(57)【要約】  本発明は、式（Ｉ）（式中、Ｒ１はアルキルＣ１〜Ｃ３を示し、Ｒ２はＣＨ３−またはＣＯＮＨ２−（メチル−または第一級アミド−）から選択される官能基を示す）で表される新規のポリエンに関する。上記ポリエンは、エルゴステロールを有する細胞膜を含む生物、例えば真菌または寄生虫に対して殺生物作用を有する。該化合物は、その生成を可能にする条件下での生成微生物の培養にある方法を用いて取得可能である。さらに、本発明は、ＡＴＰ／Ｍｇ＋＋およびアミド基供与体化合物（好ましくはグルタミン）の存在下でのカルボキシル化ポリエンのその産生株の無細胞抽出液（またはタンパク性画分）とのインキュベーションを含める、アミド化ポリエンのインビトロ生成における機構にも関する。
2008538895.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2008538895.tif 000018
[式中、Ｒ１はアルキルＣ１〜Ｃ３であり、Ｒ２はＣＨ３−またはＣＯＮＨ２−（メチル−または第一級アミド−）の中から選択される官能基である]
によって特徴づけられるポリエンマクロライド化合物、その異性体、塩、プロドラッグあるいは溶媒和物。
【請求項２】
式（Ｉ−１）
【化２】
2008538895.tif 000019
（式中、ＲはＮＨ２であり、Ｒ１はアルキルＣ１〜Ｃ３である）
によって特徴づけられる、請求項１に記載の化合物、その異性体、塩、プロドラッグまたは溶媒和物。
【請求項３】
リモシジンＢ（Ｉ−１ａ）およびＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）
【化３】
2008538895.tif 000020
として同定された、式Ｉに属するアミド化化合物の中から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
式（ＩＩＩ）
【化４】
2008538895.tif 000021
（式中、Ｒ１はアルキルＣ１〜Ｃ３である）
によって特徴づけられる、請求項１に記載の化合物、その異性体、塩、プロドラッグまたは溶媒和物。
【請求項５】
リモシジンＣ（ＩＩＩａ）およびＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）
【化５】
2008538895.tif 000022
2008538895.tif 000023
として同定された、式ＩＩＩに属する前記化合物の中から選択されることを特徴とする、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
不活性媒体とともに請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物を含むことを特徴とする殺生物組成物。
【請求項７】
式（Ｉ）の前記化合物が請求項２に記載の式（Ｉ−１）の化合物中から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の殺生物組成物。
【請求項８】
式（Ｉ−１）の前記化合物がリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）、ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）およびそれらの混合物の中から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の殺生物組成物。
【請求項９】
式（Ｉ）の前記化合物が請求項４に記載の式（ＩＩＩ）の化合物中から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の殺生物組成物。
【請求項１０】
式（ＩＩＩ）の前記化合物がリモシジンＣ（ＩＩＩａ）、ＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）およびそれらの混合物の中から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の殺生物組成物。
【請求項１１】
場合により１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤とともに請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１２】
式（Ｉ）の前記化合物が請求項２に記載の式（Ｉ−１）の化合物の中から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
式（Ｉ−１）の前記化合物がリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）、ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）およびそれらの混合物の中から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
式（Ｉ）の前記化合物が請求項２に記載の式（ＩＩＩ）の化合物の中から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
式（ＩＩＩ）の前記化合物がリモシジンＣ（ＩＩＩａ）、ＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）およびそれらの混合物の中から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
１つ以上の治療薬をさらに含む、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
細胞膜がエルゴステロールを含有するかまたはそれを含有しないポリエンマクロライドに感受性を示す病原体により誘発されるヒトまたは動物の感染の予防および／または処置を目的とした薬剤の調製における請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項１８】
式（Ｉ）の前記化合物が請求項２に記載の式（Ｉ−１）の化合物の中から選択されることを特徴とする、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
式（Ｉ−１）の前記化合物がリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）、ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）およびそれらの混合物の中から選択されることを特徴とする、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
式（Ｉ）の前記化合物が請求項４に記載の式（ＩＩＩ）の化合物の中から選択されることを特徴とする、請求項１７に記載の使用。
【請求項２１】
式（ＩＩＩ）の前記化合物がリモシジンＣ（ＩＩＩａ）、ＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）およびそれらの混合物の中から選択されることを特徴とする、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
場合により１つ以上の不活性媒体とともに請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物を含むことを特徴とする、抗真菌組成物。
【請求項２３】
式（Ｉ）の前記化合物が請求項２に記載の式（Ｉ−１）の化合物の中から選択されることを特徴とする、請求項２２に記載の抗真菌組成物。
【請求項２４】
式（Ｉ−１）の前記化合物がリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）、ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）およびそれらの混合物の中から選択されることを特徴とする、請求項２３に記載の抗真菌組成物。
【請求項２５】
式（Ｉ）の前記化合物が請求項４に記載の式（ＩＩＩ）の化合物の中から選択されることを特徴とする、請求項２２に記載の抗真菌組成物。
【請求項２６】
式（ＩＩＩ）の前記化合物がリモシジンＣ（ＩＩＩａ）、ＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）およびそれらの混合物の中から選択されることを特徴とする、請求項２５に記載の抗真菌組成物。
【請求項２７】
１つ以上の抗真菌剤をさらに含む請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
植物内の植物病原性真菌によって誘発される感染を制御するための方法であって、前記植物またはそれをとりまく媒体に請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の抗真菌組成物を適用するステップを含む、方法。
【請求項２９】
果物内の植物病原性真菌によって誘発される感染を制御するための方法であって、前記果物に請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の抗真菌組成物を適用するステップを含む、方法。
【請求項３０】
調製された食物内で発生可能な真菌によって誘発される感染を制御するための方法であって、前記調製された食物に請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の抗真菌組成物を適用するステップを含む、方法。
【請求項３１】
請求項２に記載の式（Ｉ−１）の化合物を生成するための方法であって、
ストレプトマイセス・ディアスタティカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）変種１０８／７４３Ｂ、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−５００／７４３Ｂおよびそれらの組み合わせの中から選択される微生物を式（Ｉ−１）の前記化合物の生成を可能にする条件下で培養し、かつ必要に応じてこの前記化合物を単離および精製するステップを含むことを特徴とする、方法。
【請求項３２】
生成されるべき式（Ｉ−１）の前記化合物がリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）、ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）およびそれらの混合物の中から選択されることを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
式（Ｉ−１）の前記ポリエンマクロライド、好ましくはリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）、ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）またはそれらの混合物とともに、前記出発物質のポリエンのリモシジン（ＩＩａ）、ＣＥ−１０８（ＩＩｂ）またはそれらの混合物が同時に生成されることを特徴とする、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項４に記載の式（ＩＩＩ）の化合物を生成するための方法であって、
−前記微生物ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−７６８／７４３Ｂの、式（ＩＩＩ）の化合物の生成を可能にする条件下での培養
−前記発酵培養物の取得および、必要に応じて
−式（ＩＩＩ）の化合物の単離および精製
の段階を含むことを特徴とする、方法。
【請求項３５】
式（ＩＩＩ）の前記化合物がリモシジンＣ（ＩＩＩａ）、ＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）およびそれらの混合物からなる群に属することを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７４３Ｂ、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４（ＤＳＭ１７１８７）およびストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−５００／７４３Ｂの中から選択されることを特徴とする、請求項３１〜３３に記載の方法を実施するのに必要な組換え微生物。
【請求項３７】
請求項４に記載の式（ＩＩＩ）の前記化合物を生成し、かつ前記遺伝子ｒｉｍＧまたは相同遺伝子の発現に排他的に作用することを特徴とする、請求項３４または３５に記載の方法を実施するのに必要な組換え微生物。
【請求項３８】
微生物ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−７６８／７４３Ｂ（寄託番号：ＤＳＭ１７４８２）であり、かつ一般的式（ＩＩＩ）の前記メチル化ポリエン、リモシジンＣ、ＣＥ−１０８Ｃおよびそれらの混合物の産生株であることを特徴とする、請求項３７に記載の微生物。
【請求項３９】
前記微生物ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−７６８／７４３Ｂ（寄託番号：ＤＳＭ１７４８２）に機能的に等価な微生物であることを特徴とする、請求項３８に記載の微生物。
【請求項４０】
ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７４３Ｂ、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−５００／７４３Ｂ、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：：ＰＭ１−７６８Ｂ／７４３Ｂおよびそれらの組み合わせの中から選択されることを特徴とする微生物の培養物。
【請求項４１】
請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物を取得するための請求項３６〜３９のいずれかに記載の微生物または請求項４０に記載の微生物の培養物の使用。
【請求項４２】
式（Ｉ−１）および（ＩＩＩ）の前記化合物が、それぞれリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）またはＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）の中、リモシジンＣ（ＩＩＩａ）またはＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）の中、あるいはそれら化合物の混合物の中から選択されることを特徴とする請求項４１に記載の微生物の使用。
【請求項４３】
式（Ｉ）の化合物を含むことを特徴とする、請求項３６〜３９のいずれかに記載の微生物の発酵培養物。
【請求項４４】
前記微生物がストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７４３Ｂ、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−５００／７４３Ｂおよびそれらの組み合わせからなる群に属し、かつ、リモシジンＢ（Ｉ−１ａ）、ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）およびそれらの混合物からなる群に属する請求項２に記載の式（Ｉ−１）の化合物を含むことを特徴とする、請求項４３に記載の発酵培養物。
【請求項４５】
前記微生物がストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：：ＰＭ１−７６８Ｂ／７４３Ｂであり、かつリモシジンＣ（ＩＩＩａ）、ＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）およびそれらの混合物からなる群に属する請求項４に記載の式（ＩＩＩ）の化合物を含むことを特徴とする、請求項４３に記載の発酵培養物。
【請求項４６】
請求項３６に記載のアミド基を有するポリエンマクロライドの微生物を生成する組換え体を取得するための方法であって、
遊離カルボキシル基を有するポリエンマクロライドの微生物を生成する発現ベクターを導入するステップ、あるいは、遊離カルボキシル基を有するポリエンマクロライドの微生物の生成において、一方で
（ｉ）ポリエンの生合成クラスタを含むベクターまたはその断片と、他方で
（ｉｉ）前記遺伝子ｅｒｍＥを含むＳＣＰ２＊由来のベクターまたはＳＣＰ２＊の複製起点と異なる複製起点、前記遺伝子ｅｒｍＥ、および前記ベクターＳＣＰ２＊の断片を含むベクターの組み合わせを導入するステップを含むことを特徴とする、方法。
【請求項４７】
前記生成された株が前記遺伝子ｒｉｍＧの発現において排他的に作用を受け、以下の段階：
ａ）ポリエンを生成できない、前記遺伝子の破壊または欠失による前記微生物ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８の遺伝子ｒｉｍＧにおける変異体またはその等価物の取得、
ｂ）その後の、前記変異体内の染色体内での前記遺伝子ｒｉｍＡの破壊を補完できるベクター、好ましくはプラスミドによる形質転換
を含むことを特徴とする、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の微生物を取得するための方法。
【請求項４８】
前記生成された株が前記株ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−７６８／７４３Ｂであることを特徴とする、請求項４６に記載の微生物を取得するための方法。
【請求項４９】
前記生成された株が前記相同遺伝子ｒｉｍＧの発現において排他的に作用を受け、以下の段階：
ａ）ポリエンを生成できない、前記遺伝子の破壊または欠失による前記元の微生物の相同遺伝子における変異体の取得、
ｂ）その後、前記変異体内の染色体内での前記遺伝子ｒｉｍＡの破壊を補完できるベクター、好ましくはプラスミドによる形質転換
を含むことを特徴とする、請求項３７に記載の微生物を取得するための方法。
【請求項５０】
前記遺伝子ｒｉｍＧの相同遺伝子がｐｉｍＧ、ａｍｐｈＮ、ｎｙｓＮ、ｃａｎＣ）といった遺伝子に属するチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ活性を有する遺伝子であることを特徴とする、請求項４９に記載の微生物を取得するための方法。
【請求項５１】
前記元の微生物が放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ）であることを特徴とする、請求項４６または５０に記載の微生物を取得するための方法。
【請求項５２】
前記放線菌がストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）であることを特徴とする、請求項５１に記載の微生物を取得するための方法。
【請求項５３】
前記ストレプトマイセス属が、ストレプトマイセス・ノウルセイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｕｒｓｅｉ）、ストレプトマイセス・アルビダス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｉｄｕｓ）、ストレプトマイセス・リモサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｉｍｏｓｕｓ）、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８、ストレプトマイセス・ノドサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｄｏｓｕｓ）、ストレプトマイセス・ナタレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・チャッタノオゲンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｈａｔｔａｎｏｏｇｅｎｓｉｓ）およびストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）からなる群に属することを特徴とする、請求項５２に記載の微生物を取得するための方法。
【請求項５４】
請求項４６〜５３のいずれか一項に記載の方法によって取得可能な組換え微生物。
【請求項５５】
ａ）ＳＣＰ２＊の複製起点および前記エリスロマイシン耐性遺伝子ｅｒｍＥ）を有する前記ベクターＳＣＰ２＊由来のベクターまたはその断片、
ｂ）（ｉ）前記ベクターＳＣＰ２＊の複製起点、（ｉｉ）前記遺伝子ｅｒｍＥ、および（ｉｉｉ）前記ベクターＳＣＰ２＊の断片を有するベクター、
ｃ）（ｉ）ＳＣＰ２＊の複製起点と異なる複製起点、（ｉｉ）前記遺伝子ｅｒｍＥ、および（ｉｉｉ）前記ベクターＳＣＰ２＊の断片を有するベクター、
ｄ）複製起点が欠けており、かつ前記遺伝子ｅｒｍＥおよび前記ベクターＳＣＰ２＊の断片を有するベクター、
ｅ）（ｉ）複製起点、（ｉｉ）前記遺伝子ｅｒｍＥ、および（ｉｉｉ）ポリエンの前記生合成クラスタ全体または前記クラスタの断片を有する、前記ベクターＳＣＰ２＊由来のベクター、
ｆ）（ｉ）前記複製ベクターＳＣＰ２の複製起点と等しいかまたは異なる複製起点、（ｉｉ）前記遺伝子ｅｒｍＥ、（ｉｉｉ）前記ベクターＳＣＰ２＊の断片、および（ｉｖ）ポリエンの前記生合成クラスタ全体または前記クラスタの断片を有する、前記ベクターＳＣＰ２＊由来のベクター、
ｇ）複製起点が欠けており、かつ前記遺伝子ｅｒｍＥ、およびポリエンの前記生合成クラスタ全体または前記クラスタの断片を有するベクター、ならびに
ｈ）複製起点が欠けており、かつ（ｉ）前記遺伝子ｅｒｍＥ、（ｉｉ）前記ベクターＳＣＰ２＊の断片、および（ｉｉｉ）ポリエンの前記生合成クラスタ全体または前記クラスタの断片を有するベクター
の中から選択されることを特徴とする、請求項４６に記載の発現ベクター。
【請求項５６】
ベクターＳＣＰ２＊および前記エリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＥ）の担体に由来することを特徴とする、請求項５５に記載の発現ベクター。
【請求項５７】
前記プラスミドｐＳＭ７８４であることを特徴とする、請求項５６に記載の発現ベクター。
【請求項５８】
ＳＣＰ２＊の複製起点、前記エリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＥ）および前記ベクターＳＣＰ２＊の断片を含むことを特徴とする、請求項５５に記載の発現ベクター。
【請求項５９】
ＳＣＰ２＊の複製起点と異なる複製起点、前記エリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＥ）および前記ベクターＳＣＰ２＊の断片を含むことを特徴とする、請求項５４に記載の発現ベクター。
【請求項６０】
前記遺伝子ｅｒｍＥおよびポリエンの前記生合成クラスタ全体または前記クラスタの断片をプロモーターの制御下で含むＳＣＰ２＊の誘導体であることを特徴とする、請求項５５に記載の発現ベクター。
【請求項６１】
前記クラスタｒｉｍ全体または前記クラスタの断片をさらに含むことを特徴とする、請求項５７〜５９のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項６２】
前記プラスミドｐＳＭ７４３Ｂであることを特徴とする、請求項６１に記載の発現ベクター。
【請求項６３】
マクロラクトン環内に遊離カルボキシル化基を有するポリエンからアミド化ポリエンを取得するための酵素的方法であって、
アミド化ポリエンの産生株の無細胞抽出液を用い、以下の段階：
ａ）精製または未精製の、遊離カルボキシル化基を有するポリエンからなる基質を有する混合物またはそれらの数種の混合物、およびアミド化ポリエンの１つまたは複数の産生株に由来するタンパク質抽出物の調整、
ｂ）ＡＴＰ／Ｍｇ＋＋およびグルタミンまたはそれ以外でアミド基の供与体が存在する条件下でのａ）の前記混合物の反応、ならびに
ｃ）アミド化ポリエンの精製
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項６４】
取得するべき前記アミド化ポリエンがＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）、リモシジンＢ（Ｉ−１ａ）またはそれらの混合物であり、ａ）の前記基質ポリエンが、精製または未精製の、ＣＥ−１０８（ＩＩｂ）、リモシジン（ＩＩａ）またはそれらの混合物であり、かつａ）の前記抽出物がストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４およびストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７４３Ｂからなる株から取得されることを特徴とする、請求項６３に記載の酵素的方法。
【請求項６５】
取得するべき前記アミド化ポリエンがＡＢ−４００（ＩＶｂ）であり、ａ）の前記基質ポリエンが精製または未精製のピマリシン（ＩＶａ）であり、かつａ）の前記抽出物がストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４およびストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７４３Ｂからなる株から取得されることを特徴とする、請求項６３に記載の酵素的方法。
【請求項６６】
取得するべき前記アミド化ポリエンがＡＢ−４００（ＩＶｂ）であり、ａ）の前記基質ポリエンが精製または未精製のピマリシン（ＩＶａ）であり、かつａ）の前記抽出物がストレプトマイセス属ＲＧＵ５．３の株から取得されることを特徴とする、請求項６３に記載の酵素的方法。
【請求項６７】
カルボキシル化ポリエンをそれに対応するアミドに「インビトロ」で変換可能なアミドトランスフェラーゼ活性を包含し、かつアミド化ポリエンの産生株由来であることを特徴とする、アミド化ポリエンの産生株を対象とした請求項６３〜６７のいずれか一項に記載の酵素的方法を開始させるのに必要な無細胞抽出液。
【請求項６８】
ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７４３Ｂ、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４（ＤＳＭ１７１８７）および／またはストレプトマイセス属ＲＧＵ５．３といった微生物が得られることを特徴とする、請求項６７に記載の無細胞抽出液。
【請求項６９】
メチル化アンフォテリシンＢ、メチル化ナイスタチン、メチル化ピマリシンおよびメチル化カンジシジンからなる群に属することを特徴とするメチル化ポリエン化合物。
【請求項７０】
殺生物および薬理学的組成物の調製を目的とする請求項６９に記載のメチル化ポリエンの使用。
【請求項７１】
請求項５４に記載の組換え微生物を、前記化合物の生成を可能にする条件下で培養し、かつ必要に応じて前記化合物を単離および精製するステップを含むことを特徴とするポリエンマクロライドを生成するための方法。
【請求項７２】
前記ポリエンマクロライドが、遊離カルボキシル基を有するポリエンマクロライド、遊離アミド基を有するポリエンマクロライドおよびそれらの混合物の中から選択されることを特徴とする、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
遊離カルボキシル基を有する前記ポリエンマクロライドが、アンフォテリシンＢ、ナイスタチン、リモシジン、ピマリシン、カンジシジンおよびそれらの混合物の中から選択されることを特徴とする、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
アミド基を有する前記ポリエンマクロライドが前記化合物ＡＢ−４００（ＩＶｂ）および請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物の中から選択されることを特徴とする、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
式（Ｉ）の前記化合物がリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）、ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）およびそれらの混合物の中から選択されることを特徴とする、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記ポリエンマクロライドがピマリシン（ＩＶａ）、ＡＢ−４００（ＩＶｂ）、リモシジン（ＩＩａ）、リモシジンＢ（Ｉ−１ａ）、ＣＥ−１０８（ＩＩｂ）、ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）およびそれらの混合物の中から選択されることを特徴とする、請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
場合により１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤とともに前記化合物ＡＢ−４００（ＩＶｂ）を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項７８】
細胞膜がエルゴステロールを有する病原体によって生じるヒトまたは動物の感染の予防および／または処置を目的とした薬剤の調製における前記化合物ＡＢ−４００（ＩＶｂ）の使用。
【請求項７９】
細胞膜がエルゴステロールを有する前記ヒトまたは動物の病原体が寄生虫および真菌の中から選択されることを特徴とする、請求項７８に記載の使用。
【請求項８０】
細胞膜がエルゴステロールを有する病原体によって生じるヒトまたは動物の全身性感染の治療を目的とした、請求項７８または７９に記載の薬剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のアミド化およびメチル化ポリエン、それらを取得するための方法、生物活性の特徴づけ、ならびに治療、農業およびアグロアリメンタリー（ａｇｒｏ−ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ）を例とする用途に関する。本発明は、（ａ）他のポリエンのメチル化誘導体であり、それら各々の生成生物において同様に得られるもの、（ｂ）アミド化ポリエンの組換え生成微生物、ならびに（ｃ）該微生物を取得するのに有用なベクター、ならびに（ｄ）アミド化ポリエンマクロライドの産生株から得られる無細胞抽出液またはタンパク性画分を用いてアミド化ポリエンを取得するための方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、真菌感染における感染症全体の中で占める位置はほとんど重要視されなかった。しかし、ここ２０年にわたりその展望が変化してきた。免疫低下患者の増加、骨髄移植および固形臓器の移植、癌患者数の増加、化学療法治療、自然防御機構を変化させる免疫抑制剤および広域スペクトルの抗菌剤と他の薬剤との併用、ならびにエイズ禍のすべてがこの変化に関与している。真菌種に起因する院内感染が、これまでになく一層深刻なものになっており、かつ慢性真菌症に関連した真菌種も激増している。
【０００３】
抗真菌剤を服用する必要性があるにもかかわらず、全身性感染の治療を目的とする市販されているこれら医薬品の数は危険なまでに少ない。アンフォテリシンＢを包含する、アゾールおよびポリエンなどのそれらの大部分が構造的に完全な真菌膜に標的化されるが、近年では細胞壁に特異的な成分に標的化される抗真菌剤（エチノカンジン）が開発されている。
【０００４】
ポリエンは、その抗真菌活性故に極めて興味深いポリケトンマクロライドの群である。これらの化合物は、紫外／可視領域内に特性スペクトルを有する発色団を形成する、極めて多数のコンジュゲーションされた二重結合を有するマクロラクトン環を有し、これらの特性はそれらの物理および化学特性（光の高吸収、光不安定性（ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｉｔｙ）および低レベルの水への溶解度）に関与している。アンフォテリシンＢなどのそれらの一部が抗真菌剤として重要であるにもかかわらず、それらの正確な作用機序まだ十分に理解されていないが、抗真菌活性はポリエン分子とステロールを含有する膜との相互作用に起因するようである。この相互作用はイオンのチャネルをもたらし、膜が浸透可能になり、電気化学的勾配の破壊と必然的な細胞死が誘発される。これらの化合物は、コレステロールを含有する膜（哺乳類の細胞）よりもエルゴステロール（トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）およびリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）などの真菌および寄生虫の膜内に存在する主要ステロール）を含有する膜に対して有意に高い親和性を示す。にもかかわらず、ポリエンとコレステロールを含有する膜との間の相互作用はささいなことではなく、副作用を引き起こし、それは低い溶解度とともに、化合物が全身性真菌感染の治療にとって全体的に十分ではないことを意味する。アンフォテリシンＢにおけるこれらの望ましくない特性および有毒な副作用に反して、この古い薬剤は４０年を超えて使用されており、大部分の全身性感染の治療における好ましい抗真菌剤であり続けており、事実、新生真菌感染との闘いに利用できるより優れた選択肢がないことは認められている。リポソーム製剤中に薬剤を放出することによって一部の望ましくない作用が最小化でき、これにより、アンフォテリシンＢの毒性が低減され、その細胞壁がエルゴステロールを含有する生物についての抗真菌剤（真菌症）および抗寄生虫剤（例えば、他の寄生虫の中でもリーシュマニア症およびトリパノソーマ症を対象）としての全身適用が可能になっている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。
【０００５】
この理由のため、新規抗真菌剤の発見または既存の抗真菌剤の薬理学的特性の改善は刺激的な課題である。これを目的とし、分子モデルの有理近似を用い、アンフォテリシンＢの数種の半合成誘導体が生成され、かつ有効な抗真菌剤として試験されている。構造的修飾を行うため、特に側鎖のカルボキシル基と糖内のアミノ基という２つの主な標的が検討されている。これらの半合成誘導体には依然として同じ毒性を示したものもあったが、抗真菌活性の向上、水への溶解度の向上、エルゴステロールを含有する膜に対する特異性の向上および溶血活性の低下といった、アンフォテリシンＢの分子と比べて改善された薬理学的特性を示すものもあり、それはエルゴステロールを含有する膜に対して特異性が高まることを示唆した。抗真菌活性の向上によりこれらの化合物についてのいくつかの利点が付与されるが、意外なことに、これらの構造的改良は微生物から単離される天然ポリエン内部に共通に現れるものではない。事実、改善された薬剤が半合成誘導体である限り、記載のすべてのポリエンは、バイオトランスフォーメーションではなく有機合成によって生成される。
【非特許文献１】バーマン（Ｂｅｒｍａｎ）ら、１９９２年、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ３６：１９７８−１９８０頁
【非特許文献２】ハーウォルト（Ｈｅｒｗａｌｄｔ）（１９９９年）、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ．３５４：１１９１−１１９９頁
【非特許文献３】ヤードリー（Ｙａｒｄｌｅｙ）ら、１９９９年、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．６１：１６３−１９７頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
様々な非ポリエン抗真菌剤が使用可能であるが、これらの薬剤の使用は、将来的にこれらの化合物の抗真菌剤治療に対する効率を危うくしうる、それらに耐性を示す株の選択および開発を促進する。したがって、新規抗真菌剤に対する探索および既存の抗真菌剤における薬理学的特性の改善において幅広い関心が認められる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の発明者らは、ポリエンマクロライド系抗生物質リモシジン（ＩＩａ）およびＣＥ−１０８（ＩＩｂ）の産生株であるストレプトマイセス・ディアスタティカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）変種１０８（ペレス−ズニガ（Ｐｅｒｅｚ−Ｚｕｎｉｇａ）ら（２００４年）、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（東京（Ｔｏｋｙｏ））５７：１９７−２０４頁）ならびに２種の天然ポリエンの遺伝子操作により、新規のポリエンマクロライドも組換え株の発酵培養物中で得られることを見出しており、それらは化学的に特徴づけられた後、カルボキシル酸のアミド、すなわちポリエンのリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）およびＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）（それらは各々、リモシジン（ＩＩａ）およびＣＥ−１０８（ＩＩｂ）に由来）、ならびに式（ＩＩＩ）のメチル、すなわちリモシジンＣ（ＩＩＩａ）およびＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）（これら全部が式（Ｉ）に含められる）であることが判明した。インビトロでの生物活性試験および一部の毒性試験では、新規化合物中に存在する化学修飾物が、それらの由来となる生成物によって示される生物学的特性と比べて改善された生物学的特性をもたらすことが示された（実施例１および実施例２を参照）。
【０００８】
より詳細には、本発明の発明者らは、ポリエンマクロライド系抗生物質リモシジン（ＩＩａ）およびＣＥ−１０８（ＩＩｂ）の産生株であるストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８の遺伝子操作（ペレス−ズニガ（Ｐｅｒｅｚ−Ｚｕｎｉｇａ）ら（２００４年）、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（東京（Ｔｏｋｙｏ））５７：１９７−２０４頁）および好ましくはエリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＥ）を有するＳＣＰ２＊に由来するベクター（ウチヤマ（Ｕｃｈｉｙａｍａ）ら、（１９８５年）、Ｇｅｎｅ３８：１０３−１１０頁）ならびに２種の天然ポリエンを用いた形質転換により、新規のポリエンマクロライドも組換え株の発酵培養物中で得られることを見出しており、それらは化学的に特徴づけられた後、カルボキシル酸のアミド、すなわちポリエンのリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）およびＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）（それらは各々、リモシジン（ＩＩａ）およびＣＥ−１０８（ＩＩｂ）に由来）であることが判明した。インビトロでの生物活性試験および一部の毒性試験では、新規化合物（カルボキシル酸の代わりにアミド）中に存在する化学修飾物が、それらの由来となる生成物によって示される生物学的特性と比べて改善された生物学的特性をもたらすことが示された（表２、実施例１）。
【０００９】
さらに本発明では、上記のこれらのアミド化ポリエンのリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）およびＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）の形成についての生合成機構が解明され、２種のポリエンマクロライド系抗生物質のリモシジン（ＩＩａ）およびＣＥ−１０８（ＩＩｂ）の生合成に関与するクラスタの遺伝子操作により（セコ（Ｓｅｃｏ）ら、２００４年、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１１：３５７−３６６頁）、２種の新規ポリエンのリモシジンＣ（ＩＩＩａ）およびＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）（メチル化ポリエン、実施例２）を取得する方法に関する記載がなされる。新規のメチル化ポリエンは、アミド化ポリエンと同様、薬理学的特性において天然テトラエンに対して明らかな改善を示す。
【００１０】
天然テトラエンのリモシジン（ＩＩａ）およびＣＥ−１０８（ＩＩｂ）の生合成において提案されたモデル（セコ（Ｓｅｃｏ）ら、２００４年、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１１：３５７−３６６頁）に基づき、ポリケチドシンテターゼ（ＰＫＳ）のモジュール７は伸長単位としてメチルマロナミル−ＣｏＡを取り込み、それは大環状環内のメチル基の存在を担い、それは後に部位特異的なＰＫＳ後修飾（ｐｏｓｔ−ＰＫＳ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）により、酸化に至ることでリモシジン（ＩＩａ）およびＣＥ−１０８（ＩＩｂ）にて存在する遊離カルボキシル基がもたらされるであろう。チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼがこの酸化に関与し、かつ上記ポリエンの生合成クラスタにてコードされることが記載されている（アパリシオ（Ａｐａｒｉｃｉｏ）ら、２００３年、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６１：１７９−１８８頁）。リモシジン（ＩＩａ）およびＣＥ−１０８（ＩＩｂ）の生合成の場合、その配列の類似性および生合成モデルにおいて単一のチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼのみが必要とされるという事実のため、ＲｉｍＧがカルボキシル基をもたらすためのメチル基の酸化に関与するチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼであることが提示された（セコ（Ｓｅｃｏ）ら、２００４年、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１１：３５７−３６６頁）。
【００１１】
アミド化ポリエンのリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）およびＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）内に存在するアミド基の形成においては、２つの考えられる機構が理論として最初に提示された：（ａ）リモシジン（ＩＩａ）およびＣＥ−１０８（ＩＩｂ）の形成において提示されたメチルマロニル−ＣｏＡ単位に加えて、ポリケトン鎖の構築の中でのマロナミル−ＣｏＡ単位の取り込み、または（ｂ）一旦大環状環の側鎖メチル基がカルボキシル基に酸化されると作用するアミドトランスフェラーゼ活性である。
【００１２】
本発明は、本明細書中で後にリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）およびＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）として同定される２種のアミド化ポリエン、および後にリモシジンＣ（ＩＩＩａ）およびＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）として同定される２種のメチル化ポリエンに関し、それらの取得方法および用途は本発明のさらなる態様を構成する。
【００１３】
該化合物は、一般に、エルゴステロールを含有する細胞膜を有する生物、すなわち真菌または寄生虫に対してより選択的な殺生物活性を有する。殺生物組成物、例えば、該アミド化またはメチル化ポリエンを含有する農業またはアグロアリメンタリー用途の医薬組成物および／または抗真菌組成物は、本発明のさらなる態様を構成する。ヒトまたは動物用途のサニタリー分野での医薬組成物中および／あるいは農業またはアグロアリメンタリー用途の抗真菌組成物中での、アミド化またはメチル化されるかかるポリエンの使用は本発明の別の態様を構成する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、ピマリシン（ＩＶａ）の対応するアミドであるポリエンＡＢ−４００（ＩＶｂ）の用途に関し（カネド  Ｌ．Ｍ．（Ｃａｎｅｄｏ  Ｌ．Ｍ．）ら、２０００年、Ｊ．，Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（東京（Ｔｏｋｙｏ））５３：６２３−６２６頁）、それは、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＲＧＵ５．３から単離され、かつ本発明で強調されるこの化合物の試験の結果に基づくものである。
【００１５】
別の態様では、本発明は、さらに下文で同定されるｐＳＭ７８４またはｐＳＭ７４３Ｂなどのエリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＥ）を少なくとも有するＳＣＰ２＊由来のベクターの使用に関する。遊離カルボキシル基を有するポリエンマクロライドの生成微生物をはじめ、カルボキシル基の代わりにアミド基を有するポリエンマクロライドの組換え生成微生物を生成するための該ベクターの使用は、本発明の別の態様を構成する。
【００１６】
本発明は、別の態様では、該化合物の組換え生成微生物を該ポリエンの生成を可能にする条件下で培養してそれらをアミド化またはメチル化し、かつ必要に応じてそれら化合物を単離および精製するステップからなる、該アミド化ポリエンを生成するための方法に関する。かかる組換え微生物の具体例として、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７４３Ｂおよびストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−５００／７４３Ｂが挙げられ（実施例を参照）、それらは、該アミド化ポリエンの取得、および場合によりカルボキシル基を有するポリエンを含有するこれらの混合物の取得における、それらまたは類似の組換え微生物の使用を伴う本発明のさらなる態様を構成する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、アミド化ポリエンのアミド基を形成するための機構の解明に関し、ここではカルボキシル基の形成の遮断を目的とした遺伝子ｒｉｍＧの中断または欠失が重要であった。一旦カルボキシル基の形成が遮断され、もしそこでポリケトン鎖の構築の間にアミド基の形成が生じるならば、破壊株をアミド化テトラエンの生合成の誘導プラスミドで形質転換する場合、後者は発酵培養物中で検出されるはずである。陰性の場合であれば、一旦後者が形成されていると、アミド基の形成が遊離カルボキシル基上のアミドトランスフェラーゼ活性により生じると結論づけられることになる。
【００１８】
遺伝子ｒｉｍＧに変異を生じさせるための代替案として、不活性化遺伝子の破壊が選択された。しかし、この初期条件では、想定外に、上記のように行われた遺伝子ｒｉｍＧにおける破壊により、ポリエンを生成できない組換え体が生成される。これは、破壊に用いたプロモーターがおそらくは挿入点の後に位置する遺伝子ｒｉｍＡ上での極性効果を阻止できないことを意味するものと解釈された。その後、アミド化テトラエンの形成の誘発に加え、染色体内の下流に位置する遺伝子ｒｉｍＡにおける極性効果を補完できるプラスミドｐＳＭ７４３Ｂが存在する場合、株内の染色体内のこの遺伝子ｒｉｍＧにおける中断により、リモシジンＣ（ＩＩＩａ）およびＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）と称されている２種の新規のメチル化ポリエンの単離が可能になった。これは遺伝子ｒｉｍＧの中断の結果としての遊離カルボキシル基とメチル基との置換を示す。生成された株（ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−７６８／７４３Ｂ）（寄託番号ＤＳＭ１７４８２）の発酵培養物中でのアミド化テトラエンの非存在下では、ポリケトン鎖の伸長の間ではなく一旦大環状環および遊離側鎖カルボキシル基が形成されていると、部位特異的なＰＫＳ後修飾により、リモシジンＢ（Ｉ−１ａ）およびＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）の中でアミド基の形成が生じ、かつそれがおそらくはアミドトランスフェラーゼによる「装飾（ａｄｏｒｎｍｅｎｔ）」活性に起因すると結論づけることが可能であった。
【００１９】
さらに、インビトロでの、真菌（ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｌｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ））の様々な株に対する生物活性の試験および一部の毒性試験では、新規化合物中に存在する化学修飾物がそれらの由来の天然ポリエンに対して明らかな薬理学的利点をもたらすことが示される（表２、実施例２）。
【００２０】
したがって、本発明は、式（ＩＩＩ）のメチル化ポリエンすなわち抗真菌剤および抗寄生虫剤ならびに該ポリエンの特定対象として有用な下記の本発明の化合物にも関し、以下のメチル化ポリエンは、本明細書にてリモシジンＣ（ＩＩＩａ）およびＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）としてさらに下記で同定され記載される。
【００２１】
本発明は、別の態様では、それら化合物の破壊生成微生物を該メチル化ポリエンの生成を可能にする条件下で培養し、かつ必要に応じてそれら化合物を単離および精製するステップを含む、式ＩＩＩの該メチル化ポリエンを生成するための方法に関する。特に、それはストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−７６８／７４３Ｂ）（寄託番号ＤＳＭ１７４８２、発明微生物）、リモシジンＣ（ＩＩＩａ）およびＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）の産生株を含み、該メチル化ポリエンの取得におけるそれらまたは類似する破壊微生物の使用を伴う本発明のさらなる態様を構成する。
【００２２】
別の態様では、本発明は、ポリエンの他の生合成クラスタ内のＲｉｍＧに対して提示されたものと同じ化学修飾物に関与する遺伝子（それらの一部は既に記載されている）の中断についての、対応するメチル化誘導体を生成することを目的とした利用にも関する。
【００２３】
本発明のメチル化ポリエンのリモシジンＣ（ＩＩＩａ）およびＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）における薬理学的利点は、ヒト細胞膜に対してよりも真菌または寄生虫におけるエルゴステロールを有する膜に対して向上した選択毒性に基づいており、それによりその毒性が著しく低下する。それらメチル化ポリエンを含有する殺生物組成物、例えば、サニタリー、農業またはアグロアリメンタリー用途の医薬組成物および／または抗真菌組成物は、本発明のさらなる態様を構成する。
【００２４】
本発明の別のさらなる態様は、ヒトおよび動物の健康、農業および栄養の分野における感染症の処置を目的とする本発明の殺生物組成物の使用である。
【００２５】
さらに、アミド化ポリエンの産生株（ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７４３Ｂ、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４）の無細胞抽出液ならびに基質としてリモシジン（ＩＩａ）およびＣＥ−１０８（ＩＩｂ）を用いるインビトロでのアミド化試験により、アミド基の形成がアミド基供与体としてグルタミンを使用可能なＡＴＰ／Ｍｇ＋＋依存性のアミドトランスフェラーゼ活性によると結論づけられた（実施例２、項目Ｂを参照）。ストレプトマイセス属ＲＧＵ５．３の無細胞抽出液を用いて実施される同じ試験により、ピマリシン（ＩＶａ）のアミドであるポリエンＡＢ−４００（ＩＶｂ）が、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８の場合に酷似するアミドトランスフェラーゼ活性によって生じ、それがＡＴＰ／Ｍｇ＋＋依存性である反応においてピマリシンの遊離カルボキシル基をアミド基に変換するために、同遊離カルボキシル基に作用することが確認できた。
【００２６】
さらに、遺伝子組換え体のストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８の無細胞抽出液中に存在するアミドトランスフェラーゼ活性が、天然基質のリモシジン（ＩＩａ）およびＣＥ−１０８（ＩＩｂ）をそれらの対応するアミドのリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）およびＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）に変更可能であるだけでなく、ピマリシン（ＩＶａ）などの異種基質も認識可能である、基質に対する緩やかな特異性を示すと結論づけることがでた。これはストレプトマイセス属ＲＧＵ５．３のアミドトランスフェラーゼ活性に対して生じたものではなく、試験条件下で基質としてピマリシン（ＩＶａ）を認識できるにすぎなかった。
【００２７】
遊離カルボキシル基は、アンフォテリシンＢ、ナイスタチン、ピマリシン、カンジシジンなどの大部分の典型的なポリエン内でかなり良好に保存される。これらのカルボキシル基とアミド基との置換を仮定すると、おそらくは改善された薬理学的特性を有するアミド化ポリエンが生成されることになる。したがって、この態様では、本発明は、酵素的方法、すなわち、産生株の無細胞抽出液あるいは、直接的に選択されるかまたは基質をはじめとする固定化された系に関する分野の技術に従って適切な支持体上で固定化される化合物を用いて、特定の培養条件下でカルボキシル化ポリエンを対応するアミド化ポリエンに変換するための下記の本発明の酵素的方法を提供する。
【００２８】
別の態様では、本発明は、「インビトロ」でのカルボキシル化ポリエンを、本発明の酵素的方法を開始するのに必要なそれに対応するアミドに変換できるアミドトランスフェラーゼ活性の担体である、アミド化ポリエンの産生株の無細胞抽出液に関する。
【００２９】
別の特定の態様では、本発明は、リモシジン（ＩＩａ）およびＣＥ−１０８（ＩＩｂ）ならびに他の異種基質を、それらの対応するアミドに変換するための能力を有するアミドトランスフェラーゼ活性の担体である、微生物のストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７４３Ｂ、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４（それら双方はアミド化ポリエンのＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）およびリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）の産生株）の無細胞抽出液、ならびに試験条件下で少なくともピマリシン（ＩＶａ）をその対応するアミド化ポリエンＡＢ−４００（ＩＶｂ）に変換可能な、アミド化ポリエンＡＢ−４００（ＩＶｂ）の産生株である微生物ストレプトマイセス属ＲＧＵ５．３の無細胞抽出液に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明は、式（Ｉ）
【化１】
2008538895.tif 000003
（式中、Ｒ１はアルキルＣ１〜Ｃ３であり、Ｒ２はＣＨ３−またはＣＯＮＨ２−（メチル−または第一級アミド−）の中から選択される官能基である）によって特徴づけられる新規ポリエンマクロライド化合物、その異性体、塩、プロドラッグあるいは溶媒和物について記載する。
【００３１】
上記の式（Ｉ）で示される本発明の化合物は、キラル中心の存在に依存する光学または鏡像異性体を含む、複数の結合（例えばＺ、Ｅ）の存在に依存する異性体を含みうる。個々の異性体、すなわち鏡像異性体またはジアステレオ異性体およびそれらの混合物は、本発明の範囲内に含まれる。個々の鏡像異性体またはジアステレオ異性体およびそれらの混合物は、従来の技術によって分離されうる。
【００３２】
本明細書で用いられる「塩」という用語は、医薬的に許容できる塩、つまり薬剤の調製において使用可能な式（Ｉ）の化合物の塩、ならびに医薬的に許容できない塩の両方を含み、これは、これらが医薬的に許容できる塩の調製において使用可能であるためである。医薬的に許容できる塩の性質は、それが医薬的に許容できるという条件下では、常に重要なことではない。式（Ｉ）の化合物の医薬的に許容できる塩の中から、まず有機酸または無機酸から取得可能な酸付加塩が、当業者には周知の従来の方法を用いて化学量的に適切な量にて適切な酸と式（Ｉ）の化合物とを反応させることにより、見出される。該酸付加塩を取得するのに使用可能な酸の具体例として、有機酸では、例えば、酢酸、アスコルビン酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、コハク酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸など、または無機酸では、例えば、臭化水素酸、塩酸、リン酸、硝酸、硫黄酸などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３３】
同様に、本発明の範囲内で式（Ｉ）の化合物のプロドラッグが見出される。本明細書で用いられる「プロドラッグ」という用語は、式（Ｉ）の化合物由来の任意の化合物、例えば、カルボキシル酸エステル、アミノ酸エステル、リン酸塩エステル、金属塩のスルホン酸塩エステルなどを含むエステル、カルバメート、アミドなどを含み、それは個体に投与される場合、式（Ｉ）の該化合物を直接的または間接的に該個体に送達可能である。有利には、該誘導体は、生物区画内での式（Ｉ）の化合物のバイオアベイラビリティを高める化合物である。該誘導体の性質は、それが個体に投与可能でありかつ式（Ｉ）の化合物を個体の生物区画内に送達するという条件では常に重要なことではない。該プロドラッグの調製を当業者に既知の従来の方法によって行ってもよい。
【００３４】
本発明の化合物は、遊離化合物または溶媒和物として結晶形態であってもよく、両形態が本発明の範囲内で生じることを意図している。これに関連して、本明細書で用いられる「溶媒和物」という用語は、医薬的に許容できる溶媒和物、つまり薬剤の調製において使用可能な式（Ｉ）の化合物の溶媒和物、ならびに医薬的に許容できない溶媒和物の両方を含み、これは、これらが医薬的に許容できる溶媒和物または塩の調製において使用可能であるためである。医薬的に許容できる溶媒和物の性質は、それが医薬的に許容できるという条件では常に重要なことではない。特定の実施形態では、溶媒和物は水和物である。溶媒和物を当業者に周知の従来の方法によって取得することができる。
【００３５】
治療でのそれらの用途においては、式（Ｉ）の化合物、その異性体、塩、プロドラッグまたは溶媒和物は、好ましくは、換言すれば、希釈剤および担体などの通常の医薬添加剤を除いて医薬的に許容できるレベルの純度を有しかつ通常の用量レベルで有毒と考えられる物質を含まない、医薬的に許容できるまたは実質的に純粋な形態である。活性成分における純度のレベルは、好ましくは５０％より高く、より好ましくは７０％より高く、より好ましくは９０％より高い。好ましい実施形態では、該レベルは、式（Ｉ）の化合物、またはその塩、溶媒和物もしくはプロドラッグの９５％より高い。
【００３６】
他に規定されない限り、本発明の化合物は、１つ以上の同位体標識原子の存在下でのみ異なる化合物も含む。例えば、水素と重水素または三重水素との置換あるいは炭素と１３Ｃもしくは１４Ｃに富む炭素または１５Ｎに富む窒素との置換を例外としてその構造を有する化合物は、本発明の範囲内である。
【００３７】
別の態様では、本発明は、式（Ｉ−１）の化合物、式（Ｉ）
【化２】
2008538895.tif 000004
（式中、ＲはＮＨ２であり、Ｒ１はアルキルＣ１〜Ｃ３である）
の本発明のポリエンのアミド化誘導体、またはその異性体、塩、プロドラッグまたは溶媒和物に関する。
【００３８】
特定の実施形態では、前記式（Ｉ−１）の化合物は、本明細書にて式（Ｉ−１ａ）の「リモシジンＢ」および式（Ｉ−１ｂ）の「ＣＥ−１０８Ｂ」として同定される化合物、それらの異性体、塩、プロドラッグまたは溶媒和物からなる群から選択される。
【化３】
2008538895.tif 000005
【００３９】
したがって、これら２種の新規のアミド化ポリエンは、天然化合物リモシジン（ＩＩａ）およびＣＥ−１０８（ＩＩｂ）に対応するアミドであることから、リモシジンＢ（Ｉ−１ａ）およびＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）と称されている。
【化４】
2008538895.tif 000006
【００４０】
これらの化合物の化学構造は、様々な技術（例えば、分光測定、ＮＭＲ、耐性記録、溶血活性など）を用いてそれらの生物活性を有するものとして特徴づけられている。リモシジンおよびＣＥ−１０８のマクロラクトン環内に存在する遊離カルボキシル基とアミド基との置換により、コレステロールを有する膜（動物細胞内に存在）に対してよりもエルゴステロールを有する膜（真菌ならびに寄生虫のトリパノソーマおよびリーシュマニアのような他の生物の親和性など）に対して高い親和性が得られるようである。この化学修飾は、これらのポリエンの真菌に対する選択毒性を高めることから、それらの臨床用途に関しては明らかな利点となる。事実、殺真菌剤活性試験（図２）および動物細胞（赤血球）に対する毒性試験（表２、実施例１）は、それらの生物活性における極めて有意な向上というよりも動物細胞に対する酷似した毒性値を示し、親テトラエンのリモシジンおよびＣＥ−１０８の場合よりも真菌に対する選択毒性の向上が生じる。類似の特異性は、寄生虫のリーシュマニアおよびトリパノソーマなど、それらの膜内にエルゴステロールを有する他の生物に適用可能である。両方のアミド化テトラエンは、それらに対応する親化合物よりも可溶性を示すことも判明した。ＡＢ−４００の場合も類似の試験が実施され（カネド  Ｌ．Ｍ．（Ｃａｎｅｄｏ  Ｌ．Ｍ．）ら、２０００年、Ｊ．，Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（東京（Ｔｏｋｙｏ））５３：６２３−６２６頁）（図３）、その溶解度の増加に加え、その非アミド化相同体（ピマリシン）に関してその薬理学的特性における改善が示されたことから、全身性感染の治療のための抗真菌剤／抗寄生虫剤としてそれを使用することも可能である。
【００４１】
別の主題として、本発明は、式（ＩＩＩ）の化合物、すなわち式（Ｉ）
【化５】
2008538895.tif 000007
（式中、ＲはアルキルＣ１〜Ｃ３である）
における本発明のポリエンのメチル化誘導体、またはその異性体、塩、プロドラッグまたは溶媒和物にも関する。
【００４２】
特定の実施形態では、式（ＩＩＩ）の該化合物は、本明細書にて式（ＩＩＩａ）の「リモシジンＣ」および式（ＩＩＩｂ）の「ＣＥ−１０８」として同定された化合物からなる群から選択される。
【化６】
2008538895.tif 000008
【００４３】
この２種の新規メチル化ポリエンは、カルボキシル側鎖基がメチル基と置換される場合、天然化合物のリモシジン（ＩＩａ）およびＣＥ−１０８（ＩＩｂ）に由来するメチル化ポリエンであることからリモシジンＣ（ＩＩＩａ）およびＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）と称されている。
【００４４】
これらの化合物の化学構造は、様々な技術（例えば、分光測定、ＮＭＲ、耐性記録、溶血活性など）を用いてそれらの生物活性を有するものとして特徴づけられている。アミド化ポリエンの場合と異なり、親化合物リモシジンおよびＣＥ−１０８に対して抗真菌活性が増強しないにもかかわらず、実際には溶血期間内での平均毒性は化合物リモシジンおよびＣＥ−１０８の活性よりも確かに低く、これは同様に、天然ポリエンに対して真菌膜に対する選択毒性が向上することを示唆している（実施例２）。
【００４５】
新規のアミド化およびメチル化ポリエンの用途
式（Ｉ）の化合物、およびそれらの中の式（Ｉ−１）および（ＩＩＩ）の化合物は、一般に殺生物活性および特にエルゴステロールを含有する細胞膜を有する生物に対する殺生物活性を有することから、殺生物剤として有用な可能性を持つものである。本明細書で用いられる「殺生物」は、成長を停止させるかまたは様々なタイプの生物を殺す化学物質である。
【００４６】
同様に、「エルゴステロールを含有する細胞膜を有する生物」という表現は、エルゴステロールを含有する細胞膜を包含する任意の生物、例えば真菌、寄生虫などを含む。かかる生物の具体例として、特にフサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、ボトリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）（植物病原体）、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・クルゼイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｒｕｚｅｉ）、アスペルギルス・ニガー、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（ヒト病原体）などの真菌とともに寄生虫のトリパノソーマ、リーシュマニアなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４７】
したがって、式（Ｉ）の該化合物、ならびにそれらの中の式（Ｉ−１）および（ＩＩＩ）の化合物、特に化合物リモシジンＢ（Ｉ−１ａ）、ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）、リモシジンＣ（ＩＩＩａ）およびＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）は、エルゴステロールを含有する細胞膜を有する該生物に対する殺生物剤として有用な可能性を持つ。特定の実施形態では、該化合物は、抗寄生虫剤または抗真菌剤として対応する非アミド化ポリエンよりも有用である。「抗真菌剤」という用語は、殺真菌剤と静真菌剤の双方を含む。
【００４８】
結果として、別の態様では、本発明は、式（Ｉ）の化合物、ならびにその中の式（Ｉ−１）および（ＩＩＩ）の化合物を不活性媒体とともに含有する殺生物組成物に関する。特定の実施形態では、式（Ｉ）の該化合物は、式（Ｉ−１）ならびに好ましくはリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）、ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）およびそれらの混合物の群から選択され、別の実施形態では、式（ＩＩＩ）の該化合物は、式（ＩＩＩ）ならびに好ましくはリモシジンＣ（ＩＩＩａ）、ＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）およびそれらの混合物の群から選択される。該殺生物組成物は、エルゴステロールを含有する細胞膜を有する生物に対して特に有用である。特定の実施形態では、該殺生物組成物は、場合により１つ以上の不活性媒体とともに、化合物リモシジンＢ（Ｉ−１ａ）、ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）、リモシジンＣ（ＩＩＩａ）、ＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）およびそれらの混合物の中から選択される化合物などの式（Ｉ）の化合物を含有する抗真菌組成物である。
【００４９】
本明細書で用いられる「不活性」という用語は、該ビヒクルが全く有意な殺生物活性を有しないことを意味する。
【００５０】
必要に応じて、該組成物は、他の天然殺生物、組み換えられた殺生物または合成殺生物をさらに含有することも可能であり、そうであれば式（Ｉ）の該化合物、例えば化合物のリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）および／またはＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）、リモシジンＣ（ＩＩＩａ）、ＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）およびそれらの混合物の殺生物作用が増強されるか、または活性のスペクトルが高まる可能性がある。
【００５１】
１．治療用途
式（Ｉ）の化合物、特に化合物リモシジンＢ、ＣＥ−１０８Ｂ、リモシジンＣおよびＣＥ−１０８Ｃの用途が見出される重要な分野は、ヒトおよび動物の健康における分野である。したがって特定の実施形態では、本発明は、場合により１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤とともに式（Ｉ）の化合物、なかでも式（Ｉ−１）もしくは（ＩＩＩ）の化合物またはこれらの混合物を含有する医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、式（Ｉ）の該化合物は、化合物のリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）、ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）およびそれらの混合物から選択され、さらに式（ＩＩＩ）の化合物は、リモシジンＣ（ＩＩＩａ）、ＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）およびそれらの混合物の中から選択される。
【００５２】
本明細書で用いられる意味では、「医薬的に許容できる賦形剤」という表現は、投与剤形の調製の際に用いられる医薬品業界では既知であり、かつアジュバント、固体または液体、溶媒、界面活性剤などを含む物質または物質の組み合わせ物を示す。
【００５３】
必要に応じて、該医薬組成物は、式（Ｉ）の該化合物、例えば、化合物のリモシジンＢおよび／またはＣＥ−１０８Ｂ、リモシジンＣ、ＣＥ−１０８Ｃおよびそれらの混合物の治療作用を増強するか、またはそれらの作用スペクトルを高める可能性がある１つ以上の治療薬をさらに有しうる。
【００５４】
該医薬組成物は、エルゴステロールを含有する細胞膜を有するヒトまたは動物の病原体、例えばヒトまたは動物の病原体である寄生虫および真菌によって誘発される感染を予防および／または処置するために使用されうる。
【００５５】
したがって、特定の実施形態では、該医薬組成物は、抗寄生虫組成物であり、かつエルゴステロールを含有する細胞膜を有するヒトまたは動物の病原体、例えばトリパノソーマ、リーシュマニアなどによって誘発される感染の予防および／または処置において使用されうる。必要に応じて、該抗寄生虫組成物は、式（Ｉ）の該化合物、例えば、リモシジンＢ、ＣＥ−１０８Ｂ、リモシジンＣ、ＣＥ−１０８Ｃの化合物の治療作用を増強する可能性があるかまたはそれらの作用スペクトルを高める１つ以上の抗寄生虫剤をさらに含有しうる。
【００５６】
別の特定の実施形態では、該医薬組成物は、抗真菌組成物であり、かつ真菌（その細胞膜がエルゴステロールを有する）によって誘発される感染の予防および／または処置において使用されうる。該抗真菌組成物は、必要に応じて、式（Ｉ）の該化合物、例えば、リモシジンＢ、ＣＥ−１０８Ｂ、リモシジンＣ、ＣＥ−１０８Ｃの治療作用を増強する可能性があるかまたはそれらの作用スペクトルを高める１つ以上の抗真菌剤をさらに含有し得る。該抗真菌剤の具体例として、アンフォテリシンＢ、ナイスタチン、ＡＢ−４００、アリルアミン（例えば、テルビナフィン、ナフチフィンなど）、アモロルフィン、トルナフテートなどのポリエン、クロトリマゾール、ミコナゾール、ケトコナゾール、フルコナゾール、イトラコナゾールなどのアゾール、ベンゾフラン、例えばグリセオフルビンなど、ピリミジン、例えばフルオシトシンなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【００５７】
式（Ｉ）の化合物、中でも式（Ｉ−１）および（ＩＩＩ）の化合物は、治療有効量で換言すればその治療効果を発揮するのに適する量で医薬組成物中に存在する。特定の実施形態では、本発明により提供される医薬組成物は、化合物のリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）、ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）、リモシジンＣ（ＩＩＩａ）、ＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）およびそれらの混合物の中から選択される化合物などの式（Ｉ）の化合物を０．０１重量％〜９９．９９重量％含有し、かつ例えば、経口、非経口または局所といった選択される投与経路によって任意の投与に適切な剤形で存在しうる。薬剤の投与の異なる剤形およびそれらの調製方法に関するレビューが、例えばＴｒａｔａｄｏ  ｄｅ  Ｆａｒｍａｃｉａ  Ｇａｌｅｎｉｃａ、Ｃ．Ｆａｕｌｉ  ｉ  Ｔｒｉｌｌｏ、第１版、１９９３年、Ｌｕｚａｎ  ５、Ｓ．Ａ．ｄｅ  Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓにて見出されうる。
【００５８】
したがって、本発明は、細胞膜がエルゴステロールを含有するヒトまたは動物の病原性真菌、例えばヒトまたは動物の寄生虫あるいはヒトまたは動物の病原性真菌によって誘発される感染の予防および／または処置を目的とした薬剤の調製における式（Ｉ）および／または（ＩＩＩ）の化合物の使用にも関する。特定の実施形態では、式（Ｉ）および／または（ＩＩＩ）の該化合物は、リモシジンＢ（Ｉ−１ａ）、ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）、リモシジンＣ（ＩＩＩａ）、ＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）およびそれらの混合物の中から選択される。
【００５９】
同様に、別の態様では、本発明は、治療を必要としている動物またはヒトに本発明によって提供される医薬組成物の治療有効量を投与する段階を含む、エルゴステロールを含有する細胞膜を有する、ヒトまたは動物の病原体、例えばヒトまたは動物の病原体である寄生虫および真菌によって誘発される感染を予防および／または処置するための方法も提供する。
【００６０】
２．農業用途
式（Ｉ）の化合物、中でも式（Ｉ−１）または（ＩＩＩ）の化合物において見出される用途として重要な別の分野は農業分野である。これに関連して、本発明は、細胞膜がエルゴステロールを含有する様々な真菌によって誘発される、アグロアリメンタリー生成物の貯蔵条件下での真菌感染（収穫後の感染）を予防または制御するための、場合により１つ以上の農業的に許容できる不活性媒体とともに、化合物のリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）、ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）、リモシジンＣ（ＩＩＩａ）、ＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）およびそれらの混合物の中から選択される化合物などの式（Ｉ）および／または（ＩＩＩ）の化合物を含有する、細胞膜がエルゴステロールを含有する植物病原性真菌（特にボトリティス・シネレア、フサリウム・オキシスポラム、リゾクトニア・ソラナ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａ）、リゾクトニア・メロニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｍｅｌｏｎｉ）、ウスチラゴ・メイジス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）など）によって誘発される感染を制御するのに有用な抗真菌組成物を提供する。
【００６１】
本明細書で用いられる「制御」という用語は、該真菌の除去または真菌によって誘発される損傷の低減をもたらしうる胞子の発芽および／または真菌の菌糸体の成長に関する阻害、低下もしくは停止を含む。
【００６２】
本明細書で用いられる「農業的に許容できる不活性媒体」という表現は、目的化合物を媒体化するために用いられかつアジュバント、固体または液体、溶媒、界面活性剤などを含む、農業分野において既知の物質または物質の組み合わせを示す。
【００６３】
特定の実施形態では、該抗真菌組成物は、式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の該化合物に加え、リモシジンＢ（Ｉ−１ａ）、ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）、リモシジンＣ（ＩＩＩａ）、ＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）およびそれらの混合物の中から選択される化合物、抗真菌活性を有する１つ以上の化合物、例えば真菌の細胞膜を変更する１つ以上の化合物、または上記化合物などのエルゴステロールの合成を阻害する１つ以上の化合物、または細胞壁の修飾もしくは分解に必要な酵素的活性を有する１つ以上の化合物、例えばセルロース分解性、マンナン分解性、キチン分解性またはタンパク質分解性を有する酵素などの真菌の細胞壁を修飾または分解可能な１つ以上の溶菌酵素（例えば、セルラーゼ、α−（１，３）−グルカナーゼ、β−（１，６）−グルカナーゼ、β−（１，３）−グルカナーゼ、マンナナーゼ、エンド−もしくはエキソ−キチナーゼ、キトサナーゼ、プロテアーゼ、α−もしくはβ−マノシダーゼなど）を含む。
【００６４】
式（Ｉ）および／または式（ＩＩＩ）の化合物は有効な抗真菌量、換言すれば植物病原性真菌によって誘発される感染を制御するのに適する量で抗真菌組成物中に存在するべきである。特定の実施形態では、本発明によって提供される有用な抗真菌組成物は、式（Ｉ）および／または（ＩＩＩ）の該化合物を、例えば該化合物のリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）、ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）、リモシジンＣ（ＩＩＩａ）およびＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）の０．０１重量％〜１００重量％を含有する。該組成物は、従来の方法によって調製可能であり、かつ液体または固体形態、例えば顆粒形態で存在しうる。さらに該組成物は、添加剤、例えばその保存性および安定性を延長させる保存剤および安定剤を含有しうる。
【００６５】
該抗真菌組成物を、例えば植物内および／または果物内の植物病原性真菌によって誘発される感染を制御するために使用できる。したがって、本発明は、植物病原性真菌を制御するために、該組成物を該植物またはそれを取り巻く媒体に適用するステップを含む、植物内の植物病原性真菌、特に細胞膜がエルゴステロールを含有する植物病原性真菌によって誘発される感染を制御するための方法を提供する。特定の実施形態では、該方法は、植物病原性真菌によって誘発される真菌感染の予防および／または処置を目的として、該組成物を適量で植物の地上部に適用するステップを含む。
【００６６】
本発明は、植物病原性真菌を制御するために、該組成物を該果物に適用することを含む、果物内の植物病原性真菌、特に細胞膜がエルゴステロールを含有する植物病原性真菌によって誘発される感染を制御するための方法も提供する。特定の実施形態では、該組成物の適量での果物への適用がその採取に先立って（収穫前）なされる一方、別の実施形態では、既に採取され回収された果物（収穫後）に対して組成物の適用がなされる。
【００６７】
３．アグロアリメンタリーの用途
式（Ｉ）および／または（ＩＩＩ）の化合物、および特にリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）、ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）、リモシジンＣ（ＩＩＩａ）、ＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）は、アグロアリメンタリー分野にも適用される。これに関連して、本発明は、特にリポソーム懸濁液、水中懸濁液など、アグロアリメンタリーの観点から、場合により１つ以上の許容できる不活性媒体とともに、式（Ｉ）の化合物、例えば化合物リモシジンＢ（Ｉ−１ａ）、ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）、リモシジンＣ（ＩＩＩａ）、ＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）およびそれらの混合物の中から選択される化合物を含有する加工食品、例えばチーズなどを例とする乳製品などの加工食品の表面上で発生する可能性がありうる真菌を制御するのに有用な抗真菌組成物を提供する。
【００６８】
「制御」という用語は、真菌によって誘発される損傷の顕著な低減をもたらしうる胞子の発芽および／または真菌の菌糸体の成長の阻害、低下もしくは停止を含み、このようにして、真菌の成長によって誘発される食品の腐敗が防止または処理されうる。
【００６９】
「アグロアリメンタリーの観点から許容できる不活性媒体」という用語は、目的化合物を媒体化するために使用されかつアジュバント、固体または液体、溶媒、界面活性剤などを含む、アグロアリメンタリー分野にて既知の物質または物質の組み合わせを示す。
【００７０】
特定の実施形態では、該抗真菌組成物は、式（Ｉ）の該化合物に加え、リモシジンＢ（Ｉ−１ａ）、ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）、リモシジンＣ（ＩＩＩａ）、ＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）およびそれらの混合物の中から選択される化合物、抗真菌活性を有する１つ以上の化合物、例えば真菌の細胞膜を変更する１つ以上の化合物、または上記化合物などのエルゴステロールの合成を阻害する１つ以上の化合物、または細胞壁の修飾もしくは分解にとって必要な酵素的活性を有する１つ以上の化合物、例えばセルロース分解性、マンナン分解性、キチン分解性またはタンパク質分解性を有する酵素（例えば、セルラーゼ、α−（１，３）−グルカナーゼ、β−（１，６）−グルカナーゼ、β−（１，３）−グルカナーゼ、マンナナーゼ、エンド−もしくはエキソ−キチナーゼ、キトサナーゼ、プロテアーゼ、α−もしくはβ−マノシダーゼなど）などの真菌の細胞壁を修飾または分解可能な１つ以上の溶菌酵素を含む。
【００７１】
式（Ｉ）の化合物は、有効な抗真菌量、換言すれば加工食品上で成長する傾向がある真菌によって誘発される感染を制御するのに適する量で抗真菌組成物中に存在するべきである。特定の実施形態では、本発明によって提供される、加工食品上で発達する傾向がある真菌によって誘発される感染を制御するのに有用な該抗真菌組成物は、式（Ｉ）の該化合物、例えば該化合物のリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）、ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）、リモシジンＣ（ＩＩＩａ）およびＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）の０．０１重量％〜１００重量％を含有する。該組成物は、従来の方法によって調製可能であり、かつ液体または固体形態、例えば顆粒形態で存在しうる。さらに該組成物は、添加剤、例えばその保存性および安定性を延長させる保存剤および安定剤を含有しうる。
【００７２】
例えば、該抗真菌組成物を、加工食品、例えば加工食品の表面上で成長する傾向がある真菌を制御するために使用できる。したがって、本発明は、加工食品上で発達する傾向がある真菌を制御するための方法を提供するものであって、特に該抗真菌組成物を該加工食品またはそれを取りまく媒体に適用するステップを含む、加工食品上で成長する傾向がある真菌によって誘発される感染を制御する、特に細胞膜がエルゴステロールを含有する加工食品上で成長する傾向がある真菌によって誘発される感染を制御するための方法も提供する。特定の実施形態では、該方法は、真菌の成長により誘発される食品の腐敗の防止および／または処理を目的とした、該組成物を加工食品の表面上に適用するステップを含む。該抗真菌組成物は、加工食品の表面に外部から適用される。
【００７３】
新規アミド化ポリエンを取得するための方法
式（Ｉ）の化合物およびそれらの中でも式（Ｉ−１）の化合物ならびにより詳細には化合物のリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）および／またはＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）は、本明細書中でｐＳＭ７４３ＢおよびｐＳＭ７８４として同定されるプラスミドとともに、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８の形質転換により得られる、本明細書中でストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７４３Ｂおよびストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４として同定される組換え微生物（ペレス−ズニガ  Ｆ．Ｊ．（Ｐｅｒｅｚ−Ｚｕｎｉｇａ  Ｆ．Ｊ．）ら（２００４年）、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（東京（Ｔｏｋｙｏ））５７：１９７−２０４頁）、あるいは本明細書に添付の実施例１に記載されかつ表１中に含められるｐＳＭ７４３Ｂとして同定されるプラスミドとともに、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／ＰＭ１−５００の形質転換によって得られる、本明細書中でストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−５００／７４３Ｂとして同定される組換え微生物（セコ  Ｅ．Ｍ．（Ｓｅｃｏ  Ｅ．Ｍ．）ら、２００４年、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１１：３５７−３６６頁）の発酵培養物中に存在する。該化合物は、それらの発酵培養物から直接的に取得され、かつ比較的単純な従来の方法を用い、例えばイオン交換カラムおよび／または疎水性相互作用または逆相カラムの使用によって容易に精製されうる。
【００７４】
プラスミドｐＳＭ７４３Ｂ（表１、実施例１）（図１Ａ）は、プラスミドｐＩＪ９２２に由来し、かつ遺伝子ｒｉｍＡおよびエリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＥ）を含む。プラスミドｐＳＭ７８４（表１、実施例１）（図１Ｂ）は、プラスミドｐＩＪ９４１に由来し、かつエリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＥ）を有する。
【００７５】
該プラスミドｐＩＪ９２２およびｐＩＪ９４１（リディエート  Ｄ．Ｊ．（Ｌｙｄｉａｔｅ  Ｄ．Ｊ．）ら、１９８５年、Ｇｅｎｅ  ３５：２２３−２３５頁）は、レプリコンＳＣＰ２＊由来のベクター、すなわちストレプトマイセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）に由来する少数の複製物を有するプラスミドである。
【００７６】
したがって、別の態様では、本発明は、式（Ｉ−１）の化合物を生成するための方法であって、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７４３Ｂ、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−５００／７４３Ｂ、およびそれらの組み合わせの中から選択される微生物を式（Ｉ）の化合物の生成を可能にする条件下で培養し、かつ必要に応じてそれら化合物を単離および精製するステップを含む、方法に関する。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、リモシジンＢ（Ｉ−１ａ）、ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）およびそれらの混合物の中から選択される。
【００７７】
上述したように、ポリエン中でのアミド基の形成は、アミドトランスフェラーゼによる「装飾」活性に起因する。アミド化ポリエンの産生株の無細胞抽出液および基質としてリモシジン（ＩＩａ）およびＣＥ−１０８（ＩＩｂ）を用いるインビトロでのアミド化試験により、アミド基の形成が実はＡＴＰ／Ｍｇ＋＋依存性のアミドトランスフェラーゼ活性に起因し、かつグルタミンをアミド基の供与体として使用可能であると結論づけることができた（実施例２、項目Ｂを参照）。ストレプトマイセス属ＲＧＵ５．３の無細胞抽出液を用いて実施される同じ試験により、ＡＢ−４００（ＩＶｂ）すなわちピマリシン（ＩＶａ）のアミドがストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８の場合と酷似するアミドトランスフェラーゼ活性によって生じ、それがＡＴＰ／Ｍｇ＋＋依存性も示す反応にてピマリシンの遊離カルボキシル基をアミド基に変換するために該遊離カルボキシル基に作用することが確認できた。
【００７８】
さらに、遺伝子組換え体のストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８の無細胞抽出液中に存在するアミドトランスフェラーゼ活性は、天然基質のリモシジン（ＩＩａ）およびＣＥ−１０８（ＩＩｂ）をそれらの対応するアミドのリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）およびＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）に変更可能であるだけでなく、ピマリシン（ＩＶａ）などの異種基質も認識可能である、基質に対する緩やかな特異性を示すと結論づけることもさらに可能であった。これはストレプトマイセス属ＲＧＵ５．３のアミドトランスフェラーゼ活性において生じるものではなく、それは試験条件下で基質としてピマリシン（ＩＶａ）を認識できるにすぎなかった。
【００７９】
遊離カルボキシル基は、アンフォテリシンＢ、ナイスタチン、ピマリシン（ＩＶａ）、カンジシジンなどの大部分の典型的なポリエン内でかなり良好に保存される。これらのカルボキシル基とアミド基との置換により、おそらくは水への溶解度の増加、抗真菌活性の向上、および溶血活性の低下などの改善された薬理学的特性を有するアミド化ポリエンを生じるであろう。つまり該化合物は、真菌に対する選択毒性の向上を示す。
【００８０】
したがって、本態様では、本発明は、酵素的方法、すなわち、
ａ）精製または未精製の、遊離カルボキシル化基を有するポリエンからなる基質を有する混合物またはそれらの数種の混合物、およびアミド化ポリエンの１つまたは複数の産生株に由来するタンパク質抽出物の調整、
ｂ）ＡＴＰ／Ｍｇ＋＋依存性でかつグルタミンをアミド基の供与体として使用可能な条件下でａ）の混合物の反応、および
ｃ）アミド化ポリエンの精製
といった段階による、アミド化ポリエンの産生株の無細胞抽出液を用いてマクロラクトン環内に遊離カルボキシル化基を有するポリエンからアミド化ポリエンを取得するための本発明の酵素的方法を提供する。
【００８１】
本発明の特定の目的は、得られるべきアミド化ポリエンがＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）、リモシジンＢ（Ｉ−１ａ）またはこれらの混合物であり、ａ）の基質ポリエンが精製または未精製のＣＥ−１０８（ＩＩｂ）、リモシジン（ＩＩａ）またはこれらの混合物であり、かつａ）の抽出物がストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４およびストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７４３Ｂといった株から得られるという本発明の酵素的方法からなる。
【００８２】
本発明の別の特定の目的は、得られるべきアミド化ポリエンがＡＢ−４００（ＩＶｂ）であり、ａ）の基質ポリエンが精製または未精製のピマリシン（ＩＶａ）であり、かつａ）の抽出物がストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４およびストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７４３Ｂといった株から得られるという本発明の酵素的方法からなる。
【００８３】
本発明の別の特定の目的は、得られるべきアミド化ポリエンがＡＢ−４００（ＩＶｂ）であり、ａ）の基質ポリエンが精製または未精製のピマリシン（ＩＶａ）であり、かつａ）の抽出物がストレプトマイセス属ＲＧＵ５．３株から得られるという本発明の酵素的方法からなる。
【００８４】
別の態様では、本発明は、「インビトロ」でカルボキシル化ポリエンを、本発明の酵素的方法を開始するのに必要なそれに対応するアミドに変換可能な、アミドトランスフェラーゼ活性の担体であるアミド化ポリエンの産生株の無細胞抽出液、に関する。
【００８５】
無細胞抽出液が、懸濁液中もしくは溶液中に大部分の細胞成分を含有する精製生成物とするために、様々な機械的方法（慣例的にタンパク質処理の分野にて適用される）による細胞の均一化、その後の濾過または分画遠心による分画により得られる抽出物であると理解されている。
【００８６】
2008538895.tif 000009
【００８７】
あるいは、本発明の酵素的方法を、固体支持体上に固定化した無細胞酵素系（本発明の無細胞抽出液）に関する従来の方法を用いて実施してもよく、この分野における当業者に既知の固定化系の分野の技術に従うことで、対応する移動相との反応成分の流れが生じる。
【００８８】
新規メチル化ポリエンを取得するための方法
式（ＩＩＩ）の化合物、特に化合物リモシジンＣ（ＩＩＩａ）およびＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）は、組換えファージＰＭ１−７６８との相同組換えによる遺伝子ｒｉｍＧの破壊（表１、実施例２を参照）および表１、実施例１に含まれるように株ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７４３ＢからのコンジュゲーションによるプラスミドｐＳＭ７４３Ｂの転移によって得られるストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−７６８／７４３Ｂとして本明細書中で同定される組換え微生物の発酵培養物中に存在する。遺伝子ｒｉｍＧの破壊をもたらすための断片と極性効果を回避するための完全遺伝子ｒｉｍＡ内に含まれる断片の双方は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の増幅に関する従来の技術を用いて当業者によって容易に取得されうる。対応する増幅のために、ドイチェ・サムルング・フォン・ミクロオーガニズメン・ウント・ツェルクルトゥーレン（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）（ＤＳＭＳ）、ブラウンシュヴァイク（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）、ドイツに寄託された株（寄託番号ＤＳＭ１７１８７）を使用してもよい。従来の技術（形質転換、形質移入、コンジュゲーションなど）を用い、対応するベクターを上記の株ＤＳＭ１７１８７に導入してもよい。
【００８９】
本発明では、組換えファージＰＭ１−７６８はファージＰＭ１から得られたものであり、下流に位置する遺伝子に対する極性効果を回避するために、ここで断片が遺伝子ｒｉｍＧ内部にクローニングされ、かつプロモーターｅｒｍＥＰが導入された[遺伝子発現を目的としたストレプトマイセスの処理において広範に用いられるプロモーター：キーザー（Ｋｉｅｓｅｒ）ら、２０００年、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ザ・ジョン・イネス・ファウンデーション（Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、ノーウィッチ（Ｎｏｒｗｉｃｈ）、英国]。一方、最終構築体に至るまでの中間体クローンについては実施例２の表１に記載されており、上記のようにストレプトマイセスを扱う当業者から容易に入手できる。
【００９０】
該化合物リモシジンＣ（ＩＩＩａ）およびＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）は、微生物ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−７６８／７４３Ｂの発酵培養物から直接的に取得され、かつ比較的単純な従来の方法、例えば疎水性相互作用または逆相カラムの使用によって容易に精製されうる。
【００９１】
したがって、別の態様では、本発明は、
−式（ＩＩＩ）の化合物の生成が可能な条件下での微生物ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−７６８／７４３Ｂを培養すること、
−発酵培養物の取得すること、および必要に応じて
−式（ＩＩＩ）の化合物の単離および精製すること、
を含む、式（ＩＩＩ）の化合物を生成するための方法に関する。
【００９２】
特定の実施形態では、該方法はリモシジンＣ（ＩＩＩａ）、ＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）およびそれらの混合物の中から選択される式（ＩＩＩ）の化合物を取得するために実施される。
【００９３】
その組換え微生物用培養培地は、一般に、水性培地に溶解された、１つ以上の炭素源、１つ以上の窒素源、微生物によって吸収可能な１つ以上の無機塩、および必要であればビタミンおよびアミノ酸などの１つ以上の栄養素からなる。該培地は、適切な条件（通気／攪拌、温度および発酵時間、段階など）と同様、当業者に既知である。これらの組換え微生物を成長させるための培地および条件の具体例が本発明の実施例２（「実験方法」の項）に記載されるがそれらに限定されない。
【００９４】
該組換え微生物のストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−７６８／７４３Ｂまたはその機能的等価物の発酵培養物は、式（ＩＩＩ）の化合物、例えばリモシジンＣ（ＩＩＩａ）、ＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）およびそれらの混合物の中から選択される化合物を含有し、それをそのまま使用するか、または目的化合物を分離するために引き続き処理し、従来の方法によって単離してもよい。例として、特定の実施形態では、上清と細胞抽出物を分離するために細胞培養物を遠心分離し、かつ単離するために上清を使用し、必要に応じて、アミド化されたまたはアミド化されていない、目的のポリエンを精製する。当業者は、それら化合物の物理化学的特性付けの研究により、それらを上清から精製するための方法を設計できる。
【００９５】
組換え微生物および用途
１．アミド化ポリエンの取得および用途に関する組換え微生物
組換え微生物のストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７４３Ｂ、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４およびストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−５００／７４３Ｂは本発明の一部を形成する。したがって、別の態様では、本発明は、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７４３Ｂ、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４およびストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−５００／７４３Ｂの中から選択される微生物に関連し、かつストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７４３Ｂ、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−５００／７４３Ｂおよびそれらの組み合わせの中から選択される微生物の培養物を提供する。
【００９６】
同様に、本発明は、式（Ｉ）の化合物、好ましくは式（Ｉ−１）の化合物を得る際にストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７４３Ｂ、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−５００／７４３Ｂおよびそれらの組み合わせの中から選択される微生物、またはストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７４３Ｂ、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−５００／７４３Ｂおよびそれらの組み合わせの中から選択される微生物の該培養物の使用に関する。特定の実施形態では、式（Ｉ−１）の該化合物は、リモシジンＢ（Ｉ−１ａ）、ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）およびそれらの混合物の中から選択される。
【００９７】
さらに、発明者らによって実施された試験により、該組換え微生物のストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７４３Ｂ、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４およびストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−５００／７４３Ｂの発酵培養物が、アミド化ポリエンのリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）および／またはＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）に加え、遊離カルボキシル基を有する非アミド化ポリエンのリモシジン（ＩＩａ）および／またはＣＥ−１０８（ＩＩｂ）も含有することが示された。
【００９８】
したがって、別の態様では、本発明は、式（Ｉ）の化合物、リモシジン（ＩＩａ）、ＣＥ−１０８（ＩＩｂ）およびそれらの混合物の中から選択される化合物を生成するための方法であって、式（Ｉ）の化合物、リモシジン（ＩＩａ）、ＣＥ−１０８（ＩＩｂ）およびそれらの混合物の中から選択される化合物の生成を可能にする条件下で、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７４３Ｂ、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−５００／７４３Ｂおよびそれらの組み合わせの中から選択される微生物を培養し、かつ必要に応じて該化合物を単離および精製することからなる方法に関する。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、リモシジンＢ（Ｉ−１ａ）、ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）およびそれらの混合物の中から選択される。
【００９９】
ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７４３Ｂ、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−５００／７４３Ｂおよびそれらの組み合わせの中から選択される微生物の発酵培養物は、式（Ｉ）の化合物、リモシジン（ＩＩａ）、ＣＥ−１０８（ＩＩｂ）およびそれらの混合物の中から選択される化合物からなるもので、殺生物剤として有用な可能性を持つ可能性があり、本発明のさらなる態様を構成する。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、リモシジンＢ（Ｉ−１ａ）、ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）およびそれらの混合物の中から選択される。
【０１００】
該組換え微生物の培地は、一般に、水性培地に溶解された、１つ以上の炭素源、１つ以上の窒素源、微生物によって吸収可能な１つ以上の無機塩、および必要であればビタミンおよびアミノ酸などの１つ以上の栄養素からなる。該培地は、適切な条件（通気／攪拌、温度および発酵時間、株など）と同様、当業者に既知である。これらの組換え微生物を成長させるための培地および条件の具体例が実施例（「実験方法」の項）に記載されるがそれらに限定されない。ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７４３Ｂ、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−５００／７４３Ｂおよびそれらの組み合わせの中から選択される該組換え微生物の発酵培養物は、式（Ｉ）の化合物、例えばリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）、ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）、リモシジン（ＩＩａ）、ＣＥ−１０８（ＩＩｂ）およびそれらの混合物の中から選択される化合物を含有し、かつそのまま使用されうるか、またはそれに続いてそれらは目的化合物を分離するために処理され、従来の方法により単離されうる。例として、特定の実施形態では、上清と細胞抽出物を分離するために細胞培養物を遠心分離し、かつ単離するために上清を使用して、必要に応じて、アミド化されたまたはアミド化されていない、目的のポリエンを精製する。当業者は、それら化合物の物理化学的特性の研究により、それらを上清から精製するための方法を設計できる。
【０１０１】
２．メチル化ポリエンの取得および用途に関与する組換え微生物
微生物のストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−７６８／７４３Ｂまたは任意の他の機能的等価物は、本発明の一部を形成する。したがって、別の態様では、本発明は、式（ＩＩＩ）の化合物を取得しかつそれら微生物の培養物を提供するための方法を実施するのに有用な微生物のストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−７６８／７４３Ｂまたは機能的等価物に関する。本発明の特定の実施形態は、メチル化ポリエンのリモシジンＣ（ＩＩＩａ）およびＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）の産生株である微生物ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−７６８／７４３Ｂ（寄託番号：ＤＳＭ１７４８２）からなる。
【０１０２】
本発明で用いられる「機能的等価物」という用語は、異なる既存の選択肢を用いてその分野の当業者によって開発可能であり、かつ言及されている本来の構成因子と同一または相同な特性を有する因子（それは場合に応じ、微生物、ベクター、遺伝子構築体、または遺伝子断片、遺伝子の破壊や細胞もしくは微生物の遺伝子形質転換に関する方法）を示す。
【０１０３】
したがって、これに関連しかつ例として、「機能的等価物」は、不活化挿入（ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）ではなくまたは任意の他の技術により、遺伝子ｒｉｍＧの染色体欠失によって取得されうる組換え微生物であると理解されており、該欠失は、熱感受性複製物中に起点を有する非複製プラスミドまたは複製可能なプラスミドという従来のベクターの使用により容易に実施可能である。これらの欠失または挿入は、その分野である程度の経験を有する技術者により実施可能である。
【０１０４】
同様に、本発明は、式（ＩＩＩ）の化合物を取得するための微生物のストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−７６８／７４３Ｂまたはその機能的等価物の使用に関する。特定の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物は、リモシジンＣ（ＩＩＩａ）、ＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）およびそれらの混合物の中から選択される。
【０１０５】
特定の用途においては、このように本発明の方法を用いて得られる発酵培養物を特定の殺生物溶液の調製のために直接使用してもよく、この場合には本発明の化合物を精製する必要性は全くない。したがって、式（ＩＩＩ）の化合物を含有する、上記の微生物のストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−７６８／７４３Ｂまたはその機能的等価物の発酵培養物は、潜在的に殺生物剤として有用である可能性があり、本発明のさらなる態様を構成する。
【０１０６】
ベクターおよび用途
１．アミド化ポリエンの誘導に関与するベクターおよび用途
ベクターｐＩＪ９４１（ベクター上にエリスロマイシン耐性遺伝子がクローニングされている）由来のプラスミドｐＳＭ７８４がストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８に導入される場合、それは新規アミド化ポリエンのリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）およびＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）ならびにリモシジン（ＩＩａ）およびＣＥ−１０８（ＩＩｂ）の産生株である株（ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４）を生成する。
【０１０７】
ベクターＳＣＰ２＊由来のプラスミドｐＳＭ７４３Ｂさらには遺伝子ｅｒｍＥおよび内因性または外因性プロモーター、例えばストレプトマイセス・ハルステディ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈａｌｓｔｅｄｉｉ）ＪＭ８のキシラナーゼの遺伝子のプロモーターｘｙｓＡ（ｘｙｓＡｐ）（ルイス−アリバス  Ａ．（Ｒｕｉｚ−Ａｒｒｉｂａｓ  Ａ．）ら、１９９７年、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、６３：２９８３：２９８８頁）などの下で発現される（遺伝子ｒｉｍＡを有する）クラスタｒｉｍの断片の、担体が、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８またはストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−５００に導入された場合、アミド化ポリエン［リモシジンＢ（Ｉ−１ａ）およびＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）］と非アミド化ポリエン［リモシジン（ＩＩａ）およびＣＥ−１０８（ＩＩｂ）］の双方の生成全体において増加が観察される。この事実から、該ポリエンの他の生成生物内でのカルボキシル基および／またはアミド化ポリエンを有するポリエンの生成全体を増加させるために利用可能であろう。
【０１０８】
したがって、別の態様では、本発明は、
ａ）ＳＣＰ２＊の複製起点およびエリスロマイシン耐性遺伝子ｅｒｍＥを含有する該ベクターＳＣＰ２＊由来のベクターまたはその断片、
ｂ）（ｉ）該ベクターＳＣＰ２＊の複製起点、（ｉｉ）該遺伝子ｅｒｍＥ、および（ｉｉｉ）該ベクターＳＣＰ２＊の断片を有するベクター、
ｃ）（ｉ）ＳＣＰ２＊の複製起点と異なる複製起点、（ｉｉ）該遺伝子ｅｒｍＥ、および（ｉｉｉ）該ベクターＳＣＰ２＊の断片を有するベクター、
ｄ）複製起点が欠けており、かつ遺伝子ｅｒｍＥおよびベクターＳＣＰ２＊の断片を有するベクター、
ｅ）（ｉ）複製起点、（ｉｉ）遺伝子ｅｒｍＥ、および（ｉｉｉ）ポリエンの該生合成クラスタ全体または該クラスタの断片を有する、該ベクターＳＣＰ２＊由来のベクター、
ｆ）（ｉ）該複製ベクターＳＣＰ２の複製起点と等しいかまたは異なる複製起点、（ｉｉ）該遺伝子ｅｒｍＥ、（ｉｉｉ）該ベクターＳＣＰ２＊の断片、および（ｉｖ）ポリエンの該生合成クラスタ全体または該クラスタの断片を有する、該ベクターＳＣＰ２＊由来のベクター、
ｇ）複製起点が欠けており、かつ該遺伝子ｅｒｍＥ、およびポリエンの該生合成クラスタ全体または該クラスタの断片を有するベクター、ならびに
ｈ）複製起点が欠けており、かつ（ｉ）該遺伝子ｅｒｍＥ、（ｉｉ）該ベクターＳＣＰ２＊の断片、および（ｉｉｉ）ポリエンの該生合成クラスタ全体または該クラスタの断片を有するベクター
の中から選択されるベクターに関する。
【０１０９】
実際には、ベクターＳＣＰ２＊由来の任意のベクター、例えばｐＩＪ９２２、ｐＩＪ９４１などを用いてもよい。遺伝子ｅｒｍＥは既知の遺伝子である（ウチヤマ（Ｕｃｈｉｙａｍａ）ら、（１９８５年）  Ｇｅｎｅ  ３８：１０３−１１０頁）。本明細書で用いられる「ベクターＳＣＰ２＊の断片」という表現は、アミド化ポリエンの形成を誘発するのに十分なＳＣＰ２＊の１つ以上の断片からなる核酸を示す。発明者らによって行われた試験では、遺伝子ｅｒｍＥとともにベクターＳＣＰ２＊の１つ以上の断片からなる核酸は、アミド化ポリエンが組換え微生物内で生成可能である程度必要でありかつ十分であることが示された。
【０１１０】
特定の実施形態では、本発明のベクターは、ＳＣＰ２＊の複製起点を有するＳＣＰ２＊由来の複製ベクターであり、かつ遺伝子ｅｒｍＥ、例えばｐＳＭ７８４の担体でもある。該プラスミドを、従来の方法（例えば、形質転換、エレクトロポレーション、コンジュゲーションなど）により、遊離カルボキシル基を有するポリエンマクロライド（例えば、アンフォテリシンＢ、ナイスタチン、ピマリシン、カンジシジンなど）の生成微生物に、対応するアミド化ポリエンの生成を目的として導入してもよい。かかる微生物の具体例として、ストレプトマイセス・ノウルセイ（Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ）、ストレプトマイセス・アルビダス（Ｓ．ａｌｂｉｄｕｓ）、ストレプトマイセス・リモサス（Ｓ．ｒｉｍｏｓｕｓ）、ストレプトマイセス・ノドサス（Ｓ．ｎｏｄｏｓｕｓ）、ストレプトマイセス・ナタレンシス（Ｓ．ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・チャッタノオゲンシス（Ｓ．ｃｈａｔｔａｎｏｏｇｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１１】
別の特定の実施形態では、本発明のベクターは、ＳＣＰ２＊の複製起点、遺伝子ｅｒｍＥ、およびベクターＳＣＰ２＊の断片を有する複製ベクターである。
【０１１２】
別の特定の実施形態では、本発明のベクターは、ＳＣＰ２＊の複製起点と異なる複製起点、遺伝子ｅｒｍＥ、およびベクターＳＣＰ２＊の断片を有する複製ベクターである。
【０１１３】
別の特定の実施形態では、本発明のベクターは、統合ベクターまたは複製起点が欠けている非複製ベクターであり、かつ遺伝子ｅｒｍＥおよびベクターＳＣＰ２＊の断片を有する。
【０１１４】
別の特定の実施形態では、本発明のベクターは、ＳＣＰ２＊の複製起点に等しいかまたはそれと異なる複製起点、遺伝子ｅｒｍＥ、およびポリエンの生合成クラスタ全体または該クラスタの断片を有する複製ベクターである。
【０１１５】
別の特定の実施形態では、本発明のベクターは、ＳＣＰ２＊の複製起点、遺伝子ｅｒｍＥ、ベクターＳＣＰ２＊の断片、およびポリエンの生合成クラスタ全体または該クラスタの断片を有する複製ベクターである。
【０１１６】
別の特定の実施形態では、本発明のベクターは、複製起点が欠けており、かつ遺伝子ｅｒｍＥおよびポリエンの生合成クラスタ全体または該クラスタの断片を有する統合ベクターまたは非複製ベクターである。
【０１１７】
別の特定の実施形態では、本発明のベクターは、統合ベクターまたは複製起点が欠けている非複製ベクターであり、かつ遺伝子ｅｒｍＥ、ベクターＳＣＰ２＊の断片およびポリエンの生合成クラスタ全体または該クラスタの断片を有する。
【０１１８】
遊離カルボキシル基を有するポリエンの生成微生物を形質転換するために、ポリエンの生合成クラスタ全体またはその断片を有する本発明のベクターが用いられる場合、アミド化ポリエンの生成および／またはアミド化ポリエンと非アミド化ポリエンの双方の生成全体における増加が観察され、それ故、該ベクターを、ポリエンの生成生物内での遊離カルボキシル基を有するポリエンおよび／またはアミド化ポリエンの生成全体を増加させるのに用いることができる。
【０１１９】
実際には、任意の生合成クラスタまたはその断片は、本発明のベクター内に存在しうるが、それに反して特定の実施形態では、該ベクターはリモシジンの生合成クラスタｒｉｍ全体を含みうる（セコ  Ｅ．Ｍ．（Ｓｅｃｏ  Ｅ．Ｍ．）ら、２００４年、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１１：３５７−３６６頁）。クラスタｒｉｍの任意の断片が使用可能であるが、特定の実施形態では、クラスタｒｉｍの該断片はクラスタｒｉｍの遺伝子ｒｉｍＡを含む。
【０１２０】
ポリエンの該生合成クラスタまたはその断片は、場合によりプロモーターの制御下で見られうる（換言すれば、該プロモーターが制御する遺伝子の発現をそれが指示するような方法で該プロモーターに作動可能に連結されうる）。該プロモーターは内因性または外因性でありうる。実際には、後にベクターで形質転換するべき微生物内で機能的な任意の外因性プロモーターを使用できるが、特定の実施形態では、該外因性プロモーターは、ストレプトマイセス属、例えばストレプトマイセス・ハルステディＪＭ８のキシラナーゼの遺伝子のプロモーターｘｙｓＡ（ｚｙｓＡｐ）などである（ルイス−アリバス  Ａ．（Ｒｕｉｚ−Ａｒｒｉｂａｓ  Ａ．）ら、１９９７年、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、６３：２９８３−２９８８頁）内で機能的なプロモーターである。プラスミドｐＳＭ７４３Ｂは、本発明のベクターのこのタイプの具体例である。
【０１２１】
本発明のベクターを当業者に既知の従来の方法によって取得してもよい（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州、１９８９年）。
【０１２２】
本発明のベクターを、遊離カルボキシル基を有するベクターの生成微生物内でアミド化または非アミド化ポリエンを生成するために使用してもよい。同様に、一方で（ｉ）クラスタｒｉｍまたはその断片などのポリエンの生合成クラスタを含むベクター、他方で（ｉｉ）遺伝子ｅｒｍＥを含むＳＣＰ２＊由来のベクター、またはＳＣＰ２＊の複製起点とは異なる複製起点、遺伝子ｅｒｍＥ、およびベクターＳＣＰ２＊の断片を含むベクターを有するベクターの組み合わせ物をポリエンマクロライドの生成微生物に、該微生物内でアミド化または非アミド化ポリエンを生成するために導入してもよい。
【０１２３】
したがって、別の態様では、本発明は、従来の方法により、遊離カルボキシル基を有するポリエンマクロライド（例えば、アンフォテリシンＢ、ナイスタチン、リモシジン、ピマリシン、カンジシジンなど）への導入のための本発明のベクターの使用に関し、対応する結果として得られた組換え微生物から対応するアミド化ポリエンの生成を目的とした使用に関する。本発明のベクターの宿主としての使用に適する微生物は、アンフォテリシンＢの天然産生株であるストレプトマイセス・ノドサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｄｏｓｕｓ）、リモシジンの産生株であるストレプトマイセス・リモサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｉｍｏｓｕｓ）、カンジシジンの産生株であるストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、ピマリシンの産生株であるストレプトマイセス・ナタレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ）、ナイスタチンの産生株であるストレプトマイセス・ノウルセイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｕｒｓｅｉ）など、遊離カルボキシル基を提示するポリエンの生成微生物であると判る。
【０１２４】
別の態様では、本発明は、本発明のベクターを、遊離カルボキシル基を有するポリエンマクロライドの生成微生物に導入するステップからなるアミド基を有するポリエンマクロライドの組換え生成微生物を取得するための方法に関する。あるいは、アミド基を有するポリエンマクロライドの該組換え生成微生物を、遊離カルボキシル基を有するポリエンマクロライドの生成微生物に、一方で（ｉ）クラスタｒｉｍまたはその断片などのポリエンの生合成クラスタを含むベクター、および他方で（ｉｉ）遺伝子ｅｒｍＥを含むＳＣＰ２＊由来のベクターまたはＳＣＰ２＊の複製起点と異なる複製起点、遺伝子ｅｒｍＥ、およびベクターＳＣＰ２＊の断片を含むベクターの組み合わせ物を導入することによって取得するかまたは、遊離カルボキシル基を有するポリエンマクロライドの生成微生物に、該微生物内でアミド化または非アミド化ポリエンを生成するために導入してもよい。該本発明のベクターまたはベクターの組み合わせの該微生物への導入を当業者に既知の従来の技術、例えば形質転換、エレクトロポレーション、コンジュゲーションなどにより実施してもよい。遊離カルボキシル基を有するポリエンマクロライドの生成微生物の具体例として、ストレプトマイセス、例えば、ストレプトマイセス・ノウルセイ、ストレプトマイセス・リモサス、ストレプトマイセス・ノドサス、ストレプトマイセス・ナタレンシス、ストレプトマイセス・グリセウスなどの様々な種が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２５】
上記のように取得した組換え微生物すなわち下記の本発明の組換え微生物は、本発明の一部を形成し、そのさらなる態様を構成する。
【０１２６】
別の態様では、本発明は、ポリエンマクロライドを生成するための方法であって、本発明の組換え微生物を該ポリエンマクロライドの生成を可能にする条件下で培養し、かつ必要に応じてその化合物を単離および精製するステップを含む方法に関する。特定の実施形態では、該ポリエンマクロライドは、遊離カルボキシル基を有するポリエンマクロライド、アミド基を有するポリエンマクロライドおよびそれらの混合物の中から選択される。アミド基を有する該ポリエンマクロライドの中で、化合物ＡＢ−４００（ＩＶｂ）および式（Ｉ−１）の化合物、例えば化合物のリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）およびＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）ならびにこれらの混合物を見出される。上記の方法によって取得可能なポリエンマクロライドの具体例として、式（Ｉ）の化合物、例えば、ピマリシン（ＩＶａ）、ＡＢ−４００（ＩＶｂ）、リモシジン（ＩＩａ）、リモシジンＢ（Ｉ−１ａ）、ＣＥ−１０８（ＩＩｂ）、ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）およびそれらの混合物の中から選択される化合物が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２７】
該組換え微生物は、それらの微生物の発酵を意図して任意の適切な培地で培養され、培地は一般に、水性培地中に溶解される、１つ以上の炭素源、１つ以上の窒素源、微生物によって取込み可能な１つ以上の無機塩、および必要に応じてビタミンおよびアミノ酸などの１つ以上の栄養素を有し、として微生物の成長およびポリエンマクロライドの生成に適する条件（通気／攪拌、温度および発酵時間、段階など）が適用される。得られるポリエンマクロライドは培地中に有利に分泌され、そこからポリエンマクロライドを、場合によっては細胞抽出物の回収前に、従来の技術、例えばクロマトグラフィー法を使用して回収できる。目的のポリエンマクロライドを、その物理化学的特性に基づいて分離でき、発酵プロセス後の培養培地からそれを精製するための方法を設計できる。
【０１２８】
２．メチル化ポリエンの誘導に関与するベクターおよび用途
本発明は、アクチノファージＰＭ１（マルパーティダ（Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ）およびホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）（１９８６年）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０５：６６−７３頁）由来の組換えファージＰＭ１−７６８Ｂの使用にも関し、そこで遺伝子ｒｉｍＧ内部のＤＮＡ断片がプロモーターｅｒｍＥｐとともにクローニングされており、遺伝子内部の断片の前にあるプロモーターは、挿入点の次に位置する遺伝子に対して起こり得る極性効果を回避する。あるいは、ストレプトマイセスにおいて機能的な別のプロモーター活性を有するＤＮＡの断片であれば使用し、それをリモシジン（ＩＩａ）およびＣＥ−１０８（ＩＩｂ）の産生株の染色体ＤＮＡの増幅によって得られる遺伝子ｒｉｍＧ内部の任意の断片の前にクローニング可能である；得られる構築体は、その分野で使用されかつその熟練した任意のオペレーターが利用しやすい方法に従い、ベクターＰＭ１またはストレプトマイセス内で複製されない別のベクター（または、それは複製型であるが、熱感受性複製起点のプラスミドなど、ベクターが複製しない場合の培養条件に従う）に関係なくクローニングされうる。組換え株（不活化された挿入がリモシジン（ＩＩａ）およびＣＥ−１０８（ＩＩｂ）におけるシンテターゼのポリケチドのモジュール７によって導入されるメチル側鎖基の酸化を完了させるという組換え体の能力に作用するにすぎないことから、組換え株（ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／ＰＭ１−７６８）（または上記の方法によって生成可能な別の機能的等価物）は、リモシジン（ＩＩａ）およびＣＥ−１０８（ＩＩｂ）における生合成経路の中間化合物の産生株であるに違いない（セコ（Ｓｅｃｏ）ら、２００４年、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ、先に引用）。にもかかわらず、これらの初期条件下でかつ想定されない方法で、生じる遺伝子ｒｉｍＧの破壊により、ポリエンを生成できない組換え体が生成された。これは、破壊に用いたプロモーターがおそらくは挿入点の下流に位置する遺伝子ｒｉｍＡでの極性効果を阻止できないという意味で解される。この理由から、遺伝子ｒｉｍＡでの極性効果の不在を保証するため、破壊物質（ｄｉｓｒｕｐｔａｎｔ）は、染色体内での遺伝子ｒｉｍＡの破壊を補完できるプラスミドｐＳＭ７４３Ｂまたは他の機能的に等価なベクターで補完される必要がある。したがって、遺伝子組換え体が得られるならば、それは遺伝子ｒｉｍＧの破壊の下流に位置する染色体に加え、プラスミドｐＳＭ７４３Ｂ（または他の機能的に等価なベクター）内に遺伝子ｒｉｍＡの追加の複製物を有する。挿入の結果として遺伝子ｒｉｍＡの染色体の複製物に対する任意の極性効果が、ｐＳＭ７４３Ｂ（または他の機能的に等価なベクター）内にクローニングされた染色体外の複製物によって補完され、それにより遺伝子ｒｉｍＧ内で排他的な作用（マクロラクトン環の側鎖メチル基の酸化）を受ける組換え体が生じる。プラスミドｐＳＭ７４３Ｂ（または上記のような他の機能的に等価なベクター）は、ストレプトマイセスの処理において常に利用可能な任意の他の技術（プロトプラストの形質転換、感染、コンジュゲーションなど）を用いて転移されうる。生成された株（上記のようなストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−７６８／７４３Ｂまたは他の機能的等価物）の発酵培養物のＨＰＬＣ分析により、構築体が確認された上で、親テトラエンのリモシジン（ＩＩａ）およびＣＥ−１０８（ＩＩｂ）ではなくリモシジンＣ（ＩＩＩａ）およびＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）の生成が確認された。場合により、遺伝子ｒｉｍＧの変異は、ストレプトマイセスの処理において用いた従来の技術に従い、遺伝子ｒｉｍＧ内部の断片の欠失によって行われうる。
【０１２９】
したがって、本発明は、得られた株が遺伝子ｒｉｍＧの発現において排他的な作用を受け、かつ、下記段階
ａ）ポリエンを生成できない、該遺伝子の破壊または欠失による微生物ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８またはその機能的等価物の遺伝子ｒｉｍＧにおける変異体の取得、
ｂ）その後の、該変異体内の染色体内での遺伝子ｒｉｍＡの破壊を補完できるベクター、好ましくはプラスミドによる形質転換
を含む、メチル化ポリエンにおける本発明の産生株であるストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−７６８／７４３Ｂまたはその等価物を取得するための方法に関する。
【０１３０】
より詳細には、本発明は、ステップａ）の変異体が株ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８の遺伝子ｒｉｍＧの破壊または欠失をもたらすために機能的等価物である組換えファージＰＭ１−７６８または任意の他の不活性化系の使用により得られ、かつステップｂ）が、組換え体の染色体内で遺伝子ｒｉｍＡの起こり得る極性効果を補うためにプラスミドｐＳＭ７４３Ｂ（上記のような機能的に等価なベクター）を用いて実施されるという本発明の微生物を取得するための方法に関する。
【０１３１】
本発明は、上記の特定の実施形態に加え、別の態様では、任意の従来の方法により、かつ任意の適切なベクターを用いた、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８の染色体内での遺伝子ｒｉｍＧの中断に関する。該中断は、極性効果を回避するための強力なプロモーター、例を挙げるならばプロモーターｅｒｍＥＰ＊（キーザー（Ｋｉｅｓｅｒ）ら（２０００年）  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ザ・ジョン・イネス・ファウンデーション（Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、ノーウィッチ（Ｎｏｒｗｉｃｈ）、英国）を用いて実施可能であり、それは破壊株内でのメチル化ポリエンのリモシジンＣ（ＩＩＩａ）およびＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）の直接的な生成に関与するかまたはツールとして任意のベクターを用いる外因性プロモーターの制御下での遺伝子ｒｉｍＡの発現により該遺伝子ｒｉｍＡ上の極性効果を補完に関与する。
【０１３２】
さらに、別の態様では、本発明は、それらのメチル化誘導体を取得することを目的とした、この同じ酸化（対応するポリエンのメチル基からのカルボキシル基の形成）に関与するチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子のポリエンの他の産生株内での破壊に関する。チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼがこの酸化に関与しかつ上記のポリエンの生合成クラスタ内にコードされることが記載されている（アパリシオ（Ａｐａｒｉｃｉｏ）ら、２００３年、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６１：１７９−１８８頁）。この酸化に関与する一部の遺伝子について記載がされており、かつ遺伝子ｐｉｍＧ（アパリシオ（Ａｐａｒｉｃｉｏ）ら、２０００年、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７：８９５−９０５頁）、ａｍｐｈＮ（キャフリー（Ｃａｆｆｒｅｙ）ら、２００１年、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８：７１３−７２３頁）、ｎｙｓＮ（ブラウタセット（Ｂｒａｕｔａｓｅｔ）ら、２０００年、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７：３９５−４０３頁）およびｃａｎＣ（キャムペロ（Ｃａｍｐｅｌｏ）ら、２０００年、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４８：５１−５９頁）を、それぞれピマリシン、アンフォテリシン、ナイスタチンおよびカンジシジンの生合成について挙げられる。これら化合物のメチル化誘導体であれば、本発明のリモシジンＣおよびＣＥ−１０８Ｃに記載のメチル化化合物の改善された機能、換言すれば毒性の低下および真菌および寄生虫に対する特異性の向上を示すことになる。
【０１３３】
したがって、別の態様では、本発明は、メチル化ポリエンマクロライドの生成微生物を取得するための方法に関し、その目的のために任意の従来の方法（形質転換、コンジュゲーション、エレクトロポレーション、感染など）を用い、遊離カルボキシル基を有するポリエンマクロライドの生成微生物内で、遊離カルボキシル基の形成に関与するチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子、すなわち他の株内の本発明のｒｉｍＧにおいて記載した遺伝子と相同性を示す遺伝子を中断するステップからなる、方法に関する。
【０１３４】
さらに、別の態様では、本発明は、例としてかつ本発明の範囲を限定することなく、特にアンフォテリシンＢ、ナイスタチン、リモシジン、ピマリシンおよびカンジシジンからなる群に属し、対応するメチル化ポリエンの生成を目的とする、遊離カルボキシル基を有するポリエンマクロライドの生成微生物内での遊離カルボキシル基の形成に関与するチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子の破壊を行うための任意のベクターの使用に関する。発明者らは、例としてかつ本発明の範囲を限定することなく、メチル基からカルボキシル基への酸化に関与するチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子の中断の結果としてのメチル化ポリエンを生成するための使用に適する微生物の中で、アンフォテリシンＢの天然産生株であるストレプトマイセス・ノドサス、リモシジンの産生株であるストレプトマイセス・リモサス、カンジシジンの産生株であるストレプトマイセス・グリセウス、ピマリシンの産生株であるストレプトマイセス・ナタレンシス、ナイスタチンの産生株であるストレプトマイセス・ノウルセイを利用する。
【０１３５】
さらに、本発明は、対応する遺伝子の破壊を行う場合に、極性効果による作用を受けているかもしれない遺伝子の適切な発現に関し、それには媒体として任意のベクター（複製プラスミド、統合プラスミド、アクチノファージなど）が用いられ、かつ導入は従来の方法（形質転換、コンジュゲーション、エレクトロポレーション、感染など）のいずれかによる。遊離カルボキシル基を有するポリエンマクロライドの生成微生物の具体例として、ストレプトマイセスの種、例えばストレプトマイセス・ノウルセイ、ストレプトマイセス・リモサス、ストレプトマイセス・ノドサス、ストレプトマイセス・ナタレンシスおよびストレプトマイセス・グリセウスが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３６】
上記のような遺伝子組換え微生物、すなわち本発明のメチル化ポリエンマクロライドに関する以下の遺伝子組換えされた相同な生成微生物は、本発明の一部を形成し、かつそのさらなる態様を構成する。
【０１３７】
別の態様では、本発明は、メチル化ポリエンマクロライドを生成するための方法であって、本発明の遺伝子組換え微生物を、該メチル化ポリエンの生成を可能にする条件下で培養し、かつ必要に応じて該化合物を単離および精製するステップを含む方法に関し、該化合物は、例としてかつ本発明の範囲を限定することなく、メチル化アンフォテリシンＢ、メチル化ナイスタチン、メチル化ピマリシンおよびメチル化カンジシジンからなる群に属する。本発明の別の目的は、これらの新規メチル化ポリエン、メチル化アンフォテリシンＢ、メチル化ナイスタチン、メチル化ピマリシン、およびメチル化カンジシジンのいずれかからなり、それらをリモシジンＣおよびＣＥ−１０８Ｃの場合と同様、殺生物および薬理学的組成物の調製において使用できる。
【０１３８】
該遺伝子組換え微生物は、それらの微生物の発酵に適する任意の培地内で培養され、かつ一般に、水性培地に溶解された、１つ以上の炭素源、１つ以上の窒素源、微生物によって吸収可能な１つ以上の無機塩、および必要であればビタミンおよびアミノ酸などの１つ以上の栄養素を有し、かつ適切な条件（通気／攪拌、温度および発酵時間、段階など）が微生物の成長およびポリエンマクロライドの生成において適用される。得られるポリエンマクロライドは培地に有利に分泌され、場合により細胞抽出物の回収の前に、マクロライドを従来の技術、例えばクロマトグラフィー法の使用によって回収できる。目的のポリエンマクロライドをその物理化学的特性に基づいて分離でき、それにより発酵プロセス後に、培地からポリエンマクロライドを精製するための方法が設計可能である。
【０１３９】
化合物ＡＢ−４００（ＩＶｂ）
ピマリシン（ＩＶａ）に対応するアミドである化合物ＡＢ−４００（ＩＶｂ）は、ストレプトマイセス・コスタエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｓｔａｅ）に由来する既知の天然生成物である（カネド  Ｌ．Ｍ．（Ｃａｎｅｄｏ  Ｌ．Ｍ．）ら、２０００年、Ｊ．，Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（東京（Ｔｏｋｙｏ））５３：６２３−６２６頁）。
【０１４０】
発明者らがＡＢ−４００（ＩＶｂ）およびピマリシン（ＩＶａ）を用いて実施した試験により、ヒト赤血球に対する溶血活性が生じないでＡＢ−４００が殺真菌活性における実質的な増強を示し、それはエルゴステロールを含有する膜に対し、その非アミド化相同体ピマリシン（ＩＶａ）よりも顕著な選択毒性を示すことが言えることを明らかにした。
【０１４１】
発明者らが実施した他の試験では、アミド化ポリエンがその非アミド化相同体よりも有意に水への可溶性が高いことが示されている。この特性は、上記の薬理学的特性とともにこの化合物が臨床使用すなわち真菌症または寄生虫症の局所または全身治療に加え、アグロアリメンタリー産業においても適節であることを意味する。
【０１４２】
したがって、別の態様では、本発明は、場合により１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤とともに化合物ＡＢ−４００（ＩＶｂ）を含有する医薬組成物に関する。該医薬組成物は、必要に応じて、該化合物ＡＢ−４００（ＩＶｂ）の治療作用を増強するかまたはその作用スペクトルを高める可能性がある１つ以上の治療薬をさらに含有しうる。
【０１４３】
該医薬組成物を、エルゴステロールを含有する細胞膜を有するヒトまたは動物の病原体、例えばヒトまたは動物における寄生虫および病原性真菌によって誘発される感染の予防および／または処置において使用してもよい。
【０１４４】
したがって、別の特定の実施形態では、該医薬組成物は抗寄生虫組成物であって、細胞膜がエルゴステロールを含有する寄生虫、例えばトリパノソーマ、リーシュマニアなどによって誘発される感染の予防および／または処置において使用してもよく、該抗寄生虫組成物は、必要に応じて、該化合物ＡＢ−４００（ＩＶｂ）の治療作用を増強するかまたはその作用スペクトルを高める可能性がある１つ以上の抗寄生虫剤をさらに含有しうる。
【０１４５】
別の特定の実施形態では、該医薬組成物は抗真菌組成物であり、かつそれを真菌（その細胞膜はエルゴステロールを含有する）によって誘発される感染の予防および／または処置において使用してもよい。該抗真菌組成物は、必要に応じて、該化合物ＡＢ−４００（ＩＶｂ）の治療作用を増強するかまたはその作用スペクトルを高める可能性がある１つ以上の抗真菌剤をさらに含有しうる。該抗真菌剤の具体例として、アンフォテリシンＢ、ナイスタチン、ＡＢ−４００（ＩＶｂ）、アリルアミン（例えば、テルビナフィン、ナフチフィンなど）、アモロルフィン、トルナフテートなどのポリエン、クロトリマゾール、ミコナゾール、ケトコナゾール、フルコナゾール、イトラコナゾールなどのアゾール、ベンゾフラン、例えばグリセオフルビンなど、ピリミジン、例えばフルオシトシンなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４６】
化合物ＡＢ−４００（ＩＶｂ）は、治療有効量つまりその治療効果を発揮するのに適する量で該医薬組成物中に存在するべきである。特定の実施形態では、本発明によって提供される医薬組成物は、ＡＢ−４００（ＩＶｂ）の化合物を０．０１重量％〜９９．９９重量％含有し、例えば経口、非経口または局所といった選択される投与経路に依存して任意の適切な投与剤形中に存在しうる。薬剤の異なる投与剤形およびそれらの調製方法に関するレビューが、例えば、Ｔｒａｔａｄｏ  ｄｅ  Ｆａｒｍａｃｉａ  Ｇａｌｅｎｉｃａ、Ｃ．Ｆａｕｌｉ  ｉ  Ｔｒｉｌｌｏ、第１版、１９９３年、Ｌｕｚａｎ  ５、Ｓ．Ａ．ｄｅ  Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓにて見出されうる。
【０１４７】
したがって本発明は、細胞膜がエルゴステロールを含有する、ヒトまたは動物の病原性真菌、例えばヒトまたは動物の寄生虫またはヒトまたは動物の病原性真菌によって誘発される感染の予防および／または処置を目的とした薬剤の調製におけるＡＢ−４００（ＩＶｂ）の使用にも関する。
【０１４８】
同様に、別の態様では、本発明は、治療を必要とする動物またはヒトに、本発明によって提供される化合物ＡＢ−４００（ＩＶｂ）を含有する医薬組成物の治療有効量を投与する段階を含む、エルゴステロールを含有する細胞膜を有するヒトまたは動物の病原体、例えばヒトまたは動物の病原体である寄生虫および真菌によって誘発される感染を予防および／または処置するための方法も提供する。
【化７】
2008538895.tif 000010
2008538895.tif 000011
【０１４９】
以下の実施例は、本発明を例示するものであり、その範囲を限定するものとして解釈してはならない。
【実施例】
【０１５０】
実施形態の例示
実施例１．リモシジンＢ（Ｉ−１ａ）およびＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）の生成および特徴づけ
Ｉ．実験方法
細菌株および成長条件
細菌株およびプラスミドを表１に示す。
【０１５１】
遺伝子組換えによるストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８およびその誘導体を、テトラエンの生成の分析において液体および固体培地ＳＹＭ２（アトラス  Ｒ．Ｍ．（Ａｔｌａｓ  Ｒ．Ｍ．）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、ボカラトン（Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ）、フロリダ州）内、ならびにプラスミドおよび全ＤＮＡの抽出のために液体培地ＴＳＢ（Ｏｘｏｉｄ）中で通常の方法により成長させた。
【０１５２】
取扱い説明書（キーザー  Ｔ（Ｋｉｅｓｅｒ  Ｔ）ら、２０００年、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｎｏｒｗｉｃｈ）に記載のように、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２１をクローニング用の汎用宿主として使用し、固体培地Ｒ５中および液体培地ＹＥＭＥ中で成長させた。
【０１５３】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を、専門文献（マニアティス  Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．）ら、１９８２年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州）に記載のように、ルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）寒天中またはＬＢ培養物中で成長させた。
【０１５４】
抗真菌活性の試験用に用いられるペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、カンジダ・クルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）およびクリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）といった真菌をＭＰＤＡ培地（組成物：２％麦芽抽出物、２％グルコース、０．１％バクトペプトン）中で成長させた。
【０１５５】
表１：本発明で用いられる細菌株およびプラスミド
【表１−１】
2008538895.tif 000012
【表１−２】
2008538895.tif 000013
【０１５６】
遺伝的方法
マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら（１９８２年）に記載のように、大腸菌の株を成長させ、形質転換した。上記（キーザー  Ｔ．（Ｋｉｅｓｅｒ  Ｔ．）ら、２０００年、先に引用）のようにストレプトマイセスの株を処理した。選択なしに固体培地Ｒ５中で供与株および受容株を一緒に成長させ、その後にプラスミドの抗生物質および遺伝マーカーに対応する耐性に基づいて選択時に種内コンジュゲーション（ｉｎｔｒａｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）を行った。上記（マニアティス  Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．）ら、（１９８２年）、先に引用）のようにＤＮＡの処理を行った。
【０１５７】
テトラエンの生成における試験
上記のように、培養物のアリコート全てをメタノールで抽出することにより、テトラエンの生成について分析した（セコ  Ｅ．Ｍ．（Ｓｅｃｏ  Ｅ．Ｍ．）ら、２００４年、先に引用）。抽出物を濾過し、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）  ９９６  ＰＤＡを装備したウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）  ６００Ｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ機器を用いてＨＰＬＣ分析を行った。定量およびクロマトグラフィーの条件は上記と同じであった（ペレス−ズニガ  Ｆ．Ｊ．（Ｐｅｒｅｚ−Ｚｕｎｉｇａ  Ｆ．Ｊ．）ら、２００４年、先に引用）。
【０１５８】
ＨＰＬＣ−ＭＳ試験
質量スペクトルを、四重極検出器のアギレント・テクノロジー・ディテクター（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）に接続された１１００ＭＳＤ  ＨＰＬＣ機器で、起源として電子スプレーおよび正のイオン化モードを用いて測定した。クロマトグラフィー条件は上記と同様であった（ペレス−ズニガ  Ｆ．Ｊ．（Ｐｅｒｅｚ−Ｚｕｎｉｇａ  Ｆ．Ｊ．）ら、２００４年、先に引用）。
【０１５９】
新規化合物の精製
アミド化ポリエンを生成できる構築体（先に述べてきたように）で改良されうるストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４または微生物を、固体または液体培地ＳＹＭ２（ペレス−ズニガ  Ｆ．Ｊ．（Ｐｅｒｅｚ−Ｚｕｎｉｇａ  Ｆ．Ｊ．）ら、２００４年、先に引用）中で培養した。６日後、微生物を培養した完全固体培地を剪断により断片化し、５０ｍＬの注射器に通して、断片化した固体培地を、２５ｍＭのギ酸で予め酸性化した４容量のメタノールで抽出した。液体培地から得られる培養物をメタノールで同様の抽出を行う前に凍結乾燥させた。懸濁液中の固体粒子を除去するため、水性懸濁液を１時間撹拌し、５，０００ｇで２０分間遠心分離した。透明な上清を、３０４ナノメートル（ｎｍ）の波長で測定したマイクロリットル（μＬ）当たり１０〜２０×１０６単位で回転蒸発させることにより濃縮した。次いで、試料を使用するまで８０％メタノール／水中に保存した。液体細胞培養物（２００ｍＬ）、または培養物を予め５容量のメタノールで抽出したプレート（２４×２４ｃｍ）は、４０ｍｇまでのアミド化テトラエンの混合物を生成させた。沈降物質を除去するため、メタノールで抽出した試料を、水を含有する２０％メタノールに移して濾過した。濾液を、予め同溶液で平衡したＳＰセファローズ、ファスト・フロー（Ｐｈａｓｔ  Ｆｌｏｗ）（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））などのイオン交換樹脂を予め充填したオムニフィット（Ｏｍｎｉｆｉｔ）カラム（２５０×２５ｍｍ、スペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）カタログ番号５６０１０）にゆっくりと重層した。これらの条件下でリモシジンおよびＣＥ−１０８を、培養物から得られる色素とともに、充填カラムに付着されていないフロントとともに溶出させる一方、対応するアミド化ポリエンのリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）およびＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）を完全に保持させた。充填ＳＰセファローズと相互作用しなかった化合物を除去するため、固相で保持された目的化合物を含有するカラムを同じ溶液で徹底的に洗浄した。カラムとの相互作用によって保持されたアミド化ポリエンのリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）およびＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）を、定期的に回収される画分と共に２０％メタノール中のｐＨ５の３００ｍＭ酢酸アンモニウムを用いて溶出した。溶出画分については目的のアミドの混合物を含有するものを選択し、これらをまとめて脱塩の物理的プロセスを施し、このためにＳｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ））を使用した。最後に、脱塩画分を２０％メタノールに溶解した。脱塩したアミド化ポリエン（１５ｍｇ）の混合物を含有する画分を（アミド化ポリエンを分離する目的で）最終的にＨＰＬＣにより分画し、このために半分取カラムを使用した（スペルコシル（Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ）製ＰＬＣ−８，２５０×２１．２ｍｍ）。自動勾配コントローラー（ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）製Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）で制御したクロマトグラフィーのパラメータおよび移動相は、１００％のＢ（２０ｍＭ酢酸アンモニウム  ｐＨ５、２０％エタノール）で１２分、５０％までの���（メタノール）および５０％のＢの２重勾配において４３分（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）製クロマトグラフィー用コントローラーにおいて規定された曲線６）、１００％までのＡ（曲線８、上で規定と同じコントローラー）の２進勾配において３５分、ならびに５ｍＬ／分の一定流量であった。画分を定期的に回収し（１画分当たり５ｍＬ）、上記のように精製単離した化合物を含有する画分にさらなる脱塩段階を施し、最後に２回凍結乾燥した。上記のようにストレプトマイセス属ＲＧＵ５．３の液体培養物からＡＢ−４００も精製した（カネド  Ｌ．Ｍ．（Ｃａｎｅｄｏ  Ｌ．Ｍ．）ら、２０００年、Ｊ．，Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（東京（Ｔｏｋｙｏ））５３：６２３−６２６頁）。
【０１６０】
溶血活性の試験
試験を、ゴメス−ゴメス（Ｇｏｍｅｚ−Ｇｏｍｅｚ）らによる方法（ゴメス−ゴメス  Ｊ．Ｍ．（Ｇｏｍｅｚ−Ｇｏｍｅｚ  Ｊ．Ｍ．）ら、１９９６年、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９：９０９−９１０頁）に従って実施した。ポリエンの試料をまず乾燥し、次いで１０〜３０ｍｇ／ｍＬの推定濃度でＤＭＳＯ中に溶解した。様々なポリエンの増加量分を、最終容量１００μＬのＤＭＳＯに移し、軽く攪拌させてヒト血液、ひいてはウマ血液を２．５％含有するＰＢＳ緩衝液５００μＬと混合した（ゴメス−ゴメス  Ｊ．Ｍ．（Ｇｏｍｅｚ−Ｇｏｍｅｚ  Ｊ．Ｍ．）ら、１９９６年、先に引用）。攪拌せずに３７℃で３０分間インキュベートした後、細胞を遠心分離により沈降させ、５４５ｎｍで吸収を測定して溶血の度合いを評価した。溶血全体に対応する値を、蒸留水中の２．５％のウマ血液の懸濁液を用いて評価した。ヒト血液（基本的に赤血球）を地域の血液バンク（オスピタル・ラモン・イ・カハル（Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｒａｍｏｎ  ｙ  Ｃａｊａｌ）、マドリード（Ｍａｄｒｉｄ））、ウマ血液をオクソイド（Ｏｘｏｉｄ）（脱線維血）から入手した。アンフォテリシンＢおよびナイスタチンをシグマ（Ｓｉｇｍａ）（各々、カタログ番号Ａ−４８８８およびＮ−３５０３）から、ピマリシンをカルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）（５２７９６２）から入手した。これらのポリエン全部を、さらなる精製を全く行わずに市販の試料から直接試験した。
【０１６１】
ＩＩ．結果
組換え遺伝子ｒｉｍＡの生成
ポリシストロニックｍＲＮＡ内にコードされた遺伝子ｒｉｍＡ（セコ  Ｅ．Ｍ．（Ｓｅｃｏ  Ｅ．Ｍ．）ら、２００４年、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１１：３５７−３６６頁）を、ストレプトマイセス・ハルステディＪＭ８のキシラナーゼの遺伝子のプロモーターｘｙｓＡ（ｘｙｓＡｐ）の制御下でクローニングした（ルイス−アリバス  Ａ．（Ｒｕｉｚ−Ａｒｒｉｂａｓ  Ａ．）、１９９７年、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、６３：２９８３−２９８８頁）。これを行うため、プロモーターｘｙｓＡｐの上流に位置するメチレノマイシン耐性遺伝子（Ｔ１：アダム  Ｓ．Ａ．（Ａｄｈａｍ  Ｓ．Ａ．）ら、２００１年、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７７：９１−９７頁）のターミネーターをさらに担持する５４７塩基対からなるＢｇＩＩ／Ｓｍａｌ断片としてｐＨｉｓ１からプロモーターｘｙｓＡｐを取り出した（レスキュー）。表１に記載の様々な段階を経た後、ＤＮＡクローニングにおける通常の手順に従い、遺伝子ｒｉｍＡおよび３’末端に遺伝子ｒｉｍｌを有するＤＮＡの断片（図１に示されるように登録番号ＡＹ４４２２２５下でジェンバンク（ＧｅｎｅＢａｎｋ）中に寄託された配列から始まる９３３６〜１５４４５塩基対の位置；セコ  Ｅ．Ｍ．（Ｓｅｃｏ  Ｅ．Ｍ．）ら、２００４年、先に引用）を、プロモーターｘｙｓＡｐ下でのｒｉｍＡの発現を可能にする適切な方向でｘｙｓＡｐと融合した（組換え遺伝子ｒｉｍＡ）。最後に、ｐＮＡｅ−１の遺伝子ｅｒｍＥ（表１）を隣接する酵素による消化により切り取り（rescue）、中間段階で得られたＤＮＡ断片をクローニングした。最終作成において、プロモーターｘｙｓＡｐの制御下での遺伝子ｒｉｍＡ、切断された遺伝子ｒｉｍＩの断片および最後に完全な遺伝子ｅｒｍＥを左から右に含有するＤＮＡの断片（図１Ａ参照）を生成するため、得られたＤＮＡ断片を「組換えｒｉｍＡ」遺伝子の後にクローニングした。分子生物学での通常の技術に従い、得られたＤＮＡ断片を、ストレプトマイセスのベクターｐＩＪ９２２のチオストレプトン耐性遺伝子内に位置する固有の制限部位ＥｃｏＲＶで平滑末端を介してクローニングした。得られたプラスミド（ｐＳＭ７４３Ｂ、図１Ａ）に、チオストレプトンではなくエリスロマイシンに対する耐性を、対応するチオストレプトン耐性遺伝子を上記ＤＮＡ断片の挿入によって中断することによって付与する。
【０１６２】
上記のように、ｐＳＭ７４３Ｂ内でクローニングした組換え遺伝子ｒｉｍＡの正確な機能性を、予め天然遺伝子ｒｉｍＡの破壊により生成した変異体、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８（セコ  Ｅ．Ｍ．（Ｓｅｃｏ  Ｅ．Ｍ．）ら、２００４年（先に引用）として記載のストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／ＰＭ１−５００）へのプラスミドｐＳＭ７４３Ｂの導入によって検証した。得られた遺伝子組換え体（予め中断した遺伝子ｒｉｍＡを有するストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８の変異体へのプラスミドｐＳＭ７４３Ｂの導入によって生成した）は、天然マクロライドポリエン（リモシジンおよびＣＥ−１０８）ならびに新規のマクロライドポリエン（リモシジンＢおよびＣＥ−１０８Ｂ）を生成できる。同様に、野生株内に導入したプラスミドｐＳＭ７４３Ｂは４種の（アミド化およびカルボキシル化）テトラエンの生成も誘発したが、ここでポリエンのあらゆる生成が増加したのはおそらくクラスタｒｉｍの生合成遺伝子の発現によるものであろう。これと並行してプラスミドｐＳＭ７８４を作成した。これを行うため、遺伝子ｅｒｍＥを、分子生物学での通常の技術に従い、かつ後続する段階で、平滑末端を有するＤＮＡ断片として取り出されうる（rescue）完全遺伝子ｅｒｍＥを取得するのに適する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のベクターにクローニングした。最後に、平滑末端を有するＤＮＡ断片内に遺伝子ｅｒｍＥを有するＤＮＡ断片を、ベクターｐＩＪ９４１に特有の制限部位ＥｃｏＲＶにクローニングした。得られたベクターはエリスロマイシンおよびハイグロマイシンＢに対して耐性を付与するが、それはそれに対応する耐性遺伝子における遺伝子ｅｒｍＥの断片の不活化挿入による中断によってチオストレプトンに感受性を示す（図１Ｂを参照）。プラスミドｐＳＭ７８４が野生株ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８に導入される場合、得られた組換え微生物は、新規のアミド化ポリエンのリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）およびＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）ならびにリモシジンＢ（ＩＩａ）およびＣＥ−１０８Ｂ（ＩＩｂ）を生成可能である。
【０１６３】
したがって、ベクターｐＳＭ７４３ＢまたはベクターｐＳＭ７８４を有するストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８における遺伝的改変により、元のポリエン（リモシジンおよびＣＥ−１０８）と新規のアミド化ポリエン（ＣＥ−１０８ＢおよびリモシジンＢ）の双方が生成され、それらは図１Ｃに示すようにＨＰＬＣでの分析によると類似したクロマトグラフィー特性を有する。質的に両方の遺伝子組換え体が同じポリエンを生成するという事実にも拘わらず、それらの生成は、遺伝子ｒｉｍＡおよびエリスロマイシン遺伝子（プラスミドｐＳＭ７４３Ｂ）を有する組換え体でかなり顕著であった。
【０１６４】
プラスミドｐＳＭ７４３Ｂを導入する場合、中断された遺伝子ｒｉｍＡを有するストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８変異体内で両テトラエン（リモシジンおよびＣＥ−１０８）の生成が回復し、これは組換え遺伝子ｒｉｍＡが機能性を有することを示している。それに反し、この補完された変異体ではポリエンの生成は、同じプラスミドｐＳＭ７４３Ｂの野生担体株の場合よりも有意に低い（表１）、グルコースまたはキシランを培地に添加しても、この生成低下は有意に変化しなかった。これらの結果は、ｒｉｍＡの発現がポリエンの生成での制限する段階となることを示唆するように思われ、この制限段階は遺伝子用量の増加によって明らかに克服される。
【０１６５】
これらの結果は、ＳＣＰ２＊由来のベクター内の遺伝子ｅｒｍＥが新規ポリエンの生成において基本的な役割を果たすことを明示している。ｐＨＪＬ４０１などの他のベクターにクローニングされるエリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＥ）（ラルソン  Ｊ．Ｌ．（Ｌａｒｓｏｎ  Ｊ．Ｌ．）ら、（１９８６年）Ｐｌａｓｍｉｄ  １５．１９９−２０９頁）、ＳＣＰ２＊由来のベクターのいずれもが単独では新規の構造体を生成するのに十分でないことは強調される必要がある。
【０１６６】
新規ポリエンの特徴づけ
ＨＰＬＣ−ＭＳ分析
ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７４３Ｂおよびストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−５００／７４３Ｂの発酵培養物の質量分析と組み合わせてＨＰＬＣ分析を行い、２種の新規テトラエンの推定質量は、保持時間の最小および最大においてそれぞれ７３８および７６６であった。いずれの場合においても、新規ポリエンの質量は、最も近い保持時間を有するポリエンであるＣＥ−１０８（７３９）およびリモシジン（７６７）の質量よりも小さい単位である。その質量差およびクロマトグラフィーの移動度の両者とも、新規ポリエンが天然マクロライドに由来するという考えを裏付けている。
【０１６７】
化学構造の解明
化学構造を解明するため、新規ポリエンを、その精製のための方法を開発する目的をもって予備的に特徴づけを行った。両化合物はＣ８およびＣ１８のように逆相でシリカゲルだけでなくＳＰ−セファローズのようなイオン交換樹脂と相互作用し、これらの化合物が接近可能な正電荷を有することが判明した。この一次的な特徴づけにより、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／ｐＳＭ７４３Ｂまたはストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４の発酵培養物をはじめとして一様に単純な精製方法を設計することができた（実験方法に関する項を参照）。
【０１６８】
化合物ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）は、ＣＥ−１０８（ＩＩｂ）のそれに類似のテトラエンに特有の可視スペクトル（λｍａｘ＝３１７、３０２、２８９ｎｍ）を有する粉末として得た（Ｆ．Ｊ．（Ｐｅｒｅｚ−Ｚｕｎｉｇａ  Ｆ．Ｊ．）ら、２００４年、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ））５７：１９７−２０４頁）。δ６．２５（ｄｄ、１４．９、１０．９Ｈｚ）でｓｐ２範囲内の３つのシグナル、δ６．００〜６．１５で多重線およびδ５．８７（１５．２、８．４Ｈｚ）での二重線の二重線を有する１Ｈ−ＮＭＲのスペクトルは、ＣＥ−１０８のスペクトルと類似していた。２個の交換可能な陽子が、幅広い一重線としてδ７．３０および６．８３で見られた。δ１．４０〜２．５０の脂肪族範囲では、スペクトルは複雑な多重線パターンを示し、３つのメチル−三重線および二重線のシグナルはそれぞれδ１．１７、１．１５および０．８３で見られた。質量スペクトル（＋）−ＥＳＩ  ＭＳでは、高分解能（［Ｍ＋Ｈ］＋においては観察値７３９．４０１１０、計算値７３９．４０１７１５）を用い、分子式Ｃ３７Ｈ５８Ｎ２Ｏ１３に対応する、ｍ／ｚが７３９（［Ｍ＋Ｈ］＋）および７６１（［Ｍ＋Ｎａ］＋）での偽分子イオンの存在が示された。磁気共鳴スペクトル１３Ｃ−ＮＭＲにより、分子式に定められるように、ＣＥ−１０８と同様、３７炭素シグナルが示された。ＣＥ−１０８およびＣＥ−１０８Ｂについての１３Ｃ−ＮＭＲに関するデータには密接な関連があることから、ＣＥ−１０８およびＣＥ−１０８Ｂがアミノ糖を含む同じ炭素骨格を有すると結論づけることができた。これらのデータによると、第２の窒素がアミド機能に帰属する必要があり、それによりＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）がＣＥ−１０８（ＩＩｂ）のアミドと同定される。
【０１６９】
リモシジンＢ（Ｉ−１ａ）粉末をＤＭＳＯ中に溶解させた。質量スペクトル（＋）−ＥＳＩ  ＭＳでは、リモシジンＢ（Ｉ−１ａ）の分子量が７６６であり、それは高分解能によると分子式Ｃ３９Ｈ６２Ｎ２Ｏ１３に対応することが判定された（［Ｍ＋Ｎ］＋において観察値７６７．４３２５４、計算値７６７．４３３０１）。１Ｈ−ＮＭＲのスペクトルは、ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）のそれに類似し、δ７．３０および６．８３での２個の交換可能な陽子のＨ／Ｄ、δ６．４０〜５．８０の間隔内での２つの二重線の二重線および多重線を示した。脂肪族領域は、分解能がより低いことから極めて複雑であったが、δ１．８３および１．１６での三重線および二重線はメチル−シグナルにより容易に同定された。スペクトル１３Ｃ−ＮＭＲでは、３９炭素のシグナルの存在が示された。ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）との比較により、１３６．７〜１２８．３の間隔内での８炭素原子のｓｐ２シグナルに加え、２０８．８、１７４．１および１７２．１での３つのカルボニルシグナルならびに２つのアセタル基の存在が示された。最終的に、ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）との近似性により、この化合物がリモシジンのアミドとして同定され、本明細書ではリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）として同定された。
【０１７０】
新規のアミド化ポリエン化合物の生物活性
抗真菌活性試験
新規のアミド化テトラエン［リモシジンＢ（Ｉ−１ａ）およびＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）］の抗真菌活性を、ペニシリウム・クリソゲナム、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・ニガー、カンジダ・クルセイおよびクリプトコッカス・ネオフォルマンスといった様々な真菌に対して試験した。メタノールに溶解した様々なテトラエンの増加量分をペーパーディスク（直径９ｍｍ）に適用し、適用後、ディスクを乾燥させ、対応する試験真菌が予め拡散されているバイオアッセイプレート上に置いた。これらのアミド化テトラエンの活性をその分子の元の分子［リモシジンＢ（ＩＩａ）およびＣＥ−１０８Ｂ（ＩＩｂ）］の活性と比較したところ、それはすべての試験真菌中でアミド化ポリエンの生物活性がそれらの誘導されたテトラエンの生物活性よりも実質的に大きいことを示した（図２）。あらゆる場合において、遊離カルボキシル基とアミド基との置換により、抗真菌活性が約４倍に増大した。
【０１７１】
毒性試験
上記実験では、遺伝子組換え体ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８によって生成される新規アミド化ポリエンの修飾により、高い抗真菌活性を有する化合物が生成されることは明らかである。毒性もまた増加するか否かを判定するため、新規のアミド化ポリエンの溶血活性について、野生株によって生成される化合物と比較することで判定した。この試験における細胞モデルとして、ヒト赤血球を用いた（シブルスカ  Ｂ．（Ｃｙｂｕｌｓｋａ  Ｂ．）ら、２０００年、Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｐｏｌ．４７：１２１−１３１頁；ゴメス−ゴメス  Ｊ．Ｍ．（Ｇｏｍｅｚ−Ｇｏｍｅｚ  Ｊ．Ｍ．）ら、１９９６年、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９：９０９−９１０頁）。新規化合物の溶血活性をリモシジンおよびＣＥ−１０８に対し（実験方法に関する項を参照）、アンフォテリシンＢおよびナイスタチンＡについても含めて評価した。表２に示すように、アミド化テトラエン［リモシジンＢ（Ｉ−１ａ）およびＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）］の溶血活性と誘導源に対応するテトラエンの溶血活性との違いが有意でないが、一方でそれらの抗真菌活性は明らかに向上した。ＣＥ−１０８（ＩＩｂ）およびＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）にて観察される毒性とリモシジン（ＩＩａ）およびリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）の場合との差異を強調することは意義があり、後者の２種のポリエンにおいて４０〜６０ナノモルで５０％の溶血が得られる一方、同程度の溶血を得るのにＣＥ−１０８の濃度がアミドの６もしくは７倍高いことが必要とされる。したがって、アミド化ポリエンＣＥ−１０８Ｂの薬理学的特性が有意に改善されている、すなわち、ＣＥ−１０８が低い抗真菌活性を示す一方、その対応するアミド化誘導体（ＣＥ−１０８Ｂ）はリモシジンのレベルとほぼ同程度の高レベルに向上した抗真菌活性を有するが、その溶血活性は６もしくは７倍低い。これらの試験をウマ血液でも実施し、それらは類似の結果を示した（データは示さず）。
【０１７２】
ピマリシン（ＩＶａ）とそのアミド化誘導体ＡＢ−４００（ＩＶｂ）を比較して同じ結果を得た。実験方法に関する項に示されるように、両化合物を、まず単離した株のストレプトマイセス属ＲＧＵ５．３から精製した。株をグルコースと酢酸ナトリウムの双方を補充した培地内で培養し、酢酸ナトリウムを培養物に添加する場合にアミド化誘導体の生成が顕著に増大することを見出した。酢酸ナトリウムではなくグルコースを炭素源として含有する発酵培養物を用いるとこの方法では、ピマリシン／ＡＢ−４００のバランスは７０／３０であり、同じ培地に酢酸ナトリウムを補充する場合には生成特性は逆転し、主なポリエン化合物としてＡＢ−４００（ＩＶｂ）が生成される（図３）。遺伝子組換え株ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８により生成される、アミド化ポリエンの生成においては、この効果は観察されなかった。アミド化ポリエンをまずこの培地から精製し、抗真菌活性と溶血活性の双方について試験した。図３Ｃにまとめた結果は、予め遺伝子組換え体ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８から得られるアミド化ポリエンで観察された結果に一致しており、試験濃度のピマリシン（ＩＶａ）では抗真菌活性が全く観察されない一方、同量のＡＢ−４００（ＩＶｂ）は高活性を示し、ペニシリウム・クリソゲナムが使用される場合、活性においてほぼ一桁の差異が観察された。それに反し、ＡＢ−４００（ＩＶｂ）および市販のピマリシンを用いて行った溶血活性の試験では、２種のポリエン間に有意な差異が示されなかった。このデータを全体的に考慮すると、ピマリシンのアミド化誘導体がカルボキシル化ピマリシンより優れた薬理学的な利点をもたらすと結論づけられる。
【０１７３】
表２：様々なポリエンの溶血活性比較。各ポリエンにおいて試験された値はナノモルで(左列)かつ対応する溶血活性は溶血の総百分率として示される（実験方法を参照）。
【表２】
2008538895.tif 000014
【０１７４】
ＩＩＩ．考察
天然生成生物（ｐｒｏｄｕｃｅ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）の遺伝子操作によって生成される大部分アミド化されていない２種のポリエン、リモシジンおよびＣＥ−１０８のカルボキシル基における変化を有する２種の新規アミド化ポリエンに関する生合成について記載する。
【０１７５】
２種の天然テトラエン（リモシジンおよびＣＥ−１０８）の産生株であるストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８は、もしそれが遺伝子操作により適切に改変される場合、対応するアミド（リモシジンＢおよびＣＥ−１０８Ｂ）を天然にかつ主な化合物として生成する能力を得る。遊離カルボキシル基のアミド基への変換は、他の半合成ポリエン誘導体と同様、その薬理学的特性の一部における明らかな改善（溶血活性ではなく抗真菌活性における大幅な向上）を包含することから、天然テトラエンの場合と比べて抗真菌剤としての著しい利点をもたらす。両誘導体におけるこの化学的改変は、組成物がエルゴステロールを有する生物の膜における選択毒性の向上を包含する。発明者らは、ピマリシン（ＩＶａ）およびＡＢ−４００（ＩＶｂ）の場合に類似の結果が得られることを強調しており、それは、それらポリエンにおけるカルボキシル基のアミド基との置換が他のポリエンの相対的毒性も向上させることになるという考えを裏付ける。
【０１７６】
これらの新規のアミド化ポリエンの生合成においては、（ａ）アミドがアグリコンのポリケトン鎖の構築後の、本発明に記載の実験条件下で活性化されうるアミドトランスフェラーゼ活性の結果であり（「装飾」活性またはＰＫＳ後修飾）、または（ｂ）ＣＥ−１０８およびリモシジンの生成における生合成モデルにおいて提示されるように、マロナミル−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性が、対応するＰＫＳの縮合モジュール７により（セコ  Ｅ．Ｍ．（Ｓｅｃｏ  Ｅ．Ｍ．）ら、２００４年、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１１：３５７−３６６頁）、メチルマロニル−ＣｏＡではないマロナミル−ＣｏＡを取り込むという少なくとも２つの有望な機構を仮定してもよい。この後者の場合、クレイセン（Ｃｌａｙｓｅｎ）型の脱炭酸縮合が、生合成チオラーゼ内で生じる場合（ヒース（Ｈｅａｔｈ）およびロック（Ｒｏｃｋ）、２００２年、Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｐ．１９：５８１−５９６頁）、ポリケトン鎖内でのマロナミドの取り込みに必要となり：この場合であれば、縮合単位としてのマロナミドのインビボでの利用可能性が成長するポリケトン鎖内での良好な取り込みにとって重要となる。生産株がオキシテトラサイクリンも生合成し、ポリケトン鎖におけるその仮定された「スターター（ｓｔａｒｔｅｒ）」単位がマロナミドであることは強調するに値する。したがってこの株内であれば、この代謝産物は他の二次代謝物質ならびにオキシテトラサイクリンの生成のために容易に使用可能なものとなる。
【０１７７】
ＣＥ−１０８ＢおよびリモシジンＢの生成をもたらす遺伝的機構は未知であるが、それには少なくともＳＣＰ２＊由来のプラスミド（ｐＩＪ９２２またはｐＩＪ９４１など）と遺伝子ｅｒｍＥが必要であることは明らかであろう。最近、抑制濃度以下のエリスロマイシンが細菌の転写を調節可能であるという記載がなされている（ゴー（Ｇｏｈ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１７０２５−１７０３０頁）。それに反し、エリスロマイシンが全く添加されていない培養物中でアミドも検出されたことから、エリスロマイシンがポリエンの生成生物内でアミド化段階を可能にする有望な転写調節物質の発現を調節できるという可能性は失われる可能性がある。これにより、遺伝子ｅｒｍＥ（メチラーゼ）の産物がＳＣＰ２＊由来のプラスミド（ｐＩＪ９２２またはｐＩＪ９４１）のＤＮＡ内部でコードされる別の中間遺伝子上で作用しうるという可能性が開かれ、その結果として、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８の天然ポリエン（リモシジンおよびＣＥ−１０８）のアミド化を担う染色体遺伝子の活性化が仮定される。本発明は、遺伝子組換え株による生体内変換を用いて新規のアミド化ポリエンを生成するための系を提供する。このプロセスは、市販のポリエンの生合成経路に十分に適用されると、改善された医薬化合物を生成するための簡易なプロセスとなることは疑いない。本発明が関係するポリエン構造が複雑であると仮定すると、アミド化ポリエン化合物を生成するための本発明において提示される生体内変換は、一部の半合成構造を生成するための有機合成により、これまで記載されたものよりも明らかに効率の良いプロセスの構成要素となる。
【０１７８】
実施例２−リモシジンＣ（ＩＩＩａ）およびＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）の生成および特徴づけ
Ｉ．実験方法
細菌株、クローニングベクターおよび成長条件
細菌株およびプラスミドを表１に示す。
【０１７９】
ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８およびその誘導体をＳＹＭ２培地（アトラス  Ｒ．Ｍ．（Ａｔｌａｓ  Ｒ．Ｍ．）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、ボカラトン（Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ）、フロリダ州）内で培養した。ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２１をファージの増殖においてかつ宿主株として使用し、現場取扱い説明書（キーザー  Ｔ．（Ｋｉｅｓｅｒ  Ｔ．）ら、２０００年、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ノーウィッチ（Ｎｏｒｗｉｃｈ））に記載のように固体培地Ｒ５内および液体培地ＹＥＭＥ内で成長させた。
【０１８０】
専門文献（マニアティス  Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．）ら、１９８２年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州）に記載のように、大腸菌ＪＭ１０１株をルリア−ベルターニ（ＬＢ）寒天またはＬＢ培養物内で成長させた。
【０１８１】
ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＡＴＣＣ１０００３を、抗真菌活性の試験に使用し、ＭＰＤＡ培地（組成物：２％麦芽抽出物、２％グルコース、０．１％バクトペプトン）内で成長させた。
【０１８２】
表１：本発明で用いられる細菌株およびプラスミド
【表３−１】
2008538895.tif 000015
【表３−２】
2008538895.tif 000016
【０１８３】
遺伝的方法
上記プロトコルを用い、大腸菌株ＪＭ１０１を成長させて形質転換した（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、１９８２年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州）。上記のように、ストレプトマイセスの株を処理した（キーザー  Ｔ．（Ｋｉｅｓｅｒ  Ｔ．）ら、２０００年、先に引用）。実施例１に記載してきたように種内コンジュゲーションを行った。マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、１９８２年（先に引用）により、上記のようにＤＮＡの処理を行った。
【０１８４】
テトラエンの生成についての試験
実施例１に記載のように、テトラエンの生成について分析した。上記と同様の条件下でＨＰＬＣ分析を行った（ペレス−ズニガ  Ｆ．Ｊ．（Ｐｅｒｅｚ−Ｚｕｎｉｇａ  Ｆ．Ｊ．）ら、２００４年、先に引用）。
【０１８５】
ＨＰＬＣ−ＭＳ試験
質量スペクトルを、ソースとしてエレクトロスプレーおよび正のイオン化モードを使用した四重極検出器アジレント・テクノロジー・ディテクター（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）に接続した１１００ＭＳＤ  ＨＰＬＣ機器を用いて測定した。クロマトグラフィー条件は、上記と同様であった（ペレス−ズニガ  Ｆ．Ｊ．（Ｐｅｒｅｚ−Ｚｕｎｉｇａ  Ｆ．Ｊ．）ら、２００４年、先に引用）。
【０１８６】
ＮＭＲ分析
ＮＭＲスペクトルをバリアン・イノバ（Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｏｖａ）６００分光計（５９９９．７４０ＭＨｚ）で測定した。ＥＳＩ質量スペクトルを、レオス（Ｒｈｅｏｓ）４０００の第四ポンプ（フラックス・インスツルメント（Ｆｌｕｘ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ））を具備するフィニガン（Ｆｉｎｎｉｇａｎ）製ＬＣＱ機器上に記録した。ＨＲ  ＥＳＩ質量スペクトルをブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）製ＦＴＩＣＲ４．７  Ｔ分光計で測定した。
【０１８７】
新規化合物の精製
染色体内でのＰＭｌ−７６８相の挿入の正確な選択およびプラスミドｐＳＭ７４３Ｂの存在について、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−７６８／７４３Ｂをチオストレプトン（５０μｇ／ｍｌ）およびエリスロマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を補充した固体培地ＳＹＭ２（ペレス−ズニガ  Ｆ．Ｊ．（Ｐｅｒｅｚ−Ｚｕｎｉｇａ  Ｆ．Ｊ．）ら、２００４年、先に引用）内で培養した。６日後、実施例１で前述したように、微生物が培養される完全な固体培地を断片化した。ＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）およびリモシジンＣ（ＩＩＩａ）を、半分取カラム（スペルコシル（Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ）製ＰＬＣ−８、２５０×２１．２ｍｍ）を用いたＨＰＬＣにより精製し、適用される勾配は分析的分画（前述）において前述のものに類似しており、それを自動勾配コントローラー（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）製Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ）で制御した。ポリエンを含有する画分を互いに結合させ、それにＳｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ））を用いた脱塩段階を施し、最終的に２回凍結乾燥した。任意のメチル化ポリエンを対応する遺伝子組換え微生物の培養物から精製するのにこの方法を用いることができる。
【０１８８】
溶血活性の試験
実施例１で前述のように、赤血球内に豊富なヒト血液に関して試験を行った。
【０１８９】
無細胞抽出液の調製および「インビトロ」アミド化試験
無細胞抽出液を調製するため、アミド化ポリエンの産生株である遺伝子組換え体のストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４およびストレプトマイセス属ＲＧＵ５．３を、５０ｍＬの培地ＳＹＭ２（アトラス（Ａｔｌａｓ）ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、ボカラトン（Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ）、フロリダ州）内で３日間成長させた。菌糸体を５，０００ｇ、４℃で１０分間の遠心分離により回収し、２０％グリセロールの溶液で洗浄し、グリセロールの２０％溶液１５ｍｌで再懸濁した。５００μＬの一定分量を使用するまで−２０℃で保存した。使用時、上記のように細胞を遠心分離により回収し、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％グリセロール、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦおよび１ｍＭのβ−メルカプトエタノールの緩衝液（ＴＥＰＭ緩衝液）で再懸濁した。再懸濁した細胞に超音波による破壊を施し、８，０００ｇ、４℃で１５分間の遠心分離を２回行うことにより、ホモジネートを清澄化した。無細胞ホモジネートを汚染するポリエンを、上清をＳｅｐ−ＰａｋカートリッジＣ１８（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ））に通過させることにより部分的に除去した。これらの画分に硫酸アンモニウムによる分画を施し、これらを順次、４５％および６０％の飽和状態にした。６０％の飽和から得た沈殿物を、元に対して４倍の濃度で溶解し、アミドトランスフェラーゼの評価用に用いた。上記溶液の１００μＬを含有する２００μＬについてアミドトランスフェラーゼ試験を行い、異なるポリエン、２．５ｍＭのグルタミン、２５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、４ｍＭのＡＴＰおよび１２５ｍＭのＴＥＳ緩衝液、ｐＨ７．２を含有する溶液について、４×１０６単位の光学密度を３４０ｎｍで測定した。反応物を３０℃で６０分間インキュベートし、１容量のメタノールの添加により停止し、ペレス−ズニガ（Ｐｅｒｅｚ−Ｚｕｎｉｇａ）ら、２００４年（先に引用）に記載のように、４，０００ｇでの遠心分離により沈殿物を除去し、ＨＰＬＣにより分析した。
【０１９０】
ＩＩ．結果
ａ）新規のメチル化ポリエン
ａ．１．ポリエンアミドの生合成機構に関する判定
リモシジンＢ（Ｉ−１ａ）およびＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）の生合成に関し、（ａ）リモシジン（ＩＩａ）およびＣＥ−１０８（ＩＩｂ）の形成について示されたメチルマロニル−ＣｏＡ単位の代わりのモジュール７内のマロナミル−ＣｏＡ伸長単位の縮合、および（ｂ）リモシジン（ＩＩａ）および／またはＣＥ−１０８（ＩＩｂ）の側鎖カルボキシル基からアミドを生じさせる「装飾」活性（アミドトランスフェラーゼなど）という２つの有望な別の機構が以前から示唆されている。一方および他方の機構間について判断する上で、遺伝子ｒｉｍＧの役割が重大である可能性がある、すなわち、もし機構が（ａ）であるかまたは可能性（ｂ）の場合においてこの実施ができない場合、遺伝子ｒｉｍＧの破壊により、アミド化テトラエンの形成の誘発に関与するプラスミドの担体であることから、対応するアミドを生成可能な変異体がもたらされると考えられた。
【０１９１】
したがって、ベクターとしてアクチノファージＰＭ１を用い、遺伝子ｒｉｍＧにおける破壊によって変異体を生成した（マルパーティダ（Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ）ら、１９８６年、先に引用）。ｒｉｍＧの下流に位置する遺伝子上での考えられる極性効果を阻止するため（図４参照）、（ジェンバンク（ＧｅｎｅＢａｎｋ）  ＡＹ４４２２２５内に蓄積された配列８２６７〜８８４９を調整する）ｒｉｍＧ内部の０．６ｋｐｂのＳａｃＩＩ断片を遺伝子ｅｒｍＥｐのプロモーターを含む断片、およびファージＰＭ１内の構築物の後にクローニングした。組換えアクチノファージＰＭ１−７６８Ｂを、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−７６８のリソジーン（ｌｙｓｏｇｅｎｅｓ）を生成するストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８の胞子への感染用に使用した。これらのリソジーンはポリエンを全く生成せず、これは天然プロモーターと比較してプロモーターｅｒｍＥｐの発現が低下することを示唆した。ｅｒｍＥｐ＊などのより強力なプロモーターを用いて遺伝子ｒｉｍＧを中断する試み（キーザー（Ｋｉｅｓｅｒ）ら、２０００年、先に引用）は十分ではなかった。ｒｉｍＨおよびｒｉｍＡという挿入点の下流に２種の遺伝子が位置している。ｒｉｍＨがＲｉｍＧに必要とされている電子輸送を仲介するという提示されている役割を有するフェロドキシンをコードすると仮定すると（セコ（Ｓｅｃｏ）ら、２００４年、先に引用）、遺伝子ｒｉｍＡの適切な発現がおそらくはポリエンの生成を回復するための重要なパラメータであると考えることは理にかなっている。この理由のため、ｒｉｍＡの破壊を補完しかつアミド化ポリエンの形成を誘発する能力があるプラスミドｐＳＭ７４３Ｂ（先に言及）を、種内コンジュゲーションにより、野生株ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７４３Ｂからストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−７６８のリソジーンに移し、ここで得られた組換え体はストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−７６８／７４３Ｂであった。一旦対応する遺伝子型が確認されると、発酵培養物におけるポリエンの生成について分析した。発酵培養物中で大部分検出された化合物が２種存在し、ＨＰＬＣおよび質量スペクトル分析により、それらが７０９および７３７質量単位である（それぞれＣＥ−１０８（ＩＩｂ）およびリモシジン（ＩＩａ）の質量単位よりも３０単位小さい）と判定された。データは、それらがマクロラクトン環の側鎖カルボキシル基がｒｉｍＧの破壊の結果としてメチル基と置換された場合のＣＥ−１０８（ＩＩｂ）およびリモシジン（ＩＩａ）に由来するテトラエンであることを示唆した。該化合物は、リモシジンＣ（ＩＩＩＩａ）およびＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）と称されている。これらの条件下でのアミド化ポリエンのＣＥ１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）およびリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）の生成が明らかに誘発される場合におけるそれらの非存在は、アミド化誘導体の形成には予め側鎖カルボキシル基の形成が必要であり、かつアミド基の形成がポリケチドシンターゼのモジュール７内でのマロナミル−ＣｏＡ単位の縮合の代わりの「装飾」活性に起因することを示唆し���いる。この「装飾」活性は、おそらくはアミドトランスフェラーゼに起因する。
【０１９２】
ａ．２．リモシジンＣ（ＩＩＩａ）およびＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）の化学構造の解明
新規テトラエンのリモシジンＣ（ＩＩＩａ）およびＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）を解明することを目的として、逆相シリカＣ８カラムを使用し（実験方法を参照）、それら双方をストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−７６８／７４３Ｂの発酵培養物から精製した。
【０１９３】
化合物リモシジンＣ（ＩＩＩａ）を、高分解能（［Ｍ＋Ｈ］において観察値７３８．４４２２１７、計算値７３８．４４２３００）を用い、分子式Ｃ３９Ｈ６３ＮＯ１２に対応するｍ／ｚ７３８（［Ｍ＋Ｈ］）および７６０（［Ｍ＋Ｎａ］＋）で疑似分子イオンの存在を示す黄色粉末として得た。この化合物は、リモシジン（ＩＩａ）（Ｃ３９Ｈ６１ＮＯ１４）と比較し、酸素の２個の原子の欠損およびリモシジンＣ（ＩＩＩａ）への２個の陽子の付加に対応し、これは正式には炭素Ｃ−１４内のカルボキシル基とメチル基残留物質との置換として解釈されうる。
【０１９４】
１Ｈ−ＮＭＲのスペクトルは、リモシジン（ＩＩａ）のスペクトルと酷似し、ｓｐ２の範囲内の３つのシグナル、すなわちδ６．３０で二重線二重線（ｄｄ）、δ６．０５〜６．１８で多重線、およびδ５．９０で第２のｄｄを示した（表２）。糖の陽子がδ３．２５〜４．６２の範囲内で見られた。スペクトル１Ｈ−ＮＭＲの脂肪族領域はまた、特にδ１．３０〜２．５０の範囲内の５つの複雑な多重線パターンに関し、リモシジン（ＩＩａ）のそれとの類似性を示した。リモシジン（ＩＩａ）などの３つではなく４つのメチル基が、２つの三重線および２つの二重線としてそれぞれδ０．９０、０．９５および１．２６、１．００で見られた。リモシジン（ＩＩａ）とリモシジンＣ（ＩＩＩａ）の間の最大の差異はメチル−二重線δ１．００の存在であった。それはＨと記されたδ１．２２（δＣ４３．８）で１４−Ｈを有するＣＯＳＹスペクトル内のＨクロスを示す。
【０１９５】
スペクトル１３Ｃ−ＮＭＲでは、分子式で規定されるように、リモシジン（ＩＩａ）などで３９炭素シグナルが示された。これと陽子スペクトルの類似性により、リモシジン（ＩＩａ）およびリモシジンＣ（ＩＩＩａ）が糖マイコサミンを含む場合と同じ炭素骨格を有し、リモシジン（ＩＩａ）内の３つではなく２つのカルボニル基の存在が唯一の差異であると結論づけることができた。シグナルδ２１１．６および１７４．５はそれぞれケトン基およびラクトンのカルボニル基に起因していた。１７４．５でのカルボニルに対するδ５．０３（Ｃ−２７）での陽子の共役ＨＭＢＣ３Ｊではラクトンが確認され、それ故にリモシジンＣ（ＩＩＩａ）は１４−デカルボキシ−１４−メチル−リモシジン（Ｉ−１ａ）である必要がある。
【０１９６】
ＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）の黄色粉末はメタノールに容易に溶解できた。このいずれの場合でも、１Ｈ−ＮＭＲのスペクトルはリモシジンＣ（ＩＩＩａ）およびＣＥ−１０８（ＩＩｂ）のスペクトルとの類似性を示した。脂肪族領域は、ＣＥ−１０８（ＩＩｂ）などで、３つのメチル−シグナルではなく、δ１．２５、１．２３および０．９９で３つの二重線および０．９０で三重線を伴う４つのメチル基のシグナルを示した。質量スペクトル（＋）−ＥＳＩ  ＮＳでは、ＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）の分子量がｍ／ｚ７０９であり、それは高分解能（［Ｍ＋Ｈ］＋において観察値７１０．４１０９０５、計算値７１０．４１１０００）を用いると分子式Ｃ３７Ｈ５９ＮＯ１２に対応すると判定された。磁気共鳴スペクトル１３Ｃ−ＮＭＲでは、分子式で規定されるように、ＣＥ−１０８（ＩＩｂ）などで３７炭素シグナルの存在が確認された。ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）における磁気共鳴スペクトル１３Ｃ−ＮＭＲとの比較により、δ２１１．３および１７４．３で２通りのみのカルボニルのシグナルの存在が示され、これらは再びケトン基およびラクトンのカルボニル基に起因していた。この場合における最大の差異は、ＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）においてδ１７９．３でのカルボニル酸の非存在、および１Ｈ−ＮＭＲのスペクトルにおけるδ０．９９でのメチル−二重線に属する１３．７での追加のメチル−シグナルの存在であった。ＣＥ−１０８（ＩＩｂ）およびＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）に関するデータを注意深く比較することで、このテトラエンにおいても、ＣＥ−１０８（ＩＩｂ）のＣ−１４のカルボキシル基がメチル基と置換されることが明示された。それによりＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）が誘導体１４−デカルボキシ−メチル−ＣＥ−１０８であると同定される。
【０１９７】
新規のアミド化ポリエン化合物の生物活性
ペニシリウム・クリソゲナム、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・ニガー、カンジダ・クルセイおよびクリプトコッカス・ネオフォルマンスに対する新規のカルボキシル化されていないテトラエンのリモシジンＣ（ＩＩＩａ）およびＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）の抗真菌活性を測定し、天然テトラエンのリモシジン（ＩＩａ）およびＣＥ−１０８（ＩＩｂ）の抗真菌活性と比較した。実施例１に記載のように測定される２種の中間物のリモシジンＣ（ＩＩＩａ）およびＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）の抗真菌活性は、最終産物のリモシジン（ＩＩａ）およびＣＥ−１０８（ＩＩｂ）のそれとは有意に異なることはない。
【０１９８】
新規テトラエンの他の薬理学的特性が異なるか否かを測定するため、溶血活性試験を行い、親化合物の場合と比較した。これらの試験では、ヒト赤血球を用いた。結果を表４に示す。リモシジン（ＩＩａ）とリモシジンＣ（ＩＩＩａ）の抗真菌活性は類似していたが、（溶血活性の観点で測定した）それらの毒性はリモシジンＣ（ＩＩＩａ）ではリモシジン（ＩＩａ）の場合よりも２．５〜５倍低かったことを指摘することができる。溶血試験においては６００ｎモルのＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）に至るまで増加量分を用い、検出した溶血は２０％未満であり、これはカルボキシル化していないテトラエンＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）の毒性が他のテトラエンのいずれの場合よりも低かったことを示唆している。これは薬理学的特性において興味深い改善があったことを示唆する。
【０１９９】
表２：リモシジン (IIa)、リモシジン C (IIIa)、CE-108 (IIb)およびCE-108C (IIIb)の溶血活性比較。各テトラエンへの適用量はナノモルで記載される(左列)。対応する溶血活性の値は溶血全体に対する百分率で記載される。
【表４】
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【０２００】
ｂ）アミドトランスフェラーゼ活性の基質に関する判定
ｂ．１．遺伝子ｒｉｍＥの破壊
「装飾」活性の基質または推定されるアミドトランスフェラーゼが何であるかを判定することを目的として、糖マイコサミンのマクロラクトン環への取り込みを担うグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｒｉｍＥの破壊を進めた。
【０２０１】
遺伝子ｒｉｍＥが遺伝子ｒｉｍＦ、ｒｉｍＧ、ｒｉｍＨおよびｒｉｍＡも収容する約９ｋｂのポリシストロン内で転写されるという事実があるため（セコ  Ｅ．Ｍ．（Ｓｅｃｏ  Ｅ．Ｍ．）ら、２００４年、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１１：３５７−３６６頁）（図４Ａ）、染色体内の下流に位置する遺伝子上の極性効果を阻止する必要があった。破壊をもたらすため、強力なプロモーターｅｒｍＥｐ＊（キーザー（Ｋｉｅｓｅｒ）ら、２０００年、先に引用）を、残りの伝令ＲＮＡの転写を可能にするための正確な方向で、（ジェンバンク（ＧｅｎｅＢａｎｋ）ＡＹ４４２２２５内に寄託された配列５６２９〜６４８４を調整する）遺伝子ｒｉｍＥ内部の０．８ｋｐｂ  ＳａｌＩの断片の前にクローニングした。得られた構築体を、表１に記載の様々なステップでファージＰＭ１にクローニングした。得られた組換え相（ＰＭ１−７０２Ｂ）を、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８の胞子を感染させ、リソジーンのストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−７０２Ｂの単離を可能にするために用いた。染色体への正確な統合をサザン・ブロッティングにより確認した。ＨＰＬＣおよび質量スペクトル分析による発酵培養物の分析により、ＣＥ−１０８およびリモシジンのアグリコン、さらにリモシジンＣ（ＩＩＩａ）およびＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）のアグリコンに対応する４種の主要化合物の存在を判定した（図５参照）。アミドのリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）およびＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）を野生型ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８内への形成を誘発可能なプラスミドｐＳＭ７４３Ｂがコンジュゲーションによりこのリソジーンに導入される場合、アミド化アグリコンの形成が全く認められなかった。データは、まるで有望なアミドトランスフェラーゼ活性の基質が実際にはリモシジン（ＩＩａ）およびＣＥ−１０８（ＩＩｂ）であってそれらのアグリコンではないかのように解釈される。
【０２０２】
２．リモシジン（ＩＩａ）およびＣＥ−１０８（ＩＩｂ）の「インビトロ」アミド化試験
上に提示したあらゆるデータによると、リモシジン（ＩＩａ）およびＣＥ−１０８（ＩＩｂ）のそれらの対応するアミドへの変換が、基質として十分に形成されたテトラエンのリモシジン（ＩＩａ）とＣＥ−１０８（ＩＩｂ）の双方を用いるアミドトランスフェラーゼの「装飾」活性によって行われるようである。この活性の存在を判定するため、基質としてＨＰＬＣで精製したＣＥ−１０８（ＩＩｂ）およびリモシジン（ＩＩａ）を用いてアミドトランスフェラーゼ活性試験を行った。試験実施を目的として、無細胞抽出液を得るため、実験方法に記載のように、実施例１に引用したストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４株を液体培地ＳＹＭ２内で３日間成長させた。基質、酵素共同因子、アミド基の供与体、反応における最適ｐＨといった異なるパラメータを初期に試験した。反応生成物をＨＰＬＣにより分析し、酵素試験において硫酸アンモニウムを有する様々な画分の沈殿物を用いて評価を最適化し、その分野での生化学研究における標準使用条件に従って評価を行った。最後に、アミドトランスフェラーゼ活性の評価において見出されたほとんどの最適条件が実験方法に関する項にて記載されている。ＣＥ−１０８（ＩＩｂ）およびリモシジン（ＩＩａ）がそれぞれ、それらの対応するアミドのリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）およびＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）に明らかに変換されたことが観察された（図６Ａおよび６Ｂを参照）。観察された化合物の正体を質量スペクトル分析により判定した。データにより、「装飾」活性が実際にはアミド基の供与体としてグルタミンを用いるＡＴＰ依存性のアミドトランスフェラーゼ活性であると判定できた。活性は、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４［リモシジン（ＩＩａ）、リモシジンＢ（Ｉ−１ａ）、ＣＥ−１０８（ＩＩｂ）およびＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）の産生株］の抽出物中だけでなくストレプトマイセス属ＲＧＵ５．３［ピマリシン（ＩＶａ）およびＡＢ−４００（ＩＶｂ）の産生株］の抽出物中に検出可能であると考えられ、ここでのアミドトランスフェラーゼ活性はストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４の活性に類似することが判明した。
【０２０３】
アミドトランスフェラーゼ活性における基質特異性を判定するため、アンフォテリシンＢおよびピマリシン（ＩＶａ）などの異種基質に対し、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４の無細胞抽出液もまた試験したが、満足すべき結果は基質としてピマリシン（ＩＶａ）を用いた場合のみであった。図６Ｃに示すように、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４の無細胞抽出液は、ピマリシン（ＩＶａ）をその対応するアミドＡＢ−４００（ＩＶｂ）に変換する能力を有した。にもかかわらず、基質としてリモシジン（ＩＩａ）、ＣＥ−１０８（ＩＩｂ）またはアンフォテリシンＢを用い、ストレプトマイセス属ＲＧＵ５．３の無細胞抽出液のアミドトランスフェラーゼ活性を検出することができず、アミド化可能な唯一の化合物はピマリシン（ＩＶａ）であった（図７）。データにより、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４のアミドトランスフェラーゼ活性がストレプトマイセス属ＲＧＵ５．３よりも広範囲の基質認識を有すると考えることが可能である。
【０２０４】
生体物質の寄託
プラスミドｐＳＭ７８４が導入されている野生株ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８に対応する微生物ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４の培養物を、ドイチェ・サムルング・フォン・ミクロオーガニズメン・ウント・ツェルクルトゥーレン（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）（ＤＳＭＺ）、ブラウンシュヴァイク（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）、ドイツ、２００５年３月１４日に寄託した。その登録番号はＤＳＭ１７１８７である。株は、リモシジン（ＩＩａ）およびＣＥ−１０８（ＩＩｂ）を生成するための完全な経路を含み、かつ対応するアミド化物のリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）およびＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）をさらに生成可能である。
【０２０５】
微生物ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−７６８／７４３Ｂの培養物を、ドイチェ・サムルング・フォン・ミクロオーガニズメン・ウント・ツェルクルトゥーレン（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）、ブラウンシュヴァイク（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）、ドイツ、２００５年７月１８日に寄託した。その登録番号はＤＳＭ１７４８２である。この株は、メチル化ポリエンのリモシジンＣ（ＩＩＩａ）およびＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）の産生株である。
【０２０６】
ストレプトマイセス属の遺伝的処理のための慣習的に使用した技術およびそれらの公的なアクセスのための遺伝子／プロモーターの寄託により、本発明に記載の構築体または他の機能的等価物の生成できる。用いられるベクターは公用であり、ストレプトマイセスを用いる研究が常になされている研究所で通常用いられる。
【０２０７】
本発明に記載の遺伝子をコードしているＤＮＡの配列は、寄託されており、登録番号ＡＹ４４２２２５下のジェンバンク（ＧｅｎｅＢａｎｋ）データベースにおいて公にアクセス可能である。
【図面の簡単な説明】
【０２０８】
【図１】組換えプラスミドｐＳＭ７４３Ｂ（ｐＩＪ９２２内に導入される遺伝子ｒｉｍＡ）［図１Ａ］およびｐＳＭ７８４（ｐＩＪ９４１内に導入される遺伝子ｅｒｍＥ）［図１Ｂ］の物理地図を図示したものを示す。これらの図１Ａおよび１Ｂでは、ｘｙｓＡｐ：プロモーターｚｙｓＡ；ｒｉｍＡ：ＣＥ−１０８およびリモシジンの生合成経路に関与するＰＫＳ  Ｔｙｐｅ  Ｉ；Ｔｉ：メチレノマイシン耐性遺伝子のターミネーター；ｅｒｍＥ、ｔｓｒおよびｈｙｇ：それぞれエリスロマイシン、チオストレプトンおよびハイグロマイシンに対する耐性遺伝子；ｒｉｍＩ＊：そのＮ−末端が切断されたｒｉｍＩ。図１Ｃは、遺伝子組換え株ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７４３Ｂの発酵培養物のクロマトグラフィー特性（ＨＰＬＣ）を示す。該図１Ｃでは、番号１〜４は、１：ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）；２：ＣＥ−１０８（ＩＩｂ）；３：リモシジンＢ（Ｉ−１ａ）および４：リモシジン（ＩＩａ）を示す。
【図２】ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７４３Ｂによって生成される４種のテトラエンの抗真菌活性を示す。該図では、Ａ：リモシジン（ＩＩａ）、Ｂ：リモシジンＢ（Ｉ−１ａ）、Ｃ：ＣＥ−１０８（ＩＩｂ）、Ｄ：ＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）。各耐性記録上に見られる番号は、ナノモルで表現される各ポリエンの適用量を示す。標的生物はペニシリウム・クリソゲナム、カンジダ・クルセイ、アスペルギルス・ニガー、カンジダ・アルビカンスおよびクリプトコッカス・ネオフォルマンスであった（表１、実施例１を参照）。
【図３】ストレプトマイセス属ＲＧＵ５．３から単離されたポリエンのピマリシン（ＩＶａ）およびＡＢ−４００（ＩＶｂ）の生物活性を示す。それは、炭素源として酢酸塩（図３Ａ）またはグルコース（図３Ｂ）を有する培地内で成長したストレプトマイセス属ＲＧＵ５．３に由来する発酵培養物のＨＰＬＣ分析（クロマトグラム）を示す。図３Ｃは、ペニシリウム・クリソゲナムに対するピマリシン（ＩＶａ）およびＡＢ−４００（ＩＶｂ）の抗真菌活性を図示し、適用されたポリエンの試料は、（１）市販のピマリシン（カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）５２７９９６２）；（２）グルコース培地内で成長したストレプトマイセス属ＲＧＵ５．３の発酵培養物の全抽出物；（３）ストレプトマイセス属ＲＧＵ５．３に由来する精製されたＡＢ−４００；および（４）ストレプトマイセス属ＲＧＵ５．３に由来するピマリシンであり、各試験において全部で２００ｎｇが添加された。図３Ｄは、ピマリシン（カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）５２７９６２、純度９８．８％）およびＡＢ−４００（実験方法にて示される、ＨＰＬＣによる精製）における溶血活性を示し、各ポリエンの値はナノモルで表され（左列）、対応する溶血活性は溶血全体の百分率として示される（実験方法における文章を参照）。
【図４】パネルＡではＤＮＡの異なる断片を用いて行われるエンドヌクレアーゼＳ１に関する保護アッセイによって推定された、染色体のこの特異的領域内での遺伝子転写について図示する（セコ（Ｓｅｃｏ）ら、２００４年、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１１：３５７−３６６頁）。転写産物は、遺伝子ｒｉｍＥ、ｒｉｍＦ、ｒｉｍＧ、ｒｉｍＨおよびｒｉｍＡのポリシストロンに対応する、途切れた矢印によって示される。遺伝子ｒｉｍＧおよびｒｉｍＥの不活化挿入について推定された転写産物は、灰色の線で示され、括弧内の数字は登録番号ＡＹ４４２２２５下に寄託されたＤＮＡ配列に対応する。この図のパネルＢは、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−７６８／７４３Ｂの発酵培養物に対応するクロマトグラムを示し、ここでａおよびｂはそれぞれＣＥ−１０８Ｃ（ＩＩＩｂ）およびリモシジンＣ（ＩＩＩａ）に対応する。
【図５】左側パネルではストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８：：ＰＭ１−７０２Ｂ／７４３Ｂの発酵培養物のクロマトグラムを示す。クロマトグラムの右側は、クロマトグラフにおいて検出された化合物から制定された化学構造である。化学構造は質量分光分析に基づいて推定された。
【図６】ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４の無細胞抽出液を用いて行われた、インビトロでのアミドトランスフェラーゼ試験のＨＰＬＣ分析を示す。左列および右列のクロマトグラムは、それぞれ０分および６０分のインキュベーション時間に対する反応を示す。ピークは、ａ．ＣＥ−１０８Ｂ；ｂ．ＣＥ−１０８；ｃ．リモシジンＢ；ｄ．リモシジン；ｅ．ピマリシン；ｆ．ＡＢ−４００である。  Ａ．ＣＥ−１０８（ＩＩｂ）のそのアミドのＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）への酵素変換。ピークａおよびアスターリスクを付記したピークはそれぞれＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）およびリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）に対応し、ここでは無細胞抽出液から完全に除去できていない。  Ｂ．リモシジン（ＩＩａ）のそのアミドのリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）への酵素変換。ピークｃおよびアスターリスクを付記したピークはそれぞれリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）およびＣＥ−１０８Ｂ（Ｉ−１ｂ）に対応し、それらは無細胞抽出液中に存在する。  Ｃ．ピマリシン（ＩＶａ）のそのアミドＡＢ−４００（ＩＶｂ）への酵素変換。アスターリスクを付記したピークは無細胞抽出液中に存在するリモシジンＢ（Ｉ−１ａ）に対応する。異種基質（ピマリシン）をその対応するアミド（ＡＢ−４００）に変換可能な、ストレプトマイセス・ディアスタティカス変種１０８／７８４の無細胞抽出液中に存在するアミドトランスフェラーゼによる基質認識に対する緩やかな特異性に留意されたい。
【図７】ストレプトマイセス属ＲＧＵ５．３の無細胞抽出液を用いて行われた、ピマリシン（ＩＶａ）についてのインビトロでのアミド化試験のＨＰＬＣ分析を示す。左列および右列のクロマトグラムは、それぞれ０分および６０分のインキュベーション時間に対する反応を示す。時間ゼロで示されるピークａは、ストレプトマイセス属ＲＧＵ５．３の無細胞抽出液中に存在するＡＢ−４００（ＩＶｂ）に対応し、ここでは完全に除去できていない。ピマリシン（ＩＶａ）（ピークａ）のその対応するアミドＡＢ−４００（ＩＶｂ）（ピークｂ）への変換が明白であることに留意されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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