図１４に示す元の粗抽出物（ＩＣ５０＝２０μｇ／ｍｌ）の１０倍の効力（ＩＣ５０＝１．５μｇ／ｍｌ）（すなわち、例えば、図２を参照のこと）を示す。異なる細胞株に対する化合物Ｙの選択性を試験し、化合物Ｙが、子宮頸癌細胞と比較して、卵巣癌細胞ではるかに高い効力を有することが見出された。図１５を参照のこと。
【００５３】
本発明は、植物、ハーブ、または植物抽出物から生物活性化合物を同定および単離する方法を提供する。１つの実施形態では、抽出物には、ブンカンカまたはムクロジ科由来の植物の抽出物が含まれる。本発明は、ブンカンカまたはムクロジ科由来の植物から単離した６つの生物活性化合物の化学構造を提供する。本発明の化合物の構造を、図１に示す。本発明は、構造配置を補助するためのスペクトルデータ（Ｈ−ＮＭＲ、Ｃ−１３−ＮＭＲ、二次元ＮＭＲ（ＨＭＢＣ、ＨＭＱＣ、ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ）、およびＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＥＭＳ−ＭＳ））を提供する。
【００５４】
本発明は、画分Ｙから精製された生物活性化合物由来のコンセンサスサブ構造または官能基を提供する。化合物（Ｙ（すなわち、Ｙ３）、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ８、Ｙ９、およびＹ１０など）を、画分Ｙから単離し、これらを集合的に「Ｙｓ」といい、その一般名は、Ｘａｎｉｆｏｌｉａ−Ｙｓである。これらの化合物のコンセンサスサブ構造または官能基は、隣接炭素上に存在するジアンゲロイル基である。例えば、化合物Ｙ、Ｙ２、Ｙ８、およびＹ１０では、ジアンゲロイル基は、トリテルペン骨格の２１βおよび２２αに存在する。図５を参照のこと。化合物Ｙ１およびＹ９では、ジアンゲロイル基は、糖環のＣ３およびＣ４に存在する。図６を参照のこと。したがって、本発明の活性化合物のジアンゲロイル基は、互いにトランス位で構造上に存在する。図７を参照のこと。本発明の化合物の生物活性官能基が構造中に存在する隣接炭素とトランスで結合したジアンゲロイル基であることが示された。図７を参照のこと。本発明は、上記化合物の塩を提供する。
【００５５】
本発明は、上記化合物および適切なキャリアを含む組成物を提供する。本発明は、有効量の上記化合物および薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。本発明は、抗卵巣癌薬または上記組成物を含む組成物を提供する。本発明は、癌成長に有効な組成物を提供する。癌には、膀胱癌、骨肉腫、および卵巣癌が含まれるが、これらに限定されない。本発明は、皮膚癌およびＫＢ癌成長に有効な組成物を提供する。本発明は、腫瘍成長を阻害することができる上記化合物およびその塩、エステル、誘導体、または代謝産物を含む組成物を提供する。本発明は、上記化合物およびその塩、エステル、誘導体、または代謝産物を含む、ウイルスの成長および／または活性を阻害するための組成物を提供する。
【００５６】
本発明は、溶血活性能力のある上記化合物およびその塩、エステル、誘導体、または代謝産物を含む組成物を提供する。図７３を参照のこと。２つのアンゲロイル基を有する本発明の化合物が１つのアンゲロイル基を含む化合物より強い抗癌活性を有することを示した。図６５、２、３を参照のこと。２つのアンゲロイル基を有する化合物は、１つのアンゲロイル基を含む化合物より強い溶血活性を有する。図７３Ａを参照のこと。化合物は、アンゲロイル基が除去された場合、溶血活性が喪失する図７３Ｂを参照のこと。本発明の化合物またはその誘導体を、化学合成によって得ることができるか、天然供給源または生物供給源（ムクロジ科由来の植物が含まれる）から単離する。２つのアンゲロイル基を有するサポニン化合物が、溶血活性に関連する疾患の治療についてエシンよりも効力が高いことが示された。図７３Ａを参照のこと。
【００５７】
本発明は、慢性静脈不全、末梢浮腫、抗抗止血、慢性静脈疾患、静脈瘤疾患、静脈瘤性症候群、静脈鬱滞、去痰薬、脳−器官痙攣、脳循環障害、脳浮腫、精神病、月経困難症、会陰切開術、血液様疾患、末梢浮腫形成、または術後腫脹の治療、脚の疼痛症状、そう痒、脚の堆積の低下（ｌｏｗｅｒ  ｌｅｇ  ｖｏｌｕｍｅ）の軽減、血栓症、血栓性静脈炎の軽減、および胃潰瘍の防止（抗痙攣薬）のための組成物を提供する。本発明は、抗ＭＳ、抗動脈瘤、抗喘息薬、抗運動緩慢薬、抗毛細管出血薬、抗頭痛薬、抗頸腕薬、抗子癇薬、抗浮腫薬、抗脳炎薬、抗喉頭蓋薬、抗滲出薬、抗インフルエンザ薬、抗骨折薬、抗歯肉炎薬、抗血腫薬、抗疱疹薬、抗ヒスタミン薬、抗関節炎薬、抗髄膜炎薬、酸化防止剤、抗歯周病薬、抗静脈炎薬、抗胸膜炎薬、抗嗄声薬、抗鼻炎薬、抗扁桃炎薬、抗潰瘍薬、抗静脈瘤薬、抗めまい薬、制癌薬、糖質ステロイド生成薬、利尿薬、殺真菌薬、溶血薬、ヒアルロニダーゼインヒビター、リンパ生成促進薬、ナトリウム利尿薬、殺虫剤、脳下垂体賦活薬、胸腺溶解薬、血管保護薬、血管緊張薬のための組成物を提供する。
【００５８】
ブンカンカ抽出物の画分Ｒおよび画分Ｏから他の化合物も単離し、これらをそれぞれＲ１およびＲ５４と名付けた。両化合物は、トリテルペノイドサポニンである。両化合物は、トリテルペン骨格中または糖環中にジアンゲロイル結合を欠く。予備実験により、Ｒ１およびＯ５４は、抗癌活性を持たないことが示された。
【００５９】
化合物Ｒ１
化合物Ｒ１の構造を、以下および図４７に示す。化合物Ｒ１は、化学式Ｃ65Ｈ106Ｏ29および化学名３−Ｏ−［アンゲロイル−（１→３）−β−Ｄ−グルコピラノシル（１→６）］−β−Ｄ−グルコピラノシル−２８−Ｏ−［α−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→２）−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−３β，２１β，２２α，２８−テトラヒドロキシオレアン−１２−エン（Ｘａｎｉｆｏｌｉａ−Ｒ１としても公知）を有する。
【化１６】
2008513360.tif 000020
【００６０】
本構造の配置は、スペクトルデータ（すなわち、Ｈ−ＮＭＲ、Ｃ１３−ＮＭＲ、二次元ＮＭＲ（ＨＭＢＣ、ＨＭＱＣ、ＣＯＳＹ）およびＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＥＭＳ））によって支持されている。したがって、本化合物は、図４８〜５２に示す固有性を有する。
【００６１】
化合物Ｏ５４
本発明は、ブンカンカ抽出物から単離した化合物Ｏ５４を提供する。Ｏ５４の構造を測定し、式Ｃ60Ｈ100Ｏ28を有する。化合物Ｏ５４の構造を、以下に示す。図５３も参照のこと。
【化１７】
2008513360.tif 000021
【００６２】
化合物Ｏ５４の化学名は、３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル（１→６）］−β−Ｄ−グルコピラノシル−２８−Ｏ−［α−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→２）−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−３β，２１β，２２α，２８−テトラヒドロキシオレアン−１２−エン（Ｘａｎｉｆｏｌｉａ−Ｏ５４としても公知）である。本構造の配置は、スペクトルデータ（すなわち、１Ｈ−ＮＭＲ、二次元ＮＭＲ（ＨＭＢＣ、ＨＭＱＣ）によって支持されている。したがって、本化合物は、図５４〜５６に示す固有性を有する。
【００６３】
化合物Ｙｓ、Ｒ1、およびＯ５４に加えて、ブンカンカ抽出物の画分Ｘから他の化合物も単離し、これを本明細書中でＸと名付けた。その構造を測定した。化合物は、トリテルペンのＣ２２に結合したアンゲロイル基を有するトリテルペノイドサポニンである。
【００６４】
化合物Ｘ
本発明は、ブンカンカ抽出物から単離した、「化合物Ｘ」と名付けた活性化合物を提供する。化合物Ｘは、アグリコンのＣ−３に結合したトリサッカリド鎖およびＣ−２２でアシル化した１つのアンゲロイル基を含むオレアネントリテルペノイドサポニンである。化合物Ｘの式は、Ｃ58Ｈ92Ｏ22であり、化合物Ｘの化学名は、３−Ｏ−｛［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−［α−Ｌ−アラビノフラノシル（１→３）］−β−Ｄ−グルクロノピラノシドブチルエステル｝−２１−Ｏ−アセチル−２２−Ｏ−アンゲロイル−３β，１６α，２１β，２２α，２８−ペンタヒドロキシオレアン−１２−エンである。化合物Ｘの化学構造を、以下に示す。図７０も参照のこと。
【化１８】
2008513360.tif 000022
【００６５】
本発明は、夜尿症および頻尿の治療、中枢神経系機能（熟睡から目を覚ますか膀胱を弛緩させ、それにより、膀胱がより多くの尿を貯蔵することができるようにするための膀胱のシグナル伝達が含まれる）の改善のための本発明の化合物を含む組成物を提供する。本発明の化合物を使用して、老化、ストレス、緊張症、活動亢進、不安定、反射亢進、および無抑制膀胱による排尿筋の緊張をほぐすことができる。別の実施形態では、アセチルコリン（Ａｃｈ）によって誘導される萎縮膀胱組織の弛緩のために化合物を使用することができる。ブンカンカ抽出物から同定および単離された化合物を、尿の体積を減少させる抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）を調節するためのアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥインヒビター）および抗炎症薬として使用することができる。
【００６６】
本発明の化合物を、膀胱成長の促進、熟睡の抑制、就寝中の被験体の敏捷性の増加、抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）、およびその受容体の放出、破壊、および取り込みの調整、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）およびその受容体の分泌、破壊、および取り込みの調整、５−ヒドロキシトリプタミンおよびその受容体の放出、破壊、および取り込みの調整、アセチルコリン（Ａｃｈ）およびその受容体の放出、破壊、および取り込みの調整、アドレナリン（ＡＤ）およびその受容体の放出、破壊、および取り込みの調整、ドーパミン（ＤＡ）およびその受容体の放出、破壊、および取り込みの調整、ノルエピネフリンおよびその受容体の放出、破壊、および取り込みの調整、睡眠麻酔の防止、神経ペプチドおよびその受容体の形成、放出、破壊、および活性の調整のために使用することができる。
【００６７】
本発明は、癌の阻害、ウイルスの阻害、脳の老化の防止、記憶の改善、脳機能の改善、夜尿症、頻尿、尿失禁、認知症、アルツハイマー病、自閉症、脳外傷、パーキンソン病、または脳機能障害に起因する他の疾患の治癒、関節炎、リウマチ、循環不良、動脈硬化、レイノー症候群、狭心症、心疾患、冠状動脈性心疾患、頭痛、めまい、腎臓障害、脳血管障害の治療、ＮＦ−κＢ活性化の阻害、脳浮腫、重症急性呼吸器症候群、ウイルス性呼吸器疾患、慢性静脈不全、高血圧、慢性静脈疾患、抗浮腫疾患、抗炎症性疾患、血液様疾患、末梢浮腫形成、静脈瘤疾患、インフルエンザ、外傷後浮腫、および術後腫脹の治療、エタノール吸収の阻害、血糖値の低下、アドレノコルチコトロピンおよびコルチコステロンレベルの調節、性交不能症、早漏、または糖尿病の治療のための本発明の化合物を含む組成物を提供する。２００５年２月１４日に出願された米国特許出願番号１０／９０６，３０３号、２００４年１２月２３日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／４３４６５号、２００４年１０月８日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／３３３５９号、および２００５年５月１７日に出願された米国特許出願番号１１／１３１，５５１号（その内容が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００６８】
本発明は、膀胱細胞の酵素活性を調節することができる組成物を提供する。本発明のブンカンカ由来の化合物および／または組成物は、細胞の種々の成分または受容体を調節し、細胞成長過程を強化することができる。ブンカンカ由来の化合物および／または組成物は、細胞酵素の活性を調節する。２００５年４月２７日に出願された６０／６７５，２８４号（その内容が、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。本発明は、細胞増殖に関与する経路を調節することができるブンカンカ、またはその誘導体もしくは代謝産物から単離した化合物を提供する。２００５年２月１４日に出願された米国特許出願番号１０／９０６，３０３号、２００４年１２月２３日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／４３４６５号、２００４年１０月８日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／３３３５９号（その内容が、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００６９】
本発明は、植物から精製および単離されたトリテルペノイドサポニンの方法および使用を提供する。本発明は、腫瘍成長の阻害のためのトリテルペノイドサポニンまたはその誘導体を含む組成物を提供する。本発明の化合物は、そのサポンゲニン（ｓａｐｏｎｇｅｎｉｎ）の炭素２１および２２に結合したアンゲロイル基、チグロイル基、セネシオイル基、またはこれらの組み合わせを含む。１つの実施形態では、化合物は、そのサポンゲニンの炭素２１および２２に結合する糖環に結合した任意の２つのアンゲロイル基、チグロイル基、セネシオイル基、またはこれらの組み合わせを含み得る。生物活性化合物を、天然植物（ムクロジ科植物（１４０〜１５０の属の約１４００〜２０００種）が含まれる）から単離することができる。２００５年４月２７日に出願された６０／６７５，２８２号を参照のこと。
【００７０】
まとめ
本発明は、ブンカンカの植物抽出物から生物活性化合物を同定および精製する方法を提供する。これまで８つの生物活性化合物を同定および精製し、そのうちの６つが抗癌活性を有することが示された。これらの化合物を、集合的に、トリテルペノイドサポニンを呼ぶ。コンセンサスサブ構造を、本発明の生物活性化合物の構造から同定するか誘導した。生物活性化合物のコンセンサスサブ構造または活性官能基は、隣接炭素上に存在するジアンゲロイル基である。アンゲロイル基は、トリテルペン骨格の２１βおよび２２αに存在するか（すなわち、図５を参照のこと）、糖環のＣ３およびＣ４に存在する（すなわち、図６を参照のこと）。したがって、これらの生物活性化合物のジアンゲロイル基は、構造の隣接炭素中にトランス位でアシル化されている。図７を参照のこと。１つのアンゲロイル基を有する化合物は、２つのアンゲロイル基を有する化合物よりも抗癌活性が弱い（すなわち、図６５、２、３を参照のこと）。１つのアンゲロイル基を有する化合物は、２つのアンゲロイル基を有する化合物よりも溶血活性が低い（すなわち、図７３を参照のこと）。本発明の化合物の構造または誘導体を、化学合成または生物供給源から得ることもできる。
【００７１】
本発明は、以下の実施例からより深く理解される。しかし、当業者は、考察された特定の方法および結果は本発明の例示に過ぎず、以下の特許請求の範囲により詳述されていることを容易に認識する。
【実施例】
【００７２】
実験の詳細
実験１：ハーブの抽出
（ａ）ブンカンカの皮、枝、幹、葉、核種、根、または樹皮の粉末を有機溶媒にて１：２の比率でそれぞれ２０〜３５時間４〜５回抽出して有機抽出物を形成し、（ｂ）機抽出物を回収し、（ｃ）機抽出物を８０℃で２〜３回還流して第２の抽出物を形成し、（ｄ）第２の抽出物から有機溶媒を除去し、（ｅ）第２の抽出物を乾燥および滅菌してブンカンカの抽出粉末を形成する。
【００７３】
実験２：ＨＰＬＣクロマトグラフィによるブンカンカ抽出成分の分析
方法
ＨＰＬＣ。Ｃ−１８逆相μｂｏｎｄａｐａｋカラム（Ｗａｔｅｒ  Ｐ／Ｎ２７３２４）を、１０％アセトニトリル、０．００５％トリフルオロ酢酸（平衡溶液）で平衡化する。実験１に記載の方法を使用して調製したブンカンカを、平衡溶液（１ｍｇ／ｍｌ）に溶解し、カラムにアプライした。２０μｇのサンプルを、カラムにアプライした。溶離条件：１０％から８０％までのアセトニトリル勾配にて７０分間画分を溶離し（流速０．５ｍｌ／分）、次いで、１０分間８０％のままにした。次いで、アセトニトリル濃度を１０％に減少させ、２５分間１０％のままにした。画分を、２０７ｎｍでモニタリングし、０．２５ｃｍ／分のチャート速度および０．１２８のＯＤフルスケールでチャートに記録した。
【００７４】
装置。Ｗａｔｅｒｓ  Ｍｏｄｅｌ  ５１０  Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｗａｔｅｒｓ  ４８４  ｔｕｎａｂｌｅ  Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ；Ｗａｔｅｒｓ  ７４５／７４５Ｂ  Ｄａｔａ  Ｍｏｄｕｌｅ。
【００７５】
吸収分析。種々の波長でのブンカンカの吸収プロフィールを測定した。本発明のブンカンカ抽出物を、１０％アセトニトリル／ＴＦＡに溶解し、分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｉｎｓ．Ｍｏｄｅｌ  Ｇｅｎｅ  Ｓｙｓ２）を使用して、２００〜７００ｎｍでスキャンした。
【００７６】
結果
ＨＰＬＣ。プロフィール中で約６０〜７０のピークを明らかにすることができた。これらのうちの４つは、主なピークであり、１０個が中程度のサイズであり、残りが小さな画分である。ピークに高濃度のアセトニトリル溶離後からａ〜ｚで印をつける。図８を参照のこと。
【００７７】
吸収極大。ブンカンカ植物抽出物について、３つの吸収極大が同定された：２０７ｎｍ、２７８ｎｍ、および５００ｎｍ。図５７を参照のこと。
【００７８】
実験３：ＭＴＴアッセイを使用した異なるヒト器官由来の癌細胞でのブンカンカ抽出物によって影響を受けた細胞成長活性の測定
方法と材料
細胞。以下のヒト癌細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した：ＨＴＢ−９（膀胱）、ＨｅＬａ−Ｓ３（頸部）、ＤＵ１４５（前立腺）、Ｈ４６０（肺）、ＭＣＦ−７（乳房）、Ｋ５６２（白血球）、ＨＣＴ１１６（結腸）、ＨｅｐＧ２（肝臓）、Ｕ２ＯＳ（骨）、Ｔ９８Ｇ（脳）、およびＯＶＣＡＲ−３（卵巣）。細胞を、１０％ウシ胎児血清、グルタミン、および抗生物質を補足した培養培地（ＨｅＬａ−Ｓ３、ＤＵ１４５、ＭＣＦ−７、Ｈｅｐ−Ｇ２、およびＴ９８Ｇを含むＭＥＮ（Ｅａｒｌｅの塩）；ＨＴＢ−９、Ｈ４６０、Ｋ５６２、ＯＶＣＡＲ−３を含むＲＰＭＩ−  １６４０；ＨＣＴ−１１６、Ｕ２ＯＳを含むＭｃＣｏｙ−５Ａ）中にて、３７℃の５％ＣＯ2加湿インキュベーターで成長させた。
【００７９】
ＭＴＴアッセイ。ＭＴＴアッセイの手順は、わずかに修正した（Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）に記載の方法にしたがった。細胞を、９６ウェルプレートに、１０、０００／ウェル（ＨＴＢ−９、ＨｅＬａ、Ｈ４６０、ＨＣＴ１１６、Ｔ９８Ｇ、ＯＶＣＡＲ−３）、１５、０００／ウェル（ＤＵ１４５、ＭＣＦ−７、ＨｅｐＧ２、Ｕ２ＯＳ）、または４０、０００／ウェル（Ｋ５６２）の濃度にて薬物処置前に２４時間播種した。次いで、細胞を薬物に４８時間曝露した（ＨｅｐＧ２、Ｕ２ＯＳについては７２時間、ＭＣＦ−７については９６時間）。薬物処置後、ＭＴＴ（０．５ｍｇ／ｍｌ）を、培養物に１時間添加した。ホルマザン（生存細胞によるテトラゾリウムの還元産物）の形成後、ＤＭＳＯで溶解し、４９０ｎｍにおけるＯ．Ｄ．を、ＥＬＩＳＡリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ．Ｍｏｄｅｌ  ＭＲ７００）によって測定した。薬物処置前の細胞のＭＴＴレベルも測定した。細胞成長率（％Ｇ）を、以下の式：
（数１）
％Ｇ＝（ＴＤ−ＴＯ／ＴＣ−ＴＯ）×１００    （１）
（式中、ＴＣまたはＴＤは、コントロールまたは薬物処置細胞のＯ．Ｄ．読み取りを示す）で計算する。Ｔ０＞ＴＤの場合、コントロールに対する％で示す細胞傷害性（ＬＣ）を、以下の式：
（数２）
％ＬＣ＝（ＴＤ−ＴＯ／ＴＯ）×１００    （２）
で計算する。
【００８０】
結果
１１の細胞株研究のうち、植物抽出物の曝露後に細胞成長阻害が認められた。しかし、ブンカンカ抽出物に対するその感受性は異なる。ブンカンカ抽出物に対する細胞株の応答を、以下の４つの群に分類することができる：最高の感受性（すなわち、卵巣）、感受性（すなわち、膀胱、骨）、半感受性（すなわち、前立腺、白血球、肝臓、乳房、および脳）、最も低い感受性（すなわち、結腸、子宮頸管、および肺）。図１４、１５、１６Ａ〜Ｄを参照のこと。そのＩＣ５０値を、上記の表３．１に列挙する。
【００８１】
細胞成長阻害に加えて、ブンカンカ植物抽出物はまた、膀胱、骨、および肺のわずかな細胞成長を低濃度で刺激する。結果は、抽出物中に細胞または組織の刺激成分が存在することを示す。図１６Ａおよび１６Ｄを参照のこと。
【００８２】
ブンカンカ植物抽出物の阻害成分を調査するために、植物抽出物を作製した。図１０は、ＦＰＬＣクロマトグラフィ後に得られた画分の細胞成長阻害活性についてのスクリーニングの結果を示す。膀胱細胞を使用してアッセイを行った。図９に示すように、ＦＰＬＣから得た画分を使用した。図９に示すように、ブンカンカ抽出物の異なる成分は、細胞に対して成長または阻害効果を発揮した。画分Ｙと名付けた画分５９６２のみが、細胞成長を阻害した。横座標：濃度（μｇ／ｍｌ）。縦座標：細胞成長率（ＭＴＴアッセイによって測定）。
【００８３】
実験４：ブンカンカ抽出物中の阻害成分の精製
（Ａ）ＦＰＬＣでの植物抽出物の分画
方法
カラム。オクタデシル官能化シリカゲル。カラム寸法：２ｃｍ×２８ｃｍ（使用前に１０％アセトニトリル−０．００５％ＴＦＡで平衡化する）。
サンプルローディング：１〜２ｍｌ、濃度：１００ｍｇ／ｍｌを含む１０％アセトニトリル／ＴＦＡ。
勾配溶離条件：総体積が５００ｍｌの１０〜８０％アセトニトリル。
モニターする吸収波長：２５４ｎｍ。
フラクションコレクター：５ｍｌ／画分（１０％〜７２％アセトニトリルを回収）
装置：ＡＫＴＡ−ＦＰＬＣ，Ｐ９２０ポンプ；Ｍｏｎｉｔｏｒ  ＵＰＣ−９００；Ｆｒａｃ−９００。
【００８４】
結果
クロマトグラフィの溶離プロフィールは、４〜５つの広い画分を示す。図９を参照のこと。これらの画分を、ＨＰＬＣを使用して分析した。次いで、図８で特定したａ〜ｚに対応する特定の成分を、これらのＦＰＬＣ画分中に割り当てる。次いで、ＦＰＬＣ画分を、７つのプールに分類し、ＭＴＴアッセイを使用して、膀胱細胞の細胞成長活性について分析する。実験３を参照のこと。ＨＰＬＣにおける画分Ｙに対応するプール番号５９６２のみが阻害活性を含むことが見出された。図１０を参照のこと。６２を超える画分も阻害活性を示すこともその後の実験で認められた。画分６３〜６５から単離した成分が阻害活性を示した。図４、１２、および１３を参照のこと。
【００８５】
（Ｂ）分離ＨＰＬＣでの成分Ｙｓの単離
方法
カラム：分離ＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｄｅｌｔａ  Ｐａｋ  Ｃ１８−３００Ａ）；
溶離条件：ｒｙｕｕｓｏｋｕ１ｍｌ／分での４５％アセトニトリル定組成溶離。
画分を２０７ｎｍでモニタリングし、回収し、凍結乾燥した。
【００８６】
結果
Ｙ画分の最終分離を、分離カラムを使用したＨＰＬＣによって行った。図１１および１２を参照のこと。これらの画分（化合物Ｙ１、Ｙ２、Ｙ（すなわち、Ｙ３）、およびＹ４を含む）を回収した。化合物Ｙのリクロマトグラフィにより、Ｃ１８逆相カラムを使用したＨＰＬＣにおいて１つのピークが示された。図１１Ａおよび１１Ｂを参照のこと。化合物Ｙ８、Ｙ９、およびＹ１０のリクロマトグラフィにより、Ｃ１８逆相カラムを使用したＨＰＬＣにおいて１つのピークが示された。図１３を参照のこと。
【００８７】
（Ｃ）外観および可溶性
純粋な化合物Ｙｓは無定形の白色粉末であり、アルコール水溶液（すなわち、メタノールまたはエタノール、５０％アセトニトリル、および１００％ピリジン）に溶解する。
【００８８】
（Ｄ）ＭＴＴアッセイを使用した化合物Ｙの阻害分析
ＭＴＴアッセイを使用して、化合物Ｙの阻害分析を行った。図２は、化合物Ｙが卵巣癌細胞（ＯＣＡＲ−３）に対して活性を有し、そのＩＣ５０値は１．５μｇ／ｍｌであり、図１４に示す非精製抽出物の１０〜１５倍であることを示す。図１５は、子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）と比較した卵巣癌細胞に対する化合物Ｙの選択性を示す。図３は、卵巣癌細胞（ＯＣＡＲ−３）の成長に対する化合物Ｙ１およびＹ２の阻害活性を示す。図４は、卵巣癌細胞（ＯＣＡＲ−３）の成長に対する化合物Ｙ、Ｙ８、Ｙ９、およびＹ１０の阻害活性を示す。
【００８９】
実験５：化学構造の測定
方法
ＮＭＲ分析。ブンカンカの純粋な化合物Ｙを、０．０５％ｖ／ｖ  ＴＭＳを含むピリジンＤ５中に溶解した。２９８ＫでＱＸＩプローブ（１Ｈ／１３Ｃ／１５Ｎ／３１Ｐ）を具備したＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ６００ＭＨｚ  ＮＭＲ分光計を使用して、全ＮＭＲスペクトルを得た。一次元１Ｈスペクトルのスキャン数は、サンプル濃度に依存して、１６〜１２８であった。二次元ＨＭＱＣスペクトルを、スペクトル幅６０００×２４，０００Ｈｚおよびデータポイント数２０２４×２５６でｔ２およびｔ１のディメンジョンでそれぞれ記録した。スキャン数は、４〜１２８であった。二次元ＨＭＢＣを、スペクトル幅６０００×３０，０００Ｈｚおよびデータポイント数２０２４×５１２でｔ２およびｔ１のディメンジョンでそれぞれ得た。スキャン数は、６４であった。二次元データを、ｔ１ディメンジョンでゼロ充填してデータポイントを倍増し、ｔ１およびｔ２ディメンジョンの両方におけるコサインスクエアベル時間枠関数（ｃｏｓｉｎｅ−ｓｑｕａｒｅ−ｂｅｌｌ  ｗｉｎｄｏｗ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を掛け、ＸＷＩＮ−ＮＭＲソフトウェアを使用してフーリエ変換した。ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣについてのこれらの二次元スペクトルの最終実行列サイズは、それぞれ、２０４８×３５６データポイントおよび２０４８×５１２データポイント（Ｆ２×Ｆ１）である。
【００９０】
マススペクトル分析。サンプルの質量を、（Ａ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析および（Ｂ）ＥＳＩ−ＭＳ質量分析によって分析した。（Ａ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦのサンプルを、最初にアセトニトリルに溶解し、次いで、マトリクスＣＨＣＡ（すなわち、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸）（１０ｍｇＣＨＣＡ／ｍＬを含む５０：５０の水／アセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡ（最終濃度））と混合した。標準を使用した高分解能質量分析装置を使用して、分子量を測定した。（Ｂ）ＥＳＩについて、サンプルを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ製のＬＣＱ  ＤＥＣＡ  ＸＰ  Ｐｌｕｓ装置を使用して分析した。サンプルをＥＳＩイオン源でイオン化し、化合物用の溶媒はアセトニトリルである。
【００９１】
結果
プロトンＮＭＲのプロフィールを、図１８に示す。ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣの二次元ＮＭＲプロフィールを、図１９および２０にそれぞれ示す。これらのデータ由来の官能基の二次元ＮＭＲ化学シフトデータおよび割り当てを表５．１にまとめている。これらのデータおよび分析に基づいて、化合物Ｙ（Ｙ３）の構造を、以下に示すように割り当てる。
【００９２】
化合物Ｙの構造（図１７を参照のこと）
【化１９】
2008513360.tif 000023
Ｙの化学名は、３−Ｏ−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−α−Ｌ−アラビノフラノシル（１→３）−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１，２２−Ｏ−ジアンゲロイル−３β，１５α，１６α，２１β，２２α，２８−ヘキサヒドロキシオレアン−１２−エンである。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよびＥＳＩ−ＭＳによって測定したＹのマススペクトル（すなわち、図２１、２２を参照のこと）は、化合物Ｙの質量が１１４０．５７であり、これは、化合物Ｙの質量の理論値と一致することを示す。
【００９３】
結論
ブンカンカ抽出物から単離した活性化合物Ｙは、アグリコンのＣ−３に結合したトリサッカリド鎖ならびにＣ−２１およびＣ−２２でアシル化した２つのアンゲロイル基を含むオレアネントリテルペノイドサポニンである。Ｙの式は、Ｃ57Ｈ88Ｏ23であり、化合物Ｙの化学名は、３−Ｏ−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−α−Ｌ−アラビノフラノシル（１→３）−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１，２２−Ｏ−ジアンゲロイル−３β，１５α，１６α，２１β，２２α，２８−ヘキサヒドロキシオレアン−１２−エンである。
【００９４】
実験６：ブンカンカ抽出物のＹ１の化学構造の測定
方法
化合物Ｙ１のＮＭＲおよびＭＳ分析方法は、実験５に記載の方法と類似している。
【００９５】
結果
Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを、図２４に示す。ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、およびＣＯＳＹの二次元ＮＭＲスペクトルを、図２５、２６、および２７にそれぞれ示す。これらのデータ由来の官能基の化学シフトデータおよび割り当てを表６．１にまとめている。これらのデータおよび分析に基づいて、化合物Ｙ１の構造を、以下に示すように割り当てる。
【００９６】
化合物Ｙ１の構造（図２３を参照のこと）
【化２０】
2008513360.tif 000024
Ｙ１の化学名は、３−Ｏ−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−α−Ｌ−アラビノフラノシル（１→３）−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１−Ｏ−（３，４−ジアンゲロイル）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−２２−Ｏ−アセチル−３β，１６α，２１β，２２α，２８−ペンタヒドロキシオレアン−１２−エンである。
【００９７】
結論
ブンカンカ抽出物から単離した化合物Ｙ１は、骨格のＣ−３にトリサッカリド鎖およびＣ−２１にモノサッカリド部分を含み、２つのアンゲロイル基がＣ−３位およびＣ−４位でアシル化されている、ビスデスモジディックポリヒドロキシオレアネントリテルペノイドサポニンである。Ｙ１の式は、Ｃ65Ｈ100Ｏ27である。
【００９８】
実験７：ブンカンカ抽出物の化合物Ｙ２の化学構造の測定
方法
化合物Ｙ２のＮＭＲおよびＭＳ分析方法は、実験５に記載の方法と類似している。
【００９９】
結果
Ｙ２のＨ−ＮＭＲ、Ｃ−１３−ＮＭＲ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、および（ＴＯＣＳＹ）の一次元および二次元ＮＭＲスペクトルおよびＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を、図２９〜３４に示す。これらのデータ由来の官能基の一次元および二次元ＮＭＲ化学シフトデータおよび割り当てを表７．１にまとめている。
【０１００】
結論
これらのデータおよび分析に基づいて、ブンカンカ抽出物から単離した化合物Ｙ２は、アグリコンのＣ−３に結合したトリサッカリド鎖ならびにＣ−２１およびＣ−２２でアシル化した２つのアンゲロイル基を含むオレアネントリテルペノイドサポニンである。Ｙ２の化学式を以下に示す。図２８も参照のこと。
【０１０１】
【化２１】
2008513360.tif 000025
Ｙ２の式は、Ｃ57Ｈ88Ｏ24であり、Ｙ２の化学名は、３−Ｏ−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→２）］−α−Ｌ−アラビノフラノシル（１→３）−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１，２２−Ｏ−ジアンゲロイル−３β，１５α，１６α，２１β，２２α，２４β，２８−ヘプタヒドロキシオレアン−１２−エンである。
【０１０２】
実験７Ｂ。Ｙ４の化学構造分析
Ｙ４分析の結果
Ｙ４のプロトンＮＭＲのプロフィールを、図５８に示す。Ｙ４の二次元ＮＭＲ（ＨＭＱＣ）のプロフィールを、図５９に示す。
【０１０３】
実験８。ブンカンカ抽出物中の阻害成分Ｙ８〜Ｙ１０の精製
（Ａ）ＦＰＬＣ法を使用したブンカンカ抽出物成分の分画
方法
本実験方法は、実験４の（Ａ）項および（Ｂ）項に記載の方法と類似している。
【０１０４】
結果
溶離プロフィールは、４〜５つの広い画分を示す。図９を参照のこと。これらの画分を、ＨＰＬＣを使用して分析した。ＦＰＬＣ画分６３、６４、および６５を、４５％定組成分析によってさらに分離し、４〜５つの主な成分が分離された。図１２を参照のこと。これらの画分を、名称Ｙ８、Ｙ９、およびＹ１０に割り当てた。これらの画分を回収した。化合物Ｙ８、Ｙ９、およびＹ１０のリクロマトグラフィは、Ｃ１８逆相カラムを使用したＨＰＬＣ中で１つのピークを示した。図１３を参照のこと。
【０１０５】
（Ｂ）ＭＴＴアッセイを使用した阻害分析
ＭＴＴアッセイを使用して、精製した化合物の阻害分析を行った。結果は、化合物Ｙ８、Ｙ９、およびＹ１０が卵巣癌細胞に対して活性を有し、そのＩＣ５０値がそれぞれ３、４、および１．５μｇ／ｍｌであことを示す。図４を参照のこと。
【０１０６】
実験９。ブンカンカ抽出物の化合物Ｙ８の化学構造の測定
方法
化合物Ｙ８のＮＭＲおよびＭＳ分析方法は、実験５に記載の方法と類似している。
【０１０７】
結果
化合物Ｙ８のＨ−ＮＭＲ、Ｃ１３−ＮＭＲ、および二次元ＮＭＲ（ＨＭＱＣ）のスペクトルプロフィールを、図３６〜３８に示す。これらのデータ由来の官能基の一次元および二次元ＮＭＲ化学シフトデータおよび割り当てを表９．１にまとめている。これらのデータおよび分析に基づいて、ブンカンカ抽出物から単離した化合物Ｙ８は、アグリコンのＣ−３に結合したトリサッカリド鎖ならびにＣ−２１およびＣ−２２でアシル化した２つのアンゲロイル基を含むオレアネントリテルペノイドサポニンである。Ｙ８の式は、Ｃ57Ｈ87Ｏ23であり、Ｙ８の化学名は、３−Ｏ−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→２）］−α−アラビノフラノシル（１→３）−β−グルクロノピラノシル−２１，２２−Ｏ−ジアンゲロイル−３β，１６α，２１β，２２α，２４β，２８−ヘキサヒドロキシオレアン−１２−エンである。化合物Ｙ８の化学構造を、以下の図に示す。図３５も参照のこと。
【化２２】
2008513360.tif 000026
【０１０８】
実験１０。ブンカンカ抽出物の化合物Ｙ９の化学構造の測定
方法
化合物Ｙ９のＮＭＲおよびＭＳ分析方法は、実験５に記載の方法と類似している。
【０１０９】
結果
Ｙ９のＨ−ＮＭＲおよび二次元ＮＭＲ（すなわち、ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣ）のスペクトルプロフィールを、図４０〜４２に示す。これらのデータ由来の官能基の一次元および二次元ＮＭＲ化学シフトデータおよび割り当てを表１０．１にまとめている。これらのデータおよび分析に基づいて、ブンカンカ抽出物から単離した化合物Ｙ９は、骨格のＣ−３にトリサッカリド鎖およびＣ−２１にモノサッカリド部分を含み、２つのアンゲロイル基がＣ−３位およびＣ−４位でアシル化されている、ビスデスモジディックポリヒドロキシオレアネントリテルペノイドサポニンである。Ｙ９の式は、Ｃ65Ｈ100Ｏ27であり、Ｙ９の化学名は、３−Ｏ−［β−ガラクトピラノシル（１→２）］−α−アラビノフラノシル（１→３）−β−グルクロノピラノシル−２１−Ｏ−（３，４−ジアンゲロイル）−α−ラムノピラノシル−２８−Ｏ−アセチル−３β，１６α，２１β，２２α，２８−ペンタヒドロキシオレアン−１２−エンである。化合物Ｙ９の化学構造を、以下の図に示す。図３９も参照のこと。
【化２３】
2008513360.tif 000027
【０１１０】
実験１１。ブンカンカ抽出物の化合物Ｙ１０の化学構造の測定
方法
化合物Ｙ１０のＮＭＲおよびＭＳ分析方法は、実験５に記載の方法と類似している。
【０１１１】
結果
Ｈ−ＮＭＲ、Ｃ１３−ＮＭＲ、および二次元ＮＭＲ（ＨＭＱＣ）のプロフィールを、図４４〜４６に示す。これらのデータ由来の官能基の一次元および二次元ＮＭＲ化学シフトデータおよび割り当てを表１１．１にまとめている。これらのデータおよび分析に基づいて、ブンカンカ抽出物から単離した化合物Ｙ１０は、アグリコンのＣ−３に結合したトリサッカリド鎖ならびにＣ−２１およびＣ−２２でアシル化した２つのアンゲロイル基を含むオレアネントリテルペノイドサポニンである。Ｙ１０の式は、Ｃ57Ｈ87Ｏ22であり、Ｙ１０の化学名は、３−Ｏ−［β−ガラクトピラノシル（１→２）］−α−アラビノフラノシル（１→３）−β−グルクロノピラノシル−２１，２２−Ｏ−ジアンゲロイル−３β，１６α，２１β，２２α，２８−ペンタヒドロキシオレアン−１２−エンである。化合物Ｙ１０の化学構造を、以下の図に示す。図４３も参照のこと。
【化２４】
2008513360.tif 000028
【０１１２】
実験１２。ブンカンカ抽出物由来の成分Ｒの精製
（Ａ）ＦＰＬＣおよびＨＰＬＣを使用したブンカンカ抽出物成分の分画
方法
使用した方法は、（Ａ）項および（Ｂ）項で化合物Ｒの単離のためにＨＰＬＣで３０％アセトニトリル定組成溶離を使用したこと以外は、実験４に記載の方法に類似している。
【０１１３】
結果
ＦＰＬＣの勾配溶離由来の画分番号３９〜４１をプールし、定組成３０％アセトニトリル溶離を使用したＯＤＳ−Ｃ１８オープンカラムでさらに精製した。２つの群中の６つの同定可能な画分を回収した。画分６〜１３を、ＨＰＬＣを使用してさらに特徴づけた。これらの画分を、ＤｅｌｔａＰａｋカラムにおける３０％アセトニトリル定組成溶離を使用して４〜５つの成分にさらに分離した。本明細書中で「Ｒ１」と名付けた画分が主成分である。図６０Ａを参照のこと。その後、カラム溶離物から純粋なＲ１を回収した。図６０Ｂを参照のこと。
【０１１４】
（Ｂ）外観および可溶性
純粋なＲ１は無定形の白色粉末であり、アルコール水溶液（すなわち、メタノールまたはエタノール、５０％アセトニトリル、および１００％ピリジン）に溶解する。
【０１１５】
（Ｃ）Ｒ１の化学構造の測定
方法
Ｒ１のＮＭＲおよびＭＳ分析方法は、実験５に記載の方法と類似している。
【０１１６】
結果
純粋なＲ１のＮＭＲスペクトルを、図４８〜５２に示す。化学シフト分析に基づいて、ブンカンカ抽出物から単離した化合物Ｒ１は、５つの糖および糖部分に結合した１つのアンゲロイル基を含むトリテルペノイドサポニンである。化合物Ｒ１の化学構造を、以下の図に示す。図４７も参照のこと。
【化２５】
2008513360.tif 000029
【０１１７】
化合物Ｒ１の式は、Ｃ65Ｈ106Ｏ29であり、Ｒ１の化学名は、３−Ｏ−［アンゲロイル−（１→３）−β−Ｄ−グルコピラノシル（１→６）］−β−Ｄ−グルコピラノシル−２８−Ｏ−［α−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→２）−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−３β，２１β，２２α，２８−テトラヒドロキシオレアン−１２−エンである。
【０１１８】
実験１３：ブンカンカ抽出物由来の成分Ｏの精製
（Ａ）ＦＰＬＣおよびＨＰＬＣを使用したブンカンカ抽出物成分の分画
方法
使用した方法は、（Ａ）項および（Ｂ）項で化合物Ｏの単離のためにＨＰＬＣで２０％アセトニトリル定組成溶離を使用したこと以外は、実験４に記載の方法に類似している。
【０１１９】
結果
ＦＰＬＣから得た画分を、ＨＰＬＣを使用して分析した。元のサンプルのプロフィールと比較するために、特定の成分（この場合、画分Ｏ）を同定した（番号２８〜３０）。さらなる精製のために画分Ｏを回収した。溶離プロフィール中に１６の同定可能なＨＰＬＣ画分が認められた。図６１を参照のこと。画分２８、３４、および５４をさらに精製した。図６２を参照のこと。これらの精製された成分を、それぞれ、Ｏ２８、Ｏ３４、およびＯ５４と名付けた。
【０１２０】
（Ｂ）外観および可溶性
精製された化合物Ｏ２３およびＯ３４は、淡黄色の無定形粉末であり、アルコール水溶液（すなわち、メタノール、エタノール、５０％アセトニトリル、および１００％ピリジン）に溶解する。精製された化合物Ｏ５４は、白色の無定形粉末であり、アルコール水溶液（すなわち、メタノール、エタノール、５０％アセトニトリル、および１００％ピリジン）に溶解する。
【０１２１】
（Ｃ）Ｏ５４の構造分析
方法
Ｏ５４のＮＭＲおよびＭＳ分析は、実験５に記載の方法と類似している。
【０１２２】
結果
化合物Ｏ５４のＮＭＲスペクトルを、図５４〜５６に示す。化学シフト分析に基づいて、ブンカンカ抽出物から単離した化合物Ｏ５４は、Ｃ−３に結合したジッサリド鎖（β−Ｄ−グルクロノピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−グルクロノピラノシド）およびＣ−２８に結合したトリサッカリド鎖（α−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→２）−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−グルクロノピラノシルエステル）を含むビスデスモジディックポリヒドロキシオレアネントリテルペノイドグリコシドである。化合物Ｏ５４の化学構造を、以下の図に示す。図５３も参照のこと。
【化２６】
2008513360.tif 000030
【０１２３】
化合物Ｏ５４の式は、Ｃ60Ｈ100Ｏ28であり、Ｏ５４の化学名は、３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル（１→６）］−β−Ｄ−グルコピラノシル−２８−Ｏ−［α−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→２）−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−３β，２１β，２２α，２８−テトラヒドロキシオレアン−１２−エンである。
【０１２４】
実験１４：ブンカンカ抽出物由来の成分Ｘの精製
（Ａ）ＦＰＬＣおよびＨＰＬＣを使用したブンカンカ抽出物成分の分画
方法
使用した方法は、（Ａ）項および（Ｂ）項で化合物Ｘを含むＦＰＬＣ画分５６および５７を回収し、分離ＨＰＬＣでさらに分離した使用したこと以外は、実験４に記載の方法に類似している。
【０１２５】
結果
クロマトグラム中に５つの主なピークおよび７つの小さなピークが認められた。化合物Ｘは、溶離プロフィールの中央付近に溶離された（図６４）。化合物Ｘを回収し、凍結乾燥させた。
【０１２６】
（Ｂ）外観および可溶性
精製された化合物Ｘは白色粉末であり、５０％アセトニトリルに溶解する。
【０１２７】
（Ｃ）ＭＴＴアッセイを使用した化合物Ｘの阻害分析
ＯＶＣＡＲ−３細胞における化合物ＸのＭＴＴアッセイにより、いくらかの阻害活性が示された。化合物ＸのＩＣ５０は、約２７μｇ／ｍｌである。図６５を参照のこと。
【０１２８】
実験１５。ブンカンカ抽出物の化合物Ｘの化学構造の測定
方法
化合物ＸのＮＭＲおよびＭＳ分析方法は、実験５に記載の方法と類似している。
【０１２９】
結果
プロトンおよびＣ１３−ＮＭＲのプロフィールを、図６６および６９にそれぞれ示す。ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣの二次元ＮＭＲプロフィールを、図６７および６８に示す。これらのデータ由来の官能基の二次元ＮＭＲ化学シフトデータおよび割り当てを表１５．１にまとめている。これらのデータおよび分析に基づいて、以下に示すように化合物Ｘの構造を割り当てる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって測定した化合物Ｘのマススペクトルは、化合物Ｙの質量が１１４０．６０であり、これは、化合物Ｘの質量の理論値と一致することを示す。
【０１３０】
結論
ブンカンカ抽出物から単離した活性化合物Ｘは、アグリコンのＣ−３に結合したトリサッカリド鎖ならびにＣ−２２でアシル化した１つのアンゲロイル基を含むオレアネントリテルペノイドサポニンである。Ｘの式は、Ｃ58Ｈ92Ｏ22であり、化合物Ｘの化学名は、３−Ｏ−｛［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−［α−Ｌ−アラビノフラノシル（１→３）］−β−Ｄ−グルクロノピラノシドブチルエステル｝−２１−Ｏ−アセチル−２２−Ｏ−アンゲロイル−３β，１６α，２１β，２２α，２８−ペンタヒドロキシオレアン−１２−エンである。化合物Ｘの化学構造を、以下に示す。図７０も参照のこと。
【化２７】
2008513360.tif 000031
【０１３１】
実験１６：ブンカンカの化合物Ｙの溶血活性の測定
方法：
・ヒト全血を、ヒューストン ガルフコースト ブラッド センター（Ｈｏｕｓｔｏｎ  Ｇｕｌｆ  Ｃｏａｓｔ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ）から得た。
・赤血球を以下の方法によって単離した：ヒト血液（ＥＤＴＡ中）を、ＰＢＳと１：１に希釈し、４ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（ＳＩＧＭＡ）に重層し、４００ｇで３０分間遠心分離した。
・赤血球（ＲＢＣ）を回収し、ＰＢＳで３回洗浄した。
・使用前に、ＰＢＳを使用してＲＢＣの１０％懸濁液を調製した。
・５０μｌのＲＢＣ懸濁液を、異なる濃度の２ｍｌのサポニンに添加した。
・懸濁液をボルテックスによって混合し、室温で６０分間静置した。
・懸濁液を、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清の５４０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１３２】
結果
本実験では、Ｘａｎｉｆｏｌｉａ−Ｙ（番号６３Ｙ）、エシン、およびＳＩＧＭＡサポニン標準によるヒト赤血球の溶血活性を比較した。Ｙは２つのアンゲロイル基を含み、エシンは１つのアンゲロイル基を有し、ＳＩＧＭＡサポニン標準はキラヤ樹皮由来のサポニンの混合物である。結果は、番号６３Ｙ（化合物Ｙ）がエシンまたはＳＩＧＭＡサポニン標準（ＩＣ５０＝５μｇ／ｍｌ）よりも高い溶血活性を有する（ＩＣ５０＝１μｇ／ｍｌ）ことを示す。図７３Ａを参照のこと。
【０１３３】
実験１７：アルカリまたは酸による加水分解におるアンゲロイルまたは糖部分の除去後の化合物Ｙの溶血活性およびＭＴＴ活性の測定
方法：
（Ａ）Ｘａｎｉｆｏｌｉａ−Ｙのアルカリ加水分解。２０ｍｇのＸａｎｉｆｏｌｉａ−Ｙを、０．５ｍｌの１Ｍ  ＮａＯＨに溶解した。溶液を、８０℃の水浴中で４時間インキュベートした。これを、室温に冷却し、０．５ｍｌ  １Ｎ  ＨＣｌで中和した（約ｐＨ３に調整する）。混合物を、２ｍｌ  １−ブタノールで３回抽出した。ブタノール画分を回収し、凍結乾燥させた。加水分解サポニンを、ＨＰＬＣを使用して、２５％アセトニトリルで溶離するＣ−１８カラムにてさらに精製した。（Ｂ）Ｘａｎｉｆｏｌｉａ−Ｙの酸加水分解。１５ｍｇのＸａｎｉｆｏｌｉａ−Ｙを、１ｍｌのメタノールに溶解した。次いで、１ｍｌの２Ｎ  ＨＣｌを添加した。混合物を、８０℃の水浴中で５時間還流した。次いで、溶液を、２ｍｌ  １Ｎ  ＨＣｌで中和した（最終ｐＨ３〜４）。次いで、アグリコンを、３ｍｌの酢酸エチルで３回洗浄した。抽出物を回収し、プールした。８０％アセトニトリルの定組成溶離を使用したＨＰＬＣによって、アグリコン（糖を除去したＸａｎｉｆｏｌｉａ−Ｙ）をさらに単離した。
【０１３４】
結果：
化合物Ｙのアンゲロイル基または糖部分を、アルカリまたは酸による加水分解によってそれぞれ除去した。次いで、加水分解生成物の溶血活性を分析した。これらの研究の結果は、糖の除去によって溶血活性が減少するが、アンゲロイル基の除去によって溶血活性が破壊されることを示す。溶血活性に糖は役立つが不可欠ではないことも示唆される。図７３Ｂを参照のこと。実験結果は、アンゲロイル基が除去された場合に化合物ＹがＭＴＴ活性を喪失することを示す。しかし、化合物の糖部分を除去した場合、ＭＴＴ活性は非常に弱かった。図７３Ｃ、７３Ｄを参照のこと。化合物Ｙ、エシン、およびＳＩＧＭＡのサポニン標準の溶血活性の比較結果を、図７３Ａおよび７３Ｂに示す。化合物Ｙの間の溶血活性の比較結果により、糖部分またはアンゲロイル基を含まない化合物Ｙを図７３Ｂに示す。糖部分またはアンゲロイル基を含まない化合物Ｙの化学構造を、図７４および７４Ｂにそれぞれ示す。
【０１３５】
実験１８。化合物Ｙの抗ウイルス活性の測定
化合物Ｙの抗ウイルス活性の測定のための主な手順を以下に示す。
【０１３６】
Ａ．非致死投薬量の化合物Ｙをウイルス培養系に添加した後のＨＩＶウイルス産生を測定する。
【０１３７】
Ｂ．化合物Ｙとの接触後のＨＩＶウイルスの成長活性を測定する。これらの実験工程を以下に示す。
１．種々の期間における異なる投薬量の化合物ＹでＨＩＶを前処置する。
２．ウイルスから化合物Ｙを除去する。
３．処置したウイルスを細胞と混合する。
４．ウイルス産生を測定する。
５．負のコントロール：細胞中にウイルスなし
６．正のコントロール：非処置ウイルスを細胞と混合する
結果：化合物Ｙの処置後にウイルス成長が阻害された。
【０１３８】
実験結果の表
【表３】
2008513360.tif 000032
2008513360.tif 000033
【０１３９】
【表４】
2008513360.tif 000034
2008513360.tif 000035
【０１４０】
【表５】
2008513360.tif 000036
2008513360.tif 000037
【０１４１】
【表６】
2008513360.tif 000038
2008513360.tif 000039
【０１４２】
【表７】
2008513360.tif 000040
2008513360.tif 000041
【０１４３】
【表８】
2008513360.tif 000042
2008513360.tif 000043
【０１４４】
【表９】
2008513360.tif 000044
2008513360.tif 000045
【０１４５】
本発明を、特にその好ましい実施形態に関して詳述しているが、本発明は他の異なる実施形態が可能であり、詳細には、種々の自明の態様を修正することができると理解すべきである。当業者に容易に明らかなように、変形形態および修正形態をとることができる一方で、本発明の精神および範囲内に保持される。したがって、前述の開示、説明、および図面は例示のみを目的とし、本発明を決して制限せず、本発明は、特許請求の範囲のみによって定義される。
【０１４６】
参考
1. Carmichael, J., DeGraff, W.G., Gazdar, A.F., Minna, J. D. and Mitchell, J. B.: Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Res. 47:936-942 (1987).
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4. Zhang, Y., Zhang, H. Y., Li, W. P. 1995. Study on effects of Anjifu on improving intelligence, Chinese Bulletin of Pharmacology, 11(3): 233.
5. Yang, J., Wang, J., Feng, P. A. 2000. Study on effects of Naokkangtai capsule on improving learning and retention in mice, New Chinese Medicine and Clinical Pharmacology, 1(11 ): 29.
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7. Xia, W. J., Jin, M. W., Zhang, L. 2000. Study on treatment of senile dementia caused by angio-aging with Didang tang, Pharmacology and Clinical of Chinese Medicines, 16 (4).
8. Bian, H. M., Yu, J. Z., Gong, J. N. 2000. Study on effects of Tongmai Yizhi capsule on improving learning and retention in mice, Pharmacology and Clinical of Chinese Medicines, 16 (5): 40.
9. Wei, X. L., Zhang, Y. X. 2000. Study of animal model for studying senile dementia, Chinese journal of Pharmacology, 8(16): 372.
10. Bureau of Medicinal Police, Department of Public Health. Guide line for study of effect of medicines for treatment of nervous system diseases, in Guidebook of study of new medicine. p45.
11. Zhang, D. Sh., Zhang, J. T. 2000. Effects of crude Ginseng saponins on improving impairment induced by B- peptide, Chinese journal of Pharmacology, 8(16): 22.
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】本発明の６つの生物活性抗癌サポニン化合物の構造を示す図である。
【図２】精製された化合物Ｙの抗癌活性を示す図である。卵巣癌細胞（ＯＣＡＲ−３）について実験を行い、ＭＴＴアッセイによって阻害活性を測定した。詳細については、実験３を参照のこと。横座標：濃度（μｇ／ｍｌ）。縦座標：細胞成長率。ＩＣ５０は、約１〜１．５μｇ／ｍｌである。Ａ：ポイントスケール。Ｂ：リニアスケール。
【図３】卵巣癌細胞の成長に対する精製された化合物Ｙ１および化合物Ｙ２の阻害を示す図である。
【図４】ＭＴＴアッセイによって測定した、卵巣癌細胞に対するＹ、Ｙ８、Ｙ９、およびＹ１０の抗癌活性を示す図である。
【図５】本発明の４つの生物活性抗癌サポニン化合物（すなわち、Ｙ、Ｙ２、Ｙ８、およびＹ１０）由来のコンセンサス構造を示す図である。
【図６】本発明の２つの生物活性抗癌サポニン化合物（すなわち、Ｙ１およびＹ９）由来のコンセンサス構造を示す図である。
【図７】本発明の６つの生物活性抗癌サポニン化合物（すなわち、Ｙ、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ８、Ｙ９、およびＹ１０）由来の一般的な構造式を示す図である。（Ａ）コンセンサス活性官能基は、トリテルペン骨格の２１βおよび２２αに結合したジアンゲロイル基である。（Ｂ）コンセンサス活性官能基は、糖環（すなわち、ラムノース）のＣ３およびＣ４に結合したジアンゲロイル基である。１つの実施形態では、官能活性構造は、構造上にトランス位で存在するジアンゲロイル基である。
【図８】μｂｏｎｄａｐａｋ  Ｃ１８カラムを使用したＨＰＬＣによるブンカンカ抽出物の成分の分離を示す図である。実験の詳細を、実験２に示した。
【図９】１０〜８０％勾配を使用したＦＰＬＣにおけるブンカンカ抽出物の溶離プロフィールを示す図である。縦座標：光学密度（２４５ｎｍ）。横座標：画分（５ｍｌ／画分）。
【図１０】ＦＰＬＣクロマトグラフィから得た画分を使用した細胞成長活性のスクリーニングの結果を示す図である。膀胱細胞でアッセイを行った。図９に示すように、ＦＰＬＣから得た画分を使用した。この図で示すように、ブンカンカ抽出物の異なる成分により、細胞に対して成長効果または阻害効果のいずれかが得られる。画分５９６２（画分Ｙ）のみが細胞を阻害する。画分６１０、１１１６、および１７２４は、細胞成長をわずかに刺激する。横座標：濃度（μｇ／ｍｌ）。縦座標：細胞成長率（ＭＴＴアッセイによって測定）。
【図１１】分離Ｃ１８カラム（Ｄｅｌｔａ  Ｐａｋ  Ｃ１８）における４５％アセトニトリル定組成溶離を使用した画分ＹのＨＰＬＣプロフィールを示す図である。これらの条件下で、画分Ｙ（Ｙ３）、Ｙ１、およびＹ２は、互いに十分に分離されており、これらをその後に精製する。ＡおよびＢは、同一条件下でのＨＰＬＣによる回収したＹ３およびＹ２の精製を示す。
【図１２】分離Ｃ１８カラム（Ｄｅｌｔａ  Ｐａｋ  Ｃ１８）における４５％アセトニトリル定組成溶離を使用した画分Ｙ８、Ｙ９、およびＹ１０の分離プロフィールを示す図である。
【図１３】精製したＹ８、Ｙ９、およびＹ１０のＨＰＬＣプロフィールを示す図である。
【図１４】ＭＴＴアッセイによって測定した、ブンカンカの粗抽出物での処置後の卵巣癌細胞の成長曲線を示す図である。図中の２つの曲線は、２つの実験結果を示す。本研究は、癌細胞に対するブンカンカ抽出物の有効性を測定した。これらの実験では、１１種の異なるヒト器官由来の癌細胞株を使用した。この図は、卵巣癌細胞が、本発明のブンカンカ抽出物に対する応答において最も高い感受性を示す癌細胞であることを示す。癌細胞の結果を、図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃに示した。横座標：濃度（μｇ／ｍｌ）。縦座標：細胞成長率（ＭＴＴアッセイによって測定）。
【図１５】卵巣癌細胞および子宮頸癌細胞における化合物Ｙの効力の比較を示す図である。卵巣癌細胞は、子宮頸癌細胞よりもはるかに感受性が高い。卵巣細胞における化合物ＹのＩＣ５０は約１．５μｇ／ｍｌであり、子宮頸癌細胞におけるＩＣ５０は２０μｇ／ｍｌ超である。
【図１６Ａ】ＭＴＴアッセイによって測定した、膀胱癌細胞および骨肉腫細胞の感受性群の成長曲線を示す図である。図中の曲線は、反復実験の結果である。横座標：濃度（μｇ／ｍｌ）。縦座標：細胞成長率（ＭＴＴアッセイによって測定）。
【図１６Ｂ】ＭＴＴアッセイによって測定した、白血球癌細胞、肝臓癌細胞、前立腺癌細胞、乳癌細胞、および脳腫瘍細胞の半感受性群の成長曲線を示す図である。図中の曲線は、反復実験の結果である。横座標：濃度（μｇ／ｍｌ）。縦座標：細胞成長率（ＭＴＴアッセイによって測定）。
【図１６Ｃ】ＭＴＴアッセイによって測定した、結腸癌細胞、子宮頸癌細胞、および肺癌細胞の最小感受性群の成長曲線を示す図である。図中の曲線は、反復実験の結果である。横座標：濃度（μｇ／ｍｌ）。縦座標：細胞成長率（ＭＴＴアッセイによって測定）。
【図１７】式Ｃ57Ｈ88Ｏ23および化学名３−Ｏ−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−α−Ｌ−アラビノフラノシル（１→３）−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１，２２−Ｏ−ジアンゲロイル−３β，１５α，１６α，２１β，２２α，２８−ヘキサヒドロキシオレアン−１２−エンを有する化合物Ｙの構造を示す図である。
【図１８】化合物ＹのプロトンＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【図１９】化合物Ｙの二次元ＮＭＲ（ＨＭＱＣ）の結果を示す図である。
【図２０】化合物Ｙの二次元ＮＭＲ（ＨＭＢＣ）の結果を示す図である。
【図２１】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（高分子量）を使用した化合物Ｙのマススペクトルを示す図である：Ｙ＋マトリクス（ＣＨＣＡ）＋アンギオテンシン１「２点較正」。
【図２２】ＥＳＩ−ＭＳを使用した化合物Ｙのマススペクトルを示す図である。
【図２３】式Ｃ65Ｈ100Ｏ27および化学名３−Ｏ−［β−Ｄ−ガラクトピラノシル（１→２）］−α−Ｌ−アラビノフラノシル（１→３）−β−Ｄ−グルクロノピラノシル−２１−Ｏ−（３，４−ジアンゲロイル）−α−Ｌ−ラムノピラノシル−２２−Ｏ−アセチル−３β，１６α，２１β，２２α，２８−ペンタヒドロキシオレアン−１２−エンを有する化合物Ｙ１の構造を示す図である。
【図２４】化合物Ｙ１のプロトンＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２５】化合物Ｙ１の二次元ＮＭＲ（ＨＭＱＣ）の結果を示す図である。
【図２６】化合物Ｙ１の二次元ＮＭＲ（ＨＭＢＣ）の結果を示す図である。
【図２７】化合物Ｙ１のＣＯＳＹ−ＮＭＲプロフィールを示す図である。
【図２８】化合物Ｙ２の化学構造および化学名を示す図である。
【図２９】化合物Ｙ２のプロトンＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図３０】化合物Ｙ２の二次元ＮＭＲスペクトル（ＨＭＱＣ）−レベル−１を示す図である。
【図３１】化合物Ｙ２のＣ１３  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図３２】化合物Ｙ２の二次元ＮＭＲ（ＨＭＢＣ）−レベル−１スペクトルを示す図である。
【図３３】化合物Ｙ２の二次元ＮＭＲ  ＨＯＨＡＨＡ（ＴＯＣＳＹ）−レベル−１スペクトルを示す図である。
【図３４】化合物Ｙ２＋マトリクス＋標準のマススペクトルを示す図である。
【図３５】Ｙ８の化学構造を示す図である。
【図３６】Ｙ８のＨ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図３７】Ｙ８のＣ１３  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図３８】Ｙ８の二次元ＮＭＲ  ＨＭＱＣ（レベル１）スペクトルを示す図である。
【図３９】Ｙ９の化学構造を示す図である。
【図４０】Ｙ９のＨ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図４１】Ｙ９の二次元ＮＭＲ  ＨＭＱＣ（レベル１）スペクトルを示す図である。
【図４２】Ｙ９の二次元ＮＭＲ  ＨＭＢＣ（レベル１）スペクトルを示す図である。
【図４３】Ｙ１０の化学構造を示す図である。
【図４４】Ｙ１０のＨ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図４５】Ｙ１０のＣ１３  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図４６】Ｙ１０の二次元ＮＭＲ  ＨＭＱＣ（レベル１）スペクトルを示す図である。
【図４７】化合物Ｒ１の化学構造および化学名を示す図である。
【図４８】化合物Ｒ１のプロトンＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図４９】化合物Ｒ１の二次元ＮＭＲ（ＨＭＱＣ）スペクトルを示す図である。
【図５０】化合物Ｒ１の二次元ＮＭＲ（ＨＭＢＣ）スペクトルを示す図である。
【図５１】化合物Ｒ１の二次元ＮＭＲ（ＣＯＳＹ）スペクトルを示す図である。
【図５２】化合物Ｒ１のＣ１３  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図５３】化合物Ｏ５４の化学構造を示す図である。
【図５４】化合物Ｏ５４のプロトンＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図５５】化合物Ｏ５４の二次元ＮＭＲ（ＨＭＱＣ）スペクトルを示す図である。
【図５６】化合物Ｏ５４の二次元ＮＭＲ（ＨＭＢＣ）スペクトルを示す図である。
【図５７】本発明のブンカンカ抽出物の吸収スペクトルを示す図である。横座標：波長（ｎｍ）。縦座標：光学密度。抽出物は、２０７ｎｍ、２７８ｎｍ、および５００ｎｍに吸収極大を有する。
【図５８】Ｙ４のプロトンＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図５９】Ｙ４の二次元ＮＭＲ（ＨＭＱＣ）スペクトルを示す図である。
【図６０】ＨＰＬＣを使用した成分Ｒの精製を示す図である。Ａ：ＦＰＬＣ（ｉｓｏ−３０）の画分番号１０由来の抽出物を、ＨＰＬＣによってさらに分離した。Ｂ：Ａと同一条件下での主成分のリクロマトグラム。
【図６１】２０％アセトニトリル定組成溶離（ｉｓｏ−２０）を使用したＨＰＬＣを使用した画分Ｏの分画。
【図６２】Ｏ５４、Ｏ２８、およびＯ３４のリクロマトグラフィ（ｉｓｏ−２０由来）を示す図である。
【図６３Ａ】化合物（式中、Ｒ１はアンゲロイル基を示し、Ｒ２はアンゲロイル基を示し、Ｒ３は、ＯＨまたはＨを示し、Ｒ４は、Ｈ、ＯＨ、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＲ６、またはＣＯＯＲ６を示し、Ｒ６は、Ｈ、アセチル、または糖部分であり、化合物の炭素２３位、２４位、２５位、２６位、２９位、３０位は、独立して、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、アルキル基、アセチル基、またはこれらの誘導体を含み、Ｒ６は、ＡｃまたはＨを示し、Ｒ５は糖部分を示し、ここで、糖部分は、少なくとも１つの糖（すなわち、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ラムノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、アルズロン酸、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−ガラクツロン酸）またはその誘導体もしくは組み合わせを含む）の化学構造を示す図である。１つの実施形態では、Ｒ５は、糖部分の機能を果たすことができる化合物を示す。
【図６３Ｂ】化合物（式中、Ｒ１はアンゲロイル基を示し、Ｒ２はアンゲロイル基を示し、Ｒ３は、ＡｃまたはＨを示し、Ｒ４は、ＨまたはＯＨを示し、Ｒ６は、ＡｃまたはＨを示し、Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＲ６、またはＣＯＯＲ６を示し、Ｒ６は、Ｈ、アセチル、または糖部分であり、化合物の炭素２３位、２４位、２５位、２６位、２９位、３０位は、独立して、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、アルキル基、アセチル基、またはこれらの誘導体を含み、Ｒ５は糖部分を示し、ここで、糖部分は、少なくとも１つの糖（すなわち、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ラムノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、アルズロン酸、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−ガラクツロン酸）またはその誘導体もしくは組み合わせを含む）の化学構造を示す図である。１つの実施形態では、Ｒ５は、糖部分の機能を果たすことができる化合物を示す。
【図６４】ＦＰＬＣ画分番号５６５７のＨＰＬＣ（ｉｓｏ−４５）プロフィールを示す図である。
【図６５】ＯＣＡＲ−３細胞の成長に対する化合物Ｘの効果を示す図である。
【図６６】化合物ＸのＨ−ＮＭＲを示す図である。
【図６７】化合物Ｘの二次元ＮＭＲ（ＨＭＱＣ）を示す図である。
【図６８】化合物Ｘの二次元ＮＭＲ（ＨＭＢＣ）を示す図である。
【図６９】化合物ＸのＣ１３  ＮＭＲを示す図である。
【図７０】化合物Ｘの化学構造を示す図である。
【図７１】化合物Ｘのマススペクトル１（ＷＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を示す図である。
【図７２】化合物Ｘのマススペクトル２（ＷＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を示す図である。
【図７３】本発明のサポニン化合物および化合物ＹｓのＭＴＴおよび溶血活性の比較を示す図である。（Ａ）および（Ｂ）は、溶血活性を示す。（Ｃ）および（Ｄ）は、ＭＴＴ活性を示す。
【図７４】（Ａ）は、アンゲロイル基を含まない本発明の化合物を示す。（Ｂ）は、糖部分を含まない本発明の化合物を示す。
【図７５】本発明のサポニン化合物を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３Ａ】
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【図６３Ｂ】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【国際調査報告】
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