(57)【要約】本明細書において、乳房、肺、前立腺、および結腸の種々のヒトの癌に存在する抗原ＥｐｈＡ２と結合する抗体の開発および特性決定に関する開示が提供される。この抗原に対して作られた、そのような抗体を用いて様々な癌を診断および治療する方法も開示される。本明細書に開示される本発明は、種々のヒト癌で発現するＥｐｈＡ２という抗原と結合する抗体に関する。従って、一態様では、本発明は、抗原ＥｐｈＡ２と選択的に結合する、抗体の１ファミリー、または１つの抗体もしくは１つのポリペプチド（抗体であってもなくてもよい）である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＰＬ１、ＬＵＣＡ１９、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０である、実質的に精製された免疫グロブリン、またはその抗原結合断片。
【請求項２】
ＥｐｈＡ２と特異的に結合し、ＳＰＬ１、ＬＵＣＡ１９、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０の以下の特徴の少なくとも１つを有する、実質的に精製された免疫グロブリン、またはその抗原結合断片：
ａ．癌細胞上でＥｐｈＡ２に結合する能力；
ｂ．インビトロまたはインビボで生きた癌細胞の表面に露出しているＥｐｈＡ２の一部に結合する能力；
ｃ．ＥｐｈＡ２のホスホチロシン含量を増加させずに腫瘍細胞の増殖を阻害する能力；
ｄ．ＥｐｈＡ２を発現している癌細胞に治療薬または検出可能なマーカーを送達する能力；および
ｅ．ＥｐｈＡ２を発現している癌細胞の中に治療薬または検出可能なマーカーを送達する能力。
【請求項３】
請求項１に記載の免疫グロブリンまたはその抗原結合断片をコードする単離された核酸配列。
【請求項４】
前記核酸がプロモーターと作動可能に連結されている、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
前記プロモーターおよび前記核酸が発現ベクター中に含まれている、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
前記免疫グロブリンがモノクローナル抗体である、請求項３に記載の核酸。
【請求項７】
請求項３に記載の核酸を含有するベクターでトランスフェクトされた、形質転換された、または感染させた細胞株。
【請求項８】
実質的に精製された免疫グロブリン、またはその抗原結合断片を生成する方法であって、次の工程：
ａ．免疫グロブリンまたは抗原結合断片が発現する条件下、請求項３に記載の核酸で形質転換された細胞株を増殖させる工程；および
ｂ．発現した免疫グロブリンまたは断片を回収する工程、
を含む、方法。
【請求項９】
前記細胞株がハイブリドーマである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ハイブリドーマがＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５０７０、ＰＴＡ−６０５６、またはＰＴＡ−６０５９、あるいはハイブリドーマＳＧ３．１５Ｂ４．１Ｆ９である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記免疫グロブリンがモノクローナル抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の精製された免疫グロブリンまたは抗原結合断片の治療上有効な量を薬学的に受容可能な担体とともに含む医薬組成物。
【請求項１３】
受託番号ＰＴＡ−５０７０、ＰＴＡ−６０５６、またはＰＴＡ−６０５９を有する、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されたハイブリドーマ、あるいはハイブリドーマＳＧ３．１５Ｂ４．１Ｆ９（ＰＴＡ−ＸＸＸＸ）。
【請求項１４】
受託番号ＰＴＡ−５０７０、ＰＴＡ−６０５６、またはＰＴＡ−６０５９を有する、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されたハイブリドーマ、あるいはハイブリドーマＳＧ３．１５Ｂ４．１Ｆ９（ＰＴＡ−ＸＸＸＸ）により産生される抗体。
【請求項１５】
ヒト化されている、請求項１に記載の免疫グロブリンまたはその抗原結合断片。
【請求項１６】
キメラ化されている、請求項１に記載の免疫グロブリンまたはその抗原結合断片。
【請求項１７】
ヒト抗体である、請求項１に記載の免疫グロブリンまたはその抗原結合断片。
【請求項１８】
誘導体である、請求項１に記載の免疫グロブリンまたはその抗原結合断片。
【請求項１９】
前記精製された免疫グロブリンまたは抗原結合断片が、ＬＵＣＡ１９、ＬＵＣＡ４０、ＳＧ５またはＳＰＬ１である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
精製された免疫グロブリンまたは抗原結合断片が、ＥｐｈＡ２に対する結合に関してＬＵＣＡ１９、ＬＵＣＡ４０、ＳＧ５またはＳＰＬ１と競合する、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
精製された免疫グロブリンまたは抗原結合断片がヒト化されている、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
精製された免疫グロブリンまたは抗原結合断片がキメラ化されている、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
治療を必要とする患者において癌を治療する方法であって、ＥｐｈＡ２に特異的に結合し、ＳＰＬ１、ＬＵＣＡ１９、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０の以下の特徴：
ａ．癌細胞上でＥｐｈＡ２と結合する能力；
ｂ．インビトロまたはインビボで生きた癌細胞の表面に露出しているＥｐｈＡ２の一部と結合する能力；
ｃ．ＥｐｈＡ２のホスホチロシン含量を増加させずに腫瘍細胞の増殖を阻害する能力；
ｄ．ＥｐｈＡ２を発現している癌細胞に治療薬または検出可能なマーカーを送達する能力；および
ｅ．ＥｐｈＡ２を発現している癌細胞の中に治療薬または検出可能なマーカーを送達する能力
の少なくとも１つを有するＥｐｈＡ２抗体の治療上有効量を前記患者に投与する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、生物学および免疫療法の分野にある。より具体的には、本発明はＥｐｈＡ２と結合する抗体のファミリーの発見に関する。本発明はさらに、抗ＥｐｈＡ２ファミリー抗体を用いる、ＥｐｈＡ２に関連する種々のヒト疾患および癌の診断および／または治療を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
抗体は、それらの既知の診断における使用に加えて、治療薬として有用であることが示されている。例えば、免疫療法、または治療目的のための抗体の使用は、ここ数年、癌を治療するために用いられている。受動的な免疫療法は、癌治療でのモノクローナル抗体の使用を含む。例えば、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）Ｃｈａｐｔ．２０  ｐｐ．４９５−５０８を参照されたい。これらの抗体は、腫瘍細胞増殖もしくは生存の直接阻害、および身体の免疫系の天然の殺細胞活性を補充するそれらの能力の双方による固有の治療的生物活性を有し得る。これらの薬剤は単独で、あるいは放射線療法または化学療法薬と併用して投与することができる。リツキシマブおよびトラスツズマブは、それぞれ非ホジキンリンパ腫および乳癌の治療に認可されていて、そのような治療薬の２つの例である。あるいは、抗体を用いて、抗体が毒素と結合し、腫瘍と特異的に結合することによりその毒素を腫瘍に向ける抗体複合体を作製することができる。ゲムツズマブ・オゾガマイシンは、白血病の治療に用いられる認可された抗体複合体の例である。癌細胞と結合し、診断および治療に利用可能性を有するモノクローナル抗体が刊行物に開示されている。例えば、とりわけ、多少の分子量の標的タンパク質を開示する以下の特許出願：米国特許第６，０５４，５６１号（２００ＫＤ  ｃ−ｅｒｂＢ−２（Ｈｅｒ２）、およびサイズ４０〜２００ＫＤのその他の未知の抗原）および米国特許第５，６５６，４４４号（５０ＫＤおよび５５ＫＤ、癌胎児性タンパク質）を参照されたい。臨床実験中の抗体および／または固形腫瘍の治療に認可された抗体の例としては、トラスツズマブ（抗原：１８０ｋＤ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、エドレコロマブ（抗原：４０〜５０ｋＤ、Ｅｐ−ＣＡＭ）、抗ヒト乳脂肪球（ＨＭＦＧ１）（抗原＞２００ｋＤ、ＨＭＷ  ムチン）、セツキシマブ（抗原：１５０ｋＤおよび１７０ｋＤ、ＥＧＦ受容体）、アレムツズマブ（抗原：２１〜２８ｋＤ、ＣＤ５２）、ならびにリツキシマブ（抗原：３５ｋＤ、ＣＤ２０）が挙げられる。
【０００３】
乳癌の治療に用いられるトラスツズマブ（Ｈｅｒ−２受容体）の抗原標的、および数種類の癌の治療のための臨床実験中のセツキシマブ（ＥＧＦ受容体）は、いくらかの検出可能なレベルで皮膚、結腸、肺、卵巣、肝臓、および膵臓をはじめとする多数の正常なヒト成体組織に存在する。これらの治療薬を用いる際の安全域は、おそらくこれらの部位での抗体の発現レベル、抗体のアクセス、または抗体の活性の差によって提供される。
【０００４】
別の種類の免疫療法は、能動免疫療法、あるいは、特定の癌に存在する抗原、または抗原の発現を指示するＤＮＡ構築物を用いるワクチン接種であり、それはその後個体に免疫応答を誘起する、すなわち、それら独自の癌に対する抗体を活発に産生するよう個体を誘導する。能動免疫療法は受動免疫療法または免疫毒素ほど頻繁には用いられていない。
【０００５】
疾患（癌を含む）進行のモデルがいくつか提案されている。理論は、単一の感染／形質転換事象による因果関係から、次第に「疾患様」または「癌様」組織種へ進化し、最終的に完全に病原性のまたは悪性の可能性をもつ組織へと導くものまで多岐にわたる。例えば、癌に関して、単一の突然変異による事象が悪性腫瘍を引き起こすために十分であるという議論もあれば、その後の変更も必要であるという議論もある。別の誰かは、細胞レベルでの一連の突然変異−選択事象による新生組織形成の開始ならびに発達の双方に、突然変異荷重および腫瘍の異型度の増加が必要であると示唆している。腫瘍組織にしか見出されない癌標的もあれば、正常な組織に存在して腫瘍組織を上方制御および／または過剰発現する癌標的もある。そのような状況において、一部の研究者は過剰発現が悪性腫瘍の獲得に関連していると示唆し、その一方で、他の研究者は過剰発現が単に高まりつつある疾病状態の進路に沿った動向を示すマーカーであると示唆している。
【０００６】
理想的な診断用および／または治療用抗体に求められる一態様は、種々の癌に関連する抗原の発見および特性決定である。非癌細胞での発現が制限されている、多くの種類の癌で発現する少数の抗原（例えば、「汎癌」抗原）がある。そのような抗原の単離および精製は、抗原を標的化する抗体（例えば、診断用または治療用の）の作製に有用であろう。「汎癌」抗原との抗体結合は、異なる組織で見出される種々の癌を標的にすることができ、１つの特定の種類の癌のみと関連のある抗原に対する抗体と大きく異なっている。また、抗原は、創薬（例えば、小分子）、ならびに細胞調節、増殖、および分化のさらなる特性決定にも有用であろう。
【０００７】
必要とされるものは、疾患細胞および／または癌細胞の表面の新規な標的であり、その標的はそのような疾患および／または癌を、細胞表面標的を特異的に認識する抗体およびその他の薬剤で治療するために用いることができる。本明細書に開示される発見に基づいて、ＥｐｈＡ２の疾患を促進する活性を（低下させるかまたは高めることにより）調節することのできる、細胞の表面で標的を特異的に認識する新規な抗体およびその他の薬剤に対してさらなる必要性が存在する。
【０００８】
以前はＥＣＫとして知られていたＥｐｈＡ２は、１３０ｋＤの膜貫通型受容体チロシンキナーゼであり、成体上皮細胞に発現する。Ｌｉｎｄｂｅｒｇ，ら（１９９０）ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：６３１６−６３２４を参照されたい。ＥｐｈＡ２は、受容体チロシンキナーゼのＥｐｈファミリーの１メンバーであり、Ｅｐｈファミリーは、隣接する細胞の膜に固定される、エフリンとして公知のリガンドを認識する、という点で独特である。Ｂａｒｔｌｅｙ，ら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：５５８−５６０を参照されたい。ヒト受容体ＥｐｈＡ２の配列は文献中で公知である。それは５３４アミノ酸の細胞外ドメイン、２４アミノ酸の膜貫通ドメイン、およびチロシンキナーゼドメインを含む４１８アミノ酸の細胞質ドメインを包含する。
【０００９】
ＥｐｈＡ２は、多数の癌細胞、例えば、乳房、前立腺、肺、および結腸の癌腫において、ならびに攻撃的な黒色腫で過剰発現するが、報告によれば、これらの同じ組織の非癌性の病変では過剰発現しない。例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ら（１９９７）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７３：Ｇ８２４−Ｇ８３２；Ｅａｓｔｙ，ら（１９９５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６０：１２９−１３６；Ｗａｌｋｅｒ−Ｄａｎｉｅｌｓ，ら（１９９９）Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ４１：２７５−２８０；Ｚａｎｔｅｋら（１９９９）Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ＆  Ｄｉｆｆｅｒ．１０：６２９−６３８；Ｚａｎｔｅｋら（２００１）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７：３６４０−３６４８；Ｚｅｌｎｉｓｋｉら（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：２３０１−２３０６；ＷＯ０１／１２１１７２；およびＷＯ０１／１２８４０を参照されたい。さらに、ＥｐｈＡ２を過剰発現するように形質変換されている細胞は、悪性増殖およびリガンド結合を示し、それによりＥｐｈＡ２は内在化され、分解されて、ＥｐｈＡ２過剰発現の発癌作用が逆になる。Ｚｅｌｎｉｓｋｉら（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：２３０１−２３０６；およびＷａｌｋｅｒ−Ｄａｎｉｅｌｓ，ら（２００２）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１：７９−８７を参照されたい。
【００１０】
ＥｐｈＡ２を治療標的として用いることは、当技術分野の研究者らにより提案されてきた。一人の執筆者は、ヒト免疫グロブリンＧとのエフリンＡ１融合体などのＥｐｈＡ２リガンドの使用を提案した。ＥｐｈＡ２を発現している細胞のエフリンＡ１−Ｆｃ融合タンパク質への曝露の結果、ＥｐｈＡ２発現の下方制御がもたらされた。非特許文献１を参照されたい。
【００１１】
ｅｃｋ／ＥｐｈＡ２に対する抗体は公知である。例えば、非特許文献２を参照されたい。抗ＥｐｈＡ２抗体を用いる、抗体に基づく標的化の使用は、他の研究者らに記載されている。例えば、ヒト免疫グロブリンと融合したＥｐｈＡ２の細胞外ドメインを用いる、ＥｐｈＡ２に対するモノクローナル抗体の作製が記載されている、非特許文献３を参照されたい。これらの抗ＥｐｈＡ２モノクローナル抗体を用いる癌細胞の処置の結果、軟寒天上での細胞増殖の形態学的変化および細胞増殖の阻害がもたらされた。
【００１２】
ＥｐｈＡ２に対する抗体が作製され、癌の治療に有用であることが提案されている（例えば、特許文献１；特許文献２および特許文献３；米国特許仮出願第６０／３７９，３２２号および同６０／３７９，３６８号；特許文献４を参照されたい）。ＷＯ２００３ＵＳ１５０４４号には、ＥｐｈＡ２と結合してＥｐｈＡ２を作動させ、それにより、ＥｐｈＡ２のリン酸化を増加させてＥｐｈＡ２レベルを低下させる、有効量の抗体の投与を含む方法が記載されている。他の実施形態では、その特許出願には、ＥｐｈＡ２と結合して軟寒天での癌細胞コロニー形成を阻害する有効量の抗体の投与が、３次元の基底膜または細胞外マトリックス調製物での管状のネットワーク形成を阻害し、癌細胞に露出しているが非癌細胞には露出していないＥｐｈＡ２エピトープと選択的に結合し、かつ／または低いＫｏｆｆを有し、それにより、腫瘍細胞増殖および／または転移を阻害することが記載されている。特許文献１には、ＥｐｈＡ２のホスホチロシン含量を増加させる抗体を用いて腫瘍細胞の増殖を阻害する抗体が記載されている。
【００１３】
特許文献５には、ＥｐｈＡ２に由来するペプチドおよびそれらの抗腫瘍免疫療法での使用が記載されている。それにはＥｐｈＡ２を過剰発現する腫瘍細胞への細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞応答を誘導または模倣するために用いることのできるＥｐｈＡ２エピトープに基づくペプチドワクチン接種または免疫療法が記載されている。
【００１４】
ＥｐｈＡ２抗体は公知であるが、腫瘍細胞増殖の阻害に、先行技術で示されるＥｐｈＡ２抗体の示す有効性のレベルを超えて、極めて効果的な特定の抗ＥｐｈＡ２抗体に対する必要性がなお残っている。
【００１５】
本明細書に開示される全ての参照文献、刊行物、および特許出願は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【特許文献１】米国特許第６，９２７，２０３号明細書
【特許文献２】国際公開第０１／１２８４０号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０１／１２１７２号パンフレット
【特許文献４】米国特許第５，８２４，３０３号明細書
【特許文献５】国際公開第２００３９１３８３号パンフレット
【非特許文献１】Ｄｕｘｂｕｒｙ，ら（２００４）ＢＢＲＣ  ３２０：１０９６−１１０２
【非特許文献２】Ｌｉｎｄｂｅｒｇ，ら（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：６３１６−６３２４
【非特許文献３】Ｃｈａｒｌｅｓ−Ｋｉｎｃｈら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：２８４０−２８４７
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の概要
本明細書に開示される本発明は、種々のヒト癌で発現するＥｐｈＡ２という抗原と結合する抗体に関する。従って、一態様では、本発明は、抗原ＥｐｈＡ２と選択的に結合する、抗体の１ファミリー、または１つの抗体もしくは１つのポリペプチド（抗体であってもなくてもよい）である。本発明において特許請求される抗体は、先行技術で示されるＥｐｈＡ２抗体の示す有効性のレベルを超えて、腫瘍細胞増殖の阻害に意外にも且つ非常に効果的である。これらの抗体のうちのいくつかは、本明細書においてＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＬＵＣＡ４０、またはＳＧ５と呼ばれている。本発明の態様では、腫瘍細胞の増殖を阻害する能力を有するが、ＥｐｈＡ２のホスホチロシン含量を増加させない特定の抗体が発見された。
【００１７】
別の態様では、本発明は、以下の宿主細胞株：２００３年３月２０日Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されたＰＴＡ−５０７０、２００４年６月８日Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されたＰＴＡ−６０５６、２００４年６月８日Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されたＰＴＡ−６０５９、および２００６年２月２日Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されたＳＧ５産生宿主細胞株（ＳＧ．３．１５．Ｂ４．１Ｆ９）のうちのいずれか１つから産生されたモノクローナル抗体、抗ＥｐｈＡ２である。
【００１８】
別の態様では、本発明は、抗体、または抗ＥｐｈＡ２抗体とＥｐｈＡ２との特異的結合を競合的に阻害するポリペプチド（抗体であってもなくてもよい）である。別の態様では、本発明は、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０が選択的に結合するように、ＥｐｈＡ２の同一エピトープと選択的に結合する抗体またはポリペプチド（抗体であってもなくてもよい）である。
【００１９】
別の態様では、本発明は、抗ＥｐｈＡ２抗体の断片または領域を含む抗体である。一実施形態では、断片は抗ＥｐｈＡ２抗体の軽鎖である。もう１つの実施形態では、断片は抗ＥｐｈＡ２抗体の重鎖である。さらに別の実施形態では、断片は、抗ＥｐｈＡ２抗体の軽鎖および／または重鎖由来の１またはそれ以上の可変領域を含む。さらに別の実施形態では、断片は、抗ＥｐｈＡ２抗体の軽鎖および／または重鎖由来の１またはそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００２０】
別の態様では、本発明は、次の、抗ＥｐｈＡ２抗体の：ａ）１またはそれ以上のＣＤＲ；ｂ）軽鎖由来の３つのＣＤＲ；ｃ）重鎖由来の３つのＣＤＲ；ｄ）軽鎖由来の３つのＣＤＲおよび重鎖由来の３つのＣＤＲ；ｅ）軽鎖可変領域；ｆ）重鎖可変領域、のいずれかを含むポリペプチド（抗体であってもなくてもよい）を提供する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０に由来するヒト化抗体である。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、抗ＥｐｈＡ２抗体の１またはそれ以上のＣＤＲを含む。別の態様では、本発明は、抗ＥｐｈＡ２抗体と同一のエピトープと結合するヒト化抗体を提供する。概して、本発明のヒト化抗体は、抗ＥｐｈＡ２抗体のＣＤＲと同一の、かつ／または抗ＥｐｈＡ２抗体のＣＤＲに由来する、１またはそれ以上（１、２、３、４、５、６）のＣＤＲを含む。別の態様では、本発明は、抗ＥｐｈＡ２抗体と同一のＥｐｈＡ２上のエピトープと結合するヒト抗体を提供する。
【００２２】
別の態様では、本発明は、抗ＥｐｈＡ２抗体の重鎖および軽鎖の可変領域由来の可変領域およびヒト抗体の重鎖および軽鎖の定常領域由来の定常領域を含むキメラ抗体である。
【００２３】
さらにもう１つの態様では、本発明は、宿主細胞（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５０７０、ＰＴＡ−６０５６、ＰＴＡ−６０５９、またはＳＧ．３．１５．Ｂ４．１Ｆ９（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−ＸＸＸＸ））またはモノクローナル抗ＥｐｈＡ２抗体を産生するその後代である。
【００２４】
別の態様では、本発明は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５０７０、ＰＴＡ−６０５６、もしくはＰＴＡ−６０５９または宿主細胞ＳＧ．３．１５．Ｂ４．１Ｆ９（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−ＸＸＸＸ）の宿主細胞あるいはその後代により産生される抗ＥｐｈＡ２抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドである。別の態様では、本発明は、本明細書に記載される抗体（抗体断片を含む）のいずれか、ならびにその他のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２５】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される抗体またはポリペプチドのいずれかにより結合されているＥｐｈＡ２の複合体である。一部の実施形態では、ＥｐｈＡ２は、黒色腫細胞、乳癌細胞、結腸癌細胞、肺癌細胞、または前立腺癌細胞に存在する。一部の実施形態では、本発明は、抗ＥｐｈＡ２抗体、または抗ＥｐｈＡ２抗体が選択的に結合するエピトープと選択的に結合する抗体により結合しているＥｐｈＡ２の複合体である。一実施形態では、抗ＥｐｈＡ２抗体、または抗ＥｐｈＡ２抗体が選択的に結合するエピトープと選択的に結合するいずれかの抗体は、治療薬（毒素など）と結合されている。
【００２６】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される抗体またはポリペプチドのいずれかにより結合されているＥｐｈＡ２を発現している癌細胞の複合体である。一部の実施形態では、癌細胞は、黒色腫細胞、乳癌細胞、結腸癌細胞、肺癌細胞、または前立腺癌細胞である。一部の実施形態では、抗体は、ＳＰＬ１、ＬＵＣＡ１９、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０、あるいはこれらの抗ＥｐｈＡ２抗体のいずれかが選択的に結合するエピトープと選択的に結合するいずれかの抗体である。一部の実施形態では、ＳＰＬ１、ＬＵＣＡ１９、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０抗体、あるいはこれらの抗ＥｐｈＡ２抗体のいずれかが選択的に結合するエピトープと選択的に結合するいずれかの抗体は、治療薬（毒素など）と結合されている。
【００２７】
別の態様では、本発明は、ＳＰＬ１、ＬＵＣＡ１９、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０が選択的に結合し、それが次に本明細書に記載される抗体またはポリペプチドのいずれかにより結合されているＥｐｈＡ２上のエピトープの複合体である。一部の実施形態では、エピトープは黒色腫細胞、乳癌細胞、結腸癌細胞、肺癌細胞、または前立腺癌細胞上にある。一部の実施形態では、抗体は、ＳＰＬ１、ＬＵＣＡ１９、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０、あるいはこれらの抗ＥｐｈＡ２抗体のいずれかが選択的に結合するエピトープと選択的に結合するいずれかの抗体である。一部の実施形態では、ＳＰＬ１、ＬＵＣＡ１９、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０、あるいはこれらの抗ＥｐｈＡ２抗体のいずれかが選択的に結合するエピトープと選択的に結合するいずれかの抗体は、治療薬（毒素など）と結合されている。
【００２８】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載されるポリペプチド（抗ＥｐｈＡ２抗体などのいずれかの抗体を含む）またはポリヌクレオチドのいずれかを含む医薬組成物、例えば、抗ＥｐｈＡ２抗体（抗ＥｐｈＡ２抗体は治療薬と結合し、抗体は抗ＥｐｈＡ２抗体の断片、抗ＥｐｈＡ２抗体のヒト化抗体、抗ＥｐｈＡ２抗体の可変領域に由来する可変領域とヒト抗体の定常領域に由来する定常領域とを含むキメラ抗体、または抗ＥｐｈＡ２抗体の１またはそれ以上の特性をもつヒト抗体を含む）および薬学的に受容可能な賦形剤を含む医薬組成物である。
【００２９】
さらに別の態様では、本発明は、（ａ）宿主哺乳類を免疫原で免疫化する工程；（ｂ）哺乳類からリンパ球を得る工程；（ｃ）リンパ球（ｂ）を骨髄腫細胞株で融合してハイブリドーマを作製する工程；（ｄ）（ｃ）のハイブリドーマを培養してモノクローナル抗体を作製する工程；および（ｅ）抗体をスクリーニングして、疾患細胞および／または癌細胞あるいは疾患細胞株および／または癌細胞株と結合するが、非癌細胞または正常細胞あるいは非癌細胞株または正常細胞株と結合しない、あるいは低いレベルで正常細胞と結合するかまたは異なる方法で正常細胞と結合する抗体のみを選択する工程を含む、疾患細胞および／または癌細胞と反応性のモノクローナル抗体、抗ＥｐｈＡ２を生成する方法である。
【００３０】
別の態様では、本発明は、抗体の産生を可能にする条件下で、そのような抗体またはその後代をコードする宿主細胞を培養する工程、および抗ＥｐｈＡ２抗体を精製する工程を含む、抗ＥｐｈＡ２ファミリー抗体を生成する方法である。
【００３１】
別の態様では、本発明は、抗体の産生を可能にする条件下で、宿主細胞またはその後代を培養する工程、および抗ＥＰＨＡ２抗体を精製する工程を含む、抗ＥｐｈＡ２ファミリー抗体を生成する方法である。
【００３２】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される抗体（またはポリペプチド）のいずれかを、適した細胞において、抗体（１つのベクターから単一の軽鎖または重鎖として別々に発現してもよいし、または軽鎖および重鎖の双方が発現してもよい）をコードする１またはそれ以上のポリヌクレオチドを発現させることにより、一般に、その後目的の抗体またはポリペプチドを回収することおよび／または単離することにより、生成する方法を提供する。
【００３３】
別の態様では、本発明は、抗ＥｐｈＡ２抗体のＥｐｈＡ２との選択的な結合を競合的に阻害する、抗ＥｐｈＡ２抗体またはポリペプチド（抗体であってもなくてもよい）である。一部の実施形態では、本発明は、他の抗ＥｐｈＡ２抗体と同一または異なるＥｐｈＡ２上のエピトープと選択的に結合する、抗体またはポリペプチド（抗体であってもなくてもよい）である。
【００３４】
さらに別の態様では、本発明は、ＥｐｈＡ２のエピトープに特異的な抗体により結合されているＥｐｈＡ２を含む組成物である。一実施形態では、抗体は抗ＥｐｈＡ２である。他の実施形態では、２またはそれ以上の抗ＥｐｈＡ２抗体がＥｐｈＡ２の２またはそれ以上の異なるエピトープにマッピングする抗体とともに投与される。一部の実施形態では、抗ＥｐｈＡ２抗体は、治療薬または検出可能な標識と結合されている。
【００３５】
別の態様では、本発明は、抗ＥｐｈＡ２抗体の断片または領域を含む抗体である。一実施形態では、断片は抗体の軽鎖である。別の実施形態では、断片は抗体の重鎖である。さらに別の実施形態では、断片は、抗体の軽鎖および／または重鎖由来の１またはそれ以上の可変領域を含む。さらに別の実施形態では、断片は抗体の軽鎖および／または重鎖由来の１またはそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００３６】
別の態様では、本発明は、次の、抗ＥｐｈＡ２抗体の：ａ）軽鎖または重鎖由来の１またはそれ以上のＣＤＲ（またはその断片）；ｂ）軽鎖由来の３つのＣＤＲ；ｃ）重鎖由来の３つのＣＤＲ；ｄ）軽鎖由来の３つのＣＤＲおよび重鎖由来の３つのＣＤＲ；ｅ）軽鎖可変領域；ｆ）重鎖可変領域、のいずれかを含むポリペプチド（抗体であってもなくてもよい）を提供する。
【００３７】
別の態様では、本発明は、ヒト化抗体である。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、非ヒト抗ＥｐｈＡ２抗体の１またはそれ以上のＣＤＲを含む。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、他の抗ＥｐｈＡ２抗体と同一または異なるエピトープと結合する。概して、本発明のヒト化抗体は、本来の非ヒト抗ＥｐｈＡ２抗体のＣＤＲと同一である、かつ／またはＣＤＲに由来する１またはそれ以上の（１、２、３、４、５、６またはそれらの断片）ＣＤＲを含む。一部の実施形態では、ヒト抗体は、他の抗ＥｐｈＡ２抗体と同一または異なるエピトープと結合する。別の態様では、本発明は、非ヒト抗ＥｐｈＡ２抗体の重鎖および軽鎖の可変領域に由来する可変領域、ならびにヒト抗体の重鎖および軽鎖の定常領域由来の定常領域を含むキメラ抗体である。
【００３８】
別の態様では、本発明は、それぞれＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５０７０、ＰＴＡ−６０５６、またはＰＴＡ−６０５９の宿主細胞、および宿主細胞ＳＧ．３．１５．Ｂ４．１Ｆ９（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−ＸＸＸＸ）またはその後代により産生される抗体ＳＰＬ１、ＬＵＣＡ１９、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０のいずれか１つをコードする、単離されたポリヌクレオチドである。本発明は、上記の抗体のいずれかの固有の結合または生物活性を有する抗体ポリペプチドを包含する。別の態様では、本発明は、本明細書に記載されるいずれかの抗体（抗体断片を含む）ならびにその他の任意のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００３９】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載されるポリペプチド（本明細書に記載される抗体のいずれかを含む）またはポリヌクレオチドのいずれかを含む医薬組成物で、例えば、化学療法薬と結合されている抗ＥｐｈＡ２抗体、抗ＥｐｈＡ２抗体の断片を含む抗体、非ヒト抗ＥｐｈＡ２抗体のヒト化抗体、非ヒト抗ＥｐｈＡ２抗体の可変領域に由来する可変領域およびヒト抗体の定常領域に由来する定常領域を含むキメラ抗体、または非ヒト抗ＥｐｈＡ２抗体の１またはそれ以上の特性を持つヒト抗体、あるいは、化学療法薬（放射性部分など）と結合している本明細書に記載される抗ＥｐｈＡ２抗体のいずれか、ならびに薬学的に受容可能な賦形剤を含む医薬組成物である。
【００４０】
一態様では、本発明は、疾患細胞または癌細胞上に存在するＥｐｈＡ２と結合した抗ＥｐｈＡ２抗体を含む組成物である。好ましい実施形態では、癌細胞は、卵巣癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、膵癌細胞、結腸癌細胞、および乳癌細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、癌細胞は単離されている。一部の実施形態では、癌細胞は生体サンプル中に存在する。概して、生体サンプルは個体、例えばヒトに由来する。
【００４１】
別の態様では、本発明は、個体の細胞上のＥｐｈＡ２を検出することにより、個体における疾患、特に個体における炎症反応または自己免疫応答に関連する疾患または障害を診断する方法である。本発明の他の態様では、方法は、個体における炎症反応または自己免疫応答を調節するために提供される。本発明の組成物および方法を用いて治療され得る疾患、ならびに炎症および自己免疫疾患から生じる状態としては、例示目的であって限定目的ではないものとして、多発性硬化症、髄膜炎、脳炎、卒中、その他の脳外傷、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む）、重症筋無力症、狼瘡、慢性関節リウマチ、喘息、急性若年型糖尿病、ＡＩＤＳ、認知症、アテローム性動脈硬化症、腎炎、網膜炎、アトピー性皮膚炎、乾癬、心筋虚血および急性白血球媒介性肺損傷が挙げられる。
【００４２】
本発明の抗体およびその他の治療薬の治療用途のためのさらに他の適応としては、臓器または移植片拒絶反応のリスクがある個体への投与が含まれる。ここ数年、皮膚、腎臓、肝臓、心臓、肺、膵臓および骨髄などの組織および臓器を移植するための外科的手法の効率には相当な改善があった。おそらく、主な目立った問題は、レシピエントにおいて移植した同種移植片または臓器に対する免疫寛容を低下させる満足のいく薬剤がないことである。同種異系細胞または臓器が宿主に移植される（すなわち提供者および被提供者が同一の種の異なる個体である）場合、宿主免疫系は、移植片中の外来抗原に対する免疫応答を開始し（宿主対移植片病）、移植組織の破壊をもたらす可能性がある。
【００４３】
別の態様では、本発明は、選択された個体由来細胞でＥｐｈＡ２の発現があるかどうかを判定する工程を含む、個体が癌を有しているかどうかを診断する方法であり、この際、前記細胞でのＥｐｈＡ２の発現が前記の癌を示している。一部の実施形態では、ＥｐｈＡ２の発現は、抗ＥｐｈＡ２抗体を用いて判定される。一部の実施形態では、本方法は、細胞からＥｐｈＡ２発現のレベルを検出する工程を含む。本明細書において用語「検出」には、対照の参照を含むまたは含まない定性的および／または定量的検出が含まれる（レベル測定）。
【００４４】
さらに別の態様では、本発明は、個体由来の細胞上のＥｐｈＡ２または細胞から放出されたＥｐｈＡ２を検出することによる、個体において癌を診断する方法であり、癌は、限定されないが、副腎腫瘍、ＡＩＤＳ関連の癌、胞状軟部肉腫、星状細胞腫、膀胱癌（扁平上皮癌および移行上皮癌）、骨癌（アダマンチノーマ、動脈瘤様骨嚢胞、骨軟骨腫、骨肉腫）、脳腫瘍脳癌および脊髄癌、転移性脳腫瘍、乳癌、頚動脈球腫瘍、子宮頸癌、軟骨肉腫、脊索腫（ｄｈｏｒｄｏｍａ）、嫌色素細胞性腎癌、明細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、脳室上衣腫、ユーイング腫瘍、骨外性粘液性軟骨肉腫、骨の線維形成不全症（ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔａ  ｏｓｓｉｕｍ）、線維性骨異形成症、胆嚢癌および胆管癌、妊娠性絨毛性疾患、胚細胞腫瘍、頭頸部癌、膵島腫瘍、カポジ肉腫、腎臓癌（腎芽細胞腫、乳頭状腎細胞癌）、白血病、脂肪腫／良性の脂肪性腫瘍、脂肪肉腫／悪性の脂肪性腫瘍、肝臓癌（肝芽腫、肝細胞癌）、リンパ腫、肺癌（小細胞癌、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、など）、髄芽細胞腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌腫瘍症、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽腫、神経内分泌腫瘍、卵巣癌、膵癌、甲状腺乳頭癌、副甲状腺癌、小児癌、末梢神経鞘腫瘍、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、前立腺癌、後部ブドウ膜黒色腫（ｐｏｓｔｅｒｉｏｕｓ  ｕｎｖｅａｌ  ｍｅｌａｎｏｍａ）、珍しい血液病、腎転移癌、ラブドイド腫瘍、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃癌、滑膜肉腫、精巣癌、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺転移癌、および子宮癌（頚部の癌、子宮内膜癌、および平滑筋腫）からなる群から選択される。
【００４５】
別の態様では、本発明は、個体由来の生体サンプル中のＥｐｈＡ２の発現を判定する工程を含む、個体において癌（限定されないが卵巣癌、肺癌、前立腺癌、膵癌、結腸癌、または乳癌など）の診断を助けるための方法である。一部の実施形態では、ＥｐｈＡ２の発現は、抗ＥｐｈＡ２抗体を用いて判定される。一部の実施形態では、抗ＥｐｈＡ２抗体は、本明細書において具体的に名前を付けたファミリーメンバーである。一部の実施形態では、本方法は、細胞からＥｐｈＡ２発現のレベルを検出する。
【００４６】
さらに別の態様では、本発明は、癌細胞の増殖を低下させるために十分な、ＥｐｈＡ２と結合する有効量の抗体を投与することにより癌を治療する方法である。一部の実施形態では、抗体は抗ＥｐｈＡ２抗体である。特定の実施形態では、癌細胞は、限定されないが、副腎腫瘍、ＡＩＤＳ関連の癌、胞状軟部肉腫、星状細胞腫、膀胱癌（扁平上皮癌および移行上皮癌）、骨癌（アダマンチノーマ、動脈瘤様骨嚢胞、骨軟骨腫、骨肉腫）、脳癌および脊髄癌、転移性脳腫瘍、乳癌、頚動脈球腫瘍、子宮頸癌、軟骨肉腫、脊索腫（ｄｈｏｒｄｏｍａ）、嫌色素細胞性腎癌、明細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、脳室上衣腫、ユーイング腫瘍、骨外性粘液性軟骨肉腫、骨の線維形成不全症（ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔａ  ｏｓｓｉｕｍ）、線維性骨異形成症、胆嚢癌および胆管癌、妊娠性絨毛性疾患、胚細胞腫瘍、頭頸部癌、膵島腫瘍、カポジ肉腫、腎臓癌（腎芽細胞腫、乳頭状腎細胞癌）、白血病、脂肪腫／良性の脂肪性腫瘍、脂肪肉腫／悪性の脂肪性腫瘍、肝臓癌（肝芽腫、肝細胞癌）、リンパ腫、肺癌（小細胞癌、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、など）、髄芽細胞腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌腫瘍症、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽腫、神経内分泌腫瘍、卵巣癌、膵癌、甲状腺乳頭癌、副甲状腺癌、小児癌、末梢神経鞘腫瘍、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、前立腺癌、後部ブドウ膜黒色腫（ｐｏｓｔｅｒｉｏｕｓ  ｕｎｖｅａｌ  ｍｅｌａｎｏｍａ）、珍しい血液病、腎転移癌、ラブドイド腫瘍、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃癌、滑膜肉腫、精巣癌、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺転移癌、および子宮癌（頚部の癌、子宮内膜癌、および平滑筋腫）からなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、癌細胞は、限定されないが、乳癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌、肉腫、腎転移癌、甲状腺転移癌、および明細胞癌をはじめとする、固形腫瘍からなる群から選択される。
【００４７】
さらに別の態様では、本発明は、ＥｐｈＡ２と特異的に結合する抗体のファミリーの少なくとも１つの有効量を投与する工程を含む、癌を有する個体において転移の発生を遅らせる方法である。一実施形態では、抗体は抗ＥｐｈＡ２抗体である。別の態様では、本発明は、化学療法薬と会合している（結合しているものも含む）抗ＥｐｈＡ２抗体を含む有効量の組成物を細胞培養もしくはサンプルへ、または個体へ投与する工程を含む、インビトロで、または個体において、癌細胞の成長および／または増殖を阻害する方法である。
【００４８】
さらに別の態様では、本発明は、ＥｐｈＡ２と選択的に結合する抗体のファミリーの少なくとも１つのメンバーの有効量を個体へ投与することによる、個体において治療薬を癌細胞へ送達する方法である。他の実施形態では、抗ＥｐｈＡ２抗体は、別の治療薬と組み合わせて（結合しているものも含む）個体へ送達される。
【００４９】
一部の実施形態では、抗ＥｐｈＡ２抗体は、本明細書において名前を付けた抗体ファミリーメンバーに由来するヒト化抗体である（一般に、しかしそうとは限らないが、抗体の一部または完全ＣＤＲを１またはそれ以上含む）。一部の実施形態では、抗ＥｐｈＡ２抗体は、名前を付けた抗体ファミリーメンバーの１またはそれ以上の特性を有するヒト抗体である。一部の実施形態では、化学療法薬（毒素または放射性分子など）は癌細胞の中へ送達される（内部に取り入れられる）。一部の実施形態では、治療薬はサポリンである。
【００５０】
別の態様では、本発明は、化学療法薬と会合している（結合しているものも含む）抗ＥｐｈＡ２抗体を含む有効量の組成物を個体に投与する工程を含む、個体において癌を治療する方法である。
【００５１】
本発明は、ＥｐｈＡ２の細胞質シグナル伝達パートナーとの会合を促進または低下させることによって調節する方法をさらに提供する。ＥｐｈＡ２の細胞質シグナル伝達パートナーとの会合は、細胞表面に提示されるＥｐｈＡ２分子を、シグナル伝達パートナーとＥｐｈＡ２との結合を調節する薬剤と接触させることにより大きな影響を与えることができる。その結合および／またはシグナル伝達パートナーとＥｐｈＡ２の会合を阻害または低下させる薬剤を用いて、ＥｐｈＡ２に媒介される炎症または免疫応答に関与する生物学的過程および病理過程を調節することができる。この作用を伴う病理過程としては、腫瘍関連細胞増殖が挙げられる。
【００５２】
薬剤を、結合パートナー、例えば抗ＥｐｈＡ２抗体とのＥｐｈＡ２の会合を阻害、低下、促進、またあるいは調節するその能力について試験することができる。具体的に言えば、ＥｐｈＡ２相互作用部位を（一般に無傷な生細胞に存在するようなそのネイティブな立体構造で）含むペプチドを結合パートナーおよび試験薬剤とともにインキュベートし、試験薬剤が結合パートナーとＥｐｈＡ２ペプチドとの結合を低下または促進したかどうかを判定することにより、そのような相互作用を調節する能力について薬剤を試験することができる。アゴニスト、アンタゴニスト、およびその他のモジュレーターが特に意図される。
【００５３】
特定の態様では、本発明は、（ｉ）個体から得た血液または組織サンプル中のＥｐｈＡ２の存在を分析する工程；（ｉｉ）前記サンプルが、正常な（発病していない）血液または組織サンプルと比較してＥｐｈＡ２マーカーの量が増加していないかどうか判定する工程；および（ｉｉｉ）前記マーカーの増加量と陽性診断とを相互に関連付けるか、または前記マーカーの増加量の不在と疾患の陰性診断とを相互に関連付ける工程を含む、個体において疾患の診断を助ける方法である。特定の実施形態では、マーカーは、抗ＥｐｈＡ２抗体を用いて検出される。特定の実施形態では、本方法は、放射性核種イメージング、フローサイトメトリー、および免疫組織化学からなる群から選択される技術によって達成される。
【００５４】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される抗ＥｐｈＡ２抗体または任意のＥｐｈＡ２結合部分（限定されないが、種々の抗体および抗体誘導体を含むポリペプチド）を用いて個体由来の細胞上のＥｐｈＡ２を検出することにより、個体において癌または転移癌を診断する方法である。一部の実施形態では、癌は、黒色腫、乳癌、結腸癌、肺癌、および前立腺癌である。一部の実施形態では、本方法は、細胞からＥｐｈＡ２のレベルを検出することである。ＥｐｈＡ２の存在は、ＥｐｈＡ２とＥｐｈＡ２結合部分との間の複合体を検出することにより検出される。本明細書において用語「検出」には、対照の参照を含むまたは含まない定性的および／または定量的検出が含まれる（レベル測定）。
【００５５】
別の態様では、本発明は、限定されないが、治療薬と会合した抗ＥｐｈＡ２抗体、抗ＥｐｈＡ２抗体の断片または領域を含む抗体、ヒト化抗体（一般に、しかしそうとは限らないが、抗ＥｐｈＡ２抗体の１またはそれ以上のＣＤＲを含む）、抗ＥｐｈＡ２抗体の可変領域に由来する可変領域とヒト抗体の定常領域に由来する定常領域とを含むキメラ抗体、あるいは、抗ＥｐｈＡ２抗体の１またはそれ以上の特性を持つヒト抗体をはじめとする、本明細書に記載される抗ＥｐｈＡ２抗体、または任意の抗体（ポリペプチドを含む）もしくはポリヌクレオチド実施形態を含む組成物の、癌細胞の増殖を低下させるために十分な有効量を投与することによる、癌を治療する方法である。一部の実施形態では、癌は、黒色腫、乳癌、結腸癌、肺癌、および前立腺癌である。
【００５６】
特定の実施形態では、本発明は、患者において癌を治療する方法であり、前記方法は、ＥｐｈＡ２と特異的に結合し、次のＳＰＬ１、ＬＵＣＡ１９、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０の特性：
ａ．癌細胞上でＥｐｈＡ２と結合する能力；
ｂ．インビトロまたはインビボで生きた癌細胞の表面に露出しているＥｐｈＡ２の一部と結合する能力；
ｃ．ＥｐｈＡ２のホスホチロシン含量を増加させずに腫瘍細胞の増殖を阻害する能力；
ｄ．ＥｐｈＡ２を発現している癌細胞に治療薬または検出可能なマーカーを送達する能力；ならびに
ｅ．ＥｐｈＡ２を発現している癌細胞の中に治療薬または検出可能なマーカーを送達する能力；
のうちの少なくとも１つ、さらに好ましくは２またはそれ以上を有する、治療上有効な量のＥｐｈＡ２抗体を前記患者に投与する工程を含む。
【００５７】
別の態様では、本発明は、限定されないが、治療薬と会合した抗ＥｐｈＡ２抗体、抗ＥｐｈＡ２抗体の断片または領域を含む抗体、ヒト化抗体（一般に、しかしそうとは限らないが、抗ＥｐｈＡ２抗体の１またはそれ以上のＣＤＲを含む）、抗ＥｐｈＡ２抗体の可変領域に由来する可変領域とヒト抗体の定常領域に由来する定常領域とを含むキメラ抗体、あるいは、抗ＥｐｈＡ２抗体の１またはそれ以上の特性を持つヒト抗体をはじめとする、本明細書に記載される抗ＥｐｈＡ２抗体、または任意の抗体（ポリペプチドを含む）もしくはポリヌクレオチド実施形態を含む組成物の、癌細胞の増殖を低下させるために十分な有効量を個体へ投与することによる、個体において癌細胞の成長および／または増殖を阻害する方法である。一部の実施形態では、癌は、黒色腫、乳癌、結腸癌、肺癌、および前立腺癌である。
【００５８】
別の態様では、本発明は、限定されないが、治療薬と会合した抗ＥｐｈＡ２抗体、抗ＥｐｈＡ２抗体の断片または領域を含む抗体、ヒト化抗体（一般に、しかしそうとは限らないが、抗ＥｐｈＡ２抗体の１またはそれ以上のＣＤＲを含む）、抗ＥｐｈＡ２抗体の可変領域に由来する可変領域とヒト抗体の定常領域に由来する定常領域とを含むキメラ抗体、あるいは、抗ＥｐｈＡ２抗体の１またはそれ以上の特性を持つヒト抗体をはじめとする、本明細書に記載される抗ＥｐｈＡ２抗体、または任意の抗体（ポリペプチドを含む）もしくはポリヌクレオチド実施形態を含む組成物の、癌細胞の増殖を低下させるために十分な有効量を投与することによる、癌を有する個体において、転移の発生を防ぐまたは遅延させる、転移癌を治療する、または転移癌細胞の増殖を阻害する方法である。一部の実施形態では、癌は、黒色腫、乳癌、結腸癌、肺癌、および前立腺癌である。
【００５９】
別の態様では、本発明は、治療薬（毒素または放射性分子など）と結合している、本明細書に記載されるＥｐｈＡ２結合抗体または任意のＥｐｈＡ２結合部分（限定されないが抗体もしくは抗体誘導体を含むポリペプチド）の有効量を個体へ投与することによる、個体において、治療薬（毒素または放射性分子など）を癌細胞へ送達する方法である。ＥｐｈＡ２結合部分としては、限定されないが、抗ＥｐｈＡ２抗体、抗ＥｐｈＡ２抗体の断片または領域を含む抗体、またはヒト化抗体（一般に、しかしそうとは限らないが、抗ＥｐｈＡ２抗体の１またはそれ以上のＣＤＲを含む）、抗ＥｐｈＡ２抗体の可変領域に由来する可変領域とヒト抗体の定常領域に由来する定常領域とを含むキメラ抗体、または抗ＥｐｈＡ２抗体の１またはそれ以上の特性を持つヒト抗体が挙げられる。一部の実施形態では、癌細胞は、黒色腫、乳癌、結腸癌、肺癌、および前立腺癌に由来する。別の実施形態では、治療薬（毒素または放射性分子など）は癌細胞の中に送達される（内部に取り入れられる）。従って、本発明は、治療薬がそれらの癌細胞の中へ送達されるように、癌細胞の成長および／または増殖を阻害する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６０】
発明の詳細な説明
本明細書において開示される本発明は、抗原であるＥｐｈＡ２と結合する抗体およびポリペプチド、ならびにこれらの抗体およびポリペプチドを作製し、これらの抗体およびポリペプチドを用いてＥｐｈＡ２の発現および／または過剰発現に関連する種々の疾患ヒト癌を診断および治療する方法を提供する。ＥｐｈＡ２は種々のヒト癌に存在することが示されており、その発現は種々のヒト癌で増加している。以下の項に特定される宿主細胞のいずれか１つにより産生されたものなどの抗ＥｐｈＡ２抗体が生成され、それらはＥｐｈＡ２と選択的に結合することが示されている。
【００６１】
ブダペスト条約に従って、ｍＬＵＣＡ１９を産生するハイブリドーマを１９９３年３月２０日、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ２０１１０−２２０９に特許寄託指定番号ＰＴＡ−５０７０で寄託し、ＳＰＬ１を産生するハイブリドーマを２００４年６月８日、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に特許寄託指定番号ＰＴＡ−６０５９で寄託し、ＬＵＣＡ４０を産生するハイブリドーマを２００４年６月８日、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に特許寄託指定番号ＰＴＡ−６０５６で寄託し、ＳＧ５を産生するハイブリドーマを２００６年２月２日、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に特許寄託指定番号ＰＴＡ−ＸＸＸＸで寄託した。
【００６２】
Ｉ．一般的手法
本発明の実践には、特に示さない限り、この分野の技術の範囲内にある、分子生物学（組み換え技術を含む）、細菌学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の手法が用いられる。そのような手法は文献、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＭＪ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ  Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９３−８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓら、ｅｄｓ．，１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら、ｅｄｓ．，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＡ．Ｊａｎｅｗａｙ  ａｎｄ  Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８−１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃ��ｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）；ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａら、ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）に十分に説明されている。
【００６３】
ＩＩ．定義
ＥｐｈＡ２とは、分子量約１３０ｋＤのポリペプチド抗原を指し、本発明の抗体はこれを対象としている。本明細書にさらに詳細に記載されるように、この抗原は２以上の異なるエピトープを有する。本発明の好ましい抗体の実施形態のいくつかは、該ＥｐｈＡ２抗原の２またはそれ以上の特異的なエピトープのうちの１つを対象としている。現在、ＥｐｈＡ２は対応する正常組織と比較して、ある種の癌細胞において過剰発現すると考えられている。
【００６４】
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的と特異的に結合できる免疫グロブリン分子である。本明細書において、この用語は、無傷なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけでなく、それらの断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、一本鎖（ＳｃＦｖ）、その突然変異体、天然に存在する変異体、必要な特異性を持つ抗原認識部位を有する抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、および必要な特異性を持つ抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子のその他の任意の修飾された構造も包含する。
【００６５】
用語「モノクローナル抗体」は、無傷なモノクローナル抗体および全長モノクローナル抗体だけでなく、それらの断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、一本鎖（ＳｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ならびに必要な特異性をもつ抗原認識部位および抗原との結合能を含む免疫グロブリン分子の、その他の任意の修飾された構造も包含する。それは、抗体の源に関して、または作製方法に関して（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、トランスジェニック動物等により）制限されることを意図しない。
【００６６】
「ヒト化」抗体とは、実質的に非ヒト種由来の免疫グロブリンから得られた抗原結合部位を有し、かつ、分子の免疫グロブリンの残りの構造はヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく分子を指す。抗原結合部位は、定常領域上に融合した完全な可変領域か、または可変領域中の適切なフレームワーク領域上に移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）のみのいずれかを含み得る。抗原結合部位は野生型であってもよく、または１以上のアミノ酸置換により修飾されていてもよい（例えばヒト免疫グロブリンにさらによく似るように修飾されている）。ヒト化抗体の一部の種類は、全てのＣＤＲ配列を保存する（例えば、マウス抗体由来のＣＤＲを６つ全て含むヒト化マウス抗体）。ヒト化抗体の他の種類は、元の抗体に対して変化している１以上（１、２、３、４、５、６）のＣＤＲを有し、また、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０の１以上のＣＤＲに「由来する」１以上のＣＤＲとも呼ばれる。
【００６７】
「キメラ抗体」とは、重鎖および軽鎖の各アミノ酸配列の一部は特定の種由来または特定のクラスに属する抗体の対応する配列と相同であるが、鎖の残りの部分は別の抗体の対応する配列と相同である抗体を指す。一般に、これらのキメラ抗体では、軽鎖および重鎖双方の可変領域は、哺乳類の１つの種由来の抗体の可変領域を模倣しているが、定常部分は別の抗体由来の配列に対して相同である。そのようなキメラ構造の１つの明らかな利点は、例えば、可変領域が、例えばヒト細胞調製物由来の定常領域と組み合わせた、容易に入手できる非ヒト宿主生物由来のハイブリドーマまたはＢ細胞を用いて、現在公知の源から好適に導かれてよいことである。可変領域は調製が容易であり、特異性はその源の影響を受けないという利点を有するが、ヒト由来である定常領域は、抗体が注射された場合に、定常領域がヒト由来でないものよりもヒト被験体から免疫応答を誘起する可能性が低い。しかし、この定義はこの特定の例に限定されない。
【００６８】
抗体またはポリペプチドと「特異的に結合する」または「選択的に結合する」（本明細書では同義的に用いられる）エピトープは、当技術分野でよく理解されている用語であり、そのような特異的または選択的結合を判定する方法も当技術分野で十分に公知である。分子が、別の細胞または物質よりも、より頻繁に、より迅速に、より長い持続時間および／またはより高い親和性で、特定の細胞または物質と反応または会合する場合に、その分子は「特異的結合」または「選択的結合」を示すと言われる。抗体は、他の物質と結合する場合よりも、より高い親和性、結合力で、より容易におよび／またはより長い持続時間で結合する場合に、標的と「特異的に結合する」または「選択的に結合する」という。例えば、特異的または選択的にＥｐｈＡ２エピトープと結合する抗体は、他のＥｐｈＡ２エピトープまたは非ＥｐｈＡ２エピトープと結合する場合よりも、より高い親和性、結合力で、より容易におよび／またはより長い持続時間でこのＥｐｈＡ２エピトープと結合する抗体である。この定義を読めば、例えば、第１の標的に特異的または選択的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）が、第２の標的と特異的または選択的に結合するかどうかは分からないことも理解される。そのようなものとして、「特異的結合」または「選択的結合」は、必ずしも排他的結合を必要としない（が含み得る）。一般に、しかし必ずしもそうではないが、結合に言及する場合には選択的結合を意味する。
【００６９】
エピトープに関して、用語「免疫学的に活性である」、または「免疫学的活性が残っている」とは、抗体（例えば、抗ＥｐｈＡ２抗体）が、異なる条件下（例えば、エピトープが還元条件または変性条件に付された後など）で抗体がエピトープと結合する能力を指す。
【００７０】
本明細書において、用語「ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＬＵＣＡ４０、またはＳＧ５」「抗ＥｐｈＡ２抗体」および「モノクローナル抗ＥｐｈＡ２抗体」とは、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５０７０、ＰＴＡ−６０５６、もしくはＰＴＡ−６０５９の宿主細胞、または宿主細胞ＳＧ．３．１５Ｂ４．１Ｆ９（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−ＸＸＸＸ）もしくはその後代のいずれかにより産生された免疫グロブリンを指すために同義的に用いられる。異なる生物学的機能がＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０に付随し、それには、限定されないが、ＥｐｈＡ２に結合する能力；ＥｐｈＡ２細胞外ドメインに結合する能力；インビトロまたはインビボの生細胞の表面に露出した癌細胞上のＥｐｈＡ２と結合する能力；ＥｐｈＡ２を発現している癌細胞（卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、膵臓癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞または乳癌細胞など）に化学療法薬を送達する能力；ＥｐｈＡ２を発現している癌細胞中へ治療薬または検出可能なマーカーを送達する能力などが挙げられる。本明細書において考察されるように、本発明のポリペプチド（抗体を含む）は、これらの特徴のうちのいずれか１つ以上を有し得る。
【００７１】
「抗ＥｐｈＡ２同等抗体」または「抗ＥｐｈＡ２同等ポリペプチド」とは、抗ＥｐｈＡ２抗体に関連する１以上の生物学的機能（例えば結合特異性など）を有する抗体またはポリペプチドを指す。
【００７２】
本明細書において、「薬剤」とは、生体化合物、医薬品、または化合物を指す。限定されない例としては、単純もしくは複雑な有機もしくは無機分子、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体誘導体、抗体断片、ビタミン誘導体、炭水化物、毒素、または化学療法化合物が挙げられる。例えば、小分子およびオリゴマー（例えば、オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチド）、ならびに様々なコア構造に基づく合成有機化合物などの、様々な化合物を合成することができる。さらに、植物または動物抽出物などの様々な天然源が、スクリーニングのための化合物を提供し得る。当業者であれば、本発明の薬剤の構造的性質に関して制限がないことが容易に認識できる。
【００７３】
本発明の方法で用いられる薬剤は、無作為に選択されるか、または合理的に選択もしくは設計され得る。本明細書において、ＥｐｈＡ２とその固有の結合パートナーまたは既知の抗体との会合に関与する特定の配列を考慮せずに薬剤が無作為に選択される場合に、その薬剤は無作為に選択されると言われる。無作為に選択される薬剤の例は、化学ライブラリーまたはペプチド組み合わせライブラリーの使用である。
【００７４】
本明細書において、薬剤の作用に関連して標的部位の配列および／またはその構造を考慮に入れ、薬剤が非無作為に選択される場合に、その薬剤は合理的に選択または設計されると言われる。抗ＥｐｈＡ２薬剤に関して、現在、ＥｐｈＡ２上には抗体が惹起され得るエピトープが少なくとも３つ存在し、従ってＥｐｈＡ２／抗ＥｐｈＡ２の相互作用を阻害する薬剤の作用部位は少なくとも３つ存在すると考えられている。本発明は、ＥｐｈＡ２とその固有の結合パートナーとの間の相互作用部位で作用する薬剤も包含するが、他のリガンドおよびそれらの活性ＥｐｈＡ２相互作用部位もまた、現在公知であるかまたは後に確認されるかどうかにかかわらず本発明の範囲に包含される。薬剤は、受容体／リガンドおよび／またはＥｐｈＡ２／抗ＥｐｈＡ２抗体複合体の接触部位を構成するペプチド配列を利用することにより、合理的に選択または合理的に設計され得る。例えば、合理的に選択されたペプチド薬剤は、そのアミノ酸配列が、天然の環境において生細胞の表面上に露出したＥｐｈＡ２上に現れるエピトープと同一のペプチドであり得る。そのような薬剤は、所望のように、抗ＥｐｈＡ２抗体または固有のリガンドと結合することにより、抗ＥｐｈＡ２抗体とＥｐｈＡ２との会合、またはＥｐｈＡ２とその固有リガンドとの会合を低下または阻害するであろう。
【００７５】
本明細書において、抗体に関して用語「標識された」は、放射性薬剤またはフルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）もしくはフィコエリトリン（ＰＥ））などの検出可能な物質を抗体にカップリング（すなわち物理的に連結）させることによる抗体の直接標識、ならびに検出可能な物質との反応性によるプローブまたは抗体の間接的標識を包含することを意図する。
【００７６】
本明細書において、抗体に関して用語「会合」は、薬剤（例えば、化学療法薬）との共有付着および非共有付着または共有結合および非共有結合を含む。抗体は、直接結合により、または共通のプラットフォームへの付着を介する間接結合により、抗体が結合している癌細胞に対する薬剤の局在性を抗体が誘導するように（その際、抗体が結合している同じ癌細胞を薬剤が標的としないように、または薬剤の有効性が低減されることがないように、抗体と薬剤とは生理学的条件下では実質的に解離しない）、薬剤（例えば、化学療法薬）と会合することができる。
【００７７】
「生体サンプル」は、個体から得られ、診断またはモニタリングアッセイに用いることができる様々な種類のサンプルを包含する。その定義は、血液および生体起源の他の液体サンプル、生検検体または組織培養物もしくはそれに由来する細胞、およびその後代、例えば、癌の疑いがある個体から採取された組織サンプルから得られた細胞、好ましい実施形態においては卵巣、肺、前立腺、膵臓、結腸、および乳房組織由来の細胞などの固形組織サンプルを包含する。その定義にはまた、それらの調達後に、試薬による処理、可溶化、またはタンパク質もしくはポリヌクレオチドなどの特定成分の濃縮、または切片作製のための半固形もしくは固形マトリックス中への包埋など、何らかの方法で操作されたサンプルも含む。用語「生体サンプル」は、臨床サンプルを包含し、また培養細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、体液、および組織サンプルも含まれる。
【００７８】
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では同義的に用いられ、任意の長さのアミノ酸ポリマーを指す。ポリマーは直線状または分枝状であってよく、修飾アミノ酸を含んでよく、また非アミノ酸により中断されてよい。また、この用語は天然に、または介入（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分との複合体化などの他の操作もしくは修飾）により修飾されているアミノ酸ポリマーも包含する。また、定義には、例えば、１以上のアミノ酸類似体を含むポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸等を含む）、ならびに当技術分野で公知の他の修飾物も含まれる。本発明のポリペプチドは抗体に基づいているために、ポリペプチドは一本鎖または会合した鎖として存在し得ることが当然理解されよう。
【００７９】
抗体の「可変領域」とは、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域の、単独または組み合わせのいずれかを指す。
【００８０】
抗体の「定常領域」とは、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域の、単独または組み合わせのいずれかを指す。
【００８１】
本明細書において、「実質的に純粋な」とは、物質が少なくとも５０％純粋（すなわち混入物質が存在しない）、より好ましくは、少なくとも９０％純粋、より好ましくは、少なくとも９５％純粋、より好ましくは、少なくとも９８％純粋、より好ましくは、少なくとも９９％純粋であることを指す。
【００８２】
「宿主細胞」には、ポリヌクレオチド挿入物の組み込みのための、ベクターに対するレシピエントであり得るか、または既にレシピエントである、個々の細胞または細胞培養物が含まれる。宿主細胞には、単一の宿主細胞の後代が含まれ、後代は、自然突然な、偶然な、または意図的な突然変異の結果、元の親細胞と必ずしも（形態学的に、またはゲノムＤＮＡ相補体が）完全に同一でなくてもよい。宿主細胞には、本発明のポリヌクレオチドを用いてインビボでトランスフェクトされた細胞が含まれる。
【００８３】
本明細書において、「転移の進行を遅らせる」とは、転移の進行を延期し、妨げ、減速し、遅らせ、安定させ、および／または先送りすることを意味する。この遅れは、癌の病歴および／または治療される個体の病歴によって様々な時間の長さであり得る。当業者に明らかなように、十分な、または大幅な遅れというのは、個体が転移を発現しないという点で、実質的に予防を含み得る。
【００８４】
薬剤、化合物、または医薬組成物の「有効量」は、限定されないが、腫瘍サイズの縮小（癌の状況において、例えば乳癌または前立腺癌）、癌細胞の成長の遅延、転移の進行の遅れ、疾患の結果生じる症状の１以上の減少、疾患に苦しむ人々の生活の質の向上、疾患の治療に必要な他の薬物の用量の低減、標的化および／または内部移行によるなど別の薬物の効果の向上、疾患の進行の遅延、および／または個体の生存時間の延長などの臨床結果を含む、有益なまたは望ましい結果をもたらすために十分な量である。有効量は、１回以上の投与で投与することができる。本発明の目的上、薬剤、化合物、または医薬組成物の有効量とは、直接的あるいは間接的に、新生細胞の増殖（もしくは破壊）を低下させるために、および／または、新生細胞の転移の進行または成長を低下および／または遅延させるために十分な量である。
【００８５】
癌の臨床状況において理解されるように、薬剤、化合物、または医薬組成物の有効量は、別の薬剤、化合物、または医薬組成物と併せて達成されてもよく、そうでなくともよい。従って、「有効量」は、１以上の治療薬を投与する状況において考慮されてよく、単一の薬剤は、もし１以上の他の薬剤と併せて望ましい結果が達成される可能性があるか、または達成される場合に、有効量が投与されたとみなされ得る。
【００８６】
本明細書において「治療」または「治療する」とは、好ましい臨床結果を含む、有益な、または望ましい結果を得るためのアプローチである。本発明の目的上、有益な、または望ましい臨床結果としては、限定されないが、次の、新生細胞の増殖（または破壊）の低下、癌において見られる新生細胞の転移の低下、腫瘍サイズの縮小、疾患により生じる症状の軽減、疾患に苦しむ人々の生活の質の向上、疾患の治療に必要な他の薬物の用量の低減、疾患の進行の遅延、および／または患者の生存時間の延長、のうちの１以上の結果が挙げられる。
【００８７】
本明細書において、「転移の進行を遅らせる」とは、転移の進行を延期し、妨げ、減速し、遅らせ、安定させ、および／または先送りすることを意味する。この遅れは、癌の病歴および／または治療される個体の病歴によって様々な時間の長さであり得る。当業者に明らかなように、十分な、または大幅な遅れは、実質的に、個体が転移を発現しない、阻止を包含する。
【００８８】
「生体サンプル」は、個体から得られ、診断またはモニタリングアッセイに用いることができる様々な種類のサンプルを包含する。その定義は、血液および生体起源の他の液体サンプル、生検検体または組織培養物もしくはそれに由来する細胞、およびその後代などの固形組織サンプルを包含する。その定義にはまた、それらの調達後に、試薬による処理、可溶化、またはタンパク質もしくはポリヌクレオチドなどの特定成分の濃縮、または切片作製のための半固形もしくは固形マトリックス中への包埋など、何らかの方法で操作されたサンプルも含む。用語「生体サンプル」は、臨床サンプルを包含し、また培養細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、体液、および組織サンプルも含まれる。
【００８９】
「個体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトである。哺乳類としては、限定されないが、家畜、競技動物、ペット（ネコ、イヌ、ウマなど）、霊長類、マウスおよびラットが挙げられる。
【００９０】
「毒素」または「細胞毒素」とは、細胞の中で有害反応をもたらす任意の物質を指す。例えば、癌細胞に向けられた毒素は、癌細胞に負の影響、場合によっては悪影響を及ぼし得る。
【００９１】
本明細書において、「薬剤」とは、生体化合物、医薬品、または化合物を指す。限定されない例としては、単純もしくは複雑な有機もしくは無機分子、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体誘導体、または抗体断片が挙げられる。例えば、小分子およびオリゴマー（例えば、オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチド）、ならびに様々なコア構造に基づく合成有機化合物などの、様々な化合物を合成することができる。さらに、植物または動物抽出物などの様々な天然源が、スクリーニングのための化合物を提供し得る。
【００９２】
本明細書において、「治療薬」とは、抗腫瘍薬剤、毒素または細胞毒素、細胞毒素薬剤、および放射性薬剤をはじめとする、治療（ここでは、一般に癌における治療）に有用な任意の薬剤を意味する。
【００９３】
「能動免疫応答」とは、抗原、またはその抗原をコードするＤＮＡベクターの、アジュバント有りまたは無しの、静脈内、筋肉内、皮下、または他の投与方法による宿主哺乳類への投与に反応して起こる、インビボでの抗原に対して作られる抗体出現および進行中の産生をさす。能動免疫応答はまた、細胞免疫応答などの免疫応答の他の態様も含み得る。
【００９４】
組成物および組成物の作成方法
本発明は、ＥｐｈＡ２と結合する抗体、ポリペプチドおよびタンパク質を含む医薬組成物、ならびにＥｐｈＡ２と結合する抗体、ポリペプチドおよびタンパク質をコードする配列を含むポリヌクレオチドをはじめとする組成物を包含する。本明細書において、組成物は、ＥｐｈＡ２と結合する１またはそれ以上の抗体、ポリペプチドおよび／またはタンパク質、および／またはＥｐｈＡ２と結合する１またはそれ以上の抗体、ポリペプチドおよびタンパク質をコードする配列を含む１またはそれ以上のポリヌクレオチドを含む。これらの組成物は、当技術分野で周知の、バッファーを含む薬学的に受容可能な賦形剤などの好適な賦形剤をさらに含んでよい。
【００９５】
また、本発明は、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０の様々な製剤、および同等な抗体またはポリペプチド断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃ等）、キメラ抗体、一本鎖（ＳｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、および必要な特異性をもつ抗原認識部位である、抗原（ＥｐｈＡ２）を含むＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０の修飾された構造を包含する。また、本発明は、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０の１またはそれ以上の生物学的特徴を提示するヒト抗体も提供する。ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０の同等な抗体（ヒト化抗体およびヒト抗体を含む）、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０のポリペプチド断片、およびこれらの断片のいずれかを含むポリペプチドは、同定され、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０の１またはそれ以上の特性決定により特徴付けられる。
【００９６】
一部の実施形態では、ＥｐｈＡ２と結合する本発明の抗体、ポリペプチドおよびタンパク質は、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０のＥｐｈＡ２との選択的結合を競合的に阻害するか、または抗ＥｐｈＡ２抗体が選択的に結合するものと同一のＥｐｈＡ２上のエピトープと選択的に結合する抗体、ポリペプチドおよびタンパク質である。
【００９７】
従って、本発明は、以下に示すいずれかを含む、以下に示すいずれか（または医薬組成物を含む組成物）を提供する：（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５０７０、ＰＴＡ−６０５６、もしくはＰＴＡ−６０５９の宿主細胞、または宿主細胞ＳＧ３．１５Ｂ４．１Ｆ９（ＰＴＡ−ＸＸＸＸ）もしくはその後代により産生される抗ＥｐｈＡ２抗体；（ｂ）ヒト化型の抗ＥｐｈＡ２抗体；（ｃ）抗ＥｐｈＡ２抗体の１またはそれ以上の軽鎖および／または重鎖可変領域を含む抗体；（ｄ）抗ＥｐｈＡ２抗体の重鎖および軽鎖の可変領域と相同であるか、またはそれに由来する可変領域、ならびにヒト抗体の重鎖および軽鎖の定常領域と相同であるか、またはそれに由来する定常領域を含む、キメラ抗体；（ｅ）ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０の１またはそれ以上（少なくとも１、２、３、４、５、または６）の軽鎖および／または重鎖のＣＤＲを含む抗体；（ｆ）ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０の重鎖および／または軽鎖を含む抗体；（ｇ）ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０と同等であるヒト抗体。ヒト化型の抗体は、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＬＵＣＡ４０、もしくはＳＧ５、あるいはＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５０７０、ＰＴＡ−６０５６もしくはＰＴＡ−６０５９の宿主細胞、または宿主細胞ＳＧ３．１５Ｂ４．１Ｆ９（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−ＸＸＸＸ）により産生される抗体と同一のＣＤＲを持っていてもいなくてもよい。ＣＤＲ領域の決定は、十分この分野の技術の範囲内である。一部の実施形態では、本発明は、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０の少なくとも１つのＣＤＲ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つのＣＤＲと実質的に相同な少なくとも１つのＣＤＲを含む（または、一部の実施形態ではＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５もしくはＬＵＣＡ４０の６つ全てのＣＤＲと実質的に相同であるか、またはＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＬＵＣＡ４０、またはＳＧ５由来の）抗体、あるいはＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５０７０、ＰＴＡ−６０５６、ＰＴＡ−６０５９の宿主細胞、またはＳＧ３．１５Ｂ４．１Ｆ９（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−ＸＸＸＸ）の宿主細胞により産生される抗体を提供する。その他の実施形態としては、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＬＵＣＡ４０、もしくはＳＧ５の少なくとも２、３、４、５もしくは６つのＣＤＲと実質的に相同であるか、またはＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＬＵＣＡ４０、もしくはＳＧ５に由来する、少なくとも２、３、４、５、または６つのＣＤＲを有する抗体、あるいは、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５０７０、ＰＴＡ−６０５６、ＰＴＡ−６０５９の宿主細胞、またはＳＧ３．１５Ｂ．１Ｆ９の宿主細胞により産生された抗体を含む。本発明の目的上、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０に比べて活性の程度が変化し得る（高くなるか、または低くなり得る）が、結合特異性および／または全体的な活性（癌細胞の成長および／または増殖の低下、癌細胞におけるアポトーシス細胞死の誘発、転移の進行の遅延、および／または緩和医療という観点からであり得る）は、一般に保持されることが理解されよう。本発明はまた、これらの抗体を作製する方法を提供する。抗体を作製する方法は、当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている。
【００９８】
また、本発明は、本発明の抗体のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０など）も提供する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、抗ＥｐｈＡ２抗体の１またはそれ以上の軽鎖および／または重鎖の可変領域を含む。一部の実施形態では、該ポリペプチドは、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０の１またはそれ以上の軽鎖および／または重鎖のＣＤＲを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０の軽鎖および／または重鎖の３つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、該ポリペプチドは、以下に示すいずれか：ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０の配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸、少なくとも８個の連続するアミノ酸、少なくとも約１０個の連続するアミノ酸、少なくとも約１５個の連続するアミノ酸、少なくとも約２０個の連続するアミノ酸、少なくとも約２５個の連続するアミノ酸、少なくとも約３０個の連続するアミノ酸（ここで、アミノ酸の少なくとも３つはＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０の可変領域由来である）を有するＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、可変領域は、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０の軽鎖由来である。別の実施形態では、可変領域は、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０の重鎖由来である。別の実施形態では、５個の（またはそれ以上の）連続するアミノ酸は、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来である。
【００９９】
抗体は、ポリクローナル（例えば、同種ではない）であってもモノクローナルであってもよい。モノクローナル抗体を作製する方法は当技術分野で公知である。用いられ得る一方法は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）の方法、またはその変法である。一般に、免疫付与にはマウスまたはラットが用いられるが、他の動物も用いてよい。免疫原は、限定されないが、初代培養細胞、培養細胞株、癌細胞、核酸、組織、またはペプチドであり得る。全長のＥｐｈＡ２またはＥｐｈＡ２の任意の断片（例えば、細胞外ドメイン）、またはＥｐｈＡ２発現癌細胞を免疫原として用いる。免疫原として用いられる細胞、例えばＥｐｈＡ２発現癌細胞は、免疫原としての使用の前に一定期間（少なくとも２４時間）培養されてよい。細胞は、免疫原として単独で、またはＲｉｂｉなどの非変性アジュバントと組み合わせて用いられてよい。一般に、細胞は無傷の状態で維持すべきであり、免疫原として用いられる時に生存していることが好ましい。無傷な細胞を免疫原として用いて抗体を作製する方法は、ＷＯ００／３７５０３号に記載されている。無傷な細胞は、破裂した細胞よりも抗原を検出しやすくすることができる。さらに、無傷な細胞を免疫原として用いて作製されたモノクローナル抗体は、細胞表面の抗原決定基または膜貫通型受容体の細胞外ドメインに対抗する可能性が最も高い。変性アジュバントまたは強いアジュバント（例えば、フロインドアジュバント）の使用は、細胞を破裂させるおそれがあり、そのため推奨されない。免疫原は、例えば２週間に１回、または１週間に１回など、定期的な間隔で複数回投与されてもよいし、または動物（例えば、組織組換え体）において生存力を維持するような方法で投与してもよい。
【０１００】
抗体反応をモニターするために、少量の生体サンプル（例えば、血液）を動物から採取し、免疫原に対する抗体価を検査してもよい。脾臓および／またはいくつかの大リンパ節を摘出して単一細胞に分離することができる。所望であれば、脾臓細胞は（非特異的に粘着する細胞を除去した後）、抗原で被覆したプレートまたはウェルに細胞懸濁液を加えることによって選別され得る。抗原に特異的な膜結合免疫グロブリンを発現しているＢ細胞はプレートと結合し、懸濁液の残りの部分によってすすぎ落とされることはない。次に、得られたＢ細胞または全ての分離した脾臓細胞は、骨髄腫細胞（例えば、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３およびのＳａＩｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，ＣＡ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ由来のもの）と融合させることができる。脾臓またはリンパ球を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを形成するためにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いてもよい。次に、そのハイブリドーマを選択培地（例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地、別名「ＨＡＴ培地」）中で培養する。次に、得られたハイブリドーマを制限希釈により平板培養し、免疫原（例えば、癌細胞株の表面、ＥｐｈＡ２、など）と特異的に結合する抗体の産生について、ＦＡＣＳ、免疫組織化学（ＩＨＣスクリーニング）、およびウエスタンブロットを用いてアッセイする。次に、選択されたモノクローナル抗体分泌型ハイブリドーマをインビトロ（例えば、組織培養瓶もしくは中空繊維反応槽において）、またはインビボ（例えば、マウス腹水において）のいずれかで培養する。抗ＥｐｈＡ２抗体を産生する条件下でハイブリドーマを培養する方法、および抗体を精製する方法は、当技術分野で公知である。
【０１０１】
上記のモノクローナル抗体分泌型ハイブリッドは、抗ＥｐｈＡ２抗体が選択的に結合するＥｐｈＡ２上のエピトープと選択的に結合する抗体を産生するために選択され得る。そのような抗体を選択する方法は、当技術分野で公知である。例えば、結合競合アッセイを用いて、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０が結合するものと同一のエピトープに抗体が結合するかどうか判定することができる。ＥｐｈＡ２と結合するための、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０との抗体の競合は、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０が結合するエピトープにその抗体が選択的に結合することを示す。結合競合アッセイは、当技術分野で周知である。結合競合アッセイは、標識抗原または標識抗体のいずれかを用いていくつもの異なる形式で構成され得る。通常、抗原は９６ウェルプレート上に固定化され、放射性標識または酵素標識を用いて、非標識抗体が標識抗体の結合を阻害する能力が測定される。抗ＥｐｈＡ２抗体が選択的に結合するＥｐｈＡ２上のエピトープと選択的に結合するポリペプチドもまた同様の方法を用いて試験し、同定することもできる。
【０１０２】
細胞融合技術の別の代替法として、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞を用いて本発明のモノクローナル抗体を産生してよい。ハイブリドーマは、必要に応じて増殖させ、サブクローニングして、慣習的なアッセイ法（例えば、ＦＡＣＳ、ＩＨＣ、放射性免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法など）により上清を抗免疫原活性についてアッセイする。
【０１０３】
別の代替法では、抗体を組換え法により作製することができる。組換え抗体を作製する方法は、当技術分野で周知である。モノクローナル抗体ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０およびその他の同等な抗体は、配列決定し、インビトロで組換え技術により産生することができる。一実施形態では、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０を配列決定し、次にポリヌクレオチド配列を発現または増殖のためのベクターにクローニングする。目的の抗体をコードする配列は宿主細胞中のベクターに保持されてよく、したがって宿主細胞を増殖させ、後の使用のために凍結させることができる。別の代替法では、抗体をファージディスプレイ技術により組換え法によって作製してもよい。例えば、米国特許第５，５６５，３３２号、同第５，５８０，７１７号、同第５，７３３，７４３号、同第６，２６５，１５０号、およびＷｉｎｔｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１２：４３３−４５５を参照されたい。
【０１０４】
別の代替法では、抗ＥｐｈＡ２抗体またはその他の任意の目的の抗体またはタンパク質を、当業者に十分公知のエドマン分解による配列決定に付してもよい。質量分析またはエドマン分解によりもたらされるペプチド情報は、目的のタンパク質をクローニングするために使用されるプローブまたはプライマーの設計に用いることができる。
【０１０５】
目的のタンパク質をクローニングする別法は、目的の抗体またはタンパク質を発現する細胞に対してＥｐｈＡ２を使用する「パニング」によるものである。「パニング」法は、目的の抗体またはタンパク質を発現する組織または細胞からｃＤＮＡライブラリーを得て、第２の細胞種においてｃＤＮＡを過剰発現させ、トランスフェクトした第２の細胞種の細胞を、ＥｐｈＡ２との特異的結合についてスクリーニングすることにより行われる。「パニング」による、細胞表面タンパク質をコードする哺乳類遺伝子のクローニングに用いられる方法の詳細な説明は、当技術分野に見出すことができる。例えば、Ａｒｕｆｆｏ，Ａ．ａｎｄ  Ｓｅｅｄ，Ｂ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８４，８５７３−８５７７（１９８７）ａｎｄ  Ｓｔｅｐｈｅｎ，Ｊ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４０：５８４１−５８５４（１９９９）を参照されたい。
【０１０６】
ｃＤＮＡは、当技術分野の標準法に従って、特定の細胞種由来のｍＲＮＡを逆転写することにより得ることができる。具体的に言えば、ｍＲＮＡは、上記のＳａｍｂｒｏｏｋらに説明された方法に従って、様々な溶菌酵素または化学溶液を用いて単離するか、あるいは製造業者（例えば、Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ）により提供された添付の使用説明書に従って、市販の核酸結合樹脂により抽出することができる。次に、合成されたｃＤＮＡを発現ベクターへ導入し、第２の細胞種において目的の抗体またはタンパク質を産生する。発現ベクターは、エピソームかまたは染色体ＤＮＡの不可欠な部分のいずれかとして宿主細胞中で複製可能でなくてはならないことが示唆される。適した発現ベクターとしては、限定されないが、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスなどのウイルスベクター、およびコスミドが挙げられる。
【０１０７】
目的のポリヌクレオチドを含むベクターは、多数の適切な方法のいずれかにより宿主細胞に導入することができ、その方法としては、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を用いるトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（例えば、ベクターがワクシニアウイルスなどの病原体である場合）などが挙げられる。導入ベクターまたはポリヌクレオチドの選択は、宿主細胞の特性に依存することが多い。
【０１０８】
異種のＤＮＡを過剰発現できる宿主細胞はどれも、目的の抗体、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を単離する目的のために使用することができる。哺乳類宿主細胞の限定されない例には、限定されないが、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、およびＣＨＯ細胞が挙げられる。宿主細胞がｃＤＮＡを発現するレベルは、存在するならば宿主細胞中の対応する目的の内因性抗体またはタンパク質のレベルよりも約５倍高いことが好ましく、１０倍高いことがより好ましく、２０倍高いことがさらにより好ましい。ＥｐｈＡ２との特異的結合についての宿主細胞のスクリーニングは、免疫測定法またはＦＡＣＳにより行われる。目的の抗体またはタンパク質を過剰発現する細胞が同定され得る。
【０１０９】
本発明には、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０などの、本発明の抗体のアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。本発明のポリペプチドは、当技術分野で公知の手順により作製することができる。ポリペプチドは、抗体のタンパク質分解もしくは他の分解方法により、上記のような組換え法（すなわち一本鎖または融合ポリペプチド）により、または化学合成により生成することができる。抗体のポリペプチド、特に約５０アミノ酸までの短いポリペプチドは、好都合にも化学合成により作製される。化学合成法は、当技術分野で公知であり、市販されている。例えば、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０ポリペプチドは、固相法を用いて自動ポリペプチド合成装置により生成することができる。
【０１１０】
また、本発明は、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０などの、本発明の抗体の単鎖可変領域断片（「ｓｃＦｖ」）も包含する。単鎖可変領域断片は、短い連結ペプチドを用いて、軽鎖および／または重鎖可変領域を連結することにより作製される。Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６。例えば、連結ペプチドは、１つの可変領域のカルボキシ末端ともう１つの可変領域のアミノ末端との間の約３．５ｎｍを橋渡しすることができる。リンカーを、順に、薬剤の付着または固相支持体への付着などのさらなる機能のために修飾してよい。単鎖変異体は、組換えまたは合成のいずれかにより生成され得る。合成によるｓｃＦｖの生成のためには、自動合成装置を用いればよい。組換えによるｓｃＦｖの生成のためには、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含む適切なプラスミドを、酵母、植物、昆虫または哺乳類細胞などの真核生物、または大腸菌などの原核生物のいずれかの適した宿主細胞に導入してもよい。目的のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションなどの日常的な操作により作製することができる。得られたｓｃＦｖは、当技術分野で公知の標準的なタンパク質精製技術を用いて単離することができる。
【０１１１】
本発明は、それらの特性にはあまり影響を及ぼさない、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０と機能的に同等な抗体およびポリペプチドを含む、抗ＥｐｈＡ２抗体などの抗体、および活性の増加または低下した変異体に対する修飾を包含する。ポリペプチドの修飾は当技術分野では日常的な作業であり、本明細書に詳細に記載する必要はない。修飾されたポリペプチドの例としては、アミノ酸残基の保存的置換、機能活性を大幅に悪化させることのない１以上のアミノ酸の欠失または付加、あるいは化学類似体の使用によるポリペプチドが挙げられる。互いに保存的置換が可能なアミノ酸残基としては、限定されないが：グリシン／アラニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；セリン／トレオニン；リシン／アルギニン；およびフェニルアラニン／チロシンが挙げられる。これらのポリペプチドにはまた、グリコシル化および非グリコシル化されたポリペプチド、ならびに、例えば、異なる糖によるグリコシル化、アセチル化、およびリン酸化などの、翻訳後修飾された他のポリペプチドが含まれる。アミノ酸置換は保存的、すなわち置換アミノ酸が元のアミノ酸と同様の化学特性を有することが好ましい。そのような保存的置換は当技術分野で公知であり、その例は上記に記載されている。アミノ酸修飾は１またはそれ以上のアミノ酸の変化または修飾から、可変領域などの領域の完全な再設計まで多岐にわたる。可変領域における変化は、結合親和性および／または特異性を変化させ得る。他の修飾方法としては、当技術分野で公知のカップリング技術を用いる方法があり、限定されないが、酵素による方法、酸化的置換およびキレート化が挙げられる。修飾は、例えば、放射性免疫測定法のために放射性部分を結合するなど、免疫測定法のための標識を結合するために用いてよい。修飾されたＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０ポリペプチドは、当技術分野で確立された方法を用いて作製され、当技術分野で公知の標準的なアッセイ法を用いてスクリーニングすることができ、その一部は以下および実施例に記載されている。
【０１１２】
また、本発明は、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０などの本発明の抗体由来の１またはそれ以上の断片または領域を含む融合タンパク質を包含する。一実施形態では、軽鎖可変鎖領域の少なくとも１０個の連続するアミノ酸、および重鎖可変鎖領域の少なくとも１０個のアミノ酸を含む融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態では、融合ポリペプチドは異種の免疫グロブリン定常領域を含む。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む。本発明の目的上、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０融合タンパク質は、１またはそれ以上のＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０のポリペプチドおよび天然の分子中には付着していない別のアミノ酸配列、例えば、異種配列または別の領域由来の相同配列を含む。ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０のポリペプチドは、例えば、合成または組換えなどの当技術分野で公知の方法により生成され得る。
【０１１３】
別の実施形態では、重鎖および／または軽鎖が融合タンパク質である、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０のキメラが提供される。一部の実施形態では、該鎖の定常領域は、ある特定の種および／またはクラス由来であり、かつ、可変領域は異なる種および／またはクラス由来である。例えば、キメラ抗体は（一部の実施形態において）、定常領域がヒト由来であり、かつ、可変領域がＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５もしくはＬＵＣＡ４０と相同であるか、またはそれに由来する（すなわちネズミ）。また、本発明では、（一部の実施形態において）ＣＤＲ領域がＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０のアミノ酸配列を含み、一方、フレームワーク領域はヒト配列由来であるヒト化可変領域を有する抗体が具体化される。ヒト化抗体のその他の形態は、当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている。キメラの機能的断片も具体化されている。一例はヒト化Ｆａｂ断片であり、これには、ヒトヒンジ領域、ヒト第１定常領域、ヒトκ軽鎖または重鎖定常領域、およびＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０由来の軽鎖および／または重鎖の可変領域が含まれる。ヒト化ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０Ｆａｂ断片は、次に、Ｆａｂ二量体を形成するために作製することができる。一般に、本発明のＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０融合タンパク質およびＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０キメラは、本明細書に記載の組換え法を用いて、それらをコードするポリヌクレオチドを調製し発現することにより作製されるが、当技術分野で公知の他の方法（例えば、化学合成を含む）により調製してもよい。例えば、米国特許第５，８０７，７１５号、同第４，８１６，５６７号、および同第６，３３１，４１５号を参照されたい。
【０１１４】
また、本発明はヒト化抗体も包含する。抗体（ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５もしくはＬＵＣＡ４０など）またはその他の同等な抗体のポリヌクレオチド配列を遺伝的操作に用いて「ヒト化」抗体を作製するか、あるいは親和性または抗体のその他の特徴を改善してよい。抗体をヒト化する際の一般的な原則は、抗体の抗原結合部分の基本的配列を保持したまま、抗体の非ヒト残余部分をヒト抗体配列と交換することを含む。モノクローナル抗体をヒト化するためには、４つの一般的な工程がある。これらは：（１）開始抗体の軽鎖および重鎖可変領域のヌクレオチドおよび予測アミノ酸配列の決定（２）ヒト化抗体の設計、すなわちヒト化の過程の間に使用する抗体フレームワーク領域の決定（３）実際のヒト化手法／技術、ならびに（４）トランスフェクションおよびヒト化抗体の発現、である。例えば、ヒトにおける臨床試験および治療に該抗体が用いられる場合に免疫応答を避けるために、定常領域は、よりヒト定常領域に似るように改変してよい。例えば、米国特許第５，９９７，８６７号および同第５，８６６，６９２号を参照されたい。
【０１１５】
ヒト定常領域と融合させた、げっ歯類Ｖ領域およびそれらが関連する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するキメラ抗体をはじめとする、非ヒト免疫グロブリン由来の抗原結合部位を含む多数の「ヒト化」抗体分子が記載されている。例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９（１９９１）；Ｌｏｂｕｇｌｉｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：４２２０−４２２４（１９８９）；Ｓｈａｗら／Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４−４５３８（１９８７）；およびＢｒｏｗｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：３５７７−３５８３（１９８７）を参照されたい。他の参照文献には、適切なヒト抗体定常領域との融合に先立ち、ヒト支持フレームワーク領域（ＦＲ）中に移植されたげっ歯類のＣＤＲが記載されている。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；およびＪｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）を参照されたい。別の参照文献には、組換え法によりはり合わされたげっ歯類フレームワーク領域により支持されるげっ歯類ＣＤＲが記載されている。例えば、欧州特許公報第５１９，５９６号を参照されたい。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントにおけるそれらの部分の治療適用の持続時間および有効性を制限する、げっ歯類抗ヒト抗体分子に対する望ましくない免疫応答を最小限に抑えるために設計されている。利用してもよいその他の抗体をヒト化する方法は、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：２４７１−２４７６（１９９１）、および米国特許第６，１８０，３７７号、同第６，０５４，２９７号、同第５，９９７，８６７号、同第５，８６６，６９２号、同第６，２１０，６７１号、同第６，３５０，８６１号、ならびにＰＣＴＷＯ０１／２７１６０号に開示されている。
【０１１６】
さらに別の代替法では、特異的ヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように設計された市販のマウスを用いて完全ヒト抗体を得ることができる。より望ましい（例えば、完全なヒト抗体）免疫応答、または、より強い免疫応答を生じるように設計されたトランスジェニック動物を用いてヒト化またはヒト抗体を作製してもよい。そのような技術の例としては、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）製のＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）、ならびにＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）製のＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＴＣ  Ｍｏｕｓｅ（商標）である。
【０１１７】
また、本発明は、治療薬（放射性分子、毒素（例えば、カリチアマイシン）、もしくは化学療法薬分子など）、または化学療法化合物を含有するリポソームもしくは他の小胞と共役コンジュゲートさせた（例えば、連結させた）、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０、あるいは、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５もしくはＬＵＣＡ４０の同等な抗体またはポリペプチドを含む組成物も提供する。該組成物は、個体に投与された場合、抗体またはポリペプチドにより認識されるＥｐｈＡ２を発現している癌細胞をこれらの薬剤の標的とすることができ、従って、例えば、癌細胞を除去し、かつ／あるいは、癌細胞の増殖および／または成長を抑制することができる。簡単にするために、これらの方法が本明細書に記載されるいずれかのＥｐｈＡ２結合の実施形態に適用するという理解の下で、参照は、一般にＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５もしくはＬＵＣＡ４０または抗体に対して行う。これらの方法では、一般にコンジュゲーションとは、本明細書に記載されたこれらの成分を連結することを指す。連結（一般に、少なくとも投与のためにこれらの成分を会合に近似した状態で固定すること）は、下記のように多数の方法により達成することができる。
【０１１８】
本発明の放射性分子には、癌細胞の破壊に効果的な任意の放射性同位元素が含まれる。その例としては、限定されないが、コバルト６０およびＸ線が挙げられる。さらに、一般に放射性同位元素の混合物を代表する、ウラン、ラジウム、およびトリウムなどの天然の放射性元素は、放射性分子の適した例である。
【０１１９】
本発明の毒素には、限定されないが、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ならびにピューロマイシンおよびその類似体または同族体が挙げられる。本発明の抗体は、それらが結合する癌細胞内に取り込まれることが可能であり、従って、例えば、その有害な働きのために、取り込まれる必要のある毒素を細胞中へ送達するなど、治療適用に特に有用である。そのような毒素の例としては、限定されないが、サポリン、カリチアマイシン、オーリスタチン、およびマイタンシノイドが挙げられる。
【０１２０】
本発明の抗体またはポリペプチドは、放射性分子、毒素、もしくは他の治療薬と、または治療薬を含有するリポソームもしくは他の小胞と、共役的または非共役的に、直接的または間接的に、コンジュゲート（連結）され得る。抗体は、抗体がその標的であるＥｐｈＡ２と結合できる限り、抗体に沿った任意の位置で、放射性分子、毒素、または治療分子と連結されていてよい。
【０１２１】
毒素または治療薬は、適したモノクローナル抗体と直接的あるいは間接的に（例えば、リンカー基を介して、あるいは、米国特許第５，５５２，３９１号に記載のプラットフォーム分子などの適切な付着部位を有する連結分子を介して）結合（例えば、共有結合）させてよい。本発明の毒素および治療薬は、当技術分野で公知の方法を用いて、特定の標的タンパク質に直接結合させることができる。例えば、薬剤と抗体との間の直接反応は、各々が他方と反応できる置換基を有している場合に可能である。例えば、一方の求核基（アミノ基もしくはスルフヒドリル基など）は、他方のカルボニル含有基（無水物もしくは酸ハロゲン化物など）と、または適した脱離基（例えば、ハロゲン化物）を含有するアルキル基と反応することができる。
【０１２２】
また、抗体またはポリペプチドは、マイクロキャリアを介して治療薬に連結することもできる。マイクロキャリアとは、水に不溶で、サイズが約１５０、１２０または１００ｍｍよりも小さく、より一般的には約５０〜６０μｍよりも小さく、好ましくは、約１０、５、２．５、２または１．５μｍよりも小さい、生分解性または非生分解性の粒子を指す。マイクロキャリアには、約１μｍ未満のサイズの、好ましくは、約５００ｎｍ未満のマイクロキャリアである、「ナノキャリア」が含まれる。そのような粒子は、当技術分野で公知である。固相マイクロキャリアは、生体適合性のある天然に存在するポリマー、合成ポリマーまたは合成コポリマーから形成された粒子であってよく、アガロースまたは架橋アガロース、ならびに当技術分野で公知の他の生分解性材料から形成されたマイクロキャリアを含んでも、含まなくてもよい。生分解性固相マイクロキャリアは、分解性ポリマー（例えば、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）およびそのコポリマー）、または哺乳類の生理学的条件下で浸食され得る（例えば、ポリ（３，９−ジエチリデン−２，４，８，１０−テトラオキサピロ［５．５］ウンデカン）（ＤＥＴＯＳＵ）などのポリ（オルトエステル）、またはセバシン酸のポリ（無水物）などのポリ（無水物）から形成されてよい）。液相マイクロキャリアが生分解性であるならば、マイクロキャリアは、リポソーム、抗原を含まない免疫刺激複合体（コレステロール、およびリン脂質、アジュバント活性サポニンの安定な複合体である免疫刺激複合体）、あるいは液滴または水中油型もしくは油中水型エマルジョン中に見出されるミセルなどの液相（例えば、油または脂質ベースの）であってもよい。生分解性の液相マイクロキャリアは一般に、スクアレンおよび植物油を含む生分解性の油を内蔵し、その多くが当技術分野で公知である。マイクロキャリアは一般に球形であるが、球形から逸脱しているマイクロキャリアも許容される（例えば、楕円、棒状等）。その（水に対して）不溶性の性質に起因して、マイクロキャリアは水および水ベースの（水性）溶液から濾過することができる。
【０１２３】
本発明の抗体またはポリペプチド複合体は、毒性のある薬剤または治療薬と結合できる基、および抗体と結合できる基の双方を含む二官能性リンカーを含んでよい。リンカーは、結合能力への干渉を避けるために、薬剤から抗体を遠ざけるスペーサーとして機能し得る。リンカーは、切断可能であっても切断不可能であってもよい。また、リンカーは、薬剤または抗体上の置換基の化学反応性を高め、従って結合効率を高める役割を果たすこともできる。化学反応性の増大はまた、そうでなければ可能でない、薬剤または薬剤上の官能基の使用を容易にする可能性もある。二官能基を有するリンカーは、当技術分野で公知の方法により、抗体に結合させることができる。例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどの活性エステル部分を含むリンカーは、アミド結合を介する、抗体中のリシン残基に結合させるために使用できる。別の例では、求核アミンまたはヒドラジン残基を含有するリンカーは、抗体の炭水化物残基の解糖酸化により生じたアルデヒド基と結合し得る。これらの直接的な結合法に加えて、リンカーは、アミノデキストランなどの中間担体により間接的に抗体に結合することができる。これらの実施形態において、修飾された連結は、リシン、炭水化物、または中間担体のいずれかを介する。一実施形態において、リンカーはタンパク質中の遊離チオール残基と位置選択的に結合する。タンパク質上のチオール基への選択的結合に適した部分は、当技術分野で周知である。その例としては、ジスルフィド化合物、α−ハロカルボニルおよびα−ハロカルボキシル化合物、ならびにマレイミドが挙げられる。同じ分子中にα−ハロカルボニルまたはカルボキシル基として求核アミン官能基が存在する場合には、アミンの分子内アルキル化を介して環化が起こる可能性がある。この問題を回避する方法は当業者に周知であり、立体化学的に不利な望ましくない環化を起こす柔軟性のない基（アリール基またはトランス−アルケンなど）によってアミンおよびα−ハロ官能基が分離されている分子を調製することにより回避される。例えば、ジスルフィド部分を介するマイタンシノイドと抗体との複合体の調製については米国特許第６，４４１，１６３号を参照されたい。
【０１２４】
抗体−薬剤複合体の調製に用いられ得る、切断可能なリンカーの１つは、受容体仲介エンドサイトーシス中に遭遇するエンドソーム、およびリソソームなどの異なる細胞内コンパートメントの酸性環境をうまく利用する、シス−アコニット酸に基づく酸に不安定なリンカーである。例えば、ダウノルビシンと高分子担体との複合体調製のためには、Ｓｈｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０２：１０４８−１０５４（１９８１）；ダウノルビシンと抗黒色腫抗体との複合体調製のためには、Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．８０：１１５４−１１５９（１９８８）；ダウノルビシンと抗Ｔ細胞抗体との複合体調製と同様の方法で酸に不安定なリンカーを使用するためには、Ｄｉｌｌｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：６０９７−６１０２（１９８８）；ペプチドスペーサーアームを介してダウノルビシンを抗体に連結するためには、Ｔｒｏｕｅｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９：６２６−６２９（１９８２）を参照されたい。
【０１２５】
本発明の抗体（またはポリペプチド）は、当技術分野で公知の任意の方法により、放射性分子とコンジュゲートされ得る。放射性標抗体のための方法の考察に関しては、「Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＴ”、Ｄ．Ｍ．Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｄ．（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９５）を参照されたい。
【０１２６】
本発明の抗体（またはポリペプチド）は、蛍光分子、放射性分子または当技術分野で公知の他の標識などの標識薬剤（あるいは「標識」と呼ばれる）と連結させてもよい。標識は、当技術分野で公知であり、一般に（直接的あるいは間接的に）シグナルをもたらす。
【０１２７】
本発明の抗体、ポリペプチドおよびタンパク質の能力、例えば、ＥｐｈＡ２を発現している癌細胞の成長を阻害する能力、ＥｐｈＡ２を発現している癌を有する個体において転移の進行を遅らせる能力、ＥｐｈＡ２を発現している癌細胞に、毒素または放射性化合物などの治療薬を送達する能力（ＥｐｈＡ２を発現している癌細胞の中に治療薬を送達する能力を含む）などの、当技術分野で公知の方法を用いて試験することができ、それらのいくつかは実施例に記載されている。
【０１２８】
また、本発明は、抗ＥｐｈＡ２抗体またはＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５もしくはＬＵＣＡ４０と同等な抗体（本開示が明らかにするように、本明細書に記載の全ての抗体が含まれる）またはポリペプチドおよび治療薬を含む、組成物（医薬組成物を含む）を提供する。
【０１２９】
モノクローナル抗体のスクリーニング方法
いくつかの方法を用いて、癌細胞でＥｐｈＡ２と結合するモノクローナル抗体をさらにスクリーニングすることができる。用いることのできる１つの方法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）である。標準的な免疫組織化学手法は平均的な当業者に公知である。例えば、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｄ．Ｂａｒｎｅｓ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｖｏｌ．５７，Ｃｈ．１８  ａｎｄ  １９，ｐｐ．３１４−３５０，１９９８）を参照されたい。生体サンプル（例えば、組織）は、生検、剖検（ａｕｔｏｐｓｉｅｓ）、または剖検（ｎｅｃｒｏｐｓｉｅｓ）から得ることができる。ＥｐｈＡ２が癌細胞にしか存在しないことを確かめるため、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０を用いて、癌を有する個体由来の組織でのＥｐｈＡ２の存在を検出することができ、一方では、癌を患っている個体由来のその他の非癌組織、または癌を有さない個体由来の組織を対照として用いる。組織は、凍結中の損傷を防ぐ固体または半固体物質（例えば、アガロースゲルまたはＯＣＴ）に包埋した後、染色のために分割することができる。異なる臓器および異なる程度の癌を用いてモノクローナル抗体をスクリーニングすることができる。スクリーニングの目的に用いられ得る組織の例としては、限定されないが、卵巣、乳房、肺、前立腺、結腸、腎臓、皮膚、甲状腺、脳、心臓、肝臓、胃、神経、血管、骨、上部消化管、および膵臓が挙げられる。スクリーニングの目的に用いられ得る異なる癌の種類の例としては、限定されないが、癌腫、腺癌、肉腫、腺肉腫、リンパ腫、および白血病が挙げられる。
【０１３０】
さらに別の代替法では、癌細胞株、例えばＳＫ−Ｏｖ−３（ＡＴＣＣ  ＃ＨＴＢ  ７７）、ＬｎＣａｐ（ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ−１７４０）、ＣＯＬＯ２０５（ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ  ２２２）、Ａ５４９（ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ  １８５）、ＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ  １４６９）、ＳＫ−ＢＲ−３（ＡＴＣＣ  ＃ＨＴＢ  ３０）、ＳＫ−ＭＥＳ−１（ＡＴＣＣ  ＃ＨＴＢ  ５８）、ＨＴ−２９（ＨＴＢ−３８）、ＳＷ４８０（ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ  ２２８）、ＡｓＰＣ−１（ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ  １６８２）、Ｃａｐａｎ−１（ＡＴＣＣ  ＃ＨＴＢ  ７９）、ＣＦＰＡＣ−１（ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ  １９１８）、ＨＰＡＦ−ＩＩ（ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ−１９９７）、ＨＳ−７００Ｔ（ＡＴＣＣ  ＃ＨＴＢ  １４７）、Ｄｕ−１４５（ＡＴＣＣ  ＃ＨＴＢ−  ８１）、ＣａＬｕ−１（ＡＴＣＣ  ＃ＨＴＢ−５４）、７８６−Ｏ（ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ−１９３２）、ＣａＫｉ−２（ＡＴＣＣ  ＃ＨＴＢ−４７）、Ａ４９８（ＡＴＣＣ  ＃ＨＴＢ−４４）、ＢＴ４７４（ＡＴＣＣ  ＃ＨＴＢ−２０）、およびＰＣ−３（ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ  １４３５）ならびにそれらのそれぞれの組織由来の正常細胞を用いて、癌組織に特異的なモノクローナル抗体についてスクリーニングしてよい。異なる臓器の正常組織に由来する初代または低継代細胞培養（限定されないが、卵巣、乳房、肺、前立腺、結腸、腎臓、皮膚、甲状腺、大動脈平滑筋、および内皮細胞を含む）を陰性対照として用いてよい。癌細胞または非癌細胞は、スライドガラスもしくはカバーガラス上で、またはプラスチック表面上で増殖させるか、あるいはＷＯ０１／４３８６９号に記載されるようにＣｅｌｌＡｒｒａｙ（商標）中に調製し、上記のようにＩＨＣを用いて、組織について抗体の結合をスクリーニングすることができる。あるいは、非タンパク質分解方法を用いて細胞を増殖表面から取り出してペレットにし、次にそれを上に記載したＩＨＣ分析のために組織として包埋して処理してよい。別の代替法では、単一の細胞を、蛍光分子と結合した二次「リポーター」抗体である、一次抗体とともにインキュベートすることによりスクリーニングした後、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）機を用いて分析してよい。
【０１３１】
いくつかの異なる検出系を利用して抗体と組織切片との結合を検出してよい。一般に、免疫組織化学は一次抗体と組織との結合を含み、次に、一次抗体の種に対して反応性である二次抗体を作成し、検出可能なマーカー（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ＨＲＰ、またはジアミノベンジジン、ＤＡＢ）とコンジュゲートさせた。用いられ得る１つの代替方法は、ポリクローナルミラーイメージ相補的抗体またはｐｏｌｙＭＩＣＡである。Ｄ．Ｃ．ＭａｎｇｈａｍおよびＰ．Ｇ．Ｉｓａａｃｓｏｎに記載されるＰｏｌｙＭＩＣＡ（ポリクローナルミラーイメージ相補的抗体）技術（Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ（１９９９）３５（２）：１２９−３３）は、一次抗体（例えば、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０）と正常組織および癌組織との試験結合に用いることができる。数種類のｐｏｌｙＭＩＣＡ（商標）検出キットがＴｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  ４０７３  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  Ｂ２９  ６ＡＴ  Ｅｎｇｌａｎｄ）から市販されている。製品番号ＨＫ００４．Ｄは、ＤＡＢ色素原を用いるｐｏｌｙＭＩＣＡ（商標）検出キットである。製品番号ＨＫ００４．Ａは、ＡＥＣ色素原を用いるｐｏｌｙＭＩＣＡ（商標）検出キットである。あるいは、一次抗体を検出可能なマーカーで直接標識してもよい。
【０１３２】
適当な抗体を選択するためのＩＨＣスクリーニングの第１工程は、マウスにおいて作製した一次抗体（例えば、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０）と１またはそれ以上の免疫原（例えば、細胞もしくは組織サンプル）との結合である。一実施形態では、組織サンプルは、異なる臓器の凍結組織の切片である。細胞もしくは組織サンプルは癌細胞もしくは組織であってもよく、または非癌細胞もしくは組織であってもよい。
【０１３３】
凍結組織は、当業者に公知の多数の方法のうちのいずれかにより、調製し、固定化するかまたはせずに分割し、ＩＨＣを行うことができる。例えば、Ｓｔｅｐｈａｎら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１２：２６４−２７７（１９９９）、およびＳｔｅｐｈａｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４０：５８４１−５４（１９９９）を参照されたい。
【０１３４】
癌細胞もしくは組織と結合するが、正常な細胞もしくは組織と同じ程度まで結合しない、ヒト細胞と交差反応性のモノクローナル抗体を選択する。１またはそれ以上の癌種に発現するが正常細胞には発現しない抗原と結合するモノクローナル抗体も選択する。ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０は、多数の異なる癌に存在する抗原ＥｐｈＡ２と結合するが、正常組織との結合が限定されている抗体の例である。エピトープマッピングを用いて抗体をさらに特徴付けてもよい。商業的に入手可能なサービス（例えば、Ｐｅｐｓｃａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  ２０９８，８２０３  ＡＢ  Ｌｅｌｙｓｔａｄ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて、抗原ＥｐｈＡ２上の、抗体、例えばＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０の結合するエピトープを判定してよい。
【０１３５】
ＥｐｈＡ２と結合するＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０、同等の抗体またはポリペプチドを用いる癌の診断方法
モノクローナル抗ＥｐｈＡ２抗体、および、本明細書に開示される方法により作製される、ＥｐｈＡ２と結合するＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０の同等の抗体またはポリペプチド誘導体を用いて、種々の組織（限定されないが、卵巣、乳房、肺、前立腺、結腸、腎臓、皮膚、甲状腺、脳、心臓、肝臓、胃、神経、血管、骨、上部消化管、および膵臓を含む）において癌細胞の存在または不在を診断目的のために識別または検出することができる。簡単にするために、これらの方法が本明細書に記載されるいずれかのＥｐｈＡ２結合の実施形態に適用するという理解の下で、参照は、一般にＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５もしくはＬＵＣＡ４０または抗体に対して行う。検出は、一般に、本明細書に記載されるＥｐｈＡ２と結合する抗体またはポリペプチドと細胞とを接触させること、およびＥｐｈＡ２と特異的に結合する抗体（例えば、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０のヒト化抗体、ヒト抗体またはその他の任意のＥｐｈＡ２結合部分）との間の複合体の形成を含む。そのような複合体の形成は、インビトロであってもインビボであってもよい。理論に縛られることなく、モノクローナル抗ＥｐｈＡ２抗体は、ＥｐｈＡ２の細胞外ドメインを介してＥｐｈＡ２と結合することができる。本明細書において、検出には定性的および／または定量的検出が含まれ、さらに、癌細胞において増加したＥｐｈＡ２の発現レベルに関して、測定したレベルを正常細胞と比較することが含まれ得る。
【０１３６】
診断用の抗体の一使用法は、抗体と標識部分（例えば、蛍光剤、放射性薬剤または放射線不透過性物質）を結合させること、抗体を患者へ投与すること、およびＸ線またはその他のイメージング装置を用いて、抗原を発現している癌細胞表面での標識された抗体の局在性を視覚化することによる、インビボでの腫瘍イメージングである。標識部分は当技術分野で公知である。
【０１３７】
その他の方法では、癌細胞を取り出して、当技術分野で周知の方法（例えば、凍結化合物への包埋、固定化するかまたはしない凍結および分割；抗原回収および対比染色の種々の方法を用いるかまたは用いない固定化およびパラフィン包埋）により、組織を免疫組織化学のために調製する。また、モノクローナル抗体を用いて異なる発生段階の新生物を同定してもよい。また、抗体を用いてどの患者の腫瘍がその表面で所定のレベルの抗原を発現しているか、従って前記抗原に対する抗体を用いる免疫療法の候補であるかを判定してもよい。
【０１３８】
また、抗原を認識する抗体（またはポリペプチド）を用いて、体液（限定されないが、血液、唾液、尿、肺液、または腹水が含まれる）中の生きた癌細胞または死んだ癌細胞から放出または分泌された抗原を検出するための診断用の免疫測定法を作ってもよい。実施例でさらに詳細に考察されるように、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０は、組織由来の異なる段階の様々な形態の癌（限定されないが、黒色腫、乳房、肺、前立腺、および結腸が含まれる）と結合することができる。診断目的のためにＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０を使用する方法は、何らかの形態の抗癌治療（例えば、化学療法または放射線療法）の前および後の双方で、所定の治療に対してどの腫瘍が最も応答する可能性が高いか、患者の予後、腫瘍のサブタイプまたは転移性疾患の起源、および疾患の進行または治療に対する応答を判定するために有用である。
【０１３９】
ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５もしくはＬＵＣＡ４０または同等な抗体もしくはポリペプチドの治療目的での使用方法
本明細書に開示される方法により作製されるモノクローナル抗ＥｐｈＡ２抗体および同等な抗体（ならびに本発明のその他のポリペプチドの実施形態）は、限定されないが、黒色腫、乳癌、肺癌、結腸癌、または前立腺癌をはじめとする癌を有する個体において治療目的のために用いられ得る。また、これらの治療法は、前記の連結された実施形態にも適用される。簡単にするために、これらの方法が本明細書に記載されるいずれかのＥｐｈＡ２結合の実施形態に適用されるという理解の下で、参照は、一般にＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５もしくはＬＵＣＡ４０または抗体（限定されないが、本明細書に記載される連結された実施形態を含むヒト化抗体およびヒト抗体を含む）に対して行う。ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０を用いる治療は、上記のように、インビトロおよび／またはインビボの双方で、そのような抗体とＥｐｈＡ２との複合体の形成を必要とし得る。一実施形態では、モノクローナル抗ＥｐｈＡ２抗体は、癌細胞と結合して癌細胞の成長および／または増殖を低下させ得る。別の実施形態では、モノクローナル抗ＥｐｈＡ２抗体は癌細胞と結合して癌細胞でのアポトーシス細胞死を誘導し得る。別の実施形態では、モノクローナル抗ＥｐｈＡ２抗体は癌細胞と結合して転移の発生を遅延させ得る。別の実施形態では、モノクローナル抗ＥｐｈＡ２抗体は癌細胞と結合してＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０と連結された治療薬（毒素、または放射性化合物など）を癌細胞へ送達し得る。一部の実施形態のためには、治療薬（毒素など）が細胞へ導入される（すなわち内部に取り入れられる）。これらの方法に特に適した薬剤としては、細胞の内部で活性のある薬剤が挙げられる。そのような薬剤の例としては、限定されないが、サポリン、カリチアマイシン、オーリスタチン、およびメイタンシノイドが挙げられる。一般に、これらの実施形態において有効量（治療薬を標的癌細胞へ、および／または標的癌細胞の中に送達するために十分な量）が個体へ投与される。さらに別の実施形態では、癌を有する個体にＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０での緩和治療を行う。癌患者の緩和治療は、癌の進行に直接影響を及ぼさずに、疾患の有害症状、または疾患に対してなされた他の治療によって生じる医原性の症状を治療するかまたは軽減することを伴う。これには、疼痛、栄養補給、性的問題、心理的苦悩、鬱病、疲労、精神障害、悪心、嘔吐などの緩和が含まれる。
【０１４０】
また、本発明は、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０抗体またはＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０のうちのいずれかが選択的に結合するエピトープと同一のエピトープと選択的に結合する抗体を用いて、癌細胞の成長および／または増殖を阻害する方法も提供する。
【０１４１】
さらに別の実施形態では、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５もしくはＬＵＣＡ４０または本明細書に記載されるいずれかのＥｐｈＡ２の実施形態は、癌細胞を発現しているＥｐｈＡ２と結合し、ＥｐｈＡ２を発現している癌細胞に対して活発な免疫応答を誘導し得る。いくつかの場合、活発な免疫応答は、癌細胞の死を引き起こす（例えば、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０が癌細胞と結合し、アポトーシスまたは腫脹による細胞死を誘導する）か、または癌細胞の増殖を阻害する（例えば、細胞周期の進行を阻害する）ことができる。その他の場合、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５もしくはＬＵＣＡ４０または本明細書に記載されるいずれかのＥｐｈＡ２抗体は、癌細胞と結合することができ、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）により、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０が結合している癌細胞を排除できる。従って、本発明は、本明細書に記載されるいずれかの組成物を投与する工程を含む、免疫応答を刺激する方法を提供する。
【０１４２】
抗ＥｐｈＡ２抗体は、個体自身の免疫応答を促進または指示する薬剤（ＡＤＣＣを強化する薬剤など）とともに投与してよい。一実施形態では、抗ＥｐｈＡ２抗体中に存在する少なくとも１つのフコース残基を抗体のオリゴ糖から除去し、ＡＤＣＣを促進させる修飾をする。類似の実施形態では、抗ＥｐｈＡ２抗体中に存在するフコース残基を修飾して本来の修飾されていない抗体と比較してＡＤＣＣを促進するために必要な程度までそれらの組成を変える。
【０１４３】
いくつかの場合、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０の結合は、細胞応答および体液性免疫応答の双方を活性化させ、より多くのナチュラルキラー細胞または個体の免疫系をさらに活性化して癌細胞を破壊するサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−ａ、ＴＮＦ−ｂ、その他）の産生の増加を補充することもできる。さらに別の実施形態では、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０は癌細胞と結合することができ、マクロファージまたはその他の食細胞は癌細胞をオプソニン化できる。
【０１４４】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるいずれかの組成物を投与する工程を含む、受動免疫を付与する方法を提供する。
【０１４５】
本発明は、本明細書に記載されるいずれかの組成物（コンジュゲートを含む）を、ＥｐｈＡ２を発現している細胞、例えばＥｐｈＡ２発現癌細胞へ送達する方法を提供する。これらの方法は、本明細書に記載される組成物（コンジュゲートを含む）を個体へ投与することを伴う。一部の実施形態では、この方法は、例えば、コンジュゲートを標的細胞の中へ導入するために提供される。さらに別の実施形態では、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０を治療薬（放射性分子、毒素、例えば、サポリン、カリチアマイシン、オーリスタチン、もしくはメイタンシノイド、またはその他の化学療法分子）またはリポソームまたは化学療法化合物を含むその他の小胞とコンジュゲートし、個体へ投与して、抗体により認識される抗原を含む癌細胞をこれらの化合物の標的とし、従って癌細胞を排除する。さらに別の実施形態では、転移の発生を遅らせるために、抗原を発現している癌を外科的に切除した時点で抗体をアジュバント治療として用いてもよい。また、腫瘍のサイズを減少させるため、および従って手術を可能または平易にし、手術中の組織を控え、かつ／または傷跡による外見の損傷を減少させるため、手術の前に抗原を発現している腫瘍を有する患者へ抗体を投与してもよい（ネオアジュバント療法）。
【０１４６】
ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０および同等な抗体または断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃ、その他）の様々な構築物、例えば、キメラ抗体、一本鎖（ＳｃＦｖ）、その変異体、融合タンパク質（必要な特異性をもつ抗原ＥｐｈＡ２の認識部位を含むＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０の抗体部分、ヒト化抗体、および任意のその他の修飾された配置を含む）、を投与に用いてよい。一部の実施形態では、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５もしくはＬＵＣＡ４０抗体、またはそれらのＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５もしくはＬＵＣＡ４０の様々な構築物をそのまま投与され得る。他の実施形態では、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５もしくはＬＵＣＡ４０、またはＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５もしくはＬＵＣＡ４０の様々な構築物（本明細書に記載される任意の組成物実施形態を含む）および薬学的に受容可能な賦形剤が投与され、それは様々な構築物であってもよい。薬学的に受容可能な賦形剤は当技術分野で公知であり、薬理学的に有効な物質の投与を促進する比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤は形またはコンシステンシーを与えるか、または希釈液として働くことができる。適した賦形剤としては、限定されないが、分解防止剤、湿潤剤および乳化剤、モル浸透圧濃度を変えるための塩、カプセル化剤、バッファー、ならびに皮膚浸透促進剤が挙げられる。非経口および非−非経口薬剤送達のための賦形剤ならびに製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）に記載されている。
【０１４７】
概して、これらの薬剤は注射（例えば、腹膜内、静脈内、皮下、筋肉内、など）による投与のために処方されるが、その他の投与形態（例えば、経口、粘膜、など）を用いることもできる。従って、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０抗体およびそれらの同等物は、薬学的に受容可能な担体、例えば生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、およびその他同種類のものと組み合わせることが好ましい。特定の投与計画、すなわち、用量、タイミングおよび反復は、特定の個体およびその個体の病歴によって決まる。一般に、次の用量のいずれかが用いられ得る：少なくとも約５０ｍｇ／体重ｋｇ；少なくとも約１０ｍｇ／体重ｋｇ；少なくとも約３ｍｇ／体重ｋｇ；少なくとも約１ｍｇ／体重ｋｇ；少なくとも約７５０μｇ／体重ｋｇ；少なくとも約５００μｇ／体重ｋｇ；少なくとも約２５０ｕｇ／体重ｋｇ；少なくとも約１００μｇ／体重ｋｇ；少なくとも約５０μｇ／体重ｋｇ；少なくとも約１０μｇ／体重ｋｇ；少なくとも約１μｇ／体重ｋｇ、またはそれ以上の用量が投与される。半減期などの経験的な考察は、一般に投薬量の決定に寄与する。ヒト化抗体または完全ヒト抗体など、ヒト免疫系と両立する抗体を用いると、抗体の半減期を延長し、抗体が宿主の免疫系から攻撃を受けることを防ぐことができる。
【０１４８】
いくつかの個体では、１以上の用量が必要となる可能性がある。投与の頻度は治療を通して判断し、調節してよく、それは癌細胞の数を減少させること、癌細胞の減少を維持すること、癌細胞の成長および／または増殖を低減すること、あるいは転移の発生を遅延させることに基づいている。癌細胞の存在は当業者に公知の、または本明細書に考察されている多数の方法により確認することができる（例えば、生検または生体サンプルの免疫組織化学またはフローサイトメトリーによる検出）。いくつかの場合、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０抗体の持続連続放出製剤が適当であり得る。持続放出を達成するための種々の製剤および装置が当技術分野で公知である。
【０１４９】
一実施形態では、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０抗体の投薬量は、１回またはそれ以上の投与を受けた個体において経験的に判断してよい。個体にはＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０の漸増する投薬量が与えられる。ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０またはその他の同等な抗体の有効性を評価するため、特定の癌疾患状態のマーカーをモニターしてよい。これらのマーカーとしては、触診または目で観察することによる腫瘍サイズの直接測定；Ｘ線またはその他のイメージング技術による腫瘍サイズの間接測定；腫瘍サンプルの直接の腫瘍生検および顕微鏡検査により評価される改善；間接的な腫瘍マーカー（例えば、前立腺癌のＰＳＡ）の測定、疼痛または麻痺の減少；発声、視力、呼吸またはその他の腫瘍に関係する能力障害の改善；食欲の増加；あるいは承認された試験または生存の延長で測定される生活の質の向上、が挙げられる。個体、癌の種類、癌の病期、個体において癌が別の位置へ転移したかどうか、およびこれまでの治療および同時に用いられている治療によって、投薬量が変動することは当業者には明らかであろう。
【０１５０】
その他の製剤としては、当技術分野で公知の適した送達形態が挙げられ、限定されないが、リポソームなどの担体が含まれる。例えば、Ｍａｈａｔｏら（１９９７）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４：８５３−８５９を参照されたい。リポソーム製剤には、限定されないが、シトフェクチン（ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎｓ）、多重膜小胞および単層小胞が含まれる。
【０１５１】
一部の実施形態では、１より多い抗体が存在し得る。抗体はモノクローナルであってもポリクローナルであってもよい。そのような組成物には、癌腫、腺癌、肉腫、または腺肉腫に対して反応性の少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの異なる抗体が含まれ得る。ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５またはＬＵＣＡ４０抗体は、限定されないが、卵巣、乳房、肺、前立腺、結腸、腎臓、皮膚、甲状腺、骨、上部消化管、および膵臓をはじめとする臓器の癌腫、腺癌、肉腫、または腺肉腫に対して反応性の１またはそれ以上の抗体と混合してよい。抗体の混合物は、当技術分野でしばしば示されるように、より広範囲の個体集団の治療に特に有用であり得る。
【０１５２】
疾患の評価は、当技術分野での標準法、例えばイメージング法および適当なマーカーのモニタリングを用いて行う。
【０１５３】
ＥｐｈＡ２と結合する本発明の抗体およびポリペプチドを含むキット
また、本発明は、診断および／または治療で用いる、本明細書に記載されるＥｐｈＡ２と結合する抗体または任意の組成物を含むキットを提供する。従って、キットはＥｐｈＡ２と選択的に結合する、かつ／またはＥｐｈＡ２と複合体を形成することができる抗体（例えば、乳癌細胞、結腸癌細胞、肺癌細胞、または前立腺癌細胞の検出に有用である）を含む。一部の実施形態では、キットは、抗ＥｐｈＡ２抗体、または、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５もしくはＬＵＣＡ４０が選択的に結合するエピトープと同一のエピトープに選択的に結合する抗体を含む。一部の実施形態では、キットは、治療薬または標識薬剤と結合した、抗ＥｐｈＡ２抗体または、ＬＵＣＡ１９、ＳＰＬ１、ＳＧ５もしくはＬＵＣＡ４０が選択的に結合するエピトープと同一のエピトープに選択的に結合する抗体を含む。これらのキットには、前記抗体または本明細書に記載される任意の抗体もしくはポリペプチド実施形態と治療薬または標識薬剤とを結合させるための使用説明書および／または試薬がさらに含まれ得る。いくつかの態様では、抗体（例えば、モノクローナル、ポリクローナル、ヒト、ヒト化、その他）のＥｐｈＡ２との結合は、個体において癌を診断するため、例えば、癌細胞の存在または不在を検出するためのキット、および乳房癌細胞、結腸癌細胞、肺癌細胞、または前立腺癌細胞の存在または不在を検出するためのキットに用いられる。その他の態様では、キットは、例えば、癌または癌の家族歴を有する個体を治療するために用いられ得る。癌を有する個体を治療するためのキットとしては、限定されないが、癌細胞の成長および／または増殖を阻害するためのキット、治療薬を癌細胞へ送達するためのキット、治療薬を癌細胞の中へ送達するためのキットが挙げられる。本発明のキットは適した包装がされており、所望により、さらなる構成要素、例えば、バッファーおよびＥｐｈＡ２との結合を判定する説明書（捕獲試薬、現像試薬、標識、反応表面、検出手段、対照サンプル、および解釈データなど）を提供する。説明書は、抗原結合の任意の測定（限定されないが、本明細書に記載されるアッセイ法を含む）のためであってよい。他の実施形態では、説明書は、癌細胞（乳癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、または前立腺癌細胞など）の成長および／または増殖を阻害するための説明書、治療薬を癌細胞へ送達するための説明書、治療薬を癌細胞の中へ送達するための説明書をはじめとする、本明細書に記載される任意の方法のためであってよい。一部の実施形態では、上記の試薬は複数の測定が行われ得るように、同じ個体での経時的測定または複数個体での測定が可能となるように、供給される。標識された抗ヒト抗体など、抗体の結合を検出するためのいずれかの適当な手段を用いて（そしてキットに含めて）よい（標識は酵素、フルオロフォア、化学発光物質、放射性同位元素または補酵素であってよい）。一般に、用いられる標識は酵素である。
【０１５４】
以下の実施例は本発明を説明するために提供され、本発明を限定するためではない。
【実施例】
【０１５５】
実施例１．免疫原としての癌細胞株の調製
組織または細胞培養から単離した全細胞を、特定の細胞種を代表する表面抗原に特異的なモノクローナル抗体産生のための免疫原として用いた。そのような、本発明の実践に適した方法は米国特許第６，５４１，２２５号に記載されている。概して、特定の細胞種の細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体を産生するために、形質転換されていないＢ細胞をその種類の生存可能かつ無傷な細胞で、好ましくは、表面に血清を含まない細胞で免疫化することが望ましい。抗原ＥｐｈＡ２に対するモノクローナル抗体（限定されないが、ＬＵＣＡ１９、ＬＵＣＡ４０、またはＳＰＬ１など）の産生に適した細胞株としては、ＢＴ−４７４（ＡＴＣＣ＃  ＨＴＢ−２０）、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５ＶＩＩ（ＡＴＣＣ＃  ＨＢ−２５）、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１（ＡＴＣＣ＃  ＨＢ−２７）、ＳＫＢＲ３（ＡＴＣＣ＃  ＨＴＢ−３０）、ＳＫＭＥＳ−１（ＡＴＣＣ＃  ＨＴＢ−５８）、ＥＳ−２（ＡＴＣＣ＃  ＣＲＬ−１９７８）、ＳＫＯＶ３（ＡＴＣＣ＃  ＨＴＢ−７７）、ＨＰＡＦＩＩ（ＡＴＣＣ＃  ＣＲＬ−１９９７）、Ｈｓ７００Ｔ（ＡＴＣＣ＃  ＨＴＢ−１４７）、Ｃｏｌｏ２０５（ＡＴＣＣ＃  ＣＣＬ−２２２）、ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ＃  ＨＴＢ−３８）、ＳＷ４８０（ＡＴＣＣ＃  ＣＣＬ−２２８）、ＳＷ９４８（ＡＴＣＣ＃  ＣＣＬ−２３７）、Ａ４９８（ＡＴＣＣ＃  ＨＴＢ−４４）およびＣａｋｉ−２（ＡＴＣＣ＃  ＨＴＢ−４７）が挙げられる。
【０１５６】
増殖因子を補給した、血清を含まない適当な栄養培地で細胞を増殖させた。血清を補給した培地で増殖された細胞での免疫化は、極度な不都合を有し得る。血清には、定義されていない活性を持つ大小の生体分子の複雑な混合物が含まれる。これらの生体分子は細胞の表面に付着し、それにより特定の細胞種を代表しない分子と交差反応する抗体の産生をもたらし得る。その上、血清生体分子の細胞表面との結合は、所望の細胞表面抗原標的のマスキングをもたらし得る。多数の無血清培地調製物が商業的に公知であり、公的に入手可能である（例えば、次の栄養補助剤：インスリン（終濃度１０μｇ／ｍｌ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）（終濃度５ｎｇ／ｍｌ）、亜セレン酸（終濃度２．５×１０−８Ｍ）、およびブタ下垂体抽出物（ＰＰＥ）（終濃度５μｌ／ｍｌ）を含むＦ１２／ＤＭＥ（１：１）栄養培地）。
【０１５７】
細胞を回収するため、細胞単層をカルシウムおよびマグネシウムを含まないハンクス生理食塩水溶液で１回すすぎ、ハンクス生理食塩水溶液中１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中で３７℃にて１５分間インキュベートした。穏やかにピペッティングして細胞を培養表面から切り離した。１０００×ｇで５分間の遠心分離により細胞懸濁液をペレット化した。上清を除去し、細胞を無血清培地で、必要に応じて非変性アジュバントとともに再懸濁した。
【０１５８】
実施例２．モノクローナル抗体の産生
非変性アジュバント（Ｒｉｂｉ、Ｒ７３０、Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＭＴ）をリン酸緩衝生理食塩水で２ｍｌに再水和した。次に、この再水和アジュバント１００μｌを、免疫化に用いる実施例１からのいくつかの細胞ペレットとともに穏やかに混合した。ＢａＩｂ／ｃマウスの足の裏からマウス１匹あたり約１０６細胞を、週に約１回または２回注入した。正確な免疫化スケジュールは次の通り。０日目、免疫化＋Ｒｉｂｉ。３日目、免疫化＋Ｒｉｂｉ。７日目、免疫化＋Ｒｉｂｉ。２４日目、免疫化−Ｒｉｂｉ。２９日目、免疫化−Ｒｉｂｉ。３２日目、免疫化−Ｒｉｂｉ。３６日目、免疫化−Ｒｉｂｉ。４４日目、免疫化−Ｒｉｂｉ。５１日目、免疫化−Ｒｉｂｉ。６９日目、抗体価検査のため出血。７１日目、免疫化＋Ｒｉｂｉ。７４日目、免疫化＋Ｒｉｂｉ。８１日目、免疫化＋Ｒｉｂｉ。９１日目、融合前の追加免疫（Ｒｉｂｉ無し）。１０４日目、融合のため結節を収集。
【０１５９】
６９日目に、各免疫化動物の尾から一滴の血液を抜き、ＦＡＣＳ分析を用いて免疫化に用いた細胞株に対する抗体の力価を検査した。力価が少なくとも１：２０００に達すると、ＣＯ２を用いてマウスを犠牲にし、続いて頚椎脱臼した。ハイブリドーマ調製のためにリンパ節を収集した。
【０１６０】
マウス由来のリンパ球を、３５％ポリエチレングリコール４０００を用いてマウス骨髄腫株Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と融合した。融合後１０日目に、ハイブリドーマ上清を、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）で免疫細胞特異的モノクローナル抗体の存在についてスクリーニングした。各ハイブリドーマ由来の馴化培地を、ヒト胎児腎細胞の一定分量で３０分間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞サンプルを洗浄し、０．１ｍｌ希釈液に再懸濁し、４℃にて３０分間、ヤギ抗マウスＩｇＧのＦＩＴＣコンジュゲートＦ（ａｂ’）２断片１μｇ／ｍｌとともにインキュベートした。細胞を洗浄し、０．２ｍｌ  ＦＡＣＳ希釈液に再懸濁し、ＦＡＣＳｃａｎ細胞分析装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて分析した。ハイブリドーマクローンを、ＦＡＣＳによる、ヒト胎児腎細胞の表面との結合に基づいて、さらなる増殖、クローニング、および特性決定用に選択した。Ａｇ−ＳＰＬ１と名付けられた抗原と、その抗原上のＡｇ−ＳＰＬ１．１と名付けられたエピトープを結び付ける、ｍｕ−ＳＰＬ１と名付けられたモノクローナル抗体を作るハイブリドーマを選択した。Ａｇ−ＬＵＣＡ１９と名付けられた抗原と、その抗原上のＡｇ−ＬＵＣＡ１９．１と名付けられたエピトープとを結び付ける、ｍｕ−ＬＵＣＡ１９と名付けられたモノクローナル抗体を作るハイブリドーマを選択した。Ａｇ−ＬＵＣＡ４０と名付けられた抗原と、その抗原上のＡｇ−ＬＵＣＡ４０．１と名付けられたエピトープとを結び付ける、ｍｕ−ＬＵＣＡ４０と名付けられたモノクローナル抗体を作るハイブリドーマを選択した。Ａｇ−ＳＧ５と名付けられた抗原と、その抗原上のＡｇ−ＳＧ５．１と名付けられたエピトープとを結び付ける、ｍｕ−ＳＧ５と名付けられたモノクローナル抗体を作るハイブリドーマを選択した。モノクローナル抗体、ｍｕ−ＳＰＬ−１、ｍｕ−ＬＵＣＡ１９、ｍｕ−ＬＵＣＡ４０およびｍｕ−ＳＧ５を産生するハイブリドーマを、モノクローナル抗体の増殖および抗体精製を支持することのできる培地中でモノクローナル抗体精製のために拡大培養した。
【０１６１】
実施例３．抗ＥｐｈＡ２抗体の精製
ヒト癌細胞、例えば、限定されないが、ＳＫＭＥＳ−１、７８６−Ｏ、およびＣｏｌｏ２０５細胞株を、１０．０ｍＭ  ＥＤＴＡの存在下、組織培養フラスコから分離し、１４００ｒｐｍで５分間遠心分離し、１％  ＢＳＡおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ＦＡＣＳ希釈液）に再懸濁した。細胞を計数し、１０７細胞／ｍｌに調整した。約０．１ｍｌの細胞を、１００μｌ  ＦＡＣＳ希釈液とともに３７℃にて３０分間インキュベートした。タンパク質Ｇアフィニティークロマトグラフィーを用いてヒト癌細胞株と結合するモノクローナル抗体を組織培養上清から精製した。必要であれば、過剰なウシＩｇＧを除去するために、抗体精製の前に組織培養上清をウシＩｇＧカラムに通してもよい。次の物質が抗体精製プロセスに用いられた：ハイブリドーマ組織培養上清、Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ（Ｇ）ＩｇＧ結合バッファー（Ｐｉｅｒｃｅ  ＃２１０１１  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ  ＩｇＧ溶出バッファー（Ｐｉｅｒｃｅ  ＃２１００９）、濃ＨＣｌ（ｐＨ調節用）、Ｃｏｒｎｉｎｇ  １リットルＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）、０．２２μｍフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＃４３１０９８，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃１７−０６１８−０３）、３Ｍ  チオシアン酸カリウム／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．８で構成されるストリッピングバッファー、およびＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、３Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９．０。
【０１６２】
マウス抗ヒトＳＰＬ１、マウス抗ヒトＬＵＣＡ１９およびマウス抗ヒトＬＵＣＡ４０抗体（本明細書において、それぞれｍｕ−ＳＰＬ１、ｍｕ−ＬＵＣＡ１９およびｍｕ−ＬＵＣＡ４０と呼ばれる）を精製するため、上清の量を測定し、等量の結合バッファーを上清に加えた。混合物を室温と平衡になるまで放置した。０．２２μｍフィルターに通して上清を浄化した。ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて上清をプロテインＧセファロースカラムに付加した後、５〜１０カラム量の結合バッファーで洗浄した。モノクローナル抗体を溶出バッファーで溶出し、画分を回収した。溶出時に３Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ９．０を添加して画分を中和してチューブを空にした（画分の１／６０量）。モノクローナル抗体を含むピーク画分をプールした。プールしたサンプルを予め湿らせたスライドＡライザー・カセット（分子量カットオフ１０，０００；Ｐｉｅｒｃｅ  ＃６６８１０）に注入し、１×ＰＢＳ中で４℃にて透析した（３回のバッファー交換（１回の交換につき少なくとも４時間の透析）を含む）。精製されたモノクローナル抗体を滅菌濾過し（０．２μｍ  Ａｃｒｏｄｉｓｃ）、２〜８℃で保存した。
【０１６３】
精製された抗体のサンプルは、ＵＶ吸光度（Ａ２８０）およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による濃度決定のために取っておく。分子量の分析、モノクローナル抗体の典型的な結合パターンの同定および純度の評価のために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを非還元条件下および還元条件下の双方で行う。
【０１６４】
ハイブリドーマ上清由来のｍｕ−ＳＰＬ１、ｍｕ−ＬＵＣＡ１９およびｍｕ−ＬＵＣＡ４０モノクローナル抗体の精製後、対象の個々の免疫細胞または標的細胞との結合について再検査した。細胞サンプルを上記のように調製し、様々な濃度の精製抗体とともにインキュベートした。インキュベーションの後、細胞を洗浄し、０．１ｍｌ希釈液に再懸濁し、ヤギ抗マウスＩｇＧのＦＩＴＣコンジュゲートＦ（ａｂ）’２断片１μｇとともに４℃にて３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、０．５ｍｌ  ＦＡＣＳ希釈液に再懸濁し、ＦＡＣＳｃａｎセルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて分析した。ＦＡＣＳｃａｎヒストグラムの右へのシフトにより、精製抗体がまだ細胞と結合していることが示された。
【０１６５】
別の実験では、ｍｕ−ＳＰＬ１、ｍｕ−ＬＵＣＡ１９およびｍｕ−ＬＵＣＡ４０抗体と、それぞれＳＰＬ１、ＬＵＣＡ１９およびＬＵＣＡ４０との結合を試験し、生細胞ＥＬＩＳＡを用いて確認した。次の方法が用いられたが、当分野で一般に知られているその他の方法も適用できる。細胞（ＨＴ−２９、ＳＫＯＶ３、ＳＫＭＥＳ−１、ＳＷ４８０、ＳＫＢＲ−３、およびＨＰＡＦＩＩ）を、組織培養処理した９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）上で培地を含む１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中でコンフルエントに達するまで増殖した。細胞をＰＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウムを含有するハンクス平衡塩（ＨＢＳＳ）中、所望の濃度の所望の抗体５０μｌとともに室温にて１時間インキュベートした。次に、細胞をウェルあたり１００μｌのＨＢＳＳで３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）二次抗体（ＨＢＳＳに希釈、ウェルあたり５０μｌ）とともに室温にて３０分間インキュベーションした。細胞を最後にＨＢＳＳで３回洗浄し、変色基質（ＴＭＢ基質、ＫＰＬ）をウェルあたり１００μｌで各ウェルに添加した。ウェルあたり１００μｌの１Ｍ  リン酸を添加して変色反応を停止させた。次に、プレートをＯ．Ｄ．４５０ｎｍで読み取った。
【０１６６】
実施例４．癌細胞株ＳＷ４８０でのＳＰＬ１、ＬＵＣＡ１９およびＬＵＣＡ４０発現のウエスタンブロット解析
腎細胞癌細胞株ＳＷ４８０（ＡＴＣＣ＃  ＣＣＬ−２２８）を１７５ｃｍ２培養皿でコンフルエントに達するまで増殖させた。コンフルエントな単層をハンクス平衡塩（重炭酸ナトリウムまたはフェノールレッドを含まないＨＢＳＳ＋；１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓで緩衝）で３回洗浄し、２００μｇのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｅｎｄｏｇｅｎ）で室温にて３０分間ビオチン化した。次に、細胞を０．１Ｍ  Ｔｒｉｓを含むＨＢＳＳ＋、ｐＨ７．４（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で洗浄し、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓを含むＨＢＳＳ＋、ｐＨ７．４中で室温にて１５分間インキュベートした。細胞を最後にＨＢＳＳ＋で３回洗浄し、氷上で、溶解バッファー（２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．１％アジ化ナトリウム、および溶解バッファー５ｍｌあたり１錠のＥＤＴＡフリー、コンプリート・ミニ−プロテアーゼカクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含むＨＢＳＳ＋）中、５分間のインキュベーションにより溶解した。
【０１６７】
細胞を溶解バッファー中でこすり、ライセートを回収した。ライセートを１４，０００−×ｇで１時間４℃にて遠心分離した。次に、浄化したライセートを４℃にて２時間、５μｌのヒトＩｇＧコンジュゲート（１ｍｇ／ｍｌ）ＣＮＢｒ  ４ＭＢ  セファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で事前に洗浄した。ヒトＩｇＧビーズを遠心分離して除去した後、事前に洗浄したライセートを、次にＣＮＢｒ  ４ＭＢ  セファロースビーズと結合したモノクローナル抗体（１ｍｇ／ｍｌで結合）ｍｕ−ＳＰＬ１、ｍｕ−ＬＵＣＡ１９、ｍｕ−ＳＧ５またはｍｕ−ＬＵＣＡ４０とともに４℃にて２時間インキュベートした。２時間のインキュベーションの後、ｍｕ−ＳＰＬ１、ｍｕ−ＬＵＣＡ１９、ｍｕ−ＳＧ５またはｍｕ−ＬＵＣＡ４０ビーズを遠心分離して取り除いた。ヒトＩｇＧおよびｍｕ−ＳＰＬ１、ｍｕ−ＬＵＣＡ１９、ｍｕ−ＳＧ５またはｍｕ−ＬＵＣＡ４０ビーズの双方を個別に１ｍｌの溶解バッファーで３回洗浄した後、１ｍｌ  ＨＢＳＳ＋で３回洗浄した。３０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーの添加および９９℃にて５分間の沸騰により、洗浄したビーズを溶出した。
【０１６８】
次に、サンプルを４〜２０％  Ｎｏｖｅｘ勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離し、０．２μｍニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｅｎｄｏｇｅｎ）により視覚化するか、または５μｇ／ブロットのｍｕ−ＳＰＬ１、ｍｕ−ＬＵＣＡ１９、ｍｕ−ＳＧ５もしくはｍｕ−ＬＵＣＡ４０でウエスタンブロットを行った。
【０１６９】
ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンを用いる検出のため、ニトロセルロースを最初にブロッキングバッファー（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水中５％の脱脂粉乳）で１時間ブロッキングした。ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンをＴＢＳＴ中に１μｇ／ｍｌで希釈し、室温にて３０分間ニトロセルロースに曝露した。ＥＣＬ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で視覚化する前にニトロセルロースをＴＢＳＴ中で３回洗浄した。
【０１７０】
ｍｕ−ＳＰＬ１、ｍｕ−ＬＵＣＡ１９、ｍｕ−ＳＧ５またはｍｕ−ＬＵＣＡ４０でのウエスタンブロッティングのため、ニトロセルロースを同様にブロッキングバッファー中で１時間ブロッキングした。次に、ブロッキングバッファーに希釈した５μｇ／ｍｌのｍｕ−ＳＰＬ１、ｍｕ−ＬＵＣＡ１９、ｍｕ−ＳＧ５またはｍｕ−ＬＵＣＡ４０の１ｍｌを含有する熱封着したプラスチックポーチ中でニトロセルロースをインキュベートした。ニトロセルロースを、１０ｍｌの１μｇ／ｍｌ  ＨＲＰコンジュゲートロバ抗マウスＩｇＧ（重鎖および軽鎖特異的、ウシ、ニワトリ、ヤギ、モルモット、シリアンハムスター、ウマ、ヒト、ウサギ、ヒツジ血清タンパク質に対して交差吸収済；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  カタログ番号７０９−０３５−１４９）とともに室温にて１時間のインキュベーションの前に、ＴＢＳＴで３回洗浄した。ニトロセルロースを最後にＴＢＳＴで３回洗浄し、ＥＣＬ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で視覚化した。
【０１７１】
実施例５．免疫組織化学法
癌患者由来の凍結した組織サンプルをＯＣＴ化合物中に包埋し、ドライアイスを用いてイソペンタン中で急速冷凍した。凍結切片を、ライカ３０５０ＣＭミクロトームを用いて厚さ８〜１０μｍに切り、ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓスライド（ＶＷＲ  ＃４８３１１−７０３）に解凍マウントした。切片を７５％アセトン／２５％エタノールで１０℃にて固定し、室温にて２〜４時間風乾させた。固定した切片を使用するまで−８０℃で保存した。
【０１７２】
免疫組織化学のため、組織切片を回収し、Ｔｒｉｓ緩衝０．０５％Ｔｗｅｅｎ（ＴＢ−Ｔ）中で洗浄し、室温にて３０分間、ブロッキングバッファー（ＴＢ−Ｔ、５％正常ヤギ血清および１００μｇ／ｍｌアビジン）中でブロッキングした。次に、スライドをｍｕ−ＬＵＣＡ１９、ｍｕ−ＬＵＣＡ４０、ｍｕ−ＳＧ５またはｍｕ−ＳＰＬ１、およびブロッキングバッファーに希釈した（１μｇ／ｍｌ）対照モノクローナル抗体とともに室温にて６０〜９０分間インキュベートした。次に、切片をブロッキングバッファーで３回洗浄した。結合したモノクローナル抗体を、０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー中のヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２−ペルオキシダーゼコンジュゲートおよびペルオキシダーゼ基質ジアミノベンジジン（１ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ｄ５６３７）ｐＨ５．０５、ならびに０．００３％過酸化水素（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ｈ１００９）で検出した。染色したスライドをヘマトキシリンで対比染色し、ニコン顕微鏡で検査した。
【０１７３】
いくつかの場合、ホルムアルデヒドで固定されたパラフィン包埋組織を、適当な抗原回収手法を用いた後に免疫組織化学に用いることができる。そのような抗原回収手法の１つがＭａｎｇｈａｍおよびＩｓａａｃｓｏｎ，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ３５：１２９−３３（１９９９）に記載されている。抗原回収および／または検出のその他の方法も当業者により用いられ得る。凍結組織、または、適切な場合には、固定組織を用いて行われる抗原回収およびｐｏｌｙＭＩＣＡ検出と類似の実験の結果が行われた。抗ＬＵＣＡ１９、抗ＬＵＣＡ４０および抗ＳＰＬ１抗体と種々の正常組織および癌組織との結合を評価した。全ての場合において、対照固定組織での抗体結合を、凍結組織のものと相関させた。凍結組織の結果は対照中の２つが一致しなかった場合にのみ用いた。
【０１７４】
便宜上、異なる供給源由来の凍結手術組織を用いるいくつかの実験の総合結果の概要を下表１〜７に示す。表１〜４は、正常ヒト組織上でのＬＵＣＡ１９、ＬＵＣＡ４０、ＳＰＬ１、およびＳＧ５抗原の分布をまとめる。表５〜７は、様々なヒト腫瘍組織上でのＬＵＣＡ１９、ＬＵＣＡ４０およびＳＰＬ１抗原の分布をまとめる。
【０１７５】
【表１】
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【０１７６】
【表２】
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【０１７７】
【表３】
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【０１７８】
【表４】
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【０１７９】
【表５】
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【０１８０】
【表６】
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【０１８１】
【表７】
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実施例６．免疫細胞化学結果
モノクローナル抗体ｍｕ−ＬＵＣＡ１９、ｍｕ−ＬＵＣＡ４０およびｍｕ−ＳＰＬ１を用いて異なる組織種由来の様々な細胞株との反応を試験した。弱い陽性染色を「＋」、中程度の陽性染色を「＋＋」、強い陽性染色を「＋＋＋」および陰性の染色を「−」として結果を記録した。
【０１８２】
免疫組織化学結果は、ＷＯ０１／４３８６９号に記載のＣｅｌｌＡｒｒａｙ（商標）技術を用いて得た。確立された異なる細胞株由来の細胞を、プロテアーゼを用いずに増殖表面から取り出し、パックしてＯＣＴ化合物中に包埋した。細胞を凍結し切片を作製した後、標準的なＩＨＣプロトコールを用いて染色した。
【０１８３】
ｍｕ−ＬＵＣＡ１９、ｍｕ−ＬＵＣＡ４０およびｍｕ−ＳＰＬ１抗体と様々な確立されたヒト正常細胞株および腫瘍細胞株との結合の結果を、便宜上、表８〜１０にまとめる。表８に表される実験には、本明細書に記載される方法を用いるｍｕ−ＬＵＣＡ１９での生細胞ＥＬＩＳＡ、Ｓａｒｃｏｍａ  ＡｒｒａｙおよびＣｅｌｌＡｒｒａｙ（商標）結合実験が含まれる。表９に表される実験には、本明細書に記載される方法を用いるｍｕ−ＬＵＣＡ４０での生細胞ＥＬＩＳＡ、Ｓａｒｃｏｍａ  ＡｒｒａｙおよびＣｅｌｌＡｒｒａｙ（商標）結合実験が含まれる。表１０に表される実験には、本明細書に記載される方法を用いるｍｕ−ＳＰＬ１での生細胞ＥＬＩＳＡ、Ｓａｒｃｏｍａ  ＡｒｒａｙおよびＣｅｌｌＡｒｒａｙ（商標）結合実験が含まれる。
【０１８４】
【表８−１】
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【０１８５】
【表８−２】
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【０１８６】
【表８−３】
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【０１８７】
【表９−１】
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【０１８８】
【表９−２】
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【０１８９】
【表９−３】
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【０１９０】
【表１０−１】
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【０１９１】
【表１０−２】
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【０１９２】
【表１０−３】
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本明細書に記載される方法を用いる、ｍｕ−ＬＵＣＡ１９、ｍｕ−ＬＵＣＡ４０およびｍｕ−ＳＰＬ１抗体と、米国国立癌研究所（ＮＣＩ）の確立された様々な腫瘍細胞株との結合の結果を、便宜上、表１１にまとめる。
【０１９３】
【表１１−１】
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【０１９４】
【表１１−２】
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【０１９５】
【表１１−３】
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モノクローナル抗体ｍｕ−ＬＵＣＡ１９、ｍｕ−ＬＵＣＡ４０およびｍｕ−ＳＰＬ１を用いて神経膠腫由来細胞株での反応性を試験した。免疫細胞化学結果は、ＣｅｌｌＡｒｒａｙ（商標）技術に関する上記と同様のプロトコールを用いて得た。神経膠腫由来細胞株を、プロテアーゼを用いずに増殖表面から取り出し、パックしてＯＣＴ化合物中に包埋した。細胞を凍結し切片を作製した後、標準的なＩＨＣプロトコールを用いて染色した。ｍｕ−ＬＵＣＡ１９はスクリーニングした２５の神経膠腫由来細胞株のうち１７で陽性であった。染色強度の範囲は＋／−から３＋染色であった。Ｍｕ−ＬＵＣＡ４０はスクリーニングした２５の神経膠腫由来細胞株のうち１８で陽性であった。染色強度の範囲は＋／−から３＋染色であった。ｍｕ−ＳＰＬ−１はスクリーニングした２５の神経膠腫由来細胞株のうち１４で陽性であった。染色強度の範囲は＋／−から３＋染色であった。
【０１９６】
実施例７．抗原Ａｇ−ＳＰＬ１、Ａｇ−ＬＵＣＡ１９、Ａｇ−ＳＧ５およびＡｇ−ＬＵＣＡ４０の単離および特性決定
ＳＰＬ１、ＬＵＣＡ１９、ＳＧ５およびＬＵＣＡ４０が反応性である抗原を同定するため、免疫沈降（Ｉｐｐｔ）実験を行った。免疫沈降のために、１７５ｃｍ２フラスコ３０個のＳＷ４８０細胞を３０ｍｌの溶解バッファーで溶解した。溶解バッファーは、２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、プロテアーゼ阻害剤カクテル（溶解バッファー５ｍｌあたり１錠のＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ製コンプリート・ミニ、ＥＤＴＡフリー、プロテアーゼカクテル）、０．１％アジ化ナトリウム、および２ｍＭ  ＰＭＳＦで強化されたＨａｎｋｓ緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ＋）で構成された。細胞ライセートを４℃にて３０分間２４，０００×ｇで浄化した後、１ｍｌのタンパク質Ｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）からなるカラムに通した。次に、事前に洗浄したＳＷ４８０ライセートを、ｍｕ−ＳＰＬ１、ｍｕ−ＬＵＣＡ１９、ｍｕ−ＳＧ５またはｍｕ−ＬＵＣＡ４０に吸収させたタンパク質Ｇ（１０μｇのｍｕ−ＳＰＬ１、ｍｕ−ＬＵＣＡ１９、ｍｕ−ＳＧ５またはｍｕ−ＬＵＣＡ４０を５μｌのタンパク質Ｇとともに室温にて３０分間プレインキュベートした）とともに４℃にて２時間インキュベートした。次に、ビーズ（事前に洗浄したタンパク質Ｇビーズとタンパク質Ｇを吸収したｍｕ−ＳＰＬ１、ｍｕ−ＬＵＣＡ１９、ｍｕ−ＳＧ５またはｍｕ−ＬＵＣＡ４０ビーズの双方）を溶解バッファーで３回洗浄し、３０μｌのＳＤＳサンプルバッファー（３％  ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０ｍＭ  ＤＴＴ、２％  ブロモフェノールブルー、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）で溶出した。次に、２５μｌの溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クーマシー染色により視覚化した。５μｌの溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、さらにウエスタンブロッティングのためにニトロセルロースに移した。
【０１９７】
次に、ブロットをｍｕ−ＳＰＬ１、ｍｕ−ＬＵＣＡ１９、ｍｕ−ＳＧ５またはｍｕ−ＬＵＣＡ４０でプローブし、ウエスタンブロッティングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号ＷＢ７１０３）を用いて発色させて抗原認識を確認した。ｍｕ−ＳＰＬ１、ｍｕ−ＬＵＣＡ１９、ｍｕ−ＳＧ５またはｍｕ−ＬＵＣＡ４０、および、ｍｕ−ＳＰＬ１、ｍｕ−ＬＵＣＡ１９  ｍｕ−ＳＧ５もしくはｍｕ−ＬＵＣＡ４０に対するマウスＩｇＧ溶出液をウエスタンブロット解析することより、ｍｕ−ＳＰＬ１、ｍｕ−ＬＵＣＡ１９、ｍｕ−ＳＧ５またはｍｕ−ＬＵＣＡ４０溶出液に特有のタンパク質が観察された。染色したタンパク質のバンドを清潔な外科用メスの刃を用いてＮｕＰＡＧＥゲルから切り出し、清潔なエッペンドルフチューブに入れた。切り出したバンドは、質量分析によるタンパク質同定に使用するまで−２０℃で保存した。
【０１９８】
実施例８．ｍｕ−ＳＰＬ１、ｍｕ−ＬＵＣＡ１９、ｍｕ−ＳＧ５またはｍｕ−ＬＵＣＡ４０と結合する抗原のタンデム質量分析（ＭＳｌＭＳ）を用いる特性決定
Ｍｕ−ＳＰＬ１、ｍｕ−ＬＵＣＡ１９、ｍｕ−ＳＧ５およびｍｕ−ＬＵＣＡ４０と結合する抗原を実施例７に記載されるように単離し、Ｋａｎｅら、Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ．２００２  Ｊｕｎｅ  ２１；２７７（２５）：２２１１５−８、Ｅｐｕｂ  Ｍａｙ  ０６の方法に従ってタンデム質量分析に付した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ゲルをコロイド状のクーマシーブルー試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色する。対象のタンパク質をゲル中でトリプシン消化させる。トリプシンペプチドを、Ｗｕら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０５：４７７−４８２（２０００）に記載されるように、イオントラップ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＤＱ  ＤＥＣＡ  ＸＰ）でマイクロキャピラリー液体クロマトグラフィーＭＳ／ＭＳにより配列決定する。
【０１９９】
あるいは、一般に知られているその他の質量分析の方法、例えばＭＡＬＤＩ質量分析も本発明の実践に用いられる。質量分析法による分析の結果は、ｍｕ−ＳＰＬ１、ｍｕ−ＬＵＣＡ１９、ｍｕ−ＳＧ５およびｍｕ−ＬＵＣＡ４０と結合する抗原がＥｐｈＡ２であることを示した。
【０２００】
実施例９．ｍｕ−ＳＰＬ１、ｍｕ−ＬＵＣＡ１９、ｍｕ−ＳＧ５およびｍｕ−ＬＵＣＡ４０のエピトープマッピングのためのサンドイッチＥＬＩＳＡ
ｍｕ−ＳＰＬ１、ｍｕ−ＬＵＣＡ１９、ｍｕ−ＳＧ５およびｍｕ−ＬＵＣＡ４０と結合するＥｐｈＡ２上の特異的なエピトープを、競合サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて評価した。５０μｌ／ウェルの１０μｇ／ｍｌ濃度のｍｕ−ＳＰＬ１、ｍｕ−ＬＵＣＡ１９、ｍｕ−ＳＧ５またはｍｕ−ＬＵＣＡ４０をＨＢＳＳ（重炭酸ナトリウムおよびフェノールレッドを含まないハンクス平衡塩）に希釈し、室温にて２時間放置して９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｂマイクロタイタープレートと結合させた。次に、コーティングされたプレートを、１％  ＢＳＡ（Ｗ／Ｖ）を含有するＨＢＳＳで３０分間ブロッキングした。ＨＴ−２９細胞を実施例７に記載されるように溶解させた。次に、ブロッキングしたマイクロタイターウェルに、ライセートをウェルあたり１５０μｌの量で適用する。ライセートを室温にて１時間置いてインキュベートさせる。インキュベーション後、プレートを次にブロッキングバッファーで完全に洗浄する。ビオチン化したｍｕ−ＳＰＬ１、ｍｕ−ＬＵＣＡ１９、ｍｕ−ＳＧ５およびｍｕ−ＬＵＣＡ４０（濃度５０μｌ／ウェル、１μｇ／ｍｌ）をマイクロタイターウェルに添加し、室温にて１時間置いてインキュベートさせる。ビオチン化したｍｕ−ＳＰＬ１、ｍｕ−ＬＵＣＡ１９、ｍｕ−ＳＧ５およびｍｕ−ＬＵＣＡ４０は、精製抗体１ｍｇにつき１μｌのＤＭＳＯに希釈した２００ｍｇ／ｍｌスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを室温にて２時間インキュベートすることにより調製した。次に、終濃度０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４で室温にて３０分間ビオチン化抗体をクエンチする。次にビオチン化した抗体を分子量３０ｋＤａのカットオフフィルターに通して濃縮することにより遊離ビオチンから分離する。ビオチン化抗体を１時間インキュベートした後、プレートをＨＢＳＳで完全に洗浄する。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（ＳＡ−ＨＲＰ）をＨＢＳＳに濃度１：１０，０００にて希釈する。希釈したＳＡ−ＨＲＰを洗浄したマイクロタイターウェルに５０μｌ／ウェルで加え、室温にて３０分間インキュベートさせる。ＳＡ−ＨＲＰのインキュベーションの後、プレートを最後にＨＢＳＳで完全に洗浄し、色変化反応用の１−Ｓｔｅｐ  ＴＭＢ基質１００μｌ／ウェルを添加して発色させる。発色は、ミリＱ水に希釈した１Ｍリン酸１００μｌ／ウェルを添加して停止させる。次に、ＴｈｅｒｍｏＭａｘマイクロタイタープレートリーダーを用いて発色したプレートを４５０ｎｍで分析する。
【０２０１】
競合サンドイッチＥＬＩＳＡの結果から、本発明者らは、ｍｕ−ＳＰＬ１、ｍｕ−ＬＵＣＡ１９、ｍｕ−ＳＧ５およびｍｕ−ＬＵＣＡ４０が、１つはｍｕ−ＬＵＣＡ４０に表され、２つ目はｍｕ−ＳＰＬ１に表される、２つの個別のエピトープを介してＥｐｈＡ２と結合している３つの抗体を表すことを結論付けることができる。ｍｕ−ＬＵＣＡ１９は共有していると思われるが、ｍｕ−ＳＰＬ１に表されるエピトープと直接オーバーラップすることはない。このオーバーラップはｍｕ−ＬＵＣＡ４０エピトープに表されるエピトープに及ぶことはない。
【０２０２】
実施例１０．ｍｕ−ＬＵＣＡ１９およびｍｕ−ＳＧ５のさらなる特性決定
内因性のＥｐｈＡ２を発現する神経膠腫細胞株であるＧ５５細胞におけるＥｐｈＡ２の刺激をｍｕ−ＬＵＣＡ１９およびｍｕ−ＳＧ５を用いて調査した。細胞を３０μｇ／ｍｌまでの漸増濃度のｍｕ−ＬＵＣＡ１９かまたはｍｕ−ＳＧ５で処理し、免疫沈降したＥｐｈＡ２のホスホチロシン含量を、ホスホチロシン特異的抗体（４Ｇ１０、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を用いてウエスタンブロット解析により測定した。ｍｕ−ＬＵＣＡ１９かまたはｍｕ−ＳＧ５のいずれかで処理したＧ５５細胞から免疫沈降したＥｐｈＡ２中のホスホチロシン含量には差は見られなかった。全ＥｐｈＡ２含量の対照ウエスタンブロットを行って、各々の処理条件について免疫沈降した全ＥｐｈＡ２タンパク質が同一であることを確認した。Ａ５４９細胞およびｍｕ−ＬＵＣＡ１９およびｍｕ−ＳＧ５抗体を用いて類似の結果が見られた。これらの結果は、内因性ＥｐｈＡ２を発現している細胞をｍｕ−ＬＵＣＡ１９かまたはｍｕ−ＳＧ５のいずれかで処理してもＥｐｈＡ２のホスホチロシン含量を増加も減少もさせないことを示す。
【０２０３】
実施例１１．癌細胞株でのｍｕ−ＳＰＬ１、ｍｕ−ＬＵＣＡ１９およびｍｕ−ＬＵＣＡ４０の効果
抗体が、単層としてインビトロで増殖された場合に細胞数を減少させる能力は、様々な量の試験抗体または対照精製抗体の存在下または不在下で増殖された細胞単層を用いて評価することができ、細胞数の変化はＭＴＴを用いて評価することができる。ＭＴＴは、ミトコンドリア酵素の活性を測定し、相対生存細胞数を相互に関連付ける染料である。目的の細胞を９６ウェルプレート中の１０％ウシ胎児血清を補給したＦ１２／ＤＭＥＭ（１：１）成長培地に蒔いて増殖させた。細胞株を、濃度範囲１５００〜２５００細胞／ウェルで９６ウェル皿のウェルに３つ組で蒔いた。播種した直後に、ｍｕ−ＳＰＬ１、ｍｕ−ＬＵＣＡ１９またはｍｕ−ＬＵＣＡ４０を添加した。細胞を５％  ＣＯ２／空気にて５日間、加湿インキュベーター中で３７℃にてインキュベートした。アッセイの終わりに、ＭＴＴをＰＢＳ（５ｍｇ／ｍｌ）に溶かし、直接ウェルに１：１０希釈で添加した。プレートをインキュベーター内に戻して４時間置いた。インキュベーションの後、培地を除去し、１００μｌ  ＤＭＳＯを添加してＭＴＴの沈殿を可溶化した。プレートをＯ．Ｄ．５４０ｎｍで読み取った。これらの実験において、ｍｕ−ＬＵＣＡ４０は７８６−Ｏ、Ａ５４９、Ｃａｋｉ−２、ＥＳ−２、ＳＫＭＥＳ−１、およびＳＫＯＶ３細胞株の増殖を阻害し、ＳＰＬ１およびＬＵＣＡ１９の増殖は阻害しなかった。
【０２０４】
実施例１２．ｍｕ−ＬＵＣＡ１９、ｍｕ−ＳＧ５およびｍｕ−ＬＵＣＡ４０ならびに毒素とコンジュゲートした抗マウスＩｇＧの内部移行
Ｍａｂ−ＺＡＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）は、タンパク質合成を阻害する毒素であるサポリンにコンジュゲートした抗マウスＩｇＧである。この毒素は細胞膜に対して不透過性である。モノクローナル抗体が内部移行可能な細胞表面抗原と結合していると、毒素コンジュゲートは結合しているモノクローナルと結合することができ、それにより、細胞の内部に取り込まれることができ、最終的に細胞を死滅させることができる。毒性作用の実証は内部移行に依存しているため、Ｍａｂ−ＺＡＰは、細胞毒性効果を表するために内部移行に依存している任意の毒素の適した標的として所定の表面抗原が役立つかどうかを評価するために役立ち得る。そのようなものとして、Ｍａｂ−ＺＡＰはそのような内部移行に依存する毒素、例えばメイタンシノイドおよびカリチアマイシンのモデルとして役立つ。
【０２０５】
腫瘍細胞によるｍｕ−ＬＵＣＡ１９およびｍｕ−ＬＵＣＡ４０およびサポリンとコンジュゲートした抗マウスＩｇＧの内部移行、およびサポリンの内部移行後の腫瘍細胞の死滅効果を試験するため、ヒト神経膠腫細胞Ｇ１３０を、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて保存フラスコから取り出し、遠心分離した。適当な媒質中で細胞を５０，０００／ｍｌで再懸濁し、ウェルあたり１００μｌを９６ウェルプレートに蒔いた。抗体ｍｕ−ＳＰＬ１、ｍｕ−ＬＵＣＡ１９またはｍｕ−ＬＵＣＡ４０を１０倍濃縮物として直ちに適当なウェルに添加して、終濃度を１０ｕｇ／ｍｌとした。１５分後、室温にてＭａｂ−ＺＡＰ（カタログ番号ＩＴ−０４、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）を適当なウェルに１０倍濃縮物として添加して、終濃度０．００１ｎＭ〜１０ｎＭとした。増殖４日後、ＭＴＴを３７℃にて４時間添加した（保存５ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ、ウェル中１：１０希釈）。次に、全てのウェルから培地を除去し、１００μｌ／ウェルのＤＭＳＯを添加した。プレートを穏やかにかき混ぜて青色のＭＴＴ沈殿物を可溶化し、プレートをＯ．Ｄ．５４０ｎｍで読み取った。
【０２０６】
ｍｕ−ＬＵＣＡ１９およびｍｕ−ＬＵＣＡ４０の存在下でのＧ１３０細胞でのＭＴＴ染色には、それらの抗体の不在下での染色と比較して低下が見られた。このことは、Ｇ１３０細胞の増殖がｍｕ−ＬＵＣＡ１９およびｍｕ−ＬＵＣＡ４０およびＭａｂ−ＺＡＰの存在下で阻害されたことを示し、これらの結果はｍｕ−ＬＵＣＡ１９およびｍｕ−ＬＵＣＡ４０ならびに毒素とコンジュゲートした抗マウスＩｇＧがＧ１３０細胞の内部に取り込まれたことを示している。ＥＳ−２細胞、卵巣癌細胞株、およびｍｕ−ＳＧ５抗体を用いて、類似の結果が見られた。ｍｕ−ＳＧ５の存在下でのＥＳ−２細胞でのＭＴＴ染色には、この抗体の不在下での染色と比較して低下が見られた。このことは、ＥＳ−２細胞の増殖がｍｕ−ＳＧ５およびＭａｂ−ＺＡＰの存在下で阻害されたことを示す。この結果はｍｕ−ＳＧ５ならびに毒素とコンジュゲートした抗マウスＩｇＧがＥＳ−２細胞の内部に取り込まれたことを示している。
【０２０７】
実施例１３．ヌードマウスにおけるヒト細胞と抗ＥｐｈＡ２抗体ＳＰＬ１およびＬＵＣＡ４０の有効性
ヒト腫瘍細胞をヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスの腎被膜下に移植した。３つの腫瘍細胞株を用いた。ＥＳ−２およびＳＫＯＶ３−３卵巣腫瘍由来細胞株、およびＣａｋｉ−２腎腫瘍由来細胞株をＡＴＣＣから入手した。一部の研究では、両方の腎臓に異種移植を行った。処置動物には、移植は腎被膜に行った（コラーゲンゲル中５００Ｋ細胞）。抗ＥｐｈＡ２モノクローナル抗体ＳＰＬ１またはＬＵＣＡ４０を濃度５０ｍｇ／ｋｇおよび０．０１ｍＬ／体重ｇの量で腹膜内に注射した。移植後２日目に投薬を開始し、ＳＰＬ１、ＬＵＣＡ４０またはＰＢＳの用量を単回の急速注射として週に３回投与した。対照マウスにはＰＢＳのみを注射した。最後の注射から３日後、動物を安楽死させ、移植片を含む腎臓を調べた。
【０２０８】
腫瘍におけるヒトＤＮＡの量を、公開されている方法に従って、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）ＳＤＳ７０００システムでヒトリボソーム遺伝子ＲＰＬ１９に特異的なプライマーおよびプローブを用いるリアルタイムＰＣＲを用いて定量化した。各腫瘍サンプルを３通りのＰＣＲ反応で解析し、平均ＤＮＡ濃度を測定した。平均ＤＮＡ濃度および標準誤差を腫瘍サンプルの各群について測定した。スチューデントＴ検定を用いて統計的有意性を判定した（両側、１型）。腫瘍増殖阻害を［（処置群の平均腫瘍容積／ＰＢＳ対照群の平均腫瘍容積）×１００］−１００の絶対値として計算した。
【０２０９】
示されていないデータでは、Ｃａｋｉ−２およびＥＳ−２細胞株を用いる、対照と比較して腫瘍サイズを低減させるための目視および手検査にＳＰＬ１が現れた。Ｃａｋｉ−２腫瘍を移植したＬＵＣＡ４０処置マウスで類似の結果が見られた。ＬＵＣＡ４０抗体で処置したマウスのＣａｋｉ−２腫瘍のＤＮＡ定量化により、ＬＵＣＡ４０処置マウスが対照と比べて小さな腫瘍を有していたことを確認した。表１２は、ＳＰＬ１抗体でのその他の腎被膜下異種移植調査デザイン、およびこれらの研究によりもたらされるＤＮＡ定量化を示す。
【０２１０】
【表１２】
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＊ＴＧＩ＝ＰＢＳ対照群に対する腫瘍増殖阻害；ｐ値は対のないスチューデントＴ検定により決定した。
【０２１１】
実施例１４．ヒト卵巣腫瘍皮下モデルにおけるＳＰＬ１の抗腫瘍効力
この調査は、卵巣癌および肺癌の皮下モデルにおけるＳＰＬ１抗体の用量反応性抗腫瘍データを試験するようデザインされた。
【０２１２】
ＥＳ−２卵巣腫瘍由来細胞株を、試験的な皮下腫瘍モデル調査において同定された急速に増殖する腫瘍から再び得た。Ａ５４９肺腫瘍由来細胞は、ＡＴＣＣから得た。培養した細胞をトリプシン処理し、培地中で洗浄し、遠沈し、培地１ミリリットルにつき細胞１億個を培地に再懸濁し（容量０．０５ｍＬにつき細胞５００万個）、その後、最終の注射量０．１ｍＬのために等量のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中で混合した。雌ＣＲＬ．ｎｕ／ｎｕホモ接合体マウスを用いた。マウスの首の後部への皮下注射により細胞を接種した。移植の当日か、または腫瘍が定着して測定可能になった日のいずれかから投薬を開始した。投薬０日目のため、午前中に腫瘍を移植し、同日の午後に動物に投薬した。定着腫瘍に対して、動物を次のような群に無作為化した：腫瘍容積を測定し、動物を腫瘍容積に従って分類し、平均値を測定して、適当な数の平均値前後の動物（モデルに応じて１つの群につき１２〜１５匹）を選択し、小さな腫瘍または大きな腫瘍をもつ動物を調査から取り除いた。残りの動物を耳のタグ番号で治療群および対照群へ無作為化した。最後の群のランダム分布をＴ検定により確認した（ｐ＞０．１を無作為化されたとみなした）。
【０２１３】
各処置用量群に対して、ＳＰＬ１を適当な濃度用量でＰＢＳ（ＥＳ２細胞の調査に対して５０ｍｇ／ｋｇ、ならびにＡ５４９細胞の調査に対して１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇの濃度範囲）およびＰＢＳ対照に希釈し、０．０１ｍＬ／体重ｇの量を投与した。ＳＰＬ１またはＰＢＳの用量は週に２回腹腔への単回急速注射として投与した。対照マウスにはＰＢＳのみを注射した。調査に依って、１２〜１５匹のマウスの群で腫瘍が適当な大きさに達した時に投薬を開始した。
【０２１４】
最初の腫瘍測定に先立ち、およそ６日間腫瘍を増殖させた。その後に３次元のデジタルノギスで腫瘍を週に２回測定し、３回の測定値の積の２分の１として腫瘍容積を計算した。経時的な腫瘍容積が全ての調査の主要エンドポイントであった。臨床観察は毎日行った。週に２回各動物の体重を測定した。
【０２１５】
平均腫瘍容積および標準誤差を測定ごとに各群に対して決定した。スチューデントＴ検定（両側、１型）を用いて統計的優位性を判定した。腫瘍増殖阻害を、［（処置群の平均腫瘍容積／ＰＢＳ対照群の平均腫瘍容積）×１００］−１００の絶対値として計算した。表１３は皮下異種移植調査デザインおよび結果を示す。
【０２１６】
【表１３】
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＊ＴＧＩ＝ＰＢＳ対照群に対する腫瘍増殖阻害
図１に示すように、ＳＰＬ１処置Ａ５４９腫瘍異種移植片のサブセットは、投薬の停止後に徐々に再び増殖したことが見出された（腫瘍の再増殖は投薬の停止後に２倍またはそれ以上の量での増大と定義する）。１００ｍｇ／ｋｇ治療群の１６匹のマウスのうち７匹には腫瘍の再増殖が見られたが、１００ｍｇ／ｋｇ治療群の１６匹のマウスのうち９匹は投薬の停止後も腫瘍のないままであった。同様に、３０ｍｇ／ｋｇ治療群の１５匹のマウスのうち３匹に腫瘍の再増殖が見られたが、３０ｍｇ／ｋｇ治療群の１５匹のマウスのうち１２匹は投薬の停止後も腫瘍のないままであった。図１にグラフで示した、「投薬停止」後の時点での結果は、腫瘍の再増殖したマウスの腫瘍サイズのみが表されている。
【０２１７】
当然のことながら、本明細書に記載される実施例および実施形態は説明目的のためであって、それを踏まえた種々の改変または変更が当業者に示唆されるが、それも本願の精神および範囲内に含まれる。本明細書に引用した全ての刊行物、特許および特許出願は、あらゆる目的において、各個別の刊行物、特許または特許出願が具体的に、かつ個別に、参照により本明細書に組み込まれることを示すのと同一程度に、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２１８】
【図１】ＳＰＬ１で皮下処理したＡ５４９腫瘍異種移植片およびそれらの投薬の停止後の緩慢な再増殖の結果を示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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