(57)【要約】本発明はイガイ由来バイオ接着剤に関するものである。特に、本発明は本新規のＭＧＦＰ−５（Ｍｙｔｉｌｕｓ ｇａｌｌｏｐｒｏｖｉｎｃｉａｌｉｓ ｆｏｏｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−５）蛋白質及びＭＧＦＰ−５とＦＰ（Ｆｏｏｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）−１間の組換え蛋白質に関するものであって、本発明によって接着活性を有する接着蛋白質を経済的に量産して、化学接着剤の代用として使用することができる。【選択図】図２２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６のアミノ酸配列を有する接着蛋白質。
【請求項２】
前記接着蛋白質はカルボキシ末端及び/またはアミノ酸末端に連結された接着蛋白質の物理化学的特性を向上させるペプチドをさらに含む、請求項１に記載の接着蛋白質。
【請求項３】
前記物理化学的特性は溶解度、接着力、架橋度並びに蛋白質の発現、精製及び回収率増強からなる群より選択される、請求項２に記載の接着蛋白質。
【請求項４】
前記ペプチドは接着蛋白質由来である、請求項２に記載の接着蛋白質。
【請求項５】
前記接着蛋白質はイガイ由来の接着蛋白質である、請求項４に記載の接着蛋白質。
【請求項６】
前記ペプチドは配列番号２５に記載されたアミノ酸配列が１〜１０回連続して連結されるものである、請求項２に記載の接着蛋白質。
【請求項７】
前記接着蛋白質は配列番号１０に記載されたアミノ酸配列、配列番号１２に記載されたアミノ酸配列及び配列番号１４に記載されたアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の接着蛋白質。
【請求項８】
前記ペプチドは６個のヒスチジン残基を含むものである、請求項２に記載の接着蛋白質。
【請求項９】
前記接着蛋白質は配列番号１６に記載されたアミノ酸配列、配列番号１８に記載されたアミノ酸配列、配列番号２０に記載されたアミノ酸配列及び配列番号２２に記載されたアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むものである、請求項８に記載の接着蛋白質。
【請求項１０】
請求項１に記載の接着蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記接着蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列は配列番号５に記載されたヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号６に記載されたアミノ酸配列で構成された接着蛋白質のカルボキシ末端及び/またはアミノ酸末端に連結された接着蛋白質の物理化学的特性を向上させるペプチドを含む請求項２に記載の接着蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記ペプチドは配列番号２５に記載されたアミノ酸配列が１〜１０回連続して連結されるものである、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記ペプチドをコーディングするヌクレオチド配列は配列番号２６〜３１からなる群より選択されたヌクレオチド配列が１〜１０回連続して連結されるものである、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドは配列番号９に記載されたヌクレオチド配列、配列番号１１に記載されたヌクレオチド配列及び配列番号１３に記載されたヌクレオチド配列からなる群より選択されるものである、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項８に記載の接着蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記接着蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列は配列番号１５に記載されたヌクレオチド配列、配列番号１７に記載されたヌクレオチド配列、配列番号１９に記載されたヌクレオチド配列及び配列番号２１に記載されたヌクレオチド配列からなる群より選択されるものである、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の接着蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列を発現可能に含むベクター。
【請求項１９】
前記接着蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列は配列番号５に記載されたヌクレオチド配列、配列番号９に記載されたヌクレオチド配列、配列番号１１に記載されたヌクレオチド配列、配列番号１３に記載されたヌクレオチド配列、配列番号１５に記載されたヌクレオチド配列、配列番号１７に記載されたヌクレオチド配列、配列番号１９に記載されたヌクレオチド配列及び配列番号２１に記載されたヌクレオチド配列からなる群より選択されるものである、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
前記ベクターはｐＭＤＧ０５（ＫＣＴＣ １０２９１ＢＰ）またはｐＥＮＧ１５１（ＫＣＴＣ １０７６６ＢＰ）である、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２１】
請求項１８に記載のベクターで形質転換された形質転換体であって、
前記形質転換体は原核生物、真核生物及び真核生物由来細胞からなる群より選択されるものである形質転換体。
【請求項２２】
前記原核生物はＥ.ｃｏｌｉまたはＢａｃｉｌｌｕｓ属菌株である、請求項２１に記載の形質転換体。
【請求項２３】
前記真核生物は酵母、昆虫、植物及び動物からなる群より選択されるものである、請求項２１に記載の形質転換体。
【請求項２４】
前記真核生物由来細胞は植物細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞からなる群より選択されるものである、請求項２１に記載の形質転換体。
【請求項２５】
（ａ）請求項１に記載の接着蛋白質をコーディングするヌクレオチドを発現可能に含むベクターを製造する段階と；
（ｂ）前記ベクターを宿主細胞に形質転換して形質転換体を製造する段階と；
（ｃ）前記形質転換体を培養して組換え接着蛋白質を生産する段階とを含む接着蛋白質の生産方法。
【請求項２６】
前記接着蛋白質はカルボキシ末端及び/またはアミノ酸末端に連結された接着蛋白質の物理化学的特性を向上させるペプチドをさらに含む、請求項２５に記載の接着蛋白質の生産方法。
【請求項２７】
前記物理化学的特性は溶解度、接着力、架橋度、蛋白質の発現、精製及び回収率増強からなる群より選択される、請求項２６に記載の接着蛋白質の生産方法。
【請求項２８】
前記ペプチドは接着蛋白質由来である、請求項２６に記載の接着蛋白質の生産方法。
【請求項２９】
前記接着蛋白質はイガイ接着蛋白質由来である、請求項２８に記載の接着蛋白質の生産方法。
【請求項３０】
前記ペプチドは配列番号２５に記載されたアミノ酸配列が１〜１０回連続して連結されるものである、請求項２６に記載の接着蛋白質の生産方法。
【請求項３１】
前記接着蛋白質は配列番号１０に記載されたアミノ酸配列、配列番号１２に記載されたアミノ酸配列及び配列番号１４に記載されたアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の接着蛋白質の生産方法。
【請求項３２】
前記ペプチドは６個のヒスチジン残基からなるものである、請求項２６に記載の接着蛋白質の生産方法。
【請求項３３】
前記接着蛋白質は配列番号１６に記載されたアミノ酸配列、配列番号１８に記載されたアミノ酸配列、配列番号２０に記載されたアミノ酸配列及び配列番号２２に記載されたアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の接着蛋白質の生産方法。
【請求項３４】
（ａ）請求項２１に記載の形質転換体を破砕した後、遠心分離して上層液及びペレットをそれぞれ分離する段階と；
（ｂ）前記ペレットに酸性有機溶媒を加えた後、懸濁させて懸濁液を製造する段階と；
（ｃ）前記懸濁液を遠心分離して上層液を分離する段階とを含む接着蛋白質の精製方法。
【請求項３５】
前記酸性有機溶媒はｐＨ３〜６を有する有機溶媒である、請求項３４に記載の接着蛋白質の精製方法。
【請求項３６】
前記酸性有機溶媒は酢酸、クエン酸及び乳酸からなる群より１種以上選択されるものである、請求項３４に記載の接着蛋白質の精製方法。
【請求項３７】
前記酢酸は５〜３０（ｖ/ｖ）％の水溶液で使用される、請求項３６に記載の接着蛋白質の精製方法。
【請求項３８】
前記（ｃ）の上層液に対しゲルろ過クロマトグラフィーをさらに実施する、請求項３４に記載の接着蛋白質の精製方法。
【請求項３９】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の接着蛋白質を有効性分として含む接着剤。
【請求項４０】
前記接着蛋白質を構成するチロシン残基総数の５〜１００％が３，４−ジヒドロキシフェニル−Ｌ−アラニン（ＤＯＰＡ）に変更されたものである、請求項３９に記載の接着剤。
【請求項４１】
前記接着剤はプラスチック、ガラス、金属、真核生物の細胞、原核生物の細胞、植物細胞の細胞壁及び脂質からなる群より選択された基質に接着されるものである、請求項３９に記載の接着剤。
【請求項４２】
前記接着剤は生物試料に適用されるものである、請求項３９に記載の接着剤。
【請求項４３】
前記接着剤は界面活性剤、酸化剤及び充填剤からなる群より選択された１種以上の物質をさらに含む請求項３９に記載の接着剤。
【請求項４４】
前記界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウムまたはドデシルベンゼン硫酸ナトリウムである、請求項４３に記載の接着剤。
【請求項４５】
前記酸化剤はチロシナーゼまたはＨ２Ｏ２である、請求項４３に記載の接着剤。
【請求項４６】
前記充填剤はコラーゲン、ヒアルロン酸、コンドロイタンスルフェート、エラスチン、ラミニン、カゼイン、ヒドロキシアパタイト及びアルブミン、フィブロネクチン及びヒブリンからなる群より選択される、請求項４３に記載の接着剤。
【請求項４７】
前記接着剤は水中環境において使用される基質に適用されるものである、請求項３９に記載の接着剤。
【請求項４８】
請求項３９に記載の接着剤の接着力の調節方法であって、
酸化剤、充填剤及び界面活性剤からなる群より１種以上選択した物質で処理する段階、または前記接着剤の有効成分である接着蛋白質の濃度を調節する段階を含む接着力の調節方法。
【請求項４９】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の接着蛋白質を有効性分として含むコーティング剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はイガイ由来のバイオ接着剤に関し、より詳しくは新規のＭＧＦＰ−５（Ｍｙｔｉｌｕｓ ｇａｌｌｏｐｒｏｖｉｎｃｉａｌｉｓ ｆｏｏｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−５）蛋白質及びＭＧＦＰ−５とＦＰ（Ｆｏｏｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）−１間の組換え蛋白質に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
イガイは特別な非水溶性接着剤を生産及び分泌するので、効果的な耐水性バイオ接着剤の潜在的原料として研究されている。イガイは足から延び出す足糸で水中表面に固く付着する。各足糸の端部には耐水性接着剤を含んでいて、接着プラーク（ｐｌａｑｕｅ）で濡れた固体表面に固定できる（非特許文献１）。このような強力で柔軟な耐水性接着剤はバイオテクノロジー分野における潜在的利用の可能性が注目されている。イガイ由来接着蛋白質はまた、人体に無害で免疫反応を起こさないので、医薬用途の接着剤として使用することができる（非特許文献２）。さらに、前記イガイ由来接着蛋白質は生分解できるので、環境親和的な長所も持っている。
【０００３】
足糸は近部位と遠部位に区分することができる。近部位はイガイ足の幹腺（ｓｔｅｍ ｇｌａｎｄ）に連結されており、遠部位は接着プラークに連結されている。前記接着プラークは５種の蛋白質、つまり、ＦＰ（ｆｏｏｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）−１乃至ＦＰ−５からなっている（非特許文献３）。
【０００４】
イガイ接着蛋白質のほとんどはチロシン残基の水酸化過程から誘導された３，４−ジヒドロキシフェニル−Ｌ−アラニン（ＤＯＰＡ）を高い比率で含んでおり（非特許文献４）、付着面に隣接した接着蛋白質でＤＯＰＡ残基の含有率が最も高い（非特許文献５）。これとは対照的に、ＤＯＰＡ残基のないイガイ接着蛋白質類似体は接着性が顕著に減少することが認められる （非特許文献６）。また、ＤＯＰＡ残基は酸化過程を経て転換されたドーパキノン（Ｄｏｐａ ｏ−ｑｕｉｎｏｎｅ）と接着蛋白質間の架橋化を誘導すると確認されたことがある。つまり、イガイ接着蛋白質のＤＯＰＡ含有率は接着特性と密接な関連性がある。
【０００５】
現在、イガイから抽出した接着蛋白質産物であるセル−タック（Ｃｅｌｌ−Ｔａｋ）が商業的に市販されている。前記接着剤は主にＦＰ−１及びＦＰ−２蛋白質からなっており、少量のＦＰ−３が含まれている。しかし、これらの抽出過程は１ｍｇの蛋白質を抽出するのに１０，０００個のイガイが使用される労働集約的で、非効率的な方法である（非特許文献７）。
【０００６】
これに、大腸菌や酵母のような発現システムを通じて組換えイガイ蛋白質、例えばＦＰ−１を生産するための研究が行われている。しかし、イガイ接着蛋白質は非常に偏よったアミノ酸の組成を有し、例えば、ＦＰ−１の場合、全アミノ酸の中で８９％が５種のアミノ酸からなっている。また、イガイとその他の発現システム間のコドン利用（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）の差（ｔＲＮＡ利用問題点）及び低い蛋白質収率のような多くの問題によって機能的で経済的なイガイ接着蛋白質の生産が難しいのが実情である（特許文献１，非特許文献８〜１０）。
【特許文献１】米国特許第5242808号明細書
【非特許文献１】Waite, J. H., Biology Review. 58: 209-231 (1983)
【非特許文献２】Dove et al., Journal of American Dental Association. 112: 879 (1986)
【非特許文献３】Deming, T. J., Current Opinion in Chemical Biology. 3: 100-105 (1999)
【非特許文献４】Waite, J. H., Biology Review. 58: 209-231 (1983)
【非特許文献５】Waite, J. H., Integr. Comp. Biol. 42: 1172-1180 (2002)
【非特許文献６】Yu et al., Journal of American Chemical Society. 121: 5825-5826 (1999)
【非特許文献７】Morgan, D., The Scientist. 4: 1-6 (1990)
【非特許文献８】Filpula et al., Biotechnol. Prog. 6: 171-177 (1990)
【非特許文献９】Salerno et al., Applied Microbiology and Biotechnology 58: 209-214 (1993)
【非特許文献１０】Kitamura et al., Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry, 37:729-736 (1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前記従来の技術の問題点を解決するために案出されたものであって、本発明は、イガイから分離した新規の接着蛋白質遺伝子を提供することを目的とする。
【０００８】
また、本発明は新規のイガイ接着蛋白質を提供することを目的とする。
【０００９】
また、本発明はイガイ接着蛋白質を生物学的活性を持つ状態で量産できる方法を提供することを目的とする。
【００１０】
また、本発明は２種以上のイガイ接着蛋白質を融合させた組換え接着蛋白質を提供することを目的とする。
【００１１】
また、本発明は新規の接着蛋白質を有効性分として含む接着剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明はムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis）から抽出した新規の接着蛋白質及び前記蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列を提供する。前記接着蛋白質は、好ましくは配列番号６に記載されたアミノ酸配列を含む。前記ヌクレオチド配列の一例は配列番号５に記載されたヌクレオチド配列である。
【００１３】
また、本発明はイガイ接着蛋白質のカルボキシ末端及び/またはアミノ酸末端にＦＰ−１から由来した一部アミノ酸配列が連結された組換え接着蛋白質及び前記組換え接着蛋白質をコーディングするポリヌクレオチドを提供する。前記組換え接着蛋白質の一例は配列番号１０に記載されたアミノ酸配列、配列番号１２に記載されたアミノ酸配列、配列番号１４に記載されたアミノ酸配列、配列番号１８に記載されたアミノ酸配列、配列番号２０に記載されたアミノ酸配列及び配列番号２２に記載されたアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列である。前記組換え接着蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列の一例でとしては、配列番号９に記載されたヌクレオチド配列、配列番号１１に記載されたヌクレオチド配列、配列番号１３に記載されたヌクレオチド配列、配列番号１７に記載されたヌクレオチド配列、配列番号１９に記載されたヌクレオチド配列及び配列番号２１に記載されたヌクレオチド配列がある。
【００１４】
また、本発明は接着蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列を発現可能に含むベクターを提供する。
【００１５】
また、本発明は接着蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列を発現可能に含む形質転換体を提供する。
【００１６】
また、本発明は（ａ）接着蛋白質をコーディングする遺伝子を発現可能に含むベクターを製造する段階と；（ｂ）前記ベクターを宿主細胞に形質転換して形質転換体を製造する段階と；（ｃ）前記形質転換体を培養して組換え接着蛋白質を生産する段階を含む接着蛋白質の生産方法を提供する。
【００１７】
また、本発明は（ａ）形質転換体を破砕した後、遠心分離して上層液及びペレットをそれぞれ分離する段階と；（ｂ）前記ペレットに酸性有機溶媒を加えた後、懸濁させて懸濁液を製造する段階と；（ｃ）前記懸濁液を遠心分離して上層液を分離する段階を含む接着蛋白質の精製方法を提供する。
【００１８】
また、本発明は接着蛋白質を有効性分として含む接着剤を提供する。
【００１９】
また、本発明は、接着剤に酸化剤、充填剤及び界面活性剤からなる群より１種以上選択した物質を処理する段階、または前記接着剤の有効成分である接着蛋白質の濃度を調節する段階を含む、接着剤の接着力の調節方法を提供する。
【００２０】
また、本発明は接着蛋白質を有効性分として含むコーティング剤を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明者らはイガイの一種類であるムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis）から新規な接着蛋白質及び、これをコーディングする遺伝子を獲得し、これから翻訳される接着蛋白質を生産するシステムを確立した。また、２種以上のイガイ接着蛋白質が融合された組換え蛋白質及びその生産システムを確立した。
【００２２】
本発明の接着蛋白質は多様な基質、例えば、ガラス、金属、高分子樹脂、プラスチックまたは生物の細胞膜、例えば原核生物の細胞膜、真核生物の細胞膜、植物の細胞壁及び脂質に付着特性を有する蛋白質である。
【００２３】
本発明による接着蛋白質は、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも５０％、より好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を有し、同時に付着性、例えば配列番号６のアミノ酸配列が有する付着性と類似していたりまたは前記に比べて７０〜２００％の付着活性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。一例としては、配列番号６に記載されたアミノ酸配列を含む蛋白質がある。前記配列番号６に記載されたアミノ酸配列を含む接着蛋白質は以下ではＭＧＦＰ−５（Ｍｙｔｉｌｕｓ ｇａｌｌｏｐｒｏｖｉｎｃｉａｌｉｓ ｆｏｏｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−５）と記載する。
【００２４】
ＭＧＦＰ−５をコーディングする遺伝子はアミノ酸に対するコドン使用によって複数個のヌクレオチド配列で表示することができ、一例としては、配列番号５に記載されたヌクレオチド配列及び配列番号１５に記載されたヌクレオチド配列がある。
【００２５】
また、本発明の接着蛋白質は接着蛋白質の物理化学的特性を向上させるためのペプチドをカルボキシ末端及び/またはアミノ酸末端にさらに含むことができる。前記ペプチドは、例えば、溶解度、接着力、架橋度、蛋白質の発現、精製及び回収率増強などを目的とすることができ、一例として、前記ペプチドは精製増強の目的として、通常のリポーター蛋白質、例えばＧＳＴまたはヒスチジンタグを使用することができる。接着蛋白質の精製のための目的でペプチドがさらに含まれている形態の例としては、配列番号１６に記載されたアミノ酸配列を含む蛋白質がある。
【００２６】
好ましい前記ペプチドは接着蛋白質に由来したアミノ酸配列を含み、さらに好ましくは、イガイ接着蛋白質に由来したアミノ酸配列を含むことができる。具体的な例として、前記ペプチドは配列番号２５のアミノ酸配列が１〜１０回連続して連結された形態であってもよい。本願発明の一実施例では配列番号２５のアミノ酸配列が６回連続された配列番号８を製作して、本願発明の接着蛋白質のアミノ酸末端及び/またはカルボキシ末端に連結させた。前記配列番号２５に記載されたアミノ酸配列はＦＰ−１蛋白質配列の一部である。
【００２７】
前記配列番号２５の配列がさらに連結された組換え接着蛋白質の一例としては、配列番号１０に記載されたアミノ酸配列、配列番号１２に記載されたアミノ酸配列、配列番号１４に記載されたアミノ酸配列がある。前記配列番号１０は配列番号６のアミノ酸配列のアミノ酸末端に配列番号２５の配列が６回連続して連結された形態である。前記配列番号１２は配列番号６のアミノ酸配列のカルボキシ末端に配列番号２５の配列が６回連続して連結された形態である。前記配列番号１４は配列番号６のアミノ酸配列のアミノ酸末端及びカルボキシ末端それぞれに配列番号２５の配列が６回連続して連結された形態である。
【００２８】
また、配列番号１０に記載されたアミノ酸配列、配列番号１２に記載されたアミノ酸配列または配列番号１４に記載されたアミノ酸配列を含む組換え接着蛋白質は、精製を容易にするための目的としてペプチドをさらに含むことができる。前記ペプチドは組換え接着蛋白質のカルボキシ末端及び/またはアミノ酸末端に位置することができ、ペプチドの例としてはＧＳＴまたはヒスチジンタグがある。配列番号１８に記載されたアミノ酸配列、配列番号２０に記載されたアミノ酸配列または配列番号２２に記載されたアミノ酸配列を含む組換え接着蛋白質は配列番号１０に記載されたアミノ酸配列、配列番号１２に記載されたアミノ酸配列または配列番号１４に記載されたアミノ酸配列を含む蛋白質それぞれのアミノ酸末端にヒスチジンタグが含まれている形態である。
【００２９】
また、本発明の組換え接着蛋白質は、接着蛋白質クローニング時に付加的に挿入される１〜１０個のアミノ酸からなるペプチドがアミノ酸末端、カルボキシ末端または異種の蛋白質連結部位にさらに含まれてもよい。
【００３０】
本発明による接着蛋白質及び組換え接着蛋白質は、外部遺伝子を発現できる用途で製作された通常のベクターに発現可能に挿入して、遺伝工学的な方法で量産することができる。前記ベクターは蛋白質を生産するための宿主細胞の種類及び特性によって適切に選択したり、新規に製作することができる。前記ベクターを宿主細胞内に形質転換する方法及び形質転換体から組換え蛋白質を生産する方法は通常の方法で容易に実施することができる。前記ベクターの選択、製作形質転換及び組換え蛋白質の発現などの方法は、本願発明が属する技術分野における当業者であれば容易に実施でき、通常の方法から一部変形したものも本願発明に含まれる。
【００３１】
ベクター内に挿入される接着蛋白質をコーディングする配列は、本発明による接着蛋白質または組換え接着蛋白質をコーディングする配列であり、好ましくは配列番号６配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも５０％、より好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列；配列番号６、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも５０％以上、より好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の相同性を有する蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列の５’末端及び/または３’末端に配列番号２６〜３１からなる群より選択された１種以上の配列が１〜１０回連続して連結された配列及び配列番号６、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４のアミノ酸配列のアミノ酸末端に６個のヒスチジン残基がさらに含まれている蛋白質をコーディングする配列からなる群より選択できる。さらに好ましくは、配列番号５、７、９、１１、１３，１５、１７、１９及び２１からなる群より選択された配列を含むポリヌクレオチドをベクター内に挿入してもよい。
【００３２】
本発明では、一実施例としてＭＧＦＰ−５配列をｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローニングし、配列番号７の配列（配列番号２５のアミノ酸配列が６回反復された６ｘＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫ）はｐＵＣ１８にクローニングした。その後、ＭＧＦＰ−５配列はｐＴｒｃＨｉｓＡベクターにクローニングしてｐＭＤＧ０５ベクター（図４）を製作した。また、下記表１の構成を有する組換え蛋白質を発現するベクター製造のために、ＭＧＦＰ−５配列及び配列番号７の配列をｐＴｒｃＨｉｓＡベクターにクローニングして、ｐＭＤＧ１５０、ｐＭＤＧ０５１及びｐＭＤＧ１５１ベクターをそれぞれ製作した（図７〜９）。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
前記ｐＴｒｃＨｉｓＡベクターはｔｒｃプロモーターを含んでいるので、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を利用して外部蛋白質発現を誘導することができることが知られており、親和クロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を利用した蛋白質分離精製のための６個のヒスチジン配列が外部遺伝子の５’末端の位置に存在して、組換え蛋白質の精製が容易にできるようにした公知のベクターである。本発明ではｐＭＤＧ０５ベクターを大韓民国大田市儒城区魚隱洞に所在している韓国生命工学研究院遺伝子銀行（ＫＣＴＣ）に２００２年６月２０日付で寄託して寄託番号ＫＣＴＣ１０２９１ＢＰを受けており、ｐＥＮＧ１５１ベクターは同寄託機関に２００５年１月１９日付で寄託して寄託番号ＫＣＴＣ１０７６６ＢＰを受けている。
【００３５】
接着蛋白質及び組換え接着蛋白質発現用ベクターは原核生物、真核生物及び真核生物由来細胞からなる群より選択される宿主細胞に形質転換して形質転換体を製造することができる。前記原核生物はＥ.ｃｏｌｉ及びＢａｃｉｌｌｕｓからなる群より選択され、前記真核生物は酵母、昆虫、動物及び植物から選択され、前記真核生物由来細胞は植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞であるが、これらに限定されるわけではない。
【００３６】
一実施例として、Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１にｐＭＥＧ０５、ｐＭＤＧ１５０、ｐＭＤＧ０５１及びｐＭＤＧ１５１ベクターそれぞれを形質転換して、Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ０５、Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ１５０、Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ０５１及びＥ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ１５１を製造した。前記４種の形質転換体は通常のＬＢ培地で培養でき、組換え蛋白質の発現を誘導するためにＩＰＴＧを添加してもよい。好ましい組換え蛋白質の発現方法はＬＢ培地（５ｇ/ｌｉｔｅｒ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、１０ｇ/ｌｉｔｅｒ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、１０ｇ/ｌｉｔｅｒ ＮａＣｌ）で培養し、培養液の吸光度が６００ｎｍで０．６〜０．９である時、ＩＰＴＧを０．１〜１０ｍＭ添加して２時間〜７時間培養する。
【００３７】
前記の方法で発現させた組換え蛋白質は、形質転換体の水溶性形態及び/または非水溶性形態で発現されるので、発現様相に応じてそれぞれ分離及び精製する。水溶性形態で発現される場合、細胞破砕物の上層液を親和性樹脂、例えば、ニッケルレジンが充填されたコラムでクロマトグラフィーを実施して、組換え蛋白質を精製することができる。非水溶性形態で発現される場合には、細胞破砕物の細胞副産物（ペレット）を酸性有機溶媒、好ましくはｐＨ３〜６を有する有機溶媒に懸濁させ懸濁液を製造した後、前記懸濁液を遠心分離し上層液を分離して組換え蛋白質を精製することができる。前記酸性有機溶媒の例としては酢酸、クエン酸及び乳酸があるが、これらに限定されるわけではない。前記酢酸の場合、５〜３０（ｖ/ｖ）％の酢酸を用いることができ、好ましくは２０〜３０（ｖ/ｖ）％の酢酸溶液に細胞副産物（ペレット）を溶解させる。酸性有機溶媒処理で収得した上層液は更に、ゲルろ過クロマトグラフィを実施して組換え蛋白質をさらに精製することができる。
【００３８】
本発明の方法で組換え接着蛋白質ＭＧＦＰ−５は９５％以上の純度で２〜３ｍｇ/Ｌを収得することができ、ＭＧＦＰ−１５１は９５％以上の純度で約５ｍｇ/Ｌを収得することができる。ＭＧＦＰ−５とＭＧＦＰ−１５１はほとんど類似な水準の接着力を示すが、ＭＧＦＰ−５に比べてＭＧＦＰ−１５１の溶解度が顕著に高まって濃縮性に優れた長所がある。特に、ＭＧＦＰ−５は５％の酢酸溶液に約１ｍｇ/ｍＬで溶解するが、ＭＧＦＰ−１５１は水には約１１０ｍｇ/ｍＬで溶解し、５％の酢酸溶液には約２２０ｍｇ/ｍＬで溶解する。接着蛋白質の溶解度は高濃度で濃縮された状態にとどまる能力と直接関係するものであるので、溶解度が高いほど高濃度で簡単に濃縮することができ、産業的に利用する可能性が向上する。つまり、このような観点から、接着蛋白質ＭＧＦＰ−１５１はＭＧＦＰ−５に比べて効用性が高いと言える。
【００３９】
本発明の接着蛋白質及びこれを発現させて収得した組換え接着蛋白質は付着活性を有して接着剤の用途に用いることができる。接着活性は蛋白質のチロシン残基を３，４−ジヒドロキシフェニル−Ｌ−アラニン（ＤＯＰＡ）に変更（modifying）する実験によって確認したことである。したがって、本発明の接着蛋白質は、多様な基質に対する接着剤として使用できるだけでなく、人体に無害であるので生体用接着剤としても使用できる。
【００４０】
また、本発明は接着蛋白質を有効性分として含む接着剤を提供する。前記接着蛋白質は蛋白質中のチロシン残基総数の５〜１００％が３，４−ジヒドロキシフェニル−Ｌ−アラニン（ＤＯＰＡ）に変更（modified）された形態であってもよく、また、前記接着剤は接着蛋白質内チロシン残基を３，４−ジヒドロキシフェニル−Ｌ−アラニン（ＤＯＰＡ）に変更（modifies）できる物質をさらに含んでもよい。前記物質の代表的な例としてはチロシナーゼがあるが、これに限定されるわけではない。
【００４１】
前記接着剤は通常のバイオ接着剤に含まれていたりまたは薬理学的に許容可能な賦形剤を０．５〜９０重量％さらに含むことができる。賦形剤の例としては、界面活性剤、酸化剤及び充填剤があるが、これらに限定されない（参照:米国公開特許公報第２００３−６５０６０号及び米国特許第５，０１５，６７７号）。前記界面活性剤は陽イオン性、陰イオン性、非イオン性、両性界面活性剤等であるが、その例としてはドデシル硫酸ナトリウム及びドデシルベンゼン硫酸ナトリウムがある。前記酸化剤はチロシナーゼ、カテコールオキシダーゼ、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、ビス（スルホスクシニミディル）スベレート、３，３’−ジチオビス（スルホスクシニミディルプロピオネート）、Ｏ２、Ｆｅ３+、Ｈ２Ｏ２及びＩＯ４−からなる群より選択することができ（参照:Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ１９９８、３１、４７３９−４７４５）、前記充填剤はコラーゲン、ヒアルロン酸、コンドロイタンスルフェート、エラスチン、ラミニン、カゼイン、ヒドロキシアパタイト、アルブミン、フィブロネクチン及びヒブリンからなる群より選択できる。
【００４２】
本発明の接着剤は、ガラス、プラスチック、高分子合成樹脂または生物試料を接着したり固定するための用途として用いることができ、具体的な使用法、使用量及び剤形などは、現在市販されているＣｅｌｌ−Ｔａｋ製品（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＴｗｏＯａｋ Ｐａｒｋ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）に準じて使用できる。一例として、本発明の接着剤は可溶性、水溶性、不溶性であってもよく、基質に対して０．０１〜１００μｇ/ｃｍ２で用いることができるが、これに限定されるわけではない。また，使用法は通常の接着剤使用法に準じ、代表的な方法は塗布法である。
【００４３】
前記生物試料は、生物体に属する全ての動物、植物及び前記動物及び植物に由来する部分を全て意味する。一例としては、細胞、組織、器官、ＲＮＡ、ＤＮＡ、蛋白質、ペプチド、ポリヌクレオチド、ホルモン及び化合物があるが、これに限定されるわけではない。
本発明の接着剤の適用例は以下に限定されるわけではないが、（１）水（水または塩分のある水）中にある基質間の接着；（２）骨、靭帯、筋、半月（ｍｅｎｉｓｃｕｓ）及び筋肉の治療及び人工材料移植のような整形外科的治療；（３）穿孔、裂傷、切開などの治療並びに角膜移植、人工角膜挿入のような眼科的接合；（４）補正装置、架橋義歯、歯冠装着、緩んだ歯の固定、壊れた歯の治療及び充填剤固定のような歯科的接合；（５）血管接合、細胞組織接合、人工材料移植、傷縫合のような外科的治療；（６）植物の移植片接合、傷治癒のような植物での接合；（７）薬品、ホルモン、生物学的因子、医薬物、生理的または代謝的観察装置、抗生剤及び細胞の移植のような用途がある（参照:米国特許第５，０１５，６７７号）。
【００４４】
また，本発明は接着剤に界面活性剤、酸化剤及び充填剤からなる群より選択された物質が処理したり、または前記接着剤の有効成分である接着蛋白質の濃度を調節することによって、前記接着剤の接着力を調節する方法を提供する（参照:米国特許第５，０１５，６７７号）。前記酸化剤、界面活性剤及び充填剤は上述したものと同様である。
【００４５】
本発明はまた、前記接着蛋白質を有効性分として含むコーティング剤を提供する。本発明の接着蛋白質はガラス、プラスチック、高分子合成樹脂または生物試料に接着する特性があって、前記基質に対するコーティング剤として使用できるだけでなく、特に耐水性及び防水性を有するので、水中環境において使用される基質の表面に塗布して基質の酸化を防止することができる。コーティング剤の適用例としては、船舶のモータ部分のプロペラに塗布して腐食を防止する用途があるが、これに限定されるわけではない。前記コーティング剤は接着蛋白質のみの単独使用でもよいが、その他の公知の接着剤、本発明の接着蛋白質以外の接着蛋白質、公知のコーティング剤に含まれている樹脂、有機溶媒、界面活性剤、腐蝕防止剤または色素などをさらに含んでもよい。付加的に含む成分の含量は、成分の種類やコーティング剤の剤形によって通常許容される範囲内で適切に調節することができる。付加的な成分が含まれる場合、有効成分である接着蛋白質はコーティング剤内に接着活性を維持できる含量で含まれ、例えば、コーティング剤に０．１〜８０重量％含まれることができる。
【００４６】
本発明のコーティング剤はクリーム状、エアーゾル状（噴霧型）、固体状、液状及び乳剤に製造することができるが、前記剤形に限られない。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明の実施例を記載する。下記の実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明が下記の実施例に限定されるわけではない。
以下では、ＭＧＦＰ−５遺伝子をクローニングするためのイガイとしてムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis）を用いた。
【００４８】
［実施例１:ＭＧＦＰ−５遺伝子のクローニング］
ＭＧＦＰ−５をクローニングするために、配列番号１のプライマー（５'−ｇｇｃｃｔｇｃａｇｃａｇｔｔｃｔｇａａｇａａｔａｃａａｇｇｇ−３）と配列番号２のプライマー（ｇｔａｇａｔｃｔａｔａｃｇｃｃｇｇａｃｃａｇｔｇａａｃａｇ）をそれぞれ合成した。イガイｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを３０回実施して、２４３ｂｐ大きさのＰＣＲ産物を収得した（図１）。前記ＰＣＲ産物はｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ）にクローニングした。
【００４９】
ＭＧＦＰ−５の上流のシグナル配列を収得するために、イガイ（ムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis））ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲを実施した。プライマーはｃＤＮＡライブラリーに用いたＺＡＰベクターのＴ３プロモータープライマー（配列番号３２）と配列番号３のプライマー（５'−ｃｔｔｇｔａｔｔｔｔｃｃｇｃｔｇｔｔｔｔｔ−３'）を使用した。ＰＣＲを通じて約３００ｂｐの増幅産物を収得し、これをｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローニングした。
【００５０】
ＭＧＦＰ−５のＣ末端のポリ−Ａ部位をクローニングするために、配列番号４（５'−ａａａａａｃａｇｃｇｇａａａａｔａｃａａｇ−３'）及びＴ７プロモータープライマー（配列番号３３）を利用してネステッドＰＣＲを実施した。３５０ｂｐの増幅産物はｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローニングした。
【００５１】
前記で収得したＭＧＦＰ−５ ｃＤＮＡの塩基配列を分析して、ＭＧＦＰ−５遺伝子の分泌シグナル配列（ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を除いた配列は配列番号５に、これからコーディングされるアミノ酸配列は配列番号６に示した。
【００５２】
［実施例２:ＭＧＦＰ−５の遺伝学的生産のためのベクター製造］
ｐＧＥＭ−Ｔベクターに入っているＭＧＦＰ−５ ｃＤＮＡをＰｓｔＩとＥｃｏＲＩ制限酵素サイト（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｓｉｔｅ）を利用して分離した後、ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩ制限酵素で切られたｐＴｒｃＨｉｓＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）に挿入してｐＭＤＧ０５（４６３０ｂｐ）を製造した（図２）。ｐＭＤＧ０５は大韓民国大田市儒城区魚隱洞に所在している韓国生命工学研究院（ＫＣＴＣ ）に２００２年６月２０日付で寄託して寄託番号ＫＣＴＣ１０２９１ＢＰを受けた。
【００５３】
ｐＭＤＧ０５ベクターは大腸菌発現用プロモーターであるｔｒｃプロモーターを含んでいて、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ、Ｓｉｇｍａ、米国）を利用して発現を誘導することができる。また、親和クロマトグラフィーを利用した蛋白質分離精製のためにヒスチジン残基６個がＭＧＦＰ−５遺伝子の５'末端に位置する。
【００５４】
［実施例３:ＦＰ−１に由来するペプチド（６ｘＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫ）製造］
ＦＰ−１（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．Ｑ２７４０９又はＳ２３７６０）のアミノ酸配列から、配列番号２５と記載されるＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫからなるペプチドが６回反復して連結されたＦＰ−１変異体（以下、６ｘＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫと言う）を製造した。
【００５５】
つまり、図３に記載されたＫＤ−１〜ＫＤ−４をそれぞれ合成してアニーリングすることによって、配列番号７のＦＰ−１変異体をコーディングする配列番号８の６ｘＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫを合成した。前記６ｘＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫの５'末端に追加的に５'から３'方向にＥｄｏＲＩ及びＮｈｅＩ制限酵素部位を位置させ、３'末端にはＢａｍＨＩ制限酵素部位を位置させた（図３）。前記６ｘＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫはＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素部位を利用してｐＵＣ１８ベクターに挿入し、ｐＡＤ５０１ベクターを製造した（Ｍ．Ｋｉｔａｍｕｒａ、１９９９、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐａｒｔ Ａ:Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７、７２９−７３６）。
【００５６】
図３において、ポリヌクレオチドのＢａｍＨＩ部位５'位置に存在するＡＣＴＡＴはＯＲＦを合わせるために挿入したものである。
【００５７】
［実施例４:ＦＰ−１及びＭＧＦＰ−５からなる組合体製造］
以下、ＭＧＦＰ−５はＭＧＦＰ−０５と記載し、ＭＧＦＰ−５のＮ−末端に実施例３の６ｘＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫが結合された組合体はＭＧＦＰ−１５０と記載して、ＭＧＦＰ−５のＣ−末端に６ｘＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫが結合された組合体はＭＧＦＰ−０５１と記載し、ＭＧＦＰ−５のＮ−末端及びＣ−末端全てに６ｘＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫが結合された組合体はＭＧＦＰ−１５１と記載する（前記表１参照）。
【００５８】
配列番号１０のＭＧＦＰ−１５０、配列番号１２のＭＧＦＰ−０５１及び配列番号１４のＭＧＦＰ−１５１組合体それぞれが製造され、実験設計上、前記複数の組合体には５’末端にヒスチジンタグ（６ｘＨｉｓ）とその他のアミノ酸残基が含まれ、６ｘＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫとＭＧＦＰ−５との間にアミノ酸残基が含まれる。
【００５９】
ＭＧＦＰ−０５、ＭＧＦＰ−１５０、ＭＧＦＰ−０５１及びＭＧＦＰ−１５１組合体をそれぞれ発現するために、配列番号１５、１７、１９及び２１の構造体をベクターに挿入して、図４のｐＭＤＧ０５、ｐＭＤＧ１５０、ｐＭＤＧ０５１及びｐＭＤＧ１５１をそれぞれ製造した。前記４種のベクターはＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ、Ｓｉｇｍａ、ＵＳ）によって発現が誘導されるｔｒｃプロモーター下で発現が調節され、各組合体の５'領域にヒスチジン残基が６個存在し、組合体の３'末端には翻訳終結コドン（ＴＡＡ）が位置する。
【００６０】
各ベクターの製造方法は次の通りである。
【００６１】
実施例２のｐＭＤＧ０５ベクター内ＭＧＦＰ−５の遺伝子配列を配列番号１及び２のプライマーセットでＰＣＲし、ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩ制限酵素を利用して切断した後、同一酵素で切断されたｐＴｒｃＨｉｓＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）に挿入してｐＴＥＭＰ１５０（４６３０ｂｐ）を製作した。また、実施例２のｐＡＤ５０１ベクター内６ｘＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫを配列番号２３（５'−ＧＧＴＡＣＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＡＴＴＣＧＣＴＡＡＡＣＣＧ−３'）及び２４（５'−ＧＧＴＣＧＡＣＴＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＡＴＴＴＧＴＡＡＧＴＣＧ−３'）のプライマーセットで増幅させ、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で切った。その後、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で切られたｐＴＥＭＰ１５０に挿入してｐＭＤＧ０５１を製作した（図５）。
【００６２】
ｐＡＤ５０１ベクター内６ｘＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫをＮｈｅＩとＢａｍＨＩ制限酵素で処理して分離し、同一酵素で処理したｐＭＤＧ０５ベクターに挿入してｐＭＤＧ１５０を製作した（図６）。
【００６３】
ｐＡＤ５０１ベクター内６ｘＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫをＮｈｅＩとＢａｍＨＩ制限酵素で処理して分離し、同一酵素で処理したｐＴｒｃＨｉｓＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）に挿入してｐＴＥＭＰ１（４５２３ｂｐ）を製作した。その後、ｐＭＤＧ０５ベクター内ＭＧＦＰ−５の遺伝子配列を配列番号１及び２のプライマーセットで増幅させ、これをＰｓｔＩとＥｃｏＲＩ制限酵素で処理した後、同一酵素で処理されたｐＴＥＭＰ１に挿入してｐＴＥＭＰ２（４７４１ｂｐ）を製作した。また、ｐＡＤ５０１ベクター内６ｘＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫを配列番号２３及び２４のプライマーセットで増幅させた後、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で切断した。その後、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で切られたｐＴＥＭＰ２に挿入して、ｐＭＤＧ１５１（４９２７ｂｐ）を製作した（図７）。
【００６４】
また、ＭＧＦＰ−１５１の遺伝子はＴ７プロモーターを利用して大量発現させるために、ＭＧＦＰ−１５１の遺伝子をｐＭＤＧ１５１ベクターから配列番号３４のプライマー（５’−ＣＣＴ ＡＡＣＡＴＡ ＴＧＧ ＧＧＧ ＴＴＣ ＴＣＡ ＴＣＡ ＴＣ−３’）及び配列番号３５のプライマー（５’−ＡＴＣ ＣＧＣ ＣＡＡ ＡＡＣ ＡＧＣ ＣＡＡＧＣＴ Ｔ−３’）で増幅した後、増幅産物はＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイトを利用して、ｐＥＴ２２ｂ（+）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＥＭＢ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃ。４４１ Ｃｈａｒｍａｎｙ Ｄｒ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ ５３７１９ ＵＳＡ）に挿入することでｐＥＮＧ１５１ベクターを製造した（図８）。前記ｐＥＮＧ１５１ベクターはＥ.ｃｏｌｉに形質転換しており、２００５年１月１９日付で韓国生命工学研究院遺伝子銀行にＫＣＴＣ１０７６６ＢＰで寄託した。
【００６５】
［実施例５:ＭＧＦＰ−５及び組合体を生産する形質転換体の製造］
クローニング用Ｅ.ｃｏｌｉＴｏｐ１０（Ｆ−ｍｃｒＡ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ）Φ８０１ａｃＺΔＭ１５ΔｌａｃＸ７４ ｄｅｏＲ ｒｅｃＡ１ ａｒａＤ１３９Δ（ａｒａ−ｌｅｕ）７６９７ ｇａｌＵ ｇａｌＫ ｒｐｓＬ（Ｓｔｒｒ）ｅｎｄＡ１ ｎｕｐ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び蛋白質発現用として使用されたＥ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１（Ｆ−ｏｍｐＴ ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌｄｃ）はそれぞれＣａＣｌ２バッファーを使用してコムペテント（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞を製造した。前記コムペテント細胞それぞれに実施例４のｐＭＤＧ０５、ｐＭＤＧ０５１、ｐＭＤＧ１５０及びｐＭＤＧ１５１ベクターそれぞれを熱衝撃（４２℃で２分間放置）方法によって形質導入した。その後、アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ、Ｓｉｇｍａ）を利用した選別過程を通じて、それぞれの形質転換体、Ｅ.ｃｏｌｉＴｏｐ１０/ｐＭＤＧ０５、Ｅ.ｃｏｌｉＴｏｐ１０/ｐＭＤＧ０５１、Ｅ.ｃｏｌｉＴｏｐ１０/ｐＭＤＧ１５０、Ｅ.ｃｏｌｉＴｏｐ１０/ｐＭＤＧ１５１、Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ０５、Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ０５１、Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ１５０及びＥ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ１５１を収得した。
【００６６】
［実施例６:Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ０５からＭＧＦＰ−５の発現及び精製］
［６−１．Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ０５培養］
Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ０５はＬＢ培地（５ｇ/ｌｉｔｅｒ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、１０ｇ/ｌｉｔｅｒ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ及び１０ｇ/ｌｉｔｅｒ ＮａＣｌ）に培養し、培養液の吸光度が６００ｎｍで０．７〜０．８程度になった時にＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭで添加して組換え接着蛋白質であるＭＧＦＰ−５の発現を誘導した。この時、５０ｍｌ容の滅菌されたチューブに１０ｍｌのＬＢ培地を入れて（５００μｇのアンピシリン添加）、１２時間培養した培養液を１００ｍｌのＬＢ培地が入っている５００ｍｌフラスコに入れて接種した。Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ０５培養液は１３，０００ｒｐｍ、４〜１０分間遠心分離して細胞ペレットを収得し、これを−８０℃に保管した。
【００６７】
［６−２．ＭＧＦＰ−５発現確認］
細胞ペレットはＳＤＳ−ＰＡＧＥ用緩衝液（０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、５％ＳＤＳ、５％β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、０．２５％ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ）１００μｌに希釈して、１００℃で５分間沸騰して変成させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの場合、試料を１５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに電気泳動した後、クマシブルー（Ｃｏｏｍａｓｉｅ ｂｌｕｅ）染色またはシルバー染色（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国）を利用して蛋白質バンドを検出した。ウェスタンブロットの場合は試料を１５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに電気泳動した後、ニトロセルロース膜に１５Ｖ電圧下で移動させた。蛋白質が移動したニトロセルロース膜をモノクロナルヒスチジン親和性リガンド抗体（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を利用してＭＧＦＰ−５蛋白質を発色反応後検出した。
【００６８】
図９はＥ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ０５及びＥ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＴｒｃＨｉｓ（ｐＴｒｃＨｉｓＡで形質転換したＥ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＴｒｃＨｉｓＡ）それぞれの培養物の電気泳動写真で、ＭＷはサイズマーカであり、Ｎは対照群、ＷＣはＥ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ０５培養物である。図９において、Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ０５内のＭＧＦＰ−５蛋白質が発現することが確認された。
【００６９】
組換えＭＧＦＰ−５の発現形態を確認するために細胞試料を細胞ペレットと、細胞ペレットを溶解分離（ｌｙｓｉｓ）して収得した非溶解性細胞副産物と溶解性上層分画をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロットを行った。
【００７０】
つまり、Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ０５の細胞ペレットに１ｇ当り５ｍｌの緩衝液（８Ｍ ｕｒｅａ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１００ｍＭｓｏｄｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ８．０）を添加した後、常温で１時間攪拌して細胞を破砕した。破砕物（ｌｙｓａｔｅ）は１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、溶解性上層分画と非溶解性細胞副産物をそれぞれ収得した。
【００７１】
図１０はＥ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ０５培養液から分離した細胞ペレット（ＷＣ）、溶解性上層分画（Ｉ）、非溶解性細胞副産物（ＩＳ）及び陰性対照群（Ｎ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥに対するウェスタンブロット写真である。図１０において、ＭＧＦＰ−５蛋白質は溶解性上層分画で多量検出されて、細胞内で水溶性形態に発現することが分かった。
【００７２】
［６−３．ＭＧＦＰ−５組換え蛋白質精製］
Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ０５で水溶性形状に発現する組換えＭＧＦＰ−５を分離精製するために、ｐＭＤＧ０５ベクターに入っているヒスチジン親和性リガンドを利用して親和性クロマトグラフィを行った。
【００７３】
固定された金属親和性クロマトグラフィー（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｍｅｔａｌ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＩＭＡＣ）精製はアクタプライム精製システム（Ａｃｔａ Ｐｒｉｍｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を利用して実施しており、常温で流速１ｍｌ/ｍｉｎで実施した。レジンとしては０．１ＭのＮｉＳＯ４（Ｓａｍｃｈｕｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を付加した１０ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ（登録商標） Ａｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を利用しており、変成条件で分離した。コラムに前記レジンを充填させた後、緩衝液（８Ｍ ｕｒｅａ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１００ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ８．０）を注入して平衡化させた。その後、水溶性上層分画をコラムに注入した後、緩衝液Ａ（８Ｍ ｕｒｅａ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１００ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ６．３）及び緩衝液Ｂ（８Ｍ ｕｒｅａ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１００ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ５．９）で溶出した。ＭＧＦＰ−５組換え蛋白質の溶出は溶出緩衝液（８Ｍ ｕｒｅａ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１００ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ４．５）をコラムに流して実施し、溶出する分画は集めた後、５％の酢酸溶液に４℃で透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ、Ｓｐｅｃｔｒａ/Ｐｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｏｒｏｕｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｕｂｉｎｇ、ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ．，米国）した。
【００７４】
図１１はシルバーで染めたＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真で、Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ０５からＭＧＦＰ−５組換え蛋白質を精製する親和性クロマトグラフィー段階別試料を電気泳動したものである。Ｍはサイズマーカであり、レーン１はコラムに水溶性上層分画を注入した時に吸着しない分画であり、レーン２はコラム洗浄段階で収得した溶出分画であり、レーン３は溶出緩衝液で分離させた溶出分画である。図１１でＭＧＦＰ−５組換え蛋白質が高純度で精製されることが確認できた。
【００７５】
［６−４．ＭＧＦＰ−５組換え蛋白質分析］
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｉｍｅ-ｏｆ-ｆｌｉｇｈｔ）質量スペクトロスコーピー分析をＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を利用して実施した。
【００７６】
基質溶液として３０％のアセトニトリール及び０．１％のトリフルオロ酢酸に溶解したシナピン酸（Ｓｉｎａｐｉｎｉｃ ａｃｉｄ）を利用した。前記６−３で収得したＭＧＦＰ−５組換え蛋白質は、前記基質溶液で１:２５で希釈した後、１μｌを金プレートに点滴した後、真空ポンプで乾燥した。質量スペクトルは２５，０００Ｖの加速電圧、グリッド電圧７０〜８０％、ガイドワイヤー電圧０．３％、遅延時間２００〜５００ｎｓ、Ｎ２レーザー電源１６００〜１９００（ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔｓ）の陽性イオンモードで測定した。内部的な測定（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）は６６．４３１での[Ｍ+Ｈ]+及び３３．２１６での[Ｍ+２Ｈ]２+条件でＢＳＡを利用して実施した。
図１２は精製したＭＧＦＰ−５組換え蛋白質の質量分析結果である。
【００７７】
［実施例７:Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ０５１からＭＧＦＰ−５１の発現及び精製］
実施例６と同様な方法でＥ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ０５１を培養し、細胞ペレットを収得した後、非水溶性細胞副産物及び水溶性上層分画をそれぞれ収得した。その後、前記試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットを実施した。
【００７８】
図１３はＥ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ０５１からＭＧＦＰ−５１組換え蛋白質発現を分析したＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真（Ａ）及びウェスタンブロット写真（Ｂ）である。Ｗは細胞ペレットであり、Ｓは水溶性上層分画であり、ＩＳは非水溶性細胞副産物である。図１３において、ＭＧＦＰ−５１組換え蛋白質は細胞内水溶性形態及び非水溶性形態全てに発現することが分かる。
【００７９】
［実施例８:Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ１５０からＭＧＦＰ−１５０の発現及び精製］
実施例６と同様な方法でＥ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ１５０を培養し、細胞ペレットを収得した後、非水溶性細胞副産物及び水溶性上層分画をそれぞれ収得した。その後、前記試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットを実施した。
【００８０】
図１４はＥ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ１５０からＭＧＦＰ−１５組換え蛋白質発現を分析したＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真（Ａ）及びウェスタンブロット写真（Ｂ）である。Ｍはサイズマーカであり、Ｗは細胞ペレットであり、Ｓは水溶性上層分画であり、ＩＳは非水溶性細胞副産物である。図１４において、ＭＧＦＰ−１５組換え蛋白質は細胞内水溶性形態及び非水溶性形態全てに発現することが分かる。
【００８１】
［実施例９:Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ１５１からＭＧＦＰ−１５１の発現及び精製］
［９−１．ＭＧＦＰ−１５１の発現］
実施例６と同様な方法でＥ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ１５１を培養し、細胞ペレットを収得した後非水溶性細胞副産物及び水溶性上層分画をそれぞれ収得した。その後、前記試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットを実施した。
【００８２】
図１５はＥ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ１５１からＭＧＦＰ−１５１組換え蛋白質発現を分析したＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真（Ａ）及びウェスタンブロット写真（Ｂ）である。Ｗは細胞ペレットであり、Ｓは水溶性上層分画であり、ＩＳは非水溶性細胞副産物である。図１５において、ＭＧＦＰ−５１組換え蛋白質は水溶性及び不溶性形態に発現することが分かる。
【００８３】
［９−２．ＭＧＦＰ−１５１組換え蛋白質の精製Ｉ］
細胞ペレットに１ｇ当り５ｍｌの溶解分離緩衝液（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１００ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ８．０）を加えて懸濁した後、２０，０００ＰＳＩ（Ｃｏｎｓｔａｎｔ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｏｗ Ｍａｒｃｈ、ＵＫ）で細胞を破砕した。細胞破砕物は１８，０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離して細胞副産物は収得した。細胞副産物に５、１０、１５、２０、２５、３０、２２、２４、２６及び２８（ｖ/ｖ）％の酢酸をそれぞれ１ｇ当り２０ｍｌを加えて希釈した後、同一条件で遠心分離した。上層液はクロマトグラフィー用試料にした。
【００８４】
４０ｃｍｘ２．６ｃｍのコラムにセファクリルＳ−３００ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を充填し、５％の酢酸で平衡化させた。その後、試料２ｍｌを注入した後、前記試料稀釈に用いた酢酸を同一濃度でそれぞれ溶出しながら溶出分画を収得した。酢酸の濃度別に溶出させた分画はＳＤＳ−ポリアクリールアミドゲルに電気泳動した後、コマシブルーで染めてＭＧＦＰ−１５１の精製率を確認した（図１６）。図１６でＭＧＦＰ−１５１組換え蛋白質は酢酸２０〜３０（ｖ/ｖ）％の濃度で溶出することが確認できた。特に、２５％の酢酸で希釈した時、７５％の純度及び４５％の収率で最も良い結果を確認した。
【００８５】
［９−３．ＭＧＦＰ−１５１組換え蛋白質の精製ＩＩ］
細胞ペレットに１ｇ当り５ｍｌの溶解分離緩衝液（ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１００ｍＭｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ８．０）を加えて懸濁した後、２０，０００ＰＳＩ（Ｃｏｎｓｔａｎｔ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｏｗ Ｍａｒｃｈ、ＵＫ）で細胞を破砕した。細胞破砕物は１８，０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離して細胞副産物は収得した。細胞副産物に２５％の酢酸溶液を１ｇ当り２０ｍｌを加えて懸濁させ、同一条件で遠心分離した。上層液は凍結乾燥した後、５％酢酸溶液２ｍｌに溶解してクロマトグラフィー用試料を製造した。
【００８６】
４０ｃｍｘ２．６ｃｍのコラムにセファクリルＳ−３００ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を充填し、５％の酢酸で平衡化させた。その後、試料２ｍｌを注入した後、５（ｖ/ｖ）％の酢酸でそれぞれ溶出しながら、溶出分画Ｉ及びＩＩを収得した。前記分画Ｉ及びＩＩはＳＤＳ−ポリアクリールアミドゲルに電気泳動した後、コマシブルーで染めてｍｇｆ−１５１の精製率を確認した（図１７）。図１７はＭＧＦＰ−１５１組換え蛋白質のクロマトグラフィーを通じて収得した分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）及びそのウェスタンブロット（ｂ）である。クロマトグラフィーを通じて９５．８％の純度を有するＭＧＦＰ−１５１組換え蛋白質を分離することができた。
【００８７】
前記精製したＭＧＦＰ−１５１組換え蛋白質はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトロメーターで分析して、最初に設計したＭＧＦＰ−１５１ペプチドと同一であることが確認された。
【００８８】
［実施例１０:接着蛋白質のチロシン残基の変更（Modification）］
実施例６〜９で精製したＭＧＦＰ−０５、ＭＧＦＰ−０５１、ＭＧＦＰ１５０及びＭＧＦＰ−１５１接着蛋白質それぞれは２５ｍＭのアスコルビン酸を含む５％の酢酸緩衝液に１．４４ｍｇ/ｍｌで溶解した後、５０μｇ/ｍｌのチロシナーゼを添加した後、２５℃で６時間振盪した。前記過程を通じて接着蛋白質のチロシン残基をＤＯＰＡに変更（modified）した。また、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）は陰性対照群として利用し、イガイ接着蛋白質ＦＰ−１及びｆｐ−２からなる商品名Ｃｅｌｌ−Ｔａｋ（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＴｗｏＯａｋ Ｐａｒｋ、Ｂｅｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）は陽性対照群として使用した。
【００８９】
［実施例１１:ＭＧＦＰ−０５及びＭＧＦＰ−１５１組換え蛋白質の多様な表面におけるコーティング力の検証］
ＭＧＦＰ−０５組換え蛋白質及びＭＧＦＰ−１５１組換え蛋白質のスライドガラス、ポリメチルメタクリレート板及びアルミニウム板の上でのコーティング能力を測定した。それぞれの表面は水で何回も洗った後、窒素ガスで乾燥した。１．４４ｍｇ/ｍＬの蛋白質溶液５μＬをそれぞれの表面に点滴した後、２５℃で１２時間の間保管した。乾燥後、各板は二重蒸溜水で２時間振盪しながら洗い、各表面に残っている水は真空ポンプを利用して蒸発させた。乾燥後、表面にコーティングされた蛋白質はコマシブルー染色で目で見えるようにした。その結果は図１８に示した。
【００９０】
図１８はＭｇｆｐ−０５組換え蛋白質及びＭＧＦＰ−１５１組換え蛋白質のチロシン残基をＤＯＰＡに変更（modified）させた後、これをスライドガラス、ポリメチルメタクリレート板及びアルミニウム板の上にコーティングした結果である。Ｍｇｆｐ−０５組換え蛋白質及びＭＧＦＰ−１５１組換え蛋白質はチロシン残基が変更（modification）されていない状態でもガラス、ポリメチルメタクリレート及びアルミニウムに全て粘着しており、チロシン残基をＤＯＰＡに変更（modified）させた場合、粘着力はさらに高くなることが確認された。
【００９１】
［実施例１２:ＱＣＭ（Ｑｕａｒｔｚ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ）を利用した組換え接着蛋白質の吸着測定］
使用した水晶結晶（Ｑｕａｒｔｚ Ｃｒｙｓｔａｌ、ＳｅｉｋｏＥＧ&Ｇ）は直径が５ｍｍであり、基本振動数が９ＭＨｚである金でコーティングされたＡＴ−ｃｕｔ水晶である。蛋白質の濃度が１．４４ｍｇ/ｍＬである蛋白質（ＢＳＡ、Ｃｅｌｌ−Ｔａｋ、ＭＧＦＰ−０１組換え蛋白質及びＭＧＦＰ−１５１組換え蛋白質）溶液５μＬをそれぞれ水晶結晶の金表面上に置いた後、２５℃の恒温水槽で１２時間保管した。その後、恒温水槽から取り出して乾燥した後、二重蒸溜水で１時間の間振盪しながら洗い、水晶結晶に残っている水は真空ポンプを利用して蒸発させた。乾燥された水晶結晶はＥＱＣＭコントローラー（ＱＣＡ９１７；Ｓｅｉｋｏ ＥＧ&Ｇ）に連結し、共鳴振動数の変化を測定した。水晶結晶の振動数の減少は表面に吸着した質量と比例するので（Ｇ．Ｓａｕｅｒｂｒｅｙ、１９５９、Ｚ．Ｐｈｙｓ、１５５、２０６）、共鳴振動数の変化を数式１に代入して質量増加分を計算した（Ｍ．Ｔｈｏｍｓｏｎ、１９９１、Ａｎａｌｙｓｔ、１１６、８８１−８８９）。
【００９２】
【数１】
2008504016.tif 000004
【００９３】
前記数式１において、Δｍａｓｓは質量変化であり、Δｆｒｅｑは共鳴振動数の変化であり、μｑはＡＴ−ｃｕｔ水晶結晶定数（２．９４７ｘ１．０１１ｇ/ｃｍ/ｓｅｃ２）であり、Ｐｑは水晶結晶密度（２．６４８ｇ/ｃｍ２）であり、Ｆｑ２は参考振動数（９．００ＭＨｚ）であり、Ａは水晶結晶表面積（０．１９６ｃｍ２）である。
【００９４】
図１９はチロシン処理したＢＳＡ、Ｃｅｌｌ−Ｔａｋ、ＭＧＦＰ−０５組換え蛋白質及びＭＧＦＰ−１５１組換え蛋白質のＱＣＭ分析結果で、金表面に吸着した程度を振動数変化で示している。図１９において、チロシナーゼで変更（modified）されたＭＧＦＰ−１５１組換え蛋白質が最も大きい振動数の変化を示しており、これは最も多く質量が水晶結晶上の金表面に吸着されていることを意味する。Ｃｅｌｌ−Ｔａｋ（登録商標）もまた、ＢＳＡに比べて多量に吸着していることが分かるが、ＭＥＦＰ−５組換え蛋白質に比べて非常に吸着力が低いことが確認された。それぞれの質量変化率はＭＧＦＰ−１５１組換え蛋白質が３６％、ＭＧＦＰ−５組換え蛋白質が２３．２％であり、Ｃｅｌｌ−Ｔａｋは１０％以下であった。
【００９５】
［実施例１３:ＡＦＭ（ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を利用した組換え接着蛋白質の吸着測定］
力−距離曲線はＡＦＭ（ＳＰＡ４００；Ｓｅｉｋｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を利用して求め、ＡＦＭのカンチレバーはｄｕｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．方法によって実施した（Ｗ．Ｄｕｃｋｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９１，３５３，２３９−２４１、図２０）。
【００９６】
本実験で使用されたカンチレバーはＯｌｙｍｐｕｓ ｏｘｉｄｅ−ｓｈａｒｐｅｎｅｄｓｉｌｉｃｏｎ ｎｉｔｒａｔｅ ｐｒｏｂｅｓ（Ｖｅｅｃｏ&Ｓｅｉｋｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）であり、弾性係数が０．５７または１１Ｎ/ｍである。直径が２０μｍであるガラスビード（Ｐａｒｋ Ｓｃｉｅｎｃｅ）をエポキシレジン（Ｖａｎｔｉｃｏ）を使ってカンチレバーの端に付着して、常温で２４時間放置した。ガラスビードを付けたＡＦＭカンチレバーはＡＦＭに装着し、ガラスビードをチロシナーゼで処理した蛋白質溶液（１．４４ｍｇ/ｍｌのＢＳＡ、Ｃｅｌｌ−Ｔａｋ、ＭＧＦＰ−１またはＭＧＦＰ−５）１０μＬに３０分間の間、浸漬した。ガラスビードは清潔なガラス表面に接触させ、力−距離カーブを求めた。
【００９７】
図２１はチロシン残基が変更（modified）されたＭＧＦＰ−１５１組換え蛋白質及びＭＧＦＰ−５組換え蛋白質の粘着性を示すもので、組換えイガイ接着蛋白質ＭＧＦＰ−５とＭＧＦＰ−１５１はそれぞれ平均値が約５４０ｎＮと５００ｎＮで大きな接着能力を有することが分かり、Ｃｅｌｌ−Ｔａｋは２５０ｎＮ、ＢＳＡは約３０ｎＮを示した。この結果は、チロシナーゼで処理された（tyrosinase-treated）組換えイガイ接着蛋白質が強い接着能力を持っていることを示す。
【００９８】
［実施例１４:細胞に対する接着性測定］
ショウジョウバエ（Drosophila）Ｓ２細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用した。
Ｓ２細胞は２７℃の培養器で１０％のＩＭＳ（ｉｎｓｅｃｔ ｍｅｄｉｕｍ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ヒグロマイシン３μＬ/ｍＬを含むＭ３培地（Ｓｈｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｓａｎｇ Ｍ３ ｉｎｓｅｃｔ ｍｅｄｉｕｍ；Ｓｉｇｍａ）で培養した。滅菌されたスライドガラス（２０ｍｍｘ２０ｍｍ、Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎ）に実施例１０で準備したチロシナーゼ処理されたＭＧＦＰ−５組換え蛋白質、ＭＧＦＰ−１５１組換え蛋白質、Ｃｅｌｌ−Ｔａｋ及びＢＳＡをそれぞれ１０μＬ滴下した後、ラミナーフローフード（Ｌａｍｉｎａｒ ｆｌｏｗ ｈｏｏｄ）で２５℃で３０分間放置した後、ＰＢＳで２回洗浄した。前記スライドガラスは９５％の生存率を示す４ｘ１０６ｃｅｌｌｓ/ｍＬのＳ２細胞がある１００−ｍｍ細胞培養皿に浸漬した。２７℃の培養器で１時間〜７日間放置した後、付着されていない細胞はＰＢＳで洗浄して除去し、トリパンブルー染色をして細胞生存率及び付着位置を確認した。
【００９９】
その結果、ＭＧＦＰ−５組換え蛋白質及びＭＧＦＰ−１５１組換え蛋白質がコーティングされた部位にＳ２細胞が付着することを確認でき、付着したＳ２細胞は７日以上生存した（図２２及び図２３）。
【０１００】
［実施例１５:ＭＧＦＰ−５及びＭＧＦＰ−１５１の化学的接着安定性検査］
ＭＧＦＰ−５組換え蛋白質及びＭＧＦＰ−１５１組換え蛋白質はガラスにそれぞれ点滴して、比較群としてＣｅｌｌ−Ｔａｋも点滴した。乾燥後、これを５％の酢酸、２５％のメタノール及び７０％の水からなる溶媒に浸して、２０分間８５℃で加熱した。その結果、ガラスまたはアクリル板にコーティングさせた接着蛋白質は溶媒条件で高温に放置する場合、ＭＧＦＰ−５は剥落するが、ＭＧＦＰ−１５１は継続して付着していることが分かった。
【０１０１】
また、ガラスまたはアクリル板にそれぞれをコーティングした後、ＳＥＭで接着安定性を測定した。
【０１０２】
図２４Ａ〜図２４Ｃは、ＭＧＦＰ−５組換え蛋白質及びＭＧＦＰ−１５１組換え蛋白質がコーティングされた基質表面を示す写真で、Ａは２５００倍率写真であり、Ｂは１００００倍率写真、Ｃは３５０００倍率写真である。観察結果、ＭＧＦＰ−１５１がコーティングされた表面は滑らかであるが、ＭＧＦＰ−５がコーティングされた表面は多少粗かった。前記差異点は架橋度の差であると考えられる。
【０１０３】
［配列目録プレテキスト］
配列番号１〜４はプライマー配列である。
配列番号５はムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis）から分離したＭＧＦＰ−５蛋白質のｃＤＮＡである。
配列番号６はムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis）から分離したＭＧＦＰ−５蛋白質配列である。
配列番号７はヨーロッパイガイ（Mytilus edulis）から分離したＭＥＦＰ−５蛋白質の一部配列が６回反復連続したヌクレオチド配列である。
配列番号８はヨーロッパイガイ（Mytilus edulis）から分離したＭＥＦＰ−５蛋白質の一部配列が６回反復連続したアミノ酸配列である。
配列番号９はＦＰ−１とＭＧＦＰ−５を組み合わせて製造したＭＧＦＰ−１５０接着蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列である。
【０１０４】
配列番号１０はＦＰ−１とＭＧＦＰ−５を組み合わせて製造したＭＧＦＰ−１５０接着蛋白質のアミノ酸配列である。
配列番号１１はＦＰ−１とＭＧＦＰ−５を組み合わせて製造したＭＧＦＰ−０１５接着蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列である。
配列番号１２はＦＰ−１とＭＧＦＰ−５を組み合わせて製造したＭＧＦＰ−０１５接着蛋白質のアミノ酸配列である。
配列番号１３はＦＰ−１とＭＧＦＰ−５を組み合わせて製造したＭＧＦＰ−１５１接着蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列である。
配列番号１４はＦＰ−１とＭＧＦＰ−５を組み合わせて製造したＭＧＦＰ−１５１接着蛋白質のアミノ酸配列である。
配列番号１５はＭＧＦＰ−５の発現のためにｐＭＤＧ０５ベクターに挿入された構造体のヌクレオチド配列である。
配列番号１６はＭＧＦＰ−５の発現のためにｐＭＤＧ０５ベクターに挿入された構造体から発現する接着蛋白質のアミノ酸配列である。
配列番号１７はＭＧＦＰ−１５０の発現のためにｐＭＤＧ１５０ベクターに挿入された構造体のヌクレオチド配列である。
配列番号１８はＭＧＦＰ−１５０の発現のためにｐＭＤＧ１５０ベクターに挿入された構造体から発現する接着蛋白質のアミノ酸配列である。
配列番号１９はＭＧＦＰ−０１５の発現のためにｐＭＤＧ０１５ベクターに挿入された構造体のヌクレオチド配列である。
【０１０５】
配列番号２０はＭＧＦＰ−０１５の発現のためにｐＭＤＧ０１５ベクターに挿入された構造体から発現する接着蛋白質のアミノ酸配列である。
配列番号２１はＭＧＦＰ−１５１の発現のためにｐＭＤＧ１５１ベクターに挿入された構造体のヌクレオチド配列である。
配列番号２２はＭＧＦＰ−１５１の発現のためにｐＭＤＧ１５１ベクターに挿入された構造体から発現する接着蛋白質のアミノ酸配列である。
配列番号２３及び２４はプライマー配列である。
配列番号２５はＦＰ−１の一部配列である。
配列番号２６〜３１はＦＰ−１の一部配列であるＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫをコーディングするヌクレオチド配列である。
配列番号３２はＴ３プロモーターに対するプライマー配列である。
配列番号３３はＴ７プロモーターに対するプライマー配列である。
配列番号３４及び３５はプライマー配列である。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】ムラサキイガイ（Mytilus galloprovincialis）から抽出したＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲ処理して得られたＭＧＦＰ−５蛋白質ｃＤＮＡ断片を電気泳動した写真である。
【図２】ｐＴｒｃＨｉｓベクターにＭＧＦＰ−５ ｃＤＮＡを挿入してｐＭＤＧ０５ベクターを製作する過程を示す図面である。
【図３】ＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫからなるペプチドが６回反復して連結されたＦＰ−１変異体（以下、６ｘＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫと言う）及び、その合成に用いられた４個のオリゴマー（ＫＤ−１、ＫＤ−２、ＫＤ−３及びＫＤ−４）を示した図面である。
【図４】６ｘＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫとＭＧＦＰ−５遺伝子を同時に発現できる多様な組み合わせのベクター構成図である。
【図５】組換えＭｇｆｐ−０５１の遺伝子配列を生産するためのｐＭＤＧ０５１ベクターを製作する過程を示した図面である。
【図６】組換えＭＧＦＰ−１５０を生産するためのｐＭＤＧ１５０ベクター製作過程を示した図面である。
【図７】組換えＭＧＦＰ−１５１を生産するためのｐＭＤＧ１５１ベクター製作過程を示した図面である。
【図８】組換えＭＧＦＰ−１５１を生産するためのｐＥＮＧ１５１ベクター製作過程を示した図面である。
【図９】Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ０５及びＥ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＴｒｃＨｉｓ（ｐＴｒｃＨｉｓＡで形質転換したＥ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＴｒｃＨｉｓＡ）それぞれの培養物の電気泳動写真である。
【図１０】Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ０５培養液から分離した細胞ペレット（ＷＣ）、溶解性上層分画（Ｉ）、非溶解性細胞副産物（ＩＳ）及び陰性対照群（Ｎ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥに対するウェスタンブロット写真である。
【図１１】シルバー着色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真であって、Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ０５からＭＧＦＰ−５組換え蛋白質を精製する親和性クロマトグラフィー段階別試料を電気泳動したものである。
【図１２】精製したＭＧＦＰ−５組換え蛋白質の質量分析結果である。
【図１３】Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ０５１からＭＧＦＰ−５１組換え蛋白質発現を分析したＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真（Ａ）及びウェスタンブロット写真（Ｂ）である。
【図１４】Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ１５０からＭＧＦＰ−１５組換え蛋白質発現を分析したＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真（Ａ）及びウェスタンブロット写真（Ｂ）である。
【図１５】Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ１５１からＭＧＦＰ−１５１組換え蛋白質発現を分析したＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真（Ａ）及びウェスタンブロット写真（Ｂ）である。
【図１６】Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１/ｐＭＤＧ１５１から発現したＭＧＦＰ−１５１組換え蛋白質の回収率を酢酸溶液の濃度別に示したものである。
【図１７】ＭＧＦＰ−１５１組換え蛋白質のクロマトグラフィーを通じて収得した分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）及び、そのウェスタンブロット（ｂ）である。
【図１８】ＭＧＦＰ−０５組換え蛋白質及びＭＧＦＰ−１５１組換え蛋白質のチロシン残基をＤＯＰＡに変更（modified）した後、これをスライドガラス、ポリメチルメタクリレート板及びアルミニウム板上にコーティングした結果である。
【図１９】チロシン処理したＢＳＡ、Ｃｅｌｌ−Ｔａｋ、ＭＧＦＰ−０５組換え蛋白質及びＭＧＦＰ−１５１組換え蛋白質のＱＣＭ分析結果である。
【図２０】組換え接着蛋白質の粘着性を測定する方法の概略図である。
【図２１】チロシン残基が変更（modified）されたＭＧＦＰ−１組換え蛋白質及びＭＧＦＰ−５組換え蛋白質の粘着性を示す図面である。
【図２２】組換え接着蛋白質の細胞付着性を測定したものである。
【図２３】組換え接着蛋白質のショウジョウバエＳ２細胞付着性を測定したものである。
【図２４】ＭＧＦＰ−５組換え蛋白質及びＭＧＦＰ−１５１組換え蛋白質でコーティングされた基質表面を示す写真であって、Ａは２５００倍率写真で、Ｂは１００００倍率写真で、Ｃは３５０００倍率写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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