(57)【要約】二つの異なるloxP配列によって挟まれるDNAインサートの両端を、該両端に係る対応するloxP配列を担持するトランスポゾンを使って切り取る方法。
2008529533.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
loxPトランスポゾン・プラスミドを使ってベクター中の野生型loxPサイトとloxP511サイトとに挟まれるDNAインサートの両端を切り取る方法であって：
ａ．それぞれがloxP511サイトを担持する第一のトランスポゾンを含む同一配列の複数のプラスミドを構築する段階と；
ｂ．前記複数の第一のトランスポゾン含有プラスミドを、それぞれが第一の抗生物質耐性遺伝子を担持する前記ベクター中のDNAインサートを含む細胞に移入する段階と；
ｃ．前記複数の第一のトランスポゾンのそれぞれを前記細胞中の前記DNAインサート中に挿入されるよう誘導する段階と；
ｄ．前記DNAインサート中に前記複数の第一のトランスポゾンが挿入された前記細胞にファージP1を感染させ、ここで該感染の間にファージP1によってCreタンパク質が発現される段階と；
ｅ．それぞれが前記挿入された第一のトランスポゾンの一つを含む前記DNAインサートのそれぞれから第一の末端部分を切り取って、新たな第一の末端をもつ複数の第一末端切り取りDNAインサートを作成する段階と；
ｆ．前記第一末端切り取りDNAインサートをP1ファージ頭部にパッケージングする段階と；
ｇ．前記P1ファージ頭部を使って新鮮なNS3516細胞の第一のコロニーに感染させ、前記ベクター中に耐性遺伝子がある第一の抗生物質を含むLB寒天プレート上で選別することによって前記第一末端切り取りDNAインサートを増幅し、それにより新鮮なNS3516細胞の前記第一のコロニーから生成された複数のNS3516細胞コロニーにおいて前記複数の第一末端切り取りDNAインサートを増幅する段階と；
ｈ．前記ベクター中の前記増幅された複数の異なる第一末端切り取りDNAインサートを単離して、新鮮なNS3516細胞の前記第一のコロニーから各コロニーが同じ末端切り取りをもつ複数のコロニーを得る段階と；
ｉ．前記増幅された複数の異なる第一末端切り取りDNAインサートの、前記増幅された複数の新しい第一末端部分を、第一の合成DNAプライマーを使って配列決定する段階と；
ｊ．それぞれが野生型loxPサイトと、前記ベクター中にある前記第一の抗生物質耐性遺伝子とは異なる第二の抗生物質耐性遺伝子とを担持する第二のトランスポゾンを含む同一配列の複数のプラスミドを構築する段階と；
ｋ．前記複数の第二のトランスポゾン含有プラスミドを、前記増幅された複数の第一末端切り取りDNAインサートを含む細胞に移入する段階と；
ｌ．前記複数の第二のトランスポゾンを前記増幅された複数の第一末端切り取りDNAインサートに誘導する段階と；
ｍ．前記複数の増幅された第一末端切り取りDNAインサート中に前記複数の第二のトランスポゾンが挿入された前記細胞にファージP1を感染させ、ここで該感染の間にファージP1によってCreタンパク質が発現される段階と；
ｎ．それぞれが前記挿入された第二のトランスポゾンの一つを含む前記複数の増幅された第一末端切り取りDNAインサートのそれぞれから反対側の末端部分を切り取って、新たな反対側末端をもつ複数の両末端切り取りDNAインサートを作成する段階と；
ｏ．前記ベクター中の前記複数の両末端切り取りDNAインサートを前記P1ファージ頭部にパッケージングする段階と；
ｐ．前記P1ファージ頭部を使って新鮮なNS3516細胞の第二のコロニーに感染させ、前記第一の抗生物質および前記第二のトランスポゾン中に耐性遺伝子がある第二の抗生物質を含むLB寒天プレート上で選別することによって前記複数の両末端切り取りDNAインサートを増幅し、それにより新鮮なNS3516細胞の前記第二のコロニーから生成された複数のNS3516細胞コロニーにおいて複数の両末端切り取りDNAインサートを増幅する段階と；
ｑ．前記ベクター中の前記増幅された複数の異なる両末端切り取りDNAインサートを単離して、新鮮なNS3516細胞の前記第二のコロニーから各コロニーが同じ反対側末端切り取りをもつ複数のコロニーを得る段階と；
ｒ．前記異なる両末端切り取りDNAインサートの、前記増幅された複数の新しい反対側末端部分を、第二の合成DNAプライマーを使って配列決定する段階、
とを有する方法。
【請求項２】
前記第一のトランスポゾンがトランスポゾン・プラスミドpTnloxP511(B)markerless1である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第一のトランスポゾンがトランスポゾン・プラスミドpTnloxP511(B)markerless2である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記第二のトランスポゾンがpTn(RSVneo2)/loxPである、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記第二のトランスポゾンがpTn(RSVneo2)/loxPである、請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記第二のトランスポゾンがpTn(RSVneo1)/loxPである、請求項２記載の方法。
【請求項７】
前記第二のトランスポゾンがpTn(RSVneo1)/loxPである、請求項３記載の方法。
【請求項８】
前記第一のトランスポゾンがトランスポゾン・プラスミドpTnloxP511(A)markerless2である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記第二のトランスポゾンがpTn(RSVneo2)/loxPである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記第二のトランスポゾンがpTn(RSVneo1)/loxPである、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記第一のトランスポゾンがトランスポゾン・プラスミドpTnloxP511(B)  markerless1であり、前記第一の抗生物質がクロラムフェニコールであり、前記第二の抗生物質がカナマイシンである、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記ベクターが、pBACe3.6、pTARBAC1および2ならびにpTARBAC2.1よりなる群から選択されるBACクローンである、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記ベクターが、RP11-219A15、RP11-158M20、RP11-434D2、RP23-209O22、RP23-92L23、RP23-366M16、RP23-101N20、RP23-124B2、RP23-444K15およびRP23-130D16よりなる群から選択されるBACクローンである、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記第一の合成DNAプライマーが配列番号1に記載の塩基配列を有するDNAオリゴヌクレオチドである、請求項２記載の方法。
【請求項１５】
前記第一の合成DNAプライマーが配列番号1に記載の塩基配列を有するDNAオリゴヌクレオチドである、請求項３記載の方法。
【請求項１６】
前記第二の合成DNAプライマーが配列番号4に記載の塩基配列および配列番号6に記載の塩基配列よりなる群から選ばれる塩基配列を有するDNAオリゴヌクレオチドである、請求項４記載の方法。
【請求項１７】
前記第二の合成DNAプライマーが配列番号4に記載の塩基配列および配列番号6に記載の塩基配列よりなる群から選ばれる塩基配列を有するDNAオリゴヌクレオチドである、請求項６記載の方法。
【請求項１８】
二つの異なるloxP配列によって挟まれるDNAインサートの両端を、該二つの端に係る対応するloxP配列を担持するトランスポゾンを使って切り取る方法。
【請求項１９】
loxPトランスポゾン・プラスミドを使ってベクター中の野生型loxPサイトとloxP511サイトとに挟まれるDNAインサートの両端を切り取る方法であって：
ａ．それぞれが野生型loxPサイトを担持する第一のトランスポゾンを含む同一配列の複数のプラスミドを構築する段階と；
ｂ．前記複数の第一のトランスポゾン含有プラスミドを、それぞれが第一の抗生物質耐性遺伝子を担持する前記ベクター中のDNAインサートを含む細胞に移入する段階と；
ｃ．前記複数の第一のトランスポゾンのそれぞれを前記細胞中の前記DNAインサート中に挿入されるよう誘導する段階と；
ｄ．前記DNAインサート中に前記複数の第一のトランスポゾンが挿入された前記細胞にファージP1を感染させ、ここで該感染の間にファージP1によってCreタンパク質が発現される段階と；
ｅ．それぞれが前記挿入された第一のトランスポゾンの一つを含む前記DNAインサートのそれぞれから第一の末端部分を切り取って、新たな第一の末端をもつ複数の第一末端切り取りDNAインサートを作成する段階と；
ｆ．前記第一末端切り取りDNAインサートをP1ファージ頭部にパッケージングする段階と；
ｇ．前記P1ファージ頭部を使って新鮮なNS3516細胞の第一のコロニーに感染させ、前記ベクター中に耐性遺伝子がある第一の抗生物質を含むLB寒天プレート上で選別することによって前記第一末端切り取りDNAインサートを増幅し、それにより新鮮なNS3516細胞の前記第一のコロニーから生成された複数のNS3516細胞コロニーにおいて前記複数の第一末端切り取りDNAインサートを増幅する段階と；
ｈ．前記ベクター中の前記増幅された複数の異なる第一末端切り取りDNAインサートを単離して、新鮮なNS3516細胞の前記第一のコロニーから各コロニーが同じ末端切り取りをもつ複数のコロニーを得る段階と；
ｉ．前記増幅された複数の異なる第一末端切り取りDNAインサートの、前記増幅された複数の新しい第一末端部分を、第一の合成DNAプライマーを使って配列決定する段階と；
ｊ．それぞれがloxP511サイトと、前記ベクター中にある前記第一の抗生物質耐性遺伝子とは異なる第二の抗生物質耐性遺伝子とを担持する第二のトランスポゾンを含む同一配列の複数のプラスミドを構築する段階と；
ｋ．前記複数の第二のトランスポゾン含有プラスミドを、前記増幅された複数の第一末端切り取りDNAインサートを含む細胞に移入する段階と；
ｌ．前記複数の第二のトランスポゾンを前記増幅された複数の第一末端切り取りDNAインサートに誘導する段階と；
ｍ．前記複数の増幅された第一末端切り取りDNAインサート中に前記複数の第二のトランスポゾンが挿入された前記細胞にファージP1を感染させ、ここで該感染の間にファージP1によってCreタンパク質が発現される段階と；
ｎ．それぞれが前記挿入された第二のトランスポゾンの一つを含む前記複数の増幅された第一末端切り取りDNAインサートのそれぞれから反対側の末端部分を切り取って、新たな反対側末端をもつ複数の両末端切り取りDNAインサートを作成する段階と；
ｏ．前記ベクター中の前記複数の両末端切り取りDNAインサートを前記P1ファージ頭部にパッケージングする段階と；
ｐ．前記P1ファージ頭部を使って新鮮なNS3516細胞の第二のコロニーに感染させ、前記第一の抗生物質および前記第二のトランスポゾン中に耐性遺伝子がある第二の抗生物質を含むLB寒天プレート上で選別することによって前記複数の両末端切り取りDNAインサートを増幅し、それにより新鮮なNS3516細胞の前記第二のコロニーから生成された複数のNS3516細胞コロニーにおいて複数の両末端切り取りDNAインサートを増幅する段階と；
ｑ．前記ベクター中の前記増幅された複数の異なる両末端切り取りDNAインサートを単離して、新鮮なNS3516細胞の前記第二のコロニーから各コロニーが同じ反対側末端切り取りをもつ複数のコロニーを得る段階と；
ｒ．前記異なる両末端切り取りDNAインサートの、前記増幅された複数の新しい反対側末端部分を、第二の合成DNAプライマーを使って配列決定する段階、
とを有する方法。
【請求項２０】
前記第一のトランスポゾンがトランスポゾン・プラスミドpTn  markerless2である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記第二のトランスポゾンがpTnloxP511(B)RSVneo2よりなる群から選ばれるトランスポゾン・プラスミドである、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記第一の合成DNAプライマーが配列番号4に記載の塩基配列および配列番号6に記載の塩基配列よりなる群から選ばれる塩基配列を有するDNAオリゴヌクレオチドである、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
トランスポゾン内の抗生物質耐性遺伝子を使う代わりにファージP1頭部パッケージングを使って転移を選別する方法であって：
ａ．それぞれが野生型loxPまたは変異型loxPサイトのいずれかを担持する第一のトランスポゾンを含む同一配列の複数のプラスミドを構築する段階と；
ｂ．前記複数の第一のトランスポゾン含有プラスミドを、それぞれが第一の抗生物質耐性遺伝子を担持する前記ベクター中のDNAインサートを含む細胞に移入する段階と；
ｃ．前記複数の第一のトランスポゾンのそれぞれを前記細胞中にある前記DNAインサート中に誘導する段階と；
ｄ．前記DNAインサート中に前記複数の第一のトランスポゾンが挿入された前記細胞にファージP1を感染させ、ここで該感染の間にファージP1によってCreタンパク質が発現される段階と；
ｅ．それぞれが前記挿入された第一のトランスポゾンの一つを含む前記DNAインサートのそれぞれから第一の末端部分を切り取って、新たな第一の末端をもつ複数の第一末端切り取りDNAインサートを作成する段階と；
ｆ．前記第一末端切り取りDNAインサートを前記P1ファージ頭部にパッケージングする段階と；
ｇ．前記P1ファージ頭部を使って新鮮なNS3516細胞の第一のコロニーに感染させ、前記ベクター中に耐性遺伝子がある第一の抗生物質を含むLB寒天プレート上で選別することによって前記第一末端切り取りDNAインサートを増幅し、それにより新鮮なNS3516細胞の前記第一のコロニーから生成された複数のNS3516細胞コロニーにおいて前記複数の第一末端切り取りDNAインサートを増幅する段階と；
ｈ．前記ベクター中の前記増幅された複数の異なる第一末端切り取りDNAインサートを単離して、新鮮なNS3516細胞の前記第一のコロニーから各コロニーが同じ末端切り取りをもつ複数のコロニーを得る段階と；
ｉ．前記増幅された複数の異なる第一末端切り取りDNAインサートの、前記増幅された複数の新しい第一末端部分を、第一の合成DNAプライマーを使って配列決定する段階、
とを有する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〈関連出願への相互参照〉
出願人は、米国特許法第１１９条（ｅ）のもとで、2005年10月2日に出願された仮出願第60/651,857号、2005年10月2日に出願された仮出願第60/651,853号および2005年10月2日に出願された仮出願第60/651,858号の恩恵を主張する。
【０００２】
本発明は、NIGMSによるMBRS-SCORE助成金第SO608049、NCIによる助成金第1U56CA92077-01、NIHによるEXPORT助成金第1P20MD00175-01のもとでの政府援助を用いてなされた。政府は本発明に対してある種の権利を有する。
【０００３】
Sequence  Listingというコンピュータ・プログラム・リストの付録が本稿とともにコンパクト・ディスクで提出されており、ここに参照によって組み込まれ、本出願の一部とされる。
【背景技術】
【０００４】
ゲノム配列の比較は、ヒトとマウスとの間で高度に保存されているDNAの多くが実際にタンパク質をコードしていないことを示しており(1)、遺伝子発現の調節に関わっていると考えられる(2,3)。この保存された非コードDNAの一部はシス作用性配列をなし、時に遺伝子のコード領域から遠く隔たった位置にあり、転写を調節する(2-5)。これらの機能的同定は大きな課題を呈する。というのも、伝統的なアプローチは、小さなプラスミドにおけるDNA配列分子間の短距離相互作用しか扱ってこなかったからである。
【０００５】
遺伝子に対して遠位の調節配列を機能的に位置特定することは、該遺伝子およびその調節因子が、細菌人工染色体（BAC:  bacterial  artificial  chromosome）またはP1由来の人工染色体（PAC:  P1-derived  artificial  chromosome）のような大きな挿入クローン内に収容されることを要求する(6-8)。大きなインサートをもつクローンの、ヒト、マウスおよびラットDNAの高度なカバーをもつライブラリーが存在しており(9-11)、ヒト・ゲノム全体にわたるBACクローンのセットが利用可能になったことで、本格的な機能マッピング・プロジェクトのための舞台が整った(12)。こうしたライブラリーからのクローン内の大きなゲノム性インサートを切り取ることのできる手順がそのような努力を助けるはずである(13-19)。
【０００６】
BACおよびPAC内のゲノム性インサートの一端からDNAを漸進的に欠失させる諸方法はすでに記述があり、染色体の物理マップ上で遺伝子マーカーを位置特定するために使用されている(20,21)。インサートDNA中のランダムに転移されたloxPサイトとクローンに内生的なloxPサイトとのCreによる組み換えが欠失系列を生成する。結果として生じる切り取りは、P1ファージ内に包むことにより回収され、クローンの大きさは110kbに制限される。この制限にもかかわらず、遺伝子調節配列のための保存された非コードDNAの100kbを迅速にスキャンする容易さは顕著な利点であり、この手順は細菌、トランスジェニック・マウスでNkx2-5遺伝子の27kb上流のところに３つの新しいエンハンサー配列を機能的に同定するのに使われた(3)。
【０００７】
調節要素は時としてイントロン内にある、または遺伝子の下流に位置していることがあるので、BACインサートを両端から切り取ることができることが望ましい。幸い、pBACe3.6およびpTARBAC1または-2ベクターのような、より新しいリソース・ライブラリーのために使われるクローニング媒体は、二つの異なるloxPサイトに挟まれるインサートDNAを含んでいる(22)。このような配置は、異なるloxPサイトを担持するトランスポゾンで両端からDNAを切り取るために理想的と考えられたかもしれないが、その後の研究はそうした戦略の開発に水を差す結果となった：これらのクローンにおけるDNAインサートを挟む野生型loxPサイトと変異型loxP511サイトの間の交差組み換えが多様な設定において5ないし100%の範囲であると報告されたのである(19,23-26)。
【０００８】
異なるloxPサイト変異体の対を使った最近のある研究は、初期の発見が、組み換えの間の構成的発現からのCreタンパク質の過剰および／または持続的レベルによって影響されていた可能性があることを示唆している(27)。そのため、野生型loxPサイトと511-loxPサイトとの間の交差組み換えが、ファージP1の導入の間に起こるCreタンパク質の一過性発現を使って再調査された。我々はここに、これら二つのサイト間の組み換えにおける漏れは、二つの野生型サイト間の場合の0.5%でしかないと判明したことを報告する。この結果は、野生型または変異型loxP511サイトのいずれかを担持するトランスポゾンを使っての、pBACe3.6および関係するベクターにおけるゲノム性インサートの両端の漸進的欠失を可能にした。
【０００９】
細菌またはイースト中で伝搬される大きなインサートDNAクローンは、ヒト・ゲノムの物理マップ上で遺伝子を配列決定および位置特定するために枢要な役割を演じてきた。残念ながら、これらのリソースは、哺乳類細胞応答性の制御またはレポーター要素がないため、ヒト細胞における機能研究を追求するために直接使うことはできない。そのため、そのようなライブラリーからのクローンを改造して哺乳類細胞の解析になじむようにするか(13,15,16,39,23,18,49,50)、あるいは代替的に細菌細胞とヒト細胞の両方で伝搬されることのできるシャトル・ベクター内にゲノム・ライブラリーを再構築するか(32,51,52,53,54)に多大な努力が費やされてきた。loxPトランスポゾンを使ったBACおよびPAC内のDNAインサートの端からの漸進的な欠失はすでに記述があり(14,20)、染色体の物理マップ上で遺伝子マーカーをマッピングするのに使われている(20)。ゲノム性DNAを両端から切り取る能力は、しばしば長い距離を通じてはたらく転写調節配列のマッピングを大いに助け、遺伝子境界を定義し、正確にトリミングされた遺伝子をその染色体のコンテキストにおいて数多くの用途のために利用可能にするはずである。そのため、野生型と変異型のloxPトランスポゾンを使って両端からDNAを切り取る欠失マッピング手順の適応可能性が調査された。
【００１０】
野生型といくつかの一塩基置換変異体との間のCre組み換えは、若干の例外を除いてloxPサイトはその同一のコピーとしか組み換わらないことを示している(33)。組み換えは、二塩基置換も含め8bpのスペーサー領域における塩基変化を許容できるが、生体外での反応のためには同一の対が要求された(25)。しかしながら、最近の細胞研究は異なる結論に達した：タグ付けされた野生型Creタンパク質が、野生型loxPサイト含有プラスミドをBAC中でインサートDNAを挟む野生型および変異型のloxP511サイトに組み換える効率が同じだったのである(23)。いくつかのloxP変異体サイトを解析したもう一つの報告は、野生型とここで使われる二つを含む変異型との間の交差組み換えが1〜12%の範囲であることを記載した(24)。ゲノム性DNAを挟む野生型および変異型loxP511をもついくつかのBACライブラリーが利用可能になっているが(35,10)、インサートDNAの両端からの切り取りはいまだ報告されていない。そのため、まず、野生型のCrタンパク質を用いて野生型と変異型のloxPサイトを組み換えることに関するジレンマを解決することに努力が向けられた。次いでその結果が、いくつかのPACクローンにおいて大きなインサートのDNAを両端から欠失させる手順を開発するために使われた。
【００１１】
高等真核生物における遺伝子発現は、適切なレベルの遺伝子産物が適切な時点で、適切な組織でのみ作られることを保証するよう、しばしば複数段階において調節される。これらの制御機構の多くは転写レベルで機能する。よって、多くの哺乳類遺伝子は、その組織限定の転写因子に反応して遺伝子の発現をオンにする組織特異的なエンハンサーを含む。そのような組織特異的なエンハンサーはしばしば、遺伝子のコード領域からは長い距離のところに位置する(57-62)。遺伝子または染色体座を発現抑制する調節配列が知られており、これらの多くも長い距離を通じて機能する(63,64)。
【００１２】
遠位の調節配列の機能解析は、関心のある遺伝子がPACおよびBACのような大きなインサートのクローンに収容されているときに容易になる。そのようなクローンにおけるインサートDNAの末端からの切り取りは、トランスポゾン改造手順を使って簡単にできる(14)。次いで調節要素は、好適な哺乳類細胞ラインにおける該クローンのそのような切り取られた形における遺伝子の発現を解析することによって位置特定できる。そこで、哺乳類の細胞特異的な抗生物質耐性遺伝子をBAC/PAC欠失に導入することのできるloxPトランスポゾンがその目的のために構築された(14)。BACにおける特定の配列の大きな欠失は、細菌における誘導可能な相同組み換えシステムを使っても実現されている(13,15,16-66,68,18)。しかしながら、これらおよびその他の、配列の相同性に基づく手順(68)は、単一の実験から、欠失クローンの全体配列を解析のために生成しはしない。
【００１３】
トランスジェニック・マウス技術の最近の進展は、BACクローン全体をマウスに導入できるようにしている(18,58)。そのような手順により、動物中の内生遺伝子を暗示する組織特異的な発現パターンを得ることが可能になる。これは、それ以前には、遺伝子のcDNAのコピーのみを含む小さなプラスミド構造体を導入することによっては達成されなかったことである(13)。この技術は、近年、生体条件内でNkx2-5遺伝子の調節の境界を位置特定するよう拡張された(69)。心臓発生において枢要な役割をもつことがわかっている高度に保存されているホメオボックス転写因子遺伝子Nkx2-5の発現を制御する調節要素の同定にかなりの努力が注がれてきた(59,60)。従来式の技術を使ってそうした研究において同定されたNkx2-5遺伝子における７つの近位の調節要素は、哺乳類の心房・心室の発生の際の、きわめて複雑でモジュール式の調節パターンを示した。しかしながら、左心室、心房および舌の筋肉のエンハンサーはこうした研究では未同定のままに終わった。
【００１４】
そこで、GFP  BAC融合クローンにおけるマウスのNkx2-5遺伝子のはるか上流域での一連の切り取りが、長いレンジの転写調節配列を機能的にマッピングするために使われた。心房・心室／組織特異的な仕方でNkx2-5の発現を指揮する遺伝子の27kbほど上流に位置する３つの新たなエンハンサー領域UH4、UH5およびUH6が同定された(Chi  et  al.；原稿投稿中)。このアプローチは、loxPトランスポゾン改造手順によって生成される欠失がBACクローンに追加的なプロモーター要素を導入しないことを必要としていた。当該遺伝子に内生的なものを隠蔽するのを避けるためである。そこで、薬物耐性遺伝子および／または真核生物プロモーター要素のない新たなTn10ミニ・トランスポゾンpTnMarkerless1およびpTnMarkerless2が、この研究で使うために構築された。DNAの転移断片内に細菌性抗生物質耐性遺伝子がないので、これらの新たなトランスポゾンは、普通なら低頻度の挿入を選好するために新規のP1頭部パッケージング機構を使った。
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【非特許文献１２】Krzywinski  M,  Bosdet  I,  Smailus  D,  Chiu  R,  Mathewson  C,  Wye  N,  Barber  S,  Brown-John  M,  Chan  S,  Chand  S,  Cloutier  A,  Girn  N,  Lee  D,  Masson  A,  Mayo  M,  Olson  T,  Pandoh  P,  Prabhu  AL,  Schoenmakers  E,  Tsai  M,  Albertson  D,  Lam  W,  Choy  CO,  Osoegawa  K,  Zhao  S,  de  Jong  PJ,  Schein  J,  Jones  S,  Marra  MA.  (2004).  A  set  of  BAC  clones  spanning  the  human  genome.  Nucleic  Acids  Res.  32:  3651-3660.
【非特許文献１３】Yang  XW,  Model  P,  Heintz  N.  (1997).  Homologous  recombination  based  modification  in  Escherichia  coli  and  germline  transmission  in  transgenic  mice  of  a  bacterial  artificial  chromosome.  Nat  Biotechnol  9:  859-865.
【非特許文献１４】Chatterjee,  P.K.,  Coren,  J.C.  (1997).  Isolating  large  nested  deletions  in  PACs  and  BACs  by  in  vivo  selection  of  P1  headful-packaged  products  of  Cre-catalyzed  recombination  between  the  loxP  site  in  PAC  and  BAC  and  one  introduced  in  transposition.  Nuc.  Acids  Res.  25,  2205-2212.
【非特許文献１５】Jessen  JR,  Meng  A,  McFarlane  RJ,  Paw  BH,  Zon  LI,  Smith  GR,  Lin  S.  (1998).  Modification  of  bacterial  artificial  chromosomes  through  chi-stimulated  homologous  recombination  and  its  application  in  zebrafish  transgenesis.  Proc  Natl  Acad  Sci  USA.  95:  5121-5126.
【非特許文献１６】Zhang  Y,  Buchholz  F,  Muyrers  JP,  Stewart  AF.  (1998).  A  new  logic  for  DNA  engineering  using  recombination  in  Escherichia  coli.  Nat  Genet.  20:  123-128.
【非特許文献１７】Muyrers  JP,  Zhang  Y,  Testa  G,  and  Stewart  AF  (1999).  Rapid  modification  of  Bacterial  Artificial  Chromosomes  by  ET  recombination.  Nucleic  Acids  Res  27:  1555-1557.
【非特許文献１８】Gong  S,  Yang  XW,  Li  C,  Heintz  N.  (2002)  Highly  efficient  modification  of  bacterial  artificial  chromosomes  (BACs)  using  novel  shuttle  vectors  containing  the  R6Kgamma  origin  of  replication.  Genome  Res.  12:1992-1998.
【非特許文献１９】Nistala  R,  Sigmund  CD.  (2002)  A  reliable  and  efficient  method  for  deleting  operational  sequences  in  PACs  and  BACs.  Nucleic  Acids.  Res.  30:e41.
【非特許文献２０】Chatterjee,  P.K.,  Yarnall,  D.P.,  Haneline,  S.A.,  Godlevski,  M.M.,  Thornber,  S.J.,  Robinson,  P.S.,  Davies,  H.E.,  White,  N.J.,  Riley,  J.H.  and  Shepherd,  N.S.  (1999).  Direct  Sequencing  of  Bacterial  and  P1  Artificial  Chromosome  Nested-deletions  for  Identifying  Position-Specific  Single  Nucleotide  Polymorphisms.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  (USA)  96:13276-13281.
【非特許文献２１】Gilmore,  R.C.,  Baker  Jr.,  J.,  Dempsey,  S.,  Marchan,  R.,  Colprew  Jr.,  R.N.L.,  Maeda,  N.,  Smithies,  O.,  Byrd,  G.,  Bukoski,  R.D.,  Harewood,  K.R.  &.  Chatterjee,  P.K.  (2001).  Using  PAC  nested-deletions  to  order  contigs  and  microsatel1ite  markers  at  the  high  repetitive  sequence  containing  Npr3  gene  locus.  Gene  275:65-72.
【非特許文献２２】Frengen,  E.,  Zhao,  B.,  Howe,  S.,  Weichenhan,  D.,  Osoegawa,  K,  Gjernes,  E.,  Jessee,  J.,  Prydz,  H,  Huxley,  C.,  deJong,  P  J.  (2000).  Modular  bacterial  artificial  chromosomes  for  transfer  of  large  inserts  into  mammalian  cells.  Genomics  68:118-112.
【非特許文献２３】Wang,  Z.,  Engler,  P.,  Longacre,  A.,  Storb,  U.  (2001).  An  efficient  method  for  high-fidelity  BAC/PAC  retrofitting  with  a  selectable  marker  for  mammalian  ce11  transfection.  Genome  Res.  11:137-142.
【非特許文献２４】Siegel,  R.W.,  Jain,  R.  and  Bradbury,  A.  (2001)  Using  an  in  vivo  phagemid  system  to  identify  non-compatible  loxP  sequences.  FEBS  lett.  505:467-473.
【非特許文献２５】Lee,  G.,  Saito,  I.,  (1998).  Role  of  nucleotide  sequences  of  loxP  spacer  region  in  Cre-mediated  recombination.  Gene  216,  55-65.
【非特許文献２６】Kolb  AF.  (2001)  Selection-marker-free  modification  of  the  murine  beta-casein  gene  using  a  lox  2272  site.  Anal  Biochem.  290:260-271.
【非特許文献２７】Chatterjee,  P.K.,  Shakes,  L.A.,  Srivastava,  D.K.,  Garland,  D.M.,  Harewood,  K.R.,  Moore,  K.J.,  and  Coren,  J.S.  (2004).  Mutually  Exclusive  Recombination  of  Wild  Type  and  Mutant  loxP  Sites  in  vivo  Facilitates  Transposon-Mediated  Deletions  from  Both  Ends  of  Genomic  DNA  in  PACs.  Nucleic  Acids  Research  32:5668-5676.
【非特許文献２８】Chatterjee,  P.K.,  Mukherjee,  S.,  Shakes,  L.A.,  Wilson,  III,  W.,  Harewood,  K.R.  &  Byrd,  G.  (2004).  Selecting  Transpositions  of  a  Markerless  Transposon  Using  Phage  P1  Headful  Packaging:  New  Transposons  for  Functionally  Mapping  Long  Range  Regulatory  Sequencers  in  BACs.  Analytical  Biochemistry  335:305-315.
【非特許文献２９】Chatterjee,  P.K.  (2004).  Retrofitting  BACs  and  PACs  with  LoxP  Transposons  to  Generate  Nested  Deletions.  "Bacterial  Artificial  Chromosomes"  vol  1,  pp  231-241.  Methods  in  Mol.  Biology  series  vol  255,  The  Humana  Press  Inc.  Editors:  Shaying  Zhao  &  Marvin  Stodolsky.
【非特許文献３０】Sternberg  N,  Smoller  D,  Braden  T.  (1994).  Three  new  developments  in  P1  cloning:  Increased  cloning  efficiency,  improved  clone  recovery,  and  a  new  P1  mouse  library.  Genet  Anal  Tech  Appl.  11:  171-180.
【非特許文献３１】Coren.  JS,  Pierce,  JC  and  Sternberg  N.  (1995).  Headful  packaging  revisited:  the  packaging  of  more  than  one  DNA  molecule  into  a  bacteriophage  P1  head.  J.  Mol.  Biol.  249:176-184.
【非特許文献３２】Chatterjee,  P.K.  and  Sternberg,  N.L..  (1996).  Retrofitting  high  molecular  weight  DNA  cloned  in  P1:  introduction  of  reporter  genes,  markers  selectable  in  mammalian  cells  and  generation  of  nested  deletions.  Genet  Anal  Biomol.  Eng.  13:33-42.
【非特許文献３３】Hoess,  R.H.,  Wierzbicki,  A.,  Abremski,  K.  (1986).  The  role  of  the  loxP  spacer  region  in  Cre-mediated  recombination.  Nucleic  Acids  Res.  14:2287-2300.
【非特許文献３４】Chatterjee,  P.K.,  and  Briley,  L.P.  (2000).  Analysis  of  a  Clonal  Selection  Event  During  Transposon-mediated  Nested-Deletion  Formation  in  Rare  BAC  and  PAC  clones.  Analytical  Biochemistry  285:121-126.
【非特許文献３５】Frengen  E,  Weichenhan  D,  Zhao  B,  Osoegawa  K,  van  Geel  M,  de  Jong  PJ  (1999).  A  modular,  positive  selection  bacterial  artificial  chromosome  vector  with  multiple  cloning  sites.  Genomics  58:250-253.
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【非特許文献３８】Feng,  YQ,  Seibler,  J,  Alami,  R,  Eisen,  A,  Westerman,  KA,  Leboulch,  P,  Fiering  S,  and  Bouhassira,  EE.  (1999),  Site-specific  chromosomal  integration  in  mammalian  cells:  Highly  efficient  CRE  recombinase-mediated  cassette  exchange.  J.  Mol.  Biol.  292:779-785.
【非特許文献３９】Imam  AM,  Patrinos  GP,  de  Krom  M,  Bottardi  S,  Janssens  RJ,  Katsantoni  E,  Wai  AW,  Shenatt  DJ,  Grosveld  FG.  (2000).  Modification  of  human  beta-globin  locus  PAC  clones  by  homologous  recombination  in  Escherichia  coli.  Nucleic  Acids  Res.  28:E65
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【非特許文献４５】Nechiporuk  T,  Nechiporuk  A,  Sahba  S,  Figueroa  K,  Shibata  H,  Chen  XN,  Korenberg  JR,  de  Jong  P,  Pulst  SM.  (1997).  A  high-resolution  PAC  and  BAC  map  of  the  SCA2  region.  Genomics.  44:321-329.
【非特許文献４６】Moore  CS,  Lee  JS,  Birren  B,  Stetten  G,  Baxter  LL,  Reeves  RH  (1999).  Integration  of  cytogenetic  with  recombinational  and  physical  maps  of  mouse  chromosome  16.  Genomics.  59:1-5.
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【非特許文献４８】Ahn  J,  Won  TW,  Kaplan  DE,  Londin  ER,  Kuzmic  P,  Gelernter  J,  Gruen  JR.  (2002).  A  detailed  physical  map  of  the  6p  reading  disability  locus,  including  new  markers  and  confirmation  of  recombination  suppression,  Hum  Genet.  111:339-349.
【非特許文献４９】Kaname,  T.  and  Huxley,  C.  (2001).  Simple  and  efficient  vectors  for  retrofitting  BACs  and  PACs  with  mammalian  neoR  and  EGFP  marker  genes.  Gene  266:147-153.
【非特許文献５０】Lee  EC,  Yu  D,  Martinez  de  Velasco  J,  Tessarollo  L,  Swing  DA,  Court  DL,  Jenkins  NA,  Copeland  NG.  (2001).  A  highly  efficient  E.  coli-based  chromosome  engineering  system  adapted  for  recombinogenic  targeting  and  subcloning  of  BAC  DNA.  Genomics  73:56-65.
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【非特許文献５２】Wade-Martins,  R.,  Frampton,  J.,  James,  M.R.  (1999).  Long-term  stability  of  large  insert  genomic  DNA  episomal  shuttle  vectors  in  human  cells.  Nucleic  Acids  Res.  27,  1674-1682.
【非特許文献５３】Coren,  J.S.  and  Sternberg,  N.  (2001).  Construction  of  a  PAC  vector  system  for  the  propagation  of  genomic  DNA  in  bacterial  and  mammalian  cells,  and  subsequent  generation  of  nested  deletions  in  individual  library  members.  Gene  264,  11-18.
【非特許文献５４】Al-Hasani,  K.,  Simpfendorfer,  K.,  Wardan,  H.,  Vadolas,  J.,  Zaibak,  F.,  Villian,  R.,  Ioannou,  P.  A.  (2003).  Development  of  a  novel  bacterial  artificial  chromosome  cloning  system  for  functional  studies.  Plasmid  49,  184-187.
【非特許文献５５】Gernon,  A.,  Woldu,  E.,  Godlevski,  M.,  Wilson,  W.,  Gilmore,  R.C.,  Grant,  DJ.,  Chatterjee,  P.K.,  and  Kephart,  D.  (2003).  Automated  Purification  of  Dye  Terminator  Sequencing  Reactions:  an  Approach  to  High  Throughput  Capillary  Electrophoresis  Sequencing  of  Large  Templates.  J.  Assoc.  Lab.  Automation  8:  19-23.
【非特許文献５６】Hartung,  M.  and  Kisters-Woike,  B.  (1998).  Cre  mutants  with  altered  DNA  binding  properties.  J.  Biol  Chem.  273:  22884-22891.
【非特許文献５７】Lee,  G.,  and  Jayaram,  M.  (1995).  Role  of  partner  homology  in  DNA  recombination.  Complementary  base  pairing  orients  the  5'-hydroxyl  for  strand  joining  during  Flp  site-specific  recombination.  J.  Biol.  Chem.  270:4042-4052.
【非特許文献５８】Antoch,  M.P.,  Song,  E.J.,  Chang,  A.M.,  Vitaterna,  M.H.,  Zhao,  Y.,  Wilsbacher,  L.D.,  Sangoram,  A.M.,  King,  D.P.,  Pinto,  L.H.,  &  Takahashi,  J.S.  (1997)  Functional  identification  of  the  mouse  circadian  Clock  gene  by  transgenic  BAC  rescue.  Cell  89:655-667.
【非特許文献５９】Yang,  X.  W.,  Wynder,  C,  Doughty,  M.  L.,  and  Heintz,  N.  (1999)  BAC-mediated  gene-dosage  analysis  reveals  a  role  for  Ziprol  (Ru49/Zfp38)  in  progenitor  cell  proliferation  in  cerebellum  and  skin.  Nat  Gene.  22:  327-335.
【非特許文献６０】Reecy  JM,  Li  X,  Yamada  M,  DeMayo  FJ,  Newman  CS,  Harvey  RP,  Schwartz  RJ.  (1999)  Identification  of  upstream  regulatory  regions  in  the  heart-expressed  homeobox  gene  Nkx2-5.  Development  126:  839-849.
【非特許文献６１】Tanaka  M,  Wechsler  SB,  Lee  IW,  Yamasaki  N,  Lawitts  JA,  Izumo  S.  (1999)  Complex  modular  cis-acting  elements  regulate  expression  of  the  cardiac  specifying  homeobox  gene  Csx/Nkx2.5.  Development.  126:1439-1450.
【非特許文献６２】Carvajal,  J.  J.,  Cox,  D.,  Summerbell,  D.,  and  Rigby,  P.  W.  (2001)  A  BAC  transgenic  analysis  of  the  Mrf4/Myf5  locus  reveals  interdigitated  elements  that  control  activation  and  maintenance  of  gene  expression  during  muscle  development.  Development.  128:  1857-1868.
【非特許文献６３】Gottgens  B,  Barton  LM,  Chapman  MA,  Sinclair  AM,  Knudsen  B,  Grafham  D,  Gilbert  JG,  Rogers  J,  Bentley  DR,  Green  AR.  (2002).  Transcriptional  regulation  of  the  stem  cell  leukemia  gene  (SCL)―  comparative  analysis  of  five  vertebrate  SCL  loci.  Genome  Res.  5:  749-759.
【非特許文献６４】Jessen,  J.  R.,  Willett,  C.  E.,  and  Lin,  S.  (1999)  Artificial  chromosome  transgenesis  reveals  long-distance  negative  regulation  of  rag1  in  zebrafish.  Nat  Genet.  23:  15-16.
【非特許文献６５】DiSepio,  D.,  Bickenbach,  J.  R.,  Longley,  M.  A.,  Bundman,  D.  S.,  Rothnagel,  J.  A.,  and  Roop,  D.  R.  (1999)  Characterization  of  loricrin  regulation  in  vitro  and  in  transgenic  mice.  Differentiation.  64:  225-235.
【非特許文献６６】Brake,  R.L.,  Chatterjee,  P.K.,  Kees,  U.R  &  Watt,  P.M.  (2004).  The  functional  mapping  of  long-range  transcription  control  elements  of  the  HOX11  proto-oncogene.  Biochem.  Biophys.  Res.  Com.  313:  327-335.
【非特許文献６７】Orford  M,  Nefedov  M,  Vadolas  J,  Zaibak  F,  Williamson  R,  Ioannou  PA.  (2000)  Engineering  EGFP  reporter  constructs  into  a  200  kb  human  beta-globin  BAC  clone  using  GET  Recombination.  Nucleic  Acids  Res  18:  E84
【非特許文献６８】Lee  EC,  Yu  D,  Martinez  de  Velasco  J,  Tessarollo  L,  Swing  DA,  Court  DL,  Jenkins  NA,  Copeland  NG.  (2001)  A  highly  efficient  Escherichia  coli-based  chromosome  engineering  system  adapted  for  recombinogenic  targeting  and  subcloning  of  BAC  DNA.  Genomics.  73:  56-65.
【非特許文献６９】Swaminathan  S,  Ellis  HM,  Waters  LS,  Yu  D,  Lee  EC,  Court  DL,  Sharan  SK.  (2001).  Rapid  engineering  of  bacterial  artificial  chromosomes  using  oligonucleotides.  Genesis.  1:  14-21.
【非特許文献７０】Chi  X,  Zhang  S-X,  DeMayo,  F.J.  Rosenberg,  S  M  and  Schwartz,  R.J.  (2003)  Expression  of  Nkx2-5-GFP  bacterial  Artificial  Chromosome  Transgenic  Mice  Closely  Resembled  Endogenous  Nkx2-5  Gene  Activity.  Genesis  35:  220-226.
【非特許文献７１】Sambrook,  J.,  Fritsch,  E.F.  and  Maniatis,  T.  (1989)  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  Cold  Spring  Harbor,  NY.  2nd  edn  pp1.25-1.28.
【非特許文献７２】Elliott  T5  Roth  JR  (1988).  Characterization  of  Tn10d-Cam:  a  transposition  defective  Tn10  specifying  chloramphenicol  resistance.  MoI  Gen  Genet  213:  332-338.
【非特許文献７３】Craig  N.L.  (1997).  Target  site  selection  in  transposition.  Annu  Rev  Biochem  66:  437-474.
【非特許文献７４】Windle  BE,  Hays  JB.  (1986).  A  phage  P1  function  that  stimulates  homologous  recombination  of  the  Escherichia  coli  chromosome.  Proc  Natl  Acad  Sci  USA  83:  3885-3889.
【非特許文献７５】Laufer  CS,  Hays  JB,  Windle  BE,  Schaefer  TS,  Lee  EH,  Hays  SL,  McClure  MR.  (1989)  Enhancement  of  Escherichia  coli  plasmid  and  chromosomal  recombination  by  the  Ref  function  of  bacteriophage  P1.  Genetics  123:  465-476.
【非特許文献７６】Yarmolinsky,  M.B.  &  Sternberg  N.  (1988).  Bacteriophage  P1  in  The  Bacteriophages,  Vol  1  edited  by  Richard  Calendar,  Plenum  Publishing  Corporation.
【非特許文献７７】Coren,  J.S.,  Sternberg,  N.,  2001.  Construction  of  a  PAC  vector  system  for  the  propagation  of  genomic  DNA  in  bacterial  and  mammalian  cells,  and  subsequent  generation  of  nested  deletions  in  individual  library  members.  Gene  264,  11-18.
【非特許文献７８】Pierce  JC,  Sternberg  N,  Sauer  B.  (1992).  A  mouse  genomic  library  in  the  bacteriophage  P1  cloning  system:  organization  and  characterization.  Mamm  Genome.  3:  550-558.
【非特許文献７９】Shepherd  NS,  Pfrogner  BD,  Coulby  JN,  Ackerman  SL,  Vaidyanathan  G,  Sauer  RH,  Balkenhol  TC,  Sternberg  N.  (1994).  Preparation  and  screening  of  an  arrayed  human  genomic  library  generated  with  the  P1  cloning  system.  Proc  Natl  Acad  Sci  USA.  91:  2629-2633.
【非特許文献８０】Lewin  B.  Genes  VII  (2000)  In  Transposons,  Chapter  15,  Oxford  Univ  Press,  Inc.  New  York.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
いくつかの以前の報告に反し、野生型と変異型loxP511サイトとの間の交差組み換えは、Creタンパク質が感染中にファージP1によって発現されるなら、二つの野生型サイト間の場合の0.5%に満たない。この発見により、pBACe3.6および関係するベクターにおけるこれら二つのloxPサイトに挟まれる大きなゲノム性インサートの両端から漸進的にDNAを切り取ることを、野生型またはloxP511配列のいずれかを担持するトランスポゾンを用いて行う手順の開発が可能になる。新たに構築されたloxP511トランスポゾンは、カナマイシン耐性遺伝子を含んでいるか、全くマーカーを含まないかのいずれかであった。欠失におけるインサートDNA末端は、それぞれの組み換え後に残る各トランスポゾン末端に一意的なプライマーを用いて配列決定される。223個の欠失を末端配列決定したことで、P1導入の際にそれらのサイト間に観察された交差組み換えが低レベルでも手順が複雑にならないことが確認された：ゲノム性インサートの意図されない末端からの切り取りは起こらなかったのである。一緒にプールされた複数のBACを、末端欠失を行うために、単一の管内で処理することもできる。パブリックドメインにあるたいていのBACクローンの変異型および野生型のloxPサイトとトランスポゾンとして挿入されたloxPサイトとの間の実に極少な交差組み換えを利用するこの欠失技術は、治療上関心のあるものも含む数多くのプロジェクトにおいて、長いレンジの遺伝子調節配列を機能的にマッピングすることを容易にし、定義された機能境界を用いて遺伝子を単離するのを助けるはずである。
【００１６】
Creタンパク質によって媒介される野生型および変異型のloxPサイトの組み換えは、敏感なファージP1導入検定を使って生体条件で分析された。いくつかの以前の報告とは異なり、loxPサイト間の組み換えはきわめて特異的であることが見出された：生体条件ではloxPサイトは同一の配列をもつ別のloxPサイトとしか組み換わらず、野生型と変異型のサイトの間にも、試験された二つの異なる変異型サイトの間にも、交差組み換えはなかったのである。同一の配列の変異型loxPサイトどうしは野生型と同じくらい効率的に組み換わった。生体条件での変異型loxPサイトどうしのきわめて特異的で効率的な組み換えは、野生型または変異型のloxP配列のいずれかを担持するトランスポゾンを使って、PAC中の大きなゲノム性インサートのいずれかの末端からDNAを漸次的に切り取る手順を開発する助けになった。野生型と二つの変異型loxPサイトの一方とに挟まれるインサートを用いてヒトDNAのPACライブラリーを構築し、新たに構築した野生型と変異型のloxPトランスポゾンを使ってクローン内で両端からの欠失を生成した。結果の分析により、loxPサイトによるプラスミドのP1導入の際に形成される非常に大きな共挿入体に対する新たな洞察が与えられる：PACプラスミド、ファージDNAおよびトランスポゾン・プラスミド（単数または複数）を細胞中の中間体として含む２体および可能性としては多体の共挿入体（co-integrates）をもつモデルがデータに最もよくあてはまるようである。大きなDNA片を両端から切り取る能力は、遺伝子境界をより効率的に機能的にマッピングすることを容易にし、正確にトリミングされた遺伝子をその染色体のコンテキストにおいて、治療用途のために利用可能にすると思われる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
BACおよびPACにおける長いレンジの転写調節配列を機能的にマッピングするために新たなTn10ミニ・トランスポゾンが構築された。それぞれが野生型のloxPサイトを含むが、意義深いことに、DNAの転移された部分内には哺乳類や細菌の遺伝子および／またはプロモーター要素は含まなかった。以前に記述されたloxPトランスポゾンとは対照的に、この新たなトランスポゾンは、機能的マッピング研究においてBACクローンに内生的なものに干渉できる転写調節要素を導入しない。ゲノム性DNAのloxP末端からの漸進的な欠失はこれらのトランスポゾンを使って効率的に生成され、GFP-BAC融合クローンにおいて生成された一連の切り取りは、トランスジェニック・マウスにおけるNkx2-5遺伝子において、３つの新たな長いレンジのエンハンサー配列を、曖昧さなく、機能的に同定した。抗生物質耐性遺伝子を欠くこれらの新たなトランスポゾンのBACまたはPACへの挿入は、のちに大きなプラスミドを回収するためにどちらのloxPサイトもそのままにしてP1ファージの頭部の中にパッケージングできるようにするよう、クローンから十分なDNAを欠失させる能力によって間接的に選別された。そのような間接的な選別モードの結果は二通りある。一方は望ましく、もう一方は望ましくないものである：（１）スクリーンが抗生物質耐性マーカーに依存しないので、同じトランスポゾンがBACおよびPACの両方において効率的に段階的欠失（nested  deletions）を生成するために使うことができ、（２）LoxP-Creに関係しないインサート内での組み換えを通じた欠失もパッケージングされて回収され、真正のloxP-Cre欠失を識別するためにはNotI消化後のBAC/PACベクター・バンドのサイズ解析が不可欠である。それにもかかわらず、本手順は、組み換えを引き起こす配列をBACおよびPACにマッピングする潜在的なアプローチをもたらす。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
具体的には、本発明は、loxPトランスポゾン・プラスミドを使ってベクター中の野生型loxPサイトとloxP511サイトとに挟まれるDNAインサートの両端を切り取る方法であって：それぞれがloxP511サイトを担持する第一のトランスポゾンを含む同一配列の複数のプラスミドを構築する段階と；前記複数の第一のトランスポゾン含有プラスミドを、それぞれが第一の抗生物質耐性遺伝子を担持する前記ベクター中のDNAインサートを含む細胞に移入する段階と；前記複数の第一のトランスポゾンのそれぞれを前記細胞中の前記DNAインサート中に挿入されるよう誘導する段階と；前記DNAインサート中に前記複数の第一のトランスポゾンが挿入された前記細胞にファージP1を感染させ、ここで該感染の間にファージP1によってCreタンパク質が発現される段階と；それぞれが前記挿入された第一のトランスポゾンの一つを含む前記DNAインサートのそれぞれから第一の末端部分を切り取って、新たな第一の末端をもつ複数の第一末端切り取りDNAインサートを作成する段階と；前記第一末端切り取りDNAインサートを前記P1ファージ頭部にパッケージングする段階と；前記P1ファージ頭部を使って新鮮なNS3516細胞の第一のコロニーに感染させ、前記ベクター中に耐性遺伝子がある第一の抗生物質を含むLB寒天プレート上で選別することによって前記第一末端切り取りDNAインサートを増幅し、それにより新鮮なNS3516細胞の前記第一のコロニーから生成された複数のNS3516細胞コロニーにおいて前記複数の第一末端切り取りDNAインサートを増幅する段階と；前記ベクター中の前記増幅された複数の異なる第一末端切り取りDNAインサートを分離して、新鮮なNS3516細胞の前記第一のコロニーから各コロニーが同じ末端切り取りをもつ複数のコロニーを得る段階と；前記増幅された複数の異なる第一末端切り取りDNAインサートの、前記増幅された複数の新しい第一末端部分を、第一の合成DNAプライマーを使って配列決定する段階と；それぞれが野生型loxPサイトおよび前記ベクター中の前記第一の抗生物質耐性遺伝子とは異なる第二の抗生物質耐性遺伝子を担持する第二のトランスポゾンを含む同一配列の複数のプラスミドを構築する段階と；前記複数の第二のトランスポゾン含有プラスミドを、前記増幅された複数の第一末端切り取りDNAインサートを含む細胞に移入する段階と；前記複数の第二のトランスポゾンを前記増幅された複数の第一末端切り取りDNAインサートに誘導する段階と；前記複数の増幅された第一末端切り取りDNAインサート中に前記複数の第二のトランスポゾンが挿入された前記細胞にファージP1を感染させ、ここで該感染の間にファージP1によってCreタンパク質が発現される段階と；それぞれが前記挿入された第二のトランスポゾンの一つを含む前記複数の増幅された第一末端切り取りDNAインサートのそれぞれから反対側の末端部分を切り取って、新たな反対側末端をもつ複数の両末端切り取りDNAインサートを作成する段階と；前記ベクター中の前記複数の両末端切り取りDNAインサートを前記P1ファージ頭部にパッケージングする段階と；前記P1ファージ頭部を使って新鮮なNS3516細胞の第二のコロニーに感染させ、前記第一の抗生物質および前記第二のトランスポゾン中に耐性遺伝子がある第二の抗生物質を含むLB寒天プレート上で選別することによって前記複��の両末端切り取りDNAインサートを増幅し、それにより新鮮なNS3516細胞の前記第二のコロニーから生成された複数のNS3516細胞コロニーにおいて複数の両末端切り取りDNAインサートを増幅する段階と；前記ベクター中の前記増幅された複数の異なる両末端切り取りDNAインサートを分離して、新鮮なNS3516細胞の前記第二のコロニーから各コロニーが同じ反対側末端切り取りをもつ複数のコロニーを得る段階と；前記異なる両末端切り取りDNAインサートの、前記増幅された複数の新しい反対側末端部分を、第二の合成DNAプライマーを使って配列決定する段階とを有する方法である。前記複数のプラスミドは代替的に野生型loxPサイトを担持するトランスポゾンを含んでいてもよい。
【００１９】
第一のトランスポゾンは好ましくはトランスポゾン・プラスミドpTnloxP511(B)maerkerless1、pTnloxP511(B)maerkerless2またはpTnloxP511(A)であり、第二のトランスポゾンは好ましくはpTn(RSVneo2)/loxPまたはpTn(RSVneo1)/loxPである。第一の抗生物質は好ましくはクロラムフェニコールであり、好ましい第二の抗生物質はカナマイシンである。好ましいベクターはBACクローンであり、pBACe3.6、pTARBAC  1&2およびpTARBAC  2.1.よりなる群から、あるいはRP11-219A15、RP11-158M20、RP11-434D2、RP23-209O22、RP23-92L23、RP23-366M16、RP23-101N20、RF23-124B2、RP23-444K15およびRP23-130D16よりなる群から選択される。
【００２０】
本発明はさらに、トランスポゾン内の抗生物質耐性遺伝子を使う代わりにファージP1頭部パッケージングを使って転移を選別する方法であって：それぞれが野生型loxPまたは変異型loxPサイトのいずれかを担持する第一のトランスポゾンを含む同一配列の複数のプラスミドを構築する段階と；前記複数の第一のトランスポゾン含有プラスミドを、それぞれが第一の抗生物質耐性遺伝子を担持する前記ベクター中のDNAインサートを含む細胞に移入する段階と；前記複数の第一のトランスポゾンのそれぞれを前記細胞中の前記DNAインサート中に誘導する段階と；前記DNAインサート中に前記複数の第一のトランスポゾンが挿入された前記細胞にファージP1を感染させ、ここで該感染の間にファージP1によってCreタンパク質が発現される段階と；それぞれが前記挿入された第一のトランスポゾンの一つを含む前記DNAインサートのそれぞれから第一の末端部分を切り取って、新たな第一の末端をもつ複数の第一末端切り取りDNAインサートを作成する段階と；前記第一末端切り取りDNAインサートをP1ファージ頭部にパッケージングする段階と；前記P1ファージ頭部を使って新鮮なNS3516細胞の第一のコロニーに感染させ、前記ベクター中に耐性遺伝子がある第一の抗生物質を含むLB寒天プレート上で選別することによって前記第一末端切り取りDNAインサートを増幅し、それにより新鮮なNS3516細胞の前記第一のコロニーから生成された複数のNS3516細胞コロニーにおいて前記複数の第一末端切り取りDNAインサートを増幅する段階と；前記ベクター中の前記増幅された複数の異なる第一末端切り取りDNAインサートを分離して、新鮮なNS3516細胞の前記第一のコロニーから各コロニーが同じ末端切り取りをもつ複数のコロニーを得る段階と；前記増幅された複数の異なる第一末端切り取りDNAインサートの、前記増幅された複数の新しい第一末端部分を、第一の合成DNAプライマーを使って配列決定する段階とを有する方法を含む。
【００２１】
〈野生型とloxP511サイトとの間の生体条件での極少交差組み換えが、pBACe3.6および関係するベクター中での大きなDNAインサートの両端の切り取りを容易にする〉
〈材料および方法〉
オリゴデオキシリボヌクレオチドd(GGCCGCTAATAACTT  CGTATAGTATACA  TTATACGAAGTTATTGTTTAAACC)  (SEQ  ID  NO:  9)およびd(GGCCGGTTTAAACAATAACTT  CGTATAA-TGTATACTATACGAAGTTATTAGC)  (SEQ  ID  NO:  19)を、等モル量取って、1mMのEDTAおよび10mMのNaClを含む10mMのTris-HCl  pH8.0緩衝液中で70°Cまで加熱し、ゆっくりと室温までさますことによってアニールした。二本鎖のオリゴは、Pme-Iサイトに沿った変異型のloxP511配列を含み、NotI酵素で線状化したプラスミドDNAに連結した。
【００２２】
〈変異型loxP511サイトをもつTn10ミニ・トランスポゾンの構築〉
トランスポゾン・プラスミドpTnloxP*-1  (27)があらゆる変異型loxP511サイト含有プラスミドのための出発点であった。70bpの逆位反復末端の一方の近くに位置するクロラムフェニコール耐性のための遺伝子の除去を、pTnloxP*-1  DNAをPvuIIで完全に消化して最大の断片をゲル精製し、ScaIで部分消化を実行することによって行った。最大の断片は再びゲル精製し、PvuIIおよびScaI酵素によって作り出された二つの平滑末端を高濃度のT4  DNAリガーゼで連結した。形質転換されたコロニーを、アンピシリンをもつLB寒天プレート上で選別した。アンピシリン耐性のための遺伝子は、トランスポゾンの70bpの逆位反復末端の外に位置している。
【００２３】
次に、テトラサイクリン耐性遺伝子および変異型loxP*-1サイトのための配列がNotI消化によって除去され、そこに、NotI適合末端をもち、変異型loxP511配列およびPmeI制限部位を含む二本鎖オリゴヌクレオチドを連結させた（上に示した）。loxP511オリゴヌクレオチドを得るプラスミドは、クローンDNAをPmeI酵素で消化することによって抽出された。loxP511サイトが挿入されたトランスポゾンの両方の配位を分離した。それらはpTnLoxP511(A)markerless1およびpTnLoxP511(B)markerless1と名付けられた。markerless〔マーカーなし〕と指示されるのは、loxP511サイトの標的DNAへの転移について選別するための抗生物質耐性マーカーをトランスポゾンの70bpの逆位反復末端内に含まないからである（議論については文献28を参照）。
【００２４】
配列決定プライマー（Seq  25）をアンカーするための追加的なオリゴヌクレオチド二本鎖をpTnLoxP511(B)markerless1の一意的なAscIサイトに挿入して、pTnLoxP511(B)markerless2を生成した。プラスミドをAscIで線状化し、下記のオリゴヌクレオチドM13CとM13Dをハイブリダイズすることによって得られた二本鎖が上記のように連結された。
M13C:  d(CGCGCCTAGTAAAACGACGGCCAGTAGTCGTGACTGGGAAAACCTGTTTAAACC)  (SEQ  ID  NO:  10);
M13D:  d(CGCGGGTTTAAACAGGTTTTCCCAGTCACGACTACTGGCCGTCGTTTTACTAGG)  (SEQ  ID  NO:  11)。
【００２５】
細菌中でカナマイシン耐性をコードするRSVネオマイシン耐性遺伝子カセットをpTnBAC/loxP  (14)からAscIを用いて切り出し、pTnLoxP511(B)markerless1のAscIサイト（図１）に挿入した。結果として得られるトランスポゾン・プラスミドは、RSVneoカセットの二つの配位を区別するため、pTnLoxP511(B)RSVneo1またはpTnLoxP511(B)RSVneo2と名付けられる。ここで取り上げるのはpTnLoxP511(B)RSVneo2のみである。
【００２６】
〈野生型loxPサイトをもつTn10ミニ・トランスポゾンの構築〉
カナマイシン耐性遺伝子含有wt  loxPトランスポゾン・プラスミドpTn(RSVneo2)/loxPの構築を、RSVネオマイシン遺伝子カセットを先述した(28)  pTnMarkerless2に導入することによって行った。pTnBAC/loxP  (14)との違いは、クロラムフェニコール耐性遺伝子に関係したすべての配列がpTnBAC/loxP  (14)からは除去されていることである。この除去は、BAC中のクロラムフェニコール耐性遺伝子とpTnBAC/loxPプラスミド(14)中のそれらの配列との間の組み換えを減らすためである（議論については文献(28)参照）。DNA断片をアガロース・ゲルから精製してRSVネオマイシン遺伝子カセットをpTnBAC/loxPからAscIを用いて切り出し、やはりAscIを用いて線状化されたpTnMarkerless2に連結した。RSVneo遺伝子カセットの両方の配位を含むプラスミドpTn(RSVneo1)/loxPおよびpTn(RSVneo2)/loxPが分離され、後者の配位のみがここでは使用され、図１に示されている。
【００２７】
〈pBACe3.6ベクター由来のクローンにおけるインサートのloxP511末端からの欠失の生成〉
ヒトおよびマウスのBACライブラリーからの次の10のクローンをCHORI（米国カリフォルニア州）のPACPACリソースから得た：RP11-219A15、RP11-158M20、RP11-434D2、RP23-209O22、RP23-92L23、RP23-366M16、RP23-101N20、RP23-124B2、RP23-444K15、RP23-130D16。これらのクローンにおけるゲノム性インサートは、BACベクターpBACe3.6中の野生型および変異型loxP511サイトに挟まれる(9-11,22)。
【００２８】
上記のクローンのそれぞれにおいて、loxP511末端からのpTnLoxP511(B)markerless1、pTnLoxP511(B)markerless2およびpTnLoxP511(B)RSVneo2を使った段階的欠失が、以前に記述したようにして生成された(28,29)。
【００２９】
〈末端欠失を作成するための複数BACクローンの処理〉
末端欠失を作成するために、単一管内でBACを一緒にプールし、一緒に処理した。各BACクローンはトランスポゾン・プラスミドを用いて別個に形質転換され、形質転換されたコロニーはプールする前に飽和まで成長させた。
【００３０】
〈BAC欠失クローンの末端配列決定〉
典型的には、ミニプレップDNAは、数百メンバーのBAC欠失ライブラリーからランダムに選んだ60クローンから単離した。欠失の20%超でトランスポゾン・プラスミドが回収された場合、欠失クローンをアンピシリン感受性スクリーンに通した（文献20に記載）。FIGEで解析した第一ラウンドの欠失系列からのクローンのほぼ半分が一意的な大きさであった。loxP-Creとは独立してインサート内での組み換えから生じる、どちらかの型のマーカーなしトランスポゾンを使ったときにのみ見られる欠失は、FIGE解析後に除去した（図２のレーン１が例を示している）。これらは出発時のBACと同一の大きさのBACベクターDNA断片によって識別される(28)。各欠失系列の20個のクローンからのDNAは、トランスポゾン末端プライマー(20)およびABI-3100  AVANTジェネティック・アナライザー上のBig  Dye  Terminator化学を使って直接、配列決定された。プライマー伸長生成物はMagnesil（Promega社）を使って精製したが、その手順はメーカーによって提供され、(27,28)に記載されている。野生型末端をトリミングしたのちインサートDNAのloxP511側からの欠失の新たに作成された末端を配列決定するためのプライマーが開発された。それを下記に挙げる：
〈配列決定用プライマー〉
Seq  8:  d(GCAGTGTGACCGTGTGCTTCTCAAATGC)  (SEQ  ID  NO:  12)
Seq  21:  d(GATCGGCGCGCCATGATC)  (SEQ  ID  NO:  13)
Seq  25:  d(GCCAGTAGTCGTGACTG)  (SEQ  ID  NO:  14)
Neo  8:  d(GTTTTCCCTTGTCCAGATAGC)  (SEQ  ID  NO:  15)
Neo  11:  d(CTGAGTGCTTGCGGCAGCG)  (SEQ  ID  NO:  16)
Neo  12:  d(GAATCGTTTTCCGGGACG)  (SEQ  ID  NO:  17)
Neo  16:  d(GATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCC)  (SEQ  ID  NO:  18)。
【００３１】
〈結果〉
loxPトランスポゾンを使った、DNAインサートの両端からの切り取りは、インサートを挟む二つのloxPサイトの間の組み換えの漏れの度合いに決定的に依存する。以前の研究(19,23-26)においてこれらのサイトの間ではさまざまな度合いの組み換え交差反応性が観察されているので、我々の欠失手順において実際に使われるP1形質導入のもとでこれを再調査することが重要であった(27)。
【００３２】
〈ファージP1形質導入を使った野生型および変異型loxP511サイトの間の組み換え交差反応性の推定〉
いくつかの変異型loxPサイトについて、種々のCreタンパク質曝露条件のもとで、組み換え効率および排他性の両方が試験された(23-27)。ファージP1は、感染初期にCreを発現し、野生型loxPプラスミドに高忠実度で効率的に形質導入する(30-32)。P1ファージにおける野生型loxPサイトが変異型loxP511プラスミドの形質導入をする能力は、これらのサイト間の組み換え交差反応性の指標として使われた（文献27に記載）。表Iの結果は、P1は野生型サイトをもつプラスミドを効率的に形質導入できたものの、変異型loxP511プラスミドを回収できたのは非常に非効率的にでしかなかったことを示している（#17を#21と比較）。以前に記述した(27)他の二つの変異型loxPサイトでの結果と異なり、loxP511変異体の形質導入の阻害は不完全であった。パラレルな形質導入どうしを比較すると、loxP511プラスミドは野生型の0.1〜0.5%の効率で形質導入されることがわかる。このレベルの組み換え交差反応性は、いくつかの生体条件および生体外での解析(19,23-26)においてこれまでに報告されたものより著しく低い。二つのサイトの間の排他性は高いようであるが、もともと報告されていた(33)ような絶対的なものではない。以前の知見(27)と整合して、ファージP1は、野生型およびloxP511サイトの両方を担持する別のものが細胞中に存在している場合、効率的にloxP511を形質導入できた（表Iの行５、６）。ファージP1は、BAC  RP23-444K15から生成されたBAC欠失#39および#45があるときに、マーカーなしのwt-loxPトランスポゾンを用いて野生型loxP末端から切り取ることで、loxP511プラスミドを形質導入した(28)。
【００３３】
〈pBACe3.6におけるインサートDNAのloxP511末端からの欠失の生成〉
511と野生型のloxP配列はごくわずかしか交差組み換えしないので、これらに挟まれるインサートDNAは、それらのサイトを担持するトランスポゾンを使って両端から欠失させることができる。欠失の各ラウンド後に新たに作成された末端の正しさを検証すれば、わずかな漏れは補償されるはずである。インサートDNAの各末端での欠失形成後にTn10の異なる末端が残されるように、loxPサイトの二つの型をもつトランスポゾンを構築した。組み換え後に残るトランスポゾン末端それぞれに合うよう一意的なプライマーが設計された。
【００３４】
loxP511サイトを担持する二つのクラスのトランスポゾンを構築した：ｉ）マーカーなしのものと、ｉｉ）カナマイシン耐性遺伝子をマーカーとするものである。この研究では、loxP511が図１に示されるように配向されている、両クラスの「Ｂ」系列のトランスポゾンのみを使った。両クラスの「Ａ」系列はloxP511サイトが逆の配向にある。以前に記したように(28)、マーカーなしのloxPトランスポゾンの転移は、P1頭部パッケージング（P1-headful  packaging）を通じて選別され、抗生物質耐性遺伝子の標的DNAへの移転によってではない。これは、出発点となるBACをP1頭部いっぱいの大きさより大きくすることを必要とする。ゲノム性インサートのどちらの末端が最初に欠失させられるかに依存して、マーカーなしのトランスポゾンは野生型または変異型のloxP511サイトを担持することができる。野生型loxPサイトをもつマーカーなしのトランスポゾンについては以前に記述している(28)。
【００３５】
トランスポゾン・プラスミドpTnLoxP511(B)markerless1を「方法」のところに挙げた10のBACのそれぞれに移入した。形質転換されたコロニーは、クロラムフェニコールおよびアンピシリンを含むLB寒天プレート上で選別した。プレートからのコロニーは、野生型のloxPトランスポゾン形質転換されたBACについて以前に記載したように(34,28)末端欠失を作成するためにプールし、処理した。BAC欠失は、クロラムフェニコールのみのプレート上で選別した。欠失クローンから分離されたミニプレップDNAは、FIGEによる解析の前にNotI酵素で消化された(29)。図２のレーン３〜１５は、BAC  RP23-444K15におけるインサートのloxP511末端から欠失させられたクローンから分離されたDNAを示している。レーン１は、loxP-Creとは独立なインサート内での欠失を示しており(28)、ベクターDNA断片サイズは開始BAC（レーン１７）と同一の大きさ（8.8kb）である。
【００３６】
loxP511末端からの欠失は、BACクローンの部分集合において、pTnLoxP511(B)RSVneo2を用いても作成された。図２のレーン１９〜３０は、これらの欠失の集合からのNotI消化されたDNAを示しており、BACベクター断片は今では10.5kbのところにある。
【００３７】
〈欠失形成の際のloxP-Cre組み換えの特異性：NotIによるpBACe3.6ベクターDNA断片のサイズを診断として使って〉
pBACe3.6ベクターにおける二つのNotIサイトはloxPサイトに関して非対称に位置している：位置2,849および11,583におけるNotIサイトは、それぞれ野生型および変異型loxP511サイトより1.978kbおよび0.142kb手前にある(35)（図３）。トランスポゾンpTnLoxP511(B)RSVneo2およびpTn(RSVneo2)/loxPは、それぞれのloxPサイトの組み換え後、BACベクターNotIサイトを当該トランスポゾンからのもので置き換える（図１および図３）。両トランスポゾン内のNotIサイトはそれぞれのloxPサイトから1.7kb隔たっているので、クローン中で異なるサイズのBACベクターDNA  NotI断片がインサートの野生型または変異型loxP511末端から欠失される結果を生じる：BAC中の変異型511または野生型のloxPサイトのどちらかとの組み換えはNotIによりそれぞれ10.5kbまたは8.4kbのベクターDNA断片を生じる（それぞれ図２および図４におけるレーン１９〜３０およびレーン１６〜３０）。10.5kbおよび8.4kbの断片は、これらのトランスポゾンどちらでの欠失実験の際にも一緒には現れなかったことを注意しておく。これは組み換え反応の排他性を立証している。これは、上記のP1形質導入の際に観察される選択性を確証する。Tnベースのプライマーによる欠失末端の配列決定もこの結論を支持する。
【００３８】
以前に記述された(28)、pTnMarkerless2によるインサートDNAの野生型loxP末端からの欠失は、6.8kbの期待されたベクターDNA  NotI断片を生じる（図４のレーン１〜１３）。LoxP-Cre組み換えとは独立なインサート内での欠失は、トランスポゾン挿入とともに分離する確率は小さいので、マーカーなしのトランスポゾンを使うときのみ分離され(28)、NotIによるBACベクターDNA断片によって簡単に識別できる：図２のレーン１に示すように、出発点のBACと同じ大きさなのである。第二ラウンドの欠失のためにはマーカーなしのトランスポゾンは使えないことを注意しておく。出発点となるクローンがP1頭部いっぱいの大きさより小さいからである(28)。
【００３９】
新しい野生型loxPトランスポゾンpTn(RSVneo2)/loxPを使って、インサートDNAの野生型末端からの欠失を作成した。NotIによる期待された8.4kbのBACベクターDNA断片が生じた（図４のレーン１６〜３０）。
【００４０】
〈同じBAC中の両端からの、逐次的な、インサートDNAの切り取り〉
pBACe3.6由来のクローンにおいてインサートDNAのどちらかの末端のトリミングは、それぞれの末端に特異的なトランスポゾンを使って簡単に達成できた。同じクローン中の両端は同様にして欠失させることができるが、ただし、第二ラウンドの欠失は必然的に、耐性遺伝子マーカー含有トランスポゾンによって実行される必要がある。野生型かloxP511、インサートDNAのどちらの末端が先に切り取られるかについての選好は、pTnMarkerless2（wt型loxPをもつ；文献28に記載）かpTnLoxP511(B)markerless1（図１）かの、マーカーなしトランスポゾンの選別を支配する。
【００４１】
pTn(RSVneo2)/loxPによる第二ラウンドの切り取りは、pTnLoxP511(B)markerless1により得られる欠失系列中の最大のクローンを用いて行われた（図２のレーン３および３１に示す）。欠失の第二ラウンドにおいて得られたクローンから分離されたNotI消化されたDNAが図２のレーン３２〜４０に示されている。出発点となるクローンが110kbより小さかったので、欠失および逆位はどちらもほぼ同数分離された(14,29)。逆位はレーン４２〜４８に示されている（図２）。
【００４２】
両端からの同様の切り取りは、まずpTnMarkerless2によりインサートの野生型loxP末端から欠失させ、次いでpTnLoxP511(B)RSVneo2を使って第一ラウンドの欠失で分離されたクローンの他端をトリミングすることによっても行われた（データは示さず）。
【００４３】
〈末端欠失作成のスループット向上のために、トランスポゾン・プラスミドにより形質転換されたBACクローン混合物の処理〉
末端欠失を作成するため、複数のBACを混合物として単一管内で一緒に処理してもよい。諸クローンは異なる成長特性を有する傾向があるので、これは、各クローンを所望のトランスポゾン・プラスミドを用いて別個に形質転換し、それらをプールする前に飽和まで成長させることによって最もよく達成できる。32ものBACが並行して形質転換された。そのようにして形質転換された９つのBAC培養物からの一定分量がプールされ、ちょうど以前に記載されたように(29)欠失のために処理された。下流での配列決定の簡単のため、プール中のBACは同じTnプラスミドで形質転換された。各欠失は、欠失後に残るインサートDNAの両端に特異的なプライマー、すなわち一方はトランスポゾンからのもの、他方はインサートDNAの反対側の変更されていない末端に特異的なもの（SP6またはT7）を用いて配列決定された。後者の配列は、欠失が得られた元になった親を識別する助けになった。結果の分析は、９つのBACのそれぞれは欠失において代表されているものの、分布はきわめてゆがんでいることを示す：RP23-444K15からの欠失が、RP11-219A15、RP23-209O22またはRP23-92L23からの欠失に対して４倍も優勢なのである。ただし、個々に処理した場合は、四つとも欠失を生じる効率は同じくらいである。
【００４４】
〈野生型またはloxP511トランスポゾンからのプライマーによる欠失の末端の配列決定〉
図１、図３および図５でR（ピンク）およびL（緑）とマークされたトランスポゾン末端は、それぞれインサートDNAの野生型またはloxP511の末端からの欠失後に残る。トランスポゾン中のloxP511が「Ａ」系列の逆の配向の場合、R（ピンク）末端は欠失中に取り残されることになり、野生型loxPトランスポゾンによる第二ラウンドの欠失後、クローンの末端配列決定の際に邪魔になったであろうことを注意しておく。ここに記載されているすべてのトランスポゾンの両端は同じ70ヌクレオチドを共有しているので、その中に位置するプライマーSeq  1  (20)は、その全部によって生成された新たなインサートDNA末端を配列決定できる。しかしながら、Seq  1は、他端からの欠失がなされたのちは、その一意性を失う。ここに記載されているトランスポゾンのそれぞれの端に一意的なプライマーは「方法」のところに挙げてある。loxP511サイトおよびRSVネオマイシン遺伝子カセットの両方の配向がトランスポゾン中に構築され、解析されたが、明確のため、図５には、配列決定プライマーの所望の一意性に従う配向のみを呈示してある。
【００４５】
各欠失末端から得られた600の塩基読み取りは、95〜99%の相同性レベルでデータベース中の配列に対してBLASTできる。欠失クローンからのNotI消化されたDNAのFIGEにおけるバンドの逐次順は、染色体上の配列相同性の順に一致し、DNAの一本の鎖にしかBLASTしなかった。
【００４６】
機能的には、BAC遺伝子導入を使って、長い距離を通じて作用する遺伝子調節配列を位置特定することは、インサートの一端でDNAを系統的に欠失させる手順を必要とする。レポーター遺伝子でタグ付けしたBACインサートの間隙欠失と一端からの切り取りの両方が、相同組み換えを使った、あるいはloxPトランスポゾンを使った標的を絞った欠失戦略によって行われてきた（2-5）。loxPトランスポゾン欠失戦略は、相同ベースの目標を絞った欠失方法に対していくつかの利点を有していると信じられている。組み換えの誘導はしばしば、実際に標的にされる相同の領域外でインサート内のDNA再編成のきっかけとなる：哺乳類のDNAは組み換えを引き起こすことが知られており、通例、きわめて組み換え欠乏にされた宿主株において伝搬させることによって、手つかずの状態に保たれる(6,7,36)。時に、そのようなインサート内でのDNA欠失および／またはDNA再編成は、望ましい標的とされている欠失よりも過度により頻繁になることがある（PKC未発表の観察）。
【００４７】
loxPトランスポゾンによる末端欠失手順によってもたらされる第二の、より重要な利点は、BACインサートの特定の末端からの欠失のアレイ全体が単一の実験で得られるということである。切り取られたBAC-GFP欠失のこのライブラリーは、毎回新たな標的を絞るベクターを構築する必要なく作成できる。
【００４８】
図１および図３の図解は、欠失させられたクローンにおいて保持されているloxPサイトの手前の配列を示している。この特性は、切り取りの間に、遠く隔たった、あるいは別の遺伝子からの調節配列を、関心のある遺伝子の近くに持ってくるのに使うことができる。loxPトランスポゾン内で好適な部位に挿入された外来性の配列は、新規な方法で遺伝子を調節するために、BACクローン内に簡単に導入加工できる。
【００４９】
よく定義された機能境界をもつ遺伝子を必要とする研究は、ここに記載される手順から裨益する可能性が高い。ここに記載される手順は、同じBACクローン内に存在する隣接遺伝子の干渉する調節要素なしで遺伝子を単離することを許容するのである。
【００５０】
末端欠失技術は、複数BACを同時に扱うよう適応されることができる。しかしながら、結果は、プールする際に似たような成長特性をもつBACを使わない限り、欠失の結果はゆがんだものになりうることを示している。
【００５１】
Creタンパク質によるloxPサイトの組み換えは細菌系および哺乳類系のいずれにおいても広く使われてきた(19,23,24,26,37-41)。野生型および変異型loxPサイトを一緒に使うことについての潜在力は一層大きい。しかしながら、いくつかの近年の研究からの結果は、野生型と変異型loxP511サイトの間の排他性がCreタンパク質のレベルおよび残留によって損なわれるかもしれないことを示唆している(19,23-26)。ここに呈示した結果および以前の研究(27)からの結果は、野生型と変異型のloxPサイトの間の交差組み換えは、Creタンパク質がファージP1感染におけるように一過的に発現されれば、軽減されることを示している。ここに呈示される結果と他の研究者によって以前に報告された結果との間に観察される特異性の差は、loxPサイトがCreタンパク質に生体条件下で曝露される仕方の違いに関係している可能性がある。宿主細胞因子の除去およびトランスポゼースにおける変異は、Tn10および酵母Ty1挿入の際の標的サイト特異性を軽減するが(42)、P1感染の間の追加的な、ファージによりコードおよび／または誘導された因子がCreリコンビナーゼの忠実性を変えることを示唆する証拠はまだない。こうして、細菌系でも哺乳類系でも、Cre以外のファージP1によってコードされたタンパク質によって与えられる高められた特異性についての証拠がないなか(43,44)、これらの結果および他の者による以前の業績(24,26)は、Creタンパク質の高いレベルおよび／または持続的な曝露が実際にloxPサイトの雑交性（promiscuity）に貢献している可能性があるとの考えを支持しているように見える。
【００５２】
〈図１：野生型およびloxP511のサイトを含む新しいトランスポゾン・プラスミド〉
図１には、pBACe3.6ならびに関係するベクターpTARBAC-1および-2内でクローニングされたインサートDNAの両端を欠失させるために使われるトランスポゾン・プラスミドの概略的な表現が示されている。上のパネルに示されているトランスポゾン・プラスミドpTnLoxP511(B)markerless1は、ピンクまたは緑色の小さな長方形でマークされている転移する部分内に抗生物質耐性マーカーをもたない。下のパネルはカナマイシン耐性遺伝子含有の変種pTnLoxP511(B)RSVneo2を示している。中央のパネルはカナマイシン耐性遺伝子をもつ野生型loxPトランスポゾン・プラスミドを示している。野生型loxPサイトは太い実線矢印で示されており、変異型loxP511サイトは太い点線矢印で示されている。ピンクの末端Rは野生型loxPトランスポゾンで生成された欠失クローン中に残るのに対し、緑の末端LはloxP511トランスポゾンによる欠失中に残される。
【００５３】
〈図２：インサートDNAの一端または両端からなされる漸次的な切り取りから単離されたNotI消化されたDNAの電場反転ゲル電気泳動（FIGE）解析〉
ここで図２を参照すると、左側のパネルでは、pTnLoxP511(B)markerless1（レーン３〜１５）またはpTnLoxP511(B)RSVneo2（レーン１９〜３０）によりそれぞれBACクローンRP23-444K15およびRP11-219A15内で生成された欠失クローンから単離されたDNAがFIGEによって解析されたものである。レーン１７は出発点のBACクローンRP23-444K15からのDNAを含み、レーン２、１８および４１は5kbのDNAラダーを含む。右パネル：欠失クローンからのインサートDNAの野生型loxP末端からpTn(RSVneo2)/loxPによってなされる第二ラウンドの欠失がレーン３および３１に示されている。レーン３２〜４０は欠失を示し、４２〜４８は逆位を示す。pTnLoxP511(B)RSVneo2（レーン１９〜３０）による欠失は10.5kbのBACベクターDNA断片を生じる一方、pTnLoxP511(B)markerless1（レーン３〜１５）によるものはBACベクター・バンドを生じない。欠失の結果としてNotIサイトの一つが失われているからである（図３参照）。LoxP-Cre組み換えとは独立したインサート内欠失は出発点のBAC（レーン１）と同じ大きさのBACベクター・バンドを生じる。
【００５４】
〈図３：（ｉ）pTnLoxP511(B)markerless1により生成される、ゲノム性DNAインサートの変異型loxP511末端（上パネル）からの、および（ｉｉ）pTn(RSVneo2)/loxPによる、野生型loxP末端（下パネル）からの、逐次的になされる欠失の概略的表現〉
ここで図３を参照すると、トランスポゾンは指示されたNotIサイトの位置で三角形として示されている。loxP511サイトにより生成されるCre媒介欠失はNotIの代わりにPmeIサイトを使うことを注意しておく。野生型loxPサイトを使った欠失は下パネルに示されるように、NotIサイトを保持する。
【００５５】
〈図４：野生型のloxP末端からなされる欠失から単離されたNotI消化されたDNAのFIGE解析〉
図４では、FIGE解析が、左パネルにおいて、pTnMarkerless2（文献28に記載）により生成された欠失クローンから単離されたDNAを示している；BAC  RP23-92L23内がレーン１〜１３に示されている。レーン１６〜３０はクローンRP23-444K15内でのpTn(RSVneo2)/loxPにより生成された第一ラウンドの欠失からのDNAを示している。引き続き図４を参照すると、レーン１５は出発点のBAC  RP23-444K15からのDNAを含む。レーン１４は5kbのDNAラダーを示している。BCベクターDNA断片の大きさは、pTnMarkerless2およびpTn(RSVneo2)/loxPについてそれぞれ6.8kbおよび8.4kbである。出発点のBACは8.8kbのBACベクター・バンドを生じる（レーン１５）。
【００５６】
〈図５：第一ラウンドおよび第二ラウンドの欠失後に使用可能なプライマーの配列決定を示す概略図〉
ここで図５を参照すると、ピンクの長方形は、pTnMarkerless2（文献28）およびpTn(RSVneo2)/loxPのような野生型トランスポゾンにより生成された欠失中に残るTn10のR末端を表している。緑の長方形は、本発明で記載されるloxP511トランスポゾンのいずれかにより作成される欠失クローン中に残るL末端を示している。
【００５７】
【表１】
2008529533.tif 000003
【００５８】
〈野生型と変異型のloxPサイトの生体条件での互いに排他的な交差組み換えが、PAC中のゲノム性DNAの両端のトランスポゾン媒介欠失を容易にする〉
〈材料および方法〉
オリゴデオキシリボヌクレオチドd(GGCCGCATAACTTCGTATAATGTGTACTATACGAAGTTATGTTTAAACGC)  (SEQ  ID  NO:  1)およびd(GGCCGCGTTTAAACATAACTTCGTATAGTACACATTATACGAAGTTATGC)  (SEQ  ID  NO:  20)をアニールして変異型loxP*-1サイトを生成した。二つのサイトloxP*-1およびloxP*-2はそれぞれ変異型loxPサイト5171および2272を指す。これらは、以前に、Cre含有哺乳類細胞抽出物を使った生体外での効率的な組み換えを示すよりよい「排他的」変異体として記載されたものである(21)。
【００５９】
PmeIサイトが各オリゴデオキシリボヌクレオチド内に構築され、NotI突出がアニーリングに際して生成された。脱リン酸化オリゴデオキシリボヌクレオチドがpJCPAC-Mam1（文献22の図１参照）内の一意的なNotIサイトに連結された。野生型と二つの異なる変異型loxPサイトの一方（loxP*-1またはloxP*-2）とを同じ配向で、BamHIサイトを挟むようにもつ二つのベクターをそれぞれpJCPAC-Mam2AおよびpJCPAC-Mam2Bと名付けた。包皮線維芽細胞の細胞系から単離された（米国ミネソタ州ミネトンカのViromed社）ヒトDNAの新たなライブラリーがこれらのベクター中に作成された。該ライブラリーの詳細は後述する。
【００６０】
〈トランスポゾン・プラスミドpTnloxPwt、pTnloxP*-1およびpTnloxP*-2の構築〉
以前に記載された(28)マーカーなしのトランスポゾン・プラスミドpTnMarkerless2がpTnloxPwtの出発点の役を果たした。プラスミドDNAは一意的なBgl  IIサイトで線状化され、クレノウ・ポリメラーゼで埋められ、以前に使われた(53)平滑末端の断片EBNA-ori  Pに連結された。結果として得られるプラスミドの大きさは11kbである。pTnloxPwtの転移は、他所で詳細に記載されているように(28)、P1頭部パッケージングによって選別された。すべてのプラスミドは、トランスポゼース遺伝子の活性化を防止するためにNS3516細胞（laqIq）内で伝搬された。
【００６１】
トランスポゾン・プラスミドpTnSpliceTerminator(AT)（PKC未発表の結果）が両方の変異型loxPサイト含有プラスミドについての出発点の役割を果たした。ウサギのBグロビン3′末端エクソン・スプライス受容体カセットはNotI消化によって除去され、そこにプラスミドpZT344loxP*Tet（J.S.  Coren、未発表データ）から切り出されたloxP*テトラサイクリン耐性遺伝子カセットが連結された。二つの変異型loxP*Tnプラスミドは変異型loxPサイトの一方の側にクロラムフェニコール耐性遺伝子およびPGKピューロマイシン耐性遺伝子を含み、反対側にテトラサイクリン耐性遺伝子を含む。変異型loxPサイトに対するテトラサイクリン耐性遺伝子の位置は、転移イベントから生成された逆位においてのみテトラサイクリン耐性を保証する。したがって、pTnloxP*-1およびpTnloxP*-2による欠失および逆位はいずれもクロラムフェニコール耐性マーカーを使って選別される。
【００６２】
〈個々のPACクローン内での段階的欠失の生成〉
大きなインサートをもつクローンは、NotI消化後にFIGEによってpJCPAC-Mam2AおよびpJCPAC-Mam2B中で生成されたパイロット・ライブラリーにおいて同定された。pTnloxPwtを使った段階的欠失が、以前に記載されたように(28)いくつかのクローンにおいて生成された。転移の目印となる抗生物質耐性マーカーを含むpTnloxP*-1およびpTnloxP*-2による欠失は、以前に記述された(29)ようにして生成された。
【００６３】
〈PAC欠失クローンの末端配列決定〉
典型的にはミニプレップDNAは、数百ないし数千メンバーのPAC欠失ライブラリーからランダムに選ばれた60クローンから単離された。このうち、約60%がFIGEで一意的な大きさであった。各欠失系列からの20クローンのDNAは、トランスポゾン末端プライマー(20)およびABI-3100  AVANTジェネティック・アナライザー上のBig  Dye  Terminator化学を使って直接、配列決定された。プライマー伸長生成物はMagnesil（Promega社）を使って精製したが、その手順はメーカーによって提供され、以前(50)に記載されている。野生型末端loxP末端からすでにトリミングされたインサートDNAの変異型loxPからの欠失の新たに作成された末端を配列決定するために新たなプライマーが使用された。それを下記に挙げる：
Seq  11  d(CTTCCATGTCGGCAGAATGC)  (SEQ  ID  NO:  3)
Seq  12  d(GTTCATCATGCCGTCTGTGATG)  (SEQ  ID  NO:  4)
Seq  13  d(CGCTGGCGATTCAGGTTCATC)  (SEQ  ID  NO:  5)
Seq  14  d(CAAGGCGACAAGGTGCTGATG)  (SEQ  ID  NO:  6)
〈結果〉
〈野生型および変異型loxPサイトに挟まれるヒトDNAインサートによるPACクローンの構築〉
以前に記載された(22)PACクローニング・ベクターpJCPAC-Mam1がその一意的なNotIサイトで線状化され、変異型loxPサイトの二つのバージョンに連結されて、〈材料および方法〉で述べたpJCPAC-Mam2AおよびpJCPAC-Mam2Bが生成された。80〜140kbのサイズ選別されたヒト・ゲノム性DNAのPACライブラリーを、これらのシャトル・ベクター中に構築した。詳細は他所で報告される（J.S.  Coren原稿準備中）。
【００６４】
〈ファージP1形質導入を使った、生体条件での野生型および変異型のloxPサイト含有プラスミドの組み換えの分析〉
Creタンパク質による野生型および変異型のloxPサイト間の組み換えを分析した研究は、細胞中での非天然システムを使ったもの(23,33,24)およびCreタンパク質を含む哺乳類細胞抽出物で生体外プロトコルを使ったもの(21)両方を含めていくつかあり、雑多な結果となっている。loxP511およびloxP512ならびに5171および2272（ここではそれぞれloxP*-1およびloxP*-2と称している）といったある種の変異型loxPサイトは、これらの研究において対立する結果を与えた。制御された仕方でBACおよびPAC内のインサートDNAの各末端に特異的な欠失を生成することに成功するには、野生型と変異型のloxPサイト間に漏れまたは交差が存在しないことを要求する。(25)の組み換えの生成物DNAバンドを検出するために臭化エチジウムを使うゲル・ベースの検定は、信号における高々20倍の差の記録しか許容しない。したがって、より大きな感度およびより広い範囲をもち、インサートDNAの一端からの漸進的な欠失を生成するために特に開発された条件をも使う検定によって組み換え交差反応性を試験することが不可欠であった(14)。したがって、組み換え分析はファージP1を使った形質導入を含むよう拡張された。
【００６５】
生育可能なファージP1内の線状DNAは両側に野生型loxP配列の二つのコピーがある。P1は、野生型loxPサイトをもつ第二のプラスミドを高い効率で形質導入することも知られている(30-32)。したがって、野生型または変異型loxPサイトのいずれかを担持するTnプラスミドの形質導入をするその能力を、これらのサイト間の組み換え交差反応性を評価するために試験した（図解は図６Ａ参照）。三つのTnプラスミド含有株、すなわち野生型loxPをもつ＃１７、変異型loxP*-1をもつ＃１８および変異型loxP*-2をもつ＃１９がそれぞれP1  virファージに感染させられ、細胞溶解物が以前に記述された(29)手順を使って新鮮なNS3516細胞を感染するために使われた。ファージによって形質導入されたTnプラスミドを含むNS3516細胞は該Tnプラスミドに特異的な抗生物質を含むLBプレートにおいて選別された。表Iの上３行に示される結果は、ファージP1  virが、プラスミド＃１７を含む野生型loxPサイトしか形質導入できないことを明瞭に実証している。その回復のために生起しなければならなかったはずのP1における野生型loxPサイトと＃１８中のloxP*-1または＃１９中のloxP*-2のいずれかとの間の交差組み換えは、少なくとも1000倍低いことが見出された。形質導入の相対的な効率を比較するためにより大きな細胞サンプルおよび複数のプレートを使って、我々は、P1感染の間の一過性Creタンパク質発現のこれらの天然の生体条件下で、野生型loxPサイトどうしが、野生型と前記二つの変異型サイトのいずれかとの組み換えよりも、少なくとも10,000倍の効率で組み換わると推定する。
【００６６】
〈同じ変異型loxPサイトを含むトランスポゾンによる、DNAインサートの変異型loxP末端からの漸進的欠失の生成〉
新しいトランスポゾン・プラスミドpTnloxP*-1およびpTnloxP*-2（図６Ｂに概略的に示されている）が〈材料および方法〉で述べたようにして構築され、pJCPAC-Mam2AおよびpJCPAC-Mam2Bにおいて構築されたゲノム・ライブラリーからのいくつかのクローンに対してまず試験された。ここでは、それぞれ120kbおよび140kbのDNAインサートをもつ二つのクローンJCPAC-9およびJCPAC-13についての詳細な分析を呈示する。ここで、プラスミドpTnloxP*-1およびpTnloxP*-2をそれぞれJCPAC-13およびJCPAC-9に導入し、以前に記述されたように(29)IPTGを用いて転移が導入された。PACベクターは変異型のloxPサイトに加えて野生型のloxPサイトも含んでいたので、P1ファージによる結果として得られる欠失の形質導入は障害とは考えられなかった。結果は図７および図８Ａに与えられる概略的な図解に示されている（文献１４および２８の図１も参照）。出発点のPACクローンはインサートの一端にしかNotIサイトを有さないので、NotI酵素によるそれらのDNAの消化は別個のベクター・バンドを生成しない（レーン２および１５）。JCPAC-9およびJCPAC-13においてpTnloxP*-2およびpTnloxP*-1によって生成される欠失は、PACベクター中のNotIサイトの一つをトランスポゾンからのものと交換する（図８Ａ）。こうして、欠失においても別個のベクターDNAバンドは見られない（レーン３〜１１および１６〜２６、図７）。
【００６７】
いずれかのPACからの欠失の集合は、トランスポゾン末端ベースのプライマーを使って直接、配列決定された(20)。すべての欠失は、BLAST解析によってゲノム性DNAインサートの一つのストランドのみとの95ないし99%の排他的な同定を得る配列読みを生じた：JCPAC9およびJCPAC13の欠失がそれぞれヒト染色体1および4にマッピングされたのである。末端配列はまた、アレイにおける欠失クローンの大きさと無矛盾な順序に一致した（データは示さない）。併せて考えると、この結果は、変異型loxPトランスポゾンがPACクローン中でインサートDNAの変異型loxP末端からのみ排他的に切り取ることを確証している。二つのライブラリーからの染色体10、15および19にマッピングするインサートをもつ４つの追加的なPACにおいて（二つのライブラリーのそれぞれから一対で、インサートは野生型と、loxP*1またはloxP*2のいずれかとに挟まれる）欠失がなされたが、同一の結果が得られた。
【００６８】
図７のレーン９および１０をより綿密に調べると、5kbマーカー・バンドの位置に、トランスポゾン・プラスミドDNAからのものを思わせるDNAがあることがわかる。これら二つの欠失クローンのさらなる分析は、それらがアンピシリンおよびテトラサイクリン両方に耐性であることを明らかにする。これは、変異体loxPトランスポゾン・プラスミドが本当にファージP1によって形質導入されたということを示す。これは、セクション3.2で論じた結果から予測しうるものとは反対であり、のちに扱う。
【００６９】
〈細胞中の第二のプラスミドが野生型および同じ変異型loxPサイトの両方を有していれば、変異型loxPプラスミドは効率的にファージP1によって形質導入される〉
図７のレーン９、１０に見られるP1ファージによる変異型loxPプラスミドの回収は肩車現象のためである可能性がある。次の実験はこの仮設を検定する。セクション3.2に記載した実験とは異なり、このたびは変異型loxPプラスミドの形質導入は第二の大きなプラスミドが存在する近辺で実施された。該第二の大きなプラスミドは、野生型loxPサイトに加えて、（ｉ）同じ種類の変異型loxPサイト、（ｉｉ）異なる種類の変異型loxPサイト、（ｉｉｉ）同じ種類だが同じDNA分子の一部としてではない変異型loxPサイトを含む。トランスポゼース遺伝子はこれらの実験では抑制されており、形質導入から単離されたプラスミドDNAの特徴付けは、転移が起こらなかったことを確証した。結果は表２に示されている。
【００７０】
三つの異なる型のPACプラスミドが使用された：クローン２およびクローン５は野生型loxP配列のみを含んでいたが、クローン８、９およびクローン１２、１３は、インサートDNAを挟むものとして野生型と二つの変異型loxPサイトの一方とを担持していた（説明については表２参照）。各対の第一のメンバー（２、８および１２）はP1頭部の大きさより小さく、第二のメンバー（５、９および１３）は110kbより大きい。ファージP1がこれらPACプラスミドのそれぞれを形質導入する能力を試験した（図６Ａ）。表２第５列の結果は、以前に記述された結果と一致している。すなわち、P1頭部の容量より小さなプラスミドは効率的に形質導入されるが、この限界サイズより大きなプラスミドはそうではない(14)。
【００７１】
ファージP1による形質導入に際して三対のPACプラスミドがTnプラスミド＃１７、＃１８および＃１９を肩車する能力を次に試験した。各Tnプラスミドは野生型または変異型いずれかのloxPサイトを含み、各PACクローンに移入された。形質転換された細胞は、カナマイシンとクロラムフェニコール（＃１７）またはカナマイシンとテトラサイクリン（＃１８および＃１９）のいずれかを含むLB寒天プレート上で選別された。単一の形質転換されたコロニーが実験のために拡張された。表Iは異なる複数の単一コロニーを使った三つの独立した実験の結果を示している。
【００７２】
P1は変異型loxPプラスミドを直接的に形質導入できないが（セクション3.2）、細胞中に野生型と、同じ変異型loxPサイトとの両方を含む別のプラスミドがあれば、効率的に導入できる（図１０に図解）。これは表２において８／１９および１２／１８について見られる。loxP*-1およびloxP*-2の間の交差組み換えは不存在で、これは８／１８および１２／１９の結果によって示される。肩車は、PACとTnプラスミドの両方での同じ変異型サイトを要求するのみならず、PACがそれ自身形質導入されるには大きすぎるときにも生起する（９／１９および１３／１８の結果を比較）。その場合、効率はより低くなる。ここで使われる天然の生体条件で見られる変異型および野生型loxPサイトの見事な組み換え特異性は、以前の報告(23,24)に反するものである。
【００７３】
変異型および野生型loxPサイトが同じ分子の一部であるという要請（ポイント＃ｉｉｉ）は、変異型loxPプラスミド１８および１９がその複製のpBR322オリジンのため細胞中に50〜100コピー存在しているにもかかわらず、野生型loxPをもつPACクローン２および５が、P1ファージが変異型loxPプラスミド１８または１９を形質導入するのを助けることができないという事実によって実証される。
【００７４】
〈二つのPACクローン中でのインサートDNAの両端からの欠失の生成〉
野生型と変異型loxPサイトの間でのCreタンパク質による組み換えが互いに排他的であることを確立したところで、PACクローン中でのインサートDNAの双方向からの欠失生成に改めて注意を向けた。JCPAC9およびJCPAC13中でのゲノム性インサートの野生型loxP末端からの欠失が最初になされたが、それは次の理由による：pTnloxPwtのようなマーカーなしのトランスポゾンの転移は、P1頭部が、欠失された共挿入体から両方のloxPサイトをパッケージングできるかどうかによって選別され、P1頭部いっぱいの長さ（110kb）よりも大きな、出発点となるPACクローンを必要とする(28)。以前に記述された(25,26)のと同一の手順を使って、pTnloxPwtによるJCPAC9およびJCPAC13内に欠失ライブラリーが生成された。各欠失系列からのいくつかのクローンのNotI消化が図９Ａに示されている。図８Ｂに概略的に示されるように、pTnloxPwtを使った欠失は、クローン中にNotIサイトを導入し、それによりインサートDNAは今ではNotIサイトに挟まれている。こうして、欠失クローンDNAのNotI消化物は、出発点となるPACクローンまたは異常組み換えによって生成されるいかなるインサート内欠失の消化物にも見られない20kbのベクターDNAバンドを生成する（議論は文献28を参照）。いくつかのクローンの欠失末端配列決定およびBLAST解析により、同じPACクローンからのすべての欠失が一つのDNAストランドにのみ相同であり、大きさに従って配置されることが明らかされた。
【００７５】
双方向欠失生成のために各系列から最大のクローンが選ばれた。その結果を図９Ｂに示す。このように、JCPACクローン９および１３からそれぞれ導かれたクローン１および７７を、このたびはそれぞれの変異型loxPトランスポゾンを使った段階的欠失手順にかけた。プラスミドpTnloxP*-1および-2をそれぞれ欠失クローン７７および１中に導入し、以前に記述された(29)のと同一の手順を使って欠失が生成された。一方の系列からのいくつかのクローンからのDNAのNotI消化物が図９Ｂに示されている。PACおよびトランスポゾンにおけるNotIおよびloxPサイトの位置（図６Ｂおよび図８Ｂに示される）は、出発点のクローンと欠失クローンとの間でベクターDNAバンドに何の差異も予言しない。第二のステップにおける単離されたクローンのかなりの割合は、変異型loxPサイトの転移によって生成された、PACと反対の配向の逆位であった。出発点の欠失クローン７７および１はP1の頭部いっぱいの大きさより小さいので、逆位はこのたびは単離された。そのようなクローンはテトラサイクリン耐性であり（図８Ａ参照）、簡単に同定された。
【００７６】
〈トランスポゾン・ベースのプライマーによる、両末端で切り取られたインサートDNA末端の配列決定〉
第一ラウンドの野生型または変異型loxP末端からの欠失は、以前に記載された(19)トランスポゾン・プライマーを用いて配列決定できるものの、両端から欠失させられたインサートの末端については、新たに生成された末端に一意的なトランスポゾン領域からの新たなプライマーが必要であった。こうして、インサートDNAの新しい末端を配列決定するために、変異型loxPトランスポゾンに特異的なクロラムフェニコール耐性遺伝子内からのプライマーが使用された。これは〈材料および方法〉において述べられている。反対側の末端を切り取るために使われたpTnloxPwtからすべてのクロラムフェニコール関係の配列が欠失させられる。
【００７７】
〈議論〉
制御された仕方で両端から大きなDNA片を切り取る能力は、大きな距離を通じて作用する遺伝子調節配列をマッピングし、それにより遺伝子境界を機能的に定義し、遺伝子全体を数多くの用途のためにその染色体のコンテキストにおいて利用可能にするのを容易にするはずである。天然の生体条件のもとでの野生型Creタンパク質による、野生型と二つの変異型のloxPサイトとによって示される高度に特異的な組み換えは、ある種の用途における配列選択性タグおよび／または分子スイッチの設計において有用となりうる。ファージP1形質導入検定を使って野生型と二つのloxP変異型サイトの一方との間の相対的な組み換え効率を評価し、これまでゲル・ベースの検定(21)において可能であったよりもずっと高度の特異性が実証されるに至っている。また、セクション3.4において記載されたP1形質導入の際の変異型loxPプラスミドの肩車は、変異型loxPサイトの対の間の交差組み換えを、それらのサイトを担持する新たなファージを構築する必要なく測定する、類のない方法を提供する。ここで生体条件で得られた結果と以前に報告されている結果(23,24)との間の相違は、組み換えのために利用可能なCreタンパク質の発現が一過性発現か構成的発現かに関係している可能性がある。loxPサイト雑交性はCreタンパク質のレベルおよび持続性とともに上昇しないようである。P1感染の間に発現されたCreタンパク質によって、野生型あるいは二つの変異型loxPサイトのいずれの対も同じような効率で組み換えられることは驚くことではない。Creタンパク質認識に関してDNA上で最も敏感なサイト、塩基対２および６は、loxPサイトから13bpの逆位反復以内にあり(56)、これらはここで試験されたあらゆるloxPサイトにおいて不変である。変異は8bpのスペーサー領域においてである。
【００７８】
この領域は交差の際に完全な塩基の対形成を要求すると考えられているので(25)、野生型と変異型loxPサイトの間の選択性も驚くには当たらない。これは、相同組み換えの効率がパートナー間の相同の領域における変異に対してきわめて敏感であることとも一貫している：loxPの8塩基のスペーサーは、FLP/FRT系におけるスペーサー領域と同様な役割を果たすようであり、想定されるホリデイ様ジャンクションはそれ以外では塩基対形成の破綻を含む(57)。
【００７９】
表２の結果は、ファージP1が変異体loxPプラスミドを形質導入する能力が、野生型および同一の変異型loxPサイトの両方を有する第三のプラスミドに依存することを実証している。そのようなシナリオは、多プラスミド共挿入体が細胞中で真実の（bona  fide）中間体であることを示唆している。形質導入プロセスに参加していることが考えられる中間体の概略的な表現を図１０に示す。パッケージングはpacサイトで開始され、P1頭部がいっぱいになるまで時計回り（細い矢印で示す）に進む。最終的な共挿入体におけるDNA片BAKJはファージDNAであり、パッケージングに際して失われることを注意しておく。DNA片ＨＩ（ゲノム性インサート）がPACクローン２、８および１２にあるように小さければ、第二の野生型loxPサイト（ＩとＪの間）は楽にP1頭部内に収まる（文献14の図１参照）。Creタンパク質は、感染に際して線状DNAが細胞内にはいるとすぐ発現され、二つの変異型および野生型loxPサイトの間でのDNAの組み換えを助ける。したがって、両方のプラスミドは再生され、表２のクローン８／１９および１２／１８について見られるように、両方の抗生物質耐性マーカーが発現される。
【００８０】
DNA片ＨＩがPACクローン５、９および１３にあるように非常に大きければ、第二の野生型loxPサイト（ＩとＪの間）はP1頭部内に収まることができない。新鮮なNS3516細胞に感染した際、P1頭部の中にあるDNAは今度は出発点のPACクローン５、９および１３を救い出すことができない（文献14の図１参照）。しかしながら、二つの変異型loxPサイトが組み換わって、表Iのクローン９／１９および１３／１８について見られるように、10〜20倍低い効率だが、変異型loxPプラスミドを再生する。この場合は新たに発現されるCreタンパク質は、それをコードする遺伝子がDNAのP1頭部へのパッケージングの間に失われるため、利用可能にならず、変異型loxPサイトの時折の組み換えはおそらくは細胞のリコンビナーゼによって媒介されることを注意しておく。
【００８１】
〈図６Ａ：TnプラスミドpTnloxPwt、pTnloxP*-1およびpTnloxP*-2のP1形質導入の概略的表現〉
図６Ａに示されるように、ファージDNAは細胞にはいると、末端で重複したloxPサイトのCre組み換えによって環状化し、トランスポゾン・プラスミドによって担持されるloxPサイトも野生型であれば、トランスポゾン・プラスミドと共挿入体を形成する。引き続き図６Ａを参照すると、共挿入体DNAは「pacサイト」で開裂され、「pacサイト」の隣の細い矢印によって示される方向にパッケージングが起こる。形質導入されたプラスミドは、TnプラスミドDNAを含むファージが新しいNS3516細胞に感染するときに回収される。変異型loxPサイト含有TnプラスミドpTnloxP*-1および-2は、同一条件のもとで、野生型loxPサイト含有ファージDNAと共挿入体を形成し損なう。トランスポゾン・プラスミドを含む変異型loxPサイトの回収は、もしあれば、変異型と野生型のloxPサイトの間の交差組み換え活性の指標と解釈される。
【００８２】
〈図６Ｂ：野生型または変異型loxPサイトを含む新たなトランスポゾン・プラスミド〉
図６Ｂでは、双方向欠失のために構築されたトランスポゾン・プラスミドの概略的な表現が示されている。トランスポゾン・プラスミドpTnloxPwtは、抗生物質耐性授与マーカーを、小さな長方形で印したDNAの転移部分内にもたない。野生型および変異型のloxPサイトは、それぞれ太い矢印および点線矢印によって示されている。
【００８３】
〈図７：pTnloxP*-1およびpTnloxP*-2により生成される、ゲノム性DNAインサートの変異型loxP末端からの漸次的な欠失〉
ここで図７を参照する。図７では、それぞれクローンJCPAC-13およびJCPAC-9中のpTnloxP*-1またはpTnloxP*-2のいずれかにより生成された欠失クローンから単離されるDNAが、NotI酵素による消化後にFIGEによって解析された。レーン１およびレーン１４は大きさの標準として5kbのラダーを含んでいる。
【００８４】
〈図８Ａ：JCPAC-13および-9においてpTnloxP*-1および-2により形成される欠失および逆位の概略図〉
トランスポゾンが三角形として示され、NotIサイトの位置も示されている。逆位が単離されるのは、出発点となるPACプラスミドが110kb未満である場合のみであることを注意しておく。
【００８５】
〈図８Ｂ：JCPAC-13および-9において、まずpTnloxPwtにより、次いでpTnloxP*-1または-2のいずれかにより生成される逐次的な欠失の概略的表現〉
欠失クローンを哺乳類細胞中で有効にするよう、双方向欠失後にEBNA、oriPおよびPGK-puro遺伝子カセットのすべては再び補充されることを注意しておく。
【００８６】
〈図９Ａ：JCPAC-9および-13においてpTnloxPwtにより生成される、野生型loxP末端からの欠失〉
欠失クローンDNAのNotI消化物をFIGEによって解析した。レーン１および１７は出発点のJCPAC-9および-13のDNAをそれぞれ含む。レーン１６は5kbのラダーを示す。
【００８７】
〈図９Ｂ：pTnloxP*-2または-1によりそれぞれ生成される、欠失クローン１および７７の変異型loxPサイト末端からの欠失〉
欠失クローン１および７７は、以前にそれぞれJCPAC-9および-13からpTnloxPwtによる欠失によって得られたものである。NotI消化されたクローンDNAのFIGE解析。レーン１および１８は出発点のクローン１および７７を含み、レーン１７は5kbのラダーを示す。
【００８８】
〈図１０：ファージP1による、変異型loxPサイト含有プラスミドの形質導入の間の中間体として可能な多プラスミド共挿入体を示す概略図〉
用語「cre」はCreタンパク質をコードする遺伝子を表し、黒い点で図示されており、「pacサイト」はP1のパッケージング機構によって認識され、二本鎖切断がなされてDNAのパッケージングが始まる部分の配列を表している。「pacサイト」の隣の細い矢印はパッケージングの方向を示す。
【００８９】
【表２】
2008529533.tif 000004
【００９０】
〈ファージP1頭部パッケージングを使った転移の選別：BACおよびPAC内での長いレンジの調節配列を機能的にマッピングするための新たなマーカーなしトランスポゾン〉
〈材料および方法〉
〈pACYC177からのカナマイシン耐性遺伝子を増幅するために使われるプライマー〉
プライマー対は、プラスミドpACYC177（GenBank  Accession  ＃X06402）からのカナマイシン耐性遺伝子全体を挟む配列から設計された。順（forward）プライマーは、AscIおよびNotI制限部位配列が5′末端に組み込まれており、逆（reverse）プライマーはAscIサイトのみをその5′末端に有している。PCRで増幅した生成物は長さ1044bpで、pACYC177からの配列1768-2791を含んでいた。それは次のとおり：
kanF  5′GGCGCGCCGCGGCCGCGTGATCTGATCCTTC3′  (SEQ  ID  NO:  7)
kanR  5′GGCGCGCCGTCAAGTCAGCGTAATGC3'  (SEQ  ID  NO:  8)
上記二つのプライマーは、loxPトランスポゾン中にNotIサイトを非対称的に配置することを可能にするよう、組み込まれた制限部位の異なる組み合わせを有している。これは、このトランスポゾンにより生成される欠失クローンからDNAのNotI消化に際して得られるベクター・バンドが、電場反転ゲル電気泳動（FIGE）で区別できる大きさを有することを保証する。
【００９１】
〈pTnMarkerless1およびpTnKanトランスポゾン・プラスミドの構築〉
〈pACYC177からのカナマイシン耐性遺伝子断片の増幅〉
E4151S（New  England  BioLabs）からのプラスミドpACYC177のDNAを、アルカリ溶解ミニプレップ手順(19)を使って単離した。1044bpの断片をPerkin  ElmerからのAmpliTaq  DNAポリメラーゼを用い、プライマーkanFおよびkanRおよびpACYC177  DNAをテンプレートとして使ってPCR増幅した。25μLの各反応は、1x反応緩衝液（Perkin  Elmer）、1.5mMの塩化マグネシウム、10ngのDNAテンプレートおよび15ピコモルの各プライマーを含んでいた。95°Cでの1分間の変性に続いて60°Cでの1分間のアニールおよび72°Cでの90秒の伸張のサイクルが35サイクルにわたって使用された。サンプルは最初、95°Cで3分間変性された。生成物の５分の１を1%アガロース0.5x  TBEゲル上で解析した。
【００９２】
〈TAクローニング・ベクターpCR2.1内での増幅されたDNA断片のクローニング〉
PCR増幅されたDNAは、TAクローニング・キット製造業者推奨手順を使ってpCR2.1（米国カリフォルニア州カールスバッドのInvitrogen社）中でクローニングした。AscIによる制限消化を容易にするためにサブクローニングを実施した。制限部位に隣接するヌクレオチドの突出が小さすぎるときは、酵素による開裂は時に不完全である。カナマイシンを含むLB寒天プレート上で白コロニーを選別した。いくつかのコロニーからアルカリ溶解ミニプレップを行い、AscIおよびNotIによる別個の消化後にDNAを解析した。NotIにより線状化されてAscI時に1044bpバンドを生じたクローンを選別した。
【００９３】
〈pTnBAC/loxPからのpTnMarkerless1の作成〉
AscIでプラスミドDNAを消化し、ライゲーションし直すことにより、pTnBAC/loxPからRSVネオマイシン遺伝子カセットを除去した。いくつかのクローンを選び出し、プラスミドDNAを単離してAscI、PmeIおよびBamHIの存在およびNotIサイトの不在について試験した。結果として得られるプラスミドはpTnMarkerless1と名付けた。そのDNAの転移可能部分内に細菌抗生物質耐性遺伝子を含まないからである：細菌におけるカナマイシン耐性および哺乳類細胞におけるネオマイシン耐性を授与したRSVネオマイシン遺伝子が除去されている（図１Ａ）。このプラスミドで形質転換されたBAC/PACクローンを、アンピシリン120μg/mLを含むLB寒天プレート上で選別した。アンピシリン耐性のための遺伝子はトランスポゾン境界外にある。
【００９４】
〈pTnMarkerless1からのpTnKanの作成〉
1044bpのカナマイシン遺伝子カセットを、AscIを使ってそのTAクローニング・ベクターpCR2.1から切り出し、AscIで線状化されたpTnMarkerless1に連結した。この1044bpの追加の分子量をもつプラスミド・クローンを、カナマイシンを含むLB寒天プレート上で選別し、1044bpのDNAカセットの配向を確立するため該プラスミド・クローンのパネルを解析した。ベクターDNAを、Cre媒介された欠失クローンおよび出発点のBACから、簡単なNotI消化物を使って区別するため、プラスミド中のloxP配列から離れたNotIサイトをもつ配向が望ましかった（議論については文献20参照）。loxP配列から遠位のNotIサイトをもつTnプラスミドは、PmeIおよびNotI酵素による消化に際して長さ約1100bpのバンドを生成した。新しいプラスミドはpTnKanと名付けた（図１１Ａ）。
【００９５】
〈pTnMarkerless2トランスポゾン・プラスミドの構築〉
トランスポゾン・プラスミドpTn(Minimal)/loxP  (9)からのDNAをPvuIIにより完全に消化し、Qiagenキットを使って1X  TAE緩衝液中で1%アガロース・ゲルから6.8kb断片が精製された。精製された断片はScaIにより部分消化され、結果として得られる約6.3kbの断片をさらに1%アガロース・ゲルから精製した。両端で平滑末端をもつこのPvuII-ScaI断片は、T4  DNAリガーゼによるライゲーションによって環状化され、以前に記述された(9)  NS3516宿主株中に移入された。結果として得られるプラスミドは、pTnMarkerless2と名付けられた（図１１Ａ）。
【００９６】
〈pTnMarkerless1、pTnMarkerless2およびpTnKanによる段階的欠失〉
新たなTnプラスミドpTnMarkerless1およびpTnKanは最初にいくつかの未特定BAC上で試験されたが、ここに示される結果は、IRES-GFPカセットに融合されたマウスのNkx2-5遺伝子を含む修正されたBACクローン（Nkx2-5  GFP  BAC）についてものである（Chi  et  al.2003）。TnプラスミドpTnMarkerless1は、以前に記述された(21)PACクローン（Npr3PAC）内でも末端欠失を生成するために使われた。pTnMarkerless2は、インサートDNAを挟む野生型および変異型のloxPサイトを含むベクター中に構築された新しいヒトPACライブラリーからのクローンにおいて欠失をなすために使われた。
【００９７】
〈クローンDNA単離およびFIGE解析〉
BAC/PAC欠失からのDNAは先述されたように単離され、NotI消化後(20)、あるいは1x  NE-4緩衝液中でのNotIおよびAscIによる消化後にFIGEによって解析された。
【００９８】
〈DNA配列決定〉
以前に記述された(20)pTnMarkerless1またはpTnMarkerless2を用いて生成された各BACまたはPAC欠失中に残るトランスポゾン末端からそれぞれ38ヌクレオチドおよび240ヌクレオチドのところに位置しているプライマーSeq1またはSeq9を使って、約600ヌクレオチドの配列が得られた。ABI自動化毛細管DNA配列決定機（3100  AVANT  ジェネティック・アナライザー）をBig  Dye  Terminator化学とともに使って配列の読みを得た。毛細管に加える前に、テンプレートBAC／PAC  DNAからのプライマー伸長生成物を精製するためにMagnesil（Promega社）ベースの手順を使った(55)。各配列読みは、トランスポゾン末端から15塩基のところで始まった。
【００９９】
〈結果〉
一連のloxPサイト含有Tn10ミニ・トランスポゾンは以前にBACおよびPACで使用するために構築されたものである(9)。それらは物理マップ上でマーカーを位置特定するには有用であると判明した(20,21)が、遺伝子における長いレンジのエンハンサーおよびサイレンサーの効果の機能的評価における使用は、強い哺乳類プロモーター要素が欠失クローンに導入されてしまうため面倒になっていた（X  ChiおよびR  J  Schwartz、未発表の観察）。pTnBAC/loxPにおけるネオマイシン耐性の発現を推進する強力なRSVプロモーターは元来、哺乳類細胞における選択可能マーカーのはたらきをするためにデザインされたもので、機能分析においてマッピングされる遺伝子調節要素に干渉する可能性がある。したがって、新しいトランスポゾンでは、すべての遺伝子およびプロモーター要素はDNAの転移可能部分から除去される。新規のP1頭部パッケージング手順によって選択される挿入は図１１Ｂに概略的に示されている。
【０１００】
予備的な調査の間に、従来式の抗生物質耐性の代わりに転移のための選択をすべくP1頭部パッケージングを使うことが、インサート内の、loxP-Cre独立なのにDNA長を短縮する組み換えからくる面倒につながりうることが明らかになった。したがって、真正のloxP-Cre媒介欠失をゲノム性インサート内部での異常な組み換えイベントから区別するために、NotI消化後の欠失クローンにおけるBACベクター・サイズを検証する方針が考案された。このことは、pTnMarkerless1トランスポゾンによるNkx2-5  GFP  BACクローンにおける欠失について、図１Ｃに概略的に示されている。pTnMarkerless2トランスポゾンも同じ目標を念頭に、PACおよび種々のNotIサイト特徴をもつベクター中で作成されたゲノム・ライブラリーから導かれたP1クローンにおける使用のために設計された。
【０１０１】
第一歩として、〈材料および方法〉で述べたように、pTnBAC/loxPからRSVネオマイシン遺伝子カセットを除去してpTnMarkerless1を生成した。pTnMarkerless1を用いて生成された真正のloxP-Cre欠失クローンDNAのNotI消化物は6.7kbのBACベクターDNA断片を生じないことを注意しておく。というのも、組み換えイベントが、ベクターloxP配列に近いNotIサイトを消去するからである。その代わり、インサートDNA内に他のNotIサイトがない場合、欠失させられたゲノム性インサートおよびBACベクターDNAの両方を含む単一バンドのみが生成される。
【０１０２】
〈トランスポゾン・プラスミドpTnMarkerless1による段階的欠失〉
Tn10欠失は比較的低頻度のできごとであり、ここで記載されるような(72)誘導可能トランスポゼースを担持するトランスポゾン・ベクターについては10,000のうち1個の細胞で起こる。通常、転移は、DNAの転移片によって担持される抗生物質耐性を使って選別される(73)。段階的欠失手順では、交互の選択方針がloxPサイトの挿入のためにすでに用意されている：欠失クローンがP1ファージの頭部にパッケージングできるかどうかがそれである。出発点となるクローンあるいは結果として得られる欠失が110kbより大きければ、P1頭部はP1-BAC/PAC共挿入体からの第二のloxPサイトをパッケージングできず、頭部にはいっている線状DNAはその後、細菌に感染したときに回収不能となる（図１Ｃおよび文献14の図１Ａも参照）。欠失は導入されたloxPサイトの結果生じ、そのloxPサイトの配置は転移に依存するので、追加的な耐性マーカーなしに転移を選択するためにP1頭部パッケージングそのものを使うことができるはずである。この可能性はTnMarkerless1トランスポゾンを使って探査された。
【０１０３】
インサートDNAの一端からの漸進的欠失は、IRES-GFPカセットに融合されたマウスNkx2-5遺伝子全体を含むBACクローン中でpTnMarkerless1を用いてなされた。その際使われた手順は、次の変更があるほかは以前に述べたのと同一である：第一に、pTnMarkerless1による形質転換後にクロラムフェニコールおよびアンピシリンを含むLBプレート上で、Nkx2-5  GFP  BAC細胞が選別された。アンピシリン耐性遺伝子は、トランスポゾン境界の外側に位置しているので、その目標に挿入されない。第二に、pTnMarkerless1で形質転換されたBAC培養物を、IPTG誘導に先立って、12.5μg/mLのクロラムフェニコールおよび60μg/mLアンピシリン中で成長させた。最後に、BAC欠失クローンがクロラムフェニコールだけを含むLBプレート上で選別された。これらの新たなトランスポゾンを用いて得られた欠失ライブラリーは、以前に記載された(14)トランスポゾンを用いて得られたのと似たようなクローン数および欠失サイズ分布などの特徴を有することが見出された。
【０１０４】
pTnMarkerless1を用いて得られた欠失クローンのパネルからのDNAが図１２に示されている。ここで使われているNkx2-5  GFP  BACはNotIサイトを内部に一つ、インサートDNAを挟んで二つ含む。各欠失ライブラリーから60のクローンを解析したが、ある範囲のサイズをカバーする５〜６クローンだけの組がここでは呈示される。トランスポゾンがNotIサイトを有さないので（図１１Ａ），loxP媒介欠失はNotIサイトの一つ減少を生じ、BACベクターDNAは今度は欠失中のゲノム性インサートに融合される（図１１Ｃに概略的に示す）。図１２のレーン３〜７は、そのような欠失クローンから単離されたDNAのNotI消化物を示している。しかしながら、loxP媒介欠失は、トランスポゾンからのPmeIおよびAscIサイトを、出発点のBACにおけるNotIサイトとほぼ同じ位置に導入してこれを置き換える（図１１Ｃ）。したがって、NotIとPmeIまたはAscIのどちらかによる欠失クローンDNAの二重消化物は、元のBACベクターDNA断片を放出する。複数のPmeIサイトがこのクローン内に存在するので、BACベクターDNA断片は明確に識別されたものの（データ示さず）、消化パターンは複雑であった。ゲノム性インサート内にはAscIサイトがないので、図１２のレーン９〜１３のNotIおよびAscIの両方で消化された欠失クローンは、レーン３〜７のDNAの同じ組を表示し、6.7kbのベクターDNA断片を示す。
【０１０５】
〈pTnMarkerless1はPACにおける段階的欠失を生成するのにも好適である〉
ヒトのNpr3遺伝子(21)を含む160kbのPACをpTnMarkerless1により形質転換し、両方のプラスミドをもつ細胞をカナマイシンおよびアンピシリンを含むLBプレート上で選別した。欠失の生成は前と同様だが、pTnMarkerless1で形質転換したPACコロニーを成長させるのは、カナマイシンおよびアンピシリンへのIPTG導入に先立って行われた。PAC欠失はカナマイシンのみのプレート上で選別した。
【０１０６】
６つの欠失クローンおよび出発点のPACからのDNAが図１３Ａに示されている。NotI消化物はレーン２〜８に表示されている。pCYPAC2ベクターから導出されたPACはインサートを挟む二つのNotIサイトを含んでおり、レーン２に見られるように、酵素で消化した際に、ベクターDNAが切り取られることを許容する。loxP-Cre媒介欠失からNotIサイトが失われると、上記のBACクローンの場合のように、このベクター・バンドはインサートと融合する。したがって、NotIのみによる消化は、レーン３〜８に示されるように、欠失クローンDNAを線状化する。pTnMarkerless1を使ったPACにおけるloxPサイト間のCre媒介欠失は、BACの場合（図１３Ｂ）と同様、ベクターloxPに近いNotIサイトをAscIサイトで置き換える。したがって、欠失クローンおよび出発点のPACからのDNAの、AscIおよびNotIによる同時の消化は、レーン１０〜１６に示されるように、PACベクターDNA断片を放出する。ところが、二重消化物においてはいくつかの見かけの非一貫性が着目された：１）欠失クローンにおいてベクターDNAの位置に新しいバンドが見えるが、欠失クローン中のインサートの大きさは単独での17kbベクターDNAの除去のためには小さすぎる（レーン３〜８をそれぞれレーン１１〜１６と比較）。２）出発点となるNpr3PACは今の場合にはベクターの位置に二重項バンドを生成する（レーン２および１０あるいはレーン２６および２７をそれぞれ比較）。データは、このクローンのインサートDNAにおいて図１３Ｂに示されるように遠位NotIサイトから15kb未満離れて追加的なAscIサイトが位置していることと無矛盾である。したがって、AscI‐NotI二重消化物中で単独でのベクトルの位置に位置しているDNA断片は実際には、レーン１６の最も小さな大きさの欠失クローン以外はすべてにおいて実際には二重項バンドである。組み合わされたDNA断片の分子量は今ではNotIによる単独消化物中の分子量に一致する。出発点のNpr3PAC（レーン１０）中のベクターDNA断片は、欠失に比べてやや（400bp）大きく、これらのゲル中で分解される。レーン１９〜２５に示される、同じ組のDNAサンプルのAscI単独による消化物はこの仮設を確証する。レーン２６および２８におけるより大きなDNA断片（出発点のNpr3PACのNotIおよびAscI消化物）は、この特定のFIGEプログラムにおける貧弱な解像度のために同一に見える。レーン３０ないし３６はレーン２６〜２９と同じ組のサンプルを異なるFIGEプログラムを使って示している。
【０１０７】
pTnMarkerless1によって生成された欠失クローンの解析は、pTnMarkerless1のDNAの転移片におけるAscIサイトのところに、NotIサイトと並んで細菌カナマイシン耐性遺伝子を再導入することによってさらに強固なものとなる。この新たなトランスポゾンpTnKanの構築（図１１）は〈材料および方法〉において述べられている。pTnKanによって生成された欠失クローンは、loxP-Creによって媒介された場合、8kbのベクターDNA断片を生成することを注意しておく。
【０１０８】
〈pTnKanによる段階的欠失〉
Nkx2-5  GFP  BAC含有細胞をpTnKanにより形質転換し、先述した手順を使って段階的欠失を生成した。カナマイシンおよびクロラムフェニコール両方に耐性の欠失クローンが単離された。対照として、Nkx2-5  GFP  BACでの段階的欠失も先述したトランスポゾン・プラスミドpTnBAC/loxPと並行して生成された。
【０１０９】
pTnKanにより生成された欠失クローンからのDNAをNotI消化したものの解析は、これがBACをpTnBAC/loxPと同じくらい効率的に切り取れることを示している。ゲノム性インサート内部での異常組み換えは、カナマイシン耐性のある転移の同時選別のため、もはや回収されなくなる。図４のレーン７〜１１は、pTnBAC/loxPによって得られた欠失を表示しており、一方、pTnKanを使った場合はレーン３〜５および１２、１３に示されている。レーン２は出発点のNkx2-5  GFP  BACからのDNAを含む。先記したように、出発点のBACからのベクターDNA断片およびpTnBAC/loxPによって生成された欠失は、それぞれほぼ6.7kbおよび8.5kbで泳動する(20)。ベクター・バンドの大きさの特定の増加は、loxP配列に近いBACベクターNotIサイトを約1.7kb離れて位置するトランスポゾンのNotIサイトで置き換えることに起因しており、Cre/loxP組み換えによって特定的に生じる欠失についての厳格な診断の役割をする（文献20の図２参照）。
【０１１０】
pTnKanでは、loxP配列に近いBACベクターNotIサイトを置き換えるNotIサイトは、今や図１に示したような1.7kbではなくたったの1.1kbしか離れていないことを注意しておく。したがって、pTnKanにより生成された欠失におけるNotIベクターDNA断片は今ではレーン３〜５および１２、１３において示されるように8kbである。
【０１１１】
〈pTnMarkerless1を使った、所望の欠失対所望でない欠失の頻度〉
抗生物質耐性マーカーによる転移の選別なしでは、P1頭部によってファージ‐BAC/PAC共挿入体からの線状DNAにおける二つのloxPサイトがパッケージングされるようにする、あらゆる経路が最終的に欠失クローンとして回収される（文献９、図１Ａ参照）。一つのそのような経路は、インサートDNA内部でのサイトの組み換えからのもので、よってloxP挿入とは独立なものである。P1ファージは、大腸菌におけるプラスミドおよび染色体両者のDNA組み換えを、そのRef機能を発現することによって刺激することが知られている(26-28)。しかしながら、転移および相同組み換え両方はそれぞれ、互いに独立な低頻度イベントであり、したがって転移を通じて生起するCre/loxP欠失クローンがインサート内組み換えイベントに由来する再編成をも含むことはきわめてありそうもないことであることを銘記しておくことが重要である（下記の議論を参照）。
【０１１２】
真正のCre/loxP媒介欠失を見分ける厳格な手順が考案された：１）元のベクター中のNotIサイトがトランスポゾンからのNotIサイトで置き換えられた、BACおよびPAC両方からの欠失において、ベクター・バンドの大きさの特定の増加を同定し(20)、欠失クローンDNAのそれぞれNotIおよびAscIによる消化におけるベクターDNA断片の、不在および再出現。こうして、インサート内組み換えに由来する欠失は、次の特徴により、容易に同定される：NotI消化物は出発点のBACまたはPACと同一の大きさのベクターDNA断片を生成し、インサートDNAバンドは出発点のクローンのものよりも小さい。
【０１１３】
loxPサイトに関係しないインサート内欠失の頻度は、解析されるPACまたはBACクローンによって大きく変わり、該クローン内のゲノム性DNA中での、組み換えを引き起こすサイトの豊富さの有用な指標となりうる。インサートDNA中の配列反復は主要な貢献者であるようである。試験されたいくつかのBACおよびPACのうちでは、インサート内欠失の頻度は、JC-PAC9およびJC-PAC13におけるそれぞれ3%および5%から、Npr3PACおよびTbox18  BACクローンにおける15%および20%、Nkx2-5  GFP  BACについての約40%へと大きく変わった。ある未特定のBACクローンでは70%の高さに達した（データは示さず）。これまでの研究は200〜300bpの配列が単一の大きなクローン内のいくつかの位置でどちらかの配向に多数回繰り返されているのを同定していた(21)ので、これはおそらく驚くべきことであろう。同様の反復はNkx2-5  GFP  BACにも存在する。
【０１１４】
〈pTnMarkerless2による段階的欠失〉
わずかに異なる制限部位特徴をもつ（図１１）第二のトランスポゾンpTnMarkerless2が、ベクターがインサートDNAのどちらの端にもNotIサイトを含まないクローンにおいて生成された末端欠失の同定を容易にするために、構築された。シャトル・ベクターpJCPAC-Mam1  (29)、P1ベクター(30,31)および対JCPAC-Mam2  AおよびBであって、野生型loxPサイトと変異型loxPサイトがインサートDNAを挟んでいるものがこのカテゴリーにはいる。
【０１１５】
図１０は、NotI酵素で消化され、FIGEによって解析される段階的欠失クローンDNAの二つのパネルを示している。欠失は、pJCPAC-Mam2Aベクターでの115kbクローン（レーン３〜１５）またはpJCPAC-Mam2Bベクターでの140kbクローン（レーン２０〜３０）のいずれかでpTnMarkerless2を使って得られた。前記二つのベクターは、クローン中のインサートDNAを挟んで野生型loxPサイトと二つの異なる変異型loxPサイトの一つとを含む。pTnMarkerless2による真正のwt  loxP-Cre欠失は、ゲノム性インサートDNAがloxP-Cre組み換えの結果としてTnMarkerless2からNotIサイトを取得するため、14.5kbのベクターDNA断片を生成する（図１１）。レーン２および１９は、二つのベクター系それぞれからの出発点のクローンのNotI消化物を示しており、何らベクターDNA断片を含んでいない。Cre-loxPとは独立してインサート内組み換えによって生じる若干のクローン（それぞれ3%および5%）もこのベクターDNA断片は生成しなかった。前記二つのPACクローンにおけるpTnMarkerless2によるすべての欠失は、野生型のloxP末端からのみであった：すべてのクローンは、トランスポゾン末端プライマーで良好な配列読みを生じ、BLAST解析に際してGeneBankにおける、野生型loxP末端からの欠失と無矛盾なストランドのみの配列に揃ったのである。これに対し、インサート内のCre-loxP独立な欠失は、トランスポゾン末端プライマーで配列読みを生じなかった。
【０１１６】
〈議論〉
BAC全体を導入遺伝子として含むマウスが、組織特異的な遺伝子の調節を研究するためにますます使われている。この調節の多くは転写レベルであり、遺伝子よりずっと上流の配列要素によって媒介されているようである。インサートDNAの一端または両端から切り取られたBACまたはPACを動物中に導入することは、それらは染色体内組み込みの部位に影響されにくいので、そのような長いレンジの調節配列を生体条件でマッピングするのを容易にするはずである。修正されたBAC  DNAをマウス胚に入れてトランスジェニック動物を生成することは、クローンDNA内に哺乳類細胞選択可能マーカーを必要とはしない。したがって、改造の間に挿入された選択可能マーカーの発現を推進する強力なプロモーター要素はもはや必要ではない。実は、その存在は、転写エンハンシング配列を機能的に同定する能力に干渉し、クローン中の遺伝子に内生的な潜在的サイレンサーを隠蔽してしまうと考えられる（Chi  et  al.、未発表の観察）。したがって、BACおよびPACにおいて複雑な長いレンジの遺伝子調節配列を位置特定する際のそのような潜在的なハードルを克服するために、いくつかの新たなトランスポゾン・プラスミドが構築された。その一つpTnMarkerless1は、トランスジェニック・マウスのNkx2-5遺伝子の27kb上流に３つの新しいエンハンサー要素を同定するために成功裏に使用された（X.  Chi  et  al.、投稿中）。
【０１１７】
ここに記載されるマーカーなしのトランスポゾンpTnMarkerless1および2は、挿入を選別するために新規の方針を使う：抗生物質耐性の発現のような、目標に対してDNA転移片が与える成長上の利点についてスクリーニングする代わりに、挿入されたloxP配列がloxP-Cre組み換えを介してBAC-DNA長を短縮してP1ファージが線状BAC  DNAの両方のloxPサイトをその頭部の中にパッケージングできるようにすることに依拠したのである（図１１Ｃに概略的に示されている）。この方針は抗生物質耐性についての選別を使わないので、同じトランスポゾンがBACおよびPACの両方について使用されることができる。
【０１１８】
DNA転移片上のマーカーについての積極的な選別を回避することにより、loxP/Cre媒介されたイベントのほかloxP転移に関係ないイベントから縮小されたサイズのクローンを単離することにつながる：インサート内DNA組み換えから生じるBAC欠失も、その大きさが110kb未満であればP1頭部パッケージングによって回収されるのである。そのような欠失は、ゲノム性インサート内での配列反復の相同組み換えによって媒介されるものと思われるが、ファージにコードされたRef遺伝子の発現のため、BACクローンの通常の伝搬過程の間よりも、P1感染に際してより頻繁に起こる(75)。この知見は、なぜ少数のコロニーが時折トランスポゾン挿入なしに110kb  BACより大きなP1形質導入の間に回収されるかを説明する助けともなりうる（PKC、未発表の観察）。相同組み換えにおけるRef誘導された向上は3ないし6倍で、既存の大腸菌組み換え機能に依存する(75)。既存の大腸菌組み換え機能の多くはDH10Bのような宿主においては、BAC/PACプラスミドの安定した伝搬のために欠乏させられる。しかしながら、誘導転移の組み換えとRef向上された組み換えはいずれも非常に低頻度のイベントで、それぞれ10-4および10-7ある(80)ことを注意しておくことが重要である。ここで重要な問題は、インサート内のRef誘導された組み換えが、そうでなければ良好なloxP媒介欠失を再編成し、複雑にしうるかどうかである。そのような筋書きはきわめてありそうもないと予想され、再編成されたクローンが実質的に単離物の1%未満であることについての以前に報告された観察によって裏付けられる。
【０１１９】
マーカーなしのloxPトランスポゾンおよびその他のloxPトランスポゾンへの鍵は、真正のCre-loxP欠失を同定するために使われる厳格な基準：pTnKanまたはpTnBAC/loxPにより得られた欠失クローンDNA中で、NotIによる、特定の大きさのBACベクターDNA断片（図４）（文献20も参照）、標準的なBACおよびPACとともにpTnMarkerless1を使ってのNotIサイトのAscIサイトおよびPmeIサイトによる置き換え（図１２および図１３）、あるいはpTnMarkerless2によってJC-PAC双方向シャトル・ベクター・クローン中で野生型loxPに隣接する新たなNotIサイトの導入（図１５）である。
【０１２０】
残留抗生物質耐性遺伝子はしばしばBACおよびPACを機能的にすることの不可避的な帰結である。好適な抗生物質耐性マーカーが乏しいことを考えれば、ここに記載されているマーカーなしトランスポゾンは、これらにおいて段階的欠失を作成して、そのような修正されたゲノム性クローンを、一部を末端配列決定することによって特徴付けるのを容易にすると思われる。
【０１２１】
loxPサイトの転移を選別するP1頭部パッケージング基準は原理的には、元来PACのために設計されたpTn(Minimal)/loxPまたはpTNPGKpuro/lox(14)のような以前のトランスポゾンがBACでも段階的末端欠失を生成するのを許容するはずである。しかしながら、実際上は、Tnプラスミドは、細胞中でのそのより高いコピー数のため、欠失させられたBACクローンに比べてずっと高い頻度で回収される：いずれのプラスミドも同じ選択可能マーカー（クロラムフェニコール耐性）およびP1  virファージと共挿入体を形成し、それにより該ファージによってパッケージングされるためのloxPサイトを含むのである（pTnRSVneo/loxPによる以前の複雑さの詳細な議論については文献9を参照）。TnMarkerlessトランスポゾンはこの複雑さがない。欠失クローンについてスクリーニングするときにBAC（またはPAC）中のマーカーしか選択せず、Tnプラスミドは選択されないようにするからである。しかしながら、P1頭部パッケージングだけを使った転移の選別は110kbより大きなBACおよびPACについてしか現実的でないことは強調しておく必要がある。幸い、現在のBAC/PACライブラリー中のたいていのクローンはずっと大きく、平均インサート・サイズは160-230kbである(8)。
【０１２２】
〈図１１Ａ：真核生物のプロモーターのないトランスポゾンの概略的表現〉
図１１〜１１Ｃを参照する。ここで、太い矢印は野生型のloxPサイトを表す。小さい白抜きの縦の長方形はトランスポゾン境界を表し、細長い白抜きの長方形は遺伝子を表す。TnプラスミドpTnBAC/loxPおよびpTn(minimal)/loxPはすでに記載されている（文献14）。図１１Ｂは、マーカーなしトランスポゾン戦略がどのように機能するかを説明する概略的表現を示している：Creタンパク質媒介組み換えは、ファージP1  DNAとBAC  DNAとの間に共挿入体が形成されることを許容する。共挿入体における「pacサイト」が認識されて、P1パッケージング機構によって開裂され、末端がP1の空の頭部に詰め込まれる。パッケージングはＢ、Ｄ、Ｅ、Ｆの順にP1頭部がDNA約110kbでいっぱいになるまで続く。すると頭部の外にある残りのDNAは、「頭部充填開裂（headful-cleavage）」と呼ばれるものによって配列非特異な仕方で切り落とされる。P1頭部内のDNAの回収可能性は、第二のloxPサイト（太い矢印）も頭部に含まれているかどうかに依存する。その後の感染に際し、ファージ内の線状DNAが細胞にはいり、二つのloxPサイトを使って、新たに発現されたCreタンパク質によって環状化される。第二のloxPサイトがそこになければ、線状DNAは破壊される。そこで、両方のloxPサイトのP1頭部内へのパッケージングは、DNA  Ｄ、Ｅ、Ｆの長さを110kbより短くするかどうかに依存する。これが起こり得る方法の一つは、転移の際のloxP配列の正しい配向での挿入によってである。したがって、出発点となるBACまたはPACが110kbより大きければ、欠失クローンの回収はloxPサイトの転移の選別の役割をする。（Ｃ）はNkx2-5  GFP  BACにおけるpTnMarkerless1によるloxPトランスポゾン誘導欠失を示す概略図。診断的制限部位パターンが図示されている。
【０１２３】
〈図１２：pTnMarkerless1により生成されたNkx2-5  GFP  BAC欠失のFIGE解析〉
ここで図１２を参照すると、pTnMarkerless1によって生成された欠失系列からの５つのクローンの同じ組からのDNAが示されている。レーン３〜７はNotI酵素による消化後、レーン９〜１３はNotIおよびAscI消化後である。レーン１および８はそれぞれ1kbおよび5kbのラダーを示す。レーン２は、出発点のNkxBACをNotI酵素で消化したものである。矢印は出発点となるBACおよび欠失クローンにおけるベクターDNA断片の位置を示す。
【０１２４】
〈図１３：（Ａ）pTnMarkerless1によって生成されたNpr3PAC欠失のFIGE解析〉
ここで図１１Ａおよび図１１Ｂを参照すると、NotI酵素（レーン３〜８）、NotIおよびAscI酵素（レーン１１〜１６）およびAscI酵素のみ（レーン１９〜２４）によって消化された６つの欠失クローンの組からのDNAが示されている。出発点となるNpr3PACクローンのDNAをNotIで消化したものがレーン２、２６および３２に、NotIおよびAscI酵素で消化したものがレーン１０、２７および３３に、AscIのみによって消化したものがレーン１８、２８および３４に示されている。レーン２９および３６はどの酵素でも消化していない出発点となるNpr3PACのDNAを示している。5kbラダーがレーン１、２５および３０に加えられた。レーン１〜２９はFIGEプログラム６上で走らされ、一方、３０〜３６はプログラム８上で走らされた。（Ｂ）は出発点となるNpr3PACクローンおよびpTnMarkerless1を使って得られたその欠失の概略的な表現である。
【０１２５】
〈図１４：Nkx2-5  GFP  BAC段階的欠失からのDNAをNotIで消化したもののFIGE解析〉
ここで図１４を参照すると、pTnBAC/loxP（レーン７〜１１）またはpTnKan（レーン３〜５＆１２〜１３）によって生成された段階的欠失系列の５つのクローンからのDNAがNotI酵素で消化され、FIGEによって解析された。レーン１および６は分子量基準としてそれぞれ1kbおよび5kbのラダーを含み、出発点となるNkxBACクローンDNAの完全長がレーン２に示されている。右側の大小の矢印は、それぞれpTnBAC/loxP欠失（8.5kb）およびpTnKan（8kb）によってなされた欠失において見られるベクターDNA断片の位置を示す。
【０１２６】
〈図１５：JCPAC9（レーン３〜１５）およびJCPAC13（レーン２０〜３０）上でpTnMarkerless2によって生成された欠失クローンから単離されたDNAをNotI消化したもののFIGE解析〉
ここで図１５を参照すると、示されているレーン２および１９はそれぞれ出発点となるクローンJCPAC9およびJCPAC13をNotI消化したものを含む。同じく図１５に示されているレーン１および１８は基準として5kbのラダーを含む。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】野生型とloxP511のサイトを含む新たなトランスポゾン・プラスミドの概略図である。
【図２】漸次的な切り取りから単離されたNotI消化されたDNAのFIGE解析のグラフィック表示を示す図である。
【図３】ゲノム性DNAインサートの両端から逐次的になされる欠失を概略的に表現する図である。
【図４】野生型のloxP末端からなされる欠失から単離されるNotI消化されたDNAのFIGE解析のグラフィック表示を示す図である。
【図５】第一および第二の欠失後に使用可能なプライマーの配列決定を示す概略図である。
【図６Ａ】TnプラスミドのP1形質導入の概略図である。
【図６Ｂ】野生型または変異型loxPサイトを含む新たなトランスポゾン・プラスミドの概略図である。
【図７】pTnloxP*により生成される、ゲノム性DNAインサートの変異型loxP末端からの漸次的な欠失のグラフィック表示の図である。
【図８Ａ】JCPAC-13および-9においてpTnloxP*-1および-2により形成される欠失および逆位の概略図である。
【図８Ｂ】JCPAC-13および-9において、まずpTnloxPwtにより、次いでpTnloxP*-1または-2のいずれかにより生成される逐次的な欠失の概略図である。
【図９Ａ】JCPAC-9および-13においてpTnloxPwtにより生成される、野生型loxP末端からの欠失のグラフィック表示の図である。
【図９Ｂ】pTnloxP*-2または-1により生成される、欠失クローン１および７７の変異型loxPサイト末端からの欠失のグラフィック表示の図である。
【図１０】ファージP1による、変異型loxPサイト含有プラスミドの形質導入の間の中間体としての可能な多プラスミド共挿入体を示す概略図である。
【図１１Ａ】真核生物のプロモーターのないトランスポゾンの概略図である。
【図１１Ｂ】マーカーなしトランスポゾン戦略がどのように機能するかを説明する概略図である。
【図１１Ｃ】pTnMarkerless1を用いたNkx2-5  GFP-BACにおけるloxPトランスポゾン誘導欠失を示す概略図である。
【図１２】pTnMarkerless1を用いて生成されたNkx2-5  GFP-BAC欠失のFIGE解析のグラフィック表示の図である。
【図１３Ａ】pTnMarkerless1を用いて生成されたNpr3PAC欠失のFIGE解析のグラフィック表示の図である。
【図１３Ｂ】出発点のNpr3PACクローンと、pTnMarkerless1を使って得られたその欠失との概略図である。
【図１４】Nkx2-5  GFP-BAC段階的欠失からのNotI消化されたDNAのFIGE解析のグラフィック表示の図である。
【図１５】JCPAC9（レーン３〜１５）およびJCPAC13（レーン２０〜３０）上のpTNmarkerless2を用いて生成された欠失クローンから単離されたNotI消化されたDNAのFIGE解析のグラフィック表示の図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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