(57)【要約】【課題】テロメアがテロメラーゼ及び／又はＡＬＴのメカニズムによって維持されている細胞（癌細胞など）の増殖を阻害できる、治療的なヌクレオシドのアナログを同定すること。【解決手段】増殖細胞（癌細胞（例えばヒト癌細胞）など）において、それに対応する通常の体細胞にとり細胞障害性でないレベルで、テロメラーゼ活性及びＬ−１（ＬＩＮＥ−１）レトロトランスポゾンでコードされる逆転写酵素（Ｌ１ＲＴ）活性を妨害できる、非環状ヌクレオシドのアナログ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
不適当に若しくは病理的に増殖する細胞又は不死化細胞の存在により生じる障害を予防するための、又は哺乳類若しくはヒトの癌を治療するための方法であって、当該方法が、１つ以上の非環状ヌクレオシドのアナログ又はその薬学的に許容できる塩を含有する組成物の治療上有効量を、癌に罹患するヒトに投与することを含んでなる方法。
【請求項２】
前記ヌクレオシドのアナログがアシクロビル、ガンシクロビル及びペンシクロビル又はそのプロドラッグからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記癌が骨肉腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、副腎皮質癌又は黒色腫である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記組成物が経口投与、非経口投与、皮下投与、筋肉内投与又は血管内投与される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
２つ以上の前記ヌクレオシドのアナログを含有する組成物が投与される、請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記ヌクレオシドのアナログの１つが、１日当たり約１０ｍｇ／ｋｇ体重〜約１５０ｍｇ／ｋｇ体重で投与される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記ヌクレオシドのアナログが放射線治療及び／又は非ヌクレオシドによる化学療法との組合せで投与される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
腫瘍細胞のテロメア伸長の妨害方法であって、非環状ヌクレオシドのアナログの有効量を細胞に投与することを含んでなる方法。
【請求項９】
前記ヌクレオシドのアナログがアシクロビル、ガンシクロビル及びペンシクロビル又はそのプロドラッグからなる群から選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記ヌクレオシドのアナログが３’−アジド−２’，３’−ジデオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）及び２’，３’−ジデヒドロ−３’−デオキシチミジン（ｄ４Ｔ）からなる群から選択される異なるタイプのアナログとの組合せで投与され、前記異なるタイプのアナログが低用量で含まれ、それ単独ではテロメア伸長の停止には不十分である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記癌が骨肉腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、副腎皮質癌又は黒色腫である、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
テロメラーゼ陽性細胞の成長を防止又は阻害する方法であって、非環状ヌクレオシドのアナログの有効量を細胞と接触させることを含んでなる方法。
【請求項１３】
前記細胞を約１．５μＭ〜３．０μＭの濃度のヌクレオシドのアナログと接触させる、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記ヌクレオシドのアナログがアシクロビル、ガンシクロビル若しくはペンシクロビル又はそのプロドラッグである、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記テロメラーゼ陽性細胞が癌細胞であり、前記癌細胞が骨肉腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、副腎皮質癌及び黒色腫からなる群から選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
ヒトにおける癌の予防方法であって、前記癌がヒトの細胞のテロメラーゼ活性に起因し、１つ以上の非環状ヌクレオシドのアナログ又はその薬学的に許容できる塩を含有する組成物を前記ヒトに治療上有効量で投与することを含んでなる方法。
【請求項１７】
前記癌が骨肉腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、副腎皮質癌及び黒色腫からなる群から選択される、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
癌に罹患する個人の治療方法であって、前記個人に治療上有効量の逆転写酵素の阻害剤又はアンタゴニストを含有する組成物を投与することを含んでなり、前記逆転写酵素がＬ−１（ＬＩＮＥ−１）レトロトランスポゾン若しくはテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）によってコードされ、前記個人の前記細胞における前記テロメア伸長に関係し、前記阻害剤又はアンタゴニストが前記テロメア伸長をブロックし、前記阻害剤又はアンタゴニストがアシクロビル、ガンシクロビル及びペンシクロビル又はそのプロドラッグからなる群から選択される非環状ヌクレオシドのアナログである方法。
【請求項１９】
前記癌が移植後リンパ組織増殖性疾患を含まない、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記癌が骨肉腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、副腎皮質癌又は黒色腫である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物が経口投与、非経口投与、皮下投与、筋肉内注射、血管内注射又は局所投与される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ヒトの癌の治療方法であって、前記癌がテロメラーゼにより媒介されるテロメア伸長、又はヒトの細胞中のＬ−１（ＬＩＮＥ−１）レトロトランスポゾンでコードされる逆転写酵素により誘導される選択的テロメア伸長を示している前記細胞に起因し、前記方法が、癌に罹患する前記ヒトに、治療上有効量の１つ以上の非環状ヌクレオシドのアナログ又はその薬学的に許容できる塩を含有する組成物を投与することを含んでなり、前記ヌクレオシドのアナログが前記テロメア伸長をブロックし、前記ヌクレオシドのアナログがアシクロビル、ガンシクロビル及びペンシクロビル又はそのプロドラッグからなる群から選択される方法。
【請求項２３】
２つ以上の前記ヌクレオシドのアナログを含有する組成物が投与される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
投与される前記ヌクレオシドのアナログの１つが、１日当たり約１００ｍｇ／ｋｇ体重〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重で投与される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
テロメラーゼ陽性及びテロメラーゼ陰性腫瘍細胞のテロメア伸長を停止させる方法であって、前記方法が、癌に罹患する前記ヒトに、治療上有効量の１つ以上の非環状ヌクレオシドのアナログ又はその薬学的に許容できる塩を含有する組成物を投与することを含んでなり、前記ヌクレオシドのアナログが前記テロメア伸長をブロックし、前記ヌクレオシドのアナログがアシクロビル、ガンシクロビル及びペンシクロビル又はそのプロドラッグからなる群から選択される方法。
【請求項２６】
前記ヌクレオシドのアナログが、３’−アジド−２’，３’−ジデオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）及び２’，３’−ジデヒドロ−３’−デオキシチミジン（ｄ４Ｔ）からなる群から選択される異なるタイプのアナログとの組合せで投与され、前記異なるタイプのアナログが低用量で含まれ、それ単独ではテロメア伸長の停止には不十分である、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記癌が骨肉腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、副腎皮質癌又は黒色腫である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
テロメア伸長を示しているテロメラーゼ陽性若しくは陰性細胞の成長を防止若しくは阻害する方法であって、前記方法が、ヌクレオシドのアナログを前記細胞と接触させることを含んでなり、前記ヌクレオシドのアナログが前記テロメア伸長をブロックし、前記ヌクレオシドのアナログがアシクロビル、ガンシクロビル及びペンシクロビル又はそのプロドラッグからなる群から選択される方法。
【請求項２９】
前記細胞を０．２μＭの濃度のヌクレオシドのアナログと接触させる、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記テロメラーゼ陰性細胞が癌細胞であり、前記癌細胞が骨肉腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、副腎皮質癌又は黒色腫からなる群から選択される、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
系内におけるテロメラーゼ又はＬ１ＲＴ活性の妨害方法であって、前記テロメラーゼ又はＬ１ＲＴ活性により媒介されるテロメア伸長を示す前記系に所定量のヌクレオシドのアナログを与えることを含んでなり、前記ヌクレオシドのアナログが前記テロメア伸長をブロックし、前記ヌクレオシドのアナログがアシクロビル、ガンシクロビル若しくはペンシクロビル、又はそれらのプロドラッグであり、前記系がインヴィトロ又はインビボで増殖する細胞である方法。
【請求項３２】
ヒトの癌の予防方法であって、前記癌が前記ヒトの細胞内のテロメラーゼ又はＬ−１（ＬＩＮＥ−１）レトロトランスポゾンによりコードされる逆転写酵素により誘導又は媒介される選択的テロメア伸長を示している細胞に起因し、前記方法が、前記ヒトに治療上有効量の１つ以上のヌクレオシドのアナログはその薬学的に許容できる塩を含有する組成物を投与することを含んでなり、前記ヌクレオシドのアナログが前記テロメア伸長をブロックし、前記ヌクレオシドのアナログがアシクロビル、ガンシクロビル及びペンシクロビル又はそのプロドラッグからなる群から選択される方法。
【請求項３３】
前記癌が骨肉腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、副腎皮質癌及び黒色腫からなる群から選択される、請求項３２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本特許出願は２００５年５月１８日に出願の米国特許仮出願第６０／６８２１１０号の優先権を主張し、その全開示内容を本発明に援用する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は広義には癌の治療に関する。具体的には、本発明は癌細胞のテロメア伸長の調節に関する。更に具体的には、本発明は癌の治療若しくは予防のための、非環状ヌクレオシドのアナログの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡのリーディング鎖及びラギング鎖の合成における非対称は、線形ゲノムの複製における「末端問題」を生じさせる（非特許文献１）。この問題を解決するために、真核生物染色体は、ＴＴＡＧＧＧリピートからなる特殊な末端構造（テロメア）を有する（非特許文献２）。テロメラーゼは（非特許文献３，４）はリボ核タンパク酵素であり、テロメアを延長し、それにより細胞分裂の間、癌細胞の大多数の染色体安定性を維持する（非特許文献５）。細胞分裂の間におけるテロメア末端からのＤＮＡの段階的な損失は、体細胞の細胞増殖ポテンシャルの制御に関係するといわれている（非特許文献６）。
【０００４】
通常のヒト培養細胞は、培養液中では限られた増殖ポテンシャルしか有さない。培養液中の通常の細胞は、増殖が終了時点に至るまで、細胞増殖を行う。これは死亡ステージ１（Ｍ１ステージ）と称され、幾つかのテロメアが、細胞老齢と呼ばれる成長停止状態を生じさせるサイズに縮小することによって生じる。このステージは、ｐ５３及びｐＲＢヒト腫瘍抑制遺伝子の機能の停止により迂回させることができる。その後細胞は、他のチェックポイント死亡ステージ２（Ｍ２ステージ）又は危機ステージと称する）までテロメア長が更に減少するまで増殖することができる。Ｍ２ステージの成長停止は、細胞増殖及び細胞死率との間のバランスによって生じる。この段階、すなわち大部分のテロメアが極めて短いとき、末端同士の融合及び染色体損傷−融合により、著しい染色体異常及びアポトーシスが生じる。特殊な状況下では、そのテロメアの長さを安定させることによって細胞のＭ２を回避でき、不死化させることができる。これは酵素テロメラーゼの活性化又は選択的テロメア伸長メカニズム（すなわちテロメア又はＡＬＴの選択的伸長）によって可能となる（非特許文献７、８）。
【０００５】
ヒト生殖細胞系及び大多数の癌細胞では、テロメラーゼが発現している（非特許文献９）。テロメラーゼによる縮小テロメアの伸長は、ヒト癌細胞におけるテロメア維持の主なメカニズムである（非特許文献１０）。テロメラーゼの抑制によりテロメア長が減少し、その結果ヒトテロメラーゼ陽性癌細胞の成長が抑制される。
【０００６】
ヌクレオシドのアナログ（例えばＡＺＴ）の使用による、癌治療を目的とするヒトテロメラーゼ活性の妨害の試みがなされている。しかしながら、従来技術として開示されている、テロメラーゼ活性の調節を目的としてヌクレオシドのアナログを投与する方法は臨床的に不十分であるか、又はそれらの臨床有用性が低い治療比率（すなわち有効投与量に対する毒量の比率）により限定されたものとなり、不適切である。
【０００７】
更に癌細胞などの細胞の増殖能力は、テロメラーゼ媒介性のテロメア伸長メカニズム及び／又はＡＬＴメカニズムの活性化に起因するため、細胞増殖制御のための理想的なヌクレオシドアナログが通常の細胞及び組織に対する毒性が最小であるか、又は無毒であることが、当該メカニズムにとり効果的であると考えられる。
【非特許文献１】Ｏｌｏｖｎｉｋｏｖ，Ａ．Ｍ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  ｍａｒｇｉｎｏｔｏｍｙ  ｉｎ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｄｏｋｌ．Ａｋａｄ．Ｎａｕｋ  ＳＳＳＲ  ２０１，１４９６−１４９９（１９７１）
【非特許文献２】Ａｌｌｓｈｉｒｅ，Ｒ．Ｃ．，Ｄｅｍｐｓｔｅｒ，Ｍ．，Ｈａｓｔｉｅ，Ｎ．Ｄ．Ｈｕｍａｎ  ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎ  ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｔｈｒｅｅ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  Ｇ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  ｎｏｎ−ｒａｎｄｏｍｌｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７，４６１１−４６２７（１９８９）．
【非特許文献３】Ｇｒｅｉｄｅｒ，Ｃ．Ｗ．，Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｅ．Ｈ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｅｘｔｒａｃｔｓ．Ｃｅｌｌ  ４３，４０５−４１３（１９８５）．
【非特許文献４】Ｍｏｒｉｎ  ＧＢ．Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｓ  ａ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈａｔ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｓ  ＴＴＡＧＧＧ  ｒｅｐｅａｔｓ．Ｃｅｌｌ．１９８９  Ｎｏｖ３；５９（３）：５２１−９．
【非特許文献５】Ｋｉｍ，Ｎ．Ｗ．，Ｐｉａｔｙｓｚｅｋ，Ｍ．Ａ．，Ｐｒｏｗｓｅ，Ｋ．Ｒ．，Ｈａｒｌｅｙ，Ｃ．Ｂ．，Ｗｅｓｔ，Ｍ．Ｄ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ｉｍｍｏｒｔａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６，２０１１−２０１５（１９９４）．
【非特許文献６】Ｈａｒｌｅｙ，Ｃ．Ｂ．，Ｆｕｔｃｈｅｒ，Ａ．Ｂ．，Ｇｒｅｉｄｅｒ，Ｃ．Ｗ．Ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ  ｓｈｏｒｔｅｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｇｅｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ３４，４５８−４６０（１９９０）．
【非特許文献７】Ｂｒｙａｎ，Ｔ．Ｍ．，Ｅｎｇｌｅｚｏｕ，Ａ．，Ｄａｌｌａ−Ｐｏｚｚａ，Ｌ．，Ｄｕｎｈａｍ，  Ｍ．Ａ．，Ｒｅｄｄｅｌ，Ｒ．Ｒ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｌｅｎｇｔｈ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３，１２７１−１２７４（１９９７）．
【非特許文献８】Ｒｅｄｄｅｌ，Ｒ．Ｒ．，Ｂｒｙａｎ，Ｔ．Ｍ．，Ｃｏｌｇｉｎ，Ｌ．Ｍ．，Ｐｅｒｒｅｍ，Ｋ．Ｔ．，Ｙｅａｇｅｒ，Ｔ．Ｒ．Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｌｅｎｇｔｈｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｒａｄｉａｔ．Ｒｅｓ．１５５，１９４−２００（２００１）．
【非特許文献９】Ｗｒｉｇｈｔ，Ｗ．Ｅ．，Ｐｉａｔｙｓｚｅｋ，Ｍ．Ａ．，Ｒａｉｎｅｙ，Ｗ．Ｅ．，Ｂｙｒｄ，Ｗ．，Ｓｈａｙ，Ｊ．Ｗ．Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８，１７３−１７９（１９９６）．
【非特許文献１０】Ｇｒｅｉｄｅｒ  ＣＷ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ：ｈｅａｌｉｎｇ，  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ．１９９４；４（２）：２０３−１１．
【非特許文献１１】Ｈａｈｎ，Ｗ．Ｃ．ら、Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｌｉｍｉｔｓ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５，１１６４−１１７０（１９９９）．
【非特許文献１２】Ｅｌｉｏｎ，Ｇ．Ｂ．；Ｆｕｒｍａｎ，Ｐ．Ａ．；Ｆｙｆｅ，Ｊ．Ａ．；ｄｅ  Ｍｉｒａｎｄａ，Ｐ．；Ｂｅａｕｃｈａｍｐ，Ｌ．；Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｈ．Ｊ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｎｔｉｈｅｒｐｅｔｉｃ  Ａｇｅｎｔ，９−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｇｕａｎｉｎｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９７７，７４，５７１６−５７２０．
【非特許文献１３】Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｃ．；Ｄｖｏｒａｋ，Ｃ．Ａ．；Ｓｍｅｅ，Ｄ．Ｆ．；Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｔ．Ｒ．；Ｊｕｌｉｅｎ，Ｐ．Ｈ．；Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎ，Ｊ．Ｐ．Ｈ．９−［（１，３−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｐｒｏｐｙｌｏｘｙ）ｍｅｔｈｙｌ］ｇｕａｎｉｎｅ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ａｎｔｉｈｅｒｐｅｓ  Ａｇｅｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９８３，２６，７５９−７６１．
【非特許文献１４】Ｓｍｅｅ，Ｄ．Ｆ．；ａｒｔｉｎ，  Ｊ．Ｃ．；  Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎ，Ｊ．Ｐ．Ｈ．；Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｔ．Ｒ．Ａｎｔｉｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｃｙｃｌｉｃ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ９−（１，３−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｐｒｏｐｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｇｕａｎｉｎｅ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９８３，２３，６７６−６８２．
【非特許文献１５】Ｆｉｅｌｄ，Ｅ．Ｋ．；Ｄａｖｉｅｓ，Ｍ．Ｅ．；ＤｅＷｉｔｔ，Ｃ．；Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．Ｃ．；Ｌｉｏｕ，Ｒ．；Ｇｅｒｍｅｒｓｈａｕｓｅｎ，Ｊ．；Ｋａｒｋａｓ，Ｊ．Ｄ．；Ａｓｈｔｏｎ，Ｗ．Ｔ．；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｄ．Ｂ．；Ｔｏｌｍａｎ，Ｒ．Ｌ．９−（［２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−１−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｅｔｈｏｘｙ］ｍｅｔｈｙｌ）ｇｕａｎｉｎｅ：Ａ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｈｅｒｐｅｓ  Ｇｒｏｕｐ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８３，８０，４１３９−４１４３．
【非特許文献１６】Ｈａｒｎｄｅｎ，Ｍ．Ｒ．；Ｊａｒｖｅｓｔ，Ｒ．Ｌ．；Ｂａｃｏｎ，Ｔ．Ｈ．；Ｂｏｙｄ，Ｍ．Ｒ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ９−［４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−３−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｂｕｔ−１−ｙｌ］ｐｕｒｉｎｅｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９８７，３０，１６３６−１６４３
【非特許文献１７】Ｖｅｒｅ  Ｈｏｄｇｅ，Ｒ．Ａ．；  Ｐｅｒｋｉｎｓ，Ｒ．Ｍ．Ｍｏｄｅ  ｏｆ  Ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ９−（４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｂｕｔ−１−ｙｌ）ｇｕａｎｉｎｅ  （ＢＲＬ  ３９１２３）  ａｇａｉｎｓｔ  Ｈｅｒｐｅｓ  Ｓｉｍｐｌｅｘ  Ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ＭＲＣ−５  Ｃｅｌｌｓ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９８９，３３，２２３−２２９
【非特許文献１８】ｄｅ  Ｍｉｒａｎｄａ  Ｐ，Ｗｈｉｔｌｅｙ  ＲＪ，Ｂｌｕｍ  ＭＲ，Ｋｅｅｎｅｙ  ＲＥ，Ｂａｒｔｏｎ  Ｎ，Ｃｏｃｃｈｅｔｔｏ  ＤＭ，Ｇｏｏｄ  Ｓ，Ｈｅｍｓｔｒｅｅｔ  ＧＰ  ３ｒｄ，Ｋｉｒｋ  ＬＥ，Ｐａｇｅ  ＤＡ，Ｅｌｉｏｎ  ＧＢ．Ａｃｙｃｌｏｖｉｒ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ．Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．１９７９；２６（６）：７１８−２８．
【非特許文献１９】Ｖａｎ  Ｄｙｋｅ  ＲＢ，Ｃｏｎｎｏｒ  ＪＤ，Ｗｙｂｏｒｎｙ  Ｃ，Ｈｉｎｔｚ  Ｍ，  Ｋｅｅｎｅｙ  ＲＥ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｏｒａｌｌｙ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ａｃｙｃｌｏｖｉｒ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅｒｐｅｓ  ｐｒｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ．１９８２；７３（１Ａ）：１７２−５．
【非特許文献２０】Ｌｙｃｋｅ  Ｊ，Ｍａｌｍｅｓｔｒｏｍ  Ｃ，Ｓｔａｈｌｅ  Ｌ．Ａｃｙｃｌｏｖｉｒ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ  ａｆｔｅｒ  ｏｒａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｌａｃｙｃｌｏｖｉｒ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００３；４７（８）：２４３８−４１．
【非特許文献２１】Ｐｉｋｅｔｔｙ  Ｃ，Ｂａｒｄｉｎ  Ｃ，Ｇｉｌｑｕｉｎ  Ｊ，Ｇａｉｒａｒｄ  Ａ，Ｋａｚａｔｃｈｋｉｎｅ  ＭＤ，Ｃｈａｓｔ  Ｆ．Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｐｌａｓｍａ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ  ｉｎ  ＡＩＤＳ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  ｏｒａｌ  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ  ａｓ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ＣＭＶ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ．Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ．２０００；６（３）：１１７−２０．
【非特許文献２２】Ｂｒｏｗｎ  Ｆ，Ｂａｎｋｅｎ  Ｌ，Ｓａｙｗｅｌｌ  Ｋ，Ａｒｕｍ  Ｉ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｖａｌｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ  ａｎｄ  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｒａｌ  ｄｏｓａｇｅｓ  ｏｆ  ｖａｌｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ  ｉｎ  ＨＩＶ−  ａｎｄ  ＣＭＶ−ｓｅｒｏｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ．Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．１９９９；３７（２）：１６７−７６．
【非特許文献２３】Ｒｕｆｅｒ，Ｎ．，Ｄｒａｇｏｗｓｋａ，Ｗ．，Ｔｈｏｒｎｂｕｒｙ  Ｇ．，Ｒｏｏｓｎｅｋ，Ｅ．，Ｌａｎｓｄｏｒｐ  Ｐ．Ｍ．Ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｌｅｎｇｔｈ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｍｅａｓｕｒｅｄ  ｂｙ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６，７４３−７４７（１９９８）．
【非特許文献２４】Ｈｕｌｔｄｉｎ，Ｍ．ら、Ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６，３６５１−３６５６（１９９８）．
【非特許文献２５】ＴＲＡＰ−ＥＬＩＳＡＡ．Ｋ．Ｖｅｌｉｎ，Ａ．Ｈｅｒｄｅｒ，Ｋ．Ｊ．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｉｓ  ｎｏｔ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｄ  ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｔｉｓｓｕｅ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １４５（２００１），ｐｐ．１６１−１６４．
【非特許文献２６】ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＴＲＡＰ  （Ｗｅｇｅら、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ  ｒｅｐｅａｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００３；３１（２）：Ｅ３−３）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
以上より、テロメアがテロメラーゼ及び／又はＡＬＴのメカニズムによって維持されている細胞（癌細胞など）の増殖を阻害できる、治療的なヌクレオシドのアナログを同定することに対するニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、テロメア伸長メカニズム（テロメラーゼ又はＡＬＴのメカニズム）に無関係な細胞のテロメア伸長の調節、抑制又は抑制のための、抗ウイルス性ヌクレオシドのアナログの使用を含んでなる方法、並びにそのための組成物の提供に関する。本発明はまた、特異的なヌクレオシドのアナログを使用した、増殖障害及び全ての種類の癌の予防及び／又は治療方法を開示する。より詳細には、本発明は、増殖細胞（癌細胞（例えばヒト癌細胞）など）において、それに対応する通常の体細胞にとり細胞障害性でないレベルで、テロメラーゼ活性及びＬ−１（ＬＩＮＥ−１）レトロトランスポゾンでコードされる逆転写酵素（Ｌ１ＲＴ）活性を妨害できる、非環状ヌクレオシドのアナログを開示する。本発明においては、抗悪性腫瘍薬又は抗癌剤として非環状ヌクレオシドのアナログを使用する方法が開示されている。本発明の一態様では、ガンシクロビル、アシクロビル及び／又はペンシクロビルを有するテロメラーゼ陽性又はテロメラーゼ陰性細胞（但しＬ１ＲＴ活性を有する）の処理により、累進的なテロメア損失、Ｇ２相停止、染色体異常及び最終的な細胞死が誘発されることを見出した。更に、これらの抗癌性ヌクレオシドのアナログはテロメラーゼ又はＬ１ＲＴに対して驚くべき影響を及ぼし、すなわち臨床的に許容できるレベルでテロメラーゼ活性を制御し、増殖細胞の細胞死を誘発することが可能であり、そのため全ての種類の癌の治療又は予防に使用できる。
【００１０】
現在、非環状の、抗テロメラーゼ、抗Ｌ１ＲＴ及び抗悪性腫瘍活性を有するヌクレオシドのアナログをベースにした治療組成物は使用されていない。出願人は、活発に非環状ヌクレオシドのアナログ（また、本明細書でテロメア伸長の阻害剤又はアンタゴニストと称する）を使用する際のテロメア伸長の抑制が治療的に有益であることを初めて開示した。また、本発明以前には、かかる操作が治療的な有用性を有すると推察されるというコンセンサスが当業者の間に存在しなかった。
【００１１】
テロメアは細胞周期、細胞増殖及び老化の制御に関係しているため、本発明のヌクレオシドアナログを含有する組成物は、無秩序な細胞増殖及び腫瘍細胞の不死を防止又は制御できる。本発明の組成物は、テロメラーゼ又はＬ１ＲＴによりテロメアが維持若しくは延長されることを特徴とする細胞増殖による障害、特にヒトの腫瘍の治療において特に有用性を発揮することが見出されている。
【００１２】
本発明の一態様は、テロメラーゼ又はＬ１ＲＴにより維持又は延長されるテロメアと関連する症状、具体的には細胞における高いテロメラーゼ又はＬ１ＲＴ活性レベルの治療方法に関する。当該方法は、上記症状の治療を必要とする細胞又は哺乳類に、少なくとも１つの治療上有効量のヌクレオシドアナログ（非環状の抗テロメラーゼ、抗Ｌ１ＲＴ及び抗悪性腫瘍剤）を含有する組成物を投与することを含んでなる。テロメラーゼ活性又は細胞のＬ１ＲＴ活性のレベルは、例えば、出願人による米国特許出願公開第６０／６５５１０５号（「Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｅｌｏｍｅｒｅ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｉｎ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、２００５年３月２５日出願、及びＰＣＴ／ＵＳ０５／００１３１９号（「Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｌｉｎｅ−１  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ」、２００５年１月１８日出願）に記載されている方法に従って測定でき、それらの出願内容が本願明細書に援用される。テロメラーゼ活性又は細胞のＬ１ＲＴ活性のレベルは、その他のいかなる既存の方法又は同等の方法でも測定できる。テロメラーゼ活性又はＬ１ＲＴ活性の「レベルの増加」とは、特定の細胞におけるテロメラーゼ活性の絶対レベル又はＬ１ＲＴ活性が、その患者又は個人における通常の細胞と比較して、又はかかる症状に罹患していない他の患者又は個人の通常の細胞と比較して増加していることを意味する。かかる症状の例としては、癌症状、又はその個人に通常存在しない細胞の存在に関連する症状が挙げられる。好ましくは、当該組成物としてはＧＣＶ又はＡＣＶ又はそれらのプロドラッグが挙げられる。これらの組成物（直接テロメラーゼ活性又はＬ１ＲＴ活性を阻害してもよく、又は間接的にテロメアに取り込まれてテロメアの更なる伸長を阻害してもよい）の使用により、テロメラーゼ又はＬ１ＲＴが活性状態である腫瘍中での累進的なテロメア短縮がもたらされる。一旦テロメア長が臨界長以下に短縮されると、腫瘍は危機状態となり、細胞死に至る。通常細胞のテロメラーゼ活性及び／又はＬ１ＲＴ活性は通常、低いか若しくは検知されないため、これらの阻害剤は通常の体細胞にはほとんど影響を及ぼさない。
【００１３】
テロメア伸長又は維持に対する干渉により、直接細胞死をもたらすか、又は化学療法剤の作用を強化し最終的にアポトーシスにより細胞死をもたらすことができる。本発明は具体的には、本発明の非環状ヌクレオシドのアナログを含有する組成物を投与することによって、細胞数の連続的な増加のポテンシャルを有するテロメラーゼ／Ｌ１ＲＴ発現細胞の増殖を阻害する方法の提供に関する。ヌクレオシドのアナログの投与は、当業者に周知のいかなる適切な手段によって行ってもよい。
【００１４】
本発明の一実施態様では、哺乳類又は患者（例えばヒト）における、細胞のテロメラーゼ又はＬ１ＲＴの発現によって特徴づけられる癌の予防方法の提供に関する。当該予防方法には、哺乳類への当該組成物の治療上有効量の投与も包含される。当該組成物には、本発明のテロメラーゼ阻害剤又はアンタゴニストが含有される。当該阻害剤又はアンタゴニストは、テロメラーゼ陽性／テロメラーゼ陽性の細胞中におけるテロメア伸長をブロックし、それによりテロメラーゼ発現細胞の増殖が阻害される。当該阻害剤は、非環状ヌクレオシドのアナログ若しくはかかるアナログの薬学的に許容できる塩、又は当該阻害剤又はアンタゴニストを富化した液体又は固体食品素材である。当該食品は、例えばバター、マーガリン、ビスケット、パン、ケーキ、キャンディ、菓子類、ヨーグルト若しくは他の発酵乳製品の形態を有する機能性食品、又は人間による消費に適する穀物であってもよい。あるいは栄養サプリメント、栄養食、医薬、食品、機能性食品、健康食品及び／又はデザイナー食品であってもよい。患者に対し、定期的にテロメラーゼ陽性細胞の存在を試験するのが好ましい。一旦テロメラーゼ陽性の細胞が哺乳類においてほとんど検出されなくなった場合、当該阻害剤又はアンタゴニストの使用を停止してもよい。
【００１５】
治療的な態様に加えて、本発明はまた、テロメラーゼ又はＬ１ＲＴを発現する病理的に増殖する細胞を検出する診断法及びキットの提供に関する。以上に記載した実施態様、及びその他の本発明の実施態様を、以下で更に詳細に記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、細胞のテロメア伸長を妨害できるヌクレオシドのアナログの使用を含んでなる組成物及び方法を提供する。特に、特定のヌクレオシドのアナログが臨床的に許容できるレベルで、細胞のテロメア、テロメラーゼ及びＬ１ＲＴ機能に影響を及ぼしうることが解っている。具体的には、本発明における「ヌクレオシドアナログ」は、天然のヌクレオシドに構造的に類似する化合物であるが、非環状であるアナログに限られる。本発明に包含される非環状ヌクレオシドのアナログは、末尾部分（例えばグアニンに存在する９−（１，３−ジヒドロキシ−２−プロポキシメチル基）を有するプリン又はピリミジン骨格を有するものであるが、ヒドロキシ基を有する環状構造（ペントース）を欠くものである。本発明のアナログの例としては、限定されないが、アシクロビル、ガンシクロビル、ペンシクロビル、及びそれらに対応するプロドラッグ（すなわちバラシクロビル、バルガンシクロビル及びファムシクロビル）等が挙げられる。アシクロビル（非特許文献１２）は細胞ＤＮＡ成分（グアニン）を模倣することによって作用する。それはＤＮＡのＡＴ−ＣＧの「Ｇ」に該当する。「Ｇ」と構造的に類似するにもかかわらず、アシクロビル（９−［２（ハイドロメトキシ）−メチル］グアニン）はその尾部（ヒドロキシ基を有する「環状」構造（ペントース））を有さず、そのため「非環状」である。ガンシクロビル（非特許文献１３、１４、１５）及びペンシクロビル（非特許文献１６、１７）もヒドロキシ基を有する環状構造を欠くため、「非環状」である。本発明の一実施態様では、本発明の非環状ヌクレオシドのアナログの末尾部分は、ヌクレオシドの２’−デオキシリボース半分の３’及び５’−水酸基を模倣する少なくとも１つの水酸基を有する。本発明の非環状ヌクレオシドのアナログは、臨床的に許容できる毒性により、抗テロメラーゼ及び抗悪性腫瘍特性を有することが解っている。非環状ヌクレオシドのアナログであるアシクロビル、ガンシクロビル、ペンシクロビル、並びに対応するプロドラッグであるバラシクロビル、バルガンシクロビル及びファムシクロビルは全て抗ウイルス剤として臨床用途に承認されている。それらのウイルス感染に対抗するための化学構造及び投与計画は当業者にとり周知である。
【００１７】
アシクロビル、ガンシクロビル、ペンシクロビル及び対応するプロドラッグは、ヘルペスウイルス又は／及びＣＭＶ感染症の治療又は緩和のための薬剤であることは周知であるが、それらの癌性疾患の治療への使用は知られていない。例えば、単純疱疹ウイルスによって生じる口辺ヘルペスの治療に、ペンシクロビルを唇及びヒトの体表面に使用する。これらのヌクレオシドのアナログの標的酵素がＤＮＡポリメラーゼであることも従来技術において公知である。
【００１８】
本発明では、非環状抗ウイルス剤がテロメラーゼ又はＬ１ＲＴを標的とすることができ、哺乳類の細胞においてテロメア伸長（又は傷害テロメア）に影響を及ぼしうることも見出した。これらの薬品は、増殖細胞内部で一旦リン酸化（例えば二及び三リン酸塩の形）されると、テロメラーゼ反応において天然の基質（例えばｄＧＴＰ）と競合すると考えられる。リン酸化されたアナログは、伸長中のテロメアＤＮＡ鎖への天然基質の編入を阻害する、又はＤＮＡ自身に組み込まれる能力を有するため、テロメラーゼ又はＬ１ＲＴが媒介する重合活性が阻害され、結果的に鎖の伸長が停止する。本質的には、これらのヌクレオシドのアナログの添加により、鎖伸長が停止し、テロメアのＤＮＡに傷害が及び、テロメアが短縮し、アポトーシスが開始される。テロメアへの傷害は、通常の細胞よりも急速に増殖する細胞（例えば腫瘍）にとり有害である。
【００１９】
抗ＨＩＶ及び抗ヘルペスヌクレオシドのアナログは、ヌクレオシドからそれらのリン酸化後のヌクレオチドへのステージまでの間にのみ活性を有することが報告されている。すなわち、リン酸化は、ヌクレオシドアナログの、それらの標的に対する活性にとり重要な因子であると考えられる。この点に関しては、ＡＺＴは、３つの連続的なリン酸化がテロメラーゼに対する活性にとり必要であることが報告されている。
【００２０】
本発明の非環状ヌクレオシドのアナログは、従来技術で周知の抗テロメラーゼヌクレオシドのアナログ（例えばＡＺＴ）より有力かつ選択的なテロメア伸長の阻害剤であり、ヌクレオシドのアナログ（例えばＡＺＴ）と比較して、臨床的に許容できる投与量で、テロメア長の減少及びアポトーシス若しくは細胞死が充分行える（非特許文献１８、１９、２０、２１、２２）。
【００２１】
本発明によって可能となる有利な使用方法を示唆するものではないが、エイズ又は他の免疫不全を有する患者のＣＭＶ（サイトメガロウイルス）感染症を治療するためにＧＣＶが過去に投与されていたが、それにより例えばＧＣＶを癌患者に投与してもよいことが示唆される。
【００２２】
更に、現在ＨＳＶ及びＣＭＶ患者への非環状ヌクレオシドアナログの使用が頻繁に行われているため、これらのアナログの著しく低い投与量での使用と組み合わせれば、テロメラーゼ及び／又はＬ１ＲＴにより誘発及び／又は媒介される癌の治療への、アシクロビル、ガンシクロビル、ペンシクロビル及びそれらの対応するプロドラッグ（すなわちバラシクロビル、バルガンシクロビル及びファムシクロビル）の使用認可を早めるものと考えられる。
【００２３】
本発明にはまた、様々な動物モデルの使用が包含される。テロメラーゼを発現する細胞系を作製又は単離することによって、様々な疾患モデルの実験動物を作製できる。これらのモデルでは、細胞を皮下、同所性若しくは全身投与して様々な疾患状態を模倣する手法を用いてもよい。例えば、ＨｅＬａ細胞をヌードマウスに皮下注入し、テロメラーゼ陽性の腫瘍を得ることもできる。結果として生じる腫瘍は、テロメア繰り返し増幅プロトコル（ＴＲＡＰ）アッセイにてテロメラーゼ活性を示す。かかる動物モデルは、ヌクレオシドのアナログを個々に、あるいは組合せで試験するための有用な媒体となる。
【００２４】
ｉｎ  ｖｉｖｏで化合物の効果の測定は様々な異なる基準で行われ、それには生存、腫瘍退縮、腫瘍進行の停止又は遅延、腫瘍の除去及び抑制、又は転移の防止が含まれるがこれに限定されるものではない。
【００２５】
試験化合物による動物の処理では、動物への化合物又は組成物の適切な形での投与が行われる。医薬品組成物、本発明の阻害剤又はアンタゴニストは、経口、非経口、鼻腔内、バッカル、直腸内、膣内若しくは局所投与など（これらに限定されない）の様々な方法で投与できる。あるいは、皮内、皮下、筋肉内、気管内滴下（気管支への滴下）、腹膜内若しくは静脈内注射によって投与してもよい。特に血液又はリンパ液を経た全身静注及び局所投与、並びに腫瘍内注入が好適である。
【００２６】
本発明の組成物は、多くの態様において重要である。それらはテロメラーゼ／Ｌ１ＲＴに関連する癌の治療のための療法において重要であり、癌の治療において単独で投与してもよく、又は当業者に公知の化学的及び／若しくは放射的な療法と組み合わせてもよい。あるいは、これらの組成物は、単にテロメラーゼ又はＬ１ＲＴ活性を減少させることにより、癌細胞選択的な塊状のアポトーシスを誘発する機能を発揮する。
【００２７】
ヌクレオシドのアナログは、細胞増殖的な疾患などの治療の際、宿主に、生理的若しくは薬学的に許容できる担体に含有させて投与してもよい。薬学的に許容できる担体は部分的には、投与しようとする具体的な組成物や、組成物の投与に採用する具体的な方法に応じて決定される。
【００２８】
本発明の一態様は、不適当に若しくは病理的に増殖する細胞、又は不死化細胞の存在下で生じる哺乳類の障害を予防若しくは治療する方法の提供に関する。不適当に若しくは病理的に増殖する細胞又は不死化細胞が存在すると、それらは細胞の通常の調整メカニズムとは独立に増殖する。これらの細胞は、細胞内因子（すなわちテロメラーゼ）の活性の結果として通常の細胞から逸脱するため、病理学的な挙動を示す。もちろん、本明細書で用いられる不適当に増殖する細胞とは、特に明記しない限り、過剰に増殖する細胞であって、悪性の過剰増殖を示す癌細胞をはじめとするすべての種類の細胞のことを指し、例えば骨肉腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、副腎皮質癌又は黒色腫細胞が挙げられる。なお、本発明の一実施態様では、移植後リンパ組織増殖性疾患（ＰＴＬＤ）（血液の癌）は、本発明に係る癌の範囲から除外される。
【００２９】
具体的には、テロメラーゼ又はＬ１ＲＴを発現する特徴を有するヒト腫瘍の予防若しくは治療方法の提供に関する。本発明に係る障害の予防又は治療方法は、本発明の非環状ヌクレオシドのアナログ（テロメラーゼ又はＬ１ＲＴの阻害剤又はアンタゴニスト）の利用を特徴とする。本発明において使用される１つ以上の阻害剤又は１つ以上のアンタゴニストは、非環状ヌクレオシドのアナログであり、直接又は間接的にテロメラーゼ及びＬ１ＲＴと相互作用することにより、それらの活性及び／又はそれらのテロメアへの取り込みを阻害し、すなわちテロメラーゼ又はＬ１ＲＴが活性を有する場合にも、テロメアの更なる伸長を妨げ、これによりテロメラーゼ又はＬ１ＲＴを発現する細胞の成長を阻害する。すなわち、テロメラーゼ又はＬ１ＲＴの阻害剤又はアンタゴニストを細胞の成長を阻害するために使用する。例えば、テロメラーゼ又はＬ１ＲＴの阻害剤又はアンタゴニストを患者に投与すると、累進的なテロメア短縮、テロメラーゼを発現する細胞の細胞周期の停止及び／又は細胞の塊状のアポトーシスが生じる。本発明の「成長を阻害すること」又は「成長の阻害」の用語はまた、細胞分裂を減少させる又は防止することを意味する。本発明によるテロメラーゼ及び／又はＬ１ＲＴ発現細胞の成長の阻害は、０％でない約１００％以下であってもよい。例えば、阻害はコントロール細胞と比較して約１０％〜約１００％、好ましくは約２５％以上、より好ましくは約５０％以上、更に好ましくは約９０％、９５％以上又は１００％以上であってもよい。（コントロール細胞とは、テロメラーゼを発現するが、阻害剤又はアンタゴニストで処理しない細胞を指す）。成長阻害は、公知のいかなる方法を用いて測定してもよい。例えば、処理されたサンプル中の生細胞数は、生体染色剤によるインキュベーションの後、コントロールサンプルの生細胞数と比較することにより測定できる。更に、インヴィトロ若しくはインビボにおける細胞増殖の減少を検出するための成長阻害のアッセイ方法として、動物の宿主に注入した時の例えばトリチウムアッセイ、ＢｄＵ取り込みアッセイ、ＭＴＴアッセイ、巣を形成する能力の変化、アンカー依存又は不死化の消失、腫瘍特異性マーカーの消失及び／又は腫瘍の形成又は阻害能力の喪失が挙げられる。（Ｄｏｒａｆｓｈａｒら、２００３，Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｒｅｓ．，１１４：１７９−１８６、Ｙａｎｇら、２００４，Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｉｎ．，２５：６８−７５）。
【００３０】
一個の不死化細胞又は幾つかのかかる細胞からの癌腫瘍への成長は、ヒトでは通常数カ月〜数年かかる。しかしながら、本発明の実施により癌を予防できる。なぜなら、１つ以上の非環状ヌクレオシドのアナログを含有する組成物で処理された腫瘍形成細胞の能力が、腫瘍となる機会を有する前にそれらの増殖ポテンシャルを喪失するからである。更に、癌が臨床症状となる前に腫瘍進行を停止させるために、阻害剤又はアンタゴニストを危険群に対して定期的に予防的に投与することにより、潜在的に新規な癌が発症する確率を著しく低下させることができる。
【００３１】
ヌクレオシド化合物は、単独で、又は異なるアナログとの組合せで投与してもよく、経口投与などのいかなる経路で投与してもよい。ヌクレオシドのアナログであるＡＣＶ、ＧＣＶ、又はそれらのＬ−バリルエステルであるバルガンシクロビル（Ｖ−ＧＣＶ）及びバラシクロビル（Ｖ−ＡＣＶ）が好ましいヌクレオシドアナログである。それらの全部は市販されており、その組成は多くの特許及び刊行物に記載されている。
【００３２】
テロメラーゼ及び／又はＬ１ＲＴ活性を有する細胞は、選択的に標的とされなければならない。なぜなら、これらの細胞はテロメアの伸長又は維持の際テロメラーゼ及び／又はＬ１ＲＴに依存し、そのテロメア伸長又は維持は、ヌクレオシド及び／又はそれらのアナログと、テロメラーゼ又はＬ１ＲＴとの相互作用を必要とするからである。アナログを輸送して抗癌効果を得る際、特異的なターゲッティング剤が必要である限りにおいてターゲッティング剤としてのＰＣＶ、ＡＣＶ、ＧＣＶ及び／又は他のアナログの使用も本発明に包含される。したがって、実施態様によっては、医薬品組成物に含まれる活性化合物（この場合ＰＣＶ、ＡＣＶ及びＧＣＶ又は他のヌクレオシドのアナログ）を、特定の標的細胞又は細胞の核部分に対する特異的な輸送のためのターゲティング剤（例えばペプチド）とコンジュゲートさせてもよい。
【００３３】
テロメラーゼ及びＬ１ＲＴの阻害剤又はアンタゴニストの投与量は、当業者であればルーチン実験を行うことにより容易に決定することができる。患者への投与前に、標準的なモデル動物を用いた実験により有効性を確認してもよい。この点に関しては、テロメラーゼにより癌を誘発されたいかなる公知の動物モデルも使用できる（Ｈａｈｎら、１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５（１０）：１１６４−１１７０、Ｙｅａｇｅｒら、１９９９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５９（１７）：４１７５−４１７９）。本発明の方法を使用して処置される被験者又は患者は好ましくはヒトであり、胎児、子供又は成人であってもよい。処置できるその他の哺乳類としては、マウス、ネズミ、ウサギ、サル及びブタが挙げられる。
【００３４】
阻害剤又はアンタゴニストのみを使用してもよく、又は他の化学療法などと組み合わせて使用してもよい。例えば、テロメラーゼにより誘発された癌の治療を他の化学及び／又は放射線療法と組み合わせ、テロメラーゼ又は若干の他の因子により誘発された癌を治療してもよい。当業者に公知の化学療法薬の例としては、限定さないが、制ガン剤（例えばブレオマイシン、マイトマイシン、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）コルヒチン及びジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）などが挙げられる。複合治療を実施するには、動物又は患者の体内でそれらの複合的な抗癌活性が得られるのに効果的な方法で単に他の抗癌因子（化学剤又は放射線）と組み合わせて、本発明の阻害剤成分を動物に投与すればよい。すなわち当該薬剤は、有効量において、標的細胞の領域におけるそれらの複合的な作用を発揮させるのに効果的な期間提供される。この目的を達成するために、当該薬剤は同時に投与してもよく、また化学療法剤の場合、単一の組成物で投与してもよく、又は異なる投与ルートを使用して２つの異なった組成物として投与してもよい。あるいは、２つの処理は、例えば分単位から時間単位又は日単位にわたる間隔で行ってもよい。例えば、この例に限定されないが、ＧＣＶの一日平均投与量（全身投与の場合）は、ヒト成人では１日１００ｍｇ／ｋｇ、マウス及びヒト乳児では１日５０ｍｇ／ｋｇであってもよい。
【００３５】
治療を受ける患者の条件に応じて、投与量を若干変化させてもよい。投与に対して責任がある医師は、対象の患者における多くの判断材料（例えば年齢、条件、ファイル履歴など）に基づいて個々の患者の適当な投与量を決定することができる。
【００３６】
したがって、本発明の方法は、テロメラーゼにより誘発される細胞の病理的増殖と関連する症状及び疾患の治療的用途に使用できる。本発明の治療的な用途から利益を得る疾患には、過剰な増殖細胞によって特徴づけられるすべての疾患（例えば固形癌及び白血病及び非癌症状）が包含される。更に本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてのみならず、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいても、癌細胞の成長阻害に使用できることが考察される。本発明の方法は、特に病理的に増殖するヒト細胞（ヒト癌細胞−骨肉腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、副腎皮質癌又は黒色腫が例示されるがそれらに限定されない）の成長をｅｘ  ｖｉｖｏで阻害するのに有用である。
【００３７】
本発明は、細胞のテロメラーゼ又はＬ１ＲＴの発現を原因とする、不適当に、病理学的に又は異常に増殖する細胞を同定する方法及びキットの提供に関する。当該方法は、患者から採取した組織におけるテロメラーゼ又はＬ１ＲＴの発現の存在（及び／又はレベル）を測定することによって、患者の癌細胞又は腫瘍の存在の診断を補助するスクリーニング方法として使用でき、高いレベルでのテロメラーゼの存在又はＬ１ＲＴ発現は、患者の癌細胞又は病理学的細胞増殖の指標となる。
【００３８】
例えば、癌腫瘍サンプルは、本発明の非環状ヌクレオシドアナログの存在下では増殖することができないことを指標として診断できる。当該診断には更に、テロメラーゼ特異的なｍＲＮＡ発現の検出（核酸を使用したハイブリダイゼーション、ノーザンブロット法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成、ＲＮＡマイクロアレイ、ＲＮＡプロテクションアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲなどにより測定）、又は、テロメラーゼの触媒サブユニットをコードするタンパク質の存在の検出（ウエスタンブロット法、免疫沈降又は免疫組織化学又はテロメラーゼの酵素活性（ＴＲＡＰアッセイ及びその修飾アッセイ（非特許文献４、２６、２７））などにより測定）によって測定される。
【００３９】
好ましい実施態様では、テロメラーゼ触媒サブユニットＲＮＡを標的とする核酸プローブは、急速な細胞増殖を示す組織（例えばヒト骨肉腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、副腎皮質癌又は黒色腫などの原発性の癌細胞）における、テロメラーゼ触媒サブユニットＲＮＡ  ｍＲＮＡの存在及び／又はその濃度増加を検出するために使用できる。すなわち、本発明はテロメラーゼの配列と相補的である核酸プローブを使用して、病理的に増殖する細胞（癌細胞など）を検出、同定する方法の提供に関する。例えば、病理的に増殖する細胞を確認する方法は、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ又はＬ１ＲＴ  ｍＲＮＡに対する核酸プローブを使用して、コントロール細胞のｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ又はＬ１ＲＴ  ｍＲＮＡの発現レベルと、試験細胞のｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ又はＬ１ＲＴ  ｍＲＮＡの発現をレベルとを比較することを含んでなる。コントロール細胞と同様のｈＴＥＲＴ又はＬ１ＲＴの発現レベルが観察されるとき、試験細胞は病理的に増殖する細胞であると確認される。しかしながら、本発明の方法で使用される核酸プローブは、ヒト、マウス又は他の哺乳類のｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ又はＬ１ＲＴ  ｍＲＮＡ配列と実質的に相補的でありえる。
【００４０】
効果的に病理学的に増殖する細胞（例えば癌細胞）のｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ若しくはＬ１ＲＴ  ｍＲＮＡを検出するプローブの能力に影響を及ぼさない限りにおいて、核酸プローブを置換することが可能であることは当業者にとり自明であり、またかかる置換は本発明の範囲内である。本発明の方法で使用される核酸プローブはＤＮＡプローブであってもよく、又は修飾プローブ（ペプチド核酸プローブ、ホスホロチオネートプローブ又は２’−Ｏメチルプローブなど）であってもよい。核酸プローブの長さは約８又は１０ヌクレオチド長〜５０ヌクレオチド長であってもよく、好ましくは約１５〜２５のヌクレオチド長である。本発明の方法は、ヒト（哺乳類）又は他の脊椎動物から調製した細胞抽出物、培養細胞又は組織サンプルにおいて容易に実施することができる。
【００４１】
本発明の方法は、インヴィトロでの細胞、細胞培養及びヒト細胞及び組織（例えば固形腫瘍及び癌（例えばヒト骨肉腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、副腎皮質癌又は黒色腫））における、テロメラーゼの発現に起因する不適当、病理的又は異常に増殖する細胞の検出に有用である。
【００４２】
本発明はまた、過剰に増殖する細胞又は癌細胞を検出及び／又は阻害するキットの提供に関する。キットは、ＰＣＶ、ＡＣＶ、ＧＣＶ、バルガンシクロビル、バラシクロビル又は他の非環状ヌクレオシドのアナログを含有してもよく、及び／又はｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ又はＬ１ＲＴ  ｍＲＮＡの配列と完全に又は実質的に相補的である核酸プローブを含有してもよい。
【００４３】
本発明の医薬品組成物、阻害剤若しくはアンタゴニストは様々な方法で投与でき、例えば局所、経口、非経口、血管内、腹膜内、ウイルス感染又は皮下投与などが挙げられる。投与方法に応じて、化合物を様々な方法で処方してもよい。液体状の製剤が経口投与に適する。非経口投与（例えば関節内、心室内、鼻腔内、静脈、筋肉内、皮内、腹膜内及び皮下投与）に適する製剤としては、水性、非水性、等張性の無菌の注射液が挙げられる。本発明の実施において、組成物は、例えば静脈内、経口的、局所的、非経口的又は腹膜内に投与することができる。経口及び非経口投与が好ましい方法である。製剤及び投与の方法は従来技術においてはルーチン作業であり、詳細は例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２０００），Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲ（ｅｄ），２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに記載されている。
【００４４】
治療上有効量又は薬理学的有効量は従来技術において一般的に認識されており、意図された薬理学的結果をもたらすのに効果的な薬剤の量のことを指す。例えば、治療上有効量は、一定時間において患者にとり有益な治療効果を発揮する（すなわち患者体内における疾患又は症状を治療、又は疾患の兆候を好転させる）のに十分な量のことを指す。投与される量は実際には治療しようとする個人に依存し、所望の効果が顕著な副作用なしで提供されるように量を最適化するのが好ましい。以下に更に詳細に記載されるように、使用される特定の阻害剤又はアンタゴニストの有効性、患者の条件、並びに治療を受ける患者の体重又は体表面積を考慮して当該投与量を決定してもよい。投与量の規模はまた、特定の患者への例えば特定の薬剤、ベクター若しくは形質転換細胞種の投与に伴ういかなる副作用の存在、性質及び程度によっても決定される。
【００４５】
テロメラーゼ／Ｌ１ＲＴにより媒介される癌の発生を防止、阻害又は低下させることができる１つ以上の薬剤の治療的有効投与量は、本願明細書に開示される細胞培養アッセイからのデータ、及び／又は動物モデルを使用したインビボアッセイからのデータを使用して容易に決定できる。動物モデルはまた、ヒトへの投与の適当な用量範囲及び経路を推定するために使用してもよい。臨床段階に移行させる前の、投与量の最適化のために、ヒト（又は技術的に認可される動物モデル）起源の固形腫瘍を有する実験動物が頻繁に利用される。かかるモデルは、有効な抗癌ストラテジーを予測する際に信頼性が非常に高いことが公知である。例えば、固形腫瘍を運んでいるマウス又は技術的に許容できるマウスモデルは臨床前試験において広く用いられ、軽微な毒性を伴う有益な抗腫瘍効果を提供する治療薬の投与量範囲の決定に有用性を発揮する。技術的に許容できるモデルは既に、少なくとも本発明で例証されるヌクレオシドのアナログに関して安全性が示されているため、本発明の臨床前試験はむしろルーチン試験と言ってもよい。インビボでの有効性は、腫瘍形成（進行）の阻害、腫瘍の退縮又は転移などを測定するアッセイを使用して予測することができる。
【００４６】
癌モデルとしてヒトＨｅＬａ癌細胞系から皮下腫瘍を成長させたヌードマウス（すなわち異種移植片を有するマウス）を使用した、ＡＣＶ、ＰＣＶ及び／又はＧＣＶの抗腫瘍効果に関する典型的なインビボアッセイを以下に説明する。
【００４７】
インビボアッセイに必要とされるヒト癌細胞は例えば以下の通りに調製できる。
テロメラーゼ陽性のＨｅＬａヒト細胞系及びテロメラーゼ陰性Ｕ−２ＯＳヒト細胞株を一般の供給源から得る。
５％のＣＯ２、湿潤空気、３７℃の条件で、１０％の子牛胎児血清を添加したＤ−ＭＥＭ培地中で細胞を維持する。
【００４８】
インビボアッセイでは、適当な宿主（例えば約５−７週齢のヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）を、病原体フリーの条件下で作成し、維持する。無血清培地２０μｌに約１×１０６個のＨｅＬａ細胞（及び／又はＵ−２ＯＳ細胞）を懸濁させ、全ての動物に注入し、メトファンを側部の皮下（ｓ．ｃ．）に注入し、短時間麻酔をかける。更にマウスを実験群及び対照群に分割する。適当な濃度のＡＣＶ、ＰＣＶ及び／又はＧＣＶを使用し、腫瘍成長の進行又は退縮アッセイを行う。
【００４９】
一実施態様では、形成された腫瘍のサイズの減少（退縮）よりもむしろ、皮下における腫瘍成長の妨害又は進行時間を評価する。本実施態様では、０日から開始し、実験群のマウスにアドリブで飲料水中に含まれるＧＣＶを摂取させる。水中のＧＣＶの濃度は２ｍｇ／ｍｌであってもよい。ＧＣＶ溶液を３日毎に交換する。対照群のマウスには飲料水だけを与える。腫瘍を２〜３日毎に測定する。腫瘍が１ｃｍ３を越えたときにマウスをと殺する。腫瘍体積は式４／３πｒ３により算出する（式中、ｒは腫瘍の半径を示す）。対照群のすべてのマウスでは腫瘍が成長し、実験群のすべてのマウスでは腫瘍が存在しない状態のままである。
【００５０】
他の実施形態では、本発明の試薬及び方法は、予め形成させた腫瘍を有する免疫適格動物におけるインビボでの腫瘍退縮を促進するために使用でき、すなわち本発明の試薬は、既存の腫瘍を有する動物の治療に使用できる。この場合、１０６個のマウスｈａｐａｔｏｍａ  ＭＨ−２２細胞等をＣ３ＨＡマウスの横腹の皮下に注入し、腫瘍を形成させる。腫瘍細胞移植により腫瘍が形成された後、実験群のマウスにアドリブでＦａｍｖｉｒ  ｉ．ｇ．溶液を含有する組成物入りの飲料水を投与し、また対照群のマウスには、当該薬剤が含まれない以外は同じ組成物（例えば蒸留水）を投与する。腫瘍成長を２〜３日毎にモニターする。Ｆａｍｖｉｒはファムシクロビルを含み、ペンシクロビルの経口投与用プロドラッグである。ファムシクロビルは２−［２−（２−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）エチル］−１，３−プロパンジオールジアセテートの化合物名として公知である。Ｆａｍｖｉｒを腫瘍を有する動物に２１〜２８日にわたり投与すると、腫瘍成長の遅延が観察される。腫瘍細胞の発達のかかる阻害は、対照群においては観察されない。Ｆａｍｖｉｒで処理した動物においてのみ、処理の開始後数週間における１００％の生存が示される。
【００５１】
他の実施形態では、アポトーシスの促進を定性的に解析するインビボアッセイを使用してもよい。本実施態様では、治療組成物で処理した異種移植片保有動物においてアポトーシス巣の存在を解析し、無処理のコントロール異種移植片保有動物と比較してもよい。処理された動物の腫瘍においてアポトーシス巣が観察される程度は、組成物の治療有効性の指標となる。
【００５２】
ヒトテロメラーゼで媒介された癌（初期腫瘍及び血管新生した腫瘍）の治療用の１つ以上の薬剤の適当な投与量を設計する際に、本願明細書に記載されている動物実験から、臨床的投与における適当な投与量を容易に推定することができる。この換算を行う際、実験動物の単位重量当たりに投与された薬剤の質量を、好ましくは実験動物とヒト患者との体表面積の違いを考慮に入れることができる。かかる算出方法は全て当業者に周知であり、ルーチンワークである。すなわち治療的に有効な投与量の決定は、当業者の技量の範囲内である。
【００５３】
例えば、細胞培養アッセイ及びマウス試験においてＧＣＶ又はＡＣＶ（Ｖ−ＧＣＶ又はＶ−ＡＣＶ）の好適な投与量を算出し、重量及び体表面積に基づく標準的な計算式を適用する際、及び成人ヒト患者への使用における効果的な投与量は１日当たり、患者１人当たり、約１０００ｍｇ〜約６０００ｍｇのＧＣＶ又はＡＣＶ、好ましくは、１日当たり、患者１人当たり、約５００ｍｇ〜約１０００ｍｇのＶ−ＧＣＶ又はＶ−ＡＣＶである。したがって、この情報を使用することにより、ヒトに対する治療薬（例えばアシクロビル、ガンシクロビル、ペンシクロビル及び対応するプロドラッグ（すなわちバラシクロビル、バルガンシクロビル及びファムシクロビル）の下限投与量が１患者、１日当たりで１、５、１０、２０、２５又は３０ｍｇであってもよく、またヒトに対する治療薬の上限投与量が１患者、１日当たりで２５０、３００、４００、４５０、５００又は６００ｍｇであってもよいことが、本発明に包含される。有用な投与量は、それらの中間の１患者当たり約４０〜約２００ｍｇ程度の範囲であってもよい。
【００５４】
上記で言及した範囲にも関わらず、本願明細書にパラメータ及び詳細なガイダンスが提供された場合は、活性若しくは最適範囲の更なるバリエーションも本発明に包含されることが理解されよう。本発明の治療法の意図は通常、容認できない毒性をもたらすレベル以下に投与量を保ちながら、顕著な抗腫瘍効果を発揮させることである。投与量自体を変化させる以外にも、投与計画を採用して治療ストラテジーを最適化することもできる。本発明における好ましい治療ストラテジーの例として、約１〜５００ｍｇ、好ましくは約１０〜１００ｍｇのテロメラーゼの阻害剤若しくはアンタゴニスト、又はそれを含む治療用カクテルを、６０日間で約〜４回投与することが挙げられる。例えば、１日、３又は４日、並びに６又は７日目に投与が行われる。経口的に単回若しくは多回投与してもよく、又は例えば固形腫瘍部位に直接遅延放出製剤を投与してもよい。投与に対して責任がある医師は、本発明の開示を考慮して、個々の患者に対する投与の形態及び経路に応じた適当な投与量を決定することができる。かかる最適化及び調整は従来技術においてルーチン的に実施され、過度の実験を必要としない。特定の投与量の投与自体において、無菌性、発熱性、純度及び一般の安全基準に従ってヒト患者に全身的に薬学的に許容できる組成物を提供するのが好ましい。理学的検査、腫瘍測定及び実験室検査は当然ながら治療前、及び治療後１〜数か月の間隔を置いて実施する必要があり、当業者であればかかるルーチン作業の方法は自明である。臨床効果は、いかなる許容できる計測によって定義してもよい。例えば、治療後の一定期間内における全ての測定可能な腫瘍の消失を完全な反応として定義してもよい。
【実施例】
【００５５】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施例を例示するために提供されるが、当然ながらいかなる形であれ本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。詳細に記載されている場合を除き、下記の実施例は当業者にとり周知の及び日常的である従来技術を使用して実施した。更に、当業者に自明であるように、実施例において開示する技術は、本発明の実施において十分機能することを発明者が見出した技術を意味し、それによりその実施の好適な態様を構成するものと考えられる。しかしながら、当業者であれば、本発明の開示を考慮して、開示される具体的な実施例に対する多くの変形が可能であると認識し、本発明の技術思想と範囲から逸脱することなく同様の結果を得ることができることを認識するであろう。
【００５６】
テロメラーゼ陽性癌細胞におけるテロメア短縮の誘導、Ｇ２停止及びアポトーシスは、以下のように実施した。
【００５７】
テロメラーゼ陽性（ＨｅＬａ）及びテロメラーゼ陰性（Ｕ−２  ＯＳ）細胞株の両方を使用した。適当なアッセイを採用して、これらの細胞のテロメラーゼ／Ｌ１ＲＴ特異的な活性を検出し、確認した。
【００５８】
細胞株をＡＣＶ（３．０μＭ）、ＧＣＶ（１．５μＭ）又はＰＣＶ（１．５μＭ）の治療的な濃度で処理し、テロメアのＤＮＡ合成が細胞内で阻害され、テロメア縮小が誘導されるか否かを解析した。ＡＣＶ、ＧＣＶ及びＰＣＶで処理した細胞及び未処置の細胞におけるテロメア長を、テロメア特異的なペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ（非特許文献２３，２４）を用いたフローサトメトリで測定した。細胞周期分布を決定するために、細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（非特許文献２３）で染色した。処理後１０日及び１４日において、両方の細胞株ではテロメア縮小、塊状のアポトーシス及びＧ２停止（図１、２及び３）が観察された。
【００５９】
細胞周期分布の変化を示すために、ＨｅＬａ細胞及びＵ−２ＯＳ細胞を１４日間にわたりＡＣＶ、ＧＣＶ又はＰＣＶで処理してＰＩ染色し、随時フローサイトメトリで分析した。その結果、細胞周期のＧ２停止が示された。変化が急速なため、ＡＣＶ処理直後の数日後でのみ検出されることに留意すべきである。
【００６０】
この試験で使用されるＵ−２ＯＳ（骨肉腫）及びＨｅＬａ（子宮頸部）細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。細胞を、５％のＣＯ２、湿潤空気、３７℃の条件で、１０％の子牛胎児血清を添加したＤ−ＭＥＭ培地で培養した。ＡＣＶによる細胞の処理の際、培地に３μＭでアシクロビル（ＴＥＶＡ  Ｐｈａｒｍ．Ｉｎｄ．Ｌｔｄ社製、イスラエル）を添加した。ＧＣＶによる細胞の処理の際、培地に１．５μＭでＧＣＶ（Ｃｙｍｅｖｅｎｅ、Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ社製）を添加した。ＰＣＶによる細胞の処理の際、培地に１．５μＭでＰＣＶ（ペンシクロビル、メルク社製）を添加した。
【００６１】
Ｗｅｇｅら、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ  ｒｅｐｅａｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００３、３１（２）：Ｅ３−３に記載のように、リアルタイムＴＲＡＰアッセイを実施した。
【００６２】
フローサイトメトリによるテロメア長の測定を行う際、細胞を、Ｒｕｆｅｒら（１９９８）の方法に従いテロメア特異的なＦＩＴＣコンジュゲート（Ｃ３ＴＡ２）３ＰＮＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）プローブで染色し、０．０６μｇ／ｍｌのＰＩで比較染色し、ヒトリンパ球の部分サンプル中のテロメア長の動態を、フローサイトメトリ（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６，７４３−７４７）で測定した。
【００６３】
すなわち、ヌクレオシドのアナログであるＡＣＶ、ＧＣＶ及びＰＣＶが明らかにテロメア長の短縮を生じさせることが本発明により証明された。有用な阻害化合物は、いかなる形であれ、上記で具体的に例証した特異的な化合物又はヌクレオチドアナログ、並びに誘導体に限定されるものと解釈すべきでない。実際、この開示を元に設計され、合成される有用な医薬化合物は、第二世代の誘導体又は更に化学修飾された非環状ヌクレオシドのアナログであることが判明すると考えられる。
【００６４】
（引例）非特許文献１から２６を以上の説明において引用したが、当業者であればその番号を基に参考とすることができる。
【００６５】
明細書に記載の全ての刊行物、特許及び特許出願は、本発明の技術分野における当業者のレベルとして位置付けられる。全ての刊行物、特許及び特許出願は、それらの個々の刊行又は特許出願が、あたかも「参照により援用される」と個々明記された場合と同様に本願明細書に援用される。本発明の理解を明確にするために若干の図と実施例により詳細に記載したが、その改変と変更を、添付の特許請求の範囲内で適宜実施できることは自明である。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】処理の１０日後における、テロメア長の減少、塊状のアポトーシス及びＨｅＬａ細胞の細胞周期の変化を示すフローＦＩＳＨのデータを示す（点プロット：左パネル、棒グラフプロット：右パネル）。データ００７：処理なし、データ００８：３μＭのＡＣＶによる処理、データ００９：１．５μＭのＧＣＶによる処理、データ００１０：１．５μＭのＰＣＶによる処理。ＦＬ１：ＰＮＡ−ＦＩＴＣ、ＦＬ３：ＰＩ。
【図２】処理の１０日後における、テロメア長の減少、塊状のアポトーシス及びＵ−２ＯＳ細胞の細胞周期の変化を示すフローＦＩＳＨのデータを示す（点プロット：左パネル、棒グラフプロット：右パネル）。データ００１：処理なし、データ００２：３μＭのＡＣＶによる処理、データ００３：１．５μＭのＧＣＶによる処理、データ００４：１．５μＭのＰＣＶによる処理。ＦＬ１：ＰＮＡ−ＦＩＴＣ、ＦＬ３：ＰＩ。
【図３】処理の１４日後における、テロメア長の減少、塊状のアポトーシス及びＵ−２ＯＳ細胞の細胞周期の変化を示すフローＦＩＳＨのデータを示す（点プロット：左パネル、棒グラフプロット：右パネル）。データ００１：処理なし、データ００２：３μＭのＡＣＶによる処理、データ００３：１．５μＭのＧＣＶによる処理、データ００４：１．５μＭのＰＣＶによる処理。ＦＬ１：ＰＮＡ−ＦＩＴＣ、ＦＬ３：ＰＩ。
【図１】
2008545658.tif 000002
【図２】
2008545658.tif 000003
【図３】
2008545658.tif 000004