(57)【要約】本発明は、皮膚疾患に対するＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの治療学的用途に関する。本発明に係るＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）は、ホスホロチオエート骨格を有するＣｐＤ  ＯＤＮ、並びにホスホジエステル骨格を有するＣｐＤ  ＯＤＮの両方の場合において、皮膚疾患において優れた免疫活性効果を示す。【選択図】図１
2008502713.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｈ２サイトカインを阻害し及び／またはＴｈ１サイトカインを誘導する方法であって、その必要がある対象に以下の式により表わされるＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの有効量を投与することを含む、前記方法：
［式］：ＳＹＹＳＳＡＣＧＴＴＳＮＹＲＡＷＭＹＴＣ（配列番号１）
ここで、ＳはＧまたはＣであり、ＹはＣまたはＴであり、ＮはＡ、Ｇ、Ｔ及びＣよりなる群から選択されるいずれか一つであり、ＲはＧまたはＡであり、ＷはＡまたはＴであり、ＭはＡまたはＣであり、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、少なくとも２つの非メチル化ＣｐＧモチーフを含む。
【請求項２】
前記Ｔｈ２サイトカインは、ＩＬ−４またはＩＬ−１０である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｔｈ１サイトカインは、ＩＬ−１２またはＩＦＮ−γである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記式において、ＹＳまたはＹＲジヌクレオチドがＣＧである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドが、配列番号２〜配列番号８よりなる群から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドが、ホスホジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ）又はホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）骨格を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
免疫反応を刺激する方法であって、その必要がある対象に以下の式により表わされるＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの有効量を投与することを含む、前記方法：
［式］：ＳＹＹＳＳＡＣＧＴＴＳＮＹＲＡＷＭＹＴＣ（配列番号１）
ここで、ＳはＧまたはＣであり、ＹはＣまたはＴであり、ＮはＡ、Ｇ、Ｔ及びＣよりなる群から選択されるいずれか一つであり、ＲはＧまたはＡであり、ＷはＡまたはＴであり、ＭはＡまたはＣであり、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、少なくとも２つの非メチル化ＣｐＧモチーフを含む。
【請求項８】
前記式において、ＹＳまたはＹＲジヌクレオチドがＣＧである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドが、配列番号２〜配列番号８よりなる群から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドが、ホスホジエステル又はホスホロチオエート骨格を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
皮膚疾患を治療または予防する方法であって、その必要がある対象に以下の式により表わされるＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの有効量を投与することを含む、前記方法：
［式］：ＳＹＹＳＳＡＣＧＴＴＳＮＹＲＡＷＭＹＴＣ（配列番号１）
ここで、ＳはＧまたはＣであり、ＹはＣまたはＴであり、ＮはＡ、Ｇ、Ｔ及びＣよりなる群から選択されるいずれか一つであり、ＲはＧまたはＡであり、ＷはＡまたはＴであり、ＭはＡまたはＣであり、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、少なくとも２つの非メチル化ＣｐＧモチーフを含む。
【請求項１２】
前記式において、ＹＳまたはＹＲジヌクレオチドがＣＧである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドが、配列番号２〜配列番号８よりなる群から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドが、ホスホジエステル又はホスホロチオエート骨格を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記皮膚疾患が、アトピー性皮膚炎、アレルギー皮膚疾患、ウィルス性皮膚疾患及び皮膚癌よりなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
皮膚疾患を治療または予防するための組成物であって、有効成分として以下の式により表わされるＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドを含む、前記組成物：
［式］：ＳＹＹＳＳＡＣＧＴＴＳＮＹＲＡＷＭＹＴＣ（配列番号１）
ここで、ＳはＧまたはＣであり、ＹはＣまたはＴであり、ＮはＡ、Ｇ、Ｔ及びＣよりなる群から選択されるいずれか一つであり、ＲはＧまたはＡであり、ＷはＡまたはＴであり、ＭはＡまたはＣであり、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、少なくとも２つの非メチル化ＣｐＧモチーフを含む。
【請求項１７】
免疫反応を刺激するための組成物であって、有効成分として以下の式により表わされるＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドを含む、前記組成物：
［式］：ＳＹＹＳＳＡＣＧＴＴＳＮＹＲＡＷＭＹＴＣ（配列番号１）
ここで、ＳはＧまたはＣであり、ＹはＣまたはＴであり、ＮはＡ、Ｇ、Ｔ及びＣよりなる群から選択されるいずれか一つであり、ＲはＧまたはＡであり、ＷはＡまたはＴであり、ＭはＡまたはＣであり、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、少なくとも２つの非メチル化ＣｐＧモチーフを含む。
【請求項１８】
皮膚疾患を治療または予防するための剤の調製のための、下記式で表わされるＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの使用：
［式］：ＳＹＹＳＳＡＣＧＴＴＳＮＹＲＡＷＭＹＴＣ（配列番号１）
ここで、ＳはＧまたはＣであり、ＹはＣまたはＴであり、ＮはＡ、Ｇ、Ｔ及びＣよりなる群から選択されるいずれか一つであり、ＲはＧまたはＡであり、ＷはＡまたはＴであり、ＭはＡまたはＣであり、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、少なくとも２つの非メチル化ＣｐＧモチーフを含む。
【請求項１９】
免疫反応を刺激するための剤の調製のための、下記式で表わされるＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの使用：
［式］：ＳＹＹＳＳＡＣＧＴＴＳＮＹＲＡＷＭＹＴＣ（配列番号１）
ここで、ＳはＧまたはＣであり、ＹはＣまたはＴであり、ＮはＡ、Ｇ、Ｔ及びＣよりなる群から選択されるいずれか一つであり、ＲはＧまたはＡであり、ＷはＡまたはＴであり、ＭはＡまたはＣであり、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、少なくとも２つの非メチル化ＣｐＧモチーフを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００４年１１月５日に出願された韓国特許出願第１０−２００４−００９００００号を優先権とし、その内容を参照のため本明細書に援用する。
本発明は、皮膚疾患に対するＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの治療学的用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚疾患とは、ヒトを含む動物の皮膚に現れる全ての障害をいう。皮膚疾患の中でも、アトピー性皮膚炎は、慢性／炎症性皮膚疾患であって、重い掻痒症、乾燥肌及び湿疹性皮膚病変が特徴的な主症状である（Ｒｕｄｉｋｏｆｆ，  Ｄ．ら，  Ｌａｎｃｅｔ．  ３５１：１７１５−１７２１，  １９９８）。アトピー性皮膚炎は、一般に遺伝的傾向があり、個人の特性によってはアレルギー喘息、アレルギー鼻炎、アレルギー結膜炎及びじんましん（ｕｒｔｉｃａｒｉａ）を伴う。アトピー性皮膚炎患者において生じる免疫学的障害に関する報告された症状は、ＩｇＥ生成の増加や、ＩＦＮ−γを分泌するＴｈ１（Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｈｅｌｐｅｒ  ｔｙｐｅ  １）リンパ球の数的減少などを含む。また、組織学的観点から見た場合に、アトピー性皮膚炎の皮膚病変は、ＣＤ４＋表現型を有するＴリンパ球の増加、単核球／マクロファージの浸潤、並びに肥満細胞及び好酸球を示す。また、アトピー性皮膚炎の皮膚病変は、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ；ＤＣｓ）と表皮のランゲルハンス細胞を示す（Ｉｍｏｋａｗａ，  Ｇ．，ら，  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，  ９６：５２３−５２６，  １９９１）。このような状態は、病変部位ではなく、正常部位においても現れるものと報告された（Ｌｅｕｎｇ  ＤＹ，  Ｂｈａｎ  ＡＫ，  Ｓｃｈｎｅｅｂｅｒｇｅｒ  ＥＥ，  Ｇｅｈａ  ＲＳ．  Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ７１  （１  Ｐｔ  １），  ４７−５６，  １９８３）。最近、ＣＣＲ−４発現メモリ（ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｍｅｍｏｒｙ）ＣＤ４＋リンパ球の数がアトピー性皮膚炎の病変部位で増加すると報告されている（Ｉｍａｉ，  Ｔ．ら，  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １１：８１−８８，  １９９９）。また、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｅｉｊｄｅｎ  ＦＬなどは、病変内浸潤されたＣＤ４＋表現型を有するＴリンパ球がＩＬ−４を放出すると報告し（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｅｉｊｄｅｎ  ＦＬら，  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，  ９７：３８９−３９４，  １９９１）、ＩＬ−４の作用によって抗原提示細胞において免疫グロブリンＥに対する低い親和性のＦｃ受容体が亢進すると報告している。
【０００３】
また、Ｔリンパ球及びこれから放出される種々のサイトカインがアトピー性皮膚炎の免疫病理学的発生メカニズムと密接な関係を持つという実験的根拠が、最近報告された。また、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１０を生成するアレルゲン−特異的Ｔヘルパータイプ２（ａｌｌｅｒｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｔｙｐｅ２）リンパ球が、アトピー性皮膚炎患者において炎症の起こった病変部位で増加し、これがアレルギー反応及びＩｇＥ増加に重要な影響を及ぼすと報告されている（ｈｕｓｓａｉｎ，  Ｉ．ら，  Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｉｎｆｌａｍｍ  Ａｌｌｅｒｇｙ．，  ２：  １９９−１２０，  ２００３）。一方、他の研究者らは、アトピー性皮膚炎に関連したケモカインとそれらの受容体の皮膚障壁に対する影響を研究した。その結果、アトピー性皮膚炎患者の角質形成細胞から多量のＴＳＬＰ（ｔｈｙｍｉｃ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）とＭＤＣ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）が生成され、そしてＩＦＮ−γの刺激の際に多量のＲＡＮＴＥＳ、ＴＡＲＣ、ＭＤＣが生成されることを報告した（Ｇｉｕｓｔｉｚｉｅｒｉ，  ＭＬ．ら，  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １０７：８７１−８７７，  ２００１）。
【０００４】
一般に、脊椎動物の免疫体系は、幾種類の特徴的な微生物の分子を認識して微生物の攻撃に対して免疫活性が速く起こるように進化的に発達した。多くの研究者らの報告によれば、バクテリアＤＮＡは、脊椎動物のＤＮＡには存在しない様々な構造の決定因子が存在するものと明らかになっており、この因子が免疫細胞を活性化させると知られている（Ｇｉｌｌｋｅｓｏｎ，  ＧＳ．ら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ９５：１３９８−１４０２，  １９９５）。脊椎動物ＤＮＡとバクテリアＤＮＡ間の特徴的な差異点は、脊椎動物のゲノムはＣｐＧジヌクレオチドが抑制されており且つＣｐＧモチーフでシトシンの７０％がメチル化されていることにある（Ｋｒｉｅｇ，  ＡＭ．ら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：５４６−５４９，  １９９５）。哺乳動物と異なり、非メチル化されたＣｐＧモチーフ（ｕｎｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＣｐＧ  ｍｏｔｉｆｓ）は、バクテリアではありふれている。ＣｐＧモチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＯＤＮ）は、先天的免疫反応から獲得された免疫反応に至る宿主の防御機序を活性化させる（Ａｋｄｉｓ，  ＣＡ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １２：６４１−６４６，  ２０００）。一般に、ＣｐＧ  ＯＤＮは、Ｂ細胞とＮＫ細胞のいずれも活性化させることができる。また、ＣｐＧ配列は、ＮＫ細胞からＩＦＮ−γ生成の潜在的な誘導体であるＩＬ−１２を分泌するためにマクロファージを刺激する（Ｋｒｉｅｇ，  ＡＭ．  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２０：  ７０９−７６０，  ２００２）。これに加えて、このような細胞は、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１８およびＴＮＦ−αなどの前炎症性サイトカイン（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）と、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２などのＴｈ１に偏った（ｂｉａｓｅｄ）免疫環境またはケモカインを作るサイトカインを分泌する。しかも、ＣｐＧ  ＯＤＮは、ＩｇＧ２ａアイソタイプ（Ｔｈ１  ｔｙｐｅ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）を誘導する液性反応（ｈｕｍｏｒａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）を増進させ、細胞障害性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｓｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、ＣＴＬ）の活性化を増加させる（Ｗａｒｒｅｎ，  ＴＬ．ら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６５：６２４４−６２５１，  ２０００）。動物モデルにおけるアレルギー状態と癌治療のためのＣｐＧ  ＯＤＮの使用は、直接的または間接的な免疫反応の増進に非常に効果的である。このようなＣｐＧ  ＯＤＮは、同一のＣｐＧモチーフを持っているとしても、そのヌクレオチド配列によって異なる生理的活性を示すものと知られている。
【０００５】
最近では、ＣｐＧ  ＯＤＮの有用性を高めるために、骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を修飾したＣｐＧ  ＯＤＮが開発された。ＤＮＡの基本骨格であるホスホジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ）骨格のＣｐＧ  ＯＤＮは、ヌクレアーゼに対して感受性であって、インビボ分解される。したがって、インビボで毒性を誘発する可能性が少ない。ところが、上記のＣｐＧ  ＯＤＮは、他の骨格のＣｐＧ  ＯＤＮに比べてその活性が低い（Ｋｗｏｎ，  ＨＪ．ら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ，  ３１１：１２９−１３８，  ２００３；  ａｎｄ  Ｌｅｅ，  ＫＷ．ら，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ４１：９５５−９６４，  ２００４）。これに反し、ホスホロチオエート骨格のＣｐＧ  ＯＤＮは、インビボでヌクレアーゼによって分解されないように構造を修飾して人為的に作られたものである。ホスホロチオエート骨格のＣｐＧ  ＯＤＮは、ホスホジエステル骨格のＣｐＧ  ＯＤＮに比べてインビボで安定しており、Ｂ細胞誘導能に一層優れる。したがって、ホスホロチオエート骨格を持つように修飾されたＣｐＧ  ＯＤＮが最も広く用いられている。ところが、このようなホスホロチオエート骨格のＣｐＧ  ＯＤＮは、数多くのタンパク質に非特異的なＯＤＮの結合を増加させ、インビボで容易に分解されないため毒性を誘発する。さらに、ホスホロチオエート骨格のＣｐＧ  ＯＤＮが関節炎（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）を誘発し、そして関節炎の症状を悪化させ（Ｄｅｎｇ  ＧＭら，  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｕｍ，  ４３（２）：３５６−３６４，  ２０００；  Ｍａｓａｙｕｋｉ  Ｍｉａｙｔａら，  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｕｍ，  ４３（１１）：２５７８−２５８２，  ２０００）、ＳＬＥ（全身性エリトマトーデス  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｉｓ）のような自己免疫疾患を起こすおそれがあると報告された（Ｔａｎａｋａ，  Ｔ．ら，  Ｊ  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７５：５９７−６０７，  １９９２；  および  Ｈａｎｓ−Ｊｏａｃｈｉｍ  Ａｎｄｅｒｓら，  Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ａｒｔｉｃｌｅ  １０．  １０９６／ｆｊ．  ０３−０６４６ｆｊｅ．２００４年１月２０日にオンラインで公開された）。上記報告に加えて、ホスホロチオエート骨格を持つＣｐＧ  ＯＤＮの副作用が多くの研究者らから報告された（Ｔｓｕｎｏｄａ  Ｉ．ら，  Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．，  ９（３）：４８１−４９３，  １９９９；  ａｎｄ  Ｂａｃｈｍａｉｅｒ  Ｋ．ら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８３（５４０６）：１３３５−１３３９，  １９９９）。
【０００６】
上記のように、ＣｐＧ  ＯＤＮは、現在、免疫活性剤としての用途について広範囲に研究されているが、皮膚疾患の治療及び予防における使用についてのＣｐＧ  ＯＤＮの開示は見いだせない。特にホスホジエステル骨格を持つＣｐＧ  ＯＤＮの皮膚疾患の治療及び予防のための使用は全く研究されたことがない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、このような問題点に鑑みてなされた。本発明の目的は、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの新しい治療学的用途を提供することである。
本発明の１つの側面によれば、Ｔｈ２サイトカインを阻害し及び／またはＴｈ１サイトカインを誘導する方法であって、その必要がある対象に以下の式により表わされるＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの有効量を投与することを含む、前記方法：
［式］：ＳＹＹＳＳＡＣＧＴＴＳＮＹＲＡＷＭＹＴＣ（配列番号１）
ここで、ＳはＧまたはＣであり、ＹはＣまたはＴであり、ＮはＡ、Ｇ、Ｔ及びＣよりなる群から選択されるいずれか一つであり、ＲはＧまたはＡであり、ＷはＡまたはＴであり、ＭはＡまたはＣであり、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、少なくとも２つの非メチル化ＣｐＧモチーフを含む、が提供される。
【０００８】
本発明の他の側面によれば、前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの有効量を、これを必要とする対象に投与することを含む免疫反応を刺激する方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの有効量を、これを必要とする対象に投与することを含む、皮膚疾患を治療または予防する方法が提供される。
【０００９】
定義
他の定義がない限り、本明細書に使用された全ての技術的および科学的用語は、当業者らによって通常理解される意味と同一の意味を持つ。次の参考文献は、本発明の明細書に使用された様々な用語の一般的定義を持つ技術（ｓｋｉｌｌ）の一つを提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＴＹ  （２ｄ  ｅｄ．  １９９４）；  ＴＨＥ  ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  （Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，  １９８８）；  及びＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，  ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ。また、下記の定義は、本発明の実施のため、読者に助けを与えるために提供される。
【００１０】
本明細書において、「ＣｐＧモチーフ（ｍｏｔｉｆ）」とは、リン酸結合（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｏｎｄ）で連結された非メチル化シトシン−グアニンジヌクレオチド（ｕｎｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（または、非メチル化シトシン−リン酸−グアニンジヌクレオチド（ｕｎｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｇｕａｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）という）を含有して、免疫反応を活性化させるヌクレオチド配列をいう。
【００１１】
本明細書において、「ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（以下、「ＣｐＧ  ＯＤＮ」という」とは、前記ＣｐＧモチーフを少なくとも２つ含むオリゴデオキシヌクレオチドをいう。
【００１２】
本明細書において「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」とは、動物、特に哺乳動物をいう。対象は、動物由来の細胞、組織、器官などであってもよい。
本発明において、「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」とは、対象においてＴｈ２サイトカインを抑制し、Ｔｈ１サイトカインを誘導し、樹状細胞を活性化し、免疫反応を刺激し、または皮膚疾患を治療もしくは予防する効果を示す量をいう。
以下、本発明を詳細に説明する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、皮膚疾患の治療または予防に対する、ＣｐＧ  ＯＤＮの効果を研究し、下記式で表わされるＣｐＧ  ＯＤＮが皮膚疾患の治療または予防剤として有用であることを見いだした：
［一般式］：ＳＹＹＳＳＡＣＧＴＴＳＮＹＲＡＷＭＹＴＣ（配列番号１）
ここで、ＳはＧまたはＣであり、ＹはＣまたはＴであり、ＮはＡ、Ｇ、Ｔ及びＣよりなる群から選ばれるいずれか一つであり、ＲはＧまたはＡであり、ＷはＡまたはＴであり、ＭはＡまたはＣであり、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、少なくとも２つの非メチル化ＣｐＧモチーフを含む。
【００１４】
好ましくは、前記式において、ＹＳまたはＹＲジヌクレオチドはＣＧでありうる。より好ましくは、本発明に係るＣｐＧ  ＯＤＮは、以下の配列番号２〜配列番号８よりなる群から選ばれるいずれか一つである。最も好ましくは、以下の配列番号２または配列番号８により表わされるヌクレオチド配列を持つことができる。
【００１５】
本発明のＣｐＧ  ＯＤＮは、天然供給源（例えば：大腸菌の染色体ＤＮＡ）から由来してもよい。ＣｐＧ  ＯＤＮは、化学的に合成されるか組み換え的に製造されてもよい。本発明のＣｐＧ  ＯＤＮは、当業者に公知になっている多様な核酸合成技術及び機械を用いて調製できる（Ａｕｓｕｂｅｌら，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｈｓ  ２．  ａｎｄ  ４．，  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  １９８９；  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８２；  ａｎｄ  ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．  ４，４５８，０６６  ａｎｄ  ４，６５０，６７５）。また、本発明のＣｐＧ  ＯＤＮは、制限酵素、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを用いて、既に存在する核酸配列から製造されてもよい。
【００１６】
好ましくは、本発明のＣｐＧ  ＯＤＮは、ホスホジエステル骨格を持つ。ＤＮＡの基本骨格であるホスホジエステル骨格は、インビボでヌクレアーゼによって容易に分解され、したがって、インビボで毒性を誘発するおそれが少ない。本発明のＣｐＧ  ＯＤＮは、ホスホジエステル骨格を有していても、他のＣｐＧ  ＯＤＮとは異なり、インビトロだけでなく、インビボで優れた免疫活性を示すという特徴がある。また、本発明のＣｐＧ  ＯＤＮは、修飾された骨格を持つことができる。オリゴヌクレオチド骨格の修飾は、インビボに投与されるとき、ＣｐＧ  ＯＤＮの活性及び／または安定性を強化させうることが知られてきた。本発明のＣｐＧ  ＯＤＮにおいて、好ましい骨格の修飾は、分解に耐性を持たせるホスホロチオエート修飾を含む。ホスホロチオエートへの修飾は、ＣｐＧ  ＯＤＮのいずれかの末端で起こり得る：例えば、最後の２個または３個の５’または３’ヌクレオチドがホスホロチオエート結合によって連結できる。また、本発明のＣｐＧ  ＯＤＮもまた、分解に耐性を持たせる２次構造（例：ステムループ構造）を有するように修飾できる。好ましくは、一つ以上の部分的ホスホロチオエート修飾骨格を持つように変形できる。ホスホロチオエートは、ホスホルアミデートまたはＨ−ホスホネート化学を用いて自動化技術によって合成できる（Ｓ．  Ｅ．  Ｂｅａｕｃａｇｅら，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ２２：１８５９，  １９８１；  Ｃｏｎｎｏｌｌｙら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２３：３４４３，  １９８４；  Ａｇｒａｗａｌら，  Ｐｒｏｃ．  Ａｎｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８５：７０７９−７０８３，  １９８８；  Ｇａｒｅｇｇら，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ２７：４０５１−４０５４，  １９８６；  Ｆｒｏｅｈｌｅｒら，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．，  １４：５３９９−５４０７，  Ｇａｒｅｇｇら，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ２９：２６１９−２６２２，  １９８８）。別の修飾の例として、アリール−及びアルキル−ホスホネートは、例えば米国特許第４，４６９，８６３号に記載されている通りに調製できる。さらに、アルキルホスホトリエステル（即ち、荷電されたホスホネート酸素原子が米国特許第５，０２３，２４３号及びヨーロッパー特許第０９２，５７４号に開示されている通りにアルキル化される）が、市販試薬を用いて、自動化された固相合成によって製造できる。また、ＣｐＧ  ＯＤＮの分解感度を減じるためのさらなる他の修飾は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン及びウリジンのアセチル−、及びチオ−又はこれと類似の変形、並びに、イノシン及びキシンなどの非定型塩基の包含を含む。テトラエチルグリコールまたはヘキサエチレングリコールなどのジオールで末端をキャップされたＣｐＧ  ＯＤＮは分解にさらに耐性的である。さらに、ホスホジエステルとホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ホスホラミネート、メチルホスホネート、メチルホスホロチオネート、ホスホロジチロエート及びこれらの組み合わせとの組み合わせが使用可能である（Ｋｈｏｒａｎａら，  Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．，  ７２：２０９，  １９７２；  Ｒｅｅｓｅ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ３３：３１４３−３１７９，  １９７８；  Ｊａｇｅｔら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．，  ２７：７２３７，  １９８８；  Ａｇｒａｗａｌら，  Ｐｒｏｃ．  Ａｎｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８５：７０７９−７０８３，  １９８８；  Ｕｈｌｍａｎｎ，  Ｅ．ら，  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．，  ９０：５４４，  １９９０；  Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，  ４：１６５，  １９９０）。上記のように修飾された骨格を有するＣｐＧ  ＯＤＮは、強化されたヌクレアーゼ抵抗性（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）、増加した細胞吸収（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｐｔａｋｅ）、増加したタンパク質結合（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｐｔａｋｅ）、および／又は変更された細胞内局在（ａｌｔｅｒｅｄ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）によってさらに強力な免疫効果を示すことができる。
【００１７】
本発明のＣｐＧ  ＯＤＮの好ましい骨格は、ホスホジエステル（以下「Ｏ型」という）またはホスホロチオエート（以下「Ｓ型」という）である。最も好ましい骨格は、インビボで容易に分解されて副作用を誘発しないＯ型骨格である。
【００１８】
本発明のＣｐＧ  ＯＤＮは、Ｔｈ２サイトカイン（例えば：ＩＬ−４及びＩＬ−１０）を抑制し、及び／またはＴｈ１サイトカイン（例えば：ＩＬ−１２及びＩＦＮ−γ）を誘導することにより、Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫反応のバランスを調節する生理的活性を持つ。具体的に、本発明のＣｐＧ  ＯＤＮは、マクロファージ、白血球細胞及び樹状細胞を活性化してＩＬ−１２及び／またはＩＦＮ−γの発現を誘導する。また、本発明のＣｐＧ  ＯＤＮは、樹状細胞の表面分子（例えば：ＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  III、ＣＤ８０、及びＣＤ８６）の発現を濃度依存的に増加させ、そしてＴリンパ球と末梢血液単核球細胞の増殖を誘導する。さらに、本発明のＣｐＧ  ＯＤＮは、アトピー性皮膚炎の病変部位でＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球を減少させ、そして血清内ＩｇＥレベルを減少させる。当業者に知られる従来のＣｐＧ  ＯＤＮとは異なり、本発明のＣｐＧ  ＯＤＮは、骨格の構造を問わずほぼ同一の活性を示す。
【００１９】
したがって、本発明は、前記ＣｐＧ  ＯＤＮを、これを必要とする対象に投与することを含む、Ｔｈ２サイトカインを抑制しおよび／またはＴｈ１サイトカインを誘導する方法、並びに免疫反応を刺激する方法を提供する。本発明のＣｐＧ  ＯＤＮによって抑制されるＴｈ２サイトカインは、Ｔｈ２細胞から分泌されるサイトカインを全て含む。例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３などを含む。本発明のＣｐＧ  ＯＤＮにって誘導されるＴｈ１サイトカインは、Ｔｈ１細胞から分泌されるサイトカインを全て含み、そしてその特定の例は、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γなどを含む。本発明において、「免疫反応を刺激する」とは、樹状細胞の活性化、免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球、及び末梢血液単核球細胞）の増殖誘導、炎症関連サイトカイン（例えば：ＴＮＦ−γ、ＭＩＰ−２、ＩＬ−１、ＩＬ−１２）の誘導及び／または紫外線照射による免疫抑制反応の回復を誘導することを含む。
【００２０】
本発明のＣｐＧ  ＯＤＮはまた、前記活性によって皮膚疾患の治療または皮膚疾患状態の改善の効果を有する。したがって、本発明のＣｐＧ  ＯＤＮは、皮膚疾患の治療または予防に効果的に使用できる。本発明は、前記ＣｐＧ  ＯＤＮを、これを必要とする対象に投与することを含む、皮膚疾患を治療または予防する方法を提供する。本発明の方法が適用できる皮膚疾患は、Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫反応のバランスの異常により誘発される疾患、すなわちＴｈ２−リンパ球によって仲介されるサイトカインの過発現、Ｔｈ１−リンパ球によって仲介されるサイトカインの低発現、血清内ＩｇＥレベルの増加、ＣＤ８＋表現型Ｔリンパ球及び／またはＣＤ４＋表現型Ｔリンパ球の数的異常及び機能性異常、並びに樹状細胞及び／又はマクロファージの活性低下よりなる群から選ばれる少なくとも一つにより誘発される皮膚疾患を含む。特に、本発明のＣｐＧ  ＯＤＮによって治療または予防できる皮膚疾患は、Ｔｈ１サイトカインであるＩＬ−１２の発現低下により誘発される皮膚疾患、あるいはＩＬ−１２の発現または生成を増加させることにより治療できる疾患である。
【００２１】
ＩＬ−１２は、初期感染に対して生成される先天免疫（ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を増幅させる機能を行うだけでなく、Ｔ細胞と樹状細胞及びマクロファージを含むＡＰＣｓ（抗原提示細胞：ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）との相互作用に関与することにより、より効果的な適応的免疫反応（ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を誘導する機能がある。樹状細胞又はマクロファージなどのＡＰＣｓからのＩＬ−１２の生成は、２つのタイプの機序により実行され、即ち、Ｔ細胞非依存的機序とＴ細胞依存的機序に分けられる。Ｔ細胞非依存的機序は、ウィルスまたはバクテリアを含む感染性病原体（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ａｇｅｎｔｓ）、またはその生成物であるＬＰＳまたはバクテリアＤＮＡによって誘導される（Ｄ’  Ａｎｄｒｅａ  Ａら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １７６：１３８７，  １９９２；  Ｓａｔｏ  Ｔら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：３５２−３５４，  １９９６）。この機序は、先天免疫と適応的免疫とを連結させる仲介体としてのＩＬ−１２の免疫学的重要性を提示する。また、Ｔ細胞依存的なＩＬ−１２生成機序は、主にＣＤ４０リガンドのような分子による同時−刺激的信号（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌ）を提供する活性化Ｔ細胞との相互作用によって誘導される（Ｓｈｕ  Ｕら，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２５：１１２５−１１２８，  １９９５；  Ｃｅｌｌａ  Ｍら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １８４：７４７−７５２，  １９９６）。この機序は、適応的免疫形成において、細胞傷害性Ｔ細胞増殖及び細胞毒性の増加またはＴｈ１免疫反応の持続的な維持などのＴ細胞免疫反応を誘導するのにＩＬ−１２が重要な役割をすることを示す。ＩＬ−１２は、主にＡＰＣｓから生成されるが、樹状細胞またはマクロファージに直接作用してＩＦＮ−γの生成を誘導する。また、ＩＬ−１２は、活性化Ｔ細胞にも作用することができる。この場合、ＩＬ−１２は、Ｔ細胞からＩＦＮ−γの生成を誘導し、ＩＦＮ−γによって誘導される免疫反応を調節することができる（Ｃｈａｎ  ＳＨら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １７３：８６９−８７９，  １９９１）。
【００２２】
ＩＬ−１２が様々な疾患と関連していることが知られている。そのような疾患の例としては、アトピー性皮膚炎及びアレルギー皮膚疾患（Ｎｅｕｍａｎｎ  Ｃ．，ら，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．，  ７４：  ４０１−４０６，  １９９６；  Ａｉｂａ  Ｓ．，ら，  Ｅｘｐ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，  １２：  ８６−９５，  ２００３；  Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｃ．，ら，  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ．，  ３４：  ３７３−３８０，  ２００４）、ウィルス性皮膚疾患（Ｋａｔａｋｕｒａ，  Ｔ．，ら，  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １０５：３６３−３７０，  ２００２  Ｈｅｎｇｇｅ  Ｕ．  Ｒ．，ら，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，  １４９：１５−１９，  ２００３；  Ａｒａｎｙ  Ｉ．，ら，  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．，  ４３：  ５５−６３，  １９９９）、皮膚癌（Ｒｏｏｋ  ＡＨ．，  ｅｔ  ａｌ  Ａｎｎ．  Ｎ．  Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ７９５：３１０−３１８，  １９９６；  Ｇｏｌｌｏｂ，  ＪＡ．，ら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．，  ２１：２５６４−２５７３，  ２００３；  Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ  Ｇ．，ら，  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３：  ２５１−２７６，  １９９５；  ａｎｄ  Ｋｒｅｐｌｅｒ  Ｃ．，ら，  Ｊ  ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，  １２２：  ３８７−３９１，  ２００４）などを含む。
【００２３】
したがって、本発明に適用できる皮膚疾患は、Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫反応のバランスの異常により生じる皮膚疾患である。具体的に本発明はアトピー性皮膚炎、アレルギー皮膚疾患、ウィルス性皮膚疾患及び皮膚癌の治療に適用できる。  
【００２４】
本発明に係るＣｐＧ  ＯＤＮは、対象に直接投与されてもよく、標的細胞（例えば樹状細胞の表面）に対する高親和性結合を誘発する分子とカップリングされるか前記分子内にカプセル化され、核酸配送複合体（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）の形で投与されてもよい。本発明のＣｐＧ  ＯＤＮは、イオン結合または共有結合によってステロール（例えばコレステロール）、脂質（例えば、陽イオン脂質、ウィロソームまたはリポソーム）、または標的細胞特異的カップリング剤（例えば、標的細胞特異的受容体によって認知されるリガンド）と結合できる。適したカップリング剤または架橋剤の例は、例えばタンパク質Ａ、カルボジイミド、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオテート（ＳＰＤＰ）などを含む。
【００２５】
本発明に係るＣｐＧ  ＯＤＮは、当業者に公知になっている方法によって様々な経路で投与できる（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，  Ｊ．  Ｉｍｍ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ．，  １７６：１４５，  １９９４；  Ｖｉｔｒｅｌｌｏら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ９５：３４１，  １９９５）。すなわち、本発明のＣｐＧ  ＯＤＮは、経口または非経口、例えば口、筋肉内、静脈内、皮内、動脈内、骨髄内、経脈内、腹腔内、鼻腔内、膣内、直腸内、舌下または皮下経路、あるいは、胃腸管、粘膜または呼吸器を介して投与されてもよい。例えば、本発明に係るＣｐＧ  ＯＤＮを注射用製剤に製造し、これを、３０ゲージの注射針で皮下に一定量注射可能である。あるいは、そのような注射用製剤は、３０ゲージの注射針で皮膚を軽く刺したり、または皮膚の上に直接塗布したりすることによって投与できる。
【００２６】
また、本発明に係るＣｐＧ  ＯＤＮは、当業者に公知の慣用の方法により、経口または非経口投与のために種々の形に製剤化できる。経口投与用の場合、本発明に係るＣｐＧ  ＯＤＮは、賦形剤と混合されて経口錠剤、バッカル錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、サスペンション、シロップ及びウェーハなどに製剤化できる。これらの製剤は、有効成分以外に希釈剤（例えばラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース及び／またはグリシン）、並びに界面活性剤（例えばシリカ、タルク、ステアリン酸およびそのマグネシウム又はカルシウム塩及び／又はポリエチレングリコール）をさらに含むことができる。前記錠剤は、マグネシウムアルミニウムシリケート、澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及び／又はポリビニルピロリドンなどの結合剤を含むことができる。所望により、澱粉、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩などの崩壊剤、吸収剤、着色剤、香味剤及び／または甘味剤をさらに含むことができる。前記剤形は、慣用の混合、顆粒化またはコーティング過程によって調製できる。
【００２７】
また、非経口投与用は、等張性水溶液または懸濁液などの注射用製剤、並びに皮膚塗布用製剤に製剤化できる。注射用剤形は、適した分散剤または湿潤剤及び懸濁化剤を用いて、当業界に公知になっている技術によって調製することができる。例えば、注射用製剤は、各成分を食塩水または緩衝液に溶解させて調製できる。皮膚塗布用製剤としては、本発明の薬学的組成物と薬学的に許容される担体とを配合して、そして、混合物をパウダー、塗布薬（ｌｉｎｉｍｅｎｔ）、ゲル、ローション、クリーム、軟膏剤、パスタ剤、パプ剤、エアロゾル、座剤などの形態に製剤することにより調製可能である。これらの製剤の中でも、軟膏剤が特に好ましい。各製剤に使用可能な担体としては、以下を含む：各剤形によって、ワセリン、流動パラフィン、ゲル化炭化水素などの炭化水素類；重鎖脂肪酸トリグリセリド、豚脂、固い脂肪（ｈａｒｄ  ｆａｔ）、カカオ脂などの動植物性オイル；セタノール、ステアリルアルコール、ステアリン酸、パルミチン酸イソプロピルなどの高級脂肪酸アルコール類及びそのエステル類；ポリエチレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセロール、ゼラチン、白糖、糖アルコールなどの水溶性基材；グリセリン脂肪酸エステル、ステアリン酸ポリオキシ、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などの乳化剤アクリル酸類；アクリル酸エステル、アルギン酸ナトリウムなどの粘着剤；液化石油ガス、二酸化炭素などのスプレー剤；及びパラオキシ安息香酸エステル類などの保存剤などが使用できる。本発明の製剤はさらに安定化剤及び保存剤をさらに含むことができる。適した安定化剤は、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの抗酸化剤を含む。適した保存剤としては、ベンズアルコニウムクロライド、メチルまたはプロピル−パラベン及びクロロブタノールを含む。その他の薬学的に許容される担体としては、次の文献に記載されているものを参考とすることができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １９ｔｈ  ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ，  １９９５）。
【００２８】
本発明のＣｐＧ  ＯＤＮの総有効量は、単回投与（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｓｅ）で患者に投与でき、または複数回投与（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｏｓｅ）で長期間投与される分割治療方法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）によって投与できる。本発明のＣｐＧ  ＯＤＮを含む薬学的組成物は、疾患の度合いによって有効成分の含量を異にすることができる。全身的に投与される場合、本発明の薬学的組成物は、約０．０１μＭ〜１００ｍＭの血中オリゴヌクレオチド濃度を得るのに十分な日用量として好ましくは投与される。局所的投与の場合には、他の経路による投与に比べてより少ない用量の有効成分を投与することができる。好ましくは、本発明のＣｐＧ  ＯＤＮの全体用量は、１日当たり体重１ｋｇ当たり約０．０１μｇ〜１００ｍｇい及ぶ。ところが、前記ＣｐＧ  ＯＤＮの濃度は、患者の薬の投与経路、治療回数、年齢、体重、状態、性別、疾患の重症度、食餌状態及び排泄率を含む多様な要因により決定される。したがって、上記因子を考慮すると、皮膚疾患の治療または予防に使用するＣｐＧ  ＯＤＮの有効量は当業者により容易に決定可能である。しかしながら、本発明に係る薬学的組成物は、本発明の望ましい効果を示す限り、その製剤、投与経路及び投与方法は特に制限されない。本発明の薬学的組成物は、単独で投与されるか、当業者に公知になっている他の治療方法、例えば化学療法治療、放射線治療、手術、他の経口治療剤及び軟膏剤（例えば：エリデル（Ｅｌｉｄｅｌ、ｐｉｍｅｃｒｏｌｉｍｕｓ）］を含むと共に投与できる。また、本発明の薬剤的組成物は当業者に公知になっている他の免疫アジュバントと共に投与できる。使用可能な免疫アジュバントは、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−１２、サイクロスポリン（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ）、ＦＫ５０６（Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）、ＴＰ−５（Ｔｈｙｍｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｐｅｎｔａｐｅｐｔｉｄｅ，  ｔｈｙｍｏｐｅｎｔｉｎ）などを含む。必要であれば、本発明に係るＣｐＧ  ＯＤＮを含有する薬学的組成物は、テトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、オキシテトラサイクリン（ｏｘｙｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）、硫酸ネオマイシン（ｎｅｏｍｙｃｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）、バシトラシン（ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ）、硫酸ポリミキシンＢ（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  Ｂ  ｓｕｌｆａｔｅ）およびムピロシン（ｍｕｐｉｒｏｃｉｎ）を含む抗生剤；ジペンヒドラミン（ｄｉｐｈｅｎｈｙｄｒａｍｉｎｅ）、プロメタジン（  ｐｒｏｍｅｔａｄｉｎｅ）、トリペレナミン（ｔｒｉｐｅｒｅｎａｍｉｎ）、フェノチアジン（ｐｈｅｎｏｔｈｉａｚｉｎｅ）、クロロペニラミン（ｃｈｌｏｒｏｐｅｎｉｒａｍｉｎ）、アンタゾリン（ａｎｔｈａｚｏｌｉｎｅ）およびファントリル（ｐｈａｎｔｈｏｌｙｌ）を含む抗ヒスタミン剤（ａｎｔｉ−ｈｉｓｔａｍｉｎｅｓ）；抗炎剤（ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇｓ）；抗ウィルス剤（ａｎｔｉ−ｖｉｒａｌ  ｄｒｕｇｓ）；及び抗真菌剤（ａｎｔｉ−ｆｕｎｇａｌ  ａｇｅｎｔｓ）よりなる群から選ばれる少なくとも一つ以上をさらに含むことができる。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明の好ましい態様を詳細に説明する。下記実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。
【００３０】
＜実施例１＞
免疫反応に対するｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮの塩基修飾の効果
＜１−１＞ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮ分離及びその塩基修飾
ＤＮａｓｅＩで部分切断された大腸菌の染色体ＤＮＡ断片から、免疫反応を高いレベルに誘導する配列番号２で表わされる核酸配列を持つＣｐＧ  ＯＤＮ（以下、「ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮ」という）を単離した。その後、ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮの塩基配列を修飾させて多様な変異体を調製し、そして試験してこれらの免疫反応を決定した。ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮの塩基修飾（ｂａｓｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、次のようにした。ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮ（配列番号２）のヌクレオチド配列において、５’末端から２番目のＣｐＧモチーフをＣＡまたはＣＴジヌクレオチドで置換し、そして製造されたＯＤＮｓを「ｏｌｉｇｏ−４−１」及び「ｏｌｉｇｏ−４−２」とそれぞれ命名した。また、ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮ（配列番号２）のヌクレオチド配列において、５’末端から３番目のＣｐＧモチーフをＴＧまたはＣＡジヌクレオチドで置換し、製造されたＯＤＮｓを「ｏｌｉｇｏ−４−３」及び「ｏｌｉｇｏ−４−４」とそれぞれ命名した。また、ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮのヌクレオチド配列において、２番目のＣｐＧモチーフと３番目のＣｐＧモチーフとの間にある４ヌクレオチド（ＴＴＧＣ）から２番目のＣｐＧモチーフの３’末端側にあるジヌクレオチド（ＴＴ）をＡＡ、ＣＣ及びＧＧよりなる群から選ばれる少なくとも一つのジヌクレオチドで置換し、製造されたＯＤＮｓを「ｏｌｉｇｏ−４−５」、「ｏｌｉｇｏ−４−６」及び「ｏｌｉｇｏ−４−７」とそれぞれ命名した。一方、前記４ヌクレオチド（ＴＴＧＣ）から３番目のＣｐＧモチーフの５’末端側にあるジヌクレオチド（ＧＣ）をＧＡ、ＧＴ及びＣＧよりなる群から選ばれる一つで置換し、製造されたＯＤＮｓを「ｏｌｉｇｏ−４−８」、「ｏｌｉｇｏ−４−９」及び「ｏｌｉｇｏ−４−１０」とそれぞれ命名した。最後に、ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮのヌクレオチド配列において、１番目のＣｐＧモチーフの５’末端側にあるジヌクレオチド（ＣＴ）、１番目のＣｐＧモチーフ、１番目のＣｐＧモチーフと２番目のＣｐＧモチーフとの間にあるジヌクレオチド（ＣＡ）、３番目のＣｐＧモチーフの５’末端側にあるジヌクレオチド（ＧＣ）、及び３番目のＣｐＧモチーフの３’末端にある６ヌクレオチド（ＡＡＣＴＴＣ）から２番目と３番目のジヌクレオチド（ＡＣ）をそれぞれＧＣ、ＴＣ、ＧＡ、ＧＧ及びＴＡでそれぞれ置換し、製造されたＯＤＮを「ｏｌｉｇｏ−４−１１」と命名した。各ＯＤＮの合成は、ゼノテック社に依頼して行った。合成された全てのＯＤＮは、ホスホジエステル型のオリゴヌクレオチドである。各置換変異体の配列情報は、下記表１に示した。表１において、ブロックはＣｐＧモチーフを示し、下線は修飾された部分を示す。
【００３１】
［表１］ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮの塩基変形
【００３２】
【表１】
2008502713.tif 000003
【００３３】
＜１−２＞免疫反応に対するｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮの塩基修飾の効果の決定
前記実施例＜１−１＞で調製されたｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮ及びその多様な置換変異体を、マクロファージのＩＬ−８及びＩＬ−１２のプロモータの活性化に対する効果について決定した。
【００３４】
ａ）マウスマクロファージの培養
Ｒａｗ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）含有ＤＭＥＭ培地で培養した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２下で、インキュベーター（Ｆｏｒｍａ）中で行った。細胞の培養の間、細胞生存率と細胞数を、血球計（ｈｅｍａｔｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を用いてトリプパンブルーエクスクルージョン（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）方法で周期的に測定した。全ての培養期間において、細胞の生存率を９５％以上に維持した。
【００３５】
ｂ）ＩＬ−８／ＩＬ−１２プロモータ−Ｌｕｃレポータプラスミドの構築
ＩＬ−８プロモータ領域を増幅するために、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１４及び１５のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。前記増幅されたＩＬ−８プロモータ領域の断片を、ＢｇｌII及びＨｉｎｄIIIで切断されたｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）に挿入し、こうしてＩＬ−８プロモータ−Ｌｕｃレポータプラスミドを構築した（Ｗｕ  Ｇ．  Ｄ．ら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７２：  ２３９６−２４０３，  １９９７）。
【００３６】
一方、ＩＬ−１２プロモータ領域を増幅するために、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１６及び１７のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。増幅されたＩＬ−１２プロモータ領域の断片を、ＳａｃＩ及びＸｈｏＩで切断されたｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）に挿入し、こうしてＩＬ−１２プロモータ−Ｌｕｃレポータプラスミドを構築した（Ｗｕ  Ｇ．  Ｄ．ら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７２：  ２３９６−２４０３，  １９９７）。
【００３７】
ｃ）プロモータ活性化分析：ルシフェラーゼ活性アッセイ
Ｒａｗ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅｒ、ＭＩＤ）を５×１０４細胞／ウェルの濃度で１２−ウェルプレートに分注した。その後、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間、インキュベーター中で培養した。前記細胞を、前記ｂ）で記載したように得られたＩＬ−８プロモータ−ＬｕｃレポータプラスミドまたはＩＬ−１２プロモータ−Ｌｕｃレポータプラスミド、並びにｐＲＬ−ｎｕｌｌプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）で共トランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。その後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間、インキュベーター中で培養した。上記表１に記載されたＣｐＧ  ＯＤＮｓ（１０μｇ／ｗｅｌｌ）を各ウェルに処理し、３７℃、５％ＣＯ２下で６時間または１２時間、インキュベーター中で培養した。対照群にはＰＢＳ処理を施した。培養が完了した後、培養液を除去した。その後、デュアル−ルシフェラーゼレポータアッセイシステム（Ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ）のＰＬＢ（ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）を１００μＬ／ｗｅｌｌの濃度で各ウェルに添加して細胞を溶解した。細胞溶解液を遠心分離して、上澄み液（１５μＬ）を用いてルシフェラーゼアッセイを行った。ルシフェラーゼの活性は、ＴＤ−２０／２０照度計（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）  （Ｔｕｒｎｅｒ  ｄｅｓｉｇｎｓ）を用いて測定した。ＣｐＧ  ＯＤＮの処理による各プロモータの活性は、対照群に基づく相対的な活性として示した。すなわち、対照群の活性を「１」とし、プロモーター活性を対照群に対する活性化倍数（ｆｏｌｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）で示した。
【００３８】
その結果、図１に示すように、ＩＬ−８プロモータ及びＩＬ−１２プロモータ活性化様相は非常に類似であった。ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮのヌクレオチド配列の３番目のＣｐＧモチーフが修飾された変異体（ｏｌｉｇｏ−４−３及びｏｌｉｇｏ−４−４）と、ＣｐＧ  ＯＤＮモチーフの５’末端が修飾された変異体（ｏｌｉｇｏ−４−８、ｏｌｉｇｏ−４−９及びｏｌｉｇｏ−４−１０）は高い活性を示した。
【００３９】
より具体的には、ｏｌｉｇｏ−４−４、ｏｌｉｇｏ−４−８及びｏｌｉｇｏ−４−９  ＯＤＮｓは、ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮよりさらに高い活性を示した。中でもｏｌｉｇｏ−４−８  ＯＤＮが最も高い活性を示した。この他にも、ｏｌｉｇｏ−４−３及びｏｌｉｇｏ−４−１０  ＯＤＮｓは、ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮに比べては低かったが、比較的高い活性を示した。これに対し、２番目のＣｐＧモチーフの配列を修飾した変異体（ｏｌｉｇｏ−４−１およびｏｌｉｇｏ−４−２）と、２番目のＣｐＧモチーフの３’末端側のジヌクレオチドの配列を修飾した変異体（ｏｌｉｇｏ−４−５、ｏｌｉｇｏ−４−６及びｏｌｉｇｏ−４−７）は、ＩＬ−８プロモータの活性が著しく減少することを示した。さらに、２番目のＣｐＧモチーフ及びその３’末端側のジヌクレオチド、並びに３番目のＣｐｇモチーフを除いて、ほとんど全ての塩基を修飾した変異体（ｏｌｉｇｏ−４−１１）は、高い活性を示した。上記結果は、ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮのヌクレオチド配列の中で２番目のＣｐＧモチーフと、２番目のＣｐＧモチーフの３’末端の２つの塩基がＩＬ−８プロモータ及びＩＬ−１２プロモータの活性化に深く関与することを示唆する。
【００４０】
表１に記載のＣｐＧ  ＯＤＮｓの置換変異体の母体であるｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮ、及び最も高いレベルのヌクレオチド配列における修飾を受けたｏｌｉｇｏ−４−１１  ＣｐＧ  ＯＤＮを使用して、以下の実験を行った。
【００４１】
＜実施例２＞
免疫反応に対するｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮの骨格修飾の効果
＜２−１＞ＩＬ−８プロモータに対する活性化のアッセイ
ＲＡＷ２６４．７細胞を、前記実施例＜１−２＞のｂ）で記載したように構築したＩＬ−８−ＬｕｃプロモータレポータベクターとｐＲＬ−ｎｕｌｌプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）で共トランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞を、Ｏ型（ホスホジエステル骨格）及びＳ型（ホスホロチオエート骨格）ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮ（０または１０μｇ／ｍＬ）でそれぞれ処理し、８時間培養した。さらに、本発明に係るｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮの活性とそれらの活性を比較するために、対照群ＣｐＧ  ＯＤＮとしてＯ型１８２６ＯＤＮ（配列番号１８）及びＯ型２００６ＯＤＮ（配列番号１９）を使用した。非−ＣｐＧ  ＯＤＮとしてＳ型２０４１ＯＤＮ（配列番号２０）を使用した。その後、前記実施例＜１−２＞と同様の方法によって行ってＩＬ−８プロモータの活性を測定した。
【００４２】
その結果、図２に示すように、ＩＬ−８プロモータの活性化様相は、ＣｐＧ  ＯＤＮのヌクレオチド配列に依存して、異なることが分かった。本発明に係るｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮは、骨格の形態を問わずに（Ｏ型及びＳ型のいずれも）最も高い活性を示した。
【００４３】
＜２−２＞サイトカインの生産比較分析
ヒトの末梢血液から白血球細胞を収集し、これを１．０×１０６細胞／ウェルの濃度で各ウェルに分注した。その後、各ウェルを、Ｏ型またはＳ型ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮ（０または１０μｇ／ｍＬ）で処理し、２４時間培養した。対照群として、前記実施例＜２−１＞と同様の対照群を使用した。培養が完了した後、細胞培養液を分離した。その後、細胞培養液内のサイトカインレベルを決定するために、商用化されたヒトＩＬ−１２  ｐ４０試薬（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎ．）及びヒトＩＦＮ−γ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｍ試薬（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎ．）を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡ分析をそれぞれ行った。
【００４４】
各サイトカイン（ＩＬ−１２  ｐ４０及びＩＦＮ−γ）に対する抗体をカーボネートバッファ（ｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）（ＳＩＧＭＡ、Ｃ−３０４１）で希釈し、生じた希釈液を９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ、４４２４０４）の表面にコートした。表面を、３％ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ、Ａ−２１５４）でブロッキングした。前記細胞培養液を適当な割合で希釈して、各ウェルに分注し、２時間培養した。ビオチン化２次抗体をそこに添加して３７℃で１時間反応させた。その後、ＳａＶ−ＨＲＰ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、１３０４７Ｅ）をそこに加え、３０分間さらに反応させた後、反応混合物を洗浄して発色させた。４９０ｎｍで吸光度を測定した。サイトカインの水準は、２回の実験による平均値で求めた。
【００４５】
アッセイの結果、図３に示すように、本発明のｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮは、骨格の形態を問わずに、白血球細胞においてＩＬ−１２  ｐ４０の生産を最も高いレベルに増加させた。また、Ｏ型ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮは、ＩＦＮ−γの生産も最も高いレベルに増加させた。Ｓ型ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮも他の対照群ＯＤＮに比べてさらに高い水準に白血球細胞においてＩＦＮ−γの生産を増加させた。
【００４６】
＜２−３＞Ｏ型ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮの炎症関連サイトカインの発現に対する効果
ＲＡＷ２６４．７細胞株をＯ型ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮ（１０μｌ／ｍＬ）を０．５、１、２、４、８及び１２時間処理した。対照群では、細胞をＯ型１８２６及び２００６ＯＤＮを同一の濃度で処理した。マイクロＲＮＡ分離キット（ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて細胞から総ＲＮＡを抽出した。５０Ｕストラタスクリプト（ＳｔｒａｔａＳｃｒｉｐｔ）逆転写酵素とオリゴ（ｄＴ）プライマー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて総ＲＮＡ（５μｇ）からｃＤＮＡを合成した。総ＲＮＡから増幅されたｃＤＮＡを鋳型とし、下記表２に記載の各サイトカイン（ＴＮＦ−γ、ＭＩＰ−２、ＩＬ−１、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−１２）に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った。下記表２において、「Ｆ」は正方向プライマーを示し、「Ｒ」は逆方向プライマーを示す。
【００４７】
［表２］炎症関連サイトカインを増幅するためのプライマー配列
【００４８】
【表２】
2008502713.tif 000004
【００４９】
ＰＣＲ増幅は、９４℃で３０秒間ＤＮＡ変性、５７℃で４０秒間プライマーアニーリング、及び７２℃で１分間ＤＮＡ延長を１サイクルとして総３０回繰り返し行った。内部対照群（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）として、ＧＡＰＤＨの発現を共に調査した。
【００５０】
その結果、図４に示すように、本発明に係るＯ型ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮの処理が、ＴＮＦ−γ、ＭＩＰ−２、ＩＬ−１及びＩＬ−１２の発現を誘導する。特に、Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫反応のバランスにおいてＴｈ１免疫反応を誘導する代表的なサイトカインであるＩＬ−１２は、本発明のｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮによってのみ誘導された。これは、本発明のＣｐＧ  ＯＤＮがＴｈ１免疫反応を誘導し得ることを示唆する。
【００５１】
これらの結果より、本発明のＣｐＧ  ＯＤＮは、従来のＣｐＧ  ＯＤＮｓとは異なり、その骨格の形態を問わずに高い免疫活性を示す。
【００５２】
＜実施例３＞
アトピー性皮膚炎関連免疫反応のインビトロアッセイ
＜３−１＞樹状細胞の活性化のアッセイ
本発明のＣｐＧ  ＯＤＮを、アトピー性皮膚炎モデル動物から単離された樹状細胞を活性化させるかを決定するために試験した。
【００５３】
ａ）樹状細胞の分離及びＣｐＧ  ＯＤＮの処理
アトピー性皮膚炎モデル動物であるＮＣ／Ｎｇａマウス（ＳＬＣ、Ｈａｍａｔｓｕ、Ｊａｐａｎ）の大腿部の骨髄から前駆細胞を単離した。単離された前駆細胞にＲＢＣ溶解溶液（１５０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ炭酸カリウム、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．４）を添加して、反応混合物を５分間常温で反応させた。その後、遠心分離によって細胞を回収し、無血清ＲＰＭＩ培地で３回洗浄した。細胞をトリプパンブルー（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）で染色し、血球計（ｈｅｍａｔｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）によって細胞数を測定した。細胞を、６−ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で分注した。骨髄の前駆細胞を樹状細胞に分化させるために、ＩＬ−４とＧＭ−ＣＳＦ（ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）をそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬの濃度で添加した１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地を各ウェルに加えた（Ｇｈｏｓｈ，  Ｍ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７０：  ５６２５−５６２９，  ２００３）。細胞を３７℃で５％ＣＯ２下、インキュベーター中で培養した。細胞は、２日ごとに培地を取り替えながら６日間培養した。その後、細胞を、本発明に係るＯ型ＣｐＧ  ＯＤＮを濃度別に（４μｇ／ｍＬ）処理した。ＣｐＧ  ＯＤＮとしては、Ｏ型のｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮ（配列番号２）、及びｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮのヌクレオチド配列で最も多くの変異を与えたＯ型のｏｌｉｇｏ−４−１１  ＯＤＮ（配列番号８）を使用した。陰性対照群には何の処理も施さなかった。陽性対照群にはＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）処理を施した。
【００５４】
ｂ）ＦＡＣＳアッセイ
前記ａ）でＣｐＧ  ＯＤＮｓ（Ｏ型骨格）またはＬＰＳで処理した樹状細胞を、細胞培養溶液から回収し洗浄した。その後、細胞懸濁液に、樹状細胞の表面分子であるＭＨＣ  ｃｌａｓｓII、ＣＤ８０及びＣＤ８６に対する各抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を添加し、反応混合物を３０分間４℃で反応させた。遠心分離によって上澄み液を除去し、残った細胞をＰＢＳで１回洗浄した。さらに、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓII、ＣＤ８０及びＣＤ８６に対する２次抗体［即ち、抗ハムスターＩｇＧ２（ＣＤ８０に対する２次抗体、ＢＤ  ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、抗ラットＩｇＧ２ａ（ＣＤ８６、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓIIに対する２次抗体、ＢＤ  ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）］をそこへ添加し、生じた混合物を再び３０分間４℃で反応させた。細胞を遠心分離により得て、次いで洗浄した。その後、細胞をＰＩ染色法で染色して表面分子の活性化程度をＦＡＣＳ分析によって調査した。
【００５５】
その結果、図５に示すように、Ｏ型ＣｐＧ  ＯＤＮ（ｏｌｉｇｏ−４及びｏｌｉｇｏ−４−１１）で処理した群において、ＬＰＳを処理した場合と同様に、樹状細胞の表面分子が全て活性化された。また、本発明のＣｐＧ  ＯＤＮｓは、濃度依存的に樹状細胞の表面分子を活性化可能であることを確認することができた（図６参照）。前記の結果から、本発明のＣｐＧ  ＯＤＮがインビボの免疫を活性化可能である樹状細胞を誘導することを確認することができた。
【００５６】
＜３−２＞樹状細胞におけるサイトカインの発現アッセイ
本発明に係るＯ型ＣｐＧ  ＯＤＮを処理した樹状細胞におけるＩＬ−１２の発現量を調査するために、ＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００５７】
まず、前記実施例＜３−１＞において、アトピー性皮膚炎モデル動物であるＮＣ／Ｎｇａマウスから単離された樹状細胞を、Ｏ型ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮを時間別（０、０．５、１、２、４及び８時間）に処理した。対照群を、Ｏ型１８２６  ＣｐＧ  ＯＤＮと２０４１  非−ＣｐＧ  ＯＤＮでそれぞれ処理した。前記１８２６  ＣｐＧ  ＯＤＮは、Ｓ型に骨格を有するように修飾した場合、ＩＬ−１２の発現を高いレベルに誘導するものと知られている（Ｌｅｅ，  ＫＷ．ら，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４１：９５５−９６４，  ２００４）。その後、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて樹状細胞から総ＲＮＡを分離した。総ＲＮＡ（５μｇ）をＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理して、３７℃で１時間反応させた。反応混合物を７０℃で５分間非活性化させてｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡを鋳型とし、ＩＬ−１２に特異的なプライマーセット（配列番号３３及び３４）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅を、９５℃で３０秒間のＤＮＡ変性、５７℃で４０秒間のプライマーアニーリング、及び７２℃で１分間のＤＮＡ延長を１サイクルとして総２５回繰り返し行った。ＰＣＲ反応が完了した後、１％アガロースゲルで増幅されたＰＣＲ産物を確認した。その結果、図７に示すように、本発明に係るＯ型ＣｐＧ  ＯＤＮによってのみＩＬ−１２の発現が誘導された。一方、Ｓ型の１８２６  ＣｐＧ  ＯＤＮがＩＬ−１２の発現を高いレベルに誘導すると報告されたのとは異なり（Ｌｅｅ，  ＫＷ．ら，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４１：９５５−９６４，  ２００４）、Ｏ型の１８２６  ＣｐＧ  ＯＤＮはＩＬ−１２の発現が誘導しなかった。
【００５８】
＜３−３＞免疫細胞の増殖誘導のアッセイ
ａ）Ｔ−リンパ球の増殖誘導
本発明のＣｐＧ  ＯＤＮがＴリンパ球の増殖を誘導するかを調べるために、次の実験を行った。
【００５９】
アトピー性皮膚炎モデル動物であるＮＣ／Ｎｇａマウス（ＳＬＣ、Ｈａｍａｔｓｕ、Ｊａｐａｎ）の大腿部の骨髄から樹状細胞を単離して６日間培養した。その後、前記樹状細胞を、Ｏ型ｏｌｉｇｏ−４及びｏｌｉｇｏ−４−１１  ＣｐＧ  ＯＤＮを１６μｇ／ｍＬの濃度で４８時間処理した。対照群にはＣｐＧ  ＯＤＮを処理していない。４８時間の後、これらの樹状細胞を２０Ｇｒａｙでγ−照射した後、細胞を丸底９６−ウェルプレートに１．０×１０４細胞／ウェルの濃度で分注した。その後、既にプレートの各ウェルに分注された樹状細胞に、レスポンダー（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）としてＴリンパ球（ＮＣ／Ｎｇａマウスの脾臓から単離した）を０：１または１：１０の比で、１．０×１０５細胞／ウェルの濃度で添加し、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で９６時間反応させた。次いで、各ウェルに［３Ｈ］チミジン（１μＣｉ；Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＳＡ）を添加して、１６時間反応させた。セルハーベスターを用いて各ウェルの細胞をろ紙に集めて室温で乾燥させた。その後、水性シンチレーションカウンター（ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔｅｒ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＳＡ）をバイアル当たり２μＬの量のバイアルに適用し、バイアルに上記ろ紙を入れて溶かした。β−計数器を用いてｃｐｍ（ｃｏｕｎｔｅｒ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅ）値を測定した。各値は、３回の測定を繰り返すことにより得た。
【００６０】
その結果、図８に示すように、本発明に係るＯ型ＣｐＧ  ＯＤＮが樹状細胞からＴリンパ球の増殖を誘導した。これは、ＣｐＧ  ＯＤＮ（ｏｌｉｇｏ−４及びｏｌｉｇｏ−４−１１）をアトピー性皮膚炎患者に投与する場合、Ｔリンパ球の増殖を介して免疫力の増進が可能であることを示す。
【００６１】
ｂ）末梢血液単核球細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｅｌｌｓ、ＰＭＢＣｓ）の増殖誘導
アトピー性皮膚炎患者から採取した末梢血液でＡＭＬＲ（同系混合リンパ球反応：ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｍｉｘｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）が減少していることが報告された（Ｌｅｕｎｇ  ＤＹＭ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．，  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ７２：１４８２−１４８６，  １９８３）。したがって、本発明者らは、アトピー性皮膚炎患者から単離されたＰＢＭＣの増殖を、本発明のＣｐＧ  ＯＤＮが誘導するかを調査した。
【００６２】
アトピー性皮膚炎患者の血液からＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ、Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）を用いてＰＢＭＣｓを単離した。単離したＰＢＭＣｓを９６ｗｅｌｌ丸底プレートに３×１０５細胞／ウェルの濃度で添加した。各ウェルに本発明のＯ型ＣｐＧ  ＯＤＮ（ｏｌｉｇｏ−４及びｏｌｉｇｏ−４−１１）をそれぞれ添加し、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で７２時間反応させた。その後、各ウェルに［３Ｈ］チミジン（１μＣｉ；Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＳＡ）を添加して、反応混合物を１６時間反応させた。細胞を、セルハーベスターを用いて各ウェルからろ紙に集めて室温で乾燥させた。その後、水性シンチレーションカウンター（ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔｅｒ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＳＡ）をバイアル当たり２μＬの量のバイアルに適用し、バイアルに上記ろ紙を入れて溶かした。β−計数器を用いてｃｐｍ値を測定した。
【００６３】
その結果、図９に示すように、ＰＢＭＣの増殖が本発明に係るＣｐＧ  ＯＤＮｓによって非常に高い度合に増加することを確認することができた。
【００６４】
＜実施例４＞
本発明のＣｐＧ  ＯＤＮの皮膚透過のアッセイ
＜４−１＞本発明のＣｐＧ  ＯＤＮを含有する軟膏剤の調製
本発明に係るＯ型ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮを、当業者に公知になっている慣用の方法によってＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｇｙａｎａｔｅ）で標識した。その後、ＦＩＴＣで標識されたＯ型ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮ１０ｍｇをペトロラタム（ｐｅｔｒｏｌａｔｕｍ）（サムア製薬、韓国）５ｇと混合して軟膏剤を調製した。
【００６５】
＜４−２＞皮膚透過分析
アトピー性皮膚炎動物モデルであるＮＣ／Ｎｇａマウス（ＳＬＣ、Ｈａｍａｔｓｕ、Ｊａｐａｎ）を、その背を脱毛した。その後、前記実施例＜４−１＞に記載されるように調製された０．５ｍｇのＣｐＧ−ＯＤＮ含有軟膏剤を背に塗布した。軟膏剤を塗布した後１日目及び５日目に、１．５×１．５ｃｍ２の表面積の背の皮膚をマウスから摘出して液体窒素で冷凍させた。その後、冷凍産物を、ティッシュ−テックＯＣＴ化合物（Ｔｉｓｓｕ−Ｔｅｋ  ＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ  ＵＳＡ、ＩＮＣ．）中に包埋し、低温保持装置（ｃｒｙｏｓｔａｔ）を用いて５μｍの厚さに切断した。組織切片を蛍光顕微鏡下で観察した。
【００６６】
その結果、図１０Ａに示すように、本発明に係るＯ型ＣｐＧ  ＯＤＮがマウスの皮膚内に浸透して、塗布の時点から５日経過後でさえも、そこに残っていた。また、塗布２４時間の後、ＣｐＧ  ＯＤＮがリンパ節に浸透したことを確認することができた（図１０Ｂ参照）。
【００６７】
＜実施例５＞
アトピー性皮膚炎治療効果を決定するためのインビボアッセイ
＜５−１＞本発明のＣｐＧ  ＯＤＮ含有軟膏剤の塗布
ＮＣ／Ｎｇａマウス６匹を２群に分類した：ＣｐＧ  ＯＤＮ処理群及び無処理群。処理群のマウスに対しては、前記実施例＜４−１＞に記載されたように調製したＯ型ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮ含有軟膏剤（０．２ｍｇ  ＣｐＧ−ＯＤＮ／マウス１匹）を、マウスの背にあるアトピー性皮膚炎病変部位に塗布した。無処理群のマウスに対しては、本発明のＣｐＧ  ＯＤＮが含有されていないペトロラタムを同様の条件で塗布した。
【００６８】
＜５−２＞病変の観察
ＣｐＧ  ＯＤＮ含有軟膏剤の塗布後５日目及び７日目に、アトピー性皮膚炎の病変部位を肉眼で観察した。その結果、図１１Ａに示すように、無処理群のマウスと比較すると、本発明のＯ型ＣｐＧ  ＯＤＮで処理したマウスは、背のアトピー性皮膚病変の消失を示した。また、背の皮膚を摘出して、Ｈ＆Ｅ染色法によって染色し、アトピー性皮膚炎の治療効果を調査した。その結果、図１１Ｂに示すように、本発明のＯ型ＣｐＧ  ＯＤＮで処理したマウスの病変は、過角化症（ｈｙｐｅｒｋｅｒａｔｏｓｉｓ）とアカントーシス（ａｃａｎｔｈｏｓｉｓ）の著しい減少、並びに真皮内リンパ球の浸潤の著しい減少を示した（倍率×２００）。したがって、アトピー性皮膚炎が、本発明のＣｐＧ  ＯＤＮを使用することにより効果的に治療可能であることを確認した。
【００６９】
＜５−３＞組織化学アッセイ
ａ）サイトカインの発現のアッセイ
本発明のＯ型ＣｐＧ  ＯＤＮ含有軟膏剤の塗布後５日目に、１．５×１．５ｃｍ２の表面積のマウス皮膚を摘出した。その後、皮膚を４％ホルマリン溶液中で少なくとも一日以上固定した。固定された皮膚組織をパラフィンで処理して５μｍの厚さに切断した。パラフィンを除去した後、ＬＳＡＢ＋ｋｉｔ（ＤＡＫＯ、Ｄｅｎｍａｒｋ）のマニュアルに従って以下の実験を皮膚試料で行った。３％Ｈ２Ｏ２を１０分間処理した。その後、０．１％ＢＳＡを含有するＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）（ｐＨ７．４）で希釈した１０％正常ヤギ血清をそこへ添加し、１時間室温で試料をブロッキングした。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した後、試料を、１次抗体、即ちヤギ抗マウスＩＬ−１０、山羊抗マウスＩＬ−４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＵＳＡ）、及びラット抗マウスＩＦＮ−γ（Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ）で処理し、４℃で少なくとも１２時間反応させた。その後、ビオチン標識２次抗体をそこへ添加し、室温で３０分間反応させた。そして、ペルオキシダーゼで標識されたストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）をそこへ添加して、室温で約３０分間反応させた。ＤＡＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＤＡＫＯ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて染色した後、顕微鏡によって試料を観察した（倍率×２００）。
【００７０】
観察によると、図１２に示すように、本発明のＯ型ＣｐＧ  ＯＤＮで処理して５日後のマウスの表皮は、ＩＬ−４及びＩＬ−１０の発現の減少を示した。反対に、ＩＦＮ−γの発現は増加した。これは、本発明のＯ型ＣｐＧ  ＯＤＮがアトピー性皮膚炎において特異的に高いＴｈ２表現型Ｔリンパ球によって媒介されるサイトカインＩＬ−４及びＩＬ−１０の生成を減少させることを示唆する。一方、本発明のＣｐＧ  ＯＤＮは、Ｔｈ１表現型Ｔリンパ球によって媒介されるサイトカインＩＦＮ−γの生成を増加させる。そうすることにより、ＣｐＧ  ＯＤＮは、アトピー性皮膚炎の状態を改善し、そしてアトピー性皮膚炎を治療する。
【００７１】
ｂ）組織内ＣＤ４＋及びＣＤ８＋リンパ球の染色
本発明のＯ型ＣｐＧ  ＯＤＮ含有軟膏剤の塗布後５日目に、１．５×１．５ｃｍ２の表面積のマウス皮膚を摘出した。皮膚組織を液体窒素で冷凍した。その後、冷凍組織をティッシュ−テックＯＣＴ化合物（Ｔｉｓｓｕ−Ｔｅｋ  ＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ  ＵＳＡ、ＩＮＣ．）中に包埋し、低温保持装置（ｃｒｙｏｓｔａｔ）を用いて５μｍの厚さに切断した。組織に１次抗体、即ちラット抗マウスＣＤ４  ｍＡｂ（ＢＤ  ｐｈａｍｉｎｇｅｎ、ＵＳＡ）またはラット抗ＣＤ８  ｍＡｂ（Ｓｅｒｏｔｅｃ、ＵＫ）と、４℃で１２時間反応させた。その後、ビオチン標識２次抗体をそこに添加し、室温で３０分間反応させた。そして、ペルオキシダーゼで標識されたストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）をそこへ添加して、反応混合物を室温で約３０分間反応させた。ＤＡＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＤＡＫＯ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて染色した後、顕微鏡によって試料を観察した（倍率×２００）。
【００７２】
その結果、図１３に示すように、本発明のＯ型ＣｐＧ  ＯＤＮで処理したマウスの皮膚では、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋リンパ球細胞の数の減少を示した。アトピー性皮膚炎の病変におけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋リンパ球細胞の数の減少は、治療上好ましい現象である（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｖ．，ら  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０４：１９０７−１１０５，  １９９９）。
【００７３】
＜５−４＞血清内ｌｇＥレベルのアッセイ
各群のマウスをエーテルで麻酔した後、マウスの大静脈から血液を採取してヘパリン処理済みのチューブに入れた。その後、１０００ｇで１０分間遠心分離して血漿を収得し、血漿を使用するまで−２０℃で保管した。総ＩｇＥレベルは、マウスＩｇＥ  ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  Ｋｉｔ（ＢＤ  ｐｈａｍｉｎｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて測定した。測定は、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  Ｋｉｔにより提供された製造業者のプロトコルにしたがって行い、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬのＩｇＥキャプチャ抗体（ｃａｐｔｕｒｅ  Ａｂ）を添加し、４℃で少なくとも１２時間反応させた。各ウェル内の溶液を除去し、ウェルを洗浄バッファ（ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。その後、ブロッキングバッファ（ＰＢＳ、１０％ＦＢＳ）２００μＬを各ウェルに添加して、室温で１時間反応させた。ブロッキングバッファを除去し、前記洗浄バッファで３回洗浄した。各マウスから得た血漿サンプルをそれぞれ１００μＬずつ各ウェルに添加し、室温で２時間反応させた。その後、ウェル内の溶液を除去し、ウェルを前記洗浄バッファで５回洗浄した。アビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（アビジン−ＨＲＰ）が結合したビオチン化マウスＩｇＥ抗体（ＢＤ  ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＵＳＡ）１００μＬを各ウェルに添加し、１時間室温で反応させた。反応が完了した後、ウェルを７回洗浄した。ＴＭＢ基質溶液（ＢＤ  ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＵＳＡ）１００μＬを各ウェルに添加し、室温の暗所で３０分間反応させた。１Ｍリン酸（ＢＤ  ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＵＳＡ）５０μＬを各ウェルに停止液として添加した。停止液を添加後３０分内にＥＬＩＳＡリーダーで４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
【００７４】
その結果、図１４に示すように、本発明のＯ型ＣｐＧ  ＯＤＮ含有軟膏剤で処理したマウスは、血清内ＩｇＥレベルの著しい減少を示した。
上記の結果わかるように、本発明のＯ型ＣｐＧ  ＯＤＮが、Ｔｈ２−リンパ球によって媒介されるサイトカインの発現を減少させるが、Ｔｈ１−リンパ球によって媒介されるサイトカインの発現は増加させる。したがって、本発明のＣｐＤ  ＯＤＮは、アトピー性皮膚炎の治療に非常に効果的であるように、血清内ＩｇＥレベルを減少させる。
【００７５】
＜実施例６＞
紫外線照射で誘導されるマウスの遅延型過敏症の免疫抑制に対するＣｐＧ−ＯＤＮの回復効果
８週齢雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（体重約２０ｇ、韓国ＳＬＣ、韓国）を各グループ当たり５匹ずつ下記の５グループに分けた。
（１）陰性対照群：紫外線照射及び感作で処理しなかった
（２）陽性対照群：紫外線を照射せずに感作のみでした
（３）紫外線処理群：マウスを紫外線照射し、紫外線照射３日後に感作で処理した
（４）ｏｌｉｇｏ−４処理群：紫外線を照射して２４時間の後、本発明のＯ型ｏｌｉｇｏ−４を腹腔注射し、紫外線照射３日の後、マウスを感作した
（５）ｏｌｉｇｏ−１１処理群：紫外線を照射して２４時間の後、本発明のＯ型ｏｌｉｇｏ−１１を腹腔注射し、紫外線照射３日の後、マウスを感作した
紫外線照射のためにマウスの背部位の毛を除毛し、感作を誘導するためにマウスの腹部の毛を除毛した。各段階の実験日程は図１５に示した。
【００７６】
各グループのマウスをＵＶＢランプ（４ＦＳＸ２４Ｔ１２／ＵＶＢ−ＨＯ、ＵＢＬ、ＵＳＡ）付き紫外線ボックスに入れ、紫外線を０．６ｍＷ／ｃｍ２の線量で２８分間照射した。マウスに照射されたＵＶＢのエネルギー総量は１０ＫＪ／ｍ２であった。こうすることにより、遅延型過敏症の免疫抑制が紫外線照射により誘導された。紫外線照射２４時間の後、１ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳに溶解されている本発明のＣｐＧ  ＯＮＤｓを２０μｇの用量で腹腔注射した。対照群の場合は、同量のＰＢＳ溶液を注射した。
【００７７】
注射の２日後、除毛された各Ｂａｌｂ／ｃの雌マウスの腹部に３％ＴＮＣＢ（トリニトロクロロベンゼン）溶液（Ｔｏｋｙｏ  Ｋａｓｅｉ  Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）１００μＬを塗布して感作を誘導した。感作５日後に、マウスの耳の厚さを測定した。耳膨張を再び誘導するために、さらに１％ＴＮＣＢ溶液を各マウスの両耳に塗布した。２４時間の後、マイクロメーター（Ｍｉｔｕｔｙｏ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いてマウスの耳の浮腫を測定した。
【００７８】
その結果、図１６に示すように、除毛されたマウスの腹部に３％ＴＮＣＢ１００μＬを塗布することにより、マウスの接触過敏症が誘導された（陽性対照群：１８．５±３．７３×１０−２ｍｍ）。紫外線を照射したマウスにおいて、マウスの耳の浮腫の程度が減少した（８．３±１．６６×１０−２ｍｍ）。一方、本発明のＣｐＧ  ＯＤＮを腹腔内に注入すると、紫外線によって抑制された接触過敏症が有意に回復された。これから、本発明のＣｐＧ  ＯＤＮが紫外線による抑制された免疫反応を回復させることが可能であることが示唆された。
【００７９】
＜実施例７＞
紫外線照射によって接触過敏症（ｃｏｎｔａｃｔ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）が抑制されたマウスの脾臓から単離されたＴＮＰ特異抗原Ｔ細胞の増殖反応の誘導に対する、本発明のＣｐＧ  ＯＤＮの効果
８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（体重約２０ｇ）を各グループ当たり５匹ずつで５つのグループ（陰性対照群、陽性対照群、紫外線処理群、ｏｌｉｇｏ−４処理群及びｏｌｉｇｏ−１１処理群）に分けた。紫外線照射、本発明のＣｐＧ  ＯＤＮ処理及び感作を実施例６と同様にして行った。抗原特異的反応を誘導するために、紫外線照射及び感作をしていない陰性対照群のマウスから単離した脾臓細胞を１０ｍＭ  ＴＮＢＳＯ３（トリニトロクロロベンゼンスルホン酸）（Ｔｏｋｙｏ  Ｋａｓｅｉ  Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）と結合させた。結合した細胞を、刺激細胞（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｃｅｌｌ）として使用した。この他に陽性対象群、紫外線処理群、紫外線照射／ｏｌｉｇｏ−４処理群および紫外線照射／ｏｌｉｇｏ−１１処理群のマウスから単離した脾臓細胞を反応細胞（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ  ｃｅｌｌ）として使用した。反応細胞を、丸底９６ウェル−プレートの各ウェル中に、１×１０５細胞／ウェルの濃度で入れた。その後、前記刺激細胞を各ウェルに添加して、５日間培養した。刺激細胞と反応細胞は１：１の割合で混合した。細胞を収集する１８時間の前に、０．５μＣｉの［３Ｈ］チミジンを各ウェルに添加して１８時間反応させた。細胞を、セルハーベスターを用いて収集し、ろ紙に集めて常温で乾燥させた。その後、水性シンチレーションカウンター（ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔｅｒ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を２ｍＬの量のバイアルに適用して、ここにそれぞれのろ紙を入れて溶解させた。β−シンチレーションカウンター（β−ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔｅｒ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いてｃｐｍ（ｃｏｕｎｔｅｒ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅ）値を測定し、マウス脾臓から単離した免疫細胞（Ｔ細胞）の増殖度合いを調査した。
【００８０】
その結果、図１７に示すように、紫外線照射により特異抗原（ＴＮＣＢ）に対する接触過敏症（ｃｏｎｔａｃｔ  ｈｅｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）が抑制されたマウスから単離したＴ細胞における、ＴＮＰ（トリニトロフェニル）特異抗原Ｔ細胞増殖反応は、本発明のＣｐＧ  ＯＤＮ処理によって有意に増加した。これから、接触性皮膚炎モデルにおける紫外線による免疫抑制効果は、本発明のＣｐＧ  ＯＤＮによって有意に回復可能であることが示唆される。
【００８１】
＜適用例１＞
ウィルスにより誘発される皮膚疾患
ウィルス性皮膚疾患は、免疫が低下したヒトまたは慢性疾患の患者によく発生する。このようなヒトまたは患者において、タイプ１Ｔ細胞免疫反応（ｔｙｐｅ  １  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）が低下したが、タイプ２Ｔ細胞免疫反応は増加している（Ｈｅｎｇｇｅ  Ｕ．Ｒ．，ら，  Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，  １４９：１５−１９，  ２００３；  ＫａｔａｋｕｒａＴ．，ら，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｎｏｌ．  １０５：  ３６３−３７０，  ２００２）。これらのウィルス性疾患には、伝染性軟属腫、疣／コンジローム、ヘルペスウィルス感染などを含み、ＩＬ−１２を直接注入することにより或いはＩＬ−１２レベルを増加させることにより効果的に治療可能である（Ａｒａｎｙ  Ｉ．，ら，  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．，  ４３：  ５５−６３，  １９９９；  Ｍａｔｓｕｏ，  Ｒ．，ら，  ５９：６２３−６３０，  １９９６；  ａｎｄ  Ｋａｔａｋｕｒａ，  Ｔ．，ら，  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １０５：３６３−３７０，  ２００２）。したがって、ＩＬ−１２のレベルの増進効果を有する本発明のＣｐＧ−ＯＤＮは、ウィルス性皮膚疾患の治療に非常に効果的である。
【００８２】
＜適用例２＞
皮膚癌
皮膚癌は免疫が低下したヒト、または免疫抑制されたヒトによく発生する。このようなヒトにおいて、特に細胞性仲介免疫に関与するＴｈ１免疫反応が減少し、Ｔｈ２免疫反応が増大していると報告されている（Ｒｏｏｋ  ＡＨ．，ら，  Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．，  ７９５：  ３１０−３１８，  １９９６）。ＩＬ−１２は、感染と腫瘍に対する免疫反応を誘発し、これを治療するサイトカインとして知られている。その効果はインビボＩＦＮ−γの生成により現れる（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ  Ｇ．，ら，  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：  ２５１−２７６，  １９９５）。ＩＬ−２１が皮膚癌の治療に利用できるという報告と共に、ＣｐＧ−ＯＤＮがマウスにおいて悪性黒色腫の治療に効果的であるという報告がある（Ｇｏｌｌｏｂ  ＪＡ．，ら，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．，  ２１：  ２５６４−２５７３，  ２００３；  Ｋｒｅｐｌｅｒ  Ｃ．，ら，  Ｊ  ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，  １２２：  ３８７−３９１，  ２００４）。したがって、ＩＬ−１２レベルの増進効果を有する本発明のＣｐＧ−ＯＤＮは、皮膚癌の治療に非常に効果的である。
【００８３】
＜適用例３＞
アトピー性皮膚炎及びアレルギー皮膚疾患
アトピー性皮膚炎の病因機序は、まだ確実ではないが、ＩＬ−４とＩＬ−５を含んだＴｈ２サイトカインを生産するアレルゲン特異的Ｔ細胞が、アトピー性皮膚炎を誘発すると考えられている。さらに、アトピー性皮膚炎患者の病変にこれらの細胞が浸潤することが証明された（Ｎｅｕｍａｎｎ  Ｃ．，ら，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．，  ７４：  ４０１−４０６，  １９９６）。アトピー性皮膚炎患者から単核球または単核球由来の樹状細胞をＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃａｒｉｄｅ）で刺激するとき、正常人に比べてＩＬ−１２  ｐ４０の生産が著しく減少すると報告されたことがある（Ａｉｂａ  Ｓ．，ら，  Ｅｘｐ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，  １２：  ８６−９５，  ２００３）。これと共に、乳児の臍帯血からのＩＬ−１２を生産する単核球の数の減少が、ＩｇＥ生産と関連しており、同じ状態下でアトピー性皮膚炎は頻繁に発生すると報告された（Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｃ．，ら，  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ．，  ３４：  ３７３−３８０，  ２００４）。Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫反応を決定する重要な因子の一つがＩＬ−１２であることを勘案するとき、樹状細胞においてＩＬ−１２の生産を増加させる本発明のＣｐＧ−ＯＤＮが、アトピー性皮膚炎及びＩｇＥ増加性アレルギー皮膚疾患の治療に有効であることが予期される。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
以上述べたように、本発明に係るＣｐＧ  ＯＤＮｓは、その骨格の形態を問わずに皮膚疾患の治療または予防に効果的な免疫反応を誘導する。したがって、本発明に係るＣｐＧ  ＯＤＮｓ、特にＯ型のＣｐＧ  ＯＤＮｓは、皮膚疾患の治療または予防用の療法剤として有用に使用できる。
【００８５】
本発明は、現在最も実用的で好ましい態様と考えられるものと関連して記載されているが、本発明は、開示された態様および図面に限定されないことが理解されよう。反対に、添付の請求の範囲の精神及び範囲内にある種々の修正および変化が保護されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
本発明の前記および他の目的、特徴および利点は添付図面を参照する以降の詳細な説明からより明らかに理解可能である。  
【図１】図１は、ＩＬ−８プロモータ及びＩＬ−１２プロモータの活性化に対する、本発明に係るｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮの塩基修飾の効果を示す。
【図２】図２は、ＩＬ−８プロモータの活性化に対する、先行技術のＣｐＧ  ＯＤＮｓ（１８２６及び２００６）及び非−ＣｐＧ  ＯＤＮ（２０４１）と比較した、本発明に係るｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮの骨格修飾（ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の効果を示す。  対照群：無処理
【図３】図３は、ＩＬ−１２  ｐ４０（Ａ）及びＩＦＮ−γ（Ｂ）の生産に対する、先行技術のＣｐＧ  ＯＤＮｓ（１８２６及び２００６）及び非−ＣｐＧ  ＯＤＮ（２０４１）と比較した、本発明に係るｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮの骨格修飾の効果を示す。
【図４】図４は、マクロファージにおける炎症反応関連サイトカインの発現に対する、先行技術のＯ型ＣｐＧ  ＯＤＮｓ（１８２６及び２００６）と比較した、本発明に係るＯ型ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮの効果を示す。
【図５】図５は、樹状細胞の表面分子（ＭＨＣ−II、ＣＤ８０及びＣＤ８６）の活性化に対する、本発明のＯ型ＣｐＧ  ＯＤＮｓの効果を示す。  対照群：無処理  ＬＰＳ：リポポリサッカライド（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）処理（陽性対照群）
【図６】図６は、樹状細胞の表面分子（ＣＤ８０及びＣＤ８６）の活性化に対する、本発明のＯ型ＣｐＧ  ＯＤＮｓの効果を示す。  対照群：無処理  ＬＰＳ：リポポリサッカライド処理（陽性対照群）
【図７】図７は、樹状細胞におけるＩＬ−１２の発現に対する、先行技術のＯ型１８２６ＣｐＧ  ＯＤＮと非−ＣｐＧ  ＯＤＮ（２０４１）と比較した、本発明のＯ型ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮの効果を示す。
【図８】図８は、同種（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）Ｔリンパ球の増殖に対する、本発明のＯ型ＣｐＧ  ＯＤＮｓ（ｏｌｉｇｏ−４−１１及びｏｌｉｇｏ−４）の効果を示す。
【図９】図９は、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖において、Ｏ型ＣｐＧ  ＯＤＮｓ（ｏｌｉｇｏ−４−１１及びｏｌｉｇｏ−４）の効果を示す。
【図１０】図１０は、ＦＩＴＣで標識された本発明のＯ型ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮがＮＣ／Ｎｇａマウスの背表皮内に浸潤したことを示す。
【図１１】図１１は、動物モデルにおける、本発明に係るＯ型ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮの投与によるアトピー性皮膚炎の治療の結果を示す。  Ａ：本発明のＯ型ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮをＮＣ／Ｎｇａマウスの背にあるアトピー性皮膚炎病変に塗布した後、５日及び７日に肉眼で観察した写真である。  Ｂ：アトピー性皮膚炎が発生したＮＣ／Ｎｇａマウスの背皮膚に本発明のＯ型ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ−ＯＤＮを塗布した後、皮膚を摘出してＨ＆Ｅ染色して観察した写真である。  ←→：アカントーシス（ａｃａｎｔｈｏｓｉｓ）  →：過角化症（ｈｙｐｅｒｋｅｒａｔｏｓｉｓ）
【図１２】図１２は、本発明のＯ型ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮを投与したＮＣ／Ｎｇａマウスの背皮膚におけるサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γ）の発現の免疫組織化学の結果を示す。矢印はサイトカインの発現を示す。
【図１３】図１３は、本発明のＯ型ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮを投与したＮＣ／Ｎｇａマウスの背皮膚における、治療前後に浸潤したＣＤ４＋及びＣＤ８＋リンパ球の免疫組織化学の結果を示す。矢印はＣＤ４＋及びＣＤ８＋リンパ球を示す。
【図１４】図１４は、本発明のＯ型ｏｌｉｇｏ−４  ＣｐＧ  ＯＤＮを投与した後、ＮＣ／Ｎｇａマウスの血清内ＩｇＥレベルの結果を示す。  ＡＤ：無処理群
【図１５】図１５は、マウスにおける紫外線照射による接触過敏症（ｃｏｎｔａｃｔ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）の抑制に反して、本発明のＣｐＧ  ＯＤＮによる、接触過敏症の回復効果を実証するための実験手順を示す。
【図１６】図１６は、マウスにおける紫外線照射による接触過敏症の抑制に反して、本発明のＣｐＧ  ＯＤＮによる接触過敏症の回復効果を示す。＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊＜０．０１を示す。
【図１７】図１７は、紫外線照射によって接触過敏症（ｃｏｎｔａｃｔ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）が抑制されたマウスの脾臓から単離したＴ細胞の増殖反応（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）の誘導に対する本発明のＣｐＧ  ＯＤＮの効果を示す。＊はｐ＜０．０５を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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