(57)【要約】  ＲＮＡポリメラーゼの情報依存性を用いて、ＤＮＡ格子アレイ内での移動に適応可能な分子モーターとしての使用を可能にし、物理的構築物ならびに通常は無生物の物質および物体のようなカーゴを作動させ、移動させ、配置し、または変える材料および方法が記載される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カーゴに結合可能な高親和性結合ドメインを有しかつＤＮＡ鋳型に沿って移動可能なヌクレオチドポリメラーゼ酵素（ＮＰ）を含む、制御されかつ情報依存的な様式でカーゴを作動させる分子モーター。
【請求項２】
前記高親和性結合ドメインが、前記ＮＰへの付着または融合により可逆的または不可逆的に結合している、請求項１に記載のモーター。
【請求項３】
前記ＮＰがシングルサブユニットＮＰである、請求項１または２に記載のモーター。
【請求項４】
前記高親和性結合ドメインが前記ＮＰのＮ末端またはその近傍で結合している、請求項３に記載のモーター。
【請求項５】
前記結合ドメインが前記カーゴと固体表面とに結合可能である、請求項４に記載のモーター。
【請求項６】
前記高親和性結合ドメインがアミノ酸配列である、請求項４に記載のモーター。
【請求項７】
前記アミノ酸配列が、酵母ＧＡＬ４ポリペプチド配列、Ｚｉｆ２６８ジンクフィンガーポリペプチド配列、ストレプトアビジンポリペプチド配列、メタロチオネインポリペプチド配列、転写因子Ｓｐ１３０ポリペプチド配列、またはヒスチジン配列から選択される、請求項６に記載のモーター。
【請求項８】
前記高親和性結合ドメインがＤＮＡまたはＲＮＡ配列である、請求項４に記載のモーター。
【請求項９】
前記ＤＮＡまたはＲＮＡ配列がアプタマーである、請求項８に記載のモーター。
【請求項１０】
請求項３に記載され請求される、複数のヌクレオチドポリメラーゼを含む分子モーターの直線アレイ。
【請求項１１】
各モーターが異なる高親和性結合ドメインに融合している、請求項１０に記載のアレイ。
【請求項１２】
各モーターが異なるファージＮＰを含む、請求項１０または請求項１１に記載のアレイ。
【請求項１３】
二次元格子に並べられかつ配置されている、請求項１２に記載の複数の直線アレイ。
【請求項１４】
（ａ）ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するＤＮＡ鋳型と請求項１に記載の分子モーターとＤＮＡ鋳型の核酸に相補的な十分なヌクレオチド三リン酸との溶液に加えて安定なＥＣの形成をもたらすことにより開始複合体を作るステップと、
（ｂ）前記溶液を洗浄して過剰の基質を除去するステップと、
（ｃ）前記溶液に、安定なＥＣの位置から下流のＤＮＡ鋳型の核酸に相補的な１または複数のヌクレオチド三リン酸で構成される基質を加えるステップと、
（ｃ）前記溶液を、適切な転写条件下でインキュベートするステップと
を含む、情報依存的な様式でカーゴを作動させる方法。
【請求項１５】
前記開始複合体が、ポリメラーゼ結合部位から下流のＤＮＡ鋳型に相補的な少なくとも１４のヌクレオチド三リン酸を添加することにより形成される、請求項１４に記載のカーゴを作動させる方法。
【請求項１６】
連続様式で、ＤＮＡ鋳型配列中の連続する核酸のそれぞれに相補的なヌクレオチド三リン酸で構成される基質を加えるステップと、
各添加の後に前記溶液を洗浄して過剰の基質を除去するステップと
をさらに含む、請求項１５に記載のカーゴを作動させる方法。
【請求項１７】
ＮＰ酵素を、表面支持体またはリガンド配列に結合可能な高親和性結合ドメインに結合させることを含む、分子モーターの作製方法。
【請求項１８】
前記ＮＰ酵素がシングルサブユニットＮＰ酵素である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記高親和性結合メインが、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、あるいは酵母ＧＡＬ４ポリペプチド配列、Ｚｉｆ２６８ジンクフィンガーポリペプチド配列、ストレプトアビジンポリペプチド配列、メタロチオネインポリペプチド配列、転写因子Ｓｐ１３０ポリペプチド配列、β−ガラクトシダーゼポリペプチド配列またはヒスチジン配列から選択されるアミノ酸配列である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記高親和性結合ドメインが、前記ＮＰにそのＮ末端またはその近傍で融合されている、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
ヌクレオチドポリメラーゼ酵素は、自然界において遍在しており、バイオテクノロジー工業において広く使用されている。ＲＮＡポリメラーゼは、逆転写酵素およびＲＮアーゼＨと共に核酸増幅反応に用いられ、核酸配列に基づく増幅として知られる方法を用いて、目標のＲＮＡを増幅させる。これらはまた、タンパク質産生に必須のステップである、ＤＮＡ鋳型からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を合成するのにも広く用いられている。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型の存在下で相補ＤＮＡの形成を触媒するのに用いられる。
【０００２】
シングルおよびマルチサブユニットＲＮＡポリメラーゼ酵素が、自然界に存在する。マルチサブユニットＲＮＡポリメラーゼ酵素は、細菌、古細菌および真核生物において見出される。シングルサブユニットＲＮＡポリメラーゼ酵素は、一部のバクテリオファージ、ミトコンドリア、一部の真核生物のオルガネラにおいて見出され、一部の真核生物のプラスミドによりコードされている可能性がある。これらの両方の種類の酵素は、何ら明らかな配列または構造の相同性を共有しないが、これらの酵素は、同じ様式で転写の基本的なステップを行う。合成を開始するために、酵素は、ＤＮＡ鋳型の転写の開始部位の上流にある特異的プロモーター配列に結合する。次いで酵素は、開始シグナルの近傍の鋳型の二本鎖を分離させ（融解させ）て転写の「バブル」を形成し、下流のＤＮＡのコード鎖を鋳型としかつ１つのリボヌクレオチドをプライマーとして用いて、ＲＮＡ合成を開始する。転写の初期段階の間に、ＲＮＡポリメラーゼと上流のプロモーター配列との接触は保持されるが、活性部位は下流に移動する（拡張する）。このことが、短いＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの形成および転写バブルの伸長をもたらす。この転写の初期段階の間に、酵素は複数の開始サイクルに従事し、そこでは酵素がプロモーターから離れて移動することなく、短いＲＮＡ産物が合成されて、放出される（開始の非進行（ａｂｏｒｔｉｖｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ））。ハイブリッドが約８〜９塩基対（ｂｐ）の長さに達すると、プロモーター配列が放出され、融解したプロモーター領域が崩壊し、ＲＮＡの新生鎖の５’の端が移動され、より安定な伸長複合体（ＥＣ）をもたらす。
【０００３】
バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７  ＲＮＡＰ）は、核酸合成の研究においてプロトタイプとして用いられている。バクテリオファージＴ７  ＲＮＡＰのＥＣにおける構造が解明されている。Ｔａｈｉｒｏｖら、Ｎａｔｕｒｅ４２０（６９１１）：４３〜５０（２００２）；Ｔａｈｉｒｏｖら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５９：１８５〜８７（２００３）を参照されたい。不安定な開始複合体（ＩＣ）から安定なＥＣへの推移は、殻状構造をもたらすコンホメーション変化を伴う。下流のＤＮＡが深い溝に結合され、広い通路を通って８ｂｐのＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを含有する空洞に入る。この構造は、部分的に接近可能なチャネルと、基質の進入およびＲＮＡ産物の退出のための突出した孔とを含む。分子の内部のほぼ全体を覆う正電荷は、孔およびチャネルを通って外表面まで広がる。Ｔ７  ＲＮＡＰ  ＥＣの全体の構成は、マルチサブユニットＲＮＡＰのものによく類似しており、Ｔ７  ＲＮＡＰがＥＣ立体配置を達成する構造的機構は、細菌のＲＮＡＰにおいて観察されるステップと似ている。酵素がＥＣへの推移を行うような酵素の再構成は、一般にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）の間で一貫した主題のようである。Ｔａｈｉｒｏｖ，２００２，上記。
【０００４】
ＥＣが一旦形成されると、ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型から分離することなく非常に長いＤＮＡ（数万塩基）を転写することができる。各重合ステップでの複合体の前進は、ＤＮＡ鋳型における次の塩基に相補的なリボヌクレオチド基質の入手可能性に依存する。必要な基質が存在しなければ、ポリメラーゼの進行は停止される。停止した転写複合体は、通常、非常に安定であり、不足の基質を添加すると、転写が再開される。Ｇｏｐａｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．：４１１〜３１（１９９９）を参照されたい。転写複合体を固体表面に固定化することにより、制限された基質混合物の存在下に転写のサイクルを反復して行うことが可能になる。
【０００５】
Ｅ．ｃｏｌｉのマルチサブユニットＲＮＡＰの単一分子の研究は、ＲＮＡＰがＤＮＡ鋳型に沿って移動するにつれてかなりの力を働かせることができることを示している。このような研究において、酵素は固体表面に固定化された。（転写の結果としての）固定化された複合体を通るＤＮＡ鋳型の移動は、鋳型の下流端にレポーターリガンドをつなぐことにより監視した。Ｄａｖｅｎｐｏｒｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８７：２４９７〜２５００（２００１）；Ｈａｒａｄａら、Ｎａｔｕｒｅ４０９：１１３〜１５（２００１）；Ｍｅｈｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８３：１６８９〜９５（１９９９）；Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ７４：１１８６〜１２０２（１９９８）；Ｗａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２：９０２〜０７（１９９８）；Ｙｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０：１６５３〜５７（１９９５）を参照されたい。
【０００６】
例えばキネシン、ミオシンおよびＦ１−ＡＴＰアーゼのような生物モーターは、直線的な力または回転力を働かせ得ると記載されている。しかし、これらのいずれも、特に情報依存的な様式で精密に制御されていない可能性がある。
【０００７】
マルチサブユニットＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡＰが力を働かせ得ることが示されているが、生物モーターとしてのその使用は、おそらく以下の困難性から、示唆も試行もなされていない。内在性のマルチサブユニットＲＮＡＰは細胞増殖に必要とされるので、望ましいと思われるいずれの修飾も、致死的であると証明されるか、または細菌細胞培養からの均一なＲＮＡＰ集団の精製を困難または非効率的にする恐れがある。さらに、マルチサブユニットＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡＰを用いる実験は、ある部位で停止したときに、酵素が不可逆的に停止された状態（「行き止まり」複合体）になるか、またはＤＮＡ鋳型に沿って逆に滑り、回復前に新生ＲＮＡを切断し得る（「後戻り（ｂａｃｋｔｒａｃｋｉｎｇ）」）ことを示す。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡＰの単一分子の研究は、鋳型に沿った酵素の移動は一定でなく、転写伸長の進行は、明らかに無作為の性質の休止によりしばしば中断されることを示唆している。酵素活性におけるこれらの確率論的な中断は、上記の後戻りおよび停止の現象に関係するであろう。行き止まりまたは後戻り複合体の形成は、他のマルチサブユニットＲＮＡＰでも観察されている。これらの問題は、マルチサブユニットヌクレオチドポリメラーゼを分子モーター、すなわち構造物または分子の移動を作動させ得るモーターとして用いることを理論的には可能にするが、シングルサブユニットヌクレオチドポリメラーゼの使用に比べて工業的観点からより困難で実行不可能にする。
【０００８】
よって、情報依存的な様式で精密に制御できかつ簡単に操作できる、力を働かせることができる分子モーターを提供することは、有利である。このようなモーターは、生体分子または無機分子もしくは粒子を精密に安定して捕捉しかつ移動させる（すなわち作動させる）ことができ、ナノテクノロジーの種々の態様において有用に適用できるであろう。
【発明の概要】
【０００９】
一態様において、本発明は、「カーゴ」の様式で巨大分子または分子デバイスを作動させるための分子モーターである。該モーターは、１つまたは複数のリガンド（例えば「カーゴ」または構造要素であり得る）および／または固体表面への酵素の結合を可能にする高親和性結合ドメインを有し、かつ情報依存的な様式で移動および力を働かせる能力を有するヌクレオチドポリメラーゼ（ＮＰ）酵素を含む。
【００１０】
「情報依存的」により、我々は、ＲＮＡＰおよび結合した巨大分子もしくは粒子または分子デバイスの移動が、鋳型鎖の配列によって指示される、ポリメラーゼモーターにより組み込まれる次のリボヌクレオチド基質の入手可能性に依存することを意味する。ポリメラーゼの前進は、ＤＮＡ鋳型に相補的なリボヌクレオチドの入手可能性に依存するので、ポリメラーゼの移動は、各伸長サイクルの間に適切な基質を提供するかまたはしないことにより、配列特異的で情報依存的な様式で制御できる。
【００１１】
「高親和性結合ドメイン」により、我々は、ＲＮＡＰに融合し、かつ固体支持体または粒子あるいは別の配列または分子のいずれかの別の基質にＮＰを付着させる能力を有するかまたは与えるアミノ酸、ポリペプチドまたはタンパク質の配列を意味する。結合が可逆的な場合もあってよい。このような配列はまた、放出剤の添加または反応条件での改変時のみに放出される程度に十分強固に結合できなければならない。ｎＭ〜ｐＭ  Ｋｄの範囲の親和性を示す結合ドメインを含む配列は、用いることができるものの例である。多くの高親和性結合ドメインが当該技術において知られている。その例は、酵母ＧＡＬ４結合タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質のジンクフィンガードメイン、例えばＺｉｆ２６８、メタロチオネインの重金属結合ドメイン、転写因子Ｓｐ１３０のＤＮＡ結合ドメイン、またはストレプトアビジンタンパク質のストレプトアビジン結合ドメインである。また、ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマーを、高親和性で立体特異的結合ドメインを提供するアダプターとして用いてもよい。例えば、Ｚｉｆ２６８結合モチーフなどの規定された認識配列を含んで構築されたアプタマーは、ＮＰ酵素：Ｚｉｆ２６８融合タンパク質に結合できる。ＲＮＡＰは、ストレプトアビジンまたはストレプトアビジン複合化分子に高い親和性を有するビオチン化型にｉｎ  ｖｉｖｏで修飾してもよい。１つより多い結合ドメインをＮＰに結合させてもよい。
【００１２】
高親和性結合ドメインは、ＮＰまたはＤＮＡ鋳型の機能的能力が破壊または負に影響されない限り、その長さに沿ったいずれの部位でのＮＰへの付着または融合によっても、可逆的または不可逆的に結合できる。好ましくは、結合ドメインは、ＮＰのＮ末端またはその近傍で不可逆的な様式で結合する。
【００１３】
高親和性結合ドメインは、別の実体、構造物、基質またはデバイス（「カーゴ」）に結合可能でなければならない。カーゴは、実質的には何でもよく、別の固体支持体またはビーズ、生体小分子または巨大分子、ペプチドリガンド、ポリペプチド配列、タンパク質またはタンパク質の一部分、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、有用な特性を有し得る無機の物体または構造物、例えば半導体材料、重金属、磁性粒子を含む典型的に無生物の物質または物体、あるいは所望の光学的特性を示す材料であってよく、すなわち高親和性結合ドメインに結合しかつ修飾ＮＰ酵素の情報依存的移動により作動される能力を有するいずれのものも、カーゴとして用いることができる。
【００１４】
マルチサブユニットポリメラーゼの使用における不利な点が、シングルサブユニットヌクレオチドポリメラーゼの使用により克服できるので、後者は、モーターとして用いることが好ましい。いずれのシングルサブユニットヌクレオチドポリメラーゼでも分子モーターとして用いてよいが、特に好ましくは、バクテリオファージＴ７、Ｔ３、ＳＰ６およびＫ１１によりコードされるＲＮＡＰである。バクテリオファージのＲＮＡＰは、簡単に操作される構造的に単純なシングルサブユニットＲＮＡＰである。酵素をコードする遺伝子の操作は、新規な結合能力を付与する補助ドメインの追加を可能にする。ファージおよびその他のシングルサブユニットＲＮＡＰは細胞増殖に必要ではないので、改変された遺伝子は、宿主の生存能に影響を与えずに細菌細胞において発現できる。さらに、別個のプロモーター特異性を有するファージＲＮＡＰ、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６およびＫ１１は、容易に入手可能である。このことは、それぞれが鋳型の独特の位置に指向されかつ別個に制御できる複数のＲＮＡＰモーターの使用を可能にする。実施例において、Ｔ７  ＲＮＡＰを用いたが、これは、Ｔ７  ＲＮＡＰが最もよく研究され、理解されたヌクレオチドポリメラーゼ酵素だからである。しかし、酵素の機能的能力または活性が破壊または負に影響されない様式で高親和性結合ドメインを含むかまたは含むように修飾されていれば、いずれのヌクレオチドポリメラーゼ酵素（ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素を含む）を分子モーターとして用いてもよい。
【００１５】
シングルサブユニットヌクレオチドポリメラーゼは、マルチサブユニットヌクレオチドポリメラーゼの行き止まりおよび後戻りの傾向を欠いているようなので、これらが好ましい。Ｈｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＆Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ９：１４２〜５１（１９９７）を参照されたい。シングルサブユニットおよびマルチサブユニットのヌクレオチドポリメラーゼの両方は、種々の起源から容易にかつ公的に入手可能である。
【００１６】
ヌクレオチドポリメラーゼに高親和性結合ドメインが組み込まれ、これが酵素を固体表面またはリガンド（またはその両方）に結合することを可能にする。「結合する」により、高親和性の付着を形成することを意味する。よって、結合するとは共有的な付着も含む。「連結する」および「融合する」の用語を「結合する」と同じ様式で、同じ意味および意図で用いる。結合ドメインは、機能的活性に影響しない、すなわちＲＮＡを合成する酵素の能力に影響しない位置で、酵素に融合する。例えば、結合ドメインは、Ｔ７  ＲＮＡＰにそのＮ末端またはその近傍で融合してよい。以下の説明および実施例において、種々の高親和性結合ドメインを、本発明をどのように行うことができるかの例として、Ｔ７  ＲＮＡＰに付着させる。よって、当業者は、高親和性結合ドメインを用いて修飾されたさらなるＮＰを容易に設計しかつ試験できるはずである。また、本発明の分子モーターにより作動させるかまたは移動させることができる生体巨大分子の種類のいくつかの例を、例示して記載する。
【００１７】
別の態様において、本発明は、分子モーターを作製する方法を含む。この方法の第１ステップにおいて、ＮＰ酵素を、表面支持体またはリガンドに結合できる高親和性結合ドメインに融合させる。酵素は、この結合ドメインに可逆的または不可逆的に付着してよい。酵素は、シングルサブユニットまたはマルチサブユニットヌクレオチドポリメラーゼ酵素であってよい。高親和性結合ドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列またはアミノ酸配列であり得る。ＤＮＡおよびＲＮＡ配列の例は、ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマーを含む。アミノ酸配列の例は、酵母ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ポリペプチド配列、Ｚｉｆ２６８ジンクフィンガーＤＮＡ結合ポリペプチド配列、ストレプトアビジン結合ポリペプチド配列、メタロチオネイン結合ポリペプチド配列、転写因子Ｓｐ１３０からの配列特異的ＤＮＡ結合ポリペプチド、および６〜１５残基のヒスチジン配列を含む。実際には、カーゴとの強い結合を形成できる長さおよび性質を有する限りは、いずれのペプチド配列を用いてもよい。形成される結合はそれぞれ可逆的であってもよいし、ポリメラーゼとカーゴとの間の結合だけが可逆的であってもよい。高親和性結合ドメインは、ＮＰの酵素活性が保持される限り、ＮＰの長さに沿ってどこででもＮＰに結合、連結または融合することができる。好ましくは、高親和性結合ドメインは、ＮＰにそのＮ末端またはその近傍で結合、連結または融合する。高親和性結合ドメインのその他の特質は、当業者が容易に決定でき、モーターにより作動されるかまたは移動される所望の物質、リガンド、カーゴに依存する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、情報依存的な様式で物質を移動させるかまたはカーゴを作動させる方法を含む。この方法のステップにおいて、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）基質またはヌクレオチド三リン酸基質の混合物を含む溶液を、（ａ）ポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含むプロモーター配列を有するＤＮＡ鋳型と、（ｂ）本発明のヌクレオチドポリメラーゼ分子モーターとを含有する開始溶液と合わせる。ヌクレオチド三リン酸基質は、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰおよびＡＴＰを含む。ＤＮＡ鋳型の核酸に相補的なＮＴＰは、安定なＥＣ「開始複合体」の形成を可能にする組合せで加えられる。開始複合体が形成されるためには、少なくとも１４のヌクレオチドが転写されなければならない。開始複合体の形成の間にまたは順序づけられた様式で、３つの成分が同時に組み合わされてもよい。組み合わせたものまたは混合物を、適切な転写条件下にインキュベートして開始複合体の形成を可能にし、次いで洗浄して組み込まれなかった基質を除去する。モーターの制御された移動は、ＤＮＡ鋳型の引き続く（下流の）領域に相補的な基質を用いる基質の添加、インキュベーションおよび洗浄のステップのその後のサイクルの間に達成される。比活性およびヌクレアーゼ活性は、既知の方法および標準的な条件を用いて試験できる。
【００１９】
別の態様において、本発明は、複数の同一のファージヌクレオチドポリメラーゼで構成された分子モーターのアレイを含む。これらのポリメラーゼのそれぞれは、異なる高親和性結合ドメインに融合されてよく、それぞれが直線的な様式で並べられてアレイを形成してよい。さらにまたは代わりに、アレイは、複数の異なるファージヌクレオチドポリメラーゼで構成されていてよく、このことによりそれぞれが独特のプロモーター特異性を有するＲＮＡＰモーターの直線アレイが構築される。複数のこのような直線アレイは、二次元の格子に並べて配置してよい。
【詳細な説明】
【００２０】
ヌクレオチドの組込みの各サイクルの間に、ヌクレオチドポリメラーゼ酵素は、ＤＮＡ鋳型に沿って０．３４ｎｍ進み、３０ｐＮまでの直線的な力を働かせる。ポリメラーゼの前進は、鋳型鎖の配列によって指示される、組み込まれる次のリボヌクレオチド基質の入手可能性に依存するので、その移動は、適切な基質を提供するかまたはしないかにより制限できる。他の生物モーターは類似の力を発生できるが、精密さのレベルをもってまたは情報依存的な様式で制御可能なものではない。この様式で、ヌクレオチドポリメラーゼ転写複合体は、サイクル当たり１ヌクレオチドほど少ないかまたは数百もしくは数千のヌクレオチドほど多い複数のサイクルを介して進むことができる。
【００２１】
ヌクレオチドポリメラーゼを有用な作用の達成に利用するために、酵素を別の構造物に付着させる必要がある。ＲＮＡＰを分子モーターとして用いることの有用性を証明する予備的な研究において、我々は、Ｎ末端に高親和性結合ドメインを融合させて固体表面および他のＤＮＡ分子に結合可能とすることにより、バクテリオファージＴ７にコードされたシングルサブユニットＲＮＡＰを修飾した。次いで、我々は、制御された様式での単純なＤＮＡ構造の変化を証明した。これらの研究は、以下の実施例１および２に記載する。
【００２２】
種々の高親和性結合ドメインを用いた。まず、ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグを含有するように酵素を修飾し、タグを介してＮｉ＋＋−アガロースビーズまたはカラムに結合させた。次いで、ストレプトアビジンに高親和性を有する３８アミノ酸のＳＢＰペプチドタグを含有するようにＨｉｓ６タグ付加酵素を修飾した。ＳＰＢペプチドは、種々のストレプトアビジン複合化蛍光および酵素レポーター系と適合し、リガンドへのその結合は、ビオチンの添加により容易に元に戻せる。実施例２において、我々は、ストレプトアビジン複合化３２Ｐ−標識化ＤＮＡ断片をリガンドまたは「カーゴ」として用い、ＤＮＡ鋳型に沿ったＴ７  ＲＮＡＰの段階的な移動の間のカーゴの負荷、移動および放出を示す。これらの研究では、ＤＮＡをＮＰ分子モーターにより作動する生体巨大分子として用いたが、この技術は、他の分子または構造の移動に容易に適用可能である。例えば、ＮＰは、ＲＮＡまたはＤＮＡのリガンド特異的アプタマーに連結できる。ＮＰは、ストレプトアビジン結合タンパク質またはメタロチオネインなどの他のタンパク質からのリガンド特異的ペプチドドメインに直接融合できる。このようにして、ＮＰは、種々の生物学的、有機的または無機的カーゴを支えるのに用いることができる。
【００２３】
Ｔ７  ＲＮＡＰの結晶構造において、Ｎ末端は溶媒に曝露され、酵素の表面から離れて突出している。Ｓｏｕｓａら、Ｎａｔｕｒｅ３６４：５９３〜９９（１９９３）；ＪｅｒｕｚａｌｍｉおよびＳｔｅｉｔｚ，ＥＭＢＯ  Ｊ．１７：４１０１〜１３（１９９８）；Ｃｈｅｅｔｈａｍら、Ｎａｔｕｒｅ３９９：８０〜８３（１９９９）；Ｔａｈｉｒｏｖ２００２，上記；Ｙｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２９８：１３８７〜９５（２００２）。タンパク質ドメインの他のペプチドのこの領域への融合は、酵素活性にほとんど影響しないようである。Ｈｅ，上記；Ｂｅｎｔｏｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３５３〜６０（１９９０）；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：４８５１〜５７（１９９０）。
【００２４】
実施例において、我々は、３つの異なる生体巨大分子をＲＮＡＰのＮ末端領域に融合させ、それらを鋳型に沿って「カーゴ」として移動させるのに成功した。１つは配列特異的ＧＡＬ４結合ドメインであり、もう１つがＨｉｓ６ペプチドであり、３つ目がＳＢＰタグ付加ペプチドであった。広い範囲のストレプトアビジン複合化レポーター系が利用可能であるので、ＳＢＰタグ付加ペプチド修飾は、ＲＮＡＰ−リガンドの相互作用を監視するために特に有用である。しかし、他の結合モチーフ、特にタンデムＺｉｆ２６８のスリーフィンガーペプチドなどの配列特異的ＤＮＡ結合モチーフを生体巨大分子として用いることができる。このようなペプチドは、ＫｉｍおよびＰａｂｏ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：２８１２〜１７（１９９８）に記載されるようなフレキシブルな１１アミノ酸リンカー配列を用いて組み込んでよい。このことにより、非常に堅いＤＮＡへの結合を有するシックスジンクフィンガー融合タンパク質が得られる。
【００２５】
さらなる生体巨大分子は、転写因子Ｓｐ１およびメタロチオネインの重金属結合ドメインからの他のＤＮＡ結合ドメインで構成される融合タンパク質を含む。これらの融合タンパク質の構築に用い得る方法および材料は、Ｋａｄａｎａｇｅら、Ｃｅｌｌ５２：４８５１〜５７（１９９０）、およびＳａｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｃ．Ｓｃｉ．８９：１５３４〜３８（２００２）に開示されている。
【００２６】
ＤＮＡまたはＲＮＡのアプタマーは、「アダプター」または「リンカー」分子として用い得るさらなる高親和性結合ドメインである。アプタマーは、独特の構造に折り畳まれるそれらの能力のために、高い親和性および特異性をもって他の分子に結合できるランダムライブラリから選択される小さい核酸である。ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ、Ｎａｔｕｒｅ３４６：８１８〜８２８（１９９０）；ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：５０５〜１０（１９９０）を参照されたい。アプタマーのｎＭ〜ｐＭ  Ｋｄの範囲の堅い、すなわち高い親和性の結合が、有機分子、炭水化物、アミノ酸およびペプチドを用いて観察されている。Ｇｏｌｄら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：７３６〜９７（１９９５）；ＯｓｂｏｒｎｅおよびＥｌｌｉｎｇｔｏｎ、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７：３４９〜７０（１９９７）を参照されたい。類似の様式で、種々のリガンドに高い親和性を有する進化したペプチドを、発現ファージペプチドスクリーニングなどの選択方法により得てもよい。
【００２７】
アプタマーは、選択および核酸増幅の反復サイクルにより典型的に産生されるので、アプタマーを所望の特異性をもってＲＮＡＰモーターに連結させる最も直接的な方法は、増幅プライマー中に、規定された認識配列を組み込むことである。Ｚｉｆ２６８結合配列を、この目的のために用いることができる。認識配列は、Ｚｉｆ２６８：Ｔ７  ＲＮＡＰ融合タンパク質によるその後の結合のための「ハンドル」を提供するであろう。ＲＮＡアプタマーの代わりに、プライマーは、Ｚｉｆ２６８認識配列を含むＤＮＡオリゴマーに相補的な特異的単一鎖領域を含み得る。アプタマーおよびＤＮＡオリゴマーの相補領域のハイブリダイゼーションは、融合タンパク質がアプタマーを捕捉することを可能にするであろう。
【００２８】
リボヌクレオチドの存否に依存するために精密に制御することができるので、ＲＮＡＰは、分子モーターとしてのその適用可能性において独特の能力を提供する。ＲＮＡＰの他の材料への結合は、ナノロボティクス、サブナノメートルの精密さでのリガンドの配置または構造の変更、ならびに複雑な構造の集合および移動において実用性を見出す。例えば、現存する技術を用いて、ＲＮＡＰモーターのアレイを、固体表面に固定化されたＤＮＡ格子上に集合させることができる。アレイにおける各ＲＮＡＰの移動は、結合するＤＮＡ鋳型の配列に依存し、独立して制御できる。
【００２９】
以下の実施例は、プロトタイプＲＮＡＰ分子モーターとしてバクテリオファージＴ７  ＲＮＡＰを用いる。なぜなら、Ｔ７  ＲＮＡＰは、バクテリオファージＴ３、ＳＰ６、Ｋ１１などによりコードされるＲＮＡＰをも含むシングルサブユニット酵素の部類のプロトタイプだからである。構造および機能は類似しているが、各ファージＲＮＡＰは、それ自体のプロモーター配列について特異的である。我々は、この特異性の基礎が、ＲＮＡＰの結合間隙に突き出たＤＮＡ認識ループに関連することを示し、新規な特異性を有する変異ＲＮＡＰを作出した。Ｊｏｈｏら、Ｊ．Ｍｏ．Ｂｉｏｌ．２１５：３１〜３９（１９９０）；Ｋｌｅｍｅｎｔら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：２１〜２９（１９９０）；Ｒａｓｋｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２８：５０６〜１５（１９９２）；Ｒａｓｋｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：３１４７〜５１（１９９３）；Ｒｏｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：５１５〜５１９（１９９８）。ファージＲＮＡＰ系のこの特徴は、独特のプロモーター特異性を有するＲＮＡＰモーターの構築を可能にし、そのそれぞれを異なるリガンド結合ドメインに融合させてよい。よって、本発明は、バクテリオファージＴ７に限定されるべきではない。他のいずれのバクテリオファージからのＲＮＡＰも用いることができる。上記の文献に開示されるような作出された変異形は、用いることができ、かつ本開示の範囲内に含まれる。他のバクテリオファージ、例えばＴ３バクテリオファージからの修飾バクテリオファージＲＮＡＰも、用いることができかつ本開示の範囲内に含まれる。Ｔ３のヌクレオチド配列、その産生のためのプラスミド、そのプロモーターおよびＴ３を含むプロモーターカセットを有する転写ベクター、ならびにその他のファージＲＮＡＰプロモーターは、本明細書に参照として組み込まれる１９９１年５月２１日発行の米国特許第５０１７４８８号、１９９１年８月６日発行の米国特許第５０３７７４５号、および１９９２年４月７日発行の米国特許第５１０２８０２号に記載されている。さらに、ミトコンドリアまたはオルガネラのシングルサブユニットＲＮＡＰなどのいずれのシングルサブユニットＲＮＡＰ、および種々の非バクテリオファージ起源からのプラスミドＲＮＡＰも、等しく用いることができる。シングルサブユニットＲＮＡＰに固有の適応性は、特定の用途のためのＲＮＡＰモーターのアレイの設計において、大きい可能性を与える。
【００３０】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を例示して記載する。当業者は、過度の実験をすることなく本発明を修飾または変更することができるので、これらは本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００３１】
本発明で用いられる材料および方法は、それぞれがその開示の内容について本明細書に参照として組み込まれる、本明細書に引用される文献、およびＭａｎｉａｔｉｓ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９、ならびにＧｒｏｓｓｍａｎおよびＭｏｌｄａｖｅ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７９などの当該分野で用いられる公知のテキストに記載されている。
実施例１：Ｔ７  ＲＮＡＰの固定化および制御された移動
【００３２】
ＲＮＡＰを分子モーターとして用い得る多くの用途のために、酵素を固体表面に付着させることが必要である。このことを達成できるある方法は、ヘキサヒスチジンＨｉｓ６タグを含むように酵素を修飾することである。このタグは、酵素の性能に影響することなく、Ｎｉ＋＋アガロースビーズまたはカラムに酵素が堅く結合することを可能にする。例えばＶａｎ  Ｄｙｋｅら、Ｇｅｎｅ１１１：９９〜１０４（１９９２）を参照されたい。アミノ末端にヒスチジン残基を融合させるようにＴ７、Ｔ３およびＳＰ６ファージＲＮＡＰを修飾する方法論、修飾に用いられるオリゴヌクレオチドおよびその他の材料、ならびにＨｉｓタグ付加ＲＮＡＰを含有するプラスミドベクター（プラスミドｐＢＨ１１６、ｐＢＨ１１７、ｐＢＨ１６１、ｐＤＬ１９、ｐＤＬ２１、ｐＢＨ１１８、ｐＢＨ１７６およびｐＤＬ１８）は、特に本明細書に参照として組み込まれるＨｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ９：１４２〜１５１（１９９７）に詳細に開示されている。アミノ末端に付加するヒスチジン残基の数は重要ではなく、６〜１２の間が好ましい。さらに、Ｈｉｓリーダー配列は、トロンビン開裂部位を含むこともできる。これらの修飾は、酵素の特性または性能に影響せず、修飾が酵素の特性または性能に影響しない限りは、その他の修飾を行うことができる。
【００３３】
Ｈｉｓタグ付加ＲＮＡＰは、次いで、次のような制御された配列依存的な様式でＤＮＡ鋳型に沿って段階的に進む。Ｈｉｓタグ付加Ｔ７  ＲＮＡＰを、まず、プロモーター配列の始点から始まるＤＮＡ鋳型のものに相補的で、かつ安定なＥＣの形成を引き起こすのに充分な数および種類を含むリボヌクレオチド基質の制限された混合物の存在下に、ＤＮＡ鋳型とインキュベートした。我々には、プロモーター配列の始点から連続して下流のヌクレオチドで構成される少なくとも１４ヌクレオチドが必要であった。このことにより、停止したＥＣ開始複合体が形成された。次いで、ＥＣをＮｉ＋＋ビーズに吸着させ、組み込まれなった基質を洗浄して除去した。ＤＮＡ鋳型に沿ってＲＮＡＰが前進するためには、鋳型により特定されるリボヌクレオチドに相補的なリボヌクレオチドの存在が必要である。停止状態の開始複合体のＥＣは非常に安定であり、洗浄および伸長の複数のサイクルの間に鋳型に沿って連続して移動できる。伸長は、適切な基質の存在に厳密に依存し、１ヌクレオチドほど小さい増加、すなわち鋳型に沿って０．３４ｎｍの前進で制御できる。さらに、延長は、各ステップでほぼ定量的（＞９５％）である。
【００３４】
図１に示すように、アミノ末端でＮｉ＋＋アガロースビーズに固定されたＨｉｓ６タグ付加Ｔ７  ＲＮＡＰを、鋳型とインキュベートし、このことがプロモーターの開始部位（＋１）で始まる、記載された配列での転写を支配した。ステップ１において、ＲＮＡ合成は、ＧＴＰ、ＡＴＰおよびα−３２−ＵＴＰ（それぞれＧ、Ａおよび＊Ｕ）の添加により開始され、このことによりポリメラーゼがヌクレオチド（ｎｔ）位置＋１４まで前進し、安定なＥＣ開始複合体が形成された。ビーズをバッファーで洗浄し、次いでＣＴＰ（以下、Ｃ）、ＧおよびＡとインキュベーションし、このことによりポリメラーゼが位置＋１７まで前進した（ステップ２）。続いての転写サイクルは、図１の右下に記載される基質の存在下に行った。洗浄後、ステップ３において、Ｕ、ＣおよびＡの添加により、ポリメラーゼが位置＋２０まで前進した。再び洗浄した後、ＧおよびＡを添加すると、ポリメラーゼが位置２２まで移動した（ステップ４）。１９ヌクレオチドの鋳型の長さに沿って、８ステップを行った。洗浄および転写の各サイクルの後にサンプルを回収し、ＲＮＡ産物を、０．１％ＳＤＳ存在下の２０％ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動により分析した。複合ＳＤＳ−ｐａｇｅゲルを、図１の右上に示す。反応およびインキュベーション条件、容量、量、バッファーおよび酵素準備は、Ｔｅｍｉａｋｏｖら、Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＤＮＡ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ａ  ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ（Ｔｒａｖｅｒｓ，ＡＡ＆Ｂｕｃｋｌｅ，Ｍ編），ｐｐ３５１〜６４，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，２０００に開示された通りであった。
【００３５】
本実施例は、Ｎｉ＋＋ビーズに固定されたＴ７  ＲＮＡＰが、洗浄および重合の反復サイクルの間に、１４ｎｔほど大きく、または１ｎｔほど小さく、段階的にＤＮＡ鋳型に沿って「歩行」できることを証明する。各ステップでの延長の効率は非常に高く（＞９５％）、集団中の転写複合体のほとんどが各サイクルの間に延長したことを示した。
実施例２：結合したリガンドの捕捉および移動
【００３６】
作用するＲＮＡＰを利用するために、酵素を他の構造物またはリガンドに付着させることが必要である。ＲＮＡＰが転写の間に別の物体に結合する能力を証明するために、我々は、Ｈｉｓ６タグ付加Ｔ７  ＲＮＡＰを、ストレプトアビジンに対して高い親和性（ＫＤ＝２．５ｎＭ）を有する、さらなる３８アミノ酸のペプチド（ＳＢＰタグ）を含むように修飾した。この修飾に用いた方法および材料は、Ｋｅｅｆｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２３：４４０〜４６（２００１）に開示されている。ＳＢＰタグは、広い範囲のストレプトアビジン複合化蛍光および酵素レポーター系と適合し、リガンドへのその結合は、ビオチンの添加により容易に元に戻せる。この実験では、ビオチン複合化３２Ｐ−標識ＤＮＡ断片をレポーターリガンドとして用いた。
【００３７】
まず、ＳＢＰタグ付加ＲＮＡＰの開始複合体を、Ｇ、ＡおよびＵの存在下に、図２に示す配列のＲＮＡの合成に影響する鋳型とインキュベーションすることにより形成し、複合体をＮｉ＋＋アガロースビーズに固定化した（レーン１）。このことにより、ＲＮＡＰは、ｎｔの位置＋１４まで進み、安定なＥＣ開始複合体を形成した。洗浄後、複合体は、ＣおよびＧの添加によりｎｔ位置１６まで２ｎｔ「歩行」し（レーン２）、再び洗浄された。次いで、複合体を、ストレプトアビジンと複合させた４８ｂｐの３２Ｐ−標識ビオチン化ＤＮＡ断片と混合して洗浄した（カーゴ；レーン３）。次いでカーゴは、２サイクル、最初はＡの添加、次いでＣおよびＵの添加（間に洗浄ステップを挟む）の間に、位置＋１９まで歩行した（レーン４および５）。位置＋１９で、ビオチンの添加によりカーゴを溶出し（レーン６）、次いで、複合体は、ＡおよびＣの添加により再び前進した（レーン７）。実施例１と同様に、洗浄および転写の各サイクルの後に、サンプルを回収して、０．１％のＳＤＳの存在下に２０％ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動により分析した。複合のＳＤＳ−ｐａｇｅゲルを、図２の右側に示す。
【００３８】
上記と同じ材料および方法を用いて、いくつかの配列特異的ＤＮＡ結合ドメインをＲＮＡＰに融合させて、単純な分子間および分子内ＤＮＡデバイスを組み立てた。ある一連の実験において、酵母ＧＡＬ４結合タンパク質の一部分を、Ｏｓｔｒａｎｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１２６１〜６５（１９９０）と同じ様式、ならびに開示された材料および方法論を用いて、Ｔ７  ＲＮＡＰに融合させた。この修飾により、融合タンパク質が、１７ｂｐのＧＡＬ４認識配列を含むＤＮＡ断片に結合することが可能になる。別の実験において、マウス転写因子Ｚｉｆ２６８でみられる配列特異的ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを、Ｔ７  ＲＮＡＰに融合させた。このようなドメインは、融合タンパク質に新規な結合能力を付与するために、いくつかの別のタンパク質と融合されている。詳細な方法論については、Ｃｈｏｏ＆Ｉｓａｌａｎ，Ｃｕｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１〜１６（２０００）；Ｋｉｍ＆Ｐａｂａ，１９９８，上記；Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：５５２５〜３０（１９９７）；Ｓｍｉｔｈら、Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２７：６７４〜８１（１９９９）の開示を参照されたい。遺伝子操作の間に、それぞれが特異的な認識配列に結合するスリーフィンガーペプチドの大きい集団が得られ（Ｉｂｉｄ，上記）、これを用いて、上記の能力を有するカーゴについて構築され試験されたＳＢＰタグ付加ＲＮＡＰと同じ様式で能力を有するカーゴについて試験できる。
実施例３：単純なＤＮＡデバイスの構築
【００３９】
ＲＮＡＰモーターがＤＮＡ構造を再配置する能力を示すために、我々は、２つの単純なＤＮＡナノデバイスを構築した。１つ目のデバイスでは、我々は、補助配列特異的ＤＮＡ結合ドメイン、ＧＡＬ４結合ドメインをＴ７  ＲＮＡＰに融合させて、融合タンパク質が２つの異なるＤＮＡ領域、転写されている鋳型ＤＮＡの一部分と標的ＤＮＡとに同時に結合することを可能にした。鋳型に沿ってＲＮＡＰが移動すると、目標のＤＮＡの鋳型に対する相対的な配置が変化した。
【００４０】
この種類の複合体の形成および編成は、原子力顕微鏡（ＡＦＭ）により視覚化され、図３のパネルＡで見ることができる。一方の末端から１９５ｂｐにＴ７プロモーターを含む１００９ｂｐの鋳型ＤＮＡと、末端近傍にＧＡＬ４結合部位を含む２４４ｂｐの目標のＤＮＡを、当該技術において知られる標準的な方法を用いて、適切なプラスミドのＰＣＲ増幅により作製した。２つのＤＮＡ断片を、Ｇ、ＡおよびＵの存在下にＧＡＬ４：Ｔ７  ＲＮＡＰとインキュベートすることにより、鋳型ＤＮＡのプロモーターから２２ｎｔ下流に進む転写が可能であった。サンプルをホルムアルデヒドで固定化し、ＡＦＭ（タッピングモード）で視覚化した。ＡＦＭの結果を、図３のパネルＡに示す。比較のために、１ｋｂ離れてＴ７プロモーターおよびＧＡＬ４結合部位を含む、直線化したプラスミドを同じ様式で処理してＡＦＭにより視覚化した。結果を図３のパネルＢに示す。
【００４１】
図３に示すように、目標の配列は、第２のＤＮＡ分子（Ａ）または同じ分子（Ｂ）内に存在する。目標の配列が同じ分子内にあるとき、転写により、転写の方向に応じて次元が増加または減少し得るループが形成される。このデバイスを組み立てるために、目標の配列と転写される配列とを同じＤＮＡ分子内に配置する。融合タンパク質が目標の配列および転写される領域に同時に結合することにより、介在部分のループアウトをもたらす。転写される領域でのプロモーターの方向に応じて、ＲＮＡＰの移動は、ループのサイズを大きくするかまたは小さくするかのいずれかである。図３のＢを参照されたい。
実施例４：負荷の下でのＲＮＡＰモーターの力の測定
【００４２】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡＰを用いた以前の研究は、ＤＮＡに沿って酵素が移動するにつれて、酵素は３０ｐＮまでの直線的な力（最大出力（ｓｔａｌｌ  ｆｏｒｃｅ））および５ｐＮ−ｎｍの回転力を働かせ得ることを示した。我々は、シングルサブユニットＲＮＡＰが、類似のまたはより大きい力を働かせると予想する。これらの力を測定するために、マルチサブユニットＲＮＡＰ用に開発した方法およびアプローチを用いた。これらの方法およびアプローチは、Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ，２００１，上記；Ｗａｎｇ，１９９８，上記；Ｙｉｎ，１９９５，上記に詳細に開示されている。
【００４３】
実施例２において、我々は、ゲル電気泳動を用いて、リガンドを捕捉し、鋳型に沿って移動し、かつ結合したリガンドを放出するＴ７  ＲＮＡＰの能力を証明した。これらの実験は、ＲＮＡＰ：リガンド複合体の制御された移動を証明したが、プロセスを直接視覚化しなかったし、それに伴う力の測定も可能にしなかった。これらの問題点に対して以下に記載するアプローチにより取り組む。ここで、我々は、Ｔ７  ＲＮＡＰの回転モーターとしての使用を証明する。
【００４４】
ポリメラーゼが転写の間にＤＮＡに沿って前進するときに、ポリメラーゼは、転写複合体の先頭（下流）の端でＤＮＡヘリックスをほどき、後ろの端でＤＮＡを再び巻かなければならず、それによりＲＮＡＰに対するヘリックスの回転をもたらす。このことを達成するために、ＲＮＡＰは、約８ｂｐのＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを含む局所的に変性された転写バブルを作る。ＲＮＡＰがＤＮＡに沿って前進するにつれて、ＲＮＡＰは２本のＤＮＡ鎖をバブルの先頭の端でほどき、後ろの端で鎖を再びアニールしなければならない。図４を参照されたい。
【００４５】
ヌクレオチドの組込みの各ステップは、０．３４ｎｍの直線的な移動と３６°の回転とに相当し、ＤＮＡ鋳型の配列に影響される、次に入ってくる基質ヌクレオチドの入手可能性に依存する。ＲＮＡＰの移動は、適切な基質を加えるかまたは加えないかにより、情報依存的な様式で制御される。
【００４６】
回転モーターとしてのＴ７  ＲＮＡＰの可能性を調べるために、Ｔ７  ＲＮＡＰの伸長複合体を、Ｎｉ＋＋に対して高親和性を有するＴ７  ＲＮＡＰの修飾型（ヒスチジンタグ付加Ｔ７  ＲＮＡＰ）を用いて固体表面に固定化し、４ｋｂのＤＮＡ鋳型の下流端を、ビオチン−ストレプトアビジン連結により磁気ビーズにつないだ。鋳型の下流端は、ストレプトアビジン複合化２．８μｍ磁気ビーズにつなぎ、これはより小さい１．０μｍのビーズに付着させた。複合体を、２枚の密閉されたカバーグラススライドの間に注入し、Ｎｉ＋＋−ＮＴＡで予めコートした下のスライド上に固定化した。これらの手順は、図５Ａに示す。
【００４７】
この集合物を磁気ピンセットデバイスに入れ、そうすることで、ビーズが表面より上に配置されかつ顕微鏡で視覚化されることを可能にした。磁気ピンセットにより捕らえられた単一の磁気ビーズを視覚化した後に、基質の添加によりさらなる転写を開始し、ビーズの回転を視覚化して、１秒当たり２０フレームで記録した。図５Ｂに示すデータは、２．４秒の間隔に相当する。転写伸長の間に、らせん状の鋳型は、固定化されたＲＮＡＰを通過するにつれて回転し、この力は下流のＤＮＡを介して磁気ビーズに伝達される。この実験の条件下において、ビーズは、約３０ｒｐｍの速度で絶えず回転するのが観察された。ビーズのサイズおよび溶液の粘度に基づいて、我々は、ＲＮＡＰが、Ｆ１ＡＴＰについて報告された範囲内である約６０ｐＮ・ｎｍの回転力を働かせると推定する。鋳型は、ＤＮＡの配列に応じて、増加ステップにおいてビーズの回転の制御を可能にするように容易に設計できる。ＲＮＡＰモーターの動作は、印加された張力の広い範囲にわたって決定でき、活性な転写の間に、特に１つのｎｔの間隔での歩行の間に、または停止したときにどのようにモーターが作動するかを調べることができる。このことは、上記の実施例１〜２で１種または複数のＮＴＰを与えないとの修飾を施した初期の実験を繰り返すことにより達成される。次いで、転写プロセスの間の異なる段階でのＲＮＡＰモーターの実際の動作を評価することができる。
実施例５：ＲＮＡＰモーターのアレイの組立
【００４８】
上記の実施例３において、我々は、ＲＮＡＰ融合タンパク質と目標のＤＮＡ配列との間の分子間または分子内相互作用を伴う単純なＤＮＡナノデバイスの構築を記載した。本実施例において、我々は、ＤＮＡ鋳型上でのＲＮＡＰモーターのアレイの組立、すなわち固体表面上に固定化された「ブリッジ」を記載する。各モーターは、別個のリガンド特異性を有してよく、ブリッジ上の特定の位置に割り当てることができ、配列依存的な様式で鋳型に沿って独立して移動できる。
【００４９】
多くの用途について、ＤＮＡ鋳型を固体表面に固定することが必要であり、このことによりＲＮＡＰの軌道を制御できる。このことを行うには、２つの技術を用い得る。１つ目において、ＤＮＡの端の一本鎖領域を、表面に予め堆積した相補的なオリゴマーにアニールすることにより、表面上の２つの位置の間にＤＮＡブリッジを組み立てる。Ｂｒａｕｎら、Ｎａｔｕｒｅ３９１：７７５〜７８（１９９８）に開示されている材料および方法をこの目的のために用いてよい。図６に示すように、ＤＮＡブリッジは、ＤＮＡの端の一本鎖領域を、予め堆積したオリゴヌクレオチド（「アンカーオリゴ」）にアニールすることにより、２つの位置の間に組み立てられる。ＤＮＡのそれぞれの端について別々のオリゴマーを用いて、ブリッジ内の全ての鋳型が同じ配向を確実に共有するようにする。ブリッジＤＮＡにファージプロモーターを含めることにより、ＲＮＡＰモーターを、特定の位置でかつ特定の配向でブリッジに結合するように指向させることができる。独特のプロモーター特異性を有するファージＲＮＡＰ、例えばＴ７、Ｔ３、ＳＰ６およびＫ１１の利用可能性は、各ＲＮＡＰモーターが、ブリッジ上の特定の位置に配置されることを可能にする。異なる結合ドメインへの融合により、各ＲＮＡＰモーターは、特定のリガンドに結合するように加工される。ブリッジにおけるＤＮＡ集団は、同種（同種並列アレイ）または異種（異種並列アレイ）であり得る。近接するアレイにおいて、多くの別々のブリッジを同じ表面上に堆積できる。
【００５０】
あるいは、ＤＮＡは、ガラス表面に堆積させた疎水性パッチまたはストリップとの相互作用を介して固定化できる。付着の間にＤＮＡを伸ばす制御されたコーミング法を用いて、過度に伸ばされたＤＮＡは転写に適さないが、輪郭長（ｃｏｎｔｏｕｒ  ｌｅｎｇｔｈ）付近で堆積されたＤＮＡは、Ｔ７  ＲＮＡＰにより積極的に転写されたことが決定された。Ｇｕｅｒｏｕｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：６００５〜１０（２００２）；Ｇｕｅｒｏｕｉら、ＥＰＪ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２００３）に開示されている材料および方法を、この技術において用いる。転写は、蛍光標識リボヌクレオチド基質を、個別の複合体に組み込むことにより視覚化する。蛍光顕微鏡をフローセルにおいて簡便に用い、これが連続するステップの間に基質を交換しかつ送達するのに必須である。（この技術は、少なくとも１ｋｂ離れた複合体中の約１００ｂｐの可動域を解明できる。）結果として、上記の実施例１〜３で詳細に記載したＳＢＰドメインのタグを付加したＲＮＡＰを用い、ＲＮＡＰを、ストレプトアビジン複合化蛍光ビーズまたはナノドットへの結合により標識する。
【００５１】
以前の研究において、ブリッジ分子の集合物は、少なくとも約１０ｋｂ長のＤＮＡ鋳型、例えば全て同じ方向に配向された１７のファージプロモーターを含む４０ｋｂのバクテリオファージＴ７ゲノムを用いた。Ｇｕｅｒｏｕｉら、ＥＰＪ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２００３），上記を参照されたい。あるいは、鋳型は、５０〜１００ｂｐの増加で制御された移動を可能にするカセットの上流に位置する１または２のファージプロモーターのみを有するように構築してよい。プロモーターは、１ｋｂ離れており、直列または反対向きのいずれかの配向で並べられる。これらにより、ＲＮＡＰモーターの負荷密度およびいずれの配向でもそれらの相対的な運動を研究できる。
【００５２】
鋳型は、標準的な組換えの方法を用いて、バクテリオファージラムダまたはその他の公知のプラスミドもしくはベクターを用いて構築される。５０〜１００ｂｐの増加の歩行に適するカセットを構築するために、（ＧＡＵ）５０の組成をもつＣが少ない種類の（Ｃ−ｌｅｓｓ  ｒｕｎｓ）ＲＮＡの合成を指向するＤＮＡモジュールを合成する。このモジュールを、…ＣＣＣ…の独特の種類を含むリンカーを用いて直列に連結する。ＣまたはＧ、ＡおよびＵのいずれかを基質として提供するサイクルを交互に行うことにより、各サイクルの間に、ポリメラーゼを５０ｂｐの歩行または可動域に制限する。鋳型の構築および増加の間のＧＡＵ反復間の組換えを防ぐために、ＧＡＵモジュールの内部配列を、合成の間に無作為化する。
実施例６：二次元ＤＮＡ格子の構築
【００５３】
ある状況において、ＲＮＡＰモーターが配置され移動できるより複雑なＤＮＡプラットフォームを構築することが望まれるであろう。相補オリゴヌクレオチドの自己集合により構築される種々のＤＮＡ構築物は、当該技術において既に知られており、この目的のために適用することができるであろう。このようなＤＮＡプラットフォームを構築する材料および方法については、Ｃｈｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ３５０：６３１〜３３（１９９１）；Ｓｅｅｍａｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７：４３７〜４２（１９９９）を参照されたい。ＤＮＡのオリゴマーを、１００ｎｍの間隔で一定のパターンで堆積させた。オリゴマーは、その配列特異的結合特性を保持する。Ｄｅｍｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２９６：１８３６〜３８（２００２）。オリゴマーのこのようなパッチは、相補的な端を用いてＤＮＡ分子を繋ぎ止めるのに用いてよく、ＤＮＡ格子の指向された集合物を可能にする。研究により、固定化されたＤＮＡ分子を、二次的物質、例えば金コロイドまたは所望の電気的または機械的特性を有するその他の化合物が堆積または集合する足場として用い得ることが示されている。Ｂｒａｕｎ，１９９８，上記；Ａｌｉｖｓａｔｏｓ，Ｎａｔｕｒｅ３８２：６０９〜１１（１９９６）；Ｍｂｉｎｄｙｏら、Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．１３：２４９〜５４（２００１）；Ｍｉｒｋｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ：６０７〜０９（１９９６）。
【００５４】
あるいは、連結分子を加工して、配列特異的な様式の二次元ＤＮＡ格子の集合物を可能にすることができる。例えば、Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２の種類のスリーフィンガージンクタンパク質を、ＣｈｏｏおよびＩｓａｌａｎ、上記、Ｋｉｍ，上記、Ｌｉｕ，上記およびＳｍｉｔｈ，上記に開示される方法に従い、材料を用いて、高い親和性（Ｋｄ〜１０−１２Ｍ）を有する広い範囲のＤＮＡ配列に結合するように加工することができる。スリーフィンガードメインは、Ｋｉｍ，上記に開示される方法に従い、材料を用いて、互いに融合させることができ、これにより、さらに高い親和性（Ｋｄ〜１０−１５Ｍ）を有する１８ｂｐの認識配列に結合するシックスフィンガーペプチドがもたらされる。
【００５５】
これらのペプチドの２つを融合させることにより、二価の結合能力を有するペプチドを製造できる。２つの結合ドメインを一緒に結合させるためには、リンカーペプチドを用いるべきである。同じＤＮＡ分子内の近接する９ｂｐの２つの配列の認識のために、約１２アミノ酸のフレキシブルリンカー（スペーサまたはコネクタ）が必要である。Ｋｉｍ，上記。このリンカーを用いて、一方が９ｂｐのＺｉｆ２６８  ＤＮＡ配列に対する特異性を有し、他方が転写因子Ｓｐ１により認識される９ｂｐの配列に対する特異性を有する２つのスリーフィンガードメインを有する二価の「コネクタ」分子を構築する。
【００５６】
１つの目標のＤＮＡのみが存在するときは単独での、または両方の目的の分子が存在するときは一緒でのいずれかのこれらの目標の配列に対する融合タンパク質の結合を、当該技術において公知のゲルシフトアッセイにより決定する。２つの結合ドメイン間のより大きい間隔および柔軟性を可能にするために、ペプチドリンカーの長さを増大させるか、または介在タンパク質ドメインを挿入してよい。
【００５７】
このような二次元格子を図７に示すが、ここで、それぞれ別々の配列特異的結合能力を有する２つのジンクフィンガー結合ドメインを含む連結分子を用いて、固定化ブリッジＤＮＡ分子（水平の線）および交差する格子分子（垂直な線）に加工された目標の配列を連結する。ＲＮＡＰモーターのプロモーターは、ブリッジおよび交差する格子のＤＮＡ分子に加工してよく、このことにより、格子内でのモーターの配置および制御された移動が可能になる。Ｔ７  ＲＮＡＰ転写複合体は、ｌａｃリプレッサなどの結合したタンパク質を大きい効率で移動させるので、我々は、Ｔ７  ＲＮＡＰが上記のような二価のスリーフィンガー連結分子を移動できると予想する。Ｇｉｏｒｄａｎｏら、Ｇｅｎｅ８４：２０９〜１９（１９８９）を参照されたい。このことを確かめるために、当該技術において公知の標準的な転写アッセイを、連結タンパク質の存在下および不在下に、および／または接合（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）（非鋳型）ＤＮＡの存在下に、このような結合部位を含む鋳型に対して用いる。より高いＤＮＡ親和性を有するシックスフィンガーのジンクフィンガータンパク質を、同じ様式で用いてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】実施例１に詳細に説明するように、Ｈｉｓ６タグ付加Ｔ７  ＲＮＡＰの配列依存的な制御された移動を示す図である。
【図２】実施例２に詳細に説明するように、Ｔ７  ＲＮＡＰの制御された歩行の間の結合したリガンドの負荷および放出を示す図である。
【図３】簡単なＤＮＡデバイスを示す図であり、その構築および使用は実施例３に開示される。
【図４】実施例４で検討するような、転写の間のＤＮＡ鋳型に沿ったポリメラーゼ酵素の回転移動を示す図である。
【図５】実施例４で詳細に説明するように、固定化Ｔ７  ＲＮＡＰによる磁気ビーズの回転を測定する実験の結果を示す図である。
【図６】実施例５で詳細に検討するように、ＤＮＡブリッジ上の複数のＲＮＡＰモーターの並列アレイの構築を示す図である。
【図７】実施例６で詳細に検討するように、ＲＮＡＰモーターのためのプロモーターを含むＤＮＡの二次元格子の構築を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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