(57)【要約】  本発明者らは、細胞のアポトーシスを仲介することが可能なチャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）の配列であって、配列番号１に示されるＦＡＩＭ配列；配列番号２に示されるＦＡＤＤ配列；配列番号３に示されるＰＤＣＤ６配列；および配列番号４に示されるＲｅｑｕｉｅｍ配列から選択される配列を含んでなる、単離されたポリペプチドを提供する。【選択図】図１−２
2008526200.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のもの：
（ａ）配列番号１に示される配列に対して少なくとも９７％の配列同一性を有するｃｇＦＡＩＭ配列；
（ｂ）配列番号２に示される配列に対して少なくとも６９％の配列同一性を有するｃｇＦＡＤＤ配列；
（ｃ）配列番号３に示される配列に対して少なくとも８９％の配列同一性を有するｃｇＰＤＣＤ６配列；
（ｄ）配列番号４に示される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するｃｇＲｅｑｕｉｅｍ配列；
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの少なくとも１５個の連続した残基からなる断片である配列
より選択される配列であって、細胞のアポトーシスを仲介することが可能な配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
細胞のアポトーシスを仲介することが可能なチャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）の配列であって、配列番号１に示されるｃｇＦＡＩＭ配列；配列番号２に示されるｃｇＦＡＤＤ配列；配列番号３に示されるｃｇＰＤＣＤ６配列；および配列番号４に示されるｃｇＲｅｑｕｉｅｍ配列から選択される配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項３】
前記配列が、好ましくは、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群より選択される、請求項１または２に記載のポリペプチドをコードする配列を含んでなる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
以下のもの：
（ａ）配列番号５に示される配列に対して９０％以上の配列同一性を有するｃｇＦＡＩＭ配列；
（ｂ）配列番号６に示される配列に対して９０％以上の配列同一性を有するｃｇＦＡＤＤ配列；
（ｃ）配列番号７に示される配列に対して９３％以上の配列同一性を有するｃｇＰＤＣＤ６配列；
（ｄ）配列番号８に示される配列に対して８９％以上の配列同一性を有するｃｇＲｅｑｕｉｅｍ配列；
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの少なくとも１５個の連続した残基からなる断片である配列
からなる群より選択される配列、またはそれに相補的な配列、ストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズ可能な配列、もしくは遺伝コードによるその縮重である配列を含んでなる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
調節配列に機能的に連結された、請求項３もしくは４に記載のポリヌクレオチドまたはその一部分を含んでなる発現配列であって、該調節配列は該ポリヌクレオチドの発現を誘導することが可能なものである、上記発現配列。
【請求項６】
発現ベクターである、請求項５に記載の発現配列。
【請求項７】
請求項３または４に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクターであって、細胞に曝露した場合に、該細胞によるｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍの発現を変化させることが可能な、上記ベクター。
【請求項８】
チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）ＦＡＩＭ配列またはその一部分を含んでなる請求項７に記載のベクターであって、細胞でのｃｇＦＡＩＭのアップレギュレーションを行うことが可能であり、好ましくはｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＦＡＩＭ（配列番号３７）である、上記ベクター。
【請求項９】
チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）ＦＡＤＤ配列またはその一部分を含んでなる請求項７に記載のベクターであって、細胞でのｃｇＦＡＤＤのダウンレギュレーションを行うことが可能であり、好ましくはｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＦＡＤＤ ＤＮ（配列番号３８）である、上記ベクター。
【請求項１０】
チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）ＰＤＣＤ６配列またはその一部分を含んでなる請求項７に記載のベクターであって、細胞でのｃｇＰＤＣＤ６のダウンレギュレーションを行うことが可能であり、好ましくはｐＳＵＰＥＲ．ｎｅｏ．ＰＤＣＤ６ ｓｉＲＮＡ（配列番号３９）である、上記ベクター。
【請求項１１】
チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）Ｒｅｑｕｉｅｍ配列またはその一部分を含んでなる請求項７に記載のベクターであって、細胞でのｃｇＲｅｑｕｉｅｍのダウンレギュレーションを行うことが可能であり、好ましくはｐＳＵＰＥＲ．ｎｅｏ．Ｒｅｑｕｉｅｍ ｓｉＲＮＡ（配列番号４０）である、上記ベクター。
【請求項１２】
請求項５もしくは６に記載の発現配列または請求項７〜１１のいずれか１項に記載のベクターを含んでなる細胞であって、好ましくは前記発現配列が該細胞に導入されている、上記細胞。
【請求項１３】
請求項１もしくは２に記載のポリペプチド、請求項３もしくは４に記載のポリヌクレオチド、請求項５もしくは６に記載の発現配列、請求項７〜１１のいずれか１項に記載のベクター、または請求項１２に記載の細胞を、製薬上許容される担体もしくは希釈剤とともに含んでなる、医薬組成物。
【請求項１４】
以下のステップ：
（ａ）請求項３または４に記載のポリヌクレオチド配列と調節配列とを含んでなる発現配列であって、該調節配列は該ポリヌクレオチド配列からのポリペプチドの発現を誘導することが可能なものを用意するステップ、
（ｂ）該調節配列の制御下に該発現配列から該ポリペプチドを発現させるステップ、
（ｃ）任意により該ポリペプチドを精製するステップ
を含む、ポリペプチドの生成方法。
【請求項１５】
前記発現配列が発現ベクターを含み、該発現ベクターは、細胞に、好ましくはチャイニーズハムスター細胞にトランスフェクトされることにより該細胞による前記ポリペプチドの発現を可能にするものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
配列番号１に示される配列を有するｃｇＦＡＩＭポリペプチドまたは配列番号５に示される配列を有するｃｇＦＡＩＭポリヌクレオチドの、細胞での、好ましくはチャイニーズハムスター細胞での発現を変化させるステップ、好ましくはアップレギュレートするステップを含む方法。
【請求項１７】
配列番号２に示される配列を有するｃｇＦＡＤＤポリペプチド、配列番号３に示される配列を有するｃｇＰＤＣＤ６ポリペプチドもしくは配列番号４に示される配列を有するｃｇＲｅｑｕｉｅｍポリペプチド、または配列番号６に示される配列を有するｃｇＦＡＩＭポリヌクレオチド、配列番号７に示される配列を有するｃｇＰＤＣＤ６ポリヌクレオチドもしくは配列番号８に示される配列を有するｃｇＲｅｑｕｉｅｍポリヌクレオチドの、細胞での、好ましくはチャイニーズハムスター細胞での発現を変化させるステップ、好ましくはダウンレギュレートするステップを含む方法。
【請求項１８】
請求項７〜１１のいずれか１項に記載のベクターを細胞に曝露するステップ、好ましくは該ベクターで細胞をトランスフェクトするステップを含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
配列番号１に示される配列を有するポリペプチドまたは配列番号５に示される配列を有するポリヌクレオチドの発現を、改変されていない細胞と比較してアップレギュレートするように改変されている、好ましくは遺伝子操作されている細胞、好ましくはチャイニーズハムスター細胞。
【請求項２０】
配列番号２、３もしくは４に示される配列を有するポリペプチドまたは配列番号６、７もしくは８に示される配列を有するポリヌクレオチドの発現を、改変されていない細胞と比較してダウンレギュレートするように改変されている、好ましくは遺伝子操作されている細胞、好ましくはチャイニーズハムスター細胞。
【請求項２１】
請求項１９もしくは２０に記載の細胞、またはその子孫細胞を含んでなる細胞株、好ましくはチャイニーズハムスター細胞株。
【請求項２２】
請求項１９もしくは２０に記載の細胞、またはその子孫細胞、あるいは請求項２１に記載衣の細胞株を含んでなる細胞培養物。
【請求項２３】
請求項１９もしくは２０に記載の細胞、またはその子孫細胞を含んでなるトランスジェニック非ヒト動物、好ましくはチャイニーズハムスター。
【請求項２４】
前記ポリペプチドの発現が変化させられていない細胞と比較して、
（ｉ）前記細胞の細胞生存率が増大しているかもしくは上昇しており、好ましくは該細胞のアポトーシスが減少しており；
（ｉｉ）該細胞のタンパク質回収量、好ましくは組換え発現タンパク質回収量が増大しているかもしくは上昇しており；かつ／または
（ｉｉｉ）細胞により発現されるタンパク質の糖化、好ましくはシアル化が増大しているかもしくは上昇している、
請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法、請求項１２、１９もしくは２０に記載の細胞、請求項２１に記載の細胞株、請求項２２に記載の細胞培養物、または請求項２１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２５】
タンパク質、好ましくは異種タンパク質、より好ましくは外来性に導入された配列由来のタンパク質、最も好ましくは組換えタンパク質、好ましくはインターフェロンγの生成のための、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法、請求項１９もしくは２０に記載の細胞、請求項２１に記載の細胞株、請求項２２に記載の細胞培養物、または請求項２１に記載のトランスジェニック非ヒト動物の使用。
【請求項２６】
組換えタンパク質、好ましくはインターフェロンγの生成方法であって、請求項１９または２０に記載の細胞を用意するステップ、該組換えタンパク質を発現させることが可能な発現ベクターを用いて該細胞をトランスフェクトするステップ、および該細胞での該組換えタンパク質の発現を引き起こすステップを含む、上記方法。
【請求項２７】
配列番号９に示されるｃｇＦＡＤＤドミナントネガティブ配列を含んでなるポリペプチド、もしくは当該ポリペプチドをコードすることが可能なポリヌクレオチド、好ましくは配列番号１０に示されるポリヌクレオチド、またはその断片、ホモログ、変異体もしくは誘導体。
【請求項２８】
請求項２５または２６に記載の方法により生成可能なポリペプチド、好ましくは組換えタンパク質、より好ましくはインターフェロンγであって、改変されていない細胞から生成可能なポリペプチドと比較して、シアル化が増大している、上記ポリペプチド。
【請求項２９】
前記シアル化が、２．９モルシアル酸／モル生成ポリペプチドより多く、好ましくは約３．５モルシアル酸／モル生成ポリペプチドである、請求項２８に記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオテクノロジーおよび分子生物学の分野に関する。本発明は詳細には、アポトーシス過程の仲介に関与するチャイニーズハムスター、Cricetulus griseus由来の新規遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムプロジェクトの完了によって、治療上の潜在能力を有するいっそう多くのタンパク質が日々発見されている。これらの新たなバイオ療法薬の多くでは、世界的需要を満たすため高度に生産的な製造過程の開発が必要になることが多い。複雑な治療用生物製剤の生産に最もよく使われる細胞株の１つが、もとはチャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）に由来するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【０００３】
しかしながら、チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）のゲノムは、十分には明らかになっておらず、具体的には、生理学的に重要な過程を制御する、その生物の遺伝子に関する知識が欠如している。
【０００４】
米国特許第６，５６２，７９７号は、Ｆａｓ受容体の細胞質領域またはドメインを結合する能力を有するＦＡＤＤと名付けられた哺乳動物の精製タンパク質について記述している。この文献は、ＦＡＳ関連アポトーシスを調節する方法についても記述している。しかしながら、開示されている唯一の配列はヒト由来のものである。
【０００５】
米国特許第６，６８３，１６８号および米国特許出願公開第２００４／０１２１３８９号は、ＦＡＩＭ配列の配列をいくつかの形で、すなわち短いもの、長いもの、非常に長いものおよび肺がんに関連したものを記述している。これらの配列はヒトおよびマウス配列である。
【０００６】
米国特許第６，５４４，５２３号は、ＦａｓリガンドをコードするＤＮＡの配列を記載している。米国特許第６，４５１，７５９号は、そのようなリガンドの非切断性の変形物について記述している。
【発明の開示】
【０００７】
概要
本発明者らは、チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）ＦＡＩＭ、ＦＡＤＤ、ＰＤＣＤ６およびＲｅｑｕｉｅｍの配列を初めて記述する。
【０００８】
本発明の第１の態様によれば、本発明者らは以下のもの：（ａ）配列番号１に示される配列に対して少なくとも９７％の配列同一性を有するｃｇＦＡＩＭ配列；（ｂ）配列番号２に示される配列に対して少なくとも６９％の配列同一性を有するｃｇＦＡＤＤ配列；（ｃ）配列番号３に示される配列に対して少なくとも８９％の配列同一性を有するｃｇＰＤＣＤ６配列；（ｄ）配列番号４に示される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するｃｇＲｅｑｕｉｅｍ配列；（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの少なくとも１５個の連続した残基からなる断片である配列より選択される配列であって、細胞のアポトーシスを仲介することが可能な配列を含んでなる、単離されたポリペプチドを提供する。
【０００９】
本発明の第２の態様によれば、細胞のアポトーシスを仲介することが可能なチャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）の配列であって、配列番号１に示されるｃｇＦＡＩＭ配列；配列番号２に示されるｃｇＦＡＤＤ配列；配列番号３に示されるｃｇＰＤＣＤ６配列；および配列番号４に示されるｃｇＲｅｑｕｉｅｍ配列から選択される配列を含んでなる、単離されたポリペプチドが提供される。
【００１０】
本発明の第１の態様によれば、本発明者らは、細胞のアポトーシスを仲介することが可能なチャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）の配列であって、配列番号１に示されるｃｇＦＡＩＭ配列；配列番号２に示されるｃｇＦＡＤＤ配列；配列番号３に示されるｃｇＰＤＣＤ６配列；および配列番号４に示されるｃｇＲｅｑｕｉｅｍ配列から選択される配列を含んでなる、単離されたポリペプチドを提供する。
【００１１】
本発明の第２の態様によれば、以下のもの：（ａ）配列番号１に示される配列に対して少なくとも９７％の配列同一性を有するｃｇＦＡＩＭ配列；（ｂ）配列番号２に示される配列に対して少なくとも６９％の配列同一性を有するｃｇＦＡＤＤ配列；（ｃ）配列番号３に示される配列に対して少なくとも８９％の配列同一性を有するｃｇＰＤＣＤ６配列；（ｄ）配列番号４に示される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するｃｇＲｅｑｕｉｅｍ配列；（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの少なくとも１５個の連続した残基からなる断片である配列より選択される配列を含んでなる、単離されたポリペプチドが提供される。
【００１２】
本発明の第３の態様によれば、本発明者らは、前記配列が、好ましくは、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群より選択される、前記ポリペプチドをコードする配列を含んでなる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１３】
本発明の第４の態様として、以下のもの：（ａ）配列番号５に示される配列に対して９０％以上の配列同一性を有するｃｇＦＡＩＭ配列；（ｂ）配列番号６に示される配列に対して９０％以上の配列同一性を有するｃｇＦＡＤＤ配列；（ｃ）配列番号７に示される配列に対して９３％以上の配列同一性を有するｃｇＰＤＣＤ６配列；（ｄ）配列番号８に示される配列に対して８９％以上の配列同一性を有するｃｇＲｅｑｕｉｅｍ配列；（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの少なくとも１５個の連続した残基からなる断片である配列からなる群より選択される配列、またはそれに相補的な配列、ストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズ可能な配列、もしくは遺伝コードによるその縮重である配列を含んでなる、単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００１４】
本発明の第５の態様によれば、本発明者らは、調節配列に機能的に連結された、上記に記載のポリヌクレオチドまたはその一部分を含んでなる発現配列であって、該調節配列は該ポリヌクレオチドの発現を誘導することが可能なものである発現配列を提供する。
【００１５】
好ましくは、そのような発現配列は発現ベクターである。
【００１６】
第６の態様において、本発明は、上記に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクターであって、細胞に曝露した場合に、該細胞によるｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍの発現を変化させることが可能なベクターを提供する。
【００１７】
好ましくは、上記ベクターは、チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）ＦＡＩＭ配列またはその一部分を含んでなり、細胞でのｃｇＦＡＩＭのアップレギュレーションを行うことが可能であり、好ましくはｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＦＡＩＭ（配列番号３７）である。
【００１８】
好ましくは、上記ベクターは、チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）ＦＡＤＤ配列またはその一部分を含んでなり、細胞でのｃｇＦＡＤＤのダウンレギュレーションを行うことが可能であり、好ましくはｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＦＡＤＤ ＤＮ（配列番号３８）である。
【００１９】
好ましくは、上記ベクターは、チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）ＰＤＣＤ６配列またはその一部分を含んでなり、細胞でのｃｇＰＤＣＤ６のダウンレギュレーションを行うことが可能であり、好ましくはｐＳＵＰＥＲ．ｎｅｏ．ＰＤＣＤ６ ｓｉＲＮＡ（配列番号３９）である。
【００２０】
好ましくは、上記ベクターは、チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）Ｒｅｑｕｉｅｍ配列またはその一部分を含んでなり、細胞でのｃｇＲｅｑｕｉｅｍのダウンレギュレーションを行うことが可能であり、好ましくはｐＳＵＰＥＲ．ｎｅｏ．Ｒｅｑｕｉｅｍ ｓｉＲＮＡ（配列番号４０）である。
【００２１】
本発明の第７の態様において、前記発現配列または前記ベクターを含んでなる細胞であって、好ましくは前記発現配列が導入されている細胞が提供される。
【００２２】
本発明の第８の態様によれば、本発明者らは、前記ポリペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記発現配列、前記ベクター、または前記細胞を、製薬上許容される担体もしくは希釈剤とともに含んでなる、医薬組成物を提供する。
【００２３】
本発明の第９の態様によれば、本発明者らは、以下のステップ：（ａ）前記ポリヌクレオチド配列と調節配列とを含んでなる発現配列であって、該調節配列は該ポリヌクレオチド配列からのポリペプチドの発現を誘導することが可能なものを用意するステップ、（ｂ）該調節配列の制御下に該発現配列から該ポリペプチドを発現させるステップ、および（ｃ）任意により該ポリペプチドを精製するステップを含む、ポリペプチドの生成方法を提供する。
【００２４】
好ましくは、前記発現配列が発現ベクターを含み、該発現ベクターは、細胞に、好ましくはチャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）細胞にトランスフェクトされることにより該細胞による前記ポリペプチドの発現を可能にするものである。
【００２５】
本発明の第１０の態様によれば、配列番号１に示される配列を有するｃｇＦＡＩＭポリペプチドまたは配列番号５に示される配列を有するｃｇＦＡＩＭポリヌクレオチドの、細胞での、好ましくはチャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）細胞での発現を変化させるステップ、好ましくはアップレギュレートするステップを含む方法が提供される。
【００２６】
本発明の第１１の態様として、本発明者らは、配列番号２に示される配列を有するｃｇＦＡＤＤポリペプチド、配列番号３に示される配列を有するｃｇＰＤＣＤ６ポリペプチドもしくは配列番号４に示される配列を有するｃｇＲｅｑｕｉｅｍポリペプチド、または配列番号６に示される配列を有するｃｇＦＡＩＭポリヌクレオチド、配列番号７に示される配列を有するｃｇＰＤＣＤ６ポリヌクレオチドもしくは配列番号８に示される配列を有するｃｇＲｅｑｕｉｅｍポリヌクレオチドの、細胞での、好ましくはチャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）細胞での発現を変化させるステップ、好ましくはダウンレギュレートするステップを含む方法を提供する。
【００２７】
好ましくは、上記方法は、前記ベクターを細胞に曝露するステップ、好ましくは該ベクターで細胞をトランスフェクトするステップを含む。
【００２８】
本発明の第１２の態様によれば、本発明者らは、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドまたは配列番号５に示される配列を有するポリヌクレオチドの発現を、改変されていない細胞と比較してアップレギュレートするように改変されている、好ましくは遺伝子操作されている細胞、好ましくはチャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）細胞を提供する。
【００２９】
本発明の第１３の態様によれば、本発明者らは、配列番号２、３もしくは４に示される配列を有するポリペプチドまたは配列番号６、７もしくは８に示される配列を有するポリヌクレオチドの発現を、改変されていない細胞と比較してダウンレギュレートするように改変されている、好ましくは遺伝子操作されている細胞、好ましくはチャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）細胞を提供する。
【００３０】
本発明の第１４の態様によれば、前記細胞、またはその子孫細胞を含んでなる細胞株、好ましくはチャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）細胞株が提供される。
【００３１】
本発明の第１５の態様によれば、本発明者らは、前記細胞、もしくはその子孫細胞、または記載の細胞株を含んでなる細胞培養物を提供する。
【００３２】
本発明の第１６の態様によれば、本発明者らは、前記細胞、またはその子孫細胞を含んでなるトランスジェニック非ヒト動物、好ましくはチャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）を提供する。
【００３３】
前記ポリペプチドの発現が変化させられていない細胞と比較して、（ｉ）前記細胞の細胞生存率が増大しているかもしくは上昇しており、好ましくは該細胞のアポトーシスが減少しており；（ｉｉ）該細胞のタンパク質回収量、好ましくは組換え発現タンパク質回収量が増大しているかもしくは上昇しており；かつ／または（ｉｉｉ）細胞により発現されるタンパク質の糖化、好ましくはシアル化が増大しているかもしくは上昇していることが好ましい。
【００３４】
本発明の第１７の態様によれば、本発明者らは、タンパク質、好ましくは異種タンパク質、より好ましくは外来性に導入された配列由来のタンパク質、最も好ましくは組換えタンパク質の生成のための、記載の方法、記載の細胞、記載の細胞株、記載の細胞培養物、または記載のトランスジェニック非ヒト動物の使用を提供する。
【００３５】
本発明の第１８の態様によれば、本発明者らは、組換えタンパク質の生成方法であって、前記細胞を用意するステップ、該組換えタンパク質を発現させることが可能な発現ベクターを用いて該細胞をトランスフェクトするステップ、および該細胞での該組換えタンパク質の発現を引き起こすステップを含む、上記方法を提供する。
【００３６】
本発明の第１９の態様によれば、本発明者らは、配列番号９に示されるｃｇＦＡＤＤドミナントネガティブ配列を含んでなるポリペプチド、もしくは当該ポリペプチドをコードすることが可能なポリヌクレオチド、好ましくは配列番号１０に示されるポリヌクレオチド、またはその断片、ホモログ、変異体もしくは誘導体を提供する。
【００３７】
本発明の第２０の態様として、本発明者らは、本発明の第１７または第１８の態様に記載の方法により生成可能なポリペプチド、好ましくは組換えタンパク質、より好ましくはインターフェロンγであって、改変されていない細胞から生成可能なポリペプチドと比較してシアル化が増大しているポリペプチドを提供する。
【００３８】
前記シアル化は、２．９モルシアル酸／モル生成ポリペプチドより多く、好ましくは約３．５モルシアル酸／モル生成ポリペプチドであることが好ましい。
【００３９】
本発明のさらに詳しくかつ好ましい実施形態は、独立項および従属項として添付の特許請求の範囲に記載されている。従属項の特徴は、必要に応じて独立項の特徴と、また特許請求の範囲に明記されているもの以外の組み合わせで組み合わせることができる。
【００４０】
本発明の実施では、特に指定のない限り、当業者の能力の範囲内である、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来技術を利用することができよう。そのような技術は文献の中で説明されている。例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995および定期的追補版; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (編), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies : A Laboratory Manual : Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies : A Laboratory Manual by Ed Harlow (編), David Lane (編) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855, Lars-Inge Larsson 「Immunocytochemistry: Theory and Practice」, CRC Press inc., Baca Raton, Florida, 1988, ISBN 0-8493-6078-1, John D. Pound (編); 「Immunochemical Protocols, vol 80」, シリーズ中:「Methods in Molecular Biology」, Humana Press, Totowa, New Jersey, 1998, ISBN 0-89603-493-3, Handbook of Drug Screening, Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes (2001, New York, NY, Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9)編; Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Jane Roskams and Linda Rodgers編, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3; およびThe Merck Manual of Diagnosis and Therapy (第17版, Beers, M. H., and Berkow, R(編), ISBN: 0911910107, John Wiley & Sons)を参照されたい。これらの一般的なテキストの各々は、参照により本明細書に組み入れられる。
【００４１】
配列表
配列番号１はチャイニーズハムスター（C. griseus）ＦＡＩＭのアミノ酸配列の配列である。配列番号２はチャイニーズハムスター（C. griseus）ＦＡＤＤのアミノ酸配列である。配列番号３はチャイニーズハムスター（C. griseus）ＰＤＣＤ６のアミノ酸配列である。配列番号４はチャイニーズハムスター（C. griseus）Ｒｅｑｕｉｅｍのアミノ酸配列である。
【００４２】
配列番号５はチャイニーズハムスター（C. griseus）ＦＡＩＭの核酸配列である。配列番号６はチャイニーズハムスター（C. griseus）ＦＡＤＤの核酸配列である。配列番号７はチャイニーズハムスター（C. griseus）ＰＤＣＤ６の核酸配列である。配列番号８はチャイニーズハムスター（C. griseus）Ｒｅｑｕｉｅｍの核酸配列である。
【００４３】
配列番号９はチャイニーズハムスター（C. griseus）ＦＡＤＤドミナントネガティブのアミノ酸配列である。配列番号１０はチャイニーズハムスター（C. griseus）ＦＡＤＤドミナントネガティブの核酸配列である。配列番号１１はチャイニーズハムスター（C. griseus）ＦＡＤＤドミナントネガティブ５’−ＰＣＲプライマーの配列である。配列番号１２はチャイニーズハムスター（C. griseus）ＦＡＤＤドミナントネガティブ３’−ＰＣＲプライマーの配列である。配列番号１３はチャイニーズハムスター（C. griseus）ＰＤＣＤ６抑制ベクターインサート５’の配列である。配列番号１４はチャイニーズハムスター（C. griseus）ＰＤＣＤ６抑制ベクターインサート３’の配列である。配列番号１５はチャイニーズハムスター（C. griseus）Ｒｅｑｕｉｅｍ抑制ベクターインサート５’の配列である。配列番号１６はチャイニーズハムスター（C. griseus）Ｒｅｑｕｉｅｍ抑制ベクターインサート３’の配列である。
【００４４】
配列番号１７はチャイニーズハムスター（C. griseus）ＦＡＩＭ ５’ＰＣＲプライマーの配列である。配列番号１８はチャイニーズハムスター（C. griseus）ＦＡＩＭ ３’ＰＣＲプライマーの配列である。配列番号１９はチャイニーズハムスター（C. griseus）ＦＡＤＤ ５’ＰＣＲプライマーの配列である。配列番号２０はチャイニーズハムスター（C. griseus）ＦＡＤＤ ３’ＰＣＲプライマーの配列である。配列番号２１はチャイニーズハムスター（C. griseus）ＰＤＣＤ６ ５’ＰＣＲプライマーの配列である。配列番号２２はチャイニーズハムスター（C. griseus）ＰＤＣＤ６ ３’ＰＣＲプライマーの配列である。配列番号２３はチャイニーズハムスター（C. griseus）ＰＤＣＤ６ ３’−ＲＡＣＥプライマーの配列である。配列番号２４はチャイニーズハムスター（C. griseus）Ｒｅｑｕｉｅｍ ５’ＰＣＲプライマーの配列である。配列番号２５はチャイニーズハムスター（C. griseus）Ｒｅｑｕｉｅｍ ３’ＰＣＲプライマーの配列である。配列番号２６はチャイニーズハムスター（C. griseus）Ｒｅｑｕｉｅｍ ３’−ＲＡＣＥプライマーの配列である。
【００４５】
配列番号２７はチャイニーズハムスター（C. griseus）ＦＡＩＭの定量的リアルタイムＰＣＲプライマー５’の配列である。配列番号２８はチャイニーズハムスター（C. griseus）ＦＡＩＭの定量的リアルタイムＰＣＲプライマー３’の配列である。配列番号２９はチャイニーズハムスター（C. griseus）ＦＡＤＤの定量的リアルタイムＰＣＲプライマー５’の配列である。配列番号３０はチャイニーズハムスター（C. griseus）ＦＡＤＤの定量的リアルタイムＰＣＲプライマー３’の配列である。配列番号３１はチャイニーズハムスター（C. griseus）ＰＤＣＤ６の定量的リアルタイムＰＣＲプライマー５’の配列である。配列番号３２はチャイニーズハムスター（C. griseus）ＰＤＣＤ６の定量的リアルタイムＰＣＲプライマー３’の配列である。配列番号３３はチャイニーズハムスター（C. griseus）Ｒｅｑｕｉｅｍの定量的リアルタイムＰＣＲプライマー５’の配列である。配列番号３４はチャイニーズハムスター（C. griseus）Ｒｅｑｕｉｅｍの定量的リアルタイムＰＣＲプライマー３’の配列である。配列番号３５はβ−アクチンの定量的リアルタイムＰＣＲプライマー５’の配列である。
【００４６】
配列番号３６はβ−アクチンの定量的リアルタイムＰＣＲプライマー３’の配列である。配列番号３７はプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＦＡＩＭの核酸配列である。配列番号３８はプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＦＡＤＤ ＤＮの核酸配列である。配列番号３９はプラスミドｐＳＵＰＥＲ．ｎｅｏ．ＰＤＣＤ６ ｓｉＲＮＡの核酸配列である。配列番号４０はプラスミドｐＳＵＰＥＲ．ｎｅｏ．Ｒｅｑｕｉｅｍ ｓｉＲＮＡの核酸配列である。
【００４７】
本明細書中に記載されている方法および組成物は配列表に示された配列のうちのいずれか１つまたは複数を好適に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
詳細な説明
チャイニーズハムスター配列
本開示は全体として、細胞でのアポトーシスを変化させることが可能な、チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）由来のある種の核酸、ポリペプチド、ならびにその断片、ホモログ、変異体および誘導体を提供する。
【００４９】
具体的には、本発明者らは配列表に記載のチャイニーズハムスターＦＡＤＤ、ＦＡＩＭ、ＰＤＣＤ６およびＲｅｑｕｉｅｍのポリペプチドおよび核酸配列を提供する。さらに本発明者らはそのような遺伝子、断片、ホモログの使用を提供する。
【００５０】
特に好ましい使用は、生存率の増大、タンパク質（特に組換えタンパク質）を発現する能力の増大およびそのようなタンパク質の糖化、好ましくはシアル化の増大などの、特性の増強のための、細胞、特にチャイニーズハムスター卵巣細胞の改変を含む。そのような改変細胞およびこれらの誘導体（コロニー、クローン、細胞株などのような）は、以下にさらに詳細に記述されており、組換えタンパク質の生成のためのアポトーシス耐性細胞として使用することができる。
【００５１】
ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６およびｃｇＲｅｑｕｉｅｍポリペプチド
本明細書に開示されるポリペプチド配列は、配列表に記載されている特定の配列、もしくはその断片、またはｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／もしくはｃｇＲｅｑｕｉｅｍタンパク質から得られる配列に限定されるものだけではなく、場合によっては、任意の供給源、例えば、関連する細胞ホモログ、その他の種由来のホモログおよびその変異体または誘導体から得られる相同配列も、それらがｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍの生物学的活性の少なくとも１つを有するならば、含まれることが理解されるであろう。
【００５２】
本開示はしたがって、配列表に記載されているアミノ酸配列の変異体、ホモログまたは誘導体、ならびに本明細書に開示されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列の変異体、ホモログまたは誘導体を包含する。そのような配列は、場合によっては、「ｃｇＦＡＤＤ配列」、「ｃｇＦＡＩＭ配列」、「ｃｇＰＤＣＤ６配列」、または「ｃｇＲｅｑｕｉｅｍ配列」と一般に称される。
【００５３】
生物学的活性
非常に好ましい実施形態において、配列は、場合によっては、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍの少なくとも１つの生物学的活性を含む。
【００５４】
好ましくは、ｃｇＦＡＩＭの場合、生物学的活性は、好ましくはカスパーゼ活性のダウンレギュレーションによってアッセイされる、アポトーシス阻害活性を含む。すなわち、本明細書に記述されるｃｇＦＡＤＤ配列は、アポトーシスを阻害できることが、具体的には細胞との関連でカスパーゼ活性をダウンレギュレートできることが好ましい。
【００５５】
非常に好ましい態様において、そのような方法を用いてアッセイされる場合、ｃｇＦＡＩＭ配列は、細胞にトランスフェクトされたとき、当該ｃｇＦＡＩＭ配列でそのようにトランスフェクトされていない細胞と比較して、少なくとも１０％、好ましくは２０％、より好ましくは３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上だけアポトーシスを阻害できる。
【００５６】
ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６およびｃｇＲｅｑｕｉｅｍの場合、生物学的活性は、好ましくはカスパーゼ活性のアップレギュレーションによってアッセイされる、アポトーシス刺激活性を含むことが好ましい。すなわち、本明細書に記述されるｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６およびｃｇＲｅｑｕｉｅｍ配列は、アポトーシスを上方刺激できることが、具体的には細胞との関連でカスパーゼ活性をアップレギュレートできることが好ましい。
【００５７】
非常に好ましい実施形態において、そのような方法を用いてアッセイされる場合、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６およびｃｇＲｅｑｕｉｅｍ配列は、細胞にトランスフェクトされたとき、当該ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍ配列でそのようにトランスフェクトされていない細胞と比較して、少なくとも１０％、好ましくは２０％、より好ましくは３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上だけアポトーシスを刺激できる。
【００５８】
非常に好ましい実施形態において、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍ配列によるアポトーシスの活性化または抑制は、カスパーゼ活性のアッセイによりアッセイされる。すなわち、上記に示されるアポトーシスの刺激または抑制の割合は、非常に好ましい態様においてカスパーゼ活性の刺激または抑制の割合として測定されることができる。
【００５９】
すなわち、比色法または蛍光法を利用したカスパーゼ活性測定アッセイなどのアポトーシス活性モニタリング法を用いて、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍの生化学的活性を確認することができる。そのような方法を、例えば当技術分野において公知の手段により、または実施例に示されるプロトコルを利用し、適切な発現構築物でトランスフェクトされた細胞で行って、アポトーシスが影響を受けているかどうかおよび／またはカスパーゼ活性がアップレギュレートもしくはダウンレギュレートされているかどうかを判定することができる。
【００６０】
カスパーゼは、アポトーシスを仲介するシステインプロテアーゼの大きなファミリーである（Nicholson & Thornberry 1997; Thornberry & Littlewood 1998）。カスパーゼ−８は、受容体介在性アポトーシス経路の最も上流に作用するイニシエーターカスパーゼである。細胞表面受容体の活性化によって、カスパーゼ−８は、カスパーゼ−３などの下流のエフェクターカスパーゼのタンパク質分解活性を直接的にまたは間接的に惹起する（Srinivasula et al 1996およびCohen 1997）。同様に、別の上流カスパーゼであるカスパーゼ−９は、ミトコンドリアからのシトクロムｃのサイトゾルへの放出を介して活性化される。放出されたシトクロムｃはアポトーシスプロテアーゼ活性化因子ＡＰＡＦ−１に結合し、プロカスパーゼ−９を活性化する複合体を形成する（Zou et al 1999およびHu et al 1999）。活性型カスパーゼ−９は、カスパーゼ−３およびその他の下流カスパーゼを同様に活性化するプロテアーゼカスケードを惹起する。
【００６１】
好ましい態様において、アポトーシス活性のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを判定するためにアッセイされるカスパーゼ活性は、カスパーゼ−８またはカスパーゼ−９を含む。
【００６２】
カスパーゼ−８およびカスパーゼ−９活性をアッセイする方法は、当技術分野において公知であり、例えば、Nicholson DW and Thornberry NA (1997) Caspases: killer proteases. Trends Biochem Sci. 272: 2952-2956およびThornberry NA and Littlewood Y (1998) Caspases: Enemies within. Science 281:1312-1316に明確に記述されている。先行技術において示されるプロトコルのいずれかを用いて、カスパーゼ活性をアッセイすることができる。
【００６３】
しかしながら、好ましい実施形態では、以下に示される「カスパーゼアッセイプロトコル」を利用して、カスパーゼ−８および／またはカスパーゼ−９活性をアッセイする。
【００６４】
カスパーゼアッセイプロトコル
カスパーゼ活性は、ウェルに固定化された種々のカスパーゼに特異的な蛍光発生基質を利用することでアッセイすることができる。活性カスパーゼを含有する細胞溶解液のウェルへの添加によって、基質が切断され、標準的な蛍光プレートリーダーを用いて検出できる蛍光生成物が放出されるであろう。
【００６５】
具体的には、ＢＤ ＡｐｏＡｌｅｒｔＴＭカスパーゼアッセイプレート（カタログ番号K2033-1、BD Biosciences Clontech、Palo Alto、California、USA）では、それぞれの活性カスパーゼにより認識される短いペプチドで構成される種々のカスパーゼ基質を使っている。それらのペプチドは蛍光色素７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）に共有結合している。ペプチド結合ＡＭＣはＵＶ領域（λｍａｘ＝３８０ｎｍ）で発光し、その一方で未結合ＡＭＣは緑色領域（λｍａｘ＝４６０ｎｍ）で発光する。これによって、４６０ｎｍでの蛍光強度の増大を試験サンプル中の各カスパーゼの活性の増大と関連づけることが可能になる。カスパーゼ−８活性をアッセイする場合、使われる基質はＶＤＶＡＤ−ＡＭＣであり、その一方、カスパーゼ−９活性のアッセイでは、その基質としてＬＥＨＤ−ＡＭＣを用いる。
【００６６】
ＢＤ ＡｐｏＡｌｅｒｔＴＭカスパーゼアッセイプレートを用いてカスパーゼ活性をアッセイするため、サンプルからの細胞を遠心分離によってペレットにし、その後、１×細胞溶解緩衝液（BD Biosciences Clontech）に再懸濁し、氷上で１０分間インキュベートする。次いで、細胞残屑を４℃で５分間の遠心分離によって除去する。次に、２×反応緩衝液／ＤＴＴ混合物５０μＬを、使用されうる９６ウェルプレートの各ウェルに加える。このプレートを３７℃で５分間プレインキュベートする。次いで、適切な細胞溶解液５０μＬをウェルに加え、３７℃で２時間インキュベートする。次に、蛍光プレートリーダーを用いて、放出されたＡＭＣの量を測定する（３８０ｎｍで励起、４６０ｎｍで発光）。
【００６７】
カスパーゼ活性は、参照サンプルの４６０ｎｍでの絶対発光の減算後のサンプルの４６０ｎｍでの絶対発光と定義される。参照サンプルは、時間基準ゼロで回収されたサンプルである。
【００６８】
ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍ発現ベクターでトランスフェクトされた細胞のカスパーゼ活性を空のベクターでトランスフェクトされた（またはトランスフェクトされていない）細胞と比較して、場合により、アポトーシスが刺激されているかまたは抑制されている割合を測定することができる。
【００６９】
好ましい実施形態において、そのような方法を用いてアッセイされる場合、ｃｇＦＡＩＭ配列は、細胞にトランスフェクトされたとき、当該ｃｇＦＡＩＭ配列でそのようにトランスフェクトされていない細胞と比較して、少なくとも１０％、好ましくは２０％、より好ましくは３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上だけカスパーゼ−８、もしくはカスパーゼ−９、またはその両方の発現を阻害できる。
【００７０】
非常に好ましい実施形態において、そのような方法を用いてアッセイされる場合、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６およびｃｇＲｅｑｕｉｅｍ配列は、細胞にトランスフェクトされたとき、当該ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍ配列でそのようにトランスフェクトされていない細胞と比較して、少なくとも１０％、好ましくは２０％、より好ましくは３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上だけカスパーゼ−８、もしくはカスパーゼ−９、またはその両方の発現を刺激できる。
【００７１】
膜変化、ＤＮＡ断片化およびその他アポトーシスの生化学的特徴などのアポトーシス関連事象を検出するその他のアッセイを、記述のアッセイに代えて、または加えて、用いることもできる。
【００７２】
ホモログ
開示されるポリペプチドは、任意の供給源から得られる相同配列、例えば、関連するウイルス／細菌タンパク質、細胞ホモログおよび合成ペプチド、ならびにその変異体または誘導体を含む。すなわち、ポリペプチドは同様に、哺乳動物（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）、特に齧歯類などの動物を含めたその他の種由来のｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍのホモログをコードするものを含む。
【００７３】
本明細書との関連で、相同配列またはホモログは、場合によって、例えば本明細書において配列表に示されるｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍと少なくとも３０、好ましくは４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００アミノ酸にわたりアミノ酸レベルで少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、８６、８７、８８、８９または９０％同一である、好ましくは少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一であるアミノ酸配列を含むと解釈される。本明細書との関連で、相同配列はｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍの配列と、好ましくは、少なくとも１５、２５、３５、５０または１００、好ましくは２００、３００、４００または５００アミノ酸にわたり、アミノ酸レベルで少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、８６、９７、８８、８９または９０％同一である、好ましくは少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一であるアミノ酸配列を含むと解釈される。例えば、配列は、ｃｇＦＡＤＤ（好ましくは配列番号１に示される配列を含む）、ｃｇＦＡＩＭ（好ましくは配列番号２に示される配列を含む）、ｃｇＰＤＣＤ６（好ましくは配列番号３に示される配列を含む）またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍ（好ましくは配列番号４に示される配列を含む）に対し表示の配列同一性を有することができる。
【００７４】
相同性は類似性（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）という点でも考慮されうるが、本明細書との関連では、相同性を配列同一性という点で表現することが好ましい。非常に好ましい実施形態において、配列同一性は関連配列長の全体に対して、すなわち、例えば関連遺伝子の全長または完全長配列にわたって判定される。
【００７５】
相同性比較は目測で、またはより一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムの助けで行うことができる。これらの市販のコンピュータプログラムでは、２つまたはそれ以上の配列間の％相同性を計算することができる。
【００７６】
％相同性は連続した配列にわたって計算することができ、すなわち、一方の配列を他方の配列と整列させ、一方の配列中の各アミノ酸を、一度に１残基ずつ、他方の配列中の対応するアミノ酸と直接的に比較する。これは「ギャップなしのアライメント」と呼ばれる。典型的には、そのようなギャップなしのアライメントは、比較的短い残基数（例えば５０未満の連続したアミノ酸）にわたってのみ行われる。
【００７７】
これは非常に単純かつ一貫した方法であるが、例えば、別の方法で同一な配列の対において、１つの挿入または欠失は、それ以降のアミノ酸残基がアライメント外に配される原因となり、それによってグローバルアライメントが行われる場合に％相同性の大幅な低下を引き起こす可能性があることを考慮に入れることができない。その結果、大部分の配列比較法は、全体の相同性スコアに過度に不利益をもたらすことなく、可能性のある挿入および欠失を考慮に入れた最適なアライメントをもたらすようデザインされている。これは、配列アライメントに「ギャップ」を挿入して、局所相同性を最大限にするよう試みることで達成される。
【００７８】
しかしながら、これらのより複雑な方法では、アライメント中に生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てるが、その結果、同じ数の同一アミノ酸の場合、２つの比較配列間のいっそう高い関連性を反映する、可能な限り少ないギャップを有した配列アライメントは、多くのギャップを有したものよりも高いスコアを達成することになる。ギャップの存在には比較的高いコストおよびギャップ中のその後の各残基にはもっと小さなペナルティを課す「アフィンギャップコスト」が典型的に使われる。これは最もよく使用されているギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティでは、もちろん、ギャップがより少ない最適化アライメントがもたらされよう。大部分のアライメントプログラムは、ギャップペナルティの改変を可能にする。しかしながら、そのようなソフトウェアを配列比較のために用いる場合、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（以下参照）を用いる場合、アミノ酸配列に対するデフォルトのギャップペナルティは、ギャップに対し−１２および各伸展に対し−４である。
【００７９】
最大の％相同性の計算ではしたがって、ギャップペナルティを考慮に入れた、最適アライメントの生成が最初に必要になる。そのようなアライメントを実行するのに適したコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（ウィスコンシン大学、米国; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387）である。配列比較を行うことができる以外のソフトウェアの例としては、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ausubel et al., 1999 前記−18章）、ＦＡＳＴＡ（Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410）および比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイートが挙げられるが、これらに限定されることはない。ＢＬＡＳＴもＦＡＳＴＡもオフラインおよびオンライン検索で利用可能である（Ausubel et al., 1999 前記、7-58から7-60頁を参照のこと）。しかしながら、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。
【００８０】
最終の％相同性は同一性という点で測定されうるが、アライメント過程それ自体は、典型的には、全か無かの対比較に基づいていない。その代わりに、化学的類似性または進化距離に基づき各対比較にスコアを割り当てるスケール付きの類似性スコアマトリックスが一般的に使用される。よく使用されているそのようなマトリックスの例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、つまりプログラムのＢＬＡＳＴスイートのためのデフォルトマトリックスである。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムでは、通常、一般のデフォルト値または提供されるならカスタムシンボル比較表のいずれかが使われる（さらに詳しくはユーザーマニュアルを参照のこと）。ＧＣＧパッケージには一般のデフォルト値、またはその他のソフトウェアの場合には、ＢＬＯＳＵＭ６２などの、デフォルトマトリックスを使用することが好ましい。
【００８１】
ソフトウェアが最適なアライメントを生成したら、％相同性、好ましくは％配列同一性を計算することが可能である。ソフトウェアは、典型的には、これを配列比較の一環として行い、計算結果を作出する。
【００８２】
好ましい態様において、配列の類似性、同一性、相同性または相補性は、比較のために使われる関連配列の全長に対して判断される。
【００８３】
変異体および誘導体
本明細書に記述されるアミノ酸配列に関して「変異体」または「誘導体」という用語は、配列からのまたは配列への１つ（または複数）のアミノ酸の任意の置換、変異、改変、交換、欠失または付加を含む。好ましくは、得られるアミノ酸配列は、未改変配列と実質的に同じ活性を保持し、配列表に示されるｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６およびｃｇＲｅｑｕｉｅｍポリペプチドと少なくとも同じ活性を有することが好ましい。したがって、配列の重要な特徴、すなわち、それらが１つまたは複数のアポトーシス過程を変化させることが可能なことは、保持されるのが好ましい。
【００８４】
実施例に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはその断片もしくはホモログは、本明細書に記述される方法および組成物で用いるために改変することができる。典型的には、配列の生物学的活性を維持する改変がなされる。アミノ酸置換は、改変配列が未改変配列の生物学的活性を保持するという条件で、例えば１、２または３から１０、２０または３０個の置換までなされうる。アミノ酸置換は、例えば治療的に投与されるポリペプチドの血漿中半減期を増大させるため、非天然の類似体の使用を含むことができる。
【００８５】
ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６およびｃｇＲｅｑｕｉｅｍの天然変異体は、同類アミノ酸置換を含む可能性が高い。同類置換は、例えば下記表によって定義することができる。第２カラム内の同一ブロック中のおよび好ましくは第３カラム内の同一列中のアミノ酸を相互に置換することができる：
2008526200.tif 000003
断片
本明細書に開示されかつマーカーとして有用なポリペプチドは同様に、配列表に示される配列の断片をはじめとする、上記の完全長のポリペプチドおよびその変異体の断片を含む。
【００８６】
ポリペプチドは同様に、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６およびｃｇＲｅｑｕｉｅｍポリペプチドのいずれかの完全長配列の断片を含む。好ましくは、断片は少なくとも１つのエピトープを含む。エピトープを同定する方法は、当技術分野において周知である。断片は、典型的には、少なくとも６アミノ酸、より好ましくは少なくとも１０、２０、３０、５０または１００アミノ酸を含むであろう。
【００８７】
ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍアミノ酸配列由来の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５もしくは１５０、またはそれ以上の残基を含む、好ましくはそれらの残基からなる断片が含まれる。
【００８８】
ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６およびｃｇＲｅｑｕｉｅｍタンパク質ならびにその対立遺伝子変異体および種変異体のポリペプチド断片は、同類置換を含めて、１つまたは複数（例えば、５、１０、１５、または２０）の置換、欠失または挿入を含むことができる。置換、欠失および／または挿入が、例えば、異なる種で起こる場合、配列表に描かれるアミノ酸残基の５０％、４０％または２０％未満が改変されることが好ましい。
【００８９】
ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６およびｃｇＲｅｑｕｉｅｍ、ならびにその断片、ホモログ、変異体および誘導体は、組換え手段によって作出することができる。しかしながら、それらは同様に、固相合成などの当業者に周知の技術を用いた合成手段によって作出することができる。それらのタンパク質を、例えば、抽出および精製を補助するため、融合タンパク質として生成することもできる。融合タンパク質パートナーの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６×Ｈｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合ドメインおよび／または転写活性化ドメイン）およびβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。融合タンパク質パートナーと対象となるタンパク質配列との間にタンパク質分解的切断部位を含めて、融合タンパク質配列の除去を可能にすることも好都合でありうる。融合タンパク質は、対象とする配列のタンパク質の機能を妨げないことが好ましいであろう。タンパク質は、動物細胞からの細胞抽出物の精製によって得ることもできる。
【００９０】
本明細書に開示されるｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６およびｃｇＲｅｑｕｉｅｍのポリペプチド、変異体、ホモログ、断片および誘導体は、実質的に単離された形態であってよい。そのようなポリペプチドは、タンパク質の所期の目的を妨害することのない担体または希釈剤と混合されてもよく、それでもなお、実質的に単離されたと見なされることが理解されるであろう。ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍの変異体、ホモログ、断片または誘導体は、実質的に精製された形態であってもよく、この場合には、それは一般に、調製物中の９０％を超える、例えば、９５％、９８％または９９％のタンパク質が１種のタンパク質である調製物中のタンパク質を含むであろう。
【００９１】
本明細書に開示されるｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６およびｃｇＲｅｑｕｉｅｍのポリペプチド、変異体、ホモログ、断片および誘導体は、明示的な標識で標識することができる。明示的な標識は、ポリペプチドなどが検出されることを可能にする任意の適当な標識とすることができる。適当な標識は、放射性同位体、例えば、１２５Ｉ、酵素、抗体、ポリヌクレオチドおよびビオチンなどのリンカーを含む。標識されたポリペプチドを免疫アッセイなどの診断的方法に用いて、サンプル中のポリペプチドの量を判定することができる。ポリペプチドまたは標識されたポリペプチドは、標準的なプロトコルを用いた動物およびヒトでのそのポリペプチドに対する免疫反応性の検出のため血清学的なまたは細胞を介した免疫アッセイで用いることもできる。
【００９２】
任意により標識されてもよい、本明細書に開示されるｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６およびｃｇＲｅｑｕｉｅｍのポリペプチド、変異体、ホモログ、断片および誘導体は同様に、固相、例えば免疫アッセイウェルまたは浸漬試験紙（dipstick）の表面に固定することができる。そのような標識されたおよび／または固定化されたポリペプチドは、適当な試薬、対照、使用説明書などと一緒に、適当な容器に入れてキットの中に包装することができる。そのようなポリペプチドおよびキットは、免疫アッセイによるポリペプチドまたはその対立遺伝子変異体もしくは種変異体に対する抗体の検出方法で用いることができる。
【００９３】
免疫アッセイ法は当技術分野において周知であり、一般的に、（ａ）タンパク質に対する抗体によって結合可能なエピトープを含むポリペプチドを用意するステップ；（ｂ）生物学的サンプルをそのポリペプチドと、抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件の下でインキュベートするステップ；および（ｃ）そのポリペプチドを含む抗体−抗原複合体が形成されるかどうかを判定するステップを含むであろう。
【００９４】
本明細書に開示されるｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６およびｃｇＲｅｑｕｉｅｍのポリペプチド、変異体、ホモログ、断片および誘導体をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの細胞培養系で用いて、疾患でのそれらの機能を含めた、細胞機能でのそれらの対応遺伝子およびそのホモログの役割を研究することができる。例えば、切断されたかまたは改変されたポリペプチドを細胞に導入して、細胞内で行われる正常な機能を破壊することができる。ポリペプチドは組換え発現ベクターからのポリペプチドのｉｎ ｓｉｔｕ発現によって、細胞に導入することができる（以下参照）。発現ベクターは、任意によりポリペプチドの発現を制御するための誘導性プロモーターを保有してもよい。
【００９５】
昆虫細胞または哺乳動物細胞などの、適切な宿主細胞の使用は、組換え発現産物に最適な生物活性を与えるのに必要とされうるような翻訳後修飾（例えば、ミリスチン化(myristolation)、糖化、切断、脂質化(lapidation)およびチロシン、セリンまたはトレオニンリン酸化）をもたらすと期待される。本明細書に開示されるｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６およびｃｇＲｅｑｕｉｅｍのポリペプチド、変異体、ホモログ、断片および誘導体が発現されるそのような細胞培養系をアッセイ系で用いて、細胞でのポリペプチドの機能を妨害するかまたは増強する候補物質を同定することができる。
【００９６】
ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６およびｃｇＲｅｑｕｉｅｍ核酸
本発明者らは全体として、いくつかのｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６およびｃｇＲｅｑｕｉｅｍ核酸を、その断片、ホモログ、変異体および誘導体とともに提供する。これらの核酸配列は、本明細書に、および特に配列表に開示されるポリペプチド配列をコードすることが好ましい。
【００９７】
好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群よりそれぞれ選択されることが好ましい、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６およびｃｇＲｅｑｕｉｅｍ核酸を含む。
【００９８】
具体的には、本発明者らは、本明細書に開示されるチャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）のポリペプチドのいずれかをコードする核酸またはポリヌクレオチドを提供する。したがって、「ｃｇＦＡＤＤ配列」、「ｃｇＦＡＩＭ配列」、「ｃｇＰＤＣＤ６配列」および「ｃｇＲｅｑｕｉｅｍ配列」という用語は、それ相応に解釈されるべきである。しかしながら、好ましくは、そのような核酸またはポリヌクレオチドは、配列番号５〜１６ならびに配列番号３７、３８、３９および４０として示される配列のいずれか、または対応するポリペプチドのいずれかをコードする配列、およびそのような核酸の断片、ホモログ、変異体または誘導体を含む。それ故、上記の用語は、好ましくは、これらの配列を指すものと解釈されるべきである。
【００９９】
本明細書において用いられる「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および核酸という用語は、相互に同義であることが意図される。「ポリヌクレオチド」は、通常、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをいい、これらは未修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであってもよい。「ポリヌクレオチド」には、非限定的に、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくは、より典型的には、二本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合物であってよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれる。さらに、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域をいう。ポリヌクレオチドという用語は同様に、１つまたは複数の修飾塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡおよび安定性のためにまたはその他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡを含む。「修飾」塩基は、例えば、トリチル化塩基およびイノシンなどの普通でない塩基を含む。様々な修飾がＤＮＡおよびＲＮＡになされており、すなわち、「ポリヌクレオチド」は、自然界において典型的に見られるように化学的に、酵素的にまたは代謝的に修飾されたポリヌクレオチド形態、ならびにウイルスおよび細胞に特有なＲＮＡおよびＤＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」は同様に、多くの場合、オリゴヌクレオチドと称される、比較的短いポリヌクレオチドを包含する。
【０１００】
多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が、遺伝コードの縮重の結果として同一のポリペプチドをコードできることを当業者は理解するであろう。さらに、当業者は、日常的な技術を利用し、ポリペプチドが発現されることになる任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映させるよう、本明細書に記述されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を与えないヌクレオチド置換をなしうることが理解されるべきである。
【０１０１】
変異体、誘導体およびホモログ
本明細書に記述されるポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むことができる。それらは一本鎖または二本鎖とすることができる。それらは同様に、その内部に合成または修飾ヌクレオチドを含んだポリヌクレオチドとすることができる。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なるタイプの修飾は、当技術分野において公知である。これらはメチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、分子の３’および／または５’末端でのアクリジンまたはポリリジン鎖の付加を含む。本明細書の目的で、本明細書において記述されるポリヌクレオチドは、当技術分野において利用可能な任意の方法により修飾できることが理解されるべきである。そのような修飾は、ポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏでの活性または寿命を増強するために行うことができる。
【０１０２】
ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、二重鎖の両鎖は、個別的にまたは組み合わせで、本明細書に記述される方法および組成物によって包含される。ポリヌクレオチドが一本鎖である場合、そのポリヌクレオチドの相補配列も含まれることが理解されるべきである。
【０１０３】
ヌクレオチド配列に関して「変異体」、「ホモログ」または「誘導体」という用語は、配列からのまたは配列への１つ（または複数）のヌクレオチドの任意の置換、変異、改変、交換、欠失または付加を含む。好ましくは、得られる配列は、アポトーシスメディエーター活性を有するポリペプチドをコードすることができる。
【０１０４】
上記に示されるように、配列同一性に関して、「ホモログ」は、配列表に示される対応する配列に対し少なくとも５％の同一性、少なくとも１０％の同一性、少なくとも１５％の同一性、少なくとも２０％の同一性、少なくとも２５％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも３５％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも４５％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも５５％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有することが好ましい。
【０１０５】
少なくとも９５％の同一性、より好ましくは少なくとも９６％の同一性、より好ましくは少なくとも９７％の同一性、より好ましくは少なくとも９８％の同一性、より好ましくは少なくとも９９％の同一性が存在することがより好ましい。ヌクレオチド相同性比較は、前述のように行うことができる。好ましい配列比較プログラムは、前述のＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムである。デフォルトのスコアリングマトリックスは、各同一のヌクレオチドに対し１０および各ミスマッチに対し−９の適合値を有する。デフォルトのギャップ作製ペナルティは−５０であり、デフォルトのギャップ伸長ペナルティは各ヌクレオチドに対し−３である。
【０１０６】
好ましい実施形態において、ｃｇＦＡＩＭポリヌクレオチドは、配列番号５として示される配列に対し少なくとも９０％またはそれ以上の配列同一性を有する。好ましくは、ｃｇＦＡＩＭポリヌクレオチドは、配列番号５として示される配列に対し９１％もしくはそれ以上、好ましくは９２％もしくはそれ以上、９３％もしくはそれ以上、９４％もしくはそれ以上、９５％もしくはそれ以上、９６％もしくはそれ以上、９７％もしくはそれ以上、９８％もしくはそれ以上、９９％もしくはそれ以上または９９．５％もしくはそれ以上の配列同一性を有する。
【０１０７】
同様に、好ましい実施形態において、ｃｇＦＡＤＤ配列は、配列番号６として示される配列に対し少なくとも９０％の配列同一性を有する。好ましくは、ｃｇＦＡＤＤポリヌクレオチドは、配列番号６として示される配列に対し９１％もしくはそれ以上、好ましくは９２％もしくはそれ以上、９３％もしくはそれ以上、９４％もしくはそれ以上、９５％もしくはそれ以上、９６％もしくはそれ以上、９７％もしくはそれ以上、９８％もしくはそれ以上、９９％もしくはそれ以上または９９．５％もしくはそれ以上の配列同一性を有する。
【０１０８】
好ましい実施形態において、ｃｇＰＤＣＤ６配列は、配列番号７として示される配列に対し少なくとも９３％またはそれ以上の配列同一性を有する。好ましくは、ｃｇＰＤＣＤ６ポリヌクレオチドは、配列番号７として示される配列に対し９４％もしくはそれ以上、９５％もしくはそれ以上、９６％もしくはそれ以上、９７％もしくはそれ以上、９８％もしくはそれ以上、９９％もしくはそれ以上または９９．５％もしくはそれ以上の配列同一性を有する。
【０１０９】
好ましい実施形態において、ｃｇＲｅｑｕｉｅｍポリヌクレオチドは、配列番号５として示される配列に対し少なくとも９０％またはそれ以上の配列同一性を有する。好ましくは、ｃｇＲｅｑｕｉｅｍポリヌクレオチドは、配列番号８として示される配列に対し９０％もしくはそれ以上、好ましくは９１％もしくはそれ以上、９２％もしくはそれ以上、９３％もしくはそれ以上、９４％もしくはそれ以上、９５％もしくはそれ以上、９６％もしくはそれ以上、９７％もしくはそれ以上、９８％もしくはそれ以上、９９％もしくはそれ以上または９９．５％もしくはそれ以上の配列同一性を有する。
【０１１０】
ハイブリダイゼーション
本発明者らはさらに、本明細書において示されている配列のいずれか、またはその任意の変異体、断片もしくは誘導体に、あるいは前記のいずれかの相補体に選択的にハイブリダイズすることが可能なｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６およびｃｇＲｅｑｕｉｅｍヌクレオチド配列について記述する。ヌクレオチド配列は、好ましくは長さが少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは長さが少なくとも２０、３０、４０または５０ヌクレオチドである。
【０１１１】
本明細書において用いられる「ハイブリダイゼーション」という用語は、「核酸の鎖が塩基対合を通じて相補鎖と結び付く過程」およびポリメラーゼ連鎖反応技術で実行されるような増幅の過程を含むものとする。
【０１１２】
本明細書において示されているヌクレオチド配列に、またはその相補体に選択的にハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドは、通常、少なくとも２０、好ましくは少なくとも２５または３０、例えば少なくとも４０、６０もしくは１００またはそれ以上の連続ヌクレオチドの領域にわたり、本明細書において示されている対応ヌクレオチド配列に対し少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％およびより好ましくは少なくとも９５％または９８％相同であろう。
【０１１３】
「選択的にハイブリダイズ可能な」という用語は、プローブとして用いるポリヌクレオチドを、標的のポリヌクレオチドがバックグラウンドを有意に上回るレベルでプローブにハイブリダイズすることが認められる条件の下で、使用することを意味する。バックグラウンドのハイブリダイゼーションは、例えば、スクリーニングされているｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーの中に存在するその他のポリヌクレオチドについて起こりうる。この場合、バックグラウンドは、プローブとライブラリーの非特異的なＤＮＡメンバーとの間の相互作用によって生じるシグナルのレベルであって、これが標的ＤＮＡとで観測される特異的な相互作用の１０倍未満、好ましくは１００倍未満の強度であることを意味する。相互作用の強度は、例えば、プローブを、例えば３２Ｐで放射能標識することによって測定することができる。
【０１１４】
ハイブリダイゼーション条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA)に教示されているように、核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づいており、以下に説明されるように規定の「ストリンジェンシー」を与える。
【０１１５】
最大のストリンジェンシーは、典型的には、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍよりも５℃低い）で行われ、高度のストリンジェンシーはＴｍの約５℃〜１０℃より低い温度で行われ、中度のストリンジェンシーはＴｍの約１０℃〜２０℃より低い温度で行われ、および低度のストリンジェンシーはＴｍの約２０℃〜２５℃より低い温度で行われる。当業者には明らかなように、最大のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションを用いて同一のポリヌクレオチド配列を同定するかまたは検出することができ、その一方、中度（または低度）のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションを用いて類似のまたは関連のポリヌクレオチド配列を同定するかまたは検出することができる。
【０１１６】
好ましい実施形態において、本発明者らは、ストリンジェントな条件（例えば、６５℃および０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸三ナトリウムｐＨ７．０｝）の下でｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍ核酸、またはその断片、ホモログ、変異体もしくは誘導体にハイブリダイズできるヌクレオチド配列を開示する。
【０１１７】
ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、二重鎖の両鎖は、個別的にまたは組み合わせで、本開示によって包含される。ポリヌクレオチドが一本鎖である場合、そのポリヌクレオチドの相補配列も開示され包含されることが理解されるべきである。
【０１１８】
本明細書に開示される配列に１００％相同ではないが、開示の範囲に入るポリヌクレオチドは、いくつかの方法で得ることができる。本明細書において記述される配列のその他の変異体は、例えば、一連の個体、例えば異なる集団由来の個体から作製されたＤＮＡライブラリーをプローブすることによって得ることができる。さらに、その他のウイルスの／細菌のホモログ、または細胞のホモログ、特に哺乳動物細胞（例えば、ラット、マウス、ウシおよび霊長類細胞）で見られる細胞のホモログを得ることができ、そのようなホモログおよびその断片は、一般に、本明細書において配列表に示される配列に選択的にハイブリダイズすることが可能であろう。そのような配列は、その他の動物種から作製されたｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーをプローブすることにより、およびそのようなライブラリーを、中度から高度のストリンジェンシーの条件の下で配列番号１〜４０の全部または一部を含むプローブでプローブすることにより得ることができる。同様の検討がｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６およびｃｇＲｅｑｕｉｅｍの種ホモログおよび対立遺伝子変異体を得るのに当てはまる。
【０１１９】
本明細書に記述されるポリヌクレオチドを用いてプライマー、例えばＰＣＲプライマー、選択的な増幅反応用のプライマー、放射性標識もしくは非放射性標識を利用し従来の手段によって明示的な標識で例えば標識された、プローブを生成してもよく、またはそれらのポリヌクレオチドをベクターにクローニングしてもよい。そのようなプライマー、プローブおよびその他の断片は、長さが少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、例えば少なくとも２５、３０または４０ヌクレオチドとなるはずであり、本明細書において用いられるポリヌクレオチドという用語によって同様に包含される。好ましい断片は、長さが５００、２００、１００、５０または２０ヌクレオチド未満である。
【０１２０】
ＤＮＡポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドおよびプローブは、組換え的に、合成的に、または当業者が利用可能な任意の手段により生成することができる。それらは同様に、標準的な技術によりクローニングすることができる。
【０１２１】
一般に、プライマーは、一度に１ヌクレオチドずつの所望の核酸配列の段階的製造を含む、合成手段によって生成されよう。自動化技術を用いてこれを達成するための技術は、当技術分野において容易に利用可能である。
【０１２２】
より長いポリヌクレオチドは一般に、組換え手段を用いて、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を用いて生成されよう。これには、クローニングすることが望まれる配列の領域に隣接する（例えば、約１５〜３０ヌクレオチドの）プライマーの対を作出するステップ、プライマーを動物またはヒト細胞から得られたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと接触させるステップ、所望の領域の増幅をもたらす条件の下でポリメラーゼ連鎖反応を行うステップ、増幅された断片を単離するステップ（例えば、反応混合物をアガロースゲル上で精製することにより）および増幅されたＤＮＡを回収するステップが含まれよう。プライマーは、増幅されたＤＮＡを適当なクローニングベクターにクローニングできるよう適当な制限酵素認識部位を含むようにデザインすることができる。
【０１２３】
ＣＧ配列の使用
実施例に示されるように、本発明者らは、これらの４種の遺伝子が細胞中でのアポトーシスの仲介に関与していることを証明した。
【０１２４】
本発明者らは同様に、そのような遺伝子の、その活性の調節による標的化がアポトーシスの低下をもたらし、それ故に、細胞生存率の改善をもたらすことを明らかにする。それらの遺伝子およびポリペプチドならびにその生成物は故に、いくつかの分野で、例えば細胞培養で有用性を有する。
【０１２５】
すなわち、米国特許第６，５８６，２０６号では、培養宿主細胞を用いた組換えタンパク質の生成でのアポトーシス阻害剤の使用、その結果、所望のタンパク質の回収量向上の効果について記述している。したがって、チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）ＦＡＩＭ、ＦＡＤＤ、ＰＤＣＤ６およびＲｅｑｕｉｅｍ配列の開示によって、細胞培養でのこれらの遺伝子の標的化は、細胞生存率を上昇させ、組換えタンパク質生成の回収量上昇を促進させることができる。具体的には、本発明者らが本明細書に記述するｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６およびｃｇＲｅｑｕｉｅｍ改変細胞、好ましくはチャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）細胞、より好ましくはチャイニーズハムスター卵巣細胞を回収量の改善された組換えタンパク質の生成のために適当に利用することができる。
【０１２６】
ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６およびｃｇＲｅｑｕｉｅｍ改変細胞
本明細書に記述される方法および組成物によれば、細胞でのｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６およびｃｇＲｅｑｕｉｅｍのいずれかの１つまたは複数の調節により、個体群、好ましくはチャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）個体群の細胞生存率が改善される。具体的には、本発明者らは、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍの発現の低下、ならびにｃｇＦＡＩＭの発現の増大が細胞生存率の改善を引き起こすことを実施例のなかで明らかにする。
【０１２７】
しかしながら、アゴニストおよびアンタゴニストなどのモジュレータ実体の使用を含む、これらの遺伝子のいずれかの制御の方法をポリペプチド発現の調節に加えて、またはこれに代わる手段として利用できることを理解されたい。
【０１２８】
これらの遺伝子のいずれかの１つまたは複数の発現が調節される細胞は、便宜上「改変」細胞と称されるが、これらはそれ自体が物理的に改変されなくてもよく、しかし改変された細胞の子孫であってもよいことを理解されたい。本発明者らは具体的には、ｃｇＦＡＩＭ発現がアップレギュレートされる細胞を提供し、ならびにｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／もしくはｃｇＲｅｑｕｉｅｍ、またはその任意の組み合わせの発現がダウンレギュレートされる細胞を提供する。すなわち、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６およびｃｇＲｅｑｕｉｅｍの１つ、２つ、３つ、または４つ全ての発現が改変細胞で改変されうることを理解されたい。改変は一過性であってもよく、あるいはそれは改変の様式に応じて、永続性または長期であってもよい。
【０１２９】
改変細胞は、哺乳動物細胞、好ましくはチャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）細胞、最も好ましくはＣＨＯ細胞を含むことができる。それらは、齧歯類細胞、好ましくはマウスまたはラット細胞を含むことができる。好ましくは、そのような改変細胞は、チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）細胞、最も好ましくはＣＨＯ細胞を含む。しかしながら、それらはサル細胞またはヒト細胞などの、霊長類細胞を含むことができる。
【０１３０】
対応する細胞が、当技術分野において公知の任意の手段により、対応する遺伝子を標的化することによって改変されてもよい。
【０１３１】
考えられる手法の１つは、遺伝子機能を阻害するためおよび対応するポリペプチドの発現を阻止するため、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍに対して作製されたアンチセンス構築物を発現することである。別の手法は、細胞死機構の細胞成分に関して内因性の遺伝子産物と競合し、その結果、機能の阻害を引き起こす、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍポリペプチドの非機能的な変異体を使用することである。あるいは、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍポリペプチドに結合することが前述のアッセイによって明らかにされた化合物を細胞に投与して、そのポリペプチドの機能を阻止することができる。これは、例えば、組換えＤＮＡ技術を用いてまたは化合物の直接投与によって行うことができる。ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍに対して作製された適当な抗体を作用物質として使用することもできる。
【０１３２】
または、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡは、一連の生物での遺伝子発現を妨げる効果的な方法であり、これは哺乳動物で成功することが最近になって明らかにされている（Wianny and Zernicka-Goetz, 2000, Nat Cell Biol 2000, 2, 70-75）。ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍポリヌクレオチドの配列に対応する二本鎖ＲＮＡを細胞もしくは細胞株に導入するかまたは細胞もしくは細胞株で発現させるかして、細胞生存率を上昇させることができる。
【０１３３】
具体的には、本発明者らは、一本鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用および発現の低下が望まれるドミナントネガティブ突然変異体の使用による改変について記述する。本発明者らはさらに、関連遺伝子の発現を増大させるために関連配列の過剰発現を可能にするベクターの使用について記述する。改変は一過性であってもよく、またはそれは永続性であってもよい。このように、本発明者らは、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍにおけるゲノムのおよび遺伝性の改変を有する細胞を含む細胞株を提供する。そのような細胞株を樹立するための詳細なプロトコルは、実施例に記載されている。
【０１３４】
改変細胞は単一の細胞、細胞の群、クローン、クローン系統、コロニー、細胞株または組織として提供されうる。本発明者らはさらに、ダウンレギュレートされたｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／もしくはｃｇＲｅｑｕｉｅｍの発現、またはアップレギュレートされたｃｇＦＡＤＤの発現、あるいはその両方を細胞が含む、トランスジェニック動物を提供する。
【０１３５】
好ましくは、ドミナント突然変異体は、配列番号９に示される配列を含んだｃｇＦＡＤＤドミナント突然変異体を含む。あるいは、またはさらに、配列は以下を含むことができる：
2008526200.tif 000004
ドミナント突然変異体は、配列番号１０に示される配列、またはあるいは、
2008526200.tif 000005
によってコードすることができる。
【０１３６】
細胞生存率の増大
改変細胞は、同系の非改変細胞、または野生型細胞、またはそれらが由来する親細胞と比較した場合にいくつかの有益な特性を有する。それらは、細胞生存率が改善しているという特性を有することができる。すなわち、それらは時間または世代数という点で、培養においていっそう長く生存することができる。
【０１３７】
好ましくは、細胞生存率は、すなわちｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６およびｃｇＲｅｑｕｉｅｍを標的化することによって改変された細胞の集団の生存細胞密度を定量化することによって測定される。好ましくは、改変細胞は、改変されていない細胞（例えば、対照の集団）に比べて、いっそう高い細胞生存率を維持する。細胞生存率は当該細胞集団での生存可能な細胞の割合として測定されることが好ましい。
【０１３８】
好ましい態様において、細胞生存率は「トリパンブルー排除による生存率アッセイ」によって判定される。このアッセイは、細胞培養の分野において細胞生存率の判定によく使われている。詳細なプロトコルは実施例に記載されているが、手短には、細胞懸濁液を０．４％トリパンブルーのリン酸緩衝液と混合し、血球計を用いて計測する。生存細胞は円形かつ青色色素の着色がなく屈折性に見えるのに対し、死細胞は色素を吸収し、青色に見える。その結果、生存率は、計測された全細胞に対する生存細胞の割合として表現される。
【０１３９】
生存細胞は、トリパンブルー排除による生存率アッセイにおいて、膜完全性がトリパンブルーの吸収を依然として阻止できる細胞と定義される。
【０１４０】
好ましくは、改変細胞は対照の集団に比べて少なくとも５％、好ましくは１０％またはそれ以上、より好ましくは１５％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上の生存細胞を有する。あるいは、またはさらに、改変細胞は、改変されていない細胞に比べていっそう長い時間、細胞生存率を維持する。例えば、改変細胞は対照細胞に比べて、いっそう長い期間ある割合の細胞生存率（例えば、９５％）を維持することができる。
【０１４１】
好ましくは、改変細胞は対照細胞に比べて、少なくとも１時間、より好ましくは少なくとも６時間、最も好ましくは少なくとも１２時間またはそれ以上、例えば、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間または少なくとも４８時間、延長された細胞生存率を有する。非常に好ましい態様において、改変細胞は対照細胞に比べて、生存率が９５％を下回り始める前に少なくとも２４時間、延長された生存率を有する。
【０１４２】
改変細胞は未改変の対照細胞に比べていっそう高い、生存培養密度の能力があることが好ましい。好ましくは、改変細胞は対照細胞に比べて１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％またはそれより高い生存細胞密度の能力がある。例えば、改変細胞は、細胞９．６×１０６個／ｍｌもの高い密度を達成することができる。
【０１４３】
改変細胞は、アポトーシスマーカー、好ましくはカスパーゼ２、カスパーゼ３またはカスパーゼ８の発現開始の遅延を示すことが好ましい。改変細胞は、個々の細胞に対するいっそう長い生存時間、またはアポトーシスを示す細胞の数という点で、アポトーシスの低減を示すという特性を有することができる。好ましくは、それらはアポトーシスに耐性であるという特性を有する（以下参照）。
【０１４４】
タンパク質回収量の増大
好都合には、改変細胞では、実施例２１で実証されるように、未改変の対照細胞に比べてタンパク質回収量の増大、好ましくは組換え発現されたタンパク質回収量の増大が可能である。好ましくは、改変細胞では、対照細胞に比べて１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％またはそれ以上のさらなる高収率が可能である。より好ましくは、改変細胞では対照細胞に比べて２．５倍、３倍、５倍、１０倍またはそれ以上のさらに高収率が可能である。好ましくは、組換え発現されたタンパク質は、インターフェロンγを含む。本発明者らはそれ故、記載したような改変細胞において、組換えタンパク質、好ましくはバイオ療法分子を発現させる方法を提供する。
【０１４５】
改変細胞はバッチ培養、フェドバッチ培養または好ましくはその両方においてその特性のいずれかの１つまたは複数を示すことが好ましい。
【０１４６】
糖化の増大
改変細胞は同様に、対照の未改変細胞に比べて発現タンパク質の糖化増大の能力があることが好ましい。実施例では、細胞培養物の生存性の喪失が起こったか否かにかかわらず、改変細胞が長期の細胞培養時間にわたってタンパク質糖化を維持できることが明らかにされる。非常に好ましい態様において、糖化はシアル化を含む。
【０１４７】
より低度のシアル化では、タンパク質に基づく薬物のｉｎ ｖｉｖｏ半減期が短縮することがあるので、改変細胞株のこの特徴はバイオ療法薬の製造において特に好都合である（Varki, 1993, Biotechnol Bioeng 43:423-428; Gramer et al., 1995, Glycobiology 3:97-130）。
【０１４８】
好ましい実施形態において、発現タンパク質の糖化は、実質的に細胞培養の１つまたは複数の増殖期を通じて、好ましくは少なくとも対数増殖期の部分を通じて（好ましくは少なくとも対数増殖中期を通じて）維持されるが、より好ましくは同様に最大の生存細胞密度が起こる時点を通じて、より好ましくは同様に細胞死が親のまたは未改変の細胞で起こるようになる時点を通じて維持される。そのような場合、糖化のレベルは、それが親のまたは未改変の細胞で減少するようになるレベルで維持されることが好ましい。好ましい態様において、糖化は、発現タンパク質１モル当たり糖が少なくとも２．７、好ましくは少なくとも２．９モルのレベルで維持される。
【０１４９】
好ましい実施形態において、改変細胞による発現タンパク質の糖化は、親のまたは未改変の細胞に比べて、増殖期における同種の時点で増大する。そのような好ましい実施形態において、糖化は、発現タンパク質１モル当たり糖が少なくとも２．９、好ましくは少なくとも３、３．１、３．２、３．３、３．４または３．５モルのレベルで達成されることができる。
【０１５０】
本発明者らはさらに、記載された改変細胞を用いて作出された、糖化の増大、好ましくはシアル化の増大を有する組換えタンパク質を提供する。そのようなポリペプチドは、そのように改変されていない細胞から生成可能なポリペプチドに比べて、シアル化の増大を有する。好ましくは、糖化またはシアル化は、２．９モルシアル酸／モル生成ポリペプチド、好ましくは約３．５モルシアル酸／モル生成ポリペプチドより多い。非常に好ましい実施形態において、発現タンパク質はインターフェロンγを含む。
【０１５１】
本発明者らはさらに、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍの細胞発現を調節することによって、上記の特性のいずれかの１つまたは複数を示すよう細胞を改変する方法を提供する。
【０１５２】
アポトーシス
本発明によれば、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍ改変細胞の細胞生存率の増大は、改変された細胞集団におけるアポトーシスの減少から生じる。そのような改変細胞は、アポトーシスの低下を示してもよく、またはアポトーシスに耐性であってもよい。改変細胞は対照細胞に比べて、好ましくはいっそう長い時間、いっそう高い生存細胞密度を維持できることが好ましい。好ましくは、改変された集団内の生存細胞の数は未改変の対照集団に比べていっそう高く、例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、２００％、５００％、またはそれ以上である。
【０１５３】
好ましくは、改変細胞は対照細胞に比べて少なくとも６時間、少なくとも１２時間、好ましくは少なくとも１８時間、および最も好ましくは少なくとも２４時間、生存率の延長を示す。非常に好ましい実施形態において、カスパーゼ２および／またはカスパーゼ３および／またはカスパーゼ８の発現が、対照細胞に比べてそのような時間だけ遅延される。
【０１５４】
したがって、好ましくは、改変された細胞集団におけるアポトーシスは、対照集団に比べて少なくとも１０％、好ましくは２５％またはそれ以上、より好ましくは４０％、５０％、７５％、９５％またはそれ以上減少する。好ましい実施形態において、改変された細胞集団におけるアポトーシス細胞の割合は、そのような量だけ減少する。非常に好ましい実施形態において、改変細胞はアポトーシスに耐性であり、すなわち、顕著なアポトーシスをほとんどまたは全く示さない。
【０１５５】
アポトーシスをアッセイする方法は当技術分野において公知であり、以下および実施例のなかで詳細に記述されている。アポトーシスをアッセイする好ましい方法は、「実施例１４  アポトーシスアッセイ」に記載されている。
【０１５６】
代替的なアポトーシスアッセイは、当該細胞でのカスパーゼ２、カスパーゼ３およびカスパーゼ８のいずれかの１つまたは複数のレベルの定量化または測定を含む。すなわち、好ましくは、これらのカスパーゼのいずれかの１つまたは複数のレベルは、そのように改変されていないものに比べて、改変された細胞または集団において１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上だけ減少する。好ましくは、改変細胞は、改変されていない対照細胞に比べて、好ましくは少なくとも１時間、より好ましくは少なくとも６時間、より好ましくは少なくとも１２時間またはそれ以上、例えば、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも１４４時間、少なくとも２８８時間、またはそれ以上の時間だけカスパーゼ２、カスパーゼ３およびカスパーゼ８のいずれかの１つまたは複数の発現の遅延を示す。カスパーゼレベルは、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡｓｅ保護、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫アッセイなどをはじめとする、当技術分野において公知の任意の手段によりアッセイすることができる。
【０１５７】
細胞死は２つの異なる機構、つまりネクローシスまたはアポトーシスのいずれかによって起こりうる。さらに、ある種の化学物質および細胞は、細胞にとって細胞傷害性である、すなわち、その死を引き起こすといわれている。
【０１５８】
「細胞傷害性」とは、化学物質（食品、化粧品、もしくは医薬品などの）またはメディエーター細胞（細胞傷害性Ｔ細胞）の殺細胞特性をいう。ネクローシスおよびアポトーシスとは対照的に、細胞傷害性という用語は、必ずしも特異的な細胞死機構を指すものではない。例えば、細胞介在性細胞傷害（すなわち、細胞傷害性Ｔリンパ球［ＣＴＬ］またはナチュラルキラー［ＮＫ］細胞のいずれかにより介在される細胞死）では、ネクローシスとアポトーシスの両方のいくつかの態様が組み合わされる。
【０１５９】
「ネクローシス」（「事故的な」細胞死とも称される）とは、細胞が重大な物理的または化学的傷害に曝露されたときに起こる病理学的過程をいう。ネクローシスは、形質膜に損傷を引き起こしうる生理学的条件（例えば、低体温、低酸素）由来の極端な変化に細胞が曝露されたときに起こる。生理学的条件の下での形質膜への直接的損傷は、補体および細胞溶解性ウイルスのような作用物質によって引き起こされる。ネクローシスは恒常性を維持する細胞の能力の機能障害から始まり、水および細胞外イオンの流入に至る。細胞内オルガネラ、最も顕著にはミトコンドリア、および細胞全体が膨潤し、破裂する（細胞溶解）。形質膜の最終的な破壊によって、リソソーム酵素を含む細胞質の内容物が細胞外液に放出される。それ故に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ネクローシス細胞死は、激しい炎症反応をもたらす広範な組織損傷と関連していることが多い。
【０１６０】
「アポトーシス」（「正常な」または「プログラムされた」細胞死）とは、不要なまたは無用な細胞が発生およびその他の正常な生物学的過程の間に除去される生理学的過程をいう。アポトーシスは、正常な生理学的条件の下で起こる細胞死の様式であり、細胞はそれ自体の消滅（「細胞の自殺」）において積極的な参加者となる。それは正常な細胞ターンオーバーおよび組織恒常性、胚形成、免疫寛容の誘導および維持、神経系の発達ならびに内分泌依存的な組織萎縮の間に見られることが最も多い。アポトーシスを起こしている細胞は、特有の形態学的および生化学的特徴を示す。これらの特徴には、クロマチン凝集、核および細胞質の凝縮、リボソーム、形態学的に無傷のミトコンドリアおよび核物質を含有する膜結合小胞（アポトーシス小体）への細胞質および核の分配が含まれる。ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、これらのアポトーシス小体は、マクロファージまたは隣接する上皮細胞のいずれかにより速やかに認識され貪食される。ｉｎ ｖｉｖｏでのアポトーシス細胞の除去に関するこの効率的な機構によって、炎症反応が誘発されることはない。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、アポトーシス小体および残存する細胞断片は、最終的に膨潤し、最後には溶解する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞死のこの最終相は「二次的なネクローシス」と呼ばれている。
【０１６１】
表１はネクローシスとアポトーシスとの間で観測可能な種々の相違を要約している。好ましくは、改変細胞はこれらの特徴の１つまたは複数の低下を示す。これらの相違のいずれかを、単独でまたは組み合わせで、細胞死がアポトーシスによりまたはネクローシスにより起こっているかどうかを判定するためにアッセイすることができる。
【表１】
2008526200.tif 000006
【０１６２】
以下の文献を参照されたい。それらはアポトーシスについて詳細に記述しているだけでなく、アポトーシスによる細胞死を測定するための様々なアッセイについても記述している：Schwartzman, R. A. and Cidlowski, J. A. (1993). Endocrine Rev. 14, 133; Vermes, I. and Haanan, C. (1994). Adv. Clin. Chem. 31, 177; Berke, G. (1991). Immunol. Today 12, 396; Krahenbuhl, O. and Tschopp, J. (1991). Immunol. Today12, 399; Van Furth, R. and Van Zwet, T. L. (1988). J. Immunol; Methods 108, 45. Cohen, J. J. (1993) Apoptosis. Immunol. Today14, 126; Savill, J. S. et al. (1989). J. Clin. Invest. 83, 865; Wyllie, A. H. (1980). Nature 284, 555; Leist, M. et al. (1994) Biochemica No. 3, 18-20; Fraser, A. and Evan, G. (1996) Cell 85, 781-784; Duke, R. C. (1983). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80,6361; Duke, R. C. & Cohen, J. J. (1986). Lymphokine Res. 5, 289; Trauth, B. C. et al. (1994) Eur. J. Cell. Biol. 63, 32, Suppl 40; Matzinger, P. (1991). J. Immunol; Methods 145, 185; Kaeck, M. R. (1993); Anal. Biochem. 208, 393; Prigent, P. et al. (1993). J. Immunol; Methods 160, 139; Huang, P. & Plunkett, W. (1992), Anal. Biochem. 207, 163; Bortner , C. D. et al. (1995) Trends Cell Biol. 5, 21; Gold, R. et al. (1994); Lab. Invest. 71, 219。
【０１６３】
アポトーシスおよび細胞介在性細胞傷害は、細胞膜が分解する前にゲノムＤＮＡが不連続断片へと切断されることによって特徴づけられる。したがって、アポトーシスはＤＮＡ断片化を測定することにより、例えば、ＤＮＡラダーの存在を観察することによりアッセイすることができる。ＤＮＡ断片は、例えば、細胞の集団に由来する「ラダー」として（ラダーの「段」として１８０ｂｐの倍数体とともに）、または、例えば、ＥＬＩＳＡを介したヒストン複合型ＤＮＡ断片の定量化によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、ヌクレオソームを検出する１ステップのサンドイッチ免疫アッセイに依る。その手順は、遠心分離により細胞をペレットにするステップおよび上清（これはインキュベーションの間に膜を通じて漏出したネクローシス細胞由来ＤＮＡを含有する）を捨てるステップを伴う。細胞を溶解緩衝液に再懸濁し、インキュベートする。溶解後、無傷の核を遠心分離によりペレットにする。上清の一定分量をマイクロタイタープレートのストレプトアビジン被覆ウェルに移し、上清中のヌクレオソームを２種のモノクローナル抗体、つまり抗ヒストン抗体（ビオチン標識）および抗ＤＮＡ抗体（ペルオキシダーゼ結合）と結合させる。抗体−ヌクレオソーム複合体は、ストレプトアビジンによってマイクロタイタープレートに結合する。固定化された抗体−ヒストン複合体を３回洗浄して、免疫反応性でない細胞成分を除去し、このサンプルをペルオキシダーゼ基質（ＡＢＴＳ(登録商標)）とインキュベートする。次いで、着色生成物の（すなわち、固定化された抗体−ヒストン複合体の）量を分光光度的に測定する。
【０１６４】
いくつかのプロテアーゼがアポトーシスの初期段階に関与している。アポトーシスはそれ故に、カスパーゼ、例えば、カスパーゼ３などのアポトーシス誘導プロテアーゼの活性をアッセイすることに加えて、またはそれに代えて、そのプロテアーゼの存在を検出することによってアッセイすることもできる。カスパーゼ活性化はさまざまな方法で、例えば、カスパーゼの捕捉と適当な基質のタンパク質分解的切断の測定によって、例えば、細胞溶解物のｉｎ ｖｉｔｒｏでの酵素アッセイによって分析することができる。さらに、カスパーゼはＰＡＲＰ（ポリ−ＡＤＰ−リボース−ポリメラーゼ）などのｉｎ ｖｉｖｏのカスパーゼ基質の切断の検出によってアッセイすることができる。切断されたＰＡＲＰ断片を抗ＰＡＲＰ抗体などの適当な抗体で検出することができる。プロテアーゼアッセイおよびＤＮＡ断片化アッセイは、細胞集団でのアポトーシスをアッセイするのに特に適している。
【０１６５】
ＩＳＮＴおよびＴＵＮＥＬ酵素標識化アッセイなどの、個々の細胞でのアポトーシスを研究する方法も利用可能である。上記のとおり、広範なＤＮＡ分解は特徴的な事象であり、これはアポトーシスの初期段階で起こることが多い。ＤＮＡの切断によって、二本鎖の低分子量ＤＮＡ断片（モノおよびオリゴヌクレオソーム）および高分子量ＤＮＡでは一本鎖切断（「ニック」）が生ずる。ＴＵＮＥＬでは、そのようなＤＮＡ鎖切断を、適当な修飾ヌクレオチド（例えば、Ｘ−ｄＵＴＰ、Ｘ＝ビオチン、ＤＩＧまたはフルオレセイン）を用いた遊離３’−ＯＨ末端の酵素標識化によって検出する。適当な標識化酵素としては、ＩＳＮＴ（「ｉｎ ｓｉｔｕニックトランスレーション」）ではＤＮＡポリメラーゼ（ニックトランスレーション）およびＴＵＮＥＬ（「ＴｄＴ仲介Ｘ−ｄＵＴＰニック末端ラベリング」; Huang, P. & Plunkett, W., 1992, Anal. Biochem. 207, 163; Bortner , C. D. et al., 1995, Trends Cell Biol. 5, 21）では末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（末端ラベリング）が挙げられる。
【０１６６】
アポトーシスは同様に、新たな糖残基を曝露させる、細胞表面糖タンパク質の側鎖からの末端シアル酸残基の喪失；トロンボスポンジンなどのマクロファージ分泌接着分子に対する受容体として機能しうる表面糖タンパク質の出現；および膜表面の疎水性と電荷の両方を変化させる、細胞膜リン脂質における非対称性の喪失を含め、膜変化を測定することによってアッセイすることができる。具体的には、ヒト抗凝固アネキシンＶは、ホスファチジルセリン（ＰＳ）に高い親和性を有する３５〜３６キロダルトンのＣａ２＋依存的なリン脂質結合タンパク質である。正常な生存細胞では、ＰＳは細胞膜の細胞質側表面に位置している。しかしながら、アポトーシス細胞では、ＰＳは形質膜の内側から外側に移行され、それによってＰＳを細胞外環境に曝露させる。それ故に、アネキシンＶを用いて、アポトーシス細胞の表面に非対称的に曝露されたホスファチジルセリンを検出することができる(Homburg, C. H. E. et al. 1995, Blood 85, 532; Verhoven, B. et al., 1995, J. Exp. Med. 182, 1597)。さらに、ＤＡＰＩ、エチジウムブロマイドおよびヨウ化プロピジウムなどのようなＤＮＡ染色を生存細胞と非生存細胞とを区別するための鑑別染色に用いることができる。ＤＮＡ含量のプロファイルを用いることもできる；すなわち、透過性アポトーシス細胞は低分子量ＤＮＡを漏出するので、「サブ−Ｇ１ピーク」、または「Ａ０」細胞（Ｇ１細胞のＤＮＡ染色よりも低いＤＮＡ染色を有する細胞）の検出を、例えば、フローサイトメトリーによって行うことができる。同様にしてアポトーシスに特徴的な形態学的変化を検出することもできる。
【０１６７】
抗体の使用によるｃｅｄ−３、ｃｅｄ−４、ｃｅｄ−９（Ellis, H. M. and Horvitz, H. R., 1986, Cell 44, 817-829; Yuan, J. Y. and Horvitz, H. R., 1990, Dev. Biol. 138, 33-41; Hentgartner, M. O., Ellis, R. E. and Horvitz, H. R., 1992, Nature 356, 494-499.）、Ｆａｓ（ＣＤ９５／Ａｐｏ−１；Enari et al., 1996, Nature 380, 723-726）、Ｂｃｌ−２（Baffy, G. et al., 1993, J. Biol. Chem. 268, 6511-6519; Miyashita, T. and Reed, J. C., 1993, Blood 81, 151-157; Oltvai, Z. N., Milliman, C. L. and Korsmeyer, S. J., 1993, Cell 74, 609-619）、ｐ５３（Yonish-Rouach, E. et al., 1991, Nature 352, 345-347）などのようなアポトーシス関連タンパク質の検出を利用して、アポトーシスをアッセイすることもできる。
【０１６８】
ヌクレオチドベクター
ポリヌクレオチドを組換え複製可能なベクターに導入することができる。このベクターを用いて、適合性の宿主細胞内で核酸を複製させることができる。すなわち、さらなる態様において、本発明者らは、ポリヌクレオチドを複製可能なベクターに導入し、ベクターを適合性の宿主細胞に導入し、ベクターの複製をもたらす条件の下で宿主細胞を増殖させることによってポリヌクレオチドを作製する方法を提供する。ベクターは宿主細胞から回収することができる。適当な宿主細胞としては、大腸菌（E. coli）などの細菌、酵母、哺乳動物細胞株およびその他の真核細胞株、例えば昆虫Ｓｆ９細胞が挙げられる。
【０１６９】
ベクター中のポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコード配列の発現をもたらすことができる制御配列に機能的に連結される、すなわち、ベクターは発現ベクターであることが好ましい。「機能的に連結された」という用語は、記述される成分が、それらをその意図する形で機能させることを可能にする関係にあることを意味する。コード配列に「機能的に連結された」調節配列は、制御配列と適合する条件の下でコード配列の発現が達成されるような方法でライゲーションされる。
【０１７０】
制御配列を、例えばさらなる転写調節エレメントの付加によって、制御配列により命令される転写のレベルを転写調節物質により強く応答するよう改変することができる。
【０１７１】
ベクターを下記のように適当な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトして、タンパク質の発現を供与することができる。この過程は、タンパク質をコードするコード配列の、ベクターによる発現をもたらす条件の下で、上記のように発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養するステップ、および任意により発現タンパク質を回収するステップを含むことができる。
【０１７２】
ベクターは、例えば、複製起点、任意により前記のポリヌクレオチドの発現用プロモーターおよび任意によりプロモーターのレギュレーターが備えられたプラスミドまたはウイルスベクターとすることができる。ベクターは１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子または哺乳動物ベクターの場合ネオマイシン耐性遺伝子を含むことができる。ベクターを用いて、例えば、宿主細胞にトランスフェクトまたは形質転換することができる。
【０１７３】
タンパク質をコードする配列に機能的に連結された制御配列としては、プロモーター／エンハンサーおよびその他の発現調節シグナルが挙げられる。これらの制御配列は、発現ベクターが使用されるようにデザインされている宿主細胞に適合するよう選択することができる。「プロモーター」という用語は、当技術分野において周知であり、サイズと複雑性が最小プロモーターから上流の要素およびエンハンサーを含むプロモーターに及ぶ核酸領域を包含する。
【０１７４】
プロモーターは、典型的には、哺乳動物細胞において機能的であるプロモーターから選択されるが、原核生物プロモーターおよびその他の真核細胞において機能的なプロモーターを用いてもよい。プロモーターは、典型的には、ウイルスのまたは真核生物の遺伝子のプロモーター配列に由来する。例えば、それは、発現が行われることになる細胞のゲノムに由来するプロモーターであってもよい。真核生物プロモーターに関して、それらは、全身的な形で機能するプロモーター（α−アクチン、β−アクチン、チュブリンのプロモーターなど）または、あるいは、組織特異的な形で機能するプロモーター（ピルビン酸キナーゼに対する遺伝子のプロモーターなど）であってもよい。それらは同様に、特異的な刺激に応答するプロモーター、例えばステロイドホルモン受容体に結合するプロモーターであってもよい。ウイルスプロモーター、例えばモロニーマウス白血病ウイルス末端反復配列（ＭＭＬＶ ＬＴＲ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーターまたはヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーターを用いてもよい。
【０１７５】
異種遺伝子の発現のレベルを細胞の寿命の間に調節できるように、プロモーターが誘導可能なことも好都合であるかもしれない。誘導可能とは、プロモーターを用いて得られる発現のレベルを調節できることを意味する。
【０１７６】
さらに、これらのプロモーターのいずれかをさらなる調節配列、例えばエンハンサー配列の付加により改変してもよい。上記の２つまたはそれ以上の異なるプロモーター由来の配列エレメントを含むキメラプロモーターを用いてもよい。
【０１７７】
ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６およびｃｇＲｅｑｕｉｅｍポリペプチドの発現
生物学的に活性なｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍポリペプチドを発現させるため、チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）ＦＡＩＭ、ＦＡＤＤ、ＰＤＣＤ６またはＲｅｑｕｉｅｍポリヌクレオチド配列を、調節配列と、そのポリヌクレオチドの発現を調節配列が命令するのを可能とするように結合させる。その後、調節配列の制御下にポリペプチドの発現が行われるようにできる。任意により、そのように生成されたポリペプチドは精製されてもよい。
【０１７８】
好ましくは、調節配列は、ＦＡＩＭ、ＦＡＤＤ、ＰＤＣＤ６またはＲｅｑｕｉｅｍポリヌクレオチド配列が天然には結び付いていないものである。
【０１７９】
本発明者らはそれ故に、チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）ＦＡＩＭ、ＦＡＤＤ、ＰＤＣＤ６またはＲｅｑｕｉｅｍポリヌクレオチド配列を、調節配列と、そのポリヌクレオチドの発現を調節配列が命令するのを可能とするように結合させた細胞、好ましくはチャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）細胞を用意するステップ、およびポリペプチドの発現を可能にする条件の下で細胞を培養するステップ、任意によりポリペプチドを精製するステップを含む、ポリペプチドを生成する方法について記述する。
【０１８０】
本発明者らはさらに、（ａ）チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）ＦＡＩＭ、ＦＡＤＤ、ＰＤＣＤ６またはＲｅｑｕｉｅｍポリヌクレオチド配列を、調節配列と、そのポリヌクレオチドの発現を調節配列が命令するのを可能とするように結合させることによって生成された発現配列を用意するステップ；（ｂ）調節配列の制御下に発現配列からのポリペプチドの発現を可能にするステップ、および（ｃ）任意によりポリペプチドを精製するステップを含む、ポリペプチドを生成する方法について記述する。
【０１８１】
具体的には、それぞれの核酸またはそのホモログ、変異体、もしくは誘導体をコードするヌクレオチド配列を適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入することができる。
【０１８２】
本発明者らは同様に、上記の方法のいずれかによって生成されたポリペプチドを提供する。
【０１８３】
ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６およびｃｇＲｅｑｕｉｅｍポリペプチドの発現を可能にする方法を以下に記載する。これらの方法は、ポリペプチドのアップレギュレーション、例えば、細胞生存率の上昇を達成するためにｃｇＦＡＤＤのアップレギュレーションが望まれる、本明細書に記述される方法および組成物の態様で用いるのに適しうることを理解されたい。
【０１８４】
発現ポリペプチドを提供するための１つの方法は、発現ベクター、すなわち、発現ベクターにクローニングされた対象となるポリペプチドをコードする配列に機能的に連結されている、任意によりエンハンサーなどのその他の調節配列とともに、調節可能なプロモーターを含有するベクター（例えば、プラスミド）を用いるものである。
【０１８５】
当業者に周知である方法を用いて、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６およびｃｇＲｅｑｕｉｅｍならびに適切な転写および翻訳制御エレメントをコードする配列を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換えを含む。そのような技術はＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（1989; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ch. 4, 8, and 16-17, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.）およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（1995および定期的追補版; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.）に記述されている。
【０１８６】
様々な発現ベクター／宿主系を利用して、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍをコードする配列を含有させ、発現させることができる。これらは、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）もしくはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））でまたは細菌発現ベクター（例えば、ＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは動物細胞系を含むが、これらに限定されることはない。任意の適当な宿主細胞を利用することができる。
【０１８７】
「制御エレメント」または「調節配列」は、転写および翻訳を実行するために宿主の細胞タンパク質と相互作用するベクターの非翻訳領域（すなわち、エンハンサー、プロモーター、ならびに５’および３’非翻訳領域）である。そのようなエレメントは、その強さおよび特異性が異なりうる。利用されるベクター系および宿主に応じて、構成性および誘導性プロモーターをはじめとする、任意の数の適当な転写および翻訳エレメントを使用することができる。例えば、細菌系にクローニングする場合、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Stratagene, La Jolla, Calif.）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（GIBCO/BRL）などのハイブリッドｌａｃＺプロモーターのような誘導性プロモーターを使用することができる。バキュロウイルス・ポリヘドリンプロモーターを昆虫細胞で使用することができる。植物細胞のゲノムに由来するプロモーターもしくはエンハンサー（例えば、熱ショック、ＲＵＢＩＳＣＯ、および貯蔵タンパク質遺伝子）または植物ウイルスに由来するプロモーターもしくはエンハンサー（例えば、ウイルスプロモーターもしくはリーダー配列）をベクターにクローニングすることができる。
【０１８８】
哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子由来のまたは哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが好ましい。ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍをコードする配列の複数コピーを含有する細胞株を作出する必要があるなら、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターを、適した選択可能なマーカーとともに使用することができる。
【０１８９】
細菌系では、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍを対象とする用途に応じて、いくつかの発現ベクターを選択することができる。例えば、抗体の誘導のために大量のｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍが必要とされる場合、容易に精製される融合タンパク質の高レベル発現をもたらすベクターを使用することができる。そのようなベクターとしては、ハイブリッドタンパク質が生成されるように、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍをコードする配列を、アミノ末端のＭｅｔに対する配列およびその後の７残基のβ−ガラクトシダーゼとインフレームでベクターにライゲーションできるＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Stratagene）のような多機能の大腸菌クローニングおよび発現ベクター、ｐＩＮベクター（Van Heeke, G. and S. M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509）などが挙げられるが、これらに限定されることはない。ｐＧＥＸベクター（Promega, Madison, Wis.）を用いて、外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させることもできる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着、引き続いて遊離グルタチオンの存在下での溶出によって溶解細胞から容易に精製することができる。そのような系で作出されるタンパク質は、クローニングされた対象となるポリペプチドをＧＳＴ部分から自由に放出できるように、ヘパリン、トロンビン、または第ＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むようデザインすることができる。
【０１９０】
酵母サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）では、α因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨなどの、構成性または誘導性プロモーターを含有するいくつかのベクターを使用することができる。概説としては、Ausubel（前記）およびGrantら（1987; Methods Enzymol. 153:516-544）を参照されたい。
【０１９１】
植物発現ベクターが使われる場合、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍをコードする配列の発現は、いくつかのプロモーターのいずれかによって推進することができる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターなどのウイルスプロモーターを単独でまたはＴＭＶ由来のωリーダー配列（Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311.）と併せて使用することができる。あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯ小サブユニットなどの植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを使用することができる（Coruzzi, G. et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R. et al. (1984) Science 224:838-843; およびWinter, J. et al. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105.）。これらの構築体は、直接的なＤＮＡ形質転換または病原体を介したトランスフェクションによって植物細胞に導入することができる。そのような技術は、いくつかの一般に利用可能な概説に記述されている（例えば、Hobbs, S. or Murry, L. E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York, N.Y.; pp. 191-196.を参照のこと）。
【０１９２】
昆虫系を用いて、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍを発現させることもできる。例えば、そのような１つの系では、オートグラファカリフォルニア核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして用いて、外来遺伝子をヨウトガ（Spodoptera frugiperda）細胞でまたはトリコプルシア（Trichoplusia）幼虫で発現させる。ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍをコードする配列を、ポリヘドリン遺伝子などのウイルスの非必須領域にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置くことができる。ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍの挿入成功は、ポリヘドリン遺伝子を不活性にし、外皮タンパク質を欠いた組換えウイルスを生成させるであろう。次いで、この組換えウイルスを用いて、例えば、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍが発現されうるヨウトガ細胞またはトリコプルシア幼虫に感染させることができる（Engelhard, E. K. et al. (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-3227.）。
【０１９３】
哺乳動物宿主細胞では、いくつかのウイルスに基づく発現系を利用することができる。アデノウイルスが発現ベクターとして使われる場合には、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍをコードする配列を、後期プロモーターおよひ三分割リーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体にライゲーションすることができる。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域中の挿入を用いて、感染宿主細胞においてｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍを発現することが可能な生存ウイルスを得ることができる。（Logan, J. and T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659.）さらに、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどの、転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞での発現を増大させることができる。
【０１９４】
このように、例えば、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍタンパク質をヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞または接着性ｄｈｆｒ ＣＨＯ細胞のいずれかで発現させる。受容体発現を最大限にするため、典型的には、ｐＣＤＮまたはｐＣＤＮＡ３ベクターへの挿入前に全ての５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を受容体ｃＤＮＡから除去する。細胞をリポフェクチンにより個々の受容体ｃＤＮＡでトランスフェクトし、４００ ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で選択する。３週間の選択後、個々のクローンを拾い、さらなる分析のために増殖させる。ベクターのみをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞は、陰性対照として役立つ。個々の受容体を安定に発現する細胞株を単離するため、典型的には、約２４クローンを選択し、ノザンブロット分析により分析する。受容体ｍＲＮＡは一般に、分析されるＧ４１８耐性クローンの約５０％において検出可能である。
【０１９５】
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）を利用して、プラスミド中に含有させ、発現させることができるよりも大きなＤＮＡ断片を送達することもできる。約６ｋｂ〜１０ＭｂのＨＡＣを構築し、治療目的のための従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオン性アミノポリマー、または小胞）により送達する。
【０１９６】
特異的な開始シグナルを用いて、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍをコードする配列のより効率的な翻訳を達成することもできる。そのようなシグナルはＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列を含む。ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍをコードする配列ならびにその開始コドンおよび上流配列が適切な発現ベクターに挿入される場合には、さらなる転写または翻訳制御シグナルは必要とされないかもしれない。しかしながら、コード配列、またはその断片だけが挿入される場合には、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナルが供与されるべきである。さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実とするよう正しい読み枠の中にあるべきである。外因性の翻訳エレメントおよび開始コドンは、天然および合成の両方の、様々な起源のものとすることができる。発現の効率は、文献に記述されているものなどの、使用される特定の細胞系に適したエンハンサーの包含によって上昇させることができる（Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162.）。
【０１９７】
さらに、宿主細胞菌株を、挿入された配列の発現を調節するかまたは発現されたタンパク質を所望の様式でプロセシングするその能力について選択することができる。ポリペプチドのそのような修飾としては、アセチル化、カルボキシル化、糖化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が挙げられるが、これらに限定されることはない。タンパク質の「プレプロ」型を切断する翻訳後プロセシングを用いて、正しい挿入、折り畳み、および／または機能を促進することもできる。翻訳後活性に特異的な細胞機序および特徴的な機構を有する異なる宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、およびＷＩ３８）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC, Bethesda, Md.）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実とするよう選択することができる。
【０１９８】
長期で、高回収量の組換えタンパク質生成の場合、安定発現が好ましい。例えば、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍを安定に発現することが可能な細胞株を、ウイルス複製起点および／または内因性の発現エレメントならびに選択可能なマーカー遺伝子を同一のベクター上にまたは別のベクター上に含みうる発現ベクターによって形質転換することができる。ベクターの導入後、選択培地に切り替える前に、細胞を富化培地中で約１〜２日間増殖させてもよい。選択可能なマーカーの目的は耐性を選択に付与することであり、その存在によって、導入された配列を成功裏に発現する細胞の増殖および回収が可能になる。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。
【０１９９】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収することができる。これらは、ｔｋ−またはａｐｒ−細胞でそれぞれ利用できる、単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ遺伝子（Wigler, M. et al. (1977) Cell 11:223-32）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Lowy, I. et al. (1980) Cell 22:817-23）を含むが、これらに限定されることはない。同様に、代謝拮抗物質、抗生物質、または除草剤耐性を選択の基礎として使用することができる。例えば、ｄｈｆｒはメトトレキサートに対する耐性を付与し（Wigler, M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70）；ｎｐｔはアミノグリコシド系ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を付与し（Colbere-Garapin, F. et al (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14）；およびａｌｓまたはｐａｔは、それぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与する（Murry、前記）。さらなる選択可能な遺伝子、例えば、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ、または細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤが報告されている（Hartman, S. C. and R. C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51.）。最近では、アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質ＧＵＳ、ならびにルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンのようなマーカーによる可視的なマーカーの使用が主流となっている。これらのマーカーは形質転換体を同定するためだけでなく、特異的なベクター系に起因する一過的なまたは安定的なタンパク質発現の量を定量化するために使用することができる（Rhodes, C. A. et al. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131.）。
【０２００】
マーカー遺伝子発現の存在／非存在は、対象となる遺伝子も同様に存在することを示唆するが、その遺伝子の存在および発現を確認する必要があるかもしれない。例えば、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍをコードする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍをコードする配列を含有する形質転換細胞は、マーカー遺伝子機能がないことによって同定することができる。あるいは、マーカー遺伝子を、単一プロモーターの制御下にｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍをコードする配列とタンデムに配置することができる。誘導または選択に応じたマーカー遺伝子の発現は、通常、同様にタンデム遺伝子の発現を示唆する。
【０２０１】
あるいは、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍをコードする核酸配列を含む、ならびにｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍを発現する宿主細胞は、当業者に公知の様々な手順によって同定することができる。これらの手順は、核酸またはタンパク質配列の検出および／または定量化のための膜、溶液、またはチップに基づく技術を含むＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよびタンパク質バイオアッセイまたは免疫アッセイ技術を含むが、これらに限定されることはない。
【０２０２】
ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍをコードするポリヌクレオチド配列の存在は、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍをコードするポリヌクレオチドのプローブまたは断片を用いたＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションまたは増幅によって検出することができる。核酸増幅に基づくアッセイは、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含有する形質転換体を検出するためのｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍをコードする配列に基づくオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの使用を含む。
【０２０３】
タンパク質に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかを用いて、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍの発現を検出および測定するための様々なプロトコルは、当技術分野において公知である。そのような技術の例としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍ上の２種の非干渉性エピトープに反応性を示すモノクローナル抗体を利用する、２部位のモノクローナル抗体に基づく免疫アッセイが好ましいが、競合的結合アッセイが採用されてもよい。これらのおよびその他のアッセイは当技術分野において、例えば、Hampton, R.ら（1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, Section IV, APS Press, St Paul, Minn.）においておよびMaddox, D. E.ら（1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216）において十分に記述されている。
【０２０４】
多種多様な標識および結合技術は、当業者によって知られており、様々な核酸およびアミノ酸アッセイで用いることができる。ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するため標識されたハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを生成する手段としては、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅が挙げられる。あるいは、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍをコードする配列、またはそのいずれかの断片をｍＲＮＡプローブの生成のため、ベクターにクローニングすることができる。そのようなベクターは、当技術分野において公知であり、市販されており、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６などの適切なＲＮＡポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドの添加によりｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＲＮＡプローブを合成するのに使用することができる。これらの手順は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ（Kalamazoo, Mich.）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Madison, Wis．）、およびＵ．Ｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．（Cleveland, Ohio)によって供給されているものなどの、様々な市販のキットを用いて行うことができる。検出を容易にするために使用できる適当なレポーター分子または標識としては、放射性核種、酵素、蛍光物質、化学発光物質、または発色物質、および基質、補因子、阻害剤、磁気粒子などが挙げられる。
【０２０５】
ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培養物からのタンパク質の発現および回収に適した条件の下で培養することができる。形質転換細胞によって生成されるタンパク質は、使用される配列および／またはベクターに応じ、細胞膜に位置づけられ、分泌されまたは細胞内に含有されうる。当業者には明らかなように、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターは、原核生物または真核生物の細胞膜を通じたｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍの分泌を命令するシグナル配列を含むようにデザインすることができる。その他の構築物を用いて、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を円滑にしうるポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に連結することができる。そのような精製円滑化ドメインは、固定化された金属での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュールなどの金属キレートペプチド、固定化された免疫グロブリンでの精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製システム（Immunex Corp., Seattle, Wash.）で利用されるドメインを含むが、これらに限定されることはない。精製ドメインとｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍコード配列との間に、第ＸＡ因子またはエンテロキナーゼに特異的なもの（Invitrogen, San Diego, Calif.）などの、切断可能なリンカー配列を包含することを利用して、精製を円滑にすることができる。そのような１つの発現ベクターは、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍならびにチオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位の前に６ヒスチジン残基をコードする核酸を含有する融合タンパク質の発現をもたらす。ヒスチジン残基は、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーでの精製を円滑にし（IMIAC; Porath, J. et al. (1992) Prot. Exp. Purif. 3: 263-281に記述されている）、その一方でエンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質からｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍを精製するための手段を提供する。融合タンパク質を含有するベクターについての議論はKroll, D. J.ら（1993; DNA Cell Biol. 12:441-453）に示されている。
【０２０６】
ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍの断片、ならびに全長ポリペプチドは、組換え産生によってだけでなく、固相技術を用いた直接的なペプチド合成によって生成することもできる（Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154.）。タンパク質合成は、用手法によりまたは自動的に行うことができる。自動合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａペプチド合成機（Perkin Elmer）を用いて達成することができる。ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍの様々な断片を別々に合成し、その後、組み合わせて完全長の分子を生成することができる。
【０２０７】
その他の発現方法も公知であり、例えば、「遺伝子活性化」として知られる方法を利用して、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６およびｃｇＲｅｑｕｉｅｍの活性または発現を調節することができる。この方法は米国特許第５，６４１，６７０号に詳細に記述されており、参照により本明細書に組み入れられる。本質的に、遺伝子活性化法は、細胞ゲノムの中に、予め選択された部位で、相同組換えを通じ、（ａ）標的化配列；（ｂ）調節配列；（ｃ）エクソンおよび（ｄ）対になっていないスプライスドナー部位を含んでなり、その標的化配列は、エレメント（ｂ）〜（ｄ）が内因性遺伝子に機能的に連結されるようにエレメント（ａ）〜（ｄ）の組込みを命令する適当なＤＮＡ構築体を挿入することにより、細胞内での対象となる内因性遺伝子の調節または活性を改変できるという認識に基づいている。ＤＮＡ構築体はまたは（ａ）標的化配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エクソン、（ｄ）スプライスドナー部位、（ｅ）イントロン、および（ｆ）スプライスアクセプター部位を含んでなることができ、その標的化配列は（ｂ）〜（ｆ）のエレメントが内因性遺伝子の第１エクソンに機能的に連結されるようにエレメント（ａ）〜（ｆ）の組込みを命令する。
【０２０８】
使用される標的化配列は、ＤＮＡが挿入されることになる部位に関連して選択される。いずれの配置でも、標的化事象は、ＤＮＡ構築体および内因性の細胞遺伝子を標的化することによって導入された配列の融合産物である新たな転写単位を作出するために使われる。例えば、新たな転写単位の形成は、記述のＤＮＡ構築体を宿主細胞のゲノムの中に導入することによって、転写的にサイレントな遺伝子（トランスフェクション前には細胞内で発現されない遺伝子）が宿主細胞内で活性化されるのを可能にする。得られる細胞で発現されるｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍなどの内因性遺伝子の発現は、それが増大される、除去されることを含めて低減される、または調節もしくは誘導のパターンが遺伝子活性化法の使用を通じて変化されうるという点で改変することができる。
【０２０９】
抗体
ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍの特異的なアンタゴニストは、これらのタンパク質の活性を調節するのに使用することができ、そのタンパク質に対する抗体を含むことができる。具体的には、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６およびｃｇＲｅｑｕｉｅｍに結合することが可能な、好ましくはそのいずれかの生物学的活性を阻害することが可能な抗体は、細胞生存率を上昇させるため、当該タンパク質の発現をダウンレギュレートさせる際に用いるのに適している。
【０２１０】
本発明者らはそれ故、具体的には、抗ｃｇＦＡＤＤ抗体、抗ｃｇＦＡＩＭ抗体、抗ｃｇＰＤＣＤ６抗体および抗ｃｇＲｅｑｕｉｅｍ抗体、ならびにそれらを生成する方法を提供する。
【０２１１】
本明細書において用いる場合、抗体とは、選択された標的に結合することが可能な、かつＦｖ、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体およびヒト化抗体を含めて遺伝子操作された抗体、ならびにファージディスプレイまたは代替技術を用いて生成された、人為的に選択された抗体を含む、完全な抗体または抗体断片をいう。ＦｖおよびＳｃＦｖなどの、小さな断片は、その小さなサイズや結果として優れた組織分布のため診断的および治療的用途に対し有利な特性を保有する。
【０２１２】
本明細書に記述される抗ｃｇＦＡＩＭ抗体、抗ｃｇＦＡＤＤ抗体、抗ｃｇＰＤＣＤ６抗体および抗ｃｇＲｅｑｕｉｅｍ抗体は、例えば、細胞との関係において、当該タンパク質の検出に使用することができる。したがって、それらは、標識などのエフェクタータンパク質を含む改変された抗体とすることができる。ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗体の分布の画像処理を可能にする標識が特に好ましい。そのような標識は、胚または細胞塊のなかで容易に視覚化可能な、放射性標識または放射線不透性標識、例えば、金属粒子とすることができる。さらに、それらは、蛍光標識または組織サンプルで視覚化可能なその他の標識とすることができる。
【０２１３】
組換えＤＮＡ技術を用いて、本明細書に記述される抗体を改良することができる。すなわち、診断的または治療的用途での抗体の免疫原性を減らすため、キメラ抗体を構築することができる。さらに、ＣＤＲ移植［欧州特許出願第０ ２３９ ４００号（Ｗｉｎｔｅｒ）参照］および、任意で、骨格改変［欧州特許第０ ２３９ ４００号］により抗体をヒト化することで、免疫原性を最小限に抑えることができる。
【０２１４】
抗ｃｇＦＡＩＭ抗体、抗ｃｇＦＡＤＤ抗体、抗ｃｇＰＤＣＤ６抗体および抗ｃｇＲｅｑｕｉｅｍ抗体は、動物血清から得ることができ、または、モノクローナル抗体もしくはその断片の場合は、細胞培養で産生させることができる。組換えＤＮＡ技術を用いて、決められた手順にしたがい抗体を細菌細胞培養で、または好ましくは哺乳動物細胞培養で産生させることができる。選択される細胞培養系は、抗体産物を分泌することが好ましい。
【０２１５】
それ故に、本発明者らは、抗体の生成方法であって、その抗体タンパク質をコードする第２のＤＮＡ配列に適切な読み枠で連結されたシグナルペプチドをコードする第１のＤＮＡ配列に機能的に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含んだハイブリッドベクターで形質転換された、宿主、例えば、大腸菌または哺乳動物細胞を培養するステップ、およびそのタンパク質を単離するステップを含む方法を開示する。
【０２１６】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのハイブリドーマ細胞または哺乳動物宿主細胞の増殖は、適当な培地の中で行われる。その培地は、任意により哺乳動物血清、例えば、ウシ胎仔血清、または微量元素および増殖支持添加物、例えば、正常なマウス腹腔滲出細胞などのフィーダー細胞、脾細胞、骨髄マクロファージ、２−アミノエタノール、インスリン、トランスフェリン、低比重リポタンパク質、オレイン酸などを添加した、通例の標準的な培地、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはＲＰＭＩ１６４０培地である。細菌細胞または酵母細胞である宿主細胞の増殖は、当技術分野において公知の適当な培地の中で、例えば、細菌の場合には培地ＬＢ、ＮＺＣＹＭ、ＮＺＹＭ、ＮＺＭ、テリフィックブロス（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）、ＳＯＢ、ＳＯＣ、２×ＹＴ、またはＭ９最少培地の中で、および酵母の場合には培地ＹＰＤ、ＹＥＰＤ、最少培地、または完全最少ドロップアウト培地の中で同様に行われる。
【０２１７】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの生成は比較的純粋な抗体調製物を提供し、大量の所望の抗体をもたらすようスケールアップを可能にする。細菌細胞、酵母または哺乳動物細胞培養のための技術は、当技術分野において公知であり、例えば、エアリフトリアクタ中でのもしくは連続撹拌式リアクタ中での均質な懸濁培養、または、例えば、中空繊維、マイクロカプセル中での、アガロースマイクロビーズもしくはセラミックカートリッジ上での、固定化もしくは封入細胞培養を含む。
【０２１８】
大量の所望の抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏで哺乳動物細胞を増殖させることで得ることもできる。このため、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を組織適合性の哺乳動物に注入して、抗体産生性の腫瘍の増殖を引き起こす。任意により、注入前に、動物は炭化水素、特にプリスタン（テトラメチル−ペンタデカン）などのミネラルオイルで初回抗原刺激されてもよい。１〜３週間後、抗体をそれらの動物の体液から単離する。例えば、抗体産生性のＢａｌｂ／ｃマウス由来脾細胞と適当なミエローマ細胞との融合によって得られたハイブリドーマ細胞、または所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株Ｓｐ２／０に由来するトランスフェクト細胞を、任意によりプリスタンで予め処置されたＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に注入し、１〜２週間後、腹水を動物から採取する。
【０２１９】
先行技術、およびその他の技術は、例えば、Kohler and Milstein, (1975) Nature 256:495-497；ＵＳ４，３７６，１１０；Harlow and Lane, Antibodies：a Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harborに論じられており、これらは参照により本明細書に組み入れられる。組換え抗体分子の調製のための技術は、上記の参考文献に記述されており、例えば、ＥＰ０６２３６７９；ＥＰ０３６８６８４およびＥＰ０４３６５９７にも記述されており、これらは参照により本明細書に組み入れられる。
【０２２０】
細胞培養上清を、例えば、イムノブロッティングにより、酵素免疫アッセイ、例えば、サンドイッチアッセイもしくはドットアッセイ、または放射免疫アッセイにより所望の抗体を求めてスクリーニングする。
【０２２１】
抗体の単離のため、培養上清中のまたは腹水中の免疫グロブリンを、例えば、硫酸アンモニウムを用いた沈殿、ポリエチレングリコールなどの吸湿材に対する透析、選択膜を通じたろ過などにより濃縮することができる。必要ならおよび／または望まれるなら、抗体を通例のクロマトグラフィー法、例えば、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロースに対するクロマトグラフィーおよび／または（免疫）アフィニティークロマトグラフィー、例えば、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／もしくはｃｇＲｅｑｕｉｅｍ、またはその断片を用いた、あるいはプロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。
【０２２２】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞も提供される。好ましいハイブリドーマ細胞は遺伝的に安定であり、所望の特異性のモノクローナル抗体を分泌し、急速冷凍培養物から融解および再クローニングにより活性化することができる。
【０２２３】
適当な哺乳動物、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスを１つまたは複数のｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／もしくはｃｇＲｅｑｕｉｅｍポリペプチド、またはその抗原性断片で免疫し；免疫された哺乳動物の抗体産生性の細胞を適当なミエローマ細胞株の細胞と融合し、融合で得られたハイブリッド細胞をクローニングし、所望の抗体を分泌する細胞クローンを選択することを特徴とする、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍに対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株の調製のための方法も含まれる。例えば、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍで免疫されたＢａｌｂ／ｃマウスの脾細胞をミエローマ細胞株ＰＡＩまたはミエローマ細胞株Ｓｐ２／０−Ａｇ１４の細胞と融合し、得られたハイブリッド細胞を所望の抗体の分泌についてスクリーニングし、陽性のハイブリドーマ細胞をクローニングする。
【０２２４】
ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍを発現する１０〜１０７〜１０８個の細胞ならびに適当なアジュバントを数回、例えば４〜６回、数ヶ月、例えば、２〜４ヶ月にわたって皮下におよび／または腹腔内に注入することによりＢａｌｂ／ｃマウスを免疫し、免疫マウスの脾細胞を最後の注入から２〜４日後に採取し、融合プロモーター、好ましくはポリエチレングリコールの存在下でミエローマ細胞株ＰＡＩの細胞と融合することを特徴とする、ハイブリドーマ細胞株の調製のための方法が好ましい。ミエローマ細胞は、分子量４０００前後の約３０％〜約５０％ポリエチレングリコールを含有する溶液中で免疫マウス由来の３〜２０倍過剰の脾細胞と融合されることが好ましい。融合の後、正常なミエローマ細胞が所望のハイブリドーマ細胞を異常増殖させるのを防ぐため定期的に、選択培地、例えばＨＡＴ培地を添加した、上述の適当な培地中で細胞を増殖させる。
【０２２５】
上述のとおりｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍに対する抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするインサートを含む組換えＤＮＡも開示される。定義によれば、そのようなＤＮＡは、コード一本鎖ＤＮＡ、そのコードＤＮＡとそれに相補的なＤＮＡとからなる二本鎖ＤＮＡ、またはこれらの相補的な（一本鎖）ＤＮＡそれ自体を含む。
【０２２６】
さらに、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍに対する抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡは、重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードする生来のＤＮＡ配列を有する酵素的にまたは化学的に合成されたＤＮＡ、あるいはその突然変異体とすることができる。生来のＤＮＡの突然変異体は、１つもしくは複数のアミノ酸が欠失されているかまたは１つもしくは複数のその他のアミノ酸と交換されている上記の抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡである。好ましくは、その改変は抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインのＣＤＲの外側である。そのような突然変異ＤＮＡは、１つまたは複数のヌクレオチドが、同じアミノ酸をコードする新たなコドンを有するその他のヌクレオチドに置き換わっているサイレントな突然変異であることも意図される。そのような突然変異配列は同様に、縮重配列である。縮重配列は遺伝コードの意義の範囲内で、無制限の数のヌクレオチドが、本来コードされるアミノ酸配列の変化をもたらすことなしに、その他のヌクレオチドに置き換わるという範囲において縮重される。そのような縮重配列は、その異なる制限部位、ならびに／または重鎖マウス可変ドメインおよび／もしくは軽鎖マウス可変ドメインの最適な発現を得るために、特定の宿主、好ましくは大腸菌によって好まれる特定コドンの使用頻度に起因して有用とすることができる。
【０２２７】
突然変異体という用語は、当技術分野において公知の方法による生来のＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発によって得られるＤＮＡ突然変異体を含むことが意図される。
【０２２８】
完全な四量体免疫グロブリン分子の組み立ておよびキメラ抗体の発現のため、重鎖および軽鎖可変ドメインをコードする組換えＤＮＡインサートを、重鎖および軽鎖定常ドメインをコードする対応するＤＮＡと融合し、次いで、例えばハイブリッドベクターへの組込みの後、適切な宿主細胞に移入する。
【０２２９】
ヒト定常ドメインに融合されたｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍに対する抗体の重鎖マウス可変ドメインｇ、例えば、γ１、γ２、γ３またはγ４、好ましくはγ１またはγ４をコードするインサートを含む組換えＤＮＡも開示される。同様に、ヒト定常ドメインに融合されたｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍに対する抗体の軽鎖マウス可変ドメインκまたはλ、好ましくはκをコードするインサートを含む組換えＤＮＡも開示される。
【０２３０】
別の実施形態において、本発明者らは、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインが、任意により宿主細胞内での抗体のプロセシングを円滑にするシグナル配列および／または抗体の精製を円滑にするペプチドをコードするＤＮＡおよび／または切断部位および／またはペプチドスペーサーおよび／またはエフェクター分子を含んでもよい、スペーサー基によって連結された組換えポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを開示する。
【０２３１】
エフェクター分子をコードするＤＮＡは、診断的または治療的用途において有用なエフェクター分子をコードするＤＮＡであることが意図される。すなわち、毒素または酵素、特にプロドラッグの活性化を触媒することが可能な酵素であるエフェクター分子がとりわけ示唆される。そのようなエフェクター分子をコードするＤＮＡは、天然の酵素もしくは毒素をコードするＤＮＡ、またはその突然変異体の配列を有し、当技術分野において周知の方法によって調製することができる。
【０２３２】
製剤化および投与
ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍペプチドおよびポリペプチドなどの、ペプチドおよびポリペプチド、核酸およびポリヌクレオチドならびにアゴニストおよびアンタゴニストペプチドまたは小分子を、適当な医薬担体と組み合わせて製剤化することができる。そのような製剤は、治療的に有効な量のポリペプチドまたは化合物、および製薬上許容される担体または賦形剤を含む。そのような担体としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されることはない。製剤化は投与方法に適合するべきであり、十分に当技術分野の技術の範囲内である。本発明者らはさらに、上記組成物の成分の１つまたは複数で満たされた１つまたは複数の容器を含む医薬包装およびキットについて記述する。
【０２３３】
ポリペプチドおよびその他の化合物は、単独でまたは治療化合物などの、その他の化合物と併せて利用することができる。
【０２３４】
医薬組成物の全身投与の好ましい形態は、典型的には静脈内注射による注射を含む。皮下、筋肉内、または腹腔内などの、その他の注射経路が使用されてもよい。全身投与の代替手段は、胆汁塩もしくはフシジン酸などの浸透剤またはその他の界面活性剤を用いた経粘膜的および経皮的投与を含む。さらに、腸溶性のまたは封入性の製剤の中に適切に製剤化されるなら、経口投与も可能でありうる。これらの化合物の投与は、軟膏剤、ペースト剤、ゲル剤などの剤形で、局在性であるかかつ／または局在化されてもよい。
【０２３５】
必要とされる投与量範囲は、ペプチドの選択、投与の経路、製剤の性質、被験体の状態の性質、および主治医の判断に依る。しかしながら、適当な投与量は０．１〜１００μｇ／ｋｇ被験体の範囲内である。しかしながら、利用可能な化合物の種類および様々な投与経路の異なる効率を考慮して、必要とされる投与量の幅広い変更が予想される。例えば、経口投与では、静脈内注射による投与よりも高い投与量を必要とするものと予想されよう。これらの投与量レベルの変化は、当技術分野において十分に理解されているように、最適化のための標準的な実験ルーチンによって調整することができる。
【０２３６】
治療で使用されるポリペプチドは同様に、前述のように「遺伝子治療」と称されることが多い治療法のなかで、被験体において内因的に作出することもできる。すなわち、例えば、被験体由来の細胞をｅｘ ｖｉｖｏで、および例えば、レトロウイルスプラスミドベクターの使用により、ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドで遺伝子操作することができる。次いで、この細胞を被験体に導入する。
【０２３７】
医薬組成物
本発明者らは同様に、治療的に有効な量の（ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍポリペプチドなどのような）ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、ベクターまたは抗体および任意により製薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤（その組み合わせを含む）の投与を含む医薬組成物を提供する。
【０２３８】
医薬組成物はヒトまたはヒトでの動物使用および獣医薬に向けられてもよく、典型的には、製薬上許容される希釈剤、担体、または賦形剤のいずれかの１つまたは複数を含むであろう。治療的使用に許容される担体または希釈剤は、製薬分野において周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（A. R. Gennaro編. 1985）に記述されている。医薬担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図される投与経路および標準的な薬務に関して行うことができる。医薬組成物は担体、賦形剤もしくは希釈剤として、またはそれらに加えて、任意の適当な結合剤、滑沢剤、懸濁化剤、コーティング剤、可溶化剤を含むことができる。
【０２３９】
保存剤、安定化剤、色素および場合により香料添加剤が医薬組成物に供与されてもよい。保存剤の例としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルが挙げられる。酸化防止剤および懸濁化剤を使用することもできる。
【０２４０】
異なる送達系に依り異なる組成物／製剤の必要条件が存在しうる。例として、本明細書に記述される医薬組成物は、小型ポンプを用いてまたは粘膜経路によって、例えば、鼻腔スプレーもしくは吸入用エアロゾルもしくは摂取可能な溶液として、あるいは組成物が、例えば、静脈内、筋肉内または皮下経路による送達のために注射可能な形態により製剤化される非経口用組成物として送達されるよう製剤化することができる。または、製剤は両経路によって送達されるようデザインすることができる。
【０２４１】
薬剤が胃腸粘膜を通じて粘膜的に送達される場合、胃腸管を通じた輸送の間に安定した状態を保つことができなければならない；例えば、タンパク質分解に耐性でなければならず、酸性ｐＨで安定でなければならず、かつ胆汁の界面活性作用に耐性でなければならない。
【０２４２】
必要に応じて、医薬組成物は吸入により、坐剤もしくは腟坐剤の形態で、ローション、溶液剤、クリーム剤、軟膏剤もしくは散剤の剤形で局所的に、皮膚パッチの使用により、デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤を含有する錠剤の形態で経口的に、またはカプセル剤もしくは卵形剤で単独でもしくは賦形剤との混合で、または香料添加剤もしくは着色剤を含有する甘味アルコール溶液剤、溶液剤もしくは懸濁液剤の剤形で投与することができ、あるいはそれらは非経口的に、例えば静脈内に、筋肉内にまたは皮下に注射することができる。非経口投与の場合、組成物は、その他の物質、例えば溶液を血液と等張にさせるのに十分な塩または単糖類を含有しうる無菌水溶液の形態で最良に使用することができる。口腔または舌下投与の場合、組成物は、従来の様式で処方されうる錠剤またはトローチ剤の形態で投与することができる。
【０２４３】
ワクチン
別の実施形態は、哺乳動物において免疫反応を誘導する方法であって、その動物をｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍ関連疾患から保護する抗体および／またはＴ細胞免疫反応をもたらすのに十分な、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／もしくはｃｇＲｅｑｕｉｅｍポリペプチド、またはその断片を哺乳動物に接種するステップを含む方法に関する。
【０２４４】
さらに別の実施形態は、哺乳動物において免疫反応を誘導する方法であって、その動物を疾患から保護する抗体をもたらすようにそのような免疫反応を誘導するため、ｉｎ ｖｉｖｏでｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍポリヌクレオチドの発現を命令するベクターを介してｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍポリペプチドを送達するステップを含む方法に関する。
【０２４５】
さらなる実施形態は、哺乳動物宿主に導入された場合、その哺乳動物においてｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍポリペプチドに対する免疫反応を誘導する免疫／ワクチン製剤（組成物）であって、ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／もしくはｃｇＲｅｑｕｉｅｍポリペプチドまたはｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／もしくはｃｇＲｅｑｕｉｅｍ遺伝子を含む組成物に関する。ワクチン製剤はさらに、適当な担体を含むことができる。
【０２４６】
ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍポリペプチドは胃のなかで分解されうるので、それは非経口的に（皮下の、筋肉内の、静脈内の、皮内などの注射を含め）投与されることが好ましい。非経口投与に適した製剤には、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤および製剤をレシピエントの血液と等張(instonic)にさせる溶質を含みうる水性および非水性の無菌注射液、ならびに懸濁化剤または増粘剤を含みうる水性および非水性の無菌懸濁液が含まれる。製剤は単位用量または反復用量の容器、例えば、密閉アンプルおよびバイアルの中に提供してもよく、使用の直前に無菌の液体担体の添加だけで済む凍結乾燥状態で貯蔵されてもよい。ワクチン製剤は同様に、水中油系および当技術分野において公知のその他の系などの、製剤の免疫原性を増強するためのアジュバント系を含むことができる。投与量はワクチンの特異的活性に依存するはずであり、通常の実験により容易に決定することができる。
【０２４７】
ワクチンは、本明細書に記述される１つまたは複数のポリペプチドまたはペプチドから調製することができる。
【０２４８】
免疫原性のポリペプチドまたはペプチドを活性成分として含有するワクチン調製物が、当業者に知られている。典型的には、そのようなワクチンは注射用薬剤として、溶液剤または懸濁液剤のいずれかとして調製される；注射前に液体中に、溶液化、または懸濁液化するのに適した固体形態を調製することもできる。調製物は乳化されてもよく、またはタンパク質がリポソーム内に封入されてもよい。活性な免疫原性成分は、活性成分と製薬上許容されかつ適合される賦形剤と混合されることが多い。適当な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどおよびその組み合わせである。
【０２４９】
さらに、必要に応じて、ワクチンは微量の補助物質、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および／またはワクチンの有効性を増強するアジュバントを含有することができる。有効でありうるアジュバントの例としては、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ １１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと称される）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと称される）、およびＲＩＢＩ（これは細菌から抽出された３つの成分、すなわちモノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコール酸および細胞壁の骨格成分（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０乳液中に含有する）が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０２５０】
アジュバントおよびその他の薬剤のさらなる例としては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム（ａｌｕｍ）、硫酸ベリリウム、シリカ、カオリン、炭素、油中水乳剤、水中油乳剤、ムラミルジペプチド、細菌内毒素、脂質Ｘ、コリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）（プロピオノバクテリウム・アクネ（Propionobacterium acnes））、ボルデテラ・ペルタシス（Bordetella pertussis）、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウム、ラノリン、リゾレシチン、ビタミンＡ、サポニン、リポソーム、レバミゾール、ＤＥＡＥ−デキストラン、ブロックコポリマーまたはその他の合成アジュバントが挙げられる。そのようなアジュバントは様々な供給元から市販されており、例えば、メルクアジュバント６５（Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.）またはフロイント不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Difco Laboratories, Detroit, Michigan）がある。
【０２５１】
典型的には、アンフィジェン（Amphigen）（水中油）、アルヒドロゲル（Alhydrogel）（水酸化アルミニウム）、またはアンフィジェンおよびアルヒドロゲルの混合物などのアジュバントが使用される。水酸化アルミニウムだけがヒトでの使用に承認されている。
【０２５２】
免疫原およびアジュバントの割合は、双方が有効な量で存在する限り、幅広い範囲にわたって変えることができる。例えば、水酸化アルミニウムはワクチン混合物（Ａｌ２Ｏ３ベース）の約０．５％の量で存在することができる。ワクチンは０．２〜２００μｇ／ｍｌ、好ましくは５〜５０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは１５μｇ／ｍｌの範囲での終濃度の免疫原を含むように製剤化されることが好都合である。
【０２５３】
製剤化の後、ワクチンを滅菌容器の中に入れることができ、次いでこれを密閉し、低温、例えば、４℃で貯蔵し、またはこれを凍結乾燥することができる。凍結乾燥により、安定化された形態での長期貯蔵が可能になる。
【０２５４】
ワクチンは慣習的に、非経口的に、注入により、例えば、皮下にまたは筋肉内に投与される。その他の投与方法に適したさらなる製剤は、坐剤および、場合によっては、経口用製剤を含む。坐剤の場合、従来の結合剤および担体としては、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを挙げることができ、そのような坐剤は、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲で活性成分を含有する混合物から形成させることができる。経口用製剤は、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような通常用いられる賦形剤を含む。これらの組成物は溶液剤、懸濁液剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤または散剤の剤形を採り、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の活性成分を含有する。ワクチン組成物が凍結乾燥される場合、凍結乾燥された材料は投与の前に、例えば、懸濁液として再調製することができる。再調製は緩衝液中で達成されることが好ましい。
【０２５５】
患者への経口投与用のカプセル剤、錠剤および丸剤には、例えば、Ｅｕｄｒａｇｉｔ「Ｓ」、Ｅｕｄｒａｇｉｔ「Ｌ」、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースを含有する腸溶コーティングを施すことができる。
【０２５６】
本明細書に記述されるポリペプチドは、中性のまたは塩の形態としてワクチンに製剤化することができる。製薬上許容される塩としては、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基と形成される）ならびに、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸およびマレイン酸などのような有機酸と形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩は同様に、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジンおよびプロカインのような有機塩基に由来することができる。
【０２５７】
投与
通常、医師は、個々の被験体に最も適すると思われる実際の投与量を決定するであろう。投与量は特定の患者の年齢、体重および応答性によって異なるであろう。以下の投与量は平均的事例の例示である。もちろん、より高いかまたはより低い投与量範囲が正当である個々の事例もありうる。
【０２５８】
本明細書に開示される医薬組成物およびワクチン組成物は、直接的な注入によって投与することができる。組成物は非経口の、粘膜の、筋肉内の、静脈内の、皮下の、眼内のまたは経皮の投与のために製剤化することができる。通常、各タンパク質は０．０１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の、より好ましくは０．１〜１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与することができる。
【０２５９】
「投与する（される）」という用語は、ウイルス性のまたは非ウイルス性の技術による送達を含む。ウイルス性の送達機構は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびバキュロウイルスベクターを含むがこれらに限定されることはない。非ウイルス性の送達機構は、脂質を介したトランスフェクション、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、カチオン性表面両親媒性物質（ＣＦＡ）およびその組み合わせを含む。そのような送達機構の経路は、粘膜の、鼻腔の、経口の、非経口の、胃腸の、局所の、または舌下の経路を含むがこれらに限定されることはない。
【０２６０】
「投与する（される）」という用語は、例えば、鼻腔スプレーもしくは吸入用エアロゾルとしてのまたは摂取可能な溶液としての、粘膜経路による送達；送達が、例えば、静脈内の、筋肉内のまたは皮下の経路などの、注射可能な形態によるものである非経口経路による送達を含むがこれらに限定されることはない。
【０２６１】
「同時に投与する」という用語は、例えば、ポリペプチドおよびアジュバントなどのさらなる物質の各々の投与の部位および時間が、免疫系の必要な調節が達成されるようなものであることを意味する。したがって、ポリペプチドおよびアジュバントを、時を同じくしておよび同じ部位に投与してもよいが、ポリペプチドをアジュバントとは異なる時点でおよび異なる部位に投与することが有利なこともある。ポリペプチドおよびアジュバントは場合により、同じ送達媒体中で送達されてもよく、すなわちポリペプチドおよび抗原は結合されてもおよび／もしくは結合されなくてもならびに／または遺伝的に結合されてもおよび／もしくは結合されなくてもよい。
【０２６２】
ｃｇＦＡＩＭ、ｃｇＦＡＤＤ、ｃｇＰＤＣＤ６および／またはｃｇＲｅｑｕｉｅｍのポリペプチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、ヌクレオチド、抗体などおよび任意によりアジュバントは、別々に投与することができ、あるいは単回用量としてまたは複数回用量で宿主被験体に同時に投与することができる。
【０２６３】
本明細書に記述されるワクチン組成物および医薬組成物は、注射（これは非経口の、皮下のおよび筋肉内の注射を含む）、鼻腔の、粘膜の、経口の、膣内の、尿道内のまたは眼内の投与などのいくつかの異なる経路によって投与することができる。
【０２６４】
本明細書に記述されるワクチンおよび医薬組成物は慣習的に、非経口的に、注入により、例えば、皮下にまたは筋肉内に投与することができる。その他の投与方法に適したさらなる製剤は、坐剤および、場合によっては、経口用製剤を含む。坐剤の場合、従来の結合剤および担体は、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含むことができ、そのような坐剤は、０．５％〜１０％の範囲（１％〜２％でもよい）で活性成分を含有する混合物から形成させることができる。経口用製剤は、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような通常用いられる賦形剤を含む。これらの組成物は溶液剤、懸濁液剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤または散剤の剤形を採り、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の活性成分を含有する。ワクチン組成物が凍結乾燥される場合、凍結乾燥された材料は投与の前に、例えば、懸濁液として再調製することができる。再調製は緩衝液中で達成されることが好ましい。
【実施例】
【０２６５】
実施例１．細胞株および細胞培養
ＣＨＯ ＩＦＮ−γは浮遊増殖するように適合されたチャイニーズハムスター卵巣細胞株である。これはもともとジヒドロ葉酸レダクターゼ陰性（ＤＨＦＲ−）のＤｕｋｘ細胞から得られた（Urlaub & Chasin 1980）。ＣＨＯ ＩＦＮ−γはＤＨＦＲおよびヒトインターフェロン−γに対する遺伝子で同時にトランスフェクトされている（Scahill et al. 1983）。
【０２６６】
ＣＨＯ ＩＦＮ−γは、４ｍＭグルタミン、２０ｍＭグルコースおよび０．２５μＭメトトレキサート（Sigma, St. Louis, MO）を添加したグルコース／グルタミン不含のＨｙＱ ＣＨＯ ＭＰＳ培地（Hyclone, Logan, UT）の中で維持する。
【０２６７】
実施例２．全ＲＮＡ抽出および第一鎖ｃＤＮＡ合成
トリゾール（Invitrogen）を用いて、全ＲＮＡをＣＨＯ Ｋ１細胞から抽出する。全ての逆転写試薬はＰｒｏｍｅｇａからのものである。１×逆転写緩衝液、１０ｍＭの各ｄＮＴＰおよび２５単位の組換えＲＮＡｓｉｎ(登録商標)リボヌクレアーゼ阻害剤を含有する反応混合物中４２℃で１時間、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素を用いて、完全長ｃＤＮＡを合成する。
【０２６８】
実施例３．遺伝子特異的ＰＣＲ
ＣＨＯ Ｋ１全ＲＮＡから調製されたｃＤＮＡを遺伝子特異的ＰＣＲの鋳型として使用する。全てのＰＣＲ試薬はＰｒｏｍｅｇａからのものである。
【０２６９】
実施例４．チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）ＦＡＩＭの遺伝子特異的クローニング
ＦＡＩＭのコード領域は５’ＰＣＲプライマー５’−ＧＣＣＧＣＧＡＧＡＧＣＴＧＣＴＧＡＣＴＡＣＧＴＣＧＴＧＧ−３’および３’ＰＣＲプライマー５’−ＧＴＴＡＣＴＧＴＧ−ＧＴＧＡＧＡＴＡＴＧＡＡＴＧＧＧＴＴＴＧＧ−３’を用いて増幅する。ＰＣＲ反応混合物には鋳型ｃＤＮＡ １μＬ、１×反応緩衝液、２００μＭの各ｄＮＴＰ、２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１μＭの各プライマーおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ混合物（計５Ｕ）が含まれる。ＰＣＲ条件は９４℃５分、その後９４℃１分、５８℃１分および７２℃２分を３１サイクルならびに７２℃で１０分間の最終伸長である。次いで、ＰＣＲ産物を配列決定のためｐＣＲ(登録商標)−ＴＯＰＯ(登録商標)（Invitrogen, Grand Island, NY）にサブクローニングする。
【０２７０】
チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）ＦＡＩＭ（ｃｇＦＡＩＭ）
ｃｇＦＡＩＭの配列は配列番号１および配列番号５に記載されている。このチャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）配列は１７９アミノ酸のタンパク質をコードする。
【０２７１】
ＣＤ９５またはＡＰＯ−１としても知られるＦａｓは、受容体を介したアポトーシス経路において主要な役割を果たす腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリー由来の受容体である。ＴＮＦ受容体ファミリーの細胞外領域は、システインに富むサブドメインの２〜６回の繰り返しを有する。Ｆａｓの活性化は、カスパーゼ８のオリゴマー形成を通じて細胞内シグナル伝達カスケードを惹起する。カスパーゼ８は、エフェクターカスパーゼのカスケード様活性化に関与するイニシエーターカスパーゼの１つであることが明らかにされている（Srinivasula et al. 1996）。Ｆａｓは同様に、カスパーゼ９およびその他のエフェクターカスパーゼの活性化をもたらすミトコンドリアからのシトクロムｃ放出を引き起こすことが明らかにされている（Li et al. 1997）。
【０２７２】
Ｆａｓアポトーシス阻害分子（ＦＡＩＭ）は、Ｆａｓ誘導性のアポトーシスに耐性を与えうる誘導性タンパク質であることが分かっている（Schneider et al. 1999; Rothstein et al. 2000）。ｓＩｇシグナルとともに、Ｂ細胞でのＦＡＩＭ発現は、Ｆａｓ殺作用を遮断することが可能であり、カスパーゼ３の活性化前のＦａｓシグナル伝達経路中のステップを遮断することでそれを行うことが明らかにされている（Schneider et al. 1999）。ＦＡＩＭは２つの選択的スプライシング型で存在することが明らかにされており、ＦＡＩＭ−Ｓが広く発現されているのに対し、ＦＡＩＭ−Ｌは脳組織特異的である（Zhong et al, 2001）。ＦＡＩＭ配列はまた、異なる種で高度に保存されているように思われることから、重要な系統発生的役割が示唆される。
【０２７３】
実施例５．チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）ＦＡＤＤの遺伝子特異的クローニング
ＦＡＤＤの部分的コード領域は５’ＰＣＲプライマー５’−ＣＣＡＴＧＧＡＣＣＣＡＴＴＣＣＴＧＧＴＧＣ−３’および３’ＰＣＲプライマー５’−ＴＴＣＴＴＣＣＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣ−ＣＡＣＣ−３’を用いて増幅される。ＰＣＲ反応混合物には鋳型ｃＤＮＡ １μＬ、１×反応緩衝液、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１μＭの各プライマーおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ混合物（計５Ｕ）が含まれる。
【０２７４】
ＰＣＲ条件は９４℃５分、その後９４℃１分、５５℃１分および７２℃２分を３１サイクルならびに７２℃で１０分間の最終伸長である。次いで、ＰＣＲ産物を配列決定のためｐＣＲ(登録商標)−ＴＯＰＯ(登録商標)（Invitrogen, Grand Island, NY）にサブクローニングする。
【０２７５】
チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）ＦＡＤＤ（ｃｇＦＡＤＤ）
ｃｇＦＡＤＤの配列は配列番号２および配列番号６に記載されている。
【０２７６】
ＦＡＤＤは、ＣＤ９５（Ｆａｓ／ＡＰＯ−１）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の両受容体誘導性アポトーシスの共通メディエーターである（Chinnaiyan et al 1996）。デスドメインとデスエフェクタードメインの両方を含むＦＡＤＤは、Ｆａｓ結合によるカスパーゼ８活性化の重要なメディエーターである（Chinnaiyan et al. 1995）。本発明者らは、人工的に遺伝子操作されたＦＡＤＤ分子、つまりアポトーシス受容体結合デスドメインだけを含有しかつＦＡＤＤのデスエフェクタードメインを含有しないＦＡＤＤ ＤＮの使用によるｃｇＦＡＤＤの発現の調節について記述する。カスパーゼを細胞死誘導性シグナル伝達複合体に動員することにより、さらに下流のアポトーシスカスケードの活性化を引き起こすのがエフェクタードメインである。本明細書に記述される方法は、遺伝子操作された型のＦＡＤＤ、すなわち、ドミナントネガティブの過剰発現、および天然のＦＡＤＤと競合することによってカスパーゼの動員を阻止するそのような遺伝子操作ざれた分子の使用、それによるアポトーシスカスケードの遮断を可能にする。
【０２７７】
実施例６．チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）ＰＤＣＤ６の遺伝子特異的クローニング
ＰＤＣＤ６の部分的コード領域は５’ＰＣＲプライマー５’−ＧＣＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＣＴＡＣＴＣＣＴＡ−３’および３’ＰＣＲプライマー５’−ＡＡＴＣＣＡＧＣＣＡＴＣＣＴＧＡＴ−ＣＣＧＴ−３’を用いて増幅される。ＰＣＲ反応混合物には鋳型ｃＤＮＡ １μＬ、１×反応緩衝液、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１μＭの各プライマーおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ混合物（計５Ｕ）が含まれる。
【０２７８】
ＰＣＲ条件は９４℃５分、その後９４℃１分、５２℃１分および７２℃２分を３１サイクルならびに７２℃で１０分間の最終伸長である。次に、ＰＣＲ産物を配列決定のためｐＣＲ(登録商標)−ＴＯＰＯ(登録商標)（Invitrogen, Grand Island, NY）にサブクローニングする。得られたＰＣＲ産物を精製し、ｐＣＲ ２．１−Ｔｏｐｏベクターにクローニングし、配列決定する。３’−ＲＡＣＥプライマーは５’−ＣＡＧＣＧＧＧＴＴＧＡＴＡＡＡＧＡＣＡＧＧＡＧＴＧＧＡＧＴＧ−３’である。
【０２７９】
３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲ産物をエチジウムブロマイド含有１％アガロースゲル中での電気泳動によって分離し、対応するバンドを切り出し、Ｑｉａｇｅｎキットによってゲルから抽出し、その後に配列決定のためｐＣＲ(登録商標)−ＴＯＰＯ(登録商標)（Invitrogen, Grand Island, NY）にクローニングする。
【０２８０】
チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）ＰＤＣＤ６（ｃｇＰＤＣＤ６）
ｃｇＰＤＣＤ６の配列は配列番号３および配列番号７に記載されている。このチャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）配列は１９１アミノ酸のタンパク質をコードする。
【０２８１】
アポトーシス関連遺伝子２（ＡＬＧ−２）としても知られるＰＤＣＤ６は、ペンタＥＦハンドタンパク質ファミリーに属するカルシウム結合タンパク質をコードする。これは受容体、Ｆａｓおよびグルココルチコイド誘導性アポトーシスに関与すると示唆されている（Vito et al. 1996; Krebs & Klemenz, 2000およびJung et al., 2001）。興味深いことに、Ｊａｎｇら，２００２は、ＡＬＧ−２欠損ではＴＣＲ、ＦＡＳまたはデキサメタゾンシグナルによって誘導されたアポトーシスの遮断が起こらないことを実証している。
【０２８２】
実施例７．チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）Ｒｅｑｕｉｅｍの遺伝子特異的クローニング
Ｒｅｑｕｉｅｍの部分的コード領域は５’ＰＣＲプライマー５’−ＡＴＧ−ＧＣＧＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＡＧＡＡＴ−３’および３’ＰＣＲプライマー５’−ＧＧＡＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＡＧ−ＡＴＧＧ−３’を用いて増幅される。ＰＣＲ反応混合物には鋳型ｃＤＮＡ １μＬ、１×反応緩衝液、２００μＭの各ｄＮＴＰ、２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１μＭの各プライマーおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ混合物（計５Ｕ）を含めた。
【０２８３】
ＰＣＲ条件は９４℃５分、その後９４℃１分、４４℃１分および７２℃２分を６０サイクルならびに７２℃で１０分間の最終伸長である。次に、ＰＣＲ産物を配列決定のためｐＣＲ(登録商標)−ＴＯＰＯ(登録商標)（Invitrogen, Grand Island, NY）にサブクローニングする。得られたＰＣＲ産物を精製し、ｐＣＲ ２．１−Ｔｏｐｏベクターにクローニングし、配列決定する。３’−ＲＡＣＥプライマーは５’−ＧＣＣＴＣＡＧＴＴＡＣＣＡＣＴＡＴＧＣＣＣＡＴＴＣＣＣＡＣＣ−３’である。
【０２８４】
３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲ産物をエチジウムブロマイド含有１％アガロースゲル中での電気泳動によって分離し、対応するバンドを切り出し、Ｑｉａｇｅｎキットによってゲルから抽出し、その後に配列決定のためｐＣＲ(登録商標)−ＴＯＰＯ(登録商標)（Invitrogen, Grand Island, NY）にクローニングする。
【０２８５】
チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）Ｒｅｑｕｉｅｍ（ｃｇＲｅｑｕｉｅｍ）
ｃｇＲｅｑｕｉｅｍの配列は配列番号４および配列番号８に記載されている。このチャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）配列は３９１アミノ酸のタンパク質をコードする。
【０２８６】
ｕｂｉ−ｄ４としても知られるＲｅｑｕｉｅｍは、骨髄細胞でのカスパーゼの活性化に必須のジンクフィンガー遺伝子である（Gabig et al. 1994）。Ｒｅｑｕｉｅｍは、生存因子除去後のアポトーシス応答に必要な転写因子をコードする可能性が高いと示唆されている（Gabig et al. 1994）。さらに、Ｇａｂｉｇら（１９９８）はマウス骨髄細胞およびヒトＫ５６２白血病細胞の細胞質のおよび核の細胞亜分画双方でそのタンパク質を後に検出しており、それによってそのタンパク質が転写因子のものとは異なる機能を持ちうることを示唆している。
【０２８７】
実施例８．チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）ＦＡＩＭ発現ベクター構築
要約すれば、ｐＣＲ(登録商標)−ＴＯＰＯ(登録商標)（Invitrogen, Grand Island, NY）にクローニングされているＦＡＩＭ遺伝子特異的ＰＣＲ由来の確認済みＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Invitrogen）にサブクローニングし、再び配列決定する。次いで、マキシプラスミド精製キット(Maxi Plasmid Purification Kit)（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて最終的なプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＦＡＩＭを精製し、ＣＨＯ ＩＦＮ−γへのトランスフェクションのため、その濃度を定量化する。
【０２８８】
詳細には、５’−ＰＣＲプライマー５’−ＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＡＧＡＴＣＴＴＧＴＡＧＣ−３’および３’−ＰＣＲプライマー５’−ＧＡＡＴＴＣＧＴＧＡＡＣＡＣＡＴＴＴＡＡＴＴＡＣＣＡ−３’を用いることにより、人工的なコザック(kozak)配列およびリンカー配列を有するｃｇＦＡＩＭを作出する。下線の配列はＥｃｏＲＩ制限部位を構成し、イタリック体の配列はＦＡＩＭの「インフレームでの」発現を円滑にする人工的なコザック配列を構成する。組込まれたｃｇＦＡＩＭ領域は太字で示してある。
【０２８９】
ＰＣＲ反応混合物にはｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ ｃｇＦＡＩＭ鋳型 １μＬ、１×反応緩衝液、２００μＭの各ｄＮＴＰ、２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１μＭの各プライマーおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ混合物（計５Ｕ）を含めた。ＰＣＲ条件は９４℃５分、その後９４℃１分、４４℃１分および７２℃２分を６０サイクルならびに７２℃で１０分間の最終伸長である。
【０２９０】
次いで、確認済みＰＣＲ産物を３７℃にておよそ４時間ＥｃｏＲＩ制限酵素で消化して、さらなるライゲーションのための付着末端を有するｃｇＦＡＩＭインサートを作出する。空のｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Invitrogen）を同様に、３７℃にておよそ４時間ＥｃｏＲＩ制限酵素で消化する。次いで、インサート１２μＬをベクター３μＬ、Ｄｎａｓｅを含まない水２μＬ、１０×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Invitrogen）２μＬおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（３Ｕ／μＬ）（Invitrogen）１μＬに加えることにより、ＥｃｏＲＩ消化済みｃｇＦＡＩＭインサートをＥｃｏＲＩ消化済みｐｃＤＮＡ３．１（＋）にライゲーションする。次いで、このライゲーション混合物を室温でおよそ１６時間インキュベートする。
【０２９１】
次いで、ライゲーション混合物１０μＬをプラスミド増殖のためコンピテントなＤＨ５α細菌細胞に形質転換する。選択用にアンピシリンの入ったＬＢ寒天プレートで培養することにより、陽性の形質転換体を選択する。次いで、配列決定のためプラスミド抽出を種々のＤＨ５αクローンについて行って、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）発現ベクターに挿入されたｃｇＦＡＩＭ配列を確認する。次いで、確認済みのクローン由来のプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｃｇＦＡＩＭをマキシプラスミド精製キット(Qiagen, Hilden, Germany)により精製し、ＣＨＯ ＩＦＮ−γへのトランスフェクションのため、その濃度を定量化する。
【０２９２】
実施例９．チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）ＦＡＤＤドミナントネガティブ発現ベクター構築
５’−ＰＣＲプライマー５’−ＧＡＴＡＴＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣ−ＡＴＧＧＣＣＴＴＴＧＡＣＡＴＴＧＴＡＴＧＣＧＡＣＡＡＴＧＴＧＧＧＧ−３’および３’−ＰＣＲプライマー５’−ＣＣＣＧＧＧ−ＣＴＣＧＡＧＴＧＣＣＴＣＣＣ−ＴＴＣＣＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧ−３’を用いることにより、コザック配列を有する人工的なＦＡＤＤドミナントネガティブ（ＦＡＤＤ ＤＮ）断片を作出する。下線の配列はそれぞれＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位を構成し、イタリック体の配列はｃｇＦＡＤＤドミナントネガティブの「インフレームでの」発現を円滑にする人工的なコザックおよび開始コドンを構成する。組込まれたｃｇＦＡＤＤコード領域は太字で示してある。
【０２９３】
ＰＣＲ反応混合物には鋳型ｃＤＮＡ １μＬ、１×反応緩衝液、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１μＭの各プライマーおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ混合物（計５Ｕ）が含まれる。ｐＣＲ(登録商標)−ＴＯＰＯ(登録商標)にサブクローニングされた部分的ＦＡＤＤ配列を鋳型として使用する。ＰＣＲ条件は９４℃５分、その後９４℃１分、５０℃１分および７２℃２分を３１サイクルならびに７２℃で１０分間の最終伸長である。
【０２９４】
次いで、確認済みＰＣＲ産物を３７℃にておよそ４時間ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で消化して、さらなるライゲーションのための付着末端を有するｃｇＦＡＤＤ ＤＮインサートを作出する。空のｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Invitrogen）を同様に、３７℃にておよそ４時間ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で消化する。次いで、インサート１２μＬをベクター３μＬ、Ｄｎａｓｅを含まない水２μＬ、１０×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Invitrogen）２μＬおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（３Ｕ／μＬ）（Invitrogen）１μＬに加えることにより、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ消化済みｃｇＦＡＤＤ ＤＮインサートをＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ消化済みｐｃＤＮＡ３．１（＋）にライゲーションする。次いで、このライゲーション混合物を室温でおよそ１６時間インキュベートする。
【０２９５】
次いで、ライゲーション混合物１０μＬをプラスミド増殖のためコンピテントなＤＨ５α細菌細胞に形質転換する。選択用にアンピシリンの入ったＬＢ寒天プレートで培養することにより、陽性の形質転換体を選択する。次いで、配列決定のためプラスミド抽出を種々のＤＨ５αクローンについて行って、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）発現ベクターに挿入されたｃｇＦＡＤＤ ＤＮ配列を確認する。次いで、確認済みのクローン由来のプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＦＡＤＤドミナントネガティブをマキシプラスミド精製キット(Qiagen, Hilden, Germany)により精製し、ＣＨＯ ＩＦＮ−γへのトランスフェクションのため、その濃度を定量化する。
【０２９６】
実施例１０．チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）ＰＤＣＤ６抑制ベクター構築
得られたｃｇＰＤＣＤ６配列に基づいて、オリゴインサートをデザインする。ＢＬＡＳＴを利用しオリゴインサートのデザインをゲノムデータベースと比較して、その他の遺伝子に対する何らかの顕著な相同性を排除する。５’オリゴインサート５’−ＧＡＴＣＣＣＧＴＧＡＧＣＴＴＣＡＧＣＡＡＧＣＡＴＴＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＡＡＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＡＧＣ−ＴＣＡＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡ−３’を３’オリゴインサート５’−ＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＴＧＡＧＣＴＴＣＡＧＣＡＡＧＣＡＴＴＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＡＡＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＣＡＣＧ−３’にアニーリングし、次いで合成し、その後ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｇｌＩＩ消化済みのｐＳＵＰＥＲ．ｎｅｏベクター（OligoEngine, Seattle, WA）にライゲーションする。
【０２９７】
アニーリング済みのオリゴインサート４μＬをＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｇｌＩＩ消化済みのｐＳＵＰＥＲ．ｎｅｏ ３μＬ、Ｄｎａｓｅを含まない水１３μＬ、１０×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Invitrogen）２μＬおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（３Ｕ／μＬ）（Invitrogen）１μＬに加える。次いで、このライゲーション混合物を室温でおよそ１６時間インキュベートする。
【０２９８】
次いで、ライゲーション混合物１０μＬをプラスミド増殖のためコンピテントなＤＨ５α細菌細胞に形質転換する。選択用にアンピシリンの入ったＬＢ寒天プレートで培養することにより、陽性の形質転換体を選択する。次いで、配列決定のためプラスミド抽出を種々のＤＨ５αクローンについて行って、ｐＳＵＰＥＲ．ｎｅｏ発現ベクターに挿入されたｃｇＰＤＣＤ６ ｓｉＲＮＡ配列を確認する。次いで、確認済みのクローン由来のプラスミドｐＳＵＰＥＲ．ｎｅｏ ｃｇＰＤＣＤ６ ｓｉＲＮＡをマキシプラスミド精製キット(Qiagen, Hilden, Germany)により精製し、ＣＨＯ ＩＦＮ−γへのトランスフェクションのため、その濃度を定量化する。
【０２９９】
実施例１１．チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）Ｒｅｑｕｉｅｍ抑制ベクター構築
得られたｃｇＲｅｑｕｉｅｍ配列に基づいて、オリゴインサートをデザインする。５’オリゴインサート５’−ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＧＡＡＣＣＴＧＡＴＴＴＣＡＡＧＡＧＡＡＴＣＡＧＧＴＴＣＡＡＧＧＡＴＣＣＧＣ−ＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡ−３’を３’オリゴインサート５’−ＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＧＡＡＣＣＴＧＡＴＴＣＴＣＴＴＧＡＡＡＴＣＡＧＧＴＴＣＡＡＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧ−３’にアニーリングし、その後ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩＩ消化済みのｐＳＵＰＥＲ．ｎｅｏベクター（OligoEngine, Seattle, WA）にライゲーションする。
【０３００】
アニーリング済みのオリゴインサート４μＬをＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｇｌＩＩ消化済みのｐＳＵＰＥＲ．ｎｅｏ ３μＬ、Ｄｎａｓｅを含まない水１３μＬ、１０×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Invitrogen）２μＬおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（３Ｕ／μＬ）（Invitrogen）１μＬに加える。次いで、このライゲーション混合物を室温でおよそ１６時間インキュベートする。
【０３０１】
次いで、ライゲーション混合物１０μＬをプラスミド増殖のためコンピテントなＤＨ５α細菌細胞に形質転換する。選択用にアンピシリンの入ったＬＢ寒天プレートで培養することにより、陽性の形質転換体を選択する。次いで、配列決定のためプラスミド抽出を種々のＤＨ５αクローンについて行って、ｐＳＵＰＥＲ．ｎｅｏ発現ベクターに挿入されたｃｇＲｅｑｕｉｅｍ ｓｉＲＮＡ配列を確認する。次いで、確認済みのクローン由来のプラスミドｐＳＵＰＥＲ．ｎｅｏ ｃｇＲｅｑｕｉｅｍ ｓｉＲＮＡをマキシプラスミド精製キット(Qiagen, Hilden, Germany)により精製し、ＣＨＯ ＩＦＮ−γへのトランスフェクションのため、その濃度を定量化する。
【０３０２】
実施例１２．トランスフェクションおよび選択
トランスフェクションはリポフェクトアミン試薬（Invitrogen）を用いて行う。１ウェル当たり細胞５０万個の入った６ウェルプレート中にて細胞を一晩培養し、翌日、１ウェル当たり線状化プラスミドおよそ１μｇでトランスフェクトする。リポフェクトアミン−ＤＮＡ複合体を製造元の使用説明書にしたがい、リポフェクトアミン（μＬ）：ＤＮＡ（μｇ）の比率３：１で調製する。
【０３０３】
安定な細胞を作出するため、細胞を２４時間増殖させた後、培地を１０００μｇ／ｍＬのジェネテシン入りの選択培地に交換する。細胞を選択培地中で４週間維持する。この場合、選択培地中の非トランスフェクト細胞は１週間以内に死滅した。
【０３０４】
実施例１２Ａ．安定に組込まれた単一の細胞クローン
各ウェル中に１個の細胞しか存在しないように９６ウェルプレートの中で細胞を連続希釈することにより、安定に組込まれた単一の細胞クローンを得る。ウェルを光学顕微鏡下で調べ、単一の細胞しか含まないウェルに印を付ける。次いで、振盪フラスコ培養に入る前に、単一のクローンを２４ウェルプレート、その後６ウェルプレートの中で増殖させる。
【０３０５】
実施例１２Ｂ．バッチ培養およびフェドバッチ培養
５．０Ｌのバイオリアクター（B. Braun, Melsungen, Germany）中にて、培地４．０Ｌの初期作業量に細胞２．５×１０５個／ｍＬの播種密度で植菌する。バッチ培養は２０ｍＭグルコースおよび４ｍＭグルタミンを添加したグルコース／グルタミン不含のＨｙＱ ＣＨＯ ＭＰＳ培地（Hyclone, Logan, UT）を用いて行い、フェドバッチ培養では４ｍＭグルコースおよび０．５ｍＭグルタミンを添加する。溶存酸素濃度を５０％空気飽和度で維持し、ガス混合物への断続的なＣＯ２付加および／または７．５％ （ｗ／ｖ）のＮａＨＣＯ３溶液（Sigma）によって培養ｐＨを７．１５で維持する。
【０３０６】
フェドバッチ操作は、改良されたオンライン動的供給方式によって行う（Lee et al., 2003）。該当する制御栄養水準の濃度のオンラインモニタリングを、自動化された無菌的オンラインサンプリングループにより１．５時間毎に行う。フェドバッチ培養用の基礎供給培地は、１０ｇ／Ｌの大豆タンパク質加水分解物であるＨｙｓｏｙ（Quest International, Hoffman Estate, IL）、１０ｍＬ／Ｌの既知組成の脂質（Gibco BRL, Grand Island, NY）、１ｍｇ／Ｌのｄ−ビオチン（Sigma）、２ｍＭ Ｌ−アスパラギン酸、２ｍＭ Ｌ−アスパラギン、４ｍＭ Ｌ−システイン、１ｍＭ Ｌ−グルタミン酸、１ｍＭ Ｌ−メチオニンおよび５ｍＭ Ｌ−セリン（Sigma）を添加した１×塩（Hyclone）入りの特別に配合された１０×無カルシウム、無グルコースおよび無グルタミンＤＭＥＭ／Ｆ１２から調製する。
【０３０７】
基礎供給培地に１００ｍＭのグルタミン（Sigma）および５００ｍＭのグルコース（Sigma）をさらに添加する。１．５時間毎に、残存するグルタミン濃度の自動オンライン測定を行う。残存するグルタミン濃度が設定した制御濃度を下回るなら、供給注入を供給培地に行い、培養グルタミン濃度を０．３ｍＭにまで上昇させる。
【０３０８】
実施例１３．リアルタイムＰＣＲを用いた遺伝子発現定量化
およそ１０００万個の細胞を安定な細胞から回収し、全ＲＮＡをトリゾールＴＭ試薬（Invitrogen）によって抽出する。次いで、ＲＮＡサンプルをＧｅｎｅＱｕａｎｔＴＭ Ｐｒｏ ＲＮＡ／ＤＮＡ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）によって定量化する。ＲＮＡの品質を２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度比によって評価し、この場合１．８およびそれを超える比であれば、十分な純度のＲＮＡサンプルと考えられる。
【０３０９】
定量的リアルタイムＰＣＲを用いて、トランスフェクション実験後の対象となる遺伝子の相対的な過剰発現または抑制を確認する。転写産物のコピーの標準曲線を作出するため、ＦＡＩＭ、ＦＡＤＤ、ＰＤＣＤ６またはＲｅｑｕｉｅｍのいずれかを保持する定量化済みのｐＣＲ(登録商標)−ＴＯＰＯ(登録商標)（Invitrogen）プラスミドを連続的に希釈し、定量的リアルタイムＰＣＲに使用する。
【０３１０】
ＦＡＩＭ転写産物に対する定量的リアルタイムＰＣＲは、５’−プライマー５’−ＴＧＧＡＧＣＴＧＣＧＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧ−３’および３’−プライマー５’−ＡＡＡＣＴＣＧＣＣＴＧＣＴＧＴＣＴＣＣＡＴ−３’を用いて行う。ＦＡＤＤドミナントネガティブ転写産物に対する定量的リアルタイムＰＣＲは、５’−プライマー５’−ＧＡＴＡＴＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧ−３’および３’−プライマー５’−ＴＧＣＣＴＣＣＣＴＴＣＣＡＣＣＡＧ−ＧＴＣＡＧ−３’を用いて行う。ＰＤＣＤ６転写産物に対する定量的リアルタイムＰＣＲは、５’−プライマー５’−ＣＡＧＣＧＧＧＴＴＧＡＴＡＡＡＧＡＣＡＧＧ−３’および３’−プライマー５’−ＧＣＣＡＧＣＣＴＴＧ−ＴＴＴＴＣＴＣＧＧ−３’を用いて行う。Ｒｅｑｕｉｅｍ転写産物に対する定量的リアルタイムＰＣＲは、５’−プライマー５’−ＴＧＧＡＧＴＡＧＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＴＴＧ−３’および３’−プライマー５’−ＴＣＧＡＣＧＣＴＴＴＴＴＡＣＧＣＣＡＧ−３’を用いて行う。
【０３１１】
次いで、各サンプルをβ−アクチン転写産物の発現に対して標準化する。β−アクチン転写産物に対する定量的リアルタイムＰＣＲは、５’−プライマー５’−ＡＧＣＴＧＡＧＡＧＧＧＡＡＡＴＴＧＴＧＣＧ−３’および３’−プライマー５’−ＧＣＡＡＣＧＧ−ＡＡＣＣＧＣＴＣＡＴＴ−３’を用いて行う。最後に、トランスフェクト細胞での標準化された定量的遺伝子発現を、空ベクターによるトランスフェクト細胞での標準化された定量的遺伝子発現で割って、標準化された相対的遺伝子発現を得る。
【０３１２】
実施例１４．アポトーシスアッセイ
エチジウムブロマイド／アクリジンオレンジアッセイを用いて、回収されたサンプル中の細胞をアポトーシス集団または非アポトーシス集団に分類する。１００μｇ／ｍＬのエチジウムブロマイド（Sigma）およびアクリジンオレンジ（Sigma）のストック溶液はＰＢＳ溶液（Sigma）中で調製する。
【０３１３】
細胞およそ１×１０６個をサンプルからサンプリングし、１：１のエチジウムブロマイド：アクリジンオレンジストック溶液１００μＬに再懸濁し、室温で５分間インキュベートする。次いで、サンプルをスライドガラスに載せて、細胞およそ４００個を蛍光顕微鏡下で調べる。
【０３１４】
次いで、核凝縮のアポトーシス形態を有する細胞をそれに応じて分類する。形態学的分析に加え、ＢＤ ＡｐｏＡｌｅｒｔＴＭカスパーゼアッセイプレート（BD Biosciences Clontech, CA）を製造元のプロトコルに従って利用し、カスパーゼ２、３、８および９活性を測定する。カスパーゼの活性化は、アポトーシスの生化学的特徴とみなす。
【０３１５】
実施例１５．ＩＦＮ−γ定量化
連続的に希釈された上清サンプルのＩＦＮ−γ濃度を酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）アッセイ（HyCult Biotechnology, Uden, Netherlands）によって分析する。高生存率（＞９５％）の間におよび低生存率（７０〜８０％）の間に最大のＩＦＮ−γ濃度を有していたサンプルを、免疫アフィニティー精製およびさらなるＮ−糖化の特徴づけにまわす。
【０３１６】
実施例１６．遺伝子発現検出のためのリアルタイムＰＣＲ
細胞での標的化遺伝子の発現を判定するため、定量的リアルタイムＰＣＲを行う。リアルタイムＰＣＲは、転写産物レベルの検出には高感度な方法と考えられる。
【０３１７】
遺伝子発現分析により、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｆａｉｍでトランスフェクトされた細胞は空のｐｃＤＮＡ３．１（＋）でトランスフェクトされた細胞よりも３倍ＦＡＩＭを過剰発現することが示される（図１）。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＦＡＤＤドミナントネガティブでトランスフェクトされた細胞は、最大で４倍までＦＡＤＤドミナントネガティブを過剰発現する（図１）。図１のデータからは、遺伝子発現を抑制するのに効果的にｓｉＲＮＡを利用できることも示される。ｐＳＵＰＥＲ ＰＤＣＤ６ ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションは、およそ６０％だけＰＤＣＤ６発現の抑制をもたらし、その一方、ｐＳＵＰＥＲ Ｒｅｑｕｉｅｍ ｓｉＲＮＡは最大で７０％までＲｅｑｕｉｅｍ発現を抑制することができる（図１）。
【０３１８】
実施例１７．チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）ＦＡＩＭの遺伝子標的化によって付与されるアポトーシス耐性
細胞をＦＡＩＭ発現ベクター（実施例８）および対照として空のベクターでトランスフェクトし、アポトーシスに対する耐性をアッセイする。
【０３１９】
空のベクターのみでトランスフェクトされた細胞に比べて、ＦＡＩＭを過剰発現する細胞は長時間にわたって高い生存細胞密度を維持することができる（図２Ａ）。ＦＡＩＭの過剰発現を伴う細胞はまた、生存率が９５％を下回り始める前に少なくとも２４時間の生存率の顕著な延長を示す（図２Ｂ）。アポトーシス細胞の割合はまた、ＦＡＩＭの過剰発現を伴わない対照細胞のものよりも顕著に低い（図２Ｄ）。カスパーゼ２および３活性の増大も対照細胞に比べておよそ２４時間遅延される（図６Ｂ）。このことから、ＦＡＩＭの過剰発現は、細胞培養過程においてアポトーシスを抑制するうえで非常に効果的でありうることが示される。
【０３２０】
実施例１８．チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）ＦＡＤＤの遺伝子標的化によって付与されるアポトーシス耐性
細胞をＦＡＤＤ発現ベクター（実施例９）および対照として空のベクターでトランスフェクトし、アポトーシスに対する耐性をアッセイする。
【０３２１】
空のベクターのみでトランスフェクトされた細胞に比べて、ＦＡＤＤドミナントネガティブを過剰発現する細胞は長時間にわたって高い生存細胞密度を維持することができる（図３Ａ）。ＦＡＤＤドミナントネガティブの過剰発現を伴う細胞はまた、生存率が９５％を下回り始める前におよそ２４時間の生存率の顕著な延長を示す（図３Ｂ）。アポトーシス細胞の割合もまた、ＦＡＩＭの過剰発現を伴わない対照細胞のものよりも顕著に低い（図３Ｄ）。カスパーゼ２、３および８活性の増大も顕著に遅延される（図６Ｃ）。このデータから、カスパーゼ２および８活性しか培養の１４４時間後に増大せず、その一方、カスパーゼ３活性の増大は顕著に抑制されることが示された。このことから、ＦＡＤＤシグナル伝達の標的化は、細胞培養過程においてアポトーシスを効果的に抑制することが示される。
【０３２２】
実施例１９．チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）ＰＤＣＤ６の遺伝子標的化によって付与されるアポトーシス耐性
細胞をＰＤＣＤ６発現ベクター（実施例１０）および対照として空のベクターでトランスフェクトし、アポトーシスに対する耐性をアッセイする。
【０３２３】
空のｓｉＲＮＡベクターのみでトランスフェクトされた細胞に比べて、ＰＤＣＤ６の抑制を伴う細胞は長時間にわたって高い生存細胞密度を維持することができる（図４Ａ）。ＰＤＣＤ６の抑制を伴う細胞はまた、生存率喪失の速度の顕著な減少を示す（図４Ｂ）。アポトーシス細胞の割合もまた、ＰＤＣＤ６の抑制を伴わない対照細胞のものよりも顕著に低い（図４Ｄ）。カスパーゼ２、３、８および９活性の増大も顕著に遅延される（図６Ｄ）。このデータから、カスパーゼ２、３および８活性しか培養の１４４時間後に増大せず、その一方、カスパーゼ９活性は常に基準点に満たないことが示された。このことから、ＰＤＣＤ６シグナル伝達の標的化は、細胞培養過程においてアポトーシスを効果的に抑制しうることが示される。
【０３２４】
実施例２０．チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）Ｒｅｑｕｉｅｍの遺伝子標的化によって付与されるアポトーシス耐性
細胞をＲｅｑｕｉｅｍ発現ベクター（実施例１１）および対照として空のベクターでトランスフェクトし、アポトーシスに対する耐性をアッセイする。
【０３２５】
空のｓｉＲＮＡベクターのみでトランスフェクトされた細胞に比べて、Ｒｅｑｕｉｅｍの抑制を伴う細胞は長時間にわたって高い生存細胞密度を維持することができる（図５Ａ）。Ｒｅｑｕｉｅｍの抑制を伴う細胞はまた、生存率喪失の速度の顕著な減少を示す（図５Ｂ）。アポトーシス細胞の割合はまた、Ｒｅｑｕｉｅｍの抑制を伴わない対照細胞のものよりも顕著に低い（図５Ｄ）。カスパーゼ２、３、および９活性の増大も顕著に遅延される（図６Ｅ）。このデータから、カスパーゼ活性が対照のものよりも顕著に低いことが示された。このことから、Ｒｅｑｕｉｅｍシグナル伝達の標的化は、細胞培養過程においてアポトーシスを効果的に抑制しうることが示される。
【０３２６】
実施例２１．組換えタンパク質回収量の改善
図７は、遺伝子標的化が最終生成物の回収量という点で細胞培養過程を改善することを示している。
【０３２７】
ＦＡＩＭの過剰発現を伴う細胞では、対照細胞で見られる典型的な回収量２．３ｍｇ／Ｌに比べて最大で３．３ｍｇ／Ｌのインターフェロンγ回収量が可能になる（図７Ａ）。
【０３２８】
ＦＡＤＤシグナル伝達の標的化では、最大で５．０ｍｇ／Ｌまでのインターフェロンγ回収濃度がさらに可能となり、２００％を超える増加が示される（図７Ｂ）。
【０３２９】
ＰＤＣＤ６およびＲｅｑｕｉｅｍの抑制では、インターフェロンγの回収量をそれぞれ４．２ｍｇ／Ｌおよび５．８ｍｇ／Ｌにまで改善することが可能になる。
【０３３０】
最終的な組換えタンパク質回収量の効果的な増大に加えて、アポトーシス誘導に対する遺伝子操作細胞の強さの増大から、ＦＡＤＤ、ＦＡＩＭ、ＰＤＣＤ６およびＲｅｑｕｉｅｍの遺伝子標的化は、細胞培養系でのバイオ療法薬の産生を向上させるのに効果的な新規の戦略であることが示される。
【０３３１】
実施例２２．フェドバッチ培養での生存率上昇に加えた生存培養密度の上昇
遺伝子操作されたアポトーシス耐性細胞株が、異なるバッチおよびフェドバッチ・ストレス／栄養環境下のフェドバッチ培養で果たす能力を判定するために実験を行う。
【０３３２】
図８Ａは、ＲｅｑｕｉｅｍまたはＰＤＣＤ６の抑制を安定に組み入れられたＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞株の生存細胞密度を示す。ＰＤＣＤ６およびＲｅｑｕｉｅｍの抑制により、フェドバッチ培養の間の生存細胞密度の顕著な増大が可能になる。
【０３３３】
細胞９×１０６個／ｍＬもの高い生存細胞密度を、いずれのアポトーシス標的化も伴わない細胞で典型的に見られる細胞５×１０６個／ｍＬに比して達成することができる。
【０３３４】
ＦＡＤＤ ＤＮまたはＦＡＩＭの過剰発現を示す安定に組み入れられたＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞株で実験を繰り返すと、類似の結果が確認される。
【０３３５】
このことから、ＲｅｑｕｉｅｍもしくはＰＤＣＤ６の抑制またはＦＡＩＭおよびＦＡＤＤ ＤＮの過剰発現によるアポトーシス耐性の遺伝子工学的改変は、培養生存率の上昇を可能にするだけでなく、細胞増殖を阻害する要因に対抗するその強さに起因して、はるかに高い生存細胞密度にまで増殖する能力も付与することが実証される。
【０３３６】
実施例２３．フェドバッチ培養での組換えタンパク質回収量の増大
図９Ａは、遺伝子標的化によってインターフェロンγの産生および回収量のさらに顕著な改善が可能になることを示す。
【０３３７】
ＲｅｑｕｉｅｍまたはＰＤＣＤ６が安定に抑制された細胞は、それぞれ最大で４９μｇ／ｍＬおよび４１μｇ／ｍＬまでのインターフェロンγ回収量を、通常のフェドバッチ培養で見られる典型的な２０μｇ／ｍＬに比してもたらす。これは組換えタンパク質回収量の２００％を超える改善に当たる。
【０３３８】
ＦＡＩＭを過剰発現する細胞で実験を繰り返すと、類似の結果が認められる。
【０３３９】
実施例２４．改変ＣＨＯ細胞株での組換えヒトＩＦＮ−γのシアル化上昇−シアル酸含量アッセイ
ＩＦＮ−γを発現する改変ＣＨＯ細胞株を、前述のように親のＣＨＯ細胞株から産生する。
【０３４０】
対数増殖中期の時点でならびに最大のＩＦＮ−γ濃度が高生存率（＞９５％）の間におよび低生存率（７０〜８０％）の間に検出される時点で回収されたサンプルから、組換えＩＦＮ−γを精製する。
【０３４１】
次いで、ＩＦＮ−γのシアル酸含量をWong et al. (2005a), Biotechnol Bioeng 89: 164-177)に記述されている改変チオバルビツール酸アッセイによって測定する。
【０３４２】
実施例２５．改変ＣＨＯ細胞株での組換えヒトＩＦＮ−γのシアル化上昇−結果
図１０は、改変ＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞株および親ＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞株に対しフェドバッチ培養の間の３つの時点で、すなわち、対数期中期（＞９５％生存率）、静止期（＞９５％生存率）および死滅期（７０〜８０％生存率）の時点で回収された組換えヒトＩＦＮ−γのシアル化を示す。
【０３４３】
後者の場合、組換えヒトＩＦＮ−γのシアル酸含量は、培養が対数期中期（２．９モルＳＡ／モルＩＦＮ−γ）〜静止期（２．３モルＳＡ／モルＩＦＮ−γ）〜死滅期（２．１モルＳＡ／モルＩＦＮ−γ）へ進行するにつれて減少した。
【０３４４】
対照的に、４つの改変ＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞株に対してその３時点で回収されたＩＦＮ−γのシアル酸含量は維持されており、２．７〜３．５モルＳＡ／モルＩＦＮ−γに及ぶシアル化の増大さえ示した。
【０３４５】
これらの結果から、アポトーシス耐性ＣＨＯ細胞の別の潜在的利益は、培養生存率の喪失（７０〜８０％）にかかわらず、長期培養時間にわたるタンパク質糖化の特質の維持／増強であることが示される。これはバイオ療法薬の製造に使われる細胞株にとって別個の利点である。シアル化度の低下はタンパク質に基づく薬物のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を減少しうるからである（Varki, 1993, Biotechnol Bioeng 43:423-428; Gramer et al., 1995, Glycobiology 3:97-130）。
【０３４６】
引用文献
2008526200.tif 000007
2008526200.tif 000008
2008526200.tif 000009
2008526200.tif 000010
本明細書中で言及した各特許出願および特許、各特許出願および特許（各特許出願および特許の審査経過中を含む）で引用または参照されている各文献（「出願引用文献」）、ならびに各特許出願および特許で、また出願引用文献のいずれかで引用または言及されているいずれの製品についての製造者による説明書もしくはカタログも、参照により本明細書中に組み入れられる。さらに、本明細書中で引用したすべての文献、本明細書中で引用した文献で引用または参照されているすべての文献、ならびに本明細書中で引用または言及したいずれの製品についての製造者による説明書もしくはカタログも、参照により本明細書中に組み入れられる。
【０３４７】
本発明に係る記載の方法および系の種々の改変および変形が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者には明らかであろう。本発明を具体的な好ましい実施形態との関連で記載してきたが、特許を受けようとする発明はそのような具体的な実施形態に不当に限定されるべきでないことは理解されるはずである。実際に、分子生物学または関連分野の当業者に自明な、本発明を実施するための記載の様式の種々の改変は、特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０３４８】
【図１−１】対応する構築体でトランスフェクトされた細胞での、ＦＡＤＤドミナントネガティブおよびＦＡＩＭの過剰発現ならびにＲｅｑｕｉｅｍおよびＰＤＣＤ６発現の抑制を示すグラフである。
【図１−２】対応する構築体でトランスフェクトされた細胞での、ＦＡＤＤドミナントネガティブおよびＦＡＩＭの過剰発現ならびにＲｅｑｕｉｅｍおよびＰＤＣＤ６発現の抑制を示すグラフである。
【図２Ａ】ＦＡＩＭを過剰発現するＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞の増殖速度を示すグラフである。図２Ａは生存細胞密度（細胞／ｍＬ）を時間に対して示す。
【図２Ｂ】ＦＡＩＭを過剰発現するＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞の増殖速度を示すグラフである。図２Ｂは全細胞密度を時間に対して示す。
【図２Ｃ】ＦＡＩＭを過剰発現するＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞の増殖速度を示すグラフである。図２Ｃは生存率を時間に対して示す。細胞培養生存率の喪失は、アポトーシス細胞の顕著な減少によって（図２Ｄ）対照細胞に比べＦＡＩＭの過剰発現で顕著に低減される（図２Ｃ）。
【図２Ｄ】ＦＡＩＭを過剰発現するＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞の増殖速度を示すグラフである。図２Ｄはアポトーシス細胞を時間に対して示す。細胞培養生存率の喪失は、アポトーシス細胞の顕著な減少によって（図２Ｄ）対照細胞に比べＦＡＩＭの過剰発現で顕著に低減される（図２Ｃ）。
【図３Ａ】ＦＡＤＤドミナントネガティブを過剰発現するＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞の増殖速度を示すグラフである。図３Ａは生存細胞密度（細胞／ｍＬ）を時間に対して示す。
【図３Ｂ】ＦＡＤＤドミナントネガティブを過剰発現するＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞の増殖速度を示すグラフである。図３Ｂは全細胞密度を時間に対して示す。
【図３Ｃ】ＦＡＤＤドミナントネガティブを過剰発現するＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞の増殖速度を示すグラフである。図３Ｃは生存率を時間に対して示す。細胞培養生存率の喪失は、アポトーシス細胞の顕著な減少によって（図３Ｄ）対照細胞に比べＦＡＤＤドミナントネガティブの過剰発現で顕著に低減される（図３Ｃ）。
【図３Ｄ】ＦＡＤＤドミナントネガティブを過剰発現するＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞の増殖速度を示すグラフである。図３Ｄはアポトーシス細胞を時間に対して示す。細胞培養生存率の喪失は、アポトーシス細胞の顕著な減少によって（図３Ｄ）対照細胞に比べＦＡＤＤドミナントネガティブの過剰発現で顕著に低減される（図３Ｃ）。
【図４Ａ】ＰＤＣＤ６の抑制を伴うＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞の増殖速度を示すグラフである。図４Ａは生存細胞密度（細胞／ｍＬ）を時間に対して示す。
【図４Ｂ】ＰＤＣＤ６の抑制を伴うＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞の増殖速度を示すグラフである。図４Ｂは全細胞密度を時間に対して示す。
【図４Ｃ】ＰＤＣＤ６の抑制を伴うＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞の増殖速度を示すグラフである。図４Ｃは生存率を時間に対して示す。細胞培養生存率の喪失は、アポトーシス細胞の顕著な減少によって（図４Ｄ）対照細胞に比べＰＤＣＤ６が抑制される場合に顕著に低減される（図４Ｃ）。
【図４Ｄ】ＰＤＣＤ６の抑制を伴うＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞の増殖速度を示すグラフである。図４Ｄはアポトーシス細胞を時間に対して示す。細胞培養生存率の喪失は、アポトーシス細胞の顕著な減少によって（図４Ｄ）対照細胞に比べＰＤＣＤ６が抑制される場合に顕著に低減される（図４Ｃ）。
【図５Ａ】Ｒｅｑｕｉｅｍの抑制を伴うＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞の増殖速度を示すグラフである。図５Ａは生存細胞密度（細胞／ｍＬ）を時間に対して示す。
【図５Ｂ】Ｒｅｑｕｉｅｍの抑制を伴うＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞の増殖速度を示すグラフである。図５Ｂは全細胞密度を時間に対して示す。
【図５Ｃ】Ｒｅｑｕｉｅｍの抑制を伴うＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞の増殖速度を示すグラフである。図５Ｃは生存率を時間に対して示す。細胞培養生存率の喪失は、アポトーシス細胞の顕著な減少によって（図５Ｄ）対照細胞に比べＲｅｑｕｉｅｍが抑制される場合に顕著に低減される（図５Ｃ）。
【図５Ｄ】Ｒｅｑｕｉｅｍの抑制を伴うＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞の増殖速度を示すグラフである。図５Ｄはアポトーシス細胞を時間に対して示す。細胞培養生存率の喪失は、アポトーシス細胞の顕著な減少によって（図５Ｄ）対照細胞に比べＲｅｑｕｉｅｍが抑制される場合に顕著に低減される（図５Ｃ）。
【図６Ａ】ＣＨＯ細胞培養でのカスパーゼ２、３、８および９の活性を示すグラフである。ＦＡＩＭ、ＦＡＤＤドミナントネガティブ、ＰＤＣＤ６またはＲｅｑｕｉｅｍの遺伝子標的化では、培養においてカスパーゼ活性を抑制し、かつ／または遅延させることができる。図６Ａは対照でトランスフェクトされた細胞でのカスパーゼ活性を示す。
【図６Ｂ】ＣＨＯ細胞培養でのカスパーゼ２、３、８および９の活性を示すグラフである。ＦＡＩＭ、ＦＡＤＤドミナントネガティブ、ＰＤＣＤ６またはＲｅｑｕｉｅｍの遺伝子標的化では、培養においてカスパーゼ活性を抑制し、かつ／または遅延させることができる。図６ＢはＦＡＩＭを過剰発現する細胞でのカスパーゼ活性を示す。
【図６Ｃ】ＣＨＯ細胞培養でのカスパーゼ２、３、８および９の活性を示すグラフである。ＦＡＩＭ、ＦＡＤＤドミナントネガティブ、ＰＤＣＤ６またはＲｅｑｕｉｅｍの遺伝子標的化では、培養においてカスパーゼ活性を抑制し、かつ／または遅延させることができる。図６ＣはＦＡＤＤドミナントネガティブを過剰発現する細胞でのカスパーゼ活性を示す。
【図６Ｄ】ＣＨＯ細胞培養でのカスパーゼ２、３、８および９の活性を示すグラフである。ＦＡＩＭ、ＦＡＤＤドミナントネガティブ、ＰＤＣＤ６またはＲｅｑｕｉｅｍの遺伝子標的化では、培養においてカスパーゼ活性を抑制し、かつ／または遅延させることができる。図６ＤはＰＤＣＤ６の抑制を伴う細胞でのカスパーゼ活性を示す。
【図６Ｅ】ＣＨＯ細胞培養でのカスパーゼ２、３、８および９の活性を示すグラフである。ＦＡＩＭ、ＦＡＤＤドミナントネガティブ、ＰＤＣＤ６またはＲｅｑｕｉｅｍの遺伝子標的化では、培養においてカスパーゼ活性を抑制し、かつ／または遅延させることができる。図６ＥはＲｅｑｕｉｅｍの抑制を伴う細胞でのカスパーゼ活性を示す。
【図７Ａ】トランスフェクトされたＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞についてのインターフェロン−γ回収量を示すグラフである。図７ＡはＦＡＩＭを過剰発現する細胞でのインターフェロン−γ活性を示す。最大で３００％までのインターフェロンγ回収量の顕著な改善を遺伝子標的化法によって達成することができる。
【図７Ｂ】トランスフェクトされたＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞についてのインターフェロン−γ回収量を示すグラフである。図７ＢはＦＡＤＤドミナントネガティブを過剰発現する細胞でのインターフェロン−γ活性を示す。最大で３００％までのインターフェロンγ回収量の顕著な改善を遺伝子標的化法によって達成することができる。
【図７Ｃ】トランスフェクトされたＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞についてのインターフェロン−γ回収量を示すグラフである。図７ＣはＰＤＣＤ６の抑制を伴う細胞でのインターフェロン−γ活性を示す。最大で３００％までのインターフェロンγ回収量の顕著な改善を遺伝子標的化法によって達成することができる。
【図７Ｄ】トランスフェクトされたＣＨＯ ＩＦＮ−γ細胞についてのインターフェロン−γ回収量を示すグラフである。図７ＤはＲｅｑｕｉｅｍの抑制を伴う細胞でのインターフェロン−γ活性を示す。最大で３００％までのインターフェロンγ回収量の顕著な改善を遺伝子標的化法によって達成することができる。
【図８Ａ】フェドバッチ培養におけるＲｅｑｕｉｅｍもしくはＰＤＣＤ６抑制またはＦＡＤＤ ＤＮもしくはＦＡＩＭ＊過剰発現のいずれかを伴う安定なＣＨＯ ＩＦＮ−γクローンの生存細胞密度を示す（示されるデータは２回の二つ組の実験の平均である）。
【図８Ｂ】フェドバッチ培養におけるＲｅｑｕｉｅｍもしくはＰＤＣＤ６抑制またはＦＡＤＤ ＤＮもしくはＦＡＩＭ＊過剰発現のいずれかを伴う安定なＣＨＯ ＩＦＮ−γクローンの生存細胞密度を示す。
【図９Ａ】フェドバッチ培養におけるＲｅｑｕｉｅｍもしくはＰＤＣＤ６抑制またはＦＡＤＤ ＤＮ＊もしくはＦＡＩＭ＊過剰発現のいずれかを伴う安定なＣＨＯ ＩＦＮ−γクローンのインターフェロンγ回収量を示す（示されるデータは２回の二つ組の実験の平均である）。
【図９Ｂ】フェドバッチ培養におけるＲｅｑｕｉｅｍもしくはＰＤＣＤ６抑制またはＦＡＤＤ ＤＮ＊もしくはＦＡＩＭ＊過剰発現のいずれかを伴う安定なＣＨＯ ＩＦＮ−γクローンのインターフェロンγ回収量を示す。
【図１０】フェドバッチ培養の対数期中期、静止期および死滅期の間のＲｅｑｕｉｅｍもしくはＰＤＣＤ６抑制またはＦＡＤＤ ＤＮ＊もしくはＦＡＩＭ＊過剰発現のいずれかを伴う安定なＣＨＯ ＩＦＮ−γクローンにおける組換えＩＦＮ−γのシアル化を示す。
【図１−１】
2008526200.tif 000011
【図１−２】
2008526200.tif 000012
【図２Ａ】
2008526200.tif 000013
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
2008526200.tif 000017
【図３Ｂ】
2008526200.tif 000018
【図３Ｃ】
2008526200.tif 000019
【図３Ｄ】
2008526200.tif 000020
【図４Ａ】
2008526200.tif 000021
【図４Ｂ】
2008526200.tif 000022
【図４Ｃ】
2008526200.tif 000023
【図４Ｄ】
2008526200.tif 000024
【図５Ａ】
2008526200.tif 000025
【図５Ｂ】
2008526200.tif 000026
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
2008526200.tif 000029
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
2008526200.tif 000034
【図７Ｂ】
2008526200.tif 000035
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
2008526200.tif 000038
【図８Ｂ】
2008526200.tif 000039
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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