(57)【要約】ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)から得られたS-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼ、それをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞、ならびに該宿主細胞を培養してトリメチルリジンを生産する方法を提供する。2008544752.tif 000004
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
L-リジンから6-N-トリメチルリジンの生成を触媒する配列番号:2のアミノ酸配列を有するS-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項２】
配列番号:2のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号:1のヌクレオチド配列を有する、請求項2記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項2または3記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５】
請求項2記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項６】
大腸菌BL21(DE3) CJ2004-1(アクセッション番号KCCM-10637)である、請求項5記載の宿主細胞。
【請求項７】
請求項5または6記載の宿主細胞をリジン存在下で培養する段階を含むトリメチルリジンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニューロスポラ・クラッサ由来のS-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼ(LMT)、それをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞、ならびに前記宿主細胞を培養してトリメチルリジンを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
L-カルニチン(3-ヒドロキシ-4-トリメチルアミノブチレート)は、生物体内に通常的に存在し、活性化した長鎖脂肪酸をミトコンドリア内膜を横切ってミトコンドリアマトリックスに伝達する化合物であって、両性化合物である。生体内でL-カルニチンは、リジンまたは蛋白質内のリジンから合成されると知られている。哺乳動物では、一般的に、蛋白質リジンがL-カルニチン生合成の前駆体として使われるが、ニューロスポラ・クラッサは、遊離リジンを使用することが特徴である。L-カルニチン生合成過程で、ε-N,N,N-トリメチルリジン、ε-N,N,N-トリメチル-β-ヒドロキシルリジン、N,N,N-トリメチルアミノブチルアルデヒド中間体、及びγ-ブチロベタインが形成され、γ-ブチロベタインは、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼによってヒドロキシル化してL-カルニチンになると推定されている。
【０００３】
このような従来の技術によっても、ニューロスポラ・クラッサにおいて、遊離リジンからL-カルニチンを生合成する過程において、第1段階反応であるL-リジンのε-N,N,N-トリメチルリジンへの転換に関与する酵素は、知られていない。前記酵素は、遊離リジンからのL-カルニチンの生産において、有用に使われる。
【０００４】
これにより、本発明の発明者らは、低コストの前駆体を利用して、L-カルニチンの生産効率の高い微生物を製作しようと努力している中、ニューロスポラ・クラッサ由来のL-リジンを6-N-トリメチルリジンに転換する活性を有する蛋白質及び遺伝子を見出し、本発明を完成した。
【発明の開示】
【０００５】
発明の詳細な説明
技術的課題
本発明の目的は、ニューロスポラ・クラッサ由来のL-リジンを6-N-トリメチルリジンに転換する活性を有する蛋白質及びそれをコードする遺伝子を提供することである。
【０００６】
本発明の他の目的は、前記遺伝子を含むベクター及び宿主細胞を提供することである。
【０００７】
本発明のさらに他の目的は、前記宿主細胞を培養してトリメチルリジンを生産する方法を提供することである。
【０００８】
技術的解決方法
本発明の一つの局面に従い、配列番号:2のアミノ酸配列を有し、S-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質が提供される。
【０００９】
本発明の蛋白質は、ニューロスポラ・クラッサから由来したものであって、配列番号:2のアミノ酸配列を有し、S-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼ活性を有する。本発明において、S-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼ活性とは、L-リジンを基質として、トリメチルリジンを形成する反応を触媒することを意味する。
【００１０】
本発明の別の局面に従い、配列番号:2のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが提供される。前記ポリヌクレオチドの例には、配列番号:1のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。
【００１１】
本発明の別の局面に従い、配列番号:2のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。本発明において、「ベクター」とは、前記ポリヌクレオチドを運搬できる媒介体の役割を行える核酸構造体を称す。前記ベクターには、プラスミド由来ベクター及びウイルス由来ベクターのように、生物体内で複製されるだけでなく、複製性のない核酸構造体も含まれる。したがって、本発明において、「プラスミド」、「ベクター」及び「カセット」は、相互交換可能に使われる。また、前記ベクターには、プロモータ、オペレータ、mRNAリボソーム結合部位及び転写/翻訳信号のような遺伝子の発現調節配列及び遺伝子操作を容易にする配列が含まれる。
【００１２】
本発明の別の局面に従い、配列番号:2のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。前記宿主細胞は、エシェリキア属に属する微生物が望ましく、さらに好ましくは、大腸菌BL21(DE3) CJ2004-1(アクセッション番号KCCM-10637)である宿主細胞である。
【００１３】
本発明の別の局面に従い、配列番号:2のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を遊離リジン存在下で培養する段階を含むトリメチルリジンの製造方法が提供される。本発明において、前記宿主細胞は、BL21(DE3) CJ2004-1(アクセッション番号KCCM-10637)であることが望ましい。培養は、選択される宿主細胞によって通常使われる適した培地及び培養条件でなされる。本発明の方法において、前記宿主細胞を培養して細胞内または培養液中にS-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼを生産し、それにより、リジンをトリメチルリジンに転換する。本発明の方法は、生成されたトリメチルリジンを細胞内またはインビトロでL-カルニチンの生合成に関連する酵素と反応させることによって、最終的にL-カルニチンの生成に使われる。生成されるL-カルニチンは、当業者に公知の通常的な方法によって精製される。
【００１４】
効果
本発明の態様によるS-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼは、インビトロで及びインビボで遊離リジンをトリメチルリジンに転換しうる。
【００１５】
本発明の態様による遺伝子は、S-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼをコードでき、本発明の態様によるベクター及び宿主細胞は、S-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼを発現できて、遊離リジンをトリメチルリジンに転換する方法に有用に使われる。
【００１６】
本発明の方法によれば、遊離リジンからトリメチルリジンを生産しうる。
【００１７】
最良の形態
以下、本発明を実施例を通じてさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１８】
実施例
実施例1：ニューロスポラ・クラッサ由来のS-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼ蛋白質の分離及び機能の確認
ニューロスポラ・クラッサを培養して細胞を回収した。その後、2mMのDTTと0.2mMのEDTAが含まれた1Mのリン酸カリウムバッファpH7.4を利用して細胞を溶解し、蛋白質を抽出した。得られた上清に最終飽和濃度が50％となるように硫酸アンモニウムを徐々に添加して蛋白質を沈殿させた後、遠心分離して沈殿された蛋白質に少量の0.1Mリン酸カリウムバッファpH7.4を添加した。前記溶液に対してT1透析膜を利用して脱塩させた。脱塩された試料をDEAEカラムを利用して精製した。このとき、洗浄バッファとしては、0.1Mリン酸カリウムバッファpH7.4を利用し、溶出バッファとして0.3MのNaClを含む0.1Mリン酸カリウムバッファpH7.4を利用して溶出溶液をプールした。次いで、その結果得られた試料を、T1透析膜を利用して脱塩させた。脱塩された試料をCMカラムを利用して精製した。カラムの洗浄バッファは、0.1Mリン酸カリウムバッファpH7.4を利用し、このとき、カラムに吸着されずに流出された試料をいずれもプールした。
【００１９】
前記蛋白質試料を再びDEAEカラムにロードした後、0.1Mリン酸カリウムバッファpH7.4を利用して、NaCl濃度が0〜0.3Mとなるように濃度勾配溶出を実施した。これにより、精製された試料を天然PAGE及びSDS-PAGEを利用して蛋白質分析を行った。
【００２０】
図1は、ニューロスポラ・クラッサ培養物を溶解し、前記のような精製過程を経ってDEAEカラムクロマトグラフィを行った後、得られた溶出液を天然PAGEまたはSDS-PAGE分析した結果を示す図面である。図1Aで、レーン1はマーカを表し、レーン2及びレーン3はDEAE溶出ピーク2を天然-PAGE分析した結果、レーン4及びレーン5はDEAE溶出ピーク3を天然-PAGE分析した結果を表す。図1Bでレーン1はマーカーを表し、レーン2はDEAE溶出ピーク2を天然-PAGE分析した結果、レーン3はDEAE溶出ピーク3を天然-PAGE分析した結果、レーン4及びレーン5はDEAE溶出ピーク2をSDS-PAGE分析した結果、レーン6及びレーン7はDEAE溶出ピーク3をSDS-PAGE分析した結果を表す。
【００２１】
図1の結果から、バンドa、b及びcをLMT候補蛋白質に選定し、各蛋白質の活性を測定した。まず、各バンドに該当するゲルを切り取ってホモジナイザで細かく破砕した後、1g/Lリジン5ml(最終濃度500mg/L)及び1g/Lメチル供与体であるS-アデノシルメチオニン2mlを添加して28℃で24時間徐々に攪拌しつつ、反応させた後、HPLCを利用してトリメチルリジンピークを分析した。
【００２２】
図2は、蛋白質バンドa、b及びcをリジン及びS-アデノシルメチオニンと共に反応させた後、トリメチルリジンをHPLCを通じて測定した結果を示すグラフである。図2に示したように、バンドaと反応させた試料で滞留時間15分近くでトリメチルリジンと推定されるピークを確認した。図2で、1、2及び3は、それぞれバンドa、b及びcに対応する結果を表す。前記バンドをさらに正確に確認するために、バンドaと反応させて得られた試料とトリメチルリジン標準品とを比較した。
【００２３】
図3は、バンドaと反応させて得られた試料とトリメチルリジン標準品とをHPLCを通じて分析した結果を示す図面である。図3に示したように、バンドaと反応させて得られた試料とトリメチルリジン標準品とは、正確に一致した。したがって、バンドaは、S-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼ(LMT)を含んでいるということを確認した。図3で、1及び2は、それぞれ標準品及びバンドaに対応する結果である。図2及び3のグラフは、別のHPLCグラフを一つのグラフで表示したものである。
【００２４】
次いで、LMT蛋白質のアミノ酸配列を確保するために、N末端配列を分析した。まず、SDS-PAGEゲルにある蛋白質をPVDF膜に伝達し、蛋白質バンドを切断し、エドマン方法を通じてN末端配列を分析した。具体的に、フェニルイソチオシアネート(PTC)をpH8〜9、室温でペプチドと反応させれば、N末端がチオカルバミル化したPTC-ペプチドを得、これを酸性条件下で反応させてN末端アミノ酸のみ遊離させた。遊離されたアミノ酸をアセト酸エチルで抽出してHPLCで同定して分析した。その結果、N末端配列がAFGKL(配列番号:5)であることを確認した。このように、確認されたN末端アミノ酸配列を基に既知のニューロスポラ・クラッサの全ゲノム配列を対象として検索を行った。その結果、前記LMTのN末端配列と一致するアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を有する蛋白質及び遺伝子を確認した。
【００２５】
実施例2：ニューロスポラ・クラッサ由来のLMTをコードする遺伝子の確認
本実施例では、ニューロスポラ・クラッサのcDNAライブラリを製作し、そこからLMTをコードする遺伝子を確認した。
【００２６】
(1)ニューロスポラ・クラッサ由来のcDNAライブラリーの構築
ニューロスポラ・クラッサから分離されたmRNAを鋳型とし、ポリTをプライマーとしたPCRを通じてcDNAを作成した。得られたcDNAは、λAD5クローニングベクターにEcoRI及びXhoIを利用して挿入した。次いで、プラスミドの形状のcDNAプールを獲得するために、次のような過程を行った：大腸菌BNN322菌株をLB Km＋0.2％麦芽糖で一晩培養し、遠心分離を利用して細胞を回収した後、1mlの10mM MgSO4溶液に再懸濁した。再懸濁された細胞をcDNAプールを保有した3.5×107λと共に30℃で30分間、攪拌せずに培養した後、2mlのLB培地を追加し、感染された細菌株を30℃で1時間超、振とう培養した。その結果得られた産物をLB＋アンピシリン(75μl/ml)培地に播種した。生成されたコロニーからプラスミドを分離してcDNAライブラリプールを作った。
【００２７】
(2)S-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼ(LMT)の遺伝子(lmt)確認
実施例1で得られたLMT蛋白質及びその遺伝子の配列情報を利用して、lmt遺伝子を増幅するための配列番号:3及び4のオリゴヌクレオチドで構成されるプライマーセットを設計した。
【００２８】
次いで、cDNAライブラリを鋳型とし、前記プライマーセットをプライマーとしたPCRを通じてS-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼの遺伝子を増幅した。得られたPCR産物をアガロース電気泳動分析した結果、約0.65kbでバンドを確認し、自動塩基配列分析を通じて遺伝子の塩基配列を確認した(配列番号:1)。分析された塩基配列をNCBI BLASTの検索エンジンを利用して、塩基配列上の類似した情報を検索した結果、ニューロスポラゲノム配列で100％同じ遺伝子が検索され、その遺伝子の機能予測は、仮設的蛋白質のみで命名された状態であることを確認した。また、前記遺伝子の配列からS-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を配列番号:2であると推定した。図4は、S-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼ遺伝子のPCR産物をアガロース電気泳動分析した結果を示す図面である。
【００２９】
次いで、前記PCR産物をNdeI及びBamHIで切断して同じ酵素で切断したpUC19に結合して大腸菌DH5αに形質転換し、ブルー/ホワイト検定によって形質転換体を分離し、S-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼの遺伝子が挿入されたプラスミドが存在することを確認した。
【００３０】
実施例3：S-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼの遺伝子の大腸菌での発現
本実施例では、ニューロスポラ・クラッサ由来の前記S-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼの遺伝子を大腸菌で発現するために大腸菌発現用ベクターを製造し、これを大腸菌に導入して前記大腸菌がニューロスポラ・クラッサ由来の前記S-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼの遺伝子を発現するか否かを確認した。
【００３１】
(1)大腸菌発現用ベクターの構築
S-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼの遺伝子の大腸菌発現用pT7-7LMTベクターを構築した。
【００３２】
まず、S-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼの遺伝子が含まれたプラスミドからNdeI及びBamHI制限酵素を利用して切断した後に、低融点アガロースゲルに電気泳動してS-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼ遺伝子のDNAのみを分離精製した。その後、NdeI及びBamHIで処理されたpT7-7にDNAを挿入した(図5)。図5は、pT7-7LMTの構成を示す図面である。結合混合物を大腸菌DH5α菌株に形質転換した後に、アンピシリンが含まれた固体平板培地で形質転換体を分離した。分離された形質転換体からリコンビナントプラスミドを分離し、NdeI及びBamHIで切断した。その結果、S-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼの遺伝子の挿入を確認し、これをpT7-7LMTと命名した。
【００３３】
(2)pT7-7LMTが導入された大腸菌BL21(DE3)の構築
大腸菌BL21DE3でpT7-7 LMTベクターを形質転換した。大腸菌BL21DE3細胞40μlとpT7-7 LMTベクター1μlとを混合して冷たい2mm間隙のキュベットに入れて2.5kV、200Ω、25μFの条件下で電気穿孔法を利用して形質転換させた。得られた形質転換体をアンピシリンが含まれた固体平板培地に塗抹し、そこから選別された形質転換体からプラスミドを精製し、NdeI及びBamHI制限酵素で切断した。結果、挿入された遺伝子とプラスミドのサイズ確認を通じてpT7-7LMTがプラスミドに導入されたことを確認し、BL21(DE3)/pT7-7LMTと命名した。
【００３４】
(3)大腸菌でのS-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼの発現
S-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼの発現を確認するために、大腸菌BL21(DE3)でpT7-7LMTが形質転換されたBL21(DE3)/pT7-7LMTを培養した。50mlのLB培地またはアンピシリンが添加されたLB培地の含まれた250mlバッフルが装着されたフラスコでOD600 0.6まで培養した後、1mMのIPTGを入れて4時間超さらに培養した。4,000×gで15分間遠心分離して細胞を回収した。1mlの溶解溶液(10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.4に140mM NaCl、200g/lグリセロール及び1mM DTT)で細胞を再懸濁した。得られた培養細胞を氷中に浸した後に超音波粉砕機を利用して10秒ずつ5回反復して細胞を破砕した。破砕後に4℃、10,000xgで20〜30分遠心分離して細胞残渣は除去し、上清のみを集めた。SDS-PAGEを行って約25kDのS-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼを確認した(図6)。図6は、ニューロスポラ・クラッサ由来のS-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼを含む大腸菌をIPTG存在下で培養し、そこから得られる菌体を破砕し、上清をSDS-PAGEした結果を示す図面である。
【００３５】
図6で、レーンMはマーカを表し、レーン1は陰性対照群、レーン2及び3は細胞溶解物を表し、レーン2及び3で円で表示した部分は、LMTに該当する25kD位置のバンドを表す。
【００３６】
実施例4：大腸菌BL21(DE3)/pT7-7LMTを利用したトリメチルリジンの構築
実施例2で構築された大腸菌BL21(DE3)/pT7-7LMTを50mlのLB培地またはアンピシリンが添加されたLB培地の含まれた250mlバッフルが装着されたフラスコでOD600 0.6まで培養した後、1mMのIPTGを入れて正確な酵素の3次構造を形成しつつ、封入体の形成を防止するために、28℃で8時間超培養した。培養時に反応液として500mg/L L-リジン、200mg/L S-アデノシルメチオニンを入れ、培養液のトリメチルリジン含量を測定した。その結果を表1に表す。
【００３７】
トリメチルリジンは、次のような条件でHPLCを通じて測定した。カラムは、Supelco社のSUPELCOSIL LC-DABSカラムを使用し、Aバッファとしては、蒸溜水：アセトニトリルが8：2で混合されているバッファに0.1％トリフルオロ酢酸(TFA)を添加し、Bバッファとしては、蒸溜水：アセトニトリルが2：8で混合されているバッファに0.1％TFAを添加して利用した。流速は、0.8ml/分に維持して直線濃度勾配方法を利用して分析した。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
表1に示したように、ニューロスポラ・クラッサ由来のS-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼ遺伝子を大腸菌中で発現させ、そこからL-リジンをトリメチルリジンに転換させることが確認できた。
【００４０】
本実施例で得られた大腸菌BL21(DE3)/pT7-7LMTを、ブダペスト条約に基づく国際寄託機関である韓国微生物保存センター(KCCM)に2004年12月13日に寄託した(寄託名:BL21(DE3)CJ2004-1；アクセッション番号KCCM-10637)。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ニューロスポラ・クラッサ培養物を溶解し、溶解物に対してDEAEカラムクロマトグラフィを行った後、得られた溶出液を天然またはSDS-PAGE分析した結果を示す図面である。
【図２】図1の蛋白質バンドa、b及びcをリジン及びS-アデノシルメチオニンと共に反応させた後、トリメチルリジンをHPLCを通じて測定した結果を示すグラフである。
【図３】リジンをバンドa蛋白質と反応させて得られた試料とトリメチルリジン標準品とをHPLCを通じて分析した結果を示すグラフである。
【図４】S-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼ遺伝子のPCR産物をアガロース電気泳動分析した結果を示す図面である。
【図５】pT7-7LMTの構成を示す図面である。
【図６】ニューロスポラ・クラッサ由来のS-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む大腸菌をIPTG存在下で培養し、そこから得られる菌体を破砕し、上清をSDS-PAGEした結果を示す図面である。
【図１】
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【図２】
2008544752.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2008544752.tif 000010
【配列表】
2008544752000001.app
【国際調査報告】
2008544752.tif 000011
2008544752.tif 000012