(57)【要約】  電流により生物学的材料を処理する方法が開示され、該方法では、生物学的材料を比較的高いイオン強度を有する少量のバッファー溶液に加える。予め設定された持続時間を有する高電圧パルスにより、バッファー溶液中で強い電界が生成される。生物学的材料は、少なくとも１００ｍｍｏｌ／Ｌのイオン強度を有する最大５０μＬのバッファー溶液に加える。少なくとも１０μｓの予め設定された持続時間を有する少なくとも１回の電圧パルスにより、バッファー溶液中で少なくとも１ｋＶ／ｃｍの電界強度を有する電界が生成される。ここで、電圧パルスは少なくとも１００μｓの持続時間にわたって少なくとも１回中断され、その後に再度継続される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
電流を用いて生物学的材料を処理する方法であって、以下のステップ：
少なくとも約１００ｍｍｏｌ／Ｌのイオン強度を有する、約５０μＬ以下のバッファー溶液を準備するステップ、
該バッファー溶液に生物学的材料を加えるステップ、
少なくとも約１０μｓの予め設定された持続時間にわたって該バッファー溶液に少なくとも１回の電圧パルスを印加して、少なくとも約１ｋＶ／ｃｍの電界強度を有する電界を生成するステップであって、該電圧パルスは少なくとも約１００μｓの持続時間にわたって少なくとも１回中断され、その後継続されること
を含む、上記方法。
【請求項２】
前記電圧パルスが、２回〜１０回中断される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
約２００μｓ〜約２ｍｓの持続時間が、前記電圧パルスの少なくとも１回の中断に対して予め設定されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記持続時間が、約３００μｓ、約４００μｓ、約５００μｓ、約６００μｓ、約７００μｓ、約８００μｓ、約９００μｓ、約１ｍｓまたは約１．５ｍｓである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
生物学的材料を含む前記バッファー溶液が、約１〜約５０μＬの総体積を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記体積が、約１０〜約４０μＬ、約１５〜約２５μＬまたは約１０〜約２０μＬである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記電圧パルスが、最大約１０ｋＶ／ｃｍの電界強度を有する電界を生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記電界強度が、約１〜約８ｋＶ／ｃｍ、約２〜約６ｋＶ／ｃｍまたは約２〜約４ｋＶ／ｃｍである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記電圧パルスが、最大約５ｍｓの予め設定された持続時間を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記予め設定された持続時間が、約２０μｓ〜約２ｍｓ、約１００〜約１０００μｓまたは約１００〜約６００μｓである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記電圧パルスが、約５μｓ、約１０μｓ、約２０μｓ、約３０μｓ、約４０μｓ、約５０μｓ、約６０μｓ、約１００μｓまたは約２００μｓの電圧付加時間後に中断される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記電界が２つの電極の間に生成され、該２つの電極間の距離が約０．５〜約５ｍｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記距離が、約１〜約４ｍｍまたは約１．５〜約２ｍｍである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記生物学的材料を反応容器中で処理し、該容器はほぼ正方形、長方形または円形の断面を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
反応容器がほぼ長方形の反応チャンバを有し、該チャンバは、平面平行配置にある２つの電極により横方向に画定されている、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的材料を電流で処理する方法に関する。特に、生物学的材料は比較的高いイオン強度を有する少量のバッファー溶液に加えられ、このバッファー溶液中で、予め設定された持続時間にわたって、高電圧パルスにより強い電界が生成される。
【背景技術】
【０００２】
例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質などの生物学的に活性な分子の生細胞への導入は、これらの分子の生物学的な機能の分析のために重要なツールである。細胞への外来性分子の導入のための好ましい方法はエレクトロポレーションであり、これは、化学的な方法とは異なり、他の生物学的に活性な分子の同時輸送によるものではない。エレクトロポレーションでは、外来性分子は、細胞に合ったバッファー溶液から、または細胞培養培地から、短時間の電流により細胞に導入される。短い電流パルスの作用により、細胞膜が外来性分子に対して透過性にされる。また、細胞懸濁液は、多くの場合、いわゆるキュベット、すなわち上部が開放された狭い容器に入れられ、該キュベットの内部は、互いに平行かつ向かい合わせに配置された２ペアの側壁により形成される。キュベットの内部は細胞懸濁液、すなわち通常はバッファー水溶液または細胞培養培地（処理対象の細胞が懸濁されている）を収容することができる。そのようなキュベットは、一般的には１ペアの向かい合わせの側壁の下側に１ペアの電極を備え、これにより電圧の印加が可能になる。これらの電極での放電は、電極間の、そして細胞懸濁液を通る電流をもたらし、核酸もしくは他の分子が細胞内に輸送されるようにするか、または選択された条件によっては細胞溶解を引き起こす。
【０００３】
強い電界の短時間の付加、すなわち高密度電流の短いパルスにより、細胞、細胞派生物、細胞内粒子および／またはビヒクルが融合する場合もある。このいわゆるエレクトロフュージョン（electrofusion）では、細胞はまず、例えば不均一な交流電界を介して、膜が近接した接触状態に置かれる。続く電界パルスの印加は、膜の一部分の結合をもたらし、これにより結果として融合が起こる。エレクトロフュージョンには、エレクトロポレーションに用いるのと同類の装置を用いることができる。
【０００４】
エレクトロポレーションの際には、生物学的に活性な分子は、最初に、細胞膜に一次的に開けられた「孔」（pore）を通って細胞質に入る。一部の場合には、該分子は目的とする機能を細胞質で既に発揮し、続いて、特定の条件では、核にも入る場合がある。特に、生物学的に活性な分子が核でのみ目的とする機能を発揮できる場合の用途、例えば、遺伝子の発現を解析しようとする場合、および特に、分裂しないか、するとしても低い分裂速度しか有しない細胞（例えば初代細胞）を用いる場合には、生物学的に活性な分子が直接的に核に輸送されるとすれば有利である。
【０００５】
ＵＳ２００４０１４２２０（参照によりその全文が本明細書中に組み入れられる）に開示されているエレクトロポレーション法から、上記のような場合には、高いトランスフェクション効率を達成するには、少なくとも２ｋＶ／ｃｍの電界強度を有する強い電界を、高電圧パルスにより少なくとも１０μｓの予め設定された持続時間にわたってバッファー溶液中に生成する必要があることが公知になっている。
【０００６】
高電流を用いて生物学的材料を処理する方法は、ＵＳ２００５０６４５９６からも公知である（参照によりその全文が本明細書中に組み入れられる）。該文献に開示された方法では、生物学的材料を少なくとも２００ｍｍｏｌ／Ｌのイオン強度を有するバッファー溶液に加えることにより、高いトランスフェクション効率を実現しながら細胞致死率を低くすることができる。
【０００７】
第一に、複数の反応バッチを同時に、かつ可能な限り短い時間で試験しなければならない生化学用途および製剤学的用途、特にＨＴ分析（ＨＴ＝ハイスループット）では、可能な限り多数の反応チャンバ（例えば９６または３８４）を準備することが必要である。この文脈で用いられる反応容器は、一般的には、マルチウェルプレート、マイクロタイタープレートまたはマルチウェルと呼ばれる。これらの容器の個々の反応チャンバ（「ウェル」）は、比較的小型で、したがって少量しか収容することができない。さらに、多くの場合、バッファーおよび細胞材料を節約するために、より少ないサンプル体積を用いることが有利である。また、特に、貴重な細胞材料（例えば初代細胞）の場合には、通常、少量の細胞しか利用することができない。よって、小さなサンプル体積を用いることは、大抵は望ましいことであり、一部の場合には必要なことである。
【０００８】
電気的加水分解は、液体中で強い電界を生じさせる場合には副次的効果として排除することができない。最も穏やかなケースで、電解は電極表面での気泡（gas bubble）の発生により感知することができ、気泡の発生は続いて泡（foam）の生成をもたらす。極端なケースでは、爆発型の気体の発生が起こり、これが、結果として生じる排除効果（displacement effect）により電極間の領域からのサンプルの飛び出し（expulsion）を引き起こす（以下では「飛び散り」（spattering）と称する）。後者は一般的にはサンプル損失か、または少なくとも予定している時間の間、電界中にサンプルが残っていない状態をもたらす。したがって、サンプルの飛び散りは、試験の結果もしくはサンプルの処理を定性的におよび／または定量的に損なわせ、さらに試験結果の再現性に悪影響を及ぼす。つまり、電界中での生物細胞の処理が必要な種々の用途では（特にエレクトロポレーションの際には）、電解は望ましくない副次的効果を構成する。
【０００９】
理論上は、飛び散りの発生確率は電気伝導度を下げることにより低減することができるであろう。しかしながら、堅固な細胞壁を有しない高等生物の細胞は、通常は特定の浸透圧の溶液中でしか生存することができない。一般的には、電解質も浸透活性を有する溶解物質に含まれ、溶液に多少なりとも高い電気伝導度をもたらす。例えば、エレクトロポレーションを行うためには、通常は細胞懸濁液にイオンを含めることが必要とされ、また、ＵＳ２００５０６４５９６（参照によりその全文が本明細書中に組み入れられる）に開示されているように、それは有利でもある。つまり、実施上の理由から、電気伝導度を低下させることにより飛び散りの発生確率を低下させることには限界がある。したがって、上記のような場合には、様々な程度での電解を予期することができる。
【００１０】
ここで、飛び散りの発生は確率的な事象である。このことは、この現象を確率でしか説明できないことを意味する。指定された条件によっては、望ましくない飛び散りの発生頻度は、例えば５％よりも低い場合もあるし、また９５％を超えることもあり得る。結果として、飛び散りの発生確率は、高い電流密度で少量を用いる場合に特に高い。１つのプロセスを製品製造段階に発展させるためには、適切な方法によりこの確率を低下させることが課題となり、適切な方法とは消費者により用いられて確率を例えば１％未満とするものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
すなわち、本発明により解決しようとする課題は、電極間の領域からのサンプルの望ましくない飛び出しの発生頻度を著しく低下させる、上記のタイプの方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の課題は、本発明の方法により解決される。該方法では、生物学的材料を、少なくとも約１００ｍｍｏｌ／Ｌのイオン強度を有する最大約５０μＬのバッファー溶液に加え、該バッファー溶液中で、少なくとも約１ｋＶ／ｃｍの電界強度を有する電界が、少なくとも１回の電圧パルスにより少なくとも１０μｓの予め設定された持続時間にわたって生成される。電圧パルスは、少なくとも約１００μｓの持続時間にわたって少なくとも１回中断され、その後継続される。ここで、電圧パルスの予め設定された持続時間は、中断を含めないパルスの現実の持続時間に対応する。すなわち、それは電流が実際に流れる合計時間に対応する。つまり、電圧パルスが中断される追加の時間の結果として、パルスの合計の持続時間は延長され、それにより、開始から終了までの電圧パルス、すなわち予め設定された持続時間に達するまでの電圧パルスは、実際には予め設定された持続時間よりも長くなる。本発明の方法では、電圧パルスを、予め決められた時間の後に予め決められた持続時間にわたって中断し、その後継続する。このプロセスを、電圧パルスの予め設定された持続時間に達するのに必要な回数、繰り返す。これに関して、電圧パルスは、バッファー溶液中の気体の発生を十分に低減して、電極間の領域からのサンプルの飛び出しを防止するのに十分な頻度で中断する必要がある。また、個々の中断の持続時間は、電極間の領域からのサンプルの飛び出しを防止するのに十分に長くする必要がある。つまり、電圧パルスを中断することにより、用いる方法の効率、特にトランスフェクション効率を維持したままで、上記以外は指定された条件の下で、飛び散りの発生頻度を顕著に低下させることができる。
【００１３】
望ましくない飛び散りの発生頻度は、一方で、例えばエレクトロポレーションの際には、電流密度（電界強度×比電気伝導度）および電界が印加される時間に正に依存する。ここで、電流密度および時間は、サンプル体積あたりに電解により生じる気体の量に直接的に関連する。電界強度および時間により、例えば高いトランスフェクション効率または分子の核への直接的な輸送が達成される条件が決定される。これら２つのパラメータのうち一方の、細胞タイプに特異的な最適条件からの低減は、通常、試験結果が定性的および／または定量的にはずれることにつながる。つまり、これらのパラメータのうち一方を低減することは不可能であるか、または限られた範囲でしか認められない。他方では、飛び散りの発生確率は、サンプルの体積（かさ（mass））に負に依存する。この依存は、より大きな体積がより不活性であることによる。短い時間枠の中では、比較的大きな体積はキュベット間隙中に残り易いように思われる。つまり、小さな体積では、それ以外は同等な条件であれば、飛び散りは特に頻繁に起こる。したがって、この飛び散りについての問題は、ＨＴの分野の方法では特に重要な役割を持つ。しかしながら、特定の用途、特にハイスループットの分野では、サンプルの体積は大きくすることができない。また、増大する体積の多数のサンプルは自動液体操作システムでは扱うことができないか、または大きな費用を用いなければ扱うことができず、また、利用可能な細胞材料の量（および場合によっては試薬の量）は、それに伴うコストの面から制限される場合が多い。さらに、大きな体積の使用は、他の理由から不利である。細胞濃度の低下は、例えばエレクトロポレーションの際の細胞生存率に関して、またはエレクトロフュージョンの効率に関して、一部の点から、目立った劣悪な結果をもたらす。つまり、特にＨＴ法では、体積の増加は、事実上、選択肢ではない。したがって、本発明の方法は、それ以外は既定の条件の下で、飛び散りの発生頻度を効率的かつ信頼性高く顕著に低減することを可能にする。
【００１４】
本発明の有利な実施形態では、電圧パルスは２〜１０回中断され、３回、４回、５回、６回、７回、８回および／または９回がこれに含まれる。ここで、中断の回数は予め設定された条件に依存し、特に、電流密度、パルスの持続時間および利用可能な体積に依る。中断の最適回数は、多くの場合、個々の用途および／または用いる細胞タイプについて経験的に決定しなければならない。しかしながら、そのような経験的な決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００１５】
本発明によれば、少なくとも１回の中断について、約２００μｓ〜２ｍｓ、好ましくは約３００μｓ、約４００μｓ、約５００μｓ、約６００μｓ、約７００μｓ、約８００μｓ、約９００μｓ、約１ｍｓまたは約１．５ｍｓの持続時間を予め設定することができる。中断時間が一定の長さを超えない限り、方法の結果の質に悪影響を及ぼすことなく、サンプルの飛び散りを防止することができる。したがって、最適な中断の持続時間および／または中断回数は、それぞれ、通常は個々の用途および／または用いる細胞タイプについて経験的に決定しなければならない。しかしながら、そのような経験的な決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。飛び散りの発生確率の低減に必要とされる持続時間はまた、特に予め設定された条件、すなわち電流密度、パルスの持続時間および利用可能な体積に依存する。
【００１６】
生物学的材料を含むバッファー溶液の体積は、例えば、総量で約１〜約５０μＬ、好ましくは約１０〜約４０μＬ、特に好ましくは約１５〜約２５μＬ、特に約１０〜約２０μＬとすることができる。また、用いる体積は一般的に、生物学的材料の利用可能性および／または化学的処理条件に依存する。
【００１７】
本発明の別の有利な実施形態では、電圧パルスが最大約１０ｋＶ／ｃｍ、好ましくは約１〜約８ｋＶ／ｃｍ、特に好ましくは約２〜約６ｋＶ／ｃｍ、特に約２〜約４ｋＶ／ｃｍの電界強度を有する電界をつくり出す。そのような高電圧パルスは、真核細胞のエレクトロポレーション、とりわけ核への核酸の導入には特に好適である。
【００１８】
本発明の別の有利な実施形態では、電圧パルスは最大約５ｍｓ、好ましくは約２０μｓ〜約２ｍｓ、特に好ましくは約１００〜約１０００μｓ、特に約１００〜約６００μｓの予め設定された持続時間を有する。これに関して、予め設定された持続時間とは、中断を含めない電圧パルスの既定の長さ、すなわち、電流が実際に印加され、電流が流れている時間である。予め設定された持続時間は、一般的には経験的に決定される値であり、個々の用途および／または用いる細胞タイプに最適なものである。特に、本発明の方法により提供される電圧パルスの中断によって、効率がわずかに低下することが予想される用途では、そのような低下した効率は、一部のケースでは、例えば経験的に決定した値を超えて、一定の限度まで該予め設定した持続時間を延長することにより改善することができる。このようにして、電圧パルスを中断することの考えられる悪影響を個々の場合で相殺することが可能である。
【００１９】
本発明の有利な実施形態では、さらに、電圧パルスは約５μｓ、約１０μｓ、約２０μｓ、約３０μｓ、約４０μｓ、約５０μｓ、約６０μｓ、約１００μｓまたは約２００μｓの電圧付加時間（voltage interval）の概ね後に中断される。これは、第１の電圧付加時間、または１回以上の後続の電圧付加時間に当てはめることができる。したがって、電圧付加時間とは、バッファー溶液中で電圧が印加され、電界が生成される時間であり、これには中断時間（interruption interval）が続くか、または中断時間がこれに先行する。特定の条件では、１回以上の電圧付加時間を短くすることにより、飛び散りの発生確率をさらに低下させるか、かつ／または最小化することができる。
【００２０】
本発明によれば、電界は２つの電極の間に生成されるものであり得る。２つの電極間の距離は、本発明の特に有利な実施形態では、約０．５〜約５ｍｍ、好ましくは約１〜約４ｍｍ、特に約１．５〜約２ｍｍとすることができる。いずれの場合にも、電極間の距離は、用いる反応容器の形状により画定されるべきものであり、それにより利用可能なバッファー溶液の体積が電極間の領域を十分にぬらすことができる。
【００２１】
本発明の有利な実施形態では、さらに、生物学的材料の処理を、ほぼ正方形、長方形または円形の断面を有する反応容器中で行う。また、反応容器がほぼ長方形の反応チャンバを備え、該チャンバは平面平行配置にある２つの電極により横方向に画定されていてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下に、例として図面を参照して、本発明をさらに詳しく説明する。
【００２３】
図面の簡単な説明
図１は、電圧に依存した飛び散り発生頻度の棒グラフである。条件等は以下のとおりである：ハイスループットＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）（ＨＴ−ｂｅｔａ、Ａｍａｘａ  ＧｍｂＨ）；細胞懸濁液の体積：２０μＬ；キュベットのギャップ幅：１．５ｍｍ；バッファー溶液のイオン強度：２０３ｍｍｏｌ／Ｌ（電気伝導度：１１．３ｍＳ／ｃｍ）；黒く塗りつぶした領域は個々のサンプルの飛び散り発生頻度を表す。；ｎ＝サンプル数。
【００２４】
図２は、パルス持続時間に依存した飛び散り発生頻度の棒グラフである。条件等は以下のとおりである：ハイスループットＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）（ＨＴ−ｂｅｔａ、Ａｍａｘａ  ＧｍｂＨ）；細胞懸濁液の体積：２０μＬ；キュベットのギャップ幅：１．５ｍｍ；バッファー溶液のイオン強度：１２９ｍｍｏｌ／Ｌ（電気伝導度：７．２ｍＳ／ｃｍ）；黒く塗りつぶした領域は個々のサンプルの飛び散り発生頻度を表す。；ｎ＝サンプル数。
【００２５】
図３は、電圧パルスの中断持続時間に依存した飛び散り発生頻度の棒グラフである。条件等は以下のとおりである：ハイスループットＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）（ＨＴ−ｂｅｔａ、Ａｍａｘａ  ＧｍｂＨ）；細胞懸濁液の体積：２０μＬ；キュベットのギャップ幅：１．５ｍｍ；バッファー溶液のイオン強度：２０３ｍｍｏｌ／Ｌ（電気伝導度：１１．３ｍＳ／ｃｍ）；黒く塗りつぶした領域は個々のサンプルの飛び散り発生頻度を表す。；ｎ＝サンプル数。
【００２６】
図４は、中断されない電圧付加時間の最大持続時間に依存した飛び散り発生頻度の棒グラフである。条件等は以下のとおりである：ハイスループットＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）（ＨＴ−ｂｅｔａ、Ａｍａｘａ  ＧｍｂＨ）；細胞懸濁液の体積：２０μＬ；キュベットのギャップ幅：１．５ｍｍ；バッファー溶液のイオン強度：２０３ｍｍｏｌ／Ｌ（電気伝導度：１１．３ｍＳ／ｃｍ）；黒く塗りつぶした領域は個々のサンプルの飛び散り発生頻度を表す。；ｎ＝サンプル数。
【００２７】
図５は、バッファー溶液の電気伝導度および／またはイオン強度に依存した飛び散り発生頻度の棒グラフである。条件等は以下のとおりである：ハイスループットＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）（ＨＴ−ｂｅｔａ、Ａｍａｘａ  ＧｍｂＨ）；細胞懸濁液の体積：２０μＬ；キュベットのギャップ幅：１．５ｍｍ；黒く塗りつぶした領域は個々のサンプルの飛び散り発生頻度を表す。；ｎ＝サンプル数；バッファー１：イオン強度２０３ｍｍｏｌ／Ｌ、電気伝導度：１１．３ｍＳ／ｃｍ；バッファー２：イオン強度１２９ｍｍｏｌ／Ｌ、電気伝導度：７．２ｍＳ／ｃｍ。
【００２８】
図６は、細胞懸濁液の体積に依存した飛び散り発生頻度の棒グラフである。条件等は以下のとおりである：ハイスループットＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）（ＨＴ−ｂｅｔａ、Ａｍａｘａ  ＧｍｂＨ）；キュベットのギャップ幅：１．５ｍｍ；バッファー溶液のイオン強度：１２９ｍｍｏｌ／Ｌ（電気伝導度：７．２ｍＳ／ｃｍ）；黒く塗りつぶした領域は個々のサンプルの飛び散り発生頻度を表す。；ｎ＝サンプル数。
【００２９】
図７は、細胞懸濁液の体積に依存した飛び散り発生頻度の棒グラフである。条件等は以下のとおりである：ハイスループットＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）（ＨＴ−ｂｅｔａ、Ａｍａｘａ  ＧｍｂＨ）；キュベットのギャップ幅：１．５ｍｍ；バッファー溶液のイオン強度：２０３ｍｍｏｌ／Ｌ（電気伝導度：１１．３ｍＳ／ｃｍ）；黒く塗りつぶした領域は個々のサンプルの飛び散り発生頻度を表す。；ｎ＝サンプル数。
【００３０】
図８は、電圧パルスの中断持続時間に依存したトランスフェクション効率の棒グラフである。条件等は以下のとおりである：ハイスループットＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）（ＨＴ−ｂｅｔａ、Ａｍａｘａ  ＧｍｂＨ）；キュベットのギャップ幅：１．５ｍｍ；バッファー溶液のイオン強度：２０３ｍｍｏｌ／Ｌ（電気伝導度：１１．３ｍＳ／ｃｍ）；トランスフェクション効率の検出のために、それぞれ２×１０５個のＨＥＫ２９３細胞を２０μＬのバッファー溶液に入れ、０．１μｇのｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、４ｋＶ／ｃｍの電界に曝露する。次いで細胞をイーグル最小必須培地（ＡＴＣＣ）に入れ（培地は１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１０％ウマ血清（ＡＴＣＣ）を含む）、湿潤化インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ２にて２４時間培養した。最後に、サンプルをフローサイトメトリーによりＧＦＰ発現について試験した（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。ＧＦＰ発現細胞のパーセンテージのそれぞれ２回分の値を示している。棒グラフ中の文字は電界曝露の中断に関する；すべてのデータはμｓで示し、最初と最後の数字はそれぞれ中断されない電圧付加時間の持続時間を表し、水平の線の間の数字はその間の中断持続時間を表す（Ｐ＝ｐａｕｓｅ）。
【００３１】
図９は、電圧パルスの中断持続時間に依存したトランスフェクション効率の棒グラフである。条件等は以下のとおりである：ハイスループットＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）（ＨＴ−ｂｅｔａ、Ａｍａｘａ  ＧｍｂＨ）；キュベットのギャップ幅：１．５ｍｍ；バッファー溶液のイオン強度：２０３ｍｍｏｌ／Ｌ（電気伝導度：１１．３ｍＳ／ｃｍ）；トランスフェクション効率の検出のために、それぞれ２×１０５個のｊｕｒｋａｔ  Ｅ６．１細胞を２０μＬのバッファー溶液に入れ、１μｇのｐｍａｘＧＦＰ（Ａｍａｘａ）を添加し、１．２５ｋＶ／ｃｍの電界に曝露する。次いで細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地（ＡＴＣＣ）に入れ（培地は１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１０％ＦＣＳ（ＡＴＣＣ）を含む）、湿潤化インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ２にて２４時間培養した。最後に、サンプルをフローサイトメトリーによりＧＦＰ発現について調べた（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。ＧＦＰ発現細胞のパーセンテージのそれぞれ２回分の値を示している。棒グラフ中の文字は電界曝露の中断に関する；すべてのデータはμｓで示し、最初と最後の数字は中断されない電圧付加時間の持続時間を表し、水平の線の間の数字はその間の中断持続時間を表す（Ｐ＝ｐａｕｓｅ）。
【実施例】
【００３２】
種々の好ましい実施形態の詳細な説明
図１は、２種類の異なる電圧パルスの比較の形での、それぞれ中断あり、または中断なしで実施した、電圧に依存した飛び散り発生頻度の棒グラフである。第１の電圧パルスは外部印加電圧８００Ｖで１００μｓの予め設定した持続時間を有する。これは約４ｋＶ／ｃｍの電界強度をもたらす（電界強度は電圧および電極抵抗から算出することができる）。第２の電圧パルスもまた１００μｓの予め設定した持続時間を有するが、印加電圧は１０００Ｖである。電界強度は約５ｋＶ／ｃｍであり、これは電圧から算出することができる。２種類の電圧パルスを、それぞれ４０μｓ後（Ｔ１ｍａｘ）に２回中断した。すなわち、パルスは４０μｓ後に中断され、その後継続され、さらに４０μｓ後に再度中断され、最後に電圧付加時間２０μｓで完了し、それにより合計の予め設定された持続時間は１００μｓに達した。中断の持続時間は、それぞれ８００μｓである（Ｔ１ｐａｕｓｅ）。したがって、全体として、電圧パルスは３回の電圧付加時間と２回の中断時間からなり、パルスの全体の持続時間は合計で１７００μｓである。ここで、予め設定された条件下で、より低い電圧および／または電界強度での電圧パルスの印加は、サンプルの飛び出しをもたらさないことが明らかである。すなわち、この場合には飛び散りは起こらない。それと比較して、比較的高い電圧および／または電界強度での電圧パルスは、サンプルの飛び出しを引き起こす（３番目のバー）。この望ましくない飛び散りは、電圧パルスを２回中断することにより防ぐことができる（最後のバー）。したがって、一方では、それ以外は一定の条件下での飛び散りの発生確率は、電界強度を上げることにより高くなることが示され、他方では、反応容器からのサンプルの飛び出しは、非常に高い電界強度であっても、電圧パルスの中断により防ぐことができることが示されている。少なくとも、パルスの中断により、飛び散りの発生確率は顕著に低下している。
【００３３】
図２は、パルス持続時間に依存した飛び散りの発生頻度の棒グラフを示す。ここで、それぞれ７００Ｖの強さで（電界強度３．５ｋＶ／ｃｍ）、２００μｓ、３５０μｓ、４００μｓおよび６００μｓと増大する、予め設定された持続時間を有する電圧パルスが用いられた。飛び散りの発生頻度のパーセンテージが、パルス持続時間の増大に伴い大きくなることが示された。しかしながら、６００μｓの最も長い持続時間を用いて、本発明により電圧パルスを中断すると、サンプルの飛び散りを効果的に防ぐことができた。このために、電圧パルスをそれぞれ２００μｓ後（Ｔ１ｍａｘ）に２回中断した。すなわち、パルスは２００μｓ後に中断され、その後継続され、さらに２００μｓ後に再度中断され、最後に再度の２００μｓの電圧付加時間により完了され、それにより合計の予め設定された持続時間は６００μｓに達した。中断の持続時間はそれぞれ２．５ｍｓ（Ｔ１ｐａｕｓｅ）とした。全体として、各電圧パルスは３回の電圧付加時間と２回の中断時間からなり、パルスの全体の持続時間は合計で５．６ｍｓである。これにより、電圧パルスの比較的長い予め設定された持続時間では、サンプルの飛び出しに至る確率が高いことが明らかになっている（４番目のバー）。この望ましくない飛び散りは、電圧パルスを２回中断することにより防ぐことができる（最後のバー）。したがって、一方では、それ以外は一定の条件下での飛び散りの発生確率は、パルス持続時間が長くなると大きくなることが示され、他方では、反応容器からのサンプルの飛び出しは、比較的長い予め設定された持続時間であっても、電圧パルスを中断することにより防ぐことができることが示されている。
【００３４】
図３は、電圧パルスの中断の持続時間に依存した飛び散りの発生頻度の棒グラフである。この実施例からは、少なくとも特定の用途および／または条件では、中断の持続時間を延長することにより、サンプルの飛び出しの発生確率をさらに低下させることができることが明らかである。７００Ｖの電圧（電界強度３．５ｋＶ／ｃｍ）および６００μｓの予め設定された持続時間での電圧パルスを、中断しないで（１番目のバー）、４００μｓずつ１１回中断して（２番目のバー）、または８００μｓずつ１１回中断して（３番目のバー）用いた。したがって、中断されるパルスはそれぞれ５０μｓの長さ（Ｔ１ｍａｘ）の１２回の電圧付加時間と、それぞれ４００μｓまたは８００μｓ（Ｔ１ｐａｕｓｅ）の１１回の中断時間からなる。これらの条件下で本発明により電圧パルスを中断しない場合には、各試験および／または各サンプルで飛び散りが起こる。４００μｓの中断持続時間では、約７０％のサンプルで飛び散りが起こるものの、中断持続時間を２倍にすることにより、これらの条件下で飛び散りを完全に防ぐことができる。自然な帰結として、バッファー溶液中の物質間の関係は、中断の長さが延長すると「落ち着き」（calm down）、それにより、中断に続く電圧付加時間の間、サンプル中で気体は全く発生しない。
【００３５】
図４は、中断されない電圧付加時間の最大持続時間に依存した飛び散りの発生頻度の棒グラフを示す。この試験は、実際は図３の試験と同じ条件で行い、但し中断持続時間（Ｔ１ｐａｕｓｅ）を４００μｓで一定とし、電圧付加時間（Ｔ１ｍａｘ）の最大長（すなわち、電界が生成されている持続時間）を変化させたことが異なる。Ｔ１ｍａｘ＝１００μｓでの試験とＴ１ｍａｘ＝４０μｓでの試験を比較すると、電圧付加時間（すなわち、電圧パルスが中断されるまでの時間）を短くすると、飛び散りの発生確率が低下することが明らかである。さらに、この実施形態では、ここでいくつかの要因により４０μｓと５０μｓとの間に閾値が存在すること、すなわち、この場合、飛び散りの発生頻度とＴ１ｍａｘに比例的な従属関係がないことが示唆される。
【００３６】
図５は、バッファー溶液の電気伝導度および／またはイオン強度に依存した飛び散りの発生頻度の棒グラフを示す。より高いイオン強度のバッファー（バッファー１：イオン強度２０３ｍｍｏｌ／Ｌ、電気伝導度１１．３ｍＳ／ｃｍ）を用いる場合には、より低いイオン強度のバッファー（バッファー２：イオン強度１２９ｍｍｏｌ／Ｌ、電気伝導度７．２ｍＳ／ｃｍ）を用いる場合よりも、飛び散りのリスクが相当に大きくなる。しかしながら、示した両方の実施例で、本発明により電圧パルスを中断することにより、飛び散りを防ぐことができる。
【００３７】
図６および図７は、それぞれ細胞懸濁液の体積に依存した飛び散りの発生頻度の棒グラフを示す。両方のグラフから、細胞懸濁液および／またはバッファー溶液の体積が小さくなるにつれ飛び散りの発生確率が高くなることが明らかである。これに関して、図６の実施例は、非常に小さい体積を用いる用途であっても、飛び散りの発生確率を事実上ゼロにまで低下させることができることを示している。
【００３８】
図８および図９は、電圧パルスの中断持続時間に依存したトランスフェクション効率の棒グラフを示す。驚くべきことに、トランスフェクション効率は、本発明の電圧パルスの中断により悪影響を受けない。方法の効率は、電圧パルスが中断されたか否かに関わりなく常に概ね同じ高いレベルである（中断あり：２本ずつのバー２〜５；中断なし：２本ずつのバー１および６）。
【００３９】
したがって、全体として、それ以外は指定された条件（電界強度および／または電流密度、電圧パルスの予め設定された持続時間、バッファー溶液の体積）の下で、飛び散りの発生および／または反応容器からのサンプルの飛び出しの発生確率を十分に抑えるためには、電圧付加時間が特定の中断されない長さを超えてはならないことが示される。つまり、それ以外は予め設定された条件の下での飛び散りの問題は、中断されるパルスおよび／または臨界的な中断されない長さを超えない電圧付加時間により解決することができる。したがって、電圧パルスの中断は、方法の質、この場合は特にトランスフェクション効率を損なうことなく、飛び散りの発生確率を顕著に低下させる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】電圧に依存した飛び散り発生頻度の棒グラフである。
【図２】パルス持続時間に依存した飛び散り発生頻度の棒グラフである。
【図３】電圧パルスの中断持続時間に依存した飛び散り発生頻度の棒グラフである。
【図４】中断されない電圧付加時間の最大持続時間に依存した飛び散り発生頻度の棒グラフである。
【図５】バッファー溶液の電気伝導度および／またはイオン強度に依存した飛び散り発生頻度の棒グラフである。
【図６】細胞懸濁液の体積に依存した飛び散り発生頻度の棒グラフである。
【図７】細胞懸濁液の体積に依存した飛び散り発生頻度の棒グラフである。
【図８】電圧パルスの中断持続時間に依存したトランスフェクション効率の棒グラフである。
【図９】電圧パルスの中断持続時間に依存したトランスフェクション効率の棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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