(57)【要約】  この発明は、虚血の治療を必要とする患者における虚血を治療する方法を提供する。この発明は、更に、虚血組織への血流の増大を必要とする患者における虚血組織例えば虚血心筋への血流を増大させる方法を提供する。この発明は、虚血を治療するための医薬の製造のための、ＣＤ１３３＋細胞を含む(但し、これに限定されない)細胞の利用を提供する。この発明は、更に、細胞ベースの配合物及び関連キットを提供する。
2008504290.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
臍帯血、骨髄又は末梢血から単離された富化ＣＤ１３３+細胞の、虚血心筋への血流を改善する必要のある患者の生存力のある心筋領域を有する虚血心筋への血流を改善するための医薬の製造における利用であって、該富化ＣＤ１３３+細胞が冠動脈への注入による投与に適しており、ＣＤ１３３+細胞の投与が該虚血心筋への改善された血流を生じる、当該利用。
【請求項２】
ＣＤ１３３+細胞を、臍帯血から単離する、請求項１に記載の利用。
【請求項３】
冠動脈が、慢性的に部分的に若しくは完全に閉塞した血管の分布域内の虚血であるが生存力のある心筋への副行血流を与える心外膜血管である、請求項１に記載の利用。
【請求項４】
臍帯血、骨髄又は末梢血から単離された富化ＣＤ１３３+細胞の、虚血末梢動脈血管床への血流を改善する必要のある患者の生存力のある骨格筋の領域を有する虚血末梢動脈血管床への血流を改善するための医薬の製造における利用であって、該ＣＤ１３３+細胞が、慢性的に完全に若しくは部分的に閉塞した血管の分布域内の該骨格筋への副行血流を与える大腿動脈へのカテーテルによる注入による投与に適しており、該ＣＤ１３３+細胞の投与が、該骨格筋への改善された血流を生じる、当該利用。
【請求項５】
ＣＤ１３３+細胞を、臍帯血から単離する、請求項４に記載の利用。
【請求項６】
(ｉ)臍帯血から単離した富化ＣＤ１３３+細胞；及び(ii)患者由来の血清の；虚血心筋への血流を冠動脈への注入により改善するための医薬の製造における利用であって、該ＣＤ１３３+細胞が該虚血心筋への改善された血流を生じる当該利用。
【請求項７】
冠動脈が、慢性的に部分的に若しくは完全に閉塞した血管の分布域内の虚血であるが生存力のある心筋への副行血流を与える心外膜血管である、請求項６に記載の利用。
【請求項８】
虚血心筋への血流を改善する必要のある患者の生存力のある心筋の領域を有する虚血心筋への血流を改善する方法であって、該方法は、下記
(ｉ)該患者から骨髄を単離し；
(ii)該骨髄からＣＤ１３３＋細胞を選択して、ＣＤ１３３＋細胞の富化集団を生成し；
(iii)このＣＤ１３３＋細胞の富化集団を、緩衝塩溶液を含む溶液中に６〜３６時間維持し；
(iv)このＣＤ１３３＋細胞の富化集団を、患者に、冠動脈内注射により投与する
ことを含み、それにより、該虚血心筋への血流を改善する、上記の方法。
【請求項９】
溶液が、患者由来の血清を更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
溶液が、可溶性ヒトフィブロネクチン、ヒアルロナン若しくはＩ型コラーゲン又はこれらの組合せを更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
冠動脈内注射が、慢性的に部分的に若しくは完全に閉塞した血管の分布域内の前記の虚血であるが生存力のある心筋への副行血流を与える心外膜血管への注射を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ(iv)が、臍帯血から単離した患者の間充織幹細胞を投与することを更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
間充織幹細胞の投与が、冠動脈内注射を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
間充織幹細胞及びＣＤ１３３＋細胞を、患者への投与の前に混合する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
患者に、サイトカイン、ケモカイン又は成長因子を投与することを更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
成長因子が、ｂＦＧＦ又はＶＥＧＦである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
患者に、抗凝固剤を投与することを更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
ＣＤ１３３＋細胞が、ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋ＫＤＲ−ＣＸＣＲ４−細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１９】
富化集団中の細胞の少なくとも１０％が、ＣＤ１３３＋細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項２０】
富化集団中の細胞の少なくとも５０％が、ＣＤ１３３＋細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項２１】
富化集団中の細胞の少なくとも７５％が、ＣＤ１３３＋細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項２２】
ＣＤ１３３＋細胞の富化集団を、患者への投与の前に、培養で拡大させない、請求項８に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ(ii)の後でステップ(iii)の前に、ＣＤ１３３＋細胞の富化集団を、イン・ビトロで、内皮細胞の生成を促進する条件下で拡大させる、請求項８に記載の方法。
【請求項２４】
内皮細胞の生成を促進する条件が、下記を含む細胞培養培地を含む、請求項２３に記載の方法
(ａ)ＦＢＳ；
(ｂ)ウマ血清；
(ｃ)ヒドロコルチゾン；
(ｄ)幹細胞成長因子(ＳＣＧＦ)；
(ｅ)ＶＥＧＦ；又は
(ｆ)これらの組合せ。
【請求項２５】
ＣＤ１３３＋細胞の治療上有効な量が、１×１０4〜５×１０8細胞を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項２６】
ＣＤ１３３＋細胞の治療上有効な量が、虚血心筋への増大した血流の誘導に必要な細胞の最少数である、請求項８に記載の方法。
【請求項２７】
患者における虚血の治療のための組成物であって、下記を含む当該組成物
(ｉ)少なくとも１０％の細胞がＣＤ１３３＋を発現する細胞の集団(これらのＣＤ１３３＋細胞は、臍帯血又はヒト末梢血に由来し、造血細胞及び内皮細胞系統に分化することができる)；及び
(ii)ＤＭＳＯ。
【請求項２８】
ＣＤ１３３＋細胞が、ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋ＫＤＲ−ＣＸＣＲ４−細胞である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
ＣＤ１３３＋細胞が、低温保存されて解凍された臍帯血に由来する、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
患者における虚血の治療のための組成物であって、下記を含む当該組成物
(ｉ)少なくとも１０％の細胞が、ＣＤ１３３＋を発現し、これらのＣＤ１３３＋細胞が、臍帯血、ヒト骨髄又はヒト末梢血に由来し、そして造血細胞及び内皮細胞系統に分化することのできる細胞の集団；及び
(ii)ヒト血清。
【請求項３１】
ＣＤ１３３＋細胞が、ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋ＫＤＲ−ＣＸＣＲ４−細胞である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
患者における虚血を治療するための組成物であって、下記を含む当該組成物
(ｉ)少なくとも１０％の細胞が、ＣＤ１３３＋を発現し、該ＣＤ１３３＋細胞は、臍帯血、ヒト骨髄又はヒト末梢血に由来し、造血細胞及び内皮細胞系統に分化することができる乾燥させた細胞集団；及び
(ii)少なくとも一種の炭水化物。
【請求項３３】
ＣＤ１３３＋細胞が、ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋ＫＤＲ−ＣＸＣＲ４−細胞である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
炭水化物が、トレハロースである、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３５】
炭水化物が、少なくとも２５ｎＭの濃度で存在する、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３６】
患者における虚血を治療するための組成物であって、下記を含む当該組成物
(ｉ)少なくとも１０％の細胞が、ＣＤ１３３＋を発現し、該ＣＤ１３３＋細胞が、臍帯血、ヒト骨髄又はヒト末梢血に由来し、そして造血細胞及び内皮細胞系統に分化することのできる細胞の集団；及び
(ii)シトレートホスフェートデキストロースアデニン(ＣＰＤＡ)。
【請求項３７】
ＣＤ１３３＋細胞が、ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋ＫＤＲ−ＣＸＣＲ４−細胞である、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
患者における虚血を治療するための組成物であって、下記を含む当該組成物
(ｉ)少なくとも１０％の細胞がＣＤ１３３＋を発現し、該ＣＤ１３３＋細胞が臍帯血、ヒト骨髄又はヒト末梢血に由来して、造血細胞及び内皮細胞系統に分化することのできる細胞集団；及び
(ii)少なくとも一種の、粘着性分子若しくはケモカイン又はこれらの両者のアップレギュレーションを促進する薬剤。
【請求項３９】
薬剤が、細胞外マトリクスタンパク質である、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
細胞外マトリクスタンパク質が、可溶性ヒトフィブロネクチン、ヒアルロナン又はＩ型コラーゲンである、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４１】
ＣＤ１３３＋細胞の細胞生存力が、フィブロネクチンの存在下において、非存在下よりも少なくとも１０％大きい、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４２】
ＣＤ１３３＋細胞が、ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋ＫＤＲ−ＣＸＣＲ４−細胞である、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４３】
患者における虚血を治療するための組成物であって、下記を含む当該組成物
(ｉ)少なくとも１０％の細胞がＣＤ１３３＋を発現し、該ＣＤ１３３＋細胞が低温保存されて解凍された臍帯血に由来して、造血細胞及び内皮細胞系統に分化することのできる細胞集団；及び
(ii)少なくとも一種のポリペプチド。
【請求項４４】
ＣＤ１３３＋細胞が、ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋ＫＤＲ−ＣＸＣＲ４−細胞である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
ポリペプチドが、組換えポリペプチドである、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４６】
組換えポリペプチドが、サイトカイン、ケモカイン又は成長因子である、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
下記を含むキット：
(ａ)臍帯血から単離された、単位投薬形態の細胞集団(少なくとも１０％の細胞は、ＣＤ１３３を発現する)；及び
(ｂ)冠動脈内注射に適した賦形剤。
【請求項４８】
賦形剤が、非発熱性賦形剤である、請求項４８に記載のキット。
【請求項４９】
下記を含むキット：
(ａ)臍帯血から単離された、少なくとも１０％の細胞がＣＤ１３３を発現する細胞の集団；及び
(ｂ)冠動脈内注射に適した閉じた無菌のシステムの少なくとも一構成要素。
【請求項５０】
構成要素が、針、注射器、カテーテルベースの注射器、針ベースの注入用デバイス又は無針注入用デバイスである、請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
下記：
(ａ)各々が予め測定した量の、臍帯血から単離された細胞(少なくとも１０％の細胞は、ＣＤ１３３を発現する)を含む少なくとも２つの小瓶；及び
(ｂ)冠動脈内注射に適した少なくとも一つの閉じた無菌システムの構成要素；
を含むキットであって、第一の小瓶は、予備試験及び／又は品質制御目的に用いられ、第二の小瓶中の細胞を、該細胞を必要とする患者に注射する当該キット。
【請求項５２】
下記を含むキット：
(ａ)予め測定した量の、臍帯血から単離された細胞(少なくとも１０％の細胞は、ＣＤ１３３を発現する)；及び
(ｂ)冠動脈内注射に適した少なくとも一つの閉じた無菌システムの構成要素。
【請求項５３】
下記を含むキット：
(ａ) 予め測定した量の、臍帯血から単離された細胞(少なくとも１０％の細胞は、ＣＤ１３３を発現する)；及び
(ｂ)少なくとも一種の抗凝固剤。
【請求項５４】
抗凝固剤が、ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ、トロンビン又はビタミンＫ依存性凝固因子のインヒビターである、請求項５３に記載のキット。
【請求項５５】
抗凝固剤を、エプチフィバチド、アルガトロバン、キシメラガトラン、ワルファリン及びヘパリンよりなる群から選択する、請求項５３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
アテローム性動脈硬化症の心臓血管病は、工業化された西半球において、罹患率及び死亡率の主因である。アテローム性動脈斑により動脈内腔が狭くなって、心臓への血流の閉塞が生じる病理的過程である冠状動脈疾患は、死亡の約半分の原因である。カテーテルベースの血行再建術又は外科手術ベースの治療アプローチは、大多数の症例において、虚血心筋への血流の回復に成功してきているが、これらの治療は、不完全に血行再建されたままの有意の数の患者にとって不十分である。これらの治療限界の分枝は、広範囲の虚血を有するが、生存力のある心筋が、慣用の血行再建技術にとって乏しい標的である血管により与えられた潅流障害により危険にさらされた患者において重大でありうる。別の治療(経皮経管心筋血行再建術などの機械的アプローチなどを含む)は、有望な結果を生成していない。サイトカイン産生を増大させ、それにより、血管形成を促進するためのアデノウイルスベクターを用いる遺伝子治療は、見込みを示しているが、この治療は、限界を有しており、未だこれらの疾患の最適治療であることが明らかとなっていない。それ故、治療のための血管形成は、慢性的心筋虚血の苦しみを回避する方法を発見することを試みる多くの研究者を引き付けている。
【０００２】
四肢のアテローム性動脈硬化は、４０代以上の患者における四肢の閉塞性動脈疾患の主因である。末梢血管の閉塞性疾患及びその合併症(手足の患部の潰瘍及び壊死さえも含む)も又、一般的である。経皮経管的動脈形成術及び双大腿大動脈バイパス手順は許容しうる罹患率及び死亡率リスクを有して、初期には非常に成功するものであるが、これらの介入は、長期にわたって有効であることは示されていない。
【０００３】
心筋虚血及び／又は末梢血管閉塞性疾患の治療を与える努力において、幾つかの血管形成技術が、現在、臨床試験にあり、それは、副行血管生成を誘導し又は増大させる遺伝子治療及び成長因子例えば血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)又は塩基性成長因子(ｂＦＧＦ)の利用を含む。最適な治療結果のためには、これらの治療技術は、患者の循環内に居る移動可能でホルモン応答性の血管内皮細胞集団の利用可能性に依存する。しかしながら、年齢と関係する血管内皮細胞の数及び機能の減少が成人において認められる。特に、血管の問題{中心(即ち、冠状動脈)及び末梢の両方で}を有していることが最もありそうな高齢の患者においては、ホルモン応答性の内皮細胞の数が、減少しており、機能不全の内皮細胞の数が増大している。その上、十分な患者由来の応答性細胞を可動化するサイトカインの投与は、白血球増加及び／又は前凝固過程の活性化に続いて、心臓血管の病理を悪化させうる。
【０００４】
それ故、内皮前駆細胞(ＥＰＣ)の外因性供給源を供給する別の治療法は、虚血を回復するための、閉塞され／狭くなった血管の周囲での脈管形成及び副行血管形成を増進するための細胞性治療にとって最適でありうる。患者由来の自家幹細胞源の臨床的利用は、潜在的な有害な同種異系免疫反応を回避するのに有利であるが、不都合なことは、患者を、活発な血管病のときに、幹細胞の採取にかけることの必要性を含む。
【０００５】
それ故、依然として、心筋虚血と末梢血管病の両方のための、虚血組織における脈管形成を促進することのできる治療様式を開発する必要がある。
【０００６】
発明の概要
この発明は、患者における虚血の細胞ベースの治療方法を提供する。幾つかの面において、この発明は、患者における虚血組織への血流を、例えば血管形成を促進することにより(但し、これに限定されない)増大させる治療法を提供する。一つの面において、この発明は、患者への、内皮細胞に分化しうる細胞又は患者由来の細胞の内皮細胞への分化を促進する細胞の導入を含む治療法を提供する。かかる細胞には、幹細胞及び前駆細胞が含まれる。これらの細胞は、骨髄、末梢血、臍帯細胞又はその他の起源から単離することができる。
【０００７】
この発明の一つの面は、患者における虚血組織を治療する方法であって、該患者に、治療上有効な量の富化ヒト内皮生成細胞及び富化ヒト間充織幹細胞を投与することを含む当該方法を提供する。
【０００８】
この発明の関連する面は、患者において虚血心筋に血流を増大させる方法であって、該患者に、治療上有効な量の富化ヒト内皮生成細胞及び富化ヒト間充織幹細胞を投与することを含む当該方法を提供する。
【０００９】
この発明の他の面は、患者の虚血心筋における血管の形成を誘導する方法であって、該患者に、治療上有効な量の富化ヒト内皮生成細胞及び富化ヒト間充織幹細胞を投与することを含む当該方法を提供する。
【００１０】
この発明の更に別の面は、患者の生存可能な心筋の領域を有する虚血心筋への血流を改善する方法であって、該患者に、治療上有効な量の富化ＣＤ１３３＋細胞例えば臍帯血から単離されたＣＤ１３３+血管芽細胞を投与することを含み、該ＣＤ１３３＋細胞を、慢性的完全閉塞血管分布域内の該虚血であるが生存力のある心筋への副行血流を与える心外膜の血管である冠状動脈への注入により投与し、該ＣＤ１３３+細胞の投与が、該虚血心筋への改善された血流を生じる当該方法を提供する。この方法の他の具体例は、更に、該患者に、ヒト間充織幹細胞を投与することを含む。他の具体例において、該ＣＤ１３３+細胞は、患者の骨髄から単離される。幾つかの具体例において、該ＣＤ１３３+細胞は、ＣＤ１３３+血管芽細胞である。幾つかの具体例において、これらの細胞は、ＣＤ１３３+ＣＤ３４-細胞であり、他の具体例では、それらは、ＣＤ１３３+ＣＤ３４+細胞である。
【００１１】
この発明の他の面は、患者の生存力のある心筋領域を有する虚血心筋への血流を改善する方法であって、(ｉ)患者から骨髄を単離し；(ii)ＣＤ１３３+細胞を骨髄から選択して該細胞の富化集団を生成し；(iii)ＣＤ１３３+細胞の富化集団を、緩衝塩溶液を含む溶液中に６〜３６時間維持し；
(iv)該ＣＤ１３３+細胞の富化集団を、該患者に、冠状動脈注入により投与し、それにより、該虚血心筋への血流を改善することを含む、当該方法を提供する。幾つかの具体例において、この溶液は、更に、患者由来の血清、又は可溶性ヒトフィブロネクチン、ヒアルロナン若しくはＩ型コラーゲン、又はこれらの組合せを含む。他の具体例において、該方法は、更に、間充織幹細胞例えば臍帯血から単離されたものを患者に冠状動脈注入により投与することを含む。
【００１２】
ある面において、この発明は、患者(特に、虚血組織を有する患者)に投与することのできる医薬配合物を提供する。一の配合物は、内皮生成細胞、間充織幹細胞、又は両者を含むことができる。適宜、これらの内皮生成細胞は、臍帯血から富化される。適宜、間充織幹細胞は、骨髄から富化される。ある好適具体例において、該配合物は、カテーテルによる血管への投与のためにデザインされる。
【００１３】
この発明の他の面は、ＣＤ１３３+細胞を含むキット例えば患者における虚血の治療のためのキットを提供する。
【００１４】
図面の簡単な説明
図１は、短期の内皮駆動性培養条件下で臍帯血(ＵＣＢ)から得られた内皮前駆細胞ＥＰＣの蛍光細胞化学染色を示している。パネルＡは、アセチル化低密度リポタンパク質(ａｃＬＤＬ)の取込みを示している。パネルＢは、Ulex europaeusアグルチニン(ＵＥＡ−１)の付着を示している。パネルＣは、ａｃＬＤＬとＵＥＡ−１の複合二重染色を示している。イメージは、倍率４０倍の共焦点顕微鏡を用いて記録された。
図２は、ＵＣＢ由来のＥＰＣのフォン  ウィルブラント因子(ｖＷＦ)についての染色を示しており、且つＥＰＣに特徴的な紡錘様形態をも示している。これらの細胞は、倍率４０倍の位相差顕微鏡を用いて研究された。核周囲の褐色の染色は、核周囲のｖＷＦ粒子と反応した二次抗体に結合されたイムノペルオキシダーゼのためである。
図３は、ＵＣＢから選択したＣＤ１３３+細胞の表面表現型のフローサイトメトリー分析を示している。ＦＳＣ利得が、非常に小さい細胞の一層優れた分離のために増大した。ＣＤ１３３+／ＣＤ３４-細胞(１００)及びＣＤ１３３+／ＣＤ３４+細胞(２００)の明確な集団が同定された。何らのゲーティングも加えなかった。
図４は、内皮駆動性培養条件下での１９日及び１２日の培養後のＵＣＢ由来のＥＰＣ細胞の内皮細胞特性とヒト骨髄(ＢＭ)との比較のフローサイトメトリー分析を示している。粘着性細胞をトリプシン処理して、ＣＤ３４及び内皮特異的マーカーのＶＥ−カドヘリン、ＣＤ１４６及びＣＤ３１につき染色した。染色されない対照を黒色で示してある。染色された細胞は、灰色で示してある。
図５は、ＵＣＢ及びＢＭ由来のＥＰＣの、マウスの後肢虚血モデルへのイン・ビボ移植により達成された新血管新生の結果を描いてある。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、大腿大動脈の結紮及び摘出を受け、その後、塩溶液、培地又は内皮駆動性培養条件下で７日間培養した細胞を注入された。レーザードップラー測定を、手術後に行ない、その後、毎週、同じ条件下で行なった。描かれたのは、虚血及び非虚血脚の間での潅流速度の比較である。
図６は、外科手術の２８日後の虚血後肢の組織学的評価を示している。ＵＣＢ由来のＥＰＣを注入された虚血脚マウスの後肢は、陽性ＣＤ３１染色を示した(白色矢印で示してある)。培地のみを注射された対照用マウスは、ＣＤ３１につき陰性であった。
図７は、ＵＣＢからのＣＤ１３３+細胞の単離・精製の結果を示している。単核細胞(ＭＮＣ)を、磁性ビーズに結合させた抗ＣＤ１３３抗体で標識した後、マグネチックカラム(Automacs, Miltenyi)を通す自動化ソーティングを行なった。一のマグネチックカラムを通過した後のこれらの標識されたＣＤ１３３+細胞の収率は、日常的に、ＭＮＣ細胞の約０．４％であり、純度は、７５〜８５％(８３．０２％と示してある)に及んだ。ＣＤ１３３−ＰＥで染色した後、これらの細胞を、ＰＥ蛍光につきＦＡＣＳソートし、純度を９８．８７％に高め、最終的収率は、最初のＭＮＣ投入量の０．１％であった。何らのゲーティングも加えなかった。
図８は、精製したＣＤ１３３+細胞におけるＣＤ４５、ＣＤ３４、ＢＣＬ−２及びｐ２１の、造血駆動条件又は内皮駆動条件下での、２４時間の培養の後の、差次的発現を示している。パーセンテージは、分析した全細胞に対するものである。
図９は、精製した培養ＣＤ１３３+細胞における細胞周期分析を示している。これらのＣＤ１３３+細胞を精製して、細胞周期のステージにつき、(Ａ)直ちに；(Ｂ)２４時間造血駆動若しくは内皮駆動条件下で培養してから；又は（Ｃ）７２時間造血駆動条件下で培養してから分析した。細胞を、固定し、透過性にし、ＤＮＡをヘキストで染色し、そして細胞周期ステージにつき分析した。
図１０は、マウス後脚虚血モデルにおける精製ＣＤ１３３+細胞由来のＥＰＣによる新血管新生を描いている。血流を経時的にレーザードップラーにより測定して、虚血脚と非虚血脚の間の比として表した。
図１１は、ヒト間充織幹細胞(ｈＭＳＣ)数の、ヒト臍静脈内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)により条件付けされた培地中でのインキュベーション後の、投与量応答的有糸分裂性拡大(Ｂ)、及びｈＭＳＣにより条件付けされた培地中でのインキュベーション後のＨＵＶＥＣ細胞数の投与量応答的有糸分裂性拡大(Ｃ)を示している。(Ａ)及び(Ｄ)は、対照用の成長培地である。
図１２は、ｈＭＳＣ(上段)及びＨＵＶＥＣ(下段)の、ｈＭＳＣ条件付けされた培地に向かう移動(左)及びＨＵＶＥＣ(上段)及びｈＭＳＣ(下段)のＨＵＶＥＣ条件付けされた培地に向かう移動(右)を示している。
図１３は、ｈＭＳＣが、血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)遺伝子を発現することを示している。ＶＥＧＦファミリー成長因子ｍＲＮＡの発現を、ＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した。特異的プライマーをｃＤＮＡに加えて、ＶＥＧＦファミリー遺伝子を３５サイクルにわたって増幅した。変化する量のＰＣＲ生成物を、２％アガロースゲル上で泳動して、エチジウムブロミド染色を用いて可視化した。ＰＣＲ生成物のサイズは、次の通りである：ＶＥＧＦ−Ａは、５７７ｂｐ、５２６ｂｐ及び４５４ｂｐであり；ＶＥＧＦ−Ｂは、３２６ｂｐ及び２２５ｂｐであり；ＶＥＧＦ−Ｃは、１８３ｂｐであり；ＶＥＧＦ−Ｄは、２２５ｂｐであり；そしてＰＩＧＦは、２４８ｂｐ及び１８４ｂｐである。
図１４は、ＶＥＧＦレセプターｍＲＮＡのｈＭＳＣによる発現を示している。全ＲＮＡを、特異的プライマーに加えて、ＶＥＧＦレセプター遺伝子を、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。変化する量のＰＣＲ生成物を、２％アガロースゲル上で泳動して、エチジウムブロミド染色を用いて可視化した。示したのは、高分子量ＤＮＡマーカー、ＶＥＧＦＲ１(１，０９８ｂｐ)；ＶＥＧＦＲ２(３２６ｂｐ)；ＶＥＧＦＲ３(３８０ｂｐ)；ニューロピリン−１(３７５ｂｐ)及びニューロピリン−２(３０４ｂｐ及び２８９ｂｐ)である。
図１５は、単独培養又はｈＭＳＣ及びＨＵＶＥＣとの共培養における、活性ＴＧＦ−ｂ１のＥＬＩＳＡ分析を示している。単独培養したｈＭＳＣ及びＨＵＶＥＣは、潜在的なＴＧＦ−ｂ１タンパク質(Ａ)を分泌する。ｈＭＳＣ及びＨＵＶＥＣの共培養は、活性なＴＧＦ−ｂ１タンパク質(Ｂ)を生成する。
図１６は、ｈＭＳＣが、内皮管様構造へ選択的に移動することを示している。単独培養中のＨＵＶＥＣ(Ａ)を、ビトロゲンゲル(Ｂ)の添加により、管様構造の形成を誘導した。ＤｉＩ染色したｈＭＳＣを、ゲル培養物(Ｃ)の上部に加えた。２４時間後に、ｈＭＳＣは、内皮細胞管様構造（Ｄ）に沿って位置している。
図１７は、ＵＣＢに由来する精製ＣＤ１３３+細胞及びＣＤ１３３+細胞＋ｈＭＳＣの組合せによる、マウス後脚虚血モデルにおける新血管新生を描いている。血流を経時的にレーザードップラーにより測定して、虚血脚と非虚血脚の間の比として表した。少数のマウスにおける結果は、外科手術の７日後に、ＣＤ１３３+細胞及びｈＭＳＣの両方を受けたマウスにおける、ＣＤ１３３+細胞だけを注入されたマウスと比較して増大した血流を示している(第１４日目)。
図１８は、ベースラインでの及びＭＮＣの注射後の、ブタの血管造影図の静止フレームイメージを示している。ＬＡＤ：左前室間動脈、ＬＣｘ：左回旋動脈、Ｄ１：第一斜分枝。
図１９は、ＣＤ１３３細胞表面マーカーの発現により精製された臍帯血細胞の細胞表面マーカーの発現(ＦＡＣＳソーティングにより測定)を記載している。
図２０は、臍帯血由来のＣＤ１３３細胞のＦＡＣＳソーティングを記載している。
【００１５】
発明の簡単な説明
Ｉ．概観
この発明は、広く、虚血組織を治療するための細胞ベースの治療に関係している。虚血組織は、その組織への血流を増大させることにより治療することができる。かかる血流の増大は、例えば、その組織に供給する血管の数を増大させることにより媒介することができる。血管の生成は、２つの主要な過程である血管形成及び脈管形成によって達成することができる。血管形成は、既存の自然の血管に由来する完全に分化した内皮細胞からの血管組織の生成を指す。血管形成は、血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)、塩基性繊維芽細胞成長因子(ｂＦＧＦ)及びその他のメディエーターを含むサイトカインの複雑なシグナリング機構によって誘導される。この過程は、おそらく虚血シグナルによって、「活性化された」内皮細胞の分断された基底膜を通過して間質へ侵入する侵入作用によって媒介される。「治療的血管形成」は、遺伝子又は組換え治療に由来するサイトカインを利用して、虚血血管病を有する患者における副行血管の生成を誘導し又は増大させることを指す。
【００１６】
対照的に、脈管形成は、最近まで胎児においてのみ起きると考えられていたもので、内皮前駆細胞(ＥＰＣ)又は血管芽細胞からの血管組織のイン・シトゥーでの形成である。共通の先祖の血管芽細胞を起源とする血島又は幹細胞のクラスターの形成が、この過程を開始する。これらの島又はクラスターにおいて、末梢に位置したＥＰＣは、内皮に成熟し、中心に位置した造血幹細胞(ＨＳＣ)は、血液細胞を生じさせる。ここで用いる場合、「治療的脈管形成」は、血管組織の、外因性内皮産生細胞の患者細胞中への導入による新生を指す。
【００１７】
この発明は、一般に、虚血組織への血流を増大させる方法、虚血組織への血流を増大させるための医薬の製造において細胞を利用する方法を提供する。この発明は、患者の虚血組織を治療する方法であって、該患者に、治療上有効な量の富化ヒト内皮生成細胞及び適宜富化ヒト間充織幹細胞を投与することを含む当該方法を提供する。ここで用いる場合、ヒト内皮生成細胞は、ヒト内皮細胞に分化することのできる細胞を指す。
【００１８】
この発明の関連する面は、患者の虚血心筋への血流を増大させる方法であって、該患者に、治療上有効な量の富化ヒト内皮生成細胞及び富化ヒト間充織幹細胞を投与することを含む当該方法、又はそれらの、かかる治療のための医薬の製造における利用を提供する。
【００１９】
この発明の他の面は、患者の虚血心筋に血管の形成を誘導する方法であって、該患者に、治療上有効な量の富化ヒト内皮生成細胞及び適宜富化ヒト間充織幹細胞を投与することを含む当該方法、又はそれらの、かかる治療のための医薬の製造における利用を提供する。
【００２０】
この発明の更に別の面は、患者の生存力のある心筋の領域を有する虚血心筋への血流を改善する方法であって、該患者に、治療上有効な量の、臍帯血から単離した富化ＣＤ１３３+細胞を投与することを含み、該ＣＤ１３３+細胞を、慢性的に完全に閉塞した血管の分布域内の、該虚血であるが生存力のある心筋への副行血流を与える心外膜の血管である冠状動脈への注入により投与し、これらのＣＤ１３３+細胞の投与が該虚血心筋への改善された血流を生じる当該方法を提供する。この方法の一具体例は、更に、該患者に、ヒト間充織幹細胞を投与することを含む。
【００２１】
これらの方法又は利用の一の好適具体例において、患者は、ヒトである。他の具体例において、患者は、成人、新生児、胚又は胎児である。患者の治療のための又は医薬の製造のためのこれらの方法又は利用の一の具体例において、該治療において用いる細胞は、患者自身の臍帯血から単離される。かかる臍帯血は、患者が産まれた時点において、必要なときに用いるために低温保存することができる。ここに記載の方法又は利用の一具体例において、虚血組織例えば虚血心筋(但し、これに限定しない)の治療は、虚血組織への血液、虚血組織への血流、虚血組織への酸素供給、又はこれらの組合せを供給する血管の形成を含む。
【００２２】
ここに記載の方法及び利用の一具体例において、ヒト内皮生成細胞は、ヒト内皮前駆細胞である。ここに記載の方法及び利用の一具体例において、内皮生成細胞は、骨髄、抹消血、又は一層好ましくは臍帯血から単離される。一具体例において、これらの内皮生成細胞例えば内皮前駆細胞又はＣＤ１３３+血管芽細胞は、患者への投与の前に、内皮細胞促進培養条件下で、培養により拡大される。他の具体例においては、これらの内皮生成細胞は、患者への投与前に、少なくとも２倍に富化される。富化は、一般に、少なくとも幾つかの非内皮生成細胞を、内皮生成細胞と非内皮生成細胞の両方を含む組成物から除去することにより、内皮生成細胞を、それらの数を非内皮生成細胞に対して増大させる培養条件下で調製することにより、又はこれらの組合せにより達成することができる。ここに記載のこれらの方法又は利用の一具体例において、これらの内皮生成細胞は、血管芽細胞、造血幹細胞、又は一層好ましくは内皮前駆細胞である。ここに記載の方法又は利用の特別の具体例において、これらの細胞の組合せを、患者に投与する。
【００２３】
ここに記載の方法又は利用のある具体例において、内皮生成細胞たとえば内皮前駆細胞又は血管芽細胞は、ＣＤ３１+、ＣＤ１４６+、ＣＤ１３３+、ＣＤ３４+、ＶＥ−カドヘリン+又はこれらの組合せである。特別の具体例において、これらの内皮生成細胞は、ＣＤ１３３+／ＣＤ３４+細胞又はＣＤ１３３+／ＣＤ３４+細胞である。ここに記載の方法又は利用の他の特別の具体例において、これらの内皮生成細胞例えば内皮前駆細胞又は血管芽細胞は、患者と、自家の、同種異系の、又はＨＬＡ適合性のものである。
【００２４】
ここに記載の方法又は利用の特別の具体例において、これらのヒト間充織幹細胞は、骨髄又は臍帯血から単離され、それらを患者に投与する前に培養により拡大することができる。ある特別の具体例においては、これらの間充織幹細胞を培養により拡大して、モノクローナル抗体ＳＨ２、ＳＨ３又はＳＨ４により同定される表面抗原を含む細胞につき富化させてから、それらのヒト間充織幹細胞を患者に投与する。
【００２５】
ここに記載の方法又は利用の特別の具体例において、ヒト間充織幹細胞は、患者と、自家の、同種異系の、又はＨＬＡ適合性のものである。虚血組織に苦しんでいる個体に投与される内皮生成細胞及び／又は間充織幹細胞の数は、虚血の重さ、虚血である組織の大きさ、及び送達方法によって変化する。ここに記載の方法又は利用の一具体例において、治療上有効な量の富化ヒト内皮生成細胞及び富化ヒト間充織幹細胞は、安全で且つ有効な量である。他の特別の具体例においては、医薬の製造に治療的に用いられた各細胞の量は、少なくとも１×１０4ヒト内皮生成細胞である。他の具体例において、ここに記載の方法において患者に投与される富化ヒト内皮生成細胞及び富化ヒト間充織幹細胞の量は、約１０4〜５×１０8細胞である。患者に投与され又は医薬の製造に用いられる細胞の量は、投与様式及び投与部位に依存する。例えば、冠状動脈内(又は腎臓内又は頚動脈内)注入により治療上有効な細胞投与量は、大腿部内注射のそれより少なくてよい。富化ヒト内皮生成細胞及び富化ヒト間充織幹細胞の両方を患者に投与する場合には、これら２種類の細胞の比は、例えば、約２０：１〜１：２０、約１０：１〜１：１０、約５：１〜１：５、及び約２：１〜１：２であってよい。
【００２６】
ここに記載の方法又は利用の具体例において、患者への投与は、細胞の患者への注入を含む。この注入は、細胞の、患者への、全身的注入を含んでよく、又はそれは、細胞の虚血組織への移動を容易にするように、虚血組織の近くへの細胞の注入を含むことができる。この注入は又、虚血組織への血液を供給する血管において、又は血液を虚血組織から取り出す血管において行なうこともできる。ここに記載の方法又は利用の特別の具体例において、細胞の患者への注入は、骨髄への注入、動脈内注入、筋肉内注入、心臓内注入、及び冠状動脈内注入、静脈内注入又は皮内注入を含む。ここに記載の方法又は利用の一具体例において、ヒト内皮前駆細胞及びヒト間充織幹細胞を、患者に、少なくとも一の冠状動脈内への注入によって投与する。ここに記載の方法又は利用の特別の具体例において、この冠状動脈は、慢性的に完全に閉塞した血管の分布域内の虚血心筋への副行血流を与える心外膜血管である。
【００２７】
ここに記載の方法又は利用の一つの具体例において、虚血組織に苦しんでいる患者は、慢性的な心筋虚血の治療を必要としている。他の具体例において、この患者は、四肢の虚血、虚血心筋症、心筋虚血、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血及び腸管虚血よりなる群から選択する虚血を治療する必要がある。ここに記載の方法は、如何なる特定の組織における虚血にも限られず、任意の種類の虚血に適用されうる。例えば、ここに記載の方法又は利用の一具体例において、患者は、多数の組織における虚血に苦しんでいる。かかる具体例において、細胞の患者への全身注入を行なうことができ、又は別法として若しくは合せて、一種以上の局所的注入を虚血組織の近くで行なうことができる。ここに記載の方法又は利用の一具体例において、虚血心筋は、生存力のある心筋の領域を含む。
【００２８】
ここに記載の方法又は利用の幾つかの具体例において、これらの細胞の患者への投与は、動脈内カテーテル例えばバルーンカテーテル(限定はされない)又はステントを利用して行われる。細胞を患者に送達するために現在利用可能な任意の方法を利用して、ここに記載の方法において、細胞を患者に投与することができる。
【００２９】
ここに記載の方法又は利用の幾つかの具体例において、少なくとも一の組換えポリペプチド又は少なくとも一の薬物を、更に、患者に投与することができる。一具体例において、この組換えポリペプチドは、成長因子、ケモカイン、サイトカイン、又は成長因子、ケモカイン若しくはサイトカインのレセプターを含む。好適具体例において、この組換えポリペプチドは、血管形成、脈管形成、又は両者を促進する。幾つかの具体例において、この組換えポリペプチドは、内皮生成細胞又は間充織幹細胞の増殖、分化又は虚血組織に局在化し若しくは虚血組織由来の細胞と相互作用する能力を促進する。特別の具体例において、この組換えポリペプチドは、ＶＥＧＦ、ＢＦＧＦ、ＳＤＦ、ＣＸＣＲ−４又はＣＸＣＲ−５を含む。
【００３０】
ここに記載の方法又は利用の幾つかの具体例において、内皮生成細胞例えば内皮前駆細胞、又は間充織幹細胞、又は両者は、遺伝的に改変される。特別の具体例において、これらの細胞は、遺伝的に改変されて、組換えポリペプチドを発現する。一具体例において、この組換えポリペプチドは、成長因子、ケモカイン若しくはサイトカイン、又は成長因子、ケモカイン若しくはサイトカインのレセプターである。他の特別の具体例において、この組換えポリペプチドは、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＤＦ、ＣＸＣＲ−４又はＣＸＣＲ−５である。他の具体例において、これらの遺伝的に改変された細胞により発現された組換えポリペプチドは、内皮生成細胞又は間充織幹細胞の、増殖、分化又は虚血組織に局在化する能力を促進する。他の具体例において、この遺伝的改変は、改変された細胞の、虚血組織の部位の細胞と相互作用する能力を増進する。関連する具体例において、内皮生成細胞例えば内皮前駆細胞、又は間充織幹細胞、又は両者は、非遺伝的に、例えばポリペプチド、抗体又は抗体結合性タンパク質によって改変されてから、患者に投与される。幾つかの具体例において、この治療は、改変された細胞の虚血組織への局在性を増大させることを意図している。
【００３１】
ここに記載の方法又は利用の幾つかの具体例において、内皮生成細胞は、内皮前駆細胞である。一具体例において、内皮前駆細胞は、ＣＤ１３３+細胞、ＣＤ３４+細胞、又はＣＤ１３３+／ＣＤ３４+細胞である。ここに記載の方法又は利用の具体例において、内皮生成細胞例えば内皮前駆細胞は、患者への投与前に、培養で拡大される。特別の具体例において、内皮生成細胞は、内皮細胞促進培養条件下で、培養により拡大してから、患者に投与される。
【００３２】
ここに記載の方法又は利用の好適具体例において、内皮生成細胞例えば内皮前駆細胞又は血管芽細胞及び間充織幹細胞は、富化させてから投与し又は医薬の製造中に富化される。富化とは、当該細胞の濃度を他の細胞に対して増大させることを意味する。富化は、他の種類の細胞を、これらの細胞を含む組成物から除去することにより、当該細胞をそれらの増殖を他の細胞より改善する条件下で培養することにより、又は一の細胞型を他の型より富化させるための当分野で公知の任意の方法によって達成することができる。幾つかの具体例において、ここに記載の方法で用いられる細胞は、少なくとも約２倍、約５倍、約２０倍、約４０倍、約１００倍、約５００倍、約１０００倍、約５０００倍、約１００００倍、又は約５００００倍に富化される。
【００３３】
この発明の一つの面は、患者の虚血の治療のための組成物であって、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の細胞がＣＤ１３３＋を発現する細胞の集団を含み、ＣＤ１３３＋細胞が、臍帯血、骨髄、又は末梢血に由来し、ＣＤ１３３＋細胞が、造血細胞及び内皮細胞系統に分化することができ、適宜、少なくとも一種類の追加の成分を含む、当該組成物を提供する。一具体例において、これらの細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％は、ＣＤ１３３＋の血管芽細胞である。
【００３４】
好適具体例において、これらのＣＤ１３３＋細胞は、低温保存されて解凍された臍帯血に由来する。幾つかの具体例において、追加の成分は、ヒト血清、好ましくはこれらの細胞の投与を意図する患者からのヒト血清である。他の具体例において、この追加の成分は、ヒト血清の成分例えばヒト血清アルブミンを含むことができる。他の具体例において、第二の成分は、防腐剤例えばシトレートホスフェートデキストロースアデニン(ＣＰＤＡ)又はヘパリンを含む。他の具体例において、第二の成分は、可溶性ヒトフィブロネクチンである。特別の具体例において、この可溶性ヒトフィブロネクチンは、少なくとも１ｎｇ／ｍＬ以上の濃度、又は一層好ましくは１０ｎｇ／ｍｌより高濃度で見出される。他の具体例において、ＣＤ１３３＋細胞の細胞生存力は、このフィブロネクチンの存在下で、非存在下よりも少なくとも１０％大きい。
【００３５】
ここで与えた組成物の幾つかの具体例において、これらの組成物は、凍結又は低温保存されて与えられる。他の具体例において、この組成物は、記載された細胞の集団を含む。この発明の一つの特別の面は、患者の虚血を治療するための組成物であって、(ｉ)少なくとも５０％の細胞がＣＤ１３３＋を発現し、ＣＤ１３３＋細胞は低温保存されて解凍されたヒト臍帯血に由来し、ＣＤ１３３＋細胞は、造血細胞及び内皮細胞系統に分化することができる乾燥された細胞集団；及び(ii)少なくとも一種の炭水化物例えばトレハロースを含む当該組成物を提供する。このテトラハロースは、少なくとも２５ｎＭの濃度で存在しうる。乾燥した細胞集団を生成する方法は、例えば、米国特許第６，５２８，３０９号に記載されている。
【００３６】
ここに記載の方法又は利用の幾つかの具体例において、患者に投与されるべき細胞は、緩衝液例えば緩衝塩溶液中にインキュベートされる。一の好適具体例において、この緩衝液は、この治療のレシピエントである同じ患者から単離されたヒト血清を含む。ヒト血清は、標準的手順を用いて単離することができる。ヒト血清を含む溶液は又、低温保存された細胞試料を解凍するために利用することもできる。幾つかの具体例において、ヒト血清を含む溶液は、１〜２０％(又は、好ましくは５〜１５％)のヒト血清を含む。
【００３７】
これらの具体例の幾つかの面は、患者における新血管新生を誘導する方法を提供する。哺乳動物が新血管新生が必要となる多くの状況がある。例えば、この哺乳動物は、治癒を求める傷を有していてよい。この傷は、急性の傷例えば火傷により及び硬く且つ／又は鋭いものに接触して生じたものであってよい。例えば、外科手術例えば心臓血管手術、心臓血管形成術、頚動脈形成術、及び冠状動脈形成術から回復中の患者は、すべて、新血管新生を必要とする。慢性の傷の幾つかの例には、潰瘍例えば血管潰瘍及び糖尿病性潰瘍が含まれる。本発明に記載された細胞から新血管新生を誘導することは、心臓又は末梢(例えば、四肢)の血管新生を増大させるのに、特に有効である。それ故、この方法は、心臓及び末梢の虚血の治療において、特に有効である。他の状況に苦しんでいる患者も又、新血管新生を必要とする。かかる状況には、鎌状細胞貧血及びサラセミアが含まれる。
【００３８】
本発明の細胞は、新血管新生を必要としている部位へ動員することができる。例えば、幹細胞を、サイトカイン例えばＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ(ｃ−ｋｉｔリガンド)及びｂＦＧＦ、ケモカイン例えばＳＤＦ−１、又はインターロイキン例えばインターロイキン１及び８によって、循環末梢血中に可動化(即ち動員)することができる。幹細胞は又、哺乳動物が傷害を受けているか又は受けさせれば、その哺乳動物の末梢循環血中に動員することができる。
【００３９】
この発明の他の面は、患者における虚血であるが生存力のある組織の領域を有する末梢動脈床への血流を改善する方法であって、該患者に、治療上有効な量の富化ＣＤ１３３+細胞例えば臍帯血、骨髄又は末梢血から単離された血管芽細胞又はＥＰＣを投与し、富化ＣＤ１３３+細胞をカテーテル注入法により、該組織に副行流を供給少なくとも一つの動脈に投与し、そしてＣＤ１３３+細胞の投与が該虚血組織への改善された血流を生じることを含む当該方法を提供する。一具体例において、このＣＤ１３３＋は、血管芽細胞例えばＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋又はＣＤ１３３＋／ＣＤ３４−血管芽細胞である。一具体例において、細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％は、ＣＤ１３３＋血管芽細胞である。特定の具体例において、この患者は、心筋虚血、心筋梗塞、狭心症、任意の心臓外科的介入、腎臓虚血、四肢の循環不全、虚血再灌流障害、卒中、外傷及び末梢血管病(ＰＶＤ)よりなる群から選択する少なくとも一の虚血状況に苦しんでいる。一つの好適具体例において、虚血状況は、腎臓虚血であり、動脈は、腎動脈である。
【００４０】
この発明の他の面は又、患者の生存力のある心筋領域を有する虚血心筋への血流を改善する方法であって、該患者に、治療上有効な量の、臍帯血、骨髄又は末梢血から単離した富化ＣＤ１３３+細胞を投与することを含み、該富化ＣＤ１３３+細胞を冠状動脈内への注入により投与し、ＣＤ１３３+細胞の投与が、該虚血心筋への改善された血流を生じる当該方法を提供する。一具体例において、これらの細胞の、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％は、ＣＤ１３３＋血管芽細胞である。特定の具体例において、これらのＣＤ１３３＋細胞は、臍帯血から単離される。他の特定の具体例において、冠状動脈は、慢性的に部分的又は完全に閉塞した血管の分布域内の、該虚血であるが生存力のある心筋への副行流を与える心外膜の血管である。
【００４１】
この発明の他の面は又、患者における生存力のある骨格筋の領域を有する虚血末梢動脈床への血流を改善する方法であって、該患者に、治療上有効な量の、臍帯血、骨髄又は末梢血から単離した富化ＣＤ１３３+細胞を投与することを含み、該富化ＣＤ１３３+細胞を、カテーテル注入法により、慢性的に全く若しくは部分的に閉塞した血管の分布域内の該骨格筋への副行流を与える大腿動脈に投与し、そして該ＣＤ１３３+細胞の投与が、該骨格筋への改善された血流を生じる当該方法をも提供する。特定の具体例において、これらのＣＤ１３３+細胞は、臍帯血から単離される。一具体例において、これらの細胞の、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％は、ＣＤ１３３＋血管芽細胞である。
【００４２】
この発明の更なる面は、患者の生存力のある心筋の領域を有する虚血心筋への血流を改善する方法であって、該患者に、治療上有効な量の組成物を投与することを含み、該組成物が、(ｉ)臍帯血から単離された富化ＣＤ１３３+細胞；及び(ii)患者由来の血清を含み；該富化ＣＤ１３３+細胞を、冠状動脈内への注入により投与し、そして該ＣＤ１３３+細胞の投与が該虚血心筋への改善された血流を生じる、当該方法を提供する。特定の具体例において、この冠状動脈は、慢性的に全く又は部分的に閉塞した血管の分布域内の該虚血であるが生存力のある心筋への副行流を与える心外膜の血管である。一具体例において、これらの血管の、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％は、ＣＤ１３３＋血管芽細胞である。
【００４３】
患者の生存力のある心筋領域を有する虚血心筋への血流を改善する方法であって、(ｉ)患者から骨髄を単離し；(ii)該骨髄からＣＤ１３３＋細胞を選択して、ＣＤ１３３＋細胞の富化集団を生成し；(iii)該ＣＤ１３３＋細胞の富化集団を、緩衝塩溶液中に６〜３６時間維持し；(iv)該ＣＤ１３３＋細胞の富化集団を、患者に、冠状動脈内注射により投与し、それにより、該虚血心筋への血流を改善することを含む。一具体例において、これらのＣＤ１３３＋血管芽細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％は、ＣＤ１３３＋血管芽細胞である。特定の具体例において、この溶液は、更に、患者由来の血清例えば末梢索血又は骨髄血に由来する血清を含む。他の具体例において、この溶液は、更に、可溶性ヒトフィブロネクチン、ヒアルロナン又はＩ型コラーゲン、又はこれらの組合せを含む。他の特定の具体例において、この冠状動脈内注射は、慢性的に全く又は部分的に閉塞した血管の分布域内の、該虚血であるが生存力のある心筋への副行流を与える心外膜血管への注射を含む。
【００４４】
患者の生存力のある心筋領域を有する虚血心筋への血流を改善する方法の他の具体例において、ステップ(iv)は、更に、患者に、その患者の骨髄から、一層好ましくは臍帯血から単離した間充織幹細胞(ＭＳＣ)を投与することを含む。幾つかの具体例において、これらのＭＳＣは、冠状動脈注射により投与される。これらのＭＳＣは、ＣＤ１３３＋細胞と混合してから患者に投与することができ、又はそれらを別々に注射することもできる。同様に、医薬を製造する場合には、これら２種類を、単一の医薬に混合することができ又は該医薬は、これらの細胞型を異なる小瓶若しくは錠剤などに別々に含むこともでき、それを別々に投与することも混合してから投与することもできる。
【００４５】
患者の生存力のある心筋領域を有する虚血心筋への血流を改善する方法の他の具体例において、少なくとも一種のサイトカイン、ケモカイン又は成長因子を患者に投与することができる。典型的な成長因子には、ｂＦＧＦ又はＶＥＧＦが含まれる。好適具体例において、該サイトカイン、ケモカイン又は成長因子は、血管形成又は心臓血管形成を促進する。他の具体例は、更に、患者に、抗凝固剤を投与することを含む。
【００４６】
患者の生存力のある心筋領域を有する虚血心筋への血流を改善するための、ここに記載の方法又は利用の他の具体例において、ＣＤ１３３＋細胞は、ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋ＫＤＲ−ＣＸＣＲ４−、ＣＤ１３３＋ＣＤ３４−ＫＤＲ−ＣＸＣＲ４−又はＣＤ１３３＋ＣＤ３４−細胞である。幾つかの具体例において、富化集団中の細胞の、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％は、ＣＤ１３３＋細胞である。特定の具体例において、このＣＤ１３３＋の富化集団は又、次のパーセンテージの特異的マーカーを有する細胞をも含む：ＣＤ１３３＋(６０％−９９％)、ＣＤ３４＋(７５％−９９％)、ＫＤＲ(ＥＧＦＲ２)(０−１０％)、ＣＤ１０５(１５％−３０％)及びＣＸＣＲ４(２％−１５％)。
【００４７】
前述の方法の一具体例において、ＣＤ１３３＋細胞の富化集団は、患者への投与前に、培養において拡大されない。或は、一具体例においては、ステップ(ii)の後でステップ(iii)の前に、ＣＤ１３３＋細胞の富化集団を、イン・ビトロで、内皮細胞の形成を促進する条件下で拡大させる。一具体例において、内皮細胞の形成を促進する条件は、(ａ)ＦＢＳ；(ｂ)ウマ血清；(ｃ)ヒドロコルチゾン；(ｄ)幹細胞成長因子(ＳＣＧＦ)；(ｅ)ＶＥＧＦ；又は(ｆ)これらの組合せを含む細胞培養培地を含む。一つの特定の具体例において、内皮細胞の形成を促進する条件は、(ａ)５−１５％ ＦＢＳ；(ｂ)５−１５％ ウマ血清；(ｃ)０．１−１０ｍＭ ヒドロコルチゾン；(ｄ)１０−１０００ｎｇ／ｍｌの幹細胞成長因子(ＳＣＧＦ)；(ｅ)５−５００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ；(ｆ)又はこれらの組合せを含む細胞培養培地を含む。典型的具体例において、内皮細胞の形成を促進する条件は、(ａ)１０％ ＦＢＳ；(ｂ)１０％ ウマ血清；(ｃ)１ｍＭ ヒドロコルチゾン；(ｄ)１００ｎｇ／ｍｌの幹細胞成長因子(ＳＣＧＦ)；(ｅ)５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ；又は(ｆ)これらの組合せを含む細胞培養培地を含む。
【００４８】
前述の方法の一具体例において、治療上有効な量のＣＤ１３３＋細胞は、１×１０4〜５×１０8細胞を含む。他の具体例において、治療上有効な量のＣＤ１３３＋細胞は、虚血心筋への増大した血流の誘導に必要な最少数の細胞である。
【００４９】
ＩＩ．定義
便宜のために、明細書、実施例及び添付の請求の範囲で用いているある一定の用語を、ここに集めた。別途指示しない限り、ここで用いたすべての技術的及び科学的用語は、当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。
【００５０】
単数形の単語は、ここでは、一つ又は一層多く(即ち、少なくとも一つ)を指す。例えば、「要素」は、一要素又は一層多くの要素を意味する。
【００５１】
用語「含む」は、ここでは、語句「含むが、それらに限られない」を意味し、該語句と交換可能に用いられる。
【００５２】
用語「又は」は、ここでは、別途指示しない限り、用語「及び／又は」を意味し、それと交換可能に用いられる。
【００５３】
用語「など」は、ここでは、語句「など、但し、それらに限られない」を意味し、該語句と交換可能に用いられる。
【００５４】
ＩＩＩ．ヒト内皮生成細胞
ここに記載の方法は、内皮生成細胞(ＥＧＣ)の利用を含む。ＥＣＧは、内皮細胞に分化することのできる任意の細胞を含む。ＥＣＧには、胚性幹細胞、血管芽細胞、多能性幹細胞、造血幹細胞及び内皮前駆細胞が含まれる。ここに記載の方法又は利用の幾つかの具体例において、内皮生成細胞例えば内皮前駆細胞は、培養において、造血幹細胞、血管芽細胞又は胚性幹細胞から生成される。
【００５５】
ここに記載の心臓血管及び／又は末梢虚血組織の治療のための新血管新生の方法の好適具体例において、内皮生成細胞は、ＣＤ１３３＋血管芽細胞又はＣＤ１３３＋内皮前駆細胞を含む。好適具体例において、これらの細胞は、富化ＣＤ１３３+細胞である。この細胞表面マーカーＣＤ１３３+は又、ＡＣ１３３としても知られている。ＡＣ１３３は、末梢血、骨髄、胎児肝及び臍帯血からのＨＳＣにつき最近発見されたマーカーである(Gehling等、2000, Blood. 95(10):3106-12；Yin等、1997. Blood 90(12):5002-12；Buhring等、1999. Ann NY Acad SCI 99 872:25-39；Majka等、2000. Folia Histochem Cytobiol.38:53-63)。ＣＤ１３３抗原を認識する抗体は、米国特許第５，８４３，６３３号に記載されている。他の具体例において、これらの細胞は、ＣＤ３４+細胞である。更に別の具体例において、これらの細胞は、ＣＤ１３３+／ＣＤ３４+細胞又はＣＤ１３３＋／ＣＤ３４−細胞である。ある具体例において、これらの細胞は、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４−血管芽細胞である。
【００５６】
骨髄、末梢血又は臍帯血(ＵＣＢ)は、ＥＰＣを生成することのできるＣＤ１３３+血管芽細胞の潜在的起源である。従って、ここに記載の方法又は利用において用いられるＥＰＣは、これら３つの起源の何れかから単離することができる。単純な単離技術である、新鮮なＵＣＢの、４日の培養の後の、粘着性細胞の収集は、以前に記載されたように(Mandel, D.等、Blood 98(11), 55b.(2001)、その内容を、そっくりそのまま、参考として本明細書中に援用する)、有意の増殖及びコロニー形成潜在能力を有する細胞集団を生成する。
【００５７】
典型的な具体例の節に記載したデータは、血管内皮培養と一致するＵＣＢ由来のＥＰＣの形態的特徴を支持している。血管内皮細胞を拡大するためにデザインされた培地における短期間の培養の後に、これらの培養した細胞の多くは、ＣＤ３１及びＣＤ１４６(Ｐ１Ｈ１２)を含む内皮細胞に特異的と考えられる表面マーカーを示す。従って、好適具体例において、ここに記載の方法で用いたＥＰＣは、血管内皮細胞を拡大するためにデザインされた培地での短期間の培養の後にＣＤ３１及びＣＤ１４６(Ｐ１Ｈ１２)を発現する内皮細胞を生じさせる。ここに記載の方法を利用してＥＰＣから得られた細胞の大部分は、ａｃＬＤＬをエンドサイトーシスにより取り込み、少数は、レクチン結合を示す(２つの重要な細胞化学的な内皮細胞の特徴)。加えて、培養により拡大されたＵＣＢ ＥＰＣは、フォン ウィルブラント因子(ｖＷＦ)を生成する。
【００５８】
ここに記載した例は、選択しなかったＵＣＢ又は成人骨髄から培養により拡大されたＥＰＣの注入が、後脚血管傷害のＮＯＤ．ＳＣＩＤ研究用モデルにおいて、血流を増大させる生物学的効果において同等であることを示す。我々は、ＵＣＢ及び骨髄の両者に由来する拡大されたＥＰＣの注入が、傷害後１４日目までに、虚血脚において、血流を有意に増大させる(細胞注入は、サイトカイン注入のみの場合を上回る)ことを認めた。このＵＣＢ由来のＥＰＣの生物学的効果は、ＵＣＢ ＥＰＣ細胞の注入が、骨髄由来ＥＰＣにおいて認められるような間質エレメントを含まないという事実を考慮すれば、注目すべきものである。この虚血脚からの組織の組織学的検査は、成熟内皮表面マーカーＣＤ３１を示す細胞の浸潤を示した。従って、出願人は、ＵＣＢを、成人骨髄由来のものと適合性のＥＰＣの幹細胞源として同定した。
【００５９】
ＵＣＢ由来のＥＰＣ対成人骨髄由来のＥＰＣの比較において。出願人は、表面表現型の類似性を認め、差異をも認めた。粘着性細胞は、ＣＤ３４及び成熟内皮特異的マーカーＣＤ１４６(ＭＵＣ１８又はＭＣＡＭ)、ＣＤ３１及びＶＥ−カドヘリンについて染色された。これらの培養した粘着性細胞の６０％より多くが、両幹細胞起源からのＣＤ１４６につき陽性であった。ＣＤ３１の発現は、骨髄由来のＥＰＣにおいて、ＵＣＢ由来の細胞と比較して一層低かった。ＶＥ−カドヘリンは又、ＵＣＢと比較して、骨髄由来の細胞の一層低いパーセンテージで発現した。その上、ＵＣＢ由来のＥＰＣは、ＣＤ３４の、骨髄由来ＥＰＣと比較して一層高い発現を示した。
【００６０】
ＵＣＢ由来ＥＰＣは、一層大きい潜在的寿命及び一層大きい修復的増殖を含むＥＰＣのための幹細胞起源として、患者の末梢血又は骨髄に由来するＥＰＣを利用する治療的脈管形成の既存のモデルと比較して明確な利点を有している。ＥＰＣのための幹細胞起源としてのＵＣＢの利用は、適当な培養条件下でＥＰＣに分化することのできる初期ＣＤ１３３+幹細胞(即ち、血管芽細胞)の高い含量並びに丈夫な増殖能力、低い免疫原性、低い感染性雑菌混入(ビリオンを含む)、及び銀行に預けた無関係のＵＣＢの組織適合性遺伝子型の異なる表現による「既製」の臨床適用潜在能力のために有利である。
【００６１】
好適具体例において、ＣＤ１３３+細胞は、好ましくは、臍帯血から単離される。ＣＤ１３３+細胞は、前述の任意の起源から単離した単核細胞から、ＣＤ１３３+細胞の富化集団を生成する任意の方法により、正の選択をすることができる。幾つかの技術は、白血球搬出法、密度勾配分画法、免疫選択法、差次的粘着分離法など(これらに限られない)ＣＤ１３３+細胞の迅速な単離に関して周知である。非制限的例として、ＭＮＣは、密度勾配遠心分離法によって得ることができ、磁性ビーズ結合体化抗ＣＤ１３３抗体で標識して、一以上の磁気化ラムを通過させて、正に選択されたＣＤ１３３+細胞を生成することができる。加えて、又は別法として、ＭＮＣは、ＣＤ１３３に対する蛍光抗体で標識して、蛍光活性化セルソーター(ＦＡＣＳ)によってソートしてＣＤ１３３+細胞を得ることができる。得られたＣＤ１３３+細胞の収率及び純度は、該細胞を生成するために用いた起源及び方法に依って変わりうる。標識した細胞を磁気カラムを通過させた後で得られた純度は、例えば、７５〜８５％であってよく、その後のＦＡＣＳ後には、純度は、９５〜９９％に増大しうる。
【００６２】
ＣＤ１３３＋細胞は、更に、更なる細胞表面分子の発現に基づいて精製することができる。もしＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋細胞が単離されたならば、この細胞マーカーＣＤ３４は、単離技術において利用することができる。例えば、ヒトＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋幹細胞を、抗ＣＤ３４抗体例えばCivinの米国特許第５，１３０，１４４号に記載された抗Ｍｙ−１０モノクローナル抗体によって更に精製することができる。同様に、ヒトＣＤ１３３＋ｃｄ３４−細胞は、部分的に、ＣＤ３４＋マーカーの存在に基づく負の選択を利用して単離することができる。抗Ｍｙモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞株は、American Type Culture Collection (米国、12301 Parklawn Drive, Rockville, メリーランド20852在)から入手可能である。ＣＤ３４＋細胞を選択することのできる抗体の更なる幾つかの供給源には、AMAC, Westbrook, メイン；Coulter, Hialea, フロリダ；及びBecton Dickinson, Mountain View, カリフォルニアが含まれる。ＣＤ３４＋細胞は又、当分野で公知の方法によって生成することのできる類似の抗体(例えば、Civinの米国特許第５，１３０，１４４号に記載されたものなど)によって単離することもできる。
【００６３】
ＣＤ１３３＋細胞は、更に、負の選択(即ち、所定の細胞マーカーを発現する細胞の除去)によって精製することもできる。例えば、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６９又は糖タンパク質Ａを発現する細胞を、負の選択をすることができる。
【００６４】
これらのＣＤ１３３+細胞は、レシピエントと同種異系の、自家の又はＨＬＡ適合性のものであってよい。イン・ビボでは、異種の、同種の及び自家のＥＰＣ移植片が、活性な血管形成又は血管傷害の部位に組み込まれる(即ち、それらは、かかる位置に選択的に移動する)ということは公知である。
【００６５】
これらの選択したＣＤ１３３+細胞は、ＥＰＣを生成するための投与ステップの前に、内皮細胞を促進する培養条件下で培養により拡大することができる。或は、骨髄、末梢血又は臍帯血由来のＭＮＣを、内皮細胞を促進する培養条件で、短期間培養(例えば、約２４時間)にて培養して、培養中にＣＤ１３３+細胞を上記のような選択技術によって選択することができる。ＣＤ１３３+ＥＰＣの少なくとも一部が、ＣＤ３１+及び／又はＣＤ１４６+などの(これらに限られない)成熟内皮細胞のマーカーをも有しうるということが認められる。
【００６６】
内皮細胞の分化を促進するのに適した幾つかの培養培地が知られている。非制限的例として、Kalka等、(2000) PNAS 97:3422-3427に記載されたかかる適当な培地は、ＥＣ塩基性培地−２(ＥＢＭ−２)(Clonetics, San Diego在)に、５％ ウシ胎児血清(ＦＢＳ)及び標準SingleQuot(商標)添加剤(ヒトＶＥＧＦ−１、ヒト塩基性繊維芽細胞成長因子−２(ＦＧＦ)、インスリン様成長因子−１(ＩＧＦ−１)、ヒドロコルチゾン、アスコルビン酸及びヘパリン含有)を加えたものである。
【００６７】
ＣＤ１３３＋細胞を単離するための更なる方法及び起源は、例えば、国際ＰＣＴ出願ＷＯ０３／０９５６３１、ＷＯ９９／３７７５１、及びＷＯ０１／９４４２０及び米国特許出願第２００３／００９１５４７、２００３／０１９９４６４及び２００２／００５１７６２(これらの全教示を、参考として本明細書中に援用する)に記載されている。
【００６８】
ここに記載の方法又は利用の一具体例において、ＥＧＣは、患者への投与の前に、遺伝的に、改変される。一具体例において、ＥＧＣは、組換えポリペプチド例えば成長因子、ケモカイン若しくはサイトカイン又はこれらのレセプターを発現するように、遺伝的に、改変される。他の具体例において、この組換えペプチドは、ＶＥＧＦ、ＢＦＧＦ、ＳＤＦ、ＣＸＣＲ−４又はＣＸＣＲ−５である。他の具体例において、この遺伝的改変は、血管形成、脈管形成、又は両方を促進する。ＥＧＣは、例えば、当分野で一般的に知られた方法を利用して、例えばトランスフェクション、トランスフォーメーション又はトランスダクション(組換え発現ベクター使用)によって改変することができる。このベクターは、染色体ＤＮＡに組み込むことができ、又は内在性プラスミドとして遺伝的に改変されたＥＣＧによって保持されうる。幾つかの具体例においては、レトロウイルスが、ＥＧＣを遺伝的に改変するために用いられる。ＥＧＣに導入することのできる更なる遺伝子は、国際ＰＣＴ公開ＷＯ９９／３７７５１に記載されている。
【００６９】
ここに記載の方法又は利用の幾つかの具体例において、内皮生成細胞は、ＣＤ１３３＋細胞を含む。ここに記載のＣＤ１３３＋細胞を含む組成物又は医薬のある具体例において、該組成物中の、これらの細胞の少なくとも１０％は、ＣＤ１３３＋細胞である。ある具体例において、該組成物又は医薬中の該細胞の少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％は、ＣＤ１３３＋細胞である。ある具体例において、該組成物又は医薬中の該細胞の少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％は、ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋細胞である。ある具体例において、該組成物又は医薬中の該細胞の少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％は、ＣＤ１３３＋ＣＤ３４−細胞である。
【００７０】
ＩＶ．ヒト間充織幹細胞／間質細胞
この発明の一つの面は、患者の虚血組織を治療する方法であって、該患者に、治療上有効な量の富化ヒト内皮生成細胞及び富化ヒト間充織幹細胞を投与することを含む当該方法を提供する。間充織幹細胞は、様々な環境の影響に依って、特定の種類の結合組織(即ち、脂肪組織、疎性結合組識、骨組織、軟骨組織、弾性組織及び繊維性結合組織)の何れかに分化することのできる骨髄及び末梢血中に見出される形成多能性芽細胞である。間充織幹細胞は又、一般に、「骨髄間質細胞」又は正に「間質細胞」として言及される。間充織前駆細胞は、間充織幹細胞に由来して、一層限られた分化潜在能力を有するが、少なくとも２種類の組織に分化することができる(例えば、Minguell等、2001 Exp Biol Med (Maywood);226(6);507-20の図１参照)。ここで用いる場合、用語「間充織幹細胞」は、間充織幹細胞、間充織前駆細胞及び骨髄間質細胞を含む。
【００７１】
出願人は、以前に、ｈＭＳＣを単離し、培養により拡大して、表現型を特性決定する方法、並びにそれらの、多数の細胞系統の発生上の潜在能力及び血管形成を含む様々な他の発生事象を調節する能力についての徹底した研究を報告した(Fleming, JE Jr.等、Dev.Dyn.212, 119-132(1998)；Barry FP等、Biochem.Biophys.Res.Commun.265, 134-139 (1999))。ｈＭＳＣは、稀である(骨髄の全有核細胞の約０．０１〜０．０００１％)が、出願人は、それらの骨髄からの単離、他の骨髄細胞から均質になるまでの精製、及び幹細胞潜在能力を失わない培養における有糸分裂による拡大についての細胞培養方法論を完成させた(Haynesworth SE等、Bone 13, 81-88(1992))。ヒト成人のＭＳＣは、骨髄由来であっても、ＣＤ３４又はＣＤ４５を発現せず、ＩＬ−６、−７、−８、−１１、−１２、−１４、−１５、Ｍ−ＣＳＦ、ｆｌｔ−３リガンド(ＦＬ)及びＳＣＦを定常状態で発現し、ＩＬ−３及びＴＧＦβを発現しないことが示されている。デキサメタゾンに対する曝露は、ＬＩＦ、ＩＬ−６及びＩＬ−１１の減少した発現を生じる(Haynesworth SE等、J.Cell Physiol. 166, 585-592(1996))。その上、初期血管芽細胞の支持に重要な間質細胞により発現される粘着性分子には、フィブリン−１及びフィブリン−２、テナシン−C、間質細胞由来因子１(ＳＤＦ−１)及びＶＩ型コラーゲンが含まれる。
【００７２】
理論には拘束されないが、ｈＭＳＣは、分泌された可溶性因子及び直接的細胞接触効果により、血管傷害の部位に帰って、初期血管芽細胞と協調して、脈管形成を増大させると考えられる。間充織細胞は、内皮細胞侵食を促進するマトリクス分解酵素主にマトリクスメタロプロテイナーゼ９を構成的に分泌することが知られている。加えて、間充織細胞は、幾つかのプロ血管形成因子(ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＩＬ０８、ＰＤＧＦを含む)及び造血成長因子(内皮細胞の移動、増殖及び／又は管形成を促進する)を分泌する。
【００７３】
この発明の方法における利用のための間充織幹細胞は、末梢血又は骨髄から単離することができる。ｈＭＳＣを調製する方法は、米国特許第５，４８６，３５９号に記載されている。その上、間充織幹細胞は又、Erices等、2000 Br.J Haematol 109(1):235-42に記載されたように、臍帯血から単離することもできる。ここに記載の方法又は利用の好適具体例において、間充織幹細胞が、虚血組織に苦しんでいる患者の骨髄又は末梢血から単離される場合には、該患者は、この治療のレシピエントとなる。
【００７４】
白血球搬出法、密度勾配分画法、免疫選択法、差次的粘着分離法を含む(但し、これらに限られない)、間充織幹細胞の迅速な単離のための幾つかの技術が知られている。例えば、免疫選択法は、例えば米国特許第６，３８７，３６７に記載されたような、骨髄由来ｈＭＳＣにより発現された表面抗原に対して高めたモノクローナル抗体即ちＳＨ２、ＳＨ３又はＳＨ４を利用するｈＭＳＣの集団の単離を含む。このＳＨ２抗体は、エンドグリン(ＣＤ１０５)に結合するが、ＳＨ３及びＳＨ４は、ＣＤ７３と結合する。更に、これらのモノクローナル抗体は、ｈＭＳＣの同定、定量及び精製に利用することのできる効果的なプローブを与える(それらの身体内の起源によらず)。ここに記載の方法又は利用の一具体例において、間充織幹細胞は、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ｓｔｒｏ−１、又はこれらの組合せを発現する細胞について富化するために培養により拡大される。他の具体例においては、ヒト間充織幹細胞を、モノクローナル抗体ＳＨ２、ＳＨ３又はＳＨ４により同定される表面抗原を含む細胞について富化するために、これらのヒト間充織幹細胞を患者に投与する前に、培養により拡大する。ｓｔｒｏ−１抗体は、Gronthos等、1996, J.Hematother. 5:15-23に記載されている。ヒト間充織幹細胞の富化のために用いることのできる更なる細胞表面マーカーは、Fibbe等、2003. Ann.N.Y.Acad.Sci. 996:235-244の２３７頁の表１に見出される。
【００７５】
この発明の方法における利用のためのｈＭＳＣは、培養培地中に維持することができ、該培地は、化学的に規定した無血清培地であってよく、又は「完全培地」例えば１０％ 血清を補ったダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ)であってもよい。適当な化学的に規定した無血清培地は、米国特許第５，９０８，７８２号及びＷＯ９６／３９４８７に記載されており、完全培地は、米国特許第５，４８６，３５９号に記載されている。化学的に規定された培地には、ヒト血清アルブミン、ヒトＥｘ Ｃｙｔｅリポタンパク質、トランスフェリン、インスリン、ビタミン、必須及び非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン及びミトゲンを補った最少必須培地例えばIscove改変ダルベッコ培地(ＩＭＤＭ)が含まれる。これらの培地は、間充織幹細胞の分化を伴わない成長を刺激する。約２週間の培養は、１０〜１４倍の粘着細胞集団を生じる。これらの細胞をプレートした後で、３〜４日ごとに培地を交換することによる非粘着細胞の除去は、高度に精製された粘着性細胞の培養物を生じ、それらは、幹細胞の特性を保持しており、モノクローナル抗体ＳＨ２、ＳＨ３及び／又はＳＨ４により同定される細胞表面抗原の発現により同定して定量することができる。
【００７６】
ここに記載した方法又は利用の一具体例において、間充織幹細胞は、患者への投与の前に、遺伝的に改変される。一具体例において、間充織幹細胞は、組換えポリペプチド例えば成長因子、ケモカイン若しくはサイトカイン、又は成長因子、ケモカイン若しくはサイトカインと結合するレセプターを発現するように遺伝的に改変される。他の具体例において、組換えペプチドは、血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)、肝細胞成長因子(ＨＧＦ)、繊維芽細胞成長因子(ＦＧＦ)、間質細胞由来因子１(ＳＤＦ−１)、又はインターロイキン８(ＩＬ−８)である。間充織幹細胞は、例えば、米国特許第５，５９１，６２５号に開示された方法又はＥＧＣについて上記した方法を利用して改変されうる。他の具体例においては、遺伝的改変は、血管形成、脈管形成、又は両者を促進する。更に別の具体例においては、間充織細胞は、それらの心筋細胞への分化を促進するように遺伝的に改変される。この組換えポリペプチドは、例えば、ＶＥＧＦ又はアンギオプロテイン−１であってよい。米国特許公開第２００３／０１４８９５２号は、内皮前駆細胞をリクルートするためのアンギオプロテイン−１の利用を記載している。他の具体例において、この組換えポリペプチドは、白血病阻止因子、ＩＬ−１〜ＩＬ−１３、ＩＬ−１５〜ＩＬ−１７、ＩＬ−１９〜ＩＬ−２２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)、マクロファージコロニー刺激因子(Ｍ−ＣＳＦ)、エリスロポエチン(Ｅｐｏ)、トロンボプロテイン(Ｔｐｏ)、Ｆｌｔ３−リガンド、Ｂ細胞活性化因子、アルテミン、骨形態形成タンパク質因子、上皮成長因子(ＥＧＦ)、グリア細胞由来神経栄養性因子、リンホタクチン、マクロファージ炎症性タンパク質、ミオスタチン、ニュールツリン、神経成長因子、血小板由来成長因子、胎盤成長因子、プレイオトロフィン、幹細胞因子、幹細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子、腫瘍壊死因子、血管内皮細胞成長因子、及び繊維芽細胞成長因子、ＦＧＦ−酸性及び塩基性繊維芽細胞成長因子よりなる群から選択される。
【００７７】
ここに記載した方法又は利用の他の具体例においては、間充織幹細胞は、患者への移植の前に、それらの虚血組織へのターゲティングを促進するように改変される。特別の具体例においては、これらの細胞は、プロテインＧ及び、虚血性傷害部位に豊富な抗原に結合する抗体により被覆される。
【００７８】
Ｖ．投与方法
ここに記載した方法において、内皮生成細胞例えばＣＤ１３３+ＥＰＣ又はＣＤ１３３＋血管芽細胞の治療上有効な量及びｈＭＳＣの治療上有効な量は、患者により安全に受容される細胞の最大数から、虚血組織における新たな血管の誘導又は虚血組織への血流の増大に必要とされる細胞の最少数に及びうる。一般に、内皮生成細胞及びｈＭＳＣの各々の治療上有効な量は、少なくとも患者の体重１ｋｇ当たり１×１０4であり、最も一般的には、１ｋｇ当たり、各細胞型の７×１０5より多くは必要でない。ＣＤ１３３+細胞のｈＭＳＣに対する比は、約５：１〜１：５に及びうる。約１：１の比が、好ましい。ｈＭＳＣが患者に対して自家又はＨＬＡ適合であるのが好ましいが、ｈＭＳＣは、他の個体若しくは種から又は遺伝子工学的に交雑されたドナー系統から分離することができ、或はイン・ビトロ細胞培養から分離することができる。
【００７９】
治療上有効な量のＣＤ１３３+細胞及び／又はＭＳＣを、製薬上許容しうるキャリアー又は賦形剤に懸濁させることができる。かかるキャリアーには、基礎培養培地に１％血清アルブミンを加えたもの、塩溶液、緩衝塩溶液、デキストロース、水、及びこれらの組合せが含まれるが、これらに限られない。この配合物は、投与方法に適しているべきである。従って、この発明は、ヒトの内皮生成細胞例えばＣＤ１３３+血管芽細胞の、虚血組織を治療することを必要とする患者の虚血組織を治療するための医薬の製造のための利用を提供する。幾つかの具体例において、この医薬は、成長因子、ケモカイン若しくはサイトカインなどの組換えポリペプチドを更に含む。更なる具体例において、これらの医薬は、ｈＭＳＣを含む。これらの医薬の製造に利用する細胞は、ここに記載した方法につき与えた変化の何れかを利用して、単離し、導き又は富化することができる。
【００８０】
好適具体例において、内皮生成細胞ＣＤ１３３+細胞及び／又はｈＭＳＣの調製物又は組成物は、日常的手順に従って、ヒトへの静脈投与に適合された医薬組成物として配合される。典型的には、静脈投与用、動脈投与用又は心内投与用組成物は、無菌の等張水性緩衝剤中の溶液である。必要であれば、この組成物は、注射部位の任意の痛みを改善するための局所麻酔剤をも含むことができる。一般に、これらの成分は、別々に又は単位投薬形態に一緒に混合して、例えば、活性剤の量を示す密封した容器例えばアンプル内の低温保存した濃縮物として供給される。組成物を点滴により投与すべき場合には、無菌の医薬等級の水又は塩溶液を含む点滴瓶を利用して投薬することができる。組成物を注射により投与する場合には、注射用の無菌の水又は塩溶液のアンプルを与えて、投与の前に成分を混合することができる。
【００８１】
細胞を患者に投与するための様々な手段は、当業者には、この明細書の故に、明らかとなろう。かかる方法には、患者の標的部位への細胞の注射が含まれる。細胞を、患者への注射による導入又は移植を容易にする送達用デバイスに挿入することができる。かかる送達用デバイスは、細胞及び液体をレシピエント患者の身体に注入するための管(例えば、カテーテル)を含むことができる。好適具体例において、これらの管は、更に、この発明の細胞を患者の所望の位置にに導入することのできる針例えば注射器を有する。好適具体例において、細胞は、カテーテルによる血管への投与のために配合される(ここに、用語「カテーテル」は、物質を血管に送達するための様々な管様システムの何れかを含むことを意図している)。これらの細胞は、送達用に、様々な異なる形態で調製することができる。例えば、これらの細胞は、溶液又はゲルに懸濁させることができる。細胞は、この発明の細胞が生存力を維持する製薬上許容しうるキャリアー又は希釈剤と混合することができる。製薬上許容しうるキャリアー及び希釈剤には、塩溶液、緩衝剤水溶液、溶剤及び／又は分散媒が含まれる。かかるキャリアー及び希釈剤の利用は、当分野では周知である。この溶液は、好ましくは、無菌で流動性であり且つしばしば等張性となる。好ましくは、この溶液は、製造及び貯蔵条件下で安定であり、細菌及びカビなどの微生物の汚染作用に対して、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの利用により保護されている。
【００８２】
内皮生成細胞例えばＣＤ１３３+ＥＰＣ及びｈＭＳＣの投与方法には、全身への心内、冠動脈内、静脈内又は動脈内注射及び活性な意図された部位の組織への直接的な注射が含まれるが、これらに限られない。この調製物は、任意の都合の良い経路によって、例えば点滴又はボーラス注射によって投与することができ、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与することができる。投与は、好ましくは、全身投与である。一層好ましくは、投与部位は、活性な意図される部位に近く又は隣接している。患者が広域虚血を患っている場合には、全身投与例えば静脈投与が好ましい。機構に拘束はされないが、内皮生成細胞例えばＣＤ１３３+ＥＰＣ及びｈＭＳＣは、投与されると、傷害により生成された化学走性因子に応答して虚血組織に移動し又は帰る。
【００８３】
一具体例において、内皮生成細胞例えばＣＤ１３３+ＥＰＣは、ｈＭＳＣと同時に投与される。他の具体例においては、ｈＭＳＣは、内皮生成細胞の注射の前又は後に投与される。ＥＧＣ又は間充織幹細胞／間質細胞の投与は、同じ又は異なる投与方法を利用して行なうことができる。例えば、ＥＰＣは、冠動脈内注射によって投与することができるが、間質細胞は、静脈投与されうる。
【００８４】
この発明の方法によって治療することのできる虚血組織には、脚の虚血、心筋虚血(特に、慢性の心筋虚血)、虚血性心筋症、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血、腸虚血などが含まれるが、これらに限られない。
【００８５】
ここに記載した方法又は利用の一具体例においては、組換えポリペプチド又は薬物が、細胞の投与と共に患者に投与される。このポリペプチド又は薬物は、細胞の投与の前に、投与と同時に又は投与後に、患者に投与することができる。一つの好適具体例において、この組換えポリペプチド又は薬物は、血管形成、脈管形成又は両者を促進する。他の具体例において、この組換えポリペプチド又は薬物は、内皮生成細胞若しくは間充織幹細胞又は両者の増殖又は分化を促進する。一具体例において、この組換えポリペプチドは、ＶＥＧＦ、ＢＦＧＦ、ＳＤＦ、ＣＸＣＲ−４若しくはＣＸＣＲ−５、又は虚血組織に対する治療活性を保持したこれらの断片である。
【００８６】
特に、この発明の方法は、ヒトの心筋虚血の治療のための治療用脈管形成に有用である。発明の方法によるＣＤ１３３+細胞及びｈＭＳＣの投与は、単独の治療として利用することができ、又は外科的及び／又は内科的療法に対する付加的治療として利用することもできる。例えば、心筋虚血の治療のためのここに記載した方法は、冠動脈バイパス移植又は経皮冠動脈介入と共に利用することができる。ここに記載した方法は、特に、外科治療後に虚血領域の不完全な脈管再生を有し、それ故、虚血であるが生存力のある心筋層領域を有する患者に有効である。この発明の方法による治療用脈管形成の恩恵を有意に受けうる患者は、脈管再生技術の不十分な標的である血管により供給される悪化した潅流により危険にさらされた広い領域の生存力のある心筋層を有する者である。治療用脈管形成法の恩恵を受けることのできる他の患者は、小さい内径の、重篤に広がったアテローム性疾患の血管を有し且つ脈管再生前(特に、バイパス移植前)の者である。それ故、この発明の方法による治療用脈管形成は、特に、慢性の心筋虚血を有する患者に利益をもたらしうる。
【００８７】
これらの幹細胞は、虚血領域に直接注射することができるが、これらの幹細胞は、好ましくは、冠状動脈(好ましくは、心筋虚血の領域に供給する冠状動脈)に点滴される。この患者が虚血心筋層の領域に正常に供給するであろう完全に閉塞した血管を有する場合は、点滴のために選択される冠状動脈は、好ましくは、完全に閉塞した血管の分布において虚血心筋層への副行流を与える心外膜血管である。
【００８８】
ＣＤ１３３+細胞の治療上有効な量は、好ましくは、患者によって安全に受容される細胞の最大数である。好適な注射の経路は、冠動脈であり、培養においてｈＭＳＣは、最初に単離されたものより大きくなるので、最大投与量は、細胞を点滴する血管のサイズを考慮して、血管が鬱血したり詰まったりしないようにすべきである。虚血心筋層における新しい血管の形成の誘導に必要な細胞の最小数は、過度の実験を行なうことなく、投与量増大研究によって経験的に決定することができる。例えば、かかる投与量増大は、体重１ｋｇ当たり約１０4のＣＤ１３３+細胞単独(又は、約１０4／ｋｇのｈＭＳＣとの組合せ)から開始することができよう。所望の新血管新生を引き起こすのに十分なＣＤ１３３＋細胞の有効量は、動物データに基づいて、日常的計算方法を利用して行なうことができる。
【００８９】
一具体例において、有効量は、体重１ｋｇ当たり約１．５×１０5〜３×１０5のＣＤ１３３＋細胞である。他の具体例において、有効量は、体重１ｋｇ当たり約３×１０5〜４．５×１０5のＣＤ１３３＋細胞である。他の具体例において、有効量は、体重１ｋｇ当たり約４．５×１０5〜５．５×１０5のＣＤ１３３＋細胞である。他の具体例において、有効量は、体重１ｋｇ当たり約５．５×１０5〜７×１０5のＣＤ１３３＋細胞である。他の具体例において、有効量は、体重１ｋｇ当たり約７×１０5〜１×１０6のＣＤ１３３＋細胞である。他の具体例において、有効量は、体重１ｋｇ当たり約１×１０6〜１．５×１０6のＣＤ１３３＋細胞である。一具体例において、ヒトＣＤ１３３＋細胞の有効量は、患者の体重１ｋｇ当たり約１．５×１０6〜４．５×１０6のＣＤ１３３＋細胞であり、好適具体例において、有効量は、患者の体重当たり約５×１０5のＣＤ１３３＋細胞である。
【００９０】
ここに記載の方法又は利用の幾つかの具体例において、ＣＤ１３３＋細胞を含む組成物を、患者の血管に、実質的に動脈血圧を変えることなく導入する。他の具体例において、この組成物は、注入した細胞がプールされて血管に付着することができるように、例えば５秒〜２分間にわたって動脈血流をブロックすることにより、血管に導入される。一具体例においては、バルーンカテーテルを用いて、圧駆動式投与を可能にする。
【００９１】
この発明の一つの面は、更に、(ａ)臍帯血から富化させたＣＤ１３３+細胞；(ｂ)骨髄から富化させたモノクローナル抗体ＳＨ２、ＳＨ３又はＳＨ４により同定される表面抗原を含む間充織幹細胞；及び(ｃ)製薬上許容しうるキャリアーを含む医薬配合物を提供する。幾つかの具体例において、この配合物は、１０4〜１０9のＣＤ１３３+細胞を含む。他の具体例において、この組成物は、１０4〜１０9の間充織幹細胞を含む。更なる具体例において、この配合物は、カテーテルによる投与用に調製される。一具体例において、ＣＤ１３３＋細胞は、ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋又はＣＤ１３３ＣＤ３４−細胞である。一具体例において、この医薬組成物中のＣＤ１３３＋細胞は、ＣＤ３１+、ＣＤ１４６+、ＣＤ１３３+、ＣＤ３４+、ＶＥ−カドヘリン+、又はこれらの組合せである。特定の具体例において、これらの内皮生成細胞は、ＣＤ１３３+／ＣＤ３４+細胞又はＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞である。ここに記載の方法又は利用の他の特定の具体例において、内皮生成細胞例えば内皮前駆細胞又は血管芽細胞は、患者の自家の、同種異系の、又はＨＬＡ適合性のものである。
【００９２】
ＶＩ．ＣＤ１３３＋細胞を含むキット
この発明の一つの面は、ＣＤ１３３＋細胞の集団を含むキットを提供する。一具体例において、これらのＣＤ１３３＋細胞は、臍帯血、抹消血又は骨髄から単離される。幾つかの具体例において、このキット中の細胞の、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％は、ＣＤ１３３＋細胞である。幾つかの具体例において、このキット中のＣＤ１３３＋細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％は、ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋細胞である。幾つかの具体例において、このキット中のＣＤ１３３＋細胞の、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％は、ＣＤ１３３＋ＣＤ３４−細胞である。幾つかの具体例において、このキットは、更に、閉じた無菌の系の少なくとも一成分を含む。この閉じた無菌の系の成分には、針、注射器、カテーテルベースの注射器、針ベースの注入用デバイス、無針の注入用デバイス、フィルター、管類、弁及びカニューレが含まれるが、これらに限られない。関連する具体例において、このキットは、細胞集団からの防腐剤の除去のための要素を含む。防腐剤には、ＥＤＴＡ又は低温保存剤例えばＤＭＳＯが含まれうる。かかる要素には、フィルター、注射器、小瓶、容器、管類などが含まれる。
【００９３】
他の具体例において、このキットは、更に、ＣＤ１３３＋細胞集団の、患者例えば、虚血状態例えば虚血心筋に苦しんでいる患者への投与のためのパッケージ及び投与のための指示書を含む。幾つかの具体例において、このキットは、更に、細胞集団の冠動脈内注射に適したできる少なくとも一種の賦形剤を含む。好適具体例において、この賦形剤は、非発熱性でない賦形剤である。典型的賦形剤には、アカシア[９０００−０１−５]、６−メチル−１，２，３−オキサチアジン−４(３Ｈ)−オン−２，２−ジオキサンカリウム塩[５５５８９−６２−３]、エタノール酸[６４−１９−７]１，２，３−プロパントリカルボン酸、２−アセチルオキシ、トリブチルエステル[７７−９０−７]、１，２，３−プロパントリカルボン酸、２−アセチルオキシ、トリエチルエステル[７７−８９−４]、血清アルブミン[９０４８−４９−１]、エタノール[６４−１７−５]、アルギン酸[９００５−３２−７](ＣＡＳナンバーを、角括弧内に示してある)が含まれる。
【００９４】
他の具体例において、このキットは、更に、抗凝固剤又は血小板凝集インヒビターを含む。一具体例において、この血小板凝集インヒビターは、ＧＰ ＩＩｂ−ＩＩＩａのインヒビター例えばエプチフィバチド(Integrillin(登録商標)として販売されている)又はトロンビンインヒビター例えばアルガトロバン若しくはエキサンタ(登録商標)(キシメラガトラン)を含む。他の抗凝固剤には、ヘパリン又はビタミンＫ依存性凝固因子を阻害するワルファリンなどの薬剤が含まれる。
【００９５】
この発明の特定の面は、(ａ)単位投薬形態の臍帯血から単離された細胞の集団(該集団中の細胞の少なくとも１０％は、ＣＤ１３３を発現する)；及び(ｂ)冠動脈内注射に適した賦形剤を含むキットを提供する。
【００９６】
この発明の他の面は、(ａ)臍帯血から単離された細胞の集団(該集団中の細胞の少なくとも１０％はＣＤ１３３を発現する)；及び(ｂ)冠動脈内注射に適した閉じた無菌の系を含むキットを提供する。特定の具体例において、この閉じた無菌の系は、針、注射器、カテーテルベースの注射器、針ベースの及び無針の注入用デバイスを含む。
【００９７】
この発明は又、(ａ)予め測定した量の、臍帯血から単離した細胞(これらの細胞の少なくとも１０％はＣＤ１３３を発現する)；及び(ｂ)冠動脈内注射に適した少なくとも一つの閉じた無菌の系の成分を含むキットをも提供する。
【００９８】
この発明は、更に、(ａ)予め測定した量の、臍帯血から単離した細胞(これらの細胞の少なくとも１０％はＣＤ１３３を発現する)；及び(ｂ)少なくとも一種の抗凝固剤を提供する。一具体例において、抗凝固剤は、ＧＰ ＩＩｂ−ＩＩＩａ、トロンビン又はビタミンＫ依存性凝固因子のインヒビターである。特定の具体例において、この抗凝固剤は、エプチフィバチド、アルガトロバン、キシメラガトラン、ワルファリン及びヘパリンよりなる群から選択される。
【００９９】
この発明は又、(ａ)少なくとも２つの小瓶(各々は、予め測定した量の、臍帯血から単離した細胞を含み、その少なくとも１０％はＣＤ１３３を発現する)；及び(ｂ)冠動脈内注射に適した少なくとも一つの閉じた無菌の系の構成要素を含むキットであって、第一の小瓶は予備試験及び／又は品質制御目的に用いられ、第二の小瓶中の細胞が患者に注射される、当該キットをも提供する。予備試験及び／又は品質制御目的は、試料中の細胞の生存力を試験し、試料中の細胞の濃度をアッセイし、試料の無菌性を試験し、又は細胞集団の患者との免疫的合成を試験することを含む(但し、これらに限られない)。更なる試験は、細胞集団中のある種の抗原例えばＨＬＡアレルの存在を、免疫ベースのアッセイにより又は試料中の遺伝子のＤＮＡ配列を決定することによって測定することを含むことができる。
【０１００】
本発明の実施は、適宜、別途指示のない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、ウイルス学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の慣用技術を利用する(これらは、当業者の技能のうちにある)。かかる技術は、文献中に記載されている。例えば、Sambrook 及び Russell 著、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第３版(Cold Spring Harbor Laboratory Press: 2001)；論文、Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)；Harlow 及び Lane著、Using Antibodies, 第２版(Cold Spring Harbor Press, New York, 1999)；Bonifacino, Dasso, Lippincott-Schwartz, Harford 及び Yamada 著、Current Protocols in Cell Biology(John Wiley and Sons, Inc., New York, 1999)を参照されたい。
【０１０１】
典型的な具体例
この発明は、今や、一般的に記載されており、下記の実施例を参照することにより、一層容易に理解されよう(これらは、単に、本発明のある面及び具体例の説明目的のために含まれるものであって、この発明を制限することを意図するものではなく、当業者は、上記の教示と以下の実施例から認めるであろうが、他の幹細胞起源及び選択方法、他の培養培地及び培養方法、他の投薬及び治療スケジュール、及び他の動物及び／又はヒトを、制限することなく、請求の範囲に記載したこの発明の範囲から離れずに、利用することができる)。
【実施例】
【０１０２】
実施例１
内皮前駆細胞の臍帯血及び成人骨髄からの分離及び特性決定
単核細胞を、臍帯血(ＵＣＢ)又は成人骨髄(ＢＭ)から分離して、内皮前駆細胞(ＥＰＣ)の発生を支持する条件下で短期培養中に置いた。これらの培養から回収された接着性細胞は、ＥＰＣ特性を示すことが、細胞化学、フローサイトメトリー、顕微鏡形態学及び免疫染色を含む多数のイン・ビトロアッセイを利用する分析により見出された。
【０１０３】
１）細胞の分離
新鮮なＵＣＢ又はＢＭに由来する単核細胞(ＭＮＣ)を、密度勾配遠心分離を利用して分離した。ＥＰＣ細胞を、Kalka等(2000)PNAS 97: 3422-3427の方法によって、細胞培養にて、分離・拡大した。簡単にいえば、これらのＭＮＣを、ヒトのフィブロネクチンでコートした培養フラスコ上に、４〜６×１０6細胞／ｍｌ(ＵＣＢ ＭＮＣ)又は１〜２×１０6細胞／ｍｌ(ＢＭ ＭＮＣ)の密度で、５％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)及び標準的ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ(商標)添加剤(ヒトＶＥＧＦ−１、ヒト繊維芽細胞成長因子２(ＦＧＦ)、インスリン様成長因子１(ＩＧＦ−１)、ヒドロコーチゾン、アスコルビン酸及びヘパリン含有)を有するＥＣ基本培地(ＥＢＭ−２)(Clonetics, San Diego)中にプレートした。非接着性細胞は、４日の培養後にリン酸緩衝塩溶液(ＰＢＳ)で洗浄することにより除去して、培地を、その後、４日ごとに交換した。培養の第２週において、これらの接着性細胞は、ＥＰＣの特徴である紡錘様形態をとった。
６〜７日目において、細胞を、トリプシン処理して計数した。ＵＣＢ培養からの接着性細胞の収率は、ＢＭ ＭＮＣで得られた収率２１．５％±３．７％と比較して、平均で、初期ＭＮＣ投入量の２．５％±０．４％であった。
【０１０４】
２）ＥＰＣ特性に関する接着性細胞の細胞染色
ａ）成熟内皮細胞の２つの主な細胞化学的染色の特徴は、Ulex europaeus アグルチニン(ＵＥＡ)−１などの特異的レクチンタンパク質の接着、及びアセチル化された低密度リポタンパク質(ａｃＬＤＬ)の取り込みである。接着細胞の蛍光顕微鏡観察を行なって、ＦＩＴＣ標識ＵＥＡ−１(Sigma)と１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカーボシアニン(ＤｉＩ)標識ａｃＬＤＬ(Biomedical Technologies, マサチューセッツ、Stoughton在)の二重結合を検出した。
【０１０５】
接着性細胞を、先ず、ａｃＬＤＬと３７℃でインキュベートして、１％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した。洗浄後、これらの細胞を、ＵＥＡ−１(１０μｇ／ｍｌ)と１時間にわたって反応させた。染色後、試料を、全細胞蛍光を記録するようにセットした共焦点顕微鏡を用いて４０倍で観察した。
【０１０６】
図１は、ＵＣＢ由来ＥＰＣの細胞化学的染色を示す蛍光顕微鏡イメージを示している。これらの細胞の大部分がａｃＬＤＬの取り込みを示すということが見出された(Ａ)。一層小さい割合が、ＵＥＡ−１レクチンについて陽性染色を示した(Ｂ)。両細胞化学的染色についての同時複合二重染色の結果を（Ｃ）に示してある。二重陽性蛍光を示す細胞を、分化中のＥＰＣとして同定した。
【０１０７】
ＢＭ及びＵＣＢの両方に由来するＥＰＣ細胞のａｃＬＤＬの取り込み及び形態の比較を測定した。培養の第二週において、両起源からの細胞は、ａｃＬＤＬの取り込みを示し且つ類似の形態的特徴を示した(データは示さない)。
【０１０８】
ｂ）フォン・ウィルブランド因子(ｖＷＦ)は、血管内皮細胞及び巨核球により合成されるよく特性決定された多量体の糖タンパク質である。ＵＣＢから培養された接着性細胞はｖＷＦに関して染色された。表面接着細胞を載せたスライドを、室温のアセトンで、１０分間固定して、風乾した。これらの細胞を、次いで、Dako(カリフォルニア、Carpinteria在)から市販されているポリクローナルウサギ抗ヒト第ＶＩＩ因子関連抗原と反応させた。この抗原と結合する細胞の検出を、日常的な西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン−ビオチン技術(ＬＳＡＢ２、Dako社製)及び３，３−ジアミノベンジジン(色原体)を利用して行なった。染色を、位相差顕微鏡によって４０倍の倍率を用いて観察した。
【０１０９】
図２に示したように、ＵＣＢから培養された非選択的接着細胞は、別の内皮染色パターンを示した。褐色の核周囲の染色は、核周囲のｖＷＦ粒子と反応する第二抗体に結合されたイムノペルオキシダーゼによるものである。ヒトの臍静脈内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)は、陽性対照として染色され、繊維芽細胞は、陰性対照として染色された(データは示さない)。
【０１１０】
３）ＵＣＢ由来のＥＰＣ細胞のフローサイトメトリー分析
ａ）ＣＤ１３３+細胞の選択及び表現型決定：
ＵＣＢ由来の５０×１０6のＭＮＣを磁気ビーズ結合した抗ＣＤ１３３抗体(Miltenyl)で標識して、２つの連続する磁気カラムを通して、０．１×１０6の陽性に選択されたＣＤ１３３+細胞を生成した。これらの選択されたＣＤ１３３+細胞を、フローサイトメトリー及びＣＤ３４とＣＤ１３３についての染色により特性決定した。図３は、明確に同定されたＣＤ１３３+／ＣＤ３４-細胞(１００)及びＣＤ１３３+／ＣＤ３４+細胞(２００)の集団を、大きさ(前方散乱、ＦＳＣ)対顆粒化度(屈折度、側方散乱、ＳＳＣ)で示している。ＦＳＣゲインは、非常に小さい細胞のより良い解像度のために増大された。ゲーティングは行なわなかった。
【０１１１】
ｂ）ＵＣＢ及びＢＭ由来の非選択ＥＰＣ細胞の表現型決定：
ＵＣＢ細胞を１９日間、ＢＭ細胞を１２日間、ＥＭＢ−２培地中で培養した。接着性細胞をトリプシン処理して、ＣＤ３４及び成熟内皮特異的マーカーのＣＤ１４６(Ｐ１Ｈ１２、ＭＵＣ１８又はＭＣＡＭ)、ＣＤ３１及びヒト血管内皮(ＶＥ)カドヘリンにつき染色した。図４に示したように、培養した接着性細胞の６０％より多くが、ＣＤ１４６陽性であった。ＣＤ３１の発現は、ＵＣＢ由来の細胞における５０％と比較して、ＢＭ由来のＥＰＣでは２５％であった。しかしながら、ＣＤ３１染色は、ＢＭにおいて一層明るかった。ＶＥ−カドヘリンは、ＵＣＢ由来の細胞における２４％と比較して、ＢＭ由来の細胞の１０％において発現された。ＵＣＢ由来のＥＰＣは、ＢＭ由来のＥＰＣの１０％と比較して、細胞の２５％においてＣＤ３４の発現を示した。
【０１１２】
まとめると、前述の研究は、非選択ＵＣＢ及びＢＭ細胞が、内皮細胞培養条件下で迅速に増殖して拡大することを示した。これらのＵＣＢ及びＢＭ由来のＥＰＣは、多数の内皮の特徴を示す。
【０１１３】
実施例２
ＵＣＢ及びＢＭ由来のＥＰＣのイン・ビボモデルにおける移植
マウス後脚虚血モデルにおける新血管新生のイン・ビボ研究を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて行なった。これらの結果は、ＵＣＢがＥＰＣの最適の起源であることを示している。ＵＣＢは、ＢＭ中に存在する間質エレメントを欠くが、ＵＣＢ由来のＥＰＣは、ＢＭ起源のＥＰＣによるものと同等の生物学的効果をイン・ビボモデルにおいて示した。
【０１１４】
１）治療グループ。すべての手順を、Case Western Reserve University's Institutional Animal Care and Use Committee に従って行なった。この実施例では、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス(１０〜１５週齢)を用いた。外科手術前に、これらのマウスを、セシウム−１３７線源からの２．５Ｇｙで照射して、注射されるヒト細胞の拒絶を一層低下させた。これらのマウスを一晩絶食させたが、水は自由に飲ませた。次いで、それらをケタミンとペントバルビタールの組合せの腹腔内注射により麻酔した。無菌条件下で、右鼠蹊領域に小さい皮膚切開を行なった。右大腿動脈を露出させて、近接する枝と共に結紮して(＃０００シルク使用)、横断切開した。大腿静脈及び大腿神経を結紮しないように、特に注意した。次いで、皮膚切開を、連続縫合様式で閉じた(＃０００シルク使用)。大腿動脈結紮後に、これらのマウスを、４つのグループに分けた。グループ１の動物は、培養７日目に収穫した１×１０6(０．０２ｍｌの培地中)の接着性(ＥＰＣ)ＵＣＢ細胞の心内注射を受けた。グループ２の動物は、培養７日目に収穫した１×１０6の接着性（ＥＰＣ）ＢＭ細胞の心臓内注射を受けた。グループ３及びグループ４の動物は、同様に、０．０２ｍｌの完全ＥＢＭ−２培地又は塩溶液のみをそれぞれ受けた。外科手術及び細胞の注射の直後に、虚血の右脚と操作してない左脚の両方のベースラインの血流を、レーザードップラー流量計(レーザー流量計 ＡＬＦ２１Ｄ、Advance Company LTD, 日本国、東京在)を利用して測定した。レーザードップラー測定を、外科手術後、７日目、１４日目及び２８日目に反復した。虚血脚／健康脚の潅流の比を利用して、３つの研究グループにおける新血管新生を比較した。
【０１１５】
２）ＵＣＢ又はＢＭ由来のＥＰＣで処理した動物における潅流比の比較
図５は、虚血脚と非虚血脚の間の潅流比の比較を示している。大腿結紮の直後に、潅流比は、０．０５７±０．０１１(ＥＢＭ−２培地のみを注射された対照用グループ)、０．０２９±０．００７(ＵＣＢ由来のＥＰＣ)及び０．０２０±０．００４(ＢＭ由来のＥＰＣ)であり、すべてのグループにおいて、減少した潅流を示している。１４日後には、ＵＣＢ由来のＥＰＣを受けた研究用グループにおける傷害を受けた脚において、対照用グループと比較して、及びＢＭ由来のＥＰＣグループと対照用グループとの間で、統計的に有意な一層高い血流があった(ｐ＜０．００１)。対照用グループにおける潅流比は、ＵＣＢ由来のＥＰＣを受けたグループにおける比０．４１±０．０３１(ｎ＝２２)(ｐ＝０．０００８)及びＢＭ由来のＥＰＣを受けたグループにおける比０．４８±０．０３９(ｎ＝１４)と比較して、０．２４±０．０３２(ｎ＝１４)の比と低いままであった。１４日目には、ＥＰＣの２つの起源間でこれらの比の有意の差異はなかった(ｐ＝０．１８)。その後の２８日目の時点での測定は、対照用グループと細胞点滴を受けたマウスとを比較したときに、潅流比を等しくする対照用動物におけるドップラー血流における改善の故に、注目すべきものであった。
【０１１６】
３）治療グループにおける虚血性後脚の組織学的評価
両後脚の下腿後部筋由来の組織を、２８日目に、組織学的評価のために収穫した。これらの試料は、液体窒素中で凍結され新鮮であり、ホルマリンで固定した。６μｍ厚の凍結切片を、塩溶液でコートしたガラス上に載せて、免疫組織化学的技術を利用して、抗ヒトＣＤ３１抗体を用いる染色により、ヒト細胞から得られたＥＰＣの組込みを同定した。図６に示したように、ＵＣＢ ＥＰＣを注射されたマウスからの試料は、ＣＤ３１についての陽性の染色を示したが、完全なＥＭＢ２倍地を注射された対照用マウスは、示さなかった。すべてのグループの健康な脚は、陽性のＣＤ３１染色を示さなかった(データは示さない)。ＢＭ ＥＰＣを注射されたマウスに由来する試料は、同様の結果を示した(データは示さない)。
【０１１７】
実施例３
ＵＣＢからのＣＤ１３３+細胞の選択と精製
ＣＤ１３３+細胞の分離と精製のために、単核細胞を上記のようにＵＣＢから分離して、ＣＤ１３３+結合した磁気ビーズで標識し、その後、磁気カラムを通す自動化ソーティング(Ａｕｔｏｍａｃｓ，Miltenyi)を行なった。これらの標識した細胞を単一のカラムを通すことにより、日常的収率は、元のＭＮＣの０．４％であり、ＣＤ１３３+細胞の純度は、７５〜８５％に及んだ。ＭＮＣの２つの連続する磁気カラムの通過により、純度は、９１．２％ ＣＤ１３３+細胞にまで高められたが、収率は、０．２％に落ちた。更なる精製の試みを、蛍光活性化セルソーティング(ＦＡＣＳ)により行なった。ＣＤ１３３+細胞を、磁気カラムを通過させることにより分離し、ＣＤ１３３−フィコエリトリン(ＰＥ)結合抗体で染色し、更に、ＦＡＣＳにより精製した。図７に示したように、磁気カラム通過の結果生成した純度は、８３．０２％ ＣＤ１３３+細胞であった。ＦＡＣＳ後、純度は、９８．８７％まで増大したが、最終的収率は、初期ＭＮＣ投入量の０．１％であった。
【０１１８】
実施例４
精製したＣＤ１３３+細胞の培養−拡大及び特性決定
１）内皮細胞駆動性サイトカイン又は造血細胞駆動性サイトカイン中でのＣＤ１３３+細胞の表面マーカーのフローサイトメトリー分析
実施例３に従って分離した精製ＣＤ１３３+細胞を、造血駆動性サイトカイン又はＣＤ１３３+細胞から内皮細胞を生成させることが報告されているサイトカイン中で培養した(Gehling, U.M.等、Blood 95(10):3106-3112)。簡単にいえば、造血駆動性条件のためには、ＣＤ１３３+細胞を、９６ウェルプレート上に、０．２×１０6細胞／ウェル／条件の濃度でプレートして、培地単独(Iscove's Modified Dulbecco's Medium, IMDM)に２％ＦＢＳを加えたもの、又は造血培養培地(ＩＭＤＭ)、３０％ ＦＢＳ、５０ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子(ＳＣＦ)、２０ｎｇ／ｍｌのヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)、インターロイキン−３(ＩＬ−３)、ＩＬ−６、及び３Ｕ／ｍｌのエリスロポエチンの何れかにおいて２４時間にわったてインキュベートした。内皮細胞駆動性条件のためには、０．２×１０6のＣＤ１３３+細胞を同様にプレートして、内皮培養培地(ＩＭＤＭ、１０％ ＦＢＳ、１０％ ウマ血清 １ｍＭ ヒドロコーチゾン、１００ｎｇ／ｍｌの幹細胞成長因子(ＳＣＧＦ)、及び５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ)中でインキュベートした。２４時間のインキュベーション後に、これらの細胞を、造血表面マーカーＣＤ３４及びＣＤ４５につき並びにＢＣＬ−２及びｐ２１(これらは、それぞれ、細胞周期及びアポトーシスを調節するタンパク質であり、ＨＳＣの運命の調節において一つの役割を演じることが示されている)の発現につき、フローサイトメトリーにより分析した。例えば、ｐ２１clp1/waf1は、サイクリン依存性キナーゼのインヒビターであり、Ｇ１での細胞周期拘束を媒介する。ｐ２１clp1/waf1欠乏マウスにおいては、正常のホメオスタシス条件下でのＨＳＣの増大した増殖及び幹細胞プールの消耗があるということが示されており、これは、ｐ２１clp1/waf1が、ＨＳＣが細胞周期に入るのを制御する分子スイッチでありうることを示唆している。抗アポトーシスタンパク質ＢＣＬ−２の、トランスジェニックマウスの造血コンパートメントにおける過剰発現は、ＨＳＣ数並びにイン・ビトロプレーティング能力を改善し、ＨＳＣを細胞周期の一層静止状態に維持することが示されている。
【０１１９】
図８に示したフローサイトメトリーの結果は、全細胞における発現の強度を示している(平均蛍光強度(ＭＦＩ)として又は分析した全細胞のパーセンテージとして表してある)。ＣＤ４５及びＣＤ３４発現は、造血細胞系統特異的なサイトカイン中での培養の２４時間後に強力に増大された。ＣＤ４５発現は、内皮サイトカイン中で失われたが、これは、細胞が、既に造血細胞系統を離れて分化を始めたことを示唆している。ｐ２１及びＢＣＬ−２タンパク質の発現は、造血サイトカイン条件にて増大した。しかしながら、両タンパク質の発現は、内皮サイトカイン条件において有意に低下したが、これは、やはり、２つの細胞集団が、既に異なる遺伝子発現プログラムを開始したことを示唆している。
【０１２０】
２）ＵＣＢから新たに分離した又は２４時間培養したＣＤ１３３+細胞における細胞周期の分析
細胞周期のステージを、実施例３におけるように新たに分離したＣＤ１３３+細胞において並びに培地のみの中で、又は上記のように造血若しくは内皮駆動性条件下で２４時間培養し、又は造血条件下で７２時間培養した後のＣＤ１３３+細胞において分析した。細胞を固定し、透過性にして、ＤＮＡをヘキストを用いて標準的条件下で染色し、そして細胞周期のステージにつき分析した。
【０１２１】
これらの結果は、図９に示してある。新たに分離したＣＤ１３３+細胞(Ａ)の細胞周期ステージの分析は、９９％の細胞が、Ｇ0期で休止していることを示した。サイトカイン中での培養(Ｂ)の２４時間後には、有意の細胞分裂は、造血又は内皮条件においては、見出されず、この時点では、大多数の細胞(９３〜９４％)は、未だＧ0期にいた。しかしながら、造血条件で７２時間後には、１５％の細胞が、Ｓ期にあり、１１％の細胞が、Ｇ2／Ｍ期にあった。このデータは、上で検討した差次的タンパク質発現が、特異的サイトカイン中でのインキュベーションの２４間後にのみ、差次的遺伝子発現プログラムに沿って進行していたことを示している(この時点では、非常に僅かの細胞しか分裂を生じていなかったが)。それ故、２４時間では、細胞分裂は起きなかったので、造血又は内皮条件で培養された細胞は、事実上、依然として、最初にプレートしたのと同じ細胞である。
【０１２２】
実施例５
マウスの後脚傷害モデルにおける、精製ＵＣＢ ＣＤ１３３+細胞由来のＥＰＣによる新血管新生
ＣＤ１３３+を、実施例３に記載したように選択した。選択後に、これらの細胞を実施例４に記載したのと同じ内皮駆動性培養条件下で、９６ウェルプレート中に５０，０００〜７０，０００細胞／ウェルで播種した。７日間の培養後に、細胞を、実施例２に記載した方法により後脚の大腿動脈の結紮を受けたマウスの心内に注射した。細胞収率は、プレートしたＣＤ１３３+細胞の５８〜１３０％に及び、又はＭＮＣの最初の数の０．２６％であった。血流を、ドップラー流量計によって、経時的に測定したが、図１０に示した結果は、傷害脚中と非傷害脚中の経時的な血流の比として表してある。これらの結果は、外科手術の１４日後にＣＤ１３３+細胞を受けたマウスにおける、同日の塩溶液を注射された対照と比較しての増大した血流を示している。もっと後の時点(２８日)での分析は、塩溶液のみを注射された対照用マウスにおけるドップラー流れ測定における有意の改善につき、注目すべきものであった。
【０１２３】
実施例６
ヒト間充織幹細胞及びヒト臍静脈内皮細胞は、相互に、有糸分裂による拡大を誘導する
物理的接触にない細胞間の初期の血管形成の相互作用は、可溶性因子により媒介される。ヒトの間充織幹細胞は、骨形成、造血及び破骨細胞形成などの発生過程を支持するための因子を分泌する。これらの過程を調節する多くのサイトカインも又、内皮細胞の成長に影響を与える。下記の実施例は、ｈＭＳＣが、成熟内皮細胞の成長を刺激するタンパク質を分泌することを説明する。これらの実施例は又、成熟内皮細胞に由来する可溶性因子がｈＭＳＣの成長を刺激することをも説明する。
【０１２４】
１）ヒトの骨髄由来の間充織幹細胞(ｈＭＳＣ)：分離及び培養による拡大
骨髄を、６人のヒトドナーの腸骨稜から吸引した。ヒトの間充織幹細胞を、以前に報告された方法(Haynesworth, SE等、1992. Bone 13, 81-88)を改変した方法によって精製して培養した。簡単にいえば、骨髄吸引物を、２０ｍｌの注射器から、２５ｍｌの成長培地を含む５０ｍｌの円錐管に移した。成長培地は、スクリーンして選択したロットからの、１０％(ｖ／ｖ)にウシ胎児血清(ＦＢＳ、GIBCO, メリーランド、Gaithersburg在)を補ったダルベッコ改変イーグル培地よりなるものであった。これらの管を、ベックマン卓上遠心器で、ＧＳ−６スウィングバケットローターにて、１，２００ｒｐｍで５分間遠心して、これらの細胞をペレット化した。脂肪層及び上清を、血清学用ピペットで吸引して廃棄した。細胞ペレットを５ｍｌの容積の成長培地に再懸濁させてから、７０％ パーコールの３５ｍｌの勾配の上に移した。これらの試料を、Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＳ−３４固定式アングルローターに載せて、Ｓｏｒｖａｌｌ Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｅｄ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅにて、４６０ｇで１５分間遠心分離した。約１２ｍｌの低密度画分(プールした密度＝１．０３ｇ／ｍｌ)を、各勾配から集めて、５０ｍｌ三角管に移し、その各々に３０ｍｌの成長培地を加えた。これらの管を、１，２００ｒｐｍで遠心分離して、細胞をペレット化した。これらの上清を捨てて、細胞を、２０ｍｌの成長培地に再懸濁させて、赤血球を４％酢酸で溶解させた後に、血球計算器を用いて計数した。細胞を、７ｍｌ当たり５×１０7細胞の濃度に調節して、１００ｍｍの培養プレートに、プレート当たり７ｍｌで播種した。
【０１２５】
これらの細胞を、培養培地中で３７℃で、９５％の空気と５％のＣＯ2を含む加湿大気中で培養し、培地を３〜４日ごとに交換した。一次培養ディッシュが、１０〜１４日目にほぼ集密になったら、それらの細胞を、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．２５％(ｗ／ｖ)トリプシンを、５分間、３７℃で用いて分離した。トリプシンの酵素活性を、１／２容のウシ血清を加えることにより停止させた。これらの細胞を、計数して、成長培地に再懸濁させた。細胞収率は、最初のＭＮＣの数の約０．２６％であった。
【０１２６】
２）条件付け培地での成長アッセイ
ヒトの間充織幹細胞(実施例６のパートＩにおけるようにして獲得)又はヒト臍静脈内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)を３５ｍｍディッシュ中にプレートして、成長培地中にて付着させた。付着後に、これらの細胞を、洗ってから、１２時間、無血清培地中(ｈＭＳＣ)か又は低血清培地中で(ＨＵＶＥＣ)インキュベートして、これらの細胞の細胞質に残っているかもしれない残留血清タンパク質を低減させ、成長位相を同期させた。これらの細胞を、再び洗った後に、それらを、様々な濃度の条件付け培地中で、７２時間(ｈＭＳＣ)又は４８時間(ＨＵＶＥＣ)インキュベートした。細胞を、血球計算器により定量した。
【０１２７】
ｈＭＳＣ条件付け培地を生成するために、１００ｍｍプレート中の７５％集密のｈＭＳＣを洗って、低グルコースを含む無血清ダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ−ＬＧ)中で２４時間インキュベートした。これらのｈＭＳＣを、タイロード平衡化塩溶液で洗ってから、無血清の規定された培地(８０％ Iscove、１２％ ＤＭＥＭ−ＬＧ及び８％ トリ繊維芽細胞基本培地ＭＣＤＢ２０１)を７２時間条件付けした。この条件付け期間後に、この培地を取り出して、遠心分離して細胞残骸を除去した。これらの培地を条件付けした細胞を定量して、条件付けした培地を、細胞数に対して、無血清規定倍位置で１０，０００細胞／ｍｌに希釈することにより標準化した。
【０１２８】
条件付けした培地を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ (３ＫＤａ 分子量(ＭＷ)カットオフ遠心分離装置)をＳｏｒｖａｌｌ遠心器にて、４℃で利用して、２０倍に濃縮した。濃縮された条件付け培地及び濾液(３ＫＤａ ＭＷを超える蛋白質を含まない濃縮ユニットからの流出液)を直ちに使うか又は−２０℃に貯蔵した。この濾液を遠心分離して、細胞残骸を除去してから、２０×条件付け培地を２×(終濃度の２倍)まで希釈するのに利用した。１×条件付け培地を生成するために、新鮮な無血清培地を、必須栄養素を与えるために、１：１の比で加えた。
【０１２９】
ＨＵＶＥＣ条件付けした培地を、ｈＭＳＣ条件つけした培地につき上記したように調製した(但し、ＨＵＶＥＣは、１％ ＦＢＳを加えたメディウム１９９中で４８時間成長させた)。濃縮後に、ＨＵＶＥＣ条件付け培地を、上記のように、濾液で２倍まで希釈した。この条件付け培地を、次いで、１％ ＦＢＳを含む新鮮なメディウム１９９で１倍まで希釈した。
【０１３０】
３）条件付け培地の、ｈＭＳＣ又はＨＵＶＥＣの有糸分裂による拡大に対する効果
図１１は、ＨＵＶＥＣにより条件付けした培地でのインキュベーション後の、ｈＭＳＣ細胞数の投与量応答性の有糸分裂による拡大(Ｂ)、及びｈＭＳＣにより条件付けした培地でのインキュベーション後の、ＨＵＶＥＣ細胞数の投与量応答性の有糸分裂による拡大(Ｃ)を、それぞれ示している。条件付けした培地(ＣＭ)による成長刺激効果は、煮沸により熱不活性化した条件付けした培地を利用した場合には、明確ではなかった。濾液(３ＫＤａのＭＷカットオフの濃縮ユニットからの流出液)は、何れの細胞型についても、刺激効果を有しなかった。
【０１３１】
すべての図の対照用培地は、合わせた非条件付け培地であった(１：１の比で、細胞型に最も適合された新鮮な最小培地と)。ＨＵＶＥＣ対照用培地の希釈物は、比較的少ないＦＢＳを含んでいるが、１％を超える変動はない。図１１(Ａ)及び(Ｄ)は、対照用成長培地である。
【０１３２】
実施例７
ｈＭＳＣ及びＨＵＶＥＣの化学走性による、条件付け培地中で分泌された因子へ向かう移動
組織は、部分的に、既存の血管から組織への、内皮細胞の化学走性による移動を誘導する因子の放出による新たな脈管構造を必要としている。同様に、新たに形成された脈管構造は、部分的に、それらの、内皮細胞から放出される化学走性因子に応答して新血管の部位に移動する間充織周細胞との相互作用の結果として、成熟して安定化する。以下の実施例は、ｈＭＳＣが、内皮細胞の移動を刺激して周細胞前駆細胞として役立つことができ、内皮細胞により放出される化学走性因子に応答することができることを説明する。ボイデンチャンバーを利用して、他の条件付け培地に分泌された化学走性因子に応答してのｈＭＳＣ及びＨＵＶＥＣの移動を測定した。
【０１３３】
１）ボイデンチャンバーにおける、条件付け培地に向かう化学走性による移動
Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ４８ウェルボイデンチャンバーの下側ウェルに、変化する濃度で、実施例６に記載したｈＭＳＣ又はＨＵＶＥＣ条件付け培地を充填した。１％ゼラチンで被覆した５μｍの細孔を有するポリカーボネート膜を、下側ウェルの上に置き、チャンバーを組み立てた。ｈＭＳＣ又はＨＵＶＥＣをペレット化して、徹底的に洗浄した後に、無血清(投与量応答アッセイ用)又は変化する濃度の条件付け培地(チェッカーボードアッセイ)に再懸濁させた。ｈＭＳＣ又はＨＵＶＥＣ細胞懸濁物を、上側ウェルに充填した。これらのチャンバーを、３７℃で、５時間、インキュベートして、細胞の上側ウェルから、膜を通って下側ウェル中の条件付け培地への移動を許した。５時間のインキュベーションの後に、これらのチャンバーを、分解して、膜を回収した。細胞を、その膜の上面からかきとり、膜の細孔内に移動した細胞のみが残った。これらの移動した細胞を、次いで、ホルムアルデヒドにて固定して、クリスタルバイオレットで染色し、そしてスライド上に載せた。スライドを、投与量応答につきスキャンして、オリンパス４８０Ｅ顕微鏡を利用する直接的な細胞計数によって定量した。フィルター上の３つの点の並びは、与えた条件の３つのウェルにおける細胞の移動を表している。
【０１３４】
図１２は、ｈＭＳＣ(上段)及びＨＵＶＥＣ(下段)の、ｈＭＳＣ条件付け培地(左パネル)に向かう移動、及びＨＵＶＥＣ(上段)及びｈＭＳＣ(下段)の、ＨＵＶＥＣ条件付け培地(右パネル)に向かう移動を示している。両細胞型について、最大の移動は、ｈＭＳＣ又はＨＵＶＥＣ条件付け培地のそれぞれの最大濃度(１０×)に対応する膜の左上の角の３つの点において認められた。これらの点(膜に付着した細胞数に直接対応する)の強度は、条件付け培地の濃度が低下すると共に減少し、従って、ｈＭＳＣ及びＨＵＶＥＣの両者のそれぞれの、ＨＵＶＥＣ又はｈＭＳＣ条件付けした培地への投与量依存性の移動を示している。熱変性させた条件付け培地は、負の対照と類似の移動パターンを示した。１０％ＦＢＳを、正の対照として利用した。
【０１３５】
実施例８
ヒトの間充織幹細胞は、血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)及びＶＥＧＦレセプター遺伝子を発現する。
ＶＥＧＦは、専ら内皮細胞上で見出されたレセプターの内皮細胞特異的リガンドとして記載された。しかしながら、最近の報告は、ヒトの骨髄間質細胞を含む非内皮細胞でのＶＥＧＦレセプターの発現を示している。次の２つの実施例は、ｈＭＳＣも、ＶＥＧＦ成長因子及びレセプターを発現することを示す。
【０１３６】
１）ｈＭＳＣによる成長因子ｍＲＮＡのＶＥＧＦファミリーの発現のＲＴ−ＰＣＲ分析
ＲＴ−ＰＣＲを利用して、ＶＥＧＦファミリーの成長因子の遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ発現を示した。Ｑｉａｇｅｎキットを利用して、ペレット化ｈＭＳＣから全ＲＮＡを生成した。ｃＤＮＡ合成キット(Amersham)は、全ＲＮＡからｃＤＮＡを生成した。ｃＤＮＡをＶＥＧＦファミリー遺伝子(ＶＥＧＦ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ及びＰＩＧＦ)に特異的なプライマーと合わせて、Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ ４８０ ＰＣＲマシーンにおける増幅のためのＲＴ−ＰＣＲ Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏビーズに加えた。全反応は、同じ３５サイクルの増幅プログラムを、特異的プライマーのためにセットした最適アニーリング温度で利用した。
【０１３７】
２）ＶＥＧＦ ＰＣＲ産物の可視化
ＰＣＲ産物の量を変化させて、２％アガロースゲル上で泳動させて、エチジウムブロミド染色を利用して可視化した。図１３は、次の通りの分離されたＰＣＲ産物の大きさを示している：ＶＥＧＦ−Ａは、５７７ｂｐ、５２６ｂｐ及び４５４ｂｐ；ＶＥＧＦ−Ｂは、３２６ｂｐ及び２２５ｂｐ；ＶＥＧＦ−Ｃは、１８３ｂｐ；ＶＥＧＦ−Ｄは、２２５ｂｐ；そしてＰＩＧＦは、２４８ｂｐ及び１８４ｂｐ。
【０１３８】
３）ｈＭＳＣによるＶＥＧＦレセプターの発現のＲＴ−ＰＣＲ分析
ＲＴ−ＰＣＲ分析を、ＶＥＧＦレセプター１、２及び３、並びにニューロピリン−１及びニューロピリン−２に特異的なプライマーを利用して、実施例９に記載したように行なった。
【０１３９】
４）ＶＥＧＦ ＰＣＲレセプター産物の可視化
可視化を上記のように行なった。図１４は、高分子量ＤＮＡマーカー、ＶＥＧＦＲ１(１，０９８ｂｐ)、ＶＥＧＦＲ２(３２６ｂｐ)、ＶＥＧＦＲ３(３８０ｂｐ)；ニューロピリン−１(３７５ｂｐ)及びニューロピリン−２(３０４ｂｐ及び２８９ｂｐ)を示している。
【０１４０】
実施例９
周細胞前駆細胞と内皮細胞との直接的細胞接触は、ＴＧＦ−β１を活性化する相互作用へと導き、これは、血管形成期を終えて、各細胞型の血管性分化を誘導する。ＴＧＦ−β１は、培養中の殆どの細胞によって潜伏性形態で分泌される。ＴＧＦ−β１の生理学的関連は、その活性の調節である。単一培養における非トランスフォーム細胞での活性ＴＧＦ−β１産生の文献での報告はない。しかしながら、内皮細胞の多能性マウス繊維芽細胞(１０Ｔ１／２細胞)、周細胞との共存培養、又は内皮細胞との共存培養中の平滑筋細胞は、潜伏性ＴＧＦ−β１を、プラスミンによる潜伏性ペプチドのタンパク質分解性開裂を含む機構によって、活性化することが示されている。この実施例は、ｈＭＳＣが、内皮細胞と直接的細胞接触によって相互作用して、鍵となる抗血管形成因子、ＴＧＦ−β１を活性化するということを示す。
【０１４１】
ＥＬＩＳＡ分析を利用して、上記の実施例６に記載したようにして調製した、ｈＭＳＣ及びＨＵＶＥＣの単独培養又は共存培養からの条件付け培地における活性なＴＧＦ−β１タンパク質を検出した。
【０１４２】
図１５(Ａ)は、単独培養におけるｈＭＳＣ及び内皮細胞による潜伏性ＴＧＦ−β１の分泌を示している。予想されるように、活性なＴＧＦ−β１は、単独培養のｈＭＳＣ又はＨＵＶＥＣからの条件付け培地においては、測定不能であった。図１５(Ｂ)は、活性なＴＧＦ−β１がｈＭＳＣ又はＨＵＶＥＣの単独培養では生成されないが、同細胞の共存培養においては検出されたことを示している。
【０１４３】
実施例１０
ｈＭＳＣは、選択的に内皮管様構造に移動する。
証拠は、内皮細胞の管が、周囲の間充織細胞をリクルートして、新たに形成中の血管に向けて移動させて該血管に共存させてそれらを安定化させることを示唆している。３次元のＩ型コラーゲンゲル中の内皮細胞の管は、新規に形成された血管のイン・ビトロ相関物である。上記の実施例で与えたデータは、ｈＭＳＣとＨＵＶＥＣが、化学走性を誘導する分泌タンパク質によって相互作用することを示している。更に、このデータは、ｈＭＳＣが、共存培養中のＨＵＶＥＣと相互作用して、血管成長期を終わらせてある種の繊維芽細胞及び内皮細胞の最終分化を誘導することが示されている抗血管形成因子であるＴＧＦ−β１を活性化するシグナリングを調節することを示している。
【０１４４】
この実施例は、ｈＭＳＣが、内皮細胞管様構造への移動、該構造での共存、及び周細胞への分化を誘導されうることを示す。
【０１４５】
１）管様構造の調製及びｈＭＳＣの移動の可視化
簡単にいえば、ＤｉＩ染色したｈＭＳＣを、内皮細胞管様構造のビトロゲン(Ｉ型コラーゲン)３Ｄゲル培養に加えて、共存を研究した。ＤｉＩは、成体色素である。ＨＵＶＥＣ管様構造の培養を確立するために、ＨＵＶＥＣを、３００，０００細胞／ｍｌで１％ゼラチンでコートした３５ｍｍプレート上にプレートした。付着後に、内皮成長培地を除去して、細胞をタイロード溶液で徹底的に洗った。ビトロゲンゲルの溶液を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−ＬＧと１：１の比で、これらの内皮細胞に加えた。ビトロゲン混合物の凝固後に、更なる１ｍｌの内皮成長培地を加えて、培養物を、一晩インキュベートして、管様構造を形成させた。
【０１４６】
ｈＭＳＣをＤｉＩで染色するために、ｈＭＳＣを、５０，０００細胞／ｍｌで３５ｍｍプレート中にプレートした。ｈＭＳＣを、一晩、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−ＬＧ中でインキュベートして、付着させた。次いで、培養物を、タイロード溶液で洗い、１μｇ／ｍｌ ＤｉＩと合わせた１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−ＬＧ中で６時間インキュベートした。インキュベーション後に、ｈＭＳＣを徹底的に洗ってから、トリプシン処理して、細胞をプレートから取り出した。これらのｈＭＳＣを、遠心分離によってペレット化してから、３０，０００細胞／ｍｌで、２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−ＬＧに再懸濁させた。
【０１４７】
１ｍｌのｈＭＳＣ懸濁液を、ゲル培養中のＨＵＶＥＣ管様構造の上面に加えた。共存は、ｈＭＳＣの３Ｄゲルを通っての、底面近くに位置する管様構造までの移動を必要とした。培養をモニターして、写真撮影を行なった。
【０１４８】
結果は、図１６に示してある。パネルＡにおいて、ＨＵＶＥＣは、典型的な２次元培養であることが示されている。パネルＢは、パネルＡの細胞にビトロゲン３Ｄコラーゲンゲルを加えてから１２時間後に形成された管様構造を示している。内皮の管の広大なネットワークの叢が見られる。パネルＣは、ＤｉＩ染色した３Ｄコラーゲンゲルの表面を横切ってランダムに分布したｈＭＳＣを示している。パネルＤは、ｈＭＳＣの３Ｄコラーゲンゲル中のＨＵＶＥＣへの添加の２４時間後の同じ培養物を示している。これらのｈＭＳＣは、このゲルを通って移動して、選択的に、内皮細胞の管と共存した。結果は、多数のｈＭＳＣ及びＨＵＶＥＣドナーを同じ実験条件で利用して、再現性があった。
【０１４９】
実施例１１
ヒト間充織幹細胞(ｈＭＳＣ)を補ったＵＣＢ ＣＤ１３３+細胞から精製したＥＰＣによるマウス後脚傷害モデルにおける増大された新血管新生
一連の実験を行なって、ＵＣＢ由来のＥＰＣに加えられた間質エレメント(例えば、ｈＭＳＣ)が、マウス後脚虚血モデルにおいて、新血管新生を増大させるかどうかを測定した。
【０１５０】
１）ｈＭＳＣの分離及び培養による拡大
成人の骨髄由来のｈＭＳＣを分離して、実施例６に記載のようにして培養において拡大した。
【０１５１】
２）ＵＣＢ由来のＣＤ１３３+細胞の分離及び培養による拡大
ＵＣＢ由来のＣＤ１３３+細胞を、実施例３に記載のようにして選択した。選択後に、これらの細胞を、５０，０００〜７０，０００細胞／ウェルで、９６ウェルプレートに、実施例４で記載したのと同じ内皮駆動性培養条件下で播種した。細胞収率は、プレートしたＣＤ１３３+細胞の５８〜１３０％に及んだ。
【０１５２】
３）ｈＭＳＣを補った精製したＣＤ１３３+細胞由来のＥＰＣによるマウス後脚傷害モデルにおける新血管新生
７日間の培養の後に、１×１０6のＣＤ１３３+細胞及び１×１０6のｈＭＳＣを、実施例２に記載した方法により、後脚の大腿動脈の結紮を受けたマウスに、同時に、心内注射した。血流を、レーザードップラー流量計により、経時的に測定したが、図１７に示した結果は、傷害脚の血流と非傷害脚の血流との間の経時的な比として表してある。これらの結果は、外科手術の７日後にＣＤ１３３+細胞及びｈＭＳＣ細胞の両方を受けたマウスにおける、ＣＤ１３３+細胞(１４日目)又はｈＭＳＣ細胞のみを点滴されたマウスと比較しての、増大した血流を示している。この結果は、ｈＭＳＣとＣＤ１３３+細胞の同時点滴後の早い時点(７日目)において、改善された血流が達成されたことを示唆している。しかしながら、同時点滴実験において研究されたマウスが少数であることにより、適当な統計的分析を行なうための十分なデータがない。同時のｈＭＳＣ点滴の増大効果は、一層遅い時点では、持続しなかった。
【０１５３】
実施例１２
慢性的冠状動脈虚血の患者におけるＵＣＢ由来のＣＤ１３３+細胞の冠状動脈内点滴
文書に記録された虚血であるが、慢性的に完全に閉塞した血管の分布域内で副行流を与える心外膜血管による供給を受けて生存力のある心筋領域を有する慢性的冠状動脈虚血の患者は、この治療の適格者である。この適格な患者は、カナダ心臓血管学会で規定するクラスＩＩ〜ＩＶの狭心症の過去の経験を報告しなければならない。患者は、経皮的冠動脈介入(ＰＣＩ、例えば、バルーン血管形成術、アテロトミー、又は回転式アテレクトミー)のスケジュールの３０日以内に篩い分けされる。虚血であるが生存力のある心筋領域は、ＰＥＴ走査に加えて、運動／薬理学的核ストレス試験により同定される。左心室の駆出率(＞４５％が、患者の適格性に求められる)及び局所的な壁の動きの心臓エコー検査による評価は、完全な病歴及び身体検査(同時に行う薬物療法、ＥＣＧ、及びベースラインラボラトリーパネル(ＣＢＣ、基本的代謝プロフィル、凝固パネル、急性心筋梗塞パネル)の再検討を含む)と共に初期篩い分けの部分である。冠状動脈血管造影法は、治療プロトコールに好都合な解剖学的構造、ＰＣＩに従順な別の容疑者の血管の十分樹立された副行流により供給される遠位分布域の心外膜動脈の即ち慢性的な完全な閉塞について評価される。
【０１５４】
幹細胞治療に不適格な患者には、枝治療、ＰＣＩ禁忌、心臓カテーテル法、骨髄吸引、を含むＰＣＩに従順な冠動脈病変を有する者、並びに直近の３ヶ月以内に心筋梗塞を有し、文書に記録された出血素質を有し、造血／リンパ系に関連する公知の悪性疾患を有し、虚血のベースラインＥＣＧの解釈を妨げるベースラインＥＣＧ異常を有し、腎不全を含む重い合併症を有し、又は心理的若しくは社会的理由により通院不能であることが予想される者が含まれる。
【０１５５】
一度適格な患者の解剖学的構造が測定されれば、その患者は、カテーテル方ラボラトリーから排除されて、知覚鎮静下で骨髄吸引を受ける。約１５０〜２５０ｍｌの骨髄吸引物を腸骨稜から取り出す。所望の容積を得るためには、多数の穿刺部位が必要とされうる。この骨髄吸引物の容積は、約１０6のＭＮＣを生成する。
【０１５６】
ＣＤ１３３+細胞を、実施例３に記載した方法により、ＣＤ１３３+結合した磁気ビーズで標識し、その後、磁気カラム(Ａｕｔｏｍａｃｓ、Miltenyi)を通す自動化ソーティングを行うことによって、ＭＮＣから分離する。これらの選択したＣＤ１３３+細胞を、次いで、緩衝溶液中で洗浄し、そして５ｍｌの規定食塩水の濃縮溶液中に貯蔵することができる。
【０１５７】
患者が、骨髄吸引から回復する時間を与えられた後で、ＰＣＩを行う。手術介入の心臓病専門医が、ＰＣＩが上首尾であると決定した場合は、患者を約５分間にわたって、任意の合併症について観察する。もしなければ、幹細胞の移植を、一気に完了させる。約１×１０4〜１×１０5のＣＤ１３３+細胞を、点滴用カテーテルによって、慢性的虚血域への大多数の副行血管に供給する心外膜血管に点滴する。今は完全に閉塞状態の血管によって以前供給を受けていた生存力のある心筋への副行血管の源である心外膜冠動脈は、蛍光透視法により同定される。装置を、インデックスＰＣＩのために末梢血管内に置いた導入器シースを通して通過させる。標的親血管に、点滴カテーテルを用いて、大動脈洞内の適当な冠動脈の小口に配置した誘導カテーテルによって、カニューレ挿入する。規定食塩水の５ｍｌの溶液中のＣＤ１３３+細胞を、３分間にわたる手による注射によって点滴する。更なる２ｍｌの規定食塩水を、残留細胞がカテーテルに蓄積するのを防ぐために、幹細胞溶液の直後にカテーテルによって点滴する。
【０１５８】
幹細胞点滴の最後に、血管の選択した冠動脈の血管造影図を行って、ＴＩＭＩ流を評価し、血管壁の完全性を評価する。この患者を、任意の合併症についての手順の後５分間、心臓カテーテル法ラボラトリーにてモニターする。
【０１５９】
次いで、この患者を、モニターセッティングにて、手順後２４時間観察し、ＥＣＧ及び心臓酵素分析を８、１６及び２４時間で得る。
【０１６０】
この患者の臨床的追跡評価を、その後、７、３０、９０、１８０及び３６５日に行う。ＰＣＩ及び幹細胞点滴治療の成功は、運動能力(例えば、数秒間の全運動持続時間、運動持続時間の変化、狭心症の開始時間、１ｍｍＳＴ下降など)の改善；主要な心臓事象(例えば、死亡、血管再生、狭心症、心筋梗塞後の再入院など)；手順後２４時間以内又は２４時間より後の心筋梗塞(例えば、心臓酵素の上昇、ＥＣＧの変化、ニトログリセリンにより軽減されない胸痛などにより測定)；狭心症の改善；二次的入院の長さ；薬物療法の利用の減少；狭心症の主観的改善；左心室の機能及び駆出率(２Ｄ心臓エコー図により測定)；全虚血領域の、核ストレス試験による初期スクリーニング試験と比較しての改善；及び心筋の、ＰＥＴ走査による初期スクリーニング試験と比較しての生存可能域の改善によって測定される。
【０１６１】
実施例１３
慢性冠状動脈虚血の患者へのＵＣＢ由来のＣＤ１３３+細胞及び骨髄由来ｈＭＳＣ細胞の冠状動脈内点滴
患者を、実施例１２に記載したプロトコールに従って選択してモニターする。一度適格患者の解剖学的構造が測定されれば、その患者をカテーテル法ラボラトリーから出して、知覚鎮静下で骨髄吸引を行う。約１５０〜２５０ｍｌの骨髄吸引物を腸骨稜から取り出す。
【０１６２】
自家ｈＭＳＣを、実施例６に記載した方法に従って骨髄吸引物から分離する。ｈＭＳＣの収率は、約１／１０，０００〜１／１００，０００ＭＮＣである。それ故、約３００〜３，０００のｈＭＳＣが、１５０〜２５０ｍｌの骨髄から得られる。約１４日間の培養の後に、ｈＭＳＣの収率は、約１０4〜１０5であり、モノクローナル抗体ＳＨ２により同定された細胞の純度は、９９％以上である。これらのｈＭＳＣは、緩衝溶液中で洗浄して、５ｍｌの規定食塩水の濃縮溶液中に貯蔵することができる。
【０１６３】
ＣＤ１３３+細胞を、臍帯血から、実施例３に記載した方法に従って、ＣＤ１３３+結合した磁気ビーズで標識した後に磁気カラム(Ａｕｔｏｍａｃｓ，Miltenyi)を通す自動化ソーティングを行うことによって分離する。選択されたＣＤ１３３+細胞を、次いで、緩衝溶液中で洗って、５ｍｌの規定食塩水の濃縮溶液中に貯蔵することができる。これらのＣＤ１３３+細胞は、所望であれば、実施例１２に記載した方法に従って、培養中で拡大させることができる。
【０１６４】
ｈＭＳＣ及びＣＤ１３３+細胞が移植に利用可能な場合には、ＰＣＩをその患者について行う。手術介入の心臓病専門医が、ＰＣＩが上首尾と決定した場合には、その患者を、約５分間、任意の合併症について観察する。何もなければ、幹細胞の移植を、一気に完了する。約１×１０4〜１×１０5の単離されたＵＣＢ由来のＣＤ１３３+細胞を、自家のｈＭＳＣと１：１の比で、点滴用カテーテルにより、慢性的虚血域への副行血管の大部分に供給する心外膜血管に点滴する。今は完全に閉塞した血管によって以前供給を受けていた生存力のある心筋への副行血管の源である心外膜冠状動脈は、螢光透視法により同定される。装置を、インデックスＰＣＩのために、末梢血管内に配置した導入器シースを通して通過させる。標的親血管に、点滴用カテーテルを用いて、大動脈洞内の適当な冠動脈の小口に配置した誘導カテーテルによって、カニューレ挿入する。ＣＤ１３３+細胞及び自家のｈＭＳＣ細胞を、規定食塩水の５ｍｌの溶液で、３分間にわたる手作業による注射によって同時に点滴する。更なる２ｍｌの規定食塩水を、残留細胞がカテーテルに蓄積するのを防ぐために、幹細胞溶液の直後にカテーテルによって点滴する。
【０１６５】
幹細胞点滴の最後に、患者の評価と監視を、実施例１２に記載したように行う。
【０１６６】
実施例１４
最近の研究は、始原単核細胞(ＭＮＣ)の冠動脈内注射は、心筋梗塞を患ったことのある患者に利益をもたらしうることを示した(Strauer B.等、2002. Circulation, 1913-1918; Assmus, B.等、Circulation 2002; 106: 3009-3017)。これらの小さい試みにおいて、治療中の患者は、２億４５００万もの多くの細胞を、３〜３．５ｃｃのボーラスの冠動脈内注射(２５×１０6細胞／ｃｃ)によって受けた。これらの細胞注射に関する合併症は、これらの試みの何れにおいても見られなかった。潜在的合併症には、細胞注射時に心筋梗塞を誘発する可能性が含まれる。細胞注射のときのトロンボゲン状態の誘導の可能性に対する理論的考察が与えられなければならない。このトロンボゲン状態は、正にそれらの細胞の性質又は、増大した細胞対血漿容積比による過粘着性又は微小血管を危険にさらすことから生じた遅い冠動脈血流に対して二次的に生じうる。現在まで、この潜在的な重大な合併症を評価する研究はない。自家の骨髄由来のＭＮＣの冠動脈内注射の安全性の閾値を確立するためにデザインした小動物の研究を行った。
【０１６７】
体重約４０〜５０Ｋｇのヨークシャーブタに、自家の骨髄由来のＭＮＣを、血漿１ｃｃ当たり１．５〜５×１０6の細胞の濃度で冠動脈内注射した。このプロトコールを、ヒトの臨床的試みを真似て確立した。大きさ及び、冠動脈潅流カテーテルを利用する接近の容易さに基づいて、細胞注射のために、第１(Ｄ１)又は第２(Ｄ２)の診断分岐を選択した(下記の図１参照)。冠動脈流量(ＴＩＭＩフレームカウントとして測定)を、細胞注射の前後で記録した。これらの分離した単核細胞を、１〜２分にわたって注射した後で、１ｃｃの塩溶液を冠動脈内にフラッシュした。
【０１６８】
これらの動物を７日間追跡して、冠動脈血管造影を繰り返した後に犠牲にした。それらの心臓を取り出して、１０％ホルマリンを含む緩衝規定食塩水を用いて加圧固定した。これらの心臓を、大きい虚血又は梗塞の証拠について視覚的に検査してから、組織学に送った。
【０１６９】
３匹のブタを、梗塞の証拠について試験した。試験した細胞濃度の何れの肉眼的検査又は組織学においても、心筋梗塞の証拠はなかった。試験した最高濃度(血清３ｃｃ当たり１５×１０6細胞)において、細胞点滴の少し後で記録された冠状動脈流(ＴＩＭＩＩ)の有意の減少があった。ＬＡＤ分布並びに標的の斜め血管(Ｄ１)において緩慢な流れが記録された(図１８)。冠動脈流は、約１０分後に回復した。低下した流れを説明する、細胞注射中又はその後の冠動脈痙攣の視覚的証拠はなかった。
【０１７０】
この記載した説明は、この発明を開示するために及び又、当業者がこの発明を実施して利用することが可能となるように、最適モードを含む実施例を利用している。この発明の特許可能な範囲は、請求の範囲によって規定され、当業者に生じる他の例を包含しうる。かかる他の例は、もしそれらが本願の請求の範囲の言葉と異ならない要素を有するか又は本願の請求の範囲の言葉と僅かしか異ならない同等の要素を含むならば、当該請求の範囲内にあるべきものである。
【０１７１】
実施例１５
ＵＣＢ由来ＣＤ１３３＋細胞の特性決定
実施例３からのＣＤ１３３＋細胞を、更に、特性決定して、様々なマーカーの表面発現を決定した。単核細胞を、ＵＣＢから、密度勾配遠心分離法により分離した。ＣＤ１３３＋細胞を、磁気分離法(Miltenyi)によって分離した。表面発現を、蛍光色素と結合したｍＡｂ及び適当なイソ型対照と４℃で２０分間にわたって、インキュベートすることにより評価した。ＬＳＲフローサイトメトリー(Coulter, フロリダ、Miami在)を利用して、試料当たり５０００を超える蛍光事象を得た。結果を、図１９及び２０並びに下記の表に示す：
【０１７２】
【表１】
2008504290.tif 000003
【０１７３】
下記の表は、個々の臍帯血試料についての５つの示したマーカーの各々を発現するＣＤ１３３＋細胞のパーセンテージを示している。
【０１７４】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】短期の内皮駆動性培養条件下で臍帯血(ＵＣＢ)から得られた内皮前駆細胞ＥＰＣの蛍光細胞化学染色を示している図である。
【図２】ＵＣＢ由来のＥＰＣのフォン  ウィルブラント因子(ｖＷＦ)についての染色を示しており、且つＥＰＣに特徴的な紡錘様形態をも示している図である。
【図３】ＵＣＢから選択したＣＤ１３３+細胞の表面表現型のフローサイトメトリー分析を示している図である。
【図４】内皮駆動性培養条件下での１９日及び１２日の培養後のＵＣＢ由来のＥＰＣ細胞の内皮細胞特性とヒト骨髄(ＢＭ)との比較のフローサイトメトリー分析を示している図である。
【図５】ＵＣＢ及びＢＭ由来のＥＰＣの、マウスの後肢虚血モデルへのイン・ビボ移植により達成された新血管新生の結果を描いてある図である。
【図６】外科手術の２８日後の虚血後肢の組織学的評価を示している図である。
【図７】ＵＣＢからのＣＤ１３３+細胞の単離・精製の結果を示している図である。
【図８】精製したＣＤ１３３+細胞におけるＣＤ４５、ＣＤ３４、ＢＣＬ−２及びｐ２１の、造血駆動条件又は内皮駆動条件下での、２４時間の培養の後の、差次的発現を示している図である。
【図９】精製した培養ＣＤ１３３+細胞における細胞周期分析を示している図である。
【図１０】マウス後脚虚血モデルにおける精製ＣＤ１３３+細胞由来のＥＰＣによる新血管新生を描いている図である。
【図１１】ヒト間充織幹細胞(ｈＭＳＣ)数の、ヒト臍静脈内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)により条件付けされた培地中でのインキュベーション後の、投与量応答的有糸分裂性拡大(Ｂ)、及びｈＭＳＣにより条件付けされた培地中でのインキュベーション後のＨＵＶＥＣ細胞数の投与量応答的有糸分裂性拡大(Ｃ)を示している図である。
【図１２】ｈＭＳＣ(上段)及びＨＵＶＥＣ(下段)の、ｈＭＳＣ条件付けされた培地に向かう移動(左)及びＨＵＶＥＣ(上段)及びｈＭＳＣ(下段)のＨＵＶＥＣ条件付けされた培地に向かう移動(右)を示している図である。
【図１３】ｈＭＳＣが、血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)遺伝子を発現することを示している図である。
【図１４】ＶＥＧＦレセプターｍＲＮＡのｈＭＳＣによる発現を示している図である。
【図１５】単独培養又はｈＭＳＣ及びＨＵＶＥＣとの共培養における、活性ＴＧＦ−ｂ１のＥＬＩＳＡ分析を示している図である。
【図１６】ｈＭＳＣが、内皮管様構造へ選択的に移動することを示している図である。
【図１７】ＵＣＢに由来する精製ＣＤ１３３+細胞及びＣＤ１３３+細胞＋ｈＭＳＣの組合せによる、マウス後脚虚血モデルにおける新血管新生を描いている図である。
【図１８】ベースラインでの及びＭＮＣの注射後の、ブタの血管造影図の静止フレームイメージを示している図である。
【図１９】ＣＤ１３３細胞表面マーカーの発現により精製された臍帯血細胞の細胞表面マーカーの発現(ＦＡＣＳソーティングにより測定)を記載している図である。
【図２０】臍帯血由来のＣＤ１３３細胞のＦＡＣＳソーティングを記載している図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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