(57)【要約】心血管疾患診断用の多重一塩基多型（ｍｕｌｔｉ−ＳＮＰ）マーカー及び心血管疾患診断方法が提供される。また、ポリヌクレオチドセット、マイクロアレイ、マイクロアレイを含むキットが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
心血管疾患診断用のポリヌクレオチドセットであって、
該セットは表２中１から１２番の多重ＳＮＰマーカーからなる群から選択された多重ＳＮＰマーカーにおいて、少なくとも２個の一塩基多型（ＳＮＰｓ）のそれぞれの遺伝子型に対応する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、
各ポリヌクレオチドは、
（ａ）配列番号１から３５のヌクレオチド配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列について、少なくとも１０個のコンティグ塩基を含む核酸配列、ここで、前記少なくとも１０個のコンティグ塩基は、前記選択されたヌクレオチド配列中ＳＮＰの塩基を含み、
ここで、該ＳＮＰは、配列番号４の７６番目のヌクレオチド、配列番号８の８５番目のヌクレオチド、配列番号９の５１番目のヌクレオチド、配列番号１０の３５番目のヌクレオチド、配列番号１９の８５番目のヌクレオチド、または配列番号１から３、５から７、１１から１８及び２０から３５の１０１番目のヌクレオチドに位置しており、あるいは、
（ｂ）核酸配列（ａ）の相補的配列を含むことを特徴とする、心血管疾患診断用のポリヌクレオチドセット。
【請求項２】
前記セットが、前記選択された多重ＳＮＰマーカーにおいて、前記ＳＮＰのそれぞれの遺伝子型に対応するポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１に記載のポリヌクレオチドセット。
【請求項３】
前記セットが、表２の前記多重ＳＮＰマーカーそれぞれにおいて、前記ＳＮＰのそれぞれの遺伝子型に対応するポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１に記載のポリヌクレオチドセット。
【請求項４】
各ポリヌクレオチドは、前記選択されたヌクレオチド配列について、１０から１００個のコンティグ塩基を含むことを特徴とする、請求項１に記載のポリヌクレオチドセット。
【請求項５】
請求項１に記載のポリヌクレオチドセットとハイブリダイズする、ポリヌクレオチドセット。
【請求項６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドセットまたは該ポリヌクレオチドセットの各ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを含む、心血管疾患診断用のマイクロアレイ。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドは、アミノ−シラン、ポリ−Ｌ−リシン及びアルデヒドからなる群から選択された活性基で被覆された基板上に固定されることを特徴とする、請求項６に記載のマイクロアレイ。
【請求項８】
前記基板は、シリコン、ガラス、石英、金属及びプラスチックからなる群から選択された材料で構成されることを特徴とする、請求項７に記載のマイクロアレイ。
【請求項９】
請求項６に記載のマイクロアレイを含む、心血管疾患診断用のキット。
【請求項１０】
心血管疾患の診断方法であって、
被検体の一塩基多型（ＳＮＰ）の遺伝子型を決定する過程を含み、
ここで、前記ＳＮＰは、表２中１から１２番の多重ＳＮＰマーカーから選択された多重ＳＮＰマーカーを含むＳＮＰのうちの一つであり、
ここで、前記ＳＮＰは、配列番号１から３５から選択された配列により同定され、
ここで、前記ＳＮＰは、前記選択された配列中、配列番号４の７６番目のヌクレオチド、配列番号８の８５番目のヌクレオチド、配列番号９の５１番目のヌクレオチド、配列番号１０の３５番目のヌクレオチド、配列番号１９の８５番目のヌクレオチド、または配列番号１から３、５から７、１１から１８及び２０から３５の１０１番目のヌクレオチドに位置することを特徴とする、心血管疾患の診断方法。
【請求項１１】
前記遺伝子型を決定する過程は、
前記被検体から核酸試料を得る段階と、
該核酸試料を前記ＳＮＰの遺伝子型に対応するポリヌクレオチドとハイブリダイズさせる段階と、
ハイブリダイゼーションの結果を検出する段階とを含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＳＮＰに対する、前記決定された遺伝子型が、前記選択された多重ＳＮＰマーカー中のＳＮＰに対する、表２に列挙された心血管疾患に関連した遺伝子型と適合する場合に、前記被検体は、心血管疾患の罹患の危険が高いと判定する過程をさらに含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記選択された多重ＳＮＰマーカー中の各ＳＮＰの遺伝子型が、前記被検体に対して決定されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記選択された多重ＳＮＰマーカー中の各ＳＮＰに対する、前記決定された遺伝子型が、前記ＳＮＰに対する表２に列挙された心血管疾患に関連した遺伝子型と適合する場合に、前記被検体は心血管疾患の罹患の危険が高いと判定する過程をさらに含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記被検体は、人間の男性であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記心血管疾患は、心筋梗塞症、狭心症、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、心不全、動脈瘤、動脈硬化症、塞栓症、脳卒中及び血栓症からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記心血管疾患は、心筋梗塞症であることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
表２に列挙された前記多重ＳＮＰマーカーの各々において、各ＳＮＰの遺伝子型を決定する過程をさらに含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
関連する特許出願の相互参照
本出願は、韓国特許庁にそれぞれ２００５年５月１８日及び２００６年２月２４日に提出した韓国特許出願第１０−２００５−００４１６５３号及び第１０−２００６−００１８４４９号の利益を主張し、各々の開示は参照によってその全体が本明細書に採用される。
【０００２】
本発明は、心血管疾患診断用の多重一塩基多型（多重ＳＮＰ）マーカー、それを利用した心血管疾患の診断方法、並びに該方法を実施するためのポリヌクレオチドセット、マイクロアレイ及びキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
あらゆる生物のゲノムは、連続する進化の過程で自発的突然変異を経てゆき、先祖の塩基配列に変異体を生じさせる（Ｇｕｓｅｌｌａ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５５，  ８３１−８５４，  １９８６）。先祖の核酸配列の変異体は、先祖形態に比べて進化にとって有利なこともまたは不利なこともあり、または中立的であることもある。変異体が致死的な不利益を与え、生物の次の世代に受け継がれない場合もある。別の場合では、種に進化の上の利益を与え、最終的に種のほとんどの個体にそのＤＮＡが組み込まれて事実上先祖形態となる。多くの場合、先祖形態及び変異体は、存続し、種集団内に共存することになる。こうして、多様な配列形態が共存することにより、多型が発生する。
【０００４】
多型にはいくつかの種類が知られており、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、縦列型反復配列（ＳＴＲ）及び一塩基多型（ＳＮＰ）などが挙げられる。このうちの「ＳＮＰ」は、同種個体間の核酸配列における一塩基の変異である。ＳＮＰが、遺伝子のうちの蛋白質のコーディング配列中に発生する場合、多型形態のいずれか一つによって非同義的なコドンへの変化が発生し、これにより欠陥があるかまたは変異した蛋白質が発現することもある。ＳＮＰが遺伝子のうち非コーディング配列中で発生する場合、多型形態の一つが、例えば、欠陥のあるｍＲＮＡのスプライシングの結果として、欠陥があるかまたは変異した蛋白質の発現を招くこともある。その他のＳＮＰは表現型に何らの影響を及ぼさない。
【０００５】
人間のＳＮＰは、１，０００ｂｐごとに一回の頻度で発生すると推定されている。それらＳＮＰが疾病の存在または非存在のような表現型の発現を誘発する場合、そのＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチドは、その疾病を診断するためにプライマーまたはプローブとして使うことができる。そのＳＮＰの対立遺伝子の一つから生成されるアミノ酸の配列に特異的に結合するモノクローナル抗体もまた、疾病の診断に使うことができる。現在、さまざまな研究機関で塩基配列及びＳＮＰの機能に関する研究が行われている。同定された人間のＳＮＰのヌクレオチド配列やその他実験結果はデータベース化され、容易にアクセスできるようになっている。
【０００６】
これまでに入手可能になった知見は、人間のゲノムまたはｃＤＮＡ上に特定のＳＮＰが存在するということを示しているものの、ＳＮＰの表現型への影響は明らかにしていなかった。ほとんどのＳＮＰの機能は未だに見い出されていない。
【０００７】
心血管疾患は、世界の先進工業国での主要な死亡原因であり、韓国でも１９７０年代から主要死亡原因になっている。韓国統計庁によれば、２００３年は、死亡者２４万６千人のうち２万２千人（１０万人当たりの死亡率９，０８７人、９．１％）が心臓疾患及び高血圧が原因となっており、癌及び脳血管疾患に次いで第三位の死亡原因となっている。
【０００８】
心血管疾患は、心筋梗塞症、狭心症、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、心不全、動脈瘤、動脈硬化症、塞栓症、脳卒中及び血栓症を含む。
【０００９】
心血管疾患のうち重要と位置づけられる冠状動脈疾患は、通常動脈硬化によって心臓に血液を供給する冠状動脈がふさがったり、または狭くなって引き起こされる。動脈硬化により冠状動脈が完全にふさがることを心筋梗塞症、狭くなることを狭心症という。冠状動脈疾患の危険因子としては、脂質異常症（高コレステロール血症）、高血圧、喫煙、糖尿、遺伝、肥満、運動不足、ストレス及び女性の閉経などが周知である。この疾患の危険因子をより多く有する人ほどこの疾患の罹患の危険も増大する。他の多くの疾病と同様に、心血管疾患も遺伝的要因に影響を受ける。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
技術的課題
従来、様々な心血管疾患及び関連疾患を診断、あるいは早期予測するのに最も大きな問題点は、それら疾患が進行した段階で初めて物理的な方法を使用して診断することができるという点である。現在、心血管疾患診断のために、心臓及び冠状動脈内部のＸ線及び超音波検査をすることができるが、これは、病気の進行した段階で診断が可能である。しかし、最近のさまざまな分子生物学的技術の発展とヒトゲノムに対する研究とが一次的に完了することにより、心血管疾患と直接または間接的に関連ある遺伝子あるいは遺伝的変異を検出することが可能になった。疾病の表現型あるいは身体的な特徴に依存した従来の診断法を用いる代わりに、遺伝的因子を用いた心血管疾患の早期診断が可能になった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
技術的解決
本発明者らは、心血管疾患の発現及びその確率に関連する遺伝的因子を見つけるために研究した結果、心血管疾患を発病したすべての個体は特定ＳＮＰの同じ対立遺伝子を有しており、したがってこれらのＳＮＰにより心血管疾患の発現、その確率及び遺伝的感受性を予測することが可能になることを見出した。
【００１２】
本発明は、心血管疾患診断用の多重一塩基多型（多重ＳＮＰ）マーカーを提供する。多重ＳＮＰマーカーは、多重の単一のＳＮＰで構成される。本発明者らは、多重ＳＮＰマーカーを含むＳＮＰセットにおける特定の遺伝子型パターンが心血管疾患のさらに高い発現またはその確率と関連があることを見い出した。
【００１３】
また、本発明は、多重ＳＮＰマーカーを含むＳＮＰを有するポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。
【００１４】
また、本発明は、前記ポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドまたはそのｃＤＮＡを含む心血管疾患診断用のマイクロアレイを提供する。
【００１５】
また、本発明は、前記マイクロアレイを含む心血管疾患診断用のキットを提供する。
【００１６】
また、本発明は、前記多重ＳＮＰマーカーを利用する心血管疾患を診断する方法を提供する。
【００１７】
本発明の一態様によれば、心血管疾患診断用の多重ＳＮＰマーカーにおける遺伝子型パターンを、ハイブリダイズすることによって決定する、ポリヌクレオチドセットが提供される。そのセットを構成する各ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１から３５のヌクレオチド配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列について、少なくとも１０個のコンティグ塩基を含む核酸配列、ここで、前記少なくとも１０個のコンティグ塩基は、前記選択されたヌクレオチド配列中一塩基多型（ＳＮＰ）の塩基を含み、ここで、該ＳＮＰは、配列番号４の７６番目のヌクレオチド、配列番号８の８５番目のヌクレオチド、配列番号９の５１番目のヌクレオチド、配列番号１０の３５番目のヌクレオチド、配列番号１９の８５番目のヌクレオチド、または配列番号１から３、５から７、１１から１８及び２０から３５の１０１番目のヌクレオチドに位置しており、あるいは、（ｂ）核酸配列（ａ）の相補的配列を含む。
【００１８】
本発明は、心血管疾患診断用のＳＮＰのためのポリヌクレオチドを提供し、それは、（ａ）配列番号１から３５のヌクレオチド配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列について、少なくとも１０個のコンティグ塩基を含む核酸配列、ここで、前記少なくとも１０個の塩基は前記選択されたヌクレオチド配列中一塩基多型（ＳＮＰ）の塩基を含み、ここで、該ＳＮＰは、配列番号４の７６番目のヌクレオチド、配列番号８の８５番目のヌクレオチド、配列番号９の５１番目のヌクレオチド、配列番号１０の３５番目のヌクレオチド、配列番号１９の８５番目のヌクレオチド、配列番号１から３、５から７、１１から１８及び２０から３５の１０１番目のヌクレオチドに位置しており、あるいは、（ｂ）核酸配列（ａ）の相補的配列を含む。
【００１９】
本発明の他の態様によれば、前記ポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチド配列の相補的ポリヌクレオチドが提供される。
【００２０】
本発明の他の態様によれば、前記ポリヌクレオチド、前記ヌクレオチド配列の相補的ポリヌクレオチド、それらポリヌクレオチドの一つとハイブリダイズするポリヌクレオチド、それらポリヌクレオチドの一つによってコードされるポリペプチドまたはそのｃＤＮＡを含む心血管疾患診断用のマイクロアレイが提供される。
【００２１】
本発明の他の態様によれば、前記マイクロアレイを含む心血管疾患診断用のキットが提供される。
【００２２】
本発明の他の態様によれば、被検体の一塩基多型（ＳＮＰ）の遺伝子型を決定する過程を含む心血管疾患の診断方法が提供され、ここで、前記ＳＮＰは、表２中１から１２番の多重ＳＮＰマーカーから選択された多重ＳＮＰマーカーを含むＳＮＰのうちの一つであり、ここで、前記ＳＮＰは、配列番号１から３５のヌクレオチド配列からなる群から選択されたポリヌクレオチドにより同定され、ここで、前記ＳＮＰは、前記選択された配列中、配列番号４の７６番目のヌクレオチド、配列番号８の８５番目のヌクレオチド、配列番号９の５１番目のヌクレオチド、配列番号１０の３５番目のヌクレオチド、配列番号１９の８５番目のヌクレオチド、または配列番号１から３、５から７、１１から１８及び２０から３５の１０１番目のヌクレオチドに位置する。
【００２３】
以下、本発明の上記の態様及び効果はその例示の実施形態を詳細に説明することにより、より明らかになる。
【００２４】
発明の詳細な説明
用語「ａ」及び「ａｎ」は、量の限定を示さず、むしろ参照された要素の少なくとも一つが存在するということを表す。用語「または」は「及び／または」を表す。用語「含む」、「有する」及び「含有する」は、制限のない用語と解釈されねばならない（すなわち、「含むが、それに限定されるものではない」ことを意味する）。
【００２５】
本明細書で特に指摘しない限り、数値範囲の記載は、単にその範囲内の各々別個の数値を個別に参照する簡単な方法として用いることを意図したものであり、各々個別の数値は、ここに個別に列記されたときのように、本明細書に組み入れられる。あらゆる範囲の終点は、その範囲に含まれ、独立的に結合できる。
【００２６】
本明細書で説明される全ての方法は、明細書に特に指摘されるか、または文脈により明白に矛盾しない限り、適切な順序で行うことができる。いずれか及び全ての実施例、または例示的用語（例えば、「のような」）の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図しており、特にクレームしない限り、本発明の範囲に限定を付するものではない。本明細書のいかなる記載も、ここで用いられた方法で発明の実施に不可欠なクレームされていない要素を指し示していると解釈してはならない。特に定義されない限り、ここで使用される技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野で当業者により一般的に知られているものと同じ意味を有する。
【００２７】
本発明の一態様による心血管疾患診断用の多重ＳＮＰマーカーは、表１に記載された一つ以上のＳＮＰを含む。ＳＮＰは、表１における配列番号１から３５のヌクレオチド配列からなる群から選択される参照ポリヌクレオチドにより核酸中で同定することができ、ここで、前記ＳＮＰは、配列番号４中７６番目、配列番号８中８５番目、配列番号９中５１番目、配列番号１０中３５番目、配列番号１９中８５番目、並びに配列番号１から３、５から７、１１から１８及び２０から３５中１０１番目のヌクレオチドに位置する。
【００２８】
国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ｄｂＳＮＰデータベースのＳＮＰ登録番号は、各ＳＮＰのフランキングまたは参照配列、及びその参照配列内のＳＮＰ位置を表すものである。当業者ならば、前記ｄｂＳＮＰのｒｓ登録番号を利用してＳＮＰの位置及び基準配列を容易に同定することができる。ＮＣＢＩのｄｂＳＮＰに登録されているＳＮＰのｒｓ番号に対応する特定の参照配列は、長い間に変更されることがある。本発明の範囲が、対応するｒｓ番号が変更されたとしても、その参照配列に及ぶということは当業者に自明なことである。
【００２９】
表１で、「ＳＮＰを含むポリヌクレオチド」と表示された欄は、核酸中のＳＮＰの同定のための参照ヌクレオチド配列についての配列同定番号を提供する。これらのヌクレオチド配列、配列番号１から３５は、それぞれ多型部位を含む多型配列である。「多型配列」は、ＳＮＰが生じている多型部位を含むポリヌクレオチド配列である。多型部位に隣接する多型配列の全部または一部は、当業者により核酸中でＳＮＰを同定するのに使うことができる。
【００３０】
配列番号１から３５のヌクレオチド配列はまた、ＳＮＰの塩基配列を含むポリヌクレオチドである。このポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡでもよい。
【００３１】
これらＳＮＰのいくつかの特徴が表１に開示されている。
【００３２】
【表１】
2008545387.tif 000002
【００３３】
表１中、「多重ＳＮＰマーカー参与回数」は、特定のＳＮＰを含む、表２中の多重ＳＮＰマーカーの個数を表すものである。
【００３４】
「バンド」は、そのＳＮＰの染色体位置を示し、「ｐ」は染色体の動原体から伸びている短腕であり、「ｑ」は動原体から伸びている長腕であり、番号はバンド番号である。例えば、配列番号１に位置するＳＮＰの「バンド」が１７ｑ２３．３であるときには、このＳＮＰは第１７染色体上の長腕（ｑ）かつ２３．３領域のバンドに位置する。
【００３５】
「遺伝子」は、ＳＮＰを含む遺伝子であって周知のものを参照している。
【００３６】
「ＳＮＰの機能」は、遺伝子のＳＮＰであって周知のものが果たす役割を示している。
【００３７】
本発明の一態様は、心血管疾患（ＣＶＤ）診断用のポリヌクレオチドセットを提供する。このポリヌクレオチドセットは、ここで開示されたＣＶＤ診断のための多重ＳＮＰマーカーの遺伝子型パターンを決定するために使ことができる。各ポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１から３５のヌクレオチド配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列について、少なくとも１０個のコンティグ塩基を含む核酸配列、ここで、前記少なくとも１０個のコンティグ塩基は、前記選択されたヌクレオチド配列中の一塩基多型（ＳＮＰ）の塩基を含み、ここで、該ＳＮＰは、配列番号４の７６番目のヌクレオチド、配列番号８の８５番目のヌクレオチド、配列番号９の５１番目のヌクレオチド、配列番号１０の３５番目のヌクレオチド、配列番号１９の８５番目のヌクレオチド、または配列番号１から３、５から７、１１から１８及び２０から３５の１０１番目のヌクレオチドに位置しており、あるいは（ｂ）核酸配列（ａ）の相補的配列を含む。
【００３８】
一実施形態では、そのセットは、前記多重ＳＮＰマーカーを含む少なくとも２個のＳＮＰの遺伝子型を決定するためのポリヌクレオチドを含む。他の実施形態では、そのセットは、前記多重ＳＮＰマーケットを含むＳＮＰのそれぞれの遺伝子型を決定するためのポリヌクレオチドを含む。さらに他の実施形態では、前記セットは、表１のＳＮＰそれぞれによる遺伝子型を決定するためのポリヌクレオチドを含む。
【００３９】
本発明の一実施形態において、多重ＳＮＰマーカーのＳＮＰに関する核酸中での遺伝子型は、以下の表２に記載されたＳＮＰの遺伝子型のうちの一つであってもよい。
【００４０】
【表２】
2008545387.tif 000003
【００４１】
本実施形態による多重ＳＮＰマーカーは、表１に列挙された単一のＳＮＰを組み合わせた１２個の多重ＳＮＰマーカーの一つであってもよい。組み合わせの中の各ＳＮＰが参照配列番号により表されているため、このＳＮＰの組み合わせ及びそれらの遺伝子型は、表２に開示されている。表２の「多重ＳＮＰマーカー」は、選択された３個の単一のＳＮＰの組み合わせを表している。「遺伝子型」は、本発明者らにより罹患した集団に特徴的であると決定された多重ＳＮＰマーカーの配列番号順に単一ＳＮＰの遺伝子型を表す。例えば、表２の１番において、「ｒｓ２０５６８」の遺伝子型（配列番号２）、「ｒｓ２０９１７６」の遺伝子型（配列番号２５）、及び「ｒｓ５０５０」の遺伝子型（配列番号３）は、それぞれＣＣ、ＣＣ及びＴＧである。
【００４２】
本発明の別の実施形態において、心血管疾患は、心筋梗塞症、狭心症、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、心不全、動脈瘤、動脈硬化症、塞栓症、脳卒中又は血栓症であってもよく、本発明の一実施形態では、心筋梗塞症である。
【００４３】
本発明の実施例では、心血管疾患の高い罹患率に符合する単一のＳＮＰの組み合わせ、すなわち、多重ＳＮＰマーカーを探索するために、一連の選択過程を経た。
【００４４】
前記多重ＳＮＰマーカーの選択は、人間の男性の被検体を対象として行なった。男性の心血管疾患患者及び男性の健常者の血液からＤＮＡを分離及び増幅した後、男性の心血管疾患患者に特に現れるが、男性の健常者には現れない特異的なＳＮＰの組み合わせ、及びそれらの遺伝子型を同定した。
【００４５】
同定されたＳＮＰの組み合わせ、及びそれらの遺伝子型を表２に表した。多重ＳＮＰマーカーの統計的特徴については、下記表３に記載されている。
【００４６】
【表３】
2008545387.tif 000004
【００４７】
表３の「番号」は、表２の多重ＳＮＰマーカーの番号に対応している。
【００４８】
「患者群の出現頻度」は、検査した全患者２２１人のうち前記多重ＳＮＰマーカーを有する患者数を表す。「健常群の出現頻度」は、検査した１９２人の健常者のうち、前記多重ＳＮＰマーカーを有する男性の数を表す。
【００４９】
「オッズ比」は、健常群における前記多重ＳＮＰマーカーを有する確率に対する、患者群における前記多重ＳＮＰマーカーを有する確率、の比率を表す。すなわち、オッズ比はａｄ／ｂｃであり、ａは患者群の多重ＳＮＰマーカーの出現頻度を表し、ｃは健常群の多重ＳＮＰマーカーの出現頻度を表し、ｂ＝［（検査した総患者数）−ａ］及びｄ＝［（総健常人数）−ｃ」である。検査した患者及び健常人がそれぞれ２２１人及び１９２人なので、結局ｂ＝［２２１−ａ］であり、ｄ＝［１９２−ｃ」である。
【００５０】
オッズ比が１を超える場合には、その多重ＳＮＰマーカーと患者群との間には相関性がある。オッズ比と共に相関性の程度も増加する。表３に表したように、本発明の一実施形態による、１番から１２番までの多重ＳＮＰマーカーは、１１．５と６１．３との間の範囲のオッズ比を有する。これらの数値は、１よりはるかに大きい数値であるので、本発明の一実施形態による１番から１２番までの多重ＳＮＰマーカーは、心血管疾患の発病と密接な相関性があると推定される。
【００５１】
「９５％信頼区間」は、実際のオッズ比をその区間が含んでいる確率が９５％であることを表し、下記の式を用いて得られる。信頼区間が１を含む場合、すなわち、信頼区間の下限が１より小さく上限が１を超えている場合には、その多重ＳＮＰマーカーと心血管疾患との間に相関性はないことを意味すると解釈される。
【００５２】
９５％信頼区間＝（下限，上限）
＝（オッズ比×ｅｘｐ（−１．９６０），オッズ比×ｅｘｐ（１．９６０））
ここで、Ｖ＝１／ａ＋１／ｂ＋１／ｃ＋１／ｄ）である。
【００５３】
本発明の一実施形態による心血管疾患診断用の多重ＳＮＰマーカーは、多重ＳＮＰマーカーの一つを含んでいればよく、２以上の多重ＳＮＰマーカーを含んでもよく、例えば、１番から１２番までの多重ＳＮＰマーカー全部を含んでいてもよい。
【００５４】
心血管疾患診断用の多重ＳＮＰマーカーに含まれる単一のＳＮＰのポリヌクレオチドは、少なくとも１０個のコンティグ塩基を含んでいてもよく、例えば１０から１００個のコンティグ塩基を含んでいてもよい。
【００５５】
本発明の他の態様による心血管疾患診断用の対立遺伝子特異的ポリヌクレオチドは、本発明の一実施形態によるポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができる。
【００５６】
対立遺伝子特異的ポリヌクレオチドとは、その対立遺伝子に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。配列番号１から３５の多型部位でのＳＮＰの塩基を明確に区別するためには、ハイブリダイゼーションがなされる必要がある。ハイブリダイゼーションは、厳しい条件で行われ、例えば、１Ｍ以下の塩濃度及び２５℃以上の温度下で行われる。例えば、５×ＳＳＰＥ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）及び２５〜３０℃の条件が対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーションに適する。ハイブリダイゼーションの条件は、当業者により所望の用途に応じて変更してもよい。
【００５７】
対立遺伝子特異的ポリヌクレオチドは、もよい。ここで、プライマーとは、適当なバッファ中で適当な条件、例えば、４種の異なるヌクレオチド三リン酸、及び適切な温度下でのＤＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素のような重合剤の存在下で、テンプレート指向ＤＮＡ合成の開始点となりうる一本鎖オリゴヌクレオチドをいう。プライマーの長さは、使用目的によって変わることがあるが、通常１５から３０ヌクレオチドである。短いプライマー分子は、一般的にテンプレートと安定してハイブリダイズするためには、より低い温度を必要とする。プライマー配列は、テンプレートと完全に相補的である必要はないが、テンプレートとハイブリダイズするには十分に相補的でなければならない。プライマーは、その３’末端が配列番号１から３５の多型部位と対応するように整列している。プライマーは、多型部位を含む標的ＤＮＡにハイブリダイズし、プライマーと完全な相同性を有する対立遺伝子の増幅を開始する。このプライマーは、反対側でハイブリダイズするもう一方のプライマーと対をなして使われる。増幅は２つのプライマーを用いて行われ、それは、特異的対立遺伝子が存在するということを意味する。本発明の一実施形態によれば、プライマーは、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）で使われるポリヌクレオチド断片を含む。
【００５８】
本発明の一実施形態において、対立遺伝子特異的ポリヌクレオチドは、プローブであってもよい。プローブとは、ハイブリダイゼーションプローブを意味し、核酸の相補鎖に特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドである。このようなプローブは、Ｎｉｅｌｓｅｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４，  １４９７−１５００（１９９１）で発表されたペプチド核酸を含む。本発明の一実施形態によれば、プローブは、対立遺伝子特異的プローブである。多型部位は同種の２つの個体に由来する核酸断片中に位置する場合には、対立遺伝子特異的プローブは一個体に由来したＤＮＡ断片にはハイブリダイズするが、もう一方の個体に由来した断片にはハイブリダイズしない。この場合、ハイブリダイゼーションの条件は、異なる対立遺伝子についてのハイブリダイゼーションの強度の有意な差を示すことによって、一つの対立遺伝子だけがハイブリダイズするのに十分厳しいものであればよい。本発明の一実施形態によれば、プローブは、中央部位が多型部位であるように、例えば、１５個のヌクレオチドからなるプローブの７番目の位置、または１６個のヌクレオチドからなるプローブの８番目または９番目の位置、となるように配置される。このようにして、異なる対立遺伝子間のハイブリダイゼーションの違いが得られる。本発明の一実施形態によれば、プローブは、対立遺伝子を検出するための診断方法などに使うことができる。診断方法はサザンブロッティングであってもよく、サザンブロッティングによれば、プローブが予め結合したマイクロアレイを用いる方法を用いて、核酸のハイブリダイゼーションを利用して検出が行われる。
【００５９】
本発明の他の態様による心血管疾患診断用マイクロアレイは、本発明の一実施形態によるポリヌクレオチド若しくはその相補的ポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド、またはそのｃＤＮＡを含む。
【００６０】
本発明の一実施形態によれば、マイクロアレイは、本発明の一実施形態によるポリヌクレオチド若しくはその相補的ポリヌクレオチド、プローブとハイブリダイズするポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド、またはそのｃＤＮＡを利用し、本分野の当業者に周知である従来の方法により製造されてもよい。
【００６１】
例えば、前記ポリヌクレオチドは、アミノ−シラン、ポリ−Ｌ−リシン及びアルデヒドの活性基で被覆された基板上に固定されていてもよい。また、基板は、シリコンウェハー、ガラス、石英、金属又はプラスチックで構成されていてもよい。ポリヌクレオチドを基板上に固定化させる方法としては、圧電方式を利用したマイクロピペッティング法、ピン状のスポッターを利用した方法のいずれかを使用できる。
【００６２】
本発明の他の態様による心血管疾患診断用のキットは、マイクロアレイを含む。
【００６３】
前記キットは、被検体からＳＮＰを含むＤＮＡを分離し増幅するためのプライマーセットをさらに含んでいてもよい。適切なプライマーセットは、本発明の一実施形態による配列を参照し、当業者であれば容易に設計しうる。例えば、表４のプライマーセットを利用できる。
【００６４】
本発明の他の態様による心血管疾患の診断方法は、本発明の多重ＳＮＰマーカーを使用する。
【００６５】
前記診断方法は、被検体のＳＮＰの遺伝子型を決定する段階を含み、ここで、ＳＮＰは、表２の多重ＳＮＰマーカーを含むＳＮＰの一つである。ＳＮＰは、配列番号１から３５のポリヌクレオチドによって同定することができ、ここで、該ＳＮＰは、参照ポリヌクレオチド中の、配列番号４の７６番目、配列番号８の８５番目、配列番号９の５１番目、配列番号１０の３５番目、配列番号１９の８５番目、または配列番号１から３、５から７、１１から１８及び２０から３５の１０１番目に位置する。この方法は、さらに各多重ＳＮＰマーカー内の各ＳＮＰ、または各多重ＳＮＰマーカー内の各ＳＮＰの遺伝子型を決定する段階を含むことができる。また、この方法は、さらに被検体から試料を得る段階を含んでもよく、ここで、試料は核酸またはポリペプチドを含んでおり、またはさらに被検体から核酸を分離する段階を含むことができる。
【００６６】
ＤＮＡ分離は、この分野の当業者に周知の方法を用いて行ってもよい。例えば、組織または細胞からＤＮＡを直接に精製したり、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などを使用し、特定の領域を増幅し、これを分離したりすることができる。本明細書において、ＤＮＡとは、ＤＮＡだけではなく、ｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡも参照する。被検体から核酸を得る段階は、例えば、ＰＣＲ増幅の一つ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４，  ５６０（１９８９）；  Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  ｅｔｃ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１，  １０７７（１９８８））、転写増幅（Ｋｗｏｈ  ｅｔｃ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６，  １１７３（１９８９））及び自家維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔｃ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７，  １８７４（１９９０））及び核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）が使われる。
【００６７】
分離されたＤＮＡの配列決定は、この分野の当業者に周知の様々な方法によって行われ得る。例えば、核酸のヌクレオチドはジデオキシ法を用いて直接的に配列決定してよい。同様に、多型部位のヌクレオチドは、ＳＮＰ部位の配列を含むプローブまたはそれに相補的なプローブをＤＮＡとハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーションの程度を調べることによって配列決定してもよい。ハイブリダイゼーションの程度は、検出可能な標識を標的ＤＮＡに標識し、ハイブリダイズした標的を特異的に検出する方法を用いるか、電気的信号検出方法を用いて測定できる。多型部位の遺伝子型を決定する段階は、被検体から分離した核酸試料を、本発明の実施形態によるＳＮＰを含むポリヌクレオチドまたはそのポリヌクレオチドとハイブリダイズしたポリヌクレオチドとハイブリダイズさせる段階、及びハイブリダイゼーションの結果を検出する段階とを含むことができる。加えて、ＳＮＰの遺伝子型決定は、実施例の質量分析法、またはこの分野で周知の他の適切な方法いずれを利用して行ってもよい。
【００６８】
心血管疾患の診断方法は、ＳＮＰの遺伝子型が、選択された多重ＳＮＰマーカーのうちのＳＮＰについて、表２に列挙された心血管疾患に関連のある遺伝子型に適合する場合、被検体を心血管疾患の発現及びその確率の高い、高危険群に属すると判定する段階をさらに含むことができる。加えて、その方法は、被検体に対して選択された多重ＳＮＰマーカーのうちの各ＳＮＰに対する遺伝子型を決定する段階、及び選択された多重ＳＮＰマーカーのうちの各ＳＮＰに対して決定された遺伝子型が、そのＳＮＰについて表２に列挙された心血管疾患に関連のある遺伝子型に適合する場合、被検体は心血管疾患発現のより高い危険群に属すると判定する段階をさらに含むことができる。
【発明の効果】
【００６９】
有利な効果
本発明のＳＮＰは、心血管疾患の診断及び治療のために使用できる。また、本発明のＳＮＰを含むマイクロアレイ及びキットにより、心血管疾患を効果的に診断できる。また、本発明の心血管疾患と関連したＳＮＰ分析により、心血管疾患の存在または危険の有無を効果的に診断できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７０】
最良の形態
本発明を以下の実施例を参照してさらに詳細に説明する。しかし、以下の実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がそれらの実施例に限定されるものではない。
【００７１】
実施例１
多重ＳＮＰマーカーの選別
心血管疾患と診断され治療中である患者群と、心血管疾患症状のない健常者との血液からＤＮＡ試料を分離した。それから、特定ＳＮＰの対立遺伝子の出現頻度を分析した。患者群と健常者群双方は韓国人からなる。本実施例のＳＮＰは、公開されたデータベース、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰ（ＮＣＢＩ  ｄｂＳＮＰ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／）またはシーケノム社のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅａｌｓｎｐ．ｃｏｍ／）から選択した。選択されたＳＮＰ近傍の配列とハイブリダイズするプライマーを利用し、ＳＮＰを分析した。
【００７２】
１−１．ＤＮＡ試料の調製
心血管疾患と診断され、治療中である２２１人の韓国人男性患者群の血液からＤＮＡを抽出した。心筋梗塞症状のない韓国人男性１９２人の健常者群の血液からもＤＮＡを抽出した。染色体ＤＮＡ抽出は、公知の抽出法（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ｐ．３９２，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）と市販のキット（Ｇｅｎｔｒａ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｄ−５０Ｋ）の説明書とを用いてなされた。ＵＶ測定（２６０／２８０ｎｍ）により、少なくとも１．７の純度を持つＤＮＡだけを抽出したＤＮＡから選別し、使用した。
【００７３】
１−２．標的ＤＮＡの増幅
分析しようとする７０５個のＳＮＰのうち、少なくとも１つを含む一定のＤＮＡ領域を有する標的ＤＮＡをＰＣＲを利用して増幅した。ＰＣＲは、従来の方法で進め、その条件は、次の通りであった。まず、染色体ＤＮＡを２．５ｎｇ／ｍｌになるまで希釈した。次に、次のＰＣＲ混合液を準備した。
【００７４】
水（ＨＰＬＣ級） ２．２４□
１０×バッファ（１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有）０．５□
ｄＮＴＰ混合液（ＧＩＢＣＯ）（２５ｍＭ／各）０．０４□
Ｔａｑ ｐｏｌ（ＨｏｔＳｔａｒｔ）（５Ｕ／□）０．０２□
フォワード／リバースプライマー混合液（１μＭ／各）０．０２□
ＤＮＡ１．００□
総体積５．００□
ここで、増幅反応によって、２００以下のヌクレオチドを含む標的ＤＮＡ断片を得るために、フォワード及びリバースプライマーは、公知の参照配列中の適正な位置に存在するＳＮＰの上流と下流とから選択した。７０５個のプライマーセットのいくつかを表４に示す。
【００７５】
ＰＣＲの熱循環は、９５℃で１５分間維持し、その後９５℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で１分を計４５回繰り返し、７２℃で３分間維持した後、４℃で保管した。
【００７６】
１−３．増幅された標的ＤＮＡのＳＮＰの分析
標的ＤＮＡ断片のＳＮＰ分析は、シーケノム社の均質的ＭａｓｓＥｘｔｅｎｄ（ｈＭＥ）法を利用して行った。ｈＭＥ法の原理は、次の通りである。まず、標的ＤＮＡ断片のＳＮＰ直前までの塩基に相補的な、伸長用プライマーとも呼ばれるプライマーを準備した。次に、そのプライマーを標的ＤＮＡ断片にハイブリダイズさせ、ＤＮＡ重合反応を促進させた。このとき、被検体のＳＮＰ対立遺伝子の中の第一対立遺伝子塩基（例えば、Ａ対立遺伝子）に相補的な塩基を加えた後、反応液に加えたのは、重合を終了させるための試薬（終止混合液、例えば、ｄｄＴＴＰ）である。その結果、標的ＤＮＡ断片が第１対立遺伝子（例えばＡ対立遺伝子）を含む場合には、添加された第一対立因子に相補的な塩基（例えば、Ｔ）だけを含む生成物が得られた。一方、標的ＤＮＡ断片が第二対立遺伝子（例えば、Ｇ対立遺伝子）を含む場合には、第一対立遺伝子塩基（例えば、Ａ）まで伸びた第二対立遺伝子に相補的な塩基（例えば、Ｃ）を有する生成物が得られた。標的ＤＮＡの中の対立遺伝子の種類を決定するため、プライマーから伸びた生成物の長さを質量分析を用いて決定した。具体的な実験条件は、次の通りであった。
【００７７】
まず、ＰＣＲ生成物から、遊離ｄＮＴＰを除去した。このために、純水１．５３□、ｈＭＥバッファ０．１７□、エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）０．３０□を１．５ｍｌチューブに入れて混合し、ＳＡＰ酵素溶液を準備した。このチューブを５，０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離した。その後、ＰＣＲ生成物をＳＡＰ溶液チューブに入れ、密封し、３７℃で２０分、８５℃で５分間維持した後、４℃で保管した。
【００７８】
次に、前記標的ＤＮＡ生成物をテンプレートとして均質的伸長反応を実施した。反応液は、次の通りであった。
【００７９】
水（ナノクラスの純水）１．７２８□
ｈＭＥ伸長混合液（２．２５ｍＭ ｄ／ｄｄＮＴＰｓを含む１０×バッファ）０．２００□
伸長プライマー（各１００μＭ）０．０５４□
サーモシークエナーゼ（３２Ｕ／□）０．０１８□
総体積２．００□
反応液をよく混合した後、スピンダウン遠心分離を行った。前記反応液の入ったチューブまたはプレートを密封し、９４℃で２分間維持し、続いて９４℃で５秒、５２℃で５秒、７２℃で５秒の条件で計４０回反復した後、４℃で保管した。得られた均質的伸長反応生成物を樹脂（ＳｐｅｃｔｒｏＣＬＥＡＮ、シーケノム社 ＃１００５３）で洗浄し、塩を除去した。均質的伸長反応に使われた延長プライマー７０５個のうちいくつかを表４に表した。
【００８０】
【表４】
2008545387.tif 000005
【００８１】
得られた伸長反応生成物について、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を用いて質量分析を行った。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦでは、分析しようとする物質がレーザービームを照射され、イオン化されたマトリックス（３−ヒドロキシピコリン酸）と共に真空中を検出器まで飛行する。検出器までの飛行時間を計算して質量を決定する。軽い物質は重い物質よりも短い時間で検出器に到達することができる。標的ＤＮＡのＳＮＰのヌクレオチド配列は、質量の差と、既知のＳＮＰの配列とに基づいてを決定できる。
【００８２】
診断数値を有すると判明した各ＳＮＰの可能な対立遺伝子を、表１に表示されたヌクレオチド配列に示す。各対立遺伝子は、個体においてホモ接合体またはヘテロ接合体の形態で存在しうる。メンデルの遺伝法則とハーディー−ワインバーグ（Hardy-Weinberg）法則とによれば、集団を構成する対立遺伝子の遺伝的な構成は、一定の頻度に維持される。与えられたＳＮＰの対立遺伝子の頻度が、疾患群と健常群とで統計的に有意なレベルで異なっている場合には（すなわち、患者群対健常群により示されるような一般的集団についてハーディー-ワインバーグ平衡を介して予想される対立遺伝子頻度）、その変動は予測値を与え、従って、心血管疾患の診断に効果的に使うことができる。選択されたＳＮＰは、一般的集団で同定され公開データベースで確認されるほど頻度が高いために、本発明の実施形態による７０５個の単一のＳＮＰはいずれも、双方の集団において生じる。
【００８３】
１−４．多重ＳＮＰマーカーの選別
心血管疾患患者で頻繁に発見されるＳＮＰの組み合わせ、すなわち多重ＳＮＰマーカーを、２２１人の男性心血管疾患患者と１９２人の男性健常者に対し、分析した７０５個のＳＮＰ配列に基づき、選別した。
【００８４】
まず、７０５個のＳＮＰ配列のうち１〜３個を有し、かつ、あり得る多重ＳＮＰマーカーの数は、ほぼ７．３×１０９個あるということを見出した。
【００８５】
一次スクリーニングの後、遺伝子型の差が０．１×（全体患者の数、すなわち２２１）以上かつ遺伝子型比２以上を有する１１，５８２，３６１個の多重ＳＮＰマーカーを選別した。
【００８６】
遺伝子型の比＝（ある遺伝子型を有する患者の数）／（その遺伝子型を有する健常者の数）
遺伝子型の差＝（ある遺伝子型を有する患者の数）−（その遺伝子型を有する健常者の数）
さらに、疾患群及び健常群で遺伝子型パターンの頻度の差についてｐ値が１０−６以下である５，３４８個の多重ＳＮＰマーカーを選別した。フィッシャーの直接確率検定を用いて得られるｐ値は、さらに正確な統計的有意性を調べるのに使われる変数である。本発明の実施形態によれば、ｐ値が１０−６以下である場合には、その遺伝子型は危険因子または保護因子を示し、それにより、表現型と疾病の間には有意な関係があることが判明する。
【００８７】
二次スクリーニングでは、オッズ比、そのオッズ比の９５％信頼区間及び９９％信頼区間を用いた。オッズ比はａｄ／ｂｃで定義され、ここで、ａ、ｂ、ｃ及びｄは表５で定義される。オッズ比が１を超える場合には、遺伝子型は心血管疾患に危険因子として働くことを意味する。
【００８８】
【表５】
2008545387.tif 000006
【００８９】
オッズ比の９５％信頼区間＝（オッズ比×ｅｘｐ（−１．９６０），オッズ比×ｅｘｐ（１．９６０）（ここで、Ｖ＝１／ａ＋１／ｂ＋１／ｃ＋１／ｄ）
オッズ比の９９％信頼区間＝（オッズ比×ｅｘｐ（−２．５７６），オッズ比×ｅｘｐ（２．５７６）（ここで、Ｖ＝１／ａ＋１／ｂ＋１／ｃ＋１／ｄ）
選別された５，３４８個の多重ＳＮＰマーカーのうち、２，８２６個の多重ＳＮＰマーカーは、９５％信頼区間の下限が２．０以上である多重ＳＮＰマーカーによって選別されて、オッズ比が３．０以上である多重ＳＮＰマーカーを選別し、それから、オッズ比の９９％信頼区間の下限が２．０以上である多重ＳＮＰマーカーを選別した。オッズ比、並びに、９５％及び９９％信頼区間の下限値が１．０を超えれば、結果は統計的に有意なものである。しかしながら、もっとも効果的なマーカーを選別するために、要求される基準値をそれぞれ２．０、３．０及び２．０とした。
【００９０】
２，８２６個の多重ＳＮＰマーカーのうち、少数の単一のＳＮＰから構成され、高いオッズ比、すなわち患者群に対しては高いカバー率、かつ、健常群に対しては低いカバー率を有する１２個の多重ＳＮＰマーカーを、最適化方法であるグリーディー法（Ｃｏｒｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ”，  ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１）を用いて選別した。１２個の多重ＳＮＰマーカーは、表２に示されている。
【００９１】
実施例２
ＳＮＰ固定マイクロアレイの製作
選別した多重ＳＮＰマーカーの遺伝子型に対応するポリヌクレオチドを基板上に固定してマイクロアレイを製作した。すなわち、配列番号１から３５の２０個のコンティグヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり、ここで、表１のヌクレオチド配列の２０個のコンティグヌクレオチドの１１番目に位置するＳＮＰの塩基を含む各ポリヌクレオチドが基板に固定された。配列番号１から３５において、ＳＮＰは、配列番号４の７６番目のヌクレオチド、配列番号８の８５番目のヌクレオチド、配列番号９の５１番目のヌクレオチド、配列番号１０の３５番目のヌクレオチド、配列番号１９の８５番目のヌクレオチド、及び配列番号１から３、５から７、１１から１８及び２０から３５の１０１番目のヌクレオチドに位置する。各ＳＮＰ配列に２つのポリヌクレオチドが基板に固定され、それは各ＳＮＰの２つの対立遺伝子それぞれに一つずつである。
【００９２】
まず、各ポリヌクレオチドの５’末端をアミン基で置換し、そのポリヌクレオチドをシリル化スライド（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ社）にスポッティングし、このとき、スポッティングバッファは２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）を使用した。スポッティング後、乾燥器中で２分間スライドの温度を９５℃に昇温させることによって結合を誘導した。結合していないポリヌクレオチドを、ブロッキング溶液（１．０ｇ ＮａＢＨ４、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）３００ｍＬ、ＥｔＯＨ １００ｍＬ）で１５分間、０．２％ＳＤＳ溶液で１分間、三次蒸溜水で２分間洗浄することによって除去し、常温で乾燥させた。
【００９３】
実施例３
マイクロアレイを利用した心血管疾患診断
実施例１の１−１及び１−２で説明した方法を用いて、心血管疾患の発現またはその確率を診断するために、被検体の血液から標的ＤＮＡを分離し、蛍光物質で標識した。蛍光標識された標的ＤＮＡは、実施例２で製造されたマイクロアレイを用い、ＵｎｉＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（ＴｅｌｅＣｈｅｍ社）でハイブリダイゼーションを４２℃で４時間行った。スライドは２×ＳＳＣで室温、５分間の条件で二回洗浄した後、空気中で乾燥した。乾燥したスライドをＳｃａｎＡｒｒａｙ ５０００（ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ社）でスキャンした。スキャン結果をＱｕａｎｔＡｒｒａｙ（ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ社）とＩｍａＧｅｎｅソフトウェア（ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒ社）とで分析した。被検体が本発明の実施形態による多重ＳＮＰマーカー全部または一部を有しているか否かを確認することにより、心血管疾患の発病可能性及び心血管疾患に対する感受性を測定した。
【００９４】
本発明を実施例を参照して特に明らかにし説明したが、当業者ならば、以下の請求の範囲で定義する本発明の範囲および趣旨から逸脱せずに多様な変更を形式や細部において加えうるということを理解するであろう。ここで特に指摘しない限り、あるい文脈により明らかに矛盾しない限り、上記の要素のどのような組み合わせも、それらの可能な変更すべてにおいて、本発明に包含される。
【配列表】
2008545387000001.app
【国際調査報告】
2008545387.tif 000007
2008545387.tif 000008
2008545387.tif 000009
2008545387.tif 000010