(57)【要約】  約７．０未満のｐＨもしくは中性のｐＨで活性化剤の存在下で活性化ＰＥＧ試薬とタンパク質を組み合わせることを含んでなる約７．０以下のｐＨもしくは中性のｐＨでの水溶液におけるタンパク質へのＰＥＧのコンジュゲーションの方法。１つの態様において、該方法は１：１、２：１および３：１  ＰＥＧ化タンパク質を包含する適度にＰＥＧ化されたタンパク質の混合集団を生成する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
約７．０未満のｐＨもしくは中性のｐＨで活性化剤の存在下でＰＥＧ誘導体化アシル化剤とタンパク質を組み合わせること
を含んでなるＰＥＧ−タンパク質分子の不均一集団における１：１  ＰＥＧ−タンパク質の最適化方法。
【請求項２】
該ＰＥＧ誘導体化アシル化剤がｍＰＥＧ−ＮＰＣである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該活性化剤がＨＯＳｕ、ＨＯＢｔおよびＨＯＡｔよりなる群から選択される請求項１もしくは２に記載の方法。
【請求項４】
該タンパク質がＥＰＯ、ＢＭＰ７、リゾチームおよびミメティボディ（ｍｉｍｅｔｉｂｏｄｙ）よりなる群から選択される請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
約７．０より低いｐＨでタンパク質をＰＥＧ誘導体化アシル化剤および活性化剤と反応させること
を含んでなる約７．０より高いｐＨもしくは中性のｐＨで不溶性であるかもしくは不安定であるタンパク質をＰＥＧ化する方法。
【請求項６】
該ＰＥＧ誘導体化アシル化剤がｍＰＥＧ−ＮＰＣである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該活性化剤がＨＯＳｕ、ＨＯＢｔおよびＨＯＡｔよりなる群から選択される請求項５もしくは６に記載の方法。
【請求項８】
該タンパク質がＥＰＯ、ＢＭＰ７、リゾチームおよびミメティボディよりなる群から選択される請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
約８．０より低いｐＨでタンパク質をＰＥＧ誘導体化アシル化剤および活性化剤と反応させること
を含んでなる、約８未満のそして反応の速度を高めるための添加剤のｐＫａより大きいｐＨで主に１：１  ＰＥＧ−タンパク質を形成するようにタンパク質をＰＥＧ化する方法。
【請求項１０】
該ＰＥＧ誘導体化アシル化剤がｍＰＥＧ−ＮＰＣである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該活性化剤がＨＯＳｕ、ＨＯＢｔおよびＨＯＡｔよりなる群から選択される請求項９もしくは１０に記載の方法。
【請求項１２】
該タンパク質がＥＰＯ、ＢＭＰ７、リゾチームおよびミメティボディよりなる群から選択される請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
遺伝子および細胞工学技術における最近の進歩のために、インビボにおいて様々な薬理学的作用を示すことが既知であるペプチドおよびタンパク質を製薬学的利用に有用な量で製造することができる。これらの治療法の開発の制約は、タンパク質の安定な製薬学的組成物の製造である。
【０００２】
治療用タンパク質は短いインビボ半減期およびごくわずかな経口生物学的利用能を有することが多いので、これらのタンパク質は経時的に頻繁な注射により典型的に投与される。ある場合には、頻繁な注射処方計画は患者に身体的負担を課し、そして小分子を投与することと関連する費用と比較した場合に、増加した投与費用と関連する。そのようなものとして、より長く続くかもしくは持続放出性組成物および製剤を開発しそして評価することに現在多大な関心がある。
【０００３】
有効な持続放出性組成物および製剤は、有効成分の血液レベルを制御する手段を提供し、そしてまたより大きい効能、安全性、患者の利便性および患者のコンプライアンスも提供することができる。
【０００４】
現在までに、タンパク質治療法の持続作用を得るために最も広く用いられる方法の２つには：１）例えば分子量を増加することおよび免疫原性を減少することにより、タンパク質の循環半減期を増加するようにタンパク質を修飾すること；ならびに２）例えばポリマーミクロスフェアに、タンパク質をカプセル封入することが包含される。
【０００５】
第一の機序、すなわちタンパク質修飾と関連して、生体適合性ポリマーと生物活性分子とのコンジュゲーションはそのような分子の製剤特性およびインビボ性能を向上するための１つの方法である。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、この目的のためにしばしば用いられる最も有用なポリマーの１つである。様々な低および高分子量薬剤へのＰＥＧ結合により達成可能な特性、および得られる高分子コンジュゲートの対応する適用は、詳細に示されている（概説には、非特許文献１および非特許文献２を参照）。特に、タンパク質はより長いインビボ循環、減少した免疫原性、ならびに向上した溶解性およびタンパク質分解酵素への耐性を得るために、ＰＥＧ、通常はメトキシ−ＰＥＧ（ｍＰＥＧ）とコンジュゲーションされることが多い。
【０００６】
特許文献１は、「骨髄細胞に網状赤血球および赤血球の生産を増加させるインビボ生物活性を有しそしてヒトエリスロポエチンおよび１〜６個のグリコシル化部位の付加もしくは少なくとも１個のグリコシル化部位の再配列により修飾されたヒトエリスロポエチンの配列を有するそのアナログよりなる群から選択されるエリスロポエチン糖タンパク質を含んでなるポリ（エチレングリコール）とエリスロポエチンとのコンジュゲートに言及し；該糖タンパク質は、アミノ基とアミド結合を形成するポリ（エチレングリコール）基の−ＣＯで式−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−ＯＲの１つのポリ（エチレングリコール）基に共有結合しており；ここで、Ｒは低級アルキルであり；ｘは２もしくは３であり；そしてｍは約４５０〜約１３５０である」。
【０００７】
特許文献２は、「ポリエチレングリコールで天然エリスロポエチン（天然ＥＰＯ）の５２の位置のリシン残基を化学的に修飾すること」により製造したＰＥＧにより修飾されたＥＰＯを記述し、このＰＥＧにより修飾されたＥＰＯは「．．．長く続く薬剤効果」を示すと記載される。
【０００８】
特許文献３は、「対応する天然ＯＢタンパク質と比較した場合に延長した半減期」を有すると記載される「ＯＢタンパク質−免疫グロブリンキメラおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ＯＢ誘導体」を記述する。
【０００９】
特許文献４は、「赤血球生成活性を有しそして非抗原性ポリマーに共有結合している少なくとも１つの酸化された炭水化物部分を有する糖タンパク質の生物活性コンジュゲート」を記述する
特許文献５は、ポリ（エチレングリコール）−Ｎ−スクシンイミドカーボネートおよびその製造を記述する。
【００１０】
ｍＰＥＧをタンパク質に、通常はポリペプチド配列のリシン残基もしくはＮ末端のそれらのアミノ基に連結するために多数の方法が利用可能である（非特許文献３）。タンパク質へのＰＥＧのウレタン（カルバメート）結合は、ＰＥＧ−タンパク質コンジュゲートを形成するための便利な方法である。カルバメート結合は、同様にタンパク質ＰＥＧ化に利用されることが多いアミド結合より加水分解に耐性である。従って、ウレタン結合コンジュゲートは、様々な生理学的条件において非常に安定である。ウレタン結合ＰＥＧ−タンパク質を製造するために用いられるいくつかの既知のＰＥＧ試薬がある（非特許文献３；非特許文献４）。これらには、遅反応性イミダゾリルホルメート、トリクロロフェニルカーボネートおよびニトロフェニルカーボネート（ＮＰＣ）誘導体が包含される。より反応性の試薬、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルカーボネート（ｍＰＥＧ−ＳＣ）が利用されることが多い（例えば、Ｚａｌｉｐｓｋｙへの特許文献６、特許文献７、特許文献８および特許文献９）。通例、より低い反応性の試薬と比較して、より反応性の試薬は、より穏やかな条件下でより速くより効率のよい反応を可能にする。一方、より低い反応性の試薬はより優れた貯蔵安定性、そして通常はより優れた選択性を有する。
【００１１】
ＰＥＧ−ＮＰＣのような遅反応性試薬でのタンパク質のＰＥＧ化は、８〜１０のｐＨ範囲では、タンパク質の大部分のアミノ基がこのｐＨ範囲において脱プロトン化されそして非常に反応性であるので、より効率よく進む。多数のタンパク質は、この塩基性ｐＨ範囲で可溶性でないかもしくは安定でない。これらの条件下で、多数のアミノ基は低い選択性でランダムに反応する。一方、ＰＥＧ−ＮＰＣはｐＨ＜８であまり反応性でなく、従って、これらの反応は非常にゆっくりとそして効率的でなく進む。この試薬は、中性および酸性のｐＨ（約５〜７）で本質的に非反応性である。
【００１２】
関連技術の前述の例およびそれと関連する制約は実例となるものとし、それに限らない。関連技術の他の制約は、明細書の読み取りの際にそして図面の研究の際に当業者に明らかになる。
【００１３】
【特許文献１】ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０４９６７３（Ｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．）明細書
【特許文献２】ＰＣＴ公開ＷＯ０２／３２９５７（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．）明細書
【特許文献３】ＰＣＴ公開ＷＯ９７／２４４４０（Ｄｅ  Ｓａｕｖａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．）明細書
【特許文献４】ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２８０２４（Ｃｈｙｉ  ｅｔ  ａｌ．）明細書
【特許文献５】ＰＣＴ公開ＷＯ９０／１３５４０（Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ）明細書
【特許文献６】米国特許５，１２２，６１４明細書
【特許文献７】米国特許５，３２４，８４４明細書
【特許文献８】米国特許５，６１２，４６０明細書
【特許文献９】米国特許５，８０８，０９６明細書
【非特許文献１】Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，６：１５０−１６５，１９９５
【非特許文献２】Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．，１６：１５７−１８２，１９９５
【非特許文献３】Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ＆  Ｌｅｅ，１９９２，“Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，”Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ，ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＮＹ，ｐｐ．３４７−３７０
【非特許文献４】Ｖｅｒｏｎｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１１：１４１−１５２
【発明の開示】
【００１４】
［発明の要約］
以下に記述しそして説明する以下の態様およびその実施態様は、典型的なそして実例となるものとし、範囲を限定するものではない。
【００１５】
１つの態様において、ＰＥＧ化ペプチドおよびタンパク質を作製する代替方法が提供される。好ましい態様において、該方法は約７もしくは約６以下のｐＨでタンパク質の効率のよい修飾を可能にする。該方法は、穏やかなＰＥＧ試薬および穏やかな反応条件を用いてウレタン結合ＰＥＧタンパク質の効率のよい形成を可能にする。該方法は、適度にＰＥＧ化されたタンパク質の形成をもたらす。１つの態様において、該方法は中性のｐＨ範囲以上で安定でないかもしくは可溶性でないタンパク質の修飾に好都合である。別の態様において、該方法は約７．０もしくは８．０より高いｐＨで不溶性であるかもしくは不安定であるタンパク質をＰＥＧ化するために有用である。
【００１６】
別の態様において、ＰＥＧ−タンパク質分子の不均一集団における１：１  ＰＥＧ−タンパク質の収率を最適化するために有用な方法が記述される。この方法は、約７．０未満のｐＨもしくは中性のｐＨで活性化の存在下でＰＥＧ誘導体化アシル化剤とタンパク質を組み合わせることを含んでなる。態様において、ＰＥＧ誘導体化アシル化剤はｍＰＥＧ−ＮＰＣである。別の態様において、活性化剤はＨＯＳｕ、ＨＯＢｔおよびＨＯＡｔよりなる群から選択される。
【００１７】
さらに別の態様において、該方法は最小限にコンジュゲーションしたタンパク質、すなわち、１：１、１：２および１：３  タンパク質：ＰＥＧの収率を最大にするために有用である。
【００１８】
さらなる態様において、約７．０より高いｐＨもしくは中性のｐＨで不溶性であるかもしくは不安定であるタンパク質をＰＥＧ化するために有用な方法が記述される。該方法は、約７．０より低いｐＨでタンパク質をＰＥＧ誘導体化アシル化剤および活性化剤と反応させることを含んでなる。態様において、ＰＥＧ誘導体化アシル化剤はｍＰＥＧ−ＮＰＣである。別の態様において、活性化剤はＨＯＳｕ、ＨＯＢｔおよびＨＯＡｔよりなる群から選択される。
【００１９】
さらなる態様において、約８未満のそして反応の速度を高めるための添加剤のｐＫａより大きいｐＨで主に１：１  ＰＥＧ−タンパク質を形成するようにタンパク質をＰＥＧ化する方法が記述される。該方法は、約８．０より低いｐＨでタンパク質をＰＥＧ誘導体化アシル化剤および活性化剤と反応させることを含んでなる。１つの態様において、ＰＥＧ誘導体化アシル化剤はｍＰＥＧ−ＮＰＣである。別の態様において、活性化剤はＨＯＳｕ、ＨＯＢｔおよびＨＯＡｔよりなる群から選択される。
【００２０】
上記の典型的な態様および実施態様に加えて、さらなる態様および実施態様が図面を参照することによりそして以下の記述の研究により明らかになる。
【００２１】
［詳細な記述］
Ｉ．定義
以下の用語は、他に示されない限り下記の意味を有する。
【００２２】
「ペプチド」は、本明細書において用いる場合、一方の酸のアミノ基ともう一方のカルボキシル基との組み合わせにより２個もしくはそれ以上のα−アミノ酸から得られる様々なアミドのいずれかをさす。ペプチドは、タンパク質の部分加水分解により得ることができる。「ポリペプチド」は、本明細書において用いる場合、ペプチドの鎖をさす。「タンパク質」は、本明細書において用いる場合、ペプチド結合により連結されたアミノ酸残基からなる多数の天然に存在する、通常は非常に複雑な、物質のいずれかをさす。タンパク質はさらに炭素、水素、窒素、酸素、通常は硫黄、そして時折他の元素（リンもしくは鉄のような）を含有することができる。タンパク質は、例えば酵素、ホルモンもしくは免疫グロブリンを包含する生物学的機能を一般に特徴とする。特に記載されないかもしくは文脈により認識可能でない限り、これらの用語は本明細書において互換的に用いられる。
【００２３】
「親水性ポリマー」は、本明細書において用いる場合、室温である程度の水溶性をポリマーに与える、水溶性である部分を有するポリマーをさす。典型的な親水性ポリマーには、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌｙｏｘａｚｏｌｉｎｅ）、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチル−アクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパルタミド、上記に引用したポリマーのコポリマーおよびポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドコポリマーが包含される。特性およびこれらのポリマーの多くとの反応は、米国特許第５，３９５，６１９号および第５，６３１，０１８号に記述されている。
【００２４】
「ＰＥＧ化」は、生物活性タンパク質への１つもしくはそれ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）置換基もしくは誘導体の結合をさす。
【００２５】
「アシル化剤」は、別の化学化合物にアシル基を連結することができる薬剤をさし、従って、アシル化剤はアシル基を提供する。典型的なアシル化剤には、ニトロフェニルカーボネート、トリクロロフェニルカーボネート、ペンタクロロフェニルカーボネートおよびカルボニルイミダゾールならびに様々な活性エステル、例えばニトロフェニルエステル、ペンタフルオロエチルエステル、トリクロロフェニルエステルが包含される。
【００２６】
「ＰＥＧ誘導体化アシル化試薬」は、ポリエチレングリコールを含むように誘導体化されるアシル化剤をさす。
【００２７】
略語：ＰＥＧ：ポリエチレングリコール；ｍＰＥＧ：メトキシポリエチレングリコール；ＨＯＳｕ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド；ＨＯＢｔ：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール；ＮＰＣ：ニトロフェニルカーボネート；ＤＴＢ：ジチオベンジル；ＳＣ：スクシンイミジルカーボネート。
【００２８】
ＩＩ．コンジュゲートを形成する方法
水溶液におけるタンパク質の溶解性は、タンパク質構造および組成に基づいて非常に異
なる。いくつかのタンパク質は非常に溶解性であるが、多数のタンパク質、特に構造タンパク質は生理学的条件下で本質的に不溶性であり、そして通常は固体として存在する。（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎ．Ｙ．（１９９３））。タンパク質の溶解性は、典型的に
【数１】
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の近くで最も低い。
【００２９】
しかしながら、上記のように、ＰＥＧ−ＮＰＣのような典型的なアシル化試薬でのタンパク質のＰＥＧ化は７．５より大きい、典型的には８より大きいｐＨで迅速に進み、なぜならＰＥＧ−ＮＰＣはこのｐＨ範囲において非常に反応性であるが、中性もしくはより低いｐＨ値ではあまり反応性でなく、ここで、反応は非常にゆっくりと進み、そして効率的でない。
【００３０】
本発明の方法は、低および高反応性ＰＥＧ試薬の利点のいくつかを利用する。特に、ｍＰＥＧ−ＮＰＣのようなより低い反応性の試薬は、より反応性の試薬と比較した場合に優れた貯蔵寿命および選択性特性を有するが、特に中性条件下での、それらの遅い反応性はそれらを使用に不適切にする。対照的に、より反応性のｍＰＥＧ−ＳＣおよび同様の化合物は、それらのより低い反応性の対応物より安定性が低くそして選択性が低いという欠点があり、そして望ましくない副反応を受け得る（Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍ，１：６９−７０，１９９８）。
【００３１】
図1において見られるように、活性化剤の使用は中性のｐＨもしくはｐＨ＜７でｍＰＥＧ−ＮＰＣのようなアシル化誘導体を用いて効率のよいＰＥＧ化反応をもたらす。従って、アミドもしくはウレタン結合ＰＥＧタンパク質の形成のために試薬としてアシル化誘導体を用いる方法は、中性のｐＨもしくはｐＨ７．０未満の条件下で反応効率を増加しそして容易なタンパク質修飾を可能にする条件下での使用のために改変される。好ましい態様において、アシル化誘導体はＰＥＧ誘導体化アシル化試薬である。該方法はＰＥＧ誘導体化アシル化試薬に関して記述されるが、他の親水性ポリマー誘導体化アシル化試薬は本明細書に記載の方法での使用に適していることが理解される。
【００３２】
ＰＥＧ化試薬にＮ−もしくはＯ−結合プロトンを提供する傾向を有するやや酸性の多数の水溶性の、カルボキシル基を持たないブロンステッド酸は、本発明の方法における活性化剤としての使用に適当であることが理解される。一般的な例には、とりわけ、酸性アルコール、フェノール、イミダゾール、トリアゾールおよびテトラゾールが包含される。本発明のこの態様における使用に適当な酸性酸の例には、Ｎ−ヒドロキシジカルボキシイミド、特に芳香環上にニトロおよび他の電子求引性置換基を有するＮ−ヒドロキシフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシテトラヒドロフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシグルタルイミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドおよびＮ−ヒドロキシ−７−オキサビシクロ［２．２１］ヘプト−５−エン−２，３−ジカルボキシイミドが包含されるがこれらに限定されるものではない。１−Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールおよび芳香環上に電子求引基、例えばニトロ、クロロ、３−ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オンを有する誘導体。Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩は非常に水溶性であり、これはそれがＨＯＳｕより水性バッファーにおいてさらに高い濃度で使用できることを意味する。典型的なヒドロキシアミン誘導体には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、ＨＯＳｕのスルホネート誘導体、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）およびヒドロキシル−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）が包含される。これらのカップリング剤は、それらのｐＫａに基づき、約４〜約
７．５のｐＨ範囲において効率のよいバッファー成分として働くことができる。例えば、ｐＫａ＝６の弱酸であるＨＯＳｕは、約５〜約７のｐＨ範囲において効率のよいバッファー成分として働く。カップリング試薬はバッファーに加えることができ、または他の塩とともにもしくはそれなしにバッファーを含んでなることができる。さらに、ＨＯＳｕは水溶液に非常に可溶性であるので、ＰＥＧ化反応をさらに高めるために比較的高い濃度でそれをバッファーに加えることができる。
【００３３】
典型的なフェノールには、ジニトロフェノール、トリニトロフェノール、トリフルオロフェノール、ペンタフルオロフェノールおよびペンタクロロフェノールが包含されるがこれらに限定されるものではない。水溶性は、ペンタフルオロフェノールおよびペンタクロロフェノールの要因であることに留意すべきである。さらに、４−もしくは２−ヒドロキシピリジンおよび誘導体もまた、ヒドロキシル−２−ニトロピリジンにより例示されるように本発明の方法における使用に適している。
【００３４】
活性化剤としての使用のための他の典型的な化合物には、電子求引基を有するイミダゾール誘導体（イミダゾール、ｐＫａ＝７）、例えば４−もしくは２−ニトロイミダゾール、トリアゾール、テトラゾール、および２−ニトロ−１，２，４−トリアゾールのようないくつかの誘導体のような、酸性のＮ−Ｈ官能基を有する化合物が包含される。
【００３５】
上記のように、１つの典型的な態様において、本発明は低〜中反応性のアシル化ＰＥＧ試薬、特に室温でそして／もしくはｐＨ＜７．０で低〜中反応性を有する試薬を用いる方法に関する。特に好ましいアシル化試薬は、ｍＰＥＧ−ＮＰＣである。ニトロフェニルカーボネート誘導体化ポリエチレングリコールが本発明のこの態様における使用に例示され、しかしながら、実施例４において見られるように、該方法はまた、ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−ＮＰＣ試薬を利用して、チオ開裂的に切断可能なジチオベンジル（ＤＴＢ）ウレタン結合ＰＥＧ−タンパク質コンジュゲートの製造にも適用されている。反応性および選択性の利点は、切断可能でないｍＰＥＧ−ＮＰＣ試薬を用いて得られるものと同様であった。本発明における使用に適当な他の低反応性ＰＥＧ試薬には、カルボニルイミダゾール、トリクロロフェニルカーボネート、およびウレタン結合ＰＥＧ−タンパク質を製造するために利用されている他のニトロフェニルカーボネート（例えば、Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ＆  Ｌｅｅ，１９９２，上記を参照）が包含されるがこれらに限定されるものではない。同様に、メトキシ−ＰＥＧ（ｍＰＥＧ）が本明細書において例示されるが、使用することができる唯一の修飾されたＰＥＧではない。好ましくは一方の末端への不活性基の付加により単官能性にされた、他の修飾されたＰＥＧもまた該方法における使用に適している。例には、当業者により理解されるように、短いアルコキシＰＥＧ誘導体（エトキシ、ブトキシなど）もしくは様々な保護された官能基で修飾されたＰＥＧが包含されるがこれらに限定されるものではない。
【００３６】
１２，０００および３０，０００ＤａのＰＥＧを含んでなるＰＥＧ試薬が本明細書において例示されるが、他のＰＥＧの長さもまた本発明の方法における使用に意図されることがさらに理解される。ＰＥＧの好ましいサイズ範囲は、１，０００〜５０，０００Ｄａである。好ましくは、ＰＥＧの長さは４０，０００Ｄａ以下、より好ましくは３０，０００Ｄａ以下である。
【００３７】
１つの態様において、該方法には好ましくは約８．０未満のｐＨで水性媒質においてタンパク質を活性化剤およびｍＰＥＧ−ＮＰＣと組み合わせる段階が包含される。
【００３８】
１つの好ましい態様において、ｐＨは約５．０もしくは６．０〜約７．５である。別の態様において、ｐＨは約７もしくは８未満である。中性条件はタンパク質の安定性および／もしくは溶解性にとってより望ましいことが多いことが理解される。中性条件はまた、
タンパク質上の最も反応性のそして最も塩基性の低いアミノ基の修飾を一般に促進する。Ｎ末端のアミノ基は、通常、リシンのε−アミノ基（ｐＫａ＝１０〜１１）より塩基性が数桁低い（ｐＫａ＝７．９）ので、より低いｐＨは完全にプロトン化された後者の基の大部分を維持する傾向がある。従って、より低いｐＨはＮ末端のアミノ基の選択的修飾に一般により望ましい。主にＮ末端アミノ上でＰＥＧ化されたタンパク質は、より高い機能活性を保持することが多いことが理解される。
【００３９】
タンパク質、活性化剤およびｍＰＥＧ−ＮＰＣは、約０．５時間〜約２４時間の期間にわたって組み合わされる。１つの態様において、時間は約２時間〜約６時間である。当業者は反応を最適化するために時間を容易に決定しそして／もしくは変更できることが理解される。
【００４０】
反応温度は一般に約室温、もしくは８℃〜３７℃の間であり、しかしながら、当業者は反応を最適化するために温度を容易に決定しそして／もしくは変更できることが理解される。
【００４１】
実施例１において記述されるように、ｉｎ  ｓｉｔｕ活性化方法においてＨＯＳｕを用いてＥＰＯをｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣにコンジュゲーションした。反応は効率よく、８１％のＥＰＯがコンジュゲーションされ、図２において見られるように主にモノ−およびジ−ＰＥＧ化−ＥＰＯの形成をもたらした。図２は、遊離のＥＰＯ（下のパネル）と比較した場合の実施例１において形成されるＰＥＧ３０ｋ−ＥＰＯコンジュゲート（上のパネル）のＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析のトレースを示す。遊離のＥＰＯは約３３分で溶出し、一方、コンジュゲートは１：１コンジュゲートについては約２５分で、２：１コンジュゲートについては約２１分で、そして３：１コンジュゲートについては約２０分で溶出した。コンジュゲートおよび遊離のＥＰＯの各々のピーク面積を計算し、そして図に示す。特に、７８％のＥＰＯがモノ−（５０％）およびジ−ＰＥＧ化−ＥＰＯ（２８％）としてコンジュゲーションされた。図３Ａにおいて見られるように、イオン交換精製はＰＥＧ化−ＥＰＯから未反応のＥＰＯおよびＰＥＧを分離することができた。この製造の目的は大部分のモノ−ＰＥＧ−ＥＰＯを含有する軽度にＰＥＧ化されたコンジュゲートを製造することであったので、２：１および３：１コンジュゲートを含有するイオン交換精製からの数画分は最終精製サンプルに含まれなかった。製造したｍＰＥＧ３０ｋ−ＥＰＯの総量は約４．３ｍｇであり、９０％を超えるモノ−ＰＥＧ化タンパク質を含有した。図３Ｂ〜３ＤはＢ１２、Ｃ１〜Ｃ１０、Ｄ２、Ｄ１０〜Ｄ１２、Ｅ１、Ｅ４およびＧ４画分のＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析の結果を示す。図３Ｂおよび３Ｃにおいて見られるように、大部分の画分は約９．５〜１０．５分で有意な量のコンジュゲーションを示す。図３Ｄにおいて見られるように、精製前のｍＰＥＧ３０ｋ−ＥＰＯは、それぞれ２：１および１：１コンジュゲートに対応する９．７７１および１０．７７９分で有意なコンジュゲーションを示した。従って、大部分の画分は主に２：１および１：１コンジュゲートであった。図３Ｄにおいてさらに見られるように、ＥＰＯ基準は約１４．７３８分で溶出した。図４は、遊離のＥＰＯと比較した場合のＰＥＧ３０ｋ−ＥＰＯコンジュゲートのプールしたＣ３〜Ｄ１１画分のＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析のトレースを示す。遊離のＥＰＯは約３３分で溶出し、一方、１：１コンジュゲートは約２５分で溶出し、そして２：１コンジュゲートは約２２分で溶出した。プールした画分は、％ピーク面積から測定した場合に以下の組成：９１％の１：１  ＰＥＧ−ＥＰＯ、６％の２：１  ＰＥＧ−ＥＰＯおよび４％の遊離のＥＰＯを示した。
【００４２】
電気泳動ゲルを泳動し、そして図５Ａ〜５Ｂに示す。図５Ａは、ＰＥＧの検出のためのヨウ素染色でのゲルを示す。図５Ｂは、タンパク質の検出のためのクーマシーブルー染色でのゲルを示す。レーン１は、５６，０００Ｄａ、２３，０００Ｄａおよび１０，０００ＤａのＰＥＧでのＰＥＧ分子量マーカーであり、レーン２はＰＥＧ３０ｋコントロールであり、レーン３はＥＰＯコントロールであり、レーン４は精製前のｍＰＥＧ３０ｋ−ＥＰ
Ｏサンプルである。レーン５は精製されたｍＰＥＧ３０ｋ−ＥＰＯであり、そしてレーン６はタンパク質分子量マーカーである（図５Ｂのみ）。図５Ａは、約３０Ｄａのバンドにより見られるように反応における過剰のＰＥＧを示す。レーン４および５は、コンジュゲートの大部分が、それぞれ約９５ｋＤａおよび約１５０ｋＤａのバンドから見られるように１：１および２：１コンジュゲートであったことを示す。レーン４において見られるように、多数の３：１コンジュゲートもまた形成された。これらの結果から見られるように、コンジュゲートの大部分は１：１コンジュゲートである。
【００４３】
実施例２において詳述されるように、ｍＰＥＧ３０ｋ−ＥＰＯのコンジュゲートを６．５、７．０もしくは８．０のｐＨでＭＯＰＳバッファーにおいてもしくは添加剤および反応性ブースティング剤としてＨＯＳｕを有するＭＯＰＳバッファーにおいて製造した。ＭＯＰＳバッファーのみでの反応において、ＥＰＯへのｍＰＥＧ３０ｋのコンジュゲーションはＰＥＧ−ＥＰＯコンジュゲートの低い収率をもたらし、タンパク質の大部分は試験した３つ全てのｐＨでコンジュゲーションしていないままであった。図６Ａにおいて見られそして表１において詳述されるように、４１％のみのＥＰＯが８．０のｐＨでコンジュゲートを形成した（３４％の１：１コンジュゲートおよび７％の２：１コンジュゲート）。７．０のより低いｐＨで、１６％のみのＥＰＯがコンジュゲートを形成した。６．５のｐＨで、９％のＥＰＯがコンジュゲートを形成した。対照的に、ＭＯＰＳ／ＨＯＳｕバッファーを用いて、ＥＰＯは、モノ−およびジ−ＰＥＧ化−ＥＰＯの形成を促進する組成を有して、ｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣと効率よく反応した。図６Ｂにおいて見られるように、ｐＨ８．０で、９２％のＥＰＯがコンジュゲートを形成した（１：１として４０％、１：２として４２％、そして１：３コンジュゲートとして１０％）。コンジュゲーションは、より低いｐＨでさえより高い程度、７．０で８３％のコンジュゲーションおよび６．５で６２％まで進んだ。
【００４４】
実施例２においてさらに説明されるように、より低いｐＨ範囲でのｍＰＥＧ−ＮＰＣのコンジュゲーションを高めることは、より高いｐＨ範囲で安定でないタンパク質にとって特に有益であり得る。活性化剤の添加は、反応の速度、反応の程度および／もしくは反応の完了までの時間の少なくとも１つを増加するために有効である。このデータは、反応性ブースティング剤、ＨＯＳｕの不在下でＰＥＧ−ＮＰＣがｐＨ７でむしろ不活性であることをさらに説明する。
【００４５】
また実施例２において詳述されるように、ｍＰＥＧ３０ｋ−ＥＰＯのコンジュゲートを比較のために６．５、７．０もしくは８．０のｐＨでＭＯＰＳバッファーにおいてｍＰＥＧ３０ｋ−ＳＣをＥＰＯと反応させることにより製造した。ＥＰＯへのｍＰＥＧ３０ｋ−ＳＣのコンジュゲーションは全てのｐＨで効率よく反応し、しかしながら、ジ−およびトリ−ＰＥＧ化−ＥＰＯの形成は全てのｐＨでＨＯＳｕの存在下でＥＰＯへのｍＰＥＧ−ＮＰＣのコンジュゲーションを用いて見られるより非常に促進された。表２において詳述されるように、ｐＨ８．０で、９８％のＥＰＯがコンジュゲートを形成した（１：１として２４％、１：２として５０％、そして１：３コンジュゲートとして２４％）。ｐＨ７．０で、９６％のＥＰＯが１：１コンジュゲートとして２９％、２：１コンジュゲートとして４８％、そして３：１コンジュゲートとして１９％でコンジュゲーションした。ｐＨ６．５で、９０％のＥＰＯが１：１コンジュゲートとして３９％、２：１コンジュゲートとして４２％、そして３：１コンジュゲートとして１０％でコンジュゲーションした。
【００４６】
骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）７もしくは骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）７（ＢＭＰ７）は、タンパク質のＴＧＦ−βスーパーファミリーの大きな構造的に関連した亜群のメンバーである。ＢＭＰ７は、特に塩の存在下で、ｐＨ＞７で可溶性でない。従って、任意のＰＥＧ化反応はｐＨ７未満、好ましくはｐＨ６〜７の間で実施されなければならない
。実施例５において記述されるように、ＨＯＳｕを活性化および緩衝剤としてｍＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ７のコンジュゲートを製造した。ＢＭＰ７はｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣと効率よく反応し、モノ−およびジ−ＰＥＧ化−ＢＭＰ７の形成を促進する組成をもたらした。図９は、遊離のＢＭＰ７（下）と比較した場合の実施例５において形成されるＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ７コンジュゲート（上）のＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析のトレースを示す。遊離のＢＭＰ７は約３５分で溶出し、一方、コンジュゲートは１：１コンジュゲートについては約２６分で、２：１コンジュゲートについては約２２分で、そして３：１コンジュゲートについては約２０分で溶出した。コンジュゲートおよび遊離のＢＭＰ７の各々のピーク面積を計算し、そして図に示す。６．０のｐＨで５８％のＢＭＰ７がコンジュゲートを形成した（４２％の１：１コンジュゲート、１６％の２：１コンジュゲートおよび４％の３：１コンジュゲート）。図１０Ａ〜１０Ｃにおいて見られるように、イオン交換精製はＰＥＧ化−ＢＭＰ７から未反応のＢＭＰ７およびＰＥＧを分離することができた。コンジュゲートは、図１０Ａ〜１０Ｃにおいて示される結果で陽イオン交換クロマトグラフィーにより分離された。図１０Ｂ〜１０Ｃは、ＢＭＰ７コントロールおよび全コンジュゲーションと比較した場合のＣ６、Ｄ３、Ｄ４〜Ｄ６、Ｄ９、Ｅ６およびＦ９画分のＰＨＬＣ−ＳＥＣ分析の結果を示す。大部分の画分は、有意な１：１（約２５〜２６分で溶出した）および２：１（約２２分での溶出）コンジュゲーションを示す。精製されたサンプルを希釈し、そしてＨＰＬＣ−ＳＥＣで分析し、図１１に示される結果を有した。遊離のＢＭＰ７は約３６分で溶出し、ここで、コンジュゲートは１：１のコンジュゲートについては約２５〜２６分で、２：１コンジュゲートについては約２２分で、そして３：１コンジュゲートについては約２０分で溶出した。コンジュゲートおよび遊離のＢＭＰ７の各々のピーク面積は、６１％の１：１  ＰＥＧ−ＢＭＰ７、３３％の２：１  ＰＥＧ−ＢＭＰ７、５％の３：１  ＰＥＧ−ＢＭＰ７および１％の遊離のＢＭＰ７で計算された。タンパク質の濃度を調整することによりさらに高い収率を得ることができることに留意すべきである。しかしながら、タンパク質はより高いｐＨで沈殿する傾向があるのでより高いｐＨでＢＭＰ７の濃度を改変することは実行可能でない可能性がある。
【００４７】
電気泳動ゲルを図１２Ａ〜１２Ｂにおいて示されるようにｍＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ７サンプルで泳動した。図１２Ａは、タンパク質の検出のためにクーマシーブルー染色を用いるゲルを示す。図１２Ｂは、ＰＥＧの検出のためにヨウ素染色を用いるゲルを示す。ゲルの各々について、レーン１はＢＭＰ７コントロールであり、レーン２はＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ７の精製された調製物であり、レーン３はＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ７  １：１コンジュゲートである。レーン４は、図１２Ａではタンパク質の分子量（ＭＷ）マーカー、そして図１２ＢではＰＥＧの分子量マーカーである。レーン５は還元したＢＭＰ７コントロールであり、レーン６は還元したＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ７であり、そしてレーン７は還元したＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ７  １：１コンジュゲートである。これらの結果から見られるように、調製物におけるコンジュゲートの大部分は１：１コンジュゲートである（約８０ｋＤａでのレーンにおけるバンドを参照）。レーン２はまた、約１１６ｋＤａのバンドにより有意な２：１コンジュゲートも示す。従って、ＢＭＰ７のような比較的不溶性のタンパク質の場合において、ｐＨ６で効率のよいＰＥＧ化反応を行う能力は、比較的低い種不均一性（ｎ＝１〜３）を有するＰＥＧ−ＢＭＰ７の製造を可能にする。
【００４８】
リゾチームは、卵白、ミルク、涙および他の分泌物に存在する酵素である。それは多くの種類の細菌の多糖壁を破壊することにより抗生物質として働く。実施例６において記述されるように、ｍＰＥＧ３０ｋ−リゾチームのコンジュゲートを比較のために６．５、７．０もしくは８．０のｐＨでＭＯＰＳバッファー溶液もしくはＭＯＰＳ／ＨＯＳｕバッファー溶液のいずれかにおいて製造した。表４において見られるように、ｐＨ８．０で、４１％のリゾチームがＭＯＰＳバッファーにおいてｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣと反応してコンジュゲートを形成した（１：１コンジュゲートとして３４％、そして２：１コンジュゲートとして７％）。ｐＨ７．０で、１０％のみのリゾチームが１：１コンジュゲートとして
ｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣと反応した。ｐＨ６．５で、６％のみのリゾチームが１：１コンジュゲートとしてｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣと反応した。ＭＯＰＳ／ＨＯＳｕバッファーにおいて、リゾチームはｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣと反応して主にモノ−およびジ−ＰＥＧ化−リゾチームを形成した。ｐＨ８．０で、４６％のリゾチームがｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣと反応してコンジュゲートを形成した（１：１コンジュゲートとして３８％、２：１コンジュゲートとして８％、そして３：１コンジュゲートとして１％）。ｐＨ７．０で、４０％のリゾチームがｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣと反応した（１：１コンジュゲートとして３４％、そして２：１コンジュゲートとして６％）。ｐＨ６．５で、３０％のリゾチームがｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣと反応した（１：１コンジュゲートとして２７％、そして２：１コンジュゲートとして３％）。
【００４９】
好ましい態様において、活性化剤の存在下での全コンジュゲーションは活性化剤なしのコンジュゲーションより１〜７倍大きい。より好ましい態様において、活性化剤を有するコンジュゲーションは活性化剤なしのコンジュゲーションより２〜５倍大きい。
【００５０】
実施例３において詳述されるように、ｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣの加水分解の速度をｐＨ６．５、７．０もしくは８．０でＨＯＳｕの存在下でそして不在下でＭＯＰＳバッファーにおいて測定した。簡潔に言えば、ｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣをＭＯＰＳバッファーもしくはＨＯＳｕを有するＭＯＰＳバッファーのいずれかを含有するバイアルに加えた。ｐ−ニトロフェノールの形成の速度を４００ｎｍで測定した。図７Ａ〜７Ｂは、ＭＯＰＳバッファーにおける（図７Ａ）もしくはＨＯＳｕの存在下でＭＯＰＳバッファーにおける(図７Ｂ)異なるｐＨでの加水分解によるｍＰＥＧ−ＮＰＣからのｐ−ニトロフェノールの形成の速度を示す。図７Ａ〜７Ｂの各々について、ｐＨ６．５での加水分解を◆により表し、ｐＨ７．０での加水分解を■により表し、そしてｐＨ８．０での加水分解を▲により表す。図７Ａにおいて見られるように、ＭＯＰＳバッファーにおけるｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣは使用した全てのｐＨでゆっくりと加水分解し（ｐＨ６．５では０．０００２ＯＤ／分、ｐＨ７．０では０．０００４ＯＤ／分、そしてｐＨ８．０では０．００１７ＯＤ／分）、そしてｐＨ＜７でかなり安定であった。しかしながら、図７Ｂにおいて見られるように、ｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣはＨＯＳｕのような活性化剤の存在下で加水分解をより受けやすかった。活性化剤の存在下での反応の速度は、ｐＨ６．５で０．０２１ＯＤ／分、ｐＨ７．０で０．０５９ＯＤ／分、そしてｐＨ８．０で０．２７８ＯＤ／分であった。図７Ａ〜７Ｂにおいて示されるように、ＨＯＳｕがバッファーに存在する場合、パラ−ニトロフェノールの遊離は見掛けの（ａｐｐａｒｅｎｔ）エステル交換反応において劇的に加速される。ＨＯＳｕは優れた水溶性を有するので、それを比較的高い濃度でバッファーに加えることができ、それはエステル交換プロセスを促進する。それだけで、ＨＯＳｕは
【数２】
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を有し、そしてｐＨ５〜７でバッファー成分として有用である。
【００５１】
活性化剤はｍＰＥＧ−ＮＰＣの炭酸エステルのエステル交換をもたらし、それは次に加水分解されてｐ−ニトロフェノール、ｍＰＥＧ−ＯＨおよびＣＯ２を生成する。好ましい態様において、活性化剤の添加は反応の速度の少なくとも１００倍の増加をもたらす。別の態様において、活性化剤の使用は、反応の速度の１０、１００もしくは１５０倍またはそれ以上の増加をもたらす。
【００５２】
収率を最大にし、そして／もしくは反応の時間を最小にするために必要に応じて関係する温度、ｐＨおよび時間の各々もしくはいずれかを変更できることが理解される。
【００５３】
１つの態様において、該方法は適度にＰＥＧ化されたタンパク質の形成をもたらし、そして１：１ＰＥＧ化、２：１ＰＥＧ化および／もしくは３：１ＰＥＧ化タンパク質を含んでなるＰＥＧ−タンパク質の製造に特に好都合である。好ましくは、反応は主に１：１ＰＥＧ化タンパク質を生成する。好ましい態様において、該方法は約４０〜４５％の１：１ＰＥＧ化タンパク質を生成する。より好ましい態様において、該方法は約５５〜６５％の１：１ＰＥＧ化タンパク質を生成する。さらに別の態様において、該方法は約６０％の１：１ＰＥＧ化タンパク質を生成する。別の態様において、該方法は２：１ＰＥＧ化タンパク質に対する１：１ＰＥＧ化タンパク質のほぼ等しいモル比を有する集団をもたらす。別の態様において、集団は約１５〜４０％の１：１ＰＥＧ化タンパク質、約３０〜５０％の２：１ＰＥＧ化タンパク質および約１５〜４０％の３：１ＰＥＧ化タンパク質を含んでなる。得られる集団はさらに、非修飾タンパク質(非ＰＥＧ化)を含むことができる。好ましい態様において、非ＰＥＧ化タンパク質は全タンパク質の約２０％、１０％もしくは５％未満の量で存在する。別の好ましい態様において、非ＰＥＧ化タンパク質は全タンパク質の約１％未満もしくは約０．１％未満の量で存在する。好ましい態様において、タンパク質の少なくとも６０〜９０％は本発明の方法でＰＥＧ化される。
【００５４】
得られる集団の組成は当該技術分野において既知である任意の適当な方法に従って分析できることが理解される。１つの態様において、集団の組成はＨＰＬＣにより分析される。サイズ排除クロマトグラフィーは有用であり、そして相互からそして非ＰＥＧ化タンパク質から様々なＰＥＧ化種を容易に分離する。
【００５５】
ＰＥＧ化タンパク質の収率を最大にするために利用することができる別の変数は、ｍＰＥＧ−ＮＰＣおよび／もしくは活性化剤に対するタンパク質の比率である。実施例４において記述されるように、ｍＰＥＧ１２ｋ−ＤＴＢ−ＮＰＣの０．２、０．４および０．６ｍＭ溶液をＨＯＳｕもしくはＨＯＢｔの存在下でＰＥＧ化ＥＰＯを製造するために使用した。溶液は、３、６もしくは９ＰＥＧ／ＥＰＯのモル比および１００、５０もしくは２５ＨＯＳｕ／ＮＰＣのモル比を有した。図８は、ゲル電気泳動の結果を示す。レーン２、３および４において見られるように、ＰＥＧ／ＥＰＯの比率を増加することは、５５〜２００ｋＤａの間のバンドにより示されるタンパク質のＰＥＧ化のより大きいパーセンテージをもたらす。ｎ＝１ＰＥＧ化種は５５ｋＤａのバンドにより表され、ｎ＝２ＰＥＧ化種は約９０ｋＤａのバンドにより表されるなど。この傾向はまた、ＨＯＢｔバッファーのレーン５、６および７によっても表される。バッファーの不在下で、ＥＰＯの非常にわずかなアシル化が起こった、レーン８を参照。レーン１０および１１は、３／１のＰＥＧ／ＥＰＯ比での反応におけるＥＰＯの量を変える効果を示す。レーン１２は、比較のためにグリシンで２０分間ブロックしたＰＥＧを使用しそして次にＥＰＯと反応させる結果を示す。これらの結果から見られるように、ＨＯＳｕおよびＨＯＢｔは両方ともバッファーのみと比較してＰＥＧ−ＮＰＣの反応性を高めた。タンパク質の出発濃度は、当業者に既知である方法を用いて、必要に応じて、さらにスケールアップもしくはダウンできることが理解される。より高いｎを有するコンジュゲートはより低いｎ値を有するものよりゆっくりと除去されるので、インビボでコンジュゲートＰＥＧ−タンパク質混合物を有することは、ＰＥＧ−タンパク質種のクリアランスがかなり延長されることを保証することに留意すべきである。１つの態様において、タンパク質の出発濃度は約０．２〜約１０ｍｇ／ｍｌの間である。好ましい態様において、タンパク質の出発濃度は約１〜５ｍｇ／ｍｌである。
【００５６】
別の態様において、ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹＴＭ（ＰＣＴ公開第ＷＯ０４／００２４１７号；第ＷＯ０４／００２４２４号；第ＷＯ０５／０８１６８７号；および第ＷＯ０５／０３２４６０号を参照）と当該技術分野において呼ばれる構造に親水性ポリマーポリ（エチレングリコール）を結合させるために本明細書に記載の方法を使用した。ミメティボディは、場合により少なくとも１つの可変抗体配列の少なくとも一部とさらに直接連結していてもよい、少なくとも１つの治療用ペプチドに直接連結している、任意のリンカー配列と
直接連結している少なくとも１つのヒンジ領域もしくはそのフラグメントと直接連結している少なくとも１つのＣＨ２領域と直接連結している少なくとも１つのＣＨ３領域を含んでなることができる。好ましい態様において、ミメティボディは１対のＣＨ３−ＣＨ２−ヒンジ−リンカー−治療用ペプチド融合ポリペプチドを含んでなり、該対は、Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合のようなしかしそれに限定されるものではない、会合もしくは共有結合により連結される。例えば、ＥＰＯ模倣（ｍｉｍｅｔｉｃ）ＣＨ１欠失ミメティボディはその固有の特性および機能を有する抗体構造を模倣し、一方、治療用ペプチドおよびその固有のもしくは獲得したインビトロ、インビボもしくはｉｎ  ｓｉｔｕ特性もしくは活性を提供する。
【００５７】
ミメティボディは、増加した半減期、増加した活性、より特異的な活性、活性の選択したもしくはより適当なサブセット、より少ない免疫原性、少なくとも１つの所望の治療効果の増加した質もしくは期間、より少ない副作用などの少なくとも１つのようなしかしこれらに限定されるものではない、既知のタンパク質と比較した場合に少なくとも１つの適当な特性を提供する。
【００５８】
少なくとも１つのタンパク質リガンドもしくはその受容体に特異的なヒトミメティボディは、単離されたおよび／もしくはＥＰＯタンパク質受容体もしくはリガンド、またはその一部(合成ペプチドのような合成分子を包含する)のような、適切なリガンドに対して設計することができる。そのようなミメティボディの製造は、少なくとも１つのタンパク質もしくはその一部のリガンド結合領域もしくは配列を同定しそして特性化するために既知の技術を用いて行われる。
【００５９】
本明細書に記載の方法に従うＰＥＧ化のモデル生体分子（ミメティボディ）としてＣＮＴＯ５２８と当該技術分野において呼ばれるミメティボディを選択した。ＣＮＴＯ５２８は、ＰＣＴ公開ＷＯ０４／００２４１７に記述される、ＥＰＯ受容体アゴニストである。実施例７および８は、本明細書に記載の反応方法に従うＣＮＴＯ５２８とＰＥＧの反応を記述する。
【００６０】
本明細書に記載の方法は、約８．０もしくは約７．０より高いｐＨで可溶性でないそして／もしくは安定でない様々なペプチドおよびタンパク質をＰＥＧ化するために有用であることが理解される。
【００６１】
別の態様において、少なくとも１つのＰＥＧはタンパク質分子上の１つもしくはそれ以上の部位で結合している。タンパク質分子上の１つより多くの部位でのＰＥＧのコンジュゲーションは、循環時間を増加し得ることがさらに理解される。
【００６２】
反応性の速度は、ＰＥＧ化反応におけるバッファーのｐＨおよび個々の第一級アミノ基の近づきやすさに非常に依存することが理解される。
【００６３】
反応は、反応媒質に遊離アミノ化合物を混合することにより停止することができる。そのような遊離アミノ化合物には、ＴＲＩＳ、リシン、グリシン、もしくは少なくとも１つの遊離アミノ基を有する任意のアミノが包含されるがこれらに限定されるものではない。好ましい態様において、遊離アミノ化合物はグリシンである。この態様において、グリシンは好ましくは約１０〜１００ｍＭ、約１〜５０ｍＭもしくは約５０〜１００ｍＭの間の濃度で使用される。
【００６４】
該方法はさらに、当該技術分野における既知の方法に従う精製段階を含むことができる。別の態様において、組み合わせる段階の生成物もしくは精製段階の生成物のいずれかを濃縮することができる。１つの態様において、濃縮段階は、例えば公称分子量限界（ＮＭ
ＷＬ）カットオフフィルターで限外濾過もしくは濃縮を用いて行うことができる。そのような濃縮を行うためのフィルターは、市販されている。時折、最適化された反応は、過剰のＰＥＧ試薬を除くために精製段階を必要としない可能性がある。しかしながら、精製および濃縮段階の両方を当該技術分野において既知である技術の中で選択できることを当業者は理解する。
【００６５】
様々な特許および公開が、本明細書の全体にわたって引用される。これらの特許もしくは公開の各々は、その全部が本明細書に引用することにより明白に組み込まれる。
【００６６】
実施例
以下の実施例は、本発明の様々な現在好ましい実施態様を説明する目的のために提供される。そのようなものとして、それらは本発明の理解もしくは記述をそのいくつかの態様において例示しそして明確にすることを目的とするが、限定するものではない。
【００６７】
材料および方法
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、２０ｍＭのクエン酸塩、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９バッファーにおいて３．５６ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆
Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ）から入手した。
【００６８】
組換えヒト骨形成タンパク質−７（ＢＭＰ７）は凍結乾燥粉末としてＣＵＲＩＳ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から入手し、そして−７０℃で保った。
【００６９】
ニトロフェニルカーボネート誘導体化メトキシ−ポリエチレングリコール３０，０００ダルトン（ｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣ）は、ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ，＃Ｍ３５５２５）から購入した。
【００７０】
スクシンイミジルカーボネート誘導体化メトキシ−ポリエチレングリコール３０，０００Ｄａ．（ｍＰＥＧ３０ｋ−ＳＣ）は、ジ−イソプロピルエチルアミンの存在下でＮ−ヒドロキシスクシンイミドとｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣを反応させることにより製造し、そして結晶化により精製した。
【００７１】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）および３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＯＰＳ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。
【実施例１】
【００７２】
ＥＰＯのＰＥＧ化
Ａ．コンジュゲーション
ｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣの１０ｍＭストック溶液をアセトニトリルにおいて調製した。コンジュゲーションバッファーを１００ｍＭ  ＭＯＰＳ（３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸ナトリウム塩）および１００ｍＭ  ＨＯＳｕ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）のストック溶液として調製し、そしてｐＨを５Ｎ  ＮａＯＨで７．０±０．１に調整した。反応は、最初に５．２ｍｌのＥＰＯを２．２５ｍｌのＭＯＰＳ／ＨＯＳｕバッファー、および１．１９４ｍｌの蒸留水に混合することにより開始した。その後、穏やかにボルテックスしながら、０．３５６ｍｌのｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣを混合物に１滴ずつ加えた。反応をロッキングミキサー上で室温（２１〜２２℃）で４時間、続いて４℃でさらに１８時間進行させた。最終反応容量は９ｍｌであり、２ｍｇ／ｍｌ（０．０６６ｍＭ）のＥＰＯおよび０．４ｍＭのｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣを含有し、６ＰＥＧ／ＥＰＯのモル比
および４％のアセトニトリルを与えた。最終ＨＯＳｕ濃度は２５ｍＭであり、これはｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣに対して約６２モル過剰である。
【００７３】
Ｂ．ＨＰＬＣサイズ排除カラムによる分析
コンジュゲーション反応の結果をＳｕｐｅｒｏｓｅ−６  １０／３００ＧＬ、１ｘ３０ｃｍカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）および５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５、移動相を用いてＨＰＬＣ−ＳＥＣにより分析した。サンプルを移動相において１／２０に希釈し、そして５０μｌをカラムに注入した。流速を０．５ｍｌ／分に設定し、そして２９５ｎｍの励起波長および３６０ｎｍの発光波長（帯域幅１５ｎｍ）に設定した蛍光検出器によりカラムからの溶出をモニターした。
【００７４】
図２は、反応の最後でのコンジュゲート（上）および親ＥＰＯ（下）のＨＰＬＣ−ＳＥＣクロマトグラムを示す。図２において見られるように、コンジュゲーション反応は主にモノ−およびジ−ＰＥＧ化種、それぞれ５０％および２８％の形成をもたらした。
【００７５】
Ｃ．精製
透析が先行するイオン交換によりコンジュゲーション反応サンプルを精製した。
【００７６】
１．透析：
６０００〜８０００の分子量カットオフを有する、ＳＰＥＣＴＲＡ／ＰＯＲ１膜チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、１０ｍＭのＴｒｉｓバッファー  ｐＨ７．５。透析を４℃で実施した。最初の３回のバッファー交換は各々１リットルのＴｒｉｓバッファーにおいて２時間行い、４回目の交換は３ＬのＴｒｉｓバッファーにおいて一晩行い、そして最後の交換は１Ｌのバッファーにおいて２時間行った。透析の最後に、サンプルを０．４５μｍのＡｃｒｏｄｉｓｃ  ＨＴ  Ｔｕｆｆｒｙｎ膜シリンジフィルター（ＰＡＬＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を通して濾過した。
【００７７】
２．イオン交換クロマトグラフィーによる分離：
第四級アミン陰イオン交換カラム、Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｑ  ４．６ｘ１００ｍｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、１．７ｍｌの総容量を２０カラム容量の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５バッファーで平衡化した。次に、７．８ｍｌの透析したコンジュゲーションサンプルをカラム上に載せた。溶出は、１．７ｍｌ／分の流速で、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５を含有する移動相Ａおよび１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５中５００ｍＭのＮａＣｌを含有する移動相Ｂを用いてステップ勾配により行った。５カラム容量の移動相Ａで非結合物質をカラムから洗浄した。移動相Ｂを１５％（７５ｍＭ  ＮａＣｌ）まで１０分間、次に２０％Ｂ（１００ｍＭ  ＮａＣｌ）まで１５分間、そして最後に７０％Ｂ（３５０ｍＭ  ＮａＣｌ）まで５分間増加することにより溶出は始まった。全分離を通して画分を０．８５ｍｌ／画分で集めた。図３Ａは、イオン交換分離の結果を示す。ＥＰＯ（ｐＩ．４．５〜５．５）はｐＨ７．５で第四級アミンマトリックスに結合し、そしてより高い対イオン濃度で溶出し、一方、ＰＥＧ−ＥＰＯは、おそらくＰＥＧ鎖によるその負に荷電した残基の遮蔽のために、より弱い程度にマトリックスと相互作用した。遊離のＰＥＧは、カラムに結合しなかった。
【００７８】
Ｄ．ＨＰＬＣ−ＳＥＣによる分析
イオン交換分離を通して集めた画分の中身を同定するために、画分からのアリコートをＴＳＫｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  ＳＷ３０００、０．４６ｘ３０ｃｍカラム（ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＬＬＣ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）、５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５、移動相および０．２５ｍｌ／分の流速
を用いてＨＰＬＣ−ＳＥＣにより分析した。
【００７９】
図３Ｂ〜３Ｄは、上記の節Ｃにおけるイオン交換分離を通して集めた画分のＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析を示す。図３Ｂ〜３Ｄにおいて見られるように、画分Ｃ３〜Ｄ１１（溶出時間１２．５〜２２．４分）は大部分の１：１  ＰＥＧ／ＥＰＯコンジュゲートを有するＰＥＧ化ＥＰＯを含有した。これらの画分を１８ｍｌの総容量において一緒にプールした。
【００８０】
Ｅ．透析および濃縮
イオン交換分離からのプールしたサンプルを上記のＳＰＥＣＴＲＡ／ＰＯＲ１チューブを用いて２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．９バッファーにおいて透析した。透析を４℃で実施した。１回目のバッファー交換は２Ｌのクエン酸塩／ＮａＣｌバッファーにおいて２日間行い、２回目の交換は２ＬのＴｒｉｓバッファーにおいて一晩行い、そして最後の交換は１Ｌにおいて４時間行った。次に、透析したサンプルを３０００の分子量カットオフを有する、ＯＭＥＧＡ限外濾過膜ディスクフィルター（ＰＡＬＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を用いて、１０ｍｌのＡｍｉｃｏｎ限外濾過攪拌セル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）において、２０ｐｓｉの窒素下で濃縮した。サンプル容量を１８ｍｌから４ｍｌの最終容量まで減らした。
【００８１】
Ｆ．無菌濾過
濃縮したサンプルを０．２２μｍのＡｃｒｏｄｉｓｃ  ＨＴ  Ｔｕｆｆｒｙｎ膜シリンジフィルターを通して無菌濾過し、そしてオートクレーブしたガラスバイアルに無菌的に詰めた。全てのバイアルを４℃で保存した。
【００８２】
ｍＰＥＧ３０ｋ−ＥＰＯ調製物の濃度は、ＥＰＯタンパク質の固有の蛍光に基づきそして親ＥＰＯでキャリブレーションして１．２ｍｇ／ｍｌであると決定された。
【００８３】
Ｇ．ＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析
精製されたｍＰＥＧ３０ｋ−ＥＰＯサンプルをＳｕｐｅｒｏｓｅ−６  １０／３００  ＧＬカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）および５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５、移動相を用いてサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。サンプルを移動相において１／２０に希釈し、そして５０μｌをカラムに注入した。流速を０．５ｍｌ／分に設定し、そして２９５ｎｍの励起波長および３６０ｎｍの発光波長（帯域幅１５ｎｍ）に設定した蛍光検出器によりカラムからの溶出をモニターした。結果を図４に示し、ここで、精製されたＰＥＧ化−ＥＰＯはそれぞれ９１％および６％のモノ−ＰＥＧおよびジ−ＰＥＧコンジュゲートを含有した。少量のコンジュゲーションしていないＥＰＯ（４％）もまた検出された。
【００８４】
Ｈ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
ｍＰＥＧ３０ｋ−ＥＰＯサンプルをＮｕＰＡＧＥＲ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ４〜１２％勾配ゲルおよびＭＯＰＳ−ＳＤＳランニングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて変性条件下でゲル電気泳動により分析した。サンプルおよびコントロールを１．５〜５μｇのタンパク質を含有して１０μｌ／ウェルでゲル上に載せた。ゲルを２００ボルトの定電圧で５５分間泳動した。ゲルを最初にＰＥＧ検出のためにヨウ素において、そして次にタンパク質検出のためにクーマシーブルーにおいて染色した。電気泳動ゲルを図５Ａ〜５Ｂに示す。図５Ａはヨウ素染色したゲルを示し、そして図５Ｂはクーマシーブルー染色したゲルを示す。レーン１はＰＥＧ分子マーカーに対応し、レーン２はＰＥＧ３０ｋコントロールに対応し、レーン３はＥＰＯコントロールに対応し、レーン４は精製前のｍＰＥＧ３０ｋ−ＥＰＯサンプルに対応し、レーン５は精製されたｍＰＥＧ３０ｋ−ＥＰＯに対応し、そしてレーン６はタン
パク質分子量マーカーに対応する。
【００８５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される精製されたｍＰＥＧ３０ｋ−ＥＰＯサンプルの組成は、図５Ａ〜５ＢのＨＰＬＣ−ＳＥＣ結果を裏付けた。サンプルは、モノおよびジ−ＰＥＧ化ＥＰＯのみを含有した。しかしながら、両方のゲルにおいて、バンドの強さは、タンパク質上のＰＥＧの存在のために、各コンジュゲート種の実際のパーセンテージを表さなかった。クーマシーブルーは、ヨウ素染色(図５Ａ)よりかなり低い特異性であるが、ＥＰＯと同様にＰＥＧを染色するように思われた。コンジュゲートにおけるタンパク質当たりのより多量のＰＥＧは、タンパク質自体が示しているより高いバンドの強さを生じさせた。
【実施例２】
【００８６】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを有するそしてそれなしのｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣへのＥＰＯのコンジュゲーション
３つのＭＯＰＳバッファー溶液を１００ｍＭで調製し、そしてｐＨ値を６Ｎ  ＨＣｌでそれぞれ６．５、７．０および８．０に調整した。
【００８７】
３つのＭＯＰＳ／ＨＯＳｕバッファー溶液を１００ｍＭ  ＭＯＰＳ／１００ｍＭ  ＨＯＳｕで調製し、そしてｐＨを５Ｎ  ＮａＯＨでそれぞれ６．５、７．０および８．０に調整した。
【００８８】
ｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣの１０ｍＭ（３０２．６ｍｇ／ｍｌ）ストック溶液をアセトニトリルにおいて作った。ｍＰＥＧ３０ｋ−ＳＣの１０ｍＭ（３０２ｍｇ／ｍｌ）ストック溶液をアセトニトリルにおいて作った。グリシンのストック溶液を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５バッファーにおいて５００ｍＭで作った。
【００８９】
合計９つのコンジュゲーション反応を組み立てた。第１組において、ＥＰＯをｐＨ６．５、７．０もしくは８．０でＭＯＰＳバッファーにおいてｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣと反応させた。第２組において、ＥＰＯをｐＨ６．５、７．０もしくは８．０でＭＯＰＳ／ＨＯＳｕバッファーにおいてｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣと反応させた。第３組において、ＥＰＯをｐＨ６．５、７．０もしくは８．０でＭＯＰＳバッファーにおいてｍＰＥＧ３０ｋ−ＳＣと反応させた。全ての反応を攪拌しながら室温（２１〜２２℃）で４時間実施し、次に４℃にさらに１８時間移した。
【００９０】
反応バイアルにおける最終濃度はＥＰＯについて２ｍｇ／ｍｌ（０．０６６ｍＭ）、そしてｍＰＥＧ３０ｋについて０．４ｍＭであり、６ＰＥＧ／ＥＰＯのモル比を与えた。最終アセトニトリル量は４％であった。ＭＯＰＳ／ＨＯＳｕバッファーを含有する反応において、最終ＨＯＳｕ濃度は２５ｍＭであり、これはｍＰＥＧに対して６２モル過剰に等しい。
【００９１】
インキュベーションの最後に、グリシンを２５ｍＭの最終濃度まで全ての反応に加え、そして室温で２０分間反応させた。
【００９２】
コンジュゲーション反応からのサンプルを５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５バッファーにおいて１：２５に希釈し、そしてＰＥＧおよびＥＰＯのコンジュゲーションの量を決定するために５０μｌをＳｕｐｅｒｏｓｅ−６  １０／３００  ＧＬカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に注入した。移動相は５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５であり、０．５ｍｌ／分の流速で流した。蛍光検出器をカラム出口に連結し、そして２９５ｎｍの励起波長および３６０ｎｍの発光波長（帯域幅１５ｎｍ）に設定した。クロマトグラ
ムをＳｔａｒ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ  ６．２（Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｃ．，Ｗａｌｎｕｔ  Ｃｒｅｅｋ，ＣＡ）により分析し、そして結果を表１に示されるようにピーク面積のパーセントで表した。ＭＯＰＳバッファーのみにおけるｍＰＥＧ３０ｋ−ＥＰＯコンジュゲートのＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析の結果を図６Ａに示し、そしてＭＯＰＳ／ＨＯＳｕバッファーにおけるｍＰＥＧ３０ｋ−ＥＰＯコンジュゲートの結果を図６Ｂに示す。
【００９３】
【表１】
2008545754.tif 000005
【００９４】
【表２】
2008545754.tif 000006
【実施例３】
【００９５】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下でのｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣの加水分解
ｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣ溶液、ＭＯＰＳバッファー、ＭＯＰＳ／ＨＯＳｕバッファーを実施例２に記載のとおり調製した。
【００９６】
９６０μｌのそれぞれ６．５、７．０および８．０のｐＨの１００ｍＭ  ＭＯＰＳバッファー溶液を各々含有する３つのバイアルに４０マイクロリットルの１０ｍＭ  ｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣを加えた。各バイアルからの混合物を三重反復で９６ウェルマイクロタイタープレートにすぐに移した（３００μｌ／ウェル）。プレート光学密度(ＯＤ）の読み取りは４００ｎｍで始まり、そしてＶｉｓ領域Ａ４００を用いて２分の読み取り間隔で２時間集めた。同様のアッセイをＭＯＰＳ／ＨＯＳｕバッファーで繰り返した。結果を図７Ａ〜７Ｂに示す。
【実施例４】
【００９７】
様々なＰＥＧ／ＥＰＯ比でＨＯＳｕおよびＨＯＢｔでのＰＥＧ化
Ａ．リン酸バッファーにおけるＨＯＳｕでの反応
ＥＰＯをｐＨ７で１００ｍＭリン酸ナトリウムおよび２０ｍＭ  ＨＯＳｕを含有するコンジュゲーションバッファーにおいて０．２、０．４および０．６ｍＭのｍＰＥＧ１２ｋ−ＤＴＢ−ＮＰＣに２ｍｇ／ｍｌで反応させた。反応をロッキングミキサー上で室温（２２〜２４℃）で５時間進行させた。反応中に、ＰＥＧ／タンパク質モル比は３／１、６／１もしくは９／１であり、そしてＨＯＳｕ／ＮＰＣモル比は１００／１、５０／１および２５／１であった。インキュベーションの最後に、反応を９ｍＭのグリシンで停止した。
【００９８】
サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、そして結果を図８においてレーン２、３および４として示す。
【００９９】
Ｂ．リン酸バッファーにおけるＨＯＢｔでの反応
コンジュゲーションバッファーをｐＨ７で１００ｍＭリン酸ナトリウムおよび２０ｍＭ
ＨＯＢｔのストック溶液として調製したことを除いて上記の節Ａにおけるように反応を行った。サンプルを上記の節ＡにおけるようにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、そして結果を図８においてレーン５、６および７として示す。
【０１００】
Ｃ．リン酸バッファーにおける反応
ＥＰＯをｐＨ７で１００ｍＭリン酸ナトリウムを含有するコンジュゲーションバッファーにおいて０．４ｍＭのｍＰＥＧ１２ｋ−ＤＴＢ−ＮＰＣに２ｍｇ／ｍｌで反応させた。反応をロッキングミキサー上で室温（２２〜２４℃）で５時間進行させた。反応中に、ＰＥＧ／タンパク質モル比は６／１であった。インキュベーションの最後に、反応を９ｍＭのグリシンで停止した。
【０１０１】
サンプルを上記の節Ａにおけるようにゲル電気泳動により分析した。結果を図８においてレーン８として示す。
【０１０２】
Ｄ．様々なＥＰＯ濃度でリン酸バッファーにおけるＨＯＳｕでの反応
ＥＰＯをｐＨ７で１００ｍＭリン酸ナトリウムおよび５もしくは１０ｍＭ  ＨＯＳｕを含有するコンジュゲーションバッファーにおいてｍＰＥＧ１２ｋ−ＤＴＢ−ＮＰＣ（０．１もしくは０．２ｍＭの）に１もしくは２ｍｇ／ｍｌで反応させた。反応をロッキングミキサー上で室温（２２〜２４℃）で５時間進行させた。反応中に、ＰＥＧ／タンパク質モル比は３／１であり、そしてＨＯＳｕ／ＮＰＣモル比は５０／１であった。インキュベーションの最後に、反応を９ｍＭのグリシンで停止した。
【０１０３】
サンプルを上記の節Ａにおけるようにゲル電気泳動により分析し、その結果を図８においてレーン１０および１１に示す。
【実施例５】
【０１０４】
ＢＭＰ７のＰＥＧ化
Ａ．コンジュゲーション
１．４ｍｇ／ｍｌのＢＭＰ７ストック溶液を２５ｍＭ  ＨＯＳｕ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）、ｐＨ６において調製した。ｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣの１０ｍＭストック溶液をアセトニトリルにおいて調製した。１２．８６ｍｌのＢＭＰ７（１８ｍｇ）を４．２４ｍｌのＨＯＳｕバッファー、ｐＨ６と混合した。その後、穏やかにボルテックスしながら、０．９ｍｌのｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣを混合物に１滴ずつ加えた。反応物をロッキングミキサー上で室温（２１〜２２℃）で１６時間インキュベーションした。最終反応容量は１８ｍｌであり、１ｍｇ／ｍｌ（０．０２８ｍＭ）のＢＭＰ７、０．５ｍＭのｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣ、５％のアセトニトリルおよび１８ＰＥＧ／ＢＭＰ７のモル比を含有した。最終ＨＯＳｕ濃度は２４ｍＭであり、これはｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣに対して約４８モル過剰である。反応を１０ｍＭのグリシンで室温で１時間クエンンチした。
【０１０５】
Ｂ．ＨＰＬＣサイズ排除カラムによる分析
コンジュゲーション反応の結果をＳｕｐｅｒｏｓｅ−６  １０／３００ＧＬ、１ｘ３０ｃｍカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）および２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、６Ｍ尿素、ｐＨ６．５、移動相を用いてＨＰＬＣ−ＳＥＣにより分析した。サンプルを移動相において１／２０に希釈し、そして５０μｌをカラムに注入した。流速を０．５ｍｌ／分に設定し、そして２９５ｎｍの励起波長および３６０ｎｍの発光波長（帯域幅１５ｎｍ）に設定した蛍光検出器によりカラムからの溶出をモニターし、結果を図９に示す。約４２％のタンパク質はコンジュゲーションしていないままであり、そして５８％のＢＭＰ７はＰＥＧ化され、大部分のモノ−ＰＥＧ化タンパク質、３８％を生成した。
【０１０６】
Ｃ．精製
１．透析：６０００〜８０００の分子量カットオフを有する、ＳＰＥＣＴＲＡ／ＰＯＲ１膜チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、１０ｍＭの酢酸Ｎａバッファー  ｐＨ５。透析を４℃で実施した。透析の最後に、サンプルを０．４５μｍのＡｃｒｏｄｉｓｃ  ＨＴ
Ｔｕｆｆｒｙｎ膜シリンジフィルター（ＰＡＬＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を通して濾過した。
【０１０７】
２．イオン交換クロマトグラフィーによる分離：
スルホプロピル陽イオン交換カラム、Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｓ  ＰＥ  ４．６ｘ１００ｍｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、１．７ｍｌの総容量を２０カラム容量の１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５バッファーで平衡化した。次に、２０ｍｌの透析したコンジュゲーションサンプルをカラム上に載せた。溶出は、１ｍｌ／分の流速で、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５を含有する移動相Ａ、１０ｍＭ酢酸ナトリウム  ｐＨ５中１ＭのＮａＣｌを含有する移動相Ｂおよび６Ｍ尿素、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５を含有する移動相Ｂ２を用いて勾配溶出により行った。カラムへの非結合物質を４０ｍｌの移動相Ａで洗浄して除いた。移動相Ｂ１を２ｍｌ／分で１０％から６０％まで５０分で、次に１００％のＢ２（１Ｍ  ＮａＣｌ、６Ｍ尿素）まで１０分間増加することにより勾配溶出が始まった。溶出段階の全体にわたって画分を１ｍｌ／画分で集め、結果を図１０Ａ〜１０Ｃに示した。未反応のＰＥＧはカラムに結合せず、そしてフロースルー物質とともに出てきた。ＰＥＧ化ＢＭＰ７は約１５０ｍＭのＮａＣｌで溶出し始め、そして約４００ｍＭのＮａＣｌで完了した。図１０Ａにおいて見られるように、遊離のＢＭＰ７は６Ｍ尿素を含有する１ＭのＮａＣｌで最後に溶出された。
【０１０８】
Ｄ．ＨＰＬＣ−ＳＥＣによる分析
イオン交換分離を通して集めた画分の中身を同定するために、画分からのアリコートを上記のＳｕｐｅｒｏｓｅ−６  １０／３００  ＧＬカラムを用いてＨＰＬＣ−ＳＥＣにより分析し、そして結果を図１０Ｂ〜１０Ｃに示す。
【０１０９】
Ｅ．透析および濃縮
ＰＥＧ化タンパク質を含有するイオン交換分離からの画分Ｂ２〜Ｄ３をプールし、濃縮し、そして３０００の分子量カットオフを有する、ＯＭＥＧＡ限外濾過膜ディスクフィルター（ＰＡＬＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を用いて、１０ｍｌのＡｍｉｃｏｎ限外濾過攪拌セル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）において、２０ｐｓｉの窒素下で、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、５％マンニトール、ｐＨ４．５バッファーにおいて透析した。サンプル容量を約３．５ｍｌの最終容量まで減らした。
【０１１０】
Ｆ．無菌濾過
濃縮したサンプルを０．２２μｍのＡｃｒｏｄｉｓｃ  ＨＴ  Ｔｕｆｆｒｙｎ膜シリンジフィルターを通して無菌濾過し、そしてオートクレーブしたガラスバイアルに無菌的に詰めた。全てのバイアルを４℃で保存した。下記のタンパク質アッセイにより決定した場合に、約合計１．２ｍｇのＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ７が精製から得られた。
【０１１１】
Ｇ．タンパク質測定アッセイ：
タンパク質測定アッセイは、タンパク質固有のトリプトファンの蛍光特性に基づいた。ＢＭＰ７を基準として使用し、そして連続希釈物を２０ｍＭ酢酸ナトリウム、５％マンニトール、ｐＨ４．５バッファーにおいて６．２５、１２．５、２５、５０、１００および２００μｇ／ｍｌで作った。ｍＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ７サンプルを同じバッファーにおいて１：１０および１：２０に希釈した。基準および試験サンプルを三重反復で２００μｌ／ウェルでブラックマイクロタイタープレートに移し、結果を表３および図１１に示す。プレートを２９５ｎｍの励起波長（２ｎｍのスリット）および３６０ｎｍの発光波長（１０ｎｍのスリット）に設定した蛍光光度計において読み取った。
【０１１２】
【表３】
2008545754.tif 000007
【０１１３】
Ｈ．ＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析
精製されたｍＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰサンプルを上記のＳｕｐｅｒｏｓｅ−６  １０／３００  ＧＬカラムを用いてサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。サンプルを移動相において５０μｇ／ｍｌに希釈し、そして５０μｌをカラムに注入した。流速を０．５ｍｌ／分に設定し、そして２９５ｎｍの励起波長および３６０ｎｍの発光波長（帯域幅１５ｎｍ）に設定した蛍光検出器によりカラムからの溶出をモニターし、結果を図１１に示す。
【０１１４】
Ｉ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
ｍＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰサンプルをＮｕＰＡＧＥＲ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ４〜１２％勾配ゲルおよびＭＯＰＳ−ＳＤＳランニングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて変性条件下でゲル電気泳動により分析した。サンプルおよびコントロールを１．５〜５μｇのタンパク質を含有して１０μｌ／ウェルで２つのゲル上に載せた。ゲルを２００ボルトの定電圧で５５分間泳動した。１つのゲルをＰＥＧ検出のためにヨウ素において（図１２Ａ）、そしてもう一方をタンパク質検出のためにクーマシーブルーにおいて（図１２Ｂ）染色した。得られるゲルを図１２Ａ〜１２Ｂに示す。
【実施例６】
【０１１５】
リゾチームのＰＥＧ化
ｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣの１０ｍＭストック溶液をアセトニトリルにおいて調製した。
リゾチームを１００ｍＭのＮａＣｌを含有するｐＨ６．９の２０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファーにおいて４．１６ｍｇ／ｍｌのストック溶液で調製した。３つのＭＯＰＳバッファー溶液を１００ｍＭで調製し、そしてｐＨを６Ｎ  ＨＣｌでそれぞれ６．５、７．０および８．０に調整した。３つのＭＯＰＳ／ＨＯＳｕバッファー溶液を１００ｍＭ  ＭＯＰＳ／１００ｍＭ  ＨＯＳｕで調製し、そしてｐＨを６Ｎ  ＮａＯＨでそれぞれ６．５、７．０および８．０に調整した。グリシンのストック溶液を１０ｍＭのＴＲＩＳ  ｐＨ７．５バッファー中５００ｍＭのグリシンで調製した。
【０１１６】
合計６つのコンジュゲーション反応を組み立てた。第１組において、リゾチームをｐＨ６．５、７．０もしくは８．０でＭＯＰＳバッファーにおいてｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣに反応させた。第２組において、リゾチームをｐＨ６．５、７．０もしくは８．０でＭＯＰＳ／ＨＯＳｕバッファーにおいてｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣに反応させた。全ての反応を攪拌しながら室温（２１〜２２℃）で４時間実施し、次に４℃にさらに１８時間移した。
【０１１７】
反応バイアルにおける最終濃度はリゾチームについて２ｍｇ／ｍｌ（０．１４ｍＭ）、そしてｍＰＥＧ３０ｋについて０．４ｍＭであり、３／１のＰＥＧ／リゾチームのモル比をもたらした。最終アセトニトリル量は４％であった。ＭＯＰＳ／ＨＯＳｕバッファーを含む反応において、最終ＨＯＳｕ濃度は２５ｍＭであり、これはｍＰＥＧ−ＮＰＣに対して６２モル過剰に等しい。
【０１１８】
ＰＥＧおよびリゾチームのコンジュゲーションの量を決定するために本質的に実施例２に記載のとおりサンプルをＳｕｐｅｒｏｓｅ−６  １０／３００  ＧＬカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）および蛍光検出器で分析した。結果を以下の表４に記載する。
【０１１９】
【表４】
2008545754.tif 000008
【実施例７】
【０１２０】
ＰＥＧ３０ｋＣＮＴＯ５２８の製造
ＰＣＴ公開第ＷＯ０４／００２４１７号に記述されるようなＥＰＯ受容体アゴニスト、ＣＮＴＯ５２８をモデル生体分子（ミメティボディ）として選択した。ＣＮＴＯ５２８において、生物活性のために二量化を必要とすることが既知であるＥＰＯ模倣ペプチド（ＥＭＰ−１）の配列をＩｇＧ１のヒンジおよびＦｃ部分に融合させ、活性Ｅｐｏ受容体アゴニストをもたらした。ＣＮＴＯ５２８のＦｃおよびヒンジ部分には２１個のリシン残基があり、そしてＥｐｏ模倣ペプチドは１個のリシン残基を有する。さらに、単一のミメティボディ分子上に２個のアミノ末端基がある（４６個の合計潜在的部位）。Ｆｃ部分は遊離のペプチドと比較してより長い循環時間に寄与するが、さらに長い循環が改善された投与処方計画に所望され得る。
【０１２１】
ＣＮＴＯ５２８のアミンを標的とするＰＥＧ化を下記のように、そして上記の反応スキームに従って行った。アセトニトリルにおけるＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣの１０ｍＭ溶液を使用直前に調製した。ミメティボディＣＮＴＯ５２８（Ｌｏｔ＃ＦＶ２４１３Ａ）をＰＣＴ公開第ＷＯ０４／００２４１７号；第ＷＯ０４／００２４２４号；第ＷＯ０５／０８１６８７号；および第ＷＯ０５／０３２４６０号に記載のとおり調製した。１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１００ｍＭ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、ｐＨ７．５のバッファーを調製した。
【０１２２】
ＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣをＣＮＴＯ５２８に対して１０倍モル過剰で用いた。ＰＥＧ溶液を４ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＨＯＳｕの最終バッファー濃度および０．６４５ｍＭの最終ＰＥＧ濃度にバッファーおよび水においてＣＮＴＯ５２８に加えた。反応物をロッキングミキサー上で暗所で室温（２１〜２２℃）で４時間進行させ、そして次に４℃に一晩置いた。反応を３０ｍＭの最終濃度のグリシンで停止した。
【０１２３】
粗反応物質を１０Ｍクエン酸塩、ｐＨ５．０において透析し、そして次にＮａＣｌ溶出勾配を用いて陽イオン交換クロマトグラフィー（ＳＰ  ＨＰ  １ｍＬもしくは５ｍＬカラム、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により精製した。反応物質を５０ｍＭリン酸ナトリウムおよび１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４移動相においてＳｕｐｅｒｏｓｅ−６（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により特性化した。ＳＥＣによる分析後に、所望の種の比率を得るために画分をプールした。ＳＥＣクロマトグラムの詳細を以下の表５に要約する。
【０１２４】
【表５】
2008545754.tif 000009
【０１２５】
次に、プールしたコンジュゲート混合物をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２に透析し、そして０．２μｍの孔径の膜を用いて濾過して滅菌した。ＰＥＧ３０ｋ−ＣＮＴＯ５２８をＡ２８０により決定されるように（１．０ｍｇ／ｍＬ）、２ｍＬ±０．１ｍＬで無菌ガラスバイアルに入れた。このコンジュゲート混合物を上記のようにＳＥＣにより特性化し、そして結果を以下の表６に示す。
【０１２６】
【表６】
2008545754.tif 000010
【実施例８】
【０１２７】
ＰＥＧ３０ｋＣＮＴＯ５２８の製造
反応成分の量に以下の変更を有して、コンジュゲートを実施例７に記載のとおり製造した。ＣＮＴＯ５２８、ＨＥＰＥＳ／ＨＯＳｕバッファーおよびＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣの最終濃度は、それぞれ５．６ｍｇ／ｍＬ、３５ｍＭおよび０．９ｍＭであった。反応を４０ｍＭの最終濃度のグリシンで停止した。
【０１２８】
コンジュゲートを５０Ｍリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０移動相においてＳｕｐｅｒｏｓｅ−６（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により特性化し、そして粗物質および精製された物質のクロマトグラムからの結果を以下の表７および８に示す。
【０１２９】
【表７】
2008545754.tif 000011
【０１３０】
【表８】
2008545754.tif 000012
【０１３１】
多数の典型的な態様および実施態様が上記に説明されているが、当業者はそのある種の改変、置換、追加およびサブコンビネーションを認識する。従って、以下の添付の請求項
および今後に導入される請求項は、全てのそのような改変、置換、追加およびサブコンビネーションをそれらの真の精神および範囲内であるとして包含すると解釈されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】中性のｐＨでｍＰＥＧ−ＮＰＣを用いるタンパク質のＰＥＧ化の反応スキームを説明する。
【図２】分単位で経時的にｍＶｏｌｔとしてプロットしたＰＥＧ３０ｋ−ＥＰＯコンジュゲートおよび遊離のＥＰＯのＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析のトレースである。
【図３Ａ−３Ｄ】分単位で経時的にｍＡＵとしてプロットしたコンジュゲーション反応サンプルのイオン交換カラムでの分離（図３Ａ）；および分単位で経時的にＶｏｌｔもしくはｍＶｏｌｔとしてプロットしたＨＰＬＣ−ＳＥＣにより分析したイオン交換カラムからの画分（図３Ｂ〜３Ｄ）のグラフである。
【図４】分単位で経時的にｍＶｏｌｔとしてプロットしたｍＰＥＧ３０ｋ−ＥＰＯのタンパク質測定アッセイのＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析のグラフである。
【図５Ａ−５Ｂ】ヨウ素染色（図５Ａ）およびクーマシーブルー染色（図５Ｂ）でのＰＥＧ３０ｋ−ＥＰＯコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図６Ａ−６Ｂ】分単位で経時的にｍＶｏｌｔとしてプロットしたバッファーに活性化剤（ＨＯＳｕ）を加えずに（図６Ａ）そして加えて（図６Ｂ）、ｐＨ６．５、７．０もしくは８．０で形成されるＰＥＧ３０ｋ−ＥＰＯコンジュゲートのＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析のグラフである。
【図７Ａ−７Ｂ】分単位で経時的に４００ｎｍでのそれぞれＭＯＰＳおよびＭＯＰＳ／ＨＯＳｕバッファーにおけるｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣの加水分解後のｐ−ニトロフェノールのＯＤのグラフである。
【図８】ｐＨ７で様々なモル比のＰＥＧ：ＥＰＯで形成されるＰＥＧ３０ｋ−ＥＰＯコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥであり、ここで、レーン１は遊離のＥＰＯであり；レーン２はＨＯＳｕの存在下で３：１のモル比のＰＥＧ：ＥＰＯであり；レーン３はＨＯＳｕの存在下で６：１のモル比のＰＥＧ：ＥＰＯであり；レーン４はＨＯＳｕの存在下で９：１のモル比のＰＥＧ：ＥＰＯであり；レーン５はＨＯＢｔの存在下で３：１のモル比のＰＥＧ：ＥＰＯであり；レーン６はＨＯＢｔの存在下で６：１のモル比のＰＥＧ：ＥＰＯであり；レーン７はＨＯＢｔの存在下で９：１のモル比のＰＥＧ：ＥＰＯであり；レーン８は活性化剤なしで６：１のモル比のＰＥＧ：ＥＰＯであり；レーン９は分子量基準であり；レーン１０はＨＯＳｕの存在下で３：１のモル比の１ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ：ＥＰＯであり；レーン１１はＨＯＳｕの存在下で３：１のモル比の２ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ：ＥＰＯであり；レーン１２はグリシンでブロックしたＰＥＧである。
【図９】分単位で経時的にｍＶｏｌｔとしてプロットしたＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ７コンジュゲートおよびＢＭＰ７基準のＨＰＬＣ−ＳＥＣのグラフである。
【図１０】図１０Ａは、分単位で経時的にｍＡＵとしてプロットした陽イオン交換クロマトグラフィーによるＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ７の分離のグラフである。図１０Ｂ〜１０Ｃは、分単位で経時的にｍＶｏｌｔとしてプロットしたＨＰＬＣ−ＳＥＣにより分析した場合のＢＭＰ７コントロールおよびコンジュゲーション反応物と比較した陽イオン交換からの画分を例示する。
【図１１】分単位で経時的にｍＶｏｌｔとしてプロットした精製されたＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ７コンジュゲートの蛍光強度のグラフである。
【図１２Ａ−１２Ｂ】ヨウ素染色（図１２Ｂ）およびクーマシーブルー染色（図１２Ａ）でのＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ７コンジュゲートの電気泳動ゲルを示す。
【図１】
2008545754.tif 000013
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図５Ａ−５Ｂ】
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【図８】
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【図１２Ａ−１２Ｂ】
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【国際調査報告】
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