(57)【要約】ＳｉｒＡＢＣ鉄シデロフォア輸送システムを阻害する化合物を同定するスクリーニング方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に対する抗体及び薬学的に受容されるキャリヤーを包含する薬学的組成物。
【請求項２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に対するアンチセンスである核酸及び薬学的に受容されるキャリヤーを包含する薬学的組成物。
【請求項３】
薬学的受容されるキャリヤー、並びにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のフラグメントであり、かつもう一つのポリペプチドと共にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６の結合を競合的に阻害する、ポリペプチドを包含する薬学的組成物。
【請求項４】
薬学的受容されるキャリヤー、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、若しくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の核酸、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９若しくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の核酸に対するアンチセンス核酸を含むｓｉＲＮＡ分子を包含する薬学的組成物。
【請求項５】
有効量の請求項１の薬学的組成物を前記被験体に投与することを包含する、被験体におけるＳ．ａｕｒｅｕｓの感染により引き起こされるか又は寄与される、疾患又は異常を治療又は予防する方法。
【請求項６】
有効量の請求項２の薬学的組成物を前記被験体に投与することを包含する、被験体におけるＳ．ａｕｒｅｕｓの感染により引き起こされるか又は寄与される、疾患又は異常を治療又は予防する方法。
【請求項７】
有効量の請求項３の薬学的組成物を前記被験体に投与することを包含する、被験体におけるＳ．ａｕｒｅｕｓの感染により引き起こされるか又は寄与される、疾患又は異常を治療又は予防する方法。
【請求項８】
有効量の請求項４の薬学的組成物を前記被験体に投与することを包含する、被験体におけるＳ．ａｕｒｅｕｓの感染により引き起こされるか又は寄与される、疾患又は異常を治療又は予防する方法。
【請求項９】
（ｉ）薬剤の存在下、及び前記薬剤の非存在下で前記二つのタンパク質間の相互作用を許容する条件下で、前記二つのタンパク質を接触させることと、
（ｉｉ）前記薬剤の非存在下に比べて、前記薬剤の存在下における、二つのタンパク質間の異なるレベルの相互作用が、前記薬剤が前記二つのタンパク質の間の前記相互作用を阻害することを示す点において、前記の二つのタンパク質間の相互作用の前記レベルを決定すること
を包含する、Ｓｉｒタンパク質、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）及びＦｈｕＣからなる群から選ばれるタンパク質と、前記の群のもう一つの構成員との間の相互作用を阻害する薬剤を同定する方法。
【請求項１０】
前記の薬剤が、ＳｉｒＡとＳｉｒＢとの間の相互作用を阻害する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記の薬剤が、ＳｉｒＡとＳｉｒＣとの間の相互作用を阻害する、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記の薬剤が、ＳｉｒＢとＳｉｒＣとの間の相互作用を阻害する、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
前記の薬剤が、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）とＳｉｒタンパク質との間の相互作用を阻害する、請求項９記載の方法。
【請求項１４】
（ｉ）鉄を豊富に含む培地でｓｉｒ欠失Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株及び野生型Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株を培養することと、
（ｉｉ）前記野生型菌株の生育における、より大きい減少が、前記薬剤がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓにおける鉄の取り込みを阻害することを示す点において、前記薬剤と前記菌株と接触させ、そして前記野性型株及び前記ｓｉｒ欠失株の生育を比較すること
を包含するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓにおける鉄の取り込みを阻害する薬剤を同定する方法。
【請求項１５】
前記ｓｉｒ欠失菌株が、ｓｉｒＡ欠失菌株である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記ｓｉｒ欠失菌株が、ｓｉｒＢ欠失菌株である、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
前記ｓｉｒ欠失菌株が、ｓｉｒＣ欠失菌株である、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
（ｉ）鉄を豊富に含む培地でＦｈｕＣ欠失Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株及び野生型Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株を培養することと、
（ｉｉ）前記薬剤と前記菌株と接触させ、そして前記野性型菌株の生育における、より大きい減少が、前記薬剤がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓにおける鉄の取り込みを阻害することを示す点において、前記野性型菌株及び前記ＦｈｕＣ欠失菌株の生育を比較すること
を包含するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓにおける鉄の取り込みを阻害する薬剤を同定する方法。
【請求項１９】
前記鉄の取り込みが、原子吸光分析により決定される、請求項１４又は請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記鉄の取り込みが、放射能を有する鉄により決定される、請求項１４又は請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
前記放射能を有する鉄が、５９Ｆｅである、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記放射能を有する鉄が、５５Ｆｅである、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
（ｉ）前記薬剤の存在下又は非存在下で野生型Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株を培養することと、
（ｉｉ）前記薬剤で処理された細胞における前記ポリペプチドの発現のより大きな減少が、前記薬剤がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓにおける前記ポリペプチドの発現を阻害することを示す点において、前記ポリペプチドの発現を比較すること
を包含する、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株におけるＳｉｒタンパク質、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）及びＦｈｕＣからなる群から選ばれるポリペプチドの発現を阻害する薬剤を同定する方法。
【請求項２４】
前記Ｓｉｒタンパク質が、ＳｉｒＡである、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｓｉｒタンパク質が、ＳｉｒＢである、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｓｉｒタンパク質が、ＳｉｒＣである、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
（ｉ）前記薬剤の存在下又は非存在下で野生型Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株を培養することと、
（ｉｉ）前記薬剤で処理された細胞における前記核酸の発現のより大きな減少が、前記薬剤がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓにおける前記核酸の発現を阻害することを示す点において、前記ポリペプチドの発現を比較すること
を包含する、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株におけるＳｉｒ核酸、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）及びＦｈｕＣからなる群から選ばれる核酸の発現を阻害する薬剤を同定するための方法。
【請求項２８】
前記ｓｉｒ核酸が、ｓｉｒＡである、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記ｓｉｒ核酸が、ｓｉｒＢである、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
前記ｓｉｒ核酸が、ｓｉｒＣである、請求項２７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２００４年８月２６日に出願された米国仮出願番号第６０／６０４，７６９号、及び引用によりそっくりそのまま、ここに援用されている米国仮出願番号第６０／６０４，７６９号の内容に対する優先権を主張している。
【０００２】
背景
スタフィロコッカス・オウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ））は、流布しているヒトの病原菌であり、より小さい皮膚の傷、インペチゴ及び食中毒から、たとえば敗血症、心内膜炎、骨髄炎、肺炎、菌血症及びトキシックショック症候群のような、より重篤な疾患までの広い範囲の感染症を引き起こす（Archer(1998)Clin. Infect. Dis.26:1179-1181）。最初に、ペニシリンが、最も重篤なＳ．  ａｕｒｅｕｓ感染症にさえ治療するために使用され得た。しかしながら、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓのペニシリン耐性菌の出現により、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ感染症の治療におけるペニシリンの有効性が減少した。そして、今日、病院の感染症で遭遇する、殆どのＳ．  ａｕｒｅｕｓは、ペニシリンに反応しない。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓのペニシリン耐性菌は、ペニシリンをペニシロ酸に変換し、それによって抗生物質活性を破壊する、ラクタマーゼを産生する。さらに、前記のラクタマーゼ遺伝子は、しばしばエピソーム的に、典型的にはプラスミド上で増殖し、そして共に多剤耐性を与える、エピソーム要素上における数個の遺伝子のうちでたった一つの遺伝子である。
【０００３】
１９６０年代に導入されたメチシリン類により、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓにおけるペニシリン耐性の問題は、おおむね克服された。これらの化合物は、抗生物質作用の源であるペニシリンの前記の部分構造を保護し、ラクタマーゼを不活性化するためにペニシリンを良好な基質にする他の部分を部分修正又は変更する。しかしながら、バンコマイシン、アミノ配糖体類、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、マクロライド類及びリンコサミド類（ｌｉｎｃｏｓａｍｉｄｅｓ）を含む、この微生物に有効な他の多くの抗生物質に対する耐性に加えて、メチシリン耐性が、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓにおいて出現した。事実、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓのメチシリン耐性菌は、一般に多剤耐性である。メチシリン耐性Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）は、世界的に最も重要な院内の病原菌の一つになり、そして重大な感染防止上の問題を持ちかけている。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ感染症の薬剤耐性は、新しい治療剤が開発されなければ、非常に悪化させるようである、重要な治療上の困難をもたらしている。それゆえ、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ感染症を治療するための新しく且つ有効な治療剤に対する差し迫った、満たされていない医学的必要性がある。
【０００４】
概要
一つの態様では、本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ）における鉄の取り込みを阻害する、抗体、アンチセンスＲＮＡ類及びｓｉＲＮＡを含む新規な抗生物質を特徴とする。
本発明の他の態様は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓにおける鉄の取り込み阻害する薬剤を同定するためのスクリーニング・アッセイ法を特徴とする。
一つの実施態様では、前記のアッセイは、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）及び／又はＦｈｕＣの間の相互作用を阻害する薬剤を同定することができる。
もう一つの実施態様では、前記のアッセイ法は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓにおけるＳｉｒポリペプチド類及び／又は核酸類の発現を阻害する薬剤を同定することができる。
さらにもう一つの実施態様では、前記のアッセイ法は、前記の試験薬剤の存在下から非存在下まで、鉄を豊富に含む培地でＳ．  ａｕｒｅｕｓの成長を測定する表現型のアッセイ法である。
さらに、ここに開示した本発明の特徴及び利点は、次の詳細な説明及び請求項に関連して述べるであろう。
【０００５】
詳細な説明
１．一般
本発明は、ＳｉｒＡＢＣ輸送体を経由してスタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）の取り込みのために必要されるＡＴＰａｓｅをエンコードするｆｈｕＣの同定だけでなく、少なくとも部分的には、鉄シデロフォアである、スタフィロバクチンの輸送における、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ））ｓｉｒＡＢＣ複合体の役割の発見に基づいている。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓにおける鉄の取り込みを阻害する新規な抗生物質、及び前記ＳｉｒＡＢＣ鉄シデロフォア輸送システムの追加の阻害剤を同定するための化合物をスクリーニングする方法が、ここに記載されている。
【０００６】
２．定義
便宜上、本明細書、実施例及び添付の請求項で使用されている、特定の用語及び語句の意味が、以下に提供される。その他の点では定義されていないならば、ここで使用されている全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における通常のスキルを有する者により一般に理解される用語又は語句と同じ意味を有する。
【０００７】
「薬剤（ａｇｅｎｔ）」という用語は、化合物、化合物の混合物、生物学的高分子（たとえば、核酸、抗体、タンパク質、又はたとえばペプチドのようなタンパク質若しくはそれの一部のような）、又は、たとえば、細菌、植物、真菌又は動物（特に哺乳動物）の細胞若しくは組織のような生物学的材料から調製された抽出物を意味するために、ここでは使用される。薬剤は、以下に記すスクリーニング・アッセイにより同定されてもよい。前記の薬剤は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓにおける鉄輸送を仲介するＳｉｒＡＢＣの阻害剤又は拮抗剤であってもよい。前記の薬剤の活性は、被験体において局所的又は全身的に作用する、生物学的に、生理学的に又は薬理学的に活性な物質（又は物質類）である「治療剤」として、それを適切に表すかもしれない。
【０００８】
「拮抗剤」又は「阻害剤」という用語は、少なくともタンパク質の一つの生理活性を下げるか又は阻害する薬剤を意味する。拮抗剤は、たとえば対象のペプチド又は酵素の基質のような他の分子とタンパク質との間の相互作用を減らすか又は阻害する化合物であってもよい。拮抗剤は、また、遺伝子の発現を減らすか又は阻害するか、又は発現されたタンパク質の存在量を減らすか又は阻害する、化合物であってもよい。
【０００９】
ここで使用されているように、「抗体」という用語は、免疫グロブリン、及び免疫グロブリン（たとえばＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＥ）のあらゆる抗原結合部位、すなわち、特異的に抗原に結合する（免疫反応をする）抗原結合サイトを含むをポリペプチドを意味する。抗体は、少なくとも一つのジスルフィド結合により相互に結合された、少なくとも一つの重鎖（Ｈ）及び少なくとも一つの軽鎖（Ｌ）を包含することができる。「ＶＨ」という用語は、抗体の重鎖の可変領域を意味する。「ＶＬ」という用語は、抗体の軽鎖の可変領域を意味する。
【００１０】
代表的な実施態様では、「抗体」という用語は、特にモノクローナル抗体類及びポリクローナル抗体類を包含する。「ポリクローナル抗体」という用語は、抗原又は抗原類により免疫性を与えられた動物の血清から誘導された抗体を意味する。「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ細胞の単一クローンにより産生された抗体を意味する。モノクローナル抗体を調製する技法としては、ハイブリドーマ法（Kohler & Milstein(1975)Nature 256:495-497を参照）、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Kozbor et al.(1983)Immunol. Today) 4:72を参照）、ＥＢＶハイブリドーマ法（Cole
et al.,1985 In:Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy),
Alan R. Liss, Inc.), 77-96を参照）及びファージ・ディスプレー（ｐｈａｒｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を、さらに操作するか又は部分修正して、キメラ抗体又はヒト化抗体を発生することができる。
「キメラ抗体」は、その軽鎖及び重鎖の遺伝子は、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから構成されているように、遺伝子的に設計された免疫グロブリン遺伝子によりエンコードされている。たとえば、ここで記載されているようにして得られような、たとえばマウスモノクローナル抗体からの遺伝子の可変セグメント（Ｖ）の根本的な部分を、ヒトの定常部セグメント（Ｃ）の根本的な部分と連結してもよい。前記のキメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体よりもヒトに対して抗原性が少ないようである。ここで使用されているように、「ヒト化された抗体」（ＨｕＡｂ）という用語は、ヒトのフレームワーク領域に対して実質的に同一（すなわち、少なくとも８５％である）であるフレームワーク領域を備え、非ヒト抗体からの相補性決定領域を有し、そしてあらゆる定常部が、ヒト免疫グロブリン定常部に対する少なくとも約８５−９０％、好ましくは９５％のポリペプチド配列の同一性を有するキメラ抗体を意味する。たとえば、ＰＣＴ公開パンフレットＷＯ９０／０７８６１及びヨーロッパ特許第０４５１２１６号を参照されたい。おそらく前記のＣＤＲ類以外の、前記のＨｕＡｂの全ての部位は、一つ又はそれより多い天然のヒト免疫グロブリン配列と実質的に同一である。ここで使用されているように、「フレームワーク領域」という用語は、Kabat et al.(1987)Sequences of Proteins of Immunologic
Interest),4th Ed.,US Dept. Health and Human Servicesに定義されているように、単一種における異なる免疫グロブリンの間で比較的保存されている（すなわち、ＣＤＲ類以外である）、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖可変領域のこれらの部位を意味する。ヒト定常部ＤＮＡ配列は、様々なヒト細胞、好ましくは不死化されたＢ細胞からよく知られた手順に従い、単離することができる。ヒト化抗体を調製するための可変部又はＣＤＲ類は、前記の抗原に結合することができるモノクローナル抗体から誘導されてもよく、そしてマウス、ラット又は他の脊椎動物を含む、手近な哺乳動物で産生されるであろう。
【特許文献１】国際公開ＷＯ９０／０７８６１号パンフレット
【特許文献２】ヨーロッパ特許第０４５１２１６号
【００１１】
「抗体」という用語は、また、抗体フラグメントを包含する。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆａｂ´−ＳＨ、Ｆ（ａｂ´）２、及びＦｖフラグメント、二重特異性抗体並びに近接したアミノ酸残基の一つの連続したシークエンスからなる一次構造を有するあらゆる抗体フラグメントを包含する。当該抗体フラグメントの例は、制限なく、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、たった一つの軽鎖可変ドメインを含む単鎖ポリペプチド、又は合体する重鎖半分を持たない、軽鎖可変領域ドメインの三つのＣＤＲを含む、それについてのフラグメント及び（３）たった一つの重鎖可変領域のを含む単鎖ポリペプチド、又は合体する軽鎖半分を持たない、前記の重鎖可変領域の三つのＣＤＲを含む、それについてのフラグメント、並びに抗体フラグメントから形成される多特異性又は多価の構造を包含する。一つ又はそれより多い重鎖を包含する抗体フラグメントにおける、重鎖（類）は、もとのままの抗体のｎｏｎ−Ｆｃ領域に見出される、あらゆる定常部配列（たとえば、ＩｇＧイソタイプのＣＨ１）を含むことができ、及び／又はもとのままの抗体に見出される、あらゆるヒンジ領域配列を含むことができ、及び／又は重鎖（類）のヒンジ領域配列又は定常ドメイン配列に融合されるか、又は位置されたロイシンジッパー配列を含むことができる。適切なロイシンジッパー配列は、Kostelney et al.,(1992)
J. Immunol., 148: 1547-1553に開示されているｊｕｎ及びｆｏｓロイシンジッパー、並びに米国特許第６，４６８，５３２号に開示されているＧＣＮ４ロイシンジッパーを包含する。
【特許文献３】米国特許第６，４６８，５３２号
【００１２】
Ｆａｂ及びＦ（ａｂ´）２は、もとのままの抗体のＦｃフラグメントを欠き、及びたとえば、パパイン（Ｆａｂフラグメントの調製用）又はペプシン（Ｆ（ａｂ´）２フラグメントの調製用）のような酵素を使用して、タンパク質加水分解により典型的には調製される。もし前記抗体が、ほとんどの他の抗原以上に、優先的に前記の抗原に結合するならば、抗体は、抗原又は抗原のエピトープに「特異的に結合する」。たとえば、前記の抗体は、約５０％、２０％、１０％、５％、１％又は０．１％よりも低い、一つ又はそれより多い他のエピトープに対する交差反応性を有していてもよい。
【００１３】
「有効量」は、治療の際に有益な又は望みどおりの臨床結果を生じさせるために十分な量である。有効量は、患者に一回又はそれより多い分量で投与することができる。治療の点から、有効量は、患者の病菌の感染を減らすために十分な量である。有効量を獲得するために、適当な用量を決定する場合、典型的には、いくつかの要因が考慮される。これらの要因は、患者の、年齢、性別及び体重、治療対象の病気、病気の激しさ、投与される前記の薬剤のフォーム及び効果的な濃度を包含する。
【００１４】
「等価体」は、核酸又はヌクレオチド配列を記述するために使用される場合、機能的に同等なポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を意味する。等価なヌクレオチド配列は、たとえば対立遺伝子の変異型のような、一つ又はそれより多いヌクレオチドの置換、付加又は欠失により異なる配列を含み、そして、それゆえ、遺伝子コードの退化に起因して異なる配列を含むであろう。たとえば、核酸変異型は、ヌクレオチドの置換、欠失又は付加により調製されるものを包含してもよい。前記の置換、欠失又は付加は、一つ又はそれよりも多いヌクレオチドを包含してもよい。前記の変異型は、コーディング領域、非コーディング領域又はその両方で変更されていてもよい。コーディング領域における変更により、保守的又は非保守的な、アミノ酸の置換、欠失又は付加を作りだしてもよい。
【００１５】
ここで使用されているように、「フェリック・ヒドロキサマートの取り込み」、すなわち「ｆｈｕシステム」という用語は、ＡＢＣ輸送体をエンコードする遺伝子群を意味する。ｆｈｕシステムは、五つの遺伝子によりコードされている。ＦｈｕＣ、ｆｈｕＢ及びｆｈｕＧは、オペロン（ｆｈｕＣＢＧオペロン）に存在し、そしてＡＴＰ−結合カセット（ＡＢＣ）輸送体の構成要素をエンコードする。ＦｈｕＤ１及びｆｈｕＤ２は、別個にエンコードされ、そして高い親和性でフェリック・ヒドロキサマート複合体に結合するリポタンパク質をエンコードする。前記のｆｈｕＣＢＧオペロンの模範的なヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＡＦ２５１２１６、ＡＡＦ９８１５３、ＡＡＦ９８１５４及びＡＡＦ９８１５５に、ｆｈｕＤ１は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ３２５８５４及びＡＡＫ９２０８５に、ｆｈｕＤ２は、ＡＦ３２５８５５及びＡＡＫ９２０８６に見出されるかもしれない。「ＦｈｕＣ」、「ＦｈｕＢ」、「ＦｈｕＧ」、「ＦｈｕＤ１」及び「ＦｈｕＤ２」という用語は、フラグメント又はそれについての部分、及び生物学的に活性なフラグメント又はそれについての部分を包含する。
【００１６】
「同族性」あるいは「同一性」は、二つのペプチドの間又は二つの核酸分子の間の配列の類似性を意味する。同族性は、比較するために一列に並べてもよい、各配列において位置を比較することにより決定される。比較されている配列の位置が、同じ塩基又はアミノ酸に占められていると、前記の分子は、その位置において同族性である。配列間の同族性の度合いは、前記の両配列で共有される、合致又は同族性の位置の数の関数である。「パーセント同一性」という用語は、二つのアミノ酸又は二つのヌクレオチドの配列間の配列同一性を意味する。同一性は、比較するために一列に並べてもよい、各配列において位置を比較することにより決定される。前記の比較されている配列における同等の位置が、同じ塩基又はアミノ酸により占められると、前記の分子は、その位置において同一であり、そして、前記の同等のサイトが、同じ又は類似したアミノ酸残基（たとえば、立体的及び／又は電子的性質において類似している）で占められていると、前記の分子は、その位置において相同（類似）であるとして言及されてもよい。同族性、類似性又は同一性のパーセントによる表記は、前記の比較された配列で共有された位置における同一又は類似のアミノ酸の数の関数を意味する。ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ又はＥＮＴＲＥＺを含む、様々な整列アルゴリズム及び／又はプログラムが使用されてもよい。ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴは、ＧＣＧ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｐａｃｋａｇｅ（University of Wisconsin,
Madison, Wis.）の一部として利用可能であり、そしてたとえばデフォールトの設定で使用されるかもしれない。ＥＮＴＲＥＺは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．を通じて利用可能である。一つの実施態様では、二つの配列の前記のパーセント同一性は、たとえば、それが、二つの配列の間の単一アミノ酸又はヌクレオチドの不適合であるかのように各アミノ酸ギャップが加重されるように、１というギャップ重によりＧＣＧプログラムにより決定されるかもしれない。整列のための他の技法は、Methods in
Enzymology),266:Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis(1996),ed.
Doolittle, Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace & Co., San Diego, California,
USAに開示されている。好ましくは、配列中にギャップを容認する整列プログラムは、前記の配列を整列するために利用される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列の整列におけるギャップを容認するアルゴリズムの一つのタイプである。Meth. Mol. Biol.70: 173-18 (1997) を参照ください。さらに、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄを使用する、前記のＧＡＰプログラムを、配列を整列するために利用してもよい。もう一つの研究戦略は、ＭＡＳＰＡＲコンピュータ上で稼動するＭＰＳＲＣＨソフトウエアを使用する。ＭＰＳＲＣＨは、超並列コンピュータ（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ）上で配列をスコアするＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍを使用する。この方法は、離れた関連するマッチを拾い集める能力を改善し、そして小さなギャップ及びヌクレオチド配列のエラーに、特に寛容である。核酸エンコードされたアミノ酸配列は、タンパク質及びＤＮＡデータベースの両者からなるデータベースを検索するために使用されるかもしれない。個々の配列を備えたデータベースは、上記のMethods in Enzymology, ed. Doolittleに記載されている。データベースとしては、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ及びＤＮＡ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ  （ＤＤＢＪ）が挙げられる。
【００１７】
ここで使用されているように、「感染」という用語は、臨床的には明白でないかもしれず、又は競合する代謝、毒素、細胞内の複製又は抗原抗体反応に起因する局所的な細胞の損傷を生ずるかもしれない、体組織における、たとえばＳ．  ａｕｒｅｕｓのような微生物の侵入及び増殖を意味する。もし、体の防御の仕組みが有効であるならば、前記の感染が、局所的、準臨床的及び一時的な状態に止まるかもしれない。局所的感染は、持続し、そして拡張により、急性、亜急性若しくは慢性の臨床的感染症又は疾患状態になるように広がるかもしれない。前記の微生物がリンパシステム又は血管システムに近づくと、局所感染は、また、全身的な感染になる。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓの感染は、フルンケル、慢性フルンケル症、インペチゴ、急性骨髄炎、肺炎、心内膜炎、熱傷様皮膚症候群、トキシックショック症候群及び食中毒を含むが、これに限定されものではない、疾患又は異常を生ずるかもしれない。
【００１８】
「阻害」という用語は、生物学的活性、核酸の発現又はタンパク質の発現の、あらゆる減少、縮小又は完全な阻害を意味する。
【００１９】
「ラベル」及び「検出可能なラベル」は、放射性同位元素、フルオロフォア、化学ルミネセンス部分、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤、染料、金属イオン及び配位子（たとえば、ビオチン又はハプテン）等を含むが、これらに限定されるものではない、検出できる分子を意味する。「フルオロフォア」は、検出できる範囲で蛍光を示すことができる、物質又は部分を意味する。本発明で使用されてもよい、ラベルの特有の例は、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、テキサス・レッド（Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ）、ルミノール、ＮＡＤＰＨ、α−又はβ−ガラクトシダーゼ及び西洋ワサビペルオキシダーゼを包含する。
【００２０】
遺伝子に関してここで使用されているように、「突然変異体」という用語は、突然変異タンパク質をエンコードする遺伝子を意味する。タンパク質に関してここで使用されているように、「突然変異体」という用語は、その通常又は正常な生理学的役割を果たさないタンパク質を意味する。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓポリペプチド突然変異体は、アミノ酸置換、欠失又は付加により調製されてもよい。前記の置換、欠失又は付加は、一つ又はそれより多い残基を含んでいてもよい。本発明のＳ．  ａｕｒｅｕｓタンパク質の、前記の性状及び活性を変える置換、付加及び欠失が、特に、これらの内で好ましい。
【００２１】
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、相互に交換できるように使用されている。それらの用語は、あらゆる長さのデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド又はその類似物の何れかの、ヌクレオチドの高分子フォームを意味する。以下は、ポリヌクレオチドの無制限の例である。前記の無制限の例は、遺伝子若しくは遺伝子フラグメントのコーディング領域若しくは非コーディング領域、結合解析により定義される遺伝子座群（遺伝子座）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、あらゆる配列の単離されたＤＮＡ、あらゆる配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマーである。ポリヌクレオチドは、たとえばメチル化されたヌクレオチド及びヌクレオチド同族体のような修飾されたヌクレオチドを包含してもよい。もし存在するならば、前記のヌクレオチド構造への修飾は、前記のポリマーの組み立ての前後に施されてもよい。
前記ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド要素で中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、さらに、たとえば、ラベル要素を備えた連結により、ポリマー化後修飾されてもよい。
「組換え」ポリヌクレオチドという用語は、ゲノム由来、ｃＤＮＡ由来、天然には出現しないか、又は非天然配列で他のポリヌクレオチドに結合しているかの何れかである、半合成若しくは合成由来のポリヌクレオチドを意味する。
「オリゴヌクレオチド」は、約１００未満のヌクレオチド、たとえば、約７５、５０、２５又は１０未満のヌクレオチドを有する１本鎖ポリヌクレオチドを意味する。
【００２２】
「ポリペプタイド」、「ペプタイド」及び「タンパク質」（単鎖ならば）という用語は、ここでは相互に交換できるように使用され、アミノ酸のポリマーを意味する。前記のポリマーは、直鎖か又は分岐であってもよく、それは、修飾されたアミノ酸を含んでいてもよく、そして非アミノ酸がそれに介在していてもよい。この用語は、また、たとえば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化又はたとえば、ラベル要素を備えた結合のような他の操作により修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。
ここで使用されているように、「アミノ酸」という用語は、グリシン、そのＤ−若しくはＬ−光学異性体の両方、及びアミノ酸同族体及び擬ペプチドを含む、天然、及び／又は非天然若しくは合成のアミノ酸類のどちらか一方を意味する。
【００２３】
ここで使用されているように、「ｓｉｒＡＢＣ  オペロン」という用語は、普通のプロモーターを共有する、ｓｉｒＡ、ｓｉｒＢ及びｓｉｒＣを包含する細菌遺伝子のグループを意味する。このオペロンは、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓの前記の鉄により制限される成長にとって、重要であることが見出された。ｓｉｒＡＢＣオペロンの典型的なヌクレオチド及びアミノ酸の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＹ２５１０２２及びＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ０７９５１８に見出され得る。ＳｉｒＡは、以前にリポタンパク質として同定され（Heinrichs et al.(1999)J. Bacteriol.181:1436-1443）、そしてその発現は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓの前記のＦｕｒタンパク質の活性により厳密に制御されている。ＳｉｒＢ及びＳｉｒＣは、ＡＢＣ−輸送体の貫膜ドメインをエンコードしている。特に、ｓｉｒＡ又はｓｉｒＢの突然変異体は、ストレプトニグリンに対するＳ．  ａｕｒｅｕｓの耐性を増し、そして鉄が制限された培地における屈従した成長を示す。前記の突然変異体は、また、前記のスタフィロバクチン  シデロフォアを認知し、そして前記の細胞に輸送する能力において、屈従されられている。「ＳｉｒＡ」、「ＳｉｒＢ」及び「ＳｉｒＣ」という用語は、フラグメント又はそれの部分、及び生物学的に活性なフラグメント又はそれの部分を包含する。
【００２４】
「ＳｉｒＡＢＣ  鉄−シデロフォア輸送システム」という用語は、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ及びＦｈｕＣポリペプチドを包含する、前記のＳｉｒＡＢＣ輸送体を意味する。
【００２５】
「Ｓｉｒタンパク質」又は「Ｓｉｒポリペプチド」という用語は、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ及び／又はＳｉｒＣタンパク質を意味する。
「ｓｉｒヌクレオチド」、「ｓｉｒ核酸」又は「ｓｉｒ遺伝子」という用語は、ｓｉｒＡ、ｓｉｒＢ及び／又はｓｉｒＣの核酸を意味する。
【００２６】
「Ｓｉｒ欠失菌株」という用語は、少なくとも一つのＳｉｒタンパク質を発現しない細菌菌株を意味する。
「ＦｈｕＣ欠失菌株」という用語は、ＦｈｕＣタンパク質を発現しない細菌菌株を意味する。
【００２７】
「スタフィロバクチン」という用語は、前記のＳｉｒＡＢＣ  鉄−シデロフォア輸送システムにより細胞内に輸送される前記の鉄−シデロフォアを意味する。
【００２８】
「小さな分子」という用語は、約５ｋＤ未満、約２．５ｋＤ未満、約１．５ｋＤ又は０．９ｋＤ未満の分子量を有する化合物を意味する。たとえば、小さな分子は、核酸類、ペプチド類、ポリペプチド、ペプチド核酸類、擬ペプチド、炭水化物、脂質、他の有機化合物（炭素を含む）又は無機化合物であってもよい。多くの製薬企業は、あらゆる本発明のアッセイによりスクリーニングすることができる、化学的混合物及び／又は生物学的混合物、しばしば真菌抽出物、細菌抽出物又は藻の抽出物の広範囲に亘るライブラリーを保有している。
「小さな有機分子」という用語は、しばしば有機化合物又は薬効のある化合物として同定され、そしてもっぱら核酸、ペプチド類又はポリペプチド類である分子を含まない、小さな分子を意味する。
【００２９】
「実質的な同族体」という用語は、アミノ酸配列に関連して使用する場合に、コンホメーションの相同性を生じ、そしてそれゆえ一つ又はそれよりも多い生物学的活性（免疫学的活性を含む）の保持及び有益な程度に生ずる、実質的に同一であるか、又は互いに配列において類似している配列を意味する前記の用語は、前記の配列の一般的な進化を暗示することを意図されていない。
【００３０】
「被験体」は、ヒトを含む、雄又は雌の哺乳動物を意味する。
【００３１】
「ベクター」は、挿入された核酸分子を、宿主細胞へ転移するか、及び／又は宿主細胞間へ転移する、自己複製をする核酸分子である。前記の用語は、細胞への核酸分子の挿入のために主に作用するベクター、核酸の複製のために主に作用する複製ベクター、及びＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳ために作用する発現ベクターを包含する。さらに、前記の機能の一つ以上を提供するベクターも包含される。
ここで使用されているように、「発現ベクター」は、適当な宿主細胞に導入されると、ポリペプチド（類）へ転写又は翻訳されうるポリヌクレオチドとして定義される。
「発現システム」は、通常、望ましい発現産生物を生じるために機能することができる発現ベクターを含む、適切な宿主細胞を意味する。
【００３２】
３．ｓｉｒＡ、ｓｉｒＢ、ｓｉｒＣ、及びｆｈｕＣ  核酸
本発明は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ及びＦｈｕＣポリペプチド類、それについての完全相補性又はそれについての突然変異体をエンコードする核酸分子に関するものである。図６乃至１１は、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ及びＦｈｕＣポリペプチド、並びにそれについての完全相補性をエンコードする核酸配列を示す。
【００３３】
本発明の核酸類は、また、ここに記載したように、あらゆる前記のＳｉｒ又は前記のＦｈｕＣヌクレオチド配列又はそれについての相補性を包含するか、からなるか、又はのみからなってもよい。さらに、他の核酸類は、ここに記載したＳｉｒ若しくはＦｈｕＣ遺伝子又はそれについての相補性と、少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％の同一性又は相同性を有するヌクレオチド配列を包含するか、からなるか、又はのみからなってもよい。実質的に相同な配列は、ストリンジェント・ハイブリッド形成条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を使用して同定されてもよい。
【００３４】
本発明の核酸とは異なる単離された核酸類は、遺伝コードにおける同義性のために、また、本発明の範囲内に含まれる。たとえば、多数のアミノ酸は、一つのトリプレットよりも多いトリプレットにより明示される。同じアミノ酸を特定するコドン、すなわち同義コドン（ＣＡＵ及びＣＡＣはヒスチジンの同義コドンである）は、タンパク質のアミノ酸配列に影響しない「サイレント」突然変異体を生ずるかもしれない。しかしながら、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列における変化を起こさないＤＮＡ配列多型性が存在するであろうことが期待される。当業者ならば、本発明の特定のタンパク質をエンコードする核酸の一つ又はそれよりも多いヌクレオチド（前記のヌクレオチドの、１％未満から約３％まで、又は５％又はことによるとそれよりも多い）における、これらの変動（前記のヌクレオチドの、１％未満から約３％まで、又は５％又はことによるとそれよりも多い）は、天然のアレリック変動のために一定の種において存在するかもしれないことを認識するであろう。あらゆる及びすべてのヌクレオチド変動、及びそれにより生じたアミノ酸多型性は、本発明の範囲内である。ここに開示されているポリペプチドに進化的に関連しているアミノ酸配列を有するタンパク質をエンコードしている核酸が提供される。ここにおいて、「進化的に関連している」は、たとえば、組合せ突然変異誘発により誘導される本発明のタンパク質の突然変異による変異型に加えて、天然に（たとえば、アレリック変異度による、又は示差スプライシングによる）発生した異なるタンパク質を意味する。前記のポリペプチドの生物学的に活性な部位をエンコードしている、本発明の前記のポリヌクレオチドのフラグメントは、また、提供される。ここで使用されているように、ここで開示されているポリペプチドの活性な部分をエンコードしている核酸のフラグメントは、本発明のポリペプチドの完全な長さのアミノ酸配列をエンコードする前記のヌクレオチドよりも短いヌクレオチドを有し、ここで定義されたように完全な長さのＳｉｒ又はＦｈｕＣタンパク質の生物学的な活性の部分を少なくとも保持している一定のポリペプチドをエンコードするか、又は、代わりに、前記の完全な長さのタンパク質の前記の生物学的な活性のモジュレーターとして作動できるヌクレオチド配列を意味する。たとえば、前記のフラグメントは、前記のタンパク質ともう一つの分子（たとえば、ポリペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ等）との相互作用を仲介する前記のポリペプチドが誘導される、完全な長さのタンパク質のドメインを含むポリペプチドを包含する。
ここで提供された核酸は、また、リンカー配列、修飾された制限エンドヌクレアーゼサイト及び前記組換えポリペプチドの、分子クローニング、発現又は精製に有用な他の配列を含んでもよい。
【００３５】
ここで提供されるＳｉｒ又はＦｈｕＣポリペプチドをエンコードする核酸は、一般に当業者に知られているプロトコールのみならず、ここに開示したプロトコールに従い、あらゆる生物からのｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡから得られてもよい。たとえば、本発明のポリペプチドをエンコードするｃＤＮＡを、たとえば、細菌、ウイルス、哺乳動物等のような生物から全てのｍＲＮＡを単離することにより得てもよい。二本鎖のｃＤＮＡは、そのとき全てのｍＲＮＡから調製されてもよく、そして、次に多くの知られた技法のうちのあらゆる技法を使用して適切なプラスミド又はバクテリオファージベクターに挿入されてもよい。本発明のポリペプチドをエンコードする遺伝子を、また、本発明により提供される前記ヌクレオチド配列情報に従い、確立されたポリメラーゼ連鎖反応技法を使用してクローンしてもよい。
ある態様では、本発明の核酸又はそのフラグメントの増幅ための方法は、（ａ）各単鎖は、長さにおいて、少なくとも８ヌクレオチドであり、本発明の核酸の配列に対して相補的であり、そしてここにおいて前記オリゴヌクレオチドが相補的である配列は、少なくとも１０ヌクレオチド離れている、一対の単鎖オリゴヌクレオチドを提供すること、及び（ｂ）前記のオリゴヌクレオチドを、一対のオリゴヌクレオチドの間に位置する前記の領域の増幅をさせる条件下で、本発明の前記の核酸を含む試料に接触させること、それによって前記の核酸を増幅させることを包含してもよい。
【００３６】
本発明は、また、前記のベクター、及び宿主細胞を構築する方法のためのみならず、前記の組換えベクターを含む宿主細胞のために、そして組換え技法によるＳ．  ａｕｒｅｕｓポリペプチド類の産生のためにそれらを使用するために、単離されたｓｉｒ又はｆｈｕＣ核酸を包含する組換えベクターを特徴づける。
【００３７】
適切なベクターは、たとえば、感染、形質導入、トランスフェクション、トランスベクション、エレクトロポレーション及び形質転換のようなよく知られた技法を使用して、宿主細胞に導入されてもよい。前記のベクターは、たとえば、ファージ、プラスミド、ウイルスベクター又はレトロウイルスベクターであってもよい。レトロウイルスベクターは、複製能があってもよく、又は複製能欠失であってもよい。後者の場合、ウイルスの増殖は、一般的に宿主細胞を補充する場合にのみ生ずるであろう。
【００３８】
前記のベクターは、宿主において増殖のための選び出すことができるマーカーを含んでいてもよい。一般的に、プラスミドベクターは、たとえば、カルシウムリン酸沈殿物又は電荷を帯びた脂質との複合体のような沈殿物中で導入される。もし前記ベクターがウイルスの場合、それは、適切なパッケージング細胞系を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでパッケージされ、そして宿主細胞に形質導入されてもよい。
【００３９】
好ましいベクターは、注目されている前記ポリヌクレオチドに対するシス作用制御領域を包含する。適切なトランス作用因子は、前記の宿主により、補足ベクターにより、又は前記の宿主への導入の際にベクター自身により供給されてもよい。
【００４０】
あるの実施態様では、前記のベクターは、誘導性及び／又は細胞の種類に特異的であってもよい、特定の発現のために提供される。前記のベクターの内でとりわけ好ましいのは、たとえば温度及び栄養添加物のような、取り扱いやすい環境要因により誘導されるベクターである。
【００４１】
本発明において有用な発現ベクターは、たとえば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピゾーム、酵母染色体要素、たとえば、バキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ）、パポバウイルス（ｐａｐｏｖａ  ｖｉｒｕｓｅｓ）、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、フォウルポックスウイルス（ｆｏｗｌ  ｐｏｘ  ｖｉｒｕｓｅｓ）、シュードラビーズウイルス（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓｅｓ）及びレトロウイルスのようなウイルスから誘導されたベクター、並びにたとえばコスミド及びファージミドのような、それらの組み合わせから誘導されたベクターのような、染色体誘導ベクター、エピゾーム誘導ベクター及びウイルス誘導ベクターを包含する。
【００４２】
前記のＤＮＡ挿入は、２、３例を挙げると、たとえば、ファージラノバＰＬプロモーター、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｌａｃ、  ｔｒｐ及びｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、並びにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターのような適切なプロモーターと有効に組み合わされるべきである。他の適当なプロモーターは、当業者に知られているであろう。前記の発現構築物は、さらに転写開始、終結のためのサイト、及び前記の転写された領域における翻訳のためのリボソーム結合サイトを含むであろう。前記の構築物により発現された前記の成熟転写のコーディング部位は、好ましくは、翻訳される前記のポリペプチドの末端に適切に配置された、開始及び終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ又はＵＡＧ）での翻訳開始サイトを含むであろう。
【００４３】
示したように、前記の発現ベクターは、好ましくは少なくとも一つの識別できるマーカーを含むであろう。前記のマーカーは、真核細胞培養用のジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子又はネオマイシン耐性遺伝子、及びＥ．  ｃｏｌｉ及び他の細菌を培養するための、テトラサイクリン、カナマイシン又はアンピシリンの耐性遺伝子を包含する。適当な宿主の代表的な例は、たとえば、Ｅ．  ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの細胞のような細菌細胞、たとえば酵母細胞のような真菌細胞、たとえば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２及びＳｆ９細胞のような昆虫細胞、たとえば、ＣＨＯ、ＣＯＳ及びボーウズ・メラノーマ（Ｂｏｗｅｓ  ｍｅｌａｎｏｍａ）細胞のような動物細胞、並びに植物細胞を含むが、これに限定されるものではない。前記の宿主細胞のための適当な培養の培地及び条件は、この技術分野では知られている。
【００４４】
細菌での使用に好ましいベクターは、キヤゲン（Ｑｉａｇｅｎ）から入手可能な、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ９及びｐＱＥ１０、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から入手可能な、ｐＢＳベクター、ファージスクリプト（Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ）ベクター、ブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）から入手可能な、ｐＥＴ  シリーズベクター、並びにファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から入手可能な、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５を包含する。好ましい真核細胞用ベクターは、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から入手可能な、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１及びｐＳＧ、並びにファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から入手可能な、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬである。他の適切なベクターは、当業者には容易に明らかになるであろう。
【００４５】
本発明における使用に適した知られた細菌用プロモーターは、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｌａｃＩ及びｌａｃＺプロモーター、Ｔ３、Ｔ５及びＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ランブダ（ｌａｍｂｄａ）ＰＲ及びＰＬプロモーター、ｔｒｐプロモーター、並びにｘｙＩ／ｔｅｔキメラプロモーターを包含する。適切な真核細胞用のプロモーターは、ＣＭＶ即時型プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、レトロウイルスＬＴＲの初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、たとえばラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のレトロウイルスＬＴＲのようなレトロウイルスＬＴＲのプロモーター、並びにたとえばマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターのようなメタロチオネインプロモーターを包含する。
【００４６】
前記の構築物の前記の宿主細胞への導入は、カルシウム−リン酸トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション、カチオニック脂質−仲介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入又は他の技法により達成され得る。前記の技法は、多くの標準的な実験マニュアルに開示されている（たとえば、Davis,
et al., Basic Methods In Molecular Biology)(1986)）。
【００４７】
高等真核生物による本発明のポリペプチドをエンコードするＤＮＡの転写は、前記のベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増加されるかもしれない。エンハンサーは、一定の宿主細胞のタイプにおいてプロモーターの転写活性を増やすように作用する、通常約１０から３００のヌクレオチドである、ＤＮＡのシス作用要素である。エンハンサーの例は、１００から２７０のヌクレオチドで複製起点の後期サイドに位置するＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期サイドに位置するポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーを包含する。
【００４８】
小胞体のルーメン、周辺腔又は細胞外環境への翻訳されたポリペプチドの分泌のために、たとえば、アミノ酸配列ＫＤＥＬのような、適切な分泌シグナルは、発現されたポリペプチドに組み入れられてもよい。前記のシグナルは、前記のポリペプチドに対して内在性であってもよく、又はそれらは、異型のシグナルであってもよい。あるいは、実施例３に示されるように、シグナルペプチドを欠失したｓｉｒＡは、大量の可溶性ＳｉｒＡを産生するためにＥ．  ｃｏｌｉ発現ベクター中にクローンされてもよい。注目のポリペプチドのためのコード配列は、異なるポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を含む融合遺伝子の一部として組み入れられてもよい。
【００４９】
本発明は、本発明の核酸、及び異型のポリペプチドを含む融合タンパク質をエンコードするために、骨格構造において、本発明の核酸のヌクレオチド配列に連結された、異型のペプチドをエンコードする、少なくとも一つの異型の配列を包含する単離された核酸を意図している。前記の異型のポリペプチドは、（ａ）本発明の核酸によりエンコードされたポリペプチドのＣ−末端、（ｂ）前記のポリペプチドのＮ−末端、又は（ｃ）前記のポリペプチドのＣ−末端及びＮ−末端に融合されていてもよい。いくらかの例では、前記の異型の配列は、それが融合されている前記のポリペプチドの検出、単離、可溶化及び／又は安定化を可能にするポリペプチドをエンコードする。さらに他の実施態様では、前記の異型の配列は、ｐｏｌｙＨｉｓ  ｔａｇ、ｍｙｃ、ＨＡ、ＧＳＴ、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、カルモジュリン結合ペプチド、チオレドキシン、マルトース−結合タンパク質、ポリアルギニン、ｐｏｌｙ  Ｈｉｓ−Ａｓｐ、ＦＬＡＧ、免疫グロブリンタンパク質の一部、及びトランスサイトーシス  ペプチドからなる群から選ばれるポリペプチドをエンコードする。
【００５０】
融合発現システムは、本発明のポリペプチドの免疫原性フラグメントを産生することが望まれる場合に、有用でありうる。たとえば、レトロウイルスのＶＰ６キャプシド  タンパク質は、モノマーのフォームか又はウイルス粒子のフォームの何れかで、ポリペプチドの一部のために免疫学的なキャリヤータンパク質として使用されてもよい。抗体が引き起こされるためのものである、本発明のポリペプチドの部分に対応する核酸配列は、ビリオンの一部として前記のタンパク質の一部を含む、一組の組換えウイルス発現融合タンパク質を産生するための、後期ワクシニアウイルス構造タンパク質のためのコード配列を含む、融合遺伝子構築物に組み込まれていてもよい。Ｂ型肝炎表面抗原は、また、なおその上、この役割で利用されてもよい。同様に、本発明のポリペプチドの一部を含む融合タンパク質、及びポリオウイルス  キャプシド  タンパク質をコードするキメラ構築物を、免疫原性を増強するために構築してもよい（ＥＰ公開特許第０２５９１４９号；及びＥvans et al.,(1989) Nature 339:
385;Huang et al.,(1988) J. Virol.62:3855;及びSchlienger et al.,(1992)J. Virol.66:2を参照。）。
【特許文献４】ヨーロッパ公開特許第０２５９１４９号
【００５１】
融合タンパク質は、タンパク質の発現及び／又は精製を容易する可能性がある。たとえば、本発明のポリペプチドは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として生み出されるかもしれない。前記のＧＳＴ融合タンパク質は、たとえば、グルタチオン誘導マトリックスの使用を通じて、本発明のポリペプチドの精製を簡単にすることに使用されるかもしれない（たとえば、Current Protocols in Molecular
Biology, eds. Ausubel et al., (N.Y.: John Wiley & Sons, 1991)  を参照）。もう一つの実施態様では、たとえば、前記の組換えタンパク質の望みの部分のＮ−末端における、ポリ−（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ開裂サイト配列のような、精製リーダー配列をコードする融合遺伝子は、Ｎｉ２＋金属樹脂を用いるアフィニティークロマトグラフィーによる前記の発現した融合タンパク質の精製を可能にするかもしれない。次に、精製リーダー配列は、精製されたタンパク質を提供するために、エンテロキナーゼ処理により除去されてもよい（たとえば、Hochuli et al., (1987) J.
Chromatography 411: 177;及びJanknecht et al., PNAS USA 88:8972を参照。）。
【００５２】
融合遺伝子を作成する技法は、よく知られている。本質的に、異なるポリペプチド配列をコードする様々なＤＮＡフラグメントの結合は、連鎖反応のため平滑末端又はスタッガー末端、適当な末端を提供するための制限酵素による消化、必要に応じて、付着末端を満たすこと、望ましくない結合をさけるためのアルカリ性ホスファターゼ処理、及び酵素的連鎖反応を利用する、一般に行われている技法に従い実施される。もう一つの実施態様では、前記の融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む一般に行われている技法により合成されてもよい。あるいは、キメラ遺伝子配列を生ずるために続いてアニールされてもよい、二つの連続する遺伝子フラグメントの間の相補的な張出しを生み出すアンカープライマーを使用して、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を実施してもよい（たとえば、Current Protocols in
Molecular Biology, eds. Ausubel et al.,
John Wiley & Sons: 1992を参照）。
【００５３】
他の実施態様では、本発明の核酸は、プレート、ミクロタイタープレート、スライド、ビーズ、微片、球体、フィルム、ストランド、沈殿物、ゲル、シーツ、管、容器、毛細管、パッド、薄片等を含む、固体表面に固定されてもよい。本発明の核酸は、アレー（ａｒｒａｙ）の一部としてチップ（ｃｈｉｐ）に固定化されてもよい。前記のアレー（ａｒｒａｙ）は、ここに記載したように、一つ又はそれより多い本発明のポリヌクレオチドを含んでいてもよい。ある実施態様では、前記のチップ（ｃｈｉｐ）は、ポリヌクレオチド配列のアレー（ａｒｒａｙ）の一部として、本発明の一つ又はそれより多いポリヌクレオチド配列を包含する。
【００５４】
もう一つの態様は、「アンチセンス治療法」における本発明の核酸の使用に関するものである。ここで使用されているように、アンチセンス治療法は、たとえば、転写及び／又は翻訳の阻害によるというような、そのポリペプチドの発現を阻害するために、本発明のポリペプチドの一つをエンコードする細胞性のｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡと、細胞性条件下で特異的にハイブリダイズするか又は別に結合する、オリゴヌクレオチドプローブ又はそれらの誘導体の、投与又はｉｎ  ｓｉｔｕでの発生を意味する。前記の結合は、一般に行われている塩基対の相補性によってもよく、又は、たとえば、ＤＮＡ二重らせんへの結合の場合において、前記の二重らせんのグルーブにおける特異的な相互作用を通じてであってもよい。一般に、アンチセンス治療法は、この技術分野で一般的に実施されている技法の範囲を意味し、そしてオリゴヌクレオチド配列への特異的な結合に依存しているあらゆる治療法を包含する。
【００５５】
前記のオリゴヌクレオチドは、もう一つの分子、たとえば、ペプチド、ハイブリッド引金架橋試薬、輸送試薬、ハイブリッド引金開裂試薬等と接合されていてもよい。アンチセンス分子は、「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）でありうる。ＰＮＡは、リジンを末端とするアミノ酸残基のペプチド骨格に結合している、長さで少なくとも５個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス分子又は抗遺伝子薬剤を意味する。末端のリジンは、前記の組成物に対して溶解性を付与する。ＰＮＡは、優先的に相補性一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡに結合し、そして転写延長を止め、そして細胞におけるそれらの寿命を延ばすためにペジレイト（ｐｅｇｙｌａｔｅ）されてもよい。
【００５６】
本発明のアンチセンス構築物は、たとえば、細胞中で転写されると、本発明のポリペプチドをエンコードする、少なくともｍＲＮＡのユニークな部分に対して相補性であるＲＮＡを産生する発現プラスミドとして放出されてもよい。あるいは、前記のアンチセンス構築物は、ｅｘ  ｖｉｖｏで産生され、そして細胞中に導入されると、本発明のポリペプチドをエンコードする、ｍＲＮＡ及び／又はゲノム配列とハイブリッドを形成することにより発現の阻害を引き起こすオリゴヌクレオチドプローブであってもよい。前記のオリゴヌクレオチドプローブは、たとえば、エキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼのような内因性ヌクレアーゼに対して耐性であり、そしてそれゆえｉｎ  ｖｉｖｏで安定である修飾されたオリゴヌクレオチドであってもよい。アンチセンス  オリゴヌクレオチドとして使用されるための典型的な核酸分子は、ＤＮＡのホスホラミデテ（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、ホスホチオエート及びメチルホスホネート  アナログである。（米国特許第５，１７６，９９６号、米国特許第５，２６４，５６４号、及び米国特許第５，２５６，７７５号も参照。）  加えて、アンチセンス治療法で有用なオリゴマーを構築する一般的なアプローチは、たとえば、van der Krol et al., (1988) Biotechniques 6:958-976;及びStein et
al., (1988) Cancer Res
48:2659-2668によりレビューされた。
【特許文献５】米国特許第５，１７６，９９６号
【特許文献６】米国特許第５，２６４，５６４号
【特許文献７】米国特許第５，２５６，７７５号
【００５７】
さらなる態様では、二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及びそれと同じものを投与する方法が提供される。ｓｉＲＮＡは、遺伝子の発現を減らすか、又は遮断する。理論により束縛されることを望まない限りは、ｓｉＲＮＡは、配列特異的なｍＲＮＡの分解を仲介することにより、遺伝子発現を阻害することが、一般的に考えられている。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、前記のサイレンスされる遺伝子の配列に相同である二重らせんＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により開始される、特に動物及び植物における配列特異的な、転写後の遺伝子サイレンシングのプロセスである（Elbashir et al. Nature 2001; 411(6836): 494-8）。したがって、本発明のポリヌクレオチドの全て又は一部に対する、実質的な配列同一性を有するｓｉＲＮＡ及び長いｄｓＲＮＡを、本発明の核酸の発現を阻害するために使用してもよいことが理解される。
【００５８】
あるいは、ここに記載されているＳｉｒ又はＦｈｕＣポリペプチドの発現を減らすか又は遮断するｓｉＲＮＡを、前記の標的遺伝子に対する、複数のｓｉＲＮＡを試すことにより決定してもよい。標的遺伝子に対する前記のｓｉＲＮＡを、化学的に合成してもよい。前記の鎖が、阻害される目的の遺伝子に対する相補性の領域を有するようにして、前記の個々のＲＮＡ鎖のヌクレオチド配列は選ばれる（すなわち、前記の相補性のＲＮＡ鎖は、前記の標的遺伝子の発現の間に形成されるｍＲＮＡ転写の領域、又はそのプロセシング産生物、又は（＋）鎖ウイルスの領域に対して相補性であるヌクレオチド配列を含む。）。前記のＲＮＡ鎖を合成するステップは、個々のヌクレオチドが、連続した合成サイクルにおいてインターヌクレオチド３‘−５’ホスホジエステル結合の形成を通じて端と端とくっつけて結合される、固相合成を包含してもよい。
【００５９】
ここで記載されているように、Ｓｉｒ又はＦｈｕＣ核酸の配列のみからなる核酸配列を包含するｓｉＲＮＡ分子が、ここでは提供される。ｓｉＲＮＡ分子は、二つの鎖を含み、各鎖が、互いに少なくとも本質的に相補性であるヌクレオチド配列を含み、そして、二つの鎖の一方が、標的遺伝子の配列に対して本質的に相当するヌクレオチド配列を含んでもよい。標的遺伝子に本質的に相当する、前記の配列は、「センス標的遺伝子」として言及され、そしてそれに対して本質的に相補的である、前記の配列は、前記のｓｉＲＮＡの「アンチセンス標的配列」として言及される。前記のセンス及びアンチセンス標的配列は、約１５から約３０の長さの連続するヌクレオチド、約１９から約２５の連続するヌクレオチド、約１９から２３の連続するヌクレオチド、又は約１９、２０、２１、２２若しくは２３の長さのヌクレオチドであってもよい。前記のセンス及びアンチセンス配列の長さは、決定された結果、前記の長さのセンス及びアンチセンス標的配列を有するｓｉＲＮＡは、好ましくは宿主のインターフェロン応答を著しく誘導することなく、標的遺伝子の発現を阻害することができる。ｓｉＲＮＡ標的配列は、ワールド・ワイド・ウェブ（ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ）上のｍｍｃｍａｎｕｓサイトにおけるエクステンションアドレス
web.mit.edu/mmcmanus/www/home1.2files/siRNAsで供給される、あらゆるアルゴリズムを利用することにより予測されるかもしれない。
【００６０】
前記センス標的配列は、標的核酸のコードしている部分、コードされていない部分又はそれの組み合わせと、本質的に又は実質的に同一であってもよい。たとえば、前記のセンス標的配列は、標的核酸又はその相補体の５‘又は３’翻訳されない領域、プロモーター、イントロン、又はエキソン本質的に相補性であってもよい。それは、また、二つの前記の遺伝子領域の間の境界を包含する領域に対して、本質的に相補性でありうる。
【００６１】
前記のセンス標的配列のヌクレオチドの塩基の組成は、アデニン（Ａ）及びチミジン（Ｔ）が約５０％、並びにシチジン（Ｃ）及びグアノシンが（Ｇ）が５０％でありうる。あるいは、前記の塩基組成は、少なくともＣ／Ｇが５０％でありえ、たとえば、Ｃ／Ｇが約６０％、７０％又は８０％でありうる。したがって、センス標的配列の選択は、ヌクレオチド塩基の組成に基づいていてもよい。ｓｉＲＮＡによる標的核酸への接近しやすさに関して、前記の接近しやすさは、たとえば、Lee et al. (2002) Nature Biotech. 19:500に記載されているようにして決定されうる。このアプローチは、たとえば、細胞抽出物におけるように基質への接近しやすさを決定するために、プローブとして、前記の標的核酸に対する相補性であるオリゴヌクレオチドの使用を含む。前記のオリゴヌクレオチドプローブとデュプレックスを形成した後、前記の基質は、ＲＮａｓｅ  Ｈに対して感受性になる。それゆえ、たとえばＰＣＲにより決定されるように一定のプローブに対するＲＮａｓｅＨの感受性の程度は、前記の選択されたサイトへの接近のしやすさを反映し、そして如何によく、対応するｓｉＲＮＡがこの標的遺伝子からの転写の阻害で実行するかについての予測値であるかもしれない。ある人は、また、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイのための、又は最初の標的配列を同定するためのアンチセンス  オリゴヌクレオチドを同定するためのプライマーを同定するアルゴリズムを使用するかもしれない。前記のセンス及びアンチセンス標的配列は、好ましくは十分に相補的である結果、両方の配列を含むｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を阻害することができる、すなわち、ＲＮＡ干渉を仲介することができる。たとえば、前記の配列は、たとえば、細胞内というような望ましい条件下でハイブリッド形成を可能にするために十分相補性であるかもしれない。
したがって、前記のセンス及びアンチセンス標的配列は、少なくとも約９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性であってもよく、そしてたとえば多くても、５、４、３、２、１又０ヌクレオチドで異なってもよい。
【００６２】
センス及びアンチセンス標的配列は、また、前記の標的遺伝子又はその相補性以外の配列と相互に意義あるように作用しないような、好ましい配列である。このことは、たとえば、標的細胞のゲノムにおいて、選択された配列と他の配列とを比較して確認することができる。配列比較は、この分野で知られている方法、たとえば、ここでさらに記載するＢＬＡＳＴアルゴニズムを使用して、実施されうる。もちろん、小スケールの実験は、また、特異な最初の標的配列が、特異的に標的核酸の発現を阻害することができ、及び本質的に他の遺伝子の発現を阻害しないということを確認するために実施されうる。
【００６３】
ｓｉＲＮＡは、また、前記のセンス及びアンチセンス配列に加えて配列を含んでいてもよい。たとえば、ｓｉＲＮＡは、少なくとも一方の鎖が３‘オーバーハングを有する二本鎖のＲＮＡからなるＲＮＡデュプレックスであってもよい。前記の他の鎖は、平滑末端であるか、又はオーバーハングを有することができる。前記のＲＮＡが二本鎖であり、そして両方の鎖がオーバーハングを含む実施態様では、前記のオーバーハングの長さは、各鎖において同じか、又は異なっていてもよい。特定の実施態様では、ｓｉＲＮＡは、対になっており、そして前記のＲＮＡの両方の３‘末端で約１から約３ヌクレオチド、特に約２ヌクレオチドのオーバーハングを有する約１９−２５ヌクレオチドからなり、一本ＲＮＡ鎖上にあるセンス配列及びアンチセンス配列を含む。さらに本発明のＲＮＡの安定性を向上するために、前記の３‘オーバーハングは分解に対して安定化されうる。一つの実施態様では、前記のＲＮＡは、たとえば、アデノシンヌクレオチド又はグアノシンヌクレオチドのようなプリンヌクレオチドを含めることにより安定化される。あるいは、たとえば、２’−デオキシチミジンによる、ウリジン２ヌクレオチド３‘オーバーハングの置換というような、修飾されたアナログによるピリミジンヌクレオチドの置換は、許容され、そしてＲＮＡｉの有効性に影響しない。２‘位の水酸基がないことは、また、少なくとも組織培養培地において、前記のオーバーハングのヌクレアーゼ耐性を著しく向上する可能性がある。ｓｉＲＮＡのＲＮＡ鎖は、５‘−リン酸及び３’−水酸基を有していてもよい。一つの実施態様では、ｓｉＲＮＡ分子は、デュプレックスを形成する、二本鎖のＲＮＡを包含する。もう一つの実施態様では、ｓｉＲＮＡ分子は、前記のセンス及びアンチセンス標的配列がハイブリダイズし、そして前記の二つ標的配列の間の配列が、本質的に前記のヘヤピン構造のループを構成するスペーサー配列である、ヘヤピンループを形成する一つのＲＮＡ鎖から成る。もし、少なくとも前記のスペーサーの一部分が前記のヘヤピンの閉鎖末端で前記のループを形成するところの、この配列を有するスペーサーにより結合された、二つの相補オリゴヌクレオチドは、ヘヤピン構造を形成することができるならば、前記のスペーサー配列は、ヌクレオチドのあらゆる組み合わせ及びあらゆる長さであってもよい。たとえば、前記のスペーサー配列は、約３から約３０ヌクレオチド、約３から約２０ヌクレオチド、約５から約１５ヌクレオチド、約５から約１０ヌクレオチド、又は約３から約９ヌクレオチドでありうる。もし、それがヘヤピン構造の形成を妨げないならば、前記の配列は、あらゆる配列でありうる。特に、前記のスペーサーが、好ましくは、前記の第一又は第二の標的配列に対して、意味のある相同性を有する配列ではない。なぜならば、これはヘヤピン構造の形成を妨げるかもしれないからである。前記のスペーサー配列は、また、好ましくは、たとえば、前記の核酸が導入されるであろう細胞のゲノム配列のような他の配列と類似していない。なぜならば、これが前記の細胞内で好ましくない影響を及ぼすかもしれないからである。
【００６４】
当業者ならば、核酸、たとえばＲＮＡに言及すると、前記のＲＮＡは、天然に存在するヌクレオチド、又はたとえば、前記の核酸に安定性を付与するヌクレオチド誘導体を包含するかもしれないか、又はから成るかもしれないことを理解するであろう。もし、前記の核酸は、望ましい様式で作用することができるならば、あらゆる誘導体が、容認される。もし、たとえば、前記のｓｉＲＮＡが、依然として前記の標的遺伝子の発現を阻害することができるならば、ｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド誘導体を包含してもよい。たとえば、ｓｉＲＮＡは、安定性又はその他の理由のために、一つ又はそれより多い、修飾された塩基及び／又は修飾された骨格を包含してもよい。たとえば、天然のＲＮＡのホスホジエステル結合は、少なくとも一つの窒素又はイオウ  へテロ原子を含むように修飾されてもよい。その上、ただ二つの例の提案するために、たとえばイノシンのような変わった塩基、又はたとえばトリチル化された塩基のような修飾された塩基を包含するｓｉＲＮＡを、本発明で使用することができる。当業者に知られている、多くの有用な目的に役立つＲＮＡに対して、非常に多種にわたる修飾がなされたことは、十分意識されているであろう。もし、それが、内因性のテンプレートから誘導されたならば、ｓｉＲＮＡという用語は、ここでそれが採用されているように、化学的、酵素的又は代謝的に修飾されたｓｉＲＮＡのフォームを包含する。
ｓｉＲＮＡが、合成される得る方法に関して、制限がない。それゆえ、それは、手動又は自動化された手順を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで合成されてもよい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成は、化学的合成又は、たとえば、ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）テンプレートの転写のためにクローン化されたＲＮＡポリメラーゼ（たとえば、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６）の使用する酵素的合成又は両者の混合であってもよい。ｓｉＲＮＡは、また、たとえば、化学的に前記の二つの鎖のそれぞれを合成し、そして前記の二つの鎖をハイブリッド形成して、デュプレックスを形成するように合成することにより、調製されてもよい。ｉｎ  ｖｉｖｏの場合、ｓｉＲＮＡは、この分野でよく知られている組換え技法を合成されてもよい。(たとえば、 Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition
(1989)、
DNA Cloning, Volumes I and II (D. N
Glover ed. 1985)、
Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed, 1984)、
Nucleic Acid Hybridisation (B. D. Hames & S. J. Higgins
eds. 1984)、
Transcription and Translation (B. D. Hames & S. J.
Higgins eds. 1984)、
Animal Cell Culture (R. I. Freshney ed. 1986)、
Immobilised Cells and Enzymes (IRL Press, 1986)、
B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the series, Methods in
Enzymology (Academic Press, Inc.)、
Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J. H. Miller and M.
P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology Vol.
154 and Vol. 155 (Wu and Grossman, and Wu, eds., respectively)、
Mayer and Walker, eds.
(1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London), Scopes, (1987), Protein Purification: Principles and Practice,
Second Edition (Springer-Verlag,
N.Y.)及び
Handbook of
Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds 1986)を参照)たとえば、細菌細胞は、前記のｓｉＲＮＡが誘導されるべきＤＮＡテンプレートを包含する発現ベクターにより形質転換することができる。
もし細胞外で合成された場合、前記のｓｉＲＮＡを、前記の細胞への導入に先立ち、精製してもよい。精製は、溶媒（たとえば、フェノール／クロロホルム）抽出、樹脂若しくは沈殿（たとえば、エタノール中）、電気泳動、クロマトグラフィー、又はそれらの組み合わせによるものであってもよい。
しかしながら、精製は、ｓｉＲＮＡの損失を生ずるかもしれない。それゆえ、精製を、最小限にするか、又はほとんど実施されなくてもよい。前記のｓｉＲＮＡは、貯蔵のために乾燥されてもよく、又は前記のＲＮＡ鎖のアニーリング及び／又は安定性を促進するために、バッファー又は塩を含んでいてもよい水性溶液に溶解されていてもよい。
【００６５】
前記の二本鎖構造は、一本鎖の自己相補性ＲＮＡ鎖又は二本の分離れた相補性ＲＮＡ鎖により形成されてもよい。
【００６６】
哺乳動物細胞は、細胞外ｓｉＲＮＡに応答することができ、それゆえｄｓＲＮＡのための輸送メカニズムを備えているかもしれない（Asher et al.)(1969) Nature 223 715-717）。それゆえ、ｓｉＲＮＡは、細胞外に腹腔、間隙スペース、哺乳動物の血液循環中に投与されてもよく、又は経口で導入されてもよい。経口にて導入する方法は、食物として使用される種を前記のＲＮＡを発現するように処理し、それから感染される哺乳動物に与える処理アプローチだけでなく、前記のＲＮＡを直接哺乳動物の食物に混ぜる方法を包含する。たとえば、Lactococcus lactisのような食用細菌を、前記のｄｓＲＮＡを産生するように変換してもよい（国際公開ＷＯ９３／１７１１７号パンフレット及び国際公開ＷＯ９７／１４８０６号パンフレットを参照）。
【特許文献８】国際公開ＷＯ９３／１７１１７号パンフレット
【特許文献９】国際公開ＷＯ９７／１４８０６号パンフレット
【００６７】
血管循環又は血管外循環、血液又はリンパシステム及び脳脊髄液は、前記のＲＮＡが注射されてもよいサイトである。
【００６８】
ＲＮＡは、細胞内的に細胞に導入されてもよい。核酸を導入する物理的な方法は、また、この場合において使用されてもよい。ｓｉＲＮＡは、Zernicka-Goetz et al. (1997) Development 124, 1133-1137 and Wianny et al. (1998) Chromosoma 107, 430-439に開示されているようなマイクロインジェクション法を使用して投与される。
【００６９】
細胞内に核酸を導入する他の物理的な方法は、たとえば、前記のｓｉＲＮＡを金の微片上に固定し、傷つけた部位を目がけて直接発砲する遺伝子銃法のような、前記のｓｉＲＮＡで覆われた微片による爆撃を包含する。それゆえ、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するための遺伝子銃におけるｓｉＲＮＡの使用を提供する。さらに、ｓｉＲＮＡ及び金微片を包含する遺伝子銃による治療法に適した組成物がここで提供される。もう一つの物理的な方法は、前記のｓｉＲＮＡの存在下での細胞膜のエレクトロポレーションを包含する。この方法は、大スケールでのＲＮＡｉを可能にする。この技術分野で知られている、細胞に核酸を導入するための他の方法としては、たとえば脂質仲介キャリヤー輸送、たとえばリン酸カルシウム等の化学物質仲介輸送を使用しもよい。ｓｉＲＮＡは、細胞によるＲＮＡの取り込み、デュプレックス鎖のアニーリングの促進、アニーリングされた鎖の安定化若しくは標的遺伝子の阻害の増加のような活性の一つ又はそれより多い活性を実行する構成成分により導入されてもよい。
【００７０】
あらゆる知られた遺伝子治療法が、前記のＲＮＡを投与するために使用することができる。ウイルス粒子に充填されたウイルス性構築物は、前記の細胞への発現構築物の効率的な導入、及び前記の発現構築物によりエンコードされたｓｉＲＮＡの転写の両方を成し遂げるであろう。それゆえ、ｓｉＲＮＡは、また、細胞内で産生することができる。たとえば、ｓｉＲＮＡ分子の一つ又は二つの鎖をコードする核酸を包含する発現ベクターのようなベクターは、その目的に使用されてもよい。前記の核酸は、さらに、前記のセンス標的配列に対して本質的に相補性であるアンチセンス配列を包含していてもよい。前記の核酸は、さらに、前記のセンスと前記のアンチセンスの標的配列の間にスペーサー配列を包含していてもよい。前記の核酸は、さらに、たとえば、ＲＮＡポリメラーゼ  ＩＩ又はＩＩＩプロモーター及び転写終結シグナルのような、細胞中での前記のセンス及びアンチセンス配列の発現を指向するためのプロモーターを包含してもよい。前記の配列は、使用できるようにリンクされていてもよい。
【００７１】
ある実施態様では、核酸は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターに使用できるようにリンクされたＲＮＡをコードする領域（たとえば、センス又はアンチセンス標的配列）を包含する。前記のＲＮＡをコードする領域に、ｐｏｌ  ＩＩＩによるＲＮＡ合成の終結を案内する、ｐｏｌ  ＩＩＩターミネーター配列により直に続くことができる前記のｐｏｌ  ＩＩＩターミネーター配列は、一般的に４個又はそれより多い、連続したチミジン（「Ｔ」）残基を有する。好ましい実施態様では、５個の連続するＴ残基の群が、ｐｏｌ  ＩＩＩ転写が前記のＤＮＡテンプレートの前記の二番目又は三番目のＴで止められ、そして、それゆえ２個又は３個のウリジン（「Ｕ」）残基のみが、前記のコード配列の３‘末端に付け加えられる、前記のターミネーターとして使用される。たとえば、ヒト又はマウス又はその他の種由来の、Ｈ１  ＲＮＡ遺伝子又はＵ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子から誘導される前記のプロモーターフラグメントを含む、様々なｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターを、本発明において使用することがでる。さらに、ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターを、偏在するか又は組織特異的であるかのどちらか一方の様式で、たとえば、小さな化学分子により誘導される能力のような、他の望ましい特性を組み入れるために修飾／加工することができる。たとえば、一つの実施態様では、前記のプロモーターは、テトラサイクリンにより活性化されてもよい。もう一つの実施態様では、前記のプロモーターは、ＩＰＴＧ（ｌａｃＩ  ｓｙｓｔｅｍ）で活性化されてもよい。
【００７２】
ｓｉＲＮＡは、たとえば、ベクター、発現カセットを含む各核酸、プロモーターを含む各発現カセット、ＲＮＡをコードする配列（一つは、センス標的配列であり、他はアンチセンス標的配列である）及び終結シグナルのような、二つの核酸により細胞の形質変換により、細胞で産生され得る。あるいは、一本の核酸は、これらの二つの発現カセットを包含してもよい。さらなるもう一つの実施態様では、核酸は、アンチセンス標的配列に結合されたスペーサーに結合されたセンス標的配列を包含する一本鎖のＲＮＡをエンコードする。前記の核酸は、たとえばベクターが導入された細胞において、前記のセンス及びアンチセンス標的配列の発現を可能にする真核発現ベクターのような、たとえば、発現ベクターのような、ベクターに存在してもよい。
【００７３】
ｓｉＲＮＡを産生するためのベクターは、以下の文献及び特許文献に開示されている。
Paul et al. (2002) Nature Biotechnology 29:505;
Xia et al. (2002) Nature Biotechnology 20:1006;
Zeng et al. (2002) Mol. Cell 9:1327;
Thijn et al. (2002) Science 296:550;
BMC Biotechnol. 2002 Aug 28;2(1):15;
Lee et al. (2002) Nature Biotechnology 19: 500;
McManus et al. (2002) RNA 8:842;
Miyagishi et al. (2002) Nature Biotechnology 19:497;
Sui et al. (2002) PNAS 99:5515;
Yu et al. (2002) PNAS 99:6047;
Shi et al. (2003) Trends Genet. 19(1):9;
Gaudilliere et al. (2002) J. Biol. Chem. 277(48):46442;
US2002/0182223;
US 2003/0027783;
WO 01/36646及び
WO 03/006477
ベクターは、また、市販されている。たとえば、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒは、ジーン・セラピー・システムズ・インク（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）から入手可能であり、ｐＳＵＰＥＲは、オリゴエンジン（Ｏｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ）から入手可能である。
【特許文献１０】米国公開特許第２００２／０１８２２２３号
【特許文献１１】米国公開特許第２００３／００２７７８３号
【特許文献１２】国際公開ＷＯ０１／３６６４６号パンフレット
【特許文献１３】国際公開ＷＯ０３／００６４７７号パンフレット
【００７４】
ここでは、また、一つ若しくはそれより多いｓｉＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡの領域をコードするＲＮＡをエンコードする核酸を包含する組成物が提供される。組成物は、薬学的組成物であってもよく、そして薬学的に受容されるキャリヤーを含んでもよい。組成物は、また、前記の組成物を細胞又は被験体に投与するためのデバイスとして提供されてもよい。たとえば、組成物は、シリンジ中又はステント上において存在していてもよい。組成物は、また、前記のｓｉＲＮＡ又は核酸の細胞への導入を促進する試薬を包含してもよい。
【００７５】
一般に、前記のオリゴヌクレオチドは、以下の文献に開示されたプロトコールを使用して合成されてもよい。なお、以下の文献の全ての内容はここに引用により援用されている。
Caruthers et al., Methods in Enzymology (1992) 211:3-19;
Thompson et al., International
PCT Publication No. WO 99/54459;
Wincott et al., Nucl. Acids Res. (1995) 23:2677-2684;
Wincott et al., Methods Mol. Bio.,
(1997) 74:59;
Brennan et al., Biotechnol. Bioeng. (1998) 61:33-45; 及び
Brennan, U.S. Pat. No. 6,001,311
一般に、オリゴヌクレオチドの合成は、たとえば、５‘−末端におけるジメトキシトリチル基、及び３’−末端におけるホスホラミダイト基のような、一般に使用されている核酸の保護基及びカップリング基を包含する。制限されない例において、小スケール合成は、アプライド・バイオシステムズ・インク（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．  （Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ））より発売されている、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９  ＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを使用して、ケムジーン・コーポレーション（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（Ａｓｈｌａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，  ２００  Ｈｏｍｅｒ  Ａｖｅｎｕｅ，  Ａｓｈｌａｎｄ，  ＭＡ  ０１７２１，  ＵＳＡ）より発売されているリボヌクレオシド  ホスホラミダイトを用いて実施される。あるいは、合成は、たとえば、プロトジーン（Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ）（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  Ｃａｌｉｆ．，  ＵＳＡ）により製造されている器械のような、９６−ウエル・プレート・シンセサイザー（９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）又は、たとえば以下の文献に開示されている方法により実施することができる。なお、以下の文献の全ての内容はここに引用により援用されている。
Usman et al., J. Am. Chem. Soc. (1987) 109:7845;
Scaringe et al., Nucl. Acids Res. (1990) 18:5433;
Wincott et al., Nucl. Acids Res. (1990) 23:2677-2684;  及び
Wincott et al., Methods Mol. Bio. (1997) 74:59
【特許文献１４】国際公開ＷＯ９９／５４４５９号パンフレット
【特許文献１５】米国特許第６，００１，３１１号
【００７６】
本発明の核酸分子は、別々に合成されてもよく、そしてｄｓＲＮＡは、合成後に、たとえば、連鎖反応
(Moore et al., Science (1992) 256:9923;
Draper et al., International PCT
publication No. WO 93/23569;
Shabarova et al., Nucl. Acids Res. (1991) 19:4247;
Bellon et al., Nucleosides & Nucleotides (1997)
16:951;  及び
Bellon et al., Bioconjugate Chem. (1997) 8:204）によるか、又は合成及び／又は保護基の脱離に続くハイブリッド形成により形成されてもよい。前記の核酸分子は、一般に行われている方法を使用するゲル電気泳動法か、又は高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、Wincott et al.による前掲の文献を参照されたし、なお、以下の文献の全ての内容はここに引用により援用されている。）に精製することができ、そして水に再懸濁する。
【特許文献１６】世界公開ＷＯ９３／２３５６９号パンフレット
【００７７】
もう一つの実施態様では、細胞中の特有のｍＲＮＡ又はポリペプチドのレベルは、リボザイムの細胞内への導入又はリボザイムをエンコードする核酸の導入により減らされる。触媒的にｍＲＮＡ転写物を切断するようにデザインされたリボザイム分子は、また、遺伝子Ｙの発現を阻害するために、導入されうるか、又は発現されうる（たとえば、Sarver et al.,
1990, Science 247:1222-1225及び米国特許第５，０９３，２４６号）。一般的に使用されているリボザイム・モチーフは、前記の基質配列の条件が最少量であるハンマーヘッドである。前記のハンマーヘッド  リボザイムのデザインは、Usman et al., Current
Opin. Struct. Biol. (1996) 6:527-533に開示されている。ウスマン（Ｕｓｍａｎ）は、また、リボザイムの治療学的な用途についても論じている。リボザイムは、また、以下の文献又は特許文献に記載されているように、調製されることができ、そして使用され得る。
Long et al., FASEB J. (1993) 7:25;
Symons, Ann. Rev. Biochem. (1992) 61:641;
Perrotta et al., Biochem. (1992) 31:16-17;
Ojwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1992) 89:10802-10806;及び
米国特許第５，２５４，６７８号
ＨＩＶ−Ｉ  ＲＮＡのリボザイム開裂が、米国特許第５，１４４，０１９号に開示され、リボザイムを使用するＲＮＡの開裂方法が、米国特許第５，１１６，７４２号に開示され、そしてリボザイムの特異性を向上する方法が、米国特許第５，２２５，３３７号及びKoizumi et al., Nucleic
Acid Res. (1989) 17:7059-7071に開示されている。ハンマーヘッド構造におけるリボザイムフラグメントの調製及び用途は、また、Koizumi et al.,
Nucleic Acids Res. (1989) 17:7059-7071に開示されている。ヘヤピン構造におけるリボザイムフラグメントの調製及び用途は、Chowrira and Burke, Nucleic
Acids Res. (1992) 20:2835に開示されている。リボザイムは、また、Daubendiek and Kool, Nat.
Biotechnol. (1997) 15(3):273-277に開示されているローリング  トランスクリプションにより作製することができる。
【特許文献１７】米国特許第５，０９３，２４６号
【特許文献１８】米国特許第５，２５４，６７８号
【特許文献１９】米国特許第５，１４４，０１９号
【特許文献２０】米国特許第５，１１６，７４２号
【特許文献２１】米国特許第５，２２５，３３７号
【００７８】
遺伝子発現は、体内の標的細胞における前記の遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成するために、前記の標的遺伝子（すなわち、前記の遺伝子プロモーター及び／又はエンハンサー）の制御領域に対して相補的であるデオキシリボヌクレオチド配列をターゲッティングすることにより減らすことができる。(一般的にHelene (1991) Anticancer Drug Des., 6(6):569-84; Helene et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci., 660:27-36及びMaher (1992) Bioassays 14(12):807-15を参照されたし。).
【００７９】
さらなる実施態様では、ＲＮＡアプタマー（ＲＮＡ  ａｐｔａｍｅｒ）は、細胞中に導入され得るか、又は細胞中で発現され得る。ＲＮＡアプタマー（ＲＮＡ  ａｐｔａｍｅｒ）は、特異的にそれらの翻訳を阻害することができる、たとえば、Ｔａｔ及びＲｅｖ  ＲＮＡ（Good et al.
(1997) Gene Therapy 4: 45-54）のようなタンパク質に対する、特異的なＲＮＡリガンドである。
【００８０】
４．ＳｉｒＡ、  ＳｉｒＢ、  ＳｉｒＣ及びＦｈｕＣポリペプチド
ここに開示されているＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ及びＦｈｕＣポリペプチドは、天然から精製された調製物、化学合成された調製物、及びたとえば、細菌、酵母、高等直物細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞を含む、原核生物又は真核生物の宿主細胞から組換え法により産生された調製物を包含する。ある実施態様では、ここで開示された、前記のポリペプチドは、Ｓｉｒポリペプチド及びＦｈｕＣの機能を阻害する。
【００８１】
ポリペプチドは、また、図６乃至図１１に示されたヌクレオチド配列によりエンコードされたアミノ酸配列を包含してもよいか、から成っていてもよいか、又は、のみから成っていてもよい。ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ及びＦｈｕＣについての典型的なポリペプチド配列は、図７乃至図９及び図１１にそれぞれ示されている。さらに、他のポリペプチドは、ここに記載したＳｉｒ又はＦｈｕＣポリペプチドと、少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９８％及び９９％の同一性又は同族性を有するアミノ酸配列を包含するか、から成るか、又は、のみから成る。たとえば、天然に存在するタンパク質の配列から、約１、２、３、４、５又はそれより多いアミノ酸において異なる、ポリペプチドは、また、意図されている。前記の相違は、たとえば同類置換、欠失及び付加のような置換であってもよい。前記の相違は、異なる種における意味ありげに保存されていない領域におけるのが好ましい。前記の領域は、様々な種からのアミノ酸配列を一列に並べることにより同定することができる。これらのアミノ酸は、たとえば、もう一つの種にあるアミノ酸により置換することができる。これらの位置又は他の位置で置換、挿入又は欠失されていてもよい、他のアミノ酸は、生物学的アッセイと結びつけた突然変異誘発研究により同定することができる。
【００８２】
ここに網羅されている他のタンパク質は、修飾されたアミノ酸を包含するものである。典型的なタンパク質は、それが誘導されたタンパク質の少なくとも一つの生物学的機能を保持する、グリコシル化、ペジィレーション（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化又はあらゆる同じようなプロセスにより修飾されたタンパク質であってもよい、誘導体化されたタンパク質である。
【００８３】
タンパク質は、また、一つ又はそれより多い天然には存在しないアミノ酸を包含してもよい。たとえば、非古典的アミノ酸又は化学的アミノ酸アナログは、置換、付加または欠失としてタンパク質に導入することができる。非古典的アミノ酸は、通常のアミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノブタン酸、α−アミノイソブタン酸、４−アミノブタン酸、Ａｂｕ、２−アミノブタン酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソブタン酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、ザルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フッ化アミノ酸、たとえば、β−メチルアミノ酸、Ｃａｌｐｈａ−メチルアミノ酸、Ｎａｌｐｈａ−メチルアミノ酸及び一般的なアミノ酸アナログのようなｄｅｓｉｇｎｅｒアミノ酸を包含するが、これらに限定されるものではない。さらに、前記のアミノ酸は、Ｄ（右旋性）又はＬ（左旋性）である。
【００８４】
ある実施態様では、ここに記載されたＳｉｒ又はＦｈｕＣポリペプチドは、その溶解性を向上する、及び／又はその精製、同定、検出及び／又は構造的な特色付けを促進するドメインを含む融合タンパク質であってもよい。典型的なドメインは、たとえば、グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、カルモジュリン結合ペプチド、チオレドキシン、マルトース結合タンパク質、ＨＡ、ｍｙｃ、ポリアルギニン、ポリヒスチジン（ｐｏｌｙＨｉｓ）、ポリＨｉｓ−Ａｓｐ又はＦＬＡＧ融合タンパク質及びｔａｇを含む。さらなる典型的なドメインは、たとえば、シグナルペプチド、ＩＩＩ型分泌システム−標的ペプチド（ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）、トランスサイトーシス、核局在化シグナル等の、ｉｎ  ｖｉｖｏでタンパク質の局在性を変えるドメインを包含する。様々な実施態様で、本発明のポリペプチドは、一つ又はそれより多い異種の融合を包含してもよい。ポリペプチドは、同じ融合ドメインの複数のコピーを含んでいてもよく、又は二つ又はそれより多い異なるドメインに対する融合を含んでいてもよい。前記の融合は、前記のポリペプチドのＮ−末端、前記のポリペプチドのＣ−末端、又は前記のポリペプチドのＮ−及びＣ−末端の両方で生じてもよい。融合タンパク質の構築を促進するため、又はタンパク質の発現又は融合タンパク質の構造的制約を最適化するために、本発明のポリペプチドと前記の融合タンパク質との間のリンカー配列を含むこともまた本発明の範囲内である。もう一つの実施態様では、前記のポリペプチドは、タンパク質の発現の後、又はその後で、前記の標識を除くために前記の融合タンパク質と本発明のポリペプチドとの間のプロテアーゼによる開裂サイトを含むように構築されてもよい。適切なエンドプロテアーゼの例は、たとえばＦａｃｔｏｒ  Ｘａ及びＴＥＶプロテアーゼを包含する。
【００８５】
前記のＳ．  ａｕｒｅｕｓポリペプチドは、硫酸アンモニウム又はエタノールによる沈殿、酸による抽出、アニオン又はカチオン交換樹脂クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィーを含む、よく知られた方法により組換え細胞培養物から回収及び精製することができ、及び高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製に使用される。タンパク質は、たとえば、調製されたタンパク質の、少なくとも約９０％が望みのタンパク質であるような、実質的に純粋な調製物として使用されてもよい。前記の望ましいタンパク質の、少なくとも約５０％、６０％、７０％又は８０％を含む組成物は、また、使用されてもよい。
【００８６】
ある実施態様では、本発明のポリペプチドを、化学的な合成、無細胞系においてリボソームにより、又は細胞内でのリボソームにより合成してもよい。本発明のポリペプチドの化学合成は、段階毎の固相合成法、ペプチドフラグメントのコンホメーションによる支援を受けた再連結反応による半合成法、クローン化された又は合成されたペプチドセグメントの酵素的連結反応法、及び化学的連結反応法を含む、様々なこの技術分野で認められた方法を使用して、実施されてもよい。本来の化学的連結反応は、一過性のチオエステルにより結合された中間体を産生するため、二つの保護されていないペプチドセグメントの化学的な選択的反応を利用する。前記の一過性のチオエステルにより結合された中間体は、その後、自然に転移反応を経て、前記の連結サイトにおける本来のペプチド結合を有する完全な長さの連結反応生成物を生ずる。完全な長さの連結反応生成物は、無細胞系における合成により産生されたタンパク質と化学的に同一である。完全な長さの連結反応生成物は、本来のジスルフィド結合を含むタンパク質分子を形成するために、認められているように、再び組み合わせられるか、及び／又は酸化されてもよい(たとえば、米国特許第6,184,344号、
米国特許第6,174,530号;
Muir et al., Curr. Opin. Biotech.
(1993): vol. 4, p 420;
Miller et al., Science (1989): vol. 246, p 1149;
Wlodawer et al., Science (1989): vol.
245, p 616;
Huang et al., Biochemistry
(1991): vol. 30, p 7402;
Schnolzer, et al., Int. J. Pept. Prot.
Res. (1992): vol. 40, p 180-193;
Rajarathnam et al., Science (1994):
vol. 264, p 90;
R. E. Offord, “Chemical Approaches to
Protein Engineering”, in Protein Design and the Development of New therapeutics
and Vaccines, J. B. Hook, G. Poste, Eds., (Plenum Press, New York, 1990) pp.
253-282;
Wallace et al., J. Biol. Chem.
(1992): vol. 267, p 3852;
Abrahmsen et al., Biochemistry (1991): vol. 30, p 4151;
Chang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA (1994) 91: 12544-12548;
Schnlzer et al., Science (1992):
vol., 3256, p 221;  及び
Akaji et al., Chem. Pharm. Bull.
(Tokyo) (1985) 33: 184を参照されたし。)。
【特許文献２２】米国特許第６，１８４，３４４号
【特許文献２３】米国特許第６，１７４，５３０号
【００８７】
ある実施態様では、本発明のポリペプチドに関して、天然に産生するポリペプチド同族体又は実験的に誘導されたポリペプチド同族体を提供することは、有益であるかもしれない。前記の同族体は、前記のポリペプチドの天然に産生するフォームの生物学的活性の一組を促進又は阻害するために、モジュレーターとして限られた能力の中で機能するかもしれない。それゆえ、特異的な生物学的な効果は、本発明のポリペプチドの生物学的活性のすべてに指向されている作動薬又は拮抗薬による治療に比べて、限られた機能の同族体による、かつより少ない副作用による治療により引き出されるかもしれない。たとえば、一定のタンパク質と関連する本発明の野性型のポリペプチドの能力を阻害するが、前記の天然のポリペプチドと他の細胞のタンパク質との間の複合体形成を実質的に阻害しない、拮抗作用を有する同族体が生ずるかもしれない。
【００８８】
ポリペプチドは、本発明の完全な長さのポリペプチドから誘導されるかもしれない。これらのポリペプチドの単離されたペプチド部分は、前記ポリペプチドをエンコードする核酸の対応するフラグメントから、組換えにより産生されるポリペプチドをスクリーニングすることにより得られるかもしれない。さらに、フラグメントは、たとえば、一般に行われているメリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃ又はｔ−Ｂｏｃ化学のような当該技術分野で知られている技法を使用して、化学的に合成されてもよい。たとえば、タンパク質は、前記のフラグメントが重複する部分がない、望ましい長さのフラグメントに随意に分割されてもよいし、又は望ましい長さの重複するフラグメントに分割さてもよい。前記のフラグメントは、たとえば、本発明のポリペプチドの調節剤として機能する能力のような、望ましい特性を有するこれらのペプチドフラグメントを同定するために産生され（組換え法又は化学合成法により）、そして試験されてもよい。説明に役立つ実施態様では、本発明のタンパク質のペプチド部分を、たとえば、本発明のタンパク質の別個のフラグメントを含む、チオレドキシン融合タンパク質のとしての発現により、阻害作用に加えて、結合能力について試験してもよい（たとえば、米国特許第５，２７０，１８１号、米国特許第５，２９２，６４６号及び国際公開ＷＯ９４／０２５０２号パンフレットを参照されたし。）。
【特許文献２４】米国特許第５，２７０，１８１号
【特許文献２５】米国特許第５，２９２，６４６号
【特許文献２６】国際公開ＷＯ９４／０２５０２号パンフレット
【００８９】
もう一つの実施態様では、切頭のポリペプチドが、調製されてもよい。切頭のポリペプチドは、前記のＮ−末端若しくは前記のＣ−末端のいずれか、又は前記のＮ−末端及び前記のＣ−末端の両方から除かれた、１個から２０個又はそれより多いアミノ酸残基を有している。前記の切頭ポリペプチドは、前記の完全な長さのポリペプチドよりも、発現、精製又は特徴づけにおいて御しやすいことが証明されるかもしれない。たとえば、切頭のポリペプチドは、結晶化、高品質の回折の結晶を生ずること、又は高強度のピーク及び最小限の重なりのピークを備えたＨＳＱＣスペクトルを生ずることにおいて御しやすいことが証明されるかもしれない。さらに、切頭されたポリペプチドを使用して、また、特徴付けをより受けやすいかもしれない前記の完全な長さのポリペプチドの安定かつ活性なドメインを同定してもよい。
【００９０】
治療学的な有効性、予防的な有効性又は安定性（たとえば、ｅｘ  ｖｉｖｏでの貯蔵寿命、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける加水分解による分解への耐性等）を促進するような、前記の目的のために、本発明のポリペプチドの構造を修飾することも、また、可能である。前記のペプチドの天然に存在するフォームの少なくとも一つの活性を保持するようにデザインされた場合、前記の修飾されたポリペプチドは、ここにより詳細に記載されたポリペプチドの「機能的均等物」と考えられる。前記の修飾されたポリペプチドは、たとえば、同類のアミノ酸置換による全体又は一部からなるアミノ酸の置換、欠失又は付加により製造されるかもしれない。
【００９１】
たとえば、ロイシンをイソロイシン又はバリンで置換、グルタミン酸をアスパラギン酸で置換、スレオニンをセリンで置換というような孤立した同類のアミノ酸による置換は、前記の生じた分子の生物学的活性への大きな影響を有していないであろうということを予期することは、道理にかなっている。ポリペプチドのアミノ酸配列における変換が機能的な同族体を与えるかどうかは、野性型タンパク質の応答に類似する応答を提供する、前記の様々なポリペプチドの能力を評価することにより、容易に決定されるかもしれない。一回の置換よりも多い置換が行われたポリペプチドは、容易に同じようにして試験されるかもしれない。
【００９２】
切頭突然変異体に加えて、本発明のポリペプチドの組み合わせ突然変異体の一群を発生させる方法が提供され、そして当該方法は、特に可能性のある変異型の配列（たとえば、同族体）を同定するために、特に有用である。前記の組み合わせライブラリーをスクリーニングする目的は、たとえば、本発明のポリペプチドの活性を調節するかもしれない同族体、又は、あるいは全体で新規な活性を保有する同族体を発生させることである。組み合わせにより誘導された同族体は、天然に存在するタンパク質に比べて、選択的な有効性を有する同族体を生じるかもしれない。前記の同族体は、治療剤の開発に使用されるかもしれない。
【００９３】
同様に、突然変異誘発は、前記の対応する野性型タンパク質よりも劇的に異なる細胞内半減期を有する同族体を生ずるかもしれない。たとえば、前記の改造されたタンパク質は、タンパク質の加水分解、又は前記のタンパク質の破壊若しくは他の不活性化を生ずる他の細胞内のプロセスに対して、より安定であるか、又はより不安定であるかの何れかを示すかもしれない。前記の同族体、及びそれらをエンコードする遺伝子を、前記のタンパク質の半減期を調節することにより、タンパク質の発現を変えるために利用してもよい。上記のように、前記のタンパク質を、治療剤又は治療方法の開発に使用してもよい。
【００９４】
同様な方式において、タンパク質同族体を、前記の対応する野生型タンパク質の活性を妨げることができる拮抗剤として作用するために、前記の組合せアプローチにより発生させるかもしれない。
【００９５】
この方法の代表的な実施態様では、タンパク質同族体の集団のためのアミノ酸配列は、好ましくは可能な最も高い同族性を増進するために調節される。たとえば、そのような変異体の集団は、一つ又はそれより多い種からの同族体、又は突然変異に起因して異なる、同じ種からの同族体を含むかもしれない。前記の一列に並べられた配列の各位置に現れるアミノ酸は、組合せ配列の同義性セットを作り出すために選択される。ある実施態様では、前記の組合せライブラリーは、各々が少なくとも可能性のあるタンパク質配列を含むポリペプチドのライブラリーをエンコードする遺伝子の同義性ライブラリーのために作り出される。たとえば、合成されたオリゴヌクレオチドの混合物は、可能性のあるヌクレオチド配列の同義性セットが、個々のポリペプチドとして、又は、あるいはより大きな融合タンパク質（たとえば、ファージディスプレイ用）セットとして発現できるような、酵素的に結合させて遺伝子配列に変換されてもよい。
【００９６】
可能性のある同族体のライブラリーを、同義性のオリゴヌクレオチド配列から発生させることができる方法には、多くの方法がある。同義性の遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成装置で実施され、そしてその合成された遺伝子は、それから発現のために適当なベクターに組みこまれてもよい。遺伝子の同義性セットの一つの目的は、可能性のあるタンパク質配列の望ましいセットをエンコードする配列の全てを、一つの混合物で提供することである。前記の同義性オリゴヌクレオチドの合成は、当該技術分野ではよく知られている(たとえば、
Narang (1983) Tetrahedron 39:3;
Itakura et al. (1981) Recombinant
DNA, Proc. 3rd Cleveland
Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam:
Elsevier pp. 273-289;
Itakura et al. (1984) Annu. Rev.
Biochem. 53:323;
Itakura et al. (1984) Science
198:1056;
Ike et al., (1983) Nucleic Acid
Res. 11:477を参照されたし。)。
前記の技法は、他のタンパク質の指定された発生に使用された。(たとえば、
米国特許第５，２２３，４０９号、
米国特許第５，１９８，３４６号及び
米国特許第５，０９６，８１５号に加えて、
Scott et al. (1990) Science
249:386-390;
Roberts et al. (1992) PNAS USA
89:2429-2433;
Devlin et al. (1990) Science
249: 404-406;
Cwirla et al. (1990) PNAS USA
87: 6378-6382を参照されたし。)。
【特許文献２７】米国特許第５，２２３，４０９号
【特許文献２８】米国特許第５，１９８，３４６号
【特許文献２９】米国特許第５，０９６，８１５号
【００９７】
あるいは、突然変異誘発の他のフォームは、組合せライブラリーを発生させるために利用されてもよい。
たとえば、タンパク質同族体（作動剤フォーム及び拮抗剤フォームの両方）は、発生させ、そして、たとえばアラニン置換変異体等(Ruf et al.
(1994) Biochemistry 33:1565-1572;
Wang et al. (1994) J. Biol. Chem.
269:3095-3099;
Balint et al. (1993) Gene
137:109-118;
Grodberg et al. (1993) Eur. J. Biochem.
218:597-601;
Nagashima et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892;
Lowman et al. (1991) Biochemistry
30:10832-10838;及び
Cunningham et al., (1989) Science
244:1081-1085)を使用してのスクリーニングにより、
リンカー  スキャニング突然変異誘発（ｌｉｎｋｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Gustin et al.
(1993) Virology 193:653-660;
Brown et
al. (1992) Mol. Cell Biol.
12:2644-2652;
McKnight et al. (1982) Science
232:316);により、
サチュレーション突然変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Meyers et al.
(1986) Science 232:613）により、
ＰＣＲ突然変異誘発（ＰＣＲ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Leung et al.
(1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19）により、
又はランダム突然変異誘発（ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）
（Miller et al.
(1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor,
NY;及び
Greener et al. (1994) Strategies in
Mol Biol 7:32-34）により、ライブラリーから発生され、そして単離されてもよい。リンカー  スキャニング突然変異誘発は、特に組合せセッティングにおいて、生理活性を有するタンパク質の切頭フォームを同定するために魅惑的な方法である。
【００９８】
広範囲の技法が、点突然変異及び切頭により作製された組合せライブラリーの遺伝子生成物をスクリーニングするため、及び一定の特性を持った遺伝子生成物のためのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための技術分野において、知られている。前記の技法は、一般的に、タンパク質同族体の組合せの突然変異誘発により産生される遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために、最も広く使用された技法は、典型的には、前記の遺伝子ライブラリーをクローニングして複製する発現ベクターを形成するステップ、前記の生成したベクターのライブラリーにより適切な細胞を形質転換するステップ、及び、望みの活性の検出が、生成物が検知される遺伝子をエンコードするベクターの比較的容易な単離を促進する条件下で、前記の組合せ遺伝子を発現するステップを、包含する。
【００９９】
スクリーニング検定の説明的な実施態様では、候補となる組合せ遺伝子の生成物は、細胞の表面に表示され、そして前記の組合せ遺伝子の生成物に結合する特定の細胞又はウイルス粒子の能力が、「パンニング検定（ｐａｎｎｉｎｇ  ａｓｓａｙ）」で検出される。
【０１００】
スクリーニング検定の説明的な実施態様では、候補となる組合せ遺伝子の生成物は、細胞の表面に表示され、そして前記の組合せ遺伝子の生成物に結合する特定の細胞又はウイルス粒子の能力が、「パンニング検定（ｐａｎｎｉｎｇ  ａｓｓａｙ）」で検出される。たとえば、前記の遺伝子ライブラリーは、細菌細胞の表面の膜タンパク質のために（Ladner et al.,
WO 88/06630;
Fuchs et al., (1991) Bio/Technology
9:1370-1371及び
Goward et al., (1992) TIBS
18:136-140）、そして潜在的に機能的な同族体のためにスコアするために、たとえば、ＦＩＴＣ−基質のような前記の細胞表面に結合する、たとえば、蛍光的にラベルされた分子を使用する、パンニング法で検出される、生じた融合タンパク質のために、前記の遺伝子にクローン化されてもよい。
細胞は、視覚的に点検し、そして蛍光顕微鏡下で分離されてもよく、又は、前記の細胞の形態学的に識別可能な場合、蛍光標示式細胞分取器により分離されてもよい。この方法は、本発明のポリペプチドと相互に作用することができる、基質又は他のポリペプチドを同定するために使用されてもよい。
【特許文献３０】国際公開ＷＯ８８／０６６３０号パンフレット
【０１０１】
同じような様式で、前記の遺伝子ライブラリーは、ウイルス粒子の表面に融合タンパク質として発現されてもよい。たとえば、繊維状ファージシステムにおいて、外来のペプチド配列は、伝染性のファージの表面に発現されるかもしれない。それによって、二つの利点を授けられるかもしれない。第一に、なぜならば、これらのファージは、非常に高濃度で親和性マトリックスに適用さてもよいので、非常に多量のファージを、一度にスクリーニングできる可能性がある。第二に、なぜならば、各伝染性ファージは、その表面に前記の組合せ遺伝子の産生物を表すので、もし、特定のファージが、親和性マトリックスから低収率で回収されたとしても、前記のファージは、感染のもう一つのラウンドにより増幅されるかもしれない。ファージｇＩＩＩ又はｇＶＩＩＩコートタンパク質のどちらか一方は、前記のウイルス粒子の基本的なパッケージングを妨げることなく、融合タンパク質を産生するために利用されてもよいので、ほとんど同一のＥ．ｃｏｌｉ繊維状ファージＭ１３、ｆｄ及びｆ１からなるグループは、非常にしばしばファージディスプレーライブラリーにおいて使用されている
(Ladner et al., PCT publication
WO 90/02909;
Garrard et al., PCT publication
WO 92/09690;
Marks et al., (1992) J. Biol. Chem. 267:16007-16010;
Griffiths et al., (1993) EMBO J. 12:725-734;
Clackson et al., (1991) Nature 352:624-628; 及び
Barbas et al., (1992) PNAS USA 89:4457-4461)。
他のファージ  コートタンパク質は、適当に使用されてもよい。
【特許文献３１】国際公開ＷＯ９０／０２９０９号パンフレット
【特許文献３２】国際公開ＷＯ９２／０９６９０号パンフレット
【０１０２】
前記のここに開示されたポリペプチドは、たとえば、もう一つの細胞のパートナーに対して真正のタンパク質の結合をまねることができる、ペプチド試薬又は非ペプチド試薬にような擬ペプチドを産生するために、減らされるかもしれない。上記に開示されたような前記の突然変異誘発方法は、また、チオレドキシンシステムだけでなく、他のタンパク質との、タンパク質−タンパク質の相互作用に関与するタンパク質の決定因子の地図を作るために特に有用である。例示するために、基質のタンパク質の分子認識に関与するタンパク質の機能残基は、前記の基質のタンパク質に結合するかもしれない擬ペプチドを生ずるために、決定され、そして使用されてもよい。それゆえ、前記の擬ペプチドは、前記の基質に結合することにより、そして前記の野性型タンパク質との相互作用のために必要とされる前記の機能残基をすっかり覆い、それによって、前記のタンパク質及び前記の基質の相互作用を妨げることにより、前記の野性型のタンパク質の阻害剤として使用されるかもしれない。基質ポリペプチドへの結合を関与するタンパク質のアミノ酸残基の地図を作製するために、たとえば、置換変異体（ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を利用すると、前記の基質に結合する場合においてこれらの残基を真似ている、擬ペプチドが生成されるかもしれない。
【０１０３】
たとえば、ここに記載されている前記のＳｉｒタンパク質及び前記のＦｈｕＣタンパク質の誘導体は、化学的に修飾されたペプチド及び擬ペプチドであってもよい。擬ペプチドは、ペプチド又はタンパク質に基づく化合物又はペプチド又はタンパク質から誘導される化合物である。擬ペプチドは、非天然アミノ酸、コンホメーションの制限、及び等電的置換等を使用する、知られているペプチド配列の構造的な修飾により得ることができる。前記の擬ペプチドは、ペプチドと非ペプチド合成構造との間の構造的なスペースの連続性を形成する。それゆえ、擬ペプチドは、ファルマコフォアの輪郭を描くことにおいて、及びペプチドを、母体となったペプチドの活性を保持した非ペプチド化合物へ翻訳することに役立つことにおいて、有用であるかもしれない。
【０１０４】
さらに、前記のペプチドのミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）を、提供することができる。前記の擬ぺプチドは、加水分解されないこと（プロテアーゼ、又は対応するペプチドを分解する他の生理学的条件に対する安定性の増加）、細胞の分化を刺激するための特異性及び／又は効力を増強することのような、前記の特性を有することができる。説明の目的のために、前記の残基の加水分解されないペプチドアナログは、
ベンゾジアゼピン(たとえば、Freidinger et
al., in Peptides: Chemistry and
Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher:
Leiden, Netherlands, 1988を参照。);
アゼピン (たとえば、Huffman et al.,
in Peptides: Chemistry and Biology,
G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands,
1988を参照。);
置換されたガンマ  ラクタム環(Garvey et al.,
in Peptides: Chemistry and Biology,
G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands,
1988);
ケト−メチレン  シュードペプチド(Ewenson et al.,
(1986) J. Med. Chem. 29:295; and
Ewenson et al., in Peptides: Structure and Function
(Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL,
1985);
β−ターン  ジペプチドコア(Nagai et al.,
(1985) Tetrahedron Lett 26:647; and
Sato et al., (1986) J Chem Soc Perkin Trans 1:1231);及び
β−アミノアルコール(Gordon et al.,
(1985) Biochem Biophys Res Commun
126:419; and Dann et al., (1986) Biochem Biophys Res Commun 134:71)を使用して形成されてもよい。
【０１０５】
擬ペプチドの形成を実施することができる、種々の側鎖の変換法に加えて、前記の記載は、特異的にペプチドの第二構造のコンホメーション的の制限された擬態物の使用を意図している。非常に多くの代替物が、ペプチドのアミド結合に関して開発された。
【０１０６】
頻繁に開発された、アミド結合の代替物は、（ｉ）トランスオレフィン、（ｉｉ）フロロアルケーン、（ｉｉｉ）メチレンアミノ、（ｉｖ）ホスホンアミド及び（Ｖ）スルホンアミドを包含する。
【化１】
2008510793.tif 000002
代替物の例
【化２】
2008510793.tif 000003
【０１０７】
さらに、ペプチドの骨格のより実質的な修飾に基づく擬ペプチドを使用することができる。このカテゴリに属する擬ペプチドは、（ｉ）レトロ−インバーソアナログ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ  ａｎａｌｏｇ）及びＮ−アルキルグリシンアナログ（いわゆる、ペプトイド（ｐｅｐｔｏｉｄ））を包含する。
【化３】
2008510793.tif 000004
アナログの例
【化４】
2008510793.tif 000005
【０１０８】
さらに、コンビナトリアルケミストリーの方法が、新しい擬ペプチドの開発において実を結んだ。たとえば、いわゆる「ペプチドモルフィング（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｏｒｐｈｉｎｇ）」ストラテジーの一つの実施態様は、広範囲のペプチド結合の置換体を包含するペプチドアナログのライブラリーのランダム生成にフォーカスしている。
【化５】
2008510793.tif 000006
【０１０９】
代表的な実施態様では、前記の擬ペプチドは、前記のジペプチドのレトロ−インバーソアナログ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ  ａｎａｌｏｇ）として誘導することができる。前記のレトロ−インバーソアナログ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ  ａｎａｌｏｇ）は、たとえばSisto et al. U.S. Patent 4,522,752の開示のような、当該技術分野で知られている方法に従い、調製することができる。レトロ−インバーソアナログ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ  ａｎａｌｏｇ）は、たとえばWO 00/01720に開示された方法により発生させることができる。たとえば、いくらかの普通のペプチド結合を含むような混合ペプチドが発生されるかもしれないということが理解されるであろう。一般的なガイドとして、タンパク質分解に対して最も感受性が高い部位が、典型的には擬態のスイッチのために随意で、より感受性の低いアミド結合に変更される。前記の最終産物又はその中間体は、ＨＰＬＣで精製されうる。
【特許文献３３】米国特許第４，５２２，７５２号
【特許文献３４】国際公開ＷＯ００／０１７２０号パンフレット
【０１１０】
ペプチドが、少なくとも一つのアミノ酸又は全てのアミノ酸がＤ−立体異性体であるペプチドを包含してもよい。他のペプチドが、少なくとも一つのアミノ酸が逆転させられているアミノ酸を包含してもよい。逆転されている前記のアミノ酸がＤ−立体異性体であってもよい。
【０１１１】
ペプチドのすべてのアミノ酸が、逆転されていてもよく、及び／又はすべてのアミノ酸がＤ−立体異性体であってもよい。
【０１１２】
もう一つの説明的な実施態様では、擬ペプチドは、ペプチドのレトロ−エナンチオアナログ（ｒｅｔｒｏ−ｅｎａｎｔｉｏ  ａｎａｌｏｇ）として誘導されることができる。たとえば、これのようなレトロ−エナンチオアナログ（ｒｅｔｒｏ−ｅｎａｎｔｉｏ  ａｎａｌｏｇ）は、市販されているＤ−アミノ酸（又は、そのアナログ）、及び、たとえばWO 00/01720に開示されているような標準的な固相ペプチド合成法又は液相ペプチド合成法により合成されることができる。前記の最終生産物は、純粋なレトロ−エナンチオアナログ（ｒｅｔｒｏ−ｅｎａｎｔｉｏ  ａｎａｌｏｇ）を産生するためにＨＰＬＣで精製されてもよい。
【０１１３】
さらなるもう一つの説明的な実施態様では、トランス−オレフィン誘導体は、前記のペプチドために、調製され得る。前記のトランス−オレフィンアナログは、Y.K. Shue et al.
(1987) Tetrahedron Letters 28:3225及びWO 00/01720に開示された方法に従い、合成され得る。さらに、アミド官能基の代わりに、いくつかのオレフィン官能基を備えたペプチド同族体を作製するために、前記の方法で合成されたシュードペプチドを、他のシュードペプチドとカップリングすることが可能である。
【０１１４】
擬ペプチド誘導体のさらなるもう一つのクラスは、前記のホスホネート誘導体を包含する。前記のホスホネート誘導体の合成は、知られた合成スキームから適合させ得る。たとえば、Loots et al.
in Peptides: Chemistry and Biology,
(Escom Science Publishers, Leiden, 1988, p. 118)及び
Petrillo et al. in Peptides: Structure
and Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium, Pierce
Chemical Co. Rockland, IL, 1985)を参照されたし。
【０１１５】
多くの他の擬ペプチド構造は、当該技術分野では知られており、そして前記の擬ペプチドでの使用のために、容易に適合させ得る。例示するために、擬ペプチドは、１−アザビシクロ[４．３．０]ノナン代替物( Kim et al.
(1997) J. Org. Chem. 62:2847を参照されたし。)、又は
Ｎ−アシルピペラジック  アシッド(Xi et al.
(1998) J. Am. Chem. Soc. 120:80を参照されたし)、又は
抑制されたアミノ酸アナログとしての２−置換ピペラジン部分(Williams et al.
(1996) J. Med. Chem. 39:1345-1348を参照されたし。)を包含してもよい。さらなる他の実施態様では、あるアミノ酸残基は、たとえば、単環性環若しくは双環性の芳香族性環若しくはヘテロ芳香族性環、又は、二つの芳香族性環、芳香族性環−ヘテロ芳香族性環若しくは二つのヘテロ芳香族性環のようなアリール部分及び二つのアリール部分により置換され得る。
【０１１６】
前記の擬ペプチドは、たとえばハイスループット  スクリーニング法と組み合わせたコンビナトリアル  シンセシス法により最適化され得る。
【０１１７】
さらに、ミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）の他の例は、タンパク質を基礎とする化合物、炭水化物を基礎とする化合物、脂質を基礎とする化合物、核酸を基礎とする化合物、天然有機化合物、合成的に誘導された有機化合物、抗イディオタイプ抗体及び／若しくは触媒性抗体、又はそのフラグメントを包含するが、これらに限定されるものではない。ミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）は、たとえば、細胞の生き残り及び／又は腫瘍成長を阻害することができる化合物のための、天然又は合成化合物のライブラリーをスクリーニングすることにより得られうる。
ミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）は、また、たとえば、天然又は合成化合物のライブラリー、特に化学的又はコンビナトリアルライブラリー（すなわち、配列又は大きさにおいて異なるが、同じ構築ブロックを有する化合物のライブラリー）から得られうる。ミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）は、また、たとえば、理論的なドラッグデザインにより得られうる。理論的なドラッグデザインの手順において、本発明の化合物の三次元構造は、たとえば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）又はＸ線結晶学により解析されうる。それから、前記の三次元構造は、たとえば、コンピュータモデリングにより、可能性のあるミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）の構造を予測するために使用されうる。それから、前記の予測されたミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）の構造は、たとえば、化学合成、若しくは組換えＤＮＡ技術により、又は天然物（たとえば、植物、動物、細菌又は真菌）からミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）を単離することにより調製されうる。
【０１１８】
「ペプチド、変形型及びそれらの誘導体」又は「ペプチド及びそのアナログ」は、「ペプチド治療剤」に含まれ、そして、たとえば、ここで記載されている擬ペプチドのような、あらゆる前記のペプチド又はその修飾されたフォームを含むことを意図されている。好ましいペプチド治療剤は、細胞の生き残りを減らし、又はアポトーシスを増やす。たとえば、それらは、たとえば、ここで記載されたアッセイで決定されるように、少なくとも約２倍、５倍、１０倍、３０倍又は１００倍というファクターにより、細胞の生き残りを減らし、又はアポトーシスを増やすかもしれない。
【０１１９】
Ｓｉｒ又はＦｈｕＣタンパク質、フラグメント又はその変異体の活性は、適当な基質又は結合パートナー、又は以下に記載したように推定された活性を試験するために適切な他の試薬を使用して、アッセイされてもよい。もう一つの実施態様では、ポリペプチドの活性は、ＲＮＡ及び／又はタンパク質分子の発現レベルをアッセイすることにより、決定されてもよい。転写のレベルは、たとえば、ノーザンプロット、すなわち、オリゴヌクレオチド配列へのハイブリッド形成を使用して、又は生じたタンパク質産生物のレベルをアッセイすることにより決定されてもよい。翻訳レベルは、たとえば、ウエスタンブロッティングを使用するか、又はタンパク質産生物により作り出される検出可能なシグナル（たとえば、蛍光、ルミネセンス、酵素活性等）を同定することにより、決定されてもよい。前記の特別な状況に依存して、単一又は複数の遺伝子の転写及び／又は翻訳のレベルを検出することが、望ましいかもしれない。
【０１２０】
あるいは、細胞中のＤＮＡの複製、転写及び／又は翻訳の全体的な率を測定することが、望ましいかもしれない。一般的に、これは、結果として生ずるＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質産生物に取り込まれる、検出できる代謝生成物の存在下で前記の細胞を発育させることにより成し遂げられるかもしれない。たとえば、ＤＮＡ合成の率は、新たに合成されたＤＮＡに取り込まれるＢｒｄＵの存在下で細胞を発育させることにより決定されるかもしれない。それから、前記のＢｒｄＵの量は、抗ＢｒｄＵ抗体を使用して、組織化学的に決定されるかもしれない。
【０１２１】
他の実施態様では、本発明のポリペプチドは、ミクロタイタープレート、スライド、ビーズ、フィルム等を含む固体表面に固定化されてもよい。本発明のポリペプチドは、アレイの一部として「チップ」に固定化されるかもしれない。複数のアドレスを有するアレイは、一つ又はそれより多いこれらのアドレスにおいて、一つ又はそれより多い本発明のポリペプチドを含んでいてもよい。一つの実施態様では、前記のチップは、ポリペプチド配列のアレイの一部として、一つ又はそれより多い本発明のポリペプチドを含んでいてもよい。
【０１２２】
他の実施態様では、本発明のポリペプチドは、プレート、ミクロタイタープレート、スライド、ビーズ、微片、球体、フィルム、繊維、沈殿物、ゲル、シート、管状物、コンテナ、キャピラリー、パッド、薄片等を含む、固体表面に固定化されてもよい。本発明のポリペプチドは、アレイの一部として「チップ」上に固定されてもよい。複数のアドレスを有するアレイは、一つ又はそれより多い、これらのアドレスにおいて、一つ又はそれより多い、本発明のポリペプチドを含んでいてもよい。一つの実施態様では、前記のチップは、アレイの一部として一つ又はそれより多い、本発明のポリペプチドを含んでいてもよい。
【０１２３】
５．抗体及びその用途
ここに開示された前記のＳｉｒ及びＦｈｕＣポリペプチドに対する抗体を産生するために、宿主動物に、Ｓｉｒ及びＦｈｕＣポリペプチド又はＳｉｒ及びＦｈｕＣペプチドを注射してもよい。宿主に、所望の標的配列を含む、異なる長さのペプチドを注射してもよい。たとえば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５又は１５０個のアミノ酸であるペプチド抗原を、使用してもよい。あるいは、もし、タンパク質の部分がエピトープを明示するが、短すぎるため、抗原性でないならば、抗体を産生するために、それは、キャリヤー分子と接合されてもよい。いくらかの適切なキャリヤー分子は、スカシ貝ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、Ｉｇ配列（Ｉｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、ＴｒｐＥ及びヒト又はウシ血清アルブミンを包含する。複合化は、当該技術分野で知られている方法により実施されてもよい。一つの前記の方法は、キャリヤー分子上でシステイン残基と、前記のフラグメントのシステイン残基とを結合することである。
【０１２４】
さらに、三次元エピトープ、すなわち、非線形エピトープに対する抗体は、また、たとえばタンパク質の結晶学的なデータに基づき、調製されてもよい。前記の注射から得られた抗体は、ここに記載したタンパク質の短い抗原に対してスクリーニングされてもよい。Ｓｉｒ又はＦｈｕＣペプチドに対して調製された抗体は、完全な長さのＳｉｒ又はＦｈｕＣタンパク質と同様に、前記のペプチドに対する活性について試験されてもよい。抗体は、ここに記載された、Ｓｉｒ又はＦｈｕＣペプチド及び／又は完全な長さのＳｉｒ又はＦｈｕＣタンパク質に対して、少なくとも約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ又は１０−１２Ｍ又はそれより高い親和性を有するかもしれない。
【０１２５】
前記のＤＮＡ配列ための適切な細胞、及び抗体の発現及び分泌ための宿主細胞を、American Type Culture Collection (“Catalogue of
Cell Lines and Hybridomas” 5th edition (1985) Rockville, Md.,
U.S.A.)を含む多くのソースから入手することができる。
【０１２６】
ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、当該技術分野で知られた方法で調製されてもよい。モノクローナル抗体は、Huse et al, Science (1989) 246:
1275-81に開示された組換えＤＮＡ技術に加えて、
Kohler and Milstein, Nature 1975;
256: 495-7;及び
Campbell in “Monoclonal Antibody
Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas”
in Burdon et al., Eds. Laboratory
Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier Science
Publishers, Amsterdam (1985)に開示された、免疫学的な方法を含む知られた手順を使用して調製されたハイブリドーマにより調製されてもよい。
【０１２７】
抗体の精製の方法は、当該技術分野でよく知られている。たとえば、Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.を参照されたし。精製方法は、塩沈殿（たとえば、硫酸アンモニウムによる）、イオン交換クロマトグラフィー（たとえば、中性で吸着され、そしてイオン強度を増加する段階的な勾配で溶離される、カチオン又はアニオン交換カラム）、ゲルろ過クロマトグラフィー（ゲルろ過ＨＰＬＣを含む）、並びに、たとえば、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、ヒドロキシアパタイト及び抗体のような親和性樹脂を使用するクロマトグラフィーを含んでいてもよい。抗体は、また、当該技術分野で知られている方法に従い、親和性カラムにより精製されてもよい。
【０１２８】
他の実施態様は、抗体の機能的な同等物を含み、そして、たとえば、キメラ化された、ヒト化された、及び一本鎖の抗体、さらにそのフラグメントを含む。機能的な同等物を調製する方法は、国際公開ＷＯ９３／２１３１９号パンフレット、ヨーロッパ特許出願第２３９，４００号、国際公開ＷＯ８９／０９６２２号パンフレット、ヨーロッパ特許出願第３８８，７４５号及びヨーロッパ特許出願第３３２，４２４号に開示されている。
【特許文献３５】国際公開ＷＯ９３／２１３１９号パンフレット
【特許文献３６】ヨーロッパ特許出願第２３９，４００号
【特許文献３７】国際公開ＷＯ８９／０９６２２号パンフレット
【特許文献３８】ヨーロッパ特許出願第３８８，７４５号
【特許文献３９】ヨーロッパ特許出願第３３２，４２４号
【０１２９】
機能的な同等物は、本発明の抗体の可変領域又は高頻度可変領域のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。「実質的に同じ」アミノ酸配列は、ここでは、Pearson and Lipman, Proc Natl Acd Sci USA
(1988) 85: 2444-8に従ってFASTA検索方法で決定されるように、もう一つのアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、及びより好ましくは９０％の相同性を備えた配列として定義される。
【０１３０】
キメラ化された抗体は、ヒト抗体定常部から実質的又はもっぱら誘導された定常部、及びヒト以外の哺乳動物からの可変領域の配列から実質的又はもっぱら誘導された可変領域を有していてもよい。ヒト化された抗体は、対応するヒト抗体領域から実質的又はもっぱら誘導された相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ（ＣＤＲ））、及びヒト以外の哺乳動物から実質的又はもっぱら誘導されたＣＤＲ以外の定常部及び可変領域を有していてもよい。
【０１３１】
ヒト以外の適切な哺乳動物は、モノクローナル抗体が作られうる、あらゆる哺乳動物を含んでよい。ヒト以外の哺乳動物の適切な例は、たとえば、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、山羊、又は霊長類（ｐｒｉｍａｔｅ）を包含する。
【０１３２】
ここで記載したＳｉｒタンパク質及びＦｈｕＣタンパク質に対する抗体は、前記のように調製してもよい。さらなる実施態様では、ここで記載したＳｉｒタンパク質及びＦｈｕＣタンパク質に対する抗体（全抗体又は抗体フラグメント）は、抗体の半減期を伸ばすために当業者に知られている方法に従い、たとえば、ポリエチレングリコール分子（ＰＥＧ）のような生体適合性の材料と複合化されてもよい。たとえば、米国特許第６，４６８，５３２号を参照されたし。機能を付与されたＰＥＧポリマーは、たとえば、Nektar Therapeuticsから入手できる。市販されているＰＥＧ誘導体は、アミノ−ＰＥＧ（ａｍｉｎｏ−ＰＥＧ）、ＰＥＧアミノ酸エステル（ＰＥＧ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｅｓｔｅｒ）、ＰＥＧ−ヒドラジド（ＰＥＧ−ｈｙｄｒａｚｉｄｅ）、ＰＥＧ−チオール（ＰＥＧ−ｔｈｉｏｌ）、ＰＥＧ−スクシネート（ＰＥＧ−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、カルボキシメチル化されたＰＥＧ（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＰＥＧ）、ＰＥＧ−プロンピオン酸（ＰＥＧ−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＥＧアミノ酸（ＰＥＧ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）、ＰＥＧスクシニイミジルスクシネート（ＰＥＧ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、ＰＥＧスクシイミドイルプロピオネート（ＰＥＧ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、カルボキシメチル化されたＰＥＧのスクシニイミジルエステル（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＰＥＧ）、ＰＥＧのスクシイミドイルカルボネート（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｏｆ  ＰＥＧ）、アミノ酸ＰＥＧのスクシイミジルエステル（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒｓ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ＰＥＧ）、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール（ＰＥＧ−ｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）、ＰＥＧ−ニトロフェニル  カルボネート（ＰＥＧ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、ＰＥＧ  トレシレート（ＰＥＧ  ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）、ＰＥＧ−グリシジル  エーテル（ＰＥＧ−ｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、ＰＥＧ−アルデヒド（ＰＥＧ−ａｌｄｅｈｙｄｅ）、ＰＥＧ  ビニルスルホン（ＰＥＧ  ｖｉｎｙｌｓｕｌｆｏｎｅ）、ＰＥＧ−マレイミド（ＰＥＧ−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、ＰＥＧ−オルソピリジル−ジスルフィド（ＰＥＧ−ｏｒｔｈｏｐｙｒｉｄｙｌ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）、ヘテロファンクショナルＰＥＧ（ｈｅｔｅｒｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＰＥＧ）、ＰＥＧビニル誘導体（ＰＥＧ  ｖｉｎｙｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）、ＰＥＧシラン（ＰＥＧ  ｓｉｌａｎｅ）、及びＰＥＧ  ホスホリド（ＰＥＧ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｄｅ）を包含するが、これらに限定されるものではない。これらのＰＥＧ誘導体とカップリングするための反応条件は、前記のポリペプチド、ＰＥＧ化の所望の程度、及び利用される前記のＰＥＧ誘導体に依存して変わるであろう。ＰＥＧ誘導体の選択に係るいくらかの要因は、所望される付加点（たとえば、リジン又はシステインＲ−基）、前記の誘導体の加水分解に対する安定性及び反応性、前記の結合の安定性、毒性及び抗原性、分析のための適合性等を包含する。
【特許文献４０】米国特許第６，４６８，５３２号
【０１３３】
６．薬学的組成物
Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ又はＦｈｕＣの抗体、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ及び他の拮抗剤は、当該技術分野でよく知られているように、それらの意図された用途に応じて様々な手段で投与されてもよい。たとえば、もし、前記のＳ．  ａｕｒｅｕｓ拮抗剤組成物は、経口で投与されるとすれば、それらは、錠剤、カプセル、顆粒、粉末又はシロップとして製剤化されてもよい。あるいは、本発明の製剤は、注射剤（静脈注射、筋肉注射、又は皮下注射）、滴下注入調製物又は座剤として、非経口的に投与されてもよい。眼科用粘膜ルートによる投与のためには、本発明の組成物は、点眼剤又は眼軟膏として製剤化されてもよい。これらの製剤は、一般に行われている方法で調製されてもよく、そして、所望ならば、前記の組成物は、たとえば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑剤、矯味薬、可溶化剤、懸濁補助剤、乳化剤又はコーティング剤のような、あらゆる一般に使用されている添加物と混合されてもよい。
【０１３４】
本発明の製剤では、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香料及び賦香剤、保存剤、並びに抗酸化剤だけでなく、たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムのような湿潤剤、乳化剤及び滑剤が、前記の製剤化された薬剤に含まれていてもよい。
【０１３５】
前記の組成物は、経口投与、経鼻投与、局所投与（口腔内投与又は舌下投与を含む）、直腸投与、経膣内投与、エアゾール投与及び／又は非経口投与に適しているかもしれない。前記の製剤は、便宜上、投与単位フォームで提供されてもよく、そして薬剤学の技術分野でよく知られたあらゆる方法により調製されてもよい。一回の用量を調製するためのキャリヤー材料と混合されてもよい組成物の量は、治療される被験体及び特定の投与の様式に依存して異なる。
【０１３６】
これらの製剤を調製する方法は、前記のキャリヤー及び、任意で一つ又はそれより多い付属成分と共に、本発明の関連組成物に添加するステップを包含する。一般に、前記の製剤は、一律かつ密接に関連して、液体キャリャー又は微細に分けられた固体キャリヤー、又はその両者と共に、関連する薬剤に添加することにより、及び必要ならば前記の調製物を成形することにより、調製される。
【０１３７】
経口投与に適した製剤は、カプセル、カシェー、ピル、錠剤、薬用ドロップ（味を付けた主成分、通常、ショ糖及びアラビアゴム又はトラガントを使用する）、散剤、顆粒剤の形で、又は水性若しくは非水性の液体中の液剤若しくは懸濁剤として、又は水中油型エマルジョン若しくは油中水型エマルジョンとして、又はエリキシル剤若しくはシロップ剤として、又はトローチ剤（たとえば、ゼラチン及びグリセリン、又はショ糖及びアラビアゴムのような不活性な基剤を使用する）としてであってもよく、活性成分として組成物の所定の量を含む各剤形であってもよい。
本発明の組成物は、また、大型丸剤、舐剤又はパスタ剤として投与されてもよい。経口投与用の固形剤形（カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、散剤及び顆粒剤等）において、前記の製剤は、たとえば、クエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウム、及び／又は以下の（１）乃至（１０）のあらゆるもののような、一つ又はそれよい多い薬学的に受容されるキャリヤーと混合される。
（１）たとえば、デンプン、乳糖、ショ糖、ブドウ糖、マンニトール及び／又はケイ酸のような賦形剤又は増量剤、
（２）たとえば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖、及び／又はアラビアゴムのような結合剤、
（３）たとえば、グリセロールのような保湿剤、
（４）たとえば、寒天、炭酸カルシウム、バレイショデンプン、タピオカデンプン、アルギン酸、若干のケイ酸塩及び炭酸ナトリウムのような崩壊剤、
（５）たとえば、パラフィンのような水剤遅延剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｒｅｔａｒｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、
（６）たとえば、４級アンモニウム化合物のような吸収促進剤、
（７）たとえば、アセチルアルコール（ａｃｅｔｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）及びモノステアリン酸グリセリンのような湿潤剤、
（８）たとえば、カオリン及びベントナイト粘土のような吸収剤
（９）たとえば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム及びそれらの混合物のような滑沢剤、及び
（１０）着色剤
カプセル、錠剤及び丸剤の場合、前記の組成物は、また、緩衝剤を含んでいてもよい。同じようなタイプの固形組成物は、また、高分子量ポリエチレングリコール等に加えて、乳糖（ｌａｃｔｏｓｅ）又は乳糖（ｍｉｌｋ  ｓｕｇａｒｓ）のような、たとえば、前記の賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）を使用して、軟ゼラチンカプセル剤及び硬ゼラチンカプセル剤において、賦形剤（ｆｉｌｌｅｒ）として使用されてもよい。
【０１３８】
錠剤は、任意により一つ又はそれより多い追加の成分を使用して、圧縮又は成型することにより調製されてもよい。圧縮された錠剤は、結合剤（たとえば、ゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性な希釈剤、保存剤、崩壊剤（たとえば、グリコールデンプンナトリウム又は架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤又は分散剤を使用して調製されてもよい。成型された錠剤は、不活性な液体希釈剤により湿潤化された前記の組成物の混合物を適切な機械で成型することにより調製されてもよい。たとえば、糖衣錠、カプセル、丸剤及び顆粒剤のような、錠剤及び他の固形剤形は、任意に、たとえば、腸溶コーティング、及び薬学的な製剤技術の分野でよく知られた他のコーティング剤のような、コーティング剤及び殻により得られてもよいか、又は調製されてもよい。
【０１３９】
経口投与のための液体剤形は、薬学的に受容される、エマルジョン、ミクロエマルジョン、水剤、懸濁剤、シロップ及びエリキシル剤を包含する。前記の組成物に加えて、液状剤形は、たとえば、水又は他の溶媒、たとえば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、オイル（特に、綿実油、グラウンドナッツ（ｇｒｏｕｎｄｎｕｔ）油、トウモロコシ油、胚芽油、オリブ油、ヒマシ油及びセサミ油）、グリセリン、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタン脂肪酸エステル、及びそれらの混合物のような可溶化剤及び乳化剤のような、当該技術分野で通常使用されている不活性な希釈剤を含有してもよい。
【０１４０】
前記の組成物に加えて、懸濁剤は、たとえば、エトキシ化されたイソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、ソルビタンエステル、微細結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド（ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｍｅｔａｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）、ベントナイト、カンテン、トラガント及びそれらの混合物のような懸濁試薬を含有してもよい。
【０１４１】
直腸又は膣への投与のための製剤は、前記の組成物を、たとえば、カカオ脂、ポリエチレングリコール、座剤ろう剤又はサリチル酸（ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ）を包含する一つ又はそれより多い、適切な刺激性がない賦形剤又はキャリヤーと混合することにより調製されてもよく、しかも、室温では固体であり、しかし体温では液体であり、それゆえ、体腔で溶け、前記の活性成分を放出することができる、座剤として提供されてもよい。膣への投与に適している製剤は、また、膣座剤、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、パスタ剤、泡製剤、当該技術分野で適当であると知られているキャリヤーを含むスプレー製剤を包含する。
【０１４２】
前記の組成物の経皮投与のための剤形は、粉剤、スプレー、軟膏剤、パスタ剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル、水剤、パッチ、及び吸入剤を包含する。
【０１４３】
前記の活性成分は、薬学的に受容されるキャリヤー、及び必要とされるかもしれない、あらゆる保存剤、緩衝剤又はプロペラントと、無菌条件下で混合されてもよい。
【０１４４】
前記の軟膏剤、パスタ剤、クリーム剤及びゲルは、前記の組成物に加えて、たとえば、動物性脂肪、植物脂質、オイル、ろう剤、パラフィン、デンプン、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、酸化亜鉛又はそれらの混合物のような賦形剤をが含有していてもよい。
【０１４５】
粉剤及びスプレーは、前記の組成物に加えて、たとえば、乳糖、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、ポリアミド粉末、又はそれら物質の混合物のような賦形剤を含有してもよい。スプレーは、さらに、たとえば、クロロフルオロ炭化水素、及びたとえば、ブタン及びプロパンのような揮発性非置換炭化水素のような通例のプロペラントを含有してもよい。あるいは、本発明の組成物は、エアゾール剤により投与されてもよい。これは、前記化合物を含む、水性エアゾール、リポゾーム調製物又は固形粒子を調製することにより成し遂げられる。非水性懸濁剤（たとえば、フルオロカーボンプロペラント）を使用することができる。音波を利用した噴霧を利用してもよい。なぜならば、前記の噴霧剤は、前記の組成物に含まれている前記の化合物の分解を生ずる可能性がある、剪断する前記の試薬に曝されるのを最小限に抑えるからである。
【０１４６】
通常、水性エアゾール剤は、一般に使用されている薬学的に受容されるキャリヤー及び安定化剤と共に、前記の組成物の水性溶液又は懸濁液を製剤化することにより調製される。前記のキャリヤー及び前記の安定化剤は、特定の組成物の条件により異なるが、典型的には、非イオン性界面活性剤（ツイーズ（Ｔｗｅｅｎｓ）、プルロニクス（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）又はポリエチレングリコール）、血清アルブミンのような無害なタンパク質、ソルビタンエステル、オレイン酸、レシチン、グリシンのようなアミノ酸、緩衝剤、糖類又は糖アルコールを包含する。一般に、エアゾール剤は、等張な溶液から調製される。
【０１４７】
非経口投与に適した本発明の薬学的組成物は、一つ若しくはそれより多い薬学的に受容される、無菌の等張な水性若しくは非水性の液剤、分散剤、懸濁剤若しくはエマルジョン、又は抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、前記の製剤を意図された被験体の血液、懸濁剤若しくは濃稠化剤と等張な前記の製剤を溶かす溶質を含んでもよい、無菌の注射用液剤若しくは無菌の注射用分散剤に用時に再構成されてもよい無菌粉末を包含する。
【０１４８】
本発明の薬学的組成物で利用されてもよい、適切な水性及び非水性キャリヤーの例は、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール及びポリエチレングリコール等）及び適切なそれらの混合物、オリブ油のような植物油、並びにオレイン酸エチルのような注射用有機エステルを包含する。適切な流動性は、たとえば、レシチンのようなコーティング剤の使用により、分散剤の場合には、必要とされた粒子サイズの維持により、及び界面活性剤の使用により、維持されてもよい。
【０１４９】
ここに記載した薬学的組成物は、フルンケル、慢性フルンケル多発症、インペチゴ、急性骨髄炎、肺炎、心内膜炎、熱傷様皮膚症候群、トキシックショック症候群及び食中毒を含むが、これらに限定されるものではない、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ感染症から生ずる状態又は疾患を、予防又は治療するために使用されてもよい。
【０１５０】
７．Ｓ．  ａｕｒｅｕｓのＳｉｒＡＢＣ仲介鉄輸送システムの阻害剤のための典型的なスクリーニング・アッセイ
一般に、病原性のビルレンスを阻害することができる薬剤又は化合物は、当該技術分野で知られた方法に従い、天然物若しくは合成（又は半合成）の抽出物の両方の大きなライブラリー又は化学ライブラリーから同定される。薬の発見及び開発の分野における当業者ならば、薬剤（たとえば、抽出物又は化合物を試験する）の明確な源は、本発明のスクリーニング方法に対して決定的ではないことを理解できるであろう。したがって、実質的に、かなり多数の化学的抽出物又は化合物を、ここに開示された方法を使用してスクリーニングすることができる。前記の薬、抽出物又は化合物の例は、既存の化合物の修飾物だけでなく、植物由来の抽出物、真菌由来の抽出物、原核生物由来の抽出物、動物由来の抽出物、醗酵培養物及び合成化合物が含まれるが、これらに限定されるものではない。非常に多くの方法が、また、糖類、脂質、ペプチド及び核酸を主材料とする化合物を含むが、これに限定されるのではない、かなり多数の化学物質のランダム又は方向付けされた合成（たとえば、半合成又は全合成）を実施するために利用できる。合成化合物のライブラリーは、Ｂｒａｎｄｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ，  ＮＨ）及びＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，  Ｗｉｓ．）から市販されている。あるいは、細菌、真菌、植物及び動物の抽出物の形態である、天然物のライブラリーは、Ｂｉｏｔｉｃｓ（Ｓｕｓｓｅｘ，  ＵＫ）、Ｘｅｎｏｖａ（Ｓｌｏｕｇｈ，  ＵＫ）、Ｈａｒｂｏｒ  Ｂｒａｎｃｈ  Ｏｃｅａｎｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｆｔ．  Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｆｌａ．）、及びＰｈａｒｍｎａＭａｒ，  Ｕ．Ｓ．Ａ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  Ｍａｓｓ．）を含む多数のソースから市販されている。さらに、所望ならば、たとえば、ｓｔａｎｄａｒｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄのような、当該技術分野で知られている方法に従って、天然及び合成的に調製されたライブラリーが構築される。さらに、所望ならば、あらゆるライブラリー又は化合物は、容易に標準的な化学的、物理的及び生化学的な方法を使用して修飾される。
【０１５１】
さらに、薬の発見及び開発に関する技術分野の当業者ならば、非重複のための方法（たとえば、分類学上の非重複、生物学上の非重複、化学上の非重複又はそれらのあらゆる組み合わせ）、又は抗病原性の活性について既に知られている物質ついての重複又は繰り返しの除去は、可能なときは何時でも利用されるべきであることを容易に理解する。
【０１５２】
粗抽出物が、抗病原性活性又は抗発病力活性又は結合活性を有することを発見された場合、前記の活性を有するリード抽出物の更なる分画が、前記の観察された効果の原因である化学的成分を単離するために必要である。それゆえ、前記の抽出、分画及び精製プロセスのゴールは、抗病原性活性を有する粗抽出物に含まれる化学物質の注意深い特徴付け及び同定である。前記の不均一の抽出物の分画及び精製の方法は、当該技術分野では知られている。所望ならば、病原性の治療のために有用な薬剤であることが示された化合物は、当該技術分野で知られた方法に従い、化学的に修飾される。
【０１５３】
ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）又はＦｈｕＣの潜在的な阻害剤は、本発明の核酸配列又はポリペプチドに結合して、それでもってその活性を阻害する、有機分子、ペプチド、擬ペプチド、ポリペプチド、抗体、アンチセンスＲＮＡ及びｓｉＲＮＡを包含する。潜在的な拮抗剤は、また、前記のポリペプチドの結合サイトに結合し、そしてそのサイトを塞ぎ、それによって細胞中の結合分子への結合を妨げる、その結果、正常な生物学的な活性を妨げる低分子を含む。他の潜在的な拮抗剤は、アンチセンス分子を包含する。
【０１５４】
７．１相互作用アッセイ法
精製された、及び組換えで調製されたＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）及びＦｈｕＣポリペプチドは、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢとＳｉｒＣとの間の相互作用、又はＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）及び／又はＦｈｕＣとの間の相互作用を調節する薬剤をスクリーニングするためのアッセイ法の開発を促進するために使用されてもよい。ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）又はＦｈｕＣの潜在的な阻害剤は、小さな有機分子、ペプチド、ポリペプチド、擬ペプチド、及びＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）又はＦｈｕＣのどちらか一方に結合し、それによりその活性を阻害する抗体を包含してもよい。
【０１５５】
典型的なスクリーニング・アッセイ法では、反応混合物が、少なくとも、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）又はＦｈｕＣポリペプチドのどちらか一方の生物学的に活性な部位、注目の薬剤及び適当な相互に作用する分子を含むように発生するかもしれない。ここで使用されているように、前記の「特定の相互に作用する分子」は、前記のスクリーニング・アッセイ法で使用されるポリペプチドに依存する、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）又はＦｈｕＣであってもよい。たとえば、ＳｉｒＡを使用した場合、特定の相互に作用する分子は、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）、ＳｉｒＢ、又はＳｉｒＣであってもよい。特定の相互に作用する分子と、特定のＳｉｒポリペプチドとの相互作用の検出及び定量は、たとえば、ＳｉｒＡ及びＳｉｒＢとの間の相互作用を阻害することにおいて、薬剤の有効性を決定する手段を提供する。前記の薬剤の有効性は、前記の試験される薬剤を様々な濃度で使用して得られたデータから用量−反応曲線を作成することにより評価することができる。さらに、対照アッセイは、また、比較のベースラインを提供するために実施され得る。前記の対照アッセイにおいて、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）又はＦｈｕＣポリペプチドと、前記の特定の相互に作用する分子との相互作用は、前記の試験される薬剤の非存在下で定量されてもよい。
【０１５６】
ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）又はＦｈｕＣポリペプチドと、前記の特定の相互に作用する分子との相互作用を、様々な技法により検出してもよい。前記の複合物の形成の阻害作用を、イムノアッセイ又はクロマトグラフィーによる検出により、たとえば、放射能で標識された、蛍光で標識された、又は酵素的に標識されたポリペプチドのような、検出できるように標識されたタンパク質を使用して定量することができる。
【０１５７】
特定のＳｉｒ又はＦｈｕＣタンパク質と、前記の特定の相互に作用する分子との相互作用の測定は、光学式バイオセンサー装置（ｏｐｔｉｃａｌ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｄｅｖｉｃｅ）における表面プラズモン共鳴技術（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して直接観察されるかもしれない。この方法は、より大きいペプチド（＞５ｋＤａ）との相互作用を測定するのに特に有用であり、そして前記のタンパク質−タンパク質相互作用の阻害剤をスクリーニングするために適用されうる。
【０１５８】
あるいは、前記のアッセイの自動化に適用することだけでなく、前記のタンパク質の一方又は両方の複合化されていないフォームから、複合物の分離を促進するために、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）若しくはＦｈｕＣ、又は前記の特定の相互に作用する分子の何れかを固定化することが望ましいであろう。たとえば、前記の特定の相互に作用する分子に対するＳｉｒＡの結合は、候補薬剤の存在下又は非存在下で、前記の反応剤を入れるのに適した、あらゆる容器中で成し遂げられうる。例は、ミクロタイタープレート、試験管及びミクロ−遠心チューブを包含する。一つの実施態様では、前記のタンパク質を基盤に結合させるようにするドメインを付加する、融合タンパク質を提供することができる。たとえば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＳｉｒＡ（ＧＳＴ／ＳｉｒＡ）融合タンパク質は、グルタチオン・セファロース・ビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｏ）又はグルタチオン誘導化ミクロタイタープレートに吸着されうる。それから、それらは、３５Ｓで標識された相互に作用する分子、及び前記の試験される薬剤に、及びわずかにより厳しい条件が望まれるかもしれないが、たとえば、塩及びｐＨについて生理学的な条件で、複合体形成へと導く条件下でインキュベートされた前記の混合物により結合される。インキュベートに続いて、前記のビーズは、あらゆる結合していないラベルを除くため洗浄され、そして固定化された前記のマトリックス及び放射能標識は、直接測定されるか（たとえば、シンチレーター（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）中に置かれたビーズ）、又は前記の複合物を解離させた後、前記の上澄み液中で、測定される。あるいは、前記の複合物は、前記のマトリックスから解離させることができ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離することができ、そして前記のビーズフラクションにおいて検出される相互に作用する分子のレベルは、標準的な電気泳動技術を使用して前記のゲルから定量される。
【０１５９】
タンパク質及び他の分子をマトリックス上に固定するための他の技法は、また、前記のアッセイでの使用に利用できる。たとえば、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）、ＦｈｕＣ又は前記の特定の相互に作用する分子の何れも、ビオチン及びストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）の複合体を利用して固定されうる。たとえば、ビオチン標識した、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）又はＦｈｕＣは、当該技術分野でよく知られた技術（たとえば、ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ，  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  Ｉｌｌ．）を使用してビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製され、そしてストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）をコートした９６ウエル・プレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウエル中に固定されうる。あるいは、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）又はＦｈｕＣのいずれかと反応性があり、前記のポリペプチドと前記の相互に作用する分子との前記の相互作用を妨げない、抗体は、前記のプレートのウエルに対して誘導体化されうるし、そして、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）又はＦｈｕＣが、抗体との複合体形成により前記のウエル中に捕獲されうる。上記のように、前記の相互に作用する分子及び試験される化合物の調製は、前記のプレートの前記のポリペプチドが存在するウエル中でインキュベートされてもよく、そして前記のウエルで捕獲された複合体の量は、試験される化合物の存在下又は非存在下で定量されうる。前記のＧＳＴ固定化複合体についての前記の方法に加えて、前記の複合体を検出する典型的な方法は、前記の相互に作用する分子と反応するを使用する複合体の免疫検出法、又は前記の相互に作用する分子と結びつけられた酵素活性を検出することに依存する酵素結合アッセイを包含する。
【０１６０】
たとえば、酵素は、前記の相互に作用する分子と化学的に結合させるか、又は前記の相互に作用する分子との融合タンパク質として調製されることができる。例示するために、前記の相互に作用する分子は、西洋ワサビペルオキシダーゼと化学的に交差結合させうるか、又は遺伝学的に西洋ワサビペルオキシダーゼと融合させることができ、そして前記の複合体中に捕獲されたポリペプチドの量は、たとえば、３，３−ジアミノベンザジン四塩酸塩（３，３‘−ｄｉａｍｉｎｏ−ｂｅｎｚａｄｉｎｅ  ｔｅｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）又は４−クロロ−１−ナフトールのような前記の酵素の発色性基質により定量されうる。同様に、前記のポリペプチド及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを具備する融合タンパク質が提供されることができ、そして複合体の形成量は、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（Habig et al.
(1974) J. Biol. Chem. 249:7130）を使用して、前記のＧＳＴ活性を検出することにより定量されうる。
【０１６１】
７．２鉄輸送アッセイ
あるいは、スクリーニング・アッセイ法は、前記のＳｉｒポリペプチドの鉄輸送活性を調節する薬剤をスクリーニングするために、開発されてもよい。前記のＳｉｒタンパク質の鉄輸送活性を調節する、試験薬剤の適切な濃度は、当業者に知られているあらゆる方法により決定されうる。
【０１６２】
一つの実施態様では、前記のスクリーニング・アッセイ法は、野性型のＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ又はＦｈｕＣポリペプチドを発現するＳ．  ａｕｒｅｕｓの全細胞を包含してもよい。前記のポリペプチドの鉄輸送活性を変える、化合物の能力は、前記の細胞の分析により検出されうる。たとえば、鉄輸送の拮抗剤は、鉄を豊富に含む培地における前記の細胞の成育又は分化（表現型）における変化を記録することにより検出されうる。試験薬剤（類）の存在下での野性型のＳ．  ａｕｒｅｕｓ株の生育を、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ又はＦｈｕＣが欠失したＳ．  ａｕｒｅｕｓ株の生育と比較してもよい。各培養物を、化合物又は天然物の抽出物のライブラリーからの試験薬剤により処理してもよく、そして特定の試験薬剤が前記の野性型株、及び前記のＳｉｒ欠失株又はＦｈｕＣ欠失株の生育に及ぼす効果について観察してもよい。細菌の生育を、クレット・メーター（Klett meter）を使用して観察してもよい。前記のＳｉｒＡＢＣ鉄シデロフォア（siderophore）輸送システムを特異的に妨げる化合物は、前記の野性型株の生育のみに影響を及ぼすであろう。
【０１６３】
あるいは、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ細胞を試験薬剤と共に培養し、そして試験薬剤により処理し、それから原子吸光スペクトル法（Cox (1994) Meth. Enzymol. 235:315）を使用して前記の細胞中の鉄の存在をスクリーニングしてもよい。
【０１６４】
あるいは、前記の鉄輸送活性の阻害を、放射能活性を有する鉄を使用することにより測定してもよい。前記のＳｉｒＡＢＣ鉄シデロフォア（siderophore）輸送システムを妨げる化合物は、前記の放射能活性を有する鉄の取り込みの低下を生ずるであろう。対照アッセイは、また、比較のためのベースラインを作成するために実施されうる。前記の対照アッセイにおいて、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ細胞における、前記の放射能活性を有する鉄の取り込みを、前記の試験化合物の非存在下で定量してもよい。放射能活性を有する鉄の例は、５９Ｆｅ又は５５Ｆｅを包含してもよい。
【０１６５】
７．３発現アッセイ
さらなる実施態様では、前記の鉄輸送システムの拮抗剤は、ｓｉｒＡ、ｓｉｒＢ、ｓｉｒＣ又はｆｈｕＣの核酸又はタンパク質の発現に影響を及ぼすかもしれない。このスクリーニングでは、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ細胞を、注目の化合物により処理してもよく、そして、その後、前記の化合物がｓｉｒＡ、ｓｉｒＢ、ｓｉｒＣ又はｆｈｕＣの核酸又はタンパク質の発現に影響を及ぼす効果のために、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ細胞を、アッセイしてもよい。
【０１６６】
たとえば、全てのＲＮＡは、Chomczynski et
al. (1987) Anal. Biochem.
162:156-159に開示された一段階グアニジウム−チオシアネート−フェノール−クロロホルム法（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ−ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ  ｍｅｔｈｏｄ）のような、あらゆる適当な技術を使用して、試験薬剤の存在下又は非存在下で培養されたＳ．  ａｕｒｅｕｓ細胞から単離されうる。それから、ｓｉｒＡ、ｓｉｒＢ、ｓｉｒＣ又はｆｈｕＣの発現を、ノーザン・ブロット・アナリシス（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合せた逆転写法（ＲＴ−ＰＣＲ）及びリガーゼ連鎖反応と組み合せた逆転写法（ＲＴ−ＬＣＲ）のような、あらゆる適切な方法により定量してもよい。
【０１６７】
ノーザン・ブロット・アナリシス（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）は、Harada et al. (1990) Cell 63:303-312に開示された方法に従い実施することができる。手短に言えば、全てのＲＮＡは、試験薬剤の存在下で培養されたＳ．  ａｕｒｅｕｓ細胞から調製される。ノーザン・ブロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ）のために、前記のＲＮＡは、適切なバッファー（たとえば、グリオキサール／ジメチルスルホキシド／リン酸ナトリウムバッファー）中で変性され、寒天ゲル電気泳動に付し、そしてニトロセルロース濾紙の上に移す。前記のＲＮＡがＵＶリンカーにより前記の濾紙に結合された後、前記の濾紙を、ホルムアミド、ＳＳＣ、デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液、変性されたサーモンの精子、ＳＤＳ及びリン酸ナトリウムバッファーを含む溶液中でプレハイブリダイズする。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ｓｉｒＡ、ｓｉｒＢ、ｓｉｒＣ又はｆｈｕＣ  ＤＮＡ配列は、あらゆる適切な方法（たとえば、３２Ｐ−マルチプライム  ＤＮＡ標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））に従い、ラベルされ、そしてプローブとして使用されてもよい。一晩ハイブリッド形成を行った後、前記の濾紙を洗浄し、そしてＸ線フィルムに晒す。さらに、対照アッセイを、また、比較のためのベースラインを作成するために実施することができる。前記の対照アッセイでは、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓにおけるｓｉｒＡ、ｓｉｒＢ、ｓｉｒＣ又はｆｈｕＣの発現を、前記の試験薬剤の非存在下で定量してもよい。
【０１６８】
あるいは、たとえば、Makino et al. (1990) Technique 2:295-301に開示されたＲＴ−ＰＣＲ法を使用するために、また、ｓｉｒＡ、ｓｉｒＢ、ｓｉｒＣ又はｆｈｕＣポリペプチドをエンコードするｍＲＮＡのレベルをアッセイしてもよい。手短に言えば、この方法は、試験薬剤の存在下で培養されたＳ．  ａｕｒｅｕｓ細胞から単離された全ＲＮＡを、ＲＴプライマー及び適切なバッファーを含む反応混合物に加えるステップを含む。プライマー・アニーリングのためにインキュベートした後、得られた混合物に、ＲＴバッファー、ｄＮＴＰ、ＤＴＴ、リボヌクレアーセ阻害剤及び逆転写酵素を補充することができる。前記のＲＮＡの逆転写を完了するためにインキュベート後、前記のＲＴ化された生成物は、それから、標識されたプライマーを使用するＰＣＲに付す。あるいは、前記のプライマーを標識するよりはむしろ、標識されたｄＮＴＰを前記のＰＣＲ反応混合物に含めることができる。ＰＣＲ増幅を、一般に行われている方法に従い、DNAサーマルサイクラー中で実施することができる。増幅を成し遂げるために適切な数のラウンド後、得られたＰＣＲ反応混合物をポリアクリルアミドゲル上での電気泳動に付す。前記のゲルを乾燥後、適合したバンドの放射能を、イメージングアナライザーを使用して測定してもよい。ＲＴ及びＰＣＲ反応の材料及び条件、試薬及びゲル濃度、並びに標識方法は、当該技術分野ではよく知られている。前記のＲＴ−ＰＣＲ方法における変化は、当業者にとって明らかであろう。本発明の核酸を検出することができる他のＰＣＲ法は、PCR Primer: A
Laboratory Manual (Dieffenbach et al. eds., Cold Spring Harbor Lab
Press, 1995)  に見出される。対照アッセイは、また、比較のためのベースラインを作成するために実施することができる。前記の対照アッセイでは、前記の試験薬剤の非存在下でＳ．  ａｕｒｅｕｓにおけるｓｉｒＡ、ｓｉｒＢ、又はｓｉｒＣの発現を定量してもよい。
【０１６９】
あるいは、たとえば、免疫測定法のような抗体を基礎とする方法を使用して、試験薬剤によりＳ．  ａｕｒｅｕｓ細胞を処理した後に、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ又はＦｈｕＣポリペプチドの発現を定量してもよい。たとえば、ウエスタン・ブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定法）、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫沈降測定法、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散測定法、凝集反応測定法、補体結合測定法、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光免疫測定法、及びタンパク質Ａ免疫測定法のような測定法を使用する、競合的及び非競合的測定システムを制限なく含む、あらゆる適切な免疫測定法を使用することができる。
【０１７０】
たとえば、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ又はＦｈｕＣポリペプチドを、二段階サンドイッチ測定法（ｔｗｏ−ｓｔｅｐ  ｓａｎｄｗｉｃｈ  ａｓｓａｙ）によって、試験薬剤で処理されたＳ．  ａｕｒｅｕｓ細胞から得られた試料において検出することができる。第一段階では、捕獲試薬（たとえば、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ又はＦｈｕＣの何れかの抗体）が、前記の特異的なポリペプチドを捕獲するために使用される。前記の捕獲試薬を、任意に固体相に固定することができる。第二段階では、直接的又は間接的に標識された検出試薬が、前記の捕獲されたマーカーを検出するために使用される。一つの実施態様では、前記の検出試薬が抗体である。試験薬剤で処理されたＳ．  ａｕｒｅｕｓ細胞に存在するＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ又はＦｈｕＣポリペプチドの量は、未処理のＳ．  ａｕｒｅｕｓ細胞に存在する量を基準として算定されうる。
【０１７１】
適切な酵素標識は、たとえば、基質と反応して過酸化水素の産生を触媒するオキシダーゼ類からの標識を包含する。グルコースオキシダーゼが、特に好ましい。なぜならば、グルコースオキシダーゼは、安定性がよく、そしてその基質（グルコース）が容易に入手できるからである。オキシダーゼ標識の活性を、前記の酵素で標識された抗体／基質との反応により産生される過酸化水素の濃度を測定することによりアッセイしてもよい。酵素に加えて、他の適切な標識は、たとえば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）のような放射性同位体を包含する。
【０１７２】
適切な蛍光標識の例は、フルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、ｏ−フタルアルデヒド標識及びフルオレスカミン標識を包含する。
【０１７３】
適切な酵素標識の例は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌性のヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母性アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセリンリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼを包含する。
【０１７４】
化学発光標識の例は、ルミノール標識、イソルミノール標識、芳香族性アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識及びエクオリン標識を包含する。
【０１７５】
実施例
【０１７６】
一般的に記載された本発明は、以下の実施例を参照することによりより容易に理解されるかもしれない。以下の実施例は、単に、本発明のある態様及び実施態様の例示の目的のため含められているのであって、あらゆる点で本発明を限定することを意図するものではない。
【０１７７】
実施例１：実施例２−５ための材料及び方法
培地及び生育条件
実施例２−５で使用される細菌菌株、プラスミド及びオリゴヌクレオチドは、表１に示す。通例のクローニング及びタンパク質の発現のために、大腸菌（E. coli）を、３７℃で、必要に応じて、エリスロマイシン（３００μｇ／ｍｌ）、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍｌ）又はカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を補充したルリア−ベルターニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地（ＬＢ培地）中で生育させた。一般的な操作のためには、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ菌株を、必要に応じて、エルスロマイシン（５μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（４μｇ／ｍｌ）、カナマイシン及びネオマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、又はクロラムフェニコール（５μｇ／ｍｌ）を含むＤｉｆｃｏ社製のＴｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）培地で培養した。鉄を制限した細菌の生育実験のためには、組成については、前記（Sebulsky et al.
(2000) J. Bacteriol. 182:4394-4400）の、Ｔｒｉｓ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ（ＴＭＳ）培地が使用された。前記の倍地中に遊離している鉄の濃度をさらに制限するために、ＴＭＳ培地に、以下の実施例で記載されている濃度の２’，２−ジピリジルを補充した。
【０１７８】
プラスミド及び菌株の構築
すべてのＤＮＡ操作及びプラスミドの構築は、標準的なプロトコールを使用して実施された。前記のｓｉｒＡＢＣオペロンは、Ｐｗｏｌポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）及びプライマーＳｉｒ  ｕｐｐｅｒ及びＳｉｒ  ｌｏｗｅｒを使用してＳ．  ａｕｒｅｕｓ８３２５−４の染色体からＰＣＲ増幅された。生じた３．８−ｋｂの生成物は、ｐＳｉｒＡＢＣを作り出すため、ｐＢＣ  ＳＫ＋のＳｍａｌサイトへクローンされた。
【０１７９】
前記のｓｉｒＡをコードする領域を分断するために、ｐＳｉｒＡＢＣを、Ｎｓｉｌにより消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで満たし、そしてｐＤＧ７８２からのＳｔｕＩ／ＳｍａＩフラグメントとして切り取られたカナマイシン耐性カセットに結合した。前記のｓｉｒＡ：：Ｋｍ領域は、ＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ−ｄｉｇｅｓｔｅｄ  ｐＡＵＬ−Ａにクローンされ、プラスミドｐＭＴＳ１２を構築した。
【０１８０】
前記のｓｉｒＢをコードする領域が、ＣｌａＩ（クレノウ酵素（Ｋｌｅｎｏｗ  ｅｎｚｙｍｅ）により末端平滑化された）によりｐＤＧ１５１３を消化すことにより誘導されたテトラサイクリン耐性カセットを、ｓｉｒＢのＳｔｕｌサイトへの挿入により、分断された。前記のｓｉｒＢ：：ｔｅｔフラグメントは、ＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ−ｄｉｇｅｓｔｅｄ  ｐＡＵＬ−Ａにクローンされ、プラスミドｐＳｉｒＢ：：Ｔｅｔ３を構築した
【０１８１】
ｓｉｒＡ及びｓｉｒＢにおける個々の突然変異を担う菌株を作り出すために、ｐＭＴＳ１２及びｐＳｉｒＢ：：Ｔｅｔ３は、Ｓ．  Ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ４２２０に導入された後、ファージ８０αの媒介でＳ．  ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ６３９０へ形質導入された。導入体は、制限分析により確認された。対立遺伝子置換は、３０℃で３時間、ついで生育温度を４３℃に上げて、さらに４時間、プラスミドを含む細菌を生育させることにより成し遂げられた。二重交差型事象は、両ケースにおいて同時に起こるエリスロマイシン耐性の欠失とともに、カナマイシンに対する耐性（ｓｉｒＡ：：Ｋｍ  ｍｕｔａｔｉｏｎ用）又はテトラサイクリンに対する耐性（ｓｉｒＢ：：Ｔｅｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ用）により、スクリーニングされた。ＰＣＲ及びサザンブロット分析が、ｓｉｒＡ及びｓｉｒＢへの前記の抗生物質耐性カセットの挿入を立証するために使用された。前記の生じた突然変異株は、Ｈ３０６（ＲＮ６３９０  ｓｉｒＡ：：Ｋｍ）及びＨ４７４（ＲＮ６３９０  ｓｉｒＢ：：Ｔｅｔ）と称された。形質導入が、たとえば、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎのような、異なる遺伝子バックグラウンドへの前記の突然変異を結集するために使用された。
【０１８２】
前記のｓｉｒＡ：：Ｋｍ  ｍｕｔａｔｉｏｎの相補性のために、前記の全ｓｉｒＡＢＣオペロンが、ｐＳｉｒＡＢＣ（ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩを使用して）から切り取られ、そしてプラスミドｐＳＥＤ４４を構築するため、ｐＡＷ８へクローンされた。前記のｓｉｒＢ：：Ｋｍ  突然変異体の相補性のために、前記のｓｉｒＢをコードする領域は、プライマーＳｉｒＢ  Ｃｏｍｐ  ５’及びＳｉｒＢ  Ｃｏｍｐ  ３’を使用してＳ．  ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ６３９０染色体からＰＣＲ法により増幅され、ついでプラスミドｐＳＥＤ４３を構築するために、ｐＡＬＣ２０７３への指向性クローニングのための、ＫｐｎＩ及びＳａｃＩによる消化が実施された。相補性ベクターは、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ４２２０にエレクトロポレーションにより導入され、及び相補性ベクターは、前記の方法（Sebulsky et al.
(2000) J. Bacteriol. 182:4394-4400）を使用して、バクテリオファージ８０αを使用して突然変異株に形質導入された。
【０１８３】
ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＴ−ＰＣＲ反応における使用のため全ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して後期対数期における細菌培養物から単離された。ＲＮＡ試料は、前記のＲＴ−ＰＣＲ反応に先立ち、室温下で１５分間、ＤＮアーゼＩで処理された。Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）  Ｔａｑキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキットが、製造社の指示に従い使用された。全ＲＮＡ  ５００ｎｇが、前記のｓｉｒＢをコードする領域に対する内部の３９９−ｂｐフラグメントを増幅するために、プライマーＳｉｒＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ５’及びＳｉｒＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ３’使用して逆転写された。内部対照として、ｇａｐ（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをエンコードする。）の４８３−ｂｐフラグメントが、前記のＧａｐｄｈ  ５’及びＧａｐｄｈ３’オリゴヌクレオチド  プライマーを使用して増幅された。
【０１８４】
細菌の生育カーブ
Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ培養物は、ＴＭＳ中で一夜予め生育させた。細胞を洗浄後、およそ各株の１０７コロニー形成単位を、ＦｅＣ１３  ５０μＭを含むか、又は含まない、２，２’−ジピリジル（Ｓｉｇｍａ）２５０μＭを含む調製したばかりのＴＭＳ培地中に植え付けた。後期定常期に達するまで、細菌の生育をクレット・メーター（Ｋｌｅｔｔ  ｍｅｔｅｒ）で観察した。
【０１８５】
シデロフォア  プレート  バイオアッセイ
シデロフォア  プレート  バイオアッセイは、以下の変更を加えた上で、本質的に前記（Sebulsky et al.
(2000) J. Bacteriol. 182:4394-4400）のように実施された。
（変更点）
試験される各株の１０５ｃｆｕ／ｍｌの接種の前に、ＴＭＳ−寒天を４５℃に冷却した。
Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ及び対照とするＮｅｗｍａｎを含むビークル（たとえば、ｐＡＷ８及びｐＡＬＣ２０７３）を含むプレートに２，２’−ジピリジル５５０μＭを添加し、又は、プラスミドを具備しているか、又は具備していない、Ｈ８０３株（Ｎｅｗｍａｎ  ｓｉｒＡ：：Ｋｍ）及びＨ８０４株（Ｎｅｗｍａｎ  ｓｉｒＢ：：Ｔｅｔ）には２，２’−ジピリジル４００μＭを添加した（図１を参照）。スタフィロバクチン（Ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）シデロフォアを、前記（(Dale et al. (2004) Infect. Immun. 72:29-37）のようにして、ＲＮ６３９０から単離した。手短に言えば、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ株を、３７℃で４８時間、ＴＭＳ培地中で激しく振とう培養した。培養液の上澄み液を、元の培養液の上澄み液の液量の１／１０を、１００％メタノール中での遠心分離により回収し、そして前記の上澄み液を、微粒子の材料を除くため、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．１濾紙を使用してろ過した。ロータリー蒸発装置により、前記の濾液を濃縮後、ＬＨ−２０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適用した。画分を集め、そしてクロムアズロールS  シャトル溶液（ｃｈｒｏｍｅ  ａｚｕｒｏｌ（ＣＡＳ）  Ｓ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）により陽性であり、かつシデロフォア  プレート  アッセイにおける生物学的活性を示す画分を濃縮乾固し、ついで水に再懸濁し、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析した。シデロフォアの最終的な精製には、分析用逆相ＨＰＬＣを使用した。利用したカラムは、Ｗａｔｅｒｓ  ＯＤＳ２  ＳＰｈｅｒｉｓｏｒｂカラム（４．６×１５０ｍｍ）であった。０．１％トリフルオロ酢酸水溶液を、溶液Ａとし、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル溶液を、溶液Ｂとして使用した。前記のクロマトグラフィーは、以下のように実施された。すなわち、流速０．７５ｍｌ／ｍｉｎで、溶液Ｂを６％で３．５分間、ついで２０分間以上にわたり、溶液Ｂを６％から６０％までグラジエントさせた。スタフィロバクチンは、２１０ｎｍで検出され、その保持時間は、およそ１７分であった。スタフィロバクチンを集め、その画分を濃縮乾固し、純度を確認するため、再度クロマトグラフィーを行った。スタフィロバクチン  シデロフォアの純度は、ＨＰＬＣ分析で確認された。エアロバクチン（Ａｅｒｏｂａｃｔｉｎ）をＥＭＣ  ｍｉｃｒｏｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓから購入し、全てのバイオアッセイの対照として１μｇ／ｍｌの濃度で使用された。
【０１８６】
５５Ｆｅ輸送アッセイ
Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ株を、２，２‘−ジピリジル１００μMを含み、ＦｅＣｌ３を含むか、又は含まないＴＭＳ中で後期対数期まで生育させた。細胞を、ＴＭＳにより０．４５μｍフィルター（Ｇｅｌｍａｎ）上で２回洗浄し、そしてＯＤ６００＝１．２に標準化された。１６０前記のアッセイに先立つこと２０分前に、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）２μＭの存在下で、５５ＦｅＣ１３（７５μＭ）を、およそスタフィロバクチン２２０μＭ（デスフェラール（ＤＥＳＦＥＲＡＬ（登録商標））当量から算定）と混合し、そして室温で平衡化させた。前記の５５Ｆｅ−スタフィロバクチン混合物１０μＬを細菌液１ｍｌに添加することにより、取り込みが開始された。異なった時点において、細胞液２００μｌを採取し、０．４５μｍ膜上でＬｉＣｌ２  １００ｍＭで２回洗浄した。膜を乾燥し、そしてＢｅｃｋｍａｎ  ＬＳ６５００シンチレーション・システムのトリチウム・チャンネルを使用して、ＣＹＴＯＳＣＩＮＴ（登録商標）液中でカウントした。いくらかの実験では、５５Ｆｅ混合物の添加に先立ち、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓを室温で２０分間シアン化カリウム（ＫＣＮ）１０ｍＭにより処理した。標示されたデータは、ブラッドフォード・アッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ａｓｓａｙ）により決定されるように、前記の細胞中の全たんぱく質含量に対して標準化された（＋／−標準偏差）、輸送された５５Ｆｅのｐｍｏｌ（ピコモル）である。
【０１８７】
ｌａｃＺ転写融合遺伝子及びβ−ガラクトシダーゼ・アッセイ
ｓｂｎＡ、ｓｂｎＦ及びｓｂｎＩに対するｌａｃＺ転写融合遺伝子の創製は、すでに記載された（Dale et al. (2004) Infect. Immun. 72:29-37）。個々の遺伝子の内部フラグメントは、グラム陽性菌では複製しないベクターである、ｐＭＵＴＩＮ４（Vagner et al.,
(1998) Microbiology 144:3097-3104）の複数のクローニング  サイトにクローンされた。これらの融合遺伝子は、Ｈ３０６及びＨ４７４遺伝子バックグラウンドに導入され、そして突然変異及び融合遺伝子の存在は、ＰＣＲにより確認された。ｓｂｎＨ：：ｌａｃＺ転写融合の構築は、すでに記載された（Dale et al. (2004) Infect. Immun. 72:29-37）。この融合遺伝子は、Ｎｅｗｍａｎ、Ｈ３０６及びＨ４７４遺伝子バックグラウンドに導入され、そして前記の融合遺伝子の存在は、ＰＣＲにより確認された。
【０１８８】
Ｓ．  ａｕｒｅｕｓからのβ−ガラクトシダーゼの発現の定量のために、細胞を、２，２‘−ジピリジル  １００μＭを補充したＴＭＳ中で、６００ｎｍでの光学濃度が０．８になるまで生育させ、そして前記（Dale et al. (2004) Infect. Immun. 72:29-37）のようにしてアッセイされた。手短に言えば、培養物を、１０  ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）、  ＥＤＴＡ  １５ｍＭ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びリソスタフィン（ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ）１０μｇを含む溶液中で、３７℃で溶菌した。細胞の破砕物の遠心分離後、上澄み液５μＬを使用して、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用して、Ｇａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ  Ｐｌｕｓ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ｋｉｔ（Ｔｒｏｐｉｘ）により、β−ガラクトシダーゼ活性をアッセイした。前記のバックグラウンドは、毎秒５０相対的光ユニットに設定され、そして、標示された前記のデータは、三つの独立サンプル±標準誤差について、毎秒の平均相対的光ユニットである。
【０１８９】
ＳｉｒＡの精製及び抗−ＳｉｒＡ抗血清の産生
我々は、ｓｉｒＡをクローニングすることにより、マイナス・ザ・シグナル・ペプチド（ｍｉｎｕｓ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）であるＳｉｒＡをＥ．  ｃｏｌｉ  ＥＲ２５６６で発現させ、プライマーｐＳｉｒＡ（ＢａｍＨＩ）及びｐＳｉｒＡ（ＥｃｏＲＩ）を使用して、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓのゲノムから、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにより消化されたｐＧＥＸ−２Ｔ−ＴＥＶに増幅した。ＩＰＴＧ  ０．５ｍＭにより４時間誘導する以前に、ｐＳｉｒＡと名付けられた、この構築物を中期対数期まで生育させた。Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓ（加圧型細胞破砕装置）を使用して、細胞を破砕し、そして前記の溶菌液を、４０，０００ｒｐｍで遠心分離してペレット状の細胞破砕物とした。前記の上澄み液を、ＰＢＳで平衡化されたＧＳＴｒａｐ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムに適用し、そして前記のＧＳＴ−ＳｉｒＡ融合タンパク質を、１０ｍＭ還元型グルタチオンを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）溶液で溶出した。タバコｅｔｃｈウイルスプロテアーゼとのインキュベーションにより、ＳｉｒＡをＧＳＴから切り離し、そして５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）に対して、４℃で一夜透析した。ＳｉｒＡを、リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）で平衡化されたＭｏｎｏ  Ｓカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してさらに精製し、そして前記のタンパク質を、１Ｍ  ＮａＣｌを含有するリン酸ナトリウムバッファーで溶出した。ＳｉｒＡの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。
【０１９０】
フロイント完全アジュバント１００μＬに懸濁させたＳｉｒＡ  ５００μｇを皮下注射により接種された、ニュジーランド白兎（Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  ｗｈｉｔｅ  ｒａｂｂｉｔｓ）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）において、ＳｉｒＡを認識する抗体を、産生させた。１４日目及び２８日目に、ウサギに、フロイント不完全アジュバントに懸濁させたＳｉｒＡ  １００μｇを追加抗原注射した。第二の追加抗原注射から１０日後、ウサギを犠牲にした。抗血清を、Ｈ３０６細胞溶菌液に対して吸収させ、、そしてウエスタン・ブロットに１：２０００に希釈して使用した。
【０１９１】
実施例２：ＳｉｒＡの発現は、Ｆｕｒ経由して鉄により制御されている。
ＳｉｒＡ発現を、鉄を豊富に含む培地（５０μＭ  ＦｅＣｌ３を含むＴＳＢ又はＴＭＳの何れか）で生育したＳ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎでは検出できなかったが、その発現を、鉄が制限された条件下で生育の間で容易に検出できた（図２）。鉄の制限レベルが強まる（すなわち、２，２‘−ジピリジルをＴＭＳに添加した場合）につれて、発現レベルが増加した（図２）。これらの発見は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ８３２５−４を使用した、以前の研究（Heinrichs et al. (1999) J. Bacteriol.
181:1436-1443）と一致している。我々は、さらにＳｉｒＡの発現が、Ｆｕｒが欠失したバックグラウンドでは、もはや鉄による制御ではないこと（図２）から、ＳｉｒＡの発現が、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓの前記のＦｕｒタンパク質の活性に支配されていることを示した。この発見は、ｓｉｒＡの共通のＦｕｒボックス上流の予測された存在と一致している（Dale et al. (2004)
Infect. Immun. 72:29-37; Heinrichs et al. (1999) J. Bacteriol. 181:1436-1443）。
【０１９２】
実施例３：ｓｉｒＢ及びｓｉｒＣが存在していない場合、ｓｉｒＡ遺伝子産物はＥ．ｃｏｌｉに毒性を示す。
様々なベクター及びプロモーターシステム（データは示されていない）を使用した、多くの不成功に終わった試みが、Ｈ８０３の相補性のための、前記のｓｉｒＡをコードする領域をクローンするためになされた。これらの不成功に終わった結果は、たとえ少量のこのリポタンパク質の「漏出的」発現が、Ｅ．  ｃｏｌｉに対して致死性であったことを示した。抗−ＳｉｒＡ抗血清の産生のためには、前記のシグナルペプチドが欠失しているｓｉｒＡは、成功裏にＥ．  ｃｏｌｉ発現ベクターにクローンされ、そして大量の可溶性ＳｉｒＡが産生されたので、ｓｉｒＡのクローニングで遭遇する前記の問題は、前記のタンパク質の可溶又は両親媒性の領域に起因することではないようである。これらの結果は、ｓｉｒＡのクローニングで遭遇する前記の問題が、Ｅ．  ｃｏｌｉにおける前記のリポタンパク質の不適当なプロセッシングに起因しているかもしれないという考えを支持する。
【０１９３】
しかしながら、興味深いことに、ｓｉｒＢ及びｓｉｒＣが前記のクローンされたＤＮＡに含まれているときではなく、試みがそれ自身上での前記のｓｉｒＡ遺伝子をクローンするためになされたときにのみ、Ｅ．  ｃｏｌｉにおける前記のＳｉｒＡリポタンパク質の明らかな毒性作用が発生した。実は、前記のｓｉｒＡＢＣ遺伝子は、成功裏にプラスミドｐＳｉｒＡＢＣにおいて単位としてクローンされ（図１）、そしてこのプラスミドはＥ．  ｃｏｌｉで大量のＳｉｒＡを発現した。この結果は、前記の膜においておそらくＳｉｒＡと相互作用する成分である、前記の輸送体の膜内外成分は、前記の膜における前記のリポタンパク質を安定化するのに寄与するかもしれないということを示唆している。
【０１９４】
実施例４：ＳｉｒＡ及びＳｉｒＢは、鉄の取り込みに関与している。
前記のＳｉｒポリペプチドは、ＡＢＣ輸送体（ＳｉｒＢ及びＳｉｒＣ）及び配位子結合タンパク質（ＳｉｒＡ）の前記の膜成分、並びに、より特異的には鉄の取り込みに関与している輸送体との類似性を共有している。鉄の取り込みにおけるｓｉｒＡＢＣの潜在的な役割を扱うために、我々は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ６３９０におけるｓｉｒＡ及びｓｉｒＢのそれぞれをコードする領域を、挿入的に不活性化するために、カナマイシン及びテトラサイクリンの耐性カセットを使用した。Ｈ３０６（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ６３９０  ｓｉｒＡ：：Ｋｍ）及びＨ４７４（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ６３９０  ｓｉｒＢ：：Ｔｅｔ）と呼称される、これらの株のそれぞれから突然変異株を、菌株を創製するために、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎに導入した。ＳｉｒＡは、Ｈ８０３（ｓｉｒＡ：：Ｋｍ）では検出されないが、前記のＨ８０４（ｓｉｒＢ：：Ｔｅｔ）突然変異株は、野性型レベルのＳｉｒＡを発現した。ＳｉｒＡよりも速く移動した、かすかに反応性があるバンドが、Ｈ８０３の細胞抽出物中に視認される。このバンドは、おそらく、使用された、前記のポリクローナル抗血清に起因するもう一つのタンパク質との交差反応性に起因するようだ。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎが、鉄を豊富に含む培地で生育した場合（図２）に、このタンパク質のバンドを視認できるので、このタンパク質のバンドは、おそらく、他の試験試料における前記のＳｉｒＡタンパク質の高レベルの発現によりマスクされている（すなわち、ＳｉｒＡの発現は、Ｅ．ｃｏｌｉ（ｐＳＥＤ４４）及びＨ６８６（ｓｂｎＥ：：Ｋｍ）において検出された。）。
【０１９５】
以前の研究では、ストレプトニグリン（ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉｎ）に対する感受性を、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓにおける鉄輸送の損失又は混乱を証明するための方法として使用された（Sebulsky et
al. (2000) J. Bacteriol. 182:4394-4400）。ストレプトニグリン（ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉｎ）が、細胞内の鉄が存在する細胞に対して毒性を示し、そして、それゆえ、鉄を移入する細胞が、一般に鉄移入が衰弱した突然変異株に比較して、この薬物の毒性作用に対してより感受性が高い（Yeowell et al. (1982) Antimicrob.
Agents Chemother. 22:961-968）。ストレプトニグリンの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）に関して、ＴＭＳ中で生育したＳ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｈ８０３又はＨ８０４の何れか一方よりも、ＴＭＳ中で生育したＳ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎのが、およそ４倍低い（図２参照）。ストレプトニグリンに対する異なる感受性は、鉄キレート剤であるＤＥＳＦＥＲＡＬｌ（登録商標）を生育培地に含めることにより克服された。このことは、このシデロフォアが、母株及び突然変異株により、同等によく使用されたことを示している。これらのデータにより、おそらく、ＳｉｒＡ及びＳｉｒＢが、鉄の細胞内への輸送に関与していたということが示された。このことに関する更なる証拠として、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎに対する２，２‘−ジピリジル（代謝されない鉄キレート剤）のＭＩＣが、Ｈ８０３及びＨ８０４の何れか一方よりも４倍高いことが立証された。
【０１９６】
ついで、ｓｉｒＡ又はｓｉｒＢの何れか一方の機能の低下と関連があるであろう生育速度における欠陥を同定するために、野性型のＮｅｗｍａｎ及びその派生物の生育は、２４−３６時間に亘り行われる。鉄を豊富に含む生育培地において、Ｈ８０３（Ｎｅｗｍａｎ  ｓｉｒＡ：：Ｋｍ）の成長は、Ｎｅｗｍａｎに比較して変わらなかった（図３Ａ差込み図）。しかしながら、Ｈ８０３は、鉄の含量が制限された培地における、Ｎｅｗｍａｎの生育に比べて、極端な生育欠陥を示した（図３Ａ）。Ｈ８０３へのプラスミドｐＳＥＤ４４（Ｐｌａｃから発現された前記のｓｉｒＡＢＣを含む；図１）の導入により、鉄の含量が制限された生育培地におけるこの菌株の生育欠陥が直された。ｐＡＷ８ベクター中のＰｌａｃプロモーターは、Ｅ．  ｃｏｌｉ中のｐＳＥＤ４４構築物から大量のＳｉｒＡを発現するが、たとえＩＰＴＧ  １ｍＭの存在下（データは示されていない）であっても、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓでは極度に少ないＳｉｒＡしか発現しない。このことは、Ｐｌａｃが機能を有するが、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓでは極めて不十分であることを示す。しかしながら、この少量のＳｉｒＡは、Ｈ８０３における前記の突然変異遺伝子を補足することができた。鉄が不足している生育培地へのＩＰＴＧ  １ｍＭの添加により、相補性が促進された（図３）。Ｎｅｗｍａｎ又はＨ８０３の何れか一方にビークルのみを導入しても、それらの成長速度に影響がなかった。（図３）
【０１９７】
我々は、前記のｓｉｒＡをコードする領域のみにより前記のｓｉｒＡ：：Ｋｍ突然変異遺伝子を補足することができなかった（下記参照）ので、我々は、下流Ｓｉｒ遺伝子の発現における前記のｓｉｒＡ：：Ｋｍ突然変異遺伝子の極性の可能性を除外しなければならかった。ＲＴ−ＰＣＲ実験により、前記のｓｉｒＡ：：Ｋｍ突然変異遺伝子が、ｓｉｒＢの発現には影響しなかったこと（データは示されていない）が実証され、そして一方、ｓｉｒＢ転写物の発現が、前記の生育培地の鉄濃度により制御されたこともまた確認された。さらに、ｓｉｒＢが、鉄欠乏条件下で生育した、ｓｉｒＢ：：Ｔｅｔ突然変異遺伝子を含む菌株であるＨ８０４では検出されなかった。なぜならば、前記のＴｅｔカセットは、前記のＰＣＲにおいて、増幅された領域を分断するからである。これらの実験では、全ＲＮＡ（５００ｎｇ）は逆転写され、そしてｓｉｒＢ及びｇａｐに対する前記のｃＤＮＡは、実施例１に記載されたように増幅された。
【０１９８】
Ｈ８０３と同様に、鉄を豊富に含む培地でのＨ８０４（Ｎｅｗｍａｎ  ｓｉｒＢ：：Ｔｅｔ）の成長は、野性型Ｎｅｗｍａｎと比較して変わるところがなかった（図３差込み図）。しかしながら、Ｈ８０３と同様に、Ｈ８０４の成長は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎと比較して、鉄が不足している生育培地で激しく損なわれた（図３Ｂ）。Ｈ８０４のこの発育の欠陥は、ｐＳＥＤ４３の前記の菌株への導入により軽減された（図３Ｂ）。なお、ｐＳＥＤ４３は、ｘｙｌ／ｔｅｔプロモーターからｓｉｒＢを発現する（図１）。前記のｘｙｌ／ｔｅｔプロモーターは、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓでは極めて漏出性であることが見出され（データは示されていない）、そして、それゆえ、野性型表現型の完全な回復をみる実験では、誘導物質（アンヒドロテトラサイクリン）を生育培地に混合することは不要であった。
【０１９９】
実施例５：ＳｉｒＡ及びＳｉｒＢの突然変異株は、スタフィロバクチン生合成ではなく、スタフィロバクチン輸送に欠失したＳ．  ａｕｒｅｕｓを生じる。
スタフィロバクチンは、前記の方法（Dale et al. (2004)
Infect. Immun. 72:29-37）を使用して、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ６３９０から単離された。精製されたスタフィロバクチンを使用して、シデロフォア  プレート  アッセイで成長促進作用を評価した。スタフィロバクチンは、容易にシデロフォア  プレート  アッセイでＳ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ  ＲＮ６３９０及びＨ２８７（ｆｈｕＧ：：Ｔｎ９１７）の成長を促進したのに対して、Ｈ３０６（ＲＮ６３９０  ｓｉｒＡ：：Ｋｍ）、Ｈ４７４（ＲＮ６３９０  ｓｉｒＢ：：Ｔｅｔ）、Ｈ８０３（Ｎｅｗｍａｎ  ｓｉｒＡ：：Ｋｍ）又はＨ８０４（Ｎｅｗｍａｎ  ｓｉｒＢ：：Ｔｅｔ）に対して、スタフィロバクチンが仲介する成長促進効果が観察されなかった。このことは、ＳｉｒＡ及びＳｉｒＢの両者が、スタフィロバクチンが仲介する鉄輸送に必須であることを示す。これらの結果を確認するために、精製されたスタフィロバクチンを５５ＦｅＣ１３と共にインキュベートし、そして輸送アッセイをＳ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ及びＨ８０３について実施した。
５５Ｆｅ−スタフィロバクチンの著しい輸送が、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎにおいて観察されたのに対して、ＦｅＣ１３を含むＴＭＳで予め生育させたＮｅｗｍａｎ、１０ｍＭ  ＫＣＮで処理されたＮｅｗｍａｎ又はＨ８０３では、ほとんど輸送が起こらなかった（データは示されていない）。総合すると、これらの結果は、スタフィロバクチン輸送が、少なくともＳｉｒＡ及びＳｉｒＢの機能を必要とする鉄により制御されたプロセスであることを立証し、そしてこの輸送が、ＡＴＰを消費する反応であるとことを示唆した。エアロバクチン（ａｅｒｏｂａｃｔｉｎ）、ＤＥＳＦＥＲＡＬ（登録商標）、及びクエン酸鉄による成長促進作用が、ｓｉｒＡ及びｓｉｒＢ突然変異株ではその効果を発揮しなかった、そしてスタフィロバクチンの存在下では成長が、前記の相補されたｓｉｒＡ：：Ｋｍ及びｓｉｒＢ：：Ｔｅｔ突然変異株において回復された（データは示されていない）。
【０２００】
少なくとも、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓの一例において、輸送システムの前記のリポタンパク質（すなわち、結合タンパク質）成分をエンコードする一つ以上の遺伝子が、前記のゲノムに見出されている。確かに、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓの多くの株における、前記の鉄−ドロキサム酸錯体（ｉｒｏｎ−ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅ）の取り込みシステムは、結合タンパク質構成成分（たとえば、ｆｈｕＤｌ及びｆｈｕＤ２）をエンコードする二つの遺伝子を除いて、前記のＡＢＣ−輸送体構成成分をエンコードする遺伝子の単コピーで構成されている（Sebulsky and Heinrichs (2001) J. Bacteriol. 183:4394-4400; Sebulsky et al. (2003) J. Biol. Chem.
278:49890-900）。ｆｈｕＤｌ及びｆｈｕＤ２の両者を含む菌株において、前記の遺伝子の一つの突然変異体は、鉄−ドロキサム酸錯体（ｉｒｏｎ−ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅ）の取り込みについて、野性型又は野性型に極めて近い型の何れか一方である表現型になる（Sebulsky and Heinrichs (2001) J. Bacteriol. 183:4394-4400）。前記のｓｉｒＡ：：Ｋｍ及びｓｉｒＢ：：Ｔｅｔの両者の突然変異体は、表現型が同等なものになるということが与えられたことから、我々は、前記の結合タンパク質（すなわち、ＳｉｒＡ）構成成分をエンコードする唯一の遺伝子、及びこの輸送システムのための前記の膜輸送体をエンコードする単コピーの遺伝子（すなわちｓｉｒＢ及びｓｉｒＣ）のみが存在すると結論した。
【０２０１】
前記のｓｂｎオペロン及び前記のｓｉｒオペロンから発現されるタンパク質の機能（すなわち、スタフィロバクチンの生合成及び取り入れ）は関連していることが与えられたことから、我々は、前記のオペロンにおける突然変異株の機能としてそれらの発現に関するどんな効果でも決定することを切望した。ｓｂｎＥの突然変異体は、スタフィロバクチン合成の欠失を生ずる（Dale et al.
(2004) Infect. Immun. 72:29-37）。しかしながら、我々は、ｓｂｎＥ機能の欠失そして、それゆえスタフィロバクチンの生合成が、ＳｉｒＡの発現に大きな影響を有うしないことを示した（データは示されていない）。必然の結果の実験において、我々は、ｓｉｒＡ又はｓｉｒＢの欠失が、スタフィロバクチンの産生の欠失又は減少を生じるかどうかについて研究した。我々は、適度に鉄が制限された培地で生育したＨ８０３が、かなりの量のスタフィロバクチンを産生したことを、分析ＨＰＬＣ及びＥＳＩ−質量分析の両方により観察した（データは示されていない）。この現象をさらに研究するために、我々は、ｌａｃＺ−ｓｂｎＨ転写融合遺伝子をＮｅｗｍａｎ、Ｈ８０３及びＨ８０４に導入した。我々は、野生型Ｎｅｗｍａｎに比べて、前記のＨ８０３及びＨ８０４遺伝子バックグラウンドにおいて、前記のｓｂｎＨ遺伝子の転写のかなりの増加を観察した（図３）。前記の融合遺伝子を含む菌株が、鉄を豊富に含む条件下で生育した場合、β−ガラクトシダーゼ活性の転写は、観察されなかった（データは示されていない）。これらの結果は、スタフィロバクチンの生合成が、このシデロフォアを輸送する能力の欠失した菌株において、おそらくは高められた鉄欠乏状態に応答する場合に促進されるかもしれないことを示唆する。
【０２０２】
実施例６：実施例７−１２のための材料及び方法
細菌菌株、プラスミド及び成長条件
実施例７−１２で使用される細菌菌株及びプラスミドは、表４に記載されている。Ｅ．  ｃｏｌｉは、ルリア−ベルターニ培地（ＬＢ培地）（Ｄｉｆｃｏ）で生育させた。鉄の取り込みの分析に直接関係していない実験の場合、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓは、Ｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）培地（Ｄｉｆｃｏ）で生育させた。トリス−ミニマル・スクシネート（Ｔｒｉｓ−ｍｉｎｉｍａｌ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）（ＴＭＳ）を記載（Sebulsky et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:53152-9）に従い調製し、そして鉄が制限されたミニマル培地（ｍｉｎｉｍａｌ  ｍｅｄｉａ）として使用した。ＴＭＳ中の遊離している鉄のレベルをさらに制限するためには、鉄キレート化合物である２，２‘−ジピリジル及びエチレンジアミン−ジ（ｏ−ヒドロキシフェノール酢酸）（ＥＤＤＨＡ）を、この明細書に示されたように添加した。必要な場合には、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）又はカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を、Ｅ．  ｃｏｌｉ株の成長のための培地に添加した。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ用には、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、ネオマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、エリスロマイシン（３μｇ／ｍｌ）及びリンコマイシン（２０μｇ／ｍｌ）を、必要に応じて成長培地に添加した。固形培地は、１．５％（ｗ／ｖ）バクトアガー（Ｂａｃｔｏ  ａｇａｒ）（Ｄｉｆｃｏ）の添加により調製された。すべての細菌の生育は、その他に記載されていないならば、３７℃で実施された。生育培地及び溶液を調製するための、鉄を含まない水は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水濾過システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）により濾過することにより調製された。
【０２０３】
組換えＤＮＡ法
標準的なＤＮＡ操作は、本質的にＳａｍｂｒｏｏｋら（Sambrook et al. (1989) Molecular
cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor）により開示された方法のように実施された。制限エンドヌクレアーゼ及びＤＮＡ修飾酵素は、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｌａｖａｌ，  Ｑｕｅｂｅｃ，  Ｃａｎａｄａ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，  Ｏｎｔａｒｉｏ，  Ｃａｎａｄａ）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，  Ｏｎｔａｒｉｏ，  Ｃａｎａｄａ）及びＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  （Ｆｌａｍｂｏｒｏｕｇｈ，  Ｏｎｔａｒｉｏ，  Ｃａｎａｄａ）から購入した。プラスミドＤＮＡは、ＱＩＡｐｒｅｐ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎｓ（ＱＩＡｇｅｎ  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、前記の製造者により記載されたようにして精製された。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓからのプラスミドの単離ために、リソスタフィン（ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ）（５０μｇ／ｍＬ）をバッファーＰ１に添加した。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓからの染色体ＤＮＡは、ＩｎｓｔａＧｅｎｅＴＭ  Ｍａｔｒｉｘ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、前記の製造者により記載されたようにして単離された。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＰｗｏＩ又はＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）の何れか一方を使用して実施された。
【０２０４】
ΔｆｈｕＣＢＧ：：ｅｒｍＢ  突然変異株の構築
ＲＮ６３９０の染色体における前記のｆｈｕＣＢＧオペロンを欠失させるために、前記のオペロンの両端に隣接するＤＮＡの二つの領域は、ＰＣＲにより前記のＲＮ６３９０染色体から増幅された。ｆｈｕＣ  上流センス（５′−ＴＴＧＡＡＴＴＣＡＡＴＡＣＣＴＣＧＡＴＧＴＡＡＧＣＡＣＧ−３′）及びｆｈｕＣ上流アンチセンス（５′−ＴＴＧＧＡＴＣＣＡＣＧＡＴＴＣＡＴＡＡＴＴＴＣＣＣＴＡＣ−３′）のプライマーを、ｆｈｕＣの７０９−ｂｐ上流フラグメントを増幅するために使用し、そして前記のｆｈｕＣオープンリーディングフレームの第一９−ｂｐを含んでいた。そして、ｆｈｕＧ下流センス（５′−ＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡＣＧＡＡＡＡＡＴＧＴＡＴＡＧＴＧＴＣ−３′）及びｆｈｕＧ下流アンチセンス（５′−ＴＴＴＣＴＡＧＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡＣＡＡＡＣ−３′）のプライマーを、前記のｆｈｕＧオープンリーディングフレームの最後の１３−ｂｐを含む、ｆｈｕＧの７１８−ｂｐ下流フラグメントを増幅するために使用した。
【０２０５】
前記のｆｈｕＣ上流フラグメントを、ＥｃｏＲ１及びＢａｍＨＩにより消化し（プライマー配列において下線を付したのが認識サイト）、そして前記のｆｈｕＧ下流フラグメントを、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩにより消化し（プライマー配列において下線を付したのが認識サイト）そして、これら二つのフラグメントを、一緒に、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩにより消化されたｐＵＣ１９にクローンした。前記の得られた構築物は、ＢａｍＨＩにより消化され、そして前記のｅｒｍＢ遺伝子を担っている、ｐＤＧ６４６からの１．６−ｋｂ  ＢａｍＨＩフラグメントが挿入された。前記の得られたプラスミド構築物を、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩにより消化し、そしてｆｈｕＣ上流及びｆｈｕＧ下流のフラグメントの間の、ｅｒｍＢを含む３０２７−ｂｐフラグメントを、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩにより消化されたｐＡＵＬ−Ａ  Ｋｍに結合して、前記のプラスミドｐΔｆｈｕＣＢＧが構築した。
【０２０６】
プラスミドｐΔｆｈｕＣＢＧを、エレクトロポレーションによりＳ．  Ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ４２２０に導入し、そして、３０℃での生育後、カナマイシン及びネオマイシンに対して耐性を示すコロニーを選択した。前記の染色体におけるプラスミド組み込みのために選別するために、カナマイシン耐性のクローンの生育温度を４２℃に変更した。エリスロマイシン及びリンコマイシンに耐性であるが、カナマイシン及びネオマイシンに感受性である細菌を選択した。ΔｆｈｕＣＢＧ：：ｅｒｍＢ突然変異遺伝子は、ＰＣＲにより確認され、そして前記の突然変異遺伝子を、次に、それぞれＨ１０７１及びＨ１０７４を構築するため、前記のＲＮ６３９０及びＮｅｗｍａｎバックグラウンドに形質導入した。
【０２０７】
相補性プラスミドの構築
前記のΔｆｈｕＣＢＧ：：ｅｒｍＢ突然変異株を相補するために、ｐＭＴＳ２０（Sebulsky et al.
(2000) J. Bacteriol. 182:4394-4400）をＢａｍＨＩにより消化し、そして、およそ４００−ｂｐの上流ＤＮＡ（前記のＦｕｒ  ｂｏｘ及びプロモーター配列を含む）を有する、生じた前記のｆｈｕＣＢＧオペロンを含む３．７−ｋｂフラグメントを、ｐＦｈｕＣＢＧを構築するために、ｐＬＩ５０のＢａｍＨＩサイトに結合させた。ｐＦｈｕＣを構築するために、プライマーｆｈｕＣＢＧ２（５′−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＡＣＡＡＧＴＴＴＣＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＣ−３′）及びｆｈｕＣアンチセンス（５′−ＴＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＴＧＴＣＡＴＧＴＴＡＡＴＴＧＴＣＣ−３′）を使用して、前記のｆｈｕＣをコードする領域プラス、ｐＦｈｕＣＢＧの場合と同じように、４００−ｂｐ上流領域を含む、１．２ｋｂ領域を増幅し、そして生じたＰＣＲ産生物をｐＬＩ５０のＢａｍＨＩサイトにクローンした。
【０２０８】
シデロフォア
フェリクロム（Ｆｅｒｒｉｃｈｒｏｍｅ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，  Ｏｎｔａｒｉｏ，  Ｃａｎａｄａ）から購入し、ＤＥＳＦＥＲＡＬ（登録商標）  （Ｎｏｖａｒｔｉｓ）として使用されているデスフェリオキサミンＢ（ｄｅｓｆｅｒｒｉｏｘａｍｉｎｅ  Ｂ）は、Ｌｏｎｄｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ，  Ｏｎｔａｒｉｏ）より入手し、エンテロバクチン（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｉｎ）は、ＥＭＣ  Ｍｉｃｒｏｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ＧｍｂＨ  （Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）より購入した。スタフィロバクチンは、前記の開示（Dale et al. (2004) J. Bacteriol. 186:8356-62）のように調製された。
【０２０９】
バイオアッセイ
シデロフォア  プレート  アッセイは、本質的に開示（Sebulsky et al. (2000) J. Bacteriol.
182:4394-4400）のように実施された。手短に言えば、１０４  ｃｅｌｌｓ／ｍＬを、鉄キレート剤としてＥＤＤＨＡ  ２５μＭを含む、溶融状態のＴＭＳ寒天培地に添加した。試験する鉄源（ＤＥＳＦＥＲＡＬ（登録商標）（５０μＭ）、フェリクロム（ｆｅｒｒｉｃｈｒｏｍｅ）（５０μＭ）、エンテロバクチン（５００μＭ）、スタフィロバクチン（５０μＭ  ＤＥＳＦＥＲＡＬ（登録商標）当量）、ヘミン（２５０μｇ／ｍＬ）、ヘモグロビン（２ｍｇ／ｍＬ）、ＦｅＣｌ３（５０ｍＭ）、又はクエン酸鉄（５ｍＭ））１０μＬを、滅菌された直径６ｍｍのペーパーディスクに加え、前記のプレートの表面に置いた。各ディスクの周りの成長輪の直径により測定される成長促進効果を、ヘム及びヘモグロビン以外については４８時間のインキュベーションで決定したが、ヘム及びヘモグロビンについては７２時間のインキュベーションで測定した。
【０２１０】
Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ株に対する２，２‘−ジピリジルの最小発育阻止濃度の決定
試験に使用した株を、予めＴＭＳで生育させ、そしてアッセイに先立ち、細胞を新たに調製したＴＭＳで洗浄した。２，２‘−ジピリジルをＴＭＳに添加し、１ｍＭから３２μＭまでの連続した濃度となるように希釈した。連続して希釈した後、５×１０４ＣＦＵ（コロニー形成単位）を各５−ｍＬ培地に接種し、そして２４時間後における成長を記録した。
【０２１１】
細菌の成長曲線
菌株を一夜ＴＭＳ中で予め生育させた。細胞をＴＭＳで洗浄し、そして５×１０４ＣＦＵを、酸で洗浄したフラスコに入れた、新たに調製したＴＭＳ  ５０ｍＬ又は２，２‘−ジピリジル  ５０μＭを補充したＴＭＳに接種した。必要な場合には、鉄が豊富に存在する条件を作り出すために、前記の培地にＦｅＣｌ３  ５０μＭを添加した。細菌の成長を、静止期に達するまで、６００ｎｍ（ＯＤ６００）における不透明度（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）を測定することにより観察した。
【０２１２】
５５Ｆｅ輸送アッセイ
シデロフォアの取り込みを、以下の修正を加えて、前記（Dale et al.
(2004) J. Bacteriol. 186:8356-62）のようにして測定した。すなわち、当該修正は、ＴＭＳのみで生育させたＲＮ６３９０ΔｆｈｕＣＢＧ：：ｅｒｍＢ（Ｈ１０７１）以外の全ての菌株を、一夜２，２‘−ジピリジル５０μＭ及び適当な抗生物質を含むＴＭＳで生育させたということである。細胞を３回ＴＭＳ中で洗浄し、そして６００ｎｍにおける不透明度２．０を常態とした。シデロフォア（ＤＥＳＦＥＲＡＬ（登録商標）  〜２００μＭ及びスタフィロバクチン〜２００μＭ）を、ニトリロ三酢酸４μＭの存在下で５５ＦｅＣｌ３（７５μＭ）と混合し、そして得られた混合物を室温で３０分間平衡状態に置いた。細胞１ｍＬに、各５５Ｆｅ−シデロフォア混合物１０μＬを加えることにより、鉄の取り込みを開始させた。様々な時点で、細胞２００μＬを採取し、ポアザイズ０．４５μＭの膜（Ｐａｌｌ  Ｇｅｌｍａｎ）上で１００ｍＭ  ＬｉＣｌで２回洗浄した。膜を乾燥し、そしてＢｅｃｋｍａｎ  ＬＳ６５００シンチレーション・システムのトリチウム・チャンネルを使用して、ＣｙｔｏＳｃｉｎｔ（登録商標）液中でカウントした。いくらかの実験では、前記の５５Ｆｅ−シデロフォア混合物による取り込みの開始に先立ち、細菌を１５分間室温で１０ｍＭシアン化カリウムに晒した。示したデータは、前記の培養物の不透明度を常態とした、輸送された５５Ｆｅのピコモルである。
【０２１３】
マウス腎臓膿瘍モデル
雌のＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（各２５ｇ）を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｃａｎａｄａ  Ｉｎｃ．より購入し、そして、ミクロアイソレーター  ケージ（ｍｉｃｒｏｉｓｏｌａｔｏｒ  ｃａｇｅ）に収容した。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ及びＮｅｗｍａｎ  ΔｆｈｕＣＢＧ：：ｅｒｍＢ  （Ｈ１０７４）を一夜ＴＳＢで生育させ、滅菌した生理的食塩水で３回洗浄し、そして１×１０８ｃｆｕ／ｍＬの懸濁液を滅菌した生理的食塩水を使用して調製した。前記の細胞懸濁液１００μＬを、その尾静脈に注射した。注射された生存可能な細菌数を、ＴＳＢ−寒天上への前記の接種を連続的に希釈したプレートにより確認した。前記の実験の過程を通して、前記のマウスをそれらのグルーミング癖及び運動機能について独自にカウントした。１というスコアは正常な機能を示し、これに対し、より高いスコアの場合、機能が変化したことを示した（結果に関しては、以下参照）。７日目、前記のマウスを安楽死させ、そして、その腎臓を無菌的に採取し、そしてＰｏｗｅｒＧｅｎ  ７００  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒを使用して、無菌のＰＢＳ＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で均質化した。ホモジェネートを連続的に希釈し、そして回収された細菌数をカウントするために、ＴＳＢ−寒天上で平板培養した。示されたデータは、マウス毎の回収されたＣＦＵの対数表示（ｌｏｇ  ＣＦＵ  ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ）である。各グループの視認できる膿瘍を呈する腎臓のパーセントの有意差を、Ｚ  ａｎｄ  Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  Ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔを使用して決定した。
【０２１４】
コンピュータ分析
ＤＮＡ配列分析及びＰＣＲオリゴヌクレオチド  プライマーのデザインを、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ  ７  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，  Ｉｎｃ．）を使用して行った。データ分析及びグラフ作成には、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ及びＳｉｇｍａｐｌｏｔ（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．）を使用した。
【０２１５】
実施例７：Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ΔｆｈｕＣＢＧ：：ｅｒｍＢ突然変異株の構築
鉄により制御されるｆｈｕＣＢＧオペロンが、すでに我々の研究室（Sebulsky et al.
(2000) J. Bacteriol. 182:4394-4400）及びＸｉｏｎｇら（Xiong et al. (2000) Microbiology 146:659-668）により同定され、そしてｆｈｕＢ又はｆｈｕＧの何れか一方における突然変異株が輸送を排除したので、前記のｆｈｕＣＢＧオペロンが、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓにおける鉄（ＩＩＩ）−ヒドロキサム酸錯体の輸送のためには必要であることが示された（Cabrera et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:1001-3; Sebulsky et al. (2000) J. Bacteriol. 182:4394-4400）。前記のオペロンは、完全なＳ．  ａｕｒｅｕｓゲノム配列に存在する（Sebulsky et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:53152-9）。モデルとしてｆｈｕシステムを使用する、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓにおける鉄（ＩＩＩ）−シデロフォア輸送メカニズムを解明するための我々の研究の一環として、我々は、ｆｈｕＣＢＧオペロン欠失を含む、Ｈ１０６８と呼称される、ＲＮ４２２０遺伝子バックグラウンドにおいてＳ．  ａｕｒｅｕｓ株を構築した（図４参照）。前記の突然変異株を、前記のＲＮ６３９０及びＮｅｗｍａｎ遺伝子バックグラウンドに、ファージ形質導入により動態化し、Ｈ１０７１及びＨ１０７４のそれぞれを構築した。
【０２１６】
実施例８：ΔｆｈｕＣＢＧ突然変異株は、鉄（ＩＩＩ）−ヒドロキサム酸錯体を利用することができない。
ｆｈｕＧ又はｆｈｕＢの何れか一方の欠失により、鉄制限下の成長にために、あらゆる鉄（ＩＩＩ）−ヒドロキサメート複合物を完全に利用できないことを示す、上記の結果と一致して、プレート  バイオアッセイにより、Ｈ１０７がＤＥＳＦＥＲＡＬ（登録商標）、フェリクロム、コプロゲン（ｃｏｐｒｏｇｅｎ）、及びエアロバクチンを利用できないことが示された。Ｈ１０７１は、前記の菌株に、ｆｈｕＣＢＧオペロンｉｎ  ｔｒａｎｓを担ったプラスミドｐＦｈｕＣＢＧを供給すると、シデロフォア  プレート  アッセイにおいて、鉄の取り込みのために、すべての前記のヒドロキサム酸錯体  シドロフォアを利用することができた（データは示されていない）。
【０２１７】
実施例９：Ｓ．  ａｕｒｅｕｓにおいて、ｆｈｕＣの突然変異株は、鉄により制限される成長欠陥を生じるが、他のｆｈｕ遺伝子の突然変異株では生じない。
我々の研究室で得られた以前の未発表の成果では、たとえば、ＲＮ６３９０  ｆｈｕＧ：：Ｔｎ９１７（Ｈ２８７）及びＲＮ６３９０  ｆｈｕＤ１：：Ｋｍ  ｆｈｕＤ２：：Ｔｅｔ（Ｈ４３１）のようなＳ．  ａｕｒｅｕｓにおけるｆｈｕの突然変異株は、鉄欠乏培地において明白な成長欠陥を有しなかったことが示された。このことは、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓの培養の上澄み液について、ヒドロキサム酸錯体についてのＣｚａｋｙ試験（Payne (1994) Detection, isolation, and characterization of siderophores, p.
329-344. In V. L. Clark and P. M.
Bavoil (ed.), Methods in Enzymology,
vol. 235. Academic Press, Inc., San
Diego, CA）が陰性であったこととも一致して、ヒドロキサム酸錯体  シドロフォアが、鉄欠乏に対応するためにＳ．  ａｕｒｅｕｓにより産生されないことを示唆している（データは示されていない）。しかしながら、驚くべきことに、我々は、野性型ＲＮ６３９０、Ｈ２８７（ＲＮ６３９０  ｆｈｕＧ）及びＨ４３１（ＲＮ６３９０  ｆｈｕＤ１  ｆｈｕＤ２）に比べて、Ｈ１０７１の成長が、鉄が不足しているＴＭＳ培地において、有意に阻止され（データは示されていない）、そして代謝されない鉄キレート剤である２，２‘−ジピリジル５０μＭを含むＴＭＳにおいても尚更阻止されること（データは示されていない）を観察した。塩化第二鉄５０μＭをＴＭＳに添加すると、Ｈ１０７１の成長が野性型のレベルまで回復した。このことは、前記の害された成長が、単に、前記の細菌が利用できる鉄のレベルに起因していることを示している（データは示されていない）。Ｈ１０７１により示された、前記の鉄により制限された成長欠陥を、前記のオペロン（ｐＦｈｕＣＢＧ）を備えているプラスミドの導入により補足することができた。しかしながら、プラスミドｐＦｈｕＣ上に存在するｆｈｕＣ  ａｌｏｎｅ  ｉｎ  ｔｒａｎｓが、Ｈ１０７１株における鉄により制限された成長欠陥を補足したという観察は、より驚きであった。このことは、Ｈ１０７１の成長欠陥は、ｆｈｕＣを発現できない結果であったことを示していた。５５Ｆｅ−ＤＥＳＦＥＲＡＬ（登録商標）取り込みアッセイを行い、そして前記のアッセイにより、Ｈ１０７１が５５Ｆｅ−ＤＥＳＦＥＲＡＬ（登録商標）を輸送する能力がないこと（データは示されていない）、そしてバイオアッセイの結果を確証したこと（上記参照）が示された。しかしながら、注目すべきは、ｐＦｈｕＣがＨ１０７１の成長欠陥を補足できたが、それが５５Ｆｅ−ＤＥＳＦＥＲＡＬ（登録商標）を輸送するＨ１０７１の能力を回復できなかった（データは示されていない）という観察であった。そして、ＦｈｕＢ及びＦｈｕＧがまた鉄（ＩＩＩ）−ヒドロキサム酸錯体の取り込みために必要とされること（Cabrera et al. (2001) Appl. Environ.
Microbiol. 67:1001-3; Sebulsky et al. (2000) J. Bacteriol. 182:4394-4400）を示した、以前の結果を確証した。しかし、また、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓにおける鉄により制限される成長のために必要とされる一つである、補足的な鉄（ＩＩＩ）−シデロフォア輸送システムが、Ｈ１０７１では妨げられたことを示した。
【０２１８】
期待されたように、そしてｆｈｕＢ（Cabrera et al. (2001) Appl. Environ.
Microbiol. 67:1001-3）でもｆｈｕＧ（Sebulsky et al. (2000) J. Bacteriol.
182:4394-4400）でもないノックアウト株が、ヒドロキサム酸錯体型のシデロフォアを利用できることを示す、以前の結果と一致して、前記のΔｆｈｕＣＢＧ：：ｅｒｍＢ突然変異株は、シデロフォア  プレート  アッセイ及び輸送アッセイの両方により示されたように、鉄（ＩＩＩ）−ヒドロキサム酸錯体を輸送できなかった、そしてこの欠陥は、ｆｈｕＣＢＧ  ｉｎ  ｔｒａｎｓの導入により完全に補足された。前記のΔｆｈｕＣＢＧ：：ｅｒｍＢ突然変異株が、ＴＭＳ培地のみで鉄依存の成長欠陥示したことは、驚くべきことである。とすれば、ｆｈｕＧ、又はｆｈｕＤ１及びｆｈｕＤ２の両者の何れかを欠失した株は、野性型ＲＮ６３９０に比べて、同じような条件下でのあらゆる測定できる成長欠陥を示さない。Ｈ１０７１へのｆｈｕＣの導入により、前記の成長欠陥は回復されたが、鉄（ＩＩＩ）−ヒドロキサム酸錯体を利用する能力は回復しなかったという我々の観察からすると、内在性鉄取り込みシステムは、前記の突然変異株では損なわれたことが提案された。
【０２１９】
実施例１０：ＦｈｕＣは、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓにおける鉄（ＩＩＩ）−スタフィロバクチン輸送には必要とされる。
ＦｈｕＣ（Sebulsky et al.
(2000) J. Bacteriol. 182:4394-4400）は、ＡＴＰａｓｅと意味深長な類似性を共有し、そしてＡＴＰ結合タンパク質（Holland and Blight (1999) J. Mol. Biol. 293:381-99）の、すべての特徴（標示配列）を備えている。前記のＳ．  ａｕｒｅｕｓゲノムの分析から、予言された産生物は、鉄（ＩＩＩ）−シデロフォアＡＢＣ−型輸送体及び鉄（ＩＩＩ）−シデロフォア結合タンパク質との意味深長な類似性を共有する、いくつかのオペロンが同定された。しかしながら、ＳｉｒＡＢＣ、ＩｓｄＥＦ及びＳＡ１９７７−ＳＡ１９７９（Ｎ３１５ゲノムという名称を使用する）という、少なくとも三つのこれらの推定上のオペロンは、予言された産生物がＡＢＣ−型輸送体のＡＴＰａｓｅ構成成分との類似性を共有する遺伝子に欠けている。それゆえ、鉄が制限された条件下での成長に必要とされる鉄複合物を輸送するために、ＦｈｕＣが、これらの他のＳ．  ａｕｒｅｕｓ  ＡＢＣ輸送体の一つ又はそれより多い輸送体と相互に作用することが、可能である。我々の以前の研究では、鉄が制限された条件下で成長が損なわれた表現型を示し、そして我々が示した、ＳｉｒＡ及びＳｉｒＢ突然変異株の表現型が、鉄（ＩＩＩ）−スタフィロバクチンの輸送に必要とされたことが特徴づけられた（Dale et al.
(2004) J. Bacteriol. 186:8356-62）。それゆえ、我々は、５５Ｆｅ−スタフィロバクチン輸送アッセイで、スタフィロバクチンを利用する能力について、Ｈ１０７１を試験した。それゆえ、これらの結果から、Ｈ１０７１が、スタフィロバクチンを利用できないことが示された（図５、差込図）。そのうえ、ｐＦｈｕＣＢＧを有するこの突然変異株及び、最も明白にはｐＦｈｕＣのみの相補性は、きわだったスタフィロバクチンの輸送を結果として生じた（図５）。このことは、ＦｈｕＢ及びＦｈｕＧが、スタフィロバクチンの輸送に関与していないこと、そしてＳｉｒＡＢＣ（ＳｉｒＡ、結合タンパク質、ＳｉｒＢ及びＳｉｒＣ、パーミアーゼ）（Dale et al. (2004) J.
Bacteriol. 186:8356-62; Heinrichs et al. (1999) J. Bacteriol. 181:1436-1443）と共に、ＦｈｕＣ（前記のＡＴＰａｓｅとして）が、スタフィロバクチンの輸送に関与していることを示している。前記の輸送アッセイの１０分間という時間枠では観察されなかったが、我々は、プラスミドｐＦｈｕＣによる相補性と比較して、ｐＦｈｕＣＢＧにより相補されたＨ１０７１によりスタフィロバクチンの利用についての４８時間継続プレート  バイオアッセイにおいて、より小さな成長ゾーンを再現性よく観察した。
【０２２０】
我々は、この観察を、前者におけるＦｈｕＢ及びＦｈｕＧタンパク質の発現が、ＦｈｕＣをＦｈｕＣＢＧ膜複合体に隔離し、ＳｉｒＡＢＣとＦｈｕＣとの間の起こりうる相互作用の可能性を減らし、そして、それゆえ鉄（ＩＩＩ）−スタフィロバクチンを輸送する能力を減らしてしまう可能性に起因すると考える。しかしながら、我々は、ｐＦｈｕＣＢＧにより相補された前記の株における、前記の減少したスタフィロバクチンの利用が、ｐＦｈｕＣにより相補された前記の菌株に比べて、この構築物からのＦｈｕＣのより乏しい発現に起因しているという比較的少ない可能性を除外することができない。両方の構築物からのＦｈｕＣの発現は、同一の上流配列により支配され、そして前記の株が同一条件下で生育した場合、ＦｈｕＣの発現が、明白に両方の構築物から同等であったことが事実らしい。
【０２２１】
実施例１１：ＦｈｕＣは、補足的な鉄輸送体と相互に作用する。
我々は、以前にＳ．  ａｕｒｅｕｓ  ｓｉｒＡ突然変異株が、スタフィロバクチンを輸送できないこと（Dale et al. (2004) J. Bacteriol. 186:8356-62）、及びこの突然変異株が鉄欠失成長の表現型を表すことを示した。しかしながら、Ｈ１０７１におけるｆｈｕＣの欠失（Ｈ１０７１は、ｆｈｕＣＢＧについて消されるが、プラスミドｐＦｈｕＣが前記の株における前記の成長欠陥を補足することを呼び起こす。）は、ｓｉｒＡ又はｓｉｒＢ突然変異株よりも鉄不足への反応において弱められた成長欠陥を生ずる（Dale et al. (2004) J. Bacteriol. 186:8356-62）。確かに、鉄取り込みの突然変異株の成長を可能にするに十分な汚染された鉄を含む、たとえば、ＴＭＳのような鉄が制限された培地を我々が使用すること、及び代謝されない鉄キレート剤である２，２‘−ジピリジルの濃度を増やす能力は、様々な異なる鉄輸送体の寄与を分割するための機会を我々に提供する。ＴＭＳに２，２‘−ジピリジル５０μＭを添加すると、野性型に比べて、Ｈ１０７１の成長が減少し、これに対して、ＴＭＳ中の２，２‘−ジピリジルの濃度が１００μＭ以上である場合、Ｈ３０６（ＲＮ６３９０  ｓｉｒＡ：：Ｋｍ）及びＨ４７４（ＲＮ６３９０  ｓｉｒＢ：：Ｔｅｔ）のみが、同等な成長の減少を示した（Dale et al.
(2004) J. Bacteriol. 186:8356-62）。以前の記載された結果と共に、これらの観察から、スタフィロバクチンを輸送するために、ＦｈｕＣがＳｉｒＡＢＣと相互に作用することばかりでなく、ＦｈｕＣが、今のところまだ決定されていない鉄キレートの輸送を許す補足的な輸送体ともまた相互に作用することが示唆される。ＦｈｕＣが前記の輸送に関与することができる補足的な鉄キレートを決定するための試みにおいて、エンテロバクチン、クエン酸鉄（ＩＩＩ）、へミン及びヘモグロビンを含む、可能性のある鉄の供給源の範囲を使用して、Ｈ１０７１によるプレート  バイオアッセイを利用した。これらの条件下で、Ｈ１０７１は、これらの追加の鉄の供給源のいずれの利用においても際立って害されなかった（データは示されていない）。
【０２２２】
これらの結果に基づくと、ＦｈｕＣが、鉄（ＩＩＩ）−ヒドロキサム酸錯体  シドロフォア及び今のところ構造的に特徴付けられていないスタフィロバクチン  シデロフォアの輸送のために必要とされることは、明らかである。、前記のデータは、また、ＦｈｕＣが、おそらく補足的な鉄取り込みシステム（すなわち、ｆｈｕ及びｓｉｒをエンコードするシステムに加えて）の輸送に関与しているという結論を支持する。このことは、前記のΔｆｈｕＣＢＧ突然変異株により示された、前記の鉄が制限された成長欠陥が、鉄の濃度が低い条件下における成長の間における、ｓｉｒＡ又はｓｉｒＢ突然変異株の何れか一方のそれよりも厳しいという観察に基づいている。目下、ｆｈｕＣの欠失により影響される前記の補足的な経路の正体は不明であるが、前記のｆｈｕＣＢＧ突然変異株は、バイオアッセイにおいて、ＲＮ６３９０と同等のレベルで、へミン、ヘモグロビン、クエン酸鉄及び前記のカテコール  シデロフォア  エンテロバクチンをやはり利用できた。このことは、ｆｈｕＣの欠失は、これらの供給源から鉄を獲得する、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓの能力に影響しないことを立証した。これらの輸送体と遺伝子的にリンクしていない、ＡＴＰａｓｅ構成成分を供給するために、ＦｈｕＣが、ＩｓｄＥＦ又はＳＡ１９７７−１９７９の一方又は両者と相互に作用することを推測するように誘われる。前記のｉｓｄ遺伝子座によりエンコードされたタンパク質は、宿主の鉄複合体（Mack et al.
(2004) Biochem. Biophys. Res. Commun.
320:781-8; Mazmanian et al. (2003) Science 299:906-9; Skaar and Schneewind.
(2004) Microbes Infect. 6:390-7）及び鉄が制限された成長欠陥を立証するために使用された、前記のＴＭＳ実験室用培地中に存在しなかった複合体との相互作用に関わった。それゆえ、Ｈ１０７１は、野性型に比べて、ヘム又はヘモグロビンの取り込みにおいて損なわれないということを発見したことは、驚くべきことではない。ＳＡ１９７７−１９７９を取り囲む遺伝子領域は、推定上の産生物がシデロフォア  生合成酵素との類似性を共有する、いくつかのオープンリーディングフレームを含み、そして、それゆえ、Ｈ１０７１におけるＦｈｕＣの欠失が、もう一つのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  シデロフォアの産生にはこの遺伝子座の中での遺伝子の発現を必要とする、もう一つのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  シデロフォアの利用を終わらせることは事実かもしれない。
【０２２３】
実施例１２：ΔｆｈｕＣＢＧ：：ｅｒｍＢ突然変異株は、マウス腎臓膿瘍モデルにおける変更された病原性プロファイルを示す。
我々は、以前に、シデロフォア生合成が、マウス腎臓膿瘍モデルにおけるＳ．  ａｕｒｅｕｓの毒性のためには重要であることを示した（Dale et al.
(2004) Infect. Immun. 72:29-37）。我々は、Ｈ１０７１（ＲＮ６３９０  ΔｆｈｕＣＢＧ：：ｅｒｍＢ）が、スタフィロバクチン取り込みのために屈従させられたことを示したので、我々は、この突然変異株が、また、このモデルシステムにおいて弱められるかどうか決定することに興味をもった。７匹のＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスからなるグループに、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ又はＨ１０７４（Ｎｅｗｍａｎ  ΔｆｈｕＣＢＧ：：ｅｒｍＢ）１０７ＣＦＵを前記のマウスの尾静脈を経由して接種し、そしてそのマウスを、グルーミング癖及び運動機能について毎日観察した。毎日、前記のマウス毎に、それらの相対的な健康状態を反映する主観的なスコアをつけた。たとえば、スコア１をつけられたマウスは、グルーミング癖及び運動機能について正常であり、これに対し、スコア４をつけられたマウスは、完全に死にかけていた。前記の実験の終了点（Ｎｅｗｍａｎを感染された一匹のマウスが第６日目に死亡した。）以前の死を説明するため、我々は、最終の臨床スコアに達するまでに生存していた日数で臨床スコアを割った。Ｈ１０７４を注射されたマウスは、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎを注射されたマウスよりも暗示的に死にかけていなかった（図５、それぞれ１．８対して２．７であり、完全に健康なマウスの臨床スコアは、１．４であった。）。第７日目、マウスを犠牲にし、そして腎臓を採取し、そして膿瘍の形成を評価した。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎを注射したマウスから採取された１４個の腎臓中、８個の腎臓に膿瘍が形成された（５７％）が、これに対してＨ１０７４を注射したマウスから除去された１４個の腎臓中、２個の腎臓のみに膿瘍の形成（１４％）が視認できた。これらの結果について、Ｚ−Ｔｅｓｔ及びＦｉｓｈｅｒ’ｓ  Ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔを使用して、非常に有意であること（ｐ＜０．０００１）が示された。しかしながら、興味深いことに、全細菌数をカウントするために腎臓ホモジェネートをプレート上に置いたとき、Ｎｅｗｍａｎ又はＨ１０７４を注射されたマウスの間で、腎臓における細菌ロードにおいて有意差はなかった（データは示されていない）。
【０２２４】
これらの結果から、野性株に比べて、前記の突然変異株Ｈ１０７４が、前記の腎臓における細菌ロードが減少することなく、腎臓膿瘍を引き起こすことにおいて極めてより低いし、そして体重の減少がより少ないので、Ｎｅｗｍａｎ親株に比べて、Ｎｅｗｍａｎ  ΔｆｈｕＣＢＧ：：ｅｒｍＢ株の病原性が変化したことが立証された。これらの結果から、ＦｈｕＣＢＧを発現するための潜在能力がないことが（前記のｆｈｕ遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏにおける発現は、今までのところでは立証されていなかったが、それらのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける鉄により制御された発現プロファイルに基づいて推定される。）、ｉｎ  ｖｉｖｏで生存するための細菌の能力に影響を与えないが、より重篤な感染症を引き起こす潜在能力を減じたようであることが示された。これらの結果は、Ｎｅｗｍａｎ  ｓｂｎＥ：：Ｋｍ突然変異株（スタフィロバクチン  シデロフォアを産生することができない）感染後第６日目における腎臓における細菌数が減少したという以前の結果とは対照的である。少なくともこのモデルシステムにおいて、ＦｈｕＣＢＧの発現が、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓの前記の完全な発病力の潜在能力に必要とされるようであるという事実は、Ｎ３１５及びＭＲＳＡ２５２のゲノムには存在しないＦｈｕＤ１とは対照的に、現在までに配列が決定されたすべてのＳ．  ａｕｒｅｕｓのゲノム（Sebulsky et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:53152-9）内のこのオペロンの保存と一致している。
【０２２５】
実施例１３：相互作用のアッセイ
Ｓｉｒポリペプチド、スタフィロバクチン及び／又はＦｈｕＣの相互作用を妨げる薬剤をスクリーニングするアッセイを、以下の様にして実施するであろう。高タンパク質吸収能を備えた９６ウエルのミクロプレートを、ストレプトアビジンにより一回ＰＢＳバッファー（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ６．８）中で３０μｇ／ｍｌの濃度で、４℃で一夜コーティングするであろう。前記の溶液を除いた後に、前記のプレートを、室温で一時間又はそれより多い時間、ＰＢＳバッファー中で２％ＢＳＡによりブロックするであろう。それから、前記のプレートを洗浄し、そして前記のアッセイに使用するであろう。たとえば、試験薬剤の非存在下又は存在下で、ビオチン化されたＳｉｒＡ及びＳｉｒＢを、室温で４５分間から６０分間、インキュベートするであろう。水で３回洗浄後、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）又は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の何れか一方と結合した第二抗体と混合した抗Ｓｉｒ抗体を添加し、１時間インキュベートするであろう。それから、前記のプレートを遊離した抗体の複合体から、結合した抗体複合体を分離するために洗浄されるであろう。結合した抗体を検出するために、化学発光基質（アルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼ用のＳｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  ｌｕｍｉｎｏｌ溶液（Ｐｉｅｒｃｅより市販））を使用するであろう。ミクロプレート  ルミノメーター（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）を使用して、化学発光シグナルを検出するであろう。前記のシグナルが検出されない場合、試験薬剤がｓｉｒＢに対するｓｉｒＡの結合を阻害又は分断することを示すであろう。同じようなアッセイを、ｓｉｒＡ及びｓｉｒＣ、ｓｉｒＢ及びｓｉｒＣ、及び／又はｓｉｒＡ、ｓｉｒＢ、ｓｉｒＣ、スタフィロバクチン及び／又はＦｈｕＣの相互作用を分断する薬剤を同定するためにも実施してもよい。
【０２２６】
実施例１４：鉄輸送アッセイ
Ｓ．  ａｕｒｅｕｓの鉄輸送システムを分断する薬剤をスクリーニングするためのアッセイを、以下の様にして実施するであろう。野性型Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ細胞及びＳｉｒＡ欠失Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ細胞をｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）（Ｄｉｆｃｏ）で培養するであろう。各株のおよそ１０７コロニー形成単位を、試験薬剤の存在下又は非存在下で、ＦｅＣ１３  ５０μＭを含む、新たに調製したＴＭＳ培地に接種する以前に、細胞を洗浄するであろう。後期静止期になるまで、細菌の成長をクレット・メーター（Ｋｌｅｔｔ  ｍｅｔｅｒ）を使用して観察するであろう。
【０２２７】
ＳｉｒＡ欠失細胞ではない、野性型のＳ．  ａｕｒｅｕｓ細胞の成長速度を変える試験薬剤は、おそらく細胞内の鉄が存在する細胞に対して毒性を示し、そして、それゆえ、鉄を取り込む細胞は、一般に、鉄の取り込みに関して弱められた突然変異株に比べて、この薬剤の毒性効果により高い感受性を示す。
【０２２８】
同様な輸送アッセイを、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ及び／又はＦｈｕＣ−欠失細胞を使用して、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ及びＦｈｕＣについて実施してもよい。
【０２２９】
実施例１５：発現アッセイ
Ｓ．  ａｕｒｅｕｓのＳｉｒＡの発現を分断する薬剤をスクリーニングするためのアッセイを、以下の様にして実施するであろう。試験薬剤の存在下又は非存在下で野性型Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ細胞を、ｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）（Ｄｉｆｃｏ）中で、一夜培養するであろう。２４時間の培養後、前記の細胞をＰＢＳ（リン酸バッファー食塩水）×１回で洗浄し、それからＳＴＥ（０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ  ８．０］、１ｍＭ  ＥＤＴＡ［ｐＨ８．０］）中でリゾスタフィン（Ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ）１０μｇを使用して３７℃で溶菌した。それから、前記の細胞溶解物を、抗ＳｉｒＡ抗体を予めコーティングしたプレートに移し、そして室温で４５分間から６０分間インキュベートするであろう。対照として、未処理のＳ．  ａｕｒｅｕｓ細胞溶解物を使用するであろう。水で３回洗浄後、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）又は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の何れか一方と結合した第二抗体を添加し、１時間インキュベートするであろう。それから、前記のプレートを、遊離した抗体の複合体から、結合した抗体複合体を分離するために洗浄されであろう。結合した抗体を検出するために、化学発光基質（アルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼ用のＳｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  ｌｕｍｉｎｏｌ溶液（Ｐｉｅｒｃｅより市販））を使用するであろう。ミクロプレート  ルミノメーター（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）を使用して、化学発光シグナルを検出するであろう。試験薬剤で処理された細胞から得られた細胞溶解物の試料において、前記のシグナルが検出されない場合、前記の試験薬剤がｓｉｒＡの発現を阻害することを示すであろう。同じようなアッセイを、ｓｉｒＢ、ｓｉｒＣ、スタフィロバクチン及び／又はＦｈｕＣについても実施するであろう。
【０２３０】
本発明の実施は、他に示されていなければ、当該技術分野の技術者の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の一般に行われている技術を採用するであろう。前記の技術は、文献に記載されている。
たとえば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.,
ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press:
1989);
DNA Cloning, Volumes I and II (D.
N. Glover ed., 1985);
Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984);
Mullis et al.
U.S. Patent No: 4,683,195;
Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S.
J. Higgins eds. 1984);
Transcription And Translation (B. D. Hames & S.
J. Higgins eds. 1984);
Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan
R. Liss, Inc., 1987);
Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986);
B.
Perbal, A Practical Guide To Molecular
Cloning (1984);
the
treatise, Methods In Enzymology (Academic
Press, Inc., N.Y.);
Gene Transfer Vectors For Mammalian
Cells
(J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory);
Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.),
Immunochemical Methods In Cell And
Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987);
Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M.
Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986);
Antibodies:
A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. (1987)),
Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)を参照されたい。
【特許文献４１】米国特許第４，６８３，１９５号
【０２３１】
表１：実施例２−５で使用された細菌株及びプラスミド
【表１】
2008510793.tif 000007
2008510793.tif 000008
2008510793.tif 000009
a略語：Cmr, Tetr, Emr, Kmr, Ampr：それぞれ、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、エリスロマイシン、カナマイシン及びアンピシリンに対する耐性を示す。
b制限エンドヌクレアーゼ認識サイトに下線を付した。
1Sebulsky et al.
(2000) J. Bacteriol. 182:4394-4400
2Dale et al. (2004) Infect. Immun. 72:29-37
3Sebulsky et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:49890-900.
4Chakraborty et al. (1992) J. Bacteriol. 174:568-574
5Guerout-Fleury et al. (1995) Gene 167:335-336
6Vaguer et al. (1998) Microbiology 144:3097-3104
【０２３２】
表２：Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ及びその誘導体に対するストレプトニグリン（ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉｎ）及び２，２‘−ジピリジルの最小阻止濃度（ＭＩＣ）
【表２】
2008510793.tif 000010
a細菌をＴＭＳで生育させた。
b決定されていない。
【０２３３】
表３：鉄が制限された培地で生育したNewman及びその誘導体におけるsbn-lacZ
融合タンパク質からのβ−ガラクトシダーゼ活性
【表３】
2008510793.tif 000011
値は、３回、すなわち３回の培養についてのアッセイからの平均値を示す。
【０２３４】
表４：実施例７−１２で使用された細菌菌株及びプラスミド
【表４】
2008510793.tif 000012
a略号：Apr、Cmr、Emr、Kmr、Tetrは、それぞれ、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性を示す。
1Kreiswirth et al. (1983) Nature 305:680-685.
2Peng et al. (1988) J. Bacteriol. 170:4365-4372.
3Duthie and Lorenz (1952)
J. Gen. Microbiol. 6:95-107.
4Sebuskly et al. (2000) J. Bacteriol. 182:4394-4400.
5Sebuskly and Heinrichs
(2001) J. Bacteriol. 183:4994-5000.
6Chakraborty et al. (1992) J. Bacteriol. 174:568-574.
7Guerout-Fleury et al. (1995) Gene 167:335-336.
8Lee (1992) Mol. Microbiol. 6:1515-1522.
9Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning. A
laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor.
【０２３５】
表５：Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ及びＨ１０７４を感染させたマウスの臨床上の特性
【表５】
2008510793.tif 000013
aA/A：両方の腎臓に膿瘍を視認。A/-：片方の腎臓に膿瘍を視認。-/-：どちらの腎臓にも膿瘍が視認されない。
b臨床上のスコアは、全実験過程におけるグルーミング癖及び運動機能に基づいており、マウスの生存日数に対して基準とした。
cマウスは、極端な病的状態のため、第６日目に犠牲にした。
d平均は、平均値±標準誤差である。
【０２３６】
引用による援用
あたかも各出版物又は特許が明確にかつ個々に引用により編入されていると示されるように、ここに引用された出版物及び特許の全文を、引用をもってここに援用する。抵触する場合には、ここに示されたあらゆる定義を含む本出願が制御するであろう。
【０２３７】
均等物
当業者は、ここに記載した本発明の特定の実施態様に対する均等物を認めるであろうし、又はわずかの決まりきった実験を使用して確認することができるであろう。前記の均等物は、次のクレームにより包含されるように意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０２３８】
【図１】図１は、ｓｂｎ−ｓｉｒＡＢＣ座の遺伝子的組織を示す。ｓｂｎオペロン（ｓｂｎＡ）の第一の遺伝子だけでなく、ｓｉｒオペロンの三つの読み枠（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）が示されている。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎバックグラウンドにおいて、Ｈ８０３株及びＨ８０４株をそれぞれ発生する、ｓｉｒＡ及びｓｉｒＢをコードする部位を分断するために使用される、前記の挿入部位の位置が示されている。ｓｉｒＢ：：ｔｅｔ及びｓｉｒＡ：：Ｋｍミュテーションの相補性のために使用されたプラスミドｐＳＥＤ４３及びｐＳＥＤ４４が、それぞれ示されている。
【図２】図２は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ及びｆｕｒ：：Ｋｍ誘導体におけるＳｉｒＡの鉄又はＦｕｒにより制御された発現を示す免疫ブロットである。細胞は、鉄が豊富な培地（ＴＳＢ，ＴＭＳ＋Ｆｅ）か又は鉄が制限されたな培地（ＴＭＳ，ＴＭＳ＋Ｄｉｐ）のうちどちらか一方で培養され、光学的濃度により標準化され、そして溶菌された。ＳｉｒＡが、細胞溶解物中でＳｉｒＡを指向するウサギポリクローナル抗血清により検出された。
【図３】図３は、２，２‘−ジピリジル  ２５０μＭ及び５０μＭ  ＦｅＣｌ３  （差し込み図）又は２，２‘−ジピリジル  ２５０μＭを含むＴＭＳ培地中で、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ、対ｓｉｒＡ：：Ｋｍ突然変異株誘導体（Ａ）又はｓｉｒＢ：：Ｔｅｔ突然変異株誘導体（Ｂ）の生育を比較するグラフである。  ■は、Ｎｅｗｍａｎを、  □は、Ｈ８０３（ｓｉｒＡ：：Ｋｍ）を、  ▲は、ｐＡＷ８ベクターを備えたＮｅｗｍａｎを、  rは、ｐＡＷ８を備えたＨ８０３を、  ◆は、ＩＰＴＧを存在させずに生育させた、ｐＳＥＤ４４を備えたＨ８０３を、  ◇は、ＩＰＴＧ  １ｍＭを存在下で生育させた、ｐＳＥＤ４４を備えたＨ８０３を、  ○は、Ｈ８０４（ｓｉｒＢ：：Ｔｅｔ）を、  ▼は、ｐＳＥＤ４３を備えたＨ８０４を示す。データは、３回の実験の代表である。
【図４】図４は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ６３９０のゲノムにおけるｆｈｕＣＢＧの対立遺伝子の置換を示す模式図である。ｆｈｕＣＢＧ、ｆｈｕＣ‘及び’ｆｈｕＧのフランキング領域を、ＲＮ６３９０染色体から増幅し、ｅｒｍＢの何れか一方の端に結合し、温度感受性シャトルベクターｐＡＵＬ−Ａ−Ｋｍにクローンした。この構築物は、相同的組換えにより、ＲＮ４２２０ゲノムにおけるｅｒｍＢによるｆｈｕＣＢＧの置換を可能にする。ファージ形質導入は、菌株Ｈ１０７１及びＨ１０７４のそれぞれを構築するために、前記のＲＮ６３９０及びＮｅｗｍａｎバックグラウンドへ、前記の突然変異株を動員するために使用された。適切なＤＮＡフラグメントのサイズが示されている。
【図５】図５は、２，２’−ジピリジル  ５０μＭを含むＴＭＳ培地で生育したＳ．  ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ６３９０及びＨ１０７１誘導体における、５５Ｆｅ−スタフィロバクチンにより仲介される鉄輸送を示すグラフである。  ●，ＲＮ６３９０；  ○，Ｈ１０７１＋ｐＦｈｕＣ；  q，Ｈ１０７１＋ｐＦｈｕＣＢＧ，  ＲＮ６３９０（s），  Ｈ１０７１＋ｐＦｈｕＣ（■）及びＨ１０７１＋ｐＦｈｕＣＢＧ（□）は、すべてアッセイに先立ち、１５分間ＫＣＮ  ２０ｍＭで処理した。  差し込み図：プラスミドを補足しないと、菌株Ｈ１０７１は、２，２’−ジピリジルの存在下ではよく生育しないので、２，２’−ジピリジルを含まないＴＭＳ培地中で実施されたアッセイに先立ち、菌株（◆，ＲＮ６３９０；◇，Ｈ１０７１）を生育させた。しかしながら、ＲＮ６３９０は、２，２’−ジピリジル  ５０μＭの存在下で生育した場合と、この実験における鉄が不足した条件下とは同様ではない。実験の終了点では、アッセイ混合物から２×１０８細胞により輸送された５５Ｆｅのピコモル（ｐｍｏｌ）を示す。
【図６】図６は、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＦ０７９５１８  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に対応するＳｉｒＡＢＣオペロン核酸配列及びその逆相補性（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を示す。
【図７】図７は、（Ａ）前記の核酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、（Ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の逆相補性（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）及び（Ｃ）ＳｉｒＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）のアミノ酸配列を示す。
【図８】図８は、（Ａ）前記の核酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、（Ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の前記の逆相補性（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）及び（Ｃ）前記のＳｉｒＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）のアミノ酸配列を示す。
【図９】図９は、（Ａ）前記の核酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、（Ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の前記の逆相補性（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）及び（Ｃ）ＳｉｒＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）の前記のアミノ酸配列を示す。
【図１０】図１０は、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＦ２５１２１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）に相当するＦｈｕＣＢＧオペロンの核酸及び前記の逆相補性（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）を示す。
【図１１】図１１は、（Ａ）前記の核酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、（Ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の前記の逆相補性（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）及び（Ｃ）ＦｈｕＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）の前記のアミノ酸配列を示す。
【図１】
2008510793.tif 000014
【図２】
2008510793.tif 000015
【図３】
2008510793.tif 000016
【図４】
2008510793.tif 000017
【図５】
2008510793.tif 000018
【図６Ａ】
2008510793.tif 000019
【図６Ｂ】
2008510793.tif 000020
【図７】
2008510793.tif 000021
【図８】
2008510793.tif 000022
【図９】
2008510793.tif 000023
【図１０Ａ】
2008510793.tif 000024
【図１０Ｂ】
2008510793.tif 000025
【図１１】
2008510793.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成18年7月27日(2006.7.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）薬剤の存在下、及び前記薬剤の非存在下で前記二つのタンパク質間の相互作用を許容する条件下で、前記二つのタンパク質を接触させることと、
（ｉｉ）前記薬剤の非存在下に比べて、前記薬剤の存在下における、二つのタンパク質間の異なるレベルの相互作用が、前記薬剤が前記二つのタンパク質の間の前記相互作用を阻害することを示す点において、前記の二つのタンパク質間の相互作用の前記レベルを決定すること
を包含する、Ｓｉｒタンパク質、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）及びＦｈｕＣからなる群から選ばれるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ）のタンパク質と、前記の群のもう一つの構成員との間の相互作用を阻害する薬剤を同定する方法。
【請求項２】
前記の薬剤が、ＳｉｒＡとＳｉｒＢとの間の相互作用を阻害する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記の薬剤が、ＳｉｒＡとＳｉｒＣとの間の相互作用を阻害する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記の薬剤が、ＳｉｒＢとＳｉｒＣとの間の相互作用を阻害する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記の薬剤が、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）とＳｉｒタンパク質との間の相互作用を阻害する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
（ｉ）鉄を豊富に含む培地でｓｉｒ欠失Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株及び野生型Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株を培養することと、
（ｉｉ）前記野生型菌株の生育における、より大きい減少が、前記薬剤がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓにおける鉄の取り込みを阻害することを示す点において、前記薬剤と前記菌株と接触させ、そして前記野性型株及び前記ｓｉｒ欠失株の生育を比較すること
を包含するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓにおける鉄の取り込みを阻害する薬剤を同定する方法。
【請求項７】
前記ｓｉｒ欠失菌株が、ｓｉｒＡ欠失菌株である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記ｓｉｒ欠失菌株が、ｓｉｒＢ欠失菌株である、請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記ｓｉｒ欠失菌株が、ｓｉｒＣ欠失菌株である、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
（ｉ）鉄を豊富に含む培地でＦｈｕＣ欠失Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株及び野生型Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株を培養することと、
（ｉｉ）前記薬剤と前記菌株と接触させ、そして前記野性型菌株の生育における、より大きい減少が、前記薬剤がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓにおける鉄の取り込みを阻害することを示す点において、前記野性型菌株及び前記ＦｈｕＣ欠失菌株の生育を比較すること
を包含するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓにおける鉄の取り込みを阻害する薬剤を同定する方法。
【請求項１１】
前記鉄の取り込みが、原子吸光分析により決定される、請求項６又は請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記鉄の取り込みが、放射能を有する鉄により決定される、請求項６又は請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記放射能を有する鉄が、５９Ｆｅである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記放射能を有する鉄が、５５Ｆｅである、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
（ｉ）前記薬剤の存在下又は非存在下で野生型Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株を培養することと、
（ｉｉ）前記薬剤で処理された細胞における前記ポリペプチドの発現のより大きな減少が、前記薬剤がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓにおける前記ポリペプチドの発現を阻害することを示す点において、前記ポリペプチドの発現を比較すること
を包含する、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株におけるＳｉｒタンパク質、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）及びＦｈｕＣからなる群から選ばれるポリペプチドの発現を阻害する薬剤を同定する方法。
【請求項１６】
前記Ｓｉｒタンパク質が、ＳｉｒＡである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｓｉｒタンパク質が、ＳｉｒＢである、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｓｉｒタンパク質が、ＳｉｒＣである、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
（ｉ）前記薬剤の存在下又は非存在下で野生型Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株を培養することと、
（ｉｉ）前記薬剤で処理された細胞における前記核酸の発現のより大きな減少が、前記薬剤がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓにおける前記核酸の発現を阻害することを示す点において、前記ポリペプチドの発現を比較すること
を包含する、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株におけるＳｉｒ核酸、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）及びＦｈｕＣからなる群から選ばれる核酸の発現を阻害する薬剤を同定するための方法。
【請求項２０】
前記ｓｉｒ核酸が、ｓｉｒＡである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記ｓｉｒ核酸が、ｓｉｒＢである、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
前記ｓｉｒ核酸が、ｓｉｒＣである、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
前記薬剤が、ＳｉｒＢとＳｉｒＣとの間の相互作用を阻害する、請求項１記載の方法。
【請求項２４】
前記薬剤が、ＳｉｒＣとＦｈｕＣとの間の相互作用を阻害する、請求項１記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２００４年８月２６日に出願された米国仮出願番号第６０／６０４，７６９号に対する優先権を主張している。
【０００２】
背景
スタフィロコッカス・オウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ））は、流布しているヒトの病原菌であり、より小さい皮膚の傷、インペチゴ及び食中毒から、たとえば敗血症、心内膜炎、骨髄炎、肺炎、菌血症及びトキシックショック症候群のような、より重篤な疾患までの広い範囲の感染症を引き起こす（Archer(1998)Clin. Infect. Dis.26:1179-1181）。最初に、ペニシリンが、最も重篤なＳ．  ａｕｒｅｕｓ感染症にさえ治療するために使用され得た。しかしながら、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓのペニシリン耐性菌の出現により、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ感染症の治療におけるペニシリンの有効性が減少した。そして、今日、病院の感染症で遭遇する、殆どのＳ．  ａｕｒｅｕｓは、ペニシリンに反応しない。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓのペニシリン耐性菌は、ペニシリンをペニシロ酸に変換し、それによって抗生物質活性を破壊する、ラクタマーゼを産生する。さらに、前記のラクタマーゼ遺伝子は、しばしばエピソーム的に、典型的にはプラスミド上で増殖し、そして共に多剤耐性を与える、エピソーム要素上における数個の遺伝子のうちでたった一つの遺伝子である。
【０００３】
１９６０年代に導入されたメチシリン類により、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓにおけるペニシリン耐性の問題は、おおむね克服された。これらの化合物は、抗生物質作用の源であるペニシリンの前記の部分構造を保護し、ラクタマーゼを不活性化するためにペニシリンを良好な基質にする他の部分を部分修正又は変更する。しかしながら、バンコマイシン、アミノ配糖体類、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、マクロライド類及びリンコサミド類（ｌｉｎｃｏｓａｍｉｄｅｓ）を含む、この微生物に有効な他の多くの抗生物質に対する耐性に加えて、メチシリン耐性が、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓにおいて出現した。事実、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓのメチシリン耐性菌は、一般に多剤耐性である。メチシリン耐性Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）は、世界的に最も重要な院内の病原菌の一つになり、そして重大な感染防止上の問題を持ちかけている。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ感染症の薬剤耐性は、新しい治療剤が開発されなければ、非常に悪化させるようである、重要な治療上の困難をもたらしている。それゆえ、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ感染症を治療するための新しく且つ有効な治療剤に対する差し迫った、満たされていない医学的必要性がある。
【０００４】
概要
一つの態様では、本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ）における鉄の取り込みを阻害する、抗体、アンチセンスＲＮＡ類及びｓｉＲＮＡを含む新規な抗生物質を特徴とする。
本発明の他の態様は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓにおける鉄の取り込み阻害する薬剤を同定するためのスクリーニング・アッセイ法を特徴とする。
一つの実施態様では、前記のアッセイは、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）及び／又はＦｈｕＣの間の相互作用を阻害する薬剤を同定することができる。
もう一つの実施態様では、前記のアッセイ法は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓにおけるＳｉｒポリペプチド類及び／又は核酸類の発現を阻害する薬剤を同定することができる。
さらにもう一つの実施態様では、前記のアッセイ法は、前記の試験薬剤の存在下から非存在下まで、鉄を豊富に含む培地でＳ．  ａｕｒｅｕｓの成長を測定する表現型のアッセイ法である。
さらに、ここに開示した本発明の特徴及び利点は、次の詳細な説明及び請求項に関連して述べるであろう。
【０００５】
詳細な説明
１．一般
本発明は、ＳｉｒＡＢＣ輸送体を経由してスタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）の取り込みのために必要されるＡＴＰａｓｅをエンコードするｆｈｕＣの同定だけでなく、少なくとも部分的には、鉄シデロフォアである、スタフィロバクチンの輸送における、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ））ｓｉｒＡＢＣ複合体の役割の発見に基づいている。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓにおける鉄の取り込みを阻害する新規な抗生物質、及び前記ＳｉｒＡＢＣ鉄シデロフォア輸送システムの追加の阻害剤を同定するための化合物をスクリーニングする方法が、ここに記載されている。
【０００６】
２．定義
便宜上、本明細書、実施例及び添付の請求項で使用されている、特定の用語及び語句の意味が、以下に提供される。その他の点では定義されていないならば、ここで使用されている全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における通常のスキルを有する者により一般に理解される用語又は語句と同じ意味を有する。
【０００７】
「薬剤（ａｇｅｎｔ）」という用語は、化合物、化合物の混合物、生物学的高分子（たとえば、核酸、抗体、タンパク質、又はたとえばペプチドのようなタンパク質若しくはそれの一部のような）、又は、たとえば、細菌、植物、真菌又は動物（特に哺乳動物）の細胞若しくは組織のような生物学的材料から調製された抽出物を意味するために、ここでは使用される。薬剤は、以下に記すスクリーニング・アッセイにより同定されてもよい。前記の薬剤は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓにおける鉄輸送を仲介するＳｉｒＡＢＣの阻害剤又は拮抗剤であってもよい。前記の薬剤の活性は、被験体において局所的又は全身的に作用する、生物学的に、生理学的に又は薬理学的に活性な物質（又は物質類）である「治療剤」として、それを適切に表すかもしれない。
【０００８】
「拮抗剤」又は「阻害剤」という用語は、少なくともタンパク質の一つの生理活性を下げるか又は阻害する薬剤を意味する。拮抗剤は、たとえば対象のペプチド又は酵素の基質のような他の分子とタンパク質との間の相互作用を減らすか又は阻害する化合物であってもよい。拮抗剤は、また、遺伝子の発現を減らすか又は阻害するか、又は発現されたタンパク質の存在量を減らすか又は阻害する、化合物であってもよい。
【０００９】
ここで使用されているように、「抗体」という用語は、免疫グロブリン、及び免疫グロブリン（たとえばＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＥ）のあらゆる抗原結合部位、すなわち、特異的に抗原に結合する（免疫反応をする）抗原結合サイトを含むをポリペプチドを意味する。抗体は、少なくとも一つのジスルフィド結合により相互に結合された、少なくとも一つの重鎖（Ｈ）及び少なくとも一つの軽鎖（Ｌ）を包含することができる。「ＶＨ」という用語は、抗体の重鎖の可変領域を意味する。「ＶＬ」という用語は、抗体の軽鎖の可変領域を意味する。
【００１０】
代表的な実施態様では、「抗体」という用語は、特にモノクローナル抗体類及びポリクローナル抗体類を包含する。「ポリクローナル抗体」という用語は、抗原又は抗原類により免疫性を与えられた動物の血清から誘導された抗体を意味する。「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ細胞の単一クローンにより産生された抗体を意味する。モノクローナル抗体を調製する技法としては、ハイブリドーマ法（Kohler & Milstein(1975)Nature 256:495-497を参照）、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Kozbor et al.(1983)Immunol. Today) 4:72を参照）、ＥＢＶハイブリドーマ法（Cole
et al.,1985 In:Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy),
Alan R. Liss, Inc.), 77-96を参照）及びファージ・ディスプレー（ｐｈａｒｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を、さらに操作するか又は部分修正して、キメラ抗体又はヒト化抗体を発生することができる。
「キメラ抗体」は、その軽鎖及び重鎖の遺伝子は、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから構成されているように、遺伝子的に設計された免疫グロブリン遺伝子によりエンコードされている。たとえば、ここで記載されているようにして得られような、たとえばマウスモノクローナル抗体からの遺伝子の可変セグメント（Ｖ）の根本的な部分を、ヒトの定常部セグメント（Ｃ）の根本的な部分と連結してもよい。前記のキメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体よりもヒトに対して抗原性が少ないようである。ここで使用されているように、「ヒト化された抗体」（ＨｕＡｂ）という用語は、ヒトのフレームワーク領域に対して実質的に同一（すなわち、少なくとも８５％である）であるフレームワーク領域を備え、非ヒト抗体からの相補性決定領域を有し、そしてあらゆる定常部が、ヒト免疫グロブリン定常部に対する少なくとも約８５−９０％、好ましくは９５％のポリペプチド配列の同一性を有するキメラ抗体を意味する。たとえば、ＰＣＴ公開パンフレットＷＯ９０／０７８６１及びヨーロッパ特許第０４５１２１６号を参照されたい。
【特許文献１】国際公開ＷＯ９０／０７８６１号パンフレット
【特許文献２】ヨーロッパ特許第０４５１２１６号おそらく前記のＣＤＲ類以外の、前記のＨｕＡｂの全ての部位は、一つ又はそれより多い天然のヒト免疫グロブリン配列と実質的に同一である。ここで使用されているように、「フレームワーク領域」という用語は、Kabat et al.(1987)Sequences of Proteins of Immunologic Interest),4thEd.,US Dept. Health and Human Servicesに定義されているように、単一種における異なる免疫グロブリンの間で比較的保存されている（すなわち、ＣＤＲ類以外である）、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖可変領域のこれらの部位を意味する。ヒト定常部ＤＮＡ配列は、様々なヒト細胞、好ましくは不死化されたＢ細胞からよく知られた手順に従い、単離することができる。ヒト化抗体を調製するための可変部又はＣＤＲ類は、前記の抗原に結合することができるモノクローナル抗体から誘導されてもよく、そしてマウス、ラット又は他の脊椎動物を含む、手近な哺乳動物で産生されるであろう。
【００１１】
「抗体」という用語は、また、抗体フラグメントを包含する。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆａｂ´−ＳＨ、Ｆ（ａｂ´）２、及びＦｖフラグメント、二重特異性抗体並びに近接したアミノ酸残基の一つの連続したシークエンスからなる一次構造を有するあらゆる抗体フラグメントを包含する。当該抗体フラグメントの例は、制限なく、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、たった一つの軽鎖可変ドメインを含む単鎖ポリペプチド、又は合体する重鎖半分を持たない、軽鎖可変領域ドメインの三つのＣＤＲを含む、それについてのフラグメント及び（３）たった一つの重鎖可変領域のを含む単鎖ポリペプチド、又は合体する軽鎖半分を持たない、前記の重鎖可変領域の三つのＣＤＲを含む、それについてのフラグメント、並びに抗体フラグメントから形成される多特異性又は多価の構造を包含する。一つ又はそれより多い重鎖を包含する抗体フラグメントにおける、重鎖（類）は、もとのままの抗体のｎｏｎ−Ｆｃ領域に見出される、あらゆる定常部配列（たとえば、ＩｇＧイソタイプのＣＨ１）を含むことができ、及び／又はもとのままの抗体に見出される、あらゆるヒンジ領域配列を含むことができ、及び／又は重鎖（類）のヒンジ領域配列又は定常ドメイン配列に融合されるか、又は位置されたロイシンジッパー配列を含むことができる。適切なロイシンジッパー配列は、Kostelney et al.,(1992) J.
Immunol., 148: 1547-1553に開示されているｊｕｎ及びｆｏｓロイシンジッパー、並びに米国特許第６，４６８，５３２号に開示されているＧＣＮ４ロイシンジッパーを包含する。
【特許文献３】米国特許第６，４６８，５３２号
【００１２】
Ｆａｂ及びＦ（ａｂ´）２は、もとのままの抗体のＦｃフラグメントを欠き、及びたとえば、パパイン（Ｆａｂフラグメントの調製用）又はペプシン（Ｆ（ａｂ´）２フラグメントの調製用）のような酵素を使用して、タンパク質加水分解により典型的には調製される。もし前記抗体が、ほとんどの他の抗原以上に、優先的に前記の抗原に結合するならば、抗体は、抗原又は抗原のエピトープに「特異的に結合する」。たとえば、前記の抗体は、約５０％、２０％、１０％、５％、１％又は０．１％よりも低い、一つ又はそれより多い他のエピトープに対する交差反応性を有していてもよい。
【００１３】
「有効量」は、治療の際に有益な又は望みどおりの臨床結果を生じさせるために十分な量である。有効量は、患者に一回又はそれより多い分量で投与することができる。治療の点から、有効量は、患者の病菌の感染を減らすために十分な量である。有効量を獲得するために、適当な用量を決定する場合、典型的には、いくつかの要因が考慮される。これらの要因は、患者の、年齢、性別及び体重、治療対象の病気、病気の激しさ、投与される前記の薬剤のフォーム及び効果的な濃度を包含する。
【００１４】
「等価体」は、核酸又はヌクレオチド配列を記述するために使用される場合、機能的に同等なポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を意味する。等価なヌクレオチド配列は、たとえば対立遺伝子の変異型のような、一つ又はそれより多いヌクレオチドの置換、付加又は欠失により異なる配列を含み、そして、それゆえ、遺伝子コードの退化に起因して異なる配列を含むであろう。たとえば、核酸変異型は、ヌクレオチドの置換、欠失又は付加により調製されるものを包含してもよい。前記の置換、欠失又は付加は、一つ又はそれよりも多いヌクレオチドを包含してもよい。前記の変異型は、コーディング領域、非コーディング領域又はその両方で変更されていてもよい。コーディング領域における変更により、保守的又は非保守的な、アミノ酸の置換、欠失又は付加を作りだしてもよい。
【００１５】
ここで使用されているように、「フェリック・ヒドロキサマートの取り込み」、すなわち「ｆｈｕシステム」という用語は、ＡＢＣ輸送体をエンコードする遺伝子群を意味する。ｆｈｕシステムは、五つの遺伝子によりコードされている。ＦｈｕＣ、ｆｈｕＢ及びｆｈｕＧは、オペロン（ｆｈｕＣＢＧオペロン）に存在し、そしてＡＴＰ−結合カセット（ＡＢＣ）輸送体の構成要素をエンコードする。ＦｈｕＤ１及びｆｈｕＤ２は、別個にエンコードされ、そして高い親和性でフェリック・ヒドロキサマート複合体に結合するリポタンパク質をエンコードする。前記のｆｈｕＣＢＧオペロンの模範的なヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＡＦ２５１２１６、ＡＡＦ９８１５３、ＡＡＦ９８１５４及びＡＡＦ９８１５５に、ｆｈｕＤ１は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ３２５８５４及びＡＡＫ９２０８５に、ｆｈｕＤ２は、ＡＦ３２５８５５及びＡＡＫ９２０８６に見出されるかもしれない。「ＦｈｕＣ」、「ＦｈｕＢ」、「ＦｈｕＧ」、「ＦｈｕＤ１」及び「ＦｈｕＤ２」という用語は、フラグメント又はそれについての部分、及び生物学的に活性なフラグメント又はそれについての部分を包含する。
【００１６】
「同族性」あるいは「同一性」は、二つのペプチドの間又は二つの核酸分子の間の配列の類似性を意味する。同族性は、比較するために一列に並べてもよい、各配列において位置を比較することにより決定される。比較されている配列の位置が、同じ塩基又はアミノ酸に占められていると、前記の分子は、その位置において同族性である。配列間の同族性の度合いは、前記の両配列で共有される、合致又は同族性の位置の数の関数である。「パーセント同一性」という用語は、二つのアミノ酸又は二つのヌクレオチドの配列間の配列同一性を意味する。同一性は、比較するために一列に並べてもよい、各配列において位置を比較することにより決定される。前記の比較されている配列における同等の位置が、同じ塩基又はアミノ酸により占められると、前記の分子は、その位置において同一であり、そして、前記の同等のサイトが、同じ又は類似したアミノ酸残基（たとえば、立体的及び／又は電子的性質において類似している）で占められていると、前記の分子は、その位置において相同（類似）であるとして言及されてもよい。同族性、類似性又は同一性のパーセントによる表記は、前記の比較された配列で共有された位置における同一又は類似のアミノ酸の数の関数を意味する。ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ又はＥＮＴＲＥＺを含む、様々な整列アルゴリズム及び／又はプログラムが使用されてもよい。ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴは、ＧＣＧ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｐａｃｋａｇｅ（University of Wisconsin,
Madison, Wis.）の一部として利用可能であり、そしてたとえばデフォールトの設定で使用されるかもしれない。ＥＮＴＲＥＺは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．を通じて利用可能である。一つの実施態様では、二つの配列の前記のパーセント同一性は、たとえば、それが、二つの配列の間の単一アミノ酸又はヌクレオチドの不適合であるかのように各アミノ酸ギャップが加重されるように、１というギャップ重によりＧＣＧプログラムにより決定されるかもしれない。整列のための他の技法は、Methods in
Enzymology),266:Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis(1996),ed.
Doolittle, Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace & Co., San
Diego, California, USAに開示されている。好ましくは、配列中にギャップを容認する整列プログラムは、前記の配列を整列するために利用される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列の整列におけるギャップを容認するアルゴリズムの一つのタイプである。Meth. Mol. Biol.70: 173-18 (1997) を参照ください。さらに、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄを使用する、前記のＧＡＰプログラムを、配列を整列するために利用してもよい。もう一つの研究戦略は、ＭＡＳＰＡＲコンピュータ上で稼動するＭＰＳＲＣＨソフトウエアを使用する。ＭＰＳＲＣＨは、超並列コンピュータ（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ）上で配列をスコアするＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍを使用する。この方法は、離れた関連するマッチを拾い集める能力を改善し、そして小さなギャップ及びヌクレオチド配列のエラーに、特に寛容である。核酸エンコードされたアミノ酸配列は、タンパク質及びＤＮＡデータベースの両者からなるデータベースを検索するために使用されるかもしれない。個々の配列を備えたデータベースは、上記のMethods in Enzymology, ed. Doolittleに記載されている。データベースとしては、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ及びＤＮＡ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ  （ＤＤＢＪ）が挙げられる。
【００１７】
ここで使用されているように、「感染」という用語は、臨床的には明白でないかもしれず、又は競合する代謝、毒素、細胞内の複製又は抗原抗体反応に起因する局所的な細胞の損傷を生ずるかもしれない、体組織における、たとえばＳ．  ａｕｒｅｕｓのような微生物の侵入及び増殖を意味する。もし、体の防御の仕組みが有効であるならば、前記の感染が、局所的、準臨床的及び一時的な状態に止まるかもしれない。局所的感染は、持続し、そして拡張により、急性、亜急性若しくは慢性の臨床的感染症又は疾患状態になるように広がるかもしれない。前記の微生物がリンパシステム又は血管システムに近づくと、局所感染は、また、全身的な感染になる。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓの感染は、フルンケル、慢性フルンケル症、インペチゴ、急性骨髄炎、肺炎、心内膜炎、熱傷様皮膚症候群、トキシックショック症候群及び食中毒を含むが、これに限定されものではない、疾患又は異常を生ずるかもしれない。
【００１８】
「阻害」という用語は、生物学的活性、核酸の発現又はタンパク質の発現の、あらゆる減少、縮小又は完全な阻害を意味する。
【００１９】
「ラベル」及び「検出可能なラベル」は、放射性同位元素、フルオロフォア、化学ルミネセンス部分、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤、染料、金属イオン及び配位子（たとえば、ビオチン又はハプテン）等を含むが、これらに限定されるものではない、検出できる分子を意味する。「フルオロフォア」は、検出できる範囲で蛍光を示すことができる、物質又は部分を意味する。本発明で使用されてもよい、ラベルの特有の例は、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、テキサス・レッド（Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ）、ルミノール、ＮＡＤＰＨ、α−又はβ−ガラクトシダーゼ及び西洋ワサビペルオキシダーゼを包含する。
【００２０】
遺伝子に関してここで使用されているように、「突然変異体」という用語は、突然変異タンパク質をエンコードする遺伝子を意味する。タンパク質に関してここで使用されているように、「突然変異体」という用語は、その通常又は正常な生理学的役割を果たさないタンパク質を意味する。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓポリペプチド突然変異体は、アミノ酸置換、欠失又は付加により調製されてもよい。前記の置換、欠失又は付加は、一つ又はそれより多い残基を含んでいてもよい。本発明のＳ．  ａｕｒｅｕｓタンパク質の、前記の性状及び活性を変える置換、付加及び欠失が、特に、これらの内で好ましい。
【００２１】
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、相互に交換できるように使用されている。それらの用語は、あらゆる長さのデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド又はその類似物の何れかの、ヌクレオチドの高分子フォームを意味する。以下は、ポリヌクレオチドの無制限の例である。前記の無制限の例は、遺伝子若しくは遺伝子フラグメントのコーディング領域若しくは非コーディング領域、結合解析により定義される遺伝子座群（遺伝子座）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、あらゆる配列の単離されたＤＮＡ、あらゆる配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマーである。ポリヌクレオチドは、たとえばメチル化されたヌクレオチド及びヌクレオチド同族体のような修飾されたヌクレオチドを包含してもよい。もし存在するならば、前記のヌクレオチド構造への修飾は、前記のポリマーの組み立ての前後に施されてもよい。
前記ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド要素で中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、さらに、たとえば、ラベル要素を備えた連結により、ポリマー化後修飾されてもよい。
「組換え」ポリヌクレオチドという用語は、ゲノム由来、ｃＤＮＡ由来、天然には出現しないか、又は非天然配列で他のポリヌクレオチドに結合しているかの何れかである、半合成若しくは合成由来のポリヌクレオチドを意味する。
「オリゴヌクレオチド」は、約１００未満のヌクレオチド、たとえば、約７５、５０、２５又は１０未満のヌクレオチドを有する１本鎖ポリヌクレオチドを意味する。
【００２２】
「ポリペプタイド」、「ペプタイド」及び「タンパク質」（単鎖ならば）という用語は、ここでは相互に交換できるように使用され、アミノ酸のポリマーを意味する。前記のポリマーは、直鎖か又は分岐であってもよく、それは、修飾されたアミノ酸を含んでいてもよく、そして非アミノ酸がそれに介在していてもよい。この用語は、また、たとえば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化又はたとえば、ラベル要素を備えた結合のような他の操作により修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。
ここで使用されているように、「アミノ酸」という用語は、グリシン、そのＤ−若しくはＬ−光学異性体の両方、及びアミノ酸同族体及び擬ペプチドを含む、天然、及び／又は非天然若しくは合成のアミノ酸類のどちらか一方を意味する。
【００２３】
ここで使用されているように、「ｓｉｒＡＢＣ  オペロン」という用語は、普通のプロモーターを共有する、ｓｉｒＡ、ｓｉｒＢ及びｓｉｒＣを包含する細菌遺伝子のグループを意味する。このオペロンは、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓの前記の鉄により制限される成長にとって、重要であることが見出された。ｓｉｒＡＢＣオペロンの典型的なヌクレオチド及びアミノ酸の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＹ２５１０２２及びＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ０７９５１８に見出され得る。ＳｉｒＡは、以前にリポタンパク質として同定され（Heinrichs et
al.(1999)J. Bacteriol.181:1436-1443）、そしてその発現は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓの前記のＦｕｒタンパク質の活性により厳密に制御されている。ＳｉｒＢ及びＳｉｒＣは、ＡＢＣ−輸送体の貫膜ドメインをエンコードしている。特に、ｓｉｒＡ又はｓｉｒＢの突然変異体は、ストレプトニグリンに対するＳ．  ａｕｒｅｕｓの耐性を増し、そして鉄が制限された培地における屈従した成長を示す。前記の突然変異体は、また、前記のスタフィロバクチン  シデロフォアを認知し、そして前記の細胞に輸送する能力において、屈従されられている。「ＳｉｒＡ」、「ＳｉｒＢ」及び「ＳｉｒＣ」という用語は、フラグメント又はそれの部分、及び生物学的に活性なフラグメント又はそれの部分を包含する。
【００２４】
「ＳｉｒＡＢＣ  鉄−シデロフォア輸送システム」という用語は、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ及びＦｈｕＣポリペプチドを包含する、前記のＳｉｒＡＢＣ輸送体を意味する。
【００２５】
「Ｓｉｒタンパク質」又は「Ｓｉｒポリペプチド」という用語は、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ及び／又はＳｉｒＣタンパク質を意味する。
「ｓｉｒヌクレオチド」、「ｓｉｒ核酸」又は「ｓｉｒ遺伝子」という用語は、ｓｉｒＡ、ｓｉｒＢ及び／又はｓｉｒＣの核酸を意味する。
【００２６】
「Ｓｉｒ欠失菌株」という用語は、少なくとも一つのＳｉｒタンパク質を発現しない細菌菌株を意味する。
「ＦｈｕＣ欠失菌株」という用語は、ＦｈｕＣタンパク質を発現しない細菌菌株を意味する。
【００２７】
「スタフィロバクチン」という用語は、前記のＳｉｒＡＢＣ  鉄−シデロフォア輸送システムにより細胞内に輸送される前記の鉄−シデロフォアを意味する。
【００２８】
「小さな分子」という用語は、約５ｋＤ未満、約２．５ｋＤ未満、約１．５ｋＤ又は０．９ｋＤ未満の分子量を有する化合物を意味する。たとえば、小さな分子は、核酸類、ペプチド類、ポリペプチド、ペプチド核酸類、擬ペプチド、炭水化物、脂質、他の有機化合物（炭素を含む）又は無機化合物であってもよい。多くの製薬企業は、あらゆる本発明のアッセイによりスクリーニングすることができる、化学的混合物及び／又は生物学的混合物、しばしば真菌抽出物、細菌抽出物又は藻の抽出物の広範囲に亘るライブラリーを保有している。
「小さな有機分子」という用語は、しばしば有機化合物又は薬効のある化合物として同定され、そしてもっぱら核酸、ペプチド類又はポリペプチド類である分子を含まない、小さな分子を意味する。
【００２９】
「実質的な同族体」という用語は、アミノ酸配列に関連して使用する場合に、コンホメーションの相同性を生じ、そしてそれゆえ一つ又はそれよりも多い生物学的活性（免疫学的活性を含む）の保持及び有益な程度に生ずる、実質的に同一であるか、又は互いに配列において類似している配列を意味する前記の用語は、前記の配列の一般的な進化を暗示することを意図されていない。
【００３０】
「被験体」は、ヒトを含む、雄又は雌の哺乳動物を意味する。
【００３１】
「ベクター」は、挿入された核酸分子を、宿主細胞へ転移するか、及び／又は宿主細胞間へ転移する、自己複製をする核酸分子である。前記の用語は、細胞への核酸分子の挿入のために主に作用するベクター、核酸の複製のために主に作用する複製ベクター、及びＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳ために作用する発現ベクターを包含する。さらに、前記の機能の一つ以上を提供するベクターも包含される。
ここで使用されているように、「発現ベクター」は、適当な宿主細胞に導入されると、ポリペプチド（類）へ転写又は翻訳されうるポリヌクレオチドとして定義される。
「発現システム」は、通常、望ましい発現産生物を生じるために機能することができる発現ベクターを含む、適切な宿主細胞を意味する。
【００３２】
３．ｓｉｒＡ、ｓｉｒＢ、ｓｉｒＣ、及びｆｈｕＣ  核酸
本発明は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ及びＦｈｕＣポリペプチド類、それについての完全相補性又はそれについての突然変異体をエンコードする核酸分子に関するものである。図６乃至１１は、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ及びＦｈｕＣポリペプチド、並びにそれについての完全相補性をエンコードする核酸配列を示す。
【００３３】
本発明の核酸類は、また、ここに記載したように、あらゆる前記のＳｉｒ又は前記のＦｈｕＣヌクレオチド配列又はそれについての相補性を包含するか、からなるか、又はのみからなってもよい。さらに、他の核酸類は、ここに記載したＳｉｒ若しくはＦｈｕＣ遺伝子又はそれについての相補性と、少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％の同一性又は相同性を有するヌクレオチド配列を包含するか、からなるか、又はのみからなってもよい。実質的に相同な配列は、ストリンジェント・ハイブリッド形成条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を使用して同定されてもよい。
【００３４】
本発明の核酸とは異なる単離された核酸類は、遺伝コードにおける同義性のために、また、本発明の範囲内に含まれる。たとえば、多数のアミノ酸は、一つのトリプレットよりも多いトリプレットにより明示される。同じアミノ酸を特定するコドン、すなわち同義コドン（ＣＡＵ及びＣＡＣはヒスチジンの同義コドンである）は、タンパク質のアミノ酸配列に影響しない「サイレント」突然変異体を生ずるかもしれない。しかしながら、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列における変化を起こさないＤＮＡ配列多型性が存在するであろうことが期待される。当業者ならば、本発明の特定のタンパク質をエンコードする核酸の一つ又はそれよりも多いヌクレオチド（前記のヌクレオチドの、１％未満から約３％まで、又は５％又はことによるとそれよりも多い）における、これらの変動（前記のヌクレオチドの、１％未満から約３％まで、又は５％又はことによるとそれよりも多い）は、天然のアレリック変動のために一定の種において存在するかもしれないことを認識するであろう。あらゆる及びすべてのヌクレオチド変動、及びそれにより生じたアミノ酸多型性は、本発明の範囲内である。ここに開示されているポリペプチドに進化的に関連しているアミノ酸配列を有するタンパク質をエンコードしている核酸が提供される。ここにおいて、「進化的に関連している」は、たとえば、組合せ突然変異誘発により誘導される本発明のタンパク質の突然変異による変異型に加えて、天然に（たとえば、アレリック変異度による、又は示差スプライシングによる）発生した異なるタンパク質を意味する。前記のポリペプチドの生物学的に活性な部位をエンコードしている、本発明の前記のポリヌクレオチドのフラグメントは、また、提供される。ここで使用されているように、ここで開示されているポリペプチドの活性な部分をエンコードしている核酸のフラグメントは、本発明のポリペプチドの完全な長さのアミノ酸配列をエンコードする前記のヌクレオチドよりも短いヌクレオチドを有し、ここで定義されたように完全な長さのＳｉｒ又はＦｈｕＣタンパク質の生物学的な活性の部分を少なくとも保持している一定のポリペプチドをエンコードするか、又は、代わりに、前記の完全な長さのタンパク質の前記の生物学的な活性のモジュレーターとして作動できるヌクレオチド配列を意味する。たとえば、前記のフラグメントは、前記のタンパク質ともう一つの分子（たとえば、ポリペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ等）との相互作用を仲介する前記のポリペプチドが誘導される、完全な長さのタンパク質のドメインを含むポリペプチドを包含する。
ここで提供された核酸は、また、リンカー配列、修飾された制限エンドヌクレアーゼサイト及び前記組換えポリペプチドの、分子クローニング、発現又は精製に有用な他の配列を含んでもよい。
【００３５】
ここで提供されるＳｉｒ又はＦｈｕＣポリペプチドをエンコードする核酸は、一般に当業者に知られているプロトコールのみならず、ここに開示したプロトコールに従い、あらゆる生物からのｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡから得られてもよい。たとえば、本発明のポリペプチドをエンコードするｃＤＮＡを、たとえば、細菌、ウイルス、哺乳動物等のような生物から全てのｍＲＮＡを単離することにより得てもよい。二本鎖のｃＤＮＡは、そのとき全てのｍＲＮＡから調製されてもよく、そして、次に多くの知られた技法のうちのあらゆる技法を使用して適切なプラスミド又はバクテリオファージベクターに挿入されてもよい。本発明のポリペプチドをエンコードする遺伝子を、また、本発明により提供される前記ヌクレオチド配列情報に従い、確立されたポリメラーゼ連鎖反応技法を使用してクローンしてもよい。
ある態様では、本発明の核酸又はそのフラグメントの増幅ための方法は、（ａ）各単鎖は、長さにおいて、少なくとも８ヌクレオチドであり、本発明の核酸の配列に対して相補的であり、そしてここにおいて前記オリゴヌクレオチドが相補的である配列は、少なくとも１０ヌクレオチド離れている、一対の単鎖オリゴヌクレオチドを提供すること、及び（ｂ）前記のオリゴヌクレオチドを、一対のオリゴヌクレオチドの間に位置する前記の領域の増幅をさせる条件下で、本発明の前記の核酸を含む試料に接触させること、それによって前記の核酸を増幅させることを包含してもよい。
【００３６】
本発明は、また、前記のベクター、及び宿主細胞を構築する方法のためのみならず、前記の組換えベクターを含む宿主細胞のために、そして組換え技法によるＳ．  ａｕｒｅｕｓポリペプチド類の産生のためにそれらを使用するために、単離されたｓｉｒ又はｆｈｕＣ核酸を包含する組換えベクターを特徴づける。
【００３７】
適切なベクターは、たとえば、感染、形質導入、トランスフェクション、トランスベクション、エレクトロポレーション及び形質転換のようなよく知られた技法を使用して、宿主細胞に導入されてもよい。前記のベクターは、たとえば、ファージ、プラスミド、ウイルスベクター又はレトロウイルスベクターであってもよい。レトロウイルスベクターは、複製能があってもよく、又は複製能欠失であってもよい。後者の場合、ウイルスの増殖は、一般的に宿主細胞を補充する場合にのみ生ずるであろう。
【００３８】
前記のベクターは、宿主において増殖のための選び出すことができるマーカーを含んでいてもよい。一般的に、プラスミドベクターは、たとえば、カルシウムリン酸沈殿物又は電荷を帯びた脂質との複合体のような沈殿物中で導入される。もし前記ベクターがウイルスの場合、それは、適切なパッケージング細胞系を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでパッケージされ、そして宿主細胞に形質導入されてもよい。
【００３９】
好ましいベクターは、注目されている前記ポリヌクレオチドに対するシス作用制御領域を包含する。適切なトランス作用因子は、前記の宿主により、補足ベクターにより、又は前記の宿主への導入の際にベクター自身により供給されてもよい。
【００４０】
あるの実施態様では、前記のベクターは、誘導性及び／又は細胞の種類に特異的であってもよい、特定の発現のために提供される。前記のベクターの内でとりわけ好ましいのは、たとえば温度及び栄養添加物のような、取り扱いやすい環境要因により誘導されるベクターである。
【００４１】
本発明において有用な発現ベクターは、たとえば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピゾーム、酵母染色体要素、たとえば、バキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ）、パポバウイルス（ｐａｐｏｖａ  ｖｉｒｕｓｅｓ）、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、フォウルポックスウイルス（ｆｏｗｌ  ｐｏｘ  ｖｉｒｕｓｅｓ）、シュードラビーズウイルス（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓｅｓ）及びレトロウイルスのようなウイルスから誘導されたベクター、並びにたとえばコスミド及びファージミドのような、それらの組み合わせから誘導されたベクターのような、染色体誘導ベクター、エピゾーム誘導ベクター及びウイルス誘導ベクターを包含する。
【００４２】
前記のＤＮＡ挿入は、２、３例を挙げると、たとえば、ファージラノバＰＬプロモーター、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｌａｃ、  ｔｒｐ及びｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、並びにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターのような適切なプロモーターと有効に組み合わされるべきである。他の適当なプロモーターは、当業者に知られているであろう。前記の発現構築物は、さらに転写開始、終結のためのサイト、及び前記の転写された領域における翻訳のためのリボソーム結合サイトを含むであろう。前記の構築物により発現された前記の成熟転写のコーディング部位は、好ましくは、翻訳される前記のポリペプチドの末端に適切に配置された、開始及び終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ又はＵＡＧ）での翻訳開始サイトを含むであろう。
【００４３】
示したように、前記の発現ベクターは、好ましくは少なくとも一つの識別できるマーカーを含むであろう。前記のマーカーは、真核細胞培養用のジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子又はネオマイシン耐性遺伝子、及びＥ．  ｃｏｌｉ及び他の細菌を培養するための、テトラサイクリン、カナマイシン又はアンピシリンの耐性遺伝子を包含する。適当な宿主の代表的な例は、たとえば、Ｅ．  ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの細胞のような細菌細胞、たとえば酵母細胞のような真菌細胞、たとえば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２及びＳｆ９細胞のような昆虫細胞、たとえば、ＣＨＯ、ＣＯＳ及びボーウズ・メラノーマ（Ｂｏｗｅｓ  ｍｅｌａｎｏｍａ）細胞のような動物細胞、並びに植物細胞を含むが、これに限定されるものではない。前記の宿主細胞のための適当な培養の培地及び条件は、この技術分野では知られている。
【００４４】
細菌での使用に好ましいベクターは、キヤゲン（Ｑｉａｇｅｎ）から入手可能な、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ９及びｐＱＥ１０、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から入手可能な、ｐＢＳベクター、ファージスクリプト（Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ）ベクター、ブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）から入手可能な、ｐＥＴ  シリーズベクター、並びにファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から入手可能な、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５を包含する。好ましい真核細胞用ベクターは、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から入手可能な、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１及びｐＳＧ、並びにファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から入手可能な、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬである。他の適切なベクターは、当業者には容易に明らかになるであろう。
【００４５】
本発明における使用に適した知られた細菌用プロモーターは、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｌａｃＩ及びｌａｃＺプロモーター、Ｔ３、Ｔ５及びＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ランブダ（ｌａｍｂｄａ）ＰＲ及びＰＬプロモーター、ｔｒｐプロモーター、並びにｘｙＩ／ｔｅｔキメラプロモーターを包含する。適切な真核細胞用のプロモーターは、ＣＭＶ即時型プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、レトロウイルスＬＴＲの初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、たとえばラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のレトロウイルスＬＴＲのようなレトロウイルスＬＴＲのプロモーター、並びにたとえばマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターのようなメタロチオネインプロモーターを包含する。
【００４６】
前記の構築物の前記の宿主細胞への導入は、カルシウム−リン酸トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション、カチオニック脂質−仲介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入又は他の技法により達成され得る。前記の技法は、多くの標準的な実験マニュアルに開示されている（たとえば、Davis, et al., Basic
Methods In Molecular Biology)(1986)）。
【００４７】
高等真核生物による本発明のポリペプチドをエンコードするＤＮＡの転写は、前記のベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増加されるかもしれない。エンハンサーは、一定の宿主細胞のタイプにおいてプロモーターの転写活性を増やすように作用する、通常約１０から３００のヌクレオチドである、ＤＮＡのシス作用要素である。エンハンサーの例は、１００から２７０のヌクレオチドで複製起点の後期サイドに位置するＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期サイドに位置するポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーを包含する。
【００４８】
小胞体のルーメン、周辺腔又は細胞外環境への翻訳されたポリペプチドの分泌のために、たとえば、アミノ酸配列ＫＤＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）のような、適切な分泌シグナルは、発現されたポリペプチドに組み入れられてもよい。前記のシグナルは、前記のポリペプチドに対して内在性であってもよく、又はそれらは、異型のシグナルであってもよい。あるいは、実施例３に示されるように、シグナルペプチドを欠失したｓｉｒＡは、大量の可溶性ＳｉｒＡを産生するためにＥ．  ｃｏｌｉ発現ベクター中にクローンされてもよい。注目のポリペプチドのためのコード配列は、異なるポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を含む融合遺伝子の一部として組み入れられてもよい。
【００４９】
本発明は、本発明の核酸、及び異型のポリペプチドを含む融合タンパク質をエンコードするために、骨格構造において、本発明の核酸のヌクレオチド配列に連結された、異型のペプチドをエンコードする、少なくとも一つの異型の配列を包含する単離された核酸を意図している。前記の異型のポリペプチドは、（ａ）本発明の核酸によりエンコードされたポリペプチドのＣ−末端、（ｂ）前記のポリペプチドのＮ−末端、又は（ｃ）前記のポリペプチドのＣ−末端及びＮ−末端に融合されていてもよい。いくらかの例では、前記の異型の配列は、それが融合されている前記のポリペプチドの検出、単離、可溶化及び／又は安定化を可能にするポリペプチドをエンコードする。さらに他の実施態様では、前記の異型の配列は、ｐｏｌｙＨｉｓ  ｔａｇ、ｍｙｃ、ＨＡ、ＧＳＴ、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、カルモジュリン結合ペプチド、チオレドキシン、マルトース−結合タンパク質、ポリアルギニン、ｐｏｌｙ  Ｈｉｓ−Ａｓｐ、ＦＬＡＧ、免疫グロブリンタンパク質の一部、及びトランスサイトーシス  ペプチドからなる群から選ばれるポリペプチドをエンコードする。
【００５０】
融合発現システムは、本発明のポリペプチドの免疫原性フラグメントを産生することが望まれる場合に、有用でありうる。たとえば、レトロウイルスのＶＰ６キャプシド  タンパク質は、モノマーのフォームか又はウイルス粒子のフォームの何れかで、ポリペプチドの一部のために免疫学的なキャリヤータンパク質として使用されてもよい。抗体が引き起こされるためのものである、本発明のポリペプチドの部分に対応する核酸配列は、ビリオンの一部として前記のタンパク質の一部を含む、一組の組換えウイルス発現融合タンパク質を産生するための、後期ワクシニアウイルス構造タンパク質のためのコード配列を含む、融合遺伝子構築物に組み込まれていてもよい。Ｂ型肝炎表面抗原は、また、なおその上、この役割で利用されてもよい。同様に、本発明のポリペプチドの一部を含む融合タンパク質、及びポリオウイルス  キャプシド  タンパク質をコードするキメラ構築物を、免疫原性を増強するために構築してもよい（ＥＰ公開特許第０２５９１４９号；及びＥvans et
al.,(1989) Nature 339: 385;Huang et al.,(1988) J. Virol.62:3855;及びSchlienger et al.,(1992)J. Virol.66:2を参照。）。
【特許文献４】ヨーロッパ公開特許第０２５９１４９号
【００５１】
融合タンパク質は、タンパク質の発現及び／又は精製を容易する可能性がある。たとえば、本発明のポリペプチドは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として生み出されるかもしれない。前記のＧＳＴ融合タンパク質は、たとえば、グルタチオン誘導マトリックスの使用を通じて、本発明のポリペプチドの精製を簡単にすることに使用されるかもしれない（たとえば、Current Protocols in Molecular
Biology, eds. Ausubel et al., (N.Y.: John Wiley & Sons, 1991)  を参照）。もう一つの実施態様では、たとえば、前記の組換えタンパク質の望みの部分のＮ−末端における、ポリ−（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ開裂サイト配列のような、精製リーダー配列をコードする融合遺伝子は、Ｎｉ２＋金属樹脂を用いるアフィニティークロマトグラフィーによる前記の発現した融合タンパク質の精製を可能にするかもしれない。次に、精製リーダー配列は、精製されたタンパク質を提供するために、エンテロキナーゼ処理により除去されてもよい（たとえば、Hochuli et al., (1987) J.
Chromatography 411: 177;及びJanknecht et al., PNAS USA
88:8972を参照。）。
【００５２】
融合遺伝子を作成する技法は、よく知られている。本質的に、異なるポリペプチド配列をコードする様々なＤＮＡフラグメントの結合は、連鎖反応のため平滑末端又はスタッガー末端、適当な末端を提供するための制限酵素による消化、必要に応じて、付着末端を満たすこと、望ましくない結合をさけるためのアルカリ性ホスファターゼ処理、及び酵素的連鎖反応を利用する、一般に行われている技法に従い実施される。もう一つの実施態様では、前記の融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む一般に行われている技法により合成されてもよい。あるいは、キメラ遺伝子配列を生ずるために続いてアニールされてもよい、二つの連続する遺伝子フラグメントの間の相補的な張出しを生み出すアンカープライマーを使用して、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を実施してもよい（たとえば、Current Protocols in
Molecular Biology, eds. Ausubel et al.,
John Wiley & Sons: 1992を参照）。
【００５３】
他の実施態様では、本発明の核酸は、プレート、ミクロタイタープレート、スライド、ビーズ、微片、球体、フィルム、ストランド、沈殿物、ゲル、シーツ、管、容器、毛細管、パッド、薄片等を含む、固体表面に固定されてもよい。本発明の核酸は、アレー（ａｒｒａｙ）の一部としてチップ（ｃｈｉｐ）に固定化されてもよい。前記のアレー（ａｒｒａｙ）は、ここに記載したように、一つ又はそれより多い本発明のポリヌクレオチドを含んでいてもよい。ある実施態様では、前記のチップ（ｃｈｉｐ）は、ポリヌクレオチド配列のアレー（ａｒｒａｙ）の一部として、本発明の一つ又はそれより多いポリヌクレオチド配列を包含する。
【００５４】
もう一つの態様は、「アンチセンス治療法」における本発明の核酸の使用に関するものである。ここで使用されているように、アンチセンス治療法は、たとえば、転写及び／又は翻訳の阻害によるというような、そのポリペプチドの発現を阻害するために、本発明のポリペプチドの一つをエンコードする細胞性のｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡと、細胞性条件下で特異的にハイブリダイズするか又は別に結合する、オリゴヌクレオチドプローブ又はそれらの誘導体の、投与又はｉｎ  ｓｉｔｕでの発生を意味する。前記の結合は、一般に行われている塩基対の相補性によってもよく、又は、たとえば、ＤＮＡ二重らせんへの結合の場合において、前記の二重らせんのグルーブにおける特異的な相互作用を通じてであってもよい。一般に、アンチセンス治療法は、この技術分野で一般的に実施されている技法の範囲を意味し、そしてオリゴヌクレオチド配列への特異的な結合に依存しているあらゆる治療法を包含する。
【００５５】
前記のオリゴヌクレオチドは、もう一つの分子、たとえば、ペプチド、ハイブリッド引金架橋試薬、輸送試薬、ハイブリッド引金開裂試薬等と接合されていてもよい。アンチセンス分子は、「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）でありうる。ＰＮＡは、リジンを末端とするアミノ酸残基のペプチド骨格に結合している、長さで少なくとも５個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス分子又は抗遺伝子薬剤を意味する。末端のリジンは、前記の組成物に対して溶解性を付与する。ＰＮＡは、優先的に相補性一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡに結合し、そして転写延長を止め、そして細胞におけるそれらの寿命を延ばすためにペジレイト（ｐｅｇｙｌａｔｅ）されてもよい。
【００５６】
本発明のアンチセンス構築物は、たとえば、細胞中で転写されると、本発明のポリペプチドをエンコードする、少なくともｍＲＮＡのユニークな部分に対して相補性であるＲＮＡを産生する発現プラスミドとして放出されてもよい。あるいは、前記のアンチセンス構築物は、ｅｘ  ｖｉｖｏで産生され、そして細胞中に導入されると、本発明のポリペプチドをエンコードする、ｍＲＮＡ及び／又はゲノム配列とハイブリッドを形成することにより発現の阻害を引き起こすオリゴヌクレオチドプローブであってもよい。前記のオリゴヌクレオチドプローブは、たとえば、エキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼのような内因性ヌクレアーゼに対して耐性であり、そしてそれゆえｉｎ  ｖｉｖｏで安定である修飾されたオリゴヌクレオチドであってもよい。アンチセンス  オリゴヌクレオチドとして使用されるための典型的な核酸分子は、ＤＮＡのホスホラミデテ（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、ホスホチオエート及びメチルホスホネート  アナログである。（米国特許第５，１７６，９９６号、米国特許第５，２６４，５６４号、及び米国特許第５，２５６，７７５号も参照。）  加えて、アンチセンス治療法で有用なオリゴマーを構築する一般的なアプローチは、たとえば、van der Krol et al., (1988) Biotechniques
6:958-976;及びStein et al., (1988) Cancer Res 48:2659-2668によりレビューされた。
【特許文献５】米国特許第５，１７６，９９６号
【特許文献６】米国特許第５，２６４，５６４号
【特許文献７】米国特許第５，２５６，７７５号
【００５７】
さらなる態様では、二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及びそれと同じものを投与する方法が提供される。ｓｉＲＮＡは、遺伝子の発現を減らすか、又は遮断する。理論により束縛されることを望まない限りは、ｓｉＲＮＡは、配列特異的なｍＲＮＡの分解を仲介することにより、遺伝子発現を阻害することが、一般的に考えられている。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、前記のサイレンスされる遺伝子の配列に相同である二重らせんＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により開始される、特に動物及び植物における配列特異的な、転写後の遺伝子サイレンシングのプロセスである（Elbashir et al. Nature 2001; 411(6836): 494-8）。したがって、本発明のポリヌクレオチドの全て又は一部に対する、実質的な配列同一性を有するｓｉＲＮＡ及び長いｄｓＲＮＡを、本発明の核酸の発現を阻害するために使用してもよいことが理解される。
【００５８】
あるいは、ここに記載されているＳｉｒ又はＦｈｕＣポリペプチドの発現を減らすか又は遮断するｓｉＲＮＡを、前記の標的遺伝子に対する、複数のｓｉＲＮＡを試すことにより決定してもよい。標的遺伝子に対する前記のｓｉＲＮＡを、化学的に合成してもよい。前記の鎖が、阻害される目的の遺伝子に対する相補性の領域を有するようにして、前記の個々のＲＮＡ鎖のヌクレオチド配列は選ばれる（すなわち、前記の相補性のＲＮＡ鎖は、前記の標的遺伝子の発現の間に形成されるｍＲＮＡ転写の領域、又はそのプロセシング産生物、又は（＋）鎖ウイルスの領域に対して相補性であるヌクレオチド配列を含む。）。前記のＲＮＡ鎖を合成するステップは、個々のヌクレオチドが、連続した合成サイクルにおいてインターヌクレオチド３‘−５’ホスホジエステル結合の形成を通じて端と端とくっつけて結合される、固相合成を包含してもよい。
【００５９】
ここで記載されているように、Ｓｉｒ又はＦｈｕＣ核酸の配列のみからなる核酸配列を包含するｓｉＲＮＡ分子が、ここでは提供される。ｓｉＲＮＡ分子は、二つの鎖を含み、各鎖が、互いに少なくとも本質的に相補性であるヌクレオチド配列を含み、そして、二つの鎖の一方が、標的遺伝子の配列に対して本質的に相当するヌクレオチド配列を含んでもよい。標的遺伝子に本質的に相当する、前記の配列は、「センス標的遺伝子」として言及され、そしてそれに対して本質的に相補的である、前記の配列は、前記のｓｉＲＮＡの「アンチセンス標的配列」として言及される。前記のセンス及びアンチセンス標的配列は、約１５から約３０の長さの連続するヌクレオチド、約１９から約２５の連続するヌクレオチド、約１９から２３の連続するヌクレオチド、又は約１９、２０、２１、２２若しくは２３の長さのヌクレオチドであってもよい。前記のセンス及びアンチセンス配列の長さは、決定された結果、前記の長さのセンス及びアンチセンス標的配列を有するｓｉＲＮＡは、好ましくは宿主のインターフェロン応答を著しく誘導することなく、標的遺伝子の発現を阻害することができる。ｓｉＲＮＡ標的配列は、ワールド・ワイド・ウェブ（ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ）上のｍｍｃｍａｎｕｓサイトにおけるエクステンションアドレス
web.mit.edu/mmcmanus/www/home1.2files/siRNAsで供給される、あらゆるアルゴリズムを利用することにより予測されるかもしれない。
【００６０】
前記センス標的配列は、標的核酸のコードしている部分、コードされていない部分又はそれの組み合わせと、本質的に又は実質的に同一であってもよい。たとえば、前記のセンス標的配列は、標的核酸又はその相補体の５‘又は３’翻訳されない領域、プロモーター、イントロン、又はエキソン本質的に相補性であってもよい。それは、また、二つの前記の遺伝子領域の間の境界を包含する領域に対して、本質的に相補性でありうる。
【００６１】
前記のセンス標的配列のヌクレオチドの塩基の組成は、アデニン（Ａ）及びチミジン（Ｔ）が約５０％、並びにシチジン（Ｃ）及びグアノシンが（Ｇ）が５０％でありうる。あるいは、前記の塩基組成は、少なくともＣ／Ｇが５０％でありえ、たとえば、Ｃ／Ｇが約６０％、７０％又は８０％でありうる。したがって、センス標的配列の選択は、ヌクレオチド塩基の組成に基づいていてもよい。ｓｉＲＮＡによる標的核酸への接近しやすさに関して、前記の接近しやすさは、たとえば、Lee et
al. (2002) Nature Biotech. 19:500に記載されているようにして決定されうる。このアプローチは、たとえば、細胞抽出物におけるように基質への接近しやすさを決定するために、プローブとして、前記の標的核酸に対する相補性であるオリゴヌクレオチドの使用を含む。前記のオリゴヌクレオチドプローブとデュプレックスを形成した後、前記の基質は、ＲＮａｓｅ  Ｈに対して感受性になる。それゆえ、たとえばＰＣＲにより決定されるように一定のプローブに対するＲＮａｓｅＨの感受性の程度は、前記の選択されたサイトへの接近のしやすさを反映し、そして如何によく、対応するｓｉＲＮＡがこの標的遺伝子からの転写の阻害で実行するかについての予測値であるかもしれない。ある人は、また、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイのための、又は最初の標的配列を同定するためのアンチセンス  オリゴヌクレオチドを同定するためのプライマーを同定するアルゴリズムを使用するかもしれない。前記のセンス及びアンチセンス標的配列は、好ましくは十分に相補的である結果、両方の配列を含むｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を阻害することができる、すなわち、ＲＮＡ干渉を仲介することができる。たとえば、前記の配列は、たとえば、細胞内というような望ましい条件下でハイブリッド形成を可能にするために十分相補性であるかもしれない。
したがって、前記のセンス及びアンチセンス標的配列は、少なくとも約９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性であってもよく、そしてたとえば多くても、５、４、３、２、１又０ヌクレオチドで異なってもよい。
【００６２】
センス及びアンチセンス標的配列は、また、前記の標的遺伝子又はその相補性以外の配列と相互に意義あるように作用しないような、好ましい配列である。このことは、たとえば、標的細胞のゲノムにおいて、選択された配列と他の配列とを比較して確認することができる。配列比較は、この分野で知られている方法、たとえば、ここでさらに記載するＢＬＡＳＴアルゴニズムを使用して、実施されうる。もちろん、小スケールの実験は、また、特異な最初の標的配列が、特異的に標的核酸の発現を阻害することができ、及び本質的に他の遺伝子の発現を阻害しないということを確認するために実施されうる。
【００６３】
ｓｉＲＮＡは、また、前記のセンス及びアンチセンス配列に加えて配列を含んでいてもよい。たとえば、ｓｉＲＮＡは、少なくとも一方の鎖が３‘オーバーハングを有する二本鎖のＲＮＡからなるＲＮＡデュプレックスであってもよい。前記の他の鎖は、平滑末端であるか、又はオーバーハングを有することができる。前記のＲＮＡが二本鎖であり、そして両方の鎖がオーバーハングを含む実施態様では、前記のオーバーハングの長さは、各鎖において同じか、又は異なっていてもよい。特定の実施態様では、ｓｉＲＮＡは、対になっており、そして前記のＲＮＡの両方の３‘末端で約１から約３ヌクレオチド、特に約２ヌクレオチドのオーバーハングを有する約１９−２５ヌクレオチドからなり、一本ＲＮＡ鎖上にあるセンス配列及びアンチセンス配列を含む。さらに本発明のＲＮＡの安定性を向上するために、前記の３‘オーバーハングは分解に対して安定化されうる。一つの実施態様では、前記のＲＮＡは、たとえば、アデノシンヌクレオチド又はグアノシンヌクレオチドのようなプリンヌクレオチドを含めることにより安定化される。あるいは、たとえば、２’−デオキシチミジンによる、ウリジン２ヌクレオチド３‘オーバーハングの置換というような、修飾されたアナログによるピリミジンヌクレオチドの置換は、許容され、そしてＲＮＡｉの有効性に影響しない。２‘位の水酸基がないことは、また、少なくとも組織培養培地において、前記のオーバーハングのヌクレアーゼ耐性を著しく向上する可能性がある。ｓｉＲＮＡのＲＮＡ鎖は、５‘−リン酸及び３’−水酸基を有していてもよい。一つの実施態様では、ｓｉＲＮＡ分子は、デュプレックスを形成する、二本鎖のＲＮＡを包含する。もう一つの実施態様では、ｓｉＲＮＡ分子は、前記のセンス及びアンチセンス標的配列がハイブリダイズし、そして前記の二つ標的配列の間の配列が、本質的に前記のヘヤピン構造のループを構成するスペーサー配列である、ヘヤピンループを形成する一つのＲＮＡ鎖から成る。もし、少なくとも前記のスペーサーの一部分が前記のヘヤピンの閉鎖末端で前記のループを形成するところの、この配列を有するスペーサーにより結合された、二つの相補オリゴヌクレオチドは、ヘヤピン構造を形成することができるならば、前記のスペーサー配列は、ヌクレオチドのあらゆる組み合わせ及びあらゆる長さであってもよい。たとえば、前記のスペーサー配列は、約３から約３０ヌクレオチド、約３から約２０ヌクレオチド、約５から約１５ヌクレオチド、約５から約１０ヌクレオチド、又は約３から約９ヌクレオチドでありうる。もし、それがヘヤピン構造の形成を妨げないならば、前記の配列は、あらゆる配列でありうる。特に、前記のスペーサーが、好ましくは、前記の第一又は第二の標的配列に対して、意味のある相同性を有する配列ではない。なぜならば、これはヘヤピン構造の形成を妨げるかもしれないからである。前記のスペーサー配列は、また、好ましくは、たとえば、前記の核酸が導入されるであろう細胞のゲノム配列のような他の配列と類似していない。なぜならば、これが前記の細胞内で好ましくない影響を及ぼすかもしれないからである。
【００６４】
当業者ならば、核酸、たとえばＲＮＡに言及すると、前記のＲＮＡは、天然に存在するヌクレオチド、又はたとえば、前記の核酸に安定性を付与するヌクレオチド誘導体を包含するかもしれないか、又はから成るかもしれないことを理解するであろう。もし、前記の核酸は、望ましい様式で作用することができるならば、あらゆる誘導体が、容認される。もし、たとえば、前記のｓｉＲＮＡが、依然として前記の標的遺伝子の発現を阻害することができるならば、ｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド誘導体を包含してもよい。たとえば、ｓｉＲＮＡは、安定性又はその他の理由のために、一つ又はそれより多い、修飾された塩基及び／又は修飾された骨格を包含してもよい。たとえば、天然のＲＮＡのホスホジエステル結合は、少なくとも一つの窒素又はイオウ  へテロ原子を含むように修飾されてもよい。その上、ただ二つの例の提案するために、たとえばイノシンのような変わった塩基、又はたとえばトリチル化された塩基のような修飾された塩基を包含するｓｉＲＮＡを、本発明で使用することができる。当業者に知られている、多くの有用な目的に役立つＲＮＡに対して、非常に多種にわたる修飾がなされたことは、十分意識されているであろう。もし、それが、内因性のテンプレートから誘導されたならば、ｓｉＲＮＡという用語は、ここでそれが採用されているように、化学的、酵素的又は代謝的に修飾されたｓｉＲＮＡのフォームを包含する。
ｓｉＲＮＡが、合成される得る方法に関して、制限がない。それゆえ、それは、手動又は自動化された手順を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで合成されてもよい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成は、化学的合成又は、たとえば、ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）テンプレートの転写のためにクローン化されたＲＮＡポリメラーゼ（たとえば、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６）の使用する酵素的合成又は両者の混合であってもよい。ｓｉＲＮＡは、また、たとえば、化学的に前記の二つの鎖のそれぞれを合成し、そして前記の二つの鎖をハイブリッド形成して、デュプレックスを形成するように合成することにより、調製されてもよい。ｉｎ  ｖｉｖｏの場合、ｓｉＲＮＡは、この分野でよく知られている組換え技法を合成されてもよい。(たとえば、 Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition
(1989)、
DNA Cloning, Volumes I and II (D. N
Glover ed. 1985)、
Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed, 1984)、
Nucleic Acid Hybridisation (B. D. Hames & S. J. Higgins
eds. 1984)、
Transcription and Translation (B. D. Hames & S. J.
Higgins eds. 1984)、
Animal Cell Culture (R. I. Freshney ed. 1986)、
Immobilised Cells and Enzymes (IRL Press, 1986)、
B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the series, Methods in
Enzymology (Academic Press, Inc.)、
Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J. H. Miller and
M. P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology Vol.
154 and Vol. 155 (Wu and Grossman, and Wu, eds., respectively)、
Mayer and Walker, eds.
(1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London),
Scopes, (1987), Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer-Verlag,
N.Y.)及び
Handbook of
Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds 1986)を参照)たとえば、細菌細胞は、前記のｓｉＲＮＡが誘導されるべきＤＮＡテンプレートを包含する発現ベクターにより形質転換することができる。
もし細胞外で合成された場合、前記のｓｉＲＮＡを、前記の細胞への導入に先立ち、精製してもよい。精製は、溶媒（たとえば、フェノール／クロロホルム）抽出、樹脂若しくは沈殿（たとえば、エタノール中）、電気泳動、クロマトグラフィー、又はそれらの組み合わせによるものであってもよい。
しかしながら、精製は、ｓｉＲＮＡの損失を生ずるかもしれない。それゆえ、精製を、最小限にするか、又はほとんど実施されなくてもよい。前記のｓｉＲＮＡは、貯蔵のために乾燥されてもよく、又は前記のＲＮＡ鎖のアニーリング及び／又は安定性を促進するために、バッファー又は塩を含んでいてもよい水性溶液に溶解されていてもよい。
【００６５】
前記の二本鎖構造は、一本鎖の自己相補性ＲＮＡ鎖又は二本の分離れた相補性ＲＮＡ鎖により形成されてもよい。
【００６６】
哺乳動物細胞は、細胞外ｓｉＲＮＡに応答することができ、それゆえｄｓＲＮＡのための輸送メカニズムを備えているかもしれない（Asher et
al.)(1969) Nature 223 715-717）。それゆえ、ｓｉＲＮＡは、細胞外に腹腔、間隙スペース、哺乳動物の血液循環中に投与されてもよく、又は経口で導入されてもよい。経口にて導入する方法は、食物として使用される種を前記のＲＮＡを発現するように処理し、それから感染される哺乳動物に与える処理アプローチだけでなく、前記のＲＮＡを直接哺乳動物の食物に混ぜる方法を包含する。たとえば、Lactococcus lactisのような食用細菌を、前記のｄｓＲＮＡを産生するように変換してもよい（国際公開ＷＯ９３／１７１１７号パンフレット及び国際公開ＷＯ９７／１４８０６号パンフレットを参照）。
【特許文献８】国際公開ＷＯ９３／１７１１７号パンフレット
【特許文献９】国際公開ＷＯ９７／１４８０６号パンフレット
【００６７】
血管循環又は血管外循環、血液又はリンパシステム及び脳脊髄液は、前記のＲＮＡが注射されてもよいサイトである。
【００６８】
ＲＮＡは、細胞内的に細胞に導入されてもよい。核酸を導入する物理的な方法は、また、この場合において使用されてもよい。ｓｉＲＮＡは、Zernicka-Goetz et al. (1997) Development 124, 1133-1137 and Wianny et al. (1998) Chromosoma 107, 430-439に開示されているようなマイクロインジェクション法を使用して投与される。
【００６９】
細胞内に核酸を導入する他の物理的な方法は、たとえば、前記のｓｉＲＮＡを金の微片上に固定し、傷つけた部位を目がけて直接発砲する遺伝子銃法のような、前記のｓｉＲＮＡで覆われた微片による爆撃を包含する。それゆえ、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するための遺伝子銃におけるｓｉＲＮＡの使用を提供する。さらに、ｓｉＲＮＡ及び金微片を包含する遺伝子銃による治療法に適した組成物がここで提供される。もう一つの物理的な方法は、前記のｓｉＲＮＡの存在下での細胞膜のエレクトロポレーションを包含する。この方法は、大スケールでのＲＮＡｉを可能にする。この技術分野で知られている、細胞に核酸を導入するための他の方法としては、たとえば脂質仲介キャリヤー輸送、たとえばリン酸カルシウム等の化学物質仲介輸送を使用しもよい。ｓｉＲＮＡは、細胞によるＲＮＡの取り込み、デュプレックス鎖のアニーリングの促進、アニーリングされた鎖の安定化若しくは標的遺伝子の阻害の増加のような活性の一つ又はそれより多い活性を実行する構成成分により導入されてもよい。
【００７０】
あらゆる知られた遺伝子治療法が、前記のＲＮＡを投与するために使用することができる。ウイルス粒子に充填されたウイルス性構築物は、前記の細胞への発現構築物の効率的な導入、及び前記の発現構築物によりエンコードされたｓｉＲＮＡの転写の両方を成し遂げるであろう。それゆえ、ｓｉＲＮＡは、また、細胞内で産生することができる。たとえば、ｓｉＲＮＡ分子の一つ又は二つの鎖をコードする核酸を包含する発現ベクターのようなベクターは、その目的に使用されてもよい。前記の核酸は、さらに、前記のセンス標的配列に対して本質的に相補性であるアンチセンス配列を包含していてもよい。前記の核酸は、さらに、前記のセンスと前記のアンチセンスの標的配列の間にスペーサー配列を包含していてもよい。前記の核酸は、さらに、たとえば、ＲＮＡポリメラーゼ  ＩＩ又はＩＩＩプロモーター及び転写終結シグナルのような、細胞中での前記のセンス及びアンチセンス配列の発現を指向するためのプロモーターを包含してもよい。前記の配列は、使用できるようにリンクされていてもよい。
【００７１】
ある実施態様では、核酸は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターに使用できるようにリンクされたＲＮＡをコードする領域（たとえば、センス又はアンチセンス標的配列）を包含する。前記のＲＮＡをコードする領域に、ｐｏｌ  ＩＩＩによるＲＮＡ合成の終結を案内する、ｐｏｌ  ＩＩＩターミネーター配列により直に続くことができる前記のｐｏｌ  ＩＩＩターミネーター配列は、一般的に４個又はそれより多い、連続したチミジン（「Ｔ」）残基を有する。好ましい実施態様では、５個の連続するＴ残基の群が、ｐｏｌ  ＩＩＩ転写が前記のＤＮＡテンプレートの前記の二番目又は三番目のＴで止められ、そして、それゆえ２個又は３個のウリジン（「Ｕ」）残基のみが、前記のコード配列の３‘末端に付け加えられる、前記のターミネーターとして使用される。たとえば、ヒト又はマウス又はその他の種由来の、Ｈ１  ＲＮＡ遺伝子又はＵ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子から誘導される前記のプロモーターフラグメントを含む、様々なｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターを、本発明において使用することがでる。さらに、ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターを、偏在するか又は組織特異的であるかのどちらか一方の様式で、たとえば、小さな化学分子により誘導される能力のような、他の望ましい特性を組み入れるために修飾／加工することができる。たとえば、一つの実施態様では、前記のプロモーターは、テトラサイクリンにより活性化されてもよい。もう一つの実施態様では、前記のプロモーターは、ＩＰＴＧ（ｌａｃＩ  ｓｙｓｔｅｍ）で活性化されてもよい。
【００７２】
ｓｉＲＮＡは、たとえば、ベクター、発現カセットを含む各核酸、プロモーターを含む各発現カセット、ＲＮＡをコードする配列（一つは、センス標的配列であり、他はアンチセンス標的配列である）及び終結シグナルのような、二つの核酸により細胞の形質変換により、細胞で産生され得る。あるいは、一本の核酸は、これらの二つの発現カセットを包含してもよい。さらなるもう一つの実施態様では、核酸は、アンチセンス標的配列に結合されたスペーサーに結合されたセンス標的配列を包含する一本鎖のＲＮＡをエンコードする。前記の核酸は、たとえばベクターが導入された細胞において、前記のセンス及びアンチセンス標的配列の発現を可能にする真核発現ベクターのような、たとえば、発現ベクターのような、ベクターに存在してもよい。
【００７３】
ｓｉＲＮＡを産生するためのベクターは、以下の文献及び特許文献に開示されている。
Paul et al. (2002) Nature Biotechnology 29:505;
Xia et al. (2002) Nature Biotechnology 20:1006;
Zeng et al. (2002) Mol. Cell 9:1327;
Thijn et al. (2002) Science 296:550;
BMC
Biotechnol. 2002 Aug 28;2(1):15;
Lee et al. (2002) Nature Biotechnology 19: 500;
McManus et al. (2002) RNA 8:842;
Miyagishi
et al. (2002) Nature Biotechnology 19:497;
Sui et al. (2002) PNAS 99:5515;
Yu et al. (2002) PNAS 99:6047;
Shi et al. (2003) Trends Genet. 19(1):9;
Gaudilliere
et al. (2002) J. Biol. Chem. 277(48):46442;
US2002/0182223;
US
2003/0027783;
WO
01/36646及び
WO
03/006477
ベクターは、また、市販されている。たとえば、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒは、ジーン・セラピー・システムズ・インク（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）から入手可能であり、ｐＳＵＰＥＲは、オリゴエンジン（Ｏｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ）から入手可能である。
【特許文献１０】米国公開特許第２００２／０１８２２２３号
【特許文献１１】米国公開特許第２００３／００２７７８３号
【特許文献１２】国際公開ＷＯ０１／３６６４６号パンフレット
【特許文献１３】国際公開ＷＯ０３／００６４７７号パンフレット
【００７４】
ここでは、また、一つ若しくはそれより多いｓｉＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡの領域をコードするＲＮＡをエンコードする核酸を包含する組成物が提供される。組成物は、薬学的組成物であってもよく、そして薬学的に受容されるキャリヤーを含んでもよい。組成物は、また、前記の組成物を細胞又は被験体に投与するためのデバイスとして提供されてもよい。たとえば、組成物は、シリンジ中又はステント上において存在していてもよい。組成物は、また、前記のｓｉＲＮＡ又は核酸の細胞への導入を促進する試薬を包含してもよい。
【００７５】
一般に、前記のオリゴヌクレオチドは、以下の文献に開示されたプロトコールを使用して合成されてもよい。なお、以下の文献の全ての内容はここに引用により援用されている。
Caruthers
et al., Methods in Enzymology (1992) 211:3-19;
Thompson et al., International PCT Publication
No. WO 99/54459;
Wincott et al., Nucl. Acids Res. (1995) 23:2677-2684;
Wincott et al., Methods Mol. Bio., (1997) 74:59;
Brennan et al., Biotechnol. Bioeng. (1998) 61:33-45; 及び
Brennan,
U.S. Pat. No.
6,001,311
一般に、オリゴヌクレオチドの合成は、たとえば、５‘−末端におけるジメトキシトリチル基、及び３’−末端におけるホスホラミダイト基のような、一般に使用されている核酸の保護基及びカップリング基を包含する。制限されない例において、小スケール合成は、アプライド・バイオシステムズ・インク（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．  （Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ））より発売されている、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９  ＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを使用して、ケムジーン・コーポレーション（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（Ａｓｈｌａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，  ２００  Ｈｏｍｅｒ  Ａｖｅｎｕｅ，  Ａｓｈｌａｎｄ，  ＭＡ  ０１７２１，  ＵＳＡ）より発売されているリボヌクレオシド  ホスホラミダイトを用いて実施される。あるいは、合成は、たとえば、プロトジーン（Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ）（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  Ｃａｌｉｆ．，  ＵＳＡ）により製造されている器械のような、９６−ウエル・プレート・シンセサイザー（９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）又は、たとえば以下の文献に開示されている方法により実施することができる。なお、以下の文献の全ての内容はここに引用により援用されている。
Usman et al., J. Am. Chem. Soc. (1987) 109:7845;
Scaringe et al., Nucl. Acids Res. (1990) 18:5433;
Wincott et al., Nucl. Acids Res. (1990) 23:2677-2684;  及び
Wincott et al., Methods Mol. Bio. (1997) 74:59
【特許文献１４】国際公開ＷＯ９９／５４４５９号パンフレット
【特許文献１５】米国特許第６，００１，３１１号
【００７６】
本発明の核酸分子は、別々に合成されてもよく、そしてｄｓＲＮＡは、合成後に、たとえば、連鎖反応
(Moore et al., Science (1992) 256:9923;
Draper et al., International PCT publication
No. WO 93/23569;
Shabarova
et al., Nucl. Acids Res. (1991) 19:4247;
Bellon et al., Nucleosides & Nucleotides (1997) 16:951;  及び
Bellon et al., Bioconjugate Chem. (1997) 8:204）によるか、又は合成及び／又は保護基の脱離に続くハイブリッド形成により形成されてもよい。前記の核酸分子は、一般に行われている方法を使用するゲル電気泳動法か、又は高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、Wincott et al.による前掲の文献を参照されたし、なお、以下の文献の全ての内容はここに引用により援用されている。）に精製することができ、そして水に再懸濁する。
【特許文献１６】世界公開ＷＯ９３／２３５６９号パンフレット
【００７７】
もう一つの実施態様では、細胞中の特有のｍＲＮＡ又はポリペプチドのレベルは、リボザイムの細胞内への導入又はリボザイムをエンコードする核酸の導入により減らされる。触媒的にｍＲＮＡ転写物を切断するようにデザインされたリボザイム分子は、また、遺伝子Ｙの発現を阻害するために、導入されうるか、又は発現されうる（たとえば、Sarver et al., 1990, Science
247:1222-1225及び米国特許第５，０９３，２４６号）。一般的に使用されているリボザイム・モチーフは、前記の基質配列の条件が最少量であるハンマーヘッドである。前記のハンマーヘッド  リボザイムのデザインは、Usman et al., Current Opin. Struct.
Biol. (1996) 6:527-533に開示されている。ウスマン（Ｕｓｍａｎ）は、また、リボザイムの治療学的な用途についても論じている。リボザイムは、また、以下の文献又は特許文献に記載されているように、調製されることができ、そして使用され得る。
Long et
al., FASEB J. (1993) 7:25;
Symons, Ann.
Rev. Biochem. (1992) 61:641;
Perrotta et
al., Biochem. (1992) 31:16-17;
Ojwang et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1992) 89:10802-10806;及び
米国特許第５，２５４，６７８号
ＨＩＶ−Ｉ  ＲＮＡのリボザイム開裂が、米国特許第５，１４４，０１９号に開示され、リボザイムを使用するＲＮＡの開裂方法が、米国特許第５，１１６，７４２号に開示され、そしてリボザイムの特異性を向上する方法が、米国特許第５，２２５，３３７号及びKoizumi et al., Nucleic Acid
Res. (1989) 17:7059-7071に開示されている。ハンマーヘッド構造におけるリボザイムフラグメントの調製及び用途は、また、Koizumi et al., Nucleic Acids Res. (1989)
17:7059-7071に開示されている。ヘヤピン構造におけるリボザイムフラグメントの調製及び用途は、Chowrira and Burke, Nucleic Acids Res. (1992)
20:2835に開示されている。リボザイムは、また、Daubendiek and Kool, Nat. Biotechnol. (1997)
15(3):273-277に開示されているローリング  トランスクリプションにより作製することができる。
【特許文献１７】米国特許第５，０９３，２４６号
【特許文献１８】米国特許第５，２５４，６７８号
【特許文献１９】米国特許第５，１４４，０１９号
【特許文献２０】米国特許第５，１１６，７４２号
【特許文献２１】米国特許第５，２２５，３３７号
【００７８】
遺伝子発現は、体内の標的細胞における前記の遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成するために、前記の標的遺伝子（すなわち、前記の遺伝子プロモーター及び／又はエンハンサー）の制御領域に対して相補的であるデオキシリボヌクレオチド配列をターゲッティングすることにより減らすことができる。(一般的にHelene (1991) Anticancer Drug Des., 6(6):569-84; Helene et al. (1992) Ann. N.Y.
Acad. Sci., 660:27-36及びMaher (1992) Bioassays
14(12):807-15を参照されたし。).
【００７９】
さらなる実施態様では、ＲＮＡアプタマー（ＲＮＡ  ａｐｔａｍｅｒ）は、細胞中に導入され得るか、又は細胞中で発現され得る。ＲＮＡアプタマー（ＲＮＡ  ａｐｔａｍｅｒ）は、特異的にそれらの翻訳を阻害することができる、たとえば、Ｔａｔ及びＲｅｖ  ＲＮＡ（Good et al. (1997) Gene Therapy 4: 45-54）のようなタンパク質に対する、特異的なＲＮＡリガンドである。
【００８０】
４．ＳｉｒＡ、  ＳｉｒＢ、  ＳｉｒＣ及びＦｈｕＣポリペプチド
ここに開示されているＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ及びＦｈｕＣポリペプチドは、天然から精製された調製物、化学合成された調製物、及びたとえば、細菌、酵母、高等直物細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞を含む、原核生物又は真核生物の宿主細胞から組換え法により産生された調製物を包含する。ある実施態様では、ここで開示された、前記のポリペプチドは、Ｓｉｒポリペプチド及びＦｈｕＣの機能を阻害する。
【００８１】
ポリペプチドは、また、図６乃至図１１に示されたヌクレオチド配列によりエンコードされたアミノ酸配列を包含してもよいか、から成っていてもよいか、又は、のみから成っていてもよい。ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ及びＦｈｕＣについての典型的なポリペプチド配列は、図７乃至図９及び図１１にそれぞれ示されている。さらに、他のポリペプチドは、ここに記載したＳｉｒ又はＦｈｕＣポリペプチドと、少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９８％及び９９％の同一性又は同族性を有するアミノ酸配列を包含するか、から成るか、又は、のみから成る。たとえば、天然に存在するタンパク質の配列から、約１、２、３、４、５又はそれより多いアミノ酸において異なる、ポリペプチドは、また、意図されている。前記の相違は、たとえば同類置換、欠失及び付加のような置換であってもよい。前記の相違は、異なる種における意味ありげに保存されていない領域におけるのが好ましい。前記の領域は、様々な種からのアミノ酸配列を一列に並べることにより同定することができる。これらのアミノ酸は、たとえば、もう一つの種にあるアミノ酸により置換することができる。これらの位置又は他の位置で置換、挿入又は欠失されていてもよい、他のアミノ酸は、生物学的アッセイと結びつけた突然変異誘発研究により同定することができる。
【００８２】
ここに網羅されている他のタンパク質は、修飾されたアミノ酸を包含するものである。典型的なタンパク質は、それが誘導されたタンパク質の少なくとも一つの生物学的機能を保持する、グリコシル化、ペジィレーション（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化又はあらゆる同じようなプロセスにより修飾されたタンパク質であってもよい、誘導体化されたタンパク質である。
【００８３】
タンパク質は、また、一つ又はそれより多い天然には存在しないアミノ酸を包含してもよい。たとえば、非古典的アミノ酸又は化学的アミノ酸アナログは、置換、付加または欠失としてタンパク質に導入することができる。非古典的アミノ酸は、通常のアミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノブタン酸、α−アミノイソブタン酸、４−アミノブタン酸、Ａｂｕ、２−アミノブタン酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソブタン酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、ザルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フッ化アミノ酸、たとえば、β−メチルアミノ酸、Ｃａｌｐｈａ−メチルアミノ酸、Ｎａｌｐｈａ−メチルアミノ酸及び一般的なアミノ酸アナログのようなｄｅｓｉｇｎｅｒアミノ酸を包含するが、これらに限定されるものではない。さらに、前記のアミノ酸は、Ｄ（右旋性）又はＬ（左旋性）である。
【００８４】
ある実施態様では、ここに記載されたＳｉｒ又はＦｈｕＣポリペプチドは、その溶解性を向上する、及び／又はその精製、同定、検出及び／又は構造的な特色付けを促進するドメインを含む融合タンパク質であってもよい。典型的なドメインは、たとえば、グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、カルモジュリン結合ペプチド、チオレドキシン、マルトース結合タンパク質、ＨＡ、ｍｙｃ、ポリアルギニン、ポリヒスチジン（ｐｏｌｙＨｉｓ）、ポリＨｉｓ−Ａｓｐ又はＦＬＡＧ融合タンパク質及びｔａｇを含む。さらなる典型的なドメインは、たとえば、シグナルペプチド、ＩＩＩ型分泌システム−標的ペプチド（ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）、トランスサイトーシス、核局在化シグナル等の、ｉｎ  ｖｉｖｏでタンパク質の局在性を変えるドメインを包含する。様々な実施態様で、本発明のポリペプチドは、一つ又はそれより多い異種の融合を包含してもよい。ポリペプチドは、同じ融合ドメインの複数のコピーを含んでいてもよく、又は二つ又はそれより多い異なるドメインに対する融合を含んでいてもよい。前記の融合は、前記のポリペプチドのＮ−末端、前記のポリペプチドのＣ−末端、又は前記のポリペプチドのＮ−及びＣ−末端の両方で生じてもよい。融合タンパク質の構築を促進するため、又はタンパク質の発現又は融合タンパク質の構造的制約を最適化するために、本発明のポリペプチドと前記の融合タンパク質との間のリンカー配列を含むこともまた本発明の範囲内である。もう一つの実施態様では、前記のポリペプチドは、タンパク質の発現の後、又はその後で、前記の標識を除くために前記の融合タンパク質と本発明のポリペプチドとの間のプロテアーゼによる開裂サイトを含むように構築されてもよい。適切なエンドプロテアーゼの例は、たとえばＦａｃｔｏｒ  Ｘａ及びＴＥＶプロテアーゼを包含する。
【００８５】
前記のＳ．  ａｕｒｅｕｓポリペプチドは、硫酸アンモニウム又はエタノールによる沈殿、酸による抽出、アニオン又はカチオン交換樹脂クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィーを含む、よく知られた方法により組換え細胞培養物から回収及び精製することができ、及び高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製に使用される。タンパク質は、たとえば、調製されたタンパク質の、少なくとも約９０％が望みのタンパク質であるような、実質的に純粋な調製物として使用されてもよい。前記の望ましいタンパク質の、少なくとも約５０％、６０％、７０％又は８０％を含む組成物は、また、使用されてもよい。
【００８６】
ある実施態様では、本発明のポリペプチドを、化学的な合成、無細胞系においてリボソームにより、又は細胞内でのリボソームにより合成してもよい。本発明のポリペプチドの化学合成は、段階毎の固相合成法、ペプチドフラグメントのコンホメーションによる支援を受けた再連結反応による半合成法、クローン化された又は合成されたペプチドセグメントの酵素的連結反応法、及び化学的連結反応法を含む、様々なこの技術分野で認められた方法を使用して、実施されてもよい。本来の化学的連結反応は、一過性のチオエステルにより結合された中間体を産生するため、二つの保護されていないペプチドセグメントの化学的な選択的反応を利用する。前記の一過性のチオエステルにより結合された中間体は、その後、自然に転移反応を経て、前記の連結サイトにおける本来のペプチド結合を有する完全な長さの連結反応生成物を生ずる。完全な長さの連結反応生成物は、無細胞系における合成により産生されたタンパク質と化学的に同一である。完全な長さの連結反応生成物は、本来のジスルフィド結合を含むタンパク質分子を形成するために、認められているように、再び組み合わせられるか、及び／又は酸化されてもよい(たとえば、米国特許第6,184,344号、
米国特許第6,174,530号;
Muir et al.,
Curr. Opin. Biotech. (1993): vol. 4,
p 420;
Miller et al.,
Science (1989): vol. 246, p 1149;
Wlodawer et al.,
Science (1989): vol. 245, p 616;
Huang et al.,
Biochemistry (1991): vol. 30, p 7402;
Schnolzer, et
al., Int. J. Pept. Prot. Res.
(1992): vol. 40, p 180-193;
Rajarathnam et
al., Science (1994): vol. 264, p
90;
R. E. Offord, “Chemical Approaches to Protein
Engineering”, in Protein Design and the Development of New therapeutics and
Vaccines, J. B. Hook, G. Poste, Eds., (Plenum Press, New York, 1990) pp.
253-282;
Wallace et al.,
J. Biol. Chem. (1992): vol. 267, p
3852;
Abrahmsen et al.,
Biochemistry (1991): vol. 30, p 4151;
Chang, et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91:
12544-12548;
Schnlzer et al.,
Science (1992): vol., 3256, p 221;  及び
Akaji et al.,
Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) (1985) 33:
184を参照されたし。)。
【特許文献２２】米国特許第６，１８４，３４４号
【特許文献２３】米国特許第６，１７４，５３０号
【００８７】
ある実施態様では、本発明のポリペプチドに関して、天然に産生するポリペプチド同族体又は実験的に誘導されたポリペプチド同族体を提供することは、有益であるかもしれない。前記の同族体は、前記のポリペプチドの天然に産生するフォームの生物学的活性の一組を促進又は阻害するために、モジュレーターとして限られた能力の中で機能するかもしれない。それゆえ、特異的な生物学的な効果は、本発明のポリペプチドの生物学的活性のすべてに指向されている作動薬又は拮抗薬による治療に比べて、限られた機能の同族体による、かつより少ない副作用による治療により引き出されるかもしれない。たとえば、一定のタンパク質と関連する本発明の野性型のポリペプチドの能力を阻害するが、前記の天然のポリペプチドと他の細胞のタンパク質との間の複合体形成を実質的に阻害しない、拮抗作用を有する同族体が生ずるかもしれない。
【００８８】
ポリペプチドは、本発明の完全な長さのポリペプチドから誘導されるかもしれない。これらのポリペプチドの単離されたペプチド部分は、前記ポリペプチドをエンコードする核酸の対応するフラグメントから、組換えにより産生されるポリペプチドをスクリーニングすることにより得られるかもしれない。さらに、フラグメントは、たとえば、一般に行われているメリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃ又はｔ−Ｂｏｃ化学のような当該技術分野で知られている技法を使用して、化学的に合成されてもよい。たとえば、タンパク質は、前記のフラグメントが重複する部分がない、望ましい長さのフラグメントに随意に分割されてもよいし、又は望ましい長さの重複するフラグメントに分割さてもよい。前記のフラグメントは、たとえば、本発明のポリペプチドの調節剤として機能する能力のような、望ましい特性を有するこれらのペプチドフラグメントを同定するために産生され（組換え法又は化学合成法により）、そして試験されてもよい。説明に役立つ実施態様では、本発明のタンパク質のペプチド部分を、たとえば、本発明のタンパク質の別個のフラグメントを含む、チオレドキシン融合タンパク質のとしての発現により、阻害作用に加えて、結合能力について試験してもよい（たとえば、米国特許第５，２７０，１８１号、米国特許第５，２９２，６４６号及び国際公開ＷＯ９４／０２５０２号パンフレットを参照されたし。）。
【特許文献２４】米国特許第５，２７０，１８１号
【特許文献２５】米国特許第５，２９２，６４６号
【特許文献２６】国際公開ＷＯ９４／０２５０２号パンフレット
【００８９】
もう一つの実施態様では、切頭のポリペプチドが、調製されてもよい。切頭のポリペプチドは、前記のＮ−末端若しくは前記のＣ−末端のいずれか、又は前記のＮ−末端及び前記のＣ−末端の両方から除かれた、１個から２０個又はそれより多いアミノ酸残基を有している。前記の切頭ポリペプチドは、前記の完全な長さのポリペプチドよりも、発現、精製又は特徴づけにおいて御しやすいことが証明されるかもしれない。たとえば、切頭のポリペプチドは、結晶化、高品質の回折の結晶を生ずること、又は高強度のピーク及び最小限の重なりのピークを備えたＨＳＱＣスペクトルを生ずることにおいて御しやすいことが証明されるかもしれない。さらに、切頭されたポリペプチドを使用して、また、特徴付けをより受けやすいかもしれない前記の完全な長さのポリペプチドの安定かつ活性なドメインを同定してもよい。
【００９０】
治療学的な有効性、予防的な有効性又は安定性（たとえば、ｅｘ  ｖｉｖｏでの貯蔵寿命、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける加水分解による分解への耐性等）を促進するような、前記の目的のために、本発明のポリペプチドの構造を修飾することも、また、可能である。前記のペプチドの天然に存在するフォームの少なくとも一つの活性を保持するようにデザインされた場合、前記の修飾されたポリペプチドは、ここにより詳細に記載されたポリペプチドの「機能的均等物」と考えられる。前記の修飾されたポリペプチドは、たとえば、同類のアミノ酸置換による全体又は一部からなるアミノ酸の置換、欠失又は付加により製造されるかもしれない。
【００９１】
たとえば、ロイシンをイソロイシン又はバリンで置換、グルタミン酸をアスパラギン酸で置換、スレオニンをセリンで置換というような孤立した同類のアミノ酸による置換は、前記の生じた分子の生物学的活性への大きな影響を有していないであろうということを予期することは、道理にかなっている。ポリペプチドのアミノ酸配列における変換が機能的な同族体を与えるかどうかは、野性型タンパク質の応答に類似する応答を提供する、前記の様々なポリペプチドの能力を評価することにより、容易に決定されるかもしれない。一回の置換よりも多い置換が行われたポリペプチドは、容易に同じようにして試験されるかもしれない。
【００９２】
切頭突然変異体に加えて、本発明のポリペプチドの組み合わせ突然変異体の一群を発生させる方法が提供され、そして当該方法は、特に可能性のある変異型の配列（たとえば、同族体）を同定するために、特に有用である。前記の組み合わせライブラリーをスクリーニングする目的は、たとえば、本発明のポリペプチドの活性を調節するかもしれない同族体、又は、あるいは全体で新規な活性を保有する同族体を発生させることである。組み合わせにより誘導された同族体は、天然に存在するタンパク質に比べて、選択的な有効性を有する同族体を生じるかもしれない。前記の同族体は、治療剤の開発に使用されるかもしれない。
【００９３】
同様に、突然変異誘発は、前記の対応する野性型タンパク質よりも劇的に異なる細胞内半減期を有する同族体を生ずるかもしれない。たとえば、前記の改造されたタンパク質は、タンパク質の加水分解、又は前記のタンパク質の破壊若しくは他の不活性化を生ずる他の細胞内のプロセスに対して、より安定であるか、又はより不安定であるかの何れかを示すかもしれない。前記の同族体、及びそれらをエンコードする遺伝子を、前記のタンパク質の半減期を調節することにより、タンパク質の発現を変えるために利用してもよい。上記のように、前記のタンパク質を、治療剤又は治療方法の開発に使用してもよい。
【００９４】
同様な方式において、タンパク質同族体を、前記の対応する野生型タンパク質の活性を妨げることができる拮抗剤として作用するために、前記の組合せアプローチにより発生させるかもしれない。
【００９５】
この方法の代表的な実施態様では、タンパク質同族体の集団のためのアミノ酸配列は、好ましくは可能な最も高い同族性を増進するために調節される。たとえば、そのような変異体の集団は、一つ又はそれより多い種からの同族体、又は突然変異に起因して異なる、同じ種からの同族体を含むかもしれない。前記の一列に並べられた配列の各位置に現れるアミノ酸は、組合せ配列の同義性セットを作り出すために選択される。ある実施態様では、前記の組合せライブラリーは、各々が少なくとも可能性のあるタンパク質配列を含むポリペプチドのライブラリーをエンコードする遺伝子の同義性ライブラリーのために作り出される。たとえば、合成されたオリゴヌクレオチドの混合物は、可能性のあるヌクレオチド配列の同義性セットが、個々のポリペプチドとして、又は、あるいはより大きな融合タンパク質（たとえば、ファージディスプレイ用）セットとして発現できるような、酵素的に結合させて遺伝子配列に変換されてもよい。
【００９６】
可能性のある同族体のライブラリーを、同義性のオリゴヌクレオチド配列から発生させることができる方法には、多くの方法がある。同義性の遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成装置で実施され、そしてその合成された遺伝子は、それから発現のために適当なベクターに組みこまれてもよい。遺伝子の同義性セットの一つの目的は、可能性のあるタンパク質配列の望ましいセットをエンコードする配列の全てを、一つの混合物で提供することである。前記の同義性オリゴヌクレオチドの合成は、当該技術分野ではよく知られている(たとえば、
Narang (1983) Tetrahedron
39:3;
Itakura et al.
(1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland
Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam:
Elsevier pp. 273-289;
Itakura et al.
(1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323;
Itakura et al.
(1984) Science 198:1056;
Ike et al.,
(1983) Nucleic Acid Res. 11:477を参照されたし。)。
前記の技法は、他のタンパク質の指定された発生に使用された。(たとえば、
米国特許第５，２２３，４０９号、
米国特許第５，１９８，３４６号及び
米国特許第５，０９６，８１５号に加えて、
Scott et al.
(1990) Science 249:386-390;
Roberts et al.
(1992) PNAS USA
89:2429-2433;
Devlin et al.
(1990) Science 249: 404-406;
Cwirla et al.
(1990) PNAS USA
87: 6378-6382を参照されたし。)。
【特許文献２７】米国特許第５，２２３，４０９号
【特許文献２８】米国特許第５，１９８，３４６号
【特許文献２９】米国特許第５，０９６，８１５号
【００９７】
あるいは、突然変異誘発の他のフォームは、組合せライブラリーを発生させるために利用されてもよい。
たとえば、タンパク質同族体（作動剤フォーム及び拮抗剤フォームの両方）は、発生させ、そして、たとえばアラニン置換変異体等(Ruf et al. (1994) Biochemistry 33:1565-1572;
Wang et al.
(1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099;
Balint et al.
(1993) Gene 137:109-118;
Grodberg et al.
(1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601;
Nagashima et al.
(1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892;
Lowman et al.
(1991) Biochemistry 30:10832-10838;及び
Cunningham et
al., (1989) Science
244:1081-1085)を使用してのスクリーニングにより、
リンカー  スキャニング突然変異誘発（ｌｉｎｋｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Gustin et al. (1993) Virology 193:653-660;
Brown et al. (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652;
McKnight et al.
(1982) Science 232:316);により、
サチュレーション突然変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Meyers et al. (1986) Science 232:613）により、
ＰＣＲ突然変異誘発（ＰＣＲ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Leung et al. (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19）により、
又はランダム突然変異誘発（ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）
（Miller et al. (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press,
Cold Spring Harbor, NY;及び
Greener et al.
(1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34）により、ライブラリーから発生され、そして単離されてもよい。リンカー  スキャニング突然変異誘発は、特に組合せセッティングにおいて、生理活性を有するタンパク質の切頭フォームを同定するために魅惑的な方法である。
【００９８】
広範囲の技法が、点突然変異及び切頭により作製された組合せライブラリーの遺伝子生成物をスクリーニングするため、及び一定の特性を持った遺伝子生成物のためのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための技術分野において、知られている。前記の技法は、一般的に、タンパク質同族体の組合せの突然変異誘発により産生される遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために、最も広く使用された技法は、典型的には、前記の遺伝子ライブラリーをクローニングして複製する発現ベクターを形成するステップ、前記の生成したベクターのライブラリーにより適切な細胞を形質転換するステップ、及び、望みの活性の検出が、生成物が検知される遺伝子をエンコードするベクターの比較的容易な単離を促進する条件下で、前記の組合せ遺伝子を発現するステップを、包含する。
【００９９】
スクリーニング検定の説明的な実施態様では、候補となる組合せ遺伝子の生成物は、細胞の表面に表示され、そして前記の組合せ遺伝子の生成物に結合する特定の細胞又はウイルス粒子の能力が、「パンニング検定（ｐａｎｎｉｎｇ  ａｓｓａｙ）」で検出される。
【０１００】
スクリーニング検定の説明的な実施態様では、候補となる組合せ遺伝子の生成物は、細胞の表面に表示され、そして前記の組合せ遺伝子の生成物に結合する特定の細胞又はウイルス粒子の能力が、「パンニング検定（ｐａｎｎｉｎｇ  ａｓｓａｙ）」で検出される。たとえば、前記の遺伝子ライブラリーは、細菌細胞の表面の膜タンパク質のために（Ladner et al., WO 88/06630;
Fuchs et al.,
(1991) Bio/Technology 9:1370-1371及び
Goward et al.,
(1992) TIBS 18:136-140）、
そして潜在的に機能的な同族体のためにスコアするために、たとえば、ＦＩＴＣ−基質のような前記の細胞表面に結合する、たとえば、蛍光的にラベルされた分子を使用する、パンニング法で検出される、生じた融合タンパク質のために、前記の遺伝子にクローン化されてもよい。細胞は、視覚的に点検し、そして蛍光顕微鏡下で分離されてもよく、又は、前記の細胞の形態学的に識別可能な場合、蛍光標示式細胞分取器により分離されてもよい。この方法は、本発明のポリペプチドと相互に作用することができる、基質又は他のポリペプチドを同定するために使用されてもよい。
【特許文献３０】国際公開ＷＯ８８／０６６３０号パンフレット
【０１０１】
同じような様式で、前記の遺伝子ライブラリーは、ウイルス粒子の表面に融合タンパク質として発現されてもよい。たとえば、繊維状ファージシステムにおいて、外来のペプチド配列は、伝染性のファージの表面に発現されるかもしれない。それによって、二つの利点を授けられるかもしれない。第一に、なぜならば、これらのファージは、非常に高濃度で親和性マトリックスに適用さてもよいので、非常に多量のファージを、一度にスクリーニングできる可能性がある。第二に、なぜならば、各伝染性ファージは、その表面に前記の組合せ遺伝子の産生物を表すので、もし、特定のファージが、親和性マトリックスから低収率で回収されたとしても、前記のファージは、感染のもう一つのラウンドにより増幅されるかもしれない。ファージｇＩＩＩ又はｇＶＩＩＩコートタンパク質のどちらか一方は、前記のウイルス粒子の基本的なパッケージングを妨げることなく、融合タンパク質を産生するために利用されてもよいので、ほとんど同一のＥ．ｃｏｌｉ繊維状ファージＭ１３、ｆｄ及びｆ１からなるグループは、非常にしばしばファージディスプレーライブラリーにおいて使用されている
(Ladner et al., PCT publication
WO 90/02909;
Garrard et al., PCT publication
WO 92/09690;
Marks et al., (1992) J. Biol. Chem. 267:16007-16010;
Griffiths et al., (1993) EMBO J. 12:725-734;
Clackson et al., (1991) Nature 352:624-628; 及び
Barbas et al., (1992) PNAS USA
89:4457-4461)。
他のファージ  コートタンパク質は、適当に使用されてもよい。
【特許文献３１】国際公開ＷＯ９０／０２９０９号パンフレット
【特許文献３２】国際公開ＷＯ９２／０９６９０号パンフレット
【０１０２】
前記のここに開示されたポリペプチドは、たとえば、もう一つの細胞のパートナーに対して真正のタンパク質の結合をまねることができる、ペプチド試薬又は非ペプチド試薬にような擬ペプチドを産生するために、減らされるかもしれない。上記に開示されたような前記の突然変異誘発方法は、また、チオレドキシンシステムだけでなく、他のタンパク質との、タンパク質−タンパク質の相互作用に関与するタンパク質の決定因子の地図を作るために特に有用である。例示するために、基質のタンパク質の分子認識に関与するタンパク質の機能残基は、前記の基質のタンパク質に結合するかもしれない擬ペプチドを生ずるために、決定され、そして使用されてもよい。それゆえ、前記の擬ペプチドは、前記の基質に結合することにより、そして前記の野性型タンパク質との相互作用のために必要とされる前記の機能残基をすっかり覆い、それによって、前記のタンパク質及び前記の基質の相互作用を妨げることにより、前記の野性型のタンパク質の阻害剤として使用されるかもしれない。基質ポリペプチドへの結合を関与するタンパク質のアミノ酸残基の地図を作製するために、たとえば、置換変異体（ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を利用すると、前記の基質に結合する場合においてこれらの残基を真似ている、擬ペプチドが生成されるかもしれない。
【０１０３】
たとえば、ここに記載されている前記のＳｉｒタンパク質及び前記のＦｈｕＣタンパク質の誘導体は、化学的に修飾されたペプチド及び擬ペプチドであってもよい。擬ペプチドは、ペプチド又はタンパク質に基づく化合物又はペプチド又はタンパク質から誘導される化合物である。擬ペプチドは、非天然アミノ酸、コンホメーションの制限、及び等電的置換等を使用する、知られているペプチド配列の構造的な修飾により得ることができる。前記の擬ペプチドは、ペプチドと非ペプチド合成構造との間の構造的なスペースの連続性を形成する。それゆえ、擬ペプチドは、ファルマコフォアの輪郭を描くことにおいて、及びペプチドを、母体となったペプチドの活性を保持した非ペプチド化合物へ翻訳することに役立つことにおいて、有用であるかもしれない。
【０１０４】
さらに、前記のペプチドのミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）を、提供することができる。前記の擬ぺプチドは、加水分解されないこと（プロテアーゼ、又は対応するペプチドを分解する他の生理学的条件に対する安定性の増加）、細胞の分化を刺激するための特異性及び／又は効力を増強することのような、前記の特性を有することができる。説明の目的のために、前記の残基の加水分解されないペプチドアナログは、
ベンゾジアゼピン(たとえば、Freidinger et al., in Peptides:
Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed.,
ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands,
1988を参照。);
アゼピン (たとえば、Huffman et al., in Peptides:
Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed.,
ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands,
1988を参照。);
置換されたガンマ  ラクタム環(Garvey et al., in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall
ed., ESCOM Publisher: Leiden,
Netherlands,
1988);
ケト−メチレン  シュードペプチド(Ewenson et al., (1986) J. Med. Chem. 29:295; and Ewenson et al., in Peptides:
Structure and Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium)
Pierce Chemical Co. Rockland,
IL, 1985);
β−ターン  ジペプチドコア(Nagai et al., (1985) Tetrahedron Lett 26:647; and Sato et al., (1986) J Chem Soc
Perkin Trans 1:1231);及び
β−アミノアルコール(Gordon et al., (1985) Biochem Biophys Res Commun 126:419; and Dann et al., (1986) Biochem Biophys
Res Commun 134:71)を使用して形成されてもよい。
【０１０５】
擬ペプチドの形成を実施することができる、種々の側鎖の変換法に加えて、前記の記載は、特異的にペプチドの第二構造のコンホメーション的の制限された擬態物の使用を意図している。非常に多くの代替物が、ペプチドのアミド結合に関して開発された。
【０１０６】
頻繁に開発された、アミド結合の代替物は、（ｉ）トランスオレフィン、（ｉｉ）フロロアルケーン、（ｉｉｉ）メチレンアミノ、（ｉｖ）ホスホンアミド及び（Ｖ）スルホンアミドを包含する。
【化１】
2008510793.tif 000027
代替物の例
【化２】
2008510793.tif 000028
【０１０７】
さらに、ペプチドの骨格のより実質的な修飾に基づく擬ペプチドを使用することができる。このカテゴリに属する擬ペプチドは、（ｉ）レトロ−インバーソアナログ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ  ａｎａｌｏｇ）及びＮ−アルキルグリシンアナログ（いわゆる、ペプトイド（ｐｅｐｔｏｉｄ））を包含する。
【化３】
2008510793.tif 000029
アナログの例
【化４】
2008510793.tif 000030
【０１０８】
さらに、コンビナトリアルケミストリーの方法が、新しい擬ペプチドの開発において実を結んだ。たとえば、いわゆる「ペプチドモルフィング（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｏｒｐｈｉｎｇ）」ストラテジーの一つの実施態様は、広範囲のペプチド結合の置換体を包含するペプチドアナログのライブラリーのランダム生成にフォーカスしている。
【化５】
2008510793.tif 000031
【０１０９】
代表的な実施態様では、前記の擬ペプチドは、前記のジペプチドのレトロ−インバーソアナログ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ  ａｎａｌｏｇ）として誘導することができる。前記のレトロ−インバーソアナログ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ  ａｎａｌｏｇ）は、たとえばSisto et al. U.S. Patent
4,522,752の開示のような、当該技術分野で知られている方法に従い、調製することができる。
レトロ−インバーソアナログ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ  ａｎａｌｏｇ）は、たとえばWO 00/01720に開示された方法により発生させることができる。たとえば、いくらかの普通のペプチド結合を含むような混合ペプチドが発生されるかもしれないということが理解されるであろう。一般的なガイドとして、タンパク質分解に対して最も感受性が高い部位が、典型的には擬態のスイッチのために随意で、より感受性の低いアミド結合に変更される。前記の最終産物又はその中間体は、ＨＰＬＣで精製されうる。
【特許文献３３】米国特許第４，５２２，７５２号
【特許文献３４】国際公開ＷＯ００／０１７２０号パンフレット
【０１１０】
ペプチドが、少なくとも一つのアミノ酸又は全てのアミノ酸がＤ−立体異性体であるペプチドを包含してもよい。他のペプチドが、少なくとも一つのアミノ酸が逆転させられているアミノ酸を包含してもよい。逆転されている前記のアミノ酸がＤ−立体異性体であってもよい。
【０１１１】
ペプチドのすべてのアミノ酸が、逆転されていてもよく、及び／又はすべてのアミノ酸がＤ−立体異性体であってもよい。
【０１１２】
もう一つの説明的な実施態様では、擬ペプチドは、ペプチドのレトロ−エナンチオアナログ（ｒｅｔｒｏ−ｅｎａｎｔｉｏ  ａｎａｌｏｇ）として誘導されることができる。たとえば、これのようなレトロ−エナンチオアナログ（ｒｅｔｒｏ−ｅｎａｎｔｉｏ  ａｎａｌｏｇ）は、市販されているＤ−アミノ酸（又は、そのアナログ）、及び、たとえばWO 00/01720に開示されているような標準的な固相ペプチド合成法又は液相ペプチド合成法により合成されることができる。前記の最終生産物は、純粋なレトロ−エナンチオアナログ（ｒｅｔｒｏ−ｅｎａｎｔｉｏ  ａｎａｌｏｇ）を産生するためにＨＰＬＣで精製されてもよい。
【０１１３】
さらなるもう一つの説明的な実施態様では、トランス−オレフィン誘導体は、前記のペプチドために、調製され得る。前記のトランス−オレフィンアナログは、Y.K. Shue et al. (1987) Tetrahedron Letters 28:3225及びWO 00/01720に開示された方法に従い、合成され得る。さらに、アミド官能基の代わりに、いくつかのオレフィン官能基を備えたペプチド同族体を作製するために、前記の方法で合成されたシュードペプチドを、他のシュードペプチドとカップリングすることが可能である。
【０１１４】
擬ペプチド誘導体のさらなるもう一つのクラスは、前記のホスホネート誘導体を包含する。前記のホスホネート誘導体の合成は、知られた合成スキームから適合させ得る。たとえば、Loots et al. in Peptides: Chemistry and Biology, (Escom
Science Publishers, Leiden, 1988, p. 118)及び
Petrillo et al.
in Peptides: Structure and Function (Proceedings
of the 9th American Peptide Symposium, Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985)を参照されたし。
【０１１５】
多くの他の擬ペプチド構造は、当該技術分野では知られており、そして前記の擬ペプチドでの使用のために、容易に適合させ得る。例示するために、擬ペプチドは、１−アザビシクロ[４．３．０]ノナン代替物( Kim et al. (1997) J. Org. Chem.
62:2847を参照されたし。)、又は
Ｎ−アシルピペラジック  アシッド(Xi et al. (1998) J. Am. Chem. Soc. 120:80を参照されたし)、又は
抑制されたアミノ酸アナログとしての２−置換ピペラジン部分(Williams et al. (1996) J. Med. Chem. 39:1345-1348を参照されたし。)を包含してもよい。さらなる他の実施態様では、あるアミノ酸残基は、たとえば、単環性環若しくは双環性の芳香族性環若しくはヘテロ芳香族性環、又は、二つの芳香族性環、芳香族性環−ヘテロ芳香族性環若しくは二つのヘテロ芳香族性環のようなアリール部分及び二つのアリール部分により置換され得る。
【０１１６】
前記の擬ペプチドは、たとえばハイスループット  スクリーニング法と組み合わせたコンビナトリアル  シンセシス法により最適化され得る。
【０１１７】
さらに、ミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）の他の例は、タンパク質を基礎とする化合物、炭水化物を基礎とする化合物、脂質を基礎とする化合物、核酸を基礎とする化合物、天然有機化合物、合成的に誘導された有機化合物、抗イディオタイプ抗体及び／若しくは触媒性抗体、又はそのフラグメントを包含するが、これらに限定されるものではない。ミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）は、たとえば、細胞の生き残り及び／又は腫瘍成長を阻害することができる化合物のための、天然又は合成化合物のライブラリーをスクリーニングすることにより得られうる。
ミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）は、また、たとえば、天然又は合成化合物のライブラリー、特に化学的又はコンビナトリアルライブラリー（すなわち、配列又は大きさにおいて異なるが、同じ構築ブロックを有する化合物のライブラリー）から得られうる。ミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）は、また、たとえば、理論的なドラッグデザインにより得られうる。理論的なドラッグデザインの手順において、本発明の化合物の三次元構造は、たとえば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）又はＸ線結晶学により解析されうる。それから、前記の三次元構造は、たとえば、コンピュータモデリングにより、可能性のあるミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）の構造を予測するために使用されうる。それから、前記の予測されたミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）の構造は、たとえば、化学合成、若しくは組換えＤＮＡ技術により、又は天然物（たとえば、植物、動物、細菌又は真菌）からミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）を単離することにより調製されうる。
【０１１８】
「ペプチド、変形型及びそれらの誘導体」又は「ペプチド及びそのアナログ」は、「ペプチド治療剤」に含まれ、そして、たとえば、ここで記載されている擬ペプチドのような、あらゆる前記のペプチド又はその修飾されたフォームを含むことを意図されている。好ましいペプチド治療剤は、細胞の生き残りを減らし、又はアポトーシスを増やす。たとえば、それらは、たとえば、ここで記載されたアッセイで決定されるように、少なくとも約２倍、５倍、１０倍、３０倍又は１００倍というファクターにより、細胞の生き残りを減らし、又はアポトーシスを増やすかもしれない。
【０１１９】
Ｓｉｒ又はＦｈｕＣタンパク質、フラグメント又はその変異体の活性は、適当な基質又は結合パートナー、又は以下に記載したように推定された活性を試験するために適切な他の試薬を使用して、アッセイされてもよい。もう一つの実施態様では、ポリペプチドの活性は、ＲＮＡ及び／又はタンパク質分子の発現レベルをアッセイすることにより、決定されてもよい。転写のレベルは、たとえば、ノーザンプロット、すなわち、オリゴヌクレオチド配列へのハイブリッド形成を使用して、又は生じたタンパク質産生物のレベルをアッセイすることにより決定されてもよい。翻訳レベルは、たとえば、ウエスタンブロッティングを使用するか、又はタンパク質産生物により作り出される検出可能なシグナル（たとえば、蛍光、ルミネセンス、酵素活性等）を同定することにより、決定されてもよい。前記の特別な状況に依存して、単一又は複数の遺伝子の転写及び／又は翻訳のレベルを検出することが、望ましいかもしれない。
【０１２０】
あるいは、細胞中のＤＮＡの複製、転写及び／又は翻訳の全体的な率を測定することが、望ましいかもしれない。一般的に、これは、結果として生ずるＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質産生物に取り込まれる、検出できる代謝生成物の存在下で前記の細胞を発育させることにより成し遂げられるかもしれない。たとえば、ＤＮＡ合成の率は、新たに合成されたＤＮＡに取り込まれるＢｒｄＵの存在下で細胞を発育させることにより決定されるかもしれない。それから、前記のＢｒｄＵの量は、抗ＢｒｄＵ抗体を使用して、組織化学的に決定されるかもしれない。
【０１２１】
他の実施態様では、本発明のポリペプチドは、ミクロタイタープレート、スライド、ビーズ、フィルム等を含む固体表面に固定化されてもよい。本発明のポリペプチドは、アレイの一部として「チップ」に固定化されるかもしれない。複数のアドレスを有するアレイは、一つ又はそれより多いこれらのアドレスにおいて、一つ又はそれより多い本発明のポリペプチドを含んでいてもよい。一つの実施態様では、前記のチップは、ポリペプチド配列のアレイの一部として、一つ又はそれより多い本発明のポリペプチドを含んでいてもよい。
【０１２２】
他の実施態様では、本発明のポリペプチドは、プレート、ミクロタイタープレート、スライド、ビーズ、微片、球体、フィルム、繊維、沈殿物、ゲル、シート、管状物、コンテナ、キャピラリー、パッド、薄片等を含む、固体表面に固定化されてもよい。本発明のポリペプチドは、アレイの一部として「チップ」上に固定されてもよい。複数のアドレスを有するアレイは、一つ又はそれより多い、これらのアドレスにおいて、一つ又はそれより多い、本発明のポリペプチドを含んでいてもよい。一つの実施態様では、前記のチップは、アレイの一部として一つ又はそれより多い、本発明のポリペプチドを含んでいてもよい。
【０１２３】
５．抗体及びその用途
ここに開示された前記のＳｉｒ及びＦｈｕＣポリペプチドに対する抗体を産生するために、宿主動物に、Ｓｉｒ及びＦｈｕＣポリペプチド又はＳｉｒ及びＦｈｕＣペプチドを注射してもよい。宿主に、所望の標的配列を含む、異なる長さのペプチドを注射してもよい。たとえば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５又は１５０個のアミノ酸であるペプチド抗原を、使用してもよい。あるいは、もし、タンパク質の部分がエピトープを明示するが、短すぎるため、抗原性でないならば、抗体を産生するために、それは、キャリヤー分子と接合されてもよい。いくらかの適切なキャリヤー分子は、スカシ貝ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、Ｉｇ配列（Ｉｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、ＴｒｐＥ及びヒト又はウシ血清アルブミンを包含する。複合化は、当該技術分野で知られている方法により実施されてもよい。一つの前記の方法は、キャリヤー分子上でシステイン残基と、前記のフラグメントのシステイン残基とを結合することである。
【０１２４】
さらに、三次元エピトープ、すなわち、非線形エピトープに対する抗体は、また、たとえばタンパク質の結晶学的なデータに基づき、調製されてもよい。前記の注射から得られた抗体は、ここに記載したタンパク質の短い抗原に対してスクリーニングされてもよい。Ｓｉｒ又はＦｈｕＣペプチドに対して調製された抗体は、完全な長さのＳｉｒ又はＦｈｕＣタンパク質と同様に、前記のペプチドに対する活性について試験されてもよい。抗体は、ここに記載された、Ｓｉｒ又はＦｈｕＣペプチド及び／又は完全な長さのＳｉｒ又はＦｈｕＣタンパク質に対して、少なくとも約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ又は１０−１２Ｍ又はそれより高い親和性を有するかもしれない。
【０１２５】
前記のＤＮＡ配列ための適切な細胞、及び抗体の発現及び分泌ための宿主細胞を、American Type Culture Collection (“Catalogue of Cell Lines and
Hybridomas” 5th edition (1985) Rockville, Md., U.S.A.)を含む多くのソースから入手することができる。
【０１２６】
ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、当該技術分野で知られた方法で調製されてもよい。モノクローナル抗体は、Huse et al, Science (1989)
246: 1275-81に開示された組換えＤＮＡ技術に加えて、
Kohler and Milstein, Nature 1975; 256:
495-7;及び
Campbell in “Monoclonal Antibody Technology, The
Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas” in Burdon et al., Eds. Laboratory Techniques in
Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier Science Publishers,
Amsterdam (1985)に開示された、免疫学的な方法を含む知られた手順を使用して調製されたハイブリドーマにより調製されてもよい。
【０１２７】
抗体の精製の方法は、当該技術分野でよく知られている。たとえば、Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, N.Y.を参照されたし。精製方法は、塩沈殿（たとえば、硫酸アンモニウムによる）、イオン交換クロマトグラフィー（たとえば、中性で吸着され、そしてイオン強度を増加する段階的な勾配で溶離される、カチオン又はアニオン交換カラム）、ゲルろ過クロマトグラフィー（ゲルろ過ＨＰＬＣを含む）、並びに、たとえば、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、ヒドロキシアパタイト及び抗体のような親和性樹脂を使用するクロマトグラフィーを含んでいてもよい。抗体は、また、当該技術分野で知られている方法に従い、親和性カラムにより精製されてもよい。
【０１２８】
他の実施態様は、抗体の機能的な同等物を含み、そして、たとえば、キメラ化された、ヒト化された、及び一本鎖の抗体、さらにそのフラグメントを含む。機能的な同等物を調製する方法は、国際公開ＷＯ９３／２１３１９号パンフレット、ヨーロッパ特許出願第２３９，４００号、国際公開ＷＯ８９／０９６２２号パンフレット、ヨーロッパ特許出願第３８８，７４５号及びヨーロッパ特許出願第３３２，４２４号に開示されている。
【特許文献３５】国際公開ＷＯ９３／２１３１９号パンフレット
【特許文献３６】ヨーロッパ特許出願第２３９，４００号
【特許文献３７】国際公開ＷＯ８９／０９６２２号パンフレット
【特許文献３８】ヨーロッパ特許出願第３８８，７４５号
【特許文献３９】ヨーロッパ特許出願第３３２，４２４号
【０１２９】
機能的な同等物は、本発明の抗体の可変領域又は高頻度可変領域のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。「実質的に同じ」アミノ酸配列は、ここでは、Pearson and Lipman, Proc Natl Acd Sci USA (1988) 85: 2444-8に従ってFASTA検索方法で決定されるように、もう一つのアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、及びより好ましくは９０％の相同性を備えた配列として定義される。
【０１３０】
キメラ化された抗体は、ヒト抗体定常部から実質的又はもっぱら誘導された定常部、及びヒト以外の哺乳動物からの可変領域の配列から実質的又はもっぱら誘導された可変領域を有していてもよい。ヒト化された抗体は、対応するヒト抗体領域から実質的又はもっぱら誘導された相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ（ＣＤＲ））、及びヒト以外の哺乳動物から実質的又はもっぱら誘導されたＣＤＲ以外の定常部及び可変領域を有していてもよい。
【０１３１】
ヒト以外の適切な哺乳動物は、モノクローナル抗体が作られうる、あらゆる哺乳動物を含んでよい。ヒト以外の哺乳動物の適切な例は、たとえば、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、山羊、又は霊長類（ｐｒｉｍａｔｅ）を包含する。
【０１３２】
ここで記載したＳｉｒタンパク質及びＦｈｕＣタンパク質に対する抗体は、前記のように調製してもよい。さらなる実施態様では、ここで記載したＳｉｒタンパク質及びＦｈｕＣタンパク質に対する抗体（全抗体又は抗体フラグメント）は、抗体の半減期を伸ばすために当業者に知られている方法に従い、たとえば、ポリエチレングリコール分子（ＰＥＧ）のような生体適合性の材料と複合化されてもよい。たとえば、米国特許第６，４６８，５３２号を参照されたし。機能を付与されたＰＥＧポリマーは、たとえば、Nektar Therapeuticsから入手できる。市販されているＰＥＧ誘導体は、アミノ−ＰＥＧ（ａｍｉｎｏ−ＰＥＧ）、ＰＥＧアミノ酸エステル（ＰＥＧ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｅｓｔｅｒ）、ＰＥＧ−ヒドラジド（ＰＥＧ−ｈｙｄｒａｚｉｄｅ）、ＰＥＧ−チオール（ＰＥＧ−ｔｈｉｏｌ）、ＰＥＧ−スクシネート（ＰＥＧ−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、カルボキシメチル化されたＰＥＧ（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＰＥＧ）、ＰＥＧ−プロンピオン酸（ＰＥＧ−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＥＧアミノ酸（ＰＥＧ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）、ＰＥＧスクシニイミジルスクシネート（ＰＥＧ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、ＰＥＧスクシイミドイルプロピオネート（ＰＥＧ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、カルボキシメチル化されたＰＥＧのスクシニイミジルエステル（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＰＥＧ）、ＰＥＧのスクシイミドイルカルボネート（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｏｆ  ＰＥＧ）、アミノ酸ＰＥＧのスクシイミジルエステル（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒｓ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ＰＥＧ）、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール（ＰＥＧ−ｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）、ＰＥＧ−ニトロフェニル  カルボネート（ＰＥＧ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、ＰＥＧ  トレシレート（ＰＥＧ  ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）、ＰＥＧ−グリシジル  エーテル（ＰＥＧ−ｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、ＰＥＧ−アルデヒド（ＰＥＧ−ａｌｄｅｈｙｄｅ）、ＰＥＧ  ビニルスルホン（ＰＥＧ  ｖｉｎｙｌｓｕｌｆｏｎｅ）、ＰＥＧ−マレイミド（ＰＥＧ−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、ＰＥＧ−オルソピリジル−ジスルフィド（ＰＥＧ−ｏｒｔｈｏｐｙｒｉｄｙｌ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）、ヘテロファンクショナルＰＥＧ（ｈｅｔｅｒｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＰＥＧ）、ＰＥＧビニル誘導体（ＰＥＧ  ｖｉｎｙｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）、ＰＥＧシラン（ＰＥＧ  ｓｉｌａｎｅ）、及びＰＥＧ  ホスホリド（ＰＥＧ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｄｅ）を包含するが、これらに限定されるものではない。これらのＰＥＧ誘導体とカップリングするための反応条件は、前記のポリペプチド、ＰＥＧ化の所望の程度、及び利用される前記のＰＥＧ誘導体に依存して変わるであろう。ＰＥＧ誘導体の選択に係るいくらかの要因は、所望される付加点（たとえば、リジン又はシステインＲ−基）、前記の誘導体の加水分解に対する安定性及び反応性、前記の結合の安定性、毒性及び抗原性、分析のための適合性等を包含する。
【特許文献４０】米国特許第６，４６８，５３２号
【０１３３】
６．薬学的組成物
Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ又はＦｈｕＣの抗体、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ及び他の拮抗剤は、当該技術分野でよく知られているように、それらの意図された用途に応じて様々な手段で投与されてもよい。たとえば、もし、前記のＳ．  ａｕｒｅｕｓ拮抗剤組成物は、経口で投与されるとすれば、それらは、錠剤、カプセル、顆粒、粉末又はシロップとして製剤化されてもよい。あるいは、本発明の製剤は、注射剤（静脈注射、筋肉注射、又は皮下注射）、滴下注入調製物又は座剤として、非経口的に投与されてもよい。眼科用粘膜ルートによる投与のためには、本発明の組成物は、点眼剤又は眼軟膏として製剤化されてもよい。これらの製剤は、一般に行われている方法で調製されてもよく、そして、所望ならば、前記の組成物は、たとえば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑剤、矯味薬、可溶化剤、懸濁補助剤、乳化剤又はコーティング剤のような、あらゆる一般に使用されている添加物と混合されてもよい。
【０１３４】
本発明の製剤では、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香料及び賦香剤、保存剤、並びに抗酸化剤だけでなく、たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムのような湿潤剤、乳化剤及び滑剤が、前記の製剤化された薬剤に含まれていてもよい。
【０１３５】
前記の組成物は、経口投与、経鼻投与、局所投与（口腔内投与又は舌下投与を含む）、直腸投与、経膣内投与、エアゾール投与及び／又は非経口投与に適しているかもしれない。前記の製剤は、便宜上、投与単位フォームで提供されてもよく、そして薬剤学の技術分野でよく知られたあらゆる方法により調製されてもよい。一回の用量を調製するためのキャリヤー材料と混合されてもよい組成物の量は、治療される被験体及び特定の投与の様式に依存して異なる。
【０１３６】
これらの製剤を調製する方法は、前記のキャリヤー及び、任意で一つ又はそれより多い付属成分と共に、本発明の関連組成物に添加するステップを包含する。一般に、前記の製剤は、一律かつ密接に関連して、液体キャリャー又は微細に分けられた固体キャリヤー、又はその両者と共に、関連する薬剤に添加することにより、及び必要ならば前記の調製物を成形することにより、調製される。
【０１３７】
経口投与に適した製剤は、カプセル、カシェー、ピル、錠剤、薬用ドロップ（味を付けた主成分、通常、ショ糖及びアラビアゴム又はトラガントを使用する）、散剤、顆粒剤の形で、又は水性若しくは非水性の液体中の液剤若しくは懸濁剤として、又は水中油型エマルジョン若しくは油中水型エマルジョンとして、又はエリキシル剤若しくはシロップ剤として、又はトローチ剤（たとえば、ゼラチン及びグリセリン、又はショ糖及びアラビアゴムのような不活性な基剤を使用する）としてであってもよく、活性成分として組成物の所定の量を含む各剤形であってもよい。
本発明の組成物は、また、大型丸剤、舐剤又はパスタ剤として投与されてもよい。経口投与用の固形剤形（カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、散剤及び顆粒剤等）において、前記の製剤は、たとえば、クエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウム、及び／又は以下の（１）乃至（１０）のあらゆるもののような、一つ又はそれよい多い薬学的に受容されるキャリヤーと混合される。
（１）たとえば、デンプン、乳糖、ショ糖、ブドウ糖、マンニトール及び／又はケイ酸のような賦形剤又は増量剤、
（２）たとえば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖、及び／又はアラビアゴムのような結合剤、
（３）たとえば、グリセロールのような保湿剤、
（４）たとえば、寒天、炭酸カルシウム、バレイショデンプン、タピオカデンプン、アルギン酸、若干のケイ酸塩及び炭酸ナトリウムのような崩壊剤、
（５）たとえば、パラフィンのような水剤遅延剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｒｅｔａｒｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、
（６）たとえば、４級アンモニウム化合物のような吸収促進剤、
（７）たとえば、アセチルアルコール（ａｃｅｔｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）及びモノステアリン酸グリセリンのような湿潤剤、
（８）たとえば、カオリン及びベントナイト粘土のような吸収剤
（９）たとえば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム及びそれらの混合物のような滑沢剤、及び
（１０）着色剤
カプセル、錠剤及び丸剤の場合、前記の組成物は、また、緩衝剤を含んでいてもよい。同じようなタイプの固形組成物は、また、高分子量ポリエチレングリコール等に加えて、乳糖（ｌａｃｔｏｓｅ）又は乳糖（ｍｉｌｋ  ｓｕｇａｒｓ）のような、たとえば、前記の賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）を使用して、軟ゼラチンカプセル剤及び硬ゼラチンカプセル剤において、賦形剤（ｆｉｌｌｅｒ）として使用されてもよい。
【０１３８】
錠剤は、任意により一つ又はそれより多い追加の成分を使用して、圧縮又は成型することにより調製されてもよい。圧縮された錠剤は、結合剤（たとえば、ゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性な希釈剤、保存剤、崩壊剤（たとえば、グリコールデンプンナトリウム又は架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤又は分散剤を使用して調製されてもよい。成型された錠剤は、不活性な液体希釈剤により湿潤化された前記の組成物の混合物を適切な機械で成型することにより調製されてもよい。たとえば、糖衣錠、カプセル、丸剤及び顆粒剤のような、錠剤及び他の固形剤形は、任意に、たとえば、腸溶コーティング、及び薬学的な製剤技術の分野でよく知られた他のコーティング剤のような、コーティング剤及び殻により得られてもよいか、又は調製されてもよい。
【０１３９】
経口投与のための液体剤形は、薬学的に受容される、エマルジョン、ミクロエマルジョン、水剤、懸濁剤、シロップ及びエリキシル剤を包含する。前記の組成物に加えて、液状剤形は、たとえば、水又は他の溶媒、たとえば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、オイル（特に、綿実油、グラウンドナッツ（ｇｒｏｕｎｄｎｕｔ）油、トウモロコシ油、胚芽油、オリブ油、ヒマシ油及びセサミ油）、グリセリン、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタン脂肪酸エステル、及びそれらの混合物のような可溶化剤及び乳化剤のような、当該技術分野で通常使用されている不活性な希釈剤を含有してもよい。
【０１４０】
前記の組成物に加えて、懸濁剤は、たとえば、エトキシ化されたイソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、ソルビタンエステル、微細結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド（ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｍｅｔａｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）、ベントナイト、カンテン、トラガント及びそれらの混合物のような懸濁試薬を含有してもよい。
【０１４１】
直腸又は膣への投与のための製剤は、前記の組成物を、たとえば、カカオ脂、ポリエチレングリコール、座剤ろう剤又はサリチル酸（ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ）を包含する一つ又はそれより多い、適切な刺激性がない賦形剤又はキャリヤーと混合することにより調製されてもよく、しかも、室温では固体であり、しかし体温では液体であり、それゆえ、体腔で溶け、前記の活性成分を放出することができる、座剤として提供されてもよい。膣への投与に適している製剤は、また、膣座剤、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、パスタ剤、泡製剤、当該技術分野で適当であると知られているキャリヤーを含むスプレー製剤を包含する。
【０１４２】
前記の組成物の経皮投与のための剤形は、粉剤、スプレー、軟膏剤、パスタ剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル、水剤、パッチ、及び吸入剤を包含する。
【０１４３】
前記の活性成分は、薬学的に受容されるキャリヤー、及び必要とされるかもしれない、あらゆる保存剤、緩衝剤又はプロペラントと、無菌条件下で混合されてもよい。
【０１４４】
前記の軟膏剤、パスタ剤、クリーム剤及びゲルは、前記の組成物に加えて、たとえば、動物性脂肪、植物脂質、オイル、ろう剤、パラフィン、デンプン、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、酸化亜鉛又はそれらの混合物のような賦形剤をが含有していてもよい。
【０１４５】
粉剤及びスプレーは、前記の組成物に加えて、たとえば、乳糖、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、ポリアミド粉末、又はそれら物質の混合物のような賦形剤を含有してもよい。スプレーは、さらに、たとえば、クロロフルオロ炭化水素、及びたとえば、ブタン及びプロパンのような揮発性非置換炭化水素のような通例のプロペラントを含有してもよい。あるいは、本発明の組成物は、エアゾール剤により投与されてもよい。これは、前記化合物を含む、水性エアゾール、リポゾーム調製物又は固形粒子を調製することにより成し遂げられる。非水性懸濁剤（たとえば、フルオロカーボンプロペラント）を使用することができる。音波を利用した噴霧を利用してもよい。なぜならば、前記の噴霧剤は、前記の組成物に含まれている前記の化合物の分解を生ずる可能性がある、剪断する前記の試薬に曝されるのを最小限に抑えるからである。
【０１４６】
通常、水性エアゾール剤は、一般に使用されている薬学的に受容されるキャリヤー及び安定化剤と共に、前記の組成物の水性溶液又は懸濁液を製剤化することにより調製される。前記のキャリヤー及び前記の安定化剤は、特定の組成物の条件により異なるが、典型的には、非イオン性界面活性剤（ツイーズ（Ｔｗｅｅｎｓ）、プルロニクス（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）又はポリエチレングリコール）、血清アルブミンのような無害なタンパク質、ソルビタンエステル、オレイン酸、レシチン、グリシンのようなアミノ酸、緩衝剤、糖類又は糖アルコールを包含する。一般に、エアゾール剤は、等張な溶液から調製される。
【０１４７】
非経口投与に適した本発明の薬学的組成物は、一つ若しくはそれより多い薬学的に受容される、無菌の等張な水性若しくは非水性の液剤、分散剤、懸濁剤若しくはエマルジョン、又は抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、前記の製剤を意図された被験体の血液、懸濁剤若しくは濃稠化剤と等張な前記の製剤を溶かす溶質を含んでもよい、無菌の注射用液剤若しくは無菌の注射用分散剤に用時に再構成されてもよい無菌粉末を包含する。
【０１４８】
本発明の薬学的組成物で利用されてもよい、適切な水性及び非水性キャリヤーの例は、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール及びポリエチレングリコール等）及び適切なそれらの混合物、オリブ油のような植物油、並びにオレイン酸エチルのような注射用有機エステルを包含する。適切な流動性は、たとえば、レシチンのようなコーティング剤の使用により、分散剤の場合には、必要とされた粒子サイズの維持により、及び界面活性剤の使用により、維持されてもよい。
【０１４９】
ここに記載した薬学的組成物は、フルンケル、慢性フルンケル多発症、インペチゴ、急性骨髄炎、肺炎、心内膜炎、熱傷様皮膚症候群、トキシックショック症候群及び食中毒を含むが、これらに限定されるものではない、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ感染症から生ずる状態又は疾患を、予防又は治療するために使用されてもよい。
【０１５０】
７．Ｓ．  ａｕｒｅｕｓのＳｉｒＡＢＣ仲介鉄輸送システムの阻害剤のための典型的なスクリーニング・アッセイ
一般に、病原性のビルレンスを阻害することができる薬剤又は化合物は、当該技術分野で知られた方法に従い、天然物若しくは合成（又は半合成）の抽出物の両方の大きなライブラリー又は化学ライブラリーから同定される。薬の発見及び開発の分野における当業者ならば、薬剤（たとえば、抽出物又は化合物を試験する）の明確な源は、本発明のスクリーニング方法に対して決定的ではないことを理解できるであろう。したがって、実質的に、かなり多数の化学的抽出物又は化合物を、ここに開示された方法を使用してスクリーニングすることができる。前記の薬、抽出物又は化合物の例は、既存の化合物の修飾物だけでなく、植物由来の抽出物、真菌由来の抽出物、原核生物由来の抽出物、動物由来の抽出物、醗酵培養物及び合成化合物が含まれるが、これらに限定されるものではない。非常に多くの方法が、また、糖類、脂質、ペプチド及び核酸を主材料とする化合物を含むが、これに限定されるのではない、かなり多数の化学物質のランダム又は方向付けされた合成（たとえば、半合成又は全合成）を実施するために利用できる。合成化合物のライブラリーは、Ｂｒａｎｄｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ，  ＮＨ）及びＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，  Ｗｉｓ．）から市販されている。あるいは、細菌、真菌、植物及び動物の抽出物の形態である、天然物のライブラリーは、Ｂｉｏｔｉｃｓ（Ｓｕｓｓｅｘ，  ＵＫ）、Ｘｅｎｏｖａ（Ｓｌｏｕｇｈ，  ＵＫ）、Ｈａｒｂｏｒ  Ｂｒａｎｃｈ  Ｏｃｅａｎｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｆｔ．  Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｆｌａ．）、及びＰｈａｒｍｎａＭａｒ，  Ｕ．Ｓ．Ａ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  Ｍａｓｓ．）を含む多数のソースから市販されている。さらに、所望ならば、たとえば、ｓｔａｎｄａｒｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄのような、当該技術分野で知られている方法に従って、天然及び合成的に調製されたライブラリーが構築される。さらに、所望ならば、あらゆるライブラリー又は化合物は、容易に標準的な化学的、物理的及び生化学的な方法を使用して修飾される。
【０１５１】
さらに、薬の発見及び開発に関する技術分野の当業者ならば、非重複のための方法（たとえば、分類学上の非重複、生物学上の非重複、化学上の非重複又はそれらのあらゆる組み合わせ）、又は抗病原性の活性について既に知られている物質ついての重複又は繰り返しの除去は、可能なときは何時でも利用されるべきであることを容易に理解する。
【０１５２】
粗抽出物が、抗病原性活性又は抗発病力活性又は結合活性を有することを発見された場合、前記の活性を有するリード抽出物の更なる分画が、前記の観察された効果の原因である化学的成分を単離するために必要である。それゆえ、前記の抽出、分画及び精製プロセスのゴールは、抗病原性活性を有する粗抽出物に含まれる化学物質の注意深い特徴付け及び同定である。前記の不均一の抽出物の分画及び精製の方法は、当該技術分野では知られている。所望ならば、病原性の治療のために有用な薬剤であることが示された化合物は、当該技術分野で知られた方法に従い、化学的に修飾される。
【０１５３】
ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）又はＦｈｕＣの潜在的な阻害剤は、本発明の核酸配列又はポリペプチドに結合して、それでもってその活性を阻害する、有機分子、ペプチド、擬ペプチド、ポリペプチド、抗体、アンチセンスＲＮＡ及びｓｉＲＮＡを包含する。潜在的な拮抗剤は、また、前記のポリペプチドの結合サイトに結合し、そしてそのサイトを塞ぎ、それによって細胞中の結合分子への結合を妨げる、その結果、正常な生物学的な活性を妨げる低分子を含む。他の潜在的な拮抗剤は、アンチセンス分子を包含する。
【０１５４】
７．１相互作用アッセイ法
精製された、及び組換えで調製されたＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）及びＦｈｕＣポリペプチドは、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢとＳｉｒＣとの間の相互作用、又はＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）及び／又はＦｈｕＣとの間の相互作用を調節する薬剤をスクリーニングするためのアッセイ法の開発を促進するために使用されてもよい。ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）又はＦｈｕＣの潜在的な阻害剤は、小さな有機分子、ペプチド、ポリペプチド、擬ペプチド、及びＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）又はＦｈｕＣのどちらか一方に結合し、それによりその活性を阻害する抗体を包含してもよい。
【０１５５】
典型的なスクリーニング・アッセイ法では、反応混合物が、少なくとも、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）又はＦｈｕＣポリペプチドのどちらか一方の生物学的に活性な部位、注目の薬剤及び適当な相互に作用する分子を含むように発生するかもしれない。ここで使用されているように、前記の「特定の相互に作用する分子」は、前記のスクリーニング・アッセイ法で使用されるポリペプチドに依存する、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）又はＦｈｕＣであってもよい。たとえば、ＳｉｒＡを使用した場合、特定の相互に作用する分子は、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）、ＳｉｒＢ、又はＳｉｒＣであってもよい。特定の相互に作用する分子と、特定のＳｉｒポリペプチドとの相互作用の検出及び定量は、たとえば、ＳｉｒＡ及びＳｉｒＢとの間の相互作用を阻害することにおいて、薬剤の有効性を決定する手段を提供する。前記の薬剤の有効性は、前記の試験される薬剤を様々な濃度で使用して得られたデータから用量−反応曲線を作成することにより評価することができる。さらに、対照アッセイは、また、比較のベースラインを提供するために実施され得る。前記の対照アッセイにおいて、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）又はＦｈｕＣポリペプチドと、前記の特定の相互に作用する分子との相互作用は、前記の試験される薬剤の非存在下で定量されてもよい。
【０１５６】
ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）又はＦｈｕＣポリペプチドと、前記の特定の相互に作用する分子との相互作用を、様々な技法により検出してもよい。前記の複合物の形成の阻害作用を、イムノアッセイ又はクロマトグラフィーによる検出により、たとえば、放射能で標識された、蛍光で標識された、又は酵素的に標識されたポリペプチドのような、検出できるように標識されたタンパク質を使用して定量することができる。
【０１５７】
特定のＳｉｒ又はＦｈｕＣタンパク質と、前記の特定の相互に作用する分子との相互作用の測定は、光学式バイオセンサー装置（ｏｐｔｉｃａｌ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｄｅｖｉｃｅ）における表面プラズモン共鳴技術（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して直接観察されるかもしれない。この方法は、より大きいペプチド（＞５ｋＤａ）との相互作用を測定するのに特に有用であり、そして前記のタンパク質−タンパク質相互作用の阻害剤をスクリーニングするために適用されうる。
【０１５８】
あるいは、前記のアッセイの自動化に適用することだけでなく、前記のタンパク質の一方又は両方の複合化されていないフォームから、複合物の分離を促進するために、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）若しくはＦｈｕＣ、又は前記の特定の相互に作用する分子の何れかを固定化することが望ましいであろう。たとえば、前記の特定の相互に作用する分子に対するＳｉｒＡの結合は、候補薬剤の存在下又は非存在下で、前記の反応剤を入れるのに適した、あらゆる容器中で成し遂げられうる。例は、ミクロタイタープレート、試験管及びミクロ−遠心チューブを包含する。一つの実施態様では、前記のタンパク質を基盤に結合させるようにするドメインを付加する、融合タンパク質を提供することができる。たとえば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＳｉｒＡ（ＧＳＴ／ＳｉｒＡ）融合タンパク質は、グルタチオン・セファロース・ビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｏ）又はグルタチオン誘導化ミクロタイタープレートに吸着されうる。それから、それらは、３５Ｓで標識された相互に作用する分子、及び前記の試験される薬剤に、及びわずかにより厳しい条件が望まれるかもしれないが、たとえば、塩及びｐＨについて生理学的な条件で、複合体形成へと導く条件下でインキュベートされた前記の混合物により結合される。インキュベートに続いて、前記のビーズは、あらゆる結合していないラベルを除くため洗浄され、そして固定化された前記のマトリックス及び放射能標識は、直接測定されるか（たとえば、シンチレーター（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）中に置かれたビーズ）、又は前記の複合物を解離させた後、前記の上澄み液中で、測定される。あるいは、前記の複合物は、前記のマトリックスから解離させることができ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離することができ、そして前記のビーズフラクションにおいて検出される相互に作用する分子のレベルは、標準的な電気泳動技術を使用して前記のゲルから定量される。
【０１５９】
タンパク質及び他の分子をマトリックス上に固定するための他の技法は、また、前記のアッセイでの使用に利用できる。たとえば、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）、ＦｈｕＣ又は前記の特定の相互に作用する分子の何れも、ビオチン及びストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）の複合体を利用して固定されうる。たとえば、ビオチン標識した、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）又はＦｈｕＣは、当該技術分野でよく知られた技術（たとえば、ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ，  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  Ｉｌｌ．）を使用してビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製され、そしてストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）をコートした９６ウエル・プレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウエル中に固定されうる。あるいは、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）又はＦｈｕＣのいずれかと反応性があり、前記のポリペプチドと前記の相互に作用する分子との前記の相互作用を妨げない、抗体は、前記のプレートのウエルに対して誘導体化されうるし、そして、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ、スタフィロバクチン（ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）又はＦｈｕＣが、抗体との複合体形成により前記のウエル中に捕獲されうる。上記のように、前記の相互に作用する分子及び試験される化合物の調製は、前記のプレートの前記のポリペプチドが存在するウエル中でインキュベートされてもよく、そして前記のウエルで捕獲された複合体の量は、試験される化合物の存在下又は非存在下で定量されうる。前記のＧＳＴ固定化複合体についての前記の方法に加えて、前記の複合体を検出する典型的な方法は、前記の相互に作用する分子と反応するを使用する複合体の免疫検出法、又は前記の相互に作用する分子と結びつけられた酵素活性を検出することに依存する酵素結合アッセイを包含する。
【０１６０】
たとえば、酵素は、前記の相互に作用する分子と化学的に結合させるか、又は前記の相互に作用する分子との融合タンパク質として調製されることができる。例示するために、前記の相互に作用する分子は、西洋ワサビペルオキシダーゼと化学的に交差結合させうるか、又は遺伝学的に西洋ワサビペルオキシダーゼと融合させることができ、そして前記の複合体中に捕獲されたポリペプチドの量は、たとえば、３，３−ジアミノベンザジン四塩酸塩（３，３‘−ｄｉａｍｉｎｏ−ｂｅｎｚａｄｉｎｅ  ｔｅｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）又は４−クロロ−１−ナフトールのような前記の酵素の発色性基質により定量されうる。同様に、前記のポリペプチド及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを具備する融合タンパク質が提供されることができ、そして複合体の形成量は、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（Habig et al. (1974) J. Biol. Chem. 249:7130）を使用して、前記のＧＳＴ活性を検出することにより定量されうる。
【０１６１】
７．２鉄輸送アッセイ
あるいは、スクリーニング・アッセイ法は、前記のＳｉｒポリペプチドの鉄輸送活性を調節する薬剤をスクリーニングするために、開発されてもよい。前記のＳｉｒタンパク質の鉄輸送活性を調節する、試験薬剤の適切な濃度は、当業者に知られているあらゆる方法により決定されうる。
【０１６２】
一つの実施態様では、前記のスクリーニング・アッセイ法は、野性型のＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ又はＦｈｕＣポリペプチドを発現するＳ．  ａｕｒｅｕｓの全細胞を包含してもよい。前記のポリペプチドの鉄輸送活性を変える、化合物の能力は、前記の細胞の分析により検出されうる。たとえば、鉄輸送の拮抗剤は、鉄を豊富に含む培地における前記の細胞の成育又は分化（表現型）における変化を記録することにより検出されうる。試験薬剤（類）の存在下での野性型のＳ．  ａｕｒｅｕｓ株の生育を、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ又はＦｈｕＣが欠失したＳ．  ａｕｒｅｕｓ株の生育と比較してもよい。各培養物を、化合物又は天然物の抽出物のライブラリーからの試験薬剤により処理してもよく、そして特定の試験薬剤が前記の野性型株、及び前記のＳｉｒ欠失株又はＦｈｕＣ欠失株の生育に及ぼす効果について観察してもよい。細菌の生育を、クレット・メーター（Klett meter）を使用して観察してもよい。前記のＳｉｒＡＢＣ鉄シデロフォア（siderophore）輸送システムを特異的に妨げる化合物は、前記の野性型株の生育のみに影響を及ぼすであろう。
【０１６３】
あるいは、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ細胞を試験薬剤と共に培養し、そして試験薬剤により処理し、それから原子吸光スペクトル法（Cox (1994) Meth. Enzymol. 235:315）を使用して前記の細胞中の鉄の存在をスクリーニングしてもよい。
【０１６４】
あるいは、前記の鉄輸送活性の阻害を、放射能活性を有する鉄を使用することにより測定してもよい。前記のＳｉｒＡＢＣ鉄シデロフォア（siderophore）輸送システムを妨げる化合物は、前記の放射能活性を有する鉄の取り込みの低下を生ずるであろう。対照アッセイは、また、比較のためのベースラインを作成するために実施されうる。前記の対照アッセイにおいて、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ細胞における、前記の放射能活性を有する鉄の取り込みを、前記の試験化合物の非存在下で定量してもよい。放射能活性を有する鉄の例は、５９Ｆｅ又は５５Ｆｅを包含してもよい。
【０１６５】
７．３発現アッセイ
さらなる実施態様では、前記の鉄輸送システムの拮抗剤は、ｓｉｒＡ、ｓｉｒＢ、ｓｉｒＣ又はｆｈｕＣの核酸又はタンパク質の発現に影響を及ぼすかもしれない。このスクリーニングでは、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ細胞を、注目の化合物により処理してもよく、そして、その後、前記の化合物がｓｉｒＡ、ｓｉｒＢ、ｓｉｒＣ又はｆｈｕＣの核酸又はタンパク質の発現に影響を及ぼす効果のために、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ細胞を、アッセイしてもよい。
【０１６６】
たとえば、全てのＲＮＡは、Chomczynski
et al. (1987) Anal. Biochem. 162:156-159に開示された一段階グアニジウム−チオシアネート−フェノール−クロロホルム法（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ−ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ  ｍｅｔｈｏｄ）のような、あらゆる適当な技術を使用して、試験薬剤の存在下又は非存在下で培養されたＳ．  ａｕｒｅｕｓ細胞から単離されうる。それから、ｓｉｒＡ、ｓｉｒＢ、ｓｉｒＣ又はｆｈｕＣの発現を、ノーザン・ブロット・アナリシス（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合せた逆転写法（ＲＴ−ＰＣＲ）及びリガーゼ連鎖反応と組み合せた逆転写法（ＲＴ−ＬＣＲ）のような、あらゆる適切な方法により定量してもよい。
【０１６７】
ノーザン・ブロット・アナリシス（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）は、Harada et al. (1990) Cell 63:303-312に開示された方法に従い実施することができる。手短に言えば、全てのＲＮＡは、試験薬剤の存在下で培養されたＳ．  ａｕｒｅｕｓ細胞から調製される。ノーザン・ブロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ）のために、前記のＲＮＡは、適切なバッファー（たとえば、グリオキサール／ジメチルスルホキシド／リン酸ナトリウムバッファー）中で変性され、寒天ゲル電気泳動に付し、そしてニトロセルロース濾紙の上に移す。前記のＲＮＡがＵＶリンカーにより前記の濾紙に結合された後、前記の濾紙を、ホルムアミド、ＳＳＣ、デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液、変性されたサーモンの精子、ＳＤＳ及びリン酸ナトリウムバッファーを含む溶液中でプレハイブリダイズする。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ｓｉｒＡ、ｓｉｒＢ、ｓｉｒＣ又はｆｈｕＣ  ＤＮＡ配列は、あらゆる適切な方法（たとえば、３２Ｐ−マルチプライム  ＤＮＡ標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））に従い、ラベルされ、そしてプローブとして使用されてもよい。一晩ハイブリッド形成を行った後、前記の濾紙を洗浄し、そしてＸ線フィルムに晒す。さらに、対照アッセイを、また、比較のためのベースラインを作成するために実施することができる。前記の対照アッセイでは、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓにおけるｓｉｒＡ、ｓｉｒＢ、ｓｉｒＣ又はｆｈｕＣの発現を、前記の試験薬剤の非存在下で定量してもよい。
【０１６８】
あるいは、たとえば、Makino et al. (1990) Technique
2:295-301に開示されたＲＴ−ＰＣＲ法を使用するために、また、ｓｉｒＡ、ｓｉｒＢ、ｓｉｒＣ又はｆｈｕＣポリペプチドをエンコードするｍＲＮＡのレベルをアッセイしてもよい。手短に言えば、この方法は、試験薬剤の存在下で培養されたＳ．  ａｕｒｅｕｓ細胞から単離された全ＲＮＡを、ＲＴプライマー及び適切なバッファーを含む反応混合物に加えるステップを含む。プライマー・アニーリングのためにインキュベートした後、得られた混合物に、ＲＴバッファー、ｄＮＴＰ、ＤＴＴ、リボヌクレアーセ阻害剤及び逆転写酵素を補充することができる。前記のＲＮＡの逆転写を完了するためにインキュベート後、前記のＲＴ化された生成物は、それから、標識されたプライマーを使用するＰＣＲに付す。あるいは、前記のプライマーを標識するよりはむしろ、標識されたｄＮＴＰを前記のＰＣＲ反応混合物に含めることができる。ＰＣＲ増幅を、一般に行われている方法に従い、DNAサーマルサイクラー中で実施することができる。増幅を成し遂げるために適切な数のラウンド後、得られたＰＣＲ反応混合物をポリアクリルアミドゲル上での電気泳動に付す。前記のゲルを乾燥後、適合したバンドの放射能を、イメージングアナライザーを使用して測定してもよい。ＲＴ及びＰＣＲ反応の材料及び条件、試薬及びゲル濃度、並びに標識方法は、当該技術分野ではよく知られている。前記のＲＴ−ＰＣＲ方法における変化は、当業者にとって明らかであろう。本発明の核酸を検出することができる他のＰＣＲ法は、PCR Primer: A Laboratory Manual (Dieffenbach et al. eds., Cold
Spring Harbor Lab Press, 1995)  に見出される。対照アッセイは、また、比較のためのベースラインを作成するために実施することができる。前記の対照アッセイでは、前記の試験薬剤の非存在下でＳ．  ａｕｒｅｕｓにおけるｓｉｒＡ、ｓｉｒＢ、又はｓｉｒＣの発現を定量してもよい。
【０１６９】
あるいは、たとえば、免疫測定法のような抗体を基礎とする方法を使用して、試験薬剤によりＳ．  ａｕｒｅｕｓ細胞を処理した後に、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ又はＦｈｕＣポリペプチドの発現を定量してもよい。たとえば、ウエスタン・ブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定法）、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫沈降測定法、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散測定法、凝集反応測定法、補体結合測定法、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光免疫測定法、及びタンパク質Ａ免疫測定法のような測定法を使用する、競合的及び非競合的測定システムを制限なく含む、あらゆる適切な免疫測定法を使用することができる。
【０１７０】
たとえば、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ又はＦｈｕＣポリペプチドを、二段階サンドイッチ測定法（ｔｗｏ−ｓｔｅｐ  ｓａｎｄｗｉｃｈ  ａｓｓａｙ）によって、試験薬剤で処理されたＳ．  ａｕｒｅｕｓ細胞から得られた試料において検出することができる。第一段階では、捕獲試薬（たとえば、ＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ又はＦｈｕＣの何れかの抗体）が、前記の特異的なポリペプチドを捕獲するために使用される。前記の捕獲試薬を、任意に固体相に固定することができる。第二段階では、直接的又は間接的に標識された検出試薬が、前記の捕獲されたマーカーを検出するために使用される。一つの実施態様では、前記の検出試薬が抗体である。試験薬剤で処理されたＳ．  ａｕｒｅｕｓ細胞に存在するＳｉｒＡ、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ又はＦｈｕＣポリペプチドの量は、未処理のＳ．  ａｕｒｅｕｓ細胞に存在する量を基準として算定されうる。
【０１７１】
適切な酵素標識は、たとえば、基質と反応して過酸化水素の産生を触媒するオキシダーゼ類からの標識を包含する。グルコースオキシダーゼが、特に好ましい。なぜならば、グルコースオキシダーゼは、安定性がよく、そしてその基質（グルコース）が容易に入手できるからである。オキシダーゼ標識の活性を、前記の酵素で標識された抗体／基質との反応により産生される過酸化水素の濃度を測定することによりアッセイしてもよい。酵素に加えて、他の適切な標識は、たとえば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）のような放射性同位体を包含する。
【０１７２】
適切な蛍光標識の例は、フルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、ｏ−フタルアルデヒド標識及びフルオレスカミン標識を包含する。
【０１７３】
適切な酵素標識の例は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌性のヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母性アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセリンリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼを包含する。
【０１７４】
化学発光標識の例は、ルミノール標識、イソルミノール標識、芳香族性アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識及びエクオリン標識を包含する。
【０１７５】
実施例
【０１７６】
一般的に記載された本発明は、以下の実施例を参照することによりより容易に理解されるかもしれない。以下の実施例は、単に、本発明のある態様及び実施態様の例示の目的のため含められているのであって、あらゆる点で本発明を限定することを意図するものではない。
【０１７７】
実施例１：実施例２−５ための材料及び方法
培地及び生育条件
実施例２−５で使用される細菌菌株、プラスミド及びオリゴヌクレオチドは、表１に示す。通例のクローニング及びタンパク質の発現のために、大腸菌（E. coli）を、３７℃で、必要に応じて、エリスロマイシン（３００μｇ／ｍｌ）、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍｌ）又はカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を補充したルリア−ベルターニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地（ＬＢ培地）中で生育させた。一般的な操作のためには、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ菌株を、必要に応じて、エルスロマイシン（５μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（４μｇ／ｍｌ）、カナマイシン及びネオマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、又はクロラムフェニコール（５μｇ／ｍｌ）を含むＤｉｆｃｏ社製のＴｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）培地で培養した。鉄を制限した細菌の生育実験のためには、組成については、前記（Sebulsky et al. (2000) J. Bacteriol. 182:4394-4400）の、Ｔｒｉｓ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ（ＴＭＳ）培地が使用された。前記の倍地中に遊離している鉄の濃度をさらに制限するために、ＴＭＳ培地に、以下の実施例で記載されている濃度の２’，２−ジピリジルを補充した。
【０１７８】
プラスミド及び菌株の構築
すべてのＤＮＡ操作及びプラスミドの構築は、標準的なプロトコールを使用して実施された。前記のｓｉｒＡＢＣオペロンは、Ｐｗｏｌポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）及びプライマーＳｉｒ  ｕｐｐｅｒ及びＳｉｒ  ｌｏｗｅｒを使用してＳ．  ａｕｒｅｕｓ８３２５−４の染色体からＰＣＲ増幅された。生じた３．８−ｋｂの生成物は、ｐＳｉｒＡＢＣを作り出すため、ｐＢＣ  ＳＫ＋のＳｍａｌサイトへクローンされた。
【０１７９】
前記のｓｉｒＡをコードする領域を分断するために、ｐＳｉｒＡＢＣを、Ｎｓｉｌにより消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで満たし、そしてｐＤＧ７８２からのＳｔｕＩ／ＳｍａＩフラグメントとして切り取られたカナマイシン耐性カセットに結合した。前記のｓｉｒＡ：：Ｋｍ領域は、ＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ−ｄｉｇｅｓｔｅｄ  ｐＡＵＬ−Ａにクローンされ、プラスミドｐＭＴＳ１２を構築した。
【０１８０】
前記のｓｉｒＢをコードする領域が、ＣｌａＩ（クレノウ酵素（Ｋｌｅｎｏｗ  ｅｎｚｙｍｅ）により末端平滑化された）によりｐＤＧ１５１３を消化すことにより誘導されたテトラサイクリン耐性カセットを、ｓｉｒＢのＳｔｕｌサイトへの挿入により、分断された。前記のｓｉｒＢ：：ｔｅｔフラグメントは、ＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ−ｄｉｇｅｓｔｅｄ  ｐＡＵＬ−Ａにクローンされ、プラスミドｐＳｉｒＢ：：Ｔｅｔ３を構築した
【０１８１】
ｓｉｒＡ及びｓｉｒＢにおける個々の突然変異を担う菌株を作り出すために、ｐＭＴＳ１２及びｐＳｉｒＢ：：Ｔｅｔ３は、Ｓ．  Ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ４２２０に導入された後、ファージ８０αの媒介でＳ．  ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ６３９０へ形質導入された。導入体は、制限分析により確認された。対立遺伝子置換は、３０℃で３時間、ついで生育温度を４３℃に上げて、さらに４時間、プラスミドを含む細菌を生育させることにより成し遂げられた。二重交差型事象は、両ケースにおいて同時に起こるエリスロマイシン耐性の欠失とともに、カナマイシンに対する耐性（ｓｉｒＡ：：Ｋｍ  ｍｕｔａｔｉｏｎ用）又はテトラサイクリンに対する耐性（ｓｉｒＢ：：Ｔｅｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ用）により、スクリーニングされた。ＰＣＲ及びサザンブロット分析が、ｓｉｒＡ及びｓｉｒＢへの前記の抗生物質耐性カセットの挿入を立証するために使用された。前記の生じた突然変異株は、Ｈ３０６（ＲＮ６３９０  ｓｉｒＡ：：Ｋｍ）及びＨ４７４（ＲＮ６３９０  ｓｉｒＢ：：Ｔｅｔ）と称された。形質導入が、たとえば、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎのような、異なる遺伝子バックグラウンドへの前記の突然変異を結集するために使用された。
【０１８２】
前記のｓｉｒＡ：：Ｋｍ  ｍｕｔａｔｉｏｎの相補性のために、前記の全ｓｉｒＡＢＣオペロンが、ｐＳｉｒＡＢＣ（ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩを使用して）から切り取られ、そしてプラスミドｐＳＥＤ４４を構築するため、ｐＡＷ８へクローンされた。前記のｓｉｒＢ：：Ｋｍ  突然変異体の相補性のために、前記のｓｉｒＢをコードする領域は、プライマーＳｉｒＢ  Ｃｏｍｐ  ５’及びＳｉｒＢ  Ｃｏｍｐ  ３’を使用してＳ．  ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ６３９０染色体からＰＣＲ法により増幅され、ついでプラスミドｐＳＥＤ４３を構築するために、ｐＡＬＣ２０７３への指向性クローニングのための、ＫｐｎＩ及びＳａｃＩによる消化が実施された。相補性ベクターは、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ４２２０にエレクトロポレーションにより導入され、及び相補性ベクターは、前記の方法（Sebulsky et al. (2000) J. Bacteriol. 182:4394-4400）を使用して、バクテリオファージ８０αを使用して突然変異株に形質導入された。
【０１８３】
ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＴ−ＰＣＲ反応における使用のため全ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して後期対数期における細菌培養物から単離された。ＲＮＡ試料は、前記のＲＴ−ＰＣＲ反応に先立ち、室温下で１５分間、ＤＮアーゼＩで処理された。Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）  Ｔａｑキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキットが、製造社の指示に従い使用された。全ＲＮＡ  ５００ｎｇが、前記のｓｉｒＢをコードする領域に対する内部の３９９−ｂｐフラグメントを増幅するために、プライマーＳｉｒＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ５’及びＳｉｒＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ３’使用して逆転写された。内部対照として、ｇａｐ（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをエンコードする。）の４８３−ｂｐフラグメントが、前記のＧａｐｄｈ  ５’及びＧａｐｄｈ３’オリゴヌクレオチド  プライマーを使用して増幅された。
【０１８４】
細菌の生育カーブ
Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ培養物は、ＴＭＳ中で一夜予め生育させた。細胞を洗浄後、およそ各株の１０７コロニー形成単位を、ＦｅＣ１３  ５０μＭを含むか、又は含まない、２，２’−ジピリジル（Ｓｉｇｍａ）２５０μＭを含む調製したばかりのＴＭＳ培地中に植え付けた。後期定常期に達するまで、細菌の生育をクレット・メーター（Ｋｌｅｔｔ  ｍｅｔｅｒ）で観察した。
【０１８５】
シデロフォア  プレート  バイオアッセイ
シデロフォア  プレート  バイオアッセイは、以下の変更を加えた上で、本質的に前記（Sebulsky et al. (2000) J. Bacteriol. 182:4394-4400）のように実施された。
（変更点）
試験される各株の１０５ｃｆｕ／ｍｌの接種の前に、ＴＭＳ−寒天を４５℃に冷却した。
Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ及び対照とするＮｅｗｍａｎを含むビークル（たとえば、ｐＡＷ８及びｐＡＬＣ２０７３）を含むプレートに２，２’−ジピリジル５５０μＭを添加し、又は、プラスミドを具備しているか、又は具備していない、Ｈ８０３株（Ｎｅｗｍａｎ  ｓｉｒＡ：：Ｋｍ）及びＨ８０４株（Ｎｅｗｍａｎ  ｓｉｒＢ：：Ｔｅｔ）には２，２’−ジピリジル４００μＭを添加した（図１を参照）。スタフィロバクチン（Ｓｔａｐｈｙｌｏｂａｃｔｉｎ）シデロフォアを、前記（(Dale et al. (2004) Infect. Immun. 72:29-37）のようにして、ＲＮ６３９０から単離した。手短に言えば、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ株を、３７℃で４８時間、ＴＭＳ培地中で激しく振とう培養した。培養液の上澄み液を、元の培養液の上澄み液の液量の１／１０を、１００％メタノール中での遠心分離により回収し、そして前記の上澄み液を、微粒子の材料を除くため、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．１濾紙を使用してろ過した。ロータリー蒸発装置により、前記の濾液を濃縮後、ＬＨ−２０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適用した。画分を集め、そしてクロムアズロールS  シャトル溶液（ｃｈｒｏｍｅ  ａｚｕｒｏｌ（ＣＡＳ）  Ｓ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）により陽性であり、かつシデロフォア  プレート  アッセイにおける生物学的活性を示す画分を濃縮乾固し、ついで水に再懸濁し、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析した。シデロフォアの最終的な精製には、分析用逆相ＨＰＬＣを使用した。利用したカラムは、Ｗａｔｅｒｓ  ＯＤＳ２  ＳＰｈｅｒｉｓｏｒｂカラム（４．６×１５０ｍｍ）であった。０．１％トリフルオロ酢酸水溶液を、溶液Ａとし、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル溶液を、溶液Ｂとして使用した。前記のクロマトグラフィーは、以下のように実施された。すなわち、流速０．７５ｍｌ／ｍｉｎで、溶液Ｂを６％で３．５分間、ついで２０分間以上にわたり、溶液Ｂを６％から６０％までグラジエントさせた。スタフィロバクチンは、２１０ｎｍで検出され、その保持時間は、およそ１７分であった。スタフィロバクチンを集め、その画分を濃縮乾固し、純度を確認するため、再度クロマトグラフィーを行った。スタフィロバクチン  シデロフォアの純度は、ＨＰＬＣ分析で確認された。エアロバクチン（Ａｅｒｏｂａｃｔｉｎ）をＥＭＣ  ｍｉｃｒｏｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓから購入し、全てのバイオアッセイの対照として１μｇ／ｍｌの濃度で使用された。
【０１８６】
５５Ｆｅ輸送アッセイ
Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ株を、２，２‘−ジピリジル１００μMを含み、ＦｅＣｌ３を含むか、又は含まないＴＭＳ中で後期対数期まで生育させた。細胞を、ＴＭＳにより０．４５μｍフィルター（Ｇｅｌｍａｎ）上で２回洗浄し、そしてＯＤ６００＝１．２に標準化された。１６０前記のアッセイに先立つこと２０分前に、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）２μＭの存在下で、５５ＦｅＣ１３（７５μＭ）を、およそスタフィロバクチン２２０μＭ（デスフェラール（ＤＥＳＦＥＲＡＬ（登録商標））当量から算定）と混合し、そして室温で平衡化させた。前記の５５Ｆｅ−スタフィロバクチン混合物１０μＬを細菌液１ｍｌに添加することにより、取り込みが開始された。異なった時点において、細胞液２００μｌを採取し、０．４５μｍ膜上でＬｉＣｌ２  １００ｍＭで２回洗浄した。膜を乾燥し、そしてＢｅｃｋｍａｎ  ＬＳ６５００シンチレーション・システムのトリチウム・チャンネルを使用して、ＣＹＴＯＳＣＩＮＴ（登録商標）液中でカウントした。いくらかの実験では、５５Ｆｅ混合物の添加に先立ち、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓを室温で２０分間シアン化カリウム（ＫＣＮ）１０ｍＭにより処理した。標示されたデータは、ブラッドフォード・アッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ａｓｓａｙ）により決定されるように、前記の細胞中の全たんぱく質含量に対して標準化された（＋／−標準偏差）、輸送された５５Ｆｅのｐｍｏｌ（ピコモル）である。
【０１８７】
ｌａｃＺ転写融合遺伝子及びβ−ガラクトシダーゼ・アッセイ
ｓｂｎＡ、ｓｂｎＦ及びｓｂｎＩに対するｌａｃＺ転写融合遺伝子の創製は、すでに記載された（Dale et al. (2004) Infect. Immun. 72:29-37）。個々の遺伝子の内部フラグメントは、グラム陽性菌では複製しないベクターである、ｐＭＵＴＩＮ４（Vagner et al., (1998) Microbiology 144:3097-3104）の複数のクローニング  サイトにクローンされた。これらの融合遺伝子は、Ｈ３０６及びＨ４７４遺伝子バックグラウンドに導入され、そして突然変異及び融合遺伝子の存在は、ＰＣＲにより確認された。ｓｂｎＨ：：ｌａｃＺ転写融合の構築は、すでに記載された（Dale et al. (2004) Infect. Immun. 72:29-37）。この融合遺伝子は、Ｎｅｗｍａｎ、Ｈ３０６及びＨ４７４遺伝子バックグラウンドに導入され、そして前記の融合遺伝子の存在は、ＰＣＲにより確認された。
【０１８８】
Ｓ．  ａｕｒｅｕｓからのβ−ガラクトシダーゼの発現の定量のために、細胞を、２，２‘−ジピリジル  １００μＭを補充したＴＭＳ中で、６００ｎｍでの光学濃度が０．８になるまで生育させ、そして前記（Dale et al. (2004) Infect. Immun. 72:29-37）のようにしてアッセイされた。手短に言えば、培養物を、１０  ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）、  ＥＤＴＡ  １５ｍＭ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びリソスタフィン（ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ）１０μｇを含む溶液中で、３７℃で溶菌した。細胞の破砕物の遠心分離後、上澄み液５μＬを使用して、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用して、Ｇａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ  Ｐｌｕｓ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ｋｉｔ（Ｔｒｏｐｉｘ）により、β−ガラクトシダーゼ活性をアッセイした。前記のバックグラウンドは、毎秒５０相対的光ユニットに設定され、そして、標示された前記のデータは、三つの独立サンプル±標準誤差について、毎秒の平均相対的光ユニットである。
【０１８９】
ＳｉｒＡの精製及び抗−ＳｉｒＡ抗血清の産生
我々は、ｓｉｒＡをクローニングすることにより、マイナス・ザ・シグナル・ペプチド（ｍｉｎｕｓ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）であるＳｉｒＡをＥ．  ｃｏｌｉ  ＥＲ２５６６で発現させ、プライマーｐＳｉｒＡ（ＢａｍＨＩ）及びｐＳｉｒＡ（ＥｃｏＲＩ）を使用して、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓのゲノムから、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにより消化されたｐＧＥＸ−２Ｔ−ＴＥＶに増幅した。ＩＰＴＧ  ０．５ｍＭにより４時間誘導する以前に、ｐＳｉｒＡと名付けられた、この構築物を中期対数期まで生育させた。Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓ（加圧型細胞破砕装置）を使用して、細胞を破砕し、そして前記の溶菌液を、４０，０００ｒｐｍで遠心分離してペレット状の細胞破砕物とした。前記の上澄み液を、ＰＢＳで平衡化されたＧＳＴｒａｐ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムに適用し、そして前記のＧＳＴ−ＳｉｒＡ融合タンパク質を、１０ｍＭ還元型グルタチオンを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）溶液で溶出した。タバコｅｔｃｈウイルスプロテアーゼとのインキュベーションにより、ＳｉｒＡをＧＳＴから切り離し、そして５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）に対して、４℃で一夜透析した。ＳｉｒＡを、リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）で平衡化されたＭｏｎｏ  Ｓカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してさらに精製し、そして前記のタンパク質を、１Ｍ  ＮａＣｌを含有するリン酸ナトリウムバッファーで溶出した。ＳｉｒＡの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。
【０１９０】
フロイント完全アジュバント１００μＬに懸濁させたＳｉｒＡ  ５００μｇを皮下注射により接種された、ニュジーランド白兎（Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  ｗｈｉｔｅ  ｒａｂｂｉｔｓ）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）において、ＳｉｒＡを認識する抗体を、産生させた。１４日目及び２８日目に、ウサギに、フロイント不完全アジュバントに懸濁させたＳｉｒＡ  １００μｇを追加抗原注射した。第二の追加抗原注射から１０日後、ウサギを犠牲にした。抗血清を、Ｈ３０６細胞溶菌液に対して吸収させ、、そしてウエスタン・ブロットに１：２０００に希釈して使用した。
【０１９１】
実施例２：ＳｉｒＡの発現は、Ｆｕｒ経由して鉄により制御されている。
ＳｉｒＡ発現を、鉄を豊富に含む培地（５０μＭ  ＦｅＣｌ３を含むＴＳＢ又はＴＭＳの何れか）で生育したＳ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎでは検出できなかったが、その発現を、鉄が制限された条件下で生育の間で容易に検出できた（図２）。鉄の制限レベルが強まる（すなわち、２，２‘−ジピリジルをＴＭＳに添加した場合）につれて、発現レベルが増加した（図２）。これらの発見は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ８３２５−４を使用した、以前の研究（Heinrichs et al. (1999) J. Bacteriol.
181:1436-1443）と一致している。我々は、さらにＳｉｒＡの発現が、Ｆｕｒが欠失したバックグラウンドでは、もはや鉄による制御ではないこと（図２）から、ＳｉｒＡの発現が、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓの前記のＦｕｒタンパク質の活性に支配されていることを示した。この発見は、ｓｉｒＡの共通のＦｕｒボックス上流の予測された存在と一致している（Dale et al. (2004) Infect. Immun. 72:29-37; Heinrichs et al. (1999) J. Bacteriol. 181:1436-1443）。
【０１９２】
実施例３：ｓｉｒＢ及びｓｉｒＣが存在していない場合、ｓｉｒＡ遺伝子産物はＥ．ｃｏｌｉに毒性を示す。
様々なベクター及びプロモーターシステム（データは示されていない）を使用した、多くの不成功に終わった試みが、Ｈ８０３の相補性のための、前記のｓｉｒＡをコードする領域をクローンするためになされた。これらの不成功に終わった結果は、たとえ少量のこのリポタンパク質の「漏出的」発現が、Ｅ．  ｃｏｌｉに対して致死性であったことを示した。抗−ＳｉｒＡ抗血清の産生のためには、前記のシグナルペプチドが欠失しているｓｉｒＡは、成功裏にＥ．  ｃｏｌｉ発現ベクターにクローンされ、そして大量の可溶性ＳｉｒＡが産生されたので、ｓｉｒＡのクローニングで遭遇する前記の問題は、前記のタンパク質の可溶又は両親媒性の領域に起因することではないようである。これらの結果は、ｓｉｒＡのクローニングで遭遇する前記の問題が、Ｅ．  ｃｏｌｉにおける前記のリポタンパク質の不適当なプロセッシングに起因しているかもしれないという考えを支持する。
【０１９３】
しかしながら、興味深いことに、ｓｉｒＢ及びｓｉｒＣが前記のクローンされたＤＮＡに含まれているときではなく、試みがそれ自身上での前記のｓｉｒＡ遺伝子をクローンするためになされたときにのみ、Ｅ．  ｃｏｌｉにおける前記のＳｉｒＡリポタンパク質の明らかな毒性作用が発生した。実は、前記のｓｉｒＡＢＣ遺伝子は、成功裏にプラスミドｐＳｉｒＡＢＣにおいて単位としてクローンされ（図１）、そしてこのプラスミドはＥ．  ｃｏｌｉで大量のＳｉｒＡを発現した。この結果は、前記の膜においておそらくＳｉｒＡと相互作用する成分である、前記の輸送体の膜内外成分は、前記の膜における前記のリポタンパク質を安定化するのに寄与するかもしれないということを示唆している。
【０１９４】
実施例４：ＳｉｒＡ及びＳｉｒＢは、鉄の取り込みに関与している。
前記のＳｉｒポリペプチドは、ＡＢＣ輸送体（ＳｉｒＢ及びＳｉｒＣ）及び配位子結合タンパク質（ＳｉｒＡ）の前記の膜成分、並びに、より特異的には鉄の取り込みに関与している輸送体との類似性を共有している。鉄の取り込みにおけるｓｉｒＡＢＣの潜在的な役割を扱うために、我々は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ６３９０におけるｓｉｒＡ及びｓｉｒＢのそれぞれをコードする領域を、挿入的に不活性化するために、カナマイシン及びテトラサイクリンの耐性カセットを使用した。Ｈ３０６（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ６３９０  ｓｉｒＡ：：Ｋｍ）及びＨ４７４（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ６３９０  ｓｉｒＢ：：Ｔｅｔ）と呼称される、これらの株のそれぞれから突然変異株を、菌株を創製するために、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎに導入した。ＳｉｒＡは、Ｈ８０３（ｓｉｒＡ：：Ｋｍ）では検出されないが、前記のＨ８０４（ｓｉｒＢ：：Ｔｅｔ）突然変異株は、野性型レベルのＳｉｒＡを発現した。ＳｉｒＡよりも速く移動した、かすかに反応性があるバンドが、Ｈ８０３の細胞抽出物中に視認される。このバンドは、おそらく、使用された、前記のポリクローナル抗血清に起因するもう一つのタンパク質との交差反応性に起因するようだ。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎが、鉄を豊富に含む培地で生育した場合（図２）に、このタンパク質のバンドを視認できるので、このタンパク質のバンドは、おそらく、他の試験試料における前記のＳｉｒＡタンパク質の高レベルの発現によりマスクされている（すなわち、ＳｉｒＡの発現は、Ｅ．ｃｏｌｉ（ｐＳＥＤ４４）及びＨ６８６（ｓｂｎＥ：：Ｋｍ）において検出された。）。
【０１９５】
以前の研究では、ストレプトニグリン（ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉｎ）に対する感受性を、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓにおける鉄輸送の損失又は混乱を証明するための方法として使用された（Sebulsky et
al. (2000) J. Bacteriol. 182:4394-4400）。ストレプトニグリン（ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉｎ）が、細胞内の鉄が存在する細胞に対して毒性を示し、そして、それゆえ、鉄を移入する細胞が、一般に鉄移入が衰弱した突然変異株に比較して、この薬物の毒性作用に対してより感受性が高い（Yeowell et al. (1982) Antimicrob.
Agents Chemother. 22:961-968）。ストレプトニグリンの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）に関して、ＴＭＳ中で生育したＳ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｈ８０３又はＨ８０４の何れか一方よりも、ＴＭＳ中で生育したＳ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎのが、およそ４倍低い（図２参照）。ストレプトニグリンに対する異なる感受性は、鉄キレート剤であるＤＥＳＦＥＲＡＬｌ（登録商標）を生育培地に含めることにより克服された。このことは、このシデロフォアが、母株及び突然変異株により、同等によく使用されたことを示している。これらのデータにより、おそらく、ＳｉｒＡ及びＳｉｒＢが、鉄の細胞内への輸送に関与していたということが示された。このことに関する更なる証拠として、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎに対する２，２‘−ジピリジル（代謝されない鉄キレート剤）のＭＩＣが、Ｈ８０３及びＨ８０４の何れか一方よりも４倍高いことが立証された。
【０１９６】
ついで、ｓｉｒＡ又はｓｉｒＢの何れか一方の機能の低下と関連があるであろう生育速度における欠陥を同定するために、野性型のＮｅｗｍａｎ及びその派生物の生育は、２４−３６時間に亘り行われる。鉄を豊富に含む生育培地において、Ｈ８０３（Ｎｅｗｍａｎ  ｓｉｒＡ：：Ｋｍ）の成長は、Ｎｅｗｍａｎに比較して変わらなかった（図３Ａ差込み図）。しかしながら、Ｈ８０３は、鉄の含量が制限された培地における、Ｎｅｗｍａｎの生育に比べて、極端な生育欠陥を示した（図３Ａ）。Ｈ８０３へのプラスミドｐＳＥＤ４４（Ｐｌａｃから発現された前記のｓｉｒＡＢＣを含む；図１）の導入により、鉄の含量が制限された生育培地におけるこの菌株の生育欠陥が直された。ｐＡＷ８ベクター中のＰｌａｃプロモーターは、Ｅ．  ｃｏｌｉ中のｐＳＥＤ４４構築物から大量のＳｉｒＡを発現するが、たとえＩＰＴＧ  １ｍＭの存在下（データは示されていない）であっても、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓでは極度に少ないＳｉｒＡしか発現しない。このことは、Ｐｌａｃが機能を有するが、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓでは極めて不十分であることを示す。しかしながら、この少量のＳｉｒＡは、Ｈ８０３における前記の突然変異遺伝子を補足することができた。鉄が不足している生育培地へのＩＰＴＧ  １ｍＭの添加により、相補性が促進された（図３）。Ｎｅｗｍａｎ又はＨ８０３の何れか一方にビークルのみを導入しても、それらの成長速度に影響がなかった。（図３）
【０１９７】
我々は、前記のｓｉｒＡをコードする領域のみにより前記のｓｉｒＡ：：Ｋｍ突然変異遺伝子を補足することができなかった（下記参照）ので、我々は、下流Ｓｉｒ遺伝子の発現における前記のｓｉｒＡ：：Ｋｍ突然変異遺伝子の極性の可能性を除外しなければならかった。ＲＴ−ＰＣＲ実験により、前記のｓｉｒＡ：：Ｋｍ突然変異遺伝子が、ｓｉｒＢの発現には影響しなかったこと（データは示されていない）が実証され、そして一方、ｓｉｒＢ転写物の発現が、前記の生育培地の鉄濃度により制御されたこともまた確認された。さらに、ｓｉｒＢが、鉄欠乏条件下で生育した、ｓｉｒＢ：：Ｔｅｔ突然変異遺伝子を含む菌株であるＨ８０４では検出されなかった。なぜならば、前記のＴｅｔカセットは、前記のＰＣＲにおいて、増幅された領域を分断するからである。これらの実験では、全ＲＮＡ（５００ｎｇ）は逆転写され、そしてｓｉｒＢ及びｇａｐに対する前記のｃＤＮＡは、実施例１に記載されたように増幅された。
【０１９８】
Ｈ８０３と同様に、鉄を豊富に含む培地でのＨ８０４（Ｎｅｗｍａｎ  ｓｉｒＢ：：Ｔｅｔ）の成長は、野性型Ｎｅｗｍａｎと比較して変わるところがなかった（図３差込み図）。しかしながら、Ｈ８０３と同様に、Ｈ８０４の成長は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎと比較して、鉄が不足している生育培地で激しく損なわれた（図３Ｂ）。Ｈ８０４のこの発育の欠陥は、ｐＳＥＤ４３の前記の菌株への導入により軽減された（図３Ｂ）。なお、ｐＳＥＤ４３は、ｘｙｌ／ｔｅｔプロモーターからｓｉｒＢを発現する（図１）。前記のｘｙｌ／ｔｅｔプロモーターは、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓでは極めて漏出性であることが見出され（データは示されていない）、そして、それゆえ、野性型表現型の完全な回復をみる実験では、誘導物質（アンヒドロテトラサイクリン）を生育培地に混合することは不要であった。
【０１９９】
実施例５：ＳｉｒＡ及びＳｉｒＢの突然変異株は、スタフィロバクチン生合成ではなく、スタフィロバクチン輸送に欠失したＳ．  ａｕｒｅｕｓを生じる。
スタフィロバクチンは、前記の方法（Dale et al. (2004) Infect. Immun. 72:29-37）を使用して、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ６３９０から単離された。精製されたスタフィロバクチンを使用して、シデロフォア  プレート  アッセイで成長促進作用を評価した。スタフィロバクチンは、容易にシデロフォア  プレート  アッセイでＳ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ  ＲＮ６３９０及びＨ２８７（ｆｈｕＧ：：Ｔｎ９１７）の成長を促進したのに対して、Ｈ３０６（ＲＮ６３９０  ｓｉｒＡ：：Ｋｍ）、Ｈ４７４（ＲＮ６３９０  ｓｉｒＢ：：Ｔｅｔ）、Ｈ８０３（Ｎｅｗｍａｎ  ｓｉｒＡ：：Ｋｍ）又はＨ８０４（Ｎｅｗｍａｎ  ｓｉｒＢ：：Ｔｅｔ）に対して、スタフィロバクチンが仲介する成長促進効果が観察されなかった。このことは、ＳｉｒＡ及びＳｉｒＢの両者が、スタフィロバクチンが仲介する鉄輸送に必須であることを示す。これらの結果を確認するために、精製されたスタフィロバクチンを５５ＦｅＣ１３と共にインキュベートし、そして輸送アッセイをＳ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ及びＨ８０３について実施した。
５５Ｆｅ−スタフィロバクチンの著しい輸送が、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎにおいて観察されたのに対して、ＦｅＣ１３を含むＴＭＳで予め生育させたＮｅｗｍａｎ、１０ｍＭ  ＫＣＮで処理されたＮｅｗｍａｎ又はＨ８０３では、ほとんど輸送が起こらなかった（データは示されていない）。総合すると、これらの結果は、スタフィロバクチン輸送が、少なくともＳｉｒＡ及びＳｉｒＢの機能を必要とする鉄により制御されたプロセスであることを立証し、そしてこの輸送が、ＡＴＰを消費する反応であるとことを示唆した。エアロバクチン（ａｅｒｏｂａｃｔｉｎ）、ＤＥＳＦＥＲＡＬ（登録商標）、及びクエン酸鉄による成長促進作用が、ｓｉｒＡ及びｓｉｒＢ突然変異株ではその効果を発揮しなかった、そしてスタフィロバクチンの存在下では成長が、前記の相補されたｓｉｒＡ：：Ｋｍ及びｓｉｒＢ：：Ｔｅｔ突然変異株において回復された（データは示されていない）。
【０２００】
少なくとも、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓの一例において、輸送システムの前記のリポタンパク質（すなわち、結合タンパク質）成分をエンコードする一つ以上の遺伝子が、前記のゲノムに見出されている。確かに、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓの多くの株における、前記の鉄−ドロキサム酸錯体（ｉｒｏｎ−ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅ）の取り込みシステムは、結合タンパク質構成成分（たとえば、ｆｈｕＤｌ及びｆｈｕＤ２）をエンコードする二つの遺伝子を除いて、前記のＡＢＣ−輸送体構成成分をエンコードする遺伝子の単コピーで構成されている（Sebulsky and Heinrichs (2001) J.
Bacteriol. 183:4394-4400; Sebulsky et
al. (2003) J. Biol. Chem.
278:49890-900）。ｆｈｕＤｌ及びｆｈｕＤ２の両者を含む菌株において、前記の遺伝子の一つの突然変異体は、鉄−ドロキサム酸錯体（ｉｒｏｎ−ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅ）の取り込みについて、野性型又は野性型に極めて近い型の何れか一方である表現型になる（Sebulsky and Heinrichs (2001) J.
Bacteriol. 183:4394-4400）。前記のｓｉｒＡ：：Ｋｍ及びｓｉｒＢ：：Ｔｅｔの両者の突然変異体は、表現型が同等なものになるということが与えられたことから、我々は、前記の結合タンパク質（すなわち、ＳｉｒＡ）構成成分をエンコードする唯一の遺伝子、及びこの輸送システムのための前記の膜輸送体をエンコードする単コピーの遺伝子（すなわちｓｉｒＢ及びｓｉｒＣ）のみが存在すると結論した。
【０２０１】
前記のｓｂｎオペロン及び前記のｓｉｒオペロンから発現されるタンパク質の機能（すなわち、スタフィロバクチンの生合成及び取り入れ）は関連していることが与えられたことから、我々は、前記のオペロンにおける突然変異株の機能としてそれらの発現に関するどんな効果でも決定することを切望した。ｓｂｎＥの突然変異体は、スタフィロバクチン合成の欠失を生ずる（Dale et al. (2004) Infect. Immun. 72:29-37）。しかしながら、我々は、ｓｂｎＥ機能の欠失そして、それゆえスタフィロバクチンの生合成が、ＳｉｒＡの発現に大きな影響を有うしないことを示した（データは示されていない）。必然の結果の実験において、我々は、ｓｉｒＡ又はｓｉｒＢの欠失が、スタフィロバクチンの産生の欠失又は減少を生じるかどうかについて研究した。我々は、適度に鉄が制限された培地で生育したＨ８０３が、かなりの量のスタフィロバクチンを産生したことを、分析ＨＰＬＣ及びＥＳＩ−質量分析の両方により観察した（データは示されていない）。この現象をさらに研究するために、我々は、ｌａｃＺ−ｓｂｎＨ転写融合遺伝子をＮｅｗｍａｎ、Ｈ８０３及びＨ８０４に導入した。我々は、野生型Ｎｅｗｍａｎに比べて、前記のＨ８０３及びＨ８０４遺伝子バックグラウンドにおいて、前記のｓｂｎＨ遺伝子の転写のかなりの増加を観察した（図３）。前記の融合遺伝子を含む菌株が、鉄を豊富に含む条件下で生育した場合、β−ガラクトシダーゼ活性の転写は、観察されなかった（データは示されていない）。これらの結果は、スタフィロバクチンの生合成が、このシデロフォアを輸送する能力の欠失した菌株において、おそらくは高められた鉄欠乏状態に応答する場合に促進されるかもしれないことを示唆する。
【０２０２】
実施例６：実施例７−１２のための材料及び方法
細菌菌株、プラスミド及び成長条件
実施例７−１２で使用される細菌菌株及びプラスミドは、表４に記載されている。Ｅ．  ｃｏｌｉは、ルリア−ベルターニ培地（ＬＢ培地）（Ｄｉｆｃｏ）で生育させた。鉄の取り込みの分析に直接関係していない実験の場合、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓは、Ｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）培地（Ｄｉｆｃｏ）で生育させた。トリス−ミニマル・スクシネート（Ｔｒｉｓ−ｍｉｎｉｍａｌ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）（ＴＭＳ）を記載（Sebulsky et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:53152-9）に従い調製し、そして鉄が制限されたミニマル培地（ｍｉｎｉｍａｌ  ｍｅｄｉａ）として使用した。ＴＭＳ中の遊離している鉄のレベルをさらに制限するためには、鉄キレート化合物である２，２‘−ジピリジル及びエチレンジアミン−ジ（ｏ−ヒドロキシフェノール酢酸）（ＥＤＤＨＡ）を、この明細書に示されたように添加した。必要な場合には、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）又はカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を、Ｅ．  ｃｏｌｉ株の成長のための培地に添加した。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ用には、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、ネオマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、エリスロマイシン（３μｇ／ｍｌ）及びリンコマイシン（２０μｇ／ｍｌ）を、必要に応じて成長培地に添加した。固形培地は、１．５％（ｗ／ｖ）バクトアガー（Ｂａｃｔｏ  ａｇａｒ）（Ｄｉｆｃｏ）の添加により調製された。すべての細菌の生育は、その他に記載されていないならば、３７℃で実施された。生育培地及び溶液を調製するための、鉄を含まない水は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水濾過システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）により濾過することにより調製された。
【０２０３】
組換えＤＮＡ法
標準的なＤＮＡ操作は、本質的にＳａｍｂｒｏｏｋら（Sambrook et al. (1989) Molecular
cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor）により開示された方法のように実施された。制限エンドヌクレアーゼ及びＤＮＡ修飾酵素は、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｌａｖａｌ，  Ｑｕｅｂｅｃ，  Ｃａｎａｄａ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，  Ｏｎｔａｒｉｏ，  Ｃａｎａｄａ）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，  Ｏｎｔａｒｉｏ，  Ｃａｎａｄａ）及びＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  （Ｆｌａｍｂｏｒｏｕｇｈ，  Ｏｎｔａｒｉｏ，  Ｃａｎａｄａ）から購入した。プラスミドＤＮＡは、ＱＩＡｐｒｅｐ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎｓ（ＱＩＡｇｅｎ  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、前記の製造者により記載されたようにして精製された。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓからのプラスミドの単離ために、リソスタフィン（ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ）（５０μｇ／ｍＬ）をバッファーＰ１に添加した。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓからの染色体ＤＮＡは、ＩｎｓｔａＧｅｎｅＴＭ  Ｍａｔｒｉｘ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、前記の製造者により記載されたようにして単離された。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＰｗｏＩ又はＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）の何れか一方を使用して実施された。
【０２０４】
ΔｆｈｕＣＢＧ：：ｅｒｍＢ  突然変異株の構築
ＲＮ６３９０の染色体における前記のｆｈｕＣＢＧオペロンを欠失させるために、前記のオペロンの両端に隣接するＤＮＡの二つの領域は、ＰＣＲにより前記のＲＮ６３９０染色体から増幅された。ｆｈｕＣ  上流センス（５′−ＴＴＧＡＡＴＴＣＡＡＴＡＣＣＴＣＧＡＴＧＴＡＡＧＣＡＣＧ−３′（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７））及びｆｈｕＣ上流アンチセンス（５′−ＴＴＧＧＡＴＣＣＡＣＧＡＴＴＣＡＴＡＡＴＴＴＣＣＣＴＡＣ−３′（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８））のプライマーを、ｆｈｕＣの７０９−ｂｐ上流フラグメントを増幅するために使用し、そして前記のｆｈｕＣオープンリーディングフレームの第一９−ｂｐを含んでいた。そして、ｆｈｕＧ下流センス（５′−ＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡＣＧＡＡＡＡＡＴＧＴＡＴＡＧＴＧＴＣ−３′（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９））及びｆｈｕＧ下流アンチセンス（５′−ＴＴＴＣＴＡＧＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡＣＡＡＡＣ−３′（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０））のプライマーを、前記のｆｈｕＧオープンリーディングフレームの最後の１３−ｂｐを含む、ｆｈｕＧの７１８−ｂｐ下流フラグメントを増幅するために使用した。
【０２０５】
前記のｆｈｕＣ上流フラグメントを、ＥｃｏＲ１及びＢａｍＨＩにより消化し（プライマー配列において下線を付したのが認識サイト）、そして前記のｆｈｕＧ下流フラグメントを、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩにより消化し（プライマー配列において下線を付したのが認識サイト）そして、これら二つのフラグメントを、一緒に、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩにより消化されたｐＵＣ１９にクローンした。前記の得られた構築物は、ＢａｍＨＩにより消化され、そして前記のｅｒｍＢ遺伝子を担っている、ｐＤＧ６４６からの１．６−ｋｂ  ＢａｍＨＩフラグメントが挿入された。前記の得られたプラスミド構築物を、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩにより消化し、そしてｆｈｕＣ上流及びｆｈｕＧ下流のフラグメントの間の、ｅｒｍＢを含む３０２７−ｂｐフラグメントを、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩにより消化されたｐＡＵＬ−Ａ  Ｋｍに結合して、前記のプラスミドｐΔｆｈｕＣＢＧが構築した。
【０２０６】
プラスミドｐΔｆｈｕＣＢＧを、エレクトロポレーションによりＳ．  Ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ４２２０に導入し、そして、３０℃での生育後、カナマイシン及びネオマイシンに対して耐性を示すコロニーを選択した。前記の染色体におけるプラスミド組み込みのために選別するために、カナマイシン耐性のクローンの生育温度を４２℃に変更した。エリスロマイシン及びリンコマイシンに耐性であるが、カナマイシン及びネオマイシンに感受性である細菌を選択した。ΔｆｈｕＣＢＧ：：ｅｒｍＢ突然変異遺伝子は、ＰＣＲにより確認され、そして前記の突然変異遺伝子を、次に、それぞれＨ１０７１及びＨ１０７４を構築するため、前記のＲＮ６３９０及びＮｅｗｍａｎバックグラウンドに形質導入した。
【０２０７】
相補性プラスミドの構築
前記のΔｆｈｕＣＢＧ：：ｅｒｍＢ突然変異株を相補するために、ｐＭＴＳ２０（Sebulsky et al. (2000) J. Bacteriol. 182:4394-4400）をＢａｍＨＩにより消化し、そして、およそ４００−ｂｐの上流ＤＮＡ（前記のＦｕｒ  ｂｏｘ及びプロモーター配列を含む）を有する、生じた前記のｆｈｕＣＢＧオペロンを含む３．７−ｋｂフラグメントを、ｐＦｈｕＣＢＧを構築するために、ｐＬＩ５０のＢａｍＨＩサイトに結合させた。ｐＦｈｕＣを構築するために、プライマーｆｈｕＣＢＧ２（５′−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＡＣＡＡＧＴＴＴＣＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＣ−３′（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１））及びｆｈｕＣアンチセンス（５′−ＴＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＴＧＴＣＡＴＧＴＴＡＡＴＴＧＴＣＣ−３′（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２））を使用して、前記のｆｈｕＣをコードする領域プラス、ｐＦｈｕＣＢＧの場合と同じように、４００−ｂｐ上流領域を含む、１．２ｋｂ領域を増幅し、そして生じたＰＣＲ産生物をｐＬＩ５０のＢａｍＨＩサイトにクローンした。
【０２０８】
シデロフォア
フェリクロム（Ｆｅｒｒｉｃｈｒｏｍｅ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，  Ｏｎｔａｒｉｏ，  Ｃａｎａｄａ）から購入し、ＤＥＳＦＥＲＡＬ（登録商標）  （Ｎｏｖａｒｔｉｓ）として使用されているデスフェリオキサミンＢ（ｄｅｓｆｅｒｒｉｏｘａｍｉｎｅ  Ｂ）は、Ｌｏｎｄｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ，  Ｏｎｔａｒｉｏ）より入手し、エンテロバクチン（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｉｎ）は、ＥＭＣ  Ｍｉｃｒｏｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ＧｍｂＨ  （Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）より購入した。スタフィロバクチンは、前記の開示（Dale et al. (2004) J. Bacteriol. 186:8356-62）のように調製された。
【０２０９】
バイオアッセイ
シデロフォア  プレート  アッセイは、本質的に開示（Sebulsky et al. (2000) J. Bacteriol.
182:4394-4400）のように実施された。手短に言えば、１０４  ｃｅｌｌｓ／ｍＬを、鉄キレート剤としてＥＤＤＨＡ  ２５μＭを含む、溶融状態のＴＭＳ寒天培地に添加した。試験する鉄源（ＤＥＳＦＥＲＡＬ（登録商標）（５０μＭ）、フェリクロム（ｆｅｒｒｉｃｈｒｏｍｅ）（５０μＭ）、エンテロバクチン（５００μＭ）、スタフィロバクチン（５０μＭ  ＤＥＳＦＥＲＡＬ（登録商標）当量）、ヘミン（２５０μｇ／ｍＬ）、ヘモグロビン（２ｍｇ／ｍＬ）、ＦｅＣｌ３（５０ｍＭ）、又はクエン酸鉄（５ｍＭ））１０μＬを、滅菌された直径６ｍｍのペーパーディスクに加え、前記のプレートの表面に置いた。各ディスクの周りの成長輪の直径により測定される成長促進効果を、ヘム及びヘモグロビン以外については４８時間のインキュベーションで決定したが、ヘム及びヘモグロビンについては７２時間のインキュベーションで測定した。
【０２１０】
Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ株に対する２，２‘−ジピリジルの最小発育阻止濃度の決定
試験に使用した株を、予めＴＭＳで生育させ、そしてアッセイに先立ち、細胞を新たに調製したＴＭＳで洗浄した。２，２‘−ジピリジルをＴＭＳに添加し、１ｍＭから３２μＭまでの連続した濃度となるように希釈した。連続して希釈した後、５×１０４ＣＦＵ（コロニー形成単位）を各５−ｍＬ培地に接種し、そして２４時間後における成長を記録した。
【０２１１】
細菌の成長曲線
菌株を一夜ＴＭＳ中で予め生育させた。細胞をＴＭＳで洗浄し、そして５×１０４ＣＦＵを、酸で洗浄したフラスコに入れた、新たに調製したＴＭＳ  ５０ｍＬ又は２，２‘−ジピリジル  ５０μＭを補充したＴＭＳに接種した。必要な場合には、鉄が豊富に存在する条件を作り出すために、前記の培地にＦｅＣｌ３  ５０μＭを添加した。細菌の成長を、静止期に達するまで、６００ｎｍ（ＯＤ６００）における不透明度（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）を測定することにより観察した。
【０２１２】
５５Ｆｅ輸送アッセイ
シデロフォアの取り込みを、以下の修正を加えて、前記（Dale et al. (2004) J. Bacteriol. 186:8356-62）のようにして測定した。すなわち、当該修正は、ＴＭＳのみで生育させたＲＮ６３９０ΔｆｈｕＣＢＧ：：ｅｒｍＢ（Ｈ１０７１）以外の全ての菌株を、一夜２，２‘−ジピリジル５０μＭ及び適当な抗生物質を含むＴＭＳで生育させたということである。細胞を３回ＴＭＳ中で洗浄し、そして６００ｎｍにおける不透明度２．０を常態とした。シデロフォア（ＤＥＳＦＥＲＡＬ（登録商標）  〜２００μＭ及びスタフィロバクチン〜２００μＭ）を、ニトリロ三酢酸４μＭの存在下で５５ＦｅＣｌ３（７５μＭ）と混合し、そして得られた混合物を室温で３０分間平衡状態に置いた。細胞１ｍＬに、各５５Ｆｅ−シデロフォア混合物１０μＬを加えることにより、鉄の取り込みを開始させた。様々な時点で、細胞２００μＬを採取し、ポアザイズ０．４５μＭの膜（Ｐａｌｌ  Ｇｅｌｍａｎ）上で１００ｍＭ  ＬｉＣｌで２回洗浄した。膜を乾燥し、そしてＢｅｃｋｍａｎ  ＬＳ６５００シンチレーション・システムのトリチウム・チャンネルを使用して、ＣｙｔｏＳｃｉｎｔ（登録商標）液中でカウントした。いくらかの実験では、前記の５５Ｆｅ−シデロフォア混合物による取り込みの開始に先立ち、細菌を１５分間室温で１０ｍＭシアン化カリウムに晒した。示したデータは、前記の培養物の不透明度を常態とした、輸送された５５Ｆｅのピコモルである。
【０２１３】
マウス腎臓膿瘍モデル
雌のＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（各２５ｇ）を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｃａｎａｄａ  Ｉｎｃ．より購入し、そして、ミクロアイソレーター  ケージ（ｍｉｃｒｏｉｓｏｌａｔｏｒ  ｃａｇｅ）に収容した。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ及びＮｅｗｍａｎ  ΔｆｈｕＣＢＧ：：ｅｒｍＢ  （Ｈ１０７４）を一夜ＴＳＢで生育させ、滅菌した生理的食塩水で３回洗浄し、そして１×１０８ｃｆｕ／ｍＬの懸濁液を滅菌した生理的食塩水を使用して調製した。前記の細胞懸濁液１００μＬを、その尾静脈に注射した。注射された生存可能な細菌数を、ＴＳＢ−寒天上への前記の接種を連続的に希釈したプレートにより確認した。前記の実験の過程を通して、前記のマウスをそれらのグルーミング癖及び運動機能について独自にカウントした。１というスコアは正常な機能を示し、これに対し、より高いスコアの場合、機能が変化したことを示した（結果に関しては、以下参照）。７日目、前記のマウスを安楽死させ、そして、その腎臓を無菌的に採取し、そしてＰｏｗｅｒＧｅｎ  ７００  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒを使用して、無菌のＰＢＳ＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で均質化した。ホモジェネートを連続的に希釈し、そして回収された細菌数をカウントするために、ＴＳＢ−寒天上で平板培養した。示されたデータは、マウス毎の回収されたＣＦＵの対数表示（ｌｏｇ  ＣＦＵ  ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ）である。各グループの視認できる膿瘍を呈する腎臓のパーセントの有意差を、Ｚ  ａｎｄ  Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  Ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔを使用して決定した。
【０２１４】
コンピュータ分析
ＤＮＡ配列分析及びＰＣＲオリゴヌクレオチド  プライマーのデザインを、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ  ７  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，  Ｉｎｃ．）を使用して行った。データ分析及びグラフ作成には、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ及びＳｉｇｍａｐｌｏｔ（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．）を使用した。
【０２１５】
実施例７：Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ΔｆｈｕＣＢＧ：：ｅｒｍＢ突然変異株の構築
鉄により制御されるｆｈｕＣＢＧオペロンが、すでに我々の研究室（Sebulsky et al. (2000) J. Bacteriol.
182:4394-4400）及びＸｉｏｎｇら（Xiong et al. (2000) Microbiology 146:659-668）により同定され、そしてｆｈｕＢ又はｆｈｕＧの何れか一方における突然変異株が輸送を排除したので、前記のｆｈｕＣＢＧオペロンが、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓにおける鉄（ＩＩＩ）−ヒドロキサム酸錯体の輸送のためには必要であることが示された（Cabrera et al. (2001) Appl. Environ.
Microbiol. 67:1001-3; Sebulsky et al. (2000) J. Bacteriol. 182:4394-4400）。前記のオペロンは、完全なＳ．  ａｕｒｅｕｓゲノム配列に存在する（Sebulsky et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:53152-9）。モデルとしてｆｈｕシステムを使用する、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓにおける鉄（ＩＩＩ）−シデロフォア輸送メカニズムを解明するための我々の研究の一環として、我々は、ｆｈｕＣＢＧオペロン欠失を含む、Ｈ１０６８と呼称される、ＲＮ４２２０遺伝子バックグラウンドにおいてＳ．  ａｕｒｅｕｓ株を構築した（図４参照）。前記の突然変異株を、前記のＲＮ６３９０及びＮｅｗｍａｎ遺伝子バックグラウンドに、ファージ形質導入により動態化し、Ｈ１０７１及びＨ１０７４のそれぞれを構築した。
【０２１６】
実施例８：ΔｆｈｕＣＢＧ突然変異株は、鉄（ＩＩＩ）−ヒドロキサム酸錯体を利用することができない。
ｆｈｕＧ又はｆｈｕＢの何れか一方の欠失により、鉄制限下の成長にために、あらゆる鉄（ＩＩＩ）−ヒドロキサメート複合物を完全に利用できないことを示す、上記の結果と一致して、プレート  バイオアッセイにより、Ｈ１０７がＤＥＳＦＥＲＡＬ（登録商標）、フェリクロム、コプロゲン（ｃｏｐｒｏｇｅｎ）、及びエアロバクチンを利用できないことが示された。Ｈ１０７１は、前記の菌株に、ｆｈｕＣＢＧオペロンｉｎ  ｔｒａｎｓを担ったプラスミドｐＦｈｕＣＢＧを供給すると、シデロフォア  プレート  アッセイにおいて、鉄の取り込みのために、すべての前記のヒドロキサム酸錯体  シドロフォアを利用することができた（データは示されていない）。
【０２１７】
実施例９：Ｓ．  ａｕｒｅｕｓにおいて、ｆｈｕＣの突然変異株は、鉄により制限される成長欠陥を生じるが、他のｆｈｕ遺伝子の突然変異株では生じない。
我々の研究室で得られた以前の未発表の成果では、たとえば、ＲＮ６３９０  ｆｈｕＧ：：Ｔｎ９１７（Ｈ２８７）及びＲＮ６３９０  ｆｈｕＤ１：：Ｋｍ  ｆｈｕＤ２：：Ｔｅｔ（Ｈ４３１）のようなＳ．  ａｕｒｅｕｓにおけるｆｈｕの突然変異株は、鉄欠乏培地において明白な成長欠陥を有しなかったことが示された。このことは、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓの培養の上澄み液について、ヒドロキサム酸錯体についてのＣｚａｋｙ試験（Payne (1994) Detection, isolation,
and characterization of siderophores, p. 329-344. In V. L. Clark and P. M. Bavoil (ed.), Methods in Enzymology, vol. 235. Academic Press, Inc., San
Diego, CA）が陰性であったこととも一致して、ヒドロキサム酸錯体  シドロフォアが、鉄欠乏に対応するためにＳ．  ａｕｒｅｕｓにより産生されないことを示唆している（データは示されていない）。しかしながら、驚くべきことに、我々は、野性型ＲＮ６３９０、Ｈ２８７（ＲＮ６３９０  ｆｈｕＧ）及びＨ４３１（ＲＮ６３９０  ｆｈｕＤ１  ｆｈｕＤ２）に比べて、Ｈ１０７１の成長が、鉄が不足しているＴＭＳ培地において、有意に阻止され（データは示されていない）、そして代謝されない鉄キレート剤である２，２‘−ジピリジル５０μＭを含むＴＭＳにおいても尚更阻止されること（データは示されていない）を観察した。塩化第二鉄５０μＭをＴＭＳに添加すると、Ｈ１０７１の成長が野性型のレベルまで回復した。このことは、前記の害された成長が、単に、前記の細菌が利用できる鉄のレベルに起因していることを示している（データは示されていない）。Ｈ１０７１により示された、前記の鉄により制限された成長欠陥を、前記のオペロン（ｐＦｈｕＣＢＧ）を備えているプラスミドの導入により補足することができた。しかしながら、プラスミドｐＦｈｕＣ上に存在するｆｈｕＣ  ａｌｏｎｅ  ｉｎ  ｔｒａｎｓが、Ｈ１０７１株における鉄により制限された成長欠陥を補足したという観察は、より驚きであった。このことは、Ｈ１０７１の成長欠陥は、ｆｈｕＣを発現できない結果であったことを示していた。５５Ｆｅ−ＤＥＳＦＥＲＡＬ（登録商標）取り込みアッセイを行い、そして前記のアッセイにより、Ｈ１０７１が５５Ｆｅ−ＤＥＳＦＥＲＡＬ（登録商標）を輸送する能力がないこと（データは示されていない）、そしてバイオアッセイの結果を確証したこと（上記参照）が示された。しかしながら、注目すべきは、ｐＦｈｕＣがＨ１０７１の成長欠陥を補足できたが、それが５５Ｆｅ−ＤＥＳＦＥＲＡＬ（登録商標）を輸送するＨ１０７１の能力を回復できなかった（データは示されていない）という観察であった。そして、ＦｈｕＢ及びＦｈｕＧがまた鉄（ＩＩＩ）−ヒドロキサム酸錯体の取り込みために必要とされること（Cabrera
et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol.
67:1001-3; Sebulsky et al. (2000) J.
Bacteriol. 182:4394-4400）を示した、以前の結果を確証した。しかし、また、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓにおける鉄により制限される成長のために必要とされる一つである、補足的な鉄（ＩＩＩ）−シデロフォア輸送システムが、Ｈ１０７１では妨げられたことを示した。
【０２１８】
期待されたように、そしてｆｈｕＢ（Cabrera et al. (2001) Appl. Environ.
Microbiol. 67:1001-3）でもｆｈｕＧ（Sebulsky et al. (2000) J. Bacteriol.
182:4394-4400）でもないノックアウト株が、ヒドロキサム酸錯体型のシデロフォアを利用できることを示す、以前の結果と一致して、前記のΔｆｈｕＣＢＧ：：ｅｒｍＢ突然変異株は、シデロフォア  プレート  アッセイ及び輸送アッセイの両方により示されたように、鉄（ＩＩＩ）−ヒドロキサム酸錯体を輸送できなかった、そしてこの欠陥は、ｆｈｕＣＢＧ  ｉｎ  ｔｒａｎｓの導入により完全に補足された。前記のΔｆｈｕＣＢＧ：：ｅｒｍＢ突然変異株が、ＴＭＳ培地のみで鉄依存の成長欠陥示したことは、驚くべきことである。とすれば、ｆｈｕＧ、又はｆｈｕＤ１及びｆｈｕＤ２の両者の何れかを欠失した株は、野性型ＲＮ６３９０に比べて、同じような条件下でのあらゆる測定できる成長欠陥を示さない。Ｈ１０７１へのｆｈｕＣの導入により、前記の成長欠陥は回復されたが、鉄（ＩＩＩ）−ヒドロキサム酸錯体を利用する能力は回復しなかったという我々の観察からすると、内在性鉄取り込みシステムは、前記の突然変異株では損なわれたことが提案された。
【０２１９】
実施例１０：ＦｈｕＣは、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓにおける鉄（ＩＩＩ）−スタフィロバクチン輸送には必要とされる。
ＦｈｕＣ（Sebulsky et al. (2000) J. Bacteriol. 182:4394-4400）は、ＡＴＰａｓｅと意味深長な類似性を共有し、そしてＡＴＰ結合タンパク質（Holland and Blight (1999) J. Mol.
Biol. 293:381-99）の、すべての特徴（標示配列）を備えている。前記のＳ．  ａｕｒｅｕｓゲノムの分析から、予言された産生物は、鉄（ＩＩＩ）−シデロフォアＡＢＣ−型輸送体及び鉄（ＩＩＩ）−シデロフォア結合タンパク質との意味深長な類似性を共有する、いくつかのオペロンが同定された。しかしながら、ＳｉｒＡＢＣ、ＩｓｄＥＦ及びＳＡ１９７７−ＳＡ１９７９（Ｎ３１５ゲノムという名称を使用する）という、少なくとも三つのこれらの推定上のオペロンは、予言された産生物がＡＢＣ−型輸送体のＡＴＰａｓｅ構成成分との類似性を共有する遺伝子に欠けている。それゆえ、鉄が制限された条件下での成長に必要とされる鉄複合物を輸送するために、ＦｈｕＣが、これらの他のＳ．  ａｕｒｅｕｓ  ＡＢＣ輸送体の一つ又はそれより多い輸送体と相互に作用することが、可能である。我々の以前の研究では、鉄が制限された条件下で成長が損なわれた表現型を示し、そして我々が示した、ＳｉｒＡ及びＳｉｒＢ突然変異株の表現型が、鉄（ＩＩＩ）−スタフィロバクチンの輸送に必要とされたことが特徴づけられた（Dale et al. (2004) J. Bacteriol. 186:8356-62）。それゆえ、我々は、５５Ｆｅ−スタフィロバクチン輸送アッセイで、スタフィロバクチンを利用する能力について、Ｈ１０７１を試験した。それゆえ、これらの結果から、Ｈ１０７１が、スタフィロバクチンを利用できないことが示された（図５、差込図）。そのうえ、ｐＦｈｕＣＢＧを有するこの突然変異株及び、最も明白にはｐＦｈｕＣのみの相補性は、きわだったスタフィロバクチンの輸送を結果として生じた（図５）。このことは、ＦｈｕＢ及びＦｈｕＧが、スタフィロバクチンの輸送に関与していないこと、そしてＳｉｒＡＢＣ（ＳｉｒＡ、結合タンパク質、ＳｉｒＢ及びＳｉｒＣ、パーミアーゼ）（Dale et al. (2004) J. Bacteriol.
186:8356-62; Heinrichs et al. (1999) J.
Bacteriol. 181:1436-1443）と共に、ＦｈｕＣ（前記のＡＴＰａｓｅとして）が、スタフィロバクチンの輸送に関与していることを示している。前記の輸送アッセイの１０分間という時間枠では観察されなかったが、我々は、プラスミドｐＦｈｕＣによる相補性と比較して、ｐＦｈｕＣＢＧにより相補されたＨ１０７１によりスタフィロバクチンの利用についての４８時間継続プレート  バイオアッセイにおいて、より小さな成長ゾーンを再現性よく観察した。
【０２２０】
我々は、この観察を、前者におけるＦｈｕＢ及びＦｈｕＧタンパク質の発現が、ＦｈｕＣをＦｈｕＣＢＧ膜複合体に隔離し、ＳｉｒＡＢＣとＦｈｕＣとの間の起こりうる相互作用の可能性を減らし、そして、それゆえ鉄（ＩＩＩ）−スタフィロバクチンを輸送する能力を減らしてしまう可能性に起因すると考える。しかしながら、我々は、ｐＦｈｕＣＢＧにより相補された前記の株における、前記の減少したスタフィロバクチンの利用が、ｐＦｈｕＣにより相補された前記の菌株に比べて、この構築物からのＦｈｕＣのより乏しい発現に起因しているという比較的少ない可能性を除外することができない。両方の構築物からのＦｈｕＣの発現は、同一の上流配列により支配され、そして前記の株が同一条件下で生育した場合、ＦｈｕＣの発現が、明白に両方の構築物から同等であったことが事実らしい。
【０２２１】
実施例１１：ＦｈｕＣは、補足的な鉄輸送体と相互に作用する。
我々は、以前にＳ．  ａｕｒｅｕｓ  ｓｉｒＡ突然変異株が、スタフィロバクチンを輸送できないこと（Dale et al. (2004) J. Bacteriol. 186:8356-62）、及びこの突然変異株が鉄欠失成長の表現型を表すことを示した。しかしながら、Ｈ１０７１におけるｆｈｕＣの欠失（Ｈ１０７１は、ｆｈｕＣＢＧについて消されるが、プラスミドｐＦｈｕＣが前記の株における前記の成長欠陥を補足することを呼び起こす。）は、ｓｉｒＡ又はｓｉｒＢ突然変異株よりも鉄不足への反応において弱められた成長欠陥を生ずる（Dale et al. (2004) J. Bacteriol. 186:8356-62）。確かに、鉄取り込みの突然変異株の成長を可能にするに十分な汚染された鉄を含む、たとえば、ＴＭＳのような鉄が制限された培地を我々が使用すること、及び代謝されない鉄キレート剤である２，２‘−ジピリジルの濃度を増やす能力は、様々な異なる鉄輸送体の寄与を分割するための機会を我々に提供する。ＴＭＳに２，２‘−ジピリジル５０μＭを添加すると、野性型に比べて、Ｈ１０７１の成長が減少し、これに対して、ＴＭＳ中の２，２‘−ジピリジルの濃度が１００μＭ以上である場合、Ｈ３０６（ＲＮ６３９０  ｓｉｒＡ：：Ｋｍ）及びＨ４７４（ＲＮ６３９０  ｓｉｒＢ：：Ｔｅｔ）のみが、同等な成長の減少を示した（Dale et al. (2004) J. Bacteriol. 186:8356-62）。以前の記載された結果と共に、これらの観察から、スタフィロバクチンを輸送するために、ＦｈｕＣがＳｉｒＡＢＣと相互に作用することばかりでなく、ＦｈｕＣが、今のところまだ決定されていない鉄キレートの輸送を許す補足的な輸送体ともまた相互に作用することが示唆される。ＦｈｕＣが前記の輸送に関与することができる補足的な鉄キレートを決定するための試みにおいて、エンテロバクチン、クエン酸鉄（ＩＩＩ）、へミン及びヘモグロビンを含む、可能性のある鉄の供給源の範囲を使用して、Ｈ１０７１によるプレート  バイオアッセイを利用した。これらの条件下で、Ｈ１０７１は、これらの追加の鉄の供給源のいずれの利用においても際立って害されなかった（データは示されていない）。
【０２２２】
これらの結果に基づくと、ＦｈｕＣが、鉄（ＩＩＩ）−ヒドロキサム酸錯体  シドロフォア及び今のところ構造的に特徴付けられていないスタフィロバクチン  シデロフォアの輸送のために必要とされることは、明らかである。、前記のデータは、また、ＦｈｕＣが、おそらく補足的な鉄取り込みシステム（すなわち、ｆｈｕ及びｓｉｒをエンコードするシステムに加えて）の輸送に関与しているという結論を支持する。このことは、前記のΔｆｈｕＣＢＧ突然変異株により示された、前記の鉄が制限された成長欠陥が、鉄の濃度が低い条件下における成長の間における、ｓｉｒＡ又はｓｉｒＢ突然変異株の何れか一方のそれよりも厳しいという観察に基づいている。目下、ｆｈｕＣの欠失により影響される前記の補足的な経路の正体は不明であるが、前記のｆｈｕＣＢＧ突然変異株は、バイオアッセイにおいて、ＲＮ６３９０と同等のレベルで、へミン、ヘモグロビン、クエン酸鉄及び前記のカテコール  シデロフォア  エンテロバクチンをやはり利用できた。このことは、ｆｈｕＣの欠失は、これらの供給源から鉄を獲得する、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓの能力に影響しないことを立証した。これらの輸送体と遺伝子的にリンクしていない、ＡＴＰａｓｅ構成成分を供給するために、ＦｈｕＣが、ＩｓｄＥＦ又はＳＡ１９７７−１９７９の一方又は両者と相互に作用することを推測するように誘われる。前記のｉｓｄ遺伝子座によりエンコードされたタンパク質は、宿主の鉄複合体（Mack et al. (2004) Biochem. Biophys. Res. Commun.
320:781-8; Mazmanian et al. (2003) Science 299:906-9; Skaar and Schneewind.
(2004) Microbes Infect. 6:390-7）及び鉄が制限された成長欠陥を立証するために使用された、前記のＴＭＳ実験室用培地中に存在しなかった複合体との相互作用に関わった。それゆえ、Ｈ１０７１は、野性型に比べて、ヘム又はヘモグロビンの取り込みにおいて損なわれないということを発見したことは、驚くべきことではない。ＳＡ１９７７−１９７９を取り囲む遺伝子領域は、推定上の産生物がシデロフォア  生合成酵素との類似性を共有する、いくつかのオープンリーディングフレームを含み、そして、それゆえ、Ｈ１０７１におけるＦｈｕＣの欠失が、もう一つのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  シデロフォアの産生にはこの遺伝子座の中での遺伝子の発現を必要とする、もう一つのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  シデロフォアの利用を終わらせることは事実かもしれない。
【０２２３】
実施例１２：ΔｆｈｕＣＢＧ：：ｅｒｍＢ突然変異株は、マウス腎臓膿瘍モデルにおける変更された病原性プロファイルを示す。
我々は、以前に、シデロフォア生合成が、マウス腎臓膿瘍モデルにおけるＳ．  ａｕｒｅｕｓの毒性のためには重要であることを示した（Dale et al. (2004) Infect. Immun. 72:29-37）。我々は、Ｈ１０７１（ＲＮ６３９０  ΔｆｈｕＣＢＧ：：ｅｒｍＢ）が、スタフィロバクチン取り込みのために屈従させられたことを示したので、我々は、この突然変異株が、また、このモデルシステムにおいて弱められるかどうか決定することに興味をもった。７匹のＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスからなるグループに、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ又はＨ１０７４（Ｎｅｗｍａｎ  ΔｆｈｕＣＢＧ：：ｅｒｍＢ）１０７ＣＦＵを前記のマウスの尾静脈を経由して接種し、そしてそのマウスを、グルーミング癖及び運動機能について毎日観察した。毎日、前記のマウス毎に、それらの相対的な健康状態を反映する主観的なスコアをつけた。たとえば、スコア１をつけられたマウスは、グルーミング癖及び運動機能について正常であり、これに対し、スコア４をつけられたマウスは、完全に死にかけていた。前記の実験の終了点（Ｎｅｗｍａｎを感染された一匹のマウスが第６日目に死亡した。）以前の死を説明するため、我々は、最終の臨床スコアに達するまでに生存していた日数で臨床スコアを割った。Ｈ１０７４を注射されたマウスは、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎを注射されたマウスよりも暗示的に死にかけていなかった（図５、それぞれ１．８対して２．７であり、完全に健康なマウスの臨床スコアは、１．４であった。）。第７日目、マウスを犠牲にし、そして腎臓を採取し、そして膿瘍の形成を評価した。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎを注射したマウスから採取された１４個の腎臓中、８個の腎臓に膿瘍が形成された（５７％）が、これに対してＨ１０７４を注射したマウスから除去された１４個の腎臓中、２個の腎臓のみに膿瘍の形成（１４％）が視認できた。これらの結果について、Ｚ−Ｔｅｓｔ及びＦｉｓｈｅｒ’ｓ  Ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔを使用して、非常に有意であること（ｐ＜０．０００１）が示された。しかしながら、興味深いことに、全細菌数をカウントするために腎臓ホモジェネートをプレート上に置いたとき、Ｎｅｗｍａｎ又はＨ１０７４を注射されたマウスの間で、腎臓における細菌ロードにおいて有意差はなかった（データは示されていない）。
【０２２４】
これらの結果から、野性株に比べて、前記の突然変異株Ｈ１０７４が、前記の腎臓における細菌ロードが減少することなく、腎臓膿瘍を引き起こすことにおいて極めてより低いし、そして体重の減少がより少ないので、Ｎｅｗｍａｎ親株に比べて、Ｎｅｗｍａｎ  ΔｆｈｕＣＢＧ：：ｅｒｍＢ株の病原性が変化したことが立証された。これらの結果から、ＦｈｕＣＢＧを発現するための潜在能力がないことが（前記のｆｈｕ遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏにおける発現は、今までのところでは立証されていなかったが、それらのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける鉄により制御された発現プロファイルに基づいて推定される。）、ｉｎ  ｖｉｖｏで生存するための細菌の能力に影響を与えないが、より重篤な感染症を引き起こす潜在能力を減じたようであることが示された。これらの結果は、Ｎｅｗｍａｎ  ｓｂｎＥ：：Ｋｍ突然変異株（スタフィロバクチン  シデロフォアを産生することができない）感染後第６日目における腎臓における細菌数が減少したという以前の結果とは対照的である。少なくともこのモデルシステムにおいて、ＦｈｕＣＢＧの発現が、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓの前記の完全な発病力の潜在能力に必要とされるようであるという事実は、Ｎ３１５及びＭＲＳＡ２５２のゲノムには存在しないＦｈｕＤ１とは対照的に、現在までに配列が決定されたすべてのＳ．  ａｕｒｅｕｓのゲノム（Sebulsky et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:53152-9）内のこのオペロンの保存と一致している。
【０２２５】
実施例１３：相互作用のアッセイ
Ｓｉｒポリペプチド、スタフィロバクチン及び／又はＦｈｕＣの相互作用を妨げる薬剤をスクリーニングするアッセイを、以下の様にして実施するであろう。高タンパク質吸収能を備えた９６ウエルのミクロプレートを、ストレプトアビジンにより一回ＰＢＳバッファー（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ６．８）中で３０μｇ／ｍｌの濃度で、４℃で一夜コーティングするであろう。前記の溶液を除いた後に、前記のプレートを、室温で一時間又はそれより多い時間、ＰＢＳバッファー中で２％ＢＳＡによりブロックするであろう。それから、前記のプレートを洗浄し、そして前記のアッセイに使用するであろう。たとえば、試験薬剤の非存在下又は存在下で、ビオチン化されたＳｉｒＡ及びＳｉｒＢを、室温で４５分間から６０分間、インキュベートするであろう。水で３回洗浄後、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）又は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の何れか一方と結合した第二抗体と混合した抗Ｓｉｒ抗体を添加し、１時間インキュベートするであろう。それから、前記のプレートを遊離した抗体の複合体から、結合した抗体複合体を分離するために洗浄されるであろう。結合した抗体を検出するために、化学発光基質（アルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼ用のＳｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  ｌｕｍｉｎｏｌ溶液（Ｐｉｅｒｃｅより市販））を使用するであろう。ミクロプレート  ルミノメーター（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）を使用して、化学発光シグナルを検出するであろう。前記のシグナルが検出されない場合、試験薬剤がｓｉｒＢに対するｓｉｒＡの結合を阻害又は分断することを示すであろう。同じようなアッセイを、ｓｉｒＡ及びｓｉｒＣ、ｓｉｒＢ及びｓｉｒＣ、及び／又はｓｉｒＡ、ｓｉｒＢ、ｓｉｒＣ、スタフィロバクチン及び／又はＦｈｕＣの相互作用を分断する薬剤を同定するためにも実施してもよい。
【０２２６】
実施例１４：鉄輸送アッセイ
Ｓ．  ａｕｒｅｕｓの鉄輸送システムを分断する薬剤をスクリーニングするためのアッセイを、以下の様にして実施するであろう。野性型Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ細胞及びＳｉｒＡ欠失Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ細胞をｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）（Ｄｉｆｃｏ）で培養するであろう。各株のおよそ１０７コロニー形成単位を、試験薬剤の存在下又は非存在下で、ＦｅＣ１３  ５０μＭを含む、新たに調製したＴＭＳ培地に接種する以前に、細胞を洗浄するであろう。後期静止期になるまで、細菌の成長をクレット・メーター（Ｋｌｅｔｔ  ｍｅｔｅｒ）を使用して観察するであろう。
【０２２７】
ＳｉｒＡ欠失細胞ではない、野性型のＳ．  ａｕｒｅｕｓ細胞の成長速度を変える試験薬剤は、おそらく細胞内の鉄が存在する細胞に対して毒性を示し、そして、それゆえ、鉄を取り込む細胞は、一般に、鉄の取り込みに関して弱められた突然変異株に比べて、この薬剤の毒性効果により高い感受性を示す。
【０２２８】
同様な輸送アッセイを、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ及び／又はＦｈｕＣ−欠失細胞を使用して、ＳｉｒＢ、ＳｉｒＣ及びＦｈｕＣについて実施してもよい。
【０２２９】
実施例１５：発現アッセイ
Ｓ．  ａｕｒｅｕｓのＳｉｒＡの発現を分断する薬剤をスクリーニングするためのアッセイを、以下の様にして実施するであろう。試験薬剤の存在下又は非存在下で野性型Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ細胞を、ｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）（Ｄｉｆｃｏ）中で、一夜培養するであろう。２４時間の培養後、前記の細胞をＰＢＳ（リン酸バッファー食塩水）×１回で洗浄し、それからＳＴＥ（０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ  ８．０］、１ｍＭ  ＥＤＴＡ［ｐＨ８．０］）中でリゾスタフィン（Ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ）１０μｇを使用して３７℃で溶菌した。それから、前記の細胞溶解物を、抗ＳｉｒＡ抗体を予めコーティングしたプレートに移し、そして室温で４５分間から６０分間インキュベートするであろう。対照として、未処理のＳ．  ａｕｒｅｕｓ細胞溶解物を使用するであろう。水で３回洗浄後、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）又は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の何れか一方と結合した第二抗体を添加し、１時間インキュベートするであろう。それから、前記のプレートを、遊離した抗体の複合体から、結合した抗体複合体を分離するために洗浄されであろう。結合した抗体を検出するために、化学発光基質（アルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼ用のＳｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  ｌｕｍｉｎｏｌ溶液（Ｐｉｅｒｃｅより市販））を使用するであろう。ミクロプレート  ルミノメーター（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）を使用して、化学発光シグナルを検出するであろう。試験薬剤で処理された細胞から得られた細胞溶解物の試料において、前記のシグナルが検出されない場合、前記の試験薬剤がｓｉｒＡの発現を阻害することを示すであろう。同じようなアッセイを、ｓｉｒＢ、ｓｉｒＣ、スタフィロバクチン及び／又はＦｈｕＣについても実施するであろう。
【０２３０】
本発明の実施は、他に示されていなければ、当該技術分野の技術者の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の一般に行われている技術を採用するであろう。前記の技術は、文献に記載されている。
たとえば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.,
ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press:
1989);
DNA Cloning, Volumes I and II (D.
N. Glover ed., 1985);
Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984);
Mullis et al.
U.S.
Patent No: 4,683,195;
Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S.
J. Higgins eds. 1984);
Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J.
Higgins eds. 1984);
Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan
R. Liss, Inc., 1987);
Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986);
B.
Perbal, A Practical Guide To Molecular
Cloning (1984);
the
treatise, Methods In Enzymology
(Academic Press, Inc., N.Y.);
Gene Transfer Vectors For Mammalian
Cells
(J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory);
Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.),
Immunochemical Methods In Cell And
Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987);
Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M.
Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986);
Antibodies:
A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. (1987)),
Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)を参照されたい。
【特許文献４１】米国特許第４，６８３，１９５号
【０２３１】
表１：実施例２−５で使用された細菌株及びプラスミド
【表１】
2008510793.tif 000032
2008510793.tif 000033
2008510793.tif 000034
a略語：Cmr, Tetr, Emr, Kmr, Ampr：それぞれ、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、エリスロマイシン、カナマイシン及びアンピシリンに対する耐性を示す。
b制限エンドヌクレアーゼ認識サイトに下線を付した。
1Sebulsky et al.
(2000) J. Bacteriol. 182:4394-4400
2Dale et al. (2004) Infect. Immun. 72:29-37
3Sebulsky et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:49890-900.
4Chakraborty et al. (1992) J. Bacteriol. 174:568-574
5Guerout-Fleury et al. (1995) Gene 167:335-336
6Vaguer et al. (1998) Microbiology 144:3097-3104
【０２３２】
表２：Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ及びその誘導体に対するストレプトニグリン（ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉｎ）及び２，２‘−ジピリジルの最小阻止濃度（ＭＩＣ）
【表２】
2008510793.tif 000035
a細菌をＴＭＳで生育させた。
b決定されていない。
【０２３３】
表３：鉄が制限された培地で生育したNewman及びその誘導体におけるsbn-lacZ
融合タンパク質からのβ−ガラクトシダーゼ活性
【表３】
2008510793.tif 000036
値は、３回、すなわち３回の培養についてのアッセイからの平均値を示す。
【０２３４】
表４：実施例７−１２で使用された細菌菌株及びプラスミド
【表４】
2008510793.tif 000037
a略号：Apr、Cmr、Emr、Kmr、Tetrは、それぞれ、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性を示す。
1Kreiswirth et al. (1983) Nature 305:680-685.
2Peng et al. (1988) J. Bacteriol. 170:4365-4372.
3Duthie and Lorenz (1952)
J. Gen. Microbiol. 6:95-107.
4Sebuskly et al. (2000) J. Bacteriol. 182:4394-4400.
5Sebuskly and Heinrichs
(2001) J. Bacteriol. 183:4994-5000.
6Chakraborty et al. (1992) J. Bacteriol. 174:568-574.
7Guerout-Fleury et al. (1995) Gene 167:335-336.
8Lee (1992) Mol. Microbiol. 6:1515-1522.
9Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning. A
laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor.
【０２３５】
表５：Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ及びＨ１０７４を感染させたマウスの臨床上の特性
【表５】
2008510793.tif 000038
aA/A：両方の腎臓に膿瘍を視認。A/-：片方の腎臓に膿瘍を視認。-/-：どちらの腎臓にも膿瘍が視認されない。
b臨床上のスコアは、全実験過程におけるグルーミング癖及び運動機能に基づいており、マウスの生存日数に対して基準とした。
cマウスは、極端な病的状態のため、第６日目に犠牲にした。
d平均は、平均値±標準誤差である。
【０２３６】
均等物
当業者は、ここに記載した本発明の特定の実施態様に対する均等物を認めるであろうし、又はわずかの決まりきった実験を使用して確認することができるであろう。前記の均等物は、次のクレームにより包含されるように意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０２３７】
【図１】図１は、ｓｂｎ−ｓｉｒＡＢＣ座の遺伝子的組織を示す。ｓｂｎオペロン（ｓｂｎＡ）の第一の遺伝子だけでなく、ｓｉｒオペロンの三つの読み枠（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）が示されている。Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎバックグラウンドにおいて、Ｈ８０３株及びＨ８０４株をそれぞれ発生する、ｓｉｒＡ及びｓｉｒＢをコードする部位を分断するために使用される、前記の挿入部位の位置が示されている。ｓｉｒＢ：：ｔｅｔ及びｓｉｒＡ：：Ｋｍミュテーションの相補性のために使用されたプラスミドｐＳＥＤ４３及びｐＳＥＤ４４が、それぞれ示されている。
【図２】図２は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ及びｆｕｒ：：Ｋｍ誘導体におけるＳｉｒＡの鉄又はＦｕｒにより制御された発現を示す免疫ブロットである。細胞は、鉄が豊富な培地（ＴＳＢ，ＴＭＳ＋Ｆｅ）か又は鉄が制限されたな培地（ＴＭＳ，ＴＭＳ＋Ｄｉｐ）のうちどちらか一方で培養され、光学的濃度により標準化され、そして溶菌された。ＳｉｒＡが、細胞溶解物中でＳｉｒＡを指向するウサギポリクローナル抗血清により検出された。
【図３】図３は、２，２‘−ジピリジル  ２５０μＭ及び５０μＭ  ＦｅＣｌ３  （差し込み図）又は２，２‘−ジピリジル  ２５０μＭを含むＴＭＳ培地中で、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ、対ｓｉｒＡ：：Ｋｍ突然変異株誘導体（Ａ）又はｓｉｒＢ：：Ｔｅｔ突然変異株誘導体（Ｂ）の生育を比較するグラフである。  ■は、Ｎｅｗｍａｎを、  □は、Ｈ８０３（ｓｉｒＡ：：Ｋｍ）を、  ▲は、ｐＡＷ８ベクターを備えたＮｅｗｍａｎを、  rは、ｐＡＷ８を備えたＨ８０３を、  ◆は、ＩＰＴＧを存在させずに生育させた、ｐＳＥＤ４４を備えたＨ８０３を、  ◇は、ＩＰＴＧ  １ｍＭを存在下で生育させた、ｐＳＥＤ４４を備えたＨ８０３を、  ○は、Ｈ８０４（ｓｉｒＢ：：Ｔｅｔ）を、  ▼は、ｐＳＥＤ４３を備えたＨ８０４を示す。データは、３回の実験の代表である。
【図４】図４は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ６３９０のゲノムにおけるｆｈｕＣＢＧの対立遺伝子の置換を示す模式図である。ｆｈｕＣＢＧ、ｆｈｕＣ‘及び’ｆｈｕＧのフランキング領域を、ＲＮ６３９０染色体から増幅し、ｅｒｍＢの何れか一方の端に結合し、温度感受性シャトルベクターｐＡＵＬ−Ａ−Ｋｍにクローンした。この構築物は、相同的組換えにより、ＲＮ４２２０ゲノムにおけるｅｒｍＢによるｆｈｕＣＢＧの置換を可能にする。ファージ形質導入は、菌株Ｈ１０７１及びＨ１０７４のそれぞれを構築するために、前記のＲＮ６３９０及びＮｅｗｍａｎバックグラウンドへ、前記の突然変異株を動員するために使用された。適切なＤＮＡフラグメントのサイズが示されている。
【図５】図５は、２，２’−ジピリジル  ５０μＭを含むＴＭＳ培地で生育したＳ．  ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ６３９０及びＨ１０７１誘導体における、５５Ｆｅ−スタフィロバクチンにより仲介される鉄輸送を示すグラフである。  ●，ＲＮ６３９０；  ○，Ｈ１０７１＋ｐＦｈｕＣ；  q，Ｈ１０７１＋ｐＦｈｕＣＢＧ，  ＲＮ６３９０（s），  Ｈ１０７１＋ｐＦｈｕＣ（■）及びＨ１０７１＋ｐＦｈｕＣＢＧ（□）は、すべてアッセイに先立ち、１５分間ＫＣＮ  ２０ｍＭで処理した。  差し込み図：プラスミドを補足しないと、菌株Ｈ１０７１は、２，２’−ジピリジルの存在下ではよく生育しないので、２，２’−ジピリジルを含まないＴＭＳ培地中で実施されたアッセイに先立ち、菌株（◆，ＲＮ６３９０；◇，Ｈ１０７１）を生育させた。しかしながら、ＲＮ６３９０は、２，２’−ジピリジル  ５０μＭの存在下で生育した場合と、この実験における鉄が不足した条件下とは同様ではない。実験の終了点では、アッセイ混合物から２×１０８細胞により輸送された５５Ｆｅのピコモル（ｐｍｏｌ）を示す。
【図６】図６は、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＦ０７９５１８  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に対応するＳｉｒＡＢＣオペロン核酸配列及びその逆相補性（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を示す。
【図７】図７は、（Ａ）前記の核酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、（Ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の逆相補性（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）及び（Ｃ）ＳｉｒＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）のアミノ酸配列を示す。
【図８】図８は、（Ａ）前記の核酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、（Ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の前記の逆相補性（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）及び（Ｃ）前記のＳｉｒＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）のアミノ酸配列を示す。
【図９】図９は、（Ａ）前記の核酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、（Ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の前記の逆相補性（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）及び（Ｃ）ＳｉｒＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）の前記のアミノ酸配列を示す。
【図１０】図１０は、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＦ２５１２１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）に相当するＦｈｕＣＢＧオペロンの核酸及び前記の逆相補性（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）を示す。
【図１１】図１１は、（Ａ）前記の核酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、（Ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の前記の逆相補性（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）及び（Ｃ）ＦｈｕＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）の前記のアミノ酸配列を示す。
【国際調査報告】
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