(57)【要約】  神経成長因子(NGF)の特異的結合メンバー、特に抗-NGF抗体分子、詳しくはヒト抗体分子、特にNGF活性を中和する当該ヒト抗体分子。疼痛、喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺線維症、他の気道炎症疾患、糖尿病性ニューロパシー、心不整脈、HIV、関節炎、乾癬及び癌といった、NGF関連障害の診断又は治療における抗-NGF抗体分子の使用方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経成長因子(NGF)に対する単離された特異的結合メンバーであって、ヒト抗体VHドメインとヒト抗体VLドメインで構成され、かつCDRのセット、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、前記VHドメインがHCDR1、HCDR2、HCDR3及びフレームワークを含み、かつ前記VLドメインがLCDR1、LCDR2、LCDR3及びフレームワークを含み、前記CDRのセットは、以下のCDRのセット：
HCDR1が配列番号193のアミノ酸配列を有し、HCDR2が配列番号194のアミノ酸配列を有し、HCDR3が配列番号195のアミノ酸配列を有し、LCDR1が配列番号198のアミノ酸配列を有し、LCDR2が配列番号199のアミノ酸配列を有し、かつLCDR3が配列番号200のアミノ酸配列を有すると定義される、CDRの1133C11セット；
前記CDRの1133C11セットと比較して1又は2個のアミノ酸置換を含む、CDRのセット；
表2の個々のクローンについて示される通りのCDRの各セット；及び
HCDR3内のアミノ酸配列LNPSLTA(配列番号531)がアミノ酸配列MISSLQP(配列番号533)又はアミノ酸配列FNSALIS(配列番号532)で置き換えられている前記CDRの113C11セットを含む、CDRのセット；
から成る群より選択されるCDRのセットから成る、前記単離された特異的結合メンバー。
【請求項２】
前記1又は2個の置換が、Kabatの標準的なナンバリングを用いて、CDR内の以下の位置における残基の1又は2個についてである、請求項１に記載の単離された特異的結合メンバー：
HCDR1の31、34；
HCDR2の51、55、56、57、58、65；
HCDR3の96；
LCDR1の26、27、27A、27B、28、29、30
LCDR2の56
LCDR3の90、94。
【請求項３】
前記1又は2個の置換が、各位置について同定された群の可能な置換残基のうち、以下の位置において生じている、請求項２に記載の単離された特異的結合メンバー：
置換の位置 以下の基から成る群より選択される置換残基
HCDR1の31：                  A
HCDR1の34：                  V
HCDR2の51：                  V
HCDR2の55：                  N
HCDR2の56：                  A
HCDR2の57：                  V
HCDR2の58：                  S
HCDR2の65：                  D
HCDR3の96：                  N
LCDR1の26：                  T
LCDR1の26：                  G
LCDR1の27：                  N
LCDR1の27：                  R
LCDR1の27A：                 T
LCDR1の27A：                 P
LCDR1の27B：                 D
LCDR1の28：                  T
LCDR1の29：                  E
LCDR1の30：                  D
LCDR2の56：                  T
LCDR3の90：                  A
LCDR3の94：                  G。
【請求項４】
LCDR1内の残基29がEである、請求項３に記載の単離された特異的結合メンバー。
【請求項５】
HCDR3内のアミノ酸配列LNPSLTA(配列番号531)がアミノ酸配列MISSLQP(配列番号533)で置き換えられている前記CDRの1133C11セットを含有するCDRのセットを含む、請求項１に記載の単離された特異的結合メンバー。
【請求項６】
HCDR3内のアミノ酸配列LNPSLTA(配列番号531)がアミノ酸配列FNSALIS(配列番号532)で置き換えられている前記CDRの1133C11セットを含有するCDRのセットを含む、請求項１に記載の単離された特異的結合メンバー。
【請求項７】
CDRの1133C11セットを含む、請求項１に記載の単離された特異的結合メンバー。
【請求項８】
VHドメインのフレームワークがヒト重鎖生殖系列のフレームワークであり、及び/又は前記VLドメインのフレームワークがヒト軽鎖生殖系列のフレームワークである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離された特異的結合メンバー。
【請求項９】
重鎖生殖系列のフレームワークがVH1 DP10を含む、請求項８に記載の単離された特異的結合メンバー。
【請求項１０】
軽鎖生殖系列のフレームワークがVL Vλ1を含む、請求項８又は９に記載の単離された特異的結合メンバー。
【請求項１１】
ラット又はマウスのNGFと結合する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離された特異的結合メンバー。
【請求項１２】
p75受容体に対するNGFの結合よりも、TrkA受容体に対するNGFの結合を優先的に遮断する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の単離された特異的結合メンバー。
【請求項１３】
1252A5 VHドメイン(配列番号392)を含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項１４】
1252A5 VLドメイン(配列番号397)を含む、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項１５】
同じ条件下で親和性を決定した場合、1252A5 VHドメイン(配列番号392)と1252A5 VLドメイン(配列番号397)で形成されたヒトNGFの抗原結合部位の親和性以上の親和性でヒトNGFと結合する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項１６】
ヒトNGFに結合及び/又はヒトNGFを中和する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項１７】
同じ条件下で中和能を決定した場合、1252A5 VHドメイン(配列番号392)と1252A5 VLドメイン(配列番号397)で形成されたNGFの抗原結合部位の中和能以上の中和能でヒトNGFを中和する、請求項１６に記載の特異的結合メンバー。
【請求項１８】
1152H5 VHドメイン(配列番号262)を含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項１９】
1152H5 VLドメイン(配列番号267)を含む、請求項９〜１１又は請求項１８のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項２０】
1165D4 VHドメイン(配列番号302)を含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項２１】
1165D4 VLドメイン(配列番号307)を含む、請求項９〜１１又は請求項２０のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項２２】
1230H7 VHドメイン(配列番号362)を含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項２３】
1230H7 VLドメイン(配列番号367)を含む、請求項９〜１１又は請求項２２のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項２４】
scFv抗体分子を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項２５】
抗体の定常領域を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー。
【請求項２６】
抗体全体を含む、請求項２５に記載の特異的結合メンバー。
【請求項２７】
抗体全体がIgG4である、請求項２６に記載の特異的結合メンバー。
【請求項２８】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の特異的結合メンバーの単離された抗体のVHドメイン。
【請求項２９】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の特異的結合メンバーの単離された抗体のVLドメイン。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー、抗体のVHドメイン又は抗体のVLドメインと、少なくとも１種の追加成分を含んでなる組成物。
【請求項３１】
医薬的に許容しうる賦形剤、ビヒクル又は担体を含んでなる、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の特異的結合メンバー又は特異的結合メンバーの抗体のVH若しくはVLドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項３３】
請求項３２に記載の核酸でin vitro形質転換された宿主細胞。
【請求項３４】
特異的結合メンバー又は抗体のVH若しくはVLドメインの製造方法であって、請求項３３に記載の宿主細胞を、前記特異的結合メンバー又は抗体のVH若しくはVLドメインの産生のための条件下で培養する工程を含む方法。
【請求項３５】
特異的結合メンバー又は抗体のVH若しくはVL可変ドメインを単離及び/又は精製する工程をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
特異的結合メンバー又は抗体のVH若しくはVL可変ドメインを、少なくとも１種の追加成分を含む組成物に調製する工程を含む、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
NGFに対する抗体抗原結合ドメインの製造方法であって、以下の工程：
HCDR1、HCDR2及びHCDR3を含む親VHドメインのアミノ酸配列の1又は2以上の付加、欠失、置換又は挿入により、前記親VHドメインのアミノ酸配列の変種であるVHドメインを供給し、場合により、このようにして供給された前記VHドメインを1又は2以上のVLドメインと結合して1又は2以上のVH/VLの組合せを供給する工程であって、前記親VHドメインのHCDR1、HCDR2及びHCDR3は、前記HCDR1が配列番号393のアミノ酸配列を有し、前記HCDR2が配列番号394のアミノ酸配列を有し、前記HCDR3が配列番号395のアミノ酸配列を有すると定義されるHCDRの12525Aセット、又は前記HCDR1が配列番号33のアミノ酸配列を有し、前記HCDR2が配列番号34のアミノ酸配列を有し、前記HCDR3が配列番号35のアミノ酸配列を有すると定義されるHCDRの1021E5セットである、前記工程；及び
前記親VHドメインのアミノ酸配列の変種である前記VHドメイン又は前記VH/VLの組合せを試験して、NGFに特異的な抗体抗原結合ドメインを同定する工程；
を含む前記方法。
【請求項３８】
親VHドメインのアミノ酸配列が、配列番号392及び配列番号32から成る群より選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
1又は2以上のVLドメインが、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む親VLドメインのアミノ酸配列の1又は2以上の付加、欠失、置換又は挿入により、それぞれ前記親VLドメインのアミノ酸配列の変種である1又は2以上のVLドメインを生成することによって供給され、前記親VLドメインのLCDR1、LCDR2及びLCDR3は、前記LCDR1が配列番号398のアミノ酸配列を有し、前記LCDR2が配列番号399のアミノ酸配列を有し、前記LCDR3が配列番号400のアミノ酸配列を有すると定義されるLCDRの1252A5セット、又は前記LCDR1が配列番号38のアミノ酸配列を有し、前記LCDR2が配列番号39のアミノ酸配列を有し、前記LCDR3が配列番号40のアミノ酸配列を有すると定義されるLCDRの1021E5セットである、請求項３７又は３８に記載の方法。
【請求項４０】
親VLドメインのアミノ酸配列が、配列番号397及び配列番号37から成る群より選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
NGFがヒトNGFである、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
NGFのための抗体抗原結合ドメインの製造方法であって、以下の工程：
HCDR1、HCDR2及びHCDR3を含む親VHドメインのアミノ酸配列の1又は2以上の付加、欠失、置換又は挿入により、前記親VHドメインのアミノ酸配列の変種であるVHドメインを供給し、場合により、このようにして供給された前記VHドメインを1又は2以上のVLドメインと結合して1又は2以上のVH/VLの組合せを供給する工程であって、前記親VHドメインのHCDR1、HCDR2及びHCDR3は、前記HCDR1が配列番号263のアミノ酸配列を有し、前記HCDR2が配列番号264のアミノ酸配列を有し、前記HCDR3が配列番号265のアミノ酸配列を有すると定義されるHCDRの1152H5セット、又は前記HCDR1が配列番号303のアミノ酸配列を有し、前記HCDR2が配列番号304のアミノ酸配列を有し、前記HCDR3が配列番号305のアミノ酸配列を有すると定義されるHCDRの1165D4セット、又は前記HCDR1が配列番号363のアミノ酸配列を有し、前記HCDR2が配列番号364のアミノ酸配列を有し、前記HCDR3が配列番号365のアミノ酸配列を有すると定義されるHCDRの1230H7セットである、前記工程；及び
前記親VHドメインのアミノ酸配列の変種である前記VHドメイン又は前記VH/VLの組合せを試験して、NGFに特異的な抗体抗原結合ドメインを同定する工程；
を含む前記製造方法。
【請求項４３】
親VHドメインのアミノ酸配列が、配列番号262、配列番号302及び配列番号362から成る群より選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
1又は2以上のVLドメインが、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む親VLドメインのアミノ酸配列の1又は2以上の付加、欠失、置換又は挿入により、それぞれ前記親VLドメインのアミノ酸配列の変種である1又は2以上のVLドメインを生成することによって供給され、前記親VLドメインのLCDR1、LCDR2及びLCDR3は、前記LCDR1が配列番号268のアミノ酸配列を有し、前記LCDR2が配列番号269のアミノ酸配列を有し、前記LCDR3が配列番号270のアミノ酸配列を有すると定義されるLCDRの1152H5セット、又は前記LCDR1が配列番号308のアミノ酸配列を有し、前記LCDR2が配列番号309のアミノ酸配列を有し、前記LCDR3が配列番号310のアミノ酸配列を有すると定義されるLCDRの1165D4セット、又は前記LCDR1が配列番号368のアミノ酸配列を有し、前記LCDR2が配列番号369のアミノ酸配列を有し、前記LCDR3が配列番号370のアミノ酸配列を有すると定義されるLCDRの1230H7セットである、請求項４２又は４３に記載の方法。
【請求項４５】
親VLドメインのアミノ酸配列が、配列番号267、配列番号307及び配列番号367から成る群より選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
NGFがヒトNGFである、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
親VHドメインのアミノ酸配列の変種である前記VHドメインがCDRの変異導入によって供給される、請求項３７〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
IgG、scFv又はFab抗体分子の構成成分として抗体抗原結合部位を生成する工程をさらに含む、請求項３７〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
NGFと結合する特異的結合メンバーの製造方法であって、以下の工程：
VHドメインをコードする出発核酸又はそれぞれVHドメインをコードする核酸の出発レパートリーを供給する工程であって、前記VHドメインが、置換されるHCDR1、HCDR2及び/又はHCDR3を含むか又はHCDR1、HCDR2及び/又はHCDR3コード化領域を欠いている、前記工程；
前記出発核酸又は出発レパートリーを、配列番号193のHCDR1、配列番号194のHCDR2、及び/又は配列番号395、265、305、365若しくは35のHCDR3のアミノ酸配列をコードするドナー核酸或いは前記アミノ酸配列の変異によって生成されたドナー核酸と、前記ドナー核酸が前記出発核酸又は出発レパートリーのCDR1、CDR2及び/又はCDR3領域に挿入されるように結合して、VHドメインをコードする核酸の生成物レパートリーを供給する工程；
前記生成物レパートリーの核酸を発現させて生成物VHドメインを生成する工程；
場合により、前記生成物VHドメインを1又は2以上のVLドメインと結合する工程；
生成物VHドメインを含み、場合によりVLドメインを含む、NGFに特異的な結合メンバーを選択する工程；及び
前記特異的結合メンバー又は該特異的結合メンバーをコードする核酸を回収する工程；
を含む、前記方法。
【請求項５０】
ドナー核酸が、HCDR1及び/又はHCDR2の変異によって生成される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ドナー核酸が、前記HCDR3の変異によって生成される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
1252A5 HCDR3(配列番号395)又は1021E5 HCDR3(配列番号35)のアミノ酸配列をコードする核酸の変異によって前記ドナー核酸を供給する工程を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
核酸のランダム変異によってドナー核酸を供給する工程を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
回収された特異的結合メンバー内に含まれる生成物VHドメインを抗体の定常領域に結合する工程をさらに含む、請求項４９〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
生成物VHドメインとVLドメインを含むIgG、scFv又はFab抗体分子を供給する工程を含む、請求項４９〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
NGFがヒトNGFである、請求項４９〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
NGFと結合する抗体抗原結合ドメイン又は特異的結合メンバーを、NGFを中和する能力について試験する工程をさらに含む、請求項３７〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
NGFと結合し、かつNGFを中和する抗体フラグメントを含む特異的結合メンバーが得られる、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
抗体フラグメントがscFv抗体分子である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記抗体フラグメントがFab抗体分子である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
抗体全体中の抗体フラグメントのVHドメイン及び/又はVLドメインを供給する工程をさらに含む、請求項５９又は６０に記載の方法。
【請求項６２】
NGFと結合する特異的結合メンバー、抗体抗原結合部位或いは前記NGFと結合する特異的結合メンバー又は抗体抗原結合部位の抗体VH若しくはVL可変ドメインを、少なくとも１種の追加成分を含む組成物に調製する工程をさらに含む、請求項３７〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
NGFと結合する特異的結合メンバーを、NGF又はNGFのフラグメントに結合させる工程をさらに含む、請求項３７〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載のNGFと結合する特異的結合メンバーを、ヒトNGF又はヒトNGFのフラグメントに結合させる工程を含む方法。
【請求項６５】
結合がin vitroで起こる、請求項６３又は６４に記載の方法。
【請求項６６】
特異的結合メンバーをヒトNGF又はヒトNGFのフラグメントに結合させる工程を含む、請求項６３〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
特異的結合メンバーがNGF又はNGFのフラグメントに結合する量を決定する工程を含む、請求項６３〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
NGFが役割を果たす疾患又は障害の治療用薬物の製造における特異的結合メンバーの使用をさらに含む、請求項３７〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の特異的結合メンバーの、NGFが役割を果たす疾患又は障害の治療用薬物の製造における使用。
【請求項７０】
NGFが役割を果たす疾患又は障害の治療方法であって、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の特異的結合メンバーを、前記疾患又は障害を罹っている患者又は前記疾患又は障害の発生の危険がある患者に投与する工程を含む方法。
【請求項７１】
疾患又は障害が、疼痛、喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺線維症、他の気道炎症疾患、糖尿病性ニューロパシー、心不整脈、HIV、関節炎、乾癬及び癌から成る群より選択される、請求項６８、６９又は７０に記載の方法又は使用。
【請求項７２】
治療が疼痛の治療である、請求項７１に記載の方法又は使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔ディスケットで提出した資料の参照による取り込み〕
配列1〜537の配列表のディスケットコピーをこの明細書と共に提出し、すべての目的のため、その全体が参照によって本明細書に取り込まれる。
本発明は、特異的な結合メンバー、特に抗-NGF抗体分子、詳しくはヒト抗体分子、特にNGF(神経成長因子)の活性を中和する当該ヒト抗体分子に関する。本発明は、さらに、NGF関連障害の診断又は治療で抗-NGF抗体分子を使用する方法に関する。NGF関連障害としては、疼痛、喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺線維症、他の気道炎症疾患、糖尿病性ニューロパシー、心不整脈、HIV、関節炎、乾癬及び癌が挙げられる。
本発明は、本明細書に含まれる実験によって、さらに支持する技術文献によって示されるように、NGFと結合し、またNGFを中和することによって特定の価値のある、ひいては何らかの種々の治療措置で有用な抗体分子を提供する。
【背景技術】
【０００２】
神経成長因子(β-NGF、一般にNGFとして知られている)は、神経系の発達において周知の中心的な役割を果たす。しかし、成人では、NGFはより制限された役割を果たし、中枢神経と末梢神経のサブセットの健康と存続を促す(Huang & Reichardt, 2001)。NGFは、これら神経細胞の機能特性の調節にも寄与する。この後者のプロセスの一部として、NGFは侵害受容器の感受性又は興奮性に強直性制御を及ぼす(Priestley et al., 2002; Bennett, 2001)。これら末梢神経細胞は、最終的に痛みという知覚(痛覚)を生じさせる種々の有害な刺激を感じて中枢神経系に伝達する。従って、NGFのレベルを減じる薬剤は、鎮痛治療薬としての有用性を有しうる。
【０００３】
十分に治療されない痛みの社会的費用は、さらに抗-NGF活性をベースとした鎮痛薬の用途の可能性を支持する。すなわち、多くの鎮痛薬が存在し、広範に使用されているにもかかわらず、新たな鎮痛薬に対する明白な要望が存在する。痛みは医薬の助けが求められる最も一般的な症状の１つであり、かつ来診する全患者の半分の主要な苦情である。痛みの社会に対する高費用はよく実証されている。例えば、米国では慢性の疼痛がおよそ3400万のアメリカ人を苦しめている。疼痛は、毎年5000万の仕事日を失わせている。背痛、関節炎痛、及び偏頭痛に起因する直接的な医療費は、毎年400億＄に達する。全体的な痛みのための処方薬市場は一年に約150億＄である(Pleuvry & Pleuvry)。
これらの統計が示すように、痛みに苦しむ人のかなりの割合の人が十分な痛みの軽減を受け損なっている。結果として、新しい作用メカニズムの安全かつ有効な鎮痛薬に対する医療が大いに要望されている(Pleuvry & Pleuvry)。
分泌されたNGFの組織レベルを低減し、或いはその作用を阻害する治療薬は正にこのような新規鎮痛薬となる可能性を有する。NGF自体の皮下注射はヒトと動物で痛みを生じさせる。その例として、注射されたNGFは急速な熱痛覚過敏、次いで遅延熱痛覚過敏及び物理学的な異痛症を引き起こす(Petty et al., 1994; McArthur et al., 2000)。内在的に分泌されたNGFは、同様に侵害受容促進的(pro-nociceptive)である。NGFの組織損傷誘発された放出とその周辺で引き続き起こる作用が、「周辺感作」のプロセスを通じた熱痛覚過敏の誘発で主要な役割を果たす(Mendell & Arvanian, 2002)。組織損傷が侵害受容促進的かつ炎症誘発性サイトカインの放出を促し、順次、ケラチノサイト及び線維芽細胞からのNGFの放出を誘発する。この放出されたNGFが直接侵害受容器に作用して有害侵襲の数分以内で有痛又は侵害受容状態を誘発する。このNGFが間接的にも作用して侵害受容/有痛状態を誘発及び維持する。NGFは肥満細胞の脱顆粒を引き起こし、ヒスタミンやセロトニン等の侵害受容促進的な因子を放出し、重要なことに、より多くのNGFは、交感神経終末をも刺激してノルアドレナリンのような侵害受容促進的神経伝達物質を放出しうる(Ma & Woolf, 1997)。
【０００４】
NGFの組織レベルは、CFA-注射及びカラギナン注射した動物で上昇する(Ma & Woolf, 1997; Amann & Schuligoi, 2000)。さらに、リウマチ性関節炎(Aloe & Tuveri, 1997)又は膀胱炎(Lowe et al., 1997)に苦しむ患者でNGFのレベル上昇が実証されている。げっ歯動物では、末梢神経損傷は、マクロファージ、繊維芽細胞、及びシュワン(Schwann)細胞におけるNGFのmRNAの発現を増やす(Heumann et al., 1987)。トランスジェニックマウスでのNGFの過剰発現は、野生型マウスの過剰発現を超えて増強された神経損傷後の神経障害性の痛みをもたらす(Ramer et al., 1998)。多くの時間及び日にわたって、上昇したNGFレベルは、「中枢感作」を促す際、すなわち脊髄の侵害受容経路のシナプスにおける神経伝達の増強において、役割を果たす。中枢感作は、持続性及び慢性の痛覚過敏症及び異痛症をもたらす。このプロセスは、NGFとその高親和性受容体であるrtkA(チロシン受容体キナーゼA)の複合体の内部移行に関与すると考えらる。これら複合体の、背根神経節(dorsal root ganglia(DRG))の侵害受容器細胞体への逆行性輸送が、脊髄の背角における侵害受容性神経ペプチド(例えば、サブスタンスP、CGRP)の分泌、PKCの活性化、及びNMDA受容体の活性化−すべて侵害受容経路の感作を促進するプロセス−を増強する(Sah et al., 2003)。NGFは、ナトリウムチャンネルサブタイプ及びカプサイシン受容体、VR1といった電位依存性のリガンド-ゲート化イオンチャンネルの上方制御及び再分布でも役割を果たす(Mamet et al., 1999; Fjell et al., 1999; Priestley et al., 2002)。神経障害性有痛状態と関係がある侵害受容器の感受性及び興奮性の上昇の根底には、伝達物質、受容体、及びイオンチャンネルの活性及び／又は発現の変化がある。
NGFは、交感神経細胞の出芽及び侵害受容性神経細胞の異所神経支配の形成をも促進しうる。この神経支配が、交感神経によって維持される痛み、又は複合局所疼痛症候群のような慢性の侵害受容/有痛状態の誘発及び維持に寄与すると考えられている(Ramer et al., 1999)。
【０００５】
NGF誘発型痛覚/疼痛は、高親和性NGF受容体、trkA(チロシン受容体キナーゼA)によって媒介される(Sah, et al., 2003)。DRG中の約40〜45%の侵害受容器細胞体がtrkAを発現する。これらは小径の線維、つまりC-線維の細胞体であり、分泌された侵害受容促進的なペプチド、サブスタンスP及びCGRPをも発現する。これら線維は背角の付着板I及びII内で終わっており、そこでこれら線維は、抹消侵害受容器によって感じられる有害刺激を中枢神経系に伝える。trkA遺伝子内の変異又は欠失は、ヒト(Indo, 2002)とtrkAノックアウトマウス(de Castro et al., 1998)の両者において痛覚の損失を特徴とする表現型を生じさせる。有意には、trkAの発現は関節炎(Pozza et al., 2000)又は膀胱痛(Qiao & Vizzard, 2002)、或いは完全フロイントアジュバント(CFA)の注射又は足へのカラギナンの注射によって引き起こされる炎症痛(Cho et al., 1996)のモデルに供される動物で上方制御される。
NGFはp75ニューロトロフィン受容体にも結合する。p75受容体の役割は、その細胞環境と補助機能又は共受容体機能を果たすと考えられる他の受容体の存在とによって決まる。trkAとp75受容体の間の相互作用の結果、NGFに高親和性の結合部位の形成を生じさせる。NGF-媒介痛のシグナル伝達における該受容体の相互作用の重要さは明かでないが、最近の研究は関連しうる細胞プロセスでp75受容体が関係あるとしている(Zhang & Nicol, 2004)。しかし、p75受容体ノックアウトマウスが有毒刺激に高い許容限界を示しながら、それらはNGFの痛覚過敏作用に対する応答性を維持しており、trkA受容体だけでこれら作用を媒介するのに十分であることを示唆している(Bergmann et al., 1998)。
【０００６】
上で引用した証拠は、NGF-媒介プロセスが急性の痛み、短期の痛み、持続性の侵害受容性の痛み及び持続性又は慢性の神経障害性の痛みの誘発の原因であることを示している。従って、抗-NGF因子は、いずれか又はすべてのこれら種々の有痛状態に苦しむ者を治療するための有効な鎮痛薬としての有用性を有すると指摘される。
１つのこのような抗-NGF因子がtrkA-Fcであり、誘因物(decoy)又はスカベンジャーとして作用して蓄積することによって、内在性NGFを不活性化する。trkA-Fcは、IgG抗体の定常ドメインフラグメント(Fc)に連結している、trkAのNGF結合領域から成る融合タンパク質である。trkA-Fcは、ナイーブな動物で痛覚鈍麻を生じさせ、侵害受容器の応答を減じ、かつ無髄の痛みを感じる神経細胞の発芽を減少させる(Bennett et al., 1998)。
NGFに対して産生される抗血清も、局所又は全身注射したときNGFレベルを低減できる。抗-NGF抗血清とtrkA-Fcは、共にカラギナン又はCFA誘導炎症性の足痛(Koltzenberg et al., 1999)及びラットにおける炎症膀胱反応(Jaggar et al., 1999)を弱める。抗-NGF抗血清は、温度痛覚過敏を遮断し、確立された熱痛覚過敏を逆転し、かつ神経障害性疼痛の慢性狭窄傷(constriction injury)(CCI)モデルにおける副行出芽を阻害する(Woolf, 1996; Ro et al., 1999)。trkA-NGF相互作用の小分子阻害因子も報告されている。ラットにおいて、熱的に誘導された炎症性疼痛モデル並びに急性及び持続性疼痛のホルマリン試験でNGF-trkA阻害因子ALE-0540が痛覚過敏を低減する(Owolabi et al., 1999)。ALE-0540は、神経障害性疼痛の坐骨神経損傷モデルでも物理学的な異痛症を低減する(Owolabi et al., 1999)。
一般に、治療用抗体は、密接に関連する受容体、受容体リガンド、チャンネル、又は酵素のファミリー内において、小分子薬物ではめったに達成できない程度の標的選択性の見込みを提供する。NGF-媒介の痛みは、NGFレベルは有毒刺激に応じてその周辺で増加し、かつ抗体は低い血液脳関門浸透性を有することから、抗体による安全かつ効率的な治療に特によく適合する。ポリクロナール抗体は疼痛の動物モデルで有効であることが分かっているが、抗-NGFモノクロナール抗体は、首尾一貫した明確に定義された化学的実体を製造及び特徴づけする際の利点のため、ヒトの治療薬としてさらにうまく開発されるだろう。マウス抗-NGFモノクロナール抗体の抗-侵害受容作用は報告されているが(Sammons et al., 2000)、これら抗体のアミノ酸配列は提供されなかった。
最近の証拠は、NGFが痛みに加えて他の病理を促進することを示唆している。従って、抗-NGF抗体は他のNGF-媒介疾患を治療するための有用性をも有しうる。他の疾患として、限定するものではないが、喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺線維症、他の気道炎の疾患(Hoyle, 2003; Lommatzch et al., 2003)、糖尿病性ニューロパシー(Yasuda et al., 2003)、心不整脈(WO04/032852)、HIV(Garaci et al., 2003)、関節炎、乾癬及び癌(Nakagawara, 2001)が挙げられる。
WO02/096458は、抗-NGF抗体、特にマウスモノクロナール抗体911、及び疼痛、喘息、関節炎及び乾癬といった種々のNGF-関連障害の治療における該抗体の使用に関する。この文献は抗体911がアレルギーの実験用マウスモデルの免疫系に何も副作用を及ぼさなかったと述べている。これら抗体はHongo et al.(2000)によっても開示された。
WO04/032870は、術後疼痛の実験モデルにおけるマウスモノクロナールNGF抗体mab 911及びヒト化NGF抗体E3の疼痛軽減効果について記載している。E3はヒト重鎖γ2a定常領域とは2個のアミノ酸が異なる。
WO04/032852は、心臓病の急死を予防する方法、及びNGF鎮痛薬を用いた 心不整脈の治療方法を開示している。
WO 01/78698は、慢性内臓痛を治療するためのNGFに対するポリクロナール抗血清の使用を開示している。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、NGF、特にヒトNGFに特異的な結合メンバーを提供する。従って、本発明の特異的な結合メンバーは、ヒトNGF又は非ヒトNGF(例えば、非ヒト霊長類のNGF及び/又はラットNGF及び/又はマウスNGF)と結合しうる。
本発明の特異的な結合メンバーは、ヒトNGFに対する抗体、特に、非ヒト霊長類のNGF及び/又はマウスNGF及び/又はラットNGFといった非ヒトNGFと交差反応しうるヒト抗体であり得る。
本発明の特異的な結合メンバーは、好ましくはNGFを中和する。中和とは、NGFの生物学的活性の低減又は阻害、例えば、NGFのその1又は2以上の受容体(好ましくはtrkA)への結合性の低減又は阻害を意味する。生物学的活性の低減は部分的でも全体的でもよい。抗体がNGFを中和する度合は、その中和能(potency)と呼ばれる。中和能は、当業者に知られた及び/又は本明細書で記載若しくは参照する1又は2以上のアッセイを用いて決定又は測定される。使用するアッセイとして、例えば以下のものが挙げられる：
−“FLIPR”カルシウム動員アッセイ(本明細書の実施例2参照)
−PC12生存率アッセイ(本明細書の実施例5参照)
−TF-1増殖アッセイ(本明細書の実施例6参照)
−受容体結合阻害アッセイ(本明細書の実施例9参照)。
アッセイ及び中和能については、本明細書の別のところでさらに詳述する。
【０００８】
中和能について本発明の特異的結合メンバーを最適化することができる。一般に中和能の最適化は、選択された結合メンバーの配列(通常、抗体の可変ドメイン配列)に変異を起こして特異的結合メンバーのライブラリーを生成してから中和能についてアッセイし、中和能の高い特異的結合メンバーを選択することを含む。このようにして選択された“中和能-最適化”特異的結合メンバーは、前記ライブラリーが生成された特異的結合メンバーより高い効力を有する傾向がある。それにもかかわらず、最適化しないでも高い効力の特異的結合メンバーが得られることもあり、例えば、最初のスクリーニングで、例えば生化学的中和アッセイにおいて直接高い能力の特異的結合メンバーが得られることもある。本発明は、中和能-最適化した場合としない場合の両方の特異的結合メンバー、並びに選択された特異的結合メンバーから中和能を最適化する方法を提供する。このように、本発明により、当業者は高い能力を有する特異的結合メンバーを生成することができる。
本発明の特異的結合メンバーは、好ましくは抗痛覚過敏活性及び／又は抗異痛活性を示し、例えば、カラギナン-誘導型熱痛覚過敏を阻害する。
いくつかの実施態様では、本発明の特異的結合メンバーは抗体分子を含む。他の実施態様では、本発明の特異的結合メンバーは、さらに後述するように、非抗体分子内の抗原結合部位、例えば非抗体タンパク質骨格内のCDRのセットを含む。
本発明の種々の局面及び実施態様では、添付の特許請求の範囲の主題が提供される。
本発明内の好ましい実施態様は抗体分子であり、抗体全体(例えば、IgG4のようなIgG)でも抗体フラグメント(例えば、scFv、Fab、dAb)でもよい。好ましくは、本発明の抗体分子はヒト抗体分子である。抗体のVHドメイン及びVLドメインのような、抗体抗原結合部位を含む抗体分子が提供される。VH及びVLドメイン内には、相補性決定領域(complementarity determining regions)(“CDR”)と、フレームワーク構造領域(framework regions)(“FR”)が備わり、場合によってVH又はVLドメインが形成される。抗体抗原結合部位は、抗体のVHドメイン及びVLドメインから成りうる。本明細書で開示されるすべてのVH配列、VL配列、CDR配列、CDRのセット及びHCDRのセット及びLCDRのセットは、本発明の局面及び実施態様を表現する。“CDRのセット”はCDR1、CDR2及びCDR3を含む。従って、HCDRのセットはHCDR1、HCDR2及びHCDR3を意味し、LCDRのセットはLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む。特に断らない限り、“CDRのセット”はHCDR及びLCDRを包含する。
本発明の抗体のVH及びVLドメイン及びCDRの例は、添付の配列表に列挙したとおりである。
【０００９】
本明細書ではいくつかの抗体の系列が開示され、配列、例えば、場合により1又は2以上、例えば2つの置換を有する、CDR配列のセットを参照して定義される。好ましい親系列は1021E5系列である。1021E5系列は好ましい抗体分子1133C11と、1252A5といった“1133C11系列”の他の抗体分子を含む。また、1021E5親系列内には、抗体分子1165D4、1230H7及び1152H5もある。発明者らは、特に価値がある、NGFに対するヒト抗体抗原結合部位を提供するとして、1021E5、1083H4、特に1133C11系列を同定した。
1133C11系列は、以下のような1133C11の6個のCDR配列のセットに関して定義される：HCDR1 配列番号193、HCDR2 配列番号194、HCDR3 配列番号195、LCDR1 配列番号198、LCDR2 配列番号199、及びLCDR3 配列番号200。HCDR1が配列番号193のアミノ酸配列を有し、HCDR2が配列番号194のアミノ酸配列を有し、HCDR3が配列番号195のアミノ酸配列を有し、LCDR1が配列番号198のアミノ酸配列を有し、LCDR2が配列番号199のアミノ酸配列を有し、かつLCDR3が配列番号200のアミノ酸配列を有するCDRのセットを本明細書では“CDRの1133C11セット”と称する。CDRの1133C11セット内のHCDR1、HCDR2及びHCDR3を“HCDRの1133C11セット”と、CDRの1133C11セット内のLCDR1、LCDR2及びLCDR3を“LCDRの1133C11セット”と称する。CDR1133C11セット、HCDRの1133C11セット又はLCDRの1133C11セット、又はその中に1若しくは2個の置換を有するCDRのセットを1133C11系列と言う。
他の好ましい系列及びCDRのセットは、本明細書の別のところで述べるような類似のCDRに関して定義される。これには、好ましい実施態様として表2a(配列番号は表2bに示される)に開示されるCDRのセットが含まれる。表2a及び表2bは、クローン1021E5から誘導された最適化クローン由来のCDR(HCDR及びLCDR)のセットを示し、最適化クローンのCDR配列が1021E5のCDR配列とどのように異なるかを示している。表2a/2bのCDRのセットは、表中に示されるいずれかのクローン由来のHCDRのセット及び/又はLCDRのセットを含み、場合により、1021E5自体を含みうる。
示された、1又は2個のアミノ酸置換を含む開示配列を有するこれらのCDRのセットが提供される。
【００１０】
本発明は、本明細書で開示されるたように定義されたCDRのセット、HCDRのセット又はLCDRのセット、及び開示されたセットのCDR内に1又は2個の置換を有するCDRのセットを含む特異的結合メンバー及び抗体分子をも提供する。CDRの関連するセットは、抗体のフレームワーク又は他のタンパク質骨格内、例えば、後述するように、フィブロネクチン又はチトクロームB(Koide et al., 1998; Nygren et al., 1997)内に与えられる。好ましくは、抗体のフレームワーク領域を利用する。例えば、抗体の1若しくは2以上のCDR又はCDRのセットをフレームワーク(例えば、ヒトフレームワーク)に移植して、抗体分子又は異なる抗体分子を与えうる。例えば、抗体分子は1021E5系列の抗体のCDR及びヒト生殖系列遺伝子セグメント配列のフレームワーク領域を有しうる。 “生殖系列化(germlining)”されていてもよいフレームワーク内にCDRのセットを有する抗体を提供することができる。前記生殖系列化においては、フレームワーク内の1又は2以上の残基を、最も類似したヒト生殖系列のフレームワーク(例えば、VH1ファミリー由来のDP10)又はλ1ファミリー、例えば、DPL5のフレームワークの同等の位置の残基と一致させるように変えることができる。従って、抗体のフレームワーク領域は、好ましくは生殖系列及び/又はヒトの抗体のフレームワーク領域である。
【００１１】
本発明は、DP10を含むヒト生殖系列のフレームワーク内にHCDRのセットを含むVHドメインを有する、NGFに特異的な単離されたヒト抗体を提供する。通常、この特異的結合メンバーは、好ましくはVλ1を含むヒト生殖系列フレームワーク、例えばDPL5内にLCDRのセットを含むVLドメインをも有する。好ましくは、CDRは、本明細書で開示されるCDRのセットである。
“実質的に述べられている通り”とは、本発明の関連CDR、又はVH若しくはVLドメインが本明細書でその配列が述べられている特定領域と同一又は高度に類似していることを意味する。“高度に類似”とは、1〜5、好ましくは1〜4、例えば、1〜3又は1若しくは2、又は3若しくは4個のアミノ酸置換がCDR及び/又はVH若しくはVHドメインに生じうることが考慮されている。
一局面では、本発明はNGFに特異的な結合メンバーであって、ヒト抗体VHドメインとヒト抗体VLドメインで構成され、かつCDRのセットを含む抗体抗原結合部位を含み、前記VHドメインがHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、前記VLドメインがLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、前記HCDR1が配列番号193のアミノ酸配列を有し、前記HCDR2が配列番号194のアミノ酸配列を有し、前記HCDR3が配列番号195のアミノ酸配列を有し、前記LCDR1が配列番号198のアミノ酸配列を有し、前記LCDR2が配列番号199のアミノ酸配列を有し、かつ前記LCDR3が配列番号200のアミノ酸配列を有するか；或いは前記CDRのセットがこのCDRのセットと比較して1又は2個のアミノ酸配列の置換を含む、NGFに特異的な結合メンバーを提供する。
従って、本発明は、NGFに特異的な結合メンバーであって、ヒト抗体VHドメインとヒト抗体VLドメインで構成され、かつCDRのセットを含む抗体抗原結合部位を含み、前記CDRのセットが、CDRの1133C11セット又は本明細書に開示されるCDRの他のセット、或いはCDRの1133C11セット又は本明細書に開示されるCDRの他のセットと比較して1又は2個のアミノ酸配列の置換を含むCDRのセットである、NGFに特異的な結合メンバーを提供する。
好ましい実施態様では、前記1又は2個の置換は、標準的なKabatナンバリング(1991)を用いて、VH及び/又はVLドメインのCDR内の以下の残基のところである。
HCDR1の31、34
HCDR2の51、55、56、57、58、65
HCDR3の96
LCDR1の26、27、27A、27B、28、29、30
LCDR2の56
LCDR3の90、94。
【００１２】
好ましい実施態様では、前記1又は2個の置換が、同定された群の可能な置換残基のCDRの1133C11セット内の以下の残基の1又は2個のところで生じている。
置換の位置 以下の基から成る群より選択される置換残基
HCDR1の31：                  A
HCDR1の34：                  V
HCDR2の51：                  V
HCDR2の55：                  N
HCDR2の56：                  A
HCDR2の57：                  V
HCDR2の58：                  S
HCDR2の65：                  D
HCDR3の96：                  N
LCDR1の26：                  T
LCDR1の26：                  G
LCDR1の27：                  N
LCDR1の27：                  R
LCDR1の27A：                 T
LCDR1の27A：                 P
LCDR1の27B：                 D
LCDR1の28：                  T
LCDR1の29：                  E
LCDR1の30：                  D
LCDR2の56：                  T
LCDR3の90：                  A
LCDR3の94：                  G。
【００１３】
LCDR1内の残基29Eは、特に好ましい実施態様である。
好ましい実施態様は、CDRの1133C11又は1252A5、1152H5、1165D4、1230H7又は1021E5セットを有する。
一実施態様では、単離された特異的結合メンバーは、HCDR3内のアミノ酸配列LNPSLTA(配列番号531)がアミノ酸配列FNSALIS(配列番号532)又はアミノ酸配列MISSLQP(配列番号533)で置き換えられているCDRの1133C11セットを含有するCDRのセットを含む。
本明細書で開示される系列のHCDRのいずれのセットも、単独で特異的結合メンバーとして使用するか又はVLドメインと組み合わせて使用するVHドメインとして供給することができる。1133C11、1021E5又は他の系列の抗体のHCDRのセット、例えば、表2a/2bに示される通りのHCDRのセットを有するVHドメインが提供され、かつ該VHドメインがVLドメインと対になっている場合、前記、1133C11、1021E5又は他の系列の抗体のLCDRのセット、例えば、表2a/2bに示される通りのLCDRのセットを有するVLドメインが提供される。HCDRのセットとLCDRのセットの対は、表2a/2bに示される通りでよく、表2a/2bに示される通りのCDRのセットを含む抗体抗原結合部位を提供する。
VHドメインとVLドメインのフレームワークは、フレームワーク領域を含み、その1又は2以上は生殖系列化フレームワーク領域、通常ヒト生殖系列のフレームワークでよい。VHドメインのフレームワークは、好ましくはヒト重鎖生殖系列のフレームワークであり、VLドメインのフレームワークは、好ましくはヒト軽鎖生殖系列のフレームワークである。重鎖ドメインのフレームワーク領域はVH-1ファミリーから選択され、好ましいVH-1フレームワークはDP-10フレームワークである。軽鎖のフレームワーク領域はλ1ファミリーから選択され、好ましいフレームワークはDPL5である。
【００１４】
1又は2以上のCDRは、1252A5のVH又はVLドメインから選択することができ、適切なフレームワークに組み込むことができる。このことはさらに本明細書で考察される。1252A5のHCDR1、HCDR2及びHCDR3はそれぞれ配列番号393、394、395に示される。1252A5のLCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号398、399、400に示される。
これはすべて、本明細書に開示される他のCDR及びCDRのセット、特に1152H5、1165D4及び1230H7について、同様に当てはまる。
本発明の実施態様は、1021E5系列の抗体分子、例えば抗体分子1021E5の抗体VHドメイン及び/又はVLドメインを利用する。該VHドメイン及び/又はVLドメインを含む抗体抗原結合部位を含む特異的結合メンバーも本発明によって提供される。
【００１５】
好ましい実施態様は以下の通りである。
以下のVHドメイン、VLドメイン、HCDRのセット、LCDRのセット、又はCDRのセット：
1126F1(VH 配列番号102；VL 配列番号107）、1126G5(VH 配列番号112；VL 配列番号117）、1126H5(VH 配列番号122；VL 配列番号127）、1127D9(VH 配列番号132；VL 配列番号137）、1127F9(VH 配列番号142；VL 配列番号147）、1131D7(VH 配列番号152；VL 配列番号157）、1131H2(VH 配列番号162；VL 配列番号167）、1132A9(VH 配列番号172；VL 配列番号177）、1132H9(VH 配列番号182；VL 配列番号187）、1133C11(VH 配列番号192；VL 配列番号197）、1134D9(VH 配列番号202；VL 配列番号207）、1145D1(VH 配列番号212；VL 配列番号217）、1146D7(VH 配列番号222；VL 配列番号227）、1147D2(VH 配列番号232；VL 配列番号237）、1147G9(VH 配列番号242；VL 配列番号247）、1150F1(VH 配列番号252；VL 配列番号257）、1152H5(VH 配列番号262；VL 配列番号267）、1155H1(VH 配列番号272；VL 配列番号277）、1158A1(VH 配列番号282；VL 配列番号287）、1160E3(VH 配列番号292；VL 配列番号297）、1165D4(VH 配列番号302；VL 配列番号307）、1175H8(VH 配列番号312；VL 配列番号317）、1211G10(VH 配列番号322；VL 配列番号327）、1214A1(VH 配列番号332；VL 配列番号337）、1214D10(VH 配列番号342；VL 配列番号347）、1218H5(VH 配列番号352；VL 配列番号357）、及び1230H7(VH 配列番号362；VL 配列番号367)。
なおさらに好ましくは、1083H4(VH 配列番号22；VL 配列番号27）、1227H8(VH 配列番号372；VL 配列番号377)及び1230D8(VH 配列番号382；VL 配列番号387)のVHドメイン、VLドメイン、HCDRのセット、LCDRのセット、又はCDRのセットである。
非常に好ましい実施態様では、配列番号192のアミノ酸配列を有するVHドメインが提供され、これを“1133C11 VHドメイン”と称する。さらに非常に好ましい実施態様では、配列番号197のアミノ酸配列を有するVLドメインが提供され、これを“1133C11 VLドメイン”と称する。本発明により提供される非常に好ましい抗体抗原結合部位は、1133C11 VHドメイン、配列番号192と1133C11 VLドメイン、配列番号197で構成される。この抗体抗原結合部位は、本明細書の別のところでさらに考察されるように、いずれの所望抗体分子型式、例えばscFv、Fab、IgG、IgG4等内にも提供されうる。
【００１６】
さらに非常に好ましい実施態様では、VHドメインが配列番号392のアミノ酸配列を有し、これを“1252A5 VHドメイン”と称する。さらに非常に好ましい実施態様では、VLドメインが配列番号397のアミノ酸配列を有し、これを“1252A5 VLドメイン”と称する。本発明により提供される非常に好ましい抗体抗原結合部位は、1252A5 VHドメイン、配列番号392と1252A5 VLドメイン、配列番号397で構成される。この抗体抗原結合部位は、本明細書の別のところでさらに考察されるように、いずれの所望抗体分子型式、例えばscFv、Fab、IgG、IgG4等でも提供されうる。
さらに非常に好ましい実施態様では、本発明は、1252A5 VHドメイン、配列番号392と1252A5 VLドメイン、配列番号397を含むIgG4抗体分子を提供する。これを本明細書では“1252A5 IgG4”と呼ぶ。
本発明により、1252A5 VHドメイン、配列番号392、及び/又は1252A5 VLドメイン、配列番号397を含む他のIgG又は他の抗体分子が提供され、例えば、抗体のVHドメイン内にHCDRの1252A5セット(配列番号393、394及び395)及び/又は抗体のVLドメイン内にLCDRの1252A5セット(配列番号398、399及び400)を含む。
上述したように、本発明は、ヒトNGFに結合し、かつ1252A5 VHドメイン(配列番号392)及び/又は1252A5 VLドメイン(配列番号397)を含む特異的結合メンバーを提供する。このような特異的結合メンバーの特性は本明細書で開示される。
一般的に、VHドメインはVLドメインと対になって、抗体抗原結合部位を与えるが、さらに後述するように、VHドメインだけを用いて抗原と結合することができる。ある好ましい実施態様では、1252A5 VHドメイン(配列番号392)が1252A5 VLドメイン(配列番号397)と対になって、1252A5 VH及びVLの両ドメインを含む抗体抗原結合部位が形成される。本明細書で開示される他のVH及びVLドメインについて類似の実施態様が提供される。他の実施態様では、1252A5 VHが1252A5 VL以外のVLドメインと対になる。軽鎖の交雑は技術的によく確立されている。この場合もやはり、本明細書で開示される他のVH及びVLドメインについて類似の実施態様が提供される。
本発明のVH及びVLドメイン並びにCDRの変種は、本明細書でアミノ酸配列が示されているものの変種、及びNGFに特異的な結合メンバーで利用できるものの変種を含め、配列の改変又は変異及びスクリーニング方法を用いて得られる。このような方法も本発明によって提供される。
【００１７】
本発明のさらなる局面により、抗原に対する結合についていずれかの特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバー（両方とも該抗原と結合し、かつ本明細書で開示される特異的結合メンバー、VH及び/又はVLドメイン、又は本明細書で開示されるHCDR3、又はこれらのいずれかの変種を含む）が提供される。結合メンバー間の競合は、in vitroで容易にアッセイしうる。例えば、ELISAを用いて、及び/又は1又は2以上の他の非標識結合メンバーの存在下で検出できる特異的なレポーター分子を一方の結合メンバーに付けて標識し、同じエピトープ又は重複エピトープと結合する特異的結合メンバーを同定することができる。
従って、本発明のさらなる局面は、NGFに対する結合性について、抗体分子、例えば特に1252A5又は他の好ましいscFv及び/又はIgG4と競合する、ヒト抗体抗原結合部位を含む特異的結合メンバーを提供する。さらなる局面では、本発明は、NGFに対する結合性について、抗体抗原結合部位と競合するヒト抗体抗原結合部位を含む特異的結合メンバーであって、前記抗体抗原結合部位がVHドメインとVLドメインで構成され、かつ前記VHドメインとVLドメインがCDRの1133C11、1021E5、1252A5又は本明細書で開示される他の系列のセットを含む、特異的結合メンバーを提供する。
NGFに対する抗体であり、かつNGFに対する結合性について、1252A5又は他の抗体分子、CDRの1252A5セット若しくは他のセットを有する抗体分子、又はCDRの1252A5若しくは他の系列のセットを有する抗体分子と競合しうる抗体を得る種々の方法が技術的に利用可能である。
さらなる局面では、本発明は、該抗原と結合できる1又は2以上の特異的結合メンバーを得る方法であって、本発明の特異的結合メンバーのライブラリーと前記抗原を接触させる工程、及び前記抗原と結合できるライブラリーの1又は2以上の特異的結合メンバーを選択する工程を含む方法を提供する。
前記ライブラリーは、粒子又は分子複合体上、例えば酵母菌、細菌又はバクテリオファージ(例えばT7)粒子のような複製可能な遺伝子パッケージ上、または共有ディスプレイ、リボソームディスプレイ若しくは他のin vitroシステム上にディスプレイされ、各粒子又は分子複合体は、その上に表示される抗体VH可変ドメイン、また場合により、存在する場合にはディスプレイされたVLドメインコードする核酸も含む。
抗原に結合でき、バクテリオファージ又は他のライブラリー粒子若しくは分子複合体上にディスプレイされた特異的結合メンバーの選択後、前記選択された特異的結合メンバーをディスプレイしているバクテリオファージ又は他の粒子若しくは分子複合体から核酸を取りうる。この核酸は、前記選択された特異的結合メンバーをディスプレイするバクテリオファージ又は他の粒子若しくは分子複合体から得た核酸の配列を有する核酸からの発現による特異的結合メンバー又は抗体のVH若しくはVL可変ドメインの製造に続いて使用される。
前記選択された特異的結合メンバーの抗体のVH可変ドメインのアミノ酸配列を有する抗体のVH可変ドメインは、該VHドメインを含む特異的結合メンバーとして、単離形態で提供される。
さらにNGFと結合する能力を試験することができ、例えば1252A5(例えばscFv型式及び/又はIgG型式、IgG4の)と、NGFに対する結合性について競合する能力も試験することができる。さらに後述するように、NGFを中和する能力も試験することができる。
本発明の特異的結合メンバーは、1252A5又は他の抗体分子、例えばscFv、好ましくは1252A5又は他のIgG4の親和性で、或いはもっと良い親和性でNGFと結合しうる。
本発明の特異的結合メンバーは、1252A5又は他の抗体分子、例えばscFv、好ましくは1252A5又は他のIgG4の中和能で、或いはもっと良い中和能でNGFを中和しうる。
種々の特異的結合メンバーの結合親和性及び中和能を適切な条件下で比較することができる。
【００１８】
本発明の抗体は、現存する商業的に入手可能な抗-NGF抗体を超えるいくつかの利点を有する。例えば、本発明は、治療用途又は診断用途のためヒトに慢性的又は反復して投与した場合、低度の免疫原性を示すことが予測される、ヒト抗体又は生殖系列の抗体を提供する。さらに、本発明は、NGFのより強力な中和因子なので、少ない抗体材料の使用で所望の治療又は診断効果を達成できる抗体を提供する。さらに、本発明の一実施態様では、NGF/TrKA受容体相互作用の阻害に対する能力がNGF/p75受容体相互作用の阻害について観察される能力より大きい。これは、この点に関して、達成される治療効果の大きさ又は性質のいずれにおいても、或いは望ましくない副作用を減らすという点で、他の明らかに非選択的なNGFアンタゴニスト治療を超える利点を与える。
本発明は、抗-NGF抗体分子を含む不均一調製物をも提供する。例えば、該調製物は、全長の重鎖を含む抗体及びC-末端リジンを欠く重鎖を含む抗体、様々な程度のグリコシル化及び/又は例えばピログルタミン酸残基を形成するためのN-末端グルタミン酸の環化のような誘導体化アミノ酸を含む抗体の混合物でよい。
【００１９】
さらなる局面では、本発明は、本発明の特異的結合メンバー、VHドメイン及び/又はVLドメインをコードする配列を含む単離された核酸、並びに前記特異的結合メンバー、VHドメイン及び/又はVLドメインの産生を惹起するための条件下で前記核酸を発現させて、それを回収する工程を含む、本発明の特異的結合メンバー、VHドメイン及び/又はVLドメインの製造方法を提供する。
本発明のさらなる局面は、本明細書で開示される抗体のVH可変ドメイン及び/又はVL可変ドメインをコードする、通常単離された核酸を提供する。
本発明の別の局面は、本明細書で開示されるVH CDR又はVL CDR配列、特に以下のVH CDR配列：1133C11(VH CDR1 配列番号193、VH CDR2 配列番号194、及びVH CDR3 配列番号195）、1152H5(VH CDR1 配列番号263、VH CDR2 配列番号264、及びVH CDR3 配列番号265）、及び1252A5(VH CDR1 配列番号393、VH CDR2 配列番号394、及びVH CDR3 配列番号395）から選択されるVH CDR配列、又は以下のVL CDR配列：1133C11(VL CDR1 配列番号198、VL CDR2 配列番号199、及びVL CDR3 配列番号200）、1152H5(VL CDR1 配列番号268、VL CDR2 配列番号269、及びVL CDR3 配列番号270）、及び1252A5(VL CDR1 配列番号398、VL CDR2 配列番号399、及びVL CDR3 配列番号400）から選択されるVL CDR、最も好ましくは1252A5 VH CDR3(配列番号395)をコードする、通常単離された核酸を提供する。個々のCDR、HCDR、LCDR及び1252A5、1133C11又は1021E5系列のCDR、HCDR、LCDRのセットをコードする核酸のように、CDRの1252A5セットをコードする核酸、HCDRの1252A5セットをコードする核酸及びLCDRの1252A5セットをコードする核酸も本発明によって提供される。
【００２０】
さらなる局面は、本発明の核酸で形質転換された宿主細胞を提供する。
なおさらなる局面は、抗体VH可変ドメインの製造方法であって、コード化核酸から発現させる工程を含む方法を提供する。該方法は、前記抗体のVH可変ドメインの製造のための条件下で宿主細胞を培養する工程を含みうる。
VL可変ドメインと、VH及び/又はVLドメインを含む特異的結合メンバーの類似の製造方法が本発明のさらなる局面として提供される。
製造方法は、生成物の単離及び/又は精製工程を含みうる。製造方法は、生成物を、医薬的に許容しうる賦形剤のような少なくとも1種の添加成分を含む組成物に調製する工程を含む。
本発明のさらなる局面は、本発明の特異的結合メンバーを含有する組成物、及びそのNGFを阻害又は中和する方法における使用を提供する。この方法には、療法によるヒト又は動物の体の治療の方法が包含される。
本発明の特異的結合メンバーは、ヒト又は動物の体の治療又は診断の方法、例えば、ヒトの患者の疾患又は障害の治療方法(予防的治療をも包含しうる)であって、前記患者に有効量の本発明の特異的結合メンバーを投与することを含む方法で使用しうる。本発明によって治療しうる状態として、NGFが役割を果たすいずれの状態も挙げられ、特に疼痛、喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺線維症、他の気道炎症疾患、糖尿病性ニューロパシー、HIV、心不整脈、関節炎、乾癬及び癌が挙げられる。
本発明のこれら及び他の局面について、さらに詳細に後述する。
【００２１】
〔用語〕
ここで、本明細書で使用される場合、“及び/又は”は、その2つの指定した各特徴又は構成要素が他方もあるか又はないという特定の開示として解釈すべきであることを指摘すしておくのが都合よい。例えば、“A及び/又はB”は、 (i)A、(ii)B及び(iii)AとBという各特定の開示として、あたかも本明細書で個々に示しているかのように解釈するものとする。
〔NGF〕
NGF(β-NGFとしても知られる)は神経成長因子である。本発明の文脈では、NGFは通常ヒトNGFであるが、非ヒトNGF(例えば、非ヒト霊長類のNGF及び/又はラットNGF及び/又はマウスNGF)でもよい。NGFは、場合によっては“抗原”とも呼ばれる。
本明細書で記載されるアッセイで用いられるNGFは、通常ヒト、ラット又はマウスのNGFであるが、別の非ヒト動物由来のNGF、例えば非ヒト霊長類のNGFを使用できるだろう。
〔疼痛(痛み)〕
これは、技術上周知なように、痛みの感覚を表し、以下の状態の1又は2以上、或いはすべてを包含しうる。
−痛覚過敏(普通に痛い刺激に対する過剰な痛みの反応)；
−異痛(普通痛くない刺激によって引き起こされる痛みの感覚)；
−如何なる明白な外部作用も存在しない何らかのメカニズムによって引き起こされる痛みの自発感覚；
−物理的刺激、例えば、熱、暖かさ、冷たさ、圧力、振動、静的若しくは動的接触、又は体位及び体の動きによって誘発される痛み；
−何らかのメカニズム、例えば、外傷、感染、炎症、代謝疾患、脳卒中又は神経性疾患によって引き起こされる肉体痛及び内臓痛。
痛みは、例えば急性の痛み、短期の痛み、持続性の侵害受容性の痛み、又は持続性若しくは慢性の神経障害性の痛みでよい。
【００２２】
〔特異的結合メンバー〕
これは、相互に結合特異性を有する分子対の構成要素を表す。特異的結合対のメンバーは、天然に誘導され、又は全体的若しくは部分的に合成的に製造される。分子対の一方のメンバーはその表面、又はキャビティ上に、該分子対の他方のメンバーの特定の空間的かつ極性の組織に特異的に結合し、ひいては前記組織に相補的な領域を有する。従って、分子対のメンバーは、相互に特異的に結合するという特性を有する。特異的結合対のタイプの例は、抗原-抗体、ビオチン-アビジン、ホルモン-ホルモン受容体、受容体-リガンド、酵素-基質である。本発明は、抗原-抗体タイプの反応に関係する。
特異的結合メンバーは、通常、抗原結合部位を有する分子を含む。例えば、特異的結合メンバーは抗体分子でよく、又は抗原結合部位を含む非抗体タンパク質でよい。抗原結合部位は、フィブロネクチン又はチトクロームB等の非抗体タンパク質骨格上のCDRの配置によって(Haan & Maggos, 2004; Koide et al., 1998; Nygren et al., 1997)、或いはタンパク質骨格内のループのアミノ酸残基をランダム化又は変異させて所望の標的に対する結合特異性を与えることによって供給されうる。タンパク質内で新しい結合部位を操作するための骨格はNygrenら(1997)によって詳細に総説されている。抗体模倣物用タンパク質骨格はWO/0034784に開示されており、該発明者らは少なくとも1つのランダム化ループを有するフィブロネクチンIII型ドメインを含むタンパク質(抗体模倣物)を開示している。1又は2以上のCDR、例えばHCDRのセットを移植するのに適した骨格は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのいずれのドメインメンバーによっても供給されうる。骨格はヒト又は非ヒトのタンパク質でよい。
非抗体タンパク質骨格の利点は、少なくともいくつかの抗体分子より小さく及び/又は製造しやすい骨格分子内に抗原結合部位を備えうることである。小サイズの特異的結合メンバーは、細胞に入り、組織の中に深く浸透し、又は他の構造内の標的に達する能力、或いは標的抗原のタンパク質キャビティ内部に結合する能力などの有用な生理学的特性を与えうる。
非抗体タンパク質骨格内の抗原結合部位の使用はWess, 2004で総説されている。典型的には、安定した骨格と1又は2以上の可変ループを有するタンパク質であり、該ループのアミノ酸配列が特異的又はランダムに変異して、標的抗原と結合するための特異性を有する抗原結合部位が生成される。このようなタンパク質として、S. aureus由来のタンパク質AIgG-結合ドメイン、トランスフェリン、テトラネクチン、フィブロネクチン(例えば、第10フィブロネクチンIII型ドメイン)及びリポカリン(lipocalin)が挙げられる。他のアプローチとして、合成“ミクロボディ”(Selecore GmbH)が挙げられ、これはシクロチド(cyclotide)、すなわち分子内ジスルフィド結合を有する小型タンパク質をベースとしている。
【００２３】
抗体配列及び/又は抗原結合部位に加え、本発明の特異的結合メンバーは、他のアミノ酸を含んで、例えば、ペプチド又はポリペプチド、折り畳みドメインを形成し、或いは該分子に、抗原と結合する能力に加えて別の機能特性を与えることができる。本発明の特異的結合メンバーは、検出可能標識を保有し、或いは毒素又は標的成分若しくは酵素に接合しうる(例えば、ペプチジル結合又はリンカーを介して)。例えば、特異的結合メンバーは抗原結合部位のみならず、触媒部位(例えば、酵素ドメイン内)を含んでよく、該抗原結合部位が抗原に結合し、そのようにして触媒部位を抗原に対する標的にする。触媒部位は、例えば切断によって、抗原の生物学的機能を阻害しうる。
上述したように、CDRはフィブロネクチン又はチトクロームB等の骨格によって保持することができるが(Haan & Maggos, 2004; Koide et al., 1998; Nygren et al., 1997)、本発明のCDR又はCDRのセットを保持するための構造は、一般的にCDR又はCDRのセットが、再配列された免疫グロブリン遺伝子によってコードされている天然に存在するVH及びVL抗体可変ドメインのCDR又はCDRのセットに対応する位置にある、抗体の重鎖若しくは軽鎖配列又はその実質的部分の構造だろう。免疫グロブリン可変ドメインの構造と位置は、下記文献を参照して決定される(Kabat, et al., 1987, およびその改訂版, インターネットから入手可能(http://immuno.bme.nwu.edu または検索エンジンで “Kabat”を検索されたし)。
【００２４】
〔抗体分子〕
これは、免疫グロブリンを表し、天然のものでも、部分的若しくは全体的に合成的に製造されたものでもよい。この用語は、抗体抗原結合部位を含むいずれのポリペプチド又はタンパク質をも包含する。抗体抗原結合部位を含む抗体フラグメントは、Fab、scFv、Fv、dAb、Fd等の分子；及びディアボディ(diabodies)である。
モノクロナール抗体及び他の抗体を考えることができ、組換えDNA技術の手法を用いて、元の抗体の特異性を保持している他の抗体又はキメラ分子を生成することができる。このような手法は、抗体の免疫グロブリン可変領域またはCDRをコードするDNAを、異なる免疫グロブリンの定常領域または定常領域とフレームワーク領域に導入する工程を含みうる。例えば、EP-A-184187、GB 2188638A又はEP-A-239400、及び多数のその後の文献を参照されたい。抗体を産生するハイブリドーマ又は他の細胞は遺伝子の変異又は他の変化を受け、産生される抗体の結合特異性を変えることも変えないこともある。
多くの手段で抗体を改変できるので、用語“抗体分子”は、必要な特異性を備えた抗体抗原結合部位を有するいずれの特異的結合メンバー又は物質をも包含するものと解釈すべきである。従って、この用語は、天然のものでも又は部分的若しくは全体的に合成のものでも、抗体抗原結合部位を含むいずれのポリペプチドも含め、抗体のフラグメント及び誘導体を包含する。従って、別のポリペプチドに融合されている、抗体抗原結合部位を含むキメラ分子、又は等価物が含まれる。キメラ抗体のクローニングと発現は、EP-A-0120694及びEP-A-0125023、並びに多数のその後の文献に開示されている。
技術上利用可能な抗体操作のさらなる方法により、ヒト抗体及びヒト化抗体を単離することができる。例えば、Kontermann & Dubel (2001)によって記載されているように、ヒトハイブリドーマを製造できる。特異的結合メンバーを製造するための別の確立された技法であるファージディスプレイ法は、Kontermann & Dubel (2001)及びWO92/01047(さらに後述する)等の多くの刊行物で詳述されている。マウス抗体遺伝子が不活化され、かつ機能的にヒト抗体遺伝子と置き換えられているが、マウスの免疫系の他の構成要素は元のままであるトランスジェニックマウスをヒト抗体を単離するために使用することができる(Mendez et al., 1997)。
【００２５】
合成抗体分子は、例えば、Knappikら(2000)又はKrebsら(2001)によって記載されているように、適切な発現ベクター内で合成及び組み立てられたオリゴヌクレオチドを用いて生成された遺伝子由来の発現によって生成される。
抗体全体のフラグメントが抗原と結合するという機能を果たせることは分かっている。結合性フラグメントの例は、(i)VL、VH、CL及びCH1ドメインから成るFabフラグメント；(ii)VH及びCH1ドメインから成るFdフラグメント；(iii)一本鎖抗体のVL及びVHドメインから成るFvフラグメント；(iv)VH又はVLドメインから成るdAbフラグメント(Ward, 1989; McCafferty et al., 1990; Holt et al., 2003)；(v)単離されたCDR領域；(vi)F(ab')2フラグメント、すなわち2つの連結されたFabフラグメントを含む二価フラグメント；(vii)単鎖Fv分子(scFv)(VHドメインとVLドメインがペプチドリンカーで結合され、前記２つのドメインが会合して抗原結合部位を形成できる)(Bird et al., 1988; Huston et al., 1988)；(viii)二重特異性単鎖Fvダイマー(PCT/US92/09965)及び(ix)“ディアボディ(diabodies)”、すなわち遺伝子融合によって構築された多価又は多特異性フラグメント(WO94/13804; Holliger et al., 1993)である。Fv、scFv又はディアボディ分子は、VH及びVLドメインを連結するジスルフィドブリッジの組み込みによって安定化される(Reiter et al., 1996)。CH3ドメインに結合しているscFvを含むミニボディ(minibodies)も作製できる(Hu et al., 1996)。
dAb(ドメイン抗体)は、抗体の小型の単量体抗原結合フラグメント、すなわち、抗体の重鎖又は軽鎖の可変領域である(Holt et al., 2003)。VH dAbは、ラクダ科の動物(例えばラクダ、ラマ)で天然に存在し、ラクダ科の動物を標的抗原で免疫化し、抗原特異性Ｂ細胞を単離し、個々のＢ細胞由来のdAb遺伝子を直接クローニングすることによって生産される。細胞培養でもdAbを生産できる。dAbは、その小さいサイズ、良い溶解性及び温度安定性のため、選択及び親和性成熟にとって特に生物学的に有用かつ好適である。本発明の特異的結合メンバーは、本明細書で実質的に述べられている通りのVH又はVLドメインを含むdAbでよく、或いは本明細書で実質的に述べられている通りのCDRのセットを含むVH又はVLドメインでよい。
【００２６】
二重特異性抗体を使用する場合、これらは、種々の手段で製造しうる従来の二重特異性抗体でよく(Holliger & Winter, 1993)、例えば、化学的又は混成ハイブリドーマから調製され、或いは上述した二重特異性抗体フラグメントのいずれでもよい。二重特異性抗体の例として、BiTETM技術が挙げられ、この技術では、特異性の異なる2つの抗体の結合ドメインを用い、短いフレキシブルなペプチドを介して直接結合できる。この技術は、短い単一のポリペプチド鎖上で2つの抗体を結合する。ディアボディ及びscFvは、可変ドメインだけを用いてFc領域なしで構成され、抗イディオタイプの反応の影響を低減する可能性がある。
二重特異性全抗体(whole antibody)（抗体全体）と対照的に、二重特異性ディアボディも、大腸菌で容易に構築及び発現させうることから特に有用である。適切な結合特異性のディアボディ(及び多くの他のポリペプチド、例えば抗体フラグメント)は、ファージディスプレイ法(WO94/13804)を用いてライブラリーから簡単に選択される。ディアボディの1つの腕が、例えば、NGFに向けられた特異性を有するように一定に保たれる場合、他方の腕が変化して適切な特異性の抗体が選択されるライブラリーを作成できる。二重特異性の全抗体(whole antibody)は、“knobs-into-holes”操作によって作成される(Ridgeway et al., 1996)。
〔抗原結合部位〕
これは、標的抗原のすべて又は一部に結合し、かつ標的抗原のすべて又は一部に相補的な分子の部分を表す。抗体分子では、抗体抗原結合部位と呼び、標的抗原のすべて又は一部に特異的に結合し、かつ標的抗原のすべて又は一部に相補的な、該抗体の部分を含む。抗原が大きい場合、抗体は該抗原の特定部分にだけ結合することがあり、この部分をエピトープと呼ぶ。抗体抗原結合部位は、1又は2以上の抗体可変ドメインによって供給されうる。好ましくは、抗体抗原結合部位は抗体の軽鎖可変領域(VL)と抗体の重鎖可変領域(VH)を含む。
〔特異的〕
これは、特異的結合対の1つのメンバーがその特異的結合相手以外の分子に対して如何なる有意な結合性をも示さないであろう状況を表すために使用しうる。この用語は、抗原結合部位が、いくつかの抗原によって支持されている特定のエピトープに特異的である場合にも適用でき、この場合、該抗原結合部位を支持している該特異的結合メンバーは、該エピトープを支持している種々の抗原に結合できるだろう。
〔単離された〕
これは、本発明の特異的結合メンバー、又は該結合メンバーをコードしている核酸が一般的に本発明に従っている状態を指す。単離されたメンバー及び単離された核酸には、該メンバー又は核酸が、その天然の環境、又はそれらがin vitro又はin vivoで実施される組換えDNA技術によって調製されるときの環境(例えば、細胞培養)で見られる他のポリペプチド又は核酸などの、前記メンバー及び核酸と天然では会合している物質が無い、或いは実質的に無い。メンバー及び核酸を希釈剤又はアジュバントと配合してよい。なお、単離される目的によっては、例えば、イムノアッセイで使うためのマイクロタイタープレートを被覆するために使用する場合、メンバーは通常ゼラチン又は他の担体と混合され、或いは診断又は治療で使用する場合、メンバーは医薬的に許容しうる担体又は希釈剤と混合されるだろう。特異的結合メンバーは、天然に、又は異種真核生物細胞(例えば、CHO又はNS0(ECACC 85110503))細胞の系によってグリコシル化されることもあり、或いは特異的結合メンバーは、グリコシル化されない場合もある(例えば、原核生物細胞の発現によって生成される場合)。
【００２７】
〔詳細な説明〕
上述したように、好ましくは本発明の特異的結合メンバーはNGFを中和する。抗体がNGFを中和する度合をその中和能と呼ぶ。
中和能は、通常、特に断らない限りIC50値としてnMで表される。IC50は、抗体分子のメジアン阻害濃度である。機能アッセイでは、IC50は、生物学的応答の最大の50%まで生物学的応答を減少させる濃度である。リガンド-結合性研究では、IC50は、最大の特異的結合レベルの50%まで受容体の結合性を減少させる濃度である。
IC50は、例えば、本明細書の実施例2、5、6又は9で記載されているように、生物学的応答の％(例えば、FLIPRアッセイではカルシウムイオン動員によって、PC12アッセイでは生存率によって、或いはTF-1増殖アッセイでは増殖によって表される)又は特異的な受容体結合性の％を、該特異的結合メンバー濃度の対数の関数としてプロットし、Prism(GraphPad)などのソフトウェアプログラムを用いてシグモイド関数を該データに当てはめてIC5O値を生成することによって計算される。
【００２８】
本発明の特異的結合メンバーは、好ましくは、TrkA受容体を発現する細胞、例えばTrkA遺伝子で組換え操作によってトランスフェクトされた細胞、例えばHEK細胞内におけるヒトNGF-誘発細胞内カルシウム動員を阻害する。本明細書の実施例2で記載されているような“FLIPR”カルシウム動員アッセイでは、好ましくはヒトNGFを中和する中和能(IC50)が600、100、90、80、70、60、50、40、30、20又は10nM以下である。一般的に、本発明の特異的結合メンバーは、5nM以下、好ましくは2.5nM以下、さらに好ましくは1nM以下の中和能を有する。特に好ましい実施態様では、中和能は0.5nM以下、例えば0.4nM以下；0.3nM以下：0.2nM以下；又は0.15nM以下である。いくつかの実施態様では、中和能は約0.1nMでありうる。
中和能は、0.1〜100nM、0.1〜50nM、0.1〜10nM、又は0.1〜1.0nMであり得る。例えば、中和能は、0.1〜5.0nM、0.2〜5.0nM、0.3〜5.0nM、又は0.3〜0.4nMであり得る。
本発明のいくつかの実施態様では、本明細書で記載されるようなHEK細胞アッセイにおいて、中和能を最適化していない特異的結合メンバーの中和能は、ヒトNGFに対して約1.8〜560nM、及び/又はラットNGFに対して約2.9〜620nMである。いくつかの実施態様では、本明細書で記載されるようなHEK細胞アッセイにおける中和能を最適化した特異的結合メンバーの中和能は、ヒトNGFに対して約0.12〜120nM、ラットNGFに対して約0.11〜37nM及びマウスNGFに対して約0.11〜71nMである。しかし、これらは単なる例に過ぎず、もっと高い中和能を達成し得る。中和能の最適化を用いて、所定の特異的結合メンバーから、より高い中和能の特異的結合メンバーを作製できるが、中和能の最適化をしない場合でさえ、高い中和能の特異的結合メンバーが得られることにも留意されたい。
【００２９】
本発明の特異的結合メンバーは、好ましくはNGF維持された血清除去PC12細胞の生存を阻害する。本明細書の実施例5で記載されているようなヒトNGFに関するPC12生存率アッセイにおける本発明の特異的結合メンバーの中和能は、通常、1500nM以下、好ましくは50nM以下、又は10nM以下である。上述したように、かつ本明細書で実証するように、中和能-最適化を用いて、より高い抗-NGF中和能を達成することができる。好ましくは、特異的結合メンバーは、5nM、4nM、3nM、2nM、1.5nM、1nM又は0.5nM以下の中和能を有する。いくつかの実施態様では、中和能は、約0.1nM以上、0.2nM以上である。従って、中和能は、0.1又は0.2nMから0.5、1.5、5又は50nMであり得る。
本発明のいくつかの実施態様では、本明細書で記載されるPC12生存率アッセイにおける中和能を最適化した特異的結合メンバーの中和能は、ヒトNGFに対して約0.2〜670nMであり、ラットNGFに対して約0.2〜54nMである。
【００３０】
本発明の特異的結合メンバーは、好ましくはNGF-刺激TF-1細胞増殖を阻害する。本明細書の実施例6で記載されるようにヒトNGFについてのTF-1増殖アッセイにおける本発明の特異的結合メンバー(通常、中和能を最適化した特異的結合メンバー)の中和能は、一般的に5nM以下、好ましくは1nM以下である。好ましくは、本発明の特異的結合メンバーは、ヒトNGFに対して0.7、0.6、0.5、0.45、0.4、0.3、0.2又は0.1nM以下の中和能を有する。例えば、中和能は、0.05〜0.1nM、0.05〜0.2nM、0.05〜0.3nM、0.05〜0.4nM、又は0.05〜0.5nMであり得る。
本発明のいくつかの実施態様では、本明細書で記載されるようにTF-1増殖アッセイにおいて、中和能を最適化した特異的結合メンバーの中和能は、ヒトNGFに対して約0.08〜0.7nM、ラットNGFに対して約0.07〜1.9nM及びマウスNGFに対して約0.07〜1.4nMである。
本発明の特異的結合メンバーは、好ましくは、TrkA及び/又はp75受容体、好ましくはヒトのTrkA及び/又はp75受容体に対するNGFの結合を阻害する。本発明は、さらに一般的に、p75受容体に対するNGFの結合よりもTrkA受容体に対するNGFの結合を優先的に遮断する特異的結合メンバーにも拡張する。本明細書の実施例9に記載されるようにTrkA受容体結合アッセイにおける本発明の特異的結合メンバー(通常、中和能を最適化した特異的結合メンバー)の中和能は、ヒトNGFを中和するため一般的に2.5nM以下、好ましくは1nM以下である。好ましくは、本発明の特異的結合メンバーは、ヒトNGFのTrkAへの結合を中和するため、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1又は0.075nM以下の中和能を有する。例えば、中和能は、0.05〜0.1nM、0.05〜0.2nM、0.05〜0.3nM、0.05〜0.4nM、又は0.05〜0.5nMであり得る。
本明細書の実施例9に記載されているようなp75受容体結合アッセイで本発明の特異的結合メンバー(通常、中和能を最適化した特異的結合メンバー)の中和能は、ヒトNGFを中和するため一般的に1.5nM以下、好ましくは1nM以下である。好ましくは、本発明の特異的結合メンバーは、ヒトNGFのp75への結合を中和するため0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2又は0.1nM以下の中和能を有する。例えば、中和能は、0.1〜0.2nM、0.1〜0.3nM、0.1〜0.4nM、0.1〜0.5nM、又は0.1〜0.6nMであり得る。
本発明のいくつかの好ましい特異的結合メンバーは、p75受容体に対するNGF(例えば、ヒト及び/又はラットのNGF)の結合よりもTrkA受容体に対するNGFの結合を優先的に阻害する。従って、いくつかの実施態様では、本発明の特異的結合メンバーは、p75に対するNGF(例えば、ヒト及び/又はラットのNGF)の結合の阻害よりもTrkAに対するNGFの結合の阻害について、より低い結合阻害定数、Kiを有する。Kiは、実施例9で示す式を用いて計算される。或いは、結合阻害定数をpKiとして表すこともでき、-log10Kiとして計算できる。従って、本発明の特異的結合メンバーは、p75に対するNGFの結合の阻害より高いTrkAに対するNGFの結合の阻害のpKi値を有する。
【００３１】
好ましくは、本発明の特異的結合メンバーは1、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3又は0.2nM以下の親和性でヒトNGF及び/又はラットNGFと結合する。例えば、特異的結合メンバーは、約0.25〜0.44nMの親和性でヒトNGFと結合し、約0.25〜0.70nMの親和性でラットNGFと結合する。
上述したように、本発明では、本明細書で開示される抗体分子の変種を製造かつ使用する。多変量データ解析法を抗体の構造/特性-活性関係に適用する際に計算化学の指示に従い(Wold, et al. 1984)、統計的回帰、パターン認識及び分類などの周知の数学法を用いて、抗体の定量的な活性-特性関係を誘導できる(Norman et al.  1998; Kandel & Backer, 1995; Krzanowski, 2000; Witten & Frank, 1999; Denison (Ed), 2002; Ghose & Viswanadhan)。抗体の特性は、抗体の配列、機能的構造及び三次元構造の実験的モデル及び理論的モデルから導くことができ(例えば、接触すると考えられる残基又は計算した物理化学的性質の解析)、これら特性を単独で、また組み合わせて考慮することができる。
【００３２】
VHドメインとVLドメインで構成される抗体抗原結合部位は、ポリペプチドの6個ループ、すなわち軽鎖可変ドメイン(VL)由来の3個のループと重鎖可変ドメイン(VH)由来の3個のループによって形成されている。既知の原子構造の抗体の解析が、抗体の結合部位の配列と三次元構造との間の関係を明らかにした(Chothia et al. 1992; Al-Lazikani, et al. 1997)。この関係は、VHドメインの第3領域(ループ)を除き、結合部位ループが小数の主鎖コンホメーション：正準構造(canocical structure)の1つを有することを示唆している。個々のループに形成される正準構造は、その大きさと、ループ及びフレームワーク領域の両方でキーとなる部位の特定残基の存在によって決定されることが分かっている(Chothia et al. 及びAl-Lazikani et al.,前出)。
この配列と構造の関係の研究は、未知の三次元構造の予測ではなく、既知配列の抗体の、そのCDRループの三次元構造を維持し、ひいては結合特異性を維持する際に重要な当該残基の予測のために使用される。この予測を、リード最適化実験からの結果に対する予測の比較によってバックアップすることができる。構造的なアプローチでは、いずれかの自由に入手可能なパッケージ又は市販パッケージ、例えばWAM(Whitelegg & Rees, 2000)を用いて、抗体分子のモデルを作製することができる(Chothia, et al. 1986)。Insight II(Accelerys, Inc.)又はDeep View(Guex & Peitsch, 1997)等のタンパク質の可視化と解析のソフトウェアパッケージを用いて、CDRの各位置で考えられる置換を評価することができる。この情報を用いて、活性に対する最小又は有益な効果を有する可能性のある置換を生じさせることができる。
CDR、抗体のVH又はVLドメイン及び特異的結合メンバーのアミノ酸配列内で置換を生じさせるために必要な方法はこの技術分野で利用可能である。活性に対する最小又は有益な効果を有すると予測され、或いは予測されていない置換のある変種配列を作製し、NGFと結合する能力及び/又はNGFを中和する能力について及び/又はいずれかの他の所望の特性について試験することができる。
【００３３】
配列が本明細書で詳細に開示されているいずれのVHドメイン及びVLドメインの可変ドメインのアミノ酸配列の変種でも、議論されるように、本発明に従って利用しうる。具体的な変種は、1又は2以上のアミノ酸配列の改変(アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び/又は挿入)を含んでよく、約20未満の改変、約15未満の改変、約10未満の改変、約5以下の改変、おそらく5、4、3、2又は1の改変でよい。改変は、1又は2以上のフレームワーク領域及び/又は1又は2以上のCDRで起こりうる。
好ましくは、改変は機能の損失をもたらさいないので、このようにして改変したアミノ酸配列を含む特異的結合メンバーは、好ましくはNGFと結合する能力及び/又はNGFを中和する能力を保持している。さらに好ましくは、特異的結合メンバーは、例えば、本明細書で述べるアッセイで測定した場合、改変が生じていない特異的結合メンバーと同じ定量的な結合能及び/又は中和能を保持する。最も好ましくは、このように改変したアミノ酸配列を含む特異的結合メンバーは、改良された、NGFと結合する能力及び/又はNGFを中和する能力を有する。
改変は、1又は2以上のアミノ酸残基を天然に存在しないか又は非標準のアミノ酸と置き換え、1又は2以上のアミノ酸残基を天然に存在しないか又は非標準のアミノ酸に改変し、或いは配列中に1又は2以上の天然に存在しないか又は非標準のアミノ酸を挿入することを含みうる。本発明の配列の改変の好ましい数と位置については、本明細書の別の箇所に記載されている。天然に存在するアミノ酸は、標準的な一文字表記によって、G、A、V、L、I、M、P、F、W、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D、Eとして同定されている20個の“標準的”L-アミノ酸を包含する。非標準のアミノ酸は、現存するアミノ酸残基のポリペプチド骨格鎖に組み込まれているか、又は現存するアミノ酸残基のポリペプチド骨格鎖の改変の結果生じうるいずれの他の残基をも包含する。非標準のアミノ酸は、天然に存在してもよく、天然に存在しなくてもよい。いくつかの天然に存在する非標準のアミノ酸、例えば、4-ヒドロキシプロリン、5-ヒドロキシリジン、3-メチルヒスチジン、N-アセチルセリン等が技術上知られている(Voet & Voet, 1995)。そのN-α位で誘導体化されている当該アミノ酸残基は、アミノ酸配列のそのN-末端にだけあるだろう。本発明では、通常、アミノ酸はL-アミノ酸であるが、いくつかの実施態様では、アミノ酸がD-アミノ酸でもよい。従って、変化は、L-アミノ酸をD-アミノ酸に改変すること、或いはL-アミノ酸をD-アミノ酸と置き換えることを含みうる。アミノ酸のメチル化、アセチル化及び/又はリン酸化形態も知られており、本発明のアミノ酸は、このような改変も受けうる。
【００３４】
本発明の抗体ドメイン及び特異的結合メンバーのアミノ酸配列は、上述したような天然に存在しないか又は非標準のアミノ酸を含んでよい。いくつかの実施態様では、合成中に非標準のアミノ酸(例えばD-アミノ酸)がアミノ酸配列中に組み込まれ、他の実施態様では、該アミノ酸配列の合成後に、“元の”標準アミノ酸の改変又は置換によって、非標準のアミノ酸が導入されうる。
非標準及び/又は天然に存在しないアミノ酸の使用は、構造的及び機能的な多様性を増やし、ひいては本発明の特異的結合メンバーにおいて所望のNGF結合特性及び中和特性を達成するための可能性を高めうる。さらに、動物に投与した後、L-アミノ酸を有するポリペプチドはin vivo分解するので、D-アミノ酸及び類似体は、標準的なL-アミノ酸と比較して良い薬物動態学的プロフィールを有することが分かっている。
上述したように、本明細書で実質的に述べられている通りのCDRアミノ酸配列は、好ましくはヒト抗体の可変ドメイン又はその実質的部分内にCDRとして支持されている。本明細書で実質的に述べられているHCDR3配列は、本発明の好ましい実施態様を示しており、各HCDR3配列は、好ましくはヒト重鎖可変ドメイン又はその実質的部分内にHCDR3として保持されている。
本発明で利用する可変ドメインは、いずれの生殖系列又は再配列されたヒトの可変ドメインからも得られ、又は誘導され、或いは既知のヒトの可変ドメインのコンセンサス配列又は実際の配列をベースとした合成可変ドメインでもよい。組換えDNA技術を用いて、CDR(例えばCDR3)を欠いている可変ドメインのレパートリーに本発明のCDR配列(例えばCDR3)を導入することができる。
例えば、Marksら(1992)は、可変ドメイン領域の5'末端に対する、又は該5'末端の隣接部に対するコンセンサスプライマーを、ヒトVH遺伝子の第3フレームワーク領域へのコンセンサスプライマーと共に用いてCDR3を欠いているVH可変ドメインレパートリーを供給する、抗体の可変ドメインのレパートリーの製造方法を開示している。Marksらは、さらに、このレパートリーを特定の抗体のCDR3と結合させる方法を開示している。類似の技術を用いて、本発明のCDR3-由来配列を、CDR3を欠くVHドメイン又はVLドメインのレパートリーとシャッフルし、このシャッフルした完全なVHドメイン又はVLドメインを同族のVHドメイン又はVLドメインと結合させて本発明の特異的結合メンバーを提供することができる。次に、このレパートリーを、WO92/01047のファージディスプレイ系、又はその後の多数のいずれかの文献(Kay, Winter & McCafferty (1996)等)の適切な宿主系で表示させうるので、適切な特異的結合メンバーを選択することができる。レパートリーは、104の個々のメンバーより以上、例えば、106〜108又は1010のメンバー由来の何でもから成りうる。他の適切な宿主系として、酵母菌ディスプレイ、細菌ディスプレイ、T7ディスプレイ、リボソームディスプレイ及び共有ディスプレイが挙げられる。
類似のシャッフリング又は組合せ法もStemmer(1994)によって開示されており、この文献はβ-ラクタマーゼ遺伝子に関する技術について述べているが、抗体の製造で使用しうるアプローチについては考察されていない。
さらなる代替法は、1又は2以上の選択されたVH及び/又はVL遺伝子のランダム変異導入を用いてその完全な可変ドメイン内に変異を起こすことによって、本発明のCDR-誘導配列を支持する新規なVH領域又はVL領域を製造することである。このような技術は、Gramら(1992)によって開示されており、エラープローンPCRを使用している。好ましい実施態様では、1又は2以上のアミノ酸の置換がHCDR及び/又はLCDRのセット内で生じている。
使用しうる別の方法はCDR領域のVH又はVL遺伝子に対する直接の変異導入である。このような技術はBarbasら(1994)及びSchierら(1996)によって開示されている。
上述したすべての方法はそれ自体技術上周知であり、当業者は該方法を用いて、技術上ルーチン的な方法論で本発明の特異的結合メンバーを提供できるだろう。
【００３５】
本発明のさらなる局面は、NGF抗原に特異的な抗体抗原結合部位を得る方法であって、本明細書で述べられるVHドメインのアミノ酸配列における1又は2以上のアミノ酸の付加、欠失、置換又は挿入を経て、該VHドメインのアミノ酸配列の変種であるVHドメインを供給する工程、場合によりこのようにして供給された前記VHドメインを1又は2以上のVLドメインと結合する工程、及び前記VHドメイン又はVH/VLの組合せを試験して、NGF抗原に特異的な、場合により1又は2以上の好ましい特性、好ましくはNGF活性を中和する能力を有する特異的結合メンバー又は抗体抗原結合部位を同定する工程を含む方法を提供する。前記VLドメインは、実質的に本明細書で述べられている通りのアミノ酸配列を有しうる。
本明細書で開示されているVLドメインの1又は2以上の変種を1又は2以上のVHドメインと結合する類似の方法を利用できる。
好ましい実施態様では、1252A5 VHドメイン(配列番号392)を変異させて1又は2以上のVHドメインのアミノ酸配列の変種を供給し、任意に1252A5 VL(配列番号397)と結合させうる。
【００３６】
本発明のさらなる局面は、NGF抗原に特異的な特異的結合メンバーの製造方法であって、以下の工程を含む方法を提供する。
(a)置換されるCDR3を含むか、又はCDR3コード化領域を欠いているVHドメインをコードする核酸の出発レパートリーを供給する工程；
(b)前記レパートリーを、VH CDR3について本明細書で実質的に述べられているアミノ酸配列をコードするドナー核酸と、前記ドナー核酸が前記レパートリーのCDR3領域に挿入されるように結合して、VHドメインをコードする核酸の生成物レパートリーを供給する工程；
(c)前記生成物レパートリーの核酸を発現させる工程；
(d)NGFに特異的な特異的結合メンバーを選択する工程；及び
(e)前記特異的結合メンバー又は前記特異的結合メンバーをコードする核酸を回収する工程。
この場合もやはり、本発明のVL CDR3を、置換されるCDR3を含むか、又はCDR3コード化領域を欠いているVLドメインをコードする核酸のレパートリーと結合させる類似の方法を利用しうる。
同様に、１以上または全ての３つのCDRをVH又はVLドメインのレパートリーに移植してから、NGFに特異的な特異的結合メンバーをスクリーニングすることができる。
好ましい実施態様では、1又は2以上の1252A5 HCDR1(配列番号393)、HCDR2(配列番号394)及びHCDR3(配列番号395)、つまりHCDRの1252A5セットを利用し、及び/又は1又は2以上の1252A5 LCDR1(配列番号398)、LCDR2(配列番号399)及びLCDR3(配列番号400)、つまりLCDRの1252A5セットを利用しうる。
他の類似の実施態様では、1252A5の代わりに1152H5、1165D4又は1230H7を使用する。
同様に、本明細書に開示される他のVH及びVLドメイン、CDRのセット、HCDRのセット及び/又はLCDRのセットを利用しうる。
【００３７】
免疫グロブリンの可変ドメインの実質的部分は、少なくとも3つのCDR領域をその間にあるフレームワーク領域と共に含むだろう。好ましくは、この部分は、第1及び第4のフレームワーク領域のどちらか又は両方の少なくとも約50%をも含み、その50%とは、第1のフレームワーク領域のC-末端の50%であり、かつ第4のフレームワーク領域のN-末端の50%であろう。可変ドメインの実質的部分のN-末端又はC-末端における付加残基は、一般的に天然に存在する可変ドメイン領域と関係ない残基でもよい。例えば、組換えDNA法によって作られる本発明の特異的結合メンバーの構築は、クローニング又は他の操作工程を容易にするために導入されるリンカーによってコードされるN-末端又はC-末端の残基の導入をもたらしうる。他の操作工程として、本明細書の別の箇所でさらに詳述されるように、本発明の可変ドメインを抗体定常領域、他の可変ドメイン(例えば、ディアボディの製造において)又は検出可能/機能標識といった、さらなるタンパク質配列に結合するためのリンカーの導入が挙げられる。
本発明の好ましい局面では、1対のVHドメインとVLドメインを含む特異的結合メンバーが好ましいが、VHドメイン配列又はVLドメイン配列のどちらかをベースとした単一結合ドメインは、本発明のさらなる局面を形成する。単一の免疫グロブリンドメイン、特にVHドメインは特異的様式で標的抗原と結合できることが知られている。例えば、上記dAbの議論を参照されたい。
単一の特異的結合ドメインのどちらについても、これらのドメインを用いてNGFと結合できる2-ドメインの特異的結合メンバーを形成できる相補的ドメインをスクリーニングすることができる。
これは、ファージディスプレイスクリーニング法により、WO92/01047に開示されているような、いわゆる階層二重組合せアプローチを用いて達成される。この方法では、H鎖又はL鎖のクローンを含む個々のコロニーを用いて、他方の鎖(L又はH)をコードするクローンの完全ライブラリーを感染させ、得られる2本鎖の特異的結合メンバーを当該文献に記載されている方法のようなファージディスプレイ法に従って選択する。この技法はMarksら(同書)によっても開示されている。
【００３８】
本発明の特異的結合メンバーは、さらに抗体の定常領域又はその一部、好ましくはヒト抗体の定常領域又はその一部を含みうる。例えば、VLドメインは、そのC-末端で、ヒトCκ又はCλ鎖、好ましくはCλ鎖を含む抗体の軽鎖定常ドメインに結合しうる。同様に、VHドメインをベースとした特異的結合メンバーは、そのC-末端でいずれの抗体イソタイプ、例えば、IgG、IgA、IgE及びIgM並びにそのイソタイプのサブクラス、特にIgG1やIgG4由来の免疫グロブリン重鎖のすべて又は一部(例えば、CH1ドメイン)にも結合しうる。IgG4が好ましい。IgG4は、補体と結合せず、かつエフェクター機能を生じないので好ましい。これら特性を有し、かつ可変領域を安定化するいずれの合成又は他の定常領域の変種も本発明の実施態様で使うために好ましい。
【００３９】
本発明の特異的結合メンバーを検出可能標識又は機能標識で標識することができる。検出可能標識として131I又は99Tc等の放射標識が挙げられ、これを抗体イメージングの技術で知られる通常の化学を用いて本発明の抗体に付着させることができる。標識には、西洋わさびペルオキシダーゼ等の酵素標識も含まれる。さらに、標識として、特異的な同族の検出可能成分、例えば標識アビジンへの結合を介して検出されるビオチンのような化学成分が挙げられる。
本発明の特異的結合メンバーは、ヒト又は動物対象、好ましくはヒトの診断又は治療の方法で使うために設計される。
従って、本発明のさらなる局面は、提供される特異的結合メンバーの投与を含む治療方法、該特異的結合メンバーを含む医薬組成物、及び投与用薬物の製造、例えば、前記特異的結合メンバーと医薬的に許容しうる賦形剤を配合する工程を含む薬物又は医薬組成物の製造方法での前記特異的結合メンバーの使用を提供する。
抗-NGF抗体を用いて治療的利益を与える臨床適応症として、疼痛、喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺線維症、他の気道炎症疾患、糖尿病性ニューロパシー、関節炎、乾癬、心不整脈、HIV及び癌が挙げられる。既に説明したように、抗-NGF治療薬がこれらすべての疾患のため必要とされる。
抗-NGF治療薬は、経口的に、注射(例えば、皮下、静脈内、腹腔内又は筋肉内)により、吸入により、膀胱内経路(膀胱中への点滴注入)により、又は局所的に(例えば、眼内、鼻腔内、直腸に、創傷中に、皮膚上に)与えられる。治療の物理化学的性質、該疾患について特に考慮すべき事柄又は効力を最適化し、又は副作用を最小限にするための要求によって、投与経路を決定することができる。
抗-NGF治療薬は診療所での使用に限定されないと予想される。従って、針のないデバイスを用いる皮下注射も好ましい。
併用治療、特に抗-NGF特異的結合メンバーと1又は2以上の他の薬物の組合せを用いて有意な相乗効果を提供しうる。本発明の特異的結合メンバーは、短期若しくは長期作用性鎮痛薬、抗-炎症薬、抗-アレルギー薬、抗-関節炎薬、抗-線維症薬、抗ウイルス薬、化学療法薬及び免疫療法薬と併用又はこれら薬物に加えて提供される。
1又は2以上の短期若しくは長期作用性鎮痛薬及び/又は抗-炎症薬、例えばオピオイド及び非ステロイド系抗-炎症薬(NSAID)との併用治療は、疼痛及び/又は炎症の特徴がある状態、例えば、リウマチ性関節炎又は手術後の痛みの治療に利用される。本発明の抗体を、抗-喘息治療薬、抗-アレルギー治療薬、又は抗-線維症治療薬、例えば吸入型βアドレノセプターアゴニスト、ステロイド、サイトカインアンタゴニスト、又は喘息、アレルギー性喘息、他のアレルギー状態、若しくは異常な線維症の特徴があるいずれかの状態の治療のための他の新規な治療アプローチと組み合わせて使用することもできる。本発明の抗体を抗-感染薬、例えばHIV感染症の治療用の抗ウイルス薬と組み合わせて使用してもよい。
【００４０】
本発明により、提供される組成物を個体に投与することができる。投与は、好ましくは“治療的に有効な量”、すなわち患者に対する利益を示すのに十分な量で行われる。このような利益は、少なくとも1つの症状の少なくとも寛解でよい。投与される実際の量、及び投与の速度と時間経過は、治療する状態の性質と重症度によって決まるだろう。治療の処方、例えば投与量などの決定は一般開業医及び他の医師の責任の範囲内であり、治療する疾患の症状及び/又は進行の重大度によって決まるだろう。抗体の適切な用量は技術上周知であり；Ledermann et al. (1991)及びBagshawe (1991)を参照されたい。投与する薬物のタイプに適するとして本明細書、又はPhysician's Desk Reference (2003)で示される特定の薬用量を使用しうる。本発明の特異的結合メンバーの治療的に有効な量又は好適な用量は、そのin vitro活性と動物モデルにおけるin vivo活性を比較することによって決定される。マウス及び他の試験動物で有効な投与量をヒトへ外挿する方法が知られている。
正確な用量は、抗体が診断のためなのか治療のためなのか、治療すべき領域の大きさと位置、抗体の正確な性質(例えば、全抗体、フラグメント又はディアボディ)、及び抗体に付着しているいずれの検出可能標識又は他の分子の性質といったいくつかの因子によって決まるだろう。典型的な抗体の用量は、全身投与で100μg〜1g、局所投与で1μg〜1mgの範囲だろう。典型的に、抗体は全抗体、好ましくはIgG4イソタイプだろう。これは成人患者の単剤治療のための用量であり、子供及び乳児のためには比例的に調整し、他の抗体型式のためにも分子量に比例して調整しうる。医師の決定により、毎日、1週間に2回、1週間又は1カ月の間隔で治療を繰り返してよい。本発明の好ましい実施態様では、治療は定期的であり、かつ投与間の期間は約2週間以上、好ましくは約3週間以上、さらに好ましくは約4週間以上又は1カ月に1回である。本発明の他の好ましい実施態様では、手術の前、及び/又は後に治療を与え、さらに好ましくは外科的処置の解剖部位に直接投与又は適用してよい。
【００４１】
本発明の特異的結合メンバーは、通常、該特異的結合メンバーに加え、少なくとも1種の成分を含む医薬組成物の形態で投与されるだろう。
従って、本発明の医薬組成物は、本発明の使用のため、活性成分に加え、医薬的に許容しうる賦形剤、担体、緩衝液、安定剤又は技術上周知の他の物質を含みうる。このような物質は無毒でなければならず、かつ活性成分の効力を妨げてはいけない。担体又は他の物質の正確な性質は投与経路、すなわち経口なのか、或いは注射、例えば静脈内注射なのかによって決まるだろう。
静脈内注射、又は患部注射では、活性成分は、発熱原がなく、かつ適切なpH、等張性及び安定性である、非経口的に許容しうる水溶液の形態にあるだろう。関連技術の当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液などの等張性ビヒクルを用いて適切な溶液を調製することができる。必要に応じて、保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤及び/又は他の添加剤を含めてよい。
組成物を単独で投与してもよく、或いは他の治療と併用してよく、治療すべき状態によって同時又は逐次投与でよい。
【００４２】
本発明の特異的結合メンバーは、分子の物理化学的性質と送達経路によって、液体、半固体又は固体形態で製剤化される。製剤は、賦形剤、賦形剤の組合せ、例えば糖、アミノ酸及び界面活性剤を含みうる。液体製剤は、広範な抗体濃度とpHを含みうる。固体製剤は、凍結乾燥、噴霧乾燥、又は例えば、超臨界流体技術を用いた乾燥によって製造される。抗-NGFの製剤は、意図した送達経路によって左右され：例えば、肺に送達するための製剤は、吸入させると深肺に確実に浸透するという物理的性質を有する粒子から成り；局所用製剤は粘度変性剤を含み、該薬物が作用部位に常在する時間を延長することができる。特定の実施態様では、特異的結合メンバーが急速に放出するのを妨げる担体と共に特異的結合メンバーを調製して、例えば、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達システムといった徐放製剤とすることができる。エチレンビニルアセテート、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの崩壊剤、生体適合性ポリマーを使用できる。このような製剤を調製するための多くの方法が技術上周知である。例えば、Robinson(1978)を参照されたい。
【００４３】
本発明は、本明細書で提供される特異的結合メンバーをNGFに結合させるまたは結合を許す工程を含む方法を提供する。上述したように、このような結合はin vivo、例えば特異的結合メンバー、又は特異的結合メンバーをコードする核酸の投与後でも起こり、或いはin vitro、例えばELISA、ウエスタンブロット、免疫細胞化学、免疫沈降、親和性クロマトグラフィー、又はTF-1アッセイ等の細胞ベースアッセイで起こりうる。
特異的結合メンバーのNGFへの結合量を決定することができる。定量化は、診断のため関心のある試験サンプル中の抗原の量に関係しうる。
本発明のいずれの局面の特異的結合メンバー又は抗体分子を含むキットも本発明の一局面として提供される。本発明のキットでは、例えばさらに後述するように、特異的結合メンバー又は抗体分子を標識して、サンプル内でのその反応性を決定できるようにしうる。キットの成分は一般的に無菌であり、密封バイアル又は他の容器に入れられる。診断解析又は抗体分子が役立つ他の方法でキットを利用できる。キットは、方法、例えば本発明の方法で該成分を使うための使用説明書含みうる。該方法を行う際又は行えるように助けるための補助的物質を本発明のキットに含めてよい。
いずれの適切な手段によっても、サンプル中の抗体の反応性を決定することができる。ラジオイムノアッセイ(RIA)は1つの可能な手段である。放射性標識抗原を非標識抗原(試験サンプル)と混合し、抗体に結合させる。結合した抗原を未結合抗原から物理的に分離し、抗体に結合した放射性抗原の量を決定する。試験サンプル中にある抗原が多いほど、抗体に結合する放射性抗原は少ないだろう。抗原、又はレポーター分子に結合した類似体を用いて非放射性抗原との競合結合アッセイを利用することもできる。レポーター分子は、分光学的に孤立した吸収又は発光を有する蛍光色素、発色団又はレーザー色素でよい。好適な蛍光色素として、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン及びテキサスレッドが挙げられる。好適な発色色素としてジアミノベンジジンが挙げられる。
他のレポーターとして、マクロ分子コロイド粒子又は粒状物質、例えば着色された磁性又は常磁性のラテックスビーズ、及び直接又は間接的に検出可能シグナルを引き起こして、可視的に観察、電子的に検出又は他のやり方で記録できる生物学的又は化学的に活性な薬剤が挙げられる。これら分子は、例えば、発色又は変色し、或いは電気的特性の変化を引き起こす反応を触媒する酵素でよい。それらは、エネルギー状態間の電子遷移が特徴的なスペクトルの吸収又は放出をもたらすように、分子的に励起しうる。それらには、バイオセンサーと組み合わせて用いられる化学的実体が含まれる。ビオチン/アビジン又はビオチン/ストレプトアビジン及びアルカリ性ホスファターゼ検出システムを利用しうる。
個々の抗体-レポーター抱合体によって生成されたシグナルを用いて、サンプル(正常及び試験)中の関連のある抗体の結合性の数量化できる絶対的又は相対的なデータを導くことができる。
【００４４】
本発明は、上述した特異的結合メンバーの競合アッセイで抗原レベルを測定するための使用、すなわち、本発明によって提供される特異的結合メンバーを競合アッセイで利用することによって、サンプル中の抗原レベルを測定する方法をも提供する。これは、未結合抗原から結合抗原を物理的に分離する必要がない場合であろう。結合すると物理的又は光学的変化が起こるようにレポーター分子を特異的結合メンバーに連結することが1つの可能な方法である。レポーター分子は、検出可能な、好ましくは測定可能なシグナルを直接的又は間接的に生成しうる。レポーター分子の連結は、直接又は間接的な共有結合、例えばペプチド結合による共有結合でよく、或いは非共有結合でよい。ペプチド結合による連結は、抗体とレポーター分子をコードしている遺伝子融合物の組換え体発現の結果としてでよい。
本発明は、本発明の特異的結合メンバーを例えばバイオセンサーシステムで利用することによって、抗原のレベルを直接測定する方法をも提供する。
結合性の決定様式は本発明の特徴でなく、当業者は自分の好みと一般知識に従って適切な様式を選択できる。
上述したように、種々の局面と実施態様において、本発明は、NGFに対する結合性について、本明細書で定義されるいずれの特異的結合メンバー、例えば1252A5 IgG4とも競合する特異的結合メンバーまで拡張する。結合メンバー間の競合は、例えば、一方の結合メンバーに特異的レポーター分子で標識して(該特異的レポーター分子で標識されない他方の結合メンバーの存在下で、該特異的レポーター分子を検出できる)、同じエピトープ又は重複エピトープに結合する特異的結合メンバーを同定できるようにすることによって、in vitroで容易にアッセイされる。
例えば、ELISAを用いて競合を決定することができる。ELISAでは、NGFをプレートに固定化し、第1の標識結合メンバーを1又は2以上の他の非標識結合メンバーと共に前記プレートに加える。標識結合メンバーと競合する非標識結合メンバーの存在を、標識結合メンバーによって放出されるシグナルの減少によって観察する。
競合に関する試験では、抗原のペプチドフラグメント、特に、対象エピトープを含むか、又は本質的に対象エピトープからなるペプチドを利用しうる。どちらかの末端にエピトープの配列プラス1又は2以上のアミノ酸を有するペプチドを使用できる。本発明の特異的結合メンバーは、抗原に対するその結合が、前記与えられた配列のペプチド又は前記与えられた配列を含むペプチドによって阻害されるようなものでよい。このための試験では、どちらかの配列プラス1又は2以上のアミノ酸を有するペプチドを使用しうる。
【００４５】
特異的ペプチドと結合する特異的結合メンバーは、例えば、該ペプチドによるパニングによってファージディスプレイライブラリーから単離される。
本発明は、さらに、本発明の特異的結合メンバーをコードする単離された核酸を提供する。核酸はDNA及び/又はRNAを含みうる。好ましい局面では、本発明は、上で定義した本発明のCDR若しくはCDRのセット又はVHドメイン若しくはVLドメイン又は抗体抗原結合部位又は抗体分子、例えば、scFv若しくはIgG4をコードする核酸を提供する。
本発明は、上述した少なくとも1つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、ベクター、転写又は発現カセットの形態の構築物をも提供する。
本発明は、1又は2以上の上記構築物を含む組換え宿主細胞をも提供する。上記いずれのCDR若しくはCDRのセット又はVHドメイン若しくはVLドメイン又は抗体抗原結合部位又は抗体分子、例えばscFv若しくはIgG4をコードする核酸も、それ自体本発明の一局面を形成し、そのコードされた産物の製造方法も本発明の一局面を形成し、前記方法は、コードしている核酸からの発現を含みうる。発現は、該核酸を含む組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することによって都合よく達成される。発現による生産後、いずれかの適切な方法を用いてVH若しくはVLドメイン、又は特異的結合メンバーを単離及び/又は精製してから、適宜使用する。
本発明の特異的結合メンバー、VH及び/又はVLドメイン、及びコード核酸分子及びベクターは、例えばその自然環境から単離及び/又は精製された実質的に純粋又は均一な形態で提供され、或いは核酸の場合、必要な機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の、前記核酸の起源の核酸若しくは遺伝子がないか又は実質的にない形態で提供される。本発明の核酸は、DNA又はRNAを含んでよく、かつ全体的又は部分的に合成でもよい。本明細書で示されるヌクレオチド配列に対する言及は、文脈により別の意味を要しない限り、その特定した配列を有するDNA分子を包含し、かつその特定した配列において、ＴをＵで置き換えた配列を有するRNA分子を包含する。
種々の異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニング及び発現のためのシステムが周知である。好適な宿主細胞として、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母菌及びバキュロウィルス系並びにトランスジェニック植物及び動物が挙げられる。原核生物細胞内での抗体及び抗体フラグメントの発現は技術的によく確立されている。総説については、例えば、Pluckthun(1991)を参照されたい。一般的な好ましい細菌宿主は大腸菌である。
特異的結合メンバーの製造の選択肢として、例えばChadd & Chamow (2001)、Andersen & Krummen (2002)、Larrick & Thomas (2001)のように、培養中の真核生物内での発現も当業者に利用可能である。異種ポリペプチドの発現のため技術上利用可能な哺乳動物の細胞系として、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、NS0マウスメラノーマ細胞、YB2/0ラットミエローマ細胞、ヒト胚性腎臓細胞、ヒト胚性網膜細胞などが挙げられる。
【００４６】
適切な制御配列を含む好適なベクターを選択又は構築することができる。制御配列としては、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び適宜他の配列が挙げられる。ベクターは、適宜プラスミド、例えばファージミド、又はウイルス、例えば'ファージでよい。さらに詳細は、例えばSambrook & Russell (2001)を参照されたい。核酸の操作のため、例えば、核酸構築物の調製、変異導入、配列決定、細胞へのDNAの導入及び遺伝子発現、並びにタンパク質の分析の多くの公知の技術及びプロトコルが以下の文献で詳述されている：Ausubel et al., 1988及びAusubel et al., 1999。
従って、本発明のさらなる局面は、本明細書で開示される核酸を含有する宿主細胞を提供する。このような宿主細胞はin vitroで培養物でもよい。このような宿主細胞はin vivoでもよい。宿主細胞のin vivo存在は、 “イントラボデイ(intrabodeis)”、つまり細胞内抗体として本発明の特異的結合メンバーの細胞内発現を許容しうる。細胞内抗体は遺伝子治療のために使用しうる。
なおさらなる局面は、該核酸を宿主細胞に導入する工程を含む方法を提供する。導入は、いずれの入手可能な技術をも使用しうる。真核生物細胞では、適切な技術として、カルシウムホスファターゼトランスフェクション、DEAE-デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム-媒介トランスフェクション及びレトロウイルス若しくは他のウイルス、例えばワクチン、又は昆虫細胞では、バキュロウィルスを用いるトランスダクションが挙げられる。宿主細胞、特に真核生物細胞での核酸の導入は、ウイルス又はプラスミドベースの系を使用しうる。プラスミド系はエピソームによって維持され、或いは宿主細胞又は人工染色体に取り入れられる。取入れは、単座位又は多座位での1又は2以上のコピーのランダム又は標的組込みによってでよい。細菌細胞では、好適な技術として、塩化カルシウムトランスフォーメーション、エレクトロポレーション及びバクテリオファージを用いるトランスフェクションが挙げられる。
導入後、例えば、該遺伝子の発現のための条件下で宿主細胞を培養することによって、核酸から発現させうる。
一実施態様では、本発明の核酸を宿主細胞のゲノム(例えば染色体)に組み込む。標準的な技術により、該ゲノムとの組換えを促進する配列を含めることで組込みを促進することができる。
本発明は、上記構築物を発現系で用いて、上記特異的結合メンバー又はポリペプチドを発現させる方法をも提供する。
【００４７】
ここで、例として、以下の実験及び添付図面を参照して本発明の局面と実施態様について説明する。
図1は、ヒトTrkA受容体カルシウム動員アッセイにおけるヒト(図1A)およびラット(図1B)のNGFの抗体中和に関する濃度-阻害曲線を示す。1nMのNGFによって誘導される細胞内カルシウム動員の阻害について、ヒトIgG4 NGF抗体と市販のNGF抗体G1131、Mab5260Z、及びMAB256とを比較した。データ点は単一実験の結果を示し、各抗体濃度について三通りの測定の平均±sdである。
図2は、組換えによってヒトTrkA受容体を発現しているHEK-293細胞での細胞内カルシウム動員の阻害を示す。中和能を最適化したヒトIgG4抗体1nMの、ヒト(図2A)、ラット(図2B)、及びマウス(図2C)のNGFによって誘発される応答の阻害について評価した。データ点は単一実験の結果を示し、各抗体濃度について三通りの測定の平均±sdである。
図3は、PC12細胞生存率アッセイにおけるヒトIgG4 NGF抗体の阻害効果を示す。1nMのヒトNGF(図3A)又はラットNGF(図3B)の存在によって、細胞の生存率が維持された。データは、単一実験の三通りの測定の平均±sdを示す。
図4は、生殖系列及び非生殖系列のヒトIgG4 NGF抗体、及び基準NGF抗体、MAB256によるNGF-媒介TF-1細胞増殖の阻害を示す。細胞を200pMのヒトNGF(図4A)、ラットNGF(図4B)、又はマウスNGF(図4C)で刺激した。データは、単一実験の三通りの測定の平均±semを示す。
図5は、ヒトIgG4 NGF抗体、1252A5のニューロトロフィンBDNF、NT-3及びNT-4との交差反応の欠如を示す。1ウェル当たり100ngのニューロトロフィンを吸着させた。各データ点は、単一実験の三通りの測定の平均±sdを示す。
図6は、ヒト125I-NGFのヒトIgG4 NGF抗体1252A5(図6A)及びG1152H5(図6B)に対する結合の飽和結合曲線を示す。Kdの計算値は、それぞれ0.35nM及び0.37nMであり、単一実験の結果である。
図7は、ラット125I-NGFのヒトIgG4 NGF抗体1252A5(図7A)及びG1152H5(図7B)に対する結合の飽和結合曲線を示す。Kdの計算値は、それぞれ0.44nM及び0.50nMであり、単一実験の結果である。
図8は、ヒト(図8A)又はラット(図8B)の125I-NGFのTrkA受容体融合タンパク質に対する結合のヒトIgG4又は基準抗体による濃度依存性阻害を示す。各アッセイウェル内の放射標識NGFの濃度は約150pMである。データは単一実験の結果を示す。表6及び7も参照されたい。
図9は、ヒト(図9A)又はラット(図9B)の125I-NGFのp75受容体融合タンパク質に対する結合のヒトIgG4又は基準抗体による濃度依存性阻害を示す。各アッセイウェル内の放射標識NGFの濃度は約150pMである。データは単一実験の結果を示す。表8及び9も参照されたい。
図10は、ヒトIgG4抗-NGF、1252A5の全身投与48時間後のマウスにおけるカラギナン誘発熱痛覚過敏の用量関連阻害を示す。
【００４８】
〔実施例1〕
〔抗-NGF scFvの単離〕
ScFv抗体レパートリー：
選抜のため、ファージミドベクターにクローン化した3つの大きい単鎖Fv(scFv)ヒト抗体ライブラリーを使用した。(A)脾臓リンパ球(Hutchings, 2001)、(B)末梢血リンパ球、扁桃B細胞及び骨髄B細胞の組合せ(Vaughan et al., 1996)並びに(C)DP47生殖系列重鎖のフレームワークと組合せた、Aの軽鎖とVH CDR3領域からライブラリーを誘導した。
scFvの選抜：
用いたファージ選抜手順は、基本的にHutchings(前出)に記載の通りとした。NGFを認識したScFvを、ヒトとラットのNGFについての一連の選抜サイクルでファージディスプレイライブラリーから単離した。簡単に言えば、未改変抗原をNunc Maxisorbチューブにコートした。総体積500μlにて該抗原上でファージを1時間インキュベート後、洗浄して未結合ファージを除去した。次に、結合したファージをVaughanら(前出)によって記載されているようにレスキューし、選抜プロセスを繰り返した。ヒト/げっ歯類交叉scFvの単離を補助するため、NGFのそれぞれの種のイソタイプについて、交互に選抜を行った。この交互イソタイプ選抜戦略を用いて、いずれのライブラリーについても最大4回の選抜を行った。ヒト又はラットのどちらかのβ-NGFを第1回めの選抜用の初期抗原として用いた。
単離されたNGF-特異的クローンのパーセンテージとこれらクローンの配列の多様性をベースとして、生化学スクリーニングについて第2〜4回目の結果産物に優先順位をつけた。各場合に、ファージELISAによってNGF-特異的クローンのパーセンテージを決定した。DNA配列決定によって配列の多様性を決定した。
【００４９】
〔ファージELISAプロトコル〕
100μg/mlのアンピシリンと50μg/mlのカナマイシンを含有する1mlの2xTY培地中で30℃にて16時間振とうさせてファージ形質導入細菌の培養物を調製した。培養物の遠心分離(3000rpmで10分)によりファージ上清を調製し、PBS中3%w/vの粉乳で1時間ブロッキングした。次に、予め(1μg/ml)の抗原又は無関係な抗原で被覆したプレートにこのブロッキングしたファージを加えた。各工程の間に、PBS-Tween 20(0.1%v/v)中で3回のリンス後、PBS中で3回のリンスによってプレートを洗浄した。3%w/vの粉乳PBS中1:5000に希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)/抗-M13抱合体(Amersham UK)との1時間のインキュベーションによって結合ファージを検出し、テトラメチルベンジジン(TMB)基質(Sigma)とのインキュベーションで発色させた。適切な時間後、0.5Mの硫酸を添加して比色反応を止めた。450nMで吸光度を読み取った。無関係な抗原についてのシグナルの5倍以上のシグナルを有するものを、抗原に特異的に結合するクローンとして同定した。
【００５０】
〔DNA配列決定〕
プライマーFDTETSEQ24(TTTGTCGTCTTTCCAGACGTTAGT−配列番号534)とPUCリバース(AGCGGATAACAATTTCACACAGG−配列番号535)を用いてscFvのPCRによって配列決定用の二本鎖DNA鋳型を得た。Macherey-Nagel Nucleofast 96ウェルPCRプレート(Millipore)を用い、製造業者の勧告に従って最初のPCRから過剰なプライマーとdNTPを除去した。プライマーLseq(GATTACGCCAAGCTTTGGAGC 配列番号536)でVH遺伝子の配列を決定した。プライマーMYC Seq 10(CTCTTCTGAGATGAGTTTTTG 配列番号537)でVL遺伝子の配列を決定した。各反応混合物は20μlの体積に20〜40ngのDNA、3〜20pmolのプライマー及び4μlのBig Dye Terminator V3.0(Applied Biosystems, UK)を含んだ。配列決定反応は、25サイクルの、96℃で10秒；50℃で5秒；60℃で4分からなる。Applied Biosystems 3700 DNA Analyserでサンプルを流して分析した。不明瞭な領域は、企業内で開発したContinuityソフトウェア(Cambridge Antibody Technology, UK)及びSeqEd DNA配列操作ソフトウェア(Applied Biosystems, UK)を用いて手動で分析した。
【００５１】
〔NGF-中和性scFvについての生化学スクリーニング〕
ファージ選抜工程の結果産物をさらにスクリーニングして、TrkA受容体細胞外ドメイン融合タンパク質へのNGFの結合を阻害するクローンを同定した。
結合アッセイの評価のために、選抜したファージでトランスフェクトした大腸菌TG-1細菌のペリプラズムライセートから粗scFvサンプルを調製した。Nunc Maxisorb 96ウェルプレートを一晩ヒトTrkA受容体細胞外ドメイン融合タンパク質で被覆した(R&D Systems;被覆濃度；ヒトNGFアッセイ、0.25nM；ラットNGFアッセイ、1nM)。アッセイプレートをPBS/Tween 20で洗浄し、PBS中1%のウシ血清アルブミン(BSA)で2時間ブロッキングし、再び洗浄した。ScFvサンプルを1%のBSA中1nMのヒト又はラットの組換えβ-NGF(R&D Systems)と30分プレインキュベートした。サンプルを100μlの容積に移してプレートをアッセイし、室温で60分インキュベートした。プレートを洗浄し、プレートに結合したまま残ったNGFを、1%のBSAに希釈した0.3μg/mlの抗-ヒトNGFビオチン(Peprotech)又は抗-ラットNGFビオチン(R&D Systems)で標識後、室温で60分インキュベーションした。ビオチン-標識した抗-NGFを、DELFIA(Wallac)時間分解蛍光検出システムで検出した。簡単に言えば、プレートを洗浄し、各ウェルに100μlのストレプトアビジンEu3+を加え、DELFIAアッセイ緩衝液で1/1000に希釈した。プレートを室温でさらに60分インキュベートし、DELFIA洗浄緩衝液で洗浄後、各ウェルに100μlのDELFIA増感溶液を添加した。Wallac Victor蛍光定量プレートリーダー(励起波長314nm；発光波長615nm)を用いてプレートを読み取った。
ペリプラズムライセートscFv調製物としてヒトとラットの両NGFの結合を70%強まで阻害したクローンを結合アッセイの精製scFvとして再評価した。WO01/66754の実施例3に記載したように精製scFv調製物を調製した。BCA法(Pierce)で精製scFv調製物のタンパク質濃度を決定した。再アッセイは、ヒト及びラットのNGFのヒトTrkA受容体細胞外ドメイン融合タンパク質に対する強力な中和因子である以下のscFv抗体を際だたせた：
1064F8 (VH 配列番号2; VL 配列番号7)、
1022E3 (VH 配列番号12; VL 配列番号17)、
1083H4 (VH 配列番号22; VL 配列番号27)、
1021E5 (VH 配列番号32; VL 配列番号37)、
1033G9 (VH 配列番号42; VL 配列番号47)、
1016A8 (VH 配列番号52; VL 配列番号57)、
1028F8 (VH 配列番号62; VL 配列番号67)、
1033B2 (VH 配列番号72; VL 配列番号77)、
1024C4 (VH 配列番号82; VL 配列番号87)、及び
1057F11 (VH 配列番号92; VL 配列番号97)。
【００５２】
〔実施例2〕
〔ヒトIgG4抗体の発現及びNGF-中和能のin vitro機能評価〕
NGF-中和性scFv 1064F8、1022E3、1083H4、1021E5、1033G9、1016A8、1028F8、1033B2、1024C4、及び1057F11をヒトIgG4抗体として再編成し、全細胞アッセイシステムでNGF中和能をアッセイした。
IgG転換：
基本的にPersicら(1997)に記載されているように、全抗体ヒトIgG4として再発現できる最強のscFvクローン用のベクターを構築した。条件培地で維持したEBNA-293細胞を、重鎖ドメインと軽鎖ドメインを発現する構築物で同時トランスフェクトした。プロテインA親和性クロマトグラフィー(Amersham Pharmacia)を用いて培地から全抗体を精製した。この精製抗体製剤を無菌ろ過し、in vitro中和能評価まで、リン酸緩衝食塩水(PBS)中4℃で貯蔵した。Machら(1992)に従って分光光度的にタンパク質濃度を決定した。
【００５３】
〔細胞内カルシウム動員のFLIPRアッセイ〕
細胞ベースの蛍光カルシウム-動員アッセイで、NGFを中和する抗-ヒトIgGの中和能と効力を決定した。ヒト抗体の中和能をマウスの抗-ヒトNGF(MAB256；R&D Systems)、ラットの抗-マウスNGF(G1131；Promega)、及びマウスの抗-マウスNGF(MAB5260Z；Chemicon)と比較した。抗-NGF IgGを組換えヒトβ-NGF(Calbiochem, 480275)又は組換えラットβ-NGF(R&D Systems, 556-NG-100)と同時インキュベートした。この複合体を、カルシウム感受性色素、Fluo-4を装荷した、組換えヒトTrkA受容体を発現しているHEK293細胞に加えてから、Ca2+-依存性蛍光をモニターした。
組換えヒトTrkA(M. Chao, Skirball Institute, NYから得た)でトランスフェクトされたHEK細胞(ピーク-S, Edge Biosystems)を、10%のウシ胎児血清(Hyclone, SH30071.03)、1.5μg/mlのピューロマイシン(Edge Biosystems, 80018)及び1%のペニシリン-ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地(MEM, Cellgro, MT10-017-CV)で増殖させた。ダルベッコのリン酸緩衝食塩水(DPBS)で細胞を引き剥がすことによってコンフルエントな細胞を収集してから、アニオン輸送阻害因子(1%のFBS/MEM中2.5mMのプロベネシド)の存在下37℃にて1.5時間6μMのFluo-4(Molecular Probes)を含有するローディングバッファを添加した。アッセイ緩衝液(0.1%のBSA Hank's/HEPES中2.5mMのプロベネシド)で1回細胞を洗浄後、ポリ-D-リジン被覆した透明底の96-ウェルプレート(Costar #3904)に120μl中、約60,000細胞/ウェルで細胞を蒔いた。細胞を暗所で30分室温でインキュベートしてからプレートを1,200rpm(290xg)で5分遠心分離した。試験前に、プレートを35℃で20分予め温めた。三つ組のウェルで7種の濃度にて試験用IgGをアッセイした。35μlの10倍の抗--NGF IgGと等量の10nMのヒト-、ラット-又はマウス-2.5S NGFを室温で約1時間プレインキュベートした。プレ-複合体化したIgGを含有するプレートと100μl/ウェルのアッセイ緩衝液を予め35℃で20分温めた後、Fluorometric Imaging Plate Reader(FLIPR; Molecular Devices)で試験した。80μl/ウェルのアッセイ緩衝液の細胞プレートへの添加と35℃で5分のインキュベーション後、Ca2+-依存性蛍光のモニタリングを持続しながら、FLIPRの細胞プレートに50μl/ウェルの希釈抗-ヒトIgG/NGF複合体を加えた。NGF添加直前のベースラインの蛍光強度と、NGF添加2分後に得られる最高の蛍光強度との間の差異としてNGF-誘導蛍光を計算した。抗体の非存在下での三つ組のNGF-誘導蛍光値を100%のカルシウム動員と定義した。抗体の存在下で、三つ組のNGF-誘導蛍光値の平均±SDをコントロールのカルシウム動員のパーセントとして計算した。コントロールのカルシウム動員のパーセントの値をIgG濃度のlogの関数としてプロットした。Prism(GraphPad)を用いてシグモイド用量-応答(可変勾配)関数のフィッティングによってIC50値を計算した。
試験したすべての抗体がヒトNGF-誘発細胞内カルシウム動員の濃度-関連阻害を示した。ヒトNGFの中和能の順位は、1064F8＞1022E3＞1083H4≧1033G9≧1016A8≧1028F8≧1021E5≧1033B2＞＞1024C4＞＞1057F11だった(表1)。5つの抗体をさらにラットNGFの機能的中和について評価したが、これらは両方の種のイソタイプに対してほぼ等しい中和能だった(図1A及び1B；表1)。
【００５４】
〔実施例3〕
〔最適化ヒトIgG4 NGF抗体の単離〕
リボソームディスプレイscFv中和能の最適化
基本的にHanesら(2000)に記載されているように、大きいリボソームディスプレイライブラリーを作成し、特異的に組換えヒトNGF(R&D Systems)を認識するscFvについて選択した。最初にクローン1064F8、1022E3、1083H4、1021E5、1033G9、1016A8、1028F8、1033B2、及び1024C4をリボソームディスプレイ型式に転換し、該鋳型を引き続きライブラリー作成に使用した。クローン1057F11は中和能最適化のために選択しなかったので、この抗体についてはリボソームディスプレイ鋳型を作らなかった。mRNAへの効率的な転写のため、DNAレベルでT7プロモーターを5'-末端に付加した。mRNAレベルに関しては、この構築物は原核生物リボソーム-結合部位(Shine-Dalgarno配列)を含ませた。単鎖の3'末端にて、終止コドンを除去し、スペーサーとして働くようにgIIIの一部を加えた(Hanes et al., 前出)。
scFv HCDR3の変異導入により、1064F8、1022E3、1083H4、1021E5、1033G9、1016A8、1028F8、1033B2、及び1024C4由来のリボソームディスプレイライブラリーを作成した。非プルーフリーデイング(non-proof reading)TaqポリメラーゼでPCR反応を行った。親和性ベース選択を行って、ライブラリーと共にインキュベーション後、ビオチン化したヒトNGFをストレプトアビジン-被覆常磁性ビーズ(Dynal M280)に結合した。結合型三次複合体(mRNA-リボソーム-scFv)を磁性分離で回収し、未結合複合体を洗い流した。Hanesら(前出)に記載されている通りに、結合型scFvをコードするmRNAをRT-PCRによってレスキューし、選抜の際に存在するビオチン化ヒトNGFの濃度を減らしながら選抜工程を繰り返した(5ラウンドにわたって100nM〜10pM)。
さらにライブラリーサイズを増大させるため、エラープローンPCRも使用した。選抜レジメの際、1,000bp当たり7.2の変異というエラー率を用い(DiversifyTM, Clontech)、ラウンド3及び4で選択を開始する前、それぞれ1nM及び0.1nMのビオチン化ヒトNGF濃度を用いて、エラープローンPCRを行った。
選抜ラウンド3、4及び5の産物から代表的な割合のscFvをpCantab6ベクター(Vaughan et al., 1996)に連結し、大腸菌のTG1株中にクローン化した。これらscFvのサンプルは、NGF中和活性のin vitroスクリーニングの前に、産物の配列多様性を確認するために実施例1に記載したように配列決定したDNAだった。実施例1で述べたように、NGF/TrkA受容体細胞外ドメイン融合タンパク質結合アッセイにおいて、クローンを未精製scFvとしてスクリーニングした。アッセイ中のペリプラズムライセートscFv調製物の濃度を最終アッセイ体積の0.5%〜5%に減じ、ヒトとラットの両NGFの結合を95%より多く阻害するクローンをさらなる研究用に単離した。このようにして、中和能を最適化した交差反応性NGF中和因子のパネルを単離した。驚くべきことに、最強のNGF中和因子が親クローン1021E5及び1083H4から誘導されたが、これらの親クローンは親抗体の最強のものではなかった。最適化クローンの配列を決定し、実施例2に記載のヒトIgG4への再編成前に、精製scFvとして再びアッセイして中和能を確認した。
【００５５】
親クローン1021E5(VH 配列番号32；VL 配列番号37)から誘導され、ヒトIgG4型に転換された抗体は、1126F1(VH 配列番号102；VL 配列番号107)、1126G5(VH 配列番号112；VL 配列番号117)、1126H5(VH 配列番号122；VL 配列番号127)、1127D9(VH 配列番号132；VL 配列番号137)、1127F9(VH 配列番号142；VL 配列番号147)、1131D7(VH 配列番号152；VL 配列番号157)、1131H2(VH 配列番号162；VL 配列番号167)、1132A9(VH 配列番号172；VL 配列番号177)、1132H9(VH 配列番号182；VL 配列番号187)、1133C11(VH 配列番号192；VL 配列番号197)、1134D9(VH 配列番号202；VL 配列番号207)、1145D1(VH 配列番号212；VL 配列番号217)、1146D7(VH 配列番号222；VL 配列番号227)、1147D2(VH 配列番号232；VL 配列番号237)、1147G9(VH 配列番号242；VL 配列番号247)、1150F1(VH 配列番号252；VL 配列番号257)、1152H5(VH 配列番号262；VL 配列番号267)、1155H1(VH 配列番号272；VL 配列番号277)、1158A1(VH 配列番号282；VL 配列番号287)、1160E3(VH 配列番号292；VL 配列番号297)、1165D4(VH 配列番号302；VL 配列番号307)、1175H8(VH 配列番号312；VL 配列番号317)、1211G10(VH 配列番号322；VL 配列番号327)、1214A1(VH 配列番号332；VL 配列番号337)、1214D10(VH 配列番号342；VL 配列番号347)、1218H5(VH 配列番号352；VL 配列番号357)、及び1230H7(VH 配列番号362；VL 配列番号367)である。
親クローン1083H4(VH 配列番号22；VL 配列番号27)から誘導され、ヒトIgG4型に転換された抗体は、1227H8(VH 配列番号372；VL 配列番号377)及び1230D8(VH 配列番号382；VL 配列番号387)である。
【００５６】
〔1252A5及び他の1021E5変種を誘導するための1133C11フレームワーク領域の生殖系列化〕
1021E5由来の最適化クローンについてのVH及びVL CDR配列情報の実験は、多くの割合のこれら抗体がVH CDR3(すなわち、Kabatナンバリングシステムのアミノ酸100A〜100G)中にアミノ酸配列LNPSLTA(配列番号531)を含むことを際だたせた。これらクローンは表2aに、、VH及びVL CDR領域のアミノ酸配列でそれらがどのように変化しているかを明らかにして、精製scFvとしてアッセイした場合の該クローンのNGF中和能の評価と共に示されている。これらクローンのうち、1133C11は、示されるように、CDR領域で1021E5と7つの連続するアミノ酸100A〜100Gだけが異なっている。従って、第１に、変更されたフレームワークと共に中和能が保持されることを確証し、第２に、所望であればその後のCDRの変異を導入できるようにし、同じ系列から関心のあるさらなる生殖系列の抗体を生成するため、1133C11を生殖系列化のために選択した。
1133C11由来のアミノ酸VH及びVL配列をVBASEデータベース(Tomlinson [1997], MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK)の既知のヒト生殖系列の配列とアラインメントさせ、最も近い生殖系列を同定した。1133C11のVHに最も近い生殖系列はVH1ファミリーのメンバーであるDP10として同定された。1133C11のVHは、フレームワーク領域内にDP10生殖系列と5つアミノ酸の変化を有する。1133C11のVLに最も近い生殖系列はVλ1ファミリーのメンバーであるDPL5と同定された。1133C11のVLは、フレームワーク領域内に該生殖系列と4つしかアミノ酸の変化を有しない。該scFvの部位特異的変異導入によって1133C11のフレームワークを生殖系列に戻してscFv 1252A5(VH 配列番号392；VL 配列番号397)を誘導した。これは、実施例2で述べたようにヒトIgG4に転換された。生殖系列化1252A5 IgG4骨格鎖にCDR変異を導入することによって、1021E5-誘導クローンの他の変種の生殖系列化を行った。この方法は、生殖系列化抗体G1152H5(VH 配列番号402；VL 配列番号407)、G1165D4 (VH 配列番号412；VL 配列番号417)及びG1230H7(VH 配列番号422；VL 配列番号427)の生成をもたらした。
【００５７】
〔実施例4〕
〔細胞内カルシウム動員のFLIPRアッセイにおける最適化ヒトIgG4抗体の評価〕
実施例2で記載したように、組換えによってヒトTrkA受容体を発現している細胞におけるNGF-誘発細胞内カルシウム動員のアッセイで、最適化ヒトIgG4 NGF抗体を評価した。ヒト、ラット、及びマウスのNGFに対する中和活性について抗体をアッセイした(図2A、2B、及び2C；表3)。
1nMのNGFによって誘導される細胞内カルシウム動員は、試験したすべての最適化ヒト抗体によって阻害された。最適化抗体はnM以下のIC50値を示し、多くの場合、親IgGより100倍以上高いNGF中和能を示した(表3)。ヒト、ラット及びマウスのNGFイソタイプに対する生殖系列のヒトIgG4抗体の中和能(IC50)はそれぞれ以下のとおりだった：
1252A5−0.33nM、0.29nM、及び0.26nM;
G1152H5−0.22nM、0.27nM、及び0.18nM;
G1165D4−0.32nM、0.33nM、及び0.27nM;
G1230H7−0.31nM、0.34nM、及び0.25nM。
これらの結果により、抗体中和能の最適化のためのリボソームディスプレイ法の効率と価値が強調される。抗体最適化への過去の慣習的なアプローチは、変種scFv抗体のファージディスプレイライブラリーを作成しなければならなかった。このプロセスは大きな労働力を要し、かつリボソームディスプレイ法より遅い。すなわち、ライブラリー構築のための出発点として単一の親scFvだけを使用することを意味する。リボソームディスプレイライブラリーの作成が相対的に容易なため、同時に複数の親scFvを最適化でき、かつ実施例3で実証されるように、これは、そうでなければ最適化を見過ごしていたであろう親クローン由来の非常に強力な抗体の単離をもたらすことができる。
【００５８】
〔実施例5〕
〔PC12細胞生存率アッセイにおける最適化ヒトIgG4抗体の評価〕
PC12アッセイでは、NGFは、天然のTrkA及びp75受容体を発現している血清欠乏ラットPC12細胞の生存率を2日間維持する。NGFを中和する抗体は、アラマーブルー(AlamarBlue)で測定される細胞生存率を低減する。
5%のウシ胎児血清(JRH,12103-78P)、10%の熱-不活化ドナーウマ血清(JRH, 12446-77P)、及び1%のペニシリン-ストレプトマイシンを補充したRPMI 1640(Cellgro, 18040181)でラットのクロム親和細胞腫PC12細胞を増殖させた。粉砕によって細胞を収集してから0.01%のBSAを含有する無血清RPMI 1640(Sigma, A7030)で2回洗浄した。ラット尾部コラーゲン(Biological Technology Institute, BT-274)で被覆した96ウェルプレートに、0.01%のBSAを有する120μlの無血清培地中、50,000細胞/ウェルで細胞を蒔いた。無血清培地を用いて5倍の抗-ヒトNGF IgGの段階希釈を作り、40μl/ウェルを細胞プレートに加えた。40μl/ウェルの0.5nMのヒトβ-NGF(Calbiochem, 480275)又はラット組換えNGF(R&D Systems, 556-NG-100)をプレートに加え、無血清培地で総体積を200μl/ウェルとした。三つ組のウェルで80μl/ウェルの無血清培地によって最大の細胞死を定義した。100%の生存率を、三つ組のウェルで40μl/ウェルの無血清培地と40μl/ウェルの0.5nMのNGFで定義した。プレートを37℃にて5%のCO2中で48時間インキュベートした。細胞の生存能を測定するため、22μl/ウェルのアラマーブルーを加え、蛍光定量プレートリーダー(BMG)で530nmの励起波長と590nmの発光波長にて各ウェルのプレートを即座に読み取ってバックグラウンドの蛍光を決定した。37℃にて6〜7時間インキュベーション後、プレートを再び読み取って総蛍光を決定した。バックグラウンドと総蛍光の強度との差異としてアラマーブルー蛍光を計算した。抗体の存在下で、三通りの蛍光値の平均±SDを三つ組の100%生存率の蛍光値の平均のパーセントとして計算した。コントロールの生存率の値の百分率をIgG濃度のlogの関数としてプロットした。Prism(GraphPad)を用いて用量-依存性(変数勾配)シグモイド関数のフィッティングによってIC50値を計算した。
PC12アッセイの結果は、最適化ヒトIgG4 NGF抗体の中和能がその親IgGより高いことを確証した。抗体は、濃度に関連する様式でヒト及びラットのNGF-維持PC12細胞の生存を阻害した(図3A及び3B；表3)。生殖系列化は、試験抗体の、NGF中和能、特にラットNGFイソタイプに対するNGF中和能を低減するようだ。例えば、1nMのヒト又はラットNGFによって媒介される細胞生存率についての生殖系列の抗体G1152H5の平均IC50は、それぞれ1.1nM及び7.3nMだった。対照的に、1152H5(すなわち非生殖系列の抗体)について1nMのヒト又はラットのNGFの中和の平均IC50はそれぞれ0.40nM及び0.38nMだった。
【００５９】
〔実施例6〕
〔TF-1細胞増殖アッセイにおけるNGF-中和活性〕
TF-1細胞系は、外因性成長因子及びサイトカインによって刺激されて増殖しうるヒトの前骨髄(premyeloid)細胞株である。TF-1細胞はヒトTrkA受容体を発現し、NGFによる活性化に応答して増殖する。TF-1細胞増殖アッセイを用いて、ヒトIgG4 NGF抗体を中和するという機能の能力をin vitroで特徴づけした。
R&D SystemsからTF-1細胞を得、供給されたプロトコルに従って維持した。アッセイ培地は、RPMI-1640と、5%の胎児ウシ血清(Hyclone)及び1%のピルビン酸ナトリウム(Sigma)を含有するGLUTAMAX I(Invitrogen)とを含む。各アッセイの前に300xgで5分遠心分離してTF-1細胞をペレットにし、吸引によって培地を除去して細胞をアッセイ培地に再懸濁させた。この工程を3回繰り返し、アッセイ培地中105/mlの最終濃度で細胞を再懸させ、96ウェル平底の組織培養アッセイプレートの各ウェルに100μl加えて最終細胞密度1×104/ウェルを得た。抗体の試験溶液(三つ組)を希釈してアッセイ培地中で最終アッセイ濃度1μg/mlとなるようにし、アッセイプレートをまたがって1:5滴定した。NGFに対するものでない無関係の抗体(CAT-001)を陰性コントロールとして使用した。さらに、基準のモノクロナール抗体MAB256(R&D Systems)を陽性コントロールとして用いた。50μlの試験抗体を各ウェルに添加後、50μlの天然の純粋のマウス(7S型; Invitrogen)、ラット(Sigma)又はヒト(Sigma)のNGFを希釈して最終アッセイ濃度200pMを得た。アッセイプレートを湿潤チャンバー内37℃にて5% CO2中で68時間インキュベートした。20μlのトリチウム化チミジン(5.0μCi/ml, NEN)を各アッセイウェルに加え、アッセイプレートをさらに5時間インキュベーターに戻した。96ウェルガラスファイバーフィルタープレート(Perkin Elmer)上でセルハーベスターを用いて細胞を収集した。次に、フィルタープレートの各ウェルにMicroScint 20TM(50μl)を加え、Packard TopCountマイクロプレート液体シンチレーションカウンターを用いて[3H]-チミジンの取り込みを定量した。抗体の存在下で、1分当たりの平均バックグラウンドカウント(すなわち細胞をNGFにさらさない)と平均総カウント(すなわち細胞をNGFで刺激した)との差異として、チミジンの取り込み(1分当たりのカウントとして数量化)を計算し、最大増殖のパーセントとして表した。最大増殖のパーセントをIgG濃度のlogの関数としてプロットした。GraphPadプリズムを用いてシグモイドの用量(可変勾配)関数のフィッティングによってIC50値を計算した。
ヒトIgG4 NGF抗体は、ヒト、ラット及びマウスのNGFイソタイプによって媒介されるTF-1細胞増殖の強力な阻害因子だった(図4A、4B、及び4C)。これらの結果は、1021E5系列から誘導される抗体が、天然のヒトNGF受容体の活性化によって媒介されるNGFのシグナル伝達をin vitroで破壊しうることを明らかにしている。PC12細胞生存率アッセイ(実施例5)で観察されるヒトNGF抗体の活性によれば、TF-1増殖アッセイにおいて、非生殖系列抗体は、その生殖系列同等物より強力だった(表3)。平均IC50データに基づいて、200pMのヒトNGFによって媒介される増殖の阻害について試験した抗体の中和能の順位は、1133C11＞1152H5＞1252A5＝G1152H5＞＞MAB256だった。
【００６０】
〔実施例7〕
〔他のニューロトロフィンとの抗-NGF IgGの交差反応性〕
ELISAを行って、他のニューロトロフィンについて抗-NGF IgGの交差反応性を決定した。このELISAは、プレートを100ng/ウェルのヒトNGF(R&D systems, 256-GF)、脳由来ニューロトロフィン因子(BDNF; R&D systems, 248-BD)、ニューロトロフィン-3(NT-3; R&D systems, 257-N3)、又ニューロトロフィン-4(NT4; R&D systems, 257-N4)で室温にて5〜6時間被覆後、プレートを0.25%のHSAで4℃にて一晩ブロッキングすることからなっている。抗-NGF IgGの濃度を0.03〜10nMの範囲で増加させ、室温で2時間インキュベートして各ニューロトロフィンに結合させた。ビオチン化抗-ヒトポリクロナール抗体(1:300)(Rockland 609-1602)、ストレプトアビジン-連結アルカリ性ホスファターゼ(1:1000)、及び蛍光基質Aで抗-NGF IgGを検出した。ニューロトロフィンのプレートへの結合を実証する陽性コントロールは市販のビオチン化抗-ヒトポリクロナール抗体(R&D Systemsの抗-NGF BAF 256、抗-BDNF BAM 648、抗-NT-3 BAF 267、抗-NT-4 BAF 268)を利用し、これらは、ストレプトアビジン-連結アルカリ性ホスファターゼとその後に基質Aの添加によって直接検出した。ニューロトロフィンの代わりにBSAで被覆したウェルを用いて非特異的な結合を決定した。基質Aの添加後、0〜60分経時的に産物の生成を追った。1064F8では15分間線形の産物の生成の後、おそらく基質の枯渇のため、やがて時間と共に横ばい状態になった。すべてのIgGの濃度について、NGFと比較したニューロトロフィンに対する特異的結合のパーセントとして交差反応性を計算した。1064F8などの高親和性のIgGでは、15分の産物の生成データを用いて交差反応性のパーセントを計算した。1016A8などの低親和性のIgGでは、60分の産物の生成データを用いて交差反応性のパーセントを計算した。
7種のヒトIgG4 NGF抗体の、NGFと比較したBDNF、NT-3、及びNT-4に対する交差反応性を決定した。試験した濃度では、7種のすべての抗体が無視できる交差反応性を示した(表4)。例えば、NT-3、NT-4及びBDNFとの最高レベルの交差反応性が観察された1252A5では、それぞれ1.1%、0.9%及び1.4%だった(図5)。
【００６１】
〔実施例8〕
〔ヒトNGF抗体のNGF-結合親和性の決定〕
放射リガンド-結合アッセイ型式を室温にて行い、ヒトIgG4 NGF抗体のNGF-結合親和性を決定した。簡単にいえば、リン酸緩衝食塩水(PBS)中100μl/ウェルの2.2μg/mlのヤギの抗-ヒトIgG(Sigma-Aldrich, UK)でフラッシュプレート(Perkin Elmer SMP200)を1時間被覆した。ウェルをPBSで洗浄してから、3%w/vのウシ血清アルブミン(BSA; Sigma-Aldrich, UK)を含有する200μl/ウェルのPBSでブロッキングした。ウェルをPBSで洗浄し、0.5%w/vのBSAを含有する0.1mlのPBSの体積の各ウェルに10ngのヒトNGF抗体を加えた。1時間のインキュベーション後、プレートをPBSで洗浄した。
Amersham UK(ヒト125I-NGF, Amershamカタログ番号IM286；ラット125I-NGF、カスタム標識した組換えラットβ-NGFはR&D Systems,カタログ番号556-GF-100から購入)から、放射性ヨウ素標識したヒト及びラットのNGFを得た。各125I-NGFイソタイプをアッセイ緩衝液(0.5%w/vのBSAと0.05%v/vのTween 20を含有するPBS)で段階希釈し、二つ組の100μlのサンプルをアッセイプレートに加え、2pM〜15nMの濃度範囲にわたる‘総結合’の測定値を得た。大過剰の非放射性標識NGFの存在下で結合を測定することによって、各125I-NGF濃度における非特異的結合(non-specific binding)(NSB)を決定した。NSBウェルは、適宜最終濃度500nMの非標識ヒトβ-NGF(R&D Systems カタログ番号256-GF-100)又はラットβ-NGF(R&D Systems カタログ番号556-GF-100)と共に125I-NGF(2pM〜15nM)を含む。プレートを一晩インキュベートし、γカウンター(TopCount NXT, Perkin Elmer)でウェルを1分間カウントした。式「特異的結合＝総結合−非特異的結合」に従って特異的結合を計算した。結合曲線をプロットし、Prismソフトウェア(GraphPad Software Inc., USA)を用い、単一部位飽和結合モデル(one-site saturation binding model)に従って結合パラメーターを決定した。
ヒトとラットの125I-NGFは、ヒトIgG4 NGF抗体、1252A5及びG1152H5に対して飽和性の高親和性結合を示した(図6及び7)。ヒト125I-NGFとの結合相互作用の計算値Kdは、1252A5については0.35nM、G1152H5については0.37nMだった。ラット125I-NGFの結合に関するKd値は、1252A5については0.44nM、G1152H5については0.50nMだった。
【００６２】
〔実施例9〕
〔NGFの、ヒトTrkA及びp75受容体に対する結合の阻害についてのKi値の決定〕
抗体1252A5及びG1152H5が、TrkA及びp75受容体へのNGFの結合の示差的な阻害を示すかどうか決定するための実験を行った。結合阻害定数(Ki)値を計算するために競合結合実験を設計した。放射性ヨウ素標識したヒト又はラットNGFのヒトTrkA-又はp75-受容体融合タンパク質に対する結合の抗体-媒介阻害についてIC50を計算した。次に、Cheng-Prusoff方程式を用いてKi値を導いた。
ヒトTrkA及びp75受容体融合タンパク質(R&D Systems)をダルベッコのPBS(Gibco)に希釈して、それぞれ最終濃度10nM及び0.6nMとした。Maxisorp Nunc白色96ウェルマイクロタイタープレート(Nalge Nunc)を一晩4℃にて100μl/ウェルの希釈TrkA又はp75受容体溶液で被覆した。プレートを3回PBS Tween 20で洗浄してから、PBS中の200μl/ウェルの3%w/vウシ血清アルブミン(BSA)でブロッキングした。室温で1時間インキュベーション後、プレートを洗浄した。試験抗体をアッセイ緩衝液(PBS中0.5%w/vのBSA及び0.05%v/vのTween 20)で所望濃度に希釈した。NGFに対するものでない無関係の抗体を陰性コントロールとして用い、放射性リガンド結合の基準阻害因子として、放射性標識していないNGFを用いた。試験サンプルの各濃度について二つ組のウェルを調製した。試験サンプルと混合したときアッセイウェルの最終濃度が100μlの総アッセイ体積中で150pMとなるように、ヒト又はラットの125I-NGF(Amersham Biosciences)をアッセイ緩衝液で希釈した。アッセイプレートを室温で2時間インキュベート後、PBS/Tween 20で洗浄して未結合の125I-NGFを除去した。100μl/ウェルのMicroscint 20(Perkin Elmer)を添加後、Packard TopCountマイクロプレート液体シンチレーションカウンターを用いてカウントすることによって、結合している放射性標識を定量した。データをプロットし、Graphpad Prismソフトウェアを用いて解析して各実験についてIC50値を計算し、下記Cheng-Prusoff方程式に従って対応するKiを導いた。
Ki＝IC50/(1＋D/Kd)
式中：
D＝  アッセイ中のNGF濃度(名目上150pMであるが、実際のアッセイ濃度は各実験で決定)
Kd＝  同一のアッセイ条件下におけるNGFのTrkA又はp75受容体に対する親和性。これは、別個の実験でTrkA及びp75受容体に対する125I-NGFの結合の飽和結合分析によって決定した。
ヒトIgG4コントロールを除き、評価したすべての抗体がヒト及びラットの125I-NGFのヒトTrkA及びp75受容体に対する結合を阻害した(図8及び9；表5)。表6は図8Aに示されるデータから計算したIC50及びKi値を示し；表7は図8Bに示されるデータから計算したIC50及びKi値を示し；表8は図9Aに示されるデータから計算したIC50及びKi値を示し；表9は図9Bに示されるデータから計算したIC50及びKi値を示す。抗体1252A5は一貫して125I-NGF結合阻害の最高の中和能を示した。興味深いことに、TrkAとp75受容体に対するNGFの結合の1252A5-媒介阻害について決定した結合阻害定数値は有意に異なっていた。このように、ヒトNGFのTrkAとp75に対する結合の阻害について計算した平均pKiはそれぞれ10.26±0.08及び9.85±0.04だった(P<0.01、スチューデントのT-検定；両方ともn=3)。ラットNGFのTrkA及びp75受容体に対する阻害について計算した平均pKiは、それぞれ9.79±0.04及び9.55±0.03だった(P<0.05、スチューデントのT-検定；両方ともn=3)。この結果は、1252A5がNGFとTrkA受容体との間の相互作用の示差的阻害因子であることを示唆しており、また予想外にも、対応するpKi値間には有意な差異がないというG1152H5で得られた結果と対照的である(表5)。
【００６３】
〔実施例10〕
〔ヒトIgG4 NGF抗体の抗痛覚過敏活性〕
カラギナン-誘発熱過敏症のマウスモデルでNGF抗体の抗痛覚過敏活性を評価した。最初に、オスのマウス(体重20〜25g)を2時間試験装置の環境に慣らした。次の日、両方の後足の熱刺激に対する反応性のベースライン測定値を決定した。後足の底面に集束熱源を施し、Hargreavesらの方法(1988)に従って後退行動の潜伏時間を記録した。各足について、10分感覚で記録した三つ組の平均としてベースライン値を計算した。次に、マウスに、リン酸緩衝食塩水(PBS)ビヒクル中のNGF-中和性のヒトIgG4抗体又はコントロールのイソタイプ-合致ヌル抗体の腹腔内注射を行った。24時間後、カラギナンの足底下(subplantar)注射(PBS中2%w/v；30μlの注射体積)によって炎症性痛覚過敏を誘発した。さらに24時間後、炎症した後足と炎症していない後足について、再び後退行動の潜伏時間を決定した。
カラギナン注射の24時間後に観察される熱痛覚過敏は、ヒトIgG4 NGF抗体1252A5でマウスを予め処置することで用量依存的に阻害された(図10)。
【００６４】
すべての引用文書は参照によって本明細書に取り込まれる。
〔参考文献〕
Al-Lazikani, et al.  Journal Molecular Biology (1997) 273(4), 927-948
Aloe, L. and Tuveri, M.A. (1997) Clin Exp Rheumatol, 15(4): 433-8.
Amann, R.  and Schuligoi R. (2000) Neurosci Lett, 278(3): 173-6.
Andersen DC and Krummen L (2002) Current Opinion in Biotechnology 13: 117
Ausubel et al. eds., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 4th edition 1999
Bagshawe K.D. et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922
Barbas et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:3809-3813
Bennett, D.L. et al. (1998) Eur J Neurosci, 10(4): 1282-91.
Bennett, D.L. (2001) Neuroscientist, 7(1): 13-7.
Bergmann I. et al., Neurosci Lett., 255(2) 87-90, 1998
Bird et al, Science, 242, 423-426, 1988;
de Castro,F. et al. (1998) Eur J Neurosci, 10(1): 146-52.
Chadd HE and Chamow SM (2001) Current Opinion in Biotechnology 12: 188-194
Cho, H.J. et al. (1996) Brain Res, 716(1-2): 197-201.
Chothia, et al.  Science, 223,755-758 (1986)
Chothia C.  et al.  Journal Molecular Biology (1992) 227, 799-817
Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1988
Denison David G.  T. (Editor), Christopher C.  Holmes, Bani K.  Mallick, Adrian F.  M.  Smith.  Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics).  John Wiley & Sons; (July 2002), ISBN: 0471490369
Fjell, J. et al. (1999) J Neurosci Res, 57(1): 39-47.
Garaci, E. et al. (2003)Proc Natl Acad Sci USA, 100(15): 8927-8932.
Ghose, Arup K.  & Viswanadhan, Vellarkad N..  Combinatorial Library Design and Evaluation Principles, Software, Tools, and Applications in Drug Discovery.  ISBN: 0-8247-0487-8
Gram et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3576-3580
Guex, N.  and Peitsch, M.C. Electrophoresis (1997) 18, 2714-2723
Haan & Maggos (2004) BioCentury, 12(5): A1-A6
Hanes et al., Methods in Enzymology, 328: 24, (2000)
Hargreaves et al., Pain, 32: 77 (1988)
Heumann, R. et al. (1987) J Cell Biol, 104(6): 1623-31.
Holliger, P. and Winter G. Current Opinion Biotechnol 4, 446-449 1993
Holliger, P. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993
Holt et al (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490
Hongo, J.S. et al. (2000) Hybridoma 19(3): 215-227.
Hoyle, G.W. (2003) Cytokine Growth Factor Rev, 14(6): 551-8.
Hu, S. et al, Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996.
Huang,E.J. and Reichardt, L.F. (2001) Ann Rev Neurosci, 24: 677-736.
Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988
Hutchings, in Antibody Engineering, Konterman and Dubel eds., Springer, Berlin, pp. 93-108 [2001]
Indo, Y. (2002) Clin Auton Res, 12 Suppl 1: I20-32.
Jagger, S.I. et al. (1999) Br J Anaesth, 83(3): 442-8.
Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition. US Department of Health and Human Services. 1987
Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition. US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington.
Kandel, Abraham & Backer, Eric.  Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis.  Prentice Hall PTR, (May 11, 1995), ISBN: 0133418847
Kay, B.K., Winter, J., and McCafferty, J. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, San Diego: Academic Press.
Knappik et al. J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86
Koide et al. (1998) Journal of Molecular Biology, 284: 1141-1151.
Koltzenburg, M. et al. (1999) Eur J Neurosci, 11(5): 1698-704.
Kontermann, R & Dubel, S, Antibody Engineering, Springer-Verlag New York, LLC; 2001, ISBN: 3540413545.
Krebs et al. Journal of Immunological Methods 254 2001 6784
Krzanowski, Wojtek.  Principles of Multivariate Analysis: A User's Perspective (Oxford Statistical Science Series, No 22 (Paper)).  Oxford University Press; (December 2000), ISBN: 0198507089
Larrick JW and Thomas DW (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:411-418.
Ledermann J.A. et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664
Lommatzsch, M. et al. (2003) Ann NY Acad Sci, 992: 241-9.
Lowe, E.M. et al. (1997) Br J Urol, 79(4): 572-577.
Ma, Q.P. and Woolf, C.J. (1997) Neuroreport, 8(4): 807-10.
Mach et al., Analytical Biochemistry, 200: 74, (1992)
Mamet, J. et al. (2003) J Biol Chem, 278(49): 48907-13. 
Marks et al Bio/Technology, 1992, 10:779-783
McArthur, J.C. et al. (2000) Neurology, 54(5): 1080-8.
McCafferty et al (1990) Nature, 348, 552-554
Mendell, L.M. and Arvanian, V.L. (2002) Brain Res Rev, 40(1-3): 230-9. 
Mendez, M. et al. (1997) Nature Genet, 15(2): 146156.
Nakagawara, A. (2001) Cancer Lett, 169(2): 107-14.
Norman et al.  Applied Regression Analysis.  Wiley-Interscience; 3rd edition (April 1998) ISBN: 0471170828
Nygren et al. (1997) Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469.
Owolabi, J.B. et al. (1999) J Pharmacol Exp Ther, 289(3): 1271-6.
Persic et al., Gene, 187: 9, (1997)
Petty, B.G. et al. (1994) Ann Neurol, 36(2): 244-6.
Pleuvry B. & Pleuvry A., (2000) Analgesia: Markets and Therapies, ISBN 1860674143
Pluckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991)
Pozza, M., et al. (2000) J Rheumatol, 27(5): 1121-7.
Priestley, J.V. et al. (2002) Can J Physiol Pharmacol, 80(5): 495-505.
Qiao, L.Y. and Vizzard, M.A. (2002) J Comp Neurol, 454(2): 200-11.
Ramer, M.S. et al. (1998) Neurosci Lett, 251(1): 53-6.
Ramer, M.S. et al. (1999) Pain, Suppl 6: S111-20.
Reiter, Y. et al, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996
Ridgeway, J. B. B. et al, Protein Eng., 9, 616-621, 1996
Ro, L.S. et al. (1999) Pain, 79(2-3): 264-74.
Robinson, J. R. ed., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978
Sah, D.W. et al. (2003) Nat Rev Drug Discov, 2(6): 460-72.  
Sambrook and Russell, Molecular Cloning: a Laboratory Manual:  3rd edition, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press
Sammons, M.J. et al. (2000) Brain Res, 876(1-2): 48-54.
Schier et al., 1996, J. Mol. Biol. 263:551-567
Stemmer, Nature, 1994, 370:389-391
Vaughan et al., Nature Biotechnology 14 309-314, 1996.
Voet & Voet, Biochemistry, 2nd Edition, (Wiley) 1995.
Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)
Wess, L.  In: BioCentury, The Bernstein Report on BioBusiness, 12(42), A1-A7, 2004.
Whitelegg, N.R.u.  and Rees, A.R (2000).  Prot.  Eng., 12, 815-824
Witten, Ian H.  & Frank, Eibe.  Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations.  Morgan Kaufmann; (October 11, 1999), ISBN: 1558605525
Wold, et al.  Multivariate data analysis in chemistry.  Chemometrics Mathematics and Statistics in Chemistry (Ed.: B.  Kowalski), D.  Reidel Publishing Company, Dordrecht, Holland, 1984 (ISBN 90-277-1846-6)
Woolf, C.J. (1996) Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 351(1338): 441-8.
Yasuda, H. et al. (2003) Prog Neurobiol, 69(4): 229-85.
Zhang YH, Nicol GD. Neurosci Lett. 2004 Aug 12;366(2):187-92.
【００６５】
表１
カルシウム動員アッセイにおけるヒトIgG4 NGF抗体の中和能
2008527989.tif 000002
データは、an=14、bn=12、cn=3、dn=4(平均±sem)及びen=1を除き、2つの別個の測定の平均を示す。*外挿によって決定した値。ND＝決定せず。
【００６６】
表2a
HCDR3配列LNPSLTA（配列番号531）を含む1021E5-由来最適化クローンのCDR
2008527989.tif 000003
（右欄第1列：ヒトNGF結合アッセイにおけるscFv IC50(nM)；右欄第2列：ラットNGF結合アッセイにおけるscFv IC50(nM)）
表の右の欄は各クローンについてのNGF中和能(IC50)の評価値を示す。実施例3に記載したようにNGF-結合アッセイで精製scFvをアッセイした。
【００６７】
2008527989.tif 000004
【００６８】
2008527989.tif 000005
【００６９】
2008527989.tif 000006
【００７０】
2008527989.tif 000007
【００７１】
表4
最適化ヒトIgG4 NGF抗体の他のニューロトロフィンとの交差反応性
2008527989.tif 000008
【００７２】
列中のデータは、計算された抗体の交差反応性の範囲を示す。値は、同じ試験抗体濃度におけるNGF結合シグナルについて、各ニューロトロフィンに対して観察されたシグナルのパーセンテージとして計算される。100ng/ウェルの濃度でアッセイプレートにニューロトロフィンをコートし、試験抗体の結合性を0.03〜10nMの濃度範囲にわたって測定した。データは単一実験の結果を表す。
【００７３】
表5
1252A5及びG1152H5の結合阻害定数決定の概要。
データは3つの独立した実験の平均±s.e.m.を表す。
2008527989.tif 000009
* P<0.01 c.f. ヒトNGF/p75相互作用
** P<0.05 c.f. ラットNGF/p75相互作用
§ N/S c.f. p75 
スチューデントの対応のないT-検定(unpaired t-test)
【００７４】
表6
2008527989.tif 000010
【００７５】
表7
2008527989.tif 000011
【００７６】
表8
2008527989.tif 000012
【００７７】
表9
2008527989.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１Ａ】ヒトTrkA受容体カルシウム動員アッセイにおけるヒトのNGFの抗体中和の濃度-阻害曲線を示す。
【図１Ｂ】ヒトTrkA受容体カルシウム動員アッセイにおけるラットのNGFの抗体中和の濃度-阻害曲線を示す。
【図２Ａ】組換えによってヒトTrkA受容体を発現しているHEK-293細胞での細胞内カルシウム動員の、ヒトのNGFによって誘発される応答の、中和能を最適化したヒトIgG4抗体1nMの阻害示す。
【図２Ｂ】組換えによってヒトTrkA受容体を発現しているHEK-293細胞での細胞内カルシウム動員の、ラットのNGFによって誘発される応答の、中和能を最適化したヒトIgG4抗体1nMの阻害示す。
【図２Ｃ】組換えによってヒトTrkA受容体を発現しているHEK-293細胞での細胞内カルシウム動員の、マウスのNGFによって誘発される応答の、中和能を最適化したヒトIgG4抗体1nMの阻害示す。
【図３Ａ】PC12細胞生存率アッセイにおける1nMのヒトNGFの存在下のヒトIgG4 NGF抗体の阻害効果を示す。
【図３Ｂ】PC12細胞生存率アッセイにおける1nMのラットNGFの存在下のヒトIgG4 NGF抗体の阻害効果を示す。
【図４Ａ】生殖系列及び非生殖系列のヒトIgG4 NGF抗体、及び基準NGF抗体、MAB256によるNGF-媒介TF-1細胞増殖。細胞を200pMのヒトNGFで刺激した。
【図４Ｂ】生殖系列及び非生殖系列のヒトIgG4 NGF抗体、及び基準NGF抗体、MAB256によるNGF-媒介TF-1細胞増殖の阻害を示す。細胞を200pMのラットNGFで刺激した。
【図４Ｃ】生殖系列及び非生殖系列のヒトIgG4 NGF抗体、及び基準NGF抗体、MAB256によるNGF-媒介TF-1細胞増殖の阻害を示す。細胞を200pMのマウスNGFで刺激した。
【図５】ヒトIgG4 NGF抗体、1252A5のニューロトロフィンBDNF、NT-3及びNT-4との交差反応の欠如を示す。
【図６Ａ】ヒト125I-NGFのヒトIgG4 NGF抗体1252A5に対する結合の飽和結合曲線を示す。
【図６Ｂ】ヒト125I-NGFのヒトIgG4 NGF抗体G1152H5に対する結合の飽和結合曲線を示す。
【図７Ａ】ラット125I-NGFのヒトIgG4 NGF抗体1252A5に対する結合の飽和結合曲線を示す。
【図７Ｂ】ラット125I-NGFのヒトIgG4 NGF抗体G1152H5に対する結合の飽和結合曲線を示す。
【図８Ａ】ヒトの125I-NGFのTrkA受容体融合タンパク質に対する結合の、ヒトIgG4又は基準抗体による濃度依存性阻害を示す。
【図８Ｂ】ラットの125I-NGFのTrkA受容体融合タンパク質に対する結合の、ヒトIgG4又は基準抗体による濃度依存性阻害を示す。
【図９Ａ】ヒトの125I-NGFのp75受容体融合タンパク質に対する結合の、ヒトIgG4又は基準抗体による濃度依存性阻害を示す。
【図９Ｂ】ラットの125I-NGFのp75受容体融合タンパク質に対する結合の、ヒトIgG4又は基準抗体による濃度依存性阻害を示す。
【図１０】ヒトIgG4抗-NGF、1252A5の全身投与48時間後のマウスにおけるカラギナン誘発熱痛覚過敏の用量関連阻害を示す。
【図１Ａ】
2008527989.tif 000014
【図１Ｂ】
2008527989.tif 000015
【図２Ａ】
2008527989.tif 000016
【図２Ｂ】
2008527989.tif 000017
【図２Ｃ】
2008527989.tif 000018
【図３Ａ】
2008527989.tif 000019
【図３Ｂ】
2008527989.tif 000020
【図４Ａ】
2008527989.tif 000021
【図４Ｂ】
2008527989.tif 000022
【図４Ｃ】
2008527989.tif 000023
【図５】
2008527989.tif 000024
【図６Ａ】
2008527989.tif 000025
【図６Ｂ】
2008527989.tif 000026
【図７Ａ】
2008527989.tif 000027
【図７Ｂ】
2008527989.tif 000028
【図８Ａ】
2008527989.tif 000029
【図８Ｂ】
2008527989.tif 000030
【図９Ａ】
2008527989.tif 000031
【図９Ｂ】
2008527989.tif 000032
【図１０】
2008527989.tif 000033
【配列表】
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【国際調査報告】
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2008527989.tif 000035
2008527989.tif 000036
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