(57)【要約】  本発明は、容易に検出可能な生物学的マーカーの血清濃度を使用することにより、特に、肝臓脂肪症を伴う疾患を患うか、或いは肝線維症及び／又は肝臓の壊死性炎症性病変の存在についての陽性診断試験をすでに受けた患者において、患者の肝臓脂肪症の程度を検出するための新たな診断方法に関するものである。また、本発明は、本発明の診断方法を実施するための診断キットにも関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の血清又は血漿サンプルから肝臓脂肪症を診断するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法であって、
ａ）５つの生化学マーカー、
−ＡｐｏＡ１（アポリポタンパク質Ａ１）、
−アルファ−２−マクログロブリン、
−ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、
−ＧＧＴ（ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ）及び
−トリグリセリド
を、前記患者の血清又は血漿におけるそれらの濃度の値を測定することにより研究する過程、
ｂ）ボディ・マス・インデックス（体重／身長2）、ウエストサイズ、及び（ウエストサイズ／ヒップサイズ）比から成る群において選択される一つの臨床的マーカーを研究する過程、
ｃ）前記マーカーを含むロジスティック関数を通して前記値を組み合わせて最終値を得る過程であって、前記ロジスティック関数が、
ｉ）患者の疾患の程度に従った、種々の群への患者コホートの分類、
ｉｉ）一次元分析による、これらの群間で有意に異なる因子の同定、
ｉｉｉ）肝臓脂肪症の診断のためのマーカーの独立した識別値を評価するためのロジスティック回帰分析、
ｉｖ）これらの同定された独立因子の組み合わせによるロジスティック関数の構築、
の方法から得られる過程、
からなる方法。
【請求項２】
前記ロジスティック関数が、患者の年齢及び性別をさらに考慮に入れる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ロジスティック関数が、総ビリルビン、ハプトグロビン、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、グルコース、及び（コレステロール又はＨＤＬ−コレステロール）から成る群において選択される少なくとも一つの生化学マーカーをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ロジスティック関数が、総ビリルビン、ハプトグロビン、グルコース及びコレステロールを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ロジスティック関数が、
ｆ＝ａ１−ａ２・［年齢（才）］＋ａ３・［ＡｐｏＡ１（ｇ／Ｌ）］−ａ４・［ボディ・マス・インデックス（体重／身長2）］＋ａ５・Ｌｏｇ［アルファ−２−マクログロブリン（ｇ／Ｌ）］−ａ６・Ｌｏｇ［ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）（ＩＵ／Ｌ）］−ａ７・Ｌｏｇ［総ビリルビン（μｍｏｌ／Ｌ）］−ａ８・［コレステロール（ｍｍｏｌ／Ｌ］−ａ９・Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ）（ＩＵ／Ｌ）］−ａ１０・［グルコース（ｍｍｏｌ／Ｌ）］−ａ１１・Ｌｏｇ［ハプトグロビン（ｇ／Ｌ）］−ａ１２・［トリグリセリド（ｍｍｏｌ／Ｌ）］＋ａ１３・［性別（女性＝０、男性＝１）］であり、式中、
ａ１が、［６．６８８０５−９０％；６．６８８０５＋９０％］の区間に含まれ、
ａ２が、［１．５５３３７Ｅ−０２−９０％；１．５５３３７Ｅ−０２＋９０％］の区間に含まれ、
ａ３が、［１．１６１５３１−９０％；１．１６１５３１＋９０％］の区間に含まれ、
ａ４が、［０．１１８８９−９０％；０．１１８８９＋９０％］の区間に含まれ、
ａ５が、［１．７４７９１−９０％；１．７４７９１＋９０％］の区間に含まれ、
ａ６が、［０．９６４５３−９０％；０．９６４５３＋９０％］の区間に含まれ、
ａ７が、［０．１１９５８−９０％；０．１１９５８＋９０％］の区間に含まれ、
ａ８が、［０．６８１２５−９０％；０．６８１２５＋９０％］の区間に含まれ、
ａ９が、［１．１７９２２−９０％；１．１７９２２＋９０％］の区間に含まれ、
ａ１０が、［１．４６９６３−９０％；１．４６９６３＋９０％］の区間に含まれ、
ａ１１が、［０．３４５１２−９０％；０．３４５１２＋９０％］の区間に含まれ、
ａ１２が、［１．１７９２６−９０％；１．１７９２６＋９０％］の区間に含まれ、そして
ａ１３が、［０．３５０５２−９０％；０．３５０５２＋９０％］の区間に含まれる、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ロジスティック関数が、
ｆ＝６．６８８０５−１．５５３３７Ｅ−０２・［年齢（才）］＋１．１６１５３１・［ＡｐｏＡ１（ｇ／Ｌ）］−０．１１８８９・［ボディ・マス・インデックス（体重／身長2）］＋１．７４７９１・Ｌｏｇ［アルファ−２−マクログロブリン（ｇ／Ｌ）］−０．９６４５３・Ｌｏｇ［ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）（ＩＵ／Ｌ）］−０．１１９５８・Ｌｏｇ［総ビリルビン（μｍｏｌ／Ｌ）］−０．６８１２５・Ｌｏｇ［コレステロール（ｍｍｏｌ／Ｌ）］−１．１７９２２・Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ）（ＩＵ／Ｌ）］−１．４６９６３・Ｌｏｇ［グルコース（ｍｍｏｌ／Ｌ）］−０．３４５１２・Ｌｏｇ［ハプトグロビン（ｇ／Ｌ）］−１．１７９２６・Ｌｏｇ［トリグリセリド（ｍｍｏｌ／Ｌ）］＋０．３５０５２・［性別（女性＝０、男性＝１）］
である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記患者が脂肪症を伴う疾患を患う、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記疾患が、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎、アルコール依存症、ヘモクロマトーシス、代謝障害、糖尿病、肥満症、自己免疫性肝疾患、原発性胆汁性肝硬変、アルファ−１−アンチトリプシン欠乏症、及びウィルソン病から成る群に包含される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記患者が、肝線維症及び／又は肝臓の壊死性炎症性病変の存在についての診断試験をすでに受けている、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記診断試験がＦｉｂｒｏＴｅｓｔ／ＡｃｔｉＴｅｓｔである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
患者の肝臓脂肪症の診断用のキットであって、
ａ）前記患者における肝臓脂肪症の存在を確定するための説明書、
ｂ）５つの生化学マーカー、
−ＡｐｏＡ１（アポリポタンパク質Ａ１）、
−アルファ−２−マクログロブリン、
−ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、
−ＧＧＴ（ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ）及び
−トリグリセリド
の濃度の血清値を測定するための試薬、
ｃ）任意で、総ビリルビン、ハプトグロビン、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、グルコース、又は（コレステロール又はＨＤＬ−コレステロール）の濃度の血清値を測定するための少なくとも１つの試薬、
ｄ）最終値を得るための、ボディ・マス・インデックス（体重／身長2）、ウエストサイズ、及び（ウエストサイズ／ヒップサイズ）比から成る群において選択される一つの臨床的マーカーと前記値とを組み合わせるために使用されるロジスティック関数を使用するための説明書、
を含む診断用のキット。
【請求項１２】
ＲＯＣ曲線をさらに含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
患者群における肝臓脂肪症の予想有病率に応じた、的中率を得ることを可能にする表をさらに含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１４】
肝臓脂肪症の種々のグレード（なし＝０％、軽度＝１〜５％、中程度＝６〜３２％、顕著＝３３〜６６％、及び重度＝６７〜１００％）及び他の中間のグレードの定量化に関する説明書をさらに含む、請求項１１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、容易に検出可能な生物学的マーカーの血清濃度を使用することにより、特に、肝臓脂肪症を伴う疾患を患うか、或いは肝線維症及び／又は肝臓の壊死性炎症性病変の存在についての陽性診断試験をすでに受けた患者において、患者の肝臓脂肪症の程度を検出するための新たな診断方法に関するものである。また、本発明は、本発明の診断方法を実施するための診断キットにも関するものである。
【背景技術】
【０００２】
肝臓脂肪症とも称される脂肪肝は、肝細胞における脂肪の過剰な蓄積と定義される（Ｂｒａｖｏ  ＡＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ．  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００１：３４４；４９５−５００；Ａｎｇｕｌｏ  Ｐ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００２  Ａｐｒ  １８；３４６（１６）：１２２１−３１）。脂肪肝疾患は、肝細胞におけるトリグリセリドの蓄積、肝細胞の壊死、炎症（Ｄａｙ  ＣＰ．Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２００２；１６：６６３−７８；Ｂｒｏｗｎｉｎｇ  ＪＤ，Ｈｏｒｔｏｎ  ＪＤ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００４；１１４：１４７−５２）、小肝静脈閉塞、並びに多くの場合、肝硬変、肝細胞癌及び肝臓関連の死へ進行することがある線維症（Ｅｌ−Ｓｅｒａｇ  ＨＢ，ｅｔ  ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２００４；１２６：４６０−４６８，Ｄａｍ−Ｌａｒｓｅｎ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｕｔ  ２００４；５３：７５０−５）を伴う。
【０００３】
世界規模で、肝臓脂肪症の有病率は、アルコール、糖尿病、肥満、高脂血症、インスリン抵抗性、遺伝子型３のＣ型肝炎、無βリポタンパク血症、及び一部の薬物のような、幾つかの因子に関連して非常に高い（Ｂｅｌｌｅｎｔａｎｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．２０００；１３２：１１２−７；Ｌｅｖｉｔｓｋｙ  Ｊ，Ｍａｉｌｌｉａｒｄ  ＭＥ．Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ．２００４；２４：２３３−４７）。
【０００４】
非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を誘発する可能性があるインスリン抵抗性に対する肝臓の適応反応であり、非アルコール性脂肪性肝炎自体が、肝硬変をもたらす可能性がある線維形成反応を誘起する可能性がある（Ｄａｙ．ＣＰ．Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２００２；１６：６６３−７８）。
【０００５】
アルコール性肝疾患（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ＴＩ，ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ．１９８４；２：２４１−４）、慢性Ｃ型肝炎（Ｆａｂｒｉｓ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２００４；４１：６４４−５１）、及び、恐らく慢性Ｂ型肝炎（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＭＪ，ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．  Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９２；１４０：１２９５−３０８）の患者において、肝臓脂肪症の存在は、関連する壊死性炎症性病変（アルコール性肝炎又はウイルス性肝炎）の有無を問わず、線維症の進行にも関係している。
【０００６】
肝臓脂肪症の診断についての標準的な推奨は存在しない。通常の推奨は、ＧＧＴ及びＡＬＴを測定すること、並びにグレードの決定及び病期の決定のために肝生検を実施することである（Ｂｅｌｌｅｎｔａｎｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．２０００；１３２：１１２−７；Ｌｅｖｉｔｓｋｙ  Ｊ，Ｍａｉｌｌｉａｒｄ  ＭＥ．Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ．２００４；２４：２３３−４７；Ｂｒａｖｏ  ＡＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００１：３４４；４９５−５００）。肝生検は、潜在的な標本誤差を伴い、依然として侵襲的且つ高価な方法であるため、患者の肝臓脂肪症のレベルの良好な的中率が得られる、迅速且つ容易に実施できる試験があれば有利であろう。
【０００７】
線維症の診断に関して、非侵襲的なＦｉｂｒｏＴｅｓｔ（ＦＴ）（Ｂｉｏｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ，Ｐａｒｉｓ  Ｆｒａｎｃｅ，米国特許第６６３１３３０号明細書）は、慢性Ｃ型肝炎（Ｐｏｙｎａｒｄ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐ  Ｈｅｐａｔｏｌ．２００４；３：８）及び慢性Ｂ型肝炎（Ｍｙｅｒｓ  ＲＰ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ．２００３；３９：２２２−３０）において、また最近ではアルコール性肝疾患（Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ２００４；１０；１−６、Ｎａｖｅａｕ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）において、代用マーカーとして有効性が確認されている。
【０００８】
しかしながら、これまで、最も一般的な原因であるアルコール性肝炎、ウイルス性肝炎、及びＮＡＦＬＤにおいて肝臓脂肪症を診断するために、肝生検に対する代替物として単一のバイオマーカー又はバイオマーカー群を使用することができるということを実証する研究はされていない。
【特許文献１】米国特許第６６３１３３０号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、患者の肝臓脂肪症の程度の良好な的中率が得られ、且つ、肝生検の必要性を低減させるのに十分な信頼性のある診断方法を開発する必要がある。この方法は、肝臓脂肪症を伴う疾患を患うか、或いは肝線維症又は壊死性炎症性病変についての陽性診断試験をすでに受けた患者が自らの正確な疾患に治療を適合させるのに特に有利となる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、特に肝臓脂肪症を伴う疾患を患うか、或いは肝線維症及び／又は肝臓の壊死性炎症性病変の存在についての陽性診断試験をすでに受けた患者の肝臓における肝臓脂肪症を診断するための、簡素な血清生化学マーカーの組み合わせの的中率をプロスペクティブに評価する診断方法を提供する。高い陽性的中率（有意な肝臓脂肪症の予測）又は高い陰性的中率を得ることにより、生検の指示の数を低減させることができる。このことは、肝生検の費用及び危険性を低減するため、患者及び社会にとって有用になり得る。
【００１１】
図１は、分析した、訓練群及び検証群に包含される患者のフローチャートを示す図である。
【００１２】
図２は、ＳｔｅａｔｏＴｅｓｔ、ＧＧＴ（ＩＵ／Ｌ）及びＡＬＴ（ＩＵ／Ｌ）と、肝臓脂肪症のグレードとの間の関係性を示す図である。
【００１３】
切り込みのある箱ひげ図は、訓練群における関係性を示し（図２Ａ）、検証群１では治療前のＨＣＶ患者を示し（図２Ｂ）、検証群２では治癒したＨＣＶ患者を示し（図２Ｃ）、検証群３ではアルコール性肝疾患の患者を示し（図２Ｄ）、そして、対照群では、空腹時及び非空腹時の健常なボランティア並びに非空腹時の血液ドナーを示す（図２Ｅ）。
【００１４】
各箱の内部の水平線は中央値を表し、各箱の幅は中央値±１．５７×四分位範囲／√ｎを表し、それにより中央値群間の９５％の有意性レベルを評価する。影付きの箱が重複していないことは、統計学的な有意性があることを示す（Ｐ＜０．０５）。各箱の上下の水平線は、四分位範囲（第一四分位数から第三四分位数）を包含し、箱の末端からの垂線は、隣接値（上部：第三四分位数＋１．５×四分位範囲、下部：第一四分位数−１．５×四分位範囲）を包含する。検証群３では、ほぼ全ての患者が脂肪症を有し、Ｓ０群とＳ１群は組み合わされている。
【００１５】
図３は、対照群、訓練群及び検証群を組み合わせた、統合されたデータベースにおける、ＳｔｅａｔｏＴｅｓｔ、ＧＧＴ（ＩＵ／Ｌ）及びＡＬＴ（ＩＵ／Ｌ）と肝臓脂肪症のグレードとの間の関係性を示す図である。
【００１６】
影付きの箱が重複していないことは、中央値間で統計学的な有意性があることを示す（Ｐ＜０．０５）。平均値間の全てのペアワイズの差について、テューキー・クレーマー多重比較検定で全てのグレード間で有意な差が存在した。
【００１７】
ＧＧＴ及びＡＬＴに関しては、「脂肪症なし」と「５％未満」との間、及び、「５〜３３％」と「３３〜１００％」との間で有意な差が見られなかった。また、ＡＬＴに関しても、「脂肪症なし」と「５〜３３％」との間、「５％未満」と「５〜３３％」との間で有意な差は見られなかった。
【００１８】
したがって、本発明は、患者において、又は患者の血清もしくは血漿サンプルから、肝臓脂肪症を診断する方法に関するものであり、以下の過程を含む。
【００１９】
ａ）５つの生化学マーカーを、前記患者の血清又は血漿におけるそれらの濃度の値を測定することにより研究する過程。ここで、前記マーカーは、以下のとおりである。
−ＡｐｏＡ１（アポリポタンパク質Ａ１）、
−アルファ−２−マクログロブリン、
−ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、
−ＧＧＴ（ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ）、及び
−トリグリセリド。
ｂ）ボディ・マス・インデックス（体重／身長2）、ウエストサイズ、及び（ウエストサイズ／ヒップサイズ）比から成る群において選択される一つの臨床的マーカーを研究する過程。
ｃ）前記マーカーを含むロジスティック関数を通して前記値を組み合わせて最終値を得る過程。ここで、前記ロジスティック関数は、以下の方法により得られる。
ｉ）患者の疾患の程度に従った、種々の群への患者コホートの分類、
ｉｉ）一次元分析による、これらの群間で有意に異なる因子の同定、
ｉｉｉ）肝臓脂肪症の診断のためのマーカーの独立した識別値を評価するためのロジスティック回帰分析、
ｉｖ）これらの同定された独立因子の組み合わせによるロジスティック関数の構築、
（ｄ）前記患者における肝臓脂肪症の存在を確定するための、前記ロジスティック関数の前記最終値の分析。
【００２０】
肝臓脂肪症は、アルコール、糖尿病、肥満、高脂血症、インスリン抵抗性、遺伝子型３のＣ型肝炎、無βリポタンパク血症、及び一部の薬物のような幾つかの因子に関連し得る。特に、本発明は、アルコール性脂肪症及び非アルコール性脂肪症の両方の診断に関する。
【００２１】
定義によれば、識別の点での最良の指標（「脂肪症スコア」）は、独立因子を組み合わせたロジスティック回帰関数であった。
【００２２】
ロジスティック関数は、ロジスティック回帰で個別に確定された各パラメータの相対的なウエイトを、マーカーが肝臓脂肪症の病期と逆相関を有する場合には負の符合と組み合わせることにより得られる。対数は、その値の範囲が非常に大きいマーカーに使用される。
【００２３】
ロジスティック関数の質は、診断に望ましい閾値に応じて得られる受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を用いて分析される。ＲＯＣ曲線を得る方法は実施例に記載されている。本発明では、患者の分類は、肝臓脂肪症の種々のグレード（なし＝０％、軽度＝１〜５％、中程度＝６〜３２％、（顕著及び重度）＝３３〜１００％、ここで各パーセンテージは、脂肪症を伴う肝細胞のパーセンテージを指す）に従って行われるが、患者の分類は、顕著又は重度の等級のみの患者の診断を目的とする場合には変更することができる。この場合、別のＲＯＣ曲線が得られることになる。
【００２４】
患者における肝臓脂肪症の有無の診断は、集団における肝臓脂肪症の予想有病率に関するデータによりさらに精緻にすることができる。
【００２５】
ロジスティック関数は、他の臨床的マーカー又は生化学マーカーをさらに含んでもよい。好適な実施形態では、ロジスティック関数は患者の年齢及び性別も含む。別の実施形態では、ロジスティック関数はまた、総ビリルビン、ハプトグロビン、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、グルコース、及び（コレステロール又はＨＤＬ−コレステロール）のような他の生化学マーカーを含んでもよい。好ましくは、ロジスティック関数は、少なくとも１個又は２個、より好ましくは３個〜５個のこれらの他の生化学マーカーを含む。最も好ましくは、ロジスティック関数はまた、総ビリルビン、ハプトグロビン、グルコース、及びコレステロールを含んでもよい。
【００２６】
本発明による方法の過程ａ）で定量される生化学マーカーは「簡素な」生化学マーカーであり、このことは、これらのマーカーが当該技術分野で既知の方法（クロマトグラフィー、電気泳動、ＥＬＩＳＡ分析・・・）で容易に定量されることを意味する。
【００２７】
ロジスティック関数における種々のマーカーについて得られた値に使用される種々の係数は、実施例で記載されるように、統計学的分析を通して算出することができる。
【００２８】
特に、本発明の方法を実施するために使用することができる適切なロジスティック関数は、以下である。
ｆ＝ａ１−ａ２・［年齢（才）］＋ａ３・［ＡｐｏＡ１（ｇ／Ｌ）］−ａ４・［ボディ・マス・インデックス（体重／身長2）］＋ａ５・Ｌｏｇ［アルファ−２−マクログロブリン（ｇ／Ｌ）］−ａ６・Ｌｏｇ［ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）（ＩＵ／Ｌ）］−ａ７・Ｌｏｇ［総ビリルビン（μｍｏｌ／Ｌ）］−ａ８・［コレステロール（ｍｍｏｌ／Ｌ］−ａ９・Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ）（ＩＵ／Ｌ）］−ａ１０・［グルコース（ｍｍｏｌ／Ｌ）］−ａ１１・Ｌｏｇ［ハプトグロビン（ｇ／Ｌ）］−ａ１２・［トリグリセリド（ｍｍｏｌ／Ｌ）］＋ａ１３・［性別（女性＝０、男性＝１）］であり、式中、
ａ１は、［６．６８８０５−ｘ％；６．６８８０５＋ｘ％］の区間に含まれ、
ａ２は、［１．５５３３７Ｅ−０２−ｘ％；１．５５３３７Ｅ−０２＋ｘ％］の区間に含まれ、
ａ３は、［１．１６１５３１−ｘ％；１．１６１５３１＋ｘ％］の区間に含まれ、
ａ４は、［０．１１８８９−ｘ％；０．１１８８９＋ｘ％］の区間に含まれ、
ａ５は、［１．７４７９１−ｘ％；１．７４７９１＋ｘ％］の区間に含まれ、
ａ６は、［０．９６４５３−ｘ％；０．９６４５３＋ｘ％］の区間に含まれ、
ａ７は、［０．１１９５８−ｘ％；０．１１９５８＋ｘ％］の区間に含まれ、
ａ８は、［０．６８１２５−ｘ％；０．６８１２５＋ｘ％］の区間に含まれ、
ａ９は、［１．１７９２２−ｘ％；１．１７９２２＋ｘ％］の区間に含まれ、
ａ１０は、［１．４６９６３−ｘ％；１．４６９６３＋ｘ％］の区間に含まれ、
ａ１１は、［０．３４５１２−ｘ％；０．３４５１２＋ｘ％］の区間に含まれ、
ａ１２は、［１．１７９２６−ｘ％；１．１７９２６＋ｘ％］の区間に含まれ、そして
ａ１３は、［０．３５０５２−ｘ％；０．３５０５２＋ｘ％］の区間に含まれる。
【００２９】
「［ａ−ｘ％；ａ＋ｘ％］の区間」は、［（１００−ｘ）／１００・ａ；（１００＋ｘ）／１００・ａ］の区間を意味する。好ましくは、ｘは、最大で９０、８０又は７０であり、より好ましくは最大で６０、５０又は４０であり、さらに好ましくは最大で３０、２０、１０又は５である。係数ａiは全て、小数点以下５桁の数字まで切り捨てることができる。例えば、ｘが９０に等しいとき、ａ１３は［０．０３５０５；０．６６５９８］の区間に含まれる。
【００３０】
実際に、種々の関数における係数のための数値の定義は、研究する患者の数及び特徴に応じて変化してよい。したがって、種々のマーカーの係数に付与される値は、本発明の範囲を低減させることなく、わずかに異なることが可能であると解釈されなくてはならない。
【００３１】
ｘがゼロに等しい場合、特定の有用な関数は、以下のとおりである。
ｆ＝６．６８８０５−１．５５３３７Ｅ−０２・［年齢（才）］＋１．１６１５３１・［ＡｐｏＡ１（ｇ／Ｌ）］−０．１１８８９・［ボディ・マス・インデックス（体重／身長2）］＋１．７４７９１・Ｌｏｇ［アルファ−２−マクログロブリン（ｇ／Ｌ）］−０．９６４５３・Ｌｏｇ［ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）（ＩＵ／Ｌ）］−０．１１９５８・Ｌｏｇ［総ビリルビン（μｍｏｌ／Ｌ）］−０．６８１２５・Ｌｏｇ［コレステロール（ｍｍｏｌ／Ｌ）］−１．１７９２２・Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ）（ＩＵ／Ｌ）］−１．４６９６３・Ｌｏｇ［グルコース（ｍｍｏｌ／Ｌ）］−０．３４５１２・Ｌｏｇ［ハプトグロビン（ｇ／Ｌ）］−１．１７９２６・Ｌｏｇ［トリグリセリド（ｍｍｏｌ／Ｌ）］＋０．３５０５２・［性別（女性＝０、男性＝１）］
【００３２】
ロジスティック関数による生物学的マーカーの値の分析により得られる最終値に応じて、患者の肝臓脂肪症の有無に関する結論を出すことが可能である。また、肝臓脂肪症のグレードをＲＯＣ曲線の描線における閾値として取ることにより、肝臓脂肪症のグレードに関して結論付けることが可能である。
【００３３】
したがって、或る特定の実施形態では、本発明は、ロジスティック関数の最終値がさらに肝臓脂肪症のグレードの診断に使用される、上述した方法に関するものである。肝臓脂肪症の種々のグレードは、肝生検の組織学的特徴に従って定義される。肝臓脂肪症のグレードの、より正確な定義は、実施例１で提供される。
【００３４】
本発明による方法は、ロジスティック関数の最終値から推論される肝臓脂肪症のグレードに基づいて疾患の進展を予測する過程をさらに含んでもよい。特に、０．３０のカットオフでの脂肪症スコアは、種々の群にしたがって８５％〜１００％の範囲の非常に高い感度を有し（表４）、０．７０のカットオフでの脂肪症スコアでは、８３％〜１００％の範囲の非常に高い特異度を有する。さらに、ＦｉｂｒｏＴｅｓｔに関してすでに実証されたように（Ｐｏｙｎａｒｄ  ２００４  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００４）、Ｓｔｅａｔｏスコアと生検との間の不一致の多くは生検の誤差（小さな標本のサイズ）によるものであった。本発明の方法では、８０％以上、肝生検の必要性を低減させることが期待される。臨床医は、肝硬変を招くか或いは肝臓検査における異常を示す、主要な組織学的特徴である、脂肪症に関する脂肪症スコア、線維症に関する線維症スコア（ＦｉｂｒｏＴｅｓｔ、Ｂｉｏｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、慢性Ｃ型肝炎及び慢性Ｂ型肝炎の壊死性炎症性の特徴に関する活性スコア（ＡｃｔｉＴｅｓｔ、Ｂｉｏｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）の推定値を初めて得ることができる。生検は、線維症スコア（ＦｉｂｒｏＴｅｓｔ）について示されるような解釈不可能な要素、即ち、急性炎症、ジルベール症候群、又は溶血（Ｐｏｙｎａｒｄ  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００４）の場合の二次治療においてのみ指示されるはずである。
【００３５】
本発明によれば、ロジスティック関数の最終値から推論される肝脂肪症のグレードは、医師が疾患の病期に従って患者に適した治療を選択するためにも非常に有益であり得る。
【００３６】
また、前記肝臓脂肪症のグレードに基づいて、医師は患者に対して肝生検を実施するか否かを決定してもよい。
【００３７】
診断を受けている患者群における肝臓脂肪症の有病率に応じて、本発明の方法により得られるデータを使用して、患者に対して肝生検を実施する必要性を決定することができる。本発明の方法は、およそ８０％、肝生検の必要性を低減させることが期待される。
【００３８】
本発明の方法は、肝硬変へ進行する可能性がある肝臓脂肪症を伴うあらゆる疾患を患っている患者に使用することを目的としている。「肝臓脂肪症を伴う疾患」とは、肝臓脂肪症への進行を招く可能性があるすべての疾患を意味する。特に、本発明の方法は、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎、アルコール依存症、ヘモクロマトーシス、代謝障害、糖尿病、肥満症、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、アルファ−１−アンチトリプシン欠乏症、ウィルソン病から成る群に含まれる疾患を患う患者において肝臓脂肪症を検出するため有利に実施される。
【００３９】
本発明の方法は、特に、肝線維症及び／又は肝臓の壊死性炎症性病変の存在についての診断試験をすでに受けた患者に使用することを目的としている。
【００４０】
より好ましくは、本発明の方法は、参照により本明細書に援用される米国特許第６６３１３３０号明細書に記載されるようなＦｉｂｒｏＴｅｓｔ／ＡｃｔｉＴｅｓｔの診断試験をすでに受けた患者に使用することを目的としている。
【００４１】
本発明は、生化学マーカーの定量により患者における肝臓脂肪症の有無を決定するための説明書を含む、患者における肝臓脂肪症の診断用のキットにも関するものである。
【００４２】
説明書は、生化学マーカーの量の確定後に使用する必要があるロジスティック関数を含んでもよい。説明書は印刷支持体、並びにソフトウェアのようなコンピュータで使用可能な支持体として表示することができる。また、説明書は、ロジスティック関数から得られる最終データの分析を可能にするために、求められる閾値に応じたＲＯＣ曲線を含んでもよい。また、説明書は、患者群における肝臓脂肪症の予想有病率に応じた、的中率を得ることを可能にする様々な表を含んでもよい。
【００４３】
また、本発明による診断キットは所望の生物学的マーカーの定量を可能にする要素を含有してもよい。
【００４４】
また、前記診断キットは、肝臓脂肪症の種々のグレード（なし＝０％、軽度＝１〜５％、中程度＝６〜３２％、顕著＝３３〜６６％、重度＝６７〜１００％）、及び他の中間のグレードの定量化に関する説明書を含んでもよい。
【００４５】
本発明の方法は容易に自動化することができ、マーカーの定量は自動的に実施され、データは、ロジスティック関数の値を算出し、ＲＯＣ曲線を用いてその値を分析するコンピュータ又は計算機へ送信されて、最終的には患者群における肝臓脂肪症の有病率となる。したがって、医師により得られるデータは、より容易に解釈可能であり、生検の必要性又は処方するのに適切な治療を決定するためのプロセスの改善を可能にする。
【００４６】
以下の実施例は、発明の態様を説明するためのものであり、本発明の方法を反復するための手順を提供するが、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００４７】
患者及び方法
１．１．患者
血清が利用可能であり、肝生検材料間に差がなく、血清と生検材料の採取の期間が３ヶ月より短い患者が包含される。（図１）。包含されない基準としては、利用不可能な血清、利用不可能な生検材料、及び生検材料と血清とが３ヶ月以上離れて採取された患者が挙げられる。分析は、第一の群（訓練群）で実施し、３つの異なる群（検証群）で検証した。
【００４８】
訓練群の患者は、この特定の分析にレトロスペクティブに包含されたが、２０００年９月から２００４年８月にＦｉｂｒｏＴｅｓｔの以前のプロスペクティブな検証研究ですでに分析されている（Ｐｏｙｎａｒｄ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２００４；３：８；  Ｍｙｅｒｓ  ＲＰ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ．２００３；３９：２２２−３０；Ｒａｔｚｉｕ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２００３；３８：５１０Ａ）。全て、ＮＡＦＬＤ、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎及びアルコール性肝疾患のためＧｒｏｕｐｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌｉｅｒ  Ｐｉｔｉｅ−Ｓａｌｐｅｔｒｉｅｒｅの肝臓・消化器病科に入院している入院患者であった。
【００４９】
検証群１の患者（Ｃ型肝炎患者）は、慢性Ｃ型肝炎の患者における肝臓脂肪症の研究からレトロスペクティブに分析した（Ｐｏｙｎａｒｄ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２００３；３８：７５−８５）。この目的のため、ＰＥＧ−ＩＦＮとリバビリンのプロスペクティブな多施設無作為試験でこれまでは治療されていない患者が包含された。ベースラインでのバイオマーカー及び生検の結果を用いた。
【００５０】
検証群２の患者（ＨＣＶが検出不可能な、以前Ｃ型肝炎であった患者）は、持続性ウイルス学的著効を示し「治癒」している、つまりＨＣＶのＲＮＡが治療の終了から２４週間後に検出不可能である、検証群１と同一の無作為試験の患者であった（Ｐｏｙｎａｒｄ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２００３；３８：７５−８５）。治療の終了から２４週間後に実施したバイオマーカー及び生検の結果を使用した。この群は、考えられるウイルス性脂肪症が治療により治癒しているため、ＮＡＦＬＤの検証群とみなされた（Ｐｏｙｎａｒｄ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２００３；３８：７５−８５）。
【００５１】
検証群３の患者（アルコール性肝疾患患者）は、この特定の分析にレトロスペクティブに包含されたが、一つの主要な評価項目が生化学マーカーの同定であるアルコール依存症患者コホートにおいて１９９８年から２０００年にプロスペクティブに包含された。このコホートの詳細は、ＦｉｂｒｏＴｅｓｔの検証研究において近年公開された（Ｎａｖｅａｕ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２００５  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）。全て、アルコール性肝疾患の合併症のためＨｏｐｉｔａｌ  Ａｎｔｏｉｎｅ  Ｂｅｃｌｅｒｅの肝臓・消化器病科に入院している入院患者であった。
【００５２】
種々の群の患者の特徴を表１に列挙する。
【００５３】
【表１】
2008529030.tif 000002
【００５４】
対照群もまた分析した。対照群は、ＦｉｂｒｏＴｅｓｔの検証に以前包含された、明らかに健常な空腹時及び非空腹時のボランティア（Ｍｕｎｔｅａｎｕ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２００４；３，３）、及び追加の非空腹時の血液ドナーから構成された。
【００５５】
１．２．血清マーカー
１０個の以下の生化学マーカーを種々の群について評価した。ＡｐｏＡ１、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、アルファ−２−マクログロブリン、ＧＧＴ（ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ）、総ビリルビン、ハプトグロビン、コレステロール、グルコース、及び、トリグリセリド。
【００５６】
これらの１０個の生化学マーカーは、年齢及び性別により調節されたＦｉｂｒｏＴｅｓｔ−ＡｃｔｉＴｅｓｔの６つの要素（特許された人工知能アルゴリズム、米国特許第６６３１３３０号明細書）に加えて、ＡＳＴ、コレステロール、グルコース、トリグリセリドマーカー、及びＢＭＩを包含する。
【００５７】
ＦｉｂｒｏＴｅｓｔ（Ｂｉｏｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ，  Ｐａｒｉｓ，  Ｆｒａｎｃｅ；ＦｉｂｒｏＳＵＲＥ  ＬａｂＣｏｒｐ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ，ＵＳＡ）は、以前に公開されたように確定された（Ｐｏｙｎａｒｄ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐ  Ｈｅｐａｔｏｌ．２００４；３：８；  Ｍｙｅｒｓ  ＲＰ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ．２００３；３９：２２２−３０；Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ２００４；１０；１−６；  Ｎａｖｅａｕ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ；Ｉｍｂｅｒｔ−Ｂｉｓｍｕｔ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  ２００４；４２：３２３−３３；  Ｍｕｎｔｅａｎｕ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ２００４；３：３）。
【００５８】
公開された推奨の事前分析方法及び分析方法を使用した（Ｐｏｙｎａｒｄ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐ  Ｈｅｐａｔｏｌ．２００４；３：８；Ｍｙｅｒｓ  ＲＰ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ．  ２００３；３９：２２２−３０；  Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ２００４；１０；１−６；Ｎａｖｅａｕ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ；Ｉｍｂｅｒｔ−Ｂｉｓｍｕｔ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  ２００４；４２：３２３−３３；Ｍｕｎｔｅａｎｕ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ２００４；３：３）。
【００５９】
訓練群及び対照群では、ＧＧＴ、ＡＬＴ、血清グルコース、トリグリセリド、コレステロール及び総ビリルビンを、製造業者の試薬を使用して、Ｈｉｔａｃｈｉ９１７分析器又はＭｏｄｕｌａｒＤＰ分析器（ともに、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により測定した。アポリポタンパク質Ａ１、アルファ−２−マクログロブリン、及びハプトグロビンを、自動比濁計ＢＮＩＩ（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ；Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定した。
【００６０】
検証群１と２では、ＧＧＴ、ＡＬＴ、血清グルコース、トリグリセリド、コレステロール及び総ビリルビンを、製造業者の試薬を使用してＨｉｔａｃｈｉ７４７又はＨｉｔａｃｈｉ９１７（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）を用いて測定した。アポリポタンパク質Ａ１、アルファ−２−マクログロブリン及びハプトグロビンを、自動比濁計（ＢＮＩＩ、」Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ；Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して血清サンプル中で測定した。
【００６１】
検証群３では、ＡＬＴ、ＧＧＴ、血清グルコース、トリグリセリド、コレステロール、総ビリルビン及びハプトグロビンを、製造業者の試薬（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｒｕｎｇｉｓ  Ｆｒａｎｃｅ）を使用して自動分析器（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ  ６４０  Ａｕｔｏｍａｔｅ）により測定した。アルファ−２−マクログロブリン及びアポリポタンパク質Ａ１を、自動比濁計（ＢＮＩＩ、Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ；Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定した。
【００６２】
分析の変動係数は全て、１０％未満であった。
【００６３】
１．３．組織学的グレード決定
組織学的グレード決定は、肝生検に基づいて実施した。共通規則を種々の群において適用し、患者の特徴を知らない一群当たり一人の病理学者が組織学的特徴を分析した。肝生検材料は、標準的な技術を使用して処理した。
【００６４】
肝臓脂肪症を四つのグレードへのスコアリングシステムで０〜４にスコア付けした：０＝脂肪症なし、１〜５％＝軽度、６〜３２％＝中程度、３３〜６６％＝顕著、６７〜１００％＝重度であり、パーセンテージは全て脂肪症に関与する肝細胞のパーセントを指す（Ｐｏｙｎａｒｄ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２００３；３８：７５−８５）。主な組織学的基準は、脂肪症のグレード２〜４（６％〜１００％の間）の存在であった。
【実施例２】
【００６５】
統計学的分析
統計学的分析は、フィッシャーの正確確率検定、カイ二乗検定、スチューデントｔ検定、マンホイットニー検定、並びにボンフェローニの全ペアワイズ検定及びテューキー・クレーマー多重比較検定を使用した分散分析を使用して、多変量解析のための多重比較及び多重ロジスティック回帰を考慮に入れた（Ｈｉｎｔｚｅ  ＪＬ．ＮＣＳＳ  ２００３  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ．Ｎｕｍｂｅｒ  Ｃｒｕｎｃｈｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ２００３  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＮＣＳＳ，Ｋａｙｓｖｉｌｌｅ，Ｕｔａｈ）。分析は、表１で見られるような患者コホートにおいて、第一の群（訓練群）で実施し、３つの異なる群（検証群１、２及び３）で検証した。
【００６６】
肝臓脂肪症のスコアリングシステムに従って、患者を幾つかの群に分けた。
【００６７】
第一の結果は、肝臓脂肪症のグレード２、３又は４（中程度、顕著又は重度）を有する患者の同定であった。
【００６８】
第二の分析では、患者を４つの尺度のスコアリングシステムに従って分類した。
【００６９】
第一段階は、カイ二乗検定、スチューデントｔ検定又はマンホイットニー検定を使用した一次元分析により、これらの群間で有意に異なる因子を同定することから構成される。
【００７０】
第二段階は、線維症の診断のためのマーカーの独立した識別値を評価するためのロジスティック回帰分析から構成される。
【００７１】
第三段階は、これらの同定された独立因子を組み合わせた指標を構築することであった。定義によれば、識別に関する最良の指標（「脂肪症スコア」）は、独立因子を組み合わせたロジスティック回帰関数であった。以下の全ての実施例では、脂肪症スコアは、「ＳｔｅａｔｏＴｅｓｔスコア」と称される。ＳｔｅａｔｏＴｅｓｔスコアは０〜１．００の範囲であり、スコアが高ければ、重大な病変がある可能性が高いということである。
【００７２】
マーカーの診断値は、感度、特異度、陽性的中率（ＰＰＶ）と陰性的中率（ＮＰＶ）、及び受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下の面積を用いて評価した（Ｈｉｎｔｚｅ  ＪＬ．ＮＣＳＳ  ２００３  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ．Ｎｕｍｂｅｒ  Ｃｒｕｎｃｈｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ２００３  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＮＣＳＳ，Ｋａｙｓｖｉｌｌｅ，Ｕｔａｈ）。
【００７３】
各々の全体的な診断値は、ＲＯＣ曲線下の面積により比較した。ＲＯＣ曲線は、種々の閾値（０〜１）で、ロジスティック関数に関して得られた値に従って患者を分類した後に、（１−特異度）に対する感度をプロットすることにより描かれる。通常、その下の面積が０．７を超える値を有するＲＯＣ曲線が診断にとって良好な予測曲線であることが認められている。ＲＯＣ曲線は、診断法の質を予測することを可能にする曲線として認められなくてはならない。
【００７４】
ＲＯＣ曲線下の面積は、経験的なノンパラメトリック法を使用して算出した。また、感度分析も、生検標本のサイズに従って第一の結果についてマーカーの精度を測定するために実施した。全ての分析に関して、両側検定を使用した。０．０５以下のＰ値は有意であるとみなした。全ての分析に関して、Ｎｕｍｂｅｒ  Ｃｒｕｎｃｈｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ２００３  ソフトウェア（ＮＣＳＳ，  Ｋａｙｓｖｉｌｌｅ，Ｕｔａｈ）を使用した（Ｈｉｎｔｚｅ  ＪＬ．ＮＣＳＳ  ２００３  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ．Ｎｕｍｂｅｒ  Ｃｒｕｎｃｈｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ２００３  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＮＣＳＳ，Ｋａｙｓｖｉｌｌｅｓ，Ｕｔａｈ）。
【００７５】
これらの統計学的分析は、これまでに定義したように種々の群に関して別々に実施した。
【実施例３】
【００７６】
ロジスティック関数の確定
「ＳｔｅａｔｏＴｅｓｔスコア」は、肝臓脂肪症の有無の識別に関する最良の指標を再現する、独立因子を組み合わせたロジスティック回帰関数として定義される。
【００７７】
表２に、１０個の各生化学マーカー、ＦｉｂｒｏＴｅｓｔスコア及びＳｔｅａｔｏＴｅｓｔスコアに関する肝臓脂肪症の存在、並びに線維症とのそれらの個別の関連性に従う患者の特徴を示した（Ｐ値）。
【００７８】
訓練群では、単変量分析におけるグレード２〜４の脂肪症の存在に関連する最も有意な要素は、ＢＭＩ、年齢、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＧＧＴ、グルコース、及びトリグリセリドであった。
【００７９】
ロジスティック回帰分析では、最も有意な要素は、ＢＭＩ（ＯＲ＝０．８９、Ｐ＝０．０００２）、ＧＧＴ（ＯＲ＝０．３１、Ｐ＝０．００２）、アポリポタンパク質Ａ１（ＯＲ＝３．２０、Ｐ＝０．０１）、アルファ−２−マクログロブリン（ＯＲ＝５．７４、Ｐ＝０．０２）、ＡＬＴ（ＯＲ＝０．３８、Ｐ＝０．０３）、及びトリグリセリド（ＯＲ＝０．３１、Ｐ＝０．０４）であった。
【００８０】
検証群では同程度の差が見られ、ＢＭＩ、ＧＧＴ、ＡＬＴ、及びトリグリセリドに関して最も有意であった（表２）。
【００８１】
【表２】
2008529030.tif 000003
【００８２】
９個のマーカーと年齢、性別及びＢＭＩを組み合わせた最良のロジスティック関数（ＳｔｅａｔｏＴｅｓｔ）は、以下のように訓練群で確定した。
ｆ＝６．６８８０５−１．５５３３７Ｅ−０２・［年齢（才）］＋１．１６１５３１・［ＡｐｏＡ１（ｇ／Ｌ）］−０．１１８８９・［ボディ・マス・インデックス（体重／身長2）］＋１．７４７９１・Ｌｏｇ［アルファ−２−マクログロブリン（ｇ／Ｌ）］−０．９６４５３・Ｌｏｇ［ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）（ＩＵ／Ｌ）］−０．１１９５８・Ｌｏｇ［総ビリルビン（μｍｏｌ／Ｌ）］−０．６８１２５・Ｌｏｇ［コレステロール（ｍｍｏｌ／Ｌ］−１．１７９２２・Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ）（ＩＵ／Ｌ）］−１．４６９６３・Ｌｏｇ［グルコース（ｍｍｏｌ／Ｌ）］−０．３４５１２・Ｌｏｇ［ハプトグロビン（ｇ／Ｌ）］−１．１７９２６・Ｌｏｇ［トリグリセリド（ｍｍｏｌ／Ｌ）］＋０．３５０５２・［性別（女性＝０、男性＝１）］
【００８３】
この関数は、ロジスティック回帰で個別に確定した各パラメータの相対的なウエイトを、マーカーが肝臓脂肪症の病期との逆相関を有する場合に負の符合と組み合わせることにより、訓練群で得られた。対数は、その値の範囲が非常に大きいマーカーに使用した。
【００８４】
年齢、性別及びＢＭＩにより調節した、９個のマーカー（アルファ−２−マクログロブリン、ＡＬＴ、ＡｐｏＡ１、ハプトグロビン、ＧＧＴ、及び総ビリルビン）を組み合わせるＳｔｅａｔｏＴｅｓｔスコアの値は、訓練サンプル並びに検証サンプルで、肝臓脂肪症の有無と高い相関があった（表２）。
【００８５】
本研究の主要な発見の一つは、マーカーを組み合わせると、ＧＧＴ及びＡＬＴのようなこれまでに推奨された従来の通常の試験に対して脂肪症の診断値が非常に有意に改善することである。ＢＭＩ、グルコース、トリグリセリドのようなインスリン抵抗性の単純なマーカーにより、ＡＬＴ及びＧＧＴの診断値が増大した。これは、肝臓脂肪症の種々の原因においてこれまでに実証されていなかった。さらに、脂肪症の診断に関しては、ＡＬＴの診断値はＧＧＴよりもはるかに大きいことが初めて実証された。また興味深いことに、ＧＧＴ値は、ＡＬＴと比較して、脂肪症の重篤性に応じて増加しなかった。
【実施例４】
【００８６】
データの分析
４．１  肝臓脂肪症の診断のためのＳｔｅａｔｏＴｅｓｔスコアの信頼性
種々の患者群に関するＳｔｅａｔｏＴｅｓｔスコアの診断値（ＲＯＣ曲線下の面積）を表３に示す。０．３０、０．５０及び０．７０のカットオフでのＳｔｅａｔｏＴｅｓｔスコアの感度、特異度、及び、陽性的中率と陰性的中率を表４に示す。
【００８７】
【表３】
2008529030.tif 000004
【００８８】
【表４】
2008529030.tif 000005
【００８９】
結果は全て、ＳｔｅａｔｏＴｅｓｔスコアが、非常に高い診断値（ＲＯＣ曲線の下の面積、表３を参照）、及び、肝臓脂肪症の診断のための高い特異度、感度、及び、陽性的中率又は陰性的中率を得ることができることを示す（表４を参照）。
【００９０】
ＳｔｅａｔｏＴｅｓｔスコアの診断値（ＲＯＣ曲線の下の面積）は、訓練群と検証群１、２及び３との間で高度に再現性があった。また、感度も訓練群と検証群１、２及び３との間で極めて高度に再現性があった（表４）。さらに、研究した種々の集団において観察されるＳｔｅａｔｏＴｅｓｔスコアの感度及び特異度は、ボランティア及び血液ドナーにおいて優れた特異度が観察されたこと（図２Ｅ）、及び、本研究が病的肥満のような幾つかの代謝危険因子を有する限られた数の患者を包含していたことから、より一般的な集団においてはおそらく増大するであろう。
【００９１】
一部の患者に関して、生検とＳｔｅａｔｏＴｅｓｔスコアによる肝臓脂肪症の存在について診断が不一致であった。生化学マーカーと生検により予測された５％を超える肝臓脂肪症の存在の不一致の原因は、これまでに詳述されたような不良の各々の危険因子に従って生じた（Ｐｏｙｎａｒｄ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２００４；５０：１３４４−５５）。有意な不一致は、ＳｔｅａｔｏＴｅｓｔスコアにより予測された又は生検標本において観察された、５％を超える肝臓脂肪症（グレード２〜４）の予測における不一致として、また、５％を超える肝臓脂肪症のパーセンテージにおける３０％以上の差として定義した。ＳｔｅａｔｏＴｅｓｔスコアの不良の危険因子は、溶血、ジルベール症候群、急性炎症及び肝外胆汁うっ滞であった。生検の不良の危険因子は、生検標本のサイズ（２５ｍｍ未満）及び断片化（二つ以上の断片）であった。生検標本が１５ｍｍ未満であり、且つ断片化され、さらに少なくとも一つの代謝危険因子が存在する場合に、生検に起因する不良（偽陰性）が疑われた。
【００９２】
訓練群では、ＳＴにより予測される脂肪症のパーセンテージと生検標本で観察される脂肪症のパーセンテージとの間の有意な不一致が５６事例（１８％）見られた。ＳＴに起因する不良（ＳＴの偽陽性）は、慢性Ｂ型肝炎に付随する急性薬物性肝炎を有する一事例で疑われた。生検に起因する不良（生検の偽陰性）は、生検標本の質が悪く（平均長さ１３ｍｍ、２つの断片）少なくとも一つの代謝危険因子を伴う１６の事例で疑われた。
【００９３】
検証群に関しては、有意な不一致は、群１では１７事例（１６％）、群２では２０事例（１０％）、及び、群３では１３事例（２１％）で観察された。有意な不一致は、広範な線維症を伴う患者（病期Ｆ３又はＦ４）においてより多く観察された：６０９事例のうちの９１事例（１５％、Ｐ＝０．００１）に対して１３５事例のうちの３８事例（２８％）。
【００９４】
侵襲的で且つ高価な生検診断と比較して、本発明の方法が、患者に対する多くの不必要な治療、又は、治療を必要とする患者の排除を招かないものであるということに留意することが非常に重要である。本出願で提示されるデータは、本発明による診断方法の信頼性を高める。
【００９５】
４．２  他の非侵襲的な診断試験（ＦｉｂｒｏＴｅｓｔ、５０ＩＵ／ＬのＧＧＴ、及び５０ＩＵ／ＬのＡＬＴ）とＳｔｅａｔｏＴｅｓｔとの比較
ＳｔｅａｔｏＴｅｓｔスコア（年齢、性別及びＢＭＩにより調節した９つの生化学パラメータを使用）で得られる結果を、肝臓脂肪症の有無を示すために有用なマーカーであると通常考えられているＧＧＴ及びＡＬＴのような単離されたマーカーを用いて得られる結果と比較した。同一の標準的なカットオフ値である５０ＩＵ／Ｌを、ＧＧＴ及びＡＬＴに使用する。前記カットオフ値未満で、肝臓脂肪症の診断は陰性であるとみなし、前記カットオフ値を超えると肝臓脂肪症の診断は陽性であるとみなす。
【００９６】
個々の生化学マーカー、ＦｉｂｒｏＴｅｓｔ及びＳｔｅａｔｏＴｅｓｔスコアに関する肝臓脂肪症の存在に従った患者の特徴を表２に示した。
【００９７】
ＦｉｂｒｏＴｅｓｔと比較して、ＳｔｅａｔｏＴｅｓｔスコアは、分析した全ての群において、特に訓練群及び検証群２に関して、肝臓脂肪症の有無のはるかに良好な識別を可能にする（表２）。
【００９８】
主要な項目評価（即ち、グレード２〜４の肝臓脂肪症）の診断について、ＳｔｅａｔｏＴｅｓｔスコア、５０ＩＵ／ＬのＧＧＴ、及び、５０ＩＵ／ＬのＡＬＴの診断値（ＲＯＣ曲線の下の面積）を表３に示した。ＳｔｅａｔｏＴｅｓｔスコアは、分析した全ての群において５０ＩＵ／ＬのＧＧＴよりも、また訓練群及び検証群１においては５０ＩＵ／ＬのＡＬＴよりも、大きいＲＯＣ曲線下の面積を有する（表３）。
【００９９】
０．３０、０．５０又は０．７０のカットオフでのＳｔｅａｔｏＴｅｓｔスコア、並びに５０ＩＵ／ＬのＧＧＴ及び５０ＩＵ／ＬのＡＬＴの感度、特異度、及び陽性的中率と陰性的中率を表４に示した。グレード２〜４の脂肪症の診断に関して、０．５０のカットオフでのＳｔｅａｔｏＴｅｓｔスコアは、訓練群及び検証群のそれぞれに従って、良好な感度（０．６９、０．８９、０．６８及び０．６２）及び良好な特異度（０．７４、０．５８、０．７９、１．００）を得た。さらに、０．５０のカットオフでのかかるＳｔｅａｔｏＴｅｓｔスコアは、検証群１における５０ＩＵ／ＬのＡＬＴの陰性的中率を除いて、分析した全ての群において５０ＩＵ／ＬのＧＧＴ及び５０ＩＵ／ＬのＡＬＴよりも高い陽性値及び陰性値を示す。
【０１００】
さらに、肝臓脂肪症の種々のグレード間の識別に関しては、分析した全ての群において、５０ＩＵ／ＬのＧＧＴ及び５０ＩＵ／ＬのＡＬＴと比較してＳｔｅａｔｏＴｅｓｔスコアで最良のものが得られる（図２）。
【０１０１】
また、肝臓脂肪症の種々のグレード間の識別も、訓練群、三つの検証群及び対照群の全ての包含された被験者（８８４人の被験者）から構成される、統合されたデータベースで分析した。
【０１０２】
対照から「３３〜１００％」まで、ＳｔｅａｔｏＴｅｓｔスコアと脂肪症のグレードとの間に非常に有意な全体的な相関が見られた（グレード３〜４、図３を参照）。ＳｔｅａｔｏＴｅｓｔスコアに関して、平均値間の全てのペアワイズの差について、テューキー・クレーマー多重比較検定で全てのグレード間で有意な差が見られた（Ｐ＜０．０５）。一方、ＧＧＴ及びＡＬＴに関しては、「脂肪症なし」（グレード０）と「５％未満」（グレード１）との間で有意な差は見られなかった。ＡＬＴに関しては、「脂肪症なし」（グレード０）と「６〜３２％」（グレード２）、「５％未満」（グレード１）と「６〜３２％」（グレード２）、及び「６〜３２％」（グレード２）と「３３〜６６％」（グレード３）との間でも有意な差は見られなかった。
【０１０３】
結論として、本発明は、肝臓脂肪症の有無の検出に使用するための、年齢、性別及びＢＭＩにより調節された少なくとも５個、好ましくは９個の生化学マーカーの組み合わせを提示する。本発明で使用されるマーカーは、ＲＯＣ曲線下の面積により示されるような、このように良好な的中率を得るべく、特に患者の年齢、性別及びＢＭＩとこのように組み合わされたことはかつてなかった。
【０１０４】
本発明の診断方法は、マーカーの値の自動測定後に自動的に分析することができ、肝生検の指示を低減させるために、肝臓脂肪症を伴う疾患の患者に有利に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】分析した、訓練群及び検証群に包含される患者のフローチャートを示す図。
【図２】ＳｔｅａｔｏＴｅｓｔ、ＧＧＴ（ＩＵ／Ｌ）及びＡＬＴ（ＩＵ／Ｌ）と、肝臓脂肪症のグレードとの間の関係性を示す図。
【図２Ａ】訓練群における、ＳｔｅａｔｏＴｅｓｔ、ＧＧＴ（ＩＵ／Ｌ）及びＡＬＴ（ＩＵ／Ｌ）と、肝臓脂肪症のグレードとの間の関係性を示す図。
【図２Ｂ】検証群１における、ＳｔｅａｔｏＴｅｓｔ、ＧＧＴ（ＩＵ／Ｌ）及びＡＬＴ（ＩＵ／Ｌ）と、肝臓脂肪症のグレードとの間の関係性を示す図。
【図２Ｃ】検証群２における、ＳｔｅａｔｏＴｅｓｔ、ＧＧＴ（ＩＵ／Ｌ）及びＡＬＴ（ＩＵ／Ｌ）と、肝臓脂肪症のグレードとの間の関係性を示す図。
【図２Ｄ】検証群３における、ＳｔｅａｔｏＴｅｓｔ、ＧＧＴ（ＩＵ／Ｌ）及びＡＬＴ（ＩＵ／Ｌ）と、肝臓脂肪症のグレードとの間の関係性を示す図。
【図２Ｅ】対照群における、ＳｔｅａｔｏＴｅｓｔ、ＧＧＴ（ＩＵ／Ｌ）及びＡＬＴ（ＩＵ／Ｌ）と、肝臓脂肪症のグレードとの間の関係性を示す図。
【図３】対照群、訓練群及び検証群を組み合わせた、統合されたデータベースにおける、ＳｔｅａｔｏＴｅｓｔ、ＧＧＴ（ＩＵ／Ｌ）及びＡＬＴ（ＩＵ／Ｌ）と肝臓脂肪症のグレードとの間の関係性を示す図。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
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【国際調査報告】
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