(57)【要約】  本発明は、スクテラリアの根、オウレンの根茎、ダイオウの根および根茎、ならびにニンジン（またはアメリカニンジン）の抽出物を含む薬草薬剤組成物を提供する。前記薬草薬剤組成物は、高血圧または虚血の治療、血管内皮の変性からの保護、ならびに血圧の低下または安定な血圧の維持に効果的である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
黄ごん（Ｒａｄｉｘ  Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａｅ）（スクテラリア（ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ）の根）の抽出物；
黄連（Ｒｈｉｚｏｍａ  Ｃｏｐｔｉｄｉｓ）（オウレン（ｃｏｐｔｉｓ）の根茎）の抽出物；
大黄（Ｒａｄｉｘ  ｅｔ  Ｒｈｉｚｏｍａ  Ｒｈｅｉ）（ダイオウ（ｒｈｕｂａｒｂ）の根および根茎）の抽出物；および
人参（Ｒａｄｉｘ  Ｇｉｎｓｅｎｇ）（ニンジン（ｇｉｎｓｅｎｇ）の根）の抽出物；
を含み、前記スクラテリアの根の抽出物、前記オウレンの根茎の抽出物、前記ダイオウの根および根茎の抽出物、前記ニンジンの根の抽出物が、水およびエチルアルコールからなる群から選択される少なくとも１つの溶媒で前記スクラテリアの根、前記オウレンの根茎、前記ダイオウの根／根茎、および前記ニンジンの根を抽出することによって製造される、薬草薬剤組成物。
【請求項２】
前記スクテラリアの根、前記オウレンの根茎、前記ダイオウの根および根茎、ならびに前記ニンジンの根は、約１〜２：１〜２：１〜２：１〜２の重量比である、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項３】
前記スクテラリアの根、前記オウレンの根茎、前記ダイオウの根および根茎、ならびに前記ニンジンの根は、約１：１：２：１の重量比である、請求項２に記載の薬剤組成物。
【請求項４】
前記スクテラリアの根は水で抽出される、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項５】
前記スクテラリアの根は約９８±５℃で抽出される、請求項４に記載の薬剤組成物。
【請求項６】
前記オウレンの根茎は水で抽出される、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項７】
前記オウレンの根茎は約９８±５℃で抽出される、請求項６に記載の薬剤組成物。
【請求項８】
前記ダイオウの根および根茎は約９５％のエチルアルコールで約７０±５℃で抽出される、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項９】
前記ニンジンの根は約５０％のエチルアルコールで約７０±５℃で抽出される、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項１０】
前記スクテラリアの根の抽出物、前記オウレンの根茎の抽出物、前記ダイオウの根／根茎の抽出物、および前記ニンジンの根の抽出物は、それぞれ濾過され濃縮されてそれぞれ前記スクテラリアの根、前記オウレンの根、前記ダイオウの根／根茎、および前記ニンジンの根の濃縮粉末を形成し、前記スクテラリアの根、前記オウレンの根茎、前記ダイオウの根／根茎、および前記ニンジンの根の前記それぞれ濃縮された粉末は混合され造粒されて前記薬剤組成物の顆粒が製造される、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項１１】
製薬上許容される賦形剤または担体が前記濃縮の前に添加される、請求項１０に記載の薬剤組成物。
【請求項１２】
前記薬剤組成物が、哺乳類の血管拡張を改善する、および／または正常な血管拡張を維持する、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項１３】
前記薬剤組成物が、血管の内皮細胞を変性から保護する、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項１４】
前記薬剤組成物が、哺乳類の血圧を低下させる、および／または安定な血圧を維持する、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項１５】
前記スクテラリアの根、前記オウレンの根茎、前記ダイオウの根／根茎、および前記ニンジンの根を前記溶媒でそれぞれ抽出して前記スクテラリアの根の抽出物、前記オウレンの根茎の抽出物、前記ダイオウの根／根茎の抽出物、および前記ニンジンの根の抽出物を個々に形成すること；
前記スクテラリアの根の抽出物、前記オウレンの根茎の抽出物、前記ダイオウの根／根茎の抽出物、および前記ニンジンの根の抽出物を個々に濾過し、濃縮してスクテラリアの根の薬草ペースト、オウレンの根茎の薬草ペースト、ダイオウの根／根茎の薬草ペースト、およびニンジンの根の薬草ペーストにすること；
前記スクテラリアの根の薬草ペースト、前記オウレンの根茎の薬草ペースト、前記ダイオウの根／根茎の薬草ペースト、および前記ニンジンの根の薬草ペーストを個々に乾燥させてスクテラリアの根の濃縮粉末、オウレンの根茎の濃縮粉末、ダイオウの根／根茎の濃縮粉末、およびニンジンの根の濃縮粉末を形成すること；
前記スクテラリアの根の濃縮粉末、前記オウレンの根茎の濃縮粉末、前記ダイオウの根／根茎の濃縮粉末、および前記ニンジンの根の濃縮粉末を混合して薬草粉末混合物を形成すること；および
前記薬草粉末混合物を造粒して前記薬草薬剤組成物の顆粒を形成すること；
を含む、請求項１に記載の薬草薬剤組成物の製造方法。
【請求項１６】
前記乾燥段階の前に、製薬上許容される賦形剤または担体を前記それぞれの薬草ペーストに添加する段階をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の薬草薬剤組成物の有効量を哺乳類に投与すること；
を含む、哺乳類の血管拡張を改善する、および／または正常な血管拡張を維持する方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の薬草薬剤組成物の有効量を哺乳類に投与すること；
を含む、哺乳類の血管内皮を変性から保護する方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の薬草薬剤組成物の有効量を哺乳類に投与すること；
を含む、哺乳類の血圧を低下させる、および／または安定な血圧を維持する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本発明は、２００１年１２月２１日に提出された台湾の出願第９０１３１８９７号の優先権を主張する、２００２年６月１０日に提出された米国特許出願第１０／１６４，５６８号の部分継続出願（ＣＩＰ）である。両出願の内容は参照として本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、血管拡張の改善および／または正常な血管拡張の維持；血圧の低下および安定な血圧の維持、ならびに血管の内皮細胞の変性からの保護のための、スクラテリア（ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ）の根（黄ごん（Ｒａｄｉｘ  Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａｅ））、オウレン（ｃｏｐｔｉｓ）の根茎（黄連（Ｒｈｉｚｏｍａ  Ｃｏｐｔｉｄｉｓ））、ダイオウ（ｒｈｕｂａｒｂ）の根／根茎（大黄（Ｒａｄｉｘ  ｅｔ  Ｒｈｉｚｏｍａ  Ｒｈｅｉ））、およびニンジン（ｇｉｎｓｅｎｇ）の根（人参（Ｒａｄｉｘ  Ｇｉｎｓｅｎｇ））からの抽出物を含む薬剤組成物に関する。本発明はまた、薬草薬剤組成物の調製または使用の方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
世界保健機関（ＷＨＯ）のデータに基づくと、循環器疾患は１９９９年の全世界における死亡の１／３を占め、２０１０年までには発展途上国の主な死亡原因になると予想されている。循環器疾患は、特に制限されないが、高血圧、冠状動脈性心臓病（心臓発作）、脳血管疾患（発作）、末梢血管疾患、心臓麻痺、リウマチ性心疾患、先天性心疾患、および心筋症を含む心臓および血管の障害の群の名称である。
【０００４】
高血圧は圧倒的に最も広くみられる循環器疾患である。４５歳以上のアメリカ人の１／３以上が高血圧であり、その中で、５０％以上が６０歳以上である。未治療の高血圧は、例えば発作、冠状動脈性心臓病、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、心臓麻痺、腎不全および失明などの、深刻で命にかかわる合併症を引き起こしうる。
【０００５】
高血圧に関する第７次米国合同委員会報告（ＪＮＣ  ＶＩＩ）に示されるように、高血圧の現在の治療は、利尿薬、α−遮断薬、β−遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、ＡＣＥ阻害剤、およびアンジオテンシン拮抗薬を含む。これらの薬剤は、単剤としてまたは組み合わせて用いられうる。しかしながら、これらの薬剤のほとんどは、症状を改善するが疾患を治癒しない。これらの薬剤はまた、しばしば副作用を伴う。
【０００６】
ヒトの高血圧を引き起こす主なメカニズムのひとつは、内皮の機能障害である。内皮は、心臓ならびに血管およびリンパ管のキャビティに並ぶ上皮細胞の層である。その主な役割は、血管拡張および血管収縮のメディエーターを生成することによって血管の調子と構造との両方を調節することである。
【０００７】
アセチルコリンのような特定の作用薬に活性化されると、内皮細胞は、内皮ＮＯシンターゼ（「ｅＮＯＳ」）の活性を介したＬ−アルギニンの分解によって生じる不安定な物質である一酸化窒素（「ＮＯ」）を生成する。ＮＯは、さらに血小板凝集を阻害し、筋肉細胞の増殖を円滑にする強力な弛緩剤である。
【０００８】
高血圧または加齢などの病的状態の下では、内皮のアゴニスト誘導性の刺激は、シクロオキシゲナーゼ経路を活性化し、その結果トロンボキサンＡ２またはプロスタグランジンＨ２、またはフリーラジカル（例えばスーパーオキシドアニオン）を含むシクロオキシゲナーゼ依存性因子を生成する。機能障害の内皮はまた、血管損傷、特にアテローム性動脈硬化を引き起こしうる。
【０００９】
シクロオキシゲナーゼには２つのアイソフォームであるシクロオキシゲナーゼ１および２（ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２）がある。これはプロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ１および２とも呼ばれ、アラキドン酸のプロスタグランジン、トロンボキサン、および他のエイコサノイドへの変換において鍵となる酵素である。ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２は、その組織発現および調節における著しい違いによって、異なった生理的機能を有すると考えられている。ＣＯＸ−１は、常時体内に存在し、胃粘膜の完全性の維持、正常な血小板機能の媒介、および腎血流の調節などの恒常性維持機能に重要な細胞保護プロスタグランジンの生成に関与する構成酵素である。対照的にＣＯＸ−２は、炎症性プロスタグランジンの生成をもたらす、シクロオキシゲナーゼの速い誘導型である。ＣＯＸ−２の発現は基本条件に強く制限されるが、炎症時は大きく上方調節される。ＣＯＸ−２の関与およびプロスタグランジンの生成の上昇は、高濃度のＮＯが存在する疾患および障害に加えて、脳虚血および癌などのさまざまな疾患および障害に関連する。
【００１０】
ＮＯは、ＣＯＸ−２の活性を調節し、炎症および自己免疫が媒介する組織の破壊に関与する。ＮＯのＣＯＸ−２に対する効果は投与量に依存する。低濃度のＮＯはＣＯＸ−２を活性化する。一方、誘導型一酸化窒素合成酵素（「ｉＮＯＳ」）によって生成された大量のＮＯはＣＯＸ−２の誘導を阻害し、ＣＯＸ−２代謝産物の生成を抑制しうる。
【００１１】
ｉＮＯＳは、心筋梗塞（ＭＩ）後の心筋層において、および心臓麻痺において発現する。心筋層は、心筋から形成される心臓壁の中央の最も厚い層である。ｉＮＯＳの上方調節および過剰発現は、軽度の炎症細胞の浸潤、心臓繊維症、肥大および膨張に関連する。心臓肥大はうっ血性心不全（ＣＨＦ）の進行の重要な危険因子である。ｉＮＯＳの過剰発現はＮＯの過剰生産をもたらし、心筋機能障害およびＣＨＦの原因となる。
【００１２】
ＣＨＦは、弱くなった心臓機能が付随する浮腫とともに存在する心臓疾患の形態である。ＣＨＦは、血液を心筋に供給する動脈の狭窄（冠状動脈性心臓病）、正常な電子心臓機能を妨げるのに十分な大きさ、または配置の瘢痕組織をもたらす事前の心臓発作（心筋梗塞）、高血圧などを含む多くの異なる原因がある。ＣＨＦは、成人に発生する最も深刻な循環器疾患のひとつである。４００万人以上の人がＣＨＦを有し、発生率は上昇している。この疾患または状態の発生率は、人口の加齢に伴って上昇し、現在は高齢者の入院の最も多い原因である。ＣＨＦに関する米国ヘルスケアの総支出は年間５０億ドルを超える。
【００１３】
心房細動（ＡＦ）は、心房心筋の速いランダムな収縮を特徴とする心房性不整脈であり、全体的に不規則な、しばしば速い心拍数を引き起こす。ＡＦは炎症によって促される心房の構造変化によって持続しうる。Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、ＡＦの一般的な続発症である心血管系疾患および発作を予測する全身性炎症マーカーである。ＣＲＰはまた、内皮細胞による接着分子の発現を誘導する。
【００１４】
長年西洋医学において万能薬が探索されてきたが、研究者はさまざまな疾患の薬物治療に用いる伝統的な漢方薬に転換した。漢方薬は、数千年間さまざまな疾患を治療するために存在し、用いられてきた。
【００１５】
例えば、Ｓａｎ−Ｈｕａｎｇ−Ｈｓｉｅ−Ｈｓｉｎ−Ｔａｎｇは、Ｃｈｉｎ−Ｋｕｅｉ−Ｙａｏ−Ｌｕｅｈ（英語に訳すと「金のチャンバからの処方」）に初めて記載された、「火をパージし３つの胴をクリアにする」のための古い薬草の煎じ薬であり、不十分な心臓の「Ｃｈｉ」、吐血および鼻出血に対して示されるものである。前記煎じ薬は、等量のスクテラリアの根（黄ごん）、オウレンの根茎（黄連）、ならびにダイオウの根および根茎（大黄）から作製された。前記煎じ薬は苦味を有し、寒性である。前記煎じ薬は、うっ血、紅潮、落ち着きのなさ、肩こり、胃の閉塞性の下降、便秘、および強い脈を有する患者に対するものである。しかしながら、前記煎じ薬は、長引く出血、著しい貧血、およびきわめて弱い脈の症状のある患者には禁忌であるか、適さない。
【００１６】
米国特許第５，４４３，８３９号には、特にスクテラリアの抽出物を含む、抗炎症、抗アレルギー、または抗老化の活性を有する組成物が開示されている。この組成物が循環器疾患および高血圧の治療に効果があることは示唆されていない。
【００１７】
米国特許第６，２７４，１７７号には、抗炎症および抗血小板凝集に強力なショウガ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）からの抽出物を調製する方法が開示されている。この薬草組成物が循環器疾患および高血圧の治療に効果があることは示唆されていない。
【００１８】
米国特許第６，３４０，４８０号には、全身血管の弛緩および拡張を促進することによる、高血圧を含む循環状態を治療するための組成物および方法が開示されている。前記組成物は、経口でまたは局所的に投与される形態の、Ｌ−アルギニン、ニンジン、およびタイソウ（Ｚｉｚｙｐｈｉ  ｆｒｕｃｔｕｓ）の天然の組み合わせである。この組み合わせは相乗的に働いてＮＯを合成し、これによって全身の血管の弛緩および拡張を促進する。組み合わされる成分は、それ自体がＮＯを製造しえない領域においてＮＯの臨界しきい値を維持するように働き、これによって高血圧を抑えるために全身の血管の弛緩および拡張を促進しうる。しかしながら、循環器疾患の治療において薬草組成物が効果的であるかどうかは明らかではない。
【００１９】
親出願である米国特許出願第１０／１６４，５６８号には、スクテラリアの根（黄ごん）の抽出物、オウレンの根茎（黄連）の抽出物、ダイオウの根／根茎（大黄）の抽出物、およびニンジンの根（人参）またはアメリカ人参の根（Ｒａｄｉｘ  Ｐａｎａｃｉｓ  Ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｉ）の粉末を含む薬草薬剤組成物が記載されている。この薬草薬剤組成物は、循環器疾患の予防および治療の双方に効果がある。前記組成物はまた無毒であり、したがって、虚弱、高齢、および衰弱した人を含むすべての年齢および健康状態の患者に用いられうる。
【００２０】
このＣＩＰ出願には、ニンジンの根（人参）の粉末がニンジンの根の抽出物で置き換えられている、わずかに異なる薬草薬剤組成物が記載されている。本発明の薬草薬剤組成物は、循環器疾患の予防と治療との両方において同様の効果を示すだけでなく、血管拡張の改善および／または正常な血管拡張の維持において優れた機能を、血管の内皮細胞において、特に内皮細胞の変性を防止することによって、保護機能を示す。
【発明の開示】
【００２１】
発明の概要
本発明は、黄ごん（Ｒａｄｉｘ  Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａｅ）（スクテラリア（ｓｃｔｅｌｌａｒｉａ）の根）、黄連（Ｒｈｉｚｏｍａ  Ｃｏｐｔｉｄｉｓ）（オウレン（ｃｏｐｔｉｓ）の根茎）、大黄（Ｒａｄｉｘ  ｅｔ  Ｒｈｉｚｏｍａ  Ｒｈｅｉ）（ダイオウ（ｒｈｕｂａｒｂ）の根／根茎）、および人参（Ｒａｄｉｘ  Ｇｉｎｓｅｎｇ）（ニンジン（ｇｉｎｓｅｎｇ）の根）の抽出物を含み、前記抽出物が、水およびエチルアルコールからなる群から選択される少なくとも１つの溶媒で前記スクテラリアの根、前記オウレンの根茎、前記ダイオウの根／根茎、および前記ニンジンの根をそれぞれ抽出することによって製造される、薬草薬剤組成物を提供する。
【００２２】
本発明の薬剤組成物の、前記スクテラリアの根、前記オウレンの根茎、前記ダイオウの根および根茎、ならびに前記ニンジンの根は、約１〜２：１〜２：１〜２：１〜２、好ましくは約１：１：２：１の重量比である。好ましくは、前記スクテラリアの根および前記オウレンの根茎は水で約９８±５℃で抽出され；前記ダイオウの根／根茎は約９５％のエチルアルコールで約７０±５℃で抽出され；前記ニンジンの根は約５０％のエチルアルコールで約７０±５℃で抽出される。
【００２３】
本発明の薬剤組成物の抽出物は、抽出、濾過および濃縮によってそれぞれ処理される。これによって、それぞれの薬草のそれぞれの抽出物は濃縮ペーストになる。それぞれの濃縮ペーストはその後さらに乾燥されてそれぞれ濃縮粉末になる。任意で、製薬上許容される担体が、濃縮段階の前に、濃縮ペーストの乾燥を促進するために添加されうる。それぞれの薬草の濃縮粉末はさらに混合され、一体化されて造粒されて、カプセルに入れられうる顆粒を形成する。
【００２４】
本発明の薬剤組成物は、哺乳類の血管拡張を改善する、および／または正常な血管拡張を維持する；血圧を低下させる、および／または安定な血圧を維持する；ならびに血管の内皮細胞を変性から保護する効果を有する。血管拡張は、血管の拡張、特に血管の一部への血流の増加をもたらす細動脈の拡張を意味する。
【００２５】
本発明はさらに、以下の段階：（１）スクテラリアの根、オウレンの根茎、ダイオウの根／根茎、およびニンジンの根を溶媒（水、エチルアルコールまたはこれらの混合物）でそれぞれ抽出して、スクテラリアの根の抽出物、オウレンの根茎の抽出物、ダイオウの根／根茎の抽出物、およびニンジンの根の抽出物を個々に形成する；（２）スクテラリアの根、オウレンの根茎、ダイオウの根／根茎、およびニンジンの根からのそれぞれの抽出物を、個々に濾過し、濃縮して、スクテラリアの根、オウレンの根茎、ダイオウの根／根茎、およびニンジンの根の個々の薬草ペーストを形成する；（３）スクテラリアの根、オウレンの根茎、ダイオウの根／根茎、およびニンジンの根のそれぞれの薬草ペーストを個々に乾燥させて、スクテラリアの根、オウレンの根、ダイオウの根／根茎、およびニンジンの根のそれぞれの濃縮粉末を形成する；（４）スクテラリアの根、オウレンの根茎、ダイオウの根／根茎、およびニンジンの根のそれぞれの濃縮粉末を混合して薬草粉末混合物を形成する；および（５）前記薬草粉末混合物を造粒して前記薬草薬剤組成物の顆粒を形成する；を含む、本発明の薬草薬剤組成物を調製する方法を提供する。任意で製薬上許容される賦形剤または担体を、乾燥段階の前に各薬草ペーストにそれぞれ添加してもよい。薬剤組成物の顆粒をカプセルに入れてもよい。
【００２６】
最後に、本発明は、本発明の薬草薬剤組成物の有効量を哺乳類に投与することによって、例えばヒトなどの哺乳類の血管拡張を改善する、および／または正常な血管拡張を維持する；例えばヒトなどの哺乳類の安定な血圧を低下させる、および／または維持する；ならびに例えばヒトなどの哺乳類の血管の内皮細胞を変性から保護するための方法を提供する。薬草薬剤組成物は好ましくは経口で哺乳類に投与される。
【００２７】
図面の簡単な説明
図１は、本発明の薬剤組成物を製造するための製造工程のフローチャートを示す。ＱＣ：品質管理。ＱＣ工程には、（ａ）薬草成分段階（原料を含む）；（ｂ）原薬段階（各薬草の濃縮粉末を含む）；（ｃ）半製品段階（混合顆粒を含む）；および（ｄ）完成製剤段階（カプセルを含む）の、４つの試料捕集点がある。
【００２８】
図２は、さまざまな週齢のＳＨＲラットのアセチルコリンに応答する血管拡張を比較する：ＳＨＲ−１２Ｗコントロール（●）；ＳＨＲ−１５Ｗコントロール（□）ＳＨＲ−１８Ｗコントロール（▲）およびＳＨＲ−２５Ｗコントロール（○）。＊は特定の群の血管拡張がＳＨＲ−２５Ｗコントロール群のものと統計的に異なっていたことを示す（ｐ＜０．０５，ｔｗｏ−ｆａｃｔｏｒ  ＡＮＯＶＡ）。
【００２９】
図３は、１２週齢のＳＨＲラットのアセチルコリンに応答する血管拡張を比較する：コントロール（■）およびＳＢ２２１（◇）群。ＳＢ２１１群は本発明の薬剤組成物を与えられた。
【００３０】
図４は、１５週齢のＳＨＲラットのアセチルコリンに応答する血管拡張を比較する：コントロール（■）およびＳＢ２２１（◇）群。ＳＢ２１１群は本発明の薬剤組成物を与えられた。
【００３１】
図５は、１８週齢のＳＨＲラットのアセチルコリンに応答する血管拡張を比較する：コントロール（■）およびＳＢ２２１（◇）群。ＳＢ２１１群は本発明の薬剤組成物を与えられた。＊はＳＢ２２１群とコントロール群との間で血管拡張に統計的に有意な差があったことを示す（ｐ＜０．０５，ｔｗｏ−ｆａｃｔｏｒ  ＡＮＯＶＡ）。
【００３２】
図６は、２５週齢のＳＨＲラットのアセチルコリンに応答する血管拡張を比較する：コントロール（■）およびＳＢ２２１（◇）群。ＳＢ２１１群は本発明の薬剤組成物を与えられた。＊はＳＢ２２１群とコントロール群との間で血管拡張に統計的に有意な差があったことを示す（ｐ＜０．０５，ｔｗｏ−ｆａｃｔｏｒ  ＡＮＯＶＡ）。
【００３３】
図７は、さまざまな週齢のＷＫＹラットのアセチルコリンに応答する血管拡張を比較する：ＷＫＹ−１２Ｗコントロール（◆）；ＷＫＹ−１５Ｗコントロール（□）ＷＫＹ−１８Ｗコントロール（▲）およびＷＫＹ−２５Ｗコントロール（○）。＊は特定の群の血管拡張がＷＫＹ−２５Ｗコントロール群のものと統計的に異なっていたことを示す（ｐ＜０．０５，ｔｗｏ−ｆａｃｔｏｒ  ＡＮＯＶＡ）。
【００３４】
図８は、１２週齢のＷＫＹラットのアセチルコリンに応答する血管拡張を比較する：コントロール（■）およびＳＢ２２１（◇）群。ＳＢ２１１群は本発明の薬剤組成物を与えられた。＊はＳＢ２２１群とコントロール群との間で血管拡張に統計的に有意な差があったことを示す（ｐ＜０．０５，ｔｗｏ−ｆａｃｔｏｒ  ＡＮＯＶＡ）。
【００３５】
図９は、１５週齢のＷＫＹラットのアセチルコリンに応答する血管拡張を比較する：コントロール（■）およびＳＢ２２１（◇）群。ＳＢ２１１群は本発明の薬剤組成物を与えられた。
【００３６】
図１０は、１８週齢のＷＫＹラットのアセチルコリンに応答する血管拡張を比較する：コントロール（■）およびＳＢ２２１（◇）群。ＳＢ２１１群は本発明の薬剤組成物を与えられた。
【００３７】
図１１は、２５週齢のＷＫＹラットのアセチルコリンに応答する血管拡張を比較する：コントロール（■）およびＳＢ２２１（◇）群。ＳＢ２１１群は本発明の薬剤組成物を与えられた。
【００３８】
図１２は、細胞培地中にみられる乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性（細胞溶解物の％として表す）（ｎ＝３）に基づくヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＳＢ２２１の細胞毒性の研究の結果を示す。ＬＤＨ活性の結果を、（ＳＢ２２１なしに細胞を成長させた）基礎ＬＤＨ値および（細胞が収集されて均一化された）全細胞溶解物と比較した。全細胞溶解物を１００％ＬＤＨ値として表した。この研究の結果は、基礎群とＳＢ２２１群との間にＬＤＨ活性に統計的に有意な差がなかったことを示す（１０−６〜１０−３ｇ／ｍｌの間）。ＨＵＶＥＣの基礎ＬＤＨ活性は、全溶解物の約１４％であり、ＳＢ２２１群のＬＤＨ活性は基礎群のそれと３％以内の差であった。基礎群およびＳＢ２２１群の双方においてＬＤＨ活性は全細胞溶解物のものと有意に異なっていた。
【００３９】
図１３は、ＳＢ２２１処理細胞および基礎値を与えるコントロール細胞（すなわちＳＢ２２１処理をしない細胞）から収集した細胞培地のＭＴＴテトラゾリウム塩熱量分析（ｎ＝７）に基づくヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＳＢ２２１の細胞毒性の研究の結果を示す。データ解析は、ｏｎｅ−ｆａｃｔｏｒ  ＡＮＯＶＡを用いて行った。この結果は、基礎群とＳＢ２２１群との間に統計的に有意な差がなかったことを示す。
【００４０】
図１４は、ＳＨＲコントロールラットの胸部大動脈組織の断面のＣＤ３１免疫組織化学染色を示す：（Ａ）ＳＨＲ−１２Ｗコントロール、（Ｂ）ＳＨＲ−１５Ｗコントロール、（Ｃ）ＳＨＲ−１８Ｗコントロール、および（Ｄ）ＳＨＲ−２５Ｗコントロール。ＣＤ３１は、白血球（ＴおよびＢ細胞、単球、顆粒球、血小板、骨髄細胞の４０％）、内皮、および平滑筋細胞上にみられる、質量１３０〜１４０ｋＤの、広く分布した単一鎖の糖タンパク質である。図は、ＣＤ３１抗体を１：３００の濃度で用いて、光学顕微鏡下で４００×で撮影した。矢印は、血管の空洞が並ぶ細胞の層を形成する内皮細胞を示す。（Ｃ）および（Ｄ）に示される内皮（内皮細胞の層）は、中皮層のいくつかを見せる、不均一で部分的にはがれた表面を含む。
【００４１】
図１５は、ＳＢ２２１で治療されたＳＨＲラットの胸部大動脈組織の断面のＣＤ３１免疫組織化学染色を示す：（Ａ）ＳＨＲ−１２Ｗ  ＳＢ２２１、（Ｂ）ＳＨＲ−１５Ｗ  ＳＢ２２１、（Ｃ）ＳＨＲ−１８Ｗ  ＳＢ２２１、および（Ｄ）ＳＨＲ−２５Ｗ  ＳＢ２２１。図は、ＣＤ３１抗体を１：３００の濃度で用いて、光学顕微鏡下で４００×で撮影した。矢印は内皮細胞を示す。不均一で部分的にはがれた表面を有したＳＢ２２１治療をしない１８週齢および２５週齢のラットの内皮細胞（図１４（Ｃ）および（Ｄ）を参照）と対照的に、ＳＢ２２１での治療後、全ての週齢群において内皮細胞は滑らかで均一な表面を有した。
【００４２】
図１６は、ＷＫＹコントロールラットの胸部大動脈組織の断面のＣＤ３１免疫組織化学染色を示す：（Ａ）ＷＫＹ−１２Ｗコントロール、（Ｂ）ＷＫＹ−１５Ｗコントロール、（Ｃ）ＷＫＹ−１８Ｗコントロール、および（Ｄ）ＷＫＹ−２５Ｗコントロール。図は、ＣＤ３１抗体を１：３００の濃度で用いて、光学顕微鏡下で４００×で撮影した。矢印は内皮細胞を示す。ＷＫＹコントロールラットの内皮細胞は滑らかで均一な表面を有した。
【００４３】
図１７は、ＳＢ２２１で治療されたＷＫＹラットの胸部大動脈組織の断面のＣＤ３１免疫組織化学染色を示す：（Ａ）ＷＫＹ−１２Ｗ  ＳＢ２２１、（Ｂ）ＷＫＹ−１５Ｗ  ＳＢ２２１、（Ｃ）ＷＫＹ−１８Ｗ  ＳＢ２２１、および（Ｄ）ＷＫＹ−２５Ｗ  ＳＢ２２１。図は、ＣＤ３１抗体を１：３００の濃度で用いて、光学顕微鏡下で４００×で撮影した。矢印は内皮細胞を示す。ＳＢ２２１（本発明の薬剤組成物）での治療後、ＷＫＹラットの内皮細胞は滑らかで均一な表面を有した。
【００４４】
発明の詳細な説明
本発明は、高齢者および衰弱した人を含む全ての年齢およびさまざまな健康状態の患者に適した、循環器疾患の予防および治療のための新しい薬草薬剤組成物を提供する。
【００４５】
循環器疾患の科学的および医学的な理解の最近の進歩は、これらの疾患における、内皮の損傷、一酸化窒素（ＮＯ）、炎症反応、およびＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の関与に関してより多くの知識を提供する。内皮ＮＯシンターゼ（ｅＮＯＳ）によって内皮で生じるＮＯは、強力な血管拡張剤であるだけでなく、血小板凝集を阻害し、筋肉細胞の増殖、単球接着および接着分子の発現を円滑にし、したがって内皮組織の完全性を維持する。プロスタノイドおよび酸素フリーラジカルを含むシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）依存性の因子の生成は、内皮の機能障害のおもな原因となりうる。機能障害の内皮は、したがって、より深刻な循環器疾患をさらにもたらしうる血管損傷を引き起こすおもなメカニズムの１つになりうる。シクロオキシゲナーゼの阻害は、本質的な高血圧においてＮＯが媒介する血管拡張を回復させうるため、抗炎症介入は治療的有用性を有しうる。
【００４６】
疾患の状態、例えば心臓肥大、心筋梗塞（ＭＩ）、虚血、心筋炎および敗血性ショックの間、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の過剰発現は、ＮＯの生成の増加をもたらす。高いＮＯレベルは、例えば心筋機能障害、うっ血性心臓麻痺および突然心臓死などのより深刻な合併症をもたらしうる。
【００４７】
炎症過程の間、急性反応物質であるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）が生成する。ＣＲＰはしばしば、接着分子の発現を促進し、血管炎症、特にアテローム性動脈硬化の発症に直接的な役割をはたしうる、全身性炎症マーカーとして用いられる。ＣＲＰは、血管の危険因子ならびに一般のおよび偶発的なアテローム性循環器疾患、すなわち冠状動脈性心臓病、発作、および末梢動脈疾患と関連付けられてきた。
【００４８】
循環器疾患の治療の新しいアプローチは、疾患のすべての態様を考慮するべきである。例えば、抗高血圧活性に加えて、新しい薬剤は健康な内皮を保護するだけでなく、機能障害の内皮の機能を改善するべきである。
【００４９】
本発明は、循環器疾患を治療し予防するために、高い血圧を低下させ、正常な血圧を維持する；血管拡張を改善し、および／または正常な血管拡張を維持する；ならびに血管の内皮細胞を変性から保護する機能を有する薬草薬剤組成物を提供する。
【００５０】
本発明の薬草薬剤組成物は、スクテラリアの根、オウレンの根茎、ダイオウの根および根茎、ならびにニンジンの根の４つの薬草を含む。前記組成物に用いられる薬草は、上述の薬草の任意の変種でありうる。例えば、スクテラリアの根は、Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ  Ｇｅｏｒｇｉ、Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  ｖｉｓｃｉｄｕｌａ  Ｂｇｅ．、およびＳｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  ａｍｏｅｎａ  Ｃ．Ｈ．Ｗｒｉｇｈｔの３つの近縁関係にある変種を有する。オウレンの根は、Ｃｏｐｔｉｓ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ  Ｆｒａｎｃｈ．、Ｃｏｐｔｉｓ  ｄｅｌｔｏｉｄｅａ  Ｃ．Ｙ．Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  Ｈｓｉａｏ、Ｃｏｐｔｉｓ  ｔｅｅｔｏｉｄｅｓ  Ｃ．Ｙ．Ｃｈｅｎｇ、およびＣｏｐｔｉｓ  ｏｍｅｉｅｎｓｉｓ（Ｃｈｅｎ）Ｃ．Ｙ．Ｃｈｅｎｇの４つの近縁関係にある変種を有する。ダイオウの根および根茎は、Ｒｈｅｕｍ  ｐａｌｍａｔｕｍ  Ｌ．、Ｒｈｅｕｍ  ｔａｎｇｕｔｉｃｕｍ  Ｍａｘｉｍ．、およびＲｈｅｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ  Ｂａｉｌｌの３つの近縁関係にある変種を有する。
【００５１】
スクテラリアの薬剤効果は乾燥した根にあり、黄ごんの薬物名を有する。スクテラリアはシソ（Ｌａｂｉａｔｓｅ）科に属する。この薬草は主に中国の河北省、陝西省、および内蒙古で生産される。この薬草の最大の収穫期は春または秋である。スクテラリアの根は日光の下で乾燥され、薄く切られ、調製されずに用いられるか、または酒で撹拌ベークされるか炭に撹拌ベークされる。この薬草は苦味があり寒性である。伝統的な漢方薬によれば、この薬草は肺、胆嚢、胃、および大腸の経路における疾患の治癒に用いられうる。特にこの薬草は、患者の湿熱の除去、毒性の中和、止血および流産の予防に用いられうる。
【００５２】
スクテラリアの根は、特に制限されないが、バイカリン（ｂａｉｃａｌｉｎ）、オロキシリンＡ−グルクロニド（ｏｒｏｘｙｌｉｎ  Ａ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ）、オウゴニン−７−Ｏ−グルクロニド（ｗｏｇｏｎｉｎ−７−Ｏ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ）、バイカレイン（ｂａｉｃａｌｅｉｎ）、オウゴニン（ｗｏｇｏｎｉｎ）およびオロキシリンＡ（ｏｒｏｘｙｌｉｎ  Ａ）などの活性成分を含む。バイカリンは、薬草の量的なまたは質的な制御のための基準として用いられうる。
【００５３】
オウレンの薬剤効果はオウレンの乾燥した根茎にあり、黄連の薬物名を有する。オウレンはキンポウゲ（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ）科に属する。これは、主に中国の四川、湖北、および雲南で生産される。好ましい収穫期は秋である。オウレンの根茎は、細根および土が除去された後、日光の下で乾燥され、調製されずにまたはショウガ汁で撹拌ベークされて用いられる。この薬草は苦味があり寒性である。伝統的な漢方薬によれば、この薬草は心臓、胃、肝臓、および大腸の経路における疾患の治癒に用いられうる。
【００５４】
オウレンの根茎は、特に制限されないが、ベルベラスチン（ｂｅｒｂｅｒａｓｔｉｎｅ）、コロンバミン（ｃｏｌｕｍｂａｍｉｎｅ）、ジャトロリジン（ｊａｔｒｏｒｒｈｉｚｉｎｅ）、エピベルベリン（ｅｐｉｂｅｒｂｅｒｉｎｅ）、コプチシン（ｃｏｐｔｉｓｉｎｅ）、パルマチン（ｐａｌｍａｔｉｎｅ）、およびベルベリン（ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ）などの活性成分を含む。ベルベリンは、薬草の量的なまたは質的な制御のための基準として用いられうる。
【００５５】
ダイオウの薬剤効果はダイオウの乾燥した根および根茎にあり、大黄の薬物名を有する。ダイオウはタデ（Ｐｏｌｙｇｏｎａｃｅａｅ）科に属する。これは、主に中国の青海州および四川州で生産される。ダイオウの根および根茎は、その茎および葉が枯れ始める晩秋、または植物が発芽し始める前の春先に掘られる。収穫された薬草は乾燥され、薄く切られる。ダイオウの根および根茎は調製されずに、酒で撹拌ベークされて、または炭化されて用いられうる。これは苦味があり寒性である。伝統的な漢方薬によれば、ダイオウの根および根茎は脾臓、大腸、肝臓、および心臓の経路における疾患の治癒に用いられうる。
【００５６】
ダイオウの根および根茎は、特に制限されないが、センノシドＢ（ｓｅｎｎｏｓｉｄｅ  Ｂ）、センノシドＡ（ｓｅｎｎｏｓｉｄｅ  Ａ）、アロエーエモジン（ａｌｏｅ−ｅｍｏｄｉｎ）、レイン（ｒｈｅｉｎ）、エモジン（ｅｍｏｄｉｎ）、およびクリソファノール（ｃｈｒｙｓｏｐｈａｎｏｌ）などの活性成分を含む。センノシドＡおよび／またはエモジンは、薬草の量的なまたは質的な制御のための基準として用いられうる。
【００５７】
人参（ニンジンの根）およびＲａｄｉｏ  Ｐａｎａｃｉｓ  Ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｉ（アメリカニンジン、Ｐａｎａｘ  ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｌｕｍ  Ｌの根）の２種のニンジンがある。人参（ニンジンの根）は、本発明の薬草薬剤組成物に用いられる。人参は、ウコギ科に属するＰａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ  Ｃ．Ａ．Ｍｅｙである。ニンジン（人参）は、主に中国の吉林、遼寧、および黒竜江省で生産される。吉林の撫松で生産されるニンジンは特に品質がよい。この薬草は、栽培することもでき、野生にみられるニンジンを称する「山ニンジン」に対して、「園芸用ニンジン」と呼ばれる。栽培されたニンジンは秋に収穫される。収穫されたニンジンは、「天日乾燥ニンジン」と称されるように日光で乾燥されるか焼かれるか、「赤ニンジン」と称されるように蒸気に当てられた後乾燥されるか、または「砂糖加工ニンジン」として知られるようにシロップに漬けられる。繊維質の細根は細根ニンジンとして知られている。日光で乾燥させた野生のニンジンは日光乾燥野生ニンジンとして知られている。この薬草は薄く切って使用される。この薬草は甘く、少し苦味があり、中性である。伝統的な漢方薬によれば、ニンジンは肺、脾臓、および心臓の経路における疾患の治癒に特に優れる。
【００５８】
ニンジンの薬剤効果はその乾燥した根にある。ニンジンはまた、中枢神経系に効果がある。ニンジンは、中枢神経系において促進および阻害の両方の過程を高め、これによって神経の応答の順応性を高める。ニンジンはまた、血中グルコースおよびコレステロールを低下させうる。ニンジンはまた、消化性潰瘍の治療および予防の効果を示す。
【００５９】
ニンジンの根の活性成分は、特に制限されないが、ジンセノサイド（ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ）Ｒｇｌ、ジンセノサイドＲｅ、およびジンセノサイドＲｂｌを含み、中でも、ジンセノサイドＲｂｌは、薬草の量的なまたは質的な制御のための基準として用いられうる。
【００６０】
本発明に用いられる薬草の薬物名、植物名、科名、慣用名、および主な成分を表１に示す。
【００６１】
【表１】
2008511629.tif 000002
【００６２】
伝統的に、植物、動物、または鉱物源の成分を含む漢方薬は、調製方法に基づいて以下の投与形態に分類されうる：ｗａｎ（丸薬）、ｓａｎ（粉末）、ｇａｏ（シロップ、柔らかい抽出物またはプラスター）、ｄａｎ（特殊な丸薬またはヴァーミリアン丸薬）およびｔａｎｇ（煎じ薬）。中でも、煎じ薬および粉末は最も一般的な投与形態である。伝統的に、煎じ薬は、薬草処方の薬草成分を混合し、その後混合物を水または他の媒体中で煮沸することによって調製される。粉末の投与形態は、薬草処方の薬草成分を混合し、混合物を直接粉砕して粉末にすることによって調製される。伝統的な濃縮された漢方薬は、薬草処方に従って薬草成分を集め、前記成分を合わせて混合し、混合物を煮沸し、濾過し、濃縮し、適当な量の賦形剤を添加し、造粒し、最後に丸薬、粉末、カプセルおよび錠剤に調製される。
【００６３】
特に制限されないが、栽培の場所および条件、収穫、選択、貯蔵の時期および方法、調製の方法を含むさまざまな因子が薬草調製の質に影響する。漢方薬を製造する現在の手法は、一般に、質の制御の目的で生の薬草、半製品、および完成品の試料を収集する。図１に示すように、よりよい質の制御を提供するために、本発明は、薬剤組成物の質が一貫してよく制御されることを保証するために、薬草成分段階（ＱＣ、サンプリング点１、図１）；原薬段階（ＱＣ、サンプリング点２）；半製品段階（ＱＣ、サンプリング点３）；および最終の完成品段階（ＱＣ、サンプリング点４）の４点サンプリングを用いる。
【００６４】
製造工程の各点から採取した試料を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけ、各薬草成分の質を保証する目的で各薬草の成分を決定した。ＨＰＬＣ法および本発明の薬草成分の試験結果は以下の通りである：
Ａ．ＨＰＬＣのための薬草抽出物の調製
１．薬草成分の試料０．５ｇを正確に秤量し、５０ｍＬのサンプル瓶に入れた。
【００６５】
２．７０％メタノール２０ｍＬを（１）のサンプル瓶に加えた。
【００６６】
３．（２）の混合物を室温で１５分間超音波処理して、さらに４０℃の水浴で１６０ｒｐｍで２０分間振とうした。その後２層の溶液が形成されるまで３０分以上放置した。
【００６７】
４．溶液の透明な上層を取り出し、英国Ｗｈａｔｍａｎ社製の０．４５μｍのＰＶＤＦフィルターを通過させた。
【００６８】
５．約２０μＬの濾過した溶液を、定量分析のためにＨＰＬＣに注入した。
【００６９】
Ｂ．ＨＰＬＣ分析の装置
用いた装置は、Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅポンプ、Ｗａｔｅｒｓ  ７ｌ７Ｐｌｕｓ  オートサンプラー、およびＷａｔｅｒｓ  ９９６フォトダイオードアレイ検出器を含む。
【００７０】
Ｃ．ＨＰＬＣ条件および各薬草の結果
【００７１】
【表２】
2008511629.tif 000003
【００７２】
（ｂ）結果：
ダイオウの根／根茎のＨＰＬＣクロマトグラムは、センノシドＢ、センノシドＡ、アロエ−エモジン、レイン、エモジン、およびクリソファノールの指示的な成分を含む。これらの成分の保持時間および最大吸収波長を表２に示す。
【００７３】
【表３】
2008511629.tif 000004
【００７４】
【表４】
2008511629.tif 000005
【００７５】
（ｂ）結果：
スクテラリアの根のＨＰＬＣクロマトグラムは、バイカリン、オロキシリンＡ−グルクロニド、オウゴニン−７−Ｏ−グルクロニド、バイカレイン、オウゴニン、およびオロキシリンＡの指示的な成分を含む。これらの成分の保持時間および最大吸収波長を表３に示す。
【００７６】
【表５】
2008511629.tif 000006
【００７７】
【表６】
2008511629.tif 000007
【００７８】
（ｂ）結果：
オウレンの根茎のＨＰＬＣクロマトグラムは、ベルベラスチン、コロンバミン、ジャトロリジン、エピベルベリン、コプチシン、パルマチン、およびベルベリンの指示的な成分を含む。これらの成分の保持時間および最大吸収波長を表４に示す。
【００７９】
【表７】
2008511629.tif 000008
【００８０】
【表８】
2008511629.tif 000009
【００８１】
（ｂ）結果：
ニンジンの根のＨＰＬＣクロマトグラムは、ジンセノサイドＲｇｌ、ジンセノサイドＲｅ、およびジンセノサイドＲｂｌの指示的な成分を含む。これらの成分の保持時間および最大吸収波長を表５に示す。
【００８２】
【表９】
2008511629.tif 000010
【００８３】
薬剤組成物
本発明の薬剤組成物において、スクテラリアの根、オウレンの根茎、ダイオウの根および根茎、ならびにニンジンは、溶媒抽出と、その後の抽出物の濃縮および乾燥によって最も適切に調製される。任意で製薬上の賦形剤が乾燥前に濃縮物に添加されうる。例えば、特に限定されないが、コーンスターチが挙げられる。
【００８４】
本発明の薬剤組成物において、スクテラリアの根、オウレンの根茎、ダイオウの根および根茎、ならびにニンジンの根の重量比は、約１〜２：１〜２：１〜２：１〜２であり、最も好ましくは１：１：２：１である。
【００８５】
本発明の薬剤組成物は以下の手順で調製された（図１）：
（１）薬草抽出物の調製
薬草は好ましくはそれぞれ溶媒で抽出される。溶媒は水または抽出の目的で製薬上許容される有機溶媒、または水と有機溶媒との混合物でありうる。好ましい有機溶媒はエチルアルコールである。スクテラリアの根およびオウレンの根茎は水で９８±５℃で；ダイオウの根および根茎はアルコール、特に９５％（ｖ／ｖ）のアルコール水溶液で７０±５℃で；そしてニンジンの根はアルコール、特に５０％（ｖ／ｖ）のアルコール水溶液で７０±５℃で抽出されることが好ましい。前記抽出物はそれぞれさらに濾過される。
【００８６】
（２）薬草ペーストの調製
抽出によって調製された薬草について、それぞれの薬草抽出物は、それぞれ濾過される。濾過後、各薬草抽出物はそれぞれ減圧下で水浴（５０℃に維持される）中で、各薬草ペーストが形成されるまで濃縮される。
【００８７】
（３）濃縮粉末の調製
濃縮物は、好ましくはそれぞれ乾燥され、濃縮粉末が製造される。任意で製薬上適切な賦形剤が濃縮物に添加されてもよく、得られた混合物は乾燥されて抽出物（原薬）が製造される。前記賦形剤は、好ましくは、特に制限されないが、デンプン、アミロース、アミロペクチン、ゼラチン、スターチ１５００、デンプングリコール酸ナトリウム、セルロース、微結晶性セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、クロスカルメロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、およびキトサンを含む多糖類製品である。最も好ましい賦形剤はコーンスターチである。
【００８８】
（４）顆粒の調製
各薬草の濃縮粉末を混合し、ふるいを通して粉末混合物のサイズが一定の範囲内であることを確実にする。さらに、ステアリン酸マグネシウムなどの製薬上適切な賦形剤を粉末混合物に添加し、混合物を完全に混合し造粒する。造粒は流動床（Ｆｌｏｗ  ｂｅｄ）を用いて熱乾燥段階で行われる。得られた顆粒はふるいを通して顆粒のサイズが一定の範囲内であることを確実にし、半製品を形成する。さらに、前記半製品の顆粒は、ステアリン酸マグネシウムなどの製薬上適切な賦形剤と完全に混合され、当業者、特に製薬産業においてよく知られた処方によって、錠剤、ボール、粉末、カプセル、および顆粒に加工されうる。
【００８９】
以下の実施例は説明のためのものであって、発明の範囲を限定しようとするものではない。正当な当業者に理解されるような正当な変形は、本発明の範囲を逸脱することなく行われうる。
【実施例】
【００９０】
実施例１
薬草薬剤組成物（ＳＢ２２１）の調製
本発明の薬草薬剤組成物１は以下のように調製した：
１．それぞれ約２０ｇのスクテラリアの根、オウレンの根茎、およびニンジン、ならびに約４０ｇのダイオウの根／根茎を、煎じて使用できる薬草の小さな薄い薄片を含む「Ｙｉｎ  Ｐｌａｎ（「飲用小片」の意味）」の形態で、それぞれ秤量した。
【００９１】
２．（１）の薬草は、それぞれグラインダーで、それぞれの粉末の形態に粉砕された。
【００９２】
３．それぞれ秤量したスクテラリアの根およびオウレンの根茎の薬草を個々に、約２０体積の水で約６０分間煮る、および／または茹で、スクテラリアの根およびオウレンの根茎の薬草抽出物をそれぞれ製造した。
【００９３】
４．それぞれ秤量したダイオウの根／根茎の薬草を約２０体積のアルコール：水（９５：５，ｖ／ｖ）で約６０分間還流下で抽出しダイオウの抽出物を製造した。
【００９４】
５．それぞれ秤量したニンジンの根の薬草を約２０体積のアルコール：水（５０：５０，ｖ／ｖ）で約６０分間還流下で抽出しニンジンの抽出物を製造した。
【００９５】
６．それぞれ濾過した（６）の薬草抽出物を、５０℃の水浴で加圧下で、薬草ペーストが形成されるまで個々に濃縮した。
【００９６】
７．適当な量のコーンスターチ（賦形剤）を、スクテラリアの根、オウレンの根茎、ダイオウの根／根茎、およびニンジンの根のそれぞれの薬草ペーストに添加して完全に混合し、コーンスターチが添加された各薬草ペーストを、各薬草ペーストが濃縮粉末になるまで乾燥処理した。
【００９７】
８．４つの薬草ペースト（すなわちスクテラリアの根、オウレンの根茎、ダイオウの根／根茎、およびニンジンの根）のすべてからの濃縮粉末を完全に混合し、１００メッシュのふるいでふるって混合粉末を形成した。
【００９８】
９．任意で、さらにコーンスターチを混合粉末に加え、その後流動床で造粒して顆粒を形成した。
【００９９】
１０．前記顆粒を再びふるい、本発明の薬剤組成物の半製品とされるＳＢ２２１顆粒を形成する。
【０１００】
１１．ＳＢ２２１顆粒をサイズ０のハードゲルカプセルに充填し、本発明の薬剤組成物の完成製剤とした。
【０１０１】
薬理学的研究
研究１
ＷＫＹおよびＳＨＲラットの血管拡張におけるＳＢ２２１の効果
Ｉ．研究デザイン：
装置および機器：
血圧測定装置（Ｂｉｏｐａｃ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＭＰ１５０）；バイオセーフ滅菌オペレーティングステーション；Ｄｙｎｅｘ  ＭＲＸ  Ｒｅｖｅｌａｔｉｏｎマイクロプレートリーダー；Ｎｉｋｏｎ  ＴＲＡＤＥ  ＳＥＣＲＥＴ−１００倒立顕微鏡；Ｇａｌａｘｙ  Ｒ  ＣＯ２インキュベータ。
【０１０２】
試薬：
ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−Ｉ）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｃａｔ．ＳＣ−１５０６）；コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．Ｃ−５１３８）；内皮細胞成長サプリメント，ＥＣＧｓ（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．Ｅ−９６４０）；アセチルコリン，ＡＣｈ（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．Ａ６６２５）；ＮＷ−ニトロ−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＮＡ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．Ｎ−５５０１）；塩化テトラエチルアンモニウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．Ｔ−２２６５）；フェニレフリン（Ｌ−型）（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．Ｐ−６１２５）；Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸，ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．Ｈ−３３７５）；ウシアルブミン，ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．Ａ−４５０３）；エチレンジアミン四酢酸，ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．ＥＤＳ）；グルコース（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．Ｇ−８２７０）；硫酸マグネシウム，ＭｇＳＯ４（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．Ｍ−７５０６）；３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド，ＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．Ｍ−５６５５）；コラーゲン（Ｖｉｔｒｏｇｅｎ  １００）；ウシ胎仔血清，ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  Ｃａｔ．１０２７０−１０６）；グルタミン（Ｇｉｂｃｏ  Ｃａｔ．２５０３０−０８１）；Ｍ１９９（Ｇｉｂｃｏ  Ｃａｔ．３１１００−３５）；ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（Ｇｉｂｃｏ  Ｃａｔ．１５１４０−１２２）；ピルビン酸塩（Ｇｉｂｃｏ  Ｃａｔ．１１３６０−０７０）；トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ  Ｃａｔ．１５４００−０５４）；乳酸脱水素酵素，ＬＤＨ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃａｔ．Ｇ１７８０）；リン酸二水素カリウム，ＫＨ２ＰＯ４（Ｍｅｒｃｋ  Ｃａｔ．１．０４８７３．０２５０）；塩化ナトリウム，ＮａＣｌ（Ｍｅｒｃｋ  Ｃａｔ．１．０６４０４．１０００），炭酸水素ナトリウム，ＮａＨＣＯ３（Ｍｅｒｃｋ  Ｃａｔ．１．０６３２９．０５００）；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｃａｔ．１．０９６７８．０１００）；塩化カリウム，ＫＣｌ（Ｓｈｏｗａ  Ｃａｔ．ＳＥ−３４３９Ｋ）；無水塩化カルシウム，ＣａＣｌ２（Ｊｕｎｓｅｉ  Ｃａｔ．４−２２）。
【０１０３】
研究動物：
本研究では、チャールズ  リバー  ラボラトリーズから入手した８週齢の雄のＷＫＹラットおよび高血圧自然発生ラット（ＳＨＲ）を用いた。動物を空調管理された動物室で２２±２℃、１２時間の暗／明サイクル（７：００〜１９：００を明）下に保った。前記動物は制限されずに水と食物を与えられた。
【０１０４】
試験溶液：
ａ．Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ（ＫＨ）緩衝液；ｐＨ７．４；ＮａＣｌ  １１８ｍＭ；ＮａＨＣＯ３  ２４ｍＭ；ＫＣｌ  ４．７ｍＭ；ＫＨ２ＰＯ４  １．２ｍＭ；ＭｇＳＯ４  １．２ｍＭ；ＣａＣｌ２  １．７ｍＭ；ＥＤＴＡ３０μＭ；グルコース１０ｍＭ；を二回蒸留水中に含む。
【０１０５】
ｂ．Ｍ１９９  ｐＨ７．４溶液；ＮａＨＣＯ３  ２．２ｇ；ＨＥＰＥＳ  ４．８ｇ；Ｍ１９９  １パック；Ｐ／Ｓ  １０ｍＬ；ヘパリン１５〜１７ｍｇ、ピルビン酸塩１０ｍＬ、およびグルタミン１０ｍＬを１Ｌの二回蒸留水に溶解して調製される。
【０１０６】
ＩＩ．方法：
処理：
ＷＫＹおよびＳＨＲラットをそれぞれの週齢によって４つの群に分けた：（ａ）１２週、（ｂ）１５週、（ｃ）１８週および（ｄ）２５週。各週齢の群は、さらにコントロールおよびＳＢ２２１の部分群に細分された。ＳＢ２２１治療群は、胃管栄養を介して１８０ｍｇ／ｋｇのＳＢ２２１で治療された（１０ｍＬ／ｋｇで１８ｍｇ／ｍＬのＳＢ２２１溶液を投与）。コントロール群は等体積の水を与えられた。動物は４週間連続して毎日治療された。治療の完了後の日の間のあらかじめ設定された制限時間内に前記動物を殺して血管試験および免疫組織化学染色分析の試料をとった。
【０１０７】
血管切片の調製：
ａ．実験開始前に循環水浴を作動させ、温度を３７℃に設定した。
【０１０８】
ｂ．約１０〜２０ｍＬのＫＨ緩衝液を、３つのペトリ皿にそれぞれ入れた。前記緩衝液を９５％Ｏ２／５％ＣＯ２でエアレートした。
【０１０９】
ｃ．動物を麻酔した後、動物の胸腔を開いて心臓を露出した。血液を心臓から取り出した。大動脈のアーチから隔膜の上の胸部大動脈までの部分を解剖し、速やかに酸素処理ペトリ皿に入れた。
【０１１０】
ｄ．胸部大動脈の結合組織および血管枝を眼科用鋏を用いて切り取った。大動脈の血壊を注意深く洗浄した後、大動脈を外科用ブレードを用いて２〜４の切片（それぞれ約２〜３ｍｍ長さ）に切断した。大動脈の各切片を血管フックを用いて掛け、注意深くチャンバに入れた。動物の数に応じて大動脈の切片を４〜８のチャンバに分けてもよい。
【０１１１】
ｅ．大動脈の切片の基礎張力を２ｇに調整して３０分間維持し、その後張力測定を行った。
【０１１２】
血管拡張試験：
大動脈の切片をはじめに１０−６Ｍのフェニレフリンで収縮させた。収縮が安定した後、１０−９〜１０−６Ｍのアセチルコリン（ＡＣｈ）を大動脈の切片に加えた。大動脈の切片の血管拡張率を観察し、内皮細胞の機能が正常であるかどうかを決定した。
【０１１３】
統計的分析
張力の変化を弛緩％で表した。最大収縮を、誘導因子の最大濃度における収縮張力で表した。各動物は試験化学物質に対して異なる応答を示しうるのみならず、同じ動物の異なる大動脈の切片もまた試験化学物質に対して異なる応答を示しうる。したがって、各大動脈の切片の結果はデータ解析の際に独立したデータとして扱い、結果を平均±標準偏差（ＳＤ）として表した。群間の比較をｔｗｏ−ｆａｃｔｏｒ  ＡＮＯＶＡを用いて行った。ＡＮＯＶＡにおいて有意な差がみられたデータについてさらにＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ’ｔｅｓｔを用いた事後解析を行った。有意のレベルをｐ＜０．０５に設定した。
【０１１４】
結果
図２に示すように、ＡｃｈはＳＨＲコントロールラットの大動脈において血管拡張を誘起した。弛緩％（すなわち血管拡張）は、Ａｃｈ濃度が１０−９Ｍから１０−７Ｍまで増加するにしたがって増加し、１０−７Ｍで血管拡張率の最大値を示した。Ａｃｈが１０−８ＭのときＳＨＲ−２５Ｗコントロールラットの平均血管拡張率は、ＳＨＲ−１５Ｗコントロールラットと約１４％異なった（これは統計的に有意である［ｐ＜０．０５］）。Ａｃｈが１０−７Ｍのとき２５週齢のＳＨＲコントロールラットの平均血管拡張率は、ＳＨＲ−１２ＷおよびＳＨＲ−１５Ｗコントロールラットと約２９％異なった（これは統計的に有意である［ｐ＜０．０５］）。Ａｃｈが１０−６Ｍのとき２５週齢のＳＨＲコントロールラットの平均血管拡張率は、ＳＨＲ−１２ＷおよびＳＨＲ−１５Ｗコントロールラットと、それぞれ１３％および１６％の有意な差を示した。これらの結果は、ＳＨＲコントロールラットの血管拡張機能がラットの加齢にしたがって低下したことを示し、これは血管の内皮細胞の機能が時間とともに低下したことを示唆している。
【０１１５】
図３および４に示すように、ＳＨＲ−１２Ｗ  ＳＢ２２１、ＳＨＲ−１２Ｗコントロール、ＳＨＲ−１５Ｗ  ＳＢ２２１およびＳＨＲ−１５Ｗコントロールラットの平均最大弛緩％（すなわち血管拡張）はそれぞれ８３％、９５％、９１％および９６％であった。コントロール群とＳＢ２２１群との間に血管拡張の有意な差はなかった。これは１２週齢および１５週齢のラットにおいてＳＢ２２１治療は有意な効果がなかったことを示している。
【０１１６】
図５に示すように、ＳＨＲ−１８Ｗ  ＳＢ２２１およびＳＨＲ−１８Ｗコントロールラットの最大弛緩％（すなわち血管拡張）はＡｃｈが１０−７Ｍで起こり、ＳＨＲ−１８Ｗ  ＳＢ２２１ラットで約９０．７％の、ＳＨＲ−１８Ｗコントロールラットで約６８％の最大弛緩％を与えた。これは約２３％の統計的に有意な差を与えた。Ａｃｈが１０−８Ｍのとき、ＳＨＲ−１８Ｗ  ＳＢ２２１ラットは、ＳＨＲ−１８Ｗ  ＳＢ２２１とＳＨＲ−１８Ｗコントロールラットとの間に約３７％の統計的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を示した。この結果は、ＳＢ２２１治療は１８週齢のＳＨＲラットの最大弛緩％を増加させることによって内皮細胞の機能を改善したことを示す。
【０１１７】
図６に示すように、ＳＨＲ−２５Ｗ  ＳＢ２２１およびコントロール群は、Ａｃｈが１０−７Ｍで最大弛緩％（すなわち血管拡張）を示し、ＳＨＲ−２５Ｗ  ＳＢ２２１およびコントロールラットの最大弛緩％はそれぞれ約９０％および約６７％であった。これは約２３．２％の統計的に有意な差を示した。Ａｃｈが１０−８および１０−６Ｍのとき、ＳＨＲ−２５Ｗ  ＳＢ２２１ラットは、ＳＨＲ−２５Ｗコントロールラットに対して約１９％および約１２％の最大弛緩％の有意な差を示した。この結果は、ＳＢ２２１治療は２５週齢のＳＨＲラットの内皮細胞の機能を改善したことを示す。
【０１１８】
図７に示すように、Ａｃｈが１０−８Ｍのとき、ＷＫＹ−２５Ｗコントロールラットは、ＷＫＹ−１２Ｗコントロール、ＷＫＹ−１５ＷコントロールおよびＷＫＹ−１８Ｗコントロールラットに対して、それぞれ約２１％、約２５％、および約１３％の最大弛緩％（すなわち血管拡張）の有意な差を示した。Ａｃｈが１０−７ＭのときＷＫＹ−２５Ｗコントロールラットは、ＷＫＹ−１２Ｗコントロール、ＷＫＹ−１５ＷコントロールおよびＷＫＹ−１８Ｗコントロールラットに対して、それぞれ約３５％、約３１％、および約２１％の最大弛緩％の有意な差を示した。Ａｃｈが１０−６ＭのときＷＫＹ−２５Ｗコントロールラットは、ＷＫＹ−１２ＷコントロールおよびＷＫＹ−１５Ｗコントロールラットに対して、それぞれ２５％および２３％の血管拡張の有意な差を示した。これらの結果は、ＷＫＹコントロールラットの血管拡張機能は、ラットの加齢にしたがって低下したことを示し、これは内皮細胞の機能の低下を示唆している。
【０１１９】
図８および９に示すように、ＷＫＹ−１２ＷおよびＷＫＹ−１５ラットの最大弛緩％（すなわち血管拡張）は、Ａｃｈ濃度が１０−９Ｍから１０−６Ｍまで増加するにしたがって増加し、１０−６Ｍで血管拡張の最大値を示した。１０−９、１０−７、および１０−６Ｍのとき、ＷＫＹ−１２Ｗ  ＳＢ２２１とコントロールラットとの弛緩％は約５％以下の差であった。１０−８Ｍのとき、ＷＫＹ−１２Ｗ  ＳＢ２２１とコントロールラットとの最大弛緩％の間に約２８％の有意な差があった。ＷＫＹ−１５Ｗ  ＳＢ２２１ラットおよびコントロールラットの最大弛緩％はそれぞれ約１００％および約９５％であった。この結果はＳＢ２２１治療にかかわらず、ＷＫＹ−１５Ｗラットの内皮細胞の機能において有意な差を示さない。
【０１２０】
図１０に示すように、ＷＫＹ−１８Ｗ  ＳＢ２２１およびコントロール群は、Ａｃｈが１０−７および１０−６Ｍで最大弛緩％（すなわち血管拡張）を示した。ＷＫＹ−１８Ｗ  ＳＢ２２１ラットおよびコントロールラットの最大弛緩％はそれぞれ約９４％および約８６％であった。ＳＢ２２１群とコントロール群との間に血管拡張の有意な差はなかった。これはＷＫＹ−１８Ｗラットの内皮細胞の機能においてＳＢ２２１治療は有意な効果がなかったことを示している。
【０１２１】
図１１に示すように、ＷＫＹ−２５Ｗラットの最大弛緩％（すなわち血管拡張）は、Ａｃｈ濃度が１０−９Ｍから１０−６Ｍまで増加するにしたがって増加した。ＷＫＹ−２５Ｗ  ＳＢ２２１ラットとコントロールラットとの最大弛緩％はそれぞれ約７８％および約７３％であった。ＳＢ２２１群とコントロール群との間に血管拡張の有意な差はなかった。これはＷＫＹ−２５Ｗラットの血管の内皮細胞においてＳＢ２２１治療は有意な効果がなかったことを示している。
【０１２２】
つまり、正常血圧（ＷＫＹ）ラットの血管拡張の研究の結果は、正常なラットの最大弛緩％は一般に、および有意に、加齢によって減少することを示し（図７）、加齢による血管の内皮細胞の機能の低下を示した。しかしながら、ＷＫＹラットに対するＳＢ２２１治療は、血管拡張に有意な差を示さず、正常血圧のラットにおけるＳＢ２２１の効果は有意ではないことが示唆された（図８〜１１）。
【０１２３】
しかしながら、ＷＫＹラットでの知見とは対照的に、ＳＨＲラットがさまざまな週齢の動物の血管拡張の効果の研究に用いられた場合、図２に示されるように、最大弛緩％は、１２Ｗ群と１５Ｗ群との間で加齢によって有意に減少し（ｐ＜０．０５）、ＷＫＹラットで起こったのと同様に加齢が血管拡張の変化に寄与することを示した。しかしながら、ＷＫＹラットの場合（図７）と異なって、最大のＡｃｈ（１０−６Ｍ）が与えられると、２５Ｗ−ＷＫＹラットの約７０％（図７）に対して、ＳＨＲ−２５Ｗ群における最大弛緩％は約５０％であり（図２）、ＳＨＲラットは老化すると潜在的な高血圧が進行することが示された。また、図８〜１１に示すように、ＳＨＲラットのコントロールとＳＢ２２１群との間に最大弛緩％の有意な差があり（ｐ＜０．０５）、ＳＢ２２１が高血圧の進行および血管拡張の低下を阻害する効果を示すことが示唆された。
【０１２４】
この研究の結果は、正常血圧のラットにはＳＢ２２１の効果は有意ではないことを示した。しかしながら、ＳＢ２２１は、おそらく血管内皮における内皮細胞の変性を防止する保護効果を通して、血管の拡張を有意に増加させることによって高血圧の動物において有意な血圧低下効果を示した。
【０１２５】
議論
内皮依存性血管拡張剤（すなわちＡＣｈ）を用いた機能試験を通して、内皮細胞の変性に対する予防効果を示すことがわかった。
【０１２６】
ＷＫＹおよびＳＨＲラットの双方における加齢による内皮細胞の変性は、おそらく以下の理由による：（１）Ｇａｉタンパク質の損傷；（２）ＮＯ、プロスタサイクリン、および内皮由来過分極因子（ＥＤＨＦ）の分泌の減少；（３）エンドペロキシドの分泌の増加；（４）活性酸素種の生成の増加；（５）エンドセリン−１の生成の増加；および（６）ＮＯ、プロスタサイクリンおよびＥＤＨＦに対する血管平滑筋細胞の感度の低下。同様の現象が高齢者および高血圧の人の患者にもみられた。上腕の動脈血流の測定を通して、これらの２つの人口集団はＮＯ経路の機能を失い、シクロオキシゲナーゼ依存性血管収縮剤の生成を増加させる傾向にあることがわかった。
【０１２７】
結論
この研究は、１８週齢またはそれ以上のＳＨＲラットにおいて、ＳＢ２２１が血圧低下効果を有するだけでなく内皮保護効果も有することを示した。
【０１２８】
研究２
内皮細胞におけるＳＢ２２１の保護効果：ＣＤ３１免疫組織化学法を用いた形態学的研究
血小板／内皮細胞接着分子−１（ＰＥＣＡＭ−１）は、ＣＤ３１とも呼ばれ、単球、好中球、血小板、およびある種のＴ細胞、内皮細胞の表面に発現する糖タンパク質である（本明細書中に参照として組み込まれるＳｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９０；１７１：２１４７−２１５２；Ｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６；１５６：１５１５−１５２４を参照）。ＣＤ３１は１３０〜１４０ｋＤの単一鎖の糖タンパク質である。ウエスタンブロット法、免疫沈降および免疫組織化学（パラフィン包埋切片を用いた）による、ＰＥＣＡＭ−１抗体を用いたＣＤ３１の検出が内皮細胞の形態学的研究において用いられてきた。
【０１２９】
以下の段落では、上述の研究１に従って調製した大動脈の切片の形態学的研究を、免疫組織化学法によって、ＣＤ３１を検出するためにマウス由来のＰＥＣＡＭ−１のカルボキシ末端でのペプチドマッピングに対して生じる、アフィニティー精製したヤギのポリクローナル抗体を用いて行った。
【０１３０】
方法：
装置／機器、試薬、試験溶液、動物、動物の処理、および血管切断は上記研究１と同様である。
【０１３１】
ＣＤ３１免疫組織化学染色
大動脈の切片を１０％ホルマリンに浸し、その後パラフィンに包埋し、切断した。パラフィン切片にＣＤ３１免疫組織化学染色を行った。いくつかの染色チャンバを、キシレン１（１００％キシレンを含む）、キシレン２（１００％キシレン）、キシレン３（１００％キシレン）、１００％エタノール、９５％エタノール、７５％エタノール１、５０％エタノール、および１００％水として準備した。パラフィン切片を、はじめにキシレン１、キシレン２、およびキシレン３に１０分間ずつ順次入れ、次いで１００％、９５％、７５％、５０％エタノールに、その後水に５分間ずつ順次入れた。次にパラフィン切片を３％Ｈ２Ｏ２／メタノール（１／４）溶液の入った容器に１０分間入れ、過剰の溶液をすすぎ、その後０．１％トリプシンに３７℃で３０分間、および３％ＢＳＡブロティングに７０分間、順次入れた。溶液を捨て、ＣＤ３１の一次抗体を１：３００で加えた後、パラフィン切片を４℃で一晩浸した。その後パラフィン切片を溶液から取り出し、続けてリンク抗体溶液、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ溶液に１５分間ずつ入れた。パラフィン切片をＤＡＢで染色した。溶液の交換の間、切片をＰＢＳで５分間ずつ５回洗浄した。染色後、パラフィン断片を顕微鏡下で観察した。
【０１３２】
統計的分析
ＣＤ３１免疫組織化学染色の結果を可視的に評価した。
【０１３３】
結果：
図１４に示すように、ＳＨＲ−１２Ｗコントロールラット（Ａ）およびＳＨＲ−１５Ｗコントロールラット（Ｂ）の内皮は、それぞれ無傷で滑らかな表面であった。しかしながら、ＳＨＲ−１８Ｗコントロールラット（Ｃ）およびＳＨＲ−２５Ｗコントロールラット（Ｄ）の内皮は、それぞれ平坦でない、部分的に剥離した表面を有した。この結果は、１８週齢またはそれ以上の週齢のＳＨＲラットは損傷された内皮を有することを示した。
【０１３４】
図１５（Ａ）〜（Ｄ）に示すように、ＳＨＲ−１２Ｗ  ＳＢ２２１、ＳＨＲ−１５Ｗ  ＳＢ２２１、ＳＨＲ−１８Ｗ  ＳＢ２２１およびＳＨＲ−２５Ｗ  ＳＢ２２１ラットの内皮は、それぞれ無傷で滑らかな表面を有した。この結果は、ＳＢ２２１は、ＳＨＲラットの内皮細胞に保護効果を有し、１８週齢またはそれ以上の週齢以降、細胞を損傷から保護することを示す。
【０１３５】
図１６に示すように、ＷＫＹ−１２Ｗコントロールラット、ＷＫＹ−１５Ｗコントロールラット、ＷＫＹ−１８Ｗコントロールラット、およびＷＫＹ−２５Ｗコントロールラットの内皮は、それぞれ無傷で滑らかな表面を有した。この結果は、１２〜２５週齢では、ＷＫＹラットの内皮細胞は劣化しなかったことを示す。
【０１３６】
図１７に示すように、ＷＫＹ−１２Ｗ  ＳＢ２２１、ＷＫＹ−１５Ｗ  ＳＢ２２１、ＷＫＹ−１８Ｗ  ＳＢ２２１、およびＷＫＹ−２５Ｗ  ＳＢ２２１ラットの内皮は、それぞれ無傷で滑らかな表面を有した。この結果は、ＳＢ２２１はＷＫＹラットの内皮細胞の形態に影響を与えなかったことを示した。
【０１３７】
研究３
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＳＢ２２１の細胞毒性の研究
豊富で利用しやすい内皮細胞の型として、ＨＵＶＥＣは血管形成および心臓病を調べる循環器研究のツールとしてしばしば用いられる。
【０１３８】
ＨＵＶＥＣにおけるＳＢ２２１の細胞毒性効果を、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）アッセイおよびＭＴＴアッセイを用いて研究した。細胞の原形質膜が試験薬物によって崩壊すると、細胞質ＬＤＨは周囲の媒質中に放出される。したがって、より低いＬＤＨ活性の計測値は、試験薬物のより低い細胞毒性を示す。一方、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）は水溶性のテトラゾリウム色素である。生きた細胞の活性なミトコンドリアの脱水素酵素は、黄色がかったＭＴＴを不溶性の濃い紫色のホルマザンに変換する。この変換は死んだ細胞では起こらない。水に不溶のホルマザンは単離され、有機溶媒に溶解され分光光度法で定量されうる。したがって、より高いホルマザンの計測値は、試験薬物のより低い細胞毒性を示す。
【０１３９】
材料：
ＨＵＶＥＣは、台湾台北県中和の龍山婦人小児科病院の院長であるＤｒ．Ｋ．Ｃ．Ｌｉｎによって提供された。ヒトの臍帯の試料を滅菌ＰＢＳ緩衝液に入れた。Ｉ型コラゲナーゼを溶液に入れた。内皮細胞を溶液の吸引／放出を繰り返すことによって洗浄した。細胞を、２０％の血清、内皮培養増殖溶液（ＥＣＧｓ）１５ｍｇ／ｍＬを含むＭ１９９培地で、３７℃で、５％ＣＯ２／９５％空気のインキュベータで培養した。培地を次の日に換え、その後１日おきに換えた（Ｊａｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９７３；５２：２７４５−２７５６）。
【０１４０】
他の試薬は上記研究１に記載したものと同様であった。
【０１４１】
方法：
１．ＬＤＨアッセイ
ＨＵＶＥＣ細胞が培養瓶中に密集した後、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ溶液で懸濁させた。次いで、懸濁させた細胞を９６ウェル培養プレートに５×１０３細胞／ウェルで入れた。細胞毒性のない基礎参照値を得るために、コントロール群をＦＢＳを含まないＭ１９９培地で成長させた。実験群をさまざまな濃度のＳＢ２２１を含むＭ１９９培地で成長させた。４時間後、培地を回収し、等体積のＬＤＨキット試薬と均一に混合した。混合物を露光から保護して室温に３０分間保持した。その後、培地と等体積の停止試薬を混合物に加えた。次いで、反応の結果を４９０ｎｍの波長で検出した。細胞の全溶解物もまた、１００％の細胞毒性の参照値を得るために実験に含められた。ＬＤＨ活性の結果は、細胞の溶解物の％で表され、全溶解物群の吸収を１００％として計算された。
【０１４２】
２．ＭＴＴアッセイ
ＨＵＶＥＣ細胞が培養瓶中に密集した後、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ溶液を培地に加えて懸濁させた。細胞を９６ウェル培養プレートに５×１０３細胞／ウェルで入れた。その後、細胞をＭ１９９培地中で２４時間インキュベートした。次いで、基礎参照値を得るためにコントロール群をＭ１９９培地で培養した。試験群をさまざまな濃度のＳＢ２２１を含むＭ１９９培地で培養した。２４時間後、培地を０．５ｍｇ／ＬのＭＴＴを１００μＬ含む新しい培地で置き換えた。細胞を３７℃のインキュベータで２時間培養した。ＭＴＴを除去した後、ＤＭＳＯを各ウェルに加えて細胞を溶解させた。ＥＬＩＳＡリーダーを用いて５５０ｎｍでの溶液の吸光度を測定した。吸光度の差を決定し、基礎コントロール群の吸光度の差を１００％としてパーセンテージを計算した。
【０１４３】
統計的分析
ＬＤＨおよびＭＴＴアッセイの結果を平均±標準偏差（ＳＤ）として表した。群間の差はｏｎｅ−ｆａｃｔｏｒ  ＡＮＯＶＡを用いて解析した。さらに、ＡＮＯＶＡ解析において有意な差を示したデータについてＰｏｓｔ  Ｈｏｃ  Ｔｕｋｅｙ試験を行った。有意のレベルをｐ＜０．０５に設定した。
【０１４４】
結果
図１２に示すように、コントロール群（基礎値、細胞毒性を示さない）のＬＤＨ活性は、全溶解物群（１００％の細胞毒性を示す）と比べて約１４％であった。１×１０−６〜１×１０−３ｍｇ／ｍＬのＳＢ２２１で処理されたＨＵＶＥＣ細胞のＬＤＨ活性は、基礎値のものに対して３％以内の差であり、基礎値のものと有意な差はなかった。ＬＤＨアッセイの結果は、ＳＢ２２１は内皮細胞に対して毒性がないことを示す。
【０１４５】
図１３に示すように、ＳＢ２２１はＨＵＶＥＣに対して細胞毒性効果を有さない。１×１０−６〜１×１０−３ｍｇ／ｍＬのＳＢ２２１で処理されたＨＵＶＥＣ細胞によるＭＴＴ変換は、コントロール群（基礎値、細胞毒性なし）のものと比較して、１２５．４％から８０．０％まで変化した。基礎値とＳＢ２２１群の値との間に有意な差はなかった。ＭＴＴアッセイの結果は、ＳＢ２２１は内皮細胞に対して毒性がないことを示す。
【０１４６】
結論：
ＳＢ２２１はＨＵＶＥＣに対して細胞毒性がなかった。
【０１４７】
本発明は、例として好ましい実施形態を記載したものであって、本発明は開示された実施形態に制限されないと理解されるべきである。むしろ、当業者に明らかであろう様々な変更を含むことを意図する。したがって、特許請求の範囲は、これらの変更のすべてを包含するように最も広く解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】本発明の薬剤組成物を製造するための製造工程のフローチャートを示す。ＱＣ：品質管理。ＱＣ工程には、（ａ）薬草成分段階（原料を含む）；（ｂ）原薬段階（各薬草の濃縮粉末を含む）；（ｃ）半製品段階（混合顆粒を含む）；および（ｄ）完成製剤段階（カプセルを含む）の、４つの試料捕集点がある。
【図２】さまざまな週齢のＳＨＲラットのアセチルコリンに応答する血管拡張を比較する：ＳＨＲ−１２Ｗコントロール（●）；ＳＨＲ−１５Ｗコントロール（□）ＳＨＲ−１８Ｗコントロール（▲）およびＳＨＲ−２５Ｗコントロール（○）。＊は特定の群の血管拡張がＳＨＲ−２５Ｗコントロール群のものと統計的に異なっていたことを示す（ｐ＜０．０５，ｔｗｏ−ｆａｃｔｏｒ  ＡＮＯＶＡ）。
【図３】１２週齢のＳＨＲラットのアセチルコリンに応答する血管拡張を比較する：コントロール（■）およびＳＢ２２１（◇）群。ＳＢ２１１群は本発明の薬剤組成物を与えられた。
【図４】１５週齢のＳＨＲラットのアセチルコリンに応答する血管拡張を比較する：コントロール（■）およびＳＢ２２１（◇）群。ＳＢ２１１群は本発明の薬剤組成物を与えられた。
【図５】１８週齢のＳＨＲラットのアセチルコリンに応答する血管拡張を比較する：コントロール（■）およびＳＢ２２１（◇）群。ＳＢ２１１群は本発明の薬剤組成物を与えられた。＊はＳＢ２２１群とコントロール群との間で血管拡張に統計的に有意な差があったことを示す（ｐ＜０．０５，ｔｗｏ−ｆａｃｔｏｒ  ＡＮＯＶＡ）。
【図６】２５週齢のＳＨＲラットのアセチルコリンに応答する血管拡張を比較する：コントロール（■）およびＳＢ２２１（◇）群。ＳＢ２１１群は本発明の薬剤組成物を与えられた。＊はＳＢ２２１群とコントロール群との間で血管拡張に統計的に有意な差があったことを示す（ｐ＜０．０５，ｔｗｏ−ｆａｃｔｏｒ  ＡＮＯＶＡ）。
【図７】図７は、さまざまな週齢のＷＫＹラットのアセチルコリンに応答する血管拡張を比較する：ＷＫＹ−１２Ｗコントロール（◆）；ＷＫＹ−１５Ｗコントロール（□）ＷＫＹ−１８Ｗコントロール（▲）およびＷＫＹ−２５Ｗコントロール（○）。＊は特定の群の血管拡張がＷＫＹ−２５Ｗコントロール群のものと統計的に異なっていたことを示す（ｐ＜０．０５，ｔｗｏ−ｆａｃｔｏｒ  ＡＮＯＶＡ）。
【図８】図８は、１２週齢のＷＫＹラットのアセチルコリンに応答する血管拡張を比較する：コントロール（■）およびＳＢ２２１（◇）群。ＳＢ２１１群は本発明の薬剤組成物を与えられた。＊はＳＢ２２１群とコントロール群との間で血管拡張に統計的に有意な差があったことを示す（ｐ＜０．０５，ｔｗｏ−ｆａｃｔｏｒ  ＡＮＯＶＡ）。
【図９】１５週齢のＷＫＹラットのアセチルコリンに応答する血管拡張を比較する：コントロール（■）およびＳＢ２２１（◇）群。ＳＢ２１１群は本発明の薬剤組成物を与えられた。
【図１０】１８週齢のＷＫＹラットのアセチルコリンに応答する血管拡張を比較する：コントロール（■）およびＳＢ２２１（◇）群。ＳＢ２１１群は本発明の薬剤組成物を与えられた。
【図１１】２５週齢のＷＫＹラットのアセチルコリンに応答する血管拡張を比較する：コントロール（■）およびＳＢ２２１（◇）群。ＳＢ２１１群は本発明の薬剤組成物を与えられた。
【図１２】細胞培地中にみられる乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性（細胞溶解物の％として表す）（ｎ＝３）に基づくヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＳＢ２２１の細胞毒性の研究の結果を示す。ＬＤＨ活性の結果を、（ＳＢ２２１なしに細胞を成長させた）基礎ＬＤＨ値および（細胞が収集されて均一化された）全細胞溶解物と比較した。全細胞溶解物を１００％ＬＤＨ値として表した。この研究の結果は、基礎群とＳＢ２２１群との間にＬＤＨ活性に統計的に有意な差がなかったことを示す（１０−６〜１０−３ｇ／ｍｌの間）。ＨＵＶＥＣの基礎ＬＤＨ活性は、全溶解物の約１４％であり、ＳＢ２２１群のＬＤＨ活性は基礎群のそれと３％以内の差であった。基礎群およびＳＢ２２１群の双方においてＬＤＨ活性は全細胞溶解物のものと有意に異なっていた。
【図１３】ＳＢ２２１処理細胞および基礎値を与えるコントロール細胞（すなわちＳＢ２２１処理をしない細胞）から収集した細胞培地のＭＴＴテトラゾリウム塩熱量分析（ｎ＝７）に基づくヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＳＢ２２１の細胞毒性の研究の結果を示す。データ解析は、ｏｎｅ−ｆａｃｔｏｒ  ＡＮＯＶＡを用いて行った。この結果は、基礎群とＳＢ２２１群との間に統計的に有意な差がなかったことを示す。
【図１４】ＳＨＲコントロールラットの胸部大動脈組織の断面のＣＤ３１免疫組織化学染色を示す：（Ａ）ＳＨＲ−１２Ｗコントロール、（Ｂ）ＳＨＲ−１５Ｗコントロール、（Ｃ）ＳＨＲ−１８Ｗコントロール、および（Ｄ）ＳＨＲ−２５Ｗコントロール。ＣＤ３１は、白血球（ＴおよびＢ細胞、単球、顆粒球、血小板、骨髄細胞の４０％）、内皮、および平滑筋細胞上にみられる、質量１３０〜１４０ｋＤの、広く分布した単一鎖の糖タンパク質である。図は、ＣＤ３１抗体を１：３００の濃度で用いて、光学顕微鏡下で４００×で撮影した。矢印は、血管の空洞が並ぶ細胞の層を形成する内皮細胞を示す。（Ｃ）および（Ｄ）に示される内皮（内皮細胞の層）は、中皮層のいくつかを見せる、不均一で部分的にはがれた表面を含む。
【図１５】ＳＢ２２１で治療されたＳＨＲラットの胸部大動脈組織の断面のＣＤ３１免疫組織化学染色を示す：（Ａ）ＳＨＲ−１２Ｗ  ＳＢ２２１、（Ｂ）ＳＨＲ−１５Ｗ  ＳＢ２２１、（Ｃ）ＳＨＲ−１８Ｗ  ＳＢ２２１、および（Ｄ）ＳＨＲ−２５Ｗ  ＳＢ２２１。図は、ＣＤ３１抗体を１：３００の濃度で用いて、光学顕微鏡下で４００×で撮影した。矢印は内皮細胞を示す。不均一で部分的にはがれた表面を有したＳＢ２２１治療をしない１８週齢および２５週齢のラットの内皮細胞（図１４（Ｃ）および（Ｄ）を参照）と対照的に、ＳＢ２２１での治療後、全ての週齢群において内皮細胞は滑らかで均一な表面を有した。
【図１６】ＷＫＹコントロールラットの胸部大動脈組織の断面のＣＤ３１免疫組織化学染色を示す：（Ａ）ＷＫＹ−１２Ｗコントロール、（Ｂ）ＷＫＹ−１５Ｗコントロール、（Ｃ）ＷＫＹ−１８Ｗコントロール、および（Ｄ）ＷＫＹ−２５Ｗコントロール。図は、ＣＤ３１抗体を１：３００の濃度で用いて、光学顕微鏡下で４００×で撮影した。矢印は内皮細胞を示す。ＷＫＹコントロールラットの内皮細胞は滑らかで均一な表面を有した。
【図１７】ＳＢ２２１で治療されたＷＫＹラットの胸部大動脈組織の断面のＣＤ３１免疫組織化学染色を示す：（Ａ）ＷＫＹ−１２Ｗ  ＳＢ２２１、（Ｂ）ＷＫＹ−１５Ｗ  ＳＢ２２１、（Ｃ）ＷＫＹ−１８Ｗ  ＳＢ２２１、および（Ｄ）ＷＫＹ−２５Ｗ  ＳＢ２２１。図は、ＣＤ３１抗体を１：３００の濃度で用いて、光学顕微鏡下で４００×で撮影した。矢印は内皮細胞を示す。ＳＢ２２１（本発明の薬剤組成物）での治療後、ＷＫＹラットの内皮細胞は滑らかで均一な表面を有した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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