(57)【要約】  本発明は、相乗的有効量の鮫肉の抽出物、およびキノコの抽出物を含む抗ガン組成物、特に鮫肉抽出物、およびメシマコブPhellinus linteusの抽出物を含有する組成物に関する。本発明は、ガン、特に黒色腫を、本発明の組成物を用いて治療または予防する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ガン活性を有する鮫肉抽出物、および抗ガン活性を有するキノコ抽出物を含有する組成物であって、各抽出物が相乗的有効量で存在する組成物。
【請求項２】
キノコ抽出物がアガリクスなるキノコ（Agaricus blazei murrill）、マイタケ（Grifola frondosa）またはメシマコブ（Phellinus linteus）の抽出物である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
キノコ抽出物がメシマコブPhellinus linteusの抽出物である、請求項２記載の組成物。
【請求項４】
鮫肉抽出物およびキノコ抽出物の量が４：１〜２４：１の比率の範囲内にある、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
比率が約９：１である、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
キノコ抽出物が、キノコのエタノール抽出によって調製された抽出物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
キノコ抽出物がβ−グルカンを実質的に含有しない、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
キノコ抽出物が脂質を含有する、請求項６記載の組成物。
【請求項９】
最大量で存在する脂質がステロールである、請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
鮫肉抽出物が、鮫肉のエタノール抽出によって調製された抽出物である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
鮫肉抽出物が、サメ、リグ（レモンフィッシュ）、ツノザメ、カイブツギンザメ、アオザメ、ヨシキリザメ、ギンザメ、ネズミザメおよびツマグロからなる群のいずれか１以上の肉の抽出物である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
鮫肉抽出物およびキノコ抽出物を食用油と混合する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
食用油がオリーブ油である、請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
経口または局所投与に向けて処方される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
局所投与のための軟膏またはクリーム剤として処方される、請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
経口投与のためのカプセル剤で処方される、請求項１４記載の組成物。
【請求項１７】
ガンを予防または治療する方法であって、対象者に、それぞれ相乗的有効量で存在する、抗ガン活性を有する鮫肉抽出物と、抗ガン活性を有するキノコ抽出物とを含有する、有効量の組成物を投与することを含む方法。
【請求項１８】
ガンが黒色腫である、請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
ガンが肺ガンである、請求項１７記載の組成物。
【請求項２０】
それぞれ相乗的有効量で存在する、抗ガン活性を有する鮫肉抽出物と、抗ガン活性を有するキノコ抽出物とを含有する組成物の使用であって、ガンを予防または治療する医薬を製造するための使用。
【請求項２１】
ガンが黒色腫である、請求項２０記載の使用。
【請求項２２】
ガンが肺ガンである、請求項２０記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、相乗的有効量の鮫肉の抽出物、およびキノコの抽出物を含む抗ガン組成物に関するものである。特に、本発明は、鮫肉抽出物、およびメシマコブPhellinus linteusの抽出物を含有する組成物に関するものである。本発明は、ガン、特に黒色腫を、本発明の組成物を用いて治療または予防する方法にも関するものである。
【０００２】
背景技術
血管形成は、新たな血管の成長および増殖である。血管形成は、多くの生理学的および病理学的状態に重要な役割を果たす。健康な身体では、血管形成は、創傷治癒の増殖期の際に、傷害または損傷後の組織への血流を回復するために、また女性では、月次生殖周期の際、および妊娠の際に生じる。
【０００３】
健康な身体は、血管形成を一連の「入」および「切」のスイッチを通じてコントロールする。「入」スイッチは、血管形成刺激成長因子として知られ、「切」スイッチは、血管形成インヒビターと称される。正常な健康体では、血管形成成長因子および血管形成インヒビターの発現は、血管形成の活性化および抑制を助長するために、精密な均衡が保たれている。
【０００４】
血管形成は、ガン腫の生存および成長に重要である。そのような腫瘍は、ガン性ではない成長または器官に比して、高率の代謝を有し、結果的に、より高いその栄養の必要性を満たすために、より多くの血液が腫瘍には必要とされる。したがって、血管形成の阻害は、腫瘍の成長をコントロールまたは防止する一つの機序である。
【０００５】
サメ軟骨が抗血管形成活性を有することは、かねてから知られている。より最近の研究は、鮫肉の抽出物が、有意な抗血管形成活性を有することを示している。したがって、これらの材料は、ガンの治療および予防に役立つ効果を有すると考えられる。
【０００６】
メシマコブPhellinus linteusなるキノコは、南朝鮮に産し、医薬品としての名声を有する。本出願人は、メシマコブのエタノール抽出物を調べた。以前は、このキノコの抽出物の医学的特性は、β−グルカンの存在に起因すると考えられた。しかし、このエタノール抽出物は、β−グルカンをほとんど、または全く含有しない。
【０００７】
新規かつ有用な抗ガン剤に関する進行中の研究で、本出願人は、鮫肉抽出物とその他の天然産物抽出物との混合物を調べた。本出願人は、驚異的にも、鮫肉抽出物およびPhellinus linteus抽出物を含む組成物が、鮫肉抽出物のみまたはPhellinus linteus抽出物のみに比して、強化された抗ガン活性を示すことを見出した。本出願人は、鮫肉抽出物とのこの驚異的な相乗的活性が、Phellinus linteusの抽出物ばかりでなく、他のキノコの種にも限られないことも見出した。
【０００８】
上記により、ガンの予防もしくは治療に役立つ、鮫肉の抽出物およびキノコ抽出物を含有組成物を提供するか、または少なくとも有用な選択肢を提供することが、本発明の目的である。
【０００９】
発明の説明
第一の態様では、抗ガン活性を有する鮫肉抽出物、および抗ガン活性を有するキノコ抽出物を含有する組成物であって、各抽出物が相乗的有効量で存在する組成物を提供する。
【００１０】
キノコ抽出物は、抗ガン活性を示すいかなるキノコの抽出物であってもよいが、好ましくは、アガリクスなるキノコ（Agaricus blazei murrill）、マイタケなるキノコ（Grifola frondosa）、またはメシマコブ（Phellinus linteus）の抽出物である。本発明の好適実施態様では、該キノコは、メシマコブPhellinus linteusである。
【００１１】
鮫肉抽出物対キノコ抽出物の比率は、４：１〜２４：１の範囲内、最も好ましくは約９：１であるのが好ましい。キノコ抽出物は、エタノール抽出によって調製されるのが更に好ましい。
【００１２】
キノコ抽出物は、好ましくは、β−グルカンをほとんど、または全く含有しない。また、該キノコ抽出物は、好ましくは、脂質に富み、支配的な脂質がステロールである。
【００１３】
鮫肉抽出物は、好ましくは、エタノール抽出によって調製される。該肉は、サメ、リグ（レモンフィッシュ）、ツノザメ、カイブツギンザメ、アオザメ、ヨシキリザメ、ギンザメ、ネズミザメおよびツマグロのいずれからであってもよい。
【００１４】
本発明の抽出物は、好ましくは、食用油、たとえばオリーブ油と混合される。
【００１５】
該組成物は、いかなる形態の投与に向けて処方してもよいが、好ましくは、経口または局所投与向けに処方される。該組成物は、局所投与のためのクリーム剤または軟膏の形態をなす。
【００１６】
もう一つの態様では、本発明は、ガンを予防または治療する方法であって、対象者に、有効量の本発明の組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００１７】
本発明の好適実施態様では、ガンは、黒色腫または肺ガンである。
【００１８】
もう一つの態様では、本発明は、ガン、好ましくは黒色腫または肺ガンを予防もしくは治療する医薬を製造するための、本発明の組成物の使用を提供する。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明は、鮫肉抽出物およびキノコ抽出物、特にメシマコブPhellinus linteusの、ガンの予防または治療に用いるのに適切な相乗的組成物に関する。
【００２０】
本明細書に用いられる限りでの用語「抽出物」は、いかなる抽出方法によっても得られる物質を意味して、該未精製抽出物が、クロマトグラフィーおよび濾過のような常法によって分画または精製されたものであるか否かを問わない。抽出方法は、溶媒抽出を非限定的に包含する。適切ないかなる溶媒を用いてもよい。溶媒は、有機溶媒もしくは水性溶媒、または有機および水性溶媒の混合物であり得る。エタノールは、有機溶媒（または水エタノールミックス）として代表的に用いられるが、他の有機溶媒を用いてもよい。抽出用溶媒は、超臨界ＣＯ2のような超臨界液体であってもよい。
【００２１】
本明細書に用いられる限りでの用語「鮫肉」は、サメ、リグ（レモンフィッシュ）、ツノザメ、カイブツギンザメ、アオザメ、ヨシキリザメ、ギンザメ、ネズミザメおよびツマグロを非限定的に包含する、いかなるサメまたはサメ様生物のいかなる食肉もしくは肉をも意味する。
【００２２】
鮫肉抽出物は、いかなる抽出手法によって得てもよいが、代表的には、エタノールによる抽出による。
【００２３】
本明細書に用いられる限りでの用語「メシマコブ抽出物」は、Phellinus linteusの単数および／または複数の菌糸体（子実体）の抽出物を意味する。当業者は、メシマコブ抽出物を製造するのに多くの抽出方法を用い得ることを認識していると思われるが、好適な抽出方法は、β−グルカンをほとんどまたは全く含有しない抽出物を生成するよう、エタノール抽出による。
【００２４】
本出願人は、マウスの実験的な黒色腫において、鮫肉抽出物およびメシマコブPhellinus linteus抽出物を含む組成物が腫瘍の成長に対して有意な効果を有することを見出した。
【００２５】
マウス黒色腫細胞を、補強されていない正常な食餌によるマウスに皮下注射した。腫瘍が急速に成長した結果、２１日までに腫瘍の７０％は、大きさが２００mm2を上回った。
【００２６】
マウスを４つの実験群（第１群−補強なし、第２群−１００mlあたり１ml（１％）の鮫肉抽出物で補強した食餌、第３群−１００mlあたり１ml（１％）のメシマコブ抽出物で補強、第４群−１００mlあたり１ml（１％）の鮫肉抽出物：メシマコブ抽出物（体積比９：１）で補強）に分割した。
【００２７】
補強しなかった群と比較すると、鮫肉抽出物は、腫瘍の８０％が３週間後には２００mm2より大きかったことから、黒色腫の成長に対して非常に僅かな効果を有したにすぎない。１％という比較的低い用量でのメシマコブ抽出物は、確かに陽性の効果を有した。３週の終わりに、マウスの５０％は、大きさが２００mm2未満の腫瘍を有した。
【００２８】
興味深いことに、鮫肉抽出物およびメシマコブ抽出物を９：１の比率で組み合わせたならば、実質的に改善された効果が存在した。１０匹のマウスのうち１匹のみに大きさが２００mm2より大きい腫瘍があったにすぎない。これは、補強されていない食餌を摂取した対照群に優る有意な改善であった。加えて、これは、鮫肉抽出物のみを用いた群について見出された結果に優る改善であった。この結果は、鮫肉抽出物による補強が、それ自体では、腫瘍の大きさに影響しなかったことから、最も驚異的であった。それでも、同じレベルの用量の鮫肉抽出物の９０％を摂取したこの群は、有意に優れた結果を得た。これは、キノコ抽出物の存在のためである。この効果は、二者の加算効果について生じ得た可能性があるそれより多大である。この相乗効果が、本発明のための根拠である。
【００２９】
腫瘍の平均的な大きさは、生存の状況と平行関係がある。実験の結論では、鮫肉抽出物を摂取した群における腫瘍の平均的な大きさは、対照群の８８．８％であった。メシマコブ抽出物を摂取した群（飲用水の１％）については、実験終了時での腫瘍の平均的な大きさは、３５．４％小さくて、これは有意差である。組合せの効果は、腫瘍の大きさをはるかに減少させることであった。鮫肉抽出物およびメシマコブ抽出物の双方を与えたとき、腫瘍の平均的な大きさは、対照群の僅か４８．６％にすぎなかった。これは、鮫肉抽出物およびメシマコブ抽出物の組合せが、腫瘍の平均的な大きさを半分以下に減少させることを示す。
【００３０】
要約すると、鮫肉抽出物のみを与えることは、腫瘍の成長またはマウスの生存には非常に僅かな効果を有するにすぎなかった。キノコ抽出物のみを与えることは、腫瘍の大きさを減少させるのに多少の効果を有した。しかし、最も有意なことに、鮫肉抽出物およびメシマコブ抽出物の組合せは、腫瘍の平均的な大きさを、非処理対照群のそれの僅か５０％にまで減少させた。
【００３１】
加えて、動物の生存見込みは、はるかに優れていて、対照群における１０匹中８匹に比して、１０匹中１匹のみが失われたにすぎない。
【００３２】
以下、実施例を参照して、本発明を更に説明する。本発明は、これらの実施例に限定されないことを認識しなければならない。
【実施例１】
【００３３】
抽出物の調製
実施例１．１：鮫肉抽出物の調製
代表的な抽出では、１匹またはそれ以上のサメからの肉片を、ミキサーを用いて大きさを減少させ、凍結乾燥させ、粉末化してから、溶媒、たとえばエタノールと混合した。混合物は、代表的には、室温で１〜２４時間撹拌した。次いで、濾過によって、溶媒を肉から除去した。肉と溶媒との混合の工程は、場合により、反復した。次いで、蒸発によって溶媒を除去して、鮫肉抽出物を油として得た。そうして、この油は、オリーブ油のような担体と混合してもよい。
【００３４】
以下の実施例に用いた鮫肉抽出物は、エタノールによる抽出、次いで、溶媒除去、およびオリーブ油の９：１の重量比（オリーブ油対抽出物）での添加によって得た。
【００３５】
実施例１．２：キノコ抽出物の調製
乾燥したキノコ粉末を、２０：１の比率（v/w）での純エタノールを用い、約２０℃で１８時間抽出した。残渣を、遠心分離によって除去し、上清を濾過した。次いで、蒸発によってエタノールを除去した結果、上清の体積は、約４０分の１に減少した。得られた濃縮物を、オリーブ油で、オリーブ油９容対キノコ抽出物１の比率で希釈した。ビタミンＥを、５％（w/w）の最終濃度として加えた。残留エタノールを除去するための更なる濃縮、および濾過を、その後に実施した。
【実施例２】
【００３６】
鮫肉抽出物およびメシマコブ抽出物−マウス黒色腫の研究
５〜７週齢のＣＢ５１系マウスの４群（オス５、メス５）を設定した。そのすべてに、げっ歯類の食餌を随意に与えたが、食餌は、下記のとおりに補強した：
Ａ群−対照群（補強なし）、
Ｂ群−１００mlあたり１ml（１％）の鮫肉抽出物で補強した食餌、
Ｃ群−１００mlあたり１ml（１％）のメシマコブ抽出物で補強した食餌、
Ｄ群−１００mlあたり１ml（１％）の鮫肉抽出物：メシマコブ抽出物（体積比９：１）で補強）。
【００３７】
補強された食餌の給餌は、黒色腫Ｂ１６の細胞１ｘ１０5個を各マウスの左脇腹に注入する１日前に開始した。水の消費は、２日ごとに測定し、補強された水は、新鮮な補強水と交換した。これから、投与量を決定した。加えて、実験期間全体を通じて、各マウスを毎日秤量した。細胞の注入後は毎日、各腫瘍の寸法を測定し、面積を決定した。腫瘍が２００mm2を超えたならば、マウスを安楽死させた。各マウスを殺処分した後、腫瘍を切り出し、ホルマリン中に保存した。２１日の実験期間の終了時に、生存マウスから各腫瘍を切り出し、秤量した。切開前に、各腫瘍の周囲のリンパの量を評定した。安楽死の後、各動物の死体を剖検し、転移およびその他の巨視的な病理学的変化の証拠について、器官を検査した。脾臓および消化管には、特別な注意を払った。統計的に有意な変化に関するデータの解析は、スチューデントのｔ検定を用いて評価して、０．０５未満の確率を有意であると見なした。
【００３８】
実施例２．１：腫瘍の重量
殺処分の時点で、各マウスから腫瘍を取り出し、秤量した（表１）。
【００３９】
【表１】
2008507512.tif 000002
【００４０】
鮫肉抽出物は、確かに、腫瘍の平均重量を約２２％軽減したが、これは、統計的に有意ではなかった。メシマコブ抽出物は、より効果的であった。この抽出物を与えたマウスからの腫瘍の平均重量は、約３０％減少したが、この減少も、統計的に有意ではなかった。しかし、鮫肉抽出物およびメシマコブ抽出物を与えたマウスからの腫瘍の重量は、平均して、４０％減少した（有意な減少）。
【００４１】
実施例２．３：腫瘍の大きさ
実験期間全体を通じて、腫瘍の平均面積を算出した。鮫肉抽出物のみを与えた群（Ｂ群）における腫瘍の大きさは、非処理群のそれと有意に異なることがなかった。実験の終了時に、この群の腫瘍の平均的な大きさは、対照群より約１１％少なかったにすぎない。
【００４２】
しかし、メシマコブ抽出物を与えた群については、実験終了時の腫瘍の平均的な大きさは、３５％減少した。これは、統計的に有意な（ｐ＜０．０２５）結果である。鮫肉抽出物／メシマコブ抽出物混合物を与えたマウスについては、腫瘍の平均的な大きさは、５０％減少した。この結果は、統計的に極めて有意である（ｐ＜０．００２５）。
【００４３】
実施例２．４：生存率
殺処分しなければならなかった最初の動物は、Ｂ群からであった。これは、実験開始の１７日後に生じた。１８日目に、対照群およびＤ群の最初の動物を殺処分した。１９日目に、Ｃ群の最初の動物を殺処分した。しかし、Ｂ群からのマウスは、残りの日々にわたって、絶えず殺処分されたため、実験終了までには、僅か２匹のマウスが残存するにすぎなかった。対照的に、対照群（Ａ群）のマウス１０匹中３匹は、終了時に生存していた。実際、１７日目以後の各時点で、Ａ群にはＢ群より多くのマウスが生存していた。すなわち、鮫肉抽出物を与えたマウスは、対照群より劣る生存率を有した。
【００４４】
キノコ抽出物のみを摂取したマウス（Ｃ群）間の最初の死は、１９日目までは発生せず、その後、死亡数が着実に増加した結果、２１日目までには、マウスの５０％のみが生存するにすぎなかった。これは、対照群（Ａ群）、および鮫肉抽出物おのみを摂取した群（Ｂ群）に優る改善であった。
【００４５】
しかし、鮫肉抽出物およびキノコ抽出物を摂取した群についての生存率は、他のいかなる群よりも顕著に改善された。１９日目にマウス１匹が殺処分されたが、それは実験期間中の唯一の死亡であった。研究の終了時には、Ｄ群のマウスの９０％が依然として生きていた。
【実施例３】
【００４６】
鮫肉抽出物およびメシマコブ抽出物−最適比
マウス黒色腫に対する、９：１の比（重量比）での鮫肉抽出物／メシマコブ抽出物の効果を決定した後、７：３の比率での抽出物との比較を調べた。
【００４７】
６〜１２週齢のＣＢ５１系マウスの３群（オス５、メス５）を設定した。そのすべてに、げっ歯類の食餌を随意に与えたが、飲用水を、下記のとおりに補強した：
Ａ群−対照群（３％エタノール中１％のオリーブ油）、
Ｂ群−１００mlあたり１ml（１％）の、３％エタノール中の鮫肉抽出物：メシマコブ抽出物（体積比９：１）で補強した食餌、
Ｃ群−１００mlあたり１ml（１％）の、３％エタノール中の鮫肉抽出物：メシマコブ抽出物（体積比７：３）で補強した食餌。
【００４８】
実施例２に記載した方法を用いたが、細胞の注入の８日後から、各腫瘍の成長の寸法を毎日測定し、面積を決定し、また実験期間は１６日とした。
【００４９】
実施例３．１：腫瘍の大きさ
実験の終点で、各腫瘍の大きさを測定し、各群について平均を算出した。結果を表２に要約する。
【００５０】
【表２】
2008507512.tif 000003
【００５１】
すべての時点で、９：１の抽出物混合物を与えた群における腫瘍の大きさは、いかなる処理も受けなかったマウスにおけるそれより小さかった。実験の終点での差は、僅か６．３％にすぎなかったが、腫瘍の成長の際には、その差ははるかに顕著であった。たとえば、１３日目には、処理動物における腫瘍の大きさは、６２％も小さかった。９：１の抽出物混合物は、黒色腫の成長率を有意に阻害した。対照的に、７：３の抽出物混合物は、初めの１２日間の成長率に対する効果が皆無であった。すなわち、阻害効果を全く示さなかった。その時点の後は、非処理群の成長率の減速があったが、抽出物混合物を与えたマウスにおけるそれは、より速い速度で持続した。実験終了時には、この群（７：３）に関する腫瘍の平均的な大きさは、非処理マウスに関してより１４．５％大きかった。したがって、９：１の抽出物混合物の方が、黒色腫の阻害には好適とされる。
【００５２】
実施例３．２：生存率
１４日目には、非処理群についての僅か３０％に比して、７：３の抽出物混合物で処理した動物の５０％が生きていた。実験を終了した１６日目には、非処理群のうちで生きていたのは皆無であったが、この処理群の３０％は生きていた。
【００５３】
しかし、９：１の抽出物混合物で処理したマウスについての生存率は、非処理動物、および７：３の抽出物混合物を与えたものの双方より優れていた。１４日目には、この群の９０％が、依然として生きており、実験終了時には、５０％が生存し続けた。
【００５４】
実施例３．３：血管新生
各マウスを殺処分した時点で、原発腫瘍の周辺における血管新生の程度を評価した。結果を表３に示す。
【００５５】
【表３】
2008507512.tif 000004
【００５６】
９：１の抽出物混合物は、７：３の抽出物混合物より強い血管形成の阻害を示した。
【００５７】
実施例３．４：転移
対照群（Ａ群）では、オスのマウス中２匹が転移性の成長を示した。１匹では、黒色腫の部位の付近に４個所の皮膚病変があった。他方では、皮膚付近に３個所、および更に５個所が肝臓に位置した。この群のメスのうち、２匹が転移を示した。１匹には、肝臓に５個所の病変、および腎臓上に２個所があり、他方は、黒色腫の付近の皮膚、および肺にもう一つがあった。
【００５８】
９：１の抽出物混合物を与えた群（Ｂ群）では、すべてのオス、および５匹のメスのうち３匹が、転移性成長を示した。オスのうちでは、１匹に非常に大きい成長が脾臓にあった（この器官の約２５％）ばかりでなく、皮膚にも３個所があった。第二のオスには、体積の約１０％を占める脾臓病変があったばかりでなく、皮膚にも一つがあった。第三のマウスには、２個所の脾臓病変があった。この群の他の２匹のオスは、皮膚転移を示した。メスのうち３匹には、非常に大きい腫瘍が脾臓にあった（この器官の大きさの２０％より大）。興味深いことに、この補強を受けたメスのうちでは、皮膚腫瘍をはじめ、その他の転移は皆無であった。
【００５９】
７：３の抽出物混合物を与えた群（Ｃ群）では、オスのうちでは１匹に転移性成長があった（肺腫瘍）にすぎない。５匹のメスのうち２匹に、それぞれ、皮膚に一つだけ転移があり、１匹には大きい脾臓新生物があり、他方には肺腫瘍があった。
【実施例４】
【００６０】
鮫肉抽出物およびマイタケ抽出物−最適比
６〜１２週齢のＣＢ５１系マウスの３群（オス５、メス５）を設定した。そのすべてに、げっ歯類の食餌を随意に与えたが、飲用水は、下記のとおりに補強した：
Ａ群−対照群（補強せず）、
Ｂ群−１００mlあたり１ml（１％）の、３％エタノール中の鮫肉抽出物：マイタケ抽出物（９：１体積比）で補強した食餌、
Ｃ群−１００mlあたり１ml（１％）の、３％エタノール中の鮫肉抽出物：マイタケ抽出物（７：３体積比）で補強した食餌。
【００６１】
実施例２に記載した方法を用いたが、黒色腫細胞を注入する１日前に給餌を開始し、細胞の注入の８日後から、各腫瘍の成長の寸法を毎日測定し、面積を決定し、また実験期間は１６日とした。
【００６２】
実施例４．１：腫瘍の大きさ
実験の終点で、各腫瘍の大きさを測定し、各群について平均を算出した。結果を表４に要約する。
【００６３】
【表４】
2008507512.tif 000005
【００６４】
すべての時点で、９：１の抽出物混合物を与えた群における腫瘍の大きさは、いかなる処理も与えなかったマウスにおけるそれより小さかった。実験の終点での差は、僅か１２．８％にすぎなかったが、腫瘍の成長の際には、その差ははるかに顕著であった。たとえば、１３日目には、処理動物における腫瘍の平均的な大きさは、５４％小さくて、これは、実質的な縮小である。９：１の抽出物混合物は、黒色腫の成長率を有意に阻害した。対照的に、７：３の抽出物混合物は、成長を刺激するように見えた。すべての時点で、これらのマウスにおける腫瘍の平均的な大きさは、対照群におけるそれより大きかった。１３日目には、腫瘍の大きさは、２６．９％大きくなり、１６日目には、５５．６％大きくなった。
【００６５】
実施例４．２：生存率
最低の生存率は、７：３の抽出物混合物を与えたマウスについてであった。１４日目以外で、生存は、いかなる処理も受けなかったマウスについてより悪かった。しかし、ほとんどの時点で、生存レベルは、９：１の抽出物混合物で補強した群の方が、対照群についてより優れていた。９：１を与えたマウスは、７：３の抽出物混合物を与えたマウスより優れた生存率を有した。
【００６６】
実施例４．３：血管新生
各マウスを殺処分した時点で、原発腫瘍の周辺における血管新生の程度を評価した。結果を表５に示す。
【００６７】
【表５】
2008507512.tif 000006
【００６８】
この比較研究に基づき、９：１の抽出物混合物は、血管形成の阻害を示したが、強い阻害ではなかった。７：３の抽出物混合物は、刺激性であると判明した（１３．４％）。
【００６９】
実施例４．４：転移
対照群（Ａ群）では、オスのマウス中１匹が転移性成長を脾臓に示して、脾臓の約２５％を覆った。この群のメスのうち、２匹は、脾臓への転移を示した。１匹には、器官の約１２％を占める病変があり、他方は約２５％を占めた。９：１の抽出物混合物で補強した群では、３匹のオスが、脾臓への転移性成長を示した。すべてに、非常に大きい成長（器官の約２５％）があった。メスのうち１匹は、非常に拡大された脾臓を有した。興味深いことに、この補強を受けたメスのうちでは、その他の転移は皆無であった。７：３の抽出物混合物で補強された群では、オスのうち１匹に転移性成長があったにすぎない。それは、原発病変に密接する皮膚腫瘍であった。この群の５匹のメスのうち１匹には、脾臓の約２５％を占める大きい脾臓新生物があった。
【実施例５】
【００７０】
鮫肉抽出物およびメシマコブ抽出物−最適用量
この研究は、９：１の比率での鮫肉抽出物：メシマコブ抽出物の異なる５用量レベルを必要としたため、二つの別個の実験を実施した。双方の実験で、抽出物混合物は、補強として飲用水に加えた。
【００７１】
実験１に対しては、下記の群を設定した：
Ａ．対照群（エタノール中３％のオリーブ油（最終濃度：５％））；
Ｂ．０．０３％の鮫肉抽出物：メシマコブ抽出物（９：１）（最終濃度：５％エタノール）；
Ｃ．０．１％の鮫肉抽出物：メシマコブ抽出物（９：１）（最終濃度：５％エタノール）；
Ｄ．０．３％の鮫肉抽出物：メシマコブ抽出物（９：１）（最終濃度：５％エタノール）。
【００７２】
実験２に対しては、下記の群を設定した：
Ａ．対照群（エタノール中３％のオリーブ油（最終濃度：５％））；
Ｂ．１．０％の鮫肉抽出物：メシマコブ抽出物（９：１）（最終濃度：５％エタノール）；
Ｃ．３．０％の鮫肉抽出物：メシマコブ抽出物（９：１）（最終濃度：５％エタノール）。
【００７３】
５〜６週齢のＣＢ５１系マウス（オス５、メス５）を、各群に対して設定した。そのすべてに、げっ歯類の食餌を随意に、また補強された飲用水を与えた。補強食餌の給餌は、黒色腫Ｂ１６の細胞１ｘ１０5個を各マウスの左脇腹に注入する１週間前に開始した。水の消費は、週３回測定し、補強水は、それぞれの測定後に新鮮な補強水と交換した。補強を始めたとき、そうして、黒色腫の注入直前、次いで７日および１４日後に、各マウスを秤量した。細胞の注入の９日後から、各腫瘍の成長の寸法を測定し、式：体積＝（πｘＸｘＹｘＺ）／６（式中、Ｘは長さであり、Ｙは幅であり、Ｚは高さである）に従って、毎日体積を決定した。これらの測定は、実験の終点まで毎日実施した。
【００７４】
実施例５．１：腫瘍の成長速度
実験の全体を通じて、各腫瘍の大きさを測定し、それぞれの日に各群について、平均値を算出した。結果を表６および７に要約する。
【００７５】
【表６】
2008507512.tif 000007
【００７６】
【表７】
2008507512.tif 000008
【００７７】
飲用水への抽出物混合物の添加は、腫瘍の成長速度を確かに減速した。用量レベルが非常に低かった実験１では、０．０３％の用量（Ｂ群）は、非常に効果的であり、腫瘍の寸法は、すべての時点で、非処理マウスにおける寸法より小さかった（表７）。たとえば、１７日目では、Ｂ群の腫瘍は、非処理マウスの腫瘍より６７．８％も小さかった（Ａ群）。この差は持続し、そのため、１９日目には、差は７５．５％、２１日目には４１．８％、２３日目には２７．５％であった。
【００７８】
０．１％の抽出物混合物（Ｃ群）の有効性は、より低い用量についてほど大きくはなかった。１７日目では、成長は、約８．７％低下し、１９日目には約４８．９％低下した。２１および２３日目には、腫瘍の平均的な大きさは、対照より大きかった。
【００７９】
１７日目では、０．３％の補強（Ｄ群）は、腫瘍のほとんど完全な阻害（９５．９％）を示した。１９日目でさえ、実質的な阻害があった。これらのマウスにおける腫瘍の大きさは、平均して、大幅に減少した（８６．０％）。２１日目には、補強された動物の成長速度は、依然として５７．４％低く、研究の終点近くでは、３１．９％低かった（２３日目）。
【００８０】
実験２では、高い用量の抽出物混合物の効果は、非常に有意であった。たとえば、１２日目には、１％の補強を与えられたマウス（Ｂ群）における腫瘍の平均的な大きさは、対照動物より３５％小さかった。１４日目には、この差は９．４％であり、１６日目にはいかなる効果も失われた。最高用量の抽出物混合物では、差ははるかに顕著であった。１２日目には、腫瘍の平均的な大きさは、１％の補強とほぼ同じであったが、１４日目には、２７．５％小さかった。１６日目でさえ、腫瘍の平均的な大きさは、非処理マウスより約２３％小さかった。これは、この時点での１％の用量レベルの効果の欠如とも対照的である。
【００８１】
したがって、鮫肉抽出物：メシマコブ抽出物の組合せによる、マウスにおける黒色腫の成長の阻害については、明確な用量応答が存在するが、最適用量は、このデータからは容易に認識可能ではない。
【００８２】
実施例５．２：生存率
実験１では、鮫肉抽出物：メシマコブ抽出物を与えられた３群は、すべて、対照群（Ａ群）より優れた生存率を有した。最高なのは、非常に最低のレベルを与えられたマウス（Ｂ群）であった。
【００８３】
実験２では、１３日目以降は、高用量の抽出物混合物を与えたマウスの生存率は、処理を受けなかったマウスより高いことが明白であった。１％の用量（Ｂ群）と３％の用量（Ｃ群）との間には、大きい差はなかった。
【００８４】
実施例５．３：血管新生
各マウスを殺処分した時点で、原発腫瘍の周辺における血管新生の程度を評価した。結果を表８および９に示す。
【００８５】
【表８】
2008507512.tif 000009
【００８６】
【表９】
2008507512.tif 000010
【００８７】
実験１では、三様の補強のすべてについて、腫瘍周辺付近の血管新生の程度には、実質的な低下があった。実験の終了時には、０．０３％および０．１％双方の抽出物混合物を与えたマウスにおいて、血管密度は平均して３０％低く、０．３％の抽出物混合物を与えた群（Ｄ群）については、約１５％低かった。
【００８８】
実験２では、１％の抽出物混合物は、血管新生の程度を刺激した可能性があるが、３％の抽出物混合物については、そのレベルは対照に比して８％低かった。しかし、これらの測定は、腫瘍がすべての動物で非常に大きかった、研究の終了時になされたものである。
【実施例６】
【００８９】
鮫肉抽出物およびマイタケ抽出物−最適用量
実施例５と同様に、鮫肉抽出物とマイタケ（Grisfola frondosa）なるキノコの抽出物との組合せに関するこれらの研究は、二つの別個の実験として実施した。方法論は、実施例５と同じである。
【００９０】
実験１に対しては、下記の群を設定した：
Ａ．対照群（エタノール中３％のオリーブ油（最終濃度：５％））；
Ｂ．０．０３％の鮫肉抽出物：マイタケ抽出物（９：１）（最終濃度：５％エタノール）；
Ｃ．０．１％の鮫肉抽出物：マイタケ抽出物（９：１）（最終濃度：５％エタノール）；
Ｄ．０．３％の鮫肉抽出物：マイタケ抽出物（９：１）（最終濃度：５％エタノール）。
【００９１】
実験２に対しては、下記の群を設定した：
Ａ．対照群（エタノール中３％のオリーブ油（最終濃度：５％））；
Ｂ．１．０％の鮫肉抽出物：マイタケ抽出物（９：１）（最終濃度：５％エタノール）；
Ｃ．３．０％の鮫肉抽出物：マイタケ抽出物（９：１）（最終濃度：５％エタノール）。
【００９２】
実施例６．１：腫瘍の成長速度
異なる投与量の鮫肉抽出物：マイタケ（Grisfola frondosa）キノコの抽出物を与えた動物における、腫瘍の成長速度を表１０および１１に提示する。
【００９３】
【表１０】
2008507512.tif 000011
【００９４】
抽出物混合物の二つの最低用量は、大体において、マウスの黒色腫の成長速度に対して無効果であった。この速度は、対照動物について、これら二つのレベルを与えた動物についてと実質的に同じであるが、より早い時点では、０．０３％の抽出物混合物（Ｂ群）は確かに阻害を示す。
【００９５】
【表１１】
2008507512.tif 000012
【００９６】
実験２では、抽出物混合物の二つの高用量の効果は、相対的に最小限であった。１．０％の用量（Ｂ群）は、腫瘍の大部分の成長期の間、多少とも注目に値した。１３日目には、腫瘍の平均的な大きさは、対照動物（Ａ群）より約１８．５％小さかったが、１５日目までには、同じ大きさになり、１７日目には、約１０％大きかった。
【００９７】
マウスにおける黒色腫なる腫瘍の成長を阻害するための、抽出物混合物の最適用量は、約０．３％である。
【００９８】
実施例６．２：生存率
実験１では、０．０３％の用量レベルによる動物（Ｂ群）についての生存率は、対照動物より僅かに優れていた。しかし、３．３倍高い用量によったマウス（Ｃ群）は、同様には生存しなかった。Ｄ群の動物（０．３％）は、一貫して、Ｂ群のものより高く、対照群（Ａ群）のものよりはるかに高い生存率を有した。
【００９９】
実験２では、高用量の抽出物混合物を与えた両群のマウスについての生存率は、高くなかった。いずれの場合も、それらは、対照群のそれと同一であったか、または非常に近似した。
【０１００】
最高の生存率は、０．３％の用量を与えた群、すなわち、腫瘍の成長速度の最強の阻害を示した同じ群で達成された。
【０１０１】
実施例６．３：血管新生
各マウスを殺処分した時点で、原発腫瘍の周辺における血管新生の程度を評価した。結果を表１２および１３に示す。
【０１０２】
【表１２】
2008507512.tif 000013
【０１０３】
【表１３】
2008507512.tif 000014
【０１０４】
実験１では、実験の終了時での腫瘍の血管新生は、抽出物混合物の用量レベルが上昇するにつれて着実に低下した。０．０３％の抽出物混合物を与えた群には、１８．６％低いレベルの血管新生があった。上昇する用量の補強による腫瘍周辺の血管新生における、この比例する低下は、その抗血管形成作用を裏付ける。
【０１０５】
実験２では、いずれの用量の抽出物混合物も、血管新生を阻害した。１．０％の用量（Ｂ群）は、対照マウス（Ａ群）と比較して、研究の終了時での８％低い血管新生の評点を招いた。３．０％の用量を与えたものは、腫瘍の周辺の血管新生における５．４％の低下を示した。
【０１０６】
０．３％の用量レベルの抽出物混合物は、腫瘍への血管の供給を低下させるのに最適であると判明した。これは、腫瘍の成長速度を阻害し、最高の生存を与えるのにも最適である。
【実施例７】
【０１０７】
鮫肉抽出物：アガリクスなるキノコの抽出物−最適用量
実施例５と同様に、鮫肉抽出物とアガリクスなるキノコ（Agaricus blazei murrill）の抽出物との組合せに関するこれらの研究は、二つの別個の実験として実施した。方法論は、実施例５と同じである。
【０１０８】
実験１に対しては、下記の群を設定した：
Ａ．対照群（エタノール中３％のオリーブ油（最終濃度：５％））；
Ｂ．０．０３％の鮫肉抽出物：アガリクス抽出物（９：１）（最終濃度：５％エタノール）；
Ｃ．０．１％の鮫肉抽出物：アガリクス抽出物（９：１）（最終濃度：５％エタノール）；
Ｄ．０．３％の鮫肉抽出物：アガリクス抽出物（９：１）（最終濃度：５％エタノール）。
【０１０９】
実験２に対しては、下記の群を設定した：
Ａ．対照群（エタノール中３％のオリーブ油（最終濃度：５％））；
Ｂ．１．０％の鮫肉抽出物：マイタケ抽出物（９：１）（最終濃度：５％エタノール）；
Ｃ．３．０％の鮫肉抽出物：マイタケ抽出物（９：１）（最終濃度：５％エタノール）。
【０１１０】
実施例７．１：腫瘍の成長速度
実験の全体を通じて、各腫瘍の大きさを測定し、それぞれの日に各群について平均値を算出した。
【０１１１】
飲用水への抽出物混合物の添加は、黒色腫なる腫瘍の成長速度を確かに減速した。用量レベルが非常に低かった実験１では、０．０３％の用量（Ｂ群）は、非常に効果的であり、腫瘍の寸法は、すべての時点で、非処理マウスについての腫瘍の寸法より小さかった（表１４）。たとえば、１２日目では、平均的な腫瘍は、僅か半分の大きさであったが、１４日目には、約２０％小さく、対照腫瘍が非常に大きくなった１６日目にも、腫瘍の平均的な大きさは、依然として約２０％小さかった。
【０１１２】
０．１％の用量も、腫瘍の成長速度に対する効果的な阻害因子であった。１２日目には、この群（Ｃ群）のマウスの腫瘍は、対照群のそれより平均して２５．５％小さかった。１４日目には、この低下は、僅か４％にすぎず、１６日目には１１％であった。
【０１１３】
１２日目には、Ｄ群の動物（０．３％）は、非処理マウスのそれより体積が約３８％少ない腫瘍を有した。しかし、１４日目までには、この差は、僅か９％に減少した。
【０１１４】
【表１４】
2008507512.tif 000015
【０１１５】
【表１５】
2008507512.tif 000016
【０１１６】
実験２では、高い用量の抽出物混合物の効果は、非常に有意であった。たとえば、１２日目には、１％の用量を与えられたマウス（Ｂ群）における腫瘍の平均的な大きさは、対照動物におけるそれより６７．７％小さかった。すなわち、腫瘍は、非処理マウスのそれの僅か約３分の１の大きさにすぎなかった。１４日目には、この差は、３５．６％の減少で、依然として高かった。Ｂ群の腫瘍は、実験の終了時（１６日目）でさえ約８．５％小さかった。最高用量の抽出物混合物では、差は、やはり非常に顕著であった。１２日目には、腫瘍の大きさは、１％の用量についてとほぼ同じであったが（６１．２％減少）、１４日目には、３７．３％小さかった。したがって、これら二様の用量における応答は、ほぼ同じであった。１６日目には、腫瘍の平均的な大きさは、非処理マウスより約７．５％大きかった。
【０１１７】
したがって、鮫肉抽出物：アガリクス抽出物の組合せによる、マウスにおける黒色腫の成長の阻害については、明確な用量応答が存在する。１％および３％の用量は、ともに、マウスにおける黒色腫の成長速度を阻害するのに、ほぼ等しく効果的である。より低い用量は、合理的に強い拮抗作用を示した０．０３％の用量以外は、より効果が少ない。
【０１１８】
実施例７．２：生存率
実験１では、この群のうち、強い生存率を有したものは皆無であった。４群のすべてが、非常に類似した生存状況を示した。１６日を越えて生存したものは、皆無であった。より高い用量の抽出物混合物を与えられたマウスについての生存傾向（実験２）は、いずれも優れていなかった。やはり、すべての動物が上限に達し、生存の一般的傾向は、補強されたマウスおよび対照マウスについて非常に類似した。
【０１１９】
鮫肉抽出物：アガリクス抽出物は、ガンのマウスの生存率を改善するのを支援するようには思われないが、腫瘍の成長を減速するのには非常に効果的であることができる。
【０１２０】
実施例７．３：血管新生
各マウスを殺処分した時点で、原発腫瘍の周辺における血管新生の程度を評価した。結果を表１６および１７に示す。
【０１２１】
【表１６】
2008507512.tif 000017
【０１２２】
【表１７】
2008507512.tif 000018
【０１２３】
実験の終了時における、腫瘍の周囲の血管の延長に対する低用量の抽出物混合物の効果は、０．０３％の用量については１１％の阻害を示唆したが、他の二様の用量（０．１％および０．３％）は、無視し得る効果を有した。０．１％の用量は、研究の終点において、血管密度の８．７％の低下を生じる効果を有したが、０．３％の用量は、無視し得る効果を有した。
【実施例８】
【０１２４】
肺ガンの研究
マウスにおける肺ガンの成長に対する効果について、鮫肉抽出物：メシマコブ抽出物（９：１）を調べた。この研究のために、ヌードマウス、およびヒト非小細胞肺癌腫を用いた。
【０１２５】
１２．５〜１３．５週齢のヌードマウスの２群（それぞれ、オス５匹、メス５匹を含む）を設定した。そのすべてに、げっ歯類の食餌を随意に与えたが、飲用水は、下記のとおりに補強した：
Ａ群−対照群（５％エタノール中３％のオリーブ油）、
Ｂ群−１００mlあたり３ml（３％）の５％エタノール中の鮫肉抽出物：メシマコブ抽出物（９：１体積比）で補強した食餌。
【０１２６】
実施例５のようなサンプル方法論に従った。
【０１２７】
実施例８．１：腫瘍の成長速度
異なる投与量の抽出物混合物を与えた動物における腫瘍の成長速度を、表１８に示す。
【０１２８】
抽出物混合物による水の補強は、実験マウスにおける肺ガンの成長を減速するのに効果的であった。たとえば、３９日目には、補強されたマウスにおける腫瘍の平均的な大きさは、対照マウスにおけるそれより２３％小さかった。５日後に、この差は、４１％に増大した。５１日目には、実験群における病変は、３０．８％小さく、５６日目には、処理マウスは、体積が依然として２９．５％小さいガンを有した。
【０１２９】
したがって、この用量レベルでの抽出物混合物は、肺ガンの成長を阻害するのに非常に強く効果的であった。
【０１３０】
【表１８】
2008507512.tif 000019
【０１３１】
実施例８．２：生存率
抽出物混合物を与えたマウスの生存率は、担体のオリーブ油のみを与えたものについてより目立って高かった。研究の終了時（６０日）には、これらの動物の５０％が生存したのに対し、対照群の僅か２０％が生存したにすぎなかった。
【０１３２】
実施例８．３：血管新生
各マウスを殺処分した時点で、原発腫瘍の周辺における血管新生の程度を評価した。結果を表２８に示す。
【０１３３】
【表１９】
2008507512.tif 000020
【０１３４】
腫瘍が、特に対照群で大きくなった、研究の終了時には、各腫瘍の周囲の血管新生の程度は、その水が抽出物混合物で補強されたマウスでは、約１３．３％低かった。これは、補強が抗血管形成活性を発揮することを示している。
【０１３５】
実施例を通じて本発明を説明したが、クレームの範囲から逸脱せずに、変化および改変を加え得ることを認識しなければならない。更に、特定の特徴に対して公知の等価体が存在する場合、そのような等価体は、本明細書に具体的に参照されたかのように組み込まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１３６】
本発明の組成物は、抗ガン特性を有する。それらは、相乗的有効量の鮫肉の抽出物およびキノコの抽出物を含む。該組成物は、ガン、特に黒色腫の治療または予防に使用できる見込みがある。
【国際調査報告】
2008507512.tif 000021
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