(57)【要約】  本発明は、小分子タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤、とりわけ、式(Ｉ)及び／又は(II)のＳｈｐ−２阻害剤、並びに、それらを含む薬剤組成物に関する。本発明はまた、ホスファターゼ媒介性疾患、とりわけ、癌及び転移の治療のための前記化合物の使用を対象とする。本発明は、更に増殖性疾患、遺伝性疾患、自己免疫疾患、血管新生障害又は癌の治療を必要とする患者において、このような治療をする方法であって、前記患者に、式(Ｉ)及び／又は(II)の少なくとも１種の化合物の治療上有効な量を投与することを含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性物質として、次式(Ｉ)
【化１】
2008545735.tif 000012
又は次式(II)
【化２】
2008545735.tif 000013
の少なくとも１種の化合物又は式(Ｉ)及び(II)の物質の混合物又はその製薬上許容される塩若しくは溶媒和物を含む薬剤組成物
[式中、
Ｒは、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、(アリールカルバモイル)アルキル又は(ヘテロアリールカルバモイル)アルキルから選択される非置換又は置換基であり、
Ｘは、水素、ハロゲン原子、ヒドロキシ、カルボキシ、アルキル、ハロアルキル、アルコキシ又はニトロ基であり、
Ｒ1及びＲ2は、互いに独立に、アリール又はヘテロアリールから選択される非置換又は置換基である]
[但し、Ｘ＝臭素であり、Ｒ＝ベンジルである式(Ｉ)のスルホン酸は除く]。
【請求項２】
Ｒが、(アリールカルバモイル)アルキル、好ましくは、(フェニルカルバモイル)アルキル、最も好ましくは、(フェニルカルバモイル)メチルである、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項３】
Ｒが、フェニル部分の３又は４位で、Ｃ1〜Ｃ4−アルコキシ、ハロゲン、トリフルオロアルキル又はトリクロロアルキルで置換されている(フェニルカルバモイル)アルキルである、請求項２に記載の薬剤組成物。
【請求項４】
Ｒが、非置換又は置換アリール、好ましくは、ベンジル又は４位でＣ1〜Ｃ4−アルキルで置換されたベンジルである、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項５】
Ｒが、(４−エトキシフェニルカルバモイル)メチル、(３−ブロモフェニルカルバモイル)メチル、(４−フルオロフェニルカルバモイル)メチル、(３−(トリフルオロメチル)フェニルカルバモイル)メチル、４−メチルベンジル又はベンジルである、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項６】
Ｘが、水素、ヒドロキシ、カルボキシ、メトキシ、エトキシ、メチル、トリフルオロメチル、トリクロロメチル又はニトロ基、フッ素、塩素又は臭素原子、好ましくは、水素又は臭素原子である、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項７】
Ｒ1が、フェニル、又は、チアゾリル、ピリジニル、ピリミジニル、イミダゾリル若しくはトリアゾリル好ましくは１，２，４−トリアゾリルからなる群から選択されるヘテロアリールである、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項８】
Ｒ1が、４位で置換された、アルキル、アルキルアミノ、ハロゲン、ハロアルキル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、ヒドロキシ、Ｎ−モルホリノ、Ｎ−モルホリノアルキル、Ｎ−モルホリノカルボニル、Ｎ−メチル−Ｎ−ピペラジニル、Ｎ−メチル−Ｎ−ピペラジニルアルキル、Ｎ−メチル−Ｎ−ピペラジニルカルボニル又はスルホ、好ましくは、フェニルで置換された、アリール又はヘテロアリールである、請求項７に記載の薬剤組成物。
【請求項９】
Ｒ1が、４−フルオロフェニル、４−トリフルオロフェニル、４−カルボキシフェニル又は４−エトキシカルボニルフェニルである、請求項８に記載の薬剤組成物。
【請求項１０】
Ｒ１が、好ましくは、４位で、フェニルで置換された、チアゾール−２−イル又はチアゾール−２−イルである、請求項７に記載の薬剤組成物。
【請求項１１】
Ｒ2が、フェニル、又は、好ましくは４位で、ニトロ、ハロゲン、ハロアルキル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、ヒドロキシ若しくはスルホで置換されたフェニルである、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項１２】
Ｒ2が、４−ニトロフェニル−、４−クロロフェニル、４−フルオロフェニル、４−トリフルオロメチルフェニル、４−カルボキシフェニル、４−エトキシカルボニルフェニル、４−ヒドロキシフェニル又は４−スルホフェニル基である、請求項１１に記載の薬剤組成物。
【請求項１３】
Ｓｈｐ−２媒介性疾患、好ましくは、増殖性疾患、遺伝性疾患、自己免疫疾患、血管新生障害又は癌を治療するための薬剤組成物を製造するための、式(Ｉ)若しくは(II)の少なくとも１種の化合物又は式(Ｉ)及び(II)の物質の混合物又はその製薬上許容される塩若しくは溶媒和物の使用。
【請求項１４】
増殖性疾患が新生物である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
新生物が、白血病、リンパ腫、肉腫、癌種、神経系細胞腫瘍、未分化腫瘍、センシノーマ(sensinoma)、黒色腫、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、混合細胞腫瘍、転移性新生物及び病原性感染による新生物からなる群から選択される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
自己免疫疾患が、糖尿病、好ましくは、II型糖尿病である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１７】
障害が、ヌーナン症候群又は若年性骨髄単球性白血病(ＪＭＭＬ)である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１８】
癌腫が、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、肝細胞癌、結腸直腸癌及び胃癌及びその転移である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１９】
生体ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏシステムにおける細胞プロセスを調べるために、式(Ｉ)又は(II)の少なくとも１種の化合物又は式(Ｉ)及び(II)の物質の混合物の、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤、好ましくは、Ｓｈｐ−２阻害剤としての使用。
【請求項２０】
増殖性疾患、遺伝性疾患、自己免疫疾患、血管新生障害又は癌の治療を必要とする患者において、このような治療をする方法であって、前記患者に、式(Ｉ)又は(II)の少なくとも１種の化合物又は式(Ｉ)及び(II)の物質の混合物の治療上有効な量を投与するステップを含む方法。
【請求項２１】
次式(II)の化合物又はその製薬上許容される塩若しくは溶媒和物
【化３】
2008545735.tif 000014
[式中、
Ｒ1は、非置換アリール又はヘテロアリール、或は、アルキル、アルキルアミノ、ハロゲン、ハロアルキル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、ヒドロキシ、Ｎ−モルホリノ、Ｎ−モルホリノアルキル、Ｎ−モルホリノカルボニル、Ｎ−メチル−Ｎ−ピペラジニル、Ｎ−メチル−Ｎ−ピペラジニルアルキル、Ｎ−メチル−Ｎ−ピペラジニルカルボニル若しくはスルホで置換されたアリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ2は、ニトロ、ハロゲン、ハロアルキル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、ヒドロキシ又はスルホ基で置換されたフェニルである]
[但し、４−((１，５−ジヒドロ−３−(４−ニトロフェニル)−５−オキソ−１−フェニル−４Ｈ−ピラゾール−４−イリデン)−ヒドラジノ)−ベンゼンスルホン酸(II−１)及び４，４’−(４，５−ジヒドロ−５−オキソ−((４−スルホフェニル)−ヒドラゾノ)−１Ｈ−ピラゾール−１，３−ジイル)−ビスベンゼンスルホン酸は除く]。
【請求項２２】
アリールがフェニルであり、ヘテロアリールがチアゾリル、ピリジニル、ピリミジニル、イミダゾリル又はトリアゾリル、好ましくは、１，２，４−トリアゾリルである、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒ1が、フェニル、又は、ハロゲン、ハロアルキル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、ヒドロキシ、Ｎ−モルホリノ、Ｎ−モルホリノアルキル、Ｎ−モルホリノカルボニル、Ｎ−メチル−Ｎ−ピペラジニル、Ｎ−メチル−Ｎ−ピペラジニルアルキル、Ｎ−メチル−Ｎ−ピペラジニルカルボニル若しくはスルホで置換されたフェニルである、請求項２１又は２２に記載の化合物。
【請求項２４】
フェニル部分での置換が、３位又は４位において、好ましくは、４位においてである、請求項２１乃至２３の何れか１項に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｒ1が、フェニル、４−ハロフェニル、好ましくは、４−フルオロフェニル、４−トリフルオロメチルフェニル、４−カルボキシフェニル又は４−エトキシカルボニルフェニルである、請求項２１乃至２４の何れか１項に記載の化合物。
【請求項２６】
Ｒ2が、４−ニトロフェニル又は４−ハロフェニルである、請求項２１乃至２５の何れか１項に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、式(Ｉ)及び／又は(II)の小分子タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤、とりわけ、Ｓｈｐ−２阻害剤、並びに、それらを含む薬剤組成物に関する。本発明はまた、ホスファターゼ媒介性疾患、とりわけ、癌及び転移の治療のための前記化合物の使用を対象とする。本発明は更に、増殖性疾患、遺伝性疾患、自己免疫疾患、血管新生障害又は癌の治療を必要とする患者において、このような治療をする方法であって、前記患者に式(Ｉ)及び／又は(II)の少なくとも１種の化合物の治療上有効な量を投与することを含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
転移は原発腫瘍細胞の遠隔定着と定義される。遅かれ早かれ、ほとんどの種類のヒト癌の発達の間に、原発腫瘍塊から、隣接組織に転出し、浸潤する先駆細胞が生じ、遠隔部位に移動するが、それらがそこで新規コロニーを築くことに成功する場合がある。浸潤及び転移についての能力が、癌細胞が原発腫瘍塊から逃れて、少なくとも最初は、栄養及び空間が制限されていない、身体中の新しい領域にコロニー形成することを可能にする。転移は後期癌における疼痛の最大の供給源の１つである。
【０００３】
肝細胞増殖因子／散乱因子(ＨＧＦ／ＳＦ)、その受容体、チロシンキナーゼＭｅｔ及び下流シグナル伝達アダプターＧａｂ１は、上皮細胞の増殖、細胞間解離及び運動性、マトリックス変性及び生存の増加を含む浸潤性増殖の重要なメディエーターである。ＨＧＦ／ＳＦは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける血管新生、腫瘍における血管形成にとっても重要であるプロセスの強力な誘導物質である。これらのプロセスはすべて転移の際、重要となる[ビルヒマイヤー(Birchmeier)ら、２００３]。
【０００４】
生理学的条件下では、胚の形成及びパターン化、創傷治癒、軸索誘導又は器官再生はＨＧＦ／Ｍｅｔ／Ｇａｂ１システムによって調節される。発達におけるこれらのタンパク質の重要性は、ＨＧＦ／ＳＦ、Ｍｅｔ又はＧａｂ１ヌル突然変異の胚性致死性によって示される。ほぼ同一の表現形によって、これらの因子がＭｅｔシグナル伝達の重要な成分として確認される。
【０００５】
Ｍｅｔ受容体は、癌遺伝子として構成的に活性な変異型(Ｔｐｒ−Ｍｅｔ)において最初に同定された。種々のヒト充実腫瘍(すなわち、乳癌、甲状腺癌、前立腺癌、肝細胞癌、結腸直腸癌及び胃癌)は、ＨＧＦ依存性自己分泌ループ、Ｍｅｔ過剰発現、遺伝子増幅又は遺伝子突然変異による異常なＭｅｔ活性を示す。実験的に、ＨＧＦ及びＭｅｔ又は変異Ｍｅｔの発現は、正常細胞に悪性の特性を付与した(運動性、浸潤、腫瘍形成能)[ジェファーズ(Jeffers)ら、１９９８]。臨床上、いくつかの種類の癌において、ＨＧＦ／Ｍｅｔ過剰発現は予後不良と相関することが解っている。したがって、Ｍｅｔシグナル伝達系は、癌、とりわけ、転移の治療における有望な治療標的と考えられている。
【０００６】
ポリペプチド増殖因子及びサイトカインは、通常、特異的細胞表面受容体を活性化することによってその作用を引き起こし、それによってシグナル伝達カスケードを開始する。ＨＧＦ／ＳＦと呼ばれるこのようなリガンドの、その受容体Ｍｅｔとの結合が、Ｍｅｔの二量化及びリン酸化を開始させる。ＨＧＦ／ＳＦによって活性化されると、ＭｅｔはＧａｂ１、Ｇｒｂ２、ＣＲＫＬ、ＰＩ(３)Ｋ及びＳｈｐ−２のような種々のアダプター及びシグナルタンパク質を蓄積し、Ｍｅｔシグナル伝達複合体を形成する。ドッキングタンパク質Ｇａｂ１はリン酸化Ｍｅｔ受容体チロシンキナーゼと直接結合し、細胞培養においてＭｅｔのシグナルを媒介する。Ｇａｂ１は、Ｍｅｔによって、またその他の受容体及び非受容体チロシンキナーゼによってリン酸化される。Ｇａｂ１−ＳＨＰ２相互作用は、チロシンベースの活性化モチーフとの結合によって、又はＮ−ＳＨ２ドメインの欠失によってＳＨＰ２を活性化する。
【０００７】
Ｓｈｐ−２は、Ｎ末端領域に位置する二つのＳｒｃ相同性２(ＳＨ２)ドメイン(Ｎ−ＳＨ２及びＣ−ＳＨ２)と、Ｃ末端領域に位置する二つの可能性あるＧｒｂ２ ＳＨ２ドメイン結合部位を含む６８ｋＤタンパク質チロシンホスファターゼである。ＳＨＰＴＰ２、Ｓｙｐ、ＰＴＰ１Ｄ及びＰＴＰ２Ｃとしても知られる。Ｓｈｐ−２はそのＮ−ＳＨ２ドメインによる自己阻害のために基本的に不活性である。酵素は、種々の成分との相互作用によって活性化され、細胞増殖の正のレギュレーターとして作用する。
【０００８】
ＭＡＰキナーゼ活性化における、活性化Ｓｈｐ−２とのＧａｂ１結合の主な機能として、活性化Ｓｈｐ−２の膜へのターゲッティングが挙げられる。
【０００９】
チロシンホスファターゼＳｈｐ−２は、癌の発達に必要な、細胞形質転換につながり得るマイトジェン活性化タンパク質(ＭＡＰ)キナーゼ経路の活性化のための、Ｍｅｔ／Ｇａｂ１の重要な下流シグナル伝達分子であるということが解っている。
【００１０】
Ｇａｂ１のＳｈｐ−２との(ＰＩ３Ｋ、ＣＲＫＬ又はＧｒｂ２とではなく)結合が分枝形態形成プログラムを誘導するために必須であった[シェーパー(Schaeper)ら、２０００]。このアッセイにおいて観察される表現型によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける上皮細胞の解離、運動性及び侵襲性をモニターすることが可能となり、したがって、このアッセイの結果をｉｎ  ｖｉｖｏにおける形質転換細胞の転移能と相関させることができる。
【００１１】
分枝形態形成に加え、散乱アッセイが、上皮細胞の転移能の可能性を評価するための代替ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル系である。また、本明細書においては、Ｓｈｐ−２機能の干渉(ドミナントネガティブＳｈｐ−２変異株による)が上皮細胞のＨＧＦ／ＳＦ誘導性細胞散乱を阻害するために[コダマ(Kodama)ら、２０００]、Ｓｈｐ−２が目立った役割を果たす。この表現型は、Ｍｅｔ活性自体の直接干渉を暗示する。したがって、特異的Ｓｈｐ−２阻害剤の開発により、異常なＭｅｔ活性をブロック又は減少させることができ、ＨＧＦ／Ｍｅｔ依存性転移の治療のための優れた手段が提供される。
【００１２】
ＨＧＦ／ＳＦによるＭｅｔ活性化と同様に、ＥＧＦ受容体での上皮成長因子(ＥＧＦ)依存性トランス活性化も、Ｇａｂ１とのＳｈｐ−２結合を干渉することによって、又は触媒的に不活性なＳｈｐ−２変異株を用いてブロックでき[ベネット(Bennett)ら、１９９６]、このことは増殖因子誘導性有糸分裂誘発におけるＳｈｐ−２の重要な役割を実証する。Ｓｈｐ−２はＭＡＰキナーゼ経路中のＧａｂ１の下流且つＳｒｃ及びＲａｓの上流のシグナル伝達ステップを活性化する。
【００１３】
Ｓｈｐ−２は、Ｇａｂ１上のＲａｓＧＡＰ結合部位(Ｇａｂ１〜Ｙ３１７)の脱リン酸化によって、Ｇａｂ１とＲａｓＧＡＰの結合を負に調節し、それによってＲａｓを介した持続的ＭＡＰキナーゼシグナル伝達がもたらされることが解った。
【００１４】
特異的Ｍｅｔシグナル伝達アンタゴニストは、Ｍｅｔシグナル伝達が浸潤性／転移性表現型に寄与している癌の治療のための重要な治療可能性を有し得るということが解っている。Ｍｅｔのカルボキシ末端テールに相当するペプチドは、そのキナーゼ活性及び上皮細胞の浸潤性増殖を阻害する。腫瘍細胞株において安定に発現されるドミナントネガティブＭｅｔは、マウスモデルにおいて、腫瘍増殖及び転移を遅延させる。もう１つのＭｅｔアンタゴニストタンパク質ＮＫ４は、腹膜内投与によって同所性マウスモデルにおいて、治療遺伝子のアデノウイルス導入によって異種移殖片マウスモデルにおいて腫瘍増殖及び転移を阻害する。送達するためのタンパク質／ペプチドを調製する場合に対処しなければならない不利点として、これらの分子の大きな大きさ、親水性、並びに、物理的及び化学的不安定性が挙げられる。また、患者に免疫応答をもたらし得るウイルスコートタンパク質の高い免疫原性のために、遺伝子をコードするタンパク質／ペプチドのウイルス送達には問題がある。
【００１５】
また、Ｍｅｔシグナル伝達アンタゴニストとして化合物が記載されている：ゲルダナマイシン誘導体は、アニサマイシン(anisamycin)抗生物質として最初に記載され、ＨＧＦ／ＳＦ媒介性プラスミン活性化及び細胞運動／浸潤を阻害し、Ｍｅｔタンパク質発現をダウンレギュレートするが[ウェブ(Webb)ら、２０００]、Ｈｓｐ９０シャペロン機能の干渉を介して間接的に作用する。
【００１６】
スタウロスポリン誘導体Ｋ２５２ａは、セリン／トレオニンキナーゼ阻害剤として最初に記載され、Ｍｅｔ自己リン酸化及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨＧＦ誘導性散乱及びヌードマウスモデルにおけるＭｅｔ依存性発癌性細胞株の肺転移を形成する能力を阻害する[モロッティ(Morotti)ら、２００２]。これらの実験における悪性細胞は、動物の尾の静脈中に注射する前にｉｎ  ｖｉｔｒｏで化合物で前処理しなくてはならなかった。初期の実験において、Ｋ２５２ａはｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を示さないことが解った。
【００１７】
しかし、天然物に由来する先行技術の化合物は、高い分子量及びいくつかの立体中心を有することが多く、これによって、その改善及び抗癌剤としての使用のために大変な合成の試みが必要である。更に、シグナル伝達カスケード中の初期の衝撃が、Ｍｅｔ又はＧａｂ１の下流の分枝経路に影響を及ぼし、おそらくは重大な副作用を引き起こす可能性がある。
【００１８】
Ｓｈｐ−２ホスファターゼは、とりわけ、Ｒａｓ経路における増殖因子シグナル伝達の正のメディエーターであるので、その阻害は治療的に有用なものであるはずである。例えば、若年性骨髄単球性白血病(ＪＭＭＬ)と組合わせてヌーナン症候群を患う患者は、そのＳＨＰ−２／ＰＴＰＮ１１遺伝子に生殖細胞系列変異を保持する。ＰＴＰＮ１１における体細胞変異は、非症候群ＪＭＭＬ(ヌーナン症候群を伴わない)の３４％を占める。更に、ＰＴＰＮ１１中の変異は、骨髄異形成症候群(ＭＤＳ)及びｄｅ  ｎｏｖｏ急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)を患う個体の小さなパーセンテージに見られる。興味深いことに、これらの変異はＳｈｐ−２のホスファターゼ活性の増大をもたらす。この機能獲得型表現型は、Ｒａｓ／ＭＡＰキナーゼ経路の活性化の増大及び細胞増殖の増大、白血病の発生の必要条件をもたらす。ＪＭＭＬはＭＤＳのすべての小児の症例の３０％及びすべての白血病疾患の２％を占める。Ｓｈｐ−２のホスファターゼ活性の阻害は、このような患者にとって治療的に有用なものであるはずであり、したがって、特異的Ｓｈｐ−２阻害剤の開発はまた、大部分の癌(例えば、乳癌及び前立腺癌)に相当する、上皮起源のＥＧＦ／ＥＧＦＲ依存性腫瘍の治療にとっても優れた手段であるはずである。
【００１９】
Ｓｈｐ−２はアンチセンス核酸によって調節され得ることが知られている。このような分子はＵＳ６，２００，８０７  Ｂ１(Ｉｓｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社)に記載されている。本明細書において、ＳＨＰ２アンチセンス核酸は、トランスフェクション剤によって細胞に送達され、ＳＨＰ２  ｍＲＮＡ発現レベルに対するこの送達の影響はノーザンブロッティング又はリアルタイムＰＣＲによって測定され、Ｓｈｐ−２タンパク質レベルに対するこの送達の影響はウエスタンブロッティングによって測定される。分析されるアンチセンス分子のサブセットは、細胞培養物におけるＳＨＰ２  ｍＲＮＡレベルを４０〜５０％を超えて低下させることができる。アンチセンス核酸は、通常、トランスフェクション試薬(例えば、リポソーマル製剤)によって細胞に送達されるか、遺伝的にコードされなければならない(例えば、プラスミド又はウイルスベクターによって)高度に帯電した大きな分子である。
【００２０】
遺伝子機能を干渉するための代替方法は、ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)である。サイレンシングリボ核酸(ｓｉＲＮＡｓ)は、２０〜２２ヌクレオチドの長さであり細胞に送達され、細胞機構によって対応するｍＲＮＡの分解をもたらす。このようなオリゴヌクレオチドはＵＳ２００４／００７７５７４  Ａ１(Ｃｅｐｔｙｒ社)に記載されている。本明細書において、種々のＳｈｐ−２特異的ｓｉＲＮＡは、種々の細胞種の細胞増殖の１０〜５０％の阻害をもたらす。アンチセンス核酸に関しては、ｓｉＲＮＡは、通常、トランスフェクション試薬(例えば、リポソーマル製剤)によって細胞に送達されるか、遺伝的にコード化されなければならない(例えば、プラスミド又はウイルスベクターによって)高度に帯電した大きな分子である。
【００２１】
しかし、これらの技術は確立されておらず、また、核酸及びその誘導体は簡単な投与にも充分適していない。
【００２２】
ホスファターゼの阻害剤として先行技術に記載されるよく知られている小分子は、１個又は２個のカルボキシレート基又はジフルオロメチレンホスホネート基の何れかを含み、生理学的ｐＨでホスフェート上に存在する二つの形式電荷を模倣する。最も進化したものは、ＰＴＰ１Ｂ、II型糖尿病(インスリン耐性)における共通薬剤標的の酵素活性を調節するような阻害剤である。このような阻害剤の開発は研究の活動的な領域であり、広く概説されている[ヒュイスドゥイネン(Huijsduijnen)ら、２００４]。記載された強力なホスホチロシンミメティクスのほとんどが、少なくとも二つの酸を含み、細胞透過性の乏しい阻害剤をもたらす。
【００２３】
スルフィダントイン(Sulfhydantoins)は、Ｓｈｐ−２の帯電していない小分子阻害剤としてＷＯ２００４／０６２６６４  Ａ１(Ｖｅｒｔｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社)に記載されている。それに記載される３種の最良の化合物は、ｐＮＰＰ加水分解を阻害し、ＩＣ５０値は１〜１００μＭの範囲である。これらのＳｈｐ−２阻害剤の細胞活性は全く記載されていない。
【００２４】
現在、Ｍｅｔシグナル伝達系を調節するために、及び／又は、ＨＧＦ／Ｍｅｔ依存性疾患を治療するために利用できる有効な化合物はない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
したがって、本発明の根底にある技術上の課題は、異常なＭｅｔ活性をブロック又は減少させることを可能にする化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
この課題は、本発明の特許請求の範囲において定義される実施形態の提供によって解決される。式(I)若しくは(II)の化合物又はその混合物は、タンパク質チロシンホスファターゼ、とりわけ、Ｓｈｐ−２を効果的に阻害し、これによってそれらが、Ｓｈｐ−２の阻害によって正に影響を受け得るＨＧＦ／ｍｅｔ依存性疾患を治療するのに適したものとなることが解った。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
手短には、本発明は、活性物質として以下の一般式(Ｉ)若しくは(II)の少なくとも１種の化合物又は式(Ｉ)及び(II)の物質の混合物又はその製薬上許容される塩若しくは溶媒和物を含む薬剤組成物を提供する：
【００２８】
【化１】
2008545735.tif 000002
【００２９】
[式中、
Ｒは、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、(アリールカルバモイル)アルキル又は(ヘテロアリールカルバモイル)アルキルから選択される非置換又は置換基であり、
Ｘは、水素、ハロゲン原子、ヒドロキシ、カルボキシ、アルキル、ハロアルキル、アルコキシ又はニトロ基であり、
Ｒ1及びＲ2は互いに独立に、アリール又はヘテロアリールから選択される非置換又は置換基である]。
【００３０】
本発明の薬剤組成物は、式(Ｉ)及び／又は(II)の化合物を、好ましくは、スルホン酸、その塩又はエステルとして含む。
【００３１】
Ｘ＝臭素であり、Ｒ＝ベンジルである式(Ｉ)のスルホン酸は、本発明の薬剤組成物から除外される。
【００３２】
驚くべきことに、これらの化合物は特異的Ｓｈｐ−２阻害剤として有用であることが解った。それらは最適薬物動態特性、例えば、水溶性及び膜透過性などを有する小分子であることが有利である。
【００３３】
式(Ｉ)及び(II)の化合物及びその薬剤組成物は、種々の障害、例えば、癌及び自己免疫疾患などを治療するために又はその危険を低下させるために有用である。詳しくは、疾患がＳｈｐ−２などのホスファターゼの異常な酵素活性によって、例えば、ヌーナン症候群及び若年性骨髄単球性白血病の場合であるＳＨＰ２／ＰＴＰＮ１１遺伝子中における突然変異の活性化によって引き起こされる場合には、患者へのこのような化合物の投与は利益であり得る。
【００３４】
本発明は、スルホネート／スルホン酸基含有分子のホスホチロシンミメティクスとしての発見に基づいている。本発明は、２−(５−(２−オキソインドリン−３−イリデン)−４−オキソ−２−チオキソチアゾリジン−３−イル)−エタンスルホネート(Ｉ)又は４−(２−(５−オキソ−１，５−ジヒドロ−４Ｈ−ピラゾール−４−イリデン)ヒドラジノ)−ベンゼンスルホネート(II)基を含有する化合物の、ホスファターゼ酵素モジュレーターとしての新規用途を記載する。詳しくは、式(Ｉ)及び(II)の化合物及びその薬剤組成物は、Ｓｈｐ−２ホスファターゼの阻害剤として有効であることが解った。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態では、式(Ｉ)中Ｒは、(アリールカルバモイル)アルキル、好ましくは、(フェニルカルバモイル)アルキル、最も好ましくは、(フェニルカルバモイル)メチルを表す。(アリールカルバモイル)アルキル基は、非置換であっても置換されていてもよい。好ましい実施形態では、フェニル部分の３位又は４位で、Ｃ1〜Ｃ4−アルコキシ、好ましくは、メトキシ又はエトキシ、ハロゲン、トリフルオロアルキル又はトリクロロアルキル、好ましくは、トリフルオロメチルで置換されている。
【００３６】
本発明の更なる実施形態では、式(Ｉ)中Ｒは、非置換又は置換アリール、好ましくは、ベンジル又は４位でＣ1〜Ｃ4−アルキルで置換されたベンジルである。
【００３７】
特に好ましい実施形態では、式(Ｉ)中Ｒは、４−エトキシフェニルカルバモイル)メチル、(３−ブロモフェニルカルバモイル)−メチル、(４−フルオロフェニルカルバモイル)メチル、(３−(トリフルオロメチル)フェニルカルバモイル)メチル、４−メチルベンジル又はベンジルである。
【００３８】
式(Ｉ)中置換基Ｘに関して、アルコキシは、好ましくは、Ｃ1〜Ｃ4−アルコキシ、とりわけ、メトキシ及びエトキシを意味し、アルキルは、好ましくは、Ｃ1〜Ｃ4−アルキル、とりわけ、メチルを意味する。ハロアルキルは、好ましくは、過ハロゲン化基ＣnＨａｌ2n+1(式中、ｎは１又は２であり、Ｈａｌはフッ素又は塩素である)、特に、トリフルオロメチル又はトリクロロメチルを表す。好ましい実施形態では、Ｘは水素又は臭素原子である。
【００３９】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、式(Ｉ)の活性物質は２−(５−(１−((４−エトキシフェニルカルバモイル)メチル)−２−オキソインドリン−３−イリデン)−４−オキソ−２−チオキソチアゾリジン−３−イル)−エタンスルホン酸又は−エタンスルホネート(Ｉ−１)である。
【００４０】
【化２】
2008545735.tif 000003
(Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌａｂｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  ＣＤＬ  ４３４０−０５８０)
【００４１】
本発明のその他の実施形態では、式(II)中Ｒ1は、チアゾリル、ピリジニル、ピリミジニル、イミダゾリル又はトリアゾリルからなる群から選択されるフェニル又はヘテロアリール、好ましくは、１，２，４−トリアゾリルを表す。フェニル又はヘテロアリール部分はまた置換されていてもよい。好ましい実施形態では、Ｒ１は、アルキル、アルキルアミノ、ハロゲン、ハロアルキル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、ヒドロキシ、Ｎ−モルホリノ、Ｎ−モルホリノアルキル、Ｎ−モルホリノカルボニル、Ｎ−メチル−Ｎ−ピペラジニル、Ｎ−メチル−Ｎ−ピペラジニルアルキル、Ｎ−メチル−Ｎ−ピペラジニルカルボニル又はスルホン酸基で置換された、アリール又はヘテロアリ(heteroary)、好ましくは、４位で置換されたフェニルを表す。
【００４２】
特に好ましい実施形態では、Ｒ１は、４−フルオロフェニル、４−トリフルオロフェニル、４−カルボキシフェニル又は４−エトキシカルボニルフェニルである。チアゾリルとは、好ましい実施形態では、チアゾール−２−イルを意味し、置換チアゾリルとは、好ましい実施形態では、好ましくは、４位でフェニルで置換されたチアゾール−２−イルを意味する。
【００４３】
式(II)中Ｒ2は、フェニル又はニトロ、ハロゲン、好ましくは、塩素又はフッ素、ハロアルキル、好ましくは、トリフルオロアルキル又はトリクロロアルキル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、ヒドロキシ又はスルホン酸基で、好ましくは４位で置換されたフェニルを表すことが好ましい。本発明の特に好ましい実施形態では、Ｒ2は４−ニトロフェニル−、４−クロロフェニル、４−フルオロフェニル、４−トリフルオロメチルフェニル、４−カルボキシフェニル、４−エトキシカルボニルフェニル、４−ヒドロキシフェニル又は４−スルホフェニルである。
【００４４】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、式(II)の活性物質は４−(２−(３−(４−ニトロフェニル)−５−オキソ−１−フェニル−１，５−ジヒドロ−４Ｈ−ピラゾール−４−イリデン)ヒドラジノ)−ベンゼンスルホン酸又は−ベンゼンスルホネート(II−１)である。
【００４５】
【化３】
2008545735.tif 000004
(ＶｉｔａｓＭＬａｂ、Ｍｏｓｋａｕ、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  ＴＲＧ  ０２０  ３３９)
【００４６】
特に断りのない限り、本明細書に用いられるすべての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料を本発明の実施又は試験において使用できるが、適した方法及び材料を以下に記載する。上記で論じられるすべての刊行物、特許出願、特許及びその他の参照文献は、単に、本願の出願日に先立つその開示のために提供される。本明細書において、本発明が、その先行発明によって、このような開示に先行する権利を与えられないということの承認と解釈されるべきものは全くない。本明細書に記載されるすべての刊行物、特許出願、特許及びその他の参照文献は、参照により、図及び図面を含むその全文が組み込まれる。
【００４７】
語句「置換基」とは、各置換可能な位置に置換基を有することができ、各置換が何れかのその他の置換とは独立していることを意味する。例示的置換基として、それだけには限らないが、以下の群のうち１種以上が挙げられる：ハロゲン(例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ)、ヒドロキシ、カルボキシ(−ＣＯ−ＯＨ)、アルキル、シクロアルキル、ハロアルキル(例えば、トリクロロメチル及びトリフルオロメチル)、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルオキシカルボニル(Ｒ−Ｏ−ＣＯ−)、アルキルカルボニルオキシ(Ｒ−ＣＯ−Ｏ−)、ニトロ、シアノ、アミノ(−ＮＨ2)、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルバモイル(−ＮＨ−ＣＯ−ＯＲ−又は−ＯＣ−Ｏ−ＮＨＲ−)、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、アルキルチオ、チオール(−ＳＨ)、尿素(−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＲ)又はスルホンアミド。定義されるアルキル基はまた、１以上の炭素間二重結合又は１以上の炭素間三重結合を含み得る。
【００４８】
用語「アルキル」とは、特に断りのない限り、１〜２０個の炭素原子を含む一価アルカン(炭化水素)由来の基を指す。アルキル基は、所望により置換されていてもよい直鎖又は分岐炭化水素基である。置換されている場合は、アルキル基は、何れかの利用可能な接着点で残基Ｒで置換され得る。非置換アルキル基の例として、それだけには限らないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、４，４−ジメチルペンチル、オクチル、２，２，４−トリメチルペンチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシルが挙げられる。
【００４９】
用語「アリール」とは、単環式、二環式、三環式又は四環式芳香環、例えば、フェニル(Ｃ6Ｈ5−)など、並びに、縮合されている基、例えば、ナフチル、フェナントレニルなどを指す。したがって、アリール基は、少なくとも６個の原子を有する少なくとも１つの環を含み、最大５個のこのような環が存在し、中に最大２２個の原子を含み、隣接する炭素原子又は適したヘテロ原子の間の交互(共鳴)二重結合を含む。本発明によれば、用語「アリール」とはまた、ベンジル基を対象とする。
【００５０】
用語「ヘテロアリール」とは、少なくとも１個のヘテロ原子(Ｏ、Ｓ又はＮ)を含む、５又は６個の環原子を有する単環式芳香族炭化水素基、８〜１０個の原子を有する二環式芳香族基又は１１〜１４個の原子を有する三環式芳香族基を指し、ここで、炭素又は窒素原子が接着点であり、１〜３個の更なる炭素原子がＯ、Ｎ又はＳから選択されるヘテロ原子によって場合により置換されていてもよく、前記ヘテロアリール基は本明細書に記載されるように場合により置換されていてもよい。例示的ヘテロアリール基として、それだけには限らないが、以下が挙げられる：チエニル、フリル、ピロリル、ピリジニル、イミダゾリル、オキサゾリル、ピロリジニル、ピペリジニル、チアゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジナル、トリアジニルアゼピニル、インドリル、イソインドリル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾキサゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾキサジアゾリル、ベンゾフランザニル。
【００５１】
用語「アリールアルキル」とは、上記のアルキル基と結合している上記の芳香環を表す。
【００５２】
用語「アルコキシル」とは、酸素結合(−Ｏ−)を介して結合している上記のアルキル基を表す。
【００５３】
用語「ヘテロ原子」とは、独立的に選択される、酸素(Ｏ)、硫黄(Ｓ)又は窒素(Ｎ)を意味する。
【００５４】
用語「ハロゲン」とは、塩素(Ｃｌ)、臭素(Ｂｒ)、フッ素(Ｆ)又はヨウ素(Ｉ)を指す。
【００５５】
ナトリウム、カリウム、リチウム若しくはマグネシウムのようなスルホネート基の適した塩又はその他の製薬上許容される塩も含まれる。スルホン酸(−ＳＯ2−ＯＨ)のような、及びスルホン酸エステル(−ＳＯ2−ＯＲ)のようなプロトン化型のスルホネート及び場合により置換されていてもよいスルホン酸アミド(−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨＲ1、−ＳＯ2−ＮＲ1Ｒ2)(Ｒ1及びＲ2は独立に水素又はＣ1〜Ｃ4アルキルである)も、本発明の範囲内にある。
【００５６】
混合物の、又は純粋若しくは実質的に純粋な形の、本発明の化合物のすべての異性体が含まれる。
【００５７】
本発明の化合物は、代替互変異性型で存在し得る。特に断りのない限り、何れかの互変異性体という表現は、もう一方を含むものとする。
【００５８】
式(Ｉ)及び(II)の化合物の溶媒和物(例えば、水和物)も、本発明の範囲内にある。溶媒和の方法は、当技術分野では一般に知られている。したがって、本発明の化合物は遊離又は水和物の形であり得、例示される方法によって得られる。
【００５９】
本発明は、チロシンホスフェート基を含む分子の模倣体として有用であるスルホネート及びスルホン酸基含有分子の発見に基づいている。
【００６０】
本発明の好ましい実施形態では、式(Ｉ)及び／又は(II)のスルホネート／スルホン酸基含有分子は、ホスファターゼなどの酵素の可逆的阻害剤として有用であり得る。したがって、それらを、タンパク質のＸ線又はＮＭＲベースの構造分析においてプローブとして、好ましくは、Ｓｈｐ−２ホスファターゼドメインの、小分子阻害剤と共の同時結晶化のために使用できる。
【００６１】
本発明によれば、式(Ｉ)又は(II)の化合物は、ホスファターゼ、Ｓｒｃ相同性２(ＳＨ２)及びホスホチロシン結合(ＰＴＢ)ドメイン含有タンパク質及びホスホチロシン結合性タンパク質を含む群から選択されるタンパク質を阻害する。それらは、タンパク質チロシンホスファターゼ(ＰＴＰ)を阻害することが好ましい。タンパク質チロシンホスファターゼはＳｈｐ−２又はＳｈｐ−２の発癌性変異体又は点突然変異体であることがより好ましい。
【００６２】
もう１つの好ましい実施形態では、前記化合物を細胞増殖、細胞周期進行、細胞間解離、細胞極性、細胞運動、マトリックス変性、浸潤及び幹細胞再生などのホスファターゼ依存性機能を干渉するために細胞培養において用いる。したがって、本発明はまた、生物ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏシステム、例えば、細胞培養物における細胞プロセスの研究のための、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤、好ましくは、Ｓｈｐ−２阻害剤としての式(Ｉ)及び／又は(II)の化合物の使用を対象とする。
【００６３】
活性物質として、式(Ｉ)及び／又は(II)の化合物を含む薬剤組成物はまた、従来の補助剤、好ましくは、担体、アジュバント及び／又はビヒクルを含み得る。例えば、前記担体は、充填剤、増量剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤、溶解遅延剤、吸収促進剤、湿潤剤、吸着剤及び／又は滑沢剤であり得る。
【００６４】
本発明の薬剤組成物はゲル剤、散剤、錠剤、持続放出性錠剤、プレミックス剤、エマルジョン剤、注入製剤、点滴剤、濃縮物、顆粒剤、シロップ剤、ペレット剤、ボーラス剤、カプセル剤、エアゾール剤、噴霧剤及び／又は吸入剤として調製でき、かつ／又はこの形で使用できる。錠剤、コーティング錠、カプセル剤、丸剤及び顆粒剤は、不透明化剤を場合により含んでいてもよい、従来の被膜及び膜と共に提供でき、式(Ｉ)及び(II)の活性物質(類)の放出が、場合により遅延様式で、腸管の特定の部分においてのみで起こるか、又は好ましくは、腸管の特定の部分で起こるように構成でき、その端部に、包埋材として、ポリマー物質及びワックスを使用できる。
【００６５】
例えば、本発明の薬剤組成物は、何れかの経口的に許容される投与形、例えば、それだけには限らないが、カプセル剤、錠剤及び水性懸濁液剤及び溶液剤で経口投与できる。経口適用用錠剤の場合には、よく用いられる担体として、微晶質セルロース、ラクトース及びコーンスターチが挙げられる。通常、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤を添加できる。カプセル剤の形での経口投与のためには、ラクトース及び乾燥コーンスターチなどの有用な希釈剤を使用する。水性懸濁液の経口投与では、活性物質を乳化剤及び沈澱防止剤と組合わせる。また、必要に応じて、特定の甘味料及び／又は矯味剤及び／又は着色剤を添加できる。
【００６６】
活性物質(類)はまた、場合により、上記で説明された担体のうち１種以上と共にマイクロカプセル化された形で存在し得る。
【００６７】
坐剤は、活性物質(類)に加え、ポリエチレングリコール、脂肪、例えば、ココア脂及び高級エステル(例えば、Ｃ16脂肪酸を伴うＣ14アルコール)又はこれらの物質の混合物などの従来の水溶性又は水不溶性担体を含み得る。
【００６８】
軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤及びゲル剤は、活性物質(類)に加え、動物性脂肪及び植物性脂肪、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、タルク及び酸化亜鉛又はこれらの物質の混合物などの従来の担体を含み得る。
【００６９】
散剤及び噴霧剤は、活性物質(類)に加え、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム及びポリアミド粉末又はこれらの物質の混合物などの従来の担体を含み得る。更に、噴霧剤はクロロフルオロ炭化水素などの従来の噴射剤を含み得る。
【００７０】
溶液剤及びエマルション剤は、活性物質(類)、すなわち、本発明の組成物に加え、溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えば、水、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、オイル、とりわけ、綿実油、ピーナッツオイル、コーンオイル、オリーブオイル、ヒマシ油及びゴマ油、グリセロール、グリセロールホルマール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪エステル又はこれらの物質の混合物などの従来の担体を含み得る。溶液剤及びエマルション剤はまた、非経口適用のためには、滅菌された、血液等張性の形で存在し得る。
【００７１】
懸濁液剤は、活性物質(類)に加え、液体希釈剤、例えば、水、エチルアルコール、プロピレングリコール、沈澱防止剤、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微晶質セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天及びトラガカント又はこれらの物質の混合物などの従来の担体を含み得る。
【００７２】
薬剤組成物は、例えば、滅菌注射用水溶液又は水性若しくは油性懸濁液のような凍結乾燥滅菌注射用製剤の形で存在し得る。このような懸濁液はまた、適した分散剤又は湿潤剤(例えば、Ｔｗｅｅｎ８０)及び懸濁剤を用いて当技術分野で公知の方法によって製剤できる。
【００７３】
好ましくは、本発明の活性物質は、上記の薬剤製剤中、混合物全体の約０．０１〜９９．９、より好ましくは、約０．０５〜９９重量％という濃度で存在すべきである。
【００７４】
更に、上記の薬剤製剤は、式(Ｉ)及び／又は(II)の１種以上の活性物質と、場合により更なる製薬上活性な物質とを含み得るが、前記の更なる製薬上活性な物質に加え、塩、バッファー、ビタミン類、糖誘導体、とりわけ、サッカライド、酵素、植物抽出物及びその他のものも含み得る。バッファー及び糖誘導体は皮下適用の際、疼痛を減少させ、ヒアルロニダーゼなどの酵素は有効性を高めることが有利である。上記で明記された薬剤製剤の製造は、周知の方法にしたがって通常の方法で、例えば、活性物質(類)を担体(類)と混合することによって進む。
【００７５】
本発明によれば、式(Ｉ)又は(II)の活性物質又は式(Ｉ)及び(II)の物質の混合物を、０．１〜９９．５、好ましくは、０．５〜９５、より好ましくは、２０〜８０重量％という濃度で薬剤製剤に組み込む。すなわち、活性物質は上記の薬剤製剤、例えば、錠剤、丸剤、顆粒剤及びその他のものの中に、混合物全体の、０．１〜９９．５重量％という濃度で存在することが好ましい。当業者ならば、活性物質の量は治療される患者及び投与の個々の種類に応じて変わるという事実は承知している。患者の状態が改善されれば、製剤中の活性物質の割合は、疾患を停止させる維持量が得られるよう改変すればよい。
【００７６】
経口摂取に加え、筋肉内又は皮下注射又は血管への注射を、本発明の組成物のもう１つの好ましい治療のための投与経路として想定することができる。同時に、カテーテル又は外科的チューブを介した、例えば、個々の臓器、例えば、腎臓、肝臓、脾臓、腸、肺などに直接つながるカテーテルを介した流入も使用できる。
【００７７】
好ましい実施形態では、本発明の薬剤組成物を、２４時間あたり、好ましくは、０．０５〜５００ｍｇ／体重１ｋｇ、より好ましくは、５〜１００ｍｇ／体重１ｋｇという総量で使用できる。それが、障害の症状又は反応性の病的生理学的状態を防ぐか、改善するために使用される治療的量であることが有利である。
【００７８】
用量は、受容者の年齢、健康状態及び体重、疾患の程度、必要とされる同時に行われる治療の種類、治療の頻度及び所望の効果の種類、並びに、副作用に応じて変わることは明らかである。０．０５〜５００ｍｇ／体重１ｋｇという１日用量は、所望の結果を提供するために単回用量として適用しても、複数回用量として適用してもよい。当技術分野の専門知識を有する人物ならば、各場合において必要とされる最適投与量及び活性物質の適用の種類を決定できる。
【００７９】
本発明のもう１つの特に好ましい実施形態では、薬剤組成物を、１〜１００、とりわけ、２〜５０ｍｇ／体重１ｋｇの単回投与で用いる。１日あたりの総量と同様に(上記参照)、適用あたりの単回用量の量は、当技術分野の専門知識を有する人物によって変えることができる。同様に、本発明に従って使用される物質は、上記の単回濃度及び飼料又は飼料製剤又は飲料水と共の製剤を用いて獣医薬に使用できる。
【００８０】
本発明の更なる目的は、Ｓｈｐ−２媒介性疾患、好ましくは、増殖性疾患、遺伝性疾患、自己免疫疾患、血管新生障害及び癌の治療のための(薬剤組成物の製造のための)式(Ｉ)若しくは(II)の少なくとも１種の化合物又は式(Ｉ)及び(II)の物質の混合物の使用である。
【００８１】
好ましい実施形態によれば、本発明は、患者においてＳｈｐ−２媒介性疾患又は状態の重篤度を治療又は軽減する方法であって、前記患者に、本発明の式(Ｉ)若しくは(II)の少なくとも１種の化合物又は式(Ｉ)及び(II)の物質の混合物の有効量を投与することを含む方法を提供する。本明細書において、用語「Ｓｈｐ−２媒介性疾患」とは、Ｓｈｐ−２が役割を果たしていることが解っている何れかの疾患又はその他の有害な状態を意味する。このような状態として、それだけには限らないが、遺伝性疾患、自己免疫疾患、増殖性疾患、血管新生障害及び癌が挙げられる。
【００８２】
式(Ｉ)又は(II)の化合物によって治療できるか、又は防ぐことができる遺伝性疾患として、それだけには限らないが、ヌーナン症候群が挙げられる。
【００８３】
式(Ｉ)又は(II)の化合物によって治療できるか、又は防ぐことができる増殖性疾患として新生物があり、これとしては、それだけには限らないが、白血病、リンパ腫、肉腫、癌種、神経系細胞腫瘍、未分化腫瘍、センシノーマ(sensinoma)、黒色腫、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、混合細胞腫瘍、転移性新生物及び病原性感染による新生物が挙げられる。白血病としては、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病及び若年性骨髄単球性白血病が挙げられる。
【００８４】
式(Ｉ)又は(II)の化合物によって治療できるか、又は防ぐことができる血管新生障害として、それだけには限らないが、眼新生血管(ocular neovasculization)及び小児血管腫が挙げられる。
【００８５】
したがって、本発明は、転移、血管新生又は自己免疫不全症の治療における、及び付随する疾患の治療における式(Ｉ)及び／又は(II)の化合物の使用に関する。これらは、炎症反応、自己免疫疾患、例えば、糖尿病、肥満症及び細胞分裂障害、例えば、癌に付随する疾患であり得る。式(I)又は(II)の物質は、例えば、乳癌、甲状腺癌、前立腺癌、肝細胞癌、結腸直腸癌及び胃癌及びそれらの転移などの充実腫瘍の治療に適している
【００８６】
したがって、本発明はまた、癌の治療を必要とする患者又は動物において、このような治療をする方法であって、前記患者又は動物に、式(Ｉ)又は(II)の少なくとも１種の化合物又は式(Ｉ)及び(II)の物質の混合物の安全かつ有効な量を投与することを含む方法に関する。
【００８７】
式(Ｉ)又は(II)の化合物はまた、胃癌の治療以外に、ピロリ菌感染及びこのような感染によって引き起こされ得る胃潰瘍の治療にも適している。ドイツの人口の約３５％がピロリ菌細菌に感染していると考えられている。
【００８８】
本発明をより理解するために、以下に用いられる用語を説明する。
【００８９】
本発明の意味では、炎症とは、外部又は内部で誘発された炎症性刺激に対する、結合組織及び血管によって媒介される生物の反応であり、後者を排除するか不活化すること及び前記刺激によって引き起こされた組織病変を修復することを目的とする。
【００９０】
本発明の意味では、自己免疫疾患とは、完全に又は一部が自己抗体の形成及び生物全体又は臓器系に対するその損傷作用による、すなわち、自己侵襲による疾患である。
【００９１】
用語「血管新生」とは、細胞、組織、臓器又は腫瘍への新しい血管の生成を指す。
【００９２】
用語「転移」とは、腫瘍細胞が身体の遠隔部分へ広がるプロセスを指す。この用語はまた、本明細書において、転移プロセスを通じて発達する腫瘍を指すよう用いられる。
【００９３】
本明細書において、用語「安全かつ有効な量」とは、本発明の方法で用いた場合に、妥当なリスク対効果比に見合った、過度の不都合な副作用(例えば、毒性、刺激作用又はアレルギー反応)を伴わずに所望の治療反応が生ずるのに充分である成分の量を指す。「治療上有効な量」とは、所望の治療反応が生ずるのに有効な本発明の化合物の量を意味する。例えば、癌、肉腫又はリンパ腫の何れかの増殖を遅延させるか、癌、肉腫又はリンパ腫の何れかを縮小させるか転移させないのに有効な量。個別の安全かつ有効な量又は治療上有効な量は、治療される個々の状態、患者の身体状態、治療される哺乳類の種類、治療期間、併用療法の性質(あるとすれば)及び用いられる個別の製剤及び化合物又はその誘導体の構造などの因子によって変わる。
【００９４】
「抗血管新生」量とは、血管新生を低下、抑制又は阻害するのに、又は血管新生疾患に伴われる症状の改善をもたらすのに有効な化合物又は組成物の量を指す。所望の結果は、症状(類)の自覚的な軽減又は投与量の受容者における客観的に同定可能な改善、内皮細胞の血管新生化の減少又は臨床医若しくはその他の有資格観察者によって気づかれる血管新生速度の低下の何れかであり得る。
【００９５】
用語「癌を治療すること」、「療法」などは、通常、改善が本発明の化合物を用いる治療によるものであり得る、癌を有する哺乳類における何らかの改善を指す。改善は自覚的又は他覚的の何れであってもよい。例えば、哺乳類がヒトである場合は、患者が、改善又は治療に対する反応の自覚的な症状として、気力若しくは活力の向上又は疼痛の減少に気づく場合がある。あるいは、臨床医が健康診断、検査値、腫瘍マーカー又はＸ線写真所見に基づいて腫瘍の大きさ又は腫瘍量の減少に気づく場合もある。臨床医が療法に対する反応に関して観察できる検査の徴候の中には、白血球数、赤血球数、血小板数、赤血球沈降速度及び種々の酵素レベルなどの試験の正常化が含まれる。更に、臨床医は、検出可能な腫瘍マーカーの低下を観察する場合がある。あるいは、超音波画像、核磁気共鳴試験及びポジトロン放出検査などのその他の試験を用いて、他覚的改善を評価することができる。
【００９６】
「腫瘍細胞の増殖を阻害すること」は、腫瘍細胞の増殖が遅くなったか減少したかどうかを測定する何れかの許容される方法によって評価できる。これとしては、上記で論じられる自覚的症状又は他覚的徴候などの直接観察及び間接評価が挙げられる。
【００９７】
本発明の更なる目的は次式(II)の化合物又はその製薬上許容される塩若しくは溶媒和物である
【００９８】
【化４】
2008545735.tif 000005
【００９９】
[式中、
Ｒ1は非置換アリール又はヘテロアリールあるいはアルキル、アルキルアミノ、ハロゲン、ハロアルキル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、ヒドロキシ、Ｎ−モルホリノ、Ｎ−モルホリノアルキル、Ｎ−モルホリノカルボニル、Ｎ−メチル−Ｎ−ピペラジニル、Ｎ−メチル−Ｎ−ピペラジニルアルキル、Ｎ−メチル−Ｎ−ピペラジニルカルボニル又はスルホン酸基で置換されたアリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ2はニトロ、ハロアルキル、ハロゲン、カルボキシ、アルコキシカルボニル、ヒドロキシ又はスルホン酸基で置換されたフェニルである]
[但し、４−((１，５−ジヒドロ−３−(４−ニトロフェニル)−５−オキソ−１−フェニル−４Ｈ−ピラゾール−４−イリデン)−ヒドラジノ)−ベンゼンスルホン酸(II−１)及び４，４’−(４，５−ジヒドロ−５−オキソ−((４−スルホフェニル)−ヒドラゾノ)−１Ｈ−ピラゾール−１，３−ジイル)−ビスベンゼンスルホン酸は除く]。Ｒ1中アリールは、フェニルであることが好ましい。Ｒ1中ヘテロアリールは、チアゾリル、ピリジニル、ピリミジニル、イミダゾリル又はトリアゾリル、好ましくは、１，２，４−トリアゾリルを意味することが好ましい。
【０１００】
式(II)中Ｒ1は、フェニル又はハロゲン、ハロアルキル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、ヒドロキシ、Ｎ−モルホリノ、Ｎ−モルホリノアルキル、Ｎ−モルホリノカルボニル、Ｎ−メチル−Ｎ−ピペラジニル、Ｎ−メチル−Ｎ−ピペラジニルアルキル、Ｎ−メチル−Ｎ−ピペラジニルカルボニル若しくはスルホン酸基で置換されたフェニルであることが好ましい。
【０１０１】
Ｒ1又はＲ2中フェニル置換基は、３位又は４位であることが好ましく、４位であることが特に好ましい。
【０１０２】
本発明の更なる実施形態では、式(II)中Ｒ1はフェニル、４−ハロフェニル、好ましくは、４−フルオロフェニル、４−トリフルオロメチルフェニル、４−カルボキシフェニル又は４−エトキシカルボニルフェニルである。
【０１０３】
本発明のその他の実施形態では、式(II)中Ｒ2は、４−ニトロフェニル又は４−ハロフェニルである。
【０１０４】
式(Ｉ)の化合物は以下の合成法によって調製できる。
【０１０５】
チオキソチアゾリジン(Ｉ−Ｃ)の合成のための一般手順(ステップ１)：
【０１０６】
【化５】
2008545735.tif 000006
【０１０７】
エチル２−メルカプトアセテート(Ｉ−Ａ)及び二者択一に、エチル２−イソチオシアナト−エタンスルホネート(Ｉ−Ｂ)又は２−イソチオシアナト−エタンスルホン酸を１，２−ジクロロエタンに溶解し、トリエチルアミンを加える。例えば、１時間撹拌し、続いて溶媒を除去した後に、生成物エチル２−(４−オキソ−２−チオキソチアゾリジン−３−イル)−エタンスルホネート(Ｉ−Ｃ)を単離することができる。
【０１０８】
Ｎ−アルキル化インドリン−２，３−ジオン(Ｉ−Ｇ及びＩ−Ｈ)の合成のための一般手順(ステップ２)：
【０１０９】
【化６】
2008545735.tif 000007
【０１１０】
インドリン−２，３−ジオン(Ｉ−Ｄ)を、ベンジルクロリド(Ｉ−Ｅ)又はＮ−フェニル−２−クロロ−アセトアミド(Ｉ−Ｆ)の何れかでＮ−アルキル化すると、１−ベンジルインドリン−２，３−ジオン(Ｉ−Ｇ)又は１−フェニルカルバモイルメチルインドリン−２，３−ジオン(Ｉ−Ｈ)がそれぞれ得られる。
【０１１１】
インドリニリデン−チオキソチアゾリジン(Ｉ−Ｉ及びＩ−Ｊ)の合成のための一般手順(ステップ３)：
【０１１２】
【化７】
2008545735.tif 000008
【０１１３】
ステップ２から得たジオキソインドール(Ｉ−Ｇ)又は(Ｉ−Ｈ)を、ステップ１から得たチオキソチアゾリジノン(Ｉ−Ｃ)と縮合すると、それぞれ、スルホンエステルエチル２−(５−(１−ベンジル−２−オキソインドリン−３−イリデン)−４−オキソ−２−チオキソチアゾリジン−３−イル)−エタンスルホネート(Ｉ−Ｉ)又はエチル２−(５−(２−オキソ−１−フェニルカルバモイルメチルインドリン−３−イリデン)−４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−３−イル)−エタンスルホネート(Ｉ−Ｊ)が得られる。
【０１１４】
スルホネート(Ｉ−Ｋ及びＩ−Ｌ)の合成のための一般手順(ステップ４)：
【０１１５】
【化８】
2008545735.tif 000009
【０１１６】
ステップ３から得たスルホンエステル(Ｉ−Ｉ)又は(Ｉ−Ｊ)を、水酸化ナトリウムを用いて加水分解すると、それぞれ、２−(５−(１−ベンジル−２−オキソインドリン−３−イリデン)−４−オキソ−２−チオキソチアゾリジン−３−イル)−エタンスルホン酸のナトリウム塩(Ｉ−Ｋ)又は２−(５−(２−オキソ−１−(フェニルカルバモイルメチル)インドリン−３−イリデン)−４−オキソ−２−チオキソチアゾリジン−３−イル)−エタンスルホン酸のナトリウム塩(Ｉ−Ｌ)が得られる。
【０１１７】
ベンジルクロリド(Ｉ−Ｅ)又はＮ−フェニル−２−クロロ−アセトアミド(Ｉ−Ｆ)それぞれ(ここで、Ｙは水素又は場合により置換されていてもよいアルキル若しくはアルコキシ基を表す)のフェニル環の、及びインドリン−２，３−ジオン(Ｉ−Ｄ)(ここで、Ｘは、例えば、水素又はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＨ、ＣＦ3、カルボキシ、スルホ、アルキル、アルコキシ又はニトロ基を表す)の縮合されたフェニル環の種々の置換は、対応するスルホン酸又はその対応するナトリウム塩、それぞれ、(Ｉ−Ｋ)又は(Ｉ−Ｌ)をもたらす。
【０１１８】
式(II)の化合物は以下の合成法によって調製した。
【０１１９】
方法１：
【０１２０】
【化９】
2008545735.tif 000010
【０１２１】
第１のステップでは、メチル２−(トリフェニルホスホラニリデン)−アセテート(II−Ａ)を、ルチジンのような塩基の存在下でカルボン酸塩化物Ｒ2ＣＯＣｌを用いてアシル化した(あるいは、活性化試薬１−(２−メシチレンスルホニル)−３−ニトロ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール(ＭＳＮＴ)の存在下、カルボン酸Ｒ2ＣＯＯＨによって)。第２のステップでは、得られたメチル３−オキソ−２−トリフェニルホスホラニリデンプロパノエート(II−Ｂ)をジメチルジオキシラン(ＤＭＤＯ)を用いて酸化し、メチル２，２−ジヒドロキシ−３−オキソ−プロパノエート(II−Ｃ)を得た。第３のステップでは、この化合物を、４−ヒドラジニルベンゼンスルホン酸と縮合し、メチル２−(４−スルホフェニルヒドラゾノ)−３−オキソ−プロパノエート(II−Ｄ)を形成した。第４のステップでは、この化合物をヒドラジンＲ1ＮＨＮＨ2と縮合し、４−(２−(１，５−ジヒドロ−５−オキソ−４Ｈ−ピラゾール−４−イリデン)−ヒドラジノ)−ベンゼンスルホン酸(II−Ｅ)を形成した。
【０１２２】
ヒドラジンＲ1ＮＨＮＨ2及びカルボン酸塩化物Ｒ2ＣＯＣｌの(あるいは、カルボン酸Ｒ2ＣＯＯＨの)種々の置換Ｒ1及びＲ2は、それぞれ対応するベンゼンスルホン酸(II−Ｅ)をもたらした(ここで、Ｒ1及びＲ2は互いに独立に、アリール又はヘテロアリールから選択される非置換又は置換基を表す)。
【０１２３】
ケトホスホラニリド類(ketophosphoranylides)(II−Ｂ)の合成のための一般手順(ステップ１)：
【０１２４】
窒素雰囲気中、１当量のメチル２−(トリフェニルホスホラニリデン)−アセテート(II-A)を乾燥ジクロロメタン(５ｍｌ)中に供した。乾燥ジクロロメタン(５ｍｌ)中、１．２当量のカルボン酸塩化物Ｒ2ＣＯＣｌ(あるいは、１．２当量のＭＳＮＴの存在下、１．２当量のカルボン酸Ｒ2ＣＯＯＨ)及び１．１当量のルチジンの混合物を加えた。反応混合物を、窒素雰囲気中、室温で１６時間撹拌し、その後、５ｍｌの水でクエンチした。二層を分離し、水層をジクロロメタンで２回抽出した。合わせた有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、真空濃縮した。粗ケトホスホラニリド(ketophosphoranylide)(II−Ｂ)を、溶出剤として酢酸エチル／ヘキサンを用いるシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。
【０１２５】
水和２，３−ジケトエステル(Il−Ｃ)の合成のための一般手順(ステップ２)：
【０１２６】
ジクロロメタン中、ケトホスホラニリド(ketophosphoranylide)(II−Ｂ)の溶液に、３当量のジメチルジオキシラン(ＤＭＤＯ；２４０ｍｂａｒ／−７８℃で、水性炭酸水素ナトリウムの存在下、オキソン三塩ＫＨＳＯ5．ＫＨＳＯ4．２Ｋ2ＳＯ4を用いるアセトンの酸化によって製造した)を加えた。反応混合物を、脱染されるまで室温で１時間撹拌し、続いて、真空濃縮した。水和２，３−ジケトエステル(II−Ｃ)を、溶出剤として酢酸エチル／ヘキサンを用いるシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。
【０１２７】
フェニルヒドラゾン(Il−Ｄ)の合成のための一般手順(ステップ３)：
【０１２８】
窒素雰囲気中、１当量の水和２，３−ジケトエステル(II−Ｃ)を、エタノール(１０ｍｌ)に溶解し、１．２当量の４−ヒドラジニルベンゼンスルホン酸１／２水和物を加えた。続いて、反応混合物に濃塩酸を注意深く滴下し、その後、これを還流下８５℃で１６時間煮沸し、真空濃縮した。
【０１２９】
ピラゾロン(Il−Ｅ)の合成のための一般手順(ステップ４)：
【０１３０】
窒素雰囲気中、エタノール(１０ｍｌ)に１当量の粗フェニルヒドラゾン(II−Ｄ)を溶解し、１．２当量のヒドラジンＲ1ＮＨＮＨ2を加えた。続いて、反応混合物に濃塩酸(０．１ｍｌ)を注意深く滴下し、その後、これを還流下８５℃で１６時間煮沸した。室温に冷却した後、飽和塩化水素ナトリウム溶液を、溶液のｐＨが塩基性となるまで加えた。続いて、溶液を濾過し、部分的に真空濃縮した。４℃で数時間後に形成された沈澱物は、純粋なピラゾロン(II−Ｅ)を含んでおり、続いて、これを濾過によって単離した。
【０１３１】
方法２：
【０１３２】
【化１０】
2008545735.tif 000011
【０１３３】
ケトエステルエチルベンゾイルアセテート(II−Ｆ)をフェニルヒドラジンと縮合すると、１，２−ジヒドロ−１，３−ジフェニル−ピラゾール−５−オン(II−Ｇ)が得られる。続いて、４−アミノベンゼンスルホン酸を低ｐＨの亜硝酸ナトリウム水溶液を用いてジアゾチレートし(diazotylated)、得られたジアゾニウム塩を、(II−Ｇ)を添加することによって、４−(２−(１，５−ジヒドロ−１，３−ジフェニル−５−オキソ−４Ｈ−ピラゾール−４−イリデン)−ヒドラジノ)−ベンゼンスルホン酸(II−Ｈ)に直ちに変換する。ケトエステル(II−Ｇ)のフェニル環の種々の置換は、対応するスルホン酸(II−Ｈ)をもたらす[ここで、Ｚは、例えば、水素、又は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＨ、トリハロアルキル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、スルホ若しくはニトロ基を表す]。
【０１３４】
制限しようとするものではないが、本発明を以下の実施例を参照して、より詳細に説明する。
【実施例】
【０１３５】
実施例１：酵素的ｐＮＰＰアッセイ
Ｓｈｐ−２(アミノ酸２２５〜５４１)の触媒ドメインに、６個のヒスチジン及びそれに続くタバコエッチウイルス(ＴＥＶ)プロテアーゼ切断部位を用いてＮ末端にタグをつける。ニッケルニトリロ三酢酸(Ｎｉ−ＮＴＡ)樹脂(Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ)を介した固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(ＩＭＡＣ)によって精製する。Ｓｈｐ−２酵素活性は、黄色生成物４−ニトロフェノール(ｐＮＰ)を生ずる４−ニトロフェニルホスフェート(ｐＮＰＰ)の脱リン酸化によって生ずる吸収を測定することによって評価した。アッセイは９６ウェルマイクロタイタープレートで実施する。アッセイバッファーは、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ(ｐＨ７．０)、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｂｒｉｊ３５、１０％グリセロール、１ｍＭジチオトレイトール(ＤＴＴ)及び２５ｎＭ  Ｓｈｐ−２という最終濃度を含み、最終アッセイ容積は１００μｌとする。化合物は、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)に溶解し、アッセイは１％ＤＭＳＯという最終濃度で実施する。反応はｐＮＰＰを１０ｍＭという最終濃度に添加することによって開始し、３０℃でインキュベートする。４０５ｎｍでの吸収(Ａ４０５)を１分間隔で６０分間モニターする。Ａ４０５を時間に対してプロットし、曲線の直線部分の傾きを求める(ｍＯＤ／分)。Ｋｉ値を算出するには、８２００ＯＤ  Ｍ−１ｃｍ−１(ｐＨ７．０)という４−ニトロフェノールの吸光係数εを用いる。
【０１３６】
ＩＣ50値の測定
サンプルｘ(ＳＭｘ)の速度(ｍＯＤ／分で)のすべての測定は、３連で実施し、続いて、平均する。ブランク対照(ＢＬ)は、ホスファターゼを用いない、少なくとも３つの別個のマイクロタイターウェルにおいて求める。陽性対照(ＰＣ)として、少なくとも３つのウェルにおいてホスファターゼを用いるが阻害剤は用いない反応を供する。ＢＬ及びＰＣも、それぞれ、すべての測定されたウェルにかけて平均する。シグナルのパーセンテージ(％Ｓｉｇ)は、次式によって求める
％Ｓｉｇ＝(ＳＭｘ−ＢＬ／ＰＣ−ＢＬ)×１００％
その後、％Ｓｉｇを、阻害剤の濃度(マイクロモル／リットル、対数スケールで)によってプロットする。得られた曲線を、Ｏｒｉｇｉｎバージョン６．０(Ｍｉｃｒｏｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、米国、ノーサンプトン)を用いてシグモイドの形に適合させ、適合させた曲線から、阻害剤が半阻害作用(５０％シグナル)に達する濃度(マイクロモル／リットルで)として、ＩＣ50値を求めることができる。
【０１３７】
実施例２：上皮細胞の転移能を測定するためのＨＧＦ／ＳＦ散乱アッセイ
マディン−ダービー(Madin-Darby)イヌ腎臓(ＭＤＣＫ)上皮細胞を、０．０２×１０Ｅ６個細胞／ｍｌ(１００μｌ／ウェル)で、９６ウェルマイクロタイタープレート中、１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ、ミュンヘン)を補給したダルベッコの改変イーグル培地(ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ドイツ、カルルスルーエ)に播種し、５％二酸化炭素(ＣＯ２)を含有する加湿雰囲気下、３７℃で一晩インキュベートする。肝細胞増殖因子／散乱因子(ＨＧＦ／ＳＦ)はＳｆ９昆虫細胞において発現され、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。培地はＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ及び１０ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦ／ＳＦ及び５〜５０μＭ化合物(最終ＤＭＳＯ濃度１％未満)に交換する。細胞を３７℃／５％ＣＯ２で２０時間インキュベートし、散乱活性について顕微鏡(Ａｘｉｏｖｅｒｔ  １３５、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＡＧ、ドイツ、オーバーコッヘン)下で分析する。画像をデジタルカメラ(ＰｒｏｇＲｅｓ  ３０１２ｍＦ、Ｊｅｎｏｐｔｉｋ、ドイツ、イェナ)で撮る。
【０１３８】
実施例３：ＨＧＦ／ＳＦリン酸化アッセイ
ＭＤＣＫ細胞を、０．１５×１０Ｅ６個細胞／ｍｌ(１ｍｌ／ウェル)で、１２ウェルマイクロタイタープレート中、ＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳに播種し、３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。培地をＤＭＥＭ／１％ＦＢＳ及び５、１０又は２０μＭ(最終濃度)化合物に交換し、細胞を３７℃／５％ＣＯ２で１６時間インキュベートする。培地をＤＭＥＭ(血清不含)及び５、１０又は２０μＭ化合物(最終ＤＭＳＯ濃度１％未満)に交換し、細胞を３７℃／５％ＣＯ２で２時間インキュベートする。培地をＤＭＥＭ(血清不含)及び５、１０又は２０μＭ化合物(最終ＤＭＳＯ濃度１％未満)及び１０ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦ／ＳＦに交換し、細胞を３７℃／５％ＣＯ２で６時間インキュベートする。示される時点(０、５、１５、６０、１２０、３６０分)の後、培地を除去し、細胞を、ウェルあたり１ｍｌのＰＢＳバッファー(＝１３７ｍＭ塩化ナトリウム、３ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭリン酸二水素カリウム、８．２ｍＭリン酸一水素二ナトリウム、ｐＨ７．４)で１回洗浄し、ウェルあたり２００μｌのＲＩＰＡバッファー(＝１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)二ナトリウム塩、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、１０％グリセロール、１ｍＭフッ化ナトリウム、１ｍＭ  オルトバナジウム酸ナトリウム、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド(ＰＭＳＦ))に４℃で３０分間溶解する。溶解物を４℃、１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。７５μｌの上清を、２５μｌの４×ＳＤＳサンプルバッファーと共に９５℃で５分間煮沸する。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)によって２５μｌのサンプルを分離し、ウエスタンブロッティングによってニトロセルロースにトランスファーする。ｐ４２／ｐ４４ＭＡＰキナーゼに対する抗体(Ｅｒｋ１／Ｅｒｋ２)(Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国、ベバリー)及びホスホ−Ｅｒｋ１／Ｅｒｋ２(Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国、ベバリー)によってブロット上のタンパク質を分析する。
【０１３９】
抗体の、ニトロセルロース上のＭＡＰキナーゼとの結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合している二次ヤギ抗ウサギ抗体(Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、英国、ソーハム)とのインキュベーションと、それに続くＥＣＬ試薬(Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ(商標)、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社  米国、ボストン)との反応及びＸ線フィルム曝露(Ｘ−ＯＭＡＴ(商標)、Ｋｏｄａｋ  ＧｍｂＨ、ドイツ、シュトゥットガルト)とによって検出した。ウエスタンブロットシグナルの強度は、イメージングソフトウェアＴＩＮＡバージョン２．０８ｅ(ｒａｙｔｅｓｔ  ｌｓｏｔｏｐｅｎｍｅｓｓｇｅｒａｔｅ  ＧｍｂＨ、ドイツ、シュトラウベンハルト)によって定量した。
【０１４０】
実施例４：細胞増殖アッセイ(ＭＴＴアッセイ)
ヒト癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５(黒色腫)、ＨＣＴ−１１６(結腸癌)、ＨＣＴ−１５(結腸癌)、ＰＣ−３(前立腺癌)ＨＴ−２９(結腸癌)及びＮＣＩ−Ｈ６６１(肺癌)は、ＡＴＣＣ／ＬＧＣ  Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ(ドイツ、ウェーゼル)から入手した。ＨＴ−２９を除くすべての細胞株は、１０％ＦＢＳを補給したＲＰＭＩ１６４０培地(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ドイツ、カルルスルーエ)で維持した。ＨＴ−２９細胞は、１０％ＦＢＳを補給したＤＭＥＭで維持した。化合物はＤＭＳＯに溶解し、１０ｍＭの保存液を作製した。細胞は、化合物処理の２４時間前に、０．０１×１０Ｅ６個細胞／ｍｌの密度で、９６ウェルマイクロタイタープレート中１００μｌの培地に播種した。次いで、細胞を、１００μｌの培地中、種々の濃度の化合物で処理し、５％ＣＯ2を用いて３７℃で６日間インキュベートした(培地中ＤＭＳＯの最大最終濃度は０．５％であった)。標準曲線を設定するために、実験細胞のインキュベーション期間の最後に、対応する細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレート中、ウェルあたり１００μｌの培地に一連の種々の密度で播種した。各ウェルに、１０μｌの５ｍｇ／ｍｌのメチルチアゾリルジフェニルテトラゾリウムブロミド(ＭＴＴ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ、ミュンヘン)の溶液を加え、細胞を３７℃で４時間インキュベートした。次いで、各ウェルに１００μｌの酸性イソプロパノール(イソプロパノール中０．０４Ｍ塩酸)を加え、青色複合体を溶解する。最後に、変換された色素の吸光度を、５５０ｎｍの波長で測定し、６３０ｎｍでバックグラウンド除去した。標準曲線からアッセイ時の生細胞数を読み取った。各条件は３連で実施し、データは少なくとも３回の独立実験から得た平均±平均の標準誤差(ＳＥＭ)として示されている。
【０１４１】
実施例５：コロニー形成アッセイ(軟寒天アッセイ)
軟寒天コロニー形成アッセイを、６ウェルマイクロタイタープレートで実施した。各ウェルは、底層として１．５ｍｌの完全培地中０．６％の寒天、支持細胞層として１．５ｍｌの完全培地中０．３％の寒天、１×１０Ｅ４個細胞及び種々の濃度の化合物、並びに、最上層として１ｍｌの種々の濃度の化合物を補給した完全培地を含んでいた。細胞を、３７℃、５％ＣＯ2で３〜４週間維持した。最上層の培地は７日毎に交換した。実験の最後に、ｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレットを用いてコロニーを染色し、１００×倍率で倒立顕微鏡(Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ１３５，Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＡＧ、ドイツ、オーバーコッヘン)下で観察した。各ウェルにつき１０視野を無作為に選択し、デジタルカメラ(ＰｒｏｇＲｅｓ３０１２ｍＦ，Ｊｅｎｏｐｔｉｋ、ドイツ、イェナ)及びグラフィックソフトウェア(Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  Ｖ７．０，Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｍｂＨ、ドイツ、ミュンヘン)を用いてコロニーによって占められる面積(コロニーの数及び大きさの双方を考慮した)を染色されたコロニーのピクセル値として推定した。
【０１４２】
実施例６：ＨＧＦ／ＳＦリン酸化アッセイ
一般に、ヒト腫瘍細胞(例えば、ＮＣＩ−Ｈ６６１)を０．２５×１０Ｅ６個細胞／ｍｌ(１ｍｌ／ウェル)で、６ウェルマイクロタイタープレート中、ＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳに播種し、３７℃／５％ＣＯ２を一晩インキュベートした。培地をＲＰＭＩ／１％ＦＢＳ及び５、１０又は２０μＭ(最終濃度)化合物に交換し、細胞を３７℃／５％ＣＯ２で２０時間インキュベートした。培地をＲＰＭＩ(血清不含)及び５、１０又は２０μＭ化合物(最終ＤＭＳＯ濃度１％未満)に交換し、細胞を３７℃／５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。培地をＤＭＥＭ(血清不含)及び５、１０又は２０μＭ化合物(最終ＤＭＳＯ濃度１％未満)及び１０ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦ／ＳＦに交換し、細胞を３７℃／５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。示した時点(０、５、１５、６０、１２０、２４０分)の後、培地を除去し、細胞をウェルあたり１ｍｌのＰＢＳバッファー(＝１３７ｍＭ塩化ナトリウム、３ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭリン酸二水素カリウム、８．２ｍＭリン酸一水素二ナトリウム、ｐＨ７．４)で１回洗浄し、ウェルあたり２００μｌのＲＩＰＡバッファー(＝１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)二ナトリウム塩、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、１０％グリセロール、１ｍＭフッ化ナトリウム、１ｍＭ  オルトバナジウム酸ナトリウム、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド(ＰＭＳＦ))に４℃で３０分間溶解した。溶解物を４℃、１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。７５μｌの上清を、２５μｌの４×ＳＤＳサンプルバッファーと共に９５℃で５分間煮沸した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)によって２５μｌのサンプルを分離し、ウエスタンブロッティングによってニトロセルロースにトランスファーした。ｐ４２／ｐ４４ＭＡＰキナーゼに対する抗体(Ｅｒｋ１／Ｅｒｋ２)(Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国、ベバリー)及びホスホ−Ｅｒｋ１／Ｅｒｋ２(Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国、ベバリー)によってブロット上のタンパク質を分析した。抗体の、ニトロセルロース上のＭＡＰキナーゼとの結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合している二次ヤギ抗ウサギ抗体(Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、英国、ソーハム)とのインキュベーションと、それに続くＥＣＬ試薬(Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ(商標)、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国、ボストン)を用いる反応及びＸ線フィルム曝露(Ｘ−ＯＭＡＴ(商標)、Ｋｏｄａｋ  ＧｍｂＨ、ドイツ、シュトゥットガルト)とによって検出した。
【０１４３】
実施例７：化合物II−１の合成
メチル２−(トリフェニルホスホラニリデン)−アセテート(５０２ｍｇ、１５ｍｍｏｌ)を乾燥ジクロロメタン(５ｍｌ)に溶解した。乾燥ジクロロメタン(５ｍｌ)中、４−ニトロ安息香酸(３０１ｍｇ、１８ｍｍｏｌ)、ＭＳＮＴ(５３３ｍｇ、１８ｍｍｏｌ)及びルチジン(１８２ｍｇ、１７ｍｍｏｌ)の混合物を加えた。溶出剤として酢酸エチル／ヘキサン(８０：２０、ｖ／ｖ)を用いるシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーによって、粗生成物メチル３−(４−ニトロフェニル)−３−オキソ−２−トリフェニルホスホラニリデン−プロパノエートを精製した。
【０１４４】
ジクロロメタン２ｍｌ中、精製生成物(１９３ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ)の溶液に、ジメチルジオキシラン(１．２ｍｍｏｌ)を加えた。粗生成物を、溶出剤として酢酸エチル／ヘキサン(４０：６０、ｖ／ｖ)を用いるシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。
【０１４５】
精製生成物メチル２，２−ジヒドロキシ３−(４−ニトロフェニル)−３−オキソ−プロパノエート(９５ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ)をエタノール(１０ｍｌ)に溶解し、４−ヒドラジニルベンゼンスルホン酸半水和物９９ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ)及び塩酸(３７％、０．１ｍｌ)を加えた。反応時間(１６時間)の後、溶媒を真空除去した。残渣は、メチル３−(４−ニトロフェニル)−３−オキソ−２−(２−(４−スルホフェニル)ヒドラゾノ)−プロパノエートを含んでいた。
【０１４６】
この粗生成物(８１ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ)をエタノール(１０ｍｌ)に溶解し、フェニルヒドラジン(２６ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ)及び塩酸(３７％、０．１ｍｌ)を加えた。５３ｍｇの生成物４−((１，５−ジヒドロ−３−(４−ニトロフェニル)−５−オキソ−１−フェニル−４Ｈ−ピラゾール−４−イリデン)−ヒドラジノ)−ベンゼンスルホン酸を、橙色の固体として濾過によって単離した(収率５４％)。
【０１４７】
ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ  ４６６．０［Ｍ＋Ｈ+］
1Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ6，３００ＭＨｚ)：δ＝８．４９−８．４０(ｍ，４Ｈ，ＮＯ2−Ｐｈ)、８．０６−８．０３(ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，２Ｈ，ＳＯ3Ｈ−Ｐｈ)、７．７４−７．６４(ｍ，４Ｈ，ＳＯ3Ｈ−Ｐｈ及びＰｈ)、７．５４−７．４９(ｍ，２Ｈ，Ｐｈ)、７．１６−７．１０(ｍ，１Ｈ，Ｐｈ)。
13Ｃ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ6，７５ＭＨｚ)：δ＝１４６．３８、１４３．９０、１３５．９５、１２９．０６、１２８．０７、１２６．９５、１２４．０２、１２０．４６、１１８．５２、１１６．４３。
【０１４８】
実施例８：化合物II−６の合成
メチル２−(トリフェニルホスホラニリデン)−アセテート(５０２ｍｇ、１５ｍｍｏｌ)を、乾燥ジクロロメタン(５ｍｌ)に溶解した。乾燥ジクロロメタン(５ｍｌ)中、４−フルオロ安息香酸(２５２ｍｇ、１８ｍｍｏｌ)、ＭＳＮＴ(５３３ｍｇ、１８ｍｍｏｌ)及びルチジン(１８２ｍｇ、１７ｍｍｏｌ)の混合物を加えた。粗生成物メチル３−(４−フルオロフェニル)−３−オキソ−２−トリフェニルホスホラニリデン−プロパノエートを、溶出剤として酢酸エチル／ヘキサン(５０：５０、ｖ／ｖ)を用いるシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。
【０１４９】
ジクロロメタン２ｍｌ中、精製生成物(１８２ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ)の溶液に、ジメチルジオキシラン(１．２ｍｍｏｌ)を加えた。溶出剤として酢酸エチル／ヘキサン(３３：６６、ｖ／ｖ)を用いるシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーによって粗生成物を精製した。
【０１５０】
精製生成物メチル２，２−ジヒドロキシ−３−(４−フルオロフェニル)−３−オキソ−プロパノエート(８４ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ)をエタノール(１０ｍｌ)に溶解し、４−ヒドラジニルベンゼンスルホン酸１／２水和物(９９ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ)及び塩酸(３７％、０．１ｍｌ)を加えた。反応時間(１６時間)の後、溶媒を真空除去した。残渣はメチル３−(４−フルオロフェニル)−３−オキソ−２−(２−(４−スルホフェニル)ヒドラゾノ)−プロパノエートを含んでいた。
【０１５１】
この粗生成物(１３７ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ)をエタノール(１０ｍｌ)に溶解し、フェニルヒドラジン(４６ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ)及び塩酸(３７％、０．１ｍｌ)を加えた。１２６ｍｇの生成物４−((１，５−ジヒドロ−３−(４−フルオロフェニル)−５−オキソ−１−フェニル−４Ｈ−ピラゾール−４−イリデン)−ヒドラジノ)−ベンゼンスルホン酸を赤色固体として濾過によって単離した(収率８０％)。
【０１５２】
ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ４３９．２［Ｍ＋Ｈ+］
1Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ6，３００ＭＨｚ)：δ＝８．２６−８．２１(ｍ，２Ｈ)、８．０３−８．００(ｍ，２Ｈ)、７．７１−７．５８(ｍ，５Ｈ)、７．３３−７．２４(ｍ，３Ｈ)、６．９４−６．９２(ｍ，１Ｈ)。
13Ｃ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ6，７５ＭＨｚ)：δ＝１６４．６７、１６１．３９、１５６．８９、１４５．３１、１４０．９７、１３７．７２、１２９．０６、１２９．０３、１２７．０５、１２６．４８、１２６．４４、１２５．３１、１２１．６４、１１８．２７、１１４．３３。
【０１５３】
実施例９：化合物II−７の合成
メチル２−(トリフェニルホスホラニリデン)−アセテート(５０２ｍｇ、１５ｍｍｏｌ)を、乾燥ジクロロメタン(５ｍｌ)に溶解した。乾燥ジクロロメタン(５ｍｌ)中、３−ニトロ安息香酸(３０１ｍｇ、１８ｍｍｏｌ)、ＭＳＮＴ(５３３ｍｇ、１８ｍｍｏｌ)及びルチジン(１８２ｍｇ、１７ｍｍｏｌ)の混合物を加えた。粗生成物を溶出剤として酢酸エチル／ヘキサン(８０：２０、ｖ／ｖ)を用いるシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。
【０１５４】
ジクロロメタン(２ｍｌ)中、精製生成物メチル３−(３−ニトロフェニル)−３−オキソ−２−トリフェニルホスホラニリデン−プロパノエート(１９３ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ)の溶液にジメチルジオキシラン(１．２ｍｍｏｌ)を加えた。粗生成物を、溶出剤として酢酸エチル／ヘキサン(５０：５０、ｖ／ｖ)を用いるシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。
【０１５５】
精製生成物メチル２，２−ジヒドロキシ−３−(３−ニトロフェニル)−３−オキソ−プロパノエート(９５ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ)をエタノール(１０ｍｌ)に溶解し、４−ヒドラジニルベンゼンスルホン酸１／２水和物(９９ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ)及び塩酸(３７％、０．１ｍｌ)を加えた。反応時間(１６時間)の後、溶媒を真空除去した。残渣は、メチル３−(３−ニトロフェニル)−３−オキソ−２−(２−(４−スルホフェニル)ヒドラゾノ)−プロパノエートを含んでいた。
【０１５６】
この粗生成物(１４２ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ)をエタノール(１０ｍｌ)に溶解し、フェニルヒドラジン(４５ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ)及び塩酸(３６〜３８％、０．１ｍｌ)を加えた。６１ｍｇの生成物４−((１，５−ジヒドロ−３−(３−ニトロフェニル)−５−オキソ−１−フェニル−４Ｈ−ピラゾール−４−イリデン)−ヒドラジノ)−ベンゼンスルホン酸を橙色固体として濾過によって単離した(収率３７％)。
【０１５７】
ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ４６６．０［Ｍ＋Ｈ+］
1Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ6，３００ＭＨｚ)：δ＝８．６６−８．６３(ｍ，１Ｈ，ＮＯ2−Ｐｈ)、８．２１−８．１８(ｍ，３Ｈ，ＮＯ2−Ｐｈ)、７．７７−７．６０(ｍ，６Ｈ，ＳＯ3Ｈ−Ｐｈ及びＰｈ)、７．４３−７．３８(ｍ，２Ｈ，Ｐｈ)、７．１４−７．０９(ｍ，１Ｈ，Ｐｈ)。
13Ｃ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ6，７５ＭＨｚ)：δ＝１８５．４５、１５５．３８、１４７．７５、１４５．４０、１４４．２６、１４０．２９、１３５．８６、１３２．９３、１２９．４８、１２８．４１、１２６．０３、１２３．３６、１２２．５４、１２２．１３、１１９．６１、１１８．４８。
【０１５８】
実施例１０：化合物II−８の合成
粗生成物メチル３−(４−ニトロフェニル)−３−オキソ−２−(２−(４−スルホフェニル)ヒドラゾノ)−プロパノエート(１０２ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ)(II−１について記載したように合成した)を、エタノール(１０ｍｌ)に溶解し、４−トリフルオルメチルフェニルヒドラジン(５３ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ)及び塩酸(３７％、０．１ｍｌ)を加えた。４４ｍｇの生成物４−((１，５−ジヒドロ−３−(４−ニトロフェニル)−５−オキソ−１−(４−トリフルオルメチルフェニル)−４Ｈ−ピラゾール−４−イリデン)−ヒドラジノ)−ベンゼンスルホン酸を、橙色固体として濾過によって単離した(収率３４％)。
【０１５９】
ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ５３４．２［Ｍ＋Ｈ+］
1Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ6，３００ＭＨｚ)：δ＝８．４７−８．４０(ｍ、４Ｈ)、８．２７−８．２４(ｍ、２Ｈ)、７．７３−７．６４(ｍ、６Ｈ)。
13Ｃ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ6，７５ＭＨｚ)：δ＝１６０．２５、１５７．１１、１４８．７１、１４７．８６、１４６．５３、１４４．６８、１４０．８２、１３５．６９、１２８．２０、１２７．０６、１２６．３７、１２５．５２、１２４．０６、１２１．４７、１１８．０７。
【０１６０】
実施例１１：化合物II−９の合成
メチル２−(トリフェニルホスホラニリデン)−アセテート(５０２ｍｇ、１５ｍｍｏｌ)を乾燥ジクロロメタン(５ｍｌ)に溶解した。乾燥ジクロロメタン(５ｍｌ)中、４−クロロ安息香酸(２８２ｍｇ、１８ｍｍｏｌ)、ＭＳＮＴ(５３３ｍｇ、１８ｍｍｏｌ)及びルチジン(１８２ｍｇ、１７ｍｍｏｌ)の混合物を加えた。粗生成物を、溶出剤として酢酸エチル／ヘキサン(４０：６０、ｖ／ｖ)を用いるシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。
【０１６１】
ジクロロメタン２ｍｌ中、精製生成物メチル３−(４−クロロフェニル)−３−オキソ−２−トリフェニルホスホラニリデン−プロパノエート(１８９ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ)の溶液に、ジメチルジオキシラン(１．２ｍｍｏｌ)を加えた。粗生成物を、溶出剤として酢酸エチル／ヘキサン(３０：７０、ｖ／ｖ)を用いるシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。精製生成物メチル２，２−ジヒドロキシ３−(４−クロロフェニル)−３−オキソ−プロパノエート(１０４ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ)をエタノール(１０ｍｌ)に溶解し、４−ヒドラジニルベンゼンスルホン酸１／２水和物(１０８ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ)及び塩酸(３７％、０．１ｍｌ)を加えた。反応時間(１６時間)の後、溶媒を真空除去した。残渣は、メチル３−(４−クロロフェニル)−３−オキソ−２−(２−(４−スルホフェニル)ヒドラゾノ)−プロパノエートを含んでいた。この粗生成物(１５９ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ)をエタノール(１０ｍｌ)に溶解し、フェニルヒドラジン(５２ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ)及び塩酸(３７％、０．１ｍｌ)を加えた。３４ｍｇの生成物４−((１，５−ジヒドロ−３−(４−クロロフェニル)−５−オキソ−１−フェニル−４Ｈ−ピラゾール−４−イリデン)−ヒドラジノ)−ベンゼンスルホン酸を褐色固体として濾過によって単離した(収率２１％)。
【０１６２】
ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ４５５．０［Ｍ＋Ｈ+］
1Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ6，３００ＭＨｚ)：δ＝８．２４−８．１７(ｍ，４Ｈ)、７．６１−７．４８(ｍ，６Ｈ)、７．４０−７．３５(ｍ，２Ｈ，Ｐｈ)、７．１１−７．０６(ｍ，１Ｈ，Ｐｈ)。
13Ｃ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ6，７５ＭＨｚ)：δ＝１５５．５２、１４５．２１、１４０．５０、１３３．２２、１２９．１８、１２８．３１、１２７．９２、１２６．００、１１９．４３、１１８．２５。
【０１６３】
実施例１２：化合物II−１０の合成
粗生成物メチル３−(４−ニトロフェニル)−３−オキソ−２−(２−(４−スルホフェニル)ヒドラゾノ)−プロパノエート(２００ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ)(II−１について記載したように合成した)をエタノール(１０ｍｌ)に溶解し、４−ヒドラジノ安息香酸(９０ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ)及び塩酸(３７％、０．２ｍｌ)を加えた。生成物４−((１，５−ジヒドロ−３−(４−ニトロフェニル)−５−オキソ−１−(４−エトキシカルボニルフェニル)−４Ｈ−ピラゾール−４−イリデン)−ヒドラジノ)−ベンゼンスルホン酸を橙色固体として濾過によって単離した(収率５４％)。
【０１６４】
ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ５３８．２［Ｍ＋Ｈ+］
1Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ6，３００ＭＨｚ)：δ＝８．４５−８．３８(ｍ，４Ｈ，ＣＯＯＲ−Ｐｈ)、８．１８−８．０４(ｍ，４Ｈ，ＮＯ2−Ｐｈ)、７．７３−７．６５(ｍ，４Ｈ，ＳＯ3Ｈ−Ｐｈ)、４．１６(ｍ，２Ｈ，ＣＨ2)、１．３３(ｍ，１Ｈ，ＣＨ3)。
13Ｃ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ6，７５ＭＨｚ)：δ＝１６５．０６、１５７．１１、１４７．８４、１４６．４８、１４４．６３、１４１．２３、１４０．８３、１３５．７０、１３０．３７、１２８．１８、１２７．０７、１２６．２４、１２６．０３、１１７．４５、６０．７０、１４．１７。
【０１６５】
実施例１３：化合物II−１１の合成
粗生成物メチル３−(４−ニトロフェニル)−３−オキソ−２−(２−(４−スルホフェニル)ヒドラゾノ)−プロパノエート(２００ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ)(II−１について記載したように合成した)をエタノール(１０ｍｌ)に溶解し、４−フルオロフェニルヒドラジン(９６ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ)及び塩酸(３７％、０．２ｍｌ)を加えた。生成物４−((１，５−ジヒドロ−３−(４−ニトロフェニル)−５−オキソ−１−(４−フルオロフェニル)−４Ｈ−ピラゾール−４−イリデン)−ヒドラジノ)−ベンゼンスルホン酸を褐色固体として濾過によって単離した(収率８２％)。
【０１６６】
ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ４８３．９［Ｍ＋Ｈ+］
1Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ6，３００ＭＨｚ)：δ＝８．４９−８．３８(ｍ，４Ｈ，Ｆ−Ｐｈ，ＮＯ2−Ｐｈ)、８．０３−７．９９(ｍ，２Ｈ，ＮＯ2−Ｐｈ)、７．７６−７．６４(ｍ，４Ｈ，ＳＯ3Ｈ−Ｐｈ)、７．３８−７．３３(ｍ，２Ｈ，Ｆ−Ｐｈ)。
13Ｃ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ6，７５ＭＨｚ)：δ＝１４７．７２、１４３．７８、１４０．８６、１３７．４８、１３５．９０、１２８．０３、１２７．０７、１２６．２３，１２４．０７、１２０．６４、１１７．４５、１１６．１９。
【０１６７】
実施例１４：化合物II−１２の合成
４−((１，５−ジヒドロ−３−(４−ニトロフェニル)−５−オキソ−１−(４−エトキシカルボニルフェニル)−４Ｈ−ピラゾール−４−イリデン)−ヒドラジノ)−ベンゼンスルホン酸(５３ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ)(II−１０)を水(２ｍｌ)及びエタノール(４ｍｌ)に溶解した。水酸化カリウム(１９ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ)を加えた。反応混合物を還流下１１０℃で４時間煮沸した。続いて、反応混合物に塩酸(３７％、０．３ｍｌ)を注意深く滴下した。形成された沈澱物は、４−((１，５−ジヒドロ−３−(４−ニトロフェニル)−５−オキソ−１−(４−カルボキシフェニル)−４Ｈ−ピラゾール−４−イリデン)−ヒドラジノ)−ベンゼンスルホン酸を含んでおり、これを赤色固体として濾過によって単離した(収率４８％)。
【０１６８】
ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ５１０．００［Ｍ＋Ｈ+］
1Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ6，３００ＭＨｚ)：δ＝８．４９−８．４２(ｍ，４Ｈ，ＣＯＯＨ−Ｐｈ)、８．２０−８．０７(ｍ，４Ｈ，ＮＯ2−Ｐｈ)、７．７３−７．６６(ｍ，４Ｈ，ＳＯ3Ｈ−Ｐｈ)。
13Ｃ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ6，７５ＭＨｚ)：δ＝１６６．６５、１５７．１３、１４７．８５、１４４．６１、１４１．０１、１３５．７７、１２８．２２、１２７．２４、１２７．０６、１２６．１１、１２４．０９、１１７．５０。
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】式Ｉの化合物の構造活性関係を示す図である。ＩＣ５０値(μＭでの)は実施例１に従って求めた。ＭＤＣＫ細胞の散乱の阻害は、実施例２に従って求めた；「＋＋＋」は、１５μＭの示される化合物を用いて、散乱の完全又はほぼ完全な(９０〜１００％)阻害を表し、「＋＋」は中間の阻害(５０〜９０％)を表し、「＋」は弱い阻害(１０〜４０％)を表し、「−」は極めて弱い阻害か、阻害が無いこと(０〜１０％)を表す。本発明の式(Ｉ)の対象でない化合物Ｉ−３及びＩ−４は、比較理由のために調べた。
【図２】式IIの化合物の構造活性関係を示す図である。ＩＣ５０値(μＭでの)は実施例１に従って求めた。ＭＤＣＫ細胞の散乱の阻害は、実施例２に従って求めた；「＋＋＋」は、１５μＭの示される化合物を用いて、散乱の完全又はほぼ完全な(９０〜１００％)阻害を表し、「＋＋」は中間の阻害(５０〜９０％)を表し、「＋」は弱い阻害(１０〜４０％)を表し、「−」は極めて弱い阻害か、阻害がないこと(０〜１０％)を表す。本発明の式(II)の対象でない化合物II−４及びII−５は、比較理由のために調べた。
【図３】ＨＧＦ／ＳＦ散乱アッセイを示す図である。ＭＤＣＫ細胞の散乱の阻害は、本発明の化合物Ｉ−１及びＩＩ−１を用い、実施例２に従って実施した。
【図４】ＨＧＦ／ＳＦリン酸化アッセイを示す図である。  Ａ：ＭＡＰキナーゼＥｒｋ１及びＥｒｋ２のリン酸化の阻害は、本発明の化合物II−１を用い、実施例３に従って実施した。「II−１」は、μＭ／Ｌでの化合物II−１の濃度を示す。「ＨＧＦ」は、溶解前の数分におけるＭＤＣＫ細胞の刺激を示す。「Ｐ−Ｅｒｋ１／２」は、トレオニン２０２及びチロシン２０４でリン酸化されたＭＡＰキナーゼｐ４４／Ｅｒｋ１(上部バンド)又はｐ４２／Ｅｒｋ２(下部バンド)に対する抗体を用いたウエスタンブロットシグナルを示す。「Ｅｒｋ１／２」は、リン酸化されているか、又はリン酸化されていないＭＡＰキナーゼｐ４４／Ｅｒｋ１(上部バンド)又はｐ４２／Ｅｒｋ２(下部バンド)に対する抗体を用いたウエスタンブロットシグナルを示す。  Ｂ：Ｅｒｋ１のリン酸化シグナル(「Ｐ−Ｅｒｋ１」)の強度を、Ｅｒｋ１のシグナル(「Ｅｒｋ１」)と比較して定量化し、「Ｐ−Ｅｒｋ１／Ｅｒｋ１」として％で表した。化合物II−１の濃度は、白色(０μＭ)、薄灰色(５μＭ)、灰色(１０μＭ)及び濃い灰色(２０μＭ)で示されている。「ＨＧＦ」は上記に示されている。ＭＡＰキナーゼリン酸化の持続は、化合物II−１によって用量依存的に阻害されることは留意される。
【図５】化合物II−１を用いるＭＴＴアッセイを示す図である。種々のヒト腫瘍細胞株(以下に示される、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＨＣＴ−１１６、ＨＣＴ−１５、ＨＴ−２９、ＰＣ−３及びＮＣＩ−Ｈ６６１)の増殖の阻害を、本発明の化合物II−１を用い、実施例４に従って実施した。化合物II−１の濃度は、それぞれ白色(０μＭ)及び黒色(３０μＭ)で示されている。
【図６】化合物II−１を用いる軟寒天アッセイを示す図である。種々のヒト腫瘍細胞株(以下に示される、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＨＣＴ−１１６、ＨＣＴ−１５、ＨＴ−２及びＰＣ−３)のコロニー形成の阻害を、本発明の化合物II−１を用い、実施例５に従って実施した。  Ａ．実施例５に従って、概ね、３週間後にコロニーの代表的な顕微鏡像を撮った。化合物II−１の濃度は左側に示されている。  Ｂ．コロニーサイズの定量化(相対ピクセル値での)を実施例５に従って実施した。化合物II−１の濃度は、それぞれ、白色(０μＭ)、灰色(１５μＭ)及び黒色(３０μＭ)で示されている。
【図７】化合物II−１で処理した腫瘍細胞株ＮＣＩ−Ｈ６６１を用いるＨＧＦ／ＳＦリン酸化アッセイを示す図である。ＭＡＰキナーゼＥｒｋ１及びＥｒｋ２のリン酸化の阻害は、本発明の化合物II−１を用い、実施例６に従って実施した。「II−１」は、μＭ／Ｌでの化合物II−１の濃度を示す。「ＨＧＦ」は、溶解前数分におけるＮＣＩ−Ｈ６６１細胞の刺激を示す。「Ｐ−Ｅｒｋ１／２」は、トレオニン２０２及びチロシン２０４でリン酸化されたＭＡＰキナーゼｐ４４／Ｅｒｋ１(上部バンド)又はｐ４２／Ｅｒｋ２(下部バンド)に対する抗体を用いたウエスタンブロットシグナルを示す。「Ｅｒｋ１／２」は、リン酸化されているか、又はリン酸化されていないＭＡＰキナーゼｐ４４／Ｅｒｋ１(上部バンド)又はｐ４２／Ｅｒｋ２(下部バンド)に対する抗体を用いたウエスタンブロットシグナルを示す。ＮＣＩ−Ｈ６６１細胞[ＳＨＰ２／ＰＴＰＮ１１遺伝子において推定活性化突然変異Ｎ５８Ｓを含む；ベンタイアーズ−アリー(Bentires-Alj)、Ｍら、キャンサー・リサーチ(Cancer Research)６４、８８１６〜８８２０頁、２００４参照のこと]におけるＭＡＰキナーゼリン酸化の持続は、化合物II−１によって用量依存的に阻害されることは留意される。  参考文献  ベネット(Bennett)，Ａ．Ｍ．、ハウスドルフ(Hausdorff)，Ｓ．Ｆ．、オーライリ(O'Reilly)，Ａ．Ｍ．、フリーマン(Freeman)，Ｒ．Ｍ．及びニール(Neel)，Ｂ．Ｇ．(１９９６)。Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ＳＨＰＴＰ２  ｉｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．モレキュラー・セル・バイオロジー(Molecular Cell Biology)１６、１１８９〜１２０２頁。  ビルヒマイヤー(Birchmeier)，Ｃ、ビルヒマイヤー(Birchmeier)，Ｗ．、ゲラルディ(Gherardi)，Ｅ．及びヴァンデヴァウデ(Vande Woude)，Ｇ．Ｆ．(２００３)。Ｍｅｔ、ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，ｍｏｔａｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｏｒｅ．ネイチャー・レビューズ・モレキュラー・セル・バイオロジー(Nature Reviews Molecular Cell Biology)４、９１５〜９２５頁。  ヒュイスドゥイネン(Huijsduijnen)，Ｒ．Ｈ．ｖ．、ザウアー(Sauer)，Ｗ．Ｈ．、ボムラン(Bombrun)、Ａ．及びスウィネン(Swinnen)、Ｄ．(２００４)。Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １Ｂ  ａｓ  ａｎｔｉｄｉａｂｅｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ．ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー(Journal of Medicinal Chemistry)４７、４１４２〜４１４６頁。  ジェファーズ(Jeffers)，Ｍ．、フィセラ(Fiscella)，Ｍ．、ウェブ(Webb)，Ｃ．Ｐ．、アンバー(Anver)，Ｍ．、コッケポア(Koochekpour)、Ｓ．及びヴァンデヴァウデ(Vande Woude)，Ｇ．Ｆ．(１９９８)。Ｔｈｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｍｅｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｍｏｔａｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ジ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America)９５、１４４１７〜１４４２２頁。  コダマ(Kodama)，Ａ．、マトザキ(Matozaki)，Ｔ．、フクハラ(Fukuhara)，Ａ．、キキョー(Kikyo)，Ｍ．、イチハ���(Ichihashi)，Ｍ．及びタカイ(Takai)，Ｙ．(２０００)。Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ＳＨＰ−２−Ｒｈｏ  ｓｍａｌｌ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ／ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ．モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・セル(Molecular Biology of the Cell)１１、２５６５〜２５７５頁。  モロッティ(Morotti)，Ａ．、ミラ(Mila)，Ｓ．、アコメロ(Accomero)，Ｐ．、タグリアビュー(Tagliabue)，Ｅ．及びポンゼット(Ponzetto)，Ｃ．(２００２)。Ｋ２５２ａ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｍｅｔ、ｔｈｅ  ＨＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．オンコジーン(Oncogene)２１、４８８５〜４８９３頁。  シェーパー(Schaeper)，Ｕ．、ゲーリング(Gehring)，Ｎ．Ｈ．、フックス(Fuchs)，Ｋ．Ｐ．、ザックス(Sachs)，Ｍ．、ケンケス(Kempkes)，Ｂ．及びビルヒマイヤー(Birchmeier)，Ｗ．(２０００)。Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｇａｂ１  ｔｏ  ｃ−Ｍｅｔ，Ｇｒｂ２，ａｎｄ  Ｓｈｐ２  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー(Journal of Cell Biology)１４９、１４１９〜１４３２頁。  ウェブ(Webb)，Ｃ．Ｐ．、ホース(Hose)，Ｃ．Ｄ．、コッケポー(Koochekpour)，Ｓ．、ジェファーズ(Jeffers)，Ｍ．、オスカーソン(Oskarsson)，Ｍ．、ザウスヴィレ(Sausville)，Ｅ．、モンクス(Monks)，Ａ．及びヴァンデヴァウデ(Vande Woude)，Ｇ．Ｆ．(２０００)．  Ｔｈｅ  ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎｓ  ａｒｅ  ｐｏｔｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ／ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ−ｍｅｔ−ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｐｌａｓｍｉｎ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｎｅｔｗｏｒｋ．キャンサー・リサーチ(Cancer Research)６０、３４２〜３４９頁。  ベンタイアーズ−アリー(Bentires-Alj)，Ｍ．、パエス(Paez)，Ｊ．Ｇ．、デイビッド(David)，Ｆ．Ｓ．、ケイルハック(Keilhack)，Ｈ．、ハルモス(Halmos)，Ｂ．、ナオキ(Naoki)，Ｋ．、マリス(Maris)，Ｊ．Ｍ．、リチャードソン(Richardson)，Ａ．、バルデリ(Bardelli)，Ａ．、シュガーベーカー(Sugarbaker)，Ｄ．Ｊ．ら(２００４)。Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｏｎａｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ＳＨＰ２／ＰＴＰＮ１１  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．キャンサー・リサーチ(Cancer Research)６４、８８１６〜８８２０頁。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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