(57)【要約】  本発明は、ガラス質氷被覆粒子液滴を急速に形成するための方法と装置を提供する。
2008538235.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラス質氷粒子液滴ビームを急速に形成するための方法であって、
水和粒子液滴ビームを、温度が２００Ｋ以下でかつ圧力が１気圧以下である第１室の中で、低温ガスと接触させることによって、ガラス質氷粒子液滴ビームを形成するステップを備える方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法であって、
前記第１室の温度は４Ｋ以下である方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の方法であって、
前記低温ガスは、前記第１室の中で前記水和粒子液滴ビームと反対方向に流れる方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、
水和粒子溶液を、ノズルを通じて前記第１室の中へ送って、前記水和粒子液滴ビームを形成するステップを備える方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法は、更に
前記水和粒子溶液を前記第１室へ送る間に、前記ノズルに摂動を加えるステップを備える方法。
【請求項６】
請求項４又は５記載の方法は、更に
前記液滴ノズルに電位をかけて、前記粒子液滴の帯電を制御するステップを備える方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、
前記電位は、前記ガラス質氷粒子液滴ビーム内の電流の流れを測定するフィードバックループにより制御される誘導帯電からなる方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法は、更に
前記ガラス質氷粒子液滴ビームを第２室に注入するステップを備え、
前記第２室は２００Ｋ以下の温度を有すると共に、前記ガラス質氷粒子液滴ビームを維持するのに適した圧力を有する方法。
【請求項９】
請求項８記載の方法であって、
前記第２室は真空室からなる方法。
【請求項１０】
請求項８又は９記載の方法であって、
前記注入するステップは、前記ガラス質氷粒子液滴ビームを１００μＭ以下の内径を有する毛細管に通過させるステップと、前記ガラス質氷粒子液滴ビームを前記毛細管から前記第２室内に注入するステップとからなる方法。
【請求項１１】
請求項９又は１０記載の方法であって、
前記第２室内の圧力は１０−５トールから１０−８トールの範囲内である方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、
前記低温ガスは、ヘリウム、水素、ネオン、アルゴン、窒素、メタン、エタン、及びプロパンからなるグループより選択される方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法であって、
前記低温ガスはヘリウムからなる方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法は、更に
前記粒子の構造を決定するステップを備える方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法であって、
前記粒子の構造を決定するステップは、
（ｉ）前記ガラス質氷粒子液滴ビームをレーザービームと回折ビームに通過させて前記ガラス質氷粒子液滴ビーム内の複数の粒子の第１整列に対する回折パターンを生成するステップを備える方法。
【請求項１６】
請求項１５記載の方法は、更に
（ｉｉ）前記ガラス質氷粒子液滴ビームを前記レーザービームと前記回折ビームに通過させて前記ガラス質氷粒子液滴ビーム内の複数の粒子の第２整列に対する回折パターンを生成するステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）を所望の回数繰り返して、前記ガラス質氷粒子液滴ビーム内の複数の粒子の更に別の整列の回折パターンを生成するステップと、
（ｉｖ）前記粒子の異なる整列から得られた複数の回折パターンから前記粒子の構造を決定するステップと
を備える方法。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、
各ガラス質氷粒子液滴は１μｍ以下の直径を有する方法。
【請求項１８】
請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法であって、
前記ガラス質氷粒子液滴ビームをレーザービームと回折ビームに通過させるステップは、交差容積内の３つの全てのビームの同時交差からなる方法。
【請求項１９】
請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法であって、
前記ガラス質氷粒子液滴ビームをレーザービームと回折ビームに通過させるステップは、
（ａ）前記ガラス質氷粒子液滴ビームをレーザービームに通過させて前記ガラス質氷粒子液滴ビーム内の前記粒子の第１整列を生成するステップであって、前記第１整列は第１整列を有する複数の粒子からなるステップと、
（ｂ）前記粒子の第１整列を回折ビームに通過させて前記粒子の前記第１整列の回折パターンを生成するステップと、
（ｃ）前記ガラス質氷粒子液滴ビームを前記レーザービームに通過させて前記ガラス質氷粒子液滴ビーム内の前記粒子の第２整列を生成するステップであって、前記第２整列は第２整列を有する複数の粒子からなるステップと、
（ｄ）前記粒子の第２整列を前記回折ビームに通過させて前記粒子の第２整列の回折パターンを生成するステップと、
（ｅ）ステップ（ｃ−ｄ）を所望の回数繰り返して、前記ガラス質氷粒子液滴ビーム内の複数の粒子の更に別の整列の回折パターンを生成するステップと
を備える方法。
【請求項２０】
請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法であって、
前記レーザービームは直線偏波レーザー場を生成する方法。
【請求項２１】
請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法であって、
前記レーザービームは楕円偏波レーザー場を生成する方法。
【請求項２２】
請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法であって、
前記レーザービームは円偏波レーザー場を生成する方法。
【請求項２３】
請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の方法は、更に
前記ガラス質氷粒子液滴ビーム内の複数の粒子の異なる整列の少なくとも６個の回折パターンを生成するステップを備える方法。
【請求項２４】
請求項１５〜２３のいずれか１項に記載の方法であって、
前記回折ビームは電子ビームからなる方法。
【請求項２５】
請求項１５〜２３のいずれか１項に記載の方法であって、
前記回折ビームはＸ線ビームからなる方法。
【請求項２６】
請求項１５〜２５のいずれか１項に記載の方法であって、
前記分子の構造を決定するステップは、複数の回折パターンを組み合わせて前記粒子の三次元パターンを形成するステップを備える方法。
【請求項２７】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法は、更に
基板上に粒子を堆積させるステップを備える方法。
【請求項２８】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法は、更に
前記粒子について分光分析法を行うステップを備える方法。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法であって、
前記粒子は蛋白質からなる方法。
【請求項３０】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法であって、
前記粒子はウイルスからなる方法。
【請求項３１】
ガラス質氷粒子液滴を急速に形成するための装置であって、
（ａ）遠心端と近心端を備えた毛細管であって、前記遠心端は水和粒子溶液を収容するのに適した容器と流体接続するのに適しており、前記近心端はノズルを備えた毛細管と、
（ｂ）前記ノズルと流体接続している第１室と、
（ｃ）前記第１室と流体接続している低温ガス源と、
（ｄ）入口と出口を備えた注入管であって、前記入口は前記第１室と流体結合しており、前記出口は第２室と流体結合するのに適している注入管と、
（ｅ）ハウジングと
を備える装置。
【請求項３２】
請求項３１記載の装置は、更に
前記第１室を２００Ｋ以下の温度に保つのに適した冷却システムを備える装置。
【請求項３３】
請求項３１〜３２のいずれか１項に記載の装置であって、
前記注入管は、１００ｎｍから１００μｍの間の範囲の内径を有する装置。
【請求項３４】
請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の装置は、更に
前記注入管の出口と流体結合している第２室を備える装置。
【請求項３５】
請求項３４記載の装置であって、
前記第２室は真空室からなる装置。
【請求項３６】
請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の装置は、更に
前記ノズルを摂動させる手段を備える装置。
【請求項３７】
請求項３１〜３６のいずれか１項に記載の装置は、更に
前記ノズルに電位を加える手段を備える装置。
【請求項３８】
連続回折を行うための装置であって、
（ａ）真空室と、
（ｂ）前記真空室と流体結合している回折ビーム源と、
（ｃ）前記真空室と流体結合しているレーザービーム源と、
（ｄ）請求項３１の装置からなるガラス質氷粒子液滴ビーム源であって、前記注入管の出口は前記真空室と流体結合しているガラス質氷粒子液滴ビーム源と、
（ｅ）２００Ｋ以下の前記真空室内の温度を維持するための温度制御システムと、
（ｆ）前記真空室と接続した検出器システムとを備え、
前記回折ビーム源、前記レーザービーム源及び前記ガラス質氷粒子液滴ビーム源は、前記回折ビーム源、前記レーザービーム源及び前記ガラス質氷粒子液滴ビーム源から送られたビームを１０μＬから１００μＬの間の範囲にある交差容積で前記真空室内において交差させるように配置され、前記検出器システムは、前記回折ビームを通過する分子ビーム内の分子から回折パターンを受け取るように配置されている装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、ガラス質氷被覆粒子液滴を形成するための方法と装置ならびにその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質又は他の生体分子などの粒子の解析及び操作は、しばしば、粒子を真空へ導入又は注入することを必要とし、その場合、粒子が持つ固有の構造を維持しなければならない。真空への粒子注入を必要とする粒子の操作又は解析の例として、分子構造決定、分光分析法、（例えばセンサーアレイを生成するための）基板上への粒子堆積、ナノスケールでの自由な形態の製造、粒子含有複合体の新規な低温形態の形成、レーザー光、Ｘ線放射、中性子、又は他の強力ビームによる粒子の射突、可能なナノスケールでの空間分解能を備え、かつ指向性を有する自由空間化学反応の制御又は促進、及びこれらの粒子の分離、解析、又は精製などがある。なお、本出願は、２００５年３月１５日に出願された米国仮特許出願（出願番号ＵＳ６０／６６２，２７３、ＵＳ６０／６６２，５４６７）と、２００６年２月２１日に出願された米国特許出願「分子構造決定のための方法と装置」（出願番号付与予定）の権利を主張するものであり、これらの出願のすべてが参照として本明細書に組み込まれている。また、本作業の一部は、全米科学財団、生物学インフラストラクチャ部門、器械用プログラム、及び器械開発（認可番号０４２９８１４）により支援されており、米国政府は本発明において一定の権利を有している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、真空への粒子の注入に適した粒子の構造上の安定性を促進するための方法と装置は、これらの種々の分野において大変有益である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
第１態様において、本発明は、ガラス質氷粒子液滴ビームを急速に形成するための方法であって、水和粒子液滴ビームを、温度が２００Ｋ以下でかつ圧力が１気圧以下である第１室の中で、低温ガスと接触させることによって、ガラス質氷粒子液滴ビームを形成するステップを備える方法を提供する。好ましい実施態様において、本方法は、水和粒子溶液を、ノズルを通じて第１室の中へ送って、水和粒子液滴ビームを形成するステップを備えている。更に別の実施態様において、本方法は、更に、ガラス質氷粒子液滴ビームを第２室に注入するステップを備え、第２室は２００Ｋ以下の温度を有すると共に、ガラス質氷粒子液滴ビームを維持するのに適した圧力を有する。好ましい実施態様において、第２室は真空室からなる。更に好ましい実施態様において、低温ガスはヘリウムからなる。
【０００５】
第１態様の更に別の実施態様において、本方法は、更に、ガラス質氷粒子液滴ビームをレーザービームと回折ビームに通過させてガラス質氷粒子液滴ビーム内の複数の粒子の第１整列に対する回折パターンを生成することにより、粒子の構造を決定するステップを備えている。好ましい実施態様において、粒子構造決定ステップは、更に、（ｉｉ）ガラス質氷粒子液滴ビームをレーザービームと回折ビームに通過させてガラス質氷粒子液滴ビーム内の複数の粒子の第２整列に対する回折パターンを生成するステップと、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）を所望の回数繰り返して、ガラス質氷粒子液滴ビーム内の複数の粒子の更に別の整列の回折パターンを生成するステップと、（ｉｖ）粒子の異なる整列から得られた複数の回折パターンから粒子の構造を決定するステップとを備える。一実施態様において、回折ビームは電子ビームからなり、それとは別の実施態様において、回折ビームはＸ線ビームからなる。
【０００６】
第１態様の全ての実施態様のうちの好ましい実施態様において、粒子は蛋白質からなる。
第２態様において、本発明は、ガラス質氷粒子液滴を急速に形成するための装置であって、（ａ）遠心端と近心端を備えた毛細管であって、遠心端は水和粒子溶液を収容するのに適した容器と流体接続するのに適しており、近心端はノズルを備えた毛細管と、（ｂ）ノズルと流体接続している第１室と、（ｃ）第１室と流体接続している低温ガス源と、（ｄ）入口と出口を備えた注入管であって、入口は第１室と流体結合しており、出口は第２室と流体結合するのに適している注入管と、（ｅ）ハウジングとを備えた装置を提供する。
【０００７】
第２態様の更なる実施態様において、本装置は、更に、記第１室を２００Ｋ以下の温度に保つのに適した冷却システムを備えている。更に別の実施態様において、本装置は、更に、注入管の出口と流体結合している第２室を備えている。
【０００８】
第３態様において、本発明は、連続回折を行うための装置であって、（ａ）真空室と、（ｂ）真空室と流体結合している回折ビーム源と、（ｃ）真空室と流体結合しているレーザービーム源と、（ｄ）請求項３１の装置からなるガラス質氷粒子液滴ビーム源であって、注入管の出口は真空室と流体結合しているガラス質氷粒子液滴ビーム源と、（ｅ）２００Ｋ以下の真空室内の温度を維持するための温度制御システムと、（ｆ）真空室と接続した検出器システムとを備え、回折ビーム源、レーザービーム源及びガラス質氷粒子液滴ビーム源は、回折ビーム源、レーザービーム源及びガラス質氷粒子液滴ビーム源から送られたビームを１０μＬから１００μＬの間の範囲にある交差容積内で真空室内において交差させるように配置され、検出器システムは、回折ビームを通過する分子ビーム内の分子から回折パターンを受け取るように配置されている装置を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は参照として本明細書に含まれる。本明細書にて使用される単数形「１つの」及び「その」は、文脈が特に明確に示さない限りは複数の概念を含む。
【００１０】
第一の態様において、本発明は、ガラス質氷粒子液滴ビームを急速に形成するための方法であって、温度が２００Ｋ以下でかつ圧力が１気圧以下である第１室の中で、水和粒子液滴ビームと低温ガスとを接触させることによって、ガラス質氷粒子液滴ビームを形成するステップを備えた方法を提供する。本発明の方法にて使用される圧力範囲は、液滴の寸法、使用される低温のガス種、及び液滴がガス内を移動する距離などの種々の要因に応じて決まる。例えば、空気中におけるミクロン以下の直径の液滴について、好ましい圧力は、式ｐＬ〜１００トール／ｃｍによって決定される。ここで、Ｌは移動距離であって、ｐ＝１０００トールにおいてＬ＝１ｍｍである。好ましい実施態様では、約０．０１気圧から１気圧の間の範囲の圧力が使用される。
【００１１】
２００Ｋ以下の温度をこれらの方法において使用することができる。更に低い温度を、例えば、粒子整列が望まれる実施態様（例えば以下に述べる構造決定実施態様）に使用することもできる。そのような実施態様において、粒子が小さくなるほど、より低い温度を必要とする。粒子がリボゾームなどの高分子種からなる例において、２００Ｋ以下の温度が好ましい。より小さい粒子（例えばリゾチーム）について、〜１Ｋ以下の温度が好ましく、この温度は、例えば、以下に詳細に説明するように、真空中で液体ヘリウム液滴を用いることで得られる。
【００１２】
本発明の第１の態様の方法は、溶媒和粒子を急速冷却してそれら固有の構造を「急冷」し、保護ガラス質氷被覆中に入れられた粒子の周期的単分散単一方向の流れを生成する。この流れは、更なる操作及び解析のいずれか一方のために外部信号に対し位相固定される。
【００１３】
本明細書にて使用されるように、「水和粒子液滴ビーム」は１列縦隊粒子ビームであり、粒子は溶媒中を浮遊している。好ましい実施態様において、溶媒は、水又は標準的な緩衝溶液である。本発明と共に使用される他の典型的な溶媒として、脂質溶液、例えば、浮遊粒子を特定の状態及び構造にすることのできる脂質溶液がある。更に、溶媒は、ＰＨと抗凍結剤を設定するための緩衝剤を際限なく含み、ガラス質氷の形成を促進すると共に、液滴が凍結する際の結晶質氷化を回避することができる。粒子ビームの調製は、参照として本明細書に組み込まれる「エイチ・ポーリ、原子分子クラスタービーム、スプリンガー２０００、第１版、第１巻、頁１４９、４．１．１節」等の文書中に述べられている。
【００１４】
ノズルを通る水和粒子液の層流によるなど、１列縦隊（即ち単一方向）の水和粒子ビームを形成するための任意の手段を使用することもできる。好ましい実施態様において、その方法は、水和粒子溶液をノズルを通じて第１室へ送って水和粒子液滴ビームを形成するステップを備えている。本明細書にて使用されるように、「ノズル」は、流体の流れが水和粒子溶液源から第１室へ存在するときに、流体の流れの特性を制御するように設計された何らかの機械的装置である。液滴の寸法はノズル口径によって制御されるとの理由から、このノズルは、所望の水和粒子液滴ビームの仕様に基づいて設計される。好ましい実施態様において、水和粒子液滴の直径の範囲は、５μｍから５ｎｍの間の範囲であり、より好ましくは、１μｍから５０ｎｍの間の範囲であり、より一層好ましくは、１μｍから１００ｎｍの間の範囲であり、対象とされる直径は、対応する寸法のノズル口径の使用によりもたらされる。ノズルは、溶媒の凍結温度よりも高い温度に維持されることが更に好ましい。
【００１５】
更に好ましい実施態様において、この第１態様の方法は、更に、水和粒子溶液を第１室へ送る間ノズルに摂動を加えて、各液滴への水和粒子流れの分解を容易にするステップを備えている。そのような摂動は、同軸圧電素子に限定されない任意の適切な手段によっても加えることができ、小振動をノズル管に加え、所望の周波数でレイリー不安定性を誘発し、それにより液滴生成を制御可能な位相に固定することができる。更なる実施態様において、要求に応じて液滴を生成するための強力な非周期励磁がノズルに加えられる。例えば、インクジェットプリンタのように「要求に応じて液滴」を供給するために単一強力パルスを用いてもよい。
【００１６】
また、流路を流れる流体は印加電位のない場合でさえも界面動電効果により帯電されるとの理由から、水和分子ビーム源によって生成される氷被覆蛋白質の帯電を制御することが好ましい。従って、好ましい実施態様において、更に、その方法は、ノズルに電位をかけて粒子液滴の帯電を制御するステップを備えている。この電位は、ガラス質氷粒子液滴ビーム内の電流を測定するフィードバックループにより制御される誘導帯電からなることが更に好ましい。
【００１７】
本願の全体を通して用いられるように、「粒子」は、任意の生物学的又は化学的化合物、分子、高分子又は固有構造を「急冷する」ための急速冷却方法が有用なより大きな集合体であってもよく、蛋白質、核酸、脂質、炭水化物、化合物、結合複合体（例えば、蛋白質−配位子複合体）、及びウイルスを含むが、それらに限定されない。好ましい実施態様において、粒子は、蛋白質又は蛋白質−配位子複合体からなる。
【００１８】
本願の全体を通して用いられるように、「低温ガス」は、気体を２００Ｋ以下に保つ任意の物質（有機又は無機）であってもよく、ヘリウム、水素、ネオン、アルゴン、窒素、メタン、エタン、及びプロパンを含むが、これらに限定されない。第１室内の平行流又は逆流の低温ガスの使用は、ガラス質氷液滴を形成するために、水和粒子溶液内の粒子の温度、寸法及び帯電状態のいずれかを変更する機能を果たす。
【００１９】
本明細書に述べられる第１室は、その中で水和粒子液滴ビーム及び低温ガスを、２００Ｋ以下の温度でかつ１気圧以下の圧力の下で接触させることのできる任意の密閉体又は部分密閉体であってもよい。
【００２０】
限定されない例において、結晶化を避けるために加えられる抗凍結剤を場合によっては有するほぼ室温の水和粒子溶液が、ノズルから出て第１室へ入り、冷たい低温ガスが、この第１室を通って反対方向に流れる。好ましい実施態様において、約１気圧の４Ｋヘリウムが用いられるが、より高い温度、より高い圧力及びより低い圧力のいずれの使用も可能である。ノズルから出る水和粒子溶液はレイリー不安定性のために分解し、第１室の軸に沿って動く単分散単一方向液滴の流れを形成する。溶液内の粒子分子の濃度、ノズル通過流量及びノズル口径を調節することによって、液滴のかなりの部分が粒子分子を１つだけ含むようにすることができる。例えば、１０ｍ／ｓで移動する液滴ビームを形成する１００ｎｍ直径ノズルからの最適レイリー分解のもとで、流量は８０ｐＬ／ｓ（ピコリットル毎秒）に調節され、平均して各液滴内に一つの検体分子を有するため、水分子当たり８×１０−９検体分子の数濃度が必要とされる。当業者は、本発明の示唆に基づいて、一つの粒子を含む液滴の生成のため、他の適切な条件を定めることができる。
【００２１】
これらの液滴が冷たく乾いた低温ガスを通過する際、これらの液滴は、逆流する冷たい低温ガスへの熱エネルギーの伝達と、液滴からの水分子の蒸発とによって急速に冷やされる。冷却速度は、おそらく１０８Ｋ／ｓを超える。液滴は、急速に凍結し、ガラス質、即ち非晶質の氷を形成する。
【００２２】
「ガラス質氷」はガラス状態の粒子のことを指し、構成原子は結晶の特徴である長い距離の秩序を示さないが、短い距離の秩序を示し、原子の分離及び共有結合の長さの少なくともいずれかは一般的な均衡距離に非常に近い。結晶質氷よりもむしろガラス質氷の形成（本明細書にて示唆した急冷による）は、固有粒子構造を「固定」する機能を果たし、それにより変性を防ぐ。
【００２３】
得られた「ガラス質氷粒子液滴ビーム」は一列縦隊粒子ビームでもあり、粒子はガラス質氷被覆により保護される。氷被覆の厚みの範囲は、数マイクロメータから１ナノメータ未満までの範囲であり、０．２ｎｍから１μｍの間の範囲であり、好ましくは、１ｎｍから１μｍの間の範囲の直径を有することが好ましい。粒子は、ガラス質氷により覆われており、高圧や高温に晒されることはない。許容される圧力及び温度は、厳密には、例えば各分子及び溶液のｐＨに応じて決まるが、数キロバールより大きい圧力及び室温よりも遙かに高い温度（依然として水の沸点よりも十分低い温度）は、ハマーらによる［ジー・ハマーらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1552-1555 (1998)］や、へレマンズ及びスメラーによる［ケー・へレマンズ及びエル・スメラーによるBiochimica et Biophysica Acta B1386B, 353-370 (1998)］などに示唆されるように、ほとんどの蛋白質を変性させる。
【００２４】
更なる実施態様において、本発明の第１の態様による方法は、更に、ガラス質氷粒子液滴ビームを第２室に注入するステップを備え、第２室は２００Ｋ以下の温度を有すると共に、ガラス質氷粒子液滴ビームを維持するのに適した圧力を有し、第２室は真空室からなることが好ましく、真空室内の圧力は約１０−５トールから１０−８トールの範囲であることが好ましい。この技術に関しよく知られるように、真空室は、物質及び放射線の存在しない部分空間を形成するための装置であり、空気を含むことにより、ガス圧は、標準的な大気圧よりもはるかに小さい。そのような任意の真空室は、真空室内の２００Ｋ以下の温度が維持される限り、本発明の方法とともに使用することができる。
【００２５】
好ましい実施態様において、注入するステップは、ガラス質氷粒子液滴ビームを１００μＭ以下の内径を有する毛細管に通過させるステップと、毛細管からのガラス質氷粒子液滴ビームを真空室へ注入するステップとからなる。毛細管を使用する主な理由は、高圧第１室（即ち、「乾燥」部）から真空室への低温ガス流を最小にするためと、自由噴流膨張による冷却を促進するためである。ヘリウムは、非均質核形成中心を含むガスの自由噴流膨張のための最も効果的な低温ガスであり、正確には、ビーム内のガラス質氷粒子液滴を構成するものである。液滴は、基本的には直線（実際には重力加速度のためにやや双曲線）的に移動して毛細管に向かい、入口に到着する。第１室内で十分な熱伝達があれば、液滴は、約４Ｋの温度で入口に達する。液滴は、第１室の〜１気圧から毛細管の近心端の真空中に膨張するヘリウム原子ガスにより、この直線に沿って毛細管を通過する。この圧力勾配は低温ガスを加速させ、それに応じて圧力を低下させる。毛細管の近心端において、低温ガスは、残存圧力差の下で、周囲の真空への自由噴流により膨張する。ガラス質氷液滴は、直線軌道に沿って継続するものの、低温ガス原子は、毛細管出口から外に向けて広い範囲に亘り放射する膨張扇状体を形成する。低温ガスの膨張の際に、低温ガスは冷えかつ加速する。しかしながら、液滴速度と低温ガス速度の間には常に「ずれ」があるため、低温ガス原子は液滴を追い抜く。膨張時に低温ガスの温度が十分低下するのであれば、低温ガスは液滴上において凝縮する。この凝縮により潜熱が放出され、ガラス質氷液滴の温度が一定の値に固定される。この膨張が継続し、低温ガス密度が更に低下すると、衝突は最終的に停止し、低温ガスコーティングの蒸発が開始される。これにより、ガラス質氷液滴が冷却されて、蒸気圧が周囲の圧力にまで達するか、分子ビームの移動時間の規模で遅くなるまで継続される。全体的にみて、低温ガス温度は、毛細管を通じての移動とその後の自由噴射膨張の間に、５〜１０倍以上低下すると予想される。ガラス質氷液滴が同じ量だけ冷却されるのであれば、それらは、完全膨張ガラス質氷液滴ビームの中で〜５００ｍＫ未満の最終温度にまで到達する。この最終温度は、低温ガスのない場合に水滴の単純な気化冷却により可能なものよりも数桁低い。
【００２６】
これらの方法は、液滴内の粒子の急冷（「超急冷」と称す）を行い、これは、少なくとも以下の理由により望ましい。（１）急冷は、蛋白質、蛋白質−配位子複合体、又はウイルスなどの粒子の固有構造を凍結する。（２）急冷は、結晶質氷よりもむしろ非晶質又はガラス質氷の形成を促進し、この目的のために粒子溶液に抗凍結剤を加える必要性を最小限にする。（３）粒子の低回転温度は、（以下に述べる分子構造決定のため）効果的なレーザー整列にとって重要である。（４）液滴の蒸気圧は、温度と共に指数関数的に減少し、十分低い温度で完全に超高真空（ＵＨＶ）相当になる。
【００２７】
第１態様のこれら実施態様による各方法は、真空室内の粒子を解析又は操作するステップを更に含むことができる。真空への粒子注入を必要とする粒子の操作又は解析の限定されない例として、分子構造決定、分光分析法、（例えばセンサーアレイを生成するための）基板上への粒子堆積、ナノスケールでの自由な形式の製造、粒子含有複合体の新規な低温形態の形成、レーザー光、Ｘ線放射、中性子、又は他の強力ビームによる粒子の射突、可能なナノスケールの空間分解能を備え、指向性を有する自由空間化学反応の制御又は促進、及びこれらの粒子の分離、解析、又は精製がある。
構造決定
この第１態様の各実施態様における好ましい実施態様において、本方法は、更に、粒子の構造を決定するステップを備える。そのような構造決定を行う任意の方法を使用することができ、回折に基づく方法を含むがそれに限定されない。
【００２８】
好ましい実施態様において、粒子の構造を決定するステップは、更に
（ｉ）ガラス質氷粒子液滴ビームをレーザービームと回折ビームに通過させて、ガラス質氷粒子液滴ビーム内の複数の粒子の第１整列に対する回折パターンを生成するステップを備えている。更なる好ましい実施態様において、
（ｉｉ）ガラス質氷粒子液滴ビームをレーザービームと回折ビームとに通過させて、ガラス質氷粒子液滴ビーム内の複数の粒子の第２整列に対する回折パターンを生成するステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）を所望の回数繰り返して、ガラス質氷粒子液滴ビーム内の複数の粒子の更なる整列の回折パターンを生成するステップと、
（ｉｖ）粒子の異なる整列から得られた複数の回折パターンから粒子の構造を決定するステップとを備えている。
【００２９】
これらの実施態様において、本発明は、「連続回折」を含む非結晶化ベース分子構造決定を促進するための新規な方法を提供する。蛋白質などの分子を三次元周期的配列（結晶）で配置する代わりに、本方法は、高エネルギー電子又はＸ線ビームなどの高エネルギー回折ビームに、低温で粒子の多くのコピーを含むガラス質氷粒子液滴ビームを通過させるステップであって、散乱（回折）パターンを生成するステップを備えている。ガラス質氷粒子液滴ビームの粒子は、各粒子がほぼ同じように整列されるように、レーザービームによって整列される。本明細書に使用されるように、「ほぼ同じように整列される」は、整列の程度が回折パターンから平均分子構造の有用な再生像を得るのに十分であることを意味する。あらゆる瞬間に回折ビーム中に多くの整列された粒子が存在するとの理由から、これらのすべてから平均構造を得て、露出時間はこの数だけ減少する。電子ビーム又はＸ線ビームに対する粒子（例えば蛋白質）の放射感度のため、単一粒子からそれを破壊せずに回折パターンを得ることはできない。従って、（ガラス質氷粒子液滴ビームにより連続的に補給される）多くの粒子からの散乱の蓄積された効果であって、それぞれが通過するときに回折ビームの臨界未満の照射量を受けるものが使用される。（「臨界照射量」とは、任意の寸法のものを破壊する放射線量である）。好ましい実施態様において、本方法は、レーザービームの偏波の方向を変更することによって、複数の粒子整列に対する回折パターンを集合させるステップを備えている。これらの方法は、粒子構造決定のための以前の方法を実質的に改良したものである。
【００３０】
この構造決定の実施態様による方法は２００Ｋ以下の低温で行われる。粒子は整列を容易にするために冷却されなければならない。使用される特定の温度は、解析される粒子の物性と、集束レーザー整列ビームの電力とに応じて決まり、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）などのウイルスについてのほぼ室温から、リゾチームなどの小蛋白質についての僅か数度Ｋに至るまでの範囲である。
【００３１】
構造決定実施態様のうちの更なる好ましい実施態様において、大量の（最大毎秒何百万）の粒子が、集束整列レーザービームによって規定される空間内の小容積（整列容積）を通過する。この整列容積を通る粒子の流束が大きくなるほど、全回折強度は大きくなり、測定時間は短くなる。好ましい実施態様において、整列容積は一辺が５から３０マイクロメータの間（より好ましくは、一辺が５から１５マイクロメータの間）の範囲であり、ガラス質氷粒子液滴ビームの横幅はこれよりも大きくない。
【００３２】
構造決定方法は、ガラス質氷粒子液滴ビームをレーザービームと回折ビームとに通過させるステップを備えている。時間依存性はないため、レーザービームにより整列された粒子を回折ビームの中に供給するあらゆるプロセスを使用することもできる。一実施態様は、前記整列容積を含む「交差容積」内の３つの全てのビームの同時交差からなる。それとは別の実施態様において、粒子のレーザー整列が最初に生じ、続いて、整列粒子を回折ビームに通過させる。この実施態様において、ガラス質氷粒子液滴ビームをレーザービームと回折ビームに通過させるステップは、
（ａ）ガラス質氷粒子液滴ビームをレーザービームに通過させてガラス質氷粒子液滴ビーム内の粒子の第１整列を生成するステップであって、第１整列は第１整列を有する複数の粒子からなるステップと、
（ｂ）粒子の第１整列を回折ビームに通過させて粒子の第１整列の回折パターンを生成するステップと、
（ｃ）ガラス質氷粒子液滴ビームをレーザービームに通過させてガラス質氷粒子液滴ビーム内に粒子の第２整列を生成するステップであって、第２整列は第２整列を有する複数の粒子からなるステップと、
（ｄ）粒子の第２整列を回折ビームに通過させて粒子の第２整列の回折パターンを生成するステップと、
（ｅ）ステップ（ｃ−ｄ）を所望の回数繰り返して、ガラス質氷粒子液滴ビーム内に複数の粒子の更に別の整列の回折パターンを生成するステップとを備える。
【００３３】
構造決定実施態様の方法は、ガラス質氷粒子液滴ビームをレーザービームに通過させるステップを備えている。氷被覆粒子によるレーザービームエネルギーの共鳴吸収が回避される限り、任意のレーザー源を使用することもできる。粒子ビームの光学整列は、本明細書に参照として含まれる「エイチ・スタペルフェルト、現代物理学概観、第７５巻、頁５４３、２００３年」の中で述べられている。好ましい実施態様において、赤外線レーザービームが使用される。更に好ましい実施態様において、約１ミクロンの波長で動作するファイバーレーザーなどの連続（ＣＷ）レーザー源が使用され、氷被覆粒子によるレーザービームエネルギーの共鳴吸収が避けられる。任意の程度の整列を達成するのに必要なレーザー強度及び温度は、少なくとも、粒子の寸法、粒子の形状、粒子の最終再生像に要求される解像度等に応じて決まる。有用な結果は、例えば、電力が５０ワットよりも大きい連続波赤外線レーザーにより得られる。しかしながら、他の波長のレーザー光を使用できることは明らかであり、レーザー光の波長は、氷被覆粒子によるレーザービームエネルギーの共鳴吸収が避けられるように選択される。整列電力は、波長依存性を有する。好ましい実施態様において、レーザー電力密度の上限は、約５×１０１４Ｗ／ｃｍ２である。（ラーセン，PRL 85 (12) 2000 p. 2470）
ファイバーレーザー以外のレーザーを使用できることも明らかである。レーザーの例として、半導体レーザー、フラッシュランプ励起レーザー又はレーザーダイオード励起固体レーザー（例えば、Ｎｄ：ＹＡＧ又は同様のもの）などの固体レーザー、及びガスレーザーがあるが、それらに限定されない。レーザーのアレイも使用できることも明らかである。
【００３４】
パルスレーザーも使用できることも明らかである。パルスレーザーの動作とパルス繰り返し数はこの技術において知られており、異なるパルス長とパルス繰り返し周波数を有することができる。パルスレーザーを使用する場合、回折パターンは、レーザーパルスが「オン」されて、ガラス質氷粒子液滴ビーム内の粒子が整列される期間からのみ得られることが好ましい。
【００３５】
本発明の方法は、真空室内又は真空室外に配置されるものなど、上述した任意のレーザー源を使用することもできる。そのような外部レーザー源から出力されるレーザービームは、この技術において知られた適切な手段によって真空室内に導入することができ、その手段として、光ファイバーフィードスルー、光パイプフィードスルー、及びレーザー光の波長を通過させる真空室のウインドウポートなどがあるがこれらに限定されない。レンズなどの（真空内又は真空外に配置される）付加的光学機器をレーザーと共に使用して、ビームが分子と相互作用する場所を制御することができる。
【００３６】
強力レーザー場において、直線、円、又は楕円に対する偏波の選択により、所定の空間固定軸に沿って分子を整列させ、分子を平面に対し強制的に動かしたり、分子の回転を完全に除去したりできることは知られている。
【００３７】
かなり長期に亘る強力な直線偏波レーザーパルスは、粒子の最も大きく偏波可能な軸を、空間内の固定された所定の方向に沿って整列させることができる。楕円偏波レーザー場を用いて、多原子粒子の全ての軸方向（向きではない）の三次元整列を達成することもできる。一般に、３Ｄ整列は、３つの粒子軸に沿って異なる分極率を有する粒子に対して適用され、均質誘電体に対する粒子形状に応じて順に決まる。整列の程度の最適化に要する楕円率は、特定の分極率テンソルと粒子形状に応じて決まる。「向き」は、任意の線に沿った「方向」、例えば、南北方向に走る道路の北又は南を意味する。向きの両義性は、例えば、直線偏波を用いたレーザー整列が、直立し、かつ逆立ちする同数の粒子−これらはレーザー場で同じエネルギーを有する−の生成を意味している。これは、三次元において、楕円偏波光により整列された粒子に対する６つの方向をもたらす。この両義性により、粒子構造の正しい三次元マップを得るための回折データの使用が妨げられない。
【００３８】
本明細書にて使用されるように、「整列」は、空間固定軸に対する粒子の幾何学的配置の定義された順序を意味する。回折ビーム内の粒子セットは、数度又はそれより良い精度の中に整列される。この精度は、上述したように、レーザー電力、温度、粒子の寸法及び形状などに応じて決まる。最終的に三次元再生された粒子の像の解像度は、この角度広がりに粒子の半分の長さを掛け合わせたものとほぼ等しく、１ナノメータよりも小さい可能性がある。この広がりが（例えば温度の増加が原因で）増大すれば、粒子の最終像の解像度は低下する。一般に、任意の粒子に対して、整列場の強度を増やしたり、粒子の回転温度を下げたりすることによって、（断熱的）整列の程度を最適化することができる。
【００３９】
ある限定されない例において、直径が１０ミクロンである１００Ｗ連続波レーザー焦点を通過するＫ＝４の仮定比誘電率を有する大粒子（例えばリボソーム）を約８０Ｋに冷却して、０．７ｎｍの解像度に相当する整列誤差を達成する。更に別の限定されない例において、同じ条件下の小粒子（例えばリゾチーム）を約１０Ｋに冷却して、同じような整列誤差を達成する。
【００４０】
それとは別の実施態様において、１ミクロン波長で１００Ｗ出力の連続波レーザー電力と、一辺が１０ミクロンの３ビーム用相互作用容積との組み合わせにより、５０ｍ／ｓ以下のガラス質氷粒子液滴ビーム速度が使用される。
【００４１】
本明細書の示唆に基づき、当業者は、対象とされる任意の粒子の構造を決定するための条件を最適化することができる。
当業者にとって明らかなように、粒子の「第２整列」又は「更なる整列」は、レーザービームの偏波の方向を変えることで、第１整列とは異なる整列である。
【００４２】
構造決定実施態様の更なる好ましい実施態様において、ガラス質氷粒子液滴ビームを真空室内でレーザービームに通過させて、複数の整列ガラス質氷粒子液滴ビームを生成するステップは、レーザービームをガラス質氷粒子液滴ビームの周りに段階的に回転させて、ガラス質氷粒子液滴ビーム内の粒子の整列を繰り返し変更するステップからなる。任意の段階の数を使用してもよい。種々の実施態様において、本方法は、レーザービームを回転させて、粒子の２，３，６，１８，４５，９０、又は１８０個の整列、即ち所望の解像度に要する数の整列を得るステップを備えることは、断層撮影法の当業者にとって明らかである。
【００４３】
構造決定実施態様の方法は、ガラス質氷粒子液滴ビーム内の整列粒子を回折ビームに通過させて、整列粒子の回折パターンを生成するステップを備えている。回折ビームは、高エネルギーの電子ビーム又はＸ線ビーム等の任意のコヒーレント回折ビームであってもよい。ここで、「高エネルギー」は、波長が粒子よりも小さくて回折することのできる十分に大きいエネルギーを意味する。回折ビームは、連続回折ビーム又はパルス回折ビームからなる。例えば、シンクロトロンを用いてパルスＸ線ビーム源を提供することができる。交差容積内の多くの粒子により同時にＸ線ビームを振動させる方法を用いて、例えば、粒子内の電子的過程の時間依存性を調べることができ、同時に回折する多くの粒子による信号の増大といった大きな利点を有する。交差容積内の粒子の少なくとも二つを解析するためにパルスが発生される限りは、パルス回折ビームは、好ましくは、同期化と組み合わせて、使用することができる。
【００４４】
一つの好ましい実施態様において、回折ビームは、電子源から生成される電子ビームからなる。第１態様の更なる好ましい実施態様において、磁気レンズを用いて、電子源に生じた電子ビームを集束させることができる。第１態様の更なる好ましい実施態様において、ビーム偏向装置により、電子ビームが、所望の場所で整列水和分子ビームと交差するように指向される。
【００４５】
上述したように、電子ビーム又はＸ線ビームに対する蛋白質などの粒子の放射感度によって、単一粒子からの回折パターンについてこの粒子を破壊せずに得ることはできないため、本方法は、多くの粒子−各粒子は回折ビームの臨界未満の照射量に晒される−の散乱の蓄積効果を決定するステップを備える。そのような「臨界未満の照射量」は、少なくとも解析される粒子と所望の解像度とに応じて決まる。例えば、蛋白質のひだを見るのに必要な解像度は約０．７ｎｍである。臨界未満の照射量の決定方法は当業者によく知られている。
【００４６】
回折パターンは、本技術においてよく知られ、かつ既存のＸ線検出システム及び電子面積検出システムを含むがそれらに限定されない適切な検出システムを用いて得ることができる。更なる好ましい実施態様において、粒子の異なる整列から得られた複数の回折パターンから粒子の構造を決定するステップは、複数の回折パターンを組み合わせて粒子の三次元パターンを形成するステップからなる。その構造は、例えば、これらの電子回折パターン及び位相問題に対する新規な反復解決法（参照として本明細書に組み込まれる「エス・マーチェシニらによるPhys. Rev. B68, P. 140101R (2003)」中に述べられる）を、重原子法と共に用いることによって解明することができる。電荷密度マップが（レーザー偏波により制御される）粒子の多くの配向に対し得られ、また、断層撮影的が統合されて三次元図を生成することができる。
【００４７】
薬品設計において、このように蛋白質などの粒子を映像化するステップは重要なステップである。そのレセプタの一つに合体薬品分子を有するもの、及び有さないものの蛋白質の映像は、どのような薬品がウイルス受容の影響を受け易い受容体を保護的にブロックするものとして相応しいかを決定するのに有効である。
【００４８】
第１態様の構造決定方法は結晶形成を必要とせず、二次元結晶を形成する蛋白質に限定されず、高分子の電子低温顕微鏡撮像よりも非常に簡単で、かつ速いデータの取得を含む。
【００４９】
第２態様において、本発明は、ガラス質氷粒子液滴を急速に形成するための装置であって、
（ａ）遠心端と近心端を備えた毛細管であって、遠心端は水和粒子溶液を収容するのに適した容器と流体接続するのに適しており、近心端はノズルを備えた毛細管と、
（ｂ）ノズルと流体接続している第１室と、
（ｃ）第１室と流体接続している低温ガス源と、
（ｄ）入口と出口を備えた注入管であって、入口は第１室と流体結合しており、出口は第２室と流体結合するのに適している注入管と、
（ｅ）ハウジングとを備えた装置を提供する。
【００５０】
本明細書に使用されるように、「流体結合」は、記載される構成部品間での液体、気体、電子、又は光子の通過が可能な結合を意味する。
毛細管、ノズル、第１室、及び第２室の実施態様は、上記に詳細に述べられている。
【００５１】
「水和粒子液を収容するのに適した容器」は、毛細管に流体接続され、粒子の水和溶液を収容することのできる任意の容器であってもよい。
同様に、「低温ガス源」は、本発明の方法における使用のための低温ガスを供給することができ、かつ第１室に流体結合される任意の容器であってもよい。
【００５２】
「注入管」は、第１室と第２室の間の接続部を備えており、高圧室から真空室などの低圧室へのガラス質氷粒子液滴ビームの注入を容易にする任意の種類の装置であってもよい。第２態様の更なる実施態様において、注入管は約１００ｎｍから１００μｍの内径を有する。
【００５３】
好ましい実施態様において、装置は、更に、第１室を２００Ｋ以下の温度に保つのに適した冷却システムを備えている。装置は、２００Ｋ以下の真空室内の温度を維持するための温度制御システムを備えている。採用されるシステムの種類について、真空室を２００Ｋ以下の温度に保つことができるのであれば、制限されない。ファウベル［エム・ファウベル）他によるZ. Phys. D 10, 269-277 (1988)］により示唆されるように、水液滴は真空中で極めて急速に冷えて、２００Ｋなどの低い温度に到達し、この温度はこの範囲の上端にまで接近する。より低い温度に到達させるには、本技術においてよく知られるように、被覆蛋白質を低温ガスに通過させて追加冷却を行うのが好ましい。
【００５４】
第２態様の更に好ましい実施態様において、本装置は、更に、注入管の出口と流体結合している第２室を備えている。第２室は真空室であることが好ましい。第２室の実施態様は上記と下記に述べられている。
【００５５】
更なる実施態様において、装置は、更に、同軸圧電素子を含むがそれに限定されないノズルを摂動させるための手段を備え、この手段により、小振動がノズル管に加えられ、所望の周波数のレイリー不安定性が誘発され、それにより、液滴の生成が制御可能位相に固定される。更なる実施態様において、手段は、ノズルに強力な非周期励磁を与えることで、必要に応じて液滴を生成するものである。例えば、単一強力パルスを用いて、インクジェットプリンタのように「必要に応じた液滴」を供給することができる。
【００５６】
更なる実施態様において、本装置は、更に、ノズルに電位を加える手段を備えている。そのような手段として、ガラス質氷粒子液滴ビーム内での電流の流れを測定するフィードバックループにより制御される誘導帯電装置があるが、それに限定されない。
【００５７】
図１は、本発明の第２態様による装置の限定されない例を示す。水和粒子溶液は、水和粒子容器（図示せず）と流体結合している毛細管（Ａ）から出る。この毛細管は、先細のノズルを形成するように「引っ張られ」ている。適切なノズルの口径は、１００ｎｍから１００μｍの範囲にある。水和粒子溶液は、好ましくは室温付近であり、抗結晶化溶液に添加された抗凍結剤を有してもよく、ノズルから第１室の中に入り、この場合の第１室は一部閉鎖されたガス管容積（Ｂ）であり、この第１室を通って冷たい低温ガスが反対方向（図の右から左）に流れる。上述したように、低温ガスの圧力及び流速は、広い範囲に亘って独立して設定することができる。ノズルから出てくる水和粒子はレイリー不安定性により分解され、ヘリウムガス管の軸に沿って（図の左から右）に動く水和粒子の流れを形成する。
【００５８】
これらの粒子液滴が冷たく乾いたヘリウムを通過するとき、これらの粒子液滴は、逆流する冷たいヘリウムガスへの熱エネルギー移動、並びに液滴からの水分子の蒸発によって、急速に冷やされる。液滴流は、内径が約１００μｍの毛細管からなる注入管の入口（Ｃ）の中に入る。注入管の取付台（Ｄ）は、毛細管へのアクセスや毛細管の交換を容易にするために設計されている。毛細管の遠心端（Ｅ）において、液滴ビームは、１０−７トールから１０−６トールの間の範囲の真空の中に出る。出口端（Ｅ）で僅かに収束する毛細管群を用いることで、圧力の低下を毛細管の出口に限定したり、それにより、膨張冷却を最大にしたりすることができる。同様に、入口端（Ｃ）は、僅かに外方にテーパーを有するように選択してもよい。更に下流では、液滴噴流は、液体窒素隔壁（図示せず）を通過した後、従来の分子ビーム「スキマー」を通過し、真空室内へと向かう。
【００５９】
上記構成部品の全ては、特注生産ハウジング内に据え付けられており、そのハウジングの上部フランジ（Ｆ）は、低温ガス容器（Ｇ）、例えば、市販のヘリウム低温槽にボルトにより固定されている。中空管（Ｈ）は、ヘリウム容器の中心を通じて大気中へと延びている。この中空管の中心を下方に通過するものが小径管（Ｉ）であり、この小径管（Ｉ）を通じて、低温ガスが所望の圧力で流れる。この小径管は、バッフル（Ｊ）付近にある大きい管の軸上に取り付けられている。このバッフルは、外管内でヘリウムの乱流を生じさせるべく交互に設けられた複数の孔を有している。結果として、この管の４Ｋ壁から内管への良好な熱伝達をもたらす。この目的は、内管を下方に流れるヘリウムを４Ｋまで効率良く冷やすためであり、ガスを液化のためではない。内管は、注入管を囲む小さな環状プレナム（Ｋ）にヘリウムガスを供給する。その後、ヘリウムガスは、プレート（Ｌ）の孔を通過して、初期粒子液滴流を乾燥及び冷却するための逆流ガスを形成する。この有孔プレートは、容易に取り外すことができ、また、異なる穴パターンや異なる穴寸法を有するプレートと交換することができる。有孔プレートの選択によって、低温ガス逆流の圧力及び流量を別々に調節することができる。
【００６０】
第１室（この場合はヘリウムガス管）（Ｂ）は、石英ガラス製の内部円筒スリーブ（Ｎ）を備えている。このヘリウムガス管は、外部金属スリーブ（Ｍ）に圧入され、この外部金属スリーブは、その前面及び後面に沿って切断された開放窓を有し、ノズル（Ａ）と注入管への入口（Ｃ）との間にある液滴形成領域を見る際に遮るものがないようにしている。従って、低温ハウジング（Ｔ）の前面及び後面の窓と、液体窒素隔壁を通る対応する窓とを介して、適切な大きさを有する作動距離の市販の顕微鏡の使用により、液滴ビームを観察することができる。ビームは、この目的のため、背面（図１のアセンブリの反対側）から照らされる。
【００６１】
ヘリウム流管から出るガスは、出口管（Ｈ）を通って上方に流れる。小ドーム（Ｖ）は、低温ハウジングの上部に圧入されて、４Ｋ壁からのヘリウム凝縮液がノズルや乾燥／冷却管の上に落下することを防止している。従って、あらゆるそのような凝縮液は、低温ハウジングの壁へと、適切な孔を介して低温ハウジングの底（Ｕ）へとダクトにより送られる。低温ハウジングは、適切な量の液体ヘリウムを収容するために提供された十分な蓄積容量を有している。凝縮液がほとんどないか全くないのが理想的である。
【００６２】
粒子溶液のノズル内での凍結を防ぐため、ノズル管は、必要に応じて、同軸ヒータ（Ｏ）により包囲するようにしてもよい。液体ヘリウム消費量を増大させてしまう低温ハウジング内への熱流を最小限に抑えるため、真空絶縁などの絶縁処理が施されている。液体供給ラインの周囲に施される加熱及び絶縁は、低温ハウジングの壁を通じて、及び低温ハウジングを囲む液体窒素冷却放射シールド（図示せず）を通じて外にまで延びていなければならない。
【００６３】
同軸圧電素子（Ｓ）は、小振動をノズル管に加えることにより、所望の周波数でレイリー不安定性を誘発し、それにより液滴の生成を制御可能な位相に固定することができる。これは、トロステル［７］により採用された機構と同様である。更に、ストロボスコープ及び他の位相固定技術をビームの解析又は使用に利用することができる。
【００６４】
ノズルアセンブリ（Ｐ）は、ベローズ（Ｑ）によって低温ハウジングの中に取り付けられている。ノズルアセンブリは、ビームの軸に沿った限定的な移動に加え、二つの直交する横方向への限定的な移動を可能にする機構（Ｒ）によって支持されている。また、プッシュプルねじジャッキによっても、ノズルの軸の限定された傾斜の調節が可能である。液体ビームがノズル管の軸に対し適度に平行に出るのであれば、このような動作は、低温ハウジング内の窓を通じてビームを観察する際にそのビームを注入管の軸へと下方に向けることができる。
【００６５】
第３態様において、本発明は、連続回折を行うための装置であって、
（ａ）真空室と、
（ｂ）真空室と流体結合している回折ビーム源と、
（ｃ）真空室と流体結合しているレーザービーム源と、
（ｄ）請求項３１の装置からなるガラス質氷粒子液滴ビーム源であって、注入管の出口は真空室と流体結合しているガラス質氷粒子液滴ビーム源と、
（ｅ）２００Ｋ以下の真空室内の温度を維持するための温度制御システムと、
（ｆ）真空室と接続した検出器システムとを備え、回折ビーム源、レーザービーム源及びガラス質氷粒子液滴ビーム源は、回折ビーム源、レーザービーム源及びガラス質氷粒子液滴ビーム源から送られたビームを１０μＬと１００μＬの間の範囲にある交差容積内で真空室内において交差させるように配置され、検出器システムは回折ビームを通過する分子ビーム内の分子から回折パターンを受け取るように配置されている装置を提供する。
【００６６】
図２は、本発明の方法を実行する装置の限定されない例を示す。真空室（１）の輪郭が示されている。本技術にてよく知られるように、真空室は、物質及び放射線の無い空間の部分容積を形成する装置であり、空気を含み、そのため、ガス圧は標準的な大気圧よりもはるかに小さい。いかなるそのような真空室も、その真空室内で２００Ｋ以下の温度が維持されるのであれば、本発明の方法と共に使用することができる。
【００６７】
真空室と流体結合しているレーザー源が設けられている。本明細書にて使用されるように、「流体結合」は、記載される構成部品での間の液体、気体、電子、又は光子の通過を可能にする結合を意味する。レーザー源は、外部レーザー源を取り付けるためのドッキングポートを備えてもよく、ドッキングポート及び外部レーザー源を備えてもよく、（部分的又は完全に）真空室内にレーザー源を備えてもよい。図１は、真空室と流体結合している典型的な外部レーザー源（２）を示している。この例において、レーザー源（２）は、１００Ｗで、かつ１ミクロン波長の赤外線連続ファイバーレーザーである。そのような外部レーザー源から出力されるレーザービームは、この技術において知られた適切な手段によって真空室内へと導くことができ、その手段として、光ファイバーフィードスルー、光パイプフィードスルー、及びレーザー光の波長を通過させる真空室のウインドウポートなどがあるがこれらに限定されない。レンズなどの付加的光学機器（真空内又は真空外に配置される）をレーザーと共に使用して、ビームが分子と相互作用する場所を制御することができる。図１に示す例において、外部レーザー源（２）は、楕円偏波レーザー場を生成するための位置決め装置、レーザーウインドウ、及び４分の１波長板（３）を備えている。
【００６８】
レーザービーム（８）がレーザー源から生成され、真空室（１）に入る。この例において、真空室へのレーザービームの入口点のちょうど反対側に、交差容積を通過した後のビームを捕らえるためのレーザーダンプ（１４）、この場合は、水冷式赤外線レーザービームダンプが設けられている。この例において、レーザービームダンプ（１４）は真空室の内部にあり、外側から水冷され、熱は真空シールを横断するように伝達される。レーザービームダンプはレーザー源のちょうど反対側に配置されるのが好ましいが、交差容積を通過した後のレーザービームを集束させることのできる任意の位置に配置してもよい。レーザーダンプは、更に観察ポートを備えてもよい。
【００６９】
本発明の第１態様において上述したように、氷被覆粒子によるレーザービームエネルギーの共鳴吸収が避けられさえすれば、任意のレーザー源も使用することができる。好ましい実施態様において、赤外線レーザービームが使用される。更に好ましい実施態様において、ファイバーレーザーなどの連続（ＣＷ）レーザー源が使用される。ファイバーレーザー以外のレーザーを使用できることも明らかである。レーザーの例として、半導体レーザー、フラッシュランプ励起レーザー又はレーザーダイオード励起固体レーザー（例えば、Ｎｄ：ＹＡＧ又は同様のもの）などの固体レーザー、及びガスレーザーがあるが、それらに限定されない。レーザーの配列も使用できることも明らかである。パルスレーザーを使用できることも明らかである。
【００７０】
回折パターンがそれぞれの新しい向きに多くの整列粒子から集束されるように、レーザービーム偏波を粒子のビームの周りに次第に回転させて、分子の整列を繰り返し変更できるようにすることが大変好ましい。好ましい典型的な実施態様において、レーザー光学の当業者によく知られているように、４分の１波長板を用いて１８０度全体に亘り１度刻みでレーザービーム偏波を回転させて、１８０個の異なる回折パターンを形成することができる。レーザーの偏波を制御する４分の１波長板は、図１のレーザービーム位置決め装置（３）付近に配置されている。これらの異なる回折パターンをその後組み合わせて、分子の回折パターンの三次元マップを形成する。レーザービーム偏波のそのような回転が行える任意の手段を、本発明と共に使用することもできる。それとは別の実施態様において、レーザービーム源自身を交差容積に対して回転させることができる。
【００７１】
レーザービームダンプ（１４）装置は、可視整列レーザー（１３）のための図２の観察ポート（１３）を備えることもできる。例えば、赤外線レーザーに対し平行に整列された可視レーザーを用いて、レーザー光学機器を液滴ビームに対して整列させることができる。このビーム（強力赤外線レーザーのスイッチはオフされている）は、１３にある窓から目で安全に観察でき、傾斜ミラーを見て、液滴ビームがこの可視レーザービームを横切るときに８から下へ来る可視レーザーの中に視点を導き、「十字形」１３の上ネック部の中に水平に挿入された半透明表示画面に特性散乱パターンを生成する。最も強いそのような散乱パターン（「フラウンホーファー回折パターン」として光学技術では知られる）にレーザービームの横位置及び焦点を合わせることによって、可視レーザー（即ち、平行整列赤外線レーザー）を液滴ビームと整列させることができる。
【００７２】
ガラス質氷粒子液滴ビーム源は、ドッキングポート及び本発明の第２態様に開示の外部ガラス質氷粒子液滴ビーム源からなるか、或いは、（部分的又は完全に）真空室内のガラス質氷粒子液滴ビーム源からなる。図１に示す例において、ガラス質氷粒子液滴ビーム源は、本発明の第２態様の装置からなり、ガラス質氷粒子液滴ビームの注入管の出口は真空室（７）と流体結合している。ガラス質氷粒子液滴ビーム源は、本発明の第１態様と第２態様において述べたガラス質氷粒子ビーム（９）を生成する。
【００７３】
また、図１は、交差容積を通過後のガラス質氷粒子液滴を集束させるための液体窒素冷却式ガラス質氷粒子液滴ビームダンプ（４）を示している。このダンプは、真空室内で所望の真空レベルを維持する機能を果たす。ガラス質氷粒子液滴ビームダンプは、ガラス質氷粒子液滴ビーム源のちょうど反対側に配置されることが好ましいが、交差容積通過後のガラス質氷粒子液滴ビームを集束可能な任意の位置にも配置してもよい。
【００７４】
ガラス質氷粒子液滴ビームが真空室を通過するとき、蒸発が生じる。従って、本装置は、更に、例えば検出器システムの部分（６）及び（１５）を損傷させる凝縮の蓄積を防ぐための低温シールド（部材番号なし：（５）のすぐ下）を備えてもよい。そのような低温シールドは、液体窒素源などの冷却源（５）を備えることが好ましい。
【００７５】
図２に示す例において、回折ビーム源（１０）は、真空室外に配置され、真空室と流体結合している。回折ビーム源は、外部回折ビーム源への取り付け用ドッキングポートを備えてもよく、ドッキングポート及び外部回折ビーム源を備えるか、或いは（部分的又は完全に）真空室内に回折ビーム源を備えてもよい。回折ビーム源は、高エネルギーの電子ビーム又はＸ線ビームなどの任意のコヒーレント回折ビーム源であってもよい。ここで、「高エネルギー」とは、波長が粒子よりも小さくて回折するように十分に大きいエネルギーを意味する。回折ビームは、連続回折ビーム又はパルス回折ビームであってもよい。例えば、シンクロトロンを用いてパルスＸ線ビーム源を提供することができる。例えば、粒子内の電子的過程の時間依存性を調べるため、交差容積内の多くの粒子で同時にＸ線ビームを振動させる方法を用いることにより、同時に回折する多くの粒子による信号の増大といった大きな利点がある。交差容積内の粒子の少なくとも二つを解析するためにパルスが発生される限り、パルス回折ビームは、好ましくは、同期化と組み合わせて使用することができる。
【００７６】
一つの好ましい実施態様において、回折ビームは、電子源から発生された電子ビームからなる。この第１態様の更なる好ましい実施態様において、磁気レンズを用いて、電子源で発生された電子ビームを集束させることができる。この第１態様の更なる好ましい実施態様において、ビーム偏向装置により、電子ビームを所望の場所で整列ガラス質氷粒子液滴ビームと交差させる。そして、電子により形成された回折（散乱）パターンの寸法は、電子光学の当業者に良く知られた磁気レンズによって拡大される。
【００７７】
本装置は、更に、真空室と接続している検出システムを備えている。分子回折パターンを検出及び記録することのできる任意の種類の検出システムを使用することもでき、この検出システムとして、この技術においてよく知られる既存のＸ線検出システム及び電子面積検出システムなどがあるが、これらに限定されない。図２は、電荷結合素子（６）などの領域検出器に対し光ファイバーにより結合された蛍光体スクリーン（又は類似物）（１５）を備えた典型的な検出器システムを示している。そして、この検出器に接続されたコンピュータを用いて、多くの二次元回折パターンを組み合わせて一つの三次元パターンにすることができる。その後、三次元パターンは、「Phys. Rev. B68, PAGE140101（2003)」に記載のマーチェシニらによる反復アルゴリズムと、（例えば、ミランによる「参照として本明細書に組み込まれかつ添付されているJ. Opt. Soc. Am. A13, P.725 (1996)」に示唆された）三次元拡張機能とを用いて原子配置を示す電荷密度の三次元マップに変換することで、隔離された物体からの散乱の連続分布に対する位相問題を解決する。各ステップで形成される各回折パターンは、平行電子ビームなどの回折ビームを回折する非常に多くの粒子により形成されるため、これらの回折パターンを（マーチェシニらにより述べられた）反復位相アルゴリズムに通過させた後、十分な細部（解像度）及びコントラストを備えた映像を再生することができる。粒子ビーム内の部分的に整列された粒子からの電子回折パターンの例は、参照として含まれかつ添付されているケー・ホシナらによる「J. Chem. Phys., 118, p.6211 (2003)」中に見出すことができる。磁気レンズを用いて、電子源に発生した電子ビームを集束させることができる。ビーム偏向装置により、電子ビームを粒子ビームに交差させることができる。
【００７８】
本装置は、２００Ｋ以下の真空室内温度を維持するための温度制御システムを備えている。真空室を２００Ｋ以下の温度に保持できるのであれば、採用されるシステムの種類は制限されない。ファウベル「エム・ファウベルらによるZ. Phys. D 10, 269-277 (1988)」により示唆されるように、水液滴は、真空中で極めて急速に冷えて、２００Ｋという低い温度に到達し、この温度は、この範囲の上端にまで接近する。より低い温度に達するため、この技術においてよく知られるように、被覆蛋白質を低温ガスに通過させて追加冷却を行うことが好ましい。
【００７９】
本装置は、回折ビーム源、レーザービーム源及びガラス質氷粒子ビーム源から送られたビームを、１０μＬから１００μＬの間の範囲にある交差容積内で真空室内において交差させるように構成されており、検出器システムは、回折ビームを通過する粒子ビーム内の粒子から回折パターンを受け取るように配置されている。好ましい実施態様において、本装置は、更に、ビームの正確な位置決めのため、真空室と共に配置された位置決め手段を備えている。一実施態様において、位置決め手段は電気モータからなる。そのような電気モータを用いて、レーザービームをガラス質氷粒子ビームと同じ高さに集束させる。（図２参照：レーザービームの横方向の位置は、レーザービームを横方向に移動させるモータ（３）によって調節される）。真空室内の他のモータは、必要に応じて、ガラス質氷粒子ビームを、例えば二つの直交する方向に沿って移動させるように配置されている。更なる実施態様において、真空室の全体を、真空室の軸に沿って回折ビームを集中させるなど、必要なビームの位置決が提供されるように、外部にある位置決めねじによって移動させることができる。真空電子工学の当業者によく知られるように、位置決め手段を、電気フィードスルーにより真空室に接続されたコンピュータからの信号によって制御することは更に好ましい。
【００８０】
更なる好ましい実施態様において、本装置は、更に、真空室の内部に、内部モータによって作動するビームストップを備えている。このビームストップは、回折ビームの非散乱部分による過負荷を抑止するため、例えば領域検出器（６）の中央に配置されている。
【００８１】
本発明の第１態様及び第２態様の少なくともいずれかに上述された回折ビーム源、レーザービーム源、ガラス質氷粒子ビーム源、真空室、２００Ｋ以下の真空室内温度を生じるための温度制御手段、及び検出システムなどのあらゆる具体例は、本発明の第３態様の装置と共に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】ガラス質氷被覆粒子液滴を急速に形成する装置の一例を示す図。
【図２】連続回折を行う装置の一例を示す図。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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