(57)【要約】  本発明は、種の対応する官能化されたキャリヤー材料上への吸着に基づく細胞および/またはウイルスを液体培地から特異的または非特異的に分離するための方法に関する。本発明に従う方法は、細胞およびウイルスのいずれかの種を分離およびまた単離するために使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体培地から細胞および/またはウイルスを特異的または非特異的に分離するための方法であり、該方法にて、
(a)  細胞および/またはウイルスの吸着を可能にするために、キャリヤー材料を表面上で化学的に官能化し；
(b)  キャリヤー材料を液体培地と接触させて、細胞および/またはウイルスをキャリヤー材料上に吸着させ；
(c)  細胞および/またはウイルスを積載したキャリヤー材料を液体培地から単離する方法。
【請求項２】
キャリヤー材料が、ポリマー類、セラミックスおよびガラスからなる群より選択されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
キャリヤー材料が、粉末、顆粒、フィルム、膜、焼結体または発泡体の形で存在することを特徴とする、請求項1〜2の1項に記載の方法。
【請求項４】
キャリヤー材料が、親水性様に官能化されることを特徴とする、請求項1〜3の1項に記載の方法。
【請求項５】
キャリヤー材料が、疎水性様に官能化されることを特徴とする、請求項1〜4の1項に記載の方法。
【請求項６】
官能基が、キャリヤー材料に直接結合されることを特徴とする、請求項1〜5の1項に記載の方法。
【請求項７】
官能基が、スペーサーを介してキャリヤー材料に結合されることを特徴とする、請求項1〜6の1項に記載の方法。
【請求項８】
吸着が、化学吸着に関係することを特徴とする、請求項1〜請求項7の1項に記載の方法。
【請求項９】
化学吸着が、イオン性相互作用に基づき、官能基が、アンモニア、カルボキシル、カルボキシレート、硫酸、スルホネート、ホスホネート基および蛋白質からなる群より選択される、請求項1〜8の1項に記載の方法。
【請求項１０】
化学吸着が、共有結合相互作用に基づき、官能基が、活性エステル類、酸アミド類、エポキシド類、ハロゲニド類、酸ハライドおよびC-C多重結合からなる群より選択される、請求項8または9の1項に記載の方法。
【請求項１１】
官能化されたキャリヤー材料が、中性、カチオン性またはアニオンを特性を有することを特徴とする、請求項1〜10の1項に記載の方法。
【請求項１２】
細胞が、原核細胞および真核細胞ならびに原始細菌から選択されることを特徴とする、請求項1〜11の1項に記載の方法。
【請求項１３】
細胞が、細菌；真菌；藻類；胞子；植物細胞；動物細胞；細胞培養からの細胞；および、遺伝的に変異した細胞からなる群より選択されることを特徴とする、請求項1〜12の1項に記載の方法。
【請求項１４】
キャリヤー材料が、液体培地に分散されることを特徴とする、請求項1〜13の1項に記載の方法。
【請求項１５】
キャリヤー材料が、液体培地の流れに賦されることを特徴とする、請求項1〜14の1項に記載の方法。
【請求項１６】
キャリヤー材料が、多孔質体の形で存在し、液体培地がその多孔質を介して流れることを特徴とする、請求項1〜15の1項に記載の方法。
【請求項１７】
キャリヤー材料が、官能化の前に活性化されることを特徴とする、請求項1〜16の1項に記載の方法。
【請求項１８】
活性化が、化学的に、特に、酸化的および/または光化学的に；または、物理的に、特に、プラズマ処理によって達成されることを特徴とする、請求項1〜17に記載の方法。
【請求項１９】
液体培地からのキャリヤー材料の単離が、濾過、沈降または遠心分離によって達成されることを特徴とする、請求項1〜18の1項に記載の方法。
【請求項２０】
細胞および/またはウイルスの少なくとも一部が、積載したキャリヤー材料の液体による溶離によって回収されることを特徴とする、請求項1〜19の1項に記載の方法。
【請求項２１】
回収された細胞および/またはウイルスが、さらに処理、特に、分析されることを特徴とする、請求項1〜20の1項に記載の方法。
【請求項２２】
液体、特に、水、液体食品、食品からの液体、体液または排泄物から細胞および/またはウイルスを単離するための請求項1〜19の1項に記載の方法の使用。
【請求項２３】
細胞および/またはウイルスの個々の種を分離するための請求項18に記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種の対応する官能化されたキャリヤー材料上への吸着に基づく細胞および/またはウイルスを液体培地から特異的または非特異的に分離するための方法に関する。本発明に従う方法は、細胞およびウイルスのいずれかの種を分離およびまた単離するために使用される。
【背景技術】
【０００２】
微生物の単離および濃縮は、微生物診断用剤にて重大な問題である。ここでは、時間をかけた濾過法(WO01/52968)または遠心分離技術(JP3270701)が利用可能である。しかし、これらは、試験される溶液が粘稠性であるかまたは固体を含む場合に、首尾よく成功しない。その他の方法は、免疫捕捉に基づき、その固体は、細胞を収集するために使用される抗体で塗被される。固体は、磁性粒子であってもよい(例えば、CA 1127571，AU 533747)。これらの技術は、抗体の使用により非常に高価である。同様に、微生物の結合は、外部影響に、例えば、温度、流速、したがって、発生する剪断応力に非常に依存する。
【０００３】
ウイルスを洗浄する時、イオン交換樹脂を備えた高圧液体クロマトグラフィーの使用が記載されている(WO00/40702)。
【０００４】
細胞、特に、動物細胞の分析は、現在、フローサイトメトリにより行われている(US 6793642，US 2004189977，DE 199 45 553)。細胞は、それによって、キャピラリーに単離され、シグナルに基づき選別される(例えば、光散乱，蛍光等)。これは、長ったらしく、あまり選択的な方法ではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、本発明の目的は、簡単かつしたがって経済的な細胞の分離および単離を可能とする方法を提供とすることであった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的は、請求項1の特徴を有する方法によって達成される。請求項23にて、本発明に従う方法の使用を記載する。さらなる従属請求項は、有益な展開を現す。
【０００７】
本発明に従えば、細胞および/またはウイルスを液体培地から特異的または非特異的に分離するための方法であり、該方法にて、
(a)  細胞および/またはウイルスの吸着を可能にするために、キャリヤー材料を表面上で化学的に官能化し；
(b)  キャリヤー材料を液体培地と接触させて、細胞および/またはウイルスをキャリヤー材料上に吸着させ；
(c)  細胞および/またはウイルスを積載したキャリヤー材料を液体培地から単離する方法が提供される。
【０００８】
数多くの微生物がイオン性表面への固定または可逆結合を示す。結合は、それによって、それぞれの微生物種に依存する。これらの相互作用は、しかし、等しく強力ではなく、種によって異なる。この定性的かつ定量的に異なる相互作用の結果、異なる細胞の分離および単離、例えば、種々の細菌種の分離が可能となる。
【０００９】
キャリヤー構造の表面との細胞および/またはウイルスの相互作用は、その表面の化学的な官能性によって影響を受け、細胞とキャリヤー材料との間の相互作用は、また、緩衝剤の選択により、例えば、イオン濃度およびpH値の選択によって調節可能である。結合は、それによって、非常に強力に調節され、分離できない。他方、結合を可逆的にすることも同様に可能である。
【００１０】
キャリヤー材料は、好ましくは、ポリマー類、セラミックスおよびガラスからなる群より選択される。キャリヤー材料は、それによって、粉末、顆粒、フィルム、膜、焼結体または発泡体の形で使用することができる。
【００１１】
キャリヤー材料の表面は、必ずしも化学反応によって官能化する必要はない。非官能化キャリヤー材料を使用することも可能であり、細胞および/またはウイルスの十分な吸着をこのようにして可能としうる。
【００１２】
キャリヤー材料の表面の官能化に関して、細胞および/またはウイルスまたは微生物の吸着の適性に関して逸脱するようなさらなる制限は存在しない。
【００１３】
好ましくは、キャリヤー材料は、親水性に官能化されうるが疎水性に官能化されてもよい。それによって、官能基のキャリヤー材料への直接結合を達成することが可能である。官能基がスペーサによりキャリヤー材料に結合されているさらなる変種も提供される。
【００１４】
好ましくは、キャリヤー材料と細胞、ウイルスまたは微生物との間に作用する吸着力は、化学吸着相互作用に関係する。
【００１５】
化学吸着の好ましい領域は、それによって、イオン性相互作用に基づく。この場合、官能基は、アンモニウム、カルボキシル、カルボキシレート、硫酸、スルホネート、ホスフェート基および蛋白質からなる群より選択される。
【００１６】
化学吸着が共有結合相互作用に基づくもう1つの好ましい変更例も提供される。この場合、官能基は、活性エステル類、酸アミド類、エポキシド類、ハロゲニド類、酸ハライドおよびC-C多重結合からなる群より選択される。
【００１７】
官能化されたキャリヤー材料の負荷に関して、吸着は、同様に、分離または単離される種に関して達成される。したがって、キャリヤー材料は、中性、カチオン性またはアニオン性を有しうる。
【００１８】
単離される細胞は、好ましくは、原核細胞および真核細胞の群からまたは原始細菌の群から選択される。特に好ましくは、細胞は、細菌；真菌；藻類；胞子；植物細胞；動物細胞；細胞培養からの細胞；および、遺伝的に変異した細胞からなる群より選択される。
【００１９】
細胞および/またはウイルスをキャリヤー材料と接触させることに関する方法の処理はは、制限されるようにデザインされておらず、本目的のための従来技術から公知の全ての方法を含む。例えば、キャリヤー材料が液体培地に分散される変更例が提供される。キャリヤー材料が液体培地の流れに賦されるもう1つの好ましい変更例が提供される。キャリヤー材料が多孔質体の形で存在する第3の好ましい変更例も提供されるが、その孔を介して液体培地が流れる。キャリヤー材料と細胞またはウイルスとの間の相互作用が十分に強い単離された種の吸着を可能とする全てのこれら変更例が提供される。
【００２０】
好ましくは、キャリヤー材料は、また、官能化前に活性化することができる。活性化は、それによって、化学的に達成されうる。好ましい変更例は、オキシダント、例えば、H2O2、過酸化物、クロモ硫酸、ヨウ素化合物および臭素化合物による酸化的な活性化である。同様に、UV光またはマイクロ波放射線による光化学的活性化も好ましい。
【００２１】
化学的な官能化は、ついで、ガス状試薬、例えば、ジアミンによる、あるいは、液体、例えば、ポリエチレンイミンまたはポリエチレングリコールの溶液による多段階で実行されうる対応するさらなる反応によって達成される。
【００２２】
活性化のもう1つの変更例は、例えば、プラズマ、すなわち、放電による物理的活性化に関係する。
【００２３】
液体培地からのキャリヤー材料の単離は、従来技術公知の全ての変更例をここで使用することも可能なように、いずれの制限にも賦さない。好ましくは、これらの濾過、沈降または遠心分離が挙げられる。
【００２４】
細胞および/またはウイルスの少なくとも一部が積載したキャリヤー材料の液体による溶離によって回収することのできる本発明に従う方法のさらに重要な変更例を提供する。したがって、これは、ここでは、個々の微生物種の単離に関係し、定量的な分離のみには関係しない。
【００２５】
回収された細胞および/またはウイルスは、好ましくは、さらに処理され、続いて、分析されるのがとりわけ好ましい。これは、液体から細胞および/またはウイルスを定量的に単離するのみならずまた同時に、対応する液体中に含まれる細胞および/またはウイルスのタイプについて定性的に決定することを可能とする。
【００２６】
細胞および/またはウイルスのキャリヤー材料に対する可逆的結合の場合、異なる細胞の所定の表面に対する結合-動力学の差を分離のために使用することができる。若干の材料は、それによって、直接使用することができるのに対し、他方、その他は、表面の官能化を必要とする。溶離は、対応するイオン濃度と対応する調節されたpH値とを有する緩衝剤によって達成される。個々の種は、この場合、キャリヤー材料に関して種々の保持挙動を示す。
【００２７】
本発明に従う方法は、液体からの細胞および/またはウイルスの単離に使用される。これらには、特に、水；液体食品；食品からの液体；体液；または、排泄物が挙げられる。さらなる使用は、細胞および/またはウイルスの個々の種の分離に関係する。
【００２８】
本発明に従う主題は、続く、図面および実施例を参考としてさらに詳細に説明することを意図するが、前記主題は、ここで示される実施体の範囲に限定されることを意図するものではない。
【実施例】
【００２９】
実施例1
(さらなる官能化なしに)5mm径および5mm高さを有する焼結ポリエチレン粉末製のシリンダー状に成形された物品の上に速度1ml/分で、1.6 106KbE/gの懸濁液を加える。溶出液内の細胞のカウントは、図1に示される値を生じた。
【００３０】
実施例2
5mm径および5mm高さを有する焼結ポリエチレン粉末製のシリンダー状に成形された物品の表面上を低圧プラズマで酸化し、続いて、アミノプロピルトリエトキシシランで変換させた。1.6 106 KbE/gの懸濁液を速度1ml/分でこれらの官能化された焼結体上に添加した。溶出液の細胞のカウントは、図2に示される値を生じた。
【００３１】
実施例3
5mm径および5mm高さを有する焼結ポリエチレン粉末製のシリンダー状に成形された物品の表面上を低圧プラズマで酸化し、続いて、アミノプロピルトリエトキシシランで変換させた。無水コハク酸との反応により、カルボキシル基をアミノ基に結合させる。1.6 106 KbE/gの懸濁液を速度1ml/分でこれらの官能化された焼結体上に添加した。バチラスサブチリス(Bacillus subtilis)、リステリアモノサイトジーンズ(Listeria monocytogenes)およびサルモネラエンテリチディス(Salmonella enteritidis)のグラム陽性細胞を溶出液中濃縮する。溶出液中の細胞のカウントは、図3に示される値を生ずる。
【００３２】
実施例4
共有結合されたポリエチレンイミンを有する表面上にポリプロピレン粉末を用意する。0.1g粉末をE．coli 1ml当り104細胞の懸濁液1ｌ中に分散させる。1時間後、先に分散させた全ての細胞を含む表面に結合した粉末を濾去する。粉末表面上に濃縮させた細胞を、さて、分子-生物学的分析に賦す(例えば、PCRにより)。
【００３３】
実施例5
50mm長さおよび5mm径の多孔質体を耐圧カートリッジにしっかりと固定し、スルーフローユニットに導入する。続いて、細菌試料を1つの端に塗布する(“エントリー端”)これは、続いて、水溶液を含むポリマー焼結体上に定めるが、そのイオン濃度およびpHは、変更しうる。細胞材料は、それによって、ポリマー焼結体と相互作用し、種々の方式で阻害する。その結果、種々の細菌の混合物は、分離され、適当な検知器(光散乱、UV、導電率、蛍光等)を有するポリマー焼結体の他方の端(“出口端”)で検知される。個々の細菌画分は、収集し、続く同定に従い同定することができ、免疫および分子-生物学的方法を特徴とする(例えば、PCR)。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図1は、本発明に従う方法をポリエチレン製の未処理キャリヤー材料で実行した液体培地中の細菌の特異なタイプの回収速度を示す線図を示す。
【図２】図2は、本発明に従う方法を化学的に官能化された(アミネートされた)キャリヤー材料で実行した液体培地中の回収速度を表す線図を示す。
【図３】図3は、本発明に従う方法を化学的に官能化(カルボキシル化)されたキャリヤー材料で実行した液体培地中の回収速度を表す線図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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