(57)【要約】  本発明は、細胞膜受容体の助けなしで細胞膜を透過し得るようにするＰＴＤ(protein transduction domain)、一つ以上のプロタンパク質転換酵素(proprotein convertase)切断部位を有し且つ前記プロタンパク質転換酵素によって切断されて不活性ＴＲＤ(tissue regeneration domain)を細胞内で活性化させるＦＡＤ(furin activation domain)、および前記ＦＡＤのプロタンパク質転換酵素の切断によって活性化され、細胞内で組織の成長または形成を促進し或いは組織の再生を誘導するＴＲＤを含有する不活性ポリペプチド(ＴＲＰｓ：tissue regenerative polypeptides)およびその製造方法に関する。本発明によるＴＲＰｓは、実用的に組み換え大腸菌などのバクテリアの培養によって量産が可能であり、生体投与の前には不活性状態なので、従来の類似用途の活性タンパク質に比べてその生産コストが数十分の１に過ぎず、分離・精製および取り扱い・投薬過程が非常に簡単で便利である。本発明による不活性ＴＲＰｓを生体内に投薬する場合、従来の公知のｒｈＢＭＰ類またはＴＧＦ−β類とは全く異なる薬理メカニズムによって骨、軟骨などの組織の形成または再生を促進し、或いは腎臓、肝、肺、及び心臓などの臓器の繊維化および硬変を解消させることができて新しいメカニズムの新薬として有用である。
2008545374.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不活性組織再生ポリペプチド（ＴＲＰ）であって、
(ａ）前記ポリペプチドを細胞膜受容体の助けなしで細胞膜を透過し得るようにするタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ)、
（ｂ）一つ以上のプロタンパク質転換酵素切断部位を有し、前記プロタンパク質転換酵素によって切断されて不活性組織再生ドメイン（ＴＲＤ)を細胞内で活性化させるフューリン活性ドメイン（ＦＡＤ)、および
（ｃ）前記ＦＡＤのプロタンパク質転換酵素の切断によって活性化され、細胞内で組織の成長または形成を促進し或いは組織の再生を誘導するＴＲＤ、
を含有する不活性ＴＲＰ。
【請求項２】
プロタンパク質転換酵素はフューリンであることを特徴とする請求項１に記載の不活性ＴＲＰ。
【請求項３】
３次元的立体規則性を持っておらず、それ自体では活性を持っていないことを特徴とする請求項１に記載の不活性ＴＲＰ。
【請求項４】
前記ＦＡＤのプロタンパク質転換酵素切断部位が細胞内でプロタンパク質転換酵素によって切断され、前記ＴＲＤが活性化されて前記活性化されたＴＲＤが細胞外に分泌されることを特徴とする請求項１に記載の不活性ＴＲＰ。
【請求項５】
前記ＴＲＤはＢＭＰｓ、ＴＧＦ−β、β−ＮＧＦ（β−神経成長因子）、β−アミロイド、ＡＤＡＭｓ（ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ様)、ＴＮＦ−α、ＭＭＰｓ(マトリックスメタルプロテナーゼ)、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）よりなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の不活性ＴＲＰ。
【請求項６】
前記ＴＲＤは配列番号：１〜１３よりなる群から選ばれたアミノ酸配列で表示されることを特徴とする請求項１に記載の不活性ＴＲＰ。
【請求項７】
前記ＦＡＤは配列番号：１４〜２６よりなる群から選ばれたアミノ酸配列で表示されることを特徴とする請求項１に記載の不活性ＴＲＰ。
【請求項８】
前記ＰＴＤはＴＡＴ、ショウジョウバエ由来Ａｎｔｐペプチド、ＶＰ２２ペプチド、およびｍｐｈ−１−ｂｔｍよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の不活性ＴＲＰ。
【請求項９】
ＰＴＤ、ＦＡＤ及びＴＲＤが融合されている請求項１に記載の不活性ＴＲＰ。
【請求項１０】
ＴＲＤをコードするＤＮＡの５’前にＦＡＤをコードする塩基配列、ＰＴＤの塩基配列、タギングのための塩基配列、および分離・精製のための４つ以上のヒスチジンをコードする塩基配列が挿入されている組み換えベクター。
【請求項１１】
請求項１０の組み換えベクターで形質転換されたバクテリア。
【請求項１２】
(ａ）請求項１１の形質転換されたバクテリアを培養して［ＰＴＤ−ＦＡＤ−ＴＲＤ］ポリペプチドを発現させる段階と、（ｂ）前記培養液を遠心分離した後、上清と細胞ペレットに尿素溶液を加えて前記ポリペプチドの２次元および３次元構造を除去し或いは１次元線形構造に変形させた後、［ＰＴＤ−ＦＡＤ−ＴＲＤ］ポリペプチドを精製する段階とを含む、不活性ＴＲＰの製造方法。
【請求項１３】
前記ＴＲＤはＢＭＰｓ、ＴＧＦ−β、β−ＮＧＦ（β−神経成長因子）、β−アミロイド、ＡＤＡＭｓ(ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ様)、ＴＮＦ−α、ＭＭＰｓ(マトリックスメタルプロテナーゼ)、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）よりなる群から選択されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＴＲＤは配列番号：１〜１３よりなる群から選ばれたアミノ酸配列で表示されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＦＡＤは配列番号：１４〜２６よりなる群から選ばれたアミノ酸配列で表示されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰＴＤはＴＡＴ、ショウジョウバエ由来Ａｎｔｐペプチド、ＶＰ２２ペプチド、およびｍｐｈ−１−ｂｔｍよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記精製段階は、前記ポリペプチドをニッケル−チタニウムビーズに結合させ、これを同一の溶液で洗浄した後、イミダゾール(imidazole)と高塩濃度緩衝溶液を用いて溶出する副工程を含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜９の何れか一項の不活性ＴＲＰを有効成分として含有する組織の形成または再生促進用組成物。
【請求項１９】
骨または軟骨形成促進用であることを特徴とする請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ及びＦＧＦよりなる群から選択される成長因子をさらに含むことを特徴とする請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項１〜９の何れか一項の不活性ＴＲＰを有効成分として含有する臓器の繊維化または硬変の解消用組成物。
【請求項２２】
ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ及びＦＧＦよりなる群から選択される成長因子をさらに含むことを特徴とする請求項２１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞膜受容体の助けなしで細胞膜を透過し得るようにするタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ：protein transduction domain)、一つ以上のプロタンパク質転換酵素(proprotein convertase)切断部位を有し且つ前記プロタンパク質転換酵素によって切断されて不活性組織再生ドメイン（ＴＲＤ：tissue regeneration domain)を細胞内で活性化させるフューリン活性ドメイン(ＦＡＤ：furin activation domain)、並びに前記ＦＡＤのプロタンパク質転換酵素の切断によって活性化され、細胞内で組織の成長または形成を促進し或いは組織の再生を誘導するＴＲＤを含有する不活性組織再生ポリペプチド(ＴＲＰｓ：tissue regenerative polypeptides)およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨形成タンパク質（Bone Morphogenetic Proteins：ＢＭＰ）は、脱無機質化条件でコラーゲンまたは生分解性高分子などと共に使用する場合、哺乳類または霊長類で骨欠損の治癒を促進し、特に、骨細胞から分泌されて隣接細胞膜の受容体を介して骨の形成を誘導するものと知られている。ｈＢＭＰは、互いに類似性を持つタンパク質群であって、現在までｈＢＭＰ２〜ｈＢＭＰ１５などの１４種以上が知られており、その中でもｈＢＭＰ２、３、４、６、７および１４は骨の再生を誘導する効果を持つものと報告されている。特に、ｈＢＭＰ２は現在まで最も確実な骨形成因子タンパク質であって、最近、このｈＢＭＰ２タンパク質の医学的効果と適用について多くの研究が行われている。ＢＭＰ７は、ＴＧＦ−β１の拮抗作用によって臓器の繊維化を抑制するうえ、臓器の再生を誘導するものと知られている(Nature Med., 9:964, 2003; J. Biol. Chem., 280:8094, 2005).。ＢＭＰ１４（ＧＤＦ−５、growth/differentiation factor-5：ＭＰ−２５）は、人体または哺乳類動物に投与する場合、皮膚の傷を効果的に治癒する機能と、胃潰瘍または十二指腸潰瘍の治癒を助ける効果があるものと知られている(US 6,764,994; Nature, 368:639, 1994; Exp. Cell Res., 235:218, 1997; Neurosurg Focus, 13:1, 2002; US 6,531,450)。肝臓又は腎臓の硬変の場合、ＢＭＰはＴＧＦ-βを中和することも知られ、繊維組織の形成を阻害し、正常組織の回復を誘導する。すなわち、ＢＭＰは、その用語的定義とは異なり、骨または軟骨の形成促進機能だけでなく、皮膚の再生、胃腸組織の再生再活機能も持つことができ、肝硬変または腎臓硬変の場合にはＴＧＦ−βを拮抗して繊維組織の形成を抑制し、正常組織の回復を誘導する機能も知られている。
【０００３】
ＢＭＰ類を製造する方法として、初期には脱灰(demineralized)された動物骨組織から自然塩(natural salt)を用いて抽出する方法(US 4,294,753)が試みられてきたが、効率が非常に低く且つ量産が不可能であるという問題点があった。１９９０年代初めに、ＢＭＰ遺伝子で形質転換されたＣＨＯ細胞を培養し、活性化された組み換えｈＢＭＰ２を分離・精製する方法(Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2220, 1990)が開発されて以来、量産が可能になった(US 4,968,590; 5,106,626; 5,106,748; 5,166,058; 5,187,076; 5,187,623; 5,208,219; 5,258,494; 5,266,683; 5,284,756; 5,399,346; 6,593,109)。
【０００４】
ところが、形質転換されたＣＨＯ細胞を用いた組み換えｈＢＭＰ２およびｈＢＭＰ７の製造方法は、活性を持つｒｈＢＭＰ２およびｒｈＢＭＰ７を得るために大量のＣＨＯ細胞培養を必要とし、分離・精製段階が複雑であり、生産コストが非常に高いという問題点、および分離・精製過程と保管、薬剤化処理、投薬過程中で活性の減少が伴うという共通の問題点を持っている。このような動物細胞培養による組み換えＢＭＰ類の製造方法に対する欠点を一部改善するために、最近、バイオファーム（Ｂｉｏｐｈａｒｍ）社は、ｒｈＢＭＰ１４（ＭＰ−５２）を組み換え大腸菌で製造する方法を開発し、その製造コストを低下させた例がある(US 2003/0181378; WO 96/33215)。しかし、前記ｒｈＢＭＰ１４も、活性を持つタンパク質の形に分離・精製する工程が複雑で不便であるうえ、保管、取り扱い及び投薬段階における、製造された活性タンパク質の活性低下の問題は依然として解決されていない。
【０００５】
また、Ｂｉｏｐｈａｒｍ社の如く、組み換え大腸菌方式を用いて、従来のように活性化されたタンパク質を生産する場合には、ＢＭＰ類の生化学的構造によってその選択に制約がある。すなわち、Ｂｉｏｐｈａｒｍ社の方式でｒｈＢＭＰ１４のような構造のタンパク質は製造可能であるが、活性化されたｒｈＢＭＰ２やｒｈＢＭＰ４、ｒｈＢＭＰ７などのような構造のＢＭＰ類を実用的に製造することは困難であると予測される。
【０００６】
商業的に流通し、医学的にスパインフュージョン（Ｓｐｉｎｅ Ｆｕｓｉｏｎ）用などに投薬されているｒｈＢＭＰ−２の場合、２００５年現在、ミリグラム(ｍｇ)当り数千ＵＳドルの高い価格で販売されている。よって、世界的に数多くのＳｐｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ施術必要患者には勿論、ｒｈＢＭＰ類が皮膚傷再生用、胃潰瘍再生用、肝硬変解消用などの様々な医学的潜在効用価値を持つにも拘らず、高いコストと活性消失による保管・取り扱い・投薬の不便性のため、ＢＭＰ類の臨床的な使用が制限されてきた。
【０００７】
したがって、当業界では、前記ｒｈＢＭＰ類またはＴＧＦ−β類と同等以上の生医学的効用性を有しながらも、従来の公知のタンパク質に比べて製造コストが画期的に低く、分離・精製段階における非効率的不便性、保管、取り扱いおよび投薬段階における不便性および活性低下の問題を根本的に解決することができるうえ、新しい薬理メカニズムを持つ新規の生化学新薬物質の開発が切実に求められる状況である。
【０００８】
そこで、本発明者らは、既存の活性タンパク質が持つ問題点を根本的に解決することができ、骨または軟骨の形成促進機能、皮膚傷再生機能、潰瘍治療機能、および／又は肝硬変などの生体組織の再生促進機能を示し、新しい生化学的構造および薬理メカニズムを持つポリペプチド群を開発するために鋭意努力した結果、製造、分離、精製、保管、処理など生体内に投薬される前までは不活性状態を維持し、生体内に投薬された以後には生体細胞内で活性化されるようにする、新しい薬理メカニズムによって骨または軟骨の形成または再生を促進し、腎臓、肝、肺、及び心臓などの臓器の繊維化および硬変を解消させ得るようにする新しい種類のポリペプチド群に着目することになった。すなわち、本発明では、細胞膜を透過させるＰＴＤ；一つ以上のプロタンパク質転換酵素切断部位を有し、且つ前記プロタンパク質転換酵素によって切断されて不活性ＴＲＤ(tissue regeneration domain)を細胞内で活性化させるＦＡＤ(furin activation domain)；および前記ＦＡＤのプロタンパク質転換酵素の切断によって活性化され、細胞内で組織の成長または形成を促進し或いは組織の再生を誘導するＴＲＤを含有する不活性組織再生ポリペプチド（ＴＲＰｓ）に着目し、前記ＴＲＰがｒｈＢＭＰなどの既存の活性タンパク質に比べて、その製造コストが画期的に低く、保管および取り扱いが容易であるうえ、投与が非常に簡単であることを確認するとともに、前記ＴＲＰが受容体なしで細胞内に透過されて細胞内でフューリンによって切断された後、活性化され、活性タンパク質の多量分泌によって骨の形成を促進するという新規の薬理メカニズムを持つことを確認することにより、本発明を完成するに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明の主な目的は、人体の骨や軟骨などの組織の形成再生を促進し、或いは腎臓、肝、肺、及び心臓などの臓器の繊維化および硬変を解消させ、究極的には再生を誘導するために、人体に直接投薬できるように設計された、従来の公知の活性タンパク質とは全く異なる構造、特性および薬理メカニズムを持つ不活性ＴＲＰｓおよびその製造方法を提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記不活性ＴＲＰｓを含有する、骨や軟骨などの組織の形成または再生促進用組成物、および腎臓、肝、肺、及び心臓などの臓器の繊維化または硬変解消用新薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記目的を達成するために、本発明は、不活性組織再生ポリペプチド（ＴＲＰ）であって（ａ）前記ポリペプチドを細胞膜受容体の助けなしで細胞膜を透過し得るようにするタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ)、（ｂ）一つ以上のプロタンパク質転換酵素切断部位を有し、前記プロタンパク質転換酵素によって切断されて不活性組織再生ドメイン（ＴＲＤ)を細胞内で活性化させるフューリン活性ドメイン（ＦＡＤ)、および（ｃ）前記ＦＡＤのプロタンパク質転換酵素の切断によって活性化され、細胞内で組織の成長または形成を促進し或いは組織の再生を誘導するＴＲＤ、
を含有する不活性ＴＲＰを提供する。
【００１２】
また、本発明は、ＴＲＤをコードするＤＮＡの５’前にＦＡＤをコードする塩基配列、ＰＴＤの塩基配列、タギング(tagging)のための塩基配列、および分離・精製のための４つ以上のヒスチジン(histidine)をコードする塩基配列が挿入されている組み換えベクター、並びに前記組み換えベクターで形質転換されたバクテリアを提供する。
【００１３】
また、本発明は、前記形質転換されたバクテリアを培養して［ＰＴＤ−ＦＡＤ−ＴＲＤ］ポリペプチドを発現させる段階と、（ｂ）前記培養液を遠心分離した後、上清と細胞ペレット(cell pellet)に尿素溶液を加えて前記ポリペプチドの２次元および３次元構造を除去し或いは１次元線形構造に変形させた後、［ＰＴＤ−ＦＡＤ−ＴＲＤ］ポリペプチドを精製する段階とを含む、不活性ＴＲＰの製造方法を提供する。
【００１４】
本発明において、前記プロタンパク質転換酵素はフューリンであることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。例えば、ＰＣ７、ＰＣ５／６Ａ、ＰＣ５／６Ｂ、ＰＡＣＥ４、ＰＣ１／３、ＰＣ２、ＰＣ４などであってもよい。
【００１５】
また、前記ＴＲＤは、配列番号：１〜１３よりなる群から選ばれたアミノ酸配列で表示されることを特徴とすることができるが、細胞内で組織の成長または形成を促進し或いは組織の再生を誘導する活性を示すタンパク質である限りは、限定されるものではない。例えば、ＢＭＰｓだけでなく、ＴＧＦ−β、β−ＮＧＦ（β−神経成長因子）、β−アミロイド、ＡＤＡＭｓ(ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ様：a disintergrin and metalloproteinase-like)、ＴＮＦ−α、ＭＭＰｓ(matrix matalloproteinases)、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）などのポリペプチドがこれに該当する。
【００１６】
前記ＦＡＤは、配列番号：１４〜２６よりなる群から選ばれたアミノ酸配列で表示されることを特徴とすることができるが、プロタンパク質転換酵素切断部位を有し、細胞内でプロタンパク質転換酵素によって切断されて前記ＴＲＤを活性化させる限りは限定されるものではない。また、前記ＰＴＤはＴＡＴ、ショウジョウバエ由来Ａｎｔｐペプチド、ＶＰ２２ペプチド、およびｍｐｈ−１−ｂｔｍよりなる群から選ばれることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。
【００１７】
本発明による不活性ＴＲＰの製造方法において、前記精製段階は、前記ポリペプチドをニッケル−チタニウムビーズに結合させ、これを同一の溶液で洗浄した後、イミダゾール(imidazole)と高塩濃度緩衝溶液を用いて溶出することを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。
【００１８】
本発明による不活性ＴＲＰは、従来の活性ＢＭＰ類が共通に持つ３次元的立体規則性を持っておらず、それ自体では生化学的活性を持っていないが、人体または哺乳類の生体内に投薬される場合、ＦＡＤのプロタンパク質転換酵素切断部位が生体細胞内にあるプロタンパク質転換酵素によって切断されながらＴＲＤが活性化され、前記活性化されたＴＲＤ部分が細胞外に分泌されながら期待すべき薬効を示す。本発明によるＴＲＰは、ＰＴＤ、ＦＡＤおよびＴＲＤが融合しているポリペプチド形態であることが好ましい。本発明によるＴＲＰは、人体の骨や軟骨などの組織の形成または再生を促進し、或いは腎臓、肝、肺、及び心臓などの臓器の繊維化および硬変を解消させ、ひいては元の組織の再生を誘導する機能を持つ。
【００１９】
したがって、本発明はまた、前記不活性ＴＲＰを有効成分として含有しながら、従来の公知の類似用途のタンパク質医薬類とは全く異なる新しい薬理メカニズムによって組織の形成または再生を促進する新薬組成物を提供する。本発明において、前記組織は骨または軟骨であることを特徴とすることができる。また、本発明は、前記不活性ＴＲＰを有効成分として含有する、臓器の繊維化または硬変解消用新薬組成物を提供する。本発明による組成物は、ＴＲＰ以外にも、その他の成長因子としてＴＧＦ−β(トランスフォーミング成長因子：transforming growth factor-β)、ＩＧＦ(インスリン様成長因子：insulin-like growth factor)、ＰＤＧＦ(血小板由来成長因子：platelet-derived growth factor)、ＦＧＦ(繊維芽細胞成長因子：fibroblast growth factor)などを適切に含むことができ、この場合、治療効果を倍加させることができる。
【００２０】
本発明の他の特徴及び具現例は、以降の詳細な説明及び特許請求の範囲から一層明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ヒトのＢＭＰ２、ＢＭＰ７およびＴＧＦ−βタンパク質の構造模式図と全体アミノ酸の配列を示す。
【図２】従来の市販されているｒｈＢＭＰ−２の２次および３次構造を示す写真である。
【図３】本発明によるＴＲＰ−１の製造および分離・精製過程を示す。
【図４】従来のｒｈＢＭＰの製造および分離・精製過程を示す。
【図５】従来のｒｈＢＭＰの薬理メカニズムを示す。
【図６】本発明による不活性ＴＲＰｓの薬理メカニズムを示す。
【図７】ｈＢＭＰ２遺伝子にＴＡＴを結合させた組み換え発現ベクターを示す。
【図８】図７の組み換え発現ベクターで形質転換された大腸菌ＢＬ２１の培養の際にＩＰＴＧでタンパク質の発現を誘導する以前と以後の総タンパク質の電気泳動写真である。
【図９】抗Ｘ−ｐｒｅｓｓ抗体(anti-X-press antibody)を用いたＴＡＴ−ＢＭＰ２のウエスタンブロット(western blot)の結果を示す。
【図１０】ＴＡＴ−ＢＭＰ２が細胞膜を透過して細胞内に移動することを確認したウエスタンブロット写真である。
【図１１】ＴＡＴ−ＢＭＰ２のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を示す写真である。
【図１２】ＴＡＴ−ＢＭＰ２と市販中のｒｈＢＭＰ−２で処理された繊維芽細胞をフォンコーサ（ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ）染色処理して骨細胞の分化と石灰化物質の形成有無を確認した写真である。
【図１３】ｍＲＮＡ移動を調節するものと予想されるシグナルペプチドとフューリンによって活性化されるプロドメインをＢＭＰ２と結合させ、フューリン活性メカニズムを確認するために考案されたＴＲＰ−１変異体の模式図である。
【図１４】本発明によるＴＲＰ−１およびその変異体が細胞膜を透過して細胞内に移動することを確認したウエスタンブロット写真である。
【図１５】本発明によるＴＲＰ−１がフューリンによって試験管内で切断されることを示す写真である。
【図１６】本発明によるＴＲＰ−１が細胞内でフューリンによって活性化されることをα１−ＰＤＸと抗Ｘ−ｐｒｅｓｓのウエスタンブロットで確認したものである。
【図１７】本発明によるＴＲＰ−１およびその変異体で処理された繊維芽細胞におけるＡＬＰ活性度を測定したものである。
【図１８】本発明によるＴＲＰ−１およびその変異体で処理された繊維芽細胞をｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色して骨細胞の分化と石灰化物質の形成有無を確認したものである。
【図１９】本発明による組み換え大腸菌の培養の際にＩＰＴＧでＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２の発現を誘導する以前と以後の総タンパク質に対する電気泳動写真である。
【図２０】本発明によるＴＲＰ−１とＴＲＰ−２を抗Ｘ−ｐｒｅｓｓ抗体(anti-Xpress antibody)を用いてウエスタンブロット(western blot)した結果を示す。
【図２１】本発明によるＴＲＰ−１が細胞内に導入される過程の抗Ｘ−ｐｒｅｓｓ抗体(anti-X-press antibody)を用いたウエスタンブロット(western blot)の結果を示す。
【図２２】本発明によるＴＲＰ−２が細胞内に導入される過程の抗Ｘ−ｐｒｅｓｓ抗体(anti-X-press antibody)を用いたウエスタンブロット(western blot)の結果を示す。
【図２３】本発明によるＴＲＰ−１で処理された繊維芽細胞における活性化されたｈＢＭＰ２の分泌をウエスタンブロットで確認したものである。
【図２４】本発明によるＴＲＰ−１と市販中のｒｈＢＭＰ−２で処理された繊維芽細胞をｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色して骨細胞の分化と石灰化物質の形成有無を確認したものである。
【図２５】本発明によるＴＲＰ−１と市販中のｒｈＢＭＰ２−で処理された繊維芽細胞におけるＡＬＰ活性度を測定したものである。
【図２６】多様な濃度のＴＲＰ−１およびｒｈＢＭＰ−２で処理された繊維芽細胞をｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色して骨細胞の分化と石灰化物質の形成有無を確認した写真である。
【図２７】本発明によるＴＲＰ−１が細胞内に導入された後の半減期を示す、抗Ｘ−ｐｒｅｓｓ抗体(anti-X-press antibody)を用いたウエスタンブロット(western blot)の結果を示す。
【図２８】本発明によるＴＲＰ−１とＴＲＰ−２の細胞内透過と温度の影響を共焦点(confocal)顕微鏡で観察した写真である。
【図２９】本発明によるＴＲＰ−１とＴＲＰ−２が細胞内に透過された後、Ｆ−ａｃｔｉｎに特異的に結合することを示す写真である。
【図３０】本発明によるＴＲＰ-１が投与された実験動物で骨の形成が誘導されることを示す写真である。
【図３１】本発明によるＴＲＰ−１と市販中の既存のｒｈＢＭＰ−２の細胞毒性を比較して示すものである。
【発明の詳細な説明および具体的な実施態様】
【００２２】
本発明による不活性ＴＲＰは、従来の公知のｒｈＢＭＰやＴＧＦ−βなどの活性タンパク質とは全く異なる構造の特性を持っている。すなわち、生体に投与される以前に、本発明によるＴＲＰはそれ自体で活性を持っていないが、従来の公知のｒｈＢＭＰ類とＴＧＦ−β類は生化学的に活性化されており、図１および図２に示すような３次元構造を持っている(Eur. J. Biochem., 237:295, 1996; J. Mol. Biol., 287:103, 1999)。
【００２３】
したがって、従来の活性ｒｈＢＭＰ類とＴＧＦ−β類を製造するためには、著しく生産性の低いＣＨＯ細胞などの組み換え動物細胞の培養に依存しなければならないという問題がある。Ｂｉｏｐｈａｒｍ社のｒｈＢＭＰ１４（ＭＰ−５２）のように、動物細胞の代わりに生産性の高い組み換え大腸菌の培養によって一部のｒｈＢＭＰを製造しているが、この場合にも、製造しようとするＢＭＰの生化学的構造に多くの制約を受ける。すなわち、活性ＭＰ−５２は組み換え大腸菌を用いて製造することができるが、活性ｒｈＢＭＰ２、ｒｈＢＭＰ４、ｒｈＢＭＰ７などのように、骨または軟骨の形成促進と多様な組織の再生用に人体内に投薬することが可能な他の活性ＢＭＰ類または活性ＴＧＦ−β類は組み換え大腸菌によって製造することが容易でない。
【００２４】
一方、ＵＳ２００４／１９７８６７Ａ１には、骨誘導ポリペプチドとＰＴＤ(protein transduction domain)の融合ポリペプチドおよびこれを投与して動物で骨の形成を誘導する方法を開示している。より具体的には、高いＢＭＰを直接投与する代わりに、安いＬＭＰ-１(LIM mineralization protein-1)とＰＴＤの融合ポリペプチドを投与すると、ＢＭＰ２とＢＭＰ７のｍＲＮＡ発現が誘導されることと共に、骨誘導ポリペプチドとしてＬＭＰ以外にＢＭＰ、ＴＧＦ−β、ＳＭＡＤなども、また羅列している。ところが、細胞内でｍＲＮＡが形成されるとしても、マイクロＲＮＡ(micro RNA)を介してのｍＲＮＡの調節および干渉(interference)によって数多くのｍＲＮＡからタンパク質が形成されないことが良く知られているので(Nature, 409:363, 2001; Cell, 115:199, 2003)、ＬＭＰ−１(LIM mineralization protein-1)によるＢＭＰ ｍＲＮＡの増加が骨細胞分化の決定的な要因という主張は信憑性が足りない。それだけでなく、ＰＴＤを用いてタンパク質を細胞内に導入しても全てのタンパク質が活性化され、期待すべき薬効を示すのではなく(Curr. Protein Peptide Sci., 4:97, 2003)、特にＢＭＰ類のように分泌されるタンパク質の場合、細胞内に存在しながら薬効を示すタンパク質とは異なり非常に複雑な活性化過程を経て薬理作用をする。
【００２５】
特に、ＢＭＰは、ＬＭＰとは全く異なる薬理メカニズムと活性化メカニズムを持つタンパク質なので、ＬＭＰ−１を単にＢＭＰで代替する場合、ＬＭＰ−ＴＡＴから得たものと類似の効果を示すことは実験的に確認する前には全く予測することができない。ＵＳ２００４／１９７８６７でのように、ＰＴＤを用いて組み換えタンパク質を細胞内に導入する場合、ＬＭＰ−１またはＳＭＡＤは活性化されて細胞内の遺伝子調節因子として機能する可能性があるが、ＢＭＰとＴＧＦ−βはＬＭＰ類とは異なり分泌タンパク質に属するので、細胞内活性化過程はＬＭＰまたはＳＭＡＤの場合とは全く異なるであろう(Genes Dev.,15:2797, 2001; J. Cell Biol., 144:139, 1999; Curr. Prot. Pept. Sci., 4:97, 2003; Nature, 425:577, 2003)。言い換えれば、ＢＭＰ類とＴＧＦ−β類は、ＬＭＰ類とは異なり、非常に複雑な翻訳後過程(例えば、細胞内プロセシング及び修飾：intercellular processing and modification)を経なくては期待すべき骨または軟骨形成促進薬効を示すことができないので、ＰＴＤをＢＭＰ類に単に結合させて生体に投与した場合、所望の生物学的機能を発揮するものと予測することはできない。それにも拘らず、ＵＳ２００４／１９７８６７には、ＢＭＰとＰＴＤの融合ポリペプチドの導入によって骨の形成が促進されるという実験的根拠または言及がないだけでなく、ＢＭＰ−ＰＴＤの投薬が、従来のＢＭＰ類を投薬する場合に比べてどのような付加的及び異なる効果を持つかについても何の言及もない。
【００２６】
本発明者らは、従来のＢＭＰ類を人体または哺乳類動物の生体に投薬するに当り、１次的な非効率性要因が生化学的活性、すなわち３次元的立体構造に起因するという点に着目し、優先的に常温で３次元的立体規則性構造を示さない不活性ポリペプチドを製造しようとした。すなわち、細胞膜受容体の助けなしで不活性ポリペプチドを細胞内に透過させるために、ＴＡＴなどのＰＴＤに融合させて細胞膜透過を確認した。このような方法により、３次元的立体構造を持たない不活性状態のＢＭＰ−ＴＡＴ融合ポリペプチドを製造して細胞に投与させた結果、後述する実施例１に示すように、前記融合ポリペプチドが細胞膜を透過して細胞内には導入されたが、所望の生化学的活性と骨または軟骨の形成促進に関する薬理効果は全く示さないことを確認した。
【００２７】
かかる問題を更に解決するために、不活性状態のＢＭＰを人体または哺乳類動物に投与するに当り、投与されるポリペプチドに細胞膜透過特性を付与するとともに、細胞内に様々に存在するフューリンなどのプロタンパク質転換酵素によって、人体内に投与された不活性ポリペプチドが人体内で活性化できるようにする機能を同時に付与する実用的な方法を開発することになった。すなわち、人体などの哺乳類動物の細胞膜受容体(receptor)の助けなしで細胞膜を透過し得るようにするＰＴＤとフューリンなどの生体内プロタンパク質転換酵素によって不活性タンパク質を細胞内で活性化させ得るようにするＦＡＤ、および骨、軟骨の形成または再生を促進し、或いは腎臓、肝、肺、及び心臓などの繊維化および硬変を解消するなど、生体内で組織の成長または再生を誘導する機能を持つように活性化できるＴＲＤを含有するポリペプチド（ＴＲＰ）を製造し、前記製造されたポリペプチドが細胞内に透過されるだけでなく、細胞内で活性化された後で分泌されて、組織の成長促進或いは再生効果を発揮することを確認した。
【００２８】
本発明によるＴＲＰｓは、組み換え大腸菌などのバクテリアの培養によるタンパク質の生化学的構造に制約を受けずに、実用的に量産することができ、生体に投与される前には生化学的に不活性状態を維持するため、従来の公知の類似用途の活性タンパク質（ｒｈＢＭＰ類、ＴＧＦ−β類など）に比べて生産コストがわずかに数十分の一であり、分離・精製過程と取り扱い、保管および投薬過程が著しく簡単で便利である。
【００２９】
従来の活性ＢＭＰ類はその製造方式に制限があったが、本発明では様々な構造のＢＭＰ類とＴＧＦ−β類をＴＲＤとして含有するＴＲＰｓを組み換え大腸菌を用いて実用的で安く製造することができるという利点がある（図３）。図３は本発明によるＴＲＰ−１の製造および分離・精製過程を示し、図４は従来のｒｈＢＭＰの製造および分離・精製過程を示す(US 4,968,590; 5,106,626; 5,106,748; 5,166,058; 5,187,076; 5,187,623; 5,208,219; 5,258,494; 5,266,683; 5,284,756; 5,399,346; 6,593,109)。図示の如く、従来の方法は形質転換されたＣＨＯ細胞培養によってＢＭＰを精製・分泌させ、大規模の培養培地からｈｅｒａｒｉｎ ｓｅｐｈａｒｏｕｓ ｃｏｌｕｍｎなどを用いて分離・精製する過程を経るなど分離・精製過程が複雑であり、精製収率が低いという問題点がある。これに対し、本発明の方法は分離・精製過程が非常に簡単で精製収率が高いという利点がある。すなわち、本発明によるＴＲＰ−１は、従来の公知のｒｈＢＭＰ−２とは異なり投薬の前には不活性状態なので、活性ＢＭＰの生産に伴う大量のＣＨＯ細胞培養が不要であり、分離・精製が単純で容易であり、その精製収率が著しく高い。したがって、本発明による不活性ＴＲＰは、従来の市販されるｒｈＢＭＰ−２に比べて数十分の一のコストで生産が可能であるうえ、保管および投薬が簡便であるという利点を持つ。
【００３０】
本発明では、従来の公知の活性ｒｈＢＭＰなどが共通に持っていた高コストの問題点と、活性製品の分離・精製、保管および投薬過程の非効率的問題を根本的に解決しながら、且つ不活性ポリペプチドを人体または哺乳類動物の生体に直接投薬して従来の公知の活性タンパク質とは全く異なる新しい薬理メカニズムを持つが、従来の活性ｒｈＢＭＰまたはＴＧＦ−βと同等或いはそれ以上の組織形成促進または再生効果を示すことを確認した。
【００３１】
本発明による不活性ＴＲＰは、従来の活性ＢＭＰやＴＧＦ−βなどとは全く異なる薬理メカニズムを持つ。すなわち、本発明による不活性ＴＲＰｓを人体或いは哺乳類の生体内に投与する場合、従来の公知のｒｈＢＭＰ類またはＴＧＦ−β類とは全く異なる薬理メカニズムによって骨または軟骨の形成を促進し、或いは腎臓、肝、肺、及び心臓の繊維化および硬変を解消させることができる。例えば、従来のｒｈＢＭＰは、図５に示すように、細胞固有の受容体に結合し、これによるＳｍａｄ信号伝達体系を介して骨形成細胞の分化を誘導する。これに対し、本発明によるＴＲＰｓは、図６に示すように、受容体と関係なく細胞膜を透過し、細胞内でＨＳＰなどによって再構成される。その後、再構成されたＴＲＰｓが、ゴルジ複合体などにあるフューリンなどのプロタンパク質転換酵素によって切断され、そして活性化され、活性化されたＢＭＰが細胞外部に分泌され、この分泌されたＢＭＰが自己(autocrine)または隣接(paracrine)細胞の受容体に結合して骨形成細胞の分化を誘導する。
【００３２】
また、本発明では、骨の形成を誘導するために試みられた従来の活性ＢＭＰを直接製造して生体内に投与した方式とは全く異なる治療方法を採用している。すなわち、ＰＴＤ、ＦＡＤおよびＴＲＤが結合した不活性ポリペプチド（ＴＲＰ）を組み換えバクテリアで製造した後、これを生体細胞内に投与し、前記ＴＲＰのアミノ酸構造が細胞内でＨＳＰ（熱衝撃タンパク質）などによってリフォールディングされ、フューリン(furin)などによって切断されて活性を持つＢＭＰに転換され、この活性化されたＢＭＰが細胞外に分泌されることにより、骨の形成を誘導する。
【００３３】
本発明による不活性ＴＲＰは、細胞膜受容体の助けなしで細胞膜を透過し得るようにするＰＴＤ、一つ以上のプロタンパク質転換酵素切断部位を有し且つ前記プロタンパク質転換酵素によって切断されて不活性ＴＲＤを細胞内で活性化させ得るようにするＦＡＤ、および前記ＦＡＤのプロタンパク質転換酵素の切断によって細胞内で活性化され、組織の成長または形成或いは組織の再生を促進するＴＲＤを含有するポリペプチドであって、それ自体では活性を持たないが、生物体または細胞に透過された後、ほぼ全ての細胞に多量で存在するプロタンパク質転換酵素によってＦＡＤが切断され、前記ＴＲＤが活性化され、活性化されたタンパク質が細胞外に分泌されて薬効を発揮する。このような本発明によるＴＲＰは、製造コストが高く、保管および取り扱いが容易でなく、受容体を必ず必要とする既存の活性タンパク質が持つ欠点を全て解決することができる。
【００３４】
本発明では、まず、ＢＭＰ遺伝子の５’部位（5’region）前にフューリン切断部位を有するＢＭＰプロドメインの塩基配列とＰＴＤの塩基配列を挿入し、その前にタギング(tagging)のための塩基配列、分離・精製のための４つ以上のヒスチジン(histidine)をコードする塩基配列、および開始塩基配列のＡＴＧを挿入して組み換えベクターを製作した。
【００３５】
本発明において、前記ＢＭＰ遺伝子として、配列番号：１のｈＢＭＰ２または配列番号：６のｈＢＭＰ７をコードする遺伝子を使用したが、これに限定されるものではない。また、前記ＦＡＤとして、配列番号：１４および１９のｈＢＭＰ２およびｈＢＭＰ７のプロドメインを使用したが、これに限定されるものではない。例えば、フューリンのようなプロタンパク質転換酵素切断部位を有し、細胞内でプロタンパク質転換酵素によって切断されてＴＲＤを活性化させることができる限りは、ＢＭＰ類およびＴＧＦ−β類のプロドメインを制限なく、使用することができる。
【００３６】
また、本発明では、前記ＰＴＤとしてＴＡＴ（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ：配列番号：２７）を使用したが、これに限定されるものではない。例えば、ショウジョウバエ由来Ａｎｔｐペプチド、ＶＰ２２ペプチド(Gene Therapy, 8:1, Blackbirch Press, 2001)、ｍｐｈ−１−ｂｔｍ（米国特許２００５／０１４７９７１）などのＰＴＤを使用することもできる。また、前記タギング塩基配列としてＸ−ｐｒｅｓｓのタグを使用したが、Ｆｌａｇ、Ｍｙｃ、Ｈａ、ＧＳＴなどを使用することもできる。
【００３７】
前記組み換えベクターを製作するために、本発明では、アンピシリン(ampicillin)抵抗性を持っており、商業的に販売されているｐＲＳＥＴを使用したが、これに限定されるものではない。例えば、選択的マーカーとしてカナマイシン(kanamycin)を持つバクテリアベクター、ｐｃＤＮＡなどの哺乳類細胞発現用ベクター、ｐＰＧＳ、ｐＢａｂｅなどのウイルスベクターを使用することもできる。
【００３８】
次に、前記組み換えベクターで形質転換された微生物を培養して本発明によるＴＲＰを発現させた後、前記発現されたＴＲＰを分離・精製した。本発明で形質転換された大腸菌は、通常用いられる培地で培養することができ、融合ポリペプチドの過発現を誘導するためにＩＰＴＧを添加することが好ましい。
【００３９】
本発明では、形質転換微生物として大腸菌(E.coli)を使用したが、他の種類のバクテリア、酵母、またはカビを使用することも可能であり、且つ微生物を利用せずに化学的方法で有効部位のみを合成して使用することもできる。
【００４０】
前記形質転換微生物の培養によって発現された融合ポリペプチドは、ＧＳＴ融合タンパク質(GST-fusion protein)またはその他の通常のタンパク質の分離・精製方法を用いて分離することができる。例えば、尿素(urea)または硫酸アンモニウムの濃度勾配を用いてタンパク質の沈澱を誘導し、これを透析して塩(slat)を除去することにより、本発明による不活性ＴＲＰｓを精製することができる。また、本発明では、過発現されたポリペプチドの２次元および３次元構造が不要なので、尿素を用いて２次元および３次元構造のタンパク質を不活性の１次元線形構造に転換して使用することが好ましい。
【００４１】
本発明によるＴＲＰを骨細胞、前駆細胞、幹細胞などに投与する場合、前記ＴＲＰのＦＡＤがフューリンのようなプロタンパク質転換酵素によって切断されてＴＲＤ（ＢＭＰ）が活性化された後、分泌される。この過程を詳細に説明すると、細胞内に透過されたＴＲＰは、細胞内のＦ−ａｃｔｉｎに特異的に結合し、これらはＨＳＰ７０のような因子によって３次元構造を回復し、細胞内タンパク切断酵素であるフューリンによってフューリン切断部位が切断されてＴＲＤ（例：ＢＭＰ）が活性化された後、活性化されたＢＭＰが細胞の外部に分泌される。細胞に透過された本発明のＴＲＰは細胞の種類と活性に応じて３〜２４時間の半減期を有するが、これは透過されたタンパク質が細胞に応じて様々な活性化時間を持つことを意味する。
【００４２】
一方、フューリン切断部位を突然変異させた場合、活性化されたＢＭＰが分泌されない点からみて、透過されたタンパク質の細胞内工程と活性化にフューリン切断酵素によるタンパク質修飾(protein modification)が決定的に作用することが分かった。また、生体内でＢＭＰが作られるとき、タンパク質の細胞内移動と活性化に重要な役割を果たすシグナルペプチドが存在する。ところが、シグナルペプチドを削除しても、骨の形成において自然状態にある(wild type)ＢＭＰ２と類似であり或いは却って良い効果を示すことからみて、ＴＡＴを用いたＢＭＰ伝達には生体とは異なりシグナルペプチドを必要としないことを確認した。
【００４３】
本発明によるＴＲＰを０．１ｎＭ以上細胞に投与する場合、前記ＴＲＰは、濃度依存的に細胞内へ移動し、細胞内で活性化されたＢＭＰに転換され、活性ＢＭＰを細胞外に分泌する。本発明のＴＲＰは、細胞膜にあるＢＭＰ受容体の存在とは関係なく、１時間以内に大部分の細胞の細胞膜を直接透過し、細胞膜透過過程は受容体を経ない温度非依存的であることを確認した。また、様々な濃度のＴＲＰを細胞に投与した場合にも、細胞毒性は観察されなかった。
【００４４】
結局、本発明による不活性ＴＲＰは、活性ＢＭＰなどの３次元構造を維持する必要がなく、１次元線形構造状態で骨細胞内に透過されて活性ＢＭＰなどに転換された後、分泌されてメカニズムを示す。すなわち、従来のｈＢＭＰが直接薬効を示す反面、本発明によるＴＲＰはｉｎ  ｖｉｖｏでの間接的な活性化により薬効(potency)を示す。したがって、本発明による不活性ＴＲＰは、３次元構造の維持のための追加的な装備またはコストが不要であり、分離・精製が非常に容易であり、生産工程が簡単であり、生産コストが低く、医学的な効率性が増大して、従来のｈＢＭＰタンパク質の問題点を全て解決することができる。本発明によるＴＲＰの特性を従来の活性ｈＢＭＰ２およびｈＢＭＰ７タンパク質と比較して下記表１に示した。表１は、本発明による不活性ＴＲＰｓ製品の分離・精製、保管および投薬過程と特徴を従来の公知の活性ｒｈＢＭＰ類の場合と比較したものである。
【００４５】
本発明による不活性ＴＲＰは、骨が正常に形成されていない環境で骨の成長を誘導し、或いは外部衝撃の骨折による骨の損失および人工関節の固定を促進するなど、骨疾患治療用として有用である。具体的な例として、先天性、外傷、または腫瘍切除、頭蓋顔面奇形などの治療、歯根膜疾病の治療などの歯科治療に用いられて骨形成細胞の分化を誘導し、骨形成細胞の成長を刺激し、或いは骨形成細胞の分化を誘引する環境を提供する。この他にも、本発明によるＴＲＰは、腎臓や肝などの組織の繊維化予防および組織の再生を誘導するために使用でき、神経または血管の再生などといった他の用途としても使用できる。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
本発明による不活性ＴＲＰは、それ自体を使用し、或いは薬学的に許容可能な酸付加塩または金属複合体、例えば亜鉛、鉄などの塩の形で使用する。より具体的に、酸付加塩は、塩化水素、臭化水素、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、ベンゾ酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩を使用することが好ましい。
【００４８】
本発明による不活性ＴＲＰを有効成分として含有する組成物は、通常の投与方法、投与形態および治療目的に応じて、前記有効成分を薬学的に許容可能な賦形剤またはマトリックスとしての担体とともに混合して希釈し、或いは容器形態の担体内に封入させることが好ましい。また、他の骨欠陥治療に有益な他の薬剤と配合して使用することができる。この際、目的とするｐＨ、等張性、安定性などを持つ生理的に受け入れられるタンパク質組成物の製法は、本発明の分野における通常の技術範囲内にあるものを使用することができる。本発明において、前記マトリックスは生物接合性、生物分解性、機械的特性、美容的外観、および接触特性に応じて選択される。本発明において使用することのできる担体の例として、硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ホリル無水物などの生物分解性および化学的物質；骨または皮膚コラーゲン、その他の純粋タンパク質または細胞のマトリックス成分などの生物分解性および生物学的物質；焼結されたヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミネートまたはその他のセラミックなどの非生物分解性および化学的物質；ポリ乳酸、ヒドロキシアパタイト、コラーゲンおよびリン酸三カルシウムなどの上述した物質の配合物を含むことができる。しかし、本発明は前記担体に限定されるものではない。
【００４９】
本発明において、賦形剤は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微結晶セルロース、マグネシウムステアレート、ポリビニルピロリドン(polyvinylpyrrolidone)、水、メチルヒドロキシベンゾエート(metylhydroxybenzoate)、プロピルヒドロキシベンゾエート(propylhydroxybenzoate)、タルク(talc)、鉱物油などを使用することができる。
【００５０】
一方、本発明による不活性ＴＲＰを含有する組成物は、骨損傷部位に入れるために粘性型にして注射し或いはカップルセル化して使用することが好ましい。本発明による組成物の投与量は使用される賦形剤やマトリックスなどの担体の種類と患者の形成された骨の重量、骨損傷部位、損傷した骨の状態、患者の年齢、性別およびダイエット、疾患の重症度、投与時間、およびその他の臨床的要因を考慮して調節できるため限定されないが、通常公知の有効量は骨の重量を考慮して適正量を連続してまたは分割して投与し、骨の成長を観察して追加投与を決定することができる。
【００５１】
実施例
以下、本発明を具体的な実施例によってさらに詳しく説明する。しかしながら、本発明は、下記実施例に限定されるものではなく、本発明の思想と範囲内において様々な変形または修正を加え得るのは、当業者には明白なことである。
【００５２】
特に、下記実施例では、ＴＲＰを構成するＴＲＤとしてｈＢＭＰ２およびｈＢＭＰ７のみを例示したが、ｈＢＭＰ３、ｈＢＭＰ４、ｈＢＭＰ６、ｈＢＭＰ１４（ＭＰ−５２）などのヒト由来ＢＭＰだけでなく、マウス、牛、豚などの哺乳類およびその他の高等動物由来のＢＭＰも使用することができるのは、当業者には自明なことである。ＢＭＰｓ以外にもＴＧＦ−β、β−ＮＧＦ（β−神経成長因子）、β−アミロイド(β-amyloid)、ＡＤＡＭｓ(a disintegrin and metalloproteinase-like)、Ｅｄａ−１(エクトディスプラシン−Ａ：ectodysplasin-A)などのＴＮＦ−α群、ＭＴ１−ＭＭＰ(膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ：membrane type-matrix metalloproteinase)とＭＭＰ−２を含むＭＭＰｓ群、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）などのポリペプチドを使用することもできるのは、当業者には自明なことである。 
【００５３】
また、下記の実施例では、ＴＲＰを構成するＦＡＤとしてＢＭＰのプロドメインのみを例示したが、プロタンパク質転換酵素切断部位を有し、細胞内でプロタンパク質転換酵素によって切断されてＴＲＤを活性化させる限り、それに限定されるものではないことも、当業者には自明なことである。
【００５４】
実施例１：［ＴＡＴ−ｈＢＭＰ２］融合ポリペプチドの製造
ＢＭＰ／ＴＧＦ−β群タンパク質は、一つのジスルフィド結合(disulfide bond)によって２つの同一のペプチドが互いに連結されたダイマー(dimer)から構成される。この際、それぞれのペプチドは、ＢＭＰの種類に応じて１２０〜１４０個のアミノ酸から構成され、各ＢＭＰｓの内部に存在する７個のシステイン端末基のうち一つが別のペプチドの同一部位とジスルフィド結合を形成することにより、ダイマー(dimer)を構成し、残り６個のシステインは同一のアミノ酸内で３つのジスルフィドボンドを形成して(intrachain disulfide bond)独特な３次元構造を持つ(Proc. Natl. Acad. Sci., 93:878, 1996; J. Bone Joint Surg., 83:S1, 2001)。この際、ＢＭＰ２は１１４個のアミノ酸、ＢＭＰ７は１３９個のアミノ酸、ＴＧＦ−β２とβ３は１１２個のアミノ酸から構成される。図１はこれらのアミノ酸配列と３次元構造の模式図を示し、図２は既に公知のＢＭＰ２の３次元構造を示す(Eur. J. Biochem., 237:295, 1996; J. Mol. Biol., 287:103, 1999)。ＢＭＰ／ＴＧＦ−βの内部の７個のシステインの位置が全て保存されていることからみて、システインが３次元構造に重要な役割を果たすことが分かる。
【００５５】
従って、従来の公知のｈＢＭＰ２にＰＴＤを結合させて融合タンパク質を製造し、これを細胞内に投与する場合、既によく知られているように、この融合タンパク質は、細胞膜受容体の助けなしでも細胞膜を透過して、ＨＳＰｓ(ヒートショックプロテイン：heat shock protein)などによって生物学的活性を持つタンパク質にリフォールディング(refolding)されるものと期待することができる(Nature Med., 4:1449, 1998; Science, 285:1569, 1999)。
【００５６】
従って、本実施例では、配列番号：２８と２９のプライマーを用いてＳａｏｓ−２細胞(American Type Culture Collection、ＡＴＣＣ ＨＴＢ−８５)のｍＲＮＡを鋳型として用いたＲＴ−ＰＣＲによって配列番号：１のアミノ酸配列を持つｈＢＭＰ２をコードする遺伝子を増幅した。バクテリア発現ベクターにクローニングするために、各プライマーの５’に制限酵素ＫｐｎＩ部位(5’-ggtacc-3’)を追加した。以下の実施例においてもクローニングのためのプライマーはいずれも制限酵素ＫｐｎＩ部位を追加して利用した。
【００５７】
配列番号: 28: 5'-caa gcc aaa cac aaa cag cgg aaa-3' 
配列番号: 29: 5'-ttt gct gta cta gcg aca ccc aca-3' 
【００５８】
前記増幅されたｈＢＭＰ２遺伝子をＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ）に挿入し、ＧｅｎＢａｎｋの塩基配列（ＮＣＢＩ、ＮＭ＿００１２０）と比較して、前述した１１４個のアミノ酸が全て含まれたことを確認した。前記クローニングされたｈＢＭＰ２遺伝子をｐＲＳＥＴバクテリア発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ）のＫｐｎＩ部位に再びクローニングし、前記ｈＢＭＰ２遺伝子の５’前にＴＡＴ（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ：配列番号：２７）塩基配列を挿入した後、その前にＸ−ｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ）タグ(tag)と、分離・精製のための６個のヒスチジン(histidine)をコードする塩基配列と開始塩基配列のＡＴＧを挿入してＢＭＰ２の発現のための組み換え発現ベクターを製作した（図７）。この際、ＴＡＴの挿入されないベクターを陰性対照群として使用した。
【００５９】
前記製作された組み換えベクターを熱衝撃(heat shock)方法によって大腸菌ＢＬ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）に導入し、３７℃で２〜３時間培養した後、ＩＰＴＧ(isopropylthio-galactoside)１ｍＭを添加し、２〜１８時間追加培養してＴＡＴ−ＢＭＰ２の発現を誘導した。
【００６０】
前記培養物を遠心分離し、ペレットを回収した。上清とペレット(cell pellet)に８Ｍの尿素溶液を添加してＢＭＰの２次元および３次元構造を除去した後、ニッケル−チタニウムビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を添加してＴＡＴ−ＢＭＰ２をビーズに結合させた後、これを同一の溶液で３回洗浄し、イミダゾール(Imidazole)と高塩濃度緩衝溶液(high salt buffer)を用いて溶出し、精製されたＴＡＴ−ＢＭＰ２を得た。
【００６１】
図８は形質転換された大腸菌ＢＬ２１の培養の際にＩＰＴＧでタンパク質発現を誘導する以前と以後の総タンパク質を電気泳動によって確認したものである。ここで、矢印はＩＰＴＧに誘導されたＴＡＴ−ＢＭＰ融合タンパク質を示し、レーン１は誘導されていないＴＡＴ−ＢＭＰ２、レーン２はＩＰＴＧに誘導されたＴＡＴ−ＢＭＰ２、レーン３は誘導されていないＢＭＰ２(w/o TAT)、レーン４はＩＰＴＧに誘導されたＢＭＰ２(w/o TAT)を示す。図示の如く、ＩＰＴＧの添加によって融合タンパク質の生成を誘導した場合、対照群に比べてＴＡＴ−ＢＭＰ２融合タンパク質がさらに多く生成されることを確認することができた。
【００６２】
図９は前記精製されたＴＡＴ−ＢＭＰ２とＢＭＰ２(w/o TAT)を抗Ｘ−ｐｒｅｓｓ抗体を用いたウエスタンブロットによって確認したものである。ここで、レーン１はＴＡＴ−ＢＭＰ２、レーン２はＢＭＰ２(w/o TAT)を示す。図示の如く、ＴＡＴが付加された場合（〜２０ｋＤａ）は、付加されていない場合（〜１８ｋＤａ）に比べて、分子量がやや増加することが分かった。前記結果より、ＴＡＴ−ｈＢＭＰ２融合ポリペプチドがうまく製造されたことを確認することができた。
【００６３】
前記製造されたＴＡＴ−ＢＭＰ２が細胞内に透過されるかを確認するために、１次培養された歯肉繊維芽細胞(gingival fibroblast)にＴＡＴ−ＢＭＰ２を４ｎＭの濃度で２時間処理した後、細胞を得て抗Ｘ−ｐｒｅｓｓ１次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ）を用いてウエスタンブロットを行った。その結果、図１０に示すように、ＴＡＴ−ＢＭＰ２は２時間以内に大部分細胞内に透過されたことが分かった。ＴＡＴがない場合には細胞内に透過されなかった。レーン１はＴＡＴのない４ｎＭのＢＭＰ２を２時間処理したもので、レーン２〜６は同じ濃度のＴＡＴ−ＢＭＰ２をそれぞれ０時間、１５分、３０分、１時間、２時間処理し、細胞にあるＴＡＴ−ＢＭＰ２の発現を抗Ｘ−ｐｒｅｓｓ抗体を用いてウエスタンブロットしたものである。レーン７はウエスタンブロット陽性対照群としてＴＡＴ−ＢＭＰ２を１０ｎｇ使用した。
【００６４】
細胞内に導入されたＴＡＴ−ＢＭＰ２が生物学的活性を持つＢＭＰ２に変化し、これらが骨細胞分化を誘導するかを調べるために、同一の細胞に２ｎＭのＴＡＴ−ＢＭＰ２を４８時間間隔で投与し、１週後にアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性度を測定し、２週間培養してｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色を行って石灰化物質の形成を観察した。この際、ＴＡＴのないＢＭＰ２を陰性対照群として使用し、市販中のｒｈＢＭＰ−２を陽性対照群として使用した。図１１はＡＬＰ活性度を示すものであり、陰性対照群（Ｎ／Ｃ）は１次培養された繊維母細胞に培地のみを１週間処理したものであり、ｒｈＢＭＰ−２は市販中のＢＭＰ２を２ｎＭの濃度で１週間処理したものであり、ＴＡＴ−ＢＭＰ−２は本実施例によるＴＡＴ−ＢＭＰ−２を２ｎＭの濃度で１週間処理したものであり、ＴＡＴ（−）ＢＭＰ−２はＴＡＴ−ＢＭＰ−２からＴＡＴを削除したものである。図１２はｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色で石灰化物質の沈着を観察したものである。図１１および図１２に示すように、市販されるｒｈＢＭＰ−２とは異なり、本実施例によるＴＡＴ−ｈＢＭＰ−２は生物学的活性を持たないことが分かった。
【００６５】
実施例２：［ＴＡＴ−ＦＡＤ−ｈＢＭＰ２］融合ポリペプチド（ＴＲＰ−１）の製造
実施例１で述べたように、ｈＢＭＰ２はジスルフィド結合によって固有な内部３次元構造とダイマーを形成することにより、生物学的活性を持つ。ところが、実施例１から分かるように、ＴＡＴとｈＢＭＰ２とが融合したタンパク質は、うまく細胞内に透過されるにも拘らず、生物学的活性、すなわち骨細胞分化を誘導しないことが分かった。これは、分泌されて生物学的活性を持つタンパク質の場合、従来のＰＴＤと融合したタンパク質(Trends Cell Biol., 10:290, 2000; Curr. Prot. Pept. Sci., 4:97, 2003)とは異なり、ＨＳＰｓなどによるアミノ酸の再構成(restructuring)のみでは活性を示すのに十分でないことを意味する。
【００６６】
ＢＭＰｓとＴＧＦ−βは、細胞内のリボソーム(ribosome)で生合成されるとき、４００個以上のアミノ酸から構成された前駆体(precursor)の形で存在する。合成されたアミノ酸は、Ｎ−末端部分に存在するシグナルペプチド(signal peptide)によってゴルジ複合体(Golgi complex)、エンドソーム(endosome)などに移動し、これらは再びフューリンなどのプロタンパク質転換酵素によって切断および活性化されて細胞外に分泌される(Nature Rev. Mol. Cell Biol., 3:753, 2002; J. Cell Biol., 144:139, 1999)。前記ゴルジ複合体などで翻訳後修飾ないし活性化過程(post-translational modification)を経るが、この際、アミノ端末部位に位置したシグナルペプチドとプロドメインが決定的な役割を果たす(Mol. Biol. Cell, 15:5012, 2004)。この過程で、ＢＭＰ前駆体は他の分泌タンパク質と類似にフューリン切断部位（−ＲＳＫＲ−）がフューリン(furin)によって切断されて成熟ＢＭＰ部分に活性化された後で分泌される(Constam, D.B. & Robertson, E.J., J. Cell Biol., 144:139, 1999; Cui, Y. et al., Genes & Development, 15:2797, 2001)。ところが、前記論文には、ＢＭＰ前駆体の細胞内投与方法については何の言及もないうえ、特にＰＴＤと融合した形でＢＭＰ前駆体を細胞内に導入させることについては示唆されたこともない。
【００６７】
フューリンなどのプロタンパク質転換酵素としては、ＰＣ７、ＰＣ５／６Ａ、ＰＣ５／６Ｂ、ＰＡＣＥ４、ＰＣ１／３、ＰＣ２、ＰＣ４などが知られている(Nature Rev. Mol. Cell Biol., 3:753, 2002)。これらは大部分の細胞内小器官、特にゴルジ複合体、エンドソーム(endosomes)、分泌顆粒(secretory granule)に豊富に存在し、多様なタンパク質の活性化および分泌だけでなく、様々な感染性疾患の活性化にも重要な役割を行う。フューリンなどのプロタンパク質転換酵素によって活性化されるヒト生体タンパク質としては、ＢＭＰｓ／ＴＧＦ−βの他にβ−ＮＧＦ（β−神経成長因子）、β−アミロイド、ＡＤＡＭｓ(a disintergrin and metalloproteinase-like)、Ｅｄａ−１(ectodysplasin-A)などのＴＮＦ−α群、ＭＴ１−ＭＭＰ(membrane type-matrix metalloproteinase)とＭＭＰ−２を含むＭＭＰｓ群、ＩＧＦ−１などがある(Nature Rev. Mol. Cell Biol., 3:753, 2002)。
【００６８】
特に、ＢＭＰｓは、細胞内で自然に生合成される場合、ＢＭＰｓ前駆体のプロドメインにある一つまたは二つのフューリン切断部位がＢＭＰｓの活性化に寄与するものと知られている(J. Cell Biol., 144:139, 1999; Genes Dev., 15:2797, 2001)。ヒトＢＭＰ２の場合、プロドメインの内部に１〜２個のフューリン切断部位（ＲＸＫＲ、Ｒ＝Ａｒｇ、Ｋ＝Ｌｙｓ、Ｘ＝ｂａｓｉｃアミノ酸を除いた他のアミノ酸）が存在し、ＰＴＤ−ＢＭＰ２融合タンパク質の活性化と分泌にこれらが重要な役割をするものと推論した。これを確認するために、本実施例では、実施例１のＴＡＴ−ｈＢＭＰ２に配列番号：１４のアミノ酸配列を持つフューリン切断部位含有ＦＡＤを追加してＴＡＴ−ＦＡＤ−ｈＢＭＰ２の構造を持つポリペプチドを製造した。
【００６９】
まず、前記ＦＡＤをコードする塩基配列を追加するために、配列番号：３０と３１のプライマーを用いて、配列番号：１のｈＢＭＰ２をコードする塩基配列と配列番号：１４のアミノ酸配列を持つＦＡＤをコードする塩基配列を全て持つＤＮＡを実施例１と同様の方法で増幅した。前記増幅されたＤＮＡの塩基配列を確認した後、実施例１と同様の方法でバクテリア発現ベクターにクローニングした。
【００７０】
配列番号: 30: 5'-gag ttt ttc cat gtg gac gct ctt-3' 
配列番号: 31: 5'-ttt gct gta cta gcg aca ccc aca-3' 
【００７１】
前記形質転換された大腸菌を実施例１と同様の方法で培養および精製してＴＡＴ−ＦＡＤ−ｈＢＭＰ２（ＴＲＰ−１）を得た。すなわち、培養物でＴＲＰ−１が生成された大腸菌を遠心分離した後、上清とペレット(cell pellet)に８Ｍの尿素溶液を添加してＢＭＰ２の２次元および３次元構造を除去し、ニッケル−チタニウムビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を添加してＴＲＰ−１をビーズに結合させた後、これを同一の溶液で３回洗浄し、イミダゾール(Imidazole)と高塩濃度緩衝溶液(high salt buffer)を用いて溶出し、精製されたＴＲＰ−１を得た（図３）。
【００７２】
一方、シグナルペプチドとプロドメイン、フューリン切断部位の重要性を確認するために、前記製作された発現ベクターを鋳型とし、それぞれ配列番号：３２と３３（ΔＳｉｇ）、配列番号：３４と３５（ΔＰｒｏ）、配列番号：３６と３７（Ｒ２８３Ａ）のプライマーを用いてそれぞれの削除(deletion)、または突然変異ベクターを製作した。その模式図は図１３に示した。
【００７３】
配列番号: 32: 5'-tcc acc atg gcc ggt acc ctc gtt ccg gag ctg ggc-3' 
配列番号: 33: 5'-gcc cag ctc cgg aac gag ggt acc ggc cat ggt gga-3' 
配列番号: 34: 5'-tcc acc atg gcc ggt acc gat gga aaa ggg cat cct-3' 
配列番号: 35: 5'-agg atg ccc ttt tcc atc ggt acc ggc cat ggt gga-3' 
配列番号: 36: 5'-ctc cac aaa aga gaa aaa gct caa gcc aaa cac aaa cag-3' 
配列番号: 37: 5'-ctg ttt gtg ttt ggc ttg agc ttt ttc tct ttt gtg gag-3' 
【００７４】
前記製作されたそれぞれの発現ベクターで大腸菌を形質転換させた後、ＴＲＰ−１と同一の培養・精製過程を経て多様なＴＲＰ−１変異体を得た。図１３において、ＴＲＰ−１はＴＡＴ−ｈＢＭＰ２にＦＡＤを追加した本実施例によるＴＡＴ−ＦＡＤ−ｈＢＭＰ２を示し、Δ（Ｓｉｇ）はＴＡＴ−ＦＡＤ−ｈＢＭＰ２からシグナルペプチド（配列番号：１４のアミノ酸１〜２４）部位を削除したものであり、Δ（ＦＡＤ）はＴＡＴ−ＦＡＤ−ｈＢＭＰ２からＴＡＴ−ｈＢＭＰ２と２番目のフューリン切断部位のみを持つようにＮ−末端部位のＦＡＤ（配列番号：１４のアミノ酸１〜２６９）を削除したものであり、Ｒ２８３ＡはＴＡＴ−ＦＡＤ−ｈＢＭＰ２から２番目のフューリン切断部位のＡｒｇをＡｌａに突然変異させたものを示す。各発現ベクターのＮ末端側には実施例１と同様にＴＡＴドメイン、Ｘ−ｐｒｅｓｓ ｔａｇなどが含まれており、各ベクターの製作後に塩基配列を確認した。
【００７５】
次に、前記製造されたＴＲＰ−１およびその変異体をそれぞれ同一の細胞に投与した。すなわち、各組み換えタンパク質を１次培養された繊維芽細胞に２ｎＭで２時間処理した後、細胞を得て抗Ｘ−ｐｒｅｓｓ抗体でウエスタンブロットした（図１４）。その結果、図１４に示すように、ＴＲＰ−１およびその変異体が全て細胞内に透過されて発現されることを確認することができた。
【００７６】
実施例３：プロタンパク質転換酵素によるＴＲＰ−１の切断および活性化
本発明による不活性ＴＲＰ−１がフューリンによって切断され、細胞内で活性化されるかを調べるために、実施例２で製造されたＴＲＰ−１を組み換えフューリンタンパク質（Ｓｉｇｍａ、米国）を用いて試験管で切断した。その結果、図１５に示すように、ＴＲＰ−１は試験管でフューリンによってうまく切断されることが分かった。
【００７７】
また、本発明による不活性ＴＲＰ−１が細胞内でフューリンによって活性化されるかを確認するために、フューリン抑制タンパク質であるα１−ＰＤＸ(α1 antitrypsin Portland) (Proc. Natl. Acad. Sci., 95:7293, 1998)発現ベクターを用いて細胞内のフューリンを抑制した。本発明による不活性ＴＲＰ−１は、細胞内に導入された以後、生物学的活性を持つタンパク質に転換されるので、ＴＲＰ−１投与の後一定の時間が経つと、細胞内に初期に導入されたＴＲＰ−１が益々減少する。したがって、α１−ＰＤＸの発現を誘導してフューリンを抑制した場合、残存ＴＲＰの量が増加することを予想することができる。
【００７８】
その結果、図１６に示すように、本発明のＴＲＰ−１は、α１−ＰＤＸ発現（フューリン酵素抑制）によって半減期が増加した。すなわち、本発明のＴＲＰ−１を投与した場合、４時間後（星印）の対照群に比べて、α１−ＰＤＸ投与群で半減期が増加した。その結果より、細胞内に投与されたＴＲＰ−１がフューリン酵素によって切断および活性化されることを確認することができた。
【００７９】
実施例４：ＴＲＰ−１の活性化時のＦＡＤの重要性
実施例２と３を通じて、ＴＲＰ−１が細胞内でフューリンによって切断され活性化されるということを確認した。よって、ＴＲＰ−１が細胞内に投与された後、生物学的活性を示すことには、ＦＡＤとフューリン切断部位が重要な役割を行うことを予想することができる。
【００８０】
これを確認するために、実施例２で得たＴＲＰ−１およびその変異体を１次培養した繊維芽細胞に投与し、ＡＬＰ活性と石灰化物質の沈着を観察した（図１７）。ＴＲＰ−１およびその変異体に対して、実施例１と同様の方法でアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性度を測定した結果、図１７に示すように、ＴＲＰ−１（ＴＡＴ−ＦＡＤ−ｈＢＭＰ２）は高いＡＬＰ活性を示し、シグナルペプチドの削除されたＴＲＰ−１変異体［Δ（Ｓｉｇ）］においてもＴＲＰ−１と類似し或いは却ってさらに高い活性を示した。その結果は、ＴＡＴとＦＡＤを用いたＢＭＰ２の活性化にシグナルペプチドが必須でないことを示す。ところが、ＴＡＴ−ｈＢＭＰ２に２番目のフューリン活性化部位のみを含む変異体［Δ（ＦＡＤ）］およびＴＲＰ−１のフューリン切断部位の一部を突然変異させた変異体（Ｒ２８３Ａ）の場合には生物学的活性がないことを確認することができた。
【００８１】
また、前述した方法でＴＲＰ−１およびその変異体をそれぞれ２週間処理し、ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色して石灰化物質の沈着を観察した結果、図１８に示すように、前記ＡＬＰ活性度結果と類似の結果を示した。ここで、ｒｈＢＭＰ−２は市販中のｒｈＢＭＰ−２を同じ濃度で処理して陽性対照群として使用したものであり、何にも処理せず培地のみを使用したものを（Ｎ／Ｃ）陰性対照群として使用した。このような結果は、ＴＡＴ−ＦＡＤ−ｈＢＭＰ２組み換えタンパク質が細胞内に投与されて生物学的活性を持つようにするためには、自然に生合成されるｈＢＭＰ−２またはｒｈＢＭＰ−２の場合とは異なり、リボソーム(ribosomes)からゴルジ複合体への移動過程は不要であるが、フューリン切断部位を完全且つ正確に持っていなければならないことを意味する。
【００８２】
本実施例を介して、本発明のＴＡＴ−ＦＡＤ−ｈＢＭＰ２融合ポリペプチドは、ＰＴＤ、ＦＡＤ、ＴＲＤ（本実施例ではｈＢＭＰ２）の３ドメインから構成されるポリペプチドのうちいずれか一つのドメインがない或いは欠陥を持つ場合、人体に投与しても所望の薬理効果を発揮することができないことを確認した。このようなＴＲＰ−１の薬理作用に対するメカニズム解析（図６）が完全なものでないこともあるが、骨、軟骨、或いは多様な種類の組織再生を目的として不活性状態のＢＭＰ類あるいはＴＧＦ−β類のポリペプチドを人体に投与する場合、本発明によるＴＲＰ−１が従来の公知の製品に比べて非常に有用な薬理効果と革新的な商業的価値を示すものと期待される。すなわち、ＴＡＴ−ＦＡＤ−ｒｈＢＭＰ−２は、従来の公知のＢＭＰ類あるいはＴＧＦ−β類とは全く異なる新しい薬理作用の概念の下に設計され、新しい方法で製造されたので、これをＴＲＰ−１と命名した。
【００８３】
実施例５：ＴＲＰ−２［ＴＡＴ−ＦＡＤ−ＢＭＰ７］の製造
実施例４に示すように、ＢＭＰｓおよびＴＧＦ−βなどの分泌タンパク質がＰＴＤと融合する場合、全長を持つだけでは不十分であり、生体で生合成されるとき、形成される前駆体(precursor)のフューリン切断および活性化部位を十分持っていなければならない。ヒトのＢＭＰ７は骨および軟骨細胞の分化を促進し、最近では、同一の遺伝子群であるＴＧＦ−βの拮抗剤として作用して腎臓、肝、肺、及び心臓の繊維化および硬変を抑えるものと知られている(Nature Med., 9:964, 2003; J. Clin. Invest., 112:1776, 2003)。
【００８４】
本実施例では、配列番号：３８と３９のプライマーを用いて、配列番号：１９のＦＡＤおよび配列番号：６のｈＢＭＰ７を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を実施例２と同様の方法で増幅した。前記増幅物の塩基配列をＧｅｎＢａｎｋで確認（ＮＣＢＩ、ＮＭ＿００１７１９）し、実施例２と同様の方法でバクテリア発現ベクターにクローニングして組み換えポリペプチドを製造し、これをＴＲＰ−２と命名した。
【００８５】
配列番号: 38: 5'-ggc gcg atg cac gtg cgc tc ctg -3' 
配列番号: 39: 5'-agg gtc tga att ctc gga gga gct -3' 
【００８６】
図１９は、形質転換された大腸菌ＢＬ２１の培養の際にＩＰＴＧでタンパク質発現を誘導する以前と以後の総タンパク質を電気泳動によって確認したものである。ここで、矢印はＩＰＴＧに誘導されたＴＲＰ融合タンパク質を示し、レーン１は誘導されていないＴＲＰ−１、レーン２はＩＰＴＧに誘導されたＴＲＰ−１、レーン３は誘導されていないＴＲＰ−１(w/o TAT)、レーン４はＩＰＴＧに誘導されたＴＲＰ−１(w/o TAT)、レーン５は誘導されていないＴＲＰ−２(w/o TAT)、レーン６は誘導されたＴＲＰ−２(w/o TAT)、レーン７は誘導されていないＴＲＰ−２、レーン８はＩＰＴＧに誘導されたＴＲＰ−２を示す。図示の如く、ＩＰＴＧの添加によって融合タンパク質の生成を誘導した場合、対照群に比べてＴＲＰｓがさらに多く生成された。
【００８７】
図２０は、前記精製されたＴＲＰｓを抗Ｘ−ｐｒｅｓｓ抗体を用いたウエスタンブロットによって確認したものである。ここで、レーン１はＴＲＰ−１、レーン２はＴＲＰ−１(w/o TAT)、レーン３はＴＲＰ−２(w/o TAT)、レーン４はＴＲＰ−２を示す。図示の如く、ＴＡＴが付加された場合は、付加されてない場合に比べて分子量がやや増加した。このことより、ＴＲＰｓ融合ポリペプチドがうまく製造されたことを確認することができた。
【００８８】
実施例６：ＴＲＰ−１とＴＲＰ−２の細胞内への導入
本実施例では、まず１次培養した歯肉の繊維芽細胞(gingival fibroblasts)に、実施例２と５で精製されたＴＲＰ１−およびＴＲＰ−２を４ｎＭ処理し、細胞と培地にそれぞれ存在するＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２の発現程度を比較して細胞内導入の有無を調べた。
【００８９】
その結果、図２１に示すように、ＴＲＰ−１は細胞膜を透過して細胞内に移動した。すなわち、１次培養された歯肉の繊維芽細胞に４ｎＭのＴＲＰ−１を処理し、細胞と培地にそれぞれ存在するＴＲＰ−１の発現程度をウエスタンブロットした結果、ＴＲＰ−１は１時間以内に大部分細胞内に移動し、６時間以後には培地に殆ど残っていなかった。ところが、ＴＡＴのない対照群の場合には細胞内に全く入らなかった。また、同一の方法でＴＲＰ−２を細胞に投与した結果、図２２に示すように、ＴＲＰ−２も２時間以内に細胞膜を透過して細胞の内部に移動したが、ＴＡＴのない対照群の場合には細胞内に全く入らなかった。
【００９０】
実施例７：ＴＲＰｓによる活性化ＢＭＰの分泌とＰＴＤの重要性
本実施例では、ＴＲＰｓが細胞内に導入された場合、前記細胞で活性化されたＢＭＰが分泌されるか否かを確認するために、ＴＲＰ−１を細胞内に導入し、４８時間以内に活性化ＢＭＰ２の分泌の有無を測定した。その結果、図２３に示すように、細胞内に入ったＴＲＰ−１は、４８時間内に活性化されたＢＭＰ２を分泌することが分かった。この際、陽性対照群として、市販される活性化ＢＭＰ２のｒｈＢＭＰ−２を使用した。
【００９１】
また、本発明のＴＲＰ−１を細胞内に導入し、１次培養された繊維芽細胞の骨細胞の分化と石灰化物質の形成有無を確認することにより、骨細胞分化および骨再生の効果を調べた。繊維芽細胞を１週間培養しながらｒｈＢＭＰ−２とＴＲＰ−１をそれぞれ２ｎＭの濃度で２週間処理し、１週後、ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色処理して肉眼で観察した結果、図２４に示すように、細胞培地のみを用いた陰性対照群（Ｎ／Ｃ）とＴＡＴのないＴＲＰ−１［ＴＲＰ−１（ＴＡＴ−）］の場合、骨細胞の分化と石灰化物質の形成を観察することができなかったが、ＴＲＰ−１と市販中のｒｈＢＭＰ−２の場合には繊維芽細胞内で骨細胞の分化と石灰化物質の形成を確認することができた。
【００９２】
しかも、同一の方法で繊維芽細胞を１週間処理し、骨細胞分化マーカーとして用いられるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性度を測定した結果、図２５に示すように、本発明のＴＲＰ−１と市販中のｒｈＢＭＰ−２が同程度のＡＬＰ誘導効果を示した。
【００９３】
一方、市販される活性化ＢＭＰ２（ｒｈＢＭＰ−２）の力価と本発明のＴＲＰ−１の力価を比較するために、１次培養された繊維芽細胞を１週間培養し、それぞれＴＲＰ−１およびｒｈＢＭＰ−２で処理した後、ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色処理して肉眼で観察した。その結果、図２６に示すように、本発明のＴＲＰ−１と市販中の活性ｒｈＢＭＰ−２は同程度の薬効(potency)を示すものと確認することができた。具体的には、０．５ｎＭ以上の濃度では市販されるｒｈＢＭＰ−２の力価と本発明によるＴＲＰ−１の力価とが類似であった。
【００９４】
実施例８：細胞膜透過後のＴＲＰｓの活性化半減期
本実施例では、細胞内に透過されて入ったＴＲＰｓがＨＳＰｓなどによるタンパク質再配列とフューリンによる活性化過程を経て、活性ＢＭＰに分泌されることを確認するために、投与されたタンパク質の活性化過程半減期を調べた。このために、フューリン活性の高い２９３細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）に本発明によるＴＲＰ−１を投与した後、実施例６と同様の方法で処理し、ＴＲＰ−１の発現程度を時間別にウエスタンブロットした。
【００９５】
その結果、図２７に示すように、細胞に投与されたＴＲＰ−１は、２９３細胞で３〜４時間の半減期を持っていた。このような半減期は、細胞によって異なり、骨原性肉腫(osteogenic sarcoma)細胞株では約６時間、１次培養された繊維芽細胞では約８時間であった。この結果より、本発明によるＴＲＰｓは、細胞内でＨＳＰｓ、フューリンなどによる活性化過程を経て活性ＢＭＰに分泌されることを確認することができた。
【００９６】
実施例９：ＴＲＰｓの細胞膜透過と透過時温度の影響
市販中の組み換えｒｈＢＭＰは細胞膜に存在する受容体を通過するが、本発明のＴＲＰｓは細胞膜を直接透過し、従来のｒｈＢＭＰ−２の受容体を介しての過程は温度に依存的である。本発明によるＴＲＰｓの細胞内透過が温度依存的であるか否かを確認するために、ＴＲＰ−１とＴＲＰ−２を多様な温度で細胞に適用し、様々な時間に共焦点蛍光顕微鏡(confocal fluorescent microscope)で観察した。この際、本発明のＴＲＰ−１またはＴＲＰ−２を１０ｎＭの一定の濃度の下に、図２８に示すように、多様な温度と時間別に処理した。透過されたＴＲＰｓを、１次抗体として抗Ｘ−ｐｒｅｓｓ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２次抗体としてＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒｏ−４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と反応させ、核の染色のためにＦａｒ−Ｒｅｄ ＴＯＴＯ−３(Molecular Probes)を使用した。図２８において最も上方の写真はＴＲＰ−１が３７℃で細胞質内に入ったことを示し、Ｍｅｒｇｅは同一断面のＴＲＰ−１と細胞核の映像を重畳したものである。また、中間写真はＴＲＰ−１を５分間、ＴＲＰ−２を５分および６０分間処理し、前述した方法で重畳したイメージを示すものである。最も下方の写真はＴＲＰ−１とＴＲＰ−２を４℃で６０分間処理し、細胞内に導入されたＴＲＰ−１とＴＲＰ−２の重畳イメージを示すものである。
【００９７】
その結果、図２８に示すように、ＴＲＰ−１は３７℃で投与した後、５分以内に細胞内に透過されて入り込み、１時間程度経過の後、ＴＲＰ−１とＴＲＰ−２は一部の核にもあったが、大部分の細胞質内に存在した。しかも、２５℃と４℃においても３７℃と類似の透過パターンを示した。その結果より、本発明によるＴＲＰｓの細胞膜透過は温度に非依存的であることが分かった。
【００９８】
実施例１０：細胞内に導入されたＴＲＰｓとＦ−ａｃｔｉｎの特異的な結合の有無
上述したように、細胞内に透過された本発明によるＴＲＰｓは、細胞内で線形(linear)の特定のパターンを持って存在することを示した。本実施例では、本発明によるＴＲＰｓが細胞膜の透過後、特定の小器官または構造に特異的に存在するかを調べるために、前記構造と類似の配列を持つＦ−ａｃｔｉｎストレスファイバー(F-actin stress fiber)に対する特異結合因子であるファロイジン(phalloidin)免疫蛍光染色を行い、共焦点蛍光顕微鏡で観察した（図２９）。この際、ＴＲＰ−１とＴＲＰ−２は実施例９と同様の方法で蛍光染色し、Ｆ−ａｃｔｉｎ特異的染色のためにファロイジン−Ａｌｅｘａ−５９４(Molecular Probes)を使用した。図２９において、重畳写真の微弱な青色イメージは細胞核の下端部位を示す。
【００９９】
その結果、図２９に示すように、本発明のＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２は、投与後に細胞のＦ−ａｃｔｉｎｔ同一の配列を持つだけでなく、同じ位置に存在することが分かった。これは、本発明のＴＲＰｓが細胞内に透過された後、Ｆ−ａｃｔｉｎに特異的に反応して結合することを示す。この結果より、ＴＲＰｓが細胞内に透過されると、細胞質内に無作為に分布するのではなく、Ｆ−ａｃｔｉｎに特異的に結合し、細胞内の多様な活性化過程とフューリン切断過程を経て活性化ＢＭＰに転換されることが分かった。
【０１００】
実施例１１：動物実験モデルにおけるＴＲＰｓによる骨形成誘導
実施例１〜１０において、本発明のＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２が細胞膜を透過してフューリンによって活性化されて分泌され、これらが骨細胞の分化と石灰化物質の形成を誘導することを示した。本実施例では、本発明によるＴＲＰｓが生体内で骨の形成を誘導するかを調べるために、ラットの頭蓋骨に自然治癒不可能な損傷（８ｍｍ）を被らせた後、本発明によるＴＲＰ−１を市販中のｒｈＢＭＰ−２と比較投与して骨形成誘導を観察した（図３０）。この際、自然治癒不可能な損傷を被らせるために、ラット(rat)の頭蓋骨に直径８ｍｍのトレフィン(trephine)を用いて骨損傷部を形成した。陰性対照群には第１型コラーゲンを、陽性対照群（ｒｈＢＭＰ）には市販中の組み換えＢＭＰ２を第１型コラーゲンに混合して利用し、本発明のＴＲＰ−１を陽性対照群と同一の方法で投与した。ｒｈＢＭＰ−２とＴＲＰ−１は、それぞれ１０ｎｍｏｌｅ投与した。ＢＭＰ投与２週後に各実験群の組織を採取して１０％のホルマリンに２４時間固定し、４μｍの切片をヘマトキシリン／エオシン染色した後、光学顕微鏡で観察した。図３０において、矢印の両方は骨損傷部位の末端部を示し、最も下方のボックスはＴＲＰ−１による骨形成部位を拡大したものである。
【０１０１】
その結果、図３０に示すように、本発明のＴＲＰ−１投与２週後に生体内で旺盛な骨細胞分化と骨形成誘導を確認することができた。また、同量のＴＲＰ−１を投与した場合、市販中のｒｈＢＭＰ−２と比較して、より優れる力価または少なくとも類似の力価を示した。
【０１０２】
実施例１２：ＴＲＰｓの細胞毒性
実施例１〜１１において本発明によるＴＲＰｓを細胞または組織に投与したときの作用メカニズムと応用可能性を提示した。最後に、本発明のＴＲＰｓを過量投与した場合の細胞毒性を調べるために、市販中のｒｈＢＭＰと共に２００ｎＭまで濃度を高めながら細胞毒性を検査した。この際、ＴＲＰ−１と組み換えＢＭＰ２を１次培養された繊維芽細胞に各濃度別に投与し、７２時間後、生存した細胞の数を測定した（図３１）。その結果、図３１に示すように、ＴＲＰ−１を２００ｎＭ投与した場合にも細胞毒性を全く示さなかった。
【０１０３】
以上、本発明の内容の特定な部分を詳細に述べたが、当業界における通常の知識を有する者には、このような具体的記述は好適な実施例に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されるものでないことは明白である。例えば、本発明のＴＲＰ−１を人体に投与する場合、既に立証したように、骨および軟骨の形成を促進するのに有用であるが、本発明のＴＲＰ−２を人体に投与する場合、骨または軟骨の形成促進だけでなく、場合と投薬条件に応じて腎臓、肝、肺、及び心臓の繊維化および硬変を解消することにも有用であるものと期待される。したがって、本発明の実質的な範囲は添付の請求項とそれらの等価物によって定義されるべきである。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
以上詳しく述べたように、本発明は、従来の活性タンパク質とは全く異なる薬理メカニズムを持つ不活性ポリペプチドを提供するという効果がある。本発明によるＴＲＰは、生体内に投与される前までは不活性状態であるが、生体内で活性化される新しいメカニズムを持っており、細胞膜受容体との結合を３次元構造に維持するための追加の装備または費用が不要である。また、生産工程が簡単であり、分離・精製が非常に容易であって生産コストが低く、保管、取り扱いおよび投与過程も便利であってｒｈＢＭＰ類などの従来の活性タンパク質を代替することができるものと期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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