(57)【要約】  本発明は、ＧＰＲ４０遺伝子の一塩基多型に関する、遺伝子型同定方法、治療方法、診断試験および剤を特徴付けする方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト被験者のＧＰＲ４０遺伝子によってアミノ酸２１１番においてコードされるアミノ酸を決定することを含んでなる、遺伝子型同定方法。
【請求項２】
さらに、被験者のＧＰＲ４０遺伝子の両方のアレルによってアミノ酸２１１番においてコードされるアミノ酸を決定することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに、被験者のＧＰＲ４０遺伝子がヒスチジン以外であるアミノ酸２１１番をコードするか否かを決定することを含んでなる、請求項１に記載の遺伝子型同定方法。
【請求項４】
さらに、被験者のＧＰＲ４０遺伝子がアルギニンであるアミノ酸２１１番をコードするか否かを決定することを含んでなる、請求項１に記載の遺伝子型同定方法。
【請求項５】
さらに、被験者のＧＰＲ４０遺伝子がヒスチジンであるアミノ酸２１１番をコードするか否かを決定することを含んでなる、請求項１に記載の遺伝子型同定方法。
【請求項６】
請求項１に記載の遺伝子型同定方法であって、さらに：
ヒト被験者から核酸を単離し；
当該核酸の隣接する配列を増幅し、ここで当該隣接する配列はアミノ酸２１１番をコードするＧＰＲ４０のヌクレオチド、またはその相補的な配列を含んでなる；
当該隣接する配列を、当該被験者のＧＰＲ４０遺伝子のアミノ酸２１１番においてコードされるアミノ酸の決定を可能にするヌクレオチドプローブで処理し；そして、
当該プローブが、高度にストリンジェントな条件下で当該隣接する配列にハイブリダイズするか否かを決定する；
ことを含んでなる、前記遺伝子型同定方法。
【請求項７】
プローブが、ＧＰＲ４０遺伝子のアミノ酸２１１番がヒスチジンであるか否かを決定することを可能にする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
プローブが、ＧＰＲ４０遺伝子のアミノ酸２１１番がアルギニンであるか否かを決定することを可能にする、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
プローブが、検出可能な標識に連結され、そしてアミノ酸２１１をコードするヌクレオチドを含む、約１３ないし約３５ヌクレオチドの長さを有する配列番号９のヌクレオチド配列の隣接する部分からなる、またはその相補的なヌクレオチド配列である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
プローブが、検出可能な標識に連結され、そしてアミノ酸２１１をコードするヌクレオチドを含む、約１３ないし約３５ヌクレオチドの長さを有する配列番号１０のヌクレオチド配列の隣接する部分からなる、またはその相補的なヌクレオチド配列である、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
ヒト被験者のＧＰＲ４０遺伝子によってアミノ酸２１１番においてコードされるアミノ酸を決定し；そして、
コードされるアミノ酸２１１番がヒスチジン以外であるＧＰＲ４０遺伝子を少なくとも１つのアレルに有することによって仲介される疾患または病理学的状態の治療または予防のための剤の療法的に有効量で当該被験者を治療する；
ことを含んでなる、治療方法。
【請求項１２】
剤が、チアゾリジンジオン抗糖尿病化合物、その薬学的に受容可能なプロドラッグ、またはその薬学的に受容可能な塩である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
剤が、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤、その薬学的に受容可能なプロドラッグ、またはその薬学的に受容可能な塩である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ヒト被験者のＧＰＲ４０遺伝子のアミノ酸２１１番においてコードされるアミノ酸の決定を可能にするヌクレオチドプローブを含んでなる、キット。
【請求項１５】
剤を特徴づけする方法であって：
ＧＰＲ４０リガンドの、アミノ酸２１１番がヒスチジンである第一のヒトＧＰＲ４０受容体への結合の、試験剤による競合的阻害を測定し；そして
ＧＰＲ４０リガンドの、アミノ酸２１１番がヒスチジン以外である第二のヒトＧＰＲ４０受容体への結合の、当該化合物による競合的阻害を測定する；
ことを含んでなる、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＧＰＲ４０遺伝子の一塩基多型に関しての遺伝子型同定方法、治療方法、診断試験、ならびに剤を特徴付けするためのキットおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
糖尿病は、１７００万を超えるアメリカ人および1億５１００万人を超える世界中の人々を冒している深刻なそして時に致命的な疾患である。Ｇａｄｓｂｙ（２００２）。糖尿病はインスリン産生またはインスリンに対する適切な応答についての身体の機能不全に起因する。グルコースはインスリン分泌を調節する主要な基質であるが、遊離の脂肪酸（ＦＦＡ）およびアミノ酸のような他の栄養素がインスリン分泌を修飾することができる。Ｈａｂｅｒら（２００２）。
【０００３】
糖尿病には二つの主要な型がある。Ｉ型糖尿病においては、インスリンを産生する膵臓のβ細胞が、体自身の免疫系によって破壊され、インスリン不全になる。ＩＩ型糖尿病は、インスリンの作用に対する体の細胞による感受性の喪失、および膵臓がインスリンを適切に放出することができなくなることに起因する。ＩＩ型糖尿病の発生率は増加しており、そして、米国においては、リスク集団において確かに特に流行している。Ｇａｄｓｂｙ（２００２）。
【０００４】
メタボリック症候群は、糖尿病および心臓血管疾患を生じるリスクを増加させる代謝の状態の集まりである。Ｐａｒｋら（２００３）。肥満、インスリン耐性、異脂肪血症、および高血圧症を含む状態が、メタボリック症候群の鍵となる構成要素であるとして報告されている。ＲｅｉｌｌｙおよびＲａｄｅｒ（２００３）；Ｐａｒｋら（２００３）；Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔｓ（２００１）。
【０００５】
肥満は、メタボリック症候群に寄与する中心的な因子として同定されてきている。過剰な体重を減らすことがメタボリック症候群に関連するリスクを最小化すると提案されてきている。Ｓｈｉｒａｉ（２００４）。
【０００６】
Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、細胞内および細胞外ループで交互に繋がれた７つのトランスメンブランα−へリックスセグメント（ＴＭ１からＴＭ７と表される）を有することにより特徴づけられる膜タンパク質のスーパーファミリーである。Ｇｅｔｈｅｒ（２０００）。ＧＰＣＲは、ホルモン、神経伝達物質および局所メディエーターのようなシグナル分子と、細胞内酵素、イオンチャンネルおよびトランスポーターとの間のシグナリングを仲介する。ＪｏｈｎｓｏｎおよびＤｈａｎａｓｅｋａｒａｎ（１９８９）を参照。
【０００７】
Ｓａｗｚｄａｒｇｏら（１９９７）は、染色体１９ｑ１３．１に座乗し（localized）、300アミノ酸タンパク質をコードし、そしてＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＦ０２４６８７によって識別されるＧＰＣＲ遺伝子、ＧＰＲ４０の同定を開示する。
【０００８】
Ｈａｇａら（２００２）は、コード配列のヌクレオチド６３２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０２４６８７の配列におけるヌクレオチド６４２に対応）がグアニン（Ｇ）またはアデノシン（Ａ）のいずれかとなり、その結果アミノ酸２１１がアルギニンまたはヒスチジンのいずれかである、ＧＰＲ４０遺伝子の一塩基多型を含む、ヒトゲノムの１９０，５６２遺伝子バリエーションを開示する。この位置塩基多型は、国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）（ＮＣＢＩ）のｄｂＳＮＰデータベースにおいて、アクセッション番号ｒｓ２３０１１５１として識別される。
【０００９】
国際特許出願公開公報第ＷＯ  ０２／０５７７８３号およびＢｒｉｓｃｏｅら（２００３）は、ＧＰＲ４０がヒト、マウスおよびラットの脳と同様に、膵臓β細胞においても特異的に発現していることを開示する。さらに、ＷＯ  ０２／０５７７８３およびＢｒｉｓｃｏｅらは、カルシウムイオン濃度を測定する実験から、ＧＰＲ４０の中鎖および長鎖の飽和および不飽和脂肪酸リガンドを同定した。
【００１０】
Ｋｏｔａｒｓｋｙら（２００３）は、ＧＰＲ４０に連結したレポーター系によって測定したところ、ＧＰＲ４０は、脂肪酸の範囲（range）によってのみならず、抗糖尿病チアゾリジンジオン薬によっても活性化されたことを開示する。
【００１１】
Ｉｔｏｈら（２００３）は、遊離の脂肪酸によるＧＰＲ４０の結合および活性化はインスリン分泌を増加させることを開示する。
国際特許出願公開公報第ＷＯ  ０４／０７２６５０は、ヒトＧＰＲ４０の核酸配列およびアミノ酸配列、そして、哺乳動物における血液学的疾患、末梢および中枢神経系の障害、胃腸管系疾患、呼吸器疾患、代謝疾患、癌、心血管疾患、ならびに泌尿器科疾患の治療のためのその調節を開示する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
本発明は、部分的に、ヒト被験者のＧＰＲ４０遺伝子によってアミノ酸２１１番においてコードされるアミノ酸を決定することを含んでなる、遺伝子型同定方法に関する。好ましい態様において、ＧＰＲ４０遺伝子の両方のアレルのアミノ酸２１１番においてコードされるアミノ酸が決定される。別の好ましい態様において、当該遺伝子型同定方法は、当該アミノ酸２１１番がヒスチジン以外であるか否かを決定することを伴う。さらに好ましい態様において、当該遺伝子型同定方法は、当該アミノ酸２１１番がアルギニンであるか否かを決定することを伴う。追加の好ましい態様において、当該遺伝子型同定方法は、当該アミノ酸２１１番がヒスチジンであるか否かを決定することを伴う。またさらに好ましい態様において、当該遺伝子型同定方法は、ヒト被験者から核酸を単離し、当該核酸の隣接する配列を増幅し、ここで当該隣接する配列はアミノ酸２１１番をコードするＧＰＲ４０のヌクレオチド、またはその相補配列を含んでなり、当該隣接する配列を当該被験者のＧＰＲ４０遺伝子のアミノ酸２１１番においてコードされるアミノ酸の決定を可能にするヌクレオチドプローブで処理し；そして当該プローブが高度にストリンジェントな条件下で当該隣接する配列にハイブリダイズするか否かを決定することを含んでなる。好ましい態様において、当該プローブは、検出可能な標識に連結され、そしてアミノ酸２１１をコードするヌクレオチドを含む、約１３ないし約３５ヌクレオチドの長さを有する配列番号９または配列番号１０のヌクレオチド配列の隣接する部分からなる、またはその相補的なヌクレオチド配列である。
【００１３】
本発明のさらなる側面は、ヒト被験者のＧＰＲ４０遺伝子によってアミノ酸２１１番においてコードされるアミノ酸を決定し、そして、コードされるアミノ酸２１１番がヒスチジン以外、好ましくはアルギニン、であるＧＰＲ４０遺伝子を少なくとも１つのアレル、そして好ましくは両方のアレル、に有することによって仲介される疾患または病理学的状態の治療または予防のための剤の療法的に有効量で当該被験者を治療する、ことを含んでなる、治療方法を提供する。好ましい態様において、当該剤は、インスリン、インスリン分泌刺激スルホニル尿素化合物、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤、ビグアナイド肝グルコース排出阻害剤（biguanide hepatic glucose output inhibitor）、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤、タンパク質チロシンホスファターゼ−１Ｂ阻害剤、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３ ベータ  阻害剤、ペルオキシソーム増殖因子−活性化受容体ガンマアゴニスト、グルカゴン受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン再取り込み阻害剤、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡレダクターゼ阻害剤、ガンマ−アミノブチル酸アゴニスト、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン−ＩＩ受容体アンタゴニスト、５型ホスホジエステラーゼ阻害剤、ソルビトールデヒドロゲナーゼ阻害剤、およびアルドースレダクターゼ阻害剤、その薬学的に受容可能なプロドラッグまたはその薬学的に受容可能な塩、から選択される。別の好ましい態様において、当該剤は、抗肥満剤、好ましくはアポリポタンパク質−Ｂ分泌／ミクロソームトリグリセリド転移タンパク質阻害剤、１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ−１阻害剤、ペプチドＹＹ３−３６、ペプチドＹＹ３−３６の類似体、カンナビノイドアンタゴニスト、ＭＣＲ−４アゴニスト、コレシストキニン−Ａアゴニスト、モノアミン再取り込み阻害剤、交感神経模倣剤、β３アドレナリン作動性受容体アゴニスト、ドーパミンアゴニスト、メラノサイト刺激ホルモン受容体類似体、５ＨＴ２ｃアゴニスト、メラニン濃縮ホルモンアンタゴニスト、レプチン、レプチン類似体、レプチン受容体アゴニスト、ガラニンアンタゴニスト、リパーゼ阻害剤、食欲低下剤、神経ペプチド−Ｙ受容体アンタゴニスト、甲状腺ホルモン模倣剤（thyromimetic agent）、デヒドロエピアンドロステロン、デヒドロエピアンドロステロンの類似体、グルココルチコイド受容体アゴニスト、グルココルチコイド受容体アンタゴニスト、オレキシン受容体アンタゴニスト、グルカゴン様ペプチド−１受容体アゴニスト、繊毛様神経栄養因子、ヒトアグーチ関連タンパク質、グレリン受容体アンタゴニスト、ヒスタミン３受容体アンタゴニスト、ヒスタミン３受容体インバースアゴニスト、およびニューロメディンＵ受容体アゴニストから選択される。
【００１４】
本発明の別の側面は、ヒト被験者のＧＰＲ４０遺伝子のアミノ酸２１１番においてコードされるアミノ酸を決定することを可能にするヌクレオチドプローブを含んでなるキットに関する。好ましい態様において、当該プローブは当該ＧＰＲ４０遺伝子のアミノ酸２１１番がヒスチジンであるか否かを決定することを可能にする。別の態様において、当該プローブは当該ＧＰＲ４０遺伝子のアミノ酸２１１番がヒスチジン以外、好ましくはアルギニン、であるか否かを決定することを可能にする。さらに好ましい態様において、当該プローブは、検出可能な標識に連結され、そしてアミノ酸２１１をコードするヌクレオチドを含む、約１３ないし約３５ヌクレオチドの長さを有する配列番号１０のヌクレオチド配列の隣接する部分からなる、またはその相補的なヌクレオチド配列である。追加の好ましい態様において、当該キットはさらに：当該ＧＰＲ４０遺伝子のアミノ酸２１１をコードするヌクレオチドの下流のヌクレオチド配列に相補的な第一のポリメラーゼ連鎖反応ヌクレオチドプライマーおよび当該アミノ酸２１１をコードするヌクレオチドの上流のヌクレオチド配列に相補的な第二のポリメラーゼ連鎖反応ヌクレオチドプライマー；または、アミノ酸２１１をコードするヌクレオチドの上流のヌクレオチド配列に相補的な第一のプライマーおよびアミノ酸２１１をコードするヌクレオチドの下流のヌクレオチド配列に相補的な第二のポリメラーゼ連鎖反応プライマー；のいずれかを含んでなる。別の好ましい態様において、当該キットはさらに容器を含んでなる。
【００１５】
本発明のさらなる側面は、ＧＰＲ４０リガンドの、アミノ酸２１１番がヒスチジンである第一のヒトＧＰＲ４０受容体への結合の、試験剤による競合的阻害を測定し、そしてＧＰＲ４０リガンドの、アミノ酸２１１番がヒスチジン以外である第二のヒトＧＰＲ４０受容体への結合の、当該化合物による競合的阻害を測定する、ことを含んでなる、剤を特徴づけする方法に関する。好ましい態様において、当該第二の受容体のアミノ酸２１１番はアルギニンである。さらに好ましい態様において、当該方法はさらに、当該化合物による当該第一の受容体および第二の受容体の結合の競合的阻害を比較することを含んでなる。
【００１６】
本発明の追加的な側面は、アミノ酸２１１番がヒスチジンである第一のヒトＧＰＲ４０受容体の試験剤による活性化を測定し、そしてアミノ酸２１１番がヒスチジン以外である第二のヒトＧＰＲ４０受容体の試験剤による活性化を測定する、ことを含んでなる、剤を特徴づけする方法に関する。好ましい態様において、当該第二の受容体のアミノ酸２１１番はアルギニンである。さらに好ましい態様において、当該方法はさらに、当該第一の受容体および当該第二の受容体の、当該化合物による活性化を含んでなる。
【００１７】
本発明の別の側面は、第一のヒトＧＰＲ４０受容体、ここで当該第一の受容体のアミノ酸２１１番はヒスチジンである、のＧＰＲ４０のアクチベーターによる活性化の、試験剤による阻害を測定し、そして、第二のヒトＧＰＲ４０受容体、ここで当該第二の受容体のアミノ酸２１１番はヒスチジン以外、好ましくはアルギニン、である、のＧＰＲ４０アクチベーターによる活性化の、試験剤による阻害を測定する、ことを含んでなる、剤を特徴づけする方法を提供する。さらに好ましい態様において、当該方法はさらに、当該第一の受容体および当該第二の受容体の当該化合物による活性化の阻害を比較することを含んでなる。
【００１８】
発明の詳細な説明
本明細書で使用する用語は、当該技術分野における通常の意味を有する。しかしながら、よりさらに本発明を明確にするため、および便宜のため、実施例および付随する請求項を含む、本明細書において用いる特定の用語および語句の意味は、以下に提供される。
【００１９】
用語「剤（単数または複数）」は、本明細書においてさらに記載される、コードされるアミノ酸２１１番がヒスチジン以外、好ましくはアルギニン、であるＧＰＲ４０遺伝子の少なくとも一つのアレル、好ましくは両方のアレル、を有することにより仲介される疾患または病理学的状態の治療または予防のための、ペプチドを含む基質および化合物を意味する。
【００２０】
ＧＰＲ４０遺伝子に関して、用語「アミノ酸２１１番」は、配列番号２および４においても示される、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０２４６８７におけるアミノ酸残基２１１番を意味する。
【００２１】
用語「高度にストリンジェントな条件」は、約０．２ｘＳＳＣおよび約０．１％ＳＤＳの存在下で６８℃、１時間の洗浄条件を意味する。これらの洗浄条件の有用な変化は、当業者に容易に明らかであろう。一般的に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、部分的に、洗浄工程が行われる温度への言及により表現される。一般的に、そのような洗浄温度は、定められたイオン強度およびｐＨにおける、特定の配列についての熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃ないし２０℃低いように選択される。Ｔｍは、（定められたイオン強度およびｐＨにおいて）標的配列の５０％が完全に一致するプローブにハイブリダイズする温度である。Ｔｍを計算する等式および核酸ハイブリダイゼーションのための条件は周知であり，Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）（第２巻、第９章を参照）において見いだすことができる。
【００２２】
用語「糖尿病」は、当業者によって理解される真性糖尿病（diabetes mellitus）を意味する。この用語は、インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）としても知られるＩ型真性糖尿病、およびインスリン非依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）としても知られるＩＩ型真性糖尿病を含む。世界保健機構（Ｗ．Ｈ．Ｏ．）は、真性糖尿病を診断するための基準を示唆した（Ｗ．Ｈ．Ｏ．  １９８０／８５  テクニカルリポートシリーズＮｏ．６４６／７２７）。糖尿病はまた、国立糖尿病データグループによって特徴づけされた（国立糖尿病データグループ（National Diabetes Data Group）：Classification and diagnosis of diabetes mellitus and other categories of glucose intolerance, Diabetes, 28: 1039-1044, 1979を参照）。しかしながら、より最近では、例えば米国糖尿病協会（the American Diabetes Association）によって、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病の診断を可能にするガイドラインが定められた（例えば、ＡＤＡ（２００４）を参照）。
【００２３】
「療法的に有効な量」という用語は、（ｉ）特定の疾患、状態または障害を治療または予防する；（ｉｉ）特定の疾患、状態または障害の１またはそれより多くの症状を減ずる、改善する、除去する；または（ｉｉｉ）特定の疾患、状態または障害の１またはそれより多くの症状を予防または遅らせる；剤の量を意味する。療法的に有効な量は、当業者によって、本明細書の開示内容に基づいて、個体ベースで決定することができる、そして少なくとも一部は、被験者の種、被験者のサイズ、用いる送達システムの型、および疾患の進行に関連した投与の型についての検討に基づいて決定することができるであろう。
【００２４】
「薬学的に受容可能な塩」という表現は、適切な場合、薬学的に受容可能な酸付加塩および薬学的に受容可能なカチオン性塩を含む。薬学的に受容可能なカチオン性塩は、非限定的に、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウムおよびカリウム）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウムおよびマグネシウム）、アルミニウム塩、アンモニウム塩、および、ベンザチン（Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン）、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）、ベネタミン（Ｎ−ベンジルフェネチルアミン）、ジエチルアミン、ピペラジン、トロメタミン（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール）、およびプロカインのような有機アミンとの塩を含む。「薬学的に受容可能な酸付加塩」という表現は、非限定的に、塩酸塩、臭化水素塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、酢酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩（メシレート）、およびｐ−トルエンスルホン酸塩（トシレート）のような塩を含むことを意図する。「そのプロドラッグまたはその薬学的に受容可能な塩」という語句または実質的に類似の語句を含む、本明細書に現れる化合物の記載は、適用可能な化合物の薬学的に受容可能な塩ならびにそのようなプロドラッグの薬学的に受容可能な塩の両方を含む意味である。
【００２５】
語句「プロドラッグ」は、ｉｎ  ｖｉｖｏで本発明の化合物を生じるように変換される化合物を意味する。変換は、血中における加水分解を通じてのような、種々の機構により生じてよい。プロドラッグの使用についての考察は、ＨｉｇｕｃｈｉおよびＳｔｅｌｌａ（１９８７）によって提供されている。例えば、本発明の化合物がカルボン酸官能基を含有する場合、プロドラッグは、酸の基の水素原子と、例えば（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ２−Ｃ１２）アルカノイルオキシメチル、４ないし９の炭素原子を有する１−（アルカノイルオキシ）エチル、５ないし１０の炭素原子を有する１−メチル−１−（アルカノイルオキシ）エチル、３ないし６の炭素原子を有するアルコキシカルボニルオキシメチル、４ないし７の炭素原子を有する１−（アルコキシカルボニルオキシ）エチル、５ないし８の炭素原子を有する１−メチル−１−（アルコキシカルボニルオキシ）エチル、３ないし９の炭素原子を有するＮ−（アルコキシカルボニル）アミノメチル、４ないし１０の炭素原子を有する１−（Ｎ−（アルコキシカルボニル）アミノ）エチル、３−フタリジル、４−クロトノラクトニル（4-crotonolactonyl）、ガンマ−ブチロラクトン−４−イル、ジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ１−Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ２−Ｃ３）アルキル（例えば、ｂ−ジメチルアミノエチル）、カルバモイル−（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−Ｃ２）アルキルカルバモイル−（Ｃ１−Ｃ２）アルキル、および、ピペリジノ−、ピロリジノ−またはモルノリノ（Ｃ２−Ｃ３）アルキルのような基との置換により形成されるエステルを含んでなることができる。同様に、本発明の化合物がアルコール官能基を含んでなる場合、プロドラッグはアルコール基の水素原子と、（Ｃ１−Ｃ６）アルカノイルオキシメチル、１−（（Ｃ１−Ｃ６）アルカノイルオキシ）エチル、１−メチル１−（（Ｃ１−Ｃ６）アルカノイルオキシ）エチル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシカルボニルオキシメチル、Ｎ−（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシカルボニルアミノメチル、スクシノイル、（Ｃ１−Ｃ６）アルカノイル、ａ−アミノ（Ｃ１−Ｃ４）アルカノイル、アリールアシルおよびａ−アミノアシル、またはａ−アミノアシル−ａ−アミノアシル、ここでそれぞれのａ−アミノアシル基は、天然に生ずるＬ−アミノ酸、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２、またはグリコシル（炭水化物のヘミアセタール型のヒドロキシル基の除去の結果生ずるラジカル）から独立して選択される、のような基との置換によって形成されることができる。本発明の化合物がアミン官能基を含んでなる場合、プロドラッグはアミン基の水素原子と、ＲＸ−カルボニル、ＲＸＯ−カルボニル、ＮＲＸＲＸ’−カルボニル、ここでＲＸおよびＲＸ’はそれぞれ独立して（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル、ベンジルである、またはＲＸ−カルボニルは天然のａ−アミノアシルまたは天然のａ−アミノアシル−天然のａ−アミノアシルである、−Ｃ（ＯＨ）Ｃ（Ｏ）ＯＹＸ（ここでＹＸはＨ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルまたはベンジルである）、−Ｃ（ＯＹＸ０）ＹＸ１（ここでＹＸ０は（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり、そしてＹＸ１は（Ｃ１−Ｃ６）アルキルで��る）、カルボキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、アミノ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、またはモノ−Ｎ−もしくはジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノアルキル、−Ｃ（ＹＸ２）ＹＸ３（ここでＹＸ２はＨまたはメチル、そしてＹＸ３はモノ−Ｎ−もしくはジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルアミノである）、モルホリノ、ピペリジン−１−イルまたはピロリジン１−イル、のような基との置換によって形成されることができる。
【００２６】
「ヌクレオチド配列」および「ポリヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖の形に関わらず、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。用語「相補的ヌクレオチド配列」は、グアニジンヌクレオチド（Ｇ）とシチジンヌクレオチド（Ｃ）、および、アデノシンヌクレオチド（Ａ）とチミジンヌクレオチド（Ｔ）、但しＲＮＡにおいてはＴはウリジンヌクレオチド（Ｕ）に置き換えられ、よってＵがＡと結合する、の対形成によって別のヌクレオチド配列にアニールする（結合する）ヌクレオチド配列を意味する。
【００２７】
本明細書において用いられる略語は当該技術分野おけるそれらの通常の意味を有する。しかしながら、本発明をさらにいっそう明確にするために、便宜的に、特定の略語が以下の通り提供される：「℃」は摂氏の度を意味する；「ＣＯ２」は二酸化炭素を意味する；「ＤＭＥＭ」はダルベッコ改変イーグル培地を意味する；「ＤＮＡ」はデオキシリボ核酸を意味する；「ＦＢＳ」はウシ胎仔血清を意味する；「ｇ」はグラムを意味する；「ＨＥＰＥＳ」は４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸を意味する；「ｋｇ」はキログラムを意味する；「ｍｇ」はミリグラムを意味する；「ｍＬ」はミリリットルを意味する；「ｍＭ」はミリモル濃度（millimolar）を意味する；「μｌ」はマイクロリットルを意味する；「μＭ」はマイクロモル濃度（micromolar）を意味する；「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を意味する；「Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ」はペニシリンおよびストレプトマイシンを含有する混合物を意味する；「ＲＮＡ」はリボ核酸を意味する；「ＲＰＭ」は１分あたりの回転数を意味する；そして、「ｘｇ」は重力の〜倍を意味する。
【００２８】
本開示において以下のアミノ酸の略語が用いられる：
【００２９】
【表１】
2008504836.tif 000002
【００３０】
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０２４６８７で特定されるＧＰＣＲ遺伝子、ＧＰＲ４０は、３００アミノ酸のタンパク質をコードする。Ｓａｗｚｄａｒｇｏら（１９９７）。膵島細胞において高度に発現されるＧＰＲ４０はインスリン分泌の調節と関係付けられてきており、そしてしたがって、糖尿病の治療のための標的として提案されてきている。Ｂｒｉｓｃｏｅら（２００３）；Ｉｔｏｈら（２００３）。Ｋｏｔａｒｓｋｙら（２００３）は、ＧＰＲ４０はチアゾリジンジオン型糖尿病薬への応答を仲介すると提案している。
【００３１】
他のＧＰＣＲとともに、ＧＰＲ４０は細胞外シグナルを細胞内へと伝達することに関与している。ＧＰＲ４０の活性化は、Ｇｑタンパク質を伴う経路を介して、細胞内カルシウムの放出を誘発する。Ｂｒｉｓｃｏｅら（２００３）。結果として生じるカルシウム流動（calcuim flux）の流れは、本開示に基づいて当業者に公知の方法により、ＧＲＰ４０の活性化を検出するのに有用である（例えば：Ｋｏｔａｒｓｋｙら（２００３）；Ｂｒｉｓｃｏｅら（２００３）を参照）。
【００３２】
チアゾリジンジオンおよび特定の脂肪酸はＧＰＲ４０を活性化することが知られている。Ｋｏｔａｒｓｋｙら（２００３）およびＢｒｉｓｃｏｅら（２００３）。本明細書の図１に示すように、チアゾジリンジオン化合物は、ＧＰＲ４０を発現しない細胞と比較して、ＧＰＲ４０を発現する細胞において、細胞内カルシウムイオン放出を刺激する。
【００３３】
本発明は、一部は、一塩基多型が、例えばチアゾジリンジオン型の薬物による、ＧＰＲ４０の活性化に影響を及ぼすという発見に基づく。ＧＰＲ４０コード配列のヌクレオチド６３２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０２４６８７の配列におけるヌクレオチド６４２に対応する）において生ずる多型は、Ａの、Ａ以外のヌクレオチド、好ましくはＧへの置換を伴い、その結果、残基２１１のヒスチジンからヒスチジン以外のアミノ酸、好ましくはアルギニンへのアミノ酸置換を生ずる。アミノ酸２１１がアルギニンであるＧＰＲ４０のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および２として表す。アミノ酸２１１がヒスチジンであるＧＰＲ４０のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３および４として表す。
【００３４】
図２に示すように、ＧＰＲ４０のヌクレオチド６３２がＧである細胞は、例えばチアゾリジンジオン活性化に対して、６３２位においてＡヌクレオチドを有する細胞と比較してより高い応答を有する。図２は、６３２位においてＡヌクレオチドに対してＧを有する細胞における細胞内カルシウムイオンを測定する、細胞に基づくアッセイの結果を示す。
【００３５】
さらに、本発明は、一部は、ヌクレオチド６４２においてＧを有する個体、特に両方の荒れるにおいてＧを有する個体、は、当該ヌクレオチドがＡである個体と比較して糖尿病についてのより高いリスクを有するという発見に基づく。図３に示すように、ヌクレオチド６４２においてヘテロ接合性またはホモ接合性のＡである与えられた肥満度指数の被験者は、ホモ接合性のＧである被験者よりもＩＩ型糖尿病を有する確率が有意に低かった。
【００３６】
本発明は、コードされるアミノ酸２１１番がヒスチジン以外、好ましくはアルギニンであるＧＰＲ４０の少なくとも１つのアレル、好ましくは両方のアレル、を有することに関連する疾患または病理学的状態の、性質決定方法、および治療または予防方法を包含する。本発明の方法のための被験者の遺伝子型決定は、本開示に基づいて当業者に公知の方法により実施してもよい。典型的な方法が、例えば、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（２００４）の第２章に記載される。
【００３７】
遺伝子型決定は、本開示に基づいて当業者に公知のように、被験者の適切な組織を用いて実施してもよい。好ましい態様において、遺伝子型決定のためのＤＮＡは、本開示に基づいて当業者に周知の手順により、全血サンプルから単離される。それらの手順は、種々の商業的に利用可能なキット、例えば、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）ＤＮＡ単離キット（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、ミネソタ州ミネアポリス）、血液用ＤＮＡ単離キット（カタログＮｏ．２−０３２−８０５、ロシュ・ダイアグノスティクス・コーポレーション）、ＧｅｎｏｍｉｃＰｒｅｐ（登録商標）血液ＤＮＡ単離キット（カタログＮｏ．２７−５２３６−０１、アマシャム・バイオサイエンス・コーポレーション、ニュージャージー州ピスカタウェイ）、ＰＡＸｇｅｎｅ血液ＤＮＡキット（カタログＮｏ．７６１１３３、キアゲン・インコーポレイテッド、カリフォルニア州バレンシア）、ＧＮＯＭＥ（登録商標）全血ＤＮＡ単離キット（カタログＮｏ．２０１１−６００、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，カリフォルニア州カールスバッド）、およびＷｉｚａｒｄ（登録商標）ゲノムＤＮＡ精製キット（カタログＮｏ．Ａ１１２０、プロメガ  Ｕ．Ｓ．，ウイスコンシン州マディソン、を用いて行ってもよい。
【００３８】
一塩基多型を含有する核酸領域を、例えば、センスおよびアンチセンスプライマーならびに検出プローブを用いるＰＣＲ技術により、増幅してもよい。しかしながら、他の核酸増幅法もまた使用してもよく、これにはリガーゼ連鎖反応（例えば、Ａｂｒａｖａｙａ，Ｋ．ら（１９９５）を参照）、分岐ＤＮＡシグナル増幅（例えば，Ｊｒｄｅａ，Ｍ．Ｓ．ら、（１９９３）を参照）、等温の核酸配列に基づく増幅（isothermal nucleic acid sequence based amplification）（ＮＡＳＢＡ）（例えば、Ｋｉｅｖｉｔｓ，Ｔ．ら（１９９１）を参照）、および他の自律的配列複製アッセイ、が含まれる。
【００３９】
ＰＣＲプライマーおよびプローブを調製する方法は、当該技術分野において周知であり、そして、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９４）、およびＩｎｎｉｓら（１９９０）によって記載される。ＰＣＲプライマー対は公知の配列から、例えばその目的を意図したコンピュータープログラム、例えばＰｒｉｍｅｒ（バージョン０．５、１９９１、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）、を用いることによって導き出すことができる。
【００４０】
プライマーとして使用するオリゴヌクレオチドは、その目的のための当該技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択してもよい。例えば、ＯＬＩＧＯ（登録商標）バージョン６ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．、コロラド州カスケード、ｗｗｗ．ｏｌｉｇｏ．ｎｅｔ）は、それぞれ１００ヌクレオチドまでのＰＣＲプライマー対の選択に有用である。類似のプライマー選択プログラムは、拡張された性能のための付加的な特色が組み込まれている。例えば、ＰｒｉｍＯＵプライマー選択プログラム（テキサス大学ゲノムセンター、サウスウエスト医療センター、テキサス州ダラス、ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｇｅｎｏｍｅ．ｏｕ．ｅｄｕ／ｐｕｂ／ｐｒｏｇｒａｍｓ／ｐｒｉｍｏｕ  ｓｒｃ．ｔａｒより一般に入手可能）は、メガベース配列から特異的なプライマーを選ぶことができ、そしてしたがって、ゲノムワイドな範囲でプライマーをデザインするのに有用である。Ｐｒｉｍｅｒ３、バージョン０．９、プライマー選択プログラム（ｔｈｅ  Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，マサチューセッツ州ケンブリッジ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｇｅｎｏｍｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｏｔｈｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ３．ｈｔｍｌより一般に入手可能）は、ユーザーに、ユーザーが特定したプライマー結合サイトとして避ける配列である「ミスプライミング・ライブラリー」を入力することを可能にする。Ｐｒｉｍｅｒ３は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である。（後者の２つのプライマー選択プログラムのソースコードはまた、それらそれぞれのソースから得てもよく、またユーザーの特定の需要にあうように修飾してもよい）。ＰｒｉｍｅＧｅｎプログラム（ＵＫヒトゲノムマッピングプロジェクトリソースセンター、英国ケンブリッジ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／Ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ／Ｏｐｔｉｏｎ／ｐｒｉｍｅｇｅｎ．ｈｔｍｌから一般に入手可能）は、多重配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、整列した核酸配列の最も保存された領域または最も保存されていない領域にハイブリダイズするプライマーの選択を可能にする。それゆえ、このプログラムはユニークおよび保存されたオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド断片の両方を同定するのに有用である。他のオリゴヌクレオチド選択法は、本開示に基づいて当業者に明らかであろう。
【００４１】
好ましくは、プローブとして用いる配列の長さは、二つのＳＮＰｓを区別するためにプローブ配列に連結したマイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）を用いて最小化されている。ＭＧＢは当業者に公知であり、例えば、米国特許第５，８０１，１５５号；第６，０８４，１０２号；第６，４２６，４０８号；第６，３１２，８９４号；および第６，６８３，１７３号に開示されている。
【００４２】
好ましい態様において、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）バージョン１．５ソフトウェア（アプライドバイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティ）が、本発明の実施のためのＰＣＲプライマーおよびプローブを設計するのに用いられる。典型的なプライマーは、フォワードプライマーとしてＣＴＴＧＧＣＣＡＴＣＡＣＡＧＣＣＴＴＣＴ（配列番号５）およびリバースプライマーとしてＣＣＡＣＧＴＴＧＧＡＧＧＣＧＴＴＧＴ（配列番号６）を含む。プローブは、ＦＡＭＴＭおよびＶＩＣ（登録商標）色素で標識されたＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブ（アプライドバイオシステムズ）であって、６ＦＡＭ−ＣＡＣＴＧＧＣＣＣＡＣＴＣＴおよびＶＩＣ−ＣＡＣＴＧＧＣＣＣＧＣＴＣ（それぞれ、配列番号７および８）、の配列を有するものであってもよい。被験者の単離されたＤＮＡは、プライマーおよびプローブを含むＰＣＲ試薬で処理し、そしてＰＣＲ反応を進展させるために繰り返しの温度サイクルに曝露する。例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ＨＴ配列検出システム（ＡＭＥバイオサイエンス、ノルウェー、トロード（Toroed））のような蛍光に基づく配列検出システムを用いて、ＳＮＰの検出を行ってもよい。
【００４３】
本発明はまた、ＧＰＲ４０コーディング配列のヌクレオチド６３２においてＡ以外のヌクレオチド、好ましくはＧ、を被験者が有するか否かを決定する診断試験キットを包含する。例えば、当該キットはＧＰＲ４０コーディング配列のヌクレオチド６３２において被験者がＡまたはＧのいずれを有するかを検出することが可能な標識されたまたは標識可能な核酸プローブのような試薬を含んでなることができる。そのようなプローブは、好ましくは長さ３５ヌクレオチドよりも少なく、より好ましくは２５ヌクレオチドよりも少なく、そして、さらにより好ましくは１３および２５ヌクレオチドの間である。当該キットはさらに、ヌクレオチド６３２を含有する核酸領域を増幅するためのＰＣＲプライマーのような試薬を含んでなってよい。当該試薬は、適切な容器にパッケージされていることができる。当該キットはＧＰＲ４０コーディング配列のヌクレオチド６３２において被験者がＡまたはＧのいずれかを有するのかを検出するためのキットを使用するための使用説明書を含んでなることができる。
【００４４】
本発明は、アミノ酸２１１がヒスチジン以外、好ましくはアルギニン、である第一のヒトＧＰＲ４０受容体の試験剤による活性化と、アミノ酸２１１がヒスチジンである第二のヒトＧＰＲ４０受容体の試験剤による活性化を比較することにより、ＧＰＲ４０を活性化する試験剤を同定する方法を提供する。ＧＰＲ４０の活性化を測定するいずれの適切な方法も、本発明の実施に使用してもよい。そのような方法は公知、または本開示に基づいて当業者に明らかとなるであろう。例えば、好ましい態様において、そのような方法は、Ｇｑタンパク質を介したＧタンパク質共役受容体の活性化に続くカルシウム流動を測定する、蛍光定量的イメージングプレートリーダーシステム（すなわち、ＦＬＩＰＲ（登録商標））におけるカルシウム感受性色素の使用を伴う（例えば、Ｃｈａｍｂｅｒｓら（２００３）を参照）。当該技術分野において公知の他の方法には、カルシウム結合性タンパク質（Ｍｉｙａｗａｋｉら（１９９７）、Ｋａｉｎ（１９９９））およびカルシウム感受性ルシフェラーゼ（ＢｕｔｔｏｎおよびＢｒｏｗｎｓｔｅｉｎ（１９９７）、Ｓｔａｂｌｅｓら（１９９７））の使用を含む。
【００４５】
本発明はさらに、アミノ酸２１１がヒスチジンである第一のヒトＧＰＲ４０受容体の試験剤による活性化の阻害と、アミノ酸２１１がヒスチジン以外、好ましくはアルギニン、である第二のヒトＧＰＲ４０受容体の試験剤による活性化の阻害、とを比較することにより、ＧＰＲ４０を活性化を阻害するする試験剤を同定する方法を提供する。そのような方法は、試験剤と組み合わせて、ＧＰＲ４０の公知の活性化剤を使用して上記の活性化アッセイを利用してもよい。生じた検出可能なシグナルは、公知の活性化剤がそれ自体で使用された場合に期待されるシグナルと比較する。当該技術分野において種々のＧＰＲ４０の活性化剤が公知であり、そしてそのような方法に使用してよく、それらにはＫｏｔａｒｓｋｙら（２００３）、Ｂｒｉｓｃｏｅら（２００３）および国際特許出願公報第ＷＯ  ０２／０５７７８３号に記載されるものが含まれる。
【００４６】
本発明はまた、アミノ酸２１１がヒスチジンである第一のヒトＧＰＲ４０受容体への既知のＧＰＲ４０リガンドの結合についての試験剤による競合阻害と、アミノ酸２１１がヒスチジン以外、好ましくはアルギニン、である第二のヒトＧＰＲ４０受容体への既知のリガンドの結合についての化合物による競合阻害、とを比較することにより、ＧＰＲ４０に結合する試験剤を同定する方法を提供する。リガンドは、当該技術分野で周知の検出可能な標識で標識されていてよく、それには例えば、放射性同位体、蛍光色素および酵素が含まれる。種々のＧＰＲ４０のリガンドは当該技術分野において公知であり、Ｋｏｔａｒｓｋｙら（２００３）、Ｂｒｉｓｃｏｅら（２００３）および国際特許出願公報第ＷＯ  ０２／０５７７８３号に記載されるものが含まれ、そしてそのような方法に用いてよい。
【００４７】
当業者は、本開示に基づいて、本発明の試験剤を同定する方法における、活性化、阻害、または結合の活性化もしくは阻害の比較は、いくらかの手法のいずれかにより実施してもよいことを当業者は理解するであろう。例えば、ＧＰＲ４０の活性化および活性化の阻害の測定は、カルシウム流動を測定する蛍光定量的または比色定量的な方法（例えばＦＬＩＰＲ）を用いて実施してよい。それゆえ、ＧＰＲ４０の活性化はそのような方法によって、例えば、数値を生ずる光検出装置を用いることにより、正確に定量される。そのような測定の結果として生ずる値は、自動または手動の手段によって比較してよい。例えば、実際的な方法は、特に多数の値が生じる場合、当業者に周知の方法によりコンピューター化したシステムを用いて値を比較することを伴うであろう。
【００４８】
さらに、本発明はコードされる２１１番のアミノ酸がヒスチジン以外、好ましくはアルギニン、であるＧＰＲ４０の少なくとも１つのアレル、好ましくは両方のアレル、を有することに関連する疾患または病理学的状態の治療または予防方法を包含する。そのような疾患または状態を同定する方法は、当業者に周知である、または本開示に基づき明らかになるであろう。例えば、図３はＩＩ型糖尿病の被験者の遺伝子型を、糖尿病を有さない被験者の遺伝子型と比較した研究の結果である。図３および実施例５に記載したのと同様の方法を、コードされる２１１番のアミノ酸がヒスチジン以外、好ましくはアルギニン、であるＧＰＲ４０の少なくとも１つのアレル、好ましくは両方のアレル、を有することに関連する他の疾患または状態を同定するために利用してもよいことは、当業者に明らかであろう。
【００４９】
本発明の一態様において、コードされる２１１番のアミノ酸がヒスチジン以外、好ましくはアルギニン、であるＧＰＲ４０の少なくとも１つのアレル、好ましくは両方のアレル、を有することに関連する疾患または病理学的状態は、糖尿病、好ましくはＩＩ型糖尿病である。別の態様において、当該疾患または状態は、糖尿病に関連する合併症である。そのような合併症は、動脈硬化症、糖尿病性心筋症、白内障、足潰瘍、糖尿病性大血管障害、糖尿病性微小血管障害、糖尿病性腎障害、糖尿病性網膜症、および糖尿病性神経障害、を含む。さらなる態様において、そのような疾患または状態は、肥満、高血圧、インスリン耐性、ＩＩ型糖尿病、および異脂肪血症を含むメタボリックシンドロームに関連するリスク因子のいずれかである。
【００５０】
本発明の方法は、コードされる２１１番のアミノ酸がヒスチジン以外、好ましくはアルギニン、であるＧＰＲ４０遺伝子の少なくとも１つのアレル、好ましくは両方のアレル、を有することに仲介される疾患または病理学的状態の治療または予防のための剤の投与に関連する治療方法を提供する（以前に「剤」として定義した）。剤は、本開示により当業者に明らかであろうし、または当該技術分野に公知の方法により容易に同定されてもよい。例えば、剤は、インスリン、インスリン分泌刺激スルホニル尿素化合物、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤（ＧＰＩ）、ビグアナイド肝性グルコース排出阻害剤、チアゾリジンジオン抗糖尿病化合物、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤、タンパク質チロシンフォスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）阻害剤、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）阻害剤、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３  ベータ（ＧＳＫ−３β）阻害剤、ペルオキソーム増殖因子（peroxisome proliferator）活性化受容体ガンマ（ＰＰＡＲγ）アゴニスト、グルカゴン受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ’ｓ）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡレダクターゼ 阻害剤（スタチン類）、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）アゴニスト、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンジオテンシン−ＩＩ（Ａ−ＩＩ）受容体アンタゴニスト、５型ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ−５）阻害剤、ソルビトールデヒドロゲナーゼ阻害剤（ＳＤＩ）およびアルドースレダクターゼ阻害剤（ＡＲＩ）、を含んでもよい。
【００５１】
剤は、いずれかのタンパク質チロシンフォスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）阻害剤を含んでよい。タンパク質チロシンフォスファターゼ−１Ｂ阻害剤という語は、酵素タンパク質チロシンフォスファターゼ−１Ｂを阻害するいずれかの化合物を指す。ＰＴＰ−１Ｂは、血中糖レベルを減少させるインスリンの能力を阻害すると信じられている。
【００５２】
典型的なＰＴＰ−１Ｂ阻害剤、そのような阻害剤を同定するためのアッセイ、ならびに、好ましい投与量および投与方法は、下記の米国特許、国際特許出願公報、および他の刊行物に開示されている：ＵＳ  ６，２５１９３６、ＵＳ  ６，２２１，９０２、ＵＳ  ６，０５７，３１６、ＵＳ  ６，００１，８６７、ＵＳ  ５，７５３，６８７、ＷＯ  ０１／４６２０３、ＷＯ  ０１／４６２０４、ＷＯ  ０１／４６２０６、ＷＯ  ０１／１７５１６、ＷＯ  ００／５３５８３、ＷＯ  ９９／５８５１８、ＷＯ  ９９／６１４３５、ＷＯ  ９９／５８５２１、ＷＯ  ９９／５８５２２、ＷＯ  ９９／５８５１４、ＷＯ  ９９／５８５２０、ＷＯ  ９９／５８５１９、ＷＯ  ９９／５８５１１、ＷＯ  ９９／６１４１０、ＷＯ  ９９／１５５２９、Ｍａｌａｍａｓら（２０００Ａ）、Ｂｌｅａｓｄａｌｅら（２００１）、Ｗｒｏｂｅｌら（１９９９）、Ｍａｌａｍａｓら（２０００Ｂ）、Ｗａｎｇら（１９９８）、Ａｎｄｅｒｓｅｎら（２０００）、Ｉｖｅｒｓｅｎら（２０００）、Ｗｒｏｂｅｌら（２０００）およびＫｅｅｓ（１９９６）。
【００５３】
剤は、いずれかのグルカゴン受容体アンタゴニストであってよい。グルカゴン受容体アンタゴニストという語は、グルカゴン受容体をアンタゴナイズし、したがってグルカゴン受容体へのグルカゴンの結合により誘導されるグルコースの放出を阻害する、いずれかの化合物を意味する。そのようなアンタゴニズムは当業者に公知のアッセイにしたがって当業者により容易に決定される。
【００５４】
典型的なグルカゴン受容体アンタゴニスト、そのようなアンタゴニストを同定する方法、ならびに好ましい投与量および投与方法は、下記の米国特許、国際特許出願公報および他の刊行物に開示されている：ＵＳ  ６，２１８，４３１、ＵＳ  ５，１３８，０９０、ＷＯ  ９８／０４５２８、ＷＯ  ９９／０１４２３、ＷＯ  ００／３９０８８、ＷＯ  ００／６９８１０、ＷＯ  ９８／２１９５７、ＷＯ  ９８／２２１０９、ＷＯ  ９８／２２１０８、ＷＯ  ９７／１６４４２、Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら（１９９９）、Ｍａｄｓｅｎら（１９９８）、ｄｅ  Ｌａｓｚｌｏら（１９９９）、Ｃｈａｎｇら（２００１）、Ｃａｓｃｉｅｒｉら（１９９９）、Ｌｉｎｇら（２００１）およびＧｕｉｌｌｏｎら（１９９８）。
【００５５】
剤は、いずれかのグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３  ベータ（ＧＳＫ−３β）アンタゴニストを含んでいてよい。典型的なＧＳＫ−３βアンタゴニスト、そのようなアンタゴニストを同定する方法、ならびに好ましい投与量および投与方法は、下記の米国特許、国際特許出願公報および他の刊行物に開示されている：  ＵＳ  ６，０５７，２８６、ＷＯ  ０１／５６５６７、ＷＯ  ０１／０９１０６、ＷＯ  ０１／４９７０９、ＷＯ  ０１／４４２４６、ＷＯ  ０１／４４２０６、ＷＯ  ０１／４２２２４、ＷＯ  ００／２１９２７、ＷＯ  ００／３８６７５、ＷＯ  ９９／６５８９７、ＷＯ  ９８／１６５２８、Ｃｏｇｈｌａｎら（２００）、Ｓｍｉｔｈら（２００１）、Ｃｒｏｓｓら（２００１）、およびＬｏｃｈｈｅａｄら（２００１）。
【００５６】
本発明のための剤は、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤を含んでいてよい。いずれのアルファ−グルコシダーゼ阻害剤も本発明において剤として用いてよい。典型的なアルファ−グルコシダーゼ阻害剤は、アカルボース（Ｐｒｅｃｏｓｅ（登録商標）としても知られる）およびミグリトール（Ｇｌｙｓｅｔ（登録商標）としても知られる）、ならびにそれらアルファ−グルコシダーゼ阻害剤の類似体、誘導体、プロドラッグ、および薬剤額的に許容可能な塩、を含む。
【００５７】
剤は、インスリン分泌刺激スルホニル尿素化合物を含んでいてよい。いずれかのインスリン分泌刺激スルホニル尿素化合物を、本発明の剤として使用してよい。典型的なインスリン分泌刺激スルホニル尿素化合物は、Ｇｌｕｃｏｔｒｏｌ（登録商標）およびＧｌｕｃｏｔｒｏｌ  ＸＬ（登録商標）としても知られるグリピジド、グリメピリド（Ａｍａｒｙｌ（登録商標）としても知られる）、グリブリドおよびクロルプロパミド（Ｄｉａｂｉｎｅｓｅ（登録商標）としても知られる）；ならびに、その類似体、誘導体、プロドラッグおよび薬学的に受容可能な塩、を含む。好ましいインスリン分泌刺激スルホニル尿素化合物はグリピジドである。
【００５８】
剤は、ビグアナイド肝グルコース排出阻害剤を含んでいてもよい。いずれかのビグアナイド肝グルコース排出阻害剤を、本発明の実施における剤として使用してよい。典型的なビグアナイドは、Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ（登録商標）としても知られる、メトホルミンである。
【００５９】
剤は、チアゾリジンジオンおよび非チアゾチジンジオン化合物を含む、ＰＰＡＲγアゴニストを含んでもよい。ＰＰＡＲγアゴニストは、脂肪組織、骨格筋、および肝臓のようなインスリン作用のために重要な組織においてインスリン感受性を増加させる。
【００６０】
いずれかのＰＰＡＲγアンタゴニストを、本発明の実施における剤として使用してもよい。典型的なＰＰＡＲγアゴニストは、以下の米国特許：ＵＳ  ４，３４０，６０５；ＵＳ  ４，３４２，７７１；ＵＳ  ４，３６７，２３４；ＵＳ  ４，６１７，３１２；ＵＳ  ４，６８７，７７７、ＵＳ  ４，７０３，０５２に記載されるもの；ならびに、その類似体、誘導体、プロドラッグ、および薬学的に受容可能な塩、を含む。好ましいＰＰＡＲγアゴニストは、ダルグリタゾン、シグリタゾン、エングリタゾン、Ａｃｔｏｓ（登録商標）としても知られるピオグリタゾン、ならびに、Ａｖａｎｄｉａ（登録商標）およびＢＲＬ−４９６５３としても知られるロシグリタゾン、を含む。ＰＰＡＲγアンタゴニストは、平均的な被験者に対し、チアゾチジンジオン抗糖尿病化合物および投与経路により、約０．１ｍｇ／日から約１００ｍｇ／日、好ましくは約０．１ｍｇ／日から約５０ｍｇ／日、の範囲で、単一用量または分割用量で、好ましくは投与される。しかしながら、治療される被験者の状態に応じて、投与量のいくらかの変化が必然的に生ずるであろう。いずれにしても、投与に対して責任を有する個人は、被験者個体に対する適切な投与量を決定するであろう。
【００６１】
剤は、いずれかのジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ  ＩＶ）阻害剤を含んでいてよい。ＤＰＰ  ＩＶ阻害剤という語は、酵素ジペプチジルペプチダーゼを阻害するいずれかの化合物を意味する。そのような阻害は、国際特許出願公報第ＷＯ  ９８／１９９９８号に開示されるようなアッセイにしたがって、当業者によって容易に決定される。
【００６２】
典型的なＤＰＰ  ＩＶ阻害剤は、米国特許第ＵＳ  ６，１２４，３０５号、ＵＳ  ６，１１０，９４９号およびＵＳ  ６，１２４，３０５号において、国際特許出願公報第ＷＯ  ０１／３４５９４号、ＷＯ  ９９／６１４３１号、ＷＯ  ９８／１９９９８号、ＷＯ  ９７／４０８３２号およびＷＯ  ９５／１５３０９号において、ならびにＡｕｇｕｓｔｙｎｓら（１９９７）において開示されるもの；そしてその類似体、誘導体、プロドラッグ、薬学的に受容可能な塩、を含む。
【００６３】
好ましい投与量および投与方法は、ＷＯ  ０１／３４５９４およびＷＯ  ９８／１９９９８に提供されるものに従う。治療される被験者の状態に応じて投与量におけるいくらかの変化が必然的に生ずるであろう。いずれにしても、投与に対して責任を有する個人は、被験者個体に対する適切な投与量を決定するであろう。
【００６４】
剤は、いずれかの選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）を含んでなってもよい。選択的セロトニン再取り込み阻害剤という用語は、求心性ニューロンによるセロトニンの再取り込みを阻害する化合物を意味する。そのような阻害は、ＵＳ  ４，５３６，５１８および次の段落で引用する他の米国特許に開示されているもののような標準的なアッセイにしたがって、当業者によって容易に決定される。
【００６５】
本発明にしたがって使用してもよい好ましいＳＳＲＩは、米国特許第３，９１２，７４３号に記載されるように調製してよいフェモキセチン；米国特許第４，３１４，０８１号に記載されるように調製してよいフルオキセチン；米国特許第４，０８５，２２５号に記載されるように調製してよいフルボキサミン；米国特許第４，０６４，２５５号に記載されるように調製してよいインダルピン；米国特許第４，１０９，０８８号に記載されるように調製してよいインデロキサジン；米国特許第４，４７８，８３６号に記載されるように調製してよいミルナシプラン；米国特許第３，９１２，７４３号または米国特許第４，００７，１９６号に記載されるように調製してよいパロキセチン；米国特許第４，５３６，５１８号に記載されるように調製してよいセルトラリン；米国特許第４，９２９，６２９号に記載されるように調製してよいシブトラミン；および、米国特許第３，９２８，３６９号に記載されるように調製してよいジメルジン、を含む。フルオキセチンはＰｒｏｚａｃ（登録商標）としても知られる。Ｚｏｌｏｆｔ（登録商標）としても知られる、塩酸セルトラリンは、ＵＳ４，５３６，５１８に記述されているように調製してもよい。シブトラミンはＭｅｒｉｄｉａ（登録商標）としても知られる。剤として使用してもよいＳＳＲＩは、上述したＳＳＲＩの類似体、誘導体、プロドラッグ、および薬学的に受容可能な塩を含む。
【００６６】
ＳＳＲＩは、平均的な被験者について、ＳＳＲＩおよび投与経路によって、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日から約５００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは１日あたり約１０ｍｇから３００ｍｇ、の範囲の量で、単一用量または分割用量で、好ましくは投与される。しかしながら、治療される被験者の状態に応じて、投与量のいくらかの変化が必然的に生ずるであろう。いずれにしても、投与に対して責任を有する個人は、被験者個体に対する適切な投与量を決定するであろう。
【００６７】
剤は、さらにいずれかの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ (ＨＭＧ−ＣｏＡ)レダクターゼ阻害剤（スタチン）を含んでなってよい。３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤という用語は、酵素  ３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−コエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼを阻害する医薬化合物を意味する。この酵素は、ＨＭＧ−ＣｏＡのメバロネートへの変換、これはコレステロール生合成の過程の一つである、に関係している。そのような阻害は、当業者に周知の標準的アッセイにしたがって容易に決定される。
【００６８】
本発明にしたがって使用してもよい好ましいスタチン類は、米国特許第４，６８１，８９３号に開示されるアトルバスタチン、米国特許第５，２７３，９９５号に開示されるアトルバスタチンカルシウム、米国特許第５，５０２，１９９号に開示されるセリバスタチン、ヨーロッパ特許出願公報第７３８，５１０  Ａ２号に開示されるダルバスタチン、ヨーロッパ特許出願公報第３６３，９３４  Ａ１号に開示されるフルインドスタチン（fluindostatin）、米国特許第４，７３９，０７３号に開示されるフルバスタチン、米国特許第４，２３１，９３８号に開示されるロバスタチン、米国特許第３，９８３，１４０号に開示されるメバスタチン、ＵＳ  ４，３４６，２２７号に開示されるプラバスタチン、  米国特許第４，４４４，７８４号に開示されるシンバスタチン、ならびに、米国特許第４，４４８，７８４号および米国特許第４，４５０，１７１号に開示されるベロスタチン、を含む。特に好ましい３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡレダクターゼ阻害剤は、アトルバスタチン、Ｌｉｐｉｔｏｒ（登録商標）としても知られるアトルバスタチンカルシウム、Ｍｅｖａｃｏｒ（登録商標）としても知られるロバスタチン、Ｐｒａｖａｃｈｏｌ（登録商標）としても知られるプラバスタチン、およびＺｏｃｏｒ（登録商標）としても知られるシンバスタチン；ならびにその類似体、誘導体、プロドラッグおよび薬学的に受容可能な塩、を含む。
【００６９】
スタチン類は、平均的な被験者について、当該スタチンおよび投与経路によって、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１０００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは１日あたり約１ｍｇ／ｋｇ／日から２００ｍｇ／ｋｇ／日、の範囲の量で、単一用量または分割用量で、好ましくは投与される。しかしながら、治療される被験者の状態に応じて、投与量のいくらかの変化が必然的に生ずるであろう。いずれにしても、投与に対して責任を有する個人は、被験者個体に対する適切な投与量を決定するであろう。
【００７０】
剤は、いずれかのアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤を含んでいてよい。アンジオテンシン変換酵素阻害剤という用語はアンジオテンシン変換酵素活性を阻害する医薬化合物を意味する。ＡＣＥは、アンジオテンシンＩの、血管収縮剤アンジオテンシンＩＩへの変換に関与する。ＡＣＥ阻害剤の活性は、以下に列挙する特許に記載されるいずれかの標準的なアッセイを含む、当業者に公知の方法により容易に決定されてよい。
【００７１】
好ましいＡＣＥ阻害剤は：米国特許第４，２４８，８８３号に開示されるアラセプリル；米国特許第４，４１０，５２０号に開示されるベナゼプリル；米国特許第４，０４６，８８９号および第４，１０５，７７６号に開示されるカプトプリル；米国特許第４，４５２，７９０号に開示されるセロナプリル；米国特許第４，３８５，０５１号に開示されるデラプリル；米国特許第４，３７４，８２９号に開示されるエナラプリル；米国特許第４，３３７，２０１号に開示されるフォシノプリル；米国特許第４，５０８，７２７号に開示されるイマダプリル；米国特許第４，５５５，５０２号に開示されるリシノプリル；米国特許第４，３４４，９４９号に開示されるモエキシプリル；ベルギー特許第８９３，５５３号に開示されるモベルトプリル；米国特許第４，５０８，７２９号に開示されるペリンドプリル；米国特許第４，３４４，９４９号に開示されるキナプリル；米国特許第  ４，５８７，２５８号に開示されるラミプリル；米国特許第４，４７０，９７２号に開示されるスピラプリル；米国特許第４，６９９，９０５号に開示されるテモカプリル；および、米国特許第４，９３３，３６１号に開示されるトランドラプリル；ならびに、その類似体、誘導体、プロドラッグおよび薬学的に受容可能な塩、を含む。
【００７２】
ＡＣＥ阻害剤は、平均的な被験者について、当該ＡＣＥ阻害剤および投与経路によって、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日から約５００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは１日あたり約１０ｍｇから３００ｍｇ、の範囲の量で、単一用量または分割用量で、好ましくは投与される。しかしながら、治療される被験者の状態に応じて、投与量のいくらかの変化が必然的に生ずるであろう。いずれにしても、投与に対して責任を有する個人は、被験者個体に対する適切な投与量を決定するであろう。
【００７３】
剤は、いずれかのアンジオテンシン−ＩＩ受容体（Ａ−ＩＩ）アンタゴニストを含んでいてよい。アンジオテンシン−ＩＩ受容体アンタゴニストという用語は、多くの組織（例えば、血管の平滑筋、副腎）において見られるＡＴ１受容体へのアンジオテンシンＩＩの結合を遮断することにより、アンジオテンシンＩＩの血管収縮剤としての効果を遮断する医薬化合物を意味する。Ａ−ＩＩアンタゴニストの活性は、以下に列挙する特許に記載されるいずれかの標準的なアッセイを含む、当業者に公知の方法により容易に決定されてよい。
【００７４】
好ましいＡ−ＩＩアンタゴニストは：米国特許第５，１９６，４４４号に開示されるように調製されてよいカンデサルタン；米国特許第５，１８５，３５１号に開示されるように調製されてよいエプロサルタン；米国特許第５，２７０，３１７号に開示されるように調製されてよいイルベサルタン；米国特許第５，１３８，０６９号に開示されるように調製されてよいロサルタン；および、米国特許第５，３９９，５７８号に開示されるように調製されてよいバルサルタン；ならびに、その類似体、誘導体、プロドラッグおよび薬学的に受容可能な塩、を含む。より好ましいアンジオテンシン−ＩＩ受容体アンタゴニストはロサルタン、イルベサルタン、およびバルサルタンである。
【００７５】
Ａ−ＩＩアンタゴニストは、平均的な被験者について、当該Ａ−ＩＩアンタゴニストおよび投与経路によって、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日から約５００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは１日あたり約１０ｍｇから約３００ｍｇ、の範囲の量で、単一用量または分割用量で、好ましくは投与される。しかしながら、治療される被験者の状態に応じて、投与量のいくらかの変化が必然的に生ずるであろう。いずれにしても、投与に対して責任を有する個人は、被験者個体に対する適切な投与量を決定するであろう。
【００７６】
剤は、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）アゴニストを含んでよい。γ−アミノ酪酸アゴニストという用語は、哺乳動物の中枢神経系におけるＧＡＢＡ受容体に結合する医薬化合物を意味する。ＧＡＢＡは、哺乳動物の中枢神経系における主要な阻害的神経伝達物質である。ＧＡＢＡアゴニストの活性は、Ｊａｎｓｓｅｎｓ  ｄｅ  Ｖｅｒｅｂｅｋｅ，Ｐ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３１，２２５７−２２６１（１９８２）、Ｌｏｓｃｈｅｒ，Ｗ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３１，８３７−８４２，（１９８２）、および／またはＰｈｉｌｌｉｐｓ，Ｎ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３１，２２５７−２２６１、に開示される手順を含む、当業者に公知の方法によって容易に決定されてよい。
【００７７】
好ましいＧＡＢＡアゴニストは：米国特許第３，２４２，１９０号に開示されるように調製してもよいムシモール；ＵＳ４，０９４，９９２に開示されるように調製してもよいプロガビド；米国特許第４，３７０，３３８号に開示されるように調製してもよいリルゾール；米国特許第３，４７１，５４８号に開示されるように調製してもよいバクロフェン；米国特許第４，０２４，１７５号に開示されるように調製してもよいガバペンチン（Ｎｅｕｒｏｎｔｉｎ（登録商標））；米国特許第３，９６０，９２７号に開示されるように調製してもよいビガバトリン；ＵＳ５，０１０，０９０に開示されるように調製してもよいチアガビン（Ｇａｂｉｔｒｉｌ（登録商標））；米国特許第４，６０２，０１７号に開示されるように調製してもよいラモトリジン（Ｌａｍｉｃｔａｌ（登録商標））；米国特許第６，０２８，２１４号に開示されるように調製してもよいプレガバリン；米国特許第２，４０９，７５４号に開示されるように調製してもよいフェニトイン（Ｄｉｌａｎｔｉｎ（登録商標））；米国特許第２，９４８，７１８号に開示されるように調製してもよいカルバマゼピン（Ｔｅｇｒｅｔｏｌ（登録商標））；および、米国特許第４，５１３，００６号に開示されるように調製してもよいトピラメート（Ｔｏｐａｍａｘ（登録商標））;ならびに、それらＧＡＢＡアゴニストの類似体、誘導体、プロドラッグおよび薬学的に受容可能な塩、を含む。
【００７８】
通常、本発明にしたがって、剤として用いるＧＡＢＡアゴニストは、１日あたり約４ｍｇ／治療される被験者の体重ｋｇないし１日当たり約６０ｍｇ／治療される被験者の体重ｋｇの用量で、単一用量または分割用量で、投与されるであろう。しかしながら、治療される被験者の状態に応じて、投与量のいくらかの変化が必然的に生ずるであろう。いずれにしても、投与に対して責任を有する個人は、被験者個体に対する適切な投与量を決定するであろう。具体的には、本発明においてＧＡＢＡアゴニストとして用いられる場合、プレガバリンは、１日あたり約３００ｍｇから約１２００ｍｇで投与され；ガバペンチンは１日あたり約６００ｍｇから約３６００ｍｇで投与されるであろう。
【００７９】
剤は、いずれかのグリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤（ＧＰＩ）を含んでよい。グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤という用語は、グリコーゲンホスホリラーゼの酵素活性を減ずる、遅らせる、または除くいずれかの基質または化合物、あるいは基質および／または化合物のいずれかの組合せを意味する。そのような活性は、米国特許第５，９８８，４６３号に記載されるような標準的なアッセイにしたがって当業者により容易に決定される。米国特許第５，９８８，４６３号、国際特許出願公報第ＷＯ９６／３９３８４号および国際特許出願公報第ＷＯ９６／３９３８５号は、剤であってよいＧＰＩを例示する。
【００８０】
ＧＰＩは、平均的な被験者について、当該ＧＰＩおよび投与経路によって、約０．００５ｍｇ／ｋｇ／日から約５０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは１日あたり約０．１ｍｇ／ｋｇから約１５ｍｇ／ｋｇ、の範囲の量で、単一用量または分割用量で、好ましくは投与される。しかしながら、治療される被験者の状態に応じて、投与量のいくらかの変化が必然的に生ずるであろう。いずれにしても、投与に対して責任を有する個人は、被験者個体に対する適切な投与量を決定するであろう。
【００８１】
剤は、いずれかのソルビトールデヒドロゲナーゼ阻害剤（ＳＤＩ）を含んでよい。ソルビトールデヒドロゲナーゼ阻害剤という用語は、ソルビトールデヒドロゲナーゼの酵素活性を減ずる、遅らせる、または除くいずれかの基質または化合物、あるいは基質および／または化合物のいずれかの組合せ、を意味する。ソルビトールデヒドロゲナーゼはソルビトールのフルクトースへの酸化を触媒する。
【００８２】
典型的なＳＤＩは、同一出願人による米国特許第５，７２８，７０４号、米国特許第５，８６６，５７８号および国際特許出願公報第ＷＯ００／５９５１０号に開示されたもの；ならびに、その類似体、誘導体、プロドラッグおよび薬学的に受容可能な塩、を含む。
【００８３】
ＳＤＩは、平均的な被験者について、当該ＳＤＩおよび投与経路によって、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日から約１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは１日あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、の範囲の量で、単一用量または分割用量で、好ましくは投与される。しかしながら、治療される被験者の状態に応じて、投与量のいくらかの変化が必然的に生ずるであろう。いずれにしても、投与に対して責任を有する個人は、被験者個体に対する適切な投与量を決定するであろう。
【００８４】
剤は、いずれかの５型ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ−５）阻害剤を含んでよい。５型ホスホジエステラーゼ阻害剤という用語は、サイクリックグアノシン一リン酸（ｃ−ＧＭＰ）特異的ＰＤＥ−５の酵素作用を減ずる、遅らせるまたは除くいずれかの基質もしくは化合物、または基質および／もしくは化合物のいずれかの組合せ、を意味する。そのような作用は、 国際特許出願公報第ＷＯ  ００／２４７４５号に記載されるようなアッセイにしたがって当業者によって容易に決定される。
【００８５】
以下の特許公報は、本発明の剤として使用することができる５型ホスホジエステラーゼ阻害剤を例示し、そしてそれら５型ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ−５）阻害剤を調製する方法に関する：国際特許出願公報第ＷＯ  ００／２４７４５号；国際特許出願公報第ＷＯ  ９４／２８９０２号；ヨーロッパ特許出願公報第０４６３７５６Ａ１号；ヨーロッパ特許出願公報第０５２６００４Ａ１号およびヨーロッパ特許出願公報第０２０１１８８Ａ２号。好ましい５型ホスホジエステラーゼ阻害剤は、米国特許第５，２５０，５３４号および第５，９５５，６１１号に記載されるように調製されてよいシルデナフィル（好ましくは、Ｖｉａｇｒａ（登録商標）としても知られる、クエン酸シルデナフィル）、米国特許第５，８５９，００６号に記載されるように調製されてよいタダラフィル（Ｃｉａｌｉｓ（登録商標）としても知られる）、および、米国特許第６，３６２，１７８号に記載されるように調製されてよいバルディナフィル（Ｌｅｖｉｔｒａ（登録商標）としても知られる）である。典型的なＰＤＥ−５阻害剤はまた、上記に列挙したＰＤＥ−５阻害剤の類似体、誘導体、プロドラッグ、および薬学的に受容可能な塩を含む。
【００８６】
ＰＤＥ−５阻害剤は、平均的な被験者について、当該ＰＤＥ−５阻害剤および投与経路によって、約５ｍｇ／日から約５００ｍｇ／日、好ましくは１日あたり約１０ｍｇ／日から約２５０ｍｇ／日、の範囲の量で、単一用量または分割用量で、好ましくは投与される。しかしながら、治療される被験者の状態に応じて、投与量のいくらかの変化が必然的に生ずるであろう。いずれにしても、投与に対して責任を有する個人は、被験者個体に対する適切な投与量を決定するであろう。
【００８７】
剤は、いずれかのアルドースレダクターゼ阻害剤を含んでもよい。アルドースレダクターゼ阻害剤という用語は、酵素アルドースレダクターゼによって触媒されるグルコースからソルビトールへの生物転換（bioconversion）を阻害する化合物を意味する。典型的なアルドースレダクターゼ阻害剤は、米国特許第４，２５１，５２８号に開示されるポナルレスタット、米国特許第４，６００，７２４号に開示されるトルレスタット、米国特許第４，４６４，３８２号、第４，７９１，１２６号および第４，８３１，０４５号に開示されるエパルレスタット、米国特許第４，７３４，４１９号および第４，８８３，８００号に開示されるゼナレスタット、米国特許第４，９３９，１４０号に開示されるゾポルレスタット、ならびに、米国特許第６，５７９，８７９号に開示される好ましいアルドースレダクターゼ阻害剤、を含む。典型的なアルドースレダクターゼ阻害剤はまた、上記に列挙したアルドースレダクターゼ阻害剤の類似体、誘導体、プロドラッグおよび薬学的に受容可能な塩を含む。 
【００８８】
用量あたり投与されるアルドースレダクターゼ阻害剤の量および用量の間の間隔は、用いられるアルドースレダクターゼ阻害剤、用いられる医薬組成物の種類、治療される被験者の特徴、および、あれば、治療される状態の重篤度に依存するであろう。アルドースレダクターゼ阻害剤は、平均的な被験者について、当該アルドースレダクターゼ阻害剤および投与経路によって、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日から約１０００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは１日あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇ、の範囲の量で、単一用量または分割用量で、好ましくは投与される。しかしながら、治療される被験者の状態に応じて、投与量のいくらかの変化が必然的に生ずるであろう。いずれにしても、投与に対して責任を有する個人は、被験者個体に対する適切な投与量を決定するであろう。好ましいアルドースレダクターゼ阻害剤はゾポルレスタットであり、好ましくは１日あたり２５０ｍｇから５００ｍｇの間の用量で投与される。
【００８９】
剤はまた、抗肥満剤、例えば、アポリポプロテイン−Ｂ分泌／ミクロソームトリグリセリド転送タンパク質（ａｐｏ−Ｂ／ＭＴＰ）阻害剤、１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ−１（１型１１β−ＨＳＤ）阻害剤、ペプチドＹＹ３−３６もしくはその類似体、カンナビノイドアンタゴニスト（例えば、リモナバントおよび米国特許公開公報第２００４／００９２５２０号に記載されたプリン化合物のようなＣＢ−１アンタゴニスト）、ＭＣＲ−４アゴニスト、コレシストキニン−Ａ（ＣＣＫ−Ａ）アゴニスト、モノアミン再取り込み阻害剤（例えばシブトラミン）、交感神経刺激薬、β３アドレナリン受容体アゴニスト、ドーパミンアゴニスト（例えばブロモクリプチン）、メラノサイト刺激ホルモン受容体類似体、５ＨＴ２ｃアゴニスト、メラニン濃縮ホルモンアンタゴニスト、レプチン（ＯＢタンパク質）、レプチン類似体、レプチン受容体アゴニスト、ガラニンアンタゴニスト、リパーゼ阻害剤（例えばテトラヒドロリプスタチン、すなわち、オルリスタット）、食欲低下剤（例えばボンベシンアゴニスト）、神経ペプチド−Ｙ受容体アンタゴニスト（例えば、米国特許第６，５６６，３６７号、第６，６４９，６２４号、第６，６３８，９４２号、第６，６０５，７２０号、第６，４９５，５５９号、第６，４６２，０５３号、第６，３８８，０７７号、第６，３３５，３４５号、および第６，３２６，３７５号、米国特許公開公報第２００２／０１５１４５６号および第２００３／０３６６５２号、ならびに、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ  ０３／０１０１７５号、第ＷＯ  ０３／０８２１９０号および第ＷＯ  ０２／０４８１５２号に記載されるスピロ化合物のようなＮＰＹ５受容体アンタゴニスト）、甲状腺ホルモン模倣剤（thyromimetic agents）、デヒドロエピアンドロステロンまたはその類似体、グルココルチコイド受容体アゴニストまたはアンタゴニスト、オレキシン受容体アンタゴニスト、グルカゴン様ペプチド−１受容体アゴニスト、繊毛様神経栄養因子（例えば、Ｒｅｇｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク州タリータウン、および、プロクター＆ギャンブルカンパニー、オハイオ州シンシナティから入手可能なＡｘｏｋｉｎｅＴＭ）、ヒトアグーチ関連タンパク質（ＡＧＲＰ）、グレリン受容体アンタゴニスト、ヒスタミン３受容体アンタゴニストまたはインバースアゴニスト、ニューロメディンＵ受容体アゴニスト、などを含む。他の抗肥満剤は、当業者に周知であり、または本開示に照らして容易に明白であろう。特に好ましいのは、オルリスタット（米国特許第５，２７４，１４３号、第５，４２０，３０５号、および第５，５４０，９１７号に記載されるように調製される）、シブトラミン（米国特許第４，９２９，６２９号に記載されるように調製される）、ブロモクリプチン（米国特許第３，７５２，８１４号および第３，７５２，８８８号）、エフェドリン、レプチン、シュードエフェドリン；リモナバント（米国特許第５，６２４，９４１号に記載されるように調製される）、ペプチドＹＹ３−３６またはその類似体（米国特許公開公報第２００２／０１４１９８５号およびＰＣＴ公開公報第ＷＯ  ０３／０２７６３７号に記載されるように調製される）���および、ＮＰＹ  Ｙ５受容体アンタゴニスト  ２−オキソ−Ｎ−（５−フェニルピラジニル）スピロ−［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），４’−ピペリジン］−１’−カルボキサミド，からなる群より選択される抗肥満剤である。他の好ましいＮＰＹ  Ｙ５受容体アンタゴニストは、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ  ０３／０８２１９０号に記載されているものであり、３−オキソ−Ｎ−（５−フェニル−２−ピラジニル）−スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），４’−ピペリジン］−１’−カルボキサミド；３−オキソ−Ｎ−（７−トリフルオロメチルピリド［３，２−ｂ］ピリジン−２−イル）−スピロ−［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），４’−ピペリジン］−１’−カルボキサミド；Ｎ−［５−（３−フルオロフェニル）−２−ピリミジニル］−３−オキソスピロ−［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），［４’−ピペリジン］−１’−カルボキサミド；トランス−３’−オキソ−Ｎ−（５−フェニル−２−ピリミジニル）］  スピロ［シクロヘキサン−１，１’（３’Ｈ）−イソベンゾフラン］−４−カルボキサミド；トランス−３’−オキソ−Ｎ−［１−（３−キノリル）−４−イミダゾリル］スピロ［シクロヘキサン−１，１’（３’Ｈ）−イソベンゾフラン］−４−カルボキサミド；トランス−３−オキソ−Ｎ−（５−フェニル−２−ピラジニル）スピロ［４−アザイソ−ベンゾフラン−１（３Ｈ），１’−シクロヘキサン］−４’−カルボキサミド；トランス−Ｎ−［５−（３−フルオロフェニル）−２−ピリミジニル］−３−オキソスピロ［５−アザイソベンゾフラン−１（３Ｈ），１’−シクロヘキサン］−４’−カルボキサミド；トランス−Ｎ−［５−（２−フルオロフェニル）−２−ピリミジニル］−３−オキソスピロ［５−アザイソベンゾフラン−１（３Ｈ），１’−シクロヘキサン］−４’−カルボキサミド；トランス−Ｎ−［１−（３，５−ジフルオロフェニル）−４−イミダゾリル］−３−オキソスピロ［７−アザイソベンゾフラン−１（３Ｈ），１’−シクロヘキサン］−４’−カルボキサミド；トランス−３−オキソ−Ｎ−（１−フェニル−４−ピラゾリル）スピロ［４−アザイソベンゾフラン−１（３Ｈ），１’−シクロヘキサン］−４’−カルボキサミド；トランス−Ｎ−［１−（２−フルオロフェニル）−３−ピラゾリル］−３−オキソスピロ［６−アザイソベンゾフラン−１（３Ｈ），１’−シクロヘキサン］−４’−カルボキサミド；トランス−３−オキソ−Ｎ−（ｌ−フェニル−３−ピラゾリル）スピロ［６−アザイソベンゾフラン−１（３Ｈ），１’−シクロヘキサン］−４’−カルボキサミド；トランス−３−オキソ−Ｎ−（２−フェニル−１，２，３−トリアゾル−４−イル）スピロ［６−アザイソベンゾフラン−１（３Ｈ），１’−シクロヘキサン］−４’−カルボキサミド、ならびにその薬学的に受容可能な塩およびプロドラッグ、を含む。好ましくは、本発明の化合物および併用療法は、運動およびしっかりとした食生活と共に、投与される。
【００９０】
剤は、本発明の方法のため、単独で、または１またはそれより多くの他の剤と組み合わせて用いられる。剤は、単独で、または１もしくはそれより多くの薬学的に受容可能な担体、希釈剤または充填剤（fillers）と共に、投与してよい。当該剤を含有する医薬組成物は種々の剤形、例えば、錠剤、粉末、ロゼンジ、シロップ、注射可能溶液など、で容易に投与してもよい。これらの医薬組成物は、そのように望まれる場合、追加の成分、例えば
香味剤、結合剤、賦形剤（excipients）などを含んでもよい。経口投与の目的のために、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、および二リン酸カルシウムのような種々の賦形剤を含有する錠剤を、デンプン、アルギン酸および特定の複合シリケート（complex silicates）のような種々の崩壊剤と共に、ポリビニルピロリドン、スクロース、ゼラチン、およびアラビアゴムのような結合剤と一緒に、用いてもよい。加えて、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルクのような潤滑剤は、錠剤化の目的のためにしばしば有用である。同様の型の固体組成物は、ソフトまたはハード充填ゼラチンカプセルにおける充填剤としても用いてよい。この使用のための好ましい材料は、ラクトースまたは乳糖、およ高分子量ポリエチレングリコールが含まれる。水性懸濁液またはエリキシルが経口投与のために好ましい場合、その剤は、種々の甘味料または香味料、着色料または色素、そして、望まれる場合、乳化剤または懸濁剤、それと一緒に水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、または種々のそれらの組合せのような希釈剤、と共に組み合わされていてよい。
【００９１】
非経口投与のために、ゴマ油もしくはピーナッツ油中の、水性プロピレングリコール、または滅菌水溶液中の、本発明において有用な剤の溶液を用いてもよい。そのような水溶液は、必要であれば適切に緩衝され、そして当該液体希釈剤は、十分な食塩水またはグルコースで第一に等張にされるべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、および腹膜内への投与に特に適している。この関係で、用いた滅菌水性媒体はすべて、当業者に公知の標準技術により容易に入手可能である。特定の量の活性成分を伴う種々の医薬組成物を調製する方法は、当業者に公知であり、または本開示の観点から明らかになるであろう。例えば、医薬組成物を調製する方法は、Ｇｅｎｎａｒｏ（２００３）に記載されている。
【００９２】
本明細書において囲繞される、パンフレットおよび技術報告を含む、すべての特許、出願、公報および文献、の開示は、その全体が引用により本明細書に明確に援用される。当業者は、実施例、図面および付随する請求項を含む本記載に基づいて、本発明をその最大限の範囲について利用できると信ずる。
【００９３】
当業者は、実施例、図面および付随する請求項を含む本記載に基づいて、本発明をその最大限の範囲について利用できると信ずる。以下の実施例は、本発明の実施の単なる例示と解釈されるべきものであり、いかなる形においても本開示の残りを限定するものではない。
【実施例】
【００９４】
実施例
実施例１
ＧＰＲ４０を発現する２９３細胞
ＧＰＲ４０遺伝子アレルを含有する発現ベクターコンストラクトを、ベクターｐＩＲＥＳｐｕｒｏ（カタログ番号６０３１−１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州フランクリンレークス）に基づいて調製した。そのような発現ベクターコンストラクトの一つは、配列番号１１の配列および図４に示される制限酵素マップを有する。アデノウイルス５で形質転換したヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞（ＡＴＣＣより入手可能。カタログ番号ＣＲＬ−１５７３）を、ＤＭＥＭ（カタログ番号１１９９５−０６５、インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド）、１０％ＦＢＳ（カタログ番号１６１４０−０７１、インビトロジェン）および１００ユニットのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（カタログ番号１５１４０−１２２、インビトロジェン）を含有する培地中で培養した。細胞が８０％集密に達したとき、それらをＦｕｇｅｎｅ−６試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、インディアナ州インディアナポリス）を用いてＧＰＲ４０含有発現ベクターでトランスフェクトした。４８時間のインキュベーション後、培地を吸引し、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１００ユニットのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐおよび１μｇ／ｍｌピューロマイシンを含有する新しい培地を加えた。４週目に、クローニングシリンダー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．、ミズーリ州セントルイス）を用いて、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏベクターにより運ばれたピューロマイシン耐性を有する安定なクローンを選択した。これらのクローンを、追加の４週間増幅させ、そして早く増殖するコロニーを選択して、実施例２のＦＬＩＰＲアッセイに用いるためのＨＥＫ２９３／ＧＰＲ４０細胞とした。
【００９５】
実施例２
ＧＰＲ４０  ＦＬＩＰＲアッセイ
１日目に、実施例１にしたがって調製したＨＥＫ２９３／ＧＰＲ４０細胞および対照ＨＥＫ２９３細胞を、ポリ−Ｄ−リジンでコートした透明底の３９４ウェルブラックプレート（カタログ番号３５４６６３、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、ＨＥＫ２９３／ＧＰＲ４０細胞についてのみ１μｇ／ｍＬピューロマイシンの追加を伴う、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳおよびＰｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐ（１００μｇ／ｍＬ）を含有する増殖培地中、１ウェルあたり１０，０００細胞（３．３ｘ１０５細胞／ｍＬ溶液を１ウェルあたり３０μｌ）で蒔き、そして３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。２日目に、各ウェルから培地を除き、ＨＥＫ２９３ＧＰＲ４０細胞についてのみ１μｇ／ｍＬのピューロマイシンの添加を伴う、３０μｌの無血清培地（ＤＭＥＭおよびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐのみ、そしてＦＢＳなし）で置き換えた。３日目に、ＦＬＩＰＲ（登録商標）カルシウム３アッセイキット（カタログ番号Ｒ８０９１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーベール）の色素バイアルを、１１ｍＬのハンクス緩衝食塩水溶液（ＦＬＩＰＲ（登録商標）アッセイキットのコンポーネント）、および５Ｎ  ＮａＯＨ（１ｍＬ）、プロベネシド（０．７４ｇ）（カタログ番号Ｐ８７６１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）および１ｘ  ＦＬＩＰＲバッファー（９ｍＬ）（１リットルあたり、ＮａＣｌ（８４．６８ｇ）、Ｄ（＋）グルコース無水物（１８．０２ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１．２ｇ）、ＫＣｌ（３．７３ｇ）、ＨＥＰＥＳ（２３．８ｇ）およびＣａＣｌ２（１．１１ｇ）、を含有する１０ｘ  ＦＬＩＰＲバッファーから作られる、ｐＨ７．４）を含有する、２２５μｌの新たに作られた２５０ｍＭプロベネシドストック、で再構成した。脂肪酸および他のＧＰＲ４０リガンド試験化合物を、ＦＬＩＰＲ／ＤＭＳＯ（０．２５％  ＤＭＳＯを含有する１ｘ  ＦＬＩＰＲバッファー）中で０．０５μＭから１００μＭの間の濃度に希釈した。３０マイクロリットルの色素を各プレートウェルに加え、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。カルシウム流動をＦＬＩＰＲプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定した。試験化合物を各ウェルに、１秒あたり１０μｌの割合で、注入した（１ウェルあたり１５μｌ）。曝露は、１曝露あたり０．４秒間をちょうど（very）２秒間、９０曝露で行った。
【００９６】
実施例３
ＤＮＡ単離および精製
全血サンプルからのＤＮＡをＰｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）ＤＮＡ単離キット（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，ミネソタ州ミネアポリス）を用い、製造者の説明書に従って単離および精製する。あるいは、凍結された全血サンプルの赤血球を、解凍した全血（１ｍＬ）をＲＢＣ溶解液（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）と、例えば、３：１の割合（すなわち、１ｍＬ全血に対して３ｍＬ  ＲＢＣ溶解液）で、混合することにより溶解しそして混合してもよい。該溶液を室温で１０分間インキュベートする。インキュベーション後、溶液を１，８００ｘｇで１０分間遠心分離する。当該チューブからの上清を捨て、そして生じたペレットを残りの上清に再懸濁する。次いで、細胞溶解液（１ｍＬ）（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を、例えば、初期全血容積と等量の容積で、加える。ＲＮａｓｅ  Ａ溶液（５μｌ）（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を、該細胞溶解物へ加え、そして該チューブを３７℃で１５分間インキュベートする。次いで、サンプルを室温まで冷却し、タンパク質沈殿溶液（３３３μｌ）（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を細胞溶解物に加え、そして当該混合物をボルテックスすることにより高速で少なくとも２０秒間混合する。混合物を１，８００ｘｇで１０分間遠心分離し、堅いタンパク質ペレットを得る。生じた、ＤＮＡを含有する上清を、１０ｍＬの１００％イソプロパノール（２−プロパノール）を含有する、きれいな１５ｍＬ遠心分離チューブに注ぎ移す。サンプルを、ＤＮＡが沈殿するまで、チューブを穏やかにひっくり返すことにより（およそ４０−６０回）混合する。ＤＮＡが現れない場合は、１ｍＬの全血（オリジナルの出発物質）あたり７μｌのグリコーゲン（２０μｇ／ｍＬ）を加え、そして室温で１５分間インキュベートする。次いでサンプルを１，８００ｘｇで３分間遠心分離し、小さな白いＤＮＡペレットを生じる。上清を捨て、そしてチューブを吸い取り紙の上で水分抜きする。１０ｍＬの７０％エタノールを加え、そしてチューブを数回ひっくり返すことによりＤＮＡペレットを洗浄する。サンプルを１分間、１，８００ｘｇで遠心分離する。次いで、上清を捨て、チューブをひっくり返して風乾する。
【００９７】
実施例４
アレル識別
プライマーおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、ソフトウェア  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓバージョン１．５（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて設計した。ＰＣＲ反応は：２．５μｌの２ｘ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）ユニバーサルＰＣＲマスターミックス（ＡｍｐＥｒａｓｅ不含）、２００ｎＭの各プローブ、９００ｎＭのフォワードおよびリバースプライマー、ならびに５μｌにする水、からなる５μｌの容積中で行った。あるいは、プライマーおよびプローブはＴａｑＭａｎ  Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ  ＤｅｍａｎｄＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）として得て、そしてＰＣＲ反応は：２．５μｌの２ｘ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）ユニバーサルＰＣＲマスターミックス（ＡｍｐＥｒａｓｅ不含）、２．２５μｌ  水および０．２５μｌの２０ｘ  アッセイミックス、からなる５μｌ中で行った。５μｌ反応混合物を、９６ウェルプレートのウェル中の約１０ｎｇの乾燥ＤＮＡへと加えた。プレートをタイタープレートシェーカー上に置き、１０分間激しく振とうし、次いで、１００ＲＰＭで短く遠心した。温度サイクルを、二重の３８４ウェルサンプルブロックモジュールを備えたＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で、以下の温度サイクル条件：９５℃１０分間、そして９２℃１５秒および６０度１分を４０サイクル、を用いて行った。蛍光シグナルを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴシークエンスディテクター（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造元の説明書にしたがって用いて検出した。データは、配列検出システム（ＳＤＳ）ソフトウェア  バージョン２．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。
【００９８】
実施例５
ＩＩ型糖尿病患者におけるＧＰＲ４０についての変異体の調査
分析した２４６５の被験者のうち、１３３２は男性であり、８５７は女性であった。アレル頻度はＧＲＰ４０の特定のアレルの存在を数え、そして次いで、各被験者によって寄与される二つのアレルを説明するよう被験者の数の２倍で割ることにより推定した。遺伝子型頻度は、特定の遺伝子型の存在を数え、そして次いで被験者の数で割ることにより推定した。
【００９９】
参考文献
【０１００】
【表２−１】
2008504836.tif 000003
【０１０１】
【表２−２】
2008504836.tif 000004
【０１０２】
【表２−３】
2008504836.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】図１は、ＧＰＲ４０を発現しないＨＥＫ細胞と比較した、ＧＰＲ４０を発現するＨＥＫ２９３細胞における細胞内カルシウムイオン放出によって測定される、チアゾリジンジオン化合物によるＧＰＲ４０の活性化を説明する。
【図２−１】図２は、ＧＰＲ４０を発現するＨＥＫ２９３細胞における細胞内カルシウムイオン放出によって測定される、アミノ酸２１１においてヒスチジンを有するＧＰＲ４０対アミノ酸２１１においてアルギニンを有するＧＰＲ４０の、チアゾリジンジオン化合物による活性化の比較を示す。
【図２−２】図２は、ＧＰＲ４０を発現するＨＥＫ２９３細胞における細胞内カルシウムイオン放出によって測定される、アミノ酸２１１においてヒスチジンを有するＧＰＲ４０対アミノ酸２１１においてアルギニンを有するＧＰＲ４０の、チアゾリジンジオン化合物による活性化の比較を示す。
【図３】図３は、９５％信頼限界（点線(dotted lines)）を伴うロジスティック回帰分析曲線（実線(solid lines)）、および、肥満度指数（body mass index）に対して糖尿病を有する見込みを比較した、２４６５人の被験者の集団（１３３２人の男性および８５７人の女性）におけるＧＰＲ４０の各遺伝子型についての個別のデータポイントを示す。プロットの頂点におけるデータポイントは、糖尿病を伴う個体の肥満度指数を示す。プロットの底部におけるデータポイントは、糖尿病を有さない個体の肥満度指数を示す。
【図４】図４は、ＧＰＲ４０を発現するＨＥＫ２９３細胞を調製するために用いた発現ベクターの制限酵素地図を示す。
【図５−１】図５は、ヒトＧＰＲ４０をコードする核酸およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号１および２）を示す、ここでアルギニンとしてアミノ酸２１１番をコードするヌクレオチドおよびアルギニンとしてのアミノ酸２１１は強調して示されている。
【図５−２】図５は、ヒトＧＰＲ４０をコードする核酸およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号１および２）を示す、ここでアルギニンとしてアミノ酸２１１番をコードするヌクレオチドおよびアルギニンとしてのアミノ酸２１１は強調して示されている。
【図６−１】図６は、ヒトＧＰＲ４０をコードする核酸およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号３および４）を示す、ここでヒスチジンとしてアミノ酸２１１番をコードするヌクレオチドおよびヒスチジンとしてのアミノ酸２１１は強調して示されている。
【図６−２】図６は、ヒトＧＰＲ４０をコードする核酸およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号３および４）を示す、ここでヒスチジンとしてアミノ酸２１１番をコードするヌクレオチドおよびヒスチジンとしてのアミノ酸２１１は強調して示されている。
【図７−１】図７は、ＧＰＲ４０アレルを含有する配列を増幅および検出するのに用いてもよいＰＣＲプライマーおよびＰＣＲプローブの配列を示す。図７はまた、ヒスチジン（配列番号９）またはアルギニン（配列番号１０）のいずれかとしてアミノ酸２１１をコードするヌクレオチド配列を示す。
【図７−２】図７は、ＧＰＲ４０アレルを含有する配列を増幅および検出するのに用いてもよいＰＣＲプライマーおよびＰＣＲプローブの配列を示す。図７はまた、ヒスチジン（配列番号９）またはアルギニン（配列番号１０）のいずれかとしてアミノ酸２１１をコードするヌクレオチド配列を示す。
【図８−１】図８は、アミノ酸２１１番においてヒスチジンをコードするＧＰＲ４０アレルを含有する発現ベクターコンストラクトの配列を示す。
【図８−２】図８は、アミノ酸２１１番においてヒスチジンをコードするＧＰＲ４０アレルを含有する発現ベクターコンストラクトの配列を示す。
【図１】
2008504836.tif 000006
【図２−１】
2008504836.tif 000007
【図２−２】
2008504836.tif 000008
【図３】
2008504836.tif 000009
【図４】
2008504836.tif 000010
【図５−１】
2008504836.tif 000011
【図５−２】
2008504836.tif 000012
【図６−１】
2008504836.tif 000013
【図６−２】
2008504836.tif 000014
【図７−１】
2008504836.tif 000015
【図７−２】
2008504836.tif 000016
【図８−１】
2008504836.tif 000017
【図８−２】
2008504836.tif 000018
【配列表】
2008504836000001.xml
【国際調査報告】
2008504836.tif 000028
2008504836.tif 000029
2008504836.tif 000030
2008504836.tif 000031
2008504836.tif 000032
2008504836.tif 000033