(57)【要約】  本発明は、化学的および酵素的修飾の組合せを利用する、リソバクチン誘導体の特異的な製造方法に関する。特に、本発明は、化学的還元および得られる生成物のキモトリプシンによる切断による、リソバクチン誘導体４−１１の製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジヒドロリソバクチンおよび／またはオクタヒドロリソバクチンの製造方法であって、水素化触媒の存在下、溶媒中で、水素を用いる水素化分解的開環により、リソバクチンをジヒドロリソバクチンおよび／またはオクタヒドロリソバクチンに変換することを特徴とする、方法。
【請求項２】
パラジウム触媒を水素化触媒として使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
イソプロパノール−水混合物を溶媒として使用する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
リソバクチンフラグメント４−１１およびリソバクチンフラグメント１−３の製造方法であって、ジヒドロリソバクチンおよび／またはオクタヒドロリソバクチンを酵素的に切断してリソバクチンフラグメント４−１１およびリソバクチンフラグメント１−３を得ることを特徴とする、方法。
【請求項５】
真核生物のセリンプロテアーゼまたは微生物のセリンプロテアーゼを酵素として使用する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
キモトリプシンをセリンプロテアーゼとして使用する、請求項４または請求項５に記載の方法。
【請求項７】
リソバクチンフラグメント３−１１および／またはリソバクチンフラグメント５−１１および／またはリソバクチンフラグメント４−１０および／またはリソバクチンフラグメント１−９の製造方法であって、ジヒドロリソバクチンおよび／またはオクタヒドロリソバクチンを酵素的に切断してリソバクチンフラグメント３−１１および／またはリソバクチンフラグメント５−１１および／またはリソバクチンフラグメント４−１０および／またはリソバクチンフラグメント１−９を得ることを特徴とする、方法。
【請求項８】
メタロプロテアーゼまたはシステインプロテアーゼを酵素として使用する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
リソバクチン誘導体の合成のための、リソバクチンフラグメント４−１１の使用。
【請求項１０】
鎖式リソバクチン誘導体の製造方法であって、リソバクチンフラグメント４−１１を、Ｃ末端の芳香族性または疎水性アミノ酸を有するトリペプチドと、Ｃ１−４−アルコールを添加したバッファー媒体中で反応させることを特徴とし、ここで、トリペプチドは遊離酸またはエステルの形態で存在し、反応媒体中のＣ１−４−アルコールの濃度は４０％より高いものである、方法。
【請求項１１】
メタノールをＣ１−４−アルコールとして使用することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学的および酵素的修飾を組み合わせることによる、リソバクチン誘導体の標的化された製造方法に関する。特に、本発明は、化学的還元および得られる生成物のキモトリプシンによる切断による、リソバクチンフラグメント４−１１の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リソバクチンは、細菌の細胞壁生合成に作用する新規抗生物質を見出すためのスクリーニングプログラムに由来する環状デプシペプチドである（O'Sullivan J. et al. (1988) J. Antibiot. 41 (12), 1740-1744 and Bonner, D. P. et al. (1988) J. Antibiot. 41 (12), 1745-1751; Tymiak, A. A. et al. (1989) J. Org. Chem. 54, 1149-1157）。それは、グラム陽性の好気性および嫌気性の細菌に対して強い活性を示す。珍しい特徴は、分子中に非タンパク質構成アミノ酸が多数あることである。３個のβ−ヒドロキシアミノ酸（２Ｓ,３Ｒ）−β−ヒドロキシロイシン、（２Ｓ,３Ｒ）−β−ヒドロキシフェニルアラニンおよび（２Ｓ,３Ｓ）−β−ヒドロキシアスパラギンに加えて、Ｄ−アミノ酸のＤ−ロイシンおよびＤ−アルギニン並びにアロ−スレオニンもある。この天然産物リソバクチンの複雑さと大きさは、標的化された化学修飾への大障害である。
【０００３】
従って、本発明の目的は、リソバクチンフラグメントを使用する新規抗生物質の製造を可能にするために、リソバクチンフラグメントの標的化された合成のための新規かつ代替的な合成方法を提供することである。
【発明の開示】
【０００４】
解決方法は、化学的修飾段階、例えば水素化と組み合わせた、標的化された酵素的切断、標的化された酵素的生成および後続のリソバクチンフラグメントの連結により与えられる。
【０００５】
リソバクチンおよび加水分解により得られる鎖式形態（「鎖式リソバクチン」；式（Ｉ）の化合物）の、ペプシン、トリプシン、キモトリプシンおよび粘膜ペプチダーゼなどの酵素による酵素的分解実験は、酵素的分解を、全く（例えばペプシンの場合）または不適切にしか示さなかった（R. A. Blackburn et. al. (1993) Drug Metab. Dispos. 21(4), 573-579）。非常に遅く非効率的なリソバクチンの酵素的切断は、使用したバッファー中での加水分解による開環後にのみ起こる。このことは、望まざる副反応として、（２Ｓ,３Ｓ）−β−ヒドロキシアスパラギンでの側鎖のアミド分解を導く。つまり、β−ヒドロキシアスパラギンユニットがβ−ヒドロキシアスパラギン酸ユニットに変換される。
【０００６】
驚くべきことに、リソバクチンフラグメント４−１１は、ジヒドロリソバクチン（式（ＩＩ）の化合物）およびオクタヒドロリソバクチン（式（ＩＩＩ）の化合物）並びに両成分の混合物から、キモトリプシンでの酵素的切断により高い効率で定量的に製造できることが見出された。切断は非常に迅速に起こるので、フラグメント１−３および４−１１は、実質的に反応パートナー（基質と酵素）の組み合わせの後に形成される。アミノ酸側鎖における望まざる副反応は起こらない。
【０００７】
【化１】
2008529970.tif 000002
【化２】
2008529970.tif 000003
【０００８】
ジヒドロリソバクチンおよびオクタヒドロリソバクチンは、リソバクチンの水素による水素化分解的開環により得られ、ここで、（２Ｓ,３Ｒ）−β−ヒドロキシフェニルアラニンユニットは、フェニルアラニンまたは３−シクロヘキシルアラニンユニットに変換される。得られるリソバクチンフラグメントであるジヒドロリソバクチンおよびオクタヒドロリソバクチンを、次いで酵素的分解に使用する。
【０００９】
驚くべきことに、ジヒドロリソバクチンおよびオクタヒドロリソバクチンは、他の酵素にも良好な基質であるので、酵素の選択により他のフラグメントも高収率で製造できる。
【００１０】
本発明は、ジヒドロリソバクチンおよび／またはオクタヒドロリソバクチンの製造方法に関する。その方法では、水素化触媒の存在下、溶媒中で水素を用いる水素化分解的開環により、リソバクチンをジヒドロリソバクチンおよび／またはオクタヒドロリソバクチンに変換する。
【００１１】
水素化触媒は、例えば、パラジウム、ルテニウム、ロジウム、イリジウムおよび白金触媒、またはラネーニッケルである。これらの触媒は、塩（例えば二酸化白金、塩化ロジウム（ＩＩＩ））として、または担持された触媒（例えばパラジウム／炭素（５−３０％）またはロジウム／炭素（５％））として、使用できる。担持された触媒に適する担持物質は、例えば、活性炭、珪藻土、シリカゲル、ベントナイト、カオリン、軽石、アルミノケイ酸または酸化アルミニウムである。好ましい担持物質は、活性炭である。
【００１２】
二金属性（bimetallic）触媒または他の複数成分の触媒も使用できる。
好ましいのは、パラジウム触媒、例えばパラジウム／炭素（５−３０％）であり、特に好ましいのはパラジウム／炭素（１０％）である。
【００１３】
水素化分解的開環は、一般的に、溶媒中、好ましくは室温ないし１５０℃の温度範囲、好ましくは室温ないし８０℃の温度範囲で、大気圧ないし２００ｂａｒの気圧範囲で、好ましくは３ないし８０ｂａｒの圧力範囲で行う。
【００１４】
溶媒は、例えば、メタノール、エタノールまたはイソプロパノールなどのアルコール、または、アルコールの水との混合物、または酢酸もしくは酢酸水溶液、またはＴＨＦ−水混合物、またはジオキサン−水混合物、または上述の溶媒の他の三成分混合物、例えばイソプロパノール−水−酢酸である。好ましいのは、イソプロパノール−水混合物である。
【００１５】
本発明はさらに、リソバクチンフラグメント４−１１およびリソバクチンフラグメント１−３の製造方法に関する。その方法では、ジヒドロリソバクチンおよび／またはオクタヒドロリソバクチンを酵素的に切断し、リソバクチンフラグメント４−１１およびリソバクチンフラグメント１−３を得る。
【００１６】
好ましいのは、真核生物のセリンプロテアーゼまたは微生物のセリンプロテアーゼを酵素として使用する、ジヒドロリソバクチンおよび／またはオクタヒドロリソバクチンの酵素的切断である。
【００１７】
真核生物のセリンプロテアーゼは、例えば、キモトリプシン、カテプシンＧ、キマーゼまたはキモトリプシンファミリーの他の酵素、または芳香族性アミノ酸の後ろで切断する他の真核生物のセリンプロテアーゼであり、好ましいのはキモトリプシンである。
【００１８】
微生物のセリンプロテアーゼは、例えば、サブチリシン、プロテイナーゼＫ、ストレプトマイセスプロテアーゼＡまたは芳香族性アミノ酸の後ろで切断する他の酵素であり、好ましいのは、サブチリシンである。
【００１９】
本発明はさらに、より小さいリソバクチンフラグメントを与えるジヒドロリソバクチンおよび／またはオクタヒドロリソバクチンの酵素的切断方法に関する。
【００２０】
従って、本発明はさらに、ジヒドロリソバクチンおよび／またはオクタヒドロリソバクチンを酵素的に切断してリソバクチンフラグメント３−１１および／またはリソバクチンフラグメント５−１１および／またはリソバクチンフラグメント４−１０および／またはリソバクチンフラグメント１−９を得ることを特徴する、リソバクチンフラグメント３−１１および／またはリソバクチンフラグメント５−１１および／またはリソバクチンフラグメント４−１０および／またはリソバクチンフラグメント１−９の製造方法に関する。
【００２１】
好ましいのは、メタロプロテアーゼまたはシステインプロテアーゼを酵素として使用する、ジヒドロリソバクチンおよび／またはオクタヒドロリソバクチンの酵素的切断である。
メタロプロテアーゼは、例えば、サーモリシンまたはミコリシン（mycolysin）である。
システインプロテアーゼは、例えば、パパイン、ブロメラインまたはフィシン（ficin）である。
【００２２】
酵素的切断は、一般的に、水性切断バッファー中、Ｃ１−Ｃ４アルコールまたはアセトニトリルを添加して、好ましくは１０℃ないし４０℃の温度範囲、好ましくは６ないし９のｐＨ範囲で、大気圧下に行う。
【００２３】
水性切断バッファーは、例えば、炭酸水素アンモニウムおよび尿素、またはリン酸ナトリウム、システインおよびＥＤＴＡ、またはナトリウムテトラボレート、またはそれによりｐＨ６ないし９の緩衝範囲が含まれる他の添加物を含有し、好ましいのは、炭酸水素アンモニウムおよび尿素である。
【００２４】
Ｃ１−Ｃ４アルコールは、例えば、メタノール、エタノールまたはイソプロパノールであり、好ましいのはメタノールである。
特に好ましくは、酵素的切断は、３０℃ないし３７℃の温度範囲で行う。
反応媒体中のアルコール濃度は、０％ないし４０％、好ましくは１０％ないし１５％である。
酵素の基質（ジヒドロリソバクチンおよび／またはオクタヒドロリソバクチン）に対する比は、１：１ないし１：４０００、好ましくは１：２５ないし１：１００である。
【００２５】
本発明はさらに、リソバクチン誘導体を合成するためのリソバクチンフラグメント４−１１の使用に関する。
これらのリソバクチン誘導体は、リソバクチンの環系の１個またはそれ以上のアミノ酸が置換されている誘導体である。
【００２６】
本発明はさらに、鎖式リソバクチン誘導体の製造方法に関し、その方法では、リソバクチンフラグメント４−１１を、Ｃ末端の芳香族性または疎水性アミノ酸を有するトリペプチドと、Ｃ１−４−アルコールを添加したバッファー媒体中で反応させる。ここで、トリペプチドは、遊離酸またはエステルの形態で存在し、反応媒体中のＣ１−４−アルコールの濃度は４０％より高い。
【００２７】
Ｃ１−Ｃ４アルコールは、例えば、メタノール、エタノールまたはイソプロパノールであり、好ましいのはメタノールである。
【００２８】
好ましいのは、リソバクチンフラグメント４−１１およびトリペプチドＨ−Ｄ−Ｘ−Ｙ−Ｐｈｅ−ＯＲまたはＨ−Ｄ−Ｘ−Ｙ−（３−シクロヘキシル）Ａｌａ−ＯＲから、メタノールを添加したバッファー媒体中で、鎖式リソバクチン誘導体を酵素的に合成する方法であり、ここで、反応媒体中のメタノール濃度は４０％より高く、
Ｒは、水素またはＣ１−Ｃ４−アルキル、好ましくはエチルまたはメチル、特に好ましくはメチルを表し、
Ｄ−Ｘは、Ｄ配置の天然または合成α−アミノ酸を表し、
そして、Ｙは、Ｌ配置の天然または合成α−アミノ酸を表す。
【００２９】
特に好ましいのは、メタノールを添加したバッファー媒体中（反応媒体中のメタノール濃度は４０％より高い）で、キモトリプシンを酵素として使用する、リソバクチンフラグメント４−１１およびトリペプチドＨ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｏメチル、Ｈ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｈ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−（３−シクロヘキシル）Ａｌａ−ＯメチルまたはＨ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−（３−シクロヘキシル）Ａｌａ−ＯＨから鎖式リソバクチン誘導体を酵素的に合成する方法である。
【００３０】
図面の説明
図１：キモトリプシンによる分取的酵素的切断（実施例１１）の時間経過。ジヒドロ−およびオクタヒドロリソバクチンの混合物のキモトリプシンによる分取的酵素的切断のＨＰＬＣ図の重ね書き。分離条件は、実施例３０の説明で報告する通りである（ＵＶ検出２１０ｎｍ）。
図２：キモトリプシンによるオクタヒドロリソバクチンの酵素的切断（実施例５）の時間経過。オクタヒドロリソバクチンのキモトリプシンによる酵素的切断のＣＺＥ図の重ね書き。分離条件は、実施例３１の説明で報告する通りである（ＵＶ検出２１０ｎｍ）。
【００３１】
定義
ジヒドロリソバクチン：Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（ＯＨ）−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−アロ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ（ＯＨ）−Ｓｅｒ
オクタヒドロリソバクチン：Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ（３−シクロヘキシル）−Ｌｅｕ（ＯＨ）−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−アロ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ（ＯＨ）−Ｓｅｒ
リソバクチンフラグメント４−１１：Ｌｅｕ（ＯＨ）−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−アロ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ（ＯＨ）−Ｓｅｒ
リソバクチンフラグメント１−３：Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＰｈｅまたはＤ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ（３−シクロヘキシル）
【００３２】
化学的および酵素的反応並びに分析的特徴解析の過程で使用される方法を、以下に列挙する。
【実施例】
【００３３】
実施例
略号
【表１】
2008529970.tif 000004
【００３４】
参考文献
ペプチドおよびシクロデプシペプチドの命名法について、以下を参照：
1. A Guide to IUPAC Nomenclature of Organic Compounds (Recommendations 1993), 1993, Blackwell Scientific publications.
2. Nomenclature and symbolism for amino acids and peptides. Recommendations 1983. IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature, UK. Biochemical Journal 1984, 219, 345-373, 並びに引用文献。
【００３５】
ＬＣ−ＭＳ、ＨＲ−ＭＳおよびＨＰＬＣの一般的方法
方法１（ＬＣ−ＭＳ）：装置タイプＭＳ：Micromass ZQ；装置タイプＨＰＬＣ：HP 1100 series; UV DAD；カラム：Phenomenex Synergi 2μ Hydro-RP Mercury 20 mm ｘ 4 mm；溶離剤Ａ：水１ｌ＋５０％ギ酸０.５ｍｌ、溶離剤Ｂ：アセトニトリル１ｌ＋５０％ギ酸０.５ｍｌ；グラジエント：０.０分９０％Ａ→２.５分３０％Ａ→３.０分５％Ａ→４.５分５％Ａ；流速：０.０分１ｍｌ／分、２.５分／３.０分／４.５分２ｍｌ／分；オーブン：５０℃；ＵＶ検出：２１０ｎｍ。
【００３６】
方法２（分取用ＨＰＬＣ；対称；トリフルオロ酢酸）：装置：Gilson Abimed HPLC；ＵＶ検出器２１０ｎｍ；バイナリポンプシステム；カラム：SymmetryPrep（商標）C18, Waters, 7 μm; 300 ｘ 19 mm；溶離剤Ａ：０.０５％トリフルオロ酢酸を含む水、溶離剤Ｂ：０.０５％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル；グラジエント：０−５分５％Ｂ、流速２０ｍｌ／分、５−３０分、５から６０％Ｂへの勾配、以下の流速上昇を伴う：６分から２２ｍｌ／分、１０分から２３ｍｌ／分、１５分から２４ｍｌ／分；３０−３５分６０％から９８％Ｂへの勾配、３８分から２１ｍｌ／分への流速低下を伴う；４０−４５分１０％Ｂ。
【００３７】
方法３（ジヒドロ−およびオクタヒドロリソバクチンのＨＰＬＣによる分取的分離方法）：カラム：SymmetryPrep（商標）C18, Waters, 7 μm 300 ｘ 19 mm；流速２５ｍｌ／分；室温；溶離剤Ａ：０.２％ＴＦＡを含む水、溶離剤Ｂ：アセトニトリル、０−１０分グラジエント：８０％Ａ、２０％Ｂから３５％Ａへ、６５％Ｂ；１０.０１−１５分：８０％Ａ、２０％Ｂ；検出２１０ｎｍ。画分をＬＣ−ＭＳ（方法１）を利用して監視し、アセトニトリルをロータリーエバポレーターで除き、凍結乾燥する。
【００３８】
方法４（分析用HPLC 1100, ZQ2, Phenomenex, Synergi, Hydro-RP）：装置タイプＨＰＬＣ：HP 1100 Series; UV DAD; カラム: Phenomenex, MercuryMS, Synergi 2μ Hydro-RP 20 ｘ 4 mm；溶離剤Ａ：水／０.０５％ギ酸、溶離剤Ｂ：アセトニトリル；グラジエント：０.０−２.５分、９０−３０％Ａ、流速１−２ｍｌ／分、２.５−３.０分、３０−５％Ａ、流速２.０ｍｌ／分、３.０−４.５分、５％Ａ；オーブン：５０℃；ＵＶ検出：２１０ｎｍ。
【００３９】
方法５（ＴＯＦ−ＨＲ−ＭＳ）：ＴＯＦ−ＨＲ−ＭＳ−ＥＳＩ＋スペクトルを、Micromass LCT 装置（キャピラリー電圧：３.２ｋＶ、コーン電圧：４２Ｖ、ソース温度：１２０℃、脱溶媒和温度：２８０℃）を使用して記録する。このために、シリンジポンプ（Harvard Apparatus）をサンプル導入用に使用する。ロイシンエンケファリン（Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ）を標準として使用する。
【００４０】
方法６（ＨＰＬＣ）：装置タイプＨＰＬＣ：HP 1100 Series; UV DAD カラム: Zorbax Eclipse XBD-C8 (Agilent), 150 mm ｘ 4.6 mm, 5 μm；溶離剤Ａ：ＨＣｌＯ４５ｍｌ／水１ｌ、溶離剤Ｂ：アセトニトリル；グラジエント：０−１分１０％Ｂ、１−４分１０−９０％Ｂ、４−５分９０％Ｂ；流速：２.０ｍｌ／分；オーブン：３０℃；ＵＶ検出：２１０および２５４ｎｍ。
【００４１】
方法７（ＨＰＬＣ）：カラム：Kromasil RP-18, 60 mm ｘ 2 mm, 3.5 μm；溶離剤Ａ：ＨＣｌＯ４５ｍｌ／水１ｌ、溶離剤Ｂ：アセトニトリル；グラジエント：０分２％Ｂ、０.５分２％Ｂ、４.５分９０％Ｂ、９分９０％Ｂ；流速：０.７５ｍｌ／分；オーブン：３０℃；ＵＶ検出：２１０ｎｍ。
【００４２】
方法８（ＨＰＬＣ）：カラム：Kromasil RP-18, 250 mm ｘ 4 mm, 5 μm；溶離剤Ａ：ＨＣｌＯ４５ｍｌ／水１ｌ、溶離剤Ｂ：アセトニトリル；グラジエント：０分５％Ｂ、１０分９５％Ｂ；流速：１ｍｌ／分；オーブン：４０℃；ＵＶ検出：２１０ｎｍ。
【００４３】
方法９（ＨＰＬＣ）：カラム：Kromasil RP-18, 250 mm ｘ 4 mm, 5 μm；溶離剤Ａ：ＨＣｌＯ４２ｍｌ／水１ｌ、溶離剤Ｂ：アセトニトリル；均一濃度：４５％Ｂ、５５％Ａ；流速：１ｍｌ／分；オーブン：４０℃；ＵＶ検出：２１０ｎｍ。
【００４４】
方法１０（ＨＰＬＣ）：装置：DAD (G1315B)、バイナリポンプ (G1312A)、オートサンプラー (G1313A)、溶媒脱気装置 (G1379A) およびカラムサーモスタット (G1316A)を有する Agilent 1100；カラム：Agilent Eclipse XDB-C8 4.6 ｘ 150 ｘ 5 mm；カラム温度：４０℃；溶離剤Ａ：７０％過塩素酸０.０５％を含む水；溶離剤Ｂ：メタノール；流速：２.００ｍｌ／分；均一濃度：０−７分５５％Ｂ。
【００４５】
方法１１（ＨＰＬＣ）：分析用ＨＰＬＣ方法、ブロメライン／キモトリプシン切断。酵素切断産物または出発化合物約２０μｇを、300SB-C18 カラム (4.6 mm ｘ 125 mm; 3.5 μm マテリアル；孔直径３００Å）でクロマトグラフィーする。溶離剤として、アセトニトリル／ＴＦＡグラジエントを使用する。溶離剤Ａ：０.１％ＴＦＡを含む水、溶離剤Ｂ：０.１％ＴＦＡを含む６０％アセトニトリル／４０％水；グラジエント：０分０％Ｂ、２分１０％Ｂ、５０分８０％Ｂ、５２分１００％Ｂ、５５分０％Ｂ、６０分０％Ｂ；流速：０.７ｍｌ／分；カラム温度：４０℃；検出：２１０ｎｍ。
【００４６】
ジヒドロ−、オクタヒドロリソバクチンおよび酵素的切断産物のタンパク質化学的特徴解析
装置
Applied Biosystems のタンパク質配列決定装置 Procise（商標）を使用して、配列解析を実施する。標準的配列決定プログラムを使用する。配列決定装置、様々な配列決定プログラム並びにＰＴＨ検出システムは、操作用手引き書である User's Manual Set, Protein Sequencing System Procise（商標）(1994), Applied Biosystems Forster City, CA 94404, U.S.A に詳細に記載されている。
配列決定装置を操作するための試薬およびＰＴＨ検出用のＨＰＬＣカラムは、Applied Biosystems から入手する。
【００４７】
Agilent の HP1100 HPLC システムを使用して、ＨＰＬＣ分析を実施する。Agilent (D-Waldbronn) の Zorbax 300SB-C18 カラム（４.６ｍｍｘ１５０ｍｍ；３.５μｍマテリアル；孔直径３００Å）を分離用に使用する。
使用する試薬は、ＨＰＬＣ品質のものであり、Merck (D-Darmstadt）から入手する。
【００４８】
キャピラリー電気泳動モデル２７０Ａ−ＨＴは、Applied Biosystems 社製のものである。一般的に、サンプルを種々の時間をかけて水圧で注入する。使用するキャピラリーカラム（直径５０μｍｘ長さ７２ｃｍ）は、Applied Biosystems 社製のものである。分離プログラムおよび分析装置の機能は、その装置の手引き書に詳細に記載されている（User's manual capillary electrophoresis system model 270A HT; Applied Biosystems Forster City, CA 94404, U.S.A.; 1989）。
使用する試薬は、生化学品質のものであり、Merck (D-Darmstadt) または Sigma (D-Deisenhofen）から入手する。
【００４９】
アミノ酸の分析は、Eppendorf/Biotronik の LC3000 アミノ酸分析装置を使用して実施する。わずかに改変した Eppendorf/Biotronik の標準的分離プログラムを使用する。分離プログラムおよび分析装置の機能は、装置の手引き書に詳細に記載されている (Handbuch des aminosaeureanalysators LC 3000 [handbook of the LC 3000 amino acid analyzer], Wissenschaftliche Geraete GmbH Biotronik, Maintal, 1996)。
使用する試薬は、生化学品質のものであり、Merck (D-Darmstadt)、Fluka (D-Neu-Ulm) または Sigma (D-Deisenhofen）から入手する。
【００５０】
分子量は、Micromass (Manchester, UK）のＺＱ−１システムを使用して決定する。そのために、フラグメントをＲＰ−１８−ＨＰＬＣクロマトグラフィー（ＨＰ１１００システム）を利用して分離し、分子量を電子スプレーイオン化法（ＥＳＩ）により測定する。外部較正を実施する。較正およびシステムの機能は、装置の手引き書に詳細に記載されている。
使用する酵素および化学物質は、生化学品質のものであり、Fluka, Calbiochem (D-Heidelberg) および Sigma から入手する。
【００５１】
分取用クロマトグラフィーソース 15RPC 用の物質は、Amersham Bioscience (D-Freiburg）から入手する。分取的分離は、Amersham Bioscience の AEKTA（商標）システムを使用して実施する。
【００５２】
本発明で言及される化合物は、塩、溶媒和物または塩の溶媒和物の形態であってもよい。
本発明の目的上好ましい塩は、本発明により製造できるか、または使用可能である化合物の、生理的に許容し得る塩である。しかしながら、それら自体は医薬適用に適さないが、例えば本発明により製造できるか、または使用可能である化合物の単離または精製に使用できる塩または混合塩も含まれる。
【００５３】
本発明により製造できるか、または使用可能である化合物の生理的に許容し得る塩には、鉱酸、カルボン酸およびスルホン酸の酸付加塩、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸および安息香酸の塩が含まれる。
【００５４】
本発明により製造できるか、または使用可能である化合物の生理的に許容し得る塩には、通常の塩基の塩、例えば、そして好ましくは、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウムおよびカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウムおよびマグネシウム塩）およびアンモニアまたは１個ないし１６個の炭素原子を有する有機アミン類（例えば、そして好ましくは、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、エチルジイソプロピルアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、ジメチルアミノエタノール、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、アルギニン、リジン、エチレンジアミンおよびＮ−メチルピペリジン）から誘導されるアンモニウム塩も含まれる。
【００５５】
本発明の目的上、溶媒和物は、本発明により製造できるか、または使用可能である化合物の、溶媒分子との配位により固体または液体状態で錯体を形成する形態を表す。水和物は、配位が水と起こる、溶媒和物の特別な形態である。
【００５６】
実施例１
Ｄ−ロイシル−Ｎ１−｛（３Ｓ,６Ｓ,１２Ｓ,１５Ｓ,１８Ｒ,２１Ｓ,２４Ｓ,２７Ｓ,２８Ｒ）−６［（１Ｓ）−２−アミノ−１−ヒドロキシ−２−オキソエチル］−１８−（３−｛［アミノ（イミノ）メチル］アミノ｝プロピル）−１２−［（１Ｓ）−１−ヒドロキシエチル］−３（ヒドロキシメチル）−２４−［（１Ｒ）−１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル］−２１−イソブチル−１５−［（１Ｓ）−１−メチルプロピル］−２,５,８,１１,１４,１７,２０,２３,２６−ノナオキソ−２８−フェニル−１−オキサ−４,７,１０,１３,１６,１９,２２,２５−オクタアザシクロオクタコサン−２７−イル｝−Ｌ−ロイシンアミドビストリフルオロアセテート
｛Ｄ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−［（３Ｒ）−３ヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニル）］−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシ−Ｌ−ロイシル］−Ｌ−ロイシル−Ｄ−アルギニル−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−アロスレオニル−グリシル−［（３Ｓ）−３−ヒドロキシ−Ｌ−アスパラギニル］−Ｌ−セリン−Ｃ１.１１−Ｏ３.３−ラクトンビストリフルオロアセテート｝（リソバクチン）
【化３】
2008529970.tif 000005
【００５７】
発酵：
培養培地：
ＹＭ：酵母−麦芽寒天：Ｄ−グルコース（４ｇ／ｌ）、酵母抽出物（４ｇ／ｌ）、麦芽抽出物（１０ｇ／ｌ）、Lewatit 水１ｌ。滅菌（２０分間、１２１℃）前に、ｐＨを７.２に調節する。
ＨＰＭ：マンニトール（５.４ｇ／ｌ）、酵母抽出物（５ｇ／ｌ）、肉ペプトン（３ｇ／ｌ）。
作業用一時保存物：凍結乾燥系統（ＡＴＣＣ５３０４２）を、ＹＭ培地５０ｍｌ中で増殖させる。
【００５８】
フラスコ発酵：１ｌの三角フラスコ中のＹＭ培地１５０ｍｌまたはＨＰＭ培地１００ｍｌを、作業用一時保存物２ｍｌで播種し、２４０ｒｐｍの振盪機上、３０−４８時間２８℃で増殖させる。
【００５９】
３０ｌ発酵：フラスコ発酵物（ＨＰＭ培地）３００ｍｌを使用して、無菌の栄養培地溶液（１ｍｌの消泡剤ＳＡＧ５６９３／ｌ）３０ｌを播種する。この培養物を、２１時間、２８℃、３００ｒｐｍおよび滅菌空気０.３ｖｖｍによる通気で増殖させる。ｐＨを１Ｍ塩酸でｐＨ＝７.２に一定に保つ。培養期間中に、全部で８８０ｍｌの１Ｍ塩酸を添加する。
【００６０】
主培養（２００ｌ）：１ｌの三角フラスコ中のＹＭ培地１５ｘ１５０ｍｌを、作業用一時保存物２ｍｌで播種し、振盪機上、２８℃で、４８時間、２４０ｒｐｍで増殖させる。この培養物２２５０ｍｌを使用して、無菌の栄養培地溶液（ＹＭ）（１ｍｌの消泡剤ＳＡＧ５６９３／ｌ）２００ｌを播種し、それを、１８.５時間、２８℃、１５０ｒｐｍおよび滅菌空気０.３ｖｖｍによる通気で増殖させる。
【００６１】
毎時間のサンプル（５０ｍｌ）を取り、発酵過程を確認する。メタノール１ｍｌ（０.５％トリフルオロ酢酸）をこの培養ブロス２ｍｌに添加し、０.４５μｍフィルターを通して混合物を濾過する。この懸濁液３０μｌを、ＨＰＬＣ（方法６および方法７）を利用して分析する。
１８.５時間後、１７０００ｒｐｍで主培養の培養ブロスを上清と沈降物に分離する。
【００６２】
単離：
上清（１８３ｌ）を濃トリフルオロ酢酸または水酸化ナトリウム溶液を使用してｐＨ６.５−７に調節し、Lewapol カラム (OC 1064、６０ｌ容量）に負荷する。続いて、純水、水／メタノール１：１および続いて純粋なメタノール（０.１％トリフルオロ酢酸を含有する）で溶出を実施する。この有機相を真空で濃縮し、水性残留物１１.５ｌを残す。
【００６３】
残存する水相をシリカゲルＣ１８に結合させ、分離する（MPLC, Biotage Flash 75, 75 x 30 cm, KP-C18-WP, 15-20 μm, 流速：３０ｍｌ；溶離剤：アセトニトリル／０.１％トリフルオロ酢酸を含有する水；グラジエント：１０％、１５％および４０％アセトニトリル）。実施例１Ａの大部分を含有する４０％アセトニトリル相を真空で濃縮し、続いて凍結乾燥する（約１３ｇ）。この固体の混合物を１.２ｇずつ、最初に分取用ＨＰＬＣ（方法１）により、続いて Sephadex LH-20 （５ｘ７０ｃｍ、アセトニトリル／水１：１、各場合で０.０５％トリフルオロ酢酸を含有する）のゲル濾過により、さらに分取用ＨＰＬＣ（方法８）で、分離する。
この方法により、２２５０ｍｇの実施例１を得る。
【００６４】
沈降物を４ｌのアセトン／水４：１に取り、Celite ２ｋｇを添加し、トリフルオロ酢酸を使用して混合物をｐＨ＝６に調節し、撹拌し、遠心分離する。溶媒を真空で濃縮し、残渣を凍結乾燥する。得られる凍結乾燥物（８９.９ｇ）をメタノールに取り、濾過し、濃縮し、シリカゲル（方法５）で分離する。次いで、実施例１Ａをゲル濾過（Sephadex LH-20、５ｘ６８ｃｍ、水／アセトニトリル９：１（０.０５％トリフルオロ酢酸を含有する）、流速：２.７ｍｌ／分、画分サイズ１３.５ｍｌ）により精製し、純粋な物質を得る。
この方法により４４７ｍｇの実施例１を得る。
【００６５】
HPLC (方法 6): Rt = 6.19 分
MS (ESIpos): m/z = 1277 [M + H]+
1H NMR (500.13 MHz, d6-DMSO): δ = 0.75 (d, 3H), 0.78 (d, 6H), 0.80 (t, 3H), 0.82 (d, 3H), 0.90 (d, 3H), 0.91 (d, 3H), 0.92 (d, 3H), 0.95 (d, 3H), 0.96 (d, 3H), 1.05 (m, 1H), 1.19 (d, 3H), 1.25 (m, 2H), 1.50 (m, 4H), 1.51 (m, 2H), 1.55 (m, 1H), 1.61 (m, 1H), 1.65 (m, 1H), 1.84 (m, 1H), 1.85 (m, 1H), 1.86 (m, 1H), 1.89 (m, 1H), 1.95 (m, 1H), 2.75 (m, 2H), 3.40 (m, 1H), 3.52 (m, 2H), 3.53 (dd, 1H), 3.64 (m, 2H), 3.66 (m, 1H), 3.68 (dd, 1H), 3.73 (m, 2H), 4.00 (dd, 1H), 4.02 (br., 1H), 4.13 (br., 1H), 4.32 (dd, 1H), 4.39 (t, 1H), 4.55 (m, 1H), 4.75 (dd, 1H), 5.19 (t, 1H), 5.29 (d, 1H), 5.30 (br., 1H), 5.58 (m, 2H), 6.68 (m, 3H), 6.89 (d, 1H), 6.93 (m, 3H), 6.94 (br., 1H), 6.98 (d, 1H), 7.12 (br., 1H), 7.20 (br., 2H), 7.23 (m, 2H), 7.42 (m, 2H), 7.54 (d, 1H), 7.58 (d, 1H), 8.32 (br., 1H), 9.18 (br., 1H), 9.20 (m, 2H), 9.50 (br., 1H).
【００６６】
13C-NMR (125.77 MHz, d6-DMSO): δ = 10.3, 15.3, 19.0, 19.2, 19.6, 20.0, 20.9, 22.0, 22.4, 23.0, 23.2, 24.3, 24.4, 25.0, 25.4, 26.0, 27.8, 30.9, 35.4, 39.5, 40.8, 40.9, 41.6, 44.1, 51.5, 52.7, 55.9, 56.2, 56.4, 57.9, 58.8, 60.2, 61.1, 62.6, 70.1, 71.6, 71.7, 75.5, 128.1, 128.6, 136.7, 156.8, 168.2, 170.1, 170.4, 171.2, 171.5, 171.9, 172.2, 172.4, 173.7.
シグナルの割当ては、文献に記載の割当てに従い実施した (T. Kato, H. Hinoo, Y. Terui, J. Antibiot., 1988, 61, 719-725）。
【００６７】
実施例２および実施例３
Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−［（３Ｒ）−Ｌｅｕ（３−ＯＨ）］−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−ａＴｈｒ−Ｇｌｙ−［（３Ｓ）−３−Ａｓｎ（３−ＯＨ）］−Ｓｅｒ−トリフルオロアセテート（ジヒドロリソバクチン）および
Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ（３−シクロヘキシル）−［（３Ｒ）−Ｌｅｕ（３−ＯＨ）］−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−ａＴｈｒ−Ｇｌｙ−［（３Ｓ）−３−Ａｓｎ（３−ＯＨ）］−Ｓｅｒ−トリフルオロアセテート（オクタヒドロリソバクチン）
【化４】
2008529970.tif 000006
【００６８】
水素化方法１：
実施例１の化合物（リソバクチン、２５０ｍｇ、１７０μｍｏｌ）を、イソプロパノール／水（２：１、６０ｍｌ）に溶解し、１ａｔｍの水素下、Ｐｄ（１０％、炭素上）２００ｍｇの存在下で水素化する。ＬＣ−ＭＳ（方法１）を利用して反応過程を追跡する。実質的に完全な変換の後（＞９５％）、触媒を濾過し、イソプロパノールで洗浄し、濾液を凍結乾燥する。この粗生成物中、ＬＣ−ＭＳによると、生成物は以下の通りに分布している：ジヒドロリソバクチン約７４％、オクタヒドロリソバクチン約１２％。残渣をＨＰＬＣ（方法２）により精製する。適する画分の凍結乾燥後、純粋な化合物実施例２を得る（８１.５ｍｇ、理論値の３１％）。
LC-MS: (方法 1): Rt = 1.56 分 ES+: m/z = 1279 [M + H]+, 640.1 [M + 2H]2+; ES-: m/z = 1277 [M - H]-, 638.1 [M - 2H]2-.
ヒドロリソバクチンのペプチド配列について、表１参照。
【００６９】
水素化方法２：
水素圧３ａｔｍ下の水素化により、それ以外は水素化方法１と同一の方法で、ＬＣ−ＭＳにより測定される粗生成物中の以下の分布が得られる：ジヒドロリソバクチン約８０％、オクタヒドロリソバクチン約１７％。ＨＰＬＣ精製（方法２）の後、純粋な化合物実施例２を得る（８６ｍｇ、理論値の３３％）。
【００７０】
水素化方法３：
３ｂａｒ水素での水素化期間を延長して、またはより高い圧力（８０ｂａｒ水素圧まで）を使用して、割合的により多くのオクタヒドロリソバクチンを得ることができる。殆どの場合、ジヒドロ−およびオクタヒドロリソバクチンの粗製混合物を分離せず、直接酵素的切断に使用する。
【００７１】
水素化方法４：
以下の場合でも、化合物オクタヒドロリソバクチンは純粋な形態で単離される：
リソバクチン（実施例１、１.０４ｇ、０.６９ｍｍｏｌ）を、イソプロパノール／水（２：１、９０ｍｌ）に溶解し、３ａｔｍ水素下、７日間、Ｐｄ（１０％、炭素上）２００ｍｇの存在下で水素化する。触媒を濾過し、イソプロパノールで洗浄し、濾液からイソプロパノールをロータリーエバポレーターで除き、次いで凍結乾燥する。この粗生成物中、生成物はＬＣ−ＭＳ（方法１）によると以下の通りに分布している：ジヒドロリソバクチン約６５％、オクタヒドロリソバクチン約３５％。残渣をＨＰＬＣ（方法２、続いて方法３）により精製する。ジヒドロリソバクチン（実施例２）（２８０ｍｇ、理論値の２７％）およびオクタヒドロリソバクチン（実施例３）（２１２ｍｇ、理論値の２０％）を得る。
LC-MS: (方法 1): Rt = 1.63 分 ESIpos.: m/z = 643.3 (100) [M + 2H]2+; ESIneg.: m/z = 1283 [M - H]-, 641.2 [M - 2H]2-.
【００７２】
水素化方法５：
高圧の水素下での水素化の実施例として、４０℃、５０ｂａｒ水素で４日後、ＬＣ−ＭＳ（方法１）によると以下の粗製混合物を得る：ジヒドロリソバクチン４５％およびオクタヒドロリソバクチン４５％。
【００７３】
水素化方法６：
リソバクチンビストリフルオロアセテート（実施例１、５００ｍｇ、０.３３ｍｍｏｌ）を、イソプロパノール／水２：１（３０ｍｌ）に溶解する。アルゴン保護気体雰囲気下、１０パーセントパラジウム／炭素（１００ｍｇ）を添加する。反応混合物を、圧力オートクレーブ中、８０−７０ｂａｒ水素および室温で、４８時間撹拌する（脱気後）。１０％パラジウム／炭素（１００ｍｇ）を再度この反応に添加する。反応混合物を、再度、圧力オートクレーブ中、８０−７０ｂａｒ水素および室温で、４８時間撹拌する（脱気後）。ここで、ＨＰＬＣ（例えば方法４）を利用して、リソバクチンは全く検出できない。反応混合物をガラスフリット（孔サイズ２または３）を通して濾過し、真空で濃縮し、再度メタノール／０.２％氷酢酸に取り、シリンジフィルター（Biotage, PTFE）を通して濾過し、真空で濃縮し、高真空下に乾燥させる。生成物（ジヒドロリソバクチン８０％、オクタヒドロリソバクチン２０％）４９６ｍｇ（定量的）を得る。
【００７４】
水素化方法７：
リソバクチンモノトリフルオロアセテートモノアセテート（５ｍｇ、３.４５μｍｏｌ）を、イソプロパノール（２ｍｌ）、水（０.２５ｍｌ）および酢酸（０.０５ｍｌ）の混合物中で、二酸化白金（２０ｍｇ）の存在下、８０ｂａｒおよび５０℃で水素化する。１７時間後、圧力を緩和し、システムをアルゴンで換気し、マイクロフィルターを利用して懸濁液から触媒を除く。濾液（方法４）のＬＣ−ＭＳ分析は、理論値の７％のオクタヒドロリソバクチン（Ｒｔ＝１.５４分、方法４）を示す。
【００７５】
水素化方法８：
リソバクチンビストリフルオロアセテート（実施例１Ａ、１０ｇ、６.６５ｍｍｏｌ）を、イソプロパノール／水９：２（１１０ｍｌ）に溶解する。アルゴン保護気体雰囲気下、パラジウム／炭素（１０％；５ｇ）を添加する。反応混合物（脱気後）を、圧力オートクレーブ中、水素圧８０−７０ｂａｒ、４０℃で、１２時間撹拌する。パラジウム／炭素（１０％；５ｇ）をこの反応に再度添加する。反応混合物（脱気後）を、圧力オートクレーブ中、水素圧８０−７０ｂａｒ、４０℃で、１２時間再度撹拌する。反応混合物（脱気後）を、圧力オートクレーブ中、水素圧８０−７０ｂａｒ、４０℃で、１２時間もう一度撹拌する。ここで、分析用ＨＰＬＣ（方法１０）を利用してリソバクチンはもはや検出できない。珪藻土を通して反応混合物を濾過し、真空で濃縮し、高真空下で乾燥させる。生成物（ジヒドロリソバクチン６０％、オクタヒドロリソバクチン４０％）９.１７ｇ（理論値の９９％）を得る。
【００７６】
水素化方法９：
リソバクチンビストリフルオロアセテート（実施例１Ａ、５ｇ、３.３２ｍｍｏｌ）を、イソプロパノール／水９：２（１１０ｍｌ）に溶解する。アルゴン保護気体雰囲気下、パラジウム／炭素（１０％；５ｇ）を添加する。反応混合物（脱気後）を、圧力オートクレーブ中、水素圧８０ｂａｒ、４０℃で、１２時間撹拌する。珪藻土を通して反応混合物を濾過し、真空で濃縮し、高真空下に乾燥させる。各回でリソバクチンビストリフルオロアセテート５.０ｇを使用して、水素化をさらに３回繰り返す（全部で４回）。合わせた生成物画分として、生成物（ジヒドロリソバクチン：オクタヒドロリソバクチン、約５：４）１８.２７ｇを得る。
【００７７】
実施例４
ジヒドロリソバクチンのキモトリプシン切断、酵素／基質比１：５０
ジヒドロリソバクチン２００μｇを、メタノール１０μｌに溶解し、次いで切断バッファー（０.１Ｍ炭酸水素アンモニウム／０.５Ｍ尿素ｐＨ８）１９０μｌを添加する。キモトリプシン４μｇ（１：５０）を添加し、反応を３７℃で実施する。３０μｌのアリコートを０、０.５、１、３、６および２４時間後に取り、酵素切断をアセトニトリル／１％ＴＦＡ３０μｌで停止する。ＨＰＬＣ、キャピラリーゾーン電気泳動、配列解析、アミノ酸分析、またはＭＳ研究による分析まで、サンプルを−２０℃で保存する。
キモトリプシン切断生成物のペプチド配列について、表２を参照。
【００７８】
実施例５
オクタヒドロリソバクチンのキモトリプシン切断、酵素基質比１：５０
オクタヒドロリソバクチン２００μｇを、メタノール１０μｌに溶解し、次いで切断バッファー（０.１Ｍ炭酸水素アンモニウム／０.５Ｍ尿素ｐＨ８）１９０μｌを添加する。キモトリプシン４μｇ（１：５０）を添加し、反応を３７℃で実施する。３０μｌのアリコートを、０、０.５、１、３、６および２４時間後に取り、酵素切断をアセトニトリル／１％ＴＦＡ３０μｌで停止する。サンプルを分析するまで−２０℃で保存する。
キモトリプシン切断生成物のペプチド配列について、表２を参照。
【００７９】
実施例６
ジヒドロ−／オクタヒドロリソバクチン混合物の分析的キモトリプシン切断、酵素基質比１：２５
ジヒドロ−（５９％）およびオクタヒドロリソバクチン（３４％）２００μｇを、メタノール１０μｌに溶解し、次いで切断バッファー（０.１Ｍ炭酸水素アンモニウム／０.５Ｍ尿素ｐＨ８）１９０μｌを添加する。キモトリプシン８μｇ（１：２５）を添加し、反応を３７℃で実施する。３０μｌのアリコートを、０、０.５、１、３時間後に取り、酵素切断をアセトニトリル／１％ＴＦＡ３０μｌで停止する。サンプルを分析するまで−２０℃で保存する。
キモトリプシン切断生成物のペプチド配列について、表２を参照。
【００８０】
実施例７
ジヒドロ−／オクタヒドロリソバクチン混合物の分析的キモトリプシン切断、酵素基質比１：４００
ジヒドロ−（５９％）およびオクタヒドロリソバクチン（３４％）１５０μｇをエタノール１５μｌに溶解し、次いで切断バッファー（０.１Ｍ炭酸水素アンモニウム／０.５Ｍ尿素ｐＨ８）１２６μｌを添加する。キモトリプシン０.３８μｇ（９μｌのキモトリプシン溶液水／エチレングリコール／切断バッファー、０.２ｍｇ／ｍｌ；１：４００）を添加し、反応を３７℃で実施する。２５μｌのアリコートを０、０.５、１、３時間後に取り、酵素切断を３０％アセトニトリル／０.１％ＴＦＡ２５μｌで停止する。サンプルを分析するまで−２０℃で保存する。
キモトリプシン切断生成物のペプチド配列について、表２を参照。
【００８１】
実施例８
基質濃度６ｍｇ／ｍｌのジヒドロ−／オクタヒドロリソバクチン混合物の分析的キモトリプシン切断
ジヒドロ−（５９％）およびオクタヒドロリソバクチン（３４％）９００μｇを、メタノール１５μｌに溶解し、次いで切断バッファー（０.１Ｍ炭酸水素アンモニウム／０.５Ｍ尿素ｐＨ８）９９μｌを添加する。キモトリプシン３６μｇ（３６μｌのキモトリプシン溶液水／エチレングリコール１：１、１ｍｇ／ｍｌ；１：２５）を添加し、反応を３７℃で実施する。２５μｌのアリコートを、０、０.５、１、３時間後に取り、酵素切断を３０％アセトニトリル／０.１％ＴＦＡ２５μｌで停止する。サンプルを分析するまで−２０℃で保存する。
キモトリプシン切断生成物のペプチド配列について、表２を参照。
【００８２】
実施例９
溶媒濃度３０％メタノールでのジヒドロ−／オクタヒドロリソバクチン混合物の分析的キモトリプシン切断
ジヒドロ−（５９％）およびオクタヒドロリソバクチン（３４％）１５０μｇを、メタノール４５μｌに溶解し、次いで切断バッファー（０.１Ｍ炭酸水素アンモニウム／０.５Ｍ尿素ｐＨ８）９９μｌを添加する。キモトリプシン６μｇ（６μｌのキモトリプシン溶液水／エチレングリコール１：１、１ｍｇ／ｍｌ；１：２５）を添加し、反応を３７℃で実施する。２５μｌのアリコートを、０、０.５、１、３時間後に取り、酵素切断を３０％アセトニトリル／０.１％ＴＦＡ２５μｌで停止する。サンプルを分析するまで−２０℃で保存する。
キモトリプシン切断生成物のペプチド配列について、表２を参照。
【００８３】
実施例１０
室温で切断するジヒドロ−／オクタヒドロリソバクチン混合物の分析的キモトリプシン切断
ジヒドロ−（５９％）およびオクタヒドロリソバクチン（３４％）２００μｇを、メタノール１０μｌに溶解し、次いで切断バッファー（０.１Ｍ炭酸水素アンモニウム／０.５Ｍ尿素ｐＨ８）１９０μｌを添加する。キモトリプシン８μｇ（８μｌのキモトリプシン溶液水／エチレングリコール１：１、１ｍｇ／ｍｌ；１：２５）を添加し、反応を室温（２０−２５℃）で実施する。３０μｌのアリコートを、０、０.５、１、３、６時間後に取り、酵素切断を３０％アセトニトリル／１％ＴＦＡ３０μｌで停止する。サンプルを分析するまで−２０℃で保存する。
キモトリプシン切断生成物のペプチド配列について、表２を参照。
【００８４】
実施例１１
フラグメント４−１１
［（３Ｒ）−Ｌｅｕ（３−ＯＨ）］−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−ａＴｈｒ−Ｇｌｙ−［（３Ｓ）−３−Ａｓｎ（３−ＯＨ）］−Ｓｅｒトリフルオロアセテート
【化５】
2008529970.tif 000007
【００８５】
基質濃度１ｍｇ／ｍｌのジヒドロリソバクチンの分取的キモトリプシン切断
ジヒドロリソバクチン２ｘ８０ｍｇ（アミノ酸分析により測定される純粋なペプチド３５.３μｍｏｌおよび３３.８μｍｏｌ）を、メタノール各８ｍｌに溶解し、次いで切断バッファー（０.１Ｍ炭酸水素アンモニウム／０.５Ｍ尿素ｐＨ８）各６９ｍｌを添加する。酵素の添加前に、溶液を乾燥キャビネット中で３７℃に温める。キモトリプシン３.２ｍｇ（３.２ｍｌのキモトリプシン溶液水／エチレングリコール１：１、１ｍｇ／ｍｌ；１：２５；事前に３７℃に加熱）を添加し、反応を３７℃で実施する。２００μｌのアリコートを、０.５、１時間後に取り、酵素切断を３０％アセトニトリル／０.１％ＴＦＡ２００μｌで停止する。サンプルをＨＰＬＣにより酵素切断と並行して１５分の内に分析する（保持時間：フラグメント４−１１約３.６分、フラグメント１−３（ＬＬＦ）約９.６分、条件：溶媒Ａ０.１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ６０％アセトニトリル／０.１％ＴＦＡ、グラジエント：０分３０％Ｂ、１０分８０％Ｂ、１１分１００％Ｂ、１２分３０％Ｂ、１５分３０％Ｂ；流速０.７ｍｌ／分、４０℃、ＵＶ検出２１０ｎｍ）。約７０分後に、アセトニトリル３ｍｌおよびＴＦＡ約０.６ｍｌで酵素反応を停止する。溶液のｐＨは、１ないし２である。溶液を分取的に分離するまで−２０℃で保存できる。
【００８６】
フラグメント１−３および４−１１の分取的分離
切断溶液２ｘ約８０ｍｌをフィルター（０.２μｍ）を通して濾過し、次いで合わせる。溶液を各約３８.５ｍｌに４分割し（全部で１５４ｍｌ）、アセトニトリル／ＴＦＡグラジエントを使用して、Source 15RPC カラム（３ｍｌ）で各々をクロマトグラフィーする。条件：溶媒Ａ０.１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ０.１％ＴＦＡ／アセトニトリル；グラジエント：４０分間で０％Ｂから４５％Ｂへ；流速２ｍｌ／分；ＵＶ検出２１０ｎｍ。４回の実行を連続的に行い、画分を同じチューブに集める。得られるクロマトグラムは、同一である。
フラグメント４−１１（Ｒｔ＝約１５分）および１−３（ＬＬＦ）（Ｒｔ＝約２５分）を合わせ、水で１：１に希釈し、次いで凍結乾燥する。
【００８７】
各々のプールのアリコート２００μｌを、アミノ酸分析、分析用ＨＰＬＣ、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、配列解析および質量分析のために別々に凍結乾燥する。
アミノ酸分析によると、フラグメント４−１１の収量は、６８.３μｍｏｌ（理論値の９９％）、フラグメント１−３は６７.４μｍｏｌ（理論値の９８％）である。
【００８８】
実施例１２
１ｍｇ／ｍｌのジヒドロ／オクタヒドロリソバクチン混合物の分取的キモトリプシン切断
バッチ１
ジヒドロ−（５６％）およびオクタヒドロリソバクチン（２１％）２ｘ７００ｍｇ（アミノ酸分析により測定される純粋なペプチドとして存在するジヒドロ−およびオクタヒドロリソバクチン６８２μｍｏｌ）を、メタノール各７０ｍｌに溶解し、次いで切断バッファー（０.１Ｍ炭酸水素アンモニウム／０.５Ｍ尿素ｐＨ８）各６０２ｍｌを添加する。酵素の添加前に、溶液を乾燥キャビネット中で３７℃に温める。キモトリプシン２８ｍｇ（２８ｍｌのキモトリプシン溶液水／エチレングリコール１：１、１ｍｇ／ｍｌ；１：２５；３７℃に事前に加熱）を添加し、反応を３７℃で実施する。２００μｌのアリコートを０.５、１時間後に取り、酵素切断を３０％アセトニトリル／０.１％ＴＦＡ２００μｌで停止する。サンプルをＨＰＬＣにより酵素切断と並行して１５分の内に分析する（保持時間：フラグメント４−１１約３.６分、フラグメント１−３（ＬＬＦ）約９.６分、フラグメント１−３（ＬＬ（３−シクロヘキシル）Ａ）約１１.３分、条件：溶媒Ａ０.１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ６０％アセトニトリル／０.１％ＴＦＡ、グラジエント：０分３０％Ｂ、１０分８０％Ｂ、１１分１００％Ｂ、１２分３０％Ｂ、１５分３０％Ｂ；流速０.７ｍｌ／分、４０℃、ＵＶ検出２１０ｎｍ）。酵素反応を約６０分後にアセトニトリル３０ｍｌおよびＴＦＡ約６ｍｌで停止する。溶液のｐＨは、１ないし２である。溶液を分取的に分離するまで−２０℃で保存できる。
【００８９】
バッチ２
ジヒドロ−（４５％）およびオクタヒドロリソバクチン（４８％）７７５ｍｇ（アミノ酸分析により測定される純粋なペプチドとして存在するジヒドロ−およびオクタヒドロリソバクチン４６８μｍｏｌ）を、メタノール７７.５ｍｌに溶解し、次いで切断バッファー（０.１Ｍ炭酸水素アンモニウム／０.５Ｍ尿素ｐＨ８）６６７ｍｌを添加する。酵素の添加前に、溶液を乾燥キャビネット中で３７℃に温める。キモトリプシン３１ｍｇ（３１ｍｌのキモトリプシン溶液水／エチレングリコール１：１、１ｍｇ／ｍｌ；１：２５；３７℃に事前に加熱する）を添加し、反応を３７℃で実施する。２００μｌのアリコートを、０.５、１時間後に取り、酵素切断を３０％アセトニトリル／０.１％ＴＦＡ２００μｌで停止する。サンプルをＨＰＬＣにより酵素切断と並行して１５分の内に分析する（保持時間：フラグメント４−１１約３.６分、フラグメント１−３（ＬＬＦ）約９.６分、フラグメント１−３（ＬＬ（３−シクロヘキシル）Ａ）約１１.３分）（溶媒Ａ０.１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ６０％アセトニトリル／０.１％ＴＦＡ、グラジエント：０分３０％Ｂ、１０分８０％Ｂ、１１分１００％Ｂ、１２分３０％Ｂ、１５分３０％Ｂ；流速０.７ｍｌ／分、温度：４０℃、ＵＶ検出２１０ｎｍ）。酵素反応を６０分後にアセトニトリル３０ｍｌおよびＴＦＡ約６ｍｌで停止する。溶液のｐＨは、１ないし２であろう。溶液を分取的に分離するまで−２０℃で保存できる。
【００９０】
フラグメント１−３および４−１１の分取的分離
切断バッチ１および２を、フィルター（０.２μｍ）を通して濾過し、次いで合わせる。溶液を数個に分割し、Source 15RPC カラムでアセトニトリル／ＴＦＡグラジエントを使用して各々を上記の通りにクロマトグラフィーする。各実行を連続的に行い、画分を同じチューブに集める。得られるクロマトグラムは同一である。
フラグメント４−１１（Ｒｔ.約１５分）を合わせ、１：１に水で希釈し、次いで凍結乾燥する。
フラグメント４−１１の凍結乾燥後の収量は、１.１ｇ（１０９５μｍｏｌ）である。切断物質の出発量１１５０μｍｏｌに対して、フラグメント４−１１の収率は理論値の９５％である。
【００９１】
実施例１３
基質濃度３ｍｇ／ｍｌのジヒドロ／オクタヒドロリソバクチン混合物の分取的キモトリプシン切断
ジヒドロ−（５２％）およびオクタヒドロリソバクチン（３７％）の混合物２ｘ０.９９５ｇをメタノール各３３ｍｌに溶解し、次いで切断バッファー（０.１Ｍ炭酸水素アンモニウム／０.５Ｍ尿素ｐＨ８）各２５７ｍｌを添加する。酵素の添加前に、溶液を乾燥キャビネット中で３７℃に温める。キモトリプシン３９.６ｍｇ（３９.６ｍｌのキモトリプシン溶液水／エチレングリコール１：１、１ｍｇ／ｍｌ；１：２５；３７℃に事前に加熱する）を添加し、反応を３７℃で実施する。２００μｌのアリコートを、０.５、１時間後に取り、酵素切断を３０％アセトニトリル／０.１％ＴＦＡ２００μｌで停止する。サンプルをＨＰＬＣにより酵素切断と並行して１５分の内に分析する（保持時間：フラグメント４−１１約３.６分、フラグメント１−３（ＬＬＦ）約９.６分、フラグメント１−３（ＬＬ（３−シクロヘキシル）Ａ）約１１.３分）（溶媒Ａ０.１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ６０％アセトニトリル／０.１％ＴＦＡ、グラジエント：０分３０％Ｂ、１０分８０％Ｂ、１１分１００％Ｂ、１２分３０％Ｂ、１５分３０％Ｂ；流速：０.７ｍｌ／分、温度：４０℃、ＵＶ検出２１０ｎｍ）。酵素反応を６０分後にアセトニトリル３０ｍｌおよびＴＦＡ約２.５ｍｌで各々停止する。溶液のｐＨは、１ないし２であろう。溶液を分取的に分離するまで−２０℃で保存できる。
【００９２】
実施例１４
基質濃度５ｍｇ／ｍｌのジヒドロ／オクタヒドロリソバクチン混合物の分取的キモトリプシン切断
ジヒドロ−（約４０％）およびオクタヒドロリソバクチン（約６０％）１０ｇをメタノール２００ｍｌに溶解し、次いで切断バッファー（０.１Ｍ炭酸水素アンモニウム／０.５Ｍ尿素ｐＨ８）１７００ｍｌを添加する。酵素の添加前に溶液を乾燥キャビネット中で３７℃に温める。キモトリプシン４００ｍｇ（１００ｍｌのキモトリプシン溶液水／エチレングリコール１：１、４ｍｇ／ｍｌ；１：２５；３７℃に事前に加熱）を添加し、反応を３７℃で実施する。２００μｌのアリコートを、０.５、１時間後に取り、酵素切断を３０％アセトニトリル／０.１％ＴＦＡ２００μｌで停止する。サンプルをＨＰＬＣにより酵素切断と並行して１５分の内に分析する（保持時間フラグメント４−１１約３.６分、フラグメント１−３（ＬＬＦ）約９.６分、フラグメント１−３（ＬＬＡ（３−シクロヘキシル））約１１.３分）（溶媒Ａ０.１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ６０％アセトニトリル／０.１％ＴＦＡ、グラジエント０分３０％Ｂ、１０分８０％Ｂ、１１分１００％Ｂ、１２分３０％Ｂ、１５分３０％Ｂ；流速０.７ｍｌ／分、温度：４０℃、ＵＶ検出２１０ｎｍ）。酵素反応を６０分後にアセトニトリル７５ｍｌおよびＴＦＡ約１５ｍｌで停止する。溶液のｐＨは１ないし２であろう。溶液を分取的に分離するまで−２０℃で保存できる。
【００９３】
フラグメント４−１１を上記の通りに数回実施する分取用ＨＰＬＣにより単離する。
使用するキモトリプシンバッチの活性（７０Ｕ／ｍｇ）を、タンパク質インターロイキン−４二重変異タンパク質Ａｒｇ（１２１）→Ａｓｐ（１２１）／Ｔｙｒ（１２４）→Ａｓｐ（１２４）（BAYER Healthcare AG, D-Wuppertal）を使用する対照の切断により確認する。
【００９４】
実施例１５
ジヒドロリソバクチンのサブチリシン切断
ジヒドロリソバクチン２００μｇを、メタノール１０μｌに溶解し、次いで切断バッファー（０.１Ｍ炭酸水素アンモニウム／０.５Ｍ尿素ｐＨ８）１９０μｌを添加する。サブチリシン４μｇ（１：５０）を添加し、反応を３７℃で実施する。３０μｌのアリコートを、０、０.５、１、３、６および２４時間後に取り、酵素切断をアセトニトリル／１％ＴＦＡ３０μｌで停止する。サンプルを分析するまで−２０℃で保存する。
サブチリシン切断生成物のペプチド配列について、表３を参照。
【００９５】
実施例１６
オクタヒドロリソバクチンのサブチリシン切断
オクタヒドロリソバクチン２００μｇをメタノール１０μｌに溶解し、次いで切断バッファー（０.１Ｍ炭酸水素アンモニウム／０.５Ｍ尿素ｐＨ８）１９０μｌを添加する。サブチリシン４μｇ（１：５０）を添加し、反応を３７℃で実施する。３０μｌのアリコートを０、０.５、１、３、６および２４時間後に取り、酵素切断をアセトニトリル／１％ＴＦＡ３０μｌで停止する。サンプルを分析するまで−２０℃で保存する。
サブチリシン切断生成物のペプチド配列について、表３を参照。
【００９６】
使用するサブチリシンバッチの活性（約１２Ｕ／ｍｇ）を、タンパク質インターロイキン−４二重変異タンパク質Ａｒｇ（１２１）→Ａｓｐ（１２１）／Ｔｙｒ（１２４）→Ａｓｐ（１２４）（BAYER Healthcare AG, D-Wuppertal）を使用する対照の切断により確認する。
【００９７】
実施例１７
ジヒドロリソバクチンのサーモリシン切断
ジヒドロリソバクチン２００μｇをメタノール１０μｌに溶解し、次いで切断バッファー（０.１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／５ｍＭ塩化カルシウムｐＨ７.４５）１９０μｌを添加する。サーモリシン４μｇ（１：５０）を添加し、反応を３７℃で実施する。３０μｌのアリコートを、０、０.５、１、３、６および２４時間後に取り、酵素切断をアセトニトリル／１％ＴＦＡ３０μｌで停止する。サンプルを分析するまで−２０℃で保存する。
サーモリシン切断生成物のペプチド配列について、表４を参照。
【００９８】
実施例１８
オクタヒドロリソバクチンのサーモリシン切断
オクタヒドロリソバクチン２００μｇをメタノール１０μｌに溶解し、次いで切断バッファー（０.１Ｍ炭酸水素アンモニウム／０.５Ｍ尿素ｐＨ８）１９０μｌを添加する。サーモリシン４μｇ（１：５０）を添加し、反応を３７℃で実施する。３０μｌのアリコートを、０、０.５、１、３、６および２４時間後に取り、酵素切断をアセトニトリル／１％ＴＦＡ３０μｌで停止する。サンプルを分析するまで−２０℃で保存する。
サーモリシン切断生成物のペプチド配列について、表４を参照。
【００９９】
使用するサーモリシンバッチの活性（約５５Ｕ／ｍｇ）を、タンパク質インターロイキン−４二重変異タンパク質Ａｒｇ（１２１）→Ａｓｐ（１２１）／Ｔｙｒ（１２４）→Ａｓｐ（１２４）（BAYER Healthcare AG, D-Wuppertal）を使用する対照の切断により確認する。
【０１００】
実施例１９
ジヒドロリソバクチンのパパイン切断
ジヒドロリソバクチン２００μｇをメタノール１０μｌに溶解し、次いで切断バッファー（０.１Ｍリン酸ナトリウム／１０ｍＭシステイン、２ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ６.５）１９０μｌを添加する。パパイン４μｇ（１：５０）を添加し、反応を３７℃で実施する。３０μｌのアリコートを、０、０.５、１、３、６および２４時間後に取り、酵素切断をアセトニトリル／１％ＴＦＡ３０μｌで停止する。サンプルを分析するまで−２０℃で保存する。
パパイン切断生成物のペプチド配列について、表５を参照。
【０１０１】
実施例２０
オクタヒドロリソバクチンのパパイン切断
オクタヒドロリソバクチン２００μｇをメタノール１０μｌに溶解し、次いで切断バッファー（０.１Ｍリン酸ナトリウム／１０ｍＭシステイン、２ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ６.５）１９０μｌを添加する。パパイン４μｇ（１：５０）を添加し、反応を３７℃で実施する。３０μｌのアリコートを、０、０.５、１、３、６および２４時間後に取り、酵素切断をアセトニトリル／１％ＴＦＡ３０μｌで停止する。サンプルを分析するまで−２０℃で保存する。
パパイン切断生成物のペプチド配列について、表５を参照。
【０１０２】
使用するパパインバッチの活性（約１１Ｕ／ｍｇ）を、タンパク質インターロイキン−４二重変異タンパク質Ａｒｇ（１２１）→Ａｓｐ（１２１）／Ｔｙｒ（１２４）→Ａｓｐ（１２４）（BAYER Healthcare AG, D Wuppertal）を使用する対照の切断により確認する。
【０１０３】
実施例２１
ジヒドロリソバクチンのプロテイナーゼＫ切断
ジヒドロリソバクチン２００μｇをメタノール１０μｌに溶解し、次いで切断バッファー（０.１ＭナトリウムテトラボレートｐＨ９）１９０μｌを添加する。プロテイナーゼＫ４μｇ（１：５０）を添加し、反応を３７℃で実施する。３０μｌのアリコートを、０、０.５、１、３、６および２４時間後に取り、酵素切断をアセトニトリル／１％ＴＦＡ３０μｌで停止する。サンプルを分析するまで−２０℃で保存する。
プロテイナーゼＫ切断生成物のペプチド配列について、表６を参照。
【０１０４】
実施例２２
オクタヒドロリソバクチンのプロテイナーゼＫ切断
オクタヒドロリソバクチン２００μｇを、メタノール１０μｌに溶解し、次いで切断バッファー（０.１ＭナトリウムテトラボレートｐＨ９）１９０μｌを添加する。プロテイナーゼＫ４μｇ（１：５０）を添加し、反応を３７℃で実施する。３０μｌのアリコートを、０、０.５、１、３、６および２４時間後に取り、酵素切断をアセトニトリル／１％ＴＦＡ３０μｌで停止する。サンプルを分析するまで−２０℃で保存する。
プロテイナーゼＫ切断生成物のペプチド配列について、表６を参照。
【０１０５】
使用するプロテイナーゼＫバッチの活性（約３０Ｕ／ｍｇ）を、タンパク質インターロイキン−４二重変異タンパク質Ａｒｇ（１２１）→Ａｓｐ（１２１）／Ｔｙｒ（１２４）→Ａｓｐ（１２４）(BAYER Healthcare AG, D-Wuppertal）を使用する対照の切断により確認する。
【０１０６】
実施例２３
ジヒドロリソバクチンのブロメライン切断
ジヒドロリソバクチン２００μｇをメタノール１０μｌに溶解し、次いで切断バッファー（０.１Ｍリン酸ナトリウム、１０ｍＭシステイン、２ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ６.５）１９０μｌを添加する。ブロメライン４ｇ（１：５０）を添加し、反応を３７℃で実施する。３０μｌのアリコートを、０、０.５、１、３、６および２４時間後に取り、酵素切断をアセトニトリル／１％ＴＦＡ３０μｌで停止する。サンプルを分析するまで−２０℃で保存する。
ブロメライン切断生成物のペプチド配列について、表７を参照。
【０１０７】
実施例２４
オクタヒドロリソバクチンのブロメライン切断
オクタヒドロリソバクチン２００μｇを、メタノール１０μｌに溶解し、次いで切断バッファー（０.１Ｍリン酸ナトリウム、１０ｍＭシステイン、２ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ６.５）１９０μｌを添加する。ブロメライン４μｇ（１：５０）を添加し、反応を３７℃で実施する。３０μｌのアリコートを０、０.５、１、３、６および２４時間後に取り、酵素切断をアセトニトリル／１％ＴＦＡ３０μｌで停止する。サンプルを分析するまで−２０℃で保存する。
ブロメライン切断生成物のペプチド配列について、表７を参照。
【０１０８】
使用するブロメラインバッチの活性（約４Ｕ／ｍｇ）を、タンパク質インターロイキン−４二重変異タンパク質Ａｒｇ（１２１）→Ａｓｐ（１２１）／Ｔｙｒ（１２４）→Ａｓｐ（１２４）(BAYER Healthcare AG, D Wuppertal）を使用する対照の切断により確認する。
【０１０９】
実施例２５
キモトリプシンによるジヒドロリソバクチンの酵素的合成
８００μｇのペプチドＬｅｕ−Ｌｅｕ−ＰｈｅＯＭｅおよび１００μｇのペプチド４−１１を、メタノール２００μｌに溶解し、次いで合成バッファー（０.１ＭナトリウムテトラボレートｐＨ９）２００μｌを添加する。キモトリプシン２４μｇを添加し、反応を３７℃で実施する。３０μｌのアリコートを、０、０.５、１、３、６および２４時間後に取り、合成をアセトニトリル／１％ＴＦＡ３０μｌで停止する。サンプルを分析するまで−２０℃で保存する。
ジヒドロリソバクチンを、ＨＰＬＣおよびＣＺＥを使用して検出する。
【０１１０】
実施例２６
キモトリプシンによるジヒドロリソバクチン誘導体の酵素的合成
８００μｇのペプチドＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＰｈｅＯＭｅを、テトラクロロメタン２００μｌに溶解し、次いで１００μｇのペプチド４−１１を含有する合成バッファー（０.１ＭナトリウムテトラボレートｐＨ９）２００μｌを添加する。キモトリプシン２４μｇを添加し、反応を３７℃で実施する。３０μｌのアリコートを、０、０.５、１、３、６および２４時間後に取り、合成をアセトニトリル／１％ＴＦＡ３０μｌで停止する。サンプルを分析するまで−２０℃で保存する。
ジヒドロリソバクチン誘導体をＨＰＬＣおよびＣＺＥにより検出する。
【０１１１】
実施例２７
キモトリプシンによるオクタヒドロリソバクチンの酵素的合成
８００μｇのペプチドＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ（３−シクロヘキシル）ＯＭｅおよび１００μｇのペプチド４−１１を、メタノール２００μｌに溶解し、次いで合成バッファー（０.１ＭナトリウムテトラボレートｐＨ９）２００μｌを添加する。キモトリプシン２４μｇを添加し、反応を３７℃で実施する。３０μｌのアリコートを、０、０.５、１、３、６および２４時間後に取り、合成をアセトニトリル／１％ＴＦＡ３０μｌで停止する。サンプルを分析するまで−２０℃で保存する。
オクタヒドロリソバクチンをＨＰＬＣおよびＣＺＥにより検出する。
【０１１２】
実施例２８
Ｎ末端配列解析
３ｎｍｏｌのフラグメントを６０％アセトニトリル／０.１％ＴＦＡに溶解し、Polybren（登録商標）で事前にインキュベートした配列決定装置のシートに負荷する。通常の配列決定装置のサイクルを使用して、タンパク質を配列決定する。４０ｐｍｏｌのＰＴＨ標準を使用するオンラインＨＰＬＣを利用して、ＰＴＨ−アミノ酸を同定する。非タンパク質構成アミノ酸を、標準的アミノ酸に対するそれらの相対的位置により同定する。ペプチドの純度を第１ＰＴＨサイクルのアミノ酸から見積もる。様々なペプチドを４ないし１２の段階で配列決定する。表１ないし７は、決定されたタンパク質配列を示す。
【０１１３】
表１：基質のペプチド配列
【表２】
2008529970.tif 000008
【０１１４】
表２：キモトリプシン切断の様々なペプチド（１−３）またはペプチドフラグメント（１−３）の配列解析
【表３】
2008529970.tif 000009
＊ＰＴＨＡｌａ（３−シクロヘキシル）は、使用したＰＴＨシステムではピークとして検出可能ではない。
【０１１５】
表３：ジヒドロ−およびオクタヒドロリソバクチン（１−４）のサブチリシン切断の様々なペプチドおよびペプチドフラグメントの配列解析。切断生成物４−１０は、大部分が２４時間後に漸く形成される。
【表４】
2008529970.tif 000010
＊ＰＴＨＡｌａ（３−シクロヘキシル）は、使用したＰＴＨシステムではピークとして検出可能ではない。
【０１１６】
表４：ジヒドロ−およびオクタヒドロリソバクチン（１−３）のサーモリシン切断の様々なペプチドおよびペプチドフラグメントの配列解析
【表５】
2008529970.tif 000011
＊ＰＴＨＡｌａ（３−シクロヘキシル）は、使用したＰＴＨシステムではピークとして検出可能ではない。
【０１１７】
表５：ジヒドロ−（１,２,３,４）およびオクタヒドロリソバクチン（１,２,３,５）のパパイン切断の様々なペプチドおよびペプチドフラグメントの配列解析。切断生成物４−１０は、２４時間後にのみ大量に形成される。
【表６】
2008529970.tif 000012
＊ＰＴＨＡｌａ（３−シクロヘキシル）は、使用したＰＴＨシステムではピークとして検出可能ではない。
【０１１８】
表６：ジヒドロ−（１,２）およびオクタヒドロリソバクチン（３,４）のプロテイナーゼＫ切断の様々なペプチドおよびペプチドフラグメントの配列解析
【表７】
2008529970.tif 000013
【０１１９】
表７：鎖式リソバクチン（１,４）、ジヒドロ−（２,４）およびオクタヒドロリソバクチン（３,４）のブロメライン切断の様々なペプチドおよびペプチドフラグメントの配列解析
【表８】
2008529970.tif 000014
＊ＰＴＨＡｌａ（３−シクロヘキシル）は、使用したＰＴＨシステムではピークとして検出可能ではない。
【０１２０】
実施例２９
アミノ酸分析
アミノ酸分析は、タンパク質の特徴解析に重要な定性的かつ定量的なパラメーターである。タンパク質含有量に加えて、既知の一次構造の場合、個々のアミノ酸の数が測定される。リソバクチン誘導体およびペプチドフラグメントのアミノ酸分析は、一次構造からの理論値と良好に一致する（表８）。非タンパク質構成アミノ酸は、対応する標準の存在下でのみ定量される。
【０１２１】
リソバクチン誘導体およびペプチドフラグメント１００μｇを、６Ｎ塩酸２００μｌに溶解し、１６６℃で１時間加水分解する。サンプル約５ｎｍｏｌをアミノ酸分析装置に導入する。アミノ酸の量を４ｎｍｏｌアミノ酸標準により測定する。
【０１２２】
表８：ジヒドロ−、オクタヒドロリソバクチン、ジヒドロ−＋オクタヒドロリソバクチン、フラグメント４−１１および１−３のアミノ酸分析。整数は、Ｉｌｅ＝１またはＬｅｕ＝２に基づく。
【表９】
2008529970.tif 000015
【０１２３】
実施例３０
逆相クロマトグラフィー
化学的に結合した逆相上のタンパク質のＨＰＬＣクロマトグラフィーにおいて、使用する相への結合は、タンパク質の疎水性相互作用を介して形成される。固定相へのそれらの結合の強度に応じて、ペプチドは有機溶媒（移動相）により置き換えられる。この理由で、この方法は、ペプチドの純度を評価し、酵素的切断の速度および得られる切断生成物を監視するのに良い基準である。ペプチドのジヒドロリソバクチンおよびオクタヒドロリソバクチンは、ＲＰ−１８相から約３５分および約３８分で、フラグメント４−１１は約１６分で、１−３（ＬＬＦ）は約３１分で、そして１−３（ＬＬＡ（３−シクロヘキシル））は約３７分で溶離する。図１は、キモトリプシンによる分取的酵素的切断（実施例１１）の時間経過を示す。
【０１２４】
約２０μｇの酵素的切断の生成物および出発化合物ジヒドロリソバクチンおよびオクタヒドロリソバクチンまたはそれらの混合物を、Zorbax 300SB-C18 カラム（４.６ｍｍｘ１５０ｍｍ；３.５μｍマテリアル；３００Å孔直径）でクロマトグラフィーする。使用する溶離剤は、アセトニトリル／ＴＦＡグラジエントである。条件：溶媒Ａ０.１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ６０％アセトニトリル／０.１％ＴＦＡ；流速０.７ｍｌ／分、カラム温度４０℃、ＵＶ検出２１０ｎｍ、溶媒Ａ０.１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ０.１％ＴＦＡ／６０％アセトニトリル；グラジエント：０分０％Ｂ、２分１０％Ｂ、５０分８０％Ｂ、５２分１００％Ｂ、５５分０％Ｂ、６０分０％Ｂ。
【０１２５】
実施例３１
キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）
キャピラリー電気泳動は、電場における電荷に基づくペプチドおよびタンパク質の分離を可能にする。分離の質は、使用するバッファー、ｐＨ、温度および添加物に依存する。使用するキャピラリーは、内直径５０−１００μｍを有するいわゆる融合シリカカラムである。この方法は、ペプチドの純度の評価および酵素的切断生成物の形成の監視のために非常に良い基準である。ペプチドのジヒドロリソバクチンおよびオクタヒドロリソバクチンは、キャピラリーカラムから約２１分で、フラグメント４−１１は約１８分で、１−３（ＬＬＦ）は約２４分で、１−３（ＬＬＡ（３−シクロヘキシル））は約２２分で、脱アミド形態は２つのピークとして約３０分（１−１１）および２４分（４−１１）で溶離する。図２は、オクタヒドロリソバクチンのキモトリプシンによる酵素的切断（実施例５）の時間経過を示す。バッファー中で２４時間後に、脱アミド生成物の大幅な増加が明確に見られる。
【０１２６】
約４ｎｇの酵素的切断生成物または出発化合物ジヒドロリソバクチンおよびオクタヒドロリソバクチン、または混合物を、ガラスカラム（長さ７２ｃｍ、内直径５０μｍ）のキャピラリー電気泳動を利用して調査する。条件：電流９０μＡ、カラム温度２５℃、１００ｍＭリン酸バッファーｐＨ３.０、ＵＶ検出２１０ｎｍ、３秒かけて加圧負荷。
【０１２７】
実施例３２
ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳにより決定される分子量
ペプチドおよび酵素的切断の生成物を、ＲＰ−１８−ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより分離し、電子スプレーイオン化法（ＥＳＩ）により分子量を決定する。
【０１２８】
ジヒドロリソバクチンとオクタヒドロリソバクチンの混合物のキモトリプシン切断物約１００μｇを、Zorbax C18-HPLC カラムで以下の条件下で分離する：溶媒Ａ０.１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ６０％アセトニトリル／０.１％ＴＦＡ；流速０.７ｍｌ／分、カラム温度４０℃、ＵＶ検出２１０ｎｍ、溶媒Ａ０.１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ０.１％ＴＦＡ／６０％アセトニトリル；グラジエント：０分０％Ｂ、２分１０％Ｂ、５０分８０％Ｂ、５２分１００％Ｂ、５５分０％Ｂ、６０分０％Ｂ。ペプチドを質量分析機の大気圧イオン源に移し、そこでイオン化する。そこからイオンを質量分析機の高真空領域に移し、検出する。表９は、測定された分子量を示す。
【０１２９】
表９：理論上の分子量（ＭＷ）と比較した、ジヒドロリソバクチン、オクタヒドロリソバクチンおよび酵素的切断生成物の分子量（ダルトン）。
【表１０】
2008529970.tif 000016
【０１３０】
実施例３３
混合物ジヒドロ／オクタヒドロリソバクチンの分取的キモトリプシン切断
ジヒドロ−およびオクタヒドロリソバクチン（約５：４）１８.２７ｇを、メタノール３６５ｍｌに溶解し、キモトリプシン（７３１ｍｇ）および切断バッファーで３６５４ｍｌに希釈する。反応を３０分間３７℃で実施し、次いでＴＦＡ２０ｍｌおよびアセトニトリル１５０ｍｌで停止する。酵素の添加前に、溶液を乾燥キャビネット中で３７℃に温める。２００μｌのアリコートを、０および０.５時間後に取り、酵素切断を０.１％ＴＦＡを含む３０％アセトニトリル／７０％水２００μｌで停止する。サンプルをＨＰＬＣにより分析する（保持時間；フラグメント４−１１約３.６分、フラグメント１−３（ＬＬＦ）約９.６分、フラグメント１−３（ＬＬ（ヘキサヒドロ）Ｆ）約１１.３分）（溶離剤Ａ：０.１％ＴＦＡを含む水、溶離剤Ｂ：０.１％ＴＦＡを含む６０％アセトニトリル／４０％水、グラジエント：０分３０％Ｂ、１０分８０％Ｂ、１１分１００％Ｂ、１２分３０％Ｂ、１５分３０％Ｂ；流速：０.７ｍｌ／分、カラム温度：４０℃、検出：２１０ｎｍ）。あるいは、方法１１を使用する。溶液を９ｘ５００ｍｌの部分に分割し、分取的ＲＰ分離まで、−７０℃で冷凍する。フラグメント４−１１を分取用ＨＰＬＣにより数回の実行で単離する。
【０１３１】
フラグメント１−３および４−１１の分取的分離：
約８００ｍｌの切断溶液を、カートリッジ（０.２μｍ）を通して濾過し、約４００ｍｌずつ２つに分けて、メタノール／ＴＦＡグラジエントを使用して Source 15 RPC カラム（カラムサイズ：２３６０ｍｌ）でクロマトグラフィーする。溶離剤Ａ：０.１％ＴＦＡを含む水、溶離剤Ｂ：０.１％ＴＦＡを含む１００％メタノール；流速：３０ｍｌ／分；検出２１５ｎｍ。グラジエントをカラム容積に従って実施する：適用後、カラムをカラム体積の３.６倍の溶離剤Ａで洗浄し、次いでカラム体積の１８倍で４５％Ｂとし、カラム体積の０.６７倍で１００％Ｂとし、カラム体積の１.３倍の１００％Ｂ、０.６７倍で０％Ｂとし、平衡化のためにカラム体積の７倍の溶離剤Ａ。
１０.３６ｇ（理論値の７７％）のフラグメント４−１１を、生成物として得る。
HPLC/UV-Vis (方法 4): Rt = 0.5 分
LC-MS (方法 1): Rt = 1.0 分;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 453.6 (100) [M + 2H]2+, 906 (10) [M + H]+.
MS (ESIneg.): m/z (%) = 904 (100) [M - H]-.
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】図１は、キモトリプシンによる分取的酵素的切断（実施例１１）の時間経過である。ジヒドロ−およびオクタヒドロリソバクチンの混合物のキモトリプシンによる分取的酵素的切断のＨＰＬＣ図の重ね書き。分離条件は、実施例３０の説明で報告する通りである（ＵＶ検出２１０ｎｍ）。
【図２】図２は、キモトリプシンによるオクタヒドロリソバクチンの酵素的切断（実施例５）の時間経過である。オクタヒドロリソバクチンのキモトリプシンによる酵素的切断のＣＺＥ図の重ね書き。分離条件は、実施例３１の説明で報告する通りである（ＵＶ検出２１０ｎｍ）。
【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年4月28日(2008.4.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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