(57)【要約】  本発明は、抗高血圧特性を有する新規なタンパク質加水分解産物、並びにこれらを含む食品および食品サプリメントを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オボムチン、リゾチームおよびオボトランスフェリンから選択される効果的な量のタンパク質加水分解産物を含む食品または食品サプリメントであって、血圧の増大したヒトに摂取されたときに、血圧の上昇を妨害するか、または血圧を有意に低下させることを特徴とする、食品または食品サプリメント。
【請求項２】
卵白、全卵および卵黄から選択される効果的な量のタンパク質加水分解産物を含む食品または食品サプリメントであって、血圧の増大したヒトに摂取されたときに、血圧の上昇を妨害するか、または血圧を有意に低下させることを特徴とする、食品または食品サプリメント。
【請求項３】
オボムチン、リゾチームおよび/またはオボトランスフェリンのプロテアーゼ加水分解により得られる酵素的タンパク質加水分解産物であって、抗高血圧活性を有することを特徴とする、酵素的タンパク質加水分解産物。
【請求項４】
卵白、卵黄および/または全卵のプロテアーゼ加水分解により得られる酵素的タンパク質加水分解産物であって、抗高血圧活性を有することを特徴とする、酵素的タンパク質加水分解産物。
【請求項５】
抗高血圧活性を備えた食品または食品サプリメントを調製するための請求項３または４に記載のタンパク質加水分解産物の使用。
【請求項６】
抗高血圧活性を備えたタンパク質加水分解産物を作成する方法であって、
(a)一または複数のターゲットタンパク質を含む溶液を提供する工程、
(b)必要に応じて前記溶液を加熱して前記ターゲットタンパク質を変性する工程、
(c)前記溶液のｐＨを、使用する酵素（enzyme or enzymes）に適したｐＨに調整する工程、および
(d)前記溶液に一または複数の加水分解酵素を添加し、前記溶液を適切な温度で適切な期間インキュベートする工程
を含み、
前記ターゲットタンパク質が、実質的に純粋なリゾチーム、オボムチン、オボアルブミン、リポビテリンおよび/またはオボトランスフェリンから選択されることを特徴とする方法。
【請求項７】
抗高血圧活性を備えたタンパク質加水分解産物を作成する方法であって、
(a)一または複数のターゲットタンパク質を含む溶液を提供する工程、
(b)必要に応じて前記溶液を加熱して前記ターゲットタンパク質を変性する工程、
(c)前記溶液のｐＨを、使用する酵素（enzyme or enzymes）に適したｐＨに調整する工程、および
(d)前記溶液に一または複数の加水分解酵素を添加し、前記溶液を適切な温度で適切な期間インキュベートする工程
を含み、
工程(a)の前記溶液が、全卵、全卵白、または全卵黄を含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
前記溶液をメンブレンフィルターにより濾過し、活性なターゲットペプチドが豊富な透過液を得る工程(e)を更に含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
請求項６または７に記載の方法により得られる、抗高血圧性タンパク質加水分解産物。
【請求項１０】
前記食品または食品サプリメントが、液体、固体、または半固体の形態である、請求項１または２に記載の食品または食品サプリメント。
【請求項１１】
請求項９に記載の加水分解産物を含む食品または食品サプリメント。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、生物活性な卵タンパク質加水分解産物、活性なタンパク質加水分解産物を作成する方法、およびこれらを適量含む機能性食品および食品サプリメントに関する。機能性食品、食品サプリメント、および機能性成分自体の活性なタンパク質加水分解産物は、血圧を下げるのに特に適しており、予防と治療の両方で摂取することができる。加えて、加水分解産物、およびこれらを含む組成物は、代謝障害および心臓血管疾患の危険因子の一または複数の構成要素、たとえばメタボリックシンドロームを治療または予防するために使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
世界中に広がる心臓血管疾患は、住民の健康状態全般および経済的困難、並びに経済全般に対して莫大な影響を及ぼす。毎年150万人が、欧州連合加盟国（欧州心臓ネットワーク）において心臓血管疾患（CVD）で死亡する。更に、障害で失われた命の140万人近くは、CVDによるものであり、その半数以上（70万人以上）は脳卒中により命を失った。血圧レベルと脳卒中および冠状動脈性心臓疾患のリスクとの間に強い関連があり、EU住民の高い割合が、血圧の（軽度の）上昇に悩んでおり、特に年配者のグループが、より高いリスクにさらされている。
【０００３】
高血圧は、通常、一群の危険因子の中に同時に存在する。アンギオテンシン-I変換酵素（ACE）阻害剤は、血圧を下げるだけでなく、アテローム発生ミリュー（atherogenic milieu）の多くの他の面に積極的に影響を及ぼす。心筋梗塞および鬱血性心不全の患者における、心臓血管の罹患率および死亡率を下げるACE阻害剤の効能に関する証拠は、今日までに充分に確立されている。血圧の軽度の低下でさえ、罹患率および死亡率に積極的に影響を及ぼすことができる。CVDリスクの性質の近年の分析により、食事が、基本的、根本的な危険因子として、過去において注目を集めていたよりも大きな注目を集めることが示唆されている（European Heart Network, Position Paper, 1998）。このPosition Paperにおいて、この事実は、健康食の供給が、CVD予防活性の中心的な位置に移される必要があることを意味すると結論づけられた。
【０００４】
ACEは、他の不活性なアンギオテンシン-IのＣ末端His-Leuを切断除去することにより、血管収縮を含む血圧上昇活性を有するアンギオテンシン-IIを生成する。高血圧は、ACEの機能を阻害することにより治療できることが知られている。インビボACE阻害活性を有する多くの化学的薬剤、たとえば、モエキシプリル（Moexipril）、キナプリル（Quinapril）、エナラプリル（Enalapril）、リジノプリル（Lisinopril）、ペリンドプリル（Perindopril）、ラミプリル（Ramipril）、トランドラプリル（Trandolapril）、およびベナゼプリル（Benazepril）が存在する。かかる薬剤は、しばしば副作用を示し、過剰摂取の危険がある。加えて、かかる薬剤は一般に予防的摂取に適していない。したがって、血圧の上昇に苦しんでいない被検体に（予防的に）摂取されたときに有害でないが、（軽度の）血圧の上昇を伴う被検体において血圧を積極的に低下させる、既存のものに代わる天然のACE阻害剤が求められている。好ましくは、かかる製品は、食品サプリメント（たとえば錠剤、小袋（sachet）の形態など）または機能性食品（たとえばドリンク、半固体または固体の食品の形態など）の何れかで摂取される。かかる食品サプリメントまたは機能性食品の定期的摂取により、結果として、CVDにかかるコストの2％に相当する健康ケアセクターのコストが減少し、EUでCVDに罹患するヒトが5％減少することが期待される。また、平均的な疾患フリーの年月を、おそらく少なくとも3年延長させることができる。加えて、これら製品の製造プロセスは、化学的薬剤と比較して環境にやさしく、製造コストがかなり低い。
【０００５】
天然源に由来する多くの抗高血圧性組成物が、既に記載されている。EP 1 228 708は、高血圧低下活性を有するミルク由来のタンパク質およびペプチドフラクションの使用を記載する。また、EP0583074は、ACE阻害活性を有するミルク由来のVal-Pro-Pro含有ペプチド、およびそれを含む発酵食品を記載する。WO01/32905は、抗高血圧性ペプチドを調製するために、乳酸菌を用いてカゼイン含有出発材料を発酵することを記載する。US 6,514,941は、高血圧性ペプチドが豊富なカゼイン加水分解産物に関する。WO01/85984は、ACE阻害活性および抗高血圧活性を有する乳漿タンパク加水分解産物の使用を記載する。EP1094071は、抗高血圧性薬剤として使用するための魚肉由来のペプチドに関する。
【０００６】
本発明の目的は、インビボでACE阻害活性および抗高血圧活性を有する新規な組成物および機能性成分を提供することである。
【一般的な定義】
【０００７】
本明細書において「食品」の用語は、ヒトおよび/または動物の摂取に適した液体、半液体、または固体の食品をいう。このため飲料が含まれる。
【０００８】
「機能性食品」は、一または複数の活性成分、とりわけ本発明の一または複数の卵タンパク質加水分解産物を含む食品をいい、活性成分が、（軽度の）血圧の上昇を伴う被検体により摂取されたときに、インビボで高血圧または血圧の上昇の発症を妨害し、および/または血圧を積極的に低下させる。
【０００９】
「食品サプリメント」は、機能性成分として本発明の一または複数の生物活性なタンパク質加水分解産物を適量含む、ヒトおよび/または動物の摂取に適したサプリメントをいう。サプリメントは、ピル、小袋（sachet）、パウダーなどの形態とすることができる。
【００１０】
「被検体」は、ヒト、非ヒト霊長類、飼育動物（farm animal）、家畜（domestic animal）、および実験動物を含むがこれらに限定されない、哺乳類綱の任意のメンバーを意味する。
【００１１】
「食品グレード」は、ヒトまたは動物の被検体に摂取されたときに、有害でないと考えられる成分をいう。食品グレード成分は、好ましくはGRASステータスをもつべきである。
【００１２】
「含む」の用語は、記載されるパート、ステップまたは成分の存在を特定するが、一または複数の追加のパート、ステップまたは成分の存在を除外しないと解釈すべきである。このため、領域Ｘを含むペプチド配列は、追加の領域を含んでもよく、すなわち、領域Ｘは、より大きなペプチド領域に埋め込まれていてもよい。
【００１３】
「効果的な用量」または「効果的な量」は、インビボで治療または予防効果を結果的に得るのに充分な用量をいう。治療に効果的な用量は、少なくとも約0.5 mmHg、1 mmHg、5 mmHg、8mmHg、10 mmHg、12mmHg、15mmHg、20、30、50、または100 mmHg以上の（経口摂取後の）インビボの血圧を低下させるのに充分な用量である。本質的に、血圧の測定可能な低下は、有意であり、心臓血管の罹患率および死亡率の結果に影響を及ぼす（McMahon et al. Lancet 1990, 335: 765-774 and Murray and Lopez 1997, Lancet 349: 1498-1504参照）。収縮期および/または拡張期血圧の両方を、このように低下させてもよい。
【００１４】
本明細書において「ACE阻害剤」または「ACE阻害活性」は、インビトロおよび/またはインビボでACE-I（アンギオテンシン-I変換酵素）活性を有意に阻害する、タンパク質加水分解産物の能力をいう。IC50値が0.5 mg/ml以下のタンパク質加水分解産物は、インビトロで有意であるとみなされ、有意なインビボACE阻害活性を（潜在的に）有するとみなされる（Sekiya et al. 1994, Science 45: 513-517参照）。IC50は、酵素活性の50％を阻害する濃度をいう。
【００１５】
本明細書において「卵」は、好ましくは鶏卵をいうが、他の鳥由来の卵を使用してもよい。
【００１６】
本明細書において「卵タンパク質加水分解産物」は、全卵、卵フラクション（たとえば卵白または卵黄）、または実質的に純粋な卵タンパク質、とりわけリポビテリン、オボムチン、リゾチーム、オボアルブミンおよびオボトランスフェリンの（インビトロで調製された）タンパク質加水分解産物をいうための一般的な用語として使用される。
【００１７】
本明細書において「非加水分解性卵タンパク質」または「未消化の卵タンパク質」は、インビトロで加水分解されていない、全卵、卵フラクション（たとえば卵白または卵黄）、または実質的に純粋な卵タンパク質、とりわけリポビテリン、オボムチン、リゾチーム、オボアルブミンおよびオボトランスフェリンをいうための一般的な用語として使用される。
【００１８】
「メタボリックシンドローム」は、たとえばMoller and Kaufman (Annual Rev. of Medicine Vol 56, 45-62)に記載されるとおり、肥満、インスリン抵抗性および高インスリン血症、グルコース不耐症、高血圧および異常脂肪血症（dyslipidemia）（高トリグリセリド血症および低HDLコレステロール値）を含む、複合的な相互に関連する臨床上の障害をいう。
【００１９】
「バイオマーカー」は、血圧に関連した疾患またはシンドローム（またはシンドロームの個々の構成要素）のインジケーターをいう。たとえば、ヒトCRP（Ｃ−反応性タンパク質）、ストレス関連タンパク質の血中レベルは、CVD危険因子のバイオマーカーである。CRPの低下は、脳卒中および心筋梗塞などの心臓血管疾患の発生低下を示唆し；CRPレベルの上昇は、脈管系の炎症を示唆し、これは、血圧とCVDリスクに影響を及ぼし；他のバイオマーカーには、（インスリン抵抗性を示唆する）グルコース負荷後に放出されるインスリンの量、および尿中に分泌されるタンパク質の量がある。
【００２０】
「総コレステロール」は、LDL-およびHDL-コレステロールの両方を指す。
【００２１】
本明細書において「インビトロ消化シミュレーション」は、卵タンパク質加水分解産物または非加水分解性卵タンパク質を、被検体の胃腸管にみられる酵素、たとえばペプシン、キモトリプシンおよびトリプシンとともに、生理的なインビボ消化プロセスをシミュレートするオーダーおよび時間枠でインキュベートすることをいう。
【００２２】
ペプチドまたはタンパク質の「活性なフラグメント」は、（たとえば酵素的加水分解またはインビボ合成により得られる）全長のタンパク質またはタンパク質変異体より短くACE阻害活性を示すタンパク質部分をいう。
【００２３】
「実質的に同一な」、「実質同一性」、「本質的に類似の」、または「本質類似性」の用語は、本明細書で別途規定されるとおり、二つのペプチドまたは二つのヌクレオチドの配列を、たとえばプログラムGAPまたはBESTFITによりデフォルトパラメーターを用いて最適に整列させたときに、それらが少なくとも一定の配列同一性パーセンテージを共有することを意味する。GAPは、ニードルマンとブンシュ（Needleman and Wunsch）のグローバルアラインメントアルゴリズムを使用して、マッチする数を最大にし、ギャップの数を最小にして二つの配列をその全長にわたって整列させる。一般に、GAPデフォルトパラメーターが使用され、ここでギャップ発生ペナルティー = 50 (ヌクレオチド) / 8 (タンパク質)、ギャップ伸長ペナルティー = 3 (ヌクレオチド) / 2 (タンパク質)である。ヌクレオチドに関して使用されるデフォルトスコアリングマトリクスは、nwsgapdnaであり、タンパク質に関してデフォルトスコアリングマトリクスは、Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919)である。
【００２４】
配列アラインメントおよびパーセンテージ配列同一性のスコアは、コンピュータープログラム、たとえばGCG Wisconsin Package, Version 10.3（Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 USAから入手）、またはオープンソースソフトウェアWindows(登録商標)用Emboss（現バージョン2.7.1-07）を用いて決定することができる。あるいは、パーセント類似性または同一性は、たとえばFASTA、BLASTなどのデータベースに対してサーチすることにより決定することができる。
【００２５】
加えて、不定冠詞“a”または“an”によるエレメントの参照は、一つまたは唯一のエレメントであることを文脈が明確に要求しない限り、二つ以上の当該エレメントが存在する可能性を除外しない。このため、不定冠詞“a”または“an”は、通常「少なくとも一つ」を意味する。
【００２６】
更に、ヌクレオチドまたはアミノ酸の「配列」を参照するとき、核酸またはアミノ酸の当該配列を有する物理的な分子、すなわち核酸分子またはタンパク質分子を指すことが理解される。
【発明の詳細な説明】
【００２７】
卵タンパク質加水分解産物、とりわけ卵白タンパク質加水分解産物が、インビトロアッセイにおいて有意なACE阻害活性を示し、ラットにおいてインビボで有意な抗高血圧活性を示すことを驚くべきことに見出した。
【００２８】
最初に、（タンパク質を定量的にスコア化しランク付けする専売権付き社内ソフトウェアを用いた）インシリコ分析を利用して、ACE阻害活性を有し、インビボで抗高血圧性の高い潜在能力を有するペプチドを含むターゲットタンパク質を鶏卵で同定した。選択基準は、計算されたスコアが、公知のACE阻害ペプチドを含有するリファレンスタンパク質β−カゼインのスコアを超えることである。定量的なスコアおよびランキング全体に基いて、5個のターゲットタンパク質が同定され、これらは、酵素により加水分解し、酵素的加水分解の後に必要に応じて活性なペプチドを豊富にした（enrich）ときに、ACE阻害ペプチドを含み、インビボで抗高血圧活性を示すことができる：リポビテリン（たとえば配列番号１、２、７および８参照）、卵黄にみられるタンパク質、オボムチン（たとえば配列番号６および９参照）、リゾチーム（たとえば配列番号４参照）、オボアルブミン（たとえば配列番号８参照）、およびオボトランスフェリン（たとえば配列番号５参照）（4つともすべて卵白にみられる）。
【００２９】
卵白および/または卵黄のタンパク質を使用して、有意なACE阻害活性を有する加水分解産物が製造されるかどうか、どのように製造されるかを分析するために、実施例に更に記載されるとおり幾つかの実験を行った。
【００３０】
本発明の一つの態様は、ACE阻害活性および抗高血圧活性を有する卵タンパク質加水分解産物を作成する方法を提供することである。この方法は、以下の工程を含む：
１．一または複数のターゲットタンパク質を含む溶液、好ましくは水溶液を提供する工程、
２．必要に応じてこの溶液を約5〜20分間、好ましくは15分間、約90℃に加熱して、当該タンパク質を変性し、および/または（存在するかもしれない）プロテアーゼ阻害剤を不活性化する工程、
３．このｐＨを、使用する加水分解酵素が活性なｐＨ、好ましくは使用する加水分解酵素にとって最適なｐＨ値に調整する工程、
４．この組成物が、使用する加水分解酵素に適した加水分解温度、好ましくは加水分解活性に関して最適な温度に達したときに、適量の加水分解酵素、好ましくは、トータルのターゲットタンパク質フラクション（w/w）に対して約2％の加水分解酵素を添加する工程、
５．この溶液を攪拌しながら少なくとも約3時間インキュベートする工程、
６．必要に応じて更なる量の酵素（2％ w/w）を添加し、更にこの溶液を攪拌しながら約2〜3時間インキュベートする工程、
７．必要に応じて、たとえば加熱処理、たとえば90℃で15分の処理により酵素を不活性化する工程。
【００３１】
また、上記方法により得られる加水分解産物、および適量のかかる加水分解産物を含む組成物、好ましくは食品または食品サプリメントの組成物が提供される。
【００３２】
この溶液は、濃縮するかまたはフリーズドライ（たとえば凍結乾燥）し、更なる使用のため、たとえばインビトロACE阻害アッセイのため、ペプチドを豊富にする（enrichment）ため、（下記参照）または更なるペプチドの精製のため、あるいは効果的な量の加水分解産物を含む食品サプリメントまたは食品の製造のために、室温で保存することができる。
【００３３】
遠心分離により固形成分を除去すると、幾つかの例において、可溶性フラクションのACE阻害活性が、全体の加水分解産物の活性と比較して、1.5〜2倍増大することが見出された。このため、必要に応じて、可溶性フラクションを単離して使用してもよい。固形フラクションは、たとえば4,500 gで約15分間の遠心分離、または同等の条件により除去することができる。また、固形フラクションは、濾過または他の分離技術により除去することもできる。他のターゲットタンパク質に関しては、固形フラクションを除去すると、可溶性フラクションのACE阻害活性が低下し、固形フラクションの除去は望ましくない。これらターゲットタンパク質に関しては、固形フラクションは、好ましくは、保持されるか、または製品に再度添加されるか、あるいは活性な食品または食品サプリメントの成分（の一部）として使用される。
【００３４】
加水分解方法の幾つかの工程は、得られる加水分解産物の特性を変化させることなく改変してもよいことが理解される。たとえば、インキュベーション工程５および６は、たとえば約4〜5時間または5〜6時間の単一の酵素インキュベーション工程に置き換えてもよい。当業者であれば、最適に使用される上記加水分解プロトコールを容易にアレンジすることができるでしょう。多量の塩が望ましくないため、とりわけヒトおよび/または動物の摂取用の大規模生産のためには、緩衝溶液の代わりに水中で加水分解を行うことが好ましい。一般に、加水分解に関して、使用される酵素の量、ｐＨ、温度およびインキュベーション時間の最適化を必須にしてもよい。適切な加水分解プロトコールの例は、実施例において提供される。
【００３５】
工程１の溶液のタンパク質成分は、以下の一または複数から選択することができる：（新鮮な）全卵、単離された卵白、単離された卵黄、卵パウダー、卵白パウダー、卵黄パウダー、オボアルブミン、リゾチーム、オボトランスフェリン、オボムチンおよび/またはリポビテリンの実質的に純粋な総タンパク質組成物。適切なターゲットタンパク質源の例は、商業的に入手可能なタンパク質組成物または卵フラクション組成物、たとえば卵白パウダーである。リゾチームは、たとえば、Belovo（100% 純粋タンパク質）から入手することができ、オボトランスフェリンは、Sigma-Aldrich（81.3% 純粋タンパク質）またはBelovo（89.5% タンパク質）から入手することができ、オボムチンは、Belovoから入手することができ、オボアルブミンは、Worthington（75.7% タンパク質）またはInterchema（70.8% タンパク質）から入手することができ、卵黄は、NIVE（31.6% タンパク質）から入手することができ、卵白は、NIVE（79.7% タンパク質）から入手することができる。明らかに、代わりに使える販売源を使用してもよいし、公知の精製方法を使用して、卵または卵フラクションから一または複数のターゲットタンパク質を精製してもよい。リポビテリン、リゾチーム、オボトランスフェリン、オボムチン、およびオボアルブミンなどのタンパク質は、当該技術分野で公知の組換えDNA技術を用いて作成してもよい。たとえば、配列番号１−１０（またはその変異体）の何れかのタンパク質フラグメントまたは全長タンパク質を、化学合成を利用してde novo合成してもよいし、組換え宿主細胞でクローニングして発現させてもよい。このため、たとえば卵を産む動物の適切な食事により、またはトランスジェニック動物により、リポビテリン、リゾチーム、オボトランスフェリン、オボムチン、およびオボアルブミン（またはこれらの何れかの変異体またはそのフラグメント）の一または複数を豊富にした（enriched）全卵、卵黄、または卵白を、出発材料として使用してもよいことが想定される。
【００３６】
配列番号１−１０のターゲットタンパク質の「変異体」には、配列番号１−１０のタンパク質と本質的に類似のタンパク質、たとえば配列番号１−１０の何れかと少なくとも60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%または100%の配列同一性を含むアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれる。かかる変異体は、de novo合成してもよいし、天然源から単離またはクローニングしてもよいし、あるいはインシリコで同定してもよい。
【００３７】
本発明の一つの態様において、タンパク質源として使用される卵は、新鮮でなく、たとえば室温、4℃、またはパウダー形態で長期間保存しておいてもよい。新鮮でない卵の供給源により、ACE阻害活性が負の影響を受けないことが見出された。これは、使用前にたとえば卵の冷却が不要であるため、加水分解産物の製造プロセスにおいて有利な点である。卵または卵フラクションの室温での保存、または約4℃と室温の間の温度での保存は、活性を失うことなく、少なくとも6週間可能である。
【００３８】
あるいは、ターゲットタンパク質は、卵から抽出して、その後精製してもよい。たとえば、卵白フラクションは、公知の方法を用いて分離することができ、特定のターゲットタンパク質は、陽イオンおよび陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル透過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および当該技術分野で公知の他の方法により精製することができる。オボトランスフェリンは、たとえば、金属キレートクロマトグラフィーにより精製することができるが、糖タンパク質の単離のためにヘパリンアフィニティークロマトグラフィーを使用してもよい。卵白中のリゾチームの濃度は、他のリゾチームの供給源と比べて高い（3-4％）。リゾチームの精製のために通常使用されるプロセスは、陽イオン交換クロマトグラフィーである。リゾチームは、そのままのｐＨ（ｐＨ９）で陽イオン交換体に結合する。これは、攪拌タンク反応器で行ってもよいし、クロマトグラフィーカラムで行ってもよい。リゾチームは、塩による吸着粒子からの溶出を終えると、食品への適用にとって充分純粋である。薬への適用に適した高度に純粋なリゾチームを得るためには、更なる精製のためにｐＨ４の陰イオン交換クロマトグラフィーが必要である。この精製プロセスの利点は、出発材料（卵白）が変わらないこと、プロセスを容易にアップスケール化できること、食品への適用のためにたった１回の吸着プロセスしか必要でないこと、並びに生物学的活性が保持されることである。このため、一つの態様において、リゾチームは、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製される。ターゲットタンパク質の何れか一つの更なる精製、メンブレン限外濾過およびダイアフィルトレーションなどの工程を適用してもよい。
【００３９】
加水分解に適した酵素は、原則として、種々の供給源、たとえば植物、動物、または微生物、たとえば真菌または細菌に由来する、任意の食品グレードのプロテアーゼまたはプロテアーゼ混合物とすることができる。たとえば、Newlase Fは、Rhizopus niveus 由来の酸性プロテアーゼを含み、Promod 184Pは、Ananas comosus由来のプロテアーゼを含み、Promod 258Pは、Carica papaya由来のプロテイナーゼ（パパイン）およびAspergillus spp.由来のプロテイナーゼとペプチダーゼを含み、Pepsin 389Pは、ブタの胃粘膜由来の動物酸性プロテアーゼを含み、アルカラーゼ（Alcalase）は、主要酵素としてエンドプロテイナーゼを有するBacillus licheniformiのプロテアーゼミックスを含む。
【００４０】
特定のターゲットタンパク質−プロテアーゼの組合せが、生物活性なペプチドを放出し、ACE阻害活性を備えた加水分解産物が得られることを見出した。タンパク質加水分解産物の調製のために使用される好ましい酵素を、酵素の最適な使用条件と併せて表１に示す。
【表１】
2008507270.tif 000002
【００４１】
試験された酵素のうち、以下の食品グレードのプロテアーゼ（またはプロテアーゼ混合物）が特に適していることが見出された：Newlase F、Promod 258P、Alcalase、PEM (Proteolytic Enzyme Mix)、PTN (Pancreatic Trypsin Novo)、およびProtex 6L。他のエンド−および/またはエキソ−プロテアーゼ（または混合物）を使用してもよいことが理解される。当業者であれば、記載されるとおり加水分解産物を作成し、本明細書で別途記載されるとおりインビトロアッセイを利用してACE阻害活性を試験することにより、その適合性を決定することができる。
【００４２】
本発明の範囲を限定しないが、エキソプロテアーゼ活性のために比較的高い割合の単一アミノ酸を放出する酵素は、あまり適切でなく、（エンド−およびエキソ−プロテアーゼ活性のため、またはエンド−プロテアーゼ活性のみのために）比較的高い割合のジ−および/またはトリ−ペプチドを放出する酵素が最も適切であると考えられる。適切には、酵素は、約10％未満、好ましくは約8％、7％、6％または5％未満の遊離のアミノ酸を放出する。好ましくは、使用される酵素は、比較的高い割合、たとえば少なくとも10％、15％、20％、30％、40％、50％以上のジ−および/またはトリ−ペプチドを放出する。
【００４３】
このため、本発明のタンパク質加水分解産物は、好ましくは高い割合の、ターゲットタンパク質のジ−および/またはトリ−ペプチドを含み、好ましくは少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80％以上含む。したがって、一つの態様において、長い鎖長および高分子量のペプチド、たとえば4、5、6、7、8個以上のアミノ酸が、好ましくは、比較的少ない量（好ましくはターゲットタンパク質フラクション全体の10％未満）で存在するか、あるいは存在しない。
【００４４】
このため、一つの態様において、本発明の加水分解産物は、ターゲットタンパク質由来のジ−および/またはトリ−ペプチドのパーセンテージ（およびタンパク質フラクションにおけるペプチド鎖長の分布）により、および/またはターゲットペプチドの分子量の分布により特徴づけることができる。たとえば、加水分解産物は、0.5 kD未満のターゲットペプチドを少なくとも30、40、50、60、70、80、90、95、99または100％含み得る。例13は、ターゲットタンパク質加水分解産物の分子量分布と加水分解の程度と加水分解産物の活性との関係を示す。したがって、好ましい分子量分布は、例13に示され、（＜0.5 kD：0.5 kDと1.0 kDの間：＞1 kDの分子量を有するフラグメントのパーセンテージとして表すと）たとえば、約70:10:20、45:21:34、70:16:14、98:1:1、99:1:0、85:10:5、90:1:9、92:4:4、および53:17:30を含む。0.5 kD未満のフラグメントは、4−5個未満のアミノ酸のフラグメントに相当し、約0.5−1.0 kDのフラグメントは、4−9個のアミノ酸に相当し、1 kDを超えるフラグメントは、9個を超えるアミノ酸のペプチドフラグメントに相当する。このため、ターゲットタンパク質の何れか、たとえば配列番号１−１０のアミノ酸配列を含むタンパク質、またはその変異体を加水分解して、これら一続きの連続アミノ酸を含むペプチドを生成してもよい。好ましくは、ターゲットタンパク質の加水分解の程度は、少なくとも約15％、20％、より好ましくは少なくとも30％以上である。このため、一つの態様において、配列番号１−１０またはその変異体の何れかの2個の連続アミノ酸、3、4、5、6、7、8、9個の連続アミノ酸の一または複数から選択される複数のフラグメントを含む組成物が含まれる。
【００４５】
このため、加水分解産物の分子量分布は、たとえば、40−70％の0.5 kD未満のターゲットペプチド、および30−50％の0.5 kDと1 kDの間のペプチドなどを含み得る。加水分解産物の分子量分布、ペプチド鎖長分布、および最大ペプチド重量は、当該技術分野で公知の方法、たとえばSDS-PAGE分析、HPLC分析、MALDI-TOF（マトリックス支援レーザー脱離/イオン化−飛行時間型質量分析（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-of-Flight mass spectrometry）、Kaufmann, J. Biotechn 1995, 41: 155-175およびSoeryapranata et al. 2002, J. Food Sci. 67: 534-538に記載）、HP-GPC（高性能ゲル透過クロマトグラフィー、Terheggen-Lagro et al. BMC Pediatrics 2002, 2: 10に記載）、およびエドマン分解（Siemensma et al. Trends Food Sci Technology 1993, 4: 16-21）により決定することができる。例13も参照されたい。ターゲットタンパク質の最大分子ペプチド重量は、好ましくは10 kD未満、より好ましくは5 kD未満、より好ましくは4 kD、3 kD、2 kD、1 kD、0.5 kD未満または約0.3 kD未満である。
【００４６】
特定の態様において、短いペプチド、たとえばジ−およびトリ−ペプチドの割合を高める（enriched）ことにより、得られる加水分解産物のACE阻害活性は、少なくとも1.5倍、2倍、好ましくは3倍以上増大する。生物活性なペプチドは、ターゲットタンパク質由来のペプチドを含む加水分解産物を、一または複数のメンブレンフィルター（たとえば、限外濾過またはナノフィルトレーションメンブレン）を通して濾過することにより高めることができ、好ましくは、分子量カットオフが0.3 kD、0.5 kD、1 kD、2 kD、3 kD、4 kD、5 kD乃至10 kD、より好ましくは2 kD乃至5 kDのメンブレンフィルターを使用する。したがって、約2、3、4および/または5個のアミノ酸の長さの短い低分子量ペプチドが豊富で、かつACE阻害活性の増大したターゲットタンパク質加水分解産物が、ここでは提供される。好ましくは、2−3 kDのサイズカットオフを用いて豊富にすること（enrichment）が使用される。たとえば、オボトランスフェリンペプチドを含む加水分解産物およびリゾチームペプチドを含む加水分解産物のACE阻害活性は、短いペプチドを豊富にした（enrichment）後に増大することが示されている（実施例参照）。このように短いペプチドが豊富な加水分解産物は、好ましくは、インビボで高まった抗高血圧活性を有する。加えて、より少ない量で、一日ベースで効果的なものとすることができ、これにより、小さい体積の食品サプリメントまたは食品の調製が可能になる。
【００４７】
また、加水分解産物に存在し、ペプチドの活性に影響を及ぼし得る望ましくない不純物を除去するために、メンブレン濾過を使用してもよい。
【００４８】
また、ターゲットタンパク質および/または酵素の組合せ（混合物）を使用し、必要に応じて低分子量ペプチド、たとえばジ−および/またはトリ−ペプチドを豊富にすることにより、生物活性なタンパク質加水分解産物を製造することが想定される。
【００４９】
あるいは、本発明のタンパク質加水分解産物に似ている組成物は、化学的合成法を利用してde novo合成することができる。とりわけ、ジ−およびトリ−ペプチドライブラリーは、コンビナトリアルケミストリーを利用して作成することにより、ジペプチドおよびトリペプチドのあらゆる可能な組合せを形成することができる。ジ−およびトリ−ペプチドのこのプールまたはライブラリーから、上述の加水分解産物と本質的に同じ血圧に対する活性を有する混合物を構成することができる。
【００５０】
以下のターゲットタンパク質−酵素の組合せにより、0.5 mg/mlの加水分解産物で約50%、55%、60%、65%、70%、80%以上のACE阻害値を有する加水分解産物が得られた（詳細については実施例を参照）：
ターゲットタンパク質 − 酵素
リゾチーム − Alcalase
リゾチーム − Protex 6L
リゾチーム − PEM
リゾチーム − PTN
オボムチン − PEM
オボムチン − Alcalase
オボムチン − Protex 6L
オボムチン − PTN
オボトランスフェリン − Newlase F
オボトランスフェリン − Promod 258P
オボトランスフェリン − PTN
オボトランスフェリン − PEM
オボトランスフェリン − Protex 6L
オボアルブミン − Promod 258P
卵黄 − Alcalase
卵白 − Protex L6
卵白 − PEM
卵黄 − Newlase F
卵白 − Alcalase
卵白 − Promod 258P。
【００５１】
10個の最も活性の高い加水分解産物のリストにより、以下のとおり（活性の高いものから活性の低いものへ）ACE阻害活性（インビトロアッセイ）によるランキングが得られた。
【００５２】
1. オボトランスフェリン − Newlase F; オボトランスフェリン − PTN
2. オボムチン − Alcalase; オボトランスフェリン − PEM; リゾチーム − PEM
3. 卵黄 − Protex L6; オボアルブミン − Promod 258P; オボトランスフェリン − Promod 258P; リゾチーム − Alcalase; リゾチーム − Protex 6L。
【００５３】
商業目的のために、大規模生産に適応させること、たとえば500、1000、1000リットル以上の出発原材料および/またはタンパク質加水分解産物の製造方法は、所望の当業者にとって通常の実験事項である。
【００５４】
このため、上述のとおり作成され、必要に応じてさらにペプチドが豊富にされ（enrich）、および/または精製された、インビボで有意なACE阻害活性と有意な抗高血圧活性を備えた卵タンパク質加水分解産物が提供される。また、本発明の加水分解産物を適量含む組成物、とりわけ食品および/または食品サプリメントが提供される。下記参照。
【００５５】
別の態様において、非加水分解性卵タンパク質または部分的に加水分解された卵タンパク質、およびその使用が提供され、更に、効果的な量の少なくとも一の非加水分解性卵タンパク質、とりわけ全卵、全卵黄、全卵白、オボトランスフェリン、オボムチン、リゾチームおよび/またはオボアルブミンから選択される少なくとも一の非加水分解性卵タンパク質を含む食品サプリメントおよび食品が提供される。ヒトおよび/または動物の被検体の胃腸管に存在するプロテアーゼによる加水分解が、ターゲットタンパク質から生物活性なペプチドを放出するのに有効であることが、（消化シミュレーションを用いて）驚くべきことに見出された。したがって、インビトロ加水分解は、それ自体必須の工程ではないが、インビボ効果のばらつきを最小限にするために好ましく、インビボ効果のばらつきは、被検体の間のばらつき（ある被検体は、別の被検体より高い消化酵素の量および/または活性を示し得る）、および/または食品の組成および歯ごたえのばらつき（異なった胃腸コンパートメントにおいて保持時間のばらつきにつながる）に由来し得る。
【００５６】
食品サプリメントまたは食品の調製のために、加水分解された卵タンパク質を使用する場合、加水分解産物の活性がインビボで改変されないか、または少なくとも実質的に改変されないか、またはマイナスに改変されない（活性を低下させない）ことが好ましい。その後の胃腸酵素との接触が加水分解産物の生物学的活性に何ら影響を及ぼさないという意味において、加水分解産物が「完全に加水分解されている」かどうかは、インビトロ消化シミュレーションアッセイを行うことにより試験することができる。このアッセイにおいて、加水分解産物は、ペプシン、トリプシンおよびキモトリプシンとともにインキュベートされ、スタート時の加水分解産物のACE阻害活性を、ペプシン/トリプシン/キモトリプシンで処理した加水分解産物のACE阻害活性と比較する（更なる詳細については実施例参照）。好ましくは、消化シミュレーション（およびインビボ消化）は、加水分解産物または加水分解産物を含む食品サプリメントもしくは食品のACE阻害活性を変化させない。
【００５７】
更に、効果的な量の少なくとも一の本発明の加水分解産物および/または効果的な量の少なくとも一の非加水分解性卵タンパク質（または部分的に加水分解された卵タンパク質）を含む食品サプリメントおよび食品が提供される。有意なACE阻害活性は、たとえばインビトロアッセイを用いて、約50％（またはそれ以上）のACE活性を阻害することができる0.5 mg/mlタンパク質加水分解産物（またはそれ以下）と定義される。ACE阻害活性を決定するためのインビトロアッセイは、公知であり（たとえば、Matsui et al. 1992, Biosc. Biotech. Biochem 56, 517-518参照）、実施例に記載される。適切には、公知のACE阻害剤、たとえばカプトプリルがリファレンスとして使用される。（拡張期および/または）収縮期血圧（SPB）を経口摂取後に定期的に測定した試験動物、たとえばSHR（自然発生的高血圧ラット）、またはヒト臨床試験で決定され得るとおり、有意な抗高血圧活性とは、インビボで血圧を下げる加水分解産物の能力と本明細書において定義される。コントロールのラットは、正常血圧のラット、たとえばWistarラットまたはWKYとすることができる。モデル動物において血圧を測定する方法は、当該技術分野で公知であり、たとえば遠隔測定法およびテールカフ（tail cuff）法が挙げられる（Van Vliet et al. 2000, J Pharmacol Toxicol Methods. 44(2): 361-73参照）。遠隔測定装置およびテールカフ血圧分析装置は、商業的に入手可能である。
【００５８】
少なくとも一の本発明のタンパク質加水分解産物および/または少なくとも一の本発明の非加水分解性卵タンパク質を含む食品サプリメントおよび食品は、当該技術分野で公知のとおり作成することができる。食品サプリメントは、たとえば、任意の投与形態、たとえば錠剤、ピル、パウダー小袋（powder sachet）、ゲル、カプセルなどの形態とすることができる。被検体による摂取は、好ましくは経口である。食品は、ドリンク（たとえば100 mlボトル、150 ml溶液）、固形または半固形の食品、たとえばスナック、デザート、ソース、全粒小麦などの形態とすることができる。好ましくは、食品は、定期的なベースで、好ましくは毎日消費される食品であり、たとえば主食（たとえばパン、麺、ソフトドリンク、乳製品、たとえばチーズ、ヨーグルト、発酵乳製品、ミルク、バターなど）である。このため、生物活性な成分を食品ベースに添加してもよいし、あるいは製造プロセスの間に食品に組み込んでもよい。このように、本発明の加水分解産物を含む任意の既存の食品または食品サプリメントが、本発明に包含される。
【００５９】
好ましい態様において、食品はドリンクであり、好ましくはフルーツジュースまたは野菜ジュースベースのドリンクであるが、ミルクベースのドリンクも包含される。ドリンクは、50ml、100ml、150ml、200mlまたはそれ以上の一日摂取量で調製することができる。食品サプリメントまたは食品が、追加の食品グレードの成分を更に含んでいてもよく、たとえば香味料、ビタミン、ミネラル、安定化剤、乳化剤、他の生物学的に活性な成分、食品ベース/栄養素、たとえばタンパク質、炭水化物および/または脂肪成分などが挙げられるがこれらに限定されないことが理解される。卵タンパク質加水分解産物または非加水分解性卵タンパク質は、食品/食品サプリメントの通常の製造プロセスの間の任意の段階で添加することができる。
【００６０】
また、食品/食品サプリメントは、他の不活性な成分およびキャリア、たとえばグルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロースまたはセルロース誘導体、たとえばカルボキシメチルセルロース（CMC）、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ナトリウムサッカリン、タルク、炭酸マグネシウムなどを含んでいてもよい。また、水、電解質、必須および非必須アミノ酸、微量元素、ミネラル、繊維、甘味料、香味料、着色剤、乳化剤および安定化剤（たとえば、大豆レシチン、クエン酸、モノ−またはジ−グリセリドのエステル）、保存剤、結合剤、フレグランスなどを含んでいてもよい。
【００６１】
添加するのに必要な効果的な用量は、多くのファクター、たとえば被検体（たとえばヒトまたは動物）、投与形態（毎日、一日に数回、週に一回）、および食品の組成および/または歯ごたえ等に依存する。タンパク質加水分解産物または非加水分解性タンパク質の一日の効果的な用量は、約50 mg/kg体重〜100 mg/kg、500 mg/kg〜1000 mg/kg体重の範囲、またはそれ以上である。しかし、非常に活性な加水分解産物については、約10 mg/kg/日またはそれ以下の量で充分であり得る。ルーチン実験を利用して効果的な用量を決定することは、当業者の領域の範囲内である。一つの態様において、10 g、20 g、30 g、40 gまたはそれ以上の加水分解産物の用量を含む食品または食品サプリメントが提供される。かかる組成物は、毎日の摂取に適している。
【００６２】
ピルまたはカプセルの形態の食品サプリメントに関しては、生物活性なペプチドのインビボでの放出場所および/または放出時間を変化させるコーティングを加えてもよい。遅延放出性製剤が、当該技術分野において公知である。
【００６３】
本発明の機能性食品および食品サプリメントは、定期的に、好ましくは毎日、効果的な用量で摂取されると、好ましくは血圧を低下させる。血圧に対する効果は、投与形態および摂取量に依存して、数週間後、たとえば3、4、5、6または7週間後にみられるでしょう。
【００６４】
かかる機能性食品または食品サプリメントは、血圧低下効果を有するものとしてラベルされてもよく、僅かな血圧の上昇または高血圧と診断された被検体に、治療として摂取されてもよい。成人の正常な血圧の値は、約120 mmHg（収縮期）/80 mmHg（拡張期）である。血圧の上昇または高血圧は、種々のレベル、たとえば境界型(120−160/90−94)、軽度(140−160/95−104)、中程度(140−180/105−114)、および重症(160+/115+)に分類することができる。本発明の食品および食品サプリメントは、境界型、軽度および中程度のグループの治療に特に適している。これらは、単独で摂取してもよいし、化学的薬剤（この場合用量を減らしてもよい）または他の血圧低下製品と組合せて摂取してもよい。
【００６５】
あるいは、これらは、血圧の上昇/高血圧を発症するリスクのある被検体または健康な被検体に予防的に摂取されてもよい。血圧の上昇に苦しむヒトにおいて、本発明の組成物の経口摂取後の血圧のほとんどすべての低下（mmHg）が、罹患率および死亡率に望ましい影響を及ぼす。本発明の食品サプリメントまたは組成物の経口摂取後に、拡張期血圧が1 mmHg (またはそれ以下)、5 mmHg、8 mmHg、10 mmHg、12 mmHg、15 mmHg、20 mmHg、30 mmHg、40 mmHgまたはそれ以上低下することは、本発明に包含される。更に、（付加的または択一的に）収縮期血圧の上記と同量の低下が、本発明に包含される。
【００６６】
別の態様において、本発明の加水分解産物または適量の一または複数の加水分解産物を含む組成物は、メタボリックシンドローム（またはメタボリックシンドロームの一または複数の個々の構成要素）の治療または予防のため、総コレステロールおよび/またはLDL-コレステロールの低下のため、血中CRPレベルの低下のため、インスリン抵抗性（すなわち糖尿病；2型糖尿病またはインスリン非依存性糖尿病またはグルコース不耐性）の治療または予防のため、および/または尿の総タンパク質レベルの低下のために使用される。このため、本発明の一または複数の加水分解産物を含む組成物を定期的に摂取した後に、バイオマーカーを測定し、バイオマーカーに対する加水分解産物の効果を決定することができる。したがって、加水分解産物を使用して、一または複数のバイオマーカーを調節し、これにより有益な健康効果を得てもよい。本発明の加水分解産物を使用してバイオマーカーを調節する方法が本発明に包含される。好ましくは、加水分解産物を定期的に摂取した後（たとえば適量を摂取してから1、2、または3週後）、血中総コレステロールレベルおよび/またはLDLコレステロールレベルは、少なくとも10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L、25 mg/L、30 mg/Lまたはそれ以上低下する。ルーチン実験使用して、適量を決定することができる。血中CRPレベルは、好ましくは、0.3 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/Lまたはそれ以上低下する。尿のタンパク質レベルは、好ましくは、2％、5％、10％またはそれ以上低下する。上記の任意の組合せが本発明に包含されることが理解される。このため、本発明の加水分解産物の摂取は、収縮期および拡張期血圧の両方、総コレステロールおよびLDLコレステロール、CRPレベルなどを低下させるために適している。
【００６７】
本発明の抗高血圧性ペプチドを含む加水分解産物は、他の方法により、たとえば細菌または他の微生物（酵母、他の真菌）による発酵、化学合成、またはトランスジェニック宿主細胞または宿主生物での発現により、作成してもよいことが理解される。たとえば、活性なペプチドをコードするDNA配列を、適切なプロモーター（好ましくは強力なプロモーター）に動作可能に連結して、植物の細胞、組織または器官および/またはトランスジェニック植物で発現させてもよい。また、単一のプロモーターの下で発現させることができる幾つかの活性なペプチドをコードする配列ストレッチ（stretch）を含むDNA配列をデザインしてもよい。このペプチドは、スペーサー配列により、たとえばプロテアーゼにより認識され切断されるアミノ酸をコードする配列により隔てられていて、その結果、活性なペプチドを、酵素的加水分解により順次放出することができる。
【００６８】
SEQ ID NO 1: VIT2_CHICK アミノ酸配列
SEQ ID NO 2: VIT2_CHICK アミノ酸配列
SEQ ID NO 3: APV1_CHICK アミノ酸配列
SEQ ID NO 4: LYC_CHICK アミノ酸配列
SEQ ID NO 5: TRFE_CHICK アミノ酸配列
SEQ ID NO 6: Q98UI9 アミノ酸配列
SEQ ID NO 7: VIT1_CHICK アミノ酸配列
SEQ ID NO 8: OVAL_CHICK アミノ酸配列
SEQ ID NO 9: Q98UI9 アミノ酸配列
SEQ ID NO 10: VIT1_CHICK アミノ酸配列。
【００６９】
以下の非限定的な例は、本発明の製品および方法を説明する。
【実施例】
【００７０】
例１−インシリコ分析
1.1  方法
すべての公知のACE阻害ペプチドについて、配列データおよび定量的活性データ（IC50値）を含有する社内ペプチドデータベースを構築した。このデータベースを、すべての鶏/卵タンパク質を含む第二のデータベースに対して分析した。シグナル配列を分析の間に除去し、並びに完全長の成熟ペプチドではないペプチドを除去した。使用したプログラムにより、ACE阻害活性を有するターゲットタンパク質配列にペプチドが存在する確率を反映するスコアを計算した。
【００７１】
1.2  結果
活性予測に基いて、ペプチドの長さを考慮して、短いペプチドの長さを優先させて、以下の結果を得た。
【表２】
2008507270.tif 000003
【００７２】
最も高い重量スコアを有するターゲットタンパク質は、（数および全活性において）ACE阻害活性を有するペプチドを含み、このため、これらタンパク質は、ACE阻害特性を備えた加水分解産物の有望な供給源である。最も有望なターゲットタンパク質は、リポビテリンＩおよびII、リゾチーム、オボトランスフェリン、オボムチンおよびオボアルブミンであった。
【００７３】
例２−本発明の最適化プロトコール
2.1  卵タンパク質の加水分解のためのプロトコール
・タンパク質フラクション（3％）を水に溶解する
・溶液を攪拌する
・溶液を90℃で15分間インキュベートする（リゾチームに対しては不要；凝固）
・所望の温度に冷却後、所望のｐＨにｐＨを調整し、酵素を添加する（タンパク質フラクションに対して2％の酵素（w/w））
・溶液を攪拌しながら3時間インキュベートする
・追加量の酵素を添加する（再度2％ w/w）
・溶液を更に2〜3時間攪拌しながらインキュベートする
・水浴で90℃で15分間インキュベートすることにより酵素を不活性化する
・溶液をフリーズドライして室温で保存する。
【００７４】
2.2  (加水分解された)サンプルのインビトロ消化シミュレーションのためのプロトコール
・4％タンパク質（加水分解産物）サンプル溶液を作成する
・ｐＨを2にする
・10 mg/mlのペプシン溶液を1/250(w/w)の割合で添加する
・溶液を振盪しながら水浴で37℃で2時間インキュベートする
・その後、ｐＨを6.5にする
・10 mg/mlトリプシンおよび10 mg/mlキモトリプシンを含有する溶液を、両酵素について1/250(w/w)の割合で添加する
・溶液を振盪しながら水浴で37℃で2.5時間インキュベートする
・90℃で15分間インキュベートすることにより酵素を不活性化する
・サンプルをフリーズドライして室温で保存する。
【００７５】
2.3  マイクロタイタープレートにおける加水分解産物のACE阻害活性の測定のためのプロトコール
ACE阻害活性は、分光測光ベースのアッセイを用いてインビトロで測定することができる。このアッセイは、ACEにより触媒されるHip-His-Leu基質からの馬尿酸の遊離に基くものである。
【００７６】
以下の溶液を使用した：
・300 mM NaClを含有する0.1 M ホウ酸バッファー、pH8.3
・5 mM EDTA.2Na溶液
・1 M NaClを含有する0.5 M Bicine 
・0.25 M NaOH
・50 mU/ml ACE
・0.1 M Na2HPO4中の50 mM 2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸 (TNBS)
・1 mg/ml ラクトフェリンを含有するホウ酸バッファー中の5 mM ヒプリル-L-ヒスチジル-L-ロイシン (Hip-His-Leu)
・タンパク質(加水分解産物)溶液 (0.500 mg/ml、0.167 mg/ml、0.055 mg/ml、0.019 mg/ml)
・リファレンス溶液、0.5 mg/ml 卵白/アルカラーゼ（Alcalase）加水分解産物。
【表３】
2008507270.tif 000004
【００７７】
EDTAはACEを変性させる（100％ACE阻害）
試験のゼロバランスのために天然タンパク質のラクトフェリンをすべてのウェルに添加する
Bicine(バッファー)は、すべてのウェルのpHをpH 9.1、すなわちTNBS反応の最適pHに調整する。
【数１】
2008507270.tif 000005
【００７８】
2.4  アルカラーゼを用いたオボムチンの更なる(最適化)加水分解
TNBS法によるDH測定のためのプロトコール
溶液：
−  0.21 M リン酸ナトリウムバッファー pH8.2
−  0.21 M NaH2PO4.H2O (25 ml溶液)
−  0.21 M Na2HPO4.2H2O (500 ml溶液)
−  溶液をpH 8.2に混合する
−  0.05% TNBS
−  アルミホイル付きMQカバー試薬チューブでTNBSストック (5%溶液) を0.05%に希釈し、暗所に保存する
−  1% SDS溶液
−  ロイシン標準液 (ストック3 mM ロイシン)
−  ロイシンを1% SDS溶液に溶解する。分析のためにストック溶液を1% SDSを用いて20x、10x、4x en 2x希釈する
−  ブランク
−  非加水分解性サンプルを1% SDS中で0.5 mg/mlのタンパク質濃度に希釈する
−  サンプル
−  加水分解されたサンプルを1% SDS中で0.5 mg/mlの濃度に2セット希釈する。
【００７９】
分析：
−  15μlのサンプル（ロイシン標準液またはサンプル）をマイクロウェルにピペットで移す。プレート(Costar, 非結合プレート)において2倍希釈をそれぞれ測定する。
【００８０】
−  45μlの0.21 M リン酸ナトリウムバッファー pH 8.2を添加する。
【００８１】
−  45μlの0.05% TNBSを添加する。アルミホイルでプレートを覆う。50℃のストーブで60分間プレートをインキュベートする。
【００８２】
−  インキュベート後、90μlの0.1 N HClを添加する。
【００８３】
−  340 nmにおける吸光度を測定する (マイクロプレートリーダー)。
【００８４】
加水分解の程度（DH）の計算：
−  ロイシン標準液のキャリブレーションラインを作成する。このキャリブレーションラインは、サンプルの吸光度の値をＮＨ2−等価物に変換するために使用する。サンプルのmmol NH2-等価物を、非加水分解性サンプルのmmol eq.について修正する。
【００８５】
−  例： 加水分解によるNH2 = 0.78 mM ロイシン NH2, 0.78 mM * 15 (サンプル体積) * 10-6 = 1.17 * 10-5 meq。サンプルのタンパク質濃度は0.5 mg/mlであり、このため15μlは7.5μgタンパク質を含有する。h = 1.17*10-5 meq/7.5*10-6 = 1.56 meq/g。h tot eiwit (値はタンパク質に依存する) = 7800 meq/kg。
【００８６】
%DH = (1.56/7.8)*100% = 20%。
【００８７】
結果
実験１
オボムチンの3％溶液、pH8、60℃、アルカラーゼ
【表４】
2008507270.tif 000006
【００８８】
実験２
オボムチンの3％溶液/アルカラーゼの加水分解産物、pH8、60℃、アルカラーゼ
【表５】
2008507270.tif 000007
【００８９】
実験３
オボムチンの3％溶液/アルカラーゼの加水分解産物（DH 23.9、IC50 0.21 mg/ml）、pH8、60℃、アルカラーゼ
【表６】
2008507270.tif 000008
【００９０】
動物研究のためのオボムチン/アルカラーゼの加水分解産物
オボムチン/アルカラーゼの加水分解産物の更なる加水分解の概要
・6 g 加水分解産物 (オボムチン/アルカラーゼの加水分解産物、5時間)
・60℃、pH 8
・120μl アルカラーゼ
・3時間後、追加の120μl アルカラーゼ
・3時間後、追加の120μl アルカラーゼ
・30分後、反応を停止させる (90℃で15分)
・フリーズドライする
全加水分解時間 (5 + 6.5) = 11.5時間
ACE活性：IC50 = 0.23 mg/ml
サンプルは、例8.2.4.1で使用した。
【００９１】
例３−最初の卵タンパク質加水分解実験（プロトコールの最適化の前）
加水分解実験のために市販の10個の酵素を使用し、9個のターゲットタンパク質サンプルを使用した。加水分解実験において以下の酵素を使用した（最適ｐＨ、温度およびバッファーを括弧内に記す）：
・Newlase F (pH 3, T50, ギ酸バッファー)
・Pepsin 389P (pH3, T50, ギ酸バッファー)
・Promod 258P (pH5.5, T45, 酢酸バッファー)
・Promod 184P (pH6, T50, Bis-Trisバッファー)
・Flavourzyme (pH7, T50, リン酸バッファー)
・Alcalase (pH8, T60, Trisバッファー)
・PEM (pH8, T50, Trisバッファー)
・PTN (pH8, T50, Trisバッファー)
・Corolase PP (pH8, T50, Trisバッファー)
・Protex 6L (pH8, T60, Trisバッファー)。
【００９２】
以下の市販のターゲットタンパク質組成物を使用した（製造者および明細を括弧内に記す）：
・リゾチーム (Belovo, 100%タンパク質)
・オボトランスフェリン (Sigma, Aldrich, 81.3%タンパク質)
・オボムチン (Belovo, 72.3%タンパク質)
・オボアルブミン (Worthington, 75.7%タンパク質)
・卵黄 (NIVE, 31.6%タンパク質)
・卵白 1101 (NIVE, 79.7%タンパク質)
・卵白 1102 (NIVE, 77.2%タンパク質)
・オボアルブミン (Interchema, 70.8%タンパク質)
・オボトランスフェリン (Belovo, 89.5%タンパク質)
パーセンテージタンパク質は、ケルダール(Kjeldahl)に従って決定した (ケルダール因子 6.25)。
【００９３】
最初の加水分解実験は、バッファー中で最適ｐＨおよび温度において行った。プロトコールは、以下のとおり：
−  タンパク質フラクション(100 mg タンパク質)を3.3 mlバッファーに溶解した
−  溶液をボルテックスにかけた(vortex)
−  t=0でサンプルを採取し(300μl)、フリーザーに−20℃で保存した
−  溶液を（振盪しながら）水浴で90℃で15分間インキュベートした。この工程は、リゾチームの場合、凝集物の形成のために行わなかった
−  所望の温度に冷却した後、酵素を添加した(1.8 mgまたは1.8μl；タンパク質フラクションに対して2% 酵素を添加した)
−  混合した後、チューブをボルテックスにかけた
−  溶液を磁気バーにより攪拌しながら3時間インキュベートした；合間に、溶液をボルテックスにかけた
−  （振盪しながら）水浴で90℃で15分間インキュベートすることにより、酵素を不活性化した
−  ｐＨを測定し、溶液をフリーズドライして4℃で保存した。
【００９４】
ターゲットタンパク質−酵素の全ての組合せを最初にスクリーニングした後（結果を示さず）、最も有望なサンプル（すなわちIC50が0.5 mg/ml以下）を再度分析した。タンパク質濃度の関数としてACE阻害の結果を、以下の表に記す（カプトプリルを6 ng/mlの濃度で使用した）：
【表７】
2008507270.tif 000009
【表８】
2008507270.tif 000010
【表９】
2008507270.tif 000011
【表１０】
2008507270.tif 000012
【表１１】
2008507270.tif 000013
【表１２】
2008507270.tif 000014
【表１３】
2008507270.tif 000015
【００９５】
上記結果の分析を、以下の表に示す。ターゲットタンパク質−酵素の組合せを、ACE阻害活性、この阻害の再現性、および外観（加水分解産物の取扱い易さの指標でもある）についてスコア化する。
【表１４】
2008507270.tif 000016
【００９６】
#：外観： s=溶液, p=粒状物, m=白濁, a=凝集物, ts=濁った溶液
1： ACE阻害＞60%は＋＋； 50-60%の間は＋
2： 最大値と最小値の間の差＜10%は＋； 10-20%の間は０； ＞20%は−
3： 溶解度：溶液は＋＋； 濁った溶液は＋; 白濁は＋; 粒状物は０; 凝集物は０。
【００９７】
上記表のすべてのタンパク質は、（とりわけ記載される酵素または等価な活性を有する酵素と組合せて、）血圧低下活性を有するターゲットタンパク質加水分解産物および（かかる加水分解産物を適量含む）食品サプリメント/食品を作成するのに適している。
【００９８】
このスコアに基いて、バッファー中でタンパク質を加水分解した後のインビトロACE阻害活性に関して、以下のタンパク質−酵素の組合せが、最良のものとランク付けされた。この目的のために、それぞれのターゲットタンパク質−酵素の組合せについて、カテゴリーごとのスコアを合計し、以下のランキングを得た：
【表１５】
2008507270.tif 000017
【００９９】
最良の組合せのセットでみられるタンパク質と酵素の数の分析は、以下の分布を示す：
【表１６】
2008507270.tif 000018
【０１００】
ある種の酵素、たとえばPepsin、Promod184P、FlavourzymeおよびCorolasePPは、ターゲットタンパク質から生物活性なペプチドを放出するのに効果が低いことが分かった。CorolasePPおよびFlavourzymeはいずれも、エキソプロテアーゼ活性のために、非常に多量の遊離アミノ酸（11.5−13.0％）を産生する酵素であることに注目することは興味深い。これらの加水分解産物では、短いペプチドよりむしろ遊離アミノ酸が形成され、低濃度のACE阻害活性ペプチドが得られた。本発明の範囲を限定しないが、ジ−およびトリ−ペプチドの量と比較して比較的多量の遊離アミノ酸を放出する酵素は、あまり適切ではないことが提案される。Promod258Pは、エンド−およびエキソプロテアーゼの混合物であり、かなり多量の遊離アミノ酸（9.3％）を産生することが知られているが、ACE阻害活性加水分解産物の調製にとって満足な酵素である。
【０１０１】
例４−水中での加水分解および加水分解プロトコールの最適化
バッファーの使用があまり望ましくない商業的適用を考慮して、加水分解を水中で実施した。消費者の製品は、明らかに必要でない場合、更なる塩成分を含有すべきでなく、このため、各酵素の最適なバッファー条件を水に置換した。反応の間、溶液のｐＨは、NaOHまたはHClの添加により調整した。
【０１０２】
更に、ターゲットタンパク質と酵素のインキュベーション時間も最適化した。最初の加水分解プロトコールは、上述のバッファー中のプロトコールと同一であったが、3時間後、追加量の酵素（再度2% w/w）を使用して、タンパク質を更に加水分解した。フラクションをACE阻害アッセイで試験し、その結果を以下の表に示す。
【表１７】
2008507270.tif 000019
【０１０３】
タンパク質濃度が0.5 mg/mlの列は、該当のリファレンスとして陰影をつけた。この値のパーセンテージ阻害が50％以上である場合、その加水分解産物は、インビボで抗高血圧活性を有すると考えられる。
【０１０４】
卵白および卵黄のサンプルについて最適な加水分解時間は、約5時間であり、IC50値は0.15〜0.25 mg/mlの間である。精製されたタンパク質、すなわちリゾチーム、オボトランスフェリンおよびオボムチンについて、最適な加水分解時間は、4〜5時間の間であり、IC50値（表のデータから計算される）は、0.1 mg/ml以下（リゾチームおよびオボトランスフェリン）乃至0.3 mg/ml（オボムチン）の範囲である。
【０１０５】
例５−インビトロ消化シミュレーション実験
5.1
タンパク質−酵素の組合せを用いて、インビトロ消化シミュレーションを実施し、内在性消化器系の起こり得る影響を検討した。インビトロで最適化された加水分解産物のACE阻害活性が、内在性タンパク分解酵素により負の影響を受ける場合、最適化は、これに対処するように適応させるべきである。したがって、以下のプロトコールを使用した：
・4％タンパク質(加水分解産物)サンプルの溶液を作成する
・ｐＨを2にする
・10 mg/mlのペプシン溶液を1/250(w/w)の割合で添加する
・溶液を振盪しながら水浴で37℃で2時間インキュベートする
・ｐＨを6.5にする
・10 mg/mlトリプシンおよび10 mg/mlキモトリプシンを含有する溶液を、それぞれ1/250(w/w)の割合で添加する
・溶液を振盪しながら水浴で37℃で2.5時間インキュベートする
・90℃で15分間インキュベートすることにより酵素を不活性化する
・サンプルをフリーズドライして4℃で保存する。
【０１０６】
6時間の時点の加水分解サンプルを用いて、このプロトコールを実施した。その結果（パーセンテージ阻害）を以下の表に示し、0.5 mg/mlレベルの加水分解産物の列は、背景に陰影をつけた。
【表１８】
2008507270.tif 000020
【０１０７】
ターゲットタンパク質−酵素の組合せに関係なく0.5 mg/mlのポイントから判断されるとおり、ACE阻害能は、インビトロ消化シミュレーション後にかなり変化した。種々の時点でのIC50値をすべて含む全結果を以下の表に示す。3種類の研究をまとめて示す：１．バッファー中での3時間の加水分解後のスクリーニング；２．水中での加水分解の最適化；３．6時間加水分解したサンプルについての消化シミュレーション。
【表１９】
2008507270.tif 000021
【０１０８】
5.2
卵黄および卵白ターゲットタンパク質の加水分解産物に対するインビトロ消化シミュレーションの影響を調べるために別の実験を行った。
【０１０９】
D = インビトロ消化シミュレーション
Y + Alc = 卵黄の加水分解産物 − アルカラーゼ（Alcalase）
卵黄 D = 全卵黄、消化(インビトロシミュレーション)
Y + Alc D = 卵黄の加水分解産物 − アルカラーゼ（Alcalase）、次いで消化(インビトロシミュレーション)
EW + Alc = 卵白の加水分解産物 − アルカラーゼ（Alcalase）
卵白 D = 全卵白、消化(インビトロシミュレーション)
EW + Alc D = 卵白の加水分解産物 − アルカラーゼ（Alcalase）、次いで消化(インビトロシミュレーション)。
【表２０】
2008507270.tif 000022
【０１１０】
示されるとおり、インビトロ消化シミュレーションは、加水分解産物のACE阻害活性を変化させない。
【０１１１】
Lyz + Alc = 加水分解産物リゾチーム − アルカラーゼ（Alcalase）
Lyz + PEM = 加水分解産物リゾチーム − PEM
Lyz D = リゾチームのインビトロ消化シミュレーション (予め加水分解せず)
Lyz + Alc D = 加水分解産物 (リゾチーム − アルカラーゼ(Alcalase))、次いでインビトロ消化シミュレーション
OM + Alc = 加水分解産物オボムチン − アルカラーゼ（Alcalase）
OM + PTN = 加水分解産物オボムチン − PTN
OM D = オボムチンのインビトロ消化シミュレーション (予め加水分解せず)
OM + Alc D = 加水分解産物 (オボムチン − アルカラーゼ(Alcalase))、次いでインビトロ消化シミュレーション
OT + NF = 加水分解産物オボトランスフェリン − NewlaseF
OT + Pr258P = 加水分解産物オボトランスフェリン − Promod258P
OT D = オボトランスフェリンのインビトロ消化シミュレーション (予め加水分解せず)
OT + Alc D = 加水分解産物 (オボトランスフェリン − Promod258P)、次いでインビトロ消化シミュレーション。
【表２１】
2008507270.tif 000023
【０１１２】
消化シミュレーションは、得られた加水分解産物のACE阻害活性に対してプラスにもマイナスにも影響を及ぼさない。オボトランスフェリン(OT)の加水分解のみが、ACE阻害活性を増大させる。
【０１１３】
全体として、インビトロ消化シミュレーションは、卵タンパク質加水分解産物のACE阻害特性をプラスにもマイナスにも変化させない。このことは、被検体の消化活性が、加水分解産物のACE阻害活性を変化させないことを意味する。しかし、このことをインビトロで確認することが必要である。
【０１１４】
5.3
インビトロ消化におけるペプシンのインキュベーション時間の影響の研究
インビトロ消化の研究は、ペプシンについて2つのインキュベーション時間、すなわちそれぞれ胃の短期滞留時間と長期滞留時間を表す30分と120分で、繰り返した。消化管シミュレーションのインキュベーション時間は、変化させず150分であった。
【０１１５】
加えて、元のタンパク質およびタンパク質フラクション（予め加水分解もインビトロ消化もせず）を、ACE阻害アッセイで試験し、これらタンパク質の見込まれるバックグラウンド活性を評価した。
【表２２】
2008507270.tif 000024
【０１１６】
上記から、元の（非加水分解性および非消化性）タンパク質（カラム１）は、ACE阻害活性を有していないと結論づけられる。ペプシンで30分処理された加水分解産物のACE阻害活性と120分処理されたものとの間に大きな差はなかったため、胃の滞留時間は、タンパク質加水分解産物の特性に影響を及ぼさないと考えられる。
【０１１７】
例６−卵白パウダーとフレッシュな出発材料との比較
本実験の目的は、卵白パウダーが、フレッシュな卵白出発材料と異なる阻害活性を有する加水分解産物であるか否かを決定することであった。商業的に入手可能な卵白パウダーを、フレッシュに調製された卵白と比較し、ACE阻害活性について試験し、フレッシュの影響を調べた。
【０１１８】
アッセイ条件は以下のとおりとした：
−  実験数：３
−  商業的に入手可能なEW 1101製品は、リゾチーム除去製品であり、本実験のために3.4％リゾチーム(Belovo)を添加した。
【０１１９】
−  コントロール：ペプシン/キモトリプシン/トリプシンの消化なし（アルカラーゼを用いた加水分解のみ）
−  D30/D120：30'/120'ペプシン消化、次いでｐＨ6.5、37℃で2.5時間のα−キモトリプシン/トリプシン消化。
【０１２０】
ACE阻害活性（IC50 mg/ml）を測定した：
【表２３】
2008507270.tif 000025
【０１２１】
この結果より、ドライの卵白パウダーとフレッシュな卵白の両方が、有意なACE阻害活性を有することが示された。
【０１２２】
例７−加水分解産物の可溶性および固形フラクションの活性
目的は、加水分解産物の可溶性および不溶性フラクションのACE阻害活性を測定することであった。この目的のため、卵白、リゾチーム、およびオボムチンをアルカラーゼにより加水分解し、得られた加水分解産物を遠心分離（15分；4,500×g）で分画した。沈殿および上清フラクションを別々にフリーズドライした。
【０１２３】
乾燥重量に基いて、沈殿および上清フラクションを以下のとおり分けた：
【表２４】
2008507270.tif 000026
【０１２４】
ACE阻害活性を測定し、加水分解の直後にフリーズドライした全加水分解産物の活性と比較した。
【表２５】
2008507270.tif 000027
【０１２５】
二つのケース、すなわちEW1101およびオボムチンにおいて、沈殿と上清の分離により、上清のACE阻害活性は増大した。遠心分離しなかった全加水分解産物との差は、2倍未満であった。
【０１２６】
また、オボムチン/アルカラーゼ加水分解産物の不溶性フラクションからわかるとおり、記載した条件下でのインビトロ消化シミュレーション後に、相当なACE阻害活性を沈殿から分離することができた。
【表２６】
2008507270.tif 000028
【０１２７】
沈殿に存在する活性は、可能であれば、最終食品に含有すべきである。
【０１２８】
例８−インビボ実験
8.1  第一のインビボ実験
8.1.1  第一の大規模な加水分解産物の調製
大きなバッチをインビボ実験で利用可能にするために、20−25グラムのスケールで加水分解を実施した。以下の加水分解産物を調製した：
1.  リゾチーム / アルカラーゼ(Alcalase) (Lys+Alc)
2.  リゾチーム / PEM (Lys+PEM)
3.  オボムチン / Alcalase (OM+Alc)
4.  オボトランスフェリン / Promod 258P (OT+Pr258P)
5.  卵黄 / アルカラーゼ(Alcalase) (Y+Alc)
6.  卵白 / アルカラーゼ(Alcalase) (EW+Alc)。
【０１２９】
これら大規模な加水分解産物のACE阻害活性を試験したところ、先に試験した小規模の加水分解産物のものと非常に類似していることが分かった。
【表２７】
2008507270.tif 000029
【０１３０】
8.1.2  第二の大規模な実験
インビボSHR研究のための加水分解産物を作成するために、別の大規模な実験を実施した。種々のバッチおよびサンプルのACE阻害活性を以下の表にまとめて示す。サンプルは2回試験した。
【表２８】
2008507270.tif 000030
【０１３１】
上記表から、特定のサンプルについてIC50値に高レベルの再現性があることが明らかであり、このことは、加水分解プロトコール、加水分解したサンプルの更なる処理、およびACE阻害アッセイの性能が、標準化され正確であることを示す。
【０１３２】
8.2  インビボSHR試験および結果
血圧に対する加水分解産物の効果を調べるため、SHR研究を行った。血圧に対する一次効果および器官損傷の発症に対する二次効果を調べた。SHRは、約190 mmHgの平均動脈圧（MAPB）を有し、これは正常な血圧より充分高い。
【０１３３】
加水分解産物を、毎日の経口処置により飲料水でSHRラットに与えた。52匹のラットを、1000 mg/kg体重/日の加水分解産物で処置した。4つの加水分解産物を試験した：
加水分解産物Ａ: リゾチーム − alcalase
加水分解産物Ｂ: オボトランスフェリン − newlase F
加水分解産物Ｃ: オボムチン − alcalase
加水分解産物Ｄ: 卵白タンパク質 − alcalase。
【０１３４】
二つの方法、テールカフ（tail cuff）法（麻酔下または非麻酔下のラットの収縮期血圧、SBPを測定する）および遠隔測定法（埋め込み型の遠隔測定装置により血圧測定を5分ごとに行う）を利用して血圧を測定した。リファレンスのラットには、プラセボを与えた。無線遠隔測定技術により、長期間にわたって、抑制されていない動物の動脈圧、心拍数、身体活動、並びにサーカディアンリズムおよび治療に対する応答を連続してモニターすることが可能である。
【０１３５】
8.2.1  テールカフの結果
加水分解産物Ａを与えられた麻酔状態のラットのSBPは、65日で201.7 mmHgから183.8 mmHgに低下し、約10％の血圧が低下した。このため、少なくとも加水分解産物Ａはインビボで有効であると思われる。他の3つの加水分解産物について実験を継続中である。
【０１３６】
また、（血漿ではない）組織のACE活性を、ACE阻害について試験するつもりである。
【０１３７】
8.2.2  遠隔測定法
リゾチーム−アルカラーゼおよびオボムチン−アルカラーゼの加水分解産物は、インビボにおいて有意な血圧低下を示した。
【０１３８】
意識のある抑制されていない動物における遠隔測定
未処置のSHRラットで予測されるとおり、最初、毎日のSBPは、すべてのTM-ラットにおいて時間を追って増大した。しかし、処置の開始から5週間後、毎日のSBPの個々のパターンは、加水分解産物Ａを与えたTM-ラットでは、一貫した低下を示し始めた。加水分解産物Ａを与えたTM-ラットのSBPの低下は、処置の開始から7週間後まで続き、その後安定した。処置から8週間後、SBPは、加水分解産物Ａで処置した遠隔測定用ラットにおいて、一貫して約10％低下した。
【０１３９】
8.2.3  麻酔状態のSHRにおけるリゾチーム/アルカラーゼの急性処置効果
この研究は、麻酔状態のSHRのリゾチーム/アルカラーゼによる急性経口処置が、血圧および血漿ACE活性に及ぼす効果を確立するために実施した。
【０１４０】
方法
ラット：SHRラット(382-440 g)をHarlan、オクソン、イギリスからHarlan、ホルスト、オランダを経由して購入した。
【０１４１】
ハウジング：ラットは、中央動物研究所（Central Animal Laboratory）(UMCG, フローニンゲン)においてグループ様式で（group-wise）収容し、1週間慣れさせた。
【０１４２】
外科処置：実験当日に、ラットに麻酔をかけ、血圧測定のために頸動脈にカニューレを挿入した。加えて、血漿ACE活性の測定のための血液をサンプリングするために頸静脈にカニューレを挿入した。
【０１４３】
プロトコール：t=0の時点で、胃管を用いた経口栄養法によりラットに治験薬を投与した。t=0の胃管栄養法の直前、並びにt=0.5、t=1、t=2、t=3、t=4、t=5およびt=6時間後に、血液サンプルを採取した。6時間の研究期間を通して（10分ごとの平均値で）血圧を記録した。
【０１４４】
治験薬：リゾチーム/アルカラーゼまたはリゾチーム（いずれも1000 mg/kg；1 ml飲料水に溶解）、あるいは水のみをラットに無作為に投与した。
【０１４５】
結果
血圧：血圧に対する治験薬の効果は、個々のラットのベースラインからのパーセンテージ変化として計算した。単回投与量のリゾチーム/アルカラーゼ(Hydro.A)の経口投与は、収縮期血圧（SBP）の大きな一過的な低下を引き起こした。SBPの最大の低下は約35％であり、リゾチーム/アルカラーゼの投与から1.5−2時間後に到達し、更に約2時間低いまま継続した。その後、約t=4時間で、SBPは再度増大し始め、研究期間の最後にt=6時間で20％低下に達した。SBPの最大低下はずっと小さい（約15％）にもかかわらず、非常に類似のパターンが、リゾチーム（コントロール）の投与後に観察された。我々は、これら実験において水の投与効果も調べた；SBPは、水の投与後にも低下し、その最大低下は、リゾチーム/アルカラーゼより小さく、リゾチーム単独より僅かに大きかった（すなわち、中間の応答）。しかし、水の投与後に得られたSBPの変化パターンは、前者二つとは明らかに異なり、とりわけ一時的であった；水の投与から2−3時間後に、SBPは完全にベースライン（すなわち100％）に復帰した。リゾチーム単独は、おそらく水よりもリゾチーム/アルカラーゼの優れたコントロールである。
【０１４６】
血漿ACE活性：リゾチーム/アルカラーゼ（Hydro.A）およびリゾチーム（コントロール）の投与後の血漿ACE活性のパターンは、SBPについて観察されたもののパターンどおりに従った。すなわち、血漿ACE活性は、再度上昇を開始してt=6時間でベースラインの約95％に達する前に、リゾチーム/アルカラーゼの投与からt=2−t=3時間後、ベースラインから最大約30％低下した。対照的に、リゾチーム単独で投与した後の血漿ACE活性の最大阻害は、約10％であった。
【０１４７】
上記発見は、麻酔状態のSHR-ラットにおいてリゾチーム/アルカラーゼが急激な血圧低減能力を有することを明らかに実証する；血漿ACE活性の同時に起こる低下は、この血圧低減効果が、レニン−アンギオテンシン系の阻害によるものであることを示唆する。この研究にかかわったラットの数はかなり少なく、好ましくは意識のある動物においてこの効果を確認したいため、我々は、TM測定を用いた第三の実験研究をデザインした（TM法は、意識のある動物においてTCほどストレスの高いものではない）。
【０１４８】
8.2.4  意識のあるSHRにおけるリゾチーム/アルカラーゼの急性処置効果
この研究は、意識のあるSHRのリゾチーム/アルカラーゼによる急性経口処置が、血圧および血漿ACE活性に及ぼす効果を確立するために実施した。
【０１４９】
方法
ラット：SHRラット(388-515 g)をHarlan、オクソン、イギリスからHarlan、ホルスト、オランダを経由して購入し、中央動物研究所（Central Animal Laboratory）(UMCG, フローニンゲン)においてグループ様式で（group-wise）収容した。
【０１５０】
無線遠隔測定：SHRラット(n=8)に対し、遠隔測定用血圧送信装置（TM）および血液サンプリング用永久カテーテルの配置のための外科処置を行った。TMは、左腎動脈に遠位の腹大動脈に埋め込んだ。永久カテーテルは、頸静脈に埋め込み、その他端は、それが固定されるラットの頭部へと皮下で通り抜ける。その後、ラットを個々に収容し、2週間回復させ、その後、無線遠隔測定データの収集を開始し、全研究期間にわたって継続した。
【０１５１】
プロトコール：その後、ラットを、単回投与量のリゾチーム/アルカラーゼ(LHA)、リゾチーム(L)、または水(H2O)を、その間を2−3日（ウォッシュアウト/コントロール）空けた3種類の実験日に3回の異なる機会（occasions）で投与する無作為の処置スケジュールに割り当てた。リゾチーム/アルカラーゼおよびリゾチーム（いずれも1000 mg/kg）を水に溶解し、胃管を経由して経口投与した（約1 ml溶液の全体積）；コントロールのラットには1 mlの水のみを投与した。実験日の経口胃管栄養は、朝9:00−10:00時の間に常に実施した。
【表２９】
2008507270.tif 000031
【０１５２】
血液サンプリング：経口処置の日、経口胃管栄養の約0.5−1.0時間前に、ラットを更に操作することなく血液サンプリングを可能にする延長カニューレに、永久カテーテルを連結した。血液サンプルを、直前（t=0）、並びに経口胃管栄養からt=0.5、1、2、3、4、5および6時間後に採取した。その後、血液サンプルを4℃で10分間1600Gで遠心分離し、血漿をスナップフリーズし（snap-frozen）、アッセイまで−80℃で保存した。
【０１５３】
血漿ACE−活性：血漿組織におけるACE活性は、以前に記載されたとおり、Hip-His-Leu法に従って測定した。要するに、血漿サンプルをACE基質Hippury-His-Leu 12.5 nMと、37℃で正確に10分間インキュベートする。基質の変換は、280 mM NaOHを添加することにより停止した。その後、遊離のHis-Leuを標識するために100μlフタルジアルデヒドを添加した。標識されたHid-Leuの量を、それぞれ364 nm、486 nmの励起波長、放射波長で蛍光分析により測定した。基質Hippuryl-His-Leuの前にNaOHを添加することにより基質の変換を妨害したコントロールサンプルも含めた。
【０１５４】
血圧データの分析：対象期間は、実験日における経口胃管栄養の約1時間前から、その後10時間まで、すなわち8:00から19:00 hrまでと考えた。これらの期間を、各ラットについて3つの実験日から得、全ラットに由来するデータを用いて、一つの特定の処置について平均した。また、同じ期間を、各ラットについて実験日の前とその合間に、6つの非実験（コントロール）日から得、全ラットについて平均した。
【０１５５】
結果
LHAによるSBPの低下が、1時間以内に観察され、H2Oと対比して、少なくとも4時間低いままであった。LHAと対比して1時間遅れているが、LによるSBPの低下が観察された。これは、Lに対する自然の消化プロセスの結果かもしれず、また、比較的高用量に基けば、ずっと少ないLHAの用量も有効であることを示唆しているかもしれない。
【０１５６】
8.2.4.1  意識のあるSHRにおけるオボムチン/アルカラーゼの急性処置効果
方法
ラット：その間に自然発生的に死亡したラット一匹を除き、8.2.4に由来する上記遠隔測定用ラットを使用した。実験日には、ラット（n=7）を、3 mlのグルコース水（10%）と混合したオボムチン/アルカラーゼ加水分解産物（1000 mg/kg）で処置するかまたは処置せず、午前中（約10:00）に平皿の上でラットに差し出した（30分）；コントロール日の処置は、グルコース水のみからなり、コントロール処置と積極的処置との間は2日であった。
【０１５７】
血圧データの分析：対象期間は、実験日における経口胃管栄養の約1時間前から、その後8時間まで、すなわち9:00から17:00 hrまでと考えた。これらの期間を、各ラットについて2つの実験日から得、全ラットに由来するデータを用いて、オボムチン処置またはコントロール処置について平均した。また、同じ期間を、各ラットについて実験日の前とその合間に、4つの非実験（コントロール）日から得、全ラットについて平均した。
【０１５８】
結果
一匹のSHR-ラットからの収縮期血圧データは非常に低く、更なる分析からこれは除外した。実験日に、多くのラットは、3 mlのグルコース−水を10分以内に飲み終えた。グルコース水を飲むことは、収縮期血圧の増大に伴って増大した；すなわち、これは、上記研究で胃管による摂取後に観察されるものと類似しているが、胃管による経口摂取（約25 mmHg）と比較して、SBPの増大程度は、グルコース−水による摂取後の方がかなり小さい（約10 mmHg）。さらに言うと、この効果は、処置をしなかったコントロール日には観察されなかった。グルコース−水のみによるコントロール処置と比較して、オボムチン/アルカラーゼ加水分解産物を含むグルコース−水による積極的処置により、SBPは迅速かつ顕著に低下した。オボムチン/アルカラーゼ加水分解産物による最大低下は、摂取から1時間以内に到達し（約15 mmHg）、これは、上記研究において意識のあるラットで観察されたタイムフレームと非常に類似している。
【０１５９】
例９−メンブレン濾過により加水分解産物を豊富にすること（enrichment）
小さなペプチドを豊富にし、その結果ACE阻害活性を増大させることができるかどうかを調べるため、二つの加水分解卵白タンパク質、オボトランスフェリンとリゾチームを、（2 kDおよび10 kDのカットオフのポリエーテルスルホン限外濾過膜を用いた）メンブレン濾過により分画した。
【０１６０】
ポリエーテルスルホン限外濾過膜は、フラットメンブレンのAmiconテストセルで使用した。体積15 mlのタンパク質加水分解産物5％溶液を、5 ml(15％)に濃縮し、5 mlの水を添加した。この溶液を再度5 mlに濃縮した（洗浄工程）。洗浄工程を更に2回繰り返した。最初の濾過の透過液と洗浄工程の透過液を合わせてフリーズドライした。フリーズドライした透過液を4℃で保存し、ACE阻害活性について試験した。
【０１６１】
この実験のセットアップは、以下のとおりとした：
−  二つの加水分解産物：オボトランスフェリン/promod258およびリゾチーム/アルカラーゼ
−  二つのメンブレン、一つは2kDのカットオフ、もう一つは10kDのカットオフ
−  分画後、種々のサンプル（原料(feed)、透過液および残留物）をインビトロ消化シミュレーションで処置しないか、または処置した。ここでは、（胃での加水分解をシミュレートする）ペプシンのインキュベーション時間を0から120分の間で変化させた。
【０１６２】
−  ペプシンのインキュベーションは、pH2、37℃であった
−  トリプシン/α-キモトリプシンのインキュベーションは、pH6.5、37℃において2.5時間であった。  
サンプルをフリーズドライした後、分画のIC50(mg/ml)値を測定した：
【表３０】
2008507270.tif 000032
【０１６３】
透過液フラクションのACE阻害活性は、原料(feed)フラクションと比較して2倍まで増大した。この増大は、オボトランスフェリンの場合10kDメンブレンで観察され、リゾチームの場合2kDで観察された。
【０１６４】
この例は、メンブレン濾過を使用して、生物活性なペプチドの加水分解産物を増大させ（enrich）、これにより加水分解産物のACE阻害活性を増大させる（enrich）ことができることを示す。この増大（enrichment）を使用して、定期的（たとえば1日）に消費しなければならない材料の量を低減することができ、体積の低減により、効果を高め、食品サプリメントおよび機能性食品への組込みを容易にすることができる。
【０１６５】
例１０−ACE阻害活性に対する卵の保存時間および温度の効果
保存時間および温度の影響は、ダイレクトに処理した（卵黄から卵白を分離し、その後卵白フラクションをアルカラーゼで加水分解した）卵、または4℃もしくは室温で6週間保存した後に処理した卵を用いて調査した。
【０１６６】
−  アルカラーゼによる加水分解：  a) 3時間またはb) 5時間（3時間後に追加の酵素の添加）
加水分解後、フラクションをフリーズドライし、パウダーフラクションを室温で保存した。フラクション全てのACE阻害活性を同じアッセイで測定した。実験は2回行った。
【表３１】
2008507270.tif 000033
【０１６７】
5時間の加水分解により、3時間の加水分解よりも良好かつ再現性の高い活性を有する加水分解産物が得られた。
【０１６８】
この実験により、ACE阻害活性に関して、卵白タンパク質加水分解産物の最適活性のために、卵をダイレクトに使用してもよいし、あるいは4℃または室温で少なくとも6週間保存できることが示された。
【０１６９】
例１１−加水分解産物の苦味
加水分解産物は、苦味を評価するために3人のボランティアにより感覚的に分析した。加水分解産物パウダーを、水（15-20 mg/ml）、または水とグルコースに溶解した。
【表３２】
2008507270.tif 000034
【０１７０】
二つの加水分解産物は苦かったが、二つは苦味を有していなかった。卵白−アルカラーゼの苦味は、グルコースの添加により僅かにマスクすることができた。幾つかの加水分解産物については、その食品に、香味料または他の味マスキング化合物、たとえばマルトデキストリン、アスパルテーム、イヌリンなどの添加が必要であると思われる。その味は、加水分解産物を消費するラットの意欲に影響を及ぼさなかった。
【０１７１】
例１２−食品サプリメントおよび食品
錠剤または小袋（sachet）
以下の組成の錠剤（または小袋）を調製した：
−  錠剤あたり250 mg ターゲットタンパク質加水分解産物 (錠剤の約60％体積)
−  コーンスターチ (20%)、セルロース (15%)、多糖類 (0.5%)、潤滑剤と光沢剤 (3%)、その他 (1.5%)を含む40％体積。
【０１７２】
例１３−タンパク質加水分解産物の分子量分布
タンパク質加水分解産物の分子量分布（MWD）は、Superdex Peptide PE 7.5/300カラム（Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden）を用いて、ゲル透過クロマトグラフィー(GPC)により実施した。このカラムは、100〜7000のMW分離範囲を有する。カラムには、A＆Fによるタンパク質加水分解産物の分析に理想的であることが示されている条件で、0.1％TFAを含有する30％アセトニトリルを流した。カラムは、公知の分子量のスタンダードペプチドを用いてキャリブレーションを行った（下記の表参照）。スタンダードおよび加水分解産物サンプルを、5 mg/mlのペプチド濃度でスタンダード溶離液に溶解した。注入（200μl）前に、不溶性粒子を除去するためにサンプルを遠心分離した。溶出パターンは、214 nmでモニターした。
【０１７３】
スタンダード                          Ｍｗ
L-ロイシン                            131.2
L-アルギニン                          174.2
VVYV                                  478.5
VVYK                                  507.6
VVYR                                  535.6
インスリン鎖B-オキシダーゼ            3,496
ウシ肺由来のアプロチニン              6,500
ウシ心臓由来のチトクロムCタイプV-A  12,327
リゾチーム.HCl                        14,300
キャリブレーションカーブは示さない。
【０１７４】
タンパク質加水分解産物のMWDは、所定の分子量の範囲にあるペプチドの割合(％)で表す：500 Daより小さい、500−1000 Daの間、および1000 Daより大きい。これは、以下の長さのペプチドに相当する：4−5未満のアミノ酸、4−9のアミノ酸、または9を超えるアミノ酸。
【表３３】
2008507270.tif 000035
【０１７５】
この結果は、ターゲットタンパク質の加水分解の程度とIC50活性との間に相関関係があることを示す。とりわけ、少なくとも約20％、より好ましくは少なくとも30％の加水分解の程度により、高いACE阻害活性を有する加水分解産物が得られる。
【０１７６】
例１４  自然発生的高血圧ラットにおいて血圧を有意に低下させた卵ペプチドを用いたインビボにおけるヒトの研究
インビボにおけるヒトの研究のためのリゾチーム加水分解産物の組成
ACE阻害性リゾチーム/アルカラーゼ加水分解産物の組成を決定した：
−  90% リゾチーム
−  1.8% アルカラーゼ
−  5% NaOH
−  3.2% 水
−  リゾチーム塩酸塩(Lysozyme Hydrochloride)は、Belovo (Schoterweg 14, 8462 TD Rotstergaast)から得た
−  イオン交換クロマトグラフィーにより精製される卵白由来のマイナータンパク質
−  SDS-PAGE en HPLCクロマトグラフィーによる純度99%
−  アルカラーゼ食品グレード(Alcalase Food Grade) van Novozymes、Alcalase 2.4L
−  透明な赤茶色の液体
−  酵素濃度2.3 AU/リットル
−  密度約1.18 g/ml
−  アルカラーゼはBacillus licheniformisの選択株から産生される
−  細菌性プロテアーゼ、エンドペプチダーゼ
−  NaOHペレットvan Merck
−  33％溶液を使用して、加水分解の間のpHを8に調整する。
【０１７７】
3％リゾチーム(100 ml)溶液に対し、pHを8に設定するためには約500μlの1 M NaOH溶液が必要であった(3 gリゾチームに対し、500μlの1 M NaOH = 0.02 g NaOH)。酵素の添加後、pHを8に維持するために更にNaOHの添加が必要である；このため数パーセントのNaOHが最終生成物に存在する。
【０１７８】
ヒトの研究：
ヒトに機能性食品を使用する研究のため、University Medical Center Groningen（UMCG）のMETc（医療倫理試験委員会；Medical Ethical Trial committee）の最終承認を得た。
【０１７９】
ヒトのボランティア（n=5）は、2回の異なる実験日に、単回投与量のリゾチーム/アルカラーゼまたは適切なプラセボを以下のドリンクで摂取した。摂取直前と、その後6時間、血圧を測定した。それに加えて、摂取直前と、摂取後の特定の時点において、血液サンプルを採取しACE活性について分析した。
【０１８０】
ドリンクのレシピ：
−  20 g 加水分解産物
−  40 g Karvan Cevitan“レッドグレープフルーツ(Red Grapefruit)”
−  60 g 水
90℃で20分間、低温殺菌する。
【０１８１】
Siliker (Ede)により微生物学的分析を行う：OK。
【０１８２】
Karvan Cevitanレッドグレープフルーツの組成： 60% 着色なしのフルーツ; 4つのビタミン添加; フルーツジュース濃縮液60% (レッドグレープフルーツ、エルダーベリー、ローズヒップ)、その54%はレッドグレープフルーツ; 他の構成成分: 糖、グルコース-フルクトースジュース、食品の酸: クエン酸、香味料、ビタミン、保存剤: ソルビン酸カリウム。  
コントロールドリンク：同上、ただし加水分解産物なし。
【０１８３】
結果
試験には、加水分解産物を摂取した5人のヒトが関与した。2週間後、5人のうち3人がコントロールのために利用可能であった。平均血圧は、6時間にわたって追跡した。コントロールと比較して、平均約5〜6％の血圧の低下が測定され、これは、加水分解産物の明らかな効果を示す。この効果は、加水分解産物の摂取から1時間以内に観察され、1.5時間後に最大であった。3時間と6時間（測定の最終時点）の時点における平均動脈圧の減少は、1.5時間の時点における平均動脈圧の減少に匹敵していた。加水分解産物の研究において、平均の血漿ACE活性は、加水分解産物の摂取から1時間以内に減少のピークを示し、3時間後にスタート時点のレベルまで回復した。
【０１８４】
ヒトの研究は、現在進行中である。
【配列表】
2008507270000001.app
【国際調査報告】
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2008507270.tif 000037
2008507270.tif 000038
2008507270.tif 000039