(57)【要約】  本発明は、宿主細胞のゲノムＤＮＡへ外来核酸配列をランダムに組み込む方法といった、標的ゲノム改変を有するヒト以外の脊椎動物の卵母細胞または卵細胞の作成方法に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ゲノム改変を有するヒト以外の脊椎動物の卵母細胞または卵細胞のインビトロでの作成方法であり、
（ａ）卵母細胞または卵細胞の核におけるエンドヌクレアーゼの発現段階であって、前記エンドヌクレアーゼが外因的に導入されること、そして前記卵細胞または卵母細胞のゲノムＤＮＡが、少なくとも１２塩基対の特異的配列に対応する、前記エンドヌクレアーゼの少なくとも一つの認識部位を有していることを特徴とし、
（ｉ）前記認識部位でのエンドヌクレアーゼの特異的配列の固定、
（ｉｉ）ゲノムＤＮＡの前記認識部位での、または、好ましくは前記認識部位から１００塩基対未満の、その隣接領域における、前記エンドヌクレアーゼによる二本鎖切断の連続的な誘導、そして
（ｉｉｉ）相同組換えメカニズムによる前記二本鎖切断の修復、
を可能にする段階、そして、
（ｂ）所望の標的ゲノム改変を有する卵細胞または卵母細胞を同定する段階
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
ゲノムＤＮＡ内に存在する前記認識部位が遺伝子組換えによって導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記エンドヌクレアーゼがメガヌクレアーゼであることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
メガヌクレアーゼが、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、ＰＩ−ＡａｅＩ、ＰＩ−ＡｐｅＩ、ＰＩ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＣｉｒＩ、ＰＩ−ＣｔｒＩ、ＰＩ−ＤｒａＩ、ＰＩ−ＭａｖＩ、ＰＩ−ＭｆｌＩ、ＰＩ−ＭｇｏＩ、ＰＩ−ＭｊａＩ、ＰＩ−ＭｋａＩ、ＰＩ−ＭｌｅＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩ、ＰＩ−ＰａｂＩＩＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｈｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−ＲｍａＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＳｓｐＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩＩ、ＰＩ−ＴｓｐＩ、ＰＩ−ＴｓｐＩＩ、ＰＩ−ＢｓｐＩ、ＰＩ−ＭｃｈＩ、ＰＩ−ＭｆａＩ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｇａＩＩ、ＰＩ−ＭｉｎＩ、ＰＩ−Ｍｍａｔ、ＰＩ−ＭｓｈＩ、ＰＩ−ＭｓｍＩＩ、ＰＩ−ＭｔｈＩ、ＰＩ−ＴａｇＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩＩ、Ｉ−ＮｃｒＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−ＰａｎＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＰｏｐＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｕｍＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ（ＨＯ）、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、またはこれらのいずれかから誘導されたメガヌクレアーゼからなる群から選択されたメガヌクレアーゼであることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
卵細胞または卵母細胞毎に外因的にタンパク質の形態で導入される前記エンドヌクレアーゼの濃度が０．１〜５単位／μｌの間、好ましくは０．５〜２．５単位／μｌの間に含まれることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項６】
切断部位における標的ゲノム改変が、欠失または挿入に対応することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項７】
さらに、ゲノムＤＮＡ内に存在するエンドヌクレアーゼの認識部位の上流および下流に位置する核酸配列との相同性を有する外来核酸配列を卵母細胞または卵細胞へ導入する段階を含むことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
導入される外来核酸配列が前記エンドヌクレアーゼのいかなる認識部位も有さないことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
卵細胞または卵母細胞毎に投与される核酸配列の濃度が１〜５０ｎｇ／μｌ、好ましくは５〜４０ｎｇ／μｌの間に含まれることを特徴とする、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記外来核酸配列が、別個の二個の核酸配列に挟まれた目的の配列を含んでおり、該別個の配列が、ゲノムＤＮＡ内に存在するエンドヌクレアーゼの認識部位の上流および下流にそれぞれ位置する核酸配列との相同性を有することを特徴とする、請求項７〜９のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１１】
ヒト以外の脊椎動物の卵細胞または卵母細胞が哺乳類、爬虫類、両生類、鳥類、昆虫類または魚類の卵細胞または卵母細胞であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１２】
ヒト以外の脊椎動物の卵細胞または卵母細胞がサケ、マス、マグロ、オヒョウ、ナマズ、ゼブラフィッシュ、メダカ、コイ、トゲウオ、アスティアナックス、ティラピア、キンギョ、バス、チョウザメ、およびドジョウからなる群から選択される魚類の卵細胞または卵母細胞であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
さらに、予め受精させた卵母細胞または標的ゲノム改変を有する卵細胞をヒト以外の脊椎動物の発生が可能となるのに適した条件下で培養する段階を含むことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１４】
さらに、培養温度が５℃〜２０℃未満の温度、好ましくは１０℃〜１５℃未満の温度で、そして、孵化に至る卵細胞に該当する卵細胞の生存率を５％より多く、好ましくは１０％より多く維持することが可能な時間、卵細胞または卵母細胞をインキュベーションすることに該当する、培養段階に先行する段階を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
培養段階に先行する前記段階が、１時間〜２４時間、好ましくは１〜２０時間実施されるインキュベーションに該当することを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、宿主細胞のゲノム内でランダム挿入を実施する方法といった、卵母細胞または卵細胞への標的ゲノム改変のインビトロでの導入方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換えは、それにより外来ＤＮＡが多細胞生物のゲノム内に導入され、該多細胞生物の子孫に伝達される、分子遺伝学的技術である。子孫へのこの伝達には、発生の早期段階にある胚のゲノムにおける前記ＤＮＡの安定した組み込みが必要である。
【０００３】
現時点では、最も用いられる遺伝子組換え技術の一つは哺乳動物の卵細胞内に裸のＤＮＡをマイクロインジェクションする技術であり、該マイクロインジェクションにより、多くの場合において、マイクロインジェクションされたＤＮＡ分子の一部分が卵細胞のゲノム内に組み込まれる。遺伝子組換えにはその他の技術、特に、当業者にはよく知られた外来ＤＮＡの生細胞への導入技術、特に、エレクトロポレーションや、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム、またはｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（ＩＮ  ＶＩＴＲＯＧＥＮ）といった修飾脂質を用いてのトランスフェクションも利用可能である。
【０００４】
ゲノム内への外来ＤＮＡの標的組み込みの場合には、相同組換えメカニズムを用いる必要がある。この場合、外来ＤＮＡは、ゲノム内の標的組み込み部位に存在するものに相同な核酸配列を有していなくてはならない。しかし、これらの相同組換えメカニズムは大部分の生物では極めて少ない頻度で生じる。最近では、「イントロンホーミング」メカニズムにおける酵母菌に関係する、「メガヌクレアーゼ」族に属するエンドヌクレアーゼの利用により、培養細胞において、そして特に哺乳動物の胚性幹細胞においてこれらの相同組換えの頻度を大幅に増やすことが可能になっている（ＣＯＨＥＮ−ＴＡＮＮＯＵＤＪＩ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ｖｏｌ．１８（３）、  ｐ：１４４４−１４４８，  １９９８）。これらの細胞において、外来メガヌクレアーゼの発現を誘導すると、Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼでは１８塩基対である、大きなサイズの特異的核酸配列におけるゲノムＤＮＡで二本鎖切断が生じ、その後外来ＤＮＡ分子配列と、この切断部位を挟む相同配列との間の相同組換えが生じる。これらのメガヌクレアーゼは、このようにゲノムＤＮＡにおける目的の配列の置換または欠失を可能にし、さらに外来配列のゲノムＤＮＡ内への導入が「標的化」した方法で可能となる。
【０００５】
驚くべき事に、本発明者は、外来核酸配列およびＩ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼを、外来核酸配列に相同な配列によって挟まれたＩ−ＳｃｅＩ部位をゲノム内に有する卵細胞に導入することにより、ゲノムのＩ−ＳｃｅＩ部位における外来核酸配列の相同組換えによる挿入に該当する標的ゲノム改変を有する卵細胞を得ることが可能であることを明らかにした。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者の発見により、メガヌクレアーゼを利用する相同組換えメカニズムをインビボで実施することが可能である場合、前記メカニズムはまた十分な有効性で卵母細胞または卵細胞内で直接実施することができ、そしてこれは、前記生物の発生プログラムの実現に障害をきたすことなく行うことが可能であるということが示された。従って、本発明者による方法は、標的ゲノム改変を有する卵細胞または卵母細胞を得ることを可能にするものであり、そして潜在的には、このような標的ゲノム改変を細胞全体に有する、遺伝子的に改変された成熟した生物を直接得ることも可能にする。前記標的ゲノム改変は従って、欠失または挿入、特に、野生型配列と比較して変異した配列の挿入に該当する。
【０００７】
卵細胞または卵母細胞は、通常の細胞と比較して重要な細胞質を含んでおり、該細胞質は遺伝物質が含まれる核への接近を困難にする。その上、膜（卵黄膜）および特に卵細胞を保護するために卵細胞の周囲にある絨毛膜の存在により、細胞への接近が制限される。これらの障壁のため、細胞内への直接注入のような特別な技術の利用が一般的に必要である。利用可能な技術の複雑性により、実験毎に処理可能な卵細胞の数は数百に制限される。
【０００８】
従って卵細胞または卵母細胞での標的ゲノム改変方法の実現性には、当業者がこのような方法の実施にあたり成功を適度に期待することができる程度に十分な頻度で標的ゲノム改変を生じさせる事象が必要である。
【０００９】
このような成功についての適度な期待は本発明による方法の実施以前にはなかったということは明らかである。実際、メガヌクレアーゼの不存在下において、相同組換えメカニズムは卵細胞においては非常に稀な遺伝学的プロセスである。このような相同組換えの頻度は、恐らく胚性幹細胞で観察されるもの以下であるか、百万個の細胞につきおよそ一回の出来事である。相同組換えの頻度を増やすためのメガヌクレアーゼの利用、特に胚性幹細胞での利用（ＥＳ、ＣＯＨＥＮ−ＴＡＮＮＯＵＤＪＩ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８、既出）では、当業者が成功を適度に期待することはもはや不可能であった。実際、この場合に相同組換えの頻度が増えたとしても、それは多くとも６×１０−６の頻度にしか達せず、このことは前記技術が卵細胞に適用することができないことを明らかに示すものである。
【００１０】
一方、ＣＯＨＥＮ−ＴＡＮＮＯＵＤＪＩ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８、既出）の論文は、培養中の胚性幹細胞に基づいた相同組換え技術を用いることを当業者に示唆しており、該胚性幹細胞は、大量に得られるという利点と、胚盤胞期の胚に注入することにより、トランスジェニック動物、つまり標的ゲノム改変を施した稀有な細胞を得ることができるという利点とを有する。更に、得られたトランスジェニック生物は、当初の胚に由来する細胞ならびに注入された遺伝子修飾された胚性幹細胞に由来する細胞とを同時に有する場合「モザイク」と呼ばれる。従って、全ての細胞が遺伝子修飾された動物を得るためには得られた動物間の交配を行う必要がある。本発明による方法は、そのすべての細胞に標的ゲノム改変が存在するトランスジェニック動物を直接得ることを可能にする。また、いかなる胚性幹細胞系統も単離されていない生物の場合、先行技術は当業者にこのような細胞の単離を提案しているが、このような生物について卵細胞から直接トランスジェニック動物を得ることを可能にする本発明による方法は示唆していない。
【００１１】
ＳＥＧＡＬおよびＣＡＲＯＬＬ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ｖｏｌ  ９２，  ｐ：８０６−８１０，  １９９５）の論文は、Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼの存在下でのアフリカツメガエルの卵母細胞における相同組換えメカニズムについて記載している。前記相同組換えはＩ−ＳｃｅＩ部位を有する環状プラスミドで実施されるが、一方、ゲノムＤＮＡ内には前記メガヌクレアーゼについてのいかなる部位も存在しない。さらに、この論文が前記プラスミドにおける相同組換えの実現について示しているのであれば、ゲノムＤＮＡに適用する場合のこのメカニズムの十分な有効性を予測することは不可能であった。プラスミドが大量にしかもＩ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼと同時に注入されているが、該Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼは、その部位に固定されない場合にはあまり安定しない。メガヌクレアーゼの安定化を容易にするこの大量のＩ−ＳｃｅＩ部位ならびにこの同時注入からは、数少ない部位の存在下で得られる相同組換えの頻度の予測はいかなる場合も不可能である。というのも、ゲノムＤＮＡ内においてそれらのコピーが多くとも数個しか存在しておらず、更にゲノムＤＮＡのコンパクトな構造に因り接近が非常に困難であるからである。クロマチン構造により、そして部位が少ないことにより、メガヌクレアーゼが分解されないうちにこれらの部位のうちの一つにメガヌクレアーゼが接近することは不可能であるということは、当然予期できることであった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
従って、本発明の第一の目的は、標的ゲノム改変を有するヒト以外の脊椎動物の卵母細胞または卵細胞のインビトロでの作成方法に関するものであり、以下を含むものである。
【００１３】
（ａ）卵母細胞または卵細胞の核におけるエンドヌクレアーゼの発現段階であって、前記エンドヌクレアーゼが外因的に導入されること、そして前記卵細胞または卵母細胞のゲノムＤＮＡが、少なくとも１２塩基対の特異的核酸配列に対応する、前記エンドヌクレアーゼの少なくとも一つの認識部位を有していることを特徴とし、
（ｉ）前記認識部位でのエンドヌクレアーゼの特異的配列の固定、
（ｉｉ）ゲノムＤＮＡの前記認識部位での、または、好ましくは前記認識部位から１００塩基対未満の、その隣接領域における、前記エンドヌクレアーゼによる二本鎖切断の連続的な誘導、そして
（ｉｉｉ）相同組換えメカニズムによる前記二本鎖切断の修復、
を可能にする段階、そして、
（ｂ）所望の標的ゲノム改変を有する卵細胞または卵母細胞を同定する段階。
【００１４】
卵細胞とは、雄性配偶子による雌性配偶子の受精から生じる単一の細胞であり、この卵細胞は新たな生物の形成に必要なあらゆる潜在能力を有している。より端的には、卵細胞は細胞期の胚に対応する。
【００１５】
卵母細胞とは、卵形成の成熟化の段階で得られた雌性生殖細胞である。
【００１６】
好ましくは、本発明による方法は、標的ゲノム改変を有するヒト以外の脊椎動物の卵細胞のインビトロでの作成方法である。
【００１７】
本発明による方法において卵細胞または卵母細胞が利用可能なヒト以外の脊椎動物の例としては、齧歯類、ヒツジ類、ウシ類、またはヒト以外の霊長類といった哺乳類、爬虫類、アフリカツメガエルといった両生類、鶏といった鳥類、ハエといった昆虫類、そしてゼブラフィッシュまたはメダカといった魚類が挙げられる。好ましくは、本発明の方法に用いられる卵細胞または卵母細胞は、サケ、マス、マグロ、オヒョウ、ナマズ、ゼブラフィッシュ、メダカ、コイ、トゲウオ、アスティアナックス、ティラピア、キンギョ、バス、チョウザメ、またはドジョウといった魚類の卵細胞または卵母細胞である。特に好ましく用いられる卵細胞または卵母細胞は、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）またはメダカ（Ｏｒｉｚｉａｓ  ｌａｔｉｐｅｓ）の卵細胞または卵母細胞である。
【００１８】
本発明による方法はまた、蛙、アフリカツメガエル、エビ、ウニといったその他の水生種にも問題なく適用される。
【００１９】
認識部位は、前記エンドヌクレアーゼが特異的に固定される少なくとも１２塩基対の長さを有し、そこへエンドヌクレアーゼが固定した後に前記エンドヌクレアーゼによるＤＮＡ二本鎖切断の誘導を可能とする、特異的核酸配列である。好ましくは、前記認識部位は、少なくとも１６塩基対、そして特に好ましくは少なくとも１８塩基対の特異的核酸配列に該当する。
【００２０】
特異的核酸配列とは、ＤＮＡ配列、好ましくは二本鎖ＤＮＡ配列である。
【００２１】
同定段階は当業者によく知られた技術を用いて行われる。この同定段階は、例として、それぞれ特異的なプローブまたはプライマーを用いることにより、得られた卵細胞または卵母細胞から単離されたゲノムＤＮＡに対してサザンブロット法またはＰＣＲ法を用いることが可能である。前記標的ゲノム改変がレポーター遺伝子を含む外来核酸配列の挿入に対応する場合には、前記同定段階は、前記レポーター遺伝子の活性を検出する技術を用いることが可能である。このような検出技術は用いられるレポーター遺伝子によって決まり、また、当業者にはよく知られているものである。前記標的ゲノム改変が、選択遺伝子を含む外来核酸配列の挿入に対応する場合には、前記同定段階は適切な培地内の前記卵細胞または卵母細胞の培養段階に対応する。このような段階の培養条件は用いられる選択遺伝子によって決まり、当業者にはよく知られているものである。
【００２２】
特定の実施態様によると、前記エンドヌクレアーゼに対する前記特異的核酸配列は、前記エンドヌクレアーゼに関して決まっている、固定についてのコンセンサス配列、または前記コンセンサス配列から誘導される配列に該当する。実際、一部のエンドヌクレアーゼは、それらのコンセンサス配列との完全な同一性を有さない配列に固定することが可能であると同時に、この固定に続き、固定した領域またはそれらの隣接領域において二本鎖切断を実施することが可能である。
【００２３】
有利には、前記特異的配列は、前記コンセンサス配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、また特に好ましくは前記コンセンサス配列と９８％以上の同一性を有する。同一性の割合は、前記特異的配列と前記エンドヌクレアーゼに関して決まっている前記固定についてのコンセンサス配列との間で性質と位置が同一な核酸の割合である。
【００２４】
用いるエンドヌクレアーゼに従って、前記特異的認識部位や当該認識部位の隣接配列のＤＮＡで二本鎖切断を実施することが可能であり、好ましくは１００塩基対未満の前記認識部位、さらに好ましくは５０塩基対未満、さらに特に好ましくは２０ｂｐ未満である。
【００２５】
有利には、エンドヌクレアーゼにより誘導される二本鎖切断はゲノムＤＮＡ内の認識部位で生じる。
【００２６】
前記認識部位は、野生型個体のゲノムＤＮＡ内に存在可能であるか、または遺伝子組換えにより前記ゲノムＤＮＡ内に導入されたものであって良い。
【００２７】
本発明の好ましい実施態様によると、前記認識部位は遺伝子組換えにより卵細胞または卵母細胞のゲノムＤＮＡ内に導入されたものである。ゲノムＤＮＡ内への認識部位の導入は、標的化したまたはランダムな方法で実施することが可能であった。
【００２８】
有利には、遺伝子組換えによる前記導入は、本発明による方法で用いられる前記卵母細胞または卵細胞においても、あるいは、卵母細胞、卵細胞または細胞であって、それから性成熟した個体が発生することが可能であり、その個体から本発明の方法で用いられる卵母細胞または卵細胞が生じる、卵母細胞、卵細胞または細胞においても、実施することが可能である。
【００２９】
好ましい前記実施態様の特定の実施態様によると、前記認識部位の導入は標的化した方法で行われる。このような標的導入は、当業者によく知られた技術に従った相同組換えによって実施することが可能である。例として、ＣＯＨＥＮ−ＴＡＮＮＯＵＤＪＩ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８、既出）には、ゲノムＤＮＡの標的配列と相同な核酸配列に挟まれた選択遺伝子およびメガヌクレアーゼの認識部位を含むベクターを、核へ注入することが説明されている。安定的に構築物が組み込まれた細胞を選択した後、特に適切な培地を用いることで、ゲノムＤＮＡ内の所望の位置に構築物が組み込まれた細胞が、特にサザンブロット法またはＰＣＲ法によって同定される。組換え率はこれらの条件下では低く、標的挿入を有する細胞数は極端に少ない。
【００３０】
有利には、ゲノムＤＮＡへの前記エンドヌクレアーゼの認識部位の標的導入は相同組換えによって実施される。
【００３１】
前記の好ましい実施態様の特定の第二の実施態様によると、前記認識部位の導入はランダムに行われる。このためには様々な技術が利用され得る。例えば、ＣＨＯＵＬＩＫＡ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８，    Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ｖｏｌ．１５（４），  ｐ ：１９６８−１９７３，  １９９５）は、ゲノムＤＮＡにＩ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼの認識部位を組み込むためのレトロウィルスベクターの利用について記載している。ＰＣＴ出願の国際公開第０３／０２５１８３号パンフレットには、Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼと、Ｉ−ＳｃｅＩの二つの認識部位に挟まれたレポーター遺伝子を有するＤＮＡ断片とを核内に同時にマイクロインジェクションすることによる、魚類の卵細胞のゲノムＤＮＡへのＩ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼの認識部位の別のランダムな組み込みの方法が記載されている。実施例で説明されている本発明による核酸配列のランダムな組み込み方法を利用することも可能である。
【００３２】
有利には、前記エンドヌクレアーゼの認識部位のゲノムＤＮＡへのランダムな導入は、国際公開第０３／０２５１８３号パンフレットに記載された核酸配列のランダムな組み込み方法、または実施例に記載された核酸配列のランダムな組み込み方法によって実施される。
【００３３】
少なくとも１２塩基対の特異的配列と結合すること、前記特異的配列またはその隣接領域でＤＮＡ二本鎖切断を連続的に誘導すること、そして最終的には相同組換えメカニズムによって前記二本鎖切断の修復をもたらすことが考えられる、多数のエンドヌクレアーゼが当業者に知られている。このようなエンドヌクレアーゼの例として、メガヌクレアーゼを挙げることができる。
【００３４】
メガヌクレアーゼは、非常に低い頻度でＤＮＡ二本鎖切断を行う酵素ファミリーを構成する。実際前記メガヌクレアーゼは、従来の制限酵素が一般的におよそ４〜８塩基対の認識部位を有するのに対し、１２〜４０の塩基対の認識部位を有する。従ってゲノムＤＮＡ内にこのような認識部位が存在する可能性は極端に低い。メガヌクレアーゼは、構造およびメカニズムの観点からみても同様に非常に特徴的である。メガヌクレアーゼは、保存されたアミノ酸モチーフの塩基に基づいて四つの別個のファミリーに分類される。
【００３５】
ドデカペプチドファミリー（１２量体、ＤＯＤ、ＤＯＤ、Ｄ１−Ｄ２、ＬＡＧＬＩ６ＤＡＤＧ、Ｐ１−Ｐ２）は、十二個のアミノ酸であるドデカペプチドの保存されたモチーフのコピーを一つ有するか（Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ）二つ有するか（Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、ＰＩ−ＡａｅＩ、ＰＩ−ＡｐｅＩ、ＰＩ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＣｉｒＩ、ＰＩ−ＣｔｒＩ、ＰＩ−ＤｒａＩ、ＰＩ−ＭａｖＩ、ＰＩ−ＭｆｌＩ、ＰＩ−ＭｇｏＩ、ＰＩ−ＭｊａＩ、ＰＩ−ＭｋａＩ、ＰＩ−ＭｌｅＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩ、ＰＩ−ＰａｂＩＩＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｈｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−ＲｍａＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＳｓｐＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩＩ、ＰＩ−ＴｓｐＩ、ＰＩ−ＴｓｐＩＩ、ＰＩ−ＢｓｐＩ、ＰＩ−ＭｃｈＩ、ＰＩ−ＭｆａＩ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｇａＩＩ、ＰＩ−ＭｉｎＩ、ＰＩ−ＭｍａＩ、ＰＩ−ＭｓｈＩ、ＰＩ−ＭｓｍＩＩ、ＰＩ−ＭｔｈＩ、ＰＩ−ＴａｇＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩＩ）によって再分類される、１５０以上の配列を有する最も重要なファミリーである。ドデカペプチドを有するメガヌクレアーゼは、およそ２０ｋＤａの分子量を示すとともに、ホモ二量体の形態で作用する。二個のドデカペプチドを有するメガヌクレアーゼは、二つのモチーフの間に７０〜１５０の残基を有し２５〜５０ｋＤａの分子量を示すと同時に、単量体の形態で活性する。
【００３６】
ＧＩＧファミリーは、ＫＳＧＩＹ−Ｘ１０／１１−ＹＩＧＳの完全に保存されたモチーフを有する（Ｉ−ＮｃｒＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−ＰａｎＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ）か部分的に保存されたモチーフを有し（Ｉ−ＴｅｖＩＩ）、このファミリーの酵素は、ＤＮＡをこれらの認識部位の別個の部位で切断する。
【００３７】
ＨＣファミリーは、ヒスチジン及びシステインに富んだ配列を有し（Ｉ−ＰｏｐＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ）、通常、「ＳＨＬＣ−Ｇ−Ｇ−Ｈ−Ｃ」におおよそ対応する保存された配列も有する。このファミリーに関する特徴を最も示すメガヌクレアーゼはＩ−ＰｐｏＩ酵素である。
【００３８】
ＨＮＨファミリーは、３５個の残基の範囲にあるコンセンサス配列「ＨＨ−Ｎ−Ｈ−Ｈ」を有し（Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ）、そしてＤＮＡ切断の固有の特性を示す。
【００３９】
しかしながら、これらの四つのファミリーに関連付けられなかった、異なるメガヌクレアーゼも同様に同定された。現時点では、これらのメガヌクレアーゼの数は五つであり、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ（ＨＯ）、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩおよびＦ−ＴｅｖＩＩに該当する。
【００４０】
しかも、これらのメガヌクレアーゼ全体には、認識部位を有するＤＮＡにおいて、この部位またはこの隣接領域において特徴的な二本鎖切断を誘導する能力がある。
【００４１】
その上、多くのメガヌクレアーゼは核移行シグナル（ＮＬＳ）を有する。このタンパク質配列は、核内への前記メガヌクレアーゼの移動および該メガヌクレアーゼが介在する相同組換えを容易にする。Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼは、このようなメガヌクレアーゼの一例である。その上、野生型メガヌクレアーゼにこのようなシグナルがない場合、当業者には、このような核移行シグナルを有する、誘導されたメガヌクレアーゼを構築することが可能であり、それは、組換えタンパク質の作成における分子生物学的な既知の技術によって行われる。
【００４２】
本発明に従った方法の好ましい第二の実施態様によれば、用いられるエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼまたはこのようなメガヌクレアーゼから誘導される酵素であり、これらは合成され得るものである。
【００４３】
メガヌクレアーゼの例としては、従って、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、ＰＩ−ＡａｅＩ、ＰＩ−ＡｐｅＩ、ＰＩ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＣｉｒＩ、ＰＩ−ＣｔｒＩ、ＰＩ−ＤｒａＩ、ＰＩ−ＭａｖＩ、ＰＩ−ＭｆｌＩ、ＰＩ−ＭｇｏＩ、ＰＩ−ＭｊａＩ、ＰＩ−ＭｋａＩ、ＰＩ−ＭｌｅＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩ、ＰＩ−ＰａｂＩＩＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｈｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−ＲｍａＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＳｓｐＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩＩ、ＰＩ−ＴｓｐＩ、ＰＩ−ＴｓｐＩＩ、ＰＩ−ＢｓｐＩ、ＰＩ−ＭｃｈＩ、ＰＩ−ＭｆａＩ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｇａＩＩ、ＰＩ−ＭｉｎＩ、ＰＩ−Ｍｍａｔ、ＰＩ−ＭｓｈＩ、ＰＩ−ＭｓｍＩＩ、ＰＩ−ＭｔｈＩ、ＰＩ−ＴａｇＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩＩ、Ｉ−ＮｃｒＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−ＰａｎＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＰｏｐＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｕｍＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ（ＨＯ）、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩといったメガヌクレアーゼ、またはこれらのうちの一つから誘導されるメガヌクレアーゼを挙げることができる。これらの様々なメガヌクレアーゼの認識部位および特異性は当業者に良く知られており、特にｈｔｔｐ：／／ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍのサイトにも記載されている。前記メガヌクレアーゼは、米国特許第６２３８９２４号明細書に記載されているＩ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼであることが好ましい。
【００４４】
誘導されたメガヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼから誘導された酵素は、野生型メガヌクレアーゼの配列を有すると同時に、当該野生型メガヌクレアーゼとは異なる認識部位を認識し、かつ／または、前記野生型メガヌクレアーゼとは別の位置でもしくは別のメカニズムに従ってＤＮＡ二本鎖切断を行う能力がある、組換えタンパク質である。前記誘導されたメガヌクレアーゼはまた、相同組換えメカニズムによる前記二本鎖切断の修復をもたらすことも可能である。このような誘導されたメガヌクレアーゼの例としては、ＤＮＡ結合ドメインがＩＩＳタイプの制限エンドヌクレアーゼまたは転写因子といった別のＤＮＡ結合タンパク質から誘導された組換えメガヌクレアーゼが挙げられる。このような誘導されたメガヌクレアーゼの例として、それらが誘導された野生型メガヌクレアーゼには存在しない一つまたは複数の核移行部位を有する組換えメガヌクレアーゼを挙げることも可能である。
【００４５】
エンドヌクレアーゼは、様々な形態で、すなわちタンパク質の形態、または前記卵細胞もしくは卵母細胞内において前記エンドヌクレアーゼの発現を可能にする核酸配列の形態で、卵細胞または卵母細胞内に外因的に導入することが可能である。
【００４６】
本発明による方法の好ましい第三の実施態様によれば、エンドヌクレアーゼはタンパク質の形態で卵細胞または卵母細胞に導入される。このようなエンドヌクレアーゼのタンパク質の形態での導入を可能にする技術は当業者の知るところである。このような技術の例として、特にマイクロインジェクションが挙げられる。
【００４７】
有利には、外因的に導入される前記エンドヌクレアーゼの濃度は、卵細胞もしくは卵母細胞毎に０．１〜５単位／μｌ、好ましくは０．５〜２．５単位／μｌ、特に好ましくは１〜２単位／μｌである。
【００４８】
卵細胞または卵母細胞毎に注入される容積は当業者の一般常識であり、該容積は卵細胞または卵母細胞の容積のおよそ１０％である。
【００４９】
例として、ゼブラフィッシュまたはメダカの卵細胞または卵母細胞に注入可能な容積は、３００ｐｌ〜１ｎｌの間に含まれる。卵細胞または卵母細胞毎に導入される核酸の量は従って、０．３×ｌ０−４〜５×１０−３単位の間、好ましくは１．５×１０−４〜２．５×１０−３単位の間、特に好ましくは０．３×１０−３〜２×１０−３単位の間に含まれる。
【００５０】
本発明による好ましい第四の実施態様によれば、エンドヌクレアーゼは、前記卵細胞または卵母細胞における前記エンドヌクレアーゼの発現を可能にする核酸分子の形態で導入される。
【００５１】
前記核酸分子は従って、卵細胞または卵母細胞における前記エンドヌクレアーゼの発現を可能にする調節配列の制御下にある、エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む。
【００５２】
核酸分子は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ならびにＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子であり、これらは一本鎖または二本鎖の形態であり得る。
【００５３】
本発明による方法で用いられる核酸分子の例として、エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ分子、または前記エンドヌクレアーゼをコードするオープインリーディングフレームを含む発現ベクターが挙げられる。
【００５４】
発現ベクターは、自身が作用可能な形式で結合している目的の核酸配列を輸送しその発現を可能にする核酸分子である。このような発現ベクターは、卵細胞または卵母細胞における前記エンドヌクレアーゼの発現を可能とするプロモーター配列を含む。このようなプロモーターの例として、特にα１チューブリンのプロモーターまたはαアクチンのプロモーター、更にはサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）といった当業者に良く知られた強力な構成的プロモーターを挙げることができる。前記発現ベクターはさらに、複製開始点、リボソームへの固定部位、一つまたは複数のスプライシング部位、ポリアデニル化部位または転写終結部位に該当する他の調節配列を含むことが可能である。
【００５５】
本発明による方法で利用可能な発現ベクターは、非制限的な例として、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工染色体）、ウィルスベクター、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、ＲＮＡベクター、ならびにバキュロウィルス、ファージ、トランスポゾンまたは線状もしくは環状のＲＮＡ分子もしくはＤＮＡ分子に由来するベクターに該当する。このようなベクターは当業者に良く知られている。ウィルスベクターの例としては、特にレトロウィルス、アデノウィルス、パルボウィルス、コロナウィルス、オルトミクソウィルス、ラブドウィルス、パラミクソウィルス、ピコナウィルス、アルファウィルス、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、ポックスウィルスが挙げられる。
【００５６】
好ましくは、用いられる発現ベクターはプラスミドベクターである。
【００５７】
卵細胞または卵母細胞に核酸分子を導入するための技術は当業者に良く知られている。このような技術の例として、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソームまたはｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（ＩＮ  ＶＩＴＲＯＧＥＮ）のような修飾脂質、更にはリン酸カルシウム沈殿を用いたトランスフェクションを挙げることができる。好ましくは、この導入はマイクロインジェクションによって実施される。
【００５８】
ＤＮＡ二本鎖切断部位における相同組換えにより導入される標的ゲノム改変は、組換えが切断部位の両側のゲノムＤＮＡの二つの相同配列間で行われる場合のゲノム配列の欠失か、組換えが外来核酸配列とゲノムＤＮＡとの間の相同領域において行われる場合の挿入に該当し得る。
【００５９】
本発明による方法の好ましい第五の実施態様によれば、前記方法はさらに、ゲノムＤＮＡ内に存在するエンドヌクレアーゼの認識部位の上流及び下流に位置する核酸配列との相同性を有する外来核酸配列を卵母細胞または卵細胞へ導入する段階を含むものである。
【００６０】
外来核酸配列とは、卵細胞または卵母細胞に導入される、線状または環状の形態で存在する二本鎖ＤＮＡ配列である。該外来核酸配列は好ましくは環状の形態である。
【００６１】
有利には、卵細胞または卵母細胞毎に投与される核酸配列の濃度は、１〜５０ｎｇ／μｌ、好ましくは５〜４０ｎｇ／μｌ、そして特に好ましくは１０〜３０ｎｇ／μｌである。
【００６２】
先ほど記載したように、卵細胞または卵母細胞毎に注入される容積は当業者の一般常識であり、卵細胞または卵母細胞の容積のおよそ１０％である。
【００６３】
例として、ゼブラフィッシュまたはメダカの卵細胞または卵母細胞毎に注入可能な容積は３００ｐｌ〜１ｎｌの間に含まれる。また、卵細胞または卵母細胞毎に導入される核酸の量は、０．３〜５０ｐｇの間、好ましくは１．５〜４０ｐｇの間、そして特に好ましくは３〜３０ｐｇの間に含まれる。
【００６４】
好ましい前記実施態様の特定の実施態様によれば、前記外来核酸配列はゲノム配列に由来するものであり、特に、前記ゲノム配列の変異した形態、または、別の個体もしくは生物に由来する前記ゲノム配列のアイソフォームの形態である。この場合、相同組換えメカニズムは、ゲノム配列の「置換」に類似する外来核酸配列の挿入をもたらす。
【００６５】
前記の好ましい実施態様の特別な第二の実施態様によると、前記外来核酸配列は、ゲノムＤＮＡ内に存在するエンドヌクレアーゼの認識部位の上流及び下流のそれぞれに位置する核酸配列との相同性を示す別個の二つの核酸配列に挟まれた目的の核酸配列を含んでいる。
【００６６】
前記の目的の核酸配列は、本発明に従った方法によって得られたトランスジェニック脊椎動物の活性および／または表現型を決定する、遺伝子または調節配列（プロモーターまたはアクチベーターなど）に相当し得る。目的の核酸配列は、ベータガラクトシダーゼ、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）といったレポーター遺伝子、またはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、またはチミジンキナーゼといった選択遺伝子を含むことが可能である。このような選択的なレポーター遺伝子を用いることは、目的の標的ゲノム改変を有する卵細胞または卵母細胞の同定を容易にすることを可能にする。好ましくは、前記レポーター遺伝子または選択遺伝子は、目的の標的ゲノム改変に対応した所望の発現特性を示す卵細胞または卵母細胞を同定するために結合されるプロモーター配列を含まない。
【００６７】
有利には、エンドヌクレアーゼの認識部位の上流及び下流に位置する核酸配列との相同性を示す一つまたは複数の核酸配列は、少なくとも５０塩基対、好ましくは少なくとも１００塩基対、特に好ましくは少なくとも２５０塩基対の長さを有する。前記配列は、より大きいサイズを有していてもよいが、しかし１０００塩基対を超える程の大きなサイズでも相同組換えの効率は上がらない。
【００６８】
さらに有利には、前記一つまたは複数の相同核酸配列は、ゲノムＤＮＡ内のエンドヌクレアーゼの認識部位の上流及び下流に位置する核酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、特に好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する。二つの核酸配列間の同一性は、同一でかつ二つの核酸配列間で同じ位置に位置するヌクレオチドの割合に対応する。多くのプログラムまたはアルゴリズムにより同一の割合の計算が可能であり、例えばＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴがある。多くのプログラムは特にＮＣＢＩのサイト（国立バイオテクノロジー情報センター、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）において利用可能である。好ましくは、相同性はＢＬＡＳＴプログラムにより決定され、さらに特に好ましくはＢＬＯＳＵＭ６２行列を用いたＢＬＡＳＴプログラムが用いられる。
【００６９】
有利には、前記外来核酸配列はベクターである。ベクターとは、自身が結合している目的の核酸配列を運搬することが可能である核酸配列である。
【００７０】
本発明による方法で用いることが可能なベクターの例として、非限定的に、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工染色体）、アデノウィルスといった適合したウィルスベクター、プラスミドベクター、ファージミド、またはコスミドが挙げられる。
【００７１】
好ましくは、用いられるベクターはプラスミドベクターである。
【００７２】
有利には、前記外来核酸配列はエンドヌクレアーゼのいかなる認識部位も有さない。
【００７３】
卵細胞または卵母細胞内に核酸分子を導入するための技術は当業者に良く知られている。このような技術の例として、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソームまたはｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（ＩＮ  ＶＩＴＲＯＧＥＮ）のような修飾脂質やリン酸カルシウム沈殿を用いたトランスフェクションを挙げることができる。好ましくは、この導入はマイクロインジェクション技術によって実施される。
【００７４】
前記外来核酸配列の導入は、エンドヌクレアーゼまたはエンドヌクレレアーゼの発現を可能にする核酸分子の導入と別々に、または同時に行うことが可能である。好ましくは、それらの導入は同時に行われる。
【００７５】
本発明による方法の好ましい第六の実施態様によれば、本発明による方法はさらに、予め受精させた卵母細胞または標的ゲノム改変を有する卵細胞をヒト以外の脊椎動物の発生が可能となるのに適した条件下で培養する段階を含む。
【００７６】
有利には、用いられる培養条件は、ヒト以外の脊椎動物の完全な発生を可能にするものである。
【００７７】
これらの培養条件は卵母細胞の受精技術と同様、当業者に良く知られており、本発明の方法で用いられる生物によって決定される。
【００７８】
例として、またゼブラフィッシュまたはメダカの卵細胞に関しては、この培養段階はおよそ２８℃±１℃または±２℃の温度での卵細胞のインキュベーションに該当する。
【００７９】
本発明による方法の好ましい第七の実施態様によれば、前記方法はさらに、培養温度よりも５℃〜２０℃低い温度、好ましくは１０℃〜１５℃低い温度で、卵細胞の生存率、すなわち孵化に達する卵細胞の数を５％より多く、好ましくは１０％より多く、そして特に好ましくは１５％より多く維持することが可能な時間、卵細胞をインキュベートすることに該当する、培養段階に先行する段階を含む。
【００８０】
卵細胞または卵母細胞を維持することができる最長の時間は当業者によって簡単に決定することができ、用いられる卵細胞または卵母細胞の温度に対する耐性によって決定される。
【００８１】
有利には、このようなインキュベーションは１時間〜２４時間の間、好ましくは１〜２０時間、また特に好ましくは１〜１０時間実施される。
【００８２】
例として、そしてメダカの卵細胞の場合、この先行する段階は、１０℃〜２５℃の間、好ましくは１２℃〜１９℃の間、そして特に好ましくは１３℃〜１８℃の間の温度におけるインキュベーションに該当する。
【００８３】
有利には、目的の標的ゲノム改変を有する卵細胞または卵母細胞の同定段階は、前記受精後の卵細胞または卵母細胞の発生時に得られたヒト以外の脊椎動物の生物に由来する細胞、好ましくはヒト以外の脊椎動物の成熟した生物に由来する細胞において実施される。
【００８４】
本発明のその他の利点および特徴は、以下に続く実施例と照らし合わせることによって明らかになろう。
【実施例１】
【００８５】
メダカゲノム内へのＩ−ＳｃｅＩ部位のランダム挿入
【００８６】
１）ｐα１ＴＩ−ＥＧＦＰ−Ｉ構築物
【００８７】
ｐα１ＴＩ−ＥＧＦＰ−Ｉ構築物は、ｐα１ＴＩ−ＥＧＦＰプラスミド（Ｇｏｌｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．，  ｖｏｌ．１０．（１），  ｐ：２１−３３，  ２００１、  ＨＩＥＢＥＲ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，  ｖｏｌ．３７（３），  ｐ：４２９−４４０，１９９８）内で、ゼブラフィッシュのα１チューブリンのプロモーターとＥＧＦＰ（増強緑色蛍光タンパク質）のレポーター遺伝子との間にＩ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼの認識部位を挿入することによって得られた。
【００８８】
第一段階では、ｐα１ＴＩ−ＥＧＦＰ構築物をＢａｍＨＩ酵素（ＢＩＯＬＡＢＳ）によって消化し、そしてこの消化した構築物を精製した。ＢａｍＨＩによって消化されたＰα１ＴＩ−ＥＧＦＰ構築物を、次に脱リン酸化し、次いで再度精製した。最終的には、ライゲーション反応を、ＢａｍＨＩ消化し脱リン酸化したｐα１ＴＩ−ＥＧＦＰ構築物と、Ｉ−ＳｃｅＩ部位（太字部分）および遊離型の付着末端を含む二本鎖オリゴヌクレオチドとの間で実施し、前記付着末端は、消化されたＢａｍＨＩ部位に適合するものである（センスオリゴヌクレオチド（配列番号１）：５’−ＧＡＴＣＡＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴＡ−３’、アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号２）：  ５’−ＧＡＴＣＴＡＴＴＡＣＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＣＴＡＴ−３’）。α１チューブリンのプロモーター配列とＥＧＦＰのオープンリーディングフレームのプロモーター配列との間の、ＢａｍＨＩ部位におけるＩ−ＳｃｅＩの認識部位の挿入及び方向付け、ならびにリーディングフレームの保存は、シーケンシングにより確認する。
【００８９】
２）ｐａｃｔ−ＧＦＰＩ２構築物
【００９０】
ｐａｃｔ−ＧＦＰＩ２構築物は、ＴＨＥＲＭＥＳ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  ｖｏｌ．１１８，  ｐ：９１−９８，  ２００２）に記載されているようにして得た。ゼブラフィッシュのαアクチンのプロモーターの上流、ならびにＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）のレポーター遺伝子の下流のそれぞれにおける、Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼの二つの機能的な認識部位の挿入と方向付けは、シーケンシングにより確認する。
【００９１】
３）ｐα１ＴＩ−ＥＧＦＰ−Ｉ構築物およびｐａｃｔ−ＧＦＰＩ２構築物の線状化
【００９２】
線状化した形態のα１ＴＩ−ＥＧＦＰ−Ｉ導入遺伝子を、ＸｈｏＩおよびＡｆｌＩＩ（ＢＩＯＬＡＢＳ社）酵素によるｐα１ＴＩ−ＥＧＦＰ−Ｉ構築物の消化によって得た。次いで、導入遺伝子を含むＸｈｏＩ−ＡｆｌＩＩ断片をＱＩＡＥＸ  ＩＩ（登録商標）カラム（ＱＩＡＧＥＮ社）で精製した後、Ｅｌｕｔｉｐ−Ｄ（登録商標）カラム（ＳＣＨＬＥＩＣＨＥＲ  ＡＮＤ  ＳＣＨＵＥＬＬ社）で濾過した。
【００９３】
線状化した形態のａｃｔ−ＧＦＰＩ２導入遺伝子を、Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ（ＲＯＣＨＥ  ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ社）によるａｃｔ−ＧＦＰＩ２構築物の消化によって得た。導入遺伝子を含むＩ−ｓｃｅＩ−Ｉ−ＳｃｅＩ断片を、次いで前述のように精製した。
【００９４】
４）導入遺伝子およびＩ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼのマイクロインジェクション
【００９５】
様々なＤＮＡを、Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼの存在下または不存在下で、Ｔｈｅｒｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２、既出）に記載された手順に従って一細胞期のメダカの卵細胞内に注入した。
【００９６】
実施した実験において、α１ＴＩ−ＥＧＦＰ−Ｉ導入遺伝子は、線状の形態（ＸｈｏＩ−ＡｆｌＩＩ断片）で、また、ａｃｔ−ＧＦＰＩ２導入遺伝子は線状の形態（ＩｓｃｅＩ−Ｉ−ＳｃｅＩ断片）または環状の形態（ａｃｔ−ＧＦＰＩ２）で注入した。
【００９７】
５）卵細胞（Ｆ０）での導入遺伝子の発現
【００９８】
マイクロインジェクションした卵細胞における導入遺伝子の発現を調べるために、ＵＶランプ（３７０〜４２０ｎｍでの励起）および４５５ｎｍのエミッションフィルターを備えたＬＥＩＣＡ社ＭＺＦＬＩＩＩ顕微鏡の下で、ＧＦＰについて胚の蛍光を観察した。
【００９９】
環状の形態のｐα１ＴＩ−ＥＧＦＰプラスミドのみを一細胞期の卵細胞内にマイクロインジェクションした予備実験では、ＧＦＰの蛍光は、神経発生の間と孵化まで（受精後９日、Ｓｔ．３９）は、ＳＮＣ内で検出可能であるという結果が示された。より詳細には、ｐα１ＴＩ−ＥＧＦＰ構築物の一過性発現に関するこれらの実験は、ゼブラフィッシュのα１チューブリンのプロモーターが、メダカの中枢神経系で、主に増殖中の細胞において活性化されていることを明らかにした。構築物の詳細な活性は、ＧＯＬＤＭＡＮ  ｅｔ  ａｌ．（２００１、既出）でゼブラフィッシュについて記載されているものと同様であるように思われる。
【０１００】
α１ＴＩ−ＥＧＦＰ−Ｉ導入遺伝子についての結果は、卵細胞におけるｐα１ＴＩ−ＥＧＦＰ構築物と同様の発現特性を示した。ａｃｔ−ＧＦＰＩ２導入遺伝子の発現特性に関しては、ＴＨＥＲＭＥＳ  ｅｔ  ａｌ．（２００２、既出）で見られたものと同様である。
【０１０１】
マイクロインジェクションの様々な実験における導入遺伝子を発現する胚の割合を以下の表１に示す。
【０１０２】
【表１】
2008523796.tif 000002
【０１０３】
メガヌクレアーゼの不存在下では、マイクロインジェクション後に生存する胚の５０％近くは蛍光を示さないことが観察される。これに反し、メガヌクレアーゼの存在下で様々な導入遺伝子をマイクロインジェクションすると、ＧＦＰを発現する胚の割合の著しい増加が観察される。つまり、これらの結果は、Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼの存在下においては、α１ＴＩ−ＥＧＦＰ−Ｉ導入遺伝子を発現しない胚の割合は、ａｃｔ−ＧＦＰＩ２導入遺伝子で得られるもの（１６％）より少なく、注入を施した胚全体のおよそ１０％（１２％、ｎ＝１１６）であったことを示している。導入遺伝子のＦ０世代での一過性発現は従って、メガヌクレアーゼの同時注入によって大きく改善される。
【０１０４】
６）子孫への導入遺伝子の伝達
【０１０５】
導入遺伝子を発現するＦ０世代の魚を初代候補として選択した。これらの魚は性成熟するまで飼育し、その後、野生型の個体と交配させた。子孫（Ｆ１）の胚を、これらの導入遺伝子の発現について分析した。結果を下記の表２に示す。
【０１０６】
【表２】
2008523796.tif 000003
【０１０７】
結果は、コントロール注入（Ｉ−ＳｃｅＩとの同時注入無し）の場合に、試験対象の大多数の魚がＧＦＰを発現しなかったことを示している。このことは、Ｆ０の生殖細胞系には導入遺伝子が存在しないことを意味する。
【０１０８】
二つのＩ−ＳｃｅＩ認識部位に挟まれているａｃｔ−ＧＦＰＩ２導入遺伝子の場合には、３０％近くの個体がこれらのゲノム内に導入遺伝子を安定的に組み込んだことが観察された。提示されたメカニズムは、メガヌクレアーゼがその「二つ」の認識部位に挟まれた導入遺伝子をゲノム内に組み込むことを可能にする、ＴＨＥＲＭＥＳ  ｅｔ  ａｌ．（２００２、既出）に記載されているメカニズムに該当する。提案されるモデルによれば、導入遺伝子はメガヌクレアーゼにより切除され、該メガヌクレアーゼは遊離型の末端を保護し、そしてゲノムへの切除された導入遺伝子のランダムな組み込みを可能にする。
【０１０９】
驚くべきことに、α１ＴＩ−ＥＧＦＰ−Ｉ導入遺伝子とＩ−ＳｃｅＩを同時注入し伝達について試験した１９の胚の中で、４つ（すなわち、２１％、ｎ＝１９）がＧＦＰを発現する子孫を生じさせたことが観察された。従って、末端のすぐそばに位置していない、メガヌクレアーゼの一つの認識部位の存在もまた、高い頻度でのゲノム内への導入遺伝子の安定的な組み込みを可能にすることから、ＴＨＥＲＭＥＳ  ｅｔ  ａｌ．（２００２、既出）で提案されるモデルは、メガヌクレアーゼの存在下での導入遺伝子の挿入メカニズムを考慮に入れていないように思われる。
【０１１０】
α１ＴＩ−ＥＧＦＰ−Ｉ導入遺伝子の組み込みにより得られた４つの初代個体は、Ｆ０．１９Ｉ、Ｆ０．２５Ｉ、Ｆ０．３４ＩおよびＦ０．３６Ｉと命名した。これらの初代から生ずるＦ１個体群はＳＮＣにおいて均一な緑色蛍光を示し、従って、早期神経胚期（２５ｈｐｆ、Ｓｔ．１７）における神経発生の観察が当初から可能であった。初代Ｆ０．２５Ｉの場合には、該初代から生ずるＦ１個体群は複数のＧＦＰ発現レベルを示した。増加する蛍光の程度により、ＧＦＰを弱く、中程度に、または強く示す個体群の区別が可能であった（それぞれＦ０．２５−１、Ｆ０．２５−２、Ｆ０．２５−３と命名）。このようなＦ１におけるばらつきは、遺伝子学的に区別される三つの組み込み部位でＦ０のゲノムに組み込まれた導入遺伝子の様々なコンカテマーの分離によって起こりうる。これらの胚（Ｆ１）は孵化まで飼育し、弱くそして中程度の蛍光の胚だけが孵化し、性成熟した魚が誕生した。導入遺伝子の次世代（すなわち、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４）への伝達は一定のままであり、このことは導入遺伝子が安定的に組み込まれたことを立証するものである。
【０１１１】
初代個体の平均伝達率は、発現を示すＦ１個体の子孫における導入遺伝子の発現を調べることで評価した。得られた率は大きなばらつきがあるものであり、５０％未満であった。α１ＴＩ−ＥＧＦＰ−Ｉ導入遺伝子の場合、平均値は３０±１２．５％であった。そして、四つの初代魚のうちの一つ（Ｆ０．１９Ｉ）のみが、有意に５０％の伝達率に達しており、この伝達率はヘミ接合の伝達の割合に対応する。この場合、導入遺伝子が、Ｆ０に、一つの部位でそして全ての生殖系細胞において組み込まれた可能性がある。つまり、結果は、二つまたは一つのＩ−ＳｃｅＩ部位の存在下での生殖系における導入遺伝子の組み込みの有効性についての明らかな改善を示している。
【０１１２】
７）ゲノムへの導入遺伝子の組み込みの分析
【０１１３】
ゲノムＤＮＡは、ＳＡＭＢＲＯＯＫ  ｅｔ  ａｌ．（ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  １９８９）に記載されている手順に従ってプロテイナーゼＫならびにフェノールを用いて、成体のトランスジェニック魚Ｆ１から抽出した。
【０１１４】
７−Ａ．  α１ＴＩ−ＥＧＦＰ−Ｉ導入遺伝子
【０１１５】
α１ＴＩ−ＥＧＦＰ−Ｉ導入遺伝子でのサザンブロット法の実験のために、ゲノムＤＮＡをＳａｃＩまたはＮｏｔＩによって消化し、０．８％アガロースゲル（１×ＴＡＥ）上で分離し、そしてニトロセルロース膜上に毛管現象によって移し、それを放射性ヌクレオチド（３２Ｐ）でランダムに標識されている特異的プローブによってハイブリダイズした。このプローブはＥＧＦＰ配列に対応する。導入遺伝子のハイブリダイゼーションは、銀フィルムに数時間晒した後に、ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒによって可視化した。結果を図１に示した。
【０１１６】
Ｆ０．１９系統については、ＳａｃＩ（プローブに認識される領域の外部に存在する部位）による消化により、４ｋｂに近いサイズの二つの強いバンドならびに小さなサイズの複数のバンド（２ｋｂおよび約３ｋｂ）の存在が明らかになった。約４ｋｂの二本のバンドは恐らく、それぞれタイプＩの順方向の直列ならびに逆方向の直列の導入遺伝子の挿入に対応する（それぞれ図２Ａおよび図２Ｂ）。小さなサイズのバンド（２ｋｂおよび約３ｋｂ）については、これらは恐らく、組み込んだＤＮＡとゲノムＤＮＡとの間の結合部位の断片に対応する。結合部位の断片と比べて４ｋｂの二本のバンドが強いことは、ゲノム内に同程度の割合でこれら二つの直列のタイプが多く存在することを示す。
【０１１７】
Ｆ０．２５−１系統およびＦ０．２５−２については、結果は４ｋｂの二本の特徴的なバンドのうちの一方だけの存在を示している（図１、矢印）。Ｆ０．１９の特性との比較により、これは恐らくタイプＩの逆方向の直列のコンカテマーの形態（図２Ｂ）に関するものであることが示された。これらバンドの強度が弱いことは、これらの系統における導入遺伝子のコピー数が少ないことを示唆している。これらの三系統について、ＡｇｅＩ（プローブに認識される領域の外部、データは示されていない）およびＢａｍＨＩ（導入遺伝子内の部位ではない、データは示されていない）による消化により、これらの結果を確認した。
【０１１８】
ＮｏｔＩによる消化を用いることにより、タイプＩＩの逆方向の直列の形態（図２Ｃ）の存在について系統を分析することが可能となる。結果は、Ｆ０．１９系統のみがこのような組み込みを示すということを示している（図１、星印）。
【０１１９】
Ｆ０．３６系統のゲノムＤＮＡの分析により、Ｆ０．１９系統のＤＮＡの消化特性と同等の消化特性が明らかになった（データは示されていない）。
【０１２０】
結果として、二つのＦ０．２５系統が、単純なコンカテマーでコピー数が少ない組み込み特性を示した（タイプＩの逆方向の直列）。
【０１２１】
７−Ｂ．  ａｃｔ−ＧＦＰＩ２導入遺伝子
【０１２２】
この導入遺伝子を用いることによって得られたトランスジェニック系統の分析は、ＴＨＥＲＭＥＳ  ｅｔ  ａｌ．（２００２、既出）に記載されている。
【０１２３】
結果はそこでさらに、試験対象の様々な系統のゲノムＤＮＡに少数の導入遺伝子のコピー（１〜８コピー）が存在するという組み込み特性を示した。
【０１２４】
結論として、Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼと、その一つまたは二つの認識部位を有する構築物とを用いることにより、分析対象の系統の大部分において、単一のコピーまたは少数のコピーの形態でゲノム内に安定的に組み込まれたレポーター遺伝子を得ることが可能になる。従って、これらの二種のランダムな組み込みの技術は、ゲノム内への多数の挿入が見られる遺伝子組換えで日常的に用いられている技術（ＨＡＣＫＥＴＴ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｆｉｓｈｅｓ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ｐ：２０７−２４０，１９９３、ＩＹＥＮＧＡＲ  ｅｔ  ａｌ，  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．，  ｖｏｌ．５，  ｐ：１４７−１６６，１９９６）に関して最良の技術を構成する。
【０１２５】
８）組み込んだＩ−ＳｃｅＩ部位の組み込み性
【０１２６】
Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼを用いて相同組換えを実施するため、そして特に目的の遺伝子の標的化された組み込みを可能にするために得られたトランスジェニック系統を用いることを考える場合、ゲノム内に組み込まれた一つまたは複数のＩ−ＳｃｅＩ部位が機能的であることが重要である。
【０１２７】
Ｆ０．２５−１、Ｆ０．２５−２、Ｆ０．１９およびＦ０．３６系統のゲノムに組み込まれたＩ−ＳｃｅＩ部位の組み込み性をインビトロで試験するために、これらの系統のゲノムＤＮＡを精製した。前記ゲノムＤＮＡを次に、Ｉ−ＳｃｅＩの認識部位の両側に位置する特別なプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した（図３Ａ）。増幅されたＤＮＡ断片は、５００塩基対の長さを有する。得られたＰＣＲ産物は、次に、メーカーの指示に従ってＩ−ＳｃｅＩ酵素（ＲＯＣＨＥ  ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ社）によって消化し、最終的に電気泳動ゲル上に乗せた。結果は図３Ｂに示した。
【０１２８】
反応生成物のゲル上の移動により、切断されていないＤＮＡに対応する約５００ｂｐのバンド、そして２００ｂｐ未満および３００ｂｐ未満のサイズの二本の他のバンドの存在が明らかになった（切断されたＤＮＡ、図３Ａおよび３Ｂ）。５００ｂｐのバンドの存在は、酵素による不完全な消化または変異したＩ−ＳｃｅＩ部位の存在の結果である。いずれの場合も、結果は、分析した４系統が、分析した系統に応じて異なる数の、変異していない機能的なＩ−ＳｃｅＩ部位を有していることを示している。
【実施例２】
【０１２９】
Ｉ−ＳｃｅＩ部位を有するトランスジェニックメダカ系統のゲノム内への導入遺伝子の標的挿入
【０１３０】
１）修復構築物（ＲＣ）
【０１３１】
標的化した方法で導入遺伝子をメダカゲノム内に組み込むことを目的として、ギャップの修復技術を試験した。このために、α１ＴＩ−ＥＧＦＰ−Ｉ導入遺伝子のＩ−ＳｃｅＩ部位に挟まれた領域と完全に相同な少なくとも５００ｂｐの配列によって両側を挟まれたｍＲＦＰ１（単量体赤色蛍光タンパク質）のトレーサー遺伝子を含む、第二の導入遺伝子を用いた（ＲＣ、修復構築物）。５’の相同領域はα１ＴＩプロモーターのイントロン配列に相当し、これにより、こうしてエピソームの形態のｍＲＦＰ１の発現についてのすべての可能性が避けられる。
【０１３２】
この構築物を得るために、Ｉ−ＳｃｅＩ部位の両側に位置する相同領域に対応する、ｐ１ＴＩ−ＥＧＦＰプラスミドのＳａｃＩ−ＮｏｔＩ断片（１．７ｋｂ）を精製し、ＳａｃＩ−ＮｏｔＩ消化によって線状化したｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内でクローニングした。得られたＲＨプラスミドは、シーケンシングによって確認した。
【０１３３】
平行して、ｍＲＦＰ１のＯＲＦに対応するｍＲＦＰ１−ｐＲＳＥＴＢプラスミドのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ｖｏｌ．９９（１２），  ｐ：７８７７−８２，  ２００２）を、ｐ１ＴＩ−ＥＧＦＰプラスミド内のＢａｍＨＩ部位とＮｏｔＩ部位の間で、ＥＧＦＰに代えてクローニングした。得られた構築物は、各末端にＢｇｌＩＩ部位を加えることで、ＰＣＲによってｍＲＦＰ１−ＰｏｌｙＡ配列を増幅するための鋳型として用いた（センスプライマー（配列番号３）：５’−ＧＡＡＧＡＴＣＴＣＴＴＡＡＧＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＧＡＣ−３’、アンチセンスプライマー（配列番号４）：５’−ＣＣＴＡＧＡＴＣＴＧＣＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＣ−３’）。得られたＰＣＲ産物はｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）内でクローニングし、配列はシーケンシングにより確認した。次いでｍＲＦＰ１−ＰｏｌｙＡ断片を、この構築物でＢｇｌＩＩ消化を実施することで単離した。
【０１３４】
最後に、修復構築物（ＲＣ）を、ｍＲＦＰ１−ＰｏｌｙＡ断片（ＢｇｌＩＩ消化）をＲＨ構築物のＢａｍＨＩ部位に導入することによって生成させた。ｐα１ＴＩ−ｍＲＦＰ１−ＥＧＦＰコントロール構築物を、同じｍＲＦＰ１−ＰｏｌｙＡ断片をｐ１ＴＩ−ＥＧＦＰ構築物に導入することによって生成させた。
【０１３５】
２）Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼおよび修復構築物のマイクロインジェクション
【０１３６】
修復構築物を、環状の形態で、Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼと共に、Ｔｈｅｒｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２、既出）に記載された手順に従って一細胞期のメダカの卵細胞に同時注入した。用いた卵細胞はトランスジェニック魚系統に由来するものであった（Ｆ３；Ｆ０．２５−１およびＦ０．２５−２、０．１９ならびにＦ０．３６）。
【０１３７】
修復構築物（ＲＣ）は、１単位／μｌの濃度のＩ−ＳｃｅＩの存在下で、Ｍｉｄｉｐｒｅｐ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ社）ならびに濾過（０．２μｍのフィルター）を用いて、増幅後におよそ１０ｎｇ／μｌの最終濃度で環状の形態で注入した。
【０１３８】
一細胞期のメダカの卵細胞の注入後、卵細胞を孵化まで２８℃のインキュベーターに置いた。
【０１３９】
同時に、そしてｍＲＦＰ１の適正な発現を確認するため、ｐα１ＴＩ−ｍＲＦＰｌ−ＥＧＦＰコントロール構築物のみを、同一の手順に従って一細胞期のメダカの卵細胞に注入した。この注入の結果、緑色蛍光を全く示すことなく胚においてｍＲＦＰ１が良好に発現した。
【０１４０】
３）卵細胞（Ｆ０）におけるｍＲＦＰ１の発現
【０１４１】
マイクロインジェクションした卵細胞での導入遺伝子の発現を確認するために、ＵＶランプ（５８０〜５９０ｎｍでの励起）および６０７ｎｍのエミッションフィルターを備えたＬＥＩＣＡ社ＭＺＦＬＩＩＩ顕微鏡で、ｍＲＦＰｌについて胚の蛍光を観察した。
【０１４２】
注入した胚は、（特に）その緑色および赤色の蛍光に関して、顕微鏡によって２８期（３０体節、６４ｈｐｆ）および３２期（体節形成の完了、受精後４日）の頃に観察した。これらの実験により、Ｆ０．２５−１系統に由来するｍＲＦＰ１を発現する胚を単離することができた（ＧＦＰの弱い発現と単純なコンカテマーの形態での導入遺伝子の融合）。赤色蛍光はＳＮＣにおいてのみ検出され、弱いが均一であり、このことは、最初の割球において導入遺伝子が等しく分布していることを示唆している。（ｉ）この発現特性がｐα１ＴＩ−ｍＲＦＰｌ−ＥＧＦＰ構築物で得られる特性に対応する限りにおいて、または（ｉｉ）修復構築物が機能的なα１チューブリンのプロモーターを有さない限りにおいて、ｍＲＦＰ１遺伝子が、α１チューブリンのプロモーターの上流ならびにＦ０．２５−１系統のゲノム内に事前に組み込まれたＩ−ＳｃｅＩ部位の少なくとも一つにおいて、相同組換えによって特異的に組み込まれたと結論付けることが可能である。
【０１４３】
従って、結果は、メガヌクレアーゼの認識部位の幾つかのコピーを有するメダカの卵細胞のゲノムにおいて、メガヌクレアーゼと同時注入した導入遺伝子の（相同組換えによる）特異的な挿入を得ることが可能であることを示している。
【０１４４】
４）マイクロインジェクションの条件の変更
【０１４５】
２）で説明した条件から、手順の様々な変更を、個々に、そして組み合わせて試験した。試験した変更は下記のとおりである。
−最大５０ｎｇ／ｍｌまで修復構築物の量を増やす、
−最大２単位／μｌまでメガヌクレアーゼの量を増やす、
−注入後の卵細胞のインキュベーション温度を、２〜１６時間の間で変動する期間、最低１３℃まで下げ、その後卵細胞を２８℃に置く。
【０１４６】
-上記のようにして得られた胚においてｍＲＦＰの発現を確認した。結果は表３に示した。
【０１４７】
【表３】
2008523796.tif 000004
【０１４８】
結果は、特異的な挿入を得るための最も好ましい条件は、Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼが２単位／ｍｌでありＤＮＡが２５ｎｇ／ｍｌであるということを示している。結果はまた、マイクロインジェクションに続いて２８℃未満の温度で卵細胞をインキュベーションすることにより、標識を有する個体の割合の劇的な増加（マイクロインジェクション後１３℃で４時間のインキュベーションでほぼ３％）が可能になることを示している。
【実施例３】
【０１４９】
別のメガヌクレアーゼを用いたメダカのトランスジェニック系統のゲノム内への導入遺伝子の標的挿入
【０１５０】
はじめに、実施例１に記載した手順に従ってランダムな組み込みを実施するが、Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼおよびＩ−ＣｅｕＩヌクレアーゼ、ならびにゼブラフィッシュのα１チューブリンのプロモーターとＥＧＦＰのレポーター遺伝子の間にＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼ（配列番号５、５’−ＣＴＧＧＧＴＴＣＡＡＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＧＡＣＡＧＴＴＴＧＧ−３’）およびＩ−ＣｅｕＩヌクレアーゼ（配列番号６、５’−ＣＧＴＡＡＣＴＡＴＡＡＣＧＧＴＣＣＴＡＡＧＧＴＡＧＣＧＡＡ−３’）の認識部位をそれぞれ有する構築物を用いた。
【０１５１】
標的挿入を実施するために用いた構築物ならびに手順は実施例２に記載したものと同じであるが、Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼおよびＩ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ社）を用いた。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】α１ＴＩ−ＥＧＦＰ−Ｉ導入遺伝子でのサザンブロット法の結果を示した図。
【図２】様々なコンカテマーの形態を示した図。
【図３】Ｆ０．２５−１、Ｆ０．２５−２、Ｆ０．１９およびＦ０．３６系統のゲノムのＰＣＲを示した図。
【図１】
2008523796.tif 000005
【図２】
2008523796.tif 000006
【図３】
2008523796.tif 000007
【配列表】
2008523796000001.app
【国際調査報告】
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2008523796.tif 000009
2008523796.tif 000010
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