(57)【要約】  本発明は、目的とする蛋白を作製するための系および方法に関する。本発明は、修飾された蛋白フォールディングまたはプロセッシング能力を有する、遺伝子改変された動物細胞または植物細胞を使用する。一態様では、本発明は、（１）目的とする蛋白、および（２）細胞の小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）経路において機能的であるポリペプチドをコードする１つまたは複数の組換え発現カセットを含む、遺伝子改変された細胞を特徴とする。ポリペプチドの共発現により、遺伝子改変された細胞における目的とする蛋白の収量は有意に増加する。一実施例では、遺伝子改変された細胞は動物細胞であり、かつ共発現されるポリペプチドは、ＸＢＰ１またはＡＴＦ６の媒介によるＵＰＲ経路の成分または調節物質である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的とする蛋白、および
小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）経路の成分またはＩＲＥ１以外の調節物質
をコードする１つまたは複数の組換え発現カセットを含む、動物細胞または植物細胞。
【請求項２】
動物細胞であり、かつ前記成分またはＩＲＥ１以外の調節物質がＸＢＰ１蛋白またはＡＴＦ６蛋白である、請求項１記載の細胞。
【請求項３】
１つまたは複数の組換え発現カセットが、
目的とする蛋白をコードしている少なくとも１種の組換え発現カセット、および
ＸＢＰ１蛋白またはＡＴＦ６蛋白をコードしている少なくとももう１種の組換え発現カセット
を含み、ここで細胞中の少なくとももう１種の組換え発現カセットの総数に対する少なくとも１種の組換え発現カセットの総数の比率が０．５：１ないし１０：１である、請求項１または２記載の細胞。
【請求項４】
細胞中の少なくとももう１種の組換え発現カセットの総数に対する少なくとも１種の組換え発現カセットの総数の比率が、少なくとも３：１である、請求項３記載の細胞。
【請求項５】
哺乳動物細胞である、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか一項に記載の細胞を含むヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項７】
動物細胞および癌細胞を融合することによって作製されるハイブリッド細胞である、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８】
目的とする蛋白、および
細胞のＵＰＲエレメント（ＵＰＲＥ）またはＥＲストレス応答エレメント（ＥＲＳＥ）に対する結合能を有するポリペプチド
をコードする１つまたは複数の組換え発現カセットを含む、動物細胞または植物細胞。
【請求項９】
動物細胞であり、かつポリペプチドが転写活性化ドメインを含む、請求項８記載の細胞。
【請求項１０】
転写活性化ドメインが、ＸＢＰ１蛋白またはＡＴＦ６蛋白の転写活性化ドメインを含む、請求項９記載の細胞。
【請求項１１】
目的とする蛋白、および
ＵＰＲ経路の成分またはＩＲＥ１以外の調節物質
をコードしている１つまたは複数の発現ベクターでトランスフェクトまたはトランスダクションされている、動物細胞培養物または植物細胞培養物。
【請求項１２】
成分またはＩＲＥ１以外の調節物質がＸＢＰ１蛋白またはＡＴＦ６蛋白であり、１つまたは複数の発現ベクターが、
目的とする蛋白をコードしている少なくとも１種の組換え発現カセット、および
ＸＢＰ１蛋白またはＡＴＦ６蛋白をコードしている少なくとももう１種の組換え発現カセット
を含み、ここで細胞培養物中の少なくとももう１種の組換え発現カセットに対する少なくとも１種の組換え発現カセットのモル比率が０．５：１ないし１０：１である、請求項１１記載の細胞培養物。
【請求項１３】
哺乳動物細胞培養物であり、細胞培養物中の少なくとももう１種の組換え発現カセットに対する少なくとも１種の組換え発現カセットのモル比率が少なくとも３：１である、請求項１２記載の細胞培養物。
【請求項１４】
動物細胞または植物細胞において目的とする蛋白を発現する工程を含む方法であって、該細胞が、
目的とする蛋白、および
ＵＰＲ経路の成分またはＩＲＥ１以外の調節物質
をコードする１つまたは複数の組換え発現カセットを含む、方法。
【請求項１５】
細胞が動物細胞であり、かつ成分またはＩＲＥ１以外の調節物質がＸＢＰ１蛋白またはＡＴＦ６蛋白である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
動物細胞または植物細胞において目的とする蛋白を発現する工程を含む方法であって、該細胞が、
目的とする蛋白、および
細胞のＵＰＲＥまたはＥＲＳＥとの結合能を有するポリペプチド
をコードする１つまたは複数の組換え発現カセットを含む、方法。
【請求項１７】
細胞が動物細胞であり、かつポリペプチドがＸＢＰ１蛋白またはＡＴＦ６蛋白の転写活性化ドメインを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
動物細胞培養物または植物細胞培養物において目的とする蛋白を発現する工程を含む方法であって、細胞培養物が、
目的とする蛋白をコードしている少なくとも１種の組換え発現カセット、および
ＵＰＲ経路の成分またはＩＲＥ１以外の調節物質をコードしている少なくとももう１種の組換え発現カセット
を含む１つまたは複数の発現ベクターでトランスフェクトまたはトランスダクションされている、方法。
【請求項１９】
細胞培養物が哺乳動物細胞培養物であり、成分またはＩＲＥ１以外の調節物質がＸＢＰ１蛋白またはＡＴＦ６蛋白であり、かつ細胞培養物中の少なくとももう１種の組換え発現カセットに対する少なくとも１種の組換え発現カセットのモル比率が０．５：１ないし１０：１である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
目的とする治療用または予防用蛋白、および
ＵＰＲ経路の成分またはＩＲＥ１以外の調節物質
をコードする発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００４年９月２日に出願された米国特許仮出願第６０／６０６，４３９号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、目的とする蛋白を作製するための発現系およびこれを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
分泌蛋白および膜蛋白は、小胞体（ＥＲ）−ゴルジ系においてフォールディングおよび他の翻訳後修飾を受ける。この系の恒常性が混乱すると、アポトーシスを招き得る細胞ストレスが引き起こされる。ＥＲ恒常性は、ＥＲ管腔中のＣａ２＋濃度もしくは酸化還元状態の変化、グリコシル化の変更、またはアンフォールドもしくはミスフォールドされた蛋白の蓄積によって変更され得る。ストレスに打ち勝つために、分泌系は、小胞体ストレス応答（unfolded protein response）（ＵＰＲ）として公知の適応的ストレス応答機序を発達させた。哺乳動物のＵＰＲを活性化すると、少なくとも３種の応答をもたらす：（１）翻訳の減少によって、ＥＲ管腔に輸送される新しい蛋白の量が減少する；（２）ＥＲ管腔中に蓄積された蛋白がサイトゾルに逆輸送され、かつ分解される；および（３）ＥＲ−ゴルジ分泌系が改造されて、その結果、系における蛋白のフォールディングおよびプロセッシング能力が増強される。
【０００４】
ストレスに応答したＥＲ−ゴルジ系の能力増強は、フォールディング酵素およびプロセッシング酵素の上方調節を伴う。これらの酵素としては、ＥＲシャペロン、グリコシル化およびジスルフィド結合形成に関与している酵素、ならびに小胞輸送に関与している酵素が挙げられる。哺乳動物細胞において、ＩＲＥ１蛋白およびＡＴＦ６蛋白は、ＵＰＲ経路のこの分岐経路（ｂｒａｎｃｈ）の主要トランスデューサーである。ＩＲＥ１蛋白は、Ｃ末端の細胞質ゾルドメインにおいてキナーゼ活性およびエンドヌクレアーゼ活性を有するＥＲ膜貫通型糖蛋白である。少なくとも２種のＩＲＥ１遺伝子、すなわちＩＲＥ１αおよびＩＲＥ１βがマウスにおいて同定されている。ＩＲＥ１αは、生存能力のために不可欠であり、かつ広く発現されている。ＩＲＥ１βは、胃腸管粘膜中でのみ検出されている。ＥＲストレスは、ＩＲＥ１蛋白のオリゴマー化およびそれらの細胞質ゾルドメインのトランス自己リン酸化を招く。ＩＲＥ１のリン酸化により、転写因子Ｘボックス結合蛋白１（ＸＢＰ１）のｍＲＮＡからイントロンを切除するエンドヌクレアーゼ活性が活性化される。このスプライシング事象により、転写不活性なＸＢＰ１アイソフォーム（すなわちＸＢＰ１ｕ）が転写活性なＸＢＰ１アイソフォーム（すなわちＸＢＰ１ｓまたはＸＢＰ１ｐ）に変換される。次いで、ＸＢＰ１ｐが核中に移動し、そこで、ＥＲストレス応答エレメント（ＥＲＳＥ）およびＵＰＲエレメント（ＵＰＲＥ）を含む、ＥＲ−ゴルジシャペロン／酵素遺伝子の調節領域中の標的配列に結合して、それらの転写を誘導する。多くのＵＰＲ標的遺伝子は、プロモーター領域中にＥＲＳＥまたはＵＰＲＥ配列の１つまたは複数のコピーを有する。
【０００５】
ＡＴＦ６（転写活性化因子６）は、別のＥＲ膜貫通型蛋白である。ＥＲストレスは、ＡＴＦ６蛋白のゴルジ区画への移行をもたらし、そこでＡＴＦ６蛋白の細胞質ゾルドメインは、サイト１プロテアーゼおよびサイト２プロテアーゼによって切断される。切断された細胞質ゾルドメインは、核に移動し、かつＥＲＳＥ配列に結合することによって転写因子として作用し、その結果として、分泌経路中の様々なシャペロンおよびプロセッシング酵素を上方調節する。
【０００６】
哺乳動物細胞におけるＵＰＲ経路の活性化はまた、ＰＥＲＫシグナル伝達経路を介して蛋白翻訳の一過性阻害をもたらす。ＰＥＲＫは、ＥＲストレスに応答して真核生物の翻訳開始因子ｅＩＦ２αをリン酸化することができるＥＲ膜貫通型キナーゼである。ｅＩＦ２αのリン酸化は、４３Ｓリボソームの開始前複合体の集合を妨げ、したがって翻訳の低減をもたらす。逆説的に、ｅＩＦ２αリン酸化はまた、転写因子ＡＴＦ４の急速な合成をもたらし、その結果として、アポトーシス誘導性転写因子ＣＨＯＰの発現を増大させる。ＣＨＯＰは、ＥＲストレスの有害な作用にもはや打ち勝つことができない場合に細胞死を助長する。
【０００７】
哺乳動物細胞における組換え分泌蛋白の過剰発現は、低い産生収量をしばしば招く。蛋白産生を改善するために通常使用される方法は、より強力なプロモーターを使用することまたは遺伝子コピー数を増加させることなど、転写速度を上昇させることである。しかし、転写速度の上昇はＥＲストレスを悪化させることがあり、したがって、収量を有意に改善することにしばしば失敗する。いくつかの場合では、産生収量をさらに減少させることさえある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、分泌蛋白または膜蛋白の産生収量が改善された発現系を提供する。これらの系は、修飾された、かつ多くの場合には増強された蛋白フォールディングまたはプロセッシング能力を有する、遺伝子改変された動物細胞または植物細胞を使用する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様では、本発明は、（１）目的とする蛋白、および（２）ＵＰＲ経路の成分または調節物質をコードする１つまたは複数の組換え発現カセットを含む、遺伝子改変された動物細胞または植物細胞を特徴とする。適切なＵＰＲ成分または調節物質としては、それだけには限らないが、ＵＰＲ経路において機能的であるＩＲＥ１以外の分子が挙げられる。これらは、宿主細胞の内在性ＵＰＲ成分、またはそれらの変異体もしくは機能的等価物であり得る。これらは、内在性ＵＰＲ成分の活性または発現を直接的にまたは間接的に調節する、天然または非天然の分子でもよい。多くの場合において、ＵＰＲ成分／調節物質は、それらの発現または活性化により宿主細胞の蛋白フォールディングまたはプロセッシング能力が増大するように選択される。
【００１０】
例示的なＵＰＲ成分／調節物質としては、それだけには限らないが、ＸＢＰ１やＡＴＦ６などの転写因子、またはそれらの生物活性を有する断片もしくは変異体が挙げられる。ＸＢＰ１またはＡＴＦ６の媒介によるＵＰＲ経路中の他の成分もまた、使用することができる。さらに、ＥＲに内在するシャペロンまたはプロセッシング酵素も使用することができる。
【００１１】
本発明に従って作製され得る蛋白としては、それだけには限らないが、エリスロポイエチン、成長ホルモン、インスリン、インターフェロン、増殖因子、膜蛋白、または他の治療用、予防用、もしくは診断用の蛋白が挙げられる。多くの実施形態において、目的とする蛋白は、分泌蛋白または膜蛋白として宿主細胞によって発現される。
【００１２】
本発明の遺伝子改変された細胞は、細胞株、初代培養物、または他の単離細胞もしくは培養細胞に由来し得る。遺伝子改変された細胞はまた、ハイブリッド細胞でもよい。多くの場合において、ハイブリッド細胞は、動物細胞および（骨髄腫細胞のような）癌細胞を融合することによって作製される。目的とする蛋白またはＵＰＲ成分／調節物質をコードしている組換え発現カセットは、融合事象の前または後にハイブリッド細胞中に組み入れまたは導入することができる。さらに、本発明の遺伝子改変された細胞は、トランスジェニック動物またはトランスジェニック植物の細胞でもよい。一実施形態では、遺伝子改変された細胞は、哺乳動物細胞である。
【００１３】
組換え発現カセットは、様々な手段によって宿主細胞中に組み入れることができる。例えば、発現カセットは、宿主細胞の染色体またはゲノム中に安定に組み込むことができる。組込みは、ランダムまたは（例えばバクテリオファージＰ１のＣｒｅ−ｌｏｘ組換え系を用いることによる）標的化のいずれかでよい。発現カセットはまた、非組込み型発現ベクターを介して宿主細胞中に導入することもできる。
【００１４】
組換え発現カセットは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターによって制御することができる。また、組織特異的プロモーターまたは発生的に調節されているプロモーターによっても制御することができる。他のタイプのプロモーターも、本発明のために使用され得る。
【００１５】
別の態様では、本発明は、（１）目的とする蛋白、および（２）宿主細胞のＵＰＲＥまたはＥＲＳＥに結合することができるポリペプチドをコードする１つまたは複数の組換え発現カセットを含む、遺伝的に修飾された動物細胞または植物細胞を特徴とする。一実施形態では、ＵＰＲＥ結合ポリペプチドまたはＥＲＳＥ結合ポリペプチドは、ＸＢＰ１やＡＴＦ６などの転写因子である。別の実施形態では、ＵＰＲＥ結合ポリペプチドまたはＥＲＳＥ結合ポリペプチドは、ＵＰＲ遺伝子のプロモーター領域に別の蛋白を動員することができ、かつ後者の蛋白は、ＵＰＲ遺伝子の転写を活性化することができるトランス活性化ドメインを含む（例えば、ＸＢＰ１またはＡＴＦ６の転写活性化ドメイン）。
【００１６】
本発明の遺伝子改変された細胞は、同じまたは異なる組換え発現カセットから目的とする蛋白およびＵＰＲ成分／調節物質を発現することができる。目的とする蛋白およびＵＰＲ成分／調節物質は、同じまたは異なるプロモーターによって制御され得る。
【００１７】
一実施形態では、本発明の遺伝子改変された細胞は、（１）目的とする蛋白をコードしている第１の組換え発現カセット、および（２）ＵＰＲ成分もしくは調節物質またはＵＰＲＥもしくはＥＲＳＥ結合蛋白（例えばＸＢＰ１もしくはＡＴＦ６）をコードしている第２の組換え発現カセットを含む。細胞中の第２の組換え発現カセットの総数に対する第１の組換え発現カセットの総数の比率は、それだけには限らないが、０．１：１以下から少なくとも１０：１までの範囲であり得る。多くの場合において、第１の組換えカセットによって使用されるプロモーターは、第２の組換えカセットによって使用されるプロモーターと同じまたは同様の強度を有してよく、かつ第２の組換えカセットの総数に対する第１の組換えカセットの総数の比率は、０．５：１〜１０：１（少なくとも１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、または９：１など）の範囲である。第１および第２の組換えカセット中のプロモーターは、異なる強度を有してもよい。例えば、第１の組換えカセット中のプロモーターは、例えば少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍以上、第２の組換えカセット中のプロモーターより強力でよい。
【００１８】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の遺伝子改変された細胞を含む動物または植物を特徴とする。遺伝的に修飾された細胞を動物または植物中に組み入れるための方法は、当技術分野において周知である。多くの実施形態において、これらの動物または植物は、トランスジェニック動物またはトランスジェニック植物である。
【００１９】
さらに別の態様では、本発明は、（１）目的とする蛋白、および（２）ＵＰＲ経路の成分またはＩＲＥ１以外の調節物質をコードしている１つまたは複数の発現ベクターでトランスフェクトまたはトランスダクションされている細胞培養物を特徴とする。多くの実施形態において、発現ベクターは、目的とする蛋白をコードしている第１の組換え発現カセットおよびＵＰＲ成分または調節物質（例えばＸＢＰ１もしくはＡＴＦ６）をコードしている第２の組換え発現カセットを含む。第１および第２の発現カセットは、同じまたは異なる発現ベクターによって搭載され得る。細胞培養物中の第２の組換え発現カセットに対する第１の組換え発現カセットのモル比率は、例えば、少なくとも１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１以上など、０．１：１以下から少なくとも１０：１の範囲でよい。細胞培養物は、哺乳動物細胞培養物、昆虫細胞培養物、植物細胞培養物、または目的とする蛋白の作製に適した別の培養物でよい。
【００２０】
本発明はまた、目的とする蛋白の作製のために遺伝子改変された細胞、動物、植物、または細胞培養物を使用する方法も特徴とする。
【００２１】
さらに、本発明は、（１）目的とする蛋白、および（２）ＵＰＲ経路の成分またはＩＲＥ１以外の調節物質をコードする発現ベクターも特徴とする。
【００２２】
本発明の他の特徴、機能、目的、および利点は、以下の詳細な説明において明らかである。しかし、この詳細な説明は、本発明の好ましい実施形態を示すが、単なる例証に過ぎず、これらに限定されないことが理解されるべきである。本発明の範囲内の様々な変化および修正は、詳細な説明から当業者に明らかになると考えられる。
【００２３】
（図面の簡単な記載）
これらの図面は、例証のために提供され、これらに制約されるものではない。
【００２４】
図１は、ＰＡ  ＤＵＫＸ細胞におけるＢＭＰ６の過剰発現がＥＲストレスを引き起こすことを実証する。
【００２５】
図２は、ストレス無負荷条件またはストレス負荷条件下での、安定にトランスフェクトされた細胞株における外来性ＸＢＰ１の発現を示す。
【００２６】
図３は、親細胞ＣＨＯ  ＤＵＫＸよりもいくつかのＸＢＰ１細胞株においてＢＭＰ６分泌が増加していることを示す。
【００２７】
図４は、親細胞ＣＨＯ  ＤＵＫＸよりもいくつかのＸＢＰ１細胞株においてＩＬ１１ＲＦｃ分泌が増加していることを例示する。
【００２８】
図５は、ＧＦＰのトランスフェクション効率が、選択されたＸＢＰ１細胞株およびＣＨＯ  ＤＵＫＸ親細胞株において同様であることを実証する。
【００２９】
図６は、ＧＦＰの転写効率および翻訳効率が、選択されたＸＢＰ１細胞株およびＣＨＯ  ＣＵＫＸ親細胞株において同様であることを示す。
【００３０】
図７は、ＣＯＳ−１細胞における誘導性ＡＴＦ６蛋白の成功裡な発現を例示する。
【００３１】
図８は、標的蛋白の作製に対する、異なる比率のＸＢＰ１またはＡＴＦ６と標的蛋白ｃＤＮＡとの効果を表す。
【００３２】
図９は、異なる標的蛋白の発現に対するＸＢＰ１またはＡＴＦ６の効果を実証する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明は、目的とする蛋白を作製するための系および方法を提供する。本発明の発現系は、修飾された、または改善された蛋白フォールディングまたはプロセッシング能力を有する遺伝子改変された動物細胞または植物細胞を使用する。多くの実施形態において、本発明の遺伝子改変された細胞は、目的とする蛋白およびＵＰＲ経路の成分または調節物質をコードする、１つまたは複数の組換え発現カセットを含む。ＵＰＲ成分／調節物質の共発現により、目的とする蛋白の収量は有意に増加する。本発明に適したＵＰＲ成分／調節物質としては、それだけには限らないが、ＸＢＰ１やＡＴＦ６などの転写因子、またはそれらの生物活性を有する断片もしくは変異体が挙げられる。ＥＲに関連したシャペロンまた酵素も使用され得る。
【００３４】
本発明の様々な態様を以下の小節においてさらに詳細に説明する。小節の使用は、本発明を限定することを意図していない。各小節は、本発明の任意の態様に適用され得る。本明細書において使用される場合、「または」という用語は、別段の記載がない限り、「および／または」を意味する。
【００３５】
Ａ．目的とする蛋白
本発明に従って作製され得る蛋白としては、それだけには限らないが、エリスロポイエチン、成長ホルモン、インスリン、インターロイキン、増殖因子、インターフェロン、コロニー刺激因子、血液因子、ワクチン、コラーゲン、フィブリノーゲン、ヒト血清アルブミン、組織プラスミノーゲンアクチベータ、グルコシダーゼ、アルグルセラーゼ、ミエリン塩基性蛋白、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、ドーパデカルボキシラーゼ、または抗体などの治療用、予防用、または診断用の蛋白が挙げられる。本発明に適する例示的な抗体としては、それだけには限らないが、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、非特異的抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、人工抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、またはそれらの機能的断片が挙げられる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの提示技術または進化戦略を用いて選択される高親和性結合物も、本発明に従って作製することができる。これらの高親和性結合物としては、それだけには限らないが、ペプチド、抗体、および抗体模倣物が挙げられる。例えば、Ｂｉｎｚら、ＮＡＴ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．、２２：５７５〜５８２頁（２００４年）；ならびにＬｉｐｏｖｓｅｋおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｊ  ＩＭＭＵＮＯＬ  ＭＥＴＨＯＤＳ、２９０：５１〜６７頁（２００４年）を参照されたい。キナーゼ、ホスファターゼ、Ｇ蛋白共役型受容体、増殖因子受容体、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、細胞表面抗体（膜結合型免疫グロブリン）、ＢＭＰ／ＧＤＦ受容体、ニューロン受容体、イオンチャネル、プロテアーゼ、転写因子、またはポリメラーゼなど他の目的とする蛋白もまた、本発明によって作製することができる。
【００３６】
多くの実施形態において、本発明によって作製される蛋白は、組換え蛋白である。本明細書において使用される場合、組換え蛋白とは、組換えＤＮＡ技術を用いて構築または作製される蛋白を意味する。組換え蛋白は、天然に存在する配列または遺伝子改変された配列を有し得る。これは、例えば、組換えベクターから、または宿主細胞に内在するが、遺伝子改変された調節配列を有する遺伝子から発現され得る。例えば、組換え蛋白は、内在性であるが、遺伝子改変されたウイルスプロモーターを有する遺伝子から作製することができる。
【００３７】
多くの場合において、組換え蛋白は、発現産物の単離、精製、検出、固定化、安定化、フォールディング、またはターゲティングを容易にするためのポリペプチドタグを含む融合蛋白である。
【００３８】
他の多くの場合において、組換え蛋白は、シグナルペプチドを含む。シグナルペプチドは、作製される蛋白に対して内在性でも異種性でもよい。シグナルペプチドは、蛋白が粗面ＥＲ上で形成されるか遊離のリボソーム上で形成されるかをしばしば決定する。シグナルペプチドは、シグナル認識粒子と相互に作用し、かつ共翻訳的挿入が起こるＥＲにリボソームを誘導することができる。多くのシグナルペプチドは、疎水性が極めて高く、正に帯電した残基を有する。シグナルペプチドは、シグナルペプチダーゼ、すなわちＥＲの腔面上に位置している特殊なプロテアーゼによって伸長中のペプチド鎖から除去され得る。
【００３９】
シグナル配列によってＥＲに標的化された蛋白は、分泌蛋白として細胞外空間中に放出され得る。例えば、分泌蛋白を含む小胞は、細胞膜と融合し、次いでその内容物を細胞外空間中に放出することができる−エキソサイトーシスと呼ばれているプロセスである。エキソサイトーシスは、構成的に、または始動シグナルの受信後に生じ得る。後者の場合、これらの蛋白は、エキソサイトーシスが引き起こされるまで、分泌小胞（または分泌顆粒）中に貯蔵される  同様に、細胞膜上に存在する蛋白は、蛋白を膜に縛り付ける「リンカー」の蛋白分解切断によって細胞外空間中に分泌され得る。
【００４０】
目的とする蛋白は、様々な手段によって発現系から単離され得る。蛋白単離のための最初の材料の例としては、それだけには限らないが、培養培地または細胞溶解物が挙げられる。適切な単離方法としては、それだけには限らないが、アフィニティークロマトグラフィー、（イムノアフィニティークロマトグラフィーを含む）、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、蛋白沈降法（免疫沈降法を含む）、示差的可溶化、電気泳動、遠心分離、結晶化、またはそれらの組合せが挙げられる。ストレプトアビジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、またはＦｃ断片などのポリペプチドタグを目的とする蛋白に融合して、単離または精製を容易にすることができる。一実施例では、ポリペプチドタグは、プロテアーゼによって目的とする蛋白から切断可能である。
【００４１】
多くの実施形態において、本発明に従って単離される目的とする蛋白は、他の蛋白または混入物を実質的に含まない。例えば、単離された蛋白は、他の蛋白から少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％純粋であり得る。一実施例では、単離された蛋白は、意図した用途を妨害すると思われるわずかな量以下の混入物しか含まない。
【００４２】
本発明に従って単離される目的とする蛋白は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥやイムノアッセイなど標準的技術を用いて確認することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、クーマシーブルー、銀、または単離された蛋白を可視化するのに適する他の薬剤で染色することができる。適切なイムノアッセイとしては、それだけには限らないが、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、サンドイッチもしくは免疫測定アッセイ、ラテックスもしくは他の粒子の凝集、またはプロテオミクスチップが挙げられる。蛋白配列決定および質量分析法もまた、単離された蛋白を確認または解析するのに使用することができる。
【００４３】
Ｂ．ＵＰＲ成分／調節物質
本発明に適するＵＰＲ成分／調節物質には、ＵＰＲ経路において機能的である分子が含まれる。これらは、天然でも非天然でもよい。これらは、遺伝子改変されるか、化学的に合成されるか、または生物学的に単離され得る。ＵＰＲ成分／調節物質は、宿主細胞と同じまたは異なる種に由来し得る。ＵＰＲ成分／調節物質が発現されると、宿主細胞の分泌能力またはＥＲプロセッシング能力が改善する。多くの場合において、宿主細胞において目的とする蛋白とＵＰＲ成分／調節物質が共発現されると、目的とする蛋白の収量が少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、または１０倍以上、改善する。
【００４４】
本発明に適しているＵＰＲ成分／調節物質の例としては、それだけには限らないが、ＸＢＰ１やＡＴＦ６などの転写因子が挙げられる。ＸＢＰ１またはＡＴＦ６の断片のような、これらの転写因子の機能的等価物もまた、使用され得る。これらの断片は、転写的に活性化されたＸＢＰ１蛋白またはＡＴＦ６蛋白の転写活性の実質的な部分を少なくとも保持している。ＥＲシャペロンや蛋白グリコシル化もしくは小胞トランスロケーションに関与している酵素など、ＸＢＰ１またはＡＴＦ６の下流のエフェクターもまた、使用され得る。
【００４５】
さらに、ＸＢＰ１またはＡＴＦ６の媒介によるＵＰＲ経路の成分の発現または生物学的機能を活性化できるＩＲＥ１以外の調節物質も、使用され得る。このような調節物質は、自己過剰発現以外の機序によって、ＵＰＲ経路を調節することができる。例えば、このような調節物質は、成分に直接結合することによってＵＰＲ成分の機能を活性化することができ、または成分をコードする遺伝子中の調節配列に結合することによって成分の発現を調節することができる。
【００４６】
さらに、ＰＥＲＫシグナル伝達経路の成分の発現または生物学的機能を阻害し得る調節物質も使用され得る。これらの調節物質としては、それだけには限らないが、抗体、アンチセンスＲＮＡ、またはＲＮＡｉ配列が挙げられる。さらに、ＰＥＲＫ経路成分の優性ネガティブな変異体も使用され得る。このような優性ネガティブな変異体の例は、５１位（マウスの配列）のセリンがアラニンに置換されたｅＩＦ２ａ  Ｓ５１Ａ変異体である。この置換により、蛋白がリン酸化される能力が消失し、したがって、ＥＲストレスの間の蛋白翻訳速度に対する阻害効果が消滅する。同様に、ＰＥＲＫのキナーゼドメイン中に変異を導入して、ｅＩＦ２ａをリン酸化するキナーゼ活性を消失または低下させ、それによってＥＲストレスの間の翻訳の低減またはアポトーシスの誘導を防止することもできる。
【００４７】
一実施形態では、ＸＢＰ１蛋白または生物活性を有するその断片が、宿主細胞における目的とする蛋白の収量を増加させるために使用される。ＸＢＰ１蛋白は、ＤＮＡ結合能力および２量体化能力を与える、転写因子中に一般に存在する２つのドメインを含む。ＸＢＰ１は、Ｘボックスと呼ばれるプロモーターエレメントに結合することによってＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を調節する転写因子として公知である。ＸＢＰ１は、Ｔ細胞白血病ウイルス１型のプロモーター中のエンハンサーにも結合する。
【００４８】
ＵＰＲ経路の活性化は、シノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）モデル系および哺乳動物モデル系の双方において、ＸＢＰ１  ｍＲＮＡからの小さなイントロンのＩＲＥ１依存性のスプライシングをもたらす。結果として生じるエキソンは、ｔＲＮＡリガーゼによって結合される。このスプライシング事象は、ＸＢＰ１  ｍＲＮＡ中のフレームシフトをもたらし、それにより、元のＮ末端ＤＮＡ結合ドメインを有するが、Ｃ末端の新しいトランス活性化ドメインを有する蛋白が生じる。マウス細胞では、スプライシング事象により、２６７アミノ酸のＸＢＰ１アイソフォームが３７１アミノ酸のＸＢＰ１アイソフォーム（ＸＢＰ１ｓまたはＸＢＰ１ｐ）に変換される。Ｃａｌｆｏｎら、ＮＡＴＵＲＥ、４１５：９２〜９６頁（２００２年）を参照されたい。
【００４９】
ＸＢＰ１ｐ蛋白は、多くのＥＲシャペロンまたはＵＰＲ遺伝子のプロモーター領域中のＥＲＳＥ配列またはＵＰＲＥ配列に結合して、これらの遺伝子の転写を活性化する。哺乳動物では、少なくとも２種のＥＲＳＥ配列、すなわちＥＲＳＥ−ＩおよびＥＲＳＥ−ＩＩが同定されている。ＥＲＳＥ−Ｉは、配列番号１（ＣＣＡＡＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＣＡＣＧ）において示される保存配列を有する。ＥＲＳＥ−ＩＩは、配列番号２（ＡＴＴＧＧＮＣＣＡＣＧ）において表される保存配列を有する。さらに、少なくとも２種の哺乳動物のＵＰＲＥ配列が同定されており、一方は配列番号３（ＴＧＡＣＧＴＧＧ）において表される保存配列を有し、もう一方は、配列番号４（ＴＧＡＣＧＴＧＡ）において例示される保存配列を有する。
【００５０】
ＸＢＰ１蛋白のコード配列は、様々な情報源から得ることができる。例えば、ヒト、マウス、ラット、ニワトリ、ショウジョウバエ、およびゼブラフィッシュのＸＢＰ１蛋白のコード配列は、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）（ベセスダ、メリーランド州）のＥｎｔｒｅｚヌクレオチドデータベースから得ることができる。これらの配列のＥｎｔｒｅｚアクセッション番号は、それぞれ、ＮＭ＿００５０８０、ＮＭ＿０１３８４２、ＮＭ＿００１００４２１０、ＮＭ＿００１００６１９２、ＮＭ＿０７９９８３、またはＮＭ＿１３１８７４である。
【００５１】
ＸＢＰ１蛋白の生物活性を有する断片は、ＸＢＰ１ｐ蛋白の転写活性化活性の実質的な部分を少なくとも保持している。例えば、本発明において使用するＸＢＰ１断片は、ＸＢＰ１ｐの転写活性化活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％以上を保持し得る。転写的に活性なＸＢＰ１断片は、多数の手段によって選択することができる。一実施例では、転写的に活性なＸＢＰ１断片は、ＥＲＳＥ配列またはＵＰＲＥ配列から下流の遺伝子の転写を活性化する能力に基づいて選択される。
【００５２】
別の実施形態では、ＡＴＦ６蛋白または生物活性を有するその断片が、宿主細胞における目的とする蛋白の収量を改善するために使用される。ＡＴＦ６は、ＥＲ管腔中に位置する「感知」ドメインおよび細胞質ゾルの転写トランス活性化ドメインを含む膜貫通型蛋白である。ＥＲストレスが起こると、ＡＴＦ６の細胞質ゾルドメインは切り離され、かつ核へと輸送され、そこでＥＲＳＥ配列に結合し、それによって下流のＵＰＲ遺伝子を活性化する。少なくとも２種のＡＴＦ６蛋白、すなわち、ＡＴＦ６αおよびＡＴＦ６βが同定されている。ＡＴＦ６αおよびＡＴＦ６βは、構造的に関連しており、かつｂ−ｚｉｐドメインに顕著な類似性を共有している。ヒトマウス、ヒツジ、およびニワトリのＡＴＦ６蛋白の例示的なコード配列のＥｎｔｒｅｚアクセッション番号は、それぞれ、ＮＭ＿００７３４８、ＸＭ＿１２９５７９、ＡＹ９４２６５４、およびＸＭ＿４２２２０８である。
【００５３】
本発明で使用されるＸＢＰ１断片と同様に、ＡＴＦ６蛋白の生物活性を有する断片は、活性化されたＡＴＦ６蛋白またはその細胞質ゾルドメインの転写活性化活性の実質的な部分を少なくとも保持している。生物活性を有するＡＴＦ６断片は、ＥＲＳＥ配列へのその結合、およびその断片がＥＲＳＥ配列の下流の遺伝子の転写を活性化する能力をモニターすることによって選択することができる。
【００５４】
さらに別の実施形態では、ＥＲに内在するプロセッシング酵素またはシャペロンが、宿主細胞における目的とする蛋白の収量を増加させるために使用される。ＥＲに配置されている適切な酵素／シャペロンの例としては、それだけには限らないが、ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４、ＧＲＰ５８、蛋白ジスルフィドイソメラーゼ、カルネキシン、およびカルレチキュリン（ｃａｌｒｅｃｔｉｃｕｌｉｎ）が挙げられる。一実施例では、本発明において使用されるＥＲ酵素（またはシャペロン）の内在性の対応物は、１つまたは複数のＥＲＳＥ−Ｉ配列またはＥＲＳＥ−ＩＩ配列を含むプロモーター領域を有する。別の実施例では、本発明において使用されるＥＲ酵素（またはシャペロン）の内在性の対応物は、１つまたは複数のＵＰＲＥ配列を含むプロモーター領域を有する。
【００５５】
本発明はまた、内在性蛋白の変異体であるＵＰＲ成分の使用も特徴とする。内在性ＵＰＲ成分の変異体は、対立遺伝子の変異や多形性によるものなど天然に存在するものでよく、または故意に設計されてもよい。変異体のＵＰＲ活性は、元の蛋白（例えば、ＸＢＰ１ｐ、転写的に活性化されたＡＴＦ６蛋白、または生物活性を有するその断片）と比べて実質的に低下しない。多くの実施形態において、本発明において使用される変異体は、対応する元の蛋白のＵＰＲ活性の少なくとも５０％を保持している。例えば、変異体は、元の蛋白のＵＰＲ活性の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％を保持し得る。一実施形態では、本発明において使用される変異体は、元の蛋白と比べて増大したＵＰＲ活性を示す。ＵＰＲ成分の望ましい変異体は、変異体の発現または活性化により、宿主細胞におけるコトランスフェクトされた蛋白の分泌が促進されるように選択され得る。
【００５６】
変異体のアミノ酸配列は、元の蛋白のものと実質的に同一である。多くの場合において、変異体のアミノ酸配列は、元の蛋白に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の全体的配列の同一性または類似性を有する。配列の同一性または類似性は、様々な方法によって決定することができる。一実施形態では、配列の同一性または類似性は、配列アラインメントアルゴリズムを用いることによって決定される。この目的に適したアルゴリズムとしては、それだけには限らないが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．、２１５：４０３〜４１０頁（１９９０年）において記載されているＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．、４８：４４４〜４５３頁（１９７０年）のアルゴリズム、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ、ＣＯＭＰＵＴＥ．ＡＰＰＬＥ．ＢＩＯＳＣＩ．、４：１１〜１７頁（１９８８年）のアルゴリズム、ならびにドットマトリックス解析が挙げられる。この目的に適したコンピュータプログラムとしては、それだけには限らないが、ＮＣＢＩによって提供されるＢＬＡＳＴプログラム、ＤＮＡＳＴＡＲ（マディソン、ウィスコンシン州）によって提供されるＭｅｇＡｌｉｇｎ、およびＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）ＧＡＰプログラム（ニードルマン−ウェンチ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｅｎｃｈ）アルゴリズム）が挙げられる。ＧＡＰプログラムの場合、デフォルト値を使用してよい（例えば、配列のうちの１つにおいてギャップを開始するためのペナルティは１１であり、かつギャップを伸長するためのペナルティは８である）。類似アミノ酸は、ＢＬＯＳＳＯＭ置換行列によって定義することができる。
【００５７】
ＵＰＲ成分の望ましい変異体を調製するために多数の方法が利用可能である。例えば、変異体は、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、１０個、または２０個以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または他の修飾によって、元の蛋白から誘導することができる。置換は、保存的でも非保存的でもよい。多くの場合において、保存的アミノ酸置換は、蛋白の構造も生物活性も有意に変更せずに、蛋白配列中に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、または両親媒性の性質の類似性に基づいて実施することができる。例えば、保存的アミノ酸置換は、リシン（ＬｙｓもしくはＫ）、アルギニン（ＡｒｇもしくはＲ）、およびヒスチジン（ＨｉｓもしくはＨ）など塩基性側鎖を有するアミノ酸；アスパラギン酸（ＡｓｐもしくはＤ）およびグルタミン酸（ＧｌｕもしくはＥ）など酸性側鎖を有するアミノ酸；アスパラギン（ＡｓｎもしくはＮ）、グルタミン（ＧｌｎもしくはＱ）、セリン（ＳｅｒもしくはＳ）、トレオニン（ＴｈｒもしくはＴ）、およびチロシン（ＴｙｒもしくはＹ）など非荷電極性側鎖を有するアミノ酸；あるいはアラニン（ＡｌａもしくはＡ）、グリシン（ＧｌｙもしくはＧ）、バリン（ＶａｌもしくはＶ）、ロイシン（ＬｅｕもしくはＬ）、イソロイシン（ＩｌｅもしくはＩ）、プロリン（ＰｒｏもしくはＰ）、フェニルアラニン（ＰｈｅもしくはＦ）、メチオニン（ＭｅｔもしくはＭ）、トリプトファン（ＴｒｐもしくはＷ）、またはシステイン（ＣｙｓもしくはＣ）など非極性側鎖を有するアミノ酸の間で実施することができる。通常使用されるアミノ酸置換の例を表１に例示する。
【表１】
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【００５８】
他の望ましいアミノ酸置換も、ＵＰＲ成分中に導入することができる。例えば、アミノ酸置換をＵＰＲ成分中に導入して、その安定性を高めることができる。別の例では、アミノ酸置換を導入して、ＵＰＲ成分のＵＰＲ活性を増大または低下させることができる。
【００５９】
さらに、本発明は、宿主細胞のＵＰＲＥ配列またはＥＲＳＥ配列に結合することができるポリペプチドの使用も特徴とする。これらのポリペプチドは、単独でまたは他の蛋白との組合せで、ＵＰＲＥまたはＥＲＳＥのプロモーター領域を有する遺伝子の転写を活性化するための転写因子として機能することができる。
【００６０】
Ｃ．組換え発現カセットおよび宿主細胞
本発明において使用される典型的な組換え発現カセットは、５’側の非翻訳調節領域および３’側の非翻訳調節領域に作動的に連結されている蛋白コード配列を含む。この蛋白コード配列は、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、それらの混合物、または他の発現可能な配列でよい。
【００６１】
一実施形態では、組換え発現カセットは、コードされている蛋白の発現を指示するのに必要な調節エレメントのすべてを含む。適切な５’側の非翻訳調節エレメントの例としては、プロモーター、エンハンサー、またはコザック配列が挙げられる。適切な３’側の非翻訳調節エレメントの例としては、ポリアデニル化配列または他の転写／翻訳終結配列が挙げられる。発現カセットのための適切なプロモーター、エンハンサー、または他の調節エレメントの選択は、当業者のレベルの範囲のごく普通の設計の事項である。多くのこのようなエレメントは文献に記載されており、かつ商業的な供給業者を通じて入手可能である。
【００６２】
本発明に適したプロモーターとしては、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターが挙げられる。これらのプロモーターは、宿主細胞に対して内在性でも異種性でもよい。一実施形態では、組織特異的プロモーターが使用される。適切な組織特異的プロモーターとしては、それだけには限らないが、肝臓に特異的なプロモーター、リンパ系に特異的なプロモーター、Ｔ細胞に特異的なプロモーター、神経単位に特異的なプロモーター、膵臓に特異的なプロモーター、または乳腺に特異的なプロモーターが挙げられる。発生的に調節されているプロモーターも、使用することができる。組織特異的プロモーターまたは発生的に調節されたプロモーターを有する組換え発現カセットを使用して、トランスジェニック動物またはトランスジェニック植物を作製することができる。このような組換え発現カセットにコードされている蛋白は、特定の組織において、またはトランスジェニック動物もしくはトランスジェニック植物の特定の発生段階に産生され得る。
【００６３】
別の実施形態では、誘導発現系を使用して、目的とする蛋白またはＵＰＲ成分／調節物質を作製する。この目的に適する系としては、それだけには限らないが、Ｔｅｔ−ｏｎ／ｏｆｆ系、エクジソン系、およびラパマイシン系が挙げられる。Ｔｅｔ−ｏｎ／ｏｆｆ系は、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｎ１０トランスポゾンのテトラサイクリン耐性オペロンに由来する２種の調節エレメントに基づいている。この系は、２種の構成要素、すなわち調節カセットおよびレポーターカセットを含む。Ｔｅｔ−ｏｆｆ系の１つの形態では、調節カセットは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のＶＰ１６活性化ドメインに融合されたＴｅｔリプレッサー（ｔｅｔＲ）を含むハイブリッド蛋白をコードする。レポーターカセットは、レポート遺伝子に作動的に連結されているｔｅｔ−応答エレメント（ＴＲＥ）を含む。レポーター遺伝子は、例えば、目的とする蛋白またはＵＰＲ成分／調節物質をコードし得る。誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリン）がない場合、ｔｅｔＲ−ＶＰ１６融合蛋白はＴＲＥに結合し、それによってレポーター遺伝子の転写を活性化する。Ｔｅｔ−ｏｎ系の１つの形態では、調節カセットは、ＨＳＶのＶＰ１６活性化ドメインに融合された、変異Ｔｅｔリプレッサー（ｒｔｅｔＲ）を含むハイブリッド蛋白をコードする。ｒｔｅｔＲは、誘導物質（例えばテトラサイクリンまたはドキシサイクリン）の存在下でＴＲＥに結合し、かつ活性化する、逆のＴｅｔリプレッサーである。
【００６４】
エクジソン系は、ショウジョウバエにおける脱皮誘導系に基づいている。１つの形態では、この系は、機能性のエクジソン受容体をコードする調節カセット、およびレポーター遺伝子に作動的に連結されているエクジソン応答性プロモーターを含むレポーターカセットを含む。誘導物質（ポナステロンＡまたはムリステロンＡなど）の存在下で、エクジソン受容体はエクジソン応答性プロモーターに結合して、レポーター遺伝子の転写を活性化する。
【００６５】
ＣＩＤ系（２量体化の化学誘導物質）としても公知のラパマイシン系は、２種のキメラ蛋白を使用する。第１のキメラ蛋白には、ＤＮＡ応答エレメントに結合するＤＮＡ結合ドメインに融合されたＦＫＢＰ１２が含まれる。第２のキメラ蛋白には、転写活性化ドメインに融合されたＦＲＡＰが含まれる。ラパマイシンの添加は、２種のキメラ蛋白の２量体化を引き起こし、それによって、ＤＮＡ応答エレメントに制御されている遺伝子の発現を活性化する。
【００６６】
一実施例では、本発明において使用される組換え発現カセットは、配列番号５を含む。配列番号５の転写により、スプライシングされていないヒトＸＢＰ１  ｍＲＮＡが生成する。ＥＲストレスによりＩＲＥ１が活性化され、これが、スプライシングされていないｍＲＮＡからイントロンを切断する。スプライシングされたｍＲＮＡの翻訳により、成熟した、かつ機能性のＸＢＰ１蛋白が生成する。このアミノ酸配列を配列番号６において示す。
【００６７】
別の実施例では、本発明において使用される組換え発現カセットは、配列番号７を含む。配列番号７は、切断可能なイントロン配列を全く含まない。配列番号７の発現により、成熟した、かつ機能性のヒトＸＢＰ１蛋白（配列番号６）が生成する。配列番号６またはその機能的等価物をコードする他の核酸配列もまた、本発明の組換え発現カセットを調製するのに使用され得る。これらの核酸配列は、イントロンまたは他の除去可能な配列を含んでも含まなくてもよい。
【００６８】
さらに別の実施例では、本発明において使用される組換え発現カセットは、配列番号８を含む。配列番号８の転写および翻訳により、ヒトＡＴＦ６蛋白が生成する。このアミノ酸配列を配列番号９において示す。
【００６９】
別の実施例において、本発明において使用される組換え発現カセットは、配列番号９のアミノ酸残基１〜３６６をコードする核酸配列を含む。このような核酸配列の例は、配列番号８のヌクレオチド１〜１０９８である。配列番号９のアミノ酸残基１〜３６６は、ヒトＡＴＦ６蛋白のロイシンジッパー領域の塩基性領域全体および大部分を含む。このＡＴＦ６断片は、内在性ＧＲＰ７８遺伝子を活性化できることが示された。Ｈａｚｅら、ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．ＣＥＬＬ、１０：３７８７〜３７９９頁（１９９９年）を参照されたい。
【００７０】
非ヒト種に由来するＸＢＰ１蛋白またはＡＴＦ６蛋白をコードしている組換えカセットもまた、本発明において使用され得る。例えば、げっ歯動物または他の動物種のＸＢＰ１蛋白またはＡＴＦ６蛋白が使用され得る。これらのＸＢＰ１蛋白またはＡＴＦ６蛋白は、これらの蛋白と目的とする蛋白の共発現により、宿主細胞における後者の蛋白の収量が改善するように、選択することができる。
【００７１】
組換え発現カセットは、様々な手段によって宿主細胞中に組み入れることができる。一実施形態では、組換え発現カセットは、トランスフェクションベクターまたはトランスダクションベクターを用いることによって、宿主真核細胞中に導入される。この目的に適したベクターとしては、それだけには限らないが、昆虫細胞発現ベクター（例えばバキュロウイルス発現ベクター）または哺乳動物の発現ベクターが挙げられる。これらのベクターは、エピソーム、コスミド、ウイルス、またはそれらの組合せなど様々な供給源に由来してよい。多くの場合において、これらのベクターは、宿主細胞中への組入れを容易にするための選択マーカーを含む。
【００７２】
別の実施形態では、本発明において使用される組換え発現カセットは、宿主細胞中の内在性遺伝子を修飾することによって構築される。この内在性遺伝子は、目的とする蛋白またはＵＰＲ成分／調節物質をコードし得る。所望の発現または調節効果を実現するために、内在性遺伝子中の多くの部分を修飾することができる。例えば、内在性遺伝子の元のプロモーターを、遺伝子の発現レベルを増大させるために、ウイルスプロモーターによって置き換えることができる。
【００７３】
組換え発現カセットは、様々な形態で宿主細胞中に組み入れることができる。例えば、組換え発現カセットは、宿主細胞の染色体またはゲノム中に組み込まれ得る。組換え発現カセットはまた、宿主細胞において非組込み型発現ベクターに搭載されてもよい。発現ベクターまたはカセットを宿主細胞中に安定にまたは一過性に導入するための方法は、当技術分野において公知である。一実施例では、発現ベクターまたはカセットは、標的化された組込みによって宿主細胞の染色体中に組み入れられる。この目的に適した方法としては、それだけには限らないが、Ｃｒｅ−ｌｏｘ組換え系ならびに米国特許第６６５６７２７号、第６５３７５４２号、および第６５４１２３１号において記載されているものが挙げられる。
【００７４】
多くの実施形態において、本発明の遺伝子改変された細胞は、（１）目的とする蛋白をコードしている第１の組換え発現カセット、および（２）ＵＰＲ成分／調節物質（例えばＸＢＰ１またはＡＴＦ６）をコードしている第２の組換え発現カセットを含む。細胞中の第２の組換え発現カセットの総数に対する第１の組換え発現カセットの総数の比率は、例えば、０．１：１以下から少なくとも１０：１までの範囲であり得る。適切な比率の非限定的な例としては、０．２：１〜５：１、０．５：１〜５：１、１：１〜２：１、１：１〜３：１、１：１〜４：１、１：１〜５：１、２：１〜３：１、２：１〜４：１、および２：１〜５：１が挙げられる。第１および第２の組換え発現カセットは、同じまたは異なるベクターに搭載されてよく、かつ同じまたは異なる強度を有する同じまたは異なるプロモーターによって駆動されてよい。一実施例では、第１の組換え発現カセット中のプロモーターは、第２の組換え発現カセット中のものと同じまたは同様の強度を有し、かつ第２の組換えカセットの総数に対する第１の組換えカセットの総数の比率は、少なくとも、１：１、２：１、３：１、４：１、または５：１以上である。
【００７５】
本発明に適した宿主細胞としては、動物細胞または植物細胞が挙げられる。宿主細胞は、細胞株や一次培養物などの培養細胞でよい。これらは、トランスジェニック動物またはトランスジェニック植物中の細胞でもよい。適切な宿主細胞の選択、ならびに培養、トランスフェクション／トランスダクション、増幅、スクリーニング、生成物の作製、および精製のための方法は、当技術分野において公知である。
【００７６】
一実施形態では、本発明において使用される宿主細胞は、哺乳動物細胞である。適切な哺乳動物細胞の例としては、それだけには限らないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、ＣＶ−１細胞、ならびにアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（マナッサス、バージニア州）によって収集されている他の哺乳動物細胞株が挙げられる。いくつかの場合では、発現された蛋白に対して所望の翻訳後修飾をしばしば提供する、治療的または予防的蛋白をヒト細胞において作製することが望ましい。
【００７７】
本発明において使用される宿主細胞はまた、２種以上の細胞の融合によって作り出されるハイブリッド細胞でもよい。多くの場合において、本発明において使用されるハイブリッド細胞は、動物細胞（例えば哺乳動物細胞）および癌／不死細胞（例えば骨髄腫細胞または芽細胞腫細胞）を融合させることによって作製される。動物細胞および癌／不死細胞は、同じ種に由来してよい。これらは、異なる種に由来してもよい。ハイブリッド細胞を作製するために、当技術分野において公知の任意の方法を使用してよい。これらの方法としては、それだけには限らないが、電気融合または化学的融合（例えばポリエチレングリコール融合）が挙げられる。
【００７８】
組換え発現カセットは、融合事象の前または後にハイブリッド細胞中に導入または組み入れることができる。例えば、目的とする蛋白をコードしている組換え発現カセットは、外来性のＵＰＲ成分または調節物質を発現している癌細胞と細胞が融合される前に、哺乳動物細胞中に組み入れることができる。別の場合では、目的とする蛋白およびＵＰＲ成分または調節物質をコードしている組換え発現ベクターで哺乳動物細胞を先にトランスフェクトまたはトランスダクションし、次いで癌細胞と融合させることができる。本発明のハイブリッド細胞を調製するために、他の手順も使用され得る。
【００７９】
多くの実施形態において、ハイブリッド細胞を調製するために使用される癌／不死細胞は、１種または複数種の選択剤に感受性である。例えば、癌／不死細胞は、「ＨＡＴ培地」として公知である、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培養培地に対して感受性でよい。これらのＨＡＴ感受性細胞は、ＨＡＴ培地に非感受性の細胞と融合される。このようにして作製されたハイブリッド細胞は、未融合細胞を死滅させるＨＡＴによって選択される。次いで、融合された細胞を、所望の特徴に関してスクリーニングする。
【００８０】
本発明はまた、本発明の宿主真核細胞を含む動物または植物も特徴とする。組換え細胞を動物または植物中に組み入れるための方法は、当技術分野において周知である。多くの実施形態において、これらの動物または植物は、目的とする蛋白およびＵＰＲ成分／調節物質をコードしている１つまたは複数の導入遺伝子を含むトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物である。トランスジェニック動物またはトランスジェニック植物は、標準的技術を用いることによって作製することができる。一実施形態では、トランスジェニック動物は、非ヒト動物である。
【００８１】
本発明はさらに、（１）目的とする蛋白、および（２）ＵＰＲ成分／調節物質をコードしている１つまたは複数の発現ベクターでトランスフェクトまたはトランスダクションされている、動物細胞培養物または植物細胞培養物も特徴とする。細胞培養物は、哺乳動物細胞培養物、昆虫細胞培養物、植物細胞培養物、または目的とする蛋白の作製に適した他の培養物でよい。発現ベクターは、一過性にまたは安定にトランスフェクトまたはトランスダクションされ得る。一実施形態では、使用される発現ベクターは、目的とする蛋白をコードしている第１の組換え発現カセットおよびＵＰＲ成分／調節物質（例えばＸＢＰ１またはＡＴＦ６）をコードしている第２の組換え発現カセットを含む。第１および第２の発現カセットは、同じまたは異なる発現ベクターによって搭載され得る。これらは、同じまたは異なるプロモーターによって駆動され得る。第２の組換え発現カセットに対する第１の組換え発現カセットのモル比率は、例えば、０．１：１以下から少なくとも１０：１の範囲であり得る。
【００８２】
一実施例では、第１の組換えカセットによって使用されるプロモーターは、第２の組換えカセットによって使用されるプロモーターと同じまたは同様の強度を有し、かつ細胞培養物中の第２の組換えカセットに対する第１の組換えカセットのモル比率は、少なくとも１：１、２：１、３：１、４：１、または５：１以上など、０．５：１から１０：１までの範囲である。
【００８３】
Ｄ．医薬組成物
本発明によって作製される治療用または予防用蛋白を用いて、治療を必要とする患者または動物の治療用の医薬組成物を調製することができる。本発明の医薬組成物は、典型的には、有効量の治療用または予防用蛋白および製薬上許容される担体を含む。適切な製薬上許容される担体としては、薬学的適用に適合性のある、溶剤、可溶化剤、増量剤、安定化剤、結合剤、吸着剤、基剤、緩衝剤、滑沢剤、制御放出ビヒクル、希釈剤、乳化剤、湿潤剤、流動促進剤、分散媒、被覆剤、抗菌剤または抗真菌剤、等張化剤、および吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および作用物質の使用は、当技術分野において周知である。補助的な作用物質も組成物中に組み入れてよい。
【００８４】
本発明の医薬組成物は、所期の投与経路に適合するように調剤することができる。投与経路の例としては、非経口投与、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口投与、吸入投与、経皮投与、直腸投与、経粘膜投与、局所投与、および全身投与が挙げられる。一実施例では、投与は、埋め込み剤によって実施される。
【００８５】
非経口、皮内、または皮下適用のために使用される液剤または懸濁剤は、以下の成分を含み得る：注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶剤などの無菌希釈剤；ベンジンアルコールやメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸や重硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；アセタート、シトラート、またはホスファートなどの緩衝剤；および塩化ナトリウムやデキストロースなど張性を調整するための作用物質。ｐＨは、塩酸や水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調整することができる。非経口調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数回投与用バイアル中に入れることができる。
【００８６】
本発明の医薬組成物は、所望の投薬量で患者または動物に投与することができる。適切な投薬量は、例えば５ｍｇ〜１００ｍｇ、１５ｍｇ〜８５ｍｇ、３０ｍｇ〜７０ｍｇ、または４０ｍｇ〜６０ｍｇの範囲でよい。５ｍｇ未満または１００ｍｇを上回る投薬量も使用することができる。医薬組成物は、１回用量または複数用量で投与することができる。これらの用量は、毎日１回、毎週１回、または毎月１回などの間隔で投与することができる。
【００８７】
治療用蛋白の毒性および治療有効性は、細胞培養または実験動物モデルにおける標準的な薬学的手順によって測定することができる。例えば、ＬＤ５０（母集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（母集団の５０％において治療的に有効な用量）が測定され得る。毒性作用と治療的効果の用量比率が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表すことができる。多くの場合、より大きな治療指数を示す治療用蛋白が選択される。
【００８８】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータを用いて、ヒトにおいて使用するための投薬量の範囲を決定することができる。一実施形態では、投薬量は、毒性をほとんどまたは全く伴わずに、母集団の少なくとも５０％において治療的有効性を示す範囲内である。投薬量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動してよい。
【００８９】
本発明によって作製される治療用蛋白を投与するための投与計画は、蛋白の作用、病変の部位、疾患の重症度、患者の年齢、性別、および食生活、炎症があればその重症度、投与時間、ならびに他の臨床的因子など様々な因子に基づいて、主治医によって決定され得る。一実施例では、最小限に有効な用量で全身投与または注射投与を開始し、かつ良い効果が観察されるまで、予め選択した期間を通して用量を増加させる。続いて、生じる可能性のある有害作用があればそれらを考慮しつつ、対応する効果の増大をもたらすレベルに制限しながら投薬量を漸増させる。
【００９０】
治療の経過は、疾患の進行の定期的評価によって観察することができる。経過は、例えばＸ線、ＭＲＩ、もしくは他の画像診断様式、滑液分析、または臨床的検査によって観察することができる。
【００９１】
目的とする治療用または予防用蛋白はまた、遺伝子デリバリーベクターを用いることによって、ヒトまたは動物中に導入することもできる。この目的に適したベクターとしては、それだけには限らないが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス性（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、アルファウイル、アストロウイルス、コロナウイルス、オルソミクソウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、またはトガウイルスのベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。リポソームに封入された発現ベクターもまた、遺伝子デリバリーに使用することができる。多くの実施形態において、遺伝子デリバリーベクターは、目的とする蛋白およびＵＰＲ調節物質の双方をコードしている。ＵＰＲ調節物質の共発現により、標的細胞（例えば腫瘍細胞または他の機能障害細胞）における目的とする蛋白の産生が促進される。目的とする蛋白およびＵＰＲ調節物質はまた、異なるベクターを用いて標的細胞に送達することもできる。遺伝子デリバリーは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで実施することができる。
【００９２】
一実施形態では、目的とする治療用／予防用蛋白またはＵＰＲ調節物質を標的細胞中に導入するために、細胞特異的な遺伝子デリバリー方法が使用される。当技術分野において公知の多くの細胞特異的な遺伝子デリバリー方法を本発明のために使用することができる。例えば、細胞特異的なリガンド（例えば、標的細胞の表面抗原に特異的な抗体）を、治療用／予防用蛋白またはＵＰＲ調節物質をコードするウイルスベクターのエンベロープに組み入れ、または結合させることができる。このリガンドは、特定の細胞型中へのウイルスベクターの侵入を媒介することができる。抗体結合リポソームもまた、特定の標的細胞に遺伝子治療用ベクターを送達するために使用することができる。
【００９３】
上述の実施形態および以下の実施例は、例証に過ぎず、これらに限定されないことが理解されるべきである。本発明の範囲内の様々な変更および修正は、本明細書から当業者に明らかになると考えられる。
【実施例】
【００９４】
実施例１  ＣＯＳ−１細胞株およびＤＵＫＸ細胞株
アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（マナッサス、バージニア州）からＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６５０のＣＯＳ−１細胞を入手した。ＣＨＯ  ＤＵＫＸ細胞およびＰＡ  ＤＵＫＸ細胞の両方とも、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の派生物である、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−６１）に由来した。
【００９５】
ＤＵＸＫ  Ｂ１１細胞またはＤＸＢ１１細胞とも呼ばれるＣＨＯ  ＤＵＸＫ細胞は、ＤＮＡ複製のプロセスにおいて重要な酵素であるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）の産生に欠陥がある。両方のｄｈｆｒアレルが変異している細胞を選択するために、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ（ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７７：４２１６〜４２２０頁（１９８０年））は、２つの工程で変異誘発および選択を実施した。ｄｈｆｒ＋細胞に対して使用される選択剤は、トリチウム標識したデオキシウリジンであった。トリチウム標識したデオキシウリジンは、ＤＮＡ中への組入れおよびそれに続く放射性崩壊が原因となって、細胞に対して毒性である。デオキシウリジンがＤＮＡ中に組み入れられるには、チミジル酸にそれが変換される必要があり、このプロセスのためにＤＨＦＲが不可欠である。ｄｈｆｒ−変異細胞は、ＤＮＡ中にデオキシウリジンを組み入れることができず、したがって、トリチウム標識したデオキシウリジンの存在下で生き残ることができる。一部のｄｈｆｒ＋細胞、ならびにＤＮＡ中へのデオキシウリジンの組入れに必要な他の何らかの酵素を欠いている変異体もまた、生き残ることができる。ｄｈｆｒ−変異体は、グリシン、ヒポキサンチン、およびチミジンの新規な生合成を実施することができず、したがって増殖のために外来性ヌクレオシドを必要とするため、区別することができる。
【００９６】
前掲のＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎによって使用された選択の第１の工程では、野生型細胞がエチルメタンスルホナート（ＥＭＳ）変異誘発に供され、かつｄｈｆｒ−阻害メトトレキサート（ＭＴＸ）の存在下で、トリチウム標識したデオキシウリジンを用いて選択されて、推定上のヘテロ接合体（ｄ＋／ｄ−）が単離された。ヘテロ接合体（ｄ＋／ｄ−）中のすべてのＤＨＦＲを不活性化するのに十分であるが、ホモ接合体（ｄ＋／ｄ＋）中のすべてを不活性化するのには十分ではない濃度のＭＴＸを用いることによって、ホモ接合体は残存するＤＨＦＲ活性を有し、かつトリチウム標識したデオキシウリジンを組み入れた。この組入れによって、（ｄ＋／ｄ＋）細胞が選択され、かつヘテロ接合体のみが生き残ることができた。生き残っている細胞の選択、貯蔵、および増殖を３回実施した後、推定上のヘテロ接合体細胞株であるＵＫＢ２５を単離した。ガンマ線照射によってＵＫＢ２５細胞をさらに変異誘発し、ＭＴＸの不在下で、トリチウム標識したデオキシウリジン中で選択した。生き残っているコロニーは、グリシン、ヒポキサンチン、およびチミジンに対する３重栄養要求性を提示し、ｄｈｆｒ−表現型が示唆された。この３重栄養要求性を提示しているコロニーをクローン化し、ｄｈｆｒ活性を欠いていることを示した。サザンブロットハイブリダイゼーションによってこのようなクローンの１つを解析したところ、ｄｈｆｒ遺伝子が大規模な再配列（ｇｒｏｓｓ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を全く受けていないことが明らかになった。このクローンをＤＸＢ１１と呼んだ。
【００９７】
このようにして作製したＤＸ  Ｂ１１細胞を検査して、細胞株の予測される特質を確認した。ＤＵＫＸ  Ｂ１１細胞は、その由来元であるＣＨＯ−Ｋ１細胞株に遺伝子型が類似していることが判明した。これらは、低二倍体ＣＨＯ細胞であり、細胞遺伝学的に広く研究されている２０種の染色体を有する。分裂中期のＤＵＫＸＢ１１染色体のギムザ（Ｇｅｉｍｓａ）バンディングにより、ＤＵＫＸＢ１１細胞がＣＨＯ−Ｋ１派生物であることが実証された。ＤＵＫＸ  Ｂ１１細胞は、ＤＨＦＲを欠損しており、したがってグリシン、プリンヌクレオシド、およびチミジンに対して栄養要求性である。ＤＵＫＸ  Ｂ１１細胞のＤＨＦＲを欠損したこの表現型が、細胞中に組換え型の異種蛋白発現プラスミドを移入するために使用される遺伝的選択の基礎である。
【００９８】
いくつかの実験において、ＤＵＫＸ  Ｂ１１細胞を培養するために使用される培地は、ヒポキサンチンもチミジンも含まなかった。ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性がない場合、細胞が生き残り、かつ複製する唯一の手段は、増殖培地中にヌクレオシドを補充することによって、細胞がそれらを作る能力を持たないことを補うものであった。したがって、アデノシン、デオキシアデノシン、およびチミジンをＤＵＫＸ  Ｂ１１細胞用の増殖培地に添加した。これらはそれぞれ１０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。この濃度は、慣例的な小スケールの増殖条件下で細胞が必要とする濃度より高かった。
【００９９】
ＤＵＫＸ  Ｂ１１細胞は、所望の蛋白に対するｃＤＮＡを含む発現プラスミドを導入するのに有用である。これらは内在性のＤＨＦＲ活性を欠いているため、異種蛋白を産生する細胞株を作製する場合に、選択可能かつ増幅可能なマーカーとして使用することができる。ｄｈｆｒのｃＤＮＡを含む別の発現ベクターをコトランスフェクトすることによって、または同じ発現ベクター上で対象のｃＤＮＡの極めて近くにｄｈｆｒのｃＤＮＡを入れることによって、どの細胞が所望の遺伝子を含む発現プラスミドを取り込み、所望の蛋白を産生する可能性があるかを判定するためのマーカーとしてｄｈｆｒ活性を利用することができる。トランスフェクション後に外来性ヌクレオシドを差し控えることによって、ｄｈｆｒ遺伝子を含むベクターを組み入れる細胞のみがｄｈｆｒを産生し、それによって生き残ることができると考えられる。生き残った細胞は、次に所望の蛋白を産生することができる。これは、所望のｃＤＮＡおよびｄｈｆｒが同じプラスミド上にある場合はバイシストロン性のメッセージによって、またはそれらの遺伝子が、トランスフェクション事象の進行中に染色体上に通常は共局在する異なるプラスミド上にある場合は、個別のメッセージによって、達成され得る。２つの別々のプラスミドを使用する場合、ｃＤＮＡを含むプラスミドに対するｄｈｆｒを含むプラスミドの比率を変更することにより、双方を含む細胞を選択する能力を向上させることができる。
【０１００】
ＤＵＫＸ  Ｂ１１細胞は、ｄｈｆｒ遺伝子中の点突然変異が原因でｄｈｆｒを欠損しており、したがって、ｄｈｆｒ＋表現型への復帰変異が可能である。この復帰変異および外来性ヌクレオシドなしで増殖する能力は、無血清懸濁液への適応行動（ａｄａｐｔａｉｏｎ  ｅｆｆｏｒｔ）の間に観察された。培養状態のＤＵＫＸ細胞の集団は、懸濁培養の開始から、約１５４回の累積的集団倍加（ＣＰＤ）の間、ｄｈｆｒ−のままであった。しかし、１９０ＣＰＤの時点での外来性ヌクレオシドに対する依存性について再び検査した場合、表現型の復帰変異が明らかであった。これらの細胞の平均増殖速度の有意な上昇は、ｄｈｆｒ＋表現型と一致している。トランスフェクションおよび遺伝子増幅戦略のためにはｄｈｆｒ−表現型が望ましいため、適応されたＤＵＫＸ細胞の無血清懸濁液を１５３．８ＣＰＤの後に作製した。これらの細胞は、発現ベクターが導入される前に、無血清懸濁培養での増殖に適応されたため、「予め適応された（ｐｒｅ−ａｄａｐｔｅｄ）」と呼ばれ、かつ「ＰＡ  ＤＵＫＸ」と称される。
【０１０１】
適応されていない、ＦＢＳ依存性のＤＵＫＸ単層を、発現ベクターをトランスフェクトするために使用することができる。異種遺伝子およびｄｈｆｒの発現が達成された後、新しい各細胞株をＦＢＳを含まない懸濁液での増殖に適応させることができる。単層細胞を用いたトランスフェクション後の適応期間は、しばしば非常に長い。「予め適応された」ＤＵＫＸ細胞は、トランスフェクションのための宿主細胞として使用することもできる。これらのＰＡ  ＤＵＫＸ細胞は、トランスフェクション後の無血清懸濁液中での増殖への再適応期間が通常はより短いため、時間および労力の面から見てしばしば利点を与える。Ｓｉｎａｃｏｒｅら、ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ、５２：５１８〜５２８頁（１９９６年）を参照されたい。
【０１０２】
実施例２  ＰＡ  ＤＵＫＸ細胞におけるＢＭＰ６の過剰発現によるＥＲストレスの誘導
ｐＳＭＥＤ２／ＸＢＰ１およびｐＳＭＥＤ２／ＢＭＰ６（＋）または空のｐＳＭＥＤ２ベクター（−）をＰＡ  ＤＵＫＸ細胞中にコトランスフェクトした。ｐＳＭＥＤ２／ＸＢＰ１発現ベクターおよびｐＳＭＥＤ２／ＢＭＰ６発現ベクターは、それぞれＸＢＰ１およびＢＭＰ６をコードする。どちらのベクターも、ＣＭＶプロモーターによって駆動される。Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ、インディアナポリス、インディアナ州）を用いて、６ウェルプレート中でトランスフェクションを実施した。細胞用の増殖培地は、ヌクレオシドおよび（加熱不活性化し、かつ透析した）１０％ＦＢＳ、ならびにペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を添加したα培地（Ｇｉｂｃｏ）であった。
【０１０３】
４００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ（Ｒｏｃｈｅ、インディアナポリス、インディアナ州のプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤）を添加したＣｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ビバリー、マサチューセッツ州）中に細胞を溶解した。トランスフェクション後７時間、２４時間、３１時間、および４８時間目に溶解産物を採取し、１０％トリシンゲル上で泳動させ、続いてウェスタンブロット解析を実施した（図１）。ＴＢＳ中４％脱脂粉乳、１％ＢＳＡ、および０．１％Ｔｗｅｅｎ２０のブロッキング緩衝液、ならびにＴＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ２０の洗浄用緩衝液を用いて、ウェスタンブロット解析を実施した。抗体は、ブロッキング緩衝液中に希釈した。ウェスタン法のためのタイトレーションは、１：１０００抗ＸＢＰ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とそれに続く、ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合された１：５０００ヤギ抗ウサギ抗体（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）であった。図１は、ＸＢＰ１ｐ蛋白（約５４ｋＤ）の増加によって測定されるように、ＰＡ  ＤＵＫＸ細胞におけるＢＭＰ６の過剰発現がＥＲストレスを引き起こしたことを示す。
【０１０４】
実施例３  ＸＢＰ１で安定にトランスフェクトされた細胞株
ｐＳＭＥＤ２／ＸＢＰ１ベクターをＣＨＯ  ＤＵＫＸ細胞中にトランスフェクトして、安定な細胞株を作製した。ｐＳＭＥＤ２ベクター上のＤＦＨＲ遺伝子は、メトトレキサート（ＭＴＸ）抵抗性を与える。トランスフェクトされた細胞を濃度５ｎＭ、１０ｎＭ、または２０ｎＭのＭＴＸ中に播種した。３つの５ｎＭ  ＭＴＸコロニー（５−２、５−４、５−５）、１つの１０ｎＭコロニー（１０−３）、および１つの２０ｎＭコロニー（２０−１０）を単離した。各コロニーからの細胞を、ＥＲストレスを引き起こすことが知られている化学物質ツナシミシン（Ｔｕｎａｃｙｍｉｃｉｎ）（Ｔｕ）で処理し（＋）、または処理しなかった（−）。溶解産物を１０％トリシンゲル上で泳動させ、続いて、ウサギポリクローナル抗ＸＢＰ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてウェスタンブロット解析（図２）を実施した。図２は、Ｔｕ処理によって細胞にストレスを加えた場合、ＸＢＰ１の安定な細胞株において、より成熟したＸＢＰ１が産生されたことを実証する。
【０１０５】
ｐＳＭＥＤ２／ＢＭＰ６をＸＢＰ１安定細胞株（５−２、５−４、および２０−１０）および親（ＣＨＯ  ＤＵＫＸ）細胞株中に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間目に馴化培地を採取し、１０％トリシンゲル上で泳動させ、続いてウェスタンブロット解析を実施した。ＢＭＰ６と強力に交差反応するマウスのモノクローナル抗ＢＭＰ５抗体（１：２０００）で、ウェスタンブロットのメンブレン（図３）をプローブした。二次抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合されたヤギ抗マウス抗体（１：５０００）（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）であった。図３の各レーンは、それぞれの細胞株に対する個別の実験に相当する。図３において示されるように、親細胞においてよりも、５ｎＭ  ＭＴＸおよび１０ｎＭ  ＭＴＸで選択されたＸＢＰ１安定細胞株において、より多くのＢＭＰ６が分泌された。
【０１０６】
ＩＬ１１ＲＦｃ蛋白をコードするｐＳＭＥＤ２／ＩＬ１１ＲＦｃも、ＸＢＰ１安定細胞株および親細胞株中に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間目に馴化培地を採取し、１０％トリシンゲル上で泳動させ、続いてウェスタンブロット解析を実施した。ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合されたヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）で、ウェスタンブロットのメンブレン（図４）をプローブした。ＣＨＯ  ＤＵＫＸ細胞においてよりも、５ｎＭ  ＭＴＸで選択されたＸＢＰ１細胞株の大多数において、より多くのＩＬ１１ＲＦｃが分泌された。
【０１０７】
実施例４  ＸＢＰ１安定細胞株およびそれらの親細胞ＣＨＯの間のトランスフェクション効率、転写効率、および翻訳効率の比較
５−２、２０−１０、およびＣＨＯ  ＤＵＫＸ細胞を計数し、かつ緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）をコードしている構築物で等量を一過性にトランスフェクトした。倍率１０×１０で細胞を可視化し、かつ、細胞株当たり３つの視野においてＧＦＰ蛍光性細胞を総細胞数と比較することによって、トランスフェクション効率（ＧＦＰを発現している細胞の百分率（％））を測定した。この比較の結果は、ＧＦＰのトランスフェクション効率が、試験したすべてのＸＢＰ１細胞株およびＣＨＯ  ＤＵＫＸ細胞株において同様であることを示す（図５）。
【０１０８】
別の実験において、ＧＦＰをコードしている構築物（＋）またはコードしていない構築物（−）をＸＢＰ１安定細胞株および親細胞株中に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間目に採取した細胞溶解物を１０％トリシンゲル上で泳動させ、続いてウェスタンブロット解析を実施した（図６）。図６の各レーンは、個別の実験に相当する。ウサギポリクローナル抗ＧＦＰ抗体およびローディングコントロール用のマウスモノクローナル抗アクチン抗体で、ウェスタンブロットのメンブレンをプローブした。図６によって示すように、ＧＦＰの転写および翻訳効率の合計は、調査したすべての細胞株において同様である。
【０１０９】
実施例５  ＡＴＦ６で一過性にトランスフェクトされた細胞株
ＡＴＦ６の活性な可溶性ドメインに由来するＦｌａｇタグ付きｃＤＮＡをＴｅｔ／ｏｆｆ誘導発現ベクターｐｔＴＡＴＯＰ６中にクローニングし、かつＣＯＳ−１細胞中に一過性にトランスフェクトした。ｐｔＴＡＴＯＰ６ベクターは、ＡＴＦ６およびＦｌａｇタグを含む融合蛋白の発現を制御する誘導性プロモーターを含む。トランスフェクション後１８時間、４８時間、および６０時間目に採取した細胞溶解物を１０％トリシンゲル上で泳動させ、続いてウェスタンブロット解析を実施した。ウェスタンブロットのメンブレン（図７）を抗ｆｌａｇ抗体でプローブした。「Ｖ」は、空のｐｔＴＡＴＯＰ６ベクターを示し、「Ｐ」は、ｆｌａｇの陽性対照を表す。図７によって示されるように、ＡＴＦ６蛋白は、ドキシサイクリンの不在下で、ＣＯＳ−１細胞において成功裡に発現された。
【０１１０】
実施例６  標的遺伝子を適切な比率でＸＢＰ１またはＡＴＦ６と共発現させると、ＨＥＫ２９３細胞における標的遺伝子の分泌が増大する
３７℃、５％ＣＯ２を含む加湿インキュベーターにおいて、５％ウシ胎児血清を添加したｆｒｅｅ−ｓｔｙｌｅ２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）中でＨＥＫ２９３−ＦＴおよびＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡを増殖させ、かつ維持した。
【０１１１】
５０ｍｌスピナーもしくは２４ウェルプレート、または１Ｌスピナー中で一過性発現を実施した。培養容積５０ｍｌ（または１Ｌ）の場合、プラスミドＤＮＡ２５μｇ（または１Ｌの場合には０．５ｍｇ）を、無血清２９３培地２．５ｍｌ（１Ｌの場合には５０ｍｌ）中のポリエチレンイミン（ＰＥＩ、２５ｋＤａ、直鎖状、ＨＣｌによってｐＨ７．０に中和、１ｍｇ／ｍｌ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、ウォリントン、ペンシルバニア州）４００μｇ（１Ｌの場合には８ｍｇ）と混合した。Ｐ２００５撹拌機（Ｂｅｌｌｃｏ）上で、回転速度１７０ｒｐｍ、３７℃で７２〜１４４時間、スピナーをインキュベートした後、回収した。２４ウェルプレートの形式の場合、ＤＮＡ  １μｇを無血清２９３培地０．５ｍｌ中のＰＥＩ  ８μｇと混合した。次いで、これらの混合物を、１０％ＦＢＳを含む２９３培地中のＨＥＫ２９３細胞０．５ｍｌと細胞濃度０．５×１０６細胞／ｍｌで混合した。Ｏｒｂｉｔａｌ振とう機（Ｂｅｌｌｃｏ）上で、回転速度３００ｒｐｍ、３７℃で７２時間、プレートをインキュベートした後、回収した。
【０１１２】
ｐＳＭＥＤ２およびｐＳＭＥＤＡをＤＮＡ構築のために使用した。Ｃ末端のＨｉｓ６タグ付き分泌性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連蛋白（ｓＦＲＰ−１）およびＣ末端のＦｌａタグ付きアグリカナーゼ−２（Ａｇｇ−２）をｐＳＭＥＤＡ中にサブクローニングした。Ｃ末端のＨｉｓ６タグ付き神経栄養性チロシンキナーゼ２型受容体（ＴｒｋＢ）をｐＳＭＥＤ２中にサブクローニングした。これらのサブクローニングされた遺伝子は、膜貫通ドメインも細胞質内ドメインも全く有さず、その結果、発現産物の分泌を可能にした。
【０１１３】
Ｃ末端のＨｉｓ６タグ付きＰｒｏｐ１およびＰｒｏｐ３４−ＬＢＤをｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）中にサブクローニングした。Ｐｒｏｐ１およびＰｒｏｐ３４−ＬＢＤは、膜貫通ドメインおよび細胞質内ドメインが欠失した低密度リポ蛋白受容体関連蛋白５（ＬＲＰ５）に由来した。Ｐｒｏｐ１およびＰｒｏｐ３４−ＬＢＤのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１０および１１に示す。配列番号１０は、アミノ酸３４２〜３４７にＨｉｓ６タグを含み、かつアミノ酸３４８〜３５６にＦｌａｇタグを含む。配列番号１１は、アミノ酸７９５〜８００にＨｉｓ６タグを含み、かつアミノ酸７７８〜７９４にＶ５タグを含む。
【０１１４】
ｐｃＤＮＡ３．１中のＰｒｏｐ１−ｈｉｓ６−Ｆｌａｇ  １μｇをｐＳＭＥＤ２ベクター中のＸＢＰ１ｐ  ０．３μｇ（１：３）または１μｇ（１：１）と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にコトランスフェクトした。ｐｃＤＮＡ３．１およびｐＳＭＥＤ２のいずれも、ＣＭＶプロモーターによって駆動される。ＤＮＡトランスフェクション後７２時間目に馴化培地を採取した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって試料を分離し、かつ抗Ｈｉｓ４抗体でイムノブロットした。２セットの実験（セット１およびセット２）を実施した。図８Ａにおいて示すように、１：１または１：３の比率でＸＢＰ１をＰｒｏｐ１とコトランスフェクションすると、Ｐｒｏｐ１の発現が大幅に改善した。
【０１１５】
別の実験では、ｐｃＤＮＡ３．１中のＰｒｏｐ３４−ＬＢＤ−Ｖ５−ｈｉｓ６  １μｇをｐｔＴＡＴＯＰ６ベクター中のＡＴＦ６  ０．３μｇ（１：３）または１μｇ（１：１）と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にコトランスフェクトした。ｐＳＭＥＤ２と同様に、ｐｔＴＡＴＯＰ６も、ＣＭＶプロモーターによって駆動される。ＤＮＡトランスフェクション後７２時間目に採取した馴化培地をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｈｉｓ４抗体を用いたイムノブロッティングによって分析した。図８Ｂは、１：１または１：３の比率でＡＴＦ６をＰｒｏｐ３４−ＬＢＤ−Ｖ５−ｈｉｓ６とコトランスフェクションすると、Ｐｒｏｐ３４−ＬＢＤの発現が有意に増大したことを示す。
【０１１６】
図９は、異なる標的蛋白の発現に対するＸＢＰ１ｐまたはＡＴＦ６の効果を例示する。ｐｃＤＮＡ３．１中のＰｒｏｐ１−ｈｉｓ６−ＦｌａｇまたはＰｒｏｐ３４−ＬＢＤ−Ｖ５−Ｈｉｓ６を、ｐＳＭＥＤ２ベクター中のＸＢＰ１ｐまたはｐｔＴＡＴＯＰ６ベクター中のＡＴＦ６と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にコトランスフェクトした。ＤＮＡトランスフェクション後７２時間目に採取した馴化培地をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｈｉｓ４抗体を用いたイムノブロッティングによって分析した。図９に示すように、シグナルをデンシトメトリーによって定量した。これらの結果は、ＸＢＰ１ｐおよびＡＴＦ−６が、Ｐｒｏｐ１およびＰｒｏｐ３４−ＬＢＤの発現に対して異なる効果を有することを示唆する。ＴｒｋＢ、ｓＦＲＰ−１、およびＡｇｇ−２に対しても、これらの蛋白をＸＢＰ１ｐかＡＴＦ−６と共発現させた場合、異なる増大効果が観察された。例えば、ＸＢＰ１ｐとの共発現により、ＴｒｋＢの収量は約５倍増加したのに対し、ＴｒｋＢをＡＴＦ６と共発現させた場合は約２倍の増加しか観察されなかった。
【０１１７】
本発明の前述の説明は、例証および説明を提供するが、網羅的であることも、開示されるまさにそのものに本発明を限定することも意図しない。上記の教示と一貫性がある修正および変形は可能であり、または本発明の実施により獲得され得る。したがって、本発明の範囲が、特許請求の範囲およびそれらの等価物によって定義されることに留意されたい。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】ＰＡ  ＤＵＫＸ細胞におけるＢＭＰ６の過剰発現がＥＲストレスを引き起こすことを実証する図である。
【図２】ストレス無負荷条件またはストレス負荷条件下での、安定にトランスフェクトされた細胞株における外来性ＸＢＰ１の発現を示す図である。
【図３】親細胞ＣＨＯ  ＤＵＫＸよりもいくつかのＸＢＰ１細胞株においてＢＭＰ６分泌が増加していることを示す図である。
【図４】親細胞ＣＨＯ  ＤＵＫＸよりもいくつかのＸＢＰ１細胞株においてＩＬ１１ＲＦｃ分泌が増加していることを例示する図である。
【図５】ＧＦＰのトランスフェクション効率が、選択されたＸＢＰ１細胞株およびＣＨＯ  ＤＵＫＸ親細胞株において同様であることを実証する図である。
【図６】ＧＦＰの転写効率および翻訳効率が、選択されたＸＢＰ１細胞株およびＣＨＯ  ＣＵＫＸ親細胞株において同様であることを示す図である。
【図７】ＣＯＳ−１細胞における誘導性ＡＴＦ６蛋白の成功裡な発現を例示する図である。
【図８】標的蛋白の作製に対する、異なる比率のＸＢＰ１またはＡＴＦ６と標的蛋白ｃＤＮＡとの効果を表す図である。
【図９】異なる標的蛋白の発現に対するＸＢＰ１またはＡＴＦ６の効果を実証する図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2008511335.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年5月1日(2007.5.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008511335000001.app
【国際調査報告】
2008511335.tif 000025
2008511335.tif 000026
2008511335.tif 000027