(57)【要約】【課題】上皮細胞が付着するための生体適合性と、付着した細胞を維持するためにグルコース及び栄養物がデバイスを通過できる優れた浸透性とを有する人工角膜を提供する。【解決手段】本発明は、（ａ）相互貫入する第１の網目と第２の網目とを有する相互貫入型の二重ヒドロゲル網目を含む光学的に透明な中心コアと、（ｂ）前記中心コアの周囲に位置し、親水性及び多孔性を有し、ヒドロゲルに基づき、生体適合性を有する周辺領域とを含み、前記第１の網目及び第２の網目は、生体適合性重合体に基づき、前記網目の重合体の少なくとも１つは、親水性重合体に基づくことを特徴とする。【選択図】図１
2008538523.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工角膜であって、
（ａ）相互貫入する第１の網目と第２の網目とを有する相互貫入型の二重ヒドロゲル網目を含む光学的に透明な中心コアと、
（ｂ）前記中心コアの周囲に位置し、親水性及び多孔性を有し、ヒドロゲルに基づき、生体適合性を有する周辺領域とを含み、
前記第１の網目及び前記第２の網目は、生体適合性重合体に基づき、
前記網目の重合体の少なくとも１つは、親水性重合体に基づくことを特徴とする人工角膜。
【請求項２】
請求項１に記載の人工角膜であって、
前記周辺領域は、相互貫入する第１の網目と第２の網目とを有する二重ヒドロゲル網目を含み、
前記第１の網目及び前記第２の網目は、生体適合性重合体に基づき、
前記網目の重合体の少なくとも１つは、親水性重合体に基づくことを特徴とする人工角膜。
【請求項３】
請求項１に記載の人工角膜であって、
前記周辺領域は、ポリ（２−ヒドロキシエチルアクリレート）（poly(2-hydroxyethyl aerylate：ＰＨＥＡ）を含むことを特徴とする人工角膜。
【請求項４】
請求項１に記載の人工角膜であって、
前記周辺領域、前記中心コア、又は前記周辺領域及び前記中心コアは、前記周辺領域、前記中心コア、又は前記周辺領域及び前記中心コアに共有結合している生体分子をさらに含むことを特徴とする人工角膜。
【請求項５】
請求項４に記載の人工角膜であって、
前記前記生体分子は、コラーゲンと、フィブロネクチンと、ラミニンと、アミノ酸と、炭水化物と、脂質と、核酸とから成る群から選択されることを特徴とする人工角膜。
【請求項６】
請求項４に記載の人工角膜であって、
前記共有結合は、アジド活性エステル結合を含むことを特徴とする人工角膜。
【請求項７】
請求項４に記載の人工角膜であって、
前記共有結合は、５−アジド−２−ニトロ安息香酸Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル結合又はその誘導体を含むことを特徴とする人工角膜。
【請求項８】
請求項４に記載の人工角膜であって、
前記生体分子は、空間選択的に結合していることを特徴とする人工角膜。
【請求項９】
請求項４に記載の人工角膜であって、
前記生体分子に付着している上皮細胞をさらに含むことを特徴とする人工角膜。
【請求項１０】
請求項１に記載の人工角膜であって、
栄養物が前記人工角膜を通過するのに十分な栄養物拡散係数を有することを特徴とする人工角膜。
【請求項１１】
請求項１に記載の人工角膜であって、
前記中心コアは、約１０−５〜１０−７ｃｍ２／秒の範囲の栄養物拡散係数を有することを特徴とする人工角膜。
【請求項１２】
請求項１に記載の人工角膜であって、
前記孔は、約２０〜２００μｍの直径を有することを特徴とする人工角膜。
【請求項１３】
請求項１に記載の人工角膜であって、
前記第１の網目は、ポリ（エチレングリコール）（poly(ethylene glycol)：ＰＥＧ）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（poly(2-hydroxyethyl methacrylate)：ＰＨＥＭＡ）、コラーゲン、ヒアルロン酸、ポリ（ビニルアルコール）（poly(vinyl alcohol)：ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（poly(vinyl pyrrolidone)：ＰＶＰ）、ポリ（２−ヒドロキシエチルアクリレート）（poly(2-hydroxyethyl acrylate) (PHEA)：ＰＨＥＡ）、又はそれらの誘導体に基づくことを特徴とする人工角膜。
【請求項１４】
請求項１に記載の人工角膜であって、
前記第２の網目は、ポリ（アクリル酸）（poly(acrylic acid)：ＰＡＡ）、ポリ（アクリルアミド）（poly(acrylamide)：ＰＡＡｍ）、ポリ（ヒドロキシエチルアクリルアミド）（poly(hydroxyethyl acrylamide)：ＰＨＥＡＡｍ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（poly(N- isopropylacrylamide)：ＰＮＩＰＡＡｍ）、ポリ（メタクリル酸）（poly(methacrylic acid)：ＰＭＡＡ）、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸）（poly(2-acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid)：ＰＡＭＰＳ）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリ（２−ヒドロキシエチルアクリレート）（ＰＨＥＡ）、又はそれらの誘導体に基づく人工角膜。
【請求項１５】
請求項１に記載の人工角膜であって、
前記第１の網目は、マクロ単量体から重合され、
前記第２の網目は、単量体から重合され、
前記第２の網目の単量体に対する前記第１の網目のマクロ単量体のモル比は、１／１００未満であることを特徴とする人工角膜。
【請求項１６】
請求項１に記載の人工角膜であって、
前記第１の網目は、マクロ単量体から重合され、
前記第２の網目は、単量体から重合され、
前記第２の網目の単量体に対する前記第１の網目のマクロ単量体のモル比は、１／１００〜１／２０００の範囲であることを特徴とする人工角膜。
【請求項１７】
請求項１に記載の人工角膜であって、
前記第１の網目と前記第２の網目との重量比は、１／９〜３／７の範囲であることを特徴とする人工角膜。
【請求項１８】
請求項１に記載の人工角膜であって、
前記第１の網目は、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（poly(ethylene glycol)-diacrylate：ＰＥＧ−ＤＡ）に基づき、
前記第２の網目は、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）に基づくことを特徴とする人工角膜。
【請求項１９】
請求項１８に記載の人工角膜であって、
前記ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）の濃度は、３０〜５０％（体積／体積）の範囲であることを特徴とする人工角膜。
【請求項２０】
請求項１に記載の人工角膜であって、
前記二重ヒドロゲル網目は、２０００Ｄａ以上の分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に基づくことを特徴とする人工角膜。
【請求項２１】
請求項１に記載の人工角膜であって、
前記二重ヒドロゲル網目は、２０００〜１４０００Ｄａの分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に基づくことを特徴とする人工角膜。
【請求項２２】
請求項１に記載の人工角膜であって、
前記コア及び前記周辺領域は、相互拡散領域で連結していることを特徴とする人工角膜。
【請求項２３】
請求項２２に記載の人工角膜であって、
前記コアを形成する物質は前記周辺領域を形成する物質に貫入する、又は前記周辺領域を形成する物質は前記コアを形成する物質に貫入することを特徴とする人工角膜。
【請求項２４】
請求項１に記載の人工角膜を作成する方法であって、
（ａ）前記二重ヒドロゲル網目を重合することによって、前記中心コアを形成するステップと、
（ｂ）フォトリソグラフィック・マスクの下に前記ヒドロゲルを置き、紫外線を照射し、前記ヒドロゲルを重合することによって、多孔性を有し、ヒドロゲルに基づき、生体適合性及び親水性を有する前記周辺領域を形成するステップとを含み、
前記フォトリソグラフィック・マスクが前記孔を定めることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、
前記中心コアの前面を生体分子で部位特異的に修飾するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、
前記周辺領域を生体分子で修飾するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、角膜のインプラントに関連する。より具体的には、本発明は、相互貫入する二重ヒドロゲル網目のコア及びその周囲のヒドロゲル周辺領域に関連する。
【背景技術】
【０００２】
角膜疾患によって失明している人は、世界で１０００万人存在すると推定されている（「Carlsson et al. (2003),"Bioengineered corneas: how close are we?", Curr. Opin. Ophthalmol. 14(4):192-197」を参照）。人間の角膜移植には限界があり、それにより、これらの患者の大多数は盲目のままであり続けるであろう。これらの患者を治療する際の主な障害は、特に発展途上国では、角膜組織の取得及びその供給源の確保の困難性である。移植可能な角膜を得るには、この組織の摘出及び保存のシステムを整備する必要がある。それには、角膜組織の提供者になり得る人を探し出し、死後数時間以内に組織を保存し、一週間以内にこの組織を適切な施設に発送する必要がある。屈折矯正手術を受けたことのある患者は、角膜組織提供者として適さないことがある。したがって、屈折矯正手術を受ける患者が増加していることから、将来的に先進諸国でさえ角膜が不足する可能性がある。運良く角膜移植を受けた患者でさえ、その多くに失明を引き起こす合併症が発生しかねない。最も一般的な合併症は、移植拒絶反応、移植組織の機能障害、及び不正又は重度の乱視である。移植が成功した場合、移植組織の浮腫又は乱視により、視力の回復には手術後何ヶ月もかかることがある。
【０００３】
組織が集積し、上皮で被覆された生体適合性人工角膜を使用することによって、人間の角膜に対する要求が満たされ、優れた手術結果を得ることができる。このような人工角膜によって、移植角膜に対する拒絶反応及び移植角膜の機能障害、並びに乱視の危険性を解消し、視力をすばやく回復させることができる。人工角膜は、眼組織銀行における必要な供給源無しに移植のために無限に供給することができるので、屈折矯正手術による人間の角膜の不足に対する懸念は解消されるであろう。さらに、人工角膜のために開発された技術を近視などの屈折異常の治療にも利用することができる。表層角膜移植術（又は角膜オンレー（corneal onlay））として知られる治療では、屈折率を変えるために細い重合体を角膜に連結させることができる。上皮で被覆され、角膜上に設置された生体適合オンレーは、角膜組織が付加逆的に除去される従来のレーザー原位置角膜切開反転術（laser in situ keratomileusis：ＬＡＳＩＫ）よりも優れている。
【０００４】
上皮化された表面を支持できる人工角膜を開発することが望ましい。重層化した上皮細胞は、感染に対する保護バリアーとして働き、破壊酵素がデバイスと角膜との接触面にアクセスするのを防止する。デバイスが上皮を支持するためには、上皮細胞が付着するための生体適合性表面、並びに付着した細胞を維持するためにグルコース及び栄養物がデバイスを通過できる優れた浸透性が必要である。人工角膜の他の重要な特性として、光学的透明度、生体適合性、優れた機械的強度、及び基質組織と一体化できる能力がある。
【０００５】
したがって、これらの所望される必要条件又は特性を包含する人工角膜の開発は、当該技術において大きな進歩と見なされるであろう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、光学的に透明な中心コアと、多孔性、親水性、生体適合性を有し、中心コアの周囲に位置する周辺領域とを有する人工角膜インプラントを提供する。
【０００７】
ある実施形態では、中心コアは、第１のヒドロゲル網目と第２のヒドロゲル網目とが相互貫入した相互貫入型の二重ヒドロゲル網目で作成され、周辺領域は、ポリ（２ヒドロキシエチルアクリレート）（ＰＨＥＡ）で作成される。他の実施形態では、中心コア及び周辺領域の両方は、相互貫入型の二重ヒドロゲル網目で作成される。両方の実施形態では、二重ヒドロゲル網目の第１及び第２の網目は、好ましくは、生体適合重合体に基づいており、網目重合体の少なくとも１つは、親水性重合体に基づいている。好ましくは、コア及び周辺領域は相互拡散領域で互いに連結されている。相互拡散領域では、周辺領域の構成物にコアの構成物が貫入している、またはその逆である。
【０００８】
好ましい実施形態では、周辺領域、中心コア、又はその両方に生体分子が結合している。これらの生体分子は、任意の種類の生体分子であり得るが、好ましくは、上皮及び／又は線維芽細胞の生存及び増殖を支持する生体分子である。これらの生体分子の例としてこれらに限定されるものではないが、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、アミノ酸、炭水化物、脂質、及び核酸がある。好ましくは、生体分子は、空間選択的に結合している。例えば、インプラントの中心コアのバルク及び後部は、タンパクが吸着し難い状態を維持し、長期にわたって光学的透明性を維持するために、分子修飾されないことがある。
【０００９】
また、本発明は、人工の角膜インプラントを作成するための方法をも提供する。本発明に係る方法では、中心コアは、二重ヒドロゲル網目を重合することによって形成される。同時又は別のステップでは、ヒドロゲルに基づき、生体適合性及び親水性を有する周辺領域は、フォトリソグラフィック・マスクの下に設置したヒドロゲルを紫外線で重合することにより形成される。フォトリソグラフィック・マスクは、周辺領域の孔を定める。コア及び周辺領域は相互拡散領域で連結している。相互拡散領域では、周辺領域の構成物に中心コアの構成物が貫入している、またはその逆である。好ましくは、周辺領域、中心コア、又はその両方が生体分子で修飾されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
図１は、本発明に係る人工角膜インプラント１００の概略図である。インプラント１００は、光学的に透明な中心コア１１０と親水性及び生体適合性を有する周辺領域１２０とを含む。基質組織との一体化及びインプラント１００における栄養物の拡散を可能にするために、周辺領域１２０は孔１２２を有する。所望に応じて、インプラント１００は、相互拡散領域１３０をも含み得る。相互拡散領域１３０では、周辺領域１２０に中心コア１００が貫入している、またはその逆である。インプラント１００の典型的な大きさは次の通りである。全直径は４．０〜１２．０ｍｍ、中心コアの直径は３．５〜１０．０ｍｍであり、中心コア及び周辺領域の厚さは１５〜２０００μｍである。孔１２２の直径は、好ましくは、約２０〜２００μｍである。
【００１１】
インプラント１００は、好ましくは、栄養物が人工角膜を通過するのに十分な栄養物拡散係数を有する。好ましくは、中心コア１１０は、約１０−５〜１０−７ｃｍ２／秒の範囲の栄養物拡散係数を有する。人工角膜を通過できる栄養物は、例えば、グルコース、成長因子などであり得る。拡散係数は、第１及び第２の網目のメッシュの大きさを変えることによって調節することができる。
【００１２】
≪中心コア≫
【００１３】
光学的に透明な中心コア１１０は、好ましくは、第１のヒドロゲル網目と第２のヒドロゲル網目とが相互貫入した相互貫入型の二重ヒドロゲル網目で作成される。好ましくは、相互貫入型の二重網目は、第１の架橋網目を合成し、その後に第１の架橋網目の存在下で第２の網目を合成することで形成される。２つの構成物を互いに意図的に化学結合させていないので、それぞれの網目が自身の特性を保持した状態でそれぞれ網目の比率を独立に変えることができる。このような二重網目構造は、例えば水の中では溶解すること無しに膨張することができ、大きな機械的強度並びに高い水分含有量を示し、それにより、栄養物が拡散することができる。
【００１４】
本発明の目的のために、二重ヒドロゲル網目は２つの生体適合性重合体に基づいており、これらの重合体の少なくとも１つは親水性である。第１の網目は、例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、コラーゲン、ヒアルロン酸、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（２−ヒドロキシエチルアクリレート）（ＰＨＥＡ）、それらに同等するもの、又はそれらの誘導体に基づく。第２の網目は、例えば、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＡｍ）、ポリ（ヒドロキシエチルアクリルアミド）（ＰＨＥＡＡｍ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＡｍ）、ポリメタクリル酸（ＰＭＡＡ）、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸）（ＰＡＭＰＳ）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリ（２−ヒドロキシエチルアクリレート）（ＰＨＥＡ）、それらに同等するもの、又はそれらの誘導体に基づく。本発明に有用な二重網目構造では、上記の第１及び第２の網目重合体の任意の組み合わせを使用することができる。
【００１５】
相互貫入型の二重ヒドロゲル網目は、紫外線で開始されるフリーラジカル重合に基づく（２ステップ）逐次的網目形成技術によって合成できる（図２）。この方法では、末端基２１２を有する第１のマクロ単量体２１０に紫外線を照射し、単一の網目２２０を形成する。次に、第２の単量体２３０を単一網目２２０に加える。第２の単量体２３０を加えると、通常、単一網目２２０は膨張する。次に、この第２の単量体に紫外線を照射し、相互貫入型の二重網目２４０形成する。この方法では、一般的に、第２の網目の構成物は第１のものとは異なる。紫外線による二重網目構造の重合には、所望の形状の人工角膜を形成する透明な型が使用できるという利点がある。
【００１６】
ある実施形態では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）重合体は、第１の網目の前駆物質として使用される。ＰＥＧは、生体適合性を有し、水溶液に溶解し、様々な範囲の分子量及び化学構造のものが得られるように合成することができると知られている。二官能性グリコールのヒドロキシル末端基は、光架橋できるアクリレート末端基に変えることができる。その場合、ＰＥＧ重合体は、ＰＥＧジアクリレート（ＰＥＧ−ＤＡ）重合体になる。ＰＥＧジアクリレート水溶液に光開始剤を加え、紫外線を照射すると、ＰＥＧジアクリレートが架橋し、ＰＥＧジアクリレート・ヒドロゲルが生じる。
【００１７】
二重ヒドロゲル網目の力学的な特性及び他の特性を最適化するために、アクリルアミド、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、アクリル酸、メタクリル酸、及びそれらの誘導体などの様々なアクリル系単量体を第２の網目の合成に使用することができる。ある実施形態では、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）ヒドロゲルは、第２の網目として使用される。ＰＡＡは、アニオン性であり、ｐＫａ４．７よりも高いｐＨでイオン化するカルボキシル基を有する。カルボキシル基がイオン化すると、それらの固定イオンが互いを押し合うので、重合体が膨張する。したがって、ｐＨ及びＡＡ（アクリル酸）が増加すると、ＰＡＡで作成されたヒドロゲルはより高い平衡膨潤を示すようになる。
【００１８】
第１の網目の前駆物質溶液は、紫外線感受性フリーラジカル開始剤として２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン（2,2-dimethoxy-2- phenylacetophenone：ＤＭＰＡ）（又は２−ヒドロキシ−２−メチル−プロピオフェノン）を脱イオン水に加え、それに精製ＰＥＧ−ＤＡを溶解することによって作成することができる。溶液を型（例えば、直径２ｃｍ、高さ２５０マイクロメートル）に注入し、ガラス板で被覆し、室温及び紫外線光源下で反応させる。紫外線を照射すると、前駆物質の溶液は、フリーラジカルによってゲル化し、不水溶性になる。
【００１９】
第２の網目を組み込むために、型からＰＥＧ系ヒドロゲルを取り出し、第２の単量体の水溶液（例えば、ＤＭＰＡ（又は２−ヒドロキシ−２−メチル−プロピオフェノン）を光開始剤として含み、トリエチレングリコールジメタクリレート（triethylene glycol dimethacrylate：ＴＥＧＤＭＡ）を架橋剤として含むアクリル酸）に室温で２４時間浸漬する。次に、膨張したゲルに紫外線を照射する。第１の網目の中に第２の網目が重合し、二重網目構造を形成する。また、第２の網目のための他の単量体（アクリル酸誘導体、メタクリル酸及びその誘導体、アクリルアミド、又は２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸など）を、同じ又は他の開始剤、架橋剤、及び重合方法と共に使用してＰＥＧ系ヒドロゲルに組み込むことができる。
【００２０】
ＰＥＧの代替物として、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、コラーゲン、及びヒアルロン酸（hyaluronic acid：ＨＡ）などの他の重合体物質を第１の網目に使用することができる。第１の網目にこれらの他の重合体を使用すると、上記の（２ステップ）逐次的網目形成技術で二重のヒドロゲル網目を作成することができる。
【００２１】
例えば、ＰＨＥＭＡを第１の網目として二重ヒドロゲル網目を作成する場合、０．１２重量％の過酸化ベンゾイルを開始剤として含む７０／３０（重量／重量）２−ヒドロキシエチルメタクリレート／蒸留水を重合することにより、ＰＨＥＭＡ系ヒドロゲルを合成することができる。溶液をゲル化させるために、型で溶液を６０℃で２４時間反応させる。上記の方法で第２の単量体（例えば、アクリル酸、アクリルアミド、メタクリル酸、又は２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸）をＰＨＥＭＡ系ヒドロゲルに組込み、二重ヒドロゲル網目を形成する。
【００２２】
ＰＶＡを第１の網目として使用する場合は、１０〜２０％（重量／重量）のＰＶＡ水溶液を８０℃に加熱し、室温まで冷却する。或いは、１０〜２０％（重量／重量）のＰＶＡを含むジメチル・スルホキシド（dimethyl sulfoxide：ＤＭＳＯ）及び水の混合溶液（それぞれ８０：２０）を１４０℃に加熱し、−２０℃で２４時間凍結する（この２４時間凍結を複数回繰り返す）。ＰＶＡを架橋するためには、２５％のグルタルアルデヒド水溶液に０．０１Ｎの硫酸及び１７％のメタノール水溶液を混合する。次に、この混合液をＰＶＡ溶液に加え、型に注入し、７５℃で２５時間加熱する。ゲル化の後、アクリル酸、アクリルアミド、メタクリル酸、又は２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸などの第２の単量体溶液にＰＶＡ系ヒドロゲルを浸漬する。上記と同様な重合方法を使用することで、ＰＶＡ系ヒドロゲルの中に第２の網目が組み込まれ、二重の網目構造が形成される。
【００２３】
コラーゲン系の二重網目の合成に関しては、まず、５０％のＩ、ＩＶ、又はＶＩＩ型のコラーゲンと０．１ＭのＮａＯＨと１０％の１０倍濃縮のハンクス緩衝塩溶液（Hank's buffer salt solution：ＨＢＳＳ）とを混合することによって、生理学的な条件下でコラーゲン・ゲルが形成される。次に、０．０２％のグルタルアルデヒド（glutaraldehyde：ＧＴＡ）を架橋剤としてバルクに加える。最終溶液を、固化する前に型に注入する。次に、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸若しくはメタクリル酸の誘導体、アクリルアミド、又は２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸などの第２の単量体の溶液に得られたコラーゲン・ゲルを浸漬する。上記と同様な重合方法を使用することで、コラーゲン・ゲルの中に第２の網目が組み込まれる。
【００２４】
ヒアルロンサン（ＨＡ）系の二重網目を作成するためには、２３０ｍｇのヒアルロン酸ナトリウム（sodium hyaluronan：ＮａＨＡ）を０．２ＭのＮａＯＨ（ｐＨ１３．０）と混合し、氷上で３０分間かき回す。次に、型でＨＡを４４μＬのジビニルスルホンと架橋させ、ゲルを形成する。アクリル酸、アクリルアミド、メタクリル酸、又は２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸などの第２の単量体の溶液にこのＨＡゲル溶液を浸漬する。上記と同様な重合反応を使用することで、ＨＡゲルの中に第２の網目が組み込まれる。
【００２５】
ヒドロゲルの光重合をモニターするために、減衰全反射／フーリエ変換赤外分光光度計（reflectance/Fourier transform infrared：ＡＴＲ／ＦＴＩＲ）を使用することができる。前駆物質からヒドロゲルへのＣ＝Ｃ結合の変化は、紫外線照射前及び照射後に末端のＣ＝Ｃ結合（ＲＣＨ＝ＣＨ２）伸縮に起因する１６３５ｃｍ−１における吸収の減少を測定することによって、モニターすることができる。合成の後に、平衡膨潤を引き起こし、且つ未反応の成分を除去するために、二重ヒドロゲル網目を蒸留水又はＰＢＳで十分に洗浄する。
【００２６】
ヒドロゲルの含水量は、重量膨潤比を測定することによって評価することができる。平衡が得られるまでに一定間隔で溶液から膨潤ゲルを取り出し、軽く水気を切り、計量する。平衡含水（water content：ＷＣ）は、ヒドロゲルの膨潤状態での重量及び乾燥重量を測定することによって計算することができる（「Cruise et al. (1998), "Characterization of permeabilily and network structure of interfacially photopolymerized poly(ethylene glycol) diacrylate hydro gels", Biomaterials 19 (14) : 1287-1294」、及び「Padmavathi et al. (1996), "Structural characterization and swelling behavior of poly (ethylene glycol) diacrylate hydro gels" , Macromolecules 29 : 1976-1979」）。全ての合成ヒドロゲルは、使用するまでに無菌水溶液に保存することができる。
【００２７】
光学的な透明度、含水量、柔軟性、及び機械的強度などのヒドロゲルの重要な特性は、第２の単量体の種類、単量体濃度、分子量、及び紫外線照射時間などの様々な因子を変えることによって調節することができる。
【００２８】
５７５〜１４０００Ｄａの分子量を有する様々なジアクリル酸ＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＡ）の二重網目を合成した。低分子量のＰＥＧ−ＤＡ（＜２０００Ｄａ）を使用すると、不透明又は脆弱なゲルが生じるのに対して、高分子量のＰＥＧ−ＤＡ（≧８０００Ｄａ）から作成されたヒドロゲルは透明及び柔軟であることが判明した。一般的に、相分離を防止するためには、ＰＥＧの分子量が少なくとも２０００Ｄａである必要があることが判明した。
【００２９】
ある例では、第１の網目のためのＰＥＧ−ＤＡ（分子量２０００〜１４０００Ｄａ）のＰＢＳ溶液の濃度を５０％（重量／重量）に固定し、アクリル酸の濃度を１５％（体積／体積）から６０％（体積／体積）に変えた。ＰＥＧの分子量が減少し、アクリル酸の濃度が増加したことにより、二重ヒドロゲル網目の架橋密度は増加した。アクリル酸の濃度が３０〜５０％（体積／体積）の間にある場合、機械的に強度である透明なヒドロゲルが得られた。アクリル酸の濃度がこの範囲にあるとき、第１の網目と第２の網目との重量比は、それぞれ１／９〜３／７であった。また、二重ヒドロゲル網目に生体分子が組み込まれても、ヒドロゲルの物理的な特性が変化しないことが判明した。本発明のある実施形態では、二重網目においては、第２の単量体成分に対する第１のマクロ単量体成分のモル比は、１／１００未満である。本発明の他の実施形態では、二重網目においては、第２の単量体成分に対する第１のマクロ単量体成分のモル比は、１／１００〜１／２０００の範囲である。
【００３０】
本発明者らは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）及びアクリル単量体系に基づく透明な二重ヒドロゲル網目の合成に成功した。これらの二重ヒドロゲル網目は、高い含水量を維持すると同時に、一重（ＰＥＧ）ヒドロゲル網目よりも優れた機械的強度を有する。例えば、より高密度に架橋された第１の網目の存在下で第２の網目を架橋すると、引張強度が１０倍増大するが、含水量は１０％未満しか減少しない。
【００３１】
≪周辺領域≫
【００３２】
人工角膜の周辺領域は、相互貫入型の二重ヒドロゲル網目（上記のように）又は１つのヒドロゲルから作成される。ある実施形態では、周辺領域は、ＰＨＥＡから作成される。ＰＨＥＡは、親水性、生体適合性を有し、すばやく光重合し、高度にパターン化できる網目である。また、重合前のＰＨＥＡを他の網目に貫入させ、「継ぎ目のない」コア−周辺領域を形成することができる。周辺領域の材料の種類に関わらず、人工角膜の中心コア及び周辺領域は、相互拡散領域で互いに融合する。相互拡散領域では、周辺領域の構成物に中心コアの構成物が貫入する、又はその逆である。
【００３３】
≪人工角膜への生体分子の結合≫
【００３４】
非付着性中心コアの表面で上皮細胞が付着及び増殖するのを促進するために、並びに基質ケラトサイト（stromal keratocyte）及び線維芽細胞が周辺領域で増殖するのを促進するために、コア、周辺領域、又はその両方は、好ましくは、生体分子で修飾されている。適切な生体分子の例として、これらに限定されるものではないが、細胞付着促進タンパク（コラーゲン、フィブロネクチン、及びラミニンなど）、アミノ酸（ペプチド）、炭水化物、脂質、核酸などがある。生体分子による修飾は、（１）重合体を合成する際に、その重合体にペプチド／タンパクを直接組み込む方法、及び（２）ヒドロゲルを合成した後にペプチド／タンパクを結合させる方法の両方のアプローチで行うことができる。後者のアプローチは、（ａ）光によるアジドベンズアミド・ペプチドの結合、（ｂ）アミノオキシ・ペプチドとカルボニルを有する重合体との化学選択的反応、又は（ｃ）光でヒドロゲルをＮ−ヒドロキシコハク酸イミド基で官能基化し、その次にペプチド／タンパクと反応させることに依存する。
【００３５】
細胞付着ペプチドを二重ヒドロゲル網目に直接組み込むためには、ペプチドをアクリロイル−ＰＥＧ−ＮＨＳと反応させ、アクリレートＰＥＧペプチド単量体を形成する（「Mann et al. (2001), "Smooth muscle cell growth in photopolymerized hydrogels with cell adhesive and proteolytically degradable domains: synthetic ECM analogs for tissue engineering", Biomaterials 22:3045-3051」、「Houseman et al. (2001), "The microenvironment of immobilized Arg-Gly-Asp peptides is an important determinant of cell adhesion", Biomaterials 22(9):943-955」、「Hern et al. (1998), "Incorporation of adhesion peptides into nonadhesive hydrogels useful for tissue resurfacing" J. Biomed. Mater. Res. 39(2):266-276」を参照）。光重合の標準的な条件下でこれらのペプチド含有アクリレート単量体をＰＥＧ−ジアクリレートなどの他の所望のアクリレートと共重合させ、ペプチド含有ヒドロゲルを形成することができる。このアプローチの最大の利点は、ペプチドがヒドロゲルに直接組み込まれ、その後に別の化学反応が必要ではないということである。
【００３６】
例えば、ＲＧＤペプチドを、アクリレート−ＰＥＧ−ＲＧＤ単量体の作成に使用することができる。第１の重合体網目を形成する際に、この単量体をＰＥＧ−ＤＡと共重合させることができる。又は、第２の重合体網目を作成する際に、他のアクリレートと共重合させることができる。ペプチドが組み込まれたこどうかは、減衰全反射／フーリエ変換赤外分光高度計（ＡＴＲ／ＦＴＩＲ）及びＸ線光電子分光法（X-ray photoelectron spectroscopy：ＸＰＳ）を使用してヒドロゲルの構造を解析することによって確認できる。他の単量体及び対応するヒドロゲルを作成するために、他のペプチドを使用することができる。
【００３７】
或いは、重合ヒドロゲルに生体分子を結合させることがある。このアプローチでは、（ａ）アジドベンズアミド・ペプチドの光開始反応、（ｂ）アミノオキシ・ペプチドとカルボニルを含む重合体との化学選択的反応、又は（ｃ）光でヒドロゲルをＮ−ヒドロキシコハク酸イミド基で官能基化し、その後にペプチド／タンパクと反応させることによって、タンパク／ペプチドを重合体に結合させる。それぞれの方法では、ペプチドは、細胞付着を促進する認識配列と結合配列／残基との２つの構造的な特徴を有する。結合配列は、アジド安息香酸部分又はアミノオキシ部分を有する。図３は、アジドベンズアミドＲＧＤペプチド（図３Ａ）及びアミノオキシＹＩＧＳＲペプチド（図３Ｂ）の２つの合成されたペプチドの例が示されている。２つのペプチドの一般的な構造は、結合配列３１０と認識配列３２０（それぞれの例のペプチドの上に示されている）とを有する。
【００３８】
認識モチーフは、ラミニン由来のＹＩＧＳＲ配列及びフィブロネクチン由来のＲＧＤ配列であり得る。それぞれの配列は、角膜における上皮細胞の付着を促進することが示された。結合部分は、ペプチドのＮ末端又はＣ末端のＬｙｓ側鎖のアミノ基に直接結合させることができる。ペプチドは、標準的及び最適化されたＢｏｃ化学反応に基づく固相ペプチド合成（solid phase peptide synthesis：ＳＰＰＳ）で合成することができる。ペプチド基質は、ＨＰＬＣで精製し、エレクトロスプレイイオン化質量分析（electrospray ionization mass spectrometry：ＥＳＩ−ＭＳ）で同定することができる。
【００３９】
ＳＰＰＳにより、高い融通性と共にペプチド合成を調節することができ、認識及び結合部分の両方を別々に最適化するために反復的な修飾を容易に行うことができるようになる。重合体の合成後にペプチドを結合させる場合の最大の利点は、ペプチドと重合体とを一体化させるのが容易となり、短時間で多くのペプチド修飾ヒドロゲルが得られるということである。例えば、５つの候補の重合体を５つのペプチドと反応させ、２５の異なるヒドロゲルを作成することができる。さらに、このモジュール的な方式により、単一の重合体の上に異なるペプチドの組み合わせを設計することができる。
【００４０】
アジドベンズアミド基は、光（２５０〜３２０ｎｍ、５分間）と反応し、芳香族ナイトレンを形成する。したがって、ペプチドを５−アジド−２−ニトロ安息香酸で修飾することができる。この方法では、候補の重合体を目的のペプチドの溶液でインキュベートし、紫外線を照射し、ペプチドと重合体との間に共有結合を形成する。この結合方法の利点は、重合体に特別な官能基が必要ではないということである。一方、この結合方法の不都合な点は、結合の非特異性である。この結合の非特異性により、表面上のペプチドの量を調節するのが困難となる。また、ナイトレンが重合体ではなく、他のペプチドに結合する副反応も起きる。さらに、特定のアミノ残基の存在下では、紫外線照射により、望まれない構造が形成される。
【００４１】
アミノオキシ基は、穏和な条件下（ｐＨ４〜５の緩衝液、室温）では、ケトンと化学選択的に反応し、安定なオキシム共有結合を形成する。本発明者らは、第２の網目の重合の際にメチルビニルケトン（methyl vinyl ketone：ＭＶＫ）を共単量体の１つとして使用することでケトン修飾のヒドロゲルを作成した。ペプチドは、アミノオキシ酢酸で修飾することができた。候補のヒドロゲル重合体をペプチドの弱酸性溶液（０．１ＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０、２４時間）でインキュベートすることで、重合体にペプチドを共有結合させることができる。オキシム形成は、生体分子の化学選択的な結合のために広範に使用されてきた。また、オキシム形成は、穏和な条件下では容易に進行する。
【００４２】
好ましい実施形態では、ペプチド／タンパクは、光化学的に人工角膜に固定している。ヒドロゲル表面にペプチド／タンパクを光化学的に固定するためには、一方の末端に光反応性アジドを有し、他方の末端にＮＨＳ末端基（細胞接着タンパク及びペプチドと結合する）を有するアジド活性エステル化学種を使用する。図４に概略的に示されているこの方法では、５−アジド−２−ニトロ安息香酸Ｎ−ヒドロキシコハク酸エステルの溶液をヒドロゲルの表面４１０に広げる。これは、１ｍＬのＮ，Ｎジメチルホルムアミド（N,N-dimethylformamide：ＤＭＦ）に５ｍｇの５−アジド−２−ニトロ安息香酸Ｎ−ヒドロキシコハク酸エステルを溶解し（Matsuda et al. (1990) "Development of micropatterning technology for cultured cells", ASAIO Transactions 36(3) :M559-562）、この溶液をヒドロゲルの表面に広げることで達成できる。ヒドロゲルを空気乾燥した後に、ヒドロゲルに紫外線を例えば５分間照射する。紫外線照射の際に、フェニルアジド基は、ヒドロゲル表面４１０と反応し、共有結合を形成する。照射した表面から未反応の化学物質を除去するために、表面を溶媒で完全に洗浄する。次に、ヒドロゲルを、関心のあるタンパク４３０を含む溶液に２４時間インキュベートする。タンパクは、露出したＮＨＳ末端基と反応する（４４０）。
【００４３】
好ましくは、この方法で人工角膜に結合した生体分子は、部位特異的に結合している（例えば、フォトリソグラフィーを使用して）。ある具体的な好ましい実施形態では、インプラントの中心コアのバルク及び後部においてタンパクがヒドロゲルに吸着し難い状態を維持し、長期の光学的透明性を可能にするために、これらの部分は修飾されない。また、瘢痕形成を最小限にすると同時に組織の集積を促進するために、周辺領域の孔を、角膜基質の細胞外マトリックスを擬態する生体分子と選択的に連結することがある。
【００４４】
図５は、生体分子で修飾された本発明に係る人工角膜インプラントの作用を概略的に示す。最初は、上皮５２０を除去し、コア５１２と孔５１６を有する周辺領域５１４とを含むインプラント５１０を基質５３０に移植する（図５Ａ）。時間が経つにつれ、上皮層５２０はコア５１２の上に増殖し、基質は孔５１６の中で増殖し、組織が完全に集積したインプラント５１０が得られる（図５Ｂ）。また、移植前に、上皮細胞がインプラントにすでに付着している場合もある。
【００４５】
重合体合成の後に表面にペプチドを結合させる際の重要な点は、結合が成功したか否かを評価することである。本発明の方法を評価するために、解析手法及び化学的な手法の両方を使用することができる。ペプチドの結合は、ＡＴＲ／ＦＴＩＲ分光光度計、ＸＰＳ、並びに重合体のアミノ酸及び元素分析（時折）で構造の特徴を明らかにすることによって確認することができる。また、ペプチドを結合させる手法の有効性は、蛍光又は可視色素で標識されたペプチドを使用すること、及び動的接触角を測定することによって立証することができる。
≪人工角膜の作成≫
【００４６】
本発明に係る人工角膜を合成するための例示的なプロトコルは、図６に示されている。シリンジ６２０でヒドロゲル前駆物質６１０を、２つの深さを有するTeflon型６３０に注入し、紫外線遮断ディスク６４２を有するフォトマスクで被覆する（図６Ａ）。それぞれの深さで同じ又は異なる前駆物質を使用することができる。次に、紫外線６５０を、マスクを通して照射することで、周辺領域の紫外線遮断ディスク６４２の下にある部分以外の型の内容物は完全に重合する（図６Ｂ）。重合したヒドロゲル６６０を型から取り出す際には、その周辺領域にマイクロメートル・スケールのチャンネル６６２のパターンが形成されている（図６Ｃ）。この構造体全体を第２の単量体の溶液内で膨張させ、軽く叩くことで余分な単量体を取り除き、その次に、膨張したヒドロゲル全体に紫外線を照射することで、二重のヒドロゲル網目を形成することができる。最終産物は、光学的に透明な中心部６７２と多孔性周辺領域６７４とを有する構造体６７０である（図６Ｄ）。次に、上記のように、アジド活性エステル結合によって、この構造体の前面並びに周辺領域をタンパク又はペプチドで被覆することができる。その後、設置の前に、この人工角膜を完全に洗浄し（例えば、ｄＨ２Ｏで１週間）、未反応の単量体を取り除く。他の工程では、目的の形状を有する二重網目のコアを最初に合成し、洗浄し、型の中に周辺領域用フォトマスクの下に設置する。周辺領域の単量体（例えば、ヒドロキシエチルアクリレート）、光開始剤、及び架橋剤をコアの周囲に注入し、所定の時間（例えば、３０分間〜１時間）に互いに混ざり合うようにする。フォトマスクを通して紫外線を溶液に照射し、コア周囲の周辺領域を重合する。したがって、コア重合体の周囲に拡散した重合体によって、コア及び周辺領域が連結する。上記の方法にしたがって、周辺領域の二重網目を作成することができる。しかし、余分な単量体を取り除いた後は、周辺領域のみに重合を引き起こすために紫外線を周辺領域のみに照射する（これにより、コア領域で第３の網目が形成されずに、周辺領域に第２の網目が形成されることが確実となる）。
【００４７】
図７は、多孔性のヒドロゲル周辺領域の合成に使用されるフォトリソグラフィック・マスクの概略図（Ａ）及び実際の映像（Ｂ，Ｃ）を示す。マスク７００は、中心コアを形成するための非マスク中心領域７１０と、周辺領域を形成するためのパターン化されたマスク周辺領域とを含む。パターン化された周辺領域７２０は、ＵＶ遮断ディスク７２４（７２２内で示されている）を含む。図７Ｂでは、本発明に使用され得る実際のフォトリソグラフィック・マスク７３０が示されている。ディスクは任意の紫外線遮断物質によって作成される。この紫外線遮断物質の例として、これらに限られるものではないが、クロム、プラチナ、タングステン、銅、アルミニウム、金、又は亜鉛がある。このマスクは、２ｃｍのパターン化されていない中心領域７４０と、互いから１°分離している線に沿って１０μｍの間隔で配置している径６０μｍのディスク７５２を有するパターン化された周辺領域とを有する。ディスク７５２は、マスク７３０の拡大図である図７Ｃで示されている。このマスクの中心領域の直径は２ｃｍであるが、他の寸法も可能である。同様にディスクの他の寸法も可能であり、好ましくは、約２０〜２００μｍの範囲である。ディスクのパターンには任意のものがあり、例として、これらに限られるものではないが、放射状及びグリッド状のパターンがある。例えば、図８では、（Ａ）グリッド型のクロームパターン、（Ｂ）紫外線照射後に生じる典型的な多孔性ヒドロゲル、及び（Ｃ）多孔性ヒドロゲルの断面の顕微鏡写真が示されている。
【実施例】
【００４８】
≪フォトリソグラフィーでパターン化された人工角膜≫
【００４９】
図９は、光学的に透明な中心コア９２０と多孔性周辺領域９３０とを有し、フォトリソグラフィーでパターン化された人工角膜９１０を示す。この実施例では、中心コアはＰＥＧ／ＰＡＡの二重網目で作成され、周辺領域はＰＨＥＡで作成された。ＰＥＧ／ＰＡＡヒドロゲルは、紫外線開始のフリーラジカル重合に基づく２ステップの逐次的網目形成技術によって合成した。第１の溶液の前駆物質は、脱イオン水に溶解した精製ＰＥＧジアクリレート（分子量８０００）と紫外線誘導フリーラジカル開始剤としてのヒドロキシメチルプロピオフェノンとから作成した。この溶液をTeflonの型に流し込み、ガラス板で被覆し、室温で紫外線の光源下で反応させた。紫外線照射の際には、前駆物質は、フリーラジカルの誘導でゲル化し、水に対して不溶となった。第２の網目を組み込むために、型からＰＥＧヒドロゲルを取り出し、開始剤として１％（体積／体積）のヒドロキシメチルプロピオフェノンと架橋剤として１％（体積／体積）のトリエチレングリコールジメタクリレートとを含む５０％（体積／体積）のアクリル酸溶液に室温で２４時間浸漬した。その後、この二重ヒドロゲル網目をDulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水で完全に洗浄し、平衡膨潤状態にした。次に円形の切削工具を用いてディスク（中心コアの構成物となる）を切り抜いた。ディスクをガラス板とフォトマスクの中心との間に挟んだ。次に、ＰＨＥＡ前駆溶液をこの中央視覚ディスク（central optic disc）の周囲に注入し、単量体をディスクの周辺領域に１５分間拡散させた。次に、フォトマスクを紫外線光源下に６０秒間置いた。その後、得られたコア−周辺領域の構造物をガラス板から取り外し、十分に洗浄し、使用するまでにリン酸緩衝生理食塩水で保存した。
【００５０】
≪コラーゲンによる部位特異的な生体官能基化（biofunctionalization）≫
【００５１】
ＰＥＧ／ＰＡＡの二重ヒドロゲル網目を、ヘテロ二官能性及び光反応性の架橋剤である５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシＮ−ヒドロキシコハク酸イミドで表面を覆った。次に、ヒドロゲルを紫外線光源（７５Ｗ、Xenon Lamp, Oriel Instruments）に晒し、アジド官能基による共有結合を誘発した。Ｎ−ヒドロキシコハク酸アミド基は、次に使用されるＩ型コラーゲンの１級アミンと反応する。アジド活性エステルで官能基化したヒドロゲル及び未修飾のヒドロゲルを、０．１％（重量／体積）のＩ型コラーゲン（Vitrogen）でインキュベートした。コントロールとして、ＰＥＧ／ＰＡＡを脱イオン水でインキュベートした。図１０に示されているように、ヒドロゲルへのイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識したコラーゲンの部位特異的結合を可視化するために蛍光顕微鏡検査法を使用した。図１０の左側ではコラーゲン−ＦＩＴＣと反応したゲル表面が示されており、右側では未反応のゲル表面が示されている。
【００５２】
≪ヒドロゲル上での細胞の増殖≫
【００５３】
ウサギの初期継代の角膜上皮細胞を上皮分化に関してスクリーニングし、表面を修飾したＰＥＧ／ＰＡＡの二重ヒドロゲル網目に１．０×１０５細胞／ｃｍ２の濃度で播種した。上皮細胞は、２時間の間にコラーゲンが結合したＰＥＧ／ＰＡＡの網目の上で見事に広がり（＞７５％）、４８時間内に高い密集度を示し、５日目までに表面の残りの未播種部分にも広がった。図１１Ａに付着細胞の典型的な顕微鏡図が示されている。予想通り、未修飾の二重網目では、細胞の付着及び広がりが促進されなかった（図に示されていない）。また、アジド活性エステルで官能基化しなかったヒドロゲルをＩ型のコラーゲンにインキュベートした場合は、細胞の広がりは確認されなかった。これは、タンパクがＰＥＧ／ＰＡＡに物理的にほとんど又は全く吸着しなかったことを示す（図１１Ｂ）。
【００５４】
孔を有するＩ型コラーゲン修飾ＰＨＥＡ基質に初期継代の角膜線維芽細胞を１．０×１０５細胞／ｃｍ２の濃度で播種した。図１１Ｃに示されているように、２４時間以内に細胞は密集するまでに増殖した。
【００５５】
≪人工角膜の移植≫
【００５６】
本発明者らは、Ｉ型コラーゲン修飾のＰＥＧ／ＰＡＡの視覚ディスクを基質内に最大２ヶ月間挿入した。Stanford大学のAnimal Research Facilityで飼育されているNew Zealand Redウサギ（体重は３．５〜５．５ｋｇ）に麻酔を施し、標準操作を用いて手術の準備をした。手術前に、それぞれのウサギに塩酸ケタミン（４０ｍｇ／ｋｇ）、塩酸キシラジン（４ｍｇ／ｋｇ）、及びグリコピロレート（０．０２ｍｇ／ｋｇ）を筋肉内注射した。これらの作用の持続時間は４５分であった。この時間の後に、投与量の半分の塩酸ケタミン（２０ｍｇ／ｋｇ）及び塩酸キシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）を３０分間間隔で必要に応じて投与した。ウサギに全身麻酔を施した後に、角膜にプロパラカインを垂らすことでさらに局所麻酔を施した。次に、左眼の手術を容易にするために、この鎮静状態のウサギを側臥位の状態にした。眼瞼縁及び眼窩周囲領域を１０％のヨードを５０：５０の比で平衡生理食塩水で希釈した溶液で消毒した。左眼の上下眼瞼の上に無菌の手術布を置いた。操作中、平衡生理食塩水を断続的に加えることで角膜の乾燥を防止した。マイクロケラト−ムを使用する前に吸引を容易にするために、ウサギの眼をわずかに突出させた。使い捨ての無菌メスの取っ手の先を下結膜円蓋部に一時的に挿入した。時計の１２時の位置を指で押し、眼を丁寧にすくい上げるようにして、眼球全体を眼瞼からわずかに突出させた。眼球後部の赤道に０絹縫合糸を結ぶことで眼球の突出状態を維持した。Bausch & Lomb Hansatomeのマイクロケラト−ムでＬＡＳＩＫフラップを形成し、上皮細胞層の下にヒドロゲルを設置した。要約すると、Hansatome装置の８．５ｍｍの吸引リングを取り付け、適切な減圧をかけ、マイクロケラト−ムで１６０μｍの基質フラップを形成した。ＬＡＳＩＫのフラップスパチュラでフラップを上げ、直径が３．５ｍｍの無菌ヒドロゲル・ディスク（厚さは１００ｍ）を基質層の上に設置した。フラップを元に戻し、下の基質に縫合した。最終的に、インプラントの突出を防止するために瞼板縫合（眼瞼閉鎖）を行った。手術後、ネオマイシン、ポリミキシンＢ、及びデキサメタゾンの組み合わせを１０日間１日３回点眼した。７日後、角膜フラップ及び眼瞼の縫合糸を取り除いた。
【００５７】
予備試験では、インプラントは周囲の基質から区別ができなかった。２週間の研究において、Ｉ型コラーゲン修飾のＰＥＧ／ＰＡＡの視覚ディスク（〜１００ｍｍの厚さ、３．５ｍｍの直径）を８羽のウサギ移植し、この視覚ディスク・プロトタイプの生体適合性及び栄養分の浸透性について評価した。このインプラントは、炎症、上皮潰瘍形成、又は混濁化の徴候を示すことなく、安定していた。８羽のウサギの内の１羽では、物理的な要因（インプラントの不適切な設置）により、このインプラントは押し出された。これらの短期の研究での上皮及び基質の健全性に関する臨床上及び組織学的な証拠により、本発明に係るＰＥＧ／ＰＡＡの視覚ディスクが生体適合性を有し、その上を覆している上皮への栄養物の輸送を促進することが示される。図１２Ａでは、ウサギの角膜におけるＰＥＧ／ＰＡＡヒドロゲル上の上皮の健全な成長（１４日後）が示されている。
【００５８】
また、本発明者らは、生きたウサギの角膜で本発明に係る視覚ディスクが表面の上皮形成を促進する能力についても研究した。下記の外科技術でＩ型コラーゲン修飾のＰＥＧ／ＰＡＡの視覚ディスク（直径は３．５ｍｍ）をウサギの角膜に移植した。改変した角膜オンレーの操作（modified corneal onlay procedure）でＰＥＧ／ＰＡＡの視覚ディスクを移植した。ウサギに麻酔を施し、上記のとおりに手術の準備をした。同様に、Hansotomeのマイクロケラト−ムで左眼にＬＡＳＩＫフラップを形成した。フラップを形成した後、下記の方法でフラップの中心に穴を形成した。まず、ＬＡＳＩＫプラップのスパチュラでフラップを上げた。次に、上げたフラップの下に土台として平坦な金属スパチュラを置き、無菌の皮膚生検パンチでフラップに直径が１．５ｍｍの穴を形成した。付着している縁をvannas scissorで切断した。３．５ｍｍのヒドロゲルのボタンを基質層の上に設置した。１．５ｍｍのフラップの穴がヒドロゲル・ボタンの中心の上に位置するようにフラップを戻し、上記のように縫合した。基質の１ｍｍの縁は角膜内にインプラントを固定することができ、中心の穴部は重合体上に周囲の上皮細胞が付着及び移動する領域として機能した。フルオレセイン色素で上皮が形成されなかった領域を示すことで、重合体表面での上皮細胞の移動及び増殖を評価した。手術後の２週間目の終わりには、フルオレセイン染色が確認されなかった。これは、創縫合を示す。図１２Ｂは、インビボでの多層状の細胞増殖（１４日後）を示す。
【００５９】
当業者は、本発明から逸脱することなく、様々な変更を行うことができることを理解するであろう。本発明の範囲は、特許請求の範囲及びそれに同等するものによって規定される。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明に係る人工角膜を示す概略図である。
【図２】本発明に係る、相互貫入する二重ヒドロゲル網目の形成を示す概略図である。
【図３】本発明に係る人工角膜の修飾に使用され得るペプチドの例を示す図である。
【図４】本発明に係る生体分子の連結を示す概略図である。
【図５】本発明に係る人工角膜での組織集積を示す概略図である。
【図６】本発明に係る人工角膜を作成する方法を示す概略図である。
【図７】本発明に係る人工角膜の作成に有用なフォトマスクを示す概略図（Ａ）及び実際の映像（Ｂ，Ｃ）である。
【図８】本発明に係るフォトマスクの例（Ａ）及び本発明に係るフォトマスクを使用して作成したヒドロゲル（Ｂ，Ｃ）を示す図である。
【図９】本発明に係る人工角膜の顕微鏡図である。
【図１０】本発明でのコラーゲンによるヒドロゲルの部位特異的修飾の例を示す図である。
【図１１】本発明に係る人工角膜上での細胞増殖の例を示す図である。
【図１２】本発明に係る移植された人工角膜における組織集積の例を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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