(57)【要約】所定の疎水性、所定の極性、所定の静電ポテンシャルを有する位置、Met、芳香族アミノ酸、配列番号：1の152位に相当するCys、野生型もしくは変異型アディポネクチンの等電点に影響を与えるアミノ酸、ベータシート形成、ヘリックスキャッピング、もしくは双極子相互作用に影響を与えるアミノ酸、またはそれらの組み合わせにおいて、対応する野生型アディポネクチンに対する一つまたは複数のアミノ酸修飾を含むアディポネクチン変異体であって、対応する野生型アディポネクチンと比較して改良された安定性、溶解度もしくは可溶性発現、発現収率、AMPKのリン酸化を誘導する能力、またはそれらの組み合わせを示す、アディポネクチン変異体。2008526885.tif 000043
2008526885.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の疎水性、所定の極性、所定の静電ポテンシャルを有する位置、Met、芳香族アミノ酸、配列番号：1の152位に相当するCys、野生型もしくは変異型アディポネクチンの等電点に影響を与えるアミノ酸、ベータシート形成、ヘリックスキャッピング、もしくは双極子相互作用に影響を与えるアミノ酸、またはそれらの組み合わせにおいて、対応する野生型アディポネクチンに対する一つまたは複数のアミノ酸修飾を含むアディポネクチン変異体であって、対応する野生型アディポネクチンと比較して、改良された安定性、溶解度もしくは可溶性発現、発現収率、5'-AMP活性化プロテインキナーゼ（AMPK）のリン酸化を誘導する能力、またはそれらの組み合わせを示す、アディポネクチン変異体。
【請求項２】
以下の式を含む、変異型ヒトアディポネクチンペプチドを含む組成物：
2008526885.tif 000038
式中、
V（109）は、野生型アミノ酸V；変異型アミノ酸D、E、H、K、N、Q、およびRのいずれか；ならびにV109の欠失からなる群より選択され；
V（110）は、野生型アミノ酸V；変異型アミノ酸D、E、H、K、N、Q、R、およびSのいずれか；ならびにV110の欠失からなる群より選択され；
V（111）は、野生型アミノ酸YおよびH；変異型アミノ酸D、E、N、R、およびSのいずれか；ならびにY122の欠失からなる群より選択され；
F（112）は、野生型アミノ酸RおよびCからなる群より選択され；
F（113-121）は、野生型アミノ酸配列SAFSVGLET；ならびにS113、A114、F115、S116、V117、G118、L119、E120、およびT121のいずれかの欠失からなる群より選択され；
V（122）は、野生型アミノ酸Y；変異型アミノ酸D、E、H、N、R、およびSのいずれか；ならびにY122の欠失からなる群より選択され；
F（123-124）は、野生型アミノ酸配列VT；ならびにV123およびT124のいずれかの欠失からなる群より選択され；
V（125）は、野生型アミノ酸I；変異型アミノ酸D、E、H、K N、Q、R、S、およびT；ならびにI125の欠失からなる群より選択され；
F（126-127）は、野生型アミノ酸配列PNを含み；
V（128）は、野生型アミノ酸M；ならびに変異型アミノ酸A、D、E、H、K、N、Q、R、S、およびTのいずれかからなる群より選択され；
F（129-134）は、野生型アミノ酸配列PIRFTKを含み；
V（135）は、野生型アミノ酸I；ならびに変異型アミノ酸D、E、H、K、N、Q、およびRのいずれかからなる群より選択され；
F（136-151）は、野生型アミノ酸配列FYNQQNHYDGSTGKFHを含み；
V（152）は、野生型アミノ酸C；ならびに変異型アミノ酸A、N、およびSのいずれかからなる群より選択され；
F（153-163）は、野生型アミノ酸配列
2008526885.tif 000039
を含み；
F（164）は、野生型アミノ酸IおよびTからなる群より選択され；
F（165-181）は、野生型アミノ酸配列
2008526885.tif 000040
を含み；
V（182）は、野生型アミノ酸M；ならびに変異型アミノ酸A、D、E、K、N、Q、R、S、およびTのいずれかからなる群より選択され；
F（183）は、野生型アミノ酸Lを含み；
V（184）は、野生型アミノ酸F；ならびに変異型アミノ酸D、H、K、N、およびRのいずれかからなる群より選択され；
F（185-206）は、野生型アミノ酸配列
2008526885.tif 000041
を含み；
V（207）は、野生型アミノ酸V；ならびに変異型アミノ酸D、E、H、K、N、Q、R、およびSのいずれかからなる群より選択され；
F（208-220）は、野生型アミノ酸配列
2008526885.tif 000042
を含み；
F（221）は、野生型アミノ酸RおよびSからなる群より選択され；
F（222-223）は、野生型アミノ酸配列NGを含み；
V（224）は、野生型アミノ酸L；ならびに変異型アミノ酸D、E、H、K、N、Q、R、およびSのいずれかからなる群より選択され；
V（225）は、野生型アミノ酸Y；ならびに変異型アミノ酸D、E、H、K、N、Q、R、およびSのいずれかからなる群より選択され；
F（226）は、野生型アミノ酸Aを含み；
V（227）は、野生型アミノ酸D；ならびに変異型アミノ酸H、K、およびRのいずれかからなる群より選択され；
F（228）は、野生型アミノ酸配列Nを含み；または
V（229）は、野生型アミノ酸D；ならびに変異型アミノ酸H、K、およびRのいずれかからなる群より選択される。
【請求項３】
変異体が、122H；122S；125E；125H；125T；184H；207E；および207Kからなる群より選択される置換を含む、請求項2記載の組成物。
【請求項４】
変異体が少なくとも二つの置換を含む、請求項2記載の組成物。
【請求項５】
変異体の溶解度または可溶性発現が少なくとも30倍改良された、請求項2記載の組成物。
【請求項６】
変異体の溶解度または可溶性発現が少なくとも100倍改良された、請求項2記載の組成物。
【請求項７】
変異体の溶解度または可溶性発現が少なくとも300倍改良された、請求項2記載の組成物。
【請求項８】
変異体の溶解度または可溶性発現が少なくとも1000倍改良された、請求項2記載の組成物。
【請求項９】
変異体の発現収率が少なくとも2倍改良された、請求項2記載の組成物。
【請求項１０】
変異体の発現収率が少なくとも10倍改良された、請求項2記載の組成物。
【請求項１１】
変異体の発現収率が少なくとも50倍改良された、請求項2記載の組成物。
【請求項１２】
変異体の発現収率が少なくとも300倍改良された、請求項2記載の組成物。
【請求項１３】
変異体の発現収率が少なくとも1000倍改良された、請求項2記載の組成物。
【請求項１４】
変異体の、筋細胞においてAMPKのリン酸化を誘導する能力が、少なくとも30％改良された、請求項2記載の組成物。
【請求項１５】
変異体の、筋細胞においてAMPKのリン酸化を誘導する能力が、少なくとも100％改良された、請求項2記載の組成物。
【請求項１６】
対応する野生型アディポネクチンがヒトアディポネクチン（配列番号：1）である、請求項2記載の組成物。
【請求項１７】
変異体が、配列番号：1の109、110、115、122、123、125、128、130、132、135、150、152、160、164、166、171、173、175、182、184、205、207、211、213、215、224、225、227、229、または234位で、一つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項13記載の組成物。
【請求項１８】
対応する野生型アディポネクチンが非ヒトアディポネクチンである、請求項2記載の組成物。
【請求項１９】
請求項2記載のアディポネクチン変異体をコードするポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項２０】
変異型アディポネクチンペプチドを含む組成物であって、変異体の溶解度または可溶性発現が少なくとも30倍改良された、組成物。
【請求項２１】
変異体の溶解度または可溶性発現が少なくとも100倍改良された、請求項20記載の組成物。
【請求項２２】
変異体の溶解度または可溶性発現が少なくとも300倍改良された、請求項20記載の組成物。
【請求項２３】
変異体の溶解度または可溶性発現が少なくとも1000倍改良された、請求項20記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般に、アディポネクチンに関する。より具体的には、本発明は、増加した組換えタンパク質発現レベル、増強された溶解度または可溶性発現および安定性、より低い免疫原性、ならびに改良された薬物動態学および／または薬力学を含む改良された特性を有するヒトアディポネクチンおよびその他のC1q/TNF-α関連タンパク質の変異体に関し、そのような変異体を作成する方法および疾患を処置するためにそれらを使用する方法にも関する。
【０００２】
先行出願に対する相互参照
本願は、2005年1月7日出願の米国仮出願第60/642,476号、2005年2月3日出願の米国仮出願第60/650,411号、2005年7月11日出願の米国仮出願第60/698,358号、2005年9月26日出願の米国仮出願第60/720,768号、および2005年11月2日出願の米国仮出願第60/733,137号（これらの内容は参照により完全に本明細書に組み入れられる）に基づく優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
脂肪沈着物の保存に加え、脂肪細胞は、哺乳動物における脂質およびグルコースの代謝の制御において重要ないくつかのサイトカインを分泌する。これらのいわゆる「アディポカイン」には、アディポネクチン（「Ad」）、アディプシン（adipsin）、レプチン、およびバスピン（vaspin）が含まれる。文献中、アディポネクチンは、GBP28、ApM1、ACRP30、AdipoQ、およびOBG3とも呼ばれている。しかしながら、他のアディポカインと異なり、アディポネクチンの血清レベルは、肥満、インスリン抵抗性、および虚血性心疾患と逆相関している（Goldstein and Scalia(2004)The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 89:2563-8(非特許文献1)（参照により完全に組み入れられる））。正常なヒトにおけるアディポネクチンの血清レベルは典型的には2〜10ug/mlの範囲であるが、肥満または糖尿病の個体においては循環血中Adのレベルが劇的に低下している。従って、II型糖尿病患者においてインスリン抵抗性を逆転させ、心臓病のリスクを有する患者において血管アテローム性動脈硬化症を改善するための可能性のある処置として、Ad補充療法が提唱されている。
【０００４】
Ad処置は、グルコースおよび脂肪酸のクリアランスを動員し、正常組織およびインスリン抵抗性組織の両方においてインスリン感受性を誘導することが示されている（Wu et al.(2003)Diabetes 52:1355-63(非特許文献2)；Fruebis et al.(2001)PNAS 98:2005-10(非特許文献3)；Berg et al.(2002)TRENDS in Endocrinology and Metabolism 13:84-9(非特許文献4)；全て、参照により完全に組み入れられる）。これらの効果は、骨格筋および肝臓の両方における、Adにより誘導される輸送タンパク質および代謝酵素の活性化によるようである。Adは、5'-AMP活性化プロテインキナーゼ（AMPK）、アセチル補酵素Aカルボキシラーゼ（ACC）のリン酸化およびその後の活性化を刺激し（Yamauchi et al.(2002)Nature Medicine 8:1288-95(非特許文献5)（参照により完全に組み入れられる））、ステロイドホルモン受容体のpPARファミリーも活性化することが既知である（Yamauchi et al.(200)Journal of Biological Chemistry 278:2461-8(非特許文献6)（参照により完全に組み入れられる））。さらなる研究は、Adが心保護特性および抗炎症特性の両方を有することを示している（Shimada et al(2004)Clinica.Chemica.Acta.344:1-12(非特許文献7)；Hug and Lodish(2005)Current Opinion in Pharmacology 5:129-34(非特許文献8)（全て、参照により完全に組み入れられる））。最近の研究は、アディポネクチンが、血小板由来増殖因子BB（PDGF-BB）、ヘパリン結合上皮増殖因子様増殖因子（HB-EGF）、および塩基性繊維芽細胞増殖因子（塩基性FGF）を含むいくつかの増殖因子と相互作用し、それらの活性を改変し得ることを示している（Wang et al.(2005)Journal of Biological Chemistry 280:18341-7(非特許文献9)（参照により完全に組み入れられる））。
【０００５】
Adは、複数のG-X-X-Gリピートを含むN末端コラーゲン様ドメインならびにC1QおよびTNFスーパーファミリーのメンバーの球状部分に構造的に類似しているC末端ドメインからなる30kDの糖タンパク質である。少なくとも二つのタンパク質分解切断部位が、コラーゲンドメインとC1Q様ドメインとの間に位置している。全長型およびタンパク質分解により切断された型の両方がヒト血清中に見出される。Adの球状部分（「球状」AdまたはgAd）は三量体構造を形成し、全長Ad（Ad）は三量体、六量体、およびさらに高次のオリゴマーを形成し得る。（全ての既知の哺乳動物Adに保存されている）コラーゲンドメインに位置しているシステイン残基の突然変異は、六量体および高次オリゴマーの形成を排除する。
【０００６】
Adに相同なタンパク質には、マウスC1q/TNF-α関連タンパク質1（CTRP1）、CTRP2、CTRP3、CTRP4、CTRP5、CTRP6、およびCTRP7が含まれるが、これらに限定はされない。これらのタンパク質のうちの少なくとも一つ（CTRP2）は、骨格筋における脂肪酸酸化を刺激することができ、従って、機能的特性がAdと類似しているかもしれない（Wong et al.(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.101:10302-7(非特許文献10)（参照により完全に組み入れられる））。
【０００７】
いくつかのAd多形が、特定のヒト集団内で発見されている。表現型の重度は、突然変異の位置に依る。例えば、G84R、G90S、Y111H、およびI164T突然変異は、肝臓によるインスリン感受性の制御において重要である可能性が高い、より高次のオリゴマーの形成の失敗の結果として、糖尿病および低アディポネクチン血症を引き起こす（Waki et al.(2003)J.Biol.Chem.278:40352-63(非特許文献11)（参照により完全に組み入れられる））。機能的に良性の多形には、R221SおよびH241Pが含まれる。
【０００８】
アミノ酸配列に基づき、既知のAd受容体（AdipoR1およびAdipoR2）は、いずれも、7回膜貫通型アルファヘリックスを含むと予測されるが、G共役型タンパク質受容体とは無関係である（Yamauchi et al.(2003)Nature 423:762-9(非特許文献12)（参照により完全に組み入れられる））。AdipoR1およびAdipoR2は相同であるが（＞67％の同一性）、AdおよびgAdに対する相対的な親和性は異なっている。骨格筋に主に発現しているAdipoR1は、Adより高い親和性でgAdに結合し、肝臓に主に発現しているAdipoR2は、Adに優先的に結合する。マウスにおけるインビボの結果は、三量体gAdが、Adの六量体型およびより高次のオリゴマー型より、体重を低下させ、インスリン感受性を改良する効果が高いことを示唆している（Yamauchi et al.(2001)Nature Medicine 7:941-6(非特許文献13)（参照により完全に組み入れられる））。
【０００９】
【非特許文献１】Goldstein and Scalia(2004)The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 89:2563-8
【非特許文献２】Wu et al.(2003)Diabetes 52:1355-63
【非特許文献３】Fruebis et al.(2001)PNAS 98:2005-10
【非特許文献４】Berg et al.(2002)TRENDS in Endocrinology and Metabolism 13:84-9
【非特許文献５】Yamauchi et al.(2002)Nature Medicine 8:1288-95
【非特許文献６】Yamauchi et al.(200)Journal of Biological Chemistry 278:2461-8
【非特許文献７】Shimada et al(2004)Clinica.Chemica.Acta.344:1-12
【非特許文献８】Hug and Lodish(2005)Current Opinion in Pharmacology 5:129-34
【非特許文献９】Wang et al.(2005)Journal of Biological Chemistry 280:18341-7
【非特許文献１０】Wong et al.(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.101:10302-7
【非特許文献１１】Waki et al.(2003)J.Biol.Chem.278:40352-63
【非特許文献１２】Yamauchi et al.(2003)Nature 423:762-9
【非特許文献１３】Yamauchi et al.(2001)Nature Medicine 7:941-6
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
本発明は、増加した組換えタンパク質発現のレベル、改良された溶解度または可溶性発現および安定性、より低い免疫原性、ならびに改良された薬物動態学および／または薬力学のために最適化された新規のアディポネクチン変異体を提供する。
【００１１】
従って、本発明は、所定の疎水性、所定の極性、所定の静電ポテンシャルを有する位置、Met、芳香族アミノ酸、配列番号：1の152位に相当するCys、野生型もしくは変異型アディポネクチンの等電点に影響を与えるアミノ酸、ベータシート形成、ヘリックスキャッピング、もしくは双極子相互作用に影響を与えるアミノ酸、またはそれらの組み合わせにおいて対応する野生型アディポネクチンに対する一つまたは複数のアミノ酸修飾を含むアディポネクチン変異体を特徴とする。アディポネクチン変異体は、対応する野生型アディポネクチンと比較して改良された安定性、溶解度もしくは可溶性発現、発現収率、5'-AMP活性化プロテインキナーゼ（AMPK）のリン酸化を誘導する能力、またはそれらの組み合わせを示す。
【００１２】
一つの局面において、本発明は、変異型ヒトアディポネクチンペプチドを含む組成物を特徴とする。変異体は、
2008526885.tif 000003
の式を含む。V（109）は、野生型アミノ酸V；変異型アミノ酸D、E、H、K、N、Q、およびRのいずれか；ならびにV109の欠失からなる群より選択され；V（110）は、野生型アミノ酸V；変異型アミノ酸D、E、H、K、N、Q、R、およびSのいずれか；ならびにV110の欠失からなる群より選択され；V（111）は、野生型アミノ酸YおよびH；変異型アミノ酸D、E、N、R、およびSのいずれか；ならびにY122の欠失からなる群より選択され；F（112）は、野生型アミノ酸RおよびCからなる群より選択され；F（113-121）は、野生型アミノ酸配列SAFSVGLET；ならびにS113、A114、F115、S116、V117、G118、L119、E120、およびT121のいずれかの欠失からなる群より選択され；V（122）は、野生型アミノ酸Y；変異型アミノ酸D、E、H、N、R、およびSのいずれか；ならびにY122の欠失からなる群より選択され；F（123-124）は、野生型アミノ酸配列VT；ならびにV123およびT124のいずれかの欠失からなる群より選択され；V（125）は、野生型アミノ酸配列I；変異型アミノ酸D、E、H、K N、Q、R、S、およびT；ならびにI125の欠失からなる群より選択され；F（126-127）は、野生型アミノ酸配列PNを含み；V（128）は、野生型アミノ酸M；ならびに変異型アミノ酸A、D、E、H、K、N、Q、R、S、およびTのいずれかからなる群より選択され；F（129-134）は、野生型アミノ酸配列PIRFTKを含み；V（135）は、野生型アミノ酸I；ならびに変異型アミノ酸D、E、H、K、N、Q、およびRのいずれかからなる群より選択され；F（136-151）は、野生型アミノ酸配列
2008526885.tif 000004
を含み；V（152）は、野生型アミノ酸C；ならびに変異型アミノ酸A、N、およびSのいずれかからなる群より選択され；F（153-163）は、野生型アミノ酸配列NIPGLYYFAYHを含み；F（164）は、野生型アミノ酸IおよびTからなる群より選択され；F（165-181）は、野生型アミノ酸配列
2008526885.tif 000005
を含み；V（182）は、野生型アミノ酸M；ならびに変異型アミノ酸A、D、E、K、N、Q、R、S、およびTのいずれかからなる群より選択され；F（183）は、野生型アミノ酸Lを含み；V（184）は、野生型アミノ酸F；ならびに変異型アミノ酸D、H、K、N、およびRのいずれかからなる群より選択され；F（185-206）は、野生型アミノ酸配列
2008526885.tif 000006
を含み；V（207）は、野生型アミノ酸V；ならびに変異型アミノ酸D、E、H、K、N、Q、R、およびSのいずれかからなる群より選択され；F（208-220）は、野生型アミノ酸配列
2008526885.tif 000007
を含み；F（221）は、野生型アミノ酸RおよびSからなる群より選択され；F（222-223）は、野生型アミノ酸配列NGを含み；V（224）は、野生型アミノ酸L；ならびに変異型アミノ酸D、E、H、K、N、Q、R、およびSのいずれかからなる群より選択され；V（225）は、野生型アミノ酸Y；ならびに変異型アミノ酸D、E、H、K、N、Q、R、およびSのいずれかからなる群より選択され；F（226）は、野生型アミノ酸Aを含み；V（227）は、野生型アミノ酸D；ならびに変異型アミノ酸H、K、およびRのいずれかからなる群より選択され；F（228）は、野生型アミノ酸配列Nを含み；またはV（229）は、野生型アミノ酸D；ならびに変異型アミノ酸H、K、およびRのいずれかからなる群より選択される。
【００１３】
一つの態様において、変異体は、122H；122S；125E；125H；125T；184H；207E；および207Kからなる群より選択される置換を含む。
【００１４】
もう一つの態様において、変異体は、置換のような修飾を少なくとも二つ含む。
【００１５】
いくつかの態様において、変異体の溶解度または可溶性発現は、少なくともn倍改良されている（ここで、nは2〜2000の任意の数である）。例えば、変異体の溶解度または可溶性発現は、少なくとも30、100、300、および1000倍改良され得る。
【００１６】
いくつかの態様において、変異体の発現収率は、少なくともn倍改良されている（ここで、nは2〜10000の任意の数である）。例えば、変異体の発現収率は、少なくとも2、5、10、50、100、300、500、1000、3000、および10000倍改良され得る。
【００１７】
いくつかの態様において、変異体の筋細胞におけるAMPKのリン酸化を誘導する能力は、少なくとも30％または100％、改良されている
【００１８】
対応する野生型アディポネクチンは、ヒトアディポネクチン（配列番号：1）であり得、変異体は、配列番号：1の109、110、115、122、123、125、128、130、132、135、150、152、160、164、166、171、173、175、182、184、205、207、211、213、215、224、225、227、229、または234位で、一つまたは複数のアミノ酸修飾を含み得る。または、対応する野生型アディポネクチンは、非ヒトアディポネクチンであってもよい。
【００１９】
もう一つの局面において、本発明は、上記のアディポネクチン変異体をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を特徴とする。
【００２０】
溶解度または可溶性発現が、少なくともn倍改良されている（ここで、nは2〜2000の任意の数である）、変異型アディポネクチンペプチドを含む組成物も、本発明に含まれる。例えば、変異体の溶解度または可溶性発現は、少なくとも30、100、300、および1000倍改良されている。
【００２１】
Adに対する特に好ましい修飾には、以下の置換が含まれるが、これらに限定はされない：
2008526885.tif 000008
、またはそれらの組み合わせ。
【００２２】
本発明の前記のおよびその他の特徴、ならびにそれらを入手し使用する様式は、添付の図面と併せて以下の説明を参照することによって、より明白になり、最もよく理解されるであろう。これらの図面は、本発明の典型的な態様を示すものにすぎず、従って、その範囲を限定しない。
【００２３】
発明の詳細な説明
より完全に本発明が理解され得るよう、いくつかの定義を以下に示す。そのような定義には、文法上の相当語句が包含されるものとする。
【００２４】
本明細書中、「アディポネクチン」とは、脂肪細胞に主として由来するポリペプチドを意味し、天然に存在するアディポネクチンの断片、特に、アディポネクチンの球状ドメインを含む断片を含む、図3に示された任意の配列のオルソログである。
【００２５】
本明細書中、「アディポネクチン変異体」とは、アディポネクチンと機能的に等価であるが、天然に存在するアディポネクチン配列に対する修飾を含むポリペプチドを意味する。
【００２６】
本明細書中、「球状ドメイン」とは、Adに関して、C1q/TNF-α様ドメインを意味し、コラーゲンドメインは含まない。この領域には、ヒトAd前駆型（配列番号：1、図1）の残基108〜244が含まれ得るが、これに限定はされない。
【００２７】
「疎水性残基」および文法上の相当語句は、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびそれらの機能的等価物を意味する。
【００２８】
本明細書中、「極性残基」および文法上の相当語句は、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、およびそれらの機能的等価物を意味する。
【００２９】
本明細書中、「タンパク質の特性」とは、物理的特性（分子量、回転半径のような流体力学的特性、正味の電荷、等電点、および吸光係数のようなスペクトル特性を含む）、構造的特性（二次、三次、および四次構造要素を含む）、安定性（熱的安定性、pHもしくは溶液条件の関数としての安定性、貯蔵安定性、ユビキチン化、タンパク質分解、またはメチオニン酸化、アスパラギンおよびグルタミンの脱アミド、側鎖のラセミ化（racemerization）もしくはエピマー化、およびペプチド結合の加水分解のような化学的修飾に対する抵抗性または感受性を含む）、溶解度（様々な条件下での凝集に対する感受性、オリゴマー化状態、および結晶化可能性を含む）、動力学的および動的な特性（可動性、剛性、折り畳み速度、折り畳みメカニズム、アロステリー、ならびにコンフォメーション変化および相関する運動を起こす能力を含む）、結合の親和性および特異性（タンパク質、核酸、多糖、脂質、および低分子を含む一つまたは複数の分子に対するもの、親和性ならびに会合および解離の速度を含む）、酵素活性（基質特異性；会合、反応、および解離の速度；反応メカニズム；ならびにpHプロファイルを含む）、合成的修飾（PEG化および他の分子または表面への接着を含む）の受けやすさ（ammenability）、発現特性（一つまたは複数の発現宿主における収率、可溶性発現対封入体発現、細胞内局在、分泌される能力、および細胞の表面にディスプレイされる能力のような）、プロセシングおよび翻訳後修飾（タンパク質分解プロセシング、NまたはC結合型グリコシル化、脂質付加、硫酸化、およびリン酸化を含む）、薬物動態学的および薬力学的な特性（皮下、筋肉内、経口、または肺への送達後の生物学的利用能；血清半減期、分布、ならびに排除のメカニズムおよび速度を含む）、ならびに改変された表現型または変化した生理学を誘導する能力（免疫原性、毒性、シグナルを伝達するかまたはシグナリングを阻害する能力、細胞の増殖、分化、または遊走を刺激または阻害する能力、アポトーシスを誘導する能力、および疾患を処置する能力を含む）を含む（がこれらに限定はされない）物理的、化学的、および生物学的な特性を意味する。
【００３０】
本明細書中、「溶解度」および文法上の相当語句は、明示された条件（即ち、pH、温度、緩衝成分、塩、界面活性剤、オスモライトの濃度等）の溶液における、所望の、または生理学的に適切なオリゴマー化状態における、タンパク質の最高の可能な濃度を意味する。
【００３１】
本明細書中、「改良された溶解度」および文法上の相当語句は、溶液における、所望の、または生理学的に適切なオリゴマー化状態における、タンパク質の最高の可能な濃度の増加を意味する。例えば、天然に存在するタンパク質が1mMに濃縮され得、変異体が同一の溶液条件下で5mMに濃縮され得る場合、その変異体は改良された溶解度を有すると言える。好ましい態様において、溶解度は、少なくとも2倍、増加し、少なくとも5倍または10倍の増加が特に好ましい。当業者によって認識されるであろうように、溶解度は溶液条件の関数である。本発明の目的のため、溶解度は、薬学的に許容される溶液条件の下で査定されるべきである。具体的には、pHは6.0〜8.0であるべきであり、塩濃度は50〜250mMであるべきである。賦形剤のような付加的な緩衝成分も含まれ得るが；アルブミンは必要とされないことが好ましい。
【００３２】
本明細書中、「可溶性発現」および文法上の相当語句は、界面活性剤の非存在下で調製された粗上清の中の標的タンパク質の量を意味する。例えば、標的タンパク質が適切な発現系において発現され、細胞が採集され、界面活性剤の非存在下で溶解させられ、粗上清が標準的な方法によって調製される。粗上清中の標的タンパク質の量が、可溶性発現タンパク質である。
【００３３】
本明細書中、「改良された可溶性発現」および文法上の相当語句は、親タンパク質と比べた、界面活性剤の非存在下で調製された粗上清の中の変異型タンパク質の量の増加を意味する。
【００３４】
「修飾」および文法上の相当語句は、タンパク質または核酸の配列に対する一つまたは複数の挿入、欠失、または置換を意味する。挿入および置換には、天然に存在する、または天然には存在しないアミノ酸およびヌクレオチド、ならびにそれらの機能的等価物が含まれる。
【００３５】
本明細書中、「天然に存在する」または「野生型」または「wt」およびそれらの文法上の相当語句は、対立遺伝子バリエーションを含む、自然界に見出されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。好ましい態様において、野生型配列は最も優勢なヒト配列である。しかしながら、野生型Adの核酸およびタンパク質は、比較的優勢でないヒト対立遺伝子、またはげっ歯類（ラット、マウス、ハムスター、モルモット等）、霊長類、および家畜（ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ等を含む）を含む（がこれらに限定はされない）多数の任意の生物に由来するAdの核酸およびタンパク質であってもよい。
【００３６】
本明細書中、「発現収率」および文法上の相当語句は、所定の発現プロトコル（即ち、特定の発現宿主、トランスフェクション法、培地、時間等）の下で産生または分泌される、好ましくは、mg/LまたはPCD（1日当たりの細胞1個当たりのピコグラム）単位のタンパク質の量を意味する。
【００３７】
本明細書中、「改良された発現収率」および文法上の相当語句は、所定の発現条件のセットの下での、野生型または親タンパク質と比べた発現収率の増加を意味する。好ましい態様において、少なくとも50％の改良が達成され、少なくとも100％、5倍、10倍、またはそれ以上の改良が、特に好ましい。
【００３８】
前述のように、健康な個体における内因性Adの血清レベルは、典型的には2〜10ug/mlであり、これは、他の血清タンパク質と比べてかなり多量である。これらの量が、例えば、肥満または糖尿病を処置するための有効な補充療法のために必要とされるのであれば、大量の、高度に可溶性の、凝集傾向のないタンパク質が必要とされるであろう。これは、患者へのAd投与を支援し、効率的な生成物製造をもたらす可能性が高い。
【００３９】
本発明は、アディポネクチンが、ポリペプチドの物理的特性および／または生物学的活性が改良されるよう修飾され得るという予想外の発見に、少なくとも一部、基づく。従って、本発明は、対応する野生型アディポネクチンと比較して改良された物理的性質（例えば、安定性、溶解度または可溶性発現、および発現収率）、ならびに／または生物学的活性（例えば、AMPKのリン酸化を誘導する能力）を有するアディポネクチン変異体を提供する。変異体は、対応する野生型アディポネクチンに対する一つまたは複数のアミノ酸修飾を含む。修飾は、以下の位置においてなされ得る：
（1）所定の疎水性および露出率を有する位置。アミノ酸の疎水性および露出率は、下記のようにして、または当技術分野において周知の任意の方法によって決定され得る。好ましい態様において、露出疎水性アミノ酸の上位10％が修飾のために選択される。
（2）所定の極性を有する位置。極性残基の例には、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、およびセリンが含まれる。いくつかの態様において、アディポネクチンに天然に存在する中性極性残基が、電荷を有する極性残基に置換される。
（3）所定の静電ポテンシャルを有する位置。アミノ酸の静電ポテンシャルは、下記のようにして、または当技術分野において周知の任意の方法によって決定され得る。好ましい態様において、0.5kcal/mol超または-0.5kcal/mol未満の静電ポテンシャルを有するアミノ酸が、修飾のために選択される。
（4）Metを有する位置、例えば、配列番号：1の40、128、168、および182位。
（5）ヒドロキシProを有する位置、例えば、配列番号：1の44、47、53、62、71、86、95および104位。
（6）芳香族アミノ酸を有する位置、例えば、配列番号：1の46、49、および94位。
（7）配列番号：1の152位に相当するCys。
（8）PEG化部位を有する位置、例えば、配列番号：1の108、109、110、120、127、133、136、137、139、141、146、170、179、180、184、186、188、189、191、192、196、202、204、206、207、208、218、220、221、223、224、225、226、227、229、240、243、および244位。
（9）野生型または変異型アディポネクチンの等電点に影響を与えるアミノ酸を有する位置。そのようなアミノ酸は、当技術分野において周知の任意の方法によって決定され得る。そのようなアミノ酸の例には、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アルギニン、チロシン、およびシステインが含まれる。
（10）ベータシート形成、ヘリックスキャッピング、または双極子相互作用に影響を与えるアミノ酸を有する位置。そのようなアミノ酸は、当技術分野において周知の任意の方法によって決定され得る。
【００４０】
溶解度または可溶性発現を改良するための戦略
改良された溶解度または可溶性発現および発現収率を有するアディポネクチン変異体を設計するため、多様な戦略が利用され得る。好ましい態様において、以下の戦略のうちの一つまたは複数が使用される：1）一つまたは複数の溶媒露出疎水性残基を適当な極性残基に置換することにより疎水性を低下させる、2）一つまたは複数の中性極性残基を電荷を有する極性残基に置換することにより極性特徴を増加させる、3）例えば、疎水性コア内のパッキングを改良するか、ベータシート形成傾向を増加させるか、ヘリックスキャッピングおよび双極子相互作用を改良するか、または不都合な静電相互作用を除去する一つまたは複数の修飾によってタンパク質の安定性を増加させる（タンパク質の安定性の増加は、凝集傾向のある部分的に折り畳まれたまたは誤って折り畳まれた状態の集団を減少させることにより、溶解度または可溶性発現を改良し得る）、4）タンパク質の等電点に影響を与え得る一つまたは複数の残基（即ち、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アルギニン、チロシン、およびシステイン残基）を修飾する。タンパク質の溶解度または可溶性発現は、典型的には、タンパク質の等電点が周囲の溶液のpHと等しい場合に最小となる。従って、タンパク質の等電点を、血清のような関連する環境のpHから遠ざけて攪乱する修飾は、溶解度または可溶性発現を改良するよう作用し得る。さらに、タンパク質の等電点を減少させる修飾は、注射部位における吸収を改良し得る（Holash et.al.(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99:11393-8（参照により完全に組み入れられる））、5）NまたはC末端残基の短縮、6）溶解度または可溶性発現のタグ（例えば、高い溶解度または可溶性発現を有するペプチドまたは化学的モエティ）の付加または化学的接着、7）PEG化、および8）グリコシル化部位の導入。付加的な戦略は、溶解度または可溶性発現を改良する変異体を発見するための定向進化法の使用を含み得る（例えば、Waldo(2002)Curr Opin Chem Biol.7(1):33-8を参照のこと）。
【００４１】
発現収率を改良するための戦略
多数の核酸特性およびタンパク質特性が、発現収率に影響を及ぼし得；さらに、発現宿主および発現プロトコルが収率に寄与する。これらのパラメーターのいずれかが、発現収率を改良するために最適化され得る。また、発現収率は、さらに後述されるように、改良された安定性および／または溶解度または可溶性発現を付与する一つまたは複数の突然変異の取り込みによっても改良され得る。さらに、プロドメインと成熟ドメインとの間の相互作用が、折り畳み効率に影響するかもしれず、従って、プロドメインも修飾の標的となり得る。
【００４２】
別の態様において、発現が真核生物系でなされる場合には、以下の戦略のうちの一つまたは複数を使用して、発現収率を改良するために、核酸特性が最適化される：1）不完全なコザック配列を交換する、2）RNAの5'GC含有量および二次構造を低下させる、3）コドン使用を最適化する、4）別のリーダー配列を使用する、5）キメライントロンを含める、または6）メッセージのC末端に最適化されたポリAテールを付加する。もう一つの好ましい態様において、以下の戦略のうちの一つまたは複数を使用して、発現収率を改良するために、タンパク質特性が最適化される：1）シグナル配列を最適化する、2）タンパク質分解プロセシング部位を最適化する、3）不適切なジスルフィド結合の形成を最小限に抑えるために一つまたは複数のシステイン残基を交換する、4）タンパク質折り畳みの速度もしくは効率を改良する、または5）タンパク質の安定性、特に、タンパク質分解に対する安定性を増加させる。別の好ましい態様において、別のプロドメイン配列が使用される。例えば、アディポネクチン-2由来のプロドメインが、アディポネクチン-4の発現を補助するために使用され得る（Wozney et al.(1988)Science 242:1528-34（参照により完全に組み入れられる））。使用され得るプロドメインには、TNFアルファスーパーファミリー配列プロドメインからのプロドメインが含まれるが、これらに限定はされない。プロドメインは、シスまたはトランスで発現され得る。
【００４３】
免疫原性を低下させるための戦略
タンパク質の免疫原性をモジュレートするためのいくつかの方法が開発されている。いくつかの例において、PEG化が、抗体アグリトープへの接近を立体的に阻止することにより、中和抗体を生じる患者の画分を低下させることが観察された（例えば、Hershfield et al.(1991)PNAS 88:7185-9；Bailon et al.(2001)Bioconjug.Chem.12:195-202；He et al.(1999)Life Sci.65:355-68（全て、参照により完全に組み入れられる）を参照のこと）。凝集物は可溶性タンパク質より免疫原性であることが観察されているため、タンパク質治療薬の溶液特性を改良する方法も、免疫原性を低下させ得る。免疫原性を低下させるための付加的な方法には、可能性のあるMHCアグリトープおよび／またはT細胞エピトープの除去、ならびに抗原性を減少させるための修飾が含まれる。
【００４４】
合理的PEG化
もう一つの好ましい態様において、一つまたは複数のシステイン、リジン、ヒスチジン、またはその他の反応性アミノ酸が、PEG化部位を組み入れるために、変異型AdまたはgAdタンパク質へと設計される。また、特定の位置におけるPEG化部位の取り込みを防止するために、一つまたは複数のシステイン、リジン、ヒスチジン、またはその他の反応性アミノ酸を除去することも可能である。例えば、好ましい態様において、非不安定PEG化部位が、活性の欠損を最小限に抑えるために、Ad三量体化インターフェースおよび任意の必要とされる受容体結合部位から除去されるよう選択される。
【００４５】
タンパク質の設計および操作の方法
改良された溶解度または可溶性発現、ならびに保持または改良された、細胞の増殖、遊走、分化、およびアポトーシスを制御する能力を有するAd変異体を与えるであろう修飾（即ち、挿入、欠失、または置換突然変異）を同定するために、多数の方法が使用され得る。これらの方法には、配列プロファイリング（Bowie and Eisenberg(1991)Science 253:164-70）、回転異性体ライブラリー選択（Dahiyat and Mayo(1996)Protein Sci 5:895-903；Dahiyat and Mayo(1997)Science 278:82-7；Desjarlais and Handel(1995)Prot.Sci.4:2006-18；Harbury et al.(1995)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 92:8408-12；Kono et al.(1994)Proteins 19:244-55；Hellinga and Richards(1994)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91:5803-7）、および残基対ポテンシャル（residue pair potentials）（Jones(1994)Prot.Sci.3:567-74）（全て、参照により完全に組み入れられる）が含まれるが、これらに限定はされない。
【００４６】
好ましい態様において、Adおよび関連タンパク質の一つまたは複数の配列アラインメントが、各位置と適合性である可能性が高い残基を同定するために分析される。好ましい態様において、PFAM、BLAST、またはClustalWアラインメントアルゴリズムが、多種のAdオルソログ、C1q/TNF-αスーパーファミリー、またはさらなるCTRPファミリーのメンバー、ホモログ、オルソログ、もしくはパラログのアラインメントを作製するために使用される。各可変位置について、適当な置換は、相同配列の同一の位置に観察される残基として定義され得る。特に好ましい置換は、相同配列に高頻度に観察される置換である。
【００４７】
特に好ましい態様において、改良されたAd変異体の合理的設計は、プロテインデザインオートメーション（Protein Design Automation）（登録商標）（PDA（登録商標））技術を使用することにより達成される；米国特許第6,188,965号；第6,269,312号；第6,403,312号；第6,708,120号；WO98/47089；米国特許出願第09/058,459号；第09/127,926号；第60/104,612号；第60/158,700号；第09/419,351号；第60/181,630号；第60/186,904号；第09/782,004号；第09/927,790号；第60/347,772号；第10/218,102号；第60/345,805号；第60/373,453号；第60/374,035号；およびPCT/US01/218,102（全て、参照により完全に組み入れられる）を参照のこと。
【００４８】
PDA（登録商標）技術は、改良された特性を有するタンパク質を発見するため、良質の配列多様性を作製するコンピュータによる設計アルゴリズムを、実験的なハイスループットスクリーニングと結び付けたものである。コンピュータ成分は、タンパク質の配列と構造と機能との間の関係を正確に捕獲するため、原子レベルスコア化関数、側鎖回転異性体サンプリング、および高度の最適化法を使用する。計算は、タンパク質の三次元構造、およびタンパク質の一つまたは複数の特性を最適化するための戦略から開始する。次いで、PDA（登録商標）技術は、設計の標的とされた位置に全ての適切なアミノ酸（所望により、非天然アミノ酸を含む）を含む配列空間を探索する。これは、許されたアミノ酸のコンフォメーション状態をサンプリングし、タンパク質構造を支配する物理的および化学的な力を記載するパラメータ化され実験的に確証された関数を使用して、それらをスコア化することにより、達成される。次いで、強力なコンビナトリアル検索アルゴリズムが、1050以上の配列を構成し得る第一の配列空間を検索し、設計基準を満たすと予測される扱いやすい数の配列を迅速に戻すために使用される。技術の有用なモードは、コンビナトリアル配列設計から、最適な単一部位置換の優先順位を付けられた選択にまで及ぶ。
【００４９】
好ましい態様において、各極性残基は、不連続の低エネルギー側鎖コンフォメーションのセットを使用して表わされる（例えば、Dunbrack(2002)Curr.Opin.Struct.Biol.12:431-40（参照により完全に組み入れられる）を参照のこと）。好ましい力場には、とりわけ、ファンデルワールス相互作用、水素結合、静電相互作用、および溶媒和を記載する項が含まれ得る。
【００５０】
好ましい態様において、デッドエンドエリミネーション（Dead-End Elimination）（DEE）が、最も好都合なエネルギーを有する各極性残基の回転異性体を同定するために使用される（Gordon et al.(2003)J.Comput Chem.24:232-43、Goldstein(1994)Biophys.J.66:1335-40、およびLasters and Desmet(1993)Prot.Eng.6:717-22（全て、参照により完全に組み入れられる）を参照のこと）。
【００５１】
別の態様において、モンテカルロ（Monte Carlo）が、好都合なエネルギーを有する極性残基の群を同定するために、DEEと併せて使用され得る。
【００５２】
好ましい態様において、一つまたは複数のPDA（登録商標）技術計算を実施した後、変異型タンパク質のライブラリーが設計され、実験的に構築され、所望の特性に関してスクリーニングされる。
【００５３】
別の好ましい態様において、配列予測アルゴリズム（sequence prediction algorithm）（SPA）が、既知のタンパク質骨格構造と適合性のタンパク質を設計するために使用される（Raha et al.(2000)Protein Sci.9:1106-19ならびに米国特許出願第09/877,695号および第10/071,859号（全て、参照により完全に組み入れられる））。
【００５４】
ライブラリー選択
上記の計算のうちの一つまたは複数を実施した後、一つまたは複数の好ましい修飾を含むライブラリーが提唱され得る。得られたライブラリーは、実験的に作成され、一つまたは複数の変異体が所望の特性を保有していることを確認するためにスクリーニングされ得る。好ましい態様において、ライブラリーは、上記の計算のうちの少なくとも一つを使用して同定された好ましい点突発変異を含む。
【００５５】
別の態様において、ライブラリーは、コンビナトリアルライブラリーである、即ち、ライブラリーは、可変位置の各々に好ましい残基の全ての可能な組み合わせを含む。例えば、3および9位が変動させられ、3位における好ましい選択がA、V、およびIであり、かつ9位における好ましい選択がEおよびQである場合、ライブラリーは、以下の六つの変異型配列を含む：3A/9E、3A/9Q、3V/9E、3V/9Q、3I/9E、および3I/9Q。
【００５６】
別の態様において、ライブラリー構築は、マスターgAd配列において実施される。N末端短縮点は、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、および126位を含む（がこれらに限定はされない）位置にあり得る。
【００５７】
各露出疎水性位置のための適当な極性残基の同定
好ましい態様において、溶媒露出疎水性残基は、構造的かつ機能的に適合性の極性残基に交換される。アラニンおよびグリシンも、疎水性の低下を構成する適当な交換として作用し得る。さらに、PheからTyrのような極性特徴を増加させる突然変異、およびIleからValのような疎水性を低下させる突然変異が、適切であり得る。
【００５８】
好ましい態様において、Ad内の溶媒露出疎水性残基は、Adの三次元構造またはモデルの分析によって同定される。好ましい態様において、溶媒接近可能表面積（solvent-accessible surface area）は、当技術分野において公知の多様な方法のいずれかを使用して計算される。好ましい態様において、溶媒接近可能表面積は、疎水性指数と組み合わせられる。好ましい態様において、各残基についての疎水性露出指数（hydrophobicity exposure index）（HEI）が、残基の溶媒露出率（fractional solvent-exposure）に、そのアミノ酸残基型についてのFauchereおよびPliskaの疎水性指数を乗じることにより計算される（Fauchere and Pliska(1983)Eur.J.Med.Chem.18:369-75（参照により完全に組み入れられる））。好ましい態様において、正のHEIを有する残基が、修飾のために選択される。
【００５９】
好ましい態様において、修飾のための位置および変異体が、上記の基準により選択され、次いで、実験的に作製された好ましい変異体が、改良された発現レベルによって、経験的に選択される。
【００６０】
好ましい態様において、好ましい適当な極性残基は、以下のような極性残基と定義される：1）PDA（登録商標）技術を使用して決定されるような最適な回転異性体配置におけるエネルギーが、その位置における露出疎水性残基のエネルギーより好都合である残基、および2）最適な回転異性体配置におけるエネルギーが、その位置における全ての極性残基のエネルギーのセットのうち最も好都合なものの一つである残基。
【００６１】
好ましい態様において、各可変位置においてライブラリーに含まれている極性残基は、PDA（登録商標）技術計算および配列アラインメントデータの両方によって適当であると見なされる。または、ライブラリーに含まれる極性残基の一つまたは複数が、PDA（登録商標）技術計算または配列アラインメントデータのいずれかによって適当であると見なされる。
【００６２】
Adに対する特に好ましい修飾には、以下の置換が含まれるが、これらに限定はされない：
2008526885.tif 000009
、またはそれらの組み合わせ。
【００６３】
当業者は、上記の置換が、Adの全長および断片の両方を最適化するために適用されてもよいし、非ヒトアディポネクチンオルソログを修飾するために使用されてもよいことを認識するであろう。
【００６４】
本発明は、上記のアディポネクチン変異体をコードする配列を含むポリヌクレオチド（DNAまたはRNA）も提供する。
【００６５】
本発明のアディポネクチン変異体およびポリヌクレオチドは、下記のようにして、または当技術分野において周知の任意の化学合成もしくは遺伝子操作法によって作成され得る。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のアディポネクチン変異体を作製するために使用され得、そのアディポネクチン変異体は、次に、抗体を作製するために使用され得る。
【００６６】
本発明のアディポネクチン変異体およびポリヌクレオチドは、薬学的組成物に組み入れられ得る。そのような組成物は、典型的には、アディポネクチン変異体またはポリヌクレオチドと、薬学的に許容される担体とを含む。薬学的組成物は、意図された投与経路と適合性であるよう製剤化される。例えば、米国特許第6,756,196号（参照により完全に組み入れられる）を参照のこと。投与経路の例には、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸の投与が含まれる。非経口、皮内、または皮下の適用のために使用される溶液または懸濁物は、以下の成分を含み得る：注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、またはその他の合成溶媒のような無菌の希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸のようなキレート化剤、酢酸、クエン酸、またはリン酸のような緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような張度の調整のための薬剤。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基により調整され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックで作成されたアンプル、使い捨て注射器、または多用量バイアルに封入され得る。
【００６７】
一つの態様において、本発明のアディポネクチン変異体およびポリヌクレオチドは、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む、放出制御製剤のような、身体からの迅速な排除からアディポネクチン変異体およびポリヌクレオチドを保護するであろう担体により調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような生分解性、生体適合性のポリマーが使用され得る。そのような製剤の調製のための方法は、当業者には明白であろう。材料は、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals,Incより商業的にも入手され得る。（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体により感染細胞へとターゲティングされたリポソームを含む）リポソーム懸濁物も、薬学的に許容される担体として使用され得る。これらは、例えば、米国特許第4,522,811号（参照により完全に組み入れられる）に記載されているような、当業者に公知の方法により調製され得る。
【００６８】
投与の容易さおよび投薬量の均一性のため、投薬単位形態で経口または非経口の組成物を製剤化することが有利である。「投薬単位形態」とは、本明細書において使用されるように、各単位が、必要とされた薬学的担体と共に所望の治療効果を生ずるために計算された所定の量の活性化合物を含む、処置される対象のための単位投薬量として適した物理的に不連続の単位をさす。
【００６９】
薬学的組成物は、包装された製品が形成されるよう、投与のための説明と共に、コンテナ、パック、またはディスペンサーに含まれ得る。例えば、包装された製品は、コンテナ、有効量の本発明のアディポネクチン変異体またはポリヌクレオチド、およびアディポネクチン関連状態を処置するために化合物を投与することを示す、コンテナに付随した挿入物を含み得る。
【００７０】
処置の方法
本発明は、有効量の上記組成物をその必要のある対象へ投与することにより、アディポネクチン関連状態を処置する方法をさらに提供する。「処置」という用語は、障害、障害の症状、障害による二次性の疾患状態、または障害の素因を矯正、緩和、軽減、治療、防止、または改善することを目的とした、対象への物質の投与と定義される。「対象」とは、本明細書において使用されるように、ヒト、ならびに全ての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類（特に、高等霊長類）、ヒツジ、イヌ、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、ウシのような哺乳動物、およびニワトリ、両生類、爬虫類のような非哺乳動物等を含む非ヒト動物をさす。好ましい態様において、対象はヒトである。もう一つの態様において、対象は、実験動物または疾患モデルとして適当な動物である。候補対象の同定は、対象または保健医療専門家によって判断され得、主観的（例えば、見解）または客観的（例えば、試験または診断法によって測定可能）であり得る。「有効量」とは、処置された対象において医学的に望ましい結果を生ずることができる組成物の量である。医学的に望ましい結果は、客観的（即ち、何らかの試験またはマーカーによって測定可能、例えば、減少または増加した遺伝子の発現）であってもよいし、または主観的（即ち、対象が、効果の徴候を示すかまたは効果を感じる）であってもよい。処置の方法は、単独で実施されてもよいし、または他の薬物および／もしくは療法と併せて実施されてもよい。
【００７１】
一つのインビボのアプローチにおいて、本発明のアディポネクチン変異体を含む組成物は、対象に投与される。一般に、組成物（ccomposition）は、経口的に投与されるか、静脈内（i.v.）注入によって投与されるか、または皮下、筋肉内、くも膜下腔内、腹腔内、直腸内、膣内、鼻腔内、胃内、気管内、もしくは肺内に注射もしくは移植される。必要とされる投薬量は、投与経路の選択、製剤の性質、対象の疾病の性質、対象のサイズ、体重、表面積、年齢、および性別、投与される他の薬物、ならびに主治医の判断に依る。適当な投薬量は、0.01〜100.0mg/kgの範囲にある。必要とされる投薬量の広い変動が、入手可能な化合物の種類および様々な投与経路の異なる効率を考慮して予想される。例えば、経口投与は、i.v.注射による投与より高い用量を必要とすると予想されるであろう。これらの投薬レベルの変動は、当技術分野において十分に理解されているような最適化のための標準的な経験的なルーチンを使用して調整され得る。適当な送達媒体（例えば、ポリマー性微粒子または移植可能装置）への組成物の封入は、特に、経口送達のため、送達の効率を増加させ得る。
【００７２】
いくつかの態様において、DNAおよびRNAのようなポリヌクレオチドが対象に投与される。ポリヌクレオチドは、例えば、当技術分野において公知のポリマー性、生分解性の微粒子またはマイクロカプセル装置の使用により、標的細胞に送達され得る。核酸の取り込みを達成するためのもう一つの手段は、標準的な方法によって調製されたリポソームを使用することである。ポリヌクレオチドは、これらの送達媒体へ単独で組み入れられてもよいし、または組織特異的もしくは腫瘍特異的な抗体と共に組み入れられてもよい。または、静電気的または共有結合性の力によってポリL-リジンに接着したポリヌクレオチドから構成された分子コンジュゲートを調製することも可能である。ポリL-リジンは、標的細胞上の受容体に結合し得るリガンドと結合する。「裸のDNA」（即ち、送達媒体なし）が、筋肉内、皮内、または皮下の部位に送達されてもよい。ポリヌクレオチドの投与のための好ましい投薬量は、およそ106〜1012コピーのポリヌクレオチド分子である。
【００７３】
関連するポリヌクレオチド（例えば、発現ベクター）において、センスまたはアンチセンスRNAをコードする核酸配列は、プロモーターまたはエンハンサー-プロモーター組み合わせと機能的に連結される。適当な発現ベクターには、プラスミド、ならびに、とりわけヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、弱毒化ワクシニアウイルス、カナリアポックスウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスのようなウイルスベクターが含まれる。
【００７４】
好ましい態様において、アディポネクチンもしくは球状アディポネクチン、または全長もしくは球状アディポネクチンの変異体は、肥満およびメタボリックシンドロームを含む（がこれらに限定はされない）代謝疾患の処置のため、単独で、または組み合わせ療法において使用されるであろう（Moller and Kaufman(2005)Ann.Rev.Med.56:45-62（参照により完全に組み入れられる））。従って、本発明のアディポネクチン変異体は、肥満、インスリン抵抗性、グルコース不耐性、高血圧、異脂肪血症（高トリグリセリド血症および低HDLコレステロールレベル）、冠動脈心疾患、および糖尿病を処置するために使用され得る。さらに、この治療モードにおいて、アディポネクチンまたは球状アディポネクチンは、以下の物質と組み合わせて使用され得る：インスリンもしくはインスリンアナログ、TZDもしくはフィブラートクラスの薬物を含む（がこれらに限定はされない）PPAR-アゴニスト、スルホニル尿素クラスの薬物のメンバー、インスリン感受性改善剤メトホルミン、GLP-1アンタゴニスト薬、またはオーリスタット、リモノバン（rimonobant）、もしくはその他の満腹誘導物質のような食欲抑制剤。アディポネクチンとこれらの付加的な物質のいずれかとの組み合わせ、特に、インスリンとの組み合わせ療法は、両方の薬物の治療効果を改良し得る。
【００７５】
以下の実施例は、本発明の範囲を限定するのではなく、例示するためのものである。これらの実施例は、特定の適用または動作理論に本発明を拘束するものではない。そのような実施例は、使用され得るものの典型であり、当業者に公知のその他の手法が、代替的に利用されてもよい。実際、当業者は、過度の実験なしに、本明細書中の教示に基づき、さらなる態様を容易に構想し作製することができる。本発明において論じられた全ての位置に関して、番号付けは、図1にリストされたような全長ヒトアディポネクチンによるものである。
【００７６】
実施例1：Adコラーゲン領域の相同性モデリング
後の計算のために必要とされる三量体ヒトAdコラーゲン領域のモデルを作出するため、コラーゲンの結晶構造（プロテインデータバンク（Protein Data Bank）エントリー1K6F）を鋳型として使用した。当技術分野において周知の方法を、ヒト相同性モデルを作製するために使用した。
【００７７】
実施例2：Adコラーゲン領域内の露出疎水性残基の同定
Adコラーゲン領域構造を、溶媒露出疎水性残基を同定するために分析した。各鎖の各残基の溶媒露出疎水性表面積の絶対値および分率を、1.4Å（オングストローム）のアド-オン半径を使用して、LeeおよびRichards（(1971)J.Mol.Biol.55:379-400（参照により完全に組み入れられる）の方法を使用して計算した。三つの鎖全てについて平均された値が、表1にリストされる。
【００７８】
（表１）Adコラーゲン領域内の露出疎水性残基および代替極性残基
2008526885.tif 000010
【００７９】
各残基についての疎水性露出指数（HEI）を、残基の溶媒露出率に、そのアミノ酸残基型についてのFauchereおよびPliskaの疎水性指数を乗じることにより計算し（Fauchere and Pliska(1983)Eur.J.Med.Chem.18:369-75（参照により完全に組み入れられる））、表1にリストした。
【００８０】
Adコラーゲン領域内の溶媒露出疎水性残基とは、少なくとも50Å2（平方オングストローム）の露出疎水性表面積および0.4超のHEI値を有する疎水性残基であると定義された。
【００８１】
実施例3：Adオルソログアラインメントに基づく代替極性残基の同定
マウス（Genbankアクセッション番号Q60994）、ラット（Genbankアクセッション番号NP653345）、マカク（Genbankアクセッション番号AAK92202）、イヌ（Genbankアクセッション番号NP001006645）、イノシシ（Genbankアクセッション番号NP999535）、ウシ（Genbankアクセッション番号NP777167）、およびニワトリ（Genbankアクセッション番号AAV48534）からのオルソロガスなAd配列を、NCBIより入手し、ClustalWアルゴリズム（（Higgins et al.(1994)Nucleic Acids Res.22:4673-80（参照により完全に組み入れられる））を使用して、ヒト配列（Genbankアクセッション番号Q15848、配列番号：1）と整列化し、図3に図示した。これらの種において配列番号：1の残基番号43〜97に存在する全ての代替アミノ酸型を、表2にリストする。これらから、可能な極性残基を同定した。
【００８２】
（表２）オルソログアラインメントからの代替極性残基
2008526885.tif 000011
【００８３】
実施例4：Adコラーゲン領域内の高い静電ポテンシャルの領域の同定
各アミノ酸の周囲の局所的な静電気的環境は、タンパク質の全体の安定性に寄与し得る。理想的には、例えば、負の電荷を有するアミノ酸（例えば、中性pHにおけるアスパラギン酸）が、正の静電ポテンシャルのエリアにある場合、安定性が付与され、その逆も同様である。例えば、アスパラギン酸残基が、負のポテンシャルの局所環境にある場合には、それを正の電荷を有する残基または中性極性残基のいずれかと置換することにより、好都合に、タンパク質が安定化され得る。この置換は、当然、PDA（登録商標）技術が説明し得る多くの構造因子に依る。高い静電ポテンシャルのエリアを調査することにより、全体のタンパク質安定性を改良するために最適な残基置換を必要とするタンパク質の領域が指摘され得る。
【００８４】
Adコラーゲン領域内の各位置における静電ポテンシャルを、Adコラーゲン領域三量体に関して、デバイ（Debye）-ヒュッケル（Huckel）の式を使用して決定した。0.5超または-0.5未満の静電ポテンシャルを有する三つの鎖のいずれかにおける位置を、表3にリストする；これらの位置における修飾は、増加した安定性または受容体結合特異性を付与し得る。野生型アミノ酸の静電ポテンシャルおよび電荷が一致している位置においては、突然変異の補償は不要である；この情報は表3に記録される。
【００８５】
（表３）Adコラーゲン領域内の高い静電ポテンシャルの領域および置換の補償
2008526885.tif 000012
【００８６】
実施例5：安定性を改良するためのAd内のメチオニンの交換
製造されたタンパク質治療薬の酸化は、製剤化および保管の条件（例えば、温度およびpH）に依存するかもしれず、酸化によって引き起こされる不均一性は、臨床的有効性および安全性に負の影響を与え得る。Adは、40、128、168、および182位にメチオニン残基を含む。除去は、製剤依存性の不均一性を減少させ、貯蔵安定性を改良するかもしれない。好ましい態様において、Ad MET残基は、ALA、ARG、ASN、ASP、GLN、GLU、HIS、ILE、LEU、LYS、SER、THR、またはVALを含む（がこれらに限定はされない）群に交換される。
【００８７】
実施例6：細菌発現を改良するためのAdコラーゲン領域内のヒドロキシプロリンの交換
コラーゲンと関係のある構造モチーフは、基礎として、...[GXY][GXY][GXY]...［式中、XおよびYはアミノ酸またはイミノ酸であり得る］というアミノ酸配列パターンを有する。ヒトコラーゲンは、Y位にPROの明瞭な優先を有している。典型的には、Y位のPROは、ヒドロキシプロリンへのヒドロキシル化を通して翻訳後に修飾される。対照的に、細菌のコラーゲンにおいて、Y位は、PROではなくTHRまたはGLNによって優先的に占められており（Rasmussen et al.(2003)J.Biol.Chem.278(34):32313-6（参照により完全に組み入れられる））、細菌におけるヒドロキシル化反応の欠如を補償している。表4に、Adコラーゲン領域内のヒドロキシプロリンが、細菌発現、安定性、および溶解度または可溶性発現を改良するための適切な置換と共にリストされる。
【００８８】
（表４）Adコラーゲン領域内のヒドロキシプロリンおよび適切な置換
2008526885.tif 000013
【００８９】
実施例7：安定性を改良するためのAdコラーゲン領域内の[GXY]または[GXYGX'Y']リピート単位の交換
ホスト-ゲスト実験は、以下の配列モチーフが、コラーゲンにおいて特に安定的であることを見出した：[GPR]、[GER]、[GPA]、[GDR]、[GKD]、[GEK]、[G_KGD_]、[G_KGE_]、[GE_G_K]、[G_KG_E]、[G_LGL_]、[GL_GL_]（Persikov et al.(2005)J.Biol.Chem.280(19):19343-9）［ここで、「_」という記号は、任意のアミノ酸またはイミノ酸のためのプレースホールダーを表わす］。好ましい態様において、一つまたは複数のアミノ酸の交換が、リストされた安定化モチーフのうちの一つまたは複数を作製するため、Adコラーゲン領域においてなされる。
【００９０】
実施例8：安定性を改良するための非球状Ad内の芳香族アミノ酸の交換
芳香族アミノ酸（F、H、W、Y）は、コラーゲン三重ヘリックスを不安定化することが見出されている（Persikov et al.(2005)J.Biol.Chem.280(19):19343-9（参照により完全に組み入れられる））。表5に、Adコラーゲン領域内の芳香族アミノ酸が、安定性を改良するための適切な置換と共にリストされる。
【００９１】
（表５）Adコラーゲン領域内の芳香族アミノ酸および適切な置換
2008526885.tif 000014
【００９２】
実施例9：特に好ましい置換
特に好ましい態様において、アミノ酸置換は表6からなされる。
【００９３】
（表６）Adコラーゲン領域内の特に好ましい置換
2008526885.tif 000015
【００９４】
実施例10：Ad球状領域の相同性モデリング
上記のように、後のPDA（登録商標）ライブラリー計算のために必要とされるヒトモデルを作出するため、マウスgAd（プロテインデータバンクエントリー1C3H、残基111〜247）の結晶構造を鋳型として使用した。図3は、マウスおよびヒトのAd配列の配列アラインメントを示す。二種の球状ドメイン間には挿入または欠失が存在しないことをアラインメントが示しているため、ループの再構築は必要でなかった。PDA（登録商標）アルゴリズムを、ヒト相同性モデルを作製するために使用した。
【００９５】
実施例11：Ad球状領域内の露出疎水性残基の同定
gAd構造を、溶媒露出疎水性残基を同定するために分析した。各鎖の各残基の溶媒露出疎水性表面積の絶対値および分率を、1.4Å（オングストローム）のアド-オン半径を使用して、LeeおよびRichards（(1971)J.Mol.Biol.55:379-400（参照により完全に組み入れられる）の方法を使用して計算した。三つの鎖全てについて平均された値が、表7にリストされる。図4は、gAd構造内の各位置についてのHEIを要約したものである。表8は、最も高いHEI値を有する表面露出疎水性アミノ酸のサブセットおよび各々についての提唱された代替極性残基を示す。
【００９６】
（表７）gAd内の露出疎水性残基
2008526885.tif 000016
【００９７】
（表８）Ad球状領域内の露出疎水性残基および代替極性残基
2008526885.tif 000017
【００９８】
各残基についての疎水性露出指数（HEI）を、実施例2に記載されたようにして計算し、それも表7にリストした。溶解度または可溶性発現に影響する可能性が高い位置を同定するため、ヒトgAdの溶媒露出疎水性残基を、少なくとも50Å2（平方オングストローム）の露出疎水性表面積および0.4超のHEI値を有する疎水性残基であると定義した。
【００９９】
実施例12：Adオルソログアラインメントに基づく代替極性残基の同定
実施例3に記載されたように、オルソロガスなAd配列をヒト配列（Genbankアクセッション番号Q15848、配列番号：1）と整列化した。これらの種において配列番号：1の残基番号109〜225に存在する全ての代替アミノ酸型が、表9にリストされる。これらから、可能な極性残基を同定した。
【０１００】
（表９）オルソログアラインメントからの代替極性残基
2008526885.tif 000018
【０１０１】
実施例13：溶解度または可溶性発現を改良するためのAdに対する好ましい置換の同定
PDA（登録商標）技術計算を、ヒトAdの構造と適合性の代替残基を同定するために実施した。各可変位置において、野生型残基、および減少した疎水性または増加した極性の特徴を有する代替残基について、エネルギーを計算した。計算は、実施例10において作出された、相同性により導出されたヒトgAd三量体を使用して実行された。
【０１０２】
まず、点突発変異計算を、各単量体鎖に沿って、独立に、モデルについて実行した；三量体の対称性はアミノ酸の同一の順位を抑制するため強要されなかった。最も好都合な回転異性体コンフォメーションにおける各代替アミノ酸のエネルギーを、結晶学的に観察された回転異性体コンフォメーションにおける野生型残基のエネルギーと比較した；下記の表10中に報告されたエネルギーは、全て、[E（最低エネルギー変異体）-E（次の変異体）]である。いくつかの場合には、野生型残基が最低エネルギーを示さない。これらの位置におけるwt残基は、表面露出疎水性アミノ酸であり、おそらくエネルギー的に不安定化しているため、この結果は驚くべきものではない。最低エネルギーアミノ酸の2.0kcal/mol以内のエネルギーを示す極性アミノ酸のみが、表10にリストされる。三量体の三つの鎖全てからの結果がリストされ、表11中の好ましい代替極性残基のリストへと組み合わせられる。好ましい態様において、これらの置換は単一の位置において適用される。より好ましい態様において、置換は、複数の位置において同時になされる。しかしながら、三次元空間における近接した位置においてなされた置換についてのエネルギーのカップリングは、同時置換のいくつかの組み合わせを制限し得る。
【０１０３】
（表１０）gAd溶媒露出疎水性残基についての最も好都合な極性置換のエネルギー
2008526885.tif 000019
2008526885.tif 000020
【０１０４】
（表１１）代替極性残基
2008526885.tif 000021
【０１０５】
実施例14：gAd内の高い静電ポテンシャルの領域の同定
gAd内の各位置における静電ポテンシャルを、gAd三量体に関して、ドバイ-ヒュッケルの式を使用して決定した。0.5超または-0.5未満の静電ポテンシャルを有する三つの鎖のいずれかにおける位置が、表12にリストされる；これらの位置における修飾は、増加した安定性または受容体結合特異性を付与し得る。好ましい態様において、D227およびD229（それぞれ-0.5および-0.6の平均ポテンシャルを有する）は、より好ましい正の電荷を有するアミノ酸と交換される。PDA（登録商標）技術を、D227およびD229の、ARG、HIS（製剤がおよそ6.0というヒスチジンのpKaより低いと仮定すると、正の電荷を有する）、またはLYSのいずれかへの置換を順位付けるために使用した。最も好都合な回転異性体コンフォメーションにおける代替の正の電荷を有する各アミノ酸のエネルギーを、最もエネルギー的に好適な残基のエネルギーと比較した；表13中に報告されたエネルギーは、全て、[E（最低エネルギー変異体）-E（次の変異体）]である。全ての報告されたエネルギーが、最低エネルギーアミノ酸の1.5kcal/mol以内にある。好ましい態様において、D227および／またはD229は、ARG、HIS、およびLYSを含む（がこれらに限定はされない）群に置換される。
【０１０６】
（表１２）gAd内の高い静電ポテンシャルの領域
2008526885.tif 000022
【０１０７】
（表１３）gAd内のアスパラギン酸227および229と交換するための最も好都合な正の電荷を有する残基のエネルギー
2008526885.tif 000023
【０１０８】
実施例15：gAd内の遊離システインの交換
Adの球状部分は152位に単一の遊離システインを含む。C152は結晶構造において溶媒に露出していないが（三つの鎖全てについて平均された溶媒接近可能表面積は1.1Å2である）、残基は外部ループに位置しており、局所的な可動性を受け得る。好ましい態様において、このシステインの除去は、非特異的なジスルフィド形成および凝集を減少させ、全体的なタンパク質の貯蔵安定性を改良するかもしれない。
【０１０９】
最も好都合な回転異性体コンフォメーションにおける各代替アミノ酸のエネルギーを、野生型システイン残基のエネルギーと比較した；表14中に報告されたエネルギーは、全て、[E（CYS）-E（次の変異体）]である。この場合、野生型残基が最低エネルギーを示す。最低エネルギーアミノ酸の5.0kcal/mol以内のエネルギーを示すアミノ酸のみがリストされる。好ましい態様において、C152は、ALA、ASN、SER、THR、およびVALを含む（がこれらに限定はされない）群に交換される。
【０１１０】
（表１４）Ad内のシステイン152と交換するための最も好都合な非グリシン残基のエネルギー
2008526885.tif 000024
【０１１１】
実施例16：安定性を改良するためのgAd内のメチオニンの交換
Adの球状部分は三つのメチオニン残基（128、168、および182）を含有しており、そのうち二つは溶媒に露出しており（それぞれ46.5Å2および43.7Å2という三つの鎖全てについて平均された溶媒接近可能表面積を有する128および182）、酸化を受けやすい。従って、これらの除去は、製剤依存性の不均一性を減少させ、貯蔵安定性を改良するかもしれない。
【０１１２】
最も好都合な回転異性体コンフォメーションにおける各代替アミノ酸のエネルギーを、最もエネルギー的に好適な残基のエネルギーと比較した；表15中に報告されたエネルギーは、全て、[E（最低エネルギー変異体）-E（次の変異体）]である。最低エネルギーアミノ酸置換の4.0kcal/mol以内にあるエネルギーを示すアミノ酸のみがリストされる。好ましい態様において、MET128および182は、ALA、ARG、ASN、ASP、GLN、GLU、HIS、LYS、SER、またはTHRを含む（がこれらに限定はされない）群に交換される。
【０１１３】
（表１５）Ad内のメチオニン128および182と交換するための最も好都合な非グリシン極性残基のエネルギー
2008526885.tif 000025
【０１１４】
実施例17：溶解度または可溶性発現を改良するためのAdに対する好ましい共役置換の同定
前述のように、三次元空間において近接した位置においてなされた置換の相互作用エネルギーは、好都合なアミノ酸の組み合わせの同一性を制限するかもしれない。好ましい態様において、実施例11に記載された表面露出疎水性残基の群を含み、6Åのスフェア内に位置する位置が同定され、PDA（登録商標）技術を使用した同時の設計および最適化に供される。上記の109、110、111、122、125、135、184、207、224、225位のうち、以下の三つの群が、相互に6Åスフェア内に位置する残基のクラスタである：1）Y109、V110、およびY111、2）Y122およびI125、ならびに3）L224およびY225。残りの位置（135、184、および207）は、実施例11において同定された他の表面露出疎水性残基の6Å以内に位置していない。
【０１１５】
最も好都合な回転異性体コンフォメーションにおける各代替アミノ酸のエネルギーを、最もエネルギー的に好適な残基のエネルギーと比較した；表16〜18中に報告されたエネルギーは、全て、[E（最低エネルギー変異体組み合わせ）-E（次の変異体組み合わせ）]である。計算においては極性アミノ酸のみが考慮され、最低エネルギーアミノ酸置換の2.0kcal/mol以内のエネルギーを示すアミノ酸組み合わせのみがリストされる。他の実施例と同様に、エネルギー差がA、BおよびC鎖についてリストされる。残基の組み合わせは、リストされた置換がエネルギー的に好適である鎖の数によってソートされる。好ましい態様において、三つの鎖のうちの少なくとも一つにおいてエネルギー的に好都合な置換の組み合わせが選ばれる。より好ましい態様において、三つの鎖のうちの二つにおいて好適な置換が選ばれる。さらに好ましい態様において、三つの鎖全てにおいて好適な置換が選ばれる。
【０１１６】
（表１６）109、110、および111位における好適な共役置換のエネルギー
2008526885.tif 000026
【０１１７】
（表１７）122および125位における好適な共役置換のエネルギー
2008526885.tif 000027
【０１１８】
（表１８）224および225位における好適な共役置換のエネルギー
2008526885.tif 000028
【０１１９】
実施例18：安定性を改良するためのgAdのコア設計
タンパク質治療薬のコア内のパッキング相互作用の最適化は、熱的安定性を増加させ、凝集を減少させ、貯蔵寿命を増加させ、薬物動態学を改良する可能性を有する（Luo et al.(2002)Proteins 11:1218-26（参照により完全に組み入れられる））。埋め込まれた疎水性残基（三つの鎖全てについて平均された溶媒接近可能表面積＜5Å2）を、可能性のあるコア残基として同定した。三量体インターフェースに位置する疎水性残基は、考慮から排除した。埋め込まれたコア残基の第1のシェルを、F115、V123、I130、F132、F150、F160、I164、V166、V171、V173、L175、L205、V211、L213、V215、およびF234と定義したが、これらに限定はされない。これらの16残基を、PDA（登録商標）技術を使用した最適化に同時に供した。以下の疎水性残基への置換のみを考慮した：F、I、L、V、およびW。好ましい態様において、全ての無極性アミノ酸が、エネルギー的に適当な置換と見なされる。上位100の配列の解が表19にリストされ、最低エネルギー配列変異体と比べた相対エネルギー（E（最低エネルギー変異体組み合わせ）-E（次の変異体組み合わせ））によって順位付けされる。溶液＃2（I164V/V166F）は、ネイティブ配列よりおよそ2.5kcal/molエネルギーが低く、図13に図示される；V166のPHEへの置換は、164位からメチル基を失うことを必要とした。もう一つの好ましい態様において、残基V117、L119、I154、およびL238のような付加的な埋め込まれた残基が、計算に含まれ得る。もう一つの好ましい態様において、最適化は、単一のコア位置において、または組み合わせられて存在し得る。
【０１２０】
（表１９）gAd内のコア位置における好適な置換のエネルギー
2008526885.tif 000029
2008526885.tif 000030
2008526885.tif 000031
【０１２１】
実施例19：薬物動態学および薬力学を改良するためのgAdの合理的PEG化
本発明の方法を、実施例10において作製された原子座標に基づき、gAd（図1を参照）内の最適なPEG化部位を選択するために使用した。合理的PEG化分析のため、A鎖に焦点を当てた。
【０１２２】
シミュレーションデータを、まず高いカップリング効率を有する部位を同定するために分析した。PEG2000について、シミュレートされたPEG鎖の20％超が遊離状態において衝突していない部位が、接着のための最適な部位と見なされる（図14、上図を参照のこと）。これらの部位には、A108、Y109、V110、E120、N127、T133、F136、Y137、Q139、N141、S146、D170、D179、K180、F184、Y186、Q188、Y189、E191、K192、Q196、L202、H204、E206、V207、G208、D218、E220、R221、G223、L224、Y225、A226、D227、D229、Y240、T243、およびN244が含まれる。
【０１２３】
予測された高いカップリング効率の部位を、これらの部位のうちのどれが、受容体結合時にPEGの運動範囲を保持するかを同定するために、さらにスクリーニングした。PEG2000について、シミュレートされたPEG鎖の20％超が結合状態において衝突していない部位が好ましい（図14参照）。これらの部位には、A108、Y109、N127、T133、N141、S146、D179、K180、E206、V207、G208、E220、R221、G223、L224、Y225、D227、T243、およびN244が含まれる。PEG2000について、シミュレートされたPEGの30％超が結合状態において衝突していない部位が、特に好ましい。これらの部位には、A108、Y109、S146、D179、E220、R221、およびL224が含まれる。
【０１２４】
好ましい態様において、これらまたはその他の位置のいずれかにおける部位特異的なPEG化は、システインのような適当なアミノ酸へのネイティブアミノ酸の交換、またはp-アセチル-L-フェニルアラニンのような非天然アミノ酸の導入を必要とするであろう。
【０１２５】
もう一つの好ましい態様において、二つのgAd分子間の連結を形成するために二価のPEGが使用され得る。これは、コラーゲン様ドメインを交換し、二つの三量体gAd単位の六量体gAd単位を形成するかもしれない。
【０１２６】
実施例20：溶解度または可溶性発現を増強するアミノ酸置換を有する球状アディポネクチンの構築および発現
標準的な分子生物学の方法を、球状アディポネクチン変異体の発現ライブラリーを構築するために利用した。簡単に説明すると、（アミノ酸110〜244をコードする）gAd cDNAを、細菌発現ベクターpET-17bへとサブクローニングした。部位特異的突然変異誘発を、表20にリストされた34個の単一アミノ酸置換変異体を作製するため、標準的な方法を使用して実施した。
【０１２７】
（表２０）
2008526885.tif 000032
【０１２８】
本発明者らは、表20にリストされた単一アミノ酸gAd変異体を発現させるために標準的なタンパク質の発現および分析の方法を使用した。簡単に説明すると、本発明者らは、BL21Star（DE3）細胞でgAd変異体のコロニーの新鮮な菌叢を作製し、全菌叢を採集し、各クローンについて50mLの開始培養物に接種するために使用した。およそ1.5時間で0.6の光学濃度（OD600）に達するまで、培養物を37℃で増殖させた。培養物を室温へと冷却し、0.5mM IPTGにより誘導し、室温に設定されたシェーカーでおよそさらに数時間増殖させた。培養物を採集し、OD600を測定し、6000rpmにおける15分間の遠心分離によって細菌ペレットを調製した。上清を廃棄し、ペレットをBugBuster HT（専用の界面活性剤を含む細菌溶解試薬）を使用して可溶化した。可溶性および不溶性の溶解物画分を、標準的な電気泳動法を使用してSDS-PAGEによって分析した。
【０１２９】
図5は、34個の単一アミノ酸置換変異体の等しい量の可溶性および不溶性の画分が負荷された九つのSDS-PAGEゲルを特徴とする。SDS-PAGE負荷は、表21に示される通りである。球状アディポネクチンは、およそ15kDの分子量を有する134アミノ酸ポリペプチドである。図5中、gAdは、左端の矢印によって強調されている。
【０１３０】
（表２１）ライブラリー＃1変異体の可溶性および不溶性の画分をスクリーニングするためのSDS-PAGE負荷
2008526885.tif 000033
【０１３１】
gAd発現細胞をこれらの界面活性剤含有条件（即ち、BugBuster）の下で溶解させた場合、ネイティブgAdは、＜10％可溶性であることが見出された（図5、レーン12〜13および40〜41）。本発明者らは、これらの発現および溶解の条件の下で改良されたタンパク質の溶解度または可溶性発現を有するいくつかの変異体を同定した。変異体Y122H（図5、レーン66および75）、Y122S（図5、レーン22〜23）、I125E（図5、レーン32-33）、I125H（図5、レーン42〜43）、I125T（図5、レーン50〜51）、F184H（図5、レーン69〜70）、V207E（図5、レーン16〜17）、およびV207K（図5、レーン26〜27）は、全て、ネイティブgAdと等しいか、または多くの場合、はるかに大きな溶解度または可溶性発現を有していた。
【０１３２】
実施例21：界面活性剤の非存在下での選択された球状アディポネクチン単一アミノ酸置換変異体の溶解度または可溶性発現の分析
上記のパイロット発現研究から判断されるような改良された溶解度特性に基づき、変異体Y122H、Y122S、I125E、I125H、I125T、F184H、V207E、およびV207Kを選択した。これらの変異体が真に改良された溶解度を有することを証明するためには、これらのタンパク質を発現している細菌を界面活性剤の非存在下で溶解させた場合に生じる可溶性タンパク質の量を測定することが必要であった。界面活性剤の非存在下での溶解度は、可溶性タンパク質のより正確な尺度として認識されており、それは将来の下流の過程の修飾を可能にし、能率化された製造過程をもたらし得る。
【０１３３】
容器の容積を10倍に増大させた点を除き、上記と同様にして、変異体を発現させた（2000mLフラスコ中500mL）。4℃で一夜誘導した後、細胞を遠心分離によって採集し、ペレットを-80℃で保存した。細胞ペレットを、界面活性剤なしの溶解緩衝剤（20mM BisTris pH6.0、1mM EDTA、0.5mM DTT）と混合し、音波破壊によって溶解させた。得られた材料を、高速遠心分離によって清浄化し、得られた清浄化された可溶性および不溶性の画分を、容量規準化し、SDS-PAGEを使用して分析した。このアプローチは、全体タンパク質発現／収率および溶解度の改良の決定を可能にする。図6は、ネイティブgAd、空ベクター（pET-17b）、または選択された変異体の可溶性および不溶性の画分を含有していた三つのSDS-PAGEゲルを示す。ゲルは、表22に記載されるようにして負荷された；図の左端の矢印は、gAd対照を指し示している。
【０１３４】
（表２２）界面活性剤の非存在下での選択された変異体の可溶性および不溶性の画分をスクリーニングするためのSDS-PAGE負荷
2008526885.tif 000034
【０１３５】
gAd発現細胞をこれらの界面活性剤なしの条件の下で溶解させた場合、ネイティブgAdは、事実上不溶性であることが見出された（図6、レーン76〜78、85〜86、および99〜A）。試験された変異体は、全て、界面活性剤の非存在下で劇的に改良された溶解度を有していた。この点において特に好都合であったのは、置換I125E、I125T、およびY122Hであった。さらに、これらの試料は容量規準化されていたため、本発明者らは、有意に改良されたタンパク質発現収率を有する多数の変異体を同定した。変異体F184H、I125H、およびV207Eは、gAdタンパク質収率の増加に対して最も大きな効果を有していた。
【０１３６】
実施例22：二重変異型球状アディポネクチンタンパク質の構築および発現の分析
増加した溶解度および発現収率を与えた八つの球状アディポネクチンアミノ酸置換を、アディポネクチン二重変異体のライブラリーを作製するため、対になるよう組み合わせた。上記と同一の分子生物学技術およびコドンを、以下の二重突然変異球状アディポネクチン変異体を作製するために使用した；F184H/Y122H、F184H/Y122S、F184H/I125E、F184H/I125H、F184H/I125T、F184H/V207E、F184H/V207K、V207E/Y122H、V207E/Y122S、V207E/I125E、V207E/I125H、V207E/I125T、V207K/Y122H、V207K/Y122S、V207K/I125E、V207K/I125H、V207K/I125T、I125E/Y122H、I125E/Y122S、I125H/Y122H、I125H/Y122S、I125T/Y122H、I125T/Y122S。これらのタンパク質を、上記実施例20において記載されたようにして発現させ、加工した。界面活性剤により誘導された溶解の後、本発明者らは、可溶性タンパク質の相対量を全画分および不溶性画分と比較した。図7は、二重突然変異球状アディポネクチン変異体についての発現および溶解度の情報を含有していた11のSDS-PAGEゲルを示す。実験対照として、単一突然変異体およびネイティブ球状アディポネクチンを、空ベクター対照と共に含めた。SDS-PAGE上の矢印は、球状アディポネクチンの位置を強調している。
【０１３７】
（表２３）界面活性剤の存在下での二重突然変異球状アディポネクチン変異体の全画分、可溶性画分、および不溶性画分をスクリーニングするためのSDS-PAGE負荷
2008526885.tif 000035
2008526885.tif 000036
【０１３８】
二重突然変異タンパク質のいくつかは、劇的に改良された発現および溶解度の特性を有していた。試験された23個の二重変異型タンパク質のうち、変異体F184H/Y122H、F184H/I125H、F184H/I125T、F184H/V207K、V207E/I125E、V207K/Y122S、V207K/I125E、およびI125E/Y122Sは、最も劇的な改善を有していた。
【０１３９】
実施例23：界面活性剤の非存在下での選択された球状アディポネクチン二重アミノ酸置換変異体の溶解度分析
変異体F184H/Y122H、F184H/I125H、F184H/I125T、F184H/V207K、V207E/I125E、V207K/Y122S、V207K/I125E、およびI125E/Y122Sを、実施例21に記載されたのと同一のタンパク質溶解度分析に供した。図8は、界面活性剤の非存在下での溶解度分析の結果を含有していた二つのSDS-PAGEゲルを示す。超音波処理により細菌を溶解させたところ、gAd二重変異体では、ネイティブタンパク質と比較して、放出された全タンパク質および可溶性タンパク質の両方が増加していた。表24は、二重変異体およびネイティブタンパク質から調製された溶解物についてのSDS-PAGE負荷を示しており、最も高発現の単一変異型F184Hが、付加的な対照として含まれた。
【０１４０】
（表２４）界面活性剤の非存在下での選択された二重変異体の可溶性画分および不溶性画分をスクリーニングするためのSDS-PAGE負荷
2008526885.tif 000037
【０１４１】
これらの変異体の大多数が、可溶性画分と不溶性画分との間のほぼ等しいタンパク質の分配を有しており、このことは、およそ50％の溶解度を示唆している。変異体F184H/Y122H、F184H/I125T、およびV207K/I125Eは、50％よりはるか大きい溶解度を有するようである。最後に、ネイティブタンパク質と比較した場合、発現された全球状アディポネクチンおよび可溶性球状アディポネクチンの量は、数桁増加している。
【０１４２】
図9は、ネイティブおよびV207E/I125E gAdからの界面活性剤なしの可溶性溶解物を含有していたSDS-PAGEを示す。ネイティブ溶解物を12.5倍に希釈し、V207E/I125E gAd変異型を発現する大腸菌から作成された等しい希釈率のまたは段階希釈された同一溶解物と比較した。ネイティブgAdと比べた、V207E/I125E gAd変異体によって作製された可溶性タンパク質の量には、少なくとも100〜1000倍の差が存在することが、この分析より明らかである。
【０１４３】
実施例24：gAd二重変異体は分化マウスC2C12細胞におけるAMPKリン酸化を誘導する
選択されたgAd変異体の生物学的活性を測定するためには、組換えgAdタンパク質を精製して大腸菌宿主細胞汚染物質を除去することが必要であった。本発明者らは、三つの別々のカラム工程からなる従来のクロマトグラフィ法を開発した。簡単に説明すると、gAd変異体を実施例20に記載されたようにして増殖させ溶解物へと加工し、可溶性画分をDEAEカラムに適用し、200mM NaClにおける同一濃度工程により溶出させた。この材料を非結合工程（即ち、gAdはカラムを素通りしたが、タンパク質汚染物質および内毒素は結合した）としてQカラムに通し、最後に、調製用S-100HRゲル濾過カラムを使用して純化した。gAd変異体について、この過程は、大腸菌培養物1リットル当たり100〜300mgの精製されたタンパク質をルーチンに与えるであろう。
【０１４４】
本発明者らは、gAdにより誘導されるAMPキナーゼ（AMPK）のリン酸化を測定するために筋管へと分化したC2C12細胞を使用した。マウスC2C12細胞を、ATCCによって記載されているような培養物において増殖させた。2％ウマ血清を含む増殖培地に細胞を移すことにより、分化を誘導した。細胞を最長7日間この培地で維持した。この期間中、細胞は伸長し共に融合して、光顕微鏡検下で観察した場合に可視にれん縮する多核性の筋管を形成した。図10は、1、3、4、および7日目の分化過程の低拡大率（10×）視野を示す一連の位相差顕微鏡検画像を示す。4日目の細胞の高拡大率視野は、明白に、多核管状構造の存在を示している。C2C12筋管を放置するか、または30ug/mLの二重アミノ酸gAd変異体V207K/I125EおよびF184H/Y122Hにより60分間処理した。この実験のための対照として、30ug/mLの市販のネイティブgAd（Bio Vision）によっても筋管を処理した。AICAR（AMPKの化学的活性化剤）を陽性対照として使用し、（gAd変異体と同一のクロマトグラフィスキームを通して加工された）空ベクター対照溶解物を陰性対照として使用した。処理の後、C2C12細胞を、溶解物へと加工し、全AMPK抗体またはリン光体（phosphor）特異的AMPK抗体のいずれかによるウェスタンブロットによって、全AMPKおよびリン酸化AMPK（pAMPK）両方の量を決定した。図10は、陽性対照AICARはpAMPKの強力な増加を誘導したが、未処理の細胞およびベクターは誘導しなかったことを示している。市販のネイティブgAdは、pAMPKの温和な増加を生じ、二つの操作されたgAd変異体ははるかに効果的であった。この実験から、本発明者らは、gAd変異体V207K/I125EおよびF184H/Y122Hが、ネイティブgAdと少なくとも等しいか、またはそれより大きい生物学的活性を保持しているとの結論を下す。
【０１４５】
実施例25：gAd二重変異体は分化ヒト筋細胞におけるAMPKリン酸化を誘導する
マウスC2C12筋管を使用して上記の結果を賞賛するため、本発明者らは、gAd変異体の分化ヒト筋細胞におけるpAMPKを誘導する能力を測定した。プレスクリーニングされたヒト骨格筋細胞（Human Skeletal Muscle Cells）（HSkMC）を、Cell Applications,Inc.より入手し、製造業者の説明に従い、骨格筋細胞増殖培地（Skeletal Muscle Cells Growth Medium）において繁殖させた。HSkMCの筋管への分化を誘導するため、6穴プレート内の90％コンフルエント細胞培養物の培地を、適切な容量の同供給元からの骨格筋分化培地（Skeletal Muscle Differentiation Medium）に交換した。分化培地を一日おきに交換し、多核筋管を分化の4日目までに観察した。分化培地は、gAd処理の18時間前に最後に交換した。gAd処置の日、細胞を洗浄し、骨格筋細胞増殖培地中で3時間インキュベートした後、アディポネクチン変異体を添加した。HSkMC筋管を、未処置のままにするか、または50ug/mLのgAd変異体F184H、F184H/I125H、F184H/I125T、V207K/I125E、およびY122S/I125Eにより15分間処理した。インキュベーションの後、細胞を氷冷PBSで2回洗浄し、次いで、ホスファターゼ阻害剤が補足された200mlの予熱された（90℃）1×SDS試料緩衝液を各ウェルに添加し、細胞を可溶化し、粗細胞溶解物を作製するため、プレートを2分間シェーカー上に置いた。この材料を採集し、1.5mLエッペンドルフチューブに移し、95℃でさらに10分間加熱し、-20℃で一夜保管した。翌日、試料を解凍し、27ゲージ注射器に3回通した後、20000gで15分間遠心分離した。20mlの各試料を、NuPAGE 7％トリス-酢酸ゲル（Tris-Acetate Gel）（1.0mm×10ウェル）に負荷し、ゲルを80分間一定の150Vでトリス-酢酸緩衝液で実行した。完了後、ゲルを0.01％SDSを含む2×転移緩衝液中で20分間インキュベートした後、一定の100Vを使用して1時間PVDF膜へと転移させた。PVDF膜を、TBS＋トゥイーン20ブロッキング緩衝液と共に20分間インキュベートした。TBST緩衝液で1：1000希釈された抗ホスホ-AMPK抗体を添加し、膜を40℃でO/Nインキュベートした。洗浄（3回、各15分）の後、室温で1時間アルカリホスファターゼ結合二次抗体により膜を処理した。タンパク質を、NBT/BCIPアルカリホスファターゼ基質を使用することにより可視化した。この実験の結果は、図11に提示される；試験された変異体は、全て、未処理対照と比べてpAMPKレベルのおよそ2倍の増加を生じた。
【０１４６】
上記のものは、相当詳細に、好ましい態様に関して記載されたが、これらは開示または以下の特許請求の範囲を限定するものと解釈されてはならない。当業者の範囲内にある修飾および変化は、本発明の範囲内に内含されるものとする。例えば、アディポネクチンと関係のあるポリペプチド（例えば、C1q/TNF-αスーパーファミリーまたはCTRPファミリーのメンバー、およびそれらのホモログ、オルソログ、またはパラログ）の変異体が、上記の方法を使用して作成され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】全長ヒトアディポネクチンアミノ酸配列（配列番号：1、Genbankアクセッション番号Q15848、残基1〜244）を示す。コラーゲン領域に下線が引かれている。
【図２】全長ヒトアディポネクチン配列（配列番号：1）とコラーゲン配列とのアラインメントを示す。
【図３】ヒト、マウス、ラット、マカクマカーク、イヌ、イノシシ、ウシ、およびニワトリの全長アディポネクチンのClustalWアラインメントを示す。
【図４】アミノ酸の表面露出とそのアミノ酸の相対疎水性との関係を示すグラフである。
【図５】34個の単一アミノ酸置換含有gAd変異体のSDS-PAGE分析を示す。タンパク質は大腸菌において発現され、溶解物は界面活性剤の存在下で調製された。
【図６】選択された単一アミノ酸置換含有gAd変異体の溶解度または可溶性発現の分析を示す。タンパク質は、大腸菌において発現され、溶解物は界面活性剤なしの条件下で調製された。
【図７】8個の単一アミノ酸置換含有gAd変異体および23個の二重アミノ酸置換含有gAd変異体のSDS-PAGE分析を示す。タンパク質は大腸菌において発現され、溶解物は界面活性剤の存在下で調製された。
【図８】選択された単一アミノ酸置換含有gAd変異体および二重アミノ酸置換含有gAd変異体の溶解度または可溶性発現の分析を示す。タンパク質は、大腸菌において発現され、溶解物は界面活性剤なしの条件下で調製された。
【図９】ネイティブgAdおよびV207E/I125E gAdからの界面活性剤なしの可溶性溶解物を含有していたSDS-PAGEを示す。
【図１０】マウスC2C12筋管分化の位相差時間経過画像を示す。
【図１１】gAd変異体および対照によるC2C12筋管の処理を示す。
【図１２】gAd変異体による分化ヒト筋細胞の処理がAMPKリン酸化を誘導することを示す。
【図１３】球状アディポネクチンドメインの低エネルギーコア設計の三次元構造を示す（表19中の2番目に低いエネルギーの配列の解）。濃い灰色のボールズアンドスティックス（balls-and-sticks）は、ネイティブのコンフォメーションにおける野生型側鎖（I164およびV166）を示し、薄い灰色の原子は、低エネルギーアミノ酸置換I164VおよびV166Fを示している。
【図１４】分子量2000のPEGを使用し、システイン-マレイミド接着モエティを使用した、アディポネクチンのためのポリエチレングリコール（PEG）部位の最適化を示す。可能性のある接着部位が、500の自己回避PEG鎖の集団を使用して評価された。gAd構造と衝突していなかった鎖の百分率が、gAdの各位置についてプロットされている。衝突していない鎖の百分率は、単量体gAd構造（上図）および三量体gAd構造の両方についてプロットされた。
【図１】
2008526885.tif 000044
【図２】
2008526885.tif 000045
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2008526885.tif 000047
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
2008526885.tif 000050
【図４】
2008526885.tif 000051
【図５】
2008526885.tif 000052
【図６】
2008526885.tif 000053
【図７Ａ】
2008526885.tif 000054
【図７Ｂ】
2008526885.tif 000055
【図８】
2008526885.tif 000056
【図９】
2008526885.tif 000057
【図１０】
2008526885.tif 000058
【図１１】
2008526885.tif 000059
【図１２】
2008526885.tif 000060
【図１３】
2008526885.tif 000061
【図１４】
2008526885.tif 000062
【手続補正書】
【提出日】平成19年9月7日(2007.9.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008526885000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年2月22日(2008.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対応する原種アディポネクチンに対する一つまたは複数のアミノ酸修飾を含むアディポネクチン変異体であって、該変異体の溶解度が配列番号：1の残基110〜244と比較して少なくとも3倍改良されている、アディポネクチン変異体。
【請求項２】
変異体の発現収率が配列番号：1の残基110〜244と比較して少なくとも2倍改良されている、請求項1記載のアディポネクチン変異体。
【請求項３】
筋肉細胞内で5'-AMP活性化プロテインキナーゼ(AMPK)のリン酸化を誘導する変異体の能力が、配列番号：1の残基110〜244と比較して少なくとも30％改良されている、請求項1または2記載のアディポネクチン変異体。
【請求項４】
原種アディポネクチンがヒトアディポネクチン(配列番号：1)である、請求項1〜3のいずれか一項記載のアディポネクチン変異体。
【請求項５】
原種アディポネクチンが非ヒトアディポネクチンである、請求項1〜3のいずれか一項記載のアディポネクチン変異体。
【請求項６】
配列番号：1に対して109、110、115、122、123、125、128、130、132、135、150、152、160、164、166、171、173、175、182、184、205、207、211、213、215、224、225、227、229、または234位に、1つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載のアディポネクチン変異体。
【請求項７】
122H、122S、125E、125H、125T、184H、207E、および207Kからなる群より選択される修飾を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載のアディポネクチン変異体。
【請求項８】
少なくとも2つの修飾を含む、請求項1〜7のいずれか一項記載のアディポネクチン変異体。
【請求項９】
ヒトアディポネクチン(配列番号：1)に対する1〜100残基を含まない、請求項1〜8のいずれか一項記載のアディポネクチン変異体。
【請求項１０】
ヒトアディポネクチン(配列番号：1)に対するA108C、Y109C、S146C、D179C、E220C、R221C、およびL224Cからなる群より選択される少なくとも1つの残基で、少なくとも1つの共有結合したPEG部分を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載のアディポネクチン変異体。
【請求項１１】
変異体の溶解度が配列番号：1の残基110〜244と比較して少なくとも30倍改良されている、請求項1〜10のいずれか一項記載のアディポネクチン変異体。
【請求項１２】
変異体の溶解度が配列番号：1の残基110〜244と比較して少なくとも100倍改良されている、請求項1〜11のいずれか一項記載のアディポネクチン変異体。
【請求項１３】
変異体の溶解度が配列番号：1の残基110〜244と比較して少なくとも300倍改良されている、請求項1〜12のいずれか一項記載のアディポネクチン変異体。
【請求項１４】
変異体の発現収率が配列番号：1の残基110〜244と比較して少なくとも10倍改良されている、請求項1〜13のいずれか一項記載のアディポネクチン変異体。
【請求項１５】
請求項1〜14のいずれか一項記載のアディポネクチン変異体をコードするポリヌクレオチドを含む組成物。
【請求項１６】
請求項1〜15のいずれか一項記載のアディポネクチン変異体の治療的有効量ならびに任意で薬学的に許容される担体および/または希釈剤を含む組成物。
【請求項１７】
併用療法のために第二の化合物を治療的有効量で含む、請求項16記載の組成物。
【請求項１８】
第二の化合物が以下からなる群より選択される、請求項17記載の組成物：インスリン、インスリンアナログ、PPARアゴニスト、TZDまたはフィブラートクラスの薬物、スルホニル尿素クラスの薬物の任意のメンバー、メトホルミン、GLP-1アンタゴニスト薬、HMG-CoA還元酵素阻害剤、および食欲抑制剤。
【請求項１９】
哺乳動物におけるアディポネクチンによる疾患を処置するための組成物の製造における、請求項1〜18のいずれか一項記載のアディポネクチン変異体の使用。
【請求項２０】
アディポネクチンによる疾患が、肥満、インスリン抵抗性、グルコース不耐性、高血圧、異脂肪血症(高トリグリセリド血症および低HDLコレステロールレベル)、代謝疾患、冠動脈心疾患、および糖尿病からなる群より選択される、請求項19記載の使用。
【請求項２１】
哺乳動物がヒトである、請求項19または20記載の使用。
【国際調査報告】
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