(57)【要約】本発明は、動物におけるＢ細胞リンパ腫を診断する方法を提供する。特に、本発明は、活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）表現型を有するびまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を有する動物を、非活性化胚中心（ＧＣ）表現型を有するＤＬＢＣＬを有する動物と区別する方法を提供する。本発明はまた、Ｂ細胞リンパ腫を処置する化合物を同定する方法も提供する。本発明は、動物から単離されたサンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定するための試薬および方法をさらに提供する。この点に関して、本発明は、動物から単離されたサンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定するためのオリゴヌクレオチドのセットを提供する。
2008529531.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物におけるＢ細胞リンパ腫を診断するための方法であって、該方法は、
該動物から単離されたＢ細胞サンプルをアッセイして、該サンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定する工程、および
該Ｂ細胞サンプル中のｍｉＲ−１５５量が正常Ｂ細胞中のｍｉＲ−１５５量よりも多い場合、該動物におけるＢ細胞リンパ腫を診断する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
（ａ）前記動物から単離されたＢ細胞サンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定する工程；
（ｂ）正常Ｂ細胞中のｍｉＲ−１５５量を決定する工程；および
（ｃ）該動物から単離されたＢ細胞サンプル中のｍｉＲ−１５５量が該正常Ｂ細胞中のｍｉＲ−１５５量よりも多い場合、該動物におけるＢ細胞リンパ腫を診断する工程、
を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｂ細胞リンパ腫が、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性リンパ性リンパ腫（ＣＬＬ）、または辺縁帯（ＭＺ）Ｂ細胞リンパ腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記動物が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
侵入切断アッセイを使用して、ｍｉＲ−１５５量を決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記正常Ｂ細胞が健常な個体から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記正常Ｂ細胞が培養細胞株から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
正常Ｂ細胞中のｍｉＲ−１５５量が、正常Ｂ細胞のｍｉＲ−１５５発現量についての参照標準を参照することによって、決定される、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記動物から単離されたＢ細胞サンプル中のｍｉＲ−１５５量が、前記正常Ｂ細胞中のｍｉＲ−１５５量の少なくとも２倍である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記動物から単離されたＢ細胞サンプル中のｍｉＲ−１５５量が、前記正常Ｂ細胞中のｍｉＲ−１５５量の少なくとも１０倍である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
動物における、活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）表現型を有するびまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を診断するための方法であって、該方法は、
該動物から単離されたＢ細胞サンプルをアッセイして、該サンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定する工程、および
該Ｂ細胞サンプル中のｍｉＲ−１５５量が、ＧＣ表現型を有するＤＬＢＣＬ細胞のサンプル中のｍｉＲ−１５５量よりも多い場合、該動物におけるＡＢＣ表現型を有するＤＬＢＣＬを診断する工程、
を包含する、方法。
【請求項１３】
（ａ）前記動物から単離されたＢ細胞サンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定する工程；
（ｂ）非活性化胚中心（ＧＣ）表現型を有するＤＬＢＣＬ細胞のサンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定する工程；および
（ｃ）該動物から単離されたＢ細胞サンプル中のｍｉＲ−１５５量が、該ＧＣ表現型を有するＤＬＢＣＬ細胞のサンプル中のｍｉＲ−１５５量よりも多い場合、該動物におけるＡＢＣ表現型を有するＤＬＢＣＬを診断する工程、
を包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記動物が哺乳動物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
侵入切断アッセイを使用して、ｍｉＲ−１５５量を決定する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＧＣ表現型を有するＤＬＢＣＬ細胞のサンプルが培養細胞株から得られる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
ＧＣ表現型を有するＤＬＢＣＬ細胞のサンプル中のｍｉＲ−１５５量が、ＧＣ表現型を有するＤＬＢＣＬ細胞のｍｉＲ−１５５発現の量についての参照標準を参照することによって、決定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記動物から単離されたＢ細胞サンプル中のｍｉＲ−１５５量が、前記ＧＣ表現型を有するＤＬＢＣＬ細胞のサンプル中のｍｉＲ−１５５量の少なくとも２倍である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
Ｂ細胞リンパ腫を処置する化合物を同定するための方法であって、該方法は、
（ａ）Ｂ細胞リンパ腫サンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定する工程；
（ｂ）該Ｂ細胞リンパ腫サンプルを該化合物に曝露する工程；
（ｃ）該Ｂ細胞リンパ腫サンプルを該化合物に曝露した後で、該Ｂ細胞リンパ腫サンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定する工程；および
（ｄ）該化合物への曝露前の該Ｂ細胞リンパ腫サンプル中のｍｉＲ−１５５量が、該化合物への曝露後の該Ｂ細胞リンパ腫サンプル中のｍｉＲ−１５５量よりも多い場合、Ｂ細胞リンパ腫を処置する化合物を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２１】
侵入切断アッセイを使用して、ｍｉＲ−１５５量を決定する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｂ細胞リンパ腫サンプルが培養細胞株から得られる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
曝露前の前記Ｂ細胞リンパ腫サンプル中のｍｉＲ−１５５量が、曝露後の前記Ｂ細胞リンパ腫サンプル中のｍｉＲ−１５５量の少なくとも２倍である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
曝露前の前記Ｂ細胞リンパ腫サンプル中のｍｉＲ−１５５量が、曝露後の前記Ｂ細胞リンパ腫サンプル中のｍｉＲ−１５５量の少なくとも１０倍である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
動物から単離されたサンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定するためのオリゴヌクレオチドのセットであって、該セットは、
（ａ）配列番号１５に示されるヌクレオチド配列を有する侵入切断オリゴヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１６に示されるヌクレオチド配列を有するプローブ；および
（ｃ）配列番号１７に示されるヌクレオチド配列を有する停止オリゴヌクレオチド、
を備える、セット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００５年２月１１日に出願された米国仮特許出願第６０／６５２，３０１号、および、２００５年２月２５日に出願された同第６０／６５６，２４５号からの優先権の利益を主張する。これらの各々の開示は、参考として本明細書に明示的に援用される。
【０００２】
連邦研究補助（ＦＥＤＥＲＡＬ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＳＵＰＰＯＲＴ）の承認
本発明は、少なくとも部分的に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、奨学金第ＧＭ−３０２２０号からの基金によってなされた。したがって、米国政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
【０００３】
１．発明の分野
本発明は、動物におけるＢ細胞リンパ腫を診断するための方法に関する。特に、本発明は、活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）表現型を有するびまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌａｒｇｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）（ＤＬＢＣＬ）を有する動物を非活性化胚中心（ＧＣ）表現型を有するＤＬＢＣＬを有する動物と区別するための方法に関する。本発明はまた、Ｂ細胞リンパ腫を処置する化合物を同定するための方法にも関する。さらに、本発明は、動物から単離されたサンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定するための試薬および方法に関する。この点に関して、本発明は、動物から単離されたサンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定するためのオリゴヌクレオチドのセットに関する。
【背景技術】
【０００４】
２．発明の背景
癌原遺伝子の不適切な発現または癌抑制遺伝子の不活化は癌に寄与し得る。一例は、元来トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）誘発性リンパ腫においてプロウイルスＤＮＡの挿入のための一般的な部位として同定されたＢＩＣ遺伝子である（非特許文献１；非特許文献２）。ＢＩＣ遺伝子の活性化は、ｃ−ＭＹＣの上方制御を伴うリンパ腫および白血病の病因を加速し得、これらの疾患の病因におけるＢＩＣの機能を示し得る（非特許文献３）。ＢＩＣ  ＲＮＡの発現は、正常なリンパ組織において低いが、ホジキンリンパ腫および小児のバーキットリンパ腫ならびにインビトロで活性化されたＢ細胞およびＴ細胞においては増大される（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。
【０００５】
トリ、マウス、およびヒトＢＩＣ  ＲＮＡは、長さ約１．７ｋｂ（ポリＡテールを含む）であり、そしておそらくＲＮＡポリメラーゼＩＩによって生成された、スプライシングおよびポリアデニル化された転写物である。ＢＩＣ転写物は、長いオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を欠き、そして、それらの短い、推定上のＯＲＦは保存されていないため、ＢＩＣ  ＲＮＡはタンパク質をコードしないＲＮＡとして機能することが示唆されている（非特許文献７）。最近、マウスマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子（ｍｉＲ−１５５と命名された（非特許文献８））が、ＢＩＣ  ＲＮＡ（Ｉｄ）の唯一系統発生的に保存された領域内にコードされていることが見出された。代表的に、ｍｉＲＮＡは、植物、脊椎動物および無脊椎動物における遺伝子発現の転写後の下方制御で機能する、約２２ヌクレオチド長の分子である（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。それゆえ、ｍｉＲ−１５５は、とりわけ、癌抑制遺伝子の転写を下方制御することによって、ＢＩＣ  ＲＮＡに起因する腫瘍形成活性の原因となり得る。
【０００６】
動物細胞において、内因性のｍｉＲＮＡは、核および細胞質における連続的なプロセシングにより、一次的なＲＮＡポリメラーゼＩＩの転写物（すなわち、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）から生成される（非特許文献１２）。核の前駆体ＲＮＡは、「マイクロプロセッサー複合体（ｍｉｃｒｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ）」中のエンドヌクレアーゼＤｒｏｓｈａによって切断され、短い６０−７０ヌクレオチドの不完全なヘアピン構造体であるプレｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）を放出する。ｅｘｐｏｒｔｉｎ−５による細胞質への輸送の後、プレｍｉＲＮＡは、エンドヌクレアーゼＤＩＣＥＲによってプロセシングされ、約２２ヌクレオチドの二重鎖を生じる。このうちの一方の鎖が、成熟ｍｉＲＮＡである。ＢＩＣ  ＲＮＡをコードするｍｉＲ−１５５の保存領域は、不完全なヘアピン構造を形成し得（非特許文献７）、ｍｉＲ−１５５がこの経路によって生成されることが示唆される（図１）。
【０００７】
ｍｉＲＮＡのレベルの変化は、一部の癌において増殖またはアポトーシスの制御を変更し得る（非特許文献１３；非特許文献１４）。慢性リンパ性リンパ腫（ＣＬＬ）において、ｍｉＲ−１５ａおよびｍｉＲ−１６のレベルの低下（非特許文献１５）、肺癌においてｌｅｔ−７ａのレベルの低下（非特許文献１６）、ならびに結腸の癌腫においてｍｉＲ−１４３およびｍｉＲ−１４５のレベルの低下（非特許文献１７）が報告されている。一部のヒトのリンパ腫においてＢＩＣ  ＲＮＡが上方制御されるが（非特許文献５；非特許文献６）、これらの癌におけるｍｉＲ−１５５のレベルについては、ほとんど分かっていない。
【０００８】
びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）（リンパ腫の全症例のうちの３０％〜４０％の原因となる、浸潤性（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）Ｂ細胞新生物（非特許文献１８））は、顕著に異なる臨床上の結果を有する群に免疫組織化学的に分類され得る（非特許文献１９）。活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）表現型を有するＤＬＢＣＬを有する患者の予後は、非活性化胚中心（ＧＣ）表現型を有するＤＬＢＣＬを有する患者の予後に比べて、不良である。現在までのところ、ｍｉＲ−１５５およびＢＩＣ  ＲＮＡレベルと、ならびに全てのリンパ系新生物のうち、もっとも頻発するリンパ系新生物の表現型との間の関連性は調べられていない。
【非特許文献１】Ｔａｍら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９７）１７：１４９０−５０２
【非特許文献２】Ｃｌｕｒｍａｎら、ＭｏＬ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８９）９：２６５７−６４
【非特許文献３】Ｔａｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２００２）７６：４２７５−８６
【非特許文献４】Ｈａａｓｃｈら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００２）２１７：７８−８６
【非特許文献５】Ｍｅｔｚｌｅｒら、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ（２００４）３９：１６７−６９
【非特許文献６】ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ（２００３）３７：２０−２８
【非特許文献７】Ｔａｍ、Ｇｅｎｅ（２００１）２７４：１５７−６７
【非特許文献８】Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．（２００２）１２：７３５−３９
【非特許文献９】Ｂａｒｔｅｌ、Ｃｅｌｌ（２００４）１１６：２８１−９７
【非特許文献１０】Ｈｅら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．（２００４）５：５２２−３１
【非特許文献１１】Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．（２００２）１８：１７１−７３
【非特許文献１２】Ｃｕｌｌｅｎ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．（２００４）１６：８６１−６５
【非特許文献１３】ＭｃＭａｎｕｓ、Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．（２００３）１３：２５３−５８
【非特許文献１４】Ｘｕら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．（２００４）２０：６１７−２４
【非特許文献１５】Ｃａｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（２００２）９９：１５５２４−２９
【非特許文献１６】Ｔａｋａｍｉｚａｗａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００４）６４：３７５３−５６
【非特許文献１７】Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００３）１：８８２−９１
【非特許文献１８】Ｔｈｅ  Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  Ｌｙｍｈｏｍａ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｊｅｃｔ、Ｂｌｏｏｄ（１９９７）８９：３９０９−１８
【非特許文献１９】Ｃｈａｎｇら、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．（２００４）２８：４６４−７０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、当該分野において、患者におけるＢ細胞リンパ腫を診断する方法への必要性が存在する。加えて、当該分野において、ＡＢＣ表現型を有するＤＬＢＣＬを有する個体を、ＧＣ表現型を有するＤＬＢＣＬを有する個体と区別するための方法に対する必要性が存在する。このような方法は、従来の組織学的方法および免疫表現型による方法（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）がＢ細胞リンパ腫（そして、特に、ＡＢＣ表現型を有するＤＬＢＣＬ）の正確な診断を提供することができない状況において、特に有用であり得る。また、このような方法はまた、Ｂ細胞リンパ腫（そして、特に、ＡＢＣ表現型を有するＤＬＢＣＬ）を有する患者を処置する治療の適切な方針を決定することにおいて、有用であり得る。したがって、このような診断方法の開発は、医療分野において広範な適用を有し得る。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、動物におけるＢ細胞リンパ腫を診断するための方法を提供し、この方法は、該動物から単離されたＢ細胞サンプルをアッセイして、該サンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定する工程、および、該Ｂ細胞サンプル中のｍｉＲ−１５５量が正常Ｂ細胞中のｍｉＲ−１５５量よりも多い場合、該動物におけるＢ細胞リンパ腫を診断する工程を包含する。
【００１１】
本発明はまた、動物におけるＢ細胞リンパ腫を診断するための方法を提供し、この方法は、該動物から単離されたＢ細胞サンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定する工程；正常Ｂ細胞中のｍｉＲ−１５５量を決定する工程、または、複数の正常な個体由来のＢ細胞中のｍｉＲ−１５５の平均量の範囲を評価する工程；および、該動物から単離されたＢ細胞サンプル中のｍｉＲ−１５５量が、該正常Ｂ細胞中のｍｉＲ−１５５量よりも多い場合、該動物におけるＢ細胞リンパ腫を診断する工程を包含する。
【００１２】
本発明はまた、動物における、活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）表現型を有するびまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を診断するための方法を提供し、この方法は、該動物から単離されたＢ細胞サンプルをアッセイして、該サンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定する工程、および、該Ｂ細胞サンプル中のｍｉＲ−１５５量が、ＧＣ表現型を有するＤＬＢＣＬ細胞のサンプル中のｍｉＲ−１５５量よりも多い場合、該動物におけるＡＢＣ表現型を有するＤＬＢＣＬを診断する工程を包含する。
【００１３】
本発明はまた、動物における、活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）表現型を有するびまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を診断するための方法を提供し、この方法は、該動物から単離されたＢ細胞サンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定する工程；非活性化胚中心（ＧＣ）表現型を有するＤＬＢＣＬ細胞のサンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定する工程；および、該動物から単離されたＢ細胞サンプル中のｍｉＲ−１５５量が、該ＧＣ表現型を有するＤＬＢＣＬ細胞のサンプル中のｍｉＲ−１５５量よりも多い場合、該動物におけるＡＢＣ表現型を有するＤＬＢＣＬを診断する工程を包含する。
【００１４】
本発明はまた、Ｂ細胞リンパ腫を処置する化合物を同定するための方法を提供し、この方法は、Ｂ細胞リンパ腫サンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定する工程；該Ｂ細胞リンパ腫サンプルを該化合物に曝露する工程；該Ｂ細胞リンパ腫サンプルを該化合物に曝露した後で、該Ｂ細胞リンパ腫サンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定する工程；および、該化合物への曝露前の該Ｂ細胞リンパ腫サンプル中のｍｉＲ−１５５量が、該化合物への曝露後の該Ｂ細胞リンパ腫サンプル中のｍｉＲ−１５５量よりも多い場合、Ｂ細胞リンパ腫を処置する化合物を同定する。
【００１５】
本発明はまた、動物から単離されたサンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定するための試薬も提供する。特に、本発明は、動物から単離されたサンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定するためのオリゴヌクレオチドのセットを提供し、このセットは、配列番号１５に示されるヌクレオチド配列を有する侵入切断オリゴヌクレオチド（ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；配列番号１６に示されるヌクレオチド配列を有するプローブ；および、配列番号１７に示されるヌクレオチド配列を有する停止オリゴヌクレオチド（ａｒｒｅｓｔｏｒ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を含む。
【００１６】
本発明の具体的な好ましい実施形態は、以下の特定の好ましい実施形態のより詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、動物におけるＢ細胞リンパ腫を診断するための方法を提供する。特に、本発明は、活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）表現型を有するびまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を有する動物を、非活性化胚中心（ＧＣ）表現型を有するＤＬＢＣＬを有する動物と区別するための方法を提供する。本発明はまた、Ｂ細胞リンパ腫を処置する化合物を同定するための方法も提供する。本発明はさらに、動物から単離されたサンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定するための試薬および方法を提供する。この点に関して、本発明は、動物から単離されたサンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定するためのオリゴヌクレオチドのセットを提供する。
【００１８】
本明細書で使用される組換え核酸の方法は、一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、または、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  １９９４）に示される方法である。
【００１９】
本発明の一実施形態において、動物において、Ｂ細胞リンパ腫は以下の工程によって診断される：該動物から単離されたＢ細胞サンプルをアッセイして、該サンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定する工程、および、該Ｂ細胞サンプル中のｍｉＲ−１５５量が正常Ｂ細胞中のｍｉＲ−１５５量よりも多い場合、該動物におけるＢ細胞リンパ腫を診断する工程。
【００２０】
本発明の別の実施形態において、動物において、Ｂ細胞リンパ腫は以下の工程によって診断される：該動物から単離されたＢ細胞サンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定する工程；正常Ｂ細胞中のｍｉＲ−１５５量を決定する工程；および、該動物から単離されたＢ細胞サンプル中のｍｉＲ−１５５量が該正常Ｂ細胞中のｍｉＲ−１５５量よりも多い場合、該動物におけるＢ細胞リンパ腫を診断する工程。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態において、上記動物において診断されるＢ細胞リンパ腫は、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性リンパ性リンパ腫（ＣＬＬ）、または辺縁帯（ＭＺ）Ｂ細胞リンパ腫である。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態において、上記の診断される動物は哺乳動物であり、そして、なおより好ましくは、診断される動物はヒトである。
【００２３】
本発明の方法において、所定のサンプル中のｍｉＲ−１５５量は、当業者に公知である、ＲＮＡを定量するための任意の適切な手順を使用して決定され得る。これらの手順としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、自律型配列複製システム（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１８７４−７８）、Ｑ−βレプリカーゼ法（Ｑ−ｂｅｔａ  ｒｅｐｌｉｃａｓｅ  ｍｅｔｈｏｄ）、ノーザンブロットアッセイ、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ、サイクリングプローブ反応（Ｄｕｃｋら、１９９０，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ９：１４２−４８）、および分枝ＤＮＡ（ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡ）（ｂＤＮＡ）法（Ｕｒｄｅａら、１９８７，Ｇｅｎｅ  ６１：２５３−６４）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の好ましい実施形態において、侵入切断反応（ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（米国特許第６，６９２，９１７号；Ｅｉｓら、２００１、上記；ならびに、米国特許出願公開第２００３／０１０４３７８号および同第２００３／０１８６２３８号）（商標Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）のもとで販売されるもの）が、所定のサンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定するために使用される。
【００２４】
本発明の一方法において、正常（すなわち、コントロール）Ｂ細胞が、健常な個体から取得され得る。本発明の別の方法において、正常（すなわち、コントロール）Ｂ細胞が、培養細胞株から取得され得るが、ただし、この培養細胞株は、健常な個体から単離されたＢ細胞によって発現されるｍｉＲ−１５５量と匹敵する量のｍｉＲ−１５５を発現する。本発明の一方法において、正常Ｂ細胞中のｍｉＲ−１５５量は、正常Ｂ細胞のｍｉＲ−１５５発現の量についての参照標準（例えば、複数の正常な個体のＢ細胞サンプルから収集される）を参照することによって決定されるか、または、この量は、他の方法で既知であるか、または、当業者によって容易に決定され得る。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態において、Ｂ細胞リンパ腫の診断は、上記動物から単離されたＢ細胞サンプル中のｍｉＲ−１５５量が、正常Ｂ細胞中のｍｉＲ−１５５量の少なくとも２倍であるという観察に基づく。他の好ましい実施形態において、Ｂ細胞リンパ腫の診断は、上記動物から単離されたＢ細胞サンプル中のｍｉＲ−１５５量が、正常Ｂ細胞中のｍｉＲ−１５５量の少なくとも５倍であるか、または、正常Ｂ細胞中のｍｉＲ−１５５量の少なくとも１０倍であるか、または、正常Ｂ細胞中のｍｉＲ−１５５量の少なくとも１５倍であるか、または、正常Ｂ細胞中のｍｉＲ−１５５量の少なくとも２０倍であるか、または、正常Ｂ細胞中のｍｉＲ−１５５量の少なくとも３０倍であるという観察に基づく。
【００２６】
本発明の別の実施形態において、動物において、活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）表現型を有するびまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）は、以下の工程によって診断される：上記動物から単離されたＢ細胞サンプルをアッセイして、該サンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定する工程、および、該Ｂ細胞サンプル中のｍｉＲ−１５５量が、ＧＣ表現型を有するＤＬＢＣＬ細胞のサンプル中のｍｉＲ−１５５量よりも多い場合、該動物におけるＡＢＣ表現型を有するＤＬＢＣＬを診断する工程。
【００２７】
本発明の別の実施形態において、動物において、活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）表現型を有するびまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）は、以下の工程によって診断される：上記動物から単離されたＢ細胞サンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定する工程；非活性化胚中心（ＧＣ）表現型を有するＤＬＢＣＬ細胞のサンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定する工程；および、該動物から単離されたＢ細胞サンプル中のｍｉＲ−１５５量が、該ＧＣ表現型を有するＤＬＢＣＬ細胞のサンプル中のｍｉＲ−１５５量よりも多い場合、該動物におけるＡＢＣ表現型を有するＤＬＢＣＬを診断する工程。
【００２８】
本発明の一方法において、ＧＣ表現型を有するＤＬＢＣＬ細胞は、培養細胞株から得られるか、１つまたは複数の培養細胞株の複数のサンプルから決定されたｍｉＲ−１５５の参照標準量から得られるか、または、複数のＤＬＢＣＬ／ＧＣ臨床サンプルから得られる。
【００２９】
本発明の別の方法において、正常Ｂ細胞中のｍｉＲ−１５５量は、正常Ｂ細胞のｍｉＲ−１５５発現の量についての参照標準（例えば、複数の正常な個体のＢ細胞サンプルから収集される）を参照することによって決定されるか、または、この量は、他の方法で既知であるか、または、当業者によって容易に決定され得る。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態において、ＡＢＣ表現型を有するＤＬＢＣＬ細胞の診断は、上記動物から単離されたＢ細胞サンプル中のｍｉＲ−１５５量が、ＧＣ表現型を有するＤＬＢＣＬ細胞のサンプル中のｍｉＲ−１５５量の少なくとも２倍であるという観察に基づく。
【００３１】
本発明の別の実施形態において、Ｂ細胞リンパ腫を処置する化合物は、以下の工程によって同定される：Ｂ細胞リンパ腫サンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定する工程；該Ｂ細胞リンパ腫サンプルを該化合物に曝露する工程；該Ｂ細胞リンパ腫サンプルを該化合物に曝露した後で、該Ｂ細胞リンパ腫サンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定する工程；および、該化合物への曝露前の該Ｂ細胞リンパ腫サンプル中のｍｉＲ−１５５量が、該化合物への曝露後の該Ｂ細胞リンパ腫サンプル中のｍｉＲ−１５５量よりも多い場合、Ｂ細胞リンパ腫を処置する化合物を同定する。
【００３２】
本発明の一方法において、上記Ｂ細胞リンパ腫サンプルは、培養細胞株から取得されるか、または１つ以上の臨床サンプルから取得される。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態において、Ｂ細胞リンパ腫を処置する適切な化合物の同定は、該化合物への曝露前のＢ細胞リンパ腫サンプル中のｍｉＲ−１５５量が、該化合物への曝露後のＢ細胞リンパ腫サンプル中のｍｉＲ−１５５量の少なくとも２倍であるという観察に基づく。他の好ましい実施形態において、Ｂ細胞リンパ腫を処置する適切な化合物の同定は、曝露前のＢ細胞リンパ腫サンプル中のｍｉＲ−１５５量が、該化合物への曝露後のＢ細胞リンパ腫サンプル中のｍｉＲ−１５５量の少なくとも５倍であるか、または、該化合物への曝露後のＢ細胞リンパ腫サンプル中のｍｉＲ−１５５量の少なくとも１０倍であるか、または、該化合物への曝露後のＢ細胞リンパ腫サンプル中のｍｉＲ−１５５量の少なくとも１５倍であるか、または、該化合物への曝露後のＢ細胞リンパ腫サンプル中のｍｉＲ−１５５量の少なくとも２０倍であるか、または、該化合物への曝露後のＢ細胞リンパ腫サンプル中のｍｉＲ−１５５量の少なくとも３０倍であるという観察に基づく。
【００３４】
本発明はまた、動物から単離されたサンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定するための試薬も提供する。本発明の一実施形態において、動物から単離されたサンプル中のｍｉＲ−１５５量を決定するオリゴヌクレオチドのセットが提供され、このセットは、配列番号１５に示されるヌクレオチド配列を有する侵入切断オリゴヌクレオチド；配列番号１６に示されるヌクレオチド配列を有するプローブ；および、配列番号１７に示されるヌクレオチド配列を有する停止オリゴヌクレオチドを含む。
【００３５】
以下の実施例は、本発明の具体的な実施形態、およびその種々の使用を例示する。これらは、説明目的のためにのみ示され、本発明を限定するとはみなされないべきである。
【実施例】
【００３６】
（実施例１）
活性化リンパ系細胞中のＢＩＣ  ＲＮＡレベルおよびｍｉＲ−１５５レベルのアッセイ
多数のヒトリンパ細胞株および非リンパ細胞株におけるＢＩＣ  ＲＮＡレベルおよびｍｉＲ−１５５レベルを、それぞれ半定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）およびノーザンブロットによって決定した。総ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して培養細胞から単離し、ＲＮＡの完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を８％変性ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動によってモニタリングした。核ＲＮＡおよび細胞質ＲＮＡを、標準プロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、上記）にしたがって単離した。特に、核ペレットにＴｒｉｚｏｌを直接添加することによって、核ＲＮＡを単離した（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉら、１９８７、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−５９）。まずＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、総容量２０μＬで２μｇのＤＮａｓｅ  Ｉ処理した総ＲＮＡを逆転写することによって、半定量的ＲＴ−ＰＣＲを実行した。次に、ＢＩＣ  ＲＮＡ特異的プライマー（プライマーＡ、５’−ＣＡＡＧＡ−ＡＣＡＡＣ−ＣＴＡＣＣ−ＡＧＡＧＡ−ＣＣＴＴＡ−ＣＣ−３’配列番号１；プライマーＣ、５’−ＴＧＡＴＡ−ＡＡＡＡＣ−ＡＡＡＣＡ−ＴＧＧＧＣ−ＴＴＧＡＣ−３’；配列番号２；図２）またはβアクチンに特異的なコントロールプライマー（５’−ＣＴＧＴＧ−ＣＴＡＴＣ−ＣＣＴＧＴ−ＡＣＧＣＣ−ＴＣ−３’、配列番号３；５’−ＣＡＴＧＡ−ＴＧＧＡＧ−ＴＴＧＡＡ−ＧＧＴＡＧ−ＴＴＴＣＧ−Ｔ−３’、配列番号４）のいずれか、および５８℃のアニーリング温度を使用するＰＣＲによって、１０分の１の逆転写酵素反応混合物を増幅した。ＢＩＣ  ＲＮＡプライマーを含む反応物を、３０サイクルの間、増幅し、そして、βアクチンプライマーを含む反応物を２４サイクルの間、増幅した。２％アガロースゲル上で、異なるサイクル数で生成された産物を分析することにより、増幅産物が線形範囲（ｌｉｎｅａｒ  ｒａｎｇｅ）にあることを確認した。Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａら、２００２（上記）によって記載されるように、２０μｇの総ＲＮＡを使用して、ノーザンブロット分析を行った。トランスファーする前に、ゲルのエチジウムブロマイド染色によって、ローディングコントロールとしてｔＲＮＡを検出した。ヒトｍｉＲ−１５５配列に相補的な配列（５’−ＣＣＣＣＴ−ＡＴＣＡＣ−ＧＡＴＴＡ−ＧＣＡＴＴ−ＡＡ−３’、配列番号５）を有する［３２Ｐ］５’末端標識されたノーザンブロットプローブを使用して、ｍｉＲ−１５５を検出した。
【００３７】
図３Ａに示されるように、ＧＣ関連ＤＬＢＣＬ系統のＯＣＩ−Ｌｙ１の細胞は、低レベルのＢＩＣ  ＲＮＡしか発現していないこと（このことは、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら、２００３（上記）によって得られた結果と矛盾しない）が見出され、一方、非ＧＣ  ＤＬＢＣＬ系統の細胞は、中程度のレベルのＢＩＣ  ＲＮＡ（ＯＣＩ−Ｌｙ８）または非常に高レベルのＢＩＣ  ＲＮＡ（ＯＣＩ−Ｌｙ３）を発現することが見出された。非ＧＣ  ＤＬＢＣＬ細胞において観察された、より高いレベルのＢＩＣ  ＲＮＡは、そのより活性なＡＢＣ表現型に関連し得る。他の２つのＥＢＶ不死化リンパ芽球系統（ＬＣＬ）（インビトロで活性化されたＢ細胞（ＪＹ２５およびＣＢ３３）と類似する）もまた、高レベルのＢＩＣ  ＲＮＡを発現することが見出された。より高いＢＩＣ  ＲＮＡレベルは、ＥＢＶ感染とは無関係であるようであった。なぜなら、より高レベルのＢＩＣ  ＲＮＡが、ＥＢＶ陰性のホジキンリンパ腫（ＨＬ）細胞株Ｌ４２８、ＫＭＨ２およびＬ１２３６、ならびにＥＢＶ陽性のＨＬ細胞株Ｌ５９１において観察されたからである（図３Ａ）。ＢＩＣ  ＲＮＡの増大がヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）で形質転換されたＴ細胞（ＨＵＴ  １０２）で検出された一方で、ＢＩＣ  ＲＮＡレベルの増大は、造血細胞株（例えば、Ｕ２６６（骨髄腫）、ジャーカット（プレＴ（ｐｒｅ−Ｔ））、Ｋ５６２（慢性骨髄性白血病）またはＨＬ６０（急性前骨髄球性白血病））にも、非造血細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト胚腎臓）にも検出されなかった。半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析において得られた結果は、Ｂ細胞およびＴ細胞の活性化の間、ＢＩＣ  ＲＮＡが蓄積するという先の観察（Ｈａａｓｃｈら、２００２、上記；Ｍｅｔｚｌｅｒら、２００４、上記；ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら、２００３、上記）と矛盾しなかった。
【００３８】
図３Ｂに示されるように、成熟した約２２ヌクレオチドのｍｉＲ−１５５は、ＢＩＣ  ＲＮＡを発現する細胞においてのみ検出された。一部のサンプルにおいて、予想された約６０ヌクレオチドのプレ−ｍｉＲ−１５５もまた、薄い（ｗｅａｋ）バンドとして検出することができた。蓄積されたｍｉＲ−１５５のレベルは、ＢＩＣ  ＲＮＡのレベルと同様に、細胞株間において異なっていることが見出され、ｍｉＲ−１５５およびＢＩＣ  ＲＮＡの相対的なレベルの変化は、互いに質的に類似した。
【００３９】
（実施例２）
ＢＩＣ転写物のｍｉＲ−１５５へのプロセシング
ＢＩＣ転写物がｍｉＲ−１５５へプロセシングされ得るか否かを試験するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、プラスミドｐｃＤＮＡ３．ＢＩＣでトランスフェクトした。このプラスミドｐｃＤＮＡ３．ＢＩＣは、ｍｉＲ−１５５コード配列の約９０ヌクレオチド上流（５’）から開始する４１７ヌクレオチドのＲＮＡ（図２）の合成を駆動する、ＣＭＶプロモーターを含む。隣接するＮｈｅ  Ｉ部位およびＸｂａ  Ｉ部位を組み込む５’プライマーおよび３’プライマーを使用する、ＢＩＣエキソン３配列のＰＣＲ増幅によって、ｐｃＤＮＡ３．ＢＩＣプラスミドを生成した。この増幅反応の産物をＮｈｅ  Ｉで消化し、クレノウフラグメントを使用して、このＮｈｅ  Ｉ突出端を埋め、このＰＣＲ産物をＸｂａ  Ｉで消化し、次に、消化したＰＣＲ産物をｐｃＤΝＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターへサブクローニングした。ＢＩＣインサートとのライゲーションの前に、ｐｃＤＮＡ３をＥｃｏＲ  Ｉで消化し、クレノウフラグメントを使用して、このＥｃｏＲ  Ｉ突出端を埋め、そしてこのベクターをＸｂａ  Ｉで消化した。最終的なｐｃＤＮＡ３．ＢＩＣ構築物を配列決定によって確認した。
【００４０】
図３Ｃに示されるように、このプラスミドでトランスフェクトした細胞は、容易に検出可能な量の成熟ｍｉＲ−１５５を産生し、スプライシングされていない一部のコピーのＢＩＣ  ＲＮＡがｍｉＲ−１５５にプロセシングされ得るという考えを支持した。この実験で得られた本結果は、他の同様に切断されたヒトｍｉＲＮＡ遺伝子についての最近の研究（Ｃｈｅｎら、２００４、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３：８３−８６）と矛盾しなかった。
【００４１】
（実施例３）
ＢＩＣ  ＲＮＡおよびｍｉＲ−１５５の細胞内局在
イントロンを含まないＢＩＣ  ＲＮＡはｍｉＲ−１５５へプロセシングされ得るが、エンドヌクレアーゼＤｒｏｓｈａの通常の基質が、ノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲ増幅によって検出された一次的な約１２ｋｂ転写物またはスプライシングされた約１．７ｋｂ  ＢＩＣ  ＲＮＡ（Ｈａａｓｃｈら、２００２、上記；Ｍｅｔｚｌｅｒら、２００４、上記；ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら、２００３、上記；Ｔａｍ、２００１、上記；実施例１を参照のこと）のいずれであるか不明である。ＢＩＣ  ＲＮＡは長いオープンリーディングフレームを欠くが、ＢＩＣ  ＲＮＡは、それがスプライシングおよびポリアデニル化の両方を受ける点で、ｍＲＮＡと類似し、このことは、スプライシングされた転写物が、ｍＲＮＡ輸送（ｅｘｐｏｒｔ）経路を介して細胞質へ迅速に輸送され得ることを示唆する（Ｅｒｋｍａｎｎら、２００４、Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２９６：１２−２０）。
【００４２】
スプライシングされていないＢＩＣ  ＲＮＡに特異的なプライマーまたはスプライシングされたＢＩＣ  ＲＮＡに特異的なプライマー（図２）を使用する、ＯＣＩ−Ｌｙ３細胞およびＬ  １２３６細胞の細胞質画分および核画分から単離した総ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析によって、ＢＩＣ  ＲＮＡの細胞内局在を決定した。具体的には、ＯＣＩ−Ｌｙ３細胞およびＬ  １２３６細胞から単離したＲＮＡを逆転写し、次に、スプライシングされたＢＩＣ  ＲＮＡに特異的なプライマー（プライマーＡおよびＣ；実施例１を参照のこと）（これは、４７６ｂｐのＰＣＲ産物を生じる）、または、スプライシングされていないＢＩＣ  ＲＮＡに特異的なプライマー（プライマーＣおよびＢ、５’−ＣＴＧＴＣ−ＡＣＴＣＣ−ＡＧＣＴＴ−ＴＡＴＡＡ−ＣＣＧＣ−３’、配列番号６）（これは、４６７ｂｐのＰＣＲ産物を生じる）を使用して、ＰＣＲ増幅した。コントロール反応を、逆転写酵素を含めず、かつ鋳型の非存在下で実行した。予想されたように、ＢＩＣ転写物が核で優勢である（図４Ａ）ことが見出され、一方、よりはるかに豊富なスプライシングされた転写物が主に細胞質にあり、したがって、これらが核のＤｒｏｓｈａマイクロプロセッサー複合体に最早接近できないことが見出された。それゆえ、大半の検出可能なＢＩＣ  ＲＮＡが、認識されているあらゆるｍｉＲＮＡプロセシング経路によってもｍｉＲ−１５５へプロセシングされ得ない（Ｃｕｌｌｅｎ、２００４、上記）。
【００４３】
ｍｉＲ−１５５の細胞内局在を、ヒトｍｉＲ−１５５配列に相補的な配列を有するプローブ（実施例１を参照のこと）を使用する、ＯＣＩ−Ｌｙ３細胞およびＬ  １２３６細胞の細胞質画分および核画分から単離した総ＲＮＡのノーザンブロット分析によって決定した。プレ−ｍｉＲ−１５５（約６２ヌクレオチド長であることが予想された）は、核画分でのみ検出され（図４Ｂ）、これが細胞質へ輸送された後、迅速にプロセシングされることが示された。核画分および細胞質画分の両方における成熟ｍｉＲ−１５５の検出は、他のｍｉＲＮＡについて文献に記載される分布に似ている（Ｚｅｎｇら、２００３、ＲＮＡ  ９：１１２−２３；Ｍｅｉｓｔｅｒら、２００４、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １５：１８５−９７）。核画分中の成熟ｍｉＲ−１５５の存在はまた、核周囲の細胞質（ｍｉＲＮＡに富む）が核に混入することに部分的に起因し得る。
【００４４】
（実施例４）
Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）ｍＲＮＡおよびｍｉＲ−１５５アッセイ
実施例３に記載されるように、細胞内で検出することのできる大半のＢＩＣ  ＲＮＡは、細胞質にあり、それゆえ、これがｍｉＲ−１５５の前駆体として働く可能性は低い。結果として、ＢＩＣ  ＲＮＡレベルは、ｍｉＲ−１５５レベルの有効な予測因子（ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ）ではあり得ない。ＢＩＣ  ＲＮＡおよびｍｉＲ−１５５両方の細胞レベルの間の関連性を分析するために、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡアッセイを使用して、培養リンパ腫細胞株中のＢＩＣ  ＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを定量した。他の型のｍｉＲＮＡ測定（Ｃａｌｉｎら、２００４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１１７５５−６０）とは違い、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）ｍｉＲＮＡアッセイは、極微量の総ＲＮＡ（２０〜８０ｎｇ）しか必要とせず、かつ約２２ヌクレオチドのｍｉＲＮＡを直接測定し、ヘアピン前駆体も一次的な転写物も測定しない。実際に、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイは、測定されるＲＮＡの型およびその発現レベルに依存して、わずか０．１〜２０ｎｇの細胞の総ＲＮＡで、ｍＲＮＡ分子およびｍｉＲＮＡ分子の正確な定量化を可能にする（Ａｌｌａｗｉら、２００４、上記；Ｅｉｓら、２００１、上記）。
【００４５】
ＢＩＣ  ｍＲＮＡの検出に使用したＩｎｖａｄｅｒ（登録商標）プローブは、スプライシングされたＲＮＡに特異的であり、スプライシングされていない前駆体を検出しなかった。スプライシングされたＢＩＣ  ＲＮＡ転写物およびスプライシングされていないＢＩＣ  ＲＮＡ転写物を測定した他のプローブは匹敵するコピー数を得、ＢＩＣ  ＲＮＡの前駆体が非常に少量で存在することを確認した。ｍｉＲＮＡ  Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイは、成熟ｍｉＲ−１５５に特異的であった（Ａｌｌａｗｉら、２００４、上記）（図５）。スプライシングされたＢＩＣ  ＲＮＡ（スプライスジャンクション２〜３）、スプライシングされたＢＩＣ  ＲＮＡおよびスプライシングされていないＢＩＣ  ＲＮＡの両方（エキソン３）、ならびに成熟ｍｉＲ−１５５を検出するＩｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイを、公開された方法にしたがって開発した（Ａｌｌａｗｉら、２００４、上記；Ｅｉｓ、２００２、上記；Ｅｉｓら、２００１、上記；Ｗａｇｎｅｒら、２００３、ＲＮＡ  ９：１５５２−６１）。合成ｍｉＲＮＡに関して記載されるように、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）プローブセットのオリゴヌクレオチド（表Ｉ）および二次反応の鋳型（ＳＲＴ）を、ＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）により合成し、ゲル精製した。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒにより、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）製ホスホラミダイトを使用して、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを合成およびＨＰＬＣ精製した。オリゴヌクレオチド濃度を、Ａ２６０ｎｍ測定およびオリゴの製造者によって提供された吸光率から算出した。
【００４６】
【表１】
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１Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイ（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を、ｍｉＲＮＡ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙウェブサイトから取得したマイクロＲＮＡ配列を使用して設計した。ＢＩＣ  ＲＮＡ配列については、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＦ４０２７７６を使用した；Ｕ６  ＲＮＡ配列については、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号Ｘ５９２６２を使用した。ユニバーサルオリゴヌクレオチドを、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイの二次反応に使用し、プローブ上の５’アーム配列に依存して、これを交換可能に使用することができる。
２Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイ検出システムは、プローブの５’アーム配列およびＦＲＥＴオリゴヌクレオチド配列に特異的なＳＲＴと組み合わせて使用される、ＦＡＭ  ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドまたはＲｅｄ  ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドのいずれかから構成された。
３オリゴヌクレオチドの型は、以下を含んだ：Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）オリゴヌクレオチド（Ｉ）、プローブ（Ｐ）、スタッキングオリゴヌクレオチド（ｓｔａｃｋｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（Ｓ）、停止オリゴヌクレオチド（Ａ）、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチド（ＦＲＥＴ）、および二次反応の鋳型（ＳＲＴ）。
４天然のデオキシリボヌクレオチドは小文字で示され、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドは大文字で示される；プローブ（Ｐ）配列の非相補性５’アーム部分は太字で示される；ＢＩＣプローブおよびＵ６プローブは、３’−アミン（アミン）を有する；ＦＡＭはフルオレセイン誘導体であり、ＲｅｄはＲｅｄｍｏｎｄ  ＲｅｄＴＭ色素であり、ＥＱはＥｃｌｉｐｓｅ  ＱｕｅｎｃｈｅｒＴＭ色素である（Ｅｐｏｃｈ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ；Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）。
【００４７】
Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）ｍｉＲＮＡアッセイ一般試薬キット（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を、推奨されるように使用して、各々以下を含む、一次反応（１０μＬ）を調製した：
ＢＩＣ  ＲＮＡアッセイのためには、選択した細胞由来の２０〜４０ｎｇの総ＲＮＡ、ならびに、５ｐｍｏｌのＩｎｖａｄｅｒ（登録商標）オリゴヌクレオチド、８ｐｍｏｌのプローブ、および３ｐｍｏｌのスタッキングオリゴヌクレオチド；
ＭＩＲ−１５５アッセイのためには、選択した細胞由来の２０〜４０ｎｇの総ＲＮＡ、ならびに、５ｐｍｏｌの各々のＩｎｖａｄｅｒ（登録商標）オリゴヌクレオチドおよびプローブ；
ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６およびｌｅｔ−７ａアッセイのためには、選択した細胞由来の２０〜４０ｎｇの総ＲＮＡ、ならびに、１０ｐｍｏｌｅの各々のＩｎｖａｄｅｒ（登録商標）オリゴヌクレオチドおよびプローブ。二次反応（１５μＬ）は、４倍過剰なモル濃度の適切な停止オリゴヌクレオチド、１０ｐｍｏｌのＦＲＥＴオリゴヌクレオチド、および２．５ｐｍｏｌのＳＲＴを含んだ。Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）反応を、９６ウェルの０．２μＬマイクロプレート（ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ；Ｋａｙｓｖｉｌｌｅ，ＵＴ）内で構築し、一次反応を、９０分間、以下のいずれかの温度でインキュベートした：ＢＩＣ  ＲＮＡに対して６０℃、ｍｉＲ−１５５に対して４４℃、ｍｉＲ−１５ａおよびｍｉＲ−１６に対して５４℃、またはｌｅｔ−７ａに対して４９℃。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチド、ＳＲＴ、および適切な停止オリゴヌクレオチドを添加することによって二次反応を開始し、次に、１５分、３０分および６０分で蛍光シグナルの測定を行いながら、全部で６０分間、６０℃で反応混合物をインキュベートした。ＧＥＮｉｏｓプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ｕ．Ｓ．；Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を使用して、４０μｓの積分時間（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）でＦＡＭ蛍光（励起  ４８５／２０ｎｍおよび放出  ５３０／２５ｎｍバンドパスフィルター）またはＲｅｄ蛍光（励起  ５６０／２０ｎｍおよび放出  ６２０／４０ｎｍバンドパスフィルター）を測定した。注記した場合を除き、全ての反応を三連で行った。反復する測定値を平均し、バックグラウンドシグナル（１反応あたり１００ｎｇのｔＲＮＡを使用して測定した）に対して修正した。その後、先（Ｅｉｓら、２００１、上記；Ｗａｇｎｅｒら、２００３、上記）に記載されるように、ｍｉＲＮＡおよびＢＩＣ  ＲＮＡの標準曲線（反応あたり、１．５〜２４ａｍｏｌの合成ｍｉＲ−１５５の範囲、および、０．１５〜２．４ａｍｏｌのＢＩＣの範囲を使用した）からＲＮＡ量を算出した。
【００４８】
多くの細胞型のＵ６  ＲＮＡの発現において顕著な変動（５倍より大きい）が観察された（図６）ため、Ｕ６  ＲＮＡをｍｉＲＮＡ発現を正規化するための内標準として使用しなかった。これらの変動は、形質転換された細胞におけるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ活性の差に起因する可能性がある（Ｈｉｒｓｃｈら、２００４、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２４：５９８９−９９；Ｗｈｉｔｅ、２００４、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３：３２０８−１６）。したがって、１細胞あたりのＲＮＡコピー数を算出する際に、１細胞あたり、２０ｐｇの総ＲＮＡを想定した（Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ（Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，１９９４））。コントロールＵ２６６細胞において、ＢＩＣ  ＲＮＡおよびｍｉＲ−１５５の発現は、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイにより検出不能であった（すなわち、約１０コピー未満／細胞のＢＩＣ  ＲＮＡおよび約５０コピー／細胞のｍｉＲ−１５５）。
【００４９】
ｍｉＲＮＡ  Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイのための適切な標準を、ｍｉＲＮＡ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ、２００４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３２：Ｄ１０９−１１）に開示される配列を使用して設計した。ｍｉＲＮＡ標準をＤｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）によって合成した。脱保護した合成ｍｉＲＮＡを、２０％変性（７Ｍ尿素）ポリアクリルアミドゲルによってゲル精製し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液で溶出し、そしてＮＡＰ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上でＤＥＰＣ処理水（ＧｅｎｅＭａｔｅ；ＩＳＣ  ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ；Ｋａｙｓｖｉｌｌｅ，ＵＴ）で脱塩した。合成ｍｉＲＮＡ標準の濃度を、Ｄｈａｒｍａｃｏｎによって提供された以下のｅ２６０ｎｍ値を使用して決定した：ｍｉＲ−１５５、２２９，８００；ｍｉＲ−１５ａ、２２５，７００；ｍｉＲ−１６、２２６，１００；および、ｌｅｔ−７ａ、２３７，７００。
【００５０】
ＭａｓｔｅｒＡｍｐ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＲＴ−ＰＣＲキット（ＥｐｉＣｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、ラージ細胞から得られた総ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ増幅することによって生成された鋳型を使用するＴ７インビトロ転写により、ＢＩＣ  ＲＮＡ  Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイのための適切な標準を調製した。５０μＬの反応用量に、５μｇのＤＮａｓｅ処理された総ＲＮＡ、ならびにプライマー５’−ＴＡＡＴＡ−ＣＧＡＣＴ−ＣＡＣＴＡ−ＴＡＧＧＧ−ＡＧＣＧＧ−ＡＧＣＣＣ−ＣＧＡＧＣ−ＣＧ−３’（配列番号３６）（これは、Ｔ７プロモーター配列を含む）および５’−ＣＴＣＡＴ−ＧＡＧＡＴ−ＴＴＡＴＴ−ＴＧＧＴＴ−ＡＣＡＧＴ−ＧＡＡＴＡ−ＡＣＣＴＧ−Ｇ−３’（配列番号３７）を添加することによって、増幅反応を実行した。Ｔ７  Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、全長に近いＢＩＣ転写物（１４１０ヌクレオチド）を、生じたＰＣＲ産物から調製した。合成後、このＢＩＣ転写物を５％変性（８Ｍ尿素）アクリルアミドゲルによりゲル精製し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＳＤＳ緩衝液で溶出し、そしてフェノール：クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により脱塩および濃縮した。１  Ａ２６０ｎｍ単位＝４０ｎｇ／μＬおよび４５２，０６４ＤａのＭＷを仮定し、２６０ｎｍでの吸光度の測定を使用して、ＢＩＣ  ＲＮＡの濃度を算出した。
【００５１】
（実施例５）
培養リンパ腫細胞株におけるＢＩＣ  ＲＮＡおよびｍｉＲ−１５５の定量化
実施例３に記載されるように、細胞内で検出され得る大半のＢＩＣ  ＲＮＡは細胞質にあり、それゆえ、これがｍｉＲ−１５５の前駆体として働く可能性は低い。結果として、ＢＩＣ  ＲＮＡレベルは、ｍｉＲ−１５５レベルの有効な予測因子ではあり得ない。ＢＩＣ  ＲＮＡ細胞レベルとｍｉＲ−１５５レベルとの間の関連性を分析するために、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイを使用して、培養リンパ腫細胞株中のＢＩＣ  ＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを定量した。
【００５２】
Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）ｍＲＮＡおよびｍｉＲ−１５５アッセイにより、選択した細胞株において、約２０個〜約１，０００個のＢＩＣ  ＲＮＡ分子および約１００〜約８，０００個のｍｉＲ−１５５分子のコピー数を得た（図７Ａ；表ＩＩ）。Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイによって定量されるＢＩＣ  ＲＮＡおよびｍｉＲ−１５５のレベルは、半定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびノーザンブロット分析の結果と一致した。注記すべきことに、ＢＩＣ  ＲＮＡに対するｍｉＲ−１５５のモル濃度比は、約５から約３０まで変動し（図７Ｂ）、ＢＩＣ  ＲＮＡおよびｍｉＲ−１５５の絶対コピー数と相関しなかった。このことは、ＢＩＣ  ＲＮＡとｍｉＲ−１５５との合成、プロセシング、核輸送、および回転率の差に起因し得る。
【００５３】
【表２】
2008529531.tif 000004
先の原位置ハイブリッド形成研究は、ＤＬＢＣＬ細胞中のＢＩＣ  ＲＮＡが非常に低いか、または検出不能であることを示している（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら、２００３、上記）。しかしながら、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイは、ＢＩＣ  ＲＮＡおよびｍｉＲ−１５５の両方の検出可能な量がＳＵＤＨＬ６細胞（模範的なＧＣ型ＤＬＢＣＬ系統）に存在し、ＯＣＩ−Ｌｙ３細胞（模範的なＡＢＣ型ＤＬＢＣＬ系統）においては、これらのＢＩＣ  ＲＮＡおよびｍｉＲ−１５５のレベルがそれぞれ約２５倍および約１５倍となることを示した（図７Ａ）。したがって、両方のＤＬＢＣＬ型においてＢＩＣ  ＲＮＡおよびｍｉＲ−１５５が検出可能であるが、これらは、ＡＢＣ表現型を有する細胞において特に増大される。さらに、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら、２００３（上記）（これは、ＢＩＣ  ＲＮＡ発現の増大がホジキンリンパ腫に限られることを示した）によって得られた結果とは対照的に、ＢＩＣ  ＲＮＡレベルおよびｍｉＲ−１５５レベル両方の増大が数種の型のＢ細胞リンパ腫において検出された。
【００５４】
（実施例６）
臨床的なＢ細胞リンパ腫におけるＢＩＣ  ＲＮＡおよびｍｉＲ−１５５の定量化
臨床的に単離されたＤＬＢＣＬ細胞においてもＢＩＣ  ＲＮＡおよびｍｉＲ−１５５のレベルが増大されるか否かを決定するために、臨床的に単離された２３個のＤＬＢＣＬサンプルにおいて、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイを使用して、ＢＩＣ  ＲＮＡおよびｍｉＲ−１５５を定量した。正常な循環ＣＤ１９＋Ｂ細胞（以下の表ＩＩＩのサンプルＳ４およびＳ５）（これは、マイトジェン刺激時にＢＩＣ  ＲＮＡ発現が増加することが示されている）を、コントロールとして使用した。
【００５５】
ＤＬＢＣＬ、慢性リンパ性リンパ腫（ＣＬＬ）、および辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＭＺ）の組織サンプルを、Ｃｏｒｎｅｌｌ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＷｅｉｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅの病理学科から得た。検体を、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）により認可されたプロトコールにしたがって患者から取得し、全リンパ腫症例を、世界保健機関（ＷＨＯ）の分類にしたがって審査および分類した。ＤＬＢＣＬサンプルに関しては、新規症例のみを選択した。ヒトＢ細胞コントロールを、ヒトドナーから得られた全血のリンパ球画分（軟膜）から、ＣＤ１９＋ビーズ（ＭＡＣＳ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用する陽性選択によって精製し、１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ培地中で培養した。
【００５６】
免疫組織化学分析を、表現型マーカーＢＣＬ−６、ＣＤ１０、ＭＵＭ１／ＩＲＦ４、およびＣＤ１３８に対する抗体での染色によって、ＤＬＢＣＬ症例由来のホルマリン固定かつパラフィン包埋した組織の代表的な切片上で行った。この染色は、圧力鍋加熱（ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｃｏｏｋｅｒ  ｈｅａｔｉｎｇ）による抗原エピトープ増強を伴うアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ技術を使用する（Ｃｈａｎｇら、２００４、上記）。腫瘍性リンパ球のうち２０％超が陽性に染色された場合、各々のマーカーが陽性であるとみなした。ＤＬＢＣＬ症例がＢＣＬ−６および／またはＣＤ１０に関して陽性であるが、ＭＵＭ−１およびＣＤ１３８に関して陰性である場合に、これをＧＣ症例と分類し、そして、ＤＬＢＣＬ症例がＭＵＭ−１に関して陽性であり、かつＢＣＬ−６、ＣＤ１０およびＣＤ１３８に関して±である場合に、これをＡＢＣ症例と分類した。
【００５７】
コントロールＢ細胞と比較して、ＤＬＢＣＬ細胞においてＢＩＣ  ＲＮＡレベルは２倍〜１０倍に増大しており、１つのサンプル（Ｄ６）においては、２０倍超の増大を示した（図７Ｃ）。ｍｉＲ−１５５レベルは、より大きな程度（一般的に約１２倍〜約３０倍）まで増大したが、サンプルＩ９、Ｄ７およびＤ９に関しては５０倍〜６０倍もの範囲に及んだ（細胞あたり約８，５００コピー〜１０，０００コピー）（表ＩＩＩ）。はっきりと、ＡＢＣ表現型を有するＤＬＢＣＬ細胞において、ｍｉＲ−１５５およびＢＩＣ  ＲＮＡの両方のレベルが平均で、ＧＣ表現型を有するＤＬＢＣＬ細胞の２倍〜３倍であった（図７Ｅ）。したがって、ｍｉＲ−１５５（およびＢＩＣ  ＲＮＡ）のレベルは、臨床的に顕著なＤＬＢＣＬ亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）に対応するようであり、このことは、ｍｉＲ−１５５レベルの定量化が有用な診断指標であり得ることを示唆した。
【００５８】
【表３】
2008529531.tif 000005
１免疫組織化学（ＩＨＣ）−ＤＬＢＣＬ症例を以下のように分類した：ＧＣ症例は、ＢＣＬ−６および／またはＣＤ１０に関して陽性だが、ＭＵＭ−１およびＣＤ１３８に関して陰性であった。ＡＢＣ症例は、ＭＵＭ−１に関して陽性であり、かつＢＣＬ−６、ＣＤ１０およびＣＤ１３８に関して±であった。
２ＳＤ＝標準偏差
３ｍｉＲ−１５５は、サンプルＳ４においてバックグラウンドを超えて有意に検出されなかった。
【００５９】
比較のために、３例のＣＬＬ症例および１例のＭＺ症例もまた分析した（図７Ｃ）。全症例において、ｍｉＲ−１５５およびＢＩＣ  ＲＮＡレベルは、ＡＢＣ表現型を有するＤＬＢＣＬ細胞に関して観察されたレベルと匹敵し、おそらく、ｍｉＲ−１５５およびＢＩＣ  ＲＮＡの蓄積の増大がＢ細胞リンパ腫の一般的な特徴であることを示した。浸潤性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）およびより不活性のリンパ腫（ＣＬＬおよびＭＺ）の両方、ならびにホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫の両方におけるｍｉＲ−１５５レベルの増大（細胞あたり、約２，０００コピー〜１０，０００コピー  対  正常な循環Ｂ細胞において約１５０コピー）の観察は、ｍｉＲ−１５５が概してＢ細胞リンパ腫の病因においてより一般的な役割を果たし得ることを示唆する。
【００６０】
臨床的なサンプル中のＢＩＣ  ＲＮＡの量がｍｉＲ−１５５の間接的な尺度として働き得るということが示唆されている（Ｍｅｔｚｌｅｒら、２００４、上記）。ＢＩＣ  ＲＮＡレベルの予測価を調べるために、臨床的なサンプル中のＢＩＣ  ＲＮＡとｍｉＲ−１５５とのモル濃度比を決定した（図７Ｄ）。これらのモル濃度比は約４倍〜約２５倍と広い範囲に及ぶことが見出された。回帰プロット（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｌｏｔ）（図７Ｆ）は、ｍｉＲ−１５５レベルとＢＩＣ  ＲＮＡレベルとの間に弱い相関（Ｒ２＝０．１７）しか示さなかった（サンプルＤ６を除外した場合でも（Ｒ２＝０．５６））。これらのデータは、細胞中のＢＩＣ  ＲＮＡの量を、細胞中のｍｉＲ−１５５量の正確な尺度としてみなすべきではないことを示している。なぜなら、ｍｉＲ−１５５は、特に、ＢＩＣ  ＲＮＡ転写物の活性な遺伝子産物であるようだからである。
【００６１】
ｍｉＲＮＡは遺伝子発現の転写後の下方調節因子（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）として作用するため、ｍｉＲ−１５５のレベルの増大は、癌抑制作用またはアポトーシス促進作用（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を有するタンパク質の合成を直接的にか、または間接的に低下させ得る。最近、転写因子ＰＵ．１（Ｂ細胞の後期分化に必要とされる（Ｌｏｄｄｅｎｋｅｍｐｅｒら、２００４、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２０２：６０−６９））のｍＲＮＡが、ｍｉＲ−１５５に対する可能な標的として同定された（Ｊｏｈｎら、２００４、上記）。同様のｍｉＲ−１５５標的配列が、他の哺乳動物およびニワトリ由来のＰＵ．１  ｍＲＮＡ分子の３’ＵＴＲで同定され得る（図８）。さらに、Ｂ細胞発生の間に制御される他の転写因子（Ｃ／ＥＢＰ／β（Ｘｉｅら、２００４、Ｃｅｌｌ  １１７：６６３−７６））のｍＲＮＡが、その３’ＵＴＲにｍｉＲ−１５５のための潜在的な標的部位を有する（図８）。
【００６２】
（実施例７）
他のＭｉＲＮＡ分子の定量化
最近、ｍｉＲ−１５ａおよびｍｉＲ−１６のレベルが、ＣＬＬ細胞の臨床的な単離物で低下していることが報告され（Ｃａｌｉｎら、２００２、上記）、そして乏しい臨床成果を有する肺癌の生検において、より低いレベルのｌｅｔ−７ａ  ＲＮＡが検出されている（Ｔａｋａｍｉｚａｗａら、２００４、上記）。リンパ腫細胞が同様な変化を示すか否かを決定するために、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）ｍｉＲ−１５５アッセイを使用して、培養リンパ腫細胞株および臨床的なＢ細胞リンパ腫単離物におけるｍｉＲ−１５レベル、ｍｉＲ−１６レベル、およびｌｅｔ−７ａレベルを定量した（図９および１０；表ＩＶ）。
【００６３】
【表４】
2008529531.tif 000006
１免疫組織化学（ＩＨＣ）−ＤＬＢＣＬ症例を以下のように分類した：ＧＣ症例は、ＢＣＬ−６および／またはＣＤ１０に関して陽性だが、ＭＵＭ−１およびＣＤ１３８に関して陰性であった。ＡＢＣ症例は、ＭＵＭ−１に関して陽性であり、かつＢＣＬ−６、ＣＤ１０およびＣＤ１３８に関して±であった。
２ＳＤ＝標準偏差。
【００６４】
実施例４に記載されるように、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイを行った。大半のＤＬＢＣＬ単離物において、ｍｉＲ−１５ａレベルは、循環Ｂ細胞のｍｉＲ−１５ａレベルと比較して約３０％〜７０％低下し、ｍｉＲ−１６レベルは平均で約２５％低下し、ｌｅｔ−７ａに関しては、変化について、一定のパターンは観察されなかった。しかしながら、アッセイした細胞株のいずれにおいても、これらのいずれのｍｉＲＮＡ分子レベルも、ｍｉＲ−１５５に関して観察された（実施例５および６を参照のこと）約３０倍の増加を示さなかった。全ての培養リンパ腫細胞（特に、ホジキン細胞株）において、正常な循環Ｂ細胞よりも低いレベルのｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６およびｌｅｔ−７ａが観察された（表ＩＶ）。
【００６５】
上記の開示内容は、特定の本発明の具体的な実施形態を強調し、かつ、それへの等価な改変または代替法の全てが添付の特許請求の範囲に示される本発明の精神および範囲内であることが理解されなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、ｍｉＲ−１５５産生の概略表示を示す。ここにおいて、プレ−ｍｉＲ−１５５は、一次ＢＩＣ遺伝子転写物またはスプライシングかつポリアデニル化されたＢＩＣ  ＲＮＡ（これらはまだ核から輸送されていない）に作用する核のＤｒｏｓｈａ含有マイクロプロセッサー複合体によって産生される。このダイヤグラムはまた、プレ−ｍｉＲ−１５５にプロセシングされる前に細胞質へ輸送された、スプライシングかつポリアデニル化されたＢＩＣ  ＲＮＡが、その後にプレ−ｍｉＲ−１５５へプロセシングされ得ないことも示す。なぜなら、核のＤｒｏｓｈａ含有マイクロプロセッサー複合体は、細胞質のＢＩＣ  ＲＮＡに接近しないからである。
【図２】図２Ａは、ヒトＢＩＣ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３８）を示す。５’末端のＢＩＣ  ＲＮＡは１位（Ｔａｍ、２００１、上記）に対応し、一次転写物に存在するイントロンの位置および大きさは示される通りである（イントロン２、配列番号３９）。成熟ｍｉＲ−１５５に対応する領域は３０８位から始まり、それは点線で示される。Ａ、ＢおよびＣで示される矢印は、ＲＴ−ＰＣＲアッセイで使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを表す。１９６位〜２３７位および１０１９位〜１０７０位（ＢＩＣ  ＲＮＡに対する）ならびに３０８位〜３２９位（ｍｉＲ−１５５に対する）での影つきのヌクレオチドは、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイで検出される配列を表す。ＢＩＣ  ＲＮＡアイソフォーム（Ｉｄ．）を生じるポリアデニル化シグナルを、太字の斜体で示す。白抜きの矢印は、ｐｃＤＮＡ３．ＢＩＣにクローニングされたＢＩＣエキソン３配列の末端を示す（実施例２を参照のこと）。図２Ｂは、プレ−ｍｉＲ−１５５の配列（配列番号４０）および予測される二次構造を示す。成熟ｍｉＲ−１５５の配列（配列番号４１）は太字で示される。
【図３】図３Ａは、ＢＩＣ  ＲＮＡに特異的なプライマーを使用する、ヒトリンパ系細胞株および非リンパ系細胞株の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。図３Ｂは、ｍｉＲ−１５５に特異的なプライマーを使用する、ヒトリンパ系細胞株および非リンパ系細胞株のノーザンブロット分析の結果を示す。図３Ｃは、ｍｉＲ−１５５に特異的なプライマーを使用する、ベクターｐｃＤＮＡ３．ＢＩＣでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のノーザンブロット分析の結果を示す。（ＢＬ＝バーキットリンパ腫、ＤＬＢＣＬ＝びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、ＬＢＬ＝ＥＢＶ不死化リンパ芽球細胞株、ＭＭ＝多発性骨髄腫、ＡＬＬ＝リンパ性白血病、ＡＴＬＬ＝成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＨＴＬＶ＋）、ＨＬ＝ホジキンリンパ腫、ＧＣ＝胚中心様、ＡＢＣ＝活性化Ｂ細胞様）。
【図４】図４Ａは、スプライシングされたＢＩＣ  ＲＮＡおよびスプライシングされていないＢＩＣ  ＲＮＡに特異的なプライマーを使用する、ＯＣＩ−Ｌｙ３細胞およびＬ  １２３６細胞に由来する核および細胞質のＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。図４Ｂは、ｍｉＲ−１５５に特異的なプライマーを使用する、ＯＣＩ−Ｌｙ３細胞およびＬ  １２３６細胞に由来する核および細胞質のＲＮＡのノーザンブロット分析の結果を示す。（Ｎ＝核、Ｃ＝細胞質、＋ＲＴ＝逆転写酵素を用いて実行したＰＣＲ、−ＲＴ＝逆転写酵素を用いずに実行したＰＣＲ、０＝鋳型の非存在化で実行したＰＣＲ）。
【図５】図５Ａは、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）オリゴヌクレオチド（配列番号４２）とプローブ（配列番号１６）との間のハイブリダイゼーションを示す。これらは、それぞれその５’末端および３’末端に２’−Ｏ−メチル化ヘアピン、ならびにｍｉＲ−１５５（配列番号４１）を含む（Ａｌｌａｗｉら、２００４、ＲＮＡ  １０：１１５３−６１）。Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）オリゴヌクレオチドおよびプローブのｍｉＲ−１５５への結合時に形成される重複構造（四角で囲った）は、プローブの非相補的な５’アームを切断（垂直の矢印）することを可能にする。このことは、引き続くＦＲＥＴベースのＩｎｖａｄｅｒ（登録商標）反応（Ｅｉｓら、２００２、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：３０７；Ｅｉｓら、２００１、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６７３−７６）において検出される。図５Ｂは、ＢＩＣ  ＲＮＡ（配列番号４３）内の内部ヘアピンによる、この複合体の破壊を示す。ここで、プレ−ｍｉＲ−１５５ヘアピンは、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）オリゴヌクレオチド（配列番号４２）およびプローブ（配列番号１６）の有効な結合を妨げ、プローブの切断を大幅に低下させる。図５Ｃは、そのＢＩＣ  ＲＮＡ前駆体よりも成熟ｍｉＲ−１５５に対するｍｉＲ−１５５  Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイの特異性を示す。
【図６】図６は、二重（ｂｉｐｌｅｘ）方式のＩｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイ（Ｅｉｓら、２００２、上記；Ｅｉｓら、２００１、上記）で決定した、６個の培養リンパ腫細胞株、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ｐｃＤＮＡ３．ＢＩＣでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞、および２つの臨床ＤＬＢＣＬサンプルにおけるｍｉＲ−１５５およびＵ６  ＲＮＡのレベルを示す。このアッセイは、各々のサンプル由来の固定量（４０ｎｇ）の総細胞ＲＮＡを使用する。データは、正味のシグナル値を使用してプロットした（ｔＲＮＡシグナルを使用してバックグラウンドを差し引いた）。エラーバーは、１標準偏差を表す。
【図７】図７Ａは、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）ｍＲＮＡおよびＭＩＲ−１５５アッセイで決定した、数個の培養リンパ腫細胞株におけるｍｉＲ−１５５およびＢＩＣ  ＲＮＡのレベルを示す。各対の最初の棒は、細胞あたりのｍｉＲ−１５５コピー数を表し、各対の二番目の棒は、細胞あたりのＢＩＣ  ＲＮＡコピー数を表す。エラーバーは１標準偏差を表す。図７Ｂは、図７Ａに示される培養リンパ腫細胞株における、ＢＩＣ  ＲＮＡコピー数に対するｍｉＲ−１５５コピー数の比を示す。図７Ｃは、臨床Ｂ細胞リンパ腫単離物におけるｍｉＲ−１５５およびＢＩＣ  ＲＮＡのレベルを示す。各対の最初の棒は、細胞あたりのｍｉＲ−１５５コピー数を表し、各対の二番目の棒は、細胞あたりのＢＩＣ  ＲＮＡコピー数を表す。エラーバーは１標準偏差を表す。図７Ｄは、図７Ｃに示される臨床Ｂ細胞リンパ腫単離物における、ＢＩＣ  ＲＮＡコピー数に対するｍｉＲ−１５５コピー数の比を示す。図７Ｅは、ＧＣ表現型またはＡＢＣ表現型のいずれかを示すＤＬＢＣＬ細胞における、ｍｉＲ−１５５コピー数（最初のパネル）およびＢＩＣ  ＲＮＡコピー数（二番目のパネル）の比較を示す。ｐ値を、統計パッケージＳｔａｔｖｉｅｗ（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）を使用するＧＣ表現型（ｎ＝４）とＡＢＣ表現型（ｎ＝１９）との間のｔ検定から算出した。エラーバーは１標準偏差を表す。図７Ｆは、臨床Ｂ細胞リンパ腫単離物におけるｍｉＲ−１５５量とＢＩＣ  ＲＮＡ量との間の相関の欠如を示す。線形回帰分析をサンプルＤ６（黒塗り円）の有無によって行った。（ＤＬＢＣＬ＝びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、ＨＬ＝ホジキンリンパ腫、ＧＣ＝胚中心様、ＡＢＣ＝活性化Ｂ細胞様；ＣＬＬ＝慢性リンパ性リンパ腫；ＭＺ＝辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫）。
【図８】図８は、ヒト、マウスおよびニワトリ由来のＰＵ．１  ｍＲＮＡ（上部のパネル）およびＣ／ＥＢＰ／β  ｍＲＮＡ（下部のパネル）の３’ＵＴＲ保存配列におけるｍｉＲ−１５５結合の潜在的な標的を示す。ＰＵ．１  ｍＲＮＡおよびＣ／ＥＢＰ／β  ｍＲＮＡの両方とも発生的に制御される転写因子をコードする（Ｊｏｈｎら、２００４、ＰＬｏｓ  Ｂｉｏｌ  ２：ｅ３６３；Ｌｅｗｉｓら、２００５、Ｃｅｌｌ  １２０：１５−２０）；配列：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５（配列番号４１）、ｍｍｕ−ｍｉＲ−１５５（配列番号４４）、ｇｇａ−ｍｉＲ−１５５（配列番号４５）、ＮＭ＿００３１２０（配列番号４６）、ＮＭ−０１１３５５（配列番号４７）、ＮＭ＿２０５０２３（配列番号４８）、ＮＭ＿００５１９４（配列番号４９）、ＮＭ−００９８８３（配列番号５０）、ＮＭ＿２０５２５３（配列番号５１）。
【図９】図９は、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）ｍｉＲＮＡアッセイで決定した、培養リンパ腫細胞株におけるｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６、およびｌｅｔ−７ａのレベルを示す。（ＤＬＢＣＬ＝びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、ＨＬ＝ホジキンリンパ腫）。
【図１０】図１０は、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）ｍｉＲＮＡアッセイで決定した、正常Ｂ細胞（サンプルＳ４およびＳ５）および臨床Ｂ細胞リンパ腫単離物におけるｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６、およびｌｅｔ−７ａ  ｍｉＲＮＡのレベルを示す。エラーバーは１標準偏差を表す。
【図１】
2008529531.tif 000007
【図２】
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【図３】
2008529531.tif 000009
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
2008529531000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年10月26日(2007.10.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008529531000001.app
【国際調査報告】
2008529531.tif 000031
2008529531.tif 000032
2008529531.tif 000033