(57)【要約】原発性腫瘍細胞に効果的に形質導入するアデノウイルスベクターが提供される。このアデノウイルスベクターは、サブグループＣアデノウイルス線維シャフトの少なくとも一部、および、サブグループＢアデノウイルスまたは血清型３７アデノウイルスヘッドの少なくとも一部を含む、キメラアデノウイルス線維タンパク質を含み、ここで、ヘッド領域はＣＤ４６に結合する。原発性腫瘍細胞において異種核酸を発現させる方法であって、キメラ線維タンパク質を含むアデノウイルスベクターで該原発性腫瘍細胞を形質導入する工程を包含し、該キメラ線維タンパク質は、サブグループＣアデノウイルスシャフト領域の少なくとも一部、およびサブグループＢアデノウイルスのヘッド領域の少なくとも一部を含み、該ヘッド領域はＣＤ４６に結合する、方法。
2008510493.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
原発性腫瘍細胞において異種核酸を発現させる方法であって、キメラ線維タンパク質を含むアデノウイルスベクターで該原発性腫瘍細胞を形質導入する工程を包含し、該キメラ線維タンパク質は、サブグループＣアデノウイルスシャフト領域の少なくとも一部、およびサブグループＢアデノウイルスのヘッド領域の少なくとも一部を含み、該ヘッド領域はＣＤ４６に結合する、方法。
【請求項２】
前記キメラ線維タンパク質は、Ａｄ５またはＡｄ２のシャフトの少なくとも一部、および、Ａｄ３５ヘッドの少なくとも一部を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞はインビトロにおいて形質導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞はインビボにおいて形質導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記キメラ線維タンパク質は、配列番号６のアミノ酸約４６〜１３６を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記キメラ線維タンパク質は、配列番号２のアミノ酸約４７〜３９９または配列番号４のアミノ酸約４７〜３９９を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記キメラ線維タンパク質は、配列番号２のアミノ酸約４７〜３９９または配列番号４のアミノ酸約４７〜３９９を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記原発性腫瘍細胞は、肺腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、頭頸部腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞、および腎臓腫瘍細胞からなる群より選択される細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記原発性腫瘍細胞は、非小細胞肺腫瘍細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記アデノウイルスは、前記原発性腫瘍細胞において優先的に複製する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記アデノウイルスは、複製に必須の少なくとも一つのアデノウイルスコード配列に作動可能に連結された異種転写調節エレメント（ＴＲＥ）を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＴＲＥは、細胞特異的ＴＲＥ、細胞状態特異的ＴＲＥおよび組織特異的ＴＲＥからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＴＲＥは、ＰＳＡ  ＴＲＥ、Ｅ２Ｆ  ＴＲＥ、テロメラーゼ（ＴＥＲＴ）ＴＲＥ、ウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）ＴＲＥ、プロバシンＴＲＥ、チロシナーゼ関連タンパク質−２  ＴＲＥ、ＭＡＲＴ−１  ＴＲＥ、ＣＲＧＬ２  ＴＲＥ、およびＰＲＬ−３タンパク質チロシンホスファターゼＴＲＥからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記アデノウイルスコード配列は、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、およびＥ４からなる群より選択されるアデノウイルスコード領域にある、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記アデノウイルスは、Ｅ１Ｂ  １９−ｋＤａ領域の一部または全部の欠失を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記アデノウイルスは、複製に必須のアデノウイルスコード配列の欠失を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記アデノウイルスは、前記原発性腫瘍細胞において複製不能である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記複製に必須のアデノウイルスコード配列は、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、およびＥ４からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記アデノウイルスは、少なくとも１個のアデノウイルスＥ３コード配列の欠失を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記アデノウイルスＥ３コード配列は、１９Ｋ、１４．７Ｋ、１４．５Ｋ、１２．５Ｋ、１１．６Ｋ、１０．４Ｋ、および６．７ＫのＥ３タンパク質のコード配列からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｅ３コード配列の全てが欠失している、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記アデノウイルスは、１０．４Ｋ、１４．５Ｋ、および１４．７ＫのＥ３コード配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記アデノウイルスは、天然のＥ３コード配列を全て含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記アデノウイルスは、調節エレメントに作動可能に連結されたＧＭ−ＣＳＦコード配列を含み、ＧＭ−ＣＳＦは前記原発性腫瘍細胞において発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＧＭ−ＣＳＦコード配列は、ヒトの配列である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記形質導入された腫瘍細胞を不活性化する工程、および該形質導入された原発性腫瘍細胞を哺乳動物に投与する工程をさらに包含する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記腫瘍細胞は、前記哺乳動物に対して自己の細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記腫瘍細胞は、前記哺乳動物に対して同種異系の細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記哺乳動物は、前記形質導入腫瘍細胞と同じタイプの腫瘍細胞を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記哺乳動物はヒトである、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、２００４年８月２５日出願の米国仮出願第６０／６０４，００９号の優先権の利益を主張する。米国仮出願第６０／６０４，００９号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、キメラ線維タンパク質を含み、非キメラアデノウイルスベクターと比べて、腫瘍細胞、特に、原発性腫瘍細胞への形質導入の強化を示すアデノウイルスベクターに関する。
【背景技術】
【０００３】
（技術の背景）
遺伝子治療は、外因性ヌクレオチド配列を細胞に供給する手段としての機能を果たし、もっとも革新的で強力な可能性がある疾患治療ツールの内、いくつかのツールの基礎である。このアプローチは、がんだけでなく、嚢胞性線維症、貧血症、血友病、糖尿病、ハンティングトン病、ＡＩＤＳ、異常に高い血清コレステロールレベル、特定の免疫不全、および様々な形のがんを含めた他の多くの疾患の処置に大きな可能性を持つ。遺伝子治療は、一般に、外因性配列を細胞に供給するために、送達ビヒクル、例えば、ウイルスベクターに依存する。これらの疾患に対しては、組み換えアデノウイルスベクターが、ある程度の治療効力を示した。概説については、非特許文献１、および非特許文献２を参照のこと。
【０００４】
アデノウイルスベクターには主要な２つのタイプがある。複製不能（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）（複製欠損）型および複製可能型（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）である。伝統的に、複製欠損ベクターは、複製に必須の１種以上の遺伝子を欠く。これらの複製不能ウイルスは、欠けている必須遺伝子を補う細胞において増殖される。インビトロおよびインビボで細胞に形質導入し、各種導入遺伝子を発現させるために、複製不能型アデノウイルスベクターが広く使われている。伝統的に、複製可能型アデノウイルスベクターは、複製に必須のアデノウイルス遺伝子がどれも欠けていないので、特定の細胞において選択的に複製されるように操作され得る。
【０００５】
免疫系は、多種多様ながんの病因において決定的に重要な役割を果たす。がんが進行する場合、免疫系は十分には反応できないか、または適切に反応できず、そのためにがん細胞の増殖を許すと広く考えられている。最近、がんの標準的医療処置（化学療法、手術、放射線療法、および細胞治療が挙げられる）が、効力および毒性の両面において明らかな限界に来ている。今日まで、これらのアプローチは、がんのタイプ、患者の一般的健康状態、診断時における疾患の段階等に応じて程度の差はあれ成功を収めてきた。がんに対する免疫応答の特異的操作を標準的医療処置と組み合わせた改善された戦略は、効力を強化し毒性を下げる手段を提供し得る。
【０００６】
ここしばらくの間、抗腫瘍免疫を増強するためのワクチンとして自己のがん細胞を用いる方法が研究されている（非特許文献３〜５）。
【０００７】
腫瘍に対する免疫応答の調節には数多くのサイトカインが役割を果たしていることが明らかにされている。例えば、特許文献１は、既存の腫瘍と戦うための、相乗的に効果的な量のＴＮＦ、ＩＬ−２、およびＩＦＮ−βの組み合わせの使用を記載する。特許文献２〜特許文献４は、腫瘍の処置のためのＧＭ−ＣＳＦの使用を記載する。しかしながら、サイトカインはしばしば全身毒性であるので、がん治療のためのサイトカインの直接投与は、実用的でない可能性がある（例えば、非特許文献６、および非特許文献７を参照のこと）。
【０００８】
このアプローチを拡張したものとしては、ワクチン部位においてサイトカインを局所的に発現する遺伝子改変された腫瘍細胞の使用が挙げられる。様々な免疫調節性サイトカイン（それぞれ、非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；および非特許文献１９に記載される通り、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−６、および、ＧＭ−ＣＳＦが挙げられる）を用いた腫瘍モデルにおいて活性が証明されている。
【０００９】
ＧＭ−ＣＳＦを発現する自己または同種異系細胞ワクチン（ＧＶＡＸ（登録商標））を用いた臨床試験が、前立腺がん、メラノーマ、肺がん、膵臓がん、腎臓がん、および多発性骨髄腫の処置に関して始まっている（非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４；および非特許文献２５）。
【特許文献１】米国特許第５，０９８，７０２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，０７８，９９６号明細書
【特許文献３】米国特許第５，６３７，４８３号明細書
【特許文献４】米国特許第５，９０４，９２０号明細書
【非特許文献１】Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ  １２：５１９−５２７
【非特許文献２】Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：４９６−５０２
【非特許文献３】Ｏｅｔｔｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」，Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｄｅｖｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（編）Ｊ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ  Ｃｏ．，ｐｐ８７−１９９，１９９１
【非特許文献４】Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，ＴＤ  ａｎｄ  Ｊａｆｆｅｅ  ＥＭ，Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｎ  Ａｍ．１１（３）：６８１−９６，２００２
【非特許文献５】Ｂｏｄｅｙ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０（４）：２６６５−７６，２０００
【非特許文献６】Ａｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：３２２７−３２３４，１９９１
【非特許文献７】Ｈａｖｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：１０６７−１０８５，１９８８
【非特許文献８】Ｇｏｌｕｍｂｅｃｋ  ＰＴ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１３−７１６，１９９１
【非特許文献９】Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１２１７−１２２４，１９９０
【非特許文献１０】Ｆｅａｒｏｎ  ＥＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６０：３９７−４０３，１９９０
【非特許文献１１】Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：７８２０−２５，１９９０
【非特許文献１２】Ｔｅｎｇ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ８８：３５３５−３５３９，１９９１
【非特許文献１３】Ｃｏｌｕｍｂｏ  ＭＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１２９１−１２９８，１９９１
【非特許文献１４】Ａｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９（９）：３８５０−４，１９９２
【非特許文献１５】Ｐｏｒｇａｄｏｒ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎ．１３（２−３）：１１３−３０，１９９４
【非特許文献１６】Ｄｒａｎｏｆｆ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９０：３５３９−３５４３，１９９３
【非特許文献１７】Ｌｅｅ  ＣＴ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：１８７−１９３，１９９７
【非特許文献１８】Ｎａｇａｉ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｏｎｔｈｅｒ．４７：２−８０，１９９８
【非特許文献１９】Ｃｈａｎｇ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１：８３９−８５０、２０００
【非特許文献２０】Ｄｕｍｍｅｒ  Ｒ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  ２（６）：８４４−８，２００１
【非特許文献２１】Ｓｉｍｏｎｓ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５；５９（２０）：５１６０−８，１９９９
【非特許文献２２】Ｓｏｉｆｆｅｒ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９５：１３１４１−１３１４６，１９９８
【非特許文献２３】Ｓｉｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５；５７：１５３７−１５４６，１９９７
【非特許文献２４】Ｊａｆｆｅｅ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．１９：１４５−１５６，２００１
【非特許文献２５】Ｓａｌｇｉａ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２１：６２４−６３０，２００３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
腫瘍細胞に形質導入するために従来からアデノウイルスベクターが使用されているが、原発性腫瘍細胞への形質導入は一般に非効率的であった。従って、腫瘍細胞、特に原発性腫瘍細胞への形質導入の効率の向上が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、キメラ線維タンパク質を有するアデノウイルスを腫瘍細胞に形質導入することによって該腫瘍細胞において異種核酸を発現させるための組成物および方法を提供し、ここで、このキメラ線維タンパク質は、サブグループＢアデノウイルスまたは血清型３７アデノウイルスのヘッドの少なくとも一部、およびサブグループＣアデノウイルスまたはウシアデノウイルスの線維シャフトの少なくとも一部を含む。一つの実施態様では、腫瘍細胞は、インビトロ、エキソビボ、またはインビボにおいて形質導入される。ある好ましい実施態様では、腫瘍細胞は、原発性腫瘍細胞である。
【００１２】
本発明を実施するに際しては、アデノウイルスは、複製可能（すなわち、腫瘍崩壊性）であってもよいし、あるいは複製不能であってもよく、そして、導入遺伝子をコードしてもよいし、またはコードしていなくともよい。
【００１３】
従って、一つの局面では、選択的細胞溶解の方法、すなわち、細胞集団における新生物細胞を殺傷する方法であって、本発明の複製可能ウイルスベクターおよび／またはウイルス粒子の有効量を、該ウイルスベクターおよび／または粒子が新生物細胞において選択的に複製し該新生物細胞を殺傷する条件下で、この細胞集団と接触させることを含む方法が提供される。細胞集団は、インビボ、インビトロ、または、エキソビボの環境に存在し得る。
【００１４】
一つの局面では、本発明は、腫瘍細胞において、導入遺伝子、例えば、サイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ）を発現する方法を提供する。ある好ましい局面では、腫瘍細胞は原発性腫瘍細胞である。さらに、腫瘍ワクチンを作製する方法が提供される。また、本発明の腫瘍ワクチンを哺乳動物に送達する方法も提供される。
【００１５】
本発明は、アデノウイルス粒子であって、標的リガンドがこの粒子のキャプシドタンパク質に含まれるアデノウイルス粒子をさらに提供する。さらなる実施態様では、このキャプシドタンパク質は線維タンパク質であり、リガンドは、この線維タンパク質のＣ末端またはＨＩループにある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、キメラ線維タンパク質を有するアデノウイルスによって腫瘍細胞に形質導入することにより、該腫瘍細胞において異種核酸（例えば、導入遺伝子）を発現させるためのアデノウイルス組成物および方法を提供する。その際、キメラ線維タンパク質は、サブグループＢアデノウイルスまたは血清型３７アデノウイルスのヘッドの少なくとも一部、および、サブグループＣアデノウイルスまたはウシアデノウイルス線維シャフトの少なくとも一部を含む。一つの実施態様では、キメラ線維タンパク質は、Ａｄ５またはＡｄ２シャフトの少なくとも一部、および、Ａｄ３５ヘッドの少なくとも一部を含む。典型的には、腫瘍細胞は原発性腫瘍細胞である。
【００１７】
理論または機構によって縛られることを望むものではないが、本発明は、Ａｄ５またはＡｄ２シャフト（またはテール）領域、およびＡｄ３５ヘッド（ノブ）領域を有するキメラ線維を含むアデノウイルスベクターの方が、Ａｄ２、Ａｄ５、またはＡｄ３５の自然のままの線維を有するものよりも、ある種のがん細胞に対しより効率的に形質導入するという所見に基づく。特に興味あるのは、第１血清型の線維シャフトと第２血清型の線維ヘッドを有するキメラアデノウイルス（例えば、Ａｄ５またはＡｄ２シャフト（テール）、および、サブグループＢアデノウイルスまたは血清型３７アデノウイルスのヘッドを有するアデノウイルス）は、単一血清型の非キメラアデノウイルスよりも効率的に原発性腫瘍細胞に形質導入する能力を持つことである。本発明のキメラアデノウイルスベクターによってより効率的に形質導入される、腫瘍細胞の非限定的例としては、肺腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、頂頸部腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞、および腎臓腫瘍細胞が挙げられる。腫瘍細胞への形質導入は、マーカー遺伝子（例えば、ベータ−ガラクトシダーゼまたはＧＦＰ）の発現によって測定されるが、本発明のアデノウイルスには、任意の導入遺伝子を含めること、および発現させることが可能である。
【００１８】
Ａｄ５はサブグループＣアデノウイルスであり、Ａｄ３５はサブグループＢウイルスである。アデノウイルス血清型３（Ｓｉｒｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００４  Ｍａｙ；７８（９）：４４５４−６２）、１１、１４、１６、２１、３５、３７、および５０と同様、Ａｄ３５線維ヘッド領域はＣＤ４６に結合する。Ａｄ３７は、アデノウイルスサブグループＤに属する。本発明の好ましい実施態様は、サブグループＣアデノウイルス、例えば、Ａｄ２またはＡｄ５の線維シャフト、および、ＣＤ４６に結合する、アデノウイルスのヘッドを有する。
【００１９】
本発明の実施は、別様に指示しない限り、従来技術の能力の範囲にある、化学、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養、およびトランスジェニック生物学の通例の技術を用いる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，定期的な更新を含む）；Ｇｌｏｖｅｒ，１９８５，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）；Ａｎａｎｄ，１９９２，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｆｉｎｋ，１９９１，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｊａｋｏｂｙ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ，１９７９；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；学位論文、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ���，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；Ｒｉｏｔｔ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，  １９８８；Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）。
【００２０】
（定義）
別様に指示しない限り、本明細書で用いる用語は全て、当業者に対する意味と同じ意味を持ち、本発明の実施は、微生物学および組み換えＤＮＡ技術において、当業者の知識の範囲内に含まれる、通例の技術を用いる。
【００２１】
本明細書に引用される出版物およびその他の資料、すなわち、全ての特許、特許出願、公報（公開特許出願を含む）、およびデータベースアクセス番号を含む資料は、本発明の背景、特に、実施に関するさらなる詳細を与える事例を具体的に明らかにするために用いられる。本明細書に引用される出版物およびその他の資料、すなわち、全ての特許、特許出願、公報（公開特許出願を含む）、およびデータベースアクセス番号を含む資料は、参照することにより、それぞれその全体が本明細書に含まれる。
【００２２】
本発明を記述するに際して、下記の用語が用いられるが、後述のように定義されることが意図される。
【００２３】
略語「ｐｆｕ」は、プラーク形成単位を表す。
【００２４】
用語「ウイルス」、「ウイルス粒子」、「ベクター粒子」、「ウイルスベクター粒子」、および「ビリオン」は、相互交換的に用いられ、感染性ウイルス粒子、例えば、本発明のウイルスベクターが、感染性粒子生成のために適切な細胞または細胞株の中に形質導入された場合に形成される、感染性ウイルス粒子を広く意味するものと理解されなければならない。本発明によるウイルス粒子は、インビトロかインビボのいずれかにおいてＤＮＡを細胞に転送するために利用されてもよい。本発明の目的のためには、これらの用語は、アデノウイルス、本発明のアデノウイルスベクターがアデノウイルスキャプシドに被覆された場合に形成される組み換えアデノウイルスを含むアデノウイルスを指す。
【００２５】
本明細書で呼ばれる「アデノウイルスベクター」または「アデノウイルス様ベクター」（相互交換的に使用される）とは、アデノウイルス様ビリオンにパックされるポリヌクレオチド構築物である。いくつかの実施態様では、本発明のアデノウイルス様ベクターは、治療遺伝子配列、例えばサイトカイン遺伝子配列を含む。本発明の、例示のアデノウイルス様ベクターは、ＤＮＡ、アデノウイルスコートに被覆されたＤＮＡ、別のウイルスまたはウイルス様形態（例えば、単純ヘルペス、およびＡＡＶ）にパックされたアデノウイルスＤＮＡ、リポソームに被覆されたアデノウイルスＤＮＡ、ポリリシンと複合体を形成するアデノウイルスＤＮＡ、合成ポリカチオン分子と複合体を形成するアデノウイルスＤＮＡ、トランスフェリンと接合体を形成するアデノウイルスＤＮＡ，または、抗原性を免疫学的に「マスク」するために、および／または、半減期を増すために、ＰＥＧのような化合物と複合体を形成するアデノウイルスＤＮＡ、あるいは、非ウイルス性タンパク質と接合体を形成するアデノウイルスＤＮＡを含むが、ただしこれらに限定されない。
【００２６】
本発明のアデノウイルス様ベクターに関連して、本明細書で用いられる「複製可能」という用語は、本発明のアデノウイルス様ベクターと粒子とは、ある種の細胞または組織では好んで複製するが、別の種類のものではその程度が劣るか、全く複製しないことを意味する。本発明の一つの実施態様では、アデノウイルス様ベクターおよび／または粒子は、腫瘍細胞および／または異常増殖細胞、例えば、固形腫瘍およびその他の新生物において選択的に複製する。そのようなベクターまたは粒子としては、米国特許第５，６７７，１７８、５，６９８，４４３、５，８７１，７２６、５，８０１，０２９、５，９９８，２０５、および６，４３２，７００号、および国際公開ＷＯ９５／１９４３４、ＷＯ９８／３９４６５、ＷＯ９８／３９４６７、ＷＯ９８／３９４６６、ＷＯ９９／０６５７６、ＷＯ９８／３９４６４、およびＷＯ００／１５８２０によって開示されるものが挙げられる。このようなウイルスは、「腫瘍崩壊性ウイルス」または「腫瘍崩壊性ベクター」と呼ばれてもよく、「細胞溶解性」または「細胞病原性」と見なしてもよく、標的細胞の選択的「細胞溶解」を実行すると考えてもよい。
【００２７】
本明細書で用いる「ウイルスベクター」という用語は、従来技術で認知済みの意味に従って使用される。この用語は、ウイルス起源を持つ少なくとも一つの要素を含み、ウイルスベクター粒子にパックされてもよい核酸ベクター構築物を指す。このウイルスベクターおよび／または粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかにおいて、ＤＮＡ、ＲＮＡ，または他の核酸を細胞中に転送する目的のために利用されてもよい。アデノウイルス様ベクターを含む様々な形のウイルスベクターが従来技術で知られる。
【００２８】
あるアデノウイルス様ベクターと関連して使用される場合「由来の」という用語は、そのアデノウイルス様ベクターゲノムと相同の、アデノウイルス血清型を意味する。多くの場合、アデノウイルスゲノムの大部分は一つの血清型から到来するものであり、この場合、アデノウイルスベクターは、一つの血清型由来であると言われる。アデノウイルス様ベクターゲノムが、第２血清型から、ただ一つのアデノウイルスコード配列を持つ場合、このアデノウイルス様ベクターは、第１アデノウイルス血清型からのみ由来すると言われる。
【００２９】
「キメラ線維タンパク質」という用語は、天然の線維アミノ酸配列の一部に加えて、または、一部に代えて、非天然のアミノ酸配列を含むアデノウイルス線維タンパク質を指す。非天然アミノ酸配列は、異なる血清型のアデノウイルス線維タンパク質からのものであってもよい。非点念アミノ酸配列は、適切なものであれば任意の長さを持っていてよい（例えば、３から約２００アミノ酸）。例示の「キメラ線維タンパク質」は、一つのアデノウイルス血清型由来のシャフトと、異なるアデノウイルス血清型由来のヘッドとを持つ。
【００３０】
「ベクター」、「ポリヌクレオチドベクター」、「ポリヌクレオチドベクター構築物」、「核酸ベクター構築物」、および「ベクター構築物」という用語同士は、本明細書では、当業者によって理解されるものと同じ意味で遺伝子転送のための任意の核酸構築物を意味するために相互交換的に使用される。
【００３１】
「複製のために必須の遺伝子」という用語は、ウイルスが標的細胞で複製するためには、その転写が必要であるヌクレオチド配列を指す。例えば、本発明のアデノウイルスベクターでは、複製のために必須の遺伝子は、Ｅ１ａ，Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、およびＥ４遺伝子からなる群から選ばれてもよい。
【００３２】
本明細書で用いる「パッケージング細胞」とは、アデノウイルスゲノムまたは改変ゲノムをパックして、ウイルス粒子を生成することが可能な細胞である。この細胞は、欠失遺伝子産物、またはその等価物を供給することが可能である。従って、パッケージング細胞は、アデノウイルスゲノムにおいて欠失した遺伝子のための補償機能を果たすことが可能であり、アデノウイルスゲノムをパックして、アデノウイルス粒子とすることが可能である。このような粒子の産生は、ゲノムが複製され、かつ、成分を取り集めて感染性ウイルスとするのに必要なタンパク質が生産されることを必要とする。この粒子はまた、該ウイルス粒子の成熟に必要なある種のタンパク質を必要とすることがある。このようなタンパク質は、ベクターによって、またはパッケージング細胞によって供給することが可能である。
【００３３】
「ＨｅＬａ−Ｓ３」という用語は、米国基準菌株保存機関（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、バーモント州）から入手が可能で、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２．２と表示される、ヒト頸部腫瘍由来細胞株を意味する。ＨｅＬａ−Ｓ３は、１９５５年にＴ．Ｔ．Ｐｕｃｋ等によってクローンされた（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１０３：２７３−２８４（１９５６））。
【００３４】
本明細書で用いる「自己プロセシング切断部位」または「自己プロセシング切断配列」は、ＤＮＡまたはアミノ酸配列であって、その翻訳時または翻訳される際に、自己プロセシング切断部位を含むポリペプチドの速やかな分子内（ｃｉｓ）切断が起こり、それぞれ別々の成熟タンパク質またはポリペプチド産物の発現をもたらすＤＮＡまたはアミノ酸配列である。このような「自己プロセシング切断部位」はまた、翻訳後、または翻訳時処理切断部位、例えば、２Ａ部位、配列、またはドメインと呼ばれてもよい。２Ａ部位、配列、またはドメインは、リボソームの活性を改変してエステル結合の加水分解を増進し、それによって、ある１個の下流翻訳産物の合成の進行を可能とするやり方で、翻訳複合体からポリペプチドを放出する（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，２００１）。それとは別に、２Ａ部位、配列、またはドメインは、自身のＣ末端をシスにおいて切断することによって「自己タンパク質分解」または「切断」を示し、一次切断産物を生産する（Ｆｕｒｌｅｒ；Ｐａｌｍｅｎｂｅｒｇ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：６０３−６２３（１９９０））。
【００３５】
「核酸」という用語は、１本鎖形または２本鎖形のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、およびそのポリマー（「ポリヌクレオチド」）を指す。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と近似の結合特性を有する、天然ヌクレオチドの既知の類縁体を含む核酸を含み、天然に見られるヌクレオチドと同様のやり方で代謝される。別様に指示されない限り、ある特定の核酸分子および／またはポリヌクレオチドはまた、明白に表示される配列の外に、その保存的に改変された変異種（例えば、縮重コドン置換体）、および相補的配列をも含む。特に、縮重コドン置換体は、１個以上の選択された（または全ての）コドンの第３位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基によって置換される配列を生成することによって実現される（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。ヌクレオチドは、その塩基によって、下記の標準的略語、すなわち、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびグアニン（Ｇ）に基づいて表される。
【００３６】
核酸は、別の核酸と機能的な関係に置かれた場合、「動作的に結合される。」例えば、プロモーター、または調節的ＤＮＡ配列は、ＲＮＡおよび／またはタンパク質をコードするＤＮＡ配列に対し、この二つのヌクレオチド配列が動作的に結合、または配置され、その結果、プロモーターまたは調節的ＤＮＡ配列が、コード、または構造的ＤＮＡ配列の発現レベルに影響を及ぼすように配置された場合、該ＤＮＡ配列に「動作的に結合される」と言われる。動作的に結合されたＤＮＡ配列同士は、通常隣接するが、必ずしも隣接していなくともよい。
【００３７】
「コード配列」および「コード領域」という用語は、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、センスＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡに転写されるヌクレオチド配列を指す。一つの実施態様では、ＲＮＡは次に細胞内で翻訳されてタンパク質を生産する。
【００３８】
「ＯＲＦ」は、オープンリーディングフレームを意味する。
【００３９】
「遺伝子」という用語は、ゲノム内に存在する定義された領域で、前述のコード配列の外に、コード部分の発現、すなわち、その転写および翻訳の調節に与る、他の、主に調節的ヌクレオチド配列を含む領域を指す。遺伝子はまた、他の５’および３’非翻訳配列および終結配列を含んでもよい。遺伝子の供給源に依存するが、さらにその他に存在する可能性のあるエレメントは、例えば、イントロンである。
【００４０】
核酸分子、例えば、プロモーターおよび遺伝子コード配列の参照の下に本明細書で用いる「異種性」および「外来性」という用語は、ある特定のウイルス、または宿主細胞に対して外来の供給源から得られたヌクレオチド配列、あるいは、供給源が同じ場合には、元の形から改変されたヌクレオチド配列を指す。従って、ウイルスまたは細胞における異種遺伝子は、その特定のウイルスにとって内因性ではあるが、例えば、コドン最適化を通じて改変された遺伝子を含む。この用語はまた、天然に見られるヌクレオチド配列の、非天然的に起こる複数コピーを含む。従って、本用語は、ウイルスまたは細胞に対して外来の、または異種の核酸分節、あるいは、ウイルスまたは細胞に対して同種ではあるが、宿主ウイルスまたは細胞ゲノムにおいて、通常は認められない位置にある核酸分節を指す。
【００４１】
核酸分子参照の下に本明細書で用いる「相同的」という用語は、天然状態で宿主ウイルスまたは細胞と連結するヌクレオチド配列を指す。
【００４２】
「相補体」および「相補的」という用語は、逆平行ヌクレオチド配列を含む、二つのヌクレオチド配列であって、その逆平行ヌクレオチド配列の相補的塩基残基の間に水素結合を形成することによって相互に対合することが可能な二つのヌクレオチド配列を指す。
【００４３】
「天然」という用語は、野生型ウイルスまたは細胞のゲノム中に存在する遺伝子またはタンパク質を指す。
【００４４】
「天然に見られる」または「野生型」という用語は、ヒトによって人工的に生産されるのとは違って、天然に認められる対象物を記載するのに用いられる。例えば、生物体（ウイルスを含む）中に存在し、天然の供給源から単離することが可能であるが、実験室でヒトによって意図的に改変されることのないタンパク質またはヌクレオチド配列は天然に見られるものである。
【００４５】
本明細書で用いる「標的化リガンド」という用語は、所望の細胞タイプおよび／または組織に向けてアデノウイルス粒子を積極的に指向させる化学的機能基を指す。このようなリガンドのカテゴリーとしては、ペプチド、ポリペプチド、１本鎖抗体、およびマルチマータンパク質が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。特異的リガンドとしては、腫瘍壊死因子（またはＴＮＦ）、例えば、ＴＮＦ−アルファおよびＴＮＦ−ベータを含むリガンドのＴＮＦスーパーファミリー、リンフォトキシン（ＬＴ）、例えば、ＬＴ−アルファおよびＬＴ−ベータ、Ｆａｓ抗原に結合するＦａｓリガンド；Ｂリンパ球のＣＤ４０受容体に結合するＣＤ４０リガンド；ホジキンリンパ腫の新生物細胞のＣＤ３０受容体に結合するＣＤ３０リガンド；ＣＤ２７リガンド、ＮＧＦリガンド、およびＯＸ−４０リガンド；腫瘍細胞、活性化Ｔ細胞、および神経組織細胞に局在するトランスフェリン受容体に結合するトランスフェリン；肝臓細胞のＬＤＬ受容体に結合するＡｐｏＢ；肝臓細胞のＬＲＰ受容体に結合するアルファ−２−マクログロブリン；肝臓のアシアロ糖タンパク質受容体に結合するアルファＩ酸性糖タンパク質；マクロファージのマンノース受容体に結合するマンノース含有ペプチド；活性化内皮細胞のＥＬＡＭ−１受容体に結合するシアリル−ルイス−Ｘ抗原含有ペプチド；造血先駆細胞のＣＤ３４受容体に結合するＣＤ３４リガンド；リンパ球のＬＦＡ−Ｉ（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）受容体、または、マクロファージのＭａｃ−Ｉ（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）受容体に結合するＩＣＡＭ−Ｉ；脾臓および骨髄マクロファージのｃ−ｆｍｓ受容体に結合するＭ−ＣＳＦ；肝臓細胞の肝熱帯熱マラリア原虫に結合するスポロゾイト辺縁タンパク質；活性化内皮細胞のＶＣＡＭ−Ｉ受容体に結合するＶＬＡ−４；Ｔヘルパー細胞のＣＤ４受容体に結合するＨＩＶｇｐ１２０およびクラスＩＩＭＨＣ抗原；アポ脂質タンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）分子のＬＤＬ受容体結合領域；ＣＳＦ受容体に結合するコロニー刺激因子、またはＣＳＦ；インスリン様増殖因子であって、例えば、それぞれＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに結合するＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ；それぞれインターロイキン１から１４までの受容体に結合するインターロイキン１から１４まで；免疫グロブリンのＦｖ抗原結合部位；ゼラチナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤；ボンベスチン、ガストリン放出ペプチド；Ｐ物質；ソマトスタチン；黄体ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）；血管作動性ポリペプチド（ＶＩＰ）；ガストリン；メラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）；環状ＲＧＤペプチド、および他の任意のリガンド、または細胞表面タンパク質結合（または標的化）分子が挙げられる。本発明の一つの実施態様では、ペプチド標的化リガンドが、アデノウイルス様ベクターのキャプシドタンパク質、通常、アデノウイルス様ベクターの線維タンパク質中に挿入される。
【００４６】
核酸分子参照の下に本明細書で用いる「組み換え」という用語は、複数の核酸分子であって、組み換えＤＮＡ技術を用いて結合されて先駆核酸分子となる核酸分子の組み合わせを指す。ウイルス、細胞、および生物体を参照しながら本明細書で用いる場合、「組み換え」、「形質転換」、および「トランスジェニック」という用語は、異種核酸分子が導入された、宿主ウイルス、細胞、または生物体を指す。この核酸分子は、宿主のゲノム中に安定に取り込まれるか、あるいは、この核酸分子は、染色体外分子として存在することも可能である。このような染色体外分子は自己複製することも可能である。組み換えウイルス、細胞、および生物体は、形質変換過程の最終産物ばかりでなく、その組み換え先駆体を含むものと理解される。「非形質変換」、「非トランスジェニック」、または「非組み換え」宿主とは、異種核酸分子を含まない、野性型のウイルス、細胞、または生物体を指す。
【００４７】
「調節エレメント」とは、核酸発現の調節に関与する核酸配列である。調節エレメントとしては、プロモーター、エンハンサー、および終結信号が挙げられる。これらは、通常、ヌクレオチド配列の適切な翻訳のために必要とされるヌクレオチド配列を含む。
【００４８】
「プロモーター」という用語は、通常コード領域の上流に位置し、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに対する結合部位を含み、ＤＮＡの転写を開始する、非翻訳ＤＮＡ配列を指す。プロモーター領域はまた、遺伝子発現の調節因子として作動する他のエレメントも含んでもよい。「最小プロモーター」という用語は、不活性で、上流の活性化エレメントが不在の場合にはプロモーターの活性を大きく減じてしまうプロモーターエレメント、特にＴＡＴＡエレメントを指す。
【００４９】
本発明の意味における「エンハンサー」という用語は、任意の遺伝エレメント、例えば、ヌクレオチド配列であって、プロモーターに動作的に連結するコード配列の転写を、該コード配列に動作的に連結された場合、プロモーター自体によって実行される転写活性化よりも増大させる、すなわち、プロモーターからの転写を増大させる、任意の遺伝エレメントであってもよい。
【００５０】
「発現」という用語は、細胞中の内因性遺伝子、導入遺伝子、またはコード領域の転写および／または翻訳を指す。アンチセンス構築物の場合、発現は、アンチセンスＤＮＡのみの転写を指してもよい。
【００５１】
本明細書で用いる「上方調節」とは、ある特定の遺伝子について、別の細胞に比べて、より大量のＲＮＡが標的細胞において検出されることを意味する。例えば、腫瘍細胞が、非腫瘍細胞に比べてより多量のテロメラーゼＲＮＡを生産する場合、該腫瘍細胞は、テロメラーゼの発現を上方調節したわけである。標的細胞（例えば、腫瘍細胞）における特定ＲＮＡの量が、別の細胞（非腫瘍細胞）の量よりも少なくとも３倍高ければ、発現は上方調節されると考えられる。別の実施態様では、特定ＲＮＡの量は少なくとも５倍より多い。別の実施態様では、特定ＲＮＡの量は少なくとも１０倍多い。当業者であれば、ある特定のＲＮＡ配列についてＲＮＡレベルを測定する方法（例えば、ノーザンアッセイ）を知っている。
【００５２】
本明細書で用いる「腫瘍選択的プロモーター活性」という用語は、腫瘍細胞における、本発明のプロモーター断片のプロモーター活性は、非腫瘍細胞タイプの活性よりも高いことを意味する。
【００５３】
本明細書で用いる「内部的リボソーム進入部位」または「アイレス（ＩＲＥＳ）」とは、シストロン（タンパク質コード領域）の開始コドン、例えば、ＡＴＧに対する内部的リボソーム直接進入を促進し、それによって遺伝子のキャップ独立性翻訳を実現するエレメントを指す。Ｊａｃｋｓｏｎ  ＲＪ，Ｈｏｗｅｌｌ  ＭＴ，Ｋａｍｉｎｓｋｉ  Ａ（１９９０）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １５（１２）：４７７−８３）およびＪａｃｋｓｏｎ  ＲＪ  ａｎｄ  Ｋａｍｉｎｓｋｉ，Ａ．（１９９５）ＲＮＡ  １（１０）：９８５−１０００）。本発明は、シストロンの開始コドンへの内部的リボソーム直接進入を促進することが可能な、任意のＩＲＥＳエレメントの使用を含む。本発明で用いる「ＩＲＥＳの翻訳調節下に」とは、翻訳がＩＲＥＳと連結し、キャップ独立的に進行することを意味する。従来技術で既知の「ＩＲＥＳ」の例としては、ピコルナウイルスから獲得可能なＩＲＥＳ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １５（１２）：４７７−４８３）；およびウイルスまたは細胞ｍＲＮＡ供給源、例えば、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８（１１）：６１７８−６１９０）、線維芽細胞増殖因子２およびインスリン様増殖因子、翻訳起動因子ｅＩＦ４Ｇ、酵母転写因子ＴＦＩＩＤおよびＨＡＰ４が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。「ＩＲＥＳ」はまた、様々なウイルス、例えば、カルジオウイルス、ライノウイルス、アフトウイルス、ＨＣＶ、フレンドのネズミ白血病ウイルス（ＦｒＭＬＶ）とモロニーのネズミ白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）においても報告されている。本明細書で用いる「ＩＲＥＳ」は、ＩＲＥＳ配列の機能的変異種であって、その変異種が、シストロンの開始コドンにたいする内部的リボソーム直接進入を促進可能なものである限り、該変異種を含む。好ましい実施態様では、ＩＲＥＳは哺乳類由来である。別の実施態様では、ＩＲＥＳはウイルスまたは原虫由来である。本明細書に開示される一つの例示の実施態様では、ＩＲＥＳは、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）から獲得が可能である（Ｎｏｖｏｇｅｎから市販されている、Ｄｕｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ６６（３）：１６０２−１６０９）。本明細書に開示される別の例示の実施態様では、ＩＲＥＳはＶＥＧＦ由来である。ＩＲＥＳ配列の例は、米国特許第６，６９２，７３６号に記載される。
【００５４】
二つ以上のヌクレオチドまたはタンパク質配列に関する話題において「同一」または、パーセント「同一」という用語は、二つ以上の配列またはサブ配列において、比較され、最大一致を示すように整列させられ、本明細書に記載される配列比較アルゴリスムの内の一つ、例えば、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｍａｎアルゴリスムを用いて、または目視によって測定した場合、同じである、あるいは、一定パーセントの、同一アミノ酸残基またはヌクレオチドを有する、二つ以上の配列またはサブ配列を指す。
【００５５】
「正常細胞状態」または「正常生理状態」とは、正常な生理的状態にあって、分裂していない、または調節的に分裂する細胞の状態、すなわち、正常な生理的状態にある細胞の状態である。「異常細胞状態」とは、同じタイプの、非分裂／調節分裂状態にあって、正常な生理的状態にある細胞に関して定義される。従って、「異常細胞状態」を有する細胞は、非調節的細胞分裂を呈することになる。
【００５６】
本明細書で用いる「がん」、「がん細胞」、「新生物細胞」、「新形成」、「腫瘍」、および「腫瘍細胞」（相互交換的に使用される）は、比較的自律的成長を示し、そのために異常な成長表現型、または、細胞増殖調節の著明な消失によって特徴付けられる異常な細胞状態を示す。腫瘍細胞は、過形成細胞、インビトロまたはインビボにおいて接触成長抑制の欠如を示す細胞、インビボで転移不能な細胞、または、インビボで転移可能な細胞であってもよい。新形成細胞は、悪性であっても良性であってもよい。従って、がん細胞は、異常な細胞状態を有すると見なされる。
【００５７】
「原発性腫瘍細胞」という用語は、従来技術における意味に従って用いられる。原発性腫瘍細胞は、哺乳動物の腫瘍から単離され、インビトロで広く培養されていないがん細胞である。
【００５８】
本明細書において、ある特定のヌクレオチド配列の参照下に用いられる、「から事実上成る。」、または「から事実上成るところの」という用語は、特定のヌクレオチド配列が、５’または３’末端のいずれか、または両端においてさらに別の残基を持つ可能性があり、その際、その追加の残基は、言及配列の基本的および新規の特性に実質的に影響を及ぼさないことを意味する。
【００５９】
「サイトカイン」という用語、または文法的にそれと等価な用語によって本明細書中で意味されるものは、免疫系細胞の、一般クラスのホルモン、例えば、リンフォカイン、モノカインその他を含むホルモンである。この定義は、局所的に動作し、血液中を循環しないホルモン、および、本発明に従って用いられると、個体の免疫応答の変更をもたらすホルモンを含むが、ただしそれらに限定されない。
【００６０】
「腫瘍細胞由来の抗原」という用語、または文法的にそれと等価な用語によって本明細書中で意味されるものは、免疫応答を惹起することが可能な腫瘍細胞から得られる、任意のタンパク質、糖質またはその他の成分である。この定義は、全腫瘍細胞であって、その関連抗原の全てを抗原として含む細胞を始め、細胞体から分離される任意の成分、例えば、細胞膜、細胞質タンパク質、膜貫通タンパク質、細胞表面または膜から精製されたタンパク質、または、細胞表面と関連する独特な糖質機能基を含むことを意味するが、ただし上記に限定されない。本定義はまた、それに達するには細胞の特別処理を要求する、細胞表面由来の抗原も含む。
【００６１】
本明細書で用いられる「遺伝学的に改変された腫瘍細胞」という用語は、導入遺伝子を発現するように遺伝学的に改変された細胞集団を含む組成物であって、がん治療投与スケジュールの一部として患者に投与される組成物を指す。遺伝学的に改変された腫瘍細胞ワクチンは、治療を受ける患者に対し「自己」または「同種」である腫瘍細胞を含むか、あるいは、患者から採取された腫瘍細胞と混ぜ合わされる「傍系細胞」を含む。ＧＭ−ＣＳＦ発現を遺伝学的に改変された腫瘍細胞ワクチンは、本明細書では「ＧＶＡＸ」と呼ばれることがある。
【００６２】
本明細書において「全身免疫応答」またはその文法的等価物によって意味されるものは、局所的ではなく、その個体全体に影響を及ぼす免疫応答であって、同じ刺激に対して、特定順序の反応を可能とする免疫応答である。
【００６３】
本明細書において「確立腫瘍の逆転」またはその文法的等価物によって意味されるものは、既存の腫瘍の抑圧、抗体、あるいは部分的または完全的消失である。本定義の意味は、既存腫瘍のサイズ、活力、または増殖率における任意の減少を含む。
【００６４】
「腫瘍の成長を遅延させる」という用語によって意味されるものは、腫瘍の成長速度の低下、腫瘍サイズまたは腫瘍細胞数増加の抑制、あるいは、腫瘍細胞数、腫瘍サイズ、または腫瘍数の低下である。
【００６５】
「形質導入」という用語によって意味されるものは、物理的手段による外来性核酸の細胞内への導入である。例えば、形質導入は、本発明のウイルス粒子による、外来性核酸の細胞内への導入を含む。哺乳類細胞の操作に関する各種技術については、Ｋｅｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５：５２７−５３７（１９９０）を参照のこと。
【００６６】
本明細書で用いる「治療」、「治療的使用」、または「医療的使用」という用語は、病状または症状を治療する、あるいは、その他のやり方で、疾患またはその他の不快症状の進行をどのようなやり方でもよいから予防、妨害、遅延、または逆転させる、主張される組成物の任意の、かつ全ての使用を指す。
【００６７】
本明細書で用いる「治療的有効量」という用語、または文法的等価物は、個体の全身免疫応答を、刺激によるか抑圧によるかして改変するのに十分な量の調剤を指す。本発明のがんワクチンの場合、がん細胞に対する哺乳動物の免疫応答を刺激することである。この量は、異なる個体、異なる腫瘍タイプ、および異なる調剤では異なっていてもよい。この「治療的有効量」は、「改善された治療結果」がもたらされるように当業者によって通例的に採用される手順を用いて決定される。
【００６８】
がんに関して、本明細書で用いる「改善された治療結果」および「強化された治療効力」という用語は、がん細胞または固形腫瘍の成長遅滞または減少、あるいは、がん細胞全数または腫瘍の全体負荷の低下を指す。従って、「改善された治療結果」および「強化された治療効力」という用語は、任意の臨床的に受容可能な基準に基づいても患者の状態に改善があること、すなわち、余命の延長、クォリティオブライフの改善を含む改善があることを意味する。本明細書における「不活性化細胞」および「増殖不能細胞」、またはその文法的等価物によって意味されるものは、細胞を増殖不能とならしめる処置によって不活性化された細胞である。この処置によって、多数回の有糸分裂を経過することはできないが、サイトカインおよび／または腫瘍抗原のようなタンパク質を発現することのできる能力を保持する細胞が得られる。このことは、当業者には既知の数多くの方法によって実現することが可能である。
【００６９】
「照射細胞」は、そのような不活性化細胞の一例である。このような照射細胞は、該細胞を増殖不能とするのに十分な照射に暴露される。
【００７０】
「個体」、「被験体」、またはその文法的等価物によって、任意の個別の哺乳動物が意味される。
【００７１】
（標的細胞）
本発明は、標的細胞、例えば、原発性腫瘍細胞において異種核酸を発現する方法を提供する。標的細胞は、インビトロ、インビボ、またはエキソビボにおいて、キメラ線維タンパク質を有するアデノウイルスによって形質導入される。その際、キメラ線維タンパク質は、Ａｄ５またはＡｄ２シャフトの少なくとも一部、およびＡｄ３５ヘッドの少なくとも一部を含む。
【００７２】
標的細胞は、いずれの細胞タイプまたは組織タイプであってもよい。好ましい方法では、標的細胞は腫瘍細胞、通常原発性腫瘍細胞である。一つの実施態様では、原発性腫瘍細胞は、肺腫瘍細胞（例えば、非小細胞型肺腫瘍細胞）、前立腺腫瘍細胞、頭頸部腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞、メラノーマ腫瘍細胞、リンパ腫細胞、および腎臓腫瘍細胞からなる群より選択される細胞である。
【００７３】
ある好ましい実施態様では、原発性腫瘍細胞は、膀胱がん、乳がん、結腸がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん（例えば、非小細胞型肺がん）、卵巣がん、頸がん、膵臓がん、直腸がん、前立腺がん、胃がん、上皮がん；リンパまたは骨髄系統の造血細胞がん；中胚葉起源のがん、例えば、線維肉腫または黄紋筋肉腫；その他の腫瘍タイプ、例えば、メラノーマ、奇形がん、神経芽細胞腫、グリオーマ、および腺がんからなる群より選択されるタイプのがん細胞である。
【００７４】
本発明のキメラアデノウイルスベクターによって実現される利点は、腫瘍細胞、特に、原発性腫瘍細胞の形質導入の増加である。形質導入効率の上昇は、アデノウイルスベクターの必要がより少なくなることを意味する。このことは、生産しなければならないアデノウイルスベクター量の低下をもたらす。さらに、アデノウイルスベクターの形質導入効率はより強力になるわけであるから、同じ形質導入効率を実現するのに、非キメラアデノウイルスベクターの場合に通常必要とされるものよりも少容量のウイルスを用いることが可能となる。
【００７５】
本発明のアデノウイルスベクターと方法はいくつかの利便性を有する。例えば、アデノウイルスベクターは、数十年に渡って異種コード配列を細胞に導入し発現するために使われてきた。本発明は、さらに効率的に異種コード配列を原発性腫瘍細胞に導入し発現するアデノウイルスベクターおよび方法を提供する。これによって、原発性腫瘍細胞に対する様々の導入遺伝子の作用を研究するための効率的なツールが得られる。本発明のベクターおよび方法はまた、腫瘍細胞、特に原発性腫瘍細胞において様々な治療用導入遺伝子を試験するためにも使用されてよい。本発明のアデノウイルスベクターおよび方法は、治療応用、例えば、哺乳動物におけるがん治療のためのベクターおよび方法を提供する。本発明の方法は、インビトロ、インビボ、および／またはエキソビボ設定条件下に腫瘍細胞の形質導入のために使用されてもよい。
【００７６】
（本発明のアデノウイルスベクター）
本明細書で用いる「アデノウイルス」および「アデノウイルス粒子」という用語は、アデノウイルスとして分類される任意の、全てのウイルスであって、ヒトまたは動物に感染する任意のアデノウイルス、および、全てのグループ、サブグループ、および血清型を含む、任意の、および全てのウイルスを指す。従って、本発明で用いる場合、「アデノウイルス」および「アデノウイルス粒子」は、別様に指示しない限り、ウイルスそれ自体、またはその誘導体を指し、天然に見られるもの、および組み換え型両方の、全ての血清型およびサブタイプを含む。このようなアデノウイルスは、野生型であってもよいし、従来技術で既知の、または、本明細書に開示される方法に従って様々なやり方で改変されてもよい。そのような改変としては、感染性ウイルスを作製するために、粒子の中にパックされるアデノウイルスゲノムに施される改変を含む。そのような改変は、従来技術で既知の欠失、例えば、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｆ２ａ、Ｆ２ｂ、Ｅ３、またはＥ４コード領域の内の一つ以上の欠失を含む。この用語はまた、複製特異的アデノウイルスを含む。すなわち、ある種の細胞または組織では好んで複製するが、別の種類のものではその程度が劣るか、全く複製しないウイルスである。このようなウイルスは、時に、「細胞溶解性」または「細胞病原性」ウイルス（またはベクター）とも呼ばれ、かつ、該ウイルスが新生物細胞に作用を及ぼす場合には、「腫瘍崩壊性」ウイルス（またはベクター）と呼ばれる。
【００７７】
本発明のアデノウイルスベクターは、キメラ線維タンパク質をコードし、本発明のアデノウイルス粒子はキメラ線維タンパク質を含む。その際、前記キメラ線維タンパク質は、Ａｄ３５ヘッドの少なくとも一部、およびＡｄ５またはＡｄ２シャフトの少なくとも一部を含む。保持されたＡｄ３５ヘッドおよびＡｄ５またはＡｄ２シャフトの一部は、がん細胞の効率的形質導入を実現する。本発明を実施するのに有用なキメラアデノウイルス線維タンパク質を下記にさらに説明する。
【００７８】
本発明に従って用いられるアデノウイルス株は、任意のアデノウイルス血清型を含む。アデノウイルス血清型１から５１は、最近、米国基準菌株保存機関（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、バーモント州）から入手が可能であり、かつ、本発明は、任意の供給源から得られる、他の、任意の血清型のアデノウイルスを含む。本発明に従って用いられるアデノウイルスは、ヒト起源のものであっても、あるいは、非ヒト起源、例えば、ウシ、ブタ、イヌ、サル、トリ起源のものであってもよい。例えば、アデノウイルスは、サブグループＡ（例えば、血清型１２、１８、３１）、サブグループＢ（例えば、血清型３、７、１１、１４、１６、２１、３４、３５、５０）、サブグループＣ（例えば、血清型１、２、５、６）、サブグループＤ（例えば、血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２−３０、３２、３３、３６−３９、４２−４７、４９、５１）、サブグループＥ（血清型４）、サブグループＦ（血清型４０、４１）、または他の任意のアデノウイルス血清型であってもよい。本明細書全体を通じて、アデノウイルスタイプ５における特定のヌクレオチドに対して参照が行われる。当業者であれば、他の血清型における対応ヌクレオチドを定め、従って、他のアデノウイルス血清型における類似のアデノウイルスベクターを構築することが可能である。一つの好ましい実施態様では、アデノウイルス核酸バックボーンは、アデノウイルス血清型２（Ａｄ２）、５（Ａｄ５）、または３５（Ａｄ３５）から得られるか、あるいは、アデノウイルス血清型２（Ａｄ２）または５（Ａｄ５）の一部と、アデノウイルス血清型３５（Ａｄ３５）の一部との組み合わせを含むアデノウイルスキメラバックボーンである。ヒトおよび動物アデノウイルスの数多くの実例が、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ＳｅａｒｃｈＣａｔａｌｏｇｓ／ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ．ｃｆｍにおいて見出される米国基準菌株保存機関において入手が可能である。
【００７９】
アデノウイルス血清型２、５、３５（Ｈｏｌｄｅｎ株）、および３５（３５ｐ株）のＤＮＡおよびタンパク質配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋのアクセス番号ＮＣ＿００１４０５、ＡＹ３３９８６５、ＡＹ１２８６４０、およびＡＹ２７１３０７において見出すことができる。なお、これら全てについて、参照することによりその全体を本明細書に含める。アデノウイルス血清型１１および１４の線維のタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて、それぞれ、アクセス番号ＢＡＤ１１２０５およびＢＡＢ８３６９１の下に見出すことができ、アデノウイルス血清型３の線維のＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセス番号Ｘ０１９９８およびＭ１２４１１の下に見出すことができる。これら全てについて、参照することによりその全体を本明細書に含める。アデノウイルス血清型１６および２１のＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて、それぞれ、アクセス番号ＡＢ０７３６３２およびＡＢ０７３２２２の下に見出すことができる。この両方を、参照することによりその全体を本明細書に含める。配列情報と共に、ＧｅｎＢａｎｋの書き込み記事は、有用な詳細、例えば、参考文献、スプライシングシグナルの位置、ポリアデニル化部位、ＴＡＴＡシグナル、イントロン、各特定遺伝子の開始および終結コドン、タンパク質配列、各遺伝子のｃＤＮＡ、および、文献を通じて存在する配列変異のリストを含む。
【００８０】
アデノウイルスベクターは、そのゲノムのサイズによって制限される（Ｂｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９１１−５９２１，１９９３）。これは次に、ベクターに挿入される異種ＤＮＡの量を制限し、従って、アデノウイルスゲノムに取り込まれる異種コード配列の量および／または長さを制限する。従って、複製不能ウイルスは、一般に、最大の異種ＤＮＡ挿入体を容れることが可能であるが、それでも、アデノウイルスゲノムＤＮＡのサイズと、欠失したアデノウイルスＤＮＡの量によって制限される。
【００８１】
アデノウイルスベクターに関連して言うと、「５」という用語は、「上流」と相互交換的に用いられ、左の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）方向を意味する。アデノウイルスベクターに関連して言うと、「３」という用語は、「下流」と相互交換的に用いられ、右のＩＴＲ方向を意味する。
【００８２】
本発明のアデノウイルスベクターは、複製不能および複製可能ベクターを含む。複製不能ベクターは、標的細胞において複製をしないか、または極めて低レベルでしか複製しない。一つの局面では、複製不能ベクターは、Ｅ１ａ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、またはＥ４の内の少なくとも一つのコード領域を、通常、そのコード領域の一部または全部を欠失するか、または突然変異されることによって不活性化される。上記ベクターを継代させる方法は従来技術においてよく知られる。
【００８３】
別の局面では、アデノウイルスベクターは複製可能である。複製可能ベクターは、標的細胞において複製することができる。複製可能ウイルスは、野生型ウイルス、および、標的細胞において複製するように加工されたウイルスを含む。これらは複製特異的ウイルスを含む。複製特異的ウイルスは、別タイプの細胞に比べて、あるタイプの細胞において特異的に、または好んで複製するように設計される。
【００８４】
複製欠損および複製可能アデノウイルスベクターは、両方とも、がん治療用の治療剤として現在開発中のものである。これらのベクターは、少なくとも一つのＥ３コード領域において欠失を持っていてもよいが、ある場合にはＥ３領域を保持してもよい（例えば、ＷＯ０２／０６７８６１、ＷＯ０１／０２５４０を参照のこと）。
【００８５】
標的細胞において選択的に複製するアデノウイルスベクターの例では、特異的に減衰された複製可能ウイルスベクターであって、がん細胞における選択的複製がそれらのがん細胞を好んで破壊する、そのようなベクターが開発されている。ある特定の細胞タイプにおいて好んで複製（従って破壊）する、各種の細胞特異的複製可能アデノウイルス構築物が、例えば、ＷＯ９５／１９４３４、ＷＯ９６／１７０５３、ＷＯ９８／３９４６４、ＷＯ９８／３９４６５、ＷＯ９８／３９４６７、ＷＯ９８／３９４６７、ＷＯ９８／３９４６６、ＷＯ９９／０６５７６、ＷＯ９９／２５８６０、ＷＯ００／１５８２０、ＷＯ００／４６３５５、ＷＯ０２／０６７８６１、ＷＯ０２／０６８６２、米国特許出願公報ＵＳ２００１００５３３５２、および米国特許第５，６９８，４４３、５，８７１，７２６、５，９９８，２０５、および６，４３２，７００号に記載される。複製可能アデノウイルスベクターは、腫瘍細胞において選択的に複製するように設計されている。
【００８６】
標的細胞は、ある細胞タイプ、組織タイプであってもよいし、ある細胞状態を有していてもよい。本発明の組成物および方法に便利に用いられる複製特異的ウイルスの例が、さらに、米国特許第５，９９８，２０５、５，８４６，９４５、５，８０１，０２９号、およびＰＣＴ特許ＷＯ９５／１９４３４、ＷＯ９８／３９４６５、ＷＯ９８／３９４６７、ＷＯ９８／３９４６６、ＷＯ９９／０６５７６、ＷＯ９８／３９４６４、およびＷＯ００／１５８２０に記載される。
【００８７】
「条件付複製ウイルス」、「複製指向型ウイルス」、「特異的複製ウイルス」、および「選択的複製ウイルス」という用語は、相互交換的に用いられる用語であり、ある種の細胞または組織では好んで複製するが、別の種類のものではその程度が劣るか、全く複製しない複製可能型ウイルスベクターである。本発明の一つの実施態様では、ウイルスベクターおよび／または粒子は、腫瘍細胞および／または異常増殖組織、例えば、固形腫瘍およびその他の新生物において選択的に複製する。このようなウイルスは、「腫瘍崩壊性ウイルス」、または「腫瘍崩壊性ベクター」と呼ばれてもよく、「細胞溶解性」または「細胞病原性」と見なされてもよく、標的細胞の「選択的細胞溶解」を実行すると考えられる。
【００８８】
「指向的複製」、「選択的複製」、および「特異的複製」は相互交換的に用いられるが、ウイルスは、非標的細胞よりは、標的細胞においてより盛んに複製することを意味する。ウイルスは、非標的細胞に比べて標的細胞においてより高い率で、例えば、少なくとも約３倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、ある場合には、少なくとも約１００倍、４００倍、５００倍、１０００倍、または極端な場合１ｘ１０６倍高い率で複製する。一つの実施態様では、ウイルスは、標的細胞でのみ複製する（すなわち、非標的細胞では全く、または極めて低レベルでしか複製しない）。
【００８９】
本発明の別の実施態様では、アデノウイルスベクターは、Ｅ１Ｂ  １９−ｋＤａ領域の一部または全ての欠失を含む。一つの実施態様では、アデノウイルスベクターは、Ｅ１ｂ１９ｋＤａコード配列の完全な、または部分的な欠失を除いて、Ｅ１コード配列の全てを含む。この欠失のために、Ｅ１ｂ  １９ｋＤａタンパク質は発現されないか、または該タンパク質は機能を失う。アデノウイルスＥ１Ｂ  １９−ｋＤａ領域は、Ｅ１Ｂ  １９−ｋＤａ産物をコードするアデノウイルスＥ１Ｂ遺伝子のゲノム領域を指す。野生型Ａｄ５によれば、Ｅ１Ｂ  １９−ｋＤａ領域は、ヌクレオチド（ｎｔ）１７１４とｎｔ２２４４の間に配される２６１ｂｐ領域である。このＥ１Ｂ  １９−ｋＤａ領域は、例えば、Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：７７４２−７７４６に記載される。本発明は、Ｅ１Ｂ  １９−ｋＤａ領域の一部または全部の欠失の外に、Ｅ１Ｂ  １９−ｋＤａ領域が突然変異される実施態様を、その欠失または突然変異が、Ｅ１Ｂ  １９−ｋＤａに関連するアポトーシスの抑制を減衰、または除去する限り、含む。
【００９０】
本発明の一つの実施態様では、キメラ線維タンパク質は、アデノウイルスのヘッドの少なくとも一部において、ＣＤ４６に結合する異種アミノ酸配列（例えばリガンド）、例えば、Ａｄ３５を含む。本発明のある実施態様では、異種アミノ酸配列、例えば、Ａｄ３５は、ＣＤ４６に結合する、アデノウイルスのヘッドの少なくとも一部のＨＩ−ループまたはＣ末端に配される。
【００９１】
本発明の一つの実施態様では、アデノウイルスは、複製に必須のアデノウイルスコード配列の欠失を含む。一つの実施態様では、複製欠損アデノウイルスは、下記の領域の内の少なくとも一つにおいて少なくとも一つの欠失を持つ。その領域とは、すなわち、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、およびＥ４である。一つの実施態様では、アデノウイルスは、原発性腫瘍細胞において複製不能である。
【００９２】
本発明のある実施態様では、アデノウイルスベクターは、少なくとも一つのアデノウイルスＥ３コード配列の欠失を含む。一つの実施態様では、前記少なくとも一つのアデノウイルスＥ３コード配列は、１９Ｋ、１４．７Ｋ、１４．５Ｋ、１２．５Ｋ、１１．６Ｋ、１０．４Ｋ、および６．７Ｋ  Ｅ３タンパク質のコード配列からなる群より選択される。一つの実施態様では、前記Ｅ３コード配列の全てが、対応するタンパク質が発現されないように、または機能を失うように、欠失される、および／または、突然変異される。一つの実施態様では、アデノウイルスは、１０．４Ｋ、１４．５Ｋ、および１４．７Ｋ  Ｅ３コード配列を含む。一つの実施態様では、天然Ｅ３コード配列の全てがベクターの中に保持される。
【００９３】
本発明のある実施態様では、アデノウイルスベクターは、がん細胞において好んで複製するが、その複製指向は、がん標的細胞における複製レベル（例えば、細胞殺作用および／または力価）を、非標的細胞、例えば、正常またはコントロール細胞における複製レベルと比較することによって示される。標的がん細胞におけるアデノウイルスの力価を、非標的細胞タイプにおける力価と比較することによって、総合的複製指向性が標的細胞において強化されているかどうか、および／または、複製が非標的細胞において低下しているかどうかについて決定的指標が得られる。
【００９４】
本発明の一つの局面では、アデノウイルスベクターは、二つ以上のコード配列の翻訳を連結する遺伝子間ＩＲＥＳエレメント（単数または複数）を含む。リンクされるコード領域は、二つのアデノウイルスコード領域であってもよいし、二つの導入遺伝子であってもよいし、または、一つのアデノウイルスコード領域と一つの導入遺伝子コードであってもよい。
【００９５】
二つのアデノウイルスコード領域を連結するＩＲＥＳを含むアデノウイルスベクターは安定であり、ある実施態様では、ＩＲＥＳを含まないベクターに比べ、より優れた特異性が得られる。遺伝子間ＩＲＥＳを含むアデノウイルスベクターのもう一つの利点は、第２のＴＲＥではなくＩＲＥＳを用いることによって、ベクターにおいて追加の遺伝子、例えば、治療遺伝子のためのスペースが得られることである。ＩＲＥＳを含むアデノウイルスベクターの例は、米国特許第６，６９２，７３６号に記載される。本発明の一つの局面では、本明細書に記載されるウイルスベクターは通常、マルチシストロン転写体の中に少なくとも一つのＩＲＥＳを含む。その際、マルチシストロン転写体の生産は、異種の、標的細胞特異的ＴＲＥによって調節される。ＩＲＥＳの調節下に置かれる第２のアデノウイルスコード領域を含むアデノウイルスベクターの場合、ＩＲＥＳの翻訳調節下に置かれる第２コード領域の内因性プロモーターは、それが第２コード領域の転写を妨げることがないよう取り除かれることが好ましい。第２コード領域は、ＩＲＥＳが開始コドンを含む場合、該ＩＲＥＳとフレームが一致していることが好ましい。開始コドン、例えば、ＡＴＧがＩＲＥＳ中にある場合、第２コード配列の開始コドンは取り除かれ、かつ、ＩＲＥＳと第２コード配列はフレーム一致していることが好ましい。それとは別に、ＩＲＥＳが開始コドンを含まない場合、あるいは、開始コドンがＩＲＥＳから取り除かれている場合、第２コドン領域の開始コドンが使われる。一つの実施態様では、アデノウイルスベクターは、異種ＴＲＥの転写調節下に、アデノウイルス必須遺伝子、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を、そして、Ｅ１ＡとＥ１Ｂの間に導入されたＩＲＥＳを含む。従って、Ｅ１ＡとＥ１Ｂの両方とも共通の転写調節の下にあり、Ｅ１Ｂコード領域の翻訳は、ＩＲＥＳの存在のお蔭で得られる。一つの実施態様では、Ｅ１Ａは、その内因性プロモータを除去される。別の実施態様では、Ｅ１Ａは、内因性エンハンサーを除去され、さらに別の実施態様では、Ｅ１Ａは、その内因性プロモーターおよびＥ１Ａエンハンサーが除去される。別の実施態様では、Ｅ１Ｂは、その内因性プロモーターが除去される。さらに別の実施態様では、Ｅ１Ｂは、Ｅ１Ｂの１９−ｋＤａ領域の一部または全部の欠失を受ける。
【００９６】
腫瘍崩壊性アデノウイルスプラットフォームの、ある好ましい実施態様では、自己プロセシング切断配列、例えば、２Ａ、または２Ａ様配列を含む、二シストロン性、またはマルチシストロン性カセットは、ウイルスの生涯サイクルにおいて、アデノウイルスの早期のウイルス遺伝子（Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３、および／またはＥ４）、または後期に発言される遺伝子（線維、ペントン、およびヘキソン）を含む。
【００９７】
ある事例では、がん標的細胞の、例えば、比較的難治性または特定の攻撃性のために、細胞傷害活性の程度、および／または、速度の強化が望ましい場合がある。細胞傷害性に貢献するウイルス遺伝子の例としては、アデノウイルス死亡タンパク質（ＡＤＰ）遺伝子が挙げられるが、ただしそれに限定されない。本明細書に開示される別の実施態様では、アデノウイルスは、その内因性プロモーター中に欠失を、またはそれ自身の欠失を有するアデノウイルスＥ１Ｂ遺伝子を含む。本明細書に開示される別の実施態様では、Ｅ１Ｂの１９−ｋＤａ領域が除去される。
【００９８】
標的細胞に対する細胞毒性を強化するために、細胞毒性作用を持つ、１個以上の導入遺伝子がベクターの中に存在してもよい。さらに、または別に、細胞毒性および／または細胞死に寄与するアデノウイルス遺伝子、例えば、アデノウイルス死亡タンパク質（ＡＤＰ）遺伝子をベクター中に、要すれば任意に異種ＴＲＥの選択的転写調節下に、および、要すれば任意にＩＲＥＳ、または自己プロセシング切断配列、例えば、２Ａ，または２Ａ様配列の翻訳調節下に含めてもよい。これは、標的細胞特異的細胞傷害活性を、異種遺伝子または導入遺伝子の細胞特異的発現と結合させることによって実現されると考えられる。
【００９９】
本発明の、例示のアデノウイルスベクターは、ＤＮＡ、アデノウイルスコートに被覆されたＤＮＡ、別のウイルスまたはウイルス様形態（例えば、単純ヘルペス、およびＡＡＶ）にパックされたアデノウイルスＤＮＡ、リポソームに被覆されたアデノウイルスＤＮＡ、ポリリシンと複合体を形成するアデノウイルスＤＮＡ、合成ポリカチオン分子と複合体を形成するアデノウイルスＤＮＡ、トランスフェリンと接合体を形成するアデノウイルスＤＮＡ，または、抗原性を免疫学的に「マスク」するために、および／または、半減期を増すために、ＰＥＧのような化合物と複合体を形成するアデノウイルスＤＮＡ、あるいは、非ウイルス性タンパク質と接合体を形成するアデノウイルスＤＮＡを含むが、ただしこれらに限定されない。
【０１００】
アデノウイルスベクター粒子はまた、後述するように、線維タンパク質に対しさらに別の改変を含んでもよい。一つの実施態様では、本発明のアデノウイルスベクターは、粒子のキャプシドタンパク質に含まれる標的化リガンドをさらに含む。標的化アデノウイルスの例については、例えば、ＷＯ００／６７５７６、ＷＯ９９／３９７３４、米国特許第６，６８３，１７０、６，５５５，３６８、５，９２２，３１５、５，５４３，３２８、５，７７０，４４２、および５，８４６，７８２号を参照のこと。
【０１０１】
さらに、本発明のアデノウイルスベクターはまた、他のウイルスキャプシドタンパク質に対する改変を含んでもよい。この突然変異の例としては、米国特許第５，７３１，１９０、６，１２７，５２５、および５，９２２，３１５号に記載されるものが挙げられるが、ただしそれらに限定されない。その他の改変アデノウイルスが米国特許第６，０５７，１５５、５，５４３，３２８、および５，７５６，０８６号に記載される。
【０１０２】
「Ｅ３領域」（「Ｅ３」と相互交換的に使われる）は、従来技術においてよく理解される用語であり、Ｅ３遺伝子産物をコードする、アデノウイルスゲノム領域を意味する。Ｅ３領域は、各種出版物、例えば、Ｗｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９：２３７−２７４に記載されている。Ｅ３領域の「一部」は、全Ｅ３領域よりも小さいことを意味し、従って、ポリヌクレオチド欠失の外に、Ｅ３領域の１種以上のポリペプチド産物をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１０３】
Ｅ３領域を含むアデノウイルス構築物であって、Ｅ３含有アデノウイルスプラスミド、例えば、ＢＨＧＥ３（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，トロント）と、非Ｅ３含有アデノウイルスプラスミドの間の相同組み換えが行われる構築物を生成することが可能である。
【０１０４】
別態様として、Ｅ３領域を含むアデノウイルスベクターを、アデノウィル構築物、またはアデノウイルスプラスミド構築物と共に、細胞、例えば、２９３細胞に導入することが可能である。その際、ベクターおよび構築物は、相同組み換えを受け、Ｅ３領域を含むアデノウイルスを生成する。この場合、Ｅ３含有アデノウイルスベクターとアデノウイルス構築物またはプラスミド構築物とは、アデノウイルスの相補領域を含む、例えば、一方は左手領域を、他方は右手領域を含み、しかも両者は相同的組み換えを可能とするほど十分な重複を有する。
【０１０５】
別態様として、本発明のＥ３含有アデノウイルスベクターは、他の通例法、例えば、標準的組み換え法（例えば、制限ヌクレアーゼおよび／またはＰＣＲによる方法）、化学的合成、または上記の任意のものの組み合わせを含む方法を用いて構築することが可能である。さらに、Ｅ３領域の部分の欠失は、分子生物学の標準的技術を用いて実行される。
【０１０６】
いくつかの実施態様では、Ｅ３領域の内部にコードされる、アデノウイルス死亡タンパク質（ＡＤＰ）はアデノウイルスベクターにおいても維持される。主要後期プロモーター（ＭＬＰ）の調節下に置かれるＡＤＰ遺伝子は、宿主細胞の分解の促進に重要なタンパク質（ＡＤＰ）をコードするようである。Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（４）：２２９６；Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６（６）：３６３３．従って、ＡＤＰ遺伝子を含むアデノウイルスベクターは、アデノウイルスベクターをより強力にするから、治療はより有効となり、および／または、用量要求はより下がる。
【０１０７】
一つの実施態様では、複製可能ベクターは、選択的ＴＲＥの転写調節下に複製に必須な遺伝子を含む。一つの実施態様では、アデノウイルスベクターは、Ｅ１Ｂを含む、複製可能がん特異的ベクターである。Ｅ１Ｂは、１９−ｋＤａ領域の一部または全ての欠失を有する。本発明のいくつかの実施態様では、複製に必須な、アデノウイルス遺伝子は、早期遺伝子、例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、およびＥ４の内の一つ以上である。さらに別の実施態様では、さらに一つ以上のＴＲＥが、複製に必須の、１個以上のアデノウイルス遺伝子、または、導入遺伝子、例えば、治療遺伝子に対し動作的に連結されてもよい。
【０１０８】
アデノウイルスベクターは、標的細胞特異的ＴＲＥと同じ遺伝子（単複）に対し動作的に連結されていても、されていなくともよい、さらに別の異種ＴＲＥを含んでもよい。例えば、ＴＲＥ（例えば、細胞タイプ特異的または細胞状態特異的ＴＲＥ）は、第２タイプの標的特異的ＴＲＥに接続されてもよい。「接続」とは、標的細胞特異的ＴＲＥと第２ＴＲＥとが、同じ遺伝子を転写に関して調節することを意味する。上記実施態様では、標的細胞特異的ＴＲＥと第２ＴＲＥとは、いくつかの形態、例えば、（ａ）隣接（すなわち、当接）；（ｂ）両方とも、転写調節される遺伝子に対し５’側；（ｃ）一方のＴＲＥは、遺伝子に対し５’側、他方のＴＲＥは、遺伝子に対し３’側、を含む形態の内の任意のものであってよい。ただし、形態は上記に限定されない。
【０１０９】
（転写調節エレメント）
転写調節エレメント、および、その特定、単離、特性、遺伝学的操作、動作的に連結されるコード配列調節のための使用を実行する方法は従来技術で既知である。ＴＲＥは、単一遺伝子の転写調節配列から得られてもよいし、異なる遺伝子の配列を組み合わせて機能的なＴＲＥを生成してもよいし、あるいは、ＴＲＥは合成的に生成されてもよい（例えば、ＣＴＰ４プロモーター）。
【０１１０】
ＴＲＥは、組織または細胞中に存在する細胞タイプに応じて、組織特異的、腫瘍特異的、発達段階特異的、細胞状態特異的等であってもよい。このようなＴＲＥは、本明細書では、まとめて組織特異的または標的細胞特異的と呼ばれる。下記にさらに詳述するように、標的細胞特異的ＴＲＥは、任意の数の形態、例えば、標的細胞特異的プロモーターおよび標的細胞特異的エンハンサー；異種プロモーターおよび標的細胞特異的エンハンサー；標的細胞特異的プロモーターおよび異種エンハンサー；異種プロモーターおよび異種エンハンサー；および前記のもののマルチマーを含む形態を含んでもよいが、ただしこれらに限定されない。標的細胞特異的ＴＲＥのプロモーターおよびエンハンサー成分は、所望の標的細胞特異的転写活性が得られる限り、対象コード配列に対し任意の方向を持ち、該配列から任意の距離離れていてもよい。
【０１１１】
転写活性化は、従来技術で既知のいくつかのやり方で測定が可能であるが（かつ、下記にさらに詳述されるが）、一般に、その標的細胞特異的ＴＲＥ調節下の（すなわち、動作的に結合される）コード配列のｍＲＮＡまたはタンパク質産物の検出および／または定量によって測定される。
【０１１２】
本明細書にさらに詳述されるように、標的細胞特異的ＴＲＥは、様々な長さを持ってよいし、様々な配列構成を持ってよい。標的細胞特異的ＴＲＥは、限られた細胞集団（またはタイプ）、例えば、前立腺細胞、肝臓細胞、メラノーマ細胞等において機能的であることが好ましい。従って、ある実施態様では、使用されるＴＲＥは、下記の組織タイプ、すなわち、前立腺；肝臓；乳房；尿道（膀胱）；結腸；肺；卵巣；膵臓；胃；および子宮の内のどれかにおいて機能的であることが好ましい。
【０１１３】
既に当業者には察知されるように、ＴＲＥはポリヌクレオチド配列であり、従って、様々な配列組み合わせにまたがって機能を発現することが可能である。ヌクレオチド置換、付加、および欠失の方法は従来技術で既知であり、簡単に利用可能な機能的アッセイ（例えば、ＣＡＴ、またはルシフェラーゼリポーター遺伝子アッセイ）を用いて、通常の錬度を持つ当業者でも、ある配列変異種が、必要な細胞特異的転写調節機能を示すかどうかを判定することが可能である。従って、核酸置換、付加、および／または欠失を含む、機能的に保存されたＴＲＥ変異種は、本明細書に開示されるベクターに使用が可能である。従って、変異ＴＲＥは、標的細胞において機能を保持するが、最大機能を発揮する必要はない。事実、ＴＲＥの最大転写活性化活動は、所望の結果を実現するのに必ずしも必要ではなく、ある種の応用では、ＴＲＥの断片によって実現される誘発レベルが十分であることもある。例えば、病状の治療または寛解のために使用される場合、最大未満の反応性が、例えば、標的細胞が特に悪性ではなく、および／または、病気の範囲が比較的限局されている場合は、十分であることがある。
【０１１４】
ある種の塩基改変が、発現レベル、および／または細胞特異性の強化をもたらす場合がある。例えば、従来技術で知られるように、ＴＲＥ内の核酸配列の欠失または付加が、転写調節タンパク質結合部位同士を、正常な形態の場合と比べて、互いに近づけたり、遠ざけたり、あるいは、両者を回転させてＤＮＡ螺旋の対向側に位置づけ、そうすることによって、ＴＲＥ結合転写因子の間の空間関係を変え、それが、転写の減少または増加を招くことがある。従って、だからと言って理論に拘束されることを望むものではないが、本開示は、ＴＲＥのある種の改変は、ＴＲＥによって指示される発現レベルの変調を、細胞特異性の強化を含む変調をもたらす可能性があると推察する。比較的侵襲性の高い新生物増殖の場合、および／または、より速やかなおよび／または攻撃的なパターンの細胞殲滅が必要とされる場合（例えば、免疫機能が侵されている被験体）には、発現レベルの強化の実現が特に望ましい。
【０１１５】
本発明で使用されるＴＲＥは、サイレンサーを含んでもよいし、含まなくともよい。サイレンサー（すなわち、従来技術で既知の、陰性調節エレメント）の存在は、非標的細胞における転写（従って、複製）の遮断を助ける。従って、サイレンサーの存在は、非標的細胞における複製を効果的に阻止することによって、細胞特異的ベクターの複製強化の実現を可能とする。別態様として、サイレンサーの欠如は、標的細胞における複製を刺激し、標的細胞特異性の強化を実現する可能性がある。
【０１１６】
ＴＲＥ（抑制と強化の両方を含む）によって指令される転写活性は、従来技術で既知のいくつかのやり方で測定が可能であるが（かつ、下記にさらに詳述されるが）、一般に、ＴＲＥ調節下の（すなわち、動作的に結合される）配列のｍＲＮＡまたは配列によってコードされるタンパク質産物の検出および／または定量によって測定される。
【０１１７】
本明細書に論じられるように、ＴＲＥは、様々な長さを持ってよいし、様々な配列構成を持ってよい。異種ＴＲＥのサイズは、一部はウイルスベクターの容量によって決められ、容量の方は、ベクターの予想形状に依存する。一般に、ＴＲＥには最小サイズが好まれる。なぜなら、好ましい他の配列、例えば、導入遺伝子および／または追加の調節配列の挿入用の余地を提供するからである。一つの実施態様では、そのような追加の調節配列は、自己プロセシング切断配列、例えば、２Ａ，または２Ａ様配列である。
【０１１８】
例を挙げて述べると、アデノウイルスは、ウイルス配列の欠失を要することなく、余分の配列、最大ではゲノムサイズの約１０５％、すなわち１．８ｋｂまで含めてパックすることが可能である。必須ではない配列がアデノウイルスから取り除かれた場合、さらに４．６ｋｂの挿入体の受け入れが可能である（すなわち、約６．４ｋｂの合計挿入体容量）。
【０１１９】
複製可能アデノウイルスベクターの場合、非特異的複製を防ぐために、内因性（アデノウイルス）ＴＲＥ（すなわち、天然のＥ１Ａおよび／またはＥ１Ｂプロモーター）はベクターから取り除かれるのが好ましい。標的細胞特異的複製を促進する外に、内因性ＴＲＥの除去はまた、ベクターの中により大きな挿入体容量を与える。これは、アデノウイルスベクターがウイルス粒子の中にパックされなければならない場合には重大な関心事となる。さらに重要なことは、内因性ＴＲＥの欠失は、異種ＴＲＥが除去され、内因性ＴＲＥが、それぞれのアデノウイルスコード配列の転写調節を扱う（従って、非特異的複製を可能とする）という組み換え事象の可能性を阻止する。一つの実施態様では、アデノウイルスベクターは、１個以上のアデノウイルス遺伝子の内因性転写調節配列が除去され、１個以上の異種ＴＲＥによって置換されるように構築される。一方、内因性ＴＲＥは、十分な細胞特異的複製指向が維持される限り、アデノウイルスベクター（単複）中に維持されてもよい。これらの実施態様は、異種ＴＲＥを、内因性ＴＲＥと、複製に必要な遺伝子コード分節との間に挿入することによって構築される。必要な、細胞特異的複製指向性は、異種ＴＲＥの機能を可能とする細胞におけるアデノウイルスベクターの複製を、異種ＴＲＥの機能を可能としない細胞における複製と比較するアッセイを実行することによって定量される。
【０１２０】
ある実施態様では、ＴＲＥは、標的細胞におけるベクターの複製を、ＴＲＥを欠く複製の基本レベルと比べ、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約４００から５００倍、少なくとも約１０００倍増す。受容可能な差は経験的に定められるが（例えば、ＲＮＡブロットアッセイ、ＲＮアーゼ保護アッセイ、または従来技術で既知の、その他のアッセイを用いてｍＲＮＡレベルを測定することによって）、ベクターの予想使用法および／または所望結果に依存する。
【０１２１】
特定の標的細胞に向けられるアデノウイルスベクターは、標的細胞に機能的指向性を持つＴＲＥを用いることによって生成される。本発明の一つの実施態様では、標的細胞特異的、または細胞状態特異的異種ＴＲＥは、腫瘍細胞特異的である。ベクターは、単一の腫瘍細胞特異的ＴＲＥ、または、腫瘍細胞特異的であり、同じ細胞において機能する複数の異種ＴＲＥを含んでもよい。別の実施態様では、ベクターは、全ての細胞が同じ細胞で機能的となるように、腫瘍細胞特異的な、１種以上の異種ＴＲＥを含み、さらに、組織特異的な１種以上の異種ＴＲＥを含む。
【０１２２】
一つの実施態様では、腫瘍崩壊アデノウイルスプラットフォームのために、二シストロンまたは複数シストロンカセットは、自己プロセシング切断配列、例えば、２Ａ，または２Ａ様配列を含むカセットは、アデノウイルス早期ウイルス遺伝子（Ｅ１Ａ，Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３、および／またはＥ４）、あるいは、ウイルスの生涯サイクルにおいて後期に発現される遺伝子（線維、ペントン、およびヘキソン）を含む。
【０１２３】
ある事例では、がん標的細胞の、例えば、比較的難治性または特定の攻撃性のために、細胞傷害活性の程度、および／または、速度の強化が望ましい場合がある。細胞傷害性に貢献するウイルス遺伝子の例としては、アデノウイルス死亡タンパク質（ＡＤＰ）遺伝子が挙げられるが、ただしそれに限定されない。本明細書に開示される別の実施態様では、アデノウイルスは、その内因性プロモーター中に欠失を、またはそれ自身の欠失を有するアデノウイルスＥ１Ｂ遺伝子を含む。本明細書に開示される別の実施態様では、Ｅ１Ｂの１９−ｋＤａコード領域は、該１９ｋＤａタンパク質が発現されない、または非機能的となるように、部分的または完全欠失される。
【０１２４】
標的細胞に対する細胞毒性を強化するために、細胞毒性作用を持つ、１個以上の導入遺伝子がベクターの中に存在してもよい。さらに、または別に、細胞毒性および／または細胞死に寄与するアデノウイルス遺伝子、例えば、アデノウイルス死亡タンパク質（ＡＤＰ）遺伝子をベクター中に、要すれば任意に異種ＴＲＥの選択的転写調節下に、および、要すれば任意にＩＲＥＳ、または自己プロセシング切断配列、例えば、２Ａ，または２Ａ様配列の翻訳調節下に含めてもよい。これは、標的細胞特異的細胞傷害活性を、異種遺伝子または導入遺伝子の細胞特異的発現と結合させることによって実現されると考えられる。
【０１２５】
いくつかの異種治療遺伝子または導入遺伝子の内の任意のものが、下記に後述するように、本発明の複製可能ウイルスベクターの中に含められる。
【０１２６】
通常、前述の二シストロンまたはマルチシストロンカセットは、転写反応エレメント、一般に、がんまたは腫瘍細胞において好んで発現される、細胞タイプまたは細胞状態関連転写調節エレメントの調節の下に置かれる。従って、任意の構築物に含められる治療遺伝子は、治療されるがんのタイプに応じて変動する。
【０１２７】
従来技術で知られるように、ＴＲＥの活動は誘発が可能である。誘発可能なＴＲＥは、一般に、誘発因子が無い場合には低い活性しか示さず、誘発因子の存在下に上方調節される。誘発因子としては、例えば、核酸、ポリペプチド、小型分子、有機化合物、および／または、温度、圧、または低酸素状態のような環境条件が挙げられる。誘発性ＴＲＥは、発現がある時点またはある場所で望まれる場合、あるいは、誘発因子を用いて発現レベルを定量することば望ましい場合に好ましい。例えば、ＰＳＥ−ＴＲＥ、ＰＢ−ＴＲＥ、およびｈＫＬＫ２−ＴＲＢの転写活性は、本明細書およびＰＣＴ／ＵＳ９８／０４０８０に記載されるように、アンドロゲンによって誘発が可能である。なお、上記特許を、参照することにより本明細書に含めることを明言する。従って、本発明の一つの実施態様では、アデノウイルスベクターは、誘発性異種ＴＲＥを含む。
【０１２８】
本発明で用いられるＴＲＥは、様々な形態として存在してよい。ＴＲＥはマルチマーを含むことも可能である。例えば、ＴＲＥは、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個の、標的細胞特異的ＴＲＥから成る直列配列を含んでもよい。これらのマルチマーも、異種プロモーターおよび／またはエンハンサー配列を含んでもよい。別態様として、ＴＲＥは、１個以上のエンハンサー領域と共に１個以上のプロモーター領域を含むことも可能である。ＴＲＥマルチマーはまた、異なる遺伝子由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーを含んでもよい。ＴＲＥのプロモーターおよびエンハンサー成分は、互いに任意の方向性を取ってよく、所望の細胞特異的転写活性が得られる限り、対象コード配列に対し任意の方向および／または任意の距離において存在してよい。
【０１２９】
一つの実施態様では、アデノウイルスは、腫瘍細胞において好んで複製する。一つの実施態様では、アデノウイルスは、複製に必須の、少なくとも１本のアデノウイルスコード配列に動作的に結合する異種転写調節エレメント（ＴＲＥ）を含む。ＴＲＥは、細胞特異的ＴＲＥ、細胞状態特異的ＴＲＥ、および組織特異的ＴＲＥを含むが、ただしこれらに限定されない。本発明で使用が可能な特異的ＴＲＥの例としては、ＰＳＡ  ＴＲＥ、Ｅ２Ｆ  ＴＲＥ、テロメナーゼ（ＴＥＲＴ）ＴＥＲ、ウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）ＴＲＥ、ウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）ＴＲＥ、ＰＲＬ−３タンパク質チロシンホスファターゼＴＲＥが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。本発明はまた、ＴＲＥの組み合わせの使用も考慮に入れる。複製に必須のアデノウイルスコード配列は、１個を超える異種ＴＲＥと動作的に連結されてよい。それとは別にまたはそれに加えてさらに、複製に必須の、１本を超えるアデノウイルスコード配列は、１個以上の異種ＴＲＥに動作的に結合されてよい。複製に必須のアデノウイルスコード配列の例は、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、およびＥ４領域に配されるコード配列である。複製に必要な複数コード領域は、１個のＴＲＥ、または複数のＴＲＥの組み合わせと、例えば、ＩＲＥＳによって動作的に結合される。一つの実施態様では、少なくとも１個のＴＲＥは、複製に必須の第１アデノウイルスコード配列に動作的に結合され、他方、第１アデノウイルスコード配列の方はＩＲＥＳに動作的に結合され、前記ＩＲＥＳは、複製に必須の第２アデノウイルスコード配列に結合される。例えば、少なくとも１個の異種ＴＲＥは、Ｅ１ａコード領域のコード配列に動作的に結合され、これらのＥ１ａコード配列もまた、下流のＩＲＥＳに動作的に結合される。ここでＩＲＥＳも、Ｅ１ｂ領域のコード配列に動作的に結合される。
【０１３０】
本明細書では、ある特定の遺伝子から得られたＴＲＥは、その由来の遺伝子によって呼ばれ、その遺伝子を発現する宿主細胞中の動作的に結合するポリヌクレオチド配列の転写を調節するポリヌクレオチド配列である。例えば、本明細書で用いる「ヒト分泌腺カリクライン転写調節エレメント」または「ｈＫＬＫ２−ＴＲＥ」は、ｈＫＬＫ２−ＴＲＥが機能することを可能とする宿主細胞、例えば、アンドロゲン受容体を発現する細胞（好ましくは哺乳類細胞、さらに好ましくはヒト細胞）、例えば、前立腺細胞において、動作的に結合するポリヌクレオチド配列の転写を増進するポリヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列である。従って、ｈＫＬＫ２−ＴＲＥは、アンドロゲン受容体への結合に対して反応性を持ち、ｈＫＬＫ２プロモーターおよび／またはｈＫＬＫ２エンハンサーの少なくとも一部（すなわち、ＡＲＥ、またはアンドロゲン受容体結合部位）を含む。ヒト内分泌腺カリクラインエンハンサー、および該エンハンサーを含むアデノウイルスベクターは、ＷＯ９９／０６５７６に記載される。なお、この特許を参照することにより本明細書に含めることを明言する。
【０１３１】
本明細書で用いる「プロバシン（ｐｒｏｂａｓｉｎ）（ＰＢ）転写調節エレメント」、または「ＰＢ−ＴＲＥ」は、ＰＢ−ＴＲＥが働くのを可能とする宿主細胞、例えば、アンドロゲン受容体を発現する細胞（好ましくは、哺乳類細胞、さらに好ましくは、ヒト細胞、さらに好ましくは前立腺細胞）において動作的に結合するポリヌクレオチド配列の転写を選択的に増大させるポリヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列である。従って、ＰＢ−ＴＲＥは、アンドロゲン受容体への結合に対して反応性を持ち、ＰＢプロモーターおよび／またはＰＢエンハンサーの少なくとも一部（すなわち、ＡＲＥ、またはアンドロゲン受容体結合部位）を含む。アンドロゲンを発現する細胞に対して特異的なアデノウイルスベクターは、ＷＯ９８／３９４６６に記載される。なお、この特許を参照することにより本明細書に含めることを明言する。
【０１３２】
本明細書で用いる「前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の転写調節エレメント」、または「ＰＳＡ−ＴＲＥ」、または「ＰＳＥ−ＴＲＥ」は、ＰＳＡ−ＴＲＥが働くのを可能とする宿主細胞、例えば、アンドロゲン受容体を発現する細胞（好ましくは、哺乳類細胞、さらに好ましくは、ヒト細胞、さらに好ましくは前立腺細胞）において動作的に結合するポリヌクレオチド配列の転写を選択的に増大させるポリヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列である。従って、ＰＳＡ−ＴＲＥは、アンドロゲン受容体への結合に対して反応性を持ち、ＰＳＡプロモーターおよび／またはＰＳＡエンハンサーの少なくとも一部（すなわち、ＡＲＥ、またはアンドロゲン受容体結合部位）を含む。前立腺において活性を持ち、アデノウイルスベクターにおいて使用される組織特異的エンハンサーは、ＷＯ９５／１９４３４およびＷＯ９７／０１３５８に記載される。なお、これらの特許それぞれを参照することにより本明細書に含めることを明言する。
【０１３３】
本明細書で用いる「がん胎児性抗原（ＣＥＡ）転写調節エレメント」、または「ＣＥＡ−ＴＲＥ」は、ＣＥＡ−ＴＲＥが働くのを可能とする宿主細胞、例えば、ＣＥＡを発現する細胞（好ましくは、哺乳類細胞、さらに好ましくは、ヒト細胞）において動作的に結合するポリヌクレオチド配列の転写を選択的に増大させるポリヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列である。従って、ＣＥＡ−ＴＲＥは、ＣＥＡ生産細胞に関連する転写因子および／または補因子（単複）に対して反応性を持ち、ＣＥＡプロモーターおよび／またはＣＥＡエンハンサーの少なくとも一部を含む。がん胎児性抗原を発現する細胞に対して特異的なアデノウイルスベクターは、ＷＯ９８／３９４６７に記載される。なお、この特許を参照することにより本明細書に含めることを明言する。
【０１３４】
本明細書で用いる「アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）転写調節エレメント」または「ＡＦＰ−ＴＲＥ」は、ＡＦＰ−ＴＲＥが働くのを可能とする宿主細胞、例えば、ＡＦＰを発現する細胞（好ましくは、哺乳類細胞、さらに好ましくは、ヒト細胞）において動作的に結合するポリヌクレオチド配列の転写を選択的に増大させるポリヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列である。従って、ＡＦＰ−ＴＲＥは、ＡＦＰ−生産細胞に関連する転写因子および／または補因子（単複）に対して反応性を持ち、ＡＦＰプロモーターおよび／またはエンハンサーの少なくとも一部を含む。アルファ−フェトプロテインを発現する細胞に対して特異的なアデノウイルスベクターは、ＷＯ９８／３９４６５に記載される。なお、この特許を参照することにより本明細書に含めることを明言する。
【０１３５】
本明細書で用いる「ムチン遺伝子（ＭＵＣ）転写調節エレメント」または「ＭＵＣ１−ＴＲＥ」は、ＭＵＣ１−ＴＲＥが働くのを可能とする宿主細胞、例えば、ＭＵＣ１を発現する細胞（好ましくは、哺乳類細胞、さらに好ましくは、ヒト細胞）において動作的に結合するポリヌクレオチド配列の転写を選択的に増大させるポリヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列である。ＭＵＣ１−ＴＲＥは、ＭＵＣ１−生産細胞に関連する転写因子および／または補因子（単複）に対して反応性を持ち、ＭＵＣ１プロモーターおよび／またはエンハンサーの少なくとも一部を含む。
【０１３６】
本明細書で用いる「尿路細胞特異的転写反応エレメント」または「尿路細胞特異的ＴＲＥ」は、尿路上皮特異的ＴＲＥが働くのを可能とする宿主細胞、例えば、標的細胞において動作的に結合するポリヌクレオチド配列の転写を選択的に増大させるポリヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列である。様々の尿路上皮細胞特異的ＴＲＥが既知であり、細胞タンパク質（尿路上皮細胞と関連する転写因子および／または補因子（単複））に対して反応性を持ち、かつ、尿路上皮特異的プロモーターおよび／または尿路上皮特異的エンハンサーの少なくとも一部を含む。例示の尿路上皮細胞特異的転写調節配列は、ヒトまたはげっ歯類のウロプラキン（ｕｒｏｐｌａｋｉｎ；ＵＰ）、例えば、ＵＰＩ、ＵＰＩＩ、ＵＰＩＩＩ等を含む。ヒトの尿路上皮細胞特異的ｕｒｏｐｌａｋｉｎ転写調節配列、および、同配列を含むアデノウイルスベクターは、ＷＯ０１／７２９９４に記載される。なお、この特許を参照することにより本明細書に含めることを明言する。
【０１３７】
本明細書で用いる「メラノサイト細胞特異的転写反応エレメント」または「メラノサイト細胞特異的ＴＲＥ」は、メラノサイト特異的ＴＲＥが働くのを可能とする宿主細胞、例えば、標的細胞において動作的に結合するポリヌクレオチド配列の転写を選択的に増大させるポリヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列である。様々のメラノサイト細胞特異的ＴＲＥが既知であり、細胞タンパク質（メラノサイト細胞と関連する転写因子および／または補因子（単複））に対して反応性を持ち、かつ、メラノサイト特異的プロモーターおよび／またはメラノサイト特異的エンハンサーの少なくとも一部を含む。本明細書には、メラノサイト特異的ＴＲＥの活性を測定するための方法、従って、任意の細胞が、メラノサイト細胞特異的ＴＲＥを機能させるかどうかを決めるための方法が記載される。本発明の実施の際に使用されるメラノサイト特異的ＴＲＥの例としては、チロシナーゼ遺伝子の５’隣接領域から得られるＴＲＥ、チロシナーゼ関連タンパク質１遺伝子、チロシナーゼ関連タンパク質−２遺伝子の５’隣接領域から得られるＴＲＥ、ＭＡＲＴ−１遺伝子の５’隣接領域から得られるＴＲＥ、または、メラノーマにおいて異常に発現される遺伝子の５’隣接領域から得られるＴＲＥが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【０１３８】
別の局面では、本発明は、アデノウイルス複製に必須の遺伝子、または導入遺伝子に動作的に結合されるＰＲＬ−３遺伝子から得られる、転移性結腸がん特異的ＴＲＥを含むアデノウイルスベクターを提供する。本明細書で用いる「ＰＲＬ−３遺伝子から得られる、転移性結腸がん特異的ＴＲＥ」、または「ＰＲＬ−３  ＴＲＥ」は、ＰＲＬ−３  ＴＲＥが働くのを可能とする宿主細胞、例えば、細胞（好ましくは、哺乳類細胞、さらに好ましくは、ヒト細胞、さらに好ましくは転移性結腸がん細胞）において動作的に結合するポリヌクレオチド配列の転写を選択的に増大させるポリヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列である。転移性結腸がん特異的ＴＲＥは、１個以上の調節配列、例えば、同じ、または異なる遺伝子から得られてもよいエンハンサー、プロモーター、転写因子結合部位等を含んでもよい。一つの好ましい実施態様では、ＰＲＬ−３  ＴＲＥは、ＰＲＬ−３プロモーターを含む。一つの好ましいＰＲＬ−３  ＴＲＥは、ＷＯ０４／００９７９０に記載されるように、ＰＲＬ−３遺伝子の翻訳開始コドンの０．６ｋｂ配列上流から得られる。なお、この特許を参照することにより本明細書に含めることを明言する。
【０１３９】
別の局面では、本発明は、アデノウイルス複製に必須の遺伝子、または導入遺伝子に動作的に結合されるＣＲＧ−Ｌ２遺伝子から得られる、肝臓がん特異的ＴＲＥを含むアデノウイルスベクターを提供する。本明細書で用いる「ＣＲＧ−Ｌ２遺伝子から得られる、肝臓がん特異的ＴＲＥ」、または「ＣＲＧ−Ｌ２  ＴＲＥ」は、ＣＲＧ−Ｌ２が働くのを可能とする宿主細胞、例えば、細胞（好ましくは、哺乳類細胞、さらに好ましくは、ヒト細胞、さらに好ましくは肝臓がん細胞）において動作的に結合するポリヌクレオチド配列の転写を選択的に増大させるポリヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列である。肝臓がん特異的ＴＲＥは、１個以上の調節配列、例えば、同じ、または異なる遺伝子から得られてもよいエンハンサー、プロモーター、転写因子結合部位等を含んでもよい。一つの好ましい実施態様では、ＣＲＧ−Ｌ２  ＴＲＥは、米国仮出願第６０／５１１，８１２号に記載されるように、ＣＲＧ−Ｌ２遺伝子の翻訳開始コドンの０．８ｋｂ配列上流から、または該０．８ｋｂ配列内に含まれる０．７ｋｂ配列から、または該０．８ｋｂ配列から得られるＥｃｏＲＩからＮｃｏＩまでの断片から得られてもよい。なお、この特許文書を参照することにより本明細書に含めることを明言する。
【０１４０】
別の局面で、本発明は、アデノウイルス複製に必須の遺伝子、または導入遺伝子に動作的に結合されるＥＢＶ−特異的転写調節エレメント（ＴＲＥ）を含むアデノウイルスベクターを提供する。一つの局面では、ＥＢＶ特異的ＴＲＥは、米国仮出願第６０／４２３，２０３号にさらに記載されるように、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａ、またはＬＭＰ２Ｂ遺伝子の翻訳開始コドンの上流の配列から得られる。なお、この特許文書を参照することにより本明細書に含めることを明言する。ＥＢＶ−特異的ＴＲＥは、１個以上の調節配列、例えば、同じ、または異なる遺伝子から得られてもよいエンハンサー、プロモーター、転写因子結合部位等を含んでもよい。
【０１４１】
さらに別の局面では、本発明は、アデノウイルス複製に必須の遺伝子、または導入遺伝子に動作的に結合される低酸素症特異的転写調節エレメント（「ＨＲＥ」）を含むアデノウイルスベクターを提供する。ＨＲＥは、転写複合体ＨＩＦ−１、または低酸素症誘発因子−１に対する結合部位を含む転写調節エレメントであり、血管内皮増殖因子を含むいくつかの遺伝子の調節領域、および、ｅｎｏｌａｓｅ−１を含む糖分解酵素をコードするいくつかの遺伝子と相互作用を持つ。従って、一つの実施態様では、アデノウイルスベクターは、ＷＯ００／１５８２０にさらに記載されるように、細胞状態特異的ＴＲＥ、例えば、ＨＲＥの転写調節下に、アデノウイルス遺伝子、好ましくは、複製に必須の、アデノウイルス遺伝子を含む。なお、この特許文書を参照することにより本明細書に含めることを明言する。
【０１４２】
さらに別の局面では、本発明は、アデノウイルス複製に必須の遺伝子、または導入遺伝子に動作的に結合される「テロメラーゼプロモーター」または「ＴＥＲＴプロモーター」を含むアデノウイルスベクターを提供する。本明細書で用いる「テロメラーゼプロモーター」または「ＴＥＲＴプロモーター」は、天然のＴＥＲＴプロモーター、および、その機能的断片、突然変異、および誘導体を指す。ＴＥＲＴプロモーターは、全長のプロモーター、または野生型のプロモーターである必要はない。当業者であれば、ＴＥＲＴプロモーターから断片を誘導し、所望の選択性についてそれらを試験する方法を知っている。本発明のＴＥＲＴプロモーター断片は、腫瘍細胞に対して選択的なプロモーター活性を持つ、すなわち、動作的に連結するコード配列の腫瘍選択的発現を駆動する。一つの実施態様では、本発明のＴＥＲＴプロモーターは、哺乳類のＴＥＲＴプロモーターである。別の実施態様では、哺乳類ＴＥＲＴプロモーターは、ヒトのＴＥＲＴ（ｈＴＥＲＴ）プロモーターである。本発明の組成物および方法において有用性が認められる、例示のＴＥＲＴプロモーターについては、例えば、ＷＯ９８／１４５９３およびＷＯ００／４６３５５を参照のこと。
【０１４３】
さらに別の局面では、本発明は、アデノウイルス複製に必須の遺伝子、または導入遺伝子に動作的に結合される「Ｅ２Ｆプロモーター」を含むアデノウイルスベクターを提供する。本明細書で用いる「Ｅ２Ｆプロモーター」は、天然のＥ２Ｆプロモーター、および、その機能的断片、突然変異、および誘導体を指す。Ｅ２Ｆプロモーターは、全長のプロモーター、または野生型のプロモーターである必要はない。当業者であれば、Ｅ２Ｆプロモーターから断片を誘導し、所望の選択性についてそれらを試験する方法を知っている。本発明のＥ２Ｆプロモーター断片は、腫瘍細胞に対して選択的なプロモーター活性を持つ、すなわち、動作的に連結するコード配列の腫瘍選択的発現を駆動する。Ｅ２Ｆプロモーターについてはいくつかの例が知られている。例えば、Ｐａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９７７：３（１０）１１４５−１１４９、ＷＯ０２／０６７８６１、ＵＳ２００１００５３３５２、およびＷＯ９８／１３５０８を参照のこと。
【０１４４】
プロテインウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）、およびその細胞表面受容体、ウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）は、もっとも頻繁に見られる新生物の多くに発現し、がん転移において重要なタンパク質を代表するように見える。両タンパク質共、乳がん、結腸がん、前立腺がん、肝臓がん、腎臓がん、肺がん、および卵巣がんに関与している。ｕＰＡおよびｕＰＡＲの転写を調節する配列エレメントは広範に研究されている。（Ｒｉｃｃｉｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１３：２７５９−２７７１；Ｃａｎｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：２３０３−２３０８；さらにＷＯ９８／３９４６４も参照）。
【０１４５】
（アデノウイルスベクターの調製および生産）
挿入配列発現用アデノウイルスベクター生成のための標準システムは、従来技術で既知であり、市場の供給業者から入手が可能である。例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，カリフォルニア州）から市販されるＡｄｅｎｏ−Ｘ（登録商標）（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２０００年１月）ｐ．１０−１２）、共にＱｂｉｏｇｅｎｅ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）から市販されるＡｄｅｎｏｖａｔｏｒ（登録商標）アデノウイルスベクターシステムおよびＡｄＥａｓｙ（登録商標）である。
【０１４６】
好都合なことに、アデノウイルスの必要部分を供給するプラスミドの利用が可能である。プラスミドｐＸＣ．１（ＭｃＫｉｎｎｏｎ（１９８２）Ｇｅｎｅ  １９：３３−４２）は、Ａｄ５の野性型の左手末端を含む。ｐＢＨＧ１０（Ｂｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）；Ｍｉｃｒｏｂｉｘ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，トロント）は、Ｅ３における欠失を含む、Ａｄ５の右手末端を提供する。ｐＢＨＧ１１は、さらに大きなＥ３欠失を提供する。すなわち、さらに０．３ｋｂが除去される（Ｂｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４））。それとは別に、ｐＢＨＧＥ３（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いることによって、Ｅ３の全長を含む、Ａｄ５の右手末端が得られる。
【０１４７】
早期遺伝子の操作のために、Ａｄ５  Ｅ１Ａの転写開始部位は４９８にあり、Ｅ１Ａコード分節のＡＴＧ開始部位は、ウイルスゲノムの５６０にある。この領域は、異種ＴＲＥの挿入のために使用することが可能である。
【０１４８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることによって制限部位を導入してもよい。その際、使用されるプライマーはＡｄ５ゲノムに限定されてもよいし、あるいは、Ａｄ５ゲノムＤＮＡを担うプラスミド部分を含んでもよい。例えば、ｐＢＲ３２２を用いる場合、プライマーは、ｐＢＲ３２２バックボーンにＥｃｏＲＩ部位を、そして、Ａｄ５のｎｔ１３３９にＸｂａＩ部位を用いてもよい。ＰＣＲを２段階実行することによって、その際、領域の中央で重複するプライマーがヌクレオチド配列変化を導入し、これが一意な制限部位をもたらすと、その部位に異種ＴＲＥを挿入することが可能になる。
【０１４９】
Ｅ１Ｂに対し動作的に結合する異種ＴＲＥエレメントの挿入にも類似の戦略を使用してよい。Ａｄ５のＥ１Ｂプロモーターは、Ｓｐ１およびＴＡＴＡボックスに対して高い親和性を持つ単一認識部位から成る。この領域は、Ａｄ５  ｎｔ１６３６から１７０１に延びる。この領域に細胞特異的異種ＴＲＥを挿入することによって、Ｅ１Ｂ遺伝子の細胞特異的転写を実現することが可能となる。細胞特異的反応エレメント調節性Ｅ１Ａによって改変された左手領域を、Ｅ１Ｂを調節する異種ＴＲＥを導入するための鋳型として用いることによって、得られたアデノウイルスベクターは、Ｅ１ＡとＥ１Ｂ両方の発現について細胞特異的転写因子に依存するようになる。いくつかの実施態様では、Ｅ１Ｂの１９−ｋＤａ領域の一部または全部が除去される。
【０１５０】
同様に、細胞特異的異種ＴＲＥは、その発現を細胞特異的とするために、Ｅ２遺伝子の上流に挿入されてもよい。Ａｄ５の約２７０５０−２７１５０にマップされる、Ｅ２早期プロモーターは、大および小転写開始部位であって、後者は、Ｅ２転写の約５％を占める二つの開始部位、２個の非標準的ＴＡＴＡボックス、２個のＥ２転写因子結合部位、および、１個のＡＴＦ転写因子結合部位から成る（Ｅ２プロモーター構造の詳細については、Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）１９９（ｐａｒｔ３）：１７７−１９４の総説を参照のこと）。
【０１５１】
Ｅ２後期プロモーターは、対向鎖によってコードされる遺伝子のコード配列と重複し、従って遺伝子操作に応じない。しかしながら、Ｅ２早期プロモーターは、僅か数塩基ペアの範囲ではあるが、対向鎖の３３ｋＤタンパク質をコードする配列と重複する。特に、ＳｐｅＩ制限部位（Ａｄ５位置２７０８２）は、前述の３３ｋＤタンパク質の開始コドンの一部であり、好都合にも、大Ｅ２早期転写開始部位とＴＡＴＡ結合タンパク質部位とを、上流の転写因子結合部位Ｅ２ＦおよびＡＴＦとから隔てる。従って、ＳｐｅＩ末端を持つ異種ＴＲＥのＳｐｅＩ部位への挿入は、Ａｄ５の内因性Ｅ２早期プロモーターを破壊することになり、Ｅ２転写の細胞特異的発現を可能とする筈である。
【０１５２】
Ｅ４については、アデノウイルスゲノムの右手部分を用いなければならない。Ｅ４転写開始部位は、Ａｄ５では主に約ｎｔ３５６０５にあり、ＴＡＴＡボックスは約ｎｔ３５６３１にあり、ＯＲＦ  Ｉの最初のＡＵＧ／ＣＵＧは約ｎｔ３５５３２にある。Ｖｉｒｔａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：８２２−８３１．他の遺伝子についても上記の戦略の内の任意のものを用いて、異種ＴＲＥが転写開始部位の上流に導入される。Ｅ４領域に異種ＴＲＥを挿入させた全長アデノウイルスを構築するには、Ｅ４タンパク質をｔｒａｎｓで供給し、これらのタンパク質の合成における欠陥を補償するＷ１６２細胞において同時トランスフェクションおよび相同組み換えを行ってもよい（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：５３８３−５３８６）。
【０１５３】
一つの実施態様では、本発明は、アデノウイルスベクターであって、アデノウイルス遺伝子が第１ＴＲＥの転写調節下にあり、ＡＤＰをコードするポリヌクレオチド配列が第２ＴＲＥエレメントの調節下にあり、かつ、前記アデノウイルス遺伝子が複製に必須であることが好ましいアデノウイルスベクターを提供する。ＡＤＰをコードするＤＮＡ配列、およびＡＤＰのアミノ酸配列は、公共機関から入手が可能である。手短に言うと、ＡＤＰコード配列は、従来技術で既知の技術、例えば、ＰＣＲを用いてＡｄから得られる。Ｙリーダー（後期遺伝子の適正な発現にとって重要な配列である）も入手され、ＡＤＰコード配列に連結される。ＡＤＰコード配列（Ｙリーダーを持つ、または持たない）は次に、アデノウイルスゲノムに、例えば、Ｅ３領域（ここでは、ＡＤＰコード配列は、ＭＬＰによって駆動される）の中に導入される。ＡＤＰコード配列はまた、アデノウイルスゲノムの他の場所に、例えば、Ｅ４領域に挿入することも可能である。別態様として、ＡＤＰコード配列は、異なるタイプのＴＲＥ、例えば、別のウイルスＴＲＥ、ただしこれに限定されない、を含むＴＲＥに動作的に連結されてもよい。一つの実施態様では、本発明のベクターは、その天然のＴＲＥに動作的に結合されるＡＤＰを持つ。
【０１５４】
本発明のウイルスベクターは、従来技術で標準的な組み換え技術を用いて調製が可能である。複製可能または複製不能ウイルスベクターを改変する方法は、従来技術においてよく知られており、本明細書に、また、本明細書に引用される出版物にも記載される。アデノウイルスベクターを改変し、導入遺伝子および所望の転写エレメントをアデノウイルスにおいてクローンするための、様々の方法は、本明細書に記載され、標準的であり、従来技術でよく知られる。アデノウイルスゲノムの様々な部分を含む各種のプラスミドが、アデノウイルスの全ゲノムを含むプラスミドを含めて従来技術には存在する。これらのプラスミドの構築は、従来技術（例えば、ＵＳ２００３０１０４６２５）に十分に記載されている。一旦改変される部位が選択されたならば、適切なプラスミドを用いてその改変を実行することが可能である。次に、改変を、例えば、相同組み換え、またはインビトロ連結を用いて、全長アデノウイルスベクターゲノムの中に導入してもよい。相同組み換えは、例えば、哺乳類細胞（例えば、ＰｅｒＣ６）、または細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＷＯ９６１７０７０を参照のこと）中で行ってもよい。それとは別に、またはそれに加えてさらに、ウイルスベクターゲノムの操作は、よく知られた分子生物学方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＰＣＲ−ＳＯＥｉｎｇ、および制限酵素消化、ただしこれらに限定されないが、を含む方法を含んでもよい。相同組み換えを用いる場合には、二つのプラスミドは、少なくとも約５００ｂｐの配列重複を共有すべきである。もっとも、通常は効率は低くなるが、それよりも小さい重複領域でも組み換えは起こる。要すれば、各プラスミドは独立に操作され、次にコンピテントな宿主に同時トランスフェクトされると、アデノウイルスベクターの継代に好適な相補的遺伝子を提供する。プラスミドは一般に、適切な形質導入手段、例えば、陽イオン性リポソーム、またはリン酸カルシウムを用いて、適切な宿主細胞（例えば、２９３、ＰｅｒＣ．６、Ｈｅｌａ−Ｓ３細胞）に導入される。別態様として、アデノウイルスゲノムの右手および左手部分のインビトロ連結を用いて、アデノウイルスゲノムの全ての複製必須部分を含む組み換えアデノウイルス誘導体を構築することが可能である。Ｂｅｒｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ１１：６００３−６０２０；Ｂｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：６３１−６３８。
【０１５５】
ウイルスベクター用「プロデューサー細胞」は従来技術でよく知られる（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４０８０）。プロデューサー細胞とは、アデノウイルスベクターがその中で運ばれ、複製され、パックされてビリオンとなる細胞である。好ましいパッケージング細胞は、野生型アデノウイルス粒子となる可能性のある相同組み換えを制限するように設計されたものである。ウイルスベクターの必須遺伝子が除去されたり、または不活性化された場合、プロデューサー細胞が、その不活性化遺伝子を補う。本発明のアデノウイルス粒子を生産するために使用することが可能な細胞としては、ヒト胎児腎臓細胞株２９３（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２（１９７７））、ヒト胎児網膜芽細胞株ＰＥＲ．Ｃ６（米国特許第５，９９４，１２８および６，０３３，９０８号；Ｆａｌｌａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：１９０９−１９１７（１９９８））、およびヒト頸部腫瘍由来細胞株ＨｅＬａ−Ｓ３（ＰＣＴ出願番号ＵＳ０４／１１８５５）が挙げられる。それとは別に、またはそれに加えて、プロデューサー細胞は、ウイルスベクターにおいて選択的に調節または不活性化される遺伝子を発現してもよい。本発明の一つの実施態様は、本発明のアデノウイルスベクターを含むプロデューサー細胞を含む。
【０１５６】
（キメラアデノウイルス線維タンパク質）
アデノウイルスの線維タンパク質は、ビリオンの、細胞受容体に対する付着にとって重要な役割を果たす。従来技術において、数種の異なるアデノウイルス血清型から得られた線維遺伝子の配列が知られる。線維タンパク質は三つのドメインに分割される。保存されるＮ末端は、ペントン基との連結、および核局在信号を担当する配列を含む。様々の長さを持つロッド様「シャフト」は、１５−アミノ酸ベータ構造から成る反復を含み、反復の数は、Ａｄ３の６から、Ａｄ５の２２の範囲に渡る。配列ＴＬＷＴを含む、アミノ酸の保存直線部が、シャフトのベータ構造の反復単位と、小球状のヘッドドメインとの間の境界を識別する。Ｃ末端ヘッドドメインは、サイズにおいて、Ａｄ４１の短線維における１５７アミノ酸残基から、Ａｄ５線維の１８８残基までの範囲に渡る。線維スパイクはホモトリマーであり、ビリオン当たり１２本のスパイクがあり、これらは、ペントン基複合体との連結を介して付着する。線維タンパク質は、機能的であるためには、３重合することができなければならない。３重合ドメインは、天然ドメインであっても、または異種の３重合ドメインであってもよい。
【０１５７】
本発明において有用なキメラアデノウイルス線維は、サブグループＣアデノウイルス（例えば、Ａｄ１、２、５、および６血清型）のシャフト領域の少なくとも一部、および、サブグループＢアデノウイルス（例えば、Ａｄ３、７、１１、１４、１６、２１、３５、および５０）のヘッド領域の少なくとも一部を含む。その際、ヘッド領域はＣＤ４６に結合する。一つの実施態様では、完全なシャフト領域がＡｄ２またはＡｄ５から得られ、完全なヘッド領域がＡｄ３５から得られる。別の実施態様では、キメラ線維は、サブグループＣアデノウイルスシャフト領域の一部、および、ＣＤ４６に結合するアデノウイルスのヘッド領域を含む。ＣＤ４６に結合する線維ヘッド領域は、Ａｄ３（Ｓｉｒｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００４Ｍａｙ；７８（９）：４４５４−６２）、１１、１４、１６、２１、３５、３７、および５０から得られるものであるが、ただしそれらに限定されない。別の実施態様では、キメラ線維タンパク質は、ウシのアデノウイルスシャフトドメイン、および、Ａｄ３、７、１１、１４、１６、２１、３５、３７、５０、およびサブグループＤアデノウイルスからなる群より選択されるアデノウイルス血清型から得られたヘッド領域の一部を含む。別の実施態様では、キメラ線維タンパク質は、サブグループＣアデノウイルスシャフト領域の一部、および、サブグループＤアデノウイルスのヘッド領域の一部を含む。下記の実施例において、Ａｄ２またはＡｄ５由来アデノウイルスベクターで、Ａｄ２またはＡｄ５シャフトおよびＡｄ３５ヘッド領域を含むキメラ線維を有するアデノウイルスベクターは、天然のＡｄ５またはＡｄ３５線維タンパク質を有する同じアデノウイルスベクターよりも効率的にある種の原発性腫瘍細胞に形質導入することが証明された。当業者であれば、原発性腫瘍細胞に対する形質導入の強化を維持しながら、キメラ線維タンパク質に対しさらに別の改変を施すことが可能であることは認識されるであろう。
【０１５８】
ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＡ７５３３１は、Ａｄ３５線維の配列を開示する。これは例示の配列であり、いくつかのゲノム変異種が存在する（Ｆｌｏｍｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．，１５５（６）１１２７−１１３４（１９８７））。本発明を実施するに際し、Ａｄ３５ヘッド領域から得られるアデノウイルスのタンパク質部分は、任意のＡｄ３５ゲノム変異種から得られてもよい。
【０１５９】
従来技術および本明細書で与えられる参考文献案内で知られるＡｄ２、Ａｄ５、およびＡｄ３５の配列情報があるからには、当業者であれば、腫瘍細胞、特に、原発性腫瘍細胞に対する形質導入の強化を実現するために、Ａｄ２またはＡｄ５シャフトの適切な部分、およびＡｄ３５ヘッドの適切部分を組み合わせることは可能である。例えば、当業者であれば、様々な配列部分の組み合わせ方を決めるために、欠失および置換分析を実行することが可能である。
【０１６０】
一つの実施態様では、キメラ線維タンパク質は、アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）の完全な線維シャフト（配列番号２のアミノ酸４７から３９９）、または、Ａｄ２の完全な線維シャフト（配列番号４のアミノ酸４７から３９９）を含む。別の実施態様では、キメラ線維タンパク質は、アデノウイルス血清型３５の線維タンパク質由来のヘッド領域（配列番号６のアミノ酸４６から１３２）を含む。別の実施態様では、キメラ線維タンパク質は、アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）の完全な線維シャフト（配列番号２のアミノ酸４７から３９９）、または、Ａｄ２の完全な線維シャフト（配列番号４のアミノ酸４７から３９９）、および、アデノウイルス血清型３５の線維タンパク質由来のヘッド領域（配列番号６のアミノ酸４６から１３２）を含む。別の実施態様では、キメラ線維タンパク質は、Ａｄ２またはＡｄ５線維シャフトから得られた配列部分、および、Ａｄ３５のヘッド領域から得られた配列部分を含む。
【０１６１】
一つの実施態様では、Ａｄ５またはＡｄ２シャフト領域は、ＫＫＴＫ配列（配列番号２または配列番号４のアミノ酸９１−９４）を保持する。別の実施態様では、天然シャフト配列中のＫＫＴＫ配列（配列番号２または配列番号４の残基９１−９４）は、除去されるか、変異される。一つの実施態様では、Ａｄ５シャフトは、ＫＬＧＴＧＬＳＦＤ配列（配列番号２のアミノ酸３７６−３８４）を保持し（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００３  Ｊｕｌ；７７（１３）：７２２５−３５）、Ａｄ２シャフトは、ＫＬＧＡＧＬＳＦＤ配列（配列番号４のアミノ酸３７６−３８４）を保持するか、あるいは、該シャフトは、共通モチーフＫＬＧＸＧＬＸＦＤ／Ｎ（配列番号７；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．２００３）を含む。一つの実施態様では、Ａｄ５シャフトは、屈曲性ドメインを持つ、シャフトの第３反復領域を含むＧＮＬＴＳＱＮＶＴＴＶＳＰＰＬＫＫＴＫ（配列番号２のアミノ酸７６−９４）を保持する。ある別の実施態様では、Ａｄ３５シャフトは、該シャフトの第３反復列（ＧＴＬＱＥＮＩＲＡＴＡＰＩＴＫＮＮ）を含む。これは、線維の屈曲性に与る配列（配列番号６のアミノ酸７６−９２）を欠く。
【０１６２】
キメラ線維タンパク質は、さらに別の改変、例えば、ある特定の細胞タイプ、または１種を超える細胞タイプに対するウイルスベクター粒子の結合を低減するもの、ある特定の細胞タイプ、または１種を超える細胞タイプに対するウイルスベクター粒子の結合を強化するもの、および／または、動物におけるアデノウイルスベクターに対する免疫応答を低減させるものを含む改変をさらに含んでもよいが、改変は上記に限定されない。このような改変の例は、米国出願第１０／４０３，３３７号、ＷＯ９８／０７８７７、ＷＯ０１／９２２９９、ＷＯ２００３／６２４００、および米国特許第５，９６２，３１１、６，１５３，４３５、６，４５５，３１４、およびＷｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００３  Ｊｕｌ  １；７７（１３）：７２２５−７２３５）に記載されるものを含むが、ただしこれらに限定されない。
【０１６３】
キメラ線維タンパク質のＨＩループ、またはカルボキシル末端には非天然性リガンドが含まれてもよい。
【０１６４】
（自己プロセシング切断部位および２Ａ様配列）
本発明の別の局面では、一つのｍＲＮＡから二つのポリペプチドを発現するために、「自己プロセシング切断部位」（例えば、２Ａ様配列）が利用される。「自己プロセシング切断部位」または「自己プロセシング切断配列」は、ＤＮＡまたはアミノ酸配列であって、翻訳されると、自己プロセシング切断部位を含むポリペプチドの、速やかな分子内（ｃｉｓ）切断が起こり、それぞれ別々の成熟タンパク質、またはポリペプチド産物が得られる、ＤＮＡまたはアミノ酸配列と定義される。このような「自己プロセシング切断部位」はまた、翻訳後、または翻訳時処理切断部位と呼ばれてもよく、本明細書では、２Ａ部位、配列、またはドメインと表示される。本明細書で用いる「自己プロセシングペプチド」は、事故処理切断部位または配列であって、翻訳されると、自己プロセシング切断部位を含むタンパク質またはポリペプチドの、速やかな分子内（ｃｉｓ）切断を仲介し、それぞれ別々の成熟タンパク質、またはポリペプチド産物を生成する、事故処理切断部位または配列をコードするＤＮＡ配列のペプチド発現産物と、本明細書では定義される。２Ａ部位、配列、またはドメインは、リボソームの活性を改変してエステル結合の加水分解を促進し、それによって、ある１個の下流翻訳産物の合成の進行を可能とするやり方で、翻訳複合体からポリペプチドを放出させる、そのような翻訳作用を呈示することが報告されている（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．２００１  Ｍａｙ；８２（Ｐｔ５）：１０１３−２５）。それとは別に、２Ａ部位、配列、またはドメインは、ｃｉｓの、自身のＣ末端を切断することによって「自己タンパク質分解」または「切断」を呈示し、一次切断産物を生成することも報告されている（Ｆｕｒｌｅｒ；Ｐａｌｍｅｎｂｅｒｇ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：６０３−６２３（１９９０））。
【０１６５】
２Ａ配列の変異種について、その、ポリタンパク質の効率的処理仲介能力に関して試験された（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１（２００１））。相同体および変異２Ａ配列は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１６６】
オープンリーディングフレームの間において、自己プロセシング切断配列、例えば、２Ａまたは２Ａ様配列をコードする配列を含むベクター構築物は、切断後、自己プロセシング切断配列を含むアミノ酸を取り除くために、該自己プロセシング切断配列に隣接してさらに別のタンパク質分解切断部位を含んでもよい。この「追加のタンパク質分解性切断部位」という用語は、自己プロセシング切断部位、例えば、２Ａまたは２Ａ様配列に連接して本発明のアデノウイルスベクターに組み込まれ、自己プロセシング切断配列による切断後に残留する付加的アミノ酸を除去する手段を与える配列を指す。例示の「追加のタンパク質分解性切断部位」は本明細書に記載されるが、共通配列ＲＸＫ（Ｒ）Ｒを有するフリン分断部位を含むが、ただしそれに限定されない。オープンリーディングフレームの間において、自己プロセシング切断配列、例えば、２Ａまたは２Ａ様配列をコードする配列を含み、さらに追加のタンパク質分解切断部位を含むベクター構築物が、これも米国特許出願第１０／８３１，３０２号に記載されている。なお、この特許を参照することにより本明細書に含めることを明言する。
【０１６７】
一つの実施態様では、本発明は、残留アミノ酸を除去するための方法、および、同方法発現のための組成物を提供する。タンパク質のＣ末端からの付加的アミノ酸の除去を実行する、新規の構築物がいくつか設計されている。フリン切断は、Ｃ末端における、共通配列ＲＸＲ（Ｋ）Ｒを持つ切断部位で起こる。Ｘは任意のアミノ酸である。一つの局面で、本発明は、カルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）と呼ばれる一群の酵素、例えば、カルボキシペプチダーゼＤ、Ｅ、およびＨ（ＣＰＤ、ＣＰＥ、ＣＰＨ）を含む、がそれらに限定されない、酵素群から選ばれる酵素を用いることによって、タンパク質のＣ末端から、新規に暴露された塩基性アミノ酸残基ＲまたはＫを除去するための手段を提供する。ＣＰは、タンパク質のＣ末端における塩基性アミノ酸残基を取り除くことが可能であるから、もっぱら塩基性アミノ酸残基ＲまたはＫ、例えば、ＲＫＫＲ（配列番号２５）、ＲＫＲＲ（配列番号２６）、ＲＲＲＲ（配列番号２７）を含む、フリン切断部位から得られる全てのアミノ酸残基は、ＣＰによって除去することが可能である。
【０１６８】
本発明の一つの実施態様では、自己プロセシング切断部位（例えば、２Ａまたは２Ａ様配列）は、アデノウイルスタンパク質コード領域および導入遺伝子に動作的に結合される。アデノウイルスタンパク質ＣＤＳは、導入遺伝子を下流とし、自己プロセシング切断部位の上流にあってもよい。別態様として、導入遺伝子ＣＤＳは、アデノウイルスタンパク質ＣＤＳを下流とし、自己プロセシング切断部位の上流にあってもよい。
【０１６９】
複数のＣＤＳは、自己プロセシング切断部位によって結合されてもよい。一つの実施態様では、Ａｄ  ＣＤＳは、自己プロセシング切断部位によって、第１導入遺伝子に動作的に結合され、前記第１導入遺伝子は、自己プロセシング切断部位によって、第２導入遺伝子に動作的に結合される。一つの実施態様では、第１および第２導入遺伝子は、同じか、または異なるタンパク質をコードする。
【０１７０】
（導入遺伝子）
本発明のベクターは、１個以上の導入遺伝子を含んでもよい。このようにして、様々な遺伝的能力を標的細胞に導入することが可能である。
【０１７１】
「サイトカイン」、またはその文法的等価物としては、ただし限定されないが、局所的に作用し、血液中を循環しないホルモンであって、本発明に従って用いられると、個体の免疫応答の変更をもたらすホルモンが挙げられる。さらに、サイトカインの定義に含まれるものとして、個体の免疫応答の変更をもたらす接着または補助分子が挙げられる。従って、サイトカインの例としては、ただし限定されないが、ＩＬ−１（ａまたはＰ）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＬＴ、ＴＧＦ−Ｐ、ｙ−ＩＦＮ、ａ−ＩＦＮ、Ｐ−ＩＦＮ、ＴＮＦ−ａ、ＢＣＧＦ、ＣＤ２、またはＩＣＡＭが挙げられる。前述のサイトカイン、およびその他の適用可能な免疫調節剤の記述は、「Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」，Ａ．Ｓ．Ｈａｍｌｉｎ，Ｄ．Ｍａｌｅ（ｅｄ．），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３））、または、「Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ  ｔｏ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」，Ｎ．Ａ．Ｎｉｃｏｌａ（ｅｄ．），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９５））の中に見出すことが可能である。ヒトにおける治療的使用を意図する場合、サイトカインは、ヒトのタンパク質形と実質的に類似することが好ましく、あるいは、ヒトの配列（すなわち、ヒト起源の）から得られたものであることが好ましい。一つの好ましい実施態様では、導入遺伝子は、サイトカイン、例えば、ＧＭ−ＣＳＦである。
【０１７２】
さらに、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−ａ、およびその他に対し、実質的に構造的な相同性、および／または、アミノ酸配列同一性を持つ、他の哺乳類のサイトカインも、免疫系に対し類似の活性を示すことが証明された場合は、本発明にとって有用である。同様に、任意の特定のサイトカインと実質的に類似するが、タンパク質配列の保存的変化を持つタンパク質も、本発明にとって有用と考えられる。従って、タンパク質配列における保存的置換は、タンパク質分子の機能性を妨げることなく可能と考えられるから、本発明においてサイトカインとして機能しながら、現在既知の配列とは若干異なるアミノ酸配列を持つタンパク質を調製することは可能である。このような保存的置換としては、通常、下記のグループ、すなわち、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン、内部における置換が挙げられる。
【０１７３】
最後に、本出願書における「サイトカイン」の単数形または複数形は、指示詞として使用されるのではなく、本発明および請求項の解釈を制限するものではない。サイトカインの外に、接着または補助分子、またはそれらの組み合わせも、単独、またはサイトカインと組み合わせて用いることが可能である。
【０１７４】
顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、線維芽細胞、内皮細胞、Ｔ細胞、およびマクロファージによって生産されるサイトカインである。このサイトカインは、顆粒球およびマクロファージ系統の造血細胞の増殖を誘発することが明らかにされている。さらに、このサイトカインは、免疫系の主要抗原提示細胞（ＡＰＣ）である樹状細胞の抗原処理および提示機能を活性化する。動物モデル実験の結果は、ＧＭ−ＣＳＦ生産腫瘍細胞（すなわち、ＧＶＡＸ）は、両親から受け継いだ、非形質導入性腫瘍細胞に対する免疫応答を誘起することが可能であることを疑問の余地無く示した。
【０１７５】
ＧＭ−ＣＳＦは、強力な抗腫瘍反応を刺激することが可能な、樹状細胞（ＤＣ）サブクラスの抗原提示能力を増強する（Ｇａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ１９９１  Ｍａｒ１５；７７（６）：１１３１−４５；Ｍａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０００  Ｊｕｎ１５；６０（１２）：３２３９−４６；ＭａｃｈおよびＤｒａｎｏｆｆによる総説、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  Ｏｃｔ；１２（５）：５７１−５）。例えば、Ｂｏｏｎ  ａｎｄ  Ｏｌｄ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７  Ｏｃｔ  １；９（５）：６８１−３）を参照のこと。排出リンパ節においてＴ細胞に対し腫瘍抗原エピトープを提示することは、腫瘍転移に対する全身の免疫応答をもたらすことが予測される。さらに、ＧＭ−ＣＳＦを発現する腫瘍細胞の照射は、腫瘍攻勢に対する強力なワクチンとして機能することが示された（「ＧＶＡＸ」という表題の下に、本節の下記にさらに説明される）。一般に改変細胞によって運ばれる、ある種のサイトカインの高濃度の局在は、腫瘍の減衰をもたらすことが見出されている（Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２１：５８７−５９２（１９９５）；Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：７８２０−７８２５（１９９０）；Ｆｏｒｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｔ．Ｒｅｖｉｅｗｓ７：２８９−３０９（１９８８））。国際公開ＷＯ２０００７２６８６は、各種サイトカインを発現する腫瘍細胞を記載する。
【０１７６】
本発明の一つの実施態様では、アデノウイルスは、原発性腫瘍細胞において発現されるように、調節エレメントに動作的に結合されるＧＭ−ＣＳＦコード配列を含む。一つの実施態様では、このＧＭ−ＣＳＦコード配列は、ヒトのＧＭ−ＣＳＦをコードする。別態様として、ＧＭ−ＣＳＦコード配列は、ネズミのＧＭ−ＣＳＦをコードしてもよい。ある実施態様では、ＧＭ−ＣＳＦのコード配列は、ｃＤＮＡ配列（例えば、配列番号１６）である。言い換えると、ＧＭ−ＣＳＦのコード配列は、翻訳の前にスプライシングで切り落とされるイントロン配列を含まない。別の実施態様では、ＧＭ−ＣＳＦのコード配列は、ゲノムコード配列（例えば、配列番号１５）である。言い換えると、このコード配列は、翻訳の前にスプライシングによって切り落とされる、少なくとも１個の天然ＧＭ−ＣＳＦイントロンを含む。一つの実施態様では、ＧＭ−ＣＳＦコード配列は、配列番号１４をコードする。ＧＭ−ＣＳＦコード配列の、他の例が、ＧｅｎＢａｎｋのアクセス番号、ＡＦ３７３８６８、ＡＣ０３４２２８、ＡＣ０３４２１６，Ｍ１０６６３、およびＮＭ０００７５８において見られる。
【０１７７】
一つの実施態様では、導入遺伝子はマーカーをコードする。別の実施態様では、導入遺伝子は、細胞傷害性タンパク質をコードする。細胞傷害性タンパク質をコードするベクターは、細胞傷害活性の速度を強化することによって治療効力の程度を増強するために使用されてもよい。これは、調節されるウイルス複製と対応する選択的細胞傷害性を、１種以上の代謝的酵素の発現と結合させることによって実現が可能である。そのような酵素としては、例えば、ＨＳＶ−ｔｋ、ニトロレダクターゼ、シトクロームＰ４５０またはシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、これらの酵素は、細胞に、５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）を分解して化学療法剤５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）とする能力を与える、カルボキシルエステラーゼ（ＣＡ）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）、プリンヌクレオチドフォスフォリラーゼ（ＰＮＰ）、カルボキシペプチダーゼＧ２（ＣＰＧ２；Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−Ｄｕｖａｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００４  Ｍａｙ６；４７（１０）：２６５１−２６５８）、チミジンフォスフォリラーゼ（ＴＰ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、またはキサンチン−グアニンフォスロリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）がある。このタイプの導入遺伝子は、バイスタンダー効果を付与するために使用してもよい。
【０１７８】
本発明のアデノウイルスベクターに含めてもよい導入遺伝子のさらに別の例としては、アポトーシス、アンチセンス、またはリボザイムを起動することが可能な因子であって、特に、細胞または病原体の増殖にとって必須のタンパク質をコードするｍＲＮＡに向けられる因子が挙げられる。そのようなタンパク質としては、例えば、構造タンパク質、転写因子、ポリメラーゼ等、ウイルスまたは他の病原性タンパク質であって、病原体が細胞内で増殖するもの、細胞傷害性タンパク質、例えば、ジフテリア連鎖、リシン、アブリン等、ヌクレアーゼ（例えば、ＲＮアーゼ）またはプロテアーゼ（例えば、トリプシン、パパイン、プロテイナーゼＫ、カルボキシペプチダーゼ等）の加工された細胞質変異種をコードする遺伝子、ケモカイン、例えば、ＭＣＰ３アルファまたはＭＩＰ−１、ウイルス、細菌、または哺乳類細胞から得られる孔形成タンパク質、融合起動遺伝子、化学療法感受性強調遺伝子、および放射線感受性強調遺伝子がある。興味のある他の遺伝子としては、サイトカイン、抗原、膜貫通タンパク質など、例えば、ＩＬ−１，ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、またはｆｌｔ３、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＩＦＮ−α、β、γ、ＴＮＦ−α、β、ＴＧＦ−α、β、ＮＧＦ、ＭＤＡ−７（メラノーマ分化関連遺伝子−７、ｍｄａ−７／インターロイキン−２４）が挙げられる。さらに他の例としては、アポトーシス促進遺伝子、例えば、Ｆａｓ、Ｂａｘ、カスパーゼ、ＴＲＡＩＬ、Ｆａｓリガンド、酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）等；細胞融合をもたらす、または細胞融合を促進する融合遺伝子、例えば、Ｖ２２、ＶＳＶ等；腫瘍抑制遺伝子、例えば、ｐ５３、ＲＢ、ｐ１６、ｐ１７、Ｗ９等；細胞サイクルに関連する遺伝子、および、抗血管形成タンパク質、例えば、エンドスタチン、アンギオスタチン等をコードする遺伝子が挙げられる。
【０１７９】
本発明の実施に際しては、関連する任意の遺伝子またはコード配列の使用が可能であるが、ある種の遺伝子、またはその断片が特に好適である。例えば、免疫原性ポリペプチド、トキシン、免疫トキシン、およびサイトカインをコードするコード領域は、本発明の実施において有用である。これらのコード領域は、前述のものを含むが、さらに新たなコード領域としては、下記をコードするものが挙げられる。すなわち、免疫細胞との相互作用を刺激するタンパク質、例えば、Ｂ７、ＣＤ２８、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＴＡＰ、腫瘍関連抗原、例えば、ＭＡＲＴ−１から得られる免疫原性配列、ｇｐ１００（ｐｍｅｌ−１７）、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、チロシナーゼ関連タンパク質−２、メラノサイト刺激ホルモン受容体、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ１２、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、β―カテニン、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ−４、カスパーゼ８、ＫＩＡ０２０５、ＨＬＡ−Ａ２Ｒ１７０１、α−フェトプロテイン、テロメラーゼ触媒タンパク質、Ｇ−２５０，ＭＵＣ−１、がん胎児性タンパク質、ｐ５３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、トリオースフォスフェートイソメラーゼ、ＣＤＣ−２７、ＬＤＬＲ−ＦＵＴ、テロメラーゼ逆転写酵素、ＰＳＭＡ、抑制シグナルを阻止する（ＣＴＬＡ４阻止）抗体のｃＤＮＡ、ケモカイン類（ＭＩＰ１α、ＭＩＰ３α、ＣＣＲ７リガンド、およびカルレチクリン）、抗血管形成遺伝子で、ＭＥＴＨ−１、ＭＥＴＨ−２、ＴｒｐＲＳ断片をコードする遺伝子を含むが、ただしそれらに限定されない、プロリフェリン関連タンパク質、プロラクチン断片、ＰＥＤＦ、バソスタチン、細胞外基質タンパク質および増殖因子／サイトカイン阻害剤の各種断片、細胞外基質タンパク質、例えば、アンギオテンシン、エンドスタチン、キニノスタチンを含む、ただしそれらに限定されない、細胞外基質タンパク質の各種断片、フィブリノーゲンＥ断片、トロンボスポンジン、ツムスタチン、カンスタチン、レスチン、増殖因子／サイトカイン抑制因子であって、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ拮抗剤を含む、ただしそれらに限定されない、増殖因子／サイトカイン抑制因子、ｓＦｌｔ−１、ｓＦｌｋ、ｓＮＲＰ１、アンギオポエチン／ｔｉｅ拮抗因子、ｓＴｉｅ−２、ケモカイン（ＩＰ−１０，ＰＦ−４、Ｇｒｏ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ（Ｍｉｇ）、ＩＦＮα、ＦＧＦ／ＦＧＦＲ拮抗因子（ｓＦＧＦＲ）、エフリン／Ｅｐｈ拮抗因子（ｓＥｐｈＢ４およびセフリンＢ２）、ＰＤＧＦ、ＴＧＦβ、およびＩＧＦ−１である。本発明の実施において好適に使用される遺伝子は、下記のタンパク質をコードしてもよい。すなわち、酵素（例えば、ウレアーゼ、レニン、トロンビン、金属プロテアーゼ、酸化窒素シンターゼ、スーパーオキシドムターゼ、カタラーゼ、および当業者に既知の他のもの）、酵素抑制因子（例えば、アルファ１−アンチトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ、細胞性またはウイルス性プロテアーゼ抑制因子、プラスミノゲン活性化抑制因子−１、金属プロテアーゼの組織抑制因子等）、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節（ＣＦＴＲ）タンパク質、インスリン、ジストロフィン、または、クラスＩまたはＩＩの、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）抗原である。さらに有用なのは、対応遺伝子の発現を変調／調節することが可能なポリペプチド、細菌、寄生虫、またはウイルスの感染、またはその発達を抑制することが可能なポリペプチド（例えば、抗原性ポリペプチド、抗原性エピトープ、および、競合によって天然タンパク質を抑制する膜貫通タンパク質変異種）、アポトーシス誘発因子または抑制因子（例えば、Ｂａｘ、Ｂｃ１２、Ｂｃ１Ｘ、および、その他の、当業者に既知のもの）、静菌性因子（例えば、ｐ２１、ｐ１６、Ｒｂ等）、アポリポタンパク質（例えば、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ等）、酸素ラジカル捕食因子、抗腫瘍作用を持つポリペプチド、抗体、トキシン、免疫トキシン、マーカー（例えば、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等）をコードする遺伝子、あるいは、臨床状態の治療または予防のために有用であると従来技術において認知済みの、他の、任意の興味の遺伝子である。さらに別の導入遺伝子としては、細胞分裂またはシグナル変換を抑制するポリペプチド、腫瘍抑制タンパク質（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、ｐ７３）、宿主の免疫系を活性化するポリペプチド、任意にサイトカインと組み合わされる、腫瘍関連抗原（例えば、ＭＵＣ−１、ＢＲＣＡ−１、ＨＰＶ早期または後期抗原、例えば、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、Ｌ２等）をコードする遺伝子が挙げられる。
【０１８０】
本発明はさらに、２個以上の導入遺伝子の組み合わせを含むアデノウイルスベクターを含む。ある場合には、２個以上の導入遺伝子は、協調的、相補的、および／または、非重複的毒性および作用法を持つ。
【０１８１】
本発明のアデノウイルスベクターを設計するに際しては、導入遺伝子の生物学的活性が考慮される。例えば、ある場合には、導入遺伝子は、アデノウイルス感染の早期段階または後期段階においては、該導入遺伝子のみが、または多くの場合発現されるようにベクターに挿入されると有利である。いくつかの導入遺伝子の場合、導入遺伝子を、ウイルスのライフサイクルの早い時期に発現することが好ましい。そのような場合、導入遺伝子は、早期領域（例えば、Ｅ３）の内の任意のもの、または上流のＬ１領域に挿入される。
【０１８２】
（ＧＶＡＸ）
本発明はまた、キメラ線維タンパク質を持つアデノウイルスによって形質導入された腫瘍細胞を供給することによって、標的抗原（単数）または抗原（複数）に対する個体の免疫応答を変える方法にも関する。その際、キメラ線維タンパク質は、Ａｄ５またはＡｄ２シャフトの少なくとも一部、および、Ａｄ３５ヘッドの少なくとも一部を含む。典型的には、腫瘍細胞は原発性腫瘍細胞である。例示の腫瘍細胞としては、同じ個体（自己由来）から得られた、または、異なる個体（同種異系）から得られた腫瘍細胞が挙げられる。別の実施態様では、腫瘍細胞は、治療される腫瘍またはがんと同じタイプの腫瘍細胞株由来のものである。
【０１８３】
本発明はさらに、キメラ線維タンパク質を持つアデノウイルスによって形質導入された腫瘍細胞を哺乳動物に投与することによって、腫瘍細胞に対する免疫応答を増強する方法にも関する。その際、キメラ線維タンパク質は、Ａｄ５またはＡｄ２シャフトの少なくとも一部、および、Ａｄ３５ヘッドの少なくとも一部を含み、腫瘍細胞に対する哺乳動物の免疫応答は増強される。一つの実施態様では、増強免疫応答は体液性である。別の実施態様では、増強免疫応答は細胞性である。さらに別の実施態様では、増強免疫応答は、細胞性および体液性の両方である。
【０１８４】
関連実施態様では、方法はさらに、形質導入された腫瘍細胞を不活性化し、該細胞を哺乳動物に投与することを含む。投与される腫瘍細胞は、自己由来の形質導入腫瘍細胞、異種細胞、またはバイスタンダー細胞（下記にさらに定義する）であってもよい。通常、形質導入腫瘍細胞は、投与前に増殖不能とされる。一つの実施態様では、哺乳動物は、形質導入腫瘍細胞と同じタイプの腫瘍細胞を抱えるヒトである。ある好ましい実施態様では、哺乳動物の腫瘍細胞は、形質導入腫瘍細胞の投与の後増殖抑制または細胞死を呈する。
【０１８５】
さらに別の局面では、本発明は、少なくとも一つのヒトサイトカインをコードする核酸を含む、キメラ組み換えアデノウイルスの形質導入によって遺伝学的に改変された、増殖不能腫瘍細胞の治療的有効量を投与することによって、腫瘍に対する哺乳動物の、全身の免疫応答を刺激する方法を提供する。その際、形質導入腫瘍細胞と腫瘍は同じタイプであり、少なくとも一つの共通抗原を発現する。
【０１８６】
ある実施態様では、腫瘍に対する全身性免疫応答は、腫瘍の後退をもたらすか、または、腫瘍の増殖を抑制する。
【０１８７】
一つの実施態様では、腫瘍細胞は、腫瘍を抱える哺乳動物、例えば、ヒトから得られる。ある実施態様では、腫瘍細胞は、投与前に寒冷保存される。ある実施態様では、治療される腫瘍細胞のタイプは、前立腺腫瘍、メラノーマ、非小細胞型肺がん、乳がん、上皮がん、膀胱がん、前立腺がん、頭頸部がん、先行性新生病変、がん性ポリープ、卵巣がん、頸がん、白血病、および腎臓がんからなる群より選択される。治療される腫瘍細胞のタイプが前立腺がんである場合、前立腺腫瘍細胞株が、ＤＵ１４５、ＰＣ−３、およびＬｎＣａＰからなる群より選択される。
【０１８８】
本発明の一つの好ましい実施態様では、本発明のアデノウイルスベクターは、ヒトのＧＭ−ＣＳＦ導入遺伝子を、体外で、ヒトの原発性腫瘍細胞に伝播するために利用される。形質導入後、細胞は照射されて増殖不能とされる。次に、この増殖不能ＧＭ−ＣＳＦ発現細胞は、（例えば、皮内または皮下ルートを通じて）患者に再び投与されることによって、がんワクチンとして働く。
【０１８９】
腫瘍細胞は、自己由来腫瘍細胞、異種腫瘍細胞、および腫瘍細胞株からなる群より選択される。腫瘍細胞は、インビトロ、エキソビボ、またはインビボにおいて形質導入されてよい。サイトカイン、例えば、ＧＭ−ＣＳＦを発現するように遺伝学的に改変され、次に、がんの治療のために患者に再投与される、自己由来および異種がん細胞は、米国特許第５，６３７，４８３、５，９０４，９２０、および６，３５０，４４５号に記載される。なお、これらの特許を、参照することにより本明細書に含めることを明言する。膵臓がんの治療のために、ＧＭ−ＣＳＦを発現するように遺伝学的に改変された腫瘍細胞の１形、すなわち、「サイトカイン発現細胞ワクチン」（「ＧＶＡＸ」）が米国特許第６，０３３，６７４および５，９８５，２９０号に記載されている。なお、これらの特許を、参照することにより本明細書に含めることを明言する。遺伝学的に改変された汎用免疫変調バイスタンダー細胞株が、米国特許第６，４６４，９７３号に記載されている。なお、この特許を、参照することにより本明細書に含めることを明言する。
【０１９０】
ＧＭ−ＣＳＦ発現細胞ワクチン（ＧＶＡＸ）を用いた臨床試験が、前立腺がん、メラノーマ、肺がん、膵臓がん、腎臓がん、および多発性骨髄症の治療のために行われた。ＧＶＡＸ細胞ワクチンを用いたいくつかの臨床試験が、特にメラノーマにおいて、また、前立腺がん、腎臓がん、および膵臓がんについて記載されている（Ｓｉｍｏｎｓ  ＪＷ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９９；５９：５１６０−５１６８；Ｓｉｍｏｎｓ  ＪＷ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９７；５７：１５３７−１５４６；Ｓｏｉｆｆｅｒ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９８；９５：１３１４１−１３１４６；Ｊａｆｆｅｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００１；１９：１４５−１５６；Ｓａｌｇｉａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００３  ２１：６２４−３０；Ｓｏｉｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００３  ２１：３３４３−５０；Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．２００４  Ｆｅｂ１８  ９６（４）：３２６−３１）。
【０１９１】
本発明は、哺乳類被験体、好ましくはヒトの患者において、がんに対する免疫応答の改善を刺激する方法を提供する。方法は、がんに対して、全身性免疫応答、すなわち、Ｔ細胞反応および／またはＢ細胞反応を実現することが望ましい。改善は、遺伝学的に改変された腫瘍細胞を患者に投与することを含み、その際、腫瘍細胞は、患者の抱える腫瘍細胞によって発現される少なくとも１種の抗原を発現し、遺伝学的改変は、キメラ線維タンパク質を持つアデノウイルスベクターを用いて実現される。ここに、キメラ線維タンパク質は、サブグループＣアデノウイルス（例えば、Ａｄ１、２、５、および６血清型）のシャフト領域の少なくとも一部、および、サブグループＢアデノウイルス（例えば、Ａｄ３、７、１１、１４、１６、２１、３５、および５０）の、ＣＤ４６に結合するヘッド領域の少なくとも一部、例えば、Ａｄ５またはＡｄ２のシャフトと、Ａｄ３５ヘッドの少なくとも一部を含む。このようなアデノウイルスベクターの使用は、形質導入および導入遺伝子発現を促進する。この遺伝学的に改変された腫瘍細胞は、典型的には照射によって増殖不能とされる。もっとも、細胞を増殖不能とすることが可能である限り、どのような既知の方法、または後に発見される方法であっても使用することは可能である。この遺伝学的に改変された腫瘍細胞が被験体に投与されると、がん抗原（単複）に対する免疫応答が刺激される。
【０１９２】
一つのアプローチでは、遺伝学的に改変された腫瘍細胞は、サイトカインを発現するように改変された細胞の単一集団を含み、治療処方の一部として被験体に投与される。別の方法では、遺伝学的に改変された腫瘍細胞の二つ以上の集団が、異なる導入遺伝子を発現するように個別に改変され、被験体に投与される。治療処方は、さらに１種以上のがん治療剤または処置を含んでもよい。
【０１９３】
一般に、本発明を実施する際に使用される遺伝学的に改変される腫瘍細胞は、自己由来腫瘍細胞、異種腫瘍細胞、および腫瘍細胞株（すなわち、バイスタンダー細胞）の内の１種以上を含む。例として挙げると、一つの方法では、遺伝学的に改変された腫瘍細胞（すなわち、ＧＶＡＸ）が、異種またはバイスタンダー細胞株として与えられ、さらに１種以上のがん治療剤が自己由来細胞によって発現される。別の方法では、さらに１種以上の導入遺伝子が異種またはバイスタンダー細胞株によって発現され、一方、サイトカイン（すなわち、ＧＭ−ＣＳＦ）が自己由来細胞によって発現される。各種サイトカインを形質導入されたネズミ腫瘍細胞同士を直接比較したところ、ＧＭ−ＣＳＦ分泌腫瘍細胞が、全体として、もっとも良好な抗腫瘍保護を誘発したことが証明された。一つの好ましい実施態様では、本発明の、遺伝学的に改変された腫瘍細胞によって発現されるサイトカインはＧＭ−ＣＳＦ（「ＧＶＡＸ」）である。このＧＭ−ＣＳＦコード配列は、キメラ線維タンパク質を有する改良型アデノウイルスベクターを用いて導入される。該キメラ線維タンパク質は、サブグループＣアデノウイルスシャフト領域の少なくとも一部、および、サブグループＢアデノウイルスの、ＣＤ４６に結合するヘッド領域の少なくとも一部を含み、例えば、Ａｄ５またはＡｄ２のシャフトと、Ａｄ３５ヘッドの少なくとも一部を含む。ＧＭ−ＣＳＦの好ましいコード配列は、Ｈｕｅｂｎｅｒ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０（４７３１）：１２８２−５，１９８５に記載されるゲノム配列である。しかしながら、ある場合には、ＧＭ−ＣＳＦのｃＤＮＡ形が本発明を実行するのに役立つ（Ｃａｎｔｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２，６２５０−６２５４，１９８５）。
【０１９４】
ある実施態様では、遺伝学的に改変された腫瘍細胞は、投与前に寒冷保存される。ある好ましい実施態様では、遺伝学的に改変された腫瘍細胞は、それが得られた同じ個体に対して投与される。別の好ましい実施態様では、遺伝学的に改変された腫瘍細胞と腫瘍は異なる個体から得られる。ある好ましい実施態様では、治療される腫瘍タイプは、膀胱がん、乳がん、結腸がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、頸がん、膵臓がん、直腸がん、前立腺がん、胃がん、上皮がん；リンパまたは骨髄系統の造血細胞がん；中胚葉起源のがん、例えば、線維肉腫または黄紋筋肉腫；その他の腫瘍タイプ、例えば、メラノーマ、奇形がん、神経芽細胞腫、グリオーマ、腺がん、および非小細胞型肺細胞がんからなる群より選択される。
【０１９５】
遺伝学的に改変される腫瘍細胞は、患者に対して投与する前に、好ましくは約５０から約２００ｒａｄ／分、さらに好ましくは約１２０から約１４０ｒａｄ／分の用量で照射される。細胞は、該細胞の実質的に１００％をその後の増殖から抑制するのに十分な合計用量で照射するのが好ましい。従って、細胞は、約１０，０００から２０，０００ｒａｄ、もっとも好適には約１５，０００ｒａｄの合計用量で照射することが好ましい。
【０１９６】
（自己由来）
遺伝学的に改変された導入遺伝子発現型自己由来腫瘍細胞の使用はいくつかの利点を提供する。なぜなら、患者の腫瘍はそれぞれ、別の患者から得られた、組織学的には類似した、ＭＨＣ適合腫瘍細胞の表面に認められるものとは違った、独特の一組の腫瘍抗原を発現するからである。例えば、Ｋａｗａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８，６３８−６４３（１９９２）；Ｄａｒｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２，３３２９−３３３５（１９８９）；Ｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０，１５３−１６４（１９９１）を参照のこと。それとは対照的に、ＭＨＣ適合腫瘍細胞では、患者は、遺伝学的に改変された腫瘍細胞の生産のため自分の腫瘍サンプルを提供するために手術の場に連れていかれる必要がないという利点を提供する。
【０１９７】
一つの好ましい局面では、本発明は、下記の工程を実行することによってがんを治療する方法を含む。すなわち、（ａ）腫瘍を抱える哺乳動物被験体から腫瘍細胞を入手する工程；（ｂ）該腫瘍細胞を、キメラ線維タンパク質を持つアデノウイルスベクターを用いて改変し、未改変腫瘍細胞に比べて、１種以上の導入遺伝子について、その生産レベルの増大を可能とさせる工程、ここに、該キメラ線維タンパク質は、サブグループＣアデノウイルスシャフト領域の少なくとも一部、および、サブグループＢアデノウイルスの、ＣＤ４６に結合するヘッド領域の少なくとも一部を含み、例えば、Ａｄ５またはＡｄ２のシャフトと、Ａｄ３５ヘッドの少なくとも一部とを含み；（ｃ）改変腫瘍細胞を増殖不能とする工程；および、（ｄ）改変腫瘍細胞を、それから腫瘍細胞が得られた哺乳動物被験体に対し、または、腫瘍細胞が得られた哺乳動物と同じＭＨＣタイプを持つ哺乳動物に対し再度投与する工程を含む方法である。投与される腫瘍細胞は、宿主に対し、自己由来で、ＭＨＣ適合性である。組成物は、哺乳動物被験体の皮下、皮内、または腫瘍内部に投与されることが好ましい。
【０１９８】
単一自己由来腫瘍細胞は、１種を超える導入遺伝子を発現してよいし、あるいは、各導入遺伝子は、異なる自己由来腫瘍細胞によって発現されてもよい。本発明の一つの局面では、自己由来腫瘍細胞は、本明細書に記載される、キメラ線維タンパク質、および、導入遺伝子、例えば、サイトカイン、例えば、ＧＭ−ＣＳＦをコードする核酸配列であって、プロモーター、および、その導入遺伝子の発現のために必要な発現／調節配列に動作的に結合される核酸配列を含むアデノウイルスベクターの導入によって改変される。別の局面では、同じ自己由来腫瘍細胞、または第２自己由来腫瘍細胞は、少なくとも１種の追加の導入遺伝子をコードする核酸配列を含むベクターの導入によって改変される。該追加の導入遺伝子は、プロモーター、および、その導入遺伝子の発現のために必要な発現／調節配列に動作的に結合される。１種以上の導入遺伝子をコードする核酸配列は、同じまたは異なるベクターを用いて、同じまたは異なる自己由来腫瘍細胞に導入される。導入遺伝子（単複）をコードする核酸配列は、プロモーターに動作的に結合される選択性マーカー配列をさらに含んでもよいし、含まなくともよい。
【０１９９】
（同種異系）
研究者たちは、腫瘍ワクチンとして、自己由来およびＭＨＣ適合細胞に代わるものを求めてきた。これについては、Ｊａｆｆｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２２，８１−９１（１９９５）に総覧される通りである。初期の腫瘍ワクチン戦略は、腫瘍細胞にワクチン作用を施すことは、自らのＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子の上に腫瘍抗原を提示する抗原提示細胞と同様に機能し、免疫系のＴ細胞側を直接活性化するという理解に基づく。Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４，９６１−９６５，１９９４）の結果から、ワクチン作用腫瘍細胞ではなく、宿主の本来のＡＰＣが、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカイン（単複）を分泌することによって免疫系のＴ細胞側の準備を整え、それによって、骨髄由来ＡＰＣが腫瘍領域に招集されることが示された。骨髄由来ＡＰＣは、腫瘍の全細胞タンパク質を取り上げて処理し、次に、そのＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子の上に抗原ペプチド（単複）を提示し、そうすることによって免疫系のＣＤ４＋およびＣＤ８＋両Ｔ細胞の態勢を整え、これによって全身的な腫瘍特異的な、抗腫瘍免疫応答が実現される。これらの結果は、抗がん免疫応答を惹起するためには、自己由来またはＭＨＣ適合腫瘍細胞を用いることは必要でも、最善でもないかもしれないこと、および、同種異系ＭＨＣ遺伝子（同じ種に属する遺伝的に不等な個体から得られたもの）の転送が、腫瘍免疫原性を強化することができるかもしれないことを示唆する。さらに具体的に言うと、ある場合には、同種異系ＭＨＣクラスＩ分子を発現する腫瘍に対する拒絶は、未改変の、両親から受け継いだ腫瘍による、その後の抗原惹起に対して強調された全身的免疫応答をもたらした。
【０２００】
本明細書で用いる「腫瘍細胞株」は、始め腫瘍から得られた細胞を含む。そのような細胞は通常は変形される（すなわち、培養下に無限の増殖を示す）。一つの好ましい局面では、本発明は、下記の工程を実行することによってがんを治療する方法を提供する。すなわち、（ａ）腫瘍細胞株を獲得する工程；（ｂ）該腫瘍細胞株を、キメラ線維タンパク質を持つアデノウイルスベクターを用いて改変し、未改変腫瘍細胞に比べて、１種以上の導入遺伝子について、その生産レベルの増大を可能とさせる工程、ここに、該キメラ線維タンパク質は、サブグループＣアデノウイルスシャフト領域の少なくとも一部、および、サブグループＢアデノウイルスの、ＣＤ４６に結合するヘッド領域の少なくとも一部を含み、例えば、Ａｄ５またはＡｄ２のシャフトと、Ａｄ３５ヘッドの少なくとも一部とを含み；（ｃ）改変腫瘍細胞株を増殖不能とする工程；および、（ｄ）それから腫瘍細胞株が得られたものと同じタイプの腫瘍である少なくとも一つの腫瘍を持つ、哺乳動物被験体（宿主）に対し、腫瘍細胞株を投与する工程を含む方法である。投与された腫瘍細胞株は、同種異系であり、宿主に対してＭＨＣ適合性ではない、このような同種異系細胞株は、あらかじめ調製し、特性を解明し、既知の数の、導入遺伝子発現性細胞を含む瓶に分液し、保存（すなわち、凍結）することが可能であり、このため、患者に投与するに際し、十分その特徴が解明された細胞が利用可能であるという利点を提供する。遺伝子改変同種異系細胞の生産法は、例えば、ＷＯ００／７２６８６Ａ１に記載される。なお、この特許を参照することにより本明細書に含めることを明言する。
【０２０１】
遺伝学的に改変された導入遺伝子発現性同種異系細胞を調製するための一つのアプローチとして、１種以上の治療因子をコードする核酸配列（導入遺伝子）が、同種異系腫瘍細胞株である（すなわち、治療される個体とは別の個体から得られた）細胞株の中に導入される。別の方法では、１種以上の導入遺伝子は、別々の同種異系腫瘍細胞株の中に導入される。一般に、細胞、または細胞集団は、治療される腫瘍またはがんと同じタイプの腫瘍細胞株から得られる。腫瘍および／または腫瘍細胞株は、どのような形態のがんであっても、例えば、膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、頸部、膵臓、直腸、前立腺、胃、上皮のがん；リンパまたは骨髄系統の造血細胞がん；中胚葉起源のがん、例えば、線維肉腫または黄紋筋肉腫；その他の腫瘍、例えば、メラノーマ、奇形がん、神経芽細胞腫、グリオーマ、腺がん、および非小細胞型肺細胞がん含むがんであってもよいが、ただしこれらに限定されない。
【０２０２】
本発明の一つの局面では、同種異系腫瘍細胞は、キメラ線維タンパク質を持つアデノウイルスベクターを導入することによって改変される。ここに、該キメラ線維タンパク質は、サブグループＣアデノウイルスシャフト領域の少なくとも一部、および、サブグループＢアデノウイルスの、ＣＤ４６に結合するヘッド領域の少なくとも一部を含み、例えば、Ａｄ５またはＡｄ２のシャフトと、Ａｄ３５ヘッドの少なくとも一部とを含み、かつ、Ａｄ３５ヘッドは、導入遺伝子、例えば、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカインをコードする核酸を、その発現のために必要なプロモーターおよび発現調節配列に対し動作的に結合された状態で含む。別の局面では、同じ同種異系腫瘍細胞、または第２同種異系腫瘍細胞は、前述のようなキメラ線維タンパク質を持つ別のアデノウイルスベクターであって、少なくとももう一つの導入遺伝子を、その発現のために必要なプロモーターおよび発現調節配列に対し動作的に結合された状態で含むアデノウイルスベクターの導入によって改変される。導入遺伝子（単複）をコードする核酸配列が、同じ、または異なるベクターを用いて、同じ、または異なる同種異系腫瘍細胞中に導入されてもよい。導入遺伝子（単複）をコードする核酸配列は、プロモーターに動作的に結合される選択性マーカー配列をさらに含んでもよいし、含まなくともよい。同種異系細胞株は、高レベルのサイトカイン、例えば、ＧＭ−ＣＳＦを発現することが好ましい。
【０２０３】
本発明を実施するに当たって、１種以上の同種異系細胞株が、自己由来がん抗原、例えば、自己由来腫瘍細胞とインキュベートされ（これらは合わさって同種異系細胞株組成物を含む）、次に、この同種異系細胞株組成物が患者に投与される。典型的には、がん抗原は、治療されるがんの細胞、すなわち、自己由来がん細胞によって（の上に）供給される。このような場合、組成物は、通常照射によって増殖不能とされる。そのためには、同種異系細胞とがん細胞は、組織培養プレートに静置され、上に詳述したようにＣｓ光源によって室温で照射される。ある任意の投与における自己がん細胞に対する同種異系細胞の比は、組み合わせに応じて変動する。
【０２０４】
同種異系細胞株組成物を患者の体内に導入するためには、適切であればいずれの投与ルートを用いてもよいが、組成物は、皮下、皮内、または筋肉内に投与されることが好ましい。
【０２０５】
本発明の実施において同種異系細胞株を用いることは、がんを抱える患者に対し、遺伝学的に改変された導入遺伝子発現性細胞株を、自己由来がん抗原と共に投与することによって、治療的導入遺伝子の傍分泌生産、例えば、サイトカインが、腫瘍に対して効果的な免疫応答をもたらすという治療的利点を提供する。これは、各患者について自己由来腫瘍細胞を培養し、形質導入する必要を解消する。
【０２０６】
（バイスタンダー）
もう一つの局面では、本発明は、少なくとも一つの導入遺伝子を発現する、遺伝学的に改変された導入遺伝子発現性、汎用免疫変調性バイスタンダー細胞を提供する。同じ汎用バイスタンダー細胞株が、１種を超える導入遺伝子を発現してもよいし、あるいは、個々の導入遺伝子が、異なる汎用バイスタンダー細胞株によって発現されてもよい。汎用バイスタンダー細胞株は、腫瘍組織適合遺伝子複合体クラスＩ（ＭＨＣ−１）抗原、および腫瘍組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ（ＭＨＣ−２）抗原を、元々欠くか、または、ＭＨＣ−１抗原およびＭＨＣ−２抗原を欠くように改変された細胞を含む。本発明の一つの局面では、汎用バイスタンダー細胞株は、キメラ線維タンパク質を持つアデノウイルスベクターを導入することによって改変される。ここに、該キメラ線維タンパク質は、サブグループＣアデノウイルスシャフト領域の少なくとも一部、および、サブグループＢアデノウイルスの、ＣＤ４６に結合するヘッド領域の少なくとも一部を含み、例えば、Ａｄ５またはＡｄ２のシャフトと、Ａｄ３５ヘッドの少なくとも一部とを含み、かつ、該ベクターは、導入遺伝子、例えば、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカインをコードする核酸を、その発現のために必要なプロモーターおよび発現調節配列に対し動作的に結合された状態で含む。別の局面では、同じ汎用バイスタンダー細胞株、または第２汎用バイスタンダー細胞株は、少なくとももう一つの導入遺伝子を、その発現のために必要なプロモーターおよび発現調節配列に対し動作的に結合された状態で含むアデノウイルスベクターの導入によって改変される。導入遺伝子（単複）をコードする核酸配列が、同じ、または異なるベクターを用いて、同じ、または異なる汎用バイスタンダー細胞株中に導入されてもよい。導入遺伝子（単複）をコードする核酸配列は、プロモーターに動作的に結合される選択性マーカー配列をさらに含んでもよいし、含まなくともよい。抗腫瘍免疫応答を刺激する導入遺伝子（単複）の組み合わせは、いずれのものでも、本発明の実施に役立つ。本汎用バイスタンダー細胞株は、成分の確定した、すなわち、血清無添加培養体において、懸濁液として育成されることが好ましい。
【０２０７】
好ましい汎用バイスタンダー細胞株は、Ｋ５６２（ＡＴＣＣＣＣＬ−２４３；Ｌｏｚｚｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ４５（３）：３２１−３３４（１９７５）；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １８：４２１−４３１（１９７６））である。ヒトのバイスタンダー細胞株の生成に関する詳細な記述は、例えば、米国特許第６，４６４，９７３号に記載される。なお、この特許を参照することにより本明細書に含めることを明言する。
【０２０８】
汎用バイスタンダー細胞株は、高レベルのサイトカイン、例えば、ＧＭ−ＣＳＦを発現することが望ましい。
【０２０９】
本発明を実施するに当たって、１種以上の汎用バイスタンダー細胞株が、自己由来がん抗原、例えば、自己由来腫瘍細胞とインキュベートされ（これらは合わさって汎用バイスタンダー細胞株組成物を含む）、次に、この汎用バイスタンダー細胞株組成物が患者に投与される。汎用バイスタンダー細胞株組成物を患者の体内に導入するためには、適切であれがいずれの投与ルートを用いてもよい。組成物は、皮下、皮内、または筋肉内に投与されることが好ましい。
【０２１０】
典型的には、がん抗原は、治療されるがんの細胞、すなわち、自己由来がん細胞によって（の上に）供給される。このような場合、組成物は、通常照射によって増殖不能とされる。そのためには、バイスタンダー細胞とがん細胞は、組織培養プレートに静置され、上に詳述したようにＣｓ光源によって室温で照射される。
【０２１１】
ある任意の投与における自己がん細胞に対するバイスタンダー細胞の比は、組み合わせに応じて変動する。ＧＭ−ＣＳＦ生産バイスタンダー細胞に関しては、ある任意の投与におけるバイスタンダー細胞の自己由来がん細胞に対する比は、治療的に有効なレベルのＧＭ−ＣＳＦが生産されるようになっていなければならない。ＧＭ−ＣＳＦの閾値に加え、バイスタンダー細胞の、自己由来がん細胞に対する比は、１：１以下でなければならない。バイスタンダー細胞の、腫瘍細胞、または腫瘍抗原に対する適切な比は、従来技術で既知の通例法を用いて決めることが可能である。
【０２１２】
本発明の実施においてバイスタンダー細胞株を用いることは、がんを抱える患者に対し、サイトカイン発現性バイスタンダー細胞株と、少なくとも１種の追加のがん治療剤（同じ、または異なる細胞によって発現される）を、自己由来がん抗原と共に投与することによって、免疫変調サイトカインの傍分泌生産が、腫瘍に対して効果的な免疫応答をもたらすという治療的利点を提供する。これは、各患者について自己由来腫瘍細胞を培養し、形質導入する必要を解消する。
【０２１３】
典型的には、細胞を不活性化し、該細胞を増殖不能とするためには、約３５００ｒａｄの最小用量で十分である。ただし、最大約３０，０００Ｒａｄの用量は受容可能である。ある実施態様では、細胞は、哺乳動物に対して投与する前に、約５０から約２００ｒａｄ／分、または約１２０から約１４０ｒａｄ／分の用量で照射される。照射を用いる場合、典型的には、必要とされる照射は、２，５００ｒａｄ、５，０００ｒａｄ、１０，０００ｒａｄ、１５，０００ｒａｄ、または２０，０００ｒａｄである。一つの実施態様では、細胞を不活性化し、それを増殖不能にするために、約１０，０００ｒａｄの用量が用いられた。照射は、細胞を増殖不能にするための、僅かに一つの方法であるにすぎないこと、細胞が多数回の細胞分裂を実行することはできないが、導入遺伝子（例えば、サイトカイン）を発現する能力は保持することを可能とする、他の不活性化法（例えば、マイトマイシンＣ、シクロヘキシイミド、および概念的に類似の薬剤による処理、または、細胞による自殺遺伝子の取り込み）も本発明に含められることを理解しなければならない。
【０２１４】
（本発明を実施するための組成物および方法）
本発明は、本発明の組み換えアデノウイルスベクターおよび／または粒子、および／または、本発明の組み換えアデノウイルスベクターおよび／または粒子を用いて遺伝学的に改変された腫瘍細胞を含む製薬組成物を、該組成物を使用する方法と共に提供する。
【０２１５】
一つの局面では、本発明は、製薬学的に受容可能な担体に溶解した、治療有効量の本発明のアデノウイルスベクターを含む組成物であって、単位剤形として、無菌の非経口液または懸濁液として、水中油または油中水乳剤として、個体に対し、局所的または全身的投与するのに好適な組成物を提供する。非経口的、および経口的薬剤送達のための処方は従来技術で既知である。組成物はまた、本発明のアデノウイルスベクターおよび粒子の凍結乾燥、および／または、再建形態を含む。受容可能な製薬学的担体としては例えば、生食液、硫酸プロタミン（Ｅｌｋｉｎｓ−Ｓｉｎｎ，Ｉｎｃ．，Ｃｈｅｒｒｙ  Ｈｉｌｌ，ニュージャージー州）、水、水性バッファー、例えばリン酸バッファーおよびＴｒｉｓバッファー、またはＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，セントルイス、ミズーリ州）、およびリン酸バッファー生食液、およびスクロースがある。適切な製薬学的担体の選択は、本明細書に含まれる教示から当業者には明白と思われる。これらの溶液は無菌であり、一般に、所望のアデノウイルスビリオンを除いては粒状物質を含まない。組成物は、生理的条件を近似させるために必要な、製薬学的に受容可能な補助物質、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調節剤等、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を含んでもよい。アデノウイルスによる細胞の感染を強化する賦形剤も含まれてよい。
【０２１６】
一つの実施態様では、本発明のアデノウイルスベクターは、腫瘍細胞の増殖を抑制、防止、または破壊するのに有効な量（すなわち、治療有効量）として宿主に投与される。これは、例えば、腫瘍細胞におけるウイルスベクターの複製、および／または、腫瘍細胞の形質導入後における導入遺伝子の発現によって実行されてもよい。この投与は、アデノウイルスベクターを腫瘍標的細胞に送達する、例えば、全身投与によって、あるいは、ベクターを直接腫瘍に注入することによって送達するのに効果的な量であれば、いずれの量であってもよい。一つの局面では、ベクターは、体重ｋｇ当たり少なくとも５×１０９ウイルス粒子の量として全身的に投与されるが、一般に、その量は、体重ｋｇ当たり１×１０１３ウイルス粒子を超えない。別の方法では、ベクターは、少なくとも２×１０１０ウイルス粒子の量として腫瘍内部に投与されるが、一般にその量は体重ｋｇ当たり１×１０１３ウイルス粒子を超えない。さらに別の方法では、ベクターは、被験体の膀胱に注入される。その場合、膀胱は、ＵＳ２００４０１３１５９０に記載されるように、膀胱強化剤によって事前処理されてもよい。投与される正確な用量は、様々な因子、例えば、患者の年齢、体重、および性別、治療される腫瘍のサイズおよび重度に依存する。ベクターは、１回以上に渡って投与されてよい。組成物の単回または複数回投与は、用量レベルおよびパターンは、治療に当たる医師によって選択されて実行される。要すれば、免疫応答は、各種免疫抑制剤の使用、既存の抗体の除去によって減衰させ、ウイルスに対する免疫応答を下げることによって反復投与を可能としたり、および／または、複製を強化してもよい。本発明のアデノウイルスベクターの投与は、他の抗新生物プロトコールと組み合わせてもよい。そのようなプロトコールの多数の例が従来技術で既知である。この抗新生物プロトコールは、治療される腫瘍のタイプに応じて変動する。抗新生物プロトコールの例示の成分は下記にさらに記載される。
【０２１７】
送達は、様々の方法、すなわち、リポソーム、直接注入、全身性注入、カテーテル、局所塗布、吸入等による方法によって実現が可能である。
【０２１８】
本発明は、新生物病態（典型的にはがん患者）を有する被験体を治療する方法であって、本発明のアデノウイルスベクターの治療的有効量を該被験体に投与することを含む方法を提供する。アデノウイルスベクターは、複製可能、または複製不能であってもよい。本発明の一つの局面は、増殖不能とされ（すなわち、照射によって）、被験体に投与される、遺伝学的に改変された、導入遺伝子発現性腫瘍細胞の使用に関する。この遺伝学的に改変された、増殖不能腫瘍細胞は、治療的有効量として、被験体に、典型的にはヒトのがん患者に投与される。
【０２１９】
腫瘍細胞は、前述のように、本発明のアデノウイルスベクターの形質導入によって改変される。一つの実施態様では、本発明は、１種以上の導入遺伝子をコードする１種の組み換えアデノウイルスベクターによる、腫瘍細胞集団の単回形質導入を利用する。別の実施態様では、本発明は、同じ組み換えアデノウイルスベクターによる、腫瘍細胞集団の複数回形質導入（感染）を利用する。さらに別の実施態様では、本発明は、様々な導入遺伝子をコードする複数の組み換えアデノウイルスによる、複数回、または単回形質導入を利用する。
【０２２０】
形質導入細胞の、哺乳動物に対する投与は、個体の全身性免疫応答を、刺激方向に調整する。別の局面では、本発明は、１種以上の導入遺伝子を発現する、改変腫瘍細胞（例えば、原発性腫瘍細胞）を、既存の腫瘍の逆転または抑制のために使用することに関する。腫瘍細胞はまた、複数薬剤耐性タンパク質（ＭＤＲ）を発現するように形質導入されてもよい。ＭＤＲは、同じアデノウイルスベクターに、異なるアデノウイルスベクターに、または、非アデノウイルスベクターにコードされてもよい。腫瘍細胞に形質導入するために、本発明のアデノウイルスベクターと組み合わせて他のベクターを用いてもよい。様々なベクターは、事実上同時に腫瘍細胞に送達されてもよいし、あるいは、所望の作用にとって適切な別の時点に送達されてもよい。
【０２２１】
別の局面では、本発明は、腫瘍抗原に対する免疫応答を強化する方法を提供する。この方法では、原発性腫瘍細胞は、本発明のアデノウイルスベクターによって、導入遺伝子を発現するように改変され、被験体、例えば、ヒトのがん患者に投与される。この改変腫瘍細胞は、治療的有効量として、かつ、抗原にたいする哺乳動物の免疫応答の増加が実現されるようなやり方で投与される（例えば、皮内、または皮下）。
【０２２２】
関連実施態様では、遺伝学的に改変された腫瘍細胞と、本発明のアデノウイルスベクターの両方が被験体に投与される。この遺伝学的に改変された腫瘍細胞は、自己由来細胞、同種異系細胞、またはバイスタンダー細胞であってもよく、投与は、同時であっても、継時的であってもよい。
【０２２３】
導入遺伝子を発現するように形質導入された細胞と、哺乳動物の抱える腫瘍細胞とは必ずしも同じ腫瘍タイプではない。例えば、バイスタンダー細胞は、インビボで導入遺伝子を発現してもよいが、哺乳動物の抱える腫瘍とは同じ細胞、または腫瘍でないかもしれない。別の例で、ＧＭ−ＣＳＦを発現するように形質導入された細胞は、哺乳動物の腫瘍細胞と同じ腫瘍タイプではないが、共通の腫瘍抗原を発現するかもしれない。この場合、哺乳動物の腫瘍に対する免疫応答を増強する。
【０２２４】
腫瘍、および形質導入された腫瘍細胞（すなわち、原発性腫瘍細胞）は、通常は、同じタイプのがんであり、共通の抗原を持つ。がんはいずれのタイプのものであってもよく、例えば、膀胱がん、骨がん、脳および脊髄がん、脳および脊髄がん、頸がん、結腸直腸がん、子宮内膜および子宮がん、食道がん、胆嚢および胆管がん、胃がん、頭頸部がん、腎臓がん、白血病、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、血液学的障害、網膜芽細胞腫、皮膚がん、軟部組織肉腫、睾丸がん、甲状腺がん、子宮がん、ウィルムス腫瘍、先行性新生病変、がん性ポリープ等が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【０２２５】
一つの実施態様では、本発明は、形質導入されない増殖不能腫瘍細胞、および、アジュバント、例えば、本発明のアデノウイルスベクターを投与することを含む。ただし、アジュバントは、サイトカイン発現性腫瘍細胞の投与と同時に、またはその後に投与される。一つの方法では、本発明のアデノウイルスベクターは、導入遺伝子、例えば、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカインのコード配列を含み、増殖不能腫瘍細胞と同時に投与される。その際、腫瘍細胞は自己由来のものか、同種異系のものである。
【０２２６】
典型的には、被験体はヒトの患者である。ヒト患者では、異種コード配列がベクターに含まれた場合、その異種コード配列は、ヒト起源のものであってよい。ただし、ヒトの機能と高い相同性および、生物学的に同じ、または等価な機能を示す、極めて近縁な種の遺伝子を使用することは、その異種コード配列の産物が、レシピエントにおいて有害な免疫応答を生成／惹起しないのであれば、可能である。一つの実施態様では、異種コード配列は、治療タンパク質、または治療ＲＮＡをコードする。治療的活性量の核酸配列または治療遺伝子とは、所望の結果を実現するために必要な投与回数および期間において有効な量である。この量は、様々な要因、例えば、被験体の性別、年齢、および体重等を含む要因に従って変動してよい。
【０２２７】
当業者であれば、医療従事者または患者の立場から見れば、不快な症状（例えば、病気に関連する症状、環境因子に対する過敏、正常な加齢等）の寛解または阻止は、たとえそれがどんなものであっても、それは望ましいものであることが了解されるであろう。
【０２２８】
本発明の製薬組成物は、個体における免疫応答の生成またはがんの治療に関連する他の治療の後で、の前に、の代わりに、または、と組み合わせて与えられてもよい。例えば、哺乳動物は、化学療法、放射線療法、および他の形の免疫療法および養子免疫細胞移入によって、その前に、または同時に治療されてもよい。例えば、本発明の組成物は、シスプラチン、シスプラチン／シクロフォスファミド、タキソールまたはシスプラチン／シクロフォスファミド／ドキソルビシンの組み合わせのような化学療法剤と組み合わせて使用されてもよい。このような方式が使用される場合、それは、本発明の組成物の免疫原性を妨げないやり方、またはタイミングで用いられる。哺乳動物はまた、免疫応答を刺激するために、他のワクチン、または他の組成物を投与されてもよい。このような代替組成物としては、腫瘍抗原ワクチン、腫瘍抗原をコードする核酸ワクチン、抗イディオタイプワクチン、および、サイトカイン発現性腫瘍細胞株を含む他のタイプの細胞性ワクチンが挙げられる。
【０２２９】
一つの実施態様では、形質導入細胞は、該細胞を調製する際に使用された多くの付加的成分を除去するために処理される。特に、培養液中の、ウシ胎児血清、ウシ血清成分、または、他の生物学的添加物は取り除かれる。一つの実施態様では、細胞は、例えば、反復される穏やかな遠心によって洗浄され、適切な製薬学的に適合的な賦形剤に投入される。適合的賦形剤としては等張生食液であって、生理的に適合するバッファー、例えばリン酸塩またはＨｅｐｅｓ、および、栄養素、例えば、デキストロース、生理的に適合するイオンまたはアミノ酸、および、各種培養液、特に、他の免疫原性成分を含まないものを含有する、または含有しない等張生食液が挙げられる。担体試薬、例えば、アルブミン、および血漿分画、非活性増粘剤も使用してよい。一つの実施態様では、非活性生物成分も、製剤に許される程度まで、ヒトから得られるが、場合によっては、治療される被験体から前もって獲得されてもよい。
【０２３０】
本発明のさらに他の局面は、腫瘍抗原に対する哺乳動物の免疫応答を調節するためのキットに関する。このキットは、キメラ線維タンパク質を持つ、本発明の組み換えアデノウイルスを含む。ここに、該キメラ線維タンパク質は、サブグループＣアデノウイルスシャフト領域の少なくとも一部、および、サブグループＢアデノウイルスの、ＣＤ４６に結合するヘッド領域の少なくとも一部を含み、例えば、Ａｄ５またはＡｄ２のシャフトと、Ａｄ３５ヘッドの少なくとも一部とを含み、かつ、導入遺伝子、例えば、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカインをコードする核酸をさらに含んでもよいし、含まなくともよい。キットはさらに、例えば、腫瘍細胞または腫瘍断片を収容し、含むのに有用な容器であって、その内部で腫瘍細胞が組み換えウイルスによって形質導入される容器を含む。ある実施態様では、キットはさらに、腫瘍組織は、単一細胞懸濁液に変換する消化酵素を含む。ある実施態様では、酵素はコラゲナーゼである。ある実施態様では、キットはさらに、サイトカインをコードする遺伝物質を含む、組み換えウイルスによって形質導入されなかった増殖不能腫瘍細胞を含むアジュバントを含む。
【実施例】
【０２３１】
本発明は、下記の実施例を参照することによって記載される。これらの実施例は、例示のために提供されるものであって、いかなる意味でも本発明を限定する意図をもってなされるものではない。従来技術でよく知られる標準的技術、または下記に特異的に記述される技術が利用される。当業者であれば、本明細書に特異的に記述される特異的実施態様に対し、多くの等価物を認識し、または、ほんの通例の実験を用いるだけで、それらを確かめることが可能であろう。このような等価物は、下記の特許請求項の範囲内に含められることが意図される。
【０２３２】
（実施例１：ヒト腫瘍細胞株および細胞培養）
本明細書に記載される実施例で用いた、ヒトの頭頸部がん細胞株、およびヒトのメラノーマ細胞株が、表１に列挙される。
【０２３３】
【表１】
2008510493.tif 000003
表１に列挙したヒト頭頸部がん細胞株およびヒトメラノーマ細胞株は、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０培養液中で培養した。ヒト前立腺がん細胞株、ＰＣ３Ｍ−２ＡＣ６は、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０培養液中で培養した。ヒト前立腺がん細胞株、ＬＮＣａＰ（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１０９９５）は、１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、非必須アミノ酸（０．１ｍＭ）、炭酸ナトリウム（０．０７５％）、およびピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）を含むＲＰＭＩ中で培養した。ヒト前立腺がん細胞株、ＰＣ−３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１４３５）は、１０％ＦＢＳおよびＬ−グルタミン（２ｍＭ）を添加したＲＰＭＩ中で培養した。
【０２３４】
（実施例２：Ｅ１欠損、ＧＦＰ発現線維キメラ状Ａ５ベクターの構築）
Ａｄ５ベクターに基づく線維キメラを生成するために、先ず、シャトルプラスミドｐＡｄ５ＬｔＲｔ−ＳｍａＩを後述のように構築する。先ず、Ａｄ５ＤＮＡの左端（ｂｐ  １−１００９ｂｐ）を二つのプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。
プライマー１（５’−ＧＡＡＴＴＣＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣＴＴ−３’；配列番号１７）およびプライマー２（５’−ＣＣＣＧＧＧＧＴＧＣＴＣＣＡＣＡＴＡＡＡＴＣＴ−３’；配列番号１８）。Ａｄ５ＤＮＡの右端５８０は、プライマー３（５’−ＡＡＧＣＴＴＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣＴＴ-3’；配列番号１９）およびプライマー４（５’−ＣＣＣＧＧＧＧＧＡＡＴＡＣＡＴＡＣＣＣＧＣＡＧＧ−３’；配列番号２０）と表示される第２組のプライマーを用いて増幅した。Ｉ−ＳｃｅＩの認識配列は、プライマー１および３に組み込まれた。第１ＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＩとＳｍａＩによって消化し、第２ＰＣＲ産物は、ＨｉｎｄＩＩＩとＳｍａＩによって消化した。得られた断片をゲル精製し、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラホヤ、カリフォルニア州）のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位に３方ライゲーションによってクローンし、ｐＡｄ５ＬｔＲｔ−ＳｍａＩを生成した。Ｉ−ＳｃｅＩ部位によって区分されるＡｄ５  ＧＦＰベクターゲノムを含むプラスミドｐＦＬＡｄ５．ＣＭＶ５−ＧＦＰは、ＳｍａＩ−直線化ｐＡｄ５ＬｔＲｔ−ＳｍａＩと、Ａｄ５．ＣＭＶ５−ＧＦＰ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）とを、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて結合させて生成した。
【０２３５】
線維キメラベクターは、いくつかの工程を経て生成された。先ず、プラスミドｐＦＬＡｄ５．ＣＭＶ５−ＧＦＰをＳｍａＩで消化し、Ａｄ５．ＣＭＶ５−ＧＦＰの左端および右端断片（それぞれ、ｎｔ  １から３０４７、および３２６５２から３３２３１）をゲル精製し、自己ライゲーションしてｐＡｄ５Ｌｔ＆ＲｔＳｍａＩ−ＣＭＶ５−ＧＦＰを生成した。これらのプラスミド、ｐＦＬＡｄ５．ＣＭＶ５−ＧＦＰ５Ｔ３５Ｈ、ｐＦＬＡｄ５．ＣＭＶ５−ＧＦＰ３５Ｆ、ｐＦＬＡｄ５．ＣＭＶ５−ＧＦＰ−５Ｔ３Ｈ、ｐＦＬＡｄ５．ＣＭＶ５−ＧＦＰ−５Ｔ３Ｈ−ＲＧＤは、Ｅ１コード領域をＧＦＰコード領域が置換した状態でＡｄ５ＤＮＡ全長を含み、かつ、キメラ線維コード領域を含むが、これらのプラスミドは、ＳｍａＩ直線化ｐＡｄ５Ｌｔ＆ＲｔＳｍａＩ−ＣＭＶ５−ＧＦＰと、それぞれ、Ａｖ１ｎＢｇ５Ｔ３５Ｈ、Ａｖ１ｎＢｇ３５Ｆ、Ａｖ１ｎＢｇ−５Ｔ３Ｈ（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．２００３）、および、ＣＲＡｄ：ｈＵＰＩＩ−Ｅ１ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１ｂ／Ｆｂ５／３ＬＬ−ＲＧＤのゲノムＤＮＡとを結合することによって生成した。条件付き複製可能アデノウイルスＣＲＡｄ：ｈＵＰＩＩ−Ｅ１ａ−ＩＲＥＳ−Ｅ１ｂ／Ｆｂ５／３ＬＬ−ＲＧＤにおける線維タンパク質のシャフト部分をコードする遺伝子は、Ａｄ５から得られ、一方、ノブコード領域は、Ａｄ３から得られた。このウイルスのキメラ線維部分は、タンパク質のカルボキシル末端においてＲＧＤリガンドを取り込むことによってさらに改変された。キメラ線維ベクターを生成するために、全長プラスミドをＩ−ＳｃｅＩによって消化し、ＰＥＲ．Ｃ６細胞にトランスフェクトした。
【０２３６】
（実施例３：Ｅ１欠損およびヒトＧＭ−ＣＳＦ発現線維キメラＡｄ５ベクターの構築）
上記のベクターを生成するために、先ず、シャトルプラスミド、ｐＡｄ５ＬｔＲｔＳｍａ−ＣａＧｈＧＭを後述のように構築する。ｈＧＭＣＳＦをコードする遺伝子は、下記のプライマーを用いてｐＤＲ２０ｈＧＭＦからＰＣＲ増幅する。プライマーは、ＰＳＲ３（５−ＣＴＴＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧ−３；配列番号２１）とＰＳＲ４（５−ＣＴＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＴＡＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧ−３；配列番号２２）。制限酵素認識配列は、クローニングを容易にするために、プライマーＰＳＲ３（ＥｃｏＲＩ）およびＰＳＲ４（ＨｉｎｄＩＩＩ）に組み込まれる。ＰＣＲ産物（４３５ｂｐ）をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、得られた断片をゲル精製する。ＳＶ４０後期ポリ（Ａ）シグナルを、下記のプライマーを用いてｐＣＡＴ−ｂａｓｉｃからＰＣＲ増幅する。プライマーは、ＰＳＲ６（５−ＣＴＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＴＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧ−３；配列番号２３）およびＰＳＲ７（５−ＣＴＴＣＧＡＧＧＧＡＴＣＣＴＡＣＣＡＣＡＴＴＴＧＴＡＧＡＧＧＴＴＴＡＣ−３；配列番号２４）。制限酵素認識配列は、プライマーＰＳＲ６（ＨｉｎｄＩＩＩ）およびＰＳＲ７（ＢａｍＨＩ）に組み込まれる。ＰＣＲ産物（２２２ｂｐ）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、得られた断片をゲル精製する。この二つのゲル精製断片を、ｐＧＥＭ−７Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ，マジソン、ウィスコンシン州）のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位にクローンし、ｐＧＭＣＳＦ−ＳＶ４０ｐＡ−７Ｚを生成する。
【０２３７】
得られたプラスミドをＢａｍＨＩで消化し、両端を、Ｋｌｅｎｏｗ断片を用いて、ｄＮＴＰミックスで充填する。フェノール−クロロフォルム抽出およびエタノール沈殿の後で、得られたＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、６７０ｂｐ断片をゲル精製する。次に、ｐＡｄ５Ｌｔ＆ＲｔＳｍａＩ−ＣＭＶ５−ＧＦＰをＢｇＩＩＩで消化し、得られた両端を、Ｋｌｅｎｏｗ断片を用いて、ｄＮＴＰミックスで充填する。Ａｄ５  ＤＮＡの左端（３５７ｂｐ）および右端（５８３ｂｐ）、およびプラスミドバックボーンをゲル精製する。ＣＡＧプロモーターを含む１．６ＫＢ断片（ＣＭＶエンハンサー、ニワトリベータアクチンプロモーターおよびイントロン、およびウサギグロビンイントロン）が、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ消化およびゲル精製により、ｐＲＲＬｓｉｎｈＣＡＧ．ｇａｍｍａｐｐｔｐｒｅ（Ｓｈｏｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２６５７−２６６４；Ｍｉｙａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｇｅｎｅ７９：２６９−２７７．ｕｒｃｅ）から得られる。合計３本のゲル精製断片は連結されてシャトルプラスミド、ｐＡｄ５ＬｔＲｔＳｍａ−ＣＡＧｈＧＭを生成する。ＳｍａＩ直線化ｐＡｄ５ＬｔＲｔＳｍａ−ＣＡＧｈＧＭを、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＡｄ５−ＣＭＶ５−ＧＦＰ（配列番号１を参照）のゲノムＤＮＡと結合すると、全長プラスミド、ｐＦＬＡｄ５−ＣＡＧ−ｈＧＭ−５Ｆが得られる。Ａｄ３５およびＡｄ３由来のノブコード領域を含む、類似の全長クローンを生成するために、新規のシャトルプラスミドｐＡｄ５Ｌｔ＆ＲｔＳｔｕ−ＣＡＧ−ｈＧＭを、ｐＦＬＡｄ５−ＣＡＧ−ｈＧＭ−５Ｆから、ＳｔｕＩによる消化後、左端および右端断片を含む制限酵素断片をゲル精製し、自己ライゲーションすることによって構築する。得られたプラスミドをＳｔｕＩによって直線化し、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＡｄ５−ＣＭＶ５−ＧＦＰ−５Ｔ３５ＨおよびＡｄ５−ＣＭＶ５−ＧＦＰ−５Ｔ３Ｈ−ＲＧＤ由来のゲノムＤＮＡと結合して、それぞれ、ｐＦＬＡｄ５．ＣＡＧ−ｈＧＭ−５Ｔ３５およびｐＦＬＡｄ５．ＣＡＧ−ｈＧＭ−５Ｔ３Ｈ−ＲＧＤを生成する。この全長プラスミドをＩ−ＳｃｅＩで消化し、ＰＥＲ．Ｃ６細胞にトランスフェクトさせると、Ａｄ５．ＣＡＧ−ｈＧＭ，Ａｄ５．ＣＡＧ−ｈＧＭ−５Ｔ３５Ｈ、およびＡｄ５．ＣＡＧ−ｈＧＭ−５Ｔ３Ｈ−ＲＧＤを生成する。
【０２３８】
（実施例４：原発性腫瘍細胞の調製法）
外科的に得られた腫瘍組織（例えば、肺）について、腫瘍組織としてのその本体（すなわち、非小細胞型肺がん）を確認するために病理学的評価を行った。残りの腫瘍は、輸送媒体（Ｔｄ媒体、１％ヒト血清アルブミンを含むアルファＭＥＭ）に４０℃で浸して、実験室に出荷／輸送する。多くの場合、腫瘍の輸送は、２４時間未満に行われる。到着直後、輸送媒体は吸引され、腫瘍は５０ｍｌのＴｄ媒体で洗浄され、Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ実験用ブレンダー（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ニューヨーク州）を用いて３０分機械的に消化することにより単一細胞懸濁液とする。細胞片および凝集塊をろ過およびＦｉｃｏｌ密度勾配遠心（Ａｍｅｒｓｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ウプサラ、スウェーデン）にて取り出す。この細胞を、６ウェル組織培養皿にプレートする。
【０２３９】
（実施例５：実施例３の手順により細胞株または単離原発性腫瘍細胞の感染、および形質導入パーセントの定量）
プレートされた原発性腫瘍細胞または細胞株は、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む培養液中で、Ａｄ５系ＧＦＰベクター（例えば、キメラ線維を持つ）に対し、１種または数種の感染倍数（ＭＯＩ）の下で、３７℃で２時間暴露される。血清濃度を４−１０％に増し、さらに２４時間インキュベートし、ＧＦＰを発現させる。細胞をＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリーにより形質導入パーセントを定量する。
【０２４０】
Ａｄ５線維キメラの形質導入効率を、野生型線維を担うＡｄ５のそれと比較するために、選択されたヒト細胞株に対し、細胞当たり５０粒子（ｐｐｃ）のベクターによって、０．５ｍｌの合計容量を持つ、２％ＦＢＳを含む培養液において３７℃で２時間形質導入した。感染培養液を、４％ＦＢＳを含む、適切な培養液２ｍｌで置換する。導入遺伝子（ベータガラクトシダーゼ、または緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰ）を発現させるために、細胞を２４時間インキュベートする。ベータガラクトシダーゼの発現を監視するために、細胞単層を固定し、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）で２４時間染色する。形質導入のパーセンテージは、光学顕微鏡により高倍視野における全細胞数当たりの、形質導入された青色細胞の数をカウントすることによって定量する。ウェル当たり三つの視野をカウントし、平均形質導入パーセントを求める。ＧＦＰ発現を監視するために、細胞単層をトリプシン処理で剥がし、次に細胞をＰＢＳで洗浄する。形質導入パーセントはフローサイトメトリーで定量する。ベクター形質導入の各実験は３重ウェルにて実行し、平均形質導入パーセントを求める。
【０２４１】
（実施例６：Ａｄ５およびキメラ線維ベクター仲介による、ヒト細胞のインビトロ形質導入）
細胞は、実施例５に記載される通り、細胞当たり５０粒子の比で形質導入される。感染された細胞は、感染後２４時間、ベータガラクトシダーゼ発現について監視される。結果は、表２に示されるが、形質導入細胞のパーセンテージを反映する。
【０２４２】
【表２】
2008510493.tif 000004
（実施例７：Ａｄ５およびキメラ線維ベクター仲介による、ヒト一次非小細胞型肺がん細胞のインビトロ形質導入）
細胞に、キメラ線維ベクターによって形質導入し、細胞の形質導入パーセントを、実施例５に記載する通り、感染２４時間後にＧＦＰ発現をＦＡＣＳによって監視することによって定量する。結果を表３に示す。
【０２４３】
【表３】
2008510493.tif 000005
（実施例８：ヒト腫瘍細胞株における選択細胞表面受容体の密度）
前述のように、メラノーマおよび頭頸部がん（ＨＮＣ）細胞株は、キメラ線維アデノウイルスベクターと比べて、Ａｄ５感染に対して比較的感受性が低い。これらの細胞株が、Ａｄ５に対しては比較的耐性を持つのに、キメラ線維ベクターに対してはそうでないことの生物学的根拠を調べるために、アデノウイルスベクターによって使用される受容体の細胞レベルを定量した。培養腫瘍細胞をＰＢＳで洗浄し、０．０２５％トリプシンでプレートから剥がし、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１回洗浄し、かつ、再懸濁した。細胞を、ｃｏｘｓａｃｋｉｅ−アデノウイルス受容体（ＣＡＲ、Ｒｍｃｂ、Ｕｐｓｔａｔｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｋｅ  ｐｌａｃｉｄ，ニューヨーク州）、ＣＤ４６（Ｃｌｏｎｅ  Ｅ４．３，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，サンディエゴ、カリフォルニア州）、ανβ３（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，カリフォルニア州）、またはανβ５（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，カリフォルニア州）に向けたマウス抗体と共に４℃で３０分インキュベートした。続いて、細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、ＦＩＴＣ−接合二次抗マウスＩｇＧ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，サンディエゴ、カリフォルニア州）と共に４℃で３０分インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、細胞をＰＢＳに懸濁し、フローサイトメトリーで分析し、陽性細胞のパーセントを定量した。ヒトの頭頸部がん細胞株、およびメラノーマ細胞株のデータを、それぞれ、表４および５に示す。
【０２４４】
【表４】
2008510493.tif 000006
【０２４５】
【表５】
2008510493.tif 000007
これらの実験は、メラノーマおよびＨＮＣ細胞株は、低レベルのＣＡＲしか発現しないことを示す。逆に、検出されるＣＤ４６のレベルは比較的高く、特に、頭頸部がん細胞株ではそうである。さらに、試験された５種の頭頸部細胞株は、きわめて低レベルのανβ３およびανβ５インテグリンしか持たず、従って、フローサイトメトリーでは検出されなかった。一方、大多数のメラノーマ細胞では、ανβ３インテグリンの発現レベルは高かった。従って、キメラ線維ベクターに対して相対的に感受性の高いこと、および、Ａｄ５に対して耐性を有することは、メラノーマおよびＨＮＣ細胞における、Ａｄ３およびＡｄ３５の主要受容体であるＣＤ４６の高い発現レベル、および、Ａｄ５に対する主要受容体であるＣＡＲ発現は低レベルであることによって説明されるようである。
【０２４６】
（実施例９：Ｅ１含有およびヒトＧＭ−ＣＳＦ発現キメラ線維Ａｄ５ベクターの構築）
キメラ線維を含むＥ１含有腫瘍崩壊性ベクターはいくつかの工程を経て生成された。先ず、全長プラスミドｐＦＬＡｄ５が、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、ＳｍａＩ直線化ｐＡｄ５ＬｔＲｔＳｍａＩとＡｄ５のゲノムＤＮＡを結合することによって構築された。得られたシャトルプラスミドｐＦＬＡｄ５は、Ｉ−Ｓｃｅｌ部位によって区分されるＡｄ５ゲノムを含む。次に、ｐＦＬＡｄ５をＸｈｏＩで消化し、Ａｄ５の左右の末端断片を含む断片をゲル精製し、自己連結して、ｐＡｄ５−ＬｔＲｔＸｈｏＩを生成した。線維コード領域全体をＰＣＲによって除去し、ＳｗａＩの認識配列を挿入して、ｐＡｄ５−ＬｔＲｔＸｈｏｄｅｌｆｉｂｅｒを生成した。ＸｈｏＩ直線化ｐＡｄ５ＬｔＲｔＸｈｏｄｅｌｆｉｂｅｒとＣＧ００７０（例えば、ＷＯ２００５０３０２６１に記載される通り）とを結合し、全長ＣＧ００７０ＤＮＡ、マイナス、線維コード領域を含むプラスミドｐＦＬＡｒ２０ｐＡＥｆｈＧｍｄｅｌｆｉｂｅｒが得られた。Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｉｎｃ．，（ＧＴＩ）から購入し、Ａｄ５線維シャフト、およびＡｄ３５線維ノブをコードする遺伝子を含む組み換えプラスミドｐＦＢＳＥ５Ｔ３５Ｈを、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、キメラ線維領域を含む断片を標準技術を用いてゲル精製した。Ａｄ５シャフトおよびＡｄ３５ノブが、Ａｄ５線維コード領域を置換する、プラスミドｐＦＬＡｒ２０ｐＡＥ２ｆＧｍ−５Ｔ３５Ｈが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、ＳｗａＩ直線化ｐＦＬＡｒ２０ｐＡＥ２ｆｈＧｍｄｅｌｆｉｂｅｒを、ゲル精製断片と結合することによって生成された。キメラ線維腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターＯＶ１１９１が、ｐＦＬＡｒ２０ｐＡＥ２ｆＧｍ−５Ｔ３５ＨをＩ−ＳｃｅＩで消化し、ＰＥＲ．Ｃ６細胞にトランスフェクトすることによって生成された。
【０２４７】
Ｅ１含有腫瘍崩壊性ベクターＯＶ１１９２を生成するために、キメラ線維タンパク質（Ａｄ５シャフトおよびＡｄ３ノブ）をコードする遺伝子を含む、３．６ｋｂ  ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩ制限酵素断片を、ＣＲＡｄ：ｈＵＰＩＩ−Ｅ１ａ−ＩＲＥＳ−Ｅｉｂ／Ｆｂ５／３ＬＬ−ＲＧＤのゲノムＤＮＡから得、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔにクローンし、ｐＢｌｕｅ−５Ｔ３Ｈ−ＲＧＤを生成した。次に、線維コード領域に跨る３．１６ｋｂ制限酵素断片を、ｐＢｌｕｅ−５Ｔ３Ｈ−ＲＧＤをＥａｇＩおよびＫｐｎＩで消化することによって得た。このゲル精製ダンペンを、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、ＳｗａＩ−直線化ｐＦＬＡｒ２０ｐＡＥ２ｆｈＧｍｄｅｌｆｉｂｅｒと結合させてｐＦＬＡｒ２０ｐＡＥ２ｆｈＧＭ−５Ｔ３Ｈ−ＲＧＤを生成した。得られたプラスミドをＩ−ＳｃｅＩで消化し、ＰＥＲ．Ｃ６細胞にトランスフェクトすることによってＯＶ１１９２を生成した。
【０２４８】
ＣＧ００７０、ＯＶ１１９１および１１９２に近似する、さらに３個のＥ１含有腫瘍崩壊性ベクターで、正規のＥ１Ａ  ＡＴＧの上流に配される余分のＡＴＧが除去されるベクターが数工程を経て生成された。先ず、ｐＦＬＡｒ２１ｐＡｅ２ｆＦから得られた左右端ＫｐｎＩ制限酵素断片を自己連結してｐＡｒ２１Ｌｔ＆ＲｔＫｐｎ−Ｅ２ｆを生成した。１．３ｋｂ  ＮｈｅＩ−Ｋｐｎ１断片を、全長プラスミドｐＡｒ２１ｐＡＥ２ｆｅ（ＧＴＩ）から得た。この全長プラスミドでは、Ｅ１Ａ  ＡＴＧの上流の余分のＡＴＧは除去された。この制限酵素断片を用いて、ｐＡｒ２１ＬｔＲｔ−Ｋｐｎ−Ｅ２ｆの対応断片を置換して、ｐＡｒ２１ＬｔＲｔＫｐｎ−Ｅ２ｆｅを生成した。ＫｐｎＩ直線化ｐＡｒ２１ＬｔＲｔＫｐｎ−Ｅ２ｆｅを、ＣＧ００７０、ＯＶ１１９１、およびＯＶ１１９２のゲノムＤＮＡと結合し、それぞれ、３個の、全長プラスミド、ｐＦＬＡｒ２０ｐＡＥ２ｆｅ−５ｆｉｂｅｒ、ｐＦＬＡｒ２０ｐＡＥ２ｆｅ−５Ｔ３５Ｈ、およびｐＦＬＡｒ２０ｐＡＥ２ｆｅ−５Ｔ３Ｈ−ＲＧＤを生成した。Ｉ−ＳｃｅＩ消化による直線化、および、ｐＦＬＡｒ２０ｐＡＥ２ｆｅ−５ｆｉｂｅｒ、ｐＦＬＡｒ２０ｐＡＥ２ｆｅ−５Ｔ３５Ｈ、およびｐＦＬＡｒ２０ｐＡＥ２ｆｅ−５Ｔ３Ｈ−ＲＧＤをＰＥＲ．Ｃ６細胞にトランスフェクトすることによって、それぞれ、ＯＶ１１９３、ＯＶ１１９４、およびＯＶ１１９５を得た。
【０２４９】
さらに、Ｅ１Ａの発現がｈＴＥＲＴプロモーターの調節下に置かれるがん崩壊性アデノウイルスベクターが生成された。先ず、Ｅ２Ｆ−１プロモーターをｈＴＥＲＴプロモーターによって置換するために、ｐＡｒ２１ＬｔＲｔＫｐｎ−Ｅ２ｆのＮｈｅＩ−ＫｐｎＩ制限酵素断片が、ｐＡｒ６ｐＡＴｒｔｅｘＥ３Ｆから得られた１２９３ｂｐ  Ｎｈｅ−ＫｐｎＩ断片によって置換された。得られたプラスミドｐＡｒ２１ＬｔＲｔＫｐｎ−ＴｒｔｅｘをＫｐｎＩによって直線化し、ＣＧ００７０、ＯＶ１１９１、ＯＶ１１９２から得られたゲノムＤＮＡと結合するとｐＦＬＡｒ２０ｐＡＴｒｅｘ−５ｆｉｂｅｒ、ｐＦＬＡｒ２０ｐＡＴｒｅｘ−５Ｔ３５Ｈ、およびｐＦＬＡｒ２０ｐＡＴｒｅｘ−５Ｔ３Ｈ−ＲＧＤが得られた。Ｉ−ＳｃｅＩ酵素消化による直線化、および、ｐＦＬＡｒ２０ｐＡＴｒｅｘ−５ｆｉｂｅｒ、ｐＦＬＡｒ２０ｐＡＴｒｅｘ−５Ｔ３５Ｈ、およびｐＦＬＡｒ２０ｐＡＴｒｅｘ−５Ｔ３Ｈ−ＲＧＤをＰＥＲ．Ｃ６細胞にトランスフェクトすることによって、それぞれ、ＯＶ１１９６、ＯＶ１１９７、およびＯＶ１１９８を得た。
【０２５０】
本明細書で用いられるその他のアデノウイルスベクターとしては、全ての野生型ＤＮＡ配列を含む野生型Ａｄ５であり、陽性コントロールとして使用されるＣＶ８０２が挙げられる。Ａｄｄ／３１２は、Ｅ１ａ遺伝子に欠失を持つ複製欠損ベクターであり、陰性コントロールベクターとして用いられた。
【０２５１】
全てのＥ１含有ベクターは、２回の塩化セシウム密度勾配遠心によって精製された。ウイルス粒子の力価は、以前に記載した通り（例えば、Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．１９９６）分光光度法によって定量した。
【０２５２】
（実施例１０：Ａｄ５およびキメラ線維ベクター仲介による、ヒト細胞のインビトロ形質導入および細胞傷害性）
本発明のＡｄ５およびＡｄ５キメラ線維ベクターのインビトロ細胞傷害性を、一連の腫瘍および正常細胞を、連続希釈液に７日間暴露することによって定量した。細胞の生存率は、メーカーの指示に従って行われる、ＭＴＳ細胞傷害性アッセイによって測定した（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓＮｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｆｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ，Ｐｒｏｍｅｇａ、マジソン、ウィスコンシン州）。吸収値は、非感染コントロールのパーセントとして表し、ベクター用量に対してプロットした。データにはＳ字状の用量−反応曲線がフィットした。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア、バージョン３．０を用いて各実験についてＥＣ５０値を計算した。ＥＣ５０値とは、暴露細胞培養体の最大光吸収能力を５０％低下させる、細胞当たりの粒子数で表したベクターの用量である。
【０２５３】
キメラ線維の、腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターのインビトロにおける細胞傷害性を、４種の代表的な、頭頸部細胞株およびメラノーマ細胞株で試験した。このデータは、表６および７に要約される。
【０２５４】
【表６】
2008510493.tif 000008
【０２５５】
【表７】
2008510493.tif 000009
これらのデータは、キメラ線維ベクター、ＯＶ１１９４，ＯＶ１１９５、ＯＶ１１９７，およびＯＶ１１９８による感染に対しＥＣ５０値が比較的低いこと、および、Ａｄ５に対し対応する耐性が見られることを示すが、これは、メラノーマおよびＭＨＣ細胞では、Ａｄ３およびＡｄ３５の主要受容体であるＣＤ４６の発現レベルが高く、Ａｄ５の主要受容体であるＣＡＲの発現レベルが低いことによって説明される。
【０２５６】
（実施例１１：キメラ線維Ａｄベクターによって発現されるヒトＧＭ−ＣＳＦレベルの定量）
ヒトＧＭ−ＣＳＦ発現を評価するために、培養腫瘍細胞に５０ウイルス粒子／細胞で感染し、感染後２４および７２時間に上清を収集し、市販のＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ミネアポリス、ミネソタ州）を用いて、発現した全ＧＭ−ＣＳＦを定量した。培養細胞上清は、アッセイバッファーで１０倍から１０００倍に希釈した。データは、分光光度計にて４９０ｎｍにおいて得、ＳｏｆｔＭａｘソフトウェアパッケージを用いて分析した。ヒトのＧＭ−ＣＳＦの標準曲線は、通常、Ｒ２値＞０．９９５を持ち、アッセイの感度は、典型的には７．８ｐｇ／ｍＬであった。頭頸部がん細胞株に対する代表的キメラ線維ベクターに関して表されるヒトＧＭ−ＣＳＦの量を、表８Ａ（２４時間）および表８Ｂ（７２時間）に示す。また、メラノーマ細胞株に関するデータを、表９Ａ（２４時間）および表９Ｂ（７２時間）に示す。
【０２５７】
【表８Ａ】
2008510493.tif 000010
【０２５８】
【表８Ｂ】
2008510493.tif 000011
【０２５９】
【表９Ａ】
2008510493.tif 000012
【０２６０】
【表９Ｂ】
2008510493.tif 000013
結果から、高レベルのヒトＧＭ−ＣＳＦの発現は、代表的頭頸部およびメラノーマ細胞株が、キメラ線維ベクターＯＶ１１９４およびＯＶ１１９５によって感染された場合に得られることが示された。
【０２６１】
（実施例１２：異種移植片腫瘍モデルにおけるキメラ線維Ａｄベクターのインビボ効力）
ＦａＤｕ（頭頸部がん）またはＡ３７５−ｌｕｃ（メラノーマ）異種移植片を負荷されたヌードマウスにおいて、Ｅ１含有キメラ線維Ａｄベクターの効力を評価した。ヌードマウス（Ｈｓｄ：無胸腺ヌードｎｕ；Ｓｉｍｏｎｓｅｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇｉｌｒｏｙ，カリフォルニア州）の右横腹に、Ｆａｄｕ（１００μｌのＨＢＳＳに懸濁させた５×１０６細胞）またはＡ３７５−ｌｕｃ（１００μｌのＨＢＳＳに懸濁させた２×１０６細胞）を植えつけた。腫瘍が５０−１５０ｍｍ３に達した時点で、マウスを数群（ｎ＝１０）に分割し、５０μｌ用量において１×１０１０ウイルス粒子またはＰＢＳを、腫瘍内部に４回投与した。腫瘍のサイズを、週に２度、２次元的に測定し、腫瘍容量を、Ｗ×（Ｌ）２×Ｈ／６として計算した。各治療グループの平均腫瘍容量±ＳＥ平均を、ベクター感染後の日数に対してプロットした。
【０２６２】
（実施例１３：原発性腫瘍細胞を単離し、本発明のアデノウイルスを形質導入し、その細胞を再度哺乳動物に投与する一つの方法）
腫瘍細胞を、皮膚病変および皮下病変、リンパ節、および、肺、肝臓、および軟部組織転移部から切り出した。摘出後、標本を無菌的に、滅菌容器に移し、実験室に輸送した。
【０２６３】
その後の手順は全て、無菌状態の下で行われることが好ましい。腫瘍組織は、コラゲナーゼ処理、または機械的解離によってバラバラにされ、次に、培養体として育成するか、および／または、５０パーセントＦＣＳ（コラゲナーゼ処理）またはヒトアルブミン（機械的解離）を含むＤＭＳＯにおいて凍結する。一次および二次自己由来腫瘍細胞の数を培養において拡張し、その後、それらの細胞の一部または全てを、ｈＧＭ−ＣＳＦをコードする本発明の組み換えアデノウイルスを用いてｈＧＭ−ＣＳＦを生産するように形質導入する。
【０２６４】
好ましくは、形質導入細胞は、無菌で、生存しており、サイトカインを生産することを確認した後に、この形質導入細胞に照射し、正常生食液に懸濁し、元のドナーに注入（皮内と皮下両方に、０．２５−１．０ｍｌ容量で、最大５箇所）によって戻す。１回の注入当たりの細胞の量は、通常、５×１０５から５×１０８であるが、一つの実施態様では、４×１０６から５×１０７細胞である。複数回の注入を行ってもよい。一つの実施態様では、複数回の注入が、異なる日にちに行われる（例えば、７日、１４日、２１日、１ヶ月の間隔、またはそれらの組み合わせ）。一つの実施態様では、最大３回の注入が行われる。注入スケジュールは、特に、形質導入細胞の収率に依存する。
【０２６５】
（実施例１４：原発性腫瘍細胞を単離し、本発明のアデノウイルスを形質導入し、その細胞を再度哺乳動物に投与する別法）
外科的手法を用いて、ワクチン製剤用の腫瘍組織（例えば、自己由来）を得る。ワクチン細胞調製は、４８時間の製造工程を含む。ワクチンは、リンパ節、肺、胸水、副腎、甲状腺皮下結節、および傍棘突起塊を含む部位から得られる転移性腫瘍から製造される。
【０２６６】
簡単に言うと、腫瘍標本が、個体から取り出され、ＨＢＳＳバッファーで洗浄され、好ましくは３グラム以下の複数部分に切り分けられる。各部分は、個別のペトリ皿に移され、そこに、組織１グラム当たり５ｍｌのコラゲナーゼが加えられる。腫瘍組織は、１から３ｍｍ３切片にスライスされ、Ｓｔｏｍａｃｈｅｒバッグに移される。
【０２６７】
容量は２０ｍｌ未満であることが好ましい。バッグは密封され、機械的ホモジェナイザー、または、Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ  Ｌａｂ  Ｂｌｅｎｄｅｒの中に収められ、消化が完了するまでホモジェナイズされる（通常３０から４０分、すなわち、バッグの中身が、あったとしても、ごく僅かな未消化の組織片を留めるだけの、粘ちょうなミルク状の懸濁液となるまで）。次に、このホモジェネートを、２０ｍｌの培養液で希釈し、最終容量を４０ｍｌとし、２０００ＲＰＭで、４℃で１０分遠心する。上清を廃棄し、細胞ペレットを、氷上で、１０ｍｌの培養液に再懸濁する。これらの工程を、標本全部が消化され、事実上完全に酵素（例えば、コラゲナーゼ）が洗い流されるまで洗浄され、培養液に懸濁される。次に、この懸濁液における細胞の数と生存率をトリパンブルーによって定量することが可能である。
【０２６８】
次に、この細胞懸濁液を、２，０００ｒｐｍ、４℃で１０分遠心することによって、形質導入に好適な密度にまで濃縮してもよい。次に、このペレットを再懸濁して、形質導入に好適な最終細胞密度（例えば、１０７細胞／ｍｌ）とする。若干の細胞は取り分けて、遅延型過敏症（ＤＴＨ）試験、細胞株の決定、および、寒冷保存のために使用してもよい。残余の細胞は、組み換えアデノウイルス、例えば、ヒトＧＭ−ＣＳＦをコードするアデノウイルスによって形質導入される。
【０２６９】
形質導入を実行するのに必要なプラーク形成単位（ｐｆｕ）の数またはウイルス粒子の数は、全体細胞数（死亡＋生存、腫瘍消化後に計算される）を掛けることによって求められる。例えば、１０という感染倍数が所望ならば、細胞全体数に１０を掛ける。次に、ウイルスは、培養液で、最終濃度の１０倍に希釈される。次に、腫瘍懸濁液１ｍｌ当たり０．１ｍｌのアデノウイルス−ＧＭ−ＣＳＦ懸濁液が、細胞懸濁液に加えられる。組み換えアデノウイルスは、例えば、標準的な第１世代Ｅ１およびＥ２遺伝子欠損複製不能ウイルスで、ヒトＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを、そのＥ１欠失領域に挿入させたウイルスであってもよい。もちろんサイトカインｃＤＮＡは、ウイルスゲノムの他の領域に導入させることも可能である。
【０２７０】
細胞は、１０分毎に穏やかに掻き回しながら、室温（すなわち、約２３−２５℃）で１時間インキュベートする。次に、腫瘍細胞懸濁液の容量を、この懸濁液に適切容量の培養液を加えることによって２倍にする。細胞懸濁液を、適切な組織培養容器に移し、細胞を３７℃でインキュベートする。
【０２７１】
この腫瘍細胞を、組み換えアデノウイルスによって３７℃で一晩形質導入する。一晩の形質導入後、細胞を、ＨＢＳＳで十分に洗浄した後、ガンマ照射器を用い１０，０００Ｒａｄで２４時間照射する。小分液の細胞（最大全体の１０％）を培養液の存在下４８時間培養する。
【０２７２】
ＧＭ−ＣＳＦが導入遺伝子である場合、形質導入細胞からのＧＭ−ＣＳＦ分泌は、ＧＭ−ＣＳＦ生産の適切な標的レベルを記録するために、ＥＬＩＳＡ（例えば、市販のキット、例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ミネアポリス、ミネソタ州から販売されるキットを用いて）で定量してもよい。本発明のある実施態様では、標的レベルは、少なくとも２０ｎｇＧＭ−ＣＳＦ／１０６細胞／２４時間であり、少なくとも４０ｎｇＧＭ−ＣＳＦ／１０６細胞／２４時間、少なくとも１００ｎｇＧＭ−ＣＳＦ／１０６細胞／２４時間、または、１０００ｎｇＧＭ−ＣＳＦ／１０６細胞／２４時間以上である。
【０２７３】
さらに、操作される細胞の無菌性を保証するために、細菌および真菌の通例培養を実施してもよい。ワクチン接種および免疫学的評価用の細胞は、１０％ＤＭＳＯ／９０％ウシ胎児血清で凍結し、液体窒素中で保存する。
【０２７４】
ワクチン接種手順の例は下記の通りである。細胞は解凍し、Ｈａｎｋｓバッファー塩（ＨＢＳＳ）液で２回洗浄する。投与するには、細胞を、投与前１時間以内に解凍し、無菌の生食液中で、全体１ｍｌ以下の容量で懸濁する。ワクチン接種は、単回注入で、できれば全体が１ｍｌ以下の容量で、皮内に２３または２５ゲージ針で、上腕と大腿に交互に投与されるのが好ましい。各注入の合計容量は、投与される容量レベルに依存する。
【０２７５】
（配列表における配列の説明）
本開示に関連する配列表は、本開示中に参考として援用される。下記は、配列表に含まれる配列の説明である。
【０２７６】
配列番号１は、Ａｄ５線維タンパク質をコードするヌクレオチド配列である（Ａｄ５−ＣＭＶ５−ＧＦＰ；Ｂｐ位置：２８３３８−３００８３）。
【０２７７】
配列番号２は、５８１アミノ酸長のＡｄ５線維アミノ酸配列である。
【０２７８】
配列番号３は、Ａｄ２線維タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
【０２７９】
配列番号４は、Ａｄ２線維アミノ酸配列である。
【０２８０】
配列番号５は、Ａｄ３５線維タンパク質をコードするヌクレオチド配列である（Ａｄ５−ＣＭＶ５−ＧＦＰ−３５Ｆ；Ｂｐ位置２８３３７−２９３０８）。
【０２８１】
配列番号６は、３２３アミノ酸長のＡｄ３５線維アミノ酸配列である。
【０２８２】
配列番号７は、アデノウイルス線維共通モチーフＫＬＧＸＧＬＸＦＤ／Ｎである。
【０２８３】
配列番号８は、５Ｔ３５Ｈ線維タンパク質をコードする遺伝子（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列である（Ａｄ５−ＣＭＶ５−ＧＦＰ−５Ｔ３５Ｈ；Ｂｐ位置２８３３８−３０１１０）。
【０２８４】
配列番号９は、５Ｔ３５Ｈ線維（Ａｄ５由来のテールおよびシャフト、ならびに、Ａｄ３５から得られたノブ領域）のアミノ酸配列である：５９０アミノ酸長。
【０２８５】
配列番号１０は、５Ｔ３Ｈ線維タンパク質をコードする遺伝子（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列である（Ａｄ５−ＣＭＶ５−ＧＦＰ−５Ｔ３Ｈ；Ｂｐ位置２８３３８−３００９７）。
【０２８６】
配列番号１１は、５Ｔ３Ｈ線維（Ａｄ５由来のテールおよびシャフト、ならびに、Ａｄ３から得られたノブ領域）のアミノ酸配列である：５８７アミノ酸長。
【０２８７】
配列番号１２は、５Ｔ３Ｈ−ＲＧＤ線維タンパク質をコードする遺伝子（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列である（Ａｄ５−ＣＭＶ５−ＧＦＰ−５Ｔ３Ｈ−ＲＧＤ；Ｂｐ位置３０２１７−３２０５２）。
【０２８８】
配列番号１３は、５Ｔ３Ｈ−ＲＧＤ線維（Ａｄ５由来のテールおよびシャフト、ならびに、Ａｄ３から得られたノブ領域）のアミノ酸配列である：６１１アミノ酸長。ＲＧＤ配列は、線維タンパク質のカルボキシル末端に位置する。
【０２８９】
配列番号１４は、ｈＧＭ−ＣＳＦのアミノ酸配列である。
【０２９０】
配列番号１５は、ｈＧＭ−ＣＳＦをコードするヌクレオチド配列である。
【０２９１】
配列番号１６は、ｈＧＭ−ＣＳＦをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
【０２９２】
配列番号１７は、アデノウイルス５  ＰＣＲプライマー１である。
【０２９３】
配列番号１８は、アデノウイルス５  ＰＣＲプライマー２である。
【０２９４】
配列番号１９は、アデノウイルス５  ＰＣＲプライマー３である。
【０２９５】
配列番号２０は、アデノウイルス５  ＰＣＲプライマー４である。
【０２９６】
配列番号２１は、ヒトＧＭ−ＣＳＦ  ＰＣＲプライマーＰＳＲ３である。
【０２９７】
配列番号２２は、ヒトＧＭ−ＣＳＦ  ＰＣＲプライマーＰＳＲ４である。
【０２９８】
配列番号２３は、ＳＶ４０後期ポリ（Ａ）シグナルＰＣＲプライマーＰＳＲ６である。
【０２９９】
配列番号２４は、ＳＶ４０後期ポリ（Ａ）シグナルＰＣＲプライマーＰＳＲ７である。
【０３００】
配列番号２５は、カルボキシラーゼによって除去され得る、フリン切断部位由来のアミノ酸残基ＲＫＫＲである。
【０３０１】
配列番号２６は、カルボキシラーゼによって除去され得る、フリン切断部位由来のアミノ酸残基ＲＫＲＲである。
【０３０２】
配列番号２７は、カルボキシラーゼによって除去され得る、フリン切断部位由来のアミノ酸残基ＲＲＲＲである。
【図面の簡単な説明】
【０３０３】
【図１】図１は、野生型線維構築物および例示的なキメラ線維構築物の代表を提供する。全ての改変された線維は、アデノウイルスベクターに組み込まれ得る（例えば、Ｅ１領域が欠失したＡｄ５ベースのベクター）。Ａｖ１ｎＢｇベースのベクターは、ＲＳＶプロモーターの制御下でβ−ガラクトシダーゼを発現する。Ａｄ５−ＣＭＶ５−ＧＦＰベースのベクターは、ＣＭＶ前初期プロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質を発現する。各ベクターについてのシャフト領域およびノブ領域の供給源も図に示されている。
【図２】図２は、ＦａＤｕヒト頭頸部腫瘍異種移植片腫瘍モデルにおける、ＯＶ１９９１の抗腫瘍効力を図示するグラフである。
【図３】図３は、Ａ３７５−ｌｕｃヒトメラノーマ異種移植片腫瘍モデルにおける、キメラ線維腫瘍崩壊性ベクターの抗腫瘍効力を図示するグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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