(57)【要約】  本発明は、組織損傷を最小限に留める又は予防するための手段としてｐＨ低下事象の前、最中及び後に使用されるべきｐＨ依存性化合物の選択のための改良法の分野にある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において虚血性又は低酸素障害を治療又は予防するのに有用な化合物を同定するための方法であって、
（ｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により１５％を超えて変化しないように、少なくとも５回効力促進実験を繰り返すことにより、細胞において生理的ｐＨ対疾患誘導性低ｐＨでの化合物の効力促進を評価することと；
（ｉｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により５％を超えて変化しないように、少なくとも１２回実験を繰り返すことにより、一時的局所性虚血の動物モデルにおいて化合物を試験し、梗塞体積における化合物の影響を測定することと；
（ｉｉｉ）段階（ｉ）に従い少なくとも５の効力促進を有し、段階（ｉｉ）に従い梗塞体積を少なくとも３０％低下させる化合物を選択することと；
を含む方法。
【請求項２】
ｐＨを低下させる疾患を治療又は予防するために化合物を選択するための方法であって、該化合物は、（ｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により１５％を超えて変化しないように、少なくとも５回効力促進実験を繰り返すことにより、細胞において生理的ｐＨ対疾患誘導性低ｐＨでの化合物の効力促進を評価する実験において求めた場合に、少なくとも５の効力促進を示し、（ｉｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により５％を超えて変化しないように少なくとも１２回実験を繰り返すことにより調べ、局所性虚血の動物モデルにおいて測定した場合、梗塞体積を少なくとも３０％低下させるものである、方法。
【請求項３】
哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細胞がグルタミン酸受容体を発現する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
グルタミン酸受容体がＮＭＤＡ受容体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＮＭＤＡ受容体が、ＮＲ１サブユニット及び、ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ、ＮＲ２Ｃ及びＮＲ２Ｄ又は何らかのそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１個のＮＲ２サブユニットを含有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＮＭＤＡ受容体が、ＮＲ１サブユニット及び、ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ、ＮＲ２Ｃ及びＮＲ２Ｄ、ＮＲ３Ａ及びＮＲ３Ｂ又は何らかのそれらの組み合わせからなる群から選択される、ＮＲ２又はＮＲ３サブユニットを含有する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
グルタミン酸受容体が、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６、ＧｌｕＲ７、ＫＡ１、ＫＡ２、デルタ−１及びデルタ−２からなる群から選択されるグルタミン酸受容体サブユニットを含有する、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
化合物が、
【化１】
2008511004.tif 000054
である請求項１又は請求項２に記載の化合物ならびに、医薬的に許容される、それらの、塩、エステル、鏡像異性体、鏡像異性混合物及び混合物。
【請求項１０】
化合物が、
【化２】
2008511004.tif 000055
ならびに、医薬的に許容されるそれらの塩である、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
疾患が虚血性又は低酸素障害である、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
疾患が、神経因性疼痛又は関連疾患である、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
疾患が脳腫瘍である、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
疾患がてんかんである、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
疾患が神経変性疾患である、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
虚血性又は低酸素障害が、脳卒中、くも膜下出血後の血管けいれん、外傷性脳損傷、バイパス手術後の認知障害、頸動脈血管形成術後の認知障害；及び低体温循環停止後の虚血からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
神経因性疼痛又は関連疾患が、末梢性糖尿病性神経障害、ヘルペス後神経痛、複合性局所疼痛症候群、末梢神経障害、癌性神経因性疼痛、化学療法誘発性神経因性疼痛、神経因性腰痛、ＨＩＶ神経因性疼痛、三叉神経痛及び中枢脳卒中後疼痛からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
神経変性疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病及び筋萎縮性側索硬化症からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
虚血性又は低酸素障害が脳卒中である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
虚血性又は低酸素障害がくも膜下出血後の血管けいれんである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
化合物が認知機能障害を引き起こさない、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項２２】
認知機能障害が精神病様症状である、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織損傷を最小限に留める又は予防するための手段としてｐＨ低下事象の前、最中及び後に使用されるべきｐＨ依存性化合物の選択のための改良法の分野にある。
【背景技術】
【０００２】
神経細胞又はニューロンは、様々な中枢神経系（ＣＮＳ）領域中で周囲から中枢神経系（ＣＮＳ）へと、及びＣＮＳからその他の器官（つまり末梢）へと、シグナルを伝達する。このシグナル伝達には、主に神経伝達物質と呼ばれる小分子が介在する。一般に、神経伝達物質は、興奮性及び抑制性の何れかに分類することができる。興奮性神経伝達物質は、シグナル受容（つまりシナプス後）ニューロンの活性（例えば発火頻度）を向上させ、抑制性神経伝達物質はそれを低下させる。ニューロンは、神経伝達物質により運ばれるシグナルを認識、統合及び伝達する能力が様々である。例えば、あるニューロンは連続的にある速度で発火し、したがって、周囲の変化に応じて興奮又は抑制させられ得る。他のニューロンは、通常、外部からの刺激がない場合休止している。したがって、それらの活性の何らかの修飾により興奮が起こる。結果として、ニューロンの興奮は、脳機能の調節において基本的役割を果たす。正常な脳の機能を支配する多くの分子の中で、グルタメート（グルタミン酸とも呼ばれる。）は、最も重要なものの１つである。その機能の研究により、脳の働きに対する理解が格段に進歩した。重要なシグナリング分子としてのグルタミン酸の役割が認識されるようになったのはわずかこの２０年のことである。
【０００３】
グルタミン酸はアミノ酸である。他のアミノ酸のように、グルタミン酸は、比較的高濃度で脳中に存在する。結果として、研究者らは、最初、グルタミン酸は主に、ニュローンのシグナル伝達に関係のない多くの細胞性反応の中間代謝産物であると考え、したがってニュローンにおけるその存在が、神経伝達物質としての潜在的な役割の証明であるとは考えなかった。脳におけるグルタミン酸の興奮性機能が最初に指摘されたのは１９５０年代であるが、ニューロンへのグルタミン酸の適用により、試験した実質的に全ての脳の領域において興奮性応答が誘発されたため、これらの知見は最初否定され、この興奮性は特異的応答ではないと考えられた。後になって、科学者らは、ＣＮＳ中に存在する興奮性受容体の活性に寄与し得るため、観察したグルタミン酸の効果がまさに有効であったことを認識した。１９７０年代及び１９８０年代に、研究者らは特異的なグルタミン酸受容体、すなわち、他のニューロンにより分泌されるグルタミン酸に特異的に結合し、それによりシナプス後ニューロンの興奮を導く事象を開始するニューロンの表面におけるタンパク質を同定した。これらのグルタミン酸受容体の同定により、興奮性神経伝達物質としてのグルタミン酸の重要性が強調された。
【０００４】
主にグルタミン酸受容体及びトランスポーターの研究に対する分子生物学的技術の適用により、グルタミン酸作動性シナプスの知識は過去１０年間に大きく進歩してきた。現在、本質的な陽イオン透過性チャネルを伴うイオンチャネル型の受容体の３種類のファミリー、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソオキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）及びカイニン酸受容体があることが知られている。膜イオンチャネル及び、イノシトール３リン酸及びｃＡＭＰなどの二次メッセンジャーにおいて作用するＧタンパク質サブユニットを介してニュローン及びグリアの興奮性を修飾する、代謝調節型、Ｇタンパク質カップリンググルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）の３種類のグループも存在する。さらに、脳において、２種類のグリアのグルタミン酸トランスポーター及び３種類のニュローンのトランスポーターもある。
【０００５】
グルタミン酸は、正常な脳の機能において必須である。グルタミン酸は、認知、運動機能、シナプス可塑性、学習及び記憶の調節において主な役割を果たす。ＮＭＤＡ、ＡＭＰＡ又はｍＧｌｕＲ１受容体のその過剰活性化により、内在性グルタミン酸が高レベルであると、脳損傷の一因となる可能性がある。過剰なグルタミン酸又は興奮毒性に関する脳損傷の例は、てんかん重積状態、脳虚血及び外傷性脳損傷後に見られる。興奮毒性（例えば、グルタミン酸受容体の過剰活性化により引き起こされる毒性）もまた、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、網膜変性及びハンチントン舞踏病などの疾患における慢性神経変性の一因となる。脳虚血及び外傷性脳損傷の動物モデルにおいて、ＮＭＤＡ及びＡＭＰＡ受容体アンタゴニストは、急性脳損傷及び遅発性行動欠陥に対する保護作用を有する。グルタミン酸作動性神経伝達において作用する他の薬物に反応し得るその他の臨床状態としては、てんかん、記憶喪失、神経不安症、痛覚過敏及び精神病が挙げられる（Ｍｅｌｄｒｕｍ  ＢＳ．Ｊ  Ｎｕｔｒ．２０００；１３０（４Ｓ  Ｓｕｐｐｌ）：１００７Ｓ−１５Ｓ）。
【０００６】
ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト
グルタミン酸依存性イオンチャネルのＮＭＤＡサブタイプは中枢神経系においてニューロン間の興奮性シナプス伝達に介在する（Ｄｉｎｇｌｅｄｉｎｅら（１９９９）、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５１：７−６１）。ＮＭＤＡ受容体は、ＮＲ１、ＮＲ２（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）及びＮＲ３（Ａ及びＢ）サブユニットから構成され、それらは、ネイティブのＮＭＤＡ受容体の機能特性を決定する。ＮＲ１サブユニットのみの発現により、機能性受容体は得られない。機能性チャネルを形成するためには、１以上のＮＲ２サブユニットの共発現が必要である。グルタミン酸に加えて、ＮＭＤＡ受容体には、受容体が機能することができるようにするために共アゴニスト、グリシンの結合が必要である。グリシン結合部位はＮＲ１サブユニットにおいて見出され、グルタミン酸結合部位はＮＲ２サブユニットにおいて見出される。ＮＲ３サブユニットはまた、グリシンに結合する。ＮＲ２Ｂサブユニットはまた、ＮＭＤＡ受容体の機能を調節する制御分子であるスペルミン様ポリアミンに対する結合部位も有する。静止膜電位において、ＮＭＤＡ受容体はかなり不活性である。これは、そこでのイオンの流れを妨害する、マグネシウムイオンによる、チャネル孔の電位依存性ブロックのためである。脱分極により、チャネルブロックが解除され、活性化ＮＭＤＡ受容体がシナプス後膜を通ってイオン電流を運ぶことができるようになる。ＮＭＤＡ受容体は、カルシウムイオンならびに他のイオンに対して透過性である。数多くの内在性及び外部化合物により、ＮＭＤＡ受容体が調節される。同様に、ナトリウム、カリウム及びカルシウムイオンは、ＮＭＤＡ受容体チャネルを通るだけでなく、ＮＭＤＡ受容体の活性を調節する。亜鉛は、非競合的に、高親和性及び電位非依存性に、ＮＲ２Ａ含有受容体を介してＮＭＤＡ電流をブロックする。ＮＲ２Ｂ含有ＮＭＤＡ受容体において亜鉛は同様の影響を持つが、効力が小さい。ポリアミンは直接ＮＭＤＡ受容体を活性化しないが、その代わりに、グルタミン酸介在性反応を増強又は阻害するために作用することも分かっている。
【０００７】
脳卒中及び脳外傷の動物モデルにより、罹患ニューロンから放出されるグルタミン酸がＮＭＤＡ受容体を過剰に刺激し得、次いで、ニューロンの死を引き起こすことが確認される。したがって、ＮＭＤＡ受容体をブロックする化合物は、脳卒中又は頭部損傷の治療薬の候補と考えられている。動物実験から、最近、脳卒中、脳及び脊髄損傷における神経保護のための標的としてのＮＭＤＡ受容体及び、脳虚血を含む関連設定が確認された。ＮＭＤＡ受容体ブロッカーは、脳卒中及び外傷性脳損傷の実験モデルにおいて損傷を受けた脳組織体積を抑えるのに効果的である（Ｃｈｏｉ，Ｄ．（１９９８）、Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ  Ｊ  Ｍｅｄ６５：１３３−１３８；Ｄｒｉｎａｇｌｅら（１９９９）Ｔｒ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：３９１−３９７；Ｏｂｒｅｎｏｖｉｔｃｈ，Ｔ．Ｐ．及びＵｒｅｎｊａｋ，Ｊ．（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ１４：６７７）。
【０００８】
脳卒中の初期臨床試験において、多くのＮＭＤＡ受容体アンタゴニストの試験が行われてきた。脳卒中は米国の死因の第三位であり、成人の障害の最大の原因である。虚血性脳卒中は、脳血管が閉塞し、脳の一部への血流が障害される場合に起こる。現在認められている唯一の脳卒中の治療剤である組織プラスミノーゲン活性化因子（「ＴＰＡ」）は、血管中で血栓の溶解を促進する血栓溶解剤である。神経保護薬は、血栓溶解剤療法と同じように興味が持たれてきた（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｃｏｍ／ｎｅｕｒｏ／ｔｏｐｉｃ４８８．ｈｔｍ、Ｌｕｔｓｅｐ及びＣｌａｒｋ「Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｓｔｒｏｋｅ」、２００４年４月３０日）が、しかし、ヒトの治療に対してはまだ承認されていない。
【０００９】
急性脳卒中に対して最もよく研究されている神経保護薬は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体をブロックする。デキストロファン、ＮＭＤＡチャネルブロッカー及び鎮咳剤の構造類似体は、ヒト脳卒中作患者において研究された最初のＮＭＤＡアンタゴニストの１つであった。残念ながら、デキストロファンは、幻視及び興奮ならびに低血圧を引き起こし、その使用に限界があった（Ａｌｂｅｒｓら、Ｓｔｒｏｋｅ（１９９５）２６：２５４−２５８）。競合的ＮＭＤＡアンタゴニストであるセルフォテルは、プラセボ処置群よりも処置患者中で死亡率が高くなる傾向を示し、そのため、試験は中断となった。別のＮＭＤＡ受容体アンタゴニストである、アプチガネルＨＣｌ（セレスタット）の試験は、損益比のために打ち切られた。これらの副作用を避けようと、受容体のグリシン部位で働く間接的ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストが開発された。これらの薬剤は、グリシンが結合するのを妨害し、次いでグルタミン酸が受容体を活性化するのを妨害する。初期の臨床試験から、これらのグリシン部位ＮＭＤＡアンタゴニストにおいて精神異常副作用の発生頻度が少ないことが示唆される。薬剤ＧＶ１５０５２６を用いた大規模な１３６７名の患者の有効性試験が２０００年に完了した。この薬物は安全で耐容性良好であることが報告されたにもかかわらず、３ヶ月の結果測定の何れでも改善が観察されなかった（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｃｏｍ／ｎｅｕｒｏ／ｔｏｐｉｃ４８８．ｈｔｍ、Ｌｕｔｓｅｐ及びＣｌａｒｋ「Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｓｔｒｏｋｅ」、２００４年４月３０日）。
【００１０】
てんかんは、長く、グルタミン酸受容体アンタゴニストに対して可能性のある治療標的と考えられてきた。ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストは、てんかんの多くの実験モデルにおいて抗痙攣薬であることが知られている（Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９９５）Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４７：４７７−５１１；ＭｃＮａｍａｒａ，Ｊ．Ｏ．（２００１）Ｄｒｕｇｓ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｐｉｌｅｐｓｉｅｓ）。Ｇｏｏｄｍａｎ及びＧｌｉｍａｎのＴｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ［Ｊ．Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎ及びＬ．Ｅ．Ｌｉｍｂｉｒｄ編］ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【００１１】
ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストは慢性疼痛の治療に有用であり得る。末梢又は中枢神経の損傷によるものなどの慢性疼痛は、オピオイドを用いてさえも治療が非常に困難であるとされることが多い。ケタミン及びアマンジンを用いた慢性疼痛の治療は有用であることが分かっており、ケタミン及びアマンタジンの鎮痛効果にはＮＭＤＡ受容体のブロックが介在すると考えられている。いくつかのケースの報告において、アマンタジン又はケタミンの全身投与により、外傷誘発性神経因性疼痛の度合いが実質的に低下することが示されている。小規模二重盲検、無作為臨床試験により、アマンタジンが癌患者における神経因性疼痛を顕著に緩和し得（Ｐｕｄら、（１９９８）、Ｐａｉｎ７５：３４９−３５４）、ケタミンが末梢神経損傷（Ｆｅｌｓｂｙら（１９９６）、Ｐａｉｎ  ６４：２８３−２９１）、末梢血管性疾患（Ｐｅｒｒｓｏｎら（１９９８）、Ａｃｔａ  Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉｏｌ  Ｓｃａｎｄ４２：７５０−７５８）の患者又は腎臓ドナー（Ｓｔｕｂｈａｕｎｇら（１９９７）、Ａｃｔａ  Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉｏｌ  Ｓｃａｎｄ  ４１：１１２４−１１３２）の疼痛を緩和し得ることが確認された。繰り返しピンで刺すことにより起こる「ワインドアップ疼痛」もまた劇的に緩和された。これらの知見から、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストを投与することにより、侵害受容により起こる中枢性感作を防ぐことができることが示唆される。
【００１２】
ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストはまた、パーキンソン病の治療にも有用であり得る（Ｂｌａｎｄｉｎｉ及びＧｒｅｅｎａｍｙｒｅ（１９９８）、Ｆｕｎｄａｍ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １２：４−１２）。抗パーキンソン病薬、アマンタジンは、ＮＭＤＡ受容体チャネルブロッカーである（Ｂｌａｎｐｉｅｄら（１９９７）、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓ７７：３０９−３２３）。アマンタジンは、効果が限られているため、単独で使用されることは殆どない。しかし、小規模臨床試験から、Ｌ−ＤＯＰＡとの追加治療としてのアマンタジンの価値が明らかになった。アマンタジンは、Ｌ−ＤＯＰＡそのものの抗パーキンソン病効果を低下させることなく、これらの患者においてジスキネジーの重症度を６０％緩和した（Ｖｅｒｈａｇｅｎ  Ｍｅｔｍａｎら、（１９９８）、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ５０：１３２３−１３２６）。同様に、別のＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、ＣＰ−１０１，６０６が、サルモデルにおいてＬ−ＤＯＰＡによるパーキンソン病の症状の緩和を促進した（Ｓｔｅｅｃｅ−Ｃｏｌｌｉｅｒら（２０００）Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１６３：２３９−２４３）。
【００１３】
ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストは、さらに、脳腫瘍の治療においても有用であり得る。急速に成長する脳神経膠腫は、死にゆく細胞が成長した腫瘍に対してスペースを作るように、グルタミン酸を分泌し、ＮＭＤＡ受容体を過剰に活性化することにより、近接するニューロンを死に至らしめ得、腫瘍成長を刺激する細胞性成分を放出し得る。研究により、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストがインビボならびにあるいくつかのインビトロモデルにおいて腫瘍成長速度を低下させ得ることが分かった（Ｔａｋａｎｏ，Ｔ．ら（２００１）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７：１０１０−１０１５；Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｄ．及びＢｒｅｎ，Ｈ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７：９９４−９９５；Ｒｚｅｓｋｉ，Ｗ．ら、（２００１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８：６３７２）。
【００１４】
今まで、ＮＭＤＡ−受容体アンタゴニストが多くの非常に困難な疾患の治療に有用であり得る一方、投与量を制限する副作用により、これらの状態に対するＮＭＤＡ受容体アンタゴニストの臨床での使用が妨げられてきた。ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストの最初の３世代（チャネルブロッカー、グルタミン酸又はグリシンアゴニスト部位の競合的ブロッカー及び非競合アロステリックアンタゴニスト）は、精神病症状及び心臓血管の影響など、毒性のある副作用により臨床での有用性が明らかになっていない。さらに、ＮＭＤＡアンタゴニストの投与から、記憶及び注意における望ましくない影響も与えられ得る。さらに、ケタミンなどのＮＭＤＡ受容体アンタゴニストはまた、統合失調症の症状を彷彿とさせるヒトにおける精神病的状態を引き起こし得る（Ｋｒｙｓｔａｌら（１９９４）、Ａｒｃｈ  Ｇｅｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ５１：１９９−２１４）。さらに、運動失調、認知障害、運動不全、興奮、混乱、眩暈及び低体温は全て、ＮＭＤＡアンタゴニストの投与により起こった。したがって、グルタミン酸アンタゴニストが多くの重篤な疾患を治療する大きな可能性を有するにもかかわらず、副作用の重篤度から、耐容性の良いＮＭＤＡ受容体アンタゴニストを開発し得るという希望を多くが断念することとなってきた（Ｈｏｙｔｅ  Ｌ．ら（２００４）「Ｔｈｅ  Ｒｉｓｅ  ａｎｄ  Ｆａｌｌ  ｏｆ  ＮＭＤＡ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｆｏｒ  Ｉｓｃｈｅｍｉｃ  Ｓｔｒｏｋｅ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」４（２）：１３１−１３６；Ｍｕｉｒ，Ｋ．Ｗ．及びＬｅｅｓ，Ｋ．Ｒ．（１９９５）Ｓｔｒｏｋｅ，２６：５０３−５１３；Ｈｅｒｒｌｉｎｇ，Ｐ．Ｌ．編（１９９７）「Ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｐａｒｓｏｎｓら（１９９８）Ｄｒｕｇ  Ｎｅｗｓ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ＩＩ：５２３  ５６９）。
【００１５】
ｐＨ感受性ＮＭＤＡ受容体
１９８０年代後半、ＮＭＤＡ受容体の新しい特性が発見され、さらに最近、ＮＭＤＡアンタゴニストの新しいクラスを開発するために利用された。ＮＭＤＡ受容体の２つの最も一般的なサブタイプは、生理的ｐＨでプロトンにより約５０％通常阻害されるという特異な特性を有する（Ｔｒａｙｎｅｌｉｓ，Ｓ．Ｆ．及びＣｕｌｌ−Ｃａｎｄｙ，Ｓ．Ｇ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４５：３４７）。プロトンによるＮＭＤＡ受容体の阻害は、ＮＲ２Ｂサブユニット及びＮＲ２Ａサブユニット、ならびにＮＲ１サブユニットでのオルタナティブエクソンスプライシングにより調節される（Ｔｒａｙｎｅｌｉｓら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６８：８７３−８７６；Ｔｒａｙｎｅｌｉｓら（１９９８）、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １８：６１６３−６１７５）。
【００１６】
細胞外ｐＨは、哺乳動物の脳において非常にダイナミックであり、グルタミン酸受容体機能を含め、多数の生化学プロセス及びタンパク質の機能に影響を与える。少なくとも２つの理由のために、ＮＭＤＡ受容体のｐＨ感受性に対する関心が高まっている。第一に、ｐＨ７．４のプロトン阻害のＩＣ５０値は、受容体を生理的ｐＨで持続的抑制下に置く。第二に、ｐＨの変化は、シナプス伝達、グルタミン酸受容体活性化、グルタミン酸受容体取り込み中、及び、より一般的には虚血及び発作の際に、ＣＮＳにおいて詳しく記録されている（Ｓｉｅｓｊｏ，ＢＫ（１９８５）、Ｐｒｏｇｒ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ６３：１２１−１５４；Ｃｈｅｓｔｅｒ，Ｍ（１９９０）、Ｐｒｏｇ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  ３４：４０１−４２７；Ｃｈｅｓｌｅｒ及びＫａｉｌａ（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １５：３９６−４０２；Ａｍａｔｏら（１９９４）、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ  ７２：１６８６−１６９６）。これらの後者の病理状態を伴う酸性化により、ＮＭＤＡ受容体が部分的に阻害され得、それにより、神経毒性（Ｋａｋｕら（１９９３）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０：１５１６−１５１８；Ｍｕｎｉｒ及びＭｃＧｏｎｉｇｌｅ（１９９５）、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １５：７８４７−７８６０；Ｖｏｒｎｏｖら（１９９６）、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ６７：２３７９−２３８９；Ｇｒａｙら（１９９７）、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌ  ９：１８０−１８７；しかし、Ｏ‘Ｄｏｎｎｅｌｌ及びＢｉｃｋｌｅｒ（１９９４）、Ｓｔｒｏｋｅ、２５：１７１−１７７を参照のこと。；Ｔｏｍｂａｕｇｈ及びＳａｐｏｌｓｋｙによる概説（１９９３）、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ６１：７９３−８０３）及び発作の維持（Ｂａｌｅｓｔｒｉｎｏ及びＳｏｍｊｅｎ（１９８８）、Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ（Ｌｏｎｄ）３９６：２４７−２６６；Ｖｅｌｉｓｅｋら（１９９４）、Ｅｘｐ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ１０１：４４−５２）へのそれらの寄与を低下させるネガティブフィードバックが与えられる。グルタミン酸トランスポーターのｐＨ感受性は、酸性化の間に細胞外グルタミン酸レベルが高くなる可能性を高め（Ｂｉｌｌｕｐｓ及びＡｔｔｗｅｌｌ（１９９６）、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ）３７９：１７１−１７３）、それによって、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストを用いた、例えば脳卒中の損傷後治療の機会が増える（Ｔｏｍｂａｕｇｈ及びＳａｐｏｌｓｋｙ（１９９３）、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ６１：７９３−８０３）。
【００１７】
発作中、一時的虚血により、梗塞のコアとなる領域でｐＨが６．４−６．５に劇的に低下し、コア周辺領域で緩やかに低下する。コア領域を取り囲み、外側に広がる周縁部領域では顕著なニューロン損失が起こる。この領域のｐＨは、ｐＨ６．９前後に低下する。ｐＨ誘発性低下は、過剰なグルタミン酸が存在すると促進され、低血糖状態で軽減する（例えば、Ｍｕｔｃｈ及びＨａｎｓｅｎ（１９８４）Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ  ４：１７−２７；Ｓｍｉｔｈら（１９８６）Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ  ６：５７４−５８３；Ｎｅｄｅｒｇａａｒｄら（１９９１）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２６０（Ｐｔ３）：Ｒ５８１−５８８；Ｋａｔｓｕｒａら（１９９２Ａ）Ｅｕｒｏ  Ｊ  Ｎｅｕｒｓｃｉ  ４：１６６−１７６；及びＫａｔｓｕｒａ及びＳｉｅｓｊｏ（１９９８）、ｐＨ  ａｎｄ  Ｂｒａｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ｋａｉｌａ及びＲａｎｓｏｍ編）Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋの「Ａｃｉｄ  ｂａｓｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｉｓｃｈｅｍｉａ」を参照のこと。）。
【００１８】
虚血に加えて、ＮＭＤＡアンタゴニストによる治療による影響を受けやすい、正常及び異常な状態でｐＨが変化する状況の様々なさらなる例がある。一般に、組織細胞外ｐＨはは通常、プロトンの制御ならびに代謝産物の能動的及び受動的な動きにより、脳脊髄液よりも酸性である。細胞外ｐＨにおけるダイナミックな活性依存性の多面的な酸及びアルカリ変化が起こることがほぼ２０年前から知られている。これらの変化は、広範囲にわたる動物標本及び脳領域において記載されている。これらは、複数の分子機構に関連し、代謝性変化、乳酸分泌、陰イオンチャネルを介した重炭酸流出、Ｎａ＋／Ｈ＋及びＣａ２＋／Ｈ＋交換及び酸性化されたベシクルからのプロトン放出を含む。これらは、細胞外緩衝系に依存し、哺乳動物の脳においては重炭酸に大きく依存する。ゆえに、観察されるｐＨ変化の大きさは、ＣＮＳ組織が重炭酸−ＣＯ２を迅速に相互転換する能力に依存することが多い。したがって、これを行う酵素（炭酸脱水酵素）は、達成可能なｐＨ変化のレベルを設定することにおいて役立つ。
【００１９】
神経因性疼痛は脊髄のｐＨ変化を伴う。例えば、仔ラットから単離された脊髄の１回の電気刺激により、０．０５ｐＨ単位のアルカリ性シフトが起こり、１０Ｈｚ刺激後０．１ｐＨ単位のシフトが起こる。酸性化は刺激休止に続いて起こり、この酸性化は、齢数の高い動物ほど大きい（Ｊｅｎｄｅｌｏｖａ及びＳｙｋｏｖａ（１９９１）Ｇｌｉａ  ４：５６−６３）。さらに、カエルの後根の３０−４０Ｈｚ刺激により、インビボで、下方の後角において０．２５ｐＨ単位低下するという最大上限に達する一時的な細胞外酸性化が起こった。細胞外ｐＨ変化は、刺激強度及び頻度により増加した（Ｃｈｖａｔａｌら（１９８８）Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｏｈｅｍｏｓｌｏｖ  ３７：２０３−２１２）。さらに、インビボでの成体ラット脊髄における高頻度（１０−１００Ｈｚ）神経刺激により、細胞外ｐＨの三相性のアルカリ−酸−アルカリシフトが起こった（Ｓｙｋｏｖａら（１９９２）Ｃａｎ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７０：Ｓｕｐｐｌ  Ｓ３０１−３０９）。さらに、急性の侵害刺激（つまむ、押す、熱）をラットの後足に与えると、インビボで下方の後角において０．０１−０．０５ｐＨ単位の一時的酸性化が起こることがわかった（ｌａｍｉｎａｅＩＩＩ−ＶＩＩ）。化学的又は熱による末梢損傷により、０．０５−０．１ｐＨ単位の組織内ｐＨの低下が２時間にわたり延長された。高頻度神経刺激により、アルカリｐＨシフトが起こり、次いで０．２ｐＨ単位の酸性シフトが優性となった（Ｓｙｋｏｖａ及びＳｖｏｂｏｄａ（１９９０）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ５１２：１８１−１８９）。したがって、痛覚繊維の発火が増えることにより、脊髄の後角のｐＨ低下（酸性化）が起こり得る。この酸性化により、この領域でのｐＨ依存性ブロッカーの有効性が向上し、それにより、慢性神経損傷又は慢性疼痛症候群の治療において有用となる。
【００２０】
視床下部ニューロンはパーキンソン病において過剰に活性であり、その結果、局所的ｐＨが低くなり得る。このようなｐＨ低下により、この領域でのｐＨ感受性アンタゴニストの効力が増強する。脳領域において、ニューロンの活性と細胞外ｐＨとの間に相関がある（活性が酸性化を引き起こす。）。脳スライスの高頻度刺激により、最初の酸性化が起こり、次いで、アルカリ化が起こり、次いでゆっくりと酸性化する（例えば、Ｃｈｅｓｌｅｒ（１９９０）Ｐｒｏｇ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  ３４：４０１−４２７、Ｃｈｅｓｌｅｒ及びＫａｉｌａ（１９９２）Ｔｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １５：３９６−４０２、及びＫａｉｌａ及びＣｈｅｓｌｅｒ（１９９８）、ｐＨ  ａｎｄ  Ｂｒａｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ｋａｉｌａ及びＲａｎｓｏｍ編）Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋにおける、「Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｅｖｏｋｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ」を参照のこと）。
【００２１】
酸性化はまた、発作の際にも起こる。ＮＭＤＡアンタゴニストは抗痙攣薬であり、したがって、てんかんは、発作の空間的及び時間的境界の外側で不活性でありながら、ｐＨ感受性ＮＭＤＡアンタゴニストが抗痙攣薬として効果的に作用し得る標的となる。広範囲の動物標本における電気記録発作が細胞外ｐＨを変化させることが示されている。例えば、電気的又は化学的に誘発した発作の際に、ネコ歯状回又はラット海馬もしくは歯状回においてｐＨの０．２から０．３６以下の低下が起こり得る。低酸素状態で０．５に近いｐＨのより大幅な低下が起こり得る。これは一般によく認められた知見であり、多くの動物標本及び研究室で再現されている（Ｓｉｅｓｊｏら（１９８５）Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ  ５：４７−５７；Ｂａｌｅｓｔｒｉｎｏ及びＳｏｍｊｅｎ（１９８８）Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３９６：２４７−２６６；及びＸｉｏｎｇ及びＳｔｒｉｎｇｅｒ（２０００）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ  ８３：３５１９−３５２４）。
【００２２】
さらに、他のタイプの脳損傷の結果、酸性化が起こり得る。「Ｓｐｒｅａｄｉｎｇ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ（拡延性抑圧）」は、脳組織に対する多くの外傷性損傷後に起こる電気的不活性のゆっくりと動く波を述べるために用いられる用語である。脳震盪又は片頭痛の際に拡延性抑圧が起こり得る。拡延性抑圧とともに酸性ｐＨ変化が起こる。例えば過呼吸を介して、全体的な二酸化炭素含量の低下（低炭酸症）により全身的アルカローシスが起こり得る。逆に、呼吸困難又はガス交換もしくは肺機能を損なう状態の際に、血中二酸化炭素の増加（高炭酸症）により全身的アシドーシスが起こり得る。糖尿病性のケトアシドーシス及び乳酸アシドーシスは、糖尿病の３つの最も重篤な急性合併症であり、結果として脳の酸性化を引き起こし得る。さらに、出産の際の胎児仮死が正産期１０００例のうち２５例で起こる。これは、虚血と同様であるが区別される、低酸素症及び脳損傷を含む。
【００２３】
１９９５年まで、ＮＭＤＡ受容体のプロトン感受性特性が、治療薬を開発するための受容体の小分子調節に対する標的として利用され得るか否かは分からなかった。Ｔｒａｙｎｅｌｉｓら（１９９５  Ｓｃｉｅｎｃｅ２６８：８７３）は、最初に、小分子スペルミンがプロトン阻害の軽減によりＮＭＤＡ受容体機能を調節し得ることを報告した。スペルミン、ポリアミンは、プロトンセンサーのｐＫａを酸性値にシフトさせ、生理的ｐＨでの持続的抑制の度合いを低下させるが、これは機能の相乗因子として現れる（Ｔｒａｙｎｅｌｉｓら（１９９５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６８：８７３−８７６；Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｅ（１９９６）、Ｍａｇｎｅｓ  Ｒｅｓ  ９（４）：３１７−３２７）。
【００２４】
１９９８年、フェニルエタノールアミンＮＭＤＡアンタゴニストの作用メカニズムがプロトンセンサーに関与することが分かった。イフェンプロジル及びＣＰ−１０１，６０６は、プロトンに対する受容体の感受性を高め、それにより、プロトン阻害が促進された。よりアルカリに傾いた値へとＮＭＤＡ受容体のプロトンブロックに対するｐＫａをシフトさせることにより、イフェンプロジル結合によって、受容体のより大きな断片が生理的ｐＨにおいてプロトン化され、したがって、阻害される。さらに、イフェンプロジルが、ラット大脳皮質の初代培養においてＮＭＤＡ誘導性興奮毒性のインビトロモデルで試験したところ、高いｐＨ（７．５）よりも、低いｐＨ（６．５）においてより強力であることが分かった。著者らは、脳卒中の治療での用途に対して、コンテクスト依存性のブロッカーが生理的ｐＨで不活性であるが、虚血の際に起こる低いｐＨ値で活性があるように作られ得ると推測した（Ｍｏｔｔら、１９９８  Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １：６５９）。
【００２５】
イフェンプロジルは、局所性脳虚血の動物モデルにおいて神経保護性である（Ｇｏｔｔｉら（１９８８）、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２４７：１２１１−１２２１；Ｄｏｇａｎら（１９９７）、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  ８７（６）：９２１−９２６）。イフェンプロジルは、中大脳動脈閉塞後の哺乳動物において神経保護性であることが示されている。Ｄｏｇａｎらは、ラットにおいて梗塞体積が２２％減少することを報告し、一方、Ｇｏｔｔｉらは、ネコにおいて試験した最大用量で梗塞体積が４２％減少したことを報告した。Ｇｏｔｔｉらはまた、ＳＬ  ８２．０７１５、イフェンプロジル誘導体により、ネコ及びラットにおいて試験した最大用量で梗塞体積が３６−４８％低下したことを報告した。残念ながら、イフェンプロジル及びその類似体のいくつか（エリプロジル及びロペリドールを含む。）（Ｌｙｎｃｈ及びＧａｌｌａｇｈｅｒ（１９９６）、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２７９：１５４−１６１；Ｂｒｉｍｅｃｏｍｂｅら（１９９８）、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２８６（２）：６２７−６３４）は、ＮＭＤＡ受容体に加えてある種のセロトニン受容体及びカルシウムチャネルをブロックし、その臨床での有用性が限定的である（Ｆｌｅｔｃｈｅｒら（１９９５）、Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １１６（７）：２７９１−２８００；ＭｃＣｏｏｌ及びＬｏｖｉｎｇｅｒ（１９９５）、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３４：６２１−６２９；Ｂａｒａｎｎら（１９９８）、Ｎａｕｎｙｎ  Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ  Ａｒｃｈ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３５８：１４５−１５２）。さらに、イフェンプロジル類似体であるエリプロジルは、ＩＫｒの阻害により心再分極を引き延ばし（Ｌｅｎｇｙｅｌら（２００４）Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １４３：１５２−８）、イフェンプロジル及びある種の類似体はまた、カルシウムチャネルを阻害し得る（Ｂｉｔｏｎら（１９９４）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２５７：２９７−３０１；Ｂｉｔｏｎら（１９９５）、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２９４：９１−１００；Ｂａｔｈら（１９９６）、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２９９：１０３−１１２）。イフェンプロジルのいくつかのさらなるＮＭＤＡ受容体選択性誘導体が臨床開発に対して考慮されており、これには、ＣＰ１０１，６０６（Ｍｅｎｎｉｔｉら（１９９７）、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３３１：１１７−１２６）、Ｒｏ２５−６９８１（Ｆｉｓｈｅｒら（１９９７）、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２８３：１２８５−１２９２）及びＲｏ８−４３０４（Ｋｅｗら（１９９８）、Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １２３：４６３−４７２）が含まれる。
【００２６】
これらのアロステリック調節因子に加えて、他のＮＭＤＡアンタゴニストが、局所性虚血の動物モデルにおいて神経保護効果を与えることが示されている（Ｇｉｌｌら（１９９４）Ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｂｒａｉｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ６：２２５−２５６）。これらのＮＭＤＡアンタゴニストは、３種類の機能的クラスに分類される：すなわち、グルタミン酸結合部位の競合的ブロッカー、グリシン結合部位の競合的ブロッカー及びチャネルブロッカーであり、これらは、ヒトにおいて、毒性のある副作用を示すか、又は限られた有効性しか示さない。
【００２７】
（ｉ）セルフォテル、Ｄ−ＣＰＰｅｎｅ（ＳＤＺ  ＥＡＡ  ４９４）及びＡＲ−Ｒ１５８９６ＡＲ（ＡＲＬ  １５８９６ＡＲ）などのグルタミン酸部位の競合的ＮＭＤＡアンタゴニストは、興奮、幻覚、混乱及び昏迷（Ｄａｖｉｓら（２０００）、Ｓｔｒｏｋｅ、３１（２）：３４７−３５４；Ｄｉｅｎｅｒら（２００２）、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２４９（５）：５６１−５６８）；偏執症及びせん妄（Ｇｒｏｔｔａら（１９９５）、Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  ２３７：８９−９４）；精神異常様症状（Ｌｏｓｃｈｅｒら（１９９８）、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ  ２４０（１）：３３−３６）；低い治療可能比（Ｄａｗｓｏｎら（２００１）、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ８９２（２）：３４４−３５０）；アンフェタミン様常同的行為（Ｐｏｔｓｃｈｋａら（１９９９）、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３７４（２）：１７５−１８７）を含む毒性のある副作用を引き起こす。
【００２８】
（ｉｉ）ＨＡ−９６６、Ｌ−７０１，３２４、ｄ−サイクロセリン、ＣＧＰ−４０１１６及びＡＣＥＡ１０２１などのグリシン部位アンタゴニストは、顕著な記憶障害及び運動不全を含む毒性のある副作用を生じる（Ｗｌａｚ，Ｐ．（１９９８）、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｕｌｌ  ４６（６）：５３５−５４０）。
【００２９】
（ｉｉｉ）ＭＫ−８０１及びケタミンを含むＮＭＤＡ受容体チャネルブロッカーは、精神病様の影響（Ｈｏｆｆｍａｎ，ＤＣ（１９９２）、Ｊ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ  Ｇｅｎ  Ｓｅｃｔ  ８９：１−１０）；認知障害（自由再生における減衰、認識記憶及び注意；Ｍａｌｈｏｔｒａら（１９９６）、Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １４：３０１−３０７）；統合失調症様症状（Ｋｒｙｓｔａｌら（１９９４）、Ａｒｃｈ  Ｇｅｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ５１：１９９−２１４；Ｌａｈｔｉら（２００１）、Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２５：４５５−４６７）などの、毒性のある副作用を示し得る。
【００３０】
Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙに対するＷＯ０２／０７２５４２は、卵母細胞アッセイを用いてインビトロで及びてんかんの実験的モデルにおいて試験した場合にｐＨ感受性を示す、ｐＨ依存性ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストのクラスについて述べている。しかし、カエル卵母細胞を用いたインビトロデータは、選択された化合物に対するＩＣ５０測定値が広範囲にわたり、これにより、最適な化合物又はリード化合物の正しい選択が制限された。また、このアッセイは細胞を用いたスクリーニングに限定されたため、ｐＨ依存性アンタゴニストにより引き起こされる実質的な影響を観察するためにインビボでの罹患虚血性組織において十分に大きなｐＨ低下があるか否かを評価することができなかった。さらに、虚血は、特に、コア及び周縁部損傷を伴うインビボ組織に基づく疾患であるため、ｐＨ低下が梗塞のコアから放射状に低下する場合、コアの外側のどの程度遠くまでｐＨ依存性ＮＭＤＡアンタゴニストが影響を与えるか分からなかった。最後に、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストが精神病及びその他の意識変化性の副作用を誘発することが分かっている場合、虚血性ｐＨ低下により起こる神経保護活性の促進が、ｐＨ感受性ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストの緩和効果を観察すること及びＮＭＤＡ−受容体関連副作用を回避することの両方に十分であるか否かが分からなかった。
【００３１】
まとめると、ヒトにおいて耐容性であり得る適切なＮＭＤＡ受容体アンタゴニストを選択するために、薬物は、グルタミン酸神経伝達の正常な機能に顕著な影響を与えてはならず、さらに、病的状態の際にグルタミン酸系の効果的なブロックを与え、それにより、毒性のある副作用を回避しなければならない。さらに、１９９０年代初めから、ｐＨ依存性ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストがこの目的を達成し得ると推定されてきたが、今まで、虚血性損傷のインビボモデルにおいてこの概念は試験されていない。インビトロにおいて低いｐＨでＮＭＤＡ受容体に対する大きな親和性を表すｐＨ依存性選択的ＮＭＤＡアンタゴニストがまた市販薬を与えるのに十分な応答をインビボで示すか否かを予想することは不可能であった。ｐＨ依存性ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストが開発されてきた一方で、ヒトの臨床使用を目的とする薬物選択に対する優れたパラメーターを的確に確立するための、これらの薬物の適切な特性は分かっていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３２】
したがって、本発明の目的は、組織損傷を最小限に留める又は予防するために、インビボでｐＨ低下事象の前、最中及び後に使用されるべきｐＨ依存性化合物の選択のための改良法又はより正確な方法を提供することである。
【００３３】
本発明の別の目的は、インビボで虚血性損傷を治療するのに有用な活性化合物を同定する方法を提供することである。
【００３４】
本発明の目的は、実質的な精神病作用を与えることなく、インビボにおいてｐＨ依存性化合物の十分量を投与することにより、病的なｐＨ低下事象の効果的な治療法を提供することである。
【００３５】
本発明の目的は、実質的な毒性のある影響を与えることなく、インビボでｐＨ依存性化合物の十分量を投与することにより、病的なｐＨ低下事象の効果的な治療法を提供することである。
【００３６】
本発明のさらなる態様は、インビボで病的なｐＨ低下事象を治療するのに有用な化合物及び組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００３７】
（本発明の要約）
発明者らは、例えばヒトなどの哺乳動物の改良薬物療法のための、グルタミン酸受容体に結合するｐＨ依存性化合物の選択に対して優れたパラメーターを確立した。本発明以前に、インビボでのｐＨの破壊的低下に対して十分に保護効果を与えるインビボ使用のための化合物を合理的に選択する方法は分かっておらず、その結果、有害なインビボ効果が生じることとなった。本発明は、効果的な神経保護薬の、非常に必要とされている開発のため、及び使用を促進するために、長年の切実な要求に対する答えを与える。この目的を達成する薬剤がないことは、本発明が必要な証拠である。虚血の動物モデル全体において薬物の性能についてインビトロで候補薬物のｐＨ効力促進における繰り返しデータを慎重に比較することにより、これを達成した。発明者らは、初めて、インビトロでの性能をインビボでの性能と関連付け、ｐＨ低下に関連する広範囲にわたる消耗性疾患の治療又は予防に対する選択基準の適合及び境界（ｍｅｅｔｓ  ａｎｄ  ｂｏｕｎｄｓ）を確立した。発明者らはさらに、本明細書中でさらに述べる方法に従い使用できる活性化合物を提供する。インビボでｐＨ依存性グルタミン酸受容体アンタゴニストの有効性を決定したのは発明者らが最初であると思われる。
【００３８】
本発明のある態様において、（ｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により１５％を超えて変化しないように、少なくとも５回効力促進実験を繰り返すことにより、細胞において生理的ｐＨ対疾患誘導性低ｐＨでの化合物の効力促進を評価することと（例えば、生理的ｐＨでのＩＣ５０／疾患誘導性低ｐＨでのＩＣ５０）；（ｉｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により５％を超えて変化しないように、少なくとも１２回実験を繰り返すことにより、一時的局所性虚血の動物モデルにおいて化合物を試験し、梗塞体積における化合物の影響を測定することと；（ｉｉｉ）段階（ｉ）に従い少なくとも５の効力促進を有し、段階（ｉｉ）に従い梗塞体積を少なくとも３０％低下させる化合物を選択することにより、哺乳動物、特にヒトにおいて虚血性損傷を治療又は予防するのに有用な化合物を同定する方法を提供する。本発明によると、候補薬物は、ヒトでの使用に効果的な薬物であるためのインビトロ及びインビボ基準の両方に合致するか又はそれを超えなければならない。ある実施形態において、グルタミン酸受容体を発現する細胞において効力促進を調べることができる。別の実施形態において、ＮＭＤＡ、ＡＭＰＡ及び／又はカイニン酸受容体を発現する細胞において効力促進を調べることができる。ある実施形態において、細胞はＮＭＤＡ受容体のＮＲ１サブユニット及び少なくとも１個のＮＲ２サブユニットを発現することができる。さらなる実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ｂサブユニットであり得る。別の実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ａサブユニットであり得る。
【００３９】
本発明の別のより一般的な態様において、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストを活性化させる様式においてｐＨを低下させる疾患を治療するために化合物を選択する方法を提供し、この化合物は、（ｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により１５％を超えて変化しないように少なくとも５回効力促進実験を繰り返すことにより、細胞において試験して、生理的ｐＨ対疾患誘導性低ｐＨでの化合物の効力促進を評価する（例えば、生理的ｐＨでのＩＣ５０／疾患誘導性低ｐＨでのＩＣ５０）実験において求めた場合に、少なくとも５の効力促進を示し、（ｉｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により５％を超えて変化しないように少なくとも１２回実験を繰り返すことにより調べた場合、局所性虚血の動物モデルにおいて測定して、梗塞体積の少なくとも３０％の低下を示す。ある実施形態において、グルタミン酸受容体を発現する細胞において効力促進を調べることができる。別の実施形態において、ＮＭＤＡ、ＡＭＰＡ及び／又はカイニン酸受容体を発現する細胞において効力促進を調べることができる。ある実施形態において、細胞は、ＮＭＤＡ受容体のＮＲ１サブユニット及び少なくとも１個のＮＲ２サブユニットを発現することができる。さらなる実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ｂサブユニットであり得る。別の実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ａサブユニットであり得る。
【００４０】
ある特定の実施形態において、９５％信頼区間が新しい実験の追加により１５％を超えて変化しないように少なくとも５回効力促進実験を繰り返すことにより、ＮＲ１／ＮＲ２、ＮＭＤＡ受容体及び／又はＮＲ１／ＮＲ２Ｂ  ＮＭＤＡ受容体を発現する細胞において試験して、生理的ｐＨ対「疾患誘導性低ｐＨ」（例えば、生理的ｐＨにでのＩＣ５０／疾患誘導性低ｐＨでのＩＣ５０）において化合物の効力促進を評価する実験において調べた場合、少なくとも５の効力促進を示す化合物を選択する方法又はこのような化合物を提供する。別の特定の実施形態において、９５％信頼区間が新しい実験の追加により５％を超えて変化しないように、少なくとも１２回実験を繰り返すことにより調べた場合に、局所性虚血の動物モデルにおいて測定して、梗塞体積の少なくとも３０％の減少を示す化合物を選択する方法又はこのような化合物を提供する。別の特定の実施形態において、「疾患誘導性低ｐＨ」は発作などの虚血性疾患に伴う。
【００４１】
図１は、ヒトなどの哺乳動物の改良薬物療法を達成することができる、ＮＭＤＡ−受容体アンタゴニストの選択のための新規パラメーターを説明する。
【００４２】
ある実施形態において、本明細書中に記載のプロセス及び方法に従って選択した化合物は、選択的ＮＲ１／ＮＲ２Ａ  ＮＭＤＡ受容体及び／又はＮＲ１／ＮＲ２Ｂ  ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストである。ある実施形態において、化合物はＮＭＤＡ受容体チャネルブロッカーではない。別の実施形態において、本明細書中に記載のプロセス及び方法に従い選択した化合物はＮＭＤＡ受容体グルタミン酸部位アンタゴニストではない。別の実施形態において、本明細書中に記載のプロセス及び方法に従い選択した化合物はＮＭＤＡ受容体グリシン部位アンタゴニストではない。
【００４３】
さらなる実施形態において、例えば、化合物は、運動不全又は認知機能障害などの実質的な毒性のある副作用を示さない。さらに、又はあるいは、化合物は、少なくとも２以上の治療指数を有する。さらなる追加的又は代替的実施形態において、化合物は、何らかの他のグルタミン酸受容体よりも、ＮＭＤＡ受容体への結合に対して少なくとも１０倍選択性が高い。ある実施形態において、卵母細胞を使用して効力促進を調べる。別の実施形態において、例えばマウスなどのげっ歯類などにおいて、中大脳動脈梗塞モデルを一時的局所性虚血の動物モデルとして使用する。
【００４４】
さらなる実施形態において、化合物は、段階（ｉ）に従い少なくとも６、７、８、９、１０、１５又は２０の効力促進を示し、段階（ｉｉ）に従い梗塞体積を少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％又は６０％減少させる。本発明のある一定の実施形態において、効力促進及び梗塞体積実験に対して、平均つまり、全観察値の合計を観察数で割ったもの、を計算することができ、図１で示すように、化合物の平均値は、生理的ｐＨ対虚血性ｐＨ（つまり、（生理的ｐＨでのＩＣ５０／虚血ｐＨでのＩＣ５０））で少なくとも５の効力促進を示し、梗塞体積の少なくとも３０％の減少を示し得る。
【００４５】
本発明のさらなる態様において、本明細書中に記載のプロセス及び方法に従い選択した化合物は、
【００４６】
【化３】
2008511004.tif 000002
ならびに、医薬的に許容される、それらの、塩、エステル、鏡像異性体、鏡像異性混合物及び混合物であり得る。
【００４７】
別の実施形態において、本明細書中に記載のプロセス及び方法に従い選択した化合物は
【００４８】
【化４】
2008511004.tif 000003
ならびに、医薬的に許容される、それらの、塩、エステル、鏡像異性体、鏡像異性混合物及び混合物であり得る。
【００４９】
別の実施形態において、本明細書中に記載のプロセス及び方法に従い選択した化合物は
【００５０】
【化５】
2008511004.tif 000004
ならびに、医薬的に許容される、それらの、塩、エステル、鏡像異性体、鏡像異性混合物及び混合物であり得る。
【００５１】
さらなる実施形態において、本明細書中に記載のプロセス及び方法に従い選択した化合物は
【００５２】
【化６】
2008511004.tif 000005
ならびに、医薬的に許容される、それらの、塩、エステル、鏡像異性体、鏡像異性混合物及び混合物であり得る。
【００５３】
さらなる実施形態において、本明細書中に記載のプロセス及び方法に従い選択した化合物は、
【００５４】
【化７】
2008511004.tif 000006
ならびに、医薬的に許容される、それらの、塩、エステル、鏡像異性体、鏡像異性混合物及び混合物であり得る。
【００５５】
ある特定の実施形態において、上述の化合物は、ＮＭＤＡ受容体のＮＲ２Ｂサブユニットに結合することができる。別の特定の実施形態において、上記化合物は、ＮＭＤＡ受容体のＮＲ２Ｂサブユニットに対して選択的であり得る。ある実施形態において、例えば図１で示されるように、本明細書中で開示される化合物（Ｓ）９８−５、（Ｓ）９３−４、（Ｓ）９３−８、（Ｓ）９３−３１及び（Ｓ）９３−４１は、ＮＭＤＡ受容体のＮＲ２Ｂサブユニットに結合することができる。別の実施形態において、本明細書中で開示される化合物（Ｓ）９８−５、（Ｓ）９３−４、（Ｓ）９３−８、（Ｓ）９３−３１及び（Ｓ）９３−４１は、ＮＭＤＡ受容体のＮＲ２Ｂサブユニットに対して選択的であり得る。
【００５６】
本明細書中に記載のプロセス又は方法に従い選択される化合物を投与することにより、ｐＨ低下に伴う虚血又は興奮毒性カスケードの進行を抑制するための方法をさらに提供する。さらに、本明細書中に記載のプロセス又は方法に従い選択される化合物を投与することにより、ｐＨ低下に伴う梗塞体積を減少させるための方法と提供する。さらに、本明細書中に記載のプロセス又は方法に従い選択される化合物を投与することにより、ｐＨ低下に伴う細胞死を減少させるための方法を提供する。またさらに、本明細書中に記載のプロセス又は方法に従い選択される化合物を投与することにより、ｐＨ低下に伴う虚血事象に伴う行動の欠陥を軽減する方法を提供する。
【００５７】
本発明のさらなる態様において、本明細書中に記載の方法又はプロセスに従い選択される化合物を投与することにより、患者を治療するための方法を提供する。本明細書中に記載の方法に従い、低ｐＨを誘発するあらゆる疾病、状態及び疾患を治療することができる。
【００５８】
ある実施形態において、本明細書中に記載の方法又はプロセスに従い選択される化合物を投与することにより、虚血性損傷もしくは低酸素症の患者を治療するための、又は虚血性損傷もしくは低酸素症に伴う神経毒性を予防もしくは治療するための方法を提供する。ある特定の実施形態において、虚血性損傷は脳卒中であり得る。別の特定の実施形態において、虚血性損傷はくも膜下出血後の血管けいれんであり得る。他の実施形態において、虚血性損傷は、以下に限定されないが、次の疾患のうちの１つから選択され得る：外傷性脳損傷、バイパス術後の認知障害、頸動脈血管形成術後の認知障害；及び／又は低体温循環停止後の新生児虚血。
【００５９】
別の実施形態において、本明細書中に記載の方法又はプロセスに従い選択される化合物を投与することにより、神経因性疼痛又は関連疾患の患者を治療するための方法を提供する。ある一定の実施形態において、神経因性疼痛又は関連疾患は、以下に限定されないが、末梢性糖尿病性神経障害、ヘルペス後神経痛、複合性局所疼痛症候群、末梢神経障害、化学療法誘発性神経因性疼痛、癌性神経因性疼痛、神経因性腰痛、ＨＩＶ神経因性疼痛、三叉神経痛及び／又は中枢脳卒中後疼痛を含む群から選択され得る。
【００６０】
別の実施形態において、本明細書中に記載の方法又はプロセスに従い選択される化合物を投与することにより、脳腫瘍の患者を治療するための方法を提供する。さらなる実施形態において、本明細書中に記載の方法又はプロセスに従い選択される化合物を投与することにより、神経変性疾患の患者を治療するための方法を提供する。ある実施形態において、神経変性疾患は、パーキンソン病であり得る。別の実施形態において、神経変性疾患は、アルツハイマー病、ハンチントン病及び／又は筋萎縮性側索硬化症であり得る。
【００６１】
さらに、本明細書中に記載の方法又はプロセスに従って選択された化合物を予防的に使用して、本明細書中に記載のものなどの、疾患又は神経症状に対する予防又は保護を行うことができる。ある実施形態において、本明細書中に記載の方法及び化合物を用いて、遺伝性素因など、虚血事象の傾向のある患者を予防的に処置することができる。別の実施形態において、本明細書中に記載の方法及び化合物を用いて、血管けいれんを示す患者を予防的に処置することができる。さらなる実施形態において、本明細書中に記載の方法及び化合物を用いて心臓バイパス術を行った患者を予防的に処置することができる。
【００６２】
図１は、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストの選択のための、組織梗塞体積減少に対する、ｐＨ６．９対７．６でのインビトロの効力促進の比較の例示である。
【００６３】
黒記号により示される化合物に対する、一時的又は永久的局所性虚血事象後にＣ５７Ｂ１／６マウスにおいて梗塞体積を測定した。本明細書中に記載のように、脳室内投与（ＩＣＶ；０．５ｍＭを１μＬ；黒四角）により、又は腹腔内注入（ＩＰ、黒丸；ＮＰ９３−４、３０ｍｇ／ｋｇ；ＮＰ９３−５、１０−３０ｍｇ／ｋｇ、両用量に対する結果は同様であり、したがって組み合わせた；ＮＰ９３−４０、１０−３０ｍｇ／ｋｇ；ＮＰ９３−８、３０ｍｇ／ｋｇ；ＮＰ９３−３１、３ｍｇ／ｋｇ）により薬物を与えた。エラーバーはＳＥＭである。薬物処置動物における梗塞体積を直接測定し、通常同日に虚血にするビヒクル注入対照マウスにおける梗塞体積のパーセントとして表した。白記号は、様々なげっ歯類又はウサギ虚血モデルにおいて文献で述べられているように、ＣＮＳ１１０２（ＣＮ、アプチガネル又はセレスタット、Ｄａｗｓｏｎら、２００１）、デキストロメトルファン（ＤＭ、Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇら、１９９５）、デキストロファン（ＤＸ；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇら、１９９５）、レボメトルファン（ＬＭ；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇら、１９９５）、（Ｓ）ケタミン（ＫＴ；Ｐｒｏｅｓｃｈｏｌｄｔら、２００１）、メマンチン（ＭＭ；Ｃｕｌｍｓｅｅら、２００４）、イフェンプロジル（ＩＦ、Ｄａｗｓｏｎら、２００１）、ＣＰ１０１，６０６（ＣＰ；Ｙａｎｇら、２００３）、ＡＰ７（Ｓｗａｎ及びＭｅｌｄｒｕｍ、１９９０）、セルフォテル（ＣＧＳ１９７５５、Ｄａｗｓｏｎら、２００１）、（Ｒ）ＨＡ９６６（ＨＡ；Ｄａｗｓｏｎら２００１）、レマセミド（ＲＥ、Ｄａｗｓｏｎら、２００１）、ハロペリドール（Ｏ’Ｎｅｉｌｌら、１９９８）、７−Ｃｌ−キヌレニン酸（ＣＫ、Ｗｏｏｄら、１９９２）及びＭＫ８０１の立体異性体（＋ＭＫ又は−ＭＫ；Ｄｒａｖｉｄら、準備中）の投与による梗塞体積の減少を示す。薬物によるニューロン密度の％低下を測定したケタミン及び７−Ｃｌ−キヌレニン酸を除く全化合物に対して、対照における梗塞体積に対する薬物における梗塞体積の比から、梗塞の％減少を計算した。文献（Ｍｏｔｔら、１９９８）から、イフェンプロジル及びＣＰ１０１，６０６に対するｐＨ上昇を調べた。全ての他の化合物に対して、２つの実験で評価した（下記表３参照。）競合的アンタゴニストを除き、ｐＨ６．９対７．６でのＮＲ１／ＮＲ２Ｂ含有ＮＭＤＡ受容体の阻害に対する効力促進を本明細書中に記載のように計算した。化合物の効力が酸性ｐＨにおいて低い場合、効力促進を負の逆数として示す。灰色の陰影部分は、効果的な薬物性能に対する基準の特定されている境界を定義する領域を示す。境界内にある薬物は、灰色のブロック領域内に平均値（エラーバーではない。）を有するものである。試験した２４種類の化合物のうち、１９種類の化合物が本発明の領域の外側となり（灰色の陰影領域）、このことから、試験した化合物の７５％を超えるものが有効なインビボ療法に対する特定標準に合致しないことが示される。
【００６４】
図２は、試験薬物を脳室内投与により与えた場合（ＩＣＶ；黒四角）の、組織梗塞体積保護に対する、ｐＨ６．９対７．６での選択化合物９３−９７、９３−４３、９３−５、９３−４１及び９３−３１のインビトロ効力促進の比較を示す。灰色の陰影領域は、薬物性能向上のための基準の特定された境界を定義する領域を示す。境界内にある薬物は、灰色のブロック領域内に平均値（エラーバーではない。）を有するものである。
【００６５】
図３は、腹腔内注入（ＩＰ、黒丸）により与えた場合の組織梗塞体積保護に対する、ｐＨ６．９対７．６での、５種類の選択化合物９３−４、９３−５、９３−８、９３−３１、９３−４０のインビトロ効力促進の比較を示す。灰色の陰影領域は、薬物性能向上のための基準の特定された境界を定義する領域を示す。境界内にある薬物は、灰色のブロック領域内に平均値（エラーバーではない。）を有するものである。
【００６６】
図４は、選択化合物の、組織梗塞体積に対するｐＨ６．９対７．６でのインビトロ効力促進の例示である。灰色の陰影領域は、薬物性能向上のための基準の特定された境界を定義する領域を示す。右のパネルはＮＲ１／ＮＲ２Ａに対する比較を示し、左のパネルはＮＲ１／ＮＲ２Ｂに対する比較を示す。
【００６７】
図５は、１時間の馴化後２時間にわたり、コンピューターにより数えた光線の中断として定量した、ラットの自発運動における化合物９３−３１及び（＋）ＭＫ−８０１の効果を説明する。自発運動指数は、試験中の光線中断の総数を１０００で割ったものである。化合物９３−３１は、３００ｍｇ／ｋｇ以下の用量でＩＰ投与した場合、自発運動指数に有意な影響を与えず、（＋）ＭＫ−８０１は、低用量で自発運動を誘発し、高用量で運動失調を誘発した。
【００６８】
図６は、神経因性疼痛の動物モデルにおいて、損傷を受けた足が実質的な異痛症を示したことを説明する。ビヒクル群の動物は、試験の全期間にわたり、顕著な機械的異痛症を示した。ビヒクルで処理した動物の損傷足及び正常足における平均値±ＳＥＭ（ｎ＝１０）ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ閾値を示す。足間の差異は、全時間点で有意であった（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。
【００６９】
図７は、化合物９３−３１（ｉ．ｐ．で投与）が正常な手足に影響を与えなかったことを示す。ビヒクル、ガバペンチン又は、化合物９３−３１の３０及び１００ｍｇ／ｋｇ用量でｉ．ｐ．で投与により処理した動物の正常足における平均値±ＳＥＭ（ｎ＝１０−１２）ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ閾値を示す。
【００７０】
図８は、化合物９３−９７（ｉ．ｐ．）が正常な手足に影響を与えなかったことを示す。ＮｅｕｒＯＰ９３−９７は、正常足でのｖｏｎ  Ｆｒｅｙ閾値を変化させなかった。ｉ．ｐ．で投与して、ビヒクル、ガバペンチン又は、化合物９３−９７の３０及び１００ｍｇ／ｋｇ用量で処理した動物の正常足における平均値±ＳＥＭ（ｎ＝１０−１２）ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ閾値を示す。
【００７１】
図９は、ラットでの脊髄神経結紮（ＳＮＬ）モデルにおいて、ｉ．ｐ．投与した化合物９３−３１（１００ｍｇ／ｋｇ）が機械的異痛症を軽減したことを示す。化合物９３−３１（１００ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）での処理によって、その投与後３０及び６０分で無痛覚が観察された。実験を行ったいずれの時間点でも化合物９３−３１の３０ｍｇ／ｋｇ及び９３−３７の３０及び１００ｍｇ／ｋｇの鎮痛効果はなかった。この実験におけるビヒクル群の統計解析から、ベースラインと６０、１２０及び２４０分の時間点との間で、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ閾値の有意差がなかったことが示された（Ｆｒｉｅｄｍａｎ両側ＡＮＯＶＡ）。
【００７２】
図１０は、ｉ．ｐ．投与した化合物９３−３１（１００ｍｇ／ｋｇ）がＳＮＬラットにおいて機械的異痛症を軽減したことを示す。化合物９３−３１試験化合物（１００ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．投与により機械的異痛症が軽減した。ｉ．ｐ．で投与して、ビヒクル、ガバペンチン（参照化合物）又は化合物９３−３１の３０及び１００ｍｇ／ｋｇ用量で処理した損傷足における平均値±ＳＥＭ（ｎ＝１０−１２）ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ閾値を示す。事後解析（Ｄｕｎｎ検定）により、３０及び６０分において化合物９３−３１（１００ｍｇ／ｋｇ）とビヒクル群との間に有意なペアワイズ差が示された（ｐ＜０．０１）。６０、１２０及び２４０分でのガバペンチンの効果もまた有意であった（それぞれ、ｐ＜０．００１、ｐ＜０．０１及びｐ＜０．０１）。
【００７３】
図１１は、げっ歯類脊髄神経結紮モデルでの痛覚閾値の倍の増加に対する、ｐＨ６．９対７．６でのインビトロ効力促進の比較の説明である。本明細書中に記載の各化合物に対して効力促進を調べた。化合物９３−３１の投与後、痛覚閾値を測定した。ＩＦ（イフェンプロジル、Ｄｅ  Ｖｒｙら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４９１：１３７−１４８、２００４）、Ｋ（ケタミン、Ｃｈａｐｌａｎら、ＪＰＥＴ  ２８０：８２９−８３８  １９９７）、ＣＰ（ＣＰ１０１，６０６、Ｂｏｙｃｅら、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３８：６１１−６２３、１９９９）、ＭＫ（ＭＫ８０１、Ｃｈａｐｌａｎら、ＪＰＥＴ２８０：８２９−８３８  １９９７）、Ｄ（デキストロファン、Ｃｈａｐｌａｎら、ＪＰＥＴ２８０：８２９−８３８  １９９７）、ＤＭ（デキストロメトルファン、Ｃｈａｐｌａｎら、ＪＰＥＴ２８０：８２９−８３８  １９９７）及びＭ（メマンチン、Ｃｈａｐｌａｎら、ＪＰＥＴ２８０：８２９−８３８  １９９７）に対する痛覚閾値は既に報告されている。
【００７４】
灰色の陰影領域は、薬物性能向上のための基準の特定された境界を定義する領域を示す。境界内にある薬物は、灰色のブロック領域内に平均値（エラーバーではない。）を有するものである。
【００７５】
（詳細な説明）
発明者らは、例えばヒトなどの哺乳動物の改良臨床性能のための、ＮＭＤＡ−受容体アンタゴニストの選択のための優れたパラメーターを確立した。虚血の動物モデル全体において薬物の性能についてインビトロで候補薬物のｐＨ効力促進における繰り返しデータを慎重に比較することにより、これを達成した。発明者らは、初めて、インビトロでの性能をインビボでの性能と関連付け、ｐＨ低下に関連する広範囲にわたる消耗性疾患の治療又は予防に対する選択基準の適合及び境界（ｍｅｅｔｓ  ａｎｄ  ｂｏｕｎｄｓ）を確立した。発明者らはさらに、本明細書中でさらに述べるプロセスに従い使用できる活性化合物を提供する。インビボでｐＨ依存性グルタミン酸受容体アンタゴニストの有効性を決定したのは発明者らが最初であると思われる。
【００７６】
本発明のある態様において、（ｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により１５％を超えて変化しないように少なくとも５回効力促進実験を繰り返すことにより、細胞において生理的ｐＨ対疾患誘導性低ｐＨでの化合物の効力促進を評価することと（例えば、生理的ｐＨでのＩＣ５０／疾患誘導性低ｐＨでのＩＣ５０）；（ｉｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により５％を超えて変化しないように少なくとも１２回実験を繰り返すことにより、一時的局所性虚血の動物モデルにおいて化合物を試験し、梗塞体積における化合物の影響を測定することと；（ｉｉｉ）段階（ｉ）に従い少なくとも５の効力促進を有し、段階（ｉｉ）に従い梗塞体積を少なくとも３０％低下させる化合物を選択することにより、哺乳動物、特にヒトにおいて虚血性損傷を治療又は予防するのに有用な化合物を同定するプロセスを提供する。本発明によると、候補薬物は、ヒトでの使用に効果的な薬物であるためのインビトロ及びインビボ基準の両方に合致又はそれを超えなければならない。ある実施形態において、グルタミン酸受容体を発現する細胞において効力促進を調べることができる。別の実施形態において、ＮＭＤＡ、ＡＭＰＡ及び／又はカイニン酸受容体を発現する細胞において効力促進を調べることができる。ある実施形態において、細胞はＮＭＤＡ受容体のＮＲ１サブユニット及び少なくとも１個のＮＲ２サブユニットを発現することができる。さらなる実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ｂサブユニットであり得る。別の実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ａサブユニットであり得る。
【００７７】
本発明の別のより一般的な態様において、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストを活性化させる様式においてｐＨを低下させる疾患を治療するために化合物を選択するプロセスを提供するが、この化合物は、（ｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により１５％を超えて変化しないように少なくとも５回効力促進実験を繰り返すことにより、細胞において試験して、生理的ｐＨ対疾患誘導性低ｐＨでの化合物の効力促進を評価する（例えば、生理的ｐＨでのＩＣ５０／疾患誘導性低ｐＨでのＩＣ５０）実験において求めた場合に、少なくとも５の効力促進を示し、（ｉｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により５％を超えて変化しないように少なくとも１２回実験を繰り返すことにより調べた場合、局所性虚血の動物モデルにおいて測定して、梗塞体積を少なくとも３０％低下させる。ある実施形態において、グルタミン酸受容体を発現する細胞において効力促進を調べることができる。別の実施形態において、ＮＭＤＡ、ＡＭＰＡ及び／又はカイニン酸受容体を発現する細胞において効力促進を調べることができる。ある実施形態において、細胞はＮＭＤＡ受容体のＮＲ１サブユニット及び少なくとも１個のＮＲ２サブユニットを発現することができる。さらなる実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ｂサブユニットであり得る。別の実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ａサブユニットであり得る。
【００７８】
本発明の別のより一般的な態様において、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストを活性化させる様式においてｐＨを低下させる疾患を治療するための化合物を選択するプロセスを提供するが、この化合物は、（ｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により１５％を超えて変化しないように少なくとも５回効力促進実験を繰り返すことにより、細胞において生理的ｐＨ対疾患誘導性低ｐＨでの化合物の効力促進を評価する（例えば、生理的ｐＨでのＩＣ５０／疾患誘導性低ｐＨでのＩＣ５０）実験において求めた場合に、少なくとも５の効力促進を示し、（ｉｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により５％を超えて変化しないように少なくとも１２回実験を繰り返すことにより、局所性虚血の動物モデルにおいて測定した場合に梗塞体積を少なくとも３０％低下させる。ある実施形態において、グルタミン酸受容体を発現する細胞において効力促進を調べることができる。別の実施形態において、ＮＭＤＡ、ＡＭＰＡ及び／又はカイニン酸受容体を発現する細胞において効力促進を調べることができる。ある実施形態において、細胞はＮＭＤＡ受容体のＮＲ１サブユニット及び少なくとも１個のＮＲ２サブユニットを発現することができる。さらなる実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ｂサブユニットであり得る。別の実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ａサブユニットであり得る。
【００７９】
ある特定の実施形態において、９５％信頼区間が新しい実験の追加により１５％を超えて変化しないように少なくとも５回効力促進実験を繰り返すことにより、ＮＲ１／ＮＲ２Ａ  ＮＭＤＡ受容体及び／又はＮＲ１／ＮＲ２Ｂ  ＮＭＤＡ受容体を発現する細胞で試験して、生理的ｐＨ対「疾患誘導性低ｐＨ」（例えば、生理的ｐＨでのＩＣ５０／疾患誘導性低ｐＨでのＩＣ５０）において化合物の効力促進を評価する実験において調べた場合、少なくとも５の効力促進を示す化合物を選択するを選択する方法及びこのような化合物を提供する。別の特定の実施形態において、９５％信頼区間が新しい実験の追加により５％を超えて変化しないように少なくとも１２回実験を繰り返すことにより調べた場合に、局所性虚血の動物モデルにおいて測定した梗塞体積を少なくとも３０％減少させる化合物を選択する方法又はこのような化合物を提供する。別の特定の実施形態において、「疾患誘導性低ｐＨ」は、脳卒中などの虚血性疾患に伴う。
【００８０】
本明細書中に記載のプロセス又は方法に従い選択される化合物を投与することにより、ｐＨ低下に伴う虚血又は興奮毒性カスケードの進行を抑えるための方法をさらに提供する。さらに、本明細書中に記載のプロセス又は方法に従い選択される化合物を投与することにより、ｐＨ低下に伴う梗塞体積を減少させるための方法を提供する。さらに、本明細書中に記載のプロセス又は方法に従い選択される化合物を投与することにより、ｐＨ低下に伴う細胞死を減少させるための方法を提供する。またさらに、本明細書中に記載のプロセス又は方法に従い選択される化合物を投与することにより、ｐＨ低下に伴う虚血事象に伴う行動の欠陥を軽減する方法を提供する。他の実施形態において、バキュロゼーション（ｖａｃｕｌｏｚａｔｉｏｎ）など、例えば非行動性副作用もまた軽減することができる。
【００８１】
Ｉ．効力促進の評価
「卵母細胞」という用語は、卵形成の最終産物である成熟した動物の卵子及び卵原細胞である前駆形態（それぞれ一次卵母細胞及び二次卵母細胞）も指す。
【００８２】
「トランスフェクション」とは、宿主細胞へのＤＮＡの導入を指す。細胞は天然にはＤＮＡを取り込まない。したがって、様々な技術的「トリック」を利用して、遺伝子導入を促す。トランスフェクションの多くの方法が当業者にとって公知であり、例えば、ＣａＰＯ４、エレクトロポレーション及び／又は、細胞への直接的なＤＮＡ又はＲＮＡの直接マイクロインジェクションがある（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。宿主細胞の形質転換は、トランスフェクションが成功したことを意味する。
【００８３】
細胞におけるグルタミン酸受容体の発現
本発明のある態様において、グルタミン酸受容体を発現する細胞において効力促進を調べることができる。ある実施形態において、細胞はグルタミン酸受容体を内在的に発現することができる。ある実施形態において、細胞はＮＭＤＡ受容体を発現することができる。別の実施形態において、細胞はＡＭＰＡ受容体を発現することができる。さらなる実施形態において、細胞はカイニン酸受容体を発現することができる。またさらなる実施形態のいて、細胞はオーファングルタミン酸受容体を発現することができる。別の実施形態において、細胞はＮＭＤＡ受容体を内在的に発現することができる。ＮＭＤＡ受容体を内在的に発現することができる細胞としては、以下に限定されないが、幹細胞、Ｐ１９細胞、神経上皮細胞、神経内皮細胞、ドーパミン作動性黒質ニューロン、星状細胞、巨細胞系神経内分泌細胞、視索上核ニューロン、小脳ニューロン、脳幹細胞、間脳ニューロン、中脳ニューロン、後脳ニューロン、脊髄運動ニューロン、脊髄間ニューロン、後角ニューロン、皮質ニューロン、小脳顆粒細胞、海馬ニューロン、隔膜ニューロン、尾状細胞、被殻細胞、線条体細胞、嗅球細胞、視床細胞、ＣＡ１錐体細胞、基底核細胞、ラット視覚野のＩＶ層ニューロン、体性感覚皮質ニューロン及び膵臓細胞が挙げられる。
【００８４】
別の実施形態において、細胞は一般に、グルタミン酸受容体を発現させるために修飾され得る。ある特定の実施形態において、卵母細胞は一般に、グルタミン酸受容体を発現させるために修飾され得る。当業者により知られているように、以下に限定されないが、ゼノパス（以下に限定されないが、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）、ニシツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、ゼノパス・ミューラー（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ）、ゼノパス・ウィッティ（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｗｉｔｔｅｉ）、ゼノパス・ギリ（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｇｉｌｌｉ）及びゼノパス・ボレアリス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓ）が挙げられる。）卵母細胞などのカエル卵母細胞などの何らかの適切な卵母細胞を使用することができる。ある実施形態において、当業者にとって公知の何らかの技術に従い、動物の卵巣から卵母細胞を単離することができる。
【００８５】
他の実施形態において、初代細胞株を含む何らかの適切な細胞タイプの遺伝子改変を行い、グルタミン酸受容体を発現させることができ、細胞としては、以下に限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ腎臓細胞、細菌細胞、Ｅ．コリ細胞、酵母細胞、ニューロン細胞、心臓細胞、肺細胞、胃細胞、脾臓細胞、膵臓細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、腸細胞、皮膚細胞、有毛細胞、視床下部細胞、下垂体細胞、上皮細胞、繊維芽細胞、神経細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（Ｂ及びＴ）、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞、その他の筋肉細胞、卵丘細胞、表皮細胞、内皮細胞、ランゲルハンス島細胞、血液細胞、血液前駆細胞、骨細胞、骨前駆細胞、ニューロン幹細胞、始原幹細胞、肝細胞、ケラチノサイト、臍静脈内皮細胞、大動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、繊維芽細胞、肝臓星細胞、大動脈平滑筋細胞、心筋細胞、ニューロン、クッパー細胞、平滑筋細胞、シュワン細胞及び上皮細胞、赤血球、血小板、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、脂肪細胞、軟骨細胞、膵島細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、耳下腺細胞、腫瘍細胞、グリア細胞、星状細胞、赤血球細胞、白血球細胞、マクロファージ、上皮細胞、体細胞、下垂体細胞、副腎細胞、有毛細胞、膀胱細胞、腎臓細胞、網膜細胞、桿体細胞、錐体細胞、心臓細胞、ペースメーカー細胞、脾臓細胞、抗原提示細胞、記憶細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、形質細胞、筋肉細胞、卵巣細胞、子宮細胞、前立腺細胞、膣上皮細胞、精子細胞、精巣細胞、生殖細胞、卵細胞、ライディッヒ細胞、傍尿細管細胞、セルトリ細胞、ルテイン細胞、頸部細胞、子宮内膜細胞、乳腺細胞、濾胞細胞、粘液細胞、繊毛細胞、非角化上皮細胞、角化上皮細胞、肺細胞、杯細胞、円柱上皮細胞、扁平上皮細胞、胚性幹細胞、骨細胞、骨芽細胞及び破骨細胞が挙げられる。
【００８６】
ある実施形態において、細胞に対して遺伝子改変を行い、選択されたＡＭＰＡ受容体サブユニットを発現させることができる。ＡＭＰＡ受容体サブユニットは、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３もしくはＧｌｕＲ４サブユニット又はこれらの何らかの組み合わせであり得る。ＡＭＰＡ受容体は、一般に当業者にとって公知である。別の実施形態において、細胞に対して遺伝子改変を行い、選択したカイニン酸受容体サブユニットを発現させることができる。カイニン酸受容体サブユニットは、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６、ＧｌｕＲ７、ＫＡ１もしくはＫＡ２サブユニット又はこれらの何らかの組み合わせであり得る。カイニン酸受容体は一般に当業者にとって公知である。さらなる実施形態において、細胞に対して遺伝子改変を行い、選択したオーファングルタミン酸受容体サブユニットを発現させることができる。オーファングルタミン酸受容体サブユニットはデルタ−１もしくはデルタ−２サブユニット及びこれらの組み合わせであり得、このような受容体は当業者にとって公知である。
【００８７】
別の実施形態において、細胞に対して遺伝子改変を行い、選択したＮＭＤＡ受容体サブユニットを発現させることができる。ＮＭＤＡ受容体は、ＮＲ１、ＮＲ２（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）及びＮＲ３（Ａ及びＢ）サブユニットから構成され、これらはネイティブＮＭＤＡ受容体の機能特性を決定する。ＮＭＤＡ受容体は、ＮＲ２及び／又はＮＲ３サブユニットとＮＲ１とから構成されるヘテロマータンパク質である。何らかの種由来のＮＭＤＡ受容体サブユニットの何れかをコードするＤＮＡを使用して、細胞の遺伝子改変を行うことができる。表ＡはＮＭＤＡ受容体サブユニットに対するＧｅｎＥＭＢＬ受入番号を与える。
【００８８】
【表１】
2008511004.tif 000007
【００８９】
例えば、ｃＤＮＡ鋳型からｃＲＮＡを合成し、次いで細胞に注入することができる。あるいは、細胞に挿入する前に、受容体サブユニットをコードするｃＤＮＡをコンストラクト又はベクターに挿入することができる。ＤＮＡコンストラクト又はベクターを宿主細胞に入れるために使用できる技術としては、リン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈殿、核へのＤＮＡのマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、インタクトの細胞との細菌原形質融合、トランスフェクション又は当業者にとって公知の何らかのその他の技術が挙げられる。ＤＮＡは線状又は環状、緩んでいるか又はスーパーコイル状ＤＮＡであり得る。哺乳動物細胞に対してトランスフェクトするための様々な技術に関しては、例えば、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８５，ｐｐ．５２７−５３７（１９９０）を参照のこと。
【００９０】
当技術分野で公知の方法に従い、コンストラクト又はベクターを調製することができる。例えばＥ．コリにより認識可能な複製基点など、原核生物複製系を含む細菌ベクターを用いてコンストラクトを調製することができ、各段階でコンストラクトをクローニングし分析することができる。選択可能マーカーも利用できる。コンストラクトを含有するベクターが完成したら、細菌配列の欠失、線状化、相同配列における短い欠失の導入などにより、これをさらに操作することができる。最終操作後、コンストラクトを細胞に導入することができる。
【００９１】
本発明はさらに、上述のような１以上の配列を含有する組み換えコンストラクトを含む。コンストラクトは、順方向又は逆方向で本発明の配列を挿入することができる、プラスミド又はウイルスベクターなどのベクターの形であり得る。コンストラクトはまた、例えば配列に操作可能に連結されたプロモーターなどの、制御配列を含み得る。非常に多くの適切なベクター及びプロモーターが当業者にとって公知であり、市販されている。例として次のベクターを挙げる：ｐＢｓ、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ファージスクリプト、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＢＳＳＫ、ｐＧＥＭ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。真核：ｐＣｉＮｅｏ、ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳｖ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰｖ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。また、宿主中で複製可能であり生存可能である限り、何らかの他のプラスミド及びベクターを使用することもできる。本発明に従い、当技術分野で公知のベクター及び市販品（及びこれらの変異型及び誘導体）を使用して、本発明の方法で使用するために１以上の組み換え部位を含むように操作することができる。例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎｏｖａｇｅｎ、ＮＥＢ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＥｐｉＣｅｎｔｅｒ、ＯｒｉＧｅｎｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ及びＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓからこのようなベクターを得ることができる。関心のあるその他のベクターとしては、真核発現ベクター、例えば、ｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴ、ｐＦａｓｔＢａｃＤＵＡＬ、ｐＳＦＶ及びｐＴｅｔ−Ｓｐｌｉｃｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＵＫ−Ｃ１、ｐＰＵＲ、ｐＭＡＭ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＤＲ２、ｐＣＭＶＥＢＮＡ及びｐＹＡＣｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＭＳＧ、ｐＣＨ１１０及びｐＫＫ２３２−８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．）、ｐ３’ＳＳ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＰｂａｃ、ｐＭｂａｃ、ｐＭＣｌｎｅｏ及びｐＯＧ４４（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）及びｐＹＥＳ２、ｐＡＣ３６０、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ  Ａ、Ｂ及びＣ、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１、ｐＺｅｏＳＶ、ｐｃＤＮＡ３  ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４及びｐＥＢＶＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｏｒｐ．）及びこれらの変異型又は誘導体が挙げられる。
【００９２】
本発明での使用に適切なさらなるベクターとしては、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ、ｐＳＰＯＲＴ、コスミド、ファージミド、ＹＡＣｓ（酵母人工染色体）、ＢＡＣｓ（細菌人工染色体）、Ｐ１（Ｅ．コリファージ）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ９（ｑｕａｇａｎ）、ｐＢｓベクター、ＰｈａｒｇｅＳｃｒｉｐｔベクター、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＧＥＸ、ｐＴｒｓｆｕｓ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＥＴ−５、ｐＥＴ−９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＳＰＯＲＴ１、ｐＳＰＯＲＴ２、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ２．０及びｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びこれらの変異型又は誘導体が挙げられる。レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターも使用できる（例えば、ＷＯ０３／０５９９２３；Ｔｉｓｃｏｒｎｉａら、ＰＮＡＳ  １００：１８４４−１８４８（２００３）を参照のこと。）。関心のあるさらなるベクターとしては、ｐＴｒｘＦｕｓ、ｐＴｈｉｏＨｉｓ、ｐＬＥＸ、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＴｒｃｆｆｉｓ２、ｐＲＳＥＴ、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐｃＤＮＡ３．１（−）／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ、ｐＳｅｃＴａｇ、ｐＥＢＶＨｉｓ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＡＯ８１５、ｐＰＩＣＺ、ｐＰＩＣＺＡ、ｐＰＩＣＺＢ、ｐＰＩＣＺＣ、ｐＧＡＰＺＡ、ｐＧＡＰＺＢ、ｐＧＡＰＺＣ、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐＭｅｌＢａｃ、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ｐＳｉｎＨｉｓ、ｐＩＮＤ、ｐＩＮＤ（ＳＰ１）、ｐＶｇＲＸＲ、ｐｃＤＮＡ２．１、ｐＹＥＳ２、ｐＺＥｒＯ１．１、ｐＺＥｒＯ−２．１、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ、ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ３８０、ｐＳＥ４２０、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１．１、ｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ、ｐＳｅ、ＳＶ２、ｐＲｃ／ＣＭＶ２、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲＥＰ４、ｐＲＥＰ７、ｐＲＥＰ８、ｐＲＥＰ９、ｐＲＥＰ１０、ｐＣＥＰ４、ｐＥＢＶＨｉｓ、ｐＣＲ３．１、ｐＣＲ２．１、ｐＣＲ３．１−Ｕｎｉ及びｐＣＲＢａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより）；λＥｘＣｅｌｌ、λｇｔ１１、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ−１λＴ、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＧＥＸ−２ＴＫ、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１、ｐＧＥＸ−４Ｔ−２、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３、ｐＧＥＸ−３Ｘ、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１、ｐＧＥＸ−５Ｘ−２、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３、ｐＥＺＺ１８、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＭＣ１８７１、ｐＳｖＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＭＳＧ、ｐＣＨ１１０、ｐＫＫ２３２−８、ｐＳＬ１１８０、ｐＮＥＯ及びｐＵＣ４Ｋ（Ｐｈａｒｍａｃｉａより。）；ｐＳＣＲＥＥＮ−１ｂ（＋）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２、ｐＣＩＴＥ−４ａｂｃ（＋）、ｐＯＣＵＳ−２、ｐＴＡｇ、ｐＥＴ−３２ＬＩＣ、ｐＥＴ−３０ＬＩＣ、ｐＢＡＣ−２Ｃｐ  ＬＩＣ、ｐＢＡＣｇｕｓ−２ｃｐＬＩＣ、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２  ＬＩＣ、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２、λＳＣＲＥＥＮ−１、λＢｌｕｅＳＴＡＲ、ｐＥＴ−３ａｂｃｄ、ｐＥＴ−７��ｂｃ、ｐＥＴ９ａｂｃｄ、ｐＥＴ１１ａｂｃｄ、ｐＥＴ１２ａｂｃ、ｐＥＴ−１４ｂ、ｐＥＴ−１５ｂ、ｐＥＴ−１６ｂ、ｐＥＴ−１７ｂ−ｐＥＴ−１７ｘｂ、ｐＥＴ−１９ｂ、ｐＥＴ−２０ｂ（＋）、ｐＥＴ−２１ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）、ｐＥＴ−２３Ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ−２４ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ−２５ｂ（＋）、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）、ｐＥＴ−２７ｂ（＋）、ｐＥＴ−２８ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−２９ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−３０ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−３１ｂ（＋）、ｐＥＴ−３２ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−３３Ｂ（＋）、ｐＢＡＣ−１、ｐＢＡＣｇｕｓ−１、ｐＢＡＣ４ｘ−１、ｐＢＡＣｇｕｓ４ｘ−１、ｐＢＡＣ−３ｃｐ、ｐＢＡＣｇｕｓ−２ｃｐ、ｐＢＡＣｓｕｌｆ−１、ｐｌｇ、Ｓｉｇｎａｌ  ｐｌｇ、ｐＹＸ、Ｓｅｌｅｃｔａ  Ｖｅｃｔａ−Ｎｅｏ、Ｓｅｌｅｃｔａ  Ｖｅｃｔａ−Ｈｙｇ及びＳｅｌｅｃｔａ  Ｖｅｃｔａ−Ｇｐｔ（Ｎｏｖａｇｅｎより。）；ｐＬｅｘＡ、ｐＢ４２ＡＤ、ｐＧＢＴ９、ｐＡＳ２−１、ｐＧＡＤ４２４、ｐＡＣＴ２、ｐＧＡＤ  ＧＬ、ｐＧＡＤ  ＧＨ、ｐＧＡＤ１０、ｐＧｉｌｄａ、ｐＥＺＭ３、ｐＥＧＦＰ、ｐＥＧＦＰ−１、ｐＥＧＦＰ−Ｎ、ｐＥＧＦＰ−Ｃ、ｐＥＢＦＰ、ｐＧＦＰｕｖ、ｐＧＦＰ、ｐ６ｘＨｉｓ−ＧＦＰ、ｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ、ｐＳＥＡＰ２−Ｃｏｎｔｒａｌ、ｐＳＥＡＰ２−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｐＳＥＡＰ２−Ｅｎｈａｎｃｅｒ、ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ、ｐβｇａｌ−Ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐβｇａｌ−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｐβｇａｌ−Ｅｎｈａｎｃｅｒ、ｐＣＭＶ、ｐＴｅｔ−Ｏｆｆ、ｐＴｅｔ−Ｏｎ、ｐＴＫ−Ｈｙｇ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｆｆ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｎ、ｐＩＲＳＥ１ｎｅｏ、ｐＩＲＳＥ１ｈｙｇ、ｐＬＸＳＮ、ｐＬＮＣＸ、ｐＬＡＰＳＮ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＭＡＭｎｅｏ−ＣＡＴ、ｐＭＡＭｎｅｏ−ＬＵＣ、ｐＰＵＲ、ｐＳｖ２ｎｅｏ、ｐＹＥＸ４Ｔ−１／２／３、ｐＹＥＸ−Ｓ１、ｐＢａｃＰＡＫ−Ｈｉｓ、ｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＡｃＵＷ３１、ＢａｃＰＡＫ６、ｐＴｒｉｐｌＥｘ、λｇｔ１０、λｇｔ１１、ｐＷＥ１５及びλＴｒｉｐｌＥｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈより。）；λＺＡＰＩＩ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ＋／−、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋／−、ｐＡＤ−ＧＡＬ４、ｐＢＤ−ＧＡＬ４  Ｃａｍ、ｐＳｕｒｆｓｃｒｉｐｔ、λＦＩＸ  ＩＩ、λＤＡＳＨ、λＥＭＢＬ３、λＥＭＢＬ４、ＳｕｐｅｒＣｏｓ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｇｔ  Ａｍｐ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ｃａｍ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ｄｉｒｅｃｔ、ｐＢｓ＋／−、ｐＢＣ  ＫＳ＋／−、ｐＢＣ  ＳＫ＋／−、ＰｈａｒｇｅＳｃｒｉｐｔ、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ、ｐＣＡＬ−ｎ、ｐＣＡＬ−ｃ、ｐＣＡＬ−ｋｃ、ｐＥＴ−３ａｂｃｄ、ｐＥＴ−ＩＩａｂｃｄ、ｐＳＰＵＴＫ、ｐＥＳＰ−１、ｐＣＭＶＬａｃＩ、ｐＯＰＲＳＶＩ／ＭＣＳ、ｐＯＰＩ３  ＣＡＴ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＰｂａｃ、ｐＭｂａｃ、ｐＭＣ１ｎｅｏ、ｐＭＣ１ｎｅｏ  ＰｏｌｙＡ、ｐＯＧ４４、ｐＯＧ４５、ｐＦＲＴβＧＡＬ、ｐＮＥＯβＧＡＬ、ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６、ｐＲＳ４１３、ｐＲＳ４１４、ｐＲＳ４１５及びｐＲＳ４１６（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより。）が挙げられる。
【００９３】
さらなるベクターとしては、例えば、ｐＰＣ８６、ｐＤＢＬｅｕ、ｐＤＥＴｒｐ、ｐＰＣ９７、ｐ２．５、ｐＧＡＤ１−３、ｐＧＡＤ１０、ｐＡＣｔ、ｐＡＣＴ２、ｐＧＡＤＧＬ、ｐＧＡＤＧＨ、ｐＡＳ２−１、ｐＧＡＤ４２４、ｐＧＢＴ８、ｐＧＢＴ９、ｐＧＡＤ−ＧＡＬ４、ｐＬｅｘＡ、ｐＢＤ−ＧＡＬ４、ｐＨＩＳｉ、ｐＨＩＳｉ−１、ｐｌａｃＺｉ、ｐＢ４２ＡＤ、ｐＤＧ２０２、ｐＪＫ２０２、ｐＪＧ４−５、ｐＮＬｅｘＡ、ｐＹＥＳＴｒｐ及びこれらの変異型又は誘導体が挙げられる。
【００９４】
ＮＭＤＡ受容体サブユニットを含有する細胞の選択を可能にするために、選択可能マーカーもベクターに挿入することができる。適切な選択可能マーカーとしては、以下に限定されないが、ある一定の培地基質において増殖可能にさせる遺伝子、例えばｔｋ遺伝子（チミジンキナーゼ）又は、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン）において増殖可能にさせるｈｐｒｔ遺伝子（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）；ＭＡＸ培地（ミコフェノール酸、アデニン及びキサンチン）での増殖を可能にさせる細菌性ｇｐｔ遺伝子（グアニン／キサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）が挙げられる。例えば、Ｓｏｎｇ  Ｋ−Ｙ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：６８２０−６８２４（１９８７）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ｃｈａｐｔｅｒ１６を参照のこと。選択可能マーカーのその他の例としては、抗生物質などの化合物に対して耐性を与える遺伝子、選択された基質での増殖能力を与える遺伝子、化学発光又は蛍光などの検出可能シグナルを生成するタンパク質（緑色蛍光タンパク質、強化された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）など）をコードする遺伝子が挙げられる。多岐にわたるこのようなマーカーが公知であり、利用可能であり、それには例えば、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．及びＰ．Ｂｅｒｇ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−３４１（１９８２））；及びハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｙｇ）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：６８９５−６９１１（１９８３）及びＴｅ  Ｒｉｅｌｅ，Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：６４９−６５１（１９９０））などの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。その他の選択可能マーカー遺伝子としては、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、ノパリンシンターゼ、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）及びこれらの誘導体が挙げられる。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキセート、ホスフィノトリシン、プロマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性を与える複数の選択可能マーカーが利用可能である。
【００９５】
抗生物質耐性遺伝子の組み込み及び陰性選択因子に対する方法は、当業者にとって周知である（例えば、ＷＯ９９／１５６５０；米国特許第６，０８０，５７６号；米国特許第６，１３６，５６６号；Ｎｉｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３：３４３−３４９（１９９３）；及びＹｏｓｈｉｄａら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４：２７７−２８７（１９９５）を参照のこと。）。
【００９６】
本発明において有用なさらなる選択可能マーカー遺伝子は、例えば、米国特許第６，３１９，６６９号；同第６，３１６，１８１号；同第６，３０３，３７３号；同第６，２９１，１７７号；同第６，２８４，５１９号；同第６，２８４，４９６号；同第６，２８０，９３４号；同第６，２７４，３５４号；同第６，２７０，９５８号；同第６，２６８，２０１号；同第６，２６５，５４８号；同第６，２６１，７６０号；同第６，２５５，５５８号；同第６，２５５，０７１号；同第６，２５１，６７７号；同第６，２５１，６０２号；同第６，２５１，５８２号；同第６，２５１，３８４号；同第６，２４８，５５８号；同第６，２４８，５５０号；同第６，２４８，５４３号；同第６，２３２，１０７号；同第６，２２８，６３９号；同第６，２２５，０８２号；同第６，２２１，６１２号；同第６，２１８，１８５号；同第６，２１４，５６７号；同第６，２１４，５６３号；同第６，２１０，９２２号；同第６，２１０，９１０号；同第６，２０３，９８６号；同第６，１９７，９２８号；同第６，１８０，３４３号；同第６，１７２，１８８号；同第６，１５３，４０９号；同第６，１５０，１７６号；同第６，１４６，８２６号；同第６，１４０，１３２号；同第６，１３６，５３９号；同第６，１３６，５３８号；同第６，１３３，４２９号；同第６，１３０，３１３号；同第６，１２４，１２８号；同第６，１１０，７１１号；同第６，０９６，８６５号；同第６，０９６，７１７号；同第６，０９３，８０８号；同第６，０９０，９１９号；同第６，０８３，６９０号；同第６，０７７，７０７号；同第６，０６６，４７６号；同第６，０６０，２４７号；同第６，０５４，３２１号；同第６，０３７，１３３号；同第６，０２７，８８１号；同第６，０２５，１９２号；同第６，０２０，１９２号；同第６，０１３，４４７号；同第６，００１，５５７号；同第５，９９４，０７７号；同第５，９９４，０７１号；同第５，９９３，７７８号；同第５，９８９，８０８号；同第５，９８５，５７７号；同第５，９６８，７７３号；同第５，９同第６８，７３８号；同第５，９５８，７１３号；同第５，９５２，２３６号；同第５，９４８，８８９号；同第５，９４８，６８１号；同第５，９４２，３８７号；同第５，９３２，４３５号；同第５，９２２，５７６号；同第５，９１９，４４５号；及び同第５，９１４，２３３号に記載されている。
【００９７】
機能分析又は分子分析により、グルタミン酸受容体を発現するようにうまく形質転換された細胞を確認することができる。ある実施形態において、機能的ＮＭＤＡ受容体の有無に対して、電気生理学的記録により、ＮＭＤＡ受容体サブユニットｃＲＮＡが挿入されている卵母細胞などの細胞を試験することができる。別の実施形態において、次に、ＮＭＤＡ受容体サブユニット遺伝子及び選択可能マーカー遺伝子をコードするＤＮＡが挿入されている細胞を適切に選択した培地中で増殖させ、適切な組み込みを与える細胞を同定することができる。次に、制限分析、電気泳動、サザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応又は当技術分野で公知の別の技術により、所望の表現型を示すこれらの細胞をさらに分析することができる。標的遺伝子部位に適切な挿入を示す断片を同定することにより、標的遺伝子を不活性化するか、又は修飾するために相同組み換えが起こった細胞を同定することができる。
【００９８】
効力促進実験
本発明のさらなる態様において、本明細書中の方法及びプロセスに従い述べられている化合物などの化合物の効力促進を調べることができる。
【００９９】
本発明のある態様において、９５％信頼区間が新しい実験の追加により１５％を超えて変化しないように少なくとも５回効力促進実験を繰り返すことにより、細胞で生理的ｐＨ対「疾患誘導性低ｐＨ」（例えば、生理的ｐＨでのＩＣ５０／疾患誘導性低ｐＨでのＩＣ５０）において化合物の効力促進を評価することによって、哺乳動物、特にヒトでの虚血性損傷を治療するのに有用な化合物を同定するためのプロセスを提供する。ある実施形態において、グルタミン酸受容体を発現する細胞において効力促進を調べることができる。特定の実施形態において、ＮＭＤＡ受容体を発現する細胞において効力促進を調べることができる。別の実施形態において、細胞は、ＮＭＤＡ受容体のＮＲ１サブユニット及び少なくとも１個のＮＲ２サブユニットを発現できる。さらなる実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ｂサブユニットであり得る。別の実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ａサブユニットであり得る。
【０１００】
本発明の別のより一般的な態様において、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストを活性化させる様式においてｐＨを低下させる疾患を治療するために化合物を選択するたプロセスを提供するが、この化合物は、（ｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により１５％を超えて変化しないように少なくとも５回効力促進実験を繰り返すことにより、細胞において試験して、生理的ｐＨ対疾患誘導性低ｐＨでの化合物の効力促進を評価する実験（例えば、生理的ｐＨでのＩＣ５０／疾患誘導性低ｐＨでのＩＣ５０）において求めた場合、少なくとも５の効力促進を示す。ある実施形態において、グルタミン酸受容体を発現する細胞において効力促進を調べることができる。特定の実施形態において、ＮＭＤＡ受容体を発現する細胞において効力促進を調べることができる。別の実施形態において、細胞は、ＮＭＤＡ受容体のＮＲ１サブユニット及び少なくとも１個のＮＲ２サブユニットを発現することができる。さらなる実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ｂサブユニットであり得る。別の実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ａサブユニットであり得る。
【０１０１】
ある実施形態において、９５％信頼区間が新しい実験の追加により１５％を超えて変化しないように少なくとも５回効力促進実験を繰り返すことによって、ＮＭＤＡ受容体のＮＲ１サブユニット及び少なくとも１個のＮＲ２サブユニットを発現する細胞において生理的ｐＨ対「疾患誘導性低ｐＨ」（例えば、生理的ｐＨでのＩＣ５０／「疾患誘導性低ｐＨ」でのＩＣ５０）での化合物の効果を試験することにより、化合物の効力促進を調べることができる。ある特定の実施形態において、化合物を選択する方法を提供するか、又は、９５％信頼区間が新しい実験の追加により１５％を超えて変化しないように少なくとも５回効力促進実験を繰り返すことにより、ＮＭＤＡ受容体のＮＲ１サブユニット及び少なくとも１個のＮＲ２サブユニットを発現する細胞において試験して、生理的ｐＨ対疾患誘導性低ｐＨでの化合物の効力促進を評価する実験において求めた場合に、少なくとも５の効力促進を示す化合物を選択する。ある実施形態において、効力促進実験は、９５％信頼区間が新しい実験の追加により１５％を超えて変化しないように少なくとも５回行う。さらなる実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ｂサブユニットであり得る。別の実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ａサブユニットであり得る。
【０１０２】
本発明のさらなる実施形態において、ＮＭＤＡ受容体は、ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ、ＮＲ２Ｃ及び／又はＮＫＺＤなどの少なくとも１個のＮＲ２サブユニットと組合されたＮＲ１サブユニットの何らかの組み合わせを含有し得る。例えば、ＮＭＤＡ受容体は、以下に限定されないが、次のサブユニットの何れかを含有し得る：ＮＲ１／ＮＲ２Ａ、ＮＲ１／ＮＲ２Ｂ、ＮＲ１／ＮＲ２Ｃ、ＮＲ１／ＮＲ２Ｄ、ＮＲ１／ＮＲ２Ａ／ＮＲ２Ｂ、ＮＲ１／ＮＲ２Ａ／ＮＲ２Ｃ、ＮＲ１／ＮＲ２Ａ／ＮＲ２Ｄ、ＮＲ１／ＮＲ２Ｂ／ＮＲ２Ｃ、ＮＲ１／ＮＲ２Ｂ／ＮＲ２Ｄ、ＮＲ１／ＮＲ２Ｃ／ＮＲ２Ｄ、ＮＲ１／ＮＲ２Ａ／ＮＲ３Ａ、ＮＲ１／ＮＲ２Ｂ／ＮＲ３Ａ、ＮＲ１／ＮＲ２Ｃ／ＮＲ３Ａ、ＮＲ１／ＮＲ２Ｄ／ＮＲ３Ａ、ＮＲ１／ＮＲ２Ａ／ＮＲ３Ｂ、ＮＲ１／ＮＲ２Ｂ／ＮＲ３Ｂ、ＮＲ１／ＮＲ２Ｃ／ＮＲ３Ｂ、ＮＲ１／ＮＲ２Ｄ／ＮＲ３Ｂ。代替的な実施形態において、本発明のＮＭＤＡ受容体は、ＮＲ１サブユニット及び少なくとも１個のＮＲ３サブユニットを含有し得る。例えば、ＮＭＤＡ受容体は、以下に限定されないが、次のものの何れかを含有し得る：ＮＲ１／ＮＲ３Ａ、ＮＲ１／ＮＲ３Ｂ及び／又はＮＲ１／ＮＲ３Ａ／ＮＲ３Ｂ。
【０１０３】
「疾患誘導性低ｐＨ」は、本明細書中で言及する何らかの疾病又は疾患に伴うｐＨの低下として定義される。「疾患誘導性低ｐＨ」は、約６．４から約７．２の間、一般に約６．９、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０又は７．１であり得る。生理的脳−組織ｐＨは、約７．２から約７．６の間、一般に約７．４、７．３又は７．５である。ある実施形態において、「疾患誘導性低ｐＨ」は、脳卒中などの虚血性疾病に伴い得る。
【０１０４】
「効力促進」実験により、ｐＨ７．６などの生理的ｐＨ及びｐＨ６．９などの虚血性ｐＨでの、最大半量活性、増強作用又はその受容体もしくは標的の阻害（ＥＣ５０又はＩＣ５０値）を引き起こす化合物濃度の比を求める。当技術分野で公知の、化合物に対するＥＣ５０又はＩＣ５０値を求めるための何らかの方法を使用することができる。比としてＩＣ５０値を表し、ＩＣ５０での平均シフトを求めるために一緒に平均を出すことができる。
【０１０５】
ある実施形態において、２電極電圧クランプ記録を用いて、化合物に対するＩＣ５０値を求めることができる。電圧電極が含有する塩化カリウム濃度が電流電極よりも低くなるようにガラス微小電極に塩化カリウムを満たすことができる。細胞をチャンバーに置き、生理溶液を用いてかん流することができる。ｐＨ６．９などの虚血性ｐＨ又はｐＨ７．６などの生理的ｐＨの何れかに外部ｐＨを調整することができる。次に、グルタミン酸及びグリシンの最大効果濃度を適用し、次いでグルタミン酸／グリシン＋試験化合物の様々な濃度を連続的に適用することにより、用量反応曲線を得ることができる。最初のグルタミン酸応答のパーセンテージとして、適用したアンタゴニストによる阻害のレベルを表すことができる。細胞にわたり、例えば１匹のカエルからの卵母細胞にわたって、これらの値の平均を出すことができる。アンタゴニストの各濃度での平均パーセンテージ反応をロジスティック方程式：（１００−ｍｉｎ）／（１＋（［ｃｏｎｃ］／ＩＣ５０）ｎＨ）＋ｍｉｎ（式中、ｍｉｎは、飽和アンタゴニストにおける残留パーセント反応であり、ＩＣ５０は、達成可能な阻害の半分を引き起こすアンタゴニストの濃度であり、ｎＨは、阻害曲線の勾配の大きさを表す傾斜因子である。）によりフィットさせることができる。Ｍｉｎは、０以上であるとみなすことができる。例えば、既知のチャネルブロッカーを用いた実験の場合、ｍｉｎを０に設定することができる。次に、生理的ｐＨ及び虚血性ｐＨでのＩＣ５０値を比として表すことができ、ＩＣ５０での平均シフトを求めるために一緒に平均を出すことができる。さらなる実施形態において、生理的ｐＨ対「疾患誘導性低ｐＨ」（すなわち、（生理的ｐＨでのＩＣ５０）／（「疾患誘導性低ｐＨ」でのＩＣ５０））において、化合物は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２又は２３を超える効力促進を示すことができる。
【０１０６】
新しい実験の追加により９５％信頼区間が１５％を超えて変化しなくなるまで効力促進実験を繰り返すことができる。別の実施形態において、新しい実験の追加により９５％信頼区間が約２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％又は２％を超えて変化しなくなるまで効力促進実験を繰り返すことができる。さらなる実施形態において、新しい実験の追加により９６％、９７％、９８％又は９９％信頼区間が約２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％又は２％を超えて変化しなくなるまで効力促進実験を繰り返すことができる。
【０１０７】
ＩＩ．インビボアッセイ
一時的局所性虚血のインビボモデル
本発明のある態様において、（ｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により１５％を超えて変化しないように少なくとも５回効力促進実験を繰り返すことにより、細胞において生理的ｐＨ対疾患誘導性低ｐＨでの化合物の効力促進を評価することと（例えば、生理的ｐＨでのＩＣ５０／「疾患誘導性低ｐＨ」でのＩＣ５０）；（ｉｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により５％を超えて変化しないように少なくとも１２回実験を繰り返すことにより、一時的局所性虚血の動物モデルにおいて化合物を試験し、梗塞体積における化合物の影響を測定することと；（ｉｉｉ）段階（ｉ）に従い少なくとも５の効力促進を有し、段階（ｉｉ）に従い梗塞体積を少なくとも３０％低下させる化合物を選択することにより、哺乳動物、特にヒトでの虚血性損傷を治療するのに有用な化合物を同定するプロセスを提供する。本発明によると、候補薬物は、ヒトでの使用に効果的な薬物であるためのインビトロ及びインビボ基準の両方に合致又はそれを超えなければならない。ある実施形態において、グルタミン酸受容体を発現する細胞において効力促進を調べることができる。別の実施形態において、ＮＭＤＡ、ＡＭＰＡ及び／又はカイニン酸受容体を発現する細胞において効力促進を調べることができる。ある実施形態において、細胞はＮＭＤＡ受容体のＮＲ１サブユニット及び少なくとも１個のＮＲ２サブユニットを発現することができる。さらなる実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ｂサブユニットであり得る。別の実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ａサブユニットであり得る。
【０１０８】
本発明の別のより一般的な態様において、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストを活性化させる様式においてｐＨを低下させる疾患を治療するために化合物を選択するプロセスを提供するが、この化合物は、（ｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により１５％を超えて変化しないように少なくとも５回効力促進実験を繰り返すことにより、細胞において試験して、生理的ｐＨ対疾患誘導性低ｐＨで化合物の効力促進を評価する実験（例えば、生理的ｐＨでのＩＣ５０／疾患誘導性低ｐＨでのＩＣ５０）において求めた場合に、少なくとも５の効力促進を示し、（ｉｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により５％を超えて変化しないように少なくとも１２回実験を繰り返すことにより調べた場合、局所性虚血の動物モデルにおいて化合物を試験し、梗塞体積における化合物の影響を測定して、梗塞体積を少なくとも３０％低下させる。ある実施形態において、グルタミン酸受容体を発現する細胞において効力促進を調べることができる。別の実施形態において、ＮＭＤＡ、ＡＭＰＡ及び／又はカイニン酸受容体を発現する細胞において効力促進を調べることができる。ある実施形態において、細胞はＮＭＤＡ受容体のＮＲ１サブユニット及び少なくとも１個のＮＲ２サブユニットを発現することができる。さらなる実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ｂサブユニットであり得る。別の実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ａサブユニットであり得る。
【０１０９】
特定の実施形態において、９５％信頼区間が新しい実験の追加により１０％を超えて変化しないように、少なくとも１５回実験を繰り返すことにより調べた場合に、局所性虚血の動物モデルにおいて測定して、梗塞体積を少なくとも３０％減少させる化合物を選択する方法を提供するか、又はこのような化合物を選択する。別の特定の実施形態において、「疾患誘導性低ｐＨ」は、脳卒中などの虚血性疾患に伴い得る。別の実施形態において、例えばマウスなどのげっ歯類などの中大脳動脈梗塞モデルを一時的局所性虚血の動物モデルとして使用し得る。
【０１１０】
局所性虚血脳卒中は、その領域への血液供給の遮断により引き起こされる脳への損傷であり得る。局所性虚血脳卒中は通常、補助的動脈又は細動脈とは対照的に、何らかの１以上の「主要な大脳動脈」（例えば、中大脳動脈、前大脳動脈、後大脳動脈、内頸動脈、椎骨動脈又は脳底動脈）の閉塞により起こる。動脈閉塞は、１個の塞栓又は血栓であり得る。したがって、本明細書中で定義するような局所性虚血脳卒中は、複数の凝血塊の粒が補助的な動脈又は細動脈を塞ぐ脳塞栓の脳卒中モデルとは区別される（Ｂｏｗｅｓら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ４５：８１５−８１９（１９９５）により記載されているように。）。
【０１１１】
以下に限定されないが、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ及びスナネズミを含む何らかの哺乳動物において局所性虚血を誘発することができる（Ｒｅｎｏｌｌｅａｕ  Ｓ，Ｓｔｒｏｋｅ，１９９８年７月；２９（７）：１４５４−６０；Ｇｏｔｔｉ，Ｂ．らＢｒａｉｎ  Ｒｅｓ、１９９０、５２２、２９０−３０７も参照のこと。）。例えば、脳血液供給がわずか２本の総頸動脈により調節されているので、虚血脳卒中に対する研究に対する実験モデルとしてスナネズミが広く使用されてきた。スナネズミは不完全な大脳動脈輪を有するため、この珍しい特性が生じる（Ｃｈａｎｄｌｅｒら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４：１３７−１４６、１９８５；Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎら、Ｒｅｓｔｏｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１：３８７−３９４、１９９０；Ｌｅｖｉｎｅ及びＳｏｈｎ、Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．８７：３１５−３１７、１９６９；Ｋａｈｎ、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ２２：５１０−５１５、１９７２）。
【０１１２】
動脈閉塞の前又は後に、動物に試験化合物を投与することができる。ある実施形態において、試験化合物を腹腔内投与することができる。ある実施形態において、試験化合物を脳室内投与することができる。動脈閉塞の前に、例えば、虚血事象の約１０、２０、３０、４０、５０又は６０分前に、試験化合物を投与することができる。あるいは、動脈閉塞後、例えば虚血事象後約１０、２０、３０、４０、５０、６０、９０もしくは１２０分、４、６、８もしくは１０時間又は約１、２、３、４、５、６、７もしくは８日後、つまり再かん流後に、試験化合物を投与することができる。
【０１１３】
中大脳動脈（ＭＣＡ）が実験的に閉塞されている動物モデル（中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）モデル）において、虚血領域で化合物が細胞を保護できるということを実証するために試験を行うことができる。この動物モデルは、ヒト対象で起こり得るように、インビボ虚血事象を刺激することが当技術分野で広く知られている。ＭＣＡの実験的閉塞により、大脳基底核及び前頭葉、頭頂葉及び側頭葉皮質領域を通常含む、広い片側性虚血領域が生じる（Ｍｅｎｚｉｅｓら、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ３１、１００−１０６（１９９２））。虚血性損傷は、ＭＣＡによりかん流される部位においてより小さなコアを有して始まり、時間とともに大きくなる。コア梗塞周囲のこの周縁部領域は、閉塞中に側副循環によりかん流され続けている組織へと外側に広がる、コアから損傷が広がる結果により生じると思われる。脳スライスを動物から得た場合、虚血事象のコアを取り巻く周縁部に対する治療薬の効果を調べることができる。ＭＣＡは、前頭葉、頭頂葉及び側頭葉ならびに大脳基底核及び内包の皮質表面に血液を供給する。虚血の影響が最大である領域周囲から、脳のスライスを採取することができる。以下に限定されないが、マウス、ラット、ウサギ及びスナネズミを含む何らかの哺乳動物において、ＭＣＡＯを誘発することができる（Ｒｅｎｏｌｌｅｕａ，Ｓ．、Ｓｔｒｏｋｅ，１９９８年７月；２９（７）：１４５４−６０；Ｇｏｔｔｉ，Ｂ．ら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ、１９９０、５２２、２９０−３０７も参照のこと。）。ＭＣＡモデルにより、虚血事象（つまり左中大脳動脈の閉塞）後のニューロン細胞死の間接的測定が可能となる。ある実施形態において、中大脳動脈の一時的局所性脳虚血を用いて化合物を試験することができる。
【０１１４】
腔内中大脳動脈（ＭＣＡ）閉塞により、一時的局所性脳虚血を誘発することができる。例えば、モノフィラメント縫合糸などの縫合糸を用いて、動脈をブロックする何らかの手段を介して閉塞を達成することができる。動物を麻酔した後、局所的な脳血流の相対的変化を監視するために、プローブをその頭蓋に固定することができる。レーザーＤｏｐｐｌｅｒフローメーター（Ｐｅｒｉｍｅｄ）を用いてこのような変化を監視することができる。例えば、マウスにおいて、ブレグマ２ｍｍ後部及び４−６ｍｍ側部にプローブを固定することができる。次に、ＭＣＡに近付くために切開することができ、ＭＣＡを閉塞させるために材料を挿入することができる。例えば、監視している血流が停止するまで、外頸動脈基部を介して内頸動脈基部に縫合糸を導入することができる。約３０分、４５分又は６０分などのＭＣＡ閉塞の時間後、ブロックする材料をはずすことにより、血流を再開することができる。
【０１１５】
別の実施形態において、両側頸動脈閉塞モデルを使用して、化合物が虚血領域で細胞を保護することができることを示すことができる。動物に麻酔をかけて、腹側頸部において切開を行い、総頸動脈を分離し、例えば５、１０、１５、２０、３０、４５又は６０分の間、完全に閉塞させることができる。例えば、微細動脈瘤クリップなどのクリップを用いるなど、何らかの手段で動脈を閉塞させることができる。次に、閉塞をやめて、切開を縫合し得る。ある特定の実施形態において、スナネズミにおいて両側頸動脈閉塞を行うことができる。
【０１１６】
次いで、術後に動物を回復させることができる。例えば、約１２、２４、３６、４８又は７２時間などの時間、動物を生存させた後、動物を屠殺し、脳を取り出して、例えばおよそ１、２、３、４、５又は１０ｍｍの切片にすることができる。次いで、例えば、３７℃でおよそ２０分間、ＰＢＳ中の２％塩化２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）などの適切な色素で脳切片を染色することにより、梗塞の体積を確認することができる。次に、各切片の梗塞領域を測定し、切片厚を乗じて、その切片の梗塞体積を求めることができる。同側半球切片体積に対する反対側の比にも、対応する梗塞切片体積を乗じ、浮腫に対する補正を行うこともできる。全切片に対して梗塞領域の時間切片厚を合計することにより、梗塞体積を求めることができる。
【０１１７】
一時的局所性虚血の動物モデルにおいて化合物を試験し、梗塞体積における化合物の影響を測定した後、梗塞体積を少なくとも３０％減少させる化合物を選択することができる。さらなる実施形態において、梗塞体積を少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９又は１００％減少させる化合物を選択することができる。さらなる実施形態において、化合物は、図１で示されるように、生理的ｐＨ対虚血性ｐＨ（つまり、生理的ｐＨ／虚血ｐＨ）において、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０又は５０の効力促進を示すことができ、梗塞体積を少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９又は１００％減少させることができる（独立に、これらの数の何らかの組み合わせを含めて、その各組み合わせが具体的に開示されるものとする。）。本発明のある一定の実施形態において、効力促進及び梗塞体積実験に対して、平均、つまり、全ての観察値の合計を観察数で割ったもの、を計算することができ、図１で示されるように、化合物の平均値は、生理的ｐＨ対虚血性ｐＨ（つまり、生理的ｐＨ／虚血ｐＨ）で少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２又は２３の効力促進を示し得、梗塞体積の少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６５、７０、７５、８０又は８０％減少を示し得る。
【０１１８】
新しい実験の追加により９５％信頼区間が１０％を超えて変化しなくなるまで梗塞体積実験を繰り返すことができる。別の実施形態において、新しい実験の追加により９５％信頼区間が約２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％又は２％を超えて変化しなくなるまで梗塞体積実験を繰り返すことができる。さらなる実施形態において、新しい実験の追加により９６％、９７％、９８％又は９９％信頼区間が約２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％又は２％を超えて変化しなくなるまで梗塞体積実験を繰り返すことができる。
【０１１９】
一時的局所性虚血のその他の動物モデルとしては、以下に限定されないが、微小球もしくは凝固血液の動脈内注入、ラットにおける４本の血管閉塞、スナネズミにおける２本の血管閉塞又は溶解を伴う光化学的誘発性血栓形成が挙げられる。このようなモデルは当業者にとって公知である。
【０１２０】
神経因性疼痛の動物モデル
本発明のある態様において、本明細書中で開示する化合物を神経因性疼痛及び関連疾患の治療に使用することができる。
【０１２１】
本発明のある態様において、（ｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により１５％を超えて変化しないように少なくとも５回効力促進実験を繰り返すことにより、細胞において生理的ｐＨ対疾患誘導性低ｐＨでの化合物の効力促進を評価することと（例えば、生理的ｐＨでのＩＣ５０／疾患誘導性低ｐＨでのＩＣ５０）；（ｉｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により５％を超えて変化しないように少なくとも１２回実験を繰り返すことにより、神経因性疼痛の動物モデルにおいて化合物を試験し、疼痛閾値の上昇における化合物の影響を測定することと；（ｉｉｉ）段階（ｉ）に従い少なくとも５の効力促進を有し、段階（ｉｉ）に従い疼痛閾値を少なくとも２倍上昇させる化合物を選択することによる、哺乳動物、特にヒトにおいて神経因性疼痛を治療するのに有用な化学化合物を同定するためのプロセスを提供する。本発明によると、候補薬物は、ヒトでの使用に効果的な薬物であるためのインビトロ及びインビボ基準の両方に合致又はそれを超えなければならない。ある実施形態において、グルタミン酸受容体を発現する細胞において効力促進を調べることができる。別の実施形態において、ＮＭＤＡ、ＡＭＰＡ及び／又はカイニン酸受容体を発現する細胞において効力促進を調べることができる。ある実施形態において、細胞はＮＭＤＡ受容体のＮＲ１サブユニット及び少なくとも１個のＮＲ２サブユニットを発現することができる。さらなる実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ｂサブユニットであり得る。別の実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ａサブユニットであり得る。
【０１２２】
本発明の別のより一般的な態様において、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストを活性化させる様式においてｐＨを低下させる疾患を治療するために化合物を選択するプロセスを提供するが、この化合物は、（ｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により１５％を超えて変化しないように少なくとも５回効力促進実験を繰り返すことにより、細胞において試験して、生理的ｐＨ対疾患誘導性低ｐＨでの化合物の効力促進を評価する実験（例えば、生理的ｐＨでのＩＣ５０／疾患誘導性低ｐＨでのＩＣ５０）において求めた場合に、少なくとも５の効力促進を示し、（ｉｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により５％を超えて変化しないように少なくとも１２回実験を繰り返すことにより、神経因性疼痛の動物モデルにおいて化合物を試験し、疼痛閾値上昇における化合物の影響を測定し、（ｉｉｉ）段階（ｉ）に従い少なくとも５の効力促進を有し、段階（ｉｉ）に従い痛覚閾値が少なくとも２倍向上する化合物を選択する。ある実施形態において、グルタミン酸受容体を発現する細胞において効力促進を調べることができる。別の実施形態において、ＮＭＤＡ、ＡＭＰＡ及び／又はカイニン酸受容体を発現する細胞において効力促進を調べることができる。ある実施形態において、細胞はＮＭＤＡ受容体のＮＲ１サブユニット及び少なくとも１個のＮＲ２サブユニットを発現することができる。さらなる実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ｂサブユニットであり得る。別の実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ａサブユニットであり得る。
【０１２３】
ある実施形態において、以下に限定されないが、慢性狭窄損傷モデル、部分的坐骨神経結紮モデル、脊髄神経結紮モデル又は当業者にとって公知の何らかの他のモデルを含む群から、神経因性疼痛の動物モデルを選択することができる。特定の実施形態において、インビボ動物モデルとして脊髄神経結紮モデルを使用することができる。
【０１２４】
痛覚が起こる前に必要な刺激の量を痛覚閾値と定義することができる。神経因性疼痛モデルにおいて、動物に対して、慢性疼痛状態を誘発するような損傷を与える。次に、侵害刺激を与え、侵害刺激に反応せずに動物がそれに耐えられる時間量を計算することができる。例えば、非損傷動物が足を表面から引っ込める前に２０分間冷たい面に曝露し得たが、損傷後、神経因性疼痛のモデルである下記の動物などの損傷動物は、わずか１分後にその手足を引っ込め得る。侵害刺激の例としては、以下に限定されないが、熱、冷たいもの、機械的刺激、例えばｖｏｎ  Ｆｒｅｙ’ｓ刺激、化学的刺激などが挙げられる。
【０１２５】
ある実施形態において、慢性狭窄損傷モデル（ＣＣＩ又はＢｅｎｎｅｔｔモデル）を神経因性疼痛の動物モデルとして使用することができる（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔ、Ｇａｒｙ  Ｊ．ら、Ｐａｉｎ、１９８８、３３、８７−１０７）。このモデルにおいて、神経因性疼痛のヒト患者により報告された症状を誘発するために発見された様式で、例えばラットなどの動物の坐骨神経に意図的に損傷を与えることができる。特に、膝窩における神経の三叉の近位の中腿部で坐骨神経を曝露することができる。その位置で、神経の軌道約７ｍｍを接着組織から離し、その周囲で約１ｍｍ間隔で４本の結紮糸をゆるく絞める。各動物をそれ自身の対照として使用できるように、各動物において、結紮せずに反対側に同一の切開を行うことができる。結紮側において、結紮を受けた後足の皮膚が明白に過剰に疼痛性及び異痛性になり（つまり、通常は疼痛反応を誘発しない刺激により疼痛が起こる。）、おそらく、同様に自発痛の源となる。痛覚過敏を試験するために、熱などの侵害刺激をガラスフロアの下から後足の足底に向け、足引っ込めの反応時間（痛覚閾値のマーカー）を測定することができる。神経損傷側での反応は、異常な大きさ及び持続時間となる傾向があり、例えば足上げは３０秒を超え、長時間の舐めを伴い得る。正常な反応とは、動物があまり頻繁に足を上げず、上げる時間は１秒又は２秒未満である。冷異痛症を試験するために、例えば４℃の温度の冷却した金属床に動物を置くことができる。結紮していない足の場合、接触後２０分でもこの床による疼痛は生じない。結紮したラットに対して、神経損傷を与えた足の引っ込めを測定することができ、例えば、５倍超に延長し得、持続時間を測定すると例えば２倍超に延長し得る。このようなモデルを用いて、薬物を用いずに、及び本明細書中に記載の化合物の投与後にも、疼痛閾値を計算できる。
【０１２６】
別の実施形態において、部分的坐骨神経結紮モデル（Ｓｅｌｔｚｅｒモデル）を使用して、神経因性疼痛閾値を計算することができる（Ｓｅｌｔｚｅｒ，Ａら、Ｐａｉｎ、１９９０、４３、２０５−２１８）。このモデルにおいて、ラットなどの動物の腿上部の坐骨神経の半分を一方的に結紮することができる。術後数時間内、及び術後数ヶ月の間、動物は、同側の後足の防御行動を起こすようになり、しばしばそれを舐めるようになり得、このことから、自発痛の可能性が示唆される。足底面は、非侵害及び侵害刺激に対して均等に知覚過敏になり得る。本発明の化合物に曝露した動物及び曝露していない動物において、侵害刺激に対する一般的な刺激を測定することができる。侵害刺激には、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｈａｉｒ刺激、ＣＯ２レーザー熱パルス及びピンプロックが含まれ得る。足底側での反復的Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｈａｉｒ刺激に対する反応において、引っ込め閾値が急激に低下し得る。手術した側での一連のこのような刺激の後、軽く触れることで回避行動が誘発され、このことから、接触に対する異痛症が示唆される。ＣＯ２レーザー熱パルスに対する引っ込め閾値も顕著に低下する。閾値上侵害熱パルスは一方的に過剰な反応を誘発し、このことから、熱痛覚過敏が示唆される。ピンプロックもまたこのような過剰な反応を起こす（機械的痛覚過敏）。このようなモデルを用いて、薬物を用いずに、及び本明細書中に記載の化合物の投与後にも、痛覚閾値を計算することができる。
【０１２７】
別の実施形態において、脊髄神経結紮モデル（Ｃｈｕｎｇモデル）を使用して神経因性疼痛を測定することができる（Ｋｉｍ，Ｓ．Ｈ．及びＣｈｕｎｇ，Ｊ．Ｍ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１９９１、１３４、１３１−１３４；Ｋｉｍ，Ｓ．Ｈ．及びＣｈｕｎｇ，Ｊ．Ｍ．Ｐａｉｎ、１９９２、５０、３５５−３６３を参照のこと。）。このモデルにおいて、Ｌ５（又はＬ５＋Ｌ６）脊髄神経を固く結び、次に切断する。外科的手技により、手術を行った足の侵害熱及び機械的異痛症に対する痛覚過敏が長時間持続する。手術を行った足の機械的感受性を測定することができる。ｖｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメントを用いて後足に与えた無害の機械的刺激に対して足引っ込めが起こる回数が増えたことにより分かるように、術後第１日目から顕著に機械的感受性が向上し得る。さらに、手術を行った足に自発痛があることに対する行動徴候も見られる。本発明の化合物の投与あり、又は投与なしで、このような測定を行い得、痛覚閾値を計算することができる。
【０１２８】
神経因性疼痛の動物モデルにおける化合物の試験及び痛覚閾値における化合物の影響測定後、痛覚閾値を少なくとも２倍増加させる化合物を選択することができる。他の実施形態において、化合物は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０又は３０倍痛覚閾値が向上し得る。さらなる実施形態において、新しい実験の追加により９５％信頼区間が１０％を超えて変化しなくなるまで少なくとも１５回実験を繰り返すことができる。新しい実験の追加により９５％信頼区間が１０％を超えて変化しなくなるまで神経因性疼痛実験を繰り返すことができる。別の実施形態において、新しい実験の追加により９５％信頼区間が約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％又は２％を超えて変化しなくなるまで神経因性疼痛実験を繰り返すことができる。さらなる実施形態において、新しい実験の追加により９６％、９７％、９８％又は９９％信頼区間が約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％又は２％を超えて変化しなくなるまで神経因性疼痛実験を繰り返すことができる。
【０１２９】
神経因性疼痛のその他の動物モデルとしては、以下に限定されないが、神経枝結紮損傷モデル（Ｄｅｃｏｓｔｅｒｄ  ＆  Ｗｏｏｌｆ、Ｐａｉｎ．２０００年８月；８７（２）：１４９−５８を参照。）、直接的な損傷のない坐骨神経の局所的炎症により誘発される坐骨神経炎症神経障害（ＳＩＮ）及び／又は化学療法剤ビンクリスチン注入後の疼痛の末梢神経モデル（Ａｌｅｙら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １９９６；７３：２５９−６５）が挙げられる。さらなるモデルが当業者にとって公知である。Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  Ｍ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００１；４２９：２３−３７；Ｓｈｉｒら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ  １９９０；１１５：６２−７；Ｗａｌｌら、Ｐａｉｎ  １９７９；７：１０３−１１；ＤｅＬｅｏら、Ｐａｉｎ  １９９４；５６：９−１６；Ｃｏｕｒｔｅｉｘら、Ｐａｉｎ  １９９４；５７：１５３−６０；Ａｌｅｙら；Ｓｌａｒｔら、Ｐａｉｎ  １９９７；６９：１１９−２５；Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓら、Ｐａｉｎ  １９８８；３２：７７−８８も参照のこと。
【０１３０】
ＩＩＩ．化合物
本発明のある態様において、（ｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により１５％を超えて変化しないように少なくとも５回効力促進実験を繰り返すことにより、細胞において生理的ｐＨ対疾患誘導性低ｐＨでの化合物の効力促進を評価することと（例えば、生理的ｐＨでのＩＣ５０／疾患誘導性低ｐＨでのＩＣ５０）；（ｉｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により５％を超えて変化しないように少なくとも１２回実験を繰り返すことにより、一時的局所性虚血の動物モデルにおいて化合物を試験し、梗塞体積における化合物の影響を測定することと；（ｉｉｉ）段階（ｉ）に従い少なくとも５の効力促進を有し、段階（ｉｉ）に従い梗塞体積を少なくとも３０％低下させる化合物を選択することによる、哺乳動物、特にヒトにおいて虚血性損傷を治療するのに有用な化学化合物を同定するためのプロセスを提供する。本発明によると、候補薬物は、ヒトでの使用に効果的な薬物であるためのインビトロ及びインビボ基準の両方に合致又はそれを超えなければならない。ある実施形態において、グルタミン酸受容体を発現する細胞において効力促進を調べることができる。別の実施形態において、ＮＭＤＡ、ＡＭＰＡ及び／又はカイニン酸受容体を発現する細胞において効力促進を調べることができる。ある実施形態において、細胞はＮＭＤＡ受容体のＮＲ１サブユニット及び少なくとも１個のＮＲ２サブユニットを発現することができる。さらなる実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ｂサブユニットであり得る。別の実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ａサブユニットであり得る。
【０１３１】
本発明の別のより一般的な態様において、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストを活性化させる様式においてｐＨを低下させる疾患を治療するために化合物を選択するプロセスを提供するが、この化合物は、（ｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により１５％を超えて変化しないように少なくとも５回効力促進実験を繰り返すことにより、細胞において試験して、生理的ｐＨ対疾患誘導性低ｐＨでの化合物の効力促進を評価する実験（例えば、生理的ｐＨでのＩＣ５０／疾患誘導性低ｐＨでのＩＣ５０）において求めた場合に、少なくとも５の効力促進を示し、（ｉｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により５％を超えて変化しないように少なくとも１２回実験を繰り返すことにより調べ、局所性虚血の動物モデルにおいて測定した場合に、梗塞体積を少なくとも３０％減少させる。ある実施形態において、グルタミン酸受容体を発現する細胞において効力促進を調べることができる。別の実施形態において、ＮＭＤＡ、ＡＭＰＡ及び／又はカイニン酸受容体を発現する細胞において効力促進を調べることができる。ある実施形態において、細胞はＮＭＤＡ受容体のＮＲ１サブユニット及び少なくとも１個のＮＲ２サブユニットを発現することができる。さらなる実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ｂサブユニットであり得る。別の実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ａサブユニットであり得る。
【０１３２】
ある特定の実施形態において、（ｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により１５％を超えて変化しないように少なくとも５回効力促進実験を繰り返すことにより、ＮＭＤＡ受容体のＮＲ１サブユニット及び少なくとも１個のＮＲ２サブユニット細胞において生理的ｐＨ対疾患誘導性低ｐＨでの化合物の効力促進を評価することと（例えば、生理的ｐＨでのＩＣ５０／疾患誘導性低ｐＨでのＩＣ５０）；（ｉｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により５％を超えて変化しないように少なくとも１２回実験を繰り返すことにより、一時的局所性虚血の動物モデルにおいて化合物を試験し、梗塞体積における化合物の影響を測定することと；（ｉｉｉ）段階（ｉ）に従い少なくとも５の効力促進を有し、段階（ｉｉ）に従い梗塞体積を少なくとも３０％減少させる化合物を選択することによる、哺乳動物、特にヒトにおいて虚血性損傷を治療するのに有用な化学化合物を同定するためのプロセスを提供する。本発明によると、候補薬物は、ヒトでの使用に効果的な薬物であるためのインビトロ及びインビボ基準の両方に合致又はそれを超えなければならない。ある実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ｂサブユニットであり得る。別の実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ａサブユニットであり得る。
【０１３３】
別の特定の実施形態において、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストを活性化する様式でｐＨを低下させる疾患を治療するための化合物が選択されるプロセスを提供するが、この化合物は、（ｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により１５％を超えて変化しないように少なくとも５回効力促進実験を繰り返すことにより、ＮＭＤＡ受容体のＮＲ１サブユニット及び少なくとも１個のＮＲ２サブユニットを発現する細胞において試験して、生理的ｐＨ対疾患誘導性低ｐＨでの化合物の効力促進を評価する実験（例えば、生理的ｐＨでのＩＣ５０／疾患誘導性低ｐＨでのＩＣ５０）において求めた場合に、少なくとも５の効力促進を示し、（ｉｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により５％を超えて変化しないように少なくとも１２回実験を繰り返すことにより、局所性虚血の動物モデルにおいて測定した場合に、梗塞体積を少なくとも３０％減少させる。ある実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ｂサブユニットであり得る。別の実施形態において、ＮＲ２サブユニットはＮＲ２Ａサブユニットであり得る。
【０１３４】
さらに、さらなる実施形態において、例えば、運動不全、認知機能障害及び心臓毒性又は本明細書中に記載の毒性などの毒性を化合物は示さない。さらに、又はあるいは、化合物は、何らかの他のグルタミン酸受容体、本明細書中に記載のその他の受容体よりも、ＮＭＤＡ受容体への結合に対して少なくとも１０倍の選択性を有し得る。さらなる追加的又は代替的実施形態において、化合物は、少なくとも２：１以上の治療指数を有し得る。
【０１３５】
本発明の別の実施形態において、（ｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により１０％を超えて変化しなくなるまで効力促進実験を繰り返すことにより、ＮＲ１／ＮＲ２Ａ  ＮＭＤＡ受容体及び／又はＮＲ１／ＮＲ２Ｂ  ＮＭＤＡ受容体を発現する細胞において生理的ｐＨ対疾患誘導性低ｐＨでの化合物の効力促進を評価することと（例えば、生理的ｐＨでのＩＣ５０／疾患誘導性低ｐＨでのＩＣ５０）；（ｉｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により１０％を超えて変化しなくなるまで実験を繰り返すことにより、一時的局所性虚血の動物モデルにおいて化合物を試験し、梗塞体積における化合物の影響を測定することと；（ｉｉｉ）段階（ｉ）に従い少なくとも５の効力促進を有し、段階（ｉｉ）に従い梗塞体積を少なくとも３０％減少させる化合物を選択することにより、ヒトにおける虚血性損傷を治療するのに有用な化学化合物を同定するプロセスを提供する。
【０１３６】
本発明のさらなる実施形態において、虚血性損傷に伴う疾患を治療するための化合物を選択するプロセスを提供するが、この化合物は、（ｉ）少なくとも５回、又は９５％信頼区間が新しい実験の追加により１０％を超えて変化しなくなるまで効力促進実験を繰り返すことにより、ＮＲ１／ＮＲ２Ａ  ＮＭＤＡ受容体及び／又はＮＲ１／ＮＲ２Ｂ  ＮＭＤＡ受容体を発現する細胞において生理的ｐＨ対疾患誘導性低ｐＨでの化合物の効力促進を試験する実験において求めた場合に、少なくとも５の効力促進を示し、（ｉｉ）９５％信頼区間が新しい実験の追加により１０％を超えて変化しなくなるまで実験を繰り返すことにより調べて、局所性虚血の動物モデルにおいて測定した場合に、梗塞体積を少なくとも３０％減少させる。
【０１３７】
さらに、又はあるいは、化合物は、何らかの他のグルタミン酸受容体よりも、ＮＭＤＡ受容体への結合に対して少なくとも１０倍の選択性を有し得る。他の実施形態において、化合物は、何らかの他のグルタミン酸受容体（例えば、以下に限定されないが、次のグルタミン酸受容体、ＡＭＰＡ  ＧｌｕＲ１（ＧｅｎＥＭＢＬ受入番号Ｘ５７４９７、Ｘ１７１８４、Ｉ５７３５４）、ＡＭＰＡ  ＧｌｕＲ２（ＧｅｎＥＭＢＬ受入番号Ｘ５７４９８、Ｍ８５０３５、Ａ４６０５６）、ＡＭＰＡ  ＧｌｕＲ３（ＧｅｎＥＭＢＬ受入番号Ｍ８５０３６、Ｘ８２０６８）、ＡＭＰＡ  ＧｌｕＲ４（ＧｅｎＥＭＢＬ受入番号Ｍ３６４２１、Ｕ１６１２９）、カイニン酸ＧｌｕＲ５（ＧｅｎＥＭＢＬ受入番号Ｘ６６１１８、Ｍ８３５６０、Ｕ１６１２５）、カイニン酸ＧｌｕＲ６（ＧｅｎＥＭＢＬ受入番号Ｄ１００５４、Ｚ１１７１５、Ｕ１６１２６）、カイニン酸ＧｌｕＲ７（ＧｅｎＥＭＢＬ受入番号Ｍ８３５５２、Ｕ１６１２７）、カイニン酸ＫＡ−Ｉ（ＧｅｎＥＭＢＬ受入番号Ｘ５９９９６、Ｓ６７８０３ｑ）、カイニン酸ＫＡ−２（ＧｅｎＥＭＢＬ受入番号Ｄ１００１１、Ｚ１１５８１、Ｓ４０３６９）、オーファンｄ１  ＧＲＩＤＩ（ＧｅｎＥＭＢＬ受入番号Ｄ１０１７１、Ｚ１７２３８）、オーファンｄｓ  ＧＲＩＤ２（ＧｅｎＥＭＢＬ受入番号Ｄ１３２６６、Ｚ１７２３９）及び／又は代謝調節型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）、例えばＧｒｏｕｐ１  ｍＧｌｕＲ（ｍＧｌｕＲ１及びｍＧｌｕＲ５を含む。）、Ｇｒｏｕｐ２  ｍＧｌｕＲ（ｍＧｌｕＲ２及びｍＧｌｕＲ３を含む。）及びＧｒｏｕｐ３ｍＧｌｕＲ（ｍＧｌｕＲ４、ｍＧｌｕＲ６、ｍＧｌｕＲ７及びｍＧｌｕＲ８を含む。）など。）よりも、ＮＭＤＡ受容体への結合に対して少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、７８、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００又は１０００倍選択的であり得る。ＮＭＤＡ受容体は、以下に限定されないが、ＮＭＤＡ  ＮＲ１（染色体（ヒト）９ｑ３４．３、マウスに対するＧｅｎＥＭＢＬ受入番号：Ｄ１００２８、ラットに対するＧｅｎＥＭＢＬ受入番号：Ｘ６３２５５、ヒトに対するＧｅｎＥＭＢＬ受入番号：Ｘ５８６３３）、ＮＭＤＡ  ＮＲ２Ａ（染色体（ヒト）：１６ｐ１３．２、マウスに対するＧｅｎＥＭＢＬ受入番号：Ｄ１０２１７、ラット対するＧｅｎＥＭＢＬ受入番号：Ｄ１３２１１、ヒト対するＧｅｎＥＭＢＬ受入番号：Ｕ０９００２）；ＮＭＤＡ  ＮＲ２Ｂ（染色体（ヒト）：１２ｐ１２  マウスに対するＧｅｎＥＭＢＬ受入番号：Ｄ１０６５１、ラット対するＧｅｎＥＭＢＬ受入番号：Ｍ９１５６２、ヒト対するＧｅｎＥＭＢＬ受入番号：Ｕ２８８６１ａ）；ＮＭＤＡ  ＮＲ２Ｃ（染色体（ヒト）１７ｑ２４−ｑ２５、マウスに対するＧｅｎＥＭＢＬ受入番号：Ｄ１０６９４、ラット対するＧｅｎＥＭＢＬ受入番号：Ｄ１３２１２）；ＮＭＤＡ  ＮＲ２Ｄ（染色体（ヒト）１９ｑ１３．１ｑｔｅｒ、マウスに対するＧｅｎＥＭＢＬ受入番号：Ｄ１２８２２、ラット対するＧｅｎＥＭＢＬ受入番号：Ｄ１３２１４、ヒト対するＧｅｎＥＭＢＬ受入番号：Ｕ７７７��３）；ＮＭＤＡ  ＮＲ３Ａ（ラット対するＧｅｎＥＭＢＬ受入番号：Ｌ３４９３８及び／又はＮＭＤＡ  ＮＲ３Ｂを含む、そのサブユニットの何れかから構成され得る。ＮＭＤＡ受容体に対して、あるいは、化合物は、上記で挙げた別のグルタミン酸受容体よりも選択的ではないか、又は少なくとも２、３、４、５、６、７、８もしくは９倍選択的ではない。
【０１３８】
さらに、又はあるいは、化合物は、別の受容体タイプよりも、ＮＭＤＡ受容体への結合に対して少なくとも１０倍の選択性を有し得る。他の実施形態において、化合物は、例えば、以下に限定されないが次の受容体を含む別の受容体タイプよりも、ＮＭＤＡ受容体への結合に対して少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、７８、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００又は１０００倍選択的であり得る：ドーパミン受容体、例えばＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４及びＤ５ドーパミン受容体；オピオイド受容体、例えば、ｍｕオピオイド受容体（ｍｕ１及びｍｕ２を含む。）；デルタオピオイド受容体（デルタ１及びデルタ２を含む。）及びカッパオピオイド受容体（κ１及びκ２を含む。）；コリン作用性受容体（ムスカリン性及びニコチン性受容体を含む。）；アドレナリン作用性受容体（エピネフリン受容体及びエピネフリン受容体を含む。）、ＧＡＢＡ受容体（ＧＡＢＡ−Ａ及びＧＡＢＡ−Ｂ受容体を含む。）又はペプチド受容体、例えば、以下に限定されないが、下記表Ｂで挙げるペプチドに対する受容体。あるいは、化合物は、ＮＭＤＡ受容体に対して、上記で挙げた受容体よりも選択的ではないか、又は少なくとも２、３、４、５、６、７、８又は９倍選択的ではない。
【０１３９】
【表２】
2008511004.tif 000008
2008511004.tif 000009
【０１４０】
別の実施形態において、化合物は、セロトニン受容体よりも、ＮＭＤＡ受容体への結合に対して少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、７８、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００又は１０００倍選択的であり得る。あるいは、化合物は、ＮＭＤＡ受容体に対して、セロトニン受容体よりも選択的でないか、又は少なくとも２、３、４、５、６、７、８又は９倍選択的ではない。セロトニン受容体としては、以下に限定されないが、５ＨＴ１（５ＨＴ１Ａ、５ＨＴ１Ｂ、５ＨＴ１Ｄ、５ＨＴ１Ｅ及び５ＨＴ１Ｆを含む。）；５ＨＴ２（５ＨＴ２Ａ、５ＨＴ２Ｂ及び５ＨＴ２Ｃを含む。）；５ＨＴ３；５ＨＴ４；５ＨＴ５（５ＨＴ５ａ及び５ＨＴ５Ｂを含む。）；５ＨＴ６及び５ＨＴ７が挙げられる。別の実施形態において、化合物は、ヒスタミン受容体（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３及びＨ４ヒスタミン受容体を含む。）よりも、ＮＭＤＡ受容体への結合に対して、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、７８、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００又は１０００倍選択的であり得る。あるいは、化合物は、ＮＭＤＡ受容体に対して、ヒスタミン受容体（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３及びＨ４ヒスタミン受容体を含む。）よりも選択的ではないか、又は少なくとも２、３、４、５、６、７、８又は９倍選択的ではない。別の実施形態において、化合物は、カルシウムチャネルよりも、ＮＭＤＡ受容体への結合に対して、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、７８、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００又は１０００倍選択的であり得る。
【０１４１】
特定の受容体への薬物の親和性を調べるために化合物をスクリーニングすることは、薬物探索プロセスにおける重要事項の１つである。当業者にとって公知の何らかの方法により、受容体選択性を調べるためのプロセスを行い得る。大規模な化合物ライブラリに対する一次スクリーニング法として、又は様々な受容体型もしくはサブタイプに対する結合親和性に関して化合物を順位付けするための二次スクリーニングとして、スクリーニングを使用することができる。ある実施形態において、例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎＴＭＨＴＳプレートなどのフィルター−プレートスクリーニング系といった高スループット系においてこの分析を行い得る。
【０１４２】
ある実施形態において、放射性リガンド結合アッセイを使用して、特定の受容体に対する受容体選択性を決定することができる。ある特定の実施形態において、飽和結合アッセイを使用して、特定の受容体に対する試験化合物の結合定数（Ｋｄ）を求めることができる。当技術分野で公知の何らかの方法に従い飽和結合アッセイを行うことができる。一般に、特定の受容体を発現する細胞膜を得ることにより、飽和結合アッセイを行うことができる。例えば、ＣＨＯ細胞などの細胞に対してトランスフェクションを行い、ＮＭＤＡ受容体、例えば、ＮＲ１／ＮＲ２Ａ又はＮＲ１／ＮＲ２ＢＮＭＤＡ受容体又はＡＭＰＡ受容体などのグルタミン酸受容体を発現させるようにすることができる。あるいは、ＮＲ１／ＮＲ２Ｂ又はＮＲ１／ＮＲ２Ａ  ＮＭＤＡ受容体といったＮＭＤＡ受容体などの特定の受容体を内在的に発現する細胞を使用することができる。ある実施形態において、細胞全体の結合アッセイを行うことができる。あるいは、例えば、細胞を溶解し、次いで遠心を用いて細胞溶解液の膜分画を得ることにより、膜を細胞から単離することができるが、例えば、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ａ．Ｈｕｂｂａｒｄ及びＺ．Ｃｏｈｎ  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９７５）及びＲｏｇｅｒら、１９９１、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：２７１３−２７２４を参照のこと。次に細胞全体又は細胞膜を、放射性標識リガンド、すなわち、例えば３Ｈ−標識リガンドなどの試験化合物の連続希釈物とインキュベートすることができる。例えば、少なくとも１、２又は３時間のインキュベート後、例えば、５、１０、１５又は２０回、膜を洗浄することができる。次に、シンチレーション液を添加し、細胞又は細胞もしくは膜の放射活性を行うことができる。過剰の非標識競合リガンドを用いた別の実験において非特異的結合もまた求めることができる。総活性から非特異的活性を差し引いたものとして、特異的結合を計算することができる。次に、例えば、Ｐｒｉｚｍデータソフトウェア（ｗｗｗ．Ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）を用いることにより、非線形回帰及びＳｃａｔｃｈａｒｄ解析によって遊離リガンド濃度により特異的結合をフィットさせて、結合定数（Ｋｄ）を求めることができる。さらに、結合部位数［最大結合能（Ｂｍａｘ）］もまた、例えばＰｒｉｚｍデータソフトウェアを用いることによって、非線形回帰及びＳｃａｔｃｈａｒｄ解析により、計算することができる。
【０１４３】
別の実施形態において、置換放射性リガンド結合アッセイを行って、相対親和性値（ＩＣ５０）を求めることができる。上述のように、特定の受容体を発現する細胞全体又は単離細胞膜を使用することができる。一定の放射性リガンド濃度及び、非標識リガンドなしの対照結合実験と比較する場合に非標識競合リガンドの連続希釈物を使用することにより、阻害を求めることができる（％対照）。例えば、Ｐｒｉｚｍデータソフトウェアを用いることにより、非線形回帰によって結合阻害値をフィットさせることにより、相対的親和性値（ＩＣ５０）を求めることができる。
【０１４４】
本発明に従い選択した化合物
ＮＭＤＡ−受容体アンタゴニストが介在し得る疾患の治療における哺乳動物（例えばヒト）の臨床性能改良のために、次の化合物を選択した。本明細書中で広く述べる指針に従うことにより、新しいパラメーターを満たす他の化合物を選択することができる。
【０１４５】
ある実施形態において、本明細書中に記載のプロセス及び方法に従い選択した化合物は、
【０１４６】
【化８】
2008511004.tif 000010
ならびに医薬的に許容される、塩、鏡像異性体、鏡像異性体混合物及び混合物であり得る。
【０１４７】
別の実施形態において、本明細書中に記載のプロセス及び方法に従い選択した化合物は、
【０１４８】
【化９】
2008511004.tif 000011
ならびに医薬的に許容される、塩、鏡像異性体、鏡像異性体混合物及び混合物であり得る。
【０１４９】
別の実施形態において、本明細書中に記載のプロセス及び方法に従い選択した化合物は、
【０１５０】
【化１０】
2008511004.tif 000012
ならびに医薬的に許容される、塩、鏡像異性体、鏡像異性体混合物及び混合物であり得る。
【０１５１】
さらなる実施形態において、本明細書中に記載のプロセス及び方法に従い選択した化合物は、
【０１５２】
【化１１】
2008511004.tif 000013
ならびに医薬的に許容される、塩、鏡像異性体、鏡像異性体混合物及び混合物であり得る。
【０１５３】
またさらなる実施形態において、本明細書中に記載のプロセス及び方法に従い選択した化合物は、
【０１５４】
【化１２】
2008511004.tif 000014
ならびに医薬的に許容される塩であり得る。ある実施形態において、（−）ＭＫ８０１を使用して、本明細書中に記載のように、神経因性疼痛、脳腫瘍及び／又は神経変性疾患を治療することができる。
【０１５５】
別の実施形態において、化合物（Ｓ）ケタミンは、虚血性損傷又は低酸素症の治療に対して選択されない。別の実施形態において、（Ｓ）ケタミンを使用して、本明細書中に記載のように、神経因性疼痛、脳腫瘍及び／又は神経変性疾患を治療することができる。
【０１５６】
ラセミ合成を行い、次いで鏡像異性の面で純粋な（−）異性体を得るために分解するか（例えば、Ｍｏｌａｎｄｅｒ，Ｇ．Ａ．ら、Ｊ，Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、６４：ｐｐ．６５１５−６５１７（１９９９）；Ｃｈｒｉｓｔｙ，Ｍ．Ｅ．ら、Ｊ，Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、４４：ｐｐ．３１１７（１９７９）を参照。）又は、位置選択的ラジカル環化を用いたＲｅｉｓｓｅｒｔ生成物からの６段階での鏡像異性選択適合性により（例えば、Ｆｕｎａｂａｓｈｉ，Ｋ，ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：ｐｐ．１０７８４−１０７８５（２００１）を参照のこと。）、ＭＫ８０１（５Ｓ，１０Ｒ）−（−）異性体の合成を行うことができる。
【０１５７】
本明細書中で開示されるその他の化合物の合成は、ＷＯ０２／０７２５４２で見出すことができる。
【０１５８】
立体化学
当然のことながら、化合物の三次元配置は治療用途のための化合物の活性及び／又は適切性に関与しうる。本明細書中に記載の基準を用いて、化合物の鏡像異性体が両方選択され得るか、又は一方が選択され得、一方が選択され得ないことが、本明細書中で実験的に観察されている。おそらく、ある一定の状況において、与えられた基準を用いて、両方の鏡像異性体が選択され得る。
【０１５９】
非限定例は次のとおりである。
【０１６０】
ある実施形態において、図１で示すように、鏡像異性体（Ｓ）９３−４は、治療用途に有効な化合物として選択基準に当てはまる。
【０１６１】
【化１３】
2008511004.tif 000015
【０１６２】
別の実施形態において、図１で示すように、鏡像異性体（Ｓ）９３−３１は、治療用途に有効な化合物として選択基準に当てはまる。
【０１６３】
【化１４】
2008511004.tif 000016
【０１６４】
別の実施形態において、図１で示すように、鏡像異性体（Ｓ）９３−８は、治療用途に有効な化合物として選択基準に当てはまる。
【０１６５】
【化１５】
2008511004.tif 000017
【０１６６】
別の実施形態において、図１で示すように、鏡像異性体（Ｓ）９３−４１は、治療用途に有効な化合物として選択基準に当てはまる。
【０１６７】
【化１６】
2008511004.tif 000018
【０１６８】
さらに別の実施形態において、図１で示すように、鏡像異性体（Ｓ）９３−５は、治療用途に有効な化合物として選択基準に当てはまる。
【０１６９】
【化１７】
2008511004.tif 000019
【０１７０】
ある実施形態において、化合物（Ｓ）９８-５、（Ｓ）９３−４、（Ｓ）９３−８、（Ｓ）９３−３１及び（Ｓ）９３−４１は、例えば、図１で示されるように、ＮＭＤＡ受容体のＮＲ２Ｂサブユニットに結合することができる。別の実施形態において、化合物（Ｓ）９８−５、（Ｓ）９３−４、（Ｓ）９３−８、（Ｓ）９３−３１及び（Ｓ）９３−４１は、ＮＭＤＡ受容体のＮＲ２Ｂサブユニットに対して選択的であり得る。
【０１７１】
さらに別の実施形態において、図１で示されるように、（−）ＭＫ８０１は、治療用途に効果的な化合物として選択基準に当てはまるが、（＋）−ＭＫ８０１は、本明細書中に記載のように、選択基準に当てはまらない。
【０１７２】
鏡像異性体９３−４０及び９３−４３のいずれも、図１で示されるように、治療用途に効果的な化合物として選択基準に当てはまらない。
【０１７３】
【化１８】
2008511004.tif 000020
【０１７４】
【化１９】
2008511004.tif 000021
【０１７５】
さらに、鏡像異性体（Ｓ）９３−９７は、図１で示されるように、治療用途に効果的な化合物として選択のための基準に当てはまらない。
【０１７６】
【化２０】
2008511004.tif 000022
【０１７７】
さらなる実施形態
ある実施形態において、（Ｓ）ケタミンは、本発明の方法から特別に除外され得る。別の実施形態において、（−）ＭＫ８０１は、本発明の方法から特別に除外され得る。別の実施形態において、（Ｓ）ケタミンは、虚血性損傷を治療することに関して本発明から除外され得る。さらなる実施形態において、（−）ＭＫ８０１は、虚血性損傷を治療することに関して本発明から除外され得る。
【０１７８】
別の実施形態において、本明細書中に記載のプロセス及び方法に従い選択される化合物は、以下に限定されないが、ＦＲ１１５４２７、ＮＰＳ１５０６、フェンシクリジン（ＰＣＰ）、レマセミド、ＴＣＰ又はＥＡＡ−０９０など、ＮＭＤＡ受容体チャネルブロッカーではない。別の実施形態において、本明細書中に記載のプロセス及び方法に従い選択される化合物は、以下に限定されないが、ＣＧＰ４０１１６、Ｄ−ＣＰＰｅｎｅ、ＧＰＩ３０００（ＮＰＣ１７７４２）、ＭＤＬ１００，４５３又はセルフォテル（ＣＧＳ１９７５５）など、ＮＭＤＡ受容体グルタミン酸部位アンタゴニストではない。別の実施形態において、本明細書中に記載のプロセス及び方法に従い選択される化合物は、以下に限定されないが、７−Ｃｌ−キヌレン酸、ＨＡ９６６、ＭＲＺ２／５７６、ＺＤ９３７９、ガベスチネル（ＧＶ１５０５２６）、アンドリコスチネル（ＡＣＥＡ１０２１，５−ニトロ−６，７−ジクロロ−１，４−ジヒドロ−２，３−キノキサリンジオン）など、ＮＭＤＡ受容体グリシン部位アンタゴニストではない。
【０１７９】
別の実施形態において、本明細書中に記載のプロセス及び方法に従い選択される化合物は、
【０１８０】
【化２１】
2008511004.tif 000023
（式中、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１８の１つは、
【０１８１】
【化２２】
2008511004.tif 000024
（式中、Ｒ１３はアルキル、アラルキル又はアリールであり、Ｒ１７はＨ又は低級アルキルであり、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１８のその他のものは、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｉ又はＲであり、Ｒは低級アルキルである。）である。）又は、
【０１８２】
【化２３】
2008511004.tif 000025
（式中、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及びＲ（Ｒは低級アルキルである。）からなる群から独立に選択され、Ｒ１３は、アルキルアラルキル又はアリールである。）；
（式中Ａは、
【０１８３】
【化２４】
2008511004.tif 000026
（式中、Ｒ１及びＲ５は、独立にＨ又はＦであり；Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及びＯＲ（Ｒは低級アルキルである。）からなる群から独立に選択されるか、又は、Ｒ２及びＲ３は一緒になってＯ−ＣＨ２−Ｏである。）、
【０１８４】
【化２５】
2008511004.tif 000027
（式中、Ｒ１、Ｒ４及びＲ５は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及びＯＲ（Ｒは低級アルキルである。）からなる群から独立に選択され、Ｒ３は独立にＯ、Ｓ、ＮＨ又はＮＲであり、Ｒ２はＮであり、Ｒ１６はＣ−アルキル、Ｃ−アラルキル又はＣ−アリールである。）、
【０１８５】
【化２６】
2008511004.tif 000028
（式中、Ｒ１、Ｒ４及びＲ５は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及びＯＲ（Ｒは低級アルキルである。）からなる群から独立に選択され、Ｒ２は独立にＯ、Ｓ、ＮＨ又はＮＲであり、Ｒ３はＮであり、Ｒ１６はＣ−アルキル、Ｃ−アラルキル又はＣ−アリールである。）、
【０１８６】
【化２７】
2008511004.tif 000029
（式中、Ｒ１からＲ４は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及びＯＲ（Ｒは低級アルキルである。）からなる群から独立に選択されるか、又はＲ２及びＲ３は一緒にＯ−ＣＨ２−Ｏである。）、
【０１８７】
【化２８】
2008511004.tif 000030
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、Ｏ、Ｓ、ＮＨ又はＮＲ（Ｒは低級アルキルである。）からなる群から独立に選択されるか、又はＲ２及びＲ３は一緒にＯ−ＣＨ２−Ｏであり、Ｒ４はＮである。）、
【０１８８】
【化２９】
2008511004.tif 000031
（式中、Ｒ２及びＲ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及びＯＲ（Ｒは低級アルキルである。）からなる群から独立に選択され、Ｒ４はＮである。）、
【０１８９】
【化３０】
2008511004.tif 000032
（式中、Ｒ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＨ及びＮＲ（Ｒは低級アルキルである。）からなる群から選択され、Ｒ２はＮであり、Ｒ３及びＲ４は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及びＯＲ（Ｒは低級アルキルである。）からなる群から独立に選択される。）、
【０１９０】
【化３１】
2008511004.tif 000033
（式中、Ｒ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＨ及びＮＲ（Ｒは低級アルキルである。）からなる群から選択され、Ｒ２及びＲ４はＮであり、Ｒ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及びＯＲ（Ｒは低級アルキルである。）からなる群から独立に選択される。）、
【０１９１】
【化３２】
2008511004.tif 000034
（式中、Ｒ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＨ及びＮＲ（Ｒは低級アルキルである。）からなる群から選択され、Ｒ２は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及びＯＲ（Ｒは低級アルキルである。）からなる群から独立に選択され、Ｒ３及びＲ４はＮである。）、
【０１９２】
【化３３】
2008511004.tif 000035
（式中、Ｒ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＨ及びＮＲ（Ｒは低級アルキルである。）からなる群から選択され、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はＮである。）、
【０１９３】
【化３４】
2008511004.tif 000036
（式中、Ｒ１及びＲ３は、Ｏ、Ｓ、ＮＨ及びＮＲ（Ｒは低級アルキルである。）からなる群から独立に選択され、Ｒ２、Ｒ２’及びＲ４は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及びＯＲ（Ｒは低級アルキルである。）からなる群から独立に選択される。）、
【０１９４】
【化３５】
2008511004.tif 000037
（式中、Ｒ１及びＲ２は、Ｏ、Ｓ、ＮＨ及びＮＲ（Ｒは低級アルキルである。）からなる群から独立に選択され、Ｒ２’及びＲ３及びＲ４は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ及びＯＲ（Ｒは低級アルキルである。）からなる群から独立に選択される。）、
【０１９５】
【化３６】
2008511004.tif 000038
（式中、Ｘ１はＣ−Ｒ３又はＮであり、Ｘ２はＣ−Ｒ４又はＮであり、Ｘ３はＣ−Ｒ４’又はＮ（Ｒ１−Ｒ４’はＯ、Ｓ、ＮＨ及びＮＲ（Ｒは低級アルキルである。）からなる群から独立に選択される。）であるか、Ｒ１及びＲ２は一緒にＯ−ＣＨ２−Ｏである。）からなる群から選択され；
式中、Ｂは、
【０１９６】
【化３７】
2008511004.tif 000039
（式中、Ｒ６及びＲ６’は独立にＨ又はＦであり、Ｒ７はＨ、低級ｎ−アルキル、ＣＨ２Ａｒ、ＣＨ２ＣＨ２Ａｒ、ＣＨ２ＣＨＦＡｒ又はＣＨ２ＣＨＦ２Ａｒであり、Ｒ８はＯＨ、ＯＲ（Ｒは低級アルキルである。）又はＦである。）、
【０１９７】
【化３８】
2008511004.tif 000040
（式中、Ｒ６及びＲ６’は独立にＨ又はＦであり、Ｒ７はＣＨ２であり、Ｒ８はＯである。）、
【０１９８】
【化３９】
2008511004.tif 000041
（式中、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は独立にＣＨ２、ＣＨＲ又はＣＲ２（Ｒは低級アルキルである。）であり、Ｒ８はＯＨ、ＯＲ（Ｒは低級アルキルである。）又はＦである。）、
【０１９９】
【化４０】
2008511004.tif 000042
（式中、Ｒ６及びＲ７は独立にＣＨ２、ＣＨＲ又はＣＲ２（Ｒは低級アルキルである。）であり、Ｒ８はＯＨ、ＯＲ（Ｒは低級アルキルである。）又はＦである。）又は
【０２００】
【化４１】
2008511004.tif 000043
（式中、Ｒ６及びＲ７は独立にＣＨ２、ＣＨＲ又はＣＲ２（Ｒは低級アルキルである。）であり、Ｒ８はＯＨ又はＦであり、ｎ＝１−３である。）からなる群から選択される。）及び医薬的に許容される、これらの塩、鏡像異性体、鏡像異性体混合物及び混合物を含み、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０７２５４２に記載されていない。
【０２０１】
「アルキル」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味をとり、直鎖、分枝鎖及びシクロアルキル基を含むものとする。この用語は、以下に限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ネオペンチル、２−メチルブチル、１−メチルブチル、１−エチルプロピル、１，１−ジメチルプロピル、ｎ−へキシル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、３，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、１，１−ジメチルブチル、２−エチルブチル、１−エチルブチル、１，３−ジメチルブチル、ｎ−ヘプチル、５−メチルヘキシル、４−メチルヘキシル、３−メチルヘキシル、２−メチルヘキシル、１−メチルヘキシル、３−エチルペンチル、２−エチルペンチル、１−エチルペンチル、４，４−ジメチルペンチル、３，３−ジメチルペンチル、２，２−ジメチルペンチル、１，１−ジメチルペンチル、ｎ−オクチル、６-メチルヘプチル、５−メチルヘプチル、４−メチルヘプチル、３−メチルヘプチル、２−メチルヘプチル、１−メチルヘプチル、１−エチルヘキシル、１−プロピルペンチル、３−エチルヘキシル、５，５−ジメチルヘキシル、４，４−ジメチルヘキシル、２，２−ジエチルブチル、３，３−ジエチルブチル及び１−ジメチル−１−プロピルブチルを含む。アルキル基は場合によっては置換されている。低級アルキル基は、特に、メチル、エチル、ｎ−プロピル及びイソプロピル基を含む。本明細書中で言及する低級アルキル基は、１から６個の炭素原子を有する。
【０２０２】
「大型環含有基」という用語は、アリール環又はシクロアルキル環であり得る１以上の環構造を含有する基を指す。
【０２０３】
「シクロアルキル」という用語は、炭化水素環を有するアルキル基、特に、３から７個の炭素原子を有するものを指す。シクロアルキル基には、環上にアルキル基置換を有するものが含まれる。シクロアルキル基には、直鎖及び分枝鎖部分が含まれ得る。シクロアルキル基には、以下に限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル及びシクロノニルが含まれる。シクロアルキル基は、場合によっては置換され得る。
【０２０４】
「アリール」という用語は、通常、共役したｐｉ電子系を有する少なくとも１個の環を有する芳香族基を指すために本明細書中で使用され、以下に限定されないが、炭素環アリール、アラルキル、複素環アリール、ビアリール基及び複素環ビアリール基を含み、これらは全て、場合によっては置換され得る。特定のアリール基は、１又は２個の芳香環を有する。
【０２０５】
アルキル基の置換には、ヘテロ原子を含有する部分によるその基の１以上の炭素における置換が含まれる。これらの基に対する適切な置換基としては、以下に限定されないが、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＣＯＨ、ＣＯ２Ｈ、ＯＲｃ、ＳＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＣＯＲｃＲｄ及びハロゲン、特にフッ素が挙げられ、ここでＲｃ及びＲｄは独立に、アルキル、不飽和アルキル又はアリール基である。特定のアルキル及び不飽和アルキル基は、１から約３個の炭素原子を有する、低級アルキル、アルケニル又はアルキニル基である。
【０２０６】
「アラルキル」は、アリール基で置換されているアルキル基を指す。適切なアラルキル基としては、とりわけ、ベンジル、フェネチル及びピコリルが挙げられ、場合によっては置換され得る。アラルキル基には、複素環及び炭素環芳香族部分を有するものが含まれる。
【０２０７】
「複素環アリール基」は、環中に１から３個のヘテロ原子を有し、他が炭素原子である、少なくとも１個の複素環芳香族環を有する基を指す。適切なヘテロ原子としては、以下に限定されないが、酸素、イオウ及び窒素が挙げられる。複素環アリール基としては、とりわけ、フラニル、チエニル、ピリジル、ピロリル、Ｎ−アルキルピロロ、ピリミジル、ピラジニル、イミダゾリル、ベンゾフラニル、キノリニル及びインドリルが挙げられ、全て場合によっては置換されている。
【０２０８】
「複素環ビアリール」は、デカリン又はシクロヘキサンへのフェニル環の付加点に対して、オルト、メタ又はパラで、フェニル基が複素環アリール基で置換されている複素環アリールを指す。パラ又はメタ置換が有用である。複素環ビアリールとしては、とりわけ、複素環芳香族環により置換されているフェニル基を有する基が挙げられる。複素環ビアリールの芳香族環は、場合によっては置換され得る。
【０２０９】
「ビアリール」は、デカリン又はシクロヘキサンへのフェニル環の付加点に対して、オルト、メタ又はパラで、フェニル基が炭素環アリール基で置換されている炭素環式アリール基を指す。ビアリール基としては、とりわけ、デカリン又はシクロヘキサン構造への第一のフェニル環の付加点に対してオルト、メタ又はパラで、第二のフェニル基により置換されている第一のフェニル基が挙げられる。パラ置換が有用である。ビアリール基の芳香族環は場合によっては置換され得る。
【０２１０】
アリール基置換には、１以上の炭素における、又は可能であれば、アリール基の芳香環の１以上のヘテロ原子における、非アリール基（Ｈを除く）による置換が含まれる。一方、非置換アリールは、芳香族環炭素が全てＨで置換されているアリール基を指し、例えば非置換フェニル（−Ｃ６Ｈ５）又はナフチル（−Ｃ１０Ｈ７）である。アリール基に対する適切な置換基としては、とりわけ、アルキル基、不飽和換アルキル基、ハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＣＯＨ、ＣＯ２Ｈ、ＯＲｅ、ＳＲｅ、ＮＲｅＲｆ、ＣＯＲｅＲｆが挙げられ、ここでＲｅ及びＲｆは独立に、アルキル、不飽和アルキル又はアリール基である。具体的な置換基は、ＯＨ、ＳＨ、Ｏｒｅ及びＳｒｅである（Ｒｅは低級アルキル、すなわち、１から約３個の炭素原子を有するアルキル基である。）。その他の具体的な置換基はハロゲン、より好ましくはフッ素、及び低級アルキル及び不飽和低級アルキル基（１から約３個の炭素原子を有する。）である。置換基としては、−ＣＯ２−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＣＨＣＨ−及び−（ＣＨ２）ｌ−（ここで、ｌは、１から約５の整数であり、特に−（ＣＨ２）−である。）などの、アリール基での芳香族環間の架橋基があげられる。架橋置換基を有するアリール基の例としては、安息香酸フェニルが挙げられ、置換基としてはまた、−（ＣＨ２）ｌ−、−Ｏ−（ＣＨ２）ｌ−又は−ＯＣＯ−（ＣＨ２）ｌ−（ここで、ｌは、その部分に対して適切なように、約２から約７の整数であり、例えば１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン基においてのように、１個の芳香族環において２個の環原子を架橋する。）などの部分が挙げられる。次に、置換アルキル及び不飽和アルキル基に対しては、上述のように、アリール基のアルキル及び不飽和アルキル置換基が場合によっては置換され得る。
【０２１１】
代替的な実施形態において、本明細書中に記載のプロセス及び方法に従い選択される化合物は、
【０２１２】
【化４２】
2008511004.tif 000044
又は、別の実施形態において、医薬的に許容される、それらの、塩、エステル、鏡像異性体、鏡像異性体混合物及び混合物ではない。
【０２１３】
別の代替的な実施形態において、本明細書中に記載のプロセス及び方法に従い選択される化合物は、
【０２１４】
【化４３】
2008511004.tif 000045
2008511004.tif 000046
又は別の実施形態において、医薬的に許容される、それらの、塩、エステル及び混合物ではない。
【０２１５】
副作用
本明細書中に記載の方法及びプロセスのさらなる態様において、化合物は実質的な毒性及び／又は精神病的副作用を示さない。毒性副作用としては、以下に限定されないが、興奮、幻覚、混乱、昏迷、パラノイア、せん妄、精神異常様症状、ロータロッド機能障害、アンフェタミン様常同的行為、常同症、精神病記憶機能障害、運動不全、抗不安薬様影響、血圧上昇、血圧低下、脈拍上昇、脈拍低下、血液学的異常、心電図（ＥＣＧ）異常、心毒性、心悸亢進、運動刺激、精神運動機能、情緒の変化、短期記憶欠損、長期記憶欠損、覚醒（興奮）、鎮静、錐体外路副作用、心室頻拍が挙げられる。心臓再分極の長期化、運動失調、認知障害及び／又は統合失調症様症状。
【０２１６】
さらに、別の実施形態において、本明細書中に記載のプロセス及び方法に従い選択又は同定される化合物は、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストの他のクラスに伴う実質的な副作用がない。ある実施形態において、このような化合物は、実質的に、興奮、幻覚、混乱及び昏迷（Ｄａｖｉｓら（２０００）Ｓｔｒｏｋｅ、３１（２）：３４７−３５４；Ｄｉｅｎｅｒら（２００２）、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２４９（５）：５６１−５６８）；パラノイア及びせん妄（Ｇｒｏｔｔａら（１９９５）、Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  ２３７：８９-９４）；精神異常様症状（Ｌｏｓｃｈｅｒら、（１９９８）、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ  ２４０（１）：３３−３６）；低い治療効果比（Ｄａｗｓｏｎら（２００１）、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ８９２（２）：３４４−３５０）；アンフェタミン様常同的行為（Ｐｏｔｓｃｈｋａら（１９９９）、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３７４（２）：１７５−１８７）を含む、セルフォテル、Ｄ−ＣＰＰｅｎｅ（ＳＤＺ  ＥＡＡ  ４９４）及びＡＲ−Ｒ１５８９６ＡＲ（ＡＲＬ１５８９６ＡＲ）などの、グルタミン酸部位のＮＭＤＡアンタゴニストに伴う副作用を示さない。別の実施形態において、このような化合物は、顕著な記憶機能障害及び運動不全（Ｗｌａｚ，Ｐ．（１９９８）、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｕｌｌ  ４６（６）：５３５-５４０）を含む、ＨＡ−９６６、Ｌ−７０１，３２４、ｄ−シクロセリン、ＣＧＰ−４０１１６及びＡＣＥＡ１０２１などのグリシン部位のＮＭＤＡアンタゴニストに伴う副作用を示さない。またさらなる実施形態において、このような化合物は、精神病様影響（Ｈｏｆｆｍａｎ，ＤＣ．（１９９２）、Ｊ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ  Ｇｅｎ  Ｓｅｃｔ  ８９：１−１０）；認知障害（自由再生、認識記憶及び注意の低下；Ｍａｌｈｏｔｒａら（１９９６）、Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ１４：３０１−３０７）；統合失調症様症状（Ｋｒｙｓｔａｌら（１９９４）、Ａｒｃｈ  Ｇｅｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ５１：１９９−２１４；Ｌａｈｔｉら（２００１）、Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ２５：４５５−４６７）及び多動及び常動（ｓｔｅｒｅｏｔｐｙ）の増加（Ｆｏｒｄら（１９８９）Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ４６：７５５−７５８を含む、ＭＫ−８０１及びケタミンなどのＮＭＤＡ高親和性受容体チャネルブロッカーの副作用を示さない。
【０２１７】
さらなる追加的又は代替的実施形態において、化合物は、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも４０：１、少なくとも５０：１、少なくとも７５：１、少なくとも１００：１又は少なくとも１０００：１以上の治療指数を有する。治療反応を生じるのに要する用量に対する、毒性又は致死性の影響を生じるのに要する用量の比として、治療指数を定義することができる。これは、中央値毒性用量（群の５０％が薬物の副作用を示す投与量）と中央値有効用量（特定の様式において集団の５０％が薬物に反応する投与量）との間の比であり得る。治療指数が高いほど、薬物はより安全であるとみなされる。これは、有用な効果を生じるためにそれが行う毒性反応を引き起こすのにより高い用量を用いることを単純に示す。
【０２１８】
当業者にとって公知の何らかの方法により、化合物の副作用プロファイルを調べることができる。ある実施形態において、例えば自発運動及び／又はローターロッド性能を測定することにより、運動不全を測定し得る。ローターロッド実験は、加速的なロッド上に動物が居続けられる持続時間を測定することを含む。別の実施形態において、例えば、短期記憶に対して受動回避パラダイム；Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ記憶スキャン及びペアドワード（ｐａｉｒｄ  ｗｏｒｄｓ）、又は長期記憶に対して絵の自由再生遅延を用いることにより、記憶機能障害を評価することができる。さらなる実施形態において、例えば、高架式十字迷路において抗不安薬様の影響を測定することができる。他の実施形態において、血圧及び／又は体温測定及び／又は副作用に対して試験するために行われる心電図により、心臓機能を監視することができる。他の実施形態において、例えば、重要なフリッカー融合頻度閾値、選択反応時間及び／又は身体の揺れを分析することにより、精神運動機能及び覚醒（興奮）を測定することができる。他の実施形態において、例えば自己評価を使用して、気分を評価することができる。さらなる実施形態において、例えばＰＡＮＳＳ、ＢＰＲＳ及びＣＧＩを用いて統合失調症の症状を評価することができ、ＨＡＳ及びＳ／Ａスケールを用いて副作用を評価することができる。
【０２１９】
ＩＶ．疾患
本発明のさらなる態様において、本明細書中に記載のプロセス又は方法に従い選択される化合物を投与することにより、患者を治療するための方法を提供する。低ｐＨを誘発する何らかの疾病、状態又は疾患を本明細書中に記載の方法に従い治療し得る。
【０２２０】
さらに、本明細書中に記載の特性を示す化合物の有効量を投与することにより、ｐＨ低下に伴う虚血、低酸素又は興奮毒性カスケードの進行を緩和するための方法を提供する。さらに、本明細書中に記載の特性を示す化合物を投与することにより、ｐＨ低下に伴う梗塞体積を減少させるための方法を提供する。さらに、本明細書中に記載の特性を示す化合物を投与することにより、ｐＨ低下に伴う細胞死を減少させるための方法を提供する。またさらに、本明細書中に記載の特性を示す化合物を投与することにより、ｐＨ低下を伴う虚血事象に伴う行動の欠陥を軽減するための方法を提供する。
【０２２１】
ある実施形態において、本明細書中に記載の方法又はプロセスに従い選択される化合物を投与することにより、虚血性損傷又は低酸素症の患者を治療する又は虚血性損傷もしくは低酸素症に伴う神経毒性を予防もしくは治療するための方法を提供する。ある特定の実施形態において、虚血性損傷は脳卒中であり得る。他の実施形態において、虚血性損傷は、以下に限定されないが次の１つから選択され得る：外傷性脳損傷、バイパス術後の認知障害、頸動脈血管形成術後の認知障害；及び／又は低体温循環停止後の新生児虚血。
【０２２２】
別の特定の実施形態において、虚血性損傷は、くも膜下出血後の血管けいれんであり得る。くも膜下出血とは、血液がくも膜（脳を包む膜）下に集まる異常な状態を指す。この領域は、くも膜下腔と呼ばれ、通常は脳脊髄液を含有する。くも膜下腔における血液の蓄積及び、結果として起こる血管の血管けいれんにより、脳卒中、発作及びその他の合併症が引き起こされ得る。本明細書中に記載の方法及び化合物を使用して、くも膜下出血の患者を治療することができる。ある実施形態において、本明細書中に記載の方法及び化合物を使用して、例えば、くも膜下出血の結果として起こり得る、脳卒中及び／又は虚血を含む、くも膜下出血の毒性影響を限定することができる。特定の実施形態において、本明細書中に記載の方法及び化合物を使用して、外傷性くも膜下出血の患者を治療することができる。ある実施形態において、外傷性くも膜下出血は、頭部損傷によるものであり得る。別の実施形態において、患者は、自然発生的なくも膜下出血であり得る。
【０２２３】
別の実施形態において、本明細書中に記載の方法又はプロセスに従い選択される化合物を投与することにより、神経因性疼痛又は関連疾患の患者を治療する方法を提供する。ある一定の実施形態において、神経因性疼痛又は関連疾患は、以下に限定されないが、末梢性糖尿病性神経障害、ヘルペス後神経痛、複合性局所疼痛症候群、末梢神経障害、化学療法誘発性神経因性疼痛、癌性神経因性疼痛、神経因性腰痛、ＨＩＶ神経因性疼痛、三叉神経痛及び／又は中枢脳卒中後疼痛を含む群から選択され得る。
【０２２４】
神経因性疼痛は、異所的に、及びしばしば、末梢又は中枢神経系で病的プロセスによる進行性の有害事象なく生じるシグナルを伴い得る。この機能不全は、異痛症、痛覚過敏、断続的知覚異常及び自然発生的な、灼熱感、疼くような感覚、突き刺すような感覚、発作性の感覚又は電気的感覚、知覚異常、痛覚過敏及び／又は感覚異常などの共通の症候を伴い得、これらもまた、本明細書中に記載の化合物及び方法により治療することができる。
【０２２５】
さらに、本明細書中に記載の化合物及び方法を用いて、以下に限定されないが、外傷、虚血；以下に限定されないが、糖尿病、糖尿病性神経障害、アミロイドーシス、アミロイドポリニューロパチー（一次及び家族性）、モノクローナルタンパク質を伴うニューロパチー、脈管ニューロパチー、ＨＩＶ感染、ヘルペスゾスター−−帯状疱疹及び／又はヘルペス後神経痛を含む、感染又は進行性の代謝又は毒性疾患から、感染又は内分泌疾患から；ギラン−バレー症候群に伴うニューロパチー；ファブリー病に伴うニューロパチー；解剖学的異常による絞扼；三叉神経及びその他のＣＮＳ神経痛；悪性腫瘍；以下に限定されないが、脱髄性の炎症性疾患、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群を含む、炎症状態又は自己免疫疾患；及び以下に限定されないが、特発性末梢細径線維ニューロパチーを含む潜源性の原因を含む、末梢又は中枢神経系病的事象から起こる神経因性疼痛を治療することができる。本明細書中に記載の方法及び組成物に従い治療することができる神経因性疼痛のその他の原因としては、以下に限定されないが、毒物又は薬物（ヒ素、タリウム、アルコール、ビンクリスチン、シスプラチン及びジデオキシヌクレオシドなど）への曝露、食生活又は吸収異常、免疫グロブリン血症、遺伝的な異常及び切断（乳腺切除を含む）が挙げられる。神経因性疼痛はまた、神経根障害及び手根管症候群などの神経線維の圧迫によるものであり得る。
【０２２６】
別の実施形態において、本明細書中に記載の方法又はプロセスに従い選択される化合物を投与することにより、脳腫瘍の患者を治療するための方法を提供する。さらなる実施形態において、本明細書中に記載の方法又はプロセスに従い選択される化合物を投与することにより、神経変性疾患の患者を治療するための方法を提供する。ある実施形態において、神経変性疾患はパーキンソン病であり得る。別の実施形態において、神経変性疾患は、アルツハイマー病、ハンチントン病及び／又は筋萎縮性側索硬化症であり得る。
【０２２７】
さらに、本明細書中に記載の方法又はプロセスに従って選択された化合物を予防的に使用して、本明細書中に記載のようなものなど、このような疾患又は神経学的状態を予防又は防御することができる。ある実施形態において、本明細書中に記載の方法及び化合物を用いて、遺伝的傾向など虚血事象の傾向がある患者を予防的に治療することができる。別の実施形態において、本明細書中に記載の方法及び化合物を用いて、血管けいれんを示す患者を予防的に治療することができる。さらなる実施形態において、本明細書中に記載の方法及び化合物を用いて、心臓バイパス術を受けた患者を予防的に治療できる。
【０２２８】
さらに、本明細書中に記載の方法又はプロセスに従い選択される化合物を投与することにより、次の疾患又は神経学的状態を治療するための方法を提供する：以下に限定されないが、慢性神経損傷、慢性疼痛症候群（以下に限定されないが、糖尿病性ニューロパシー、一時的又は持続性血管閉塞後の虚血、発作、拡延性抑圧、脚不穏症、低炭酸症、高炭酸症、糖尿病性ケトアシドーシス、胎児仮死、脊髄損傷、外傷性脳損傷、てんかん重積、てんかん、低酸素症、周産期低酸素症、脳震盪、片頭痛、低炭酸症、過呼吸、乳酸アシドーシス、出産時の胎児仮死、脳グリオーマ及び／又は網膜症。
【０２２９】
Ｖ．投与／処方
医薬的に許容される担体又は希釈剤と場合によっては組み合わせて、本明細書中に記載の化合物又は医薬的に許容されるそれらのプロドラッグ、エステル及び／又は塩の有効量をホストに投与することにより、本明細書中に記載の疾患の何れかに罹患している哺乳動物及び特にヒトを含むホストを治療することができる。例えば、経口、非経口、静脈内、皮内、筋肉内、皮下、舌下、経皮、気管支投与、咽頭喉頭投与、鼻腔内、クリームもしくは軟膏などの局所投与、直腸投与、関節内投与、嚢内投与、くも膜下投与、膣内投与、腹腔内投与、眼内投与、吸入によるもの、口内投与又は経口もしくは鼻内噴霧など、何らかの適切な経路により、活性化合物を投与することができる。
【０２３０】
無機又は有機酸由来の医薬的に許容される塩の形態で、本発明の化合物を使用することができる。「医薬的に許容される塩」は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などなく、ヒト及び下等動物の組織との接触での使用に適切な、健全な医学的判断の範囲内にある塩を意味し、妥当な損益比と釣り合っている。医薬的に許容される塩は当技術分野で周知である。例えば、Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌらが、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ」（Ｗｉｌｅｙ  ＶＣＨ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ：２００２）において医薬的に許容される塩を詳細に記載している。本発明の化合物の最終単離及び精製の際に、又は別個に適切な有機酸と遊離塩基官能基を反応させることにより、インシトゥで塩を調製することができる。代表的な酸付加塩としては、以下に限定されないが、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、カンファスルホン酸塩、二グルコン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩（イセチオン酸塩）、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パモン酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、リン酸塩、グルタミン酸、重炭酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩及びウンデカン酸塩が挙げられる。また、塩化、臭化及びヨウ化、メチル、エチル、プロピル及びブチルなどのハロゲン化低級アルキル；ジメチル、ジエチル、ジブチル及びジアミル硫酸塩などのジアルキル硫酸塩；塩化、臭化及びヨウ化、デシル、ラウリル、ミリスチル及びステアリルなどの長鎖ハロゲン化物；臭化ベンジル及び臭化フェンエチル及びその他のようなハロゲン化アリールアルキルのような試薬を用いて、塩基性窒素含有基を四級化することができる。水溶性もしくは油溶性又は分散性生成物をこれにより得ることができる。医薬的に許容される酸付加塩を形成するために使用できる酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸及びリン酸などの無機酸及びシュウ酸、マレイン酸、コハク酸及びクエン酸などの有機酸が挙げられる。
【０２３１】
本発明の化合物の最終単離及び精製の際に、医薬的に許容される金属陽イオンの水酸化物の炭酸塩もしくは重炭酸塩などの適切な塩基又はアンモニアもしくは有機一級、二級もしくは三級アミンと、カルボン酸含有部分を反応させることにより、塩基付加塩をインシトゥで調製することができる。医薬的に許容される塩としては、以下に限定されないが、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム及びアルミニウム塩などのアルカリ金属又はアルカリ土類金属に基づく陽イオン及び、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミンなどを含む無毒性四級アンモニウム及びアミン陽イオンが挙げられる。塩基付加塩の形成に有用な他の代表的な有機アミンとしては、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、ピペラジンなどが挙げられる。
【０２３２】
医薬的に許容される塩はまた、例えば、生理学的に許容される陰イオンを与える適切な酸、アミンなどの十分に塩基性の化合物を反応させることにより、当技術分野で周知の標準的手段を用いて得ることができる。カルボン酸の、アルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウムもしくはリチウム）又はアルカリ土類金属（例えばカルシウム又はマグネシウム）塩も使用することができる。
【０２３３】
処方物は、都合よく、単位投与剤形で与えることができ、製薬分野で周知の何らかの方法により調製することができる。本発明の化合物又は医薬的に許容される塩もしくはその溶媒和物（「活性化合物」）に、１以上の補助的化合物からなる担体を混合する段階が全ての方法に含まれる。一般に、均一かつ緊密に活性化合物を液体担体もしくは微粉化固体担体もしくは両方と混合し、次いで、必要に応じて、生成物を所望の製剤へと成形することにより、処方物を与える。
【０２３４】
化合物又は医薬的に許容される、エステル、塩、溶媒和物又はプロドラッグを、所望の作用に害を与えない他の活性物質と、又は所望の作用を与える物質と混合することができる。非経口、皮内、皮下又は局所適用に使用される溶液又は懸濁液としては、例えば次の成分が挙げられる：注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又はその他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩などの緩衝剤及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの等張性を調整する物質が挙げられる。非経口製剤は、ガラス又はプラスチック製の、アンプル、使い捨てシリンジ又は複数回投与バイアルに封入することができる。静脈内投与の場合、具体的な担体は、生理食塩水又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。
【０２３５】
非経口注入のための本発明の医薬組成物は、医薬的に許容される、滅菌水性もしくは非水性溶液、分散液、懸濁液又はエマルジョン及び、滅菌の注射可能な溶液又は懸濁液に再構成するための滅菌粉末を含む。適切な水性及び非水性担体、希釈剤、溶媒又はビヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロールなど）、それらの適切な混合物、植物油（オリーブ油など）及び、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合は必要な粒子サイズの維持により、及び界面活性剤の使用により、適切な流動性が維持され得る。
【０２３６】
これらの組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤を含むアジュバントを含有し得る。様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などにより、微生物の作用を確実に防ぎ得る。例えば糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが望ましい場合もある。例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの、吸収を遅延させる物質の使用により、注射可能な医薬形態の吸収を延長させ得る。
【０２３７】
場合によって、薬物の効果を延長させるために、皮下又は筋肉内注入からの薬物の吸収速度を遅くすることが望ましい場合が多い。水溶性が低い、結晶性又は非晶質の液体懸濁液の使用により、これを達成し得る。次に、薬物の吸収速度は、結晶サイズ及び結晶形態に依存し得る、溶解速度に依存する。あるいは、油性ビヒクル中で薬物を溶解又は懸濁することにより、非経口投与薬物形態の吸収を遅延させる。
【０２３８】
活性化合物に加えて、懸濁液は、例えば、懸濁剤、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天、トラガカント及びそれらの混合物のような懸濁剤を含有し得る。
【０２３９】
不活性希釈剤に加えて、処方組成物はまた、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、甘味料、香味料及び香料などのアジュバントも含み得る。
【０２４０】
活性化合物はまた、適切であれば１以上の賦形剤を伴う、マイクロカプセル又はナノカプセル封入形態であり得る。
【０２４１】
ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生体分解性ポリマーにおいて薬物のマイクロカプセル封入マトリクスを形成することにより、注射用デポー形態を調製する。ポリマーに対する薬物の比及び使用する具体的なポリマーの性質に依存して、薬物放出速度を制御することができる。その他の生体分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射製剤はまた、生体組織に適合する、リポソーム又はマイクロエマルジョンに薬物を封入することにより調製する。
【０２４２】
例えば、細菌保持フィルターに通してろ過することにより、又は滅菌水に溶解もしくは分散させることができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤、又は使用直前にその他の滅菌注射用メディウムを組み込むことにより、注射用製剤を滅菌することができる。適切な分散又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて公知の技術に従い、注射用製剤、例えば滅菌注射用液又は油性懸濁液を処方し得る。滅菌注射用製剤はまた、１，３−ブタンジオール中の溶液など、無毒性の非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒中の、滅菌注射用溶液、懸濁液又はエマルジョンでもあり得る。使用し得る許容可能なビヒクル及び溶媒の中でも、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．及び当張塩化ナトリウム溶液が挙げられる。さらに、滅菌不揮発性油を溶媒又は懸濁メディウムとして都合よく使用する。この目的のために、合成モノ又はジグリセリドを含む何らかの無刺激性の不揮発性油を使用することができる。さらに、注射用液の調製においてオレイン酸などの脂肪酸を使用する。
【０２４３】
非経口（皮下、皮内、筋肉内、静脈内及び関節内投与を含む。）投与のための処方物としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤及び、処方物を意図する受容者の血液と等張にする溶質を含有し得る、水性及び非水性滅菌注射溶液；及び、懸濁剤及び増粘剤を含み得る、水性及び非水性滅菌懸濁液が挙げられる。単位用量又は複数用量の容器（例えば、密封アンプル及びバイアル）で処方物を与えることができ、使用直前に例えば生理食塩水、注射用の水などの滅菌液体担体の添加のみが必要なフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保管し得る。既に述べられている種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から、即席注射溶液及び懸濁液を調製し得る。
【０２４４】
本発明の処方の別の方法は、水溶性を高めるポリマーに本明細書中に記載の化合物を混合することを含む。適切なポリマーの例としては、以下に限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリ（ｄ−グルタミン酸）、ポリ（１−グルタミン酸）、ポリ（１−グルタミン酸）、ポリ（ｄ−アスパラギン酸）、ポリ（１−アスパラギン酸）、ポリ（１−アスパラギン酸）及びそれらのコポリマーが挙げられる。分子量が約５，０００から約１００，０００のポリグルタミン酸を使用することができ、分子量が約２０，０００から約８０，０００のポリグルタミン酸を使用することができ、分子量が３０，０００から６０，０００のポリグルタミン酸も使用することができる。基本的に米国特許第５，９７７，１６３号（参照により本明細書中に組み込む。）に記載のプロトコールを使用して、エステル連結を介して、本発明のエポチロンの１以上のヒドロキシルにポリマーを結合させる。具体的な結合部位としては、本発明の２１−ヒドロキシ−誘導体の場合、炭素−２１から外れたヒドロキシル部位が挙げられる。その他の結合部位としては、以下に限定されないが、炭素３から外れたヒドロキシル及び／又は炭素７から外れたヒドロキシルが挙げられる。
【０２４５】
さらに別の処方方法において、本発明の化合物をモノクローナル抗体に共役させることができる。このストラテジーにより、本発明化合物の標的を具体的な標的に向けることができるようになる。共役抗体の設計及び使用のための一般的なプロトコールは、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｂａｓｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ」［Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｌ．Ｇｒｏｓｓｂａｒｄ、編（１９９８）］に記載されている。
【０２４６】
単回投与形態を調製するために担体材料と合わせ得る活性化合物の量は、治療対象及び投与の具体的な投与様式により変化する。例えば、静脈内使用のための処方物は、約１ｍｇ／ｍＬから約２５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約５ｍｇ／ｍＬから１５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約１０ｍｇ／ｍＬの範囲の本発明化合物の量を含有し得る。本発明の組成物に従い、１日当たり約０．００１ｍｇ／ｋｇから１日当たり約２５００ｍｇ／ｋｇの用量範囲が普通である。好ましくは、用量範囲は、１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇから１日当たり約１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは用量範囲は、１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇから１日当たり約５００ｍｇ／ｋｇ（１日当たり１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ及びこの範囲において与えられた値のいずれか２個の間の値を含む。）である。ヒトに対する用量範囲は通常１日当たり約０．００５ｍｇから１００ｇである。あるいは、本発明による用量範囲は、本発明化合物の血液血清レベルが約０．０１μＭから約１００μＭ、好ましくは約０．１μＭから約１００μＭとなるようなものである。本発明による血清レベルの適切な値としては、以下に限定されないが、約０．０１μＭ、約０．１μＭ、約０．５μＭ、約１μＭ、約５μＭ、約１０μＭ、約１５μＭ、約２０μＭ、約２５μＭ、約３０μＭ、約３５μＭ、約４０μＭ、約４５μＭ、約５０μＭ、約５５μＭ、約６０μＭ、約６５μＭ、約７０μＭ、約７５μＭ、約８０μＭ、約８５μＭ、約９０μＭ、約９５μＭ及び約１００μＭ、ならびに、これらの値のいずれか２個の内の範囲にある何らかの血清レベル（例えば約１０μＭと約６０μＭとの間）が挙げられる。錠剤又は不連続単位で与えられる投与製剤のその他の形態は、このような投与量範囲又はこれらの範囲の間の範囲で有効である本発明の化合物の１以上の量を都合よく含有する。
【０２４７】
投与形態
当技術分野で標準的な公知の投与形態（固体投与形態、半固体投与形態又は液体投与形態、ならびにこれらの形態のそれぞれのさらに細かいカテゴリー）の何れかで本発明の化合物及び処方物を投与することができる。
【０２４８】
経口投与のための固体投与形態としては、カプセル、カプレット、錠剤、丸剤、粉末、トローチ剤及び顆粒が挙げられる。このような固体投与形態において、クエン酸ナトリウム又はリン酸２カルシウムなどの少なくとも１個の不活性な医薬的に許容される賦形剤又は、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウムなどの担体及び／又はａ）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール及びサリチル酸などの充てん剤もしくは増量剤；ｂ）カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及びアラビアゴムなどの結合剤；ｃ）グリセロールなどの保湿剤；ｄ）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のケイ酸塩及び炭酸ナトリウムなどの崩壊剤；ｅ）パラフィンなどの溶液遅延剤；ｆ）四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤；ｇ）セチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロールなどの湿潤剤；ｈ）カオリン及びベントナイト粘土などの吸収剤；及びｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム及びそれらの混合物などの潤滑剤と、活性化合物を混合する。カプセル、錠剤及び丸剤の場合、投与形態はまた、緩衝剤も含有し得る。
【０２４９】
ラクトースもしくは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を用いた軟及び硬充てんゼラチンカプセルにおいて、同様のタイプの固体組成物もまた充てん剤として使用し得る。
【０２５０】
腸溶性コーティング及び製薬処方技術において周知のその他のコーティングなどのコーティング及びシェルとともに、錠剤、カプセル、丸剤及び顆粒の固体投与形態を調製することができる。これらは、場合によっては、乳白剤を含有し得、それらの活性化合物のみを放出する、又は好ましくは、遅延様式で腸管のある部分において放出する、組成物でもあり得る。使用できる埋め込み組成物の例としては、ポリマー性物質及びワックスが挙げられる。
【０２５１】
場合によっては１以上の補助化合物とともに圧縮又は成形することにより錠剤を調製し得る。適切な機械において、場合によっては結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、平滑剤、界面活性剤又は分散剤と混合して、粉末又は顆粒などの自由流動性形態の活性化合物を圧縮することにより、圧縮錠剤を調製し得る。適切な機械において、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化化合物の混合物を成形することにより、成形錠剤を調製し得る。場合によっては錠剤をコーティングするか又は切れ目を入れ、そこで活性化合物が徐放又は制御放出されるように処方することができる。
【０２５２】
直腸又は膣投与のための組成物は、好ましくは、周囲温度で固体であるが体温で液体となり、その結果直腸又は膣腔において融解し、活性化合物を放出する、カカオバター、ポリエチレングリコール又は坐薬ワックスなどの適切な非刺激性賦形剤又は担体と本発明の化合物を混合することにより調製できる坐薬である。
【０２５３】
半液体投与形態としては、柔らかい構造のために固体として認められないが、液体としては濃厚すぎる投与形態が挙げられる。これらとしては、本発明の活性化合物を含有する、クリーム、ペースト、軟膏、ジェル、ローション及びその他の半固体エマルジョンが挙げられる。
【０２５４】
経口投与のための液体投与形態としては、医薬的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルが挙げられる。活性化合物に加えて、液体投与形態は、例えば、水又はその他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤（エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油及びゴマ油など。）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル及びそれらの混合物など。）などの当技術分野で一般に使用される不活性希釈剤を含有し得る。
【０２５５】
経皮パッチなどの適用により、皮膚を介して本発明の化合物を含有する処方物を投与し得る。ポリアクリルアミド、ポリシロキサン又はこの両方などのマトリクス及び、物質が皮膚に送達される速度を制御するための適切なポリマー製の半透過性膜から、パッチを調製し得る。その他の適切な経皮パッチ処方及び形態は、米国特許第５，２９６，２２２号及び同第５，２７１，９４０号、ならびにＳａｔａｓ，Ｄ．ら、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ａｄｈｅｎｓｉｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２版、Ｖａｎ  Ｎｏｓｔｒａｎｄ  Ｒｅｉｎｈｏｌｄ，１９８９：２５章、ｐｐ．６２７−６４２に記載されている。
【０２５６】
粉末及びスプレーは、さらに、本発明の化合物に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム及びポリアミド粉末及びこれらの物質の混合物などの賦形剤を含有し得る。スプレーはさらに、クロロフッ化炭化水素などの通常の推進剤を含有し得る。このような賦形剤は、例えば、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第３版」、Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ編（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，２０００）（その全体の内容を参照により本明細書中に組み込む。）に記載されている。
【０２５７】
制御放出処方物
ある実施形態において、身体からの急速な排出又は急速な放出が起こらないように化合物を保護する担体とともに、本発明の活性化合物を調製する（インプラント及びマイクロカプセル封入送達系を含む制御放出処方物など）。酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ酢酸などの、生体分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。このような処方物の調製のための方法は、当業者にとって明らかである。
【０２５８】
説明のためであって、限定するためではなく、次の実施例を与える。
【０２５９】
実施例
【実施例１】
【０２６０】
ＮＭＤＡ受容体対その他のグルタミン酸受容体に対する化合物９３−４の選択性
ＡＭＰＡ受容体及びカイニン酸受容体サブユニットを注入したゼノパス卵母細胞において影響がないことから、化合物９３−４シリーズがＮＭＤＡ受容体に対して選択的であることが示された。２個の電極電圧クランプ及び、アゴニスト（ＡＭＰＡ受容体に対するグルタミン酸、カイニン酸受容体に対するドーモイ酸）とともに共投与した化合物９３−４  ３μＭを用いて、グルタミン酸又はドーモイ酸誘発電流記録を行った。アゴニスト誘発反応の低下は見られず、このことから、化合物９３−４がＡＭＰＡ及びカイニン酸受容体を阻害しないことが示される。さらに、化合物９３−４の３μＭは、受容体がＮＲ１／ＮＲ２Ｂサブユニットからなり、ＮＲ１／ＮＲ２Ａ又はＮＲ１／ＮＲ２Ｄ受容体ではない場合、ＮＭＤＡ受容体介在性電流を阻害するのに有効であった。
【実施例２】
【０２６１】
ラットの自発運動における９３シリーズ化合物の影響
光ビーム分断として自発運動を定量化するために視覚的モニターを備えたアクティビティボックスにおいて１時間馴化を行った後、１００−１５０ｇのＳｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットにＩＰで９３−４、９３−５、９３−８、９３−３１、９３−４０、９３−４１の様々な用量を投与した。２時間注入した後、自発運動を監視した。ＭＫ８０１の両方の立体異性体をポジティブ対照として使用した。（＋）ＭＫ８０１は、自発運動に対して最初に促進が起こり、次いで運動失調を反映した低下が起こる、自発運動における常同的な２相性の影響を示した。このデータから、ビヒクル注入対照動物と比較して、自発運動誘発を引き起こすことにおいて、（−）ＭＫ８０１が、（＋）ＭＫ８０１よりも、少なくとも１０倍効力が低いことが分かる。さらに、３から３００ｍｇ／ｋｇの９３−４、３から３００ｍｇ／ｋｇ９３−５、９３−８  ３０から３００ｍｇ／ｋｇ、９３−３１  ３から３００ｍｇ／ｋｇ（図５）、９３−４０  ３０ｍｇ／ｋｇ及び９３−４１  ３０から３００ｍｇ／ｋｇは、自発運動に対して有意な影響がなかった。神経保護性であることが知られている９３シリーズの化合物の投与は自発運動に対して影響がない。
【実施例３】
【０２６２】
ゼノパス卵母細胞におけるｐＨ依存性効力シフトの決定
ゼノパス卵母細胞におけるＮＭＤＡ受容体の発現。製造者の説明書に従い（Ａｍｂｉｏｎ）、ＮＭＤＡ受容体サブユニットに対する線状化した鋳型ｃＤＮＡからｃＲＮＡを合成した（ＮＲ１−１ａ、ＮＲ２Ｂ、ＮＲ２Ａ）。使用されるｃＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｕ０８２６１及びＵ１１４１８（ＮＲ１−１ａ）、ＡＦ００１４２３及びＣＤ１３２１１（ＮＲ２Ａ）、Ｕ１１４１９（ＮＲ２Ｂ）に対応する。簡潔に述べると、コード領域の下流で適切な制限酵素を用いてｃＤＮＡを線状化し、精製し、ＲＮＡポリメラーゼ及びリボヌクレオチドの適切な濃度とともにインキュベートした。標準的方法を用いてインビトロ転写したｃＲＮＡを精製した。ゲル電気泳動により合成ｃＲＮＡの質を評価し、分光法及びゲル電気泳動法により量を推定した。３−アミノ−安息香酸エチルエステル（１ｇｍ／Ｌ）により麻酔した大型の栄養十分で健康なアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵巣から、ステージＶ及びＶＩの卵母細胞を手術により取り出した。濾胞上皮細胞層を除去するために、ゆっくりと撹拌しながら、１１５ＮａＣｌ、２．５ＫＣｌ及び１０ＨＥＰＥＳ（単位はｍＭ）ｐＨ７.５からなるＣａ２＋不含の溶液中で、２９２Ｕ／ｍＬ  Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ（Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ）タイプＩＶコラゲナーゼ又は１．３ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ；１７０１８−０２９）とともに２時間、卵母細胞の塊をインキュベートした。次に、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２を供給した同じ溶液中で卵母細胞をよく洗浄し、８８ＮａＣｌ、１  ＫＣｌ、２４  ＮａＨＣＯ３、１０  ＨＥＰＥＳ、０．８２  ＭｇＳＯ４、０．３３  Ｃａ（ＮＯ３）２及び０．９１  ＣａＣｌ２（単位はｍＭ）からなり、１００μｇ／ｍＬゲンタマイシン、４０μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び５０μｇ／ｍＬペニシリンを供給したＢａｒｔｈの溶液中で維持した。卵母細胞の濾胞層を手で除去し、単離２４時間以内に５０ｎＬ体積中のＮＲ１サブユニット５ｎｇ及びＮＲ２サブユニット１０ｎｇを注入し、Ｂａｒｔｈの溶液中で１８℃にて３から７日間インキュベートした。ガラス製注入ピペットのチップサイズは、１０から２０ミクロンの範囲であり、鉱物油で埋め戻した。
【０２６３】
試験のためのｐＨ依存性ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストの調製
ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストは、典型的には、１００％ＤＭＳＯ中の２０ｍＭ溶液として調製し、−２０℃で保存した。２ｍＭ、０．２ｍＭ及び０．０２ｍＭ（全て１００％ＤＭＳＯ中）を用いてこの保存溶液を連続希釈した（１／１０  ｖ／ｖ）。９０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ  ＢａＣｌ２、１０μＭ  ＥＤＴＡ、１００μＭ  グルタミン酸、５０μＭ  グリシン（必要に応じてＮａＯＨ又はＨＣｌでｐＨ６．９又は７．６のいずれかに調整。）を含有する希釈標準溶液中で、これらの保存溶液を適切な濃度範囲に連続希釈した。試験薬物の濃度は、０．０１、０．０３μＭ（０．０２ｍＭ保存溶液を適切な体積に希釈）、０．１、０．３μＭ（０．２ｍＭ保存溶液を適切な体積に希釈）、１、３μＭ（２ｍＭ保存溶液を適切な体積に希釈）及び／又は１０、３０、１００μＭ（２０ｍＭ保存溶液を適切な体積に希釈）であった。
【０２６４】
ゼノパス卵母細胞からのボルテージクランプ記録
注入から２−７日後に２個の電極のボルテージクランプ記録を行った。２個の卵母細胞をかん流するためにＹ−配置において分ける１本のかん流ラインを有する並行プレキシガラス記録チャンバーに卵母細胞を置いた。製造者により推奨されるように配置した２つのＷａｒｎｅｒ  ＯＣ７２５Ｂ  ２電極ボルテージクランプ増幅器を用いて、室温にてデュアルレコーディングを行った。ガラス微小電極（１−１０メガオーム）に３００ｍＭ  ＫＣｌ（電位電極）又は３Ｍ  ＫＣｌ（電流電極）を満たした。バスクランプは、記録チャンバーの各側に置かれた塩化銀ワイヤと交差し、これらは両方とも０ｍＶの基準電位であると仮定した。９０  ＮａＣｌ、１  ＫＣｌ、１０  ＨＥＰＥＳ及び０．５  ＢａＣｌ２、ｐＨ７．３（単位はｍＭ）から成る溶液を用いて卵母細胞をかん流し、−４０ｍＶに保持した。それぞれ１００及び３０ｍＭ保存溶液の適切な体積を添加することにより、グルタミン酸（１００μＭ）＋グリシン（５０μＭ）の対照投与に対する最終濃度を得た。さらに、Ｚｎ２＋などの混入２価イオンをキレートするために、１０ｍＭ  ＥＤＴＡの１：１０００希釈液を添加することにより、１０μＭ最終濃度ＥＤＴＡを得た。６．９又は７．６のいずれかに外部ｐＨを調整した。連続様式で最大のグルタミン酸及びグリシン、次いでグルタミン酸／グリシン＋アンタゴニストの可変濃度を適用することにより、用量反応曲線を得た。このようにして４から６種類の濃度からなる用量反応曲線を得た。記録の前後及びフルレコーディングをリーク電流での何らかの変化に対して線形的に補正する前後に、−４０ｍＶにおけるベースラインのリーク電流を測定した。グルタミン酸−誘発反応がｐＨ７．６において１００ｎＡより小さいか、又はｐＨ６．９において５０ｎＡより小さい卵母細胞は除外した。最初のグルタミン酸反応のパーセンテージとして、適用したアンタゴニストによる阻害レベルを表し、１匹のカエル由来の卵母細胞を合わせて平均値を計算した。各実験は、１匹のカエルから得られた３個から１０個の卵母細胞における各ｐＨでの記録から構成された。４から８種類のアンタゴニスト濃度のそれぞれにおける平均パーセンテージ反応をロジスティック方程式、（１００−ｍｉｎ）／（１＋（［ｃｏｎｃ］／ＩＣ５０）ｎＨ）＋ｍｉｎ（式中、ｍｉｎは、飽和アンタゴニストにおける残存パーセンテージ反応であり、ＩＣ５０は、達成可能な阻害の半分を引き起こすアンタゴニスト濃度であり、ｎＨは、阻害曲線の勾配を示す傾斜因子である。）によりフィットさせた。Ｍｉｎは、０以上であるとする。公知のチャネルブロッカーを用いた実験の場合、Ｍｉｎを０に設定した。比としてｐＨ７．６及び６．９で得られたＩＣ５０値を表し、合わせて平均を計算し、ＩＣ５０における平均シフトを求めた。
【実施例４】
【０２６５】
一時的局所性虚血のインビボモデルにおける神経保護の決定
一時的局所性虚血：モノフィラメント縫合糸を用いた腔内中大脳動脈（ＭＣＡ）閉塞により、一時的局所性虚血を誘発した。簡潔に述べると、９８％Ｏ２中、２％イソフルランを用いて雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（３−５ヶ月齢、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を麻酔した。恒温性ブランケットを用いて３７℃（３６．５から３７．５℃の範囲）に直腸温度を調整した。レーザーＤｏｐｐｌｅｒ  ｆｌｏｗｍｅｔｅｒ（Ｐｅｒｉｍｅｄ）を用いて局所的な脳血流の相対変化を監視した。これを行うために、プローブをブレグマの２ｍｍ後方及び４から６ｍｍ側方の頭蓋に直接貼り付けた。監視している血流が停止するまで、チップフレームが丸くなった（ｔｉｐ  ｆｒａｍｅ−ｒｏｕｎｄｅｄ）１１−ｍｍ  ５−０Ｄｅｒｍａｌｏｎ又はＬｏｏｋ（ＳＰ１８５）黒色ナイロン非吸収性縫合糸を外頸動脈基部を介して左内頸動脈に導入した（縫合糸挿入１０．５−１１ｍｍにおいて。）。３０分間のＭＣＡ閉塞後、縫合糸を引き抜くことにより血流を回復させた。２４時間生存させた後、脳を取り出し、２ｍｍの切片に切断した。３７℃にて２０分間、ＰＢＳ中の２％塩化２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）を用いて損傷を同定した。ＮＩＨ  ＩＭＡＧＥ（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｔａ４．０．２リリース）を用いて各切片の梗塞領域を測定し、切片の厚さを乗じ、切片の梗塞体積を求めた。ＮＩＨ  ＩＭＡＧＥにおける密度スライスオプションを使用して、逆側の損傷のない皮質におけるそれの７０％又は７５％として求めた強度に基づき画像を分割した。全動物における解析を通してこの標準を維持し、領域測定のために、この強度の対象のみを強調した。ＴＴＣ染色におけるデジタル的に同定した閾値低下により同定した場合の損傷の領域の輪郭を手動でとった。同側半球切片体積に対する逆側の比に、対応する梗塞切片体積を乗じ、浮腫に対する補正を行った。全ての切片に対して梗塞領域ｘ切片の厚さを合計することにより梗塞体積を求めた。各測定において少なくとも１２匹の動物を使用した。ある実験に対して、染色度が低下した領域をフリーハンドで囲むことにより、損傷領域を直接測定した。２種類の手法を用いて同一の結果が得られた。
【０２６６】
ｐＨ依存性ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストの腹腔内投与
ＭＣＡ閉塞手術３０分前に、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに対して９３−４、９３−５、９３−８、９３−３１、９３−４０の腹腔内（ＩＰ）注入を行った。ＤＭＳＯ０．５ｍＬ中に化合物３０ｍｇを添加し、次いでボルテックスにかけながら０．９％食塩水０．５ｍＬを添加することにより、５０％ＤＭＳＯ中の３０ｍｇ／ｍＬ保存溶液を調製した。
【０２６７】
ＩＰ注入溶液のための希釈標準溶液は０．９％食塩水中３ｍｇ／ｍＬであり（５０％ｖ／ｖ  ＤＭＳＯ）、保存溶液０．２ｍＬを新しい試験管に移し、ボルテックスにかけながら、ＤＭＳＯ  ０．９ｍＬ及び０．９％食塩水０．９ｍＬを添加することにより調製した。動物体重及び所望の用量により変化する注入体積で、３−３０ｍｇ／ｋｇ最終用量をマウスに投与した。
【０２６８】
ｐＨ依存性ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストの脳室内投与
実験の別個のセットにおいて、手術前に、ＮＭＤＡアンタゴニスト（９３−５、９３−９７、９３−３１、９３−４１、９３−４３）又は適切なビヒクルの少量をマウスに脳室内（ＩＣＶ）注入した。最初に、全ての薬物に対して１００％ＤＭＳＯ中の２０ｍＭ保存溶液を調製した。この保存溶液５μＬを新しい試験管に移し、ボルテックスにかけながら、ＤＭＳＯ４５μＬを薬物９３−４１、９３−４３に添加した。その後リン酸緩衝食塩水１５０μＬ（ＰＢＳ、０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、Ｓｉｇｍａ１０００−３）を添加し、２５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中の０．５ｍＭ薬物溶液を得た。他の全ての薬物に対しては、２０ｍＭ  ＤＭＳＯ保存溶液５μＬを新しい試験管に移し、ボルテックスにかけながら、ＤＭＳＯ１５μＬを添加した。この溶液にＰＢＳ  １８０μＬを添加し、１０％ｖ／ｖＤＭＳＯ中の０．５ｍＭ薬物の希釈標準溶液を得た。ビヒクルの場合、ＤＭＳＯ中の２０ｍＭ薬物をＤＭＳＯに置き換えた。ＩＣＶ注入は全て、ＭＣＡ閉塞術の３０分前に、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（３から５ヶ月齢、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の右脳室に行った（ブレグマの２ｍｍ後方及び１ｍｍ側方、針挿入３ｍｍ）。ＭＣＡ術後２４時間でマウスを屠殺し、上述のように損傷を同定し、解析した。頭蓋底での〜１ｍｍ超の血栓の出現によりくも膜下出血のあるマウスを同定し、これらを除外した。
【０２６９】
結果
化合物９３−９７、９３−４３、９３−５、９３−４１及び９３−３１
図２は、化合物９３−９７、９３−４３、９３−５、９３−４１及び９３−３１の薬物のＩＣＶ投与後の組織梗塞体積に対する、ｐＨ６．９対７．６での、これらの薬物のインビトロ効力促進の比較を示す。このデータは、ビヒクル注入対照に対して求めた梗塞体積の％及び上述のように測定した効力促進を表す。灰色の陰影領域は、薬物性能向上のための基準の確認されている境界を定義する領域を示す。境界内にある薬物は、灰色のブロック領域内に平均値（エラーバーではない。）を有するものである。
【０２７０】
各化合物に対して、上述のような一時的局所性虚血事象後に、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて梗塞体積を測定した。化合物９３−９７、９３−４３、９３−５、９３−４１及び９３−３１を上述のように脳室内（ＩＣＶ；黒丸）投与した。エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）である。ＮＲ１／ＮＲ２Ｂ受容体を発現する卵母細胞に対して、本明細書中に記載のように、化合物９３−５、９３−３１、９３−４１、９３−４３及び９３−９７に対して、ｐＨ６．９対７．６での効力促進を計算した。
【０２７１】
化合物９３−４、９３−５、９３−８、９３−３１、９３−４０、（−）ＭＫ８０１及び（＋）ＭＫ８０１
図３は、組織梗塞体積に対する、ｐＨ６．９対７．６での、化合物９３−４、９３−５、９３−８、９３−３１、９３−４０のインビトロ効力促進の比較を示す。このデータは、ビヒクル注入対照動物における梗塞体積のパーセンテージとして表された実際の梗塞体積を表し、上述のように効力促進を計算した。灰色の陰影領域は、薬物性能向上のための基準の確認されている境界を定義する領域を示す。境界内にある薬物は、灰色のブロック領域内に平均値（エラーバーではない。）を有するものである。
【０２７２】
各化合物に対して、上述のように一時的局所性虚血事象後にＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいて梗塞体積を測定した。上述のように薬物を腹腔内注入（ＩＰ）した。エラーバーはＳＥＭである。ペアとなっている対照と比較したＩＰ投与に対する梗塞体積の％減少から梗塞体積を推測した。独立した実験において薬物により誘発される対照梗塞の％及びＩＣＶ実験に対する平均対照梗塞体積（ｍｍ３）として表される梗塞体積の積としてこれを計算し、これを実線として示す（破線は、平均対照梗塞＋−ＳＥＭを示す。）。ＮＲ１／ＮＲ２Ｂ受容体を発現する卵母細胞に対し、本明細書中に記載のようにして、化合物９３−４、９３−５、９３−８、９３−３１及び９３−４０、（＋）ＭＫ８０１及び（−）ＭＫ８０１に対してｐＨ６．９対７．６での効力促進を計算した。
【０２７３】
追加化合物
図４は、％対照組織梗塞体積に対する、ｐＨ６．９対７．６での公知の化合物のＮＲ１／ＮＲ２Ａ及びＮＲ１／ＮＲ２Ｂでのインビトロ効力促進を比較する。灰色の陰影領域は、薬物性能向上のための基準の確認されている境界を定義する領域を示す。境界内にある薬物は、灰色のブロック領域内に平均値（エラーバーではない。）を有するものである。
【０２７４】
白印は、様々なげっ歯類又はウサギ虚血モデル（下記参考文献を参照のこと。）において文献で述べられているような、ＣＮＳ１１０２（ＣＮ、アプチガネル又はセレスタット、Ｄａｗｓｏｎら、２００１）、デキストロメトルファン（ＤＭ、Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇら、１９９５）、デキストロファン（ＤＸ；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇら、１９９５）、レボメトルファン（ＬＭ；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇら、１９９５）、（Ｓ）ケタミン（ＫＴ；Ｐｒｏｅｓｃｈｏｌｄｔら、２００１）、メマンチン（ＭＭ；Ｃｕｌｍｓｅｅら、２００４）、イフェンプロジル（ＩＦ、Ｄａｗｓｏｎら、２００１）、ＣＰ１０１，６０６（ＣＰ；Ｙａｎｇら、２００３）、ＡＰ７（Ｓｗａｎ及びＭｅｌｄｒｕｍ、１９９０）、セルフォテル（ＣＧＳ１９７５５、Ｄａｗｓｏｎら、２００１）、（Ｒ）ＨＡ９６６（ＨＡ；Ｄａｗｓｏｎら２００１）、レマセミド（ＲＥ、Ｄａｗｓｏｎら、２００１）、ハロペリドール（Ｏ’Ｎｅｉｌｌら、１９９８）、７−Ｃｌ−キヌレニン酸（ＣＫ、Ｗｏｏｄら、１９９２）及びＭＫ８０１の立体異性体（＋ＭＫ又は−ＭＫ；Ｄｒａｖｉｄら、準備中）の投与による梗塞体積の減少を示す。ケタミン及び７−Ｃｌ−キヌレニン酸を除く全ての化合物に対して、対照における梗塞体積に対する薬物における梗塞体積の比から梗塞の％減少を計算し、そのために、薬物によるニューロン密度の％低下を測定した。
【０２７５】
ＮＲ１／ＮＲ２Ａ又はＮＲ１／ＮＲ２Ｂ受容体のいずれかを発現する卵母細胞に対して、上述のように全化合物に対してｐＨ６．９対７．６での効力促進を計算した（実験数のまとめは、表３及び４を参照のこと。）。文献（Ｍｏｔｔら、１９９８）から、イフェンプロジル（ＩＦ）、ＣＰ１０１，６０６（ＣＰ）に対してｐＨ促進を求めた。
【０２７６】
梗塞体積を調べたマウス数を表３に示す。ＮＲ１−１ａ／ＮＲ２Ｂ受容体での効力促進測定の場合の、使用カエル数及びｐＨ６．９及びｐＨ７．６で単一濃度で試験した卵母細胞の最大数を表３で示す。各ｐＨでのＩＣ５０を求めるために、各薬物の複数濃度を試験した。ＮＲ１−１ａ／ＮＲ２Ａ受容体での効力促進測定の場合の、使用カエル数及びｐＨ６．９及びｐＨ７．６で単一濃度で試験した卵母細胞の最大数を表４で示す。
【０２７７】
【表３】
2008511004.tif 000047
【０２７８】
【表４】
2008511004.tif 000048
【０２７９】
図１は、図２、３及び４を合わせたものを表す。これは、試験した２４種類の化合物のうち、２０種類の化合物（８３％）が本発明のエリア外となることを示し（影付きの領域により示される。）、このことから、試験した化合物のうち８０％を超えるものが、有効なインビボ療法での有効性に対して確認した基準に合致しないことが分かる。灰色の陰影付き領域は、薬物性能向上に対する基準の確認されている境界を定義する領域を示す。境界内にある薬物は、灰色のブロック領域内に平均値（エラーバーではない。）を有するものである。化合物９３−４、９３−５、９３−４１、９３−３１の平均は、ＮＲ１／ＮＲ２Ｂの陰影付き領域に入る。（−）ＭＫ８０１及びケタミンの平均は、ＮＲ１／ＮＲ２Ａの陰影付き領域に入る（図４）。
【０２８０】
特に、図１において、印を付した化合物に対して、上述のように一時的局所性虚血事象後、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて梗塞体積を測定した。上述のように、脳室内注入（ＩＣＶ；四角）又は腹腔内注入（ＩＰ；丸）により薬物を投与した。エラーバーはＳＥＭである。ペアとなっている対照と比較したＩＰ投与に対する対照梗塞体積の％として梗塞体積を直接測定した。対照を実線で示す（破線は平均対照梗塞＋／−ＳＥＭを示す。）。白印は、様々なげっ歯類又はウサギ虚血モデル（下記参考文献を参照のこと。）において文献で述べられているような、ＣＮＳ１１０２（ＣＮ、アプチガネル又はセレスタット、Ｄａｗｓｏｎら、２００１）、デキストロメトルファン（ＤＭ、Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇら、１９９５）、デキストロファン（ＤＸ；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇら、１９９５）、レボメトルファン（ＬＭ；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇら、１９９５）、（Ｓ）ケタミン（ＫＴ；Ｐｒｏｅｓｃｈｏｌｄｔら、２００１）、メマンチン（ＭＭ；Ｃｕｌｍｓｅｅら、２００４）、イフェンプロジル（ＩＦ、Ｄａｗｓｏｎら、２００１）、ＣＰ１０１，６０６（ＣＰ；Ｙａｎｇら、２００３）、ＡＰ７（Ｓｗａｎ及びＭｅｌｄｒｕｍ、１９９０）、セルフォテル（ＣＧＳ１９７５５、Ｄａｗｓｏｎら、２００１）、（Ｒ）ＨＡ９６６（ＨＡ；Ｄａｗｓｏｎら２００１）、レマセミド（ＲＥ、Ｄａｗｓｏｎら、２００１）、ハロペリドール（Ｏ’Ｎｅｉｌｌら、１９９８）、７−Ｃｌ−キヌレニン酸（ＣＫ、Ｗｏｏｄら、１９９２）及びＭＫ８０１の立体異性体（＋ＭＫ又は−ＭＫ；Ｄｒａｖｉｄら、準備中）の投与による梗塞体積の減少を示す。ケタミン及び７−Ｃｌ−キヌレニン酸を除く全ての化合物に対して、対照における梗塞体積に対する薬物における梗塞体積の比から梗塞の％減少を計算し、ケタミン及び７−Ｃｌ−キヌレニン酸のために薬物によるニューロン密度の％低下を測定した。
【０２８１】
また、図１において、表１及び２で報告された観察数を用いて、化合物９３−４、９３−５、９３−８、９３−３１、９３−４０、９３−４３、９３−９７、（＋）ＭＫ８０１、（−）ＭＫ８０１及びその他の全化合物に対するｐＨ６．９対７．６での効力促進を上述のように計算した。文献から（Ｍｏｔｔら、１９９８）、イフェンプロジル（ＩＦ）、ＣＰ１０１，６０６（ＣＰ）に対するｐＨ促進を求めた。
【実施例５】
【０２８２】
神経因性疼痛のインビボモデルにおける評価
方法
動物：手術日に体重１００±１０ｇ及び試験日に体重２５０±１０ｇの雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈｓｄ：Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（Ｒ）ＴＭＳＤ（Ｒ）ＴＭ、Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を３匹ずつケージに入れて飼育した。動物に対して餌及び水を自由に摂取させ、１２：１２時間の明／暗サイクルで維持した。２１℃、湿度６０％で動物コロニーを維持した。国際疼痛学会ガイドライン（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｐａｉｎ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）に従い全実験を行い、ミネソタ大学動物実験委員会（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）より承認を得た。
【０２８３】
薬物及び投与溶液：蒸留水中の１％ｖ／ｖＤＭＳＯ及び６６％ｖ／ｖＰＥＧ４００に薬物を溶解させた。化合物をｉ．ｐ．経路で投与した。
【０２８４】
慢性神経因性疼痛の誘発：脊髄神経結紮（ＳＮＬ）モデル（Ｋｉｍ及びＣｈｕｎｇ、１９９２  Ｐａｉｎ  ５０：３５５−６３）を使用して慢性神経因性疼痛を誘発した。イソフルランで動物を麻酔し、左のＬ５横突起を除去し、６−０絹縫合糸でＬ５及びＬ６脊髄神経をきつく結紮した。次に、体内縫合及び外部の止め金により傷を閉じた。手術から１０日後に傷の止め金を除去した。
【０２８５】
機械的異痛症試験：上げ下げ法（Ｃｈａｐｌａｎ，Ｂａｃｈら、１９９４  Ｊ  Ｎｅｕｒｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５３：５５−６３）に従い、様々な剛性（０．４、０．７、１．２、２．０、３．６、５．５、８．５及び１５ｇ）を有する８本のＳｅｍｍｅｓ−Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎフィラメント（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ，Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて非侵害機械的感受性に対するベースライン及び処理後の値を評価した。有孔金属プラットフォーム上に動物を置き、試験前に最低３０分間、その周囲に順応させた。各処理群において各動物に対して平均及び平均の標準誤差（ＳＥＭ）を求めた。この刺激は通常痛みのあるものではない考えられるので、この試験での反応性における顕著な損傷誘発性上昇は、機械的異痛症の目安と解釈される。
【０２８６】
実験デザイン：薬物投与のそれぞれ３０分及び２４時間前にｖｏｎ  Ｆｒｅｙベースライン測定を行った。３０、６０、１２０及び２４０分にさらなるｖｏｎ  Ｆｒｅｙ測定を行った。試験の時間系列を下記にまとめる。実験群は、ビヒクル（蒸留水中１％ＤＭＳＯ＋６６％ＰＥＧ４００、ｉ．ｐ．、４ｍＬ／ｋｇ、ｎ＝１０）、３０ｍｇ／ｋｇ化合物９３−３１試験（ｉ．ｐ．、４ｍＬ／ｋｇ、ｎ＝１０）、１００ｍｇ／ｋｇ化合物９３−３１試験（ｉ．ｐ．、４ｍＬ／ｋｇ、ｎ＝１０）、３０ｍｇ／ｋｇ化合物９３−９７試験（ｉ．ｐ．、４ｍＬ／ｋｇ、ｎ＝１０）、１００ｍｇ／ｋｇ化合物９３−９７試験（ｉ．ｐ．、４ｍＬ／ｋｇ、ｎ＝１０）、１００ｍｇ／ｋｇガバペンチン（ｉ．ｐ．、４ｍＬ／ｋｇ、ｎ＝１２）（ラット総数：６２）。
【０２８７】
【表５】
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【０２８８】
盲検法：行動試験を行わなかった別の実験者が薬物溶液を投与した。
【０２８９】
データ解析：ＰｒｉｓｍＴＭ４．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて統計解析を行った。ビヒクル群中で逆側及び同側足で観察される値を比較することにより、損傷足の機械的異痛症を調べた。順位による分散のＦｒｉｅｄｍａｎの両側検定を用いて、長期にわたるビヒクル群の損傷足の安定性を調べた。順位による分散のＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｉｓ片側検定を行い、次いでＤｕｎｎの事後検定を行うことにより、各時間点で薬物効果を解析した。
【０２９０】
結果
ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験
ＳＮＬ手術から１４日後に機械的異痛症（ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ）に対する試験を開始した。ベースライン（薬物投与３０分前）及び単回薬物投与後３０、６０、１２０及び２４０分に、損傷（同側）及び正常（逆側）の両足において試験を行った。
【０２９１】
ベースラインにおいて、全動物が損傷足において機械的異痛症を示した（表２）。機能障害のレベルは、群中で同程度であり、実験を通して、損傷足のｖｏｎ  Ｆｒｅｙ閾値はビヒクル処理群の正常足で見られるものと有意差があった（図６）。図６は、実験の全期間にわたり、ビヒクル群の動物が顕著な機械的異痛症を示したことを示す。ビヒクル処理動物の損傷及び正常足における平均±ＳＥＭ（ｎ＝１０）ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ閾値を示す。足間の差異は全時間点で有意であった（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。化合物９３−３１及び９３−９７は、正常足において測定したｖｏｎ  Ｆｒｅｙ閾値に対して影響がなかった（図７及び８）。図７は、正常足において化合物９３−３１がｖｏｎ  Ｆｒｅｙ閾値を変化させなかったことを示す。ｉ．ｐ．投与した、ビヒクル、ガバペンチン又は化合物９３−３１の３０及び１００ｍｇ／ｋｇ用量で処理した動物の正常足における平均±ＳＥＭ（ｎ＝１０−１２）ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ閾値を示す。図８は、正常足において化合物９３−３７がｖｏｎ  Ｆｒｅｙ閾値を変化させなかったことを示す。ｉ．ｐ．投与した、ビヒクル、ガバペンチン又は化合物９３−３７の３０及び１００ｍｇ／ｋｇ用量で処理した動物の正常足における平均±ＳＥＭ（ｎ＝１０−１２）ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ閾値を示す。
【０２９２】
【表６】
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【０２９３】
【表７】
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【０２９４】
化合物９３−３１（１００ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）での処理により、投与後３０及び６０分で無痛覚であることが観察された（図９）。図９は、化合物９３−３１（１００ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．投与により、機械的異痛症が軽減することを示す。ｉ．ｐ．投与した、ビヒクル、ガバペンチン（参照化合物）又は化合物９３−３１の３０及び１００ｍｇ／ｋｇ用量で処理した動物の損傷足における平均±ＳＥＭ（ｎ＝１０−１２）ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ閾値を示す。事後検定（Ｄｕｎｎ検定）から、３０及び６０分において、化合物９３−３１（１００ｍｇ／ｋｇ）とビヒクル群との間に有意なペアワイズ差が示された（ｐ＜０．０１）。６０、１２０及び２４０分におけるガバペンチンの効果も有意であった（それぞれ、ｐ＜０．００１、ｐ＜０．０１及びｐ＜０．０１）。実験を行った何れの時間点においても化合物９３−３１の３０ｍｇ／ｋｇ及び化合物９３−９７の３０及び１００ｍｇ／ｋｇの鎮痛効果はなかった。この実験におけるビヒクル群の統計解析から、ベースラインと３０、６０、１２０及び２４０分時間点の間において、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ閾値の有意差はなかったことが示された（Ｆｒｉｅｄｍａｎ両側ＡＮＯＶＡ）。
【０２９５】
さらに、ＳＮＬラットにおいて、ｉ．ｐ．投与した化合物９３−９７により機械的異痛症は軽減されなかった。図１０は、化合物９３−９７（３０及び１００ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．投与がｖｏｎ  Ｆｒｅｙ閾値に対して影響を与えなかったを示す。ｉ．ｐ．投与した、ビヒクル、ガバペンチン（参照化合物）又は化合物９３−３７の３０及び１００ｍｇ／ｋｇ用量で処理した動物の損傷足における平均±ＳＥＭ（ｎ＝１０−１２）ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ閾値を示す。６０、１２０及び２４０分におけるガバペンチンの影響もまた有意であった（それぞれｐ＜０．００１、ｐ＜０．０１及びｐ＜０．０１）。
【０２９６】
この実験における試験動物群においていくつかの副作用が観察された（６２匹の動物中８匹）。観察された副作用はライジング及びストレッチングであった（８例観察）。これらの副作用は、ｉ．ｐ．での薬物投与後、最初の数分間（〜５分間）最もよく見られた。ビヒクルｉ．ｐ．で処理した動物（３／１０）を含む全実験群においてストレッチング／ライジングが見られ、薬物用量に依存していないと思われた。これらの副作用の重症度は、中程度であり、この実験からの動物を排除するほどにはエンドポイント測定を妨害しなかった。表１において、この実験において観察された副作用についてまとめる。エンドポイント測定中にいくつかの副作用が観察された。最も一般的なものは、ある種の内臓痛又は過敏性の徴候であり得るストレッチング／ライジングであった。ビヒクル及び薬物処理ｉ．ｐ．群においてこれが見られた。動物のサブセットにおいて、これは、ビヒクルのｉ．ｐ．投与に付随するものであろうと思われる。これは比較的稀であり、短く（＜５分間）、大きさはエンドポイント測定を妨害するほど大きくはなかった。
【０２９７】
【表８】
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【０２９８】
化合物９３−３１は、１００ｍｇ／ｋｇでｉ．ｐ．投与した場合、神経因性疼痛のＳＮＬモデルにおいて機械的異痛症を軽減すると見られる。化合物９３−３７は、この実験において、試験した用量（３０及び１００ｍｇ／ｋｇ）でＳＮＬラットの機械的異痛症を軽減しなかった。化合物９３−３１（１００ｍｇ／ｋｇ）は、参照化合物ガバペンチン（１００ｍｇ／ｋｇ）よりも、作用開始が早く（３０分）、作用持続時間が短い（６０分）と思われる。化合物９３−３１の１００ｍｇ／ｋｇ用量で処理した動物において観察されるピーク閾値は、正常足において見られたもののおよそ半分であった。化合物９３−３１のより高い用量で完全な回復が達成され得ると仮定すれば、これにより、そのＥＤ５０がおよそ１００ｍｇ／ｋｇとなることが示唆される。
【実施例６】
【０２９９】
選択した化合物のｐＨ依存性
ｐＨ依存性について一連のｎ−アルキル誘導体を試験した。
【０３００】
【表９】
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【０３０１】
前述の発明を明確にし、理解する目的のために、前述の発明を詳細に説明してきたが、この開示を読むことにより、本発明の真の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細において様々な変更が成され得ることは当業者に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０３０２】
【図１】図１は、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストの選択のための、組織梗塞体積減少に対する、ｐＨ６．９対７．６でのインビトロの効力促進の比較の例示である。
【図２】図２は、試験薬物を脳室内投与により与えた場合（ＩＣＶ；黒四角）の、組織梗塞体積保護に対する、ｐＨ６．９対７．６での選択化合物９３−９７、９３−４３、９３−５、９３−４１及び９３−３１のインビトロ効力促進の比較を示す。灰色の陰影領域は、
【図３】図３は、腹腔内注入（ＩＰ、黒丸）により与えた場合の組織梗塞体積保護に対する、ｐＨ６．９対７．６での、５種類の選択化合物９３−４、９３−５、９３−８、９３−３１、９３−４０のインビトロ効力促進の比較を示す。
【図４】図４は、選択化合物の、組織梗塞体積に対するｐＨ６．９対７．６でのインビトロ効力促進の例示である。
【図５】図５は、１時間の馴化後２時間にわたり、コンピューターにより数えた光線の中断として定量した、ラットの自発運動における化合物９３−３１及び（＋）ＭＫ−８０１の効果を説明する。
【図６】図６は、神経因性疼痛の動物モデルにおいて、損傷を受けた足が実質的な異痛症を示したことを説明する。
【図７】図７は、化合物９３−３１（ｉ．ｐ．で投与）が正常な手足に影響を与えなかったことを示す。
【図８】図８は、化合物９３−９７（ｉ．ｐ．）が正常な手足に影響を与えなかったことを示す。
【図９】図９は、ラットでの脊髄神経結紮（ＳＮＬ）モデルにおいて、ｉ．ｐ．投与した化合物９３−３１（１００ｍｇ／ｋｇ）が機械的異痛症を軽減したことを示す。
【図１０】図１０は、ｉ．ｐ．投与した化合物９３−３１（１００ｍｇ／ｋｇ）がＳＮＬラットにおいて機械的異痛症を軽減したことを示す。
【図１１】図１１は、げっ歯類脊髄神経結紮モデルでの痛覚閾値の倍の増加に対する、ｐＨ６．９対７．６でのインビトロ効力促進の比較の説明である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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