(57)【要約】  次式2008545644.tif 000040のＰＥＧ化タンパク質を含む新規な化合物、このような化合物の調製方法、このような化合物の使用方法、及び他の組成物及び方法が提供される。
2008545644.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
2008545644.tif 000029
［上式中、
Ｙは１〜１４０の整数を表し；
Ｒ１は
2008545644.tif 000030
から選択されるジラジカルを表し；
Ｚは、シアノ、ニトロ、-Ｐ(Ｒ２)３＋Ｘ−、-Ｓ(=Ｏ)Ｒ３、-Ｓ(=Ｏ)２Ｒ４、又は-Ｃ(=Ｏ)Ｒ５から選択される基を表し、ここでＸはハロゲン、ＢＦ４又はＰＦ６を表し；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は独立して、ハロゲン、Ｃ１−６-アルキル、シアノ、又はカルボキシルで置換されていてもよいアリール；シアノで置換されていてもよいＣ１−６-アルキル；又はＮＲ６Ｒ７を表し、ここでＲ６及びＲ７は独立して水素又はＣ１−６-アルキルを表す］
の化合物。
【請求項２】
Ｚがシアノを表す請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｚが-ＰＰｈ３Ｃｌを表す請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１が
2008545644.tif 000031
を表す請求項１から３の何れか一項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｙが、１０、２０、３０、４０又は６０を表す請求項１から４の何れか一項に記載の化合物。
【請求項６】
2008545644.tif 000032
から選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
タンパク質にＰＥＧを共有結合させる方法であって、タンパク質由来アルデヒド又はケトンを請求項１から６の何れか一項に記載の化合物とｐＨ＞７で反応させることを含んでなる方法。
【請求項８】
タンパク質由来アルデヒドがＮα１-グリオキシリル-ｈＧＨである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
反応が水中で実施される請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
第３級アミンがｐＨを上昇させるために添加される請求項７から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
第３級アミンがＤＡＢＣＯである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
式ＩＩ
2008545644.tif 000033
［上式中、Ｙは１〜１４０の整数を表し；
Ｒ１は
2008545644.tif 000034
から選択されるジラジカルを表し；
Ｇは、水素、シアノ、ニトロ、-Ｐ(Ｒ２)３＋Ｘ−、-Ｓ(=Ｏ)Ｒ３、-Ｓ(=Ｏ)２Ｒ４、又は-Ｃ(=Ｏ)Ｒ５を表し、ここでＸはハロゲン、ＢＦ４、又はＰＦ６を表し；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は独立して、ハロゲン、Ｃ１−６-アルキル、シアノ、又はカルボキシルで置換されていてもよいアリール；シアノで置換されていてもよいＣ１−６-アルキル；又はＮＲ６Ｒ７を表し、ここでＲ６及びＲ７は独立して水素又は低級アルキルを表し；
ＥはＯ又はＨ２を表し；
-prot１は、グルタミン酸側鎖のヒドロキシル基又はＮ末端アミノ基のホルマール除去によりタンパク質から誘導された基を表す］
の化合物。
【請求項１３】
Ｚがシアノ又は水素を表し；ＥがＯを表し；Ｙが２０、４０又は６０を表す請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
式ＩＩＩ：
2008545644.tif 000035
［上式中、Ｙは１〜１４０の整数を表し；
Ｒ１は
2008545644.tif 000036
から選択されるジラジカルを表し；
Ｇは、水素、シアノ、ニトロ、-Ｐ(Ｒ２)３＋Ｘ−、-Ｓ(=Ｏ)Ｒ３、-Ｓ(=Ｏ)２Ｒ４、又は-Ｃ(=Ｏ)Ｒ５を表し、ここでＸはハロゲン、ＢＦ４、又はＰＦ６を表し；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は独立して、ハロゲン、Ｃ１−６-アルキル、シアノ、又はカルボキシルで置換されていてもよいアリール；シアノで置換されていてもよいＣ１−６-アルキル；又はＮＲ６Ｒ７を表し、ここでＲ６及びＲ７は独立して水素又は低級アルキルを表し；
-prot２は、Ｎ末端アミノ基のホルマール除去によりタンパク質から誘導された基を表す]
の化合物。
【請求項１５】
Ｚがシアノ又は水素を表し；ＥがＯを表し；Ｙが２０、４０又は６０を表す請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
次の式ＩＶ：
2008545644.tif 000037
[上式中：
Ｙは１〜１４０の整数を表し；
Ｒ１は
2008545644.tif 000038
から選択されるジラジカルを表し；
Ｚは、シアノ、ニトロ、-Ｐ(Ｒ２)３＋Ｘ−、-Ｓ(=Ｏ)Ｒ３、-Ｓ(=Ｏ)２Ｒ４、又は-Ｃ(=Ｏ)Ｒ５から選択される基を表し、ここでＸはハロゲン、ＢＦ４、又はＰＦ６を表し；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は独立して、ハロゲン、Ｃ１−６-アルキル、シアノ、又はカルボキシルで置換されていてもよいアリール；シアノで置換されていてもよいＣ１−６-アルキル；又はＮＲ６Ｒ７を表し、ここでＲ６及びＲ７は独立して水素又はＣ１−６アルキルを表し；
-prot２は、Ｎ末端アミノ基のホルマール除去によりタンパク質から誘導された基を表す］
の化合物。
【請求項１７】
Ｚがシアノを表す請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
-prot１又は-prot２が、成長ホルモン由来の基を表す請求項１１から１７の何れか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
-prot１又は-prot２が、Ｎ末端アミノ基のホルマール除去により得られる成長ホルモン由来の基を表す請求項１１から１７の何れか一項に記載の化合物。
【請求項２０】
前記基がヒト成長ホルモン由来である請求項１８又は１９に記載の化合物。
【請求項２１】
前記基が、Ｎ末端アミノ基のホルマール除去により得られるヒト成長ホルモン由来の基である請求項１８又は１９に記載の化合物。
【請求項２２】
2008545644.tif 000039
から選択される請求項１１から２１の何れか一項に記載の化合物。
【請求項２３】
治療に使用される請求項１１から２２の何れか一項に記載の化合物。
【請求項２４】
治療に使用される請求項１８から２２の何れか一項に記載の化合物。
【請求項２５】
請求項１１から２２の何れか一項に記載の化合物を含有する医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１８から２２の何れか一項に記載の化合物を含有する医薬組成物。
【請求項２７】
循環成長ホルモンのレベルの増加から治療効果が得られる疾患の治療方法であって、請求項１８から２２の何れか一項に記載の化合物の治療的有効量を、それを必要としている患者に投与することを含む方法。
【請求項２８】
前記投与が２日毎又はそれ以上の間隔を開けてなされる請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
循環成長ホルモンのレベルの増加から治療効果が得られる疾患の治療のための医薬の製造における請求項１８から２２の何れか一項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
(発明の分野)
本発明は、新規なポリ(エチレングリコール)誘導体、及びポリ(エチレングリコール)のタンパク質への共有結合方法に関する。
【０００２】
(発明の背景)
改善された薬理学的特性を有する類似体を得る目的でポリ(エチレングリコール)（ＰＥＧ）をペプチド及びタンパク質に共有結合させることは、十分に確立された方策である(Zobelら, Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003, 13, 1513-1515)。ｍＰＥＧ(４０ｋ)等の高分子量ＰＥＧの特定の誘導体は、これらを通常は腎臓濾過によって除去できず、よって血漿中において長い半減期を有しているため有用である。
【０００３】
タンパク質への化合物の共有結合は、一般的には、アシル化(リジン側鎖又はＮ末端アミノ酸とのアミド結合の形成)又は適切なアルコキシルアミン、ヒドラジン、又は２-アミノチオールとタンパク質由来ケトン又はアルデヒドとの縮合反応で、それぞれオキシム、ヒドラゾン又はチアゾリジンを生成させることにより、実施される(Shao及びTam, J. Am. Chem. Soc. 1994, 117, 3893-3899)。これらの反応は、タンパク質と誘導化試薬が溶解している条件下でのみ実施することができ、そのような反応条件の確認には、溶媒、ｐＨ、濃度、添加剤、及び温度のような重要なパラメータの時間がかかる面倒な調整が必要となる場合がある。
【０００４】
アルコキシルアミン類及びカルボニル化合物、例えばアルデヒド類又はケトン類からのオキシム類の形成速度はｐＨに大きく依存し、通常は、わずかに酸性条件(ｐＨ２−４)で、最も速やかに進行する。許容可能な反応速度はｐＨ１−６で達成できる。関連する縮合反応、例えばヒドラゾン類、チアゾリジン類又は１,３-チアジン類の形成は、同様のｐＨ依存性を示す。多くのアミノ酸を含むタンパク質は、酸性条件(ｐＨ＜７)下で低溶解度を有しており、そのようなタンパク質は、オキシム形成又は関連した既知の反応を使用してＰＥＧと縮合させることは困難である。例えば、ヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)の等電点、すなわち水へのその溶解度が最も低いｐＨは５．１であり、ｈＧＨ由来アルデヒド又はケトンのオキシム化をｐＨ４で試みると、通常はタンパク質の沈殿が起こり、収率が乏しいものとなる。ＰＥＧは水に対して高い親和性を有しており、タンパク質の沈殿を誘導するため、沈殿はＰＥＧの存在でさらに促進される。さらに、高分子量ＰＥＧ（例えばＰＥＧ(２０ｋ)、ＰＥＧ(３０ｋ)、ＰＥＧ(４０ｋ)、ＰＥＧ(６０ｋ)等）を用いた大きなタンパク質のＰＥＧ化は、十分に素早く進行させるために、通常は、高濃度の反応体を必要とする。そのような反応体の高濃度が、酸性タンパク質の沈殿をさらに促進する。
【０００５】
よって、塩基性反応条件下で実施することができる新規なカップリング反応を同定することには、高い一般的な関心が寄せられている。そのような方法があれば、沈殿の危険を大きく低下させながら、酸性タンパク質のＰＥＧ化が可能になる。とりわけ、本発明はそのような方法を提供する。本発明のこれらの及び他の有用な特徴、側面及び効果は、以下に提供する開示から当業者には明らかであろう。
【０００６】
(発明の概要)
本発明者は、驚くべきことに、ＰＥＧ誘導シアノアセトアミド類及びＰＥＧ誘導ホスホニウム塩が、塩基性反応条件下で水中においてタンパク質由来アルデヒド類又はケトン類と順調に反応することを見出した。この発見から、多くの発明組成物及び方法を着想した。
【０００７】
例示的な一実施態様では、本発明は、式Ｉ
2008545644.tif 000003
［上式中、
Ｙは１〜１４０の整数を表し(他で示すように、「ｋ」は、変数Ｙが実際には１０００倍であることを意味する)；
Ｒ１は
2008545644.tif 000004
から選択されるジラジカルを表し、
Ｚは電子求引性基を表す］
の化合物に関する。
【０００８】
一実施態様では、本発明は、タンパク質にＰＥＧ誘導体を共有結合させる方法に関し、該方法は、前記タンパク質のアルデヒド又はケトン誘導体を塩基性のｐＨで式Ｉの化合物を用いて処理することを含む。
一実施態様では、本発明は、本発明の反応により得られたＰＥＧ化タンパク質に関する。特に、本発明は、式ＩＩ
2008545644.tif 000005
［上式中、Ｙは１〜１４０の整数であり；
Ｒ１は
2008545644.tif 000006
から選択されるジラジカルを表し；
Ｇは電子求引性基又は水素を表し；
ＥはＯ又はＨ２を表し；
-prot１は、グルタミン酸側鎖のヒドロキシル基又はＮ末端アミノ基のホルマール除去によりタンパク質から誘導された基を表す]
の化合物に関する。
【０００９】
一実施態様では、本発明は、式ＩＩＩ
2008545644.tif 000007
[上式中、Ｙは１〜１４０の整数であり；
Ｒ１は
2008545644.tif 000008
から選択されるジラジカルを表し；
Ｇは電子求引性基又は水素を表し；
ＥはＯ又はＨ２を表し；
-prot２は、Ｎ末端アミノ基のホルマール除去によりタンパク質から誘導される基を表す］
の化合物に関する。
【００１０】
一実施態様では、本発明は、式ＩＶ
2008545644.tif 000009
［上式中、Ｙは１〜１４０の整数であり；
Ｒ１は
2008545644.tif 000010
から選択されるジラジカルを表し；
Ｚは電子求引性基を表し；
prot２は、Ｎ末端アミノ基のホルマール除去によりタンパク質から誘導される基を表す］
の化合物に関する。
【００１１】
一実施態様では、本発明は、治療に使用される式ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶの化合物を提供する。
一実施態様では、本発明は、式ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶの化合物を含有する組成物、特に医薬組成物に関する。
一実施態様では、本発明は、疾患の治療方法に関し、該方法は、式ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶの化合物の治療的有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む。
一実施態様では、本発明は、医薬の製造における式ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶの化合物の使用に関する。
一実施態様では、本発明は、タンパク質の薬理学的特性を改善する方法を提供し、該方法は、式Ｉの化合物をタンパク質と塩基性ｐＨで接触させることを含む。
本発明のこれら及び他の有用な側面、特徴及び効果は、本明細書の他の箇所にさらに記載する。
【００１２】
「非天然アミノ酸」なる用語は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリンではない、少なくとも一つの第１級又は第２級アミノ基と少なくとも一つのカルボキシル基を有する任意の化合物を意味する。
【００１３】
「ヒト成長ホルモン」なる用語は、次のアミノ酸配列：
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF
を有するタンパク質を意味する。
「ハロゲン」なる用語は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩを含む。
【００１４】
本明細書において、「アルキル」なる用語は、Ｃ１−１０-アルキルとも表される、１〜１０の炭素原子を有する直鎖状、分枝状及び／又は環状の飽和した一価炭化水素基を示すものである。特に、アルキルはＣ１-６-アルキル、例えばメチル、エチル、ｎ-プロピル、イソプロピル、ｎ-ブチル、sec-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、ｎ-ペンチル、２-メチルブチル、３-メチルブチル、４-メチルフェニル、ｎ-ヘキシル、１,１-ジメチルプロピル、１,２-ジメチルプロピル、２,２-ジメチルプロピル（ネオペンチル）及び１,２,２-トリメチルプロピルを示すものである。
【００１５】
ここで使用される「アリール」なる用語は、炭素環芳香族環系、例えばフェニル、ビフェニリル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、フルオレニル、インデニル、ペンタレニル、アズレニル等を含むことを意図している。またアリールは、上に列挙された炭素環系の部分的に水素化された誘導体を含む。そのような部分的に水素化された誘導体の非限定的な例は、１,２,３,４-テトラヒドロナフチル、１,４-ジヒドロナフチル等である。
【００１６】
ここで使用される「置換されていてもよい」なる用語は、当該基が、未置換か、特定された一又は複数の置換基で置換されていることを意味する。当該基が一を越える置換基で置換されている場合、その置換基は同一でも異なっていてもよい。
【００１７】
「ＰＥＧ」なる用語は、約１００から約１００００００Ｄａの分子量のポリエチレングリコールを示すことを意図しており、その類似体も含み、例えば末端ＯＨ基は、アルコキシ基、例えばメトキシ基、エトキシ基又はプロポキシ基で置き換えられている。特に、末端ＯＨ基がメトキシで置き換えられているＰＥＧが有用であり、ｍＰＥＧと称される。
【００１８】
「ｍＰＥＧ」(又はより適切には「ｍＰＥＧｙｌ」)なる用語は、次の構造
2008545644.tif 000011
[上式中、ｍは１を越える整数である]の多分散又は単分散基を意味する。よって、ｍが９０であるｍＰＥＧは、３９９１Ｄａ、すなわち約４ｋＤａの分子量を有する。同様に、２０ｋＤａの平均分子量を有するｍＰＥＧは４５４の平均ｍを有する。ｍＰＥＧを製造する方法のために、これらの分子はしばしば分子量のある分布を有する。この分布は多分散度により記述される。
【００１９】
ここで使用される「多分散度」なる用語は、高分子化学の分野で知られている重量平均分子量と数平均分子量の比を意味する（例えば"Polymer Synthesis and Characterization", J.A. Nairn, University of Utah, 2003を参照）。多分散度は１以上の数であり、ゲル浸透クロマトグラフィーデータから推定することができる。多分散度が１である場合、生成物は単分散性で、よって単一の分子量を有する化合物から構成されている。多分散度が１を越える場合、それは、そのポリマーの多分散度、すなわち、様々な分子量を有するポリマーの分布が如何に広いかの尺度である。
【００２０】
式、化合物名又は分子構造中における例えば「ｍＰＥＧ(２０ｋ)」の使用は、ｍＰＥＧが多分散性であり、約２０ｋＤａの分子量を有しているｍＰＥＧ残基を示している。
【００２１】
多分散度は、典型的には、ＰＥＧ又はｍＰＥＧの分子量と共に増加する。５ｋＤａのＰＥＧ、特に５ｋＤａのｍＰＥＧという場合、それが、多分散度が１．０６以下、例えば１．０５以下、例えば１．０４以下、例えば１．０３以下、例えば１．０２〜１．０３である化合物(又は実際には化合物の混合物)を示すものである。１０ｋＤａのＰＥＧ、特に１０ｋＤａのｍＰＥＧという場合、多分散度が１．０６以下、例えば１．０５以下、例えば１．０４以下、例えば１．０３以下、例えば１．０２〜１．０３である化合物(又は実際には化合物の混合物)を示すものである。１５ｋＤａのＰＥＧ、特に１５ｋＤａのｍＰＥＧという場合、多分散度が１．０６以下、例えば１．０５以下、例えば１．０４以下、例えば１．０３以下、例えば１．０２〜１．０３である化合物(又は実際には化合物の混合物)を示すものである。２０ｋＤａのＰＥＧ、特に２０ｋＤａのｍＰＥＧという場合、多分散度が１．０６以下、例えば１．０５以下、例えば１．０４以下、例えば１．０３以下、例えば１．０２〜１．０３である化合物(又は実際には化合物の混合物)を示すものである。３０ｋＤａのＰＥＧ、特に３０ｋＤａのｍＰＥＧという場合、多分散度が１．０６以下、例えば１．０５以下、例えば１．０４以下、例えば１．０３以下、例えば１．０２〜１．０３である化合物(又は実際には化合物の混合物)を示すものである。４０ｋＤａのＰＥＧ、特に４０ｋＤａのｍＰＥＧという場合、多分散度が１．０６以下、例えば１．０５以下、例えば１．０４以下、例えば１．０３以下、例えば１．０２〜１．０３である化合物(又は実際には化合物の混合物)を示すものである。６０ｋＤａのＰＥＧ、特に６０ｋＤａのｍＰＥＧという場合、多分散度が１．０６以下、例えば１．０５以下、例えば１．０４以下、例えば１．０３以下、例えば１．０２〜１．０３である化合物(又は実際には化合物の混合物)を示すものである。
【００２２】
タンパク質という用語は、例えばペプチド及びポリペプチド等、ペプチド結合を介して結合した２又はそれ以上のアミノ酸を含む化合物を示すものである。典型的には、タンパク質は、３０又はそれ以上、例えば５０又はそれ以上、例えば１００又はそれ以上のアミノ酸残基を含む。また本用語は、天然又は非天然誘導体化、例えばグリコシル化、ＰＥＧ又は親油性基の結合がなされたポリペプチド、及びさらなる基、例えば補欠分子族、例えばヘムを含むポリペプチドを含むものである。さらに本用語は、高次構造、例えば二量体及び多重鎖タンパク質を含むものである。
【００２３】
ここで使用される化合物の「治療的有効量」は、与えられた疾患及びその合併症の臨床症状を治癒、軽減又は部分的に抑えるのに十分な量を意味する。これを達成するのに十分な量が「治療的有効量」として定義される。各目的のための有効量は、疾患又は傷害の重症度並びに体重、性別、年齢及び患者の一般的症状に依存するであろう。適切な用量の決定は、値のマトリックスを構築し、マトリックス中の異なった点を試験することにより、常套的な実験を使用してなすことができ、これは全て熟練した医師又は獣医の通常の技量内のものである。
【００２４】
ここで使用される「治療」及び「治療する」なる用語は、疾患又は疾病等の病状に抗することを目的として、患者の管理又は世話をすることを意味する。本用語は、症状又は合併症を軽減、又は疾患、疾病又は病状の進行を遅延化、症状及び合併症を軽減又は緩和し、及び／又は疾患、疾病又は病状を治癒し又は除去し、並びに病状を予防するための活性な化合物の投与等、患者が被っている与えられた病状に対するあらゆる種類の治療を含むものであり、ここで予防とは、疾患、病状又は疾病に抗することを目的として、患者を管理又は世話することと理解され、兆候又は合併症の発症を防止する活性化合物の投与が含まれる。治療される患者は、好ましくは哺乳動物、特にヒトであるが、さらにイヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ及びブタ等の動物を含んでもよい。しかしながら、治療レジメン及び予防(防止)レジメンは、本発明の別々の側面を表すものと認められるべきである。
【００２５】
(発明の詳細な説明)
一実施態様では、本発明は、式Ｉ
2008545644.tif 000012
の化合物に関する。
一実施態様では、Ｚは電子求引性基、例えばシアノ、ニトロ、Ｐ(Ｒ２)３＋Ｘ−、-Ｓ(=Ｏ)Ｒ３、-Ｓ(=Ｏ)２Ｒ４、又は-Ｃ(=Ｏ)Ｒ５を表し、ここでＸはハロゲン、ＢＦ４、又はＰＦ６を表し；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は独立して、ハロゲン、Ｃ１−６-アルキル、シアノ、又はカルボキシルで置換されていてもよいアリール；シアノで置換されていてもよいＣ１−６-アルキル；又はＮＲ６Ｒ７を表し、ここでＲ６及びＲ７は独立して水素又はＣ１−６-アルキルを表す。特に、Ｚはシアノ又は-ＰＰｈ３Ｃｌを表し、ここでＰｈはフェニルを表す。
一実施態様では、Ｒ１は次の式：
2008545644.tif 000013
を表す。
一実施態様では、Ｙは１０、２０、３０、４０又は６０を表す。
【００２６】
式Ｉの化合物の特定の例には、
2008545644.tif 000014
が含まれる。
特に、式Ｉの化合物には、(１-(４-(４-(１,３-ビス(ｍＰＥＧ(２０Ｋ)オキシ)-２-プロピルオキシ)ブチリル)ピペラジン-１-イル)アセト-２-イル)トリフェニルホスホニウムクロライド；及びＮ-(ｍＰＥＧ(２０ｋ)イル)シアノアセトアミドが含まれる。
【００２７】
ＰＥＧ誘導シアノアセトアミド類は、例えば以下に概略が示されるように、シアノ酢酸を用いてＰＥＧ誘導アミンをアシル化するか、又はＮ-ヒドロキシスクシンイミジルエステル等の、ＰＥＧ誘導アシル化試薬を用いてモノ-シアノアセチルジアミンをアシル化することで、調製することができる。
2008545644.tif 000015
【００２８】
塩基性ｐＨ、例えばｐＨ８−１２、優先的にはｐＨ９−１１で、水又は水溶液中において、これらの試薬でタンパク質由来アルデヒド又はケトンを処理すると、ＰＥＧ化タンパク質が生じる。ＰＥＧ誘導シアノアセトアミドとタンパク質由来アルデヒド又はケトンの比に応じて、タンパク質の単一又は二重のＰＥＧ化が生じるであろう。これは、タンパク質由来アルデヒドの特定の例について以下に概略が示されるように、縮合の最初の生成物が電子不足アルケンであり、これが炭素求核試薬を用いたマイケル付加を容易に受けるためである。
2008545644.tif 000016
【００２９】
よって、この方法により、タンパク質、特に酸性タンパク質を単一又は二重にＰＥＧ化し、高分子量のＰＥＧ、例えばｍＰＥＧ(４０ｋ)、ｍＰＥＧ(６０ｋ)、ｍＰＥＧ(８０ｋ)、又はｍＰＥＧ(１２０ｋ)の誘導体を調製することができる。そのような化合物は、もはや腎臓濾過によっては通常は除去されず、よってインビボにおいて長時間にわたる血漿半減期を有しているはずである。
【００３０】
ＰＥＧ誘導ホスホニウム塩は、以下
2008545644.tif 000017
に概略が示されるように、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミジルエステル等のＰＥＧ誘導アシル化試薬を用いて、モノ-ホスホニオアセチルジアミンをアシル化することにより調製することができる。
タンパク質由来アルデヒドの特定の例について以下に概略が示されるように、塩基性ｐＨ、例えばｐＨ８−１２、優先的にはｐＨ９−１１で、水又は水溶液中において、これらの試薬でタンパク質由来アルデヒド又はケトンを処理すると、ウィッティヒ反応によりＰＥＧ化タンパク質が生じる：
2008545644.tif 000018
【００３１】
タンパク質由来アルデヒド類又はケトン類は、いくつかの経路により調製することができる。本発明は、それが調製された方法に関係なく、任意のタンパク質由来アルデヒド又はケトンに適用される。
【００３２】
タンパク質由来アルデヒドを調製するための一つの可能性は、Ｎ末端アミノ酸としてセリン又はスレオニンを含むタンパク質の過ヨウ素酸塩媒介性酸化である。これは、このようなＮ末端アミノ酸を既に含んでいるタンパク質であり得、又はＮ末端セリン又はスレオニンが結合させられたタンパク質の類似体であり得る。そのような類似体は標準的な遺伝子工学によって調製することができる。あるいは、さらなるアミノ酸を、過剰のアミノ酸の存在下で、例えばアミノペプチターゼ等の酵素の助けにより、タンパク質のＮ末端に結合させてもよい。伸長した類似体は、一つのセリンのみがタンパク質に添加された類似体であってもよい。あるいは、元のタンパク質のＮ末端と付加されたセリンの間に数個のアミノ酸を含んでいる類似体を、すなわちＸＸが１−５０の天然及び／又は非天然アミノ酸の任意の配列を表す一般式Ｓｅｒ-ＸＸ-タンパク質の化合物を得るために、調製することができる。
【００３３】
あるいは、タンパク質由来アルデヒドを、タンパク質の誘導体の過ヨウ素酸塩媒介性酸化により調製することができ、ここで、一又は複数の利用可能なアスパラギン酸又はグルタミン酸残基は、一般式Ｈ２Ｎ-Ｒ１０-ＣＨ(ＸＨ)-ＣＨＲ２０-ＷＨのアミンをアシル化するために使用され、上式中、Ｒ１０は有機ジラジカルを表し、Ｒ２０は有機基を表し、各Ｗは独立してＯ又はＮＨを表す。このようなアシル化は、過剰の上記アミンと適切な酵素、例えばグルタミル又はアスパルチルトランスペプチターゼでタンパク質を処理することにより選択的に達成することができる。
【００３４】
あるいは、タンパク質由来アルデヒド又はケトンは、文献(S. Itoら, J. Med. Chem. 1981, 24, 673-677)に記載されているように、マッシュルームチロシナーゼ等のチロシナーゼにより、利用可能なチロシン残基の一つに、Ｒ３０が有機ジラジカルを表し、Ｒ４０が水素又は有機基を表す一般式ＨＳ-Ｒ３０-Ｃ(=Ｏ)-Ｒ４０のチオールをカップリングさせることにより調製することができる。
【００３５】
あるいは、タンパク質由来アルデヒド又はケトンは、Ｒ５０が有機ジラジカルを表し、Ｒ６０が水素又は有機基を表し、各Ｗが独立してＯ又はＮＨを表す一般式ＨＳ-Ｒ５０-ＣＨ(ＷＨ)-ＣＨＲ６０-ＷＨのチオールをカップリングさせ、続いて得られた生成物を過ヨウ素酸塩媒介性酸化することにより調製することができる。
【００３６】
あるいは、タンパク質由来アルデヒド又はケトンは、側鎖官能基としてケトン又はアルデヒドを含む非天然α-アミノ酸アミドで前記タンパク質のカルボキシ末端にアミドを形成させることにより調製することができる。そのような非天然α-アミノ酸アミドは、カルボキシペプチターゼのような酵素の助けにより、前記タンパク質にカップリングさせることができる。
【００３７】
あるいは、トランスグルタミナーゼを、グルタミン又はリジン、特にグルタミンを含有するタンパク質に部分を導入するのに使用することができる。前記部分はアルデヒド又はケトンを含んでいてもよく、又はさらなる反応、例えば酸化時に、アルデヒド又はケトンに転換される潜在的アルデヒド又はケトンを含有していてもよい。
【００３８】
上で検討した反応は、反応が進行するｐＨよりもおよそ２単位であるｐｌのタンパク質にＰＥＧを結合させるために非常に適した手段である。特に、反応は酸性タンパク質、すなわち７以下、例えば６以下のｐｌを有するタンパク質をＰＥＧ化するのに適している。酸性タンパク質の特定の例には、ガストリン、グルカゴン、ＩＬ-１０β鎖レセプター、ＩＬ-２０β鎖レセプター、ＩＮＦα、ＩＬ-１８、ＩＬ-１ファミリーのメンバー、ＩＬ-９ファミリーのメンバー、ＩＬ-１０ファミリーのメンバー、ＩＬ-３２、インターフェロン調節因子１、インテグリンα-ＩＩｂ、メラノーマ関連抗原１、ＡＤＰ-糖ピロホスファターゼ、食欲促進神経ペプチド、チューブリン特異的シャペロンＡ、トレフォイル因子２、トレフォイル因子３、プロトロンビン、リンホトキシン-β、テノモジュリン(tenomodulin)、Ｔ-リンホカイン活性化キラー細胞由来プロテインキナーゼ、ビトロネクチン、インスリン、成長ホルモン(ＧＨ)、特にヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)が含まれる。
【００３９】
一実施態様では、ＧＨは、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するヒト成長ホルモンである。
一実施態様では、ＧＨはｈＧＨの変異体であり、ここで変異体とは、ｈＧＨ配列中の一又は複数のアミノ酸残基を他の天然又は非天然アミノ酸で置換することにより；及び／又は、一又は複数の天然又は非天然アミノ酸をｈＧＨ配列に付加することにより；及び／又はｈＧＨ配列から一又は複数のアミノ酸残基を欠失することにより得られる化合物であると理解され、ここでこれらの工程の任意のものの後に、場合によっては一又は複数のアミノ酸残基のさらなる誘導体化を続けてもよい。特に、このような置換は、一つのアミノ酸残基が同じグループからの他のアミノ酸残基、すなわち同様の特性を有する他のアミノ酸残基で置換されるという意味で保存的である。アミノ酸は、それらの特性に基づき、簡便に以下のグループに分けることができる：塩基性アミノ酸(例えばアルギニン及びリジン)、酸性アミノ(例えばグルタミン酸及びアスパラギン酸)、極性アミノ酸(例えばグルタミン、ヒスチジン、システイン及びアスパラギン)、疎水性アミノ酸(例えばロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン及びバリン)、芳香族アミノ酸(例えばフェニルアラニン、トリプトファン、チロシン)及び小アミノ酸(例えばグリシン、アラニン、セリン及びスレオニン)。
【００４０】
一実施態様では、ＧＨは、ｈＧＨと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有する。一実施態様では、ｈＧＨに対する前記同一性は、ここでアッセイ１で測定されるように、ｈＧＨの成長ホルモン活性の少なくとも２０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも８０％に合わせられる。
【００４１】
当該分野で知られている「同一性」なる用語は、配列を比較することにより決定される、２又はそれ以上のタンパク質の配列間の関係を意味する。当該分野では、「同一性」は、２又はそれ以上のアミノ酸残基のストリング間の一致数によって決定されるタンパク質間の配列の関連度合いをまた意味する。「同一性」は、特定の数学モデル又はコンピュータプログラム（つまり「アルゴリズム」）によって取り組まれる間隙アラインメント（ある場合）を施した２以上の配列のなかの小さい方の間の完全同一のパーセントを判定する。関連したタンパク質の同一性は、既知の方法により容易に算出することができる。そのような方法には、限定されるものではないが、Computational Molecular Biology, Lesk, A. M編, Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W編, Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M.及びGriffin, H. G.編, Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.及びDevereux, J編, M. Stockton Press, New York, 1991；及びCarilloら, SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988)に記載されているものが含まれる。
【００４２】
同一性を決定するための好ましい方法は、調べられる配列間に最も大きな一致をもたらすように設計される。同一性を決定するための方法は、公に入手可能なコンピュータプログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法には、ＧＡＰ(Devereuxら, Nucl. Acid. Res., 12：387(1984)；Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)を含むＧＣＧプログラムパッケージ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ(Altschulら, J. Mol. Biol., 215：403-410(1990))が含まれる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)及び他の供給源(BLAST Manual, Altschulら, NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894；Altschulら,上掲)から公に入手可能である。よく知られているスミス・ウォーターマン・アルゴリズム(Smith Waterman algorithm)もまた同一性を決定するために使用することができる。
【００４３】
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)を使用して、パーセント配列同一性が決定されることになる２つのタンパク質を、その各アミノ酸が最適に一致するように整列させる(アルゴリズムにより決定される「マッチドスパン」)。ギャップ開裂ペナルティ(平均ダイアゴナルの３倍と算出される；「平均ダイアゴナル」は使用される比較マトリックスのダイアゴナルの平均である；「ダイアゴナル」とは、特定の比較マトリックスによるそれぞれの完全アミノ酸一致に割り当てられるスコア又は数である)及びギャップ伸長ペナルティ(通常、ギャップ開裂ペナルティの{分率(１／１０)}である)、並びに比較マトリックス、例えばＰＡＭ２５０又はＢＬＯＳＵＭ６２は、アルゴリズムに併せて使用される。標準的な比較マトリックス(ＰＡＭ２５０比較マトリックス用には、Dayhoffら, Atlas of Protein Sequence and Structure, vol.5, supp.3(1978)；ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックス用には、Henikoffら, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89：10915-10919(1992))も、アルゴリズムに使用される。
【００４４】
タンパク質配列比較のために好ましいパラメータは、次のものを含む：
アルゴリズム：Needlemanら, J. Mol. Biol, 48：443-453(1970)；比較マトリックス：Henikoffら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89：10915-10919(1992)のＢＬＯＳＵＭ６２；ＧＡＰペナルティ：１２、ＧＡＰ長ペナルティ：４、類似性閾値：０
【００４５】
上述したパラメータを有するＧＡＰプログラムが有用である。上述したパラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを使用するタンパク質比較(末端ギャップのペナルティを伴わない)のための初期設定パラメータである。
【００４６】
一実施態様では、ＧＨは、Ｎ末端が１００までのアミノ酸で伸長させられたｈＧＨである。特に、前記伸長は５０まで、例えば４０まで、例えば２０まで、例えば１０まで、例えば５まで、例えば１、２又は３のアミノ酸残基である。ＧＨ変異体の特定の例はＳｅｒ-ｈＧＨ又はＳｅｒ-Ｘｎ-ｈＧＨであり、ここでＸｎは１、２、３又は４の天然又は非天然アミノ酸を表す。
【００４７】
本発明の上述の検討から、ＧＨ変異体は、その酸性度を維持すべきである、すなわち７以下、例えば６以下のｐｌを有すべきであることが明らかである。さらに、ＧＨ変異体がアルデヒド又はケトンを含んでいないならば、これら官能性の一つを含むように、上で検討したように誘導体化されなければならない。
【００４８】
一実施態様では、本発明は、本発明の反応により得られるＰＥＧ化タンパク質に関する。特に、本発明は、式ＩＩ
2008545644.tif 000019
［上式中、Ｙは１〜１４０の整数であり；
Ｒ１は
2008545644.tif 000020
から選択されるジラジカルを表し；
Ｇは電子求引性基又は水素を表し；
ＥはＯ又はＨ２を表し；
-prot１は、グルタミン酸側鎖のヒドロキシル基又はＮ末端アミノ基のホルマール除去により、タンパク質から誘導された基を表す］
の化合物に関する。
【００４９】
一実施態様では、Ｚは、シアノ、ニトロ、Ｐ(Ｒ２)３＋Ｘ−、-Ｓ(=Ｏ)Ｒ３、-Ｓ(=Ｏ)２Ｒ４、又は-Ｃ(=Ｏ)Ｒ５から選択される基を表し、ここでＸはハロゲン、ＢＦ４、又はＰＦ６を表し；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は独立して、ハロゲン、Ｃ１−６-アルキル、シアノ、又はカルボキシルで置換されていてもよいアリール；シアノで置換されていてもよいＣ１−６-アルキル；又はＮＲ６Ｒ７を表し、ここでＲ６及びＲ７は独立して水素又はＣ１−６-アルキルを表す。特に、Ｚはシアノ又は-ＰＰｈ３Ｃｌを表し、ここでＰｈはフェニルを表す。一実施態様では、Ｚは水素を表す。一実施態様では、ＥはＯを表す。一実施態様では、Ｙは２０、４０又は６０を表す。
【００５０】
一実施態様では、本発明は、式ＩＩＩ
2008545644.tif 000021
［上式中、Ｙ、Ｒ１及びＧは、式ＩＩに対して上で検討した通りに定義され、-prot２は、Ｎ末端アミノ基のホルマール除去によりタンパク質から誘導された基を表す]
の化合物に関する。
【００５１】
一実施態様では、本発明は、式ＩＶ
2008545644.tif 000022
［上式中、Ｙは１〜１４０の整数であり；
Ｒ１は
2008545644.tif 000023
から選択されるジラジカルを表し；
Ｚは電子求引性基を表し；
prot２は、Ｎ末端アミノ基のホルマール除去によりタンパク質から誘導された基を表す］
の化合物に関する。特に、Ｚは、シアノ、ニトロ、Ｐ(Ｒ２)３＋Ｘ−、-Ｓ(=Ｏ)Ｒ３、-Ｓ(=Ｏ)２Ｒ４、又は-Ｃ(=Ｏ)Ｒ５から選択される基を表し、ここでＸはハロゲン、ＢＦ４、又はＰＦ６を表し；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は独立して、ハロゲン、Ｃ１−６-アルキル、シアノ、又はカルボキシルで置換されていてもよいアリール；シアノで置換されていてもよいＣ１−６-アルキル；又はＮＲ６Ｒ７を表し、ここでＲ６及びＲ７は独立して水素又はＣ１−６-アルキルを表す。特に、Ｚはシアノ又は-ＰＰｈ３Ｃｌを表し、ここでＰｈはフェニルを表す。
【００５２】
prot１及びprot２の特定の例は、ＧＨ、例えばＮ末端アミノ基のホルマール除去により得られるｈＧＨ又はＳｅｒ-ｈＧＨラジカルを含む。
本発明の化合物の特定の例には、次の式：
2008545644.tif 000024
［上式中、ｈＧＨは、ｈＧＨからＮ末端アミノ基のホルマール除去により得られた基を表す］のものが含まれる。上述の化合物の系統的名称は、それぞれＮα１-(４-(４-(４-(１,３-ビス(ｍＰＥＧ(２０Ｋ)オキシ)-２-プロピルオキシ)ブチリル)ピペラジン-１-イル)フマル-１-イル)-ｈＧＨ；Ｎα１-(４-(ｍＰＥＧ(２０ｋ)イルアミノ)-３-シアノフマル-１-イル)-ｈＧＨ；及びＮα１-(２,２-ビス(１-(ｍＰＥＧ(２０ｋ)イルアミノカルボニル)-１-シアノメチル)アセチル-ｈＧＨである。
【００５３】
式ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶの化合物、特にＧＨを含有する式ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶの化合物は、親ＧＨとも称される対応する非コンジュゲートＧＨと比較して、改善された又は別の薬理学的特性を有し得る。そのような薬理学的特性の例には、機能的インビボ半減期、免疫原性、腎臓濾過性、プロテアーゼ保護、及びアルブミン結合性が含まれる。
【００５４】
「機能的インビボ半減期」なる用語は、その通常の意味、すなわち、ＧＨ又はコンジュゲートしたＧＨの生物学的活性の５０％が、体／標的器官中に存在している時間、又はＧＨ又はＧＨコンジュゲートの活性がその最初の値の５０％である時間で、使用される。機能的インビボ半減期の決定の代替として、「インビボ血漿半減期」、すなわち、除去される前に、ＧＨ又はＧＨコンジュゲートの５０％が血漿又は血流中を循環している時間を測定してもよい。血漿半減期の測定は、しばしば機能的半減期を測定するよりも簡単で、血漿半減期の大きさは、通常、機能的インビボ半減期の大きさの良好な目安となる。血漿半減期の代替用語には、血清半減期、循環半減期(circulating half-life)、循環性半減期(circulatory half-life)、血清クリアランス、血漿クリアランス、及びクリアランス半減期が含まれる。
【００５５】
機能的インビボ半減期又は血漿半減期に関連して使用される「増加した」なる用語は、ＧＨコンジュゲートの関連半減期が、比較条件下で測定された親ＧＨのものに対して統計的に有意に増加したことを示すために使用される。例えば関連半減期は、少なくとも約２５％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約１００％、１５０％、２００％、２５０％、又は５００％増加しうる。一実施態様では、本発明の化合物は、親ＧＨの半減期に対し、少なくとも約５時間、好ましくは少なくとも約２４時間、より好ましくは少なくとも約７２時間、最も好ましくは少なくとも約７日間の半減期の増加を示す。
【００５６】
インビボ血漿半減期の測定は、文献に記載されているような多くの方法により実施することができる。インビボ血漿半減期の増加は、クリアランス(ＣＬ)の減少、又は平均滞留時間(ＭＲＴ)の増加として定量されうる。適切なアッセイにより測定して親ＧＨのＣＬの７０％未満、例えば５０％未満、例えば２０％未満、例えば１０％未満までＣＬが低下した本発明のコンジュゲートＧＨは、増加したインビボ血漿半減期を有していると言える。適切なアッセイにおいて親ＧＨのＭＲＴの１３０％以上、例えば１５０％、例えば２００％以上、例えば５００％以上まで、ＭＲＴが増加した本発明のコンジュゲートＧＨは、増加したインビボ血漿半減期を有していると言える。クリアランス及び平均滞留時間は、適切な試験動物を使用し、標準的な薬物動態学的研究において評価することができる。与えられたタンパク質に対して適切な試験動物を選択することは当業者の技量の範囲内である。もちろん、ヒトでの試験が最終試験となる。適切な試験動物には、正常なオスのＳＤラット、マウス及びカニクイザルが含まれる。典型的には、マウス及びラットには、一回、皮下ボーラス注射し、サルには、一回、皮下ボーラス注射、又は一回、ｉｖ投与してもよい。注射される量は試験動物に依存する。続いて、ＣＬ及びＭＲＴの評価のために必要に応じて１〜５日の期間をあけて、血液サンプルを採取する。血液サンプルは、簡便にはＥＬＩＳＡ技術により分析する。
【００５７】
化合物の「免疫原性」なる用語は、ヒトに投与された場合、体液性、細胞性又はその双方の如何にかかわらず、有害な免疫反応を誘発する化合物の能力を意味する。任意のヒト亜母集団においては、特定の投与されたタンパク質に対して感受性を示す個体が存在し得る。免疫原性は、当該分野で知られている一般的な方法を使用し、感受性の個体における成長ホルモン抗体及び／又は成長ホルモン反応性Ｔ細胞の存在を定量することにより測定されうる。一実施態様では、本発明のコンジュゲートＧＨは、親ＧＨのその個体に対する免疫原性に対して、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約４０％、最も好ましくは少なくとも約５０％の感受性の個体における免疫原性の低下を示す。他の態様では、免疫原性は、臨床試験における患者集団での典型的な応答のように、同様の被験者集団中での典型的な応答を意味する場合がある。
【００５８】
ここで使用される「プロテアーゼ保護」又は「プロテアーゼ保護された」なる用語は、本発明のコンジュゲートＧＨが、親ＧＨよりも、血漿ペプチダーゼ又はプロテアーゼに対してより耐性があることを示すものである。血漿中に存在するプロテアーゼ及びペプチダーゼ酵素は、循環ペプチドホルモン、例えば成長ホルモン等の、循環タンパク質の分解に関与していることが知られている。
【００５９】
例えばジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶ(ＤＰＰＩＶ)による分解に対するタンパク質の耐性は、次の分解アッセイにより測定される：１００μＬの０．１Ｍのトリエチルアミン-ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．４中において、タンパク質のアリコート(５ｎｍｏｌ)を、５ｍＵの酵素活性に相当する１μＬの精製ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶと共に３７℃で１０−１８０分インキュベートする。１０％のトリフルオロ酢酸５μＬを添加して、酵素反応を終結させ、タンパク質分解産物を分離し、ＨＰＬＣ分析を使用して定量する。この分析を実施するための一方法は次の通りである：混合物をＶｙｄａｃ Ｃ１８ワイドポア(widepore)(３０ｎｍ孔、５μｍの粒子)２５０×４．６ｍｍのカラムに適用し、Siegelら, Regul. Pept. 1999；79；93-103及びMentleinら, Eur. J. Biochem. 1993；214：829-35に従って、０．１％のトリフルオロ酢酸中に線形段階的勾配でアセトニトリルが入ったもの(３分間は０％のアセトニトリル、１７分間は０−２４％のアセトニトリル、１分間は２４−４８％のアセトニトリル)を、１ｍｌ／分の流量で溶出させる。タンパク質とその分解産物を、２２０ｎｍ(ペプチド結合)又は２８０ｎｍ(芳香族アミノ酸)の吸光度によりモニターし、標準のものに関連させてそれらのピーク面積を積分することにより定量する。ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶによるタンパク質の加水分解速度は、加水分解されるペプチドが１０％未満になるインキュベート時間で推定される。他の血漿プロテアーゼ又はペプチダーゼに対する耐性は、類似した方法で測定することができる。一実施態様では、ＧＨコンジュゲートの加水分解速度は、親ＧＨのものの７０％未満、例えば４０％未満、例えば１０％未満である。
【００６０】
哺乳動物種の循環血液中において最も豊富なタンパク質成分は血清アルブミンで、これは通常、全血１００ｍＬ中、約３〜４．５グラムの濃度で存在している。血清アルブミンは約７００００ダルトンの血液タンパク質であり、循環系において、いくつか重要な機能を有している。それは、血液中に見出される様々な有機分子のトランスポーターとして、血液を通して脂肪酸及びビリルビンのような様々な代謝産物のトランスポーターとして、またその豊富さのため、循環血液の浸透圧調節因子として機能する。血清アルブミンは１週間以上の半減期を有しており、タンパク質の血漿半減期を増加させるための一アプローチは、血清アルブミンに結合する基をタンパク質にコンジュゲートさせることであった。アルブミン結合特性は、出典明示によりここに援用されるJ. Med. Chem. 43, 2000, 1986-1992に記載されているようにして決定されうる。
【００６１】
式ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶの化合物は該化合物がＧＨを含んでいる場合、成長ホルモン活性に作用し、例えば、成長ホルモンの循環量が増加することから効果が得られるであろう疾患又は状態の治療に使用されうる。特に、本発明は、成長ホルモン欠損症(ＧＨＤ)；ターナー症候群；プラダーウィリ症候群(ＰＷＳ)；ヌーナン症候群；ダウン症候群；慢性腎臓病、若年性関節リウマチ；嚢胞性線維症、ＨＡＡＲＴ治療を受けた小児のＨＩＶ感染(ＨＩＶ／ＨＡＬＳ小児)；ＳＧＡで出生した低身長小児；ＳＧＡ以外の極少低出生時体重で出生した低身長症；骨格形成異常；軟骨低形成症；軟骨形成不全；特発性低身長(ＩＳＳ)；成人のＧＨＤ；脛骨、腓骨、大腿、上腕、橈骨、尺骨、鎖骨、中手、中足、及び指等、長骨又は内部の骨折；頭蓋骨、手の基部、及び足の基部等、海綿様骨の中又はその骨折；例えば手、膝又は肩等の腱又は靱帯の手術後の患者；仮骨延長術を受けるか又は受けた患者；人工股関節置換手術又は円板置換手術、半月板修復、脊椎固定術、又は膝、臀部、肩、肘、手首又は顎の補綴固定術後の患者；例えばネイル、スクリュー及びプレートのような骨接合術材料が固定されている患者；骨折の変形癒合又は偽関節を有する患者；例えば脛骨又は第一趾からの骨切り術後の患者；移植片植え込み後の患者；外傷又は関節炎に起因する膝の関節軟骨変性；ターナー症候群を患っている患者の骨粗鬆症；男性における骨粗鬆症、慢性透析の成人患者(ＡＰＣＤ)；ＡＰＣＤにおける栄養不良関連循環器疾患；ＡＰＣＤにおける悪液質の逆流；ＡＰＣＤにおける癌；ＡＰＣＤにおける慢性的閉塞性肺疾患；ＡＰＣＤにおけるＨＩＶ；ＡＰＣＤの高齢者；ＡＰＣＤにおける慢性的な肝臓病、ＡＰＣＤにおける疲労症候群；クローン病；肝機能障害；ＨＩＶ感染した男性；短腸症候群；中心性肥満；ＨＩＶ関連リポジストロフィー症候群(ＨＡＬＳ)：男性不妊；待機的大手術後の患者、アルコール／薬物解毒又は神経的トラウマ；加齢；虚弱な高齢者；骨関節炎；衝撃的な損傷を受けた軟骨；勃起不全；繊維筋痛；記憶障害；鬱病；外傷性脳損傷；くも膜下出血；極低出生体重；メタボリックシンドローム；グルココルチコイドミオパシー；又は小児のグルココルチコイド治療による低身長症を治療するための方法を提供するものであり、該方法は、ＧＨを含有する式ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶの化合物の治療的有効量を、それを必要としている患者に投与することを含む。
【００６２】
一態様では、本発明は、筋組織、神経組織又は創傷の治癒を加速させ；損傷した組織に対する血流を促進又は改善し；又は損傷した組織における感染率を低下させるための方法であって、ＧＨを含有する式ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶの化合物の治療的有効量を、それを必要としている患者に投与することを含む方法を提供する。
【００６３】
一実施態様では、本発明は、成長ホルモン血漿レベルの増加から治療効果が得られる疾患、例えば上述の疾患の製造におけるＧＨを含有する式ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶの化合物の使用に関する。
【００６４】
典型的な非経口投与量は、投与当たり１０−９ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。典型的な投与量は、投与当たり約０．００００００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。正確な投与量は、例えば徴候、医薬、投与頻度及び方式、性別、年齢、及び治療される患者の一般的病状、治療される疾患又は病状の性質及び重篤度、治療の所望される効果及び当業者には明らかな他の要因に依存するであろう。
【００６５】
典型的な投薬頻度は、毎日２回、毎日１回、隔日、週２回、週１回又はさらに長い投与間隔とされる。本発明の融合タンパク質の半減期は長いため、長い投与間隔、例えば週２回、週１回、又はそれ以上の長い投与間隔の投薬計画が、本発明の特定の実施態様である。
【００６６】
多くの疾患が、治療において、同時投与か又は連続投与の形で一種を超える医薬を使用して治療される。よって、上述した疾患を治療する治療方法において、前記疾患の治療に通常使用される一又は複数の他の治療用活性化合物と組合せて、ＧＨを含有する式ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶの化合物を使用することは本発明の範囲にある。同様に、上述した疾患の治療に通常使用される他の治療用活性化合物と組合せて、前記疾患用の医薬の製造において、ＧＨを含有する式ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶの化合物を使用することもまた本発明の範囲にある。
【００６７】
医薬組成物
他の目的は、１０−１５ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌ、例えば１０−１０ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する本発明のコンジュゲートＧＨを含有する医薬組成物を提供することであり、ここで該組成物は２．０〜１０．０のｐＨを有する。組成物はバッファー系、保存料(類)、等張剤(類)、キレート剤(類)、安定剤及び界面活性剤をさらに含有しうる。本発明の一実施態様では、医薬組成物は水性組成物、すなわち水を含有する組成物である。このような組成物は典型的には溶液又は懸濁液である。本発明のさらなる実施態様では、医薬組成物は水溶液である。「水性組成物」なる用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含有する組成物として定義される。同様に「水溶液」なる用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含有する溶液として定義され、「水性懸濁液」なる用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含有する懸濁液として定義される。
【００６８】
他の実施態様では、医薬組成物は凍結乾燥組成物であり、医師又は患者が使用前に溶媒及び／又は希釈剤を添加する。
他の実施態様では、医薬組成物は事前の溶解の必要がない使用準備が整った乾燥組成物（例えば凍結乾燥又はスプレードライ）である。
【００６９】
本発明のさらなる態様では、本発明は、ＧＨコンジュゲートとバッファーの水溶液を含有する医薬組成物に関し、ここで前記ＧＨコンジュゲートは０．１−１００ｍｇ／ｍｌ又はそれ以上の濃度で存在しており、前記組成物は約２．０から約１０．のｐＨを有している。
【００７０】
本発明の他の実施態様では、組成物のｐＨは、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、及び１０．０からなるリストから選択される。
【００７１】
本発明のさらなる実施態様では、バッファーは、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、シトレート、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、スクシネート、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸又はそれらの混合物からなる群から選択される。これらの特定のバッファーの各一が本発明の別の実施態様を構成する。
【００７２】
本発明のさらなる実施態様では、組成物は製薬的に許容可能な保存料をさらに含有する。本発明のさらなる実施態様では、保存料は、フェノール、ｏ-クレゾール、ｍ-クレゾール、ｐ-クレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ-ヒドロキシ安息香酸プロピル、２-フェノキシエタノール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸ブチル、２-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びチオメロサール、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン（３ｐ-クロルフェノキシプロパン-１,２-ジオール）又はそれらの混合物からなる群から選択される。本発明のさらなる実施態様では、保存料は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明のさらなる実施態様では、保存料は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明のさらなる実施態様では、保存料は、５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明のさらなる実施態様では、保存料は、１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。これらの特定の保存料の各一が本発明の別の実施態様を構成する。医薬組成物中における保存料の使用は当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第20版, 2000が参照される。
【００７３】
本発明のさらなる実施態様では、組成物は等張剤をさらに含有する。本発明のさらなる実施態様では、等張剤は、塩（例えば塩化ナトリウム）、糖又は糖アルコール、アミノ酸（例えばＬ-グリシン、Ｌ-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン）、アルジトール（例えばグリセロール(グリセリン)、１,２-プロパンジオール(プロピレングリコール)、１,３-プロパンジオール、１,３-ブタンジオール)ポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ４００)、又はそれらの混合物からなる群から選択される。例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、及びカルボキシメチルセルロース-Ｎａを含む単糖類、二糖類、又は多糖類、又は水溶性グルカン類のような任意の糖を使用することができる。一実施態様では、糖添加剤はスクロースである。糖アルコールは少なくとも一つの-ＯＨ基を有するＣ４-Ｃ８炭化水素として定義され、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール及びアラビトールを含む。一実施態様では、糖アルコール添加剤はマンニトールである。上述の糖類又は糖アルコールは個々に又は組合せて使用することができる。糖又は糖アルコールが液体調製物中で可溶性であり、本発明の方法を使用して得られる安定化効果に悪影響を及ぼさない限り、使用される量に決まった制限はない。一実施態様では、糖又は糖アルコール濃度は約１ｍｇ／ｍｌと約１５０ｍｇ／ｍｌの間である。本発明のさらなる実施態様では、等張剤は１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明のさらなる実施態様では、等張剤は１ｍｇ／ｍｌ〜７ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明のさらなる実施態様では、等張剤は８ｍｇ／ｍｌ〜２４ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明のさらなる実施態様では、等張剤は２５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。これらの特定の等張剤の各一は本発明の別の実施態様を構成する。医薬組成物中における等張剤の使用は当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第20版, 2000が参照される。
【００７４】
本発明のさらなる実施態様では、組成物はキレート剤をさらに含有する。本発明のさらなる実施態様では、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)、クエン酸、及びアスパラギン酸の塩、及びそれらの混合物から選択される。本発明のさらなる実施態様では、キレート剤は０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明のさらなる実施態様では、キレート剤は０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明のさらなる実施態様では、キレート剤は２ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。これらの特定のキレート剤の各一は本発明の別の実施態様を構成する。医薬組成物中におけるキレート剤の使用は当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第20版, 2000が参照される。
【００７５】
本発明のさらなる実施態様では、組成物は安定剤をさらに含有する。医薬組成物中における安定剤の使用は当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第20版, 2000が参照される。
【００７６】
より詳細には、本発明の組成物は、液体医薬組成物での保存中に凝集体形成をおそらくは示すタンパク質をその治療的活性成分が含む安定化液体医薬組成物である。「凝集体形成」とは、可溶性のままでありうるオリゴマーか、溶液から沈殿する大きな可視できる凝集体の形成を生じるタンパク質分子間の物理的相互作用のことである。「貯蔵中」とは、ひとたび調製された液体医薬組成物又は組成物が直ぐには患者に投与されないことを意図する。むしろ調製後に、液体形態、凍結状態、又は患者への投与に適した液体形態又は他の形態へ後で再構成するための乾燥形態で貯蔵のために包装される。「乾燥形態」とは、液体医薬組成物又は組成物が、フリーズドライ（すなわち凍結乾燥；例えばWilliams及びPolli(1984)J. Parenteral Sci. Technol. 38：48-59を参照）、スプレードライ（Masters(1991) Spray-Drying Handbook(第5版；Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), PP.491-676；Broadheadら, (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18：1169-1206；及びMumenthalerら, (1994) Pharm. Res. 11：12-20）、又はエアードライ（Carpenter及びCrowe (1988) Cryobiology 25：459-470；及びRoser (1991) Biopharm. 4：47-53）の何れかによって乾燥されることを意図する。液体医薬組成物の貯蔵中でのタンパク質による凝集体形成はそのタンパク質の生物学的活性に悪影響を及ぼし得、医薬組成物の治療効果が損なわれる。さらに、凝集体形成は、そのタンパク質含有医薬組成物を、注入系を使用して投与する場合、チューブ、膜、又はポンプの詰まりのような他の問題を生じうる。
【００７７】
本発明の医薬組成物は組成物の貯蔵の間のタンパク質の凝集体形成を減少させるのに十分な所定量のアミノ酸塩基をさらに含みうる。「アミノ酸塩基」とは、アミノ酸又はアミノ酸の組合せのことであり、任意の与えられたアミノ酸はその遊離塩基形態又はその塩形態で存在する。アミノ酸の組合せが使用される場合、アミノ酸の全てがその遊離塩基形態で存在し得、全てはその塩形態で存在し得、あるいはいくつかがその遊離塩基形態で存在しうる一方、他のものはその塩形態で存在する。一実施態様では、本発明の組成物を調製する際に使用するアミノ酸は、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸のような荷電側鎖を担持しているものである。特定のアミノ酸（例えばメチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン及びそれらの混合物）の任意の立体異性体（つまりＬ又はＤ異性体、又はそれらの混合体）又はこれら立体異性体の組合せ又はグリシン又は有機塩基、例えば限定されるものではないがイミダゾールは、特定のアミノ酸又は有機塩基がその遊離塩基形態又はその塩形態の何れかで存在している限り、本発明の医薬組成物中に存在しうる。一実施態様では、アミノ酸のＬ立体異性体が使用される。一実施態様では、Ｌ立体異性体が使用される。また本発明の組成物はこれらのアミノ酸の類似体と共に製剤化されうる。「アミノ酸類似体」とは、本発明の液体医薬組成物の貯蔵中にタンパク質による凝集体形成を減少させるという所望の効果をもたらす天然に生じるアミノ酸の誘導体のことである。適切なアルギニン類似体には、例えばアミノグアニジン、オルニチン及びＮ-モノエチルＬ-アルギニンが含まれ、適切なメチオニン類似体には、エチオニン及びブチオニンが含まれ、適切なシステイン類似体にはＳ-メチル-Ｌ-システインが含まれる。他のアミノ酸の場合と同様、アミノ酸類似体はその遊離の塩基形態又は塩形態で組成物中に導入される。本発明のさらなる実施態様では、アミノ酸又はアミノ酸類似体は、タンパク質の凝集を防止又は遅延させるのに十分な濃度で使用される。
【００７８】
本発明のさらなる実施態様では、治療剤として作用するタンパク質が、酸化を受けやすい少なくとも一のメチオニン残基を含むタンパク質である場合、メチオニン（又は他の硫酸アミノ酸又はアミノ酸類似体）を添加してメチオニン残基がメチオニンスルホキシドへ酸化するのを阻害することができる。「阻害する」とは、メチオニンが酸化された種の経時的な最小の蓄積のことである。メチオニンの酸化を阻害することはタンパク質をその正しい分子形態にさらに保持されることになる。メチオニンの任意の立体異性体（Ｌ又はＤ異性体）又はその任意の組合せを使用することができる。付加される量は、メチオニンスルホキシドの量が規制機関に受け入れられるようにメチオニン残基の酸化を阻害するのに十分な量でなければならない。典型的には、これは、組成物がわずか約１０％から約３０％のメチオニンスルホキシドを含むことを意味する。一般に、これは、メチオニン残基に加えられるメチオニンの比が約１：１から約１０００：１、例えば１０：１から約１００：１の範囲であるようにメチオニンを添加することによって達成することができる。
【００７９】
本発明のさらなる実施態様では、組成物は高分子量ポリマー又は低分子化合物の群から選択される安定剤をさらに含有する。本発明のさらなる実施態様では、安定剤はポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ３３５０）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、カルボキシ／ヒドロキシセルロース又はその誘導体（例えばＨＰＣ、ＨＰＣ-ＳＬ、ＨＰＣ-Ｌ及びＨＰＭＣ)、シクロデキストリン類、硫黄含有物質、例えばモノチオグリセロール、チオグリコール酸及び２-メチルチオエタノール、及び異なった塩（例えば塩化ナトリウム）から選択される。これらの特定の安定剤の各一が本発明の他の実施態様を構成する。
【００８０】
医薬組成物はまたその中の治療的に活性なタンパク質の安定性をさらに向上させる付加的な安定剤を含有しうる。本発明にとって特に興味がある安定剤には、限定されるものではないが、メチオニンの酸化からタンパク質を保護するメチオニン及びＥＤＴＡと、凍結融解又は機械的剪断に伴う凝集からタンパク質を保護する非イオン性界面活性剤が含まれる。
【００８１】
本発明のさらなる実施態様では、組成物はさらに界面活性剤を含有する。本発明のさらなる実施態様では、界面活性剤は、洗浄剤、エトキシル化ヒマシ油、ポリグリコール化グリセリド、アセチル化モノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシプロピレン・ポリオキシエチレンブロックポリマー（例えばプルロニック(Pluronic)(登録商標)Ｆ６８、ポロキサマー１８８及び４０７、トリトン(Triton)Ｘ-１００のようなポロキサマー類)、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン及びポリエチレン誘導体、例えばアルキル化及びアルコキシル化誘導体（トゥイーン類、例えばＴｗｅｅｎ-２０、Ｔｗｅｅｎ-４０、Ｔｗｅｅｎ-８０及びＢｒｉｊ-３５）、モノグリセリド類又はそのエトキシル化誘導体、ジグリセリド類又はそのポリオキシエチレン誘導体、アルコール、グリセロール、レシチン及びリン脂質（例えばホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロール及びスフィンゴミエリン)、リン脂質誘導体（例えばジパルミトイルホスファチジン酸）及びリゾリン脂質誘導体（例えばパルミトイルリゾホスファチジル-Ｌ-セリン及びエタノールアミン、コリン、セリンもしくはスレオニンの１-アシル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスフェートエステル)並びにリゾホスファチジル及びホスファチジルコリンのアルキル、アルコキシル(アルキルエステル)、アルコキシ(アルキルエーテル)誘導体、例えばリゾホスファチジルコリンのラウロイル及びミリストイル誘導体、ジパルミトイルホスファチジルコリン、及び極性頭部基、つまり、コリン類、エタノールアミン類、ホスファチジン酸、セリン類、スレオニン類、グリセロール、イノシトール、及び正荷電ＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡ、ＤＣＰ、ＢＩＳＨＯＰ、リゾホスファチジルセリン及びリゾホスファチジルスレオニンの修飾体、及びグリセロリン脂質（例えばセファリン類）、グリセロ糖脂質（例えばガラクトピラノシド）、スフィンゴ糖脂質（例えばセラミド類、ガングリオシド類）、ドデシルホスホコリン、ニワトリ卵白リゾレシチン、フシジン酸誘導体（例えばタウロ-ジヒドロフシジン酸ナトリウム等々）、長鎖脂肪酸及びそのＣ６-Ｃ１２塩（例えばオレイン酸及びカプリル酸）、アシルカルニチン類及び誘導体、リジン、アルギニン又はヒスチジンのＮα-アシル化誘導体、又はリジン又はアルギニンの側鎖アシル化誘導体、リジン、アルギニン又はヒスチジンと中性又は酸性アミノ酸の任意の組合せを含むジペプチドのＮα-アシル化誘導体、中性アミノ酸と二つの荷電アミノ酸の任意の組合せを含むトリペプチドのＮα-アシル化誘導体、ＤＳＳ(ドキュセート・ナトリウム、ＣＡＳ登録番号[５７７-１１-７])、ドキュセート・カルシウム、ＣＡＳ登録番号[１２８-４９-４])、ドキュセート・カリウム、ＣＡＳ登録番号[７４９１-０９-０])、ＳＤＳ(ドデシル硫酸ナトリウム又はラウリル硫酸ナトリウム)、カプリル酸ナトリウム、コール酸又はその誘導体、胆汁酸及びその塩及びグリシンもしくはタウリンコンジュゲート、ウルソデオキシコール酸、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、���-ヘキサデシル-Ｎ,Ｎ-ジメチル-３-アンモニオ-１-プロパンスルホネート、アニオン性（アルキル-アリール-スルホネート）一価界面活性剤、両性イオン性界面活性剤（例えばＮ-アルキル-Ｎ,Ｎ-ジメチルアンモニオ-１-プロパンスルホネート類、３-コールアミド-１-プロピルジメチルアンモニオ-１-プロパンスルホネート、カチオン性界面活性剤（第４級アンモニウム塩基）（例えば臭化セチル-トリメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム)、非イオン性界面活性剤(例えばドデシルβ-Ｄ-グルコピラノシド)、エチレンジアミンへプロピレンオキシド及びエチレンオキシドを連続付加して誘導される四官能性ブロックコポリマーであるポロキサミン類（例えばテトロニックス(Tetronic's)）から選択することができ、あるいは該界面活性剤はイミダゾリン誘導体又はその混合物の群から選択されうる。これらの特定の界面活性剤の各一は本発明の別の実施態様を構成する。
医薬組成物中における界面活性剤の使用は当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第20版, 2000が参照される。
【００８２】
その他の成分が本発明の医薬組成物中に存在することもありうる。そのようなさらなる成分には、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、充填剤、張度調節剤、キレート剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質（例えばヒト血清アルブミン、ゼラチン又はタンパク質）及び双性イオン（例えばベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジン、ヒスチジンのようなアミノ酸）が含まれうる。そのような付加的な成分は、当然ながら、本発明の医薬組成物の全体の安定性に悪影響を及ぼしてはならない。
【００８３】
本発明のＧＨコンジュゲートを含む医薬組成物は、そのような治療を必要とする患者のいくつかの部位に投与され得、例えば局所的部位、例えば皮膚及び粘膜部位、吸収をバイパスする部位、例えば動脈、静脈、心臓への投与、及び吸収を含む部位、例えば皮膚、皮下、筋肉又は腹部への投与である。
【００８４】
本発明の医薬組成物の投与は、いくつかの投与経路、例えば舌、舌下、頬、口、経口、胃及び腸、鼻、肺を介して、例えば細気管支及び肺胞及び／又はそれらを組合せたもの、表皮、真皮、経皮、膣、直腸、眼を介して、例えば結膜、尿管、及び非経口を介して、そのような治療を必要としている患者に投与されうる。
【００８５】
本発明の組成物は、いくつかの投薬形態、例えば溶液、懸濁液、エマルション、マイクロエマルション、多相エマルション、フォーム、膏薬、ペースト、プラスター、軟膏、錠剤、コート錠剤、リンス、カプセル、例えば硬質ゼラチンカプセル及び軟質ゼラチンカプセル、坐薬、直腸用カプセル、ドロップ、ゲル、スプレー、パウダー、エアゾール、吸入剤、点眼剤、眼軟膏、眼用リンス、膣用ペッサリー、膣用リング、膣用軟膏、注射液、インサイツ形質転換溶液、例えばインサイツゲル化、インサイツ硬化、インサイツ沈殿、インサイツ結晶化のもの、輸液、及び移植片として投与されうる。
【００８６】
本発明の組成物は、ＧＨコンジュゲートの安定性をさらに高め、生物学的利用能を増加させ、溶解度を高め、副作用を低減させ、当業者によく知られている時間療法を達成し、また患者のコンプライアンスを高め、又はそれらの任意の組合せのために、例えば共有的、疎水的及び静電気的相互作用を介して、薬剤担体、薬剤デリバリー系及び先端薬剤デリバリー系にさらに配合され、又は結合されうる。担体、薬剤デリバリー系及び先進薬剤デリバリー系の例には、限定されるものではないが、ポリマー、例えばセルロース及び誘導体、多糖類、例えばデキストラン及び誘導体、デンプン及び誘導体、ポリ(ビニルアルコール)、アクリレート及びメタクリレートポリマー、ポリ乳酸及びポリグリコール酸及びそれらのブロックコポリマー、ポリエチレングリコール、担体タンパク質、例えばアルブミン、ゲル、例えばサーモゲル化系、例えば当業者によく知られているブロックコポリマー系、ミセル、リポソーム、ミクロスフィア、ナノ粒子、液晶及びそれらの分散液、脂質-水系における相挙動の当業者によく知られているＬ２相とそのディスパージョン、ポリマーミセル、多相エマルション、自己乳化、自己-マイクロ乳化、シクロデキストリン及びその誘導体、及びデンドリマーが含まれる。
【００８７】
本発明の組成物は、全ての装置が当業者によく知られたものである例えば定量吸入器、乾燥パウダー吸入器及びネブライザーを使用し、ＧＨコンジュゲートを肺に投与するための固形物、半固形物、パウダー及び溶液の組成物に有用である、
【００８８】
本発明の組成物は、制御された徐放性、持続性、遅延及び持続放出薬物デリバリー系の組成物に特に有用である。より詳細には、限定されるものではないが、組成物は、当業者によく知られている非経口用の制御放出及び徐放系（双方の系は、投与数を何倍も低下させる)組成物に有用である。さらにより好ましくは、皮下投与される制御放出及び徐放系である。本発明の範囲を限定するものではないが、有用な制御放出系及び組成物の有用な例は、ヒドロゲル、油性ゲル、液晶、ポリマーミセル、ミクロスフィア、ナノ粒子である。
【００８９】
本発明の組成物に有用な徐放系の製造方法は、限定されるものではないが、結晶化、凝縮、共結晶化、沈殿、共沈殿、乳化、分散、高圧ホモジナイズ、カプセル化、噴霧乾燥、マイクロカプセル化、コアセルベーション、相分離、ミクロスフィアを製造するための溶媒蒸発、押出及び超臨界プロセスを含む。一般的には、Handbook of Pharmaceutical Controlled Release(Wise, D.L.編 Marcel Dekker, New York, 2000)及びDrug and the Pharmaceutical Sciences vol.99：Protein Composition and Delivery(MacNally, E.J.編 Marcel Dekker, New York, 2000)を参照。
【００９０】
非経口投与は、シリンジ、場合によってはペン状シリンジによる皮下、筋肉内、腹膜内又は静脈内注射によって実施することができる。あるいは、非経口投与は輸液ポンプにより実施することができる。さらなる選択肢は、鼻用又は肺用スプレーの形態でＧＨコンジュゲートを投与するための溶液又は懸濁液であってもよい組成物にある。さらなる選択肢としては、本発明のＧＨコンジュゲートを含む医薬組成物を、例えば針のない注射、又はイオン導入パッチであってよいパッチによる経皮投与、又は頬等の経粘膜投与用に適合させることもできる。
【００９１】
「安定化された組成物」なる用語は、物理的な安定性が増し、化学的な安定性が増し、又は物理的及び化学的安定性が増した組成物を意味する。
ここで使用されるタンパク質組成物の「物理的安定性」という用語は、熱機械的ストレスへのタンパク質の暴露及び／又は疎水性表面及び界面のような不安定化している界面及び表面との相互作用の結果としてのタンパク質の生物学的に不活性な及び／又は不溶性の凝集体を形成するタンパク質の傾向を意味する。タンパク質水性組成物の物理的安定性は、適切な容器（例えばカートリッジ又はバイアル）中に満たした組成物を機械的／物理的ストレス（例えば攪拌）に様々な時間の間、異なった温度で暴露した後に視覚検査及び／又は濁度測定によって評価される。組成物の視覚検査は暗い背景中において鋭く集光された光下で実施される。組成物の濁りは例えば濁度を０から３の尺度（濁りを示さない組成物が視覚スコア０に相当し、昼光で可視できる濁りを示す組成物は視覚スコア３に相当する）でランク付けすることにより特徴付けされる。組成物は、昼光下で可視できる濁りを示す場合にタンパク質凝集に対して物理的に不安定であると分類される。あるいは、組成物の濁りは当業者によく知られている簡単な濁度測定によって評価することができる。タンパク質水性組成物の物理的安定性はタンパク質の立体構造状態の分光学的薬剤又はプローブを使用してまた評価することができる。プローブは好ましくはタンパク質の非天然配座異性体に優先的に結合する小分子である。タンパク質構造の小分子分光学的プローブの一例はチオフラビンＴである。チオフラビンＴはアミロイド線維の検出に広く使用されている蛍光染料である。線維と、おそらくは他のタンパク質立体配置もまた存在すると、チオフラビンＴが約４５０ｎｍで新たな励起極大を引き起こし、線維タンパク質形態に結合したとき約４８２ｎｍで増強した発光を生じる。未結合のチオフラビンＴは本質的にはその波長で非蛍光である。
【００９２】
天然から非天然状態までのタンパク質構造における変化のプローブとして、他の小分子を使用することができる。例えば、タンパク質の露出した疎水性パッチに優先的に結合する「疎水性パッチ」プローブである。疎水性パッチは、一般には、その天然状態のタンパク質の３次構造内に埋められているが、タンパク質がアンフォールドされ又は変性が始まると、露出するようになる。これらの小分子の分光学的プローブは、芳香族の疎水性染料、例えばアントラセン、アクリジン、フェナントロリン等である。他の分光学的プローブは金属-アミノ酸錯体、例えば疎水性アミノ酸、例えばフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、及びバリン等のコバルト金属錯体である。
【００９３】
ここで使用されるタンパク質組成物の「化学的安定性」なる用語は、天然タンパク質構造と比較して潜在的に少ない生物学的効力及び／又は潜在的に増加した免疫原性を持つ化学的変性産物の形成に至るタンパク質構造中の化学共有結合変化を意味する。天然タンパク質のタイプと性質及びタンパク質がさらされる環境に応じて、様々な化学的変性産物が形成されうる。最も可能性が高いことは化学的変性は完全には避けることができないことであり、当業者にはよく知られているように、化学的変性産物の量の増加がタンパク質組成物の貯蔵や使用中にしばしば見られる。殆どのタンパク質は、脱アミド化を受ける傾向があり、これはグルタミニル又はアスパラギニル残基の側鎖アミド基が加水分解されて遊離のカルボン酸を形成するプロセスである。他の変性経路は、アミド基転移及び／又はジスルフィド相互作用を通して二以上のタンパク質分子が互いに共有結合し、共有結合した二量体、オリゴマー及び多量体変性産物の形成に至る高分子量転換産物の形成を含む（Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T. J. & Manning M. C., Plenum Press, New York 1992）。(例えばメチオニン残基の)酸化は化学的変性の他の変形例として挙げることができる。タンパク質組成物の化学的安定性は、異なった環境条件への暴露後に様々な時点において化学的変性産物の量を測定することによって評価することができる（変性産物の形成は例えば温度上昇によってしばしば加速され得る）。それぞれ個々の変性産物の量は、様々なクロマトグラフィー法（例えばＳＥＣ-ＨＰＬＣ及び／又はＲＰ-ＨＰＬＣ)を使用して分子サイズ及び／又は電荷に応じて変性産物を分離することにより決定されることが多い。
【００９４】
よって、上に概説したように、「安定化された組成物」とは増加した物理的安定性、増加した化学的安定性、又は増加した物理的及び化学的安定性を有する組成物を意味する。一般に、組成物は、有効期限に達するまで（推奨された使用及び貯蔵条件に応じて）使用及び貯蔵中に安定でなければならない。
【００９５】
本発明の一実施態様では、ＧＨコンジュゲートを含有する医薬組成物は、６週間を越える使用の間、また３年を越える貯蔵の間、安定している。
本発明の他の実施態様では、ＧＨコンジュゲートを含有する医薬組成物は、４週間を越える使用の間、また３年を越える貯蔵の間、安定している。
本発明のさらなる実施態様では、ＧＨコンジュゲートを含有する医薬組成物は、４週間を越える使用の間、また２年を越える貯蔵の間、安定している。
本発明のさらなる実施態様では、ＧＨコンジュゲートを含有する医薬組成物は、２週間を越える使用の間、また２年を越える貯蔵の間、安定している。
【実施例】
【００９６】
実施例において、次の用語は次の一般的意味を有するものである：
Boc：           tert-ブチルオキシカルボニル
Bt：            １-ベンゾトリアゾリル
DABCO：         １,４-ジアザビシクロ[２.２.２]オクタン
DBU：           １,８-ジアザビシクロ[５.４.０]ウンデセ-７-エン
DCM：           ジクロロメタン、塩化メチレン
DIC：           ジイソプロピルカルボジイミド
DIPEA：         ジイソプロピルエチルアミン
DMA：           Ｎ,Ｎ-ジメチルアセトアミド
DMF：           Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド
DMSO：          ジメチルスルホキシド
DMAP：          ４-ジメチルアミノピリジン
DMPU：          １,３-ジメチルテトラヒドロピリミジン-２-オン
EDC又はEDAC：   Ｎ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩
FMOC：          ９-フルオレニルメチルオキシカルボニル
HBTU：          ２-(１Ｈ-ベンゾトリアゾール-１-イル-)-１,１,３,３テトラメチル                  ウロニウムヘキサフルオロホスフェート
HOAt：          ３-ヒドロキシ-３Ｈ-[１,２,３]トリアゾロ[４,５-ｂ]ピリジン,４-                  アザ-３-ヒドロキシベンゾトリアゾール
HOBt：          Ｎ-ヒドロキシベンゾトリアゾール,１-ヒドロキシベンゾトリアゾー                  ル
HONSu：         Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド
NMP：           Ｎ-メチルピロリドン
HPLC：          高圧液体クロマトグラフィー
Pmc：           ２,２,５,７,８-ペンタメチルクロマン-６-スルホニル
r.t.            室温
Su：            スクシンイミジル
TFA：           トリフルオロ酢酸
TIS：           トリイソプロピルシラン
Trt：           トリチル,トリフェニルメチル
Ts：            トルエンスルホニル
TSTU：          Ｏ-(１-スクシンイミジル)-Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチルウロニウム                  ヘキサフルオロホスフェート
【００９７】
ＮＭＲスペクトルをBruker３００ＭＨｚ及び４００ＭＨｚ機器で記録した。ＨＰＬＣ-ＭＳをPerkin Elmer機器(ＡＰＩ１００)で実施した。
Merck-Hitachi(HibarＴＭ RT 250-4, LichrosorbＴＭ RP 18, 5.0μm, 4.0x250mm, 勾配溶出, 30分以内に20%〜80%のアセトニトリル水, 1.0ml/分, 254nmで検出)製及びWaters(SymmetryＴＭ, C18, 3.5μm, 3.0x150mm, 勾配溶出, 15分以内に5%〜90%のアセトニトリル水, 1.0ml/分, 214nmで検出)製のＨＰＬＣシステムを使用した。
【００９８】
４２℃で１ｍｌ／分で溶出される、２１８ＴＰ５４ ４．６ｍｍ×１５０ｍｍのＣ-１８シリカカラムにおいて２１４、２５４、２７６及び３０１ｎｍでＵＶ検出器を使用し、逆相分析を実施した。カラムを５％のアセトニトリル、８５％の水、及び水中０．５％のトリフルオロ酢酸の１０％溶液で平衡にし、５％のアセトニトリル、８５％の水、及び０．５％のトリフルオロ酢酸の１０％溶液から、９０％のアセトニトリル、及び０．５％トリフルオロ酢酸の１０％溶液まで線形勾配で１５分以上かけて溶出させた。
さらに、述べる場合は、次のＨＰＬＣ法Ａを使用した：
【００９９】
ＲＰ分析を、Waters９９６ダイオードアレイ検出器が取付けられたWaters２６９０システムを使用して実施した。ＵＶ検出結果を、４２℃で１ｍｌ／分で溶出する２１８ＴＰ５４ ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ ５μＣ-１８シリカカラム(The Seperations Group, Hesperia)において、２１４、２５４、２７６及び３０１ｎｍで集めた。カラムを、水中ＴＦＡの水溶液(０．１％)中５％のアセトニトリル(＋０．１％のＴＦＡ)で平衡にした。注入後、サンプルを、水中ＴＦＡの水溶液（０．１％）に入った０％〜９０％のアセトニトリル(＋０．１％のＴＦＡ)の勾配により、サンプルを５０分の間、溶出させた。
【０１００】
ＰＥＧ化成長ホルモンを、次の形でイオン交換クロマトグラフィーにより精製した：
カラム：モノＱ ＨＲ１０／１０
装置：ＡＫＴＡ精製器
バッファーＡ：１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０
バッファーＢ：１０ｍＭのトリス、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０
カラムを５カラム容量(ＣＶ)で平衡にする。
流量：４．０ｍｌ／分
検出器：２８０ｎｍ
画分サイズ：２ｍｌ
洗浄：２ＣＶ
勾配：２０ＣＶを越えて０％のＢから１００％のＢ
【０１０１】
実施例１．ウィッティッヒ反応によるｍＰＥＧ(４０ｋ)-ｈＧＨ
Ａ．ｍＰＥＧ(４０ｋ)誘導ホスホニウム塩の調製
(１-(４-(４-(１,３-ビス(ｍＰＥＧ(２０ｋ)オキシ)-２-プロピルオキシ)ブチリル)ピペラジン-１-イル)アセト-２-イル)トリフェニルホスホニウムクロライド
2008545644.tif 000025
ＤＣＭ(２０ｍｌ)中にＢｏｃ-ピペラジン(０．６３ｇ、３．３８ｍｍｏｌ)が入った溶液に、ＤＩＰＥＡ(１．０ｍｌ、５．８０ｍｍｏｌ)を添加し、ついで無水クロロ酢酸(０．５２ｇ、３．０４ｍｍｏｌ)を一度に添加した。その混合物を室温で１時間攪拌した。水(５０ｍｌ)と１ＮのＨＣｌ(２０ｍｌ)を添加し、生成物をＤＣＭ(３×)で抽出した。混合した抽出物をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。ゆっくりと結晶化する油として、０．７６ｇ(９５％)の１-Ｂｏｃ-４-クロロアセチルピペラジンが得られた。
１Ｈ ＮＭＲ(ｄ６-ＤＭＳＯ)δ１．４１(ｓ,９Ｈ)、３．２８-３．４７(ｍ,８Ｈ)、４．３９(ｓ,２Ｈ)
【０１０２】
ホスホニウム塩への転換：１-Ｂｏｃ-４-クロロアセチルピペラジン(０．７６ｇ、２．８９ｍｍｏｌ)、トルエン(１０ｍｌ)、及びトリフェニルホスフィン(１．５ｇ、５．７２ｍｍｏｌ)の混合物を９０℃で攪拌した。１．５時間後、厚い沈殿物が形成され、さらにトルエン(５ｍｌ)を添加した。全体で４時間後、加熱を中断した。濾過、トルエンを用いた固形物の洗浄、及び減圧下での乾燥により、０．８１ｇ(５３％)の(１-(４-(tert-ブチルオキシカルボニル)ピペラジン-１-イル)アセト-２-イル)トリフェニルホスホニウムクロライドが固形物として得られた。
１Ｈ ＮＭＲ(ｄ６-ＤＭＳＯ)δ１．４１(ｓ,９Ｈ)、３．２２-３．４５(ｍ,６Ｈ)、３．６０(ｍ,２Ｈ)、５．５４(ｄ,Ｊ=１３．８Ｈｚ, ２Ｈ)、７．６９-７．８８(ｍ,１５Ｈ)。
【０１０３】
脱保護及びアシル化：(１-(４-(tert-ブチルオキシカルボニル)ピペラジン-１-イル)アセト-２-イル)トリフェニルホスホニウムクロライド(１７０ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ)に、ＤＣＭ(１０ｍｌ)とＴＦＡ(１０ｍｌ)を添加した。０．５時間後、混合物を濃縮し、アセトニトリルとトルエンの混合物を用いて、残渣を一度に同時蒸発させた。残渣をＤＣＭ(７．５ｍｌ)に再溶解させ、ＤＩＰＥＡ(１．０ｍｌ)を添加し、得られた溶液をｍＰＥＧ(４０ｋ)-ＮＨＳ(１．０ｇ、０．０２５ｍｍｏｌ)に添加した。その混合物を室温で５日間、攪拌した。生成物を、Ｅｔ２Ｏ(１００-２００ｍｌ)で５回沈殿させ、ＤＣＭに再溶解させて、精製した。減圧下で乾燥させたところ、１．０８ｇの表題化合物が得られた。
１Ｈ ＮＭＲ(ｄ６-ＤＭＳＯ)δ３-４(ｍ)、５．４４(ｄ,Ｊ=１４Ｈｚ)、７．６５-７．９０(ｍ)。
【０１０４】
Ｂ：Ｓｅｒ-ｈＧＨの酸化及びウィッティッヒ反応
Ｎα-(４-(４-(４-(１,３-ビス(ｍＰＥＧ(２０ｋ)オキシ)-２-プロピルオキシ)ブチリル)ピペラジン-１-イル)フマル-１-イル)-ｈＧＨ
2008545644.tif 000026
次の溶液を調製した：
バッファーＡ：水(２０ｍｌ)に１３５ｍｇのトリエタノールアミンと２９０ｍｇの３-メチルチオ-１-プロパノールが入ったもの
バッファーＢ：水(８０ｍｌ)に３-メチルチオ-１-プロパノール(１．２ｇ)が入ったもの
過ヨウ素酸ナトリウム溶液：１．０ｍｌの水に４８．２ｍｇのＮａＩＯ４
上のようにして調製されたＰｅｇ(４０ｋ)-ホスホニウム塩(１９ｍｇ、４７５ｎｍｏｌ)とＤＡＢＣＯ(２０ｍｌ)をバッファーＢ(０．４０ｍｌ)に溶解させた。
ＳｅｒｈＧＨ(２０ｍｇ、９００ｎｍｏｌ)をバッファーＡ(４ｍｌ)に溶解させ、過ヨウ素酸塩溶液(０．４０ｍｌ)を添加した。１５分後、混合物をバッファーＢで希釈し、このバッファーを用いて４回透析した(ミリポア(Millipore)、アミコン(Amicon)、カットオフ５０００、２０−３０分)。残渣(０．３ｍｌ)をバイアルに移し、バッファーＢ(０．１ｍｌ)を用いてチューブをすすいだ。得られた溶液(０．４ｍｌ)をホスホニウム塩の溶液に添加した。室温で１８時間放置した後、分析により、表題化合物が３０％の収率であったことが示された。
【０１０５】
実施例２．クネベナーゲル及びマイケル反応によるｍＰＥＧ(４０ｋ)-ｈＧＨ及びｍＰＥＧ(２０ｋ)-ｈＧＨ
Ａ．ｍＰＥＧ(２０ｋ)誘導シアノアセトアミドの調製
Ｎ-(ｍＰＥＧ(２０ｋ)イル)シアノアセトアミド
2008545644.tif 000027
ＤＣＭ(１０ｍｌ)中にＰｅｇ(２０ｋ)-ＮＨ２(１．０ｇ、０．０５ｍｍｏｌ)が入った溶液に、シアノ酢酸(５７ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ)、ＨＯＢｔ(８５ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ)、ＥＤＡＣ(１１２ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ)を添加し、ついでＤＩＰＥＡ(０．１８ｍｌ、１．０４ｍｍｏｌ)を滴下した。室温で２４時間攪拌した後、混合物をＥｔ２Ｏ(１００ｍｌ)に注ぎ、攪拌し、濾過して、ＤＣＭ(１０ｍｌ)に再溶解させた。沈殿／再溶解を５回繰り返した。
【０１０６】
Ｂ：Ｓｅｒ-ｈＧＨの酸化及びクネベナーゲル-マイケル反応
Ｎα１-(４-(ｍＰＥＧ(２０ｋ)イルアミノ)-３-シアノフマル-１-イル)-ｈＧＨ及びＮα１-(２,２-ビス(１-(ｍＰＥＧ(２０ｋ)イルアミノカルボニル)-１-シアノメチル)アセチル-ｈＧＨ
2008545644.tif 000028
Ｐｅｇ(２０ｋ)-シアノアセトアミド(１０ｍｇ、５００ｎｍｏｌ)及びＤＡＢＣＯ(２０ｍｇ)をバッファーＢ(０．４０ｍｌ)に溶解させた。
ＳｅｒｈＧＨ(２０ｍｇ、９００ｎｍｏｌ)をバッファーＡ(４ｍｌ)に溶解させ、過ヨウ素酸塩溶液(０．４０ｍｌ)を添加した。１５分後、混合物をバッファーＢで希釈し、このバッファーを用いて４回透析した(ミリポア、アミコン、カットオフ５０００、２０−３０分)。残渣(０．３ｍｌ)をバイアルに移し、バッファーＢ(０．１ｍｌ)を用いてチューブをすすいだ。得られた溶液(０．４ｍｌ)をシアノアセトアミドの溶液に添加した。室温で１８時間放置した後、分析により、混合物が、Ｎα１-グリオキシリル-ｈＧＨ、Ｎα１-(４-(ｍＰＥＧ(２０ｋ)イルアミノ)-３-シアノフマル-１-イル)-ｈＧＨ、及びＮα１-(２,２-ビス(１-(ｍＰＥＧ(２０ｋ)イルアミノカルボニル)-１-シアノメチル)アセチル-ｈＧＨの等モル混合物を含んでいることが示された。
【０１０７】
薬理学的方法
アッセイ(Ｉ) 成長ホルモン活性を測定するＢＡＦ-３ＧＨＲアッセイ
ＢＡＦ-３細胞(骨髄由来のマウスプロ-Ｂリンパ球系細胞)は、本来は成長及び生存に対してＩＬ-３依存性である。ＩＩ-３は、ＧＨが刺激時に活性化する同じ媒介物質であるＪＡＫ-２及びＳＴＡＴを活性化する。ヒト成長ホルモンレセプターの形質移入後、細胞株は、成長ホルモン依存性細胞系に変化した。このクローンを使用し、ＢＡＦ-３ＧＨＲの生存に対する様々な成長ホルモンサンプルの効果を評価することができる。
ＢＡＦ-３ＧＨＲ細胞を、５％のＣＯ２、３７℃で２４時間、飢餓培地(成長ホルモンを含まない培養培地)中で増殖させる。
細胞を洗浄し、飢餓培地に再懸濁させ、プレートに播種した。その細胞に異なる濃度の１０μｌの成長ホルモン化合物又はヒト成長ホルモン又はコントロールを添加し、プレートを５％のＣＯ２、３７℃で６８時間インキュベートした。
【０１０８】
アラマーブルー(登録商標)を各ウェルに添加し、ついで細胞をさらに４時間インキュベートした。アラマーブルー(登録商標)はレドックス指示剤であり、細胞代謝に固有の反応により還元され、よって生存細胞数の間接的な測定値を与える。
最後に、細胞の代謝活性は、蛍光プレートリーダーで測定される。サンプルの吸光度は、成長ホルモン化合物又はコントロールで刺激されない細胞のパーセントで表され、濃度-反応曲線から活性(５０％で細胞を刺激する化合物の量)を算出することができる。
【０１０９】
ここに引用された刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての文献は、本明細書の他の箇所で特定の文献が別個に援用されているかどうかにかかわらず、あたかも各文献が個々にかつ特に出典明示により援用され、その全体がここに記載されているかの如く、ここに出典明示によりその全体が同じ程度に援用される。
【０１１０】
本発明で記述する場合における「ａ」及び「ａｎｄ」及び「ｔｈｅ」及び類似の指示対象の使用は、ここに特段の定義が示されたり、明瞭に内容に矛盾が生じていない限り、単数形と複数形の双方をカバーしていると解釈される。例えば、「化合物」なる表現は、特段の定義がない限りは、本発明の種々の「化合物」又は特定の記載された態様を意味するものと理解される。
【０１１１】
特段の定義が示されない限り、ここで提供される全ての正確な値は、対応する近似値を代表する(例えば、特定の因子又は測定に対して提供される全ての正確な例示値は、適切な場合には「約」により修飾される、対応する近似測定値をまた提供すると考えることができる)。
【０１１２】
要素又は要素群に関して「含有する」、「持つ」、「有する」、又は「含む」のような用語を使用する任意の態様又は本発明の態様のここに記載した説明は、特段の定義が示されないか又は明瞭に内容が矛盾しない限り、その特定の要素又は要素群「からなる」、「から本質的になる」、「含む」又は「含める」態様又は本発明の態様に対して裏付けを提供するものである（例えば、特定の成分を含有するここに記載の組成物は、特段の定義が示されないか又は明瞭に内容が矛盾しない限り、その成分からなる組成物を記述するものと理解されなければならない)。本発明のそのような態様に関して基本的かつ新規の性質がここで提供される（例えば、本発明のＧＨ含有化合物においては、このような特性には、ＧＨ様生物活性を示すことが含まれる)。
【国際調査報告】
2008545644.tif 000041
2008545644.tif 000042