(57)【要約】  開示の技術は、マイコバクテリア由来の表層多糖抗原に高度に特異的な濃縮抗体群を提供する。関連の実施形態では、抗体は、抗原活性を示す抗原を維持する環境で産生されることにより濃縮される。これらの抗体は、被験者由来の試料中のマイコバクテリア感染の存在を検出するために、免疫反応環境で使用することができる。【選択図】  図８
2008507544.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコバクテリア由来の表層多糖抗原に高度に特異的な濃縮抗体群。
【請求項２】
抗体が、抗原活性を示す抗原を維持する環境で産生されることによって濃縮されたものである、請求項１に記載の濃縮抗体群。
【請求項３】
抗体が、比較的不活性な抗原を認識する抗体を排除することによって濃縮されたものである、請求項１に記載の濃縮抗体群。
【請求項４】
抗体が、比較的不活性な抗原を認識する抗体を排除することによって濃縮されたものである、請求項２に記載の濃縮抗体群。
【請求項５】
マイコバクテリアがヒト型結核菌である、請求項１に記載の濃縮抗体群。
【請求項６】
表層多糖がリポアラビノマンナン（ＬＡＭ）である、請求項５に記載の濃縮抗体群。
【請求項７】
マイコバクテリアの抗原に高度に特異的な濃縮抗体を製造する方法であって、
マイコバクテリア由来の抗原に対する抗体を産生、単離する工程と、
単離抗体から、比較的不活性な抗原に特異的な抗体群を分離して、単離濃縮抗体を得る工程と、
を含む方法。
【請求項８】
マイコバクテリアの抗原に特異的な濃縮抗体を製造する方法であって、
抗原活性を保持する条件下でマイコバクテリア由来の抗原を単離する工程と、
単離抗原に対する抗体を、その抗原活性を保持させながら産生する工程と、
を含む方法。
【請求項９】
マイコバクテリアの抗原に高度に特異的な濃縮抗体を製造する方法であって、
マイコバクテリア由来の単離抗原で作製した第１のアフィニティーマトリックスに、単離抗原に特異的な抗体が第１のアフィニティーマトリックスに保持されるように、マイコバクテリアを接種した哺乳動物に由来の血清をアプライする工程と、
単離抗原に特異的な抗体を第１のアフィニティーマトリックスから単離する工程と、
マイコバクテリア由来の修飾抗原で作製した第２のアフィニティーマトリックスに、修飾抗原に特異的な抗体が第２のアフィニティーマトリックスに保持されるように、単離抗体をアプライする工程と、
第２のアフィニティーマトリックスからの溶出物を回収することにより単離抗原に特異的な濃縮抗体を単離して、マイコバクテリア抗原に対する特異性及び感受性が非濃縮抗体より高い濃縮抗体を得る工程と、
を含み、
前記修飾抗原が、薬剤で処理されて、単離抗原と比較して非活性化されたものである方法。
【請求項１０】
マイコバクテリアがヒト型結核菌である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
表層多糖がリポアラビノマンナン（ＬＡＭ）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記薬剤が過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
表層多糖が、フロイントアジュバントから単離されたものである、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
被験者由来の試料中のマイコバクテリア感染を検出する方法であって、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の濃縮抗体から作り出された免疫反応環境を提供する工程と、
免疫反応環境下で試料を反応させて、マイコバクテリア感染を検出する工程と、
を含む方法。
【請求項１５】
マイコバクテリア感染が、ヒト型結核菌によるものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
表層多糖がリポアラビノマンナン（ＬＡＭ）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
免疫反応環境がＥＬＩＳＡを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
マイコバクテリア感染がヨーネ病である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
マイコバクテリア感染が肺結核菌感染である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
マイコバクテリア感染が肺外結核菌感染である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記試料が、喀痰、血液、尿、組織又は他の適切な試料のいずれかである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料が未処理の非濃縮尿である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
試料中のマイコバクテリア感染を検出するためのキットであって、
免疫反応環境を提供するアッセイを含み、
免疫反応環境が、請求項１〜４のいずれか一項に記載の濃縮抗体を含むキット。
【請求項２４】
免疫反応環境がＥＬＩＳＡを含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
マイコバクテリア感染が、ヒト型結核菌によるものである、請求項２３に記載のキット。
【請求項２６】
抗体がリポアラビノマンナン（ＬＡＭ）である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
免疫反応環境がストリップテストとして行われる、請求項２３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物に起因する疾患及び状態を検出するための診断検査、より詳しくは、結核を検出するための診断検査及び方法に関する。
【背景】
【０００２】
ここ数十年間に、結核は、肺外症例の割合が増大するにつれ、肺を中心に発症する感染症から多面的な病変へと変貌した。今日まで、迅速で実地に即したスクリーニングアッセイが欠如していることが効果的な結核予防プログラムを妨げている。高所得国では、マイコバクテリア培養が依然として標準的な診断法であるが、これは時間がかかり、また、比較的高価である。理論的には、３つの喀痰塗抹標本に基づく喀痰鏡検によれば、培養陽性症例を６７％まで同定することができる。ＨＩＶ陽性か陰性か（ｓｅｒｏｓｔａｔｕｓ）がＡＦＢ診断に及ぼす影響を全く報告していない研究者もいるが、ＨＩＶ重感染では、喀痰中のヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の証明が困難であることが既に報告されている。ＨＩＶ陽性結核患者における肺外結核の割合が高くなると、ＡＦＢ陰性結核症例の割合が更に増大する。このことによって、結核の診断が益々困難になり、診断用検査ツールの改良が急務であることが明白になる。
【０００３】
現在の結核診断法は十分なものではない。特に喀痰に検出可能な細菌が存在しない場合、又は喀痰試料を取得することができない場合は、肺結核の喀痰検査は必ずしも有効ではない。更に、この診断検査では、診断の確認に鏡検及び／又は細菌培養が必要であるが、これらはいずれも、現場の診断に特に適しているというわけではない。また、結核性髄膜炎の診断に脳脊髄液を使用する場合も、通常、診断の確認に鏡検及び／又は細菌培養及び／又はＥＬＩＳＡ検査が必要であるので、特に現場では問題がある。
【０００４】
結核の血液検査も知られているが、実績が乏しく、また、複雑で信頼性が低い。尿検査は簡単で、より信頼性が高いが、現在の方法では、診断検査の実施前に尿の処理が必要である（そのような処理は通常、尿の濃縮を含む）。
【０００５】
新たに開発された方法としては、多数のマイコバクテリア抗原に対する抗体検査が挙げられるが、ルーチンの診断に必要な特異性を実現しているものは現時点では存在しない。また、ＨＩＶ陽性症例で感度が低いことも大きな制約である。別のアプローチとして、ＥＳＡＴ−６等のヒト型結核菌特異的抗原に対する免疫反応の測定が挙げられるが、これまでのところ、潜在結核感染と結核疾患との区別は不可能である。
【０００６】
結核は多様な形態で存在する極めて複雑な病変であるが、常に空気感染からスタートする。肺結核は、微生物が侵入した時点で直ちに発症し、肺外結核は、患者の体内に更に侵入した結果として生じるものである。肺外結核の最も一般的な例は、結核性髄膜炎及び骨結核である。この病変の複雑性は、この現代医学の世紀に試行される数多くの様々なアプローチを左右する。更に、ＨＩＶ随伴性肺結核の臨床所見及びＸ線所見は、免疫不全によって大幅に変化する。これらの要因によって、ＨＩＶ／結核患者の結核の症状を早期に認識することが極めて困難になると共に、このような患者の親類及び介護者への結核感染の危険性も高くなる。
【０００７】
マイコバクテリアは、例えば、上気道採取物（喀痰、気管支洗浄物、気管支肺胞洗浄物、気管支生検試料等）；尿、糞便、血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、組織生検試料、及び事実上あらゆる組織又は器官の深部穿刺吸引物を含む、様々な臨床検査試料から回収可能である。細菌培養は、今なお、結核診断で最も標準的な方法であるが、確定診断を行うのに６〜８週間も要する場合がある。マイコバクテリア感染の迅速な（細菌培養よりも速い）診断のために用いられる主要な技術として、次の３つが挙げられる。
・喀痰塗抹標本の直接鏡検
・ＰＣＲベースのアッセイ
・免疫診断法
【０００８】
（喀痰塗抹標本の直接鏡検）
一世紀以上前に、ロベルトコッホ（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｋｏｃｈ）は、臨床検査試料から結核の病原体を染色、培養することによって、それを同定した。今日の結核の診断法は、通常、コッホが用いた技術と実質的に異ならない染色培養技術を用いて確立されたものである。喀痰の直接鏡検は、今日の開発途上国における標準的な結核診断法であり、また、新たな検査法の性能を評価する際の基準である。この方法は肺結核に適用されるが、小児、又は初期段階の肺結核患者に対してはあまり有効でない。
【０００９】
（ＰＣＲベースのアッセイ）
７つの研究所におけるＰＣＲ検査の性能比較試験において、３％〜２０％の範囲の高レベルの偽陽性ＰＣＲ結果が示された（ある研究所では７７％という極端な数値を示した）。このような比較的見劣りする性能は、この方法の各工程のモニタリングが不十分であったことによるものであり、アッセイの全段階で注意深く品質管理を行う必要があることを強く示している。
【００１０】
（免疫診断法）
結核皮膚検査：この検査は、恐らく、結核の最も古典的な免疫検査である。少量のＰＰＤツベルクリンと呼ばれる物質を、小型針を用いて前腕の皮膚の最上層の真下に接種する。この検査では、物質投与後４８〜７２時間に判定する。一般に、１０ｍｍ以上の腫脹が陽性であると考えられている。多数の開発途上国が、結核予防のためにＢＣＧ接種を行っている。ＢＣＧ接種後、ＰＰＤ皮膚検査は通常陽性になる。皮膚検査の結果は、ＰＰＤ抗原の質、免疫系の反応性によって、また、恐らくは個体の人種によっても異なる。また、この検査は、感染の段階及び部位に関する絶対的な指標を提供するものではない。
【００１１】
ヒト型結核菌の血清学的検査：この方法は、マイコバクテリア抗原に対する抗体免疫反応の検出に基づくものであり、研究及び臨床の場で最も広く用いられている方法の１つである。血清学的検査は全て、精製抗原を使用すれば、ほぼ同じ感度及び特異性を有する。検査の感度は、最良の検査を行えば、塗布標本陽性では８０％、塗布標本陰性では６０〜７０％である。報告された特異性は一般に高く、９５〜１００％の範囲である。
【００１２】
現行の技術は、いくつかの点で性能が制限されている。
【００１３】
最も広く受け入れられ、迅速に実施可能な鏡検検査は、完了までに数時間を要すると共に、熟練の技術者及び臨床検査室環境が必要である。検査結果の分析は、感染症分野における現在の標準である迅速ＰＯＣ検査と比較してはるかに難しい。患者１人当たりの分析１回の実質費用は、米国の病院では１００〜１５０ドルの範囲である。この検査の臨床上の特異性は極めて良好であるが、感度の改良が期待される。
【００１４】
皮膚検査は、感度は十分であるが、長時間を要し、病理過程の段階に関する情報が得られず、また、感染個体と予防接種を受けた個体とが十分に区別されない。
【００１５】
血清学的検査は、通常、感度が十分でない。検査結果は、結核抗原に対する個体の免疫反応の差異に応じて異なる。これらの検査は、ヒト型結核菌に感染したＨＩＶ患者では殆ど機能しない。この要因が、アフリカ及び多くのアジア諸国における適用可能性を大幅に制限している。米国では、この患者集団が結核感染患者の大部分を構成している。
【００１６】
ＰＣＲ検査は先進国で広く使用されているが、複雑で、費用が高く、また、開発途上国におけるスクリーニング検査として受け入れられる程度には感度がよくない。
【００１７】
感染症の迅速診断として好ましい方法は、患者試料中の細菌抗原の検出に基づくものであり、特定の病原体に起因する活動性感染過程の決定的な証拠を提供するものである。マイコバクテリア感染の検出に直接抗原検査を使用するというコンセプトは、いくつかの刊行物に記載されている。
【００１８】
例えば、１９８２年には、ヒト型結核菌の最初の直接抗原アッセイの開発が報告されている（ウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）（ＢＣＧワクチン）の全細胞に特異的なウサギ抗体を用いる、活動性肺結核患者の喀痰中のヒト型結核菌抗原検出のためのラジオイムノアッセイ）。オートクレーブにかけ、超音波処理した喀痰が試料として用いられた。このアッセイでは、活動性肺結核患者から得た喀痰３９試料のうち３８試料で抗原が検出された。
【００１９】
その後の研究では、結核性髄膜炎患者の脳脊髄液中のマイコバクテリア抗原を検出するＥＬＩＳＡ系の開発が報告されている。これもやはり、ウシ型結核菌の全細胞に特異的な抗体を用いる。いずれの系も、驚くほど高い特異性を示した。検出を担う主要抗原はＬＡＭであったが、マイコバクテリウム・カンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）が５％の交差反応性を示し、マイコバクテリウム・イントラセルラー（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・フォルツイツム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）及びマイコバクテリウム・ヴァッカエ（Ｍ．ｖａｃｃａｅ）の交差反応がわずか２％であったことが報告されている。他には、結核性髄膜炎の患者１２人のうち、９人のＣＳＦ中のマイコバクテリア抗原がＥＬＩＳＡによって検出された（８１．２５％の感度に相当）ことが報告されている。この検査の特異性は９５％であった。
【００２０】
結核診断用検査の開発の従来の試みは殆ど全て、この疾病の肺型の検出に焦点が当てられていた。肺外型は、診断が難しいことが周知であり、肺型と比べて罹患率が低いことから、関心が比較的低かった。１９５０年代及び１９６０年代まで、肺外結核症例は、全結核症例の約１０％を占めるにすぎなかった。しかし、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの発症が大流行して、状況は完全に変わった。これらの２つの疾病は、ついには、新たな複雑な公衆衛生問題へと変化した。今日、少なくとも６０％の未治療ＨＩＶ患者が、その生涯において活動性結核を発症し、７０％もの結核患者が、サハラ以南のアフリカ及びアジアでＨＩＶに感染している。ＨＩＶと結核との複合は、結核の疫学だけでなく、その疾病自体の経過も変化させた。ここ数十年間に、結核は、肺外症例の割合が増大するにつれ、肺を中心に発症する感染症から多面的な病変へと変貌した。現在、肺外結核症例が結核の全症例の３０％まで占めると推定されているが、この数は、肺外型結核の迅速なスクリーニング及び診断ツールが存在しないことから過小評価の可能性さえある。更に、ＨＩＶ患者の肺結核であっても、非定型的な症状を示す場合が多い。例えば、このような患者は、一般に喀痰を生じない。これらの要因によって、ＨＩＶ／結核患者の結核の症状を早期に認識することが極めて困難になると共に、このような患者の親類及び介護者への結核感染の危険性も高くなる。肺外型結核の検査を含む、ヒト型結核菌感染による広範囲の病変が検出可能で、使用が容易なスクリーニング検査が至急求められている。このような必要性については長く議論されてきたが、目的の実現への進歩はなかった。今日、それは、公衆衛生医療における急務となっている。
【００２１】
別の肺細菌感染の症例では、現在一般に行われているスクリーニング方法は、患者尿中に分泌される多糖抗原の検出をベースとするものである。細菌多糖はヒトには稀な単糖から構成され、そのため、ヒト酵素による切断に耐性を有する。これにより、細菌多糖は、多糖特異的イムノアッセイによる検出に好適な免疫化学的にインタクトな形態で尿中に分泌される。尿中に分泌された細菌多糖は極めて低濃度であるので、それをスクリーニング法として使用するためには、極めて高感度のイムノアッセイが必要となる。
【００２２】
スウェーデン及びノルウェーの共同研究グループは、患者尿中のＬＡＭ抗原を検出するＬＡＭ特異的ＥＬＩＳＡ系の開発を試みた。この系では、ＳｖｅｎｓｏｎのＰＣＴ出願ＷＯ９７／３４１４９に記載されているように、リポアラビノマンナンに基づく、尿中の結核検出のための抗原捕捉を用いている。リポアラビノマンナンは、ヒト結核の発症に関与する生物であるヒト型結核菌の表層に存在する多糖である。開示の診断法は、ＡＦＢ陽性患者の８１．３％及びＡＦＢ陰性患者の５７．４％の患者尿中のＬＡＭの存在を検出し、マイコバクテリア感染の診断における、マイコバクテリアＬＡＭ抗原の検出の有用性を明らかにした。他方、上記系は、開示の方法のスクリーニングにおける有用性は明らかにしていない。上記方法は、ＬＡＭ抗原に特異的なアフィニティー精製ウサギポリクローナル抗体を使用していたにも関わらず、未処理の非濃縮尿試料で使用するのに十分な感度を欠いていた。上記診断法では、患者の尿を濃縮し、ＥＬＩＳＡ検査による分析用に調製するために、生化学検査室で約２４〜４８時間高度な操作を行うことが求められる。全体的に、Ｓｖｅｎｓｏｎのアッセイの感度は、開示の方法を実地で使用するには不十分である。このイムノアッセイは、複雑で、時間がかかることから、マイコバクテリア感染を検出するスクリーニング検査として実際に使用することはできない。疾患状態の検出に用いる診断検査においてスピード、使い易さ及び高感度の全てが極めて重要である臨床の場では使用しにくいためである。
【発明の概要】
【００２３】
本発明の第１の実施形態では、緩和な酸化法（例えば、低濃度のＮａＩＯ４による処理）を用いてリポアラビノマンナン（ＬＡＭ）を酸化することにより作製した、ヒト型結核菌由来ＬＡＭの抗原活性を示すアイソフォームが提供される。別の実施形態では、対象患者由来の尿、喀痰、血液、組織又は他の試料中の多糖（例えばＬＡＭ）の検出で使用するための、非活性化マイコバクテリアに対する、より詳しくは、表層多糖（例えばＬＡＭ）に対する高度に特異的で高純度の抗体が作製される。これは、緩和な酸化法によって作製した、抗原活性を示すＬＡＭのアイソフォームを用いて行われる。別の実施形態では、対象患者の結核を診断するために、抗原活性を示す形態のＬＡＭに対して産生された高度に特異的で高純度の抗体が使用される。
【００２４】
別の特定の実施形態では、マイコバクテリア由来の表層多糖抗原に対して高度に特異的な濃縮抗体群が提供される。この実施形態では、濃縮抗体群は、抗原活性を示す抗原を維持する環境で産生されることによって濃縮されてもよい。それに代えて、又はそれに加えて、抗体は、比較的不活性な抗原を認識する抗体を排除することによって濃縮される。一部の実施形態では、マイコバクテリアはヒト型結核菌であってもよい。同様に、表層多糖はリポアラビノマンナン（ＬＡＭ）であってもよい。
【００２５】
別の実施形態では、マイコバクテリアの抗原に高度に特異的な濃縮抗体を製造する方法が提供される。この実施形態において、上記方法は、マイコバクテリア由来の抗原に対する抗体を産生、単離する工程と、単離抗体から、比較的不活性な抗原に特異的な抗体群を分離して、単離濃縮抗体を得る工程と、を含む。
【００２６】
別の実施形態では、マイコバクテリアの抗原に高度に特異的な濃縮抗体を製造する方法が提供される。この実施形態では、上記方法は、抗原活性を保持する条件下でマイコバクテリア由来の抗原を単離する工程と、単離抗原に対する抗体を、その抗原活性を保持させながら産生する工程と、を含む。
【００２７】
更に別の実施形態では、マイコバクテリアの抗原に高度に特異的な濃縮抗体を製造する方法が提供される。この実施形態では、上記方法は、マイコバクテリア由来の単離抗原で作製した第１のアフィニティーマトリックスに、単離抗原に特異的な抗体が第１のアフィニティーマトリックスに保持されるように、マイコバクテリアを接種した哺乳動物に由来の血清をアプライする工程と、単離抗原に特異的な抗体を第１のアフィニティーマトリックスから単離する工程と、マイコバクテリア由来の修飾抗原で作製した第２のアフィニティーマトリックスに、修飾抗原に特異的な抗体が第２のアフィニティーマトリックスに保持されるように、単離抗体をアプライする工程（ここで、修飾抗原は、薬剤で処理されて、単離抗原と比較して非活性化されたものである。）と、第２のアフィニティーマトリックスからの溶出物を回収することにより単離抗原に特異的な濃縮抗体を単離して、マイコバクテリア抗原に対する特異性及び感受性が非濃縮抗体より高い濃縮抗体を得る工程と、を含む。
【００２８】
更なる関連の実施形態では、マイコバクテリアはヒト型結核菌であってもよく、また、表層多糖はリポアラビノマンナン（ＬＡＭ）であってもよい。
【００２９】
別の実施形態では、マイコバクテリア由来の抗原を修飾する薬剤は過ヨウ素酸ナトリウムである。別の関連の実施形態では、表層多糖は、フロイントアジュバントから単離されたものであってもよい。
【００３０】
更に別の実施形態は、被験者由来の試料中のマイコバクテリア感染を検出する方法が提供される。この実施形態では、上記方法は、免疫反応環境を提供する工程（ここで、免疫反応環境は、上述の濃縮抗体から作り出されたものである。）と、免疫反応環境下で試料を反応させて、マイコバクテリア感染を検出する工程と、を含む。
【００３１】
場合により、マイコバクテリア感染は、ヒト型結核菌によるものであっても、ヨーネ病であってもよい。同様に、表層多糖はリポアラビノマンナン（ＬＡＭ）であってもよい。更なる関連の実施形態では、免疫反応環境はＥＬＩＳＡを含み、また、ストリップテストとして行われてもよい。関連の実施形態では、マイコバクテリア感染は、肺結核菌感染であっても肺外結核菌感染であってもよく、また、試料は、喀痰、血液、尿、組織又は他の適切な試料のいずれであってもよい。関連の特定の実施形態では、試料は、未処理の濃縮されていない尿であってもよい。
【００３２】
別の実施形態では、試料中のマイコバクテリア感染を検出するためのキットであって、免疫反応環境を提供するアッセイを含むキット（ここで、免疫反応環境は、上述の濃縮抗体を含む。）が提供される。関連の実施形態では、免疫反応環境はＥＬＩＳＡを含み、また、ストリップテストとして行われてもよい。更なる関連の実施形態では、マイコバクテリア感染はヒト型結核菌によるものであってもよく、抗体はリポアラビノマンナン（ＬＡＭ）であってもよい。
【００３３】
本発明の以上の特徴は、添付の図面を参照しながら、以下の詳細な説明を参照することにより、更に容易に理解されよう。
【実施形態の詳細な説明】
【００３４】
定義：
文脈上異なる意味に解するべきでない限り、以下の用語は以下に示す意味を有するものとする。
【００３５】
本明細書で使用する「免疫反応環境」とは、イムノアッセイ、免疫反応、免疫化学、及び、所望の結果を達成するために免疫反応を含み、又はそれに関与し、又はそれに依存する全てのプロセス、アッセイ、方法又は系を支持する環境を意味する。免疫反応環境の例としては、Ｓｗａｎｓｏｎらの米国特許第５０７３４８４号；Ｇｕｉｒｅらの米国特許第５６５４１６２号及び同第６０２０１４７号に詳述されているものが挙げられる。これらには、液体中の分析対象物を定量的に測定する方法及び装置が開示されているが、そこでは、特定の実施形態において、分析対象物及び反応物が、特異的リガンド（抗原）−抗体（抗リガンド）結合ペアの異なる部分に相当する免疫化学反応が用いられている。これらの特許は、本明細書及び添付の特許請求の範囲でいう「ストリップテスト」として実施された技術に関連する。
【００３６】
「フロイントアジュバント」は米国Ｓｉｇｍａ社製のものである。
【００３７】
本発明者らは、体液（尿を含むが、これに限定されない。）中のマイコバクテリア抗原（特にヒト型結核菌抗原、例えば、表層多糖リポアラビノマンナン（ＬＡＭ）、及び近縁種）の存在を検出する高感度な方法を開発した。従来は、この種の検査は感度不足で、未処理の尿試料に対して、又は肺外結核感染の検出のために実施することができなかった。特に、本発明者らは、マイコバクテリア由来の抗原に対して産生された濃縮抗体であって、抗原活性を示す抗原を維持する環境で産生されることにより濃縮された濃縮抗体を開発した。この第１のクラスの濃縮抗体を製造する方法を「直接法」と呼び、これについては以下で更に詳しく説明する。
【００３８】
本発明者らはまた、比較的不活性な抗原を認識する抗体を排除することによって濃縮された抗体を開発した。このクラスの抗体の製造方法は、「直接法」に従って濃縮抗体を得ることによって開始するが、その後、比較的不活性な抗原を認識する抗体を排除することによって行う。本発明者らは、この第２のクラスの濃縮抗体の製造方法を「強化法」と呼び、これについても以下で更に詳しく説明する。
【００３９】
図８には、強化法の一実施形態の実施の際に必要な工程を示す概略図である。強化法は直接法を基礎とするので、第１のアフィニティーカラムの後にストップすれば、図８はまた直接法を示すことになる。
【００４０】
以下、いずれか１つ又は両方のクラスの濃縮抗体を用いて、様々な試料（未処理の（即ち、濃縮されていない）尿試料を含むが、これに限定されない。）中の結核の肺感染及び肺外感染をどのように検出するかを示す。（他に試料源となりうるものとしては、喀痰、脳脊髄液、血液、組織、洗浄物が挙げられる。）実施例では、濃縮抗体は、その抗原活性を保持する環境でリポアラビノマンナン（ＬＡＭ）のエピトープに対して産生される。
【００４１】
血清、尿、喀痰等の種々の体液を用いて表層多糖（ＬＡＭ）を検出する従来の方法を調査したが、問題があることが明らかとなった。血清では、免疫複合体の形成によってＬＡＭの検出が妨げられるようである。肺外感染では、マイコバクテリア抗原を含有する喀痰が得られないことが多いので、喀痰中のＬＡＭの検出は、肺結核患者の試料でのみ可能である。尿を使用する従来の研究は多くの試料処理及び操作を要し、そのため、そのような方法は現場では制限される。いずれも、肺外マイコバクテリア感染（例えば、ＨＩＶ陽性の被験者で増加しているもの感染）の診断には有効ではなかった。
【００４２】
本発明の実施形態は、被験者由来の広範囲の試料タイプにおけるマイコバクテリア抗原検出に使用可能な濃縮抗体を提供することにより、従来技術の問題を解決する。これらの試料タイプとしては、とりわけ、血清、血液、喀痰、洗浄物、組織、及び未処理の非濃縮尿が挙げられる。
【００４３】
リポアラビノマンナン（ＬＡＭ）は、マイコバクテリウム属に特異的な１７５００ｍｏｌ  ｗｔのリポ多糖である。リポアラビノマンナンは、マンノース残基及びアラビノース残基からなる複合多糖抗原であり、高度に分枝した複雑な構造を形成している。マイコバクテリアの多糖抗原に関する構造研究が４０年以上行われているにも関わらず、当業者からは未だ、構造の断片又は構造モチーフ及び複合モデルについてしか報告されていない。ＬＡＭ構造の最新の複合モデルを図１に示す。
【００４４】
ＬＡＭは、マイコバクテリアの外細胞壁の一部として、代謝的に活性な細菌細胞又は変性した細菌細胞から放出される。活動性結核感染では、ＬＡＭが循環中に漏出し、腎臓を通過し、それ故、尿（マイコバクテリア量のレベルが反映されている。）中で検出することができると考えられる。ＬＡＭは、ヒトの分解性グリコシダーゼが存在しないグリコシド結合を有する糖鎖抗原であるので、抗原は尿中にインタクトな形態で生じる。
【００４５】
マイコバクテリアのＬＡＭ抗原は、次の３つの主要な構造ドメインからなる。可変鎖長を有する可変数の脂肪酸を含有するマンノシル−ホスファチジル−ミオ−イノシトール（ＭＩＰ）アンカー；マンノース残基数が可変のマンナンコア多糖；及び、マンナンコアに結合している分枝状アラビナン多糖鎖。これまでの多くの努力にも関わらず、マンナンコア上のアラビナン鎖結合部位は未だ知られていない。アラビナン多糖鎖は、長さが不定のモノ−、（α１−２）−ジ−、及び（α１−２）−トリ−マンノシル単位からなるマンノースオリゴ糖でキャップされている（キャッピングモチーフ）。キャッピングの程度は菌株によって異なり、また、場合によっては増殖条件にも依存する。
【００４６】
マイコバクテリアＬＡＭが極めて高度な構造上の複雑性及び可変性を有することにより、抗原エピトープのスペクトルは極めて複雑なものとなっている。選択された診断用抗原が複雑であるため、主たるイムノアッセイ試薬としてはアフィニティー精製ポリクローナル抗体を使用せざるを得ない。ポリクローナル抗体の使用によってのみ、臨床試料中に存在するＬＡＭが有する可能性のある抗原特異性のスペクトル全体をカバーすることができる。サンドイッチイムノアッセイをできるだけ高いアッセイ感度で行うために、最大限の濃度の抗原特異的抗体が、捕捉ゾーン中で、また、標識抗体として用いられる。抗原特異的なアフィニティー精製は、そのような抗体を生じることが知られている。
【００４７】
抗原ベースのアフィニティーカラムを作製するために、本発明者らは、抗原単離、及び固相支持体へのカップリングを行う方法を開発した。ＬＡＭ抗原の単離方法は、一部のマイナーな変更があるが、文献に記載され、当技術分野で周知の別の細菌多糖の単離方法に基づくものである。以下で説明する。
【００４８】
文献に記載の従来のＬＡＭベースの直接抗原イムノアッセイは、ＬＡＭセファロースカラムを用いる抗原特異的なアフィニティークロマトグラフィーによって精製されたポリクローナル抗体を用いる。アフィニティーマトリックスの合成に関する従来のアプローチは、ＬＡＭ多糖の部分的なＮａＩＯ４酸化を行い、その後、ＮＨ２−セファロースへのカップリングを行うことに基づくものである。驚くべきことに、図２から明らかなように、本発明者らの実験により、ＬＡＭ多糖のＮａＩＯ４酸化の抗原活性が示された。
【００４９】
ＮＨ２−固相支持体への酸化多糖のカップリング効率が酸化の程度に比例することから、本発明者らは、５０ｍＭのＮａＩＯ４で酸化したＬＡＭ抗原を、官能基化ＢＳＡスペーサー分子を介してセファロース支持体にカップリングさせた。このレベルの酸化では、後述のように、ＬＡＭ多糖は依然としていくらかの抗原活性を保持するが、高いカップリング効率を示す。このようなアフィニティーマトリックスに免疫血清をアプライすると、ウサギ抗体画分が高収率で単離された。そのような抗体をプレートＥＬＩＳＡイムノアッセイフォーマットにおいて捕捉抗体として試験したところ、いくらかの機能的活性が示されたが、非濃縮尿試料を用いるスクリーニング用途に必要な高感度イムノアッセイで使用するのに十分なレベルではなかった。これらのデータにより、従来の文献（ＬＡＭ特異的アフィニティー精製抗体を使用している。）で得られた結果を説明することができるが、試料中に存在するＬＡＭを検出するには、依然として尿試料の濃縮が必要であった。
【００５０】
意外なことに、図３から明らかなように、ＬＡＭのカップリング化学を、臭化シアン（ＣＮＢｒ）による多糖の活性化に基づく緩和な非破壊的方法に変更することによって、はるかに品質が高いＬＡＭ特異的抗体が精製された。
【００５１】
次いで、驚くべきことに、インタクトなＬＡＭを保持するカラムで精製した抗体（ＣＮＢｒ活性化法）を、深く強いＮａＩＯ４還元（以下参照）の後に、ＬＡＭ抗原を保持するカラムに通過させることによって、ＬＡＭ特異的直接抗原イムノアッセイで極めて高い活性を示す、比較的小さな画分の抗体が得られた（アプライ量の約７〜１０％）。図３は、そのような抗体の捕捉抗体としての性能を示す。そのような抗体を西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識し、標識抗体として用いると、試験した、又は公知の他のどの抗体よりも高い活性を示した。そのような抗体をベースとしたＥＬＩＳＡ系は、極めて感度が高く、非濃縮尿試料の検査において有用であることが判明した。これにより、現場における、又は、肺結核及び肺外結核の両症例における迅速スクリーニングに適したパフォーマンス特性を有するスクリーニングＬＡＭ特異的イムノアッセイを得ることができる（これは、従来誰も達成することができなかった偉業である）。即ち、従来ＬＡＭは結核患者の凍結尿中に存在するものと報告されてきたが、そのような報告に係るアッセイは多くの試料調製を要し、このため、実地に即したものではない。
【００５２】
〔プロトコール〕
このセクションでは、上述の定義の「直接法」及び「強化法」を実施するのに好適なプロトコールを説明する。この説明自体は、直接法か強化法かによって厳密に区分されるものではないが、文脈に応じて、いずれかの、又は両方の方法における使用に適したカラムの作製方法が特に説明されている。図８は、直接法及び強化法の概略図である。
【００５３】
（フロイントアジュバントからのヒト型結核菌の乾燥細胞の単離）
まず、使用前に、細胞をフロイントアジュバントと共に室温で最低１週間置く。アジュバントバイアルからキャップを取り除き、バイアルの底にある細胞を分散させることなく、多量の鉱油を取り出す。少量の鉱油は、細胞沈殿物が入るのを避ける予防措置としてバイアル中に残してもよい。鉱油を廃棄し、次いで、６．０Ｌのエタノール及び６．０Ｌのジエチルエーテルを混合し、各バイアルへ５ｍＬのエタノール：ジエチルエーテル混合物を加える。
【００５４】
次に、バイアルを閉め、ボルテックスにかけ、懸濁液を１Ｌのエルレンマイヤーフラスコにすばやく移す。この工程中、細胞がバイアル中に再び沈殿しないようにする。１Ｌのエルレンマイヤーフラスコを１Ｌラインまで満たし、細胞を１〜１．５時間置く。次に、エルレンマイヤーフラスコから綺麗な１Ｌビーカーに溶媒を静かにデカントする。沈殿した細胞を分散させることなく、溶媒と共に移動させる。ビーカーへデカントした溶媒が透明な場合は、それを廃棄する。細胞がかなりの量で溶媒と共にデカントされた場合は、エルレンマイヤーフラスコにデカントした溶媒を戻し、静置工程を繰り返す。エタノール：ジエチルエーテル混合物の２０〜３０ｍｌアリコートを用いて、細胞をガラスの焼結フィルターに移す。
【００５５】
５００ｍＬのエタノール−ジエチルエーテル混合物で細胞を洗浄し、次いで、２００ｍｌのジエチルエーテルで洗浄する。次に、１００ｍｍＨｇ＋／−１０の真空（低真空）を用いてフィルターの細胞を風乾する。時々混ぜ合わせて細胞集団を均質化し、次いで、多孔質材料（例えばキムワイプ）でフィルターを覆い、乾燥するまでフード中に静置する（約１５時間、即ち一晩）。
【００５６】
全重量を計量して記録し、細胞の乾燥重量を算出する。次いで、ゴム内張りキャップで固く密閉し、１５〜３０℃で保存する。
【００５７】
（粗ＬＡＭ抗原のフェノール抽出）
２５０ｍＬのパイレックス培地ボトルにヒト型結核菌の乾燥細胞を入れ、細胞に、加温した脱イオン水を加える。ボルテックスにかけ、懸濁液が均質になるまで超音波水浴中で懸濁液に超音波処理する（〜２０秒パルス）。
【００５８】
細胞をフェノール抽出し、次いでエタノール沈殿させ、沈殿した細胞を一晩（〜１６時間）冷蔵庫（２〜８℃）に置き、沈殿物を沈降させる。沈殿物を混濁しないように十分に注意して、約１００ｍＬの上清が沈殿物を覆う状態になるまで上清を静かに除去する。静かに振盪混合し、次いで、テフロン製遠心分離管に残っている懸濁液を移し、２０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離する。ペレットを混濁させずに、全ての遠心分離管からできるだけ多くの上清を取り除き、各遠心分離管に脱イオン水５ｍｌを加え、ボルテックスにかけ、超音波処理を行い、水中にペレットを溶解させる。全ての画分を溶解したペレットと合わせ、５００ｍＬのフラスコに入れる（注：フラスコ容量／容積の１／１０を超えないようにする）。最小容量までロータリーエバポレーターで蒸発させるが、試料をカラメル化しないようにする。水約５０ｍＬでフィルムを再溶解し、試料が乾燥するまで３回乾燥及び再溶解を繰り返す。水５０ｍＬに再溶解させ、凍結乾燥する。
【００５９】
（セファデックスＧ−２５クロマトグラフィーによるＬＡＭ抗原の精製）
０．２５％の酢酸溶液１５ｍＬに８００ｍｇの粗ＬＡＭ  Ａｇを溶解させる。ボルテックスにかけ、超音波浴中で超音波処理し、完全に溶解させる。５０００ｒｐｍで５分間、微小遠心で遠心分離する。２０ｍＬのガラス製バイアルに上清を回収し、別々のクロマトグラフィーを実施するために上清を３つの均等部に分け、次いで、先に回収したＬＡＭ  Ａｇ上清の１／３をクロマトカラムに静かに加える。１００ｍＬの容量をカラムから流出させた後、画分の回収を始める。クロマトグラフィーの開始から３５０ｍＬの移動相が通過するまで、画分の回収を続ける。全ての画分を覆い、２〜８℃で保存する。２５０ｍＬのエバポレーションフラスコでロータリーエバポレーションを行う（容量は２５ｍＬを超えない）。最小容量まで蒸発させるが、試料をカラメル化しないようにする。水２０ｍＬに蒸発させた物質を希釈し、超音波処理し、完全に溶解するまでボルテックスにかけ、次いで、凍結乾燥する（約８時間）。スパーテルで乾燥させた物質を秤量用ガラスバイアルに掻き集め、秤量する。
【００６０】
以上の工程を図６に概略的に示す。
【００６１】
（ＣＮＢｒ活性化によるＬＡＭ抗原のＢＳＡスペーサーへのカップリング）
まず、０．５Ｍ重炭酸ナトリウムと１Ｍ炭酸カリウム溶液を調製する。次いで、脱イオン水１．５ｍＬ中に３０．０ｇの精製ＬＡＭ  Ａｇを溶解する。パルス超音波処理（１０〜２０秒パルス）を用いて、ボルテックスにかけ、ＬＡＭ  Ａｇを完全に溶解させる。
【００６２】
脱イオン水１５ｍＬ中にＢＳＡ−ヒドラジンリガンド３００ｍｇを溶解する。パルス超音波処理を行い（１０〜２０秒パルス）、ボルテックスにかけて完全に溶解させ、次いでマイクロチューブに入れ、１０，０００ｒｐｍで１０分間、微小遠心で遠心分離する。パスツールピペットを用いて、各チューブから透明な上清を注意深く回収、プールし、２０ｍＬのバイアルへ移す。形成されうる全てのペレットを混濁しないようにする。０．５Ｍ重炭酸ナトリウム１．０ｍＬを上記バイアルに加え、振盪させて十分に混合する。冷却した１Ｍ炭酸カリウム１５０μＬをＬＡＭ溶液に加え、短時間ボルテックスにかけて十分に混合する。得られた溶液を氷／水浴中に置く。
【００６３】
すぐに使用する、アセトニトリルに溶解した５ｍｇ／ｍＬのＣＮＢｒを調製し、この臭化シアン溶液１８０μＬをＬＡＭ溶液に加える。ボルテックスにかけて混合し、約１５分間氷上に置く。パスツールピペットで（上述の）ＢＳＡヒドラジンリガンド溶液に上記溶液を加える。よく混合し、しっかり密閉したバイアル中、２〜８℃で一晩（１６〜２４時間）インキュベートする。
【００６４】
（ＮａＩＯ４活性化によるＬＡＭ抗原のＢＳＡスペーサーへのカップリング）
３〜４ｍＬバイアル中の脱イオン水１．２５ｍＬにＬＡＭ抗原を溶解させる。超音波処理し、ボルテックスにかけて完全に溶解させる。０．１Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を調製する（ＮａＯＡｃ緩衝液中、ｐＨ４．０）。０．１Ｍ  ＮａＩＯ４溶液１．２５ｍＬを１．２５ｍＬのＬＡＭ溶液に加える。ボルテックスにかけて混合する。バイアルをアルミニウムホイルで覆い、振盪パレットに置き、室温で１時間＋／−５分間混合する。
【００６５】
２５〜４０ｍＬのガラス製血清バイアル中の脱イオン水１２．５ｍＬにＢＳＡ−ヒドラジンリガンド２５０ｍｇを溶解させる。超音波処理を用いて、ボルテックスにかけて完全に溶解させ、次いで、１０，０００ｒｐｍで約１０分間遠心分離を行う。パスツールピペットを用いて各チューブから上清を回収し、２５〜４０ｍＬのガラスバイアルへプールする。ペレットを混濁しないようにする。バイアルに０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）を１２．５ｍＬ加え、短時間ボルテックスにかけてよく混合する。
【００６６】
カップリング法：
ＢＳＡヒドラジン溶液に酸化ＬＡＭ溶液を加え、ボルテックスにかける。シアノ水素化ホウ素ナトリウムを１００ｍｇ加え、密閉する。最終溶液１０μＬをサンプリングし、９０μＬの１×ＰＢＳ緩衝液（ＱＣ溶液）で希釈し、更なる分析用に保存する（ＬＡＭ濃度は約０．７５ｍｇ／ｍＬになる）。
【００６７】
ＮａＩＯ４によるセファロースの活性化：
沈降ゲル８０ｍｌに対応するセファロース４Ｂ−ＣＬの懸濁液のアリコートを測定し、焼結ガラスフィルター上に移す。５００ｍＬの水で洗浄し、ゲル表面の粒状構造が見えるようになるまで、低真空（約３００ｍｍＨｇ）で流出させる。ゲル層に空気の隙間が形成されないようにする。０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０溶液）を調製し、これを用いて、０．１Ｍ  ＮａＯＡｃに溶解した３０ｍＭ  ＮａＩＯ４溶液を調製する。
【００６８】
ゲルに３０ｍＭ  ＮａＩＯ４を２５０ｍＬ加え、完全に混合する。アルミホイルでボトルを覆い、室温で１．５時間±１０分間、中間スピードの振盪パレットに４５度の角度で置く。焼結ガラスフィルターに移し、低真空（約３００ｍｍＨｇ）で水１Ｌを用いて洗浄する。活性化ゲルは、使用の最大４時間以内に調製しなければならない。
【００６９】
（ＢＳＡ−ＬＡＭリガンドの活性化セファロースへのカップリング（第１のアフィニティーカラム及び第２のアフィニティーカラムの合成用））
マトリックスの作製：
１×ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に溶解した０．１％のアジ化ナトリウム溶液を調製する。６０ｍｌの沈降ゲル（又は別の好適なマトリックス）に対応する活性化セファロースの懸濁液を測定し、焼結ガラスフィルター上に移す。ゲルを充填し、粒状構造が見えるようになるまで、低真空（３００ｍｍＨｇ）でゲルを流出させるが、ゲル表面に割れ目が形成されないようにする。
【００７０】
ＢＳＡ−ＬＡＭリガンド溶液：
２５０ｍＬ培地ボトル中、約１７〜２０ｍＬのＢＳＡ−ＬＡＭリガンド溶液をリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で９０ｍＬに希釈する。結晶性シアノ水素化ホウ素ナトリウム９０ｍｇをこの溶液に加える。供給品のプラスチックキャップを用いて、しっかりとボトルを閉める。短時間ボルテックスにかけて十分に混合する。この溶液は乳白色に見えるかもしれないが、沈殿物はないはずである。シアノ水素化ホウ素ナトリウムによって形成された微小の気泡は見えるかもしれない。
【００７１】
カップリング工程：
上で調製したＬＡＭ溶液に、流出させた活性化セファロースゲルを加える。しっかりと閉め、緩やかにボルテックスにかけ、懸濁液を完全に混合する。３７℃＋／−２℃で約４時間インキュベートし、１時間毎に反応混合物を（逆さにして）混合する。１．５Ｍトリス緩衝液４．５ｍＬを加え、再度キャップをしっかりと閉める。３７℃＋／−２℃で約１６時間（一晩）インキュベーションを続ける。
【００７２】
焼結ガラスフィルター上に反応混合物を移し、低真空（３００ｍｍＨｇ）を用いて、綺麗な１００〜２００ｍＬのブンゼンフラスコに液相を回収する。脱イオン水４００ｍｌでフィルター上のＬＡＭ−セファロースゲルを洗浄し、６００ｍＬの１×ＰＢＳで洗浄を続ける。
【００７３】
カラムの充填及び保存：
２５０ｍＬビーカー中で、調製したゲルに１×ＰＢＳを１００ｍＬ加える。手動で攪拌してスラリーにする。１×ＰＢＳを用いて、標準の手順に従ってカラムへ充填する。１×ＰＢＳ及び０．１％アジ化ナトリウムでカラムを平衡化する。
【００７４】
（ＬＡＭリガンドの活性化セファロースへの一般的なカップリング（アフィニティーカラムＩ及びＩＩの作製用））
沈降ゲル１００ｍｌに対応する活性化セファロースの懸濁液を測定し、焼結ガラスフィルター上に移す。ゲルが充填され、粒状構造が見えるようになるまで、低真空（３００ｍｍＨｇ）でゲルを流出させるが、ゲル表面上に割れ目が形成されないようにする。後で使用するために流出ゲルを保存する。
【００７５】
ＢＳＡ−ＬＡＭリガンド溶液：
２５０ｍＬパイレックス培地ボトル中で、ＢＳＡ−ＬＡＭリガンドの約２７．５ｍＬの溶液を、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を用いて１００ｍＬに希釈する。この溶液に結晶性シアノ水素化ホウ素ナトリウムを１００ｍｇ加える。供給品のプラスチックキャップを用いてボトルをしっかりと閉める。短時間ボルテックスにかけることにより十分混合する。この溶液は乳白色のように見えるかもしれないが、沈殿物はないはずである。シアノ水素化ホウ素ナトリウムによって形成された微小の気泡は見えるかもしれない。
【００７６】
カップリング工程：
上で調製したＬＡＭ溶液に、流出した活性化セファロースゲルを加える。供給品のプラスチックキャップでしっかりと閉める。緩やかにボルテックスにかけること（中間スピード）により、懸濁液を完全に混合し、３７℃±２℃で約４時間インキュベートし、１時間毎に反応混合物を（逆さにして）混合する。１．５Ｍトリス緩衝液７．５ｍＬを加え、しっかりと閉める。３７℃±２℃で約１６時間（一晩）インキュベーションを続ける。
【００７７】
焼結ガラスフィルター上に反応混合物を移し、低真空（３００ｍｍＨｇ）を用いて、綺麗な１００〜２００ｍＬのブンゼンフラスコに液相を回収する。脱イオン水８００ｍｌでフィルター上のＬＡＭ−セファロースゲルを洗浄する。約１．２Ｌの１×ＰＢＳで洗浄を続ける。
【００７８】
カラムの充填及び保存：
２５０ｍＬビーカー中で、上述のゲルに１×ＰＢＳを約１６０ｍＬ加える。（スパーテル／ガラスロッドを用いて）手動で攪拌してスラリーにする。１×ＰＢＳを用いて、標準の手順に従ってカラムへ充填する。１×ＰＢＳ及び０．１％アジ化ナトリウムでカラムを平衡化する。
【００７９】
精製ＬＡＭの使用、並びにアフィニティーカラムＩ及びＩＩの作製を含む以上の工程を、図７に概略的に示す。
【００８０】
（アフィニティークロマトグラフィーＩによる抗体の単離（「直接法」））
以下のストック溶液を調製する。
０．１Ｍグリシン緩衝液１リットル。これを１Ｍ  ＨＣｌでｐＨ２．５に調整する。
３×ＰＢＳ溶液１リットル（脱イオン水で１０×ＰＢＳストック溶液を希釈）。ｐＨをチェックし、必要に応じて、１Ｍ  ＨＣｌ又は１Ｍ  ＮａＯＨで７．２〜７．４に再調整する。
１×ＰＢＳ及び０．１％のアジ化ナトリウム溶液  ２００ｍＬ。
０．５Ｍリン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）溶液１００ｍＬ。
【００８１】
血清調製：
凍結血清を、完全に溶解するまで冷蔵庫内でゆっくりと解凍する（約１６時間／一晩）。血清容量を測定し、血清１００ｍＬ毎に塩化ナトリウム２．９ｇを秤量し、血清に加える。完全に溶解するまで穏やかに振盪する。最終濃度は０．５Ｍ  ＮａＣｌである。
【００８２】
２０分間、〜８０００ｇで遠心分離にかける（４〜８℃）。パスツールピペットを用いて全ての遠心分離管から上清を取り除く。ペレットは混濁しないようにする。上清を、綿充填漏斗を通して濾過し、濾液を回収する。回収した濾液はわずかに乳白色であるが、いかなる粒状物質も含有されていないはずである。冷蔵庫内に濾過血清を置く。
【００８３】
血清アプライ：
１×ＰＢＳで平衡化することにより、血清使用のためのカラムＩ（カラム材料に結合した非変性ＬＡＭ）を作製する。流速を２．０ｍＬ／分に調整し、基準線が少なくとも１時間安定を維持するまで、１×ＰＢＳを加え続ける。必要に応じて、記録計及び検出器を０に調整する。基準線が安定したならば、０．５〜０．６ｍＬ／分に流速を調整し、次いで、０．５〜０．６ｍｌ／分の流速でＬＡＭアフィニティーカラムＩに、上で調製した血清をアプライする。排出容量溶離液を回収する（これはカラム容量の約３０％になる）。２６０〜２８０ｎｍのＵＶ検出により画分をモニターし、シグナルの上昇が生じた場合、５００〜１０００ｍＬ血清のうちの、カラムを通過した血清の回収を開始する。カラムに全容量の血清を加えた後、すぐにカラムの送流を止め、３×ＰＢＳ緩衝液を加え、次いで、液体流出を再開する。シグナルが基準線の約５０％に下がるまで、３×ＰＢＳでカラムを洗浄し続ける。この時点で血清の回収を止め、全ての回収画分を保存する。流速を２．０ｍＬ／分に変え、基準線が約１０〜１５％になるまで、３×ＰＢＳでのカラム洗浄を続ける。流出液を廃棄する。３×ＰＢＳ緩衝液を１×ＰＢＳ緩衝液に置換し、２．０ｍＬ／分の流速で約２〜２．５カラム容量で洗浄する。流出液を廃棄する。
【００８４】
抗体溶離工程：
流速を１．０ｍＬ／分に調整する。１×ＰＢＳを、上で調製した冷却０．１Ｍ  Ｇｌｙ−ＨＣｌ緩衝液に置換し、吸着抗体の溶離を開始する。シグナルが速やかに上昇し、フルスケールの約１０〜１５％が得られたら、氷水浴（０℃）中に置いた１５ｍｌコニカルチューブに溶離液カラムを回収し始める。５ｍｌの画分を回収する。
【００８５】
シグナルが速やかに下がり始めるまで、Ｇｌｙ−ＨＣｌ緩衝液で抗体の回収を継続する。シグナルが、回収開始のシグナルレベルまで下がった場合（フルスケールの１０〜１５％）、画分の回収を止める。各５ｍＬ画分に、０．１ｍｌずつ０．５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４を０．５ｍＬ加えることにより、回収した抗体溶液を中和する。加えた全容量は、中和前の画分容量の１０％に等しいはずである。
【００８６】
Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液の添加中に溶液を穏やかに混合し、中和した画分をプールする。０．１Ｍ  Ｇｌｙ−ＨＣｌ緩衝液のみを含むブランクに対する２８０ｎｍの抗体ＯＤを測定し、抗体濃度を算出する。回収した抗体を最低３日間２〜８℃に置くと、破砕及び廃棄可能になる。
【００８７】
カラムケア：
中性（ｐＨ７）になるまで１×ＰＢＳでカラムを平衡化する。使用しない間は、１×ＰＢＳ及び０．１％アジ化ナトリウム溶液でカラムを平衡化し、その後、使用時まで４〜８℃でカラムを保管する。
【００８８】
透析：
作製した抗体を１０，０００Ｇで最低５分間遠心分離にかける。上清を１２〜１４ｍｏｌ．ｗｔ．カットオフの透析チューブに移し、Ａｂ溶液対全容積の比が＞１：２０であるようにして、最低４回緩衝液を変えて２〜３日間１×ＰＢＳに対して透析する。透析から抗体を取り出す。ガラスメスシリンダーを用いて、抗体溶液の容量を測定する。何らかの更なる（沈殿物形態の）破砕物／剥離物が存在する場合、抗体溶液を最低５分間１０，０００Ｇで更に遠心分離にかける。１×ＰＢＳ緩衝液で分光光度計をブランキングした後、２８０ｎｍで抗体のＯＤを測定する。濃度をｍｇ／ｍＬで算出し、保存のために４〜８℃に置く。
【００８９】
（アフィニティークロマトグラフィーＩＩによる抗体の単離（「強化法」））
高特異性抗体の精製：
基準線が少なくとも１５分間安定して維持されるまで、上で作製したＬＡＭアフィニティーカラム２（ＮａＩＯ４を用いてカラム材料にカップリングされ、強度の酸化によって修飾されたＬＡＭ）に、１×ＰＢＳを２．０ｍＬ／分の流速で加える。必要に応じて、記録計及び検出器を０に調整する。次の３０分間、基準線をモニターし続け、安定したら、抗体をカラムに加える。流速を０．５〜０．６ｍＬ／分に調整し、Ｅｃｏｎｏポンプ又は類似の器具を用いて、Ａｂの〜１００〜１５０ｍｇに対応する容量の、上で作製した抗体をＬＡＭアフィニティーカラム２に加える。２８０ｎｍにおける排出容量溶離液を回収する（これはカラム体積の約３０％になる）。綺麗な血清ボトルで上記基準線より約１０〜１５％上までシグナルが上昇したら、抗体を回収し始める。全抗体容量を加えたら、即座に液体送流を止め、１×ＰＢＳ緩衝液を加え、０．５〜０．６ｍＬ／分で液体送流を再開する。２８０ｎｍでカラムを通過して流出する物質の回収を続ける。シグナルが回収開始時の１０〜１５％上（基準線の３０〜５０％上）になったら、溶液の回収を止める。
【００９０】
２８０ｎｍで高特異性抗体のＯＤを測定した後、抗体濃度を算出する。直ちに、一時貯蔵のため抗体溶液を４〜８℃に置く。
【００９１】
カラム洗浄：
２．０〜２．５ｍＬ／分の流速の１×ＰＢＳでカラムの洗浄を続ける。最低３カラム容量の１×ＰＢＳを通す。上で調製した冷却０．１Ｍ  Ｇｌｙ−ＨＣｌ緩衝液で、カラム上に吸着されている物質を溶出する。溶出した物質をガラスバイアル中に回収する。モニター／シグナルが基準線の〜１０〜１５％になったら、回収を止める。上で調製した０．５Ｍリン酸ナトリウムの全容量の１０％を０．５ｍＬずつ加えることにより、回収した抗体溶液を中和する。２８０ｎｍで抗体のＯＤを測定し、抗体濃度を算出する。直ちに、回収した抗体溶液を４〜８℃に置き、上記工程で回収した抗体の分析が完了するまで保存する。上記抗体の濃度が０．３ｍｇ／ｍＬ未満である場合は、濃縮する。
【００９２】
２．０〜２．５ｍＬ／分の流速の最低３カラム容量の１×ＰＢＳでカラムを洗浄する。再度カラムを１カラム容量の１×ＰＢＳ及び０．１％アジ化ナトリウムで洗浄し、次に使用するまで４〜８℃で保管する。
【００９３】
直接法及び強化法を用いてアフィニティーカラムＩ及びＩＩから濃縮抗体を単離する以上の工程を、図８に概略的に示す。
【００９４】
（ＥＬＩＳＡプレートコーティング法）
Ｍｏｄｕｌｉｎｅ３００システムのセットアップ：
Ａｂコーティングは、コーティング溶液Ｍ８１５の調製終了から最大８時間以内に終わらなければならない。抗体コーティング溶液は、コーティング工程中、氷（０℃）上で保存されなければならない。
【００９５】
工程１：
予め空のプレートを計量、検査し、全ての破損プレートは廃棄する。Ｍｏｄｕｌｉｎｅ３００システムを用いて、各ストリッププレートの各ウェルへＭＴＢ−ＬＡＭ特異的Ａｂコーティング溶液１００μｌを分注する。コーティング工程中、充填が十分に均一であるかどうかについて、各プレートの９６ウェル全てを目視によりチェックする。未使用のＡｂ溶液は残し、プレートのロット全体が処理され、使用に供されるまで、２〜８℃で保存する。１０枚の各プレートのスタック中に、分注したＡｂ入りのプレートを積み重ね、カバーとして使用する空のプレートで最上部をカバーする。積み重ねカバーした１〜１８枚の各プレートを標識化する。積み重ねたプレートを２〜８℃で冷蔵し、一晩（１４〜１８時間）インキュベートする。
【００９６】
工程２：
Ｍｏｄｕｌｉｎｅ３００システムをセットアップし、洗浄サイクルを３回、直後にブロック溶液３１２μＬの分注サイクルを行う。ブロック溶液は、調製終了から最大２４時間以内に使用しなければならない。プレートを冷蔵庫から取り出し、Ｍｏｄｕｌｉｎｅ上にプレートが置かれている場合、カバーしているプレートを取り除き、横に置く。タイマーを６時間に設定する。連番を付したトレー上に、コンベヤーから来るブロックしたプレートをセットし、室温（２０〜２８℃）で５〜６時間ブロックする。
【００９７】
トレー上のプレートを乾燥チャンバーに置き、２４〜７２時間、２０〜２３℃、相対湿度２０〜２２％でインキュベートする。乾燥チャンバーから乾燥プレートを取り出す。
【００９８】
（ＨＲＰへのコンジュゲーション用のＭＴＢ−Ａｂの作製）
ＭＴＢ−Ａｂ溶液調製は、コンジュゲーションの少なくとも７日前に行うべきである。
【００９９】
透析：
２〜８℃で、最低４回変えながら最低４８時間、１×ＰＢＳに対して必要量のＭＴＢ−ＬＡＭ−Ａｂ溶液を透析する。ＭＷＣＯが１２〜１４，０００の透析チューブを用いる。１２，０００ｒｐｍで１０分間、Ａｂ溶液を透析遠心分離した後、１５ｍｌの目盛り付き遠心管へ上清を注意深く吸引する。
【０１００】
２８０ｎｍで透析後のＡｂ溶液の光学濃度を測定し、透析後のＡｂ濃度を算出する。透析後のＡｂ溶液がＯＤ280nm＞２．８である場合、１×ＰＢＳでＡｂ溶液を１：７に希釈する。
【０１０１】
濃縮：
Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−１５遠心濾過装置を１×ＰＢＳで予備洗浄する。装置に１×ＰＢＳ溶液約１５ｍＬを入れ、約５分間、３５００ｒｐｍで遠心分離する。全ての溶液を装置一式から廃棄する。３５００ｒｐｍで約５分間×３回、ベンチトップ遠心分離機（バケットローター）で遠心分離することにより、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−１５遠心濾過装置で、透析後の上述のＡｂ溶液を４．５〜５．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮する。Ａｍｉｃｏｎ装置のフィルターユニットから得た濃縮Ａｂ溶液を、１５ｍＬチューブに注意深く吸引する。回収を最大化するために、遠心分離直後に濃縮試料を取り出し、Ａｂ吸引前にピペットで濃縮物容量を数回再懸濁して適切な混合を確実に行う。
【０１０２】
１００００ｒｐｍで約１５分間、濃縮Ａｂ溶液を遠心分離にかけ、１５ｍＬチューブへＡｂ上清を吸引する。１×ＰＢＳ中で１：２０に希釈したＡｂ溶液のＯＤ280を測定し、Ａｂの濃度を算出する。
【０１０３】
Ａｂ溶液０．１ｍｌをＥＬＩＳＡ分析用にサンプリングする。２〜８℃で保存する。
【０１０４】
（ＭＴＢ−ＬＡＭ−Ａｂ−ＨＲＰコンジュゲート作製）
コンジュゲーション工程用の全てのガラスバイアル及び攪拌棒、並びにコンジュゲート保存用ガラスバイアルをＨ２ＳＯ４溶液で洗浄し、水道水及び脱イオンＨ２Ｏで完全にすすぐ。
【０１０５】
クロマトグラフィー用セファデックスＧ−２５カラムの作製：
セファデックスＧ−２５（ファイン）を充填した、約Ｖ＝５０ｍｌのカラム（１．５×３０ｃｍ）を入手する。上述のようにカラムを充填する。１ｍＭナトリウムでカラムを平衡化するため、次のクロマトグラフィー条件を設定する。
・緩衝酢酸溶液、ｐＨ４．４
・２８０ｎｍのＵＶモニター波長
・モニター感度：０．２ＯＤ
・チャート記録計スピード：２ｍｍ／分
・カラム洗浄のポンプ流速：６０ｍｌ／時間
【０１０６】
約１００〜１５０ｍｌの１ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．４）でカラムを洗浄し、０の位置にＵＶモニター基準線を調節する。所定のベースラインが約３０分間安定していることを確かめる。コンジュゲーションに必要なＭＴＢ−ＬＡＭ−Ａｂ溶液の量を算出し、約１０分間、１２，０００ｒｐｍでＡｂを遠心分離する。綺麗なガラスバイアルにＡｂ上清を注意深く吸引する。１×ＰＢＳで１：２０希釈したＡｂ溶液のＯＤ280nmを測定し、未希釈Ａｂ溶液の濃度を算出する。使用時までＡｂ溶液を２〜８℃で保管する。
【０１０７】
ＮａＩＯ４によるＨＲＰ（西洋わさびペルオキシダーゼ）の酸化：
Ｖ型ガラスバイアルにＨＲＰ８ｍｇを秤量する。脱イオンＨ２Ｏを２．０ｍｌ加える。ＨＲＰが全て溶解するまで、この溶液を２〜３分間穏やかに攪拌する。溶解していないＨＲＰ粒子がガラスバイアル壁に残っていないことを確認する。
【０１０８】
使用する新しい０．１Ｍ  ＮａＩＯ４（ｐＨ４．４）溶液を最長５分以内に調製し、光から保護する。攪拌しながら、上で調製したＨＲＰ溶液に０．１Ｍ  ＮａＩＯ４を０．４ｍｌ加える。アルミニウムホイルでバイアルを覆い、混合物を光から保護する。混合物を２０分間室温で攪拌しながらインキュベートする。反応混合物にエチレングリコールを４滴加え、約２分攪拌する。
【０１０９】
酸化ＨＲＰのクロマトグラフィー及び濃縮：
工程５．４．７の終了直後に、セファデックスＧ−２５（ファイン）カラムのゲル濾過によって酸化ＨＲＰを精製する。試料溶離のポンプ流速を約５０ｍｌ／時間に設定する。上で調製した酸化ＨＲＰの全容量を乾燥ゲル床上に注意深く加えるが、この場合、ゲル床を乱さないように注意する。乾燥ゲルを超えないようにする。全ての酸化ＨＲＰ（有色溶液）を１本の１５ｍｌチューブに回収する。クロマトグラフィーチャート上の第１のピーク、ＯＤ280nm＞０．０５。クロマトグラフィー終了後、セファデックスＧ−２５カラムを空にし、ゲルを廃棄し、クロマトグラフィー後のＨＲＰ溶液の容量を記録する。
【０１１０】
酸化ＨＲＰの濃縮：
１ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．４）及び約１５ｍＬの１ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．４）でＵｌｔｒａｆｒｅｅ−１５遠心濾過装置を予備洗浄し、ベンチトップ遠心分離機（バケットローター）を用いて、３５００ｒｐｍで約５分間、フィルターユニットを遠心分離する。次いで、フィルターユニットからの全ての溶液を廃棄する。クロマトグラフィー後直ちに、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−１５遠心分離機フィルターユニット（Ｂｉｏｍａｘ−１０Ｋ膜）を用いて、３５００ｒｐｍ、約５分間の遠心分離で約２±０．２ｍｌまで（上で得た）酸化ＨＲＰ溶液を濃縮する。濃縮ＨＲＰ溶液を装置のフィルターユニットから綺麗なガラスバイアルへ注意深く吸引し、容量を測定、記録し、２〜８℃で保存する。
【０１１１】
ＭＴＢ−ＬＡＭ−ＡｂへのＨＲＰのコンジュゲーション：
ＨＲＰへのコンジュゲーションに必要なＭＴＢ−ＬＡＭ−Ａｂ溶液の量を算出する。三角形の攪拌棒を備えたＶ字型ガラスバイアルに、バイアル壁にＡｂ溶液の液滴を残すことなく、（上で得た）ＭＴＢ−ＬＡＭ−Ａｂを入れる。ＭＴＢ−ＬＡＭ−Ａｂ溶液に、（上で得た）酸化ＨＲＰ溶液の１／２容量を加え、アルミニウムホイルでバイアルを覆って反応混合物を光から保護し、室温で３０分間ガラスバイアル中の反応混合物を攪拌する。泡立たないようにする。
【０１１２】
ｐＨ９．５まで１Ｍ  炭酸塩−ＨＣｌを加え、２時間室温で攪拌する。遮光し、泡立たないようにする。
【０１１３】
使用直前に４ｍｇ／ｍｌの水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を調製し、アルミニウムホイルで遮光する。上で調製したＭＴＢ−ＬＡＭ−Ａｂ溶液に必要とされる計算量のＮａＢＨ４を直ちに加え、２〜８℃で約２時間、反応混合物をインキュベートする。２〜８℃で最低４８時間、８〜１６時間の間隔で最低４回緩衝液を換えて１×ＰＢＳに対して反応混合物を透析する。透析には、１２〜１４ｋＤａのカットオフ透析用チューブを用いる。
【０１１４】
コンジュゲートの保存及び分析：
透析後、コンジュゲート溶液を４０００ｒｐｍで約４分間遠心分離する。注意深く上清を取り出し、綺麗な６ｍｌのガラスバイアルにコンジュゲート溶液を入れる。磁気攪拌棒を入れた５０ｍｌガラス瓶へＧａｒｄｉａｎペルオキシダーゼコンジュゲート安定剤／希釈剤１８ｍｌを測り分ける。ＭＴＢ−Ａｂ−ＨＲＰコンジュゲート２ｍｌを加え、約１０分間混合物を攪拌する。２〜８℃で保存し、遮光する。
【０１１５】
ＭＴＢコンジュゲート作製の以上の工程を図９に概略的に示す。
【０１１６】
（結果）
以下に、濃縮抗体製造のための「直接法」を用いて未処理の非濃縮尿中のＬＡＭを検出する直接抗原ＥＬＩＳＡの評価から得られたデータを提示する（上述した「強化法」を用いて製造した濃縮抗体を使用することにより、より優れたデータが得られるものと思われる）。これらのデータを得た研究は、限局性結核及びハンセン病プログラム、及びＭｂｅｙａメディカルリサーチプロジェクト（Ｍｂｅｙａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｊｅｃｔ：ＭＭＲＰ）との共同で、タンザニアの南西高地に位置するＭｂｅｙａ地域で行った。Ｍｂｅｙａ領域では、毎年約３，５００件の新規結核症例が診断されており、国のＤＯＴＳ計画に従って治療が行われている。全ての治療は、Ｍｂｅｙａ  Ｒｅｆｅｒｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの中心施設で開始されている。結核治癒率は、２００２年は７２．３％であった。この研究の目的は、医療における市販ＬＡＭ捕捉ＥＬＩＳＡの性能を評価し、それらの結果を結核診断用の最も標準的な検査、即ち喀痰鏡検、結核培養、胸部Ｘ線撮影及び臨床検査と比較することである。
【０１１７】
〔材料及び方法〕
（ＬＡＭ−ＥＬＩＳＡの説明）
ＭＴＢ−ＥＬＩＳＡ直接抗原サンドイッチイムノアッセイ（ＭＴＢ−ＥＬＩＳＡ、Ｃｈｅｍｏｇｅｎ，Ｓｏ．Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＭＥ、米国）は、第三者によって開発されたアッセイに類似のＬＡＭ−ＥＬＩＳＡである。免疫血清は、ヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖを非活性化した全細胞で免疫した白色ニュージーランドウサギから回収した。ポリクローナルＬＡＭ特異的抗体は、リガンドとして固定化ＬＡＭを用いて、アフィニティークロマトグラフィーによって単離した。検査キットは、乾燥剤が入ったプラスチックパウチ中に詰めて密閉したＬＡＭ特異的抗体事前被覆９６ウェルＥＬＩＳＡプレート；ＬＡＭ特異的ＨＲＰ結合ＬＡＭ特異ポリクローナル抗体を入れたバイアル；ＴＭＢの一成分である発色性基質を入れたバイアル；陰性対照溶液を入れたバイアル；並びに、尿試料のＬＡＭ０．５ｎｇ／ｍｌ、１．５ｎｇ／ｍｌ及び４．５ｎｇ／ｍｌに対応するキャリブレータを入れた３本のバイアルからなる。４５０ｎｍで得られた光学濃度が陰性対照のシグナルよりも少なくとも０．１上であった場合、尿試料は、ＥＬＩＳＡで陽性であると考えられた（＞２ＳＤ）。
【０１１８】
０．１ｍｌの患者尿試料をＥＬＩＳＡプレート上の２ヶ所に置き、１時間インキュベートし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）溶液で洗浄する。ＬＡＭ特異的ＨＲＰコンジュゲート０．１ｍｌを加える。１時間インキュベーションした後、ＰＢＳＴ溶液でプレートを洗浄し、ＴＭＢ基質０．１ｍｌを加える。１０分間インキュベーションした後、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を０．１ｍｌ加えて基質反応を停止し、４５０ｎｍで発色を読み取る。
【０１１９】
別の実施形態では、抗原活性を有することが決定されているリポアラビノマンナン（ＬＡＭ）の特定のアイソフォームは、上述したプロトコールに類似のプロトコールを用いた、活動性結核についてスクリーニングする患者尿中のマイコバクテリアリポアラビノマンナン検出で使用する、高特異性、高純度のポリクローナル抗体を製造するために用いられる。ＬＡＭの抗原活性を示すアイソフォームは、ＬＡＭの選択的酸化を用いて同定されたが、この場合、２種類のアイソフォームが容易に同定され、識別可能であった（データは示さず）。１つのアイソフォームは、高濃度の過ヨウ素酸ナトリウムでＬＡＭの血清学的活性が破壊されるような、高濃度の過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）に対する高感度部分を有していた。別のアイソフォームは、高濃度の過ヨウ素酸ナトリウムに曝された場合であっても、血清学的活性を保持していた。緩和な酸化剤又は低濃度のＮａＩＯ４のいずれかを用いて２種類のＬＡＭ酸化法を比較したところ、ＬＡＭの抗原活性は保持されていた。しかし、高濃度のＮａＩＯ４による酸化の場合は、ＬＡＭの抗原活性が低下した。
【０１２０】
従って、対象患者の結核診断で尿試料中のＬＡＭを検出する際に使用するための高特異性、高純度のポリクローナル抗体の作製で使用する高抗原性ＬＡＭを得るには、ＣＮＢｒで活性化したＬＡＭ、緩和な酸化剤又は低濃度のＮａＩＯ４で酸化したＬＡＭのみを使用する。
【０１２１】
これらの結果は、マイコバクテリアＬＡＭの酸化に高濃度のＮａＩＯ４のみを使用し、その結果、抗体の生産に用いるＬＡＭの抗原活性が破壊される、Ｓｖｅｎｓｏｎらに記載の検査法（例えば国際公開第９７／３４１４９号パンフレットを参照されたい）と比べると全く予測されないものである。また、検出対象のＬＡＭのアイソフォームが複数であったことは知られておらず、抗原活性を有するＬＡＭに対する高度に特異的な抗体を作製することは、これまでに開示の技術では不可能であった。というのは、抗原活性を有する別々のアイソフォームが存在すること、或いは、そのような活性が、標準的な酸化法（即ち、高濃度のＮａＩＯ４による処理）の実施の際に失われることが、これらの研究以前は誰にも知られていなかったからである。
【０１２２】
（臨床現場の説明）
８週間以内に、結核の疑いがある２４２名の患者がタンザニアのＭｂｅｙａにある５ヶ所の医療センターの外来に集まった。検査の標準プロトコールには、臨床的診断、胸部Ｘ線撮影、ＥＳＲ、白血球ｘ数及びＨＩＶ検査、１、２及び３日目の喀痰の３×ＡＦＢ染色（Ｚｉｅｈｌ  Ｎｅｅｌｓｏｎ）、Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ  Ｊｅｎｓｓｅｎ培地における２痰培養、並びに尿及び血清のＬＡＭ−ＥＬＩＳＡが含まれていた。
【０１２３】
患者は全員、結核の臨床症状を有していた（咳＞４週間、寝汗、減量、食欲不振）。これらのうち１３７名は、検査室確認の肺結核（ＰＴＢ）に罹患しており、９名は、Ｘ線診断によりＰＴＢ（胸水又は肺門リンパ節腫脹）が高度に疑われ、８名は、ミリタリー結核（ｍｉｌｉｔａｒｙ  ＴＢ）の臨床的徴候及びＸ線診断による徴候を示した。同意する患者については、彼らのＨＩＶ状態を検査し、７０％がＨＩＶ陽性として確認された。データは内々に取り扱った。この研究は、タンザニア共和国の地方施設内治験審査委員会及び国家倫理委員会により承認済みであった。
【０１２４】
全ての検査法は、Ｍｂｅｙａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｊｅｃｔの検査施設で行った。
【０１２５】
（喀痰試料の鏡検及び培養）
Ｚｉｅｈｌ  Ｎｅｅｌｓｏｎ染色及び鏡検は、経験を積んだ、十分に熟練した実験技術者によって行われた。浄化喀痰試料は、２連で、Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ  Ｊｅｎｓｓｅｎ培地で培養した。培養は、８週間、増殖について毎週試験した。
【０１２６】
（尿検体）
各患者から尿３０ｍｌを、各患者のデータ形態のコード番号で標識した殺菌済みプラスチック容器に採取した。新しく未処理の尿１００μｌを２連のＥＬＩＳＡプレートのウェルに加えた。また、二連の各プレートに、陰性対照、低陽性対照、中間陽性対照及び高陽性対照も加えた。２４時間以内に標本を処理し、次いで、ドイツで更なる試験を行うために−２０℃で保管した。
【０１２７】
（タンザニア及び米国の対照集団）
Ｍｂｅｙａ  Ｒｅｆｅｒｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの２３名のスタッフメンバーから得た尿試料、Ｃｈｅｍｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．の２０名のスタッフメンバーから得た尿試料、及びニューヨークの２つの病院の患者２００人から得た尿試料をＬＡＭ  ＥＬＩＳＡで試験した。彼らは全て、臨床検査で健康であることが明らかであり、いかなる呼吸器感染症の徴候も有していなかった。
【０１２８】
〔結果〕
（ＥＬＩＳＡ系の前臨床評価）
図４Ａは、尿中の異なる濃度のＬＡＭを用いた用量応答曲線を示す。最適のカットオフ値は、陰性対照のＯＤを０．１ＯＤ超える光学濃度（ＯＤ）を生じるＬＡＭ濃度として、この曲線に従って決定されるが、これは、陰性対照試料のシグナルより２以上の標準偏差分超えた値に相当する。このカットオフ値より上の光学濃度を有する全ての試料をＥＬＩＳＡ陽性と見なした。カットオフ値は、新しい未処理の尿中のＬＡＭ約０．２５ｎｇ／ｍｌと等しかった。
【０１２９】
ＭＴＢ−ＥＬＩＳＡを、尿路感染及び細菌性肺炎に典型的な種々のグラム陽性及びグラム陰性細菌の他の種属との交差反応性について評価した。試験した種のいずれにおいても、最も高い試験濃度でさえ、評価したＬＡＭ−ＥＬＩＳＡ系でいかなる反応性も示さなかった（図４Ｂ）。ＬＡＭ−ＥＬＩＳＡ系における様々なマイコバクテリア種の全細胞に関する分析では、マイコバクテリア（Ｍ．）の試験した全ての種と交差反応性を示す（図４Ｃ）が、ヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ及びウシ型結核菌が最も感度よく検出される。両種は免疫化学的見地から極めて近いが、ウシ型結核菌は、稀にヒトにおいてマイコバクテリア感染を発症する。
【０１３０】
（研究参加者データ）
表１に従って、２４２名の結核が疑われる人を３つの大きなカテゴリーに分類した：（１）確認済みの鏡検診断及び／又は培養診断を有する肺結核患者、（２）典型的な臨床的徴候及びＸ線写真の徴候を有する患者、及び、（３）入手可能な診断ツール（Ｘ線撮影、喀痰鏡検及び培養）が全て陰性だったために結核患者とは考えられないが、結核の臨床症状を有する患者。
【０１３１】
第１の集団には、検査確認された肺結核に罹患している１３７名の患者が含まれていた。１３２名がＬｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ  Ｊｅｎｓｓｅｎ培養により確認され、５名が陰性培養であったが、ＡＦＢ染色では陽性であった。１３２名の培養陽性症例から、６２．１２％がＡＦＢ陽性であった。
【０１３２】
第２の集団には、Ｘ線写真所見及び臨床所見に基づいてＤＯＴＳ治療プログラムに入れられた追加の１７名の患者が含まれている（表１）。第３の集団の８８名の患者は喀痰陰性であり、且つ肺結核に特異的なＸ線診断による徴候が見受けられなかったので、ＤＯＴＳプログラムには入らなかった。
【０１３３】
参加者の平均年齢は３４才であった。女性対男性の比率は４１：５９であった。ＨＩＶに関して試験を受けることに合意した２２３名の患者のうち、全ＨＩＶ有症率は１０６９．１％であった（表２参照）。ＨＩＶ有症率は、結核が確認された患者の間では７３．２％であり、結核が確認されていな患者の間では６０．８％であった。
【０１３４】
（ＥＬＩＳＡの臨床評価）
確認された肺結核に罹患している１３７名の患者（培養又はＡＦＢで陽性）のうち、１１１名は、所定のカットオフ値（陰性対照＋０．１の光学濃度（ＯＤ））に対してＬＡＭ−ＥＬＩＳＡ陽性であった（感度８１．０２％）。塗抹標本及び培養で陽性の集団（８２）に関する平均ＯＤインクリメント（＝絶対平均ＯＤ−陰性対照のＯＤ）は、０．６０４であった。塗抹標本陰性及び培養陽性の症例（５０）に関しては、平均ＯＤインクリメントは０．２９３であり、塗抹標本陽性であるが培養陰性の症例（５）では０．２４９であった。
【０１３５】
培養及びＡＦＢでは陰性であったが、結核に関する典型的なＸ線診断による徴候及び臨床的徴候があった第２の集団の１７名の患者のうち１３名（７６．４７％）は、０．１８３の平均ＯＤインクリメントであり、ＬＡＭ−ＥＬＩＳＡ検査結果が陽性であった。これらの１３名（７６．４７％）はＨＩＶ陽性であった。
【０１３６】
肺結核を示唆する臨床的徴候のある、特定の結核病院を訪れた残りの８８名の患者は、培養及びＡＦＢは陰性であり、結核特有のＸ線写真の所見もなかった。これらのうち、１３名（１４．７７％）はＬＡＭ−ＥＬＩＳＡ検査で陽性であった（平均ＯＤインクリメント０．１８４）。
【０１３７】
各プレートに含まれていた低陽性、中間陽性及び高陽性の対照の既知濃度に基づいて、ＥＬＩＳＡのＯＤ値に基づく各尿試料のおよそのＬＡＭ濃度を検出することができた。ＬＡＭ濃度が各結核細菌の量に相関するか否かをＡＦＢ陽性患者で評価した。鏡検で低密度の結核細菌が認められた患者（ＡＦＢ＋）では、尿中の平均ＬＡＭ抗原濃度が０．９３ｎｇ／ｍｌであったが、中間密度の抗酸菌が認められた患者（ＡＦＢ＋＋）は、尿中の平均抗原濃度が１．７４ｎｇ／ｍｌであり、ＡＦＢ＋＋＋患者では２．０２ｎｇ／ｍｌであった（図５）。最後の値は、ＡＦＢ＋＋＋患者の尿中の実際のＬＡＭ濃度よりも低い。というのは、タンザニアの研究所で使用したＥＬＩＳＡリーダーが約４ｎｇ／ｍｌに相当する２以上のシグナルを解読することができなかったためである。
【０１３８】
ＨＩＶ陽性か陰性か（ｓｅｒｏｓｔａｔｕｓ）は、確認された肺結核患者のＬＡＭ−ＥＬＩＳＡの感度に影響を及ぼさなかった。周知のＨＩＶ  ｓｅｒｏｓｔａｔｕｓ及び結核培養及び／又はＡＦＢ染色が陽性の１２４名の患者のうち、８９名のＨＩＶ感染者のうち７３名（８２．０％）は、３５名の非感染個体のうちの２６個体（７４．３％）と比較した場合、ＬＡＭ−ＥＬＩＳＡで陽性であった。同様に、ＡＦＢの感度は、ＨＩＶ  ｓｅｒｏｓｔａｔｕｓの影響を受けなかった。ＨＩＶ感染個体及び陰性個体における感度は、それぞれ６１．２％及び５８．８％であった。
【０１３９】
このアッセイの特異性は、健康なタンザニア及び米国のボランティアの尿を用いて評価した。タンザニア人の健康な病院スタッフメンバー２３名の尿を分析した。検査したいずれの試料もＬＡＭ−ＥＬＩＳＡにおいて陽性ではなかった（平均ＯＤ比−０．０４７、特異性１００％）。米国の健康なボランティア２２０名の尿試料を回収し、分析した。４名以外の全ての試料は、光学濃度がカットオフ値０．１未満であった（特異性９８．１８％）。
【０１４０】
〔考察〕
結核診断のための古典的なツール（痰培養及び塗抹標本鏡検）には、明らかに不利な点がある。両方法は、周知の肺結核の症例のみを検出する。これによって、器官症状に関わらず、活動性結核の症例を全て検出する可能性が著しく損なわれる。このため、特に手段の乏しい場で古典的ツールを補うことが可能な複数の新たな方法が過去に評価されてきた。このような新たなアッセイで設定された基準は、ａ）鏡検より高感度、ｂ）比較可能な特異性、ｃ）限定された追加的作業負荷、ｄ）喀痰陰性結核の診断の可能性、及びｅ）ＨＩＶ重感染によって損なわれない感度、である。
【０１４１】
この第１の評価では、ＬＡＭ−ＥＬＩＳＡの感度（培養陽性の８１％）は、ＡＦＢ染色（６９％）よりも優れていた。新鮮尿を濃縮することにより感度を更に改善することができるが、これは、実験技術者に更なる負担を生じる。Ｘ線診断により確認されたミリタリー結核の症例に対するＬＡＭ−ＥＬＩＳＡの検出率（８７．５％）、並びに、肺結核の典型的なＸ線診断上の症状を有する喀痰陰性の症例に対するＬＡＭ−ＥＬＩＳＡの検出率（６７％）は有望であったが、症例数は、最終結論を出すのに十分に多くはなかった。健康な個体に対しては、ＥＬＩＳＡの特異性は高かった（米国で９８．１８％及びタンザニアで１００％）。培養で陽性の結核症例におけるＨＩＶ重感染は、ＬＡＭ−ＥＬＩＳＡの感度に影響を及ぼさなかった。
【０１４２】
ＬＡＭ−ＥＬＩＳＡの以前に公表された結果と比較した場合、この新規の検査は、以前の検査に比べて低い濃度（０．２ｎｇ／ｍｌ）でＬＡＭを検出する。新規検査の感度は、処理した凍結尿を用いる以前の検査では感度が８１．３％であったのに対して、濃縮されていない新鮮尿に対しては８２．９％（ＡＦＢ＋の場合）であった。以前の研究では特異性が８６．９％であったのに対して、この検査の特異性は９８．３６％であった。
【０１４３】
このクロスセクショナル結核検査における不利な点は、結核が疑われる特定の割合の患者が結核の状態の点で紛らわしいということであった（第２及び第３の集団）。この問題を確認するために、本発明者らは、分析のための３つの大きなカテゴリーを作った：第１の集団：検査室で確認した結核、第２の集団：臨床的に、及びＸ線診断で診断された結核、第３の集団：検査室又はＸ線診断の証拠がない結核。本発明者らは、カテゴリー１の関係者が真の結核症例であると確信しているが、カテゴリー２及び３に、誤って分類された一部の患者が含まれている可能性を排除することはできない。そこで、本発明者らは感度及び特異性の算出からそれらの患者を除外した。結核の診断は、患者の長期的な追跡が必要とされることが多い。特に、異常なＸ線診断上の特徴を有する喀痰陰性患者は、患者の結核状態を再調査するために数種類の追跡診察を必要とした。長期的研究では、臨床的、診断的再評価及び結核治療結果により、第２及び第３の集団を結核患者及び非結核患者に分類するための重要な追加情報が得られた。
【０１４４】
最も興味を引いたのは、ヒト型結核菌の細菌の量と、尿で検出されるＬＡＭの量と、の間に定量的相関関係があるかどうかという疑問である。クロスセクショナル研究フォーマットにおいてこの質問に取り組む唯一の方法は、ＡＦＢ喀痰染色スコアを尿中のＬＡＭ濃度と相関させることであった。図５から明らかなように、尿中の抗原濃度と喀痰中の結核細菌密度との間には明らかな正相関があった。このような相関関係により、ＬＡＭアッセイにはいくつかの更なる用途が与えられる。治療終了後の治療目的達成のモニタリング及び再発の早期確認は、当面の実務上の重要課題である。肺外結核及びＡＦＢ陰性結核を検出する能力と組み合わせると、ＬＡＭアッセイは、結核の肺外型、及び非典型的な臨床症状を伴う肺型の有症率が増加している環境における強力なツールとなる。ＬＡＭ−ＥＬＩＳＡは、臨床症状がある患者の診断に用いられるだけでなく、ＨＩＶ陽性患者及び他のハイリスクの集団のスクリーニングにも用いることができる。活動性結核の早期症例検出及び効果的治療は、結核との戦いに勝つための２本柱である。この戦いにおけるＬＡＭアッセイの役割を更に調査するため、本発明者らは現在、いくつかの有望な多施設共同研究を計画している。
【０１４５】
要約すると、ＬＡＭ−ＥＬＩＳＡは、先進国及び開発途上国のいずれにおいても、検査室のルーチン的診断法に容易に取り入れることができる。これは、使いやすく、着実なアッセイである。ＥＬＩＳＡの終了までには２時間半しかかからず、多数の試料を同時に分析することができる。抗原リポアラビノマンナンは安定しているので、光学濃度の有意な低下を起こすことなく、３日間尿を冷蔵庫で保存することができる。この未処理尿中のＬＡＭを検出する新規開発のＭＴＢ−ＥＬＩＳＡは、開発途上国の現場条件下でも用いられるスクリーニング検査法となる可能性を有する。
【０１４６】
【表１】
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【０１４７】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１Ａ】マイコバクテリアのＭａｎＬＡＭ、ＰＩＬＡＭ及びＡｒａＬａｍの構造モデルを示す図（図１）の一部である。
【図１Ｂ】マイコバクテリアのＭａｎＬＡＭ、ＰＩＬＡＭ及びＡｒａＬａｍの構造モデルを示す図（図１）の一部である。
【図２】ＬＡＭ実験における血清学的活性の比較を示す図である。
【図３】捕捉ＥＬＩＳＡにおけるＬＡＭ特異的Ａｂ作製物の性能を示す図である。
【図４Ａ】尿中の異なる濃度のＬＡＭに関するＬＡＭ  ＥＬＩＳＡの感度を示す図である。カットオフ値は陰性対照＋０．１の光学濃度であり、最小検出限界は０．２５ｎｇ／ｍｌであった。
【図４Ｂ】ＥＬＩＳＡにおけるＬＡＭ特異的抗体の非マイコバクテリア抗原への結合を、次の細菌種について除外した。  肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｂ群連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）１４／１２Ｆ、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）２５９２３／４３３００、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）８７３９、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ａ／Ｂ／１３１０２、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）Ａ／Ｂ／Ｄ。
【図４Ｃ】種々のマイコバクテリア株に関するＬＡＭ  ＥＬＩＳＡの感度を示す図である。ウシ型結核菌及びヒト型結核菌のＬＡＭが最も感度よく検出される。
【図５】ＡＦＢ陽性患者のマイコバクテリアの微視的な密度と、ＬＡＭ  ＥＬＩＳＡによって測定された未処理尿中の抗原濃度と、の相関関係を示す図である。ＡＦＢ＋（光学顕微鏡法  １０００×倍率：１００フィールド当たり４〜９０個の抗酸菌）２８例。ＡＦＢ＋＋（１〜９個／フィールド）２３例。ＡＦＢ＋＋＋（〜１０個／フィールド）２０例。ボックスプロットは、１０、２５、５０、７５、９０パーセンタイル、及び平均抗原濃度を示す。
【図６】本発明の特定の実施形態による抗原精製プロセスの概略図である。
【図７】本発明の特定の実施形態によるアフィニティーカラム作製の概略図である。
【図８】本発明の特定の実施形態による抗体精製プロセスの概略図である。
【図９】本発明の特定の実施形態によるコンジュゲート作製の概略図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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