(57)【要約】本発明はヒトの急性白血病及びリンパ芽球性リンパ腫の細胞上で発現するＣＤ４３抗原決定基及びその用途に関するものである。より詳細には、本発明はヒトの急性白血病及びリンパ芽球性リンパ腫の細胞上では発現するが、成熟した造血細胞及び造血幹細胞上では発現しないＣＤ４３抗原決定基、そして前記ＣＤ４３抗原決定基を急性白血病及びリンパ芽球性リンパ腫の診断及び治療に適用することに関するものである。
2008544956.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤ４３抗原決定基として単離されたポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドのアミノ酸配列個数が１００個未満であることを特徴とする請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドのアミノ酸配列個数が５０個未満であることを特徴とする請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
前記ＣＤ４３抗原決定基が胸腺細胞、骨髄細胞の造血前駆体サブセット、急性白血病細胞、母細胞危機が発生した慢性白血病の母細胞、及びリンパ芽球性リンパ腫細胞の表面に特異的に発現することを特徴とする、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
前記ＣＤ４３抗原決定基が配列番号２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤ４３抗原決定基に特異的に結合する抗体または抗体の断片。
【請求項７】
配列番号１のアミノ酸配列で構成されるペプチドに結合する抗体または抗体の断片。
【請求項８】
前記ＣＤ４３抗原決定基が胸腺細胞、骨髄細胞の造血前駆体サブセット、急性白血病細胞、母細胞危機が発生した慢性白血病の母細胞、及びリンパ芽球性リンパ腫細胞の表面に特異的に発現するが、成熟造血細胞、造血幹細胞、及び非造血細胞では発現しないことを特徴とする、請求項６または７に記載の抗体または抗体の断片。
【請求項９】
前記抗体が配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合することを特徴とする、請求項６または７に記載の抗体または抗体の断片。
【請求項１０】
前記抗体が配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドで動物を免疫化し、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体をスクリーニングして製造されることを特徴とする、請求項６または７に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１１】
前記抗体がポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項６または７に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１２】
前記抗体がヒトのモノクローナル抗体または動物のモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１１に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１３】
前記抗体がキメラ抗体またはヒト化抗体であることを特徴とする、請求項６または７に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１４】
前記抗体または抗体断片が放射線同位元素、蛍光物質、発光物質、酵素及び染色物質からなる群より選択される化合物で標識されたことを特徴とする、請求項６または７に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１５】
前記抗体または抗体断片が、放射線同位元素、毒素化合物、毒素蛋白質及び抗癌剤からなる群より選択される毒性物質と結合されたものであることを特徴とする、請求項６または７に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１６】
前記抗体または抗体断片が毒性物質と結合されて融合蛋白質を形成することを特徴とする、請求項１５に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１７】
請求項６または７に記載の抗体または抗体断片を生産する細胞株。
【請求項１８】
請求項６または７に記載のＣＤ４３に対する抗体と生物学的試料中の白血病細胞を反応させ、前記抗−ＣＤ４３抗体に対する陽性免疫反応を検出することを含む急性白血病診断方法。
【請求項１９】
前記陽性免疫反応の検出が酵素反応、蛍光、発光または放射線を検出して判断することを特徴とする、請求項１８に記載の急性白血病診断方法。
【請求項２０】
請求項６または７に記載のＣＤ４３に対する抗体と生物学的試料中の白血病細胞を反応させ、前記抗体に対する陽性免疫反応を検出することを含む、母細胞危機が発生した慢性白血病の診断方法。
【請求項２１】
請求項６または７に記載のＣＤ４３に対する抗体と生物学的試料中のリンパ腫細胞を反応させ、前記抗体に対する陽性免疫反応を検出することを含む、リンパ芽球性リンパ腫の診断方法。
【請求項２２】
請求項６または７に記載の抗−ＣＤ４３抗体を治療に有効な量で投与することを含む急性白血病治療方法。
【請求項２３】
前記抗−ＣＤ４３抗体が放射線同位元素、毒素化合物、毒素蛋白質及び抗癌剤からなる群より選択される毒性物質と結合されたものであることを特徴とする、請求項２２に記載の急性白血病治療方法。
【請求項２４】
請求項６または７に記載の抗−ＣＤ４３抗体を治療に有効な量で投与することを含む、母細胞危機が発生した慢性白血病の治療方法。
【請求項２５】
請求項６または７に記載の抗−ＣＤ４３抗体を治療に有効な量で投与することを含むリンパ芽球性リンパ腫治療方法。
【請求項２６】
請求項６または７に記載の抗−ＣＤ４３抗体と薬学的に許容可能な担体とを含む急性白血病治療用薬学組成物。
【請求項２７】
請求項６または７に記載の抗−ＣＤ４３抗体と薬学的に許容可能な担体とを含む母細胞危機が発生した慢性白血病治療用薬学組成物。
【請求項２８】
請求項６または７に記載の抗−ＣＤ４３抗体と薬学的に許容可能な担体とを含むリンパ芽球性リンパ腫治療用薬学組成物。
【請求項２９】
請求項６または７に記載の抗−ＣＤ４３抗体を含む白血病診断用キット。
【請求項３０】
請求項６または７に記載の抗−ＣＤ４３抗体を含むリンパ腫診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒトの急性白血病及びリンパ芽球性リンパ腫の細胞上で発現するＣＤ４３抗原決定基及びその用途に関するものである。特に、本発明はヒトの急性白血病及びリンパ芽球性リンパ腫の細胞上では発現するが、成熟した造血細胞及び造血幹細胞上では発現しないＣＤ４３抗原決定基(epitope)、そして前記ＣＤ４３抗原決定基を急性白血病及びリンパ芽球性リンパ腫の診断及び治療に適用することに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
シアロフォリン(sialophorin)またはレウコシアリン(leukosialin)とも呼ばれるＣＤ４３は赤血球を除いた大部分の造血細胞上で発現する細胞−表面分子である。ヒトのＣＤ４３は２３５個のアミノ酸からなるムチン−類似細胞外領域、２３個のアミノ酸からなる細胞膜領域及び１２３個のアミノ酸からなる細胞内領域を有し、それらは全て１つのエクソンによって暗号化される（非特許文献１９(Pallantら, Proc Nall Acad Sci USA. 1989,86:1328-32);非特許文献２０(Shelleyら, Proc Natl Acad Sci USA 1989, 86:2819-23)）。前記細胞外領域には４６個のセリン残基と４７個のスレオニン残基が豊富に存在し、これらの残基は大部分約８０個の酸素基−結合された糖鎖(O-linked carbohydrate chain)を有し、さらに１個の窒素基−結合された糖鎖(N-linked carbohydrate)を有している。このような多糖の構造は細胞に応じて多様である（非特許文献２１(Carlssonら, JBiol Chem. 1986, 261:12787-95)）。
【０００３】
ヒトのＣＤ４３の遺伝子は２個のエクソンと、１個のイントロン（intron:３７８ｂｐ）で構成され、遺伝子全体翻訳産物(translation product)は全て２番目エクソンによって暗号化される（非特許文献２２(Shelleyら, Biochem J. 1990, 270:569-76)）。ＣＤ４３は赤血球を除いた大部分の白血球、血小板及び造血幹細胞上に限定された特異な白血球−タイプマーカとして考えられてきた（非特許文献２３(Remold-O'Donnellら, Blood. 1987, 70:104-9);非特許文献２４(Fukuda、Glycobiology. 1991, 1:347-56)）。前記ＣＤ４３はヒトの子宮頸部癌細胞株（ＣａＳＫＩ）、ヒトの肺癌細胞株（例：Ａ５４９）、ヒトの乳房腺癌種細胞株（例：ＭＣＦ７）、ヒトの繊維肉腫細胞株（例：ＨＴ１０８０）及びヒトの結腸腺癌種細胞株（例：ＣＯＬＯ２０５、ＨＴ２９、Ｃａｃｏ−２、ＤＬＤ−１及びＳＷ４８０）のような非造血細胞に由来するヒトの腫瘍細胞株で発現することが知られており（非特許文献２５(Fernandez-Rodriguezら, Tumour Biol. 2002, 23:193-201)）、またヒトの結腸癌組織でも発現することが報告された（非特許文献２６(Sikutら, Int J Cancer. 1999, 82:52-8);非特許文献２７(Jungら, Korean J Pathol. 38:8-14)）。
【０００４】
生合成研究を通じて、ＣＤ４３の前駆体は約４０ｋＤａ大きさ（１個のＮ−グリカン(glycan)を含む）を有し、電気泳動時に５４ｋＤａの分子量を示すことが確認された。前記ＣＤ４３前駆体は多様な糖化過程によって１１５ｋＤａから２００ｋＤａ以上の大きさを有する成熟した糖化分子に転換される。胸腺細胞、ＣＤ４+Ｔリンパ球及び単核球は１１５ｋＤａ以上の亜型(isoform)を発現するが、１３０ｋＤａ大きさの亜型は大部分活性化したＣＤ４+Ｔ細胞で発現する（非特許文献２８(Rosensteinら, Immunol Res. 1999, 20:89-99)）。つまり、１個以上の亜型は同一な細胞の表面で共に発現することができる。また、十分に制御された翻訳後Ｏ−糖分解パターンは、その結果としてこのような特徴的な分子量を有する亜型を招き、これによって前記亜型は細胞に応じて特異的に発現する。特に、胸腺細胞及びＴ細胞で発現するコア２β１、６Ｎ−アセチルガラトサミン転移酵素（Ｃ２ＧｎＴ）は１３０ｋＤａ大きさのＣＤ４３亜型の発現を誘導する（非特許文献２９(Pillerら, JBiol Chem.1988, 263:15146-50））。
【０００５】
現在まで１７個以上の抗−ヒトのＣＤ４３抗体が知られており、これら抗体の大部分は細胞外領域に存在する糖抗原決定基と反応し、通常の抗−ＣＤ４３抗体は成熟した造血細胞上で発現するＣＤ４３抗原を認識する（表１）。したがって、前記抗体は白血病またはリンパ腫細胞を検出したり除去したりするのには効果的でない。
【表１】
2008544956.tif 000003
【特許文献１】Cabilly, 米国特許第4,816,567号
【非特許文献１】Foxら, J Immunol. 1983, 131:762-7
【非特許文献２】Saitohら, Blood. 1991, 77:1491-9
【非特許文献３】Remold-O’Donnellら, Blood. 1987, 70:104-9
【非特許文献４】Borche etら, Eur Jlmmunol. 1987, 17:1523-6
【非特許文献５】Stefanovaら, Folia Biol (Praha). 1988, 34:255-65
【非特許文献６】Alvaradoら, Eur J Immunol. 1995, 25:1051-5
【非特許文献７】Strossら, J Clin Pathol. 1989, 42:953-61
【非特許文献８】Horejsiら, 1997, In Kishimoto T, ら, Leucocyte Typing, Vol. VI: White Cell Differentiation Antigens 494. Garland, New York and London
【非特許文献９】Tkaczukら, Tissue Antigens. 1999, 54:1-15
【非特許文献１０】Sikutら, Int J Cancer. 1999, 82:52-8; 11. Mukasaら, Int Immunol. 1999, 11:259-68
【非特許文献１１】Shaw、ら, J. Immun., 138:4534(1987), Sun, LK., ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:214218(1987)
【非特許文献１２】Borrebaeck, C. A., Antibody Engineering:A Practical Guide, W. H.Freeman and Company, New York, 1992
【非特許文献１３】Queenら(1989)Proc. Nat'l Acad. Sci.USA86:10029-10033
【非特許文献１４】ANTIBODY ENGINEERING:A PRACTICAL APPROACH(Oxford University Press 1996
【非特許文献１５】Koeler & Milstein Nature, 1975, 256, 495-497
【非特許文献１６】Haraguchiら, Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.1994, 91:10455-9
【非特許文献１７】Davisら, Methods in Molecular Biology、Elsevier Science、New York 1986:285-289
【非特許文献１８】Wysockiら, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1978, 75:2844-8
【非特許文献１９】Pallantら, Proc Nall Acad Sci USA. 1989,86:1328-32
【非特許文献２０】Shelleyら, Proc Natl Acad Sci USA 1989, 86:2819-23
【非特許文献２１】Carlssonら, JBiol Chem. 1986, 261:12787-95
【非特許文献２２】Shelleyら, Biochem J. 1990, 270:569-76
【非特許文献２３】Remold-O'Donnellら, Blood. 1987, 70:104-9
【非特許文献２４】Fukuda、Glycobiology. 1991, 1:347-56
【非特許文献２５】Fernandez-Rodriguezら, Tumour Biol. 2002, 23:193-201
【非特許文献２６】Sikutら, Int J Cancer. 1999, 82:52-8
【非特許文献２７】Jungら, Korean J Pathol. 38:8-14
【非特許文献２８】Rosensteinら, Immunol Res. 1999, 20:89-99
【非特許文献２９】Pillerら, JBiol Chem.1988, 263:15146-50
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明の目的は、成熟した造血細胞及び造血幹細胞上では発現しないが、ヒトの急性白血病、母細胞危機(blast crisis)が発生した慢性白血病及びリンパ芽球性リンパ腫細胞上で特異的に発現するリンパ芽球性リンパ腫細胞関連ＣＤ４３抗原決定基を提供することにある。したがって、本発明は配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤ４３抗原決定基の単離されたポリペプチドを提供する。
【０００７】
本発明の他の目的は、ＣＤ４３抗原決定基を認識する物質を提供することにある。好ましくは、本発明は配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤ４３抗原決定基に特異的に結合する抗体またはその断片を提供することにある。
【０００８】
本発明の第３目的は、前記ＣＤ４３抗原決定基を認識する物質を製造する方法を提供することにある。
【０００９】
本発明の第４目的は、急性白血病、母細胞危機が発生した慢性白血病及びリンパ芽球性リンパ腫の診断用物質を提供することにある。
【００１０】
本発明の第５目的は、急性白血病、母細胞危機が発生した慢性白血病及びリンパ芽球性リンパ腫を診断する方法を提供することにある。したがって、本発明は生物試料である白血病細胞と抗−ＣＤ４３抗原決定基に対する抗体を使用して前記抗−ＣＤ４３抗原決定基に対する抗体の陽性反応を検出することを含む急性白血病を診断する方法を提供する。本発明は生物試料である白血病細胞と抗−ＣＤ４３抗原決定基に対する抗体を培養して前記抗−ＣＤ４３抗原決定基に対する抗体の陽性反応を検出することを含む母細胞危機が発生した慢性白血病を診断する方法を提供する。本発明は生物試料であるリンパ腫細胞と抗−ＣＤ４３抗原決定基に対する抗体を培養して前記抗−ＣＤ４３抗原決定基に対する抗体の陽性反応を検出することを含むリンパ芽球性リンパ腫を診断する方法を提供する。
【００１１】
本発明の第６目的は、白血病、母細胞危機が発生した慢性白血病及びリンパ芽球性リンパ腫の腫瘍細胞を死滅させる薬学組成物を提供することにある。
【００１２】
本発明の第７目的は、本発明の診断用物質を使用する診断方法を提供することにある。
【００１３】
追加的に、本発明は本発明による治療用物質を使用する治療方法を提供する。
【００１４】
実施例の詳細な説明
本発明は急性白血病、母細胞危機が発生した慢性白血病及びリンパ芽球性リンパ腫細胞上では発現するが、成熟した造血細胞及び造血幹細胞上では発現しないＣＤ４３抗原決定基を提供する。本発明のＣＤ４３は好ましくはヒトのＣＤ４３であり、その配列順序はＮＣＢＩ遺伝子バンク・アクセス番号Ｍ６１８２７に登載されている。ＣＤ４３抗原決定基は配列番号１のアミノ酸配列（以後ＥＰ６）を含むポリペプチドであり、好ましくは配列番号２のアミノ酸配列（以後ＥＰ９） を含むポリペプチドである。
【００１５】
ＥＰ６:Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ（配列番号１）
ＥＰ９:Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ（配列番号２）
好ましい実施例では、本発明はアミノ酸配列長さが２００個未満のポリペプチドを提供し、更に好ましくはアミノ酸配列長さが１００個未満、更に好ましくは配列長さが５０個未満の配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【００１６】
また、本発明は配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を必須的に含むポリペプチドを提供する。本発明はまた、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【００１７】
ＣＤ４３抗原決定基（ＥＰ６及びＥＰ９）はヒトの組織から精製したり、化学的に合成したり、または遺伝工学技術で生産することができる。
【００１８】
また、本発明はＣＤ４３抗原決定基を認識する物質を提供する。前記物質は抗体、抗体断片、リガンドからなる群より選択することができ、好ましく、前記抗体はモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体からなる群より選択することができ、さらに好ましくは、前記抗体はヒトおよび動物に由来するものであり得る。
【００１９】
ＣＤ４３抗体は抗原を認識する部位、つまり、重鎖可変部位（ＶＨ）及び軽鎖可変部位（ＶＬ）を含むので、抗原を優先的に認識することができる。また、本発明はＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ及びＦｖなどの抗体断片を含む。特に、Ｆｖは前記重鎖可変部位（ＶＨ）と軽鎖可変部位（ＶＬ）をリンカーペプチドで連結して作った単鎖ポリペプチドの抗体断片（いわゆる単鎖Ｆｖ）であり、熱安定性を増加させたものである。
【００２０】
本発明は、本発明のＣＤ４３抗原決定基を認識するキメラ抗体をさらに提供する。本発明で“キメラ抗体”とは１つの種に由来した抗体の可変領域と他の種に由来した抗体の不変領域が結合された抗体またはＣＤＲ移植抗体のことを言う。キメラ抗体は組換えＤＮＡ技術によって製造することができ、例示的な製造方法は非特許文献１１(Shaw、ら, J. Immun., 138:4534(1987), Sun, LK., ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:214218(1987))に記載されている。
【００２１】
公知の他の技術を使用してＣＤＲ移植抗体及びキメラ抗体を製造することができる。“ＣＤＲ”または“相補性決定領域”または“超可変領域”は抗原結合部位を形成するのに寄与する３次元ループ構造を形成する抗体の軽鎖及び重鎖に位置するアミノ酸配列順序のことである。
【００２２】
本明細書で“ＣＤＲ移植抗体”とは、不変ドメイン及び／または可変ドメインにある１つ以上のＣＤＲ配列順序の少なくとも一部が、与えられた抗原または受容体に対して相異なる結合特異性を有する抗体に由来したＣＤＲ配列順序の類似部分で置換されたアミノ酸配列順序を有する抗体のことである。
【００２３】
本明細書で“軽鎖可変領域”及び“重鎖可変領域”とは各抗体の多様な１次アミノ酸配列順序をそれぞれ有する軽鎖及び重鎖のＮ−末端部分に位置した領域またはドメインのことである。前記抗体の可変領域は軽鎖及び重鎖のＮ−末端ドメインを含み、これらが共に折り畳まれて抗体の３次元結合部位を形成する。
【００２４】
類似ＣＤＲ配列順序は受血者抗体または基質上に“移植”される。“提供者”抗体はＣＤＲ配列順序を供給する抗体であり、前記置換された配列順序を受容する抗体は“基質”抗体である。本技術分野の公知の方法と本明細書に記載された技術を併合して、本技術分野の専門家は容易にＣＤＲ移植抗体を製造することができた（非特許文献１２(Borrebaeck, C. A., Antibody Engineering:A Practical Guide, W. H.Freeman and Company, New York, 1992, 参照として含まれる)）。
【００２５】
本発明はまた、本発明のＣＤ４３抗原決定基を認識するヒト化抗体を提供する。本明細書で“ヒト化抗体”とはヒトの抗体だけでなく、非ヒトの（例：マウス）の抗体に由来した配列順序を含む抗体を形成することを言う。前記ヒト化抗体は非ヒトの免疫グロブリンに由来した最小の配列順序を含むキメラ抗体である。一般に、前記ヒト化抗体は少なくとも１つ、一般には２つの可変ドメインを含み、前記超可変ループの全てまたは実質的に全ての領域は非ヒトの免疫グロブリン配列順序に対応し、全てまたは実質的に全てのＦＲ領域はヒトの免疫グロブリン配列順序である。選択的にヒト化抗体はまた少なくとも一部分の免疫グロブリン不変領域（Ｆｃ）、一般にヒトの免疫グロブリンを含む。例えば、特許文献１(Cabilly U.S.Pat.No.4,816,567);非特許文献１３(Queen ら,(1989)Proc. Nat'l Acad. Sci.USA86:10029-10033);及び非特許文献１４(ANTIBODY ENGINEERING:A PRACTICAL APPROACH(Oxford University Press 1996))を参照せよ。
【００２６】
本発明の好ましい一例では、前記抗体は配列番号１のアミノ酸配列で構成されるペプチドに結合する。
【００２７】
前記抗体または抗体の断片は、放射線同位元素、毒素、蛍光物質、クロモゲン及び染色物質からなる群より選択される物質で標識することをさらに含むことができる。前記蛍光物質としてはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）及びビオチンなどを使用することができるが、これに制限されるわけではない。
【００２８】
ＣＤ４３抗体または抗体断片は放射線同位元素、毒素化合物、毒素蛋白質及び抗癌剤からなる群より選択される毒性物質をさらに含むことができる。前記抗体または抗体断片は毒性物質と結合して融合蛋白質を形成する。前記毒素蛋白質としてはリシン、サポリン、ゲロニン、モモルディン、ジフテリア毒素及びシュードモナス毒素を含むことができるが、これに制限されるわけではない。
【００２９】
また、本発明はＣＤ４３抗原決定基を選択的に認識する物質を製造する方法と、前記抗体を生産する細胞株を提供する。前記抗体または抗体断片の製造方法は、（ａ）ＣＤ４３抗原決定基を含むポリペプチド、ＣＤ４３抗原決定基を含む蛋白質、ＣＤ４３抗原決定基を含むＣＤ４３蛋白質断片またはＣＤ４３抗原決定基を発現する細胞を動物に注入して免疫化させる段階、（ｂ）前記免疫化された動物から脾臓細胞を収得する段階、（ｃ）前記脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させる段階、及び（ｄ）ＣＤ４３抗原決定基に対する抗体を生産するハイブリドーマ細胞を選別する段階を含むことができる。前記抗体は生体外で抗体生産細胞を培養したり、前記抗体を生産する細胞を動物に注入したりして分離することができる。前記抗体は培養上澄み液または腹水をイオン交換クロマトグラフィーまたは親和性クロマトグラフィーを利用して精製することができる。
【００３０】
本発明の一例では、本発明は抗−ＣＤ４３抗原決定基に対する抗体またはその断片と薬学的に許容可能な担体とを含む、急性白血病、母細胞危機が発生した慢性白血病及びリンパ芽球性リンパ腫を治療するための薬学的組成物を提供する。
【００３１】
本発明による抗体または抗体断片の投与は薬学的組成物の利用可能な投与方法を使用して行うことができる。例えば、前記抗体は経口または好ましくは非経口で患者に投与することができる。投与剤形は固形、半固形、凍結乾燥粉末または液剤形態、例えば、錠剤、坐薬、丸薬、軟質及び硬質ゼラチンカプセル、粉末、溶液、懸濁液、エアロゾルなどのような形態であってもよく、好ましくは正確な投与量で簡単に投与できる形態であってもよい。
【００３２】
本発明の薬学的組成物は通常の薬学的担体または賦形剤と本発明の抗体を活性成分として含むことができ、さらに、他の医薬剤、薬学的作用剤、担体、賦形剤、希釈剤、ベヒクルまたはこれらの混合物を含むことができる。前記薬学的に許容可能な賦形剤、担体、または添加剤だけでなく、多様な投与方式で製造された薬学的組成物は本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者によく知られている。活性成分の適した投与量は患者の状態に応じて決めることができ、例えば、１日当たり３ｍｇ乃至６,０００ｍｇであり得る。
【００３３】
本発明の一例では、本発明は前記抗体または抗体断片を利用して急性白血病、母細胞危機が発生した慢性白血病またはリンパ芽球性リンパ腫を治療する方法を提供し、前記抗体または抗体断片は抗体、抗体断片、単鎖ポリペプチド抗体断片及びリガンドからなる群より選択される。好ましくは、前記抗体または抗体断片はモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体からなる群より選択されることができ、さらに好ましくはヒトおよび動物に由来したものであってもよい。前記抗体または抗体断片は放射線同位元素、毒素化合物、毒素蛋白質及び抗癌剤からなる群より選択される毒性物質を含むものであってもよい。
【００３４】
さらに、本発明は前記抗体または抗体断片を利用して急性白血病、母細胞危機が発生した慢性白血病、またはリンパ芽球性リンパ腫を診断する方法を提供する。前記方法は（ａ）生物試料である細胞と前記抗体または抗体断片を反応させる段階、及び（ｂ）前記抗体に陽性反応を示す試料を検出する段階を含む。本発明の腫瘍は好ましくは急性白血病、母細胞危機が発生した慢性白血病またはリンパ芽球性リンパ腫である。
【００３５】
また、本発明は前記抗体または抗体断片を利用して急性白血病、母細胞危機が発生した慢性白血病またはリンパ芽球性リンパ腫を診断するキットを提供する。前記診断キットは、前記抗体物質に加えて、抗原−抗体反応を検出する方法を含むことができる。前記検出方法は好ましくは流動細胞測定法、免疫組織化学法、酵素結合免疫吸収分析法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫決定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）及び発光免疫測定法（ＬＩＡ）からなる群より選択される方法であり得る。前記検出方法は酵素（例：ＨＲＰ）、蛍光物質（例：ＦＩＴＣ）、発光物質（例：ルミノール、イソルミノール及びルシゲニン）及び同位元素（例；１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ及び１３１Ｉ）からなる群より選択される標識物質を含むことができるが、これに制限されるわけではない。前記抗原因植物質の反応度は酵素反応、蛍光、発光または放射線を検出する装置を利用して確認できる。前記診断キットは前記抗体または抗体断片を含む流動細胞測定キット、免疫化学的キット、ＥＬＩＳＡキットまたはストリップキットで製造することができる。
【００３６】
本発明を下記の実施例によってより詳しく説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明が下記の実施例に限定されるわけではない。
【実施例１】
【００３７】
胸腺細胞の新規な表面蛋白質をスクリーニングするために、下記の実施例に記載された方法によってヒトの胸腺細胞をＢａｌｂ／ｃマウスに接種して前記ヒトの胸腺細胞に対する抗体を製造した。
【００３８】
Ｂａｌｂ／ｃマウスに６週間の２週間隔で１０７個のヒトの胸腺細胞を腹腔内走査して免疫反応を誘導し、最後の追加接種後３日目に脾臓を摘出して脾臓細胞懸濁液を製造した。モノクローナル抗体はヒトの胸腺細胞で免疫化させたＢａｌｂ／ｃ脾臓細胞と９−アザグアニンに耐性を有するＳＰ２／０−Ａｇ１４マウス骨髄種細胞を融合させて製造した。細胞融合蛋白質はKoeler及びMilsteinの方法（非特許文献１５(Koeler & Milstein Nature, 1975, 256, 495-497)）によって製造した。５０％のポリエチレングリコール４０００を利用して１０８個の脾臓細胞を１０７個の骨髄種細胞と融合させ、前記融合細胞を洗浄した後、２０％の牛胎児血清アルブミン、１００μＭのヒポキサンチン、０．４４μＭのアミノプテリン及び１６μＭのチミジンを含むＤＭＥＭ(Dulbeco's modified Eagle's medium)培地（ＨＡＴ培養液）に再懸濁させた。前記細胞を４個の９６−ウェルプレートに分株し、３７℃、５％のＣＯ２が供給される培養器で培養した。２週後コロニーが形成されると上澄み液を取り、免疫組織化学染色及び流動細胞測定法を利用して前記抗体の力価を測定した。
【００３９】
ウェル当たり１０５個以上の細胞を含む場合、そのウェルを陽性グループと定めた。高い抗体力価を示すウェルから細胞を取り、抗体力価の高い安定したハイブリドーマクローンを製造するために前記細胞を制限稀釈試験法によってサブクローニングした。このように製造されたハイブリドーマクローンは培地内で抗体を分泌し、このような培地はその後の実験のために保存した。
【実施例２】
【００４０】
実施例１で製造されたハイブリドーマクローンの中で胸腺細胞の表面抗原を特異的に認識する抗体を分泌する単一クローンを選別するためにアビジンとビオチンとの結合によるアビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ）染色法によって実施例１から得られたハイブリドーマクローンの上澄み液を使用して４μｍ厚さに剥片された新鮮な組織とホルマリン固定されたパラフィン包埋組織のスライドに免疫組織化学染色を実施した。前記モノクローナル細胞の上澄み液を１次抗体として使用した。前記パラフィン包埋組織はパラフィン除去過程を経た後、非特異的な染色反応を防止するために正常マウス血清で１時間処理した。１次抗体処理後、１日間反応させて燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。２次抗体としてはビオチンが結合されたヤギ抗マウス免疫クルロブルリンを使用した。２次抗体処理後１時間室温で放置した後、ＰＢＳで３回洗浄した。その後、ストレプトアビジン及び西洋ワサビ過酸化酵素（ＨＲＰ）接合体を処理し、３，３'−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ）及びＤＡＫＯ社のＨ２Ｏ２溶液を前記染色された細胞に処理して２０分間放置し、ＰＢＳで３回洗浄した。その後、前記スライドにカバーガラスを覆って光学顕微鏡で観察した。
【００４１】
その結果、ヒトの胸腺細胞に特異的に反応する抗体を生産するハイブリドーマ単一クローン細胞株を選別し、これをＥＢ−１と命名した。図１はＥＢ−１抗体を生産するハイブリドーマクローンの上澄み液で胸腺を免疫組織化学染色した写真である。図１に示したように、大部分の胸腺細胞は陽性で染色され、胸腺細胞の表面は強く染色されてＥＢ−１抗体によって認識される抗原が前記細胞表面の抗原であることを分かる。
【実施例３】
【００４２】
胸腺細胞の発達段階によるＥＢ−１抗体の反応性を確認するために流動細胞測定法を実施した。心臓手術によって摘出されたヒトの胸腺を細かく裂き、単一の細胞懸濁物を調製した。１ｘ１０６細胞を１００μｌのＰＢＳに懸濁させて実験用チューブに分配し、１００μｌのＥＢ−１培養上澄み液を添加して攪拌した。前記溶液を４℃で３０分間反応させ、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、ペレットをＰＢＳで２回洗浄して未反応抗体を除去した。前記ペレットを希釈された２次抗体（ＦＩＴＣ−結合されたヤギ抗−３０マウスＩｇ、Ｚｙｍｅｄ社）を含む５０μｌの溶液に懸濁させ、４℃の暗室で３０分間反応させた。２回洗浄した後、前記ペレットをフィコエリトリン（ＰＥ）−結合された抗−ＣＤ８抗体及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ）−結合された抗−ＣＤ４抗体を含む５０μｌの溶液に懸濁させた後、４℃の暗室で３０分間さらに反応させて２回洗浄した。
【００４３】
遠心分離した後、２００μｌのＰＢＳを前記ペレットに添加した。胸腺細胞をＣＤ４及びＣＤ８の発現パターン（つまり、ＣＤ４ＣＤ８二重陰性胸腺細胞、ＣＤ４+ＣＤ８+二重陽性胸腺細胞、ＣＤ４+ＣＤ８またはＣＤ４ＣＤ８+単一陽性胸腺細胞）によって４個のサブセットに分類し、ＥＢ−１陽性細胞の比率及びＥＢ−１染色の強度を流動細胞測定器で分析した。図２は三色流動細胞測定法を利用してヒトの胸腺細胞に対するＥＢ−１の反応性を示す結果で、胸腺細胞の全てのサブセット、特に二重陽性胸腺細胞上で最も強く染色されることを確認した。図２で実線はＥＢ−１抗体による染色を示し、関係ない抗体による陰性染色を黒塗りのヒストグラムで示した。
【実施例４】
【００４４】
ＥＢ−１抗体を分泌するハイブリドーマクローンから分泌された前記抗体を高濃度で収得するために腹水を準備した。０．５ｍｌのプリスティンをＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に注射し、３週後１０％の牛胎児血清が含まれたＤＭＥＭ培地で培養された１０７個のＥＢ−１ハイブリドーマクローンを前記マウスの腹腔内に接種した。２〜３週後腹水を採取し、前記腹水から５〜１０ｍｇ／ｍｌの高濃度の抗体を収得した。腹水にはアルブミンのような汚染蛋白質が複数存在するためにヒトの胸腺細胞に反応する免疫グロブリンのみを精製した。前記Ｂａｌｂ／ｃマウスで収得した腹水から高濃度の抗体を精製するために、Ｑ−セファロースクロマトグラフィー及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（Ｂｉｏ−ｇｅｌ ＨＴＰ Ｇｅｌ, Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を行った。
【００４５】
腹水１０ｍｌ当り３．１４ｇの硫酸アンモニウムを加えて氷上で徐々に溶かした（５０％（ＮＨ４）２ＳＯ４沈澱）。前記混合物を１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、脱イオン水に再懸濁させた後、１Ｌの緩衝溶液（２０ｍＭのリン酸、ｐＨ７．４）で透析した。前記溶液を緩衝溶液（２０ｍＭのリン酸、ｐＨ７．４）で予め平衡化させたＱ−セファロースコラムに通過させて吸着させた後、前記コラム上に存在する遊離蛋白質を除去するために前記緩衝溶液を再び前記コラムに通過させて吸着させた。その後、緩衝溶液Ｉ（２０ｍＭのリン酸、ｐＨ７．４）及び緩衝溶液ＩＩ（２０ｍＭのリン酸、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を利用してＮａＣｌの濃度勾配を０Ｍから０．８Ｍまで線状勾配に流して前記コラムに吸着した蛋白質を溶出した。各分画物に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、これからＥＢ−１抗体を含む分画物を収得した。
【００４６】
前記分画物を緩衝溶液（２０ｍＭのリン酸、ｐＨ６．８）で透析し、緩衝溶液（２０ｍＭのリン酸、ｐＨ６．８）で予め平衡化させたヒドロキシアパタイトコラムに通過させて吸着させた後、前記コラム上に存在する遊離蛋白質を除去するために前記緩衝溶液を再び前記コラムに通過させて吸着させた。その後、緩衝溶液ＩＩＩ（２０ｍＭのリン酸、ｐＨ６．８）及び緩衝溶液ＩＶ（３００ｍＭのリン酸、ｐＨ６．８）を利用して燐酸の濃度勾配を０Ｍから０．３Ｍまで線状勾配に流して前記コラムに吸着した蛋白質を溶出した。各分画物に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、抗体の純度が９５％以上である分画物を収得した。得られたＥＢ−１抗体を適切な緩衝溶液で透析した後、保存した。反復実験を通じて腹水１ｍｌ当り５〜１０ｍｇのモノクローナル抗体を調製した。
【実施例５】
【００４７】
本実施例では胸腺の代わりに正常白血球に対するＥＢ−１抗体の反応有無を調査するために、１次抗体として実施例４で精製されたＥＢ−１抗体を使用し、実施例３の流動細胞測定法によって分析した。前記分析のためにＥＢ−１抗体をＦＩＴＣまたはＰＥと直接結合して使用するか（この場合、前記抗体は蛍光のための２次抗体が必要ではない）、またはビオチン−結合されたＥＢ−１抗体を蛍光物質−結合されたストレプトアビジンと結合して使用した。
【００４８】
下記表２は１０μｇ／ｍｌのＰＨＡ(Phytohemagglutinin)または５μｇ／ｍｌの抗−ＣＤ３抗体を含む培地で培養された正常末梢血液白血球、活性化した末梢血液単核細胞、正常脾臓細胞、正常胸腺細胞及び臍帯血内に存在するＣＤ３４+ＡＣ１３３+造血幹細胞の表面上に現れるＥＢ−１抗体の反応性を示す。これらの全ては、胸腺細胞を除いて、ＥＢ−１抗体に対して陰性として現れた。図３は正常白血球に対する流動細胞測定結果を示すもので、この時、実線はＥＢ−１抗体による染色を示し、関係ない抗体による陰性染色を黒塗りのヒストグラムで示した。
【表２】
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【実施例６】
【００４９】
本実施例では胸腺の代わりに正常組織に対するＥＢ−１抗体の反応有無を調査するために、１次抗体として実施例４で精製されたＥＢ−１抗体を使用し、実施例２の免疫組織化学染色法によって測定した。下記表３は多様な各組織で現れるＥＢ−１抗体の反応性を示す。胸腺細胞を除いて、末梢リンパ組織、小脳、膵臓、卵巣及び睾丸、皮膚、肺、副腎及び腎臓を含む他の全ての組織はＥＢ−１抗体に対して陰性として現れた。
【表３】
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【実施例７】
【００５０】
本実施例では正常骨髄細胞に対するＥＢ−１抗体の反応有無を調査するために、１次抗体として実施例４で精製されたＥＢ−１抗体を使用し、実施例３の流動細胞測定法によって分析した。前記分析のために、ビオチン−結合されたＥＢ−１抗体及びＡＰＣ−結合されたストレプトアビジンをＦＩＴＣ−結合された抗−ＣＤ１０、抗−ＣＤ３３、抗−ＣＤ３８、抗−ＣＤ７１または抗−ＡＣ１３３抗体及びＰＥ−結合された抗−ＣＤ３４抗体と共に使用した。図４は三色流動細胞測定法で測定した結果であり、この時、ＣＤ３４+細胞に対する結果は除いた。その結果、骨髄または臍帯血ではＣＤ３４+ＡＣ１３３+（図４Ａ）またはＣＤ３４+ＣＤ３８−／ｄｉｍ（図４Ｂ）細胞が多能性幹細胞であると確認され、これらはＥＢ−１抗体と全く反応しなかった。さらに、顆粒区を形成する前駆細胞、赤血球、単核細胞、巨核細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）、ＣＦＵ−ＧＭ、バースト形成単位赤血球、及びＣＤ３４+ＣＤ７１ｂｒｉｇｈｔ赤芽球系委任(erythroid-committed)前駆細胞のような実質的にコロニーを形成する全ての細胞を含むＣＤ３４+ＣＤ３３+細胞（図４Ｄ）はＥＢ−１抗体によって染色されなかった（図４Ｅ）。これに反し、ＥＢ−１抗体によって染色される陽性細胞は大部分のリンパ系委任(lymphoid-committed)ＣＤ３４+ＣＤ１０+前駆細胞で確認された（図４Ｃ）。
【００５１】
前記結果を総合してみると、ＥＢ−１抗体は胸腺細胞及び骨髄内一部造血幹前駆細胞でのみ制限的に反応し、その他に成熟した末梢血液細胞、造血幹細胞及び非−造血組織を含む造血幹細胞では反応しなかった。
【実施例８】
【００５２】
ＥＢ−１抗体によって認識される抗原を調査するために、インビトロゲン(Invitrogen)によって製造されたｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡ及びｐｃＤＮＡ３発現ベクターを利用してヒトの胸腺細胞のｃＤＮＡライブラリーを製造した。前記ライブラリーは３．５ｘ１０６個の独立したコロニーを含み、宿主細胞はバクテリアＭＣ１０６１／Ｐ３菌株を使用した。制限酵素であるＸｈｏＩで処理されたＧｂ３合成酵素ｃＤＮＡクローン、ｐＤ３Ｔ３１（非特許文献１６(Haraguchiら, Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.1994, 91:10455-9)）の切片を、ＸｈｏＩ制限酵素認知部位を有するｐＭＩＫ／Ｎｅｏ発現ベクターに挿入して、ｐＭＩＫ／Ｄ３Ｔ３１プラスミドを製造した。
【００５３】
前記ｃＤＮＡライブラリーのプラスミドを増幅させてｐＭＩＫ／Ｄ３Ｔ−３１ベクターと共にＤＥＡＥ−デキストリン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を利用して従来の方法（非特許文献１７(Davisら, Methods in Molecular Biology、Elsevier Science、New York 1986:285-289)）によって２９３Ｔ細胞に形質感染させた。具体的に、８μｇの前記各ｃＤＮＡライブラリーのプラスミドとｐＭＩＫ／Ｄ３Ｔ−３１プラスミドを１０ｃｍ培養皿上に半分ほど満たされた２９３Ｔ細胞（１．５ｘ１０６個の細胞数）に形質感染させた。６０時間後、前記形質感染した細胞を培養皿から分離し、１:２００に希釈したＥＢ−１モノクローナル抗体と氷上で４５分間反応させた。前記反応させた細胞を従来方法によって（非特許文献１８(Wysockiら, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1978, 75:2844-8)）ヤギ抗−マウスＩｇＭでコーティングされた培養版に移した。培養版に付着された細胞からプラスミドＤＮＡを回収し、これを２９３Ｔ細胞に形質感染させ、拡張されたプラスミドＤＮＡを再び２９３Ｔ細胞に形質感染させ、前記過程を４回以上繰り返した。その後、３０個の各コロニーを含む９６プールを調製し、ＥＢ−１抗体に対する反応性によってスクリーニングした。最終的に２個の陽性プールから１７個のクローンを検出し、このうち２９３Ｔ細胞上でＥＢ−１と直接反応する３個の単一コロニーをマイクロスケールＤＥＡＥ−デキストリン形質感染及び免疫蛍光測定法を利用して分離した。
【００５４】
前記で分離されたｃＤＮＡプラスミドを制限酵素であるＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断して抽出した後、これをｐｈａｇｅｍｉｄ ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（ｐＢＳＫ）ＫＳ（+）ベクターにクローニングした。前記クローンの欠損型突然変異はＫｉｌｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｋｉｔを利用して準備した。
【００５５】
ジデオキシヌクレオチドターミネーター配列順序はＴ３／Ｔ７ｄｙｅプライマーまたは４個の追加的なジオキシターミネーターと、ＰＲＩＳＭｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社で製造されたＭｏｄｅｌ３７７ＤＮＡ配列順序分析器を利用して分析した。分析されたＤＮＡ塩基配列をＢｌａｓｔ検索した結果、ＥＢ−１抗体によって認識された抗原はＣＤ４３であることが確認された。
【００５６】
ＥＢ−１モノクローナル抗体がヒトのＣＤ４３抗原を認識するかどうかを確認するために、ヒトのＣＤ４３が形質感染された２９３Ｔ細胞をＥＢ−１抗体及び通常使用される抗−ＣＤ４３抗体であるＤＦＴ−１で染色した。図５に示したように、ＥＢ−１抗体は自然型２９３Ｔ細胞に対してはいかなる反応も示さなかったが、ＣＤ４３−形質感染した２９３Ｔ細胞はＥＢ−１及びＤＦＴ−１によって全て染色されることを確認した。したがって、ＥＢ−１はヒトのＣＤ４３抗原に特異的なモノクローナル抗体である。
【００５７】
ＣＤ４３は重糖鎖化蛋白質であるので、本発明者らはＣＤ４３−陽性Ｍｏｌｔ−４細胞にシアリダーゼ(sialidase)を処理する場合、シアリダーゼがＣＤ４３抗原に対するＥＢ−１抗体の免疫反応を調節するかどうかを測定した。図６はシアリダーゼ処理前後のＭｏｌｔ−４細胞の流動細胞測定結果を示し、点線は関係ない抗体による陰性染色であり、細い実線および太い実線はそれぞれシアリダーゼ処理されなかったＭｏｌｔ−４細胞及びシアリダーゼ処理されたＭｏｌｔ−４細胞に対するＥＢ−１抗体の免疫反応を示す。Ｍｏｌｔ−４細胞に対するＥＢ−１抗体の免疫反応でシアリダーゼはいかなる影響度与えなかった。
【００５８】
このような結果を確認するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティング(Western blotting)を実施した。具体的には、シアリダーゼ処理または未処理された１ｘ１０'個のヒトの胸腺細胞またはＭｏｌｔ−４腫瘍細胞を１ｍｌの細胞粉砕溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１，ｐＨ７．４;１５０ｍＭ ＮａＣｌ;０．５％ｗ／ｖ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０;１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ））に懸濁させて粉砕した後、１３,０００ｇで１５分間遠心分離して上澄み液蛋白質を取った。
【００５９】
前記蛋白質を還元状態の１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動して分離した。前記分離ゲルのアクリルアミド濃度は１０％であり、適切な分子量を示すマーカと共に使用した。前記ゲル上にある蛋白質をニトロセルロース膜に転写するために４５Ｖで１６時間電気泳動を行った。その後、前記ニトロセルロース膜を５％の脱脂乳及び０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳを含むブロッキング溶液で２時間培養した後、培養されたニトロセルロース膜に１ｕｇ／ｍｌ濃度で前記ブロッキング溶液に希釈されたＥＢ−１抗体を処理して１日間培養した。前記膜を洗浄溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した後、ブロッキング溶液に１:３０００比率で希釈されたＨＲＰ−結合されたヤギ抗−マウス免疫グロブリンＧを前記膜に処理して１時間培養した。３回洗浄した後、各反応蛋白質バンドをＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社で製造されたＥＣＬキットで検出した。図７はＥＢ−１抗体を処理した胸腺細胞（ＡおよびＢ）及びＭｏｌｔ−４細胞（ＣおよびＤ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティング分析結果を示す。レーンＡ及びＣはシアリダーゼが未処理された細胞粉砕物の電気泳動写真を示し、レーンＢ及びＤはシアリダーゼ処理された細胞粉砕物の電気泳動写真を示したものである。ＥＢ−１抗体はシアリダーゼ−処理及び未処理されたＣＤ４３分子を認識した。これからＥＢ−１抗体はＣＤ４３分子の糖化されない部位も認識することが分かる。
【実施例９】
【００６０】
ＥＢ−１抗体によって認識されるＣＤ４３抗原決定基を決めるために、ＣＤ４３突然変異体を製造した。ヒトのＣＤ４３遺伝子のコーディング配列順序はＣＤ４３ ｃＤＮＡから増幅し、発現ベクターを製造するのに使用した。例えば、ＧＳＴ−融合蛋白質を製造するためにＰＣＲで増幅した前記ＣＤ４３コーディング配列順序をＰｈａｒｍａｃｉａ社で製造されたｐＧＥＸ−２Ｔベクター内にクローニングしてＣＤ４３組換えプラスミドを製造した。前記ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーはＧｅｎｅＢａｎｋに登載された配列順序に基づいてして設計され、精製されたＰＣＲ産物を３７°Ｃで１日中ＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩまたはＥｃｏＲＩ制限酵素で処理されたｐＧＥＸ−２Ｔベクター内に容易にクローニングするために、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩまたはＢｇｌＩＩ制限酵素認知部位を含むように設計された。クローニングは前記ＰＣＲ産物とベクターの混合物にＴ４連結酵素を添加して１６℃で１日間反応させた後、大腸菌コンピテント(competent)ＴＯＰ１０Ｆ’細胞に形質転換した。図８は１１種のＣＤ４３欠損突然変異体を図式化したものである。例えば、ｐＧＥＸ１−２５３はヒトのＣＤ４３蛋白質の１乃至２５３番目アミノ酸配列順序を含むベクターを意味する。
【００６１】
ヒトのＣＤ４３コーディング配列順序を含むＧＳＴ−融合蛋白質を発現させるために、前記形質転換されたＴＯＰ１０バクテリア細胞を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンが含まれたＬＢ培地で３７℃で１日間の培養した。培養された細胞を前記と同一濃度のアンピシリンを含む新鮮なＬＢ培地に２０倍で希釈して接種した後、吸光度が０．６になるまで３７℃で３１４時間培養した。前記蛋白質発現を誘導するために、前記培養された培地に最終濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加した。３７℃で４時間の間に一定に攪拌した後、４℃、６０００ｇで１５分間遠心分離してペレットを得た。その後、前記ペレットを３ｍｌの細胞粉砕溶液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８．０;１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ）で再懸濁させた。前記懸濁物に最終濃度が０．２ｍＭになるようにＰＭＳＦを添加した後、氷上で３０分間培養した。
【００６２】
ＣＤ４３突然変異体に対するＥＢ−１抗体の免疫反応を確認するためのウェスタンブロッティングを実施するために、ＧＳＴ−ＣＤ４３融合蛋白質の各細胞粉砕物の一定の量を１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動して分離した後、ニトロセルロース膜に転写した。前記ニトロセルロース膜をＥＢ−１抗体または抗−ＧＳＴポリクローナル抗体で処理し、実施例８による強化された化学発光法で各反応蛋白質バンドを検出した。
【００６３】
図９はＣＤ４３突然変異体とＥＢ−１抗体（Ａ）及びＣＤ４３突然変異体と抗−ＧＳＴ抗体（Ｂ）のウェスタンブロッティング結果を示す。レーン１はｐＧＥＸ１−２５３で、レーン２はｐＧＥＸ１−９８で、レーン３はｐＧＥＸ１−８７、レーン４はｐＧＥＸ１−８１、レーン５はｐＧＥＸ１−７５、レーン６はｐＧＥＸ１−７０、レーン７はｐＧＥＸ７０−９９、レーン８はｐＧＥＸ７１−８１、レーン９はｐＧＥＸ７３−８１、レーン１０はｐＧＥＸ７６−８１、レーン１１はｐＧＥＸ７３−８０、レーン１２はｐＧＥＸ−２Ｔ、及びレーン１３はヒトの胸腺細胞の粉砕物である。図９に示したように、ｐＧＥＸ７３−８１はＥＢ−１抗体によって認識されるＣＤ４３抗原の最少配列順序を含むので、ＥＢ−１抗体に対するＣＤ４３抗原決定基はＣＤ４３の７３乃至８１番目アミノ酸配列順序であることが分かる。前記配列順序はＧｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ（配列番号２）である。したがって、このような配列順序はＥＢ−１抗体によって認識される前記抗原決定基が成熟した血液細胞、造血幹細胞、骨髄内の造血前駆細胞のサブセット、または非造血組織では全く発現されないという特徴を知るのに非常に有用である。
【実施例１０】
【００６４】
実施例３、５、６及び７の結果からＥＢ−１抗体は造血幹細胞を除いた骨髄内の造血前駆細胞のサブセットでのみ制限的に免疫反応が現れることを確認した。したがって、本実施例ではＥＢ−１抗体によって認識されるＣＤ４３抗原決定基が白血病細胞でも発現するかどうかを調査しようとし、そのために実施例３の流動細胞測定法を利用した。白血病患者から末梢血液を採血してＥＤＡＴＡチューブに入れ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社から製造されたＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅを利用した遠心分離によって赤血球及び成熟した顆粒区を分離した。精製された細胞をＦＩＴＣ−結合されたＥＢ−１抗体で処理して流動細胞測定器で分析した。下記表４はＥＢ−１抗体を利用して白血病試料の流動細胞測定結果を示したものである。全３８個の白血病試料の中で３１個の白血病試料（８１．６％）、つまり、急性骨髄白血病（ＡＭＬ）の９０．９％（２２個のうちの２０個）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）の６９．２％（１３個のうちの９個）及び母細胞危機が発生した慢性骨髄白血病（ＣＭＬ）の６６．７％（３個のうちの２個）で陽性として現れ、腫瘍細胞でもＥＢ−１抗体に対して陽性が現れた。図１０はＥＢ−１抗体で染色した代表的な白血病細胞の流動細胞測定結果である。実線はＥＢ−１抗体によって染色された部分であり、関係ない抗体によって染色された部分を黒塗りのヒストグラムで示した。
【表４】
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【００６５】
また、本実施例では実施例４から精製されたＥＢ−１抗体を１次抗体として使用する場合、リンパ芽球性リンパ腫組織に対して免疫反応を示すかどうかを調査するために、実施例２の免疫組織化学染色法を行った。図１１はＥＢ−１抗体によって染色された代表的なリンパ芽球性リンパ腫組織の免疫染色パターンを示したものである。全９個の中で４個（４４．４％）のリンパ芽球性リンパ腫組織でＥＢ−１抗体に陽性反応を示した。
【００６６】
したがって、ＥＢ−１抗体及びそのＣＤ４３抗原決定基は急性白血病、母細胞危機が発生した慢性白血病及びリンパ芽球性リンパ種などの多様な疾患に有用な診断及び治療用道具として使用することができる。
【実施例１１】
【００６７】
ＥＢ−１抗体を治療目的として使用できるかどうかを調査するために、ＥＢ−１免疫毒素及びヒトの白血病を誘発するマウスモデルを開発した。免疫毒素を生産するためにＥＢ−１抗体のＳＨ基にＳｉｇｍａで製造されたサポニンを結合した（Politoら, 2004）。ヒトの白血病を誘発するマウスモデルは３００μｌのＰＢＳに２ｘ１０６個のＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を懸濁させた後、これをＲＡＧ−１欠乏マウスの尻尾静脈に注射して製造した。１週間後、２日間隔で全４回にかけてＥＢ−１抗体単独、ＥＢ−１−サポリン免疫毒素または非関連性抗体を一度に１００μｇ（３００μｌのＰＢＳ中）ずつ、尻尾静脈に投与した。４週後、各マウスの眼窩静脈叢で採血した血液を実施例３及び実施例１０の流動細胞測定法によってＦＩＴＣ−結合されたＥＢ−１抗体及びＰＥ−結合された抗−ヒトのＭＨＣクラスＩ抗体と反応させた。図１２はマウスの血液内白血病細胞の代表的な流動細胞分析結果を示したものである。対照群マウスの場合、末梢血液内細胞中２３．４％の細胞がＣＤ４３−及びヒトのＭＨＣクラスＩ−陽性であるＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞であったが、ＥＢ−１−サポニン免疫毒素を処理したマウスの場合、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞は１．３％以上減少し、ＥＢ−１抗体のみを処理したマウスの場合には対照群マウスに比べて約２倍程度白血病細胞の数が減少した。したがって、ＥＢ−１抗体は腫瘍細胞内への毒性物質伝達、抗体依存的細胞連携毒性（ＡＤＣＣ）、または他の機序によって急性白血病細胞を治療する効果的な道具として提供される。
【実施例１２】
【００６８】
ＥＢ−１抗体はＣＤ４３の前記７３乃至８１番目アミノ酸配列、つまり、Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ（配列番号２）を認識する。これに、本実施例では白血病及びリンパ腫の診断及び治療に有用な新規な抗−ＣＤ４３抗体を開発するために、配列番号２を含むＣＤ４３の７０乃至９８番目アミノ酸配列順序を暗号化するＤＮＡ切片をｐＱＥ−４０ベクターにクローニングし、これをコンピテント大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ´細胞に形質転換した。形質転換されたＴＯＰ１０Ｆ’細胞は実施例９に記載された方法によって培養し、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社で製造されたＮｉｃｋｅｌコラムを利用してバクテリア細胞粉砕物からＣＤ４３融合蛋白質を精製した。精製されたＳＹ−ＣＤ４３融合蛋白質１００μｇを完全フロイントアジュバント(complete Freund's adjuvant)と混合してＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に注射した。
【００６９】
４週後、２週間隔で２回にわたって不完全フロイントアジュバントと混合したＣＤ４３融合蛋白質１００μｇをマウス腹腔内に再び注射した。最後の追加接種を行った後、３日目に免疫化されたマウスから脾臓を摘出し、ハイブリドーマ細胞を実施例１に記載された方法によって製造した。ハイブリドーマ細胞の培養上澄み液をヒトのＣＤ４３−形質感染したマウスＥＬ４細胞と反応させて流動細胞分析を実施し、ＣＤ４３−形質感染したＥＬ４細胞と反応する２個のハイブリドーマクローンをそれぞれＥＢ−２及びＥＢ−３として命名した。図１３はＣＤ４３−形質感染したＥＬ４細胞株、ヒトの胸腺細胞、ヒトの末梢血液細胞及びヒトの急性白血病細胞をＥＢ−２抗体及びＥＢ−３抗体と反応させて測定した流動細胞分析結果を示したものである。その結果、ＥＢ−２及びＥＢ−３抗体に対してＣＤ４３−形質感染したＥＬ４細胞株、ヒトの胸腺細胞及びヒトの白血病細胞は全て陽性として現れたが、ヒトの末梢血液細胞は前記２つの抗体に対して陰性として現れた。したがって、ＥＢ−２及びＥＢ−３抗体は全てＥＢ−１抗体と類似な染色様相を示すことが分かる。
【実施例１３】
【００７０】
本実施例ではＣＤ４３欠損突然変異体を利用してＥＢ−２及びＥＢ−３抗体によって認識されるＣＤ４３抗原決定基を決めるために、実施例９によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングを実施した。図１４はＥＢ−２及びＥＢ−３とＣＤ４３突然変異体のウェスタンブロッティング結果を示したものである。ＥＢ−３抗体に対するＣＤ４３抗原決定基はＥＢ−１抗体に対するＣＤ４３抗原決定基と類似する。つまり、ＥＢ−１及びＥＢ−３抗体に対する最小抗原決定基は全てＣＤ４３の７３乃至８１番目アミノ酸配列順序（配列番号２;Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ）である。しかし、ＥＢ−２抗体はＥＢ−１及びＥＢ−３抗体より小さいペプチド配列順序を認識する。つまり、ＥＢ−２抗体に対する最小抗原決定基はＣＤ４３の７６乃至８１番目アミノ酸配列順序であり、その配列順序はＰｒｏ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ（配列番号１）である。
【００７１】
本発明のＣＤ４３抗原決定基は胸腺細胞を除いた正常の非造血組織、成熟した血液細胞及び活性化した末梢血液細胞では発現しないので、ＣＤ４３抗原決定基が組織検査または末梢血液検査の際に発現するかどうかを測定することにより、急性白血病、母細胞危機が発生した慢性白血病及びリンパ芽球性リンパ腫の診断に有用に用いることができる。また、本発明のＣＤ４３抗原決定基は胸腺細胞及び骨髄内の造血前駆細胞のサブセットを除いた造血幹細胞及び正常組織では発現しないために、急性白血病、母細胞危機が発生した慢性白血病及びリンパ芽球性リンパ腫の治療のための治療剤として有用に用いることができる。
【００７２】
生物学的活性ポリペプチドの実施例の説明は本発明に例示されるが、当分野の熟練した者の明白な変形によって本発明が前記に記載した特定の実施例によって制限されるわけではない。本発明の範囲は下記請求項の範囲内で定められる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
下記発明の詳細な説明を下記添付図面と共に考慮することによって本発明及びその長所についてさらに容易に理解できる。
【図１】図１は、ＣＤ４３抗原決定基に特異的なＥＢ−１モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマクローンの上澄み液で胸腺を免疫組織化学染色した写真である。
【図２】図２は、三色流動細胞測定法を利用してヒトの胸腺細胞の表面上に現れるＥＢ−１モノクローナル抗体の反応性を測定した写真である。
【図３】図３は、三色流動細胞測定法を利用してヒトの末梢血液白血球及び造血幹細胞の表面上に現れるＥＢ−１モノクローナル抗体の反応性を測定した写真である。
【図４】図４は、三色流動細胞測定法を利用してヒトの骨髄細胞の表面上に現れるＥＢ−１モノクローナル抗体の反応性を測定した写真である。
【図５】図５は、三色流動細胞測定法を利用してヒトのＣＤ４３が形質感染された２９Ｔ細胞株の表面上に現れるＥＢ−１モノクローナル抗体の反応性を測定した写真である。
【図６】図６は、三色流動細胞測定法を利用してシアリダーゼ処理前後のヒトのＭｏｌｔ−４細胞株の表面上に現れるＥＢ−１モノクローナル抗体の反応性を測定した写真である。
【図７】図７は、シアリダーゼ処理前後のヒトの胸腺細胞及びＭｏｌｔ−４細胞破砕物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ＥＢ−１モノクローナル抗体で免疫ブロッティングして測定した写真である。
【図８】図８は、１１種のＣＤ４３欠損突然変異体を図式化したものである。
【図９】図９は、１１種のＣＤ４３欠損突然変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ＥＢ−１モノクローナル抗体と抗−ＧＳＴポリクローナル抗体で免疫ブロッティングして測定した写真である。
【図１０】図１０は、単色流動細胞測定法を利用してヒトの白血病細胞の表面上に現れるＥＢ−１モノクローナル抗体の反応性を測定した写真である。
【図１１】図１１は、リンパ芽球性リンパ腫組織をＥＢ−１モノクローナル抗体で免疫組織化学染色した写真である。
【図１２】図１２は、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞をマウスの尻尾静脈内に注入し、ＥＢ−１または対照区抗体を処理したＲＡＧ−１欠乏マウスの末梢血液内白血病細胞の表面上に現れるＥＢ−１と抗−ヒトのＭＨＣクラスＩモノクローナル抗体の反応性を二重色流動細胞測定法を利用して測定した写真である。
【図１３】図１３は、ＣＤ４３が形質感染されたＥＴＡ細胞株、ヒトの胸腺細胞、ヒトの末梢血液白血球及びヒトの白血病細胞の表面上に現れるＣＤ４３抗原決定基で免疫化して製造された２個のさらなる抗−ＣＤ４３抗体（ＥＢ−２及びＥＢ−３）の反応性を単色流動細胞測定法を利用して測定した写真である。
【図１４】図１４は、５種のＣＤ４３欠損突然変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ＥＢ−２及びＥＢ−３モノクローナル抗体で免疫ブロッティングして測定した写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年12月20日(2007.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤ４３抗原決定基として単離されたポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドのアミノ酸配列個数が１００個未満であることを特徴とする請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドのアミノ酸配列個数が５０個未満であることを特徴とする請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
前記ＣＤ４３抗原決定基が胸腺細胞、骨髄細胞の造血前駆体サブセット、急性白血病細胞、母細胞危機が発生した慢性白血病の母細胞、及びリンパ芽球性リンパ腫細胞の表面に特異的に発現することを特徴とする、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
前記ＣＤ４３抗原決定基が配列番号２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤ４３抗原決定基に特異的に結合する抗体または抗体の断片。
【請求項７】
配列番号１のアミノ酸配列で構成されるペプチドに結合する抗体または抗体の断片。
【請求項８】
前記ＣＤ４３抗原決定基が胸腺細胞、骨髄細胞の造血前駆体サブセット、急性白血病細胞、母細胞危機が発生した慢性白血病の母細胞、及びリンパ芽球性リンパ腫細胞の表面に特異的に発現するが、成熟造血細胞、造血幹細胞、及び非造血細胞では発現しないことを特徴とする、請求項６または７に記載の抗体または抗体の断片。
【請求項９】
前記抗体が配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合することを特徴とする、請求項６または７に記載の抗体または抗体の断片。
【請求項１０】
前記抗体が配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドで動物を免疫化し、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体をスクリーニングして製造されることを特徴とする、請求項６または７に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１１】
前記抗体がポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項６または７に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１２】
前記抗体がヒトのモノクローナル抗体または動物のモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１１に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１３】
前記抗体がキメラ抗体またはヒト化抗体であることを特徴とする、請求項６または７に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１４】
前記抗体または抗体断片が放射線同位元素、蛍光物質、発光物質、酵素及び染色物質からなる群より選択される化合物で標識されたことを特徴とする、請求項６または７に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１５】
前記抗体または抗体断片が、放射線同位元素、毒素化合物、毒素蛋白質及び抗癌剤からなる群より選択される毒性物質と結合されたものであることを特徴とする、請求項６または７に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１６】
前記抗体または抗体断片が毒性物質と結合されて融合蛋白質を形成することを特徴とする、請求項１５に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１７】
請求項６または７に記載の抗体または抗体断片を生産する細胞株。
【請求項１８】
請求項６または７に記載の抗−ＣＤ４３抗体と薬学的に許容可能な担体とを含む急性白血病治療用薬学組成物。
【請求項１９】
請求項６または７に記載の抗−ＣＤ４３抗体と薬学的に許容可能な担体とを含む母細胞危機が発生した慢性白血病治療用薬学組成物。
【請求項２０】
請求項６または７に記載の抗−ＣＤ４３抗体と薬学的に許容可能な担体とを含むリンパ芽球性リンパ腫治療用薬学組成物。
【請求項２１】
請求項６または７に記載の抗−ＣＤ４３抗体を含む白血病診断用キット。
【請求項２２】
請求項６または７に記載の抗−ＣＤ４３抗体を含むリンパ腫診断用キット。
【国際調査報告】
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