(57)【要約】  本発明は、関心対象の生物学的実体を含むと見込まれる流体中に懸濁される磁性粒子を操作するための方法に関し、この磁性粒子は関心対象の実体に結合することが可能であり、この流体はじょうご形状を備えた大きな上側区画、実質的に一定の断面を備えた細長の下側区画、および閉じた基底部で構成された反応容器内に含まれる。この方法は、ａ）磁性粒子を、容器の少なくとも上側区画にある前記磁性粒子すべてを流体から分離するために同時に印加される２つの磁界に晒す工程、ｂ）分離された磁性粒子を上側区画から細長の下側区画へと移す工程、ｃ）容器から流体を取り除く工程、ｄ）下側区画に洗浄用液体を加える工程、ｅ）下側区画にある磁性粒子すべてを洗浄するために流体の残りを、異なっていて変化する方向性を備えて連続的に印加される少なくとも２つの磁界に晒す工程、および前記下側区画内に前記磁性粒子を濃縮する工程で構成される。本発明によると、核酸のさらなる処理を可能にするような核酸の抽出のための方法に特に有用である。
2008507705.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
関心対象の生物学的実体を含むと見込まれる流体（１）中に懸濁される磁性粒子（２）を操作するための方法であり、磁性粒子（２）は関心対象の実体に結合することが可能であり、流体（１）はじょうご形状を備えた大きな上側区画（４）、実質的に一定の断面を備えた細長の下側区画（５および６）、および閉じた基底部（７）で構成された反応容器（３）内に含まれ、
ａ）磁性粒子（２）を、容器（３）の少なくとも上側区画（４）にある前記磁性粒子（２）すべてを流体（１）から分離するために同時に印加される２つの磁界に晒す工程、
ｂ）分離された磁性粒子（２）を上側区画（４）から細長の下側区画（５および６）へと移す工程、
ｃ）容器（３）から流体（１）を取り除く工程、
ｄ）下側区画（５および６）に洗浄用液体（２０）を加える工程、
ｅ）下側区画（５および６）にある磁性粒子（２）すべてを洗浄するために流体（１）の残りを、異なっていて変化する方向性を備えて連続的に印加される少なくとも２つの磁界に晒す工程、および
ｆ）前記下側区画（５および６）内に前記磁性粒子（２）を濃縮する工程で構成される方法。
【請求項２】
同時に印加される２つの磁界が少なくとも２つの磁石（９Ａと１０Ａ）によって作り出され、磁石（９Ａ、１０Ａ）の磁極軸（１１Ａまたは１２Ａ）が一緒に１８０°とは異なる、好ましくは３０°と１５０°の間に含まれ、さらに好ましくは６０°と１２０°の間に含まれる角度を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
連続的に印加される少なくとも２つの磁界が少なくとも２つの磁石（１３Ａと１４Ａ）によって作り出され、磁石（１３Ａ、１４Ａ）の磁極軸（１５Ａまたは１６Ａ）が互いに平行である、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
異なっていて変化する方向性を備えた連続的磁界が、磁石（１３Ａと１４Ａ）を容器（３）の位置に関して移動させることによって、および／または容器（３）を磁石（１３Ａと１４Ａ）の位置に関して移動させることによって容器（３）に印加される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも２つの磁石（９Ａと１３Ａ）および少なくとも２つの磁石（１０Ａと１４Ａ）が容器（３）の対向する両方の側に配置される、請求項２から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
磁石（９Ａ、１０Ａ、１３Ａ、１４Ａ）が１つの支持体と相互に支え合う、請求項２から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
分離用に意図された磁石と混合用に意図された磁石が同一である、請求項２から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
支持体が（分離から混合の構成へと通過するために）周囲回転方向で、および（混合工程を実現するために）各磁石を通り過ぎる心棒に沿って経線方向で移動させられることが可能であり、該心棒が請求項４に規定された移動と平行であり、磁石の磁極軸に直角である、請求項６と７両方の組合せによる方法。
【請求項９】
分離用に意図された磁石（９Ａと１０Ａ）と混合用に意図された磁石（１３Ａと１４Ａ）が異なる、請求項２から６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
下側区画が
磁界が連続的に印加される１つの中間区画（５）、および
磁性粒子（２）が濃縮される１つの底部区画（６）、
によって構成される、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に開示される工程e）と工程ｆ）の間に以下の中間工程、
ｅ１）分離されて混合された磁性粒子（２）を前記中間区画（５）から前記底部区画（６）へと移す工程、
ｅ２）容器（３）から洗浄用液体（２０）を取り除く工程、および
ｅ３）底部区画（６）に溶離バッファー（２１）を加える工程、
が実現される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
以下のさらなる工程、
ｇ）磁性粒子（２）を前記底部区画（６）から中間区画（５）または上側区画（４）へと移す工程、
ｈ）底部区画（６）にある溶離バッファー（２１）を取り除き、及びさらなる処理のために関心対象の実体を含む工程、
が請求項１の工程ｆ）の後に実現される、請求項１０または１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
中間区画（５）の容積が上側区画（４）に比べて小さく、底部区画（６）に比べて大きい、請求項１０から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
磁性粒子（２）の移動が磁石（９Ａ）によって支えられる、請求項１０から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
関心対象の分子が核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）によって構成される、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
核酸の結合が非特異的であり、磁性粒子（２）の表面上で直接的に実現される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
核酸の結合が特異的であり、磁性粒子（２）の表面に担持される捕捉プローブ上で直接的に実現される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１つの反応容器（３）内に含まれ、及び関心対象の分子に結合することが可能な磁性粒子または（超）常磁性粒子（２）の懸濁液が加えられた流体（１）から、見込まれる関心対象の分子を抽出するための装置であり、
各々の反応容器（３）の大きい上側区画（４）にある磁性粒子（２）を捕捉するための少なくとも１つの分離用ステーション、
各々の反応容器（３）の中間区画（５）にある前記磁性粒子（２）を混ぜるための少なくとも１つの洗浄用ステーション、
各々の反応容器（３）の底部区画（６）にある前記磁性粒子（２）を混ぜるための少なくとも１つの濃縮用ステーション、および
請求項１から１７による方法を支えるために必要とされる流体（１）、洗浄用液体（２０）、および産出用バッファー（２１）の一部または全部を分注および／または除去するための少なくとも１つのピペット手段
を含む装置。
【請求項１９】
分離用ステーションが少なくとも２つの磁石（９Ａと１０Ａ）を有し、磁石（９Ａと１０Ａ）の磁極軸（１１Ａと１２Ａ）が一緒に１８０°とは異なる、好ましくは６０°と１５０°の間に含まれ、さらに好ましくは８０°と１２０°の間に含まれる角度を形成することを特徴とする、請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
洗浄用ステーションが少なくとも２つの磁石（１３Ａと１４Ａ）を有し、磁石（１３Ａと１４Ａ）の磁極軸（１５Ａと１６Ａ）が互いに平行であることを特徴とする、請求項１８に記載の装置。
【請求項２１】
請求項１８から２０のいずれかに記載の抽出装置内で使用されることが可能であり、
上端開口部（１９）、
じょうご形状を備えた１つの上側区画（４）、
実質的に一定の断面を備えた１つの中間区画（５）、
実質的に一定の断面を備えた１つの底部区画（６）、
閉じた基底部（７）、および
下側区画（５および６）によって規定される縦軸（６）、
を有する反応容器（３）。
【請求項２２】
じょうご形状を構成する上側区画（４）の対向する壁の各々が、この壁に関して存在する磁石（９Ａと１０Ａ）の磁極軸（１１Ａと１２Ａ）に対して直角であることを特徴とする、請求項２１に記載の反応容器。
【請求項２３】
上側区画（４）の対向する壁が一緒に１８０°とは異なる、好ましくは６０°と１５０°の間に含まれ、さらに好ましくは８０°と１２０°の間に含まれる角度を形成することを特徴とする、請求項２２に記載の反応容器。
【請求項２４】
中間区画（５）の容積が上側区画（４）に比べて小さく、底部区画（６）に比べて大きい、請求項２１から２３のいずれかに記載の反応容器。
【請求項２５】
中間区画（５）と上側区画（４）の容積の間の比、または底部区画（６）と中間区画（５）の容積の間の比が１：２から１：１００の間、好ましくは１：５から１：２０の間、さらに好ましくは１：１０である、請求項２１から２４のいずれかに記載の反応容器。
【請求項２６】
請求項２１から２５のいずれかに記載の、少なくとも２個の容器（３）、好ましくは少なくとも５個の容器（３）、さらに好ましくは少なくとも８個の容器（３）によって構成され、前記容器（３）が１本の線に沿って対称に配置される反応容器（３）のセット（２３）。
【請求項２７】
少なくとも２つのチップ、好ましくは少なくとも５つのチップ、さらに好ましくは８つのチップと協同し、前記チップが
流体（１）の一部または全部を分注および／または除去するための第１のピペット手段、
洗浄用液体（２０）の一部または全部を分注および／または除去するための第２のピペット手段、および
産出用バッファー（２１）の一部または全部を分注および／または除去するための第３のピペット手段、
を構成する、請求項２６に記載の反応容器のセット。
【請求項２８】
第１または第２または第３のピペット手段を構成するチップの開放端部が１本または２本の線に沿って対称に配置され、各々の配列の２本の線が互いに平行である、請求項２７に記載の反応容器のセット。
【請求項２９】
第１のピペット手段を構成するチップの開放端部が１本の線に沿って対称に配置され、
第２のピペット手段を構成するチップの開放端部が１本または２本の線に沿って対称に配置され、ならびに
第３のピペット手段を構成するチップの開放端部が２本の線に沿って対称に配置される、請求項２８に記載の反応容器のセット。
【請求項３０】
第１のピペット手段、第２のピペット手段、および第３のピペット手段が１つの固有のピペット手段、２つまたはさらに３つの異なるピペット手段を構成する、請求項２８から２９のいずれかに記載の反応容器のセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁性粒子または磁化可能な粒子の使用に関し、特に、磁性または（超）常磁性粒子を効率的に流体と分離、混合および濃縮し、場合によっては続いて別の流体にこれら粒子を再懸濁させる方法に関する。本発明はさらに、これらを行うための装置を提供した。以下に公開される発明では、磁性粒子、常磁性粒子および超常磁性粒子が磁性粒子と呼ばれる。
【背景技術】
【０００２】
（分離工程に関する現況技術）
生物学的分析の多くの方法において、固相が液相から分離され、続いて洗浄されなければならない。固相を洗浄するために、固相を入れた反応容器の中にバッファー溶液の規定の量がピペット注入されることでバッファー溶液中に固相を懸濁させる。次いで固相と液相が分離される。次いで吸い込み（吸引）によって液相が取り除かれ、新たな洗浄処理が始まる。通常ではいくつかの洗浄サイクルが実施され、各々のサイクルが懸濁、分離および吸引処理を含む。
【０００３】
固相としての磁性粒子の使用および永久磁石による分離は原理的に知られている。永久磁石が粒子を反応容器の壁に引き付け、粒子をここに保持する。
【０００４】
磁性粒子はしばしば分離処理に使用される。磁性粒子が使用される多くの生物学的分析方法および精製方法が存在する。例えば、免疫学的検定方法、核酸ハイブリダイゼーションアッセイなどである。磁性粒子は、特定の成分、タンパク質、核酸をこれらが含まれる材料から単離するための精製方法にもやはり使用されることが可能である。例えば、これらの粒子がある種の成分に特異的な親和性を備えた反応物でコーティングされるので、これらの粒子が混合物からある種の成分を分離するために使用されることが可能である。磁性粒子は例えば、これらの磁性粒子を伴なった流体が入れられた容器の壁に引き寄せられることが可能であり、この流体が取り除かれ、場合によっては別の流体で置き換えられることが可能である。このようにして、磁性粒子は特定の成分が取り出される流体と混合されることが可能であり、この成分が磁性粒子に結合し、この成分を随伴した粒子を流体中の混合物の残りから分離するために磁石が使用されることが可能である。場合によっては、磁性粒子は洗浄されてもよく、別の流体中に分離されてもよい。または、この成分は、磁性粒子から取り除いて別の流体中に移されてもよい。
【０００５】
欧州特許出願公開第０１３６１２６号は固相の免疫学的検定時の分離処理のための装置を記述している。磁性粒子を入れた反応容器の下端部が２つの永久磁石の間に配置される。磁化の軸は反応容器の壁に対して直角であり、したがって漂遊磁界を減少させる。
【０００６】
国際出願公開第９２／０５４４３号は磁性粒子を分離するための装置を記述している。磁性粒子を入れた反応容器は複数の列を成して配置される。複数の列の間に磁性ブロックが置かれる。反応容器は２つの磁石が反応容器に相対して正反対になるように磁性ブロック内に配置される。これらの磁石は交番磁界を有し、これらの磁化の軸は平行に延びる。分離される粒子は反応容器の片側のみにある。
【０００７】
本願明細書にその内容を参照で組み入れる米国特許第４８９５６５０号は分離装置を記述しており、ここでは粒子は永久磁石によって分離される。磁石は反応容器の片側のみにある。試験管の中の試験溶液のレベルと磁石の位置の間の関係が焦点を当てられる。磁石の位置、さらに特定すると磁石の高さは反応容器内の試験溶液のレベルと一致しなければならず、磁石を保持する装置の底部の充填材料によって望ましい高さに持っていかれる。
【０００８】
免疫学的検定時では、必要な反応物類を添加後の反応容器内の流体のレベルは必ずしも一様ではない。例えば、共役溶液を添加後の反応容器内のレベルが洗浄用バッファー溶液添加後のレベルよりも低いこともあり得る。この前出の米国特許第４８９５６５０号に述べられた分析の方法はこれらのレベルの違いを考慮に入れていない。
【０００９】
磁性粒子を分離するための知られている装置はすべての磁性粒子が液相から分離されるまでに相対的に長時間を必要とする不利益を有する。特に大量では、分離時間は無視できないものになる可能性が高い。
【００１０】
磁性粒子の高速分離のための装置が欧州特許出願公開第０３１７２８６号に記述されている。この装置では、反応容器は４つの永久磁石（磁石１、２、３および４）によって取り巻かれ、これらは反応容器の周囲に均一に配分される。磁石１および３の磁界の方向は磁石２および４の磁界の方向に相対して１８０°にわたって回転させられる。この装置は分離を高速化するために相対的に多数の永久磁石を必要とする不利益を有する。これはまた、多くの見込まれるセルの移動を排除する。
【００１１】
欧州特許第０６４４４２５号では懸濁液から磁性粒子を分離するための装置を有する分析器が提示されており、この分離装置は２つの永久磁石を有し、懸濁液を入れた反応容器がこれら磁石の間に置かれる。磁性微粒子のさらに高速でさらに完全な分離のために、これらの磁石は反応容器に相対して正反対に配置され、磁石の磁極軸は反応容器の経線方向軸と鋭角を形成する。この発明の目的は、たとえ反応容器が異なるレベルに充填されても懸濁液中の磁性粒子が高速で分離されることが可能になるように磁性粒子を分離するための装置を有する分析装置を提供することである。別の目的は懸濁液中の磁性粒子が集中的な方式で分離されることが可能となるように磁性粒子を分離するための分析装置を提供することである。
【００１２】
これらの文書が、関心対象の液体からの磁性粒子の分離に関して考慮され得るとしても、これらは粒子を効率的に洗浄して磁性粒子表面への結合のすべての機会を磁性粒子に与えることが可能な有効な混合が遂行できない。生物学的試料から核酸標的を精製するためには混合のこの効率的な工程が完全に必要である。
【００１３】
（混合工程に関する現況技術）
磁性粒子を使用する核酸の精製方法は、例えば、欧州特許出願公開第０７５７１０６号および国際公開第９６／４１８１１号などの様々な出願に述べられてきた。これらの出願では、核酸を含む試料溶液が核酸を放出するようにカオトロピック物質で処理される方法が述べられている。溶解バッファー中における生物学的実体からの核酸の放出の後に、これらの核酸は磁性粒子へと結合させられる。標的に特異的なプローブでコーティングされた粒子ならびに金属酸化物（例えばシリカ）のコーティングを有する粒子の両方（試料中に含まれるすべての核酸の包括的な結合を与える）がこの目的のために使用される。標的を結合させた後、洗浄バッファー（のセット）中で磁性粒子を洗浄することによって細胞破片、酵素類、タンパク質類、抗凝固物質および塩などの妨害成分が取り除かれる。最後に、精製された核酸は溶離バッファーの少量中でこれらの粒子を混ぜることによって粒子から放出される。
【００１４】
効率的な洗浄および溶離のために、磁性粒子は該当するバッファー中で十分に分散および混合される必要がある。概して、この洗浄および溶離処理は溶解された試料（例えばゲノムＤＮＡ）中の特定の成分の吸着、または粒子内に誘導される残留磁気双極子場のどちらかによって引き起こされる磁性粒子の凝集または目詰まりによって妨害されることがあり得る。特に、ゲノムＤＮＡ（全血、唾液、組織）の有意の量を含む試料を伴なったシリカ被覆（磁性）粒子の使用は結果として処理することが難しい堅いペレットにつながる。
【００１５】
液体バッファー中で（磁気）ビーズを混ぜるためのよく知られている方法は渦流撹拌、超音波処理またはピペット処理である。しかしながら、これらの方法は自動化することが難しく、および／またはエーロゾルの発生による試料間の汚染の危険性を与え、またはこれらの方法は核酸標的を劣化させることもあり得る。さらに、溶離処理を必要とするような極めて少量の液体（通常では０．０１ｍｌ）においてこれらの方法は十分に適していない。
【００１６】
本発明による方法および装置は、通常では試料流体の相対的に大量から成分がかなり純粋な形で単離され、さらなる用途に適した別の流体のさらに少量中に濃縮される単離手順を伴なった用途に特に適している。
【００１７】
核酸の単離のための方法のケースでは、そのようなさらなる用途は核酸増幅方法または核酸の検出のための分析、または両方であることがあり得る。
【００１８】
超常磁性粒子を分離および再懸濁させるための方法および装置は国際公開第９１／０９３０８号の出願に開示されている。この出願では、引き続く異なる磁場の印加によって超常磁性粒子が凝集させられ、再懸濁させられることが可能であることが開示された。磁場の第１および第２の印加は同じ磁石で供給されることが可能であり、次いでこれらは粒子を入れた容器の周囲で異なる場所へと回された。しかしながら、２つの間隔を置いて対向した電磁石が使用されることもやはり可能であった。粒子を懸濁液中に保持し、粒子が含まれる流体と粒子を混ぜ合わせる第１および第２の磁場を作り出すためにこれらの電磁石が交互にエネルギー供給された。
【００１９】
流体からの磁性粒子の分離のための方法が米国特許第３９８５６４９号に開示されている。粒子は磁石の近接位置に粒子を運ぶことによって流体から分離され、容器の壁に沿って液体を通り抜けて移動させられることが可能である。これらはこの方式で液体の外に移動させられることすら可能であり、第２の容器へと移送されることが可能である。
【００２０】
米国特許第４９８８６１８号では、多数の少量試料が同時に試験される分析で使用するための装置が述べられている。分析のこのタイプは、例えばマイクロタイタープレートで実施されることが可能である。マイクロタイタープレートの各々のウェルの中に磁気微粒子が存在する。したがってこの装置は多数のオリフィスを有し、これらのオリフィスは多数の、好ましくは４つの永久磁石によって各々取り囲まれる。結果として生じる磁石とオリフィスの構造は固定型であり、磁石は移動させられるように意図されておらず、これら自体および装置の基台に関して固定された関係で取り付けられる。全部の磁石は一列に並べられ、磁石の磁場配向は、全部の磁石が同じ磁界方向を有するか、または隣接する磁石が反対の磁界方向を有するようにされることが可能である。したがって磁石の配向は結果として１オリフィス当たり４点の引力位置につながる。これらの磁石は純粋に分離目的のために設けられる。この装置が容器の中の反応物類をかき混ぜる手段をさらに有することがこの特許に開示されている。
【００２１】
出願人は混合を改善するための解決策を提案する国際公開第０１／０５５１０号を既に申請した。これは磁性粒子または磁化可能な粒子の流体中への効率的な混合および場合によっては前記流体からの粒子の分離を可能にする方法および装置に関連する。使用法は反対で変化する方向性の磁界でできている。流体中の磁性粒子または磁化可能な粒子がこれらの磁界に晒されると粒子は磁界の影響下で効率的に流体と接触することが見出された。このような粒子は通常では凝集塊を形成し易いと考えられ、これが流体との効率的な混合を妨げる可能性が高い。異なっていて変化する方向性の磁界に流体と粒子が含まれる容器を晒すことによって、極めて効率的な混合が生じるような方式で粒子が互いに効率的に分離され、流体を通って引き寄せられることが見出された。この方法は極めて少ない流体量であっても粒子の効率的混合を可能にする。したがってこの発明の方法は、例えば洗浄用流体を節約することを可能にし、必要とされる流体の量の削減を可能にし得るという利点を有する。したがって、例えば単離手順では、この発明の方法は高濃度での反応物の精製を可能にする。さらに、先行技術の方法が労力を要して多大な時間を要する可能性が高いのに対して、この方法は迅速で実施し易い。
【００２２】
したがって、本出願で提供されるものは複数の磁石を使用して１つ以上の容器中で磁性粒子または（超）常磁性粒子を流体と混合する方法であり、それにより、これらの容器は磁石を（複数の）容器の位置に関して移動させることによって、および／または容器を磁石の位置に関して移動させることによって異なっていて変化する方向性を備えた磁界に晒される。
【００２３】
（濃縮工程に関する現況技術）
多くの診断試験は生物学的試料から標的検体を抽出する工程、試験の成績に不利益をもたらす寄生生成物を除去するために精製する工程、バッファー量の単位当たりの検体の量を増大させるために標的検体を濃縮する工程、および検体を化学的に受容可能にするために標的検体をバッファーに溶解する工程の後に実行される。
【００２４】
付け加えると、検体を明示するための試験の感度および特異性を高めるために、探索される検体のコピーが発見されるバッファーの量を減らし、その一方で同時に前記検体を完全に保全することが時には必要である。
【００２５】
生物学者は、特に遠心分離、濾過、および／または磁気的沈殿技術を使用して検体を濃縮する完全に従来式の手段を有する。これらの技術は溶液の移動および検体の操作を必要とし、これは分析され得る検体の量の必然的な減少につながる。
【００２６】
例えば、遠心分離および磁気的沈殿法では、現実の遠心分離および磁気的沈殿の工程は数回繰り返されなければならない可能性が高く、反復の数の限度は従来式のピペットで容易に信頼性よく取り扱いされることが可能な溶液の最少量によって設定される。この最少量は約１０マイクロリットルの位数である。これよりも下だと、これをピペット、フラスコなどの「大きな」容器に移すことは液体、したがって検体を失う。付け加えると、これらの操作中の蒸発および容器の壁への吸着の問題がある。
【００２７】
出発試料中の検体の低濃度のケースでは、これは検体の完全な消失、または検出不可能になりかねないような検体の量の減少を引き起こす可能性が高い。
【００２８】
上述の欠点に加えて、これらの操作は材料の点から見て費用がかさみ、多くの時間を使う。これは多くの産業的用途、例えば生物学的標本または工業的試料中の病原微生物の検出にとって不変の課題であり続ける。
【００２９】
国際出願公開第０２／４３８６５号は試料中に存在する検体を移すための方法、試料中に存在する検体を濃縮するための方法、および前記方法を実施するための装置に関連する。試料中に存在する検体を移すための方法は試料から溶液を調製する（ここでは検体は磁性粒子に固定される）工程、この溶液を、第２の容器に瓶首を経由して接続された第１の容器中に導入する工程、磁性粒子上に固定された検体を第１の容器から瓶首を経由して第２の容器に磁気システムで移す工程、第２の容器が前記溶液の全部または一部、および／または他の溶液で満たされる工程から成る。
【００３０】
ここでも再び、磁性粒子を液体の少量の中に濃縮するための方法に解決策が提供される。しかしながら、特に磁石が第１の容器に比べて小さいサイズである場合に分離は効率的に処理されず、混合は検討すらされていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
したがって、磁性粒子に結合した検体を処理し、その一方で同時に、例えば検体に向けられた診断試験およびいずれかの化学反応の感度および特異性を高めるため、および上述の欠点を克服するために出発時に存在する検体の量を保全するための方法および装置に関して現実の必要性が存在する。
【００３２】
本発明はこれらの必要性を満たし、上述の欠点を克服する利点だけでなく当業者が気付くはずである多くの他の利点もやはり有する。
【００３３】
このようにして、上記の文書のいずれもが１つのみの容器中の液体試料から関心対象の分子を分離、混合、および濃縮する利点を提供する処理を提示していない。同様に、これらはそのような処理の稼動を許可する技術的特徴を有する容器を提案していない。権利主張された方法に関わり無く、方法は手動または自動のどちらであってもよく、または自動化された装置によって運転されてもそうでなくてもよい。
【課題を解決するための手段】
【００３４】
流体中に懸濁し、関心対象の生物学的実体を含むと見込まれる磁性粒子を操作するための方法を提案することが本発明の主な目標であり、これらの磁性粒子は関心対象の実体に結合することが可能であり、この流体はじょうご形状を備えた大きな上側区画、実質的に一定の断面を備えた細長の下側区画、および閉じた基底部で構成された反応容器内に含まれ、この方法は
ａ）磁性粒子を、容器の少なくとも上側区画にある前記磁性粒子すべてを流体から分離するために同時に印加される２つの磁界に晒す工程、
ｂ）分離された磁性粒子を上側区画から細長の下側区画へと移す工程、
ｃ）容器から流体を取り除く工程、
ｄ）下側区画に洗浄用液体を加える工程、
ｅ）下側区画にある磁性粒子すべてを洗浄するために流体の残りを、異なっていて変化する方向性を備えて連続的に印加される少なくとも２つの磁界に晒す工程、および
ｆ）前記下側区画内に前記磁性粒子を濃縮する工程で構成される。
【００３５】
本発明の特定の構成では、同時に印加される２つの磁界が少なくとも２つの磁石によって作り出され、これらの磁石の磁極軸は一緒に１８０°とは異なる角度を形成し、この角度は好ましくは３０°と１５０°の間に含まれ、さらに好ましくは６０°と１２０°の間に含まれる。
【００３６】
本発明の別の特定の構成では、連続的に印加される少なくとも２つの磁界が少なくとも２つの磁石によって作り出され、これらの磁石の磁極軸は互いに平行である。
【００３７】
直ぐ上に提示された後者の特定の構成のうちの特定の実施形態では、異なっていて変化する方向性を備えた連続的磁界が、容器の位置に関する磁石の移動および／または磁石の位置に関する容器の移動によって容器に印加される。
【００３８】
本発明の特定の構成では常に、一緒に協同して同軸の磁界を有する少なくとも２つの磁石、および一緒に協同して同軸でない磁界を有する少なくとも２つの磁石は容器の両方の対向する側に配置される。
【００３９】
本発明の特定の構成では、これらの磁石は１つの支持体と相互に支えあっている。
【００４０】
本発明の別の特定の構成では、分離に意図された磁石および混合に意図された磁石は同一である。
【００４１】
一実施形態では、支持体は（分離から混合の構成へと通過するために）周囲回転方向で、および（混合工程を実現するために）各磁石を通り過ぎる心棒に沿って経線方向で移動させられることが可能であり、この心棒は予め規定されたこの移動と平行であり、磁石の磁極軸に直角である。
【００４２】
本発明の別の特定の構成では、分離に意図された磁石および混合に意図された磁石は異なっている。
【００４３】
本発明の前出の特定の構成のいずれによっても、下側区画は
・磁性粒子を洗浄するために磁界が連続的に印加される１つの中間区画、および
・磁性粒子が濃縮され、粒子を溶離バッファーと接触させるため磁界が連続的に印加される１つの底部区画で構成される。
【００４４】
１つの特定の構成では、上記に開示された主要な方法の中で工程ｅ）と工程ｆ）の間に以下の中間工程が実現される。
【００４５】
ｅ１）分離されて混合された磁性粒子を前記中間区画から前記底部区画へと移す工程、
ｅ２）容器から洗浄用液体を取り除く工程、および
ｅ３）底部区画に溶離バッファーを加える工程。
【００４６】
１つの特定の構成では、上記に開示された主要な方法の中で以下のさらなる工程が工程ｆ）の後に実現される。
【００４７】
ｇ）磁性粒子を前記底部区画から中間区画または上側区画へと移す工程、
ｈ）底部区画にある溶離バッファーを取り除き、さらなる処理のために関心対象の実体を含む工程。
【００４８】
好ましい構成では、中間区画の容積は上側区画に比べると小さく、底部区画に比べると大きい。
【００４９】
特定の構成では、磁石が磁性粒子の移動を引き起こす。
【００５０】
本発明の前出の特定の構成のいずれによっても、関心対象の分子は核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）によって構成される。
【００５１】
一方では、核酸の結合は非特異的であり、磁性粒子の表面の上で直接的に実現される。
【００５２】
他方では、核酸の結合は特異的であり、磁性粒子の表面によって担持された捕捉プローブ上で直接的に実現される。
【００５３】
本発明はまた、少なくとも１つの反応容器内に含まれて関心対象の分子に結合することが可能な磁性粒子または（超）常磁性粒子の懸濁液を加えられる流体から、見込まれる関心対象の分子を抽出するための装置に関し、この装置は
・各々の反応容器の大きい上側区画にある磁性粒子を捕捉するための少なくとも１つの分離用ステーション、
・各々の反応容器の中間区画にある前記磁性粒子を混ぜるための少なくとも１つの洗浄用ステーション、
・各々の反応容器の底部区画にある前記磁性粒子を混ぜるための少なくとも１つの濃縮用ステーション、および
・上記に提示された処理を支えるために必要とされる流体、洗浄用液体、および産出用バッファーの一部または全部を分注および／または除去するための少なくとも１つのピペット手段を含む。
【００５４】
この装置の一実施形態では、分離用ステーションは少なくとも２つの磁石を有し、これらの磁石の磁極軸は一緒に１８０°とは異なる角度を形成し、この角度は好ましくは６０°と１５０°の間に含まれ、さらに好ましくは８０°と１２０°の間に含まれる。
【００５５】
この装置の別の実施形態では、洗浄用ステーションは少なくとも２つの磁石を有し、これらの磁石の磁極軸は互いに平行である。
【００５６】
本発明はまた、上記に公表された抽出用装置に使用されることが可能な反応容器に関し、この容器は
・上端開口部、
・じょうご形状を備えた１つの上側区画、
・実質的に一定の断面を備えた１つの中間区画、
・実質的に一定の断面を備えた１つの底部区画、
・閉じた基底部、および
・下側区画によって規定される縦軸を有する。
【００５７】
この反応容器の一実施形態によると、じょうご形状を構成する上側区画の対向する壁の各々はこの壁に関して存在する磁石の磁極軸に対して直角である。
【００５８】
この反応容器の別の実施形態によると、上側区画の対向する壁は一緒に１８０°とは異なる角度を形成し、この角度は好ましくは６０°と１５０°の間に含まれ、さらに好ましくは８０°と１２０°の間に含まれる。
【００５９】
上述の反応容器の実施形態のいずれによっても、中間区画の容積は上側区画に比べると小さい（底部区画に比べると大きい）。
【００６０】
再び上述の反応容器の実施形態のいずれによっても、中間区画と上側区画の容積の間の比、または底部区画と中間区画の容積の間の比は１：２から１：１００の間、好ましくは１：５から１：２０の間に含まれ、さらに好ましくは１：１０である。
【００６１】
本発明はまた、上記に提示された容器のいずれかによる少なくとも２個の容器、好ましくは少なくとも５個の容器、さらに好ましくは８個の容器によって構成される反応容器のセットに関し、前記容器は１本の線に沿って対称に配置される。
【００６２】
反応容器のセットの一実施形態によると、これは少なくとも２つのチップ、好ましくは少なくとも５つのチップ、さらに好ましくは８つのチップと協同し、前記チップは
・流体の一部または全部を分注および／または除去するための第１のピペット手段、
・洗浄液の一部または全部を分注および／または除去するための第２のピペット手段、および
・産出用バッファーの一部または全部を分注および／または除去するための第３のピペット手段を構成する。
【００６３】
このセットの一実施形態によると、第１または第２または第３のピペット手段を構成するチップの開放端部は１本の線または２本の線に沿って対称に配置され、各々の配列の２本の線は互いに平行である。
【００６４】
このセットの別の実施形態によると、
・第１のピペット手段を構成するチップの開放端部は１本の線に沿って対称に配置され、
・第２のピペット手段を構成するチップの開放端部は１本または２本の線に沿って対称に配置され、
・第３のピペット手段を構成するチップの開放端部は２本の線に沿って対称に配置される。
【００６５】
このセットの一実施形態によると、第１のピペット手段、第２のピペット手段、および第３のピペット手段は１つの固有のピペット手段、２つまたは３つの異なるピペット手段さえ構成する。
【００６６】
この文脈の「混合」でもって、粒子と流体が密に接触させられることが意味される。したがって「混合」という単語は、例えば粒子が流体中で洗浄されるか、または流体中に存在する成分と反応させられるときに極めて効率的な方式で接触することを意味する。この文脈では混合は処理終了後に均質の混合物を必ずしも与えるわけではない。磁石が取り除かれると粒子はこれらが含まれる容器の底部へと分離することも考えられ、または磁石によって特定の場所で容器の壁に保持されることもあり得る。混合処理は、例えば粒子を洗浄するため、または粒子を液体の成分と反応させるため、または液体の成分を粒子上にコーティングされた反応物に結合させるために使用されることが可能である。同様に、混合処理が元来粒子上にあったある種の成分の周囲液体中への溶離に帰着することもあり得る。本発明の方法はこれらの処理の各々に応用可能であり、磁性粒子または磁化可能な粒子をある種の流体の量と接触させる効率的で迅速で便利な方法を提供する。
【００６７】
ここで範例の方式で添付の図面を参照しながら本発明がさらに説明される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６８】
１．好ましい実施形態の説明
１．１  反応容器の詳細
反応容器３は図１〜４に十分に開示されている。これは３つの区画すなわち
・容器３の、じょうご形状を備えた大きな上側インキュベーション区画４、
・容器３の、一定の断面を備えた細長の中間洗浄区画５、
・容器３の、一定の断面を備えた細長の底部産出用区画６から成る。
【００６９】
この構成は、前記容器３の内側にあるいずれの液体も導入／分注または除去することが可能な上端開口部１９だけでなく閉じた基底部７も有することを強いる。最後に、図４によると、容器３は縦軸８を有する。
【００７０】
ここでさらに特定して図１を参照すると、好ましい構成の容器３はセット２３を構成するように配列され、ユーザによる取り扱いを容易にする操作用舌状部２４を有する。通常よりもなおもさらに効率的な自動装置への据え付けを提供するために図面に表現されていない位置決め手段が追加されることも可能である。
【００７１】
主な特徴は以下である。
【００７２】
・２２、２５、２６のような標準的な使い捨てフィルタチップを使用して産出用区画６からの産出用バッファー２１の回収を容易にするために容器３の全高は４０ｍｍであることが好ましい。
【００７３】
・インキュベーション区画４の容積は２〜６ｍｌ、好ましくは４ｍｌである。現在の設計である後者の構成では、寸法は高さ２０ｍｍ、深さ２５ｍｍ、幅９ｍｍである。
【００７４】
・洗浄区画５の容積は０．１〜１ｍｌ、好ましくは０．２ｍｌである。現在の設計である後者の構成では、この円筒形状は直径として５ｍｍ、および高さとして８ｍｍを有する。
【００７５】
・産出用区画６の容積は１０〜１００μｌ、好ましくは２０μｌである。現在の設計である後者の構成では、この円筒は高さ５ｍｍ、および直径２ｍｍである。
【００７６】
容器の壁の厚さは０．２ｍｍと１ｍｍの間（現在の設計：０．５ｍｍ）である。
【００７７】
反応容器は例えばポリプロピレンを使用して射出成形によって生産される使い捨てのプラスチックであることが好ましい。操作者による使い易い操作を可能にするために、いくつかの反応容器３をセット２３に集積化することが推奨される。本出願人は、セットが８個の容器３を含む設計を実現した。同じ理由で、チップの数が反応容器３の数と等しく、チップ間の間隔がセット２３内の容器の位置と一致する単一のユニットを得るためにチップ２１、２５、２６をこれらの共通の基台２９で集積化することが便利である。
【００７８】
この装置はネオジムから製造されて１．２テスラの残留磁場を備えた磁石（ＮｄＦｅＢ）を使用することが好ましい。現在の装置で、６ｍｍの直径と７ｍｍの長さの円柱磁石が磁石９、１０、１３および１４に適していることを示した。
【００７９】
磁性粒子２をインキュベーション区画４内の液体１から分離するとき、磁石９および１０の面と反応容器の壁との間の間隔は通常では０．５ｍｍである。洗浄運動（Ｆ１１、図１３）の間では、磁石１３と１４は毎秒１ｃｍの通常速度で容器に関して平行移動させられる。容器を通過するとき、洗浄区画５の壁への距離は通常では１ｍｍである。溶離運動（Ｆ１１、図１８）の間では、磁石１３と１４は毎秒１ｃｍの通常速度で容器に関して平行移動させられる。容器を通過するとき、産出用区画６の壁への距離は通常では２ｍｍである。
【００８０】
１．２  本発明による方法
好ましい実施形態では、本願明細書に開示される装置は液体を吸入するための吸引ポンプと液体路、液体分注器モジュールおよび磁石を平行移動させるためのいくつかの機械的手段、反応容器に関する吸入チップおよび分注器などのいくつかの標準的な部品と組み合わされる。好ましい実施形態では、この装置は全血、血清、軟膜（血液のｃｒｕｓｔａ  ｐｈｌｏｇｉｓｔｉｃａまたは白血球画分）、尿、糞便、髄液、精液、唾液、組織、細胞培養物などといった複雑な生物学的出発試料から核酸を単離するために有用である。上述の生物学的材料から単離される核酸はまた、試料が由来する生物からの内因性核酸およびいずれかの外因性（ウィルス、真菌、細菌または寄生生物の）核酸を含むこともあり得る。
【００８１】
この装置は以下の手順に従って使用される。
（ａ）反応容器への液体混合物の添加
一次試料の混合物１、リーシスバッファー、および磁性粒子２が反応容器３に加えられる。標的分子（核酸、図示せず）が試料中の細胞または生物から放出され、磁性粒子２に結合する。この処理工程は「インキュベーション」と定義される。この工程では、前記容器３を構成するすべての区画、すなわちインキュベーション区画４、洗浄区画５、および産出用区画６は流体１で満たされる。前記区画４〜６のサイズの違いのせいで、前記流体１の大部分は反応容器３のインキュベーション区画４に含まれる。通常では、インキュベーション時間は約５分である。
【００８２】
（ｂ）試料からの粒子の分離
インキュベーションの後、容器３内の液体混合物１は２つの磁石９Ａまたは９Ｂまたは９Ｃなどとそれぞれ１０Ａまたは１０Ｂまたは１０Ｃなどの間に配置され、図５に開示されるように各々の１つ９または１０がそれぞれ磁界１１および１２を発生する。この構成は図９にやはり十分に規定されている。結果として、磁性粒子２が（ペレットとして）磁石の場所に対応するインキュベーション区画４の側壁の２つの位置に集められる（図６）。収集時間は通常では約１分である。
【００８３】
（ｃ）洗浄区画への粒子の移送
図７によると、磁石９と１０をＦ２に従って下方向に移動させることによって磁性粒子２のペレットがインキュベーション区画４から洗浄区画５へと移送される。容器３をＦ１に従って上方向に移動させることによってこの移動を達成すること、またはそれぞれ前記磁石９と１０、および前記容器３の下（Ｆ２）および上（Ｆ１）の移動を組み合わせることもやはり可能である。この（複数の）移動の間、初期に磁石１０によって集められた粒子２はＦ３に従って磁石９に向かって跳躍し、ここでこれらは初期に磁石９によって集められた粒子２と一緒になる。この合併の後、すべての磁性粒子２は図８に示されるように洗浄区画５へと移送される。
【００８４】
（ｄ）磁性粒子の洗浄
すべての試料成分ならびに下流での利用を妨害しかねない他の反応物類を除去するために磁性粒子２が洗浄される。洗浄は反応容器３を磁石１３と１４に配置すること、引き続いて前記容器３にＦ４に従って垂直に導入されるチップ２２（図１０）を使用して反応容器３から液体試料を除去すること（Ｆ５）によって達成される。次に、図１１によると、Ｆ８に従って容器内に導入される（さらなる今後の処理工程に不利益となる内側壁への液滴を生じる飛沫のいかなる危険性も除外するために、これは容器３の垂直姿勢と比べて斜めの角度である）チップ２５によって新たな洗浄液２０がＦ９に従って前記容器３の中に加えられる。試料の除去および液体の添加の間では、磁性粒子２は磁石１３と１４の作用下で洗浄区画５の側壁に留められる。次に、粒子２を洗浄液２０と接触させるために洗浄区画５の対向する側の間で図１２のＦ１０に従って前後に移送するために、図１３に描かれるように磁石１３と１４が方向Ｆ１１で動かされる。これらの環境で、磁性粒子２は反対方向の２つの磁界１５と１６に交互に従わされる。
【００８５】
磁石１３と１４に関して容器３を移動させることによってＦ１１方向のこの運動を達成すること、または前記磁石１３と１４、および前記容器３の両方の移動を組み合わせることもやはり明らかに可能である。
【００８６】
十分な洗浄実績が得られるまで工程（ｄ）が繰り返されることもあり得る。適切であれば多様な洗浄液の配列が使用されることもあり得る。多様な洗浄液が使用されるケースでは、バッファーを変えるときに分注用チップが適切に洗浄されることは明らかである。
【００８７】
磁石１３と１４は介在アレイの幾何学構造で置かれる。このレイアウトは高い処理能力の形式を与えるような本発明の方法の使用を可能にする。容器と磁石が介在アレイの幾何学構造で置かれる実施形態は図１３に具体的に示される。容器３は、磁石の支持体として使用されて容器３に関して平行移動する第２のアレイ１８に固定された一方の側の磁石１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃなど、および他方の側の１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃなどとアレイの幾何学構造で置かれる。
【００８８】
この方式で試料の多数の系が同時に処理される。液体の添加および吸引は手動によるもの、または当該技術で知られているような自動マルチチップ分注機器によるものであってもよい。そのような構成は、２００１年１月２５日に公開された「Ｄｅｖｉｃｅ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｍｉｘｉｎｇ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｆｌｕｉｄ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ  ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｆｌｕｉｄ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｔｈｅｒｅｏｆ  ｉｎ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ」という表題の国際公開第０１／０５５１０号の以前の出願で本出願人によって十分に公表されている。読者はこの文書で前記構成について関連する情報を見出すことが可能である。これが理由でその内容が参照で同封されている。
【００８９】
（ｅ）溶離のための調製
磁性粒子２が洗浄区画５の側壁に留められている間に、Ｆ１２に従って容器３内に導入されるチップ２６（最終的に図１４に描かれた構成になる）を使用してすべての洗浄液がＦ１３に従って容器３から取り除かれる。次に、産出用区画および洗浄区画６および５を満たす（Ｆ１５）ためにＦ１４に従って反応容器３に導入されるチップ２６または図面に表示されていない新たなチップを経由して産出用または溶離バッファー２１が加えられる。この後、磁石１３と１４を下方向（Ｆ１６）に移動させることによって、および／または容器３を上方向（Ｆ１７）に移動させることによって磁性粒子２が洗浄区画５から産出用区画６へと移送される（図１６）。次に、Ｆ１８に従ってチップ２６を反応容器３内に下ろすことによって産出用バッファー２１の量がセットされ、その一方で産出用バッファーの特定の量に対応するレベルへと液体の一部をＦ１９に従って吸入する（図１７）。
【００９０】
磁性粒子２は溶離バッファー２１と接触しているが標的の有意の放出は、
・接触時間が短い、
・前記磁性粒子２が塊として集められる、
・溶離バッファー２１が室温にある、
という事実に起因して起こらない。
【００９１】
（ｆ）溶離バッファーの加熱
産出用バッファー２１を特定の温度に加熱するためにヒータ素子３３が反応容器３の産出用区画６を囲んでいる（図１７）。溶離処理のための通常の温度は６０〜８０℃である。この温度は約１５秒間から１０分間、好ましくは１分間から６分間、さらに好ましくは３分間加えられる。これらの条件が標的の有意の放出を許可する。
【００９２】
（ｇ）磁性粒子からの核酸の溶離
図１８に従って方向Ｆ１１で磁石１３と１４を移動させることによって標的分子が磁性粒子２から放出され、底部区画６にのみ存在する産出用バッファー２１中に回収される。洗浄工程（ｄ）と同様に、磁性粒子２が産出用区画６の対向する側の間で前後に平行移動させられることで前記粒子２を産出用バッファー２１に効果的に接触させる。この工程の間、産出用バッファー２１の温度を制御するためにヒータ３３が産出用区画６を囲んでいる。
【００９３】
（ｈ）産出用バッファーからの磁性粒子の分離
溶離工程の後、磁石９が粒子２を産出用区画６の側壁に集めることを可能にするように試料容器３を磁石９と１０に対して配置（図１９参照）し、次いで前記粒子２を図２０に開示されるようにインキュベーション区画４の、または場合によっては洗浄区画５の側壁に維持するために容器３をＦ２０に従って下方向に移動させ、および／または磁石９と１０をＦ２１に従って上方向に移動させることによって磁性粒子２が産出用バッファー２１から一掃される（分離される）。
【００９４】
次いで、産出用区画６にある溶離バッファー２１はさらなる処理のために使用されてもよく、または図２０に従って、容器３の中に導入される（Ｆ２２）チップ２６によって移送されてもよく、標的分子を含む溶離バッファー２１が吸入（Ｆ２３）によって取り出される。
【００９５】
上記に開示された装置ならびにこの装置を使用するための方法が、例えばステッピングモータによって制御されるリニアアクチュエータのセットを使用して反応容器、磁石、ヒータ、およびチップに関する平行移動を自動方式で実施することによって容易に自動システムに統一されることはいずれの当業者にも明白である。特定の用途に応じて上記のプロトコルの特定の工程（例えば（ｆ）、（ｇ）または（ｈ））が省略され得ることもやはり明らかである。
【００９６】
例えば、磁性粒子２が１つのみの磁石１３によって単一の容器内で定位置に維持されているので図１０と１４は極めて類似している。セット２３の各々の隣り合う容器３は磁石１４によって引き付けられる磁性粒子２もやはり有する。言い換えると、隣り合う容器３は反対側の側壁にこれらの磁性粒子２を有する。８個の容器のセット２３内へのチップ２２または２５の導入を容易にするために、前記８つのチップの位置決めは図２１および２２に開示されるように改善された方式で実施された。このようにして、容器３の１セット２３と共同して働くすべてのチップは主本体２９に付随させられ、この後者が８個のチップ支持体３０を有し、各々の３０が互いにずれている。さらに特定すると、各々のチップは２つの開放端部を有し、一方はチップの下側端部２７であり、他方は上側端部２８である。開放端部２７または２８は２本の線に沿って対称に配置され、各々の線は４つの下側端部２７または４つの上側端部２８によって引かれ、２本の線は互いに平行である。
【００９７】
明らかに、チップ２２または２５が図１０および１４に従って容器３内に導入されるときに、さらなる今後の処理工程に不利益となるどのような接触も避けるためにこれらのチップは可能な限り磁性粒子２から遠ざけられる。
【００９８】
ここでさらに特定して図２１を参照すると、好ましい構成の主本体２９はユーザによる取り扱いを容易にする操作用舌状部３２を有する。通常よりもなおもさらに効率的な自動装置への据え付けを提供するために、図面に特に表現されていない位置決め手段が追加されることも可能である。さらに、前記主本体２９はどのような流体の分注または除去も可能にする取入／排出開口部３１を有する。この開口部３１はまた、位置決め手段として役立つことも可能である。
【００９９】
上記に提示された本発明を使用して投入試料から核酸が単離される４通りの実施例が提示される。これらの実施例で、洗浄バッファー、溶離バッファー、および磁性粒子は「ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ」（製品コード２００２９７）から入手された。リーシスバッファーは「ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ  Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ」（製品コード２００２９５）である。ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ製品はｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  Ｂ．Ｖ．（Ｂｏｘｔｅｌ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって供給される。
【０１００】
２．実施例１：血漿試料からのリボソームＲＮＡの濃縮
２．１  材料と方法
標的ＲＮＡはＱｉａｇｅｎ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  ｍａｘｉｋｉｔ（製品コード１４１６２、Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞から抽出される。各々の試料について、２マイクログラム（μｇ）が投入量として使用される。
【０１０１】
試料は１００個体の寄贈血液のプールから得た通常のＥＤＴＡ／クエン酸血漿試料によって構成される。
【０１０２】
ＲＮＡの定量化はマイクロタイタープレート用の発光読取装置（「Ｖｉｃｔｏｒ２」、供給元Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ：１４２０マルチラベルカウンタ）と組み合わせたＲＮＡ用発光マーカ（ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ−ＩＩ、供給元Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ：製品コードＳ−７５６４）を使用して実施される。
【０１０３】
産出用バッファーの純度はＵＶスペクトル光度計（供給元Ｕｎｉｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎ：Ｕｎｉｃａｍ  ＵＶ−１）を使用して２６０ｎｍと２８０ｎｍのスペクトル吸収に関する相対値（Ａ２６０／Ａ２８０）から判定される。
【０１０４】
２．２  試料の調製
２４個の血漿試料のセットが以下のように調整される。
【０１０５】
・各々の試料について、血漿の１ｍｌが反応容器に加えられ、２ｍｌのＮｕｃｌｉＳｅｎｓ  Ｌｙｓｉｓバッファーと混合される。
【０１０６】
・次に、各々の試料について２μｇのＲＮＡの投入量を使用して標的ｒＲＮＡがこの混合物に加えられる。
【０１０７】
・引き続いて、磁性粒子の１ｍｇが溶解した血漿試料に加えられ、手動ピペット操作を使用して均質な分散が作り出される。
【０１０８】
２．３  抽出方法
２４試料のバッチが上記に示された工程（ａ）から（ｇ）の手順に従って同時に処理される。これらの試料は、各々のセットが８個の同じ容器を含む反応容器の３セットに加えられる。
【０１０９】
インキュベーション区画から磁性粒子を収集後（収集時間は１分であった）に、粒子は洗浄区画へと移送され、ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ洗浄バッファー１と洗浄バッファー２を（第１と第２のサイクルそれぞれで３ｍｌと１ｍｌの２サイクルを使用する）使用して洗浄される。
【０１１０】
洗浄後に粒子が産出用区画へと移送され、ここで粒子をＮｕｃｌｉＳｅｎｓ溶離バッファー（洗浄バッファー３）中で５分間混ぜることによって標的ＲＮＡが放出される。溶離の間、バッファーの温度は６０℃である。産出用バッファーの量は２０μｌである。
【０１１１】
溶離の後、磁石９を使用して磁性粒子が産出用バッファーから分離される。
【０１１２】
このプロトコル完了後に、各々の容器の産出用区画で回収されたＲＮＡの量が発光ＲＮＡマーカを使用して測定される。この目的で、産出用バッファーの１０μｌが各々の反応容器からマイクロタイタープレートのウェルの中に移され、Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ溶液の１９０μｌが各々のウェルに加えられる。各々のウェルで、発光プレート読取装置（Ｖｉｃｔｏｒ２はウェルにあるＲＮＡの量に関して直接測定である）によって光信号が検出される。
【０１１３】
２．４  結果
２４試料について、容器の産出用区画内の標的ｒＲＮＡの平均量は５０ｎｇの標準偏差で１．３２μｇである。これは６６％の平均収率に相当する。
【０１１４】
産出物の純度はＵＶスペクトル光度計を使用するＡ２６０／Ａ２８０比から結論付けると優秀である。産出用バッファーは２．１の比を示すが、それに対してこのバッファー中の純粋ＲＮＡは１．９と２．１の間のＡ２６０／Ａ２８０比を有する。
【０１１５】
標的ＲＮＡの一貫性が２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｍｓｔｅｌｖｅｅｎ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して判定される。この機器は１６Ｓおよび２３Ｓ  ＲＮＡに対応する２つの別個のＲＮＡバンドを検出する。小さいＲＮＡ断片などの他の産物は検出されなかった。
【０１１６】
２４試料のこのバッチに関して抽出手順を完了するための合計の時間は、溶解試料への磁性粒子添加後に開始して３０分である。産出物中の濃縮ＲＮＡを作り出すために操作者からの介入は必要とされない。
【０１１７】
３．実施例２：血漿試料からのプラスミドＤＮＡの濃縮
３．１  材料と方法
標的はプラスミドＤＮＡであり、ｐＢＲ３２２（製品コードＮ３０３３Ｌ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）がＢａｍＨＩ（製品コードＥ１０１０ＷＨ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐ，ＮＹ，ＵＳＡ）によって直線化される。ＤＮＡの６μｇが試料当たりの投入量として使用される。
【０１１８】
試料は寄贈血液から得た０．１ｍｌの通常のＥＤＴＡ／クエン酸血漿によって構成される。
【０１１９】
３．２  試料の調製
実施例１と同じ手順を使用して２４試料が同時に処理される。個々の血漿試料が反応容器に加えられる。次にＮｕｃｌｉＳｅｎｓリーシスバッファーの２ｍｌが加えられる。引き続いて、プラスミドＤＮＡが試料に入れられ、磁性粒子の１ｍｇがこの混合物に加えられる。
【０１２０】
３．３  抽出方法
抽出手順の収集工程、洗浄工程、および溶離工程は実施例１と同じである。
【０１２１】
３．４  結果
手順を完了後に、抽出されたＤＮＡの量が２６０ｎｍにおける産出用バッファーの光学密度から判定される。
【０１２２】
反応容器から回収されるＤＮＡの平均量は異なる容器間で４％の変動計数を伴なって３．１μｇである。これは投入量としてＤＮＡの６μｇを使用して５２％の単離収率に相当する。
【０１２３】
産出用バッファーに関して平均のＡ２６０／Ａ２８０比は１．９である。産出用バッファー内の純粋ＤＮＡについてはこの比は１．７と２．１の間である。
【０１２４】
実施例１と同様に、抽出手順を完了するために要する時間は磁性粒子の添加後に始まって３０分である。
【０１２５】
４．実施例３：唾液試料からのウィルスＲＮＡの回収
４．１  材料と方法
この実験では、９つの唾液試料に加えられるＨＩＶ  ＲＮＡの回収がＮｕｃｌｉＳｅｎｓ  ＥａｓｙＱ  ＨＩＶ−１アッセイ−バージョン１．１（製品コード２８５０２９、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  Ｂ．Ｖ．，Ｂｏｘｔｅｌ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して判定される。
【０１２６】
ＲＮＡは培養されたＨＩＶ−１タイプＢウィルス株（ＨＸＢ２）から得られるＨＩＶ  ＲＮＡであり、これがＮｕｃｌｉＳｅｎｓリーシスバッファーを使用して溶解され、ＷＨＯ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＨＩＶ−１  ＲＮＡ規格に対して較正される。
【０１２７】
唾液試料はＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｗｅｒｐｅｎ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）から入手した。
【０１２８】
４．２試料の調製
各々の唾液試料で、１ｍｌの量がプロテアーゼ溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）の０．５ｍｌと混合され、室温にて２０分間プレート振盪機でインキュベートされて液化試料を得る。
【０１２９】
ＮｕｃｌｉＳｅｎｓリーシスバッファーの２ｍｌを入れた試験管に標的ＨＩＶ  ＲＮＡが、各々の試料について３０，０００コピー投入量を使用して加えられる。ＨＩＶ  ＲＮＡと一緒に、ＥａｓｙＱキットの一部であるキャリブレータＲＮＡがリーシスバッファーに加えられる。次に、液化唾液試料がＲＮＡを含むリーシスバッファー（２ｍｌ）と一緒に反応容器に加えられる。１０分後、磁性粒子の１ｍｇが各々の試料に加えられる。手動のピペット操作で混ぜることによって均質な分散が得られる。
【０１３０】
４．３  ＲＮＡ抽出
抽出手順は上述された実施例１および２と同様に進行する。
【０１３１】
４．４  ＲＮＡ検出
抽出手順の終わりに、ＨＩＶ  ＲＮＡおよびキャリブレータＲＮＡが産出用区画内の溶離バッファーの１２μｌ中に濃縮される。各々５μｌの２つの画分が産出用区画から吸引され、ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ  ＥａｓｙＱアッセイにおける投入量として使用される。検出については、ＥａｓｙＱアッセイの使用説明書に示される手順が追従される。
【０１３２】
４．５  結果
結果は下記の表に提示される。
【０１３３】
【表１】
2008507705.tif 000003
2008507705.tif 000004
【０１３４】
これらの結果から、本出願に開示された装置は唾液試料からウィルスＲＮＡを単離すること、およびこれを標準的な増幅方法を使用して検出を容易にする形に濃縮することが十分に可能であると結論付ける。
【０１３５】
５．実験４：多様な試料タイプからのウィルスＤＮＡの回収
５．１  材料と方法
この実験は、各々２２試料で４通りの抽出実行の系を表わす。各々の実行で異なる試料タイプが使用される。
【０１３６】
・実行１：個人寄贈からの血漿試料（試料当たり１ｍｌ）
・実行２：脳脊髄液（ＣＳＦ）（試料当たり１ｍｌ）
・実行３：個人寄贈からの血清試料、試料当たり１ｍｌを使用する
・実行４：全血試料（試料当たり０．１ｍｌ）。
【０１３７】
５．２  試料の調製
各々の試料が２ｍｌのＮｕｃｌｉＳｅｎｓリーシスバッファーに加えられる。
【０１３８】
標的として、ブタヘルペスウィルス（ＰｈＨＶ−１）が溶解した試料の２０に各々の実行で加えられる。２つの試料（２１番目と２２番目）は負対照区（ＤＮＡが加えられない）として使用された。
【０１３９】
５．３  ＤＮＡ抽出
各々の実行（試料タイプ）に関する抽出方法は実施例１、２、および３で述べられた手順と同じである。
【０１４０】
５．４  ＤＮＡ検出
産出用バッファーに回収されるＤＮＡはリアルタイムＰＣＲを使用して検出される。正の信号を作り出すために必要とされるＰＣＲサイクルの数（ＣＴ）が各々の試料について判定される。
【０１４１】
図２３はすべての試料に関するこれらＣＴ値のグラフ表現を示している。負対照区の試料はすべて負であった。
【０１４２】
５．５  結果
実験のこのセットから、この特許出願に開示された装置は多様な試料タイプから由来するウィルス粒子から核酸を優れた収率で単離することが十分に可能であると結論付ける。
【０１４３】
記号の意味
１．流体又は混合物
２．磁性粒子
３．反応容器
４．じょうご形状を備えた容器３の上部インキュベーション区画
５．容器３の一定断面を備える細長中間洗浄区画
６．容器３の一定断面を備える細長底部産出区画
７．容器３の閉じた基底部
８．容器３の縦軸
９．分離工程に用いられる容器セットの片側にある磁石（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ等）
１０．分離工程に用いられる容器セットの他方の側にある磁石（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ等）
１１．磁石（９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ等）の磁極軸（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ等）
１２．磁石（１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ等）の磁極軸（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ等）
１３．混合及び／または濃縮工程に用いられる容器セットの片側にある磁石（Ａ、Ｂ等）
１４．混合及び／または濃縮工程に用いられる容器セットの他方の側にある磁石（Ａ、Ｂ等）
１５．磁石（１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃ、１３Ｄ等）の磁極軸（Ａ、Ｂ等）
１６．磁石（１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃ、１４Ｄ等）の磁極軸（Ａ、Ｂ等）
１７．磁石の支持体（９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ等または１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ等）
１８．磁石の支持体（１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃ、１３Ｄ等または１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃ、１４Ｄ等）
１９．容器３の上端開口部
２０．洗浄用液体
２１．産出用バッファー
２２．流体１の添加、除去用チップ
２３．容器セット
２４．容器セット２３の操作用舌状部
２５．洗浄用液体２０の添加および／または産出用バッファー２１の除去用チップ
２６．洗浄用液体２０および／または産出用バッファー２１の除去用チップ
２７．チップ２５の下端
２８．チップ２５の上端
２９．チップ支持体３０の基台
３０．チップ支持体
３１．基台２９の取入／排出開口部
３２．基台２９の操作用舌状部
３３．加熱システム
Ｆ１．容器３の上昇
Ｆ２．磁石９および１０の下降
Ｆ３．粒子２の磁化
Ｆ４．チップ２２の下降
Ｆ５．チップ２２による流体１の吸込除去
Ｆ８．チップ２５の下降
Ｆ９．傾けたチップ２５からの洗浄用液体の注入
Ｆ１０．磁性粒子２の動き
Ｆ１１．セット２３と磁石１３および１４の相対的運動
Ｆ１２．チップ２５の下降
Ｆ１３．チップ２５による洗浄用液体の吸込除去
Ｆ１４．チップ２６の下降
Ｆ１５．傾けたチップ２６からの産出用バッファーの注入
Ｆ１６．磁石１３および１４の下降
Ｆ１７．容器３の上昇
Ｆ１８．チップ２６の下降
Ｆ１９．洗浄区画２６の産出用バッファーの除去
Ｆ２０．容器の下降
Ｆ２１．磁石１３および１４の上昇
Ｆ２２．チップ２６の下降
Ｆ２３．チップ２６による産出用バッファーの吸込除去
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】本発明による８個の容器によって構成されるセットの透視図である。
【図２】容器セットの、図１のＡ−Ａによる断面図である。
【図３】容器セットの、図２のＢ−Ｂによる断面図である。
【図４】図３の細部Ｃを表わす図である。
【図５】図２に類似している図であるが、このケースでは流体に同時に作用する２つの磁石の間に生物学的試料で満たされた容器が配置される。
【図６】出発試料中に存在するすべての磁性粒子を２つの磁石が引き付けた後の状態を表わす、図５と同様の図である。
【図７】前記２つの磁石が下方向に動かされ、磁性粒子をインキュベーション区画から洗浄区画へと移すときの状態を表わす、図６と同様の図である。
【図８】磁石がこれらの最終位置に到達し、すべての磁性粒子が単一のペレットを形成したときの状態を表わす、図７と同様の図である。
【図９】１つの反応容器の、図５のＤ−Ｄによる断面図である。
【図１０】容器が２つの他の磁石の間に配置され、生物学的試料の液体部分の引き出しの後の状態を表わす、図８と同様の図である。
【図１１】飛び跳ねを避けるために傾けたチップで洗浄液が加えられるときの状態を表わす、図１０と同様の図である。
【図１２】洗浄液の内部の磁性粒子の前後運動を示す、図１１と同様の図である。
【図１３】１つの反応容器の、図１２のＥ−Ｅによる断面図であり、磁性粒子の動きと磁石に対する容器のセットの相対的運動の間の連関を説明している。
【図１４】容器が同じ２つの磁石の間に配置されている図１０と同様の図であるが、前記洗浄液の除去の後の状態を表わす。。
【図１５】磁石位置に関しては図１４に類似しており、産出用または溶離バッファーが図１１に開示されたチップ、または別のチップによって加えられるときの状態を表わす図である。
【図１６】２つの他の磁石が下方向に動かされて磁性粒子が洗浄区画から産出用区画へと移されるときの状態を表わす、図７に極めて類似した図である。
【図１７】洗浄区画にある産出用バッファーの除去後の状態を表わす、図１６と同様の図である。この段階で、関心対象の分子の溶離を達成するために産出用バッファーが熱システムに掛けられる。
【図１８】磁石に対する容器のセットの相対的運動に起因する産出用バッファー内の磁性粒子の動きを説明する、図１３と同様の図である。
【図１９】図１６に極めて類似しているが、２つの前出の磁石を上方に動かして使用し、磁性粒子を産出用区画から液体が存在しない洗浄区画へと移す状態を表わす図である。
【図２０】図１９に極めて類似しているが、溶離した関心対象の分子を含む産出用バッファーの残りを産出用区画から除去できるようにするために磁石が磁性粒子を洗浄区画からインキュベーション区画へと移すように上方への移動が維持される状態を表わす図である。
【図２１】８つのチップから離されたチップ支持体の主本体の透視図であり、チップ支持体に接続されることが可能な複数のチップは相補的な形状を有する。
【図２２】チップが接続された主本体の底面図である。
【図２３】リアルタイムのＰＣＲ反応のセットの結果のグラフ表示を示す図であり、ここではブタヘルペスウィルス（ＰｈＨＶ−１）のＤＮＡ断片が、本特許出願に開示された装置を使用して多様な試料からこのウィルスを単離した後に増幅された。水平方向軸に沿って異なる試料の番号が示される。垂直軸は各々の試料について正のＰＣＲ信号が観察されるときの閾値サイクル数を示す。４つの異なる試料タイプ（ＣＳＦ、血漿、血清、および血液）が使用された。各々の試料タイプで２０個の個別試料が使用された。
【図１】
2008507705.tif 000005
【図２】
2008507705.tif 000006
【図３】
2008507705.tif 000007
【図４】
2008507705.tif 000008
【図５】
2008507705.tif 000009
【図６】
2008507705.tif 000010
【図７】
2008507705.tif 000011
【図８】
2008507705.tif 000012
【図９】
2008507705.tif 000013
【図１０】
2008507705.tif 000014
【図１１】
2008507705.tif 000015
【図１２】
2008507705.tif 000016
【図１３】
2008507705.tif 000017
【図１４】
2008507705.tif 000018
【図１５】
2008507705.tif 000019
【図１６】
2008507705.tif 000020
【図１７】
2008507705.tif 000021
【図１８】
2008507705.tif 000022
【図１９】
2008507705.tif 000023
【図２０】
2008507705.tif 000024
【図２１】
2008507705.tif 000025
【図２２】
2008507705.tif 000026
【図２３】
2008507705.tif 000027
【国際調査報告】
2008507705.tif 000028
2008507705.tif 000029
2008507705.tif 000030