(57)【要約】  本発明は、一般にインターフェロン−γ−誘導因子（ＩＧＩＦ）とも呼ばれるヒトＩＬ−１８の皮膚創傷、外科的創傷、下腿潰瘍、糖尿病性潰瘍、胃腸粘膜炎、口腔粘膜炎、および肺傷害の治療における使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする患者において創傷を治癒する方法であって、治療有効量のヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）を患者に投与する工程を含む方法。
【請求項２】
創傷が、皮膚創傷、外科的創傷、下腿潰瘍、糖尿病性潰瘍、粘膜炎、および肺傷害の群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒトＩＬ−１８を非経口投与により投与する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
非経口投与が、皮下、筋肉内、静脈内、および鼻腔内の投与の群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
粘膜炎が口腔粘膜炎である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
粘膜炎が腸粘膜炎である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
それを必要とする患者において創傷を治癒する方法であって、有効量のヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）を担体と組み合わせて含む医薬組成物を患者に投与する工程を含む方法。
【請求項８】
創傷が、皮膚創傷、外科的創傷、下腿潰瘍、糖尿病性潰瘍、粘膜炎、および肺傷害の群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
粘膜炎が口腔粘膜炎である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
粘膜炎が腸粘膜炎である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
医薬組成物を非経口投与により投与する、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
非経口投与が、皮下、筋肉内、静脈内、および鼻腔内の投与の群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
創傷が皮膚創傷であり、さらに医薬組成物を患者に局所投与する、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、その内容を全体として出典明示により本明細書の一部とする、２００４年８月２０日出願の先の米国特許仮出願第６０／６０３，０１２号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、一般にインターフェロン−γ−誘導因子（ＩＧＩＦ）とも呼ばれるヒトＩＬ−１８の創傷の治療における使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
このように重要である理由は、分泌タンパク質治療薬をその作用場所（体液または細胞膜）に導くことが比較的に容易なことである。分泌タンパク質、および膜貫通タンパク質の細胞外領域を、体液に直接投与することができ、または自然経路で体液または膜に向けることができる。細胞外空間へのタンパク質分泌の自然経路は、真核生物の小胞体および原核生物の内膜である（Ｐａｌａｄｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８９，３４７（１９７５）；Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．，２３９，１１７（１９７２）；Ｂｌｏｂｅｌら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６７，８３５（１９７５））。一方、タンパク質を細胞の外部からサイトゾルに輸送するための自然経路（細胞への蛇毒毒素の侵入機構である飲細胞作用を除く）は知られていない。したがって、タンパク質治療薬を細胞に導くことは、当技術分野において極めて困難である。
【０００４】
ＩＬ−１８は、最近発見された新規サイトカインである。活性ヒトＩＬ−１８は、１５７個のアミノ酸残基を含む。これは、Ｔ細胞および脾細胞によるインターフェロン−γの産生の誘導、ＮＫ細胞の殺活性の増強、ならびに未処理ＣＤ４＋Ｔ細胞からＴｈ１細胞への分化の促進を含めて、強力な生物活性を有する。さらに、ヒトＩＬ−１８は、ＧＭ−ＣＳＦの産生を増大し、ＩＬ−１０の産生を減少させる。ＩＬ−１８は、ＩＬ−１２より高いインターフェロン−γ−誘導能を有することが知られており、様々な受容体を有し、異なるシグナル伝達経路を利用するようである。
【０００５】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、すべての免疫応答の中心的な調節エレメントである。これらは、Ｔｈ１およびＴｈ２の２つのサブセットに分かれる。サブセットはそれぞれ、様々なサイトカインを分泌するその能力によって定義される。分化の最も強力な誘導物質がサイトカインそれ自体であることは興味深い。未処理前駆体からのＴｈ２細胞の発生は、ＩＬ−４によって誘導される。ＩＬ−１８が発見される前は、ＩＬ−１２が主要なＴｈ１誘導サイトカインと考えられていた。ＩＬ−１８も、Ｔｈ１誘導サイトカインであり、インターフェロン−γの産生を刺激する上でＩＬ−１２より強力である。
【０００６】
Ｔｈ１細胞は、ＩＬ−２、インターフェロン−γ、およびＴＮＦ−βを分泌する。特徴的なＴｈ１サイトカインであるインターフェロン−γは、マクロファージに直接作用して、その殺菌活性および食細胞活性を増強する。その結果、活性化されたマクロファージは、細胞内病原体および腫瘍細胞を効率的に破壊することができる。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３を産生し、Ｂ細胞が抗体産生細胞に発達するのを助けることによって作用する。まとめると、Ｔｈ１細胞は主に細胞媒介性免疫を担い、Ｔｈ２細胞は体液性免疫を担う。
【０００７】
創傷修復は、増殖因子およびサイトカインを含めて、いくつかの細胞型、細胞外マトリックス成分、および複数の可溶性媒介物質が関与する極めて調整された相互作用である。組織傷害を引き起こす外傷、微生物、または化学物質が、創傷修復の引き金となることがある。組織の完全性の回復は、宿主自然免疫応答であるが、創傷修復過程が損なわれる状況がある。いくつかの増殖因子を使用して、放射線療法または化学療法を受けている癌患者において粘膜炎の防止が試みられているが、成功は限定されている。Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ａｄｖ．Ｓｔｕｄ．Ｍｅｄ．，４（４Ｂ）：Ｓ２９９−Ｓ３１０，（２００５）。顆粒球コロニー刺激因子（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）は、治療を受けている癌患者が関与した４つの研究のうち２つにおいて、粘膜炎の発症および重症度に中程度の効果をもたらした。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（サルグラモスチム）は、化学療法および放射線によって誘発された粘膜炎の重症度について中程度の低下を誘導したが、その結果には一貫性がなかった。顆粒球コロニー刺激因子および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子は両方とも、口腔粘膜炎の予防にしか効果を示さなかった。ケラチノサイト増殖因子（パリフェルミン）は、口腔粘膜炎の発症と期間とを予防して、粘膜炎の予防に最も有望性を示している。粘膜炎の病態生理を標的とする作用剤の出現によって、臨床医は、もはや放射線療法または化学療法の投与計画を変更する必要がないが、プロトコルを粘膜炎の発症を予防することができる作用剤を含むように調整する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
当技術分野において、創傷修復を増強する、具体的には、皮膚創傷、外科的創傷、下腿潰瘍、糖尿病性潰瘍、粘膜炎、具体的には胃腸粘膜炎および口腔粘膜炎、ならびに肺傷害を治療する新規治療用タンパク質の開発が求められていることは明らかである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様では、本発明は、それを必要とする患者において創傷を治癒する方法であって、治療有効量のヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）を患者に投与する工程を含む方法を提供する。別の態様では、治療対象の創傷は、皮膚創傷、外科的創傷、下腿潰瘍、糖尿病性潰瘍、胃腸粘膜炎、口腔粘膜炎、および肺傷害の群から選択される。
【００１０】
第２の態様では、本発明は、それを必要とする患者においてこのような創傷を治癒する方法であって、有効量のヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）および担体を含む医薬組成物を患者に投与する工程を含む方法を提供する。
【００１１】
（図面の簡単な記載）
図１は、未変性ヒトＩＬ−１８のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【００１２】
図２は、マウスＩＬ−１８のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【００１３】
図３は、マウス血小板由来増殖因子−β（ＰＤＧＦ−β）のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。成熟マウスＰＤＧＦ−βは、シグナルペプチド（−２０−  −１）を除去し、Ｎ末端（１−６１）とＣ末端（１７１−２２１）のプロペプチド（下線で示す）で形成されている。
【００１４】
図４は、ヒトＫＧＦ（配列番号４）のアミノ酸配列を示す。
【００１５】
図５は、アデノウイルスにコードされたマウスＩＬ−１８（配列番号２）の局所投与がｏｂ／ｏｂマウスにおける創傷修復に及ぼす効果を示す。データ点はそれぞれ、各治療群の平均を表す。
【００１６】
図６は、腹腔内注射によるマウスＩＬ−１８精製タンパク質（配列番号２）の毎日全身デリバリーがｏｂ／ｏｂマウスにおける創傷修復に及ぼす効果を示す。データ点はそれぞれ、各治療群の平均を表す。
【００１７】
図７は、ヒトＩＬ−１８（配列番号１）の毎日局所デリバリーがｏｂ／ｏｂマウスにおける創傷修復に及ぼす効果を示す。データ点はそれぞれ、各治療群の平均を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
ヒトＩＬ−１８ポリペプチドは、欧州特許出願公開第０６９２５３６Ａ２号、欧州特許出願公開第０７１２９３１Ａ２号、欧州特許出願公開第０７６７１７８Ａ１号、および国際公開第９７／２４４１号に開示されている。ヒトＩＬ−１８のアミノ酸配列は、配列番号１に記載されている。ヒトＩＬ−１８ポリペプチドは、インターフェロン−γ−誘導ポリペプチドである。これは、Ｔ細胞および脾細胞によるインターフェロン−γの産生の誘導、ＮＫ細胞の殺活性の増強、ならびに未処理ＣＤ４＋Ｔ細胞からＴｈ１細胞への分化の促進を含めて、細胞媒介性免疫の誘導において主要な役割を果たす。
【００１９】
ＩＬ−１８を使用して、患者における創傷を修復することができる。この創傷には、皮膚創傷、外科的創傷、下腿潰瘍、糖尿病性潰瘍、褥瘡性潰瘍、粘膜炎、具体的には、胃腸粘膜炎および口腔粘膜炎、ならびに肺修復が含まれるが、これらに限定されない。創傷修復は、同じタイプの細胞による傷害細胞の再形成に付随する。創傷修復の過程は、下記の細胞事象：増殖、遊走、分化、およびリモデリングの体系的協調を含む。サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、および接着分子は、これらの活動に関与する特定の細胞を調整する細胞媒介物質として機能する。Ｋａｍｐｆｅｒら、Ｍｏｌｅｃ．Ｍｅｄ．６（１２）：１０１６０−１０２７（２０００）。炎症促進性サイトカインであるインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）は、創傷修復過程の炎症期中に役割を果たすことができる腫瘍壊死因子−α、インターロイキン１−β、ならびにＣＣおよびＣＸＣの両ケモカインを誘導することができる。Ｐｕｒｅｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：７１１−７２１（１９９８）。ＩＬ−１８を合成するいくつかの異なる細胞型が特定されている。これには、ケラチノサイトおよび活性化マクロファージが含まれ、共に創傷修復において役割を果たす。ヒトＩＬ−１８で処理されたＣｏｎ  Ａ−刺激末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養によって、顆粒球単球−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の産生が誘導される。Ｕｓｈｉｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：４２７４−４２７９（１９９６）。さらに、ＩＬ−１８は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞によるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の産生を誘導することが判明している。顆粒球単球−コロニー刺激因子は、創傷治癒を促進することが判明しており（Ａｒｎｏｌｄら、Ｊ．Ｗｏｕｎｄ  Ｃａｒｅ  ５４：４００−４０２（１９９５））、慢性静脈性下腿潰瘍の患者を治療するための診療所にある。ＤａＣｏｓｔａら、Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐ．Ｒｅｇ．７：１７−２５（１９９９）。創傷修復のマウス切除モデルにおいて、ＩＬ−１８が創傷修復を促進することを実証している。ＩＬ−１８が創傷修復を促進する機構は、サイトカインの炎症促進性のためであり、または顆粒球単球−コロニー誘導因子のような増殖因子のための誘導剤としてであり得る。
【００２０】
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、および高速液体クロマトグラフィーを含めて、周知の方法で組換え細胞培養物から回収し、精製することができる。ポリペプチドが、細胞内合成、単離、および／または精製中に変性する場合、タンパク質をリフォールディングするための周知の技法を使用して、活性型高次構造を再生することができる。活性ヒトＩＬ−１８を精製し生成する方法は、国際公開第０１／０９８４５５号に記載されている。
【００２１】
本発明は、ヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）を含む医薬組成物も提供する。このような組成物は、治療有効量の化合物を含み、さらに医薬として許容できる担体、希釈剤、または賦形剤を含むことができる。このような医薬担体は、水や、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などの石油、動物、野菜、または合成起源のものを含めて、オイルなどの無菌の液体とすることができる。医薬組成物を静脈内投与する場合、水を担体として使用することができる。生理食塩水溶液、ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液を、例えば、注射可能液剤用の液体担体として使用することもできる。適切な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。望むなら、組成物は、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有することができる。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放処方物などの形をとることができる。組成物を、通常の結合剤、およびトリグリセリドなどの担体と共に坐剤として処方することができる。経口処方には、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体が含まれ得る。適切な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによってＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。このような組成物は、治療有効量の化合物をしばしば精製された形で、適切な量の担体と共に含有し、それによって患者への適切な投与の形が提供される。処方は、投与モードに適しているべきである。
【００２２】
本発明の一実施形態では、組成物は、ルーチンの手順に従って、ヒトへの静脈内投与に適応させた医薬組成物として処方される。通常は、静脈内投与用の組成物は、無菌の等張性緩衝水溶液の液剤である。適切な場合には、組成物は、可溶化剤、およびリグノカインなど、注射部位の疼痛を軽減する局所麻酔薬も含むことができる。一般に、材料は、別々に、あるいは単位投与剤形、例えばアンプルやサシェなど、活性剤の量を示す密封容器中の凍結乾燥散剤または無水濃縮物として一緒に混合して供給される。組成物を注入投与する場合、医薬グレードの無菌水または生理食塩水を含む注入ボトルを用いて投与することができる。組成物を注射で投与する場合、材料を投与前に混合することができるように、注射用の無菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【００２３】
したがって、ポリペプチドを医薬品の製造に使用することができる。本発明の医薬組成物は、非経口投与用の液剤または凍結乾燥散剤として処方することができる。散剤は、使用前に適切な希釈剤または他の医薬として許容できる担体を添加することにより再構成することができる。液剤処方は、緩衝等張性水溶液とすることができる。適切な希釈剤の例は、規定の等張性生理食塩水溶液、標準の５％デキストロース水溶液、または酢酸ナトリウムもしくは酢酸アンモニウムの緩衝溶液である。このような処方は、特に非経口投与に適しているが、経口投与用に使用し、またはガス注入用の定量吸入器またはネブライザーに含有させることもできる。このような医薬組成物に、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、ヒドロキシセルロース、アカシア、ポリエチレングリコール、マンニトール、塩化ナトリウム、またはクエン酸ナトリウムなどの賦形剤を添加することが望ましい場合がある。
【００２４】
代わりに、ポリペプチドを、カプセル化、錠剤化、または経口投与用に乳剤もしくはシロップ剤に調製することができる。医薬として許容できる固体または液体の担体を添加して、組成物を増強しまたは安定化し、あるいは組成物の調製を容易にすることができる。固体担体には、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム二水和物、白土、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸、タルク、ペクチン、アカシア、寒天、またはゼラチンが含まれる。液体担体には、シロップ、落花生油、オリーブ油、生理食塩水、および水が含まれる。担体には、モノステアリン酸グリセリンやジステアリン酸グリセリンなどの徐放材料が単独でまたはワックスと共に含まれることもある。固体担体の量は様々であるが、用量単位当たり約２０ｍｇ〜約１ｇである。医薬製剤は、錠剤の形の場合には粉砕、混合、顆粒化、および適切な場合には圧縮；または硬質ゼラチンカプセル剤の形の場合には粉砕、混合、および充填を含む通常の薬学技法に従って作製される。液体担体を使用する場合、調製物は、シロップ剤、エリキシル剤、乳剤、または水性もしくは非水性の懸濁剤の形である。このような液体処方を、直接経口投与（ｐ．ｏ．）し、または軟質ゼラチンカプセル剤に充填することができる。
【００２５】
ヒトＩＬ−１８ポリペプチドは、医薬として許容できる担体中の活性材料として有効量のポリペプチドを含有する医薬組成物として、調製することができる。本発明の組成物では、ポリペプチドを含有する水性懸濁剤または液剤は、生理的ｐＨに緩衝され、注射の準備ができている形で使用することができる。非経口投与用の組成物は、一般に水性担体などの医薬として許容できる担体に溶解させた本発明のポリペプチドの溶液またはそのカクテルを含む。様々な水性担体、例えば、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなどを使用することができる。これらの溶液は無菌であり、一般に粒子状物質を含まない。これらの溶液は、通常の周知滅菌技法（例えば、濾過）で滅菌することができる。組成物は、ｐＨ調整剤や緩衝剤など、生理的状態に近づけるために必要に応じて医薬として許容できる補助剤を含有することができる。このような医薬処方における本発明のポリペプチドの濃度は、大幅に、すなわち約０．５％未満から、通常は約１％以上、１５または２０重量％という高さまで異なることができ、選択された特定の投与モードに従って、主に流体容量、粘度などに基づいて選択される。
【００２６】
したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの無菌緩衝水、および約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、例えば約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、または約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明のポリペプチドを含有するように調製することができる。同様に、静脈内注入用の本発明の医薬組成物は、約２５０ｍＬの無菌リンゲル液、および約１ｍｇ〜約３０ｍｇ、または約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明のポリペプチドを含有するように構成されることができる。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法は周知であり、または当業者に明らかであり、より詳細には、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａに記載されている。
【００２７】
本発明のポリペプチドは、医薬製剤として調製する場合、単位用量の形で存在することができる。適切な治療上有効用量は、当業者によって容易に決定することができる。このような用量は、適切な場合には、応答期間中、必要に応じて医師によって選択された適切な時間間隔で繰り返すことができる。
【００２８】
さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、所望により最適投与量範囲を特定するのを助けるために使用することができる。処方で使用する正確な用量は、投与経路、および疾患または障害の重篤度にも依存し、医師の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデルの試験系から導かれた用量反応曲線から外挿することができる。
【００２９】
ポリペプチドについては、患者に投与される投与量は、通常は０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／患者の体重１ｋｇである。患者に投与される投与量は、患者の体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ〜２０ｍｇ、または患者の体重１ｋｇ当たり１ｍｇ〜１０ｍｇとすることができる。一般に、ヒトポリペプチドは、外来ポリペプチドに対する免疫応答のため、他の種からのポリペプチドより、人体内での半減期が長い。したがって、ヒトポリペプチドの投与量をより少なくし、投与頻度を少なくすることが可能になる場合が多い。さらに、本発明のポリペプチドの投与量および投与頻度は、例えば脂質化などの修飾によりポリペプチドの取り込みおよび（例えば、脳への）組織浸透を増強することによって低減することができる。
【００３０】
本発明は、本発明の医薬組成物の材料のうちの１つまたは複数を充填させた１つまたは複数の容器を含む医薬パックまたはキットも提供する。このような容器に、医薬または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知書を所望により付随させることができ、その通知書は、機関によるヒト投与用の製造、使用、または販売の承認を反映している。本発明の別の実施形態では、キットは、特定の適応症の治療の投与量要件を満たす必要がある適切な数の容器を備えることができる。
【００３１】
別の実施形態では、化合物または組成物を小胞、具体的にはリポソームにデリバリーすることができる（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）を参照のこと；Ｔｒｅａｔら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ、同書、ｐｐ．３１７−３２７；全般的に同書を参照のこと）。
【００３２】
さらに別の実施形態では、化合物または組成物を放出制御システムでデリバリーすることができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる（Ｌａｎｇｅｒ、上記；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  およびＷｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ  およびＢａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒら、Ｊ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）も参照のこと）。さらに別の実施形態では、放出制御システムを治療標的、すなわち脳の近くに配置することができ、したがって全身用量のごく一部分しか必要でない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、上記、ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）を参照のこと）。他の放出制御システムは、Ｌａｎｇｅｒの概説（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））に述べられている。
【００３３】
ヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）は、適切な内部経路で投与することができ、必要に応じて、例えば１〜３回／日の頻度で、１日〜約３週間、１回／週または１回／隔週繰り返すことができる。あるいは、電荷密度を低下させるようにペプチドを変更し、したがって経口バイオアベイラビリティが可能になり得る。治療用量および期間は、本発明の分子のヒト循環における相対的期間と関連があり、患者の治療対象の病態および全身的健康状態に応じて、当業者が調整することができる。
【００３４】
本発明は、ヒトＩＬ−１８ポリペプチド（配列番号１）を含む有効量の本発明の化合物または医薬組成物をヒト患者に投与することによる治療、阻害、および予防の方法を提供する。本発明の一実施形態では、化合物を実質的に精製する（例えば、その効果を限定し、または望ましくない副作用をもたらす物質を実質的に含まない）。化合物が上記に記載するポリペプチドを含む場合、投与処方および方法を使用することができる。本明細書の下記に記載するもののうちから、追加の適切な投与処方および経路を選択することができる。
【００３５】
様々なデリバリーシステム、例えば、化合物を発現させることができるリポソーム、微粒子、マイクロカプセル、組換え細胞中でのカプセル化、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部分としての核酸の構成などが知られており、本発明の化合物を投与するために使用することができる。導入方法には、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が含まれるが、これらに限定されない。化合物または組成物を、好都合な経路、例えば注入またはボーラス注射、上皮または粘膜皮膚の内壁（ｌｉｎｉｎｇ）（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を通した吸収によって投与することができ、他の生物活性剤と共に投与することができる。投与は、全身または局所とすることができる。さらに、本発明の医薬化合物または組成物を、脳室内および包膜内の注射を含めて、適切な経路で中枢神経系に導入することが望ましい場合がある。例えばオンマヤ槽などの貯蔵器に取り付けた脳室内カテーテルによって、脳室内注射を容易にすることができる。例えば吸入器またはネブライザーの使用、およびエアロゾル化剤を用いた処方によって、経肺投与も使用することができる。
【００３６】
本発明の一実施形態では、治療を必要とする領域に本発明の医薬化合物または組成物を局所投与することが望ましい場合がある。このような投与は、例えば外科手術中の局所注入、例えば創傷被覆材と併用した外科手術後の局所塗布、注射、カテーテル、坐剤、またはインプラントによって実現することができるが、これらに限定されない。前記インプラントは、シアラスティックメンブランなどのメンブランまたはファイバーを含めて、多孔質、非多孔質、またはゼラチン質の材料である。タンパク質を投与する場合、タンパク質が吸収されない材料を使用するとよい。
【００３７】
本発明のポリペプチドの投与モードは、作用剤を宿主にデリバリーする適切な経路とすることができる。本発明のポリペプチドおよび医薬組成物は、特に非経口投与、すなわち皮下、筋肉内、静脈内、もしくは鼻腔内投与、または皮膚上の創傷を修復するために使用する場合には局所投与に有用である。粘膜炎を治療するために、患者にポリペプチドを非経口投与によってデリバリーすることができる。
【００３８】
本発明を、その趣旨または本質的属性から逸脱することなく、他の特有の形で具体化することができ、したがって、前述の明細書または下記の実施例ではなく、本発明の範囲を示す添付の特許請求の範囲を参照すべきである。
【００３９】
用語
本明細書の上記にしばしば用いられているいくつかの用語の理解を容易にするために、下記の定義を提供する。
【００４０】
本明細書では、用語「担体」は、それを用いて治療剤が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。
【００４１】
「単離された」は、「人工的」にその自然状態から変更されたこと、すなわち、自然界に存在する場合、その本来の環境から変更され、または取り出されたこと、あるいはその両方を意味する。この用語が本明細書で使用されているように、例えば、生きている有機体に自然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離されて」いないが、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、その自然状態のその共存細胞材料のうちの少なくとも１つから分離されると、「単離される」。さらに、形質転換、遺伝子操作、または他の組換え方法で有機体に導入されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、依然として前記有機体に存在している場合でも単離されている。この有機体は、生きていても、生きていなくてもよい。
【００４２】
本明細書では、用語「粘膜炎」は、照射または化学療法に起因する、器官、例えば腸、膀胱、口腔の上皮内壁の破壊を意味する。
【００４３】
本明細書では、用語「医薬」は、本発明の獣医用途を含む。用語「治療有効量」は、選択された病態を軽減するのに有用な治療剤の量を指す。
【００４４】
本明細書では、用語「医薬として許容できる」は、連邦または州政府の規制庁によって承認され、あるいは動物、さらに具体的にはヒトに使用するための米国薬局方または他の一般に認められている薬局方に列挙されていることを意味する。「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合によって互いに接合された２つ以上のアミノ酸を含むポリペプチド、すなわちペプチド同配体を指す。「ポリペプチド」は、一般的にペプチド、オリゴペプチド、またはオリゴマーと呼ばれる短鎖と、一般にタンパク質と呼ばれるより長い鎖とを指す。ポリペプチドは、遺伝子でコードされた２０個のアミノ酸以外のアミノ酸を含むことができる。「ポリペプチド」は、翻訳後プロセシングなどの自然過程、または当技術分野でよく知られている化学修飾技法によって修飾されたアミノ酸配列を包含する。このような修飾は、基本的な教科書、より詳細には専攻論文、および多数の研究文献に十分に記載されている。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含めて、ポリペプチドのどこでも行うことができる。所与のポリペプチドのいくつかの部位で、同じタイプの修飾が同じまたは様々な程度に存在できることを理解されたい。また、所与のポリペプチドは、多くのタイプの修飾を含むことができる。ポリペプチドは、ユビキチン化の結果、分枝状とすることができ、枝分かれさせまたは枝分かれさせずに環状とすることができる。環状、分枝状、および分枝環状ポリペプチドは、翻訳後自然過程に由来することがあり、または合成方法で作製することができる。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、ビオチン化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋形成、シスチン形成、ピログルタマート形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのトランスファーＲＮＡによって媒介されるタンパク質へのアミノ酸付加、およびユビキチン化が含まれる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  −  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｗｏｌｄ，Ｆ．，Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，１−１２，ｉｎ  ＰＯＳＴ−ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＶＡＬＥＮＴ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８３；Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１８２，６２６−６４６，１９９０；Ｒａｔｔａｎら、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６３：４８−６２（１９９２��を参照のこと）。水溶性ポリマーへの生物活性化合物の共有結合は、これらの化合物について生体内分布、薬物動態、およびしばしば毒性を変更し制御するための一方法である（Ｄｕｎｃａｎ，Ｒ．およびＫｏｐｅｃｅｋ，Ｊ．（１９８４）Ａｄｖ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．５７：５３−１０１）。これらの効果を実現するために、ポリ（シアル酸）、デキストラン、ポリ（Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）（ＰＨＰＭＡ）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（エチレングリコール−コ−プロピレングリコール）、ポリ（Ｎ−アクリロイル  モルホリン（ＰＡｃＭ）、およびポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）など、多くの水溶性ポリマーが使用されている（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｇ．Ｍ．（１９８０）Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ．Ｉｎ  Ｒ．Ｌ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ（Ｅｄ．）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｗａｔｅｒ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕｍｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｉｎｓ．ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｃｈａｐｔｅｒ  １８）。ＰＥＧは、理想的な１組の特性を有する：非常に低い毒性（Ｐａｎｇ，Ｓ．Ｎ．Ｊ．（１９９３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１２：４２９−４５６）、水溶液中での優れた溶解性（Ｐｏｗｅｌｌ、上記）、低い免疫原性および抗原性（Ｄｒｅｂｏｒｇ，Ｓ．およびＡｋｅｒｂｌｏｍ，Ｅ．Ｂ．（１９９０）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．６：３１５−３６５）。タンパク質上に単一または複数の鎖のポリエチレングリコールを含むＰＥＧ複合またはＰＥＧ化タンパク質治療薬は、科学文献に記載されている（Ｃｌａｒｋ，Ｒ．ら、（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２１９６９−２１９７７；Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｓ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ（ＰＥＧ−ＡＤＡ）．Ｉｎ  Ｊ．Ｍ．ＨａｒｒｉｓおよびＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（Ｅｄｓ）Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，ｐ１４５−１５４；Ｏｌｓｏｎ，Ｋ．ら、（１９９７）Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ｙｌａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ．Ｉｎ  Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ  およびＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（Ｅｄｓ）Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，ｐ１７０−１８１）。
【００４５】
本明細書では、用語「創傷修復」は、創傷縫合が含まれるが、これに限定されない創傷治癒に関与する組織修復過程を意味する。
【００４６】
特許および特許出願が含まれるが、これらに限定されない本明細書に引用されるすべての刊行物および参考文献は、それぞれ個々の刊行物または参考文献が、完全に記述されているように参照により本明細書に完全に組み込まれることが具体的にかつ個別に示されているかのように参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本願が優先権を主張する特許出願も、刊行物および参考文献について上記に記載するように参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例１】
【００４７】
切除創傷修復モデル
ｏｂ／ｏｂ株などの糖尿病マウスは、創傷治癒遅延を示す。Ｓｔａｌｌｍｅｙｅｒら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４４：４７１−４７９（２００１）。ｏｂ／ｏｂマウスは、レプチンをコードするｏｂ／ｏｂ遺伝子が欠失している、自然界に存在する株のマウスである。レプチンは、クラスＩサイトカイン受容体のｏｂＲｂに結合し、食欲を抑制する細胞内シグナル伝達カスケードを活性化する。ｏｂ／ｏｂマウスは、レプチンを産生できないので、肥満であり、正常なＣ５７／Ｂｌ６マウスの体重の２倍である。肥満マウスには、熱発生の低下、過食、受胎能の低下、および成長ホルモンの阻害を含めて、他の代謝欠陥もある。Ｒｉｎｇら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４１（１）：４４６−４４９（２０００）。マウスにおいて創傷治癒の顕著な遅延は、その糖尿病様フェノタイプに起因すると考えられる。
【００４８】
創傷治癒障害のモデルによって、ＩＬ−１８など特有のサイトカイン、および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）などの増殖因子が創傷修復に及ぼす効果を調査する機会が与えられる。ＰＤＧＦ−βの局所塗布は、糖尿病マウス株ｄｂ／ｄｂにおいて創傷治癒を高めることが判明している。Ｇｒｅｅｎｌａｕｇｈら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５−１２４６（１９９０）。ｄｂ／ｄｂ株は、フェノタイプがｏｂ／ｏｂ株に似ているが、ｄｂ／ｄｂマウスは、レプチン受容体を欠いている。ｄｂ／ｄｂマウスの創傷は、細胞浸潤の顕著な遅延、肉芽組織形成、および創傷治癒遅延を示す。血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−β）は、平滑筋細胞および線維芽細胞の分裂促進物質でありかつ化学誘引物質であり、ｄｂ／ｄｂマウスにおける創傷の急速な再上皮化を引き起こした。インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）は、以前に創傷治癒モデルにおける治療剤として使用されたことがないが、ｏｂ／ｏｂマウスの創傷におけるＩＬ−１８の、タンパク質産生ではなく発現レベルが増大していることを示す複数の研究がある。Ｋａｍｐｆｅｒら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍ．１１３（３）：３６９−７４（１９９９）。ＩＬ−１８は炎症促進性サイトカインである（Ｋａｍｐｆｅｒら、Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．１１：６２６−３３（２０００））ので、創傷への細胞浸潤物を刺激することによって、創傷治癒において役割を果たすことができる。
【００４９】
ＩＬ−１８またはＰＤＧＦ−βの局所デリバリーが創傷修復に及ぼす効果を決定するために、１０〜１４週齢のｏｂ／ｏｂ雌マウスに、ケタミン（９０ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）のカクテルで麻酔をかけた。アデノウイルスによって媒介されたＰＤＧＦの過剰発現は、ウサギ耳モデルにおける虚血性創傷治癒を補正することが判明した。Ｌｉｅｃｈｔｙら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１３：３７５−３８３（１９９９）。Ｌｉｅｃｈｔｙらは、複製欠損アデノウイルスがＰＤＧＦ−β導入遺伝子を直接創傷領域の細胞に効率的にデリバリーすることを実証した。各マウスの上背部を剪毛し、アルコールおよびベタジン（Ｂｅｔａｄｉｎｅ）で交互に拭き取って、滅菌野を確立した。無菌の生検パンチを使用して、直径６ｍｍの円形に全層切除創傷を行い、マウス１匹当たり２個の創傷が生じた。局所デリバリーの場合、マウスＩＬ−１８（配列番号２）、マウスＰＤＧＦ−β（配列番号３の１−６１および１７１−２２１のアミノ酸）をコードするアデノウイルス（ウイルス粒子１×１０１０個／創傷）、または対照（空アデノウイルス−ＣＭＶ．Ｎｕｌｌ））を創傷領域に直接塗布した。生理食塩水対照も創傷に直接塗布した。その後に、ポラクサマー（Ｐｏｌａｘａｍｅｒ）（１０％リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７）を創傷に上塗りし、次いで透明な無菌被覆材で覆った。創傷縫合速度を決定するために、創傷の周囲を、２日間隔で透明フィルムにトレースした。創傷がすべて治癒した研究終了時に、透明フィルムを光学的に走査し、Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用して表面積を決定した。この実験の結果を下記の図５に示す。
【００５０】
対照のアデノウイルスであるＡｄ．ｍＰＤＧＦ−β（配列番号３の１−６１および１７１−２２１のアミノ酸）を、直接クローニング手法で生成した（Ｓｕｋｍａｎｍ  Ａ．Ｊ．，Ｋａｌｌａｒａｋａｌ，Ａ．，Ｆｏｒｎｗａｌｄ，Ｊ．，Ｋｏｚａｒｓｋｙ，Ｋ．Ｆ．，Ａｐｐｅｌｂａｕｍ，Ｅ．，Ｓｈａｔｚｍａｎ，Ａ．Ｒ．、ａｎｄ  Ｌｕ，Ｑ．２００２．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂｙ  ａ  ｄｉｒｅｃｔ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍ．Ｐ．Ｗｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｑ．Ｌｕ（Ｅｄｓ．）．ｐ３４１−３５５．Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）。簡潔に言えば、マウスＰＤＧＦ−β用のＯＲＦをＰＣＲ増幅し、ｐＡＣ２ＸＳのＸｂａＩ／ＳｗａＩ部位にクローンを作製し、遺伝子をＣＭＶ  ＩＥプロモーターの制御下に配置した。アデノウイルスベクターの精製分子クローンＤＮＡを、制限酵素ＰａｃＩで消化して、ＩＴＲを露出することによって直線化し、アデノウイルスのレスキューのためＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。アデノウイルスを増幅し、記載されているようにＣｓＣｌのバンディングによって精製した（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ，Ｊ．１９９９．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  ａｉｒｗａｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．Ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｐ．Ｒｏｂｂｉｎｓ（Ｅｄ．）．ｐ．１６９−１８４．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ）。濃縮したアデノウイルスをＢｉｏ−ゲルカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して脱塩し、１０％グリセロールを含む１ｘＰＢＳに−８０℃で貯蔵した。Ａｄ．ｍ−ＩＬ−１８コンストラクトを、Ｏｓａｋｉら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：８０８−８１５（１９９９）に記載されている方法で生成した。
【００５１】
アデノウイルスベクターにおけるタンパク質コンストラクトの局所デリバリーの場合、Ａｄ．ｍ−ＰＤＧＦ−β（配列番号３の１−６１および１７１−２２１のアミノ酸）とＡｄ．ｍ−ＩＬ−１８（配列番号２）は共に、ｏｂ／ｏｂ切除創傷修復モデルにおいて創傷縫合を大いに増強した。陽性対照タンパク質であるＡｄ．ｍ−ＰＤＧＦ−β（配列番号３の１−６１および１７１−２２１のアミノ酸）、およびＡｄ．ｍ−ＩＬ−１８（配列番号２）はそれぞれ、０日の縫合の５０％に７．５日および９．５日後に到達し、対してベクター対照（Ａｄ．ＣＭＶ．Ｎｕｌｌ）は、０日の縫合の５０％を創傷後２０日後に実現した。さらに、Ａｄ．ｍ−ＩＬ−１８（配列番号２）とＡｄ．ｍ−ＰＤＧＦ−β（配列番号３の１−６１および１７１−２２１のアミノ酸）は共に、創傷の完全縫合を２０日までに加速した。創傷後２２日に研究を終えるとき、生理食塩水対照群もベクター対照群も完全には治癒していなかった。切除創傷修復モデルにおいてＡｄ．ＩＬ−１８の局所塗布の陽性効果を実証し、マウスＩＬ−１８タンパク質（配列番号２）の全身デリバリーを試験した。
【００５２】
マウスＩＬ−１８（配列番号２）の全身デリバリーの効果を決定するために、１０〜１４週齢のｏｂ／ｏｂ雌マウスに、ケタミン（９０ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）のカクテルで麻酔をかけた。創傷手順の２時間前に、複数の濃度（０．１μｇ／０．５ｍｌ〜１００μｇ／０．５ｍｌ）のマウスＩＬ−１８タンパク質（配列番号２）、またはビヒクル（カルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳ）をマウスに腹腔内注射した。マウスの上背部を剪毛し、アルコールおよびベタジン（Ｂｅｔａｄｉｎｅ）で交互に拭き取って、滅菌野を確立した。無菌の生検パンチを使用して、直径６ｍｍの円形に全層切除創傷を行い、マウス１匹当たり２個の創傷が生じた。生理食塩水を創傷に直接塗布し、次いで透明な無菌被覆材で覆った。創傷縫合速度を決定するために、創傷の周囲を、２日間隔で透明フィルムにトレースした。創傷がすべて治癒した研究終了時に、透明フィルムを光学的に走査し、Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用して表面積を決定した。全身の研究の期間を通して、マウスの体重減少または増加を監視した。この実験の結果を下記の図６に示す。
【００５３】
精製タンパク質の全身デリバリーの場合、マウスＩＬ−１８（配列番号２）は、０．１μｇ〜１００μｇ／マウス／日の用量範囲にわたって、用量依存的に創傷縫合速度を高めた。最も有効な用量は、５０および１００μｇ／マウス／日であり、それぞれ、０日の縫合の５０％に８日および９日までに到達し、対してビヒクル対照は、０日の縫合の５０％を１６日までに実現した。ｍ−ＩＬ−１８（配列番号２）治療の場合、ＰＢＳ対照に比べて、完全縫合速度が向上した。
【００５４】
マウスＩＬ−１８（配列番号２）の局所および全身のデリバリーは共に、創傷修復のｏｂ／ｏｂ切除モデルにおいて創傷縫合を増強した。マウス創傷修復研究において、ＰＤＧＦを陽性対照として使用した。組換えヒト血小板由来増殖因子は、米国食品医薬品局によって糖尿病性足部潰瘍の治療用として承認された。Ｗｉｅｍａｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．１７６：７４５−７９５（１９９８）。身体的疾患の多くは、組織傷害によって引き起こされ、組織の自然の構成を乱し、創傷が生じる。本特許で特許請求される適応症はすべて、組織傷害の例であって、ヒトＩＬ−１８（配列番号１）を用いた治療によって修復することができる。
【実施例２】
【００５５】
切除創傷へのヒトＩＬ−１８の毎日の局所塗布
マウス切除創傷修復モデルにおいて、マウスＩＬ−１８（配列番号２）はアデノウイルスコンストラクトとして局所デリバリーすると有効であったので、精製ヒトＩＬ−１８（配列番号１）タンパク質を毎日、上記の実施例１の創傷に直接塗布して、研究を行った。ヒトＩＬ−１８タンパク質（配列番号１）を１０μｇ／３０μｌ／創傷で塗布した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を希釈剤対照として使用した。結果を下記の図７に示す。この結果から、ヒトＩＬ−１８（配列番号１）は、ＰＢＳ対照に比べて創傷修復を加速することが判明した。臨床では、ヒトＰＤＧＦを局所使用して、糖尿病性足部潰瘍を治療している。Ｗｉｅｍａｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．１７６：７４５−７９５（１９９８）。
【実施例３】
【００５６】
腸粘膜炎モデル
化学療法や放射線療法などの癌治療は、腺窩の破壊によって消化管に細胞毒性の損傷をもたらす場合が多い。この腺窩損失は、潰瘍を上皮の露出領域に沿って発達させ、胃腸粘膜炎を引き起こす。口腔上皮内壁が細胞毒性剤によって損傷された場合、密接に関連する病態である口腔粘膜炎が起こり、潰瘍が発達する。ヒトケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）（配列番号４）などのタンパク質は、腸粘膜炎モデルにおいて活性である場合、上皮の増殖および分化を刺激することによって分裂促進因子として働くことができる。Ｐｏｔｔｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．１２：２６５−７５（２００１）。あるいは、ヒトＫＧＦ（配列番号４）なら、細胞毒性の傷害の前に幹細胞停止を誘導し、それによって幹細胞を保護し、腺窩生存を長期化する細胞周期阻害剤として働くことができるであろう。Ｆａｒｒｅｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：９３３−３９（１９９８）。同様に、口腔粘膜炎では、細胞毒性の傷害に対する幹細胞の感受性を低減し、かつ／または曝露後の再生応答を改善する療法は、現在の癌治療プロトコルの副作用を低減することによって臨床上の影響があるであろう。Ｓｏｎｉｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｄｅｎｔ．Ａｓｓｏｃ．９７：４６８−４７２（１９７８）。
【００５７】
粘膜炎におけるＩＬ−１８の役割を検討するために、一アッセイプロトコル、すなわち腺窩生存アッセイを使用した。
【００５８】
Ａ．腺窩生存アッセイ−腸粘膜炎モデル
下記に記載するプロトコルは、ＥｐｉＳｔｅｍ，Ｌｔｄ．，Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｇｒａｆｔｏｎ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，Ｍ１３  ９ＸＸ，ＵＫから改作した。
【００５９】
３０匹の成体（１０〜１２週齢）ＢＤＦ１雄マウスを用いた。すべて、２週間収容して、概日リズムを安定にした（Ｐｏｔｔｅｎら、１９７７，Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｎｅｔ．，１０，５５７）。マウスをＳＰＦバリア施設で個別換気ケージ（ＩＶＣ）に１２時間の明暗サイクルで保持した。動物に、終始食物および水を自由に摂餌させた。手順はすべて、ＵＫ  Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅ（Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ  １９８６の認証を取得した。動物を１群６匹として下記の６群間でランダム化した。（１）照射前および照射後、生理食塩水の腹腔内投与；（２）照射前、薬物の腹腔内投与、および照射後、生理食塩水の投与；（３）照射前、生理食塩水の腹腔内投与、および照射後、薬物投与；（４）照射前および照射後、薬物投与；（５）無処置対照；ならびに（６）照射前、ヒトＫＧＦ（配列番号４）の腹腔内投与、および照射後、生理食塩水の投与（陽性対照）。
【００６０】
単回線量１３ＧｙのＸ線照射で全身曝露させて、腸損傷を誘導した。１３Ｇｙは、試験化合物の潜在的保護効果を捕らえるはずであるので、開始する最良の中間領域の線量であった。（Ｗｉｔｈｅｒｓら、１９６９，Ｒａｄ．Ｒｅｓ．，３８，５９８）。動物はすべて、処置開始から屠殺時まで１日１回計量した。照射して４日後、動物を屠殺した。小腸を取り出し、カルノア固定液で固定した。すべての組織を組織診断のために処理した（パラフィン包埋）。カルノア固定液で固定された材料を使用して、各処置群の生存腸腺窩数のスコアをつけ、無処置対照を使用して、「ＣｌｏｎｏＱｕａｎｔ（登録商標）」に従ってサイズ補正した。マウス１匹に対して、腸の横断面１０個のスコアをつけ、平均腺窩数／横断面を測定した（Ｆａｒｒｅｌｌら、１９９８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５８，９３３）。腺窩幅も測定して、スコアリングエラーをサイズ補正した。サイズ補正した後、平均腺窩数／横断面／群のスコアをつけた。使用した注射プロトコルを下記の表１に示す。タンパク質は、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈからカタログ番号１００−１９で購入した。
【００６１】
【表１】
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【００６２】
このプロトコルでは、注射はすべて、０９：００時に行った。照射を１５：００時に実施した。
【００６３】
照射後の腸腺窩生存に及ぼすマウスＩＬ−１８（配列番号２）の効果は、契約下、ＥｐｉＳｔｅｍ  Ｌｔｄ．によって行われた研究０４／１３５Ｃで決定した。ＥｐｉＳｔｅｍのＣＬＯＮＯＱＵＡＮＴ（登録商標）システムは、小腸の横断面における再生腺窩を特定し、定量化した。細胞毒性の傷害の後、再生腺窩は急速に増殖し、死滅腺窩から容易に識別された。ヒトＫＧＦ（配列番号４）を６．２５ｍｇ／ｋｇ／日で投与し、この研究における陽性対照として行った。マウスＩＬ−１８（配列番号２）を５ｍｇ／ｋｇ／日で投与した。生存腺窩数／腺窩周囲のデータを下記の図６に報告する。
【００６４】
下記の表２に、放射線によって誘導された粘膜炎モデルのデータをまとめる。放射線によって誘導された粘膜炎の研究の陽性対照であるヒトＫＧＦ（配列番号４）は、照射の３日前に投与すると、良好な活性を示した。ヒトＫＧＦ（配列番号４）群は、生存腺窩数が生理食塩水対照群に比べて４倍増加したことを示した。照射の３日前にマウスＩＬ−１８（配列番号２）を投与すると、ヒトＫＧＦ（配列番号４）に匹敵する活性があり、腺窩生存が３倍増加したことを示した。照射前と照射後にマウスＩＬ−１８（配列番号２）を投与すると、生存腺窩数が生理食塩水対照に比べて２倍増加した。照射後にしかマウスＩＬ−１８（配列番号２）を投与しないと、最も有効性が低く、生存腺窩が１．６倍増加したのみであった。したがって、照射の３日前にマウスＩＬ−１８（配列番号２）を投与することが、最も有効な用法であった。
【００６５】
化学療法および放射線治療は、癌性細胞を死滅させることに成功した治療となり得るが、健常組織も破壊される場合が多い。消化管の上皮内壁が損なわれると、潰瘍化および腺窩破壊が起こる恐れがあり、患者は、疼痛が現れ、食べることができず、易感染状態になる。さらに、粘膜炎が現れると、 放射線治療または化学療法の全治療終了時に患者コンプライアンスの欠如を招く恐れがある。マウスモデルでは、ＫＧＦは、放射線および化学療法によって誘導された口腔および消化管上皮の傷害を回復させた。組換え［ヒト］ＫＧＦは、フルオロウラシルに加えてロイコボリンを投与されている転移性結腸直腸癌患者において、口腔粘膜炎を低減することが判明している。Ｍｅｒｏｐｏｌら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２１：１４５２−１４５８（２００３）。照射によって誘導された粘膜炎モデルでは、マウスＩＬ−１８（配列番号２）は、腸腺窩の保護において有効性を示し、ヒトにおいて対症療法として使用することができる。ＩＬ−１８は、放射線によって誘導された粘膜炎を治療する際に陽性効果を示すので、口腔粘膜炎で明らかな損傷上皮を治癒することもできる。
【００６６】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】未変性ヒトＩＬ−１８のアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。
【図２】マウスＩＬ−１８のアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。
【図３】マウス血小板由来増殖因子−β（ＰＤＧＦ−β）のアミノ酸配列（配列番号３）を示す図である。
【図４】ヒトＫＧＦ（配列番号４）のアミノ酸配列を示す図である。
【図５】アデノウイルスにコードされたマウスＩＬ−１８（配列番号２）の局所投与がｏｂ／ｏｂマウスにおける創傷修復に及ぼす効果を示す図である。
【図６】腹腔内注射によるマウスＩＬ−１８精製タンパク質（配列番号２）の毎日全身デリバリーがｏｂ／ｏｂマウスにおける創傷修復に及ぼす効果を示す図である。
【図７】ヒトＩＬ−１８（配列番号１）の毎日局所デリバリーがｏｂ／ｏｂマウスにおける創傷修復に及ぼす効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年4月19日(2007.4.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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