(57)【要約】本発明は、陸生放線菌類であるアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２（ＮＲＲＬ３０７７８）により産生された新規な非常に強力な抗癌色素タンパク質に関する。本発明は、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２により産生される色素タンパク質、ならびに色素タンパク質のアポタンパク質成分のアミノ酸配列および核酸配列、および発色団のための生合成経路の成分のアミノ酸配列および核酸配列を提供する。本発明は、医薬の開発、および癌または細菌感染等の疾患の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９を有するアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２（ＮＲＲＬ３０７７８）の色素タンパク質生合成遺伝子クラスターのｏｒｆまたはその補体のヌクレオチド配列と少なくとも約７０％同一のヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
【請求項２】
前記単離ヌクレオチド配列は、前記アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２（ＮＲＲＬ３０７７８）の色素タンパク質生合成遺伝子クラスターのｏｒｆのヌクレオチド配列と同一である、請求項１に記載の単離核酸。
【請求項３】
配列番号１５１を有する前記色素タンパク質生合成遺伝子クラスターを含む、請求項１に記載の単離核酸。
【請求項４】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０を有するアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２（ＮＲＲＬ３０７７８）の色素タンパク質生合成遺伝子クラスターのｏｒｆのアミノ酸配列をコードする配列を含む、単離核酸。
【請求項５】
アポタンパク質をコードする、請求項１〜４のいずれか１つに記載の核酸。
【請求項６】
プレアポタンパク質をコードする、請求項１〜４のいずれか１つに記載の核酸。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１つに記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項８】
前記核酸は、遺伝子発現をコントロールする調節核酸配列と操作可能に連結される、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
遺伝子発現が構成的または誘導性である、請求項７に記載のベクター。
【請求項１０】
前記ベクターはコスミドである、請求項７に記載のベクター。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１つに記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項１２】
請求項７〜１０のいずれか１つに記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１３】
前記宿主細胞は原核細胞である、請求項１１または１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
前記原核細胞は、アクチノミセス属、アクチノマヅラ属、ストレプトミセス属、またはミクロモノスポラ属からなる群から選択される、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
前記原核細胞は大腸菌である、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
前記宿主細胞は真核細胞である、請求項１１または１２に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
タンパク質を発現する方法であって、宿主細胞に請求項７に記載のベクターをトランスフェクトし、該タンパク質の発現に適した条件下で該細胞をインキュベートすることを包含する、方法。
【請求項１８】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０と少なくとも約７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
【請求項１９】
前記アミノ酸配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０と同一である、請求項１８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２０】
前記ポリペプチドはアポタンパク質であり、発色団を有する非共有結合複合体を形成することができる、請求項１８または１９のいずれか１つに記載の単離ポリペプチド。
【請求項２１】
前記複合体は、一本鎖または二本鎖ＤＮＡを開裂することができる、請求項２０に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２２】
前記発色団は、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２に由来する、請求項２０に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２３】
請求項２０〜２２のいずれか１つに記載のポリペプチドの非共有結合複合体、および前記アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２（ＮＲＲＬ３０７７８）の発色団を含む、単離色素タンパク質。
【請求項２４】
配列番号１５１のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子またはその補体と特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、およびそれらの相補配列から成る群から選択される、請求項２４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
変質しており、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、およびそれらの相補配列からなる群から選択される、請求項２４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
色素タンパク質を含む９員エンジインのアポタンパク質をコードする核酸を同定する方法であって、該核酸を請求項２４〜２６のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドに接触させ、該核酸に対する該オリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションを検出することを包含する、方法。
【請求項２８】
色素タンパク質を含む９員エンジインのアポタンパク質をコードする核酸を同定する方法であって、該核酸を配列番号１５６および配列番号１５７を有するオリゴヌクレオチドに接触させ、増幅により特異的ハイブリダイゼーションを検出することを包含する、方法。
【請求項２９】
前記核酸は放線菌目の生物に由来する、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記生物は、アクチノミセス属、アクチノマヅラ属、ストレプトミセス属、またはミクロモノスポラ属からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記生物はアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２（ＮＲＲＬ３０７７８）である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
配列番号１５０を有するアポタンパク質を産生することができる、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２（ＮＲＲＬ３０７７８）の生物学的に純粋な培養物。
【請求項３３】
色素タンパク質を作る方法であって、該色素タンパク質の発現に適した条件下の培地においてアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２（ＮＲＲＬ３０７７８）をインキュベートし、該色素タンパク質を該培地から回収することを包含する、方法。
【請求項３４】
修飾色素タンパク質を作る方法であって、
ａ）アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２の選択ｏｒｆを含む複数の第１のポリヌクレオチドを同時に突然変異誘発させて複数の子孫ポリヌクレオチドを産生すること、
ｂ）エンジイン発色団を産生する宿主細胞において該子孫ポリヌクレオチドからポリペプチドを発現すること、および
ｃ）所望の特徴を有するポリペプチド／発色団複合体に関して、該宿主細胞を選択またはスクリーニングすることにより修飾色素タンパク質を同定すること、
を包含する、方法。
【請求項３５】
前記第１のｏｒｆは、ｏｒｆ１５、ｏｒｆ１９、ｏｒｆ２０、ｏｒｆ３２、ｏｒｆ３３、およびｏｒｆ４０からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１のｏｒｆはｏｒｆ１３である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
（ａ）は、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２の第２の選択ｏｒｆを含む複数の第２のポリヌクレオチドを同時に突然変異誘発させて複数の子孫ポリヌクレオチドを産生することをさらに包含する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記第２のｏｒｆは、ｏｒｆ１５、ｏｒｆ１９、ｏｒｆ２０、ｏｒｆ２３、ｏｒｆ３２、ｏｒｆ３３、およびｏｒｆ４０からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１のｏｒｆまたは第２のｏｒｆは、ｏｒｆ２３である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記所望の特徴は、少なくとも１つの発色団生合成酵素の不活性化である、請求項３４〜３９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４１】
ｏｒｆ３２は不活性化されている、請求項３４〜４０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４２】
安息香酸類似体を含む発酵培養液において前記宿主細胞を培養することをさらに包含する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記宿主細胞は、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２（ＮＲＲＬ３０７７８）である、請求項３４〜４２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４４】
前記宿主細胞は異種宿主細胞である、請求項３４〜４２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４５】
哺乳動物における腫瘍性疾患の進行を阻害する方法であって、該哺乳動物にアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２（ＮＲＲＬ３０７７８）の色素タンパク質を有効量投与することを包含する、方法。
【請求項４６】
前記腫瘍性疾患は、結腸癌、乳癌、黒色腫、頭頸部癌、および前立腺癌からなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
請求項２３に記載の色素タンパク質を有効量含み、医薬的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物。
【請求項４８】
以下の式：
【化１】
2008523817.tif 000020
を有する化合物であって、
Ｒ１はＯＨまたはＯＣＨ３であり、Ｒ２はＣｌまたはＨであり、Ｒ３はＣＨ３またはＨであり、Ｒ４はＮＨ２、Ｒ５、およびＲ６から選択され、
Ｒ５は、
【化２】
2008523817.tif 000021
であり、
Ｒ６は
【化３】
2008523817.tif 000022
である、化合物。
【請求項４９】
Ｒ１はＯＣＨ３であり、Ｒ２はＣｌであり、Ｒ３はＣＨ３であり、Ｒ４はＲ５である、請求項４８に記載の化合物。
【請求項５０】
Ｒ１はＯＣＨ３であり、Ｒ２はＨであり、Ｒ３はＣＨ３であり、Ｒ４はＲ５である、請求項４８に記載の化合物。
【請求項５１】
Ｒ１はＯＣＨ３であり、Ｒ２はＣｌであり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４はＲ５である、請求項４８に記載の化合物。
【請求項５２】
Ｒ１はＯＣＨ３であり、Ｒ２はＣｌであり、Ｒ３はＣＨ３であり、Ｒ４はＮＨ２である、請求項４８に記載の化合物。
【請求項５３】
Ｒ１はＯＣＨ３であり、Ｒ２はＣｌであり、Ｒ３はＣＨ３であり、Ｒ４はＲ６である、請求項４８に記載の化合物。
【請求項５４】
Ｒ１はＯＣＨ３であり、Ｒ２はＨであり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４はＲ３である、請求項４８に記載の化合物。
【請求項５５】
Ｒ１はＯＣＨ３であり、Ｒ２はＨであり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４はＮＨ２である、請求項４８に記載の化合物。
【請求項５６】
Ｒ１はＯＣＨ３であり、Ｒ２はＨであり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４はＲ６である、請求項４８に記載の化合物。
【請求項５７】
Ｒ１はＯＣＨ３であり、Ｒ２はＣｌであり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４はＮＨ２である、請求項４８に記載の化合物。
【請求項５８】
Ｒ１はＯＣＨ３であり、Ｒ２はＣｌであり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４はＲ６である、請求項４８に記載の化合物。
【請求項５９】
Ｒ１はＯＣＨ３であり、Ｒ２はＨであり、Ｒ３はＣＨ３であり、Ｒ４はＮＨ２である、請求項４８に記載の化合物。
【請求項６０】
Ｒ１はＯＣＨ３であり、Ｒ２はＨであり、Ｒ３はＣＨ３であり、Ｒ４はＲ５である、請求項４８に記載の化合物。
【請求項６１】
Ｒ１はＯＨであり、Ｒ２はＣｌであり、Ｒ３はＣＨ３であり、Ｒ４はＲ５である、請求項４８に記載の化合物。
【請求項６２】
Ｒ１はＯＨであり、Ｒ２はＨであり、Ｒ３はＣＨ３であり、Ｒ４はＲ５である、請求項４８に記載の化合物。
【請求項６３】
Ｒ１はＯＨであり、Ｒ２はＣｌであり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４はＲ５である、請求項４８に記載の化合物。
【請求項６４】
Ｒ１はＯＨであり、Ｒ２はＣｌであり、Ｒ３はＣＨ３であり、Ｒ４はＮＨ２である、請求項４８に記載の化合物。
【請求項６５】
Ｒ１はＯＨであり、Ｒ２はＣｌであり、Ｒ３はＣＨ３であり、Ｒ４はＲ６である、請求項４８に記載の化合物。
【請求項６６】
Ｒ１はＯＨであり、Ｒ２はＨであり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４はＲ５である、請求項４８に記載の化合物。
【請求項６７】
Ｒ１はＯＨであり、Ｒ２はＨであり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４はＮＨ２である、請求項４８に記載の化合物。
【請求項６８】
Ｒ１はＯＨであり、Ｒ２はＨであり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４はＲ６である、請求項４８に記載の化合物。
【請求項６９】
Ｒ１はＯＨであり、Ｒ２はＣｌであり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４はＮＨ２である、請求項４８に記載の化合物。
【請求項７０】
Ｒ１はＯＨであり、Ｒ２はＣｌであり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４はＲ６である、請求項４８に記載の化合物。
【請求項７１】
Ｒ１はＯＨであり、Ｒ２はＨであり、Ｒ３はＣＨ３であり、Ｒ４はＮＨ２である、請求項４８に記載の化合物。
【請求項７２】
Ｒ１はＯＨであり、Ｒ２はＨであり、Ｒ３はＣＨ３であり、Ｒ４はＲ６である、請求項４８に記載の化合物。
【請求項７３】
以下の式
【化４】
2008523817.tif 000023
を有する化合物であって、
Ｒ１はＯＨまたはＯＣＨ３であり、Ｒ２はＣｌまたはＨであり、Ｒ３はＣＨ３またはＨであり、Ｒ４はＲ７およびＲ８から選択され、
Ｒ７は、
【化５】
2008523817.tif 000024
であり、
Ｒ８は、
【化６】
2008523817.tif 000025
であり、
Ｒ１’は、Ｈ、ＣＨ３、ＯＨ、ＯＣＨ３、Ｃｌ、Ｃ３Ｈ７、またはＮＯ２であり、Ｒ２’は、Ｈ、ＣＨ３、ＮＨ２、ＯＨ、Ｆ、ＯＣＨ３、Ｆ、Ｃｌ、ＮＯ２、ＯＣ２Ｈ５、またはＮＣ２Ｈ６であり、Ｒ３’は、Ｈ、ＣＨ３、Ｃｌ、ＣＨ３、ＮＨ２、ＯＨ、Ｆ、ＣＯＨ、ＯＣＨ３、Ｃｌ、ＯＣ２Ｈ５、またはＮＯ２であり、Ｒ４’は、Ｈ、ＯＨ、またはＯＣＨ３である、化合物。
【請求項７４】
Ｒ１’はＣＨ３であり、Ｒ２’はＨであり、Ｒ３’はＣＨ３であり、Ｒ４’はＨである、請求項７３に記載の化合物。
【請求項７５】
Ｒ１’はＣＨ３であり、Ｒ２’はＯＨであり、Ｒ３’はＨであり、Ｒ４’はＨである、請求項７３に記載の化合物。
【請求項７６】
Ｒ１’はＨであり、Ｒ２’はＣＨ３であり、Ｒ３’はＨであり、Ｒ４’はＯＨである、請求項７３に記載の化合物。
【請求項７７】
Ｒ１’はＨであり、Ｒ２’はＯＨであり、Ｒ３’はＯＨであり、Ｒ４’はＨである、請求項７３に記載の化合物。
【請求項７８】
Ｒ１’はＨであり、Ｒ２’はＯＨであり、Ｒ３’はＨであり、Ｒ４’はＯＨである、請求項７３に記載の化合物。
【請求項７９】
Ｒ１’はＯＨであり、Ｒ２’はＯＨであり、Ｒ３’はＨであり、Ｒ４’はＨである、請求項７３に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、アクチノマヅラ種（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ  ｓｐ．）２１Ｇ７９２により産生される色素タンパク質、ならびに色素タンパク質のアポタンパク質成分のアミノ酸配列および核酸配列、および発色団のための生合成経路の成分のアミノ酸および核酸配列を提供する。本発明は、医薬組成物の開発、および癌または細菌感染等の疾患の治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
放線菌目のメンバーにより産生される強力な細胞毒性ポリケチドの一種であるエンジインは、癌の治療に用いられてきた。エンジイン薬物の典型的な作用形態は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ開裂を介する。ＤＮＡ開裂は、エンジイン環のバーグマン型の環芳香族化により生成されたジラジカルによるデオキシリボース糖骨格からの水素引き抜き反応により誘発される。現在、癌の臨床治療用に２つのエンジインが認可されている：ＣＤ３３モノクローナル抗体と結合したカリケアマイシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）、米国）およびポリ（スチレン−ｃｏ−マレイン酸）結合ネオカルチノスタチン（日本）。
【０００３】
エンジイン天然物は、２つのサブカテゴリーに分類することができる。第１のサブクラスは、ビシクロ［７，３，０］ドデカジイン（すなわち、９員）エンジインコアまたはその前駆体を特徴とし、第２のサブクラスは、ビシルコ［７，３，１］トリデカジイン（すなわち、１０員）エンジインコアを特徴とする。９員エンジインの例としては、ネオカルチノスタチン、Ｃ−１０２７、ケダルシジン、マクロモマイシン、Ｎ１９９９Ａ２、およびマデュロペプチン（ｍａｄｕｒｏｐｅｐｔｉｎ）が挙げられる。１０員サブクラスの例としては、カリケアマイシン、エスペラマイシン、ダイネミシン、およびナメナマイシン（ｎａｍｅｎａｍｉｃｉｎ）。９員と１０員のエンジインを区別するさらなる特徴としては、Ｎ１９９９Ａ２を除いて、全ての９員エンジインがエンジイン−タンパク質複合体として産生され、エンジイン発色団が、非共有結合により不活性アポタンパク質に付着することである。このため、９員エンジインは、しばしば、色素タンパク質と呼ばれる。アポタンパク質は、不安定な９員エンジイン発色団を安定させ、標的とする細胞毒性発色団を染色質に届ける重要な役割を果たすと考えられている。
【０００４】
いくつかのアポタンパク質のアミノ酸配列は、アポタンパク質を直接配列決定するか、またはクローン化ＤＮＡ配列からアミノ酸を推定することにより決定されている。現在までに同定されているアポタンパク質は、小さな酸性タンパク質（１０８〜１１４個のアミノ酸（ａａ））であり、これらは、プレアポタンパク質（ｐｒｅ−ａｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）から３２〜３４ａａのアミノ末端リーダーペプチドを除去して生成される。２つの色素タンパク質（ネオカルチノスタチンおよびＣ−１０２７）の生合成経路が、クローン化され、配列決定されている。これらの場合、アポタンパク質をコードする遺伝子は、対応する発色団の生合成に必要な遺伝子でクラスタ化された。
【０００５】
色素タンパク質複合体のアポタンパク質成分は、薬物特性の指令変化の魅力的な標的となる。例えば、アポタンパク質アミノ酸または核酸配列が見つかった場合、部位特異的突然変異誘発法等の確立された分子生物学技術を用いて、アポタンパク質の発色団結合モチーフを変更し、その天然型発色団をより強くまたは弱く結合する、合理的に変化したアポタンパク質を作成することができる。さらに、そのようなアポタンパク質への変化により、例えば、毒性が低減した色素タンパク質、または効力もしくは安定度が増した発色団を得る事が可能である。また、アポタンパク質を全体的に操作することにより、結合特異性が大きく変化したしたアポタンパク質、すなわち、エンジイン発色団とは大きく異なる分子の標的薬物送達手段として機能する能力を得ることが可能である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、新規な色素タンパク質、ならびに遺伝子およびそれらの合成に関与するタンパク質の分離および特性解析が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、陸生放線菌類であるアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２（ＮＲＲＬ３０７７８）により産生された新規な非常に強力な抗癌色素タンパク質に関する。アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２色素タンパク質は、アポタンパク質と、９員エンジインを含む発色団の非共有結合複合体である。色素タンパク質は、１０員エンジインに属する化合物よりも毒性が低いと思われるが、これは、アポタンパク質の活性調節作用によるものと思われる。
【０００８】
本発明は、ポリペプチド、およびアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２の色素タンパク質生合成遺伝子ラスターのポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。ポリペプチドには、発色団生合成経路およびプレアポタンパク質の成分が含まれる。宿主内では、アポタンパク質成分は、プレアポタンパク質からのシグナルペプチドの開裂により形成される。従って、本発明は、さらに、分泌シグナルペプチドに対するＮ末端で融合したアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２アポタンパク質をコードする核酸配列を提供する。
【０００９】
本発明の１つの実施形態では、上記核酸は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０のアミノ酸配列と少なくとも約７０％の相同性を有するを有するポリペプチドをコードする。本発明の他の実施形態では、上記相同性は、少なくとも約８０％もしくは少なくとも約９０％であってもよく、または上記相同性は１００％であってもよい。特定の実施形態では、上記ポリペプチドの配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０のうちの１つと同じである。
【００１０】
特定の実施形態では、上記核酸は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９またはそれらの補体の配列の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、もしくは同じであるヌクレオチド配列を含む。
【００１１】
本発明はまた、上記核酸を含むベクターおよび宿主細胞も提供する。１つの実施形態では、本発明は、色素タンパク質遺伝子クラスターの全てまたは一部を含むアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２から単離されたＤＮＡを含むコスミドを提供する。上記核酸の単離および操作法が提供される。また、色素タンパク質遺伝子クラスター核酸の同定および増幅のためのプローブおよびプライマーも提供される。
【００１２】
本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０のアミノ酸配列と少なくとも約７０％の相同性、少なくとも約８０％の相同性、少なくとも約９０％の相同性、または約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む単離タンパク質またはポリペプチド、およびそれらの変異体を提供する。
【００１３】
本発明は、組換えアポタンパク質を産生する方法を企図しており、この方法は、ａ）配列番号６３または配列番号１４９を含む核酸配列を有する発現ベクターを含む宿主細胞を、上記宿主細胞内の組換えタンパク質の発現に適した条件下の培地で培養し、ｂ）上記組換えタンパク質を上記宿主細胞または上記培地から単離する工程を含む。
【００１４】
また、組換え色素タンパク質を産生する方法も企図される。この方法は、ａ）構造および酵素成分（例えば、ｏｒｆ１〜６５の全てまたは一部を含む）をコードする遺伝子を発現するコスミドまたは他の発現ベクターを含む宿主細胞を培養し、ｂ）組換えタンパク質を宿主細胞または培地から単離することを含む。上記組換え色素タンパク質は、２１Ｇ７９２色素タンパク質、またはその変異体とすることができる。
【００１５】
本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９とハイブリダイズするかまたはそれらの一部をプローブとして含み、例えば、他のエンジインに関連する化合物を産生することができる生物を同定するか、または例えば、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２等のエンジインに関連する化合物を産生することができる生物内の色素タンパク質の合成に関与する遺伝子を同定する核酸分子を用いる方法を企図する。
【００１６】
本発明は、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２ポタンパク質を提供し、実質的に純粋な形態のアポタンパク質および色素タンパク質、ならびに色素タンパク質を含む医薬組成物、ならびに色素タンパク質を投与する方法を提供する。上記色素タンパク質は、癌性細胞および腫瘍の治療に有用であることが立証されている。
【００１７】
本発明は、さらに、生物活性が変化したアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２アポタンパク質の変異体を生成する方法を提供する。そのような変異体アポタンパク質は、変化した発色団結合特性、変化した標的特異性、またはそれらの組み合わせを有し得る。
【００１８】
本発明は、アポタンパク質および色素タンパク質の大量産生を可能にすることは言うまでもない。さらに、本発明により、エンジインに関連する化合物を産生することができる他の生物の同定または、例えば、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２等のエンジイン関連の化合物を産生することができる生物内の色素タンパク質の合成に関与する遺伝子の同定が可能となることも理解されたい。さらに、本発明は、形質転換されて、例えば、毒性が低減した、効力が増した、または安定度が増したアポタンパク質の産生を可能にすることは言うまでもない。また、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２アポタンパク質の操作により、アポタンパク質の結合特異性を変化させることにより、２１Ｇ７９２エンジイン発色団とは異なる発色団の標的薬物送達手段として機能する能力が得られることも理解されたい。最後に、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２色素タンパク質を含む医薬組成物を開発し、細菌感染または癌性増殖を有する哺乳動物、好ましくは、ヒトに投与することができることは言うまでもない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（発明の詳細な説明）
エンジイン抗生物質は、一般に、ストレプトミセス属、ミクロモノスポラ属、およびアクチノマヅラ属を含むがそれらに限定されない放線菌目に属する各種の生物により産生される。本発明は、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ，１８１５  Ｎｏｒｔｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌ．，６１０６４）に寄託されたアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２により産生される新規な色素タンパク質に関する。これらの寄託物は、ブダペスト条約による条件に基づいて作成された。アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２には、信託番号ＮＲＲＬ３０７７８が与えられている。そのような現在公知の生物のうち、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２は、ＡＴＣＣ３９１４４として寄託されたアクチノマヅラ株（米国特許第４，５４６，０８４号）と最も類似していると思われる。１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列により評価されるように、これらの株は、近縁種または近縁亜種である。
【００２０】
アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２色素タンパク質は、新規なアポタンパク質および発色団から成る。色素タンパク質の成分および発色団生合成経路の成分、またはこれらの成分の前駆体（すなわち、プレアポタンパク質）は、色素タンパク質生合成遺伝子クラスターと呼ばれる隣接する読み取り枠（ｏｒｆ）の組によりコードされる。従って、本発明は、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２色素タンパク質生合成遺伝子クラスターのｏｒｆをコードする単離核酸（表１参照）、またはそれらの発現した（すなわち、処理された）断片（例えば、アポタンパク質；配列番号１５０）を提供する。１つの実施形態では、本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を提供する。好ましい実施形態では、上記核酸は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９のヌクレオチド配列を含む。本発明の核酸が相補配列を含むことは言うまでもない。
【００２１】
【表１−１】
2008523817.tif 000002
【００２２】
【表１−２】
2008523817.tif 000003
【００２３】
【表１−３】
2008523817.tif 000004
本発明は、厳しいハイブリダイゼーション条件の下で、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９と特異的にハイブリダイズする（または特異的に結合する）核酸を提供する。また、核酸コードの縮退がなければ前述した配列と特異的に結合するであろう核酸も企図される。これらの核酸は、完全なタンパク質（例えば、完全なｏｒｆ）またはそれらの断片をコードするために十分な長さを有するものとすることができる。また、修飾されたタンパク質をコードする核酸も含まれる。タンパク質修飾の例としては、抗体、抗体断片、受容体リガンド等の標的分子との融合が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２４】
上記核酸は、プローブおよびプライマーをさらに含む。特定の実施形態では、これらプローブまたはプライマーは、変質していてもよい。さらに、それらの用途に応じて、プローブおよびプライマーは、一本鎖または二本鎖であってもよい。プローブおよびプライマーは、例えば、少なくとも約１２個のヌクレオチドの長さ、好ましくは少なくとも約１５個のヌクレオチドの長さ、より好ましくは少なくとも約１８個のヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含み、本発明のブライマーを用いて生成され得るＰＣＲ増幅産物をさらに含む。
【００２５】
厳しい条件下でのハイブリダイゼーションとは、プローブがその標的部分配列と選択的にハイブリダイズし、他の配列とのハイブリダイゼーションはより少ないかまたは全くない条件を指す。また、サザンハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーション等の核酸ハイブリダイゼーション実験に関連して、厳しいハイブリダイゼーションおよび厳しいハイブリダイゼーション洗浄条件は配列依存的であり、異なる環境パラメータにおいては異なることも理解されたい。厳しいハイブリダイゼーション条件が得られるように、ハイブリダイゼーションおよび洗浄液容量ならびに温度を調整することは当該分野では周知である。厳しさは、用いられているプローブの大きさおよびヌクレオチド容量などのパラメータに依存する。一般的な説明および例については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．）Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ、および他の文献を参照。核酸のハイブリダイゼーションに関する他の手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，１９９３，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，ｐａｒｔ  Ｉ，ｃｈａｐｔｅｒ  ２，Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．で見ることができる。
【００２６】
好ましい厳しい条件としては、プローブと約９０％以上相補的な配列とのハイブリダイゼーションを可能にするが、約７０％未満相補的な配列とはハイブリダイゼーションさせないものが挙げられる。一般に、非常に厳しいハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、（規定されたイオン強度およびｐＨ下で）標的配列の５０％が完全にマッチしたプローブとハイブリダイズする温度である。極めて厳しい条件は、特定のプローブのＴｍと等しくなるように選択される。
【００２７】
サザンまたはノーザンブロットにおいてフィルタ上に１００を超える相補残基を有する相補核酸のハイブリダイゼーションのための厳しいハイブリダイゼーション条件の一例としては、ハイブリダイゼーションを一晩実施して４２℃で１ｍｇのヘパリンを有する５０％ホルムアミドが挙げられる。非常に厳しい洗浄条件の一例としては、約１５分間７２℃の０．１５ＭのＮａＣｌが挙げられる。厳しい洗浄条件の一例としては、１５分間６５℃の０．２倍のＳＳＣ洗浄が挙げられる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９参照）。非常に厳しい洗浄の前に低度に厳しい洗浄を行い、バックグラウンドプローブ信号を除去する場合がしばしばある。例えば、１００個を超えるヌクレオチドの二本鎖に対する中程度の厳しさの洗浄の一例としては、１５分間４５℃の１倍のＳＳＣが挙げられる。例えば、１００個を超えるヌクレオチドの二本鎖に対する低度の厳しさの洗浄の例としては、１５分間４０℃の４〜６倍のＳＳＣが挙げられる。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて関係のないプローブについて観察したものよりも２倍（以上）の信号対雑音比は、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。
【００２８】
コードするポリペプチドが実質的に同一であれば、厳しい条件で相互にハイブリダイズしない核酸であっても実質的に同一である。これは、例えば、遺伝子コードにより可能な最大のコドンの縮退を用いて核酸のコピーを生成する場合に起こる。従って、本発明のヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９またはそれらの断片であって、長さが少なくとも約５０個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１００個のヌクレオチドである断片と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％同一であるヌクレオチドの配列を含む。
【００２９】
本発明はまた、発色団遺伝子クラスターによりコードされた１つ以上のタンパク質を産生する方法にも関する。そのようなタンパク質は、宿主細胞内に配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９を含む１つ以上の核酸を発現することにより産生されてもよい。例えば、前述の核酸のうちの１つ以上は、核酸を調節管理して発現に影響を与えるように操作可能に結合し、宿主細胞内での発現のためにベクターに組み込むようにすることができる。本発明の１つの実施形態では、アポタンパク質またはプレアポタンパク質が産生される。
【００３０】
本発明において有用な管理要素は、オペレーター配列およびリボソーム結合部位を任意に有するプロモーターを含む。宿主細胞の成長に関してアポタンパク質またはプレアポタンパク質の発現の調節を可能にするような他の調節配列が望ましい場合がある。調節配列は当業者に公知であり、例えば、調節化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応じて遺伝子を発現させたり、発現させないようにするものが含まれる。他のタイプの調節要素が、ベクター、例えば、エンハンサー配列に存在してもよい。種々の発現ベクターが当該分野で公知であり、例えば、コスミド、ＰＩ、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＨＡＣ等がある。
【００３１】
選択可能なマーカーも組換え発現ベクターに含むようにすることができる。形質転換細胞株の選択に有用であり、一般に、形質転換細胞を適切な選択培地で培養する場合に、発現によりそれらの細胞に選択可能な表現型を与える遺伝子を含む各種のマーカーが公知である。そのようなマーカーは、例えば、プラスミドに抗生物質耐性または感受性を与える遺伝子を含む。
【００３２】
上述したベクターは、タンパク質の発現に適したあらゆる原核または真核細胞に挿入することができる。宿主細胞は、アクチノマヅラ、ストレプトミセス、ミクロモノスポラ、アクチノミセス属、Ｎｏｎｏｍｕｒｅａ、シュードモナス属等を含むがこれらに限定されない。宿主細胞としては、アクチノマヅラ、ストレプトミセス、およびミクロモノスポラ等のエンジインを自然に発現する種または株（例えば  細菌株）が好ましい（例えば、Ｐｆｅｉｆｅｒら，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１，１７９０−２；Ｍａｒｔｉｎｅｚら，２００４，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０，２４５２−６３参照）。１つの実施形態では、タンパク質が大腸菌において発現される。発現産物の回収は、当業者に周知の標準的な方法により行なうことができる。よって、例えば、タンパク質は、単離を容易にする有用な標識（例えば、Ｈｉｓ６標識）を用いて発現することができる。他の標準的なタンパク質精製技術は適切であり当業者に周知である（例えば、Ｑｕａｄｒｉら，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７，１５８５−９５；Ｎａｋａｎｏら，１９９２，ＭｏＩ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３２，３１３−２１参照）。色素タンパク質遺伝子クラスター全体が発現される場合、色素タンパク質を回収することができる。発現のために特定のＯｒｆを選択することにより、色素タンパク質に関連する化合物を産生することができる。例えば、ｏｒｆ２３の発現によりプレアポタンパク質を産生することができる。
【００３３】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９またはそれらの断片を含む核酸分子をプローブとして用いてもよい。そのようなプローブは、本発明の核酸の同定に有用である。下記の実施例に記載の方法と同様の方法を含む任意の適切な方法によりヌクレオチド配列をプローブとして用いてもよい。本明細書中において記載するように、ｄＮＤＰ−グルコース−４，６−デヒドラターゼ（ＤＨ）プローブを用いて、アポタンパク質または他の発色団に関連するタンパク質をコードする遺伝子または遺伝子クラスターを有する可能性があるアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２ゲノムＤＮＡのコスミドクローンを同定した。同様に、本発明の核酸を用いて、他の生物において、アポタンパク質および発色団に関連するタンパク質、特に、９員環エンジイン発色団をコードするｏｒｆを同定することができる。そのような生物は、一般に、例えば、菌類、バチルス、シュードモナス、粘液細菌およびシアノバクテリア等、二次代謝産物を産生する生物を含む。好ましくは、上記核酸を用いて、アクチノミセス属、ストレプトミセス属またはミクロモノスポラ属の生物を含むがそれらに限定されない放線菌目（Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  Ｏｕｔｌｉｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｃａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｒａ：Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ｒ）  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）の生物の遺伝子を同定する。より好ましくは、上記核酸を用いて、アクチノマヅラ種および亜種の遺伝子を同定する。
【００３４】
本発明はまた、実施的に純粋なタンパク質およびポリペプチドを提供する。所与のポリペプチドについて本明細書中において用いる「実質的に純粋な」という用語は、上記ポリペプチドが実質的に他の生体高分子を含まないことを意味する。例えば、実質的に純粋なポリペプチドは、乾燥重量で少なくとも７５％、８０％、８５％、９５％、または９９％の純度である。純度は、当該分野で公知の任意の適切な標準的方法、例えば、カラムクロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析により測定することができる。実質的に純粋なタンパク質が、アポタンパク質がエンジイン分子と複合化する色素タンパク質を含むことは言うまでもない。このような付着は、例えば、水素結合等の共有または非共有結合結合により行なうことができる。
【００３５】
本発明のタンパク質およびポリペプチドは、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２の色素タンパク質遺伝子クラスターのｏｒｆによりコードされるものを含む。好ましい実施形態では、上記タンパク質およびポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０を含むものである。特定の好ましい実施形態では、上記タンパク質は、２１Ｇ７９２プレアポタンパク質（配列番号６４）またはアポタンパク質（配列番号１５０）である（図６）。２１Ｇ７９２プレアポタンパク質およびアポタンパク質のアミノ酸組成を表２に示す。
【００３６】
【表２】
2008523817.tif 000005
本発明のタンパク質またはポリペプチドが、前述の好ましいタンパク質およびポリペプチドと実質的に同じアミノ酸配列を有するものをさらに含むことも言うまでもない。本明細書中においては、実質的に同じアミノ酸配列は、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，２４４４−８に準じたＦＡＳＴＡ検索法により測定した場合、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％の相同性を有し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％同一である配列を含む配列であると規定する。
【００３７】
そのようなタンパク質は、特に、同類アミノ酸置換がある場合には、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２と同様の活性を有する。同類アミノ酸置換は、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはそれらの断片の１つ以上のアミノ酸を変更することによるアミノ酸組成の変化として規定する。この置換は、一般に同様の特性（例えば、酸性、塩基性、芳香族性、大きさ、正荷電もしくは負荷電、極性、非極性）を有するアミノ酸の置換であり、関連ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の性質（例えば、電荷、等電点、親和性、親和力、配座、溶解性）または活性を実質的に変更しない。典型的な同類置換は、以下のアミノ酸の群内で選択され、この群は、
（１）疎水性：メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）；
（２）親水性：システイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
（３）酸性：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
（４）塩基性：ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）；
（５）芳香族性：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）；
（６）鎖配向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ、
を含むが、これらに限定されない。従って、本発明はまた、特に、アミノ酸置換が同類置換である場合、アミノ酸配列が配列番号６４または配列番号１５０と実質的に同じである２１Ｇ７９２アポタンパク質と同様のアミノ酸組成を有するアポタンパク質およびポリペプチドも包含する。
【００３８】
本発明のタンパク質およびポリペプチドは、任意の適切な方法により単離することができる。例えば、上述したように、アポタンパク質またはプレアポタンパク質をコードするヌクレオチドが宿主細胞において発現した場合、アミノまたはカルボキシ末端標識を用いて上記タンパク質を発現し、単離に容易にすることができる。さらに、本発明のポリペプチドを放線菌類から単離するために、特に、エンジインを有する複合体のアポタンパク質を単離することが望まれる場合には、下記の実施例に記載の手順と同様の手順に従ってもよい。
【００３９】
本発明の１つの実施形態では、上記アポタンパク質は、発色団と複合化される。好ましい発色団は、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２により産生されたものである。アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２発色団構造（図８）は、２１Ｇ７９２色素タンパク質を有機溶媒に曝すことにより生成された分解産物の構造から推定されたものであり、マヅロペプチン発色団に関連する（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら，１９９４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：９３５１；Ｚｅｉｎ，Ｎ．ら，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４，１１５９１−７参照）。
【００４０】
本発明はまた、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２を発酵および培養する方法も提供する。アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２の培養は、多様な液体培地で行なうことができる。アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２色素タンパク質の産生に有用な培地は、デキストリン、サッカロース、糖蜜、グリセロール等の同化可能な炭素源；タンパク質、タンパク質加水分解物、ポリペプチド、アミノ酸、コーンスティーブリカー等の同化可能な窒素源；ならびにカリウム、ナトリウム、アンモニウム、カルシウム、硫酸塩、炭酸塩、リン酸塩、塩化物等の無機陰イオンおよび陽イオンを含む。ボロン、モリブデン、銅等の微量元素は、上記培地の他の組成の構成要素の不純物として供給される。
【００４１】
本発明は、例えば、１つ以上のランダムまたは標的変異、欠失、または挿入の導入により、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２色素タンパク質遺伝子クラスターの１つ以上のｏｒｆに変更を加えることを可能にする。このように、上記発色団、アポタンパク質、またはそれらの両方を修飾して、例えば、毒性の減少、効力の増加、または安定度の増加を示す色素タンパク質を作成してもよい。特定のエンジイン発色団が、当該発色団に特異的な部位のＤＮＡを開裂させることを認識されたい。さらに、各種の色素タンパク質は、ヒストンに対する固有のタンパク質分解活性を有する。従って、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２アポタンパク質および／または発色団の操作によっても特異性が変化した色素タンパク質を提供することができる。あるいは、上記アポタンパク質を修飾して、最適な活性分子のための搬送または送達手段とすることができる。本発明はまた、他の生体分子と連結することが可能な修飾アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２発色団またはアポタンパク質／発色団複合体も可能にする。１つの実施形態では、上記生体分子は、発色団または色素タンパク質を特異的に標的とすることを可能にする。そのような生体分子は、例えば、細胞表面分子または受容体のための抗体または他のリガンドとすることができる。
【００４２】
例えば、変化したアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２アポタンパク質をコードする核酸を発現ベクターおよび宿主細胞に挿入し、当該宿主細胞をアポタンパク質の発現に適した条件下で培養し、当該アポタンパク質を宿主細胞または培地から回収することができる。好ましくは、上記宿主細胞は、上記変化したアポタンパク質と複合体を形成することができるエンジイン発色団または他の分子を産生することが可能である。そのような細胞の例としては、放線菌目の生物を産生する種々の抗生物質、特に、アクチノマヅラおよびストレプトミセス等の生物を産生するエンジインが挙げられる。宿主細胞は、大腸菌および酵母などの共通宿主をさらに含む。もちろん、上記変化したアポタンパク質を、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２において発現することができる。１つの実施形態では、上記変化したアポタンパク質を宿主細胞において過剰発現する。他の内在性アポタンパク質が宿主細胞に存在する場合、上記変化したアポタンパク質をより高いレベルで発現し、他方のアポタンパク質を過小発現するか、または標識を用いて上記変化したアポタンパク質を発現しそのような精製を容易にする。好ましい実施形態では、上記変化したアポタンパク質をコードする核酸は、相同組み替えにより、内在性アポタンパク質遺伝子と置換される。このようにして、上記変化したアポタンパク質を、エンジインまたは他の分子、例えば、活性剤との複合体において単離し、そのような複合体を、例えば、癌細胞株に対してスクリーニングして、生物活性を決定することができる。
【００４３】
さらに他の実施形態では、ａ）上記変化したアポタンパク質を宿主細胞において発現し、エンジインまたは他の分子と複合化することなく回収し、ｂ）次いで、上記変化したアポタンパク質を各種のエンジインまたは他の分子に曝し、ｃ）基準に合った技術を用いて、アポタンパク質が当該エンジインまたは他の分子と複合体を形成するか否かを決定し、任意で、ｄ）生物活性に関して、当該複合体をスクリーニングする。さらに他の実施形態では、上記変化したアポタンパク質を宿主細胞において発現し、エンジインまたは他の分子と複合化することなく回収し、次いで、上記変化したアポタンパク質を各種のエンジインまたは他の分子に曝し、生物活性に関して、当該複合体をスクリーニングする。
【００４４】
他の例では、修飾発色団生合成経路をコードする核酸を発現する。
【００４５】
アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２生合成クラスターから発現されたポリペプチドの機能は、ＯＲＦ配列と公知のタンパク質および配列モチーフとを比較することにより推定することができる。（表３）
【００４６】
【表３−１】
2008523817.tif 000006
【００４７】
【表３−２】
2008523817.tif 000007
【００４８】
【表３−３】
2008523817.tif 000008
これらの機能に合わせて、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２エンジインの合成のために、集中的生合成経路が設けられる。複合体の４つの主要成分（エンジインコア、マヅロサミン、２−ヒドロキシ−３，６−ジメチル安息香酸、および３−（２−クロロ−３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）−３−ヒドロキシ−プロパン酸）が個別に産生され、集合的に最終生物活性産物を形成する。
【００４９】
３−（２−クロロ−３−ヒドロキシ−４−メトキシ−フェニル）−３−ヒドロキシ−プロパン酸部分の生合成。エンジインの３−（２−クロロ−３−ヒドロキシ−４−メトキシ−フェニル）−３−ヒドロキシ−プロピオン酸由来部分（図９）を産生するために、まず、チロシンを、ｏｒｆ１８の遺伝子産物によりβ−チロシンに変換する。Ｏｒｆ１８は、いくつかのヒスチジンおよびフェニルアラニンアンモニアリアーゼと高い類似性を示すが、α−チロシンからβ−チロシンへの変換を触媒するＣ−１０２７生合成経路のＳｇｃＣ４との類似性が最も高い（７３％の同一性、８４％の類似性）。（Ｌｉｕら，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１１７０−７３、Ｖａｎ  Ｌａｎｅｎら，２００５，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２７，１１５９４−５）。次に、β−チロシンを、ｏｒｆ１７遺伝子産物のアデニル化（Ａ）ドメインによりアミノアシルアデニレートとして活性化し、隣接するぺプチジルキャリアタンパク質（ＰＣＰ）上のホスホパンテテイニル補欠分子群のスルフィドリル基に伝達し、β−チロシニル−Ｓ−Ｏｒｆ１７を形成する。Ｏｒｆ１７は、多様な非リボソームペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）と類似する。推定されたアミノ酸配列の配列分析に基づいて、Ｏｒｆ１７は、３つの機能ドメイン、縮合（Ｃ）ドメイン、Ａドメイン、およびＰＣＰドメインを含む（図１０）。ＫｏｎｚおよびＭａｒａｈｉｅｌ，１９９９，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，Ｒ３９−Ｒ４７参照。Ａドメインの基質特異性コードをＡ４Ａドメイン構造モチーフとＡ５Ａドメイン構造モチーフ間の領域から抽出し、特異性コードＤＰＣＱＶＭＶＩＡＫ（表４）を示した。表４はまた、Ｃ１０２７生合成クラスター由来のＳｇｃＣ１（Ｃｈａｌｌｉｓら，２０００，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７，２１１−２４）およびグラミシジン生合成クラスター由来のＧｒｓＡ（Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓら，１９９９，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ，６，４９３−５０５）の基質および基質特異性コードも示す。
【００５０】
【表４】
2008523817.tif 000009
Ｏｒｆ１７は、Ｃ−１０２７生合成クラスター由来のＳｇｃＣ１に最も類似している（４１％の同一性、４９％の類似性）。タイプＩＩ非リボソームペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）をコードするＳｇｃＣ１は、孤立Ａドメインから成る。この酵素のインビトロ特徴解析では、ＳｇｃＣ２（単一のＰＣＰドメインから成るタイプＩＩＮＰＲＳ）上に載せる前にβ−チロシンを特異的に活性化することが示された。（Ｖａｎ  Ｌａｎｅｎら，２００５）。ＳｇｃＣ１およびＯｒｆ１７の基質特異性コードの比較により、上記コードが著しく類似しているが明らかである（Ｏｒｆ１７のＤＰＣＱＶＭＶＩＡＫとＳｇｃＣＩのＤＰＡＱＬＭＬＩＡＫ）。両方の酵素が同じ基質を活性化するため、この類似性は意外なことではない。興味深いことに、ｏｒｆ１７の終止コドンは、ｏｒｆ１８の初めと３ｂｐ重複しており、これら２つの遺伝子が翻訳共役している可能性があることを示している。ｏｒｆ１８が同時に発現してβ−チロシンを供給することなくｏｒｆ１７が発現することにより、標的とする基質を供給することなくＯｒｆ１７遺伝子産物が産生されるため、これらの遺伝子の発現を調節することは予想外のことではない。
【００５１】
一旦チオエステル結合によりＯｒｆ１７のＰＣＰ上に載せられると、次に、β−チロシニル−Ｓ−Ｏｒｆ１７は、Ｏｒｆ１５によりメチル化され、３−アミノ−３−（４−メトキシ−フェニル）−プロパニル−Ｓ−Ｏｒｆ１７を生じる。Ｏｒｆ１５は、多くのＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存Ｏ−メチルトランスフェラーゼと高い類似性を示し、ＳＡＭ依存メチルトランスフェラーゼ（モチーフＩ−ＶＶＤＶＧＴＦＴＧ、配列番号１６６；モチーフ２−ＰＡＡＤＬＶＦＬ、配列番号１６７；モチーフ３−ＬＬＲＰＧＧＬＬＶＡ、配列番号１６８）に共通する３つの配列モチーフを有する。ＫａｇａｎおよびＣｌａｒｋｅ，（１９９４）Ａｒｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３１０，４１７−４２７。アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２エンジインは単一のＯ−メチル基を有するため、Ｏｒｆ１５が、この反応を触媒する可能性が最も高い酵素である。続いて、この酵素につながれた中間体は、Ｏｒｆ３９によりヒドロキシル化され、３−アミノ−３−（３−ヒドロキシ−４−メトキシ−フェニル）−プロパニル−Ｓ−Ｏｒｆ１７をもたらす。ＢｌａｓｔＰ分析は、Ｏｒｆ３９が、フェノール性基質のヒドロキシル化に関与する多くのヒドロキシラーゼに類似するヒドロキシラーゼであることを示す。これは、インビトロで塩素化β−チロシニル−Ｓ−ＰＣＰ中間体をヒドロキシル化することが分かっているＣ−１０２７生合成クラスターのＳｇｃＣに際立って類似している（７３％の同一性、８２％の類似性）。（Ｌｉｕら，２００２；Ｖａｎ  Ｌａｎｅｎら，２００５）。ヒドロキシル化に続いて、ｏｒｆ１９遺伝子産物が芳香族環のＣ−２位置を塩素化して、３−アミノ−３−（２−クロロ−３−ヒドロキシ−４−メトキシ−フェニル）−プロパニル−Ｓ−Ｏｒｆ１７をもたらす。Ｏｒｆ１９は、二次代謝に関与するいくつかのアルキルハリダーゼと相同であり、最も顕著であるのは、ＰＣＰ結合β−チロシンの塩素化を行なうことが分かっているＣ−１０２７生合成クラスター由来のＳｇｃＣ３である（５８％の同一性、７０％の類似性）。（Ｌｉｕら，２００２；Ｖａｎ  Ｌａｎｅｎら，２００５）。
【００５２】
アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２エンジインに組み込まれたβ−チロシン誘導体は、アミノ基の代わりにヒドロキシル基を持つため、酸化的脱アミノ反応により、３−アミノ−３−（２−クロロ−３−ヒドロキシ−４−メトキシ−フェニル）−プロパニル−Ｓ−Ｏｒｆ１７中間体のアミノ基をＯｒｆ２１と置き換えることが想定できる。ＢｌａｓｔＰ分析により、Ｏｒｆ２１がいくつかの推定ＦＡＤおよびＮＡＤＰＨ依存モノオキシゲナーゼ／ヒドロキシラーゼとの類似性を示すことが明らかになり、ドメイン分析により、多くのモノオキシゲナーゼに共通のＦＡＤ結合ドメインを含むことが示される。このドメインはアミノ酸オキシダーゼに共通しており、酸化的脱アミノ反応が十分に裏付けされているため、Ｏｒｆ２１はこの形質転換を行なう有力な候補である。しかしながら、ＦＡＤおよびＮＡＤＰＨ依存モノオキシゲナーゼ／ヒドロキシラーゼに類似するＯｒｆ４２を含むこの反応を潜在的に触媒し得る候補が他にもいくつか存在することに留意することが重要である。さらに、Ｐ４５０ヒドロキシラーゼに類似する２つのＯｒｆ（Ｏｒｆ２５およびＯｒｆ２７）が生合成クラスターに存在し、Ｐ４５０ヒドロキシラーゼも酸化的脱アミノ反応に関係しているため、これらの酵素のうちの１つもこの工程を触媒する可能性がある。（Ｌｉら，２０００，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８２，４０８７−９５）酸化的脱アミノ反応に続いて、Ｏｒｆ２１または他の候補酵素のうちの１つにより導入されると思われるケトンの還元が発生する可能性がある。このような反応を触媒できることが最も明白な酵素は、ポリケチド生合成で用いられるものに類似するケトレダクターゼであろう。アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２エンジイン生合成クラスターの検査では、ケトレダクターゼのような酵素との類似性を示すいかなる酵素も同定されなかった。必要な還元を触媒する可能性がある未知の機能を有するいくつかの酵素がクラスターに存在するか、または酸化的脱アミノ反応の触媒に関与する酵素も還元反応を触媒する可能性がある。あるいは、現在の生合成経路外でコードされた酵素が、予想される還元を触媒し得る。ケト還元に続いて、チロシン誘導体３−（２−クロロ−３−ヒドキシ−４−メトキシ−フェニル）−３−ヒドロキシ−プロパニル−Ｓ−Ｏｒｆ１７がアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２エンジイン複合体に組み込まれる。このアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２エンジインの成分の最終産物への組み込みについては以下で議論する。
【００５３】
この合成経路は限定を目的とするものではなく単なる例示である。これをモデルとして用いることで、当業者は、他の多くの合成方式を設計し、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２発色団の３−（２−クロロ−３−ヒドキシ−４−メトキシ−フェニル）−３−ヒドロキシ−プロパニル成分またはこの成分の誘導体を産生することができる。
【００５４】
マヅロサミン部分の生合成。アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２エンジイン生合成経路の分析により、マヅロサミン（４−アミノ−４−デオキシ−３−Ｃ−メチル−β−リボピラノース）生合成に関与する５つの遺伝子が同定された（図１１）。全てのデオキシ糖と同様に、マヅロサミン（ＭＤＡ）生合成における第１の工程は、グルコース−ｄＮＤＰシンターゼによるＤ−グルコース−１−リン酸塩（Ｇ−Ｉ−Ｐ）の活性化である。Ｔｒｅｆｚｅｒら，１９９９，Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｐ．１６，２８３−９９。いくつかのグルコース−ｄＮＤＰシンターゼと相同であるＯｒｆ４３は、Ｇ−Ｉ−Ｐの活性化に関与する。これは、ＧｅｎＢａｎｋデータベース内のタンパク質に対するＯｒｆ４３の配列相同性に基づいて、ｄＴＤＰまたはｄＵＤＰ−グルコースの形成を触媒すると思われる。
【００５５】
次に、ｄＮＤＰ−糖デヒドロゲナーゼと相同性が高い酵素であるＯｒｆ３７は、第一級アルコールを酸化させ、ｄＮＤＰ−Ｄ−グルクロン酸を産生する。次いで、予想されるｄＮＤＰ−グルクロン酸デカルボイクスラーゼであるＯｒｆ３８は、ｄＮＤＰ−Ｄ−グルクロン酸をｄＮＤＰ−キシロースに変換する。ｏｒｆ３８から増幅された断片をプローブとして用い、マヅロサミンの生合成が４，６−デオキシグルコース中間体を含むｄＮＤＰ−グルコース−４，６−デヒドラターゼを伴い得るという予測に基づいてアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２エンジイン生合成クラスターを含む第１のコスミドを同定した（実施例参照）。しかしながら、ＵＤＰ−グルクロン酸デカルボキシラーゼおよびＴＤＰ−グルコース−４，６−デヒドラターゼアミノ酸配列とＯｒｆ３８の配列の比較では、ことが示される。Ｄｅｃｋｅｒらによりグルコース−４，６−デヒドラターゼ遺伝子を増幅するために用いるＰＣＲプライマーの設計に用いられた同類アミノ酸モチーフもＯｒｆ３８およびグルクロン酸デカルボキシラーゼ配列中に存在する（図１２）。（Ｄｅｃｋｅｒら，１９９４，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏ．Ｌｅｔｔ．，１４１，１９５−２０１）。結果として、これらのプライマーを用いてグルクロン酸デカルボキシラーゼが増幅されたことは驚くべきことではない。さらに、ｏｒｆ３７の終止コドンがｏｒｆ３８の開始コドンと重複しており、これらのｏｒｆが翻訳共役している可能性があることに留意されたい。
【００５６】
ｄＮＤＰ−グルクロン酸の脱カルボキシル化に続いて、ｄＮＤＰ−Ｄ−キシロースのＣ−３ヒドロキシルが、Ｏｒｆ４９によってエピマー化され、ｄＮＤＰ−Ｌ−キシロースを産生する。Ｏｒｆ４９は、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ（信託番号ＡＡＺ５５２７３．１）由来の未同定タンパク質に最も類似し、その次に最も密接な関係がある同族体は、オビエドマイシンの生合成に関与するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ  １１８９１由来の推定ＮＤＰ−糖エピメラーゼであるｏｖｍＸである（４０％の同一性、５３％の類似性）。（Ｌｏｍｂｏら，２００４，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ  ５，１１８１−７）。
【００５７】
エピマー化に続いて、ｏｒｆ４０の遺伝子産物は、ｄＮＤＰ−Ｌ−キシロースの３位炭素をメチル化する。Ｏｒｆ４０は、多数のＮＤＰ−ヘキソースＣ−メチルトランスフェラーゼと有意な類似性を示し、多様なＳＡＭ依存メチルトランスフェラーゼに共通する３つの配列モチーフ（モチーフ１−ＩＶＥＩＧＣＮＤＧ、配列番号１６９；モチーフ２−ＧＰＡＤＶＬＹＧ、配列番号１７０；モチーフ３−ＬＬＫＰＤＧＩＦＶＦ、配列番号１７１）を有する。（ＫａｇａｎおよびＣｌａｒｋｅ，１９９４，Ａｒｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３１０，４１７−２７）。結果として、Ｏｒｆ４０は、このメチル化を行なうと予想される。他のＣ−メチル化がアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２エンジインの２−ヒドロキシ−３，６−ジメチル−安息香酸（ＨＤＢＡ）部分の生合成において発生する一方、Ｃ−メチルトランスフェラーゼは、そのメチル化（Ｏｒｆ３３）を触媒すると予想され、ＨＤＢＡ炭素骨格の生成に関与するポリケチドシンターゼとともに小さなオペロンを形成すると思われ、結果として、Ｏｒｆ４０はその形質転換には加わらないと予想される。
【００５８】
次に、メチル化ｄＮＴＰ−糖は、Ｃ−４がアミノ基転移してｄＮＴＰ−マヅロサミンを形成する。この反応は、Ｄ−ｆｏｒｏｓａｍｉｎｅの形成においてデオキシ糖中間体のＣ−４アミノ基転移を行なうことが分かっているスピノシン生合成クラスター由来のＳｐｎＲとの相同性が高い（５５％の同一性、６８％の類似性）Ｏｒｆ３６により触媒されると思われる。（Ｚｈａｏら，２００５，ＪＡＣＳ，１２７，７６９２−３）アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２エンジインのマヅロサミン成分の最終産物への組み込みについては下記で議論する。
【００５９】
この合成経路は限定を目的とするものではなく単なる例示である。これをモデルとして用いることで、当業者は、他の多くの合成方式を設計し、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２エンジインのＭＤＡ成分またはこの成分の誘導体を産生することができる。
【００６０】
２−ヒドロキシ−３，６−ジメチル−安息香酸部分の生合成。アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２エンジインの２−ヒドロキシ−３，６−ジメチル安息香酸（ＨＤＢＡ）成分は、２つの遺伝子産物（繰返し型タイプＩポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）であるＯｒｆ３２、およびＳＡＭ依存Ｃ−メチルトランスフェラーゼであるＯｒｆ３３）により合成される可能性が最も高い（図１３）。最近まで、芳香族ポリケチドの生合成についての細菌の理論的枠組みは、繰返し型タイプＩＩのＰＫＳを必要としていた。（Ｓｈｅｎら，２００３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．７，２８５−９５）アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２エンジイン生合成クラスターの検査では、タイプＩＩのＰＫＳと相同する遺伝子の存在は明らかにされなかった。しかしながら、Ｏｒｆ３２は、ネオカルチノスタチンのナフトエ酸部分の産生に関与する繰返し型タイプＩのＰＫＳであるＮｃｓＢに高い類似性を示し（４７％の同一性、５９％の類似性）、真菌を元にするいくつかの６−メチルサリチル酸シンターゼにも高い類似性を示した。（Ｌｉｕら，２００５，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２９３−３０２）Ｏｒｆ３２は、ケトシンターゼ（ＫＳ）、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）、デヒドラターゼ（ＤＨ）、ケトレダクターゼ（ＫＲ）およびアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）を含むタイプＩのＰＫＳに共通する５つのドメインから成る。これは、繰返し型デアルボキシラーゼ縮合を行い、その後にＣ−４の選択的ケト還元および脱水、ならびにＣ−２のケト還元を行なうことにより、１つのアセチル補酵素Ａ（ｃｏＡ）および３つのマロニルｃｏＡから直鎖テトラケチドの形成を触媒する。次いで、新生テトラケチド中間体は、非酵素分子内アルドール縮合により、環化６−メチルサリチル（６ＭＳＡ）酸中間体を形成する。
【００６１】
その後、ｏｒｆ３３の遺伝子産物は、６ＭＳＡ中間体のＣ−３位置をメチル化してＨＤＢＡを形成する。Ｏｒｆ３３は、Ｎ−、Ｃ−およびＯ−メチルトランスフェラーゼを含む多様なＳＡＭ依存メチルトランスフェラーゼに類似する。その分類に合わせて、Ｏｒｆ３３は、多様なＳＡＭ依存メチルトランスフェラーゼに共通する３つの配列モチーフを有する（モチーフ１−ＶＬＤＬＧＧＧＤＧ、配列番号１７２；モチーフ２−ＤＧＣＤＡＩＬＹ、配列番号１７３；モチーフ３−ＡＬＰＥＧＧＶＣＶＶ、配列番号１７４）。（ＫａｇａｎおよびＣｌａｒｋｅ，１９９４）生合成クラスターに存在する他のメチルトランスフェラーゼがこの反応を触媒する可能性がある一方、Ｏｒｆ３３は、Ｏｒｆ３２のすぐ上流に位置し、ＨＤＢＡの産生に充てられる小さなオペロンの一部であるため、この反応を起こす可能性が最も高い酵素である。ＰＫＳから環化ポリケチドを放出には、多くのポリケチドの場合と同様にチオエステラーゼは必要としない。むしろ、それは、６−メチルサリチル酸生合成について報告されているものに似たケテン経路を介して放出される。ＳｐｅｎｃｅｒおよびＪｏｒｄａｎ，（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８８，８３９−８４６。
【００６２】
Ｏｒｆ３２からの放出に続いて、ＨＤＢＡが、ｏｒｆ３１の遺伝子産物によりアリールアデニレートとして活性化される。Ｏｒｆ３１は、多数のアリール酸ＡＭＰリガーゼに類似する。これらのタイプの酵素の最も研究された例は、親鉄剤生合成の調査によるものである。多くの親鉄剤の場合、サリチル酸塩または２’、３’−ジヒドロキシベンゾエート等のアリール酸は、親鉄剤の非リボソームペプチドコアのアセンブリにおける第１の工程としてアデニル化される（ＣｒｏｓａおよびＷａｌｓｈ，２００２，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６６，２２３−４９を検討のために参照されたい）。アリール酸をアデニレートとして活性化する他に、これらの酵素はまた、いわゆるアリールキャリアタンパク質（ＡｒＣＰ）のホスホパンテテイニル補欠分子群のスルフィドリル基にアリール酸を伝達する。親鉄剤バシルスバクチン（ｂａｃｉｌｌｉｂａｃｔｉｎ）の生合成に関与する２’，３’−ジヒドロキシベンゾエート−ＡＭＰリガーゼ（ＤｈｂＥ）の結晶構造と、ＮＰＲＳ  ＧｒｓＡアデニル化ドメインおよび蛍ルシフェラーゼを含む他のアデニル化酵素の結晶構造の比較により、アリール酸活性化ドメインがアミノ酸活性化ドメインには存在しない特徴的配列を含むことが明らかになった。（Ｍａｙら，２００２，ＰＮＡＳ９９，１２１２０−５）。ＤｈｂＥでは、通常アミノ酸活性化ドメイン（ＹｘＦＤｘＳ）に存在するいわゆるコアＡ４モチーフが配列モチーフＨＮＹＰＬＳＳＰＧに置き換えられる。アミノ酸活性化ドメインでは、不変Ａｓｐ残基がアミノ酸基質のα−アミノ基を安定させる一方、アリール酸活性化ドメインでは、Ａｓｐ残基は、ＤＨＢＡまたはサリチル酸の２’−ヒドロキシル基と水素結合する同類中性Ａｓｎに置き換えられる。（Ｍａｙら，２００２）。ＨＤＢＡは２’−ヒドロキシルを有するため、Ｏｒｆ３１がアリール酸活性化Ａ４モチーフを有することが予想される。Ｏｒｆ３１配列の検査により、アリール酸を活性化する酵素と整合するモチーフＨＮＦＰＬＡＳＰＧ（配列番号１７５）が明らかになった（図１４）。
【００６３】
ＮＲＰＳアミノ酸活性化ドメイン（Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓら，１９９９，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，４９３−５０５；Ｃｈａｌｌｉｓら，２０００，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７，２１１−２４）に関しては、Ａ４コアモチーフとＡ５コアモチーフ間の領域からアリール酸活性化ドメインの基質特異性コードを抽出することができる。（Ｍａｙら，２００２）。表５は、Ｏｒｆ３１基質特異性コードと、下記の二次代謝産物の生合成に関与する他のアリール酸活性化ドメインの基質特異性コードの比較を示す：ヴァージニアマイシン（ＶｉｓＢ、信託番号ＢＡＢ８３６７２）、プリスチナマイシン（ＳｎｂＡ、信託番号ＣＡＡ６７１４０）、ミコバクチン（ＭｂｔＡ、信託番号ＣＡＢ０３７５９）、エルシニアバクチン（ＹｂｔＥ、信託番号ＡＡＣ６９５９１）、ピオケリン（ＰｃｈＤ、信託番号ＡＡＤ５５７９９）、ネオカルチノスタチン（ＮｃｓＢ２、信託番号ＡＡＭ７７９８７）、ビブリオバクチン（ＶｉｂＥ、信託番号Ｏ０７８９９）、バルニバクチン（Ｖｖａ１３０１、信託番号ＢＡＣ９７３２７）、バシルスバクチン（ＤｈｂＥ、信託番号ＡＡＣ４４６３２）、およびミクソケリン（ＭｘｃＥ、信託番号ＡＦ２９９３３６）。ＧｒｓＡフェニルアラニン活性化アデニル化ドメインに準じて位置番号を付している（Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓら，１９９９）。２’，３’−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）とサリチル酸の活性化の区別に関与すると提示されている残基をアスタリスクで特定している。Ｏｒｆ３１で見られる位置と対応する各位置の残基は、灰色の影を付けている。ＨＰＡ、３−ヒドロキシピコリン酸。
【００６４】
Ｏｒｆ３１基質特異性コードと、他のアリール酸活性化酵素および３−ヒドロキシピコリン酸を活性化する２つの酵素のコードの比較により、Ｏｒｆ３１がサリチル酸またはＨＤＢＡのいずれかを活性化することが示される。（表５）。
【００６５】
【表５】
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サリチル酸またはＨＤＢＡの活性化の後、Ｏｒｆ３１は、ｏｒｆ１６によりコードされたＡｒＣＰに付着したホスホパンテテイニル補欠分子群のスルフィドリル基への活性化アリール酸の伝達を触媒する。Ｏｒｆ１６は、二次代謝に関与する多くのＰＣＰおよびＡｒＣＰに類似する（〜３０−４０％同一）小さなタンパク質（９５ａａ）であり、不変セリン残基（ＧＴＦＦＱＬＲＧＱＳＩ；配列番号１７６）を含む特徴的な４’−ホスホパンテイン付着モチーフを有する。ＡｒＣＰへの付着の後、下記で議論するように、サリチル酸塩誘導体は、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２エンジイン複合体への組み込まれる。
【００６６】
この合成経路は限定を目的とするものではなく単なる例示である。これをモデルとして用いることで、当業者は、他の多くの合成方式を設計し、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２発色団の２−ヒドロキシ−３，６−ジメチル安息香酸成分またはこの成分の誘導体を産生することができる。
【００６７】
エンジインコア生合成。少なくとも１４個の遺伝子が、図１５に概略を示すアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２エンジインコア生合成におけるそれらの役割をサポートするように機能することが推定されるアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２エンジイン生合成クラスター内で同定された。Ｏｒｆ５は、ネオカルチノスタチン（ＮｃｓＥ）、Ｃ−１０２７（ＳｇｃＥ）およびカリケアマイシン（ＣａｌＥ８）の生合成に関与するエンジインＰＫＳとの全体的な配列相同性を示す繰返し型タイプＩのＰＫＳをコードする。（Ｌｉｕら，２００５；Ｌｉｕら，２００２；Ａｈｌｅｒｔら，２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１１７３−７６）。先に同定したエンジインＰＫＳと同様に、Ｏｒｆ５は、６個のドメイン：ＫＳ、ＡＴ、ＡＣＰ、ＫＲ、ＤＨ、およびいわゆる「末端ドメイン」（ＴＤ）から成る（図１６）。ＴＤは、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼとの相同性を示す。結果として、ＴＤは、翻訳後にＡＣＰ活性部位セリンを４’−ホスホバンテテインで修飾することにより、エンジインＰＫＳの自動活性化を触媒すると見られている。（Ｚａｚｏｐｏｌｏｕｓら，２００３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２１，１８７−９０）。Ｏｒｆ５は、１つのアセチルｃｏＡおよび７つのマロニルｃｏＡから新生直鎖ポリ不飽和ポリケチド中間体を繰り返し産生すると予想される。直鎖中間体は、Ｏｒｆ５から放出され、かつ／または全てのエンジイン生合成クラスターに見られるチオエステラーゼタンパク質群との類似性を示すＯｒｆ６により環化されると考えられる。上記参照。このタンパク質群は、シュードモナス種株ＣＢＳ−３の４−ヒドロキシベンゾイルｃｏＡチオエステラーゼとの相同性に基づいて、チオエステラーゼとして機能すると予測される。上記参照。
【００６８】
ポリケチド中間体は、いくつかの遺伝子産物（Ｏｒｆ１−４、７、８、１１、１２、１４）によりさらに処理され、エンジインコアを得る（図１５）。これらの遺伝子産物は、エンジイン生合成クラスターでの保存性が高い。Ｏｒｆ５および６の他に、Ｏｒｆ１−４の同族体が現在までに研究されてきた全てのエンジイン生合成経路に見られ（上記参照）、その一方で、Ｏｒｆ７、８、１１、１２および１４の同族体は、９員エンジインＣ−１０２７およびネオカルチノスタチン生合成クラスターと共通する（Ｌｉｕら，２００５；Ｌｉｕら，２００２）。Ｏｒｆ１−４、１１および１４は、機能が公知のいずれのタンパク質とも相同性を有さないが、Ｏｒｆ７、８および１２は、各種のオキシドレラクターゼと似ている。興味深いことに、ｏｒｆ１１およびｏｒｆ１２と同様に、ｏｒｆ２−８は翻訳共役されていると思われるため（例えば、ｏｒｆ２の終止コドンはｏｒｆ３の開始コドンと重複し、ｏｒｆ３の終止コドンは開始コドンまたはｏｒｆ４と重複する、等）、これらの遺伝子の大半の発現は共調整することができる。
【００６９】
エンジインコア（図１５）は、エンジインコアのＣ１３〜Ｃ１４エポキシドからの末端アミドの産生に関与していると思われる少なくとも３つの遺伝子産物、Ｏｒｆ３０、Ｏｒｆ４１およびＯｒｆ２４によりさらに修飾される。ｏｒｆ３０は、予想されるエポキシドヒドロラーゼをコードし、ｏｒｆ４１は、アルコールデヒドロゲナーゼをコードし、ｏｒｆ２４は、アミノトランスフェラーゼをコードする。その後、完全に修飾されたエンジインコア部分は他の発色団成分で覆われて、活性代謝体を産生する。
【００７０】
この合成経路は限定を目的とするものではなく単なる例示である。これをモデルとして用いることで、当業者は、他の多くの合成方式を設計し、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２発色団のエンジインコアまたはこの成分の誘導体を産生することができる。
【００７１】
アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２発色団のアセンブリ（図１７）。アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２エンジインの生合成は、分子複合体の個々の成分のアセンブリについて集中的方法を必要とするエンジイン生合成の現在の理論的枠組みに従う。（Ｌｉｕら，２００５；Ｌｉｕら，２００２；Ａｈｌｅｒｔら，２００２）。各成分の産生に続いて、それら成分がエンジインコアに体系的に付着され、最終的に図１７において概略を示すような最終分子を得る。エンジインコアの３−（２−クロロ−３−ヒドロキシ−４−メトキシ−フェニル）−３−ヒドロキシ−プロパニル部分への付着は、Ｏｒｆ１７の縮合ドメインにより触媒されていると思われる。Ｏｒｆ１７によるこの反応の触媒作用は、通常ＮＲＰＳの縮合ドメインに起因する一般的なペプチド結合形成活性と整合する。エーテル結合形成を介して３−（２−クロロ−３−ヒドロキシ−４−メトキシ−フェニル）−３−ヒドロキシ−プロパニル部分の芳香族環をエンジインコアに付着するために用いられるメカニズムは不明であるが、Ｃ５〜Ｃ６エポキシドの開環と同時に起こり、かつ／またはアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２エンジイン生合成クラスター内に含まれるＰ４５０またはモノオキシゲナーゼをコードするｏｒｆのうちの１つ以上に関連し得る。マヅロサミン部分は、Ｏ−グリコシド結合を介してエンジインコアと結合する。天然物生合成に関与する多様なグリコシルトランスフェラーゼとの配列類似性が高いｏｒｆ２９の遺伝子産物は、この伝達を触媒する。Ｏｒｆ２９は、Ｃ−１０２７エンジインコアのグリコシル化を触媒すると考えられているＣ−１０２７生合成経路からのＳｇｃＡ６と最も類似している（４３％の同一性、５７％の類似性）。（Ｌｉｕら，２００２）。最後に、タイプＩのＮＰＲＳ縮合ドメインであるＯｒｆ２０は、非リボソームペプチド生合成でのペプチド結合形成に似た反応において、Ｏｒｆ１６のホスホパテテインの腕からマヅロサミンのアミノ基にＨＤＢＡ部分を伝達する。
【００７２】
これをモデルとして用いることで、当業者は、他の多くの合成方式を設計し、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２発色団またはこの発色団の誘導体を産生することができる。
【００７３】
本発明は、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２発色団生合成成分を含む新規な生合成経路であって、上記アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２発色団の変異体が産生されるように１つ以上の成分が突然変異しているか、または異なるエンジイン発色団の生合成経路からの成分で置換もしくは付加されている経路を提供する。標準的な分子遺伝子工学を用いることで、先に示したような個々のｏｒｆまたはｏｒｆの組み合わせを操作して、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２発色団および／または色素タンパク質の新規な生物活性類似体を産生することができる。１つの好ましい実施形態では、新規な発色団は、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２アポタンパク質と同時発現する。他の実施形態では、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２発色団は、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２アポタンパク質の変異体と同時発現する。さらに他の実施形態では、新規な発色団は、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２アポタンパク質の変異体と同時発現する。
【００７４】
本発明の１つの実施形態では、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２におけるｏｒｆ１５の不活性化により、通常は当該分子のβ−チロシニル部分に見られるＯ−メチルが欠失した類似体が産生される。（例えば、図１０参照）この変化により、Ｏ−メチルの代わりにヒドロキシル基が残る（下記のＲ１参照）。ヒドロキシル基置換を行なう理由の１つは、標準的な合成化学技術による類似体のさらなる化学誘導体化のための化学的な手かがりとしてそれを用いることである。同様に、ｏｒｆ１９によりコードされたハロゲナーゼの不活性化によりＰＣＰ結合β−チロシンの塩素化を防ぎ、その結果、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９類似体からＣｌがなくなる（下記のＲ２参照）。下記のＲ３基は、通常、ＣＨ３であり、ｄＮＤＰ−Ｌ−キシロースの３位炭素をメチル化するｏｒｆ４０の産物の不活性化によりＨに変化させることができる。
【００７５】
【化７】
2008523817.tif 000011
アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２発色団のＲ４基は、
【００７６】
【化８】
2008523817.tif 000012
（Ｒ５と示す）、ここでＲ５は、アミド窒素で糖部分と連結する。ｏｒｆ３２の不活性化により、ＨＤＢＡ部分が欠失したエンジイン類似体が産生され（例えば、図１３、１７参照）、またはｏｒｆ２０の不活性化の結果、Ｒ５がＮＨ２により置換される。さらに、Ｒ４部分は修飾されてもよい。例えば、
【００７７】
【化９】
2008523817.tif 000013
（Ｒ６と示す）は、ｏｒｆ３３を不活性化することにより得られる。
【００７８】
他の実施形態では、ｏｒｆ３２は上述のように不活性化され、突然変異体を用いて、ＨＤＢＡ部分が他のアリール酸に置き換えられたアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２エンジイン類似体のライブラリーを作成する。アリール酸は、ｏｒｆ３２突然変異体に各種の天然アリール酸、Ｎ−アセチルシステアミン連結アリール酸、またはメチルチオグリコレート等、他のチオエステルキャリアと連結したアリール酸を発酵培養液に与えることにより導入される（例えば、Ｊａｃｏｂｓｅｎら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７，３６７−９参照）。アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２分子複合体への成分の添加に関与する各ｏｒｆを単独または他のｏｒｆと組み合わせて突然変異させて、生物学的テストのための大規模なアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２エンジイン類似体のライブラリーを作成することができる。
【００７９】
よって、本発明は、下記の式を有する化合物を提供する：
【００８０】
【化１０】
2008523817.tif 000014
ここで、Ｒ１はＯＨまたはＯＣＨ３であり；Ｒ２はＣｌまたはＨであり；Ｒ３はＣＨ３またはＨであり；Ｒ４はＮＨ２、Ｒ５、およびＲ６から選択される。さらに、特定の天然アリール酸、Ｎ−アセチルシステアミン連結アリール酸、またはメチルチオグリコレート等の他のチオエステルキャリアに連結したアリール酸を付加した発酵培養液内で突然変異体ｏｒｆ３２を培養することにより、エンジイン類似体を産生することができ、ここで、Ｒ４は、
【００８１】
【化１１】
2008523817.tif 000015
Ｒ７または
【００８２】
【化１２】
2008523817.tif 000016
Ｒ８であり、
ここで、Ｒ１’はＨ、ＣＨ３、ＯＨ、ＯＣＨ３、Ｃｌ、Ｃ３Ｈ７、またはＮＯ２であり；Ｒ２’はＨ、ＣＨ２、ＮＨ２、ＯＨ、Ｆ、ＯＣＨ３、Ｆ、Ｃｌ、ＮＯ２、ＯＣ２Ｈ５、またはＮＣ２Ｈ６であり；Ｒ３’はＨ、ＣＨ３、Ｃｌ、ＣＨ３、ＮＨ２、ＯＨ、Ｆ、ＣＯＨ、ＯＣＨ３、Ｃｌ、ＯＣ２Ｈ５、またはＮＯ２であり；Ｒ４’はＯＨまたはＯＣＨ３である。
【００８３】
他の実施形態では、異なる二次代謝経路からの１つ以上のｏｒｆをアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２に導入することができる。選択されたｏｒｆを、相同組み替えにより、または例えば、ファージのｉｎｔ／ａｔｔＰ機能（例えば、ｐＳＥＴ１５２または同様のベクター）により媒介された部位特異的組込により、宿主染色体に導入することができる。あるいは、選択されたｏｒｆを自己複製ベクター上に導入することができる。一旦発現すると、遺伝子産物は、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２発色団を修飾し続ける。例えば、Ｃ−１０２７生合成遺伝子クラスター由来のｓｇｃＡ、ｓｇｃＡ１、ｓｇｃＡ２、ｓｇｃＡ３、ｓｇｃＡ４、ｓｇｃＡ５およびｓｇｃＡ６を、１つ以上のマヅロサミン生合成ｏｒｆが不活性であるアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２株に導入し、マヅロサミンの代わりにＣ−１０２７デオキシアミノ糖またはその誘導体を含むアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２エンジイン類似体を産生することが可能である。
【００８４】
本発明はまた、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２の色素タンパク質生合成クラスターから他の二次代謝産物を産生する微生物に遺伝子を導入して、その生物により産生された同種の二次代謝産物を修飾することを可能にする。例えば、異なるエンジイン発色団（例えば、Ｃ−１０２７発色団）の類似体は、その発色団の生合成経路を発現する宿主であって、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２の色素タンパク質生合成経路から１つ以上の成分が置換または付加された宿主を提供することにより産生される。
【００８５】
アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２色素タンパク質の類似体を作る以外に、負の調節因子を不活性化し、正の調節因子の発現レベルまたは遺伝子コピー数を増加することにより発酵タイターを増加することもできる。アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２生合成クラスターは、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに含まれる配列との相同性に基づいて推定転写調節因子と同定された少なくとも８個のｏｒｆ（ｏｒｆ９、１０、４６、５０、５２、５５、６２および６３）を含む。これらの調節因子の機能を体系的にテストして、どの調節因子が正の調節因子であり、どれが負の調節因子であるかを特定することができる。それらの結果に基づいて、これらの遺伝子のうちの１つ以上を合理的に変形し、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２色素タンパク質の発酵タイターを増加することができる。
【００８６】
典型的には、有毒な二次代謝産物を産生する生物は、当該産生する生物に自己耐性を与える１つ以上の遺伝子を有する。これらの遺伝子の産物は、通常、有毒な代謝体を化学的に修飾、隔離または輸送することにより耐性を与える。いくつかの場合には、上記代謝体の標的は、本質的に、当該代謝体に対する感受性が低いか、または当該標的を修飾して当該代謝体に対する感受性を低くする。アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２生合成クラスターは、自己耐性に関与している可能性がある遺伝子産物を産生する少なくとも２つのｏｒｆを含む。アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２複合体のアポタンパク質成分をコードするｏｒｆ２３は、活性発色団を隔離することにより上記産生する生物のＤＮＡを発色団による開裂から保護することに関与していると思われる。ｏｒｆ２２の遺伝子産物は、多くの膜貫通排出タンパク質と同様のタンパク質をコードし、Ｃ−１０２７発色団−アポタンパク質複合体の排出ポンプとして作用すると考えられているＣ−１０２７生合成経路からのＳｇｃＢに最も類似する（Ｌｉｕら（２００５）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２９３−３０２）。ｏｒｆ２２およびｏｒｆ２３を用いることにより、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２色素タンパク質に潜在的に耐性を与えることができる。１つの実施形態では、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２生合成経路を異種発現するように選択された細胞にこれらのｏｒｆを導入することにより、その細胞が高度なアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２色素タンパク質を産生することを可能にする一方、その有毒作用に対する免疫を有するようにすることができる。他の実施形態では、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２の生体内転換のために選択されたドナー細胞にこれらのｏｒｆを導入することができる。そのような細胞は、それ以外の場合では、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２の極度の毒性により生体内転換が発生する前に殺傷される。
【００８７】
アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２生合成クラスター全体、または選択された部分は、細菌等の異種宿主中で発現することができる。有用な細菌の例としては、例えば、ストレプトミセス属、アクチノマヅラ属、Ｎｏｎｏｍｕｒｅａ属、ミクロモノスポラ属、エシェリキア属、およびシュードモナス属のメンバーが挙げられる。（例えば、Ｐｆｅｉｆｅｒら，２００１；Ｍａｒｔｉｎｅｚら，２００４参照）上記生合成クラスターはまた、酵母等の真核宿主中でも異種発現することができる。１つの実施形態では、上記アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２生合成クラスターは、高度な二次代謝産物の産生のためにすでに修飾された生物中で有利に発現されることにより、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２色素タンパク質の産生レベルを、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２を用いて通常達成することができるレベルよりも上げることができる。（例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら，２００３，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０，４８０−８参照）。他の実施形態では、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２色素タンパク質類似体の生成を促進するために、上記アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２生合成クラスターは、特に遺伝子操作を受けやすい生物中で有利に発現される（例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙら，２００２，Ｎａｔｕｒｅ  ４１７，１４１−７；Ｂｉｎｎｉｅら，１９９７，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５，３１５−２０参照）。
【００８８】
上記アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２色素タンパク質生合成経路の全てまたは一部をコードする組換えＤＮＡを伝達するために有用な各種方法が当該分野で公知である。種々の宿主においてそのようなＤＮＡを伝達および発現するために用いることができる広範な宿主域を有するプラスミドが入手可能である（例えば、ストレプトミセス用のｐＩＪ１０１（Ｋｉｅｓｅｒら，１９８２、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１８５：２２３−８）、アクチノミセス用のｐＪＲＤ２１５（Ｙｅｕｎｇら，１９９４，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：４１７３−６））。そのようなベクターを伝達するための方法には、共役、電気穿孔法およびプロトプラスト形質転換が含まれる。大腸菌中での複製および大腸菌からストレプトミセス等のグラム陽性細菌種への接合伝達が可能なシャトルベクターも用いることができる（例えば、Ｍａｚｏｄｉｅｒら，１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：３５８３−５；Ｋｉｅｓｅｒら，２０００，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．Ｊｏｈｎ  Ｉｉｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）。
【００８９】
色素タンパク質を含む医薬組成物であって、当該色素タンパク質が本発明のアポタンパク質および発色団の複合体を含み、好ましくは、当該発色団がアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２により産生される医薬組成物を調整することが望ましい場合がある。好ましくは、上記ポリペプチドは、非共有結合により発色団に付着する。一般に、医薬組成物の調整には、本質的にピロゲンおよびヒトまたは動物に有害な任意の他の不純物を有さない医薬組成物の調整を伴う。適切なバッファを用いて複合体を安定にし、標的細胞による取り込みを許容することも望ましい場合がある。
【００９０】
本発明の水性組成物は、医薬的に許容可能なキャリアまたは水培地中でさらに分散した上記色素タンパク質を有効量含む。このような組成物は植菌とも呼ばれる。「医薬的または薬理学的に許容可能」という文言は、動物またはヒトに適切に投与した際に、副作用、アレルギーまたは他の有害反応を生じない組成物を指す。
【００９１】
本明細書中において用いる「医薬的に許容可能なキャリア」は、任意および全ての溶剤、分散培地、被覆剤、抗菌および抗真菌剤、等張剤、ならびに吸収遅延剤等を含む。医薬活性物質に対するそのような培地および薬剤の使用は当該分野で周知である。任意の従来の培地または薬剤が上記色素タンパク質に適さない場合を除いて、治療用組成物にいてそれを用いることが企図される。抗菌または抗腫瘍薬剤を含む補助的な活性成分も上記組成物に組み込んでもよい。
【００９２】
本発明の１つの実施形態では、本発明の発色団は、細胞により、例えば、飲作用によって取り込まれる。他の実施形態では、上記発色団は、特定の細胞または細胞タイプの標的となるように修飾される。そのような１つの実施形態では、色素タンパク質を、モノクローナル抗体または他のタンパク性キャリアを標的構成単位として用いるポリマーまたは複合体の形態で、標的組織に届けてもよい。各種のポリマー系および抗体複合体送達システムが公知であり、自然発生的なＣ−１０２７エンジインを伴う化学療法方針において現在利用されている。本発明では、上記色素タンパク質を、例えば、科学的に修飾して、治療、特には、化学療法に有用なポリ（スチレン−ｃｏ−マレイン酸）−接合色素タンパク質を形成してもよい。（例えば、ＭａｅｄａおよびＫｏｎｎｏ，１９９７，Ｎｅｏｃａｒｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ：ｔｈｅ  Ｐａｓｔ，Ｐｒｅｓｅｎｔ，ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ，Ｈ．Ｍａｅｄａ，Ｋ．Ｅｄｏ，Ｎ．Ｉｓｈｉｄａ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２２７−２６７参照）。
【００９３】
疎水性および親水性セグメントの両方を含むポリマーミセルは、化学療法薬剤の治療指数を増大するために最近開発された新たな薬物送達システムである（Ｙｏｋｏｙａｍａら，１９９０，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：１６９３−７００；Ｋａｂａｎｏｖら，１９８９，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２５８：３４３−５）。ミセルの大きさを調節して浸透性および保持（ＥＰＦ）効果を向上させることで、ミセル粒子が正常な組織においてよりも腫瘍組織においてより血管に浸透できるようにすることができる（Ｍａｅｄａ，２００１，Ａｄｖ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇｕｌ．４１：１８９−２０７）。これにより、腫瘍組織における薬物分布を有利なものにすることができるため、インビボでの有効性が増大すると期待される。上記２１Ｇ７９２色素タンパク質をブロック共重合体溶液と混合することにより、特別に設計されたミセルに非共有結合的に組み込むことができる。結果得られた薬物の代謝的安定性を有意に増大させることができ（Ｙｏｋｏｙａｍａら，１９９１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：３２２９−３６）、これは、癌化学療法における２１Ｇ７９２色素タンパク質の送達に潜在的に有利である。
【００９４】
上記色素タンパク質（すなわち、アポタンパク質または発色団）は、細胞または病原体への送達のために、化学的リンカーまたは他の関連する方法を用いて、タンパク質に接合することができる。２１Ｇ７９２色素タンパク質中の発色団をアジ化ナトリウムおよび第２級アミンと反応させて一連の誘導体を生じている。これらの誘導体は、Ｃ−５に、天然の発色団中のヒドロキシル基と置き換わるアジドまたは第２級アミノ基を含む。一方の末端にアミノ基を有し、他端にカルボキシル基を有するリンカーを用いてモノクローナル抗体および発色団を接続し、標的薬物の送達のための発色団−抗体複合体を形成することができる。上記Ｃ−５ヒドロキシル基と置き換わるリンカーのアミノ基は、腫瘍組織においてより酸性度が高い条件下で上記複合体を加水分解して発色団に戻すように設計される。例示的な連結を図３０に示す。
【００９５】
また、上記色素タンパク質をモノクローナル抗体と接合して、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）−色素タンパク質複合体を形成してもよい。抗原に対して高い親和性を有し、好ましくは悪性細胞の表面の抗原決定基に対する特異性を有するする抗体は、標的部分として自然な選択である。抗体により媒介される色素タンパク質の腫瘍細胞への特異的送達は、それらの抗腫瘍効果を単に増大させるだけでなく、正常な組織による標的以外の取り込みを防ぐことにより、治療指数を増大させることが期待される。本発明において用いられ得るそのような抗体キャリアの例としては、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、それらの生物学的に活性な断片、およびそれらの遺伝子または酵素が操作された対応物が挙げられる。好ましくは、そのような抗体は、癌等の増殖性疾患における標的細胞および／または組織上で発現された細胞表面抗原に向けられる。抗ＣＤ３３モノクローナル抗体は、このアプローチに有用なＭａｂの例示であり、急性骨髄性白血病の患者の状況を含む様々な状況において、色素タンパク質を癌性組織に到達させ得る。（例えば、Ｓｉｅｖｅｒｓら，１９９９，Ｂｌｏｏｄ  ９３，３６７８−８４参照）有用なモノクローナル抗体複合体の他の例としては、例えば、抗ＣＤ２２モノクローナルタンパク質がＢ細胞リンパ腫を標的とする送達のためにエンジインと接合されるＰＣＴ公報ＷＯ０３／０２９６２３に記載のものが挙げられる。前述したように、いくつかのＭＡｂ−Ｃ−１０２７複合体は、有望な抗癌剤として評価段階にある。（Ｂｒｕｋｎｅｒ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ＆Ｍｅｔ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ  ２，３４４）。抗体キャリア以外の他のタンパク性キャリアは、ホルモン、成長因子、抗体の模倣体、およびそれらの遺伝子または酵素が操作された対応物を含み、以下において単独でまたはまとめて「キャリア」と呼ぶ。キャリアの本質的特性は、その不要な細胞に関連する抗原または受容体を認識して結合した後に内在化する能力である。本発明に適用可能なキャリアの例としては、本明細書中においてその全てを参考として援用する米国特許第５，０５３，３９４号に開示されるものが挙げられる。本発明での使用が好ましいキャリアは、抗体および抗体の模倣体である。
【００９６】
多数の非免疫グロブリンタンパク質の骨組みが、抗体の特異性を有する抗原エピトープに結合する抗体の模倣体を生成するために用いられている。（ＰＣＴ公報ＷＯ００／３４７８４）。例えば、免疫グロブリン群に関連する「ミニボディ」骨組みが、３つのβ鎖をモノクローナル抗体の重鎖可変ドメインから取り除くことにより設計されている（Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏら，１９９４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．７：９−２４）。このタンパク質は６１個の残基を含み、２つの超可変ループを提示するために用いることができる。これら２つのループはランダム化され、抗原結合のために選ばれた産物であるが、今までのところ、この枠組みは、溶解性の問題のため実用性が幾分限られていると思われる。ループを表示するために用いられる他の枠組みは、テンダミスタット（哺乳動物のα−アミラーゼを特異的に阻害し、２つのジスルフィド結合により、７４残基６鎖ベータシートサンドイッチをまとめて保持したタンパク質）である（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌおよびＨｏｅｓｓ，１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５０：４６０−７０）。この骨組みは、３つのループを含むが、ランダム化の可能性に関しては、現在まで、それらのループのうちの２つについてしか検査していない。
【００９７】
他のタンパク質を枠組みとしてテストし、αへリックス表面上のランダム化した残基（Ｎｏｒｄら，１９９７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５，１１２−１；Ｎｏｒｄら，１９９５，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８，６０１−８）、アルファイルへリックス束内のαへリックス間のループ（ＫｕおよびＳｃｈｕｌｔｚ，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２，６５５２−６）、および小型のプロテアーゼ阻害剤等のジスルフィド架橋により拘束されたループ（Ｍａｒｋｌａｎｄら，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５，８０４５−５７；Ｍａｒｋｌａｎｄら，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５，８０５８−６７；ＲｏｔｔｇｅｎおよびＣｏｌｌｉｎｓ，１９９５，Ｇｅｎｅ  １６４，２４３−５０；Ｗａｎｇら，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１２２５０−６）を表示するために用いられている。
【００９８】
標的分子および色素タンパク質は、化学的架橋によってまたは組換えＤＮＡ技術の適用等による遺伝子融合を介して共有結合的に関連づけられてもよい。後者のアプローチでは、アポタンパク質は、そのＣ末端またはＮ末端を、細胞を標的とするタンパク質分子のＮ末端またはＣ末端に融合させてもよい。細胞を標的とする分子が抗体である場合、アポタンパク質のＣ末端は、当該抗体の軽鎖および／または重鎖のＮ末端と融合させることが好ましい。化学的架橋のために、いくつかの共通タンパク質−抗体リンカーは、こはく酸エステルと他のジカルボン酸、グルタルアルデヒドと他のジアルデヒドである。そのようなリンカーは他にも当該分野で周知である。
【００９９】
治療用組成物の溶液を界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合した水で調製してもよい。また、分散物をグリセロール、ポリエチレングリコール液、それらの混合物、およびオイルで調製してもよい。通常の保存および使用条件下では、これらの調製物は、微生物の成長を防ぐために防腐剤を含む。
【０１００】
本発明の治療用組成物は、溶液または懸濁液のいずれかの注入可能な組成形態で有利に投与される；また、注入の前に液体で溶解または懸濁するために適した固形を調製してもよい。これらの調製物はまた乳化してもよい。このような目的のための典型的な組成物は、医薬的に許容可能なキャリアを含む。例えば、この組成物は、リン酸塩緩衝食塩水１ミリリットルにつき、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇまたは最大で約１００ｍｇのヒト  血清アルブミンを含んでもよい。他の医薬的に許容可能なキャリアは、水性溶液、塩を含む非毒性賦形剤、防腐剤、緩衝剤等を含む。
【０１０１】
非水性溶剤の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物性油脂、およびオレイン酸エチル等の注入可能な有機エステルがある。水性キャリアは、水、アルコール／水性溶液、食塩水、ナトリウム塩化物等の非経口剤、リンゲルデキストロース等を含む。静脈内投与剤は、流体および栄養補充剤を含む。防腐剤は、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤および不活性ガスを含む。上記医薬組成物の各種成分のｐＨおよび正確な濃度は、周知のパラメータに応じて調節される。
【０１０２】
経口投与にはさらなる製剤が適切である。経口製剤は、例えば、医薬品グレードのマン二トール、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム等の典型的な賦形剤を含む。上記組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤または粉末の形態を取る。ルートが局所的である場合、上記形態はクリーム、軟膏、油薬またはスプレーであってもよい。
【０１０３】
本発明の治療用組成物は、伝統的な医薬調製物を含んでもよい。本発明に従った治療用組成物の投与は、そのルートが標的組織にとって有効である限り、任意の一般的ルートを介して行なわれる。これは、経口投与、経鼻投与、口腔投与、直腸投与、膣内投与または局所投与を含む。局所投与は、化学療法により誘発された脱毛症または他の皮膚過剰増殖性疾患を防ぐ皮膚癌の治療に特に有利である。あるいは、投与は、同所性、皮内、皮下、筋内、腹腔内または静脈注射である。このような組成物は、通常、生理学的に許容可能キャリア、緩衝剤または他の賦形剤を含む医薬的に許容可能な組成物として投与される。肺疾患の治療については、上記好ましいルートは、エアロゾールによる肺への送達である。エアロゾールの量は、約０．０１ｍｌと０．５ｍｌの間である。同様に、結腸関連の疾患の治療に好ましい方法は浣腸である。浣腸の量は、約１ｍｌと１００ｍｌの間である。
【０１０４】
上記治療用組成物の有効量は、意図する目的に基づいて決定される。「単位用量」または「投与量」という用語は、被検者における使用に適した物理的に個別の単位を意味し、各単位は、その投与、すなわち、適切なルートおよび治療計画に関して上述したような所望の応答を生じるように算出された所定量の治療用組成物を含む。治療回数および単位用量の両方に応じた投与量は、保護が所望されるものに依存する。
【０１０５】
また、上記治療用組成物の正確な量も施術者の判断に依存し、各個人に特有のものである。用量に影響する要因は、患者の物理的および臨床状態、投与ルート、意図する治療の目的（症状の緩和対治癒）ならびに特定の治療用物質の効力、安定度および毒性を含む。
【実施例】
【０１０６】
当業者は本明細書中において開示する本発明の原理に改変を行なうことが可能であることが理解および予期されるとともに、そのような修正が本発明の範囲内含まれるものであることが企図される。
【０１０７】
以下に示す本発明の実施例は、本発明をさらに例示するものであり、あらゆる点においても本発明を限定するものとして解釈されるものではない。
【０１０８】
（色素タンパク質およびアポタンパク質の単離および特徴付け）
（実施例１  アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２色素タンパク質の単離および精製）
アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２を、ＡＴＣＣ培地１７２（デキストロース１％、可溶性でんぷん２％、酵母エキス０．５％、およびＮ−ＺアミンタイプＡ０．５％、ＣａＣＯ３０．１％  ｐＨ７．３）において７２時間成長させた細胞から調製された冷凍全細胞（冷凍栄養菌糸、ＦＶＭ）として保存した。グリセロールを２０％添加し、上記細胞を−１５０℃で冷凍した。
【０１０９】
ｐＨが６．９の種培地（１．０％デキストロース；２．０％可溶性でんぷん；０．５％酵母エキス；０．５％Ｎ−ＺアミンタイプＡ（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ）；および０．１％ＣａＣＯ３を含む）を調製した。２５ｍｍ×１５０ｍｍのガラス培養試験管、７ｍｌの種培地および２つのガラスビーズに、ＡＴＣＣ寒天培地＃１７２（ＡＴＣＣ  Ｍｅｄｉａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８４）上で培養したアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２の細胞を植菌した。寒天培養培地からの十分な接種材料を用いて、７２時間成長させた後に混濁種を得た。２インチ長のジャイロロータリーシェイカーを用いて、第１種試験管を、２８℃、２５０ｒｐｍで７２時間インキュベートした。次いで、第１種（〜１４％接種材料）を用いて、５０ｍｌの培地＃１７２を含む２５０ｍｌ三角フラスコに植菌した。ジャイロロータリーシェイカー（２”ストローク）を用いて、これら第２種フラスコを、２８℃、２５０ｒｐｍで４８時間インキュベートした。
【０１１０】
ｐＨが６．９の発酵産生培地（２．０％サッカロース；０．５％糖蜜；０．５％ＣａＣＯ３；０．２％ペプトン；０．００２％硫酸マグネシウム−７Ｈ２Ｏ；０．００１％硫酸鉄−７Ｈ２０；０．０５％臭化ナトリウム；および０．２％酢酸ナトリウムを含む）を調製した。６０個の２５０ｍｌ三角フラスコをそれぞれ５０ｍｌの発酵産生培地を用いて調製し、２ｍｌ（４．０％）の第２種発酵培地を用いて植菌し、ジャイロロータリーシェイカー（２”ストローク）を用いて、２８℃、２５０ｒｐｍでインキュベートした。次いで、記載したような発酵をおよそ７２〜９６時間続けて、さらなる処理のために回収した。
【０１１１】
一体化した全培養液（６０×５０ｍｌ）を、３８００ｒｐｍで３０分間遠心分離機にかけた。次いで、上澄み液を凍結乾燥し、残留粉末を少量（例えば、３００ｍｌ）のＨ２Ｏで懸濁した。次いで、その褐色の溶液を、遠心分離時に暗所で４℃のＨ２Ｏに６ＬのセファデックスＧ７５を含むガラスカラムに入れた。４０ｍｌの画分を各々集めて、生化学誘導アッセイ（ＢＩＡ）でテストした。次いで、最も濃い画分を組み合わせて（１５画分、全部で６００ｍｌ）、凍結乾燥した。次いで、その灰色の粉末をＨ２Ｏ（４ｍｌ）で溶かし、ＨＰＬＣによって、一方がアポタンパク質に対応し、他方が色素タンパク質に対応する２つの主要なピークに分解した。
【０１１２】
上記溶液を、ＴｏｓｏＨａａｓ  ＤＥＡＥ  ５ＰＷカラム（粒径１３ｕｍ、大きさ２１．５ｍｍ×１５ｃｍ）上で、４ｍｌ／分の流量の緩衝系（３０分間一定の０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌを用いた０〜０．５Ｍの直線勾配ＮａＣｌ）を用いて調製ＨＰＬＣクロマトグラフィにかけた。アポタンパク質および色素タンパク質のそれぞれのピークを集め、Ｐｉｅｒｃｅ社の透析用カセット（７０００ＭＷＣＯ）を用いて脱塩し、凍結乾燥した。次いで、結果得られたアポタンパク質および色素タンパク質の粉末を同じ調製ＨＰＬＣ条件で再純化、脱塩、および凍結乾燥した。色素タンパク質（灰色の粉末、１０．５ｍｇ）およびアポタンパク質（白色の粉末、１９．８ｍｇ）の最終産物を分析ＨＰＬＣにより分析した（それぞれ図１および図３）。色素タンパク質およびアポタンパク質の紫外線吸収（ＵＶ）スペクトルを図２および図４に示す。
【０１１３】
アポタンパク質の分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより１２．９２４０９ｋＤａと判定された。ＭＡＬＤＩスベクトルを図５に示す。
【０１１４】
（実施例２  アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２アポタンパク質のＤＮＡ単離および配列決定）
Ｈｏｐｗｏｏｄら（１９８５），Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｎｏｒｗｉｃｈ：  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎに記載の手順を変更して、ゲノムＤＮＡをアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２から単離した。１０ｍｌのＭＹＭ培地（４ｇ／ｌマルトース、４ｇ／ｌ酵母エキス、１０ｇ／ｌ麦芽エキス、ｐＨ７．０）および２〜６ｍｍガラスビーズを含む２５ｍｍ×１５０ｍｍの種試験管に、およそ１ｍｌの冷凍ミセリアグリセロールストックを植菌した。この培養物を２８℃、２００ｒｐｍで５日間培養した。次いで、これらの細胞を３０００ｘｇで１０分間遠心分離によりぺレット化した。この上澄み液を捨てて、ペレットを５ｍｇ／ｍｌリゾチームおよび０．１ｍｇ／ｍｌリボヌクレアーゼを含む３００μｌのＴ５０−Ｅ２０（Ｔｒｉｓ５０ｍＭ−ＥＤＴＡ−２０ｍＭ）で懸濁し、３７℃で１時間、１５分毎に軽く混ぜながらインキュベートした。次いで、５０μｌの１０％ＳＤＳを加え、その試料を完全に混合した。次に、８５μｌの５ｍＭ  ＮａＣｌを加え、その試料を再度完全に混合した。次いで、この試料を、４００μｌフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（５０／４９／１）を用いて抽出した。試料を完全にボルテックスした後、１０，０００ｘｇで２０分間室温で遠心分離機にかけた。遠心分離に続いて、水相を除去し、新たな微小遠心管に入れた。等容積の室温イソプロパノールを試料に加え、反転により完全に混合した。この試料を室温で５分間放置した。次いで、この試料を１２，０００ｘｇで３０分間４℃で遠心分離機にかけた。イソプロパノールを試験管から丁寧に注ぎ出し、ＤＮＡペレットを１ｍｌの低温７０％エタノールですすいだ。氷上に５分間放置した後、その７０％エタノールを試験管から注ぎ出し、ＤＮＡを１０分間空気乾燥させた。ＤＮＡを０．３ｍｌの滅菌水に溶かした。ＤＮＡの完全性および濃度をアガロースゲル電気泳動で評価した。
【０１１５】
大腸菌；プラスミドおよび小規模コスミドＤＮＡ調製：Ｑｉａｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  ＭｉｎｉＰｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を製造者仕様書に従って用いてプラスミドＤＮＡおよび小規模コスミドＤＮＡ調製を行なった。コスミド：Ｑｉａｇｅｎ  Ｌａｒｇｅ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を製造者の仕様書に従って用いてコスミドＤＮＡを単離した。
【０１１６】
ｐＷＥＢ  Ｃｏｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を製造者仕様書に従って用いてアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２ゲノムライブラリーを構築した。一般的なライブラリー構築手順は以下の通りである。１０μｇのゲノムＤＮＡをＨａｍｉｌｔｏｎ  ＨＰＬＣ／ＧＣ注射器に通して、３０〜４５ｋｂの断片にランダムに分断した。分断に続いて、上記キットに含まれる末端処理酵素混合液を用いて、断片化したＤＮＡの末端を処理し、末端が平滑な断片を作った。次いで、直鎖Ｔ７  ＤＮＡ（〜４０Ｋｂ）を用いて１％低融点アガロースゲルで、分子量マーカーとして機能するように、分断および末端処理したＤＮＡを分離した。このＴ７  ＤＮＡとほぼ大きさが等しいゲノムＤＮＡをゲルから切り取り、そのＤＮＡをアガロースから溶離した。次いで、その精製したＤＮＡをｐＷＥＢベクターに連結した。連結に続いて、ｐＷＥＢコスミドクローニングキットに同梱されるＭａｘＰｌａｘ  Ｌａｍｂｄａ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｓを用いて、その連結挿入ＤＮＡをラムダファージ粒子に詰めた。次いで、このファージエキスのタイター測定を行ない、１ミリリッター毎のコロニー形成単位を判定した。ファージエキスのタイター判定時に、適量のエキスを用いて宿主細胞に大腸菌ＥＰＩ１００を感染させ、その感染した細胞を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＤｉｆｃｏ  Ｌｕｒｉａ寒天プレートに載せて、１プレートにつきおよそ２００コロニーの細胞密度を得た。
【０１１７】
ライブラリースクリーニング方針および方法；ｄＮＤＰ−グルコース−４，６−デヒドラターゼプローブの生成。一般に、特定の抗生物質産生する必要がある遺伝子は、産生生物のゲノムでクラスター化される。さらに、アポタンパク質遺伝子を対応する発色団の生合成経路に含まれるタンパク質をコードする遺伝子でクラスタ化する必要がある（Ｌｉｕら，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：１１７０−３）。アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２により産生された発色団は、エンジインコアに付着するアミノ糖４−アミノ−４−デオキシ−３−Ｃ−メチル−β−リボピラノースを含む。ｄＮＤＰ−Ｄ−グルコース−４，６−デヒドラターゼ（ＤＨ）は、この糖の生合成の一工程を触媒すると予期されるため、ＤＨプローブを用いて生合成クラスターを単離した。
【０１１８】
ＤＨプローブを生成するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２のゲノムＤＮＡ由来のＤＨ遺伝子断片を増幅した。予想される〜５００ｂｐのＤＨ遺伝子断片（デヒドラ１：５’−ＣＳＧＧＳＧＳＳＧＣＳＧＧＳＴＴＣＡＴＳＧＧ（配列番号１５２）およびデヒドラ２：５’−ＧＧＧＷＲＣＴＧＧＹＲＳＧＧＳＣＣＧＴＡＧＴＴＧ（配列番号１５３））のためのプライマーは、Ｄｅｃｋｅｒら，１９９６，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１４１，１９５−２０１に記載のものと同一であった。ＪｕｍｐＳｔａｒｔ  ＲＥＤＴａｑ  Ｒｅａｄｙ  Ｍｉｘ  ＰＣＲ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を製造者の仕様書に従って用いてＰＣＲを実施した。これらのプライマーは、０．５μＭの最終濃度で用いた。ＰＣＲは、Ｂｉｏｍｅｔｒａ  Ｔ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒで行なった。開始変性温度は、４分間９６℃であった。その後の３０サイクルは次の通りであった：変性温度９６℃（４５秒）、アニーリング温度６６℃（４５秒）、延伸温度７２℃（３分）。最後に、最終延伸温度は１０分間７２℃であった。
【０１１９】
ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造者が推奨するとおりに用いて、〜５００ｂｐの単位複製配列をｐＣＲ２．１にクローン化した。クローニング反応物の一部（２．５μｌ）を用いて大腸菌ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を変換し、その後、組換えクローンのブルー／ホワイトスクリーニングを容易にするために、それらを５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、４０μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ、および０．２ｍＭのＩＰＴＧを含むＤｉｆｃｏ  Ｌｕｒｉａ  Ａｇａｒ上に置いた。２０個のホワイトコロニーを採取して、それらのプラスミドＤＮＡを単離した。これらのクローンの配列決定により、２つの異なるＤＨ遺伝子断片がクローン化されたことが明らかになった。推定されるアミノ酸配列のの比較により、１つのＤＨ断片（プラスミドｐ３４５９８に含まれる）がカリケアマイシン生合成に関与するＤＨに最も類似していることが明らかになった。カリケアマイシン構造は２つのアミノ糖を含むため、ｐ３４５９８に含まれるＤＨ断片もアミノ糖の産生に関与している可能性があり、そのため、色素タンパク質遺伝子クラスターのプローブとして選ばれたと予測した。
【０１２０】
コロニーハイブリダイゼーション：ｐ３４５９８ＤＨ断片を用いたコロニーハイブリダイゼーションで、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２ゲノムライブラリーをスクリーニングした。ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（３ｒｄ  ｅｄ．）記載されるように、組換えコロニーＤＮＡをＮｙｔｒａｎ  ＳｕＰｅｒＣｈａｒｇｅナイロン膜ディスク（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）に移した。ＰＣＲおよびプライマー（デヒドラ１およびデヒドラ２）を用いてｐ３４５９８の挿入部分を増幅してＤＨプローブを調製した。この増幅されたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、５３０ｂｐ断片をアガロースから単離した。次いで、Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇキットを製造者の仕様書（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に従って用いて、この断片を［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で標識した。ＤＮＡ試料が固定されたナイロン膜を６Ｘ  ＳＳＣで洗浄し、次いで、予め温めた（６５℃）プリハイブリダイゼーション溶液（６Ｘ  ＳＳＣ／５Ｘデンハート試薬／０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤおよび１００μｇ／ｍｌの変性分断ニシン精子ＤＮＡ）を入れたハイブリダイゼーションボトルに入れ、２時間「プレハイブリダイズ」した。次いで、変性プローブを加え、６５℃で一晩ハイブリダイゼーションを続けた。翌日、上記膜を、一度、予め温めた（６５℃）２Ｘ  ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（洗浄液１）を用いて１時間洗浄し、さらに、もう一度、予め温めた（６５℃）１Ｘ  ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（洗浄液２）を用いて１時間洗浄した。次いで、このナイロン膜をサランラップに包み、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−ｏｍａｔ  ＡＲ  フィルムに４時間露光した。この露光したフィルムを、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−ｏｍａｔ  ２０００Ａプロセッサーを用いて現像した。２２個のコロニーがプローブにハイブリダイズしたことが分かった。これらのコロニーを採取して、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＤｉｆｃｏ  Ｌｕｒｉａ培養液で培養した。この培養物からコスミドＤＮＡを精製し、Ｎｏｔ  Ｉで切断した。制限消化物をアガロースゲル電気泳動により分離し、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅ１１（２００１）に記載されるように、ＤＮＡをＮｙｔｒａｎ  ＳｕＰｅｒＣｈａｒｇｅナイロン膜に移した。コロニーハイブリダイゼーションで用いた条件と同じ条件で、ｐ３４５９８挿入部分を再度プローブとして用いてこの膜を調べた。９個のコスミドがプローブに確実にハイブリダイズした。このプローブとハイブリダイズしたコスミドおよび適切な大きさの断片は次の通りであった：２１ｇＢ：１５〜２０ｋｂ，２１ｇＣ：１５〜２０ｋｂ，２１ｇＤ：８〜１２ｋｂ，２１ｇＦ：１５〜２０ｋｂ，２１ｇＧ：３〜４ｋｂ，２１ｇＩ：１．２〜２．５ｋｂ，２１ｇＫ：１５〜２０ｋｂ，２１ｇＬ：２．５〜３ｋｂ，２１ｇＶ：２〜２．５ｋｂ。
【０１２１】
アポタンパク質特異的オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション：エドマンタンパク質配列決定法を用いて、アポタンパク質の最初の３８個のアミノ酸残基（Ｎ末端ＤＴＶＴＶＮＹＤＤＶＧＹＰＳＤＩＡＶＴＩＤＡＰＡＴＡＧＶＧＤＴＡＴＦＥＶＳＶ（配列番号１５４））を決定した。どのコスミドがアポタンパク質遺伝子配列を含むのかを確実に特定するために、アポタンパク質Ｎ末端の３８個のアミノ酸（ａａ）配列の４〜１２番目の残基に基づく変質オリゴヌクレオチドをプローブとして用いてハイブリダイゼーション実験を行なった。詳細には、このオリゴヌクレオチドの配列は、５’−ＡＣＳＧＴＳＡＡＣＴＡＣＧＡＣＧＡＣＧＴＳＧＧＮＴＡＣ（配列番号１５５）であった。
【０１２２】
ＤＨプローブにハイブリダイズしたコスミドをＮｏｔ  Ｉで消化し、Ｎｙｔｒａｎ  ＳｕＰｅｒＣｈａｒｇｅナイロン膜に移した。ＫｉｎａｓｅＭａｘ  ５’Ｅｎｄ−Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔを製造者（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）の推奨するとおりに用いて、このオリゴヌクレオチドの末端を［γ−３２Ｐ］ｄＡＴＰ（６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で標識した。製造者の使用説明書（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）に従ってＮｕｃＡｗａｙ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｋｉｔを用いて、組み込まれなかった放射性ヌクレオチドを除去した。６Ｘ  ＳＳＣ、５Ｘデンハート試薬、０．０５％ピロリン酸ナトリウム、０．５％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌの分断変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液内で、ＤＮＡを載せたナイロン膜を３時間５０℃で「プレハイブリダイズ」した。この工程に続いて、プレハイブリダイゼーション溶液を、６Ｘ  ＳＳＣ、０．５％リン酸ナトリウム、１Ｘデンハート試薬、および１００μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡを含む７ｍｌの予め温めた（５０℃）ハイブリダイゼーション溶液と取り替えた。この溶液に上記標識したプローブを加え、ハイブリダイゼーション液を５０℃で２２時間インキュベートした。次に、そのハイブリダイゼーション溶液を捨て、上記膜を２０ｍｌの室温ＴＭＡＣＬ洗浄緩衝剤（３Ｍ  ＴＭＡＣＬ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．２％ＳＤＳ）で軽くすすいだ。次いで、さらに５０ｍｌの予め温めた（６７℃）ＴＭＡＣＬ洗浄緩衝剤を用いて５５分間６７℃で洗浄した。仕上げの洗浄として、５０ｍｌの予め温めた（５０℃）洗浄液１を用いて１０分間５０℃で上記膜を洗浄した。次いで、この膜をサランラップに包み、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−ｏｍａｔ  ＡＲフィルムに２４時間露光した。
【０１２３】
コスミド２１ｇＤ、２１ｇＧおよび２１ｇＫがプローブにハイブリダイズした。２１ｇＤおよび２１ｇＫのＤＮＡを含むレーンで〜４．５ｋｂの信号を観察する一方、２１ｇＧのＤＮＡを含むレーンで、〜５．２ｋｂの信号を観察した。このハイブリダイゼーションの結果を確認するために、２１ｇＤコスミドＤＮＡをアポタンパク質の９８ｂｐ断片を増幅するように設計されたテンプレートおよび変質ＰＣＲプライマーとして用いて、ＰＣＲを行なった。ＰＣＲプライマーＣＰ−ＦＷＤ３（５’−ＡＣＳＧＴＳＡＡＹＴＡＹＧＡＹＧＡＹＧＴ；配列番号１５６）およびＣＰ−ＲＥＶ４（５’−ＡＣＹＴＣＲＡＡＳＧＴＳＧＣＳＧＴＲＴＣ；配列番号１５７）は、アポタンパク質の３６ａａ配列から推定された逆方向翻訳ＤＮＡ配列を用いて設計されている。ＪｕｍｐＳｔａｒｔ  ＲＥＤＴａｑ  Ｒｅａｄｙ  Ｍｉｘ  ＰＣＲ  ＲｅａｃｔｉｏｎＭｉｘ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を製造者の仕様書に従って用いてＰＣＲを行なった。これらのプライマーは２．０μＭの最終濃度で用いた。ＰＣＲは、Ｂｉｏｍｅｔｒａ  Ｔｇｒａｄｉｅｎｔ  ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒで行なった。開始変性温度は、４分間９６℃であった。その次の５サイクルは次の通りであった：変性温度９６℃（４５秒）、アニーリング温度４０℃（４５秒）、延伸温度７２℃（２分）。その後の３０サイクルは次の通りであった：変性温度９６℃（３０秒）、アニーリング温度５５．７〜７２．０℃（４５秒；範囲内で８つの温度をテストした）、延伸温度７２℃（２分）。最後に、最終延伸温度は１０分間７２℃であった。これらの条件でいくつかのバンドが生成されたが、５５．７℃、５８．６℃および６１．４℃のアニーリング温度を用いた場合、およそ１００ｂｐの強いバンドが生成された。ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造者が推奨するとおりに用いて、〜１００ｂｐの単位複製配列をｐＣＲ２．１にクローン化した。クローニング反応物の一部（２．５μＬ）を用いて大腸菌ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を変換し、その後、組換えクローンのブルー／ホワイトスクリーニングを容易にするために、それらを５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、４０μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ、および０．２ｍＭのＩＰＴＧを含むＤｉｆｃｏ  Ｌｕｒｉａ  Ａｇａｒ上に置いた。１０個のホワイトコロニーを採取して、それらのプラスミドＤＮＡを単離した。これらのクローンの配列決定により、４個のクローン（ｐ３５５４６、ｐ３５５４７、ｐ３５５５０、ｐ３５５５４）が、推定されるアミノ酸配列が３６ａａアポタンパク質断片の配列と正確に一致するＤＮＡに含まれていることが明らかになり、これにより、アポタンパク質をコードする遺伝子がコスミド２１ｇＤに含まれていることが確認された。
【０１２４】
コスミド２１ｇＤにおける完全なアポタンパク質ＤＮＡ配列の解明。アポタンパク質をコードする遺伝子の全配列を決定するために、先に増幅した９８ｂｐのＰＣＲ産物のＤＮＡ配列から配列決定プライマーを設計した。コスミド２１ｇＤをテンプレートとて用いる初回の配列決定には次のプライマーを用いた：ＡｐｏＳｅｑＣｏｄｅ１：５’−ＧＧＣＴＡＣＣＣＧＴＣＧＧＡＣＡＴＣＧ（配列番号１５８）；ＡｐｏＳｅｑＣｏｄｅ２：５’−ＧＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＡＣＣＡＴＣＧ（配列番号１５９）；ＡｐｏＳｅｑＣｏｍｐ１：５’−ＣＣＧＧＣＧＣＧＴＣＧＡＴＧＧＴＣＡＣ（配列番号１６０）；ＡｐｏＳｅｑＣｏｍｐ２：５’−ＣＴＣＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＴＣ（配列番号１６１）。
【０１２５】
１回目の配列決定では、〜１４４０ｂｐの配列を生成した。コドン選択プログラムを用いて、小さな４９８ｂｐ読み取り枠（ＯＲＦ）を同定した。このｏｒｆの推定されたアミノ酸配列と、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２アポタンパク質の部分アミノ酸配列（エドマンタンパク質配列決定法により決定）とを比較し、これら２つのアミノ酸配列が同一であったため、このＯＲＦがアポタンパク質をコードすることが確認された。さらに、推定されたアミノ酸配列の分子量１２９２６Ｄａは、高解像度ＭＡＬＤＩ  ＭＳにより決定されたアポタンパク質の分子量１２９２４．０９とうまく一致していた。また、アポタンパク質のＤＮＡ配列を、さらに、アポタンパク質をコードするｏｒｆ（ａｓｅＡと示す）の側面に配置したプライマーを用いた両方のＤＮＡ株の広範囲な配列決定によって確認した。
【０１２６】
リーダーペプチドおよびアポタンパク質を含むプレアポタンパク質の推定されたアミノ酸配列は、配列番号６４として示す。プレアポタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６３として示す。アポタンパク質の推定されたアミノ酸配列は、配列番号１５０として示す。アポタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１４９として示す。最後に、プレアポタンパク質のＤＮＡ配列、対応するアミノ酸配列、推定された上流のリボソーム結合部位、およびリーダーペプチドとアポタンパク質の境界部位を記載する図を図６に示す。
【０１２７】
（実施例３  アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２色素タンパク質生合成クラスターの残りのＤＮＡ単離および配列決定）
アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２アポタンパク質遺伝子クラスターの遠位配列の特定。アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２アポタンパク質遺伝子クラスターのコスミド２１ｇＤに存在する部分に隣接する配列を下記に説明するように同定した。コスミド２１ｇＤとともに、これらの配列が、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２色素タンパク質の生合成クラスター全体、すなわち、色素タンパク質のアセンブルに関与する遺伝子を実質的に構成する考えられる。読み取り枠の位置は表１に示している。ＧｅｎＢａｎｋ配列寄託物を比較することで、コードされたタンパク質の機能が推定された（表３）。読み取り枠の構成は図７に示している。
【０１２８】
まず、プライマー２１ｇＤｐｒ１ＦＷＤ（５’−ＧＣＴＣＧＴＣＧＧＧＴＴＣＴＴＣＴＡＣ；配列番号１６２）および２１ｇＤｐｒ１ＲＥＶ（５’−ＧＡＣＴＴＣＧＣＧＡＴＡＧＣＴＣＴＣ；配列番号１６３）を用いて、タイプＩＩのペプチドシンテターゼ縮合ドメイン（ｏｒｆ２０；図７）の一部を含むコスミドの端部の９０４ｂｐ断片を増幅することによりコスミド２１ｇＤからプローブを生成した。ＰＣＲ増幅は、製造者の推奨するとおりに５％ＤＭＳＯのＫＯＤポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて行なった。プライマーは、０．５ｍＭの濃度で用いた。コスミド２１ｇＤはテンプレートＤＮＡとして用いた。繰り返し条件は次の通りであった：９６℃、２分間を１サイクル、その次に、９６℃、１分間、６１．２℃、１分間、および７２℃、２分間をを３０サイクル、その後に、７２℃、１０分間を１サイクル。アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ反応を調べ、９０４ｂｐのバンドを先に説明したようにアガロースから溶離した。４，６−デヒドラターゼプローブについて先に述べたように、９０４ｂｐ単位複製配列を用いてアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２ゲノムコスミドライブラリーを調べた。このプローブにハイブリダイズした３８個のコロニーを培養し（５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む５ｍｌのＤｉｆｃｏ  Ｌｕｒｉａ培養液）、コスミドＤＮＡを精製した。ｐＷＥＢベクターに含まれる配列決定プライマー部位を用いて、精製されたコスミドの端部の配列を決定した。ＤＮＡ配列の分析では、１つのコスミド（４１４１７）がコスミド２１ｇＤと１１８４ｂｐだけ重複することが示された。その後、コスミド４１４１７の全体について配列を決定し、読み取り枠を同定し、コードされたタンパク質の機能を推定した。
【０１２９】
（コスミド２１ｇＤを特定するために用いた）ｐ３４５９８でクローン化された推定ｄＮＤＰ−Ｄ−グルコース−４，６−デヒドラターゼ断片にハイブリダイズしていると先に特定されているコスミドをスクリーニングしてコスミド２１ｇＤの他端から遠位にある生合成クラスターの部分を同定した。これらのコスミドを、コスミド２１ｇＤの５’末端の１０４３ｂｐ産物（産物は、完全な生合成クラスターの７０，５７２〜７１，６１４番目のヌクレオチドに対応する）を増幅するように設計されたＰＣＲプライマーを用いてスクリーニングした。これらのプライマー２１ｇＤｅｎｄＦＷＤ（５’−ＧＣＧＡＣＧＡＡＧＧＡＣＣＣＧＡＡＧＧ；配列番号１６４）および２１ｇＤｅｎｄＲＥＶ（５’−ＣＡＣＧＣＴＧＧＣＣＣＧＣＣＣＣＴＴＣ；配列番号１６５）を用いて各コスミドをスクリーニングしたが、標準的な２５μｌのＰＣＲ反応物（ＫＯＤ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔポリメラーゼ；Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）において、０．５μＭの各プライマーとともに、１０〜１００ｎｇの各コスミドをテンプレートとして用いている。予想される１０４３ｂｐのＤＮＡ断片の増幅を助長したコスミドは、コスミド２１ｇＢおよび２１ｇＣだけであった。これらコスミドの端部の配列決定により、コスミド２１ｇＢがコスミド２１ｇＤと１７，４１１個のヌクレオチドだけ重複している一方、コスミド２１ｇＣはコスミド２１ｇＤと２２，７９６個のヌクレオチドだけ重複していることが明らかになった。コスミド２１ｇＢは、上記既知のクラスター配列との重複がより少なく、コスミド２１ｇＣよりも配列伸張が長くなる可能性がより高いことを示したため、配列決定用に選ばれた。配列決定により、コスミド２１ｇＢが、１８，４４２ｂｐの配列伸張を示した３３，１３３ｂｐの挿入部分を含んでおり、塩基対の総数が９０，５７３に決定されることが明らかになった（図７）。前述同様に、コスミドを配列決定し、読み取り枠を同定し、コードされたタンパク質の機能を推定した。
【０１３０】
２１Ｇ７９２色素タンパク質の生物学的特性
（実施例４  インビトロ抗癌活性）
ｐ５３／ｐ２１チェックポイントにより、ゲノムの完全性を監視し、ＤＮＡが損傷した場合に細胞周期の進行を阻害する。ｐ２１遺伝子を欠失させることによりチェックポイントが分裂すると、結果的に、ＤＮＡ損傷に応じて阻止できなくなり、最終的にはアポトーシスによる細胞死に繋がる。このチェックポイントが無くなることは癌細胞の特徴であるため、一対の細胞株（ｐ２１＋／＋）が損傷していないｐ２１遺伝子有し、１つのメンバー（ｐ２１−／−）がｐ２１遺伝子に欠失部分を有する同系統の細胞株の対を用いて、ｐ２１が欠損した細胞においてアポトーシスを選択的に誘発する分子を同定することにより、潜在的な抗癌化合物についてスクリーニングすることができる。
【０１３１】
アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２色素タンパク質を同系統の細胞株の対（ｐ２１＋／＋およびｐ２１−／−）に加えた。表６に示すように、色素タンパク質は、ｐ２１−／−細胞に対する選択性が高かったが、これは、ｐ２１＋／＋細胞に対して、ＩＣ５０が１３倍高いためである。また、表７に示すように、色素タンパク質は、ヒト腫瘍細胞株パネルにおいて優れた効力を示したが、これは、ＩＣ５０が１〜４７ｎｇ／ｍｌの範囲にあるためである。しかしながら、アポタンパク質だけは不活性であった。
【０１３２】
【表６】
2008523817.tif 000017
（実施例５  色素タンパク質により誘発されたＤＮＡ損傷）
Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．から入手したコメットアッセイを用いてＤＮＡ損傷を検出した。ＨＣＴ１１６ｐ２１＋／＋および−／−細胞を各種異なる量の２１Ｇ７９２色素タンパク質およびミトザントロンに晒した。図１８に示すように、色素タンパク質により誘発される用量依存ＤＮＡ鎖の切断は、ｐ２１が豊富な細胞およびｐ２１が欠損した細胞の両方において、＞１００ｎｇ／ｍｌの濃度で発生している。
【０１３３】
（実施例６  色素タンパク質により誘発されたＤＮＡ開裂）
超らせんφＸ１７４  ＤＮＡを、各種異なる濃度の２１Ｇ７９２色素タンパク質でインキュベートし、ゲル電気泳動で分析した。色素タンパク質が一本鎖切断および二本差鎖切断を誘発し、その反応が２４時間継続し続け、カリケアマイシンとは異なり、ＤＮＡ開裂に還元剤（ジチオスレイトール、ＤＴＴ）が必要とされないことが観察された。ゲル電気泳動を図１９に示す。ギザギザとはＤＮＡの一本鎖切断を意味し、線形とは、二本鎖切断を意味する。
【０１３４】
（実施例７  色素タンパク質によるヒストンＨ１の消化）
色素タンパク質エンジインがヒストンを開裂することは先に示したが（Ｚｅｉｎら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０，８００９−１２；Ｚｅｉｎら，１９９５，Ｃｈｅｍ＆Ｂｉｏｌ  ２，４５１−５；Ｚｅｉｎら，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３４，１１５９１−７）、この活性については議論の余地があるものの（Ｈｅｙｄら，２０００，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２，１８１２−８）、アポタンパク質のタンパク質分解活性によるものと考えられていた。各種異なる濃度の色素タンパク質を用いて、５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、３７℃で一晩ヒストンＨ１をインキュベートした。（図２０）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行なった後に、ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によりゲルを染色してヒストンの消化を評価した。ヒストンＨ１の消化は、ＤＮＡを加えることにより阻害されが、これは、ＤＮＡ開裂に必要なメカニズム（例えば、フリーラジカルに基づくメカニズム）と同じメカニズムがタンパク質の消化にも関与していることを示す。これに合わせて、フリーラジカルスカベンジャー、３０ｍＭのグルタチオンまたはＮ−アセチルシステイン（図示せず）を加えることにより、ヒストンの消化が阻害されたが、プロテアーゼ阻害剤を加えても阻害されなかった。タンパク質を含まないエンジインであるカリケアマイシンは、ヒストンＨ１を開裂しなかったが、これは、この活性には、損傷がない発色団−タンパク質複合体が必要であることを示している。
【０１３５】
（実施例８  色素タンパク質による消化の特異性）
色素タンパク質によるヒストンの消化の選好順序は、Ｈ１＞Ｈ２Ａ＞Ｈ２Ｂ＞Ｈ３＞Ｈ４である（図２１）。色素タンパク質はまた、ミエリン塩基性タンパク質等、他の塩基性タンパク質も開裂するが、ウシ血清アルブミン等、中性／酸性タンパク質は開裂しない。このことは、ヒストン開裂活性に発色団のアポタンパク質成分が必要であることを説明する：酸性アポタンパク質は、静電相互作用により、ヒストンおよび他の塩基性タンパク質に発色団を届け、発色団がフリーラジカルに基づくメカニズムにより塩基性タンパク質を開裂できるようにすることが可能である。
【０１３６】
（実施例９  色素タンパク質によるＨｅＬａ細胞内のヒストンＨ１の消化）
色素タンパク質によるヒストンの消化が、損傷がない細胞内で発生するかどうかを調べるために、化合物を用いて一晩３７℃でＨｅＬａ細胞をインキュベートした。抗ヒストンＨ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびタンパク質イムノブロットにより細胞溶解物を分析した。細胞を色素タンパク質でインキュベートした結果、細胞内のヒストンＨ１が減少した（図２２）。ブレオマイシン、他のＤＮＡ損傷剤、またはカリケアマイシンでは効果が見られなかった。このことは、色素タンパク質が損傷がない細胞内でヒストンを消化できること証明している。この活性は、染色質内のヒストンを消化し、ＤＮＡをより開裂し易くすることで抗腫瘍効果に寄与することが可能である。これは色素タンパク質エンジインに固有の活性であると思われる。
【０１３７】
（実施例１０  Ｇ１／Ｓチェックポイントの色素タンパク質誘導）
ＨＣＴ１１６（ｐ２１＋／＋およびｐ２１−／−）細胞を各種異なる濃度で色素タンパク質に晒した。図２３Ａに示すように、色素タンパク質に晒した結果、全てのテスト濃度についてｐ５３チェックポイントが活性化した。ｐ２１タンパク質の誘導は、ｐ２１＋／＋細胞にしか見られなかった。アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２色素タンパク質によるＤＮＡ損傷チェックポイントの活性化は、ｐ５３タンパク質の転写活性化にとって重要であることが知られているｐ５３内のセリン−１５アミノ酸残基のリン酸化反応を実証することにより確認された（図２３Ｂ）。さらに、ポリＡＤＰリボースホスホリラーゼ（ＰＡＲＰ）の開裂により示されるように、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２色素タンパク質を用いて処理した場合、アポトーシスの誘導は、ｐ２１＋／＋細胞と比較して、ｐ２１−／−細胞において選択的に観察された（図２３Ｂ）。このことは、ｐ２１−／−細胞のＩＣ５０の値がより低いことと一致する。
【０１３８】
（実施例１１  インビボ抗癌活性）
ヒト腫瘍細胞株または断片ＬｏＶｏ（結腸癌）；ＨＣＴ１１６（結腸）；ＨＴ２９（結腸）；ＬＯＸ（黒色腫）；ＨＮ５（頭部および頸部）；およびＰＣ−３（前立腺）を無胸腺（ヌード）マウスの皮下に埋め込み、腫瘤の形成を可能にした。腫瘍が９０〜２００ｍｇの大きさに達したときに、食塩水調節媒介物、または食塩水中で作成した各種異なる濃度のアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２色素タンパク質を上記マウスに静脈内投与した。このマウスは、５日目および９日目に、さらに投与を受け、相対的な腫瘍の成長が観察された。その結果を図２４および図２５のグラフに示す。色素タンパク質を受けたマウスについては、腫瘍成長の阻害が最大で８０％観察された。
【０１３９】
（実施例１２  色素タンパク質の毒性）
毒性観察により、骨髄抑制を除いて、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２色素タンパク質はヌードマウスにおいては耐え得る程度であると指摘されている。詳細には、１日目、５日目、および９日目に、食塩水調節媒介物または各種異なる投与量の色素タンパク質を６匹のヌードマウスに静脈投与した。マウスの顕微鏡観察により、色素タンパク質を受けた全てのマウスが骨髄壊死になり、最も多量の色素タンパク質を受けたマウスは最も重い病変を生じることが示された。臨床病理学実験により、最も多量の色素タンパク質を受けたマウスは、白血球およびリンパ球の数が最も少なかったことが明らかになった。しかしながら、腸、神経、脊髄、肝臓、または注射部位には有害な作用は観察されなかった。顕微鏡所見および臨床病理学的要約を表８および９に示す。
【０１４０】
【表７】
2008523817.tif 000018
（実施例１３  Ｐ−ＧＰ（ＭＤＲ−１）による色素タンパク質の輸送）
ヒトＰＧＰ（ＭＤＲ１）は、細胞膜間で多くの薬物を輸送することができるＡＴＰ依存排出ポンプである。このタンパク質の高度発現は、腫瘍の多剤耐性に関連づけられてきた。下記の表１０に示すように、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２色素タンパク質は、低質なＭＤＲ１基質であり、臨床的に有意なレベルのＭＤＲ１発現する細胞（ＫＢ−８−５細胞）は、上記複合体に対する感受性を維持する。とりわけ、タンパク質成分を有さないカリケアマイシンは、ＭＤＲ１にとって良質な基質である。色素タンパク質のタンパク質成分は、ＭＤＲ１によって媒介される薬物流出から発色団を確実に保護し、ＭＤＲ１を発現することが多い結腸細胞株において有益な抗腫瘍効果に関与し得る。
【０１４１】
【表８】
2008523817.tif 000019
（実施例１４  ＨＣＴ１１６細胞におけるＦＩＴＣ標識色素タンパク質の取り込み）
色素タンパク質が細胞に入り、その生物活性を働かせるメカニズムを判定するために、製造者の推奨するとおりにＥＺ−Ｌａｂｅｌ  蛍光標識キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて色素タンパク質に蛍光標識（ＦＩＴＣ）をした。標識時に生物活性の損失は見られなかった。ＨＣＴ１１６結腸癌細胞による標識した物質の取り込みを蛍光顕微鏡検査により調べた。最適な細胞の培養時間は３〜６時間であった。標識の大半が細胞質に現れたが、微弱な染色も細胞核で観察された（図２６）。核内蓄積は少なかったが、上記複合体の抗力を考慮すると、その量は、生物活性には十分である可能性が高い。
【０１４２】
（実施例１５  ＨＣＴ１１６細胞におけるＦＩＴＣ標識アポタンパク質および色素タンパク質の取り込み）
損傷がない発色団とアポタンパク質の複合体が細胞侵入および核侵入に必要であるか否かを判定するために、色素タンパク質およびアポタンパク質をＦＩＴＣで標識した。標識された物質の取り込みを蛍光顕微鏡検査により調べた。アポタンパク質および色素タンパク質の両方に関して、取り込みが類似しており（図２７）、これは、細胞侵入が、損傷がない発色団−タンパク質複合体には依存していないことを示唆している。
【０１４３】
（実施例１６  ＦＩＴＣ標識色素タンパク質の取り込み：標識されていない複合体との競合）
色素タンパク質の細胞への侵入が飽和（例えば、細胞表面受容体依存）プロセスによって媒介されるか否かを判定するために、１０倍過剰の標識されていない試薬が存在しないまたは存在する場合（それぞれ、無標識色素タンパク質またはアポタンパク質）、ＨＣＴ１１６細胞をＦＩＴＣ標識色素タンパク質（図２８、右側のパネル）またはアポタンパク質（図２８、左側のパネル）でインキュベートした。細胞を蛍光顕微鏡検査（左）またはフローサイトメトリー（右）により分析した。標識の競合は観察されなかったが、これは、標識された物質の取り込みが受容体に媒介されたプロセスでなかったことを示唆している。さらに、フローサイトメトリーヒストグラムで観察された単一の均一なピークは、全ての細胞による標識された試薬の均等な取り込みを示した。ヒストグラム中の数字は、平均チャネル数（ＦＩＴＣ蛍光）である。
【０１４４】
（実施例１７  ＨＣＴ１１６細胞によるＦＩＴＣ標識アポタンパク質の取り込みに対するエネルギー枯渇および微小管破壊の効果）
上記の実験は、色素タンパク質の細胞への侵入が受容体によって媒介されたプロセスではないことを示唆している。タンパク質複合体が細胞に入る他の手段は、細胞表面の小胞がくびれて、当該細胞の細胞質内で自由なピノソームを形成する飲作用である。飲作用は、機能チューブリン細胞骨格網を必要とするエネルギー依存プロセスであるため、アジ化ナトリウム、エネルギー脱共役剤、およびノコダゾール（チューブリン細胞骨格を破壊する薬剤）の細胞の取り込みに対する効果を調べた。アジ化ナトリウムまたはノコダゾールが存在しないまたは存在する場合に、ＨＣＴ１１６細胞をＦＩＴＣ標識されたアポタンパク質で処理した。これらの処理はともに、標識の取り込みを阻害した（図２９）。ノコダゾールの濃度（１００ｎＭ）が微小管を破壊するに十分であることが示された（右側のパネル）。これらのデータは、アポタンパク質の取り込みが微小管網を利用するエネルギー依存プロセスであることを示唆している。我々のデータでは、受容体により媒介されるプロセスが除外されると思われるので、飲作用が関与している可能性が最も高い。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】図１は、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２色素タンパク質のＨＰＬＣクロマトグラムである。ＨＰＬＣの分析条件は、次のとおりである。カラム：ＴｏｓｏＨａａｓ  ＤＥＡＥ  ５  ＰＷ（粒径１０ｕｍ、大きさ７．５ｍｍ×７．５ｃｍ）。バッファ：０〜０．５Ｍ直線勾配ＮａＣｌを一定の０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで２５分間、０．８ｍｌ／分の流量で用いた。
【図２】図２は、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２色素タンパク質の紫外スペクトルである。
【図３】図３は、２１Ｇ７９２アポタンパク質のＨＰＬＣクロマトグラムである。ＨＰＬＣの分析条件は次のとおりである。カラム：ＶＹＤＡＣタンパク質Ｃ４（３００Ａ、大きさ３．０×１００ｍｍ）。溶媒：Ｈ２Ｏ内の１０〜３０％のアセトニトリル、一定の０．０５％ＴＦＡで６分間、２ｍｌ／分で用いた。
【図４】図４は、２１Ｇ７９２色素タンパク質の紫外スペクトルである。
【図５】図５は、アポタンパク質の分子量決定（ＭＡＬＤＩ−ＭＳで１２．９２４０９ｋＤａ）を示す。
【図６】図６は、２１Ｇ７９２プレアポタンパク質およびアポタンパク質のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。予想リボソーム結合部位は枠内に示しており、リーダーペプチドには下線を引いている。斜線は、リーダーペプチドおよびアポタンパク質の開裂部位を示す。
【図７】図７は、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２色素タンパク質遺伝子クラスターの読み取り枠を示す。コスミド４１４１７上に位置する遺伝子は、ｏｒｆの矢印上に直線で示している。コスミド２１ｇＤ上に位置するものは、小さな点からなる破線で示しており、コスミド２１ｇＢ上に位置するものについては、大きな点からなる破線で示している。各コスミドの同定に用いるプローブの位置は、黒いバーベル状の印しで示している。ＰｓｔＩ（Ｐ）およびＥｃｏＲＩ（Ｅ）制限部位にはラベルを付けている。
【図８】図８は、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２発色団の構造を表す。
【図９】図９は、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２発色団のチロシン由来成分（３−［２−クロロ−３−ヒドロキシ−４−メトキシ−フェニル］−３−ヒドロキシ−プロピオン酸）の合成経路を表す。
【図１０】図１０は、ｏｒｆ１７遺伝子産物の構造ドメインを表す。縮合（Ｃ）、アデニル化（Ａ）、およびぺプチジルキャリアタンパク質（ＰＣＰ）ドメインのコアモチーフは、枠内に入れてラベルを付けている。ｏｒｆ１７遺伝子産物のＡドメイン基質特異性コードおよびＣ−１０２７生合成経路のＳｇｃＣ４に寄与する残基は、太字にし、下線を引いている。同一の残基には、アスタリスクを付しており、コロンは保存残基を示し、セミコロンは半保存残基を示す。
【図１１】図１１は、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２発色団のマヅロサミン（４−アミノ−４−デオキシ−３−Ｃ−メチル−β−リボピラノース）成分の合成経路を表す。
【図１２】図１２は、Ｏｒｆ３８とｄＮＤＰ−グルコース−４，６−デヒドラターゼおよびＵＤＰ−グルクロン酸デカルボキシラーゼとのアラインメントを表す。このアラインメントに含まれるグルコース−４，６−デヒドラターゼ配列は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｅｙａｇａｗａｅｎｓｉｓ  ｃｏｎｃａｎａｍｙｃｉｎ  Ａ遺伝子クラスター（ＡＡＺ９４３９６）のＯｒｆ５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｒｇｉｌｌａｃｅｕｓ  ｍｉｔｈｒａｍｙｃｉｎ遺伝子クラスター（ＣＡＡ７１８４７）のＭｔｍＥ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓ  ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ遺伝子クラスター（ＡＡＤ３１７９７）のＳｐｃＥである。上記アラインメントに含まれるグルクロン酸デカルボキシラーゼ配列は、Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ  （ＢＡＢ４０９６７）のＵｘｓ１、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  （ＡＡＫ７０８８２）のＵｘｓ３、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  （ＡＡＫ７０８８０）のＵｘｓ１、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  （ＡＡＫ７０８８１）のＵｘｓ２、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  （ＡＡＫ８５４１０）のＵｘｓ１、およびＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  （ＡＡＫ５９９８１）Ｕｘｓ１である。同一の残基には、アスタリスクを付しており、コロンは保存残基を示し、セミコロンは半保存残基を示す。
【図１３】図１３は、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２発色団の２−ヒドロキシ−３，６−ジメチル安息香酸成分の合成経路を表す。
【図１４】図１４は、Ｏｒｆ３１のＡ４およびＡ５コアモチーフ間の領域と１０個のアリール酸ＡＭＰリガーゼのアラインメントを表す。構造上のアンカーには黒色の影を付けている。カルボキシ酸結合ポケットの推測される構成には灰色の影を付けている。ＤＨＢＡの活性とサリチル酸の区別に関与していることが推測されている残基は、番号記号で特定される。同一の残基にはアスタリスクを付し、コロンは保存残基を示し、セミコロンは半保存残基を示す。
【図１５】図１５は、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２発色団のエンジインコアの生成の生合成経路を表す。
【図１６】図１６は、ドメイン構成、ならびにＯｒｆ５とＳｇｃＥおよびＮｃｓＥエンジインＰＫＳとの比較を表す。ａａ、アミノ酸；ＫＳ、ケトシンターゼ；ＡＴ、アセチルトランスファーゼ；ＡＣＰ、アシルキャリアタンパク質；ＫＲ、ケトレダクターゼ；ＤＨ、デヒドラターゼ；ＴＤ、末端ドメイン。
【図１７】図１７は、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２発色団の４つの成分の集合ルートを表す。
【図１８】図１８は、２１  Ｇ７９２色素タンパク質により誘発された用量依存的ＤＮＡ鎖切断が、ｐ２１が豊富なＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞およびｐ２１が欠損したＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞において、＞１００ｎｇ／ｍｌの色素タンパク濃度で発生することを示すグラフである。
【図１９】図１９は、２１Ｇ７９２色素タンパク質が一本鎖切断および二本鎖切断を誘発し、２４時間以上反応を継続し続け、ＤＮＡ開裂がチオール剤を必要としなかったことを示すＤＮＡ開裂アッセイである。
【図２０】図２０は、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２色素タンパク質によるヒストンＨ１の消化、およびＤＮＡによる阻害を表す。プロテアーゼ阻害剤は、ＰＭＳＦ、ロイペプチン、アプロチニン、およびペプスタチンＡである。アポタンパク質は不活性である。
【図２１】図２１は、ヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４と、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２色素タンパク質による消化の相対感度を表す。ミエリン塩基性タンパク質等の塩基性タンパク質（中性／酸性タンパク質ではない）も開裂しやすい。
【図２２】図２２は、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２色素タンパク質（ブレオマイシンまたはカリケアマイシンではない）で治療された細胞内のヒストンＨ１の減少を表す。
【図２３Ａ】図２３Ａは、ＨＣＴ１１６細胞を、各種の濃度で色素タンパク質に曝すことによりｐ５３／ｐ２１チェックポイントの活性が得られることを示すタンパク質イムノブロットである。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、ポリ−ＡＤＰ−リボースホスホリラーゼ（ＰａｒＰ）の開裂でのｐ５３のセリン−１５アミノ酸残基のリン酸化反応を表す。
【図２４】図２４は、無胸腺（ヌード）マウスにおける２１Ｇ７９２色素タンパク質の腫瘍、皮下注射ＬｏＶｏ（結腸癌）；ＨＣＴ１１６（結腸）；ＨＴ２９（結腸）；ＬＯＸ（黒色腫）；ＨＮ５（頭部および頸部）；およびＰＣ−３（前立腺）細胞に対するインビボ効力を示す一連のグラフである。
【図２５】図２５は、無胸腺（ヌード）マウスにおける２１Ｇ７９２色素タンパク質の腫瘍、皮下注射ＬｏＶｏ（結腸癌）；ＨＣＴ１１６（結腸）；ＨＴ２９（結腸）；ＬＯＸ（黒色腫）；ＨＮ５（頭部および頸部）；およびＰＣ−３（前立腺）細胞に対するインビボ効力を示す一連のグラフである。
【図２６】図２６は、ＦＩＴＣ標識されたアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２色素タンパク質のＨＣＴ１１６細胞による取り込みを表す。
【図２７】図２７は、ＦＩＴＣ標識されたアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２色素タンパク質およびアポタンパク質のＨＣＴ１１６細胞による取り込みを表す。
【図２８】図２８は、１０倍の濃度の標識されていない色素タンパク質の存在下での、標識されたアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２色素タンパク質の取り込みを表す。
【図２９】図２９は、エネルギー脱共役剤（アジ化ナトリウム）またはチューブリン破壊剤（ノコダゾール）のＨＣＴ１１６細胞によるアクチノマヅラ種２１Ｇ７９２アポタンパク質の取り込みに対する効果を表す。
【図３０】図３０は、アクチノマヅラ種２１Ｇ７９２発色団の誘導体に対するモノクローナル抗体の連結を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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