(57)【要約】  本発明は、障害が起きた骨状態を有する被験体の治療のための方法および組成物に関する。具体的には、本発明は、ＢＭＰ−２療法剤の用量関連転換障壁を克服するための、ＬＩＭミネラル化タンパク質、特にＬＭＰ−１の小分子およびペプチド模倣体を含む併用療法戦略に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
障害が起きた骨状態を有する被験体において、骨の沈着および成熟を誘導するための方法であって、少なくとも１つのＬＭＰ剤および療法的に有効な用量以下の少なくとも１つのＢＭＰ剤を、こうした治療が必要な被験体に投与する、同時療法治療措置を含む、前記方法。
【請求項２】
前記の少なくとも１つのＬＭＰ剤を、前記の少なくとも１つのＢＭＰ剤より前に投与する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記の少なくとも１つのＬＭＰ剤を、前記の少なくとも１つのＢＭＰ剤より後に投与する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ＬＭＰ剤を、前記の少なくとも１つのＢＭＰ剤と同時に投与する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記の少なくとも１つのＬＭＰ剤および前記の少なくとも１つのＢＭＰ剤を、骨形成性組成物として投与する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記投与がターゲットとする部位に対してである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ターゲットとする部位が、椎間空間、面関節、骨折部位、口、頤および顎の骨、ならびにインプラント部位である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記投与が、髄膜内注射、皮下、静脈内、腹腔内、筋内注射、インプラント内、または上記の組み合わせからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
ＢＭＰ剤の前記療法的有効用量が１．５ｍｇ／ｍｌ未満である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記の少なくとも１つのＢＭＰ剤の療法的有効用量が０．１５ｍｇ／ｍｌ未満である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記の少なくとも１つのＬＭＰ剤が、ＬＭＰタンパク質の機能断片、ＰＴＤが付着したＬＭＰタンパク質の機能断片、ＰＴＤが付着したＬＭＰタンパク質、ＰＴＤが付着していないＬＭＰタンパク質、ＬＭＰタンパク質変異体の機能断片、ＰＴＤが付着したＬＭＰタンパク質変異体の機能断片、ＰＴＤが付着したＬＭＰタンパク質変異体、ＰＴＤが付着していないＬＭＰタンパク質変異体、上記のいずれかをコードするオリゴヌクレオチド配列、およびＬＭＰ遺伝子からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
ＬＭＰがＬＭＰ１およびその生物学的活性断片である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ＬＭＰがＬＭＰ１ｔおよびその生物学的活性断片である、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
ＬＭＰがＬＭＰ−３およびその生物学的活性断片である、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
ＰＴＤがＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質である、請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
前記の少なくとも１つのＢＭＰ剤が、ＢＭＰタンパク質の機能断片、ＰＴＤが付着したＢＭＰタンパク質の機能断片、ＢＭＰタンパク質、ＢＭＰタンパク質変異体の機能断片、ＰＴＤが付着したＢＭＰタンパク質変異体の機能断片、ＢＭＰタンパク質変異体、上記のいずれかをコードするオリゴヌクレオチド配列、およびＢＭＰ遺伝子からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
ＬＭＰタンパク質断片が、以下の配列：
アセチル−ＧＡＰＰＰＡＤＳＡＰＱＱＮＧＱＰＬＲＰＬＶＰＤＡＳＫＱＲＬＭＧＧＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ−ＮＨ２
を含むペプチド７である、請求項１１記載の方法。
【請求項１８】
ＢＭＰがＢＭＰ−２である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
ＢＭＰがｒｈＢＭＰ−２である、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
状態が、骨折、骨欠陥、骨移植、骨グラフト、骨癌、関節置換、関節修復、癒合、小関節面修復；骨変性、歯科インプラントおよび修復、骨髄欠損、ならびに骨および骨性組織と関連する他の状態からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
骨欠陥が、骨における隙間、変形または非癒合骨折である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
骨変性が骨減少症または骨粗しょう症のためである、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
骨欠陥が小人症のためである、請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
関節置換が、脊椎関節、膝関節、股関節、足根関節、指関節、ひじ関節、足関節または他の連結関節からなる群より選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
関節修復が、脊椎関節、膝関節、股関節、足根関節、指関節、ひじ関節、足関節、仙腸関節からなる群より選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２６】
ＢＭＰ剤の存在下で、新規骨が形成されるのに必要な時間を減少させるための方法であって、少なくとも１つのＬＭＰ剤を同時投与することを含む、前記方法。
【請求項２７】
ＢＭＰ剤が、内因性ＢＭＰタンパク質、外因性ＢＭＰタンパク質、外因性ＢＭＰタンパク質変異体からなる群より選択される、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１つのＬＭＰ剤；
少なくとも１つのＢＭＰ剤；および
場合によって、少なくとも１つの薬学的に許容しうるキャリアー
を含む、骨形成性組成物。
【請求項２９】
少なくとも１つのＳｍｕｒｆ結合剤；および
少なくとも１つのＢＭＰ剤；および
場合によって、少なくとも１つの薬学的に許容しうるキャリアー
を含む、骨形成性組成物。
【請求項３０】
少なくとも１つの薬学的に許容しうるキャリアーが、細胞、ベクター、ゲル、微小球体、巨大分子、生体適合性の泡、生体適合性マトリックス、およびインプラントからなる群より選択される、請求項２９記載の骨形成性組成物。
【請求項３１】
少なくとも１つのリン酸化Ｓｍａｄ１競合的結合剤、および
少なくとも１つのＢＭＰ剤
を含む、骨形成性組成物。
【請求項３２】
少なくとも１つのリン酸化Ｓｍａｄ５競合的結合剤、および
少なくとも１つのＢＭＰ剤
を含む、骨形成性組成物。
【請求項３３】
前記の少なくとも１つのＳｍｕｒｆ結合剤が、ＬＭＰ−１タンパク質、およびＬＭＰ−１タンパク質断片、Ｓｍｕｒｆ  ｍＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡからなる群より選択される、請求項２９記載の骨形成性組成物。
【請求項３４】
Ｓｍｕｒｆが、Ｓｍａｄユビキチン制御因子−１（Ｓｍｕｒｆ１）およびＳｍｕｒｆ２からなる群より選択される、請求項２９記載の組成物。
【請求項３５】
前記の少なくとも１つのリン酸化Ｓｍａｄ１競合的結合剤が、ＬＭＰ−１タンパク質、およびＬＭＰ−１タンパク質断片、リン酸化Ｓｍａｄ１に特異的なｓｉＲＮＡからなる群より選択される、請求項３１記載の骨形成性組成物。
【請求項３６】
前記の少なくとも１つのリン酸化Ｓｍａｄ５競合的結合剤が、ＬＭＰ−１タンパク質、およびＬＭＰ−１タンパク質断片、リン酸化Ｓｍａｄ５に特異的なｓｉＲＮＡからなる群より選択される、請求項３１記載の骨形成性組成物。
【請求項３７】
少なくとも１つのＬＭＰ剤および少なくとも１つのＢＭＰ剤を、骨形成細胞、多能性幹細胞、間充織細胞、および胚性幹細胞からなる群より選択される細胞と合わせることを含む、骨組織を操作するための方法。
【請求項３８】
請求項３７記載の方法によって産生される、操作された骨組織。
【請求項３９】
請求項３８記載の操作された骨組織を投与することを含む、被験体において骨形成を誘導するための方法。
【請求項４０】
少なくとも１つのリン酸化Ｓｍａｄ４競合的結合剤、および
少なくとも１つのＢＭＰ剤
を含む、骨形成性組成物。
【請求項４１】
前記の少なくとも１つのリン酸化Ｓｍａｄ４競合的結合剤が、ＬＭＰ−１タンパク質、およびＬＭＰ−１タンパク質断片、リン酸化Ｓｍａｄ４に特異的なｓｉＲＮＡからなる群より選択される、請求項４０記載の骨形成性組成物。
【請求項４２】
少なくとも１つのリン酸化Ｓｍａｄ４競合的結合剤および少なくとも１つのＢＭＰ剤を、骨形成細胞、多能性幹細胞、間充織細胞、および胚性幹細胞からなる群より選択される細胞と合わせることを含む、骨組織を操作するための方法。
【請求項４３】
請求項４２記載の方法によって産生される、操作された骨組織。
【請求項４４】
請求項４３記載の操作された骨組織を投与することを含む、被験体において骨形成を誘導するための方法。
【請求項４５】
障害が起きた骨状態を有する被験体において、骨の沈着および成熟を誘導するための方法であって、該被験体に、少なくとも１つのＪＡＢ１阻害剤および療法的有効用量の少なくとも１つのＢＭＰ剤を投与することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
多くの米国人は、腰痛、変性脊髄疾患、または骨折に苦しむ。米国において、これらの筋骨格の問題は、健康管理予算の大きな部分を占め、そして慢性身体障害および生産性の喪失の最大の原因の１つである。これらの問題の整形外科手術治療は、しばしば、治癒を促進するため、骨グラフトを必要とする。癌性骨グラフトと２以上の骨が癒合すると、患者の２５〜４５％で、治癒できない可能性があり、そして退役軍人集団ではより顕著な併存疾患である、喫煙者および糖尿病患者では、さらにより高い割合となる。ＢＭＰ−２などの骨誘導性タンパク質を使用してこれらの患者で骨形成を誘導することが現在可能である。２００２年、米国食品医薬品局は、椎体間（ｉｎｔｅｒｂｏｄｙ）脊椎固定における骨グラフト代替物としての使用に関して、ｒｈＢＭＰ−２を認可した。ＢＭＰ−２のこの制御における画期的出来事にもかかわらず、この技術は、ヒトでは予想外に高い用量が必要とされ、非常に高いコストを生じたため、骨治癒の必要性がある多くの患者には、実行不能である（Ｂｏｄｅｎ  ＳＤ，  Ｚｄｅｂｌｉｃｋ  ＴＡ，  Ｓａｎｄｈｕ  ＨＳ，  およびＨｅｉｍ  ＳＥ．  Ｓｐｉｎｅ  ２０００；２５：３７６−８１；  Ａｃｋｅｒｍａｎ  ＳＪ，  Ｍａｆｉｌｉｏｓ  ＭＳ，  およびＰｏｌｌｙ  ＤＷ，  Ｊｒ．  Ｓｐｉｎｅ  ２００２；２７：Ｓ９４−Ｓ９９）。
【０００２】
細胞培養における（１００ｎｇ／ｍｌ）よりも、ヒトでは（１．５ｍｇ／ｍｌ）、骨を誘導するのに、１５，０００倍高い濃度のＢＭＰ−２が必要とされる。したがって、ＢＭＰ−２反応性を劇的に改善しないことには、骨芽細胞分化に関する最近５０年で最も影響力が大きい発見の１つの、多数の患者を助けるような転換は、健康管理の経済的理由から、ひどく制限されてしまう。
【０００３】
その結果、特に最も困難な整形外科治癒環境である後側部腰椎固定において、ＢＭＰ−２の効果を増進するか、またはその必要とされる用量を、より手ごろな量のタンパク質に限定することが可能となるように、骨芽細胞分化中のＢＭＰ−２の複雑な制御およびこうした重要な骨形成タンパク質に対する細胞反応性をさらに理解することが非常に重要である。
【０００４】
数年前、胎児および出生後骨形成に非常に重要な新規細胞内ＬＩＭドメインタンパク質が同定された（Ｂｏｄｅｎ  ＳＤ，  Ｌｉｕ  Ｙ，  Ｈａｉｒ  ＧＡら  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １９９８；１３９：５１２５−３４）。
【０００５】
該タンパク質は、ＬＩＭミネラル化タンパク質（ＬＩＭ  Ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＬＭＰ−１）と名付けられ、骨芽細胞分化に直接関連付けられた、最初のＬＩＭドメインタンパク質であった。ＬＭＰ−１発現を遮断すると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで骨芽細胞分化が妨げられ、この新規細胞内タンパク質が、非常に重要な機能的役割を果たすことが示唆された。ＬＭＰ−１  ｃＤＮＡを（プラスミドまたはアデノウイルス形質導入を介して）発現している白血球をウサギまたは無胸腺ラットに移植すると、骨性および異所性の位置で、骨形成が誘導される（Ｂｏｄｅｎ  ＳＤ，  Ｔｉｔｕｓ  Ｌ，  Ｈａｉｒ  Ｇら  Ｓｐｉｎｅ  １９９８；２３：２４８６−９２）。ウサギおよび霊長類において、脊椎固定および骨欠陥適用のためのｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療によるＬＭＰ−１送達の実行可能性が、現在、評価されつつある。ＬＭＰ−１はまた、骨粗しょう症患者において、骨密度を増加させる、局部、局所、または全身性同化作用戦略として、かなりの潜在能力を有する。しかし、臨床適用が真剣に考慮可能となる前に、このタンパク質の作用様式を理解することが非常に重要であろう。本発明は、この問題に取り組む。
【０００６】
骨芽細胞は、多能性間充織幹細胞から分化すると考えられ、その成熟は、細胞外マトリックスの分泌を生じ、これがミネラル化し、そして骨を形成することが可能である。この複雑なプロセスの制御には、トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのメンバーである、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）として知られるシグナル伝達糖タンパク質群が関与する。いくつかのＢＭＰは、全骨芽細胞分化カスケードを独自に開始することが可能であり、そしてＢＭＰ−２は、最も幅広く研究されているものの１つである。
【０００７】
ＬＭＰ−１が、ＢＭＰ−２に対する間充織幹細胞（ＭＳＣ）の細胞反応性を劇的に増加可能であることを本出願者が発見し、そしてＬＭＰ−１のシグナル伝達経路の多様な側面が機構的に解明されたことから、本発明は、ＢＭＰ−２療法剤に関する用量関連転換障壁を克服するため、小分子およびペプチド模倣体を含む、併用戦略を提供する。
発明の概要
本発明は、ＢＭＰ−２療法剤に関する用量関連転換障壁を克服するための、ＬＩＭミネラル化タンパク質、主にＬＭＰ−１の小分子およびペプチド模倣体を含む併用療法戦略に関する。
詳細な説明
本発明は、細胞、組織および生物において、増殖因子反応性を調節する際の、ＬＩＭミネラル化タンパク質（ＬＭＰ）作用の機構を解明するために設計された研究から生じる。これらの研究の結果として、本出願者らは、骨修復、置換または増大の必要がある被験体、例えば障害が起きた骨状態に苦しむ被験体において、骨形成を誘導するため、少なくとも１つのＬＩＭミネラル化タンパク質および少なくとも１つの増殖因子を含む骨形成性組成物を投与した際、予想外の相乗的結果があることを発見した。
概説
本明細書に開示する研究は、ＬＭＰ−１が、ＭＳＣにおいて、ＢＭＰ−２に対する反応性を増進することを立証する。この観察の根底にある機構を解明するため、ＢＭＰ−２シグナル伝達分子、Ｓｍａｄ１およびＳｍａｄ５の分解の重要な制御因子である、Ｓｍｕｒｆ１と同定される８５ｋＤａのタンパク質と、ＬＭＰ−１が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで相互作用することがさらに立証される。本明細書において、内因性Ｓｍｕｒｆ１およびＬＭＰ−１が細胞から免疫共沈降することもまた立証され、相互作用の生理学的関連性が示唆される。Ｓｍｕｒｆ１／ＬＭＰ−１相互作用の重要性は、ＬＭＰ−１過剰発現が、核におけるリン酸化Ｓｍａｄ１（Ｐ−Ｓｍａｄ１）のレベルを増加させ、そしてＢＭＰ−２に制御される遺伝子の発現を増加させるという事実によってさらに立証され、これらはＳｍｕｒｆ１／ＬＭＰ−１相互作用から予期される結果である。ＳｍｕｒｆへのＳｍｕｒｆ１  ＷＷドメイン抗体の結合の阻害を、ＬＭＰ−１が誘導することから、ＷＷドメインは、ＬＭＰ−１が結合するＳｍｕｒｆ１の領域と同定された。さらに、ＬＭＰ−１配列の分析によって、ＬＭＰ−１の骨誘導性領域内に、２つの潜在的なＷＷドメイン相互作用モチーフが同定されている。また、ＬＭＰ−１がＢＭＰＲ１Ａレベルを増加させることも立証され、これは、Ｓｍｕｒｆ１／Ｓｍａｄ６が仲介するＢＭＰ受容体の分解を、ＬＭＰが妨害するという仮説を支持する。本明細書において、ＬＭＰ−１は、一般的なＳｍａｄであるＳｍａｄ４の分解を制御するアダプタータンパク質であるＪａｂ１と相互作用し、その結果、核Ｓｍａｄ４の増加を生じることが示される。
【０００８】
さらに、Ｓｍｕｒｆ１と相互作用するＬＭＰの正確な領域を本明細書に同定する。この発見によって、ＬＭＰの効果を模倣する小化合物の設計が容易になる。化合物には、小タンパク質およびペプチドが含まれる。さらに、組換えＴＡＴ−ＬＭＰ融合タンパク質を単回曝露用量で使用することが可能であることが立証され、有効な療法転帰には、連続的なＬＭＰ−１発現が必要とはされないことが確認され、そしてＬＭＰ模倣小化合物の設計への道が開かれる。
【０００９】
ＬＭＰ−１およびＳｍｕｒｆ１の間の新規相互作用もまた発見し、これはＢＭＰシグナル伝達および反応性に関する強力な調節機構に相当する。このＬＭＰ−１相互作用は、Ｓｍｕｒｆ  ＷＷ２ドメインで起こり、ＬＭＰ−１における特異的ＰＹモチーフに依存し、そしてそのモチーフのみを含有する小ペプチドによって模倣可能である。さらに、ＬＭＰ−１は、競合的にＳｍｕｒｆ１に結合し、ユビキチンが仲介するＳｍａｄ類のプロテアソーム分解を妨げ、ＢＭＰ−２に対する細胞反応性の増進に寄与する。これらの知見は、ＢＭＰシグナル伝達経路の反応性をより効率的に調節する小分子療法剤の設計を可能にし、これは臨床的転換をより容易にしうるであろう。こうした小分子は、臨床的使用のために、より容易に合成され、保存され、そして送達されて、単独で、または臨床的設定で現在必要とされるよりはるかにより低い用量のＢＭＰ−２とともに、骨形成を誘導するであろう。
【００１０】
したがって、ＬＭＰ−１の効果を調節する療法剤は、骨形成を誘導する戦略として、ＢＭＰ−２を置換するか、またはｒｈＢＭＰ−２の有効性を増進して、骨形成の誘導剤としてのその使用の用量およびコストを低下させる方法として役立つかいずれかの、潜在能力を有する。
併用療法
本発明は、併用療法を用いる疾患治療に関する。特に、本明細書記載の新規ＬＭＰ剤を、ＢＭＰ剤と組み合わせて用いてもよい。本発明は、少なくとも１つのＬＭＰ剤および療法的有効用量の少なくとも１つのＢＭＰ剤の同時投与によって、骨沈着を誘導する方法を提供する。ＬＭＰ剤は、ＢＭＰ剤の反応性を増進させることによって、骨形成を加速させることが可能であることが見出された。本発明の方法において、限定されるわけではないが、内因性ＢＭＰタンパク質、外因性ＢＭＰタンパク質、外因性ＢＭＰタンパク質断片、および外因性ＢＭＰタンパク質変異体断片を含むＢＭＰ剤に影響を及ぼすことによって、ＬＭＰ剤はこれを達成する。したがって、少なくとも１つのＬＭＰ剤を投与することを含む、本発明を用いて、ＢＭＰ剤の存在下で、新規骨を形成するのに必要な時間を減少させることも可能である。
【００１１】
本明細書において、ＬＩＭミネラル化タンパク質（ＬＭＰ）「ＬＭＰ」には、ＬＭＰ−１およびその生物学的活性断片、ＬＭＰ１ｔおよびその生物学的活性断片、ならびにＬＭＰ−３およびその生物学的活性断片が含まれる。配列を含めた、より詳細な説明は、米国特許６，３００，１２７、係属出願ＵＳＳＮ  １０／９５１，２３６、およびＢｏｄｅｎらに出願された係属出願ＵＳＳＮ  ０９／９５９，５７８に見出されることも可能であり、これらの解説はすべて、本明細書に援用される。ＬＭＰ−２は、骨形成性でないため、排除される。本発明に適した増殖因子には、ＢＭＰ−２を含む骨形成タンパク質（ＢＭＰ）が含まれる。
【００１２】
本明細書において、用語「ＬＭＰ剤」には、ＬＭＰタンパク質の機能断片、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）が付着したＬＭＰタンパク質の機能断片、ＰＴＤが付着したＬＭＰタンパク質、ＰＴＤが付着していないＬＭＰタンパク質、ＬＭＰタンパク質変異体の機能断片、ＰＴＤが付着したＬＭＰタンパク質変異体、ＰＴＤが付着していないＬＭＰタンパク質変異体、上記いずれかをコードするオリゴヌクレオチド配列、およびＬＭＰ遺伝子が含まれる。
【００１３】
本明細書において、用語「ＢＭＰ剤」には、ＢＭＰタンパク質の機能断片、ＰＴＤが付着したＢＭＰタンパク質の機能断片、ＢＭＰタンパク質、ＢＭＰタンパク質変異体の機能断片、ＢＭＰタンパク質変異体、内因性ＢＭＰタンパク質、外因性ＢＭＰタンパク質、外因性ＢＭＰタンパク質断片、外因性ＢＭＰタンパク質変異体断片、上記いずれかをコードするオリゴヌクレオチド配列、およびＢＭＰ遺伝子が含まれる。特に有用なＢＭＰはＢＭＰ−２、特にｒｈＢＭＰ−２である。
タンパク質およびペプチド変異体および誘導体
当業者は、アミノ酸が欠失され（「欠失変異体」）、挿入され（「付加変異体」）、または置換された（「置換変異体」）、前述のＬＭＰ剤またはＢＭＰ剤に由来する配列において得られる、多くの分子を作製可能であることを理解するであろう。こうした置換、付加、欠失、またはその組み合わせいずれかを有する分子は、個々にまたは集合的に「変異体（単数または複数）」と称される。しかし、こうした変異体は、あるレベルまで（減少したレベルを含む）、非修飾分子または「親」分子に関連する活性を維持する（例えば、ＬＭＰ変異体はＢＭＰ反応性を調節するかまたはＳｍｕｒｆ１に結合する能力を所持する）。以下、「親分子」は、非修飾分子または考察中の特定の変異を欠く変異体分子を指す。アミノ酸配列変異体（単数または複数）の構築においては、２つの主な変数：突然変異部位の位置および突然変異の性質がある。変異体（単数または複数）の設計において、各突然変異部位の位置および各突然変異の性質は、修飾しようとする生化学的特性（単数または複数）に応じるであろう。例えば（１）ターゲットアミノ酸残基を欠失させるか、（２）位置する部位に隣接して１以上のアミノ酸残基を挿入するか、または（３）まず保存的アミノ酸選択肢で置換し、そして達成した結果に応じて、次いで、よりラジカルな選択肢で置換することによって、各突然変異部位を個々にまたは連続して修飾してもよい。
【００１４】
アミノ酸配列付加には、長さ１残基〜１００残基またはそれより多い残基の範囲のアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合の挿入、ならびに単一または多数のアミノ酸残基の内部配列内挿入が含まれてもよい。内部付加は、一般的に、約１〜２０アミノ酸残基、好ましくは約１〜１０アミノ酸残基、より好ましくは約１〜５アミノ酸残基、そして最も好ましくは約１〜３アミノ酸残基の範囲であってもよい。アミノ末端またはカルボキシ末端付加の例には、形質導入ペプチドまたは他のコンジュゲート部分のすべてまたは一部と親分子のアミノ末端またはカルボキシ末端融合を含むキメラタンパク質が含まれる。
【００１５】
アミノ酸配列欠失は、一般的に、約１〜３０アミノ酸残基、好ましくは約１〜２０アミノ酸残基、より好ましくは約１〜１０アミノ酸残基、そして最も好ましくは約１〜５連続残基の範囲である。アミノ末端、カルボキシ末端および内部配列内欠失が、本発明に意図される。本明細書において、タンパク質の「機能断片」は、親タンパク質またはペプチドの関心対象の特性を保持する、タンパク質の任意の断片または部分である。本明細書において、「生物学的に活性である」は、親分子由来の問題の特性または性質を保持することを意味する。
【００１６】
１つの態様において、タンパク質またはペプチドは、多数の結合部位によって提供されるような多数の活性を所持してもよい。これらの結合部位またはドメインは、同一でもまたは多様でもよく、そして連続していても、または非結合部位アミノ酸によって分離されていてもよい。
【００１７】
さらに別の態様において、組換えタンパク質、ペプチドまたは融合タンパク質を産生してもよい。
別の態様において、本発明のＬＭＰ剤またはＢＭＰ剤は、他のタンパク質またはペプチドにコンジュゲート化される。タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）、ならびにタンパク質およびペプチドへのこれらの付着が意図される。本発明の１つの態様において、ＰＴＤはＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質である。
【００１８】
１つの態様において、変異体タンパク質またはペプチドは、好ましくは、親分子のアミノ酸、あるいは由来する親分子の部分またはドメインに実質的に相同である。用語「実質的に相同」は、本明細書において、８０％を超える、好ましくは９０％を超える、より好ましくは９５％を超える、または最も好ましくは９９％でさえある、相同性の度合いを意味する。相同性は、より小さいペプチドまたは変異体に対して決定され、そして該変異体またはペプチドが由来する親分子における、そのドメイン、部位または断片に渡って測定される。
【００１９】
本発明はまた、その特性を修飾するため、ペプチドが、非タンパク質性部分（例えばポリマー）に連結された、親分子（単数または複数）の化学的に修飾された誘導体も含む。これらの化学的に修飾された分子は、本明細書において「誘導体」と呼ばれる。本明細書の開示を鑑みて、当業者がこうした誘導体を調製することも可能である。グリコシル化、非グリコシル化、または脱グリコシル化親分子（単数または複数）および適切な化学部分を用いて、コンジュゲートを調製してもよい。典型的には、非グリコシル化分子および水溶性ポリマーを用いる。本発明に含まれる他の誘導体には、翻訳後修飾（例えばＮ連結またはＯ連結炭水化物鎖、Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング）、アミノ酸主鎖への化学部分の付着、およびＮ連結またはＯ連結炭水化物鎖の化学的修飾が含まれる。また、ポリペプチドを、酵素的、蛍光、同位体または親和性標識などの検出可能標識で修飾して、タンパク質ペプチドの検出および単離を可能にしてもよい。
【００２０】
水溶性ポリマーが望ましく、これは各々が付着するタンパク質またはペプチドが、生理学的環境などの水性環境において、沈殿しないであろうためである。好ましくは、ポリマーは、療法製品または組成物の調製のため、薬学的に許容しうるであろう。当業者は、ポリマー／タンパク質コンジュゲートが、療法的に用いられるかどうか、そしてそうであれば、該タンパク質の療法プロフィール（例えば持続放出期間；タンパク質分解に対する耐性；あるとすれば投薬量に対する影響；生物学的活性；取り扱いの容易さ；抗原性の度合いまたは欠如、および療法タンパク質に対する水溶性ポリマーの他の公知の影響）などの考慮に基づいて、望ましいポリマーを選択可能であろう。
【００２１】
変異体および／または誘導体をスクリーニングして、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの生理学的特性を評価してもよいし、そして続いて、本明細書記載のモデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏでスクリーニングしてもよい。こうした変異体（単数または複数）は、非修飾分子と類似の特性を示すが、対応する親分子と必ずしも同じ特性すべてでなく、そして必ずしも同じ度合いでないことが認識されるであろう。
オリゴヌクレオチド
本発明のオリゴヌクレオチド配列には、関心対象のタンパク質またはペプチドを「コードする」であろうポリマー性核酸配列が含まれる。一般の当業者は、遺伝暗号の縮重を、そして多様なコドンが、なお、翻訳に際して同じタンパク質を産生可能であることを認識するであろう。本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」には、本発明のタンパク質またはペプチドあるいはその親分子をコードする核酸配列が含まれ、限定されるわけではないが、ＬＭＰおよびＢＭＰ剤、ならびに前記剤をコードするベクター、ならびに本明細書に開示する遺伝子をターゲットとするように設計された小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、特にＢＭＰおよびＬＭＰシグナル伝達経路に関与するものが含まれる。本発明の特定のオリゴヌクレオチドには、ＬＭＰ−１、Ｓｍｕｒｆ１、Ｓｍｕｒｆ２およびＪａｂ１に対して設計されたｓｉＲＮＡが含まれる。
薬剤組成物
本発明はまた、骨形成性組成物の形の薬剤組成物も提供する。本明細書において、「骨形成性組成物」は、少なくとも１つの他の剤、および場合によって、少なくとも１つの薬学的に許容しうる希釈剤、キャリアー、可溶化剤、乳化剤、保存剤および／またはアジュバントと合わせた、少なくとも１つのＢＭＰ剤の療法的有効量を含む、組成物である。好ましい態様において、骨形成性組成物は、少なくとも１つのＬＭＰ剤および少なくとも１つのＢＭＰ剤の療法的有効量、ならびに場合によって、少なくとも１つの薬学的に許容しうる希釈剤、キャリアー、可溶化剤、乳化剤、保存剤および／またはアジュバントを含む。句「少なくとも１つ」には、１つまたは１より多く；例えば２、３、４またはそれより多くが含まれると理解される。
【００２２】
別の態様において、骨形成性組成物は、少なくとも１つのＳｍｕｒｆ結合剤；および少なくとも１つのＢＭＰ剤；ならびに場合によって、少なくとも１つの薬学的に許容しうる希釈剤、キャリアー、可溶化剤、乳化剤、保存剤および／またはアジュバントを含む。本発明において、Ｓｍｕｒｆ結合剤には、ＬＭＰ−１タンパク質、およびＬＭＰ−１タンパク質断片、変異体または誘導体、ならびにＳｍｕｒｆ  ｍＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡが含まれる。ＳｍｕｒｆはＳｍａｄユビキチン制御因子−１（Ｓｍｕｒｆ１）およびＳｍｕｒｆ２からなる群より選択される。
【００２３】
さらに別の態様において、骨形成性組成物は、少なくとも１つのリン酸化Ｓｍａｄ１競合的結合剤および少なくとも１つのＢＭＰ剤を含む。本発明において、リン酸化Ｓｍａｄ１競合的結合剤には、限定されるわけではないが、ＬＭＰ−１タンパク質、およびＬＭＰ−１タンパク質断片、変異体または誘導体、ならびにリン酸化Ｓｍａｄ１に特異的なｓｉＲＮＡが含まれる。
【００２４】
別の態様において、骨形成性組成物は、少なくとも１つのリン酸化Ｓｍａｄ５競合的結合剤および少なくとも１つのＢＭＰ剤を含む。本発明において、リン酸化Ｓｍａｄ５競合的結合剤には、限定されるわけではないが、ＬＭＰ−１タンパク質、およびＬＭＰ−１タンパク質断片、変異体または誘導体、ならびにリン酸化Ｓｍａｄ５に特異的なｓｉＲＮＡが含まれる。
【００２５】
やはり開示するのは、少なくとも１つのリン酸化Ｓｍａｄ４競合的結合剤および少なくとも１つのＢＭＰ剤を含む、骨形成性組成物である。本発明において、リン酸化Ｓｍａｄ４競合的結合剤には、限定されるわけではないが、ＬＭＰ−１タンパク質、およびＬＭＰ−１タンパク質断片、変異体または誘導体、リン酸化Ｓｍａｄ４に特異的なｓｉＲＮＡが含まれる。
【００２６】
薬学的に許容しうる希釈剤、キャリアー、可溶化剤、乳化剤、保存剤および／またはアジュバントが当業者に知られる。これらには、限定されるわけではないが、細胞、ベクター、ゲル、微小球体、巨大分子、生体適合性の泡、生体適合性マトリックス、およびインプラントが含まれる。組成物はまた、延長された期間に渡る、調節された送達のための、リポソーム、ミクロエマルジョン、ミセルまたは小胞への、任意の療法分子または剤の取り込みも含んでもよい。用語「療法的有効量」は、明記する状態および投与経路のための療法効果を提供する量を意味する。独立して、または組み合わせに基づいて、量が療法的に有効であるかどうかを決定してもよい。その結果、１つの剤の療法的有効量に相当しうる量は、剤をさらなる剤と組み合わせた際には変化する可能性もある。本発明の好ましい態様において、ＬＭＰ剤をＢＭＰ剤と組み合わせて投与し、ここで、ＢＭＰ剤の用量または量は、慣用的なｒｈＢＭＰ−２療法単独に比較した際、療法以下である。したがって、独立療法としては、療法以下の用量または量のＢＭＰ剤は、療法的に有効ではないが、本発明のＬＭＰ剤と組み合わせた際には、療法用量または量に相当するであろう。
投与および用量
投薬型に応じて、本発明の薬剤組成物を異なる方式で、すなわち髄膜内注射、皮下、静脈内、腹腔内、筋内注射、インプラント内、またはこれらの組み合わせで、投与してもよい。本発明のＬＭＰ剤の投与を、ＢＭＰ剤より前、後、または同時に行ってもよく、そして投与は、単一のターゲット部位または別個の部位に対してであってもよい。投与のための部位には、限定されるわけではないが、椎間空間、面関節、骨折部位、口、頤および顎の骨、ならびにインプラント部位が含まれる。
【００２７】
さらに別の態様において、本発明の療法はさらに、患者において疾患を治療するための療法的有効量のＢＭＰ剤と組み合わせて、療法的有効量のＬＭＰ剤を投与することを含む、同時療法治療措置を含む。本明細書において、「同時療法治療措置」は、別個の配合物または併用配合物のいずれかで、２つの剤を同時に投与するか、あるいは数分、数時間、または数日置いた別の時点で、連続して投与するが、何らかの方式で、一緒に作用して、所望の療法的反応を提供することを意味する。
【００２８】
本発明のＬＭＰ剤、ＢＭＰ剤または組成物の投薬量は、ＰＴＤが付着した組換え融合タンパク質として送達される場合、１ｎＭ〜２００ｎＭの範囲であってもよく、あるいはアデノウイルスまたは類似のベクターによって送達される場合、０．１〜１００ＭＯＩ（感染多重度、すなわち細胞あたりの感染性ウイルス粒子の数）の範囲であってもよい。組み合わせると、同時投与される剤の用量を上昇させた場合、１つの剤の用量を低下させうることが理解される。例えば、ＬＭＰ剤の用量を上昇させると、投与されるＢＭＰ剤の用量を低下させうることが意図される。本明細書において、ＬＭＰ剤がＢＭＰ剤に対する細胞の反応性を相乗的に増加させることを立証するように、組み合わせの、１つの構成要素を投与すると、第二の構成要素が等しい用量である必要性が軽減されるであろうこともまた、意図される。
【００２９】
１つの態様において、ＢＭＰ剤の療法的有効用量は、現在許容されうる療法的有効量未満である。現在、１．５ｍｇ／形成される骨ｍｌが、ｉｎ  ｖｉｖｏで、霊長類におけるｒｈＢＭＰ−２の療法濃度であり、細胞培養およびげっ歯類では、より少ない用量が有効である。前記の少なくとも１つのＢＭＰ剤の療法的有効用量は、慣用的療法で必要とされる用量より、少なくとも１０倍低い。慣用的療法で必要とされる用量は、骨形成１０ｃｃの部位あたり、２０ｍｇ  ｒｈＢＭＰ−２でありうる。他の態様において、療法的有効用量のＢＭＰは、ＬＭＰ剤と組み合わせて投与した際、慣用的ＢＭＰ療法に必要な用量よりも、少なくとも２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、５０００倍、または１０，０００倍少ない。
治療転帰
本発明の療法剤および組成物は、障害が起きた骨状態を有する被験体を治療するのに有用である。本発明は、ＢＭＰ剤と組み合わせてＬＭＰ剤の療法的有効量を用いて、骨障害を治療する方法を提供する。骨障害または障害が起きた骨状態は、骨損失（骨減少症または骨溶解）によって、あるいは骨損傷または傷害によって特徴付けられる任意の障害であってもよい。こうした骨状態には、限定されるわけではないが、骨折、骨欠陥、骨移植、骨グラフト、骨癌、関節置換、関節修復、癒合、小関節面修復；骨変性、歯科インプラントおよび修復、骨髄欠損、ならびに骨および骨性組織と関連する他の状態が含まれる。
【００３０】
骨欠陥の例には、限定されるわけではないが、骨における隙間、変形または非癒合骨折が含まれる。
骨変性の例には、限定されるわけではないが、骨減少症または骨粗しょう症が含まれる。１つの態様において、骨欠陥は、小人症のためである。
【００３１】
本発明は、関節が脊椎関節、膝関節、股関節、足根関節、指関節、ひじ関節、足関節、仙腸関節、または他の連結／非連結関節である関節置換または修復に、特に有用である。
骨組織操作
さらに、本発明の化合物が有用でありうる、細胞および動物に基づく骨疾患モデルの操作および使用もまた記載する。本発明には、少なくとも１つのＬＭＰ剤および少なくとも１つのＢＭＰ剤を、骨形成細胞、多能性幹細胞、間充織細胞、および胚性幹細胞からなる群より選択される細胞と合わせることを含む、骨組織を操作するための方法が含まれる。また、上記方法によって産生される、操作された骨組織を開示する。本発明の操作された骨組織を投与することを含む、被験体において骨形成を誘導するための方法が意図される。
【００３２】
さらに、本発明には、少なくとも１つのリン酸化Ｓｍａｄ４競合的結合剤および少なくとも１つのＢＭＰ剤を、骨形成細胞、多能性幹細胞、間充織細胞、および胚性幹細胞からなる群より選択される細胞と合わせることを含む、骨組織を操作するための方法が含まれる。また、この方法によって産生される、操作された骨組織も含まれる。別の側面において、本発明には、この段落に記載するような、操作された骨組織を投与することを含む、被験体において骨形成を誘導するための方法が含まれる。
【００３３】
本発明にやはり含まれるのは、障害が起きた骨状態を有する被験体において、骨の沈着および成熟を誘導するための方法であって、該被験体に、少なくとも１つのＪａｂ１阻害剤および療法的有効用量の少なくとも１つのＢＭＰ剤を投与することを含む、前記方法である。
方法および手順
細胞培養：継代数２の間充織幹細胞（ＭＳＣ）を、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入する。これらの研究において、ＭＳＣＧＭ  Ｓｉｎｇｌｅｑｕｏｔｓ（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を補充したＭＳＣＢＭ培地中、５％ＣＯ２中、３７℃で細胞を増殖させ、集密時にスプリットし、そして継代数４で、６ウェルプレート中、３ｘ１０４細胞／ウェルで蒔く。翌日、５０μＭ  Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸および５ｍＭ  β−グリセロールリン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で、処理を適用する。培地を３〜４日ごとに交換し、適切な場合、処理を再適用する。０．５ｍｌの血清不含培地中、アデノウイルス構築物で、３０分間、細胞に形質導入する。ｒｈＢＭＰ−２は、Ｊｏｈｎ  Ｗｏｚｎｅｙの無料提供により、Ｗｙｅｔｈ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）からの贈与物として、供給され続けるであろう。
核および細胞質タンパク質分画の調製：細胞ペレットを緩衝液Ａ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、１０％グリセロール、１ｍＭ  ＰＭＳＦおよび１μｇ／ｍｌプロテアーゼ阻害剤ミックス（Ｓｉｇｍａ））に懸濁し、氷上で１０分間インキュベーションし、そして遠心分離する。上清（細胞質分画）を収集し、そして核ペレットを高塩緩衝液Ｂ（６００ｍＭ  ＫＣｌ、２０％グリセロールを加えた緩衝液Ａ）に懸濁し、氷上で３０分間インキュベーションし、そして遠心分離する。上清を核分画として収集する。タンパク質測定後、分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供する。
ＬＭＰ−１の過剰発現に際しての核中のリン酸化Ｓｍａｄ１およびＳｍａｄ５の測定：ＬＭＰ−１レベルの増加が、リン酸化Ｓｍａｄ１およびＳｍａｄ５レベルの増加を生じることを示すため、ＢＭＰ−２と相乗効果を示すのに成功したＬＭＰ−１の用量でｈＭＳＣを処理して、剤を単独でまたは一緒に投与した際、核におけるリン酸化Ｓｍａｄ１増加の経時変化を決定した。
【００３４】
ヒトＭＳＣを６ウェルプレート中、３ｘ１０４細胞／ウェルで蒔き、一晩増殖させ、そしてＡｄ５Ｆ３５−ＬＭＰ−１（０、５、１０ｐｆｕ／細胞）、ＢＭＰ−２（１００ｎｇ／ｍｌ）または両方の剤で処理する（対照＝Ａｄ５Ｆ３５−ＧＦＰ）。１、２、４、８、１２、２４および４８時間後、細胞を採取して、そしてＳｍａｄタンパク質に関するウェスタンブロットによって核タンパク質を分析する。Ｓｍａｄ１およびＳｍａｄ５の両方を測定する。リン酸化Ｓｍａｄ１に対する抗体が入手可能であり、そしてこれをウェスタン分析に用いる。リン酸化Ｓｍａｄ５に対する抗体は入手不能であり、したがって、リン酸化および非リン酸化Ｓｍａｄ５両方を検出する抗体を用いる；そして別個のブロット上で、ホスホセリン抗体を用いて、リン酸化状態を決定する。ホスホセリンを有するいくつかの分子があるであろうが、２つのブロットを比較すると、Ｐ−Ｓｍａｄ５もまた核で増加しているかどうかが決定可能になるはずである。対照としてＧＦＰ  ｃＤＮＡを所持する同じアデノウイルスベクターで細胞を処理した場合、Ｐ−Ｓｍａｄ類の核レベルに影響があるとは予期されない。ＢＭＰ−２に反応して、Ｐ−Ｓｍａｄレベルの増加が迅速に起こると予期され、これは、細胞内シグナル伝達カスケードを活性化する、存在するＳｍａｄタンパク質のリン酸化を伴うためである。対照的に、ＬＭＰ−１  ｃＤＮＡは、転写され、そして翻訳されて、細胞内タンパク質を作製しなければならず、このプロセスは数時間を必要とする。したがって、ＢＭＰ−２に対する反応に比較した際、ＬＭＰ−１に対する反応では、Ｐ−Ｓｍａｄの核レベルの増加に遅延があることが予期される。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング：１０％ゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、そしてニトロセルロース膜にトランスファーする。膜をミルクタンパク質でブロッキングし、特異的抗体とインキュベーションし、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水で洗浄し、西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼに連結された抗ウサギ・ヤギＩｇＧ（ＮＥＮ）とインキュベーションし、そして再び、ＴＢＳＴで洗浄する。化学発光基質を膜に適用し、そして膜をＸ線フィルムに３０秒間暴露することによって、シグナルを検出する。
ＲＮＡ抽出：製造者（Ｑｉａｇｅｎ）に明記されるように、ＲＮｅａｓｙミニキットを用いて、６ウェルプレート中で増殖させた細胞からＲＮＡを単離する。簡潔には、細胞を採取し、そしてＲＬＴ緩衝液中で破壊する。溶解物をＱｉａＳｈｒｅｄｄｅｒカラムに通過させ、そして生じた溶出液を３５％  ＥｔＯＨにし、そしてＲＮｅａｓｙカラムに通過させて、シリカゲル膜にＲＮＡを結合させる。結合したＲＮＡをＲＷ１緩衝液で、そして次いでＲＰＥ緩衝液で洗浄した後、膜からＲＮＡを水で溶出させる。ＲＮｅａｓｙ法中にＱｉａｇｅｎ  ＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼセットを用いるか、またはＲＮＡの最後の採取後にＡｍｂｉｏｎ  ＤＮＡ不含キットを用いるかのいずれかで、すべてのＲＮＡ試料をＤＮアーゼ処理する。消化完了後、５μｌのＤＮアーゼ不活性化緩衝液を添加し、溶液を室温で２分間インキュベーションし、そして微量遠心分離装置中、試料を１分間遠心分離する。ＲＮＡを含有する上清を取り除き、そして−７０℃で保存する。上記に加えて、トランスフェクション細胞からＲＮＡを単離している場合、制限酵素ＲｓａＩを用いて、最初のＲＮＡ調製物を３７℃で１時間消化して、いかなる混入プラスミドＤＮＡも切断し、ＲＮｅａｓｙキットを用いてＲＮＡを再単離して、そしてＡｍｂｉｏｎ試薬でＤＮアーゼ処理する。各試料は、６ウェルプレートの２ウェルから単離したＲＮＡからなり、そして各処理／時点について、少なくとも３つの試料を単離する。
ＲＮＡのリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）：５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３、５．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．１２５μＭランダム六量体、４０単位のＲＮアーゼ阻害剤、および１２５単位のＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含有する、１００μｌの総体積中で、２μｇの総ＲＮＡを逆転写する。対照試料では、ＲＮアーゼ阻害剤およびＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅを省く。試料を２５℃で１０分間、４８℃で３０分間、そして次いで９５℃で５分間インキュベーションして、酵素を不活性化する。次いで、１２．５μｌの２Ｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および各０．８μＭのプライマーを含有する２５μｌの総体積中で、生じたｃＤＮＡ  ５μｌに対して、リアルタイムＰＣＲを行う。用いるＰＣＲパラメーターは、５０℃で２分間、９５℃で１０分間、および４５周期の９５℃で１５秒間、その後、６２℃で１分間である。また、試料の標準化のため、１８Ｓプライマーを用いて、ｃＤＮＡの１／８００希釈に対して、記載するようにＰＣＲを行う。ΔΔＣｔ法（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、相対的ＲＮＡレベルを計算した。
【００３５】
表１に列挙するプライマーを合成し、そしてこれらはヒトＭＳＣにおける遺伝子発現のｍＲＮＡレベルを測定するのに成功した。
表１
ＲＴ  ＰＣＲプライマー／プローブセット
【００３６】
【表１】
2008538111.tif 000002
【００３７】
細胞のｓｉＲＮＡ処理：ＭＳＣを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）トランスフェクション試薬および無関係なｓｉＲＮＡまたは特異的ｓｉＲＮＡ配列（表２を参照されたい）のいずれかでトランスフェクションする。特異的ｍＲＮＡレベルのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析およびタンパク質レベルのウェスタン分析によって、遺伝子のサイレンシングおよび特異性を確認する。
表２
ｓｉＲＮＡ配列
【００３８】
【表２】
2008538111.tif 000003
【００３９】
Ｓｍｕｒｆ１  ｓｉＲＮＡを用いた機構研究
１．ＬＭＰ−１とＳｍｕｒｆ１との相互作用、Ｓｍｕｒｆ２とは相互作用なし：Ｓｍｕｒｆ１／ＬＭＰ−１相互作用力の特異性を確認するため、Ｓｍｕｒｆ１  ｍＲＮＡを選択的にターゲットとするよう設計されたｓｉＲＮＡを利用する。逆に、Ｓｍｕｒｆ２レベルを選択的に阻害し、そしてＬＭＰ−１とその候補結合タンパク質との相互作用が影響を受けないことを示す方法もまた使用可能である。この目的に向けて、ヒトＭＳＣを６ウェルプレート中、３ｘ１０４細胞／ウェルで蒔き、一晩増殖させ、そして無関係なｓｉＲＮＡ、あるいはＳｍｕｒｆ１またはＳｍｕｒｆ２に特異的なｓｉＲＮＡで処理する。ｓｉＲＮＡ処理の２４時間後、細胞をＡｄ５Ｆ３５−ＬＭＰ−１（０、５、１０ｐｆｕ／細胞）またはＡｄ５Ｆ３５−ＧＦＰで処理する。細胞を２、４、８、１２、２４、または４８時間後に採取し、そしてＬＭＰ−１抗体を用いた免疫沈降およびＷＷドメイン抗体を用いた共局在タンパク質のウェスタン分析に、細胞質タンパク質および核タンパク質の両方を供する。さらに細胞総ＲＮＡおよびタンパク質分画を同じ時点で採取し、そしてＳｍｕｒｆ１またはＳｍｕｒｆ２に特異的なプライマーを用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、Ｓｍｕｒｆ１およびＳｍｕｒｆ２  ｍＲＮＡのレベルを測定する。Ｓｍｕｒｆ１およびＳｍｕｒｆ２に特異的と考えられる新たに獲得した抗体を用いたウェスタンブロットによって、ｓｉＲＮＡによるタンパク質レベルの減少を確認する。
予期される結果：Ｓｍｕｒｆ１レベルの減少は、正常レベルのＳｍｕｒｆ１を有する対照に比較して、ＬＭＰ−１抗体を用いた免疫沈降後のウェスタン分析によって観察されるＷＷドメイン免疫反応性結合タンパク質の量を減少させると予期される。対照的に、Ｓｍｕｒｆ２レベルの減少は、ＬＭＰ−１がＳｍｕｒｆ２に結合するとは予期されないため、ＷＷドメイン免疫反応性結合タンパク質の量に影響を持たないと予期される。これらの結果は、ＬＭＰ−１の相互作用が、完全にＳｍｕｒｆ１との相互作用であることを確認するであろう。
２．リン酸化Ｓｍａｄ１およびＳｍａｄ５に対するＳｍｕｒｆ１減少の効果−核研究：Ｓｍｕｒｆ１にＬＭＰ−１が結合すると、Ｓｍｕｒｆ１のＰ−Ｓｍａｄ１およびＰ−Ｓｍａｄ５への結合が遮断され、そしてこうして、Ｐ−Ｓｍａｄプロテアソーム分解が減少すると仮定される。予期される全体の効果は、Ｐ−Ｓｍａｄ１およびＰ−Ｓｍａｄ５の核レベルの増加である。ＬＭＰ−１がいくつかの作用様式を有することが可能である一方、Ｓｍｕｒｆ１との相互作用は、ＬＭＰ−１の骨誘導特性の原因であると考えられる。この仮説が正しければ、Ｓｍｕｒｆ１レベルの減少は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの骨形成およびＢＭＰ−２に対する反応性を増加させる、ＬＭＰ−１と同じ効果を生じるはずである。
【００４０】
この目的に向けて、ヒトＭＳＣを６ウェルプレート中、３ｘ１０４細胞／ウェルで蒔き、一晩増殖させ、そして無関係なｓｉＲＮＡ、またはＳｍｕｒｆ１に特異的なｓｉＲＮＡで処理する。ｓｉＲＮＡを除去する際、ＢＭＰ−２（１００ｎｇ／ｍｌ）をいくつかの培養に適用する。細胞を４、８、１２、２４、３６、または４８時間後に採取し、そしてウェスタンブロットによって、Ｐ−Ｓｍａｄの存在に関して、核タンパク質を分析する。本明細書に記載するように、適用したｓｉＲＮＡがＲＮＡおよびタンパク質のレベルを減少させる有効性を監視する。上記のように蒔いたＭＳＣの別の群を分化培地中で２１日間増殖させて、そしてアリザリンレッドで染色して、マトリックス・ミネラル化を評価する。
予期される結果：Ｓｍｕｒｆ１に対するｓｉＲＮＡで処理した細胞では、Ｐ−Ｓｍａｄ１およびＰ−Ｓｍａｄ５の核レベルの増加があることが予期され、これはこれらのタンパク質が、Ｓｍｕｒｆ１の非存在下では、プロテアソーム分解に向けてターゲティングされないはずであるためである。ＬＭＰ−１の過剰発現に反応したＳｍａｄの核レベル増加を示す予備的結果（実施例３を参照されたい）は、ＬＭＰ−１がＰ−Ｓｍａｄ類のプロテアソーム分解を遮断することによって引き起こされたと仮定される。したがって、ＬＭＰ−１がＳｍｕｒｆ１を遮断するのを模倣する、Ｓｍｕｒｆ１レベルの減少は、Ｐ−Ｓｍａｄ類の分解に向けたターゲティングを生じると予期される。また、核Ｐ−Ｓｍａｄ類レベルの増加および細胞外マトリックス・ミネラル化の増加によって立証されるような、Ｓｍｕｒｆ１  ｓｉＲＮＡの存在下でのＢＭＰ−２に対する反応性の増加が観察されることも予期される。その結果、Ｓｍｕｒｆ１に対するｓｉＲＮＡは、マトリックス・ミネラル化の療法的機会に相当するであろう。
３．リン酸化Ｓｍａｄ１およびＳｍａｄ５に対するＳｍｕｒｆ１減少の効果−細胞質研究：Ｓｍｕｒｆ１にＬＭＰ−１が結合すると、Ｓｍｕｒｆ１のＳｍａｄ１への結合が遮断され、Ｓｍａｄ１のプロテアソーム分解が減少し、そしてＢＭＰ−２経路の活性化に対する細胞の反応性が増加すると仮定される。予期される全体の効果は、Ｓｍａｄ１の細胞質レベルの増加である。ＬＭＰ−１がいくつかの作用様式を有することが可能である一方、Ｓｍｕｒｆ１との相互作用は、ＬＭＰ−１の骨誘導特性に重要であると考えられる。この仮説が正しければ、Ｓｍｕｒｆ１レベルの減少は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの骨形成反応によって立証されるように、ＢＭＰ−２に対する反応性の増加において、ＬＭＰ−１と類似の効果を生じるはずである。この目的に向けて、ヒトＭＳＣを６ウェルプレート中、３ｘ１０４細胞／ウェルで蒔き、一晩増殖させ、そして無関係なｓｉＲＮＡ、またはＳｍｕｒｆ１に特異的なｓｉＲＮＡで処理する。細胞を４、８、１２、２４、３６、または４８時間後に採取し、ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡによって、総Ｓｍａｄ１およびホスホ−Ｓｍａｄ１の存在に関して、細胞質タンパク質を分析する。本明細書に記載するように、ｓｉＲＮＡがＳｍｕｒｆ１のＲＮＡおよびタンパク質のレベルを減少させる有効性を監視する。上記のように蒔いたＭＳＣの別の群を分化培地中で２１日間増殖させて、そしてアリザリンレッドで染色して、マトリックス・ミネラル化を評価する。
予期される結果：Ｓｍｕｒｆ１に対するｓｉＲＮＡで処理した細胞では、細胞質Ｓｍａｄ１の増加が生じることが予期され、これはこのタンパク質が、Ｓｍｕｒｆ１の非存在下では、プロテアソーム分解に向けてターゲティングされないはずであるためである。本明細書の他の実施例において、ＬＭＰ−１の過剰発現およびＢＭＰ−２処理に反応して、ホスホ−Ｓｍａｄ１の細胞質レベルが増加することが示されている。この結果は、ＬＭＰ−１がＳｍａｄ１のプロテアソーム分解を遮断したことによって引き起こされたと考えられる。したがって、本発明者らは、Ｓｍａｄ１を分解に向けるＳｍｕｒｆ１ターゲティングをＬＭＰ−１が遮断するのを、Ｓｍｕｒｆ１レベルの減少が模倣すると予期する。
４．ＢＭＰ−２反応性に対するＳｍｕｒｆ１発現減少の効果：上述のように、Ｓｍｕｒｆ１のレベルを直接減少させると、ＬＭＰ−１過剰発現の効果を模倣すると予期される。この仮説を試験するため、ヒトＭＳＣを６ウェルプレート中、３ｘ１０４細胞／ウェルで蒔き、一晩増殖させ、そして無関係なｓｉＲＮＡ、またはＳｍｕｒｆ１に特異的なｓｉＲＮＡで処理する。ｓｉＲＮＡを除去する際、ＢＭＰ−２をいくつかの培養に適用する。先に記載するように、総ＲＮＡ、またはＤｌｘ５、Ｓｍａｄ６およびＢＭＰ−２を含む、分泌タンパク質、細胞質タンパク質および核タンパク質の分析のため、１、２、４、８、２４、３６、４８、および７２時間後に細胞を採取する。ＥＬＩＳＡによる分析は、ウェスタンブロッティングによって達成可能であるより、より正確な定量化を可能にする。
予期される結果：理論に束縛されることは望ましくないが、特異的ｓｉＲＮＡを用いてＳｍｕｒｆ１レベルを減少させると、タンパク質およびｍＲＮＡレベルの両方で、Ｄｌｘ５、Ｓｍａｄ６、およびＢＭＰ−２の発現が増加すると予期される。Ｓｍｕｒｆ１レベルが減少した細胞は、これらの遺伝子の発現に関して、ＢＭＰ−２に対して増加した反応性を示すと予期される。これらの遺伝子発現レベルの増加は、Ｓｍｕｒｆ１レベルが減少したＭＳＣで観察される、ＢＭＰ−２に対する相乗的反応に関する非常に重要な段階と解釈される。
ＬＭＰ−１相互作用タンパク質の検出のためのビオチン・トランスファー・アッセイ：三官能性架橋剤であるスルホ−ＳＢＥＤ（Ｐｉｅｒｃｅ）は、３つの官能基（光活性化可能アリールアジド、切断可能ジスルフィド基を持つスルホン化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル、およびビオチン部分）を含有し、そして相互作用タンパク質を同定するために広く用いられている（Ｎｅｅｌｙ  ＫＥ，  Ｈａｓｓａｎ  ＡＨ，  Ｂｒｏｗｎ  ＣＥ，  Ｈｏｗｅ  Ｌ，  およびＷｏｒｋｍａｎ  ＪＬ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００２；２２：１６１５−２５）。この試薬を用いてＬＭＰ−１を標識し、おとり（ｂａｉｔ）として核タンパク質とインキュベーションし、そしてＵＶ（３６５ｎｍ）によって相互作用タンパク質に架橋する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元緩衝液中に懸濁すると、ＬＭＰ−１と物理的に相互作用するタンパク質は、ビオチン基を保持する。ニュートラアビジン・ビーズを用いて、ビオチン含有ターゲットタンパク質を分離し、ニュートラアビジン−ＨＲＰを用いたウェスタンブロッティングによって検出し、そして化学発光基質を用いてシグナルを現像する。対応するタンパク質バンドをトリプシンでゲル内消化する。トリプシン・ペプチドを回収し、濃縮し、そしてＥｍｏｒｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって、その質量プロフィールを分析する。
ＬＭＰ−１ｔ：２３３ａａ骨誘導性一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＬＭＰ−１変異体（ＬＩＭドメインを欠く）：ＬＭＰ−１はＬＩＭドメインタンパク質であるが、ＬＩＭドメインを欠くＬＭＰ−１の一部切除２２３ａａ変異体が、なお、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで骨を形成することが示されている（Ｌｉｕ  Ｙ，  Ｈａｉｒ  ＧＡ，  Ｂｏｄｅｎ  ＳＤ，  Ｖｉｇｇｅｓｗａｒａｐｕ  Ｍ，  およびＴｉｔｕｓ  Ｌ．，  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ．  Ｒｅｓ．  ２００２；１７：４０６−１４）。Ｓｍｕｒｆ１への結合およびＢＭＰ−２シグナル伝達経路の活性化が、ＬＭＰ−１作用および骨形成誘導に非常に重要であるならば、一部切除ＬＭＰ−１もまた、Ｓｍｕｒｆ１に結合し、そしてＢＭＰ−２の存在下または非存在下で、全長タンパク質の下流効果を模倣すると予期される。この目的に向けて、細胞に容易に進入するタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を含有する一部切除ＬＭＰ−１（ＬＭＰ−１ｔ）融合タンパク質を設計してもよい。過剰発現された全長ＬＭＰ−１が、ＷＷドメイン抗体結合と競合し、Ｐ−Ｓｍａｄ１およびＰ−Ｓｍａｄ５の核レベル増加を誘導し、そしてＢＭＰ／Ｓｍａｄに制御される遺伝子の発現を増加させるのと同じ能力を、ＰＴＤ−ＬＭＰ−１ｔ融合タンパク質が保持することを示すことによって、これらの実験および続く実験に使用するためのこのＰＴＤの適切さが認証される。本明細書の他のデータは、細胞に容易に進入し、そして骨形成を誘導するための、全長ＴＡＴ−ＬＭＰ−１融合タンパク質の使用を立証する。これらの研究に使用することが提唱されるＰＴＤドメインは、より早期の研究で用いられたＴＡＴタンパク質形質導入ドメインよりも、タンパク質形質導入において、より有効であることが示されている（Ｍｉ  Ｚ，  Ｍａｉ  Ｊ，  Ｌｕ  Ｘ，  およびＲｏｂｂｉｎｓ  ＰＤ．，  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ２０００；  ２：３３９−４７）。
実験設計：最初の研究は、ＭＳＣのミネラル化に対する１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ−２の効果を増進するＰＴＤ−ＬＭＰ−１ｔの用量を決定する必要があるであろう。ヒトＭＳＣを６ウェルプレート中、３ｘ１０４細胞／ウェルで蒔き、一晩増殖させ、そしてＰＴＤ−ＬＭＰ−１ｔ（０．３〜３０ｎＭ）、ＢＭＰ−２（１００ｎｇ／ｍｌ）または両方の剤で処理する。過剰発現させた全長ＬＭＰ−１に関して本明細書の実施例に記載するように、ミネラル化培地中で細胞を増殖させ、そしてアリザリンレッドでミネラルを染色する。続く研究で使用するため、ＢＭＰ−２と相乗作用を生じる２つの用量を選択する。
【００４１】
用量選択後、ヒトＭＳＣを６ウェルプレート中、３ｘ１０４細胞／ウェルで蒔き、一晩増殖させ、そしてまったく処理しないか、あるいは２つの用量のＰＴＤ−ＬＭＰ−１ｔ、ＢＭＰ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）または両方の剤で処理する（対照＝ＰＴＤ−βＧａｌ）。１、２、４、８、１２、２４、３６および４８時間後、細胞を採取し、そして細胞質および核のタンパク質分画に加えて、総ＲＮＡを調製する。ウェスタンブロット上のＳｍｕｒｆ１へのＳｍｕｒｆ１抗体結合と競合する精製ＬＭＰ−１タンパク質の能力に関して、未処理試料由来の核タンパク質分画を分析する。先に記載する適切な抗体を用いたウェスタンブロットによって、リン酸化Ｓｍａｄ１およびＳｍａｄ５の存在に関して、すべてのタンパク質試料を分析する。Ｄｌｘ５、Ｓｍａｄ６、およびＢＭＰ−２のｍＲＮＡレベルに関して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、すべてのＲＮＡ試料を分析する。同様に、Ｄｌｘ５、Ｓｍａｄ６、およびＢＭＰ−２に対する商業的に入手可能な抗体を用いたＥＬＩＳＡによって、分泌タンパク質、細胞質タンパク質および核タンパク質を分析する。
予期される結果：ＬＭＰ−１ｔタンパク質が、全長ＬＭＰ−１タンパク質の過剰発現で見られるように、ＢＭＰ−２に対するＭＳＣの骨誘導反応性を増進させると予期される。また、一部切除ＬＭＰ−１がＳｍｕｒｆ１に結合し、そしてＷＷドメイン抗体結合を妨げることも予期される。さらに、核Ｓｍａｄレベルの増加およびＳｍａｄに制御される遺伝子の活性化があり、ＢＭＰ−２の存在下または非存在下での全長ＬＭＰ−１の過剰発現で観察される結果を正確に模倣することも予期される。この結果は、ＬＭＰ−１が骨形成を誘導するか、またはＬＭＰ−１がＢＭＰ−２に対する反応性を増進するのに、ＬＩＭドメインが必要とされないという仮説を支持するであろう。
Ｓｍｕｒｆ１−ＷＷドメインおよびＬＭＰ−１相互作用アッセイ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって核タンパク質を分離し、そしてニトロセルロース膜上にブロッティングする。タンパク質ブロットを５％ミルクタンパク質でブロッキングし、そして精製ＬＭＰ−１タンパク質（１０μＭ）またはＴＢＳＴ緩衝液とプレインキュベーションする。ブロットを１：５０００希釈のＳｍｕｒｆ抗体（ＷＷドメインペプチドに対して作製したウサギ抗体）とインキュベーションする。洗浄後、ブロットをＨＲＰ標識抗ウサギ二次抗体とインキュベーションする。次いで、洗浄したブロットをＥＣＬ基質溶液とインキュベーションし、そしてシグナル検出のため、Ｘ線フィルムに膜を暴露する。
プロテインＡに基づく免疫沈降アッセイ：プロテインＡ−アガロースビーズをＬＭＰ−１抗体とインキュベーションし、３回洗浄し、核タンパク質とインキュベーションし、そして再び洗浄して、未結合タンパク質を除去する。結合したタンパク質を、０．１Ｍクエン酸、ｐＨ２．７中の２回の洗浄によって溶出させる。溶出液をＴｒｉｓ塩基で中和し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング前に、ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ試験管（Ａｍｂｉｃｏｎ）によって濃縮する。
Ｓｍａｄ類のパルス標識：（３５Ｓ）メチオニンの存在下で、細胞を１時間インキュベーションし、徹底的に洗浄し、Ａｄ５Ｆ３５ＬＭＰ−１と３０分間インキュベーションし（対照＝Ａｄ５Ｆ３５ＧＦＰ、またはなし）、リンスし、そしてＢＭＰ−２（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下、通常の培地に戻す。形質導入の１、２、３、４時間後、細胞を採取し、核分画を調製し、そして上述のように、放射標識Ｐ−Ｓｍａｄ１またはＰ−Ｓｍａｄ５を免疫沈降する。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、オートラジオグラフィーによって視覚化し、そして定量化する。
タンパク質の核および細胞質分析のための修飾パルスチェイスアッセイ
核分析：本明細書において、リン酸化Ｓｍａｄ１が、ＬＭＰ−１過剰発現に反応して４時間以内に核で増加し、そして８時間でさらに増加することが示された。ありうる説明には：１）Ｓｍａｄ１遺伝子発現の増加；２）非リン酸化Ｓｍａｄ１の細胞質プールのリン酸化の増加と、それに続く核への転位置；および３）Ｓｍａｄ１分解の減少が含まれる。Ｐ−Ｓｍａｄ増加が起こるのには短時間しか必要とはされないが、Ｓｍａｄ１の転写および翻訳の増加は排除されない。しかし、４時間の時間枠から、ＬＭＰ−１が転写されそして翻訳され、そしてまたそれに続くＳｍａｄ１の転写および翻訳の増加を引き起こしうる可能性はより低くなる。ＬＭＰ過剰発現に反応したＰ−Ｓｍａｄ１の核レベル増加に関する仮説は、ＬＭＰ−１がＳｍｕｒｆ１に結合し、Ｐ−Ｓｍａｄ１をプロテアソーム分解に向けてＳｍｕｒｆ１がターゲティングするのを妨げるというものである。Ｐ−Ｓｍａｄ５の類似の集積が予期されるが、いまだ測定されていない。Ｐ−Ｓｍａｄ１およびＰ−Ｓｍａｄ５レベルの増加は、ＢＭＰシグナル伝達の活性化を生じると予期され、この必要条件は、これらが、遺伝子発現を改変するために、核に局在することである。
【００４２】
この目的に向けて、３５Ｓ−メチオニンを用いて、新たに合成されるＳｍａｄタンパク質を標識し、そして過剰発現されたＬＭＰ−１の存在下または非存在下で、その分解速度を測定する、修飾パルスチェイス実験を行ってもよい。このアプローチによって、ＬＭＰ−１に反応したＰ−Ｓｍａｄ集積から、ＬＭＰ−１に反応したＳｍａｄ合成を区別することが可能になる。
【００４３】
パルスチェイス実験のため、ヒトＭＳＣを６ウェルプレート中、３ｘ１０４細胞／ウェルで蒔き、そして一晩増殖させる。３５Ｓ−メチオニン（３５Ｓ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＮＥＮ）を１時間適用して、新たに合成されるタンパク質プールをパルス標識する。放射標識を除去し、そして続いて洗浄して、細胞をＡｄ５Ｆ３５−ＬＭＰ−１（０、５、１０ｐｆｕ／細胞）、Ａｄ５Ｆ３５−ＧＦＰと、または何も伴わずに、３０分間インキュベーションする。形質導入インキュベーション終了時に、ＢＭＰ−２（１００ｎｇ／ｍｌ）をいくつかの培養に適用して、Ｓｍａｄ１のリン酸化を確実にする。形質導入の１、２、３、または４時間後、細胞を採取し、そして核タンパク質分画を調製する。特異的抗体を用いて、放射標識Ｐ−Ｓｍａｄ１またはＰ−Ｓｍａｄ５を核分画から免疫沈降し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび蛍光光度分析によって分析する。
予期される結果：理論に束縛されることは望ましくないが、標識期間中にＳｍａｄ１およびＳｍａｄ５タンパク質が合成され、そしてＢＭＰ−２での細胞の処理が、いくつかの新たに合成された分子の迅速なリン酸化を生じることが予期される。次いで、標識Ｐ−Ｓｍａｄ１およびＰ−Ｓｍａｄ５がＳｍａｄ４に結合し、そして核内に移動する。ＬＭＰ−１およびＳｍｕｒｆ１は、主に核で見られる。過剰発現されたＬＭＰ−１タンパク質が翻訳されるにつれて、核内に移動し、そしてＳｍｕｒｆ１に結合すると予期される。この仮説が正しければ、この事象は、これに続く、Ｐ−Ｓｍａｄ１およびＰ−Ｓｍａｄ５の分解を遮断し、そしてＬＭＰ−１を過剰発現していない細胞におけるＰ−Ｓｍａｄ類と比較して、減少した分解速度を生じるはずである。
【００４４】
細胞質分析：ヒトＭＳＣを６ウェルプレート中、３ｘ１０４細胞／ウェルで蒔き、一晩増殖させ、そしてＡｄ５Ｆ３５−ＬＭＰ−１（０、５、１０ｐｆｕ／細胞）、Ａｄ５Ｆ３５−ＧＦＰと、または何も伴わずに、３０分間インキュベーションする。非リン酸化Ｓｍａｄ１の安定性を決定するため、翌日、３５Ｓ−メチオニン（３５Ｓ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＮＥＮ）を３０分間適用して、新たに合成されるタンパク質プールをパルス標識し、そして続いて細胞を洗浄する。シクロヘキシミド（１０μｇ／ｍｌ）を伴いまたは伴わず、非放射性メチオニンを含有するチェイス培地中で細胞を２〜３時間インキュベーションし、その間、多様な時点で細胞を採取する。プロテアーゼ阻害剤の存在下で細胞を採取し、そして細胞質タンパク質分画を調製する。特異的抗体を用いて、細胞質分画から放射標識総Ｓｍａｄ１を免疫沈降し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび自動蛍光光度分析によって分析する。ホスホ−Ｓｍａｄ１の安定性を測定するため、上記のように、対照ＭＳＣまたはＬＭＰ−１を過剰発現しているＭＳＣにおいて、類似の実験を行う。核輸送阻害剤、レプトマイシンＢ（２５μＭ）の存在下で、３２Ｐ−オルトホスフェートで細胞を２時間標識して、崩壊および核への輸送の正味量ではなく、標識されたホスホ−Ｓｍａｄの崩壊のみが測定されることを確実にする。３２Ｐを除去し、そして細胞をＢＭＰ−２（１００ｎｇ／ｍｌ）で１時間処理する。プロテアーゼおよびホスファターゼの阻害剤の存在下で、細胞質分画を調製する（３２Ｐ標識の喪失を妨げるため）。細胞質分画から放射標識３２Ｐ−Ｓｍａｄ１を免疫沈降し、そして上述のように分析する。
予期される結果：理論に束縛されることは望ましくないが、ＢＭＰ−２の非存在下で、非リン酸化Ｓｍａｄ１タンパク質が合成され、そして標識期間中、３５Ｓ−メチオニンを取り込むことが予期される。過剰発現されたＬＭＰ−１タンパク質が翻訳されるにつれて、これが細胞質Ｓｍｕｒｆ１に結合することが予期される。この仮説が正しければ、この事象は、これに続く、Ｓｍａｄ１の分解を遮断し、そしてＬＭＰ−１を過剰発現していない細胞と比較して、Ｓｍａｄ１分解速度の減少を生じるはずである。この遮断は、Ｓｍａｄの非リン酸化型およびリン酸化型の両方に当てはまると予期される。Ｓｍｕｒｆ１が仲介するプロテアソーム分解に対する、非リン酸化Ｓｍａｄ１およびホスホ−Ｓｍａｄ１の相対的感受性を決定するため、非リン酸化Ｓｍａｄ１（３５Ｓ−メチオニン標識）の崩壊とホスホ−Ｓｍａｄ１（３２Ｐ−オルトホスフェート標識）の崩壊に関する動力学曲線の比較を行ってもよい。ＬＭＰ−１が主に、非リン酸化型に影響を及ぼすことが予期される。
半減期決定のための代謝パルスチェイス分析：Ｓｍａｄ１の代謝半減期を決定するため、ＭＳＣをＡｄ５Ｆ３５−ＬＭＰ−１またはＡＤ５Ｆ３５−ＧＦＰでトランスフェクションし、そして代謝標識前に２４時間増殖させる。メチオニン不含培地中で細胞を洗浄し、そして１５分間インキュベーションして、内因性メチオニンを枯渇させる。次いで、［３５Ｓ］メチオニン（１９０μＣｉ／ｍｌ）を含有するパルス標識培地で、細胞を３０分間インキュベーションする。チェイス培地（１５０ｍｇ／ｌの非標識メチオニンを含有する）で洗浄した後、シクロヘキシミド（１０μｇ／ｍｌ）を含むまたは含まないチェイス培地中で細胞を２〜３時間インキュベーションする。プロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ）を含有する緩衝液中で細胞を溶解する。特異的抗体を用いて、細胞質分画からＳｍａｄ１を免疫沈降し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび自動蛍光光度分析によって、分析する。
【００４５】
ホスホ−Ｓｍａｄ１の半減期を決定するため、細胞をＡｄ５Ｆ３５−ＬＭＰ−１またはＡＤ５Ｆ３５−ＧＦＰでトランスフェクションし、そして代謝標識前に２４時間増殖させる。ｉｎ  ｖｉｖｏ［３２Ｐ］オルトホスフェート標識のため、リン酸不含培地で細胞を１時間プレインキュベーションし、そして１ｍＣｉ／ｍｌ［３２Ｐ］オルトホスフェートに３７℃で２時間曝露する。レプトマイシンＢ（１０ｎｇ／ｍｌ）またはＲａｔｊａｄｏｎｅ（１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）を細胞と３０分間インキュベーションして、標識Ｓｍａｄ１の核転位置を阻害する。次いで、細胞をＢＭＰ−２（１００ｎｇ／ｍｌ）で１時間処理し、プロテアーゼおよびホスファターゼの阻害剤を含有する緩衝液中で溶解し、そして細胞質分画を、ホスホ−Ｓｍａｄ１特異的抗体での免疫沈降に供する。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の自動蛍光光度分析によって視覚化する。
酵素連結吸着アッセイ（ＥＬＳＡ）：精製Ｓｍｕｒｆ１をＩｍｍｕｌｏｎ  １Ｂプレートの個々のウェルにコーティングし、そして残りの表面をブロッキングする。Ｓｍａｄ１および多様な濃度の競合リガンド（ＬＭＰ−１）および／またはその逆のインキュベーションを、４℃で一晩行う。適切な一次抗体および酵素連結二次抗体を用いて、ＢｉｏＬｕｍｉｎ  ９６０マイクロタイタープレート読取装置またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２マイクロタイタープレート読取装置を用いて、特定の波長で光学密度を監視する。結合パートナータンパク質に適するように、アッセイをいくつかの方式で適応させてもよい。ビオチン標識Ｓｍａｄ１をアッセイする際、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼを二次試薬として用いる。ＬＭＰ−１／Ｓｍｕｒｆ１およびＳｍａｄ１／Ｓｍｕｒｆ１間の最大結合を決定した後、多様な濃度の相互競合曲線は、結合親和性、解離定数および結合部位の数を得る、スキャッチャードプロット分析のためのデータを提供するであろう。
Ｓｍａｄ１／５および／またはＬＭＰ−１のユビキチン化の度合いを決定するためのユビキチンアッセイ：上述のＥＬＳＡアッセイを、以下のようにユビキチンアッセイ用に修飾する：マイクロタイタープレートをＳｍａｄ１／５またはＬＭＰ−１抗体でコーティングし、そして残りの活性部位を１％  ＢＳＡによってブロッキングする。次いで、ウェル中で核タンパク質をインキュベーションすることによって、Ｓｍａｄ１／５またはＬＭＰ−１を捕捉する。特異的酵素／蛍光連結ユビキチン抗体および適切な基質溶液を用いて、ユビキチン化の度合いをアッセイしてもよい。精製および商業的に入手可能なユビキチン化アッセイ試薬（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ系を用いて、Ｓｍａｄ類のユビキチン化に対するＬＭＰ−１由来ペプチドの阻害効果を研究するため、同じアッセイを適応させてもよい。
ｉｎ  ｖｉｖｏ骨誘導のためのＭＳＣのトランスフェクション：ＭＳＣを集密まで増殖させ、試験しようとする剤とインキュベーションし、トリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、１０〜２０Ｍ／ｍｌのＤＭＥＭに懸濁し、そして懸濁物の１００μｌをウシコラーゲンの無菌ディスク（２ｘ５ｍｍ）に適用する。４〜６週齢の無胸腺ラット（ｒｎｕ−／ｒｎｕ−）の胸部に、インプラントを外科的に皮下配置する。４週間後、動物を安楽死させ；外植片を除去し、７０％エタノール中で固定し、そしてＸ線検査および非脱カルシウム処理組織検査によって分析する。
ユビキチン化の機構研究
１．Ｓｍａｄ１およびＳｍａｄ５のユビキチン化
Ｓｍｕｒｆ１へのＬＭＰ−１結合の結果、ユビキチン化されたＳｍａｄ１およびＳｍａｄ５タンパク質の数が減少すると仮定される。この目的に向けて、ｈＭＳＣにおいてＬＭＰ−１を過剰発現させ、Ｓｍａｄ１またはＳｍａｄ５を、特異的Ｓｍａｄ抗体でコーティングしたウェル上に捕捉し、そしてＳｍａｄ類のユビキチン化レベルをＥＬＩＳＡによって定量化する。ヒトＭＳＣを６ウェルプレート中、３ｘ１０４細胞／ウェルで蒔き、一晩増殖させ、そしてＡｄ５Ｆ３５−ＬＭＰ−１（０、５、１０ｐｆｕ／細胞）、またはＡｄ５Ｆ３５ＧＦＰ対照プラスミドで処理する。４、８、１２、２４、４８、および７２時間後、細胞を採取し、そして細胞質および核のタンパク質分画を調製する。抗体でコーティングした９６ウェルプレート中、細胞分画を、Ｓｍａｄ１またはＳｍａｄ５に対する抗体とインキュベーションする。Ｓｍａｄ１またはＳｍａｄ５と関連しない核タンパク質を除去するために洗浄した後、蛍光タグ付けユビキチン抗体を適用し、そしてＢｉｏｌｕｍｉｎ  ９６０マイクロタイタープレート読取装置を用いて、蛍光を検出する。蛍光タグ付け抗体を用いると、感度が増加し、そして試料に存在すると予期される低レベルのユビキチンの定量化が可能になる。ＥＬＩＳＡ結果を確認するため、細胞分画の別のアリコットを、抗Ｓｍａｄ１または抗Ｓｍａｄ５抗体を用いた免疫沈降に供し、そしてユビキチンに対する抗体、ならびにＳｍａｄ１またはＳｍａｄ５に対する抗体を用いたウェスタンブロッティングによって、沈降したタンパク質を分析する。
予期される結果：ウェスタン分析が、多様な長さのユビキチン鎖とコンジュゲート化したＳｍａｄ類に相当する、ユビキチンおよびＳｍａｄ１またはＳｍａｄ５抗体両方でのスメアを示すことが予期される。Ｓｍａｄ１抗体は、Ｓｍａｄ１のみを捕捉し、そしてＳｍａｄ５抗体は、Ｓｍａｄ５のみを捕捉すると予期される。ＥＬＩＳＡ洗浄中に未結合ユビキチンを除去する。さらなるユビキチン化タンパク質が観察されるとは予期されない。未処理またはＧＦＰ処理細胞と比較して、ＬＭＰ−１が過剰発現された場合、Ｓｍｕｒｆ１機能の妨害のため、より低いレベルのＳｍａｄユビキチン化が起こると予期される。この方法は、ユビキチン化の減少が、Ｓｍａｄ類に連結したユビキチン・サブユニット数が変動しているためであるか、またはユビキチン鎖にコンジュゲート化されたＳｍａｄ分子がより少ないためであるかを区別しないことに注目すべきである。Ｓｍａｄ１またはＳｍａｄ５およびユビキチンに関して行うウェスタンブロットの検査が、この問題を解決しうる。
２．ユビキチン化に対するＬＭＰ−１  ｓｉＲＮＡ処理の効果
ＬＭＰ−１の発現を強いると、ユビキチン化Ｓｍａｄ１およびＳｍａｄ５レベルを改変可能であることが立証されたことから、ｓｉＲＮＡを用いたＬＭＰ−１の内因性レベルの減少は、これらのＳｍａｄタンパク質の分解速度を増加させると予期される。本明細書の他の実施例は、ＬＭＰ−１をターゲットとするｓｉＲＮＡが、ＬＭＰ−１レベルを減少させるのに有効であることを示した。これらのｓｉＲＮＡを用いて、ＬＭＰ−１およびＳｍａｄ類のユビキチン化の間の関係を調べる研究を行ってもよい。内因性ＬＭＰ−１レベルを減少させるためのｓｉＲＮＡの適用が、ユビキチン化されたＳｍａｄ１／５レベルの増加を生じることを示すため、ヒトＭＳＣを６ウェルプレート中、３ｘ１０４細胞／ウェルで蒔き、一晩増殖させ、そして対照の無関係なｓｉＲＮＡまたは特異的ＬＭＰ−１  ｓｉＲＮＡで処理する。４、８、１２、２４、４８、または７２時間後に細胞を採取し、そして細胞質分画および核分画の両方を調製する。細胞分画を、Ｓｍａｄ１またはＳｍａｄ５に対する抗体でコーティングした９６ウェルプレート中、該抗体とインキュベーションする。Ｓｍａｄ１またはＳｍａｄ５と関連しない核タンパク質を除去するために洗浄した後、蛍光タグ付けユビキチン抗体を適用し、そして本明細書の他の実施例におけるように、蛍光を検出する。このアプローチは、試料に存在すると予期される低レベルのユビキチンの定量化を可能にする。
予期される結果：内因性ＬＭＰ−１レベルの減少が、Ｓｍａｄ１およびＳｍａｄ５両方のユビキチン化を増加させると予期される。本発明者らは、これを、Ｓｍａｄ結合のために、Ｓｍｕｒｆ１分子がより利用可能となるためと解釈する。
３．Ｓｍｕｒｆ１によるＳｍａｄ１のユビキチン化
ＬＭＰ−１は、Ｓｍａｄ１とＳｍｕｒｆ１の相互作用を妨げ、Ｓｍａｄ１のユビキチン化の減少を生じると考えられる。したがって、ユビキチン化減少は、Ｓｍａｄ１タンパク質のプロテアソーム分解の減少を生じると予期される。Ｓｍｕｒｆ１とＬＭＰ−１の相互作用がＳｍａｄ１のユビキチン化を阻害することを立証するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイを行う。
【００４６】
この目的に向けて、ＴＮＴカップリング網状赤血球溶解物系（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって、ビオチン標識Ｓｍａｄ１を調製し、そしてニュートラアビジン連結樹脂を用いてＳｍａｄ１を捕捉することによって、不純物を除去する。Ｓｍａｄ１を、精製Ｅ１およびＥ２リガーゼの混合物と混合し、そして組換えＬＭＰ−１タンパク質の存在下または非存在下で、ＳｍａｄユビキチンＥ３リガーゼ、Ｓｍｕｒｆ１とインキュベーションする。反応混合物はまた、ユビキチンおよびクレアチンキナーゼ−ＡＴＰ生成系も含有する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびユビキチンまたはストレプトアビジン−ＨＲＰ（ビオチン−Ｓｍａｄ１を検出するため）に対する特異的抗体を用いたウェスタンブロットによって、反応混合物を分析する。
予期される結果：反応条件下では、Ｓｍｕｒｆ１によるＳｍａｄ１のベースライン・ユビキチン化が存在すると予期される。さらに、ＬＭＰ−１の付加がこの反応を阻害すると予期される。これは、Ｓｍｕｒｆ１をＥ３リガーゼと同定し、これとＬＭＰ−１が相互作用して、Ｓｍｕｒｆ１が誘導するＳｍａｄ１のユビキチン化を減少させる。
４．ユビキチン化に対するＳｍｕｒｆ１  ｓｉＲＮＡ処理の効果
Ｓｍｕｒｆ１に対するＬＭＰ−１結合が、それ自体のユビキチン化およびそれに続くプロテアソーム分解を導く可能性がある。しかし、分解されずに、Ｅ３リガーゼに結合するタンパク質の例がある（Ｍｕｒｉｌｌａｓ  Ｒ，  Ｓｉｍｍｓ  ＫＳ，  Ｈａｔａｋｅｙａｍａ  Ｓ，  Ｗｅｉｓｓｍａｎ  ＡＭ，  およびＫｕｅｈｎ  ＭＲ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２００２；２７７：２８９７−９０７）。比較的少量のＬＭＰ−１が、単独で、ＢＭＰ−２経路を非常に活性化するという我々の経験的データによって、ＬＭＰ−１自体が、Ｓｍｕｒｆ１によるプロテアソーム分解をターゲティングするのではなく、むしろ、ＬＭＰ−１はＳｍａｄ１／５結合部位を占有し、Ｓｍａｄ１／５ターゲティングおよび分解を妨げることが示唆される。Ｓｍｕｒｆ１レベルの減少が、ＬＭＰ−１ユビキチン化の減少および内因性ＬＭＰ−１レベルの増加を生じるかどうかを決定するため、ヒトＭＳＣを６ウェルプレート中、３ｘ１０４細胞／ウェルに蒔き、一晩増殖させ、そしてＳｍｕｒｆ１または対照ｓｉＲＮＡを適用する。４、８、１２、２４、４８、または７２時間後、細胞を採取し、そして細胞質分画および核分画の両方を調製する。細胞分画を、ＬＭＰ−１に対する抗体でコーティングした９６ウェルプレート中、該抗体とインキュベーションする。ＬＭＰ−１と関連しない核タンパク質を除去するために洗浄した後、蛍光タグ付けユビキチン抗体を適用し、そして上述のように蛍光を検出する。このアプローチは、試料におけるユビキチンレベルの定量化を可能にする。言い換えると、蛍光タグ化ＬＭＰ−１抗体を適用することによって、捕捉されるＬＭＰ−１レベルを定量化する。ＥＬＩＳＡ測定がユビキチン化ＬＭＰ−１に特異的であることを確認するため、細胞分画の別のアリコットを、抗ＬＭＰ−１抗体を用いた免疫沈降に供し、そしてユビキチンに対する抗体、ならびにＬＭＰ−１に対する抗体を用いたウェスタンブロッティングによって、沈降したタンパク質を分析する。
予期される結果：ＬＭＰ−１がＳｍｕｒｆ１によるユビキチン化を経るとは考えられない。したがって、Ｓｍｕｒｆ１レベルの減少は、Ｓｍｕｒｆ１レベルが正常である細胞と比較して、ユビキチン化ＬＭＰ−１のレベルを変化させないことが予期される。さらに、Ｓｍｕｒｆ１レベルの減少が細胞内のＬＭＰ−１タンパク質レベルに影響しないことが予期される。Ｓｍｕｒｆ１がＬＭＰ−１をプロテアソーム分解に向けてターゲティングしないことを結論付けると、ＬＭＰ−１がＳｍａｄ１またはＳｍａｄ５にも結合する部位でＳｍｕｒｆ１に結合し、Ｓｍａｄのユビキチン化、そしてプロテアソーム分解に向けたターゲティングを遮断することが示唆される。したがって、Ｓｍｕｒｆ１機能のこの妨害が、ＬＭＰ−１がＢＭＰ−２経路のシグナル伝達を増進する主な機構であろう。
５．ｉｎ  ｖｉｔｒｏのユビキチン化反応：
精製Ｓｍａｄ１（１００ｎｇ）をユビキチン化緩衝液（５０μＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．８、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２ｍＭ  ＮａＦ、および３μＭオカダ酸）に緩衝液交換する。次いで、Ｓｍａｄ１を精製Ｅ１およびＥ２酵素の混合物と合わせ、そして組換えＬＭＰ−１またはＬＭＰ−２タンパク質の存在下または非存在下で、Ｓｍｕｒｆ１（Ｅ３リガーゼ）とインキュベーションする。反応混合物はまた、２ｍＭ  ＡＴＰ、ユビキチン（１５０μＭ）、ユビキチンアルデヒド（５μＭ）、およびクレアチンキナーゼ−ＡＴＰ生成系（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）も含有する。反応混合物（４０μｌ）を３７℃で４時間インキュベーションする。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ならびにＳｍａｄ１および／またはユビキチンに対する特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングのため、多様な時点でアリコットを取る。
ＢＭＰ−２受容体（ＢＭＰＲ１Ａ）の機構研究
１．Ｓｍｕｒｆ１／Ｓｍａｄ６複合体
ＬＭＰ−１がＢＭＰ−２に対する細胞反応性を増進する１つの仮説は、形質膜におけるＢＭＰＲ１Ａ（ＡＬＫ３）レベルの増加による。Ｓｍｕｒｆ１は、Ｉ−Ｓｍａｄ類との相互作用を通じて、ＢＭＰ−２受容体のプロテアソーム分解を制御することが示されている（Ｍｕｒａｋａｍｉ，  Ｇ．，  Ｗａｔａｂｅ，  Ｔ．，  Ｔａｋａｏｋａ，  Ｋ．，  Ｍｉｙａｚｏｎｏ，  Ｋ．，  およびＩｍａｍｕｒａ，  Ｔ．，  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  ２００３，  １４：２８０９−２８１７，  ２００３）。Ｉ−Ｓｍａｄ／Ｓｍｕｒｆ１複合体が核で形成され、そして形質膜に転位置し、ここで受容体へのＩ−Ｓｍａｄ結合が起こると示唆される。受容体複合体にひとたび結合すると、Ｓｍｕｒｆ１は、Ｉ−ＳｍａｄおよびＢＭＰＲ１Ａ受容体をユビキチン化し、これらをプロテアソーム分解に向けてターゲティングする（Ｅｂｉｓａｗａ，  Ｔ．，  Ｆｕｋｕｃｈｉ，  Ｍ．，  Ｍｕｒａｋａｍｉ，  Ｇ．，  Ｃｈｉｂａ，  Ｔ．，  Ｔａｎａｋａ，  Ｋ．，  Ｉｍａｍｕｒａ，  Ｔ．，  およびＭｉｙａｚｏｎｏ，  Ｋ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２００１，  ２７６：１２４７７−１２４８０；  Ｉｚｚｉ，  Ｌ．およびＡｔｔｉｓａｎｏ，  Ｌ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  ２００４，  ２３：２０７１−２０７８）。ＬＭＰ−１／Ｓｍｕｒｆ１相互作用が、Ｓｍｕｒｆ１／Ｉ−Ｓｍａｄ（Ｓｍａｄ６）複合体の形成を妨げるという仮説を試験するため、組換えＳｍｕｒｆ１、ＬＭＰ−１およびビオチン−Ｓｍａｄ６を精製し、そしてＥＬＩＳＡ結合競合アッセイにおいて試験する。該アッセイを本明細書に十分に記載する。簡潔には、９６ウェルプレートのウェルを、Ｓｍｕｒｆ１タンパク質でコーティングし、そして異なる量のＬＭＰ−１の存在下または非存在下でプレインキュベーションする。洗浄後、ビオチン−Ｓｍａｄ６をＳｍｕｒｆ１複合体とインキュベーションし、そしてストレプトアビジン−アルカリホスファターゼを用いて、結合を検出する。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２マイクロプレート読取装置を用いて、吸光度を４０５ｎｍで監視する。
予期される結果：ＬＭＰ−１の非存在下で、Ｓｍｕｒｆ１／Ｓｍａｄ６複合体が検出されると予期される。増加する濃度のＬＭＰ−１の存在下で、Ｓｍａｄ６結合の完全な阻害が達成されるまで、減少する量のＳｍｕｒｆ１／Ｓｍａｄ６複合体が形成されると予期される。
２．Ｓｍｕｒｆ−１が仲介する、Ｓｍａｄ６の核からの搬出
受容体活性化の非存在下で、Ｉ−Ｓｍａｄ類は、主に核に存在することが示されているが、受容体を活性化すると、その結果、Ｉ−Ｓｍａｄ類の細胞質への転位置が生じる（Ｉｔｏｈ，  Ｆ．，  Ａｓａｏ，  Ｈ．，  Ｓｕｇａｍｕｒａ，  Ｋ．，  Ｈｅｌｄｉｎ，  Ｃ．  Ｈ．，  ｔｅｎ  Ｄｉｊｋｅ，  Ｐ．，  およびＩｔｏｈ，  Ｓ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２００１，  ２０：４１３２−４１４２；  Ｎａｋａｙａｍａ，  Ｔ．，  Ｇａｒｄｎｅｒ，  Ｈ．，  Ｂｅｒｇ，  Ｌ．  Ｋ．，  およびＣｈｒｉｓｔｉａｎ，  Ｊ．  Ｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ，  １９９８，  ３：３８７−３９４）。核からのＳｍａｄ６の搬出が、Ｓｍｕｒｆ１によって促進されることが示唆されてきている（Ｉｚｚｉ，  Ｌ．およびＡｔｔｉｓａｎｏ，  Ｌ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００４，  ２３：２０７１−２０７８；  Ｓｕｚｕｋｉ，  Ｃ，  Ｍｕｒａｋａｍｉ，  Ｇ．，  Ｆｕｋｕｃｈｉ，  Ｍ．，  Ｓｈｉｍａｎｕｋｉ，  Ｔ．，  Ｓｈｉｋａｕｃｈｉ，  Ｙ．，  Ｉｍａｍｕｒａ，  Ｔ．，  およびＭｉｙａｚｏｎｏ，  Ｋ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２００２，  ２７７：３９９１９−３９９２５）。ＬＭＰ−１は、Ｓｍｕｒｆ１がＳｍａｄ類に結合するのと同じ部位で、Ｓｍｕｒｆ１に結合すると仮定されるため、ＬＭＰ−１／Ｓｍｕｒｆ１が相互作用する結果、ＢＭＰ−２がその受容体を活性化する結果としての、Ｓｍａｄ６の細胞質区画への移動がより少なくなると予期される。この目的に向けて、Ｆｌａｇ−Ｓｍａｄ６を過剰発現させて、ＢＭＰ−２が仲介する細胞質内へのＳｍａｄ６の転位置を、ＬＭＰ−１が遮断することを示す。Ｆｌａｇ抗体が特異的であり、そしてＳｍａｄ６抗体が他のＳｍａｄ類と交差反応性を有するため、内因性Ｓｍａｄ６ではなく、過剰発現されたＦｌａｇ−Ｓｍａｄ６を用いる。
実験設計：ヒトＭＳＣを６ウェルプレート中、３ｘ１０４細胞／ウェルで蒔き、一晩増殖させ、そして３μｇの空のベクターまたはＦｌａｇ−Ｓｍａｄ６を含有するプラスミドでトランスフェクションする。トランスフェクション後、Ａｄ５Ｆ３５−ＬＭＰ−１またはＡｄ５Ｆ３５−ＧＦＰ（０、５、１０ｐｆｕ／細胞）で形質導入する前に、細胞を１時間回復させる。形質導入が完了した２４時間後、ＢＭＰ−２（１００ｎｇ／ｍｌ）を細胞に適用する。ＢＭＰ−２処理を開始した１、２、４、８、および１２時間後に、細胞を採取して、そして細胞質分画および核分画を調製する。分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびＦｌａｇ特異的抗体を用いたウェスタン分析に供する。
予期される結果：ＢＭＰ−２受容体活性化に際して、細胞質におけるＳｍａｄ６の増加が予期される。しかし、ＬＭＰ−１を過剰発現している細胞では、この増加は予期されない。これらの結果は、ＬＭＰ−１／Ｓｍｕｒｆ１複合体が形成され、そしてＳｍａｄ６を細胞質に移動させる、Ｓｍｕｒｆ１／Ｓｍａｄ６複合体の形成を妨害することを示唆する。Ｓｍａｄ６の核から細胞質への移動を中断させることが、Ｓｍｕｒｆ１／Ｓｍａｄ６が仲介するＢＭＰＲ１Ａのプロテアソーム分解を、ＬＭＰ−１が中断させるのに必要な、非常に重要な最初の工程であると考えられる。
【００４７】
この知見はまた、ＢＭＰ−２に対するＭＳＣの反応性をＬＭＰ−１が増進させる、全体の機構の解明にも重要であろう。Ｓｍｕｒｆ１がＳｍａｄ６と相互作用するのを、ＬＭＰ−１が遮断するならば、ＢＭＰ作用に対するＬＭＰ−１の他の効果とは対照的に、未結合Ｓｍａｄ６がなお細胞質で利用可能であると思われる。しかし、Ｓｍａｄ６は、ＬＭＰ−１の存在下では、核から細胞質に搬出されないと予期される。したがって、Ｓｍａｄ６レベルが細胞質で増加しないことを立証することが重要である。
３．ＭＳＣの形質膜におけるＢＭＰＲ１Ａの量に対するＬＭＰ−１の効果
Ｓｍｕｒｆ１／Ｓｍａｄ６相互作用が減少した結果、形質膜のＢＭＰＲ１Ａレベルが増加すると考えられる。本明細書に開示する結果は、ＢＭＰ−２が、対照細胞におけるよりも、ＬＭＰ−１を過剰発現している細胞において、より多く、ＢＭＰＲ１Ａを増加させると示唆する。この知見は、受容体数を増加させるＢＭＰ−２の作用および受容体のプロテアソーム分解を減少させるＬＭＰ−１の作用の和に相当するであろう。この実験によって、受容体のこの増加に対する、ＬＭＰ−１単独の効果の解明が可能になる。受容体数の増加は、ＢＭＰ−２に対するＭＳＣの反応性を増加させるための、非常に強力な機構である。
実験設計：ヒトＭＳＣを６ウェルプレート中、３ｘ１０４細胞／ウェルで蒔き、一晩増殖させ、そしてＡｄ５Ｆ３５−ＬＭＰ−１またはＡｄ５Ｆ３５−ＧＦＰ（０、５、１０ｐｆｕ／細胞）で処理する。１、２、４、８、１２、２４および４８時間後、細胞を採取し、そして形質膜が濃縮された分画を調製する。分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびＢＭＰＲ１Ａ特異的抗体を用いたウェスタン分析に供する。
予期される結果：ＬＭＰ−１を過剰発現するＭＳＣの形質膜において、ＢＭＰＲ１Ａレベルの増加が予期される。この増加は、増加したＬＭＰ−１の存在下での、Ｓｍｕｒｆ１／Ｓｍａｄ６複合体による受容体のプロテアソーム分解の減少のためである可能性がある。その結果、この知見は、ＬＭＰ−１がＭＳＣにおけるＢＭＰの骨誘導有効性を増進する、第二の重要な機構に相当するであろう。
４．ユビキチン化ＢＭＰＲ１Ａに対するＬＭＰ−１の効果
上に示す受容体増加は、Ｓｍｕｒｆ１／Ｓｍａｄ６複合体との相互作用が減少するための、ユビキチン化およびプロテアソーム分解の減少のためであると仮定される。この仮説を試験するため、ユビキチン化されたＢＭＰＲ１Ａのレベルを測定する。過去の実験は、受容体タンパク質がプラスチックに一貫しては接着しないため、ＥＬＩＳＡによるユビキチン化受容体の検出が、困難であると示唆する。したがって、ウェスタンブロット分析を用いて、ユビキチン化レベルの変化を決定する。
実験設計：ヒトＭＳＣを６ウェルプレート中、３ｘ１０４細胞／ウェルで蒔き、一晩増殖させ、そしてＡｄ５Ｆ３５−ＬＭＰ−１（０、５、１０ｐｆｕ／細胞）、またはＡｄ５Ｆ３５ＧＦＰ対照プラスミドで処理する。４、８、１２、２４、および４８時間後、細胞を採取し、そして形質膜濃縮分画を調製する。特異的抗体でコーティングされたビーズを用いて、ＢＭＰＲ１Ａを細胞分画から免疫沈降する。ビーズを洗浄し、そしてユビキチンに対する抗体ならびにＢＭＰＲ１Ａに対する抗体を用いたウェスタンブロッティングによって、沈降したタンパク質を分析する。
予期される結果：ウェスタン分析が、多様な長さのユビキチン鎖とコンジュゲート化したＢＭＰＲ１Ａに相当する、ユビキチンおよびＢＭＰＲ１Ａ抗体両方でのスメアを示すことが予期される。さらなるユビキチン化タンパク質は予期されない。未処理またはＧＦＰ処理細胞と比較して、ＬＭＰ−１が過剰発現された場合、Ｓｍｕｒｆ１／Ｓｍａｄ６機能の妨害のため、より低いレベルのＢＭＰＲ１Ａユビキチン化が起こると予期される。この方法は、ユビキチン化の減少が、ＢＭＰＲ１Ａに連結したユビキチン・サブユニット数が変動しているためであるか、またはユビキチン鎖にコンジュゲート化されたＢＭＰＲ１Ａ分子がより少ないためであるかを定量的に区別しない可能性があることに注目すべきである。にもかかわらず、多様な処理の間のユビキチン化ＢＭＰＲ１Ａの異なる量を考慮して、処理間の比較を行ってもよい。
【００４８】
ユビキチン化されたＢＭＰＲ１Ａが検出不能である場合、これは、ユビキチン化された受容体の迅速な分解によって引き起こされる可能性がある。この場合、プロテアーゼ阻害剤、ラクタシスチンの存在下で実験を行って、ウェスタンブロットで検出するために、ユビキチン化されたＢＭＰＲ１Ａを集積させる。
【００４９】
この方法は、存在する低レベルのユビキチン化ＢＭＰＲ１Ａを検出するのに十分に高感度でない可能性もあるが、ＥＬＩＳＡは、疎水性受容体タンパク質を用いると、一貫しない可能性があるようである。したがって、ユビキチン化された受容体が十分でない場合、ＬＭＰ−１の存在下または非存在下で、Ｓｍｕｒｆ１およびＳｍａｄ６を過剰発現して、そして実験を反復してもよい。あるいは、ウェスタン分析によって検出するにはあまりに少ない受容体しか存在しない場合、Ｆｌａｇ−ＢＭＰＲ１Ａを過剰発現させて、ウェスタンブロット分析用にタンパク質を免疫沈降するため、Ｆｌａｇ抗体を用いて実験を反復してもよい。
ＬＭＰ−１およびＪａｂ１の機構研究
１．Ｊａｂ１が仲介するＳｍａｄ４のプロテアソーム分解の妨害に際してのＢＭＰ−２反応性に対する効果
１つの仮説は、ＬＭＰ−１がＪａｂ１に結合し、そしてＪａｂ１が誘導するＳｍａｄ４のプロテアソーム分解を妨げることによって、ＢＭＰ−２に対するＭＳＣの反応性を増進するというものである。Ｊａｂ１は、Ｓｍａｄ４をユビキチン化に向けてターゲティングし、そしてＳｍａｄ４分解速度を制御するアダプタータンパク質であり、これはＳｍａｄ４の細胞質レベルを調節する際の重要な役割である。Ｓｍａｄ４は、ホスホ−Ｓｍａｄ１／５を核内に転位置させるのに必要であり、そしてＢＭＰ−２に対する細胞の反応性を制御する際に非常に重要であることが示されている（Ｈａｔａ，  Ａ．，  Ｌａｇｎａ，  Ｇ．，  Ｍａｓｓａｇｕｅ，  Ｊ．，  およびＨｅｍｍａｔｉ−Ｂｒｉｖａｎｌｏｕ，  Ａ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １９９８，  １２：１８６−１９７；  Ｍｏｒｅｎ，  Ａ．，  Ｈｅｌｌｍａｎ，  Ｕ．，  Ｉｎａｄａ，  Ｙ．，  Ｉｍａｍｕｒａ，  Ｔ．，  Ｈｅｌｄｉｎ，  Ｃ．  Ｈ．，  およびＭｏｕｓｔａｋａｓ，  Ａ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２００３，  ２７８：３３５７１−３３５８２）。
【００５０】
本明細書の他の研究は、ＬＭＰ−１過剰発現が、Ｓｍａｄ４レベルを増加させることを立証している。したがって、ｓｉＲＮＡを用いたＬＭＰ−１の内因性レベルの減少は、Ｓｍａｄ４を減少させると予期される。この減少がＳｍａｄ４のプロテアソーム分解増加によって引き起こされ、そしてプロテアソーム阻害剤、ラクタシスチンの存在下では起こらないと仮定される。ＬＭＰ−１の減少がＳｍａｄ４のプロテアソーム分解を増進する、より具体的な証拠には、ＬＭＰ−１レベルが減少した際の、Ｓｍａｄ４タンパク質のユビキチン化増加を立証することが必要である。この目的に向けて、ｓｉＲＮＡによる内因性ＬＭＰ−１の減少が、Ｓｍａｄ４のプロテアソーム分解を増加させることを立証する研究を行う。
実験設計：ヒトＭＳＣを６ウェルプレート中、３ｘ１０４細胞／ウェルで蒔き、一晩増殖させ、そしてラクタシスチンの存在下または非存在下で、対照の無関係なｓｉＲＮＡまたは特異的ＬＭＰ−１  ｓｉＲＮＡで処理する。４、８、１２、２４、４８、または７２時間後、細胞を採取し、そして総ＲＮＡまたは細胞質タンパク質分画を調製する。Ｓｍａｄ４に対する抗体を用いたウェスタンブロットによって、タンパク質分画のアリコットを分析する。抗体でコーティングした９６ウェルプレート中、細胞質タンパク質の別のアリコットを、Ｓｍａｄ４に対する抗体とインキュベーションする。Ｓｍａｄ４と関連しないタンパク質を除去するために洗浄した後、蛍光タグ付けユビキチン抗体を適用し、そしてＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２蛍光および吸光度組み合わせマイクロプレート読取装置を用いて、蛍光を検出する。このアプローチは、試料に存在すると予期される低レベルのユビキチンの定量化を可能にする。
予期される結果：ユビキチン化の増加は、Ｓｍａｄ４結合のために、機能するＪａｂ１分子がより利用可能になるためである可能性が高い。これらの知見を総合すると、ＬＭＰ−１がＳｍａｄ４のプロテアソーム分解を遮断可能であることが示唆されるであろう。より可能性が低い代替機構は、ＬＭＰ−１／Ｊａｂ１相互作用が、Ｓｍａｄ４のＳＵＭＯ化増加を生じることであり、これはＳｍａｄ４の安定性増加の代替機構である（Ｌｅｅ，  Ｐ．  Ｓ．，  Ｃｈａｎｇ，  Ｃ，  Ｌｉｕ，  Ｄ．，  およびＤｅｒｙｎｃｋ，  Ｒ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２００３，  ２７８：２７８５３−２７８６３）。別の可能性は、ＴＧＦ−β阻害性ＳｍａｄであるＳｍａｄ７とＪａｂ１の相互作用が、ＴＧＦ−βホスホ−Ｒ−Ｓｍａｄ類の入手可能性を減少させることによって、これらの実験のＢＭＰ−２反応性部分を増大させうることである（Ｋｉｍ，  Ｂ．  Ｃ，  Ｌｅｅ，  Ｈ．  Ｊ．，  Ｐａｒｋ，  Ｓ．  Ｈ．，  Ｌｅｅ，  Ｓ．  Ｒ．，  Ｋａｒｐｏｖａ，  Ｔ．  Ｓ．，  ＭｃＮａｌｌｙ，  Ｊ．  Ｇ．，  Ｆｅｌｉｃｉ，  Ａ．，  Ｌｅｅ，  Ｄ．  Ｋ．，  およびＫｉｍ，  Ｓ．  Ｊ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００４，  ２４：２２５１−２２６２）。
２．ＬＭＰ−１が誘導する効果に関するＪａｂ１の必要性の研究
本明細書の研究は、Ｊａｂ１およびＬＭＰ−１の間の直接相互作用を立証し、そして特定の細胞株において、Ｊａｂ１の異所性発現が、Ｓｍａｄ４の安定状態レベルを減少させうることが周知である（Ｗａｎ，  Ｍ．，  Ｃａｏ，  Ｘ．，  Ｗｕ，  Ｙ．，  Ｂａｉ，  Ｓ．，  Ｗｕ，  Ｌ．，  Ｓｈｉ，  Ｘ．，  Ｗａｎｇ，  Ｎ．，  およびＣａｏ，  Ｘ．，  ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．  ２００２，  ３：１７１−１７６）。
実験設計：ＬＭＰ−１が誘導するＳｍａｄ４に対する効果には、Ｊａｂ１が必要であることを立証するため、ヒトＭＳＣを６ウェルプレート中、３ｘ１０４細胞／ウェルで蒔き、一晩増殖させ、そしてｒｈＢＭＰ−２（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、対照の無関係なｓｉＲＮＡまたは特異的Ｊａｂ１  ｓｉＲＮＡで処理する。４、８、１２、２４、４８、または７２時間後、細胞を採取し、そして総ＲＮＡまたは細胞質および核のタンパク質分画を調製する。Ｓｍａｄ４およびホスホ−Ｓｍａｄ１に対する特異的抗体を用いたウェスタンブロットによって、細胞分画を分析する。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、およびＪａｂ−１特異的抗体を用いたウェスタン分析によって、Ｊａｂ１特異的ｓｉＲＮＡがＪａｂ１レベルを低下させる有効性を評価する。
予期される結果：内因性Ｊａｂ１を減少させると、ＬＭＰ−１の過剰発現を用いて、本明細書において示したように、細胞質Ｓｍａｄ４レベルが増加すると予期される。さらに、ｒｈＢＭＰ−２で処理した細胞において、活性化されたＲ−Ｓｍａｄ類を核に転位置するのに利用可能な細胞質Ｓｍａｄ４のプールが増加した結果として、Ｊａｂ１の減少が核ホスホ−Ｓｍａｄ１を増加させると予期される。これらの結果は、Ｊａｂ１が、Ｓｍａｄ４プロテアソーム分解を制御することによって、ＭＳＣにおけるＢＭＰ−２の反応性を制御することを示す。これは、形質転換細胞株または癌細胞におけるこの関係を立証した他の研究者による研究を補完するであろう（Ｗａｎ，  Ｍ．，  Ｃａｏ，  Ｘ．，  Ｗｕ，  Ｙ．，  Ｂａｉ，  Ｓ．，  Ｗｕ，  Ｌ．，  Ｓｈｉ，  Ｘ．，  Ｗａｎｇ，  Ｎ．，  およびＣａｏ，  Ｘ．，  ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．，  ２００２  ３：１７１−１７６）。
３．Ｊａｂ１が仲介するＳｍａｄ４減少に対するＬＭＰ−１の効果
上述のように、内因性Ｊａｂ１の減少が、ＬＭＰの効果を模倣して、Ｓｍａｄ４を増加させるならば、Ｊａｂ１の過剰発現は細胞質Ｓｍａｄ４を減少させると予期される。さらに、Ｊａｂ１が誘導するＳｍａｄ４の分解を減少させることによって、ＬＭＰ−１がＳｍａｄ４レベルに対する効果を発揮するのならば、過剰発現されたＬＭＰ−１は、過剰発現しているＪａｂ１の効果を逆転させるはずである。
実験設計：この仮説を試験するため、ヒトＭＳＣを６ウェルプレート中、３ｘ１０４細胞／ウェルで蒔き、一晩増殖させ、そしてＪａｂ１を含有するプラスミドまたは空のベクターでトランスフェクションする。１時間の回復期間後、細胞をＡｄ５Ｆ３５−ＬＭＰ−１またはＡｄ５Ｆ３５−ＧＦＰ（０、５、１０、２５、５０、１００ｐｆｕ／細胞）で形質導入する。１、２、４、８、１２、２４および４８時間後、細胞を採取し、そして細胞質分画を調製する。特異的Ｓｍａｄ４またはＪａｂ１抗体を用いたウェスタンブロットによって、Ｓｍａｄ４およびＪａｂ１に関して、細胞質分画を分析する。
予期される結果：Ｊａｂ１レベルの増加は、過剰発現されたＬＭＰ−１の非存在下で、細胞質Ｓｍａｄ４の減少を生じると予期される。ＬＭＰ−１が、Ｊａｂ１との相互作用を通じてＳｍａｄ４を増加させるという仮説が正しければ、ＬＭＰ−１の過剰発現は、Ｊａｂ１過剰発現の効果を克服するはずである。これらの結果は、Ｊａｂ１が誘導するＳｍａｄ４のプロテアソーム分解を、ＬＭＰ−１が遮断することを確認するであろう。ＬＭＰ−１／Ｊａｂ１相互作用は、Ｊａｂ１がＳｍａｄ４に結合するのを妨げるか、またはユビキチン化およびそれに続くプロテアソーム分解に向けてＳｍａｄ４のターゲティングを増加させるアダプタータンパク質として、Ｊａｂ１が働く能力を遮断するか、いずれかでありうる。この問題は、競合的結合研究によって解決されうる。しかし、どちらの場合も、ＬＭＰ−１／Ｊａｂ１相互作用の全体の効果は、Ｓｍａｄ４レベルを増加させることであろう。
【００５１】
ＬＭＰ−１過剰発現が、Ｓｍａｄ４レベルに対するＪａｂ１過剰発現の効果を克服することができない場合、高レベルのＪａｂ１発現を克服するにはＬＭＰ−１レベルが不十分である可能性もある。この問題を解決するため、より高い用量のＡｄ５Ｆ３５−ＬＭＰ−１を用いて、実験を反復する。本明細書に記載する他の研究において、適用したＡｄ５Ｆ３５−ＬＭＰ−１の用量が、ＭＳＣにおいて、ＢＭＰ−２と相乗作用を与えることが立証されているが、Ｊａｂ１過剰発現の効果を克服するための用量は試験していない。「二重過剰発現」の結果として毒性が観察される場合、本明細書の他の研究に示すように、Ａｄ５Ｆ３５−ＬＭＰ−１の代わりに、組換えＬＭＰ−１融合タンパク質（ＴＡＴ−ＬＭＰ−１）を用いてもよい。
４．ＢＭＰ−２反応性と生理学的に関連するマーカーの増進
ＢＭＰ−２反応性に対する併用効果を調べるため、ＬＭＰ−１過剰発現の効果を立証する、一連の実験を行う。まず、Ｓｍａｄ反応性ルシフェラーゼ・レポーター構築物（９ｘＧＣＣＧ）を用いて、ルシフェラーゼ活性に対するＬＭＰ−１過剰発現の効果を決定する。次に、ＢＭＰ−２に制御される遺伝子、Ｄｌｘ５の発現を測定する。本明細書に開示する他の研究は、ＭＳＣにおいて、骨芽細胞表現型を誘導するため、ＬＭＰ−１およびＢＭＰ−２の相乗効果が重要であると示唆する。
実験設計：ヒトＭＳＣを６ウェルプレート中、３ｘ１０４細胞／ウェルで蒔き、一晩増殖させ、３μｇの９ｘＧＣＣＧ／ルシフェラーゼ・レポーター構築物でトランスフェクションし、そしてＡｄ５Ｆ３５−ＬＭＰ−１（０、５、１０ｐｆｕ／細胞）、（対照＝Ａｄ５Ｆ３５ＧＦＰ）、ＢＭＰ−２（１００ｎｇ／ｍｌ）、または両方で処理する。４、８、１２、２４、４８、および７２時間後、細胞を採取し、そしてルシフェラーゼ活性を決定する（Ｐｒｏｍｅｇａ）。
【００５２】
ルシフェラーゼ・レポーターのトランスフェクションを伴わずに、第二のセットの実験を行い、この実験では、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて、Ｄｌｘ５発現の検出のため、同じ時点でＲＮＡを採取する。
予期される結果：ＬＭＰ−１過剰発現は、ＢＭＰ−２に反応するレポーター構築物活性を非常に増進すると予期される。さらに、ＬＭＰ−１単独またはＢＭＰ−２単独のいずれかでは、活性のより少ない増加が予期される。ＬＭＰ−１がＲ−Ｓｍａｄ類およびＣｏ−Ｓｍａｄのプールを増加させるため、これは、核において、活性化されたＲ−Ｓｍａｄ／ＣｏＳｍａｄ複合体のある程度の増加を生じうる（本明細書の他のデータに示唆されるとおり）。しかし、ＢＭＰ−２有効性を増進させる際に観察される最大の効果は、ＬＭＰ−１が、ＢＭＰ−２シグナル伝達カスケードにおける多くの重要なタンパク質の分解を減少させる効果によると予期される。
【００５３】
ＬＭＰ−１は、本明細書に開示する結果によって示唆されるように、Ｄｌｘ５遺伝子発現におけるＢＭＰ−２による増加を増進させるとさらに予期される。したがって、結果が予期されるとおりであれば、ＬＭＰ−１がＢＭＰ−２に対する反応性を増加させる１つの機構は、ＢＭＰＲ１Ａ、Ｒ−Ｓｍａｄ類およびＣｏ−Ｓｍａｄ４分解の減少を伴う可能性もありうる。
アルカリホスファターゼｍＲＮＡレベル：アルカリホスファターゼ活性は、骨芽細胞表現型の初期マーカーである。ＢＭＰ−２（１００ｎｇ／ｍｌ）を伴い、そして伴わずに、Ａｄ５／３５ＬＭＰ−１（０、１、５、１０ｐｆｕ／細胞）で処理したヒトＭＳＣをＲＮＡ用に第８日に採取する。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、そして超音波によって細胞溶解物を調製する。ＲＮＡを単離し、そしてアルカリホスファターゼ特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによって、アルカリホスファターゼｍＲＮＡを定量化した。基質としてｐ−ニトロフェニルホスフェートを用いて、アルカリホスファターゼ活性を測定し、ここで、酵素活性は、産生されるｐ−ニトロフェノール（ｎｍｏｌ／ｍｌ）として表される。１８Ｓに対してデータを標準化する。
ヒトＭＳＣにおけるＯｓｔｅｒｉｘメッセージ：Ｏｓｔｅｒｉｘは、骨芽細胞分化および骨形成に必要な新規ジンクフィンガー含有転写因子である。ＢＭＰ−２を伴い、そして伴わずに、ヒトＭＳＣをＡｄ５／３５ＬＭＰ−１で処理し、そして第８日にＲＮＡ用に採取する。ＲＮＡを単離し、そしてｏｓｔｅｒｉｘプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによって、ｏｓｔｅｒｉｘ  ｍＲＮＡを定量化する。１８Ｓに対してデータを標準化する。
細菌株および細菌発現ベクターにおけるｃＤＮＡのクローニング：すべてのクローニング法を、標準的プロトコルにしたがって行う。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＸＬ１  ｂｌｕｅおよびＢＬ  ２１−コドンプラス（ＤＥ３）−ＲＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）宿主を、ＬＢ寒天培地上で維持し、そして１００ｍｇ／ｌのアンピシリンの存在下、３７℃で増殖させる。ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−１ｔ、ＬＭＰ−２、ＬＭＰ−３、Ｓｍａｄ１およびＳｍａｄ５  ｃＤＮＡをＴＡＴ−ＨＡベクターにクローニングした。表３のプライマーを用いて、ＬＭＰ−１突然変異体を生成した。
表３
ＬＭＰ−１突然変異体用のプライマー
【００５４】
【表３】
2008538111.tif 000004
【００５５】
Ｓｍｕｒｆ１  ｃＤＮＡをｐＴｒｃＨｉｓベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングする。Ｓｍｕｒｆ１ΔＷＷ２突然変異体を生成するため、表４のプライマーを用いる。Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、突然変異誘発を行う。
表４
Ｓｍｕｒｆ１突然変異体用のプライマー
【００５６】
【表４】
2008538111.tif 000005
【００５７】
組換えタンパク質の発現および精製：Ｏ．Ｄ．６００が０．８に到達するまで、細菌培養を３７℃で増殖させる。ＩＰＴＧを２００μＭまで添加し、そして培養をさらに８時間増殖させる。細胞を採取し、そしてペレットを氷冷溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）に懸濁する。各バースト間２分間間隔、氷中、最低出力設定で、４ｘ１５秒間のバーストを用いて、均質な細胞懸濁物を超音波処理する（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ、モデルＷ−３８５、Ｈｅａｔ  ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ，  Ｉｎｃ．）。溶解物を４℃、１０，０００ｇで遠心分離して、そして流速１ｍｌ／分で、Ｕｎｉｃｏｒｎ  ４．０ソフトウェア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を備えたＡＫＴＡ  ＦＰＬＣ系を用いて、上清をＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００／Ｓ−２００カラム（ＨｉＰｒｅｐ  １６ｘ６０）に適用する。ボイド容量（３５ｍｌ）後、分画（２〜４ｍｌ）を直ちに収集する。スロットブロッティング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングによって、各分画由来のアリコットをアッセイする。ウェスタンブロットによって同定された分画をプールし、ＮａＣｌ（５０ｍＭ）およびイミダゾール（２０ｍＭ）を含有する２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５に対して透析し、そしてあらかじめ４ｘ１０ｍｌの緩衝液で平衡化した、Ｎｉ＋＋アフィニティー樹脂（Ｐｒｏｂｏｎｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に適用する。ＮａＣｌ（５０ｍＭ）およびイミダゾール（２０ｍＭ）を含有する３ｘ１０ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．０を用いて、カラムから非特異的タンパク質を洗い流す。ＮａＣｌ（５０ｍＭ）を含有する２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ４．０での３ｘ１０ｍｌ洗浄を用いて、アフィニティー結合タンパク質を溶出させる。望ましいタンパク質を含有する分画をプールし（ウェスタンブロットに基づく）、そして次いで、ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐデバイス（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて濃縮し、そして脱塩する。ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイ試薬を用いて、タンパク質を定量化する。組換えタンパク質の収量は、日常的に、２リットル培養ごとに、０．５〜１ｍｇの純粋なタンパク質である。
タンパク質リガンドのビオチン化：５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．５；０．５Ｍ  ＮａＣｌ中、精製タンパク質リガンドを１０ｍｇ／ｍｌで調製する。多様な量のスルホ−ＮＨＳ−ビオチン（ＤＭＳＯ中、１００ｍＭストック）をタンパク質リガンドと混合して、１００μｌ反応体積中、１０．０のスルホ−ＮＨＳ−ビオチン／タンパク質リガンドのモル比を達成する。時々振盪しながら氷上に２時間置いた後、最終濃度２０ｍＭまでリジンを添加して、反応を終結させる。ゲルろ過によって未反応の未結合ビオチンを除去し、そして濃縮された標識リガンドを、使用するまで−２００℃に保存する。ＴｎＴカップリングｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いることによって、標識または非標識ＬＭＰ−１、Ｓｍａｄ１、Ｓｍｕｒｆ１およびＳｍａｄ５を調製する。
スロット−ブロットアッセイ：スロットブロットウェル中で、２０μｌの精製Ｓｍｕｒｆ１（５０μｇ／ｍｌ）をニトロセルロース上にブロッティングし、そしてウェルをＴＢＳＴ中の０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０で３０分間ブロッキングする。ビオチン化リガンド（ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−２、ＬＭＰ−３、Ｓｍａｄ１またはＳｍａｄ５）を多様な濃度の競合タンパク質またはペプチドと混合し、そしてＳｍｕｒｆ１とともに、スロットブロットウェル中で９０分間インキュベーションする。ウェルを洗浄し、そして０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳＴでブロットをブロッキングする。次いで、ブロットをＨＲＰ標識アビジンと１時間インキュベーションする。洗浄後、ブロットをＥＣＬ基質溶液とインキュベーションし、そしてシグナル検出のため、膜をＸ線フィルムに暴露する。
タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を有するペプチドの調製：Ｍｉ  Ｚら；Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ２０００；２：３３９−４７にしたがって、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）（ｒｒｑｒｒｔｓｋｌｍｋｒ、本明細書において、配列番号３２として取り込まれる）をＣ末端に含むペプチドを合成する。
ｈＭＳＣの骨形成性分化：継代数４のｈＭＳＣを６ウェルプレート中、３ｘ１０４細胞／ウェルで植え付ける。翌日、細胞をＡｄ３５ＬＭＰ−１（１〜１０ｐｆｕ／細胞）に感染させ、そしてＢＭＰ−２（１００ｎｇ／ｍｌ）を含み、そして含まず、インキュベーションする。３〜４日ごとに培地を交換し、そしてミネラル沈着を２週間後に観察する。ミネラル化を評価するため、培養をＰＢＳで洗浄し、そして氷冷７０％エタノールの溶液中で２〜３時間固定する。培養を水でリンスし、そして１ｍｌの４０ｍＭアリザリンレッド（ｐＨ４．１）で１０分間染色する。培養をＰＢＳで２〜３回リンスして、非特異的染色を減少させ、風乾し、そして写真撮影する。
異所性骨形成実験
９０匹の４〜６週齢オス無胸腺ラット（ｒｎｕ−／ｒｎｕ−、Ｈａｒｌａｎ；無菌ケージで飼育（２匹／ケージ）し、そして毎日観察する）を用いて、ＬＭＰ−１模倣化合物が、最適以下の用量のＢＭＰ−２（２．５μｇ／ｍｌ）で処理されたＭＳＣの反応性を増進させて、異所性骨形成のラット・モデルにおいて骨形成を誘導する能力に関して、該化合物を試験する。無胸腺ラットは、移植される外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）物質に対する免疫応答がないため、こうしたラットを用いる。ＩＡＣＵＣによって認可された後、１．５％イソフルランを用いて、４〜６週齢のラットを麻酔し、そしてＣｈｌｏｒｏｈｅｘｉｄｅｒｍスプレーで胸部をこすった。この方法は、ラットの安楽死の迅速でそして痛みがない方法であるため、ＡＶＭＡの安楽死に関する委員会の推奨と一致して、選択される。
胸部インプラント：手術領域へのアクセスを可能にするため、穴が切り取られた無菌ドレープを用いて、手術領域を覆う。ドレープ状の循環水加熱パッド上で、手術を行う。胸部の４つの位置で、１ｃｍの皮膚切開を作製し、鈍的切開によって、筋肉から皮膚を分離し、そしてＢＭＰ−２＋細胞を装填したディスクを別個のポケットに配置する。吸収性縫合糸を用いて、切開を閉じる。ラットは、典型的には４週間生存し、その後、ＡＶＭＡの推奨と一致して、キャニスターＣＯ２を用いて、ラットを安楽死させる。
対照：ＬＭＰ−１の有効用量範囲が狭いため、多数の用量の各化合物を試験し、そして陽性対照（すなわちＴＡＴ−ＬＭＰ−１）および陰性対照（すなわち細胞単独または細胞＋ＢＭＰ−２のみ）を含む必要がある。選択した陽性対照は、ＢＭＰ−２なしで、選択した用量で投与した際、骨形成を誘導しないはずである。各用量または対照を多数の部位で試験し、そして多数の部位／ラットがある。化合物が陽性であった場合、より多くの試験を行ってもよい。
麻酔：手術処置前に、１．５％イソフルランを用いて麻酔を投与してもよい。切開を行う前に、手術部位周囲での皮下注射または筋内注射によって、Ｂｕｐｉｖｉｃａｉｎｅ  ０．１〜０．３ｍｌを投与する。手術直後、および手術後３日間は８時間ごとに、Ｂｕｐｒｅｎｏｒｐｈｉｎｅ（Ｂｕｐｒｅｎｅｘ）（０．０５ｍｇ／１００ｇ）を皮下注射して、痛みを軽減させる。
ｉｎ  ｖｉｖｏで骨形成を誘導する、Ｓｍｕｒｆ１結合ペプチドの異所性実験
ＬＭＰ−１とＳｍｕｒｆ１の相互作用が、ＢＭＰ−２シグナル伝達活性および骨形成の増加を生じるという主な仮説から、Ｓｍｕｒｆ１に結合し、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏでＢＭＰ／Ｓｍａｄシグナル伝達経路を活性化するペプチドはまた、異所性骨形成のラット・モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏでも骨を誘導しうると予期される。骨形成を誘導するペプチドが同定されたならば、低用量のＢＭＰ−２と組み合わせてこれらのペプチドを試験して、どちらかの剤の必要用量を低下させうる相乗効果（ｉｎ  ｖｉｔｒｏで見られるようなもの）があるかどうかを決定する。潜在的な相乗作用を評価するため、本明細書に同定するのは、インプラントの５０％でしか骨形成を誘導しないＢＭＰ−２用量（２．５μｇ）およびラット異所性モデルにおいて、骨形成を一貫して誘導できないより低い用量（１μｇ）である。これらの用量は、「最適以下の用量」として知られる。
実験設計：これらの研究において、多数の用量のいくつかのペプチド各々を研究する。陽性対照は、Ａｄ５Ｆ３５−ＬＭＰ−１（５ｐｆｕ／細胞）で処理したＭＳＣである。ＭＳＣ（１〜２Ｍ）を、１００μｌ総体積中で、適切な用量のペプチドと混合し、そしてコラーゲンディスク上に置く。ディスクを、無胸腺ラットの胸部に皮下移植し、そして４週間後に外植する。触診、Ｘ線および非脱カルシウム組織切片の半定量的スコアリングによって、骨形成を評価する（Ｅｄｗａｒｄｓ  ＪＴ，  Ｄｉｅｇｍａｎｎ  ＭＨ，  およびＳｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ  ＮＬ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｒｔｈｏｐ．  １９９８；２１９−２８）。ＴＡＴ−ＬＭＰで形質導入した１００〜２００万の細胞が、このモデルにおいて骨形成を誘導しうるが、一貫してはいないことが先に見出されている。したがって、これらの研究は、臨床的転換に必要な、より一貫したｉｎ  ｖｉｖｏ骨形成結果を達成することを試みるであろう。さらに、ＢＭＰ−２の最適以下の用量がこのモデルにおいて異所性骨形成を誘導する能力を、成功したペプチドが増進する能力もまた、調べてもよい。
予期される結果：Ｓｍｕｒｆ１に結合し、そしてＢＭＰ−２シグナル伝達を増進することが可能なペプチドもまた、異所性骨形成のラット・モデルにおいて、形質導入されたＭＳＣを含有するインプラント中、骨を誘導すると予期される。さらに、より低い用量の同じペプチドで処理されたＭＳＣが、最適以下の用量のＢＭＰ−２による骨誘導を改善すると予測される。どちらの知見も、臨床設定において、骨を誘導するための非常に有望な戦略と解釈され、そしてこれらの戦略は、より困難なウサギおよび非ヒト霊長類モデルへと移るであろう。
略語：ＭＳＣ、間充織幹細胞；ｈＭＳＣ、ヒト間充織幹細胞；Ｐ−Ｓｍａｄ、リン酸化Ｓｍａｄ；Ｒ−Ｓｍａｄ、受容体Ｓｍａｄ：Ｉ−Ｓｍａｄ、阻害剤Ｓｍａｄ；ＰＴＤ、タンパク質形質導入ドメイン；ｓｉＲＮＡ、小干渉ＲＮＡ；ＬＭＰ、ＬＩＭミネラル化タンパク質；Ｓｍｕｒｆ、Ｓｍａｄユビキチン制御因子；ＢＭＰ−２、骨形成タンパク質−２；ｒｈＢＭＰ−２、組換えヒト骨形成タンパク質−２；Ｊａｂ１、Ｊｕｎ活性化ドメイン結合タンパク質；ｐｆｕ、プラーク形成単位；ＭＯＩ、感染多重度。本明細書において、細胞、組織または動物の処理に言及する場合、用語「ＢＭＰ−２」および「ｒｈＢＭＰ−２」は同義である。
【００５８】
本発明は、以下の限定しない実施例を参照することによって、より完全に理解されうる。
実施例
実施例１：ＬＭＰ−１は、ＢＭＰ−２に対する間充織幹細胞（ＭＳＣ）の反応性を劇的にそして相乗的に増加させる。
【００５９】
ＬＭＰ−１は骨を誘導するが、非常に少量のＢＭＰしか生じないことが知られる。この現象の背後にある機構を解明するために、ＬＭＰ−１が細胞の反応性を増加させて、骨芽細胞分化に関して、細胞がより低いレベルのＢＭＰに反応するのを可能にするという仮説を試験した。
【００６０】
ＬＭＰ−１を過剰発現するキメラＡｄ５Ｆ３５ベクターでトランスフェクションしたＭＳＣ培養を、ＬＭＰ−１（０、１、５、１０ｐｆｕ／細胞）またはＢＭＰ−２（１００ｎｇ／ｍｌ）単独のいずれかで、あるいはその組み合わせで処理した。ＢＭＰ−２またはＬＭＰ−１単独ではどちらも、第２１日、ヒトＭＳＣにおいていかなる骨結節ミネラル化も誘導しないが、ＬＭＰ−１（５〜１０ｐｆｕ／細胞）を過剰発現しているＭＳＣをｒｈＢＭＰ−２（１００ｎｇ／ｍｌ）で処理すると、アリザリンレッド染色によって示されるように、劇的な骨結節ミネラル化が誘導された。したがって、予期せぬことに、ＬＭＰ−１に対する同時暴露によって、無効な用量のＢＭＰ−２の骨形成促進が可能になり、これは、ＬＭＰ−１がＢＭＰシグナル伝達経路活性／感度を増加させることを示唆した。中和抗体に対する感受性を減少させるために、Ａｄ５線維タンパク質がＡｄ３５線維タンパク質で置換されたキメラＡｄ５Ｆ３５ベクターを用いたが、該ベクターはまた、Ａｄ５ベクターよりも、ヒトＭＳＣをより効率的に形質導入する（Ｙｏｔｎｄａ  Ｐ，  Ｏｎｉｓｈｉ  Ｈ，  Ｈｅｓｌｏｐ  ＨＥら  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００１；８：９３０−７；  Ｇｕｇａｌａ  Ｚ，  Ｏｌｍｓｔｅｄ−Ｄａｖｉｓ  ＥＡ，  Ｇａｎｎｏｎ  ＦＨ，  Ｌｉｎｄｓｅｙ  ＲＷ，  およびＤａｖｉｓ  ＡＲ．．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００３；１０：１２８９−９６）。
【００６１】
アルカリホスファターゼｍＲＮＡレベルおよび酵素活性の増加によって立証されるように、ＬＭＰ−１はまた、ＢＭＰ−２に対するヒトＭＳＣの反応性を増加させることが示された。
実施例２：ＬＭＰ変異体（ＬＭＰ−２）は、ラット頭蓋冠骨芽細胞培養において、結節形成を誘導しない。
【００６２】
二次ラット頭蓋冠骨芽細胞は、グルココルチコイド（ＧＣ）などの刺激への曝露なしには、自発的に分化しない。３つのＬＭＰ（ｈＬＭＰ−１；ｈＬＭＰ−２およびｈＬＭＰ−３）変異体を含有するプラスミドで細胞をトランスフェクションし、そして処理１４日後に、多層ミネラル化結節形成に関して評価した。対照細胞は、処理を受けず、そしてすべてのデータを対照群に対して標準化した。ｈＬＭＰ−１の過剰発現は、ＧＣで見られる結節形成（２７５結節）に匹敵する結節形成（２２５結節）を生じた。ＬＭＰ−１の一部切除型であるｈＬＭＰ−３もまた、結節形成を誘導した（２９０結節）。しかし、４５ａａ領域を欠くｈＬＭＰ−２は、結節形成を誘導できず（２０結節）、失われた４５ａａがＬＭＰの骨誘導特性に必要であることが示唆される。
実施例３：Ｓｍａｄ１およびリン酸化Ｓｍａｄ１（Ｐ−Ｓｍａｄ１）の検出
ＢＭＰシグナル伝達経路の活性化を測定するには、Ｓｍａｄ１およびＳｍａｄ５を測定可能であることが必要である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離された細胞質および核のタンパク質ブロットを、Ｓｍａｄ−１特異的抗体で探査した（ｐｒｏｂｅｄ）。未処理多能性細胞由来の細胞質および核のタンパク質の比較によって、Ｓｍａｄ１（５４ｋＤａ）の大部分が、細胞質分画において検出されることが立証された。
【００６３】
核において、Ｐ−Ｓｍａｄ１（リン酸化Ｓｍａｄ１）を検出するには、Ａｄ５Ｆ３５−ＬＭＰ−１に感染させた４時間後および８時間後、ＬＭＰ−１を過剰発現するＭＳＣから、核タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥブロットを調製した。Ｐ−Ｓｍａｄ１に特異的な一次抗体で、ブロットを探査した。ＨＲＰ標識二次抗体を用いて、増進化学発光（ＥＣＬ）によってシグナルを現像した後、一次抗体の結合を検出した。５４ｋＤａの見かけのサイズの単一のバンドは、ＬＭＰ−１を過剰発現していない対照ＭＳＣに比較して、ＬＭＰ−１を過剰発現している細胞において、早くも４時間で、核分画におけるリン酸化Ｓｍａｄ１の増加を示した。ＢＭＰ−２で処理したヒトＭＳＣもまた、過剰発現されたＬＭＰ−１の存在下で、細胞質リン酸化Ｓｍａｄ１レベルの増加を有した。
【００６４】
細胞質において、Ｐ−Ｓｍａｄ１（リン酸化Ｓｍａｄ１）を検出するには、Ａｄ５Ｆ３５−ＬＭＰ−１として送達されるＬＭＰ−１に感染させた４時間後および８時間後、ＬＭＰ−１を過剰発現しているＭＳＣから、細胞質タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥブロットを調製した。１００ｎｇ／ｍｌまたは２００ｎｇ／ｍｌのｒｈＢＭＰ−２単独で、あるいはＬＭＰ−１（５ｐｆｕ／細胞）と組み合わせて、細胞を処理した。１００ｎｇ／ｍｌまたは２００ｎｇ／ｍｌいずれかのｒｈＢＭＰ−２処理は、細胞質リン酸化Ｓｍａｄ１（６４ｋＤａバンド）の少量の増加を生じた。しかし、ｒｈＢＭＰ−２（１００ｎｇ／ｍｌ）＋ＬＭＰ−１（５ｐｆｕ／細胞）を添加すると、５ｐｆｕ／細胞のＬＭＰ−１単独では見られなかった、リン酸化Ｓｍａｄ１タンパク質の量の有意な増加（１０倍を超える増加）が生じた。これらのデータは、Ｓｍｕｒｆ１が仲介する非リン酸化Ｓｍａｄ１の分解を、ＬＭＰ−１が遮断し、より多量のＳｍａｄ１プールを生じ、そしてしたがって、所定の量のＢＭＰ−２に対して、より多量のリン酸化Ｓｍａｄ１が産生されるという仮説を支持する。
実施例４：ＢＭＰおよびＬＭＰ−１によって誘導されるＳｍａｄ１増加の研究。
【００６５】
Ｓｍａｄ１タンパク質レベルの増加が、Ｓｍａｄ１発現の増加によるものかどうかを決定するため、ＭＳＣをｒｈＢＭＰ−２（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＡｄ５Ｆ３５−ＬＭＰ−１（５ｐｆｕ／細胞）で処理した。対照細胞は未処理であった。４または８時間後、総ＲＮＡを採取して、そしてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、Ｓｍａｄ１  ｍＲＮＡを測定した。ＬＭＰ−１およびＢＭＰ−２は各々、４時間までにＳｍａｄ１  ｍＲＮＡを、それぞれ５倍および６．２倍、増加させた。８時間で、Ｓｍａｄ１  ｍＲＮＡは、それぞれ、ＬＭＰ−１およびＢＭＰ−２で、４．５倍および２倍増加した。データによって、ＬＭＰ−１がＳｍａｄ１  ｍＲＮＡ発現増加を介して、Ｐ−Ｓｍａｄ１の核レベルの増加を引き起こし、これがＢＭＰ受容体キナーゼによってリン酸化されうるＳｍａｄ１タンパク質の増加を生じることが示唆される。
【００６６】
しかし、上に示す、核におけるＰ−Ｓｍａｄ１集積の短い時間枠を考慮すると、この機構は、短期（４時間）増加の説明とはならないようである。短期制御機構の原因となるのは、Ｐ−Ｓｍａｄ類分解の減少の結果である可能性がより高い。
実施例５：ＬＭＰ−１およびＢＭＰ−２は、Ｓｍａｄ制御遺伝子の発現を相乗的に増加させる。
【００６７】
ＢＭＰシグナル伝達のすぐ下流のマーカーを測定するため、ＢＭＰ−Ｓｍａｄによって誘導されることが知られる遺伝子である、Ｄｌｘ５のｍＲＮＡレベルを測定した。ＭＳＣを処理しないか、あるいはＢＭＰ−２（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ａｄ５Ｆ３５−ＬＭＰ−１（５ｐｆｕ／細胞）、または両方で処理した。２４時間後、総ＲＮＡを採取し、そしてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、Ｄｌｘ５  ｍＲＮＡレベルを測定した。Ｄｌｘ５  ｍＲＮＡの倍変化としてデータを表す。未処理細胞は、１倍の増加を示した。ＢＭＰ−２で処理した細胞は、６倍の増加を示し、一方、ＬＭＰ−１で処理した細胞は、２倍の増加を示した。ＬＭＰ−１（５ｐｆｕ／細胞）およびＢＭＰ−２（１００ｎｇ／ｍｌ）の両方で処理すると、相乗効果が見られ、２５倍の増加が示された。
【００６８】
この研究では、タンパク質レベルは測定されなかったが、方法は周知であり、そしてウェスタン分析およびＥＬＩＳＡを含む。
実施例６：Ｓｍａｄに制御される他のターゲットの測定
Ｓｍａｄ６およびＢＭＰ−２のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの測定もまた行ってもよい。これらの研究のため、ヒトＭＳＣを６ウェルプレート中、３ｘ１０４細胞／ウェルで蒔き、一晩増殖させ、そしてＡｄ５Ｆ３５−ＬＭＰ−１（０、５、１０ｐｆｕ／細胞）、ＢＭＰ−２（１００ｎｇ／ｍｌ）あるいは組み合わせてまたは連続して両方の剤で処理する。対照処理は、ベクター、Ａｄ５Ｆ３５−ＧＦＰであろう。１、２、４、８、１２、１８、２４、３６、４８、および７２時間後、総ＲＮＡまたは細胞質タンパク質および核タンパク質の分析のため、細胞を採取する。逆転写後、ヒトＢＭＰ−２およびＳｍａｄ６に特異的なプライマーを用いて、リアルタイムＰＣＲを行う。同様に、アルカリホスファターゼがコンジュゲート化された二次抗体とともに、目的のタンパク質に対する商業的に入手可能な抗体を用いたＥＬＩＳＡによって、分泌タンパク質、細胞質タンパク質および核タンパク質を分析してもよい。ウェスタンブロットによって、抗体の特異性を決定して、免疫反応性種が１つしかないことを確実にしてもよい。
【００６９】
細胞内ＢＭＰ−２は、プロ−ＢＭＰ−２のプロセシング中の多様な切断工程に対応する、いくつかの免疫反応性バンドを示すと予期される。プロセシングされたＢＭＰ−２タンパク質はまた、迅速に分泌されるにつれて、大部分が培地中に見られる可能性もある。ＢＭＰ−２で処理した細胞由来の培地中で測定されるタンパク質の大部分は、処理として外因性に添加されたものである可能性もあるため、ＢＭＰ−２遺伝子発現に対するＬＭＰ−１およびＢＭＰ−２の相対的効果を決定するため、ＢＭＰ−２転写物の測定を用いてもよい。
実施例７：ＬＭＰ−１は、８５ｋＤａ核タンパク質と会合する。
【００７０】
組換えＬＭＰ−１をＳＢＥＤ−ビオチン・トランスファー試薬で標識し、そしておとりとして核タンパク質とインキュベーションした。光活性化によって、ターゲットタンパク質へのビオチン・トランスファーを達成し、そして結合したタンパク質パートナーの還元によって、脱カップリングを行った。ニュートラアビジン・ビーズを用いて、ビオチン化タンパク質の濃縮を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってビオチン化タンパク質を分離し、そしてＨＲＰ標識ニュートラアビジンおよびＥＣＬを用いて、ウェスタンブロット上で検出した。トリプシン消化およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析のため、対応するクーマシー染色バンドを切り出した。ＬＭＰ−１は、３つのタンパク質バンド；１つの８５ｋＤａバンドおよび２つのより小さいバンドと会合することが示された。より小さいサイズのバンドを配列決定し、そしてこのバンドは、全長ＬＭＰ−１の細胞局在に関与し、そして骨誘導特性に関与しない可能性がある、細胞骨格タンパク質に相当する。部分的配列分析に基づいて、８５ｋＤａバンドをさらに調べた（以下を参照されたい）。
実施例８：ＬＭＰ−１に結合する８５ｋＤａタンパク質のペプチド・マスプロフィール分析。
【００７１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたＬＭＰ−１結合タンパク質バンドを、５％（ｗ／ｗ）トリプシンによって、ゲル内消化した。トリプシン・ペプチドの分子量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって得て、そしてＰｅｐＩｄｅｎｔによって分析した。データベースから生じる８５ｋＤａ候補タンパク質マッチを分析した。Ｓｍｕｒｆ１およびそのスプライス・アイソフォーム変異体は、ペプチド・マスプロフィールで最適のランキングを示した。二重項タンパク質バンドに対して、トリプシン消化を行ったが、トリプシン消化において、Ｓｍｕｒｆ１の両方のアイソフォームのペプチド・プロフィールが同一であるため、ユニークな同一性がなお決定可能であった。比較すると、得られたペプチド・プロフィールは、Ｓｍｕｒｆ２のペプチド・マスプロフィールとはマッチしなかった。
実施例９：８５ｋＤａタンパク質は、Ｓｍｕｒｆ１／２抗体と反応する。
【００７２】
Ｓｍｕｒｆ１およびＳｍｕｒｆ２の両方に結合する抗体を用いたウェスタンブロットを行うことによって、ゲル精製したＬＭＰ−１結合タンパク質の同一性を確認した。一方は８６ｋＤａに泳動され、そして他方は８４ｋＤａに泳動される、２つのタンパク質バンドを含有する二重項は、どちらも、免疫反応性であり、そしておそらく、Ｓｍｕｒｆ１およびＳｍｕｒｆ２ではなく、類似の分子サイズのＳｍｕｒｆ１の２つの既知のスプライス変異体に相当する。分子サイズ、ウェスタンブロットにおけるＳｍｕｒｆ１／２抗体との免疫反応性、およびトリプシン・ペプチド・プロフィールに基づいて、推定上のＬＭＰ結合タンパク質は、Ｓｍｕｒｆ１と同定された。
実施例１０：ＭＳＣにおける内因性Ｓｍｕｒｆ１およびＬＭＰ−１の免疫沈降。
【００７３】
ヒトＭＳＣを６ウェルプレート中、３ｘ１０４細胞／ウェルで蒔き、一晩増殖させ、そしてＡｄ５Ｆ３５−ＬＭＰ−１（０、５、１０ｐｆｕ／細胞）、またはＡｄ５Ｆ３５−ＧＦＰで処理した。２、４、８、１２、２４、および４８時間後、細胞を採取し、そして核タンパク質をＬＭＰ−１またはＳｍｕｒｆ１抗体と混合し、そして免疫沈降に供した。溶出したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてＬＭＰ−１またはＳｍｕｒｆ１抗体を用いて、ウェスタン分析を行った。
【００７４】
未処理ＭＳＣの核タンパク質抽出物を、ＬＭＰ−１抗体とインキュベーションし、そしてプロテイン−Ａビーズを用いて免疫沈降した。免疫沈降したタンパク質を濃縮し、そしてＬＭＰ−１およびＳｍｕｒｆ１／２抗体を別個に用いたウェスタンブロットで分析した。内因性ＬＭＰ−１およびＳｍｕｒｆ１はどちらも、未処理ＭＳＣからＬＭＰ−１抗体を用いて免疫沈降された複合体中に存在した。Ｓｍｕｒｆ１抗体を免疫沈降に用いた場合のＬＭＰ−１の検出によって、この観察を確認した。
【００７５】
他の研究は、核分画中のこれらのタンパク質の相互作用を立証した。Ｓｍｕｒｆ１／ＬＭＰ−１相互作用がまた、細胞質でも観察されるかどうかは知られていないが、本明細書記載の方法にしたがって、これらの研究を行ってもよい。
実施例１１：ＬＭＰ−１は、Ｓｍｕｒｆ１  ＷＷドメインを介して、Ｓｍｕｒｆ１と相互作用する。
【００７６】
ＭＳＣ由来の核タンパク質を分離するＳＤＳ−ＰＡＧＥのブロットは、ウェスタンブロットにおいて、Ｓｍｕｒｆ１  ＷＷドメイン抗体を用いて探査した際、８５ｋＤａの主なバンドを示した。これらのブロットとＬＭＰ−１（１０μＭ）をプレインキュベーションすると、Ｓｍｕｒｆ１抗体結合が阻害された。ＬＭＰ−１タンパク質、および同じターゲット配列に向けられたＷＷ抗体の間の結合競合によって、ＬＭＰ−１との相互作用が、Ｓｍｕｒｆ１のＷＷドメイン（単数または複数）で起こることが示唆される。ＷＷドメインは、Ｓｍｕｒｆ１が、非常に重要なＢＭＰシグナル伝達Ｓｍａｄ１およびＳｍａｄ５に結合し、そしてこれらを分解に向けてターゲティングすることを可能にする領域である。これらのデータは、Ｓｍｕｒｆ１がＳｍａｄ１およびＳｍａｄ５と相互作用し、そしてこれらをターゲティングするのを、ＬＭＰ−１が遮断するという仮説を支持する。
【００７７】
ＬＭＰ−１が結合を阻害するだけでなく、一部切除ＬＭＰ変異体もまた、Ｓｍｕｒｆ  ＷＷドメイン抗体がＳｍｕｒｆ１に結合するのを阻害する。未処理ＭＳＣ由来の核タンパク質を分離するＳＤＳ−ＰＡＧＥのブロットを、Ｓｍｕｒｆ１  ＷＷドメインに特異的な抗体とインキュベーションした。全長組換えＬＭＰ−１および組換えＬＭＰ−１ｔ（ＬＭＰ−１のＣ末端一部切除型）をブロット上でプレインキュベーションすると、どちらもＷＷドメイン抗体が、Ｓｍｕｒｆ１に結合するのを妨げることが可能であった。これらのデータは、ＬＩＭドメイン（ＬＭＰ−１のＣ末端に位置する）が、Ｓｍｕｒｆ１との直接相互作用には不要であることを示唆する。
実施例１２：ＬＭＰ−１の競合的結合を確認するための、精製タンパク質を用いた、Ｓｍｕｒｆ１、ＬＭＰ−１、Ｓｍａｄ１、およびＳｍａｄ５の結合特性の性質決定。
【００７８】
細菌発現および精製によって、組換えＳｍａｄ１およびＳｍａｄ５を調製する。次いで、Ｓｍａｄ類およびＬＭＰ−１を蛍光標識する。マイクロタイタープレート中で、本明細書記載の酵素連結吸着アッセイ（ＥＬＳＡ）を行う。次いで、非標識基Ｓｍａｄ１またはＳｍａｄ５と蛍光標識ＬＭＰ−１のＳｍｕｒｆ１への競合的結合を評価するため、結合曲線を得る。逆に、非標識ＬＭＰ−１と蛍光標識Ｓｍａｄ類の競合的結合もまた測定してもよい。Ｂｉｏｌｕｍｉｎ  ９６０蛍光および吸光度組み合わせマイクロプレート読取装置を用いて、蛍光を監視する。当該技術分野に周知のスキャッチャード分析は、相互作用に関与する各タンパク質の結合親和性、解離定数、結合部位数、および化学量論を評価するのに役立ちうる。
【００７９】
次いで、結果は、１つまたは２つの部位でのＳｍｕｒｆ１への結合に関して、ＬＭＰ−１およびＳｍａｄ類の間の競合を予測しうる。Ｓｍｕｒｆ１が２つのＷＷドメインを含有し、そしてすべてまたはいくつかのタンパク質が一方または両方の部位に結合するかどうかは不確かであるため、２つの部位での競合結合が起こりうる。Ｓｍａｄ５が核内に集積しない場合、Ｓｍｕｒｆ１に関してＬＭＰ−１と競合するとは予期されない可能性があり、これは、ＬＭＰ−１がＳｍａｄ５とは異なるＷＷドメインで、Ｓｍｕｒｆ１に結合すると仮定されうるためである。
実施例１３：Ｓｍｕｒｆ１  ＷＷドメインに対して高い親和性を持つ、ＬＭＰ−１内の２つの領域の同定
全長ＬＭＰ−１がＳｍｕｒｆ１  ＷＷドメインに結合することが発見されたため、３つのＬＭＰ−１変異体の比較配列分析を行い、そして骨形成を誘導する２つのＬＭＰ−１アイソフォームに存在するが、骨を誘導できない第三のアイソフォームには存在しない、４５アミノ酸の「骨誘導性領域」を同定した。２つのＳｍｕｒｆ１  ＷＷドメイン相互作用部位（配列ＡＤＰＰＲＹＴＦＡＰを含むＷＷ相互作用部位Ａ；本明細書において、配列番号３４と呼ぶ；および配列ＧＡＰＰＰＡＤＳＡＰを含むＷＷ相互作用部位Ｂ；本明細書において、配列番号３５と呼ぶ）を含む、より大きい骨誘導性領域内のユニークなペプチド配列（ＡＡＤＰＰＲＹＴＦＡＰＳＶＳＬＮＫＴＡＲＰＦＧＡＰＰＰＡＤＳＡＰＱＱＮＧ；配列番号３３）を含有する、これらのＬＭＰ変異体（ＬＭＰ−１、ＬＭＰ１ｔおよびＬＭＰ−３）を生成した。ＷＷドメイン相互作用部位は、非骨形成性ＬＭＰ変異体（ＬＭＰ−２）には存在しない。４５アミノ酸の骨誘導性領域は、ＬＭＰの骨形成活性には必須であるようである。２つのＬＭＰ変異体（ＬＭＰ  １ｔおよびＬＭＰ−３）は、カルボキシ末端で一部切除され、そしてＬＩＭドメインを含有しないが、骨形成を誘導する。したがって、骨形成に必要なのは、４５アミノ酸の骨誘導性領域であり、そしてＬＩＭドメインではない（Ｌｉｕ，  Ｙら；  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ．  Ｒｅｓ．，２００２：１７：４０６−４１４）。
【００８０】
組換えＳｍｕｒｆ１を用いて調製し、そしてビオチン標識ＬＭＰ変異体とハイブリダイズさせたスロットブロットは、ＷＷドメイン相互作用部位を含有するＬＭＰ変異体（ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−１ｔおよびＬＭＰ−３）のみが、Ｓｍｕｒｆ１に結合可能であることを立証した。
【００８１】
２つのＷＷドメイン相互作用部位のどちらが、Ｓｍｕｒｆ１とＬＭＰの結合に必要なのか決定するため、ＷＷ相互作用部位Ａ（４５７アミノ酸の親タンパク質の１００位および１０１位のプロリンをアラニンに変換、本明細書において配列番号３６として取り込まれる；ＬＭＰ−１ΔＷＷＡ）または部位Ｂ（４５７アミノ酸の親タンパク質の１２２位、１２３位および１２４位のプロリンをアラニンに変換、本明細書において配列番号３７として取り込まれる；ＬＭＰ−１ΔＷＷＢ）のいずれかで突然変異させた２つの突然変異体ＬＭＰ−１タンパク質を調製した。突然変異は、Ｓｍｕｒｆ１  ＷＷドメインとの相互作用に必要であるプロリン残基を除去し、そして２つの部位各々のＰＹモチーフを破壊する。
ＬＭＰ−１ΔＷＷＡ−配列番号３６；
【００８２】
【化１】
2008538111.tif 000006
【００８３】
ＬＭＰ−１ΔＷＷＢ−配列番号３７
【００８４】
【化２】
2008538111.tif 000007
【００８５】
組換えＳｍｕｒｆ１をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動し、膜にトランスファーし、そして緩衝液、ＬＭＰ−１タンパク質、ＬＭＰ−２タンパク質（陰性対照、骨誘導性領域なし）、ＬＭＰ−１ΔＷＷＡまたはＬＭＰ−１ΔＷＷＢとインキュベーションした。洗浄後、Ｓｍｕｒｆ１  ＷＷドメイン抗体を適用し、そして次いで、ＨＲＰ標識二次抗体で検出した。競合的結合アッセイのスロットブロットを以前のように分析し、そしてＷＷドメイン相互作用部位ＢのみがＳｍｕｒｆ１との相互作用に必要であることを見出した。ＷＷ２ドメインが欠失されたＳｍｕｒｆ１の突然変異型（Ｓｍｕｒｆ１ΔＷＷ２）に、ＬＭＰ−１がもはや結合可能でないことを立証することによって、これらの相互作用部位の特異性を確認した。
実施例１４：ＬＭＰ−１のペプチド模倣体
Ｓｍｕｒｆ１とＬＭＰ−１の相互作用を模倣する分子を設計し、そして試験するため、ｉＳＰＯＴによって定義されるような、Ｓｍｕｒｆ１中のＷＷ−２ドメインおよびＬＭＰ−１中の２つの潜在的な相互作用モチーフ（ＷＷ−ＡおよびＷＷ−Ｂ）に類似の関連相同体の既知の結晶学データおよび相同性モデリングを用いた（Ｂｒａｎｎｅｔｔｉ，  Ｂ．およびＨｅｌｍｅｒ−Ｃｉｔｔｅｒｉｃｈ，  Ｍ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２００３；３１：３７０９−３７１１）。ＭＯＤＥＬＬＥＲプログラムを用いて、２つの相互作用要素に構造を割り当て、そしてテンプレートをモデリングした。設計したＳｍｕｒｆ１  ＷＷ−２テンプレートは、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）由来の相同ＷＷドメインに関して入手可能な結晶学データの座標に、緊密な（最大７０％）マッチを示した（Ｆｉｓｅｒ，  Ａ．およびＳａｌｉ，  Ａ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２００３；３７４：４６１−４９１）。次いで、ＤＯＣＫＩＮＧおよびＳＳＡ（表面溶媒アクセス可能性）プログラムを用いて、各結合パートナーにおける重要な残基を定義した（Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｇ．  Ｍ．，  Ｇｏｏｄｓｅｌｌ，  Ｄ．  Ｓ．，  Ｈｕｅｙ，  Ｒ．，  およびＯｌｓｏｎ，  Ａ．  Ｊ．，  Ｊ．  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．，  １９９６，  １０：２９３−３０４）。相補的スクリーニング（ＷＷ−２）および類似体スクリーニング（ＷＷ−ＡまたはＷＷ−Ｂ）の両方で、ＬＵＤＩプログラムを用いて、商業的に入手可能な低分子量および細胞浸透可能化学薬品のディレクトリをスクリーニングして、候補化合物を同定した（Ｈｏｎｍａ，  Ｔ．，  Ｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｒｅｖ．  ２００３，  ２３：６０６−６３２）。本発明者らは、コンピュータ突然変異誘発を用いて、非特異的化合物を除き、そして相補的および類似体化合物リストをクロスマッチさせて、ＬＭＰ−１の各ＷＷ相互作用ドメインに関して、７５の候補化合物にたどり着いた。Ｓｍｕｒｆ１と相互作用するＬＭＰモチーフの特異性を確認し、そして全長ＬＭＰタンパク質の活性が、小ペプチドによって複製可能であることを決定した。本発明者らは、推定上のＬＭＰ  ＷＷドメイン相互作用部位を１つ、２つ含有するか、またはまったく含有しない、骨誘導性領域（ＫＰＱＫＡＳＡＰＡＡＤＰＰＲＹＴＦＡＰＳＶＳＬＮＫＴＡＲＰＦＧＡＰＰＰＡＤＳＡＰＱＱＮＧＱＰＬＲＰＬＶＰＤＡＳＫＱＲＬＭ；本明細書において、配列番号３８と呼ぶ、下線断片は、ＷＷドメイン相互作用部位に相当し、ＡＤＰＰＲＹＴＦＡＰは部位Ａ、配列番号３４に相当し、そしてＧＡＰＰＰＡＤＳＡＰは部位Ｂ、配列番号３５に相当する）の多様な部分を含む小ペプチドを合成した。以下の表は、ＬＭＰ−１の骨形成性領域に対して設計した、ペプチド１、３、５、および７の配列を列挙する。これらのペプチドを化学的に合成し、ｉｎ  ｖｉｖｏ骨形成研究のため、ＨＰＬＣ精製した。ペプチド７のみは、Ｎ末端でアセチル化され、そしてしたがって、ペプチド機能を改変するとは予期されなかった。
表５
ペプチド模倣体
【００８６】
【表５】
2008538111.tif 000008
【００８７】
ペプチドの競合研究（０．００１μＭ〜１．０μＭの範囲に渡り、そして０．００１、０．０１、０．１および１μＭを含む）は、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）ＷＷドメイン相互作用部位Ｂを含有する２つのペプチドが、用量依存方式で、全長ＬＭＰ−１と、ならびにＳｍａｄ１およびＳｍａｄ５と、１．０μＭおよび１０μＭの濃度で、Ｓｍｕｒｆ１との結合に関して、競合可能であることを明らかにした。
【００８８】
この結果は、ＬＭＰのより重要な部位として部位Ｂを確立する、上記の突然変異分析と一致する。小ＬＭＰ由来ペプチドが、Ｓｍｕｒｆ１に競合的に結合する能力が、生理学的重要性を有するかどうかを決定するため、細胞内への進入を促進するタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）（配列：ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ、本明細書において、配列番号３２として取り込まれる）に、該ペプチドを連結した。本発明者らは、ペプチド７のみが、ラット異所性骨形成アッセイにおいて、骨形成を誘導する能力を有することを見出した。
実施例１５：骨誘導性領域融合ペプチド
３６アミノ酸配列（ＡＡＤＰＰＲＹＴＦＡＰＳＶＳＬＮＫＴＡＲＰＦＧＡＰＰＰＡＤＳＡＰＱＱＮＧ；配列番号３３）がＳｍｕｒｆ１とのＬＭＰ−１相互作用の原因であることを確認するため、容易に細胞に進入するＰＴＤ（ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ、本明細書において、配列番号３２として取り込まれる）を含有する、「骨誘導性領域融合ペプチド」（ＰＴＤ−ＬＭＰ−１／ＯＲ）を設計した。最初の研究を行って、１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２がｈＭＳＣをミネラル化する効果を増進する、ＰＴＤ−ＬＭＰ−１／ＯＲの用量を決定した。２つの有効用量、１５ｎＭおよび１７．５ｎＭが確立されたら、ｈＭＳＣを６ウェルプレート中、３ｘ１０４細胞／ウェルで蒔き、一晩増殖させ、そしてＰＴＤ−ＬＭＰ−１／ＯＲ、ＢＭＰ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）または両方の剤で処理した。対照は、ＰＴＤ−βＧａｌであった。１、２、４、８、１２、２４、４８、および７２時間後、細胞を採取し、そして細胞質および核のタンパク質分画に加えて、総ＲＮＡを調製した。精製ＰＴＤ−ＬＭＰ−１／ＯＲが、ウェスタンブロット上のＳｍｕｒｆ１へのＳｍｕｒｆ１抗体結合と競合する能力に関して、未処理試料由来の核タンパク質分画を分析した。適切な抗体を用いたウェスタンブロットによって、Ｐ−Ｓｍａｄ１およびＰ−Ｓｍａｄ５の存在に関して、すべてのタンパク質試料を分析した。Ｄｌｘ５、Ｓｍａｄ６、およびＢＭＰ−２のｍＲＮＡレベルに関して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、すべてのＲＮＡ試料を分析した。同様に、Ｄｌｘ５、Ｓｍａｄ６、およびＢＭＰ−２に対する商業的に入手可能な抗体を用いたＥＬＩＳＡによって、タンパク質分画を分析した。
【００８９】
結果は、全長ＬＭＰ−１がＷＷドメイン抗体結合と競合し、Ｐ−Ｓｍａｄ１およびＰ−Ｓｍａｄ５の核レベル増加を誘導し、そしてＢＭＰ／Ｓｍａｄが制御する遺伝子の発現を増加させる能力のすべてを、３６ａａペプチドが有することを例示する。他の研究者によって、骨誘導性ＬＭＰアイソフォームの１つ（ＬＭＰ−３）のＰＴＤ融合ペプチド誘導体が、骨形成を誘導することが示されたことが注目される（Ｐｏｌａ  Ｅ，  Ｇａｏ  Ｗ，  Ｚｈｏｕ  Ｙら  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００４；１１：６８３−９３）。
実施例１６：全長および一部切除ＬＭＰ−１変異体は、ｉｎ  ｖｉｖｏの異所性および同所性モデルにおいて、骨を形成する。
【００９０】
骨髄細胞および白血球を、全長またはＬＩＭドメインを欠く一部切除ＬＭＰ−１のｃＤＮＡでトランスフェクションした。操作された細胞を含有するコラーゲンディスクを、無胸腺ラット内に皮下移植した。インプラントの組織検査は、異所性および同所性骨形成を示した。一部切除ＬＭＰ−１（ＬＭＰ−１ｔ）を過剰発現している細胞を含有するインプラントにおいて、骨芽細胞で裏打ちされた新規骨梁が見られ、そして対照細胞を含有するインプラントでは、新規骨は存在しなかった。これは、遺伝子操作された細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏで骨を形成可能であることを立証し、そしてＬＭＰ−１のＬＩＭドメインが、骨形成に必要でないことを確認する。
実施例１７：ＬＭＰ−１でトランスフェクションされた骨髄細胞は、脊椎固定のラット・モデルにおいて、骨を誘導する
脊椎固定は、異所性部位より困難な骨形成モデルである。活性型または不活性型のＬＭＰ−１のｃＤＮＡでトランスフェクションされている骨髄細胞に浸したキャリアーをラットに移植した。４週での動物の側部Ｘ線検査は、骨髄細胞が活性ＬＭＰ−１タンパク質を発現している場合には、堅固な脊椎固定を示すが、骨髄細胞がＬＭＰ−１の不活性型でトランスフェクションされている場合には、骨形成の証拠はまったく見られなかった。これらのデータは、遺伝子操作された骨髄細胞が、ラット脊椎固定を誘導しうることを示す。
実施例１８：ＴＡＴ−ＬＭＰ−１融合タンパク質は、細胞の核に進入し、そしてｉｎ  ｖｉｖｏで骨を形成する
ＨＩＶタンパク質Ｔａｔに見られる１１ａａ配列を含有する融合タンパク質は、数分以内に容易に細胞に進入することが知られる（Ｎａｇａｈａｒａ  Ｈ，  Ｖｏｃｅｒｏ−Ａｋｂａｎｉ  ＡＭ，  Ｓｎｙｄｅｒ  ＥＬら  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １９９８；４：１４４９−５２）。タンパク質送達のこの方法は、免疫応答の問題を回避するため、アデノウイルス遺伝子輸送より優れている。ＬＭＰ融合タンパク質が細胞に進入することを確認するため、ＦＩＴＣ標識ＬＭＰ−１  Ｔａｔ融合タンパク質（ＴＡＴ−ＬＭＰ−１）を合成し、そして１０、２５および１００ｎＭの用量で処理した際のＭＳＣにおける局在に関して、蛍光を監視した。融合タンパク質は、用量依存方式で、有核血液細胞に容易に進入し、標識に関して、それぞれ２、２５、および９０％の細胞が陽性であった。別の実験由来のウェスタンブロットは、ＴＡＴ−ＬＭＰ−１が核に進入する能力を確認した。Ｘ線は、ＴＡＴ−ＬＭＰ−１で３０分間処理した細胞を移植したラットにおいて、コラーゲンディスク上に優れた骨が形成されることを示した。ＴＡＴ−ＬＭＰ−１での骨誘導は、実験間で常に一貫してはおらず、そしてしたがって、これは、骨形成の最適な「独立型の」戦略ではなかった。ＬＭＰ−１の作用機構のよりよい理解およびデザイナー小分子によって、これを、骨形成の「独立型の」開始因子として、またはＢＭＰに対する応答性を増加させる手段として、より一貫して行うことが可能になりうる。
実施例１９：ＬＭＰ−１  ｓｉＲＮＡ
提唱されるＬＭＰ−１作用機構の側面を解明するために、特異的遺伝子の発現を選択的に阻害するため、ＬＭＰ−１をターゲットとするｓｉＲＮＡを設計した。特異的ｍＲＮＡを破壊するための小阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用は、遺伝子発現を特異的にサイレンシングするために選択される方法となってきている（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ｊ，  Ｐａｔｋａｎｉｏｗｓｋａ  Ａ，  Ｕｒｌａｕｂ  Ｈ，  Ｌｕｈｒｍａｎｎ  Ｒ，  およびＴｕｓｃｈｌ  Ｔ．  Ｃｅｌｌ  ２００２；ｌ１０：５６３−７４；  Ｍａｅｄａ  Ｓ，  Ｈａｙａｓｈｉ  Ｍ，  Ｋｏｍｉｙａ  Ｓ，  Ｉｍａｍｕｒａ  Ｔ，  およびＭｉｙａｚｏｎｏ  Ｋ．．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２００４；２３：１−１２）。
【００９１】
ｓｉＲＮＡ処理のための条件をまず最適化し、そしてＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を，本明細書に開示するＬＭＰ−１に対するｓｉＲＮＡ（１０ｐｍｏｌ）で、そして本明細書に開示する方法にしたがって、トランスフェクションした。ＬＭＰ−１  ｍＲＮＡレベルは、処理なしに比較した際、ｓｉＲＮＡ処理４８時間後、９０％減少した。ＬＭＰ−１  ｍＲＮＡレベルの減少に加えて、減少した骨結節ミネラル化もまた観察された。
実施例２０：Ｓｍｕｒｆ１  ｓｉＲＮＡ
ＬＭＰ−１が、Ｓｍａｄ１／５への結合に利用可能なＳｍｕｒｆ１の量を減少させることによって作用するという仮説を支持するために、機能性Ｓｍｕｒｆ１のレベルを減少させる効果を立証するため、Ｓｍｕｒｆに対するｓｉＲＮＡを設計し、そしてＴＥ８５ヒト骨肉腫細胞のターゲット減少に関して試験した。本明細書に解説する方法にしたがって、細胞を処理し、そして総ＲＮＡを採取し、そしてＳｍｕｒｆ１に特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによって、Ｓｍｕｒｆ１  ｍＲＮＡレベルを測定した。特異的プライマーを用いてＳｍｕｒｆ２  ｍＲＮＡレベルもまた測定し、そしてこれらのレベルは変化しなかった。各プライマーセットの単一の産物があり、これを配列決定して同一性を確認した。結果によって、Ｓｍｕｒｆ１  ｓｉＲＮＡが、Ｓｍｕｒｆ１  ｍＲＮＡレベルの用量依存性減少を生じたことが示される。
実施例２１：ヒトＭＳＣにおけるＯｓｔｅｒｉｘメッセージ
Ｏｓｔｅｒｉｘは、骨芽細胞分化および骨形成に必要な、新規ジンクフィンガー含有転写因子である。ヒトＭＳＣを、ＢＭＰ−２（１００ｎｇ／ｍｌ）を伴い、そして伴わずに、Ａｄ５／３５ＬＭＰ−１（０、１、５、１０ｐｆｕ／細胞）で処理し、そして第８日にＲＮＡ用に採取した。ＲＮＡを単離し、そしてｏｓｔｅｒｉｘプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによって、ｏｓｔｅｒｉｘ  ｍＲＮＡを定量化した。１８Ｓに対してデータを標準化した。これらのデータは、ｏｓｔｅｒｉｘメッセージの増加によって立証されるように、ＬＭＰ−１がＢＭＰ−２に対するヒトＭＳＣの反応性を増加させたことを例示する。データを表６に要約する。
表６
ｏｓｔｅｒｉｘ  ｍＲＮＡの増加
【００９２】
【表６】
2008538111.tif 000009
【００９３】
実施例２２：ＬＭＰ−１の過剰発現は、ヒトＭＳＣにおいて、ＢＭＰＲＩＡ（ＡＬＫ３）レベルを増加させる。
ヒトＭＳＣをｒｈＢＭＰ−２（１００ｎｇ／ｍｌ）単独で、またはＡｄ５Ｆ３５−ＬＭＰ−１（５ｐｆｕ／細胞）で８時間処理し、そして形質膜分画に関して細胞質タンパク質を濃縮し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離によって分離した。次いで、ブロットを、ＩＡ型ＢＭＰ受容体（ＢＭＰＲ１Ａ／ＡＬＫ３）に特異的な抗体で探査し、そしてＢＭＰＲ１Ａに関して予期されるサイズ（５５ｋＤａ）の主なバンドが観察された。ｒｈＢＭＰ−２処理（１００ｎｇ／ｍｌ）は、未処理対照細胞を超えた、ＢＭＰＲ１Ａの予期される増加を生じた。しかし、ＬＭＰ−１の存在下で、ｒｈＢＭＰ−２を与えると、ＢＭＰＲ１Ａレベルの有意により多い増加が観察された。これらのデータは、Ｓｍｕｒｆ１／Ｓｍａｄ６が仲介するＢＭＰ受容体の分解を、ＬＭＰ−１が妨害するという仮説を支持する。
実施例２３：ＬＭＰ−１は、Ｊｕｎ活性化ドメイン結合タンパク質（Ｊａｂ１）と相互作用する。
【００９４】
酵母２ハイブリッド（Ｙ２Ｈ）系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、ＬＭＰ−１と相互作用可能な他のタンパク質を同定した。骨髄ライブラリーのＹ２Ｈスクリーニングに基づいて、陽性クローンを選択した。１０の推定上の陽性クローンの配列決定およびデータベースマッチングによって、ＬＭＰ−１のありうる候補結合パートナーとして、Ｊａｂ１が同定された。次いで、この会合が細胞で起きるかどうかを決定した。ＬＭＰ−１抗体ビーズを用いた細胞質タンパク質の免疫沈降によって、Ｊａｂ１がＬＭＰ−１との複合体中に見出されることが立証された。これらのデータは、Ｊａｂ１およびＬＭＰ−１の間の会合が細胞で起こることを立証するが、２つのタンパク質の直接の結合を確立しない。
実施例２４：ＬＭＰ−１はＪａｂ１に結合する
ＬＭＰ−１がＪａｂ１に直接結合することを立証するため、ヒト骨芽細胞性ＴＥ−８５細胞由来の細胞質タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてブロットをビオチン−ＬＭＰ−１で探査した。ニュートラアビジン−ＨＲＰを用いて、結合したビオチン−ＬＭＰ−１を検出した。２つのバンドがブロット上に存在し、そしてＬＭＰ−１が、Ｓｍｕｒｆ１（８５ｋＤａ）およびＪａｂ１（３８ｋＤａ）の両方に直接結合可能であることが立証された。Ｓｍｕｒｆ１およびＪａｂ１に特異的な抗体での染色によって、これらの２つのバンドの同一性を確認した。これらのブロットは、ＬＭＰ−１がＪａｂ１と直接相互作用する証拠を提供し、Ｊａｂ１のそのターゲットの１つ（Ｓｍａｄ４）への結合を、ＬＭＰ−１が妨害しうるという仮説を支持する。
実施例２５：Ｊａｂ１との結合相互作用の同定。
【００９５】
本明細書には同定しないが、ＬＭＰ−１およびＪａｂ１間の相互作用に必要な部位またはタンパク質ドメインを、ＬＭＰ−１およびＳｍｕｒｆ１間の相互作用に関するもの（実施例１３および１４を参照されたい）と同じ方式で、決定してもよい。ひとたび同定したら、これらの部位またはドメインを含有するペプチドを設計して、タンパク質の相互作用を調節することも可能である。
実施例２６：ＬＭＰ−１過剰発現は、ヒトＭＳＣにおいて核Ｓｍａｄ４レベルを増加させる。
【００９６】
Ｓｍａｄ４に対する、ＬＭＰ−１過剰発現およびｒｈＢＭＰ−２処理の効果を立証するため、ヒトＭＳＣを、ｒｈＢＭＰ−２（１００ｎｇ／ｍｌ）、またはＬＭＰ−１（Ａｄ５Ｆ３５、ＭＯＩ＝５）で８時間処理した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離された核タンパク質ブロットを、Ｓｍａｄ４特異的抗体で探査した。核Ｓｍａｄ４に相当する６６ｋＤａバンドが、ＬＭＰ−１処理の８時間後に増加することが観察された。非特異的バンド（６６ｋＤａバンドの上に泳動される）もまた見られた。これらの結果は、ＬＭＰ−１が、おそらく、Ｊａｂ１との相互作用を介して、プロテアソーム分解に向けたＳｍａｄ４のターゲティングを減少させ、それによって、Ｓｍａｄ４レベルの増加を生じるという仮説を支持する。予期されるように、ｒｈＢＭＰ−２単独では、このタンパク質がＪａｂ１と相互作用しないため、核Ｓｍａｄ４レベルに影響はなかった。総合すると、これらのデータは、細胞におけるＬＭＰ−１およびＪａｂ１の直接相互作用を支持し、そして細胞において、ＬＭＰ−１がＳｍａｄ４レベルを増加させうるという事実を支持する。これは、ＬＭＰ−１がＢＭＰ類に対する細胞反応性を調節する第三の制御ポイントに相当し、これは、Ｓｍａｄ４が活性化Ｒ−Ｓｍａｄ類の核輸送に必要であるためである。
実施例２７：ＬＭＰ−１模倣体のスクリーニング
骨形成の誘導に対するＬＭＰ−１の効果を模倣し、そして臨床的により好適にする特性を有する小分子を同定するため、より重要なＬＭＰ−１相互作用ドメイン（Ｂ）を含有するかまたは模倣する、多数の化合物をスクリーニングしてもよい。Ｓｍｕｒｆ１結合に関してＬＭＰ−１と競合する能力に関して、これらの化合物を試験する。
【００９７】
これらの研究において、組換えＳｍｕｒｆ１を９６ウェルプレートのウェルに適用する。過剰なＳｍｕｒｆ１を除去した後に、試験化合物（過剰）をＳｍｕｒｆ１とプレインキュベーションし、その後、Ｓｍｕｒｆ１複合体と組換えビオチン−ＬＭＰ−１をインキュベーションする。ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼを用いて、ビオチン−ＬＭＰ−１／Ｓｍｕｒｆ１を検出する。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２マイクロタイタープレート読取装置を用いて、４０５ｎｍで吸光度を測定する。次いで、ＩＣ５０（最大ＬＭＰ−１結合の５０％を妨げる用量）を決定するのに適した、より少ない量の化合物を用いて、ビオチン−ＬＭＰ−１結合を遮断する化合物を再スクリーニングしてもよい。最低ＩＣ５０を持つ化合物は、最も有効であると見なされ、そして次いで、細胞効果に関して該化合物をスクリーニングしてもよい。ＩＣ５０を用いて、スクリーニングする各化合物の用量を決定する。
実施例２８：ｉｎ  ｖｉｔｒｏの化合物スクリーニング
結合競合アッセイにおいて、Ｓｍｕｒｆ１へのＬＭＰ−１の結合を最も効率的に阻害する候補化合物を、細胞においてＬＭＰ−１を模倣する能力に関して、さらに評価する。１つの適切な細胞株は、間充織幹細胞（ＭＳＣ）であり、そして適切な終点には、ＢＭＰＲ１Ａレベルの増加およびＳｍａｄに活性化されるレポーター構築物からのルシフェラーゼ産生の増加が含まれる。
【００９８】
これらの研究において、ヒトＭＳＣを６ウェルプレート中、３ｘ１０４細胞／ウェルで蒔き、一晩増殖させ、そしてＩＣ５０用量ならびにその用量より高いおよび低い２つの用量の候補化合物で処理する。Ａｄ５Ｆ３５ＬＭＰ−１およびＡｄ５Ｆ３５ＧＦＰを陽性および陰性対照として適用する。１、２、４、８、１２、２４、および４８時間後、細胞を採取し、そして形質膜濃縮分画を調製する。分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびＢＭＰＲ１Ａ特異的抗体を用いたウェスタン分析に供する。実験の第二のセットにおいて、上述のように蒔き、そして９ｘＧＣＣＧ／Ｓｍａｄ活性化ルシフェラーゼ・レポーター構築物でトランスフェクションしたＭＳＣを、第一の実験において、ＢＭＰＲ１Ａを増加させたすべての化合物と（成功する用量で）インキュベーションする。１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ−２の存在下または非存在下で、これらの研究を行う。
【００９９】
結果によって、特定の終点に対するＬＭＰ−１の効果を模倣するであろう化合物および化合物用量の同定が可能になる。ＢＭＰＲ１Ａ増加に成功する候補化合物の用量は、単独で適用された場合、ルシフェラーゼ活性をいくぶん増加させるが、ルシフェラーゼ活性に対するＢＭＰ−２の効果を非常に増進させることもまた、予期される。
実施例２９：ｉｎ  ｖｉｖｏの化合物スクリーニング
次いで、ＢＭＰ／Ｓｍａｄシグナル伝達経路をｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化させることが見出された化合物を、本明細書に記載する異所性骨形成のラット・モデルにおいて、骨の誘導に対する効果に関して、ｉｎ  ｖｉｖｏでスクリーニングしてもよい。
実施例３０：相乗作用スクリーニング
骨形成を誘導する化合物を同定したら、次いで、これらの化合物を、低用量のＢＭＰ−２と組み合わせて試験して、いずれかの剤の必要用量を低下させうる相乗効果（本明細書の他の実施例において立証されるようなもの）があるかどうか決定する。
【０１００】
潜在的な相乗効果を評価するため、本発明者らは、本明細書において、インプラントの５０％でしか骨形成を誘導しないＢＭＰ−２の用量（２．５μｇ）およびラット・モデルにおいて骨形成を誘導することができない、より低い用量（１μｇ）を同定した。
【０１０１】
相乗効果研究では、ＭＳＣにおける、ＢＭＰ−２シグナル伝達増進の細胞培養研究において、いくつかの候補化合物各々の多数の用量を試験する。これらの研究は、インプラントの５０％より多くで骨を形成するように、ＢＭＰ−２の最適以下の用量（２．５μｇ）の有効性を、各化合物が増進する能力を試験する。陽性対照は、ＴＡＴ−ＬＭＰ−１（０．６２５ｎＭ）で処理したＭＳＣであり；陰性対照には、ＭＳＣ単独およびＢＭＰ−２（２．５μｇ）単独が含まれる。ＭＳＣ（１〜２Ｍ）を、１００μｌ総体積中で、適切な用量の化合物と混合し、そしてコラーゲンディスク上に置く。ディスクを、無胸腺ラットの胸部に皮下移植し、そして４週間後に外植する。触診、Ｘ線および非脱カルシウム組織切片の半定量的スコアリングによって、骨形成を評価する（Ｅｄｗａｒｄｓ，  Ｊ．Ｔ．，  Ｄｉｅｇｍａｎｎ，  Ｍ．Ｈ．，  およびＳｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ，  Ｎ．Ｌ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｒｔｈｏｐ．，  １９９８，２１９−２２８）。最も有望な化合物をさらに２回試験して、より高次の動物における将来の実験で用いるために最適な１つまたは２つの化合物を決定する。
【０１０２】
骨を誘導するＢＭＰ−２有効性のＬＭＰ−１による増進が、スクリーニングした化合物によっては模倣不能である場合、Ｓｍｕｒｆ４レベルの調節が律速工程である可能性もあるため、ＬＭＰ−１／Ｊａｂ１相互作用もまた模倣する必要性も調べてもよい。