(57)【要約】本発明は、急性腎臓移植拒絶反応に関連することが分かっているIMPDH2およびIL 10遺伝子の多型と任意で組み合わせる、MDR1遺伝子のエクソン26中の多型を検出することによってこの疾患を予測するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、患者において急性腎臓移植拒絶反応を予測するための方法：
(a) 患者から採取した試料から核酸を単離する段階；および 
(b) SEQ ID No. 1の176位に存在するヌクレオチドを検出する段階であって、この位置でのTの存在が急性腎臓移植拒絶反応を示す段階； 
(c) 急性腎臓移植拒絶反応を予測するための一つまたは複数の他のマーカーを任意で検出する段階。
【請求項２】
一つまたは複数の他のマーカーが、SEQ ID No. 5の682位に存在するヌクレオチドおよび／またはSEQ ID No. 6の3757位に存在するヌクレオチドである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
試料が全血である、請求項2記載の方法。
【請求項４】
検出する段階が、ジデオキシシークエンシングおよび／または対立遺伝子特異的定量的PCRにより達成される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
対立遺伝子特異的PCRがSeq ID No. 7およびSeq ID No. 8の対立遺伝子特異的プライマーならびにSeq ID No. 9の共通プライマー、ならびに／またはSeq ID No. 2およびSeq ID No. 3の対立遺伝子特異的プライマーならびにSeq ID No. 4の共通プライマーを使用して実施され、かつ／またはジデオキシシークエンシングがSeq ID No. 10およびSeq ID No. 11の対立遺伝子特異的プライマーを用いて実施される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
MDR1遺伝子におけるC3435T多型の検出において使用するための少なくとも一つの試薬、請求項1〜5のいずれか一項記載の任意の方法に従う手順を説明する指示書、およびキットの内容物用の容器を含む、患者における急性腎臓移植拒絶反応に対する感受性を評価するためのキット。
【請求項７】
MDR1遺伝子におけるC3435T多型の検出において使用するための少なくとも一つの試薬が、Seq ID No. 1の核酸に特異的にハイブリダイズすることができる核酸；または176位のヌクレオチドCがTで置換される、Seq ID No. 1の核酸を含む、請求項6記載のキット。
【請求項８】
IL 10遺伝子における-592 C>A多型、および／またはIMPDH2遺伝子におけるT3757C多型を検出するための少なくとも一つの試薬をさらに含む、請求項6または7記載のキット。
【請求項９】
本明細書、特に実施例に関して記載される、方法およびキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎臓移植の急性拒絶反応用のマーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
腎臓移植術には、高い頻度で移植の急性拒絶反応が付随する。不良な移植後転帰の個々のリスクを予測すること、ならびに、どの患者が有害な副作用の発生に対してより感受性であるか、および／またはどの患者がより重篤な疾患状態および腎不全に進行しやすいかを予測することを可能にする、免疫調節遺伝子における遺伝子多型を同定することは有利であると考えられる。さらに、薬物の標的または生合成経路および代謝経路における遺伝学的変動は、個体の治療に対する応答に影響を及ぼし得るため、ミコフェノール酸モフェチル(MMF)に関連する遺伝子多型、またはシクロスポリンA(CsA)代謝は、治療に対する応答を予測するマーカーとして有用である。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、多剤耐性1(MDR1)遺伝子座(C3435T)における一塩基多型(SNP)と、腎臓移植拒絶との関連性に基づく。この遺伝子座はSeq ID No.lの176位に対応する。この位置での多型は、この位置のヌクレオチドCの、MDR1遺伝子座のエクソン26中のTによる置き換えからなる。
【０００４】
MDR1は、多剤耐性に関係するABCトランスポーターである。
【０００５】
MDR1 C3435T多型は、P-糖タンパク質の発現レベルおよび機能における差異、ならびにCsAクリアランスの増加に関連することが示されている。
【０００６】
本発明は、以下を含む、患者において腎臓移植拒絶反応を予測するための方法に関する：(a) 患者から採取した試料から核酸を単離する段階、および(b) SEQ ID No. 1の176位に存在するヌクレオチドを検出する段階であって、この位置のTの存在が腎臓移植拒絶反応を示す段階、および(c) 急性腎臓移植拒絶反応を予測するための一つまたは複数の他のマーカーを任意で検出する段階。
【０００７】
前記の任意の一つまたは複数の他のマーカーは、他の遺伝子に存在する多型であってもよい。好ましくは、上記の方法の段階(c)は、Seq. ID No. 5の682位(-592C>A)におけるAの存在が腎臓移植拒絶反応を示す、該位置に存在するヌクレオチドの検出、および／またはSeq ID No. 6の3757位(T3757C)におけるCの存在が腎臓移植拒絶反応を示す、該位置に存在するヌクレオチドの検出を含む。Seq ID No. 5は、ヒトインターロイキン10(IL 10)遺伝子のプロモーター配列を指す。Seq ID No. 6は、ヒトイノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ2(IMPDH2)遺伝子のエクソン1〜13を指す。
【０００８】
好ましくは、上記の方法に使用される試料は全血である。該試料はまた、血清または血漿であってもよい。
【０００９】
本明細書上記のヌクレオチドの検出は、遺伝子型解析に適した任意の方法により実施され得る。ある好ましい態様において、この方法はジデオキシシークエンシングである。より好ましいある態様において、この方法はサイクルシークエンシングである。
【００１０】
もう一つの好ましい態様において、上記方法は、一つの対立遺伝子のみとアニーリングし、他の対立遺伝子とはアニーリングしない対立遺伝子特異的プライマーを使用する、定量的対立遺伝子特異的PCRである。一つのこのような定量的PCRは、キネティックサーマルサイクリング(KTC)である。一つのより好ましい検出方法は、KTCと共に用いた増幅抵抗性突然変異系(ARMS)であり、これは、蛍光プローブを使用せずに一つのチューブ内の一塩基多型(SNP)を識別することを可能にする(Higuchi et al., Biotechnology (1993), 11, 1026-1030)。
【００１１】
ヌクレオチドを検出する好ましい方法は、定量的PCRである。より好ましくは、該定量的PCRは対立遺伝子特異的定量的PCRである。
【００１２】
上記の方法を用いてMDR1多型を検出するために、最も好ましい態様においては、前記の対立遺伝子特異的PCRは、Seq ID No. 7およびSeq ID No. 8の対立遺伝子特異的プライマー、ならびにSeq ID No. 9の共通プライマーを使用して実施される。
【００１３】
上記のIL 10多型をさらに任意で検出するために、最も好ましい態様は、Seq ID No. 2およびSeq ID No. 3の対立遺伝子特異的プライマー、ならびにSeq ID No. 4の共通プライマーを使用する対立遺伝子特異的PCRの実施を含む。
【００１４】
本明細書上記の方法がSEQ ID No. 1の176位にあるMDR1遺伝子のヌクレオチドおよびSeq ID No. 5の682位にあるIL 10遺伝子のヌクレオチドの結合検出、またはSEQ ID No. 1の176位にあるMDR1遺伝子のヌクレオチド、Seq ID No. 5の682位にあるIL 10遺伝子のヌクレオチド、およびSeq ID No. 6の3757位にあるIMPDH2遺伝子のヌクレオチドの結合検出を含む場合、本明細書上記の方法の最も好ましい態様は、本方法の段階(c)において、本明細書上記のIL 10遺伝子のヌクレオチドの、Seq ID No. 2およびSeq ID No. 3の対立遺伝子特異的プライマー、ならびにSeq ID No. 4の共通プライマーを使用した実施を含む。
【００１５】
本明細書上記の方法の段階(c)におけるさらなる任意での検出は、同一のまたは別々の反応混合物において実施してもよい。
【００１６】
好ましくは、上記の方法に使用される試料は全血である。該試料はまた、血清または血漿であってもよい。
【００１７】
本明細書上記のヌクレオチドの検出は、遺伝子型解析に適した任意の方法により実施され得る。上記のIMPDH2核酸配列における多型の存在は、制限断片長多型分析、マススペクトロメトリーを使用したPCR産物の直接的な質量分析、侵入的開裂産物(invasive cleavage product)の直接的な分析、ARMS(商標)(amplification refractory mutation system)、ALEX(商標)(amplification refractory mutation system linear extension)、およびCOPS (competitive oligonucleotide priming system)のような伸長に基づく技術、OLA (oligonucleotide ligation assay)、インベーダーアッセイ、直接的配列分析、またはポリメラーゼ連鎖反応分析などの、示差的核酸分析技術により決定され得る。
【００１８】
ある好ましい態様において、この方法はジデオキシシークエンシングである。一つのより好ましい方法は、サーモサイクルシークエンシングである。
【００１９】
上記のIMPDH2多型の検出のために、最も好ましい態様においては、前記の配列決定はSeq ID No. 10およびSeq ID No. 11のプライマーを使用して実施される。
【００２０】
任意の一つの多型に関するヌクレオチドを検出する好ましい方法は、定量的PCRである。
【００２１】
より好ましい態様において、上記方法は、一つの対立遺伝子のみとアニーリングし、他の対立遺伝子とはアニーリングしない対立遺伝子特異的プライマーを使用する、定量的対立遺伝子特異的PCRである。一つのこのような定量的PCRは、キネティックサーマルサイクリング(KTC)である。一つのより好ましい検出方法は、KTCと共に用いた増幅抵抗性突然変異系(ARMS)であり、これは、蛍光プローブを使用せずに一つのチューブ内の一塩基多型(SNP)を識別することを可能にする(Higuchi et al., Biotechnology (1993), 11, 1026-1030)。
【００２２】
試料は、当技術分野において周知の多種多様な示差的核酸分析技術の任意の一つを使用して、通常の配列と異なる核酸配列の存在について試験され得る。示差的核酸分析技術は、以下を含むがこれらに限定されない：蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)、直接的なDNAシークエンシング、一本鎖立体構造分析(SSCP)、制限断片長多型分析(RFLP)を含むサザンブロッティング、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、多型特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、およびPCR-SSCP分析。核酸配列およびアミノ酸配列を評価および操作するための技術の概観については、Current Protocols In Molecular Biology, Volumes I-III, Frederick M. Ausubel et al. eds., 1995を参照されたい。ハイブリダイゼーション法は、限定されるものではないがリバースドットブロット(Reverse dot blot)、GeneChipマイクロアレイ、DASH、PNA、およびLNAプローブ、TaqMan、ならびに分子ビーコンを含み；対立遺伝子特異的PCRは、限定されるものではないがインターカレーティング色素、FRETプライマー、およびALphaScreenを含み；プライマー伸長法は、限定されるものではないがSNPstream/GBA (genetic bit analysis)、マルチプレックスミニシークエンシング/SNaPshot、ピロシーケンス、MassEXTEND/MassArray、GOODアッセイ、マイクロアレイminiseq/APEX(arrayed primer extension)、マイクロアレイプライマー伸長、「タグ」アレイ、コード化ミクロスフェア(coded microspheres)、TDI (template-directed incorporation)/蛍光偏光法を含み；オリゴヌクレオチドライゲーションは、限定されるものではないが比色定量OLA (oligonucleotide ligation assay)、配列コード化OLA、マイクロアレイライゲーション、リガーゼ連鎖反応、パドロックプローブ、ローリングサイクル増幅を含み；エンドヌクレアーゼ切断は、限定されるものではないが制限部位分析およびインベーダーアッセイを含む。これらの方法は、Syvanen, Nature Rev Genet 2, 2001, 930-942およびこれらの引用文献に記載されている。より複雑なマーカー用のマルチプレックスプラットフォームには、ビーズに基づくマルチプレックスジェノタイピング、遺伝子型解析用の高密度マイクロアレイ、再シークエンシングプラットフォーム、示差的遺伝子発現のマイクロアレイに基づく分析が含まれるがこれらに限定されない。これらの方法は、Koch, Nature Rev Drug Discovery 3, 2004, 749-761およびこれらの引用文献に記載されている。上記に列記されている方法の組み合わせをさらに使用することができる(例えば、非限定的な例として、分子反転プローブ(molecular inversion probe)とアレイ上のハイブリダイゼーションとの組み合わせ。Hardenbol et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21, 673-678)。
【００２３】
複数の方法を、DNA配列の変化を直接的に検出するために使用することができる。手動の配列決定または自動化された蛍光シークエンシングのいずれかの直接的なDNAシークエンシングにより、配列変化を検出することができる。ジデオキシシークエンシングのほかに、ピロシーケンスも使用することができる。試験される個体のMDR1領域中の遺伝子の対立遺伝子は、従来の技術を使用してクローニングされ得る。例えば、血液試料は個体から採取され、MDR1のゲノムDNAがこの試料の細胞から単離されて、増幅のために適切なベクター中に連結される。次にクローンの配列が決定され、通常のMDR1配列と比較され得る。DNAのクローニングおよび配列決定を含む技術は当技術分野において周知であり、例えば、Current Protocols In Molecular Biology, Volume 1, unit 7, Frederick M. Ausubul et al. eds., 1995を参照されたい。
【００２４】
DNA配列中の変化を検出する他のアプローチは、一本鎖構造多型アッセイ(SSCP) (Orita et al., 1989)である。この方法は、特にDNA断片の大きさが200 bpを上回る場合全ての配列変化は検出しないが、最多数のDNA配列変化を検出するよう最適化することができる。検出感度の低下は欠点であるが、SSCPにより可能となる処理量の増加は、これを、研究ベースの多型検出のために直接的に配列決定する、魅力的で実行可能な代替案にする。SSCPゲル上で移動度がシフトした断片は、DNA配列変化の正確な性質を決定するために配列決定される。他のアプローチは、締付変性電気泳動法(clamped denaturing gel electrophoresis：CDGE) (Sheffield et al., Am. J. Hum. Genet., 49: 699-706 (1991))、ヘテロ二重鎖分析(NA) (Mite et al., Genomics 12: 301-306 (1992))、および化学的ミスマッチ開裂(CMC) (Grompe et al., P.N.A.S. 86: 5855-5892 (1989))を含む、二つの相補的なDNA鎖の間のミスマッチの検出に基づく。タンパク質切断アッセイまたは非対称アッセイ(asymmetric assay)などの、これらの部類の多型を検出し得る他の方法は、特定の種類の多型のみを検出し、ミスセンス多型を検出しない。現在利用可能な、DNA配列変化の検出方法の概観は、GrompeらのNature Genetics 5: 111-117, (1993)、およびLandegrenらのGenome Research 8:769-776, (1998)による最近の総説に見出すことができる。
【００２５】
DNA配列における多型を検出するための迅速な予備的分析は、好ましくは多数の制限酵素である一つまたは複数の制限酵素によりDNAが切断され、一連のサザンブロットにおいてIMPDH2、IL 10、またはMDR1特異的プローブにより分析されるRFLPを使用して実施可能である。各ブロットには、一連の通常の個体および一連の異常な骨形成症例が含まれる。ハイブリダイズした断片を示すサザンブロット(公知の多型遺伝子座近傍の配列または公知の多型遺伝子座を含む配列を用いて探索した場合に対照DNAと長さが異なる)は、可能性のある多型を示す。RFLPを含む技術は当技術分野において周知であり、例えば、Current Protocols In Molecular Biology, Volume 1, unit 2, Frederick M. Ausubul et al. eds., 1995を参照されたい。
【００２６】
制限断片長多型分析は、特徴付けされていない多型を同定するその能力から、好ましい分析方法である。具体的には、単純にMDR1における様々な領域由来の配列をプローブとして使用することにより、当業者は核酸試料を、本明細書に開示されるMDR1 C3435T多型について評価し得、あるいは、これは本明細書において同定されたまたは当技術分野において周知の染色体ウォーキング技術により単離された近位配列を含んでもよい。例えば、Ueghara et al., Mamm. Genome 1(2): 92-99 (1991)を参照されたい。
【００２７】
ポリメラーゼによって行われる増幅を使用する核酸分析の特に好ましい方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)である。ポリメラーゼ連鎖反応および他のポリメラーゼによって行われる増幅アッセイは、ポリメラーゼによって行われる増幅サイクルの使用を通して、コピー数の、100万倍を超える増加を達成し得る。一旦増幅したならば、結果として生じる核酸は制限エンドヌクレアーゼ消化により分析され、配列決定され、またはDNAプローブ用の基質として使用され得る。特定の多型を包含する配列が公知である場合、これらの配列を標的とする様々なPCRプライマーが生成され得る。例えば、多型に隣接する配列を、これらの配列を増幅するために使用してもよい。配列特異的PCRの変化形については、その3’末端でMDR1 C3435T多型にハイブリダイズするプライマーを使用してもよい。特定の多型が存在しない場合、増幅産物は観察されない。増幅抵抗性多型系(ARMS)を、欧州特許出願第0332435号およびNewtonら1989年に開示されるように使用することもできる。増幅された産物は次に、任意の違いを同定するための、従来技術を使用する一本鎖構造多型(SSCP)により分析され、これらは次いで配列決定されて通常の遺伝子配列と比較される。
【００２８】
他の好適な増幅方法には、リガーゼ連鎖反応(LCR) (Wu and Wallace, Genomics 4:560 (1989)、Landegren et al., Science 241:1077 (1988)、転写増幅(Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173 (1989)を参照)、および自己維持配列複製(self-sustained sequence replication) (Guatelli et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87:1874 (1990))、および核酸に基づく配列増幅(NASBA)が含まれる。後者の二つの増幅方法は、等温転写に基づく等温反応を含み、これは増幅産物として一本鎖RNA（ssRNA）と二本鎖DNA（dsDNA）の双方をそれぞれ、約30：1または100：1の比で産生する。
【００２９】
本発明のプライマー対は、PCRを使用する、特定のMDR1配列のヌクレオチド配列の決定に有用である。例えば、一本鎖DNAプライマー対は、遺伝子それ自身の増幅DNA合成を開始するために、MDR1配列中の、またはMDR1配列周辺の配列にアニーリングされ得る。これらのプライマーの完全なセットは、遺伝子をコードする配列のヌクレオチド全ての合成を可能にする。プライマーセットは、好ましくはイントロン配列およびエクソン配列両方の合成を可能にする。さらに、対立遺伝子特異的プライマーを使用してもよい。このようなプライマーは、C3435がTにより置換されているMDR1対立遺伝子のみにアニーリングし、したがって、鋳型として突然変異対立遺伝子が存在する産物のみを増幅する。PCRの使用により増幅されたMDR1領域のDNA配列は、対立遺伝子特異的プローブを使用してさらにスクリーニングしてもよい。これらのプローブは、それぞれがC3435T多型を含む遺伝子配列領域を含む核酸オリゴマーである。例えば、一つのオリゴマーは、MDR1多型配列部分に対応する、約20ヌクレオチドの長さであり得る。増幅されたMDR1配列を用いた対立遺伝子特異的プローブのハイブリダイゼーションを、例えばナイロンフィルター上で実施することができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での、特定のプローブに対するハイブリダイゼーションは、対立遺伝子特異的プローブにあるような、組織における同一の多型の存在を示す。
【００３０】
他の、多型を検出するために選好的に適用される方法には、質量分析法の使用が含まれる。MDR1 C3435T多型を含むDNA配列のPCR増幅後、関心対象の多型から1塩基上流で終結するプライマーを用いた内部プライマー伸長反応が行われる。プライマー伸長反応においてジデオキシヌクレオシド三リン酸(ddNTP)のみを使用して、プライマーは多型を表す1塩基だけ伸長される。伸長したプライマーの正確な質量がMALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Time of Flight)質量分析により直接的に決定され、ヘテロ接合体が明確に区別される二つのピークを生じさせる。
【００３１】
侵入的開裂産物は、質量分析により検出してもよく、または蛍光に基づく方法により検出してもよい。一塩基多型(SNP)は、特定のDNA構造(特異的ハイブリダイゼーションにより作製される)を認識する、特殊構造特異的エンドヌクレアーゼの能力(切断)に基づいて検出される。インベーダープローブおよび標識されたシグナルプローブは、標的DNAにハイブリダイズするように設計され、それによりインベーダープローブはSNP部位を表す少なくとも1塩基だけシグナルプローブに重複する。シグナルプローブ標的二重鎖の侵入は、標識を含む一本鎖フラップを置き換える。フラップと部分的に侵入された二重鎖との接合部は、相補的な塩基の場合のみに切断部位で酵素により認識されて切断され、シグナルプローブのハイブリダイズしていない領域を解放する。切断断片の検出は、上記のように達成され得るか、または直接的なゲル分析、もしくは断片上のタグに対する、酵素に連結された抗体により達成され得る。切断後、新しいシグナルプローブがハイブリダイズし、このプロセスが繰り返されて、切断されたプローブが蓄積される。このシグナルはこのようにして本方法において増幅され、この増幅は本技術の全体的な感度を増加させる。
【００３２】
逆もまた同様であり、いくつかの多型含有オリゴヌクレオチドをナイロンフィルター(「SNPストリップ」)に固定化し、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションのために個体のDNAから得た多重PCR反応の産物にハイブリダイズしてもよい(Cheng et al., Clin. Chem. Lab. Med. (1998) 36(8): 561-566, RMS, Alameda)。
【００３３】
上記の診断アッセイの大部分は、核酸プローブを非常に重要な要素として取り入れている。標的配列の存在を検出するためにプローブを使用する場合、血液または血清などの分析すべき生物試料は、核酸を抽出するために処理してもよい。上記で考察されているように、試料核酸は、例えば変性、制限消化、電気泳動、またはドットブロッティングなどの、標的配列の検出を容易にする様々な方法で調製してもよい。分析核酸の標的とされる領域は通常、プローブの標的化配列とハイブリッドを形成させるために、少なくとも部分的に一本鎖でなければならない。配列がもともと一本鎖である場合、変性は必要とされない。しかしながら、配列が二本鎖の場合、この配列はおそらく変性が必要であると考えられる。変性は、当技術分野において公知である様々な技術によって行われ得る。
【００３４】
標的核酸、プローブ、および分析物は、分析物中の推定の標的配列とプローブ中の標的配列との安定したハイブリッド形成を促進する条件下でインキュベートされ得る。分析物に結合させるために使用されるプローブ領域は、ヒトMDR1遺伝子の標的領域に対して完全に相補的に作製される。したがって、高ストリンジェンシー条件が、偽陽性を防ぐために望ましい。しかしながら、高ストリンジェンシー条件は、ゲノムにおいて独特である染色体領域にプローブが相補的である場合のみに使用される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度、塩基組成、プローブの長さ、およびホルムアミドの濃度を含む、ハイブリダイゼーション中および洗浄工程中の複数の要因により決定される。これらの要因は、例えばManiatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, 1982およびSambrook et al., 1989に概説されている。ある特定の環境下においては、三重鎖、四重鎖等の、より高いオーダーのハイブリッドの形成が、標的配列の検出手段を提供するために望ましい場合がある。
【００３５】
核酸ハイブリダイゼーションは、当業者には容易に認識されるように、塩基組成、相補鎖の長さ、およびハイブリダイズしている核酸間のヌクレオチド基のミスマッチの数に加えて塩濃度、温度、または有機溶媒などの条件に影響されると考えられる。ストリンジェントな温度条件は、一般に30℃を上回る、典型的には37℃を上回る、および好ましくは45℃を上回る温度を含む。ストリンジェントな塩条件は、通常は1000 mM未満、典型的には500 mM未満、および好ましくは200 mM未満である。しかしながら、パラメーターの組み合わせは、任意の単独のパラメーターの測定よりも極めてより重要である。プローブ配列は、三重鎖または他のより高いオーダーのDNA複合体を形成するある特定の条件下で二重鎖DNAに特異的にハイブリダイズし得る。そのようなプローブの調製および好適なハイブリダイゼーション条件は、当技術分野において周知である。
【００３６】
存在する場合、結果として生じるハイブリッドの検出は、標識されたプローブの使用によって通常達成される。あるいは、プローブは標識しなくてもよいが、標識されたリガンドとの特異的な結合によって、直接的または間接的のいずれかで検出可能であり得る。好適な標識、ならびにプローブおよびリガンドを標識するための方法は当技術分野において公知であり、例えば公知の方法(例えばニックトランスレーション、ランダムプライミング(random priming)、またはキナージング(kinasing))に取り入れられ得る放射性標識、ビオチン、蛍光基、化学発光基(例えばジオキサン、特に励起されたジオキサン)、酵素、抗体等を含む。この基本的なスキームの変化形は当技術分野において公知であり、検出すべきハイブリッドの外来物質からの分離を容易にする、および／または標識部分からのシグナルを増幅する変更を含む。複数のこれらの変化形は、例えばMatthews & Kricka, Anal. Biochem., 169: 1, 1988; Landegren et al., Science, 242: 229, 1988; Mittlin, 1989; 米国特許第4,868,105号; および欧州特許公報第225,807号に記載されている。
【００３７】
急性腎臓移植拒絶反応に関連する多型を有する核酸配列は、ストリンジェントから中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で標的配列と安定なハイブリッドを形成するポリヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、検出することができる。本発明は、多型領域に選好的にハイブリダイズするプローブの設計を可能にする。特定の配列を選好的に標的とするプローブの設計およびこれらを使用するハイブリダイゼーション条件は、当技術分野において周知である。例えば、Current Protocols In Molecular Biology, Volumes I-III, Frederick M. Ausubel et al. eds., 1995を参照されたい。例えば、プローブが標的配列に対して完全に相補的であると予想される場合、ストリンジェントな条件が使用される。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、いくつかのミスマッチが予想される場合、例えばプローブが完全に相補的でない結果変異体が予想される場合は低減させてもよい。ノイズを最小にするために、非特異的／偶発的結合を除外する条件が選択される。
【００３８】
IMPDH2遺伝子、IL 10遺伝子、またはMDR1遺伝子における多型用のプローブは任意の好適な長さであってもよく、この多型に隣接するか、または多型の全てもしくは一部にわたり、かつこの領域に対する選好的なハイブリダイゼーションを可能にする。標的配列がプローブの配列と同一な配列を含む場合、このハイブリッドがストリンジェントな条件下であっても比較的安定であるため、このプローブは、例えば約8〜30塩基対の範囲など短いものであり得る。ある程度のミスマッチがこのプローブに予想される場合、すなわち、プローブが異なる領域にハイブリダイズすることが推測される場合、必要な特異性で標的配列にハイブリダイズする、より長いプローブが用いられ得る。
【００３９】
プローブは、標識またはレポーター分子に結合させた、単離されたポリヌクレオチドを含み得、標準の方法により、関心対象の配列に対して配列類似性を有するかまたはこれに隣接する他のポリヌクレオチド配列を単離するために使用してもよい。プローブを調製および標識する技術に関しては、例えばSambrook et al., 1989またはAusubel et al., 1992を参照されたい。他の同様のポリヌクレオチドは、相同なポリヌクレオチドを使用して選択してもよい。本発明の合成オリゴヌクレオチドまたは他のポリヌクレオチドを含むプローブは、天然の、もしくは組換え体の一本鎖ポリヌクレオチドもしくは二本鎖ポリヌクレオチドに由来し得るか、または化学的に合成してもよい。プローブはまた、ニックトランスレーション、クレノー フィル-イン(Klenow fill-in)反応、または当技術分野において公知である他の方法により標識され得る。
【００４０】
標的となる特定の配列に対する選好的な結合およびそれらの使用のためのハイブリダイゼーション条件用の、適切な大きさおよび配列を有するプローブの設計は、当技術分野において周知である。例えば、Current Protocols In Molecular Biology, Volumes 1, units 2, 4, and 6, Frederick M. Ausubel et al. eds., 1995を参照されたい。多型配列由来の、少なくとも約8ヌクレオチド、通常少なくとも約15ヌクレオチドを有し、かつ約6kb未満、通常約1.0kb未満であるポリヌクレオチド配列部分は、プローブとして好ましい。多型配列の特定の部分を有するプローブも意図される。さらに、多型領域に隣接するプローブも、核酸試料の評価において使用され得る。
【００４１】
上記のように、複数の非PCRに基づくスクリーニングアッセイ法が本発明に意図される。一つの手法は、核酸プローブ(または通常のリン酸ジエステルを置き換えるメチルホスホネートバックボーンなどの類似体)を、低濃度で存在するDNA標的にハイブリダイズさせる。このプローブは、共有結合がハイブリダイゼーションの特異性に障害を与えないような、プローブに共有結合した酵素を有し得る。この酵素-プローブ結合標的核酸複合体は次いで、遊離プローブ酵素結合体から離れて単離され、酵素検出のために基質が付加され得る。酵素活性が、感度の増加をもたらす発色または発光出力の変化として観察される。オリゴヌクレオチド-アルカリホスファターゼ結合体の調製およびこれらのハイブリダイゼーションプローブとしての使用に関連する例については、Jablonski et al., N.A.R., 14: 6115-6128, 1986を参照されたい。二段階標識増幅法は、当技術分野において公知である。これらのアッセイ法は、小さなリガンド(ジゴキシゲニン、ビオチン等など)が、MDR1遺伝子領域配列に特異的に結合可能である核酸プローブに結合するという原理の上で、機能する。対立遺伝子特異的プローブが、この例の範囲にさらに意図され、例示的な対立遺伝子特異的プローブは、本特許出願の素因的多型を含むプローブを含む。
【００４２】
一つの例において、核酸プローブに結合した小さいリガンドは、抗体-酵素結合体により特異的に認識される。この例のある態様において、ジゴキシゲニンは核酸プローブに結合される。ハイブリダイゼーションは、アルカリホスファターゼ結合体に結合した抗ジゴキシゲニン抗体により検出される。アルカリホスファターゼは、化学発光基質を改変し、これはその後検出可能である。この態様に従って核酸プローブを標識するための方法については、Martin et al., BioTechniques 9: 762-768, 1990を参照されたい。第二の例において、小さいリガンドは、第一のリガンドに対して特異的に複合体を形成することができる第二のリガンド-酵素結合体により認識される。この例の周知の態様は、ビオチン-アビジン型の相互作用である。核酸プローブを標識する方法およびビオチン-アビジンに基づくアッセイ法におけるこれらの使用については、Nguyen et al., BioTechniques 13: 116-123, 1992を参照されたい。本発明の核酸プローブアッセイ法がIMPDH2、IL 10、およびMDRlの多型を検出することができる核酸プローブの組み合わせを用いることも本発明の範囲内に意図される。したがって、細胞試料における多型の存在を検出する一つの例において、該遺伝子に相補的な複数のプローブが用いられ、特に、異なるプローブの数は、あるいは2種類または3種類の異なる核酸プローブ配列である。この混合物には、前記領域に変更を有する患者集団において同定される、対立遺伝子特有の多型に結合可能なプローブが含まれる。この態様において、任意の数のプローブが使用可能であり、これらは好ましくは、急性腎臓移植拒絶反応を有する患者における大部分の多型に対応するプローブを含む。
【００４３】
上記の多型を検出する任意の一つの方法もまた、本明細書上記のIMPDH2多型およびIL 10多型を任意で検出するために使用することができる。
【００４４】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、ヌクレオチド塩基A、T、C、およびGからなるDNA、または塩基A、U(Tの代わり)、C、およびGからなるRNAであり得る一本鎖または二本鎖の分子を指す。ポリヌクレオチドは、コード鎖またはその相補鎖を表し得る。ポリヌクレオチド分子は、天然の配列と配列が同一であり得、または天然の配列において見出されるものと同一のアミノ酸をコードする別のコドンを含み得る(Lewin "Genes V" Oxford University Press Chapter 7, pp. 171-174 (1994)を参照のこと)。さらに、ポリヌクレオチド分子は、記載されるアミノ酸の保存的置換を表すコドンを含み得る。ポリヌクレオチドは、ゲノムDNAまたはcDNAを表し得る。核酸はまた、合成的によって作製されるDNAであってもよい(例えばPCR増幅産物)。
【００４５】
本明細書において使用される場合、「特異的なハイブリダイゼーション」は、第一の核酸が第二の核酸以外の任意の核酸にハイブリダイズしないような様式で第一の核酸が第二の核酸にハイブリダイズする能力を指す(例えば、ハイブリダイゼーションが実施される試料中の任意の他の核酸よりも第二の核酸に対して第一の核酸がより高い類似性を有する場合)。ハイブリダイゼーションに関する「ストリンジェンシー条件」は、インキュベーション条件および洗浄条件、例えば特定の核酸の第二の核酸へのハイブリダイゼーションを可能にする温度および緩衝剤濃度の条件を指す専門用語であり、第一の核酸は第二の核酸に対して完全に(すなわち100%)相補的であってもよく、または第一の核酸および第二の核酸は、完全には及ばない程度(例えば70%、75%、85%、95%)の相補性を共有してもよい。例えば、完全に相補的な核酸を相補性が低い核酸から区別することができる、ある特定の高ストリンジェンシー条件が使用され得る。核酸ハイブリダイゼーションに関する「高ストリンジェンシー条件」、「中程度のストリンジェンシー条件」、および「低ストリンジェンシー条件」は、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, (2001))の2.10.1〜2.10.16ページおよび6.3.1〜6.3.6ページに説明されており、これらの全体の技術は参照により本明細書に組み入れられる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する正確な条件は、イオン強度(例えば0.2×SSC、0.1×SSC)、温度(例えば室温、42℃、68℃)、およびホルムアミドなどの不安定化剤またはSDSなどの変性剤の濃度だけでなく、核酸配列の長さ、塩基組成、ハイブリダイズした配列間のミスマッチの割合(%)、および他の非同一配列中の、その配列のサブセットの発生頻度などの要因にも依存する。したがって、同等な条件は、二つの核酸分子間の同一性または類似性の同様の程度を維持しながら一つまたは複数のこれらのパラメーターを変化させることによって決定され得る。典型的には、互いに少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、もしくは少なくとも約95%またはそれ以上同一な配列がもう一方とハイブリダイズしたままとなるように、条件は使用される。ハイブリダイゼーションが起こらないあるレベルのストリンジェンシーからハイブリダイゼーションが最初に観察されるレベルにハイブリダイゼーション条件を変化させることにより、所与の配列が試料中の最も類似する配列と(例えば選択的に)ハイブリダイズすることを可能にする条件が決定され得る。
【００４６】
例示的な条件はKrause, M.H. and S.A. Aaronson, Methods in Enzymology 200:546-556 (1991)に記載されており、Ausubel, et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, (2001)には、中程度にストリンジェンシーな条件または低ストリンジェンシー条件に関する洗浄条件の決定が記載されている。洗浄は、条件がハイブリッドの相補性の最小レベルを決定するように通常設定される段階である。一般に、相同的ハイブリダイゼーションのみが起こる最も低い温度から開始し、最終的な洗浄温度を低下させると(SSC濃度は一定に保持)、1℃毎にハイブリダイズする配列間のミスマッチの最大限度は1%ずつ増加する。一般に、SSCの濃度を二倍にすると、結果としてTmは-17℃から増加する。これらのガイドラインを使用して、洗浄温度は、求めるミスマッチのレベルに応じて高ストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、低ストリンジェンシーについて経験的に決定され得る。
【００４７】
例えば、低ストリンジェンシーの洗浄は、0.2×SSC/0.1% SDSを含有する溶液中での室温で10分間の洗浄を含み得、中程度のストリンジェンシーの洗浄は、0.2×SSC/0.1% SDSを含有する予め加温した溶液(42℃)中での42℃で15分間の洗浄を含み得、および高ストリンジェンシーな洗浄は、0.1×SSC/0.1%SDSを含有する予め加温した溶液(68℃)中での68℃で15分間の洗浄を含み得る。さらに、当技術分野において公知であるように、洗浄は所望の結果を得るために繰り返して実施され得るかまたは連続的に実施され得る。同等な条件は、標的核酸分子と使用されるプライマーまたはプローブとの間の同一性または類似性の程度をほぼ同等に維持しながら、例として与えられた一つまたは複数のパラメーターを当技術分野において公知のように変化させることによって決定され得る。
【００４８】
関連する局面において、本発明の核酸断片が、本明細書において記載されているようなアッセイ法においてプローブまたはプライマーとして使用される。「プローブ」または「プライマー」は、塩基特異的様式で核酸分子の相補鎖にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。このようなプローブおよびプライマーは、Nielsen et al., Science 254:1497-1500 (1991)に記載されているポリペプチド、核酸を含む。
【００４９】
プローブまたはプライマーは、176位のCがTにより置き換えられたSeq ID No. 1に由来する連続したヌクレオチド配列を含む核酸分子の少なくとも約15個、例えば約20〜25個、およびある特定の態様では約40、50、または75個の連続したヌクレオチドに対してハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。上記の核酸分子などの本発明の核酸分子は、標準的な分子生物学技術および本明細書に提供される配列情報を使用して同定および単離され得る。例えば、核酸分子は、Seq ID No. 1、5、もしくは6、またはこのような配列の相補鎖に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応により増幅されて単離され得る。概して、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (ed. H.A. Erlich, Freeman Press, NY, NY, 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Eds. Innis et al., Academic Press, San Diego, CA, 1990); Mattila et al., Nucl. Acids Res. 19: 4967 (1991); Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17 (1991); PCR (eds. McPherson et al., IRL Press, Oxford); および米国特許第4,683,202号を参照されたい。核酸分子は、鋳型としてcDNA、mRNA、またはゲノムDNAを使用して増幅し、適切なベクターにクローニングし、DNA配列分析により特徴付けることができる。
【００５０】
患者における急性腎臓移植拒絶反応に対する感受性を評価するための方法を実行するために、本発明は、MDR1遺伝子におけるC3435T多型の検出において使用するための少なくとも一つの試薬、本明細書上記の急性腎臓移植拒絶反応に対する感受性を評価するための任意の方法に従う手順を説明する指示書、およびキットの内容物用の容器を含むキットをさらに言及する。好ましい態様において、MDR1遺伝子におけるC3435T多型の検出において使用するための少なくとも一つの試薬は、Seq ID No.lの核酸に特異的にハイブリダイズすることができる核酸；または176位のヌクレオチドCがTで置換される、Seq ID No. 1の核酸を含む。もう一つの好ましい態様において、MDR1遺伝子におけるC3435T多型の検出において使用するための少なくとも一つの該試薬は、ストリンジェントな条件下でSeq ID No. 1にハイブリダイズし、かつ176位を含むSeq ID No. 1部分のPCR増幅に使用することができる核酸プライマーを含む。このような核酸は、Seq ID No. 7、8、および／または9の核酸であり得る。
【００５１】
より好ましい態様において、キットはIL 10遺伝子における-592>A多型、および／またはIMPDH2遺伝子におけるT3757C多型を検出するための少なくとも一つの試薬をさらに含む。最も好ましい態様において、キットはSeq ID No. 7から9、および／または2から4、 および／または10から11の核酸を含む。
【００５２】
実施例
実施例1 
コホートの説明
本分析は、CAESAR臨床試験に参加した536名の患者の内、本明細書に記載されている遺伝薬理学的研究に同意した237名の白人移植患者コホートにおいて行った。CAESARは、新たな一次腎臓同種移植被移植者において腎機能、移植片および患者の生存、ならびに生検で検出された急性拒絶反応(biopsy proven acute rejection：BPAR)を評価するよう設計された、12ヶ月、オープンラベルの、管理された多施設前向き研究である。
【００５３】
主な目的は、シクロスポリンの使用を減らすかまたは排除することによって、腎毒性最小にし、有効性に悪影響を及ぼすことなく長期の腎機能および移植片の生存を改善することである。
【００５４】
患者は、移植前に三群の内の一つに無作為化した。(1)ダクリズマブ(dac)、ミコフェノール酸モフェチル(MMF)、コルチコステロイド(CS)、低用量シクロスポリン(CsA)の後、ウィーニング(4ヶ月目)および中止(6ヶ月目); (2)dac、MMF、CS、低用量CsA; (3)MMF、CS、標準的用量のCsA。
【００５５】
患者の選抜
本研究プロトコルおよびインフォームドコンセントの形式は、承認を得るために各国の現地倫理委員会に提出された。全ての患者に、血液試料が遺伝子型解析に使用されることについて書面によるインフォームドコンセントを行った。この試料は、患者の意向が変わった場合、最大一ヶ月後に取り除いた。
【００５６】
全ての試料には新しい独立したコードを割り当て、試料収集の一ヶ月後、新しいコードと元のコードとの間の関連を消去した。これは、患者の機密保護を保証するための追加の措置であるが、結果として、患者の名前または元の臨床治験で使用された番号に基づいて遺伝子型情報を検索することが不可能になる。約15年以内に、全ての血液試料およびDNA試料は廃棄される。
【００５７】
試料の調製
単独の血液試料(9ml)を、EDTAチューブに収集した。これらは、スイス、バーゼルにあるRoche Central Sample Office (CSO)への送付前に凍結して-20℃〜-70℃で保存し、このとき、これらは三つのチューブに分注し、患者の匿名性を保証するため、バーコードラベル上に新しい独立したコードを割り当てた。二つの血液試料(1mlおよび4ml)を、スイス、バーゼルにあるRoche Center for Medical Genomics (RCMG)のRoche Sample Repository (RSR)に送付した。残りの4mlのアリコートを、スイス、バーゼルにあるCSOに-80℃で保存した。RSRで試料に実施した全ての手順は、GCPガイドラインを使用して、確立された標準的な操作手順に従って行った。
【００５８】
DNAを、シリカゲルに基づく抽出法(MagNA Pure LC DNA Isolation KIT I, Roche Molecular Biochemicals)を使用して、200μlの全血から抽出した。試料は、MDRlおよびIL 10中のSNPについてのNewton et al., Nucleic Acids Res. (1989), 17(7), 2503-16に従って増幅されたPCRプライマーと鋳型との間の3’末端ミスマッチに依拠する増幅抵抗性突然変異系(ARMS)と、IMPDH2中のSNPについての配列決定分析との組み合わせを使用して、二つの異なる一塩基多型(SNP)について遺伝子型解析を行った。
【００５９】
DNA中の二つの点突然変異の分析を、増幅抵抗性突然変異系(ARMS, Nucleic Acids Res. (1989), 17(7), 2503-16)を使用することにより、およびポリメラーゼ連鎖反応のキネティックサーマルサイクラー(KTC)形式を使用することにより変形した。この方法は、蛍光プローブを使用せずに一つのチューブ中の一塩基多型(SNP)を識別することを可能にする(Higuchi et al., Biotechnology (1993), 11, 1026-1030)。
【００６０】
このKTC形式では、二本鎖の増幅産物の生成は、DNAインターカレーティング色素、および蛍光検出CCDカメラが取り付けられたサーマルサイクラー(ABI- GeneAmp 7900 Sequence Detection System)を使用してモニタリングされる。PCR増幅プレートの各ウェル中の蛍光は、アニーリングおよび変性の各サイクルで測定される。相対的な蛍光がPE-BiosystemsのSDSソフトウェアを使用して閾値0.5に達するサイクルは、Ctと定義した。
【００６１】
増幅反応は、対立遺伝子特異的であるように設計し、そのため増幅反応は多型が存在する場合は陽性であり、かつ増幅反応は多型が存在しない場合は陰性であった。各バイアレリック(bi-allelic)多型について、増幅プレートの一つのウェルを対立遺伝子1に対して特異的であるように設定し、第二のウェルを対立遺伝子2に対して特異的であるように設定した。検出すべき各多型について、三つのプライマーを設計した - 二つの対立遺伝子特異的プライマーおよび一つの共通プライマー(表3)。対立遺伝子1についての反応物は対立遺伝子1特異的プライマーおよび共通プライマーを含み、ならびに対立遺伝子2についての反応物は対立遺伝子2特異的プライマーおよび共通プライマーを含んだ。
【００６２】
（表１）多型検出に使用したオリゴヌクレオチドプライマーのリスト
2008545445.tif 000002
【００６３】
IL10およびMDRlの増幅条件は以下の通りである。
・ 50 mM Tris pH 8.0
・ 50 mM KCl
・ 3 mM MgCl2
・ それぞれ50 μmのdATP、dCTP、およびdGTP
・ 25 μmのTTPおよび75 μmのdUTP
・ 4% DMSO
・ 2 μM ROX (カルボキシ-ローダミン) 
・ 0.1×SyBr Green (Molecular Probes, Eugene, OR)
・ 2% グリセロール
・ ウラシルN-グリコシラーゼ (UNG、2単位)
・ デルタZ05 Gold DNAポリメラーゼ(3単位)
・ ならびに、各ウェル当たり20μlの量のプライマー
【００６４】
各アッセイ法に使用したプライマーの濃度は表1に記載されている。次に、5 μlの量の5 ngのDNAを各ウェルに加えた。先在する増幅産物による汚染の可能性を減らすために、アッセイ法手順は、増幅産物へのdUTPの取り込み、および先在するU含有産物のUNG分解のためのインキュベーション段階を含んだ(Longo et al, Gene (1990), 93,125-128)。研究室管理データベースにより作成されたバーコードラベルにより識別される384ウェル増幅プレート中に、増幅反応物を、分注ロボット(Tecan)を使用して調製した。ロボットにより実施される手順のためのパラメーターは、相互汚染の可能性を最小にするように設定した。81個の試料の各プレートについて5個の試料を二回行い、二回の結果をこれらが整合しているかどうか決定するために分析した。サーマルサイクリング条件は以下の通りであった：既に汚染されているPCR産物の50℃で2分間のUNG分解、95℃で12分間のデルタZ05 Gold DNAポリメラーゼの活性化、45サイクルの、95℃の変性および表1に示されているアニーリング温度でのアニーリング、その後の一段階増幅での、60℃から95℃で1分間の解離段階。増幅反応は、ABI GeneAmp 7900配列検出システム機器中で行った。解離曲線の第一の導関数をSDSソフトウェア作成し、確認する必要に応じて、所与の反応物中の蛍光が特定の産物の増幅によるものであるかを、非特異的なプライマーダイマーではなく、十分に定義された解離ピークによって試験した。産物の判別は、K.M. Ririe et al., Anal. Biochem. (1997), 245, 154 - 160の方法に従って、PCR中のDNA融解曲線の分析により行った。
【００６５】
各増幅反応のサイクルの閾値Ctを決定し、対立遺伝子1のCtと対立遺伝子2のCtとの間の差異(ΔCt)をアッセイ法の結果として使用した。ΔCtが-3.0〜3.0である試料は、ヘテロ接合性であると見なした(A1/A2)。ΔCtが-3.0未満である試料は、A1(Al/Al)のホモ接合性であると見なし、ΔCtが3.0を上回る試料は、A2(A2/A2)のホモ接合性であると見なした。大部分の場合、遺伝子型の三つの群の間のΔCtの差異は十分に定義されており、Ct値が3.0に近い試料は矛盾として再度試験した。各アッセイ法は、各アッセイプレート上で、対照としての使用に適切な遺伝子型を有する細胞株を同定するために、47個の細胞株DNAのパネルにおいて行った(Al/Al、A1/A2、およびA2/A2)。細胞株DNAは、Corriel Instituteから入手し、Qiagen抽出キット(QiaAmp DNA Blood kits, Valencia, CA)を使用して抽出した。細胞株DNAの遺伝子型は、DNAシークエンシングにより確認した。三つの細胞株DNA(Al/Al、A1/A2、およびA2/A2)は、臨床治験試料の各プレート上で対照として行い、プレート間多様性を決定するために使用した。対照細胞株について得たCt値は、臨床治験試料について得たΔCt値のカットオフを決定するために分析した。各ウェルについてのCt値を含むデータファイルをSDSソフトウェアにより作成し、実験管理データベースに入力した。独立したコードにより識別される最終的な遺伝子型を含むデータファイルをデータベースから抽出し、独立したコードにより統計解析用にさらに識別された臨床データに整合させた。
【００６６】
IMPDH2一塩基多型(SNP)について、ABIキャピラリーシーケンサーおよびBig Dyeケミストリー(ABI)を使用する二本鎖DNAシークエンシングにより遺伝子型解析を行った。エクソン7/イントロン7の境界の増幅に使用したプライマーが表1に示されており、これらをシークエンシングプライマーとして使用した。公的に利用可能なゲノム配列を、プライマー設計用の参照として使用した。全ての多型を、以下のプライマー対セットを用いて標的とした。
プライマーIL 10 -592C>A ASl  IL10のプロモーター配列中の668位〜682位に対応し、SEQ ID No:5中の位置により定義される。
プライマーIL 10 -592C>A AS2  IL10のプロモーター配列中の668位〜682位に対応し、SEQ ID No:5中の位置により定義される。
プライマーIL 10 -592C>A 共通  相補鎖に対応し、IL10のプロモーター配列中の708位〜685位にハイブリダイズする。SEQ ID NO:5中の位置により定義される。
プライマーMDRl C3435T ASl  相補鎖に対応し、MDRlのエクソン26中の193位〜176位にハイブリダイズする。SEQ ID NO:1中の位置により定義される。
プライマーMDRl C3435T AS2  相補鎖に対応し、MDRlのエクソン26中の194位〜にハイブリダイズする。SEQ ID NO:1中の位置により定義される。
プライマーMDRl C3435T 共通  MDRlのエクソン26中の154位〜に対応し、SEQ ID NO:1中の位置により定義される。
プライマーIMPDH2 T3757C F  相補鎖に対応し、IMPDH2のイントロン6中の3938位〜3919位にハイブリダイズする。SEQ ID NO:6中の位置により定義される。
プライマーIMPDH2 T3757C R  IMPDH2のイントロン8中の3497位〜3516位に対応し、SEQ ID NO:6中の位置により定義される。
【００６７】
IMPDH2 PCRのために、20ナノグラムのゲノムDNAを、MJ research Tetrad PCRマシンを使用して20ul反応物中でPCR増幅した。
【００６８】
IMPDH2断片の増幅のための条件は、以下の通りである。
・ 50mM Tris pH 8.3
・ 10mM KCl
・ 1.5mM MgCl2
・ 0.2mMの各dNTP
・ 0.4 μMの各プライマーおよび
・ 0.6 UのAmpliTaq Goldポリメラーゼ
【００６９】
サーモサイクリングプロトコルは、95℃15分間の初期インキュベーション、その後94℃1分間、61℃30秒間、72℃1分間を35サイクル、および1回の72℃5分間の最終伸長段階を行うことからなる。
【００７０】
その後、PCR増幅断片を、Tecanバイオロボット上でMillipore PCR Cleanupプレートを使用することにより精製した。サイクルシークエンシングを、製造業者の取り扱い説明書に従ってABI Big Dyeターミネーターケミストリーを使用してMJ Tetrad PCRマシン上で実施した。配列決定後、Polyphredソフトウェアを使用して多型分析を行った(University of Washingtonから使用の許諾を受けた)。
【００７１】
実施例2
一変量snp分析 
まず最初に各多型について分析を行った。BPAR (Biopsy Proven Acute Rejection)の発生と各多型との間の関連を、処置群の性別および年齢(変数の二つのカテゴリー、<=50 y、>50 yにコード化)に合わせてロジスティック回帰モデルを用いて調整してから評価した。
【００７２】
各多型の遺伝子型とBPARの発生との間に関連性がないという仮説は、遺伝子型試験を使用して試験した(Sasieni 1997)。この試験は、遺伝子型とBPARの発生との間の独立した試験であり、これは、MDRl C3435TおよびIL 10 -592C>Aの場合、自由度2のカイ自乗に従った。IMPDH2 T3757Cについては、2個体しか含まないため、C/Cホモ接合体群をC/T遺伝子型によりプールした。したがって、遺伝子型解析試験の自由度dfはわずか1であった。遺伝子型試験のタイプIエラーは、0.05に設定し、多重比較のための調整は行わなかった。
【００７３】
MDRl C3435T多型については、この多型の対立遺伝子とBPARの発生との間に関連性がないことを試験するために、対立遺伝子傾向試験(allelic trend test) (Sasieni, 1997)をさらに実施した。対立遺伝子傾向試験は、対立遺伝子1の存在とBPARの発生との間の独立性を試験することである。対応するオッズ比およびその95％信頼区間を計算した(下記の表を参照)。
【００７４】
IMPDH2 T3757Cについては、対応するオッズ比({C/C U C/T}対 T/T)をその相対的95％信頼区間を用いて計算した。
【００７５】
IL10 -592C>Aについては、C/CおよびA/Cカテゴリーを一緒にプールすることによって、劣性コーディング試験をさらに計算した。対応する1dfのカイ自乗を計算し、ならびにA/CまたはC/C遺伝子型と比較したA/A遺伝子型に関連するBPARのオッズ比を計算した。
【００７６】
表2に示されるように、三つ全ての多型が遺伝子型解析を使用して有意であった。
【００７７】
IMPDH2 C対立遺伝子の存在は、BPAR発症のオッズをほぼ3倍増加させ(オッズ比 (OR) 2.99、95%CI: 1.27-6.99; p=0.012); MDRl T対立遺伝子の存在は、リスクをほぼ2倍増加させ(OR 1.98、95%CI: 1.24-3.14; p=0.004); IL10 A対立遺伝子の存在は、ほぼ5倍高いオッズに関連した(OR 4.76、95%CI: 1.59-14.26; p=0.005)。処置群と遺伝子型との間の有意な相互作用は、これら三つの多型について検出されなかった。
【００７８】
（表2）一変量遺伝薬理学的分析の結果
2008545445.tif 000003
凡例: n : 一群当たりの試料サイズ; OR: オッズ比 (事象のオッズ: 事象なしのオッズ) [ORの95％信頼区間]; 遺伝子型試験、対立遺伝子傾向試験、劣性コーディング試験: 本文参照; df: 自由度; p: P値; BPAR: 生検で検出された急性拒絶反応; df: 自由度
【００７９】
実施例3
多変量snp分析
三つの有意な多型(表2参照)を、他の二つに対する効果に関して調整したそれらの有意性を評価するために、ロジスティック回帰モデルに組み合わせた。この三つの多型を、上記のコーディングを使用して加えた。
【００８０】
以前に記載されているように、分析は処置群の性別および年齢を考慮に入れて実施した。結果を図3に示す。
【００８１】
同一の多変量モデルに含めた場合、三つ全ての多型は5%タイプIエラーレベルで有意であった。
【００８２】
（表3）多変量遺伝薬理学的結果
2008545445.tif 000004
【配列表】
2008545445000001.app
【国際調査報告】
2008545445.tif 000005
2008545445.tif 000006
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