(57)【要約】  本発明は、閉じられた端部(2）と、開放可能な端部(3)とを含む、生物学的試料から腫瘍細胞、特に播種性腫瘍細胞(9)を分離するための容器(1)に関して記載する。容器(1)は、下限値1.055 g/cm3、好ましくは1.057 g/cm3、特に1.060 g/cm3、及び上限値1.070 g/cm3、好ましくは1.069 g/cm3、特に1.065 g/cm3の範囲の固有密度を有するチキソトロープ物質(4)と、場合により、下限値1.060 g/cm3、好ましくは1.065 g/cm3、特に1.070 g/cm3、及び上限値1.085 g/cm3、好ましくは1.080 g/cm3、特に1.075 g/cm3の範囲の固有密度を有する密度勾配の形態での分離媒質(5)とを含む。
2008529541.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
閉じられた端部と開放可能な端部(2、3)とを含む、生物学的試料から腫瘍細胞、特に播種性腫瘍細胞(9)を分離するための容器(1)であって、下限値1.055 g/cm3、好ましくは1.057 g/cm3、特に1.060 g/cm3、及び上限値1.070 g/cm3、好ましくは1.069 g/cm3、特に1.065 g/cm3の範囲の固有密度を有するチキソトロープ物質(4)と、場合により、下限値1.060 g/cm3、好ましくは1.065 g/cm3、特に1.070 g/cm3、及び上限値1.085 g/cm3、好ましくは1.080 g/cm3、特に1.075 g/cm3の範囲の固有密度を有する密度勾配の形態での分離媒質(5)とを含む、前記容器。
【請求項２】
排気可能である、請求項1に記載の容器(1)。
【請求項３】
遠心分離可能である、請求項1又は2に記載の容器(1)。
【請求項４】
少なくとも1種の抗凝血性及び/又は凝集阻害性の物質を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の容器(1)。
【請求項５】
前記チキソトロープ物質(4)が、ケイ酸、ベントナイト、ヘクトライト、カオリン、アルギン酸塩、及び/又はこれらの混合物を含む群の材料から選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の容器(1)。
【請求項６】
前記分離媒質(5)が、特にケイ酸塩を基剤とする少なくとも1種のポリマー、及び/又は高分子炭水化物、特に糖類、ジアトリゾエート、例えばPercoll（登録商標）、Ficoll（登録商標）、もしくは同じ分離特性を有する媒質から成る水溶液である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の容器(1)。
【請求項７】
前記分離媒質(5)及び/又は前記チキソトロープ物質(4)が、1種又は2種以上の色素を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の容器(1)。
【請求項８】
多孔質バリヤ(6)が配置されている、請求項1〜7のいずれか1項に記載の容器(1)。
【請求項９】
前記多孔質バリヤ(6)が、膜、フラップ、フリット、篩、及び/又はフィルタによって形成されている、請求項8に記載の容器(1)。
【請求項１０】
前記多孔質バリヤ(6)が運動可能である、請求項8又は9に記載の容器(1)。
【請求項１１】
前記多孔質バリヤ(6)が、上限値15 mm、好ましくは10 mm、特に5 mm、及び下限値0.1 mm、好ましくは1 mm、特に2 mmの範囲の厚さを有する、請求項8〜10のいずれか1項に記載の容器(1)。
【請求項１２】
前記多孔質バリヤ(6)が、上限値150 μm、好ましくは100 μm、特に50 μm、及び下限値1 μm、好ましくは10 μm、特に20 μmの範囲の孔サイズを有する、請求項8〜11のいずれか1項に記載の容器(1)。
【請求項１３】
前記多孔質バリヤ(6)が疎水性材料から成り、及び/又は疎水性被覆体を備えている、請求項8〜12のいずれか1項に記載の容器(1)。
【請求項１４】
前記多孔質バリヤ(6)がエラストマーによって仕切られている、請求項8〜13のいずれか1項に記載の容器(1)。
【請求項１５】
前記多孔質バリヤ(6)が、収容可能な閉鎖要素を備えている、請求項8〜14のいずれか1項に記載の容器(1)。
【請求項１６】
内側に、前記多孔質バリヤ(6)を終端位置に位置決めする突起が配置されている、請求項8〜15のいずれか1項に記載の容器(1)。
【請求項１７】
生物学的試料から腫瘍細胞、特に播種性腫瘍細胞(9)を分離するための、請求項1〜16のいずれか1項に記載の容器(1)の使用。
【請求項１８】
腫瘍細胞、特に播種性腫瘍細胞(9)の検出方法であって、以下のステップ：
(a) 請求項1〜16のいずれか1項に記載の容器(1)を用意し；
(b)該容器(1)内に生物学的試料を添加し；
(c)該生物学的試料を少なくとも下側及び上側の区画(7、8)に分割するために該容器(1)を遠心分離し；並びに
(d)該遠心分離後にチキソトロープ物質及び/又は多孔質バリヤ(6)の上方の区画内に位置する、該生物学的試料の腫瘍細胞を用いて分子生物学的診断、免疫学的診断、及び/又は細胞診断を行うこと、
を含む、前記方法。
【請求項１９】
前記生物学的試料として、血液及び骨髄、尿、唾液、リンパ液、浸出液、濾液、髄液、精液、もしくは分散組織、及び/又は天然又は非天然体腔の液体を含む群に由来する体液が使用される、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
(1)(i)上皮腫瘍、例えば肺癌(小細胞肺癌及び非小細胞肺癌)、消化管腫瘍(肝細胞腫瘍、膵臓癌、食道癌、胃癌、小腸癌、結腸直腸癌)、乳癌、腎臓もしくは副腎腫瘍、膀胱癌、及び前立腺癌、及び(ii)非上皮腫瘍、例えばメラノーマ、神経芽細胞腫、脳腫瘍、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、又は奇形癌、を含む固形腫瘍、並びに(2)血液腫瘍、例えばT細胞リンパ芽球腫、T細胞白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、及び/又はリンパ腫の群に由来する転移性、特にミクロ転移性の腫瘍及び/又は新生組織の腫瘍細胞が検出される、請求項18又は19に記載の方法。
【請求項２１】
前記生物学的試料が希釈される、請求項18〜20のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
血液が凝結阻害物質中で採取される、請求項18〜21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２３】
前記生物学的試料には、腫瘍細胞における血小板の凝集を回避するための少なくとも1種の凝集阻害物質が添加される、請求項18〜22のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２４】
前記遠心分離が、下限値500 g、好ましくは800 g、特に1000 g、及び上限値2500 g、好ましくは2000 g、特に1500 gの範囲のグラム数で実施される、請求項18〜23のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２５】
前記生物学的試料が、上限値60分、好ましくは45分、特に30分、及び下限値5分、好ましくは10分、特に20分の時間にわたって遠心分離される、請求項18〜24のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２６】
前記容器が好ましくは4℃で冷却され、(i)チキソトロープ物質及び場合によっては(ii)分離媒質の好ましい密度は、この温度に合わせて調節されている、請求項18〜25のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２７】
前記容器(1)が、遠心分離後、そして、腫瘍細胞で富化された区画の取出し前に冷却される、請求項18〜26のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２８】
前記腫瘍細胞が、血漿区画内及び/又は血漿区画の下の区画から得られる、請求項18〜26のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２９】
前記播種性腫瘍細胞(9)が、上側の区画(7)から、手動、半自動、及び/又は自動で取出される、請求項18〜28のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３０】
血清学のルーティン・パラメータが、血漿である最も上側の区画から決定される、請求項18〜29のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３１】
診断のために、免疫細胞化学的着色、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)、RT-PCR(逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応)、細胞培養、FISH(蛍光インサイチュハイブリダイゼーション)、及び/又はFACS(蛍光活性化細胞分別機)を含む群のうちの少なくとも1つの方法が選択される、請求項18から30までのいずれか1項に記載の方法。
【請求項３２】
閉じられた端部と開放可能な端部(2、3)とを備えた容器(1)内の、種々異なる固有密度の生物学的試料、及び腫瘍細胞、特に播種性腫瘍細胞(9)を分離するための少なくとも1種の分離媒質の区画の配置関係であって、初めに、閉じられた端部(2)の領域に、下限値1.060 g/cm3、好ましくは1.065 g/cm3、特に1.070 g/cm3、及び上限値1.085 g/cm3、好ましくは1.080 g/cm3、特に1.075 g/cm3の範囲の固有密度を有する密度勾配の形態の分離媒質(5)と、場合により続いて、下限値1.055 g/cm3、好ましくは1.057 g/cm3、特に1.060 g/cm3、及び上限値1.070 g/cm3、好ましくは1.069 g/cm3、特に1.065 g/cm3の範囲の固有密度を有するチキソトロープ物質(4)とが提供され、開放可能な端部(3)の領域内に、該生物学的試料の収容のための十分な容積を有する自由空間が配置されており、そして遠心分離後には、(i)該容器(1)の下端部(2)の領域内の赤血球で始まって、(ii)続いて、白血球、リンパ球、単球から成る区画、及び場合により(iii)分離媒質(5)の一部、更に続いて(iv)該チキソトロープ物質(4)、これに続いて(v)希釈分離媒質(5)の区画、続いて(vi)血小板及び腫瘍細胞、特に播種性腫瘍細胞(9)を有する血漿から成る区画、及び場合により(vii)自由空間が配置されている、前記の配置関係。
【請求項３３】
請求項1〜16のいずれか1項に記載の容器(1)を含む、試験キット。
【請求項３４】
場合により濃縮形態の洗浄緩衝剤を有する、少なくとも1つの容器(1)を含む、請求項33に記載の試験キット。
【請求項３５】
試料用容器を更に含む、請求項33又は34に記載の試験キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、閉じられた端部と開放可能な端部とを備えた、生物学的試料から腫瘍細胞、特に播種性腫瘍細胞を分離するための容器、腫瘍細胞、特に播種性腫瘍細胞の検出方法、閉じられた端部と開放可能な端部とを備えた容器内の、種々異なる固有密度の生物学的試料、及び腫瘍細胞、特に播種性腫瘍細胞を分離するための少なくとも1種の分離媒質の区画の配置関係、及び試験キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ほぼ全ての固形悪性腫瘍が転移形成の可能性を有している。転移のプロセスは、多くの場合血管もしくはリンパ管に沿った、隔たった器官内への悪性細胞の播種、及び自律性娘腫瘍の形成を含む。派生の規模は、腫瘍疾患の予後を決定する。
【０００３】
腫瘍の予防又はアフターケアのプログラムの利益は、一次腫瘍、もしくは再発又は転移を、これらが臨床的に明らかになる前に早期発見することにある。このような目的はこれまで、利用可能な装置技術を用いて満足に達成することはできていない。
【０００４】
例えば末梢血中の播種性腫瘍細胞を検出することによって、早期に、すなわち臨床的に認識可能な腫瘍又は転移の発生前に、できる限り治癒的な免疫調節又は多剤併用化学療法を導入することができる。特にアジュバント療法の前後の腫瘍細胞の定量化は、重要なコントロール機器が行う。
【０００５】
体液中の腫瘍細胞を検出して定量化した後、例えば顕微鏡下でこれらの腫瘍細胞を細胞学的に特徴付けすることが興味深いこともある。更に、滅菌条件下で単離された腫瘍細胞を培養液中に取入れることにより、これから対応細胞系を確立することができる。一次腫瘍に由来する代わりに、播種された循環細胞に由来する細胞系は、分化された転移のプロセスを調査する可能性を提供する。更に、このような細胞系は、新しく効果的な腫瘍治療薬を開発するためにも貢献し、また新しい治療上及び診断上のターゲットを見いだすのを助けることができる。
【０００６】
別の興味深い可能性は、腫瘍治療前に癌患者の播種性腫瘍細胞を獲得すること、そしてこれらの細胞を腫瘍治療薬の反応に関して個別に試験することにある。
【０００７】
体液は一般に多数の種々異なる細胞を含有するので、決定された細胞タイプ、例えば腫瘍細胞、特に播種性腫瘍細胞を定量化する前に、定量化を容易にするために、これらを富化し、そして同時にできる限り大量の非腫瘍細胞を減損化させることが望ましい。
【０００８】
60年代及び70年代において既に、異なる密度に基づいて、造血性細胞から腫瘍細胞が分離された。これらのデータによれば、腫瘍細胞の固有密度は≦ 1.040から>1.065 g/cm3である一方、赤血球及び多形核白血球の密度はより高い。リンパ球はこれに対して1.060〜1.075 g/cm3の固有密度を有しており、従って腫瘍細胞の固有密度と重なり合う。
【０００９】
今日、播種性腫瘍細胞を単離して特徴付けするために、すでに種々異なる方法が用いられる。例えば濾過もしくは密度勾配遠心分離のような方法群は、細胞のサイズ又は密度のような物理特性に基づく。
【００１０】
別の方法群は、細胞を特異的抗体によって結合し、そしてポジティブな選択によって富化するか、もしくはネガティブな選択によって減損化することにより、腫瘍細胞もしくは血液細胞の固有の免疫学的特性を活用する。ポジティブな選択の場合、上皮腫瘍細胞の富化のために、細胞は例えば上皮細胞特異的抗原、例えばEPCAM(上皮細胞付着分子、これはHEAもしくは17-A抗原と同じである)及びサイトケラチンに対する特異的抗体でマーキングされ、そして磁気粒子又は蛍光分子に結合される。このようにマーキングされた腫瘍細胞は次いで、MACS(磁気細胞分別)又はFACS(蛍光活性化細胞分別)のような細胞分別機によって富化される。ポジティブな選択は、上皮起源の腫瘍細胞しか検出できないという欠点を有している。
【００１１】
このような選択法は極めて多くの手間及び時間がかかる。細胞は、方法に起因する大きいストレスに曝される。これにより、申し分のない細胞学的な精査がもはや可能でなくなるほど、細胞形態が部分的に不都合に変化するおそれがある。更に、富化された細胞を培養液中に取入れて拡張させることはもはやできない。
【００１２】
加えて、血液細胞又は腫瘍細胞上又は細胞内における個々の抗原提示は、個々に異なる状態で調節されることが可能である。細胞表面上の抗原提示が僅かな場合、このことは劣悪な分離結果を招くおそれがある。しかし更に血液細胞又は腫瘍細胞は、選択にとって不所望の表面抗原を発現させるおそれもある。このことは、非特異的な富化もしくは減損化を招き、また、誤ったポジティブな結果もしくは誤ったネガティブな結果を招くおそれがある。更に、抗体に基づく選択法及び検出法は、その都度使用される抗体の品質に大幅に依存する。
【００１３】
全体的に考察すると、細胞の細胞精査、特に免疫細胞学的精査は、高特異的と見なされるが、しかしこれは感度が低いと言われている。いずれの場合にも、このような方法は多くの手間がかかり、高価であり、ひいては日常的な診断には適しにくい。
【００１４】
分子診断、特に増幅法、例えばDNAもしくはRNAのような腫瘍特異的核酸を検出するためのPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)、RT-PCR(逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応)、及びQPCR(定量逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応)は、細胞検出法の興味深い代替法を提供する。PCR-(ポリメラーゼ連鎖反応)技術に基づいて構成された方法全体は、高感度ではあるものの、試料中の核酸の品質に大幅に依存する。採血後、細胞の核酸、特にRNAは、細胞内及び細胞外の酵素によって極めて急速に分解され得るので、細胞特異的な、特に腫瘍細胞特異的な核酸は、もはや十分に、もしくはもはや全く、定量化もしくは検出することができない。
【００１５】
更に、採血後の細胞及び特に腫瘍細胞は、細胞特異的もしくは腫瘍細胞特異的な遺伝子発現プロフィールを引下げ得ることが実証済みと見なされる。遺伝子発現プロフィール内のこのような変化は、未処理血液試料中の腫瘍細胞の滞留時間が長ければ長いほど、後まで持続する。後続の核酸精製法、特にRNA抽出法、濃縮法、及び書換え法が外生的なヌクレアーゼ、特にRNaseによる汚染に対して極めて鋭敏である以上、分子診断の感度に勝るのものがないにもかかわらず、誤ったネガティブな結果が生成されるおそれがある。
【００１６】
従来技術からは、播種性腫瘍細胞の富化のためのOncoQuick（登録商標）システムが知られている。OncoQuick（登録商標）による循環腫瘍細胞の富化は、特に、分離されるべき細胞の密度に適合され、そして15〜30 mlの全血及び骨髄の密度に対して最適化された密度勾配に基づいている。OncoQuick（登録商標）は、多孔質分離板によって2つの区画に分割される遠心分離管から成っている。下側の区画は分離媒質を含有する。上側の区画内には、30 mlまでの被験試料を満たすことができる。分離媒質及び分離板の特別な特性により、不所望の血液細胞もしくは骨髄細胞は遠心分離中に下側の区画内に沈降させられ、そして対応する分離媒質容積を上側の区画内に押退ける。とりわけ腫瘍細胞を含有する、より低い密度の細胞画分は、血漿と分離媒質との間の上側区画内で間期において富化され、そしてその場所から取出すことができる。
【００１７】
OncoQuick（登録商標）による検査は、驚くべきことに、血液の古さが、(i)播種性腫瘍細胞の富化、及び特に、(ii)不所望の非腫瘍細胞の減損化の程度及び質にとって決定的であることを示した。2時間後もしくは24時間後にOncoQuick（登録商標）で20 ml末梢血を処理すると、血液試料中に最初存在している血液細胞と比較して、不所望の非腫瘍細胞の減損化度は、相対Log減損化係数がほぼLog 5.9からLog 3.8まで減少した。その原因は、非特異的及び細胞型依存的な変化、特に血液細胞の固有密度の上昇である。
【発明の開示】
【００１８】
従って本発明の課題は、急速且つ効率的な腫瘍細胞の富化が可能であるような方法、もしくは方法を実施するための構成部分を利用可能にすることである。本発明の部分的な課題は、富化法自体のためにも、後続の細胞もしくは分子の検出法のためにも、(i)細胞平面及び(ii)分子平面上の不都合な変化を回避するか、又は少なくともできる限りわずかに保つことである。
【００１９】
本発明の課題は、(A)(a)下限値1.055 g/cm3、好ましくは1.057 g/cm3、特に1.060 g/cm3、及び上限値1.070 g/cm3、好ましくは1.069 g/cm3、特に1.065 g/cm3の範囲から選択された固有密度を有するチキソトロープ物質と、場合によっては(b)下限値1.060 g/cm3、好ましくは1.065 g/cm3、特に1.070 g/cm3、及び上限値1.085 g/cm3、好ましくは1.080 g/cm3、特に1.075 g/cm3の範囲から選択された固有密度を有する密度勾配の形態の分離媒質とが提供されている、閉じられた端部と開放可能な端部とを備えた容器、(B)(a)容器を用意し、(b)容器内に生物学的試料を添加し、(c)生物学的試料を少なくとも下側及び上側の区画に分割するために容器を遠心分離し、(d)遠心分離後にチキソトロープ物質及び/又は多孔質バリヤの上方の区画内に位置する、生物学的試料の腫瘍細胞を用いて分子生物学的診断、免疫学的診断、及び/又は細胞診断を行うステップを含む、方法、(C)初めに、閉じられた端部の領域に、(a)下限値1.060 g/cm3、好ましくは1.065 g/cm3、特に1.070 g/cm3、及び上限値1.085 g/cm3、好ましくは1.080 g/cm3、特に1.075 g/cm3の範囲から選択された固有密度を有する密度勾配の形態の分離媒質と、場合によっては続いて、(b)下限値1.055 g/cm3、好ましくは1.057 g/cm3、特に1.060 g/cm3、及び上限値1.070 g/cm3、好ましくは1.069 g/cm3、特に1.065 g/cm3の範囲から選択された固有密度を有するチキソトロープ物質とが提供されており、開放可能な端部の領域内に、(c)生物学的試料の収容のための十分な容積を有する自由空間が配置されており、そして遠心分離後には、(i)容器の下端部の領域内の赤血球で始まって、続いて、(ii)白血球、単球、リンパ球から成る区画、及び場合によっては(iii)分離媒質の一部、更に続いて(iv)チキソトロープ物質、これに続いて(v)希釈分離媒質の区画、続いて(vi)血小板及び腫瘍細胞、特に播種性腫瘍細胞を有する血漿から成る区画、及び場合によっては(vii)自由空間が配置されている、種々異なる固有密度の区画の配置関係、(D)これに適した試験キット、並びに(E)その使用、によってそれぞれ独立して解決される。
【００２０】
有利には、更に、播種性腫瘍細胞の分離を試料獲得後にできるだけ迅速に行うことができると、生物学的試料の最適な分離特性が得られることが判っている。試料採取法と、試料中に含有される播種性腫瘍細胞の分離法とを、同じ容器内で実施できると、特に有利である。
【００２１】
本発明の好ましい実施態様は従って、採血システムとして排気可能な容器を提供することであり、これにより、真空が既に存在する状態で試料採取を自動的に行うことができ、ひいては、試料を採取する人が生物学的試料と接触する必然性はない。
【００２２】
本発明の別の好ましい実施態様は、このような容器が遠心分離可能であることであり、生物学的試料が穿刺によって獲得可能な体液である場合に、試料を得た容器を直接に遠心分離することができ、そして試料採取容器から遠心分離のための容器に生物学的試料を移すための中間ステップは必要でない。
【００２３】
更に、抗凝血性且つ/又は凝集阻害性の物質が含有されていると有利であることが判っている。これにより、一方では腫瘍細胞における血小板の凝集が阻止され、且つ/又は腫瘍細胞における血小板の凝集を促進する物質から体液を解放し、他方では、生物学的試料の凝結を阻止することができる。
【００２４】
チキソトロープ物質は、ケイ酸、ベントナイト、ヘクトライト、カオリン、アルギン酸塩、及び/又はこれらの混合物を含む群の材料から選択され、機械的な力が作用することにより、この物質は流動化し、そして機械的負荷の終了後には再び硬化する。
【００２５】
分離媒質は、少なくとも1種のポリマー、特に糖類及び/又はジアトリゾエート、例えばPercoll（登録商標）、Ficoll（登録商標）、もしくは同じ分離特性を有する媒質から成る水溶液であり、これにより、異なる密度に基づいて細胞を分離するための容易で迅速な遠心分離手順を実施することができる密度勾配が利用される。
【００２６】
別の構成において、分離媒質及び/又はチキソトロープ物質は、1種又は2種以上の色素を含有しており、これにより、分離媒質もしくはチキソトロープ物質と、生物学的試料の腫瘍細胞との間の明確な境界が視認可能になる。
【００２７】
別の構成において、膜、フラップ、フリット、篩、及び/又はフィルタから成る多孔質バリヤが配置されており、これにより、容器は上側区画と下側区画とに分割され、細胞分離媒質は下側区画内に提供され、そして体液は上側区画内に導入される。この場合、生物学的試料の添加時に細胞分離媒質と混和しないことが有利であることが判っている。同時に、遠心分離後の区画の混和も回避される。
【００２８】
好ましい実施態様は、容器の下側三分の一内に提供されたチキソトロープ・ゲル4によって2つの区画、すなわち下側区画8と上側区画7との分割された、排気可能な容器1である。チキソトロープ・ゲルの下側に配置された分離媒質5は、(i)チキソトロープ・ゲルを所定の位置に保持し、そして(ii)遠心分離中に、より重い細胞が、妨げられることなしにチキソトロープ・ゲル(もしくは流動化ゲル)を通って移動し、そして元は分離媒質によって形成されていた空間内に集合できることを保証するのに役立つ。付加的に多孔質バリヤ5(膜、フラップ、フリット、篩、及び/又はフィルタ)が導入されると、以下の可能性が生じる：
実施態様1：真空を作用させることができるので、付加的な装置がない。
実施態様2：真空をより良好に作用させることができるように、付加的にチキソトロープ物質が多孔質バリヤ(膜、フリット、篩、及び/又はフィルタ、フラップ)を密封する。この場合、チキソトロープ物質は、分離媒質よりも低い密度を有しており、そして分離媒質は、チキソトロープ・ゲルの分離の役目を担う。多孔質バリヤ(膜、フリット、篩、及び/又はフィルタ、フラップ)は、分離媒質なしのチキソトロープ・ゲルに対して付加的に使用される。この場合、バリヤは分離媒質の機能を担い、そしてチキソトロープ物質の下側に位置する。チキソトロープ・ゲルの下側に配置された多孔質バリヤは、(i)チキソトロープ・ゲルを所定の位置に保持し、そして(ii)遠心分離中に、より重い細胞が、妨げられることなしにチキソトロープ・ゲル(もしくは流動化ゲル)を通って移動し、そして元は分離媒質によって形成されていた空間内に集合できることを保証するのに役立つ。
【００２９】
多孔質バリヤ5(膜、フラップ、フリット、篩、及び/又はフィルタ)は、チキソトロープ物質及び分離媒質に対して付加的に使用される。
【００３０】
多孔質バリヤは上限値15 mm、好ましくは10 mm、特に5 mm、及び下限値0.1 mm、好ましくは1 mm、特に2 mmの範囲から選択された厚さを有する。これにより、遠心力によって損傷されない状態を保持するために、相応の強度が形成される。
【００３１】
上限値150 μm、好ましくは100 μm、特に50 μm、及び下限値1 μm、好ましくは10 μm、特に20 μmの範囲から選択された孔サイズを有する多孔質バリヤは、遠心分離時に、提供された分離媒質よりも高い密度を有する液体並びに粒子状成分がバリヤを妨げられることなしに通過することができ、ひいては、分離媒質が遠心分離中に上側区画内に駆逐されることを保証する。腫瘍細胞は多孔質バリヤの上方の平面上に位置することになる。
【００３２】
さらなる構成において、多孔質バリヤは疎水性材料から成っており、且つ/又は、疎水性被覆体を備えている。これにより、細胞又はその他の粒子状構成部分の付着を阻止することができる。
【００３３】
更に、多孔質バリヤはエラストマーによって仕切られており、そしてこれにより、容器の内壁とバリヤ自体との間の密な、特に液体に対して密な閉鎖を形成できることが有利であることが判っている。
【００３４】
収容可能な閉鎖要素の配置によって、遠心力の作用中には貫通開口を提供し、この貫通開口は休止時には再び閉じられることが可能である。
【００３５】
内面には、突起を配置することができる。採血中及び採血後、並びに遠心分離中及び遠心分離後に所望の位置で多孔質バリヤをブロックすることにより、突起は多孔質バリヤをその終端位置に位置決めし、これにより下側の区画が形成される。
【００３６】
本発明による方法を用いて、有利には、数多くの種々異なる生物学的試料、例えば血液及び骨髄、尿、唾液、リンパ液、浸出液、濾液、髄液、精液、もしくは分散組織、及び/又は天然又は非天然体腔の液体を含む群に由来する体液を、生物学的試料の起源とは無関係に使用することができる。これにより、その都度異なる起源の試料のために順応ステップを実施せずに済む。
【００３７】
(1)(i)上皮腫瘍、例えば肺癌(小細胞肺癌及び非小細胞肺癌)、消化管腫瘍(肝細胞腫瘍、膵臓癌、食道癌、胃癌、小腸癌、結腸直腸癌)、乳癌、腎臓もしくは副腎腫瘍、膀胱癌、及び前立腺癌、及び(ii)非上皮腫瘍、例えばメラノーマ、神経芽細胞腫、脳腫瘍、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、又は奇形癌、を含む固形腫瘍、並びに(2)血液腫瘍、例えばT細胞リンパ芽球腫、T細胞白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、及び/又はリンパ腫の群に由来する転移性、特にミクロ転移性の腫瘍及び/又は新生組織の腫瘍細胞を検出することができる。これにより、数多くの種々異なる腫瘍疾患を同じ方法で検出することができる。
【００３８】
生物学的試料は希釈することができ、これにより、例えば生物学的試料が小さな容積で存在する場合に、容積を増大させ、且つ/又は生物学的試料の粘度を低下させることによって、より良好な分離特性を達成することができる。
【００３９】
更に、血液を凝結阻害物質中で採取することが有利であることが判っている。これにより、腫瘍細胞分離法の実施中に、血液の凝固が阻止される。
【００４０】
更に、生物学的試料に、少なくとも1種の凝集阻害性物質が添加されることが有利であることが判っている。これにより、腫瘍細胞における血小板の凝集が阻止され、もしくは腫瘍細胞における血小板の凝集を促進する物質から生物学的試料が解放される。
【００４１】
遠心分離は、下限値500 g、好ましくは800 g、特に1000 g、及び上限値2500 g、好ましくは2000 g、特に1500 gの範囲から選択されたg数で実施される。これにより、播種性腫瘍細胞の、生物学的試料の残りの成分からの最適な分離特性が達成される。有利には、更に、加速することなしに、そしてブレーキを使用することなしに、遠心分離が行われる。
【００４２】
遠心分離は、上限値60分、好ましくは45分、特に30分、及び下限値5分、好ましくは10分、特に20分の時間にわたって行われ、腫瘍細胞の分離は最も効率的に行われ、ひいては、後続の、上側区画からの腫瘍細胞獲得が容易になる。
【００４３】
遠心分離は好ましくは4℃で行われ、(i)チキソトロープ物質及び場合によっては(ii)分離媒質の好ましい密度は、この温度に合わせて調節されている。20℃の遠心分離の場合、(i)チキソトロープ物質及び場合によっては(ii)分離媒質の好ましい密度の設定値は、これに応じて高められなければならない。
【００４４】
容器は、遠心分離後、そして、腫瘍細胞で富化された区画の取出し前に冷却することができ、これにより、腫瘍細胞を含有しない区画と、これと隣接する、腫瘍細胞を含有する区画との間に明確な境界が形成される。
【００４５】
腫瘍細胞は、血漿区画内及び/又は血漿区画の下の区画から得ることができ、血漿区画内に、又は血漿区画に隣接して腫瘍細胞を配置することにより、腫瘍細胞のための最適な環境が形成される。この環境により、一方では細胞はこれらの形態学的特性で得られ、他方では、細胞は種々様々な酵素による分解作用から保護されるので、引き続いて分析されるべきこれらの含有物質、例えばDNA及びRNAは、DNAse又はRNaseによって攻撃されることはない。
【００４６】
播種性腫瘍細胞は、上側の区画から、手動、半自動、及び/又は自動で取出すことができる。これにより、例えば作業ロボットを用いて自動的に血漿を獲得し、そして取出された血漿から血清学的なルーティン・パラメータを分析することによって、播種性腫瘍細胞の他に、数多くの種々様々なパラメータを上側区画から決定することができる。
【００４７】
後続の診断のために、免疫細胞化学的着色、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)、RT-PCR(逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応)、QPCR(定量逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応)、細胞培養、FISH(蛍光インサイチュハイブリダイゼーション)、及び/又はFACS(蛍光活性化細胞分別機)を含む群から方法を選択することができる。これにより、分子生物学的診断、免疫学的診断、及び/又は細胞診断を必要に応じて行うことができる。種々異なる検出方法を用いることにより、選択された方法で決定される結果を確認することができる。腫瘍の存在に関する報告は患者にとって極めて有意義であり、従って、誤ったポジティブな結果が生じないことは極めて重要である。
【００４８】
試験キット内には、本発明による容器の他に、場合によっては濃縮形態の洗浄緩衝剤を有する容器が含有されていてよく、これにより、分析を実施する実験室もしくは研究所において付加的な試薬が必要とされることはない。
【００４９】
キット内には更に、さらなる試料用容器が含有されていてよく、試料用容器内には、洗浄済の腫瘍細胞が移され、そしてさらなる方法ステップ及び分析が実施される。
【００５０】
本発明を下記の実施態様により、更に詳しく説明する。
【００５１】
本発明を、図面に示された実施例により、以下に更に詳しく説明する。
【００５２】
初めに念のため述べておくが、異なるものとして記載された実施態様において、同一部分には同一参照符号もしくは同一構成部分符号を付す。説明全体に含まれる開示内容は、同一参照符号もしくは同一構成部分符号を有する同一部分に、意味に即して転用することができる。また、説明において選択された位置の記述、例えば上、下、側方などは、直接に説明され図示された図面に関するものであり、そして位置が変化したときには、新しい位置に意味に即して転用される。更に、図示され説明された種々異なる実施例の個々の特徴又は特徴の組み合わせも、それ自体独立した、本発明の、又は本発明による解決手段である。
【００５３】
本発明は、生物学的試料から腫瘍細胞を富化及び/又は減損化する方法であって、1種又は2種以上の物質を、容器1において液体中で生物学的試料と合体し、そして遠心分離するものに関する。
【００５４】
本発明による方法は、腫瘍細胞、特に播種性腫瘍細胞9を富化するためにも減損化するためにも、遠心分離後にどの区画を更に処理するかに依存して用いることができる。従って、これらの可能な両処理は区別されず、全体的に腫瘍細胞の富化に関して述べるが、しかし本発明によれば、両方の可能性が包含されるべきである。
【００５５】
生物学的試料は、体液であってよく、また有機組織に由来していてもよい。試料はヒト起源であっても動物起源であってもよい。体液としては、血液、尿、唾液、リンパ液、浸出液、濾液、髄液、精液、天然又は非天然体腔の液体であってよく、或いは、組織を使用する場合には、骨髄組織、又はいかなる他の分散組織もしくは均質化組織をも使用することができる。
【００５６】
生物学的試料を獲得するための、もしくは生物学的試料が満たされる容器は、閉じられた端部2と開放可能な端部3とを有している。容器1内には、下限値1.055 g/cm3、好ましくは1.057 g/cm3、特に1.060 g/cm3、及び上限値1.070 g/cm3、好ましくは1.069 g/cm3、特に1.065 g/cm3の範囲から選択された固有密度を有するチキソトロープ物質4が含有されている。
【００５７】
容器1のさらなる構成において、下限値1.060 g/cm3、好ましくは1.065 g/cm3、特に1.070 g/cm3、及び上限値1.085 g/cm3、好ましくは1.080 g/cm3、特に1.075 g/cm3の範囲から選択された、チキソトロープ物質4の固有密度と同じか又はこれよりも高い固有密度を有する密度勾配の形態の分離媒質5が付加的に含有されていてよい。
【００５８】
別の実施態様において、分離媒質5は、下限値1.055 g/cm3、好ましくは1.057 g/cm3、特に1.060 g/cm3、及び上限値1.070 g/cm3、好ましくは1.068 g/cm3、特に1.065 g/cm3の範囲から選択された固有密度と、多孔質バリヤ6とを有することもできる。
【００５９】
最も単純な実施態様の場合、容器は、1.057〜1.069 g/cm3、特に1.060 g/cm3の固有密度を有するチキソトロープ物質4、特にチキソトロープ・ゲルだけを有する。チキソトロープ物質4は、容器1の閉じられた端部2の領域に配置されている。
【００６０】
最も単純な実施態様のさらなる構成において、チキソトロープ物質4に対して付加的に、1.060〜1.085 g/cm3、特に1.065〜1.070 g/cm3の範囲の固有密度を有する密度勾配の形態の分離媒質5が更に含有されている。このような実施態様の場合、分離媒質5は閉じられた端部2の領域に含有されており、そしてチキソトロープ物質4は、容器1内の分離媒質5の上方に含有されている。
【００６１】
容器1の別の実施態様の場合、チキソトロープ物質4及び分離媒質5は、1.055〜1.070 g/cm3の範囲のほぼ同じ固有密度を有することができ、これに加えて多孔質バリヤ6が含有されている。容器1の閉じられた端部2の領域において、この実施態様の場合、分離媒質5は、その上方に多孔質バリヤ6が存在するように位置しており、そして容器1の開放可能な端部3の方向には、チキソトロープ物質4が提供されている。
【００６２】
分離媒質はチキソトロープ物質4を、試料取込み前及び取込み中、並びに遠心分離中及び遠心分離後に、容器1の所定の位置に保持する。更に、分離媒質5は、被験体液、好ましくは末梢血、静脈血、動脈血、これらの混合物、例えば指先からの血液、中心静脈血、中心動脈血、及び臍帯血、並びに骨髄の高密度成分、特に赤血球、単球、顆粒球、及び、高密度リンパ球の一部が、妨げられることなしにチキソトロープ物質4を貫通して移動し、そして、分離媒質5によって形成された空間内に到達できることを保証する。
【００６３】
この際に、分離媒質5の対応容積は押退けられ、これにより、その上側に位置するチキソトロープ物質4は上方に向かって押上げられ、且つ/又は、分離媒質5は、下方に向かって移動する細胞と一緒に運ばれた液体によって予め希釈されるので、所定量の希釈された分離媒質5が、遠心分離後には、チキソトロープ物質4の上方に位置することになる。
【００６４】
チキソトロープ物質4が、ケイ酸、ベントナイト、ヘクトライト、カオリン、アルギン酸塩、及びこれらの混合物から形成される。チキソトロープ物質4は、ゲルの形態で存在し、そして容器1を少なくとも1つの下側区画8と少なくとも1つの上側区画7とに分割し、そして固有密度に基づいて上側区画7内の播種性腫瘍細胞9を富化し、これと同時に下側区画8内の不所望な細胞を減損化するのを可能にする。チキソトロープ物質4は更に、上側区画7の排気を可能にする。
【００６５】
密度勾配の形態で存在する分離媒質5は、少なくとも1種のポリマー、特にPercoll（登録商標）、又はFicoll（登録商標）の商品名で知られる糖類又はジアトリゾエート、もしくは、例えばPercoll類似物質、又はFicoll類似物質から成る水溶液から形成される。プラスチックから成る容器1のためには、好ましくはPercoll（登録商標）が使用され、そしてガラスから成る容器1のためには、好ましくはFicoll（登録商標）が使用される。
【００６６】
本発明による容器1のさらなる構造において、分離媒質5及び/又はチキソトロープ物質4に色素を添加することができる。分離媒質5もしくはチキソトロープ物質4に添加するための色素としては、例えばトリパンブルーを使用することができる。添加によって、異なる密度の個別の相もしくは区画の相互間の境界を区別しやすくなる。
【００６７】
容器1の開いた端部は閉鎖可能であってもよい。容器1は排気することもできる。本発明による容器1は、従来技術の排気された採血管と比較可能に排気することもでき、そしてチキソトロープ物質4もしくは分離媒質5、及び場合によっては多孔質バリヤ6を含有することができる。
【００６８】
例えば生物学的試料として血液が使用される場合、血液は、本発明による排気された容器1を用いて直接に得ることができ、そして容器1の遠心分離後に腫瘍細胞9を分離することができる。
【００６９】
排気された容器1を用いて播種性腫瘍細胞9を残りの血液成分から分離可能にするために、容器1は遠心分離可能である。
【００７０】
生物学的試料は必ずしも既に容器1を用いて得る必要はなく、試料獲得後に初めて容器1に供給することもできる。組織が例えば生検によって得られる場合には、液体、例えば緩衝剤を添加することができ、そして試料は分散もしくは均質化される。この場合、生物学的試料は試料獲得後に初めて容器1に供給される。
【００７１】
体液もしくは組織はその種類に応じて、先ず希釈剤、好ましくは緩衝剤で希釈され、或いは直接に希釈されないまま容器1内に供給される。
【００７２】
生物学的試料として血液が使用される場合、容器1には更に、抗凝血性且つ/又は凝集阻害性の物質が供給される。
【００７３】
血液の凝集を阻止するために、凝結阻害物質、例えばEDTA、又はクエン酸塩、もしくはヘパリン、又はCPD(クエン酸塩、リン酸塩、デキストロース)、又は比較可能な物質を使用することができる。
【００７４】
凝集阻害物質は、例えば、希釈剤として使用された緩衝剤と一緒に添加することができる。好ましく使用される緩衝剤は、ダルベッコPBS(リン酸緩衝生理食塩水)である。腫瘍細胞における血小板の望ましくない凝集を阻止する物質としては、例えばEDTA、クエン酸塩、及びACD-A(酸性クエン酸デキストロース)が適している。これに加えて、又はこの代わりに、腫瘍細胞における血小板の凝集を促進する物質から体液を解放することができる。この場合、例えばマグネシウム・イオン及びカルシウム・イオンのようなイオンが使用される。
【００７５】
多孔質バリヤ6の厚さは、上限値15 mm、好ましくは10 mm、特に5 mm、及び下限値0.1 mm、好ましくは1 mm、特に2 mmの範囲から選択される。
【００７６】
多孔質バリヤ6の孔サイズは、上限値150 μm、好ましくは100 μm、特に50 μm、及び下限値1 μm、好ましくは10 μm、特に20 μmの範囲から選択される。
【００７７】
多孔質バリヤ6は更に疎水性材料から製造されていてよく、且つ/又は、疎水性被覆体を備えていてよい。
【００７８】
多孔質バリヤ6のさらなる構成において、エラストマーが配置されており、もしくはエラストマーが多孔質バリヤ6を仕切っている。
【００７９】
別の実施態様において、多孔質バリヤ6は、プランジャによって形成することもできる。プランジャによって、生物学的試料を負圧により容器1内に引込むことができる。このようなプランジャは多孔質バリヤ6を備えることもでき、そしてエラストマー、例えばゴムで取り囲むことができるので、プランジャは容器1を密閉する。容器1がピストンの形態の運動可能な多孔質バリヤ6によって形成される場合、チキソトロープ物質4には、採血中に多孔質バリヤ6の、容器1の開いた端部に向いた側を、容器1内に真空が作用し得るように覆うという仕事を課すことができる。細胞の分離はこの実施態様では、提供された分離媒質5によって行われる。
【００８０】
さらなる構成において、容器1の閉じられた端部2の領域内に、例えばリング、ピン、突起などのような装置を更に取付けることができる。この装置は、採血中及び採血後にプランジャを所望の位置にブロックし、これにより下側区画が形成される。このような下側区画1には、分離媒体5が提供されている。分離媒体5の密度は、1.055〜1.070 g/cm3、特に1.057〜1.063 g/cm3、及び特に好ましくは1.060 g/cm3の範囲から選択されている。後続の遠心分離によって、上側区画内の播種性腫瘍細胞9が富化され、そしてこれと同時に下側区画内の不所望な細胞が減損化される。
【００８１】
多孔質バリヤ6のさらなる構成において、収容可能な閉鎖要素が配置されていてよい。
【００８２】
既に記載したように、本発明による方法の場合、容器1を用意した後、生物学的試料を添加する。生物学的試料は、凝集阻害性且つ/又は凝結阻害性且つ/又は等張性の溶液で希釈することができる。凝集阻害性もしくは凝結阻害性の物質はもちろん、容器1の内面、特に上側区画7の内部に凍結乾燥形態もしくは噴霧形態で配置することもできる。
【００８３】
さらなる方法ステップにおいて、容器1は、播種性腫瘍細胞9を生物学的試料の残りから分離するために遠心分離され、そして少なくとも下側区画と上側区画7とに分割される。遠心分離は、下限値500 g、好ましくは800 g、特に1000 g、及び上限値2500 g、好ましくは2000 g、特に1500 gの範囲から選択されたg数で実施される。生物学的試料は、上限値60分、好ましくは45分、特に30分、及び下限値5分、好ましくは10分、特に20分の時間にわたって遠心分離される。
【００８４】
遠心分離は好ましくは+4℃で行われるが、しかしこれとは別に室温で行うこともできる。遠心分離は好ましくは4℃で行われ、(i)チキソトロープ物質及び場合によっては(ii)分離媒質の好ましい密度は、この温度に合わせて調節されている。温度が上昇すると密度は減少するので、20℃の遠心分離の場合、(i)チキソトロープ物質及び場合によっては(ii)分離媒質の固有密度の設定値は、これに応じて高められなければならない。
【００８５】
遠心分離後、そして腫瘍細胞で富化された区画の取出し前に、容器1は付加的に冷却することができる。冷却によって、特に短時間の強力な冷却によって、容器1の下側区画8内に位置する血小板及び白血球を固定化することができる。冷却は液状窒素中で行うことができる。冷却によって、異なる区画からの細胞の混和が阻止され、これにより誤ったポジティブな試験結果を排除することができる。
【００８６】
播種性腫瘍細胞9は、チキソトロープ物質4の上方、もしくは多孔質バリヤ6の上方の区画7から得られる。最も上側の区画には、血漿、血漿/PBS、もしくは、血漿のタンパク質を含有する血漿/緩衝剤混合物が存在している。
【００８７】
血漿は、試験室への輸送時間中、細胞を生きた状態に保つ。例えば診療科又は開業医において本発明による方法を用いて精製した後、富化された、播種性腫瘍細胞9を含有する細胞画分が、このような上側区画7内に、すなわち大容積の血漿中に存在する。血漿は一方では生理的環境を提供し、ひいては細胞の形態学的特性並びに細胞の機能を守る。これにより、例えば生物学的試料は分解性酵素活性から守られ、特に細胞RNAはRNaseによる分解作用から保護される。
【００８８】
腫瘍細胞の獲得は(i)手動で、すなわち容器1を開き、そして上側区画7を新しい容器内にデカント処理又はピペット処理によって移すことによって行われるか(ii)半自動で、例えば国際公開第03/09131号パンフレットに記載されているように、細胞もしくは核酸保存特性を有する排気された試料カートリッジ内に移すことにより行われるか、或いは、(iii)自動で、例えばピペット処理ロボットによって行われる。加えて、上側区画7の液体による洗浄及び/又は保存ステップを実施することができる。腫瘍細胞9だけを取出すことも、上側区画7全体を取出すこともできる。
【００８９】
更に、いずれの標準的な実験室でも行うことができるように、上側区画7から血清学のルーティン・パラメータを決定することができる。
【００９０】
残りの生物学的試料から腫瘍細胞を分離するのに続いて、診断が実施される。分子生物学、免疫学的、及び/又は細胞に基づいて診断を行うことができる。検出法としては、免疫細胞化学的着色、ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、細胞培養、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、及び/又は蛍光活性化細胞分別機が挙げられる。播種性腫瘍細胞9の獲得に続いて行われる方法の列挙は一例を示したものにすぎず、完全なものを主張するものではない。
【００９１】
本発明による容器1及び本発明による方法を用いて、生物学的試料を再短時間内で処理することができる。播種性腫瘍細胞9の分離が少なくとも試料獲得と同じ日、例えば採血の日に行われると、最適な分離特性が達成される。血液が1日よりも古い場合、遠心分離後に、より高率の不所望な血液細胞が、富化された播種性腫瘍細胞9をも含有する上側区画7内に残される。その結果、より多量の細胞、もしくはより多くの核酸総量が富化されることになり、ひいては細胞もしくは分子の検出法の過負荷が生じるおそれがある。例えば免疫細胞学的検出法のためのスライドガラスがより多く必要になる。より高い核酸量による逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)、又は定量逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(QPCR)の過負荷を排除するために、生物学的試料の部分量だけを使用することができる。このことは、診断的報告可能性の低下を招くおそれがある。なぜならば、最初に得られた生物学的試料の一部だけが使用されるからである。
【００９２】
1日よりも古い血液の場合、更に、腫瘍マーカーがポジティブである非腫瘍細胞が一緒に富化され、ひいては誤ったポジティブな結果を計算に入れなければなければならない確率が高められる。更に、より古い生物学的試料において、細胞RNAは極めて急速に分解されるので、誤ったネガティブな結果が生成されるおそれがある。本発明による方法は、これに対して、開業医又は病院の診療科における生物学的試料の即時の調製を可能にし、ひいては、後続の細胞診断もしくは分子診断のための最適な出発点を可能にする。
【００９３】
遠心分離の実施後、少なくとも2つの区画、すなわち上側区画7と下側区画8とが存在する。両区画は、種々異なる固有密度の区画によって更に分割されている。図1には、個々の区画の配置関係を示す。容器1の閉じられた端部2の領域で始まって、(i)赤血球、(ii)続いて白血球、単球、リンパ球を有する区画、及び場合によっては(iii)分離媒質5の一部、更に続いて(iv)チキソトロープ物質4、及び場合によっては多孔質バリヤ6、これに続いて(v)下方に向かって移動する細胞の液体で希釈された分離媒質5の区画、続いて(vi)血小板を有する血漿を含む区画、及びこの区画の下限部の播種性腫瘍細胞9、及び場合によっては(vii)自由空間が位置している。
【００９４】
容器1は試験キット内に含有することができる。試験キット内には更に、場合によっては溶液中の濃縮形態、又は溶剤で希釈して使用するための粉末化形態を成す洗浄緩衝剤を有する容器1が含有されていてよい。
【００９５】
試験キットは更に別の試料用容器を含有することができる。試料用容器内には、遠心分離が行われた後、(i)播種性腫瘍細胞9、もしくは好ましい使用形態において(ii)播種性腫瘍細胞9を含有する上側区画7全体を移すことができる。これらの容器内では、所要の洗浄、濃縮、及び保存ステップを、富化された腫瘍細胞9に施すことができるので、細胞、又は細胞から解放された核酸を、次いで後続の細胞診断又は分子診断に供給することができる。
【００９６】
上に挙げた区画の固有密度は、容器1の閉じられた端部2から始まって下記のように分けられる：
【００９７】
【表１】
2008529541.tif 000003
【００９８】
播種性腫瘍細胞9は、(1)(i)上皮腫瘍、例えば肺癌(小細胞肺癌及び非小細胞肺癌)、消化管腫瘍(肝細胞腫瘍、膵臓癌、食道癌、胃癌、小腸癌、結腸直腸癌)、乳癌、腎臓もしくは副腎腫瘍、膀胱癌、及び前立腺癌、及び(ii)非上皮腫瘍、例えばメラノーマ、神経芽細胞腫、脳腫瘍、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、又は奇形癌、を含む固形腫瘍、並びに(2)血液腫瘍、例えばT細胞リンパ芽球腫、T細胞白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、及び/又はリンパ腫の群に由来する転移性、特にミクロ転移性の腫瘍及び/又は新生組織の腫瘍細胞を検出するために使用することができる。
【００９９】
集められた腫瘍細胞画分中で血小板も富化される以上、集められた細胞が例えばスライドガラス上に載置される場合には、血小板を更に少なくとも一度、緩衝剤(例えばPBS、もしくは0.1 %〜7 %のBSAを有するPBS)で洗浄し、そして10分間にわたって約200 gで遠心分離することにより、細胞から血小板を分離することが、細胞診断にとって有利であり得る。
【実施例】
【０１００】
実施例：
血液容器内に、固有密度1.060 g/cm3のチキソトロープ物質4、及び固有密度1.070 g/cm3の分離媒質5、Percollが含有されている。従来技術から知られている方法によって、静脈から針ホルダで血液を容器1内に採取する。容器1内では更に、凝集阻害性の、凝結阻害性(ヘパリン)物質が含有されている。ゆっくりと加速させ、しかもブレーキなしで、1000 gで20分間にわたって4℃で遠心分離する。遠心分離後に、チキソトロープ物質4の上方の区画全体を取出し、そして後続の分析に供給する。
【０１０１】
図面は、容器1、特に容器内の成分の配置関係の可能な実施態様を示している。この場合、留意すべきなのは、本発明が特別に示した実施態様自体に限定されるものではなく、むしろ種々様々な組合わせも可能であり、そしてこのような変更は、当業者の能力の範囲内で本発明による技術的な教示内容に基づいて行うことが可能である、ということである。図示の、そして説明した実施態様の個々の詳細の組合わせにより可能となる、全ての考えられ得る実施態様も権利範囲に一緒に含まれる。
【０１０２】
形式上、最後に、容器1の構造をより良く理解するために、その構成部分が部分的に寸法通りではなく、且つ/又は拡大され、且つ/又は縮小されて示されていることを示唆しておく。
【０１０３】
独立した本発明の手段の根底を成す課題は、明細書から知ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】図１は、容器内の区画7、8の配置関係を示す縦断面図である。
【符号の説明】
【０１０５】
1    容器
2    閉じられた端部
3    開放可能な端部
4    チキソトロープ物質
5    分離媒質
6    多孔質バリヤ
7    上側区画
8    下側区画
9    播種性腫瘍細胞
【図１】
2008529541.tif 000004
【国際調査報告】
2008529541.tif 000005
2008529541.tif 000006
2008529541.tif 000007
2008529541.tif 000008
2008529541.tif 000009
2008529541.tif 000010