(57)【要約】  プロモータを操作可能なように連結した核酸、イントロン、分泌リーダー配列をコードする核酸、ヒトベータセルリン（ＢＴＣ）をコードする核酸、またはその機能的断片、およびポリアデニル化シグナル配列を含むベクターで、ＢＴＣ発現が分泌された成熟ＢＴＣを産生することを特徴とする。糖尿病を治療または予防する方法で、前記方法は、このベクターを含むウイルス粒子の有効量を投与することを含む。また、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータおよびエンハンサー領域を操作可能なように連結した核酸、β−グロビンキメライントロン、アルブミンリーダー配列をコードする核酸、ヒトベータセルリン（ＢＴＣ）をコードする核酸、またはその機能的断片、およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列を含むベクターが提供され、ＢＴＣ発現が分泌された成熟ＢＴＣを産生することを特徴とする。本発明のベクター類を含む宿主細胞が提供される。【選択図】図１Ｆ
2008529498.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモータを操作可能なように連結した核酸、イントロン、分泌リーダー配列をコードする核酸、ヒトベータセルリン（ＢＴＣ）をコードする核酸、またはその機能的断片、およびポリアデニル化シグナル配列を含むベクターであって、ＢＴＣ発現が分泌された成熟ＢＴＣを産生することを特徴とするベクター。
【請求項２】
前記ベクターがアデノウイルスベクターを含む請求項１記載のベクター。
【請求項３】
前記分泌リーダー配列をコードする核酸が、アルブミンまたは免疫グロブリンカッパチェーンリーダー配列である請求項１記載のベクター。
【請求項４】
前記分泌リーダー配列をコードする核酸が、アルブミン分泌リーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含む請求項１記載のベクター。
【請求項５】
前記ヒトＢＴＣをコードする核酸が配列番号１として示したものと実質的に同一のヌクレオチド配列を含む請求項１記載のベクター。
【請求項６】
前記ヒトＢＴＣをコードする核酸が配列番号２として示したものと実質的に同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む請求項１記載のベクター。
【請求項７】
前記アルブミン分泌リーダー配列をコードする核酸が、配列番号７として示したものと実質的に同一のヌクレオチド配列を含む請求項４記載のベクター。
【請求項８】
前記アルブミン分泌リーダー配列をコードする核酸が、配列番号１０のヌクレオチド類１−７２と実質的に同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む請求項４記載のベクター。
【請求項９】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータおよびエンハンサー領域を操作可能なように連結した核酸、β−グロビンキメライントロン、アルブミンリーダー配列をコードする核酸、ヒトベータセルリン（ＢＴＣ）をコードする核酸、またはその機能的断片、およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列を含むベクターであって、ＢＴＣ発現が分泌された成熟ＢＴＣを産生することを特徴とするベクター。
【請求項１０】
前記ベクターがアデノウイルスベクターを含む請求項９記載のベクター。
【請求項１１】
前記ヒトＢＴＣをコードする核酸が配列番号１として示したものと実質的に同一のヌクレオチド配列を含む請求項９記載のベクター。
【請求項１２】
前記ヒトＢＴＣをコードする核酸が配列番号２として示したものと実質的に同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む請求項９記載のベクター。
【請求項１３】
前記アルブミン分泌リーダー配列をコードする核酸が、配列番号７として示したものと実質的に同一のヌクレオチド配列を含む請求項９記載のベクター。
【請求項１４】
前記アルブミン分泌リーダー配列をコードする核酸が、配列番号１０のヌクレオチド類１−７２と実質的に同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む請求項９記載のベクター。
【請求項１５】
配列番号９として示したヌクレオチド配列を含む請求項９記載のベクター。
【請求項１６】
請求項１、９または１５記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１７】
糖尿病を治療または予防する方法で、前記方法は、ヒトに対して分泌された成熟ヒトベータセルリン（ＢＴＣ）またはその機能的断片を発現するベクターを有するウイルス粒子を有効量投与することを含み、ここで、前記ベクターは、プロモータを操作可能なように連結した核酸、イントロン、分泌リーダー配列をコードする核酸、ヒトベータセルリン（ＢＴＣ）をコードする核酸、またはその機能的断片、およびポリアデニル化シグナル配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
前記ベクターがアデノウイルスベクターを含む請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記分泌リーダー配列をコードする核酸が、アルブミンまたは免疫グロブリンカッパチェーンリーダー配列である請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
前記分泌リーダー配列をコードする核酸が、アルブミン分泌リーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含む請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
前記ヒトＢＴＣをコードする核酸が配列番号１として示したものと実質的に同一のヌクレオチド配列を含む請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
前記ヒトＢＴＣをコードする核酸が配列番号２として示したものと実質的に同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む請求項１７記載の方法。
【請求項２３】
前記アルブミン分泌リーダー配列をコードする核酸が、配列番号７として示したものと実質的に同一のヌクレオチド配列を含む請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
前記アルブミン分泌リーダー配列をコードする核酸が、配列番号１０のヌクレオチド類１−７２と実質的に同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
前記ベクターが薬剤学的に許容できる担体中で投与される請求項１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的に糖尿病治療のための方法類に関し、さらに詳細には、治療のためのβ細胞再生と新生に関する。
【背景技術】
【０００２】
血糖が正常に制御されているヒトでは、膵臓ホルモンインシュリンが、血糖値上昇に応答して分泌される。血糖値上昇は一般的に食事後に起こり、骨格筋のような末梢組織および脂肪に対するインシュリン作用の結果として起こる。インシュリンは、これら末梢組織の細胞を刺激し血中からグルコースを積極的に取り込み、それを貯蔵形態に変換する。この過程はグルコース消失とも称される。血糖値は、ヒトが空腹であるか、中等度であるかまたは食事摂取状態であるかに応じて、ヒトで１日中低値から正常ないし高値にまで変動する。こうした値はまた、低血糖、正常血糖および高血糖とそれぞれ称されている。糖尿病のヒトにおいては、グルコースホメオスタシスにおけるこうした変動がインシュリン分泌または作用の間違いにより制御されておらず、慢性的な高血糖状態となる。
【０００３】
糖尿病はよくある疾患で、その罹患率はおよそ４−５％である。糖尿病発症のリスクは体重増加に伴い上昇し、成人発症糖尿病患者の９０％もの多くのヒトが、肥満である。従って、肥満成人が多くなるに伴い、成人発症糖尿病の発生率が世界中で上昇している。糖尿病は３種の主要形態に分類される。２型糖尿病がひとつの形態であり、インシュリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）または成人発症糖尿病とも称されている。１型糖尿病が第二の形態であり、インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）と称されている。第三の糖尿病タイプは遺伝的であり、膵島ベータ（β）細胞機能を制御する遺伝子の変異による。糖尿病の診断はグルコース測定値に基づくが、全ての患者を正確に分類するのは必ずしも可能となっていない。２型糖尿病は成人でより多くみられ、１型糖尿病は小児および１０代の青少年で主となっている。
【０００４】
１型および２型糖尿病は、余命短縮ならびに脈管系疾患ならびに動脈硬化などの他の合併症に関連している。後期合併症予防のために糖尿病を長期にわたり管理するには、患者が１型なのか２型なのかにかかわらず、インシュリン療法が行われる。１型糖尿病は、膵β細胞を産生するインシュリンがほとんど完全に失われてしまっていることに関連している自己免疫疾患である。β細胞消失の結果、生きていくためにインシュリンに依存することになる。１型糖尿病はどの年齢でも発症し、コーカサス人種の全新生児でその約０．３−１％が生涯で本疾患を発生すると推定されている。
【０００５】
１型糖尿病治療に広く使用されている方法は２型糖尿病にもある程度使用されており、昔からインシュリン維持療法で構成されている。この療法は最も単純な場合、正常血糖値を維持するために食事後または１日中定期的に患者に対して精製したかまたは組換えインシュリンを注射することが必要となる。このような注射は、理想的には、１日に４回必要である。上記治療方法は患者に対して何らかの恩恵をもたらしはするが、しかし、このインシュリン療法という方法は、血糖値コントロールが適切でなかったり患者コンプライアンスが非常に高くなければならなかったりという問題がある。
【０００６】
１型糖尿病の別の治療方法では、インシュリンを計画通りにデリバリできるインシュリンポンプのような装具の使用が含まれる。この方法は、注射の必要性が少ないということにより上記方法よりも好適である。しかし、インシュリンポンプの使用には、３日に１回、針を交換する必要がいまだ残っているという欠点がある。インシュリン維持療法と同様、このインシュリンポンプ法はまた、血糖値変化に対応してインシュリンデリバリが制御されているわけではないので、最適グルコース制御を達成していない。こうした糖尿病治療方法は従って負担が大きく、しかも適切ではない。さらに、これらの方法はまた、平均的成人の生涯にわたって完璧に有効というわけではなく、およびまたは、本疾患予防に効果的であることが明らかになっていない。
【０００７】
生物活性インシュリンを糖尿病患者に補充するさまざまな細胞療法手法が試みられている。これらには、遺伝子療法手法、免疫療法および人工的β細胞の使用が含まれる。インシュリンまたは他のポリペプチド類発現のためのインビボ遺伝子療法には、動物モデルにおける肝臓標的ウイルス媒介形質導入が含まれている。しかし、これらの手法ではグルコース制御インシュリンデリバリを得られないし、あるいは、それらはインシュリン産生β細胞を回復させることも再生させることもなく、患者での適用が限定されている。
【０００８】
膵島β細胞の遺伝的修飾および人口的ベータ細胞の産生は、細胞療法によって糖尿病を治療するための手法である。異種移植片およびさらに同種異系細胞デリバリによりインシュリンを発現させるには、宿主免疫応答を避けるために細胞カプセル化を必要とし、細胞生存およびインシュリンデリバリ持続についての問題が明らかとなっている。膵島移植も糖尿病治療として試みられてきた。この療法を用いても、レシピエントひとり当たり成人ドナー２−５名由来の適合組織が必要となるので、その成果は限定されていることが明らかになっている。この方法はまた、移植組織が正常血糖−制御インシュリン分泌を維持して妥当な期間にわたって生きていられるということができないためも一部にはあり、うまく行かなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、インシュリン産生β細胞の生理能力を回復させるように糖尿病のヒトでグルコースホメオスタシスを制御できる簡易でより効率的な方法が必要とされている。本発明はこの必要性を満たし、また、関連した利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、プロモータを操作可能なように連結した核酸、イントロン、分泌リーダー配列をコードする核酸、ヒトベータセルリン（ＢＴＣ）をコードする核酸、またはその機能的断片、およびポリアデニル化シグナル配列を含むベクターを提供し、ＢＴＣ発現が分泌された成熟ＢＴＣを産生することを特徴とする。また、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータおよびエンハンサー領域を操作可能なように連結している核酸、β−グロブリンキメライントロン、アルブミンリーダー配列をコードする核酸、ヒトベータセルリン（ＢＴＣ）をコードする核酸、またはその機能的断片、およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列を含むベクターを提供し、ＢＴＣ発現が分泌された成熟ＢＴＣを産生することを特徴とする。本発明のベクター類を含む宿主細胞もまた、提供する。糖尿病を治療または予防する方法も、提供する。前記方法は、ヒトに対して分泌された成熟ヒトベータセルリン（ＢＴＣ）またはその断片を発現するベクターを有するウイルス粒子を有効量投与することを含み、ここで、前記ベクターは、プロモータを操作可能なように連結した核酸、イントロン、分泌リーダー配列をコードする核酸、ヒトベータセルリン（ＢＴＣ）をコードする核酸、またはその機能的断片、およびポリアデニル化シグナル配列を含むことを特徴とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、治療用ポリペプチド類のインビボ分泌のための組換えベクターおよび糖尿病を治療または予防するための方法類に関する。前記ベクターは、特に、糖尿病治療のためヒトベータセルリン（ＢＴＣ）の発現および分泌のために有用である。本発明の方法は、インシュリンを産生する膵島β細胞の再生または新生のためおよびグルコースホメオスタシスの回復のため、分泌可能なＢＴＣをコードする上記組換えベクターを糖尿病のヒトに導入することに関する。前記ベクターおよびそれを糖尿病治療に使用する利点は、細胞外環境にＢＴＣを分泌させそこで正常細胞シグナル経路を介してＢＴＣが作用できることである。このインビボ分泌の結果、患者で糖尿病の寛解が起こるかまたは糖尿病発症のリスクがあると考えられるヒトでそれを予防することができる。
【００１２】
１態様において、本発明は、ヒトベータセルリン（ＢＴＣ）を発現するアデノウイルスベクターに関する。このアデノウイルスベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ／エンハンサーおよびＢＴＣコード領域の５´のエンハンサー領域、β−グロビンキメライントロン、およびアルブミンリーダー配列を含み、ＢＴＣ分泌を促進する。ＢＴＣコード配列の３´に、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列が位置している。成熟ＢＴＣをコードするＢＴＣ〔１−８０〕ｃＤＮＡを、これらの５´および３´発現および制御領域の間に挿入した。
【００１３】
別の態様において、本発明は、アルブミンリーダー配列に融合させたヒトＢＴＣ  ｃＤＮＡを含む組換えアデノウイルスベクターの投与により糖尿病を治療することに関する。ＢＴＣの分泌発現の結果、２週以内に糖尿病の完全寛解が得られ、一方、免疫制御剤類で処置した自己免疫糖尿病ＮＯＤマウスが、１００日以上にわたり血糖正常のままであった。糖尿病寛解は、膵臓におけるβ細胞のＢＴＣ媒介再生に起因しており、ＢＴＣに対するリガンド類であるＥｒｂＢ−２レセプター類を阻害することで、それは消失した。
【００１４】
本文では、用語“糖尿病”は、糖尿病として公知の糖尿病病態を意味している。糖尿病は、インシュリンの相対的または絶対的欠損を特徴とする慢性疾患であり、その結果、グルコース不耐性が生じる。この用語には糖尿病の全てのタイプを含むものとし、例えば、Ｉ型、ＩＩ型、および遺伝的糖尿病を含む。Ｉ型糖尿病はまた、インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）とも称されており、例えば、若年発症型糖尿病も含む。Ｉ型は主に、膵β細胞の破壊による。ＩＩ型糖尿病はまた、インシュリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）としても知られており、食事後のインシュリン放出不全を部分的に特徴とする。インシュリン耐性はまた、ＩＩ型糖尿病発生につながる要因となることもできる。遺伝的糖尿病は、β細胞の機能と制御を妨害する変異による。
【００１５】
糖尿病は、約１４０ｍｇ／ｄｌを超えるかそれに等しい空腹時血糖値としてまたは約７５ｇのグルコース負荷を経口的に与えた後約２時間で評価した血漿中グルコースレベルが約２００ｍｇ／ｄｌを超えるかそれに等しいことを特徴とする。用語“糖尿病”は、また、慢性高血糖症および耐糖能不全を含む高血糖症を有するヒトを含む。高血糖症のヒトにおける血漿中グルコースレベルは、例えば、正常よりも高いグルコース濃度を含み、それは、信頼性のある診断指標により決定する。このような高血糖症のヒトは、糖尿病の顕性臨床症状を発現するリスクがあるかまたはその素因がある。
【００１６】
本文では、用語“治療する”は、糖尿病を示唆する臨床症状の改善を意味する。臨床症状改善には、治療前レベルまたは糖尿病のヒトに比べて、治療したヒトにおける例えば血糖値低下、または血中からのグルコース消失速度増加が含まれる。用語“治療する”はまた、非制御性の高血糖に困っているヒトにおける正常血糖応答の誘導を含む。正常血糖とは、臨床的に正常と確定した血糖値範囲または低血糖範囲を超えるが高血糖範囲未満を称する。したがって、正常血糖応答はグルコース取り込み刺激を称し、血漿中グルコース濃度を正常レベルに低下させる。ほとんどの成人にとって、このレベルは、血糖約６０−１０５ｍｇ／ｄＬの濃度範囲に対応し、好適には約７０−１００ｍｇ／ｄＬの間の濃度範囲に対応するが、例えば、ヒトの性別、年齢、体重、食事および全般的健康状態により個人間で変動する。糖尿病のヒトの有効な治療は、例えば、ヒトの高血糖すなわち上昇血糖値を正常なすなわち正常血糖値にまで低下させることであり、この低下はインシュリン分泌の直接的結果である。これとは別に、有効な治療は、約１４０ｍｇ／ｄＬ未満かそれに等しいレベルにまで空腹時血糖値を低下させることであろう。
【００１７】
用語“治療する”にはまた、糖尿病に関連した病理状態または慢性合併症の重篤度を低下させることも含める。上記病理状態または慢性合併症を表１に示したが、それには、例えば、筋肉疲労、ケトアシドーシス、糖尿、多尿、多渇症、糖尿病性微小血管症または小血管症、動脈硬化性脈管系疾患または大血管疾患、ニューロパシーおよび白内障を含む。
【００１８】
【表１】
2008529498.tif 000003
【００１９】
他の合併症には、例えば、感染に対して感受性が全般的に上昇することおよび創傷治癒が含まれる。用語“治療する”には、また、非治療のヒトに比べて糖尿病患者の平均余命が延長することが含まれる。他の病理的状態、慢性合併症または本疾患の表現型の発現は当業者に公知で、本疾患関連状態、合併症または発現の重篤度が低下する限りにおいて、これらを同様に糖尿病治療手段として用いることができる。
【００２０】
本文では、用語“予防する”は、糖尿病を示唆する臨床症状を妨害することを意味している。このような妨害には、例えば、糖尿病発生リスクのあるヒトにおいて糖尿病の明白な症状が現れる前または糖尿病診断の前に正常血糖値を維持することを含む。したがって、本文では、用語“予防する”には、糖尿病が発生しないようにヒトを保護するための予防的処置を含む。ヒトで糖尿病を予防することは、また、糖尿病発生を阻害するかまたは停止させることを含む。糖尿病発生の阻害または停止には、例えば、グルコースを血漿から細胞に移動できないなどの異常糖代謝の発生を阻害することまたは停止させることを含む。したがって、糖尿病の有効な予防には、肥満のヒトまたは糖尿病の家族歴のあるヒトのような糖尿病状態の素因のあるヒトで糖制御インシュリン発現によりグルコースホメオスタシスを維持することを含む。糖尿病発生の阻害または停止にはまた、例えば、糖尿病関連の１種以上の病理状態または慢性合併症の進行を阻害することまたは停止させることを含む。糖尿病関連のこのような病理状態の例を、表１に示した。
【００２１】
本文では、用語“ベータセルリン”すなわち“ＢＴＣ”は、成人の膵臓および小腸および胎児膵臓の始原管細胞で発現する表皮増殖因子ファミリーの一員を意味する。前記ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列は、例えば、Ｓａｓａｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９０：１１７３−７９（１９９３）およびＳｈｉｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１６０４−７（１９９３）によって記載されている。ベータセルリンは、インシュリン産生β膵島細胞の再生および／または新生を誘導するように機能する。ＢＴＣのヌクレオチドおよびアミノ酸配列の具体的例は、ヒトＢＴＣコード領域および推定アミノ酸配列について下記に配列番号１および２としてそれぞれ、示した。配列番号３−５は、成熟ヒト、ウシおよびマウスＢＴＣについてのアミノ酸配列をそれぞれ示し、配列番号６は、ＢＴＣのための共通アミノ酸配列を示している。ヒトＢＴＣ  ｃＤＮＡの読み取り枠（オープンリーディングフレーム）は１７８個のアミノ酸一次翻訳産物をコードし、これは、ＢＴＣ前駆体（ｐｒｏ−ＢＴＣ）に対応する。Ｐｒｏ−ＢＴＣは、分泌経路に配置するための推定シグナルペプチド（ａａ13-26）、短いプロペプチド（ａａ27-31）、成熟ＢＴＣ含有ＥＧＦモチーフ（ａａ32-111）、短い傍膜ドメイン（ａａ112-124）、親水性膜貫通ドメイン（ａａ125-138）および高疎水性アルギニン／リシン高含量領域（ａａ146-154）を含む細胞質テイルドメイン（ａａ139-178）を含むいくつかのドメインから構成されている。
【００２２】
本発明のＢＴＣポリペプチド類またはその断片類のβ細胞再生または新生活性を破壊することなく、マイナーな修飾ができること、および一次構造の部分のみが、活性を発揮するために必要であるかも知れないことがわかる。β細胞再生活性またはβ細胞新生活性が保持される限りにおいて、用語ＢＴＣおよびその機能的断片の意味の範囲内で、このような修飾を行うことができる。さらに、さまざまな分子類をＢＴＣまたはその機能的断片に融合されることができ、例えば、他のたんぱく質類、炭水化物類、脂質類または細胞毒性または細胞停止剤類も含まれる。このような修飾は、前記用語の定義に含まれる。
【００２３】
野生型ＢＴＣポリペプチドとほとんど同じβ細胞再生活性またはβ細胞新生活性を有するペプチド類のマイナー修飾には、例えば、天然アミノ酸類の保存的置換、ならびに、非天然アミノ酸類、アミノ酸アナログ類および機能的模倣体類を取り込ませる構造的改変が含まれる。たとえば、リシン（Ｌｙｓ）は、アミノ酸Ａｒｇの保存的置換体と考えられる。同様に、陽電荷ＡｒｇまたはＬｙｓアミノ酸類を同様の電荷と空間的配置を有する有機構造物類で置換した電荷置換模倣構造体類も、当業者によってＢＴＣポリペプチドまたはその機能的断片のマイナー修飾体とみなされるが、ただし、生成したＢＴＣポリペプチド模倣体が参考ＢＴＣポリペプチドとほとんど同じβ細胞再生活性またはβ細胞新生活性を示す限りにおいて、そのようにみなされる。
【００２４】
本文では、用語“機能的断片”をＢＴＣポリペプチドに言及する際に使用した時には、全長ＢＴＣに比べてほとんど同じβ細胞再生活性またはβ細胞新生活性を保持しているＢＴＣ部分を意味している。このような機能的断片類は、例えば、ＢＴＣ２４−７６と称され短くなったＮ末端のアミノ酸２３個およびＣ末端の４個のアミノ酸類を有するＢＴＣ誘導体を含むことができる。ＢＴＣ２４−７６は、分化活性が２．５倍高く分裂促進因子活性は１０分の１を示す（Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９９６６−７３（１９９４））。
【００２５】
本文では、用語“実質的に”または“実質的に同じ”をＢＴＣのヌクレオチドまたはアミノ酸配列に言及して使用する際には、このヌクレオチドまたはアミノ酸配列が、参考配列に比べて配列同一性の程度、量または度合いがかなりであることを示していることを意味している。このような配列同一性は、さらに、ＢＴＣ由来またはＢＴＣに関連しているとしてアミノ酸配列またはそれをコードするヌクレオチド配列を特性解析する際、重要でありかつ意味深いと考えられている。
【００２６】
本文では、用語“ベクター”は、非相同核酸を保有しているか、促進するかまたは発現できる組換えＤＮＡ分子を称する。アデノ関連ウイルスベクターを言及する際に用いた時、この用語は、アデノ関連ウイルスのＤＮＡの一部または全部を有しかつ非ＡＡＶ  ＤＮＡを有する組換えＤＮＡ分子を称する。非ＡＡＶ  ＤＮＡは、成長因子、酵素、構造タンパク質、抗体または抗原のようないかなる所望のポリペプチドもコードできる。コードしたポリペプチドは、全長ポリペプチドであるかまたは全長ポリペプチドの活性のまたは免疫原性の断片である。非ＡＡＶ  ＤＮＡは、プロモータ、エンハンサー等のような適切な制御要素に操作可能に連結するように、ベクター内に配置される。
【００２７】
本文では、用語“アデノウイルスベクター”は、宿主染色体中に安定に組み込まれる能力を特徴とするパルボウイルス群のメンバーを称する。アデノウイルスベクター類は当該技術で周知であり、例えば、Ｗｉｖｅｌら、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ．第５章（ｐ．８７−１１０）およびＦｒｉｅｄｍａｎｎ  Ｔ．，  Ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、ＵＳＡ．７２９ページ（１９９９）に記載されていることがわかる。組換えインビボデリバリおよび発現ベクター類のこのファミリーは、広範囲の宿主細胞および組織に感染でき容易に取り扱いでき所望の機能を達成させることができる。本発明のアデノウイルスベクターおよび本発明の治療領域で有用なアデノウイルスベクターの具体的例は、さらに実施例Ｉに記載されている。
【００２８】
アデノウイルスベクター類の他の具体的例には、例えば、ヘルパー依存性アデノウイルスベクター類およびアデノ関連ウイルスが含まれる。ヘルパー依存性アデノベクター類（無気力なアデノウイルスベクター類）は、全てのウイルス遺伝子類の欠損を惹起した。これらのアデノウイルスベクター類はシス作用要素類のみを含み、これらは、左右反転末端繰り返し配列類ならびにベクターゲノムのカプセル化に必要なパッケージング領域を包含する。このようなヘルパー依存性アデノベクター類は、アデノウイルスゲノムの約６００ｂｐを保持している。残りの介在部分は、非コードスタッファーＤＮＡで満たされている。ウイルスＤＮＡの消失により、ヘルパー依存性アデノウイルス骨格からの発現のために、ウイルス遺伝子類が確実に存在しないようにする。アデノ関連ウイルスベクター類は、高度の安全性を提供するという利点を有し、その理由は、親アデノ関連ウイルスゲノムの９６％が欠失しているからである。アデノ関連ベクター類はいかなるウイルス遺伝子類も欠失しており、代わりに問題の組換え遺伝子を含んでいる。
【００２９】
本文では、用語“操作可能なように連結している”またはそれと文法的に同等のものは、各成分の必須機能をその標的核酸上で実行できるようにする周知の遺伝的および細胞原理に従って、ベクター成分が結合していることを意味している。したがって、ベクター中に組み込まれている核酸成分類が操作可能なように連結したグループは、ベクター中で連結して、参考コード領域配列の転写、翻訳および制御を起こす。例えば、操作可能なように連結していると、コード領域配列はフレームで融合し、構成部分からの所望の全長ポリペプチドの翻訳を確実にする。
【００３０】
本文では、用語“発現する”とは、細胞による核酸の転写と翻訳を意味している。発現は、例えば、構造上であるかまたは誘導可能プロモータまたは組織または細胞特異的プロモータによる制御のように制御されている。このような核酸配列類はまた、同時に発現されるか、または、他の所望の核酸類とは独立して発現させることができる。これらのタイプのさまざまな同時発現組み合わせをさらに、発現されるアミノ酸またはヌクレオチド配列の数と機能に応じて、使用することができる。当業者は、どのタイプの同時発現を用いて特定の目的を達成しまたは所望の必要性を達成できるかがわかるしそれを決定することができる。ＣＭＶを用いた構造的発現の具体的例を、下記の実施例Ｉで述べた。
【００３１】
本文では、用語“分泌”または“分泌された”は、細胞外空間への遺伝子産物発現を意味している。分泌されたポリペプチド類は、プロポリペプチドを細胞膜貫通に向かわせるリーダー配列またはシグナル配列を用いる。真核細胞では、例えば、リーダー配列は、ざらざらしたリポゾーム付着小胞体中で切断除去され、成熟ポリペプチドを産生し、この成熟ポリペプチドは、小胞により細胞表面に送り込まれる。成熟ポリペプチドの発現と分泌を行うようにコード領域に操作可能なように連結されたリーダー配列を含むキメラ遺伝子構築体の構造は、当該技術で周知である。
【００３２】
本文では、用語“宿主細胞”は、本発明のベクターにより形質転換または形質導入される細胞を称する。この用語は、また、そのゲノムとして本発明のベクターを含むウイルス粒子が感染可能な細胞を称する。
【００３３】
本文では、用語“有効量”は、分泌された成熟ヒトベータセルリン（ＢＴＣ）またはその機能的断片を発現するベクターを有するウイルス粒子の投与に言及して使用した場合、投与したウイルス粒子の数が十分で標的組織に感染し、糖尿病のひとつ以上の症状を低下させるレベルにウイルス粒子ゲノムから発現した治療用遺伝子産物を分泌させることを意味している。たとえば、有効量のＢＴＣ分泌ウイルス粒子は、血糖値レベル低下を起こすかまたはグルコースホメオスタシスを結果としてもたらすかまたはその両者をもたらす粒子の数で構成されている。さらに、糖尿病の臨床的発現を上記表１に示したようにウイルス粒子有効量の測定値として使用することもできる。同様に、有効量のウイルス粒子とは、また、投与可能でＢＴＣ分泌をヒトの生物学的または生化学的成分細胞または組織に所望の効果をもたらすために十分なレベルとすることができるウイルス粒子数を意味する。たとえば、有効量のＢＴＣ分泌ウイルス粒子はまた、膵β細胞再生、β島細胞新生、またはβ島細胞再生と新生の両者を起こすような粒子数で構成することができる。ヒト様ウイルス粒子有効量は、例えば、当業者に周知のものと本文に述べた教示および手引きをもとに、信頼できる糖尿病動物モデルから外挿することもできる。マウス動物モデル用ウイルス粒子有効量は、約１×１０8−１×１０14、好適には約１×１０9−８×１０11、さらに好適には約１×１０10−１×１０11の間を含む。特に有用な有効量は、ウイルス粒子約４×１０11である。他に有用な有効量としては、特にヘルパー依存性アデノウイルスベクター類またはアデノ関連ウイルスを用いる際には、例えば、約１×１０12−１×１０14の間が挙げられる。アデノ関連ウイルスの特に有用な有効量は、約２．１×１０12−７．０×１０13ベクターゲノム単位の間にある。
【００３４】
本文では、用語“薬剤学的に許容できる担体”は、ヒト投与に適した溶液または媒体を意味している。このような溶液類または媒体は、化合物類およびポリペプチド類の安定性と細胞の生存性を維持するように作用できる。薬剤学的に許容できる担体は、当該技術で周知であるリン酸緩衝生理食塩水または媒体のような水溶液類を含む。また、薬剤学的に許容できる担体は、インビボ宿主細胞または組織をウイルス粒子が標的化するか、それに付加またはそれに感染する能力を高めまたは上昇させおよび／または徐放性デリバリまたは免疫防御目的のために作用する他の官能基類、化合物類および／または処方類を含む。このような官能基類、化合物類および／または処方類には当該技術で周知の、例えば、レセプターリガンド類、細胞外マトリックス分子類またはその成分類および化学デリバリ処方類が含まれる。
【００３５】
単離分子類、宿主細胞またはそれらの集団類とは、天然に通常見られるような夾雑物または物質類を実質的に含まない分子類、宿主細胞類または集団を称する。集団とは、２種以上の分子類または宿主細胞類のグループを称する。集団を構成する細胞は、同一系統または異なる系統であってよく、均質または非均質細胞グループであることができる。
【００３６】
本発明は、プロモータを操作可能なように連結した核酸、イントロン、分泌リーダー配列をコードする核酸、ヒトベータセルリン（ＢＴＣ）をコードする核酸、またはその機能的断片、およびポリアデニル化シグナル配列を含むベクターを提供し、ＢＴＣ発現が、分泌された成熟ＢＴＣを産生することを特徴とする。
【００３７】
本発明は、分泌リーダー配列とともにベータセルリンをコードする核酸類を用いて、プロポリペプチドすなわちプロベータセルリン（ｐｒｏ−ＢＴＣ）を産生させるが、それは、分泌経路を介した発現により切断されて生体活性ＢＴＣとなる。ＢＴＣ類をヒト治療目的に使用する場合、コードする核酸は、好適にはヒト由来である。同様に、このような治療用途では、分泌リーダー配列はまた、好適にはヒト起源に由来している。発現されおよび／または分泌されたプロポリペプチド類を含むポリペプチド類のためのコード核酸類を使用すると、生体外ポリペプチドが望ましくない免疫応答を惹起する可能性が低減される。しかし、当業者は、ＢＴＣおよび分泌リーダー配列の他の全ての起源も、非ヒト起源も含めて、本発明のベクターに利用でき、本発明の治療方法に使用でき、特にヒト配列との配列同一性の差が小さい場合、使用できることを理解するであろう。
【００３８】
例示的ＢＴＣコード核酸は、ヒトＢＴＣ用に配列番号１で示したヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有することができる。同様に、例示的ＢＴＣコード核酸は、ヒトＢＴＣ用に配列番号２で示したアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列をコードすることができる。同様に、例示的ＢＴＣコード核酸は、配列番号３−６で示したアミノ酸配列のいずれかをコードするヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチド配列をコードすることができる。保存的置換のようなマイナー修飾または配列番号２−６をコードするヌクレオチド配列に比較して種起源による差もまた、本発明のベクターで用いることができるが、ただし、コードされたＢＴＣ遺伝子産物が、そのβ島再生または新生活性の一部または全部を保持する限りにおいてである。
【００３９】
本発明のコード核酸類は、分泌リーダー配列に操作可能に連結したＢＴＣまたはその機能的断片のコード領域に対応する配列類を含む。操作可能な連結は、シスで起こりかつインビボ切断の結果生体活性ＢＴＣ産生を結果としてもたらすように起こる。連結は、例えばコードするリーダー配列のＢＴＣのコード領域への直接融合によって、または切断され成熟ポリペプチドとなった後もＢＴＣ活性が認識できるほど低下しない限りリンカー領域を含むことによって、起こすことができる。したがって、シグナルペプチド切断シグナルは、選択したリーダー配列から、またはリーダー配列の分泌、切断および活性ＢＴＣ産生に対応する全活性が起こる限りにおいて非相同リーダー配列から、誘導することができる。ＢＴＣをコードするこのような核酸配列類および分泌リーダー配列は、下記に示したような他の所望の発現および制御要素類と操作可能に連結した本発明のベクター中に含まれる。
【００４０】
分泌リーダー配列は、分泌される基本的にいかなる所望の真核生物ポリペプチドからも入手できる。ヒトを含む多数のゲノム類のクローニングおよび配列決定により、使用できる真核生物リーダー配列類にはさまざまな種類がある。本発明のベクターで使用できる例示的リーダー配列類をコードする核酸類は、例えば、配列ATG AAG TGG GTA ACC TTT ATT TCC CTT CTT TTT CTC TTT AGC TCG GCT TAT TCC AGG GGT GTG TTT CGT CGA GAT（配列番号７）を有するアルブミンリーダーおよび配列ATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG CTG CTC TGG GTT CCA GGT TCC ACT GGT GAC（配列番号８）を有するイムノグロブリンカッパ（Ｉｇκ）−チェーンリーダーを含む。本発明のベクターで使用できる特に有用な分泌リーダー配列は、上記に述べかつ実施例で例示したアルブミンリーダー配列である。
【００４１】
さまざまな発現および制御要素類のいずれも、本発明のベクターで使用でき、上記に述べたベクター中にコードされた成熟ＢＴＣを分泌させる。このような要素類は、コードされたプロＢＴＣポリペプチドの転写のためのプロモータ配列を少なくとも含む。他の発現要素類には、例えば、エンハンサー類、サイレンサー類、組織特異的転写制御要素類、イントロン類、ポリアデニル化シグナル類、転写終始シグナル類、および翻訳開始部位類を含む。強力な連続的発現が望ましい場合、１種以上のエンハンサー類と組み合わせて構造的または誘導可能プロモータ類を使用するのが、特に有用な組み合わせである。同様に、発現、安定性または転写、翻訳またはトラフィッキング効率を増強する他の発現および／または制御要素類もまた使用でき、本発明の成熟ＢＴＣポリペプチドの発現および分泌レベルを好都合に増強する。このような他の発現および／または制御要素類は、イントロンまたはポリアデニル化シグナルのような真核生物遺伝子中で通常コードされていると見られる構造を含ませることから、発現が起こるであろう標的種においてヌクレオチド配列がコドン用法により適合するようにこのヌクレオチド配列を修飾することまでの範囲にわたる。たとえば、霊長類のような非ヒトＢＴＣコード領域を修飾して、実質的にアミノ酸配列を改変することなく前記ヌクレオチド配列中にいくつかまたは多くのヒトコドン類を取り込ませることができる。これとは別に、非ヒトＢＴＣコード領域をヒト化して、ヌクレオチドレベルでは異なるのに実質的に同一のヒトアミノ酸配列をコードさせることができる。下記でさらに詳細に述べるように、発現および／または制御要素類のさまざまな他の組み合わせおよび交換を本発明のベクター中で用いて、成熟ＢＴＣポリペプチドの分泌を行わせることができる。
【００４２】
たとえば、適切な発現および／または制御要素類が当業者に周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）およびＡｎｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ（１９９９）に例示されている。このような発現および／または制御要素類には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ＳＶ４０アーリプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）ステロイド誘発可能プロモータ、マロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモータ等が含まれる。操作可能なように連結された核酸の組織特異的なまたは誘導可能な発現を起こす発現および／制御要素類もまた、使用できる。このような誘導可能なシステムには、例えば、テトラサイクリン誘導可能システム（Ｇｏｓｓｅｎ＆Ｂｉｚａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７−５５５１（１９９２）；Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：１７６６−１７６９（１９９５）；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ））；重金属で誘導可能なメタロチオネインプロモータ；エクダイソンまたはムリステロンのような関連ステロイド類に応答する昆虫ステロイドホルモン（Ｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：３３４６−３３５１（１９９６）；Ｙａｏら、Ｎａｔｕｒｅ，３６６：４７６−４７９（１９９３）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）；グルココルチコイドおよびエストロゲンによって誘導可能なマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）（Ｌｅｅら、Ｎａｔｕｒｅ，２９４：２２８−２３２（１９８１）；および温度変化により誘導可能なヒートショックプロモータ類が含まれる。
【００４３】
強力な構造的インビボ発現に特に有用なプロモータはＣＭＶプロモータであり、下記の実施例Ｉでさらに例示される。他の特に有用な要素類には、ＣＭＶプロモータとエンハンサー要素、ベータグロビンイントロン類およびポリアデニル化シグナル配列の操作可能な組み合わせが含まれる。ベータグロビンイントロン以外で本発明のベクターに含ませることができるイントロンには、例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原が挙げられる。本発明のベクターに含ませることができるＳＶ４０ポリアデニル化シグナル以外のポリアデニル化シグナルには、例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡシグナルおよびβ−グロビンポリＡシグナルが含まれる。このような要素類の全てが市販されており、それらの用途は当該技術で周知である。当業者は、特定宿主細胞における発現に適したプロモータを認識しているかまたは容易に決定できるであろう。
【００４４】
本発明のベクターは、さまざまな周知の起源から誘導できるかまたは当該技術で周知のさまざまな方法によって産生できる。治療法における用途について、下記で述べるように、コードする核酸と操作可能に連結させたリーダー配列および操作可能に連結させた発現および／制御要素類から成熟ＢＴＣを発現および分泌させるため、前記ベクターを宿主細胞または組織に導入する。広範囲のさまざまなベクター類をこの目的のために使用でき、標的化遺伝子デリバリによって運搬される発現ベクター類ならびに投与後宿主細胞感染のためのウイルス粒子を産生させるために使用できるウイルスベクター類を含む。ウイルスベクター類は、特にインビボ遺伝子デリバリに有用で、その理由として、宿主細胞特異性、発現および複製機構が、例えば所望の細胞タイプまたは組織における効率的導入と強力な発現を達成するために、有利に利用できるからである。ＤＮＡウイルスに基づくベクター類およびレトロウイルスに基づくベクター類の両者ともに、プロモータ、イントロン、分泌リーダー配列をコードする核酸、ヒトベータセルリン（ＢＴＣ）をコードする核酸またはその断片、ポリアデニル化シグナル配列の操作可能な連結のために本発明のベクターとして使用でき、成熟ＢＴＣの発現と分泌を達成する。
【００４５】
本発明は、アデノウイルスに基づくベクターとして例示される。アデノウイルス成分は、例えばＡｄ５ゲノムからまたは他のいかなるアデノウイルスに基づく当該技術で周知のベクター類からも、誘導できる。本発明のベクターの骨格成分として使用できる別のアデノウイルスに基づくベクターは、ヘルパー依存性すなわち“無気力な”アデノウイルスベクター類（ＨＤＡｄ）である。このＨＤＡｄアデノウイルスに基づくベクター類は、ウイルスゲノムのほとんどを欠損しており、シス作用性要素類のみを含んでいる（Ｋｏｃｈａｎｅｋら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．３：４５４−４６３（２００１））。治療用遺伝子産物のインビボデリバリのためのその用途は、トランスジーンの発現長期化と無視可能な毒性を示した（Ｓｃｈｉｅｄｎｅｒら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１８：１８０−１８３（１９９８））；Ｚｏｕら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：１０５−１１３（２０００））、およびＭｏｒｒａｌら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：２７０９−２７１６（１９９８））。さらに、無気力なアデノベクター類は、例えば組換えアデノ関連ウイルス類よりも高い形質転換効率を有している。下記の実施例Ｉに記載の具体的アデノウイルスベクターのためのヌクレオチド配列は、配列番号９として記載されている。このベクターは、ｎｔ  １−７９５にＣＭＶプロモータ／エンハンサー要素を含み；ｎｔ  ８５７−９８９にβ−グロビン／ＩｇＧキメライントロン類を含み；ｎｔ  １０９５−１１６６にアルブミンリーダー配列を含み；ｎｔ１１６７−１４０６にベータセルリン〔１−８０〕ｃＤＮＡコード配列を含み；ｎｔ  １４０７−１４０９に終始コドンを含み；ｎｔ  １４２６−１６４７にＳＶ４０後期ポリＡシグナルを含む。このベクターまたは実質的に同一のヌクレオチド配列を含むベクターもまた、本発明の方法で使用できる。
【００４６】
さらに、例示的なウイルスに基づくベクター類には、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、およびヘルペスウイルスベクター類が含まれ、これらを用いて細胞中にＡＴＸポリペプチド類を発現させることができる。先にも述べたように、ウイルスに基づく系は、比較的高レベルの非相同核酸をさまざまな細胞に導入できるという利点を示す。さらに、このようなウイルス類は、非相同ＤＮＡを非分割細胞に導入できる。ウイルスベクター類には、例えば、単純ヘルペスウイルスベクター類（米国特許５，５０１、９７９）、ワクチニアウイルスベクター類（米国特許５，５０６、１３８）、サイトメガロウイルスベクター類（米国特許５，５６１、０６３）、修飾マロニーマウス白血病ウイルスベクター類（米国特許５，６９３、５０８）、アデノウイルスベクター類（米国特許５，７００、４７０および５，７３１、１７２）、アデノ関連ウイルスベクター類（米国特許５，６０４、０９０）、構造的および制御可能レトロウイルスベクター類（それぞれ、米国特許４，４０５、７１２；４，６５０、７６４および５，７３９、０１８）、パピローマウイルスベクター類（米国特許５，６７４、７０３および５，７１９、０５４）等が含まれる。
【００４７】
本発明のベクター構築方法およびコード配列と発現および／制御要素類の操作可能な連結のための方法類は、当該技術で周知である。アルブミン分泌リーダー配列を含むＢＴＣをコードする例示的発現可能核酸配列は、本文で配列番号１０として示した。分泌可能ＢＴＣ／アルブミンｐｒｏ−ＢＴＣをコードする核酸配列構築方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同上；Ａｕｓｕｂｅｌら、同上；Ｋａｙら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２１：８１５−８１９（１９９５）；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９０：６２６−６３０（１９９２）、およびＢａｒｒら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２：１５１−１５５（１９９５）に記載のように、当該技術で周知である。たとえば、ＢＴＣをコードしかつ分泌リーダー配列を含む核酸は、ポリメラーゼチェーン反応を用いて得ることができる。適切な生物からの組織または細胞株を用いて、ＢＴＣまたはリーダー配列を増幅できる。このような方法もまた、下記の実施例Ｉに例示されている。
【００４８】
いったんプロモータを操作可能なように連結した核酸、イントロン、分泌リーダー配列をコードする核酸、ヒトベータセルリン（ＢＴＣ）をコードする核酸、またはその機能的断片、およびポリアデニル化シグナル配列を含むベクターが構築されると、このベクターについて、分泌された成熟ＢＴＣ発現を当該技術で周知の方法を用いて証明できる。たとえば、前記ベクターを、ＢＴＣを発現しない細胞に導入して、ＥＬＩＳＡまたはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）のようなアッセイを用いて、成熟インシュリンの存在を培地でアッセイする。これとは別に、発現した産物のβ細胞再生またはβ細胞新生を誘導する能力または表１に示した糖尿病症状および病理状態のいずれかひとつの重度を低下させる能力について試験できる。たとえば、発現産物を、血糖値低下を刺激する能力または培養肥満細胞または筋肉細胞への糖移動増加を刺激する能力を試験できる。細胞中への移動量測定は、放射性標識グルコースを用いて行うことができる。
【００４９】
したがって、本発明はまた、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータおよびエンハンサー領域を操作可能なように連結した核酸、β−グロビンキメライントロン、アルブミンリーダー配列をコードする核酸、ヒトベータセルリン（ＢＴＣ）をコードする核酸、またはその機能的断片、およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列を含むベクターを提供し、ＢＴＣ発現が分泌された成熟ＢＴＣを産生することを特徴とする。このベクターのためのヌクレオチド配列は、実質的に、配列番号９として示したヌクレオチド配列と同一である。
【００５０】
本発明はさらに、本発明のＢＴＣ含有ベクターを含む宿主細胞を提供する。たとえば、本発明は、分泌された成熟ＢＴＣを発現する宿主細胞または細胞群を提供する。本発明の宿主細胞は、基本的にいかなる組織または臓器由来であることもできる。一次細胞のため、容易にアクセス可能でかつ所望の成長と発現特性を示す細胞を含む組織を選択すべきである。組織起源を選択する際、さらに考慮すべきこととして、分泌形状でＢＴＣを発現させるために単離、培養および修飾できる細胞を含む組織を第一選択とすることが挙げられる。組織起源の例としては、膵臓、筋肉、肝臓または皮膚組織、ならびに造血系由来の材料が挙げられる。したがって、分泌された成熟ＢＴＣを発現するように修飾できるこれらの組織内部の細胞タイプは、例えば、実験研究、ベクター維持および継代を含む目的のためならびに細胞療法プロトコールのため、単離して使用できる。上記細胞タイプには、例えば、β島細胞、筋肉（平滑筋、骨格筋または心筋）、線維芽細胞、肝臓、脂肪、造血系、上皮、内皮、内分泌、外分泌、腎臓、膀胱、脾臓、幹および生殖細胞が含まれる。特に有用な宿主細胞は膵臓細胞であり、β島に分化可能な始原ならびに幹細胞を含む。成熟ＢＴＣを分泌するように修飾可能な他の細胞タイプも同様に当該技術で周知であり、それらは、同様に、上記のような組織起源から得られまたは単離することができる。ヒト組織起源は治療目的のために有益であるが、細胞由来の種は、基本的にいかなる哺乳類からも誘導でき、ただし、この細胞は成熟ＢＴＣの発現と分泌を可能とする特徴を示さなければならない。
【００５１】
本発明は、糖尿病を治療または予防する方法を提供する。前記方法は、ヒトに対して、分泌された成熟ヒトベータセルリン（ＢＴＣ）またはその機能的断片を発現するベクターを有するウイルス粒子を有効量、投与することを含み、前記ベクターは、プロモータを操作可能なように連結した核酸、イントロン、分泌リーダー配列をコードする核酸、ヒトベータセルリン（ＢＴＣ）をコードする核酸、またはその機能的断片、およびポリアデニル化シグナル配列を有する。
【００５２】
本発明のベクターは、別の態様において、ウイルス粒子産生のために使用することができる。感染後成熟ＢＴＣを分泌できる本発明のベクターを含む上記ウイルス粒子の投与は、糖尿病を治療しかつ予防できる。たとえば、アルブミンリーダー配列に融合させたヒトＢＴＣを含む本発明の組換えアデノウイルスベクターの単回投与は、ストレプトゾシン誘発糖尿病ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスおよび免疫制御剤で処理した自己免疫糖尿病ＮＯＤマウスにおいて２週間以内に糖尿病が完全寛解し、マウスは、１００日間以上にわたり正常血糖値のままであった。糖尿病寛解は、膵臓におけるβ細胞のＢＴＣ媒介再生により、ＢＴＣリガンド類であるＥｒｂＢ−２レセプター類を阻害することで、停止した。ＢＴＣ遺伝子療法によるβ細胞の再生は、ヒトの１型糖尿病の治癒のための見込みのある方法となるかもしれない。
【００５３】
本発明の方法で例示したウイルス粒子は、アデノウイルスベクター粒子である。しかし、前記ベクターについて先にも述べたように、本文に示した教示ならびに手引きがあれば、当業者は、広範囲のウイルス粒子類を安定遺伝子デリバリ、成熟ＢＴＣの発現ならびに分泌のために使用できることを理解するであろう。アデノウイルスであろうが、他のＤＮＡウイルスに基づいていようが、レトロウイルスまたは他であろうが、本発明のベクターをそのゲノムとして保有しているウイルス粒子は、下記でさらに述べるように糖尿病の治療または予防のために本発明の方法で使用できる。本発明のウイルス粒子は、例えば、ウイルスゲノムの取り込みのために当該技術で周知の広範囲の方法のいずれかを用いて産生させることができる。このような方法を、本発明のベクターを保有するアデノウイルス粒子に関して下記の実施例Ｉで例示した。
【００５４】
グルコースホメオスタシスを欠損している糖尿病患者は、さまざまな投与経路ならびに方法で上述のウイルス粒子で治療することができる。本発明の方法類による治療に適したヒトは、当該技術で周知の糖尿病の臨床基準と予後指標を用いて選択される。本文で先に述べた糖尿病症状または糖尿病関連病理の少なくともひとつの明確な臨床的診断が、本発明の細胞類の投与を正当化するであろう。例示的病理症状リストを表１に含めた。
【００５５】
家族病歴、空腹時血糖値または耐糖能低下のような公知の予後指標により評価した糖尿病発生リスクのあるヒトもまた、プロインシュリンおよびプロテアーゼをグルコース制御下に発現するように修飾した細胞を投与することを正当化する。当業者は、糖尿病のヒトまたは脱制御グルコース取り込みのヒトをいかにして診断するかを知っているであろうしまたは理解するであろうし、また、糖尿病の程度すなわち重篤度に応じて、本発明のウイルス粒子をいつ投与するかを適切に決定でき、もっとも望ましい投与形式を選択できる。たとえば、長期の１型糖尿病のヒトには、感染およびＢＴＣ分泌のためにウイルス粒子を迅速に投与することが必要であろうが、長期２型糖尿病のヒトは、他の処方された治療の有効性がないことがはっきりするまでは、治療を先送りすることができる。
【００５６】
プロモータを操作可能なように連結した核酸、イントロン、分泌リーダー配列をコードする核酸、ヒトベータセルリン（ＢＴＣ）をコードする核酸、またはその機能的断片、およびポリアデニル化シグナル配列を含むベクターを有するウイルス粒子で、宿主細胞に導入されるとそのベクターから分泌された成熟ヒトベータセルリン（ＢＴＣ）またはその機能的断片を発現できるウイルス粒子は、糖尿病の改善のために糖尿病治療を必要とするかまたはその恩恵を受けると確定したヒトに対して投与できる。前記ウイルス粒子は、糖尿病の１種以上の症候または症状の改善のために投与することができる。たとえば、糖尿病のヒトに、糖尿病診断後に、分泌された成熟ＢＴＣをコードするゲノムを有するウイルス粒子を投与することができる。このウイルス粒子は、標的組織および細胞に感染し、そのベクターゲノムのインビボ発現により成熟ＢＴＣまたはその機能的断片を分泌するであろう。ＢＴＣ分泌により例えば膵臓におけるβ島細胞再生、膵臓におけるβ島細胞新生、またはその両者である膵臓におけるβ島細胞再生とβ島細胞新生が起こるか、または、これらの細胞の補充とグルコースホメオスタシスの回復が起こる。糖尿病を効果的に治療されたヒトは、インシュリン分泌細胞のインプラント後糖尿病を示唆する症状の少なくともひとつの重篤度が低下するであろう。症状重篤度低下は決定でき、当業者に明らかであろう。
【００５７】
糖尿病がそれほどひどくないヒトにも、本発明のウイルス粒子を投与できる。このようなヒトにおける治療必要性は、当業者が決定できる。たとえば、標準的治療に応答しないかあるいは余り応答しない糖尿病のヒトを、本発明の方法類によって治療できる。たとえば、２型糖尿病の患者で長期体重減少を維持できていないかあるいは運動療法に厳密に従っていない患者は、本発明の細胞群のインプラントにより、そのインシュリン耐性を治療できる。
【００５８】
本発明の方法類をまた用いて、糖尿病のための他の治療法の有効性を改良することができる。本発明の方法類を既存のまたは他の治療方法と併用し、他の方法類の有効性またはその使用の容易さを改善することができる。たとえば、ＢＴＣ分泌細胞類は、インシュリンの毎日注射を受けている患者またはインシュリンポンプを使用している患者に本発明のウイルス粒子を投与した後、産生させることができる。ＢＴＣをコードするウイルス粒子の投与およびその後のＢＴＣ分泌による感染が、このような患者におけるインシュリン注射の頻度を低下させることができる。インシュリン療法を受けていないが行動変容療法を受けている糖尿病のヒトに対しても、本発明のウイルス粒子を投与することができる。このようなヒトへのＢＴＣウイルス粒子の投与を体重低下と運動療法とともに行うと、疾患再燃の可能性を低下させまたは前記疾患の症候または症状を改善することができる。本発明のＢＴＣコードウイルス粒子類をまた用いて、内因性インシュリン分泌細胞に対する自己免疫応答を有する糖尿病患者を治療することができる。このような糖尿病患者はまた、自己免疫応答の免疫療法介入により治療することもしばしばある。これらのヒトらは、さらに、ＢＴＣ分泌とβ島細胞の再生および／または新生によって治療して、免疫療法単独で得られるよりもより高い治療有効性を得ることができる。
【００５９】
本発明のウイルス粒子は分泌された成熟ＢＴＣを導入し発現させるが、これらを上記ヒトに投与してβ島細胞の増加をもたらしそれによってインシュリン分泌を高め、グルコース取り込み応答を回復または促進させることができる。ウイルス粒子ゲノムの組み込みにより、これらの機能類の発現回復により長期にわたりグルコースホメオスタシスを可能とする。糖尿病に罹患しているヒトに対して、有効量のウイルス粒子を投与し、糖尿病を緩和または予防することができる。このようなヒトは、約１４０ｍｇ／ｄｌ以上の空腹時血糖値を有することになるであろう。
【００６０】
インプラントに適したウイルス粒子の有効量は、分泌された成熟ＢＴＣを操作可能にコードするために得ることができ、修飾でき、かつインビボで標的細胞または組織にウイルスを感染させた後分泌された成熟ＢＴＣまたはその機能的断片を治療の恩恵を与えられる量だけ十分に発現できる範囲内の量または粒子数で、構成されている。ヒトのためのウイルス粒子の有効量は、例えば、糖尿病の信頼できる動物モデルから、当業者に周知のことと本文に示した教示および指針のもとに外挿することができる。マウス動物モデルのためのウイルス粒子有効量は、例えば、約１×１０8−１×１０12、好適には約１×１０9−８×１０11、さらに好適には約１×１０10−１×１０11の間を含む。特に有用な有効量は、ウイルス粒子約４×１０11である。ウイルス粒子数の選択は、粒子の起源、レシピエントの状態、および必要なＢＴＣ分泌のレベルに依存する。当業者は、当該技術で周知の方法類を用いて、いかにして治療効果を得るために適切な数のウイルス粒子を決定するかを知るであろう。
【００６１】
分泌可能なＢＴＣをコードする核酸類のデリバリのための本発明のウイルス粒子の投与は、さまざまな経路で行うことができる。静注（ｉ．ｐ．）に加えて、有効量のウイルス粒子をまた、筋肉注射、皮下注射、腹腔注射によってヒトに投与でき、または、組織または臓器部位に投与することができる。投与に用いたウイルス粒子は、当該技術で周知の方法によって得られかつ調製され、適切な生理学的担体に懸濁する。たとえば、前記ウイルス粒子を、粒子を含む装具に連結したカテーテルを介して直接点滴するかまたは組織に直接注射することもでき、前記カテーテルは静脈に挿入されている。前記ウイルス粒子は、上記で定義しさらに下記で検討する薬剤的に許容できる担体中で注射する。前記ウイルス粒子はまた、デリバリ、標的化および／または治療有効性を促進する他の分子類とともに投与できる。このウイルス粒子は、必要に応じて単回または複数回投与でき、治療レベルの分泌された成熟ＢＴＣまたはその機能的断片を十分に発現させる。
【００６２】
ウイルス粒子で治療したヒトを次に、食事摂取後インシュリン分泌レベルを測定することによって、治療の有効性をモニタリングできる。この測定は、例えばインシュリン血中レベルのラジオイムノアッセイ測定またはＥＬＩＳＡから構成することができる。これとは別に、ウイルス粒子投与後のヒトにおいて空腹時血糖値を測定することを用いて、治療の有効性を決定できる。耐糖能試験によって決定したブドウ糖消失の速度低下を用いて、治療の有効性を確認できる。さらに、糖尿病関連症状の少なくともひとつの緩和を用いて、また、治療の有効性を決定できる。当業者は、治療有効性評価および診断の適切な手段を知っているであろう。
【００６３】
本発明をまた、糖尿病予防のために使用できる。たとえば、分泌可能なＢＴＣをコードするウイルス粒子は、糖尿病発症リスクがあるヒトまたは高血糖に苦しんでいるヒトに対して予防として投与することもできる。本発明はまた、例えば、遺伝的に糖尿病を発生する素因があるヒトまたはインシュリン耐性または非制御高血糖を発症するリスクのある肥満のヒトにおいても使用できる。これらのヒトは、臨床的に明らかな高血糖になる前にまたはそれを発症している間に有効量のＢＴＣコードウイルス粒子を服用でき、標的細胞に感染させその後成熟ＢＴＣを分泌させる。後者の場合は糖尿病予防と考えられるが、また、糖尿病を治療するともみなされ、正常なグルコースホメオスタシスが、慢性的な血糖値上昇が示唆される前に得られることが理由となっている。
【００６４】
ＢＴＣコードウイルス粒子を投与し感染させかつＢＴＣをヒトで分泌させることに加えて、本発明のベクター類はまた、直接ヒトに投与して、例えばエクスビボおよびインビボ療法のために遺伝的修飾を行わせる。
【００６５】
分泌可能なＢＴＣ核酸を含む本発明のウイルス粒子類またはベクター類は、ヒトに直接導入できるかまたは薬剤的に許容できる担体を含む薬剤組成物として製剤化することができる。薬剤的に許容できる担体類は当該技術で周知であり、水、生理緩衝食塩水のような水溶液、またはグリコール類、グリセロール、オリーブオイルのようなオイル類または注入可能な有機エステル類のような他の溶媒類またはビーヒクル類を含む。
【００６６】
薬剤的に許容できる担体は、例えばウイルス粒子感染、ベクター核酸配列の吸着またはその両者を安定化または増加させるように作用する生理的に許容できる成分類を含むことができる。当業者は、生理学的に許容できる化合物を含めて薬剤的に許容できる担体の選択が例えばＢＴＣコードウイルス粒子の投与経路および例えばウイルス粒子がＤＮＡウイルスに基づくかまたはレトロウイルスに基づくかなどのウイルス粒子の特殊な特徴に依存することがわかるであろう。
【００６７】
前記薬剤組成物はまた、もし所望であれば、水中油型エマルジョン、ミクロエマルジョン、ミセル類、混合ミセル類、リポゾーム類、微小球体類または他のポリマーマトリックス類中に取り込ませることができる（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｓ．Ｉ乃至ＩＩＩ，第２版、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９９３）；Ｆｒａｌｅｙら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．，６：７７（１９８１））。たとえば、リン脂質または他の脂質類で構成されるリポゾーム類は、無毒の生理学的に許容でき代謝可能な担体であり、製造も投与も比較的容易である。さらに、リポゾーム類は、本発明のＢＴＣをコードするベクター類を本剤の生物活性を損なうことなく高効率でカプセル化でき、標的細胞に優先的にかつ実質的に結合させ、小胞の水性内容物を標的細胞に高効率で運搬できるので、特に有用である（Ｍａｎｎｉｎｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６８２（１９８８））。
【００６８】
本発明のベクターを運搬するためにヒトを標的としてリポゾームを向かわせることは、受動的であっても能動的であってもよい。受動的標的化では、例えば、網内系（ＲＥＳ）細胞および洞様毛細血管を有する肝臓のような臓器にリポゾームが集積する傾向を用いる。リポゾームとして製剤化したベクター類は、肝臓の門脈に直接点滴でき、肝臓細胞を効果的に修飾し、肝臓中のＲＥＳ細胞濃度および肝臓における循環系の洞様毛細血管の性質により、インシュリンを発現するであろう。ベクター含有リポゾーム類の能動的標的化は、このリポゾームに特定リガンドを結合させることによって、達成することができる。このようなリガンド類には、モノクローナル抗体、糖、糖脂質または標的細胞が発現したレセプターに対するリガンドのようなタンパク質を含む。インシュリン発現のために修飾する細胞タイプまたは組織位置に応じて、いずれかの標的化方法を選択することができる。
【００６９】
ウイルス粒子または分泌可能なＢＴＣをコードするベクターのヒトに対する投与は、所望のＢＴＣ分泌レベルに応じてまたは修飾する細胞数に応じて単回治療または複数回治療として行われる。ポリペプチドをコードする核酸配列類のデリバリ方法は、例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９９６年１２月３日発行米国特許５，５８０、８５９に記載されているように当該技術で公知である。複数回投与はまた修飾した細胞比率を高めるため、細胞あたりのＢＴＣコピー数を大きくするため、または所望の期間にわたり修飾細胞の有効数を維持するため、行うことができる。インビボ治療の効率は、もし糖尿病症状の少なくともひとつが回避もしくは低下されるならば、得られる。治療したヒトで糖尿病症状の重篤度が低下したかどうかは、当業者が先にも述べたようにして決定できる。
【００７０】
本発明のさまざまな態様の活性に実質的影響をもたらさない修飾も、本文に述べた発明の定義の範囲に含まれる。したがって、下記の実施例は、本発明を例示するためであり、限定するためではない。
【実施例】
【００７１】
（実施例Ｉ）
ベータセルリン誘発β細胞再生による糖尿病の長期寛解
本実施例は、膵臓におけるベータセルリン発現を介した糖尿病の治療を示している。
【００７２】
糖尿病動物モデルへの導入およびベータセルリン（ＢＴＣ）のインビボ発現のため、組換えアデノウイルスベクターを構築した。ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣと命名した前記ベクターは、ＢＴＣコード領域の５´にサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ／エンハンサーおよびエンハンサー領域、β−グロビンキメライントロンおよびアルブミンリーダー配列を含んでおり、ＢＴＣ分泌を促進する。ＢＴＣコード領域の３´に、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列が位置している。成熟ＢＴＣをコードするＢＴＣ〔１−８０〕ｃＤＮＡは、これらの５´および３´発現および制御領域の間に挿入した。ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣの概略を、図１Ａに示した。成熟ＢＴＣをコードするＢＴＣ〔１−８０〕ｃＤＮＡの完全ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を、配列番号１および２としてそれぞれ、示した。ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣの完全ヌクレオチド配列は、配列番号９として示した。アルブミンシグナル配列を含む配列番号９のコードされたＢＴＣプロペプチドは、配列番号１０として示した。
【００７３】
ヒトＢＴＣ  ｃＤＮＡ（ｒＡｄ−ＢＴＣ）を発現する組換えアデノウイルス類は、下記のようにして作製した。簡単に述べると、アミノ酸８０個の完全タンパク質をコードするヒトＢＴＣ  ｃＤＮＡは、アメリカンタイプカルチャーコレクションから購入した（ＡＴＣＣ＃１８８７０１２）。このｃＤＮＡは、ＳｍａｌＩおよびＮｏｔＩ部位でｐＣＲ２５９（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）アデノウイルストランスファーベクター中にクローニングした。次に、アルブミンリーダーペプチド配列をＳａｌＩおよびＳｍａＩ部位に挿入し、この６−ｂｐ配列にさらにＳｍａＩ認識配列を挿入し、部位特異的変異によって除去した。生成した発現カセットは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、βグロビン／ＩｇＧキメライントロン、およびシミアンウイルス（ＳＶ）４０ポリＡシグナルを含んでいた。このカセットを含むアデノウイルスベクターは、Ｔｒａｎｓｐｏｓ−ＡｄTM法（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）を用いて製造業者のプロトコールに従い、構築した。アデノウイルスベクターは、ＰａｃＩにより直線状とし、リポフェクタミン−Ｐｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＨＥＫ−２９３細胞に移入した。移入後２週の時点でウイルスを採取し、使用、保存した。ＨＥＫ−２９３細胞に保存ウイルスを感染させ、ウイルスを増幅させ、Ｂｅｃｋｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４３ＰｔＡ，１６１（１９９４）に記載されているように、ＣｓＣｌ2勾配超遠心により精製した。対照として、β―ガラクトシダーゼ発現組換えアデノウイルス（ｒＡｄ−βｇａｌ）は、ＢＴＣ  ｃＤＮＡをβ−ガラクトシダーゼｃＤＮＡにより置換することによって産生させた。ウイルス力価は、ＰＣＲとＰｒｅｖｅｃ、Ｇ．Ｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０、３６３（１９９２）により記載されている方法を用いるプラーク形成単位法により、求めた。
【００７４】
最初に、ｒＡｄ−ＢＴＣ構築体によるＢＴＣの発現と分泌は、インビトロで調べた。不滅化ヒト肝細胞株ＴＴＮＴ−１６細胞（Ｏｋｉｔｓｕら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３、１０５（２００４））にｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣを感染させ、ＢＴＣの産生と分泌を、抗ＢＴＣ抗体（Ｒ＆Ｄシステム、ＵＳＡ）を用いる免疫組織化学染色とＥＬＩＳＡをそれぞれ用いて、調べた。
【００７５】
結果を図１Ｂおよび１Ｃに示した。簡単に述べると、図１Ｂは、５ＭＯＩのｒＡｄ−ＢＴＣまたはｒＡｄ−βｇａｌによる１×１０4ＴＴＮＴ−１６細胞感染２４時間後において、抗ヒトＢＴＣ抗体による染色によってＢＴＣ発現を決定した。この結果は、ＢＴＣがｒＡｄ−ＢＴＣ感染ＴＴＮＴ−１６細胞で明らかに産生されたことを示すが、β−ガラクトシダーゼを発現する組換えアデノウイルス（ｒＡｄ−ＣＭＶ−βｇａｌ）に感染した細胞では産生されなかった。図１Ｃは、１または１０  ＭＯＩのｒＡｄ−ＢＴＣによる１×１０6ＴＴＮＴ−１６細胞感染後２４時間インキュベーションした後において、上清中に分泌されるＢＴＣレベルを示している。非感染ＴＴＮＴ−１６細胞は、コントロールとして用いた（０  ＭＯＩ）。分泌ＢＴＣの量は、ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣの量に依存することがわかった。それとともに、これらの結果は、ｒＡｄ−ＢＴＣ感染細胞が効率的にＢＴＣを発現しかつ分泌することを示唆している。
【００７６】
第２に、ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣによるＢＴＣ発現をインビボで調べた。簡単に述べると、６週齢の雄性非肥満糖尿病／重篤合併免疫不全（ＮＯＤ．ｓｃｉｄ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）を、ストレプトゾシン（クエン酸緩衝液、ｐＨ４．５中ＳＴＺ；１００ｍｇ／ｋｇ体重、ｉ．ｐ．）を２回注射することによって高血糖にし、この糖尿病マウスにｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣまたは対照としてのｒＡｄ−ＣＭＶ−βｇａｌを静注した。ＳＴＺ誘発糖尿病ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスまたは自然発生自己免疫糖尿病ＮＯＤマウス（血糖＞５００ｍｇ／ｄｌ）に対してメトキシフルラン麻酔下、ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣまたは対照としてのｒＡｄ−ＣＭＶ−βｇａｌを、ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスに対して２×１０11粒子またはＮＯＤマウスに対して４×１０11粒子を尾静脈から静注した。血糖値は、１日おきに測定した。自己免疫糖尿病ＮＯＤマウスにおける新規産生β細胞の免疫攻撃を防止するため、ＣＦＡ（１００μｌ／マウス、静注単回）および／またはｈＣＧ（５０ＩＵ／マウス、３週間毎日静注）をウイルス注入３日前に注射した。耐糖能試験は、Ｌｅｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０８、４８３（２０００）により先に記載されているように、ウイルス注入４週後に行った。
【００７７】
肝臓、膵臓、脾臓、肺および腎臓を含むさまざまな組織におけるＢＴＣ  ｍＲＮＡおよびインシュリンの発現を、注入４週後にＲＴ−ＰＣＲにより調べた。簡単に述べると、ウイルス注入ＸＸ週後ｒＡｄ−ＢＴＣ処理したＳＴＺ誘発糖尿病ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスからさまざまな組織を除去し、ＢＴＣ  ｍＲＮＡおよびインシュリンｍＲＮＡの発現を、ヒトＢＴＣのためのプライマー類：5'-AGTGGGTAACCTTTATTTCC-3'（配列番号１１）および5'-GTAAAACAAGTCAACTCTCTC-3'、および、マウスインシュリンのためのプライマー類：5'-AGGCTTTTGTCAAGCAG-3'および5'-CTGATCTACAATGCCACG-3'を用いてＲＴ−ＰＣＲにより分析した。
【００７８】
インビボ発現結果を、図１Ｄ（ＢＴＣ）およびＥ（インシュリン）に示し、図記号は、Ｌは肝臓、Ｌｕは肺、Ｋは腎臓、Ｈは心臓、Ｓは脾臓、Ｐは膵臓に対応している。島様細胞類がＮｅｕｒｏＤおよびＢＴＣを発現する無気力アデノウイルスを注射したＳＴＺ誘発糖尿病マウスの肝臓においてのみ産生されると報告されている（Ｋｏｊｉｍａら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９、５９６（２００３））ので、これらの組織におけるインシュリンの発現を調べた。ＨＰＲＴ発現は、内部コントロールとして用いた。ＢＴＣ  ｍＲＮＡは、全ての試験組織で検出されることがわかったが、主な発現は肝臓で観察された。これらの結果は、ＢＴＣがｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ処置マウスで明確に発現されることを示している。対比して、インシュリンｍＲＮＡが、ｒＡｄ−ＢＴＣ処置マウスの膵臓組織でのみ検出されたが、肝臓を含む他の組織では検出されなかった。
【００７９】
第三に、ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣをＳＴＺ誘発糖尿病ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスに注入した結果糖尿病が寛解するかどうかもまた、調べた。結果は図１Ｆに示した。ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ（２×１０11粒子）を、ＳＴＺ誘発糖尿病ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウス（◆）およびＢａｌｂ／ｃマウス（●）に投与し、血糖値を測定した。対照として、同用量のｒＡｄ−ＣＭＶ−ｂｇａｌをＳＴＺ誘発糖尿病ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスに投与した（■）。血糖値は漸次低下することが観察でわかり、ウイルス注入２週後に正常値に到達した。正常血糖値は、本試験が終わるまで１００日を超えて保持された。対比して、ｒＡｄ−ＣＭＶ−βｇａｌ処置マウスは、高血糖が持続し、死亡した。
【００８０】
ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ処置後正常血糖値になったＳＴＺ誘発糖尿病マウスにおける耐糖能試験を行った。この結果は図１Ｇに示し、ＳＴＺ誘発糖尿病ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスの血糖値がｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ処置後正常化し（▲）、そのマウスを４時間絶食させ、グルコース（２ｇ／ｋｇ体重ｉ．ｐ．）を注射した。血糖値は、グルコース注射後示した時点で測定した。未処置ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウス（◆）およびｒＡｄ−βｇａｌ処置マウス（■）を対照として用いた。
【００８１】
この結果は、ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ処置マウスが正常マウスと同一のグルコースクリアランス動態を示すことを示唆している。これらの結果をこれまでの試験と対比させたが、先の試験では、ＢＴＣ発現単独は、ＳＴＺ誘発糖尿病マウスにおいて血糖値に全く効果を示さなかった（Ｋｏｊｉｍａら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：５９６（２００３））。ＢＴＣ遺伝子療法効果がこのように違うことは、ベクターおよびＢＴＣ遺伝子構築体ならびに発現様式の差に起因することがある。たとえば、本研究ではアデノウイルスベクターを用いたが、それは先の研究で用いたヘルパー依存性アデノウイルスベクターよりも高い移入効率を示す。さらに、アルブミンリーダー配列をＢＴＣ  ｃＤＮＡの前方に挿入し分泌を促進させ、サイトメガロウイルスプロモータ／エンハンサーおよびβ−グロビンキメライントロンは、ＢＴＣトランスジーンの強力な発現のために用いた。本文に述べた結果は、ＢＴＣ遺伝子療法による糖尿病の完全寛解を示しており、それを、我々のセンターにいる二名のそれぞれ独立した異なる研究者により確認させた。
【００８２】
ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣによる糖尿病ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスの処置の結果としてインシュリン産生細胞の増加が見られるかどうかを調べるため、肝臓および膵臓切片を抗インシュリン抗体で染色し、インシュリン陽性細胞の数を調べた。結果を図２ＡおよびＢに示した。簡単に述べると、ＳＴＺ誘発糖尿病ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスにｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ（２×１０11粒子）を注入し、２週後（ＢＴＣ−２週後）または４週後（ＢＴＣ−４週後）に屠殺した。ｒＡｄ−βｇａｌ処置糖尿病ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウス（糖尿病）および未処置ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウス（正常）を対照として用いた。パネルＡは、膵臓を除去し切片をヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）または抗インシュリン抗体（赤色）または抗グルカゴン抗体（緑色）で染色したことを示す。パネルＢにおいては、膵臓のインシュリン含量をラジオイムノアッセイＥＬＩＳＡにより測定した。
【００８３】
図２ＡおよびＢに示したように、処置４週後において、インシュリン陽性細胞は、ｒＡｄ−ＣＭＶ−βｇａｌ処置マウスの膵臓よりもｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ処置マウスの膵臓で５倍高いことが観察され、正常マウス膵臓中細胞数の約４０％に到達した。インシュリン陽性細胞は、肝臓では観察されなかった。島を抗インシュリンおよび抗グルカゴン抗体でｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ処置２週後二重染色すると、ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ処置マウスの島においてインシュリン産生細胞にグルカゴン産生α細胞が散在しており、それはおそらく、ＳＴＺ及び新しく形成したβ細胞の続く出願によりβ細胞が破壊された後グルカゴン産生細胞が再局在したためであろう。しかし、β細胞は、ｒＡｄ−ＢＴＳ処置４週後においてα細胞に取り囲まれて中央に集まっており、正常マウスの場合で見られるのと同様で（図２Ａ）、そのことはおそらく、島中央付近で新しく形成したβ細胞が連続的に増加していることによるのであろう。
【００８４】
ｒＡｄ−ＢＴＣ処置が膵臓におけるインシュリン産生細胞の増加を結果としてもたらすかどうかを確認するため、ｒＡｄ−ＢＴＣおよびｒＡｄ−βｇａｌ−処置マウスおよび正常マウスの膵臓または血漿からインシュリンを抽出し、濃度を、ＹｏｏｎおよびＮｏｔｋｉｎｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４３：１１７０（１９７６）およびＹｏｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ２６４：１７８（１９７６）に記載されているようにラジオイムノアッセイによって測定した。結果を図２ＣおよびＤに示したが、パネルＣは、グルコース負荷（２ｇ／ｋｇ体重）３０分後および屠殺前にＥＬＩＳＡにより測定した血清インシュリン含量を示している。パネルＤは、抗インシュリン抗体染色後のインシュリン陽性領域の測定を示しており、正常マウスで見られる領域に対する百分率として示した。ｐ＜０．０１は、ｒＡｄ−ＣＭＶ−βｇａｌ処置糖尿病マウスと比較したものである。
【００８５】
それは、ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ処置マウスのインシュリンレベル（２６９±３１ｎｇ／ｍｇ膵臓）がｒＡｄ−ＣＭＶ−βｇａｌ処置マウスのインシュリンレベル（１１６±２２ｎｇ／ｍｇ膵臓）よりも有意に高いことを示しているが、ただし、正常マウス（７５２±６８ｎｇ／ｍｇ膵臓）よりも低かった（図２Ｃ）。血漿中インシュリンレベルもまた、グルコース負荷後ＥＬＩＳＡにより調べ、ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ処置マウスの血漿インシュリンレベルがｒＡｄ−βｇａｌ処置マウスに比較して有意に増加していることがわかった。ただし、正常マウスよりも低かった（図２Ｄ）。これらを考慮すれば、この結果は、ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ処置マウスの膵臓でインシュリン産生細胞が明らかに増加したことを示しており、このことは、ｒＡｄ−ＢＴＣ処置による糖尿病の寛解が、主に、膵臓におけるβ細胞の再生に起因したことを示唆している。ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ処置マウスの膵臓におけるβ細胞再生に関与した可能性のある機構として、既存のβ細胞の複製（Ｄｏｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ４２９：４１（２００４））、非β細胞のβ細胞への分化転換（Ｗａｔａｄａら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４５：１８２６（１９９６）；Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５１：２５０５（２００２）；Ｍａｓｈｉｍａら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３７：３９６９（１９９６）およびＩｓｈｉｙａｍａら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４１：６２３（１９９８））、および膵臓内部における成熟幹／始原細胞からのβ細胞の新生Ｔｒｕｃｃｏ、Ｍ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：５（２００５）；Ｂｏｕｗｅｎｓ，Ｌ．，Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．４３：３３２（１９９８）、およびＷｅｉｒおよびＢｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：１０９５（２００４）が挙げられる。
【００８６】
ＢＴＣは、ＥｒｂＢレセプターに結合しレセプターホモ−またはヘテロ二量体化、自己リン酸化、およびその後の下流シグナル経路の活性化を誘発し、その結果、細胞増殖および分化が起こる（Ｒｉｅｓｅら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １２：３４５（１９９６））。ＥｒｂＢ−１およびＥｒｂＢ−４の発現は、主に正常ヒト膵臓の島および管細胞でそれぞれ観察され（Ｍｉｙａｇａｗａら、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｊ．４６：７５５（１９９９））、およびＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３、およびＥｒｂＢ−４は、胎児膵臓発生時に膵臓で発現されることが明らかになった（Ｋｒｉｔｚｉｋら、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １６５：６７（２０００））。同様に、ＥｒｂＢ−２の発現は、ＮＯＤマウスにおいて免疫細胞による浸潤を受けた領域に隣接する島細胞中に誘発されることがわかった。ＢＴＣ、上皮成長因子、およびニューレグリン類を含むいくつかのリガンド類が、ＥｒｂＢ−１、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−４とのヘテロ二量体化によりＥｒｂＢ−２のリン酸化と活性化を媒介することが明らかになった（Ｋｒｉｔｚｉｋら、同上）。ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ処置糖尿病マウスにおけるβ細胞の再生がＥｒｂＢレセプター類によって媒介されるかどうかについても、決定した。
【００８７】
この観点から、正常マウス、ＳＴＺ誘発糖尿病マウスおよびｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ処置糖尿病マウスの膵島におけるＥｒｂＢ−１、−２、−３および−４の発現を、抗ＥｒｂＢ抗体類による免疫組織化学染色により調べた。図３に示した結果は、ＥｒｂＢ−２がｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣによる糖尿病寛解に関与していることを明らかに示している。簡単に述べると、パネルＡは、ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ処置およびｒＡｄ−ＣＭＶ−βｇａｌ処置（糖尿病）ＳＴＺ誘発糖尿病マウスならびに未処置（正常）ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスから調製し抗ＥｒｂＢ−１、−２、−３、または−４抗体類により染色した膵臓切片を示している。代表的島の顕微鏡写真を示した。パネルＢは、ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ（２×１０11粒子）処置ＳＴＺ誘発糖尿病ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスを示している。ウイルス注入３日後、ビーヒクル（▼）、ＥｒｂＢ−１レセプター阻害剤であるＡＧ１４７８（○）、またはＥｒｂＢ−２レセプター阻害剤であるＡＧ８２５（●）（カプチゾル中５００μｇ、ｉ．ｐ．）でマウスを１０日間、１日２回処置した。血糖値を測定した。
【００８８】
免疫組織化学分析は、膵臓をメタカーン（６０ｖ／ｖ％メタノール、３０ｖ／ｖ％クロロホルム、および１０ｖ／ｖ％氷酢酸）に一晩固定し、メチルアルコールを２回、メチル安息香酸、キシレンを２回交換処理し、パラフィンで包埋した。脱パラフィン処理および再水和の後、組織切片をオーブンに入れ（９５℃で１５分間、１０ｍＭクエン酸、ｐＨ６．０）、抗原を取り出しかつブロック溶液でブロックした（ＰＢＳ中５％ヤギまたはウマ血清、１％ＢＳＡ、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）。組織を次に、一級アルコール溶液；モルモット抗インシュリン（ＤＡＫＯ、希釈率１：５００）、ウサギ抗グルカゴン類（ＤＡＫＯ，希釈率１：２００）、ヤギ抗ＥｒｂＢ−１およびウサギ抗ＥｒｂＢ−２、−３、および−４（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ，希釈率１：１００）とインキュベーションした。二次抗体について、Ｃｙ３−結合ヤギ抗モルモットＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓ．，ＰＡ希釈率１：２００）およびＣｙ２−結合抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓ．，ＰＡ希釈率１：２００）、ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、希釈率１：５００）およびＨＲＰ結合ウマ抗ヤギＩｇＧ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、希釈率１：５００）を、用いた。蛍光は、レーザースキャニング共焦点蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０）を用いてイメージングし、発色原（紫色）としてＶＩＰによりパーオキシダーゼ染色を行った（ＶＩＰキット；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。
【００８９】
チロシンキナーゼ阻害剤類によるインビボ処置は、ＳＴＺ誘発糖尿病ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスに対してｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ（２×１０11粒子、ｉ．ｖ．）を注入し行い、１００ｍＭカプチゾル（Ｃｙｄｅｘ  Ｉｎｃ．）１００μｌ中チロシンキナーゼ阻害剤類ＡＧ１４７８またはＡＧ８２５（５００μｇ）は、ウイルス注入第３日から開始して１日２回、１０日間にわたり腹腔注入した。賦形剤（１００ｍＭカプチゾル）が単独で対照として注入された。全研究のグループについての差の統計的有意性は、Ｓｔｕｄｅｎｔ‘ｓ  ｔテストにより解析した。Ｐ＜０．０５レベルを、有意とみなした。
【００９０】
ＥｒｂＢ−１は、これらのマウスの全てに由来する島で弱く発現することが観察され、ＥｒｂＢ−３およびＥｒｂＢ−４発現が、これらのマウスのいずれか由来の島で全く測定できなかった。対比して、ＥｒｂＢ−２は、正常マウスに比較してｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ処置および未処置ＳＴＺ誘発糖尿病マウスの両者で高く発現していた（図３Ａ）。ＥｒｂＢ−１およびＥｒｂＢ−２レセプター類は島で発現しうることがわかったので、糖尿病のＢＴＣ誘発寛解にそれらが関与しているかを評価した。ＥｒｂＢ−１およびＥｒｂＢ−２レセプター類は、島で発現することがわかったので、ＢＴＣ誘発糖尿病寛解におけるそれらの関与を評価した。それぞれＥｒｂＢ−１およびＥｒｂＢ−２レセプターシグナル経路の特異的ブロッカーであるＡＧ１４７８またはＡＧ８２５を（Ｌｅｖｉｔｚｋｉ＆Ｇａｚｉｔ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：１７８２（１９９５））ＳＴＺ誘発糖尿病、ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ処置ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスにウイルス注入第３日に開始して１０日の間注入した後、血糖値を測定した。Ａ８２５注入は、ｒＡｄ−ＢＴＣによる糖尿病寛解を停止させることがわかった。しかし、ＡＧ８２５注入をウイルス注入第１３日に停止すると、血糖値は漸次低下し、ウイルス注入第２３日に正常血糖値（約１００ｍｇ／ｄｌ）になった。ＢＴＣ誘発糖尿病寛解の停止に及ぼすＡＧ１４７８の効果は、ＡＧ８２５ほど顕著ではなかった（図３Ｂ）。この差がＡＧ１４７８によるＥｒｂＢ−１レセプターの不完全ブロックによるのかまたはＢＴＣのＥｒｂＢ−１とＥｒｂＢ−２の相互作用における機能的差異によるのかは、不明である。にもかかわらず、これらの結果は、ＥｒｂＢ−２がＢＴＣによる糖尿病寛解に関与していることを示唆している。
【００９１】
ヒト自己免疫１型糖尿病のモデルである自己免疫糖尿病ＮＯＤマウスにおけるｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ遺伝子療法の有効性を調べた。新しく発症したＮＯＤマウス（血糖値＞５００ｍｇ／ｄｌ）にｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ（４×１０11粒子、ｉ．ｖ．）を注入し、血糖値変化を評価した。結果を図４に示したが、そこでパネルＡは、ｒＡｄ−ＢＴＣ（２×１０11粒子）注入前３日間、皮下からＣＦＡ（１００μｌ）を注入した自己免疫糖尿病ＮＯＤマウス（血糖値＞５００ｍｇ／ｄｌ）を示した。◆は、ＣＦＡとともにｒＡｄ−ＢＴＣを用いたことを示し；▲は、ｒＡｄ−ＢＴＣ単独を示し、●は、ＣＦＡ単独を示す。パネルＢは、ウイルス注入３ヵ月後のｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ／ＣＦＡ処置ＮＯＤマウスの膵臓を抗インシュリン抗体で染色したものを示している。数個の島が、抗インシュリン抗体で強く染色され、Ｔ細胞で取り囲まれているが、有意な浸潤は見られなかった。パネルの上部は、未処置糖尿病ＮＯＤ由来島に対応し、一方、下部は、ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ／ＣＦＡ処置ＮＯＤ由来島に対応している。パネルＣは、耐糖能試験結果を示している。血糖値がｒＡｄ−ＢＴＣ／ＣＦＡ処置（◆）後に正常化した糖尿病ＮＯＤマウスを、４時間絶食させ、グルコース（２ｇ／ｋｇ体重、ｉ．ｐ．）を注入した。血糖値は、グルコース注入後示した時点で正常になった。ＣＦＡ単独処置糖尿病ＮＯＤ（▲）と非糖尿病ＮＯＤマウス（■）を、対照として用いた。
【００９２】
血糖値は、ウイルス注入後４〜５日で３００ｍｇ／ｄｌ未満まで低下していることが観察でわかったが、ウイルス注入後２週時点で５００ｍｇ／ｄｌを上回るレベルにまで回復しており、おそらく、再生インシュリン産生細胞の自己免疫応答による再攻撃によるのであろう（図４Ａ）。完全フロインドのアジュバント（ＣＦＡ）は、ＮＯＤマウスにおいて糖尿病を予防することが明らかにされているが、それはおそらく免疫制御Ｔ細胞類の導入によるのであろう（Ｑｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：２０７２（１９９３））。同様に、最近の研究では、エフェクターおよび制御Ｔ細胞の免疫バランスを精密にコントロールすると、ＮＯＤマウスにおける自己免疫糖尿病が予防できる結果となる（Ｋｈｉｌら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３（補遺１）、Ａ４３（２００４））。したがって、糖尿病ＮＯＤマウスにおける免疫バランス制御を、ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ処置前にＣＦＡ注入によって評価した。ＣＦＡ（１００μｌ、ｉ．ｐ．）を新規発生糖尿病ＮＯＤマウスに注入し、３日後にｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ（４×１０11粒子）による処置を行い、血糖値を調べた。この結果は、血糖値がウイルス注入２〜３週で正常化すること、および正常血糖値が実験終了時点まで９０日以上にもわたり維持されたことを示している。ＣＦＡ単独による糖尿病ＮＯＤマウスの処置は、血糖値に全く効果を示さなかった（図４Ａ）。
【００９３】
ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ処置ＮＯＤマウスのウイルス注入３か月時点における膵臓切片を調べたところ、再生した島が免疫細胞で取り込まれてはいるがそれらによる浸潤はないことがわかった（図４Ｂ）。ＣＦＡ注入ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ処置ＮＯＤマウスと正常マウスで血糖クリアランスに有意な差はないことが、これらのマウスの耐糖能試験によりわかった。対比して、ＣＦＡを注入したｒＡｄ−ＣＭＶ−βｇａｌ処置ＮＯＤ対照マウスの血糖値は、測定した全ての時点でｒＡｄ−ＢＴＣ処置マウスよりも有意に高かった（図４Ｃ）。これらの結果は、ｒＡｄ−ＢＴＣ遺伝子療法の結果、免疫バランスコントロールが適切であると自己免疫糖尿病の完全寛解をもたらすことができることを示唆している。
【００９４】
２種の糖尿病動物モデルである化学的に誘発した自己免疫糖尿病マウスおよび自然発症自己免疫糖尿病マウスを用いた上記結果は、ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ処置マウスにおけるＢＴＣの構造的発現と分泌が、ＥｒｂＢ−２レセプター類を介して膵臓においてインシュリン産生細胞の再生を誘発し、その結果、糖尿病の長期完全寛解が得られた。動物モデルにおけるこのＢＴＣ遺伝子療法の成功は、ヒトにおける１型糖尿病の治癒における治療上の有用性ならびに再生β細胞の自己免疫攻撃を止めるための免疫学的戦略を明らかにしている。ＢＴＣ遺伝子療法は、移植療法を制限している免疫適合ドナーの膵島の不足を克服し、いかなる外科的手段を必要としない。
【００９５】
本出願全文にわたって、さまざまな刊行物を、カッコでくくって参考にした。これらの刊行物の開示はその全てを含めて本出願の本文で参考として引用しており、本発明が属する当該技術の常識をさらによりよく記載するために引用している。
【００９６】
本発明を開示した態様を参考に説明してきたが、当業者は上記に詳細に述べた特定の実施例および研究が、本発明を例示するためのみであることを容易に理解するであろう。本発明の精神から逸脱することなく、さまざまな修飾が可能であることを理解されたい。したがって、本発明は、下記の請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１Ａ】図１は、ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ全身投与によるＳＴＺ誘発糖尿病ＮＯＤ．ｓｃｉｄおよびＢａｌｂ／ｃマウスにおける糖尿病寛解を示した図である。Ａは、ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣの概略を示す。
【図１Ｂ】ｒＡｄ−ＢＴＣ構築体によるＢＴＣの発現と分泌をインビトロで調べた
【図１Ｃ】ｒＡｄ−ＢＴＣ構築体によるＢＴＣの発現と分泌をインビトロで調べた
【図１Ｄ】マウスの各組織におけるＢＴＣｍＲＮＡの発現を調べた結果を示す。
【図１Ｅ】マウスの各組織におけるインシュリンｍＲＮＡの発現を調べた結果を示す。
【図１Ｆ】ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ全身投与によるＳＴＺ誘発糖尿病ＮＯＤ．ｓｃｉｄおよびＢａｌｂ／ｃマウスにおける糖尿病寛解を示した図である。
【図１Ｇ】ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ処置後正常血糖値になったＳＴＺ誘発糖尿病マウスにおける耐糖能試験結果を示した図である。
【図２Ａ】図２は、β細胞マスおよびインシュリン増加の結果によるｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣによる糖尿病寛解を示す図である。Ａは、抗インシュリン抗体（赤色）または抗グルカゴン抗体（緑色）で染色した膵臓切片の顕微鏡写真を示す図である。
【図２Ｂ】膵臓のインシュリン含量をラジオイムノアッセイＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す図である。
【図２Ｃ】ＥＬＩＳＡにより測定した血清インシュリン含量の測定結果を示す。
【図２Ｄ】抗インシュリン抗体染色後のインシュリン陽性領域の測定結果を示す。
【図３Ａ】図３は、ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣによる糖尿病寛解にＥｒｂＢ−２が関与していることを示す図である。Ａは、マウスから調製し抗ＥｒｂＢ−１、−２、−３、または−４抗体により染色した膵臓切片の顕微鏡写真を示す図である。
【図３Ｂ】ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ処置ＳＴＺ誘発糖尿病ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスにおいて、ウイルス注入後、各阻害剤で処置したマウスの血糖値の測定結果を示す図である。
【図４Ａ】図４は、ｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ処置による自己免疫糖尿病ＮＯＤマウスの糖尿病寛解を示す図である。Ａは、ｒＡｄ−ＢＴＣ注入前３日間、皮下からＣＦＡを注入した自己免疫糖尿病ＮＯＤマウスの血糖値を示す図である。
【図４Ｂ】ウイルス注入３ヵ月後のｒＡｄ−ＣＭＶ−ＢＴＣ／ＣＦＡ処置ＮＯＤマウスの膵臓を抗インシュリン抗体で染色したものを示す図である。
【図４Ｃ】耐糖能試験結果を示す図である。
【図１Ａ】
2008529498.tif 000004
【図１Ｂ】
2008529498.tif 000005
【図１Ｃ】
2008529498.tif 000006
【図１Ｆ】
2008529498.tif 000007
【図１Ｇ】
2008529498.tif 000008
【図２Ｂ】
2008529498.tif 000009
【図２Ｃ】
2008529498.tif 000010
【図２Ｄ】
2008529498.tif 000011
【図３Ａ】
2008529498.tif 000012
【図３Ｂ】
2008529498.tif 000013
【図４Ａ】
2008529498.tif 000014
【図４Ｃ】
2008529498.tif 000015
【図１Ｄ】
2008529498.tif 000016
【図１Ｅ】
2008529498.tif 000017
【図２Ａ】
2008529498.tif 000018
【図４Ｂ】
2008529498.tif 000019
【配列表】
2008529498000001.xml
【国際調査報告】
2008529498.tif 000026