(57)【要約】  本発明は、ＩｇＧ Ｆｃ領域にアミノ酸修飾を有することによって変更したＦｃエフェクター機能を示すポリペプチドを提供するものである。
2008510466.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｓｎ４３４のＴｒｐ(Ｎ４３４Ｗ)へのアミノ酸置換を少なくとも含有する変異体ＩｇＧ Ｆｃ領域を含んでなる単離されたポリペプチド。
【請求項２】
前記変異体ＦｃがｐＨ６．０において天然配列ＩｇＧ Ｆｃ領域よりも高い親和性であり、ｐＨ６．０よりもｐＨ７．４において弱い結合親和性でヒトＦｃＲｎに結合する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記のｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎに対する結合親和性が天然配列のＦｃ領域より少なくとも２０倍高いものである、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、天然配列のＦｃ領域を有するポリペプチドより霊長類の血清における血清半減期が長いものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記霊長類がヒトまたはカニクイザルである、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドがイムノアドヘシンである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
さらに、Ｆｃ領域内に一ないし複数のアミノ酸置換を含有しており、その結果、前記のポリペプチドが、天然配列のＦｃ領域を有する抗体と比較して、ＦｃγＲ結合の亢進、抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)の亢進、補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)の亢進、ＣＤＣの減退、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ機能の亢進、ＡＤＣＣの亢進かつＣＤＣ機能の減退、ＦｃＲｎ結合かつ血清半減期の亢進、の何れか一の性質を示す、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
さらに、カバットのＥＵインデックスの残基番号付けでいう、ＩｇＧ Ｆｃ領域内のＤ２６５Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｋ３３４Ｌ、Ｋ３２２Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｅ３８０ＡおよびＥ３８０Ａ／Ｔ３０７Ａからなる群から選択される残基位置のアミノ酸置換を一ないし複数含有してなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
Ａｓｎ４３４のＴｒｐ(Ｎ４３４Ｗ)へのアミノ酸置換を少なくとも含有する変異体ＩｇＧ Ｆｃ領域を含んでなる単離された抗体。
【請求項１０】
前記変異体ＩｇＧ ＦｃがｐＨ６．０において天然配列ＩｇＧ Ｆｃ領域よりも高い親和性であり、ｐＨ６．０よりもｐＨ７．４において弱い結合親和性でヒトＦｃＲｎに結合する、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
前記のｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎに対する変異体Ｆｃの結合親和性が天然配列のＩｇＧ Ｆｃ領域より少なくとも２０倍高いものである、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体がキメラ、ヒト化またはヒトである、請求項９に記載の抗体。
【請求項１３】
前記抗体がＩｇＧ１である、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
さらに、Ｆｃ領域内に一ないし複数のアミノ酸置換を含有しており、その結果、天然配列のＦｃ領域を有する抗体と比較して、ＦｃγＲ結合の亢進、抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)の亢進、補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)の亢進、ＣＤＣの減退、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ機能の亢進、ＡＤＣＣの亢進かつＣＤＣ機能の減退、ＦｃＲｎ結合かつ血清半減期の亢進、の何れか一の性質を示すポリペプチドとなる、請求項９に記載の抗体。
【請求項１５】
さらに、カバットのＥＵインデックスの残基番号付けでいう、ＩｇＧ Ｆｃ領域内のＤ２６５Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｋ３３４Ｌ、Ｋ３２２Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｅ３８０ＡおよびＥ３８０Ａ／Ｔ３０７Ａからなる群から選択される残基位置のアミノ酸置換を一ないし複数含有してなる、請求項９に記載の抗体。
【請求項１６】
前記抗体が、ＣＤ２０、Ｈｅｒ２、ＢＲ３、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ、ＩｇＥおよびＣＤ１１ａからなる抗原の群から選択される抗原に結合する、請求項９に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体が、ヒトＣＤ２０に結合し、
ａ．配列番号２
ｂ．配列番号４２、および
ｃ．配列番号４５
からなる配列の群から選択されるＶＨ配列を含有してなり、
該Ｌ鎖が配列番号１のＶＬ配列または配列番号２６の完全長配列を含有してなる、請求項１６に記載の抗体。
【請求項１８】
前記抗体がヒトＣＤ２０に結合し、図１０に示す配列番号２４のＣ２Ｂ８ ＶＬ配列と配列番号２５のＶＨ配列を含有してなる、請求項１６に記載の抗体。
【請求項１９】
前記抗体がＶＥＧＦに結合し、配列番号７のＶＬ配列と配列番号８のＶＨ配列；配列番号９のＶＬ配列と配列番号１０のＶＨ配列；および配列番号１１のＶＬ配列と配列番号１２のＶＨ配列からなる配列の群から選択されるＶＬとＶＨの配列を含んでなる、請求項１６に記載の抗体。
【請求項２０】
前記抗体がＨｅｒ２に結合し、配列番号３のＶＬ配列と配列番号４のＶＨ配列；および配列番号５のＶＬ配列と配列番号６のＶＨ配列からなる配列の群から選択されるＶＬとＶＨの配列を含んでなる、請求項１６に記載の抗体。
【請求項２１】
前記抗体がヒトＣＤ１１ａに結合し、配列番号１３のＶＬ配列または配列番号１５の完全長Ｌ鎖と、並びに配列番号１４のＶＨ配列を含有してなる、請求項１６に記載の抗体。
【請求項２２】
前記抗体がヒトＩｇＥに結合し、配列番号４７のＶＬ配列と配列番号４８のＶＨ配列；配列番号４９のＶＬ配列と配列番号５０のＶＨ配列；配列番号５１のＶＬ配列と配列番号５２のＶＨ配列；配列番号５３のＶＬ配列と配列番号５４のＶＨ配列からなる配列の群から選択されるＶＬとＶＨの配列を含んでなる、請求項１６に記載の抗体。
【請求項２３】
請求項１に記載のポリペプチド又は請求項９に記載の抗体と担体とを含有してなる組成物。
【請求項２４】
請求項９に記載の抗体をコードする単離された核酸。
【請求項２５】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする発現ベクター。
【請求項２６】
請求項２４に記載の核酸を含有してなる単離された宿主細胞。
【請求項２７】
請求項９に記載の抗体を産生する請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
前記ポリペプチドを産生する請求項２７に記載の宿主細胞を培養して、該細胞培養物から該ポリペプチドを回収することを含む、請求項９に記載の抗体の産生方法。
【請求項２９】
容器と、容器内に収容される組成物とを具備する製造品であり、該組成物が請求項１に記載のポリペプチドを含有するものである製造品。
【請求項３０】
さらに、前記組成物が非ホジキンリンパ腫を治療するために使用することができることを示すパッケージ挿入物を具備する、請求項２９に記載の製造品。
【請求項３１】
ＣＤ２０を発現するＢ細胞で特徴付けられるＢ細胞腫瘍または悪性物の治療方法であって、該腫瘍または悪性物に罹患している患者に、治療的有効量の請求項１７に記載のヒト化ＣＤ２０結合抗体が投与されることを含む治療方法。
【請求項３２】
前記Ｂ細胞腫瘍が、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)またはリンパ球優性ホジキン病(ＬＰＨＤ)である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
慢性リンパ球性白血病の治療方法であって、該白血病に罹患している患者に、治療的有効量のヒトＣＤ２０に結合する請求項１７に記載の抗体が投与されることを含み、該抗体がさらにアミノ酸置換Ｋ３２６ＡまたはＫ３２９Ｗを含有するものである、治療方法。
【請求項３４】
Ｂ細胞制御性自己免疫性疾患の寛解方法であって、該疾患に罹患している患者に、治療的有効量の請求項１６または１７に記載のＣＤ２０結合抗体が投与されることを含む寛解方法。
【請求項３５】
前記自己免疫性疾患が、関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、ウェゲナー病、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)、血栓性血小板減少性紫斑病(ＴＴＰ)、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡネフロパシ、ＩｇＭ多発性神経炎、重症筋無力症、血管炎、真正糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群および糸球体腎炎からなる群から選択されるものである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
血管形成性疾患の治療方法であって、該疾患に罹患している患者に、治療的有効量の請求項１９に記載の抗体が投与されることを含む治療方法。
【請求項３７】
ＨＥＲ２発現癌の治療方法であって、該癌に罹患している患者に、治療的有効量の請求項２０に記載の抗体が投与されることを含む治療方法。
【請求項３８】
ＬＦＡ-１媒介性疾患の治療方法であって、該疾患に罹患している患者に、治療的有効量の請求項２１に記載の抗体が投与されることを含む治療方法。
【請求項３９】
ＩｇＥ媒介性疾患の治療方法であって、該疾患に罹患している患者に、治療的有効量の請求項２２に記載の抗体が投与されることを含む治療方法。
【請求項４０】
Ａｓｎ４３４のＴｙｒ(Ｎ４３４Ｙ)へのアミノ酸置換を少なくとも含有する変異体ＩｇＧ Ｆｃ領域を含んでなり、さらにＨ４３３Ｒ、Ｈ４３３Ｓ、Ｙ４３６Ｈ、Ｙ４３６Ｒ、Ｙ４３６Ｔからなる群から選択されるアミノ酸置換を含有しない単離されたポリペプチド。
【請求項４１】
Ａｓｎ４３４のＰｈｅ(Ｎ４３４Ｆ)へのアミノ酸置換を少なくとも含有する変異体ＩｇＧ Ｆｃ領域を含んでなり、さらにＨ４３３Ｋ、Ｙ４３６Ｈ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴまたはＴ２５６Ｅのアミノ酸置換を含有しない単離されたポリペプチド。
【請求項４２】
Ａｓｎ４３４のＨｉｓ(Ｎ４３４Ｈ)へのアミノ酸置換を少なくとも含有する変異体ＩｇＧ Ｆｃ領域を含んでなる単離されたポリペプチド。
【請求項４３】
前記変異体ＩｇＧ Ｆｃ領域がｐＨ６．０において天然配列ＩｇＧ Ｆｃ領域よりも高い親和性であり、ｐＨ６．０よりもｐＨ７．４において弱い結合親和性でヒトＦｃＲｎに結合する、請求項４０、４１および４２の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
前記ポリペプチドが抗体である、請求項４０、４１および４２の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
前記抗体がキメラ、ヒトまたはヒト化である、請求項４４に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
前記ＩｇＧがヒトＩｇＧ１である、請求項４５に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
前記抗体が、ＣＤ２０、Ｈｅｒ２、ＢＲ３、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ、ＩｇＥおよびＣＤ１１ａからなる抗原の群から選択される抗原に結合する、請求項４４に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
ＨＥＲ２に結合する抗体である、請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
前記抗体が、配列番号３のＶＬ配列と配列番号４のＶＨ配列；および配列番号５のＶＬ配列と配列番号６のＶＨ配列からなる配列の群から選択されるＶＬとＶＨの配列を含んでなる、請求項４８に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
さらに、前記ＨＥＲ２結合抗体はＦｃ領域内に一ないし複数のアミノ酸置換を含有しており、その結果、天然配列のＦｃ領域を有する抗体と比較して、ＦｃγＲ結合の亢進、抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)の亢進、補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)の亢進、ＣＤＣの減退、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ機能の亢進、ＡＤＣＣの亢進かつＣＤＣ機能の減退、ＦｃＲｎ結合かつ血清半減期の亢進、の何れか一の性質を示すポリペプチドとなる、請求項４８に記載のポリペプチド。
【請求項５１】
さらに、カバットのＥＵインデックスの残基番号付けでいう、ＩｇＧ Ｆｃ領域内のＤ２６５Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｋ３３４Ｌ、Ｋ３２２Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｅ３８０ＡおよびＥ３８０Ａ／Ｔ３０７Ａからなる群から選択される残基位置のアミノ酸置換を一ないし複数含有してなる、請求項４８に記載のポリペプチド。
【請求項５２】
さらに、ＩｇＧ Ｆｃ領域内にＴ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａを含有してなる、請求項４８に記載のポリペプチド。
【請求項５３】
前記抗体が配列番号５のＶＬ配列と配列番号６のＶＨ配列を含んでなり、ｐＨ６．０での該抗体のヒトＦｃＲｎに対する結合が親抗体トラスツズマブのものより少なくとも４０倍良好である、請求項５２に記載のポリペプチド。
【請求項５４】
さらに、Ｔ２８９ＨまたはＮ３１５Ｈのアミノ酸置換を含有してなる、請求項４８に記載のポリペプチド。
【請求項５５】
前記ポリペプチドがイムノアドヘシンである、請求項４０、４１および４２の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項５６】
さらに、Ｆｃ領域内に一ないし複数のアミノ酸置換を含有しており、その結果、ＦｃγＲ結合の亢進、ＡＤＣＣの亢進、ＣＤＣの亢進、ＣＤＣの減退、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ機能の亢進、ＡＤＣＣの亢進かつＣＤＣ機能の減退、の何れか一の性質を示すポリペプチドとなる、請求項４０、４１および４２の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
さらに、カバットのＥＵインデックスの残基番号付けでいう、ＩｇＧ Ｆｃ領域内のＤ２６５Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｋ３３４Ｌ、Ｋ３２２Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｅ３８０ＡおよびＥ３８０Ａ／Ｔ３０７Ａからなる群から選択される残基位置のアミノ酸置換を一ないし複数含有してなる、請求項４０、４１および４２の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
請求項４０、４１、４２および４８の何れか一に記載のポリペプチドと担体とを含んでなる組成物。
【請求項５９】
請求項４０、４１、４２および４８の何れか一に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項６０】
請求項５３に記載の核酸を含んでなる単離された宿主細胞。
【請求項６１】
請求項４０、４１、４２および４８の何れか一に記載のポリペプチドを産生する請求項６０に記載の宿主細胞。
【請求項６２】
請求項４２に記載のポリペプチドを産生する請求項６１に記載の宿主細胞を培養して、該細胞培養物から該ポリペプチドを回収することを含む、請求項４２に記載のポリペプチドの産生方法。
【請求項６３】
容器と、容器内に収容される組成物とを具備する製造品であり、該組成物が請求項４０、４１、４２および４８の何れか一に記載のポリペプチドを含有するものである製造品。
【請求項６４】
ＨＥＲ２発現癌の治療方法であって、該癌に罹患している患者に、治療的有効量の請求項４８に記載の抗体が投与されることを含む治療方法。
【請求項６５】
前記抗体が、配列番号３のＶＬ配列と配列番号４のＶＨ配列；および配列番号５のＶＬ配列と配列番号６のＶＨ配列からなる配列の群から選択されるＶＬとＶＨの配列を含んでなる、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
Ｌｙｓ３３４のロイシン(Ｋ３３４Ｌ)へのアミノ酸置換を少なくとも含有する変異体ＩｇＧ Ｆｃ領域を含んでなる単離されたポリペプチド。
【請求項６７】
前記変異体Ｆｃが、天然配列のＩｇＧ Ｆｃ領域よりも高い親和性でヒトＦｃγＲＩＩＩに結合する、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
ヒトエフェクター細胞の存在下にて、天然配列のＩｇＧ Ｆｃ領域を有するポリペプチドよりも亢進した抗体依存性細胞障害性を示す、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
さらに、Ｆｃ領域内に一ないし複数のアミノ酸置換を含有しており、その結果、天然配列のＦｃ領域を有する抗体と比較して、ＦｃγＲ結合の亢進、ＡＤＣＣの亢進、ＣＤＣの亢進、ＣＤＣの減退、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ機能の亢進、ＡＤＣＣの亢進かつＣＤＣ機能の減退、ＦｃＲｎ結合かつ血清半減期の亢進、の何れか一の性質を示すポリペプチドとなる、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
さらに、カバットのＥＵインデックスの残基番号付けでいう、ＩｇＧ Ｆｃ領域内のＤ２６５Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｅ３８０ＡおよびＥ３８０Ａ／Ｔ３０７Ａからなる群から選択される残基位置のアミノ酸置換を一ないし複数含有してなる、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
キメラ、ヒト化またはヒトＩｇＧ抗体である、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項７２】
配列番号３９のＬ鎖配列と配列番号４０のＨ鎖配列を含んでなり、Ｆｃ領域内のＮ４３４がＷ、Ｙ、ＦまたはＡに置換されているヒト化ＣＤ２０結合抗体。
【請求項７３】
請求項７２に記載の抗体と担体を含んでなる組成物。
【請求項７４】
請求項７３に記載の抗体をコードする単離された核酸。
【請求項７５】
請求項７４に記載の核酸を含んでなる宿主細胞。
【請求項７６】
ＣＤ２０を発現するＢ細胞で特徴付けられるＢ細胞腫瘍または悪性物の治療方法であって、該腫瘍または悪性物に罹患している患者に、治療的有効量の請求項７２に記載のヒト化ＣＤ２０結合抗体が投与されることを含む治療方法。
【請求項７７】
Ｂ細胞制御性自己免疫性疾患の寛解方法であって、該疾患に罹患している患者に、治療的有効量の請求項７２に記載のヒト化ＣＤ２０結合抗体が投与されることを含む寛解方法。
【請求項７８】
天然配列のＩｇＧ Ｆｃを有するポリペプチドと比較して、ｐＨ６．０でのＦｃＲｎに対する結合親和性が高く、ｐＨ６．０よりもｐＨ７．４での結合親和性が弱いポリペプチドのスクリーニング方法であって、ファージ上に候補ポリペプチドを発現させ、固形基質に固定させたヒトＦｃＲｎを作製し、ファージ粒子を基質上のヒトＦｃＲｎに結合させ、各洗浄ごとにストリンジェンシーを上げながら複数回洗浄することによって非結合のファージ粒子を除去し、ｐＨ７．４で残りの結合したファージを溶出することを含む、スクリーニング方法。
【請求項７９】
配列番号５のＶＬ配列、配列番号６のＶＨ配列、並びにＡｓｎ４３４のＡｌａ(Ｎ４３４Ａ)へのアミノ酸置換を少なくとも含有する変異体ＩｇＧ Ｆｃ領域を含んでなる、単離された抗ＨＥＲ２抗体。
【請求項８０】
さらに、カバットのＥＵインデックスの残基番号付けでいう、ＩｇＧ Ｆｃ領域内のＤ２６５Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｋ３３４Ｌ、Ｋ３２２Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｅ３８０ＡおよびＥ３８０Ａ／Ｔ３０７Ａからなる群から選択される残基位置のアミノ酸置換を一ないし複数含有してなる、請求項７９に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（出願について）
本出願は、２００４年８月１９日出願の仮出願番号６０／６０３，０５７の利益を主張するものであり、その全体は出典明記によって本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本出願は、変異形Ｆｃ領域を含有するポリペプチドに関する。さらに具体的には、本出願は、Ｆｃ領域内の一ないし複数のアミノ酸修飾の結果としてエフェクター機能が変更しているＦｃ領域含有ポリペプチドに関する。
【０００３】
（発明の背景）
抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すタンパク質である。天然抗体は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の作用領域を形成すると考えられている。
「可変」なる用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合特異性に寄与するという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の相補性決定領域(ＣＤＲ)と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つのＣＤＲにより連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら, Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)を参照)。
【０００４】
定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能を示す。重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいて、抗体または免疫グロブリンは異なるクラスが割り当てられる。免疫グロブリンには５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、更にそれらは、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４；ＩｇＡ１およびＩｇＡ２等のサブクラス(アイソタイプ)に分かれる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域はそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。ヒトイムノグロブリンのクラスの中のヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＭのみが補体を活性化することが知られており、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４より効率よくＡＤＣＣを媒介する。
天然のＩｇＧ１構造の概略を図１Ａに示す。ここには天然の抗体分子の様々な部位が示されている。抗体のパパイン消化によって、単一の抗原結合部位をそれぞれ有するＦａｂ断片と称される２つの同一の抗原結合断片と、その名称が容易に結晶化する能力を表す残りの「Ｆｃ」断片が産生される。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の結晶構造は決定されている(Deisenhofer, Biochemistry 20:2361-2370 (1981))。ヒトＩｇＧ分子では、Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６へのＮ末端のパパイン消化によって産生される。Ｆｃ領域は抗体のエフェクター機能の中心である。
【０００５】
抗体エフェクター機能
抗体Ｆｃ領域に媒介されるエフェクター機能は、２つに分類することが可能である：（１）抗体が抗原に結合した後に作用するエフェクター機能（これらの機能は、補体カスケード又はＦｃレセプター（ＦｃＲ）含有細胞の参加を含む）；及び（２）抗原結合に非依存的に作用するエフェクター機能（これらの機能により、循環の持続性及びトランスサイトーシス(transcytosis)により細胞障壁を横切って輸送される能力を獲得する）に分けられる。Ward及びGhetie, Therapeutic Immunology 2: 77-94 (1995)。
抗体の必要な抗原への結合は、外来抗原の内因性標的（例えばレセプター又はリガンド）への結合を阻害することのできる中和効果を有するが、結合のみでは外来抗原を除去することはできない。外来抗原の除去及び／又は破壊の効率をよくするためには、抗体に、その抗原に対するより高い親和性、及び有効なエフェクター機能を与えるべきである。
抗体および抗体−抗原複合体と免疫系細胞との相互作用は、抗体依存性細胞障害活性(ＡＤＣＣ) 及び補体媒介障害活性(ＣＤＣ)などを含む、様々な反応に作用する（Daeron. Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)；Ward and Ghetie, Therapeutic Immunol. 2:77-94 (1995)；Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)を参照）。
【０００６】
いくつかの抗体のエフェクター機能は、抗体のＦｃ領域に結合するＦｃレセプター（ＦｃＲｓ）によって媒介される。ＦｃＲは、イムノグロブリンアイソタイプに対する特異性により定義される；ＩｇＧ抗体に対するＦｃレセプターは、ＦｃγＲと、ＩｇＥに対してはＦｃεＲと、ＩｇＡに対してはＦｃαＲなどのように、呼ばれている。ＦｃγＲの３つのサブクラスが同定されており：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４），ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２），ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）である。それぞれのＦｃγＲサブクラスは、２または３つの遺伝子によってコードされており、さらに、選択的ＲＮＡスプライシングにより、複数種の転写産物が生じるため、ＦｃγＲアイソフォームには広い多様性が存在する。３つの遺伝子がコードするＦｃγＲＩサブクラス（ＦｃγＲＩＡ，ＦｃγＲＩＢ，ＦｃγＲＩＣ）は、第１染色体の長腕の１ｑ２１．１領域にクラスターとして存在している。ＦｃγＲＩＩアイソフォームをコードする遺伝子（ＦｃγＲＩＩＡ，ＦｃγＲＩＩＢ，ＦｃγＲＩＩＣ）とＦｃγＲＩＩＩをコードする２つの遺伝子（ＦｃγＲＩＩＩＡ，ＦｃγＲＩＩＩＢ）はすべて１ｑ２２領域にクラスターとして存在している。これらの異なるＦｃＲサブタイプは異なる型の細胞上で発現されている（Ravetch and Kinet, Annu.Rev.Immunol. 9:457-492 (1991)を参照）。例えば、ヒトでは、ＦｃγＲＩＩＩＢは好中球上にのみ見出されるが、ＦｃγＲＩＩＩＡはマクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、ある種のＴ細胞上に見出される。
【０００７】
構造的には、ＦｃγＲはすべて免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、２つ（ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩ）又は３つ（ＦｃγＲＩ）のＩｇ様ドメインからなる細胞外部分を持つＩｇＧ結合α鎖を有する。更には、ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩは、シグナル伝達で機能するα鎖と結合している補助的タンパク質鎖（γ、ζ）を有する。レセプターは、ＩｇＧに対するその親和性によっても識別される。ＦｃγＲＩは、Ｋａ＝１０８−１０９Ｍ−１というＩｇＧに対する高い親和性を示し（Ravetchら, Ann. Rev. Immunol. 19: 275-290(2001)）、単量体ＩｇＧと結合することが可能である。対照的に、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩは、Ｋａ＜１０７Ｍ−１という単量体ＩｇＧに対する比較的より弱い親和性を示し（Ravetchら, Ann. Rev. Immunol. 19: 275-290(2001)）、よって、多量体免疫複合体とのみ効率よく相互作用する。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化レセプター」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害レセプター」）が含まれ、それらは、その細胞質ドメインで主に異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインにイムノレセプターチロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する。阻害レセプターＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインにイムノレセプターチロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を有する（Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234(1997)の概説を参照）。ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩＡのみを有し、ＦｃγＲＩＩＩＡとの抗体の結合は、ＮＫ細胞によるＡＤＣＣ活性を引き起こす。
【０００８】
いくつかのヒトＦｃγＲの対立遺伝子変異体は、ヒトの集団において見出されたきた。これらの対立遺伝子変異体型は、ヒトおよびマウスＩｇＧとの結合において相違を示すことが明らかにされ、多くの関連研究により、特異的な対立遺伝子型と臨床結果との相関が示されてきた（Lehrnbecher ら, Blood 94 (12):4220-4232 (1999)を参照）。ＦｃγＲＩＩＡの２つの型、Ｒ１３１およびＨ１３１と臨床結果との相関について、多くの研究が行われてきた（Hatta ら, Genes and Immunity 1:53-60 (1999)；Yap ら Lupus 8:305-310 (1999)；および Lorenz ら European J. Immunogenetics 22:397-401 (1995)）。二つのＦｃγＲＩＩＩＡの対立遺伝子型、Ｆ１５８およびＶ１５８が、唯一現在研究が行われている（Lehrnbecher ら, supra; 及び Wu ら J. Clin. Invest. 100(5):1059-1070 (1997)）。ＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｐｈｅ１５８）アロタイプ（Shieldsら, J. Biol. Chem. 276:6591-6604(2001)；Koeneら, Blood90:1109-1114(1997)；及びWuら, J. Clin. Invest. 100: 1059-1070(1997)）よりも、ＦｃＲＩＩＩＡ（Ｖａｌ１５８）アロタイプがヒトＩｇＧと相互作用する。
【０００９】
ＦｃγＲについてのヒト及びマウス抗体上の結合部位は、以前に、残基２３３−２３９で構成される「低ヒンジ領域」と呼ばれる部分にマッピングされている（Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版. Public Health Service, 米国国立衛生研究所, ベゼスダ, メリーランド（１９９１）のようなＥＵインデックス番号付け）。Woofら, Molec. Immunol. 23:319-330(1986)；Duncanら, Nature 332: 563(1988)；Canfield及びMorrison, J. Exp. Med. 173: 1483-1491(1991)；Chappelら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9036-9040(1991)。残基２３３−２３９、Ｐ２３８及びＳ２３９は、結合に関与している可能性があるとして引用されていた。
ＦｃγＲとの結合に関わっている可能性のある以前に引用された他の領域は：ヒトＦｃγＲＩのＧ３１６−Ｋ３３８（ヒトＩｇＧ）（配列比較のみによる；置換変異は評価されなかった）（Woofら, Molec. Immunol. 23:319-330(1986)）；ヒトＦｃγＲＩＩＩ（ペプチドに基づく）のＫ２７４−Ｒ３０１（ヒトＩｇＧ１））（Sarmayら, Molec. Immunol. 21:43-51(1984)）；ヒトＦｃγＲＩＩＩ（ペプチドに基づく）のＹ４０７−Ｒ４１６（ヒトＩｇＧ）（Gergelyら, Biochem. Soc. Trans.12: 739-743(1984)）；並びにマウスＦｃγＲＩＩのＮ２９７及びＥ３１８（マウスＩｇＧ２ｂ）（Lundら, Molec. Immunol. 29:53-59(1992)）である。Armourら, Eur. J. Immunol. 29: 2613-2624(1999)も参照せよ。
【００１０】
米国特許第6,737,056号の(Presta)には、ＦｃＲとの結合が改良又は消滅したポリペプチド変異体が記載されている。Shieldsら, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604(2001)も参照のこと。また、国際公開公報00/42072にはＦｃγＲに結合する変異体Ｆｃｓが記載される。
Ｃ１ｑ及び２つのセリンプロテアーゼ、Ｃ１ｒ及びＣ１ｓは、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）経路の第１の成分である複合体Ｃ１を形成する。Ｃ１ｑは約４６０，０００の分子量を持つ６価の分子であり、６つのコラーゲン様「茎」が６つの球状頭領域に結合したチューリップのブーケのような構造を持つ。Burton及びWoof、Advances in Immunol. 51: 1-84 (1992)。補体カスケードを活性化するためには、Ｃ１ｑがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ３の少なくとも２つに結合する必要があるが（共通するのはＩｇＧ４が補体を活性化しないこと）、ＩｇＭの１分子のみが抗原性標的に結合する。Ward及びGhetie、Therapeutic Immunology 2: 77-94 (1995)第80頁。
【００１１】
化学修飾及び結晶学的研究の結果に基づいて、Burton等 (Nature, 288: 338-344 (1980)）は、ＩｇＧ上の補体補助成分Ｃ１ｑに対する結合部位はＣＨ２ドメインの少なくとも２つの（Ｃ-末端）β鎖を含むと提唱した。Burtonは後に（Molec. Immunol., 22(3): 161-206 (1985)）、アミノ酸残基３１８から３３７を含む領域が補体固定化に含まれることを示唆した。
Duncan及びWinter（Nature 332: 738-40 (1988)）は、部位指向性突然変異誘発を用いて、Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０及びＬｙｓ３２２がＣ１ｑの結合部位を形成すると報告した。Duncan及びWinterのデータは、マウスＩｇＧ２ｂアイソタイプのモルモットＣ１ｑへの結合試験から得られたものである。Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０及びＬｙｓ３２２残基のＣ１ｑの結合における役割は、これらの残基を含む短い合成ペプチドの補体媒介性溶解を阻害する能力により確認された。類似の結果は、1997年7月15日に発行された米国特許第5,648,260号及び1997年4月29日に発行された米国特許第5,624,821号に記載されている。
【００１２】
残基Ｐｒｏ３３１は、ヒトＩｇＧサブクラスの補体媒介性細胞溶解を行う能力の分析によりＣ１ｑ結合に含まれていた。ＩｇＧ４におけるＳｅｒ３３１からＰｒｏ３３１への変異は、補体を活性化する能力を付与する（Tao等, J. Exp. Med., 178: 661-667 (1993)；Brekke等, Eur. J. Immunol., 24: 2542-47 (1994)）。
Winterグループのデータ、及びTao等及びBrekke等の論文の比較から、Ward及びGhetieは、彼らの概説記事において、Ｃ１ｑの結合には少なくとも２つの異なる領域が含まれ：一方は、Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０及びＬｙｓ３２２残基を持つＣＨ２ドメインのβ鎖上にあり、他方は同じβ鎖の極近傍に位置する折り返し点（ターン）にあり、位置３３１に鍵となるアミノ酸残基を含んでいる。
他の報告者等は、低いヒンジ領域に位置するヒトＩｇＧ１残基Ｌｙｓ２３５、及びＧｌｙ２３７が補体固定化及び活性化において重要な役割を果たすことを示唆した。Xu等, J. Immunol. 150: 152A (要約)(1993)。1994年12月22日に発行された国際公開公報94/29351は、ヒトＩｇＧ１のＣ１ｑとＦｃＲとの結合に必要なアミノ酸残基はＣＨ２ドメインのＮ-末端領域、即ち残基２３１から２３８に局在化することを報告している。
【００１３】
さらに、ＩｇＧのＣ１ｑに結合する及び補体カスケードを活性化する能力も、（通常はＡｓｎ２９７で固着されている）２つのＣＨ２ドメインの間に位置する炭水化物部分の存在、不存在又は修飾に依存することが報告された。Ward及びGhetie, Therapeutic Immunology 2: 77-94 (1995),第81頁。
改良されたＦｃ領域アミノ酸配列及び増大又は減少したＣ１ｑ結合能を有するポリペプチド変異体は、米国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号及び国際公開公報９９／５１６４２に記載されている。これら特許公報の内容は、出典明記により本明細書中に具体的に組み込まれる。Idusogieら, J. Immunol. 164: 4178-4184(2000)も参照のこと。
【００１４】
他のタイプのＦｃレセプターは新生児期Ｆｃレセプター(ＦｃＲｎ)である。ＦｃＲｎは、主要組織適合性複合体(ＭＨＣ)と構造的に類似しており、β２ミクログロブリンに非共有結合的に結合したα鎖からなる。新生児期ＦｃレセプターＦｃＲｎの複数の機能は、GhetieおよびWard (2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766において検討される。ＦｃＲｎは、抗体Ｆｃ領域とのｐＨ依存性相互作用に基づくＩｇＧ恒常性機能において、重要な役割を果たす(GhetieおよびWard (2000) Annu Rev Immunol 18, 739-766、GhetieおよびWard (1997) Immunol Today 18, 592-598)。ｐＨ６ではＦｃ-ＦｃＲｎ複合体の親和性が増加するのに対してｐＨ７．４では低親和性を保つことは、抗体半減期の増加を示唆している(Hinton 等 (2004) J Biol Chem 279, 6213-6216)。ＦｃＲｎは、母から子へのイムノグロブリンＩｇＧの受動的な運搬および血清ＩｇＧレベルの調節機能において役割を果たす。ＦｃＲｎは、図６で示すように、細胞内および細胞を隔てて完全な形態でピノサイトーシスされるＩｇＧの結合および運搬においてサルベージレセプターとして働き、限定のない分解経路からそれらを救う働きがある。ＩｇＧの救助に寄与するメカニズムはいまだ不明であるが、結合していないＩｇＧがライソソームのタンパク質分解に供され、結合したＩｇＧは細胞の表面に再循環されて、放出されると考えられる。このコントロールは、成体組織の全体にわたって位置する内皮細胞内で起こる。ＦｃＲｎは、少なくとも肝臓、乳腺および成体の腸において、発現される。
【００１５】
ＦｃＲｎはＩｇＧと結合する、ＦｃＲｎ-ＩｇＧ相互作用は広く研究されており、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２、ＣＨ３ドメイン作用領域の残基を含むようである。これらの残基は、主にＦｃＲｎのα２ドメインに位置する残基と相互に作用する。
Ghetie ら in Nature Biotechnology 15: 637-640 (1997)では、マウスＦｃγ１（ＦｃＲｎ-ＩｇＧ相互作用部位に近接してある残基）のＴｈｒ２５２、Ｔｈｒ２５４およびＴｈｒ２５６のランダムな突然変異誘発を報告し、これらの変異体ヒンジ-Ｆｃ断片の血清半減期に対する効果を研究していた。マウスＦｃＲｎに対して最も高い親和性を有する突然変異体は、ｐＨ７．４でのＦｃＲｎからの解離率が低いにもかかわらず、野生型断片より長い半減期を有する。
以前の研究では、Prestaおよび共同者(Shields 等, J. Biol. Chem. 276: 6591-6604 (2001)、Presta 米国特許第6,737,056号)による広範囲アラニンスキャニングにより、Ｆｃ：ＦｃＲｎの親和性をそれぞれ３．５倍、２．２倍および１．８倍増加する３つのＦｃ変異体Ｎ４３４Ａ、Ｅ３８０ＡおよびＴ３０７Ａが同定された。３つの突然変異体は、野生型と比較してｐＨ６でのＦｃＲｎに対する親和性が１２倍に増加した。
【００１６】
ヒトＦｃ：ＦｃＲｎとラットＦｃ-ＦｃＲｎ間の構造的相同性を考えるとき、Ｘ線構造が公知であり(Burnmeister 等, Nature 372: 336-343 (1994)、Burnmeister 等, Nature 372: 379-383 (1994))、Dall'Acqua 等 (Journal of Immunology. 169: 5171-5180 (2002)、米国特許公開2003/0190311)は、ファージディスプレイによって、より高い親和性改善を追求した。彼らはＦｃの４つのランダム化ライブラリを造った。各ライブラリは完全にランダム化された４つか５つの残基を有しており(すなわち、すべてが置換されたアミノ酸である可能性があり、その結果、２０４の多様性がある２つのライブラリと２０５の多様性がある２つのライブラリとなっている)、マウスＦｃＲｎへの結合について選別されている。彼らは、ライブラリのスクリーニングにヒトＦｃＲｎを用いても成功しないことを報告した。また、マウスＦｃＲｎを用いたファージ選別から同定される結合親和性の改善によりヒトＦｃＲｎへの結合を改善したにもかかわらず、ヒトＦｃＲｎを用いた直接的ファージ選別は伝えられるところでは、記載される方法(Dall'Acqua 等, 2002)を用いても成功しなかった。これらのライブラリから、Ｈ４３３、Ｎ４３４およびＹ４３６と、Ｍ２５２、Ｓ２５４およびＴ２５６で突然変異を有する変異体が同定された。それらのライブラリ由来の変異体のうちの２つ、Ｈ４３３Ｋ＋Ｎ４３４Ｆ＋Ｙ４３６ＨおよびＭ２５２Ｙ＋Ｓ２５４Ｔ＋Ｔ２５６Ｅが、ｐＨ６．０でのマウスおよびヒトのＦｃＲｎに対する親和性を１０倍から２０倍に増加することが明らかとなった。これらの突然変異の組合せにより、マウスＦｃＲｎへの結合においては３０倍、ヒトＦｃＲｎへの結合においては５７倍に増加した。しかしながら、これらの変異体も、ｐＨ７．４での親和性は増加し、マウスの半減期は延長しない。これより、効率的なＩｇＧリサイクルはｐＨ依存的な親和性と関係することが言える。霊長類種またはヒトのＦｃＲｎトランスジェニック動物におけるこれらの変異体についての結果は報告されていない。
【００１７】
Ward 等、米国特許第6,277,375号、同第6,821,505号および同第6,165,745号では、亢進した半減期とＦｃ位置４３４での突然変異を有するイムノグロブリン様ドメインが記述されている。結果として生じる突然変異体Ｎ４３４Ｑは、予想に反して半減期の減少を示した。国際公開公報98/23289において、IsraelおよびSimisterは、ＦｃＲｎへの結合に作用する残基の付加、置換又は欠失によって、一般に残基４３４を変更することを検討しているが、その残基が何に置換されるのか、または何が付加されたのかについては言及していない。
また、ヒトＦｃ-ＦｃＲｎ作用領域をモデル化するためにラットＦｃ-ＦｃＲｎ複合体(Burnmeister 等, 1997)との構造的な相同性を考えるとき、Hinton 等 ( J. Biol. Chem. 279: 6213-6216 (2004))は、ｈｕＦｃＲｎの結合に重要でありうる残基としてヒトＩｇＧ２の残基Ｔ２５０、Ｌ３１４およびＭ４２８を同定した。突然変異Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８ＬはｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎに対してそれぞれ３倍および７倍高い親和性を有し、ｐＨ７．５では有意な結合を示さないものとして同定された。組合せ変異体Ｔ２５０Ｑ＋Ｍ４２８Ｌは、２８倍に増加した結合を有することが報告された。アカゲザルＦｃＲｎについて同様な結合が観察された。薬物動態学的研究では、これら２つの突然変異を有するＩｇＧ２抗体がアカゲザルではおよそ１．９倍のより長い除去半減期(ｔ１／２β)を有することが示された。
【００１８】
当分野では、抗体産生、特にエフェクター機能が改善されているか調節されている治療的抗体の産生のための継続的な必要性がある。抗体工学の一つの目的は、生体内での抗体の半減期を増やすことである。これは、新生児期Ｆｃレセプター(ＦｃＲｎ)を有する抗体の相互作用を調整することにより達成されうる。本発明はこれらおよび他の必要性を満たすものである。
【００１９】
（発明の要約）
本発明は、ポリペプチド、特に、天然配列／野生型配列Ｆｃ領域を有するポリペプチドよりもＦｃＲｎおよびＦｃγＲＩＩＩに対して高い結合親和性を示す抗体を提供する。これらのＦｃ変異形ポリペプチドおよび抗体は、分解されずに、救出され、再循環されやすくなる。血清半減期が増加すると、抗体への曝露が延長し、ＡｂなどのＦｃ含有ポリペプチドおよびイムノアドヘシンなどの多の抗体融合タンパク質の投与の頻度が減少するという利点がある。
本発明は、Ａｓｎ４３４のＴｒｐ(Ｎ４３４Ｗ)へのアミノ酸置換を少なくとも含有する変異体ＩｇＧ Ｆｃ領域を含んでなる単離されたポリペプチドを提供する。
第二の単離されたポリペプチドは、Ａｓｎ４３４のＨｉｓ(Ｎ４３４Ｈ)へのアミノ酸置換を少なくとも含有する変異体ＩｇＧ Ｆｃ領域を含んでなる。
本発明で提供される他の単離されたポリペプチドは、Ａｓｎ４３４のＴｙｒ(Ｎ４３４Ｙ)へのアミノ酸置換を少なくとも含有する変異体ＩｇＧ Ｆｃ領域を含んでなり、さらにＨ４３３Ｒ、Ｈ４３３Ｓ、Ｙ４３６Ｈ、Ｙ４３６Ｒ、Ｙ４３６Ｔからなる群から選択されるアミノ酸置換を含有しないポリペプチドである。
【００２０】
さらに他のポリペプチドは、Ａｓｎ４３４のＰｈｅ(Ｎ４３４Ｆ)へのアミノ酸置換を少なくとも含有する変異体ＩｇＧ Ｆｃ領域を含んでなり、さらにＨ４３３Ｋ、Ｙ４３６Ｈ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴまたはＴ２５６Ｅのアミノ酸置換を含有しない単離されたポリペプチドである。
本発明は、Ａｓｎ４３４のＴｙｒ(Ｎ４３４Ｙ)からなるまたはＮ４３４Ｙを基本的に含有してなるアミノ酸置換を有する変異体ＩｇＧ Ｆｃ領域を含んでなるポリペプチドを提供する。また、Ａｓｎ４３４のＰｈｅ(Ｎ４３４Ｆ)からなるまたはＮ４３４Ｆを基本的に含有してなるアミノ酸置換を有する変異体ＩｇＧ Ｆｃ領域を含んでなるポリペプチドを提供する。
一実施態様では、前述の実施態様の何れか一の単離されたポリペプチドは抗体である。他の実施態様では、前記ポリペプチドはイムノアドヘシンである。
好適な実施態様では、前述の実施態様の何れか一のＩｇＧ抗体はマウスまたはヒト、好ましくはヒトである。ヒトＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のヒトＩｇＧアイソタイプの何れかを包含する。マウスＩｇＧはＩｇＧ１、２ａ、２ｂ、３のアイソタイプを包含する。好適には、ヒトへの使用のための治療的抗体はヒト化、ヒトまたはキメラである。
【００２１】
抗体を含む前述のポリペプチドでは、変異体Ｆｃ領域を含んでなるポリペプチドは、ｐＨ６．０において天然配列ＩｇＧ Ｆｃ領域を含んでなるポリペプチドよりも高い親和性でヒトＦｃＲｎに結合し、ｐＨ６．０よりもｐＨ７．４又はｐＨ７．５において弱い結合親和性でヒトＦｃＲｎに結合する。好適な実施態様では、Ｆｃ変異形ポリペプチドのヒトＦｃＲｎに対するｐＨ６．０での結合親和性は、天然配列／天然配列Ｆｃよりも少なくとも４倍、好ましくは少なくとも７倍、９倍又は、より好ましくは少なくとも２０倍高い。前述の実施態様のポリペプチドは、霊長類血清、特にヒト又はカニクイザルの血清において天然配列のＦｃ領域を有するポリペプチドよりも血清半減期が長い。
本発明の更に他の態様は、Ｌｙｓ３３４のロイシン(Ｋ３３４Ｌ)へのアミノ酸置換を少なくとも含有する変異体ＩｇＧ Ｆｃ領域を含んでなる単離されたポリペプチドである。一実施態様では、このポリペプチドは、天然配列のＩｇＧ Ｆｃ領域を有するポリペプチドよりも高い親和性、３倍以上でヒトＦｃγＲＩＩＩに結合する。また、このポリペプチドは天然配列のＩｇＧ Ｆｃ領域を有するポリペプチドよりも亢進したＡＤＣＣを示すことが好ましい。
また、ｐＨ７．４では結合の亢進は見られないが、ｐＨ６でのヒトＦｃＲｎへの結合において改善を示す変異形ＩｇＧ Ｆｃ領域を含んでなる単離されたポリペプチドであって、Ｇ３８５Ｈ、Ｄ３１２Ｈ又はＮ３１５Ｈでの少なくとも一のアミノ酸置換を含有するポリペプチドを提供する。
【００２２】
一実施態様では、前述の実施態様の何れか一の単離されたポリペプチドは抗体である。他の実施態様では、前記ポリペプチドはイムノアドヘシンである。
好適な実施態様では、前述の実施態様の何れか一のＩｇＧ抗体はマウス又はヒトであり、好適にはヒトである。ヒトＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のヒトＩｇＧアイソタイプの何れかを包含する。マウスＩｇＧはＩｇＧ１、２ａ、２ｂ、３のアイソタイプを包含する。好適には、ヒトへの使用のための治療的抗体はヒト化、ヒトまたはキメラである。
本発明は、具体的には、ＣＤ２０、Ｈｅｒ２、ＢＲ３、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ、ＩｇＥおよびＣＤ１１ａからなる抗原の群から選択される抗原に結合する前述の実施態様の抗体を提供する。具体的な実施態様では、特定の抗原に結合する組み換えて産生されたヒト化抗体は、抗体組成物とサブタイトルを付けた段落の配列番号に開示される配列を含有する。
好適な実施態様では、前記ＣＤ２０は霊長類のＣＤ２０である。ヒト及びカニクイザルのＣＤ２０は具体的な実施態様である。より具体的な実施態様では、抗体がヒトＣＤ２０に結合する場合、該抗体は配列番号２のＶＨ配列と、配列番号１のＶＬ配列を含有するＬ鎖又は配列番号２６の完全長Ｌ鎖配列を含んでなる。他の実施態様では、ＣＤ２０結合抗体は、図１０に示す配列番号２４のＣ２Ｂ８ ＶＬ配列と配列番号２５のＶＨ配列を含有してなる。更に他の実施態様では、ヒトＣＤ２０に結合する単離されたヒト化抗体は、ヒト化２Ｈ７変異体について開示されるＶＨ及びＶＬ配列を含んでなる。
【００２３】
より具体的な実施態様では、抗体がＨｅｒ２に結合する場合、該抗体は、配列番号３のＶＬ配列と配列番号４のＶＨ配列；および配列番号５のＶＬ配列と配列番号６のＶＨ配列からなる配列の群から選択されるＶＬとＶＨの配列を含んでなる。ある具体的な抗ＨＥＲ２抗体は、Ａｓｎ４３４のＨｉｓ(Ｎ４３４Ｈ)へのアミノ酸置換を少なくとも含有する変異体ＩｇＧ Ｆｃ領域を含んでなる。
さらに、本発明は、配列番号５のＶＬ配列、配列番号６のＶＨ配列、並びにＡｓｎ４３４のＡｌａ(Ｎ４３４Ａ)へのアミノ酸置換を少なくとも含有する変異体ＩｇＧ Ｆｃ領域を含んでなる単離された抗ＨＥＲ２抗体を提供する。
好適な実施態様では、提供されるＶＨとＶＬの配列は図４及び図５に示される配列であるヒトＩｇＧ１定常領域に結合している。
一態様では、前述の実施態様の抗体は、さらに、Ｆｃ領域内に一ないし複数のアミノ酸置換を含有しており、その結果、天然配列のＦｃ領域を有する抗体と比較して、ＦｃγＲ結合の亢進、ＡＤＣＣの亢進、ＣＤＣの亢進、ＣＤＣの減退、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ機能の亢進、ＡＤＣＣの亢進かつＣＤＣ機能の減退、ＦｃＲｎ結合かつ血清半減期の亢進、の何れか一の性質を示す抗体となる。
【００２４】
前述の実施態様の抗体は、さらに、カバットのＥＵインデックスの残基番号付けでいう、ＩｇＧ Ｆｃ領域内のＤ２６５Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｋ３３４Ｌ、Ｋ３２２Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｅ３８０ＡおよびＥ３８０Ａ／Ｔ３０７Ａからなる群から選択される残基位置のアミノ酸置換を一ないし複数含有してなってもよい。前記ポリペプチドがＫ３３４Ｌのアミノ酸置換を含有する場合、さらに、ＩｇＧ Ｆｃ領域内のＤ２６５Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｅ３８０ＡおよびＥ３８０Ａ／Ｔ３０７Ａからなる群から選択される残基位置のアミノ酸置換を一ないし複数含有してなってもよい。
また、本発明は、前述の実施態様の何れか一のポリペプチド又は抗体と、薬学的に受容可能な担体などの担体を含んでなる組成物を提供する。
本発明の他の態様は、前述の実施態様の何れか一に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸である。また、本発明の抗体を含むポリペプチドをコードする発現ベクターも提供される。また、本発明のポリペプチド又は抗体をコードする核酸を含んでなる宿主細胞も提供される。前記ポリペプチドを発現して産生する宿主細胞には、ＣＨＯ細胞又は大腸菌細胞が含まれる。また、宿主細胞が産生するポリペプチドをコードする核酸を含んでなる宿主細胞を培養して、細胞培養物から該ポリペプチドを回収することを含む、本発明のポリペプチド、抗体及びイムノアドヘシンの産生方法を提供する。
【００２５】
また、本発明の他の態様では、容器と、容器内に収容される組成物とを具備する製造品であり、該組成物が前述の実施態様の何れか一に記載のポリペプチド又は抗体を含有するものである製造品を提供する。さらに、製造品は、前記組成物が抗体が目的とする症状を治療するために使用することができることを示すパッケージ挿入物を具備する。
本発明は、ＣＤ２０を発現するＢ細胞で特徴付けられるＢ細胞腫瘍または悪性物の治療方法であって、該腫瘍または悪性物に罹患している患者に、治療的有効量のＣＤ２０結合抗体、特に上記の実施態様のヒト化ＣＤ２０結合抗体が投与されることを含む治療方法が提供される。具体的な実施態様では、前記Ｂ細胞腫瘍は、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、小リンパ球性(ＳＬ)ＮＨＬ、リンパ球優性ホジキン病(ＬＰＨＤ)、濾胞性中心細胞(ＦＣＣ)リンパ腫、急性リンパ球性白血病(ＡＬＬ)、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)及びヘアリー細胞白血病である。
一実施態様では、慢性リンパ球性白血病の治療方法であって、該白血病に罹患している患者に、治療的有効量のヒトＣＤ２０に結合する前述の実施態様の変異形ＩｇＧ Ｆｃを含んでなる抗体が投与されることを含み、該抗体がさらにアミノ酸置換Ｋ３２６ＡまたはＫ３２９Ｗを含有するものである治療方法が提供される。
【００２６】
更なる態様は、Ｂ細胞制御性自己免疫性疾患の寛解方法であって、該疾患に罹患している患者に、治療的有効量の前述の実施態様の変異形ＩｇＧ Ｆｃを含んでなるＣＤ２０結合抗体が投与されることを含む寛解方法である。具体的な実施態様では、前記自己免疫性疾患は、関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、ウェゲナー病、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)、血栓性血小板減少性紫斑病(ＴＴＰ)、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡネフロパシ、ＩｇＭ多発性神経炎、重症筋無力症、血管炎、真正糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群および糸球体腎炎からなる群から選択されるものである。
以下のような他の治療方法が提供される：
血管形成関連の疾患の治療方法であって、該疾患に罹患している患者に、治療的有効量の前述の実施態様の変異形ＩｇＧ Ｆｃを含んでなるＶＥＧＦ結合抗体が投与されることを含む治療方法が提供される。
ＨＥＲ２発現癌の治療方法であって、該癌に罹患している患者に、治療的有効量の前述の実施態様の変異形ＩｇＧ Ｆｃを含んでなるＨＥＲ２結合抗体が投与されることを含む治療方法。
【００２７】
ＬＦＡ-１媒介性疾患の治療方法であって、該疾患に罹患している患者に、治療的有効量の前述の実施態様の変異形ＩｇＧ Ｆｃを含んでなる、ヒト抗ＣＤ１１ａに結合する抗体が投与されることを含む治療方法。
ＩｇＥ媒介性疾患の治療方法であって、該疾患に罹患している患者に、治療的有効量の前述の実施態様の変異形ＩｇＧ Ｆｃを含んでなる、ヒトＩｇＥに結合する抗体が投与されることを含む治療方法。
本発明の更なる他の態様は、ｐＨ６．０でのＦｃＲｎへの親和性結合が高く、ｐＨ６．０よりもｐＨ７．４において結合親和性が弱いポリペプチドのスクリーニング方法である。好適には、前記ポリペプチドはｐＨ６．０において天然配列ＩｇＧ Ｆｃ領域を有するポリペプチド又は抗体よりも高い親和性でヒトＦｃＲｎに結合する。前記方法は、ファージ上に候補ポリペプチドを発現させ、固形基質に固定させたヒトＦｃＲｎを作製し、ファージ粒子を基質上のヒトＦｃＲｎに結合させ、洗浄ごとにストリンジェンシーを上げながら複数回洗浄することによって非結合のファージ粒子を除去し、ｐＨ７．４で残りの結合したファージを溶出することを含む。
【００２８】
（前述の実施態様の詳細な説明）
ＩｇＧのホメオスタシスの重要な構成成分は、Ｆｃ領域と細胞表面新生児レセプターであるＦｃＲｎとのｐＨ依存的な相互作用によって媒介される再循環経路である。抗体遺伝子操作の分野での重要な目標は、ｐＨ７．４での低親和性を維持したまま、ｐＨ６．０でＦｃ-ＦｃＲｎ複合体の親和性が増加するＦｃ内の変異の同定であった(Ghetie 等, 1997)。さらに、Ｆｃに導入する変異の数を少なくして、高く保存される定常ドメインへの変異を含む、治療的抗体で治療される患者における抗薬剤免疫応答の可能性を避けることが非常に望まれる。本発明では、ランダム化したアミノ酸のライブラリの新規の作製方法とファージディスプレイを用いて、ヒトＦｃＲｎの親和性を増加する単一のアミノ酸変異(Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４ＹおよびＮ４３４Ｆ；ＩｇＧ Ｆｃ領域についてここで用いた番号付けシステムはKabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1991)に記載のＥＵ表示法である)であり、ｐＨ７．４でのｈｕＦｃＲｎへの低親和性を維持したままｐＨ６．０でのＦｃ結合親和性がおよそ１７０倍増加したＮ４３４Ｗ変異体を同定した。
【００２９】
ＦｃＲｎへの結合の測定方法は公知であり(例としてGhetie 1997, Hinton 2004を参照)、並びに実施例に記載されている。インビボでのヒトＦｃＲｎへの結合およびヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期を、例えば、トランスジェニックマウスまたはヒトＦｃＲｎを発現する形質移入されたヒト細胞株において、またはＦｃ変異体ポリペプチドを投与された霊長類において分析することができる。別の実施態様では、変異形ＩｇＧ Ｆｃを有する本発明のポリペプチドおよび具体的には抗体は、野生型ＩｇＧ Ｆｃを有するポリペプチドの少なくとも７倍、少なくとも９倍、より好ましくは少なくとも２０倍、好ましくは少なくとも４０倍、さらにより好ましくは少なくとも７０倍から１００倍高いヒトＦｃＲｎへの結合親和性を示す。具体的な実施態様では、ヒトＦｃＲｎに対する結合親和性はおよそ７０倍に増加する。
また、本発明は、Ｌｙｓ３３４のロイシン(Ｋ３３４Ｌ)へのアミノ酸置換を少なくとも含有する変異体ＩｇＧ Ｆｃ領域を含んでなる単離されたポリペプチドを提供する。このポリペプチドは天然配列のＩｇＧ Ｆｃよりも３倍以上の高い親和性でヒトＦｃγＲＩＩＩに結合する。これらのポリペプチドは、ヒトエフェクター細胞の存在下において、天然配列のＩｇＧ Ｆｃを有するポリペプチドよりも亢進したＡＤＣＣを示すのが好ましい。抗体がＣＤ２０結合抗体である場合、ＡＤＣＣ活性はヒトＣＤ２０とＣＤ１６を発現するトランスジェニックマウス(ｈＣＤ２０＋／ｈＣＤ１６＋Ｔｇマウス)で試験することができる。ＡＤＣＣについてのアッセイは記述されており、例えば米国特許第6,737,056号(Presta)を参照のこと。
【００３０】
一実施態様では、ＦｃＲｎへの結合親和性について、ポリペプチドのＥＣ５０または見かけのＫｄ(ｐＨ６．０)は≦１００ｎＭ、より好ましくは≦１０ｎＭである。ＦｃγＲＩＩＩへの亢進した結合親和性(Ｆ１５８；すなわち低親和性アイソタイプ)については、一実施態様では、ＥＣ５０または見かけのＫｄは≦１０ｎＭ、ＦｃγＲＩＩＩ(Ｖ１５８；高親和性)についてはＥＣ５０または見かけのＫｄは≦３ｎＭである。
本明細書と特許請求の範囲を通して、ＩｇＧ重鎖中の残基の番号付けは、ここに出典を明示して取り込まれるKabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のＥＵインデックスのものである。「KabatのＥＵインデックス」とはヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の残基番号付けを意味する。
「親ポリペプチド」は、ここに開示した一又は複数のＦｃ領域修飾を欠くき、及び、ここに開示したポリペプチド変異体と比較してエフェクター機能が異なるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドである。親ポリペプチドは天然のアミノ酸配列であるＦｃ領域又は(例えば付加、欠失及び／又は置換のような)アミノ酸配列の修飾を持つＦｃ領域を含みうる。
【００３１】
「Ｆｃ領域」という用語は、図１に示されているようなＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。「Ｆｃ領域」は、天然アミノ酸配列であるＦｃ領域、又は修飾を持つアミノ酸配列であるＦｃ領域含みうる。イムノグロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するかも知れないが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０の位置のアミノ酸残基からカルボキシル末端まで伸展すると定義される。イムノグロブリンのＦｃ領域は、図１に示すように、二つの定常ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。ＩｇＧ１の重鎖の最後の残基であるリジンは、成熟タンパク質のＦｃ内の末端残基として存在するべきではない。
ヒトＩｇＧＦｃ領域の「ＣＨ２」ドメイン(「Ｃγ２」ドメインとも呼ばれる)は通常アミノ酸２３１からアミノ酸３４０まで伸展する。ＣＨ２ドメインは、他のドメインと密接には対をなさないという点で独特である。むしろ、二つのＮ-結合分岐炭水化物鎖が未変性の天然ＩｇＧ分子の二つのＣＨ２ドメインの間に介在されている。炭水化物はドメイン−ドメイン対形成に対する代替物を提供し、ＣＨ２ドメインを安定化させるのに役立つと推測されてきた。Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985)。
「ＣＨ３」ドメインは、Ｆｃ領域におけるカルボキシル末端からＣＨ２領域まで伸展する。(すなわち、ＩｇＧのアミノ酸３４１からおおよそアミノ酸４４７まで伸展する。
【００３２】
「機能的なＦｃ領域」は、天然配列のＦｃ領域が有するエフェクター機能を保持する。典型的なエフェクター機能は、Ｃ１ｑ結合；補体媒介障害活性、Ｆｃレセプター結合、抗体依存性細胞障害活性(ＡＤＣＣ)；貪食作用、細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター；ＢＣＲ）の低減下などである。このようなエフェクターの機能は、一般に、Ｆｃ領域が結合領域（例えば、抗体の可変領域）に結合するのに必要とされており、ここで実施例として開示する様々はアッセイを用いることで評価することが可能である。
「天然配列のＦｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域と同一のアミノ酸配列を包含する。天然のアミノ酸配列を有するヒトＦｃ領域は、図２３に示してあるが、この配列には、天然のヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域（非Ａ-およびＡ-アロタイプ）が含まれる；天然のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域；天然のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域；天然のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域、同様に、そこから自然に生じる変異体等も含まれる。天然のアミノ酸配列を有するマウスＦｃ領域は図５に示してある。
【００３３】
「変異体Ｆｃ領域」は、ここで定義するような少なくとも一つの「アミノ酸修飾」により、天然のアミノ酸配列を持つＦｃ領域とは異なるアミノ酸配列を包含するものである。特に、変異体Ｆｃ領域には、天然配列のＦｃ領域もしくは親ペプチドのＦｃ領域と比較した場合、少なくとも１つのアミノ酸置換が存在する。例えば、天然配列のＦｃ領域又は親鎖のＦｃ領域において、おおよそ１から１０、多くの場合、おおよそ１から５ののアミノ酸の置換が存在する。ここで言う変異体Ｆｃ領域は、好ましくは少なくとも８０％以上の相同性を天然配列のＦｃ領域および/又は親ペプチドのＦｃ領域との間に有するか、さらに好ましくは、９０％以上の相同性を、さらに好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するものであろう
「相同性」とは、最大の相同率を実現するために、必要ならばギャップを導入して、対応の配列と比較整列させた場合、変異体のアミノ酸配列における同一のアミノ酸の割合として定義する。比較配列の方法およびコンピュータープログラムは本技術分野においてよく知られているものである。そのようなコンピュータープログラムの一つは、ジェネンテック、インコーポレイテッドにより著作された「アライン２(Alugn 2)」で、１９９１年１２月１０日にアメリカ合衆国、著作権局（Washington, DC 20559）に利用者資料伴に提出された。
【００３４】
「Ｆｃ領域を含んだポリペプチド」という言葉は、Ｆｃ領域を含むような抗体もしくはイムノアドヘンシン（下記記載の定義を参照）のようなポリペプチドのことを指す。
「Ｆｃレセプター」もしくは「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を指す。好適なヒトＦｃＲは、天然の配列の事である。さらに、好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスを含み、それらの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされたものも含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性型受容体」）、ＦｃγＲＩＩＢ（「阻害型受容体」）が含まれ、主として細胞質領域は異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型受容体ＦｃγＲＩＩＡは、細胞質領域にチロシン依存性免疫受容体活性化モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif ；ITAM）を含んでいる。阻害型受容体ＦｃγＲＩＩＢは、細胞質領域にチロシン依存性免疫受容体阻害性モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif ；ITIM）を含んでいる（M. in Daeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)）。ＦｃＲsに関しては、 Ravetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)；Capel 等, Immunomethods 4:25-34 (1994)；de Haas 等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に総説されている。他のＦｃＲs、ここでは、将来的に同定されるものも含めて、「ＦｃＲ」という言葉によって包含される。また、「ＦｃＲ」といる言葉は、母性ＩｇＧｓが胎児に受け継がれる要因となっている新生児性受容体「ＦｃＲｎ」（Guyer 等, J. Immunol. 117:587 (1976)および Kim 等, J. Immunol.24:249 (1994)も含まれる。
【００３５】
「抗体依存性細胞障害活性」または「ＡＤＣＣ」は、特定の細胞障害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球、及びマクロファージ)上に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲ)に結合した分泌型Ｉｇが細胞障害性エフェクター細胞を抗原保持標的細胞に特異的に結合させ、続いて標的細胞を細胞障害性によって標的細胞を殺傷する細胞障害性の形態を指す。抗体は細胞障害性細胞「に対するものであり」、必ず細胞の殺傷に必要である。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲIIIのみを発現する一方、単球はＦｃγＲI、ＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIを発現する。造血性細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch及びKinet, Annu.Rev.Immunol., 9:457-92(1991)の４６４頁の表３に要約されている。対象分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、米国特許第５５００３６２号又は第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイが実施されうる。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ)細胞を含む。あるいは、又は付加的に、対象分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等 .PNAS(USA), 95:652-656(1998)に開示されたような動物モデルにおいて、インビボで評価されてもよい。
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又はそれ以上のＦｃＲｓを発現し、エフェクターとしての機能を発揮する白血球のことである。その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を発揮することが望ましい。ＡＤＣＣを媒介する細胞の例として、抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、好中球、が含まれるが、ＰＢＭＣｓとＮＫ細胞が好適である。エフェクター細胞は天然の材料（例えば、ここで述べるように、血液やＰＭＢＣｓ）から単離してもよい。
【００３６】
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。古典的な補体経路の活性化は、補体活性化経路は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と結合した(好適なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。
「改変された」ＦｃＲ結合親和性またはＡＤＣＣ活性を有するポリペプチド変異体を含むポリペプチドとは、親ポリペプチドもしくは天然の配列を有するポリペプチドと比較して強化または減弱化されたＦｃＲ結合活性(ＦｃγＲまたはＦｃＲ)及び／又はＡＤＣＣ活性を持つ変異体である。ＦｃＲに対して「亢進した結合能を示す」変異形Ｆｃとは、少なくとも親ポリペプチドよりはより強く結合するＦｃＲのことである。親ポリペプチドと比較したときの結合の改善はおよそ３倍、好ましくはおよそ５、１０、２５、５０、６０、１００、１５０、２００、５００倍まで、またはおよそ２５％から１０００％の結合の改善である。ＦｃＲに対して「減弱した結合能を示す」ポリペプチド変異体は、親ポリペプチドよりは弱い親和性で少なくとも一のＦｃＲに結合する。親ポリペプチドと比較したときの結合の減弱は、およそ４０％またはそれ以上の結合の減弱であってもよい。このようなＦｃＲに対して減弱化した結合能を示す変異体は、ほとんどあるいは全く感知できないくらいの弱いＦｃＲへの結合能（例えば、天然配列のＩｇＧ  Ｆｃ領域と比較して０−２０％のＦｃＲ結合能、または、ここで示される例のように）しか有していない可能性がある
【００３７】
野生型又は天然配列のＩｇＧ Ｆｃを有するポリペプチド又は親ポリペプチドよりも「高い親和性」の「より良好な親和性」でＦｃＲと結合する変異形Ｆｃを有するポリペプチドは、変異形Ｆｃおよび親ポリペプチドの量を本質的に同じくしてアッセイを行った時、天然配列のＦｃを有する親ポリペプチドよりも本質的により強い結合親和性で、前述したＦｃＲｓの一又はそれ以上のものと結合するものである。例えば、改善されたＦｃＲ結合能を有する変異形Ｆｃポリペプチドは、例えば、ここで開示される例としてＦｃＲ結合親和性が測定された際、親ペプチドと比較してＦｃＲ結合能が約２倍から約３００倍、例えば約３倍から約１７０倍の改善を示す可能性がある。
ヒトエフェクター細胞存在下において、野生型ＩｇＧ Ｆｃを有するポリペプチドよりも効果的に「抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)を媒介する」または「亢進したＡＤＣＣを示す」変異形Ｆｃ領域を含有するポリペプチドは、アッセイに用いる野生型Ｆｃ領域を有するポリペプチドと変異形Ｆｃ領域を有するポリペプチドの量を実質的に同じにした場合、インビトロもしくはインビボにおいて実質的により効果的にＡＤＣＣを媒介する変異体のことである。一般にそのような変異体は、ここで開示するインビトロでのＡＤＣＣアッセイを用いる事で同定する事ができるであろう。しかし、ＡＤＣＣを測定するその他のアッセイもしくは方法（例えば、動物モデルによるアッセイ）なども考慮すべき方法である。好適な変異体は、野生型ＦｃよりもＡＤＣＣの媒介において約５倍から約１００倍、例えば約２５倍から約５０倍の有効性である。
【００３８】
「アミノ酸修飾」とは、すでに決定されているアミノ酸の配列における変異のことを指す。典型的な修飾には、アミノ酸の置換、挿入および/もしくは欠失が含まれる。ここでの好適なアミノ酸修飾は、置換である。
特定位置、例えば、Ｆｃ領域「におけるアミノ酸修飾」とは、特定されたアミノ酸残基の置換もしくは欠失、または特定されたアミノ酸残基の隣接位置に少なくとも一つのアミノ酸を挿入することを指す。特定されたアミノ酸残基の「隣接位置」への挿入とは、１または２残基以内の挿入を意味する。その挿入は、特定された残基のN末端側、もしくはC末端側の場合があり得る。
【００３９】
「アミノ酸置換」とは、すでに決定されているアミノ酸配列に存在する少なくとも１アミノ酸残基を他の異なる「置換」アミノ酸残基で置き換えることを指す。置換残基もしくは残基群は「天然に生じるアミノ酸残基」（即ち、遺伝コードでコードされるもの）で良く、アラニン（Ala）；アルギニン（Ａｒｇ）；アスパラギン（Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ）；システイン（Ｃｙｓ）；グルタミン（Ｇｌｎ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ）；グリシン（Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉｌｅ）；ロイシン（Ｌｅｕ）；リジン（Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐｒｏ）；セリン（Ｓｅｒ）；トレオニン（Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｔｒｐ）；チロシン（Ｔｙｒ）；およびバリン（Ｖａｌ）。好適には、置換アミノ酸はシステインではない。ここでのアミノ酸置換の定義には、一又はそれ以上の非天然型アミノ酸残基の置換も含める。「非天然のアミノ酸残基」とは、上述した天然アミノ酸以外のアミノ酸で、ポリペプチド鎖においてアミノ酸残基(一又は複数)に隣接して共有結合し得るものを指す。非天然のアミノ酸の例には、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、およびその他Ellman 等 Meth,Enzym. 202:301-336 (1991)に記載されているようなアミノ酸類似体が含まれる。非天然のアミノ酸残基を産生するためには、Noren 等 Science 244:182 (1989)および上掲のEllman 等の方法を利用することができる。要するに、これらの方法はインビトロにおけるＲＮＡの転写及び翻訳に先立って非天然型アミノ酸残基にてサプレッサーｔＲＮＡを化学的に活性化することを伴う。
【００４０】
本発明で使用される「保存的」アミノ酸置換という用語は、機能的に等価なアミノ酸を置換するアミノ酸置換を意味する。保存的アミノ酸変化は、結果的なペプチドのアミノ酸配列に変化を生じない。例えば、類似の極性の一又は複数のアミノ酸は等価に作用し、ペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらさない。一般に、グループ内での置換は、構造及び機能に関して保存的であるとみなす。しかしながら、特定の残基の役割はそれが存在している分子の３次元構造を背景に決定されることを当業者は認識しているであろう。例えば、Ｃｙｓ残基は、還元された（チオール）形態よりも極性の低い酸化された（ジスルフィド）形態に存在する。Arg側鎖の長い脂肪性部位は、その構造的又は機能的役割の重大な特徴を構成し、これは他の塩基性残基よりも非極性の置換によって最も保存されうる。また、芳香族のグループ（Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＰｈｅ）を含む側鎖は、イオン性-芳香族又は「カチオン-π」相互作用に関与しうることが認識されるであろう。これらの場合、酸性又は荷電していない極性のグループのメンバーを有するこれら側鎖の１つの置換は、構造又は機能に関して保存的でありうる。Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、及びＣｙｓ（ジスルフィド形態）のような残基は、主鎖の高次構造に直接的な影響力を有し、構造上の変形なしに置換されないことがある。
【００４１】
「アミノ酸挿入」とは、すでに決定されているアミノ酸配列の中に少なくとも１つアミノ酸を取り込ませることである。挿入は通常１または２のアミノ酸残基の挿入により構成されるが、本出願においては、より長い「ペプチド挿入」（例えば、約３から５、さらには約１０アミノ酸残基の挿入）を考慮する。挿入された残基(一又は複数)は、上述した天然に生じるもしくは非天然のアミノ酸である。
「アミノ酸欠失」とは既に決定されているアミノ酸配列から少なくとも１アミノ酸を除去することを意味する。
アミノ酸はその側鎖の性質の類似性に応じて分類される( Biochemistry, 第２版., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)中のA. L. Lehninger)：
(１) 非極性：Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M) 
(２) 荷電のない極性：Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q) 
(３) 酸性：Asp (D), Glu (E)
(４) 塩基性：Lys (K), Arg (R), His(H)
あるいは、天然に生じる残基は共通の側鎖性質に基づくグループに分けられる：
(１) 疎水性：ノルロイシン, Met, Ala, Val, Leu, Ile；
(２) 中性親水性：Cys, Ser, Thr, Asn, Gln；
(３) 酸性：Asp, Glu；
(４) 塩基性：His, Lys, Arg；
(５) 鎖配向に影響する残基：Gly, Pro；
(６) 芳香族：Trp, Tyr, Phe。
【００４２】
「ヒンジ領域」はヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０の伸展として一般に定義されている(Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985))。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間Ｓ-Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配することにより、ＩｇＧ１と整合させられうる。
Ｆｃ領域の「低ヒンジ領域」は、通常、カルボキシル末端からヒンジ領域（すなわち、233番目のアミノ酸残基から２３９番目のアミノ酸残基）までの伸展として定義されている。本発明に先立ち、ＦｃγＲとの結合には、一般に、ＩｇＧ  Ｆｃ領域の低ヒンジ領域が寄与しているとされていた。
「Ｃ１ｑ」は免疫グロブリンのＦｃ領域に対する結合部位を含むポリペプチドである。Ｃ１ｑは二つのセリンプロテアーゼＣ１ｒ及びＣ１ｓと共に、補体依存性細胞毒性(ＣＤＣ)経路の最初の成分である複合体Ｃ１を形成する。ヒトＣ１ｑは例えばQuidel, San Diego, CAから市販されている。
「結合ドメイン」なる用語は、他の分子に結合するポリペプチドの領域を意味する。ＦｃＲの場合には、結合ドメインはＦｃ領域の結合の原因であるそのポリペプチド鎖の一部(例えばそのα鎖)を含みうる。一つの有用な結合ドメインはＦｃＲα鎖の細胞外ドメインである。
【００４３】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、特にモノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体(例えば、二重特異的抗体)、及びそれらが所望の生物活性を示す限りは抗体断片を包含している。
本発明の「機能的な抗体」には、完全な抗体の一部、一般的には完全抗体の抗原結合領域または可変領域、ないしはＦｃＲ結合能を保持する抗体のＦｃ領域などが含まれる。抗体断片の例として、線形抗体；一本鎖抗体分子；および抗体断片から構成される多特異性抗体などがある。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対している。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他のイムノグロブリンが混入することなく、ハイブリドーマ培養物によって合成される点で有利である。「モノクローナル」との修飾詞は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の性質を示すものであり、抗体を何か特定の方法で生成しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において有用なモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature 256, 495 (1975)により記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作ることができる(例えば、米国特許第4,816,567号参照)。また「モノクローナル抗体」は、例えばClackson等, Nature 352:624-628(1991)、及びMarks等, J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００４４】
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種由来の抗体、あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同性があり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体、あるいは他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同である「キメラ」抗体、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りこのような抗体の断片を特に含む(米国特許第4,816,567号；Morrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984))。キメラ抗体の作製方法は当分野で公知である。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は抗体の他の抗原結合サブ配列）である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、マウス、ラット又はウサギなどの所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種のＣＤＲの残基（ドナー抗体）によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくは導入したＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練し、最大にするために行われる。一般に、ヒト化抗体は少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むものであり、その可変ドメインは、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域が結合親和性を改善しうる一ないし複数のアミノ酸置換を含みうるが、全てあるいは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである。ＦＲ内のアミノ酸置換の数は典型的には、Ｈ鎖内のたった６個と、Ｌ鎖内のたった３個である。ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、一般的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。更なる詳細については、Jones等, Nature, 321:522-525(1986)；Reichmann等, Nature 332:323-329(1988)；及びPresta, Curr.Op.Struct.Biol., 2:593-596(1992)を参照のこと。ヒト化抗体には、抗体の抗原結合領域が、対象の抗原でマカクザルを免疫化することによって産生した抗体由来のものであるPRIMATIZED（登録商標）抗体が含まれる。ヒト化抗体の作製方法は当分野において公知である。
【００４５】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリを含む従来技術に既知の様々な技術を用いて作成することができる。Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等、J. Mol. Biol., 222:581 (1991)。また、Cole等及びBoerner等の技術が、ヒトモノクローナル抗体の調製に使用可能である。Cole等、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)；Boerner等、J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)。
ここで用いられているように、「イムノアドヘシン」という用語は、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を持つ異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性を付与した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは抗体の抗原認識及び結合部位以外の所望の結合特異性を持つアミノ酸配列（即ち「異種」）と免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物である。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む近接アミノ酸配列を含む。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３、又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。例えば、本発明に有用なイムノアドヘシンは、ＢＬｙＳレセプターの膜貫通配列または細胞質配列のないＢＬｙＳレセプターのＢＬｙＳ結合部位を含有するポリペプチドである。一実施態様では、ＢＲ３、ＴＡＣＩまたはＢＣＭＡの細胞外ドメインはイムノグロブリン配列の定常ドメインに融合している。
【００４６】
「融合タンパク質」および「融合ポリペプチド」は、共有結合で互いに結合した２つの部分を持つポリペプチドを指し、各部分は異なる特性を有するポリペプチドである。この特性は、例えばインビトロまたはインビボ活性などの生物学的性質でよい。この特性はまた、単一の化学的または物理的性質、例えば対象抗原との結合、反応の触媒などかもしれない。この２つの部分は単一のペプチド結合によって直接、または１つまたは複数のアミノ酸残基を含んでいるペプチドリンカーを通して結合していてもよい。通常、この２つの部分とリンカーは同じ読み枠に存在する。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、（１）ローリー法で測定した場合９５％を越える抗体、最も好ましくは９９重量％を越えるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００４７】
本発明のＣＤ２０結合抗体およびヒト化ＣＤ２０結合抗体の生物活性は、ヒトＣＤ２０への抗体結合、より好ましいことにはヒトおよび他の霊長類のＣＤ２０（カニクイザル、アカゲザル、チンパンジーを含む）への結合を少なくとも含むであろう。抗体は、１×１０−８より低いＫｄ値、好ましくは１×１０−９より低いＫｄ値でＣＤ２０に結合し、このような抗体処理をしていない適当なネガティブ対照と比較して少なくとも２０％のＢ細胞をインビボで死滅または枯渇するであろう。Ｂ細胞の枯渇はＡＤＣＣ、ＣＤＣ、アポトーシス、または他のメカニズムの一または複数の結果である。ここで言う疾患治療のある実施態様では、特定の効果的機能またはメカニズムが期待され、ヒト化２Ｈ７のある変異がＡＤＣＣなどの生物学的機能を選択的にもたらす。
【００４８】
「治療すること」または「処置」または「寛解」は、治療的処置を表し、この目的は標的とした病態または疾患を予防または衰退（減少）することである。本発明の方法に従って本発明のＣＤ２０結合抗体の治療的有効量を取り込んだ後、患者のＣＤ２０陽性癌または自己免疫性疾患がうまく「治療」されれば、患者は特定の疾患の一またはそれ以上の兆候および症状が明らかにおよび／または測定可能な程度に減少または消失する。例えば、癌では、癌細胞数の減少または癌細胞の消失；腫瘍の大きさの減少；腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度の遅延および好ましくは停止）；ある程度の腫瘍成長の阻害；緩解期の延長、および／または特定の癌が関与する一またはそれ以上の症状のある程度の除去；罹患率および死亡率の減少、および生活の質の改善がある。疾患の兆候または症状の減弱は患者が感じ得るものである。癌のすべての兆候の消失を定義するならば、腫瘍の大きさが好ましくは５０％以上、より好ましくは７５％以上減少すると、処置が完全な反応または部分的な反応を達成し得たことになる。患者が疾患の安定を体験するならば、患者も治療されたと考える。好ましい実施態様では、癌患者に１年、好ましくは１５か月後に癌の進行がないことである。疾患の改善および治療の成功を評価するこれらのパラメーターは医師などの適切な当業者に知られたお決まりの手法によって簡単に測定可能である。
【００４９】
「治療的有効量」という用語は、対象物の疾患又は疾病を「治療」するのに効果的な抗体または薬剤の量を指す。癌の場合は、治療的有効量の薬剤は、癌細胞の数を減少させ；腫瘍の大きさを小さくし；癌細胞の周辺器官への浸潤を阻害(すなわち、ある程度に遅く、好ましくは止める）し；腫瘍の転移を阻害(すなわち、ある程度に遅く、好ましくは止める）し；腫瘍の成長をある程度阻害し；及び／又は癌に関連する一つ或いはそれ以上の症状をある程度和らげることが可能である。「治療する」の定義を参照。薬剤が存在する癌細胞の成長を阻害するおよび／または癌細胞を殺傷する点において、細胞増殖抑制性および／または細胞障害性であるといえる。
「慢性」投与は、長期間初期治療効果（活性）を維持するために、急性の状態とは反対に連続的状態での薬剤投与を表す。「間欠的」投与は中断せずに継続して行わずむしろ自然的周期で行う治療である。
【００５０】
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体）、化学治療薬、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロランブシル、ダウノルビシン又はその他インターカレート剤、酵素及びその断片、例えば核溶解性酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、そして下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含むように意図されている。他の細胞障害性薬が下記に記載されている。
【００５１】
ここで用いられる際の「成長阻害剤」は、細胞、特にＣＤ２０発現癌細胞の成長をインビトロ又はインビボの何れかで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、成長阻害剤は、Ｓ期でＰＳＣＡ発現細胞の割合を有意に減少させるものである。成長阻害剤の例は、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン類、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。タキサン類（パクリタキセル及びドセタキセル）は、共にイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（TAXOTERE（登録商標）、ローン・プーラン ローラー）は、パクリタキセル（TAXOL（登録商標）、ブリストル-マイヤー スクウィブ）の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、脱重合を防ぐことによって微小管を安定化し、その結果、細胞の有糸分裂を阻害する。
【００５２】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類、；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カリケアマイシン(calicheamicin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin)、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin)、イダルビシン、マルセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)などの抗生物質；メトトレキセート及び５−フルオロウラシル(５-ＦＵ）のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似物；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、及びフロキシウリジン(floxuridine)、５-ＦＵ；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；オキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)：ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)；ラゾキサン(razoxane)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２&quot;-トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカーバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；シトシンアラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（タキソール(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）、及びドキセタキセル（タキソテレ(登録商標)、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン、カルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン(navelbine)；ノバントロン(novantron)；テニポシド；ダウノマイシン；カルミノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；ＣＴＰ-１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸；エスペラマイシン；カペシタビン(capecitabine)；並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働くホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン(raloxifene)、４(５)-イミダゾール類を阻害するアロマターゼ、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、トレミフェン(Fareston)；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)及びニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド(bicalutamide)、リュープリン(leuprolide)、及びゴセレリン；プレドニゾロンなどの他の化学療法剤が含まれる。上記のものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００５３】
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる服用量及び濃度でそれらに曝露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮＴＭ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭを含む。
「哺乳動物」なる用語は、哺乳動物に分類される任意の動物を意味し、ヒト、家畜用及び農場用動物、および動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む。ここで好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００５４】
組成物
特定の実施態様では、抗体は以下に示すＶドメイン配列または完全長配列を含有するが、一又は複数のＦｃエフェクター機能を改善する本発明のＦｃ変異を有する。
本発明のポリペプチド又は抗体は、例えば、他のＦｃ機能を改善するか低減する、あるいは同じＦｃ機能をさらに改善する、抗原結合親和性を亢進する、安定性を増す、グリコシル化を変更する、ないしはアロタイプの変異体を有する他のアミノ酸置換をさらに含有しうる。さらに他の抗体はＦｃ領域内に一又は複数のアミノ酸置換を含有し、その結果、野生型のＦｃを有するポリペプチドおよび抗体と比較して、ＦｃγＲ結合の亢進、ＡＤＣＣの亢進、ＣＤＣの亢進、ＣＤＣの減退、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ機能の亢進、ＡＤＣＣの亢進かつＣＤＣ機能の減退(例えば注入反応を最小限にするため)、ＦｃＲｎ結合かつ血清半減期の亢進の何れか一の性質を示す抗体となる。これらの活性は本明細書中に記載の方法によって測定することができる。
Ｆｃ機能を改善する付加的なアミノ酸変更については、米国特許第6,737,056号を参照、出典明記により本明細書中に組み込まれる。さらに、本発明の何れかの抗体は、Ｆｃ領域内にＣＤＣ活性を低減する少なくとも一のアミノ酸置換を含有しうる、例えば少なくとも一の置換Ｋ３２２Ａを含有する。米国特許第6,528,624号B1(Idusogie 等)を参照のこと。ＡＤＣＣおよびＣＤＣを改善する変異は、本明細書中でトリプルＡｌａ変異とも称するＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａを含む。Ｋ３３４ＬはＣＤ１６への結合を亢進する。Ｋ３２２ＡはＣＤＣ活性を低減させ；Ｋ３２６ＡまたはＫ３２６ＷはＣＤＣ活性を亢進し、Ｄ２６５ＡはＡＤＣＣ活性を低減する。ＡＤＣＣ機能を亢進するグリコシル化変異体は、出典明記によって本明細書中に組み込まれる国際公開公報03/035835に記載される。安定性変異体は、例えば酸化、脱アミドに関して安定性の改善を示す変異体である。
【００５５】
マウスＨＥＲ２抗体４Ｄ５の組換えヒト化体(ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８、ｒｈｕＭＡｂ ＨＥＲ２、トラスツズマブ又はハーセプチン(商品名)；米国特許第5,821,337号)は、広範な抗癌治療を前に受けたことのあるＨＥＲ２過剰発現転移性乳癌を持つ患者において臨床的に活性であった(Baselgaら, J. Clin. Oncol. 14:737-744(1996))。トラスツズマブは、腫瘍がＨＥＲ２タンパク質を過剰発現する転移性乳癌を有する患者の治療のために、1998年9月25日、食品医薬品局から販売許可を受けた。
様々な特性を有する他のＨＥＲ２抗体は、Tagliabueら Int. J. Cancer 47:933-937(1991)；McKenzieら Oncogene 4:543-548(1989)；Maierら Cancer Res. 51:5361-5369(1991)；Bacusら Molecular Carcinogenesis 3:350-362(1990)；Stancovskiら PNAS(USA)88:8691-8695(1991)；Bacusら Cancer Research 52:2580-2589(1992)；Xuら Int. J. Cancer 53:401-408(1993)；WO94/00136；Kasprzykら Cancer Research 52:2771-2776(1992)；Hancockら Cancer Res. 51:4575-4580(1991)；Shawverら Cancer Res. 54:1367-1373(1994)；Arteagaら Cancer Res. 54:3758-3765(1994)；Harwerthら J. Biol. Chem. 267:15160-15167(1992)；米国特許第5,783,186号；及びKlapperら Oncogene 14:2099-2109(1997)に記載されている。
【００５６】
一実施態様では、抗ＨＥＲ２抗体は以下のＶＬおよびＶＨドメイン配列を含んでなる(ＣＤＲを太字で示す)：
ヒト化２Ｃ４バージョン５７４抗体ＶＬ(配列番号３)
2008510466.tif 000003
およびヒト化２Ｃ４バージョン５７４抗体ＶＨ(配列番号４)
2008510466.tif 000004
【００５７】
他の実施態様では、抗ＨＥＲ２抗体は図２Ａおよび図２Ｂに示すトラスツズマブのＶＬ(配列番号５)およびＶＨ(配列番号６)ドメイン配列を含んでなる。
具体的な実施態様では、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は以下の配列を含んでなる：
一実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下ののＶＬ配列(配列番号７)：
2008510466.tif 000005
および、以下ののＶＨ配列(配列番号８)
2008510466.tif 000006
を含んでなる。
【００５８】
他の実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体は以下のＶＬ配列(配列番号９)
2008510466.tif 000007
および、以下ののＶＨ配列(配列番号１０)
2008510466.tif 000008
を含んでなる。
【００５９】
３つめの実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体は以下のＶＬ配列(配列番号１１)
2008510466.tif 000009
および、以下のＶＨ配列(配列番号１２)
2008510466.tif 000010
を含んでなる。
【００６０】
ヒト化抗ＣＤ１１ａ抗体であるエファリズマブまたはラプティバ(登録商標)(米国特許第6,037,454号)は、乾癬の治療について2003年10月27日に食品医薬品局から承認を受けた。一実施態様では、一又は複数のＦｃエフェクター機能が改善される本発明のＦｃ変異を含有する抗ＣＤ１１ａ抗体が提供され、この抗体は以下のＨｕＭＨＭ２４のＶＬおよびＶＨ配列を含んでなる：
可変軽鎖(配列番号１３)
2008510466.tif 000011
可変重鎖(配列番号１４)
2008510466.tif 000012
【００６１】
抗ヒトＣＤ１１ａ抗体は、以下の配列を有するＨｕＭＨＭ２４の完全長Ｌ鎖と配列番号１４のＶＨを含んでなる：
2008510466.tif 000013
【００６２】
具体的な実施態様では、一又は複数のＦｃエフェクター機能を改善する本発明のＦｃ変異を含有する抗ＩｇＥ抗体は、抗ＩｇＥ抗体Ｅ２５、Ｅ２６、Ｅ２７およびＨｕ-９０１のＶ領域配列を少なくとも含んでなり、そのＬおよびＨ鎖配列を図３Ａおよび図３Ｂに示す。軽鎖配列は以下の通りである：E25 L鎖(配列番号16)；E26 L鎖(配列番号17)；E27 L鎖(配列番号18)；およびHu-901 L鎖(配列番号19)。重鎖配列は以下の通りである：E25 H鎖(配列番号20 )；E26 H鎖(配列番号21)；E27 H鎖(配列番号22)；およびHu-901 H鎖(配列番号23 )。図３Ａおよび図３Ｂに示す抗ＩｇＥ抗体について、ＶＬはＶＥＩＫ(図３Ａの残基１１１)で終わり、ＶＨはＶＴＶＳＳ(図３Ｂの残基１２１辺り)で終わる。Ｅ２５、Ｅ２６、Ｅ２７およびＨｕ-９０１抗体のＶＬ配列はそれぞれ、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１および配列番号５３である。Ｅ２５、Ｅ２６、Ｅ２７およびＨｕ-９０１抗体のＶＨ配列はそれぞれ、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２および配列番号５４である。他の実施態様では、本発明のＦｃ変異を含有する抗ＩｇＥ抗体は、図３Ａに示す配列：E25 L鎖(配列番号16)；E26 L鎖(配列番号17)；E27 L鎖(配列番号18)；およびHu-901 L鎖(配列番号19)である抗体の何れか一から選択されるＬ鎖を含んでなる。
【００６３】
ＣＤ２０抗原に結合する抗体の例には以下のものが含まれる：現在では「リツキシマブ」（「リツキサン（登録商標）」）と呼称される「Ｃ２Ｂ８」(米国特許第5,736,137号、出典明記によって特別に組み込まれる）；「Ｙ２Ｂ８」又は「Ibritumomab Tiuxetan」ゼバリン(登録商標)と命名されるイットリウム-[90]-標識２Ｂ８マウス抗体(米国特許第5,736,137号、出典明記によって特別に組み込まれる)；場合によっては「１３１Ｉ-Ｂ１」抗体(ヨードＩ131 Tositumomab、BEXXARＴＭ)を生成するために１３１Ｉで標識した「Tositumomab」とも呼称されるマウスＩｇＧ２ａ「Ｂ１」(米国特許第5,595,721号、出典明記によって特別に組み込まれる)；マウスモノクローナル抗体「１Ｆ５」(Press等 Blood 69(2):584-591 (1987)及びそれらの変異体、例として「フレームワークパッチ」又はヒト化１Ｆ５(国際公報03/002607, Leung, S；ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ-９６４５０)；マウス２Ｈ７及びキメラ２Ｈ７抗体(Clark 等 PNAS 82: 1766-1770 (1985)；米国特許第5,500,362号、出典明記によって特別に組み込まれる)；ヒト化２Ｈ７；ｈｕＭａｘ-ＣＤ２０(国際公報2004/035607、Genmab, Denmark)；ＡＭＥ-１３３(Applied Molecular Evolution)；キメラ又はヒト化Ａ２０抗体（それぞれｃＡ２０、ｈＡ２０）などのＡ２０抗体又はその変異形（米国公開番号2003/0219433、免疫医学）；及びInternational Leukocyte Typing Workshopより入手のモノクローナル抗体Ｌ２７、Ｇ２８-２、９３-１Ｂ３、Ｂ-Ｃ１又はＮＵ-Ｂ２(Valentine等, Leukocyte Typing III (McMichael, 編集, 440頁, Oxford University Press (1987))。
ここで言う「リツキシマブ」又は「リツキサン(登録商標)」なる用語は、ＣＤ２０抗原に対する一般的に遺伝学的に操作したキメラのマウス／ヒトモノクローナル抗体を指し、米国特許第5,736,137号（出典明記により特別に組み込まれる）では「Ｃ２Ｂ８」と命名されるものであり、ＣＤ２０を結合する能力を保持する該抗体の断片を含みうる。Ｃ２Ｂ８軽鎖(配列番号２４)および重鎖(配列番号２５)配列を図１０に示す。ＶＬおよびＶＨを描写する。
【００６４】
具体的な実施態様では、ＣＤ２０抗原に結合する抗体には、以下に示すヒト化２Ｈ７ｖ１６抗体およびその変異体が含まれる。ヒト化２Ｈ７ｖ１６は、以下の可変軽鎖配列：
2008510466.tif 000014
および、可変重鎖配列：
2008510466.tif 000015
を含んでなる完全な抗体または抗体断片を意味する。
【００６５】
ヒト化２Ｈ７ｖ１６抗体が完全抗体である場合、ｖ１６完全長軽鎖アミノ酸配列：
２Ｈ７ｖ１６軽鎖
2008510466.tif 000016
および、完全長重鎖アミノ酸配列：
２Ｈ７ｖ１６重鎖
2008510466.tif 000017
を含むことが好ましい。
【００６６】
バージョン１６をもとにした他のすべての変異体のＶ領域は、以下の表に示すアミノ酸置換の位置を除いてｖ１６のアミノ酸配列である。特に記載しない限り、２Ｈ７変異体はｖ１６のものと同じＬ鎖を有する。
2008510466.tif 000018
【００６７】
バージョン１１４、１１５、１１６、１３８、４７７、５１１のそれぞれは以下のＶＬ配列を含んでなる：
2008510466.tif 000019
バージョン９６、１１４、１１５、１１６、１３８、４７７のそれぞれは以下のＶＨ配列を含んでなる：
2008510466.tif 000020
【００６８】
前述のヒト化２Ｈ７ｍＡｂの変異体は、上記のｖ１６と同じＶＬ(配列番号１)およびＶＨ(配列番号２)およびＬ鎖(配列番号２６)配列と、完全長Ｈ鎖アミノ酸配列：
２Ｈ７ｖ３１ Ｈ鎖：
2008510466.tif 000021
を有する２Ｈ７ｖ３１である。
【００６９】
ヒト化２Ｈ７抗体の他の変異体は、以下に示す配列番号３９のＬ鎖配列および配列番号４０のＨ鎖配列：
２Ｈ７ｖ１３８軽鎖(配列番号３９)
2008510466.tif 000022
２Ｈ７ｖ１３８重鎖(配列番号４０)
2008510466.tif 000023
を含んでなる２Ｈ７ｖ１３８である。
【００７０】
変異形ヒト化２Ｈ７ｖ４７７は、配列番号３９のＬ鎖配列と配列番号４３のＨ鎖配列を有する(Ｎ４３４Ｗのアミノ酸置換を有する)：
2008510466.tif 000024
他のｖ１３８の変異体はＮ４３４ＹまたはＮ４３４Ｆのアミノ酸置換を有する。
変異形２Ｈ７ｖ１１４は配列番号３９のＬ鎖配列と完全なＨ鎖アミノ酸配列を有する：
2008510466.tif 000025
【００７１】
変異形２Ｈ７ｖ５１１は上記の配列番号４１のＶＬと配列番号４５のＶＨ：
2008510466.tif 000026
および、配列番号４５のＶＨ：
2008510466.tif 000027
を含んでなる。
２Ｈ７ｖ５１１は、上記の配列番号３９の軽鎖配列と以下の重鎖配列を有する。：
2008510466.tif 000028
また、芳香族残基のＦ、Ｙ、ＨまたはＳへのＮ４３４の置換を含有する抗ＢＲ３抗体も提供される。
【００７２】
発明の方法
また、本発明は、実施例に記載するように、ｐＨ６．０でのＦｃＲｎに対する結合親和性が高く、ｐＨ６．０よりもｐＨ７．４での結合親和性が弱いポリペプチドのスクリーニング方法を提供する。前記方法は、ファージ上に候補ポリペプチドを発現させ、固形基質に固定させたｈｕＦｃＲｎを作製し、ファージ粒子を基質上の該ＦｃＲｎに結合させ、洗浄ごとにストリンジェンシーを上げながら複数回洗浄することによって非結合のファージ粒子を除去し、ｐＨ７．４で残りの結合したファージを溶出することを含む。実施例１に示すように、ストリンジェンシーの増加は洗浄回数及び／又は長さの増加を意味する。溶出したファージを増殖させ、ファージからポリペプチドを単離することができる。一実施態様では、ポリペプチドは抗体やイムノアドヘシンなどのポリペプチドを含有するＩｇＧ Ｆｃである。
【００７３】
抗体生成
モノクローナル抗体 
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第4,816,567号)によって作製することができる。 
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。 
【００７４】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞（融合パートナーとも表す）の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための選択培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
好ましい融合パートナー骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支援し、融合していない親細胞を選択する選択培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫株、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡより入手し得るＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、及び、ＳＰ−２および類縁体、例としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックヴィル、メリーランド、ＵＳＡより入手し得るＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞由来のものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている（Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁、(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。 
【００７５】
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。 
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munsonら, Anal. Biochem., 107:220 (1980)に記載されているスカッチャード分析により決定できる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地は、例えば、Ｄ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地を包含する。また、そのハイブリドーマ細胞は、例えばマウス内の細胞に腹腔内注入するなどして、動物において腹水症腫瘍としてインビボで増殖させることができる。 
【００７６】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばアフィニティークロマトグラフィー（例としてプロテインＡまたはプロテインＧセファロースを用いることによる）、またはイオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析などのような常套的な抗体精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。 
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外では抗体タンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌内組み換え発現に関する文献には、Skerraら, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) および Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)がある。
【００７７】
更なる実施態様において、抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから単離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の単離をそれぞれ記述している。続く刊行物は鎖シャッフリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生産(Marks 等, Bio/Technology, 10:779-783 (1992))、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266 (1993))を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の単離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。 
キメラまたは融合抗体ポリペプチドを生成するために抗体をコードするＤＮＡを修飾する、例えば、相同的マウス配列をヒト重鎖及び軽鎖定常部のコード化配列（ＣＨおよびＣＬ）に置換することにより(米国特許第４，８１６，５６７号；およびMorrison等, Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード化配列に非免疫グロブリンポリペプチド（非相同ポリペプチド）のコード化配列の全て又は一部を共有結合させることにより、修飾することができる。 このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常部を置換し、又は抗体の１個の抗原結合部位の可変部を置換して、抗原に対する特異性を有する１個の抗原結合部位、及び異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作り出す。 
【００７８】
ヒト化抗体 
非ヒト抗体のヒト化方法は、当分野で示されている。好ましくは、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された一又は複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「移入」残基と呼ばれ、これは典型的には「移入」可変ドメインから取られている。ヒト化は、本質的にはウィンターと共同研究者の方法(Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988))に従って、ヒト抗体の対応配列を高頻度可変領域配列に置換することにより、実施することができる。従って、このような「ヒト化」抗体は、未処理のヒト可変ドメインより実質上小さい部分が非ヒト種由来の対応配列によって置換されているキメラ抗体である(米国特許第4,816,567号)。実際、ヒト化抗体は、典型的には、幾つかの高頻度可変領域残基及びことによると幾つかのＦＲ残基が、齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。 
【００７９】
ヒト化抗体の作成に使用される軽鎖と重鎖両方のヒト可変ドメインの選択は、ヒト治療の使用を目的とする場合に、抗原性およびＨＡＭＡ反応（ヒト抗マウス抗体）を低下させるために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法によれば、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。齧歯類の配列に最も近いヒトＶドメイン配列を同定して、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク(ＦＲ)として受け入れる(Sims等, J.Immunol., 151:2296 (1993)；Chothiaら, J.Mol.Biol., 196:901 (1987))。もう一つの方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを使用するものである。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用することができる(Carter等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J.Immunol., 151:2623 (1993))。 
【００８０】
更に、抗体は、抗原に対する高親和性及び他の望ましい生物学的性質を保持したままヒト化することが重要である。この目的を達成するため、好ましい方法によれば、親配列及び様々な概念的ヒト化生成物を、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いて分析する工程によって、ヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用でき、当業者には良く知られている。選ばれた候補免疫グロブリン配列の可能な三次元コンホメーション構造を例示し表示するコンピュータープログラムが利用できる。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能な役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原を結合させる能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにしてレシピエント及び移入配列からのＦＲ残基を選択し、結びつけることができ、所望の抗体の特性、例えば標的抗原に対する親和性の増加が達成される。一般に、高頻度可変領域残基は、直接的かつ最も実質的に抗原結合への影響に関与する。
ヒト化抗体は抗体断片、例としてＦａｂであり、免疫複合体を生成するために一またはそれ以上の細胞障害性剤と選択的にコンジュゲートしている。またはヒト化抗体は完全長抗体、例として完全長ＩｇＧ１抗体であり得る。
【００８１】
ヒト抗体およびファージディスプレイ方法論
ヒト化の別法として、ヒト抗体を生成することができる。例えば、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが現在は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合欠損が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovitsら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovitsら, Nature 362:255-258 (1993); Bruggemannら, Year in Immuno., 7:33 (1993)；及び米国特許第５５４５８０６号、同５５６９８２５号、同５５９１６６９号（すべてのＧｅｎＰｈａｒｍ）、同５５４５８０７号、および国際公報９７／１７８５２を参照されたい。
【００８２】
別法として、ファージディスプレイ技術(McCaffertyら, Nature 348：552-553(1990))を、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させるために使用することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３またはｆｄの主要又は少数コートタンパク質遺伝子のいずれかにおいてイン-フレームをクローンし、ファージ粒子の表面において機能的抗体断片として表示される。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択により、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択がなされる。よって、ファージはＢ細胞の特性のいくつかを模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照のこと。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源がファージディスプレイのために使用可能である。Clacksonら, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化されたマウス脾臓から得られたＶ遺伝子の小ランダム組合せライブラリからの抗-オキサゾロン抗体の異なった配列を単離した。非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、多様な列の抗原(自己抗原を含む)に対する抗体を、Marksら, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffithら, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術に本質的に従って単離することができる。また、米国特許第5565332号及び同5573905号を参照のこと。
先に述べたように、ヒト抗体はインビトロで活性化されたＢ細胞により生成される（米国特許第5567610号および同第5229275号）。
【００８３】
抗体断片
ある状況では抗体全体より抗体断片を用いることに有用性がある。断片がより小さければ早く通過できるので、固形腫瘍へより接近しやすいであろう。
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、未処理の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)；及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照のこと)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。Ｆａｂ、ＦｖおよびＳｃＦｖ抗体断片はすべて大腸菌で発現して分泌されるので、大量の抗原断片を容易に生成することができる。抗体断片は上述した抗体ファージライブラリーから単離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。エピトープ残基に結合するサルベージレセプターを含むインビボでの半減期が長いＦａｂおよびＦ(ａｂ')２断片は米国特許第５８６９０４６号に述べられている。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開第93/16185号；米国特許第5571894号；及び米国特許第5587458号を参照のこと。ＦｖおよびｓＦｖは定常領域を欠損している無処理の結合部位を有する種のみである；故に、インビボで用いる際に非特異性結合を減らすのに好適である。ｓＦｖ融合タンパク質はｓＦｖのアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかでエフェクタータンパク質の融合が起こって構築されるものである。上述のAntibody Engineering, ed. Borrebaeckを参照。また、抗体断片は、例えば米国特許第5641870号に記載されているような「線形抗体」であってもよい。このような線形抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってよい。
【００８４】
二重特異性抗体 
二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に対する結合特異性を有する。例示的な二重特異性抗体は二つの異なるＣＤ２０タンパク質エピトープに結合しうる。このような他の抗体はＣＤ２０結合部位と他のタンパク質の結合部位を併せ持つであろう。または、抗ＣＤ２０アームはリンパ球上のトリガー分子、例としてＴ細胞レセプター分子(例として、CD3)、ＩｇＧのＦｃレセプター分子 (ＦｃγＲ)、例として ＦｃγＲI (CD64)、ＦｃγＲII (CD32) およびＦｃγＲIII (CD16)、または NKG2D もしくは他のＮＫ細胞活性化リガンドに結合するアームを併せ持ち、ＣＤ２０発現細胞への細胞性防御機構を局在化する。二重特異性抗体はＣＤ２０を発現する細胞へ細胞障害性剤を局在化するために用いることができる。これらの抗体はＣＤ２０結合アームおよび細胞障害性剤（例として、サポリン、抗インターフェロンα、ビンカ・アルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート、または放射性同位体ハプテン）結合アームを有する。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
国際公報96/16673では二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体を詳述しており、米国特許第5837234では二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩ抗体について開示されている。二重特異性抗ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体は国際公報98/02463に示されている。米国特許第5821337号は二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＣＤ３抗体について教示している。
【００８５】
二重特異性抗の作製方法は当分野において既知である。全長二重特異性抗体の伝統的な組換え産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの該鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等, Nature, 305:537-539 (1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公報93/08829号及びTraunecker等,EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されている。 
異なったアプローチ法によると、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗原−抗体結合部位）を、免疫グロブリン不変ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常部との融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、そして、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、作製に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率を提供する態様において、三つのポリペプチドフラグメントの相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又は、その比率が特に重要性を持たないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【００８６】
このアプローチ法の好適な実施態様において、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖、及び他方のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)を含む。二重特異性分子の半分しか免疫グロブリン軽鎖がないことで容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公報94/04690に開示されている。二重特異性抗体を作製する更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
米国特許第5731168号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の境界面を操作することにより組換え細胞培養から回収するヘテロ二量体のパーセントを最大にすることができる。好適な境界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の境界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置換される。大きな側鎖と同じ又はより小さいサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(アラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモ二量体のような不要の他の最終産物に対してヘテロ二量体の収量を増大させるメカニズムが提供される。 
【００８７】
二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロ複合体抗体」もまた含む。例えば、ヘテロ複合体の抗体の一方はアビジンに結合され、他方はビオチンに結合され得る。そのような抗体は、例えば、不要の細胞に対する免疫系細胞を標的とするため(米国特許第４，６７６，９８０号)、及びＨＩＶ感染の治療のため(国際公報91/00360、国際公報92/200373、及びＥＰ03089)に提案された。ヘテロ複合体抗体は、任意の簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当該分野において良く知られており、幾つかの架橋技術と共に米国特許第4676980号に開示されている。 
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science, 229:81 (1985) は、無処理の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つを、次にメルカプトエチルアミンによる還元でＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。生成した二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【００８８】
二重特異性抗体を形成するために科学的に結合して大腸菌からＦａｂ'-ＳＨ断片を直接回収することが近年の進歩により容易になった。Shalabyら, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)では、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の生成について述べている。それぞれのＦａｂ'断片は別々に大腸菌から分泌され、二重特異性抗体を形成するためにインビトロで科学的に直接結合されやすい。故に、ヒト胸部腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の溶解性活性トリガーと同様に、形成された二重特異性抗体はＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞および正常ヒトＴ細胞に結合することが可能であった。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを用いて生成されている。Kostelnyら, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合によって二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法は、抗体ホモダイマーの生産にも用いることができる。Hollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)に記載の「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作成するための別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の二つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と結合している重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成し、それによって二つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用によって、二重特異性抗体断片を製造する他の方策も報告されている。Gruberら, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
【００８９】
多価抗体 
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び／又は異化)されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により素速く生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は３ないし８、好ましくは４の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖(好ましくは２つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はＶＤ１-(Ｘ１)ｎ−ＶＤ２−(Ｘ２)ｎ−Ｆｃを有し、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の１つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は：ＶＨ-ＣＨ１-柔軟なリンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも２つ(好ましくは４つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約２〜約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、あるいはＣＬドメインをさらに有する。
【００９０】
ベクター、宿主細胞および組み換え法
宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載の組み換えｍＡｂ、イムノアドヘシン及び本明細書中に記載の他のポリペプチドアンタゴニストをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日に公開された ＤＤ２６６７１０に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)であるが、他の大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３７)及び大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)のような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
【００９１】
完全長抗体、抗体断片、および抗体融合タンパク質は細菌内で生成することができ、特にグリコシル化およびＦｃエフェクター機能は必要でない、例として、治療的抗体が細胞障害性剤（例として、毒素）にコンジュゲートして、その免疫コンジュゲートが腫瘍細胞破壊に効果的である場合など。全長抗体は循環中で半減期が長い。大腸菌での生成がより早くよりコスト効率がよい。大腸菌における抗体断片およびポリペプチドの発現方法について、発現および分泌を最適化する転写開始領域（ＴＩＲ）およびシグナル配列を記載している米国特許第5,648,237号 (Carterら)、同第5,789,199号(Jolyら)、および同第5,840,523号 (Simmonsら)を参照のこと。これらの特許文献はここ文献として組み込まれる。発現後、可溶性分画の大腸菌ペーストから抗体を単離し、例としてアイソタイプによるプロテインＡまたはＧカラムにより精製しうる。例としてＣＨＯ細胞での発現抗体精製工程と同様にして最終的精製を行う。
【００９２】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＣＤ２０抗体などの抗体コードベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能でここで使用できる、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ.ラクティス、Ｋ．フラギリス(ＡＴＣＣ１２４２４)、Ｋ.ブルガリカス(ＡＴＣＣ１６０４５)、Ｋ．ウィッケラミイ(ＡＴＣＣ２４１７８)、Ｋ.ワルチイ(ＡＴＣＣ５６５００)、Ｋ．ドロソフィラルム(ＡＴＣＣ３６９０６)、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアナス；ヤローウィア(ＥＰ４０２２２６)；ピチアパストリス(ＥＰ１８３０７０)；カンジダ；トリコデルマ・リーシア(ＥＰ２４４２３４)；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属宿主、例えば偽巣性コウジ菌及びクロカビが使用できる。
例えばグリコシル化ＣＤ２０結合抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス・モリ ＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、そのようなウィルスは本発明においてここに記載したウィルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質転換に使用できる。
綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。
【００９３】
しかしながら、脊椎動物細胞におけるものが最も興味深く、培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１);ヒト胚腎臓株（２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）;サルの腎細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０); アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７); ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ２); イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４); バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２); ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５); ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５); マウス乳房腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１);ＴＲＩ細胞（Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)）；ＭＲＣ５細胞;ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。
宿主細胞は、Ｂ細胞枯渇薬剤、例えばＣＤ２０結合抗体やインテグリンアンタゴニスト抗体生産のために発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
【００９４】
宿主細胞の培養
本発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ),(シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第4767704号；同4657866号；同4927762号；同4560655号；又は同5122469号；国際公開第90/03430号；国際公開第87/00195号；又は米国再発行特許第30985号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【００９５】
抗体の精製
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔に生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。Carter等, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌された抗体の単離方法を記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間解凍する。細胞細片は遠心分離で除去できる。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＰｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
【００９６】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる（Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986)）。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂（J.T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
予備的精製工程に続いて、目的の抗体および混入物を含む混合液をｐＨ約２．５−４．５、好ましくは低塩濃度（例として、約０−０．２５Ｍ塩）の溶出緩衝液を用いて低ｐＨ疎水性作用クロマトグラフィを行う。
【００９７】
抗体コンジュゲート
抗体は細胞障害性剤、例として毒素または放射性同位体とコンジュゲートしうる。ある実施態様では、毒素はカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウリスタチンＥおよびその類似体または誘導体が好ましい。
【００９８】
抗体組成物の治療的用途
本発明のＣＤ２０結合抗体は、多くの悪性腫瘍および非悪性疾患、例えば自己免疫性疾患および関連症状、およびＢ細胞リンパ腫および白血病を含むＣＤ２０発現Ｂ細胞に特徴があるＢ細胞腫瘍ないしは悪性物の治療に有用である。骨髄の幹細胞(Ｂ細胞プロジェニター)はＣＤ２０抗原を欠損しており、治療後には健康なＢ細胞の再産生が可能となり、数か月以内には正常レベルにまで回復する。
【００９９】
ここで言う「自己免疫疾患」とは、個体自身の組織から生じて個体自身の組織に対して起こる疾患又は障害、あるいはその同時分離いたものないしは徴候又は結果として生じる症状である。自己免疫疾患又は障害の例には、限定するものではないが、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節症、乾癬の関節炎及び強直性脊椎炎）、乾癬、アトピー性皮膚炎を含む皮膚炎；慢性特発性蕁麻疹、例えば慢性自己免疫蕁麻疹、多発性筋炎／皮膚筋炎、中毒性表皮の表皮壊死症、全身強皮症及び硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（クローン病、潰瘍性大腸炎）と関連している応答、及び膿皮症壊疽の同時分離を伴うＩＢＤ、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、及び／又は上強膜炎）、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む呼吸窮迫症候群、髄膜炎、ＩｇＥ媒介性疾患、例えばアナフィラキシー及びアレルギー性鼻炎、ラスマッセン脳炎のような脳炎、ブドウ膜炎、大腸炎、例えば顕微鏡的大腸炎及び膠原性大腸炎、膜性ＧＮなどの糸球体腎炎（ＧＮ）、特発性膜性ＧＮ、Ｉ型及びＩＩ型及び急速進行性ＧＮを含む膜性増殖性ＧＮ（ＭＰＧＮ）、アレルギー症状、湿疹、喘息、Ｔ細胞の浸潤が関与している症状及び慢性炎症反応、アテローム性動脈硬化症、自己免疫心筋炎、白血球癒着不全、皮膚ＳＬＥのような全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス（腎炎、脳炎、小児科、非腎臓、ジスコイド、脱毛症を含む）、若年型糖尿病、脊髄視覚ＭＳなどの多発性硬化症（ＭＳ）、アレルギー性脳脊髄炎、サイトカイン及びＴリンパ球によって媒介される急性及び遅発性過敏症と関連している免疫応答、結核、サルコイドーシス、ヴェゲナー肉芽腫症を含む肉芽腫症、無顆粒球症、脈管炎（大動脈管炎（リウマチ性多発筋痛症及び巨細胞（高安）動脈炎を含む）、中脈管炎（川崎病および結節性多発性動脈炎を含む）、ＣＮＳ脈管炎、及び脈管炎関連ＡＮＣＡ、例えばチャーグ・ストラウス脈管炎又は症候群（ＣＳＳ））、無形成性貧血、クームス陽性貧血症、ダイアモンド・ブラックファン(Blackfan)貧血症、自己免疫溶血性貧血（ＡＩＨＡ）を含む免疫溶血性貧血、悪性貧血、純粋な赤血球形成不全（赤芽球癆）、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、血友病Ａ、自己免疫好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球血管外遊出が関与している疾患、ＣＮＳ炎症性障害、多器官損傷症候群、重症筋無力症、抗原抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病、キャッスルマン症候群、グッドパスチュア症候群、ランバート・イートン筋無力症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、固形臓器移植拒絶反応（高い試験板反応性の抗体価、組織のＩｇＡ沈澱物及び腎移植、肝移植、腸移植、心臓移植に起因している拒絶などのための前処置を含む）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、類天疱瘡水疱、天疱瘡（尋常性、落葉状及び天疱瘡粘液膜類天疱瘡を含む）、自己免疫多腺性内分泌障害、ライター症候群、スティッフマン症候群、免疫複合体腎炎、ＩｇＭ多発性神経炎又はＩｇＭ媒介性神経病、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓症血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫血小板減少を含む血小板減少（例えば心筋梗��患者に発現）、自己免疫精巣炎及び卵巣炎を含む精巣及び卵巣の自己免疫疾患、原発性甲状腺機能低下症；自己免疫性甲状腺炎を含む自己免疫内分泌性疾患、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、亜急性の甲状腺炎、特発性の甲状腺機能低下症、アジソン病、甲状腺機能亢進症、自己免疫多腺性症候群（又は多腺性内分泌障害症候群）、小児ＩＤＤＭを含むインシュリン依存性真正糖尿病（ＩＤＤＭ）とも称されるＩ型糖尿病、及びシーハン症候群；自己免疫肝炎、リンパ系間質性肺炎（ＨＩＶ）、閉塞性細気管支炎（非移植）対ＮＳＩＰ、ギランバレ症候群、ベルジェ病（ＩｇＡネフロパシ）、原発性胆管萎縮症、脂肪便症（グルテン腸疾患）、同時分離疱疹状皮膚炎を有する抵抗性スプルー、クリオグロブリン血症、アミル栄養側索硬化症（ＡＬＳ；筋萎縮性側索硬化症）、冠状動脈疾患、自己免疫内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫聴力障害、眼球クローヌス筋硬直症候群（ＯＭＳ）、抵抗性多発性軟骨炎のような多発性軟骨炎、肺胞蛋白症、アミロイドーシス、巨細胞肝炎、強膜炎、不明な／未知の重大なモノクローナル免疫グロブリン増多症（ＭＧＵＳ）、末梢神経障害、腫瘍随伴症候群、チャネル病、例えば癲癇、片頭痛、不整性、筋疾患、難聴、失明、周期性麻痺及びＣＮＳのチャネル病；自閉症、炎症性筋疾患及び巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）が含まれる。
【０１００】
ＣＤ２０を発現するＢ細胞に特徴があるＢ細胞新生物又は悪性腫瘍は、細胞表面上にＣＤ２０を発現する細胞の異常増幅を含むものである。ＣＤ２０＋Ｂ細胞を有するＢ細胞腫瘍には、リンパ球優性ホジキン病(LPHD)を含むＣＤ２０陽性ホジキン病；非ホジキンリンパ腫(NHL)；濾胞性中心細胞リンパ腫(FCC)；急性リンパ性白血病(ALL)；慢性リンパ球性白血病(CLL)；ヘアリー細胞白血病が含まれる。非ホジキンリンパ腫には、低程度／濾胞性非ホジキンリンパ腫(NHL)、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、中程度／濾胞性ＮＨＬ、中程度びまん性ＮＨＬ、高程度免疫芽細胞ＮＨＬ、高程度リンパ芽球性NHL、高程度小正円形細胞(non-cleaved cell)ＮＨＬ、厖大な病気のＮＨＬ、プラズマ細胞様リンパ球性リンパ腫、外套細胞リンパ腫、エイズ関連リンパ腫およびワルデンストロームマクログロブリン血症が含まれる。これらの癌の再発治療も含まれる。ＬＰＨＤは頻回の放射線又は化学療法にもかかわらず再発する傾向にあるホジキン型の疾患であり、ＣＤ２０陽性悪性細胞の特徴がある。ＣＬＬはリンパ球といわれる成熟Ｂ細胞の４つの主要な白血病Ａ癌のうちの一つである。ＣＬＬは血液、骨髄およびリンパ球組織における細胞の進行性蓄積が顕在化する。無痛性のリンパ腫は発育が遅く、平均的な患者は寛解と再発を数多く繰り返した後に６から１０年生存する不治の疾患である。
【０１０１】
本明細書で使用する「非ホジキンリンパ腫」又は「ＮＨＬ」という用語は、ホジキンリンパ腫以外のリンパ系の癌を意味する。通常、ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫とは、ホジキンリンパ腫にはリードシュテルンベルク細胞が存在し、非ホジキンリンパ腫には前記細胞が不在であることにより区別することができる。本明細書で使用する用語に含まれる非ホジキンリンパ腫の例は、従来技術に既知の分類方式、例えばColor Atlas of Clinical Hematology第３版; A. Victor Hoffbrand及びJohn E. Pettit（編）（Harcourt Publishers Limited 2000)(特に図11.57、11.58及び／又は11.59参照）に記載の改訂版European-American Lymphoma (REAL)方式に従って当業者（腫瘍学者または病理学者）によって認識されるあらゆるものを含む。より具体的な例としては、限定するものではないが、再発性又は抵抗性ＮＨＬ、前線低悪性度ＮＨＬ、第III／IV期ＮＨＬ、化学療法に抵抗性のＮＨＬ、前駆体Ｂリンパ芽球性白血病及び／又はリンパ腫、小リンパ球リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病及び／又は前リンパ球性白血病及び／又は小リンパ球リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、immunocytoma及び／又はリンパ形質細胞性リンパ腫、周辺帯Ｂ細胞リンパ腫、脾周辺帯リンパ腫、結節外周辺帯−ＭＡＬＴリンパ腫、結節周辺帯リンパ腫、有毛細胞白血病、プラズマ細胞腫及び／又は形質細胞骨髄腫、低悪性度／濾胞性リンパ腫、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、濾胞性中心リンパ腫（濾胞性）、中悪性度拡散性ＮＨＬ、広汎性大Ｂ細胞リンパ腫、高悪性度ＮＨＬ（高悪性度前線ＮＨＬ及び高悪性度再発性ＮＨＬを含む）、自己幹細胞移植後の又は自己肝細胞移植に抵抗性のＮＨＬ再発、原発性縦隔大Ｂ細胞リンパ腫、原発性浸出リンパ腫、高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度非切断小細胞性ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ、バーキットリンパ腫、前駆体（周辺性）Ｔ細胞リンパ芽球性白血病及び／又はリンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫及び／又は白血病、Ｔ細胞慢性リンパ球性白血病及び／又は前リンパ球性白血病、大顆粒リンパ球性白血病、菌状息肉腫及び／又はセザリー症候群、結節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞（鼻腔型）リンパ腫、超疾患型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、皮下脂肪組織炎様Ｔ細胞リンパ腫、皮膚（皮膚性）リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、血管動原体リンパ腫、腸Ｔ細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞（特に断らない限り）リンパ腫及び血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫が挙げられる。
【０１０２】
具体的な実施態様では、本発明のＣＤ２０＋Ｂ細胞を有するＢ細胞癌の治療法は、非ホジキンリンパ腫(NHL)、リンパ球優性ホジキン病(LPHD)、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、慢性リンパ球性白血病(CLL)を治療するために用いられる。
具体的な実施態様では、自己免疫性疾患の治療またはＢ細胞枯渇の方法は、リウマチ様関節炎、および若年性関節リウマチ、ループス腎炎を含む全身性紅斑性狼瘡(SLE)、ヴェゲナー病、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、抗血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、IgA腎症、IgM多発性神経炎、重症筋無力症、脈管炎、糖尿病、レーノー症候群、シェーグレン症候群、および腎炎の治療に用いられる。
Ｂ細胞枯渇の望ましいレベルは疾患による。ＣＤ２０陽性癌の治療では、本発明の抗ＣＤ２０抗体の標的であるＢ細胞の枯渇を最大にすることが望ましい。ゆえに、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞新生物の治療には、例えば、腫瘍成長（サイズ）、癌性細胞種類の増殖、転移、他の徴候及び特定の癌の症状をモニターすることによって当分野の医師によって評価される疾患の進行を少なくとも予防するために十分な程度のＢ細胞が枯渇されることが望ましい。好ましくは、少なくとも２か月、より好ましくは３か月、さらにより好ましくは４か月、より好ましくは５か月、さらにより好ましくは６か月以上の間の疾患の進行を予防するために十分な程度のＢ細胞枯渇である。より好ましい実施態様では、少なくとも６か月、より好ましくは９か月、より好ましくは１年、より好ましくは２年、より好ましくは３年、さらにより好ましくは５年以上の寛解期間を増やすために十分な程度のＢ細胞枯渇である。最も好ましい実施態様では、Ｂ細胞枯渇は疾患を治癒させるために十分な程度である。好ましい実施態様では、癌患者のＢ細胞枯渇は治療前の基準レベルの少なくとも約７５％、より好ましくは８０％、８５％、９０％、９５％、９９％及びさらに１００％である。
【０１０３】
自己免疫性疾患の治療では、ＣＤ２０結合抗体の用量を調整することによって、個々の患者の疾患及び／又は症状の重症度に従いＢ細胞枯渇の程度を調整することが望ましい。したがって、Ｂ細胞枯渇は完全でなくともよい。あるいは、初期治療ではすべてのＢ細胞枯渇が望ましいが、継続治療では、部分的な枯渇のみを達成するために用量を調整してもよく、用量は部分的な枯渇のみを達成するように調整してもよい。一実施態様では、Ｂ細胞枯渇は少なくとも２０％であり、すなわち、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞が治療前の基準レベルと比較して８０％以下残っている。他の実施態様では、Ｂ細胞枯渇は、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％以上である。好ましくは、Ｂ細胞枯渇は、疾患の進行を停止する、より好ましくは治療下にある特定の疾患の徴候及び症状を緩和する、更により好ましくは疾患を治癒するのに十分な程度である。
腫瘍治療の効率または効果を評価するパラメータが適当な疾患で医師に知られている。一般に、医師は特定の疾患の徴候及び症状の減弱を求めるであろう。パラメータは疾患の進行の中央値時間、緩解、疾患の安定時間を含む。
【０１０４】
以下に示す文献は、リンパ腫およびＣＬＬ、その診断、治療および治療効果を評価するための標準的な医療手順について記載している。Canellos GP, Lister, TA, Sklar JL: The Lymphomas.  W.B.Saunders Company, Philadelphia, 1998、van Besien K及びCabanillas, F: Clinical Manifestations, Staging and Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma, Chap. 70, 1293-1338頁, : Hematology , Basic Principles and Practice, 3rd ed. Hoffman 等 (編集). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000、及びRai, K及びPatel, D:Chronic Lymphocytic Leukemia, Chap. 72, 1350-1362頁, : Hematology , Basic Principles and Practice, 3rd ed. Hoffman等(編集). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000。
自己免疫または自己免疫関連疾患の治療の効率および成功率を評価するためのパラメータは、適当な疾患で医師に知られている。一般に、医師は特定の疾患の徴候及び症状の減弱を求めるであろう。以下は、実施例の方法による。
一実施態様では、本発明の方法及び組成物は、関節リウマチ(ＲＡ)の治療に有用である。ＲＡは多関節の炎症、軟骨の減少、骨侵食により関節の破壊および最終的に関節機能の減退をもたらす特徴がある。加えて、ＲＡは全身性疾患であるため、他の組織、例として肺、眼及び骨髄に影響しうる。
【０１０５】
ＣＤ２０結合抗体を、初期ＲＡ（すなわち、メトトレキセート(ＭＴＸ)未処理）患者の一次治療として、又は例えばＭＴＸもしくはシクロフォスファミドと組み合わせて用いることができる。あるいは、前記抗体を、ＤＭＡＲＤ及び／又はＭＴＸ抵抗性を示す患者の二次療法としての治療に、例えばＭＴＸと併用して使用することができる。また、ＣＤ２０結合抗体は、より効果的に殺傷するために血流内にＢ細胞を動員するインテグリン抗体などのＢ細胞動員化薬剤と組み合わせて投与されうる。ＣＤ２０結合抗体は、関節リウマチの炎症と関係する疼痛の低減、構造的損傷の遅延、関節損傷を予防及びコントロールするため、更に通常、中等度から重度の関節リウマチの徴候及び症状を低減するために有用である。関節リウマチ患者は、ＲＡ治療に用いられる他の薬剤（以下の併用療法を参照）の前、後又は同時に、ＣＤ２０抗体で治療されうる。一実施態様では、既に疾患変更抗リウマチ剤の効かなかった患者及び／又はメトトレキセート単独に十分応答しなかった患者はＣＤ２０結合抗体で治療される。他の実施態様では、患者は、ヒト化ＣＤ２０結合抗体、ＣＤ２０結合抗体とシクロホスファミド、又はＣＤ２０結合抗体とメトトレキセートが投与される。
【０１０６】
関節リウマチの治療効果を評価するある方法は、American College of Rheumatology (ACR)診断基準に基づくものであり、圧痛および腫大した関節の改善の割合を測定するものである。関節リウマチ患者は、無抗体治療（例として、治療前の基準）またはプラセボ治療と比較して例としてＡＣＲ２０（２０パーセントの改善）でスコア付けをする。抗体治療の効果を評価する他の方法は、Ｘ線画像、例として骨の侵食および関節腔の狭小化等の構造的傷害のスコア付けに用いられる鋭Ｘ線スコアを含む。また、患者は、治療期間中または治療後にHealth Assessment Questionnaire [HAQ]スコア、AIMSスコア、SF-36に基づいて能力障害の予防または改善の評価をすることができる。ＡＣＲ２０診断基準は、圧痛（痛み）関節数と腫大関節数の両方に２０％の改善があり、５つの追加測定のうち少なくとも３つに２０％の改善があることを含む。
１．視覚的類似尺度（ＶＡＳ）による患者の痛み評価
２．疾患活動性の患者の全体評価（ＶＡＳ）
３．疾患活動性の医師の全体評価（ＶＡＳ）
４．Health Assessment Questionnaireにより測定した能力障害の患者の自己評価、および
５．急性期反応、ＣＲＰまたはＥＳＲ
ＡＣＲ５０および７０も同様に定義する。好ましくは本発明のＣＤ２０結合抗体などのＢ細胞枯渇薬剤を少なくともＡＣＲ２０のスコア、好ましくは少なくともＡＣＲ３０、より好ましくは少なくともＡＣＲ５０、さらにより好ましくは少なくともＡＣＲ７０、最も好ましくは少なくともＡＣＲ７５より高いスコアに達する用量を患者に投与する。
【０１０７】
乾癬性関節炎は特異的で明瞭なＸ線撮影像的特徴を有する。乾癬性関節炎の関節侵食および関節腔狭小化も同様にシャープ(sharp)スコアにより評価しうる。本明細書中に記載のヒト化ＣＤ２０結合抗体などのＢ細胞枯渇薬剤は関節傷害の予防だけでなく疾患の兆候および疾病の症状の減弱に利用可能である。
さらに、本発明の他の側面では、本発明のヒト化ＣＤ２０結合抗体の治療的有効量をＳＬＥ患者に投与することによるループスまたはＳＬＥの治療方法である。ＳＬＥＤＡＩスコアでは疾患の活動性を数量で表す。ＳＬＥＤＡＩは疾患活動性に相関することが知られている２４の臨床および治験の荷重指数であり、０−１０３の数的範囲である。Bryan Gescuk & John Davis, “Novel therapeutic agent for systemic lupus erythematosus” Current Opinion in Rheumatology 2002, 14:515-521を参照。二本鎖ＤＮＡに対する抗体は、血清クレアチニン、尿蛋白、または尿中の血液で顕著に生成され増加することで定義される腎性発赤および他のループスの症状を引き起こすと信じられている。代わりに、または加えて、抗核抗体および二本鎖ＤＮＡに対する抗体のレベルで患者をモニターする。ＳＬＥ治療は高用量の副腎皮質ステロイドおよび／またはシクロホスファミド(HDCC)を含む。
【０１０８】
脊椎関節症は関節疾患のグループであり、硬直性脊椎炎、乾癬性関節炎、クローン病を含む。治療成果は、確認された患者および医師の全体的評価測定方法によって決定しうる。
様々な医薬が乾癬治療に用いられる；疾患重症度に関連して治療が異なる。より軽度な感染患者は一般的に局所治療、例として局所ステロイド、アンスラリン(anthralin)、カルシポトリエン(calcipotriene)、クロベタゾール(clobetasol)、およびタザロテン(tazarotene)が、全身的（メトトレキセート、レチノイド、シクロスポリン、ＰＵＶＡおよびＵＶＢ）治療を行うと思われる中度および重症乾癬患者では疾患の管理に有効である。タールも利用される。これらの治療は、安全性の考慮、時間のかかる投与計画、または不便な治療過程を複合して有する。さらに、いくつかは高価な設備および設置のための場所を必要とする。全身性医薬は、高血圧、高脂血症、骨髄抑制、肝疾患、腎疾患、および消化器系不調を含む様々な副作用を引き起こしうる。また、光線療法の使用は皮膚癌の発症を増加させうる。局所療法の使用に伴う不便および不快感に加え、光線療法および全身性治療は患者を処置および非処置の周期におき、その副作用のために生涯曝露をモニターする必要がある。
乾癬の治療効果は、医師の包括的評価(ＰＧＡ)変化、および乾癬領域および重症度指数(ＰＡＳＩ)スコア、乾癬症状評価(ＰＳＡ)を含む臨床兆候および疾患の症状の変化をモニターし、基礎となる症状と比較することによって評価する。特定の時点で経験した掻痒の程度を表すために用いられる視覚的類似尺度の処置を通して定期的に患者を測定する。
【０１０９】
本発明のＦｃ変異を有する抗ＨＥＲ２抗体はＨＥＲ２発現癌または過剰発現癌の千代ウニ有用である。「ＨＥＲ２発現癌」は、その細胞表面上に存在するＨＥＲ２タンパク質を有する細胞を含むものである。ＨＥＲレセプターを「過剰発現する」癌は、同じ組織型の癌性でない細胞と比較して、細胞表面上のＨＥＲレセプター、例えばＨＥＲ２を有意に高いレベル有するものである。このような過剰発現は、遺伝子増幅により、又は転写又は翻訳を増加させることにより引き起こされてもよい。ＨＥＲレセプター過剰発現は、細胞表面のＨＥＲタンパク質存在の増加レベルを評価することにより、診断又は予後アッセイで決定されうる(例えば、免疫組織化学アッセイ；ＩＨＣによる)。あるいは、又は加えて、細胞のＨＥＲコード化核酸のレベルを測定してもよい、例えば、蛍光インサイトハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ；1998年10月公開の国際公開公報98/45479参照)、サザンブロット法、又はポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)法、例えばリアルタイム定量ＰＣＲ(ＲＴ−ＰＣＲ)。また、血清のような生体液中の脱落抗原(例えば、ＨＥＲ細胞外ドメイン)を測定することにより(例えば、1990年6月12日に公開の米国特許第4,933,294号；1991年4月18日公開の国際公開公報91/15264；1995年3月28日公開の米国特許第5,401,638号；及びSiasら, J. Immunol. Methods 132: 73-80(1990))ＨＥＲレセプター過剰発現を研究してもよい。前記アッセイのみならず、様々なインビボアッセイが技術熟練者において利用できる。例えば、検知できるラベル、例えば放射性同位体で任意に標識された抗体に患者の体にある細胞を暴露してもよく、患者の細胞への抗体の結合は、例えば放射活性の外側スキャンニングにより、又は抗体に先に暴露された患者から得られたバイオプシーを分析することにより評価される。
【０１１０】
Ｈｅｒ２抗体組成物で治療されうる様々な癌を以下に挙げる。
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長により特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態に相当するか、または表すものである。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫(髄芽細胞腫および網膜芽細胞腫を含む)、肉腫(脂肪肉腫および滑液細胞肉腫を含む)、神経内分泌腫瘍(カルチノイド腫瘍、ガストリン産生腫瘍、および膵島細胞癌を含む)、中皮腫、シュワン細胞腫(聴神経腫を含む)、髄膜腫、腺癌、メラノーマ、及び白血病又はリンパ悪性腫瘍が含まれる。このような癌のより具体的な例には、扁平上皮癌(squamous cell cancer)(例えば、上皮性扁平上皮癌（epithelial squamous cell cancer）)、小細胞肺癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃(gastric又はstomach)癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓(kidney又はrenal)癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆道の腫瘍、及び頭部及び頸部の癌が含まれる。
【０１１１】
また、ＨＥＲ２抗体は非悪性の疾病又は疾患、例として、自己免疫疾患（例えば、乾癬）；子宮内膜症；強皮症；再狭窄；大腸ポリープ、鼻ポリープ、または消化管ポリープ等のポリープ；線維腺腫；呼吸器疾患；胆嚢炎；神経線維腫症；多発性嚢胞腎疾患；炎症性疾患；乾癬および皮膚炎を含む皮膚疾患；血管系疾患；血管上皮細胞の異常増殖が関与する症状；炎症性腸疾患；メネトリエ病、分泌性腺腫、またはタンパク質減少症；副腎性疾患；血管形成性疾患；老年性黄斑変性症、予測される眼性ヒストプラズマ症症候群(presumed ocular histoplasmosis syndrome)、増殖性糖尿病網膜症由来の網膜血管新生、網膜血管新生、糖尿病網膜症、または老年性黄斑変性症等の眼疾患；変形性関節症、くる病および骨粗鬆症等の骨関連病変；脳虚血後障害；肝硬変、肺線維症、サルコイドーシス、甲状腺炎、全身性高粘性症候群(hyperviscosity syndrome systemic)、オースラー-ウェーバー-ランデュ病、慢性閉塞性肺疾患、または火傷、外傷、放射線、脳卒中、低酸素症、または虚血などの線維性または浮腫疾患；皮膚の過敏症反応；糖尿病性網膜症および糖尿病性腎症；ギラン-バレー症候群；移植片対宿主病または移植片拒絶反応；パジェット病；骨または関節炎；フォトエイジング(例えば、ヒトの皮膚のＵＶ照射)；良性前立腺肥大；アデノウイルス、ハンタウイルス、ライム病菌、エルシニア菌、および百日咳菌から選択した微生物性病原体を含む微生物感染症；血小板凝集による血栓；子宮内膜症、卵巣過剰刺激症候群、子癇前症、機能不全子宮出血、または機能性子宮出血等の生殖性症状；滑膜炎；急性および慢性腎症（増殖性糸球体腎炎および糖尿病誘発性腎性疾患を含む）；湿疹；肥大性瘢痕形成；内毒性ショック(endotoxic shockおよび真菌感染：家族性大腸ポリープ症；神経変性疾患(例えば、アルツハイマー氏病、ＡＩＤＳ関連認知症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、網膜色素変性症、脊髄性筋萎縮症、および小脳変性症)；骨髄異形成症候群；再生不良性貧血；虚血性損傷；肺、腎臓、または肝臓の線維症；Ｔ細胞媒介性過敏症疾患；乳児肥大性幽門狭窄(infantile hypertrophic pyloric stenosis)；泌尿器系閉塞性症候群；乾癬性関節炎；および橋本甲状腺炎の治療に用いられうることも考慮される。ここでの治療に好ましい非悪性の症状には、乾癬、子宮内膜症、強皮症、血管系疾患（例えば、再狭窄、アテローム動脈硬化、冠動脈疾患、または高血圧）、大腸ポリープ、線維腺腫、または呼吸器疾患（例えば、喘息、気管支炎(bronchitis、bronchieactasis)、嚢胞性線維症）を含む。
【０１１２】
本発明の抗血管形成抗体および抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の腫瘍性および非腫瘍性の疾患を含む、血管形成性疾患の治療に用いられる。腫瘍性疾患には、限定するものではないが、上皮癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病又はリンパ性の悪性腫瘍が含まれる。そのような癌のより具体的な例として、腎臓又は腎臓癌、乳癌、大腸癌、直腸ガン、結腸直腸癌、肺癌を含んでいる小さい細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の肺および扁平上皮癌の腺癌、扁平上皮細胞癌(例えば上皮の扁平上皮細胞癌)、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、肝癌、膀胱癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、胃腸癌を含む腸又は胃癌、膵癌、頭頸部癌、神経膠芽腫、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、卵胞膜細胞腫、卵巣男性胚細胞腫、肝癌、非ホジキン性リンパ腫(ＮＨＬ)を含む血液学的な悪性腫瘍、多発性骨髄腫および急性血液学的な悪性腫瘍、子宮内膜又は子宮上皮癌、子宮内膜症、線維肉腫、絨毛膜癌、唾液腺上皮癌、外陰部癌、甲状腺癌、食道上皮癌、肝癌、肛門の上皮癌、陰茎上皮癌、上咽頭癌、喉頭の上皮癌、カポシ肉腫、メラノーマ、皮膚上皮癌、シュワン細胞腫、乏突起細胞腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨原性肉種、平滑筋肉腫、尿路上皮癌、甲状腺の上皮癌、ウィルムス腫瘍、並びに母斑症と関係する異常な血管増殖、浮腫(脳腫瘍と関係するものなど)およびメイグス症候群などがある。より具体的には、本発明のアンタゴニストによって治療されうる癌には、腎臓癌、乳癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、前立腺癌、肝癌、頭頸部癌、メラノーマ、卵巣癌、中皮腫および多発性骨髄腫が含まれる。
【０１１３】
抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗血管形成抗体で治療されうる非腫瘍性の症状には、限定するものではないが、例えば、望ましくない又は異常な肥大、関節炎、関節リウマチ(ＲＡ)、乾癬、乾癬のプラーク、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化、アテローム硬化性プラーク、心筋梗塞からの浮腫、未熟児の網膜症を含む糖尿病性および他の増殖的な網膜症、水晶体後繊維増殖、血管新生緑内障、年齢関連性黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、角膜移植片拒絶、網膜／脈絡叢血管新生、角度(ルベオーシス)の血管新生、眼性新生血管疾患、血管再狭窄、動静脈奇形(ＡＶＭ)、髄膜腫、血管腫、血管線維腫、甲状腺の過形成(甲状腺機能亢進症を含む)、角膜および他の組織移植、慢性の炎症、肺炎症、急性の肺損傷／ＡＲＤＳ、敗血症、原発性肺高血圧症、悪性の肺滲出、大脳浮腫(例えば、急性の脳卒中／非開放性頭部損傷／外傷と関係するもの)、滑液炎症、ＲＡのパンヌス形成、筋炎骨化(myositis)、肥大性骨形成、骨関節炎(ＯＡ)、抵抗性腹水、多嚢胞性卵巣疾患、子宮内膜症、体液疾患(膵炎、コンパートメント症候群、熱傷、腸疾患)の第３の間隔、子宮類線維腫、早産、ＩＢＤなどの慢性炎症(クローン病および潰瘍性大腸炎)、腎臓同種異系移植片拒絶反応、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、望ましくないまたは異常な組織塊成長(非癌)、出血性関節、肥大性瘢痕、体毛成長の阻害、オスラー-ウェーバー症候群、化膿肉芽腫水晶体後繊維増殖、強皮症、トラコーマ、血管癒着、関節滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心嚢貯留液(心外膜炎と関係するものなど)および胸水が含まれる。
【０１１４】
本発明のＦｃアミノ酸変化を有する抗ＣＤ１１ａ抗体は、ＬＦＡ-１媒介性の疾患の治療に用いられる。「ＬＦＡ-１媒介性の疾患」なる用語は、リンパ球上のＬＦＡ-１レセプターを伴う細胞癒着相互作用によって引き起こされる病理学的な状態を意味する。そのような疾患には、Ｔ細胞炎症反応、例えば乾癬を含む炎症性皮膚病；炎症性腸疾患に伴う応答(例えばクローン病および潰瘍性大腸炎)；成人呼吸窮迫症候群；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；アレルギー性症状、例えばＴ細胞の浸潤および慢性の炎症反応を伴う湿疹および喘息および他の症状；皮膚過敏性反応(ツタウルシおよびアメリカツタウルシを含む)；アテローム性動脈硬化；白血球粘着力欠損；自己免疫性疾患、例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、真正糖尿病、多発性硬化症、レイノー症候群、自己免疫性甲状腺炎、実験的自己免疫性脳脊髄炎、シェーグレン症候群、若年型糖尿病、および一般的に結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽腫症および血管炎にみられるサイトカインおよびＴリンパ球によって媒介される遅延型過敏症に伴う免疫応答；悪性貧血；白血球血管外遊出を伴う疾患；ＣＮＳ炎症性疾患、敗血症又は外傷の二次性の多臓器障害症候群；自己免疫性溶血性貧血症；myethemia gravis；抗原-抗体複合体媒介性疾患；移植片対宿主病又は宿主対移植片病を含む全種類の移植拒否が含まれる。
【０１１５】
ＦｃＲｎへの結合を亢進させ、血清半減期を増加させる本発明のＦｃアミノ酸変化を有する抗ＩｇＥ抗体は、ＩｇＥ媒介性の疾患の治療に用いられる。
ＩｇＥ媒介性の疾患には、多くの通常天然に生じる吸入抗原および経口摂取の抗原やＩｇＥ抗体の継続的な産生に対して遺伝的に免疫学応答を起こすことに特徴があるアトピー性疾患が含まれる。具体的なアトピー性疾患には、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、過敏性皮膚炎およびアレルギー性胃腸疾患が含まれる。アトピー患者は複数のアレルギーに罹ることが多く、これは、彼らが、季節性、多年生、職業性のアレルゲンを含む多くの環境アレルゲンに対してやそれらから生じる症状に対してＩｇＥ抗体を有することを意味する。季節的なアレルゲンの例には花粉(例えば草、木、ライ麦、オオアワガエリ、ブタクサ)が含まれ、多年草アレルゲンの例には真菌類(例えば糸状菌、糸状菌胞子)、羽毛、動物および昆虫(例えば粉塵ダニ)壊死組織片が含まれる。職業アレルゲンの例には、洗剤、金属およびイソシアネートが含まれる。ＩｇＥ媒介性の反応を生じうる非抗原特異的刺激には、感染、刺激物、例として煙、燃焼臭気、ディーゼル排気粒子および二酸化硫黄、運動、冷感ストレスおよび感情的なストレスが含まれる。過敏性反応は、食物、毒物、ワクチン、ホルモン類、抗血清、酵素およびラテックス、抗生物質、筋弛緩物質、ビタミン、細胞毒素、オピエイトおよび多糖、例えばデキストリン、鉄デキストランおよびポリジェリン(polygeline)中のタンパク質への曝露により生じうる。
【０１１６】
しかしながら、亢進したＩｇＥレベルを伴う疾患は遺伝性の(アトピー性の)原因によるものに限らない。ＩｇＥ媒介性のようであり、本発明の製剤で治療されうる、亢進したＩｇＥレベルを伴う他の疾患には、過敏症(例えばアナフィラキシー型過敏症)、湿疹、蕁麻疹、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、寄生虫病、高ＩｇＥ徴候、毛細血管拡張性運動失調症、ウィスコット‐アルドリッチ症候群、チャーグ-シュトラウス症候群、全身性血管炎、胸腺リンパ形成不全症、ＩｇＥ骨髄腫、移植片対宿主反応、炎症性腸疾患(例えばクローン病、潰瘍性大腸炎、未確定の大腸炎および感染性大腸炎)、胃腸疾患、腸炎、粘膜炎(例えば経口粘膜炎、消化管系粘膜炎、鼻粘膜炎および直腸炎)、壊死性全腸炎および食道炎が含まれる。
【０１１７】
用量
当業の医師によく知られた治療効能および用量に関する因子次第で、毒素および副作用を最小限にする一方で治療効能を有効にする用量で本発明のアンタゴニストおよび抗体を投与するであろう。ＣＤ２０陽性癌または自己免疫疾患の治療のための治療的有効量は、約２５０ｍｇ／ｍ２〜約４００  ｍｇ／ｍ２  または５００  ｍｇ／ｍ２、好ましくは約２５０〜３７５ｍｇ／ｍ２の範囲とする。一実施態様では、用量範囲は、２７５−３７５ｍｇ／ｍ２である。ＣＤ２０陽性Ｂ細胞腫瘍の治療の一実施態様では、抗体は３００−３７５ｍｇ／ｍ２の範囲で投与する。Ｂ細胞リンパ腫、例として非ホジキンリンパ腫患者の治療のための具体的な実施態様では、本発明の抗ＣＤ２０抗体およびヒト化抗ＣＤ２０抗体は１０ｍｇ／ｋｇまたは３７５ｍｇ／ｍ２の用量で患者に投与されるであろう。一実施態様では、リツキシマブは７〜１５ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与されうる。ＮＨＬの治療のある用量投与計画では、治療の初めの１週間は10mg/kgの用量当たり抗体組成物一用量で投与し、２週間の間隔の後、同量の第二用量抗体を投与する。一般に、ＮＨＬ患者は１年に１度リンパ腫の再発によってこのような治療を受けるが、このような治療は繰り返される。他の用量投与計画では、低程度ＮＨＬ患者は４週間、ヒト化２Ｈ７の型、好ましくはｖ１６（週当たり３７５ｍｇ／ｍ２）を、続く５週目には抗体＋ＣＨＯＰ（シクロフォスファミド、ドキソルビシン(doxorubicin)、ビンクリスチンおよびプレドニゾン）またはＣＶＰ（シクロフォスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン）化学療法を３追加投与過程、３週ごとに３周期で投与する。
【０１１８】
関節リウマチ治療の一実施態様では、ヒト化抗体の用量範囲は２回の用量で１２５ｍｇ／ｍ２（約２００ｍｇ／用量と当量）〜６００ｍｇ／ｍ２、例として第１日目に初期用量２００ｍｇ、その後第１５日目には２００ｍｇの第二用量を投与する。異なる実施態様では、用量は１用量当たり２５０ｍｇ、２７５ｍｇ、３００ｍｇ、３２５ｍｇ、３５０ｍｇ、３７５ｍｇ、４００ｍｇ、４２５ｍｇ、４５０ｍｇ、４７５ｍｇ、５００ｍｇ、５２５ｍｇ、５５０ｍｇ、  ５７５ｍｇ、６００ｍｇである。
疾患の治療において、本発明のＣＤ２０結合抗体などのＢ細胞標的抗体は疾患において医師によって決定されるように慢性的または間欠的に患者に投与する。
静脈注入または皮下中により薬剤を投与している患者は有害事象、例として熱、寒気、灼熱感、無力症、および頭痛を経験する。このような有害事象を軽減または最大限小さくするために、治療的用量に続いて初期調整用量の抗体を患者に投与する。調整用量はより多くの用量に耐えるように治療用量より少ないであろう。
【０１１９】
投与経路
本発明の方法に用いられる抗体は医療実施者に公知な方法でヒト患者に投与される。例としてボーラスまたは一定期間中の継続注入、皮下的、筋肉内、動脈内、腹腔内、肺内、脳脊髄内、関節内、滑膜内、クモ膜下腔内、病巣内、または吸入(例えば、鼻腔内)、一般的には静脈内または皮下的投与により患者に投与される。
一実施態様では、ヒト化２Ｈ７抗体は注入溶媒として０．９％塩化ナトリウム溶液の静脈注入により投与される。
【０１２０】
併用療法
上述のＢ細胞腫瘍の治療に一またはそれ以上の治療薬、例として多剤投与での化学療法剤と組み合わせて本発明のＣＤ２０結合抗体で患者を治療する。ＣＤ２０結合抗体は連続的、同時、または化学療法剤と交代して、または他の治療に応答しないときに投与しうる。標準的なリンパ腫治療の化学療法は、シクロホスファミド、シタラビン(cytarabine)、メルファラン、ミトキサントロン(mitoxantrone)＋メルファランを含む。ＣＨＯＰは非ホジキンリンパ腫治療の最も一般的な化学療法投与の一つである。ＣＨＯＰ投与に用いられる薬剤は以下のとおりである：シクロホスファミド(ブランド名シトキサン(cytoxan)、ネオサル(neosar)); アドリアマイシン(ドキソルビシン/ヒドロキシドキソルビシン); ビンクリスチン(オンコビン); および、プレドニゾロン(時々デルタゾン(Deltasone)またはオラソン(Orasone)と呼ばれる)。特定の実施態様では、ＣＤ２０結合抗体は以下の化学療法剤、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの一またはそれ以上を組み合わせて必要とする患者に投与する。特定の実施態様では、リンパ腫患者（例として非ホジキンリンパ腫）は本発明の抗ＣＤ２０抗体をＣＨＯＰ(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン)療法と組み合わせて治療する。他の実施態様では、癌患者は本発明のヒト化ＣＤ２０結合抗体をＣＶＰ(シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびプレドニゾン)化学療法と組み合わせて治療する。具体的な実施態様では、ＣＤ２０陽性ＮＨＬ患者は、ヒト化２Ｈ７．ｖ１６または上記に開示したその変異体をＣＶＰと組み合わせて治療する。ＣＬＬ治療の特定の実施態様では、ＣＤ２０結合抗体はフルドラビンおよびシトキサンの一または両方での化学療法と組み合わせて投与する。
【０１２１】
上述の自己免疫疾患または自己免疫関連症状の治療に、本発明のＣＤ２０結合抗体などのＢ細胞枯渇薬剤を第二治療剤、例として免疫抑制剤と組み合わせて、例として多剤投与計画で患者を処置する。Ｂ細胞枯渇薬剤は連続的、同時、または化学療法剤と交代して、または他の治療に応答しないときに投与しうる。免疫抑制剤は分野常用と同じまたはより少ない用量で投与することが可能である。好適な免疫抑制剤は治療する疾患の型だけでなく患者の病歴を含めて多くの因子によるであろう。
付加的療法についてここで用いられる「免疫抑制剤」は、患者の免疫系を抑制又はマスクするために作用する物質を意味する。このような薬剤には、サイトカイン生成を抑制する、自己抗原発現を下方制御又は抑制する、あるいはＭＨＣ抗原をマスクする物質を含む。このような薬剤の例は、グルココルチコステロイド、例えばプレドニゾン、メチルプレドニソロン、及びデキサメタゾンなどのステロイド；２-アミノ-６-アリール-５-置換ピリミジン（米国特許第4665077号参照）；アザチオプリン（アザチオプリンに抵抗性の場合はシクロホスファミド）、ブロモクリプチン；グルタルアルデヒド（米国特許第4120649号に記載されているように、ＭＨＣ抗原をマスクする）；ＭＨＣ抗原及びＭＨＣ断片に対する抗イディオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；抗インターフェロン-γ、-β又は-α抗体を含むサイトカイン又はサイトカインレセプターアンタゴニスト、抗腫瘍壊死因子-α抗体、抗腫瘍壊死因子-β抗体、抗インターロイキン-２抗体及び；抗ＩＬ-２レセプター抗体；抗Ｌ３Ｔ４抗体；異種性抗リンパ球グロブリン；全Ｔ抗体、好ましくは抗ＣＤ３又は抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；ＬＦＡ-３結合ドメインを持つ可溶性ペプチド（１９９０年７月２６日に公開された国際公開90/08187）；ストレプトキナーゼ；ＴＧＦ-β；ストレプトドルナーゼ；宿主からのＲＮＡ又はＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ-６１４４３；デオキシスペルグアリン(deoxyspergualin)；ラパマイシイン(rapamycin)；Ｔ細胞レセプター（米国特許第５１１４７２１号）；Ｔ細胞レセプター断片（Offner等, Science, 251: 430-432 (1991)；国際公開90/11294；及び国際公開91/01133）；及びＴ１０Ｂ９等のＴ細胞レセプター抗体（欧州特許第340109号）を含む。
【０１２２】
関節リウマチ治療に、本発明のＣＤ２０結合抗体を以下の薬剤のうちの一またはそれ以上と組み合わせて患者を治療する：ＤＭＡＲＤＳ（疾患変更姓抗リウマチ薬(例として、メトトレキセート)）、ＮＳＡＩまたはＮＳＡＩＤ（非ステロイド性抗炎症薬）、HUMIRAＴＭ（アダリムマブ(adalimumab)；Abbott Laboratories）、ARAVA(登録商標)（レフノミド(leflunomide)）、REMICADE(登録商標)（インフリキシマブ(infliximab)；Centocor Inc., of Malvern, Pa）、ENBREL（エターナルセプト(etanercept)；Immunex, WA）、COX-2阻害剤。一般にＲＡに用いられるＤＭＡＲＤは、ヒドロキシクロロクイン(hydroxycloroquine)、スルファサラジン、メトトレキサート、レフルノミド、エターナルセプト、インフリキシマブ、アザチオプリン、Ｄペニシラミン、ゴールド(Gold)（経口）、ゴールド（筋注）、ミノサイクリン、シクロスポリン、ブドウ球菌タンパク質A免疫吸着である。アダリムマブ(adalimumab)はＴＮＦαに結合するヒトモノクローナル抗体である。インフリキシマブはＴＮＦαに結合するキメラモノクローナル抗体である。エターナルセプトはヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に結合するヒト７５ｋＤ(p75)腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の細胞外リガンド結合部位からなる「免疫吸着」融合タンパク質である。ＲＡの従来治療は、例として“Guidelines for the management of rheumatoid arthritis” Arthritis & Rheumatism 46(2): 328-346 (February, 2002)を参照。特定の実施態様では、ＲＡ患者を本発明のＣＤ２０抗体をメトトレキセート(MTX)と組み合わせて治療する。ＭＴＸの例示的用量は、約７．５−２５ｍｇ／ｋｇ／ｗｋである。ＭＴＸは経口および皮下的ににより投与される。
【０１２３】
硬直性脊椎炎、乾癬性関節炎およびクローン病の治療には、本発明のＣＤ２０結合抗体を、例としてRemicadeR (インフリキシマブ； Centocor Inc., of Malvern, Paより)、ENBREL (エターナルセプト；Immunex, WA)と組み合わせて患者を治療する。
ＳＬＥの治療には高用量副腎皮質ステロイドおよび／またはシクロスファミド(HDCC)を含む。
乾癬治療には、ＣＤ２０結合抗体を局所的治療、例として局所的ステロイド、アンスラリン、カルシポトリエン、およびタザロテン、またはメトトレキセート、レチノイド、シクロスポリン、ＰＵＶＡおよびＵＶＢ治療と組み合わせて患者を治療する。一実施態様では、乾癬患者はシクロスポリンに続いてまたは同時にＣＤ２０結合抗体で治療する。
【０１２４】
（治療的剤形）
本発明に使用される抗体の治療的剤形は、所望の純度を有する抗体を選択的に薬剤的許容可能な担体、賦形剤、安定剤と混合して凍結乾燥の剤形または液状溶液の形態の貯蔵に適するものである(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))。許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムクロライド；ベンズエトニウムクロライド；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体）又はトゥイーン(TWEEN)（商品名）、プルロニクス(PLURONICS)（商品名）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１２５】
例示的抗ＣＤ２０抗体の剤形は、国際公開公報98/56418に記載されており、参考としてここに組み込まれる。他の剤形は液状の多用量剤形であり、２−８℃で２年間の最小限の貯蔵期間を持つように抗ＣＤ２０抗体４０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍＭ 酢酸塩、１５０ｍＭトレハロース、０．９% ベンジルアルコール、ｐＨ５．０の０．０２％ ポリソルベート２０を含むものである。目的の他の抗ＣＤ２０剤形は、１０ｍｇ／ｍＬの抗体、９．０ｍｇ／ｍＬ塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍＬ クエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、および注入用の滅菌水を含むｐＨ６．５のものである。さらに、他の液状医薬剤形は、約ｐＨ４．８〜約ｐＨ５．５、好ましくはｐＨ５．５の１０−３０ｍＭ酢酸ナトリウム、約０．０１−０．１％ｖ／ｖ量の界面活性剤としてのポリソルベート、約２−１０％ｗ／ｖ量のトレハロース、保存剤としてのベンジルアルコール（米国特許第6171586号）を含む。凍結乾燥剤形は国際公開公報97/04801に記載されるように、皮下的投与に適する。そのような凍結乾燥剤形は適当な希釈剤で高いタンパク質濃度に再編成されるかもしれない、また再編成された剤形はここで治療される哺乳動物に皮下注射されうる。
ヒト化２Ｈ７変異体の一剤形は、ｐＨ５．８の１０ｍＭヒスチジン、６％ショ糖、０．０２％ポリソルベート２０中の抗体１２−１４ｍｇ／ｍＬである。具体的な実施態様では、２Ｈ７変異体および特に２Ｈ７．ｖ１６は、ｐＨ５．８の１０ｍＭヒスチジン硫酸塩、６０ｍｇ／ｍｌショ糖、０．２ｍｇ／ｍｌポリソルベート２０、および注入用の滅菌水中の抗体２０ｍｇ／ｍＬである。
【０１２６】
また、ここでの剤形は治療を特異的に示すために必要な一以上の活性化合物、好ましくはお互い負に作用しない相補的活性を持つものを含みうる。例として、さらに細胞障害性剤、化学療法剤、サイトカインまたは免疫抑制剤（例として、シクロスポリンまたはＴ細胞結合抗体、例としてＬＦＡ-１に結合するもの等のＴ細胞作用性のもの）を提供することが望まれる。そのような多剤の有効量は剤形が存在する抗体量、疾患または疾病または治療の型、および上述した他の因子に依存する。これらは一般に同じ用量およびここに示した投与経路またはここで用いられる用量の１〜９９％量で用いられる。
また、活性成分は、例としてコアセルべーション技術または界面重合化により調製したマイクロカプセル、例として、個々のコロイド状のドラッグデリバリーシステム（例として、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン中のヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ(メチルメタサイクリン)マイクロカプセル中に包まれているかもしれない。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
持続性徐放剤が調製される。持続性徐放剤の好適な例は、アンタゴニストを含む固形疎水性ポリマーの準透過性基質を含むものであり、基質は、造形品、例としてフィルム、またはマイクロカプセルの形である。持続性徐放基質の例として、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(2ヒドロキシエチル-メタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール))、ポリ乳酸(米国特許第3773919号), L-グルタミン酸およびエチルＬグルタミン酸の共重合体、非分解性のエチレンビニール酢酸塩、分解性の乳酸グリコール酸共重合体、例としてLUPRON DEPOTＴＭ(乳酸-グリコール酸共重合体およびロイプロリド酢酸塩で構成された注入可能ミクロスフェア)、およびポリD-(-)-3ヒドロキシブチリン酸を含む。
インビボ投与に用いる剤形は無菌でなければならない。これは滅菌濾過膜を通す濾過によって容易く達成できる。
【０１２７】
（製造品およびキット）
本発明の他の実施態様は、前述の疾患、例えば自己免疫性疾患またはＣＬＬなどの癌の治療に有用な材料を具備する製造品である。製造品は、少なくとも一の容器とラベルまたは容器上にあるまたは容器に付属するパッケージ挿入物を具備する。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ等を具備する。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。少なくとも一の容器は、症状の治療に有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。前記製造品内に２つの治療的組成物が提供されてもよい。第一の組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明のＦｃ変異形抗体である。ラベルまたはパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。さらに、ラベルまたはパッケージ挿入物は組成物の患者への投与についての説明を含むであろう。パッケージ挿入物は治療的製造品の商用パッケージに含まれる慣例的な説明書を示しており、効能、使用法、用量、投与法、禁忌および／または医薬製品に関する警告についての情報を含む。加えて、さらに製造品は、薬学的に許容可能な緩衝液、例として注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、およびブドウ糖溶液を具備する容器を含みうる。さらに、商業的および消費者視点で望まれる他の材料、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、およびシリンジを具備しうる。
【実施例】
【０１２８】
これらの実験的実施例は、本発明の権利範囲を限定するものではなく、例示として示すものである。
【０１２９】
実施例１  ヒトＦｃＲｎに対して最適化ｐＨ依存性の結合を有する単一の部位突然変異体の選別のためのヒトＩｇＧ１-Ｆｃのファージディスプレイ
ファージ-ディスプレイのために、ヒンジ領域のジスルフィドが除去され(Ｃ２２６が削除され、Ｃ２２９はセリンに置換される)、Ｃ末端はファジミドコンストラクト(ｐＷ０４３７)のＭ１３ ｇＩＩＩタンパク質(ｇ３ｐ)のＣ末端領域に融合しているヒトＩｇＧ１ Ｆｃの「無ヒンジ」変異体を使用した。タンパク質配列(配列番号３８)を図７に示す。ファージ-選別標的として、ビオチン化され、ｐＨ６．０のバッファにてニュートラビジンコート免疫吸着(MaxisorpTM)プレート上に捕獲されたｈｕＦｃＲｎを使用し、ｐＨ６．０のバッファにて広く洗浄してより低い親和性変異体を除去し、ｐＨ７．４のバッファにて親和性が高くｐＨ感度が高い変異体を溶出した。３回目の選別では、クローンの多くがＮ４３４Ｗであり(４８の配列決定したクローンのうち４４がこの変異体と一致)、Ｎ４３４Ｙ(３／４８)およびＮ４３４Ｆ(１／４８)も存在した。
【０１３０】
Ｆｃへの変異の数を最小限にする(それによって、治療的抗体の免疫原性のリスクを最小化する)ために、単一のアミノ酸置換のみからファージ-ディスプレイライブラリがなる。ファージディスプレイによる選別のための抗体断片のランダム化ライブラリを作成する最も一般的な方法は、誤りを有する(error prone)ＰＣＲ又は類似の方法によるランダムな突然変異誘発法または同時に複数の残基を変異させるオリゴヌクレオチド誘導性突然変異誘発法である(ClacksonおよびLowman (eds.) in Phage Display: A Practical Approach, Oxford University Press (2004)に概説される)、しかしながら、これらの方法は一般的に一分子に複数の突然変異を引き起こすので、所望の分子性質を達成するために必要な突然変異の最小数を決定するために逆重畳しなければいけない。あるいは、オリゴヌクレオチド誘導性突然変異誘発によって、個別に(ラットＦｃＲｎ構造に対する相同性によって、(Burnmeister, 1997))ＦｃＲｎの１０Å以内の(ＦｃＲｎがＩｇＧに結合している場合の構造において)各残基を系統的に変異させることによって、ランダム化ライブラリを構築した。したがって、それぞれのライブラリが特定のアミノ酸位置に変異を有する２０個の変異体からなる４３の「ミニライブラリ」(表１)は、ＦｃＲｎに対して亢進したｐＨ依存性の結合を有する単一部位Ｆｃ変異体の選別に使用される８６００の変異体の完全なライブラリを含んでなる。
【０１３１】
表１  ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ無ヒンジ変異体において、ランダム化される残基
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【０１３２】
ヒトＦｃＲｎにより高い親和性で結合するＦｃ変異体を選択する以前の試みは失敗している(Dall'Acqua 2002、米国公開2003/0190311)。それらの研究では、ｈｕＦｃＲｎはMaxisorpプレートに直接コートされた。我々は、ｈｕＦｃＲｎがコーティング条件に非常に影響され、そのＦｃ結合能を維持するためにビオチン化して、ニュートラビジンコートMaxisorpプレートに捕獲させなければいけないことを発見した。
Maxisorpプレートは、２μｇ／ｍＬのニュートラビジンを含む５０ｍＭ 炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６にて４℃で終夜コートし、次いでアッセイ希釈液(ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ、ｐＨ６．０)にて反応を止めた。５０μＬのｈｕＦｃＲｎ(〜０．２ｍｇ／ｍＬ)を、１０μＬの新たに調製された１０ｍＭ ビオチン-ＬＣ-ＮＨＳ(Pierce)と室温で３０分間混合することによって、ビオチン化した。反応していないビオチン-ＬＣ-ＮＨＳを１０μＬの１Ｍトリスの添加によって、不活性化した。ｈｕＦｃＲｎ-ビオチンを、ＰＢＳ ｐＨ６．０の平衡化したＰＤ-１０カラム(Amersham-Pharmacia)を用いたゲル濾過によって、過剰なビオチン-トリスから精製した。２ｍＬを回収した(ｈｕＦｃＲｎ-ビオチン、５μｇ／ｍＬ)。ｈｕＦｃＲｎ-ビオチンを８つのニュートラビジンコート中で捕獲し、ウェルを１時間(１１０μＬ／ウェル)ブロックした。ファージを加える前に、プレートをアッセイ希釈液にて素早く３回すすいだ。
高密度に終夜育成したファージ粒子は、２．５Ｍ ＮａＣｌ／２０％ ＰＥＧを用いた沈殿によって、回収して、典型的には１０１３ファージ／ｍＬの濃度にアッセイ希釈液に再懸濁した。次いで、ファージをアッセイ希釈液にて１:１０に希釈し、１時間以下(１００μＬ／ウェル)、ｈｕＦｃＲｎ-ビオチンコートウェル(又はネガティブコントロールとしてコートしてないウェル)に結合させた。プレートを、ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ、ｐＨ  ６．０にて洗浄した。選別の各段階ごとにストリンジェンシーを上げながら洗浄を行った(第１回(ラウンド)：１０回素早く洗浄、第２回：２０回素早く洗浄、第３回：４０回素早く洗浄、第４回：１６回素早く洗浄して、２０回１５秒間洗浄、第５回：４回素早く洗浄して１回３分間洗浄、これを５回繰り返す(合計２０回の洗浄))。残りの結合したファージは、１１０μＬのＰＢＳ ｐＨ７．４にて溶出し、増殖させるために１０ｍＬの対数期にある大腸菌(XL1-Blue、 Stratagene, Inc.)培養物に加えた。
【０１３３】
実施例２  可溶性Ｆｃ変異体タンパク質の特徴づけ
これらの変異を有する可溶性Ｆｃ変異体を発現させ、精製して、それらのヒト、カニクイザル、ラットおよびマウスのＦｃＲｎに対する親和性をBIAcore結合アッセイにて分析した。また、Ｆｃ変異体をサイズ排除クロマトグラフィによって分析して、それらの凝集傾向を決定した。
変異体Ｆｃ断片は、突然変異体ｐＷ０４３７ファジミドにて３４Ｂ８大腸菌細胞を形質転換して、無リン酸培地中で３０℃で２４時間生育してＦｃ遺伝子の発現を誘発し、細胞を回収した。細胞ペーストを終夜凍結して、１０ｍＭ トリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ中での浸透圧ショックによって、溶解した。溶解物を遠心によって、クリアにし、プロテインＡカラムに流した。カラムをＰＢＳにて洗浄して、可溶性ＦｃをプロテインＡクエン酸溶出バッファ(０．１Ｍ クエン酸塩、ｐＨ３．０)にて溶出して、トリスｐＨ７．５にて中和した。可溶性ＦｃをAmicon Centriprepにて濃縮した。
【０１３４】
ヒト、カニクイザル、ラット又はマウスのＦｃＲｎを、密度を変えて(１００−３０００のＲＵ)、Biacore CM5チップ上にＮＨＳ化学法によって固定した。Ｆｃ変異体はｐＨ６．０のＰＢＳにて１０μＭから１ｎＭまで段階的に希釈し、結合を時間とともにモニターした。親の無ヒンジＦｃ(すなわち野生型)では、ｈｕＦｃＲｎに対する結合はほぼすぐに平衡状態に達した。これは、とても速い会合係数と解離係数を有することを示し、平衡状態分析によって、測定するとおよそ７００ｎＭのＫｄであった(図８)。Ｎ４３４Ｗ変異体では、会合係数は有意に遅く、解離係数は非常に遅い。より遅い流量で長時間Ｎ４３４Ｗを注入することによって、平衡状態の分析が可能であり、Ｋｄはおよそ４ｎＭであった。変異体Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４Ｆ、Ｎ４３４Ａおよび３突然変異体Ｎ４３４Ａ＋Ｅ３８０Ａ＋Ｔ３０７Ａは、ｐＨ６．０において、野生型Ｆｃに対してそれぞれ１７０倍以下、９倍以下、２．７倍以下および１４倍以下の親和性の増加を示した。対照的に、ｐＨ７．４においては、ｈｕＦｃＲｎに対するＮ４３４変異体の親和性は、このアッセイで測定されないほど有意に低かった。野生型と比較してＮ４３４ＷはカニクイザルＦｃＲｎへの結合を有意に改善せず、ラットＦｃＲｎへの結合についてはおよそ１０倍改善されるだけで、マウスＦｃＲｎへの結合についてはＷＴと実質的に同じであることが示された(データは示さない)。したがって、この突然変異による改善は、ヒトＦｃＲｎに特異的なものである。
凝集されたＦｃは、結合価効果からＦｃＲｎに対する親和性がより高いようである。我々は、定量的サイズ排除クロマトグラフィによって、Ｆｃ変異体(ＷＴ、Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４Ｙ、Ｎ４３４Ｆ、Ｎ４３４ＡおよびＮ４３４Ａ＋Ｅ３８０Ａ＋Ｔ３０７Ａ)を分析した。Ｎ４３４Ｗ以外のすべての変異体は少なくとも９０％単量体に見え、Ｎ４３４Ｗは二量体、四量体および八量体型の有意な集団を有した。単量体Ｎ４３４Ｗ変異体は、Ｓ-２００カラムを用いた調整サイズ排除クロマトグラフィによって、オリゴマー形態から精製した。ＳＰＲ結合実験において、精製された単量体材料はｈｕＦｃＲｎに対して高親和性を保持していた。これは、Ｎ４３４Ｗに観察された親和性の増加がｈｕＦｃＲｎに対するその内因性の親和性に事実上変化が生じたためであり、凝集の人工産物のためではないことが示唆される。精製されたオリゴマーＮ４３４Ｗは、事実上ＦｃＲｎに対する親和性の低減を示した(図８)。
【０１３５】
実施例３  ＦｃＲｎ突然変異を有するヒト化抗ＣＤ２０  ＩｇＧ１変異体の特徴づけ
また、ヒトＦｃのファージディスプレイによって特定される突然変異を、完全な抗体である２Ｈ７.ｖ１３８のバックグラウンドにおけるその変異の効果について試験した。２Ｈ７.ｖ１３８は、Ｆｃが以下の突然変異：Ｓ２９８Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａによる亢進したＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性のために修飾されているヒト化抗ＣＤ２０抗体である。位置Ｎ434の突然変異をこのバックグラウンドに導入し、ＩｇＧ(表２)は前述のように２９３細胞の一過性形質移入によって調製した。いずれの場合においても、精製されたＩｇＧ変異体は、上記の通りにサイズ排除クロマトグラフィによって低レベルのタンパク質凝集であることが示された。
表２  ヒト化抗ＣＤ２０抗体２Ｈ７.ｖ１３８の変異体
2008510466.tif 000030
【０１３６】
２Ｈ７.ｖ１３８のヒトＩｇＧ１変異体は、ビオチン化ＦｃＲｎを用いたＥＬＩＳＡにおいてヒトＦｃＲｎに対するｐＨ依存性の結合について分析した。MaxiSorp９６ウェルマイクロウェルプレート(Nunc, Roskilde, Denmark)は、２μｇ／ｍｌのＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ (Pierce, Rockford, IL)を含む５０ｍＭ 炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６、１００μｌ／ウェルにて４℃で終夜おいてコートした。プレートを、０．０５％ポリソルベートを含有するＰＢＳ(洗浄バッファ)、ｐＨ７．４にて洗浄し、１５０μｌ／ウェルの、０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４にてブロックした。室温で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄バッファ、ｐＨ７．４にて洗浄した。ヒトＦｃＲｎは、ビオチン-Ｘ-ＮＨＳ (Research Organics, Cleveland, OH)を使用してビオチン化した。ビオチン化ＦｃＲｎは、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０を含有するＰＢＳ(試料バッファ)、ｐＨ７．４に２μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェルの量で、プレートに添加した。プレートを１時間インキュベートして、洗浄バッファｐＨ６．０にて洗浄した。７つのＩｇＧ抗体の二倍段階希釈液(３．１−２００ｎｇ／ｍｌ)を含む試料バッファ、ｐＨ６．０をプレートに添加した。２時間インキュベートした後、プレートを、洗浄バッファ、ｐＨ６．０にて洗浄した。結合したＩｇＧは、ペルオキシダーゼ標識ヤギＦ(ａｂ')２抗ヒトＩｇＧ Ｆ(ａｂ')２(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)を試料バッファ、ｐＨ６．０中に１００μｌ／ウェルで添加することによって検出した。１時間インキュベートした後、プレートを洗浄バッファ、ｐＨ６．０にて洗浄し、次いで基質３,３',５,５'テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ) (Kirkegaard & Perry Laboratories)を１００μｌ／ウェルで添加した。１００μｌ／ウェルの１Ｍ リン酸を加えることによって反応を止めた。multiskanAscent読み取り器(Thermo Labsystems, Helsinki, Finland)にて４５０ｎｍの吸光度を読み取った。標準曲線の中間点(中間ＯＤ)の吸光度を算出した。この中間ＯＤの標準物質及び試料の対応する濃度は、４-パラメータ非線形回帰曲線フィッティングプログラム(KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA)を用いた滴定曲線から決定した。標準物質の中間ＯＤ濃度を試料の中間ＯＤ濃度で割って相対的な活性を算出した。
【０１３７】
ｐＨ６．０又はｐＨ７．４での結合ＩｇＧのＦｃＲｎからの解離を評価するために、同様にアッセイを行った。ただし、試料のインキュベーション工程の後とプレートを洗浄する場合にはｐＨ６．０又はｐＨ７．４の試料バッファを１００μｌ／ウェルで添加した。プレートを４５分間インキュベートして洗浄した。ついで、上記のようにアッセイを続けた。
結果(図９)は、Ｆｃ変異体で観察されたものと類似の相対的な結合能を示す。ｐＨ６．０での相対的な結合親和性はｖ４７７＞ｖ４７８＝ｖ４７９＞ｖ３６４＞ｖ１３８である。ｐＨ７．４での相対的な結合親和性は、ｐＨ６．０での同じ相対的な結合親和性より一貫して弱い：ｖ４７７＞ｖ４７８＝ｖ４７９＞ｖ３６４＞ｖ１３８。
これらのＦｃ突然変異は、概してヒトＩｇＧ抗体に適用できる。
【０１３８】
実施例４  薬物動態に影響するＦｃＲｎ結合のインビボ研究
インビボでのＦｃ変異形抗体の薬物動態に対する亢進したＦｃＲｎ結合の効果を決定するために、カニクイザル(Macaca fascicularis)又は他の霊長類種に、各々の抗体変異体を静脈注射し、時間の経過につれて血液試料を回収して抗体のクリアランスをモニタした。複数の動物に一又は複数の用量レベルで注射する。一実験では、１−２０ｍｇ／ｋｇの単回静注用量を０時点とする第１日目に注射した。投与前及び投与後の６時間後、２４時間後及び７２時間後に各動物から血液(血清)試料を採取した。さらに、第８日目、第１０日目、第３０日目及び第６０日目に試料を採取した。血清試料中の抗体の濃度はＥＬＩＳＡを用いて決定した。血清中の抗体濃度の時間依存性の減少は、標準的な薬学技術(ShargelおよびYu, Applied Pharmaceutics and Pharmacokinetics, Fourth edition, pp. 67-98, Appleton and Lange, Stamford, CT (1999))を用いてモデル化した。２-区画モデルを用いて、組織に対する抗体の開始分布(α期)、その後に続く終末期又は除去期(β期)を明らかとした。ＦｃＲｎが循環中のＩｇＧを維持するように機能するので、このようにして算出された除去半減期(ｔ1／２β)は亢進したＦｃＲｎ結合の効果を示す。
【０１３９】
このような研究の一例では、ＦｃＲｎに対して異なる結合親和性を有する３つのヒト化モノクローナル抗ＢＲ３抗体(ＰＲＯ１４５２３４、ＰＲＯ１４５１８１およびＰＲＯ１４５１８２)の薬物動態を、カニクイザルにおいて比較した。ＢＲ3(別名ＢＡＦＦ-Ｒ)は、Ｂ細胞の表面に発現される１８４残基のＩＩＩ型膜貫通タンパク質である(Thompson, J. S., 等, (2001) Science 293, 2108-2111；Yan, M., 等, (2001) Curr. Biol. 11, 1547-1552)。ＰＲＯ１４５２３４は野生型抗ＢＲ3抗体であり、一方、ＰＲＯ１４５１８１およびＰＲＯ１４５１８２はそれぞれ、ヒトおよびカニクイザルのＦｃＲｎに対して亢進した結合親和性を有するＮ４３４ＡおよびＮ４３４Ｗ変異体である。
１７匹の雄と１７匹の雌のカニクイザル(Macaca fascicularis)を、ＳＮＢＬ米国ストックから入手した。サルは、研究の開始時(例えば環境順化の開始)の理学的検査時には４５歳であり、２４ｋｇであった。健康に見え、明らかな異常のない動物のみを研究に用いた。３０匹の動物を体重によって３つのグループにランダムに分けた。グループ１、２および３の動物に２０ｍｇ／ｋｇの単回静注用量のＰＲＯ１４５２３４(野生型)、ＰＲＯ１４５１８１(Ｎ４３４Ａ)又はＰＲＯ１４５１８２(Ｎ４３４Ｗ)をそれぞれ投与した。研究の概略を表１１に示す。
【０１４０】
表１１  研究概略
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ａ 総用量容積(ｍＬ)は最も新しく計測した体重に基づいて算出した。用量容積をおよそ０．１ｍｌにした。
【０１４１】
薬物動態学的分析のためのおよそ１．０ｍＬの血液を、以下の時点で各々の動物の末梢静脈から回収した：
・ 投与前
・ 研究第１日目の投与後３０分および６時間
・ 研究第２、３、４、５、８、１１、１５、１８、２２、２９、３６、４３、５０、５７、６４、７１、７８、８５、９２、９９、１０６、１１３、１２０、１２７および１３４日目に１回ずつ
抗治療的抗体分析のためのおよそ１．０ｍＬの血液を、以下の時点で各々の動物の末梢静脈から回収した：
・ 投与前
・ 研究第１５、２９、４３、５７、７１、８５、９９、１１３、１２７および１３４日目に１回ずつ
薬物動態学的(ＰＫ)分析及び抗治療的抗体(ＡＴＡ)分析のための血液サンプルは、血清分離器チューブに採集し、およそ３０−８０分間の室温で凝固させた。遠心(室温で１５分間、２０００×ｇ)して血清(およそ０．５ｍＬ)を得た。血清試料を、予めラベルを付けた１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、ドライアイスで封入されるまで−６０℃から−８０℃の温度を維持するために冷凍庫に貯蔵し、ＰＲＯ１４５２３４、ＰＲＯ１４５１８１およびＰＲＯ１４５１８２の濃度を分析するためにジェネンテクに終夜輸送した。
各々の血清試料中のＰＲＯ１４５２３４、ＰＲＯ１４５１８１又はＰＲＯ１４５１８２の濃度は、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて決定した。血清中の定量化(ＬＬＯＱ)のアッセイ下限は０．０５μｇ／ｍＬである。この限界以下の値は記録不可能(ＬＴＲ)として記録する。各々の試料中の抗治療的抗体は、ブリッジングＥＣＬＡアッセイを用いて決定した。
【０１４２】
予定からわずかに外れた試料採集時間とわずかな量をデータ分析に用いた。雌雄カニクイザルの血清ＰＲＯ１４５２３４、ＰＲＯ１４５１８１およびＰＲＯ１４５１８２の濃度の平均とＳＤはＥｘｃｅｌ (バージョン2000, Microsoft Corporation, Redmond, WA,)を使用して算出し、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ (バージョン9.0；Systat Software, Inc., Point Richmond, CA)を使用してプロットした。記録できないほどに少ない血清中濃度はすべてのデータ分析から除外した。ｎ≦２のとき、ＳＤは算出されなかった。結果を３つの有効な図に示す。
【０１４３】
各々の動物についてのＰＫパラメータは、1 over y hat weighting scheme(WinNonlin Version 3.2、 Pharsight Corporation、 Mountain View, CA)とともにＧａｕｓｓ-Ｎｅｗｔｏｎ(Levenberg and Hartley)２区画モデルを用いて推定した。グループ１(野生型、ＰＲＯ１４５２３４)の１０匹のカニクイザルのうちの８匹およびグループ３(Ｎ４３４Ｗ、ＰＲＯ１４５１８２)の１０匹のカニクイザルのうちの５匹は、第５７日目までにＡＴＡが増えた。一般に、その時間の間か後に血清中濃度の急激な低下と相関する特定の時間のＡＴＡの検出は、最終半減期の短縮および薬剤曝露の減少となる。ＰＫに対するＡＴＡ応答の効果の大きさを理解するために、各々のグループについての平均ＰＫパラメータは、２つの方法を用いて算出した。方法１では、ＰＫパラメータ(平均値±標準偏差)は、各グループの１０匹すべてのカニクイザルからのデータを用いて算出した。方法２では、ＰＫパラメータは、第５７日目までに抗治療的抗体を増やさなかったカニクイザルのみからのデータを用いて算出した(グループ１ではｎ＝２、グループ２ではｎ＝１０、およびグループ３ではｎ＝５)。グループ１および３について、方法１では、方法２と比較して低い最終半減期(ｔ１／２,β)と曝露(ＡＵＣ、概して薬剤曝露の基準)が予測された。しかしながら、２つの方法を用いた総合的な結論は同様であった。したがって、ここで報告する平均ＰＫパラメータは、方法１を用いて(例えばすべてのカニクイザルからのデータを含む)算出した。
【０１４４】
結果
２０ｍｇ／ｋｇのＰＲＯ１４５２３４(野生型抗体)、ＰＲＯ１４５１８１(Ｎ４３４Ａ変異体)およびＰＲＯ１４５１８２(Ｎ４３４Ｗ変異体)の単回静注ボーラス投与後に、血清中濃度は、迅速な開始分布相の後により遅い排出相が続く二相性傾向を示した(図１２)。各グループについて算定されたＰＫパラメータを表１２に示し、各々のグループには１０匹すべてのカニクイザルのデータを含む。ＰＲＯ１４５２３４(野生型抗体)の最終半減期(平均±ＳＤ)は６．１５±２．０１日であって、１０匹のカニクイザルでは４．２４から１１．０日まで変動した。第５７日目までにＡＴＡを増やさなかった２匹のカニクイザルのＰＲＯ１４５２３４の平均最終半減期(ｔ１／２,β)は、８．９５日であった。ＰＲＯ１４５１８１(Ｎ４３４Ａ変異体)では、平均最終半減期は１４．１±１．５５日であり、これはＰＲＯ１４５２３４の１．６−２．３倍であった(ｐ＜０．０５)。ＰＲＯ１４５１８２(Ｎ４３４Ｗ変異体)では、１０匹のカニクイザルの平均±ＳＤ最終半減期は、９．５５±２．４９日であった。この値は、１０匹のカニクイザルのＰＲＯ１４５２３４(野生型抗体)の総合的な平均ｔ１／２,βより有意に大きいが(ｐ＜０．０５)、検出可能なＡＴＡを増やさなかった２匹のカニクイザルのＰＲＯ１４５２３４の平均ｔ１／２,βととても類似していた(８．９５日)。ＰＲＯ１４５２３４(野生型抗体)とＰＲＯ１４５１８２(Ｎ４３４Ｗ変異体)との間の観察された差異はこれらの２つのグループのＡＴＡ応答により混乱されるようである。
ＰＲＯ１４５２３４(野生型抗体)の無限と推定される血中濃度-時間曲線下面積(ＡＵＣ)は２４４０±３９８日*ｕｇ／ｍＬであり、１０匹のカニクイザルでは１７４０から３１４０まで変動する。第５７日目までにＡＴＡを増やさなかった２匹のカニクイザルのＰＲＯ１４５２３４の平均ＡＵＣは、２８５０日＊ｕｇ／ｍＬであった。ＰＲＯ１４５１８１(Ｎ４３４Ａ変異体)では、平均ＡＵＣは、４４５０±６８５日＊ｕｇ／ｍＬであり、これはＰＲＯ１４５２３４(野生型抗体)の１．６−１．８倍であった(ｐ＜０．０５)。ＰＲＯ１４５２３４(野生型抗体)およびＰＲＯ１４５１８２(Ｎ４３４Ｗ変異体)のＡＵＣに相違はなかった。
【０１４５】
表１２  ＰＲＯ１４５２３４、ＰＲＯ１４５１８１およびＰＲＯ１４５１８２のＰＫパラメータ(平均±ＳＤ)
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* ＰＲＯ１４５２３４及びＰＲＯ１４５１８２グループに８／１０及び５／１０のカニクイザルに抗薬剤抗体が存在すると、ＰＲＯ１４５２３４及びＰＲＯ１４５１８２のＰＫパラメータが混乱しうる(例えば、ＡＵＣの減少やｔ１／２,βの減少)。
** ｐ＜０．０５を有するＰＲＯ１４５２３４と異なる。
【０１４６】
要約すると、ＰＲＯ１４５１２３４、ＰＲＯ１４５１８１およびＰＲＯ１４５１８２の薬物動態は、カニクイザルに２０ｍｇ／ｋｇの単回静注の後に調べた。１０匹のカニクイザルのうちの８匹は第５６日目までにＰＲＯ１４５２３４に対する抗薬剤抗体(ＡＴＡ)を増やし、一方１０匹のカニクイザルのうちの５匹が第５６日目までにＰＲＯ１４５１８２に対するＡＴＡを増やした。第５６日目までにＰＲＯ１４５１８１に対するＡＴＡを増やしたカニクイザルはいなかった。ＰＲＯ１４５１８１(Ｎ３４３Ａ変異体)は、ＰＲＯ１４５２３４(野生型抗体)と比較して、亢進した最終半減期と増加したＡＵＣを表した(ｐ＜０．０５)。ＰＲＯ１４５１８２は、ＰＲＯ１４５２３４と比較して最終半減期のわずかな増加を表した、しかしながら、それは、おそらく、この観察された相違がＰＲＯ１４５２３４およびＰＲＯ１４５１８２の両方に対する抗治療的抗体応答により混乱されたものであるようである。
【０１４７】
実施例５  ＦｃγＲＩＩＩに対して亢進した結合を有するヒトＩｇＧ１変異体
突然変異は、活性化ＦｃγレセプターへのＩｇＧ結合の亢進と阻害ＦｃｇレセプターへのＩｇＧ結合の減退を介して抗体依存性細胞媒介性細胞障害性(ＡＤＣＣ)を改善するための突然変異は既に記載されている(Shields 等, J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001)、Presta 等, Biochem. Soc. Trans. 30:487-490 (2002))。補体依存性細胞障害性(ＣＤＣ)を維持するかまたは増やしたままで、ＡＤＣＣ活性を増やす突然変異は、両方のメカニズムが生体内でのＣＤ２０陽性細胞の細胞溶解に重要でありうるので、特に興味があるものである。特に、３つのＡｌａ突然変異は共に、改善されたＣ１ｑ結合によるＣＤＣ活性の改善(Idusogie 等, J. Immunol. 164:4178-4184 (2000))、 Idusogie 等, J. Immunol. 166:2571-2575 (2001))および、ＦｃγＲＩＩＩ結合の改善とＦｃγＲＩＩ結合の減退によるＡＤＣＣ活性の改善のために、既に同定されている：Ｓ２９８Ａ＋Ｅ３３３Ａ＋Ｋ３３４Ａ (Shields 等, 2001)。これらの突然変異は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣの活性を亢進する更なる置換であるＫ３２６Ａとともに、２Ｈ７.ｖ１３８として知られるヒト化抗ＣＤ２０抗体変異体に組み込まれている(表３)。
【０１４８】
ここで我々は、位置２９８、３３３および３３４での付加的なアミノ酸置換を記述する。各々の置換を２Ｈ７.ｖ１６のバックグラウンドに挿入し、ヒトＦｃγＲＩＩＩの高親和性又は低親和性のアイソタイプに対する相対的な結合についてＥＬＩＳＡを用いてｖ１６と比較した(図１１)。結果は、これらの位置での複数の置換、例えばＳ２９８Ｔ、Ｓ２９８Ｌ、Ｅ３３３ＬおよびＫ３３４Ｇが十分に許容されるものであり、ＦｃγＲＩＩＩへの結合親和性にほとんど影響を及ぼさないことを示唆した(表１)。レセプターと側鎖の好ましくない相互作用又はＦｃ構造を不安定にする効果の何れかが生じるために、Ｓ２９８Ｇ、Ｅ３３３ＧおよびＫ３３４Ｒなどの他の置換は結合に有害である。１つの突然変異Ｋ３３４Ｌは、ＦｃγＲＩＩＩに対する結合親和性が３倍より大きいことが同定された。
これらの結果により、Ａｌａ置換による効果を示すＦｃ内の選択された位置でのＡｌａ以外の置換がＦｃγレセプターに対する結合を改善できることを示唆された。特に、Ｋ３３４Ｌは、ＦｃγＲＩＩＩに対する結合を改善し、さらに２Ｈ７.ｖ１３８内の置換などの他のＦｃ突然変異と組み合わせて、結合を改善しうる。このような抗体変異体は、ＡＤＣＣ活性を改善し、生体内で標的細胞を減少させる際により強力であることが予測される。
【０１４９】
表３  ＣＤ２０結合に対するＦｃ領域内の置換の効果。Ｆｃ突然変異はＥＵ番号付け(上掲のKabat)で示し、２Ｈ７.ｖ１６親との相対である。相対的な結合は、２Ｈ７.ｖ１６の濃度を等量の結合に必要とされる変異体の濃度で割って表す、それゆえに、１より小さい値は変異体への低い親和性を示し、１より大きい値はより高い親和性を示す。ＦｃγＲＩＩＩのＦ１５８(低親和性)およびＶ１５８(高親和性)のアイソタイプについての結果を示す。
2008510466.tif 000033
【０１５０】
実施例６  ヒスチジン突然変異体
この実施例において、ラットＦｃＲｎと複合体にあるラットＩｇＧの発表されている構造(Burnmeister, 1997)から推測されるＦｃとＦｃＲｎとの作用領域内の残基のヒスチジン-スキャン(Ｈｉｓ-ｓｃａｎ)により点突然変異を調べた。我々は、Ｈｉｓの側鎖がｐＨ６とｐＨ７との間で滴定できることが多いため、Ｈｉｓの置換がＦｃＲｎへのＩｇＧの結合に対するｐＨ依存的な効果に有効でありうると判断した。プロトン化された形態がＦｃＲｎ結合に有益であるが、プロトン化されていない形態は有益でないＦｃ内の部位でのＨｉｓの置換により、生体内の亢進された半減期分子に所望の特徴が生じうる。
我々は、完全長抗体(ハーセプチン(登録商標))に関して既に記載した点突然変異体の更なる特徴づけを記述し、点突然変異の組合せを含むいくつかの新規な変異体の特徴を調査する。
【０１５１】
トラスツズマブＦｃＲｎ変異体の構築
前述の実施例ではＦｃＲｎへの結合を改善するＦｃ内のいくつかの突然変異体について記載し、完全抗体である２Ｈ７.ｖ１３８のバックグラウンドまたはＦｃ断片として研究した。他のＦｃ変異がない場合の、完全長ヒトＩｇＧ１に対するこれらの突然変異の影響を研究するために、既に記載したオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発法を用いて突然変異Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４Ｙ、Ｎ４３４ＦおよびＮ４３４ＡをｒｈｕＭａｂ ４Ｄ５(トラスツズマブ、ハーセプチン(登録商標))のバックグラウンドに導入した。４つの芳香族アミノ酸のうちの３つがＦｃ-ファージ点突然変異ライブラリを用いて位置Ｎ434で置換しているのがわかったので、我々は通常芳香族置換がＦｃＲｎ(低ｐＨおよびできるだけ高いｐＨ)結合を亢進すると結論付けた。したがって、付加的な突然変異、Ｎ４３４Ｈも構築した。ハーセプチンのこれら５つの変異体は、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィの後に凝集塊を取り除くためにサイズ排除クロマトグラフィを用いて、大規模な一過性ＣＨＯ細胞培養物から精製した。
さらに、突然変異Ｅ３８０Ａ、Ｅ３８０Ａ＋Ｔ３０７Ａ、＋／−Ｎ４３４Ａ、及び＋／−Ｎ４３４Ｈをハーセプチンに構築した。抗体を２９３細胞内で発現させ、プロテインＡクロマトグラフィにより精製され、ＦｃＲｎへの結合についてアッセイした。
ＦｃＲｎ結合に重要な付加的な残基および結合を改善する突然変異を同定するために、ヒスチジンスキャニングアプローチを用いた。これらの実験では、ＦｃとＦｃＲｎとの間の作用領域上の残基をヒスチジンに置換した(ラットＦｃＲｎ構造との相同性による(Burnmeister, 1997))。これらの突然変異を有する抗体を、２９３細胞内で発現させ、精製して、上記の通りに結合についてアッセイした。ＦｃＲｎへの結合の改善を示すヒスチジンスキャニング突然変異を、Ｎ４３４の突然変異と組み合わせて、更なる変異体を生じた。
【０１５２】
ＦｃＲｎ ＥＬＩＳＡ
既に記載されるように(Shields 等, 2001)、可溶性ＦｃＲｎを調製した。MaxiSorp９６ウェルマイクロウェルプレート(Nunc, Roskilde, Denmark)は、２μｇ／ｍｌのＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ (Pierce, Rockford, IL)を含む５０ｍＭ 炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６、１００μｌ／ウェルにて４℃で終夜おいてコートした。プレートを、０．０５％ポリソルベートを含有するＰＢＳ(洗浄バッファ)、ｐＨ７．４にて洗浄し、１５０μｌ／ウェルの、０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４にてブロックした。室温で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄バッファ、ｐＨ７．４にて洗浄した。ヒトＦｃＲｎは、ビオチン-Ｘ-ＮＨＳ (Research Organics, Cleveland, OH)を使用してビオチン化した。ビオチン化ＦｃＲｎは、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０を含有するＰＢＳ(試料バッファ)、ｐＨ７．４に２μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェルの量で、プレートに添加した。プレートを１時間インキュベートして、洗浄バッファｐＨ６．０にて洗浄した。７つのＩｇＧ抗体の二倍段階希釈液(３．１−２００ｎｇ／ｍｌ)を含む試料バッファ、ｐＨ６．０をプレートに添加した。ハーセプチンを標準物質として用いた。２時間インキュベートした後、プレートを、洗浄バッファ、ｐＨ６．０にて洗浄した。ｐＨ６．０またはｐＨ７．４のアッセイバッファを１００μｌ／ウェル加えて解離工程を行った。プレートを４５分間インキュベートして、洗浄バッファ, ｐＨ６．０にて洗浄した。結合したＩｇＧは、ペルオキシダーゼ標識ヤギＦ(ａｂ')２抗ヒトＩｇＧ Ｆ(ａｂ')２(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)を試料バッファ、ｐＨ６．０中に１００μｌ／ウェルで添加することによって検出した。１時間インキュベートした後、プレートを洗浄バッファ、ｐＨ６．０にて洗浄し、次いで基質３,３',５,５'テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ) (Kirkegaard & Perry Laboratories)を１００μｌ／ウェルで添加した。１００μｌ／ウェルの１Ｍ リン酸を加えることによって反応を止めた。multiskanAscent読み取り器(Thermo Labsystems, Helsinki, Finland)にて４５０ｎｍの吸光度を読み取った。標準曲線の中間点(中間ＯＤ)の吸光度を算出した。この中間ＯＤのハーセプチン及び試料の対応する濃度は、４-パラメータ非線形回帰曲線フィッティングプログラム(KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA)を用いた滴定曲線から決定した。標準物質の中間ＯＤ濃度を試料の中間ＯＤ濃度で割って相対的な活性を算出した。
【０１５３】
ＢＩＡｃｏｒｅ法
ヒト及びカニクイザルのＦｃＲｎに対する複数の４Ｄ５変異体結合の見かけの会合速度(ｋａ)、見かけの解離速度(ｋｄ)及び見かけの(ｋＤ)をＢＩＡｃｏｒｅ-３０００表面プラズモン共鳴システムを用いて測定した(6, 7)。見かけの平衡解離定数によって表されるように各抗体の抗原に対する結合親和性は、ＫＤ＝ｋｄ／ｋａとして算出されるし(7)、平衡結合実験で直接的に測定することもできる。
基本的には提供者の指示書に従って(6, 8)、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(カタログ番号CM5, BIAcore Inc.)上にヒト及びカニクイザルのＦｃＲｎを固定するためにアミン結合法を用いた。簡単に言うと、Ｎ-ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）と混合したＮ-エチル-Ｎ'-（３-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いてバイオセンサーチップを活性化した。次いで、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４）で予め調整したＦｃＲｎを活性化したチップに注入し、カニクイザルＦｃＲｎの固定化した濃度が７００−９００反応単位(ＲＵ)、ヒトＦｃＲｎがおよそ２０００ＲＵとなるようにした。反応しないスクシニミドグループに１Ｍのエタノールアミンを注入して反応を止めた。
【０１５４】
動力学的な測定を以下のように行った。抗体の３倍の段階希釈液(１μＭから０．５ｎＭ)を２５℃、０．０２ｍｌ／分の流速でランニングバッファ(０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水, ｐＨ６)に２分間注入した。１０ｍＭ  トリス、ｐＨ９、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを０．０１ｍｌ注入して再生成させた。各々の結合曲線についてデータを単純一対一ラングミュア結合モデル(simple 1:1 Langmuir binding model)にフィットさせた。偽一次速度係数(ｋｓ)を各会合曲線について算出し、タンパク質濃度としてプロットしてｋａ＋／−ｓ.ｅ.(フィットの標準偏差)を得た。ｐＨ６及びｐＨ７．４の両方で平衡結合を測定した。抗体の３倍の段階希釈液(１μＭから０．５ｎＭ)を２５℃、２μｌ／分の流速でランニングバッファ(０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水)に６分間注入した。注入後、流速を０．０２ｍｌ／分に増やした。１０ｍＭ  トリス、ｐＨ９、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを０．０１ｍｌ注入して再生成させた。平衡状態(Ｒｅｑ)で結合している抗体の量を抗体濃度としてプロットし、ＫＤを決定するために４-パラメータ反応曲線にフィットさせた。
【０１５５】
ＥＬＩＳＡ結果
ｐＨ６．０及びｐＨ７．４でのＦｃＲｎへの結合を測定した。材料と方法の項目に記載したように相対的な結合親和性を算出して、表４に示す。この結果から、変異Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４Ｙ、Ｎ４３４ＦまたはＮ４３４ＨについてのｐＨ６結合が改善されたことが示唆される。また、Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４Ｙ及びＮ４３４ＦのｐＨ７．４ではハーセプチンと比較して増加した結合が観察された。
【０１５６】
表４  Ｎ４３４点突然変異についてのＦｃＲｎ ＥＬＩＳＡの結果。親のハーセプチン分子と比較して、１より大きい相対的な結合値は結合の増加を示し；１より小さい値は結合の減少を示す。
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【０１５７】
また、Ｎ４３４ＨまたはＮ４３４Ａと既に報告されているＡｌａ置換(Shields 等, 2000)の組み合わせ変異体もｐＨ７．４での結合にほとんどまたは全く増加を示さず、ｐＨ６．０での結合が改善されたことが示された。
表５  Ｎ４３４組合せ変異体についてのＥＬＩＳＡの結果。親のハーセプチン分子と比較して、１より大きい相対的な結合値は結合の増加を示し；１より小さい値は結合の減少を示す。
2008510466.tif 000035
【０１５８】
Ｆｃ作用領域のＨｉｓ-スキャンでは、ＦｃＲｎ結合を増加または減少させる複数のＨｉｓ置換が同定された(表６)。これらの変異体には、ｐＨ７．４での結合にほとんどまたは全く増加を示さないで、ｐＨ依存的な結合を有するものもあった。これらの付加的なＨｉｓ変異単独ではＮ４３４Ｈよりも増加したｐＨ６結合を示すものはないが、置換Ｑ３１１Ｈ、Ｄ３１２Ｈ、Ｎ３１５ＨおよびＧ３８５ＨのそれぞれはｐＨ７．４での結合が有意に増加しないで、ｐＨ６の結合が４倍より多く改善した。
表６  Ｈｉｓ-スキャンについてのＦｃＲｎ ＥＬＩＳＡの結果。親のハーセプチン分子と比較して、１より大きい相対的な結合値は結合の増加を示し；１より小さい値は結合の減少を示す。
2008510466.tif 000036
【０１５９】
最後に、複数のＨｉｓ-スキャン点突然変異を変異Ｎ４３４ＡまたはＮ４３４Ｈと二つ一組に組み合わせた。これらの変異体の中で、二重変異Ｔ２８９Ｈ／Ｎ４３４ＨとＮ３１５Ｈ／Ｎ４３４Ｈは、ｐＨ７．４での結合に改善を示さないで、ｐＨ６での結合が最も改善した。
表７  Ｈｉｓ-スキャン組合せ変異についてのＦｃＲｎ ＥＬＩＳＡの結果。親のハーセプチン分子と比較して、１より大きい相対的な結合値は結合の増加を示し；１より小さい値は結合の減少を示す。
2008510466.tif 000037
【０１６０】
ＢＩＡｃｏｒｅ結果
いくつかの抗体を、ＥＬＩＳＡ  ＦｃＲｎ結合に基づいて選択して、ＢＩＡｃｏｒｅ分析のために３つのグループに分けた。集合１は主にＡｓｎ４３４の突然変異からなり、集合２はヒスチジンスキャン変異からなり、集合３は既に報告されている突然変異(3)からなる。ｐＨ６での集合１の抗体の動態学的分析および平衡状態結合分析の結果(表８)から、ＫＤの改善はｋａおよび／またはｋｄの変化の結果であることが示唆された。さらに、ヒトＦｃＲｎへの結合が改善している突然変異体は、カニクイザルＦｃＲｎへの結合も同様に改善しているようである。ｐＨ６で最も改善された結合を有する突然変異体は、Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４ＹおよびＮ４３４Ｆである。しかしながら、これらの突然変異体はｐＨ７．４でも有意に増加した結合を示す。対照的に、ハーセプチン、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４ＨおよびＴ２５０Ｑ／Ｍ４２８ＬのすべてはｐＨ７．４でほとんどないしは全く結合を示さない。Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４ＹおよびＮ４３４ＦのｐＨ７．４の結合は、野生型Ｆｃよりも顕著に増加していて、会合速度および解離速度がとても早いので平衡解離定数が正確に決定することができないことは注意すべきである。したがって、ｐＨ７．４の結合を表４中では＋または−で表した。特に、−はハーセプチンと同じレベルの結合を意味し、＋／−はごくわずかな結合を意味し、＋は顕著な結合を意味し、＋＋は有意な結合を意味する。
【０１６１】
表８  集合１突然変異体の動態学および平衡結合の比較
2008510466.tif 000038
ａ 動力学的パラメータから算出したＫＤ。
ｂ 平衡結合実験から算出したＫＤ。
ｃ ２９３細胞で発現されたタンパク質。
【０１６２】
動態学および平衡結合分析で測定されるＫＤ間にはいくつかの相違がある。しかしながら、これらの値の比較は、ヒトＦｃＲｎに対する結合では０．９９４であり、カニクイザルＦｃＲｎに対する結合では０．９３４の相関係数を示す。これは、系統的偏差を示唆する。
集合２の抗体の動態学および平衡結合分析(表９)は、集合１の抗体のものと同様の結果を示した。ヒトＦｃＲｎへの結合が改善している突然変異体は、カニクイザルＦｃＲｎへの結合も改善しているようである。ｐＨ６で結合を最も向上させた突然変異体は、Ｎ４３４Ｈ／Ｔ３７０Ａ／Ｅ３８０Ａ、Ｎ４３４Ｈ／Ｔ２８９ＨおよびＮ４３４Ｈ／Ｎ３１５Ｈである。しかしながら、これらの変異体はｐＨ７．４での結合も有意に増加した。これに反して、残りのすべての抗体はｐＨ７．４での結合がほとんどないしは全くみられなかった。
【０１６３】
表９  集合２突然変異体の動態学および平衡結合の比較
2008510466.tif 000039
ａ 動力学的パラメータから算出したＫＤ。
ｂ 平衡結合実験から算出したＫＤ。
ｃ ２９３細胞で発現されたタンパク質。
【０１６４】
動態学および平衡結合分析で測定されるＫＤ間の相関係数の試験により、ヒトＦｃＲｎ結合の相関係数は０．２４６であり、一方カニクイザルＦｃＲｎ結合の相関係数は０．９６６であることが示された。ヒトＦｃＲｎ結合の相関係数の低さは、平衡結合の間にいくつかの凝集の問題を起こすＧ３８５Ｈに起因する。この点を除くと０．９１６の相関係数であった。
集合３の抗体の動態学および平衡結合分析(表１０)は、集合１の抗体のものと同様の結果を示した。ヒトＦｃＲｎへの結合が改善している突然変異体は、カニクイザルＦｃＲｎへの結合も改善しているようである。ｐＨ６で結合を最も向上させた突然変異体は、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ組合せ変異である。また、ｐＨ７．４での結合はわずかに増加していいたが、このレベルは集合１及び集合２の変異のものと比較すると低い。
【０１６５】
表１０  集合３突然変異体の動態学および平衡結合の比較
2008510466.tif 000040
ａ 動力学的パラメータから算出したＫＤ。
ｂ 平衡結合実験から算出したＫＤ。
ｃ ２９３細胞で発現されたタンパク質。
【０１６６】
動態学および平衡結合分析で測定されるＫＤ間の相関係数の試験により、ヒトＦｃＲｎ結合の相関係数は０．９６６であり、一方カニクイザルＦｃＲｎ結合の相関係数は０．９０２であることが示された。
我々は、変異Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４ＦおよびＮ４３４Ａを含有する無ヒンジＦｃの親和性が、ｐＨ６の野生型と比較して、ヒトＦｃＲｎ結合において、１７０倍、９倍および２．７倍に改善することを既に報告した。この実施例では、完全長４Ｄ５抗体に関して、これらの突然変異と他の変異に注目した。このたび、平衡結合分析によって、得られる結果を比較したところ、Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４ＦおよびＮ４３４ＡがｐＨ６でのヒトＦｃＲｎへの結合親和性を２０倍、７倍および２倍に改善することを明らかにした。カニクイザルＦｃＲｎへの結合についても同様の結果がみられた。芳香族の突然変異、例えばＮ４３４ＹおよびＮ４３４Ｈを含有する付加的な変異体は、ヒトＦｃＲｎへのｐＨ６での結合を９倍および４倍に増加した。しかしながら、Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４ＹおよびＮ４３４Ｆの突然変異体のすべては、ヒト及びカニクイザルのＦｃＲｎへのｐＨ７．４での結合も大きく増加させた。
Ｎ４３４Ｈの予測される結果、およびｐＨ依存的なＦｃ-ＦｃＲｎ相互作用(9)におけるヒスチジン残基の重要性を考慮すると、他の状況でヒスチジン突然変異を調査することに決めた。ラットＦｃ-ＦｃＲｎ複合体の説明される構造(9,10)、及びヒトタンパク質の予測される相同性を用いて、ヒスチジン-スキャンを行った。加えて、Prestaおよび共同研究者(4)により同定されたＴ３７０ＡおよびＥ３８０Ａ突然変異と組み合わせたＮ４３４Ｈ突然変異についても調査を行った。ＢＩＡｃｏｒｅ分析によって、ｐＨ６での結合は改善するがｐＨ７．４での結合は増加しない変異体には、Ｇ３８５Ｈ、Ｄ３１２Ｈ、Ｎ３１５ＨおよびＮ４３４Ｈが含まれる。新規のヒスチジン突然変異およびヒスチジンの組合せ突然変異のいずれもが、Ｎ４３４Ｈ突然変異単独より大きいｐＨ６ ＦｃＲｎ結合の改善を示さなかった。しかしながら、組合せ変異のすべてがｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合を有意に増加した。２ないしそれ以上のヒスチジン変異を組み合わせて有する付加的な変異体は、ＦｃＲｎへのｐＨ依存的な結合を亢進しうる。加えて、Ｈｉｓ変異によって、影響を受ける部位を同定することにより、更なるアミノ酸の置換のための新規な部位が提案される。
【０１６７】
最後に、ＩｇＧ１分子に関してHintonおよび共同研究者(3)により報告される突然変異を調査した。彼らは、ＩｇＧ２分子をバックグラウンドとした、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ４２８ＬおよびＴ２５０Ｑ／Ｍ４２８ＬそれぞれがｐＨ６での結合を３倍、７倍および２８倍に増加したことを報告したが、我々はＩｇＧ１に関してそれぞれ３倍、３倍および５倍のより適度な増加があったことを発見した。カニクイザルＦｃＲｎへの結合についても同様の結果が見られた。単一の変異ではヒトおよびカニクイザルのＦｃＲｎへのｐＨ７．４での結合に増加がみられないのに対して、二重変異ではわずかながらの結合の増加がみられた。
この研究で、我々は、ｐＨ６およびｐＨ７．４でのヒトおよびカニクイザルのＦｃＲｎに対する複数のＦｃ突然変異体の親和性を数量化した。我々は、相対的な親和性と親和性改善は、与えられた分子について、ヒトとカニクイザルのＦｃＲｎ間で同様であると決定した。ＥＬＩＳＡおよびＢＩＡｃｏｒｅアッセイによるｐＨ６結合に基づいて改善された変異体の順位は、総じて一致していた、しかしながら、ｐＨ７．４結合評価は異なるものが多い。これらの食い違いは、使用した異なる固定化手順のもとでＦｃＲｎ又はＩｇＧの行動の相違によるものであろう。
【０１６８】
実施例６の参考文献
1.  Ghetie, V.,および Ward, E. S. (2000) Annu Rev Immunol 18, 739-766
2.  Ghetie, V.,および Ward, E. S. (1997) Immunol Today 18, 592-598
3.  Hinton, P. R., Johlfs, M. G., Xiong, J. M., Hanestad, K., Ong, K. C., Bullock, C., Keller, S., Tang, M. T., Tso, J. Y., Vasquez, M.,および Tsurushita, N. (2004) J Biol Chem 279, 6213-6216
4.  Shields, R. L., Namenuk, A. K., Hong, K., Meng, Y. G., Rae, J., Briggs, J., Xie, D., Lai, J., Stadlen, A., Li, B., Fox, J. A.,および Presta, L. G. (2001) J Biol Chem 276, 6591-6604
5.  Dall'Acqua, W. F., Woods, R. M., Ward, E. S., Palaszynski, S. R., Patel, N. K., Brewah, Y. A., Wu, H., Kiener, P. A.,および Langermann, S. (2002) J Immunol 169, 5171-5180
6.  Johnsson, B., Lofas, S.,および Lindquist, G. (1991) Anal Biochem 198, 268-277
7.  Karlsson, R., Michaelsson, A.,および Mattsson, L. (1991) J Immunol Methods 145, 229-240
8.  BIAcore, Inc. (1991) BIAcore Methods Manual, Piscataway, NJ
9.  Martin, W. L., West, A. P., Jr., Gan, L.,および Bjorkman, P. J. (2001) Mol Cell 7, 867-877
10.  Burmeister, W. P., Huber, A. H.,および Bjorkman, P. J. (1994) Nature 372, 379-383
【０１６９】
参考文献
特許、公開された出願および他の出版物を含め、本明細書中で挙げた参考文献は、出典明記によって本明細書中に組み込まれるものである。
本発明の実施は、特に明記しない限り、当分野の技術範囲内の、分子生物学などの従来の方法を用いるものである。そのような技術は以下の文献において十分に説明される。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (J. Sambrook 等, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989); Current Protocols in Molecular Biology (F. Ausubel 等, eds., 1987 updated); Essential Molecular Biology (T. Brown ed., IRL Press 1991); Gene Expression Technology (Goeddel 編集, Academic Press 1991); Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes (A. Bothwell 等 編集, Bartlett Publ. 1990); Gene Transfer and Expression (M. Kriegler, Stockton Press 1990); Recombinant DNA Methodology II (R. Wu 等 編集, Academic Press 1995); PCR:  A Practical Approach (M. McPherson 等, IRL Press at Oxford University Press 1991); Oligonucleotide Synthesis (M. Gait 編集, 1984); Cell Culture for Biochemists (R. Adams 編集, Elsevier Science Publishers 1990); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. Miller & M. Calos 編集, 1987); Mammalian Cell Biotechnology (M. Butler 編集, 1991); Animal Cell Culture (J. Pollard 等 編集, Humana Press 1990); Culture of Animal Cells, 2nd Ed. (R. Freshney 等 編集, Alan R. Liss 1987); Flow Cytometry and Sorting (M. Melamed 等 編集, Wiley-Liss 1990); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.);Wirth M. および Hauser H. (1993); Immunochemistry in Practice, 3rd edition, A. Johnstone & R. Thorpe, Blackwell Science, Cambridge, MA, 1996; Techniques in Immunocytochemistry, (G. Bullock & P. Petrusz eds., Academic Press 1982, 1983, 1985, 1989); Handbook of Experimental Immunology, (D. Weir & C. Blackwell, eds.); Current Protocols in Immunology (J.  Coligan 等 編集 1991); Immunoassay (E. P. Diamandis & T.K. Christopoulos, 編集, Academic Press, Inc., 1996); Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed) Academic Press, New York; Ed Harlow および David Lane, Antibodies A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Antibody Engineering, 2nd edition (C. Borrebaeck, ed., Oxford University Press, 1995);および the series Annual Review of Immunology; the series Advances in Immunologyを参照のこと。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】天然ＩｇＧと様々な抗体断片を生成するためのその酵素消化型の模式図である。ジスルフィド結合はＣＨ１及びＣＬドメイン及び２つのＣＨ２ドメインの間のＳ-Ｓで示した。Ｖは可変ドメインであり；Ｃは定常ドメインであり；Ｌは軽鎖を表しＨは重鎖を表す。
【図２】抗Ｈｅｒ２抗体(トラスツズマブ)のＶＬ(図２Ａ；配列番号５)とＶＨ(図２Ｂ；配列番号６)のアミノ酸配列を示す。
【図３Ａ】具体的な抗ＩｇＥ抗体Ｅ２５、Ｅ２６、Ｅ２７及びＨｕ-９０１の軽鎖及び重鎖の配列を示す。
【図３Ｂ】具体的な抗ＩｇＥ抗体Ｅ２５、Ｅ２６、Ｅ２７及びＨｕ-９０１の軽鎖及び重鎖の配列を示す。
【図４】天然配列のヒトＩｇＧ Ｆｃ領域配列である、ｈｕｍＩｇＧ１(非Ａ及びＡアロタイプ；それぞれ配列番号２９及び３０)、ｈｕｍＩｇＧ２(配列番号３１)、ｈｕｍＩｇＧ３(配列番号３２)及びｈｕｍＩｇＧ４(配列番号:３３)のアラインメントを示し、配列間の違いをアステリスクで示した。
【図５】天然配列のヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のアラインメントを示す。天然配列のヒトＩｇＧ Ｆｃ領域配列である、ｈｕｍＩｇＧ１(非Ａ及びＡアロタイプ；それぞれ配列番号２９及び３０)、ｈｕｍＩｇＧ２(配列番号３１）、ｈｕｍＩｇＧ３(配列番号３２)及びｈｕｍＩｇＧ４(配列番号:３３)を示す。ヒトＩｇＧ１配列は非Ａアロタイプであり、この配列とＡアロタイプとの相違(位置３５６及び３５８；ＥＵ番号付けシステム)をヒトＩｇＧ１配列の下に示す。また、天然配列のマウスＩｇＧ Ｆｃ領域配列である、ｍｕｒＩｇＧ１(配列番号３４)、ｍｕｒＩｇＧ２Ａ(配列番号３５)、ｍｕｒＩｇＧ２Ｂ(配列番号３６)及びｍｕｒＩｇＧ３(配列番号３７)を示す。
【図６】ＩｇＧホメオスタシスにおけるＦｃＲｎの役割を示す。小胞内の卵型がＦｃＲｎである。
【図７】ファージディスプレイに用いるヒトＩｇＧ１ Ｆｃタンパク質変異体(Ｗ０４３７)の配列を示す。可溶型のＦｃの成熟タンパク質配列(配列番号３８)を示す；ファージディスプレイに用いるＭ１３及びｇ３ｐの位置は示さない。成熟タンパク質配列内の第１残基であるＳｅｒは、ヒンジ領域の２番目のＣｙｓ(Ｃ２２９)の変異に対応しており、最後の残基(Ｌｅｕ)はＭ１３ ｇ３ｐへの融合部位である。下線で示した残基はＮ４３４に対応する。
【図８】ＳＰＲ(ＢＩＡｃｏｒｅ)によるｐＨ６．０でのｈｕＦｃＲｎに対する変異形Ｆｃ結合と大腸菌産生野生型Ｆｃ結合の平衡状態分析を示す。
【図９】ヒトＦｃＲｎに結合する２Ｈ７ ＩｇＧ１のＥＬＩＳＡ分析を示す。ヒトＩｇＧ１変異体は哺乳動物細胞に過渡的に形質移入して産生し、ｐＨ６．０又はｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合についてヒト化４Ｄ５(ハーセプチン(登録商標))と比較した。Neutrアビジンコート/ＦｃＲｎ−ビオチン化/抗体/ヤギ抗ｈｕ-ＩｇＧ-Ｆ(ａｂ)'２-ＨＲＰ会合(ｐＨ６．０)及び乖離(ｐＨ７．４)。
【図１０】Ｃ２Ｂ８軽鎖(配列番号２４)及び重鎖(配列番号２５)配列を示す。定常領域とＦｃ領域を囲み、可変領域を囲みの外に示す。
【図１１】ＥＬＩＳＡにおけるヒトＦｃγＲＩＩＩに対する２Ｈ７変異体(Ｖ１５８)の結合親和性を示す。
【図１２】カニクイザルにおける２０ｍｇ／ｋｇ単回ＩＶ投与の後のＰＲＯ１４５２３４、ＰＲＯ１４５１８１及びＰＲＯ１４５１８２の血清中濃度-時間の特性を示す。
【図１３】ＥＬＩＳＡによる、ｐＨ６．０及びｐＨ７．４でのヒトＦｃＲｎに対するハーセプチン及びｈｕ４Ｄ５(Ｎ４３４Ｈ)の結合を示す。
【図１】
2008510466.tif 000041
【図２】
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【図３Ａ】
2008510466.tif 000043
【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2008510466.tif 000047
【図７】
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【図８】
2008510466.tif 000049
【図９】
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【図１０】
2008510466.tif 000051
【図１１】
2008510466.tif 000052
【図１２】
2008510466.tif 000053
【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年6月26日(2007.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｓｎ４３４のＴｒｐ(Ｎ４３４Ｗ)へのアミノ酸置換を少なくとも含有する変異体ＩｇＧ Ｆｃ領域を含んでなる単離されたポリペプチド。
【請求項２】
前記変異体ＦｃがｐＨ６．０において天然配列ＩｇＧ Ｆｃ領域よりも高い親和性であり、ｐＨ６．０よりもｐＨ７．４において弱い結合親和性でヒトＦｃＲｎに結合する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記のｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎに対する結合親和性が天然配列のＦｃ領域より少なくとも２０倍高いものである、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、天然配列のＦｃ領域を有するポリペプチドより霊長類の血清における血清半減期が長いものである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記霊長類がヒトまたはカニクイザルである、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドがイムノアドヘシンである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
さらに、Ｆｃ領域内に一ないし複数のアミノ酸置換を含有しており、その結果、前記のポリペプチドが、天然配列のＦｃ領域を有する抗体と比較して、ＦｃγＲ結合の亢進、抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)の亢進、補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)の亢進、ＣＤＣの減退、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ機能の亢進、ＡＤＣＣの亢進かつＣＤＣ機能の減退、ＦｃＲｎ結合かつ血清半減期の亢進、の何れか一の性質を示す、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
さらに、カバットのＥＵインデックスの残基番号付けでいう、ＩｇＧ Ｆｃ領域内のＤ２６５Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｋ３３４Ｌ、Ｋ３２２Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｅ３８０ＡおよびＥ３８０Ａ／Ｔ３０７Ａからなる群から選択される残基位置のアミノ酸置換を一ないし複数含有してなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
Ａｓｎ４３４のＴｒｐ(Ｎ４３４Ｗ)へのアミノ酸置換を少なくとも含有する変異体ＩｇＧ Ｆｃ領域を含んでなる単離された抗体。
【請求項１０】
前記変異体ＩｇＧ ＦｃがｐＨ６．０において天然配列ＩｇＧ Ｆｃ領域よりも高い親和性であり、ｐＨ６．０よりもｐＨ７．４において弱い結合親和性でヒトＦｃＲｎに結合する、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
前記のｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎに対する変異体Ｆｃの結合親和性が天然配列のＩｇＧ Ｆｃ領域より少なくとも２０倍高いものである、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体がキメラ、ヒト化またはヒトである、請求項９に記載の抗体。
【請求項１３】
前記抗体がＩｇＧ１である、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
さらに、Ｆｃ領域内に一ないし複数のアミノ酸置換を含有しており、その結果、天然配列のＦｃ領域を有する抗体と比較して、ＦｃγＲ結合の亢進、抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)の亢進、補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)の亢進、ＣＤＣの減退、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ機能の亢進、ＡＤＣＣの亢進かつＣＤＣ機能の減退、ＦｃＲｎ結合かつ血清半減期の亢進、の何れか一の性質を示すポリペプチドとなる、請求項９に記載の抗体。
【請求項１５】
さらに、カバットのＥＵインデックスの残基番号付けでいう、ＩｇＧ Ｆｃ領域内のＤ２６５Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｋ３３４Ｌ、Ｋ３２２Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｅ３８０ＡおよびＥ３８０Ａ／Ｔ３０７Ａからなる群から選択される残基位置のアミノ酸置換を一ないし複数含有してなる、請求項９に記載の抗体。
【請求項１６】
前記抗体が、ＣＤ２０、Ｈｅｒ２、ＢＲ３、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ、ＩｇＥおよびＣＤ１１ａからなる抗原の群から選択される抗原に結合する、請求項９に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体が、ヒトＣＤ２０に結合し、
ａ．配列番号２
ｂ．配列番号４２、および
ｃ．配列番号４５
からなる配列の群から選択されるＶＨ配列を含有してなり、
該Ｌ鎖が配列番号１のＶＬ配列または配列番号２６の完全長配列を含有してなる、請求項１６に記載の抗体。
【請求項１８】
前記抗体がヒトＣＤ２０に結合し、図１０に示す配列番号２４のＣ２Ｂ８ ＶＬ配列と配列番号２５のＶＨ配列を含有してなる、請求項１６に記載の抗体。
【請求項１９】
前記抗体がＶＥＧＦに結合し、配列番号７のＶＬ配列と配列番号８のＶＨ配列；配列番号９のＶＬ配列と配列番号１０のＶＨ配列；および配列番号１１のＶＬ配列と配列番号１２のＶＨ配列からなる配列の群から選択されるＶＬとＶＨの配列を含んでなる、請求項１６に記載の抗体。
【請求項２０】
前記抗体がＨｅｒ２に結合し、配列番号３のＶＬ配列と配列番号４のＶＨ配列；および配列番号５のＶＬ配列と配列番号６のＶＨ配列からなる配列の群から選択されるＶＬとＶＨの配列を含んでなる、請求項１６に記載の抗体。
【請求項２１】
前記抗体がヒトＣＤ１１ａに結合し、配列番号１３のＶＬ配列または配列番号１５の完全長Ｌ鎖と、並びに配列番号１４のＶＨ配列を含有してなる、請求項１６に記載の抗体。
【請求項２２】
前記抗体がヒトＩｇＥに結合し、配列番号４７のＶＬ配列と配列番号４８のＶＨ配列；配列番号４９のＶＬ配列と配列番号５０のＶＨ配列；配列番号５１のＶＬ配列と配列番号５２のＶＨ配列；配列番号５３のＶＬ配列と配列番号５４のＶＨ配列からなる配列の群から選択されるＶＬとＶＨの配列を含んでなる、請求項１６に記載の抗体。
【請求項２３】
請求項１に記載のポリペプチド又は請求項９に記載の抗体と担体とを含有してなる組成物。
【請求項２４】
請求項９に記載の抗体をコードする単離された核酸。
【請求項２５】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする発現ベクター。
【請求項２６】
請求項２４に記載の核酸を含有してなる単離された宿主細胞。
【請求項２７】
請求項９に記載の抗体を産生する請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
前記ポリペプチドを産生する請求項２７に記載の宿主細胞を培養して、該細胞培養物から該ポリペプチドを回収することを含む、請求項９に記載の抗体の産生方法。
【請求項２９】
容器と、容器内に収容される組成物とを具備する製造品であり、該組成物が請求項１に記載のポリペプチドを含有するものである製造品。
【請求項３０】
さらに、前記組成物が非ホジキンリンパ腫を治療するために使用することができることを示すパッケージ挿入物を具備する、請求項２９に記載の製造品。
【請求項３１】
患者のＣＤ２０を発現するＢ細胞で特徴付けられるＢ細胞腫瘍または悪性物の治療のための医薬であって、治療的有効量の請求項１７に記載のヒト化ＣＤ２０結合抗体を含有する医薬。
【請求項３２】
前記Ｂ細胞腫瘍が、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)またはリンパ球優性ホジキン病(ＬＰＨＤ)である、請求項３１に記載の医薬。
【請求項３３】
患者の慢性リンパ球性白血病の治療のための医薬であって、治療的有効量のヒトＣＤ２０に結合する請求項１７に記載の抗体を含有してなり、該抗体がさらにアミノ酸置換Ｋ３２６ＡまたはＫ３２９Ｗを含有するものである、医薬。
【請求項３４】
患者のＢ細胞制御性自己免疫性疾患の寛解のための医薬であって、治療的有効量の請求項１６または１７に記載のＣＤ２０結合抗体を含有してなる医薬。
【請求項３５】
前記自己免疫性疾患が、関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、ウェゲナー病、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)、血栓性血小板減少性紫斑病(ＴＴＰ)、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡネフロパシ、ＩｇＭ多発性神経炎、重症筋無力症、血管炎、真正糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群および糸球体腎炎からなる群から選択されるものである、請求項３４に記載の医薬。
【請求項３６】
患者の血管形成性疾患の治療のための医薬であって、治療的有効量の請求項１９に記載の抗体を含有してなる医薬。
【請求項３７】
患者のＨＥＲ２発現癌の治療のための医薬であって、治療的有効量の請求項２０に記載の抗体を含有してなる医薬。
【請求項３８】
患者のＬＦＡ-１媒介性疾患の治療のための医薬であって、治療的有効量の請求項２１に記載の抗体を含有してなる医薬。
【請求項３９】
患者のＩｇＥ媒介性疾患の治療のための医薬であって、治療的有効量の請求項２２に記載の抗体を含有してなる医薬。
【請求項４０】
Ａｓｎ４３４のＴｙｒ(Ｎ４３４Ｙ)へのアミノ酸置換を少なくとも含有する変異体ＩｇＧ Ｆｃ領域を含んでなり、さらにＨ４３３Ｒ、Ｈ４３３Ｓ、Ｙ４３６Ｈ、Ｙ４３６Ｒ、Ｙ４３６Ｔからなる群から選択されるアミノ酸置換を含有しない単離されたポリペプチド。
【請求項４１】
Ａｓｎ４３４のＰｈｅ(Ｎ４３４Ｆ)へのアミノ酸置換を少なくとも含有する変異体ＩｇＧ Ｆｃ領域を含んでなり、さらにＨ４３３Ｋ、Ｙ４３６Ｈ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴまたはＴ２５６Ｅのアミノ酸置換を含有しない単離されたポリペプチド。
【請求項４２】
Ａｓｎ４３４のＨｉｓ(Ｎ４３４Ｈ)へのアミノ酸置換を少なくとも含有する変異体ＩｇＧ Ｆｃ領域を含んでなる単離されたポリペプチド。
【請求項４３】
前記変異体ＩｇＧ Ｆｃ領域がｐＨ６．０において天然配列ＩｇＧ Ｆｃ領域よりも高い親和性であり、ｐＨ６．０よりもｐＨ７．４において弱い結合親和性でヒトＦｃＲｎに結合する、請求項４０、４１および４２の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
前記ポリペプチドが抗体である、請求項４０、４１および４２の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
前記抗体がキメラ、ヒトまたはヒト化である、請求項４４に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
前記ＩｇＧがヒトＩｇＧ１である、請求項４５に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
前記抗体が、ＣＤ２０、Ｈｅｒ２、ＢＲ３、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ、ＩｇＥおよびＣＤ１１ａからなる抗原の群から選択される抗原に結合する、請求項４４に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
ＨＥＲ２に結合する抗体である、請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
前記抗体が、配列番号３のＶＬ配列と配列番号４のＶＨ配列；および配列番号５のＶＬ配列と配列番号６のＶＨ配列からなる配列の群から選択されるＶＬとＶＨの配列を含んでなる、請求項４８に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
さらに、前記ＨＥＲ２結合抗体はＦｃ領域内に一ないし複数のアミノ酸置換を含有しており、その結果、天然配列のＦｃ領域を有する抗体と比較して、ＦｃγＲ結合の亢進、抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)の亢進、補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)の亢進、ＣＤＣの減退、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ機能の亢進、ＡＤＣＣの亢進かつＣＤＣ機能の減退、ＦｃＲｎ結合かつ血清半減期の亢進、の何れか一の性質を示すポリペプチドとなる、請求項４８に記載のポリペプチド。
【請求項５１】
さらに、カバットのＥＵインデックスの残基番号付けでいう、ＩｇＧ Ｆｃ領域内のＤ２６５Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｋ３３４Ｌ、Ｋ３２２Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｅ３８０ＡおよびＥ３８０Ａ／Ｔ３０７Ａからなる群から選択される残基位置のアミノ酸置換を一ないし複数含有してなる、請求項４８に記載のポリペプチド。
【請求項５２】
さらに、ＩｇＧ Ｆｃ領域内にアミノ酸置換Ｔ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａを含有してなる、請求項４８に記載のポリペプチド。
【請求項５３】
前記抗体が配列番号５のＶＬ配列と配列番号６のＶＨ配列を含んでなり、ｐＨ６．０での該抗体のヒトＦｃＲｎに対する結合が親抗体トラスツズマブのものより少なくとも４０倍良好である、請求項５２に記載のポリペプチド。
【請求項５４】
さらに、Ｔ２８９ＨまたはＮ３１５Ｈのアミノ酸置換を含有してなる、請求項４８に記載のポリペプチド。
【請求項５５】
前記ポリペプチドがイムノアドヘシンである、請求項４０、４１および４２の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項５６】
さらに、Ｆｃ領域内に一ないし複数のアミノ酸置換を含有しており、その結果、ＦｃγＲ結合の亢進、ＡＤＣＣの亢進、ＣＤＣの亢進、ＣＤＣの減退、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ機能の亢進、ＡＤＣＣの亢進かつＣＤＣ機能の減退、の何れか一の性質を示すポリペプチドとなる、請求項４０、４１および４２の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
さらに、カバットのＥＵインデックスの残基番号付けでいう、ＩｇＧ Ｆｃ領域内のＤ２６５Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｋ３３４Ｌ、Ｋ３２２Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｅ３８０ＡおよびＥ３８０Ａ／Ｔ３０７Ａからなる群から選択される残基位置のアミノ酸置換を一ないし複数含有してなる、請求項４０、４１および４２の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
請求項４０、４１、４２および４８の何れか一に記載のポリペプチドと担体とを含んでなる組成物。
【請求項５９】
請求項４０、４１、４２および４８の何れか一に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項６０】
請求項５３に記載の核酸を含んでなる単離された宿主細胞。
【請求項６１】
請求項４０、４１、４２および４８の何れか一に記載のポリペプチドを産生する請求項６０に記載の宿主細胞。
【請求項６２】
請求項４２に記載のポリペプチドを産生する請求項６１に記載の宿主細胞を培養して、該細胞培養物から該ポリペプチドを回収することを含む、請求項４２に記載のポリペプチドの産生方法。
【請求項６３】
容器と、容器内に収容される組成物とを具備する製造品であり、該組成物が請求項４０、４１、４２および４８の何れか一に記載のポリペプチドを含有するものである製造品。
【請求項６４】
患者のＨＥＲ２発現癌の治療のための医薬であって、治療的有効量の請求項４８に記載の抗体を含有してなる医薬。
【請求項６５】
前記抗体が、配列番号３のＶＬ配列と配列番号４のＶＨ配列；および配列番号５のＶＬ配列と配列番号６のＶＨ配列からなる配列の群から選択されるＶＬとＶＨの配列を含んでなる、請求項６４に記載の医薬。
【請求項６６】
Ｌｙｓ３３４のロイシン(Ｋ３３４Ｌ)へのアミノ酸置換を少なくとも含有する変異体ＩｇＧ Ｆｃ領域を含んでなる単離されたポリペプチド。
【請求項６７】
前記変異体Ｆｃが、天然配列のＩｇＧ Ｆｃ領域よりも高い親和性でヒトＦｃγＲＩＩＩに結合する、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
ヒトエフェクター細胞の存在下にて、天然配列のＩｇＧ Ｆｃ領域を有するポリペプチドよりも亢進した抗体依存性細胞障害性を示す、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
さらに、Ｆｃ領域内に一ないし複数のアミノ酸置換を含有しており、その結果、天然配列のＦｃ領域を有する抗体と比較して、ＦｃγＲ結合の亢進、ＡＤＣＣの亢進、ＣＤＣの亢進、ＣＤＣの減退、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ機能の亢進、ＡＤＣＣの亢進かつＣＤＣ機能の減退、ＦｃＲｎ結合かつ血清半減期の亢進、の何れか一の性質を示すポリペプチドとなる、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
さらに、カバットのＥＵインデックスの残基番号付けでいう、ＩｇＧ Ｆｃ領域内のＤ２６５Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｅ３８０ＡおよびＥ３８０Ａ／Ｔ３０７Ａからなる群から選択される残基位置のアミノ酸置換を一ないし複数含有してなる、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
キメラ、ヒト化またはヒトＩｇＧ抗体である、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項７２】
配列番号３９のＬ鎖配列と配列番号４０のＨ鎖配列を含んでなり、Ｆｃ領域内のＮ４３４がＷ、Ｙ、ＦまたはＡに置換されているヒト化ＣＤ２０結合抗体。
【請求項７３】
請求項７２に記載の抗体と担体を含んでなる組成物。
【請求項７４】
請求項７３に記載の抗体をコードする単離された核酸。
【請求項７５】
請求項７４に記載の核酸を含んでなる宿主細胞。
【請求項７６】
患者のＣＤ２０を発現するＢ細胞で特徴付けられるＢ細胞腫瘍または悪性物の治療のための医薬であって、治療的有効量の請求項７２に記載のヒト化ＣＤ２０結合抗体を含有してなる医薬。
【請求項７７】
患者のＢ細胞制御性自己免疫性疾患の寛解のための医薬であって、治療的有効量の請求項７２に記載のヒト化ＣＤ２０結合抗体を含有してなる医薬。
【請求項７８】
天然配列のＩｇＧ Ｆｃを有するポリペプチドと比較して、ｐＨ６．０でのＦｃＲｎに対する結合親和性が高く、ｐＨ６．０よりもｐＨ７．４での結合親和性が弱いポリペプチドのスクリーニング方法であって、ファージ上に候補ポリペプチドを発現させ、固形基質に固定させたヒトＦｃＲｎを作製し、ファージ粒子を基質上のヒトＦｃＲｎに結合させ、各洗浄ごとにストリンジェンシーを上げながら複数回洗浄することによって非結合のファージ粒子を除去し、ｐＨ７．４で残りの結合したファージを溶出することを含む、スクリーニング方法。
【請求項７９】
配列番号５のＶＬ配列、配列番号６のＶＨ配列、並びにＡｓｎ４３４のＡｌａ(Ｎ４３４Ａ)へのアミノ酸置換を少なくとも含有する変異体ＩｇＧ Ｆｃ領域を含んでなる、単離された抗ＨＥＲ２抗体。
【請求項８０】
さらに、カバットのＥＵインデックスの残基番号付けでいう、ＩｇＧ Ｆｃ領域内のＤ２６５Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｋ３３４Ｌ、Ｋ３２２Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｅ３８０ＡおよびＥ３８０Ａ／Ｔ３０７Ａからなる群から選択される残基位置のアミノ酸置換を一ないし複数含有してなる、請求項７９に記載の抗体。
【国際調査報告】
2008510466.tif 000055
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