(57)【要約】  最初に有機官能基で誘導体化した基板表面を適切に被覆することによりタンパク質の最小限のバックグラウンド結合を有するマイクロアレイを作製する方法。多官能性イソシアネート部分を介して実質的な程度に架橋している親水性骨格ポリマーを有するタンパク質抵抗性ポリマーコーティングを施す。捕捉物質を含む３次元ヒドロゲルマイクロスポットを表面のアレイ領域にわたる別個の空間に付着させてマイクロアレイを形成させる。マイクロスポットは、基板またはコーティングに付着させる。ポリマーコーティングは、ウレタンポリマーを形成させるために多官能性イソシアネートにより架橋したイソシアネートでキャップされたＰＥＧを含むことが好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機官能基を有するように誘導体化されている平坦な不透過性上面を有する基板、
有機捕捉物質を含むか、あるいは有機捕捉物質に直接もしくは間接的に結合するように構成された、前記面のアレイ領域にわたる不連続の空間位置にある複数の３次元（３Ｄ）マイクロスポット、および
マイクロスポットの周囲のアレイ領域における表面を被覆し、多官能性であり、多官能性イソシアネート分子を介して実質的な程度に架橋されている親水性骨格ポリマーを含み、前記面上の前記有機官能基にイソシアネート結合を介して共有結合し、遊離イソシアネート基を供給するタンパク質抵抗性ポリマーコーティング
を含むことを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項２】
前記親水性骨格ポリマーがポリオレフィンエーテルであることを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項３】
前記ポリマーがウレタン結合によりイソシアネート基でエンドキャップされたポリオレフィンエーテルポリオールであることを特徴とする請求項２に記載のマイクロアレイ。
【請求項４】
前記ポリオレフィンエーテルポリオールがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）またはそのコポリマーであることを特徴とする請求項３に記載のマイクロアレイ。
【請求項５】
前記ポリオールが約５００〜３０,０００ダルトンの分子量を有するＰＥＧ、ＰＰＧまたはそのコポリマーであることを特徴とする請求項４に記載のマイクロアレイ。
【請求項６】
エンドキャップされた前記ポリオレフィンエーテルポリマーが尿素結合により前記多官能性イソシアネート部分に架橋されていることを特徴とする請求項３に記載のマイクロアレイ。
【請求項７】
前記骨格ポリマーが芳香族、脂環式または脂肪族多官能性イソシアネート分子により架橋されていることを特徴とする請求項６に記載のマイクロアレイ。
【請求項８】
存在する前記多官能性イソシアネート分子の少なくとも約２．５％が、前記架橋を実質的な程度に生じさせるために独立した骨格ポリマーに結合した官能基のそれぞれを有することを特徴とする請求項７に記載のマイクロアレイ。
【請求項９】
前記基板を誘導体化する前記有機官能基がアミン部分であることを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載のマイクロアレイ。
【請求項１０】
前記基板がガラススライドで、その上面がアミノシランにより誘導体化されていることを特徴とする請求項９に記載のマイクロアレイ。
【請求項１１】
前記３Ｄスポットがポリウレタンベースのヒドロゲルであることを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載のマイクロアレイ。
【請求項１２】
前記ヒドロゲルスポットが前記有機官能基を介して前記基板に直接結合していることを特徴とする請求項１１に記載のマイクロアレイ。
【請求項１３】
前記ヒドロゲルスポットが、アレイ領域にわたって前記基板に結合している前記ポリマーコーティングに前記遊離イソシアネート基を介して付着していることを特徴とする請求項１１に記載のマイクロアレイ。
【請求項１４】
バックグラウンド結合を最小限にするマイクロアレイを作製する方法であって、
有機官能基で誘導体化されている平坦な不透過性上面を有する基板を準備する段階と、
前記有機官能基にタンパク質抵抗性コーティングを共有結合させることにより前記面の少なくともアレイ領域を被覆するために、多官能性であり、多官能性イソシアネート分子を介して実質的な程度に架橋された親水性骨格ポリマーを含む前記コーティングを施す段階と、
前記コーティングを硬化させる段階と、
前記面の前記アレイ領域内にわたる不連続の空間位置に複数の３次元ヒドロゲルスポットを付着させる段階と、
問題の種々の有機捕捉物質を種々の前記３次元スポットに結合させる段階と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記３次元スポットを前記面に付着させた後に、前記有機捕捉物質の前記結合を生じさせることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記コーティングを施す前に、前記ヒドロゲルスポットを前記有機官能基を介して前記基板に直接結合させることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記コーティングをアレイ領域にわたり前記基板に結合させた後に前記ヒドロゲルスポットを前記ポリマーコーティングに付着させ、前記スポットを前記コーティングに結合させることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記タンパク質抵抗性コーティングを施す前に、３次元スポットをその後配置させる領域を覆うように前記上面に保護材料でパターンを形成し、前記タンパク質抵抗性コーティングを所定の位置に施した後に前記保護材料を除去して、前記３次元スポットの付着を可能にすることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリマーコーティングが、ウレタン結合によりイソシアネート基でエンドキャップされたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）またはそのコポリマーの骨格ポリマーを含み、骨格ポリマーがウレタン結合により前記多官能性イソシアネート分子に結合していることを特徴とする請求項１４から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヒドロゲルスポットが付着されているとき、前記有機捕捉物質が前記スポットに含まれていることを特徴とする請求項１４から１８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析に用いるマイクロアレイ製品に関し、より具体的には、様々な種類のタンパク質に対応するマイクロアレイ製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
過去ほぼ十年で、マイクロアレイ技術は、分子生物学、微生物学および他の生物学的技術を含む様々な研究分野で使用される重要なツールとして開発された。現在までのところ、この分野における多くの研究が、複数のスポット、すなわちマイクロスポットが固体表面、しばしばガラススライドまたは他の種類の「チップ」上に配置されているＤＮＡアレイの使用または他の種類の核酸の使用に焦点が当てられている。ガラス板上のアレイとしての不連続なスポットにおけるタンパク質の付着が教示され、細胞が固定化されているマイクロアレイを作製するためにタンパク質からそのようなものを拡大する願望が特許文献１で言及されている。ガラススライドまたは他のチップ上に生存細胞のマイクロアレイを作るというこの概念はまた特許文献２（２００３年４月１５日）においても扱われており、反応性アミノ基を有する親水性表面を作るために最初にアミノシランで処理するガラスウエファー等の使用を教示しており、この概念はこの技術分野で現在よく知られている。マイクロアレイの一部としてタンパク質を付着させ、表示することと、ＤＮＡアレイをＤＮＡ／タンパク質相互作用のために用いる分析の両方に焦点を合わせたタンパク質分析用のより特化されたアレイも開発され始めた。
【０００３】
そのようなタンパク質マイクロアレイに平らな基板を単に用いるのではない、ヒドロゲル等を用いた３次元（３Ｄ）マイクロスポットが、そのようなマイクロアレイの一部としてタンパク質をより十分に結合させ、提示するために開発された。チップの上面に付着されている光学的に透明なヒドロゲル細胞の形の複数のマイクロスポットを有するバイオチップが特許文献３（２００２年８月１日）に示されている。これらの重合ヒドロゲルマイクロスポットは、相互作用のためにタンパク質を結合させるために、あるいは溶液中でそれに加えたタンパク質またはペプチドと後に反応かつ／またはそれを封鎖する捕捉物質またはプローブに結合させるために用いることができる。例えば、抗原を抗体への付着のために表面に結合させることができ、また逆も同様である。
【０００４】
マイクロアレイに用いられるガラスまたは他の基板の、タンパク質捕捉物質等を含むマイクロスポットを有する表面へのタンパク質、炭水化物、細胞溶解物等のバックグラウンド結合は、多年にわたり問題となっていた。マイクロアレイをイメージングするときや、マイクロスポット上で発生したシグナルを他の方法で読み取るとき、マイクロアレイの基板に対するタンパク質の非特異的結合がバックグラウンドノイズを増大させる。そのようなバックグラウンドノイズは正確な読みを得ることを妨げるので、このような非特異的結合は、特にシグナルが弱い場合に特定のスポットに特異的に結合すべき標識から得られるシグナルを検出し、区別することが困難となる。
【０００５】
現在までのところ、この問題を軽減することを試みるのに用いられているより一般的な方法のうちの２つは、複数のマイクロスポットの各々の周囲の基板の表面の領域をブロックする方法を含むものであった。ブロックする１つの方法は、例えば、アミノ基との化学反応を行わせることによって基板の表面を化学的に被覆することであり、ガラス表面は、例えば、無水コハク酸との反応によりしばしば誘導体化されていた。第２の方法は、ガラス表面への小分子、例えば、ＢＳＡ、ｔＲＮＡ、スキムミルク固形物、カゼイン等の付着を用いるものであった。これらの様々なブロッキング法は、特許文献４に記載されており、それ自体が、核酸プローブを用いる測定法におそらく有効であると思われる「スプレディングエンハンサー（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）溶液」の使用を提案している。
【０００６】
３Ｄマイクロスポットの周囲の領域の表面へのタンパク質の非特異的結合を防ぎ、それにより、バックグラウンドシグナルを低減するために、上に示した国際公開は、ヒドロゲルマイクロスポットによって占有されていないそのようなチップ、またはプレートのウェルの表面の領域を被覆するために一端がアミノ基に共有結合するイソシアネートのような反応性部分を有する単官能ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）ポリマーを使用することを提案している。タンパク質に関する定量法に使用するための被覆基板の作製におけるそのような使用に供するＰＥＧ−ＳＰＡが特許文献５（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒ）に言及されている。該特許は、０．０５Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ８．３）中５％（重量／体積）溶液として４０℃で４時間反応させることによって、メトキシ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（ＭＷ５０００）をアミノ官能基化ガラススライド上にグラフトさせたことを報告している。そのようなＰＥＧの固定化の後に、表面をトルエンで洗浄し、真空下で乾燥し、水で洗浄した。その後のフィブリノーゲンを用いた吸着試験でＰＥＧ被覆表面へのフィブリノーゲンの吸着が実質的に減少したことが明らかになったことが報告された。分枝した単官能ＰＥＧを含む様々なそのようなＰＥＧの製造が開示されており、タンパク質吸着を防止することによって表面を非汚損状態にすることができ、それにより、血液関連操作に有用な生体材料を製造することができることがＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｉｎｃ．の特許文献６に示されている。
【０００７】
特許文献２において、光感受性保護基または別の化学的除去可能な保護基を表面に最初に適用する、マイクロパターニング反応が行われている。このマイクロパターニングの後に、脂肪酸などの疎水性物質を塗布して非保護アミノ酸と反応させて、表面のこれらの領域を細胞およびタンパク質と非反応性にする。その後、保護物質を除去し、細胞接着物質を適用することにより、マイクロスポットの付着が望ましいパターンの位置を活性化する。あるいは、二官能分子を反応性ヒドロキシル基を含む全表面に適用し、次いで、機械的ステンシルを用いて細胞を後に付着させることが望ましい部分をマスクし、一方、塩化トレシル活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を適用して細胞反発部分としての残りの領域における二官能分子と反応させることが教示されている。
【０００８】
これらの特許において、読み取るか、またはイメージングする必要がある蛍光放射、光学濃度または放射能のようなシグナルを得るために、様々な標識をそのような分析技術に用いることができることが言及されている。これらの技術が進歩したので、蛍光イメージングはより一般的になっており、現在、多くの開発が平坦なプレートまたはマルチウェルプレート上のそのようなマイクロアレイにおける蛍光測定の改善に向けられている。
【０００９】
蛍光標識とともに使用するためにマイクロアレイを作製する場合、マイクロスポットにより保持されているプローブに付着する標識リガンドからの蛍光シグナルを増強するために、鏡面状基板を用いることが有利であることも知られている。特許文献７（２００３年１月１６日）に記載されているように、ガラススライド等に反射性金属、例えば、アルミニウムを被覆し、次いで、二酸化ケイ素やアルミナなどの誘電材料の層をオーバーコートし、次に、その層をアミノ変性シランなどの有機表面層で官能基化することができる。そのような被覆ガラススライドはアレイを作製するためのマイクロアレイの製造用に市販されていることが示されており、タンパク質結合物質、例えば、アビジン、プロテインＡおよび二官能性化学リンカーなどのアダプターは捕捉物質を付着させるために用いることができることが示唆されている。アレイ要素を基板上にスポットした後、その残りの非被覆表面は、その後の非特異的結合を防ぐために親水性末端を示す分子を用いてブロックすべきことも教示されている。システインおよびＢＳＡ、ならびに誘導体化基板表面に結合する少なくとも１つの末端が変性されたＰＥＧ類似体、例えば、約３４００〜５０００の分子量を有するジチオール変性ＰＥＧのようなポリマーブロッカーを含む様々なブロッキング剤が開示されている。他の提案された化学ブロッカーは、親水性側鎖で誘導体化されたＮ−置換グリシンのオリゴマーである。
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５，１４３，８５４号明細書
【特許文献２】米国特許第６，５４８，２６３号明細書
【特許文献３】国際公開第０２／０５９３７２号パンフレット
【特許文献４】米国特許出願公開第２００３／００４４８２３号明細書
【特許文献５】米国特許第５，６７２，６６２号明細書
【特許文献６】米国特許第５，９３２，４６２号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００３／００１３１０号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
非特異的タンパク質結合の問題を解決するためのこれらの以前の試みはある程度有望であることが示されたが、結果は完全に満足のいくものでなく、したがって、この問題に対するさらなる解決策が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
そのような表面を被覆するように多官能性親水性骨格を有するポリマーを基板表面にグラフティングし、多官能性イソシアネート分子への架橋によりそのようなポリマーを実質的な程度に架橋させることによって、非常に有効なタンパク質抵抗性マイクロアレイ基板表面が作製されることが今回発見された。そのようなコーティングは、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．により市販されており、この目的のために使用されている単官能および二官能ＰＥＧと比較してバックグラウンドノイズの除去の点で改善された性能を有するであろう。
【００１３】
１つの特定の態様において、本発明は、（ａ）有機官能基を有するように誘導体化されている平坦な不透過性上面を有する基板、（ｂ）有機捕捉物質を含む、または有機捕捉物質に直接もしくは間接的に結合するように構成された前記面のアレイ領域にわたる不連続の空間位置にある複数の３次元（３Ｄ）マイクロスポット、および（ｃ）マイクロスポットの周囲のアレイ領域における表面を被覆し、多官能性であり、多官能性イソシアネート分子を介して実質的な程度に架橋されている親水性骨格ポリマーを含み、前記面上の前記有機官能基にイソシアネート結合により共有結合しており、遊離イソシアネート基を供給するタンパク質抵抗性ポリマーコーティングを含むマイクロアレイを提供する。
【００１４】
他の特定の態様において、本発明は、バックグラウンド結合を最小限にするマイクロアレイを作製する方法であって、有機官能基で誘導体化されている平坦な不透過性上面を有する基板を準備する段階と、前記有機官能基に共有結合させることにより前記面の少なくともアレイ領域を被覆するために、多官能性であり、多官能性イソシアネート分子を介して実質的な程度に架橋した親水性骨格ポリマーを含むタンパク質抵抗性ポリマーコーティングを施す段階と、前記コーティングを硬化させる段階と、前記面のアレイ領域内にわたる不連続の空間位置に複数の３次元ヒドロゲルスポットを付着させる段階と、問題の種々の有機捕捉物質を種々の前記３次元スポットに結合させる段階とを含む方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
酵素、抗体、ペプチドまたは他の生物活性分子、例えば、アプタマーの使用は、バイオアッセイおよびプロテオミクスの分野におけるスクリーニング用ツールの作製においてますます注目を集めており、これらの生物活性物質用の３次元ヒドロゲル支持体の使用は最近重要なものとなっている。ヒドロゲルは、水を含むポリマーマトリックスである。特に、タンパク質または他のそのような物質を他のいくつかの分子スケールの結合を用いて固体支持体表面に直接付着させたときに生ずるより変性性環境と対照的に、ヒドロゲルは、天然の水性細胞環境により類似した生体物質用の支持体となる。本発明は、固体基板上のマトリックスとして均一に配置されたヒドロゲル物質の多数の３次元（３Ｄ）マイクロスポットにより形成されるマイクロアレイの製造に使用することに特別の利点を有すると考えられる。しかし、３次元マイクロスポットの周囲のタンパク質抵抗性領域を有するマイクロアレイを提供するための本明細書に開示するこの不動態化法は、有機プローブまたは他の部分が基板の官能基化表面に直接または短いリンカーを介して付着している２次元マイクロアレイについても有利に用いることができる。
【００１６】
本発明の特徴を具体化するマイクロアレイに用いる固体支持体または基板は、製品の意図した用途によって異なっていてよい。固体支持体は、アレイが使用される分析方法に適合する適切な材料であってよいが、好ましくは不透過性の堅い材料である。適切な材料としては、石英により形成されるようなガラスおよびケイ素、ならびにポリマー、例えば、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリカーボネートおよびそのコポリマー、例えば、塩化ビニル／プロピレンポリマー、塩化ビニル／酢酸ビニルポリマー、スチレンコポリマー等がある。金属および金属コーティング、例えば、金、白金、銀、銅、アルミニウム、チタンおよびクロムならびにその合金も用いることができる。
【００１７】
基板は、しばしば２つまたはそれ以上の異なる材料の層の複合体、すなわち、１つまたは複数の表面コーティング層を有する上記のような支持体であってよい。例えば、ガラス支持体に反射性金属層、例えば、金、アルミニウムまたはチタンを被覆し、その上面に最初に二酸化ケイ素をオーバーコートし、次いで、有機基、例えば、アミノ変性またはチオール変性シランで官能基化することができる。
【００１８】
固体基板はその意図する用途によって様々な形態および寸法を有していてよいが、少なくとも１つの実質的に平面を有するプレート、例えば、矩形の形態のスライドまたはプレートが通常用いられる。一般的に約１ｃｍから約４０ｃｍまでの長さおよび幅を有する平坦な矩形スライドが用いられ、プレートは通常約３０ｃｍを超えず、約２０ｃｍまたはそれ以下が最も多い。支持体の厚さは、所望の堅さを保証するように、基材が作られている材料に一部は依存して、一般的に約０．０１ｍｍから約１０ｍｍの範囲にある。標準的顕微鏡スライドの寸法、すなわち、約２．５４ｃｍ×７．６２ｃｍで、厚さ１〜２ｍｍが一般的に用いられている。
【００１９】
１つの例として、ガラススライドは、反射性アルミニウム層を被覆し、これに多くの比色標識からの放射または励起光の波長の１／４にほぼ相当する約５００Å〜約２０００Åの厚さを有する二酸化ケイ素または一酸化ケイ素の層でオーバーコートしてよい。アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、トリクロロシラン、トリメトキシシランのようなアミノアルキルトリアルコキシシラン、または他の適切なトリアルコキシシランの層を酸化物の表面に被覆する。他の適切なアミノシランも用いてもよいと思われる。このシラン層の厚さは、約３Å〜約１００Å、より好ましくは約５Å〜約５０Å、最も好ましくは約７Å〜約２０Åである。１つの適切な例は、厚さが約７ÅであるＡＰＳ層である。これらのアミノ変性表面は、改善されたタンパク質抵抗性コーティングおよび／または３次元マイクロスポットを直接付着させるのに用いられる。
【００２０】
３次元マイクロスポットのこのような使用は好ましいが、アレイに用いられる有機プローブまたは他の捕捉部分に結合させるための結合剤は、（１）基材の無機固体表面に直接付着させるか、または（２）官能基化された有機上層を用いて付着させることができる。例えば、ガラスのような支持体の表面にアルミニウム、金またはチタンのような金属の薄層を被覆する場合、結合剤は、官能基化させずに金属基板表面に直接結合するのに用いることができる。例えば、チオール固定基は、介在官能基化層を用いずに金のような金属に直接結合するのに用いることができるが、上記のように、アミノ変性アルキルシラン（アミノシラン）のような官能基化有機層を用いることが好ましい。そのような官能基化有機層を用いる場合、層の有機分子の末端は、結合剤またはヒドロゲル等を安定に付着させることができる反応性基を備えている。適切な末端基は当技術分野でよく知られており、そのようなものは基板の上面に３次元マイクロスポットを付着させるために用いることが好ましい。
【００２１】
前に示したように、本発明は、タンパク質または細胞チップ、特に、３次元マイクロスポットを用いるマイクロアレイの製造に用いる場合に明確な利点を有すると考えられる。そのようなマイクロアレイ用のヒドロゲルマイクロスポットを形成するためのイソシアネート官能性プレポリマーは、二官能または多官能性イソシアネート化合物と反応するポリオキシアルキレンジオールまたはポリオールからしばしば調製される。好ましいプレポリマーは、エチレンオキシド単位のホモポリマーまたはエチレンオキシド単位とプロピレンオキシドもしくはブチレンオキシド単位の混合物を含むブロックもしくはランダムコポリマーを含む比較的低分子量のポリオキシアルキレンジオールまたはポリオールから調製されるものである。そのようなブロックもしくはランダムコポリマーの場合、単位の少なくとも７５％がエチレンオキシド単位であることが好ましい。そのようなポリオキシアルキレンジオールまたはポリオールの分子量は、好ましくは約５００〜１００００ダルトン、より好ましくは１０００〜６０００ダルトンである。適切なプレポリマーは、選択したポリオキシアルキレンジオールまたはポリオールとポリイソシアネートとを、本質的にすべてのヒドロキシル基がポリイソシアネートでキャップされるように約１．２〜約２．２のイソシアネート対ヒドロキシル比で反応させて調製することができる。一般的に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）またはそのコポリマーが好ましい。用いるイソシアネート官能性プレポリマーは、約０．１ｍｅｑ／ｇ〜約２ｍｅｑ／ｇ、より好ましくは約０．２ｍｅｑ／ｇ〜約１．５ｍｅｑ／ｇの量の活性イソシアネートを含むことが好ましい。例えば、２０００ダルトン未満の特に低い分子量のプレポリマーを用いる場合には、それらは好ましくは比較的高いイソシアネート含量（約１ｍｅｑ／ｇまたはそれより高い）を含むべきである。
【００２２】
この一般的な種類のプレポリマーの固有の反応性は、重合時の化学的官能基化基板へのポリマーの容易な共有結合による付着を促進する。有機官能基で誘導体化されているそのような表面がマイクロアレイの製造に用いる基板上に設けられていることが好ましく、それらは、そのような基板上への既知のパターンでの重合ヒドロゲルマイクロスポットの付着ならびにタンパク質抵抗性コーティングの周囲領域への付加を促進する。
【００２３】
上記のように、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｄｒｓ，Ｉｎｃ．は、表面を非汚損状態にするためにＰＥＧを第一級アミンに結合させるために用いることができる様々な末端変性ＰＥＧを含む単官能性ＰＥＧを市販している。これらは、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジル活性エステル（ＮＨＳ）、グリシジルエーテル（「エポキシド」）およびイソシアネート（ＮＣＯ）のような調節剤を含む。これらの変性ＰＥＧは様々なサイズのものが市販されており、例えば、ｍＰＥＧ−スクシニミジルプロピオネート−ＮＨＳ（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ−ＮＨＳ）は３つのサイズ２Ｋ、５Ｋおよび２０Ｋのものが市販されている。ＰＥＧ−ＮＨＳ、ＰＥＧ−エポキシド、ＰＥＧ−ＮＰＣは、水性溶媒中で用いることができる。ＰＥＧ−ＮＣＯは、塩基触媒としてのトリエチルアミンとともに有機溶媒中で用いる（ＮＣＯは水と反応する）。
【００２４】
本発明の特徴を具体化したタンパク質抵抗性ポリマーコーティングは、ヒドロゲル材料の３次元マイクロスポットの付着の前または後にマイクロアレイの基板の表面に施すことができる。下文では製造の種々の結果を述べる。タンパク質抵抗性コーティングを基板に固定するために、官能基化表面の官能基を用いることが好ましい。
【００２５】
タンパク質を特定の分析で試験しているとき、実質的な非特異的結合が存在する場合、相補的なプローブが位置するマイクロアレイ上の特定の位置における結合に利用可能な該タンパク質の量は減少し、それにより、分析の総合的感度は低下する。このポリマーコーティングは、非特異的に結合し、蛍光シグナルまたは他の比色シグナルの画像に関して望ましくないバックグラウンド（バックグラウンドノイズと呼ばれるもの）を生じさせる可能性がある広範囲のタンパク質に関するこの非特異的結合の問題を効果的に未然に防ぐ。シグナルとバックグラウンドとの比の低下は画像／分析ソフトウェアにとって妨げとなることはよく知られている。
【００２６】
タンパク質抵抗性ポリマーコーティングは、官能基化基板表面上の有機基に共有結合するように設計されており、好ましくはウレタンまたは尿素結合により実質的な程度に架橋している親水性骨格ポリマーを有する。ＰＥＧ、ＰＰＧおよびそのコポリマーを含む種々の適切なポリオレフィンエーテル骨格ポリマーを用いることができる。好ましいものは、官能基化基板表面上の有機基と容易に反応し、共有結合するように、イソシアネートで変性されているＰＥＧ（またはそのＰＰＧコポリマー）である。先に示したように、表面に結合する有機基は、ヒドロキシル、アミノ、チオールまたはマレイミドなどの当技術分野でよく知られているもののうちのいずれかであってよく、したがって共有結合を生じさせる誘導体化親水性ポリマー分子が選択される。好ましくは、ＰＥＧ末端は、基板を誘導体化するのに用いることができる種々の通常の有機基と共有結合により反応するイソシアネートで変性されている。コーティング材料を溶液として塗布し、架橋し、マイクロスポットの周囲の領域における基板の官能基化表面上の実質的にすべてのアミノ基と共有結合するのに適する時間および他の条件下で反応させる（本明細書では硬化と呼ぶ）。あるいは、コーティングは、全アレイ領域にわたり、または３Ｄマイクロスポットの付着の前にマイクロスポットを配置する位置を取り囲むパターンで施すことができる。これらのイソシアネート変性分子は、アミノシラン等で誘導体化された表面上のアミノ基と強い尿素結合を形成する。
【００２７】
ＰＥＧ骨格ポリマーをコーティングに用いる場合、脂肪族、脂環式、芳香族脂肪族（ａｒａｌｉｐｈａｔｉｃ）または芳香族ポリイソシアネートのような適切な有機ポリイソシアネートを用いて単独または２つまたはそれ以上の混合物でこれらの分子を誘導体化することができる。芳香族および脂肪族イソシアネートが好ましい。芳香族イソシアネート化合物は、脂肪族イソシアネート化合物より一般的に経済的であり、ヒドロキシルとの反応性が高く、しばしばより好ましい。適切な芳香族イソシアネート化合物としては、２，４−トルエンジイソシアネート（ＴＤＩ）、２，６−トルエン（市販のＴＤＩ中に存在する）ジイソシアネート、トリメチロールプロパンのＴＤＩ付加化合物（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、Ｐａ．）からＤＥＳＭＯＤＵＲ  ＣＢとして入手可能）、ＴＤＩのイソシアヌル酸三量体（ＢａｙｅｒからＤＥＳＭＯＤＵＲ  ＩＬとして入手可能）、ジフェニルメタン４，４’−ジイソシアネート（ＭＤＩ）、ジフェニルメタン２，４’−ジイソシアネート、１，５−ジイソシアナトナフタリン、１，４−フェニレンジイソシアネート、１，３−フェニレンジイソシアネート、１−メトキシ−２，４−フェニレンジイソシアネート、１−クロロフェニル−２，４−ジイソシアネートおよびその混合物などがある。芳香族イソシアネートのうち、特に好ましいものはＴＤＩとＭＤＩである。
【００２８】
有用な脂環式イソシアネート化合物の例としては以下のものが挙げられる。ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート（ＢａｙｅｒからＤＥＳＭＯＤＵＲ  Ｗとして市販されている）、４，４’−イソプロピル−ビス（シクロヘキシルイソシアネート）、イソホロンジイソシアネート（ＩＰＤＩ）、シクロブタン−１，３−ジイソシアネート、シクロヘキサン−１，３−ジイソシアネート、シクロヘキサン−１，４−ジイソシアネート（ＣＨＤＩ）、１，４−シクロヘキサンビス（メチレンイソシアネート）（ＢＤＩ）、１，３−ビス（イソシアナトメチル）シクロヘキサン３−イソシアナトメチル−３，５，５−トリメチルシクロヘキシルイソシアネートおよびその混合物。
【００２９】
有用な脂肪族イソシアネート化合物の例としては、１，４−テトラメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレン１，４−ジイソシアネート、ヘキサメチレン１，６−ジイソシアネート（ＨＤＩ）、１，１２−ドデカンジイソシアネート、２，２，４−トリメチル−ヘキサメチレンジイソシアネートまたは２，４，４−トリメチル−ヘキサメチレンジイソシアネート（ＴＭＤＩ）、２−メチル−１，５−ペンタメチレンジイソシアネート、二量体ジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネートの尿素、ヘキサメチレン１，６−ジイソシアネート（ＨＤＩ）のビウレット（ＢａｙｅｒからＤＥＳＭＯＤＵＲ−１００および−３２００として入手可能）、ＨＤＩのイソシアネート（ＢａｙｅｒからＤＥＳＭＯＤＵＲ−３３００および−３６００として入手可能）、ＨＤＩのイソシアヌレートとＨＤＩのウレトジオンの混合物（ＢａｙｅｒからＤＥＳＭＯＤＵＲ−３４００として入手可能）およびその混合物などがある。
【００３０】
芳香族脂肪族の例としては、ｍ−テトラメチルキシレンジイソシアネート（ｍ−ＴＭＸＤＩ）、ｐ−テトラメチルキシレンジイソシアネート（ｐ−ＴＭＸＤＩ）、１，４−キシレンジイソシアネート（ＸＤＩ）、１，３−キシレンジイソシアネート、ｐ−（１−イソシアナトエチル）−フェニルイソシアネート、ｍ−（３−イソシアナトブリル）−フェニルイソシアネート、４−（２−イソシアナトシクロヘキシルメチル）−フェニルイソシアネートおよびその混合物などがある。
【００３１】
本出願の目的のために、多官能性とは３つまたはそれ以上の官能基を意味するが、ポリイソシアネートは２つまたはそれ以上の官能基を指すのに用いる。適切なトリイソシアネートは、３モルのジイソシアネートと１モルのトリオールを反応させることによって得ることができる。例えば、トルエンジイソシアネート、３−イソシアナトメチル−３，４，４−トリメチルシクロヘキシルイソシアネートまたはｍ−テトラメチルキシレンジイソシアネートを１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）プロパンと反応させてトリイソシアネートを生成させることができる。ｍ−テトラメチルキシレンジイソシアネートとの反応による生成物は、ＣＹＴＨＡＮＥ３１６０（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄ、Ｓｔａｍｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ）として市販されている。
【００３２】
先に示したように、施すタンパク質抵抗性ポリマーコーティングは実質的な程度に架橋していることが望ましい。実質的な程度に架橋するとは、架橋が骨格ポリマーと少なくとも約２．５％、好ましくは少なくとも５％の多官能性イソシアネート分子の間で形成されていることを意味する（したがって、少なくとも３つの異なる骨格ポリマーに架橋している）。より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％の多官能性分子がそのような３つの架橋を有する。骨格分子がポリオキシアルキレンジオールまたはポリオールまたは他のそのようなポリエーテルである場合、それらは、上文で述べたように２官能性または３官能性イソシアネートにより誘導体化されている場合、ポリウレタンプレポリマーとして塗布することができる。それらの架橋または硬化は、そのようなプレポリマーを水溶液の一部として塗布することにより、基板の表面に付着させた有機部分への共有結合により同時に完了することができる。あるいは、架橋反応は、当技術分野でよく知られているように触媒させることができる。
【００３３】
施すポリマーコーティングは、本質的に単分子層であってよいので、実際にさほどの厚さを有さない。通常、それは少なくとも約３分子層の厚さであり、一般的に厚さは約０．１ミクロンより厚くない。しかし、基板の全アレイ領域を最初にタンパク質抵抗性コーティングで最初に被覆する場合には、３Ｄマイクロスポットがその後に強く結合する十分な反応性基が得られるように、コーティングの特性を選択し、調節する。これに関して、マイクロスポットがイソシアネートキャップポリウレタンから形成されたヒドロゲルである場合、約５０％以上のポリイソシアネート分子が少なくとも１つの未反応のイソシアネート部分を有するタンパク質抵抗性コーティングは、そのような３Ｄマイクロスポットのその後の付着のために十分なプラットフォームを備えている。
【００３４】
全体的にみて、本発明は、これらのタンパク質抵抗性表面を有するマイクロアレイの作製を行うための種々の順序または手順を提供する。そのようなマイクロアレイの１つの実施形態として、二酸化ケイ素の層をオーバーコートし、次に官能基化アミノ基を得るためにアミノシランで被覆した反射性アルミニウム層を有する市販のガラススライドを用いる。これらのようなスライドは、Ｅｒｉｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＣｏｍｐａｎｙおよびＴｅｌｅＣｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．により市販されている。
【実施例】
【００３５】
以下の実施例に、タンパク質チップに関するいくつかの適用例を示す。抗原−抗体相互作用（および本明細書で言及した他のそのような相互作用）のこれらの例は実際的な例を示すものにすぎず、添付した特許請求の範囲に規定されている本発明に対する制限を構成するものではない。
【００３６】
実施例１
マイクロスポットが既に配置されている場合に非特異的結合を阻止し、スライドのバックグラウンドノイズを低下させるために施すコーティング
この実験では、抗体を固定するためのマトリックスとしてのヒドロゲルプラットフォームを用いる。抗原−抗体相互作用は様々な生物学的検定に日常的に用いられており、いずれかの成分（抗体または抗原）を固定する能力は、そのようなマイクロアレイを作製するための基板抗原の望ましい特徴であり、また、基板の望ましい特徴である。所望の捕捉物質を所定の位置に含むマイクロアレイの場合には、タンパク質抵抗性ポリマーコーティングを施す。
【００３７】
トレハロース保存溶液である、５０ｍＭのホウ酸ナトリウム水性緩衝液ｐＨ８．０中５０重量／容積％Ｄ（＋）トレハロース二水和物を５０μｌの最終容積のヒドロゲル製剤に加える。製剤は、３．５重量％の最終濃度のＨＹＰＯＬ  ＰｒｅＭＡ（登録商標）Ｇ−５０ヒドロゲルプレポリマー（それぞれ１：３：３の重量／重量／重量比のＨＹＰＯＬ、アセトニトリル、−メチル−２−ピロリジノンを含むプレミックス保存溶液）、抗トランスフェリン（４ｍｇ／ｍｌのリン酸緩衝食塩水１×（ＰＢＳ）、２μｌのウシＩｇＧ（ＰＢＳおよび１．２５％グリセロール中５０ｍｇ／ｍｌ）を含む。トレハロースは、約５％のトレハロースの最終重量／容積％が得られるように含める。タンパク質を含まないブランク３Ｄヒドロゲルスポットを含める。
【００３８】
試験溶液の複数の微小液滴ならびにブランクヒドロゲルの複数の微小液滴をマルチプルピンを用いてアミノシラン被覆ガラススライド上にスポットする。封じ込められている試験タンパク質は抗トランスフェリンであり、ヒドロゲル製剤を９４〜９５％ＲＨのもとで約１９℃で少なくとも約１８０分間、完全硬化させる。
【００３９】
０．０５％のＭＤＩ誘導体化ＰＥＧトリオールを含む溶液を適切な溶媒、すなわちアセトニトリルを用いて調製する。ＰＥＧ骨格の分子量は、約１０，０００分子量単位（ダルトン）である。２０ｍｌのアセトニトリル／ＰＥＧの溶液に、塩基触媒としての２０μｌのトリエチルアミン（ＴＥＡ）を加える。タンパク質ヒドロゲルマイクロスポットを乾燥させずに、スライドをＰＥＧ／アセトニトリル／ＴＥＡ溶液中に約１０秒間浸し、次いで、清浄なアセトニトリルで１０秒間洗浄した後、ｐＨ７．４の１×ＰＢＳで水性洗浄する。
【００４０】
システムをＣｙ３蛍光色素標識トランスフェリン（Ａｍｅｒｓｈａｍ、０．１％のトリトンＸ１００を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中の約０．１μｇ／ｍｌおよび１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））とともに４５℃で定期的に振とうしながらインキュベートする。インキュベーションの後、スライドをＰＢＳＴで１０分間２回洗浄し、次いで、ＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｌｉｔｅスライドスキャナを用いて画像を得る。ブランクヒドロゲルスポットは、検出可能なシグナルを示さず、トレハロース抗体スポットは強いシグナルを示す。Ｃｙ３標識トランスフェリンは、ヒドロゲルマイクロスポット内のその天然リガンドに特異的に結合し、ヒドロゲル自体またはガラス基板に対する検出可能な結合活性はほとんどない。
【００４１】
マイクロスポットの周囲のスライドの領域に有意なシグナルが存在しないことは、非特異的に結合するタンパク質が基板に結合することを妨げるが、３Ｄマイクロスポット内の複合体の実現を妨げないという点でのこのコーティングの有効性を示すものである。
【００４２】
実施例２
事前に施されるコーティングの使用
前の実施例で述べたように、抗原−抗体反応は生物学的検定に日常的に用いられている。この実施例では、コーティングをあらかじめ施し、抗体を固定するのとは対照的に、抗原を３Ｄヒドロゲルマトリックス内に固定する。
【００４３】
１％のＭＤＩ誘導体化ＰＥＧトリオールの溶液を適切な溶媒、すなわちアセトニトリルを用いて調製する。Ｒｅｐｅｌ−Ｓｉｌａｎｅ  ＥＳは、オクタメチルシクロオクタシランに溶解したジメチルジクロロシランの２％溶液である。ＰＥＧ骨格の分子量は、約１０，０００分子量単位である。２０ｍｌのアセトニトリル／ＰＥＧの溶液に、塩基触媒としての２０μｌのトリエチルアミン（ＴＥＡ）を加える。スライドをＰＥＧ／アセトニトリル／ＴＥＡ溶液中で室温で撹拌しながら１０分間インキュベートする。次いで、清浄なアセトニトリル中で撹拌しながら１０分間３回洗浄する。最終のアセトニトリル洗浄後に、スライドを脱イオン化水で１時間洗浄し、次いで、エタノールですすぎ、乾燥する。
【００４４】
実施例１で述べた方法を用いて、タンパク質抗原であるヒトトランスフェリン（０．２ｍｇ／ｍｌ）を、そのような前処理したガラススライド上の複数の３Ｄマイクロスポットとしての５％のトレハロース、２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む３．３％のヒドロゲルに種々の希釈度で直接固定化する。スライドを種々の濃度の抗ヒトトランスフェリンを含むマウス復水とともに１時間インキュベートする。インキュベーションの後に、スライドをＰＢＳＴで１０分間３回洗浄する。スライドをＣｙ３標識ロバ抗マウスＩｇＧとともにインキュベートした後、レーザー走査画像法によりマウス抗トランスフェリン抗体を可視化する。線型用量反応が３桁の希釈度、すなわち０．１〜０．００１にわたって認められ、全体的な検定方法の一部としてのマトリックス内への抗体の逐次拡散を裏付けるヒドロゲルマトリックス内に固定された抗原の機能性とヒドロゲルマトリックスの透過性を示している。
【００４５】
Ｃｙ３標識二次抗体は、一次抗トランスフェリン抗体がヒドロゲルマイクロスポット内のその天然リガンドに特異的に結合し、ヒドロゲル自体または被覆ガラス基板に対する検出可能な結合活性はほとんどないことを示している。３Ｄマイクロスポットの周囲のスライドの領域に有意なシグナルが存在しないことは、このコーティングは非特異的に結合するタンパク質が基板に結合することを妨げるのに効果的であり、３Ｄマイクロスポット内の複合体の形成の実現を妨げないことを示すものである。
【００４６】
本発明を発明者が現在考える最良の形態を含む多くの異なる実施形態に関して記述したが、当業者に明らかであると思われる変更および修正は本明細書に添付した特許請求の範囲に示されていることを理解すべきである。例えば、種々の捕捉物質を含む複数のマイクロスポットを有するバイオチップの使用に利点はあるが、特定の状況では、１つのみの捕捉物質を含むバイオチップが望ましいことがある。
【国際調査報告】
2008510165.tif 000002
2008510165.tif 000003
2008510165.tif 000004