(57)【要約】  Ｔ−１２４９ペプチドおよびペプチド中間体の固相合成のための方法、特に優れた純度および収量を有する生成物を生じるために低負荷因子でＴ−１２４９ペプチド中間体を合成することを包含する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）式Ｚ−Ｅ−［ＳＵＰ］（式中、［ＳＵＰ］は支持体樹脂であり、Ｅはグルタミン酸残基であり、ＺはＮＨ２−末端保護基であり、Ｚ−Ｅは、０．５以下の負荷因子で［ＳＵＰ］上に存在する。）の固相合成支持体樹脂を提供する段階、
（ｂ）
【表１】
2008526699.tif 000034
を提供するため、アミノ酸をＺ−Ｅ−［ＳＵＰ］へ結合させる段階、
（ｃ）
【表２】
2008526699.tif 000035
の開裂生成物を提供するため、
【表３】
2008526699.tif 000036
を処理する段階、および
（ｄ）
【表４】
2008526699.tif 000037
の合成のために、
【表５】
2008526699.tif 000038
を使用する段階を含む、配列
【表６】
2008526699.tif 000039
を有するペプチドを調製する方法。
【請求項２】
段階（ａ）［ＳＵＰ］が、トリチル基を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
段階（ａ）、［ＳＵＰ］が、クロロ−トリチル基を含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
Ｚが、Ｆｍｏｃ基である、請求項１〜３記載の方法。
【請求項５】
段階（ａ）において、Ｚ−Ｅが、０．５未満の負荷因子で［ＳＵＰ］上に存在する、請求項１〜４記載の方法。
【請求項６】
段階（ａ）において、Ｚ−Ｅが、０．２〜０．５の負荷因子で［ＳＵＰ］上に存在する、請求項１〜５記載の方法。
【請求項７】
段階（ｂ）において、アミノ酸が、１〜１．５当量の量でＺ−Ｅ−［ＳＵＰ］へ結合する、請求項１記載の方法。
【請求項８】
段階（ｄ）において、配列
【表７】
2008526699.tif 000040
を有するペプチドを提供するため、
【表８】
2008526699.tif 000041
が、配列
【表９】
2008526699.tif 000042
を有するペプチドと反応する、請求項１記載の方法。
【請求項９】
【表１０】
2008526699.tif 000043
をフェニルアラニンアミドと反応させることによって、
【表１１】
2008526699.tif 000044
が形成される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）式Ｚ−Ｗ−［ＳＵＰ］（式中、［ＳＵＰ］が支持体樹脂であり、Ｗがトリプトファン残基であり、ＺがＮＨ２末端保護基であり、Ｚ−Ｗが０．５以下の負荷因子で［ＳＵＰ］上に存在する。）の固相合成支持体樹脂を提供する段階、
（ｂ）
【表１２】
2008526699.tif 000045
を提供するため、アミノ酸をＺ−Ｗ−［ＳＵＰ］へ結合させる段階、
（ｃ）
【表１３】
2008526699.tif 000046
の開裂生成物を提供するため、
【表１４】
2008526699.tif 000047
を処理する段階、および
（ｄ）
【表１５】
2008526699.tif 000048
の合成のために、
【表１６】
2008526699.tif 000049
を使用する段階を含む、配列
【表１７】
2008526699.tif 000050
を有するペプチドを調製する方法。
【請求項１１】
段階（ｄ）において、
【表１８】
2008526699.tif 000051
を形成するため、
【表１９】
2008526699.tif 000052
がフェニルアラニンアミドと反応する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
【表２０】
2008526699.tif 000053
を提供するため、
【表２１】
2008526699.tif 000054
が
【表２２】
2008526699.tif 000055
と反応する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）ペプチド中間体断片が、０．５以下の負荷因子を利用する固体支持体上で合成された、配列
【表２３】
2008526699.tif 000056
のペプチド中間体断片を提供する段階、
（ｂ）溶液相において、配列
【表２４】
2008526699.tif 000057
を提供するため、
【表２５】
2008526699.tif 000058
をフェニルアラニンアミド残基と反応させる段階、および
（ｃ）溶液相において、
【表２６】
2008526699.tif 000059
を提供するため、
【表２７】
2008526699.tif 000060
を
【表２８】
2008526699.tif 000061
と反応させる段階を含む、配列
【表２９】
2008526699.tif 000062
を有するペプチドを調製する方法。
【請求項１４】
段階（ａ）において、前記ペプチド中間体断片が、０．５未満の負荷因子を利用して固体支持体上で合成された、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
段階（ａ）において、前記ペプチド中間体断片が、０．２〜０．５の負荷因子を利用して固体支持体上で合成された、請求項１３または１４記載の方法。
【請求項１６】
段階（ｂ）において、前記ペプチド中間体断片が、１〜１．５当量の量で支持体と結合したアミノ酸を利用して固体支持体上で合成された、請求項１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相および液相工程を使用して、Ｔ−１２４９ペプチドを調製するための方法、ならびにこれらの方法において使用され得るＴ−１２４９の中間体ペプチド断片に関するものである。より特別には、本発明は、固相アプローチを使用して合成される２つの断片を使用する、Ｔ−１２４９ペプチドの調製に関するものである。
【０００２】
ペプチド合成についての多くの方法が、文献（例えば、米国特許第６，０１５，８８１号、 Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29:4005-4008、Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29:4009-4012、Kamber et al. (eds), Peptides, Chemistry and Biology, ESCOM, Leiden (1992) 525-526、Riniker et al. (1993) Tetrahedron Letters 49:9307-9320、Lloyd-Williams et al. (1993) Tetrahedron Letters 49:11065-11133、およびAndersson et al. (2000) Biopolymers 55:227-250参照）に記載される。合成のさまざまな方法は、合成が起こる相、すなわち液相または固相の物理的な状態によって区別される。
【０００３】
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）において、アミノ酸またはペプチド基は、固体支持体樹脂へ結合される。次に、連続的なアミノ酸またはペプチド基が、関心対象のペプチド材料が形成されるまで、支持体により結合されたペプチドへ付着される。次に、支持体により結合されるペプチドが典型的に、支持体から開裂され、さらなる工程および／または精製へ供される。いくつかの場合において、固相合成は、成熟ペプチド生成物を産じ、他の場合において、支持体から開裂したペプチド（すなわち、「ペプチド中間体断片」）が、より大きな成熟ペプチド生成物の調製に使用される。
【０００４】
固相工程から生じたペプチド中間体断片は、液相合成工程（本明細書で「溶液相合成」と呼ばれる。）において互いに結合され得る。溶液相合成は、固相による有用な成熟ペプチドの合成が不可能であるかまたは実用的でないかのいずれかの場合に特に有用であり得る。例えば、固相合成において、より長いペプチドが、不規則な高次構造を結果として採用し得る一方で、固体支持体へなおも付着され、したがって、最終生成物における活性の部分的なまたは完全な損失を生じる。また、ペプチド鎖が支持体樹脂上でより長くなるにつれ、結合および脱保護などの工程段階の効率は妥協され得る。このことは、順に、活性化可能なアミノ酸、共試薬、および溶媒などの出発材料における増大する損失に加えて、上述の問題を補償するために、より長い工程時間を生じ得る。これらの問題は、ペプチドの長さが増大するにつれ増大し得、それゆえ、固相手法のみを使用して合成される長さ３０超のアミノ酸の成熟ペプチドを見出すことは、比較的まれである。
【０００５】
溶液相結合において、２つのペプチド中間体断片、またはペプチド中間体断片および反応性アミノ酸は、適切な溶媒中で、および通常、結合反応の効率および質を促進させるさらなる試薬の存在下で結合される。ペプチド中間体断片は反応性に配置され、それによりある断片のＮ末端は、他の断片のＣ末端へ結合され、または逆もしかりである。さらに、固相合成中に存在する側鎖保護基は、断片の末端の特異的反応性を確実にするため、溶液相結合中に断片上で普遍的に保持される。これらの側鎖保護基は典型的には、成熟ペプチドが形成されるまで除去されない。
【０００６】
非常に大きなペプチドの合成について、複数の溶液相結合段階が、３または４またはそれより多くのペプチド中間体断片を使用して実施されることは珍しくない。複数のペプチド中間体断片が使用されるときに、溶液相反応における末端から末端への結合反応の一般的な概念が、一般的に理論上直接的であるが、実際には、これはまれな場合である。不純物およびペプチド収量などのさまざまな因子が、全長のペプチドの質および収量に有意な影響を及ぼし得る。それゆえ、ハイブリッドスキームを使用するペプチド合成は、しばしば挑戦的であり、多くの場合、実際の合成が実施されるまで、問題が合成スキームに内在することを予測することは困難である。
【０００７】
いくつかの場合、溶液相合成は、固相合成の後でペプチド中間体断片の純度を欠くことによって影響され得る。この点については、ペプチド中間体断片を精製段階へ供した後に、断片を溶液相工程において結合させることが必要であり得る。精製もやはり、ペプチド中間体断片の、したがって最終ペプチド生成物の収量における低下を生じ得る。
【０００８】
また、成熟ペプチドの収量は、成熟ペプチドを合成するのに必要とされる溶液相段階の数に反比例する。いくつかの場合、ペプチド中間体生成物を利用する３、４、または４を超える溶液相段階が、成熟ペプチドを生じるのに必要とされ得る。どのさらなる溶液相結合段階も、全長のペプチド生成物の回収の低下を生じ得る。それゆえ、全般的な収量を改善するため、結合に関与する段階を最小とすることが一般に望ましい。
【０００９】
合成スキーム全般での１つ以上の段階における適度の改善は、成熟ペプチドの調製における有意な改善となり得る。このような改善は、時間および試薬の大きな全体的節約に至り得、最終生成物の純度および収量も有意に改善し得る。
【００１０】
ハイブリッド合成における改善の重要性の論議が、これらの手順を使用して生じるペプチドのいずれかの種類へ適用可能である一方、それは、治療上有用であり、商業的な医学的使用のためのスケールで製造されるペプチドに関して特に重要である。小分子医薬品の合成が比較的安価となり得る一方、治療用ペプチドなどのより大きな生体分子医薬品の合成の経費は、比較の上で莫大に高くなり得る。これらのより大きな生体分子医薬品の合成工程における非常にわずかな改善でも、他の因子に加えて、試薬の経費、合成時間のため、このような医薬品を製造するのにさらに経済的に実行可能であるかどうかに及ぼす有意な衝撃を有し得る。このような改善は、多くの場合、より大きな生体分子医薬品のこれらのタイプの適切な治療上の選択肢がたとえあったとしても、ほとんどないという事実によって支持されるように、より大きな生体分子医薬品についてのこれらの高い製造経費により、必要である。
【００１１】
このことは、レトロウィルス感染によって生じる免疫不全疾病の処置のために使用される治療用ペプチドの場合において明確に見られる。抗レトロウィルス活性を有するペプチドは、異なる方法で作用し得、ウィルス粒子とホスト免疫細胞との融合を防止することによることを含む。多くの場合、伝統的に使用される抗ウィルスが、突然変異によるウィルス耐性のため、これらの疾病の処置に効果的ではなくなるため、これらの新規かつ効果的な治療用ペプチドについての需要は大きい。
【００１２】
免疫不全疾病と戦うのに有用な治療用ペプチドのある見込みのあるクラスは、融合阻害剤である。治療用ペプチドのこれらのタイプは、ウィルス力価を低下し、そして免疫不全疾病を有する患者における生活の質を有意に改善し得る。例えば、合成された３６個のアミノ酸のペプチドのハイブリッドペプチドＴ−１２４９である（エンフビルチドまたはＴ−２０としても公知の）ＦＵＺＥＯＮ（登録商標）ペプチド、ならびにこれらのペプチドの誘導体および対応物は、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の処置における融合阻害剤として有益であることが証明されている。ＦＵＺＥＯＮ（登録商標）ペプチドおよびその誘導体は、ＨＩＶに感染した人間における首尾一貫した強力な活性を示すＨＩＶの第一阻害剤である（Kilby et al. (1998) Nat Med 4:1302およびKilby et al. (2002) AIDS Res Hum Retroviruses 18:685）。
【００１３】
Ｔ−２０ペプチドおよびＴ−１２４９ペプチドなどの融合阻害剤は、ウィルスとＣＤ４＋ホスト細胞の膜との融合に関与するＨＩＶ１型（ＨＩＶ−１）の糖タンパク質４１エンベロープの領域へ結合する（Wild et al. (1993) AIDS Res. Hum. Retroviruses 9:1051）。融合阻害剤は、細胞の外側に留まり、ＨＩＶ−１が細胞へ入る前にＨＩＶ−１を遮断する。ＦＵＺＥＯＮ（登録商標）ペプチドおよびその誘導体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＩＶ−１を強力にかつ選択的に阻害することによって、薬物の相互作用、副作用、および細胞毒性を最小とする。
【００１４】
これらの関心に加え、ペプチドの大規模生産についての生成物回収および生成物純度に関する問題は、試薬の取り扱い、保存、および廃棄と同様、ペプチド合成スキームの実行可能性に大きく影響を与え得る。したがって、改善された収量の大きなバッチ量における商業的な関心対象のペプチド材料を効率よく生産できるペプチド合成工程については絶え間ない需要がある。ペプチドの固相合成後の支持樹脂からの開裂したペプチドの回収は、改善が必要とされる合成のある局面である。
【００１５】
本発明は、固相および溶液相（「ハイブリッド」）アプローチを使用して合成されるＴ−１２４９ペプチドの調製に関するものである。一般に、アプローチは、固相化学物質を使用して、２つの異なるＴ−１２４９ペプチドの中間体断片（配列番号２および配列番号３、またはそれらの対応物）を合成することを含む。いくつかの本発明の局面によれば、固相合成の後、これらの特異的Ｔ−１２４９の中間体配列は、それ自体溶液相結合段階に特によく役立つことがわかってきた。さらに、これらの中間体断片の形成に至る固相段階が、これらの中間体断片の収量および純度を有意に改善するために本発明により改変され得ることもわかってきた。この改善された収量および純度は、溶液相結合段階へと持ち越され、それにより合成工程全体を改善する。
【００１６】
本発明の方法および本明細書に記載のペプチド中間体断片は、特に多くの方法でＴ−１２４９合成工程をより効率的にするため、特に有利である。特に、Ｔ−１２４９ペプチドの中間体生成物である配列番号２または配列番号３の形成に至る固相合成段階は、標準的な固相技術において伝統的に使用されるものよりも低い負荷因子で支持体へ第一アミノ酸が結合された支持体樹脂を利用する。好ましくは、このより低い負荷因子を使用すれば、典型的には長い固相により合成された断片である配列番号２または配列番号３のＴ−１２４９ペプチドの中間体生成物が、改善された収量および改善された純度で製造されうることがわかってきた。
【００１７】
改善された純度および収量は、溶液相結合段階についての条件を有意に改善し、それによりＴ−１２４９の全般的な合成についての改善を生じる。
【００１８】
これまで、最も成功したＴ−１２４９合成のアプローチは、溶液相結合を利用してきており、その中では、３つ以上のペプチド中間体断片が固相合成により調製される。次に、これらの中間体断片が、溶液相結合反応において使用され、最終的なＴ−１２４９成熟生成物を調製する。３つ（またはそれより多く）の断片アプローチに関するいくつかの利点が、中間体の固相合成のより高い質に関して一般に見られ得るが、このことは、いくつかのＴ−１２４９断片を使用する場合では必ずしもではない。特に、良好な純度での残基２７〜３８からなるＴ−１２４９ペプチド中間体断片、および残基１３〜２６からなるＴ−１２４９ペプチド中間体断片を合成することは困難であってきた。また、中間体断片と関連した不純物が、単離のための特定の溶媒を使用する３つの断片アプローチにおいて潜在的に存在する。
【００１９】
別のマイナス面は、３つ（またはそれより多く）の断片アプローチが、２断片アプローチと比較してより多くの単離段階および精製段階を包含し、これらの更なる段階が処理時間を一般に増大させ、合成反応の全般的な収量をその後低下し得ることである。
【００２０】
本発明は固相合成を介して調製されるたった２つのペプチド中間体断片を利用するため、ある明確な利点は、処理時間が短縮され、処理段階の排除が材料および試薬のより効率的な使用を生じ得ることである。このことは、ペプチド中間体断片が、固相合成における高価な試薬である５つのトリプトファン（Ｗ）残基を含む比較的長いペプチドであるため、Ｔ−１２４９の合成において特に重要である。
【００２１】
しかしながら、２断片アプローチによる潜在的な欠点は、固相合成によるより長い中間体断片の合成が複雑となり得、しばしば深刻な純度および／または回収問題に至り得ることである。これにもかかわらず、上述のように、本発明は、配列番号２または配列番号３に基づいた配列を有する中間体ペプチド断片を選択した後、低い樹脂負荷因子を使用する固相合成によりこれらの断片を合成する方法によって、中間体断片を良好な収量および純度でうまく生じさせることを示す。このような達成は、固相および溶液相の組み合わせたアプローチを使用してペプチドを合成する従来のアプローチの点を考慮すれば、かなり注目すべきである。
【００２２】
本発明は、ペプチドの純度の他の局面が改善されることにおいても有利である。特に、配列番号２または配列番号３に記載の配列を有する中間体ペプチド断片は、Ｎ末端グルタミン酸（Ｅ）残基を含まない。各々の中間体断片がグルタミン酸残基を含む限り、各々の残基は、中間体断片の配列内またはＣ末端に位置する。Ｎ末端にグルタミン酸を有する断片はより多くのピログルタミン酸不純物を含む傾向があるけれども、（配列番号２および配列番号３などの）アミノ酸のこれらの一般的な配列配置を有する断片を使用すれば、中間体断片の純度が有意に高くあり得ることがわかってきた。
【００２３】
それゆえ、いくつかの局面において、本発明は、（ａ）グルタミン酸（Ｅ）である残基へ第一アミノ酸を結合させた固相合成支持体樹脂を提供する段階であって、ここでグルタミン酸は０．５以下の負荷因子で結合され、好ましくはグルタミン酸が０．２〜０．５の負荷因子で結合される段階、（ｂ）以下の配列
【００２４】
【表３０】
2008526699.tif 000002
【００２５】
を提供するよう、結合された支持体上の第一アミノ酸へその次のアミノ酸を結合させる段階、（ｃ）開裂反応において、支持体から
【００２６】
【表３１】
2008526699.tif 000003
【００２７】
のペプチド中間体を除去する段階、および次に、
【００２８】
【表３２】
2008526699.tif 000004
【００２９】
の全部または一部を有するペプチドの合成のために
【００３０】
【表３３】
2008526699.tif 000005
【００３１】
のペプチド中間体を使用する段階を含む、Ｔ−１２４９ペプチドの合成についてのペプチド中間体断片を調製するための方法を提供する。
【００３２】
他の局面において、本発明は、（ａ）トリプトファン（Ｗ）である残基へ第一アミノ酸を結合させた固相合成支持体樹脂を提供する段階であって、ここで、トリプトファンは０．５以下の負荷因子で結合され、好ましくはトリプトファンが０．２〜０．５の負荷因子で結合される段階、（ｂ）以下の配列
【００３３】
【表３４】
2008526699.tif 000006
【００３４】
を提供するため、その次のアミノ酸を第一アミノ酸へ、結合された支持体上で結合させる段階、（ｃ）開裂反応において支持体から
【００３５】
【表３５】
2008526699.tif 000007
【００３６】
のペプチド中間体を除去する段階、および次に、
【００３７】
【表３６】
2008526699.tif 000008
【００３８】
の全部または一部を有するペプチドの合成についての
【００３９】
【表３７】
2008526699.tif 000009
【００４０】
のペプチド中間体を使用する段階を含む、Ｔ−１２４９ペプチドの合成についてのペプチド中間体断片を調製するための方法を提供する。
【００４１】
最も好ましくは、本発明は、（ａ）配列
【００４２】
【表３８】
2008526699.tif 000010
【００４３】
を有するペプチド中間体断片であって、０．５以下の負荷因子を使用して、好ましくは０．２〜０．５の負荷因子を使用して固体支持体上で合成されたペプチド中間体断片を提供する段階、（ｂ）溶液相において、
【００４４】
【表３９】
2008526699.tif 000011
【００４５】
のペプチドをフェニルアラニンアミド残基と反応させ、配列
【００４６】
【表４０】
2008526699.tif 000012
【００４７】
を提供する段階、および（ｃ）溶液相において、
【００４８】
【表４１】
2008526699.tif 000013
【００４９】
のペプチドを
【００５０】
【表４２】
2008526699.tif 000014
【００５１】
のペプチドと反応させ、
【００５２】
【表４３】
2008526699.tif 000015
【００５３】
のペプチドを提供する段階を含む、Ｔ−１２４９ペプチドを調製するための方法を提供する。
【００５４】
他の局面では、結合段階において、第一アミノ酸は、０．５未満の負荷因子で支持体上に存在する。他の局面では、結合段階において、第一アミノ酸は、０．２〜０．４５の範囲の負荷因子、または０．２５〜０．４０の範囲の負荷因子で支持体上に存在する。
【００５５】
さらに他の局面において、固相合成は、１〜１．５当量の量で、アミノ酸を新生ペプチド鎖へ結合させることによって実施される。
【００５６】
後述の本発明の態様は、以下の詳細な記述において開示される精確な形態へ徹底的であるようにまたは本発明を制限するよう企図されるものではない。むしろ、態様は、当業者が、本発明の原理および実際を正しく認識し理解し得るよう、選択され記載される。
【００５７】
本明細書で使用される専門用語は、本発明の範囲を制限するよう企図されるものではない。上述の請求項を含む本文を通じて、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別段に脈絡が明確に記載されない限り、複数の参照を含む。したがって、例えば、「アミノ酸残基」に対する参照は、1つ以上のアミノ酸残基に対する参照であり、当業者に公知のその均等物を含む。本発明において、特定の用語が頻繁に使用され、その意味が本明細書に提供される。別段の定義がなければ、本明細書で使用される用語は、当業者に対して普遍的に理解されるのと同様の意味を有する。いくつかの用語は、明細書において後により詳細に説明され得る。
【００５８】
本発明は、Ｔ−１２４９およびＴ−１２４９対応物の合成を改善するための、特にＴ−１２４９ペプチド中間体断片の固相合成に関する合成の局面を改善するための方法を示す。本発明の方法論は、たった２つの固相合成されたペプチド断片を使用して、Ｔ−１２４９およびその対応物を作るために有用である。本発明は、一般にＴ−１２４９合成において示すが、本明細書の本発明の教示は、他のペプチドの合成、特に固相および溶液相アプローチの組み合わせを使用して合成されるものへも適用可能である。本発明は、不純物、特にピログルタミン酸塩不純物と関連したペプチド中間体断片の合成へも適用可能である。
【００５９】
本明細書に記載の方法は、Ｔ−１２４９ペプチドのスケールアップした合成の局面を改善するのに特に適している。スケールアップした手順は、流通に有用なペプチド量を提供するように典型的に実施される。例えば、スケールアップした手順におけるペプチドの量は、バッチあたり５００ｇ、または１ｋｇまたはそれより多くであり得、より典型的にはバッチあたり数十〜数百ｋｇまたはそれより多くであり得る。大規模合成などのスケールアップした合成手順では、１つ以上の大きな反応容器が使用され得る。これらは、合成工程におけるさまざまな段階についての樹脂、溶媒、アミノ酸、および化学物質などの試薬の量を収容でき、例えば１００〜５００ｋｇ以上の範囲量のペプチドの生産が可能である大きさである。
【００６０】
本明細書に記載の方法は、特にスケールアップした手順についてのペプチド合成の局面を改善するのに特に適している。好ましい態様において、本発明の方法は、処理（合成）時間における短縮、生成物の収量における改善、生成物の純度における改善、および必要とされる試薬および出発材料の量の削減などの改善を提供できる。
【００６１】
Ｔ−１２４９ペプチドは、（（カルボキシ末端に対応する）アミド末端への（アミノ末端に対応する）アセチル末端から読み取る）３９個のアミノ酸の配列を有する。
【００６２】
【表４４】
2008526699.tif 000016
【００６３】
Ｔ−１２４９ペプチドの代表的なペプチド断片としては、これらの対応物と同様に、以下の表１に記載されるようなアミノ酸配列を有するものを含むがそれらに制限されない。例えば、表では、Ｆである３９番目の位置にあるアミノ酸は、主な代謝産物の場合のようにカルボン酸末端を有し得るか、またはＴ−１２４９ペプチド自体の場合におけるアミドとして改変され得る。
【００６４】
Ｔ−１２４９は、ＨＩＶ−１感染の処置に使用される抗レトロウィルス薬である。Ｔ−１２４９は、膜融合に必要とされる高次構造の変化を遮断することによって、ＨＩＶ−１ウィルス粒子とホスト細胞との融合を遮断するよう機能する。このタイプの活性を有するペプチドを、Ｔ−１２４９活性を有すると本明細書でいう。
【００６５】
Ｔ−１２４９は典型的には、Ｔ１２４９生成物を生じるための特異的なペプチド断片の群を合成し、組み合わせるための固相手順および液相手順の両者を利用する。Ｔ−１２４９ペプチドならびにＴ−１２４９ペプチドおよびその断片を作る方法は、その全体において参照により本明細書に組み入れられる米国特許第６，４６９，１３６号に記載されている。
【００６６】
本発明は、全長のＴ−１２４９対応物およびＴ−１２４９ペプチド中間体対応物を含めて、Ｔ−１２４９対応物の合成へも適用可能である。本明細書で使用されるように、「Ｔ−１２４９対応物」は、Ｔ−１２４９またはＴ−１２４９中間体断片から派生した化合物を指す。ペプチド対応物には、ペプチドアナログ、ペプチド誘導体、融合化合物、およびそれらの類似物を含むが、それらに限定されない。それゆえ、配列番号２および配列番号３の配列を有するＴ−１２４９ペプチド中間体断片を指すとき、それらの対応物はそれぞれ、例えば配列番号２および配列番号３のペプチドアナログ、ペプチド誘導体、融合化合物を含む。
【００６７】
本明細書に使用されるように、ペプチドアナログとは一般に、別のペプチドまたはペプチド対応物に関連する１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、反転、および／または付加などによって改変されたアミノ酸配列を有するペプチドを指す。置換は、好ましくは保存され得るかまたは高度に保存され得る。保存的な置換とは、一般に同一の正味の電荷および一般に同一の大きさおよび形状を有する別のアミノ酸とのアミノ酸の置換を指す。例えば、脂肪族または置換された脂肪族アミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、それらの鎖における炭素およびヘテロ原子の総数が約４以下までで異なるとき、ほぼ同一の大きさを有する。前記アミノ酸は、それらの側鎖における分岐数が、約１または２以下までで異なるとき、ほぼ同一の形状を有する。側鎖にフェニル基または置換されたフェニル基を有するアミノ酸は、ほぼ同一の大きさおよび形状を有すると考えられる。以下に列挙されるのは、アミノ酸の５つの群である。化合物中のアミノ酸を同一群からの別のアミノ酸と置換すると、一般に保存的な置換が生じる。
【００６８】
Ｉ群：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、およびＣ１〜Ｃ４脂肪族側鎖またはＣ１〜Ｃ４ヒドリキシルにより置換された脂肪族側鎖（直鎖または単一分岐した（ｍｏｎｏｂｒａｎｃｈｅｄ））を有する天然には生じないアミノ酸。
【００６９】
ＩＩ群：グルタミン酸、アスパラギン酸、およびカルボン酸により置換されるＣ１〜Ｃ４脂肪族側鎖（非分岐または一分岐点）を有する天然には生じないアミノ酸。
【００７０】
ＩＩＩ群：リジン、オルニチン、アルギニン、およびアミンまたはグアニジノにより置換されるＣ１〜Ｃ４脂肪族側鎖（非分岐または一分岐点）を有する天然には生じないアミノ酸。
【００７１】
ＩＶ群：グルタミン、アスパラギン、およびアミドにより置換されるＣ１〜Ｃ４脂肪族側鎖（非分岐または一分岐点）を有する天然には生じないアミノ酸。
【００７２】
Ｖ群：フェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシン、およびトリプトファン。
【００７３】
「高度に保存的な置換」とは、側鎖に同一の官能基を有し、ほぼ同一の大きさおよび形状を有する別のアミノ酸とのアミノ酸の置換である。脂肪族または置換された脂肪族アミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、それらの側鎖に炭素およびヘテロ原子の総数が２以下までで異なるとき、ほぼ同一の大きさを有する。前記アミノ酸は、それらが側鎖に同一の分岐数を有するとき、ほぼ同一の形状を有する。高度に保存的な置換の例としては、ロイシンについてのバリン、セリンについてのスレオニン、グルタミン酸についてのアスパラギン酸、およびフェニルアラニンについてのフェニルグリシンがある。
【００７４】
ペプチド誘導体とは一般に、その側鎖基、アルファ炭素原子、末端アミノ基、および／または末端カルボン酸基のうちの１つ以上の化学的改変を有するペプチド、ペプチドアナログ、または他のペプチド対応物を指す。例証として、化学的改変とは、化学的部分を付加すること、新たな結合を作ること、および／または化学的部分を除去することを含むが、それらに限定されない。アミノ酸側鎖基での改変としては、リジンｅ−アミノ基のアシル化、アルギニン、ヒスチジン、またはリジンのＮ−アルキル化、グルタミン酸基またはアスパラギン酸カルボン酸基のアルキル化、およびグルタミンまたはアスパラギンの脱アミノ化を含むが、それらに限定されない。末端アミノ基の改変としては、脱アミノ、Ｎ−低級アルキル、Ｎ−ジ−低級アルキル、およびＮ−アシル（例えば、−ＣＯ−低級アルキル）改変を含むが、それらに限定されない。末端カルボキシ基の改変としては、アミド、低級アルキルアミド、ジアルキルアミド、および低級アルキルエステルの改変を含むが、それらに限定されない。したがって、部分的または全体的に保護されるペプチドは、ペプチド誘導体を構成する。
【００７５】
参照は、ペプチドの次のセットに対してなされ、表１に記載されるＴ−１２４９およびＴ−１２４９中間体断片を含む。
【００７６】
【表４５】
2008526699.tif 000017
【００７７】
概観を提供するため、本発明の方法に基づき、Ｔ−１２４９ペプチドについての全般的な合成スキームを、次に示す。Ｔ−１２４９（配列番号１）は、Ｔ−１２４９のペプチド中間体断片
【００７８】
【表４６】
2008526699.tif 000018
【００７９】
の固相合成を含む段階によって調製される。これらのペプチドは、本明細書に記載の方法を使用して合成された後、側鎖により保護された形態において固相樹脂から開裂される。次に、フェニルアラニンアミド残基が、溶液中で
【００８０】
【表４７】
2008526699.tif 000019
【００８１】
のペプチド中間体へ結合され、
【００８２】
【表４８】
2008526699.tif 000020
【００８３】
を生じる。次に、
【００８４】
【表４９】
2008526699.tif 000021
【００８５】
は、溶液中で
【００８６】
【表５０】
2008526699.tif 000022
【００８７】
へ結合され、
【００８８】
【表５１】
2008526699.tif 000023
【００８９】
を生じる。
【００９０】
本発明によれば、固相合成技術は、
【００９１】
【表５２】
2008526699.tif 000024
【００９２】
の２０個のアミノ酸の配列またはその対応物を有するＴ−１２４９の第一ペプチド断片（中間体断片１）を調製するのに使用される。固相合成の好ましい方法に関する参照として、ペプチドのＣ末端部分に存在するアミノ末端グルタミン酸（Ｅ）残基（すなわち、配列番号２の２０番残基）が固相樹脂へ結合される第一アミノ酸残基であり、こうして固体支持体樹脂に関する位置では断片のアルファアミノ酸を構成する。それゆえ、この好ましい方法では、固相合成は、アミノ末端からカルボキシル末端へとアミノ酸残基を連続して付加することによって進行し、望ましい配列に対応する方法でアミノ酸を連続的に付加する。ペプチド中間体断片の合成は、Ｎ末端残基（例えば、配列番号２のＮ末端トリプトファン（W））が新生ペプチド鎖へ付加された後に完了する。
【００９３】
固相合成技術は、
【００９４】
【表５３】
2008526699.tif 000025
【００９５】
の１８個のアミノ酸の配列またはその対応物を有するＴ−１２４９の第二ペプチド断片（中間体断片２）を調製するのにも使用される。固相合成の好ましい方法に関する参照として、アミノ末端トリプトファン（Ｗ）残基（すなわち、配列番号３の１８番目の残基）が、固相樹脂へ結合される第一アミノ酸残基であり、こうして固体支持体樹脂に関する位置では断片のアルファアミノ酸を構成する。この好ましい方法では、固相合成は、アミノ末端からカルボキシル末端へとアミノ酸残基を連続して付加することによっても進行し、望ましい配列に対応する方法でアミノ酸を連続的に付加する。ペプチド中間体断片の合成は、Ｎ末端残基（例えば、配列番号３のＮ末端リジン（Ｋ））が、新生ペプチド鎖へ付加された後に完了する。
【００９６】
有利なことに、中間体断片１も中間体断片２も、Ｎ末端グルタミン酸（Ｅ）残基を含まない。各々の中間体断片がグルタミン酸残基を含む限り、各々の残基は、中間体断片の配列内にまたはＣ末端に位置する。アミノ酸のこれらの一般的な配列配置を有する断片を使用すれば、Ｎ末端にグルタミン酸を有する断片が、より多くのピログルタミン酸不純物を含む傾向にあるとはいえ、中間体断片の純度が有意により高くあり得るということがわかった。
【００９７】
中間体断片１および２はそれぞれ、少なくとも１８個のアミノ酸の残基を含むということも注目される。これらは、固相合成に関してはかなり大きなペプチド断片であるが、本発明の原理によって、このような大きな断片および結果として生じるＴ−１２４９を高い収量および高い純度で合成できる。
【００９８】
本発明によれば、固相樹脂上で合成されるペプチドの相対的な量を適切に調節することによって、有利な効果が、ペプチド中間体断片の収量および純度に関して得ることができると発見された。合成されるペプチドの相対的な量は負荷因子によって調節され得、これはある量の樹脂へ結合されるアルファアミノ酸の量を指し、典型的には固相樹脂の１ｇあたりのアルファアミノ酸のミリモルとして表される。例えば、０．２５の負荷因子は、固相樹脂１００ｇへ実際に結合されるアルファアミノ酸の２５ｍｍｏｌに相当するであろう。第一アミノ酸を固相樹脂へ結合する反応は、完全に効率的でなくともよく、それゆえ、結合される実際の量は、出発試薬の１００％結合効率および量に基づいた理論上の量よりも少なくてよい。結合される材料の実際の量は、反応が生じた後で決定され得る。実際の結合を決定するため、ペプチドを樹脂から開裂し、例えば標準物質に対するＨＰＬＣ分析を使用することによってアッセイすることができる。結合される第一アミノ酸残基の実際の量を決定するための方法は、本明細書に記載される。
【００９９】
本発明によれば、（ペプチド中間体断片の配列番号２および配列番号３の配列などの）相対的に長いペプチド断片の収量および純度、それゆえ結果として生じるＴ−１２４９ペプチドの収量および純度は、０．５以下などの比較的低い負荷因子でより高い傾向にある。しかしながら、負荷因子が例えば０．２未満である場合、生成物処理量は抑えられ得る。これらの関係を平衡化するため、断片１および２のうちの少なくとも１つ、好ましくは断片１および２の両者に関する負荷因子は、約０．２〜約０．５０であり、好ましくは約０．２〜約０．４５の範囲にあり、より好ましくは約０．２〜約０．４０の範囲にある。例えば、ある代表的な実施態様では、約０．３４の負荷因子を使用することが適切であろう。
【０１００】
この局面を説明するため、以下の固相手順を実施してもよい。適切な樹脂を得、適切な溶媒中で洗浄することによって調製する。次に、活性化可能な保護された形態にある第一アミノ酸を含有する溶液を、洗浄した樹脂へ添加する。望ましい範囲内での負荷因子を達成するため、アミノ酸の量および／または濃度、および／またはＨＯＢＴなどの共試薬の存在および濃度、結合反応の時間、結合反応の温度などの他の反応因子を選択し得る。
【０１０１】
Ｆｍｏｃ化学を使用する固相合成を使用して、樹脂へ連結される（配列番号２および配列番号３を含むペプチド中間体断片などの）Ｔ−１２４９中間体断片を調製することができる。ペプチド中間体断片を樹脂上に合成した後、開裂試薬を使用して開裂し、保護された形態での溶液中のペプチド中間体断片を生じる。次に、ペプチド中間体断片を樹脂から分離する。いくつかの場合では、ペプチド中間体断片を、溶液相結合を実施する前に、ペプチド中間体断片を精製するための方法として、沈殿剤と接触する。
【０１０２】
固相アプローチを使用してペプチドを合成するための方法は、当技術分野において周知である。したがって、本発明は、Ｔ−１２４９最終生成物の調製において使用され得るペプチド中間体断片を調製するための低い負荷因子を使用するいずれかの固相合成アプローチを使用することを熟慮する。
【０１０３】
例えば、本明細書に記載のＴ−１２４９ペプチド中間体断片は、標準的なＦｍｏｃプロトコールを使用するＳＳＰＳ技術によって合成され得る。Ｆｍｏｃプロトコールは、例えば、Carpin et al. (1970), J. Am. Chem. Soc. 92(19):5748-5749; Carpin et al. (1972), J. Org. Chem. 37(22) :3404-3409, 「Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis」, Weng C. Chan and Peter D. White Eds. (2000) Oxford University Press Oxford Engに記載されている。
【０１０４】
固相ペプチド合成の実際では任意のタイプの支持体を使用することができる。好ましい態様において、支持体は、１つ以上のポリマー、コポリマー、またはポリアミド、ポリスルファミド、置換されたポリエチレン、ポリエチレングリコール、フェノール樹脂、多糖類、またはポリスチレンなどのポリマーの組み合わせから作られ得る樹脂を含む。ポリマー支持体は、ペプチド合成において使用される溶媒に対して十分に不溶性であり不活性であるいずれかの固体でもあり得る。固体支持体は、典型的には成長するペプチドが合成の間では結合され、支持体からペプチドを放出するのに望ましい条件下では開裂され得る連結部分を含む。適切な固体支持体は、光開裂可能な、ＴＦＡ開裂可能な、ＨＦ開裂可能な、フッ素イオン開裂可能な、還元的に開裂可能な、Ｐｄ（Ｏ）開裂可能な、求核性開裂可能な、またはラジカル性開裂可能なリンカーを有し得る。好ましい連結部分は、開裂したペプチドがなおも実質的に包括的に保護されるような条件下で開裂できる。
【０１０５】
合成のある好ましい方法において、ペプチド中間体断片は、トリチル基を含む酸感受性固体支持体上で、より好ましくは、張り出した塩素基を有するトリチル基を含む樹脂、例えば塩化２−クロロトリチル（２−ＣＴＣ）樹脂上で合成される（Barlos et al. (1989) Tetrahedron Letters 30(30):3943-3946）。例えば、塩化トリチル樹脂、塩化４−メチルトリチル樹脂、塩化４−メトキシトリチル樹脂、４−アミノブタン−１−オール２−クロロトリチル樹脂、４−アミノメチルベンゾイル２−クロロトリチル樹脂、３−アミノプロパン−１−オール２-クロロトリチル樹脂、ブロモ酢酸２−クロロトリチル樹脂、シアノ酢酸２−クロロトリチル樹脂、４−シアノ安息香酸２−クロロトリチル樹脂、グリシノール２−クロロトリチル樹脂、プロピオン酸２−クロロトリチル樹脂、エチレングリコール２−クロロトリチル樹脂、Ｎ−Ｆｍｏｃヒドロキシルアミン２−クロロトリチル樹脂、ヒドラジン２−クロロトリチル樹脂も含む。いくつかの好ましい固体支持体は、反応基を固定（anchor）する支持体材料を形成するためにジビニルベンゼンと共重合され得るポリスチレンを含む。
【０１０６】
ペプチド材料は典型的に、ビーズ表面およびビーズ内部内の両者で樹脂ビーズへ付着される。Ｆｍｏｃおよび側鎖により保護されるペプチドは、ＤＣＭまたは酢酸中の希釈したＴＦＡなどの弱酸性試薬を使用してこの樹脂から保護された状態において簡単に開裂される。
【０１０７】
固相合成において使用される他の樹脂は、スチレンおよびジビニルベンゼンと、４−ヒドロキシメチルフェニルオキシメチル固定基（Wang, S.S. 1973, J. Am. Chem. Soc）および４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸樹脂（Richter et al. (1994), Tetrahedron Letters 35(27):4705-4706）との共重合体を含む「Ｗａｎｇ」樹脂を含む。Ｗａｎｇ、塩化２−クロロトリチル、および４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸樹脂は、例えばCalbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, Californiaから購入され得る。
【０１０８】
第一の結合されたアミノ酸を有する支持体を提供するため、樹脂は、例えば洗浄によって調製され得、次に、活性化された保護されたアミノ酸を含有する溶液とともにインキュベーションされ得る。樹脂へ結合される第一アミノ酸およびその次のアミノ酸は、典型的にはＮ末端保護基、（特定のアミノ酸に依存する）側鎖保護基、および樹脂から張り出した基と反応性のある基または張り出したアミノ酸と反応性のある基を含む。
【０１０９】
好ましい局面において、第一アミノ酸は、カルボキシ末端で支持体へ付着されるのに対し、Ｎ末端基および側鎖基は、保護基によって適切に保護される。典型的な記載として、
【０１１０】
【表５４】
2008526699.tif 000026
【０１１１】
のペプチド中間体断片の固相合成は、保護されたグルタミン酸残基を塩化２−クロロトリチル（２−ＣＴＣ）樹脂へまず負荷することによって、カルボキシ末端からＮＨ２−末端の方向へ運搬される。
【０１１２】
保護基の性質および使用は、当技術分野において周知である。一般に、適切な保護基は、付着される原子または部分、例えば酸素または窒素が、処理および合成中に望ましくない反応で関与することを防止するのを助け得る基のいずれかの種類である。保護基は、側鎖保護基およびアミノ−またはＮ−末端保護基を含む。保護基は、カルボン酸、チオール、およびそれらの類似物の反応または結合も防止し得る。
【０１１３】
側鎖保護基とは、ペプチド合成、処理等の段階において使用される化学物質との反応から側鎖の一部を防止するのを助けるアミノ酸の側鎖（すなわち、一般的なアミノ酸式Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｒ）（Ｈ）−ＣＯＯＨ）へ結合される化学的な部分を指す。側鎖保護基の選択は、さまざまな因子、例えば実施される合成のタイプ、ペプチドが供されるであろう処理、および望ましい中間体生成物または最終生成物に依存し得る。側鎖保護基の性質は、アミノ酸自体の性質にも依存する。一般に、固相合成中にα−アミノ酸基の脱保護中に除去されない側鎖保護基が選択される。それゆえ、α−アミノ保護基および側鎖保護基は、典型的には同一ではない。
【０１１４】
いくつかの場合において、固相合成および他のペプチド処理において使用される試薬のタイプに依存して、アミノ酸は、側鎖保護基の存在を必要としないかもしれない。このようなアミノ酸は典型的には、側鎖に活性酸素、窒素、または他の反応性部分を含まない。
【０１１５】
側鎖保護基の例は、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ｔｅｒｔ−ブチル、トリフェニルメチル（トリチル）、テトラヒドロピラニル、ベンジルエーテル（Ｂｚｌ）および２，６−ジクロロベンジル（ＤＣＢ）、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、ニトロ、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、アダマンチルオキシカルボニル、キサンチル（Ｘａｎ）、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、メチル、エチルおよびｔ−ブチルエステル、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｚ）、Ｔｏｓ、ｔ−アミルオキシカルボニル（Ａｏｃ）、および芳香族または脂肪族ウレタン型保護基、ニトロベリトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）などの光解離性基、およびトリメチルシリルオキシカルボニル（ＴＥＯＣ）などのフッ化物不安定基を含む。
【０１１６】
好ましい側鎖保護基は、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、およびＡｓｐ（Ｄ）アミノ酸残基についてのｔ−Ｂｕ基、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、およびＡｓｎ（Ｎ）アミノ酸残基についてのトリチル（ｔｒｔ）基、およびＬｙｓ（Ｋ）およびＴｒｐ（Ｗ）アミノ酸残基についてのＢｏｃ基を含む。
【０１１７】
例えば、表１に列挙されるペプチド断片のアミノ酸残基の側鎖のいずれかの１つ以上は、ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、トリチル（ｔｒｔ）、およびｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）などの標準的な保護基で保護され得る。ｔ−Ｂｕ基は、アミノ酸残基Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、およびＡｓｐ（Ｄ）についての好ましい側鎖保護基であり、ｔｒｔ基は、アミノ酸残基Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、およびＡｓｎ（Ｎ）についての好ましい側鎖保護基であり、Ｂｏｃ基は、アミノ酸残基Ｌｙｓ（Ｋ）およびＴｒｐ（Ｗ）についての好ましい側鎖保護基である。
【０１１８】
好ましくは、本発明の各ペプチド断片のアスパラギン残基を、すべて保護する。さらに、トリプトファン残基がＢｏｃ基で保護されることが好ましい。
【０１１９】
アミノ末端保護基は、アミノ酸のアルファアミノ基へ結合された化学部分を含む。典型的には、アミノ末端保護基は、付加されるべき次のアミノ酸の成長しているペプチド鎖への付加の前の脱保護反応において除去されるが、ペプチドが支持体から開裂される際には、維持され得る。アミノ末端保護基の選択は、さまざまな因子、例えば実施される合成のタイプおよび望ましい中間生成物または最終生成物に依存し得る。
【０１２０】
アミノ末端保護基の例は、（１）ホルミル、アクリリル（Ａｃｒ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、およびアセチル（Ａｃ）などのアシル型保護基、（２）Ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニルなど、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）および置換されたＺなどの芳香族ウレタン型保護基、（３）ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、アリルオキシカルボニルなどの脂肪族ウレタン保護基、（４）９−フルオレニル−メチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、およびシクロヘキシルオキシカルボニルなどのシクロアルキルウレタン型保護基、および（５）フェニルチオカルボニルなどのチオウレタン型保護基を含む。好ましい保護基は、９−フルオレニル−メチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、２−（４−ビフェニリル）−プロピル（２）オキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、２−フェニルプロピル（２）−オキシカルボニル（Ｐｏｃ）、およびｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）を含む。
【０１２１】
本発明にしたがえば、保護基は典型的には、固相合成を通じて、および溶液相結合反応へおよび溶液相結合反応を通じて、ペプチド中間体断片上に保持される。（一般に、溶液相結合段階が完了した後、脱保護段階が、ペプチドから１つ以上の保護基を除去するために実施される。）
【０１２２】
配列番号２および配列番号３を有するペプチド中間体断片の合成のための樹脂へ結合され得る特異的な保護基を有する第一アミノ酸の特異的な例はそれぞれ、ＦｍｏｃＧｌｕ（ＯｔＢｕ）ＯＨおよびＦｍｏｃＴｒｐ（Ｂｏｃ）ＯＨであり得る。
【０１２３】
固相合成のための樹脂を調製するため、樹脂は、溶媒中で前洗浄され得る。例えば、２−ＣＴＣ樹脂などの固相樹脂は、ペプチドチャンバーへ添加され、適切な溶媒で前洗浄される。洗浄は、樹脂へ結合される第一アミノ酸と接触させるための樹脂を調製するために実施されうる。本質において、前洗浄は、第一アミノ酸の樹脂への効率的結合を促進するために実施され得る。前洗浄溶媒は、結合反応において使用される溶媒（または溶媒の混合物）のタイプに基づいて選択され得、その逆もまたしかりである。
【０１２４】
洗浄、およびその後の結合反応にも適した溶媒には、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ジクロロエタン（ＤＣＥ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、塩化メチレン、およびその類似物を、これらの試薬の混合物がある。他の有用な溶媒には、ＤＭＳＯ、ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドン、およびそれらの混合物がある。いくつかの場合、結合は、ＤＭＦおよびＤＣＭの混合物などの、２成分溶媒システムにおいて実施され得る。
【０１２５】
本明細書に記載されるように、約０．２〜約０．５０、好ましくは約０．２〜約０．４５、より好ましくは約０．２〜約０．４０の範囲となるように樹脂上での第一アルファアミノ酸の負荷因子を調節することが望ましい。それゆえ、溶液は、標的範囲において結合因子を提供するであろうアミノ酸のある量を有する溶液が調製される。このことは、結合効率が特定の反応のためのものであることを一般に公知で決定され得る。例えば、約０．３４の標的負荷因子を有することが望まれるとき、結合効率が約８０％であることが公知であるとすれば、樹脂のグラムあたりアミノ酸０．４２５ｍｍｏｌを含有する結合溶液が使用されるべきである（０．３４／０．８）。
【０１２６】
結合反応は、結合反応を亢進させるかまたは改善する１つ以上の化合物の存在において実施され得る。反応の速度を増大し得、側鎖反応の速度を低下させ得る化合物には、三級塩基、例えばジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）およびトリエチルアミン（ＴＥＡ）の存在下で、保護されたアミノ酸を活性化された種へ変換し得るホスホニウム塩およびウロニウム塩がある（例えば、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰＯ、ＨＢＴＵ、およびＴＢＴＵはすべて、ＨＯＢｔエステルを生じる。）。他の試薬は、保護する試薬を提供することによってラセミ化を防止するのを助ける。これらの試薬には、付加された補助求核試薬（例えば、１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、またはＨＯＳｕ）とともにカルボジイミド（例えば、ＤＣＣまたはＷＳＣＤＩ）がある。利用され得る別の試薬には、ＴＢＴＵである。アジ化物と関連した低ラセミ化によるアジ化物方法と同様に、付加された補助求核試薬とともにまたはそれなしでクロロギ酸イソブチルを使用する、混合した無水物の方法も利用される。化合物のこれらのタイプは、カルボジイミドにより仲介される結合の速度も増大させ得、同様に、ＡｓｎおよびＧｌｎ残基の脱水も防止し得る。
【０１２７】
結合の完了は、本明細書に記載の定性的ニンヒドリン検査でモニターされ得る。結合が完了したと決定した後、結合反応混合物を溶媒で洗浄し、ペプチド材料のその次のアミノ酸残基の各々について、結合周期を反復する。最終的な結合サイクルの後、樹脂をＮＭＰなどの溶媒で洗浄した後、ＤＣＭなどの不活性第二溶媒で洗浄する。
【０１２８】
次のアミノ酸を結合させるため、Ｎ末端保護基（例えば、Ｆｍｏｃ基）の除去が、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの溶媒中で（重量ベースの）２０〜５０％ピペリジンを含む試薬による処理によって典型的に達成される。Ｆｍｏｃ保護基の除去後、数回の洗浄が典型的には実施され、残存するピペリジンおよび（ジベンゾフルベンおよびそのピペリジン付加物などの）Ｆｍｏｃ副産物を除去する。
【０１２９】
第一アミノ酸が、望ましい負荷因子で樹脂へ結合され、Ｎ末端保護基が除去された後、その次のアミノ酸が、ペプチド中間体断片を調製するために付加され得る。その次のアミノ酸は、負荷因子に関連してアミノ酸の化学量論的過剰で利用され得る。しかしながら、本明細書に記載の特異的なＴ−１２４９中間体断片の固相合成は、これらの断片の固相合成において使用されるアミノ酸（および相当の試薬）の大過剰量を必要としないことがわかった。一般に、結合段階において使用されるアミノ酸の量は、樹脂上の第一アミノ酸の負荷因子と少なくとも等価である（１当量以上）。好ましくは、結合段階において使用されるアミノ酸の量は、１．３当量（０．３過剰）以上、最も好ましくは約１．５当量（０．５過剰）である。いくつかの場合では、例えば、結合段階は、１〜１．５（１より大きく１．５より小さい）範囲のアミノ酸の等価の量を利用する。
【０１３０】
アミノ酸のこの過剰量（例、約１．５）が完了に至るための結合反応に十分であることがわかった。この過剰量は、脱保護試薬から反応許容過剰塩基も助けることができる。
【０１３１】
結合、洗浄、Ｎ末端脱保護基の脱保護、および洗浄の段階は、望ましいＴ−１２４９中間体生成物が形成されるまで反復され得る。
【０１３２】
固相合成の後、Ｔ−１２４９中間体ペプチドを樹脂から除去するため、開裂したＴ−１２４９中間体ペプチドがなおも、十分な側鎖および末端保護基を有するような方法で、開裂処理を実施する。しかるべき位置に保護基を放置することは、開裂中または開裂後のペプチド断片の望ましくない結合または他の望ましくない反応を防止するのを助ける。ＦＭＯＣまたは同様の化学物質がペプチドを合成するのに使用される場合、保護された開裂は、樹脂を膨潤することもでき、開裂および分離工程に有用であり得るＤＣＭなどの溶媒中の酢酸または希ＴＦＡなどの比較的弱酸性の試薬を使用することなどによるいずれかの望ましい様式で達成され得る。ＤＣＭ中の０．５〜１０重量％、好ましくは１〜３重量％のＴＦＡの使用が好ましい。例えば、米国特許第６，２８１，３３５号を参照してほしい。
【０１３３】
固相樹脂からのペプチド中間体断片の開裂の段階は、次のような典型的な工程のラインに沿って進行し得る。しかしながら、樹脂からペプチド中間体断片を効率よく開裂させるいずれかの適切な工程が使用され得る。例えば、酸性開裂試薬を含有する溶媒の約５〜２０容積、好ましくは約１０容積が、容器へ添加される。樹脂ビーズは、結果として試薬中に浸漬される。開裂反応は、液体含有量を、適切な温度で適切な時間撹拌しながら生じさせる。撹拌は、ビーズが凝集するのを防止するのを助ける。適切な時間および温度の条件は、使用される酸試薬、ペプチドの性質、樹脂の性質、およびそれらの類似項目などの因子に依存するであろう。一般的なガイドラインとして、約−１５〜約５℃、好ましくは約−１０〜約０℃で約５分間〜２時間、好ましくは約２５〜約４５分間撹拌することが適切であろう。開裂時間は、約１０分間〜約２時間の範囲であり得る。ラージスケールでの生成については、好ましい時間は、約１５〜５０分間の範囲にある。開裂は、反応時に典型的に生じ得る反応熱を収容するような冷却した温度範囲において望ましくは実施される。さらに、開裂反応のより低い温度は、ｔｒｔ基などの酸感受性側鎖保護基をこの段階での除去から保護する。
【０１３４】
開裂処理の終了時に、反応物を急冷する。このことは、例えばピリジンまたは類似物などの適切な塩基を容器へ添加し、さらに５分間〜２時間、好ましくは約２０分〜約４０分間などのさらなる時間撹拌し続けることによって達成され得る。塩基を添加し、撹拌し続けると、容器の内容物の温度が上昇する。撹拌の終了時に、容器の内容物は、約０〜約１５℃、好ましくは約５〜約１０℃の範囲の温度であり得る。
【０１３５】
ペプチド回収の局面を改善するために、樹脂を膨潤および収縮させるなどの因子は、場合により、全般的な合成工程へと組み込められ得る。
【０１３６】
例えば、開裂後、支持体は、場合により、結果として生じる洗浄物へと開裂ペプチドを抽出するための膨潤試薬で１回以上洗浄され得、洗浄物は、それらの洗浄からペプチドを回収できるよう回収される。例えば、ＤＣＭ中の希ＴＦＡを使用して２−ＣＴＣ樹脂からペプチドを開裂させることは、膨潤処理のすべてまたは一部をさらに構成するであろう。開裂後および膨潤処理が完了した後、支持体は、ペプチドのさらなる量が収縮洗浄から回収でき、同様に、１回以上のその後の任意の膨潤洗浄からさらなるペプチドを回収する能力を増強できる、１回以上の任意の収縮洗浄へ供され得る。さらなる膨潤処理からなるその後の任意の膨潤洗浄は、収縮処理が完了した後に実施され得る。
【０１３７】
ＤＣＭなどの膨潤溶媒が、開裂試薬中の構成要素として使用され得るため、開裂処理は、開裂したペプチドの有意な量が液体へと抽出されるであろう第一膨潤処理も構成し得る。ＤＣＭ中のＴＦＡで膨潤する場合は、ビーズの容積は、開裂処理の開始時に最大となる傾向にあろう。ビーズは、なおも膨潤されるであろうが、その容積は、ペプチドが液体へと抽出されるため低下する。
【０１３８】
急冷後、容器の内容物を空け、洗浄物へと抽出されたペプチドを回収する。圧力をかけて、フィルターを通じて容器の外へ出た液体によって運搬されるペプチド材料を含有する液体混合物に力を加えてもよい。容器中に残存するビーズは、残余ＤＣＭをなおも含有するであろうし、ある程度までなおも膨潤されるであろう。残余ペプチドの有意な量は、ビーズ中にも保持される傾向があり、その後の収縮処理および膨潤処理は、残余ペプチドの有意な部分を回収するのを助ける。
【０１３９】
オプションとして、蒸留またはその類似実験を介する濃縮の前に、回収された開裂試薬を水で洗浄することが望ましくあり得、通常、幾分かの濃縮が達成された後は除く。それゆえ開裂後の水洗浄は、ペプチドの質をある程度まで亢進させるのに有用であると信じられている。水洗浄は、残余ＴＦＡおよびその副産物を除去する上で役に立つと信じられている。水洗浄／抽出処理の後、液体混合物を、蒸留装置へと転してもよく、そこで混合物は、例えばＤＣＭまたはその類似物を除去することによってさらに濃縮される。
【０１４０】
開裂している混合物を容器から空け、ペプチド回収のために回収した後、容器の内容物は、さらなるペプチドが抽出され得た後に回収され得る１回以上のさらなる膨潤洗浄へと供され得る。これらのさらなる膨潤洗浄も、容器を洗浄し、残余開裂試薬および副産物を除去するのを助ける。このような成分は、収縮処理による進行の前に望ましくは除去され、それにより収縮液体はそれらとは反応しないであろう。例えば、エタノールがＴＦＡと反応し得る限り、エタノールを含有する収縮液体を添加する前に、容器からＴＦＡを除去することが望ましい。典型的な膨潤洗浄処理は、約２分間〜約２時間、好ましくは約１０〜約５０分間撹拌しながら生じ得る。洗浄が実施された後、洗浄物は容器から除去され、次に、他の膨潤洗浄とともに蒸留容器へ添加され得る。場合により、蒸留ポットへ添加される前に、これらのさらなる膨潤洗浄は、もしあれば、不純物を除去するための水抽出処理へ供され得る。
【０１４１】
いくつかの局面において、ペプチド中間体断片は、それらの純度を亢進させる段階を実行することによって、例えば結晶化によって溶液相結合のために調製され得る。Ｔ−１２４９ペプチド中間体断片の１つ以上は、ペプチド中間体断片を結晶化するために、ＩＰＡおよびＤＣＭ、またはＩＰＡおよび水の混合物など、ＩＰＡを含有する溶液で処理され得る。
【０１４２】
固相合成、樹脂からの開裂、ペプチド中間体のいずれかの洗浄または精製の後、配列
【０１４３】
【表５５】
2008526699.tif 000027
【０１４４】
を有するペプチド中間体断片を、配列
【０１４５】
【表５６】
2008526699.tif 000028
【０１４６】
を有するペプチド中間体断片を生じるために、フェニルアラニンアミド（Ｆ−ＮＨ２）残基と反応させる。この溶液相反応は、本明細書に記載されるように、適切な溶液相反応溶液中で実施され得る。このペプチド中間体生成物を、非溶媒、例えば水中で沈殿し、純度を改善するために洗浄することができる。
【０１４７】
Ｔ−１２４９側鎖により保護されるペプチド中間体断片
【０１４８】
【表５７】
2008526699.tif 000029
【０１４９】
は、配列
【０１５０】
【表５８】
2008526699.tif 000030
【０１５１】
を有する全長のＴ−１２４９ペプチドを形成するため、溶液中で互いに結合される。これらの中間体断片を化学的に配置し、ここで
【０１５２】
【表５９】
2008526699.tif 000031
【０１５３】
のペプチド中間体断片のＮ末端を、
【０１５４】
【表６０】
2008526699.tif 000032
【０１５５】
のペプチド断片のＣ末端へ結合させる。
【０１５６】
好ましくは、ペプチドは、ＨＰＬＣ特性に基づいた８０％以上、またはより好ましくは８２．５％、最も好ましくは８５％以上の純度レベルで結合反応へ供給される。本発明の方法にしたがえば、低い負荷因子を利用する固相合成は、より高い純度レベルを有するＴ−１２４９中間体ペプチド断片を調製するための有意な局面である。
【０１５７】
ペプチド結合反応は、例えば、 New Trends in Peptide Coupling Reagents; Albericio, Fernando; Chinchilla, Rafeal; Dodsworth, David J.; and Najera, Armen; Organic Preparations and Procedures International (2003), 33(3), 203-303において概説されている。
【０１５８】
ペプチド中間体断片の結合は、ｉｎ  ｓｉｔｕ結合試薬、例えばＢＯＰ、ヘキサフルオロリン酸ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）、ＨＡＴＵ、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣＤＩ）、またはテトラフルオロホウ酸ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム（ＴＢＴＵ）を使用して実施され得る。他の結合技術は、ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）およびｐ−ニトロフェノール（ＨＯＮｐ）エステルなどのあらかじめ形成された活性エステル、あらかじめ形成された対称性無水物、Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）、またはフッ化アシルおよび塩化アシルなどのハロゲン化酸を使用する。
【０１５９】
適切な結合溶媒を、結合反応において使用することができる。使用される結合溶媒が、形成されるペプチド結合のラセミ化の程度、ペプチドおよび／またはペプチド断片の可溶性、および結合反応速度に影響を及ぼし得ることは理解される。
【０１６０】
いくつかの態様において、結合反応は、水混和性溶媒を含む。水混和性溶媒の例には、例えば、ＤＭＳＯ、ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、またはそれらの混合物がある。
【０１６１】
他の態様において、結合反応は、非水混和性溶媒を含む。典型的な非水混和性溶媒は、塩化メチレンである。これらの態様において、非水混和性溶媒は好ましくは、脱保護反応と互換性があり、例えば、非水混和性溶媒が好ましく使用される場合、脱保護反応に負の影響を及ぼさない。
【０１６２】
ペプチド中間体断片が、Ｔ−１２４９ペプチドを生じるために結合された後、生成物は、側鎖保護基を除去するための脱保護段階へ供され得る。
【０１６３】
包括的な脱保護による側鎖保護基の除去は典型的に、側鎖保護基を開裂させる酸性溶解（ａｃｉｄｏｌｙｔｉｃ）剤を含む脱保護溶液を利用する。包括的な脱保護のために普遍的に使用される酸性溶解試薬には、正味のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ＨＣｌ、ＢＦ３Ｅｔ２ＯまたはＭｅ３ＳｉＢｒなどのルイス酸、液体フッ化水素酸（ＨＦ）、臭化水素（ＨＢｒ）、トリフルオロメタン硫酸、およびそれらの組み合わせがある。脱保護溶液は、１つ以上の適切な陽イオンスカベンジャー、例えば、ジチオスレイトール、アニソール、ｐ−クレソール、エタンジチオール、または硫化ジメチルも含む。脱保護溶液は水も含み得る。本明細書で使用されるように、脱保護組成物中に存在する試薬の量は、典型的には比で表され、個々の成分の量は、「重量部」または「容積部」などの「部」における分子として表され、分母は、組成物中の総部分である。例えば、９０：５：５（重量／重量／重量）の比でＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：ＤＴＴを含有する脱保護溶液は、９０／１００重量部のＴＦＡ、５／１００重量部のＨ２Ｏ、および５／１００重量部のＤＴＴを有する。
【０１６４】
いくつかの態様において、脱保護組成物中の酸性溶解剤、好ましくはＴＦＡの量が９０／１００重量部よりも大きいように、脱保護反応が実施され得る。他の好ましい脱保護組成物は、９３／１００重量部以上の量で、または９３／１００〜９５／１００重量部の範囲の量で酸性溶解剤の量を含む。
【０１６５】
Ｔ−１２４９ペプチドが脱保護され、最終的な形態になった後、場合により、全般的な合成スキームにおけるこの段階に存在し得る凝集したペプチドを脱凝集させる手順へと、ペプチドのバッチが供され得る。
【０１６６】
水溶性塩基中にペプチド試料を溶解した後、水溶性混合物を酸性化して塩および共溶媒のうちの少なくとも１つの存在下でペプチドを沈殿させることによって、脱凝集が実施され得る。好ましくは、塩および共溶媒の両者が、脱凝集溶液中に存在する。脱凝集は、比較的低温で（少なくとも、アルカリ媒体のｐＨを６〜７．５の範囲のｐＨへ低下させ、そののち最終的に望ましいｐＨ、例えば３〜６への酸性化がよりゆっくりと生じ得る酸性化の第一段階において）ペプチドを比較的迅速に沈殿させることによって実施され得る。
【０１６７】
脱凝集について、水性緩衝性アルカリ溶液は、水、少なくとも１つの塩、および望ましい溶解ｐＨを提供するための少なくとも１つの塩基の十分量を含む成分から一般に派生する。Ｔ−１２４９ペプチドおよび水性緩衝性アルカリ溶液を構成するさまざまな成分は、いずれかの順序で組み合わせられ得る。実際のある態様では、溶液をその構成成分から調製した後、すでに調製された溶液へペプチドを添加する。実際の別の態様では、ペプチドは、塩を含み、溶解を生じさせるには低すぎのｐＨを有する水性溶液へ添加され得る。次に、溶解が生じるであろう値までｐＨを上昇させるために、塩基がこの混合物へ添加される。なおさらに別の選択肢として、塩は、溶解の前、間、および／または後に溶液へ添加され得る。だが一般に、さらに後述にあるように、ペプチドを沈殿させる方法でｐＨを低下させる前に、塩は溶液中へと組み込まれる。
【０１６８】
溶液中のペプチドの濃度は、幅広い範囲にわたって変動し得る。一般的なガイドラインとして、溶液中のＴ−１２４９ペプチド濃度は、約３〜約６ｇ／Ｌの範囲にあり得る。
【０１６９】
望ましいｐＨを提供するため、多様な１つ以上の塩基が溶液中へと組み込まれ得る。適切な塩基の代表的な例には、ＮａＯＨなどの水酸化物塩基、および重炭酸ナトリウムまたは重炭酸カリウムあるいは炭酸ナトリウムまたは炭酸カリウムなどの重炭酸塩基および炭酸塩基がある。水酸化ナトリウム、特に０．５〜１Ｎ  ＮａＯＨが好ましい。ペプチドが妥当な時間で溶液中に溶解するであろう望ましい値へｐＨを調整するために、塩基が使用される。多くのペプチドについて、このことは、約８〜約１１の範囲の溶解ｐＨに相当する。
【０１７０】
溶液の塩構成は、結果として生じる沈殿したペプチドの溶解特徴を改善する。特に、より低いｐＨで水溶液中に迅速に溶解する可溶性ペプチドは、塩が適切な濃度で存在する場合、より一貫して調製される。
【０１７１】
多様な塩は、本発明の実施において有用であろう。例には、炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸アンモニウム、これらのナトリウムおよびカリウム版、これらの組み合わせ、およびそれらの類似物がある。酢酸アンモニウムが最も好ましい。
【０１７２】
溶液中の塩の濃度は、幅広い範囲にわたって変動し得る。塩の１〜２００ｍＭ当量を使用することは、適切であろう塩濃度の範囲の一例である。実施の特異的な態様において、塩、特に酢酸アンモニウムの約５〜約５０ｍＭ、より好ましくは約１０ｍＭ当量を使用することが、適切であるとわかった。
【０１７３】
溶解温度は一般に、ペプチドが溶解する水溶液の温度を指す。溶解は、いずれかの適切な温度で生じ得る。一般に、約１０〜約３０℃、好ましくは約１０〜約２５℃、より好ましくは約１５〜約２０℃の範囲の１つ以上の温度で維持される溶液中でペプチドを溶解することが好ましいであろう。
【０１７４】
好ましくは共溶媒を、ペプチドのその後の沈殿が共溶媒の存在下で生じるように、溶液へと組み込む。共溶媒は、溶解の前、間、およびまたは後で溶液へ添加され得るが、好ましくは、ペプチドの溶解後に即座に添加される。共溶媒とは、ペプチドが溶解ｐＨで可溶性である１つ以上のさらなる溶媒を指す。好ましくは、ペプチドの理論的な分子量に対するペプチドの測定された分子量の比が、約２：１〜約１：１の範囲にあるとき、ペプチドは、２５℃および生理学的ｐＨで可溶性である。共溶媒の例には、アセトニトリル、メタノール、これらの組み合わせ、およびそれらの類似物がある。
【０１７５】
本発明の好ましい態様では、溶液に、共溶媒の約２〜５容積％、好ましくは約５〜約３０容積％、およびより好ましくは約１０〜約２０容積％を含有するよう、共溶媒の十分量が添加される。
【０１７６】
溶解後および望ましくは共溶媒の添加後、必要に応じて、ペプチドのさらなる脱凝集を促進するため、さらなる塩基を添加することによって、溶液のｐＨは場合によりさらに上昇する。次に、溶液は、望ましくは即座にろ過される。０．２ミクロンフィルターを通じての圧力ろ過が適しているであろう。ろ液は、真空下で場合により脱気された後、溶液は適切な時間寝かされ、脱気工程を完了するためにさらに処理される。一般に、ペプチドが、上昇したｐＨにある（寝かし時間だけではなく、ろ過時間、脱気時間、等も含む）総時間が、約５分間〜約６時間、より好ましくは約３０分間〜約２時間の範囲にあるよう寝かされる。寝かした後、溶液は、場合により再度ろ過され得る。
【０１７７】
寝かした後、ペプチドが沈殿するのに効果的な条件下で、溶液のｐＨは低下し、例えば酸性化される。一般的なガイドラインとして、約３〜約６、好ましくは４〜約６の範囲の最終ｐＨが適切であり得る。具体例としては、５．３〜５．５の最終ｐＨがＴ−１２４９ペプチドに関して望ましい。
【０１７８】
溶液のｐＨは好ましくは、１つ以上の酸を溶液へ添加することによって低下する。酸の例には、ＨＣｌ、硫酸、酢酸、シュウ酸、これらの組み合わせ、およびそれらの類似物がある。酢酸が好ましい。例えば、水溶性の５％または１０％の酢酸溶液が適していることがわかってきた。
【０１７９】
実施のいくつかの態様では、優れた溶解特性を有するペプチド生成物は、ｐＨを中間的なｐＨへのみ低下させるために比較的迅速に酸が添加してもなお、得ることができる。この初期の比較的迅速な酸の添加の後、最終的な望ましいｐＨへと溶液のｐＨを低下させるために、酸を、第二の比較的ゆっくりとした速度で添加する。適切な中間的ｐＨ値は、約６〜約８の範囲、より好ましくは約６．０〜約７．５の範囲であろう。望ましくは、約１時間未満、好ましくは３０分以下、より好ましくは１５分以下の時間でｐＨをまず迅速に低下させる。
【０１８０】
例えば、実施のある適切な態様では、１１のｐＨでまずＴ−１２４９溶液のｐＨを低下させることを包含する。ｐＨを約６．０の中間的な値へ低下させるために、酸の十分量が、１０分間にわたって比較的迅速に添加される。次に、ｐＨを５．３〜５．５に低下させるため、１０〜２０分かけてよりゆっくり酸を添加する。
【０１８１】
混合物は望ましくは、ペプチドの沈殿を生じさせるために酸を添加する経過の間に十分混合される。一般的なガイドラインとして、混合物のあわ立ちを回避するのに十分な安全上の余裕を残しながら、酸を添加する間、混合物を実施上できるだけ激しく撹拌することが好ましい。
【０１８２】
ペプチドの沈殿を生じさせる酸の添加は、いずれかの適切な温度で溶液を使用して実施され得る。ガイドラインとして、１０〜３０℃、好ましくは１５〜２５℃、最も好ましくは１６〜１８℃の範囲の温度で沈殿を実施することが適切であろう。
【０１８３】
沈殿後、ペプチドを、望ましく単離し乾燥した後、他の成分と組み合わせ、凍結乾燥し、包装し、保存し、さらに処理し、および／またはさもなくば取り扱う。このことは、いずれかの適切な様式で達成され得る。ある適切なアプローチにしたがえば、ペプチドは、ろ過を介して回収され、適切なレベルまで最終的な塩含有量を低下させるためにアンプル水洗浄で洗浄した後、乾燥する。
【０１８４】
ペプチドが、ろ過にとって不適切な形態で沈殿する場合（例えば、沈殿物が「ゲル様」である場合）、ペプチド粒子が、粒子を「硬化させる」ために凝集する望ましい撹拌をともなう寝かし工程へ、沈殿を供することができる。
【０１８５】
実施の好ましい態様では、この寝かし硬化処理は、冷却／加熱／冷却処理の経過において撹拌しながらペプチドを寝かせることを包含する。これにより、ペプチドの三次構造を過度に損傷せずに、ペプチドのろ過特徴を改善する。実施の特異的な態様では、処理は、好ましくは、０℃超〜約２０℃、好ましくは１０〜２０℃、より好ましくは約１６℃の範囲にある、周囲温度を下回る第一温度で、５分〜４８時間、好ましくは３０分〜８時間、より好ましくは３０分〜２時間、水性混合物中で粒子を寝かすことを包含した。撹拌は望ましくは、粒子が寝かしの間に十分分散することを確実にするために使用される。
【０１８６】
次に、混合物の温度は、適度により温かい温度に至る、約２〜約３０℃、好ましくは約５〜約１５℃上昇し、より温かい温度への移行は、約１分〜約４８時間、好ましくは５分〜８時間、より好ましくは２０分〜２時間の間にわたって、撹拌しながら生じる。好ましくは、新たな適度により温かい温度は、なおも周囲温度以下である。実施の特異的な態様では、温度を１６℃から２１℃まで約１時間で上昇させることが、適切であるとわかった。撹拌は望ましくは、この移行の間、続行する。次に混合物を、５分〜８時間、好ましくは２０分〜４時間、より好ましくは約３時間、撹拌しながらより温かい温度で寝かせる。
【０１８７】
この寝かし段階後、混合物の温度は、適度により冷たい温度に至る、約２〜約３０℃、好ましくは約５〜約１５℃低下し、より冷たい温度への移行は好ましくは、約１分〜約４８時間、好ましくは５分〜８時間、より好ましくは２０分〜４時間にわたって撹拌しながら生じる。好ましくは、新たな適度により冷たい温度は、約３℃超〜約１８℃の範囲、より好ましくは約１０℃である。実施の特異的な態様では、温度を２１℃から１０℃まで約２時間で低下させることが、適切であることとわかった。次に、混合物は、好ましくは約５分〜４８時間の間、より好ましくは約６時間、より冷たい温度でさらに寝かされる。
【０１８８】
この寝かし処理は、ろ液からペプチド粒子をろ過および分離することが、ペプチドの二次構造を過度に変化させることなくより迅速に生じる点で、沈殿した粒子のろ過特徴を改善する。
【０１８９】
したがって、この寝かしの後、沈殿はろ過され、好ましくは、１ｐｓｉｇのＮ２などで圧力ろ過される。フィルターケーキは、望ましくは約３〜約２０℃、好ましくは５〜約１５℃の範囲、より好ましくは約１０℃の温度などへあらかじめ冷却された水で１回以上洗浄され得る。このことは、ケーキの塩含有量を低下させるのを助ける。フィルターケーキは次に、適切な温度で１分〜４８時間、好ましくは５分〜８時間、より好ましくは約６時間の適切な時間、窒素によりケーキに窒素を通過させるなどによって、部分的にまたは完全に乾燥し得る。ほぼ周囲温度にある窒素を使用することは、簡便かつ適切である。ケーキは、乾燥を容易にするために周期的に混合され得る。乾燥は場合により、個別の乾燥装置の中で完了され得る。このような任意の乾燥は好ましくは、真空下で、例えば４０ｍｂａｒ未満で、ペプチドを分解しないような適度な温度、例えば約３０℃未満の温度、好ましくは約２８℃未満の温度で生じる。
【０１９０】
本発明の原理を、ここに以下の説明としての実施例に関してさらに説明する。
【０１９１】
実施例
次の実施例について、次の標準的な試薬および用語を採用する。
【０１９２】
クロラニル検査
トルエン中のクロラニルの飽和溶液の滴下をアセトン約１ｍＬへ添加することによって、クロラニル検査溶液を調製した。洗浄の滴下をクロラニル検査溶液へ添加することによって、ＮＭＰ洗浄を検査した。青色または紫色は、二級アミンの存在についての正の表示であり、Ｆｍｏｃにより脱保護された副産物および／または残余ピペリジンがなおも存在することを示す。
【０１９３】
ニンヒドリン（カイザー（Ｋｅｉｓｅｒ））検査
定性的なニンヒドリン検査において、樹脂２〜２０ｍｇ試料をぬきとり、ＮＭＰで洗浄した後、ＤＣＭまたはメタノールで洗浄した。エタノール中のフェノールの７６％溶液３滴、ピリジン中の０．２ｍＭ  ＫＣＮ溶液６滴、およびエタノール中のニンヒドリン０．２８Ｍ溶液の３滴を試料へ添加し、試料を約１００℃で約５分間加熱ブロック中に置いた。試料を取り出し、エタノール／水溶液（９：１）で即時希釈した。青色または紫色は、遊離アミンの存在の正の表示であり、結合反応がまだ完了していないことを示す。正のニンヒドリン検査反応を結合反応の１時間後に観察した場合、結合反応はさらに１時間続行した。正のニンヒドリン検査反応が結合反応の３時間後に生じた場合、容器を排水し、活性化されたアミノ酸および試薬の約１当量を使用して、結合を反復した。
【０１９４】
実施例１．Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）を負荷した２−ＣＴＣ樹脂の調製
窒素によりパージした１Ｌのペプチド反応器へ、４０ｇの２−ＣＴＣ樹脂および４００ｍＬのＤＣＭをチャージする。２５±２℃で３０分撹拌する。その間、１Ｌフラスコへチャージするのは、９．７ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）ＯＨ、２８０ｍＬのＤＭＦ、４０ｍＬのＤＣＭ、および５．５ｇのＤＩＥＡである。周囲温度で内容物を撹拌し、固体を溶解する。
【０１９５】
反応器からＤＣＭを排水し、上述のＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）ＯＨの調製した溶液をチャージする。混合物を２５±２℃で２時間撹拌し、反応器を排水する。
【０１９６】
反応器へチャージするのは、ＤＩＥＡ：ＭｅＯＨ（４０：３６０ｍＬ）の混合物である。内容物を２５±２℃で１時間撹拌し、反応器を排水する。
【０１９７】
樹脂ベッドを１×４００ｍＬのＤＭＦ、１×２００ｍＬのＤＭＦ、および４×４００ｍＬのＤＣＭで洗浄する。最後の洗浄を負のＵＶ検査についてチェックする。
【０１９８】
樹脂ベッドを３×４００ｍＬのイソプロパノールで洗浄する。樹脂を４０±２℃で一定重量まで真空乾燥させる。
【０１９９】
収量：４８．９ｇ
負荷因子分析：０．４４ｍｍｏｌ／ｇ
【０２００】
実施例２．Ｔ−１２４９中間体断片Ａｃ−ＡＡ（１−２０）ＯＨ（配列番号２）の固相合成
ＳＰＰＳチャンバーへ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｏ−２−ＣＴＣ（実施例１）樹脂２５．０ｇおよび２５０ｍＬのＤＣＭをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、樹脂ベッドを３×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。反応器へＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。
【０２０１】
フラスコへ、１０．１ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）ＯＨ、２．８２ｇの６−クロロＨＯＢＴ、２．４５ｇのＤＩＥＡ、および１１３ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０２０２】
分離フラスコにおいて、５．３ｇのＴＢＴＵおよび６８ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）ＯＨ溶液へ添加し、この溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを５０ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。完了反応のために樹脂ビーズをサンプリングする（カイザー（Ｋｅｉｓｅｒ）検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水し、樹脂ビーズを４×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０２０３】
反応器へＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ビーズを５×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄物をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０２０４】
フラスコへ、１０．１ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）ＯＨ、２．８４ｇの６−クロロＨＯＢＴ、２．４５ｇのＤＩＥＡ、および８０ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０２０５】
分離フラスコにおいて、５．３ｇのＴＢＴＵおよび６８ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）ＯＨ溶液へ添加し、この溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを５０ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。完了反応について樹脂ビーズをサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水し、樹脂ベッドを４×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０２０６】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて、定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０２０７】
フラスコへ、５．８３ｇのＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、２．８４ｇの６−クロロＨＯＢＴ、２．４２ｇのＤＩＥＡ、および１１３ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０２０８】
分離フラスコにおいて、５．３ｇのＴＢＴＵおよび６８ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ溶液へ添加し、この溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを５０ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。完了反応について樹脂ビーズをサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水し、樹脂ベッドを４×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０２０９】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０２１０】
フラスコへ、１１．７５ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）ＯＨ、３．３ｇの６−クロロＨＯＢＴ、２．８４ｇのＤＩＥＡ、および１１３ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０２１１】
分離フラスコにおいて、５．３ｇのＴＢＴＵおよび６８ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）ＯＨ溶液へ添加し、この溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを５０ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水し、樹脂ベッドを４×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０２１２】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０２１３】
フラスコへ、５．４５ｇのＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、３．３ｇの６−クロロＨＯＢＴ、２．８５ｇのＤＩＥＡ、および１１３ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０２１４】
分離フラスコにおいて、６．１８ｇのＴＢＴＵおよび６８ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ溶液へ添加し、この溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを５０ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水し、樹脂ベッドを４×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０２１５】
反応器へＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０２１６】
フラスコへ、１１．７５ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）ＯＨ、３．２ｇの６−クロロＨＯＢＴ、３．１ｇのＤＩＥＡ、および１１３ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０２１７】
分離フラスコにおいて、７．９ｇのＴＢＴＵおよび６８ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）ＯＨ溶液へ添加し、この溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを５０ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水し、樹脂ベッドを４×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０２１８】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０２１９】
フラスコへ、８．２ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）ＯＨ、３．２ｇの６−クロロＨＯＢＴ、２．８４ｇのＤＩＥＡ、および１１３ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０２２０】
分離フラスコにおいて、６．１８ｇのＴＢＴＵおよび６８ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）ＯＨ溶液へ添加し、この溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを５０ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水し、樹脂ベッドを４×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０２２１】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０２２２】
フラスコへ、５．８３ｇのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、２．８ｇの６−クロロＨＯＢＴ、２．４２ｇのＤＩＥＡ、および１１３ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０２２３】
分離フラスコにおいて、５．３ｇのＴＢＴＵおよび６８ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ溶液へ添加し、この溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを５０ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水し、樹脂ベッドを４×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０２２４】
反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０２２５】
フラスコへ、５．８３ｇのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、２．８ｇの６−クロロＨＯＢＴ、２．４２ｇのＤＩＥＡ、および１１３ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０２２６】
分離フラスコにおいて、５．３ｇのＴＢＴＵおよび６８ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ溶液へ添加し、この溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを５０ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水し、樹脂ベッドを４×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０２２７】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０２２８】
フラスコへ、５．１４ｇのＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、２．８ｇの６−クロロＨＯＢＴ、２．４２ｇのＤＩＥＡ、および１１３ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０２２９】
分離フラスコにおいて、５．３ｇのＴＢＴＵおよび６８ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ溶液へ添加し、この溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを５０ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水し、樹脂ベッドを４×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０２３０】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０２３１】
フラスコへ、６．６ｇのＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、２．８ｇの６−クロロＨＯＢＴ、２．４２ｇのＤＩＥＡ、および１１３ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０２３２】
分離フラスコにおいて、５．３ｇのＴＢＴＵおよび６８ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｔｈｅ（ｔＢｕ）−ＯＨ溶液へ添加し、この溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを５０ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水し、樹脂ベッドを４×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０２３３】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０２３４】
フラスコへ、５．８３ｇのＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、２．８ｇの６−クロロＨＯＢＴ、２．４２ｇのＤＩＥＡ、および１１３ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０２３５】
分離フラスコにおいて、５．３ｇのＴＢＴＵおよび６８ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ溶液へ添加し、この溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを５０ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水して樹脂ベッドを４×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０２３６】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０２３７】
フラスコへ、７．７３ｇのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、２．８ｇの６−クロロＨＯＢＴ、２．４２ｇのＤＩＥＡ、および１１３ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０２３８】
分離フラスコにおいて、５．３ｇのＴＢＴＵおよび６８ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ溶液へ添加し、この溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを５０ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水して樹脂ベッドを４×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０２３９】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０２４０】
フラスコへ、１３．４４ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、３．７３ｇの６−クロロＨＯＢＴ、３．１３ｇのＤＩＥＡ、および１１３ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０２４１】
分離フラスコにおいて、７．０６ｇのＴＢＴＵおよび６８ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ溶液へ添加してこの溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを５０ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水して樹脂ベッドを４×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０２４２】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０２４３】
フラスコへ、９．３６ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、３．７３ｇの６−クロロＨＯＢＴ、３．１３ｇのＤＩＥＡ、および１１３ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０２４４】
分離フラスコにおいて、７．０６ｇのＴＢＴＵおよび６８ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ溶液へ添加してこの溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを５０ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水して樹脂ベッドを４×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０２４５】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０２４６】
フラスコへ、１１．６ｇのＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、３．７３ｇの６−クロロＨＯＢＴ、３．１３ｇのＤＩＥＡ、および１１３ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０２４７】
分離フラスコにおいて、７．０６ｇのＴＢＴＵおよび６８ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ溶液へ添加してこの溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを５０ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水して樹脂ベッドを４×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０２４８】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０２４９】
フラスコへ、９．３６ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、３．７３ｇの６−クロロＨＯＢＴ、３．１３ｇのＤＩＥＡ、および１１３ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０２５０】
分離フラスコにおいて、７．０６ｇのＴＢＴＵおよび６８ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ溶液へ添加してこの溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを５０ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水して樹脂ベッドを４×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０２５１】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０２５２】
フラスコへ、１３．４４ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、３．７３ｇの６−クロロＨＯＢＴ、３．１３ｇのＤＩＥＡ、および１１３ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０２５３】
分離フラスコにおいて、７．０６ｇのＴＢＴＵおよび６８ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ溶液へ添加してこの溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを５０ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水して樹脂ベッドを４×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０２５４】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０２５５】
フラスコへ、１１．６ｇのＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、３．７３ｇの６−クロロＨＯＢＴ、３．１３ｇのＤＩＥＡ、および１１３ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０２５６】
分離フラスコにおいて、７．０６ｇのＴＢＴＵおよび６８ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ溶液へ添加してこの溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを５０ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水して樹脂ベッドを４×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０２５７】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１２５ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１５０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０２５８】
フラスコへ、５．６２ｇの無水酢酸、７．１１ｇのＤＩＥＡ、および１００ｍＬのＮＭＰをチャージする。溶液を混合して、１０℃へ冷却する。冷無水酢酸溶液をＳＰＰＳ反応器へ添加し、フラスコを５０ｍＬのＮＭＰですすぎ、洗浄物を反応器へ添加する。混合物を３０±３℃で１時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水し、樹脂ベッドを５×１８０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。樹脂ベッドを５×１８０ｍＬのＤＣＭ、５×１８０ｍＬのイソプロパノールで洗浄する。樹脂を４０±２℃で真空乾燥させる。
【０２５９】
収量：５７．８３ｇ
【０２６０】
実施例３．固相樹脂からのＡｃ−ＡＡ（１−２０）ＯＨ（配列番号２）の開裂および精製
ＳＰＰＳ反応器へ、上述の構築された樹脂３０ｇおよび３００ｍＬのＤＣＭをチャージする。周囲温度で約５分間撹拌する。反応器を排水し、ＤＣＭ洗浄をさらに１回反復する。反応器を−１０±５℃へ冷却する。
【０２６１】
６ｍＬのトリフルオロ酢酸および２９４ｍＬのＤＣＭの溶液を調製する。溶液を０±５℃へ冷却する。
【０２６２】
冷ＴＦＡ溶液を反応器へチャージし、スラリーを０±５℃で４５分間撹拌する。７．６ｍＬのピリジンを添加し、０±５℃でさらに５分間撹拌する。反応器を排水し、樹脂ベッドを周囲温度で１×３００ｍＬのＤＣＭ、および６×２００ｍＬのＤＣＭで洗浄する。ＤＣＭ溶液を２００ｍＬの水で洗浄する。ＤＣＭ溶液を約４０ｍＬの容積へ濃縮し、３００ｍＬのイソプロパノールを添加する。ＤＣＭを５０ｍｍ真空下で４時間蒸留する。生成物をろ過し、２×１００ｍＬのイソプロパノール（２３ｍＬ）で洗浄し、４０±２℃で真空乾燥させる。
【０２６３】
収量：１４．１ｇ（５４．１％）。７．８５ｇ（３０．１％）の第二収穫を母液から得た。
【０２６４】
実施例４．ＦｍｏｃＴｒｐ（Ｂｏｃ）を負荷した２−ＣＴＣ樹脂の調製
ＦｍｏｃＴｒｐ（Ｂｏｃ）を負荷した２−ＣＴＣ樹脂を調製するため、工程を実施した。
【０２６５】
窒素によりパージされた１Ｌのペプチド反応器へ、４０ｇの２−ＣＴＣ樹脂および４００ｍＬのＤＣＭをチャージする。２５±２℃で３０分間撹拌する。その間、１Ｌのフラスコへ、１２．６６ｇのＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）ＯＨ、２８０ｍＬのＤＭＦ、４０ｍＬのＤＣＭ、および５．７ｇのＤＩＥＡをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解する。
【０２６６】
ＤＣＭを反応器から排水し、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）ＯＨの上述に調製された溶液をチャージする。混合物を２５±２℃で２時間撹拌し、反応器を排水する。
【０２６７】
反応器へ、ＤＩＥＡ：ＭｅＯＨ（４０：３６０ｍＬ）の混合物をチャージする。内容物を２５±２℃で１時間撹拌し、反応器を排水する。
【０２６８】
樹脂ベッドを４００ｍＬのＤＭＦ、２００ｍＬのＤＭＦ、および３×４００ｍＬのＤＣＭで洗浄する。最後の洗浄を負のＵＶ検査についてチェックする。
【０２６９】
樹脂ベッドを３×４００ｍＬのＮＭＰで洗浄し、反応器へＮＭＰ中の２０％ピペリジン２７５ｍＬをチャージする。混合物を２８±２℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、段階をさらに３０分間反復する。反応器を排水し、樹脂ベッドを５×３００ｍＬのＮＭＰ、５×３００ｍＬのＤＣＭ、および３×３００ｍＬのイソプロパノールで洗浄する。樹脂を４０±２℃で一定重量まで真空乾燥させる。
【０２７０】
収量：４７．４ｇ
負荷因子分析：０．４ｍｍｏｌ／ｇ
【０２７１】
実施例５．Ｔ−１２４９中間体断片Ｆｍｏｃ−ＡＡ（２１−３８）ＯＨ（配列番号３）の固相合成
ＳＰＰＳチャンバーへ、Ｈ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｏ−２−ＣＴＣ樹脂（実施例４）２０．０ｇおよび２００ｍＬのＤＣＭをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、樹脂ベッドを３×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０２７２】
フラスコへ、５．１４ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、２．１ｇの６−クロロＨＯＢＴ、１．８１ｇのＤＩＥＡ、および５４ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０２７３】
分離フラスコにおいて、３．８８ｇのＴＢＴＵおよび３２ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）ＯＨ溶液へ添加してこの溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを２４ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水して樹脂ベッドを４×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０２７４】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０２７５】
フラスコへ、６．３３ｇのＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、２．０４ｇの６−クロロＨＯＢＴ、１．７７ｇのＤＩＥＡ、および５４ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０２７６】
分離フラスコにおいて、３．８６ｇのＴＢＴＵおよび３２ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）ＯＨ溶液へ添加してこの溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを２４ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水して樹脂ベッドを４×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０２７７】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０２７８】
フラスコへ、４．２６ｇのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、２．０４ｇの６−クロロＨＯＢＴ、１．８１ｇのＤＩＥＡ、および５４ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０２７９】
分離フラスコにおいて、３．８７ｇのＴＢＴＵおよび３２ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ溶液へ添加してこの溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを２４ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水して樹脂ベッドを３×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０２８０】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０２８１】
フラスコへ、４．６２ｇのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、２．０６ｇの６−クロロＨＯＢＴ、１．８ｇのＤＩＥＡ、および５４ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０２８２】
分離フラスコにおいて、３．８８ｇのＴＢＴＵおよび３２ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ溶液へ添加してこの溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを２４ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水して樹脂ベッドを３×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０２８３】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０２８４】
フラスコへ、３．７５ｇのＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、２．０５ｇの６−クロロＨＯＢＴ、１．７６ｇのＤＩＥＡ、および５４ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０２８５】
分離フラスコにおいて、３．８９ｇのＴＢＴＵおよび３２ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ溶液へ添加してこの溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを２４ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水して樹脂ベッドを３×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０２８６】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０２８７】
フラスコへ、６．３２ｇのＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、２．０６ｇの６−クロロＨＯＢＴ、１．８２ｇのＤＩＥＡ、および５４ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０２８８】
分離フラスコにおいて、３．８７ｇのＴＢＴＵおよび３２ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ溶液へ添加してこの溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを２４ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水して樹脂ベッドを４×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０２８９】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０２９０】
フラスコへ、５．６４ｇのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、２．０６ｇの６−クロロＨＯＢＴ、１．７９ｇのＤＩＥＡ、および５４ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０２９１】
分離フラスコにおいて、３．８７ｇのＴＢＴＵおよび３２ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ溶液へ添加してこの溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを２４ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水して樹脂ベッドを４×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０２９２】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを４×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０２９３】
フラスコへ、４．９５ｇのＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、２．０９ｇの６−クロロＨＯＢＴ、１．７６ｇのＤＩＥＡ、および５４ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０２９４】
分離フラスコにおいて、３．８８ｇのＴＢＴＵおよび３２ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ溶液へ添加してこの溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを２４ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水して樹脂ベッドを４×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０２９５】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０２９６】
フラスコへ、４．２５ｇのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、２．０９ｇの６−クロロＨＯＢＴ、１．７８ｇのＤＩＥＡ、および５４ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０２９７】
分離フラスコにおいて、３．８６ｇのＴＢＴＵおよび３２ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ溶液へ添加してこの溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを２４ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水して樹脂ベッドを４×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０２９８】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０２９９】
フラスコへ、６．４０ｇのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、２．３３ｇの６−クロロＨＯＢＴ、２．１３ｇのＤＩＥＡ、および５４ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０３００】
分離フラスコにおいて、４．４１ｇのＴＢＴＵおよび３２ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ溶液へ添加してこの溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを２４ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水して樹脂ベッドを４×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０３０１】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０３０２】
フラスコへ、８．３５ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、２．３３ｇの６−クロロＨＯＢＴ、２．０９ｇのＤＩＥＡ、および５４ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０３０３】
分離フラスコにおいて、４．３８ｇのＴＢＴＵおよび３２ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ溶液へ添加してこの溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを２４ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水して樹脂ベッドを４×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０３０４】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０３０５】
フラスコへ、４．３８ｇのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、２．３３ｇの６−クロロＨＯＢＴ、２．０６ｇのＤＩＥＡ、および５４ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０３０６】
分離フラスコにおいて、４．３７ｇのＴＢＴＵおよび３２ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ溶液へ添加してこの溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを２４ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水して樹脂ベッドを３×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０３０７】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０３０８】
フラスコへ、５．８１ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、２．３５ｇの６−クロロＨＯＢＴ、２．０８ｇのＤＩＥＡ、および５４ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０３０９】
分離フラスコにおいて、４．３９ｇのＴＢＴＵおよび３２ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ溶液へ添加してこの溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを２４ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水して樹脂ベッドを４×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０３１０】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０３１１】
フラスコへ、６．２９ｇのＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、２．３３ｇの６−クロロＨＯＢＴ、２．１１ｇのＤＩＥＡ、および５４ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０３１２】
分離フラスコにおいて、４．３９ｇのＴＢＴＵおよび３２ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ溶液へ添加してこの溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを２４ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水して樹脂ベッドを３×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０３１３】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０３１４】
フラスコへ、５．８１ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、２．３４ｇの６−クロロＨＯＢＴ、２．０６ｇのＤＩＥＡ、および５４ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０３１５】
分離フラスコにおいて、４．３７ｇのＴＢＴＵおよび３２ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ溶液へ添加してこの溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを２４ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水して樹脂ベッドを４×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０３１６】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを５×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０３１７】
フラスコへ、８．１３ｇのＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、２．３２ｇの６−クロロＨＯＢＴ、２．１７ｇのＤＩＥＡ、および５４ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０３１８】
分離フラスコにおいて、４．３７ｇのＴＢＴＵおよび３２ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ溶液へ添加してこの溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを２４ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。一度反応が完了すると、反応器を排水して樹脂ベッドを４×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。
【０３１９】
反応器へ、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージし、３０±３℃で３０分間撹拌する。反応器を排水し、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン１００ｍＬをチャージする。混合物を３０±３℃で３０分間撹拌し、反応器を排水する。樹脂ベッドを４×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。最後の洗浄をピペリジンレベルについて定性的ニンヒドリン検査によりサンプリングする。
【０３２０】
フラスコへ、６．３８ｇのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、２．３３ｇの６−クロロＨＯＢＴ、２．１６ｇのＤＩＥＡ、および５４ｍＬのＮＭＰをチャージする。内容物を周囲温度で撹拌して固体を溶解した後、１０℃へ冷却する。
【０３２１】
分離フラスコにおいて、４．３９ｇのＴＢＴＵおよび３２ｍＬのＮＭＰをチャージする。周囲温度で撹拌して固体を溶解し、１０℃へ冷却する。冷ＴＢＴＵ溶液をＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ溶液へ添加してこの溶液をＳＰＰＳ反応器へチャージする。フラスコを２４ｍＬのＤＣＭで洗浄し、洗浄物をＳＰＰＳ反応器へチャージする。混合物を３０±３℃で３時間撹拌する。樹脂ビーズを完了反応についてサンプリングする（カイザー検査）。カイザー検査は、不完全な反応を示した。樹脂ベッドを、３０ｍＬのＮＭＰ中の２．８３ｇのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＯＨ、１．０４ｇの６−クロロＨＯＢＴ、１．０１ｇのＤＩＥＡで処理した。２２ｍＬのＮＭＰ中の１．９４ｇのＴＢＴＵの溶液を添加し、混合物をさらに３時間撹拌し、サンプリングした。一度反応が完了すると、反応器を排水して樹脂ベッドを５×１２０ｍＬのＮＭＰで洗浄する。樹脂ベッドを６×１２０ｍＬのＤＣＭ、４×１２０ｍＬのイソプロパノールで洗浄する。樹脂を４０±２℃で真空乾燥させる。
【０３２２】
収量：４６．７７ｇ
【０３２３】
実施例６．固相樹脂からのＦｍｏｃ−ＡＡ（２１−３８）ＯＨ（配列番号３）の開裂および精製
【０３２４】
【表６１】
2008526699.tif 000033
【０３２５】
の開裂
【０３２６】
ＳＰＰＳ反応器へ、２００ｍＬの２％ｖ／ｖトリフルオロ酢酸／ＤＣＭ溶液をチャージする。溶液を０±５℃へ冷却し、Ｆｍｏｃ−ＡＡ（２１−３８）Ｏ−２−ＣＴＣ樹脂２０．０２ｇを添加する。混合物を４５分間撹拌する。５．１ｍＬのピリジンを添加し、混合物を周囲温度へ加温する。反応器を排水し、樹脂ベッドを７×１００ｍＬのＤＣＭで洗浄する。合わせたＤＣＭ洗浄物を２×２５０ｍＬの水で洗浄する。ＤＣＭ溶液を真空下で約２５０ｍＬの容積へと濃縮する。２５０ｍＬのヘプタンを添加し、さらに２００ｍＬの蒸留物を回収するまで蒸留し続ける。２５０ｍＬのヘプタンを添加し、生成物が沈殿するまで蒸留し続ける。生成物をろ過し、３×５０のヘプタンで洗浄する。湿性ケーキを２５０ｍＬのヘプタン中で懸濁し、周囲温度で３０分間撹拌する。生成物をろ過し、２×７５ｍＬのヘプタンで洗浄する。生成物を真空乾燥させる。
【０３２７】
収量：１２．３４ｇ（８９．８％）
【０３２８】
実施例７．Ｈ−ＡＡ（２１−３９）ＮＨ２（配列番号４）の固相合成
ＰｈｅＮＨ２をＦｍｏｃ−ＡＡ（２１−３８）ＯＨへ溶液相結合させることによって、Ｔ−１２４９中間体断片Ｈ−ＡＡ（２１−３９）ＮＨ２を調製した。
【０３２９】
Ｈ−ＡＡ（２１−３９）ＮＨ２の調製を、Ｆｍｏｃ−ＡＡ（２１−３８）ＯＨ３．００ｇで出発することで実施した。実施例６に記載されるようなＦｍｏｃ−ＡＡ（２１−３８）ＯＨ（３．００ｇ）、ＰｈｅＮＨ２−ＨＣｌ（０．７４ｇ、３．６８ｍｍｏｌ、１．３当量）、および６−クロロＨＯＢＴ（０．９６ｇ、５．６６ｍｍｏｌ、２．０当量）をＤＭＦ（１００ｍＬ、８．３容積）中に溶解した。溶液を−１０℃へ冷却し、ＤＭＦ（５ｍＬ、３．６容積）中のＤＩＥＡ（１．４ｍＬ、７．９２ｍｍｏｌ、２．８当量）を添加した。ＴＢＴＵ（１．２ｇ、３．６８ｍｍｏｌ、１．３当量）を一度に添加した後、ＤＭＦ（１５ｍＬ）ですすいだ。反応混合物を−１０℃で一晩撹拌し、そして周囲温度へ加温した。さらに４時間撹拌し続けた。出発物質の０．４％Ｆｍｏｃ−ＡＡ（２１−３８）ＯＨが残存することを示すＨＰＬＣ分析によって、反応の完了をモニターした。ピペリジン（１．２３ｍＬ、１４．４３ｍｍｏｌ、５．１当量）を添加し、溶液を３０℃で３時間撹拌した。１％未満のＦｍｏｃ−ＡＡ（２１−３８）ＮＨ２を示すＨＰＬＣ分析によって、Ｆｍｏｃ除去の完了をモニターした。水（１００ｍＬ、８．３容積）を添加して生成物を沈殿させた。固体を吸引ろ過により回収し、水で洗浄した。周囲温度で一晩乾燥させると、１１．８５ｇ（１０１％、％ＡＮ  ＨＰＬＣ）を生じた。
【０３３０】
中間体Ｆｍｏｃ−ＡＡ（２１−３９）ＮＨ２をピペリジンで処理して、Ｆｍｏｃ保護基を除去し、生成物Ｈ−ＡＡ（２１−３９）ＮＨ２を吸引ろ過により単離した。湿性ケーキを１：１のＥｔＯＨ：水中に３０分間懸濁した。１:２のＭＴＢＥ：ヘプタン中の別の再スラリーをろ過後、乾燥させて、８４．１％（ＡＮ  ＨＰＬＣ）の純度を有するＨ−ＡＡ（２１−３９）ＮＨ２２．６７ｇ（９０．７％）を得た。
【０３３１】
ＨＰＬＣ条件：
カラム：Ｂｅｔａｂａｓｉｃ  Ｃ−１８、１５０×４．６ｍｍ、３μｍ、１５０Å
流速：１．５ｍＬ／分
検出：２６２ｎＭでのＵＶ
移動相：Ａ：０．１５％ＴＦＡ／水
Ｂ：０．０５％ＴＦＡ／ＡＣＮ
Ｃ：０．０５％ＴＦＡ／ＴＨＦ
保持時間：約１２分
【０３３２】
実施例８．Ａｃ−ＡＡ（１−３９）ＮＨ２（配列番号１）の溶液相合成
Ａｃ−ＡＡ（１−２０）ＯＨをＨ−ＡＡ（２１−３９）ＮＨ２と溶液相結合させることによって、Ｔ−１２４９の最終生成物を調製した。
【０３３３】
Ｈ−ＡＡ（２１−３９）ＮＨ２（２．０７ｇ、０．５３ｍｍｏｌ、１．２当量）、Ａｃ−ＡＡ（１−２０）ＯＨ（２．０ｇ、０．４４ｍｍｏｌ、１当量）、および６-クロロＨＯＢＴ（０．１５ｇ、０．８９ｍｍｏｌ、２．０当量）をＤＭＦ（３３ｍＬ、１６容積、１５分）中に溶解した。溶液を０±５℃へ冷却し、ＤＩＥＡ（０．１６ｇ、１．３ｍｍｏｌ、３．０当量）の後にＴＢＴＵ（０．０．１８ｇ、０．５７ｍｍｏｌ、１．３当量）を添加した。０℃で１．５時間撹拌した後、溶液を周囲温度へ加温し、反応が完了するまで撹拌した。水（４０ｍＬ）を滴下して添加した。結果として生じるスラリーを周囲温度で０．８時間撹拌し、生成物を吸引ろ過により単離した。周囲温度で一晩乾燥させると、７２．１％（ＡＮ  ＨＰＬＣ）の純度を有するＡｃ−ＡＡ（１−３９）ＮＨ２４．０７ｇ（９５．１％）を付与した。
【０３３４】
ＨＰＬＣ条件：
カラム：Ｂｅｔａｂａｓｉｃ  Ｃ−１８、１５０×４．６ｍｍ、３μｍ、１５０Å
流速：１．５ｍＬ／分
検出：２６２ｎＭでのＵＶ
移動相：Ａ：０．１５％ＴＦＡ／水
Ｂ：０．０５％ＴＦＡ／ＡＣＮ
Ｃ：０．０５％ＴＦＡ／ＴＨＦ
保持時間：約２５分
【０３３５】
実施例９．Ａｃ−ＡＡ（１−３９）ＮＨ２の側鎖脱保護によるＴ−１２４９の調製
Ａｃ−ＡＡ（１−３９）ＮＨ２（５．００ｇ）をＤＣＭ（５０ｍＬ、１０容積）中に溶解し、ＴＦＡ：ＤＴＴ：水（３５ｍＬのＴＦＡ、２．５２ｇのＤＴＴ、０．８５ｍＬの水）の新鮮に調製された溶液３５ｍＬで処理した。溶液を周囲温度で６．５時間撹拌し、０±５℃へ冷却した。ＭＴＢＥ（１５０ｍＬ）を添加し、沈殿物を吸引ろ過により回収した。細かい粉末をアセトニトリル（１３０ｍＬ）、ＤＩＥＡ（２．６ｍＬ）、酢酸（１．９１ｍＬ）、および水（５．６ｍＬ）の溶液中に懸濁した。スラリーを４０℃で一晩撹拌して、トリプトファンのインドール側鎖の脱カルボキシル化をさせ、周囲温度へ冷却し、生成物を吸引ろ過により回収した。周囲温度で真空オーブン中で一晩乾燥させると、Ｔ−１２４９の２．９８ｇ（１００．４％）を付与した。Ｔ−１２４９の純度は、６１％（ＡＮ）および４２％（重量／重量）であった。
【０３３６】
ＨＰＬＣ条件：
カラム：Ｂｅｔａｂａｓｉｃ  Ｃ−１８、１５０×４．６ｍｍ、３μｍ、１５０Å
流速：１．６ｍＬ／分
検出：２２０ｎＭでのＵＶ
移動相：Ａ：水中の０．１０％ＴＦＡ／ＡＣＮ中の０．０７５％ＴＦＡ／ＭｅＯＨ、５５／４１／０．４
Ｂ：水中の０．１０％ＴＦＡ／ＡＣＮ中の０．０７５％ＴＦＡ／ＭｅＯＨ、４２／５４／０．４
Ｃ：ＣＡＮ中の０．０７５％ＴＦＡ
保持時間：約９分
【配列表】
2008526699000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年6月28日(2006.6.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）式Ｚ−Ｅ−［ＳＵＰ］（式中、［ＳＵＰ］は支持体樹脂であり、Ｅはグルタミン酸残基であり、ＺはＮＨ２−末端保護基であり、Ｚ−Ｅは、０．５以下の負荷因子で［ＳＵＰ］上に存在する。）の固相合成支持体樹脂を提供する段階、
（ｂ）
【表１】
2008526699.tif 000063
を提供するため、アミノ酸をＺ−Ｅ−［ＳＵＰ］へ結合させる段階、
（ｃ）
【表２】
2008526699.tif 000064
の開裂生成物を提供するため、
【表３】
2008526699.tif 000065
を処理する段階、および
（ｄ）
【表４】
2008526699.tif 000066
の合成のために、
【表５】
2008526699.tif 000067
を使用する段階を含む、配列
【表６】
2008526699.tif 000068
を有するペプチドを調製する方法。
【請求項２】
段階（ａ）［ＳＵＰ］が、トリチル基を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
段階（ａ）、［ＳＵＰ］が、クロロ−トリチル基を含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
Ｚが、Ｆｍｏｃ基である、請求項１〜３記載の方法。
【請求項５】
段階（ａ）において、Ｚ−Ｅが、０．５未満の負荷因子で［ＳＵＰ］上に存在する、請求項１〜４記載の方法。
【請求項６】
段階（ａ）において、Ｚ−Ｅが、０．２〜０．５の負荷因子で［ＳＵＰ］上に存在する、請求項１〜５記載の方法。
【請求項７】
段階（ｂ）において、アミノ酸が、１〜１．５当量の量でＺ−Ｅ−［ＳＵＰ］へ結合する、請求項１記載の方法。
【請求項８】
段階（ｄ）において、配列
【表７】
2008526699.tif 000069
を有するペプチドを提供するため、
【表８】
2008526699.tif 000070
が、配列
【表９】
2008526699.tif 000071
を有するペプチドと反応する、請求項１記載の方法。
【請求項９】
【表１０】
2008526699.tif 000072
をフェニルアラニンアミドと反応させることによって、
【表１１】
2008526699.tif 000073
が形成される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）式Ｚ−Ｗ−［ＳＵＰ］（式中、［ＳＵＰ］が支持体樹脂であり、Ｗがトリプトファン残基であり、ＺがＮＨ２末端保護基であり、Ｚ−Ｗが０．５以下の負荷因子で［ＳＵＰ］上に存在する。）の固相合成支持体樹脂を提供する段階、
（ｂ）
【表１２】
2008526699.tif 000074
を提供するため、アミノ酸をＺ−Ｗ−［ＳＵＰ］へ結合させる段階、
（ｃ）
【表１３】
2008526699.tif 000075
の開裂生成物を提供するため、
【表１４】
2008526699.tif 000076
を処理する段階、および
（ｄ）
【表１５】
2008526699.tif 000077
の合成のために、
【表１６】
2008526699.tif 000078
を使用する段階を含む、配列
【表１７】
2008526699.tif 000079
を有するペプチドを調製する方法。
【請求項１１】
段階（ｄ）において、
【表１８】
2008526699.tif 000080
を形成するため、
【表１９】
2008526699.tif 000081
がフェニルアラニンアミドと反応する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
【表２０】
2008526699.tif 000082
を提供するため、
【表２１】
2008526699.tif 000083
が
【表２２】
2008526699.tif 000084
と反応する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）ペプチド中間体断片が、０．５以下の負荷因子を利用する固体支持体上で合成された、配列
【表２３】
2008526699.tif 000085
のペプチド中間体断片を提供する段階、
（ｂ）溶液相において、配列
【表２４】
2008526699.tif 000086
を提供するため、
【表２５】
2008526699.tif 000087
をフェニルアラニンアミド残基と反応させる段階、および
（ｃ）溶液相において、
【表２６】
2008526699.tif 000088
を提供するため、
【表２７】
2008526699.tif 000089
を
【表２８】
2008526699.tif 000090
と反応させる段階を含む、配列
【表２９】
2008526699.tif 000091
を有するペプチドを調製する方法。
【請求項１４】
段階（ａ）において、前記ペプチド中間体断片が、０．５未満の負荷因子を利用して固体支持体上で合成された、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
段階（ａ）において、前記ペプチド中間体断片が、０．２〜０．５の負荷因子を利用して固体支持体上で合成された、請求項１３または１４記載の方法。
【請求項１６】
段階（ｂ）において、前記ペプチド中間体断片が、１〜１．５当量の量で支持体と結合したアミノ酸を利用して固体支持体上で合成された、請求項１３記載の方法。
【国際調査報告】
2008526699.tif 000092
2008526699.tif 000093
2008526699.tif 000094