(57)【要約】  本発明は、オリゴヌクレオチドを、消光物質、フルオロフォア、ビオチン、ジゴキシゲニン、ペプチド及びタンパク質を含むが、これらに限定されるものではないレポーター部分で標識する新規方法を提供する。加えて、本発明は、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する方法を提供する。本発明は、下記に示した一般式を有する新規アゾ消光物質も提供する。-Ry R4” R6。本発明は更に、標識されたオリゴヌクレオチド及び固形支持体を含有する組成物を提供する。本発明は、少なくとも1種の本発明の組成物を含むキットも提供する。【化１】2008545659.tif 000034【選択図】  なし
2008545659.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レポーター部分をオリゴヌクレオチドへ連結する方法であり、オキシム形成求核置換基を有するレポーター部分を、固形支持体にカップリングされたオキソ置換された反応体と反応し、レポーター部分と反応体の間にオキシム結合を形成する工程を含む、方法。
【請求項２】
レポーター部分が、消光物質、フルオロフォア、ビオチン、ジゴキシゲニン、ペプチド、タンパク質、抗体、糖タンパク質及び糖からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
レポーター部分が、式(I)の化合物であり：
【化１】
2008545659.tif 000022
ここで、R1-6は、電子求引基、アルキル基、アリール基、水素、ヘテロアリール基、並びにR1及びR2対、R3及びR4対、R4及びR5対、又はR5及びR6対から形成された5又は6員の環構造からなる群より独立して選択され；
R7は、置換又は非置換のアリール基であり；並びに
Yは、オキシム形成求核物質である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
オキシム形成求核物質が、アミノオキシである、請求項3記載の方法。
【請求項５】
オキシム形成求核物質が、ヒドラジンである、請求項3記載の方法。
【請求項６】
レポーター部分が：
【化２】
2008545659.tif 000023
である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
1個よりも多いレポーター部分が、標識されたオリゴヌクレオチドに連結され、及びここでレポーター部分は、同じ又は異なる、請求項1記載の方法。
【請求項８】
レポーター部分が、化合物34、化合物35、化合物36及び化合物37からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
オキシム結合を介してオリゴヌクレオチドの異なるヌクレオチドへ連結された少なくとも2個の異なるレポーター部分を含む、標識されたオリゴヌクレオチドを含有する組成物。
【請求項１０】
レポーター部分が、消光物質、フルオロフォア、ビオチン、ジゴキシゲニン、ペプチド、タンパク質、抗体、糖タンパク質及び糖からなる群より独立して選択される、請求項9記載の組成物。
【請求項１１】
レポーター部分のひとつが、化合物34、化合物35、化合物36及び化合物37からなる群より選択される、請求項9記載の組成物。
【請求項１２】
オキシム結合を介してオリゴヌクレオチドのヌクレオチドへ連結された、式(I)のレポーター部分を含む標識されたオリゴヌクレオチドを含有する組成物であり：
【化３】
2008545659.tif 000024
ここで、R1-6は、電子求引基、アルキル基、アリール基、水素、ヘテロアリール基、並びにR1及びR2対、R3及びR4対、R4及びR5対、又はR5及びR6対から形成された5又は6員の環構造からなる群より独立して選択され、
R7は、置換又は非置換のアリール基であり；並びに
Yは、オキシム形成求核物質である、組成物。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドが、その3'末端で固形支持体へ連結されている、請求項12記載の組成物。
【請求項１４】
レポーター部分が、オリゴヌクレオチドの3'末端に連結される、請求項12記載の組成物。
【請求項１５】
レポーター部分が、オリゴヌクレオチドの5'末端に連結される、請求項12記載の組成物。
【請求項１６】
レポーター部分が、内部ヌクレオチドへ連結される、請求項12記載の組成物。
【請求項１７】
レポーター部分が：
【化４】
2008545659.tif 000025
である、請求項12記載の組成物。
【請求項１８】
オキシム結合を介してオリゴヌクレオチドのヌクレオチドへ連結されたフルオロフォアを更に含む、請求項12記載の組成物。
【請求項１９】
式(I)を含む化合物であり：
【化５】
2008545659.tif 000026
ここで、R1-6は、電子求引基、アルキル基、アリール基、水素、ヘテロアリール基、並びにR1及びR2対、R3及びR4対、R4及びR5対、又はR5及びR6対から形成された5又は6員の環構造からなる群より独立して選択され；
R7は、置換又は非置換のアリール基であり；並びに
Yは、オキシム形成求核物質である、化合物。
【請求項２０】
オキシム形成求核物質が、アミノオキシである、請求項19記載の化合物。
【請求項２１】
オキシム形成求核物質が、ヒドラジンである、請求項19記載の化合物。
【請求項２２】
電子求引基が、ハロゲン、NO2、SO3RS、SO2N(RN)2、CN、CNS、ケト、及びアルコキシ基からなる群より独立して選択され；ここで、RN及びRSは、分枝した又は分枝していない、飽和又は不飽和で、及び置換又は非置換であるC1-C10アルキル基、並びに置換又は非置換のアリール基からなる群より独立して選択される、請求項19記載の化合物。
【請求項２３】
R1-6の少なくともひとつは、電子求引基である、請求項19記載の化合物。
【請求項２４】
R1-6の少なくともひとつは、アルキル基である、請求項19記載の化合物。
【請求項２５】
アルキル基は、1〜10個の炭素原子を有する、請求項24記載の化合物。
【請求項２６】
R1-6の少なくともひとつが、アリール基である、請求項19記載の化合物。
【請求項２７】
R1-6の少なくともひとつが、ヘテロアリール基である、請求項19記載の化合物。
【請求項２８】
R1-6の少なくともひとつが、水素である、請求項19記載の化合物。
【請求項２９】
R1及びR2対、R3及びR4対、R4及びR5対、又はR5及びR6対の少なくともひとつが組み合わさって、5又は6個の環員を有する環を形成する、請求項19記載の化合物。
【請求項３０】
環が、6個の環員を有する、請求項29記載の化合物。
【請求項３１】
R7が、アリール基である、請求項19記載の化合物。
【請求項３２】
アリール基が、フェニル、ナフチル、キシリル、トリル、ピリジル、及びアニリニルからなる群より選択される、請求項31記載の化合物。
【請求項３３】
アリール基が、アニリニル基である、請求項32記載の化合物。
【請求項３４】
アニリニル基が：
【化６】
2008545659.tif 000027
を含み、ここでL及びL'は、置換又は非置換のC1-10アルキルからなる群より独立して選択され、ここでC1-10アルキル基は、飽和又は不飽和であり；並びに、ここでL又はL'のひとつは、オキシム形成求核置換基で置換されている、請求項33記載の化合物。
【請求項３５】
下記式の化合物：
【化７】
2008545659.tif 000028
【請求項３６】
オキシム結合を介して固形支持体に連結されたレポーター部分を含む、組成物。
【請求項３７】
レポーター部分が、式(I)の化合物であり：
【化８】
2008545659.tif 000029
ここで、R1-6は、電子求引基、アルキル基、アリール基、水素、ヘテロアリール基、並びにR1及びR2対、R3及びR4対、R4及びR5対、又はR5及びR6対から形成された5又は6員の環構造からなる群より独立して選択され；
R7は、置換又は非置換のアリール基であり；並びに
Yは、オキシム形成求核物質である、請求項36記載の組成物。
【請求項３８】
下記を含み：
【化９】
2008545659.tif 000030
ここで、Rはアルキル基であり、及びWは、保護基、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド又はヌクレオシドからなる群より選択される、請求項37記載の組成物。
【請求項３９】
下記を含み：
【化１０】
2008545659.tif 000031
ここで、Rはアルキル基であり、Bは核酸塩基であり、及びWは、保護基、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド又はヌクレオシドからなる群より選択される、請求項37記載の組成物。
【請求項４０】
核酸塩基が、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル及びチミンからなる群より選択される、請求項39記載の組成物。
【請求項４１】
核酸塩基が、ウラシルである、請求項40記載の組成物。
【請求項４２】
抗原、ステロイド、ビタミン、薬物、ハプテン、代謝産物、毒素、環境汚染物質、アミノ酸、タンパク質、炭水化物、固形支持体、リンカー、及び脂質からなる群より選択される化合物に連結された消光物質を含有する、組成物であり、ここで消光物質が、オキシム結合を介して化合物へ結合されている、組成物。
【請求項４３】
組成物が、更にフルオロフォアを含む、請求項42記載の組成物。
【請求項４４】
消光物質が、式(I)の化合物であり：
【化１１】
2008545659.tif 000032
ここで、R1-6は、電子求引基、アルキル基、アリール基、水素、ヘテロアリール基、並びにR1及びR2対、R3及びR4対、R4及びR5対、又はR5及びR6対から形成された5又は6員の環構造からなる群より独立して選択され；
R7は、置換又は非置換のアリール基であり；並びに
Yは、オキシム形成求核物質である、請求項42記載の組成物。
【請求項４５】
フルオロフォア及び式(I)の化合物を含む色素対を含む組成物であり：
【化１２】
2008545659.tif 000033
ここで、R1-6は、電子求引基、アルキル基、アリール基、水素、ヘテロアリール基、並びにR1及びR2対、R3及びR4対、R4及びR5対、又はR5及びR6対から形成された5又は6員の環構造からなる群より独立して選択され；
R7は、置換又は非置換のアリール基であり；並びに
Yは、オキシム形成求核物質であり；並びに
ここで、式(I)の化合物は、オキシム結合を介してオリゴヌクレオチドへ付着され；並びに
ここで、フルオロフォアは、同じオリゴヌクレオチド又は異なるオリゴヌクレオチドへ付着される、組成物。
【請求項４６】
化合物が、フルオロフォアの蛍光を約90％又はそれよりも多く消光する、請求項45記載の組成物。
【請求項４７】
化合物が、フルオロフォアの蛍光を約95％又はそれよりも多く消光する、請求項45記載の組成物。
【請求項４８】
フルオロフォアが、フルオレセインである、請求項45記載の組成物。
【請求項４９】
オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する方法であり：
a)第一のオリゴヌクレオチドを、第二のオリゴヌクレオチドと共にインキュベーションし、第二のオリゴヌクレオチドは、オキシム結合を介してヌクレオチドに連結された請求項19記載の消光化合物を含有し、ここで2種のオリゴヌクレオチドの少なくとも一方は、請求項19記載の消光化合物により消光することができる蛍光を伴うフルオロフォアを含み、ここで第一及び第二のヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、フルオロフォアと請求項19記載の消光化合物の空間的関係を変更し、蛍光の変化を生じる工程；並びに
b)インキュベーションされたヌクレオチドの蛍光を測定する工程を含む方法。
【請求項５０】
フルオロフォア及び消光化合物が両方とも、第二のオリゴヌクレオチドへ連結される、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
ハイブリダイズされた構造からフルオロフォア及び消光化合物のひとつを放出する工程を更に含む、請求項49記載の方法。
【請求項５２】
請求項9記載の組成物を含む、キット。
【請求項５３】
前記組成物の使用説明書を更に含む、請求項52記載のキット。
【請求項５４】
請求項12記載の組成物を含む、キット。
【請求項５５】
前記組成物の使用説明書を更に含む、請求項54記載のキット。
【請求項５６】
請求項42記載の組成物を含む、キット。
【請求項５７】
前記組成物の使用説明書を更に含む、請求項56記載のキット。
【請求項５８】
請求項45記載の組成物を含む、キット。
【請求項５９】
前記組成物の使用説明書を更に含む、請求項58記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2005年5月20日に出願された米国特許出願第60/683,278号の優先権の恩典を主張するものであり、この出願は本明細書に参照として組入れられている。
【０００２】
発明の分野
本発明は、オリゴヌクレオチドを標識する化合物及び方法に関する。本発明は、少なくとも1種の明らかにされた化合物を含むキットも提供する。
【０００３】
発明の背景
オリゴヌクレオチドは、消光物質、フルオロフォア（fluorophore）、ビオチンなどのレポーター部分により、修飾又は標識されることが多い。これらの標識されたオリゴヌクレオチドは、結合及びその他の生物学的現象、DNA構造、高分子の会合、並びにタンパク質及びDNA複合体のサイズ及び移動度に関する情報を提供することができる。
【０００４】
いくつかの付着化学が、オリゴヌクレオチドを修飾するために現在使用されている。例えば、第1級アミノ基は、修飾因子、レポーター部分又は標識を、オリゴヌクレオチドへ付着するために広範に使用されている。加えてこれらは、オリゴヌクレオチドを固形表面へ付着するために使用することができる。
【０００５】
安定したシッフ塩基リンカーは、標識されたオリゴヌクレオチドを合成するために使用されている(Dey及びSheppardの論文、Org. Lett.、3, 25:3983-3986 (2001)、これは本明細書に参照として組入れられている。)。これらの方法は、標識のポスト合成結合に限定され、この提唱された方法は、標準合成法の商業的に実行可能な代替法ではない。先に説明されたポスト合成法は、レポーター部分の単独の型、又は同じレポーター部分の複数のコピーのみを、オリゴヌクレオチドへ取込むことを可能にする。
【０００６】
標識されたオリゴヌクレオチドは、広範に有用な適用を有する。例えば、それらの空間的関係の変化としてフルオロフォア及び消光物質の相互作用に頼る消光プロセスは、オリゴヌクレオチド及び他の生物学的現象の検出及び/又は同定のための簡便なプロセスにおいて使用することができる。そのような方法のひとつにおいて、フルオロフォア又は消光物質の蛍光の変化は、互いにハイブリダイズするふたつのオリゴヌクレオチド(ひとつはフルオロフォアを含み、及びひとつは消光物質を含む)としてモニタリングすることができる。このハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドからハイブリダイズされないオリゴヌクレオチドを分離する精製工程を介在することなく、検出することができる。現在、単に合成を容易にするために、消光基は、通常プローブ配列の末端に配置される一方で、フルオロフォアは、反対側末端に配置される。しかしリアルタイムPCRなどの一部の適用において、二重標識されたプローブは、標識が互いにより近傍に配置された場合に、より効果がある。
【０００７】
おそらく蛍光消光の最も一般的機構は、蛍光共鳴エネルギー転移(「FRET」)である。FRETを引き起こすために、フルオロフォア及び蛍光消光物質は、ドナーからエネルギーを吸収するのに、消光物質にとって適当な距離内に存在しなければならない。加えて、蛍光ドナーの放出スペクトルと消光物質の吸収スペクトルの間で重複しなければならない。全ての可能性のある消光物質/フルオロフォア対を使用することはできないので、この必要要件は、FRETを利用するプローブのデザインを複雑にする。例えば、波長範囲約520〜550nmの光を吸収するBHQ-1として公知の消光物質は、約520nmに最大に蛍光を発するフルオロフォアフルオレセインから放出された蛍光を消光することができる。対照的に、波長範囲約650〜700nmの光を吸収する消光物質BHQ-3は、FRETによるフルオレセインの蛍光を消光する際にはほぼ完全に不活性であるが、約670nmに蛍光を発するCy5として公知であるフルオロフォアの蛍光を消光する際には極めて活性がある。
【０００８】
フルオロフォア及び消光物質で標識されたオリゴヌクレオチドも、PCR増幅の速度論をモニタリングするために使用することができる。例えばPCR反応は、増幅プライマーの3'側(「下流」)にハイブリダイズするようにデザインされたオリゴヌクレオチドを用い実行することができ、その結果ポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性は、プローブの5'末端を消化し、この色素のひとつを切断する。この試料の蛍光強度は増加し、及び増幅の過程においてプローブが消化されたことをモニタリングすることができる。
【０００９】
エンドポイントPCR、インサイチュハイブリダイゼーション、インビボDNA及びRNA種検出、一塩基多形(SNPs)解析、酵素アッセイ、並びにインビボ及びインビトロ全細胞アッセイのような、他の分子/細胞生物学アッセイ及び診断アッセイにおいて、同様のオリゴヌクレオチド組成物を使用することができる。
【００１０】
発明の簡単な概要
本発明は、固形支持体にカップリングされたオキソ置換された反応体と、オキシム形成求核置換基を有するレポーター部分を反応し、レポーター部分と反応体の間にオキシム結合を形成する工程を含む、オリゴヌクレオチドへレポーター部分を連結する方法を提供する。レポーター部分は、消光物質、フルオロフォア、ビオチン、ジゴキシゲニン、ペプチド及びタンパク質を含むが、これらに限定されるものではない。本発明は、少なくとも2種の異なるレポーター部分で標識されたオリゴヌクレオチドも提供する。
【００１１】
本発明は更に、下記式(I)に示された一般式を有する新規アゾ消光物質を提供する：
【００１２】
【化１】
2008545659.tif 000003
R1-6の各々は、水素；ハロゲン、NO2、SO3RS、SO2N(RN)2、CN、CNS、ケト、アルコキシ基などの、電子求引基；C1-C10アルキル基；アリール基；及び、ヘテロアリール基からなる群より独立して選択される。RN及びRSは、飽和もしくは不飽和で、分枝したもしくは分枝していない、及び置換もしくは非置換であってよいC1-C10アルキル基、又は置換もしくは非置換のアリール基であることができる。好適な置換基は、先に説明されたような電子求引基を含む。
【００１３】
R7は、アゾ結合により複合環システムに連結し、フルオロフォアの蛍光を消光することが可能である化合物を形成することができる、任意のアリール基であることができる。好適なアリール基は、いくつかの基の中でも特に、フェニル、ナフチル、ベンジル、キシリル、トルイル、ピリジル及びアニリニルを含む。R7は、消光化合物を他の関心対象の化合物へ連結するために少なくとも1個の連結基で置換又は誘導体化することができる。
Yは、オキシム結合を形成するためにオキソ基と反応することが可能である求核物質（nucleophile）含有基、例えばアミノオキシ又はヒドラジンなどである。加えて、R1/R2対、R3/R4対、R4/R5対及びR5/R6対は組み合わさって、5又は6個の環員を有する環構造を形成することができる。これらの環構造は、水素、ヘテロ原子置換のアルキル、ハロゲン、アルケニル、アルコキシ、アルコキシ-アルキル、ヒドロキシル、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシル、カルボアルコキシル、カルボキシアミド、メルカプト、スルファモイル、フェニル、及びナフチルで置換することができる。
【００１４】
加えて本発明は、新規消光物質で標識されたオリゴヌクレオチドに加え、標識されたオリゴヌクレオチドを使用し、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する方法を提供する。
本発明は、抗原、ステロイド、ビタミン、薬物、ハプテン、代謝産物、毒素、環境汚染物質、アミノ酸、タンパク質、炭水化物、固形支持体、リンカー、及び脂質からなる群より選択される化合物に連結された消光物質を含む組成物を提供し、ここで消光物質は、オキシム結合を介し化合物へ結合される。本発明は更に、標識されたオリゴヌクレオチド及び固形支持体を含む組成物を提供する。本発明は、少なくとも1種の本発明の組成物を含むキットも提供する。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、オリゴヌクレオチドの合成時にレポーター部分でオリゴヌクレオチドを標識する新規方法を提供する。本方法は、いくつかの異なるレポーター部分の単独のオリゴヌクレオチドへの付着を可能にする。
本発明の目的に関して、用語「レポーター部分」は、低濃度の化合物の直接的又は間接的のいずれかの検出を可能にする置換基を意味する。好適なレポーター部分は、(1)例えば、比色分析、蛍光又はルミネセンスにより、検出可能なシグナルを発生する酵素、例としてホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ又はグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ；(2)蛍光化合物、ルミネセンス化合物又は色素化合物などの、発色団；(3)電子顕微鏡によるか、又は伝導度、アンペロメトリー、ボルタンメトリー、もしくはインピーダンス測定などによるそれらの電気特性を通じ検出することができる電子密度を伴う基；並びに、(4)屈折率、表面プラズマ共鳴もしくは接触角の変動などの光学的方法、又は原子間力分光法、もしくはトンネル効果などの物理的方法を用い、検出することができる基を含むが、これらに限定されるものではない。その他の好適なレポーター部分は、ビオチン、ジゴキシゲニン、ペプチド、タンパク質、抗体、糖タンパク質、及び糖を含むが、これらに限定されるものではない。
【００１６】
ひとつの実施態様において、この方法は、オキソ基によるオキシム結合を形成することが可能な求核物質を有するレポーター部分(求核物質含有レポーター部分とも称される)とオキソ置換された反応体の間に、O-置換のオキシム(「オキシム」)結合を形成することを含む。オキシム結合は、ホスホロアミダイトオリゴヌクレオチド合成サイクル時に反応に対し完全に直交し(orthogonal to)、及びオリゴヌクレオチドへの複数の修飾を導入するための汎用法として使用することができる。オキシム結合は、固形支持体の修飾により、合成時又は合成前にほとんどあらゆる修飾をオリゴヌクレオチドへ導入するために使用することができる。この結合は予想外に安定しており、サーモサイクリング時には不変のまま残存する。この方法は、複数の異なるレポーター部分のオリゴヌクレオチドへの導入も可能にする。
【００１７】
オキソ置換された反応体は、固形支持体へ連結されたオキソ置換されたオリゴヌクレオチド、オキソ置換されたヌクレオチド、オキソ置換されたヌクレオシド、オキソ置換されたヌクレオシドホスホロアミダイト、又は式(II)の組成物であることができる：
【００１８】
【化２】
2008545659.tif 000004
ここで、Rは、H又はアルキルであり、PGは、ヒドロキシル保護基、例えばオリゴヌクレオチド合成において通常使用されるもの、例としてジメトキシトリチル(DMT)、モノメトキシトリチル(MMT)、又はトリチルなどであり、並びにAは、オリゴヌクレオチドの合成時に、オリゴヌクレオチドの固形支持体への付着に使用されるリンカー、例えば、図3の20a及び20bに示されたようなリン酸リンカーである。好適なことに、アルキルは、C1-6アルキル基から選択され、これは置換又は非置換で、分枝した又は分枝していない、及び飽和又は不飽和である。好適な置換基は、アルコキシ、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ハロゲン、アルキルチオ、及びチオールを含むが、これらに限定されるものではない。オキソ置換されたヌクレオチド及びオキソ置換されたヌクレオシドは、固形支持体へ付着することができる。
【００１９】
本発明において使用するためのオキソ置換されたオリゴヌクレオチド、オキソ置換されたヌクレオチド、オキソ置換されたヌクレオシド、及びオキソ置換されたヌクレオシドホスホロアミダイトは、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル及びチミンなどの従来の核酸塩基を含むもの、並びに修飾された核酸塩基を含むものである。
用語「固形支持体」は、オリゴヌクレオチド合成に適合可能である支持体のいずれかを意味する。例えば、ガラス、細孔性ガラス(CPG)、高分子材料、ポリスチレンビーズ、コーティングガラスなどが適している。
【００２０】
別の実施態様において、本方法は、オキソ置換されたヌクレオチドのオリゴヌクレオチドへの取込み、それに続くオキソ基とオキシム結合を形成することが可能な求核置換基を有するレポーター部分との反応を可能にする。レポーター部分は、オキソ置換されたヌクレオチドが添加された直後に、オリゴヌクレオチドへ添加することができるか、又はレポーター部分は、更なるヌクレオチド又はオキソ置換されたヌクレオチドがオリゴヌクレオチドへ添加された後に添加することができる。別の好適な実施態様において、新規方法は、標準ホスホロアミダイト化学を使用しオリゴヌクレオチドへ取込まれるレポーター部分置換されたヌクレオチドとしての、レポーター部分のオリゴヌクレオチドへの内部取込みを可能にする。
【００２１】
別の実施態様において、レポーター部分を含む求核物質は、オキソ置換された反応体と反応することができる。得られる組成物であるレポーター部分で置換された反応体は、その後実施例3のように、固形支持体を誘導体化するために使用され、並びに誘導体化された支持体は、標準方法によるオリゴヌクレオチド合成の基礎として役立つことができる。実施例3は、アゾ消光化合物の細孔性ガラス(CPG)への付着を明らかにしているが、この方法はより一般的に、ケトン及びアルデヒドを含む遊離の反応性求電子基を含有するあらゆる固形支持体へのレポーター部分の付着に適用可能である。固形支持体結合したレポーター部分は、好都合なことに、オリゴヌクレオチドの合成時にレポーター部分をそれらへ直接取込むために、自動オリゴヌクレオチド合成装置と組合せ、使用することができる。
本方法は、複数のレポーター部分が、単独のオリゴヌクレオチドへ導入されることを可能にする。これらのレポーター部分は、同じ又は異なって良い。単独のオリゴヌクレオチド上の異なるレポーター部分の使用は、単独のオリゴヌクレオチドを使用して複数のシグナルを検出することを可能にする。検出は、同時又は逐次であってよい。
【００２２】
本発明は、蛍光消光物質として有用である新規アゾ化合物も提供する。光を放出することなくフルオロフォアから吸収されたエネルギーを放出する、すなわち「暗消光物質」である本発明の消光物質は、下記式(I)において示された一般式を有する：
【００２３】
【化３】
2008545659.tif 000005
R1-6の各々は、水素、電子求引基、例えばハロゲン、NO2、SO3RS、SO2N(RN)2、CN、CNS、ケト、及びアルコキシ基、C1-C10アルキル基、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群より個別に選択される。RN及びRSは、分枝した又は分枝していない、飽和又は不飽和の、及び置換又は非置換のC1-C10アルキル基、並びに置換又は非置換であってよいアリール基であることができる。好適な置換基は、先に説明されたもののような電子求引基を含む。
【００２４】
R7は、フルオロフォアの蛍光を消光することが可能である化合物を形成するために、アゾ結合により複合環システムに結合することができる任意のアリール基であることができる。好適なアリール基は、いくつかの基の中で特に、フェニル、ナフチル、ベンジル、キシリル、トルイル、ピリジル、及びアニリニルを含む。R7は、消光化合物を関心対象の他の化合物と連結するために、少なくとも1個の連結基により、置換又は誘導体化することができる。
【００２５】
Yは、アミノオキシ又はヒドラジンのような、オキシム結合を形成するためにオキソ基と反応することが可能である求核物質含有基である。加えて、R1/R2対、R3/R4対、R4/R5対及びR5/R6対のいずれかひとつは組み合わさって、5又は6員を有する環構造を形成することができる。これらの環構造は、水素、ヘテロ原子-置換のアルキル、ハロゲン、アルケニル、アルコキシ、アルコキシ-アルキル、ヒドロキシル、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシル、カルボアルコキシル、カルボキシアミド、メルカプト、スルファモイル、フェニル、及びナフチルで、置換することができる。
【００２６】
加えて、アミノ、ヒドロキシル、及びカルボキシル基のような、R1-6での反応性置換基は、連結基又は関心対象の他の分子に付着することができる。
本発明の目的に関する用語「連結基」とは、例えば、ホスホロアミダイトのケトン基など、試薬の「相補的官能性」と反応し、この試薬へ式(I)のアゾ消光化合物を接続する結合を形成することが可能である化学基を意味する。様々な色素を様々な化合物と複合する多くの様式を明らかにしている、R. 35 Haugland「Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals」(1992)Molecular Probes, Inc.を参照することとし、これは本明細書に参照として組入れられている。
【００２７】
ひとつの実施態様において、R7-Yは、式(III)の化合物であり、ここでアリール環は、L及びL'位置で様々な基により置換することができるアニリニル基である。
【００２８】
【化４】
2008545659.tif 000006
L及びL'は、置換又は非置換のC1-10アルキル及び求核物質含有C1-10アルキル基からなる群より独立して選択され、ここでC1-10アルキル基は、飽和又は不飽和である。例えば、ひとつの実施態様において、L又はL'の一方は、非反応基(すなわち、求核物質を含まないもの、及び求核物質を含むように修飾することができないもの)、例えばアルキル基、好ましくはエチル基であることができ、並びに他方は、消光物質の関心対象の他の分子への連結を促進するために、アミノオキシなどの求核基に更に修飾されることができるヒドロキシエチル基のような反応基であることができる。当業者は、アニリニル基を修飾するために、あらゆる長さのヒドロキシアルキル鎖を使用することができることを認めるであろう。
【００２９】
式(III)の好適な実施態様は、下記式(IV)に示されており：
【００３０】
【化５】
2008545659.tif 000007
ここで、Yは、オキソ基と反応し、オキシム結合を形成することが可能である求核物質である。
【００３１】
式(I)のひとつの実施態様において、アゾ消光化合物は、式(V)の構造を有し、ここでYは、アミノオキシ基である：
【００３２】
【化６】
2008545659.tif 000008
【００３３】
好適なアゾ消光前駆体化合物は、第1級アミノ基を有し、及び式(VI)の一般構造を有する。式(VI)の具体的実施態様は、化合物1及び2を含む：
【００３４】
【化７】
2008545659.tif 000009
【００３５】
式(I)のアゾ消光物質は、先に考察されたように、オリゴヌクレオチドへの取込みに適している。式(I)のアゾ消光物質は、様々な他の有用な化合物に連結することができ、但し好適な反応基は、それらの化合物上に存在することを条件とする。そのような化合物は、抗原、抗体、ステロイド、ビタミン、薬物、ハプテン、代謝産物、毒素、環境汚染物質、アミノ酸、タンパク質、炭水化物、脂質などを含む。
他のアミノオキシ置換されたレポーター部分の例は、図15に示されている。
【００３６】
本発明は、色素対を含有するオリゴヌクレオチド組成物にも関し、これは明らかにされた消光化合物及び適切な波長の光に曝露された際に蛍光を発するフルオロフォアのひとつを含む。色素対中の好適なフルオロフォアは、色素対の消光物質により消光され得る蛍光を放出するものである。ある実施態様において、色素対は、オリゴヌクレオチドのような単独の化合物へ付着することができる。別の実施態様において、フルオロフォア及び消光物質は、異なる化合物上に存在することができる。
【００３７】
多種多様な反応性フルオロフォアが、文献において公知であり、対応する消光物質と共に使用することができる。典型的には、フルオロフォアは、芳香族又は複素環式芳香族化合物であり、並びにピレン、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドール、ベンズインドール、オキサゾール、チアゾール、ベンゾチアゾール、シアニン、カルボシアニン、サリチル酸塩、アントラニル酸塩、クマリン、フルオレセイン、ローダミン又は他の同様の化合物であることができる。好適なフルオロフォアは、キサンテン色素、例えば、6-カルボキシフルオレセイン(FAM)、2'7'-ジメトキシ-4'5'-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン(JOE)、テトラクロロフルオレセイン(TET)、6-カルボキシローダミン(R6G)、N,N,N；N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA)、6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)を含むフルオレセイン又はローダミン色素などを含む。好適なフルオロフォアは、α又はβ位にアミノ基を有するナフチルアミン色素も含む。例えば、ナフチルアミノ化合物は、1-ジメチルアミノナフチル-5-スルホン酸塩、1-アニリノ-8-ナフタレンスルホン酸塩及び2-p-トルイジニル-6-ナフタレンスルホン酸塩、5-(2'-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸(EDANS)を含む。他のフルオロフォアは、クマリン、例えば3-フェニル-7-イソシアナトクマリン；アクリジン、例えば9-イソチオシアナトアクリジン及びアクリジンオレンジ；N-(p-(2-ベンゾオキサゾリル)フェニル)マレイミド；シアニン、例えばインドジカルボシアニン3(Cy3)、インドジカルボシアニン5(Cy5)、インドジカルボシアニン5.5(Cy5.5)、3-(-カルボキシ-ペンチル)-3'-エチル-5,5'-ジメチルオキサカルボシアニン(CyA)；1H,5H,11H,15H-キサンテノ[2,3,4-ij:5,6,7-i'j']ジキノリジン-18-イウム、9-[2(又は4)-[[[6-[2,5-ジオキソ-1-ピロリジニル)オキシ]-6-オキソヘキシル]アミノ]スルホニル]-4(又は2)-スルホフェニル]-2,3,6,7,12,13,16,17-オクタヒドロ-内塩(TR又はTexas Red)；BODIPY(商標)色素；ベンゾオキサゾール；スチルベン；ピレン；などを含む。ある種のフルオロフォアの蛍光放出を、以下に提示する。
【００３８】
フルオロフォア                              最大放出
6-カルボキシフルオレセイン(6-FAM)      520nm
テトラクロロフルオレセイン(TET)        536nm
ヘキサクロロフルオレセイン(HEX)        556nm
Cy3                                    570nm
テトラメチルローダミン(TAMRA)          580nm
Cy3.5                                  596nm
カルボキシ-x-ローダミン(ROX)           605nm
Texas Red                              610nm
Cy5                                    667nm
Cy5.5                                  694nm
【００３９】
式(I)の消光物質は、約500〜約620nmの範囲の蛍光エネルギーの吸収が可能であり、従ってTexas Redを介したフルオレセインの蛍光を消光するために使用することができる。
【００４０】
多くの好適なフルオロフォアの形が利用可能であり、及び状況に応じ使用することができる。キサンテン化合物により、置換基は、オリゴヌクレオチドへの結合のように、様々な物質と結合するために、キサンテン環に付着することができる。フルオレセイン及びローダミン色素に関して、オリゴヌクレオチドへ付着するための適当な連結法が説明されている。例えば、Khannaらの米国特許第4,439,356号、これは本明細書に参照として組入れられており；Marshallの論文、Histochemical J., 7:299-303 (1975)、これは本明細書に参照として組入れられており；Menchenらの米国特許第5,188,934号、これは本明細書に参照として組入れられており；Menchenらの欧州特許出願第87310256.0号、これは本明細書に参照として組入れられており；並びに、Bergotらの国際公開公報第PCT/U590/05565号、これは本明細書に参照として組入れられているものなどを参照のこと。他の消光物質は、本発明の方法を使用し、オリゴヌクレオチドへ取込まれる可能性があるであろう。これらの一部は、下記表1に示されている。
【００４１】
【表１】
2008545659.tif 000010
【表２】
2008545659.tif 000011
【００４２】
好適なことに、色素対が、フルオロフォアが消光物質色素により効果的に消光される配置である場合、その蛍光は、消光の非存在下でのその蛍光と比べ、少なくとも80％の倍率まで、より好ましくは90％、95％、又は98％まで低下される。高レベルの消光は、組成物がその最大非消光状態である場合(シグナル)、対、その最大消光状態である場合(ノイズ)に存在するシグナル量として定義される、高いシグナル対ノイズ比を有するオリゴヌクレオチドプローブの調製を可能にする。
【００４３】
高いシグナル対ノイズ比を有するプローブは、高感度アッセイの開発に望ましい。シグナル対ノイズ比を測定するために、相対蛍光が、消光物質及びフルオロフォアがForster距離内にあり及びフルオロフォアが最大消光された(バックグラウンド蛍光又は「ノイズ」)配置において測定され、並びに消光非存在でフルオロフォア及び消光物質が分離された時に測定された蛍光(「シグナル」)と比較された。本発明の色素対のシグナル対ノイズ比は一般に、少なくとも約2:1であるが、一般にはより高い。シグナル対ノイズ比は、一般にフルオロフォア−消光物質対、合成の質、及びオリゴヌクレオチド配列により影響を受ける。
【００４４】
色素対を含むオリゴヌクレオチドプローブを使用し、標的オリゴヌクレオチドを検出することができる。ひとつの方法において、色素対の個々の成分は、単独のオリゴヌクレオチドの反対側に位置し、ハイブリダイズ可能で、自己相補性であるセグメントであることができ、その結果外因性配列の非存在下で、オリゴヌクレオチドがそれ自身とハイブリダイズする場合、FRETが生じる。このオリゴヌクレオチドプローブは、内部ハイブリダイズが破壊されるように構築され、及び蛍光は、このオリゴヌクレオチドプローブが、相補的標的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする時に観察される。このようなオリゴヌクレオチドプローブを使用し、そのオリゴヌクレオチドプローブに結合する配列を有する標的オリゴヌクレオチドを迅速に検出することができる。別の実施態様において、組成物は、生体分子の一方に付着したフルオロフォア及び他方に付着した消光物質を伴う、2種の生体分子、例えばオリゴヌクレオチドを含む。
【００４５】
自己-相補性を喪失しているオリゴヌクレオチドプローブも、同様の方法で利用することができる。例えば、消光物質及びフルオロフォアは、自己-ハイブリダイズ特性を欠いているオリゴヌクレオチド上に配置することができ、その結果オリゴヌクレオチドのランダムコイル構造は、フルオロフォア及び消光物質を、蛍光消光に適した距離内に保持する。このようなオリゴヌクレオチドは、所望の標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする時に、フルオロフォア及び消光物質は更に離れ、並びに蛍光を観察することができるようにデザインすることができる。
【００４６】
他のDNA結合フォーマットも、可能である。例えば、2種のオリゴヌクレオチドプローブは、それらが標的オリゴヌクレオチドの連続する長さ(contiguous length)上で互いに隣接してハイブリダイズすることができるようにデザインすることができる。これら2種のプローブは、それらが標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる場合に、オリゴヌクレオチドプローブ上の消光物質が、他方のオリゴヌクレオチドプローブ上のフルオロフォアに対しFRETが生じるのに十分に近接するようにデザインされる。オリゴヌクレオチドプローブの標的オリゴヌクレオチドへの結合は、フルオロフォアの蛍光の減少として追跡することができる。
【００４７】
あるいは、互いにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのセットは、消光物質及びフルオロフォアが、反対のオリゴヌクレオチド上のForster距離内に位置するように、構成することができる。そのようなオリゴヌクレオチド二重鎖の、一方又は両方のオリゴヌクレオチドの結合と競合する他のオリゴヌクレオチドとのインキュベーションは、オリゴヌクレオチド二重鎖の正味の分離を引き起こし、これはフルオロフォアの蛍光シグナルの増加につながる。ポリマー鎖への結合に好ましいように、ひとつのオリゴヌクレオチドは、より長いか、又はミスマッチが、オリゴヌクレオチド二重鎖内に取込まれることができる。
【００４８】
これらのアッセイフォーマットは、各オリゴヌクレオチドが、異なるスペクトル分解可能な放出スペクトルを伴うフルオロフォアを有するオリゴヌクレオチドの混合物を有する、マルチ-レポーターシステムに容易に拡大することができる。従って個々のオリゴヌクレオチドの結合は、試料から放出される蛍光波長を決定することにより、検出することができる。このようなマルチ-レポーターシステムを使用し、単独のアッセイにおいて複数のハイブリダイゼーション事象を分析することができる。
【００４９】
オリゴヌクレオチドは、明らかにされた消光物質と共に構成されることもでき、その結果これらは、PCR反応混合物を操作することなく(すなわち、閉鎖されたチューブフォーマットにおいて)、PCR反応の進行をモニタリングするために使用することができる。このアッセイは、蛍光が実質的に消光されるような構成で、フルオロフォア及び消光物質で標識されたオリゴヌクレオチドを利用する。このオリゴヌクレオチドは、増幅されたオリゴヌクレオチドの領域に対する十分な相補性を有し、これは増幅産物と特異的にハイブリダイズするようにデザインされる。ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドは、DNA合成の次ラウンドにおいてTaqポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により分解される。オリゴヌクレオチドは、オリゴマーが分解される時、色素対のメンバーの一員が放出され、フルオロフォアからの蛍光が観察され得るように、デザインされる。試料中の蛍光強度の増加は、増幅産物の蓄積を示す。
【００５０】
リボ核酸ポリマーを、フルオロフォア及び消光物質と共に構成し、RNaseを検出するために使用することもできる。例えば色素対は、RNase基質中のRNase切断部位の反対側に配置することができ、その結果フルオロフォアの蛍光は消光される。適当な基質は、切断することができる1本鎖領域を有するオリゴヌクレオチドであり、並びにアデノシン残基のすぐ3'側に少なくとも1個の内部ヌクレオチド連結を、シトシン残基のすぐ3'側に少なくとも1個の内部ヌクレオチド連結を、グアノシン残基のすぐ3'側に少なくとも1個の内部ヌクレオチド連結を、及びウリジン残基の隣に少なくとも1個の内部ヌクレオチド連結を有し、及び任意にデオキシリボヌクレアーゼ-切断可能な内部ヌクレオチド連結を欠くことができるオリゴヌクレオチドを含む。このアッセイを実行するために、基質は、被験試料と共に、試料中に存在する場合にリボヌクレアーゼ酵素による基質の切断に十分な時間、インキュベーションされる。この基質は、内部位置に少なくとも1個のリボヌクレオチド残基を含む1本鎖オリゴヌクレオチドであることができる。内部リボヌクレオチド残基の切断時に、その放出が消光物質により消光されるフルオロフォアの蛍光は、検出可能になり始める。蛍光の出現は、リボヌクレアーゼ切断事象が発生し、従ってこの試料は、リボヌクレアーゼ活性を含むことを示す。この試験は、基質を既知量のリボヌクレアーゼを含む対照試料と共にインキュベーションし、適当な時間経過後に得られたシグナルを測定し、及びこのシグナルを被験試料で得られたシグナルと比較することにより、リボヌクレアーゼ活性のレベルを定量するように適合することができる。
【００５１】
本発明は、標識されたオリゴヌクレオチド又は本発明のアゾ消光物質を含むキットも提供する。このキットは、使用説明書も含むことができる。このようなキットは、説明された方法の実践、又は説明された組成物の合成の材料を提供するために有用であることができる。特定の方法の必要性に応じ、追加の成分をキットに含むことができる。例えばキットがPCR反応の進行を測定するように指示された場合、これは、DNAポリメラーゼを含むことができる。キットがRNase検出アッセイの実践を意図された場合、RNase-非含有水を含むことができる。キットは、陰性対照及び/又は陽性対照並びに緩衝液も含むことができる。
【００５２】
下記実施例は、本発明を更に例証するが、当然、いかなる意味においてもその範囲を限定するように構築されるものではない。特に下記実施例は、本発明の化合物を得るための合成法を明らかにする。本発明の化合物及びそれらの中間体を調製するために有用な出発材料は、市販されているか、又は公知の合成法及び物質を使用し市販の材料から調製することができる。全てのオリゴヌクレオチド配列は、左側5'-末端から右側3'-末端へ記載されている。
【００５３】
実施例1
アミノオキシ活性化された(1-ニトロ-4-ナフチルアゾ)-N,N-ジエタノールアニリン消光物質(6)の合成
【００５４】
【化８】
2008545659.tif 000012
合成は、図1のスキーム1に示されたように行った。THF 10mL中のアルコール(4) 0.36g(0.1mmol)、N-ヒドロキシ-フタルイミド0.17g(0.1mmol)及びトリフェニルホスフィン0.27g(0.1mmol)の溶液へ、ジエチルアゾジカルボキシラート(DEAD) 0.18mL(0.1mmol)を添加した。一晩攪拌した後、反応混合物を、減圧下で濃縮した。1:4 EtOAc/ヘキサンによるフラッシュクロマトグラフィーは、(5) 150mgを提供した。TLC：Rf 0.75 (EtOAc/ヘキサン−60/40)。1H NMR (CDCl3) δ 9.04 (d, J=8.4Hz, 1H), 8.68 (d, J=8.4Hz, 1H), 8.34 (d, J=8.4Hz, 1H), 8.03 (d, J=8Hz, 2H), 7.7-7.9 (m, 7H), 6.85 (d, J=8Hz, 2H), 4.46 (t, J=7.5Hz, 2H), 3.92 (t, J=7.5Hz 2H), 3.72 (q, J=8Hz, 2H), 1.34 (t, J=8Hz 3H)。
エタノール中の濃アンモニア溶液2mL中の(5) 10mgの溶液を、55℃で一晩インキュベーションした。溶媒を減圧下で除去し、(6)を提供し、これは更に精製することなく使用した。
【００５５】
実施例2
ケトンホスホロアミダイト(16)の合成
【００５６】
【化９】
2008545659.tif 000013
合成は、図2のスキーム2に示されたように行った。
N-Fmoc-3-アミノプロピルソルケタール(10)：3-アミノプロピルソルケタール(9)を、Misiuraらの手順(Misiura, K., Durrant, I., Evans, M.R., Gait, M.J. (1990) Nucleic Acids Research, v. 18, No. 15, pp. 4345-4354、これは本明細書に参照として組入れられている。)に従い、市販のソルケタール(7)から出発し合成した。(9)を、真空蒸留することなく、粗のまま次工程で使用した。粗生成物(9) (12.85g；68mmol)を、無水CH3CN (100mL)に攪拌しながら溶解した。NaHCO3 (4.2g；50mmol)を、引き続きFmoc-OSu (16.9g；50mmol)を添加した。反応混合物を、室温で一晩攪拌した。溶媒を蒸発させ、油状残渣を、EtOAc (500mL)と5％NaHCO3 (150mL)の間で分配した。有機相を分離し、5％NaHCO3 (2x150mL)、ブライン(150mL)で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥した。生成物(10)を、シリカゲルカラム(5x20cm)上で、EtOAc:CH2Cl2:石油エーテル(PE)(15:15:70)で負荷し、EtOAc: CH2Cl2:PE(1:1:2)で溶離するフラッシュクロマトグラフィーにより単離した。単離された生成物(10)は、EtOAc:CH2Cl2:PE(1:1:1)中のTLCによりRf 0.4を有した。収量：油状物20.95g。1H NMR (CDCl3) δ 1.35 (s, 3H), 1.45 (s, 3H), 1.81 (m, 2H), 3.34 (q, 2H), 3.47-3.60 (m, 4H), 3.75 (dd, 1H), 4.07 (dd, 1H), 4.22-4.32 (m, 2H), 4.42 (d, 2H), 5.29 (br.t, 1H), 7.33 (dt, 2H), 7.42 (t, 2H), 7.62 (d, 2H), 7.78 (d, 2H)。
【００５７】
1-O-(N-Fmoc-3-アミノプロピル)グリセロール(11)：粗化合物(10) (5g；12.1mmol)を、THF (15mL)に溶解し、2M HCl (5mL)で処理した。得られるエマルションを、それが均質になるまで、時折音波処理しながら、室温で振盪した。これはその後、室温で更に1時間放置した。この反応混合物を真空で濃縮し、得られる油状物を、無水EtOH(3x20mL)と同時蒸発させた。反応生成物(Rf：EtOAc:CH2Cl2:MeOH (10:10:1)中で〜0.3)を、EtOAc:CH2Cl2 (1:1)中MeOHの0〜5％勾配を使用する、シリカゲルクロマトグラフィー(5x20cm)により単離した。純粋な生成物を含有する画分をプールし、濃縮し、油状残渣を得、これは真空乾燥時に結晶化された。収量：白色固形物(11) 2.64g。1H NMR (DMSO-d6) δ 1.63 (m, 2H), 3.05 (q, 2H), 3.25-3.41 (m, 6H), 3.53-3.60 (m, 1H), 4.21 (t, 1H), 4.30 (d, 2H), 4.47 (t, 1H), 4.60 (d, 1H), 7.27 (t, 1H), 7.33 (dt, 2H), 7.42 (t, 2H), 7.69 (d, 2H), 7.89 (d, 2H)。
【００５８】
1-O-DMT-3-O-(N-Fmoc-3-アミノプロピル)グリセロール(12)：1-O-(N-Fmoc-3-アミノプロピル)グリセロール(11) (2.64g；7.1mmol)を、無水ピリジン(50mL)中に溶解し、DMT-Cl (2.65g；7.8mmol)で処理した。この反応混合物を、室温で一晩攪拌し、MeOH (5mL)で反応停止した。その後これを、減圧下で油状物に濃縮した。残渣を、EtOAc (〜300mL)に溶解し、飽和NaHCO3 (3x100mL)、引き続きブライン(100mL)で抽出した。有機相を分離し、無水Na2SO4上で乾燥し、油状物へと濃縮した。生成物(12)を、石油エーテル(「PE」)中のEtOAcの33〜66％勾配を使用する、シリカゲルクロマトグラフィーにより単離した。収量：白色泡状物(12) 4.03g (84％)。TLCは、EtOAc:PE (2:1)中でRf 〜0.6に1個のスポットを示した。1H NMR (CDCl3) δ 1.68-1.80 (m, 2H), 2.57 (br d, 1H), 3.17-3.34 (m, 4H), 3.43-3.61 (m, 4H), 3.79 (s, 6H), 3.93-4.00 (m, 1H), 4.22 (t, 1H), 4.41 (d, 2H), 5.20 (br t, 1H), 6.82-6.86 (m, 4H), 7.21-7.46 (m, 13H), 7.61 (d, 2H), 7.77 (d, 2H)。
【００５９】
1-O-DMT-3-O-(3-アミノプロピル)グリセロール(13)：化合物(12) (3.82g；5.67mmol)を、i-PrOH (100mL)に溶解し、水素化ホウ素ナトリウム(4g)を、攪拌しながら一気に添加した。この懸濁液を、70℃で2時間加熱した。EtOAc:TEA (99:1)におけるTLC分析は、出発材料(Rf 〜0.75)の消失及び出発時に脱プロトン化された生成物の形成を明らかにした。この反応は、10％水酸化ナトリウム(32mL)で慎重に停止し、分液漏斗へ移し、酢酸エチル300mLで分配した。有機相を分離し、飽和NaHCO3 (3x100mL)、引き続きブライン(100mL)で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。これを次に、真空で濃縮し、油状残渣を得、これを無水アセトニトリル(50mL)で同時蒸発した。この粗物質(13)を、更に精製することなく次工程において使用した。
【００６０】
5-オキソヘキサン酸ペンタフルオロフェニル(14)：5-オキソヘキサン酸(2.6g；20mmol)を、CH2Cl2 (50mL)に溶解した。N,N-ジイソプロピルエチルアミン(10.4mL, 60mmol)を添加し、次にトリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル(3.61mL；21mmol)を添加した。この反応混合物を、室温で1時間維持し、蒸発させた。残渣を、EtOAc:ヘキサン(1:1)中に再懸濁し、シリカゲルカラム(5x20cm)に装加し、同じ混合物で平衡としかつ展開した。生成物(14)(Rf 〜0.7)を含む画分をプールし、濃縮し、真空で乾燥した後、黄色がかった油状物4.7g(79％)を得た。1H NMR (CDCl3) δ 2.05 (m, 2H), 2.18 (s, 3H), 2.61 (t, 2H), 2.74 (t, 2H)。
【００６１】
1-O-DMT-3-O-(N-(5-オキソヘキサノイル)-3-アミノプロピル)グリセロール(15)：粗生成物(13)を、無水CH3CN(50mL)に溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(2.6mL, 15mmol)及び(14) (1.68g, 5.67mmol)で処理した。この混合物を、室温で2時間反応させた。この反応混合物を、真空で蒸発させ、残渣を、EtOAc (50mL)中に再構成させた。生成物を、EtOAc中の1％トリエチルアミン(TEA)で負荷し、及びMeOH:EtOAc:TEA (5:95:1)で溶離する、シリカゲルクロマトグラフィー(4x25cm)により単離した。単独の成分(Rf 0.35)を含有する画分をプールし、真空で濃縮し、標題化合物(15)(2.70g, 85％)をわずかにオレンジ色の油状物として得た。1H NMR (DMSO-d6) δ 1.60 (m, 2H), 1.66 (m, 2H), 2.03 (t, 2H), 2.05 (s, 3H), 2.40 (t, 2H), 2.94 (d, 2H), 3.04 (q, 2H), 3.35-3.46 (m, 4H), 3.72-3.79 (m, 7H； OCH3の1重線3.74), 4.84 (d, 1H), 6.88 (d, 4H), 7.19-7.42 (m, 9H), 7.72 (t, 1H)。
【００６２】
1-O-DMT-3-O-(N-(5-オキソヘキサノイル)-3-アミノプロピル)グリセロール2-O-(N,N-ジイソプロピル-(2-シアノエチル)ホスホロアミダイト)(16)：アルコール(15)(1.35g, 2.4mmol)及びジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(206mg, 1.2mmol)を、無水CH3CN (30mL)中に、大気圧下で溶解した。2-シアノエチル N,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロアミダイト(0.953mL, 3.0mmol)を、室温で攪拌しながら添加し、この反応混合物を一晩攪拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をEtOAc (200mL)中で再構成し、飽和NaHCO3 (3x50mL)、引き続きブライン(50mL)で洗浄した。有機相を、無水Na2SO4上で乾燥し、溶媒を減圧下で蒸発させた。油状残渣を、EtOAc:TEA(95:5)で溶離する、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。TLC上で2個のスポットとして移動した(Rf 〜0.55；EtOAc:TEA (95:5))純粋な生成物(16)を含有する画分をプールし、真空で濃縮し、無色の油状物(16) 1.74gを得た。1H NMR (DMSO-d6) δ 1.01-1.17 (m, 12H), 1.56 (m, 2H), 1.66 (m, 2H), 2.02 (m, 2H), 2.05 (s, 3H), 2.39 (m, 2H), 2.65 (t, 1H), 2.77 (t, 1H), 2.97-3.16 (m, 4H), 3.36-3.81 (m, 15H； OCH3の1重線3.73及び3.74), 6.88 (m, 4H), 7.19-7.44 (m, 9H), 7.69 (t, 1H)。31P NMR (DMSO-d6) δ 148.19及び148.64。
【００６３】
実施例3
(1-ニトロ-4-ナフチルアゾ)-N,N-ジエタノールアニリン消光物質を伴うアミノオキシ複合したCPG支持体の合成(20a及び20b)
【００６４】
【化１０】
2008545659.tif 000014
合成は、図3のスキーム3に示したように行った。
ケトン置換された細孔性ガラス(CPG)支持体の合成：スペーサーC3 CPG (2g；44μmol/g)を、50mLのペプチド合成反応装置中に入れ、ジクロロメタン中の3％ジクロロ酢酸で数回にわけて(30mL)処理することにより(全ての色が支持体から洗浄除去されるまで)脱トリチル化した。その後これを、アルゴン大気下で、CH3CN (5x50mL；最後の2回は無水CH3CNで)及び「アクチベーター」(30mL；無水CH3CN中の0.45M 5-エチルチオ-1H-テトラゾール)で洗浄した。次に、CPG(18)を、適当なホスホロアミダイトの溶液(公開された手順に従い合成されたホスホロアミダイト(17a)：Dey, S. Shepard, T., Org Lett, v.3, pp. 3983-3986 (2001))、これは本明細書に参照として組入れられている；「アクチベーター」10mLと混合した無水CH3CN 10mL中(250μmol))により、Ar掃流下で室温で30分間処理した。これらの試薬を、真空吸引により除去し、新鮮な部分と交換した。このカップリング反応を繰り返し；改質されたCPGを濾過し、CH3CN (5x30mL)で洗浄した。この固形支持体を、THF/Py/H2O中の0.1M I2で処理し(3x30mL；各処理は5分間)、CH3CN (5x30mL)で洗浄した。未反応のヒドロキシルを、Ac2O:MeIm:Py(10:10:80)で処理することにより(3x30mL；各処理5分間)、キャップ形成した。誘導体化されたCPG(19a)を、CH3CN (5x30mL)、CH2Cl2 (3x30mL)で洗浄し、真空で一晩乾燥した。DMT-負荷は通常、30μmol/gを上回った。
【００６５】
消光物質のケトン置換された支持体への付着：消光物質(6) 10mgの溶液に、ケトン置換された支持体(19a) 0.1gを添加し、室温で一晩インキュベーションした。得られる支持体(20a)を濾過し、アセトニトリルの1ml部分で3回洗浄し、その後オリゴヌクレオチド合成に使用した。
【００６６】
実施例4
アミノ-オキシ消光物質誘導体の消光効率
本実施例は、フルオレセイン及び実施例1〜3において調製されたアゾ消光物質の両方を含有するオリゴヌクレオチドのシグナル対ノイズ比(S:N)を明らかにしている。蛍光-消光されたプローブは、分子生物学の様々な適用において使用される。所定のフルオロフォア及び消光物質が一緒に十分機能するかどうかを評価するひとつの方法は、シグナル対ノイズ比(S:N)の測定により、ここで相対蛍光は、未変性の構成(バックグラウンド蛍光又は「ノイズ」)において測定され、フルオロフォア及び消光物質が分離された場合に測定された蛍光(「シグナル」)と比較される。
【００６７】
オリゴヌクレオチド合成：下記オリゴヌクレオチドは、標準ホスホロアミダイト化学及び前掲の実施例3に説明されたアミノオキシ消光剤を用い、合成した。オリゴヌクレオチドは、HPLCにより精製した。二重-標識されたオリゴヌクレオチドは、5'末端に配置されたフルオレセインレポーター基(6-FAM、単独の異性体6-カルボキシフルオレセイン、Glen Research, Sterling, VA)を伴う、プローブの3'-末端に本発明の新規アミノオキシ(1-ニトロ-4-ナフチルアゾ)-N,N-ジエタノールアニリン消光物質(6)を伴うように作製した。同じ配列を、アミノオキシ消光物質(6)-合成後の複合(IBAOket)、アミノオキシ消光物質(6)-dU-CPGの合成時の複合(IBAOdU, 式V, 前掲)、及びアミノオキシ消光物質(6)-ケトン-CPGの合成時の複合(IABAOC7, 式(IV), 前掲)を含む、消光物質付着の様々な方法を用い、作製した。比較のために、市販の消光基Eclipse消光物質(商標)-CPG(Epoch Biosciences, ボセル, WA)を取込むオリゴヌクレオチドを作製した。Eclipse消光物質プローブは、アミノオキシ求核物質を含まない。ケトンホスホロアミダイト(配列番号:5)を使用し3'-又は内部FAM修飾を作製するために、FAM-オキシム複合体は、ホスホロアミダイトサイクルの後、無水酢酸キャップ形成試薬で、アセチル化されなければならない。
【００６８】
各オリゴヌクレオチドプローブのエレクトロスプレー-イオン化液体クロマトグラフィー質量分析(ESI-LCMS)は、ThermoFinnigan TSQ7000、Xcaliburデータシステム、ProMassデータ処理ソフトウェア及びParadigm MS4(商標)HPLC(Michrom BioResources, オーバーン, CA)からなる、Oligo HTCSシステム(Novatia, プリンストン, NJ)を用いて行った。製造業者により推奨されたプロトコールに従った。全ての化合物の実験的モル質量は、予想されるモル質量の0.02％以内であり、合成された化合物の同一性を確認している。
【００６９】
表2
2008545659.tif 000015
【００７０】
オリゴヌクレオチド合成において実施例3に概説された物質を使用し得られた最終構造の代表として、アミノオキシ消光物質とオリゴヌクレオチド配列番号:3の3'-末端の間の化学連結が、下記に示されている(式(VII))。
【００７１】
【化１１】
2008545659.tif 000016
蛍光-消光した線状プローブのシグナル対ノイズ(S:N)アッセイ：オリゴヌクレオチドは、プレ-及びポスト-ヌクレアーゼ分解アッセイにおいて消光効率について評価した。プローブオリゴヌクレオチド(配列番号:1-4)は、HPLC-等級水中に、濃度100nMで個別に再懸濁した。このストック液から、100nMプローブ溶液2mlを、10mMトリス(pH8.3)、50mM KCl、5mM MgCl2、1mM CaCl2を含有するSTNR緩衝液で調製し、これをふたつの同等な1mL画分に分けた。ひとつの画分は、バックグラウンド対照として、酵素処理せずに維持した。第二の画分は、以下のようなヌクレアーゼ分解に供した。ミクロコッカス・ヌクレアーゼ15単位(Roche, 15U/μl)を、このオリゴヌクレオチド溶液に添加し、37℃で1時間インキュベーションした。各試料に関する相対蛍光強度を、PTI QuantaMasterモデルC-60キュベット-ベースの蛍光分光光度計(Photon Technology International, モンマスジャンクション, NJ)で測定した。無傷のプローブを含有する溶液の蛍光測定値は、アッセイの「バックグラウンド」又は「ノイズ」成分を構成した。分解したプローブを含有する(ヌクレアーゼ処理した)溶液の蛍光測定値は、アッセイの「シグナル」成分を構成した。シグナル対ノイズ比(S:N)を、計算した。
【００７２】
表3：蛍光-消光した線状オリゴヌクレオチドのシグナル対ノイズ比
2008545659.tif 000017
RFU＝相対蛍光単位
【００７３】
表3に示されたように、新規アミノオキシ付着した消光物質(6)は、通常使用される市販の消光基と同様の効率で、フルオレセインを消光することが可能である。
【００７４】
実施例5
定量的リアルタイムPCRアッセイでの蛍光プローブにおけるアミノオキシ-消光物質の使用
蛍光-消光されたプローブを使用し、標的核酸配列を検出することができる。通常、このような検出は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの、増幅工程に連続される。本実施例は、アミノオキシ消光物質で修飾された蛍光プローブの使用は、関連する適用であるリアルタイムPCRアッセイにおいて機能することを明らかにしている。
【００７５】
オリゴヌクレオチドプライマーは、標準ホスホロアミダイト化学を用いて合成し、脱塩し、更に精製することなく使用した。使用したプローブオリゴヌクレオチドは、前掲の実施例4において試験した化合物である配列番号:1-4と同じであった。使用したプライマーは、以下であった：
フォワードプライマー：HP48 For
AGAAGGTCATCATCTGCCATCG      配列番号:5
リバースプライマー：HP48 Rev
TCCAGACTTTGGCTGTTCGGAT      配列番号:6
【００７６】
標的核酸は、ヒトbHLHタンパク質PTF1A遺伝子(Genbank # NM_178161)に由来した150塩基対(bp)アンプリコンである配列番号:7であり、これをpCRII-TOPOベクター(Invitrogen, カールスバッド, CA)にクローニングし、以後「p48-遺伝子標的」と称した。
【００７７】
標的核酸配列：
HP48 For                                     HP48プローブ
AGAAGGTCATCATCTGCCATCGGGGCACCCGGTCCCCCTCCCCCAGCGACCCTGATTATGGCCTCCCTCCCCTAGCAGGACACTCTCTCTCATGGACTGATGAAAAACAACTCAAGGAACAAAATATTATCCGAACAGCCAAAGTCTGGA  
HP48 Rev
配列番号:7
【００７８】
PCR増幅は、熱安定したDNAポリメラーゼImmolase(商標)(Bioline, ランドルフ, MA)、800μM dNTPs、及び3mM MgCl2を使用し行った。反応は、容量25μL中で実行し、及び各200nMの増幅プライマー及び蛍光消光したプローブ、標的DNAの500、50,000及び5,000,000コピーを含有した。サイクリング条件は、50℃で2分間、95℃で10分間、その後95℃で15秒間及び60℃で1分間の2-工程PCRを40サイクルであった。PCR及び蛍光測定は、ABI Prism(商標)7700配列検出器(Applied Biosystems Inc., フォスターシティー, CA)を用いて行った。全てのデータ点は、3つ組で行った。サイクル閾値(Ct)は、バックグラウンドを上回る蛍光の統計学的に有意な増加が検出されるサイクルとして規定した。より低いCt値は、より高い濃度の標的DNAの指標である。これらのアッセイは、同量の投入標的DNA(PTF1a p48-遺伝子標的プラスミドの5x102−5x104−5x106コピー)を用いて行った。各プローブについてPCR時に収集された相対蛍光レベルは、サイクル数に対し、図面にプロットし、図1〜5に示した。
【００７９】
合成後に付着されたアミノオキシ(1-ニトロ-4-ナフチルアゾ)-N,N-ジエタノールアニリン消光物質(6)(IBAOket)を取込んでいる、プローブ配列番号:1を使用する40-サイクルリアルタイムPCR反応の多成分図(multicomponent view)を、図6に示した。蛍光ベースラインは、サイクル18まで平坦に維持され、この時生成物は最初に、PCR増幅の結果としての検出可能レベルに達した。オキシム結合は、使用された反応条件において安定しており、ベースラインバックグラウンド蛍光の上昇は認められなかった。従ってオキシム結合は、これらの反応条件における使用に適しており、これは多くの分子生物学適用において通常使用される条件に類似している。
【００８０】
合成後に付着されたアミノオキシ(1-ニトロ-4-ナフチルアゾ)-N,N-ジエタノールアニリン消光物質(6)(IBAOket)を取込んでいるプローブ配列番号:1の増幅追跡は、図6に示した。この結果は、3つ組反応の良好なクラスター化を示し、標的核酸の異なる投入濃度間で明確に区別された。
dU塩基連結を介したCPG複合体として合成時に付着されたアミノオキシ(1-ニトロ-4-ナフチルアゾ)-N,N-ジエタノールアニリン消光物質(6)(IBAOdU)を取込んでいるプローブ配列番号:2に関する増幅追跡は、図7に示した。この結果は、3つ組反応の良好なクラスター化を示し、標的核酸の異なる投入濃度間で明確に区別された。
【００８１】
オリゴヌクレオチドの3'-末端への直接連結によりCPG複合体として合成時に付着されたアミノオキシ(1-ニトロ-4-ナフチルアゾ)-N,N-ジエタノールアニリン消光物質(IBAOC7)を取込んでいるプローブ配列番号:3に関する増幅追跡は、図8に示した。この結果は、3つ組反応の良好なクラスター化を示し、標的核酸の異なる投入濃度間で明確に区別された。
オリゴヌクレオチドの3'-末端への直接連結によりCPG複合体として合成時に付着された市販のEclipse消光物質(Eclipse)を取込んでいるプローブ配列番号:4に関する増幅追跡は、図9に示した。この結果は、3つ組反応の良好なクラスター化を示し、標的核酸の異なる投入濃度間で明確に区別された。
【００８２】
4種のプローブ全てに関するリアルタイムPCR結果を、1種の標的濃度5x106について一緒にプロットし、図10に示した。蛍光の絶対変化(ΔRf)は、プローブ間で変動した。これは典型的には、合成時の精製の質の変動から生じた。投入標的核酸の定量的検出に対する実際の感度は、使用したプローブと消光物質の間でほぼ同じであった。
【００８３】
表4は、リアルタイムPCRの結果をまとめており、これは全てのオリゴヌクレオチドは、消光物質付着の方法にかかわらず、同様のCt値を提供し、並びに本適用において同様の性能で機能したことを明らかにしている。
【００８４】
表4. リアルタイムPCRアッセイにおけるプローブ配列番号:1-4に関する相対Ct値
2008545659.tif 000018
【００８５】
表4に示されたように、本発明の新規アミノオキシ(1-ニトロ-4-ナフチルアゾ)-N,N-ジエタノールアニリン消光物質(6)を含有するプローブ組成物は、定量的リアルタイムPCRアッセイにおいて良好に作用し、並びに他の消光物質部分を含むプローブと機能的に互換性があった。
【００８６】
実施例6
定量的リアルタイムPCRアッセイにおける蛍光プローブ機能での内部アミノオキシ-dU消光物質の使用
消光基は、通常、合成を容易にするために、プローブ配列の末端に配置される。新規アミノオキシ消光物質は、塩基修飾されたアミノオキシ消光物質-dU部分としての消光物質の内部取込みを可能にする。本実施例は、内部アミノオキシ-消光物質で修飾された蛍光プローブが、リアルタイムPCRアッセイにおいて、標準の末端-消光されたプローブよりも、より良く機能することを明らかにする。
【００８７】
内部修飾により二重標識されたオリゴヌクレオチド(配列番号:12-14)を、ケトン-dUホスホロアミダイト(公表された手順に従い合成した：Dey及びShepardの論文、Org. Lett.、3: 3983-3986 (2001)、これは本明細書に参照として組入れられている。)を用い、引き続き合成時にエタノール中のアミノオキシ-消光剤(6)の10mM溶液300μL(固形支持体上のオリゴヌクレオチド1μmole当たり)と内部複合し、作製した。2時間後、過剰なアミノオキシ-消光物質を除去し、固形支持体を、アセトニトリル1mLで洗浄し、オリゴヌクレオチドを、標準ホスホロアミダイト化学を用い伸長した。
【００８８】
オリゴヌクレオチドプライマーを、標準ホスホロアミダイト化学を用い合成し、脱塩し、及び更に精製することなくアッセイにおいて使用した。使用したプライマー及びプローブのオリゴヌクレオチドは、以下に示している。内部消光物質修飾を伴うプローブは、PCR時の伸長をブロックするために消光基の代わりに3'-末端に配置された、C3スペーサー基を有した。オリゴヌクレオチドは、先に説明したように合成した。
【００８９】
表5
2008545659.tif 000019
【００９０】
フォワードプライマー及びリバースプライマーは、配列番号:8及び9に示されている。内部アミノオキシ-消光物質-dUは、(iIBAOdU)と記されている。配列番号:11は、3'-末端消光物質配置を伴う従来のプローブを表している。配列番号:12は、5'-末端から9個の位置に内部dT塩基の内部アミノオキシ-消光物質-dU置換を有する。配列番号:13は、5'-末端から10個の位置に内部dC塩基の内部アミノオキシ-消光物質-dU置換を有し、これはハイブリダイゼーション時に好ましいU:G塩基対形成事象を生じる。配列番号:14は、5'-末端から13個の位置に内部dA塩基の内部アミノオキシ-消光物質-dU置換を有し、これはハイブリダイゼーション時に好ましくないU:T塩基対形成事象を生じる。アミノオキシ-消光物質-dU塩基は、化合物(20a_)である。
【００９１】
標的核酸は、ヒトEnolase遺伝子(Genbank # NM_001428)に由来した配列番号:10の162塩基対(bp)アンプリコンであり、pCRII-TOPOベクター(Invitrogen, カールスバッド, CA)にクローニングされ、以後「hEnolase-遺伝子標的」と称する。
【００９２】
標的核酸配列：
Enolase For                                  Enolaseプローブ
AACTCTGAAGTCATCCTGCCAGTCCCGGCGTTCAATGTCATCAATGGCGGTTCTCATGCTGGCAACAAGCTGGCCATGCAGGAGTTCATGATCCTCCCAGTCGGTGCAGCAAACTTCAGGGAAGCCATGCGCATTGGAGCAGAGGTTTACCACAACCTGAAG  
Enolase Rev
配列番号:10
【００９３】
PCR増幅は、熱安定したDNAポリメラーゼImmolase(商標)(Bioline, ランドルフ, MA)、800μM dNTPs、及び3mM MgCl2を使用し行った。反応は、容量25μL中で実行し、及び各200nMの増幅プライマー及び蛍光消光したプローブ、標的DNAの500、50,000及び5,000,000コピーを含有した。サイクリング条件は、50℃で2分間、95℃で10分間、その後95℃で15秒間及び60℃で1分間の2-工程PCRを40サイクルであった。PCR及び蛍光測定は、ABI Prism(商標)7700配列検出器(Applied Biosystems Inc., フォスターシティー, CA)を用いて行った。全てのデータ点は、3つ組で行った。サイクル閾値(Ct)は、バックグラウンドを上回る蛍光の統計学的に有意な増加が検出されるサイクルとして規定した。より低いCt値は、より高い濃度の標的DNAの指標である。これらのアッセイは、同量の投入標的DNA(hEnolase-遺伝子標的プラスミドの5x102−5x104−5x106コピー)を用いて行った。各プローブについてPCR時に収集された相対蛍光レベルは、サイクル数に対し、図面にプロットした。4種のプローブ全てに関するリアルタイムPCRの結果を、1種の標的濃度5x106について一緒にプロットし、図12に示した。蛍光の絶対変化(ΔRf)は、プローブ間で顕著に変動した。この場合、プローブは、同様の質を有し、蛍光の差異は、消光物質位置により変動する消光の異なる強度に関連している。投入標的核酸の定量的検出に対する実際の感度は、プローブ間で変動し、下記表6に定量化している。
【００９４】
表6. リアルタイムPCRアッセイにおけるプローブ配列番号:10-13に関する相対Ct値
2008545659.tif 000020
【００９５】
dU塩基上に内部配置された新規アミノオキシ(1-ニトロ-4-ナフチルアゾ)-N,N-ジエタノールアニリン消光物質(6)を含有するプローブ組成物は、標準の3'-消光物質プローブと比較し、リアルタイムPCRアッセイにおいて優れた特性を示している。検出限界は、〜1Ct値まで改善され、これは約2倍の検出感度に対応している。
【００９６】
実施例7
吸収スペクトル
本実施例は、アゾ消光物質(6)を含むようにその5'末端が修飾されたオリゴヌクレオチドの吸収スペクトルを示している。オリゴヌクレオチドは、最後の添加サイクルが、分子(6)で実行される、標準自動ホスホロアミダイトヌクレオチド合成法を用いて作製した。オリゴヌクレオチドの組成は、以下に示している。
配列番号:15 (アゾ消光物質)-CAGAGTACCTGA
【００９７】
一旦合成されると、オリゴヌクレオチドは、HPLC-等級水中に濃度400nMで懸濁した。光学的吸光度を、Hewlett Packardモデル8453分光光度計(Hewlett Packard, パロアルト, CA)において、光路長1cmの半微量(sub-micro)石英キュベット内で、10mMトリス(pH8.0)、1mM EDTA(TE緩衝液)中で測定した。吸光度の密度は、220nm〜700nmで記録し、図13に示している。
図13に示したように、吸収スペクトルは、広幅であり、420〜620nmの範囲に広がり、ピーク吸収は531nmであった。この吸収範囲は、分子生物学適用において通常使用される多種多様なフルオロフォアの蛍光放出と重なっている。FRETベースの消光機構に関して、このスペクトルは、フルオレセインのスペクトル範囲において色素に最大消光能を提供するように、位置付けられている。
【００９８】
実施例8
アミノオキシ基は、アルコール(21)とN-ヒドロキシフタルイミドの間のMitsunobu反応、それに続くフタルイミド加水分解を介し、レポーター部分に導入される(図4のスキーム4)。
この方法は、塩基性条件に対し安定しているフルオロフォア、消光物質、ビオチン、ペプチド及び他のレポーター部分の誘導体化に使用することができる。
【００９９】
実施例9
アルキルアミノ官能性を有する一部のペプチド、タンパク質、レポーター部分のような、塩基で不安定な分子の場合、アミノオキシ基は、対応するNHSエステル(28)との反応、それに続く酸に不安定なMMT基の除去により導入される(図5のスキーム5)。
【０１００】
実施例10
フルオレセインアミノオキシ誘導体(33)の合成
本実施例は、下記式の化合物の化学合成を明らかにしている：
【０１０１】
【化１２】
2008545659.tif 000021
この合成は、下記図14に示している。THF 10mL中のアルコール(31)0.72g (0.14mmol)、N-ヒドロキシ-フタルイミド0.23g (0.14mmol)、及びトリフェニルホスフィン0.36g (0.14mmol)の溶液へ、DEAD 0.26mL (0.15mmol)を添加した。一晩攪拌した後、反応混合物を、減圧下で濃縮した。1:4 EtOAc/ヘキサンによるフラッシュクロマトグラフィーは、(32)の380mgを提供した。TLC：Rf 0.55 (EtOAc/ヘキサン−60/40)。1H NMR (CDCl3) δ 8.13 (d, J=8.4Hz, 1H), 8.07 (d, J=8.4Hz, 1H), 7.7-7.9 (m, 4H), 7.49 (s, 1H), 7.03 (d, 2.4Hz, 2H), 6.75-6.83 (m, 4H), 6.42 (t, J=6.5Hz, 1H), 4.21 (t, J=6.5Hz, 2H) 3.45 (dd, J=8.5, J=6.5, 2H), 1.35-1.80 (m, 8H), 1.36 (s, 18H)。
【０１０２】
エタノール中の濃アンモニア溶液2mL中の(32) 10mgの溶液を、55℃で一晩インキュベーションした。溶媒を、減圧下で除去し、(33)を提供し、これを更に精製することなく使用した。
【０１０３】
本明細書に列記された、刊行物、特許出願及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が個別に具体的に本明細書に組入れられ及びその全体が本明細書において説明されていることが指摘されるのと、同程度に、本明細書に参照として組入れられている。
【０１０４】
本発明を説明する文中(特に「特許請求の範囲」において)における用語「ひとつ(a, an, the)」及び同様の言及の使用は、特に本明細書において指摘されないか又は明らかに状況と矛盾しない限りは、単数及び複数の両方を対象とするように構成されなければならない。用語「含む」、「有する」、「含有する」及び「包含する」は、特に記さない限りは、制約のない用語(open-ended term)として構築される(すなわち、「含有する」を意味するが、これらに限定されるものではない。)。本明細書における値の範囲の詳述は、本明細書において特に記さない限りは、各個別の値がその範囲内に収まることを、個々に意味する簡単明瞭な方法として役立ち、並びに各個別の値は、それが本明細書において個別に言及されるように、その特定に組込まれることが単に意図されている。本明細書において説明された全ての方法は、本明細書において特に指摘さないか又は明らかに状況と矛盾しない限りは、いずれか適当な順番で実行することができる。本明細書に提供されるいずれか又は全ての例、又は例証的言葉(例えば、「など」)の使用は、本発明をより良く注意を促すことのみ意図されており、特に主張されない限りは、本発明の範囲の限定は有さない。本明細書中の言語は、本発明の実践に必須であるとして請求されない要素を示すようには、構築されない。
【０１０５】
これらの好ましい実施態様の変形は、先の説明を読むことで、当業者には明らかになるであろう。従って本発明は、適用法令により許される、添付された「特許請求の範囲」に列記された対象物質のあらゆる修飾及び同等物を含む。更に全ての可能な変動において先に説明された要素の組合せは、本明細書において特に指摘されないか又は明らかに状況と矛盾しない限りは、本発明に包含される。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】図1は、式(I)の化合物の合成を示す。
【図２】図2は、ケトンホスホロアミダイトの合成を示す。
【図３】図3は、アミノオキシ複合された細孔性ガラス(CPG)支持体の合成を示す。
【図４】図4は、アミノオキシ基の塩基性条件で安定しているレポーター部分への導入を示す。
【図５】図5は、アミノオキシ基の塩基で不安定なレポーター部分への導入を示す。
【図６】図6は、多成分図におけるプローブ配列番号:1のリアルタイムPCRデータを示す。フルオレセインデータプロットは、上側グラフに第一の曲線として配置され、これはプローブからのシグナルを表している。Roxデータプロットは、上側プロット中に第二(フラット)曲線として配置され、これは検出対照を表している。サーマルサイクリング時の温度追跡は、下側グラフにプロットされている。
【図７】図7は、増幅追跡としてのプローブ配列番号:1のリアルタイムPCRデータを表す。反応は、左側から右側に示した、5x106個分子、5x104個分子、及び5x102個分子の投入標的を用いて行った。全ての標的濃度は、3つ組で試行した。
【図８】図8は、プローブ配列番号:2のリアルタイムPCR増幅追跡を示している。反応は、左側から右側に示した量、5x106個分子、5x104個分子、及び5x102個分子の投入標的を用いて行った。全ての標的濃度は、3つ組で試行した。
【図９】図9は、プローブ配列番号:3のリアルタイムPCR増幅追跡を示している。反応は、左側から右側に示した量、5x106個分子、5x104個分子、及び5x102個分子の投入標的を用いて行った。全ての標的濃度は、3つ組で試行した。
【図１０】図10は、プローブ配列番号:4のリアルタイムPCR増幅追跡を示している。反応は、左側から右側に示した量、5x106個分子、5x104個分子、及び5x102個分子の投入標的を用いて行った。全ての標的濃度は、3つ組で試行した。
【図１１】図11は、プローブ配列番号:1-4のリアルタイムPCR増幅追跡を示している。5x106個投入標的分子を使用する各プローブの追跡が示されている。全ての標的濃度は、3つ組で試行した。
【図１２】図12は、プローブ配列番号:11-14のリアルタイムPCR増幅追跡を示している。5x106個投入標的分子を使用する各プローブの追跡が示されている。全ての標的濃度は、3つ組で試行した。
【図１３】図13は、配列番号:15のオリゴヌクレオチドの吸収スペクトルを示している。
【図１４】図14は、フルオレセインアミノオキシ誘導体の合成を示している。
【図１５】図15は、アミノオキシ置換のレポーター部分の例を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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