(57)【要約】  本発明は、１つまたは複数の生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質を発現するように改変された腸内共生細菌を提供するが、本細菌は、食物中のキシランの存在に応答して誘導され、前記生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質の発現を調節する、キシラナーゼプロモーターなどのプロモーターを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数の生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質を発現するように改変された腸内共生細菌であって、前記細菌が、食物因子の存在に応答して誘導され、前記生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質の発現を調節するプロモーターをさらに含む腸内共生細菌。
【請求項２】
前記プロモーターが構成的である、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
前記プロモーターがキシラナーゼプロモーターである、請求項１または２のいずれかに記載の細菌。
【請求項４】
偏性嫌気性菌である、請求項１〜３のいずれかに記載の細菌。
【請求項５】
バクテロイデス・オバタスまたはプレボテラ属のいずれかである、請求項１〜４のいずれかに記載の細菌。
【請求項６】
ヒトにとって非病原性である、請求項１〜５のいずれかに記載の細菌。
【請求項７】
使用される前記生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質が、前記細菌にとって相同または非相同であり、真核生物もしくは原核生物もしくはウイルスのいずれかに由来する、請求項１〜６のいずれかに記載の細菌。
【請求項８】
前記生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質が、インスリン、成長ホルモン、プロラクチン、カルシトニン、黄体化ホルモン、副甲状腺ホルモン、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン、ワクチン、抗原、血管作用性腸ポリペプチド、トレフォイル因子、細胞および組織修復因子、形質転換成長因子β、ケラチノサイト成長因子、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＩＦＮ−γ、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＮＴＦ、ＧＨ、ＰＲＬもしくはＩＦＮα／βを含む群から選択される逆平行４αヘリックス束を取る構造群１サイトカイン、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＣＤ４０、ＣＤ２７もしくはＦＡＳリガンド、サイトカインのＩＬ−１ファミリー、線維芽細胞成長因子ファミリー、血小板由来成長因子、形質転換成長因子βおよび神経成長因子を含む群から選択される構造群２サイトカイン、サイトカインの上皮成長因子ファミリー、ケモカイン、インスリン関連サイトカインを含む構造群３サイトカイン、ならびにＥＧＦ、免疫グロブリン様およびクリングルドメインを含む群から選択される構造群４サイトカインから選択される、請求項１〜７のいずれかに記載の細菌。
【請求項９】
前記生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質が、請求項８に記載の生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質に対する受容体またはアンタゴニストである、請求項８に記載の細菌。
【請求項１０】
複数の生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質を発現するように改変された、請求項１〜９のいずれかに記載の細菌。
【請求項１１】
１つまたは複数の生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質を発現するように改変された腸内共生細菌であって、前記細菌は、食物因子の存在に応答して誘導され、前記生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質の発現を調節するプロモーターをさらに含む腸内共生細菌を含む薬剤。
【請求項１２】
生理学的に許容可能な担体、希釈剤もしくは賦形剤を含む、請求項１１に記載の薬剤。
【請求項１３】
請求項２〜１０のいずれか１つまたは複数の特徴をさらに含む、請求項１１または１２のいずれかに記載の薬剤。
【請求項１４】
１つまたは複数の生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質を発現するように改変された腸内共生細菌の使用であって、前記細菌が、食物因子の存在に応答して誘導され、前記生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質の発現を調節するプロモーターをさらに含む、慢性炎症性腸疾患の治療のための薬剤の製造における使用。
【請求項１５】
請求項２〜１０のいずれか１つまたは複数の特徴をさらに含む、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
１つまたは複数の生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質もしくは抗原もしくは酵素もしくはワクチンを送達する方法であって、発現が食物因子の存在に応答して活性化されるプロモーターの制御下にある１つまたは複数の前記生物活性物質を発現する腸内共生細菌を被験者に投与する工程を含む方法。
【請求項１７】
前記細菌は、２つ以上の生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質もしくは抗原もしくは酵素もしくはワクチンまたはそれらの組み合わせを発現する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
種々の生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質もしくは抗原もしくは酵素もしくはワクチンまたはそれらの組み合わせを発現する細菌の混合物が投与される、請求項１６または１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
請求項２〜１０のいずれか１つまたは複数の特徴をさらに含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
腸の慢性炎症を治療する方法であって、そのような状態に苦しんでいる個体に１つまたは複数の生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質を発現するように改変された製薬学的に有効量の腸内共生細菌を投与する工程を含み、前記細菌が、食物因子の存在に応答して誘導され、前記生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質の発現を調節するプロモーターをさらに含む方法。
【請求項２１】
請求項２〜１０のいずれか１つまたは複数の特徴をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸内細菌叢による生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質の産生および分泌、これらの送達方法ならびに前記生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質の産生および分泌を制御する方法に関する。本発明は、新規免疫療法の開発において、そして特に炎症性腸疾患を治療するために特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ヒト大腸における微生物群は、主として偏性嫌気性菌である多様な細菌からなる。これらの細菌は一緒に、結腸に到達する栄養基質（インスリン、フルクトオリゴ糖および難消化性デンプン）を分解するように作用し、ヒトの健康および疾患にとって重要である多様な生成物を産生する。
【０００３】
正常常在性細菌叢の操作によって粘膜免疫応答に影響を及ぼすことができる。この細菌叢は、粘膜免疫系の発達および機能へ直接的もしくは間接的に影響を及ぼし得る極めて多種多様な生物学的および免疫調節的特性を有する。例えばクローン病や潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のような腸の慢性疾患には、先進国における大きな割合の国民が罹患している。粘膜炎症の動物モデルは、これらの疾患の病因に関係する免疫機構を試験して決定するために使用されてきた。慢性大腸炎は、ＩＢＤのモデルとして使用されるインターロイキン（ＩＬ）２-/-およびＩＬ１０-/-マウスにおいて自然に発生する。ＩＢＤの多数の他のマウスモデルについても記載されているが、それらの大多数は免疫応答遺伝子の標的欠損を有している。ＩＢＤの現行療法は、組換えＩＬ−１０および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に対する抗体を含む抗炎症薬および免疫抑制薬療法に限定されている。しかし、これらの療法は治癒的ではなく、毒性および免疫抑制などの副作用を誘発することがある。このために、より標的を定めて制御された形態の免疫療法に対する必要性がある。
【０００４】
先行技術からは、ヒトにおける腸炎症および特定の形態のＩＢＤを治療するために消化管において自然に発生するラクトバシラス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）およびストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）などの共生生物または細菌を使用することは知られているが（Ｓｈａｎａｈａｎ  ２００１）、しかしこれらの結果では成功の証拠が限定され、有効性については矛盾した結果が得られている。先行技術からはさらに、２種類のマウスＩＢＤモデルへ胃内投与した場合に疾患の予防および治療の両方において、より従来型のステロイド療法と同等に有効であることが証明されたインターロイキン−１０（ＩＬ１０）を分泌する遺伝子組換え食品用ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）を使用することも知られている（Ｓｔｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。このラクトコッカス系は、生物活性のあるＩＬ２およびＩＬ６を産生するためにも使用されてきた（Ｓｔｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９５；Ｓｔｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。しかし、これらの先行技術の系に付随する主要な欠点は、微生物が腸上皮へ結合できないこと、および／またはインビボでは入手できないアミノ酸およびペプチドの供給へ栄養依存性があることに起因して、Ｌ．ラクティスがコロニーを形成不能であることにある。したがって、どのインビボの治療もしくは療法も、適切な部位に改変された微生物を繰り返し投与することを必要とする。
【０００５】
この特定の嫌気性細菌を使用するもう一つの生物学的安全性の懸念および短所は、宿主／患者の体外で他人へ感染するために十分な時間にわたり生残可能であることにある。
【０００６】
先行技術の系のさらにまた別の短所は、免疫学的に活性なインターロイキン分子の構成的発現を制御する手段がなく、これらの活性分子自体が過剰産生されると副作用を有する可能性があることである。したがって、先行技術の遺伝子組換えプロバイオティック系は、投与後のプロバイオティック細菌の活性の制御および調節が欠如している。これは、ヒトへの療法にとって深刻な安全性の問題を提示する。
【０００７】
先行技術におけるこれらの欠陥に対処し、さらに生物活性分子のための新規送達系としての共生細菌を開発するために、本発明者らは、共生細菌によるインサイチュでの免疫療法薬の産生を食物因子（ｄｉｅｔａｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）によって調節および制御できる遺伝子組換えプロバイオティック微生物を開発した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の１つの目的は、慢性腸疾患のための新規な免疫療法のための基礎として、調節された方法で生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質を産生および分泌できるように腸内共生細菌を遺伝子組換えにより作成することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１態様によると、１つまたは複数の生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質を発現するように改変された腸内共生細菌であって、食物因子の存在に応答して誘導され、前記生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質の発現を調節するプロモーターをさらに含む細菌が提供される。
【００１０】
本明細書の記載および特許請求の範囲を通して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」およびそれらの用語の変形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含むがそれらに限定されない」ことを意味し、他の部分、添加物、構成成分、整数もしくは工程を排除することを意図していない（そして排除しない）。
【００１１】
本明細書の記載および特許請求の範囲を通して、単数形は、その状況が他のことを要求していない限り、複数形を含む。詳細には、不定冠詞が使用される場合は、本明細書は、その状況が他のことを要求していない限り、単数だけでなく複数も意図していると理解されたい。
【００１２】
本発明の特定の態様、実施形態もしくは実施例と結び付けて記載される特徴、整数、特性、化合物、化学的部分もしくは化学基は、矛盾していない限り、本明細書に記載した任意の他の態様、実施形態もしくは実施例に適用できると理解されたい。
【００１３】
オペロンは、プロモーター、オペレーターおよび多数の構造遺伝子からなる機能単位と規定できる。１つの例は、キシラナーゼオペロンである。構造遺伝子は、一般には数種の機能的に関連する酵素をコードしており、それらは１つの（ポリシストロン性）ｍＲＮＡとして転写されるが、各々が別個の翻訳開始部位を有している。典型的なオペロンでは、オペレーター領域は、ｍＲＮＡの合成のスイッチを入れる、もしくは切る際の制御エレメントとして機能する。キシラナーゼオペロンは、キシランの存在下で活性化される。
【００１４】
好ましくは、プロモーターは構成的であり、より好ましくはキシラナーゼプロモーターである。従って、当然のことながら１つまたは複数の生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質の発現は、食物中のキシランの存在によって制御される。このため本発明の細菌は、キシラン誘導性調節エレメントを含むと言うことができる。
【００１５】
キシランは、植物細胞壁中に見られ、加水分解によりキシロースを産生する水溶性の粘性多糖である。このため、これは一般的な食物の因子もしくは構成成分であり、したがって食物中にキシランを含ませることもしくは食物からキシランを排除することは生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質の発現を制御する。このため、本発明の改変された細菌はまた付随して任意の副作用を最小限に抑えながら腸内でコロニー形成することもできるので、本発明の改変された細菌は有利にも個体の反復的な侵襲性の投与を回避する容易に制御可能な発現系を提供する。
【００１６】
好ましくは、細菌は偏性嫌気性菌であり、より好ましくは前記細菌はバクテロイデス・オバタス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ）またはプレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）のいずれかである。
【００１７】
好ましくは、細菌はヒトにとって非病原性である。
【００１８】
「生物活性」は、生物学的機能を実行する能力を意味する。本発明において使用される生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質は、本細菌にとって相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）または非相同（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）のどちらかであってよく、真核生物もしくは原核生物もしくはウイルスのいずれかに由来してよい。
【００１９】
本発明において使用されるそのようなポリペプチドおよびタンパク質の具体例には、好ましくはインスリン、成長ホルモン、プロラクチン、カルシトニン、黄体化ホルモン、副甲状腺ホルモン、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン、血管作用性腸ポリペプチド、トレフォイル因子、細胞および組織修復因子、形質転換成長因子β、ケラチノサイト成長因子、例えばＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＩＦＮ−γ、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＮＴＦ、ＧＨ、ＰＲＬもしくはＩＦＮα／βなどの逆平行４αヘリックス束構造を取る構造群１サイトカイン、しばしば細胞表面結合性であり、対称性ホモトリマーを形成し、サブユニットがサイトカインのＴＮＦファミリー、例えばＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＣＤ４０、ＣＤ２７もしくはＦＡＳリガンド、サイトカインのＩＬ−１ファミリー、線維芽細胞成長因子ファミリー、血小板由来成長因子、形質転換成長因子βおよび神経成長因子などの特定のウイルスコートタンパク質について記載されたβ−ジェリーロールのコンフォメーションを取る構造群２サイトカイン、各々が細胞外領域において少なくとも１つのＥＧＦドメインを包含する大きな膜貫通型前駆体分子として生成される短鎖α／β分子、例えばサイトカインの上皮成長因子ファミリー、保存されたシステイン残基の周辺でグループ化されたアミノ酸配列を持つことを特徴とするケモカイン（Ｃ−ＣもしくはＣ−Ｘ−Ｃケモカインサブグループ）もしくはインスリン関連サイトカインを含む構造群３サイトカイン、例えばＥＧＦ、免疫グロブリン様およびクリングルドメインなどの相違するドメインからなるヘレグリンもしくはニューレグリンなどのモザイク構造を示す構造群４サイトカインが含まれる。
【００２０】
または、生物活性ポリペプチドは、上記で規定した生物活性ポリペプチドに対する受容体もしくはアンタゴニストであってよい。
【００２１】
細菌は、その中に含有された核酸から生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質および抗原を発現する。核酸は、生物活性ポリペプチドをコードする核酸および抗原をコードする核酸が細菌内での発現のために適切な調節配列の制御下にある１つまたは複数の核酸構築物を含んでもよい。
【００２２】
細菌は、生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質をワクチンとして発現してもよい。
【００２３】
好ましくは、本発明の細菌は、複数の生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質を発現するように改変されていてよい。
【００２４】
本発明のまた別の態様によると、１つまたは複数の生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質を発現するように改変された腸内共生細菌を含む薬剤であって、その細菌は、食物因子の存在に応答して誘導され、前記生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質の発現を調節するプロモーターをさらに含む薬剤が提供される。
【００２５】
好ましくは、本発明の薬剤は、生理学的に許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤中の組成物として提供される。
【００２６】
好ましくは、本発明の薬剤は、上記に挙げたいずれか１つまたは複数の特徴を含む。
【００２７】
本発明のまた別の態様によると、１つまたは複数の生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質を発現するように改変された腸内共生細菌の使用であって、その細菌は、食物因子の存在に応答して誘導され、前記生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質の発現を調節するプロモーターをさらに含む、慢性炎症性腸疾患の治療のための薬剤の製造における使用が提供される。
【００２８】
好ましくは、本使用は、上記に挙げたいずれか１つまたは複数の特徴をさらに含む。
【００２９】
本発明のまた別の態様によると、発現が食物因子の存在下で活性化されるプロモーターの制御下にある１つまたは複数の前記生物活性物質を発現する腸内共生細菌を被験者に投与する工程を含む、１つまたは複数の生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質もしくは抗原もしくは酵素もしくはワクチンを送達する方法が提供される。
【００３０】
好ましくは、細菌は、２つ以上の生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質もしくは抗原もしくは酵素もしくはワクチンまたはそれらの組み合わせを発現する。
【００３１】
好ましくは、本方法は、多様な生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質もしくは抗原もしくは酵素もしくはワクチンまたはそれらの組み合わせを発現する細菌の混合物の投与を含む。
【００３２】
そこで、本発明の本実施形態では、例えば、ＩＬ２を発現できる細菌ならびにＩＬ１２および／またはＩＬ９を発現できる細菌ならびに任意で細胞および組織修復因子を発現できる細菌が提供されるが、これらには限定されない。
【００３３】
好ましくは、本方法は、本明細書において上記に挙げたいずれか１つまたは複数の特徴を含む。
【００３４】
バクテロイデス・オバタスは、外来ＤＮＡの生体内への導入およびゲノム内への組み込みを可能にするクローニングシステムが利用可能な、ヒトおよび齧歯類における主要な共生結腸内グラム陰性細菌である（Ｔａｎｃｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．１９９２）。この細菌はさらに、多糖類であるキシランを分解することのできるほんの少数の細菌の１つでもある。本発明者らは、キシランの存在下で活性であるキシラナーゼプロモーターの制御下で、細胞内でマウスＩＬ２（ＭｕＩＬ２）を産生するＢ．オバタスの遺伝子操作に成功した証拠を提供する。本発明者らの結果は、Ｂ．オバタスがキシランに応答して生物活性ＭｕＩＬ２を産生するように誘導されることを証明している。本発明者らは、さらにそのタンパク質へＢ．フラジリス（Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）エンテロトキシン分泌シグナル配列を付け加えることによってＭｕＩＬ２を分泌する第２菌株も遺伝子操作により作製した。組換え菌株は、細胞溶解液および培養液上清の酵素免疫吸着法によって確認されたように、キシランの存在下でのみＭｕＩＬ２を生成した。ＩＬ２依存性細胞株ＣＴＬＬ−２を使用すると、両方のＢ．オバタスによって産生したＭｕＩＬ２が生物活性であることが証明された。さらに、この活性は、抗ＩＬ２中和抗体によって阻害することができた。
【００３５】
本発明のまた別の態様によると、腸の慢性炎症を治療する方法であって、そのような状態に苦しんでいる個体に１つまたは複数の生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質を発現するように改変された製薬学的に有効量の腸内共生細菌を投与する工程を含み、本細菌は、食物因子の存在に応答して誘導され、前記生物活性ポリペプチドもしくはタンパク質の発現を調節するプロモーターをさらに含む方法が提供される。
【００３６】
本発明の細菌の薬物送達ビヒクルとしての使用は、腸の慢性炎症を治療するためにサイトカインなどの免疫調節因子、および他の生物活性分子を作用部位へ直接的に送達する手段を提供する。
【００３７】
この独創的な治療送達の形態の長所は、非経口的療法に付随する非便宜性および全身曝露を回避して、作用部位へ直接的に生物活性タンパク質を送達する便宜的かつ単純な手段である点である。
【００３８】
以下の図面のみを簡単に参照して、実施例によって本発明について説明する。
【００３９】
[細菌株、プラスミドおよび一般的なＤＮＡの操作]
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αおよびＪ５３／Ｒ７５１はＬＢ培地中で培養された。大腸菌Ｊ５３／Ｒ７５１の培養液に２００μｇ／ｍＬのトリメトプリムを補給した。Ｂ．オバタスＶ９７５は、１０μｇ／ｍＬのヘミンを補給した脳−心臓浸出物（ＢＨＩ）培養液中において、またはＨｅｓｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）によって記載されたように調製して０．１％（ｗ／ｖ）グルコースを補給したルーチン増殖培地（ｒｏｕｔｉｎｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｍｅｄｉｕｍ：ＲＧＭ）中において３７℃で嫌気的に培養された。キシランが必要とされた場合は、オートスペルトキシランの温水可溶性分画をＨｅｓｐｅｌｌ  ａｎｄ  Ｏ’Ｂｒｙａｎ（１９９２）の方法によって調製し、０．２％（ｗ／ｖ）の濃度で培地へ加えた。大腸菌Ｊ５３／Ｒ７５１からＢ．オバタスへのプラスミドの転移は、Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）によって記載されたようにコンジュゲーションによって実施した。ｐＢＴ２（Ｔａｎｃｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．１９９２）は、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを用いて大腸菌において選択した。Ｂ．オバタスのトランスコンジュガントは、２００μｇ／ｍＬのゲンタマイシンおよび５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含有するＢＨＩ−ヘミン寒天上で選択された。トランスコンジュガントは、引き続いて１μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含有する培地中で培養された。大腸菌は、Ｈａｎａｈａｎ（１９８３）の方法によって形質転換させた。一般的なＤＮＡ操作は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）によって記載された通りに実施した。
【００４０】
[ＭｕＩＬ２産生およびコントロールのＢ．オバタス菌株の構築]
ＭｕＩＬ２産生菌株ＢＯＭｕＩＬ２。ＭｕＩＬ２遺伝子は、プライマーであるＭｕＩＬ２Ｆ１
【化１】
2008527988.tif 000002
およびＭｕＩＬ２Ｒ１
【化２】
2008527988.tif 000003
を用いてｐＵＣ１３にクローニングしたｃＤＮＡからＰＣＲで増幅させた。ｏｒｆ遺伝子の３’側半分およびこの遺伝子とｘｙｌ遺伝子との間の領域を含むＢ．オバタスキシラナーゼのオペロンは、プラスミドｐＯＸ１（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  ａｎｄ  Ｈｅｓｐｅｌｌ  １９９０）からプライマーＯＲＦＦ１
【化３】
2008527988.tif 000004
およびＯＲＦＲ１
【化４】
2008527988.tif 000005
を用いて増幅させた。ＭｕＩＬ２およびＯＲＦのＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にクローニングしてプラスミドｐＧＥＭ−ＭｕＩＬ２およびｐＧＥＭ−ＯＲＦを各々作製した。ＭｕＩＬ２はＮｄｅＩを備えるｐＧＥＭ−ＭｕＩＬ２から取り出し、ＮｄｅＩ−消化ｐＧＥＭ−ＯＲＦにライゲートしてｐＯＲＦ−ＭｕＩＬ２を作製した。挿入部分をシーケンシングして構築物を確認した。ＯＲＦ−ＭｕＩＬ２構築物はＢａｍＨＩ消化によってｐＯＲＦ−ＭｕＩＬ２から取り出し、ｐＢＴ２のＢａｍＨＩ部位にクローニングしてｐＢＯＭｕＩＬ２を作製した。このプラスミドをコンジュゲーションによってＢ．オバタス内へ転移させ、トランスコンジュガントのゲノムへのこのプラスミドの組み込みはＰＣＲによって確証した。
【００４１】
ＭｕＩＬ２分泌菌株ＢＯＭｕＩＬ２−Ｓ。Ｂ．オバタス菌株であるＢＯＭｕＩＬ２−Ｓは、プライマーＢＦＴＳＩＧＩＬ２Ｆ
【化５】
2008527988.tif 000006
およびＭｕＩＬ２Ｒ１を用いてＭｕＩＬ２遺伝子をＰＣＲ増幅させる以外は菌株ＢＯＭｕＩＬ２と同一の方法で構築された。これによりプラスミドｐＧＥＭ−ＭｕＩＬ２−Ｓ、ｐＯＲＦ−ＭｕＩＬ２−ＳおよびｐＢＯＭｕＩＬ２−Ｓが作製された。
【００４２】
コントロール菌株ＢＴ２。ＭｕＩＬ２遺伝子を含有しないｐＢＴ２を含むコントロール菌株は、以下の通りに構築した。上記で使用したｏｒｆ遺伝子の同一部分を、プライマーのＯＲＦＦ１およびＯＲＦＲ２
【化６】
2008527988.tif 000007
を用いてＰＣＲ増幅させ、ｐＧＥＭ−ＴへクローニングしてｐＧＥＭ−ＯＲＦＢを作製した。挿入部分はＢａｍＨＩを用いて取り出し、ｐＢＴ２のＢａｍＨＩ部位内へクローニングしてｐＢＴ−ＯＲＦを作製した。このプラスミドを上述したようにＢ．オバタス内へ転移させた。
【００４３】
[ＭｕＩＬ２を産生するＢ．オバタスのサンプルの調製]
Ｂ．オバタス菌株であるＶ９７５、ＢＴ２、ＢＯＭｕＩＬ２およびＢＯＭｕＩＬ２−Ｓは、キシランを添加した、または添加していない１０ｍＬのＲＧＭ中で２４時間にわたり培養された。菌株ＢＯＭｕＩＬ２およびＢＯＭｕＩＬ２−Ｓはまた、キシランを添加せずに１６時間、その後にキシランを添加してさらに８時間培養された。インキュベーション後、細胞を集菌した（５，０００ｇ、３０分間、４℃）。上清を取り除いて冷凍した。細胞は１０ｍＬのＲＧＭ中で１回洗浄し、５ｍＬの蒸留水中に再懸濁させた。細胞は１２μｍで４×２０秒間にわたり氷上での超音波処理により破壊した（Ｓｏｎｉｐｒｅｐ  １５０、ＭＳＥ社）。未破壊細胞および細胞片は遠心分離によって除去した（１３，０００ｇ、２０分間、４℃）。溶解液および上清を凍結乾燥し、０．５ｍＬの蒸留水中に再懸濁させた。
【００４４】
[ＭｕＩＬ２を検出するためのアッセイ]
各々捕捉および検出抗体としての天然ラット抗マウスＩＬ２（クローンＪＥＳ６−１Ａ１２）およびビオチン化ラット抗マウスＩＬ２（クローンＪＥＳ６５Ｈ４）を組み込んでいるＥＬＩＳＡが、Ｂ．オバタスの組換え菌株によって生成されたＭｕＩＬ２のレベルを定量するために使用され、製造業者の取扱説明書（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）によって実施された。組換えＭｕＩＬ２（ｒＭｕＩＬ２；Ｓｉｇｍａ社）は、標準曲線を得るためのコントロールとして使用した。インジケータ細胞株ＣＴＬＬ−２（Ｇｉｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．１９７８）を用いるＩＬ２バイオアッセイを使用して、サンプル中の生物活性ＭｕＩＬ２の存在を検出した（Ｗａｄｈｗａ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。簡潔には、細胞は、９６穴プレート中の試験サンプルまたはコントロールｒＭｕＩＬ２の希釈液とともに２点複製で（ｉｎ  ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）１８時間にわたりインキュベートされた。次に細胞に０．５μＣｉ［3Ｈ］チミジンをパルスし、４時間後に集菌し、ＤＮＡ内に組み込まれた放射能をシンチレーション計数によって測定した。このアッセイをＩＬ２中和抗体（クローンＪＥＳ６−１Ａ１２）の存在下でも実施した。これは細胞を添加する１時間前に５μｇ／ｍＬの濃度でサンプルへ加えた。
【００４５】
[ＲＴ−ＰＣＲによるＭｕＩＬ２転写の検出]
Ｂ．オバタスのＶ９７５、ＢＴ２、ＢＯＭｕＩＬ２およびＢＯＭｕＩＬ２−Ｓは、キシランを添加せずにＲＧＭ中で１６時間にわたり培養された。誘導前サンプルは、キシラナーゼオペロンの転写を誘導するためにキシランを加える前にＢＯＭｕＩＬ２およびＢＯＭｕＩＬ２−Ｓの培養液から採取された。サンプルは、１時間後に全４つの培養液から採取された。全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて細胞サンプルから抽出し、その後にＴＵＲＢＯ  ＤＮＡ−ｆｒｅｅ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ社）による処理を実施し、任意の混入している残余ＤＮＡを除去した。ＲＴ−ＰＣＲは、ＡｃｃｅｓｓＱｕｉｃｋ（商標）ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社）ならびに陽性コントロールとしてのｏｒｆ−Ｍｕｉｌ２融合のためのプライマー（ＣＣＧＡＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＣＡＴＴＡＡＡ（配列番号７）およびＣＴＧＴＧＣＴＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧ（配列番号８）または陽性コントロールとしてのｇｙｒＡ遺伝子（ＣＴＣＣＡＴＧＴＣＧＧＴＣＡＴＣＧＴＴＴＣ（配列番号９）およびＣＡＡＡＧＧＡＴＡＡＣＧＣＡＴＴＧＣＣＣＡ（配列番号１０））を用いて実施した。陰性コントロールとして、逆転写酵素を添加せずに反応を実施した。
【００４６】
[Ｂ．オバタス菌株の構築]
キシラン誘導方法においてＭｕＩＬ２を発現することのできるＢ．オバタスの菌株を構築するために、ＭｕＩＬ２遺伝子（マイナス天然シグナル配列）およびキシラナーゼオペロンのｏｒｆ遺伝子の３’部分をＰＣＲ増幅させ、ｐＧＥＭ−Ｔ内にライゲートしてプラスミドｐＯＲＦ−ＭｕＩＬ２を得た。ＡＴＧ開始コドンは、ＮｄｅＩ部位の一部として成熟ＭｕＩＬ２をコードする配列の前に位置した。これはタンパク質の翻訳を保証した。クローニングのためのこのＮｄｅＩ部位の使用は、ｏｒｆおよびｘｙｌの間の野生型の領域に比較してｏｒｆおよびＭｕＩＬ２遺伝子の間の非コーディング領域内の一つの塩基変化（ＧからＡへ）を生じさせた。しかし、これはＭｕＩＬ２発現に影響を及ぼすとは予想されなかった。図１におけるプラスミドｐＢＯＭｕＩＬ２の構築は、ＰＣＲによって増幅され、一緒にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにライゲートされ、次にｐＢＯＭｕＩＬ２を作製するためにｐＢＴ２内へサブクローニングされたＢ．オバタスのｏｒｆ遺伝子の３’部分および全ＭｕＩＬ２遺伝子を含む。図面には、クローニングのために使用された制限酵素認識部位だけが示されている。ｔｅｔ、Ｂ．オバタスにおける選択のためのテトラサイクリン耐性；ｋａｎ、大腸菌における選択のためのカナマイシン耐性；ｏｒｉＶ、複製起点；ｒｅｐＡ、ｒｅｐＢ、ｒｅｐＣは複製機能をコードし、ｍｏｂは、大腸菌からＢ．オバタスへの移動のために必要とされる。ｐＢＯＭｕＩＬ２プラスミド（図１）は、次にＢ．オバタスＶ９７５へ転移させるのに成功した。ＭｕＩＬ２分泌菌株であるＢ．オバタスＢＯＭｕＩＬ２−Ｓは、ＭｕＩＬ２遺伝子をＰＣＲ増幅させるために使用したフォワードプライマーが、Ｂ．フラジリスのエンテロトキシン分泌シグナル配列をコードする配列を含有していたことを除いて同一方法で構築した。コントロール菌株であるＢ．オバタスＢＴ２もまたｏｒｆ遺伝子だけをｐＢＴ２にクローニングすることにより構築した。ＭｕＩＬ２およびＭｕＩＬ２−Ｓ発現菌株、ならびにＢＴ２コントロール菌株の構築の成功は、ＰＣＲおよびヌクレオチドシーケンシングによって確証した（データは示していない）。
【実施例１】
【００４７】
キシランの存在下でマウス成長因子インターロイキン２（ＩＬ−２）を産生するように設計されたＢ．オバタスの遺伝子組換え菌株であるＢ．オバタス−ＭｕＩＬ２がマウス腸内でコロニーを形成する能力を評価するための試験を実施した。
【００４８】
ＩＬ２-/-マウスを治療するためにＢ．オバタス−ＭｕＩＬ２を使用する有用性は、それがマウス結腸でコロニー形成できることを証明できるかどうかに依存するので、本発明者らは、Ｂ．オバタス−ＭｕＩＬ２が野生型マウスの結腸でコロニー形成できるかどうかを究明した。従来型飼料（キシランを含有する）で飼養された野生型の、特定病原微生物を有しない（ＳＰＦ）、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、経口強制飼養によって約１０10ｃｆｕのＢ．オバタス−ＭｕＩＬ２の単一接種材料で感染させた。コロニー形成は、全バクテロイデス種またはＢ．オバタス−ＭｕＩＬ２のみが増殖可能な抗生物質の存在下において嫌気性条件下で糞便ペレットを培養することによって７、１４、２１および２８日後に評価した。今後の実験においては、糞便培養中でのＢ．オバタス−ＭｕＩＬ２の同一性は、プローブとして全長マウスＩＬ２のｃＤＮＡクローンを用いるコロニーフィルタ・ハイブリダイゼーション技術によってより広範囲にわたり検証される。表１に示したように、Ｂ．オバタス−ＭｕＩＬ２は、マウス結腸で少なくとも一時的にコロニーを形成するそれらの能力に一致して、接種後２８日まで５匹中３匹の動物の糞便ペレット中に存在した。接種後２８日目に分析した動物２、３および５の結腸は、糞便中細菌数と一致して、多数（理論的には２０〜８０ｐｇのＭｕＩＬ２を産生できる２〜８×１０7ｃｆｕ／ｇ）のＢ．オバタス−ＭｕＩＬ２を含有していた。これとは対照的に、Ｎｏ．１および４のマウスの結腸は、コロニー形成失敗と一致してＢ．オバタス−ＭｕＩＬ２を含有していなかった。コロニー形成の効率および持続時間は、感染接種材料中の細菌数を増加させること、または細菌の反復投与によって改善することができる。
【００４９】
【表１】
2008527988.tif 000008
【実施例２】
【００５０】
キシランの存在下でマウス成長因子インターロイキン２（ＩＬ−２）を生成するように設計されたＢ．オバタスの遺伝子組換え菌株であるＢ．オバタス−ＭｕＩＬ２の、ＩＬ−２が遺伝的に欠損しているマウス（ＩＬ−２-/-マウス）において自然に発生する腸炎症の発病もしくは重症度に悪影響を及ぼす能力を評価するための試験を実施した。
【００５１】
ＩＢＤのための免疫療法プロトコールにおいて共生細菌を使用することについての問題は、選択される細菌が、免疫不全の動物および患者において、「病原性」である可能性があり、腸炎症を促進する、拡大する、または持続させる可能性がある点である。バクテロイデス属、ならびに詳細にはＢ．フラジリスおよびＢ．ブルガティス（Ｂ．ｖｕｌｇａｔｉｓ）は、ＩＢＤの実験動物モデルおよびＩＢＤ患者における腸炎症の発生と関連付けられてきた。ある研究は、ＩＢＤ患者の血清中においてＢ．オバタスの抗原と反応性であるＩｇＡおよびＩｇＧ抗体の増加した力価についても確認した5。しかし、これが腸炎症の原因であったかどうか、または全身循環へ入り込んで、上皮障壁への損傷の結果としての免疫応答を引き起こしているバクテロイデス属および他の共生細菌によって二次的に起こるかどうかは不明である。これらの所見に照らし、本発明者らは、Ｂ．オバタスがＩＬ２-/-マウスにおける結腸炎の発生に何らかの有害作用を有するかどうかを究明することが必要であり、さもないとＢ．オバタス−ＭｕＩＬ２を用いた治療がこれらの動物にもたらす何らかの潜在的利益を混乱させる、または無効にすると考えた。
【００５２】
２群（各々、ｎ＝６）の、従来型飼料で飼養した、年齢および性別が対応する３週齢の結腸炎を有さないＳＰＦ  ＩＬ２-/-マウスを、２００ｕＬのＰＢＳ中の約１０10ｃｆｕのＢ．オバタス（Ｖ９７５）、またはＰＢＳ単独を用いて６週間にわたり７日毎に感染させたが、その期間までに未処置のＩＬ２-/-マウスは重篤な疾患を発生した。感染３週間後および６週間後に、動物を安楽死させ、組織（脾臓、リンパ節および結腸）を肉眼的に分析し、疾患病理について組織学的に検査した。腸炎症の盲験評価のためには、有効な組織学的炎症スコアを使用した。
【００５３】
本発明者らの結果は、Ｂ．オバタスがＩＬ２-/-マウスにおいて通常発生する結腸炎の発生を促進せず、重症度を増加させもしないことを示している。しかしこの肉眼的および組織学的評価は、Ｂ．オバタスで治療された動物の組織および結腸における免疫細胞の数、分布および／または活性における他の、より些細な変化が存在する可能性を排除しない。このために、より詳細な免疫学的分析が実施される。
【実施例３】
【００５４】
菌株ＢＯＭｕＩＬ２およびＢＯＭｕＩＬ２−ＳによるＭｕＩＬ２の産生を評価するために、組換え菌株（ＢＯＭｕＩＬ２、ＢＯＭｕＩＬ２−ＳおよびＢＴ２）および野生型菌株（Ｖ９７５）は、キシランを添加した、または添加していない培地中で培養した。さらに、ＢＯＭｕＩＬ２およびＢＯＭｕＩＬ２−Ｓは、産生の誘導性の性質を実証するためにキシランを添加せずに（グルコースを含むＲＧＭ）１６時間、その後キシランを添加してさらに８時間培養された。細胞溶解液および培養液上清をＥＬＩＳＡおよびバイオアッセイによってＭｕＩＬ２について分析した。３つの独立実験からの代表的な結果である、キシランを添加して２４時間（＋Ｘ）またはキシランを添加せずに培養されたＢ．オバタスＢＯＭｕＩＬ２、Ｂ．オバタスＢＯＭｕＩＬ２−Ｓおよびコントロール菌株（Ｖ９７５およびＢＴ２）の細胞溶解液（ＣＬ）および培養上清（ＳＮ）中のＭｕＩＬ２のレベルは図２に示されている。ＢＯＭｕＩＬ２−Ｓは、キシランを添加せずに１６時間、その後にキシランを添加して８時間培養された（＋Ｘ８）。Ｂ．オバタスの試験菌株およびコントロール菌株は、キシランを添加した、またはキシランを添加していないＲＧＭ中で培養された。細胞を集菌し、溶解させ、溶解液および培養液上清中のＭｕＩＬ２の量をＥＬＩＳＡによって決定した。ＭｕＩＬ２は、組換えＭｕＩＬ２の希釈系列との比較によって定量した。データポイントは、平均値±標準誤差である。ＭｕＩＬ２は、キシラン中で培養されたＢ．オバタスＢＯＭｕＩＬ２の細胞溶解液中で検出され（５３９．５ｐｇ／ｍＬ）、そして培養液上清中では低濃度（４４．２ｐｇ／ｍＬ）で検出された。菌株ＢＯＭｕＩＬ２−Ｓについては、ＢＯＭｕＩＬ２に比較してキシランの存在下で培養された培養液の上清中で１９．３倍以上のＭｕＩＬ２（８４９．９ｐｇ／ｍＬ）が検出された。ＢＯＭｕＩＬ２−Ｓの細胞溶解液中では、低濃度のＭｕＩＬ２（１８４．３ｐｇ／ｍＬ）が検出された。ＭｕＩＬ２は、２つのコントロール菌株由来またはキシランの不在下で培養されたＢ．オバタスのＢＯＭｕＩＬ２もしくはＢＯＭｕＩＬ２−Ｓ由来の細胞溶解液もしくは培養液上清中では検出されなかった。
【実施例４】
【００５５】
ＩＬ２バイオアッセイは、ＢＯＭｕＩＬ２−Ｓによって産生したＭｕＩＬ２が生物活性を有すること証明した（図３）。図３は、キシランを添加して培養されたＢ．オバタスＢＯＭｕＩＬ２−Ｓの培養液上清中のＭｕＩＬ２のバイオアッセイの結果を示している。ＣＴＬＬ−２細胞の増殖は：『黒い四角形』、Ｂ．オバタスＢＯＭｕＩＬ２−Ｓ上清単独；『白い四角形』、抗ＭｕＩＬ２抗体を含むＢ．オバタスＢＯＭｕＩＬ２−Ｓ上清の２倍の希釈液とのインキュベーション後の［3Ｈ］チミジンの取込みによって測定した。ＭｕＩＬ２は、組換えＭｕＩＬ２の希釈系列との比較によって定量した。データポイントは、平均値±標準誤差である。生物活性は、コントロール菌株または培養培地単独由来の上清中では検出されなかった（データは示していない）。抗ＭｕＩＬ２抗体の添加によるインジケータ細胞株の増殖の阻害は、Ｂ．オバタスｐＢＯＭｕＩＬ２−Ｓの培養液上清中の増殖促進活性がＭｕＩＬ２に起因することを証明した。菌株ＢＯＭｕＩＬ２−Ｓにおいては、翻訳を促進するために、ＭｕＩＬ２遺伝子の５’末端へＡＴＧコドンを付加した。その結果として、メチオニン残基が成熟タンパク質のＮ−末端に存在した。バイオアッセイの結果は、これがタンパク質の生物活性を除去しないことを証明した。同様に、Ｂ．フラジリスのエンテロトキシン分泌シグナル配列によって指令されたＭｕＩＬ２の分泌は、ＭｕＩＬ２の生物活性を排除しなかった。より高濃度の細胞溶解液および上清はインジケータ細胞株にとって阻害性であることを証明し、したがってＢＯＭｕＩＬ２−Ｓ上清の１／４０の希釈液中ではより低濃度のＭｕＩＬ２が測定された。
【実施例５】
【００５６】
ｏｒｆ−ＭｕＩＬ２融合遺伝子の転写を確証するために、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。Ｂ．オバタスのＢＯＭｕＩＬ２およびＢＯＭｕＩＬ２−Ｓは、グルコースを添加したＲＧＭ中で１６時間にわたり培養し、細胞サンプルを採取した。キシランを次に加え、１時間後にサンプルを採取した。コントロール菌株の培養液からのサンプルをさらにキシラン導入後にも採取した。全ＲＮＡは、細胞から抽出し、ｏｒｆ−ＭｕＩＬ２構築物および一般的に使用される構成的に発現させたコントロール遺伝子であるｇｙｒＡに対して特異的なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを実施した。基底レベルの転写は、キシランの添加前のＢＯＭｕＩＬ２およびＢＯＭｕＩＬ２−Ｓ菌株の両方において検出できたが、これはキシランの添加１時間後に増加した（図４）。図４は、ＲＴ−ＰＣＲによって確認されたようにキシランに応答してＭｕＩＬ２のｍＲＮＡの増加した発現を示している。Ｂ．オバタスの試験菌株（ＢＯＭｕＩＬ２およびＢＯＭｕＩＬ２−Ｓ）またはコントロール菌株（Ｖ９７５およびＢＴ２）は、キシランを添加していないＲＧＭ中で２４時間培養させた。キシランを次に添加し、１時間にわたりインキュベーションを続けた。細胞を集菌し、全ＲＮＡを抽出し、ＭｕＩＬ２およびＭｕＩＬ２−Ｓ転写産物を検出するためにＲＴ−ＰＣＲを実施した。陽性コントロールとしてｇｙｒＡを使用した。レーン：１、キシランを添加して１時間培養させたＶ９７５；２、キシランを添加して１時間培養させたＢＴ２；３、キシランを添加せずに増殖させたＢＯＭｕＩＬ２；４、キシランを添加して１時間培養させたＢＯＭｕＩＬ２；５、キシランを添加せずに培養させたＢＯＭｕＩＬ２−Ｓ；６、キシランを添加して１時間培養させたＢＯＭｕＩＬ２−Ｓ。
【００５７】
ＭｕＩＬ２遺伝子の転写は、２つのコントロール菌株で検出されなかった。キシラン添加前にはＭｕＩＬ２産生菌株中で転写が検出されたが、細胞溶解液もしくは培養液上清中でＭｕＩＬ２タンパク質を検出することはできなかった（図２）。
【００５８】
本明細書に提示したデータは、常在性腸内細菌叢のメンバーであるＢ．オバタスにおいてキシラナーゼオペロンの厳密な調節下で生物活性ＭｕＩＬ２が産生されうることを証明している。さらに、生物活性ＭｕＩＬ２は、Ｂ．フラジリスエンテロトキシン分泌シグナル配列を組み込むことによってＢ．オバタスによって分泌させることもできる。菌株ＢＯＭｕＩＬ２の培養液上清中のＭｕＩＬ２のレベルは相対的に低かったが、分泌シグナル配列の付加によって１９．３倍に増加した（菌株ＢＯＭｕＩＬ２−Ｓ）。キシラナーゼオペロンは、有益にも、キシランの存在下でこのオペロンが誘導性を持つという性質により、調節される遺伝子発現のために利用されてきた。このオペロンのプロモーターはクローン化もキャラクタリゼーションされていないが、このオペロン内の遺伝子によってコードされた酵素の活性がキシランに応答してアップレギュレートされることは証明されている。本発明の系は、さらにまたキシランの食事摂取によってインビボでの制御または調節も提供する。本発明のこの特徴は、キシランが腸から結腸へ通過する間には未消化のままであり、結腸内でのみ微生物の酵素の作用によって分解される点で他の誘導系より優れた長所を有する。
【００５９】
キシランを添加せずに培養された細胞では基底レベルの転写が検出されたが、ＭｕＩＬ２産生は、細胞溶解液もしくは培養液上清中でのＥＬＩＳＡによる検出のためには低すぎるレベルにあった（＜２０ｐｇ／ｍＬ）。キシラン除去後に、Ｂ．オバタスのｐＢＯＭｕＩＬ２のキシラン誘導性培養液中で任意のＭｕＩＬ２を検出できないことは、キシラナーゼオペロンの厳密性およびＭｕＩＬ２産生のためにキシランの持続的な存在が必要であることを証明した（データは示していない）。Ｂ．オバタスによって産生および分泌されたＭｕＩＬ２のレベルは低いが、生理的な範囲内にある。このことは、生物学的作用を有するのに十分なＭｕＩＬ２を産生させなければならないが、そのレベルは有害な作用を有するほど高くてはならないので、この系を治療的に使用しなければならない場合には極めて重要である。本発明者らは現在、それらが疾患を治療および予防する能力を調べるためにＩＢＤのマウスモデルにおいてＢ．オバタスのＭｕＩＬ２産生および分泌菌株を分析することを企図している。
【実施例６】
【００６０】
成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、経口チューブ投与によってマウスＩＬ２遺伝子を発現するＢ．オバタスの組換え菌株（ＰＢＳ中で１０8ｃｆｕ）を単回投与し、その３日および７日（Ｔ）後に、選択的培養条件および抗生物質を使用して、全天然バクテロイデス種および組換えＢ．オバタスの存在について糞便を培養した。細菌コロニー（ｃｆｕ）は、２４時間後に定量した。
【００６１】
結果は、組換えＢ．オバタス菌株が、細菌の単回投与から１週間後まではマウスの大多数（４／５）の結腸でコロニー形成することを証明している。組換えＢ．オバタスの存在は、バクテロイデス属の内因性集団のサイズに何も影響を及ぼさない。
【００６２】
【表２】
2008527988.tif 000009
【実施例７】
【００６３】
図５は、ヒトＴＧＦβまたはＫＧＦのいずれかを発現しているＢ．オバタスの構築物マップを示している。ヒトＫＧＦ（ＢｏＨｕＫＧＦ）もしくはＴＧＦβ（ＢｏＨｕＴＧＦ）のいずれかをコードする遺伝子を発現するＢ．オバタスの組換え菌株、または異種遺伝子を含まないコントロール菌株（ＢｏＢＴＳ）を、ＥＬＩＳＡによってＴＧＦβおよびＫＧＦについて培養上清をアッセイする前の８時間もしくは２４時間にわたって、完全培地単独（Ｍｅｄｉａ）またはキシランを含有する培地中で培養した。組換えＢ．オバタスの一部の培養液はキシランを加えて８時間にわたり培養し、培地を取り除き、さらに完全培地単独中でさらに２４時間培養した（ＢｏＨｕＫＧＦ／ＴＧＦ±キシラン）。図６Ａは、ヒトＴＧＦβ（ＢｏＨｕＴＧＦ）をコードする遺伝子を発現するＢ．オバタスを用いた３回の独立実験において検出された培養液上清中に存在するサイトカインの平均量（±ＳＥＭ）のグラフを示している。図６Ｂは、ヒトＫＦＧ（ＢｏＨｕＫＧＦ）をコードする遺伝子を発現するＢ．オバタスからの同様の実験データを示している。
【００６４】
これらを要約すると、上述したように、食物因子の制御下で免疫調節分子を生成する共生細菌を遺伝子組換えで作製できることは、ＩＢＤなどの慢性腸疾患のためのより慎重な、特異的および制御された療法を提供する可能性を提供する。このアプローチは、様々な疾患の治療および予防における用途とともに、サイトカイン、酵素およびワクチンを含む、様々な生体関連分子を送達するために使用できる。
【００６５】
［参考文献］
【表３Ａ】
2008527988.tif 000010
【表３Ｂ】
2008527988.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】プラスミドｐＢＯＭｕＩＬ２の構造の略図を示す。
【図２】キシランを添加して２４時間（＋Ｘ）またはキシランを添加せずに培養されたＢ．オバタスＢＯＭｕＩＬ２、Ｂ．オバタスＢＯＭｕＩＬ２−Ｓおよびコントロール菌株（Ｖ９７５およびＢＴ２）の細胞溶解液（ＣＬ）および培養液上清（ＳＮ）中のＭｕＩＬ２のレベルの棒グラフを示す。
【図３】キシランを添加して培養されたＢ．オバタスＢＯＭｕＩＬ２−Ｓの培養液上清中のＭｕＩＬ２のバイオアッセイの結果を示す。
【図４】キシランを添加せずにＲＧＭ中で２４時間およびその後にキシランを添加して１時間培養されたＢ．オバタスの試験菌株（ＢＯＭｕＩＬ２およびＢＯＭｕＩＬ２−Ｓ）またはコントロール菌株（Ｖ９７５およびＢＴ２）を用いてＲＴ−ＰＣＲによって決定されたキシランに応答したＭｕＩＬ２  ｍＲＮＡの増加した発現のゲルを示す。
【図５】ヒトＴＧＦβまたはＫＧＦのいずれかを発現するＢ．オバタスの構築物マップを示す。
【図６Ａ】キシランに応答してヒトＴＧＦβを発現するＢ．オバタスによるヒトサイトカインの産生を示す。
【図６Ｂ】キシランに応答してヒトＫＦＧを発現するＢ．オバタスによるヒトサイトカインの産生を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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2008527988.tif 000019
2008527988.tif 000020
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