(57)【要約】組成物および方法は、抗体−抗原平衡原理が薬物クリアランス機構に対抗できるように抗体が身体区画の溶液に存続するという驚くべき発見に基づいて、被験体において１つ以上の薬物の望ましい濃度範囲を維持することに関する実施態様、および特に被験体の身体区画において望ましい薬物濃度を維持するための実施態様において提供される。望ましい薬物濃度に類似する解離定数ＫＤを有する１つ以上の抗体が選択され、ここでＫＤは被験体における特異的な薬物標的（受容体）に対する薬物の親和性とは独立している。
2008513372.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体に（ｉ）少なくとも１用量の薬物および（ｉｉ）該薬物に特異的に結合する少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントを同時または逐次的に、およびいずれかの順序で投与することを含む、該被験体において１つ以上の該薬物の望ましい濃度範囲を維持するための方法であって、ここで該抗体に関しては抗体解離定数ＫＤは該薬物の望ましい濃度に実質的に類似する値を有し、かつ該抗体解離定数ＫＤは該被験体における特異的な薬物標的に対する該薬物の親和性とは独立している、方法。
【請求項２】
身体区画に（ｉ）少なくとも１用量の薬物および（ｉｉ）該薬物に特異的に結合する少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントを同時または逐次的かついずれかの順序で投与することを含む、被験体の該身体区画において１つ以上の該薬物の望ましい濃度範囲を維持するための方法であって、ここで該抗体に関しては抗体解離定数ＫＤは該薬物の望ましい濃度に実質的に類似する値を有し、かつ該抗体解離定数ＫＤは該被験体における特異的な薬物標的に対する該薬物の親和性とは独立している、方法。
【請求項３】
前記身体区画が中枢神経系区画、心膜、胸膜腔、眼窩後区画、眼区画、関節包、リンパ区画、腹膜区画、鼻内区画、肺区画、および泌尿生殖器区画からなる群より選択される区画を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記身体区画が中枢神経系区画を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記身体区画が中枢神経系区画を含み、そして投与の工程が薬物の髄腔内、脳室内、実質、硬膜下、くも膜下または硬膜外導入を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも２用量の前記薬物を投与することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体および前記薬物をほぼ等モル濃度で投与する、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
抗体対薬物モル比が少なくとも２：１で前記抗体および前記薬物を投与する、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体がキメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗原結合フラグメントがＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、（Ｆａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ、ｄＡｂおよびダイアボディからなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記投与の工程が
（ａ）少なくとも１用量の第１薬物、および該第１薬物に特異的に結合する少なくとも１つの第１抗体またはその抗原結合フラグメントを投与すること；ならびに
（ｂ）少なくとも１用量の第２薬物、および該第２薬物に特異的に結合する少なくとも１つの第２抗体またはその抗原結合フラグメントを投与すること；
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが前記薬物に特異的に結合する複数の抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、ここで該抗体の各々は該薬物の望ましい濃度範囲内である望ましい濃度範囲に実質的に類似する値を有する抗体解離定数ＫＤを有する、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
中枢神経系区画に（ｉ）少なくとも１用量の薬物および（ｉｉ）該薬物に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを同時または逐次的かついずれかの順序で投与することを含む、被験体の該中枢神経系区画において該薬物の望ましい濃度範囲を維持するための方法であって、ここで該抗体に関しては抗体解離定数ＫＤは薬物の望ましい濃度に実質的に類似する値を有し、そして該抗体解離定数ＫＤは被験体における特異的な薬物標的に対する該薬物の親和性とは独立している、方法。
【請求項１５】
前記被験体が中枢神経系疾患または障害を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記中枢神経系疾患または障害が新生物による症状、神経変成疾患、血管疾患および自己免疫疾患からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記被験体が中枢神経系の新生物による症状を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記新生物による症状がグリオーマ、星細胞腫、神経線維腫、神経芽細胞腫、リンパ腫、脳転移、ならびに脳実質、髄膜、脳神経、下垂体、松果体、乏突起膠細胞、上衣および脈絡叢のうちの少なくとも１つに存在する腫瘍からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
被験体の身体区画における薬物の望ましい濃度範囲を維持することができる抗体を同定するための方法であって、該方法は、
（ａ）該被験体の身体区画において維持される該薬物の望ましい濃度範囲を決定すること；ならびに
（ｂ）該薬物に特異的に結合し、かつ該身体区画において維持される該薬物の望ましい濃度に実質的に類似する値を有する抗体解離定数ＫＤを有する抗体を調製し、そしてそれにより該薬物の望ましい濃度範囲を維持することができる抗体を同定すること；
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ」と題され、そしてＣａｒｏｌ．Ｅ．Ｏ’ＨｅａｒおよびＪｅｆｆｅｒｓｏｎ  Ｆｏｏｔｅにより２００４年９月１３日に出願された米国仮特許出願第６０／６０９８０３号の利益を請求し、この仮出願はその全てを出典明示により本明細書の一部とする。
【０００２】
（米国政府利権の記載）
本発明は国立衛生研究所により付与された認可番号ＮＩＨ  Ｔ３２  ＣＡ８０４１６の下で米国政府により為されたものであった。政府は本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
（関連分野の説明）
ヒトおよび動物における膨大な数の疾患が罹患した個体の特定の部位、組織または器官に局在する病態生理学的な悪影響を特徴とするという事実にも関わらず、かかる症状のための大部分の治療的処置計画が例えば経口または静脈内経路を介する治療用薬物の全身的または全体的投与を伴う（例えば、非特許文献１を参照）。結果的に、比較的限定された部位でかかる薬物を治療上有効なレベルに到達させるための努力の副産として、受容者内で臨床的に無関係な、不適切なおよび／または望ましくない解剖学的位置で（循環血漿濃度を含む）薬理学または超薬理学的薬物レベルがしばしば達成される。体内の薬物クリアランスおよび分解活性はしばしば薬物の反復投与を必要とし、これはしばしば実際に循環する薬物濃度の激しい変動の反復に至り得る。
【０００４】
例えば、脳腫瘍の幼児のための現在の処置計画では、放射線照射がしばしばこれらの患者における発達遅延および神経内分泌欠損に至るので、化学療法が重要な役割を果たしている（非特許文献２）。中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍は１５歳以下の子供の頻発する悪性腫瘍の第２位である（非特許文献３）。生存者の疾病率は十分には記録されていないが、現在用いられている積極的化学療法プロトコールおよび腫瘍自体に随伴される運動および知的障害の結果、これらの子供の４５％がこれらの疾患で死亡する。多くの脳に内在する新生物が正常な脳実質の容赦ない腫瘍細胞浸潤を特徴とするとすれば、治療薬が腫瘍をターゲティングする計画はしばしば、血管の裂け目および軸索経路に沿って遊走する侵攻性腫瘍細胞クラスタに到達させるために拡散特性を有する薬物を特色とする（非特許文献４）。
【０００５】
脳実質を伴う固形腫瘍の処置における化学療法薬の使用は、その広範囲適用にも関わらずあまり成功していない（非特許文献５）。ＣＮＳの腫瘍は通常進行遅延性であり、そのために現在利用可能な細胞サイクル阻止薬物を用いる処置計画は典型的には、これらの薬剤が長時間にわたり有効濃度を維持することを必要とする。腫瘍部位でかかる期間この有効薬物濃度を達成することは、重大な技術的障害を示している（非特許文献６）。化学療法の使用に対するさらなる欠点は化学療法薬耐性細胞の発達および不十分な薬物分配方法である（非特許文献５）。抗癌薬は腫瘍細胞を死滅させ得るが、かかる薬物の有用な投薬量範囲は、望ましくない骨髄抑制に至る造血細胞に対する全体的な薬物毒性により限定されるということもまた問題である。
【０００６】
限局的な部位への有効な薬物分配の問題は、ＣＮＳであろうと、別の場所であろうと、薬物吸収およびインビボ安定性（例えば、非特許文献７）、生理学的薬物クリアランスおよび排泄機構（例えば、非特許文献８）、循環中の血漿タンパク質へのおよび／または間質液中のタンパク質への結合による薬物不活性化（例えば、非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）、ならびに罹患した細胞および組織中の特異的な薬物標的分子に対する薬物の接近可能性（例えば、非特許文献１２）のような種々の因子により悪化する。特に、全身的に投与された薬物の限局的な部位への有効な分配に対する妨害は、多くの身体区画を分離する物理学的、解剖学的、薬物動態的および／または生理学的バリアの結果として生じる。
【０００７】
例えばＣＮＳは血液脳関門（ＢＢＢ、例えば非特許文献１２）により別個の身体区画が与えられる。別の実例としては、眼、比較的無血管性の関節軟骨を含む関節包（例えば、特許文献１およびそこに引用された参照文献）、胸膜嚢、腹膜および心膜は、有効な局在的な薬物分配が問題になり得るさらなる身体区画を表す。
【０００８】
経口または静脈内経路のような全体投与を用いるかかる身体区画への有効量の治療用薬物を分配する試みで多数の計画が考案されている。これらの計画にはポリマー、ゲル、マイクロキャリア、リポソーム、凝集物、親和性ターゲティング抱合体、吸入剤、マイクロスフェア、ウイルスベクター、イオントフォレーシス薬剤、化学的修飾された誘導体、徐放製剤およびその他の形式が含まれる（例えば、非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４）。しかしながら、望ましい身体区画への特異的分配に関して、これらの研究法は例えば、望ましい局所薬物レベルの達成における困難、長時間の望ましい局所薬物レベルの維持における困難、薬物の望ましくない区画への非特異的受動拡散および／または能動輸送、薬物の時期尚早なクリアランスおよび／または排泄、薬物分配の結果である隣接する組織に及ぼす付随的な副作用、薬物に対する区画の不十分な接近可能性、分配の改変に対する活性成分の不適当性、ならびにその他の問題を含む１つ以上の欠点により悩まされる。（例えば、非特許文献２５；非特許文献２６；非特許文献２７；非特許文献２８；非特許文献２９；非特許文献３０）
特定の場合では、治療用薬物の身体区画への特異的および有効な分配を達成するための代替の試みは罹患部分への薬物の直接注射を伴っている（非特許文献１；非特許文献１２；非特許文献８；非特許文献３１；非特許文献３２；非特許文献３３；非特許文献３４）。しかしながら、かかる研究法は安全性、有効性、経費、利便性およびその他の因子の課題により悩まされており、そして全ての身体区画が治療の時間枠内での複数回の直接的介入に反応するわけではない。例えばＣＮＳへの直接注射はＣＮＳ組織に対する非可逆的損傷に随伴される危険性、および部位への反復する接近に随伴される微生物感染の可能性を伴い、そしてＣＮＳおよびその他の区画は技術および労働集約的な外科的手順によってのみ直接接近可能である。加えて、ＣＮＳに直接投与される治療用薬物はそこに存続できず、代わりにＣＮＳ間質液の指向性のバルク流の結果としてＣＮＳから全身循環に放出される（例えば、非特許文献３５）。別の実例では、抗癌薬の直接的腹腔内注射を伴う癌治療は、腹膜区画から外へ、および全身循環への薬物の有意なそして毒性の可能性のあるレベルの漏出を招いている（例えば、非特許文献３６；非特許文献３７；非特許文献３８）。
【特許文献１】国際公開第０１／２００１８号パンフレット
【非特許文献１】Ｒａｎｇ，Ｈ．Ｐ．ら（編）、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（２００３）、Churchill Livingstone,New York、第７章９１−１０５頁
【非特許文献２】Ｚａｌｕｔｓｋｙ、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃ．（２００４）９０：１４６９
【非特許文献３】Ｈｅｉｄｅｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ（１９９７）８０：４９７
【非特許文献４】Ｍｅｒｌｏら、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ．Ｓｕｐｐｌ．（２００３）８８：８３
【非特許文献５】Ｃａｓｔｒｏら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００３）９８：７１
【非特許文献６】Ｂｌａｓｂｅｒｇ、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．（１９７５）１９５：７３
【非特許文献７】Ｂｉａｌｅｒ、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．（１９９２）２２：１１
【非特許文献８】Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｃ１ｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．（１９９４）２７：１９１
【非特許文献９】Ｋｏｃｈ−Ｗｅｓｅｒら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（１９７６）２９４：３１１
【非特許文献１０】Ｋｒｅｍｅｒら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．（１９８８）４０：１
【非特許文献１１】Ｓｐａｒｒｅｂｏｏｍら、Ｎｅｔｈ．Ｊ．Ｍｅｄ．（２００１）５９：１９６
【非特許文献１２】Ｂｅｇｌｅｙ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ．（２００４）１０４：２９
【非特許文献１３】Ｃｈｅｎｇら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．（２００４）１：１８３
【非特許文献１４】Ｇｏｙａｌら、Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍ．（２００５）５５：１
【非特許文献１５】Ａｇｕら、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｓ．（２００４）３０：４５５
【非特許文献１６】Ｓｉａｓｈｉｎら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．（２００３）４４：４９８９
【非特許文献１７】Ｇｏｓｋｏｎｄａら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（２００１）９０：１２
【非特許文献１８】Ｐｅｔｔｉｔら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９８）１６：３４３
【非特許文献１９】Ｇｒｏｏｔｈｕｉｓら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．（１９９７）３：３８７
【非特許文献２０】Ｌａｎｇｎｅｒら、２００  Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．５：４３３
【非特許文献２１】Ｏｈｎｉｎｇ、Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｎｅｔｗ．（１９９５）１４：７
【非特許文献２２】Ｏｈｎｉｎｇ、Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｎｅｔｗ．（１９９５）１４：１５
【非特許文献２３】Ｓｏｏｄら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．（２００３）２６１：２７
【非特許文献２４】Ｏｌｉｖｉｅｒ、ＮｅｕｒｏＲｘ（２００５）２：１０８
【非特許文献２５】Ｂａｋｅｒ、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ａｇｅｎｔｓ（１９８７）、John  Wiley  ＆  Sons、New York
【非特許文献２６】Ｄａｓｈら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｍｅｔｈｓ．（１９９８）４０：１
【非特許文献２７】Ｈｕａｎｇら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ（２００１）７３：１２１
【非特許文献２８】Ｇｏｒｄｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ（１９９５）７５：２１６９
【非特許文献２９】Ｌｏｔｅｍら、Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．（２０００）１３６：１４７５
【非特許文献３０】Ｌｙａｓｓら、Ｃａｎｃｅｒ（２０００）８９：１０３７
【非特許文献３１】Ｄｅｄｒｉｃｋら、Ｃａｎｃ．Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｐ．（１９７８）６２：１
【非特許文献３２】Ｃｌａｙら、Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃ１ｉｎ．Ｎ．Ａｍ．（１９９２）６：９１５
【非特許文献３３】Ｏｈら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９５）１２：４３３
【非特許文献３４】Ｈｏｐｋｉｎｓら、Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ（１９９３）１：１７５
【非特許文献３５】Ｂｅｒｇｓｎｅｉｄｅｒ、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａｍｅｒ．（２００１）１２：６３１
【非特許文献３６】Ｂａｌｔｈａｓａｒら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．（１９９４）２６８：７３４
【非特許文献３７】Ｂａｌｔｈａｓａｒら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（１９９６）８５：１０３５
【非特許文献３８】Ｌｏｂｏら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（２００３）９２：１６６５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
明らかに、反復する直接介入を行わず薬物を投与および分配するための、そして選択された身体区画において望ましい薬物レベルを維持することを可能にする様式の改善された方法および組成物に関する必要性が存在する。新たな研究法はまた、局部薬物濃度の激しい変動またはその他の臨床上有害な影響のような非特異的薬物分配の好ましからざる結果を望ましく回避する。本発明はかかる必要性を満足し、そしてその他の関連する利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明の特定の実施態様によれば、被験体に（ｉ）少なくとも１用量の薬物および（ｉｉ）薬物に特異的に結合する少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントを同時または逐次的かついずれかの順序で投与することを含む、被験体において１つ以上の薬物の望ましい濃度範囲を維持するための方法が提供され、ここで抗体に関しては、抗体解離定数ＫＤは薬物の望ましい濃度に実質的に類似する値を有し、そしてここで抗体解離定数ＫＤは被験体における特異的な薬物標的に対する該薬物の親和性とは独立している。
【００１１】
別の実施態様では、身体区画に（ｉ）少なくとも１用量の薬物および（ｉｉ）薬物に特異的に結合する少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントを同時または逐次的かついずれかの順序で投与することを含む、被験体の身体区画において１つ以上の薬物の望ましい濃度範囲を維持するための方法が提供され、ここで該抗体に関しては、抗体解離定数ＫＤは薬物の望ましい濃度に実質的に類似する値を有し、そしてここで抗体解離定数ＫＤは被験体における特異的な薬物標的に対する該薬物の親和性とは独立している。
【００１２】
前記で記載した方法のさらなる特定の実施態様では、身体区画は中枢神経系区画、心膜、胸膜腔、眼窩後区画、眼区画、関節包、リンパ区画、腹膜区画、鼻内区画、肺区画、および泌尿生殖器区画から選択される区画を含む。特定のかかる実施態様では、身体区画は中枢神経系区画を含む。前記で記載した方法のさらなる特定の実施態様では、身体区画は中枢神経系区画を含み、そして投与の工程は薬物の髄腔内、脳室内、実質、硬膜下、くも膜下または硬膜外導入を含む。
【００１３】
前記で記載した方法の特定のその他のさらなる実施態様では、方法は少なくとも２用量の薬物を投与することを含む。その他のさらなる実施態様では、抗体および薬物をほぼ等モル濃度で投与する。その他のさらなる実施態様では、抗体対薬物モル比が少なくとも２：１で抗体および薬物を投与する。その他のさらなる実施態様では、抗体はモノクローナル抗体であり、そして特定のその他のさらなる実施態様では、抗体はキメラ抗体またはヒト化抗体である。特定のその他のさらなる実施態様では、抗原結合フラグメントはＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、（Ｆａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ、ｄＡｂおよびダイアボディ(diabody)から選択される。
【００１４】
前記で記載した方法の異なるさらなる実施態様では、投与の工程は少なくとも１用量の第１薬物および第１薬物に特異的に結合する少なくとも１つの第１抗体、またはその抗原結合フラグメントを投与すること；ならびに少なくとも１用量の第２薬物および第２薬物に特異的に結合する少なくとも１つの第２抗体、またはその抗原結合フラグメントを投与することを含む。前記で記載した方法の特定のその他のさらなる実施態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントは薬物に特異的に結合する複数の抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、ここで該抗体の各々は薬物の望ましい濃度範囲内である濃度範囲に実質的に類似する値を有する抗体解離定数ＫＤを有する。
【００１５】
別の実施態様では本発明は、中枢神経系区画に（ｉ）少なくとも１用量の薬物および（ｉｉ）薬物に特異的に結合する少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントを同時または逐次的かついずれかの順序で投与することを含む、被験体の中枢神経系区画において薬物の望ましい濃度範囲を維持するための方法を提供し、ここで該抗体に関しては、抗体解離定数ＫＤは薬物の望ましい濃度に実質的に類似する値を有し、そしてここで抗体解離定数ＫＤは被験体における特異的な薬物標的に対する該薬物の親和性とは独立している。特定のさらなる実施態様では、被験体は中枢神経系疾患または障害を有し、特定のなおさらなる実施態様ではこれは新生物による症状、神経変成疾患、血管疾患または自己免疫疾患である。１つの実施態様では、被験体は中枢神経系の新生物による症状を有する。さらなる実施態様では、新生物による症状はグリオーマ、星細胞腫、神経線維腫、神経芽細胞腫、リンパ腫、脳転移、ならびに脳実質、髄膜、脳神経、下垂体、松果体、乏突起膠細胞、上衣および脈絡叢のうちの少なくとも１つに存在する腫瘍から選択される。
【００１６】
別の実施態様によれば、被験体の身体区画において維持される薬物の望ましい濃度範囲を決定すること；ならびに薬物に特異的に結合する、および身体区画において維持される薬物の望ましい濃度に実質的に類似する値を有する抗体解離定数ＫＤを有する抗体を調製し、そしてそれにより薬物の望ましい濃度範囲を維持することができる抗体を同定することを含む、被験体の身体区画における薬物の望ましい濃度範囲を維持することができる抗体を同定するための方法が提供される。
【００１７】
本発明のこれらのおよびその他の態様は以下の詳細な説明を参照したときに明白になろう。この目的のために、さらに詳細な特定の背景情報、手順、化合物および／または組成物を説明する種々の参照文献を本明細書にて示し、そして各々はその全てを示すがごとくに出典明示により本明細書の一部とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（発明の詳細な説明）
特定の実施態様では、本発明は被験体に薬物および薬物に特異的に結合する抗体を投与することによりインビボで被験体において薬物の望ましい濃度範囲を維持するための方法および組成物に関する。
【００１９】
（抗体緩衝）
ここで開示するようにこれらのおよび関連する実施態様は、抗薬物抗体の存在により統計的に有意な様式で身体区画内の薬物の有効半減期が延長され得る、すなわち薬物クリアランスを抑制または遅延させることができる驚くべき発見に由来する。したがってかかる抗体は本明細書で「抗体緩衝」効果として記載されるものを媒介し、それにより（ｉ）抗体と複合体形成する薬物および（ｉｉ）未結合の遊離の薬物との間のインビボ平衡分布を抗体親和性特性に応じて制御して遊離の、生物学的に利用可能な薬物の望ましい濃度範囲を得ることができる。
【００２０】
したがって、および抗体−薬物会合および解離のインビボ平衡動力学の予期せぬ、そして有用な機能として、適切に選択された抗薬物抗体を用いて、絶え間ない再平衡過程で、解離された遊離薬物分子が生理学的クリアランス機構により排泄され、そして／または特異的な薬物標的（薬理学的受容体）との相互作用により除去されるときに結合薬物分子の亜集団を放出することにより身体区画の薬物濃度を維持することがでる。
【００２１】
身体区画における薬物の望ましい濃度に実質的に類似する値である抗体解離定数ＫＤを有する適当な抗薬物抗体を選択することができ、ここでＫＤは被験体における薬物の任意の薬物標的との親和性とは独立している。以下に詳記するように、ここで開示するようなこれらのおよび関連する実施態様は、薬物投与の頻度の減少、予想できる薬物濃度範囲の維持、薬物製品の消費および浪費の減少、過剰な薬物投薬量からの毒性の低減、ならびにその他の関連する利点を含む、治療方法に関する多くの利点を提供する。
【００２２】
背景として、たいていの場合、単位時間あたりに除去される薬物の量が存在する薬物の量に比例する一次過程により、全薬物は身体から除去される。また前記で記したように、臨床投与は典型的には効果の閾値よりもはるかに高い初期薬物レベルを生じ、一次クリアランスの結果としてそのレベルは急落するが、次いで続く用量の投与により回復し得る。結果はインビボ薬物濃度における有意な変動のパターンの繰り返しである。対照的に最新の薬物は細胞、組織または器官において薬物と飽和できる受容体として挙動する特異的な薬物標的（薬理学的受容体）と相互作用し、その薬物標的は別個のもしくは一過性の単分子もしくは多分子構造または機能的な生物学的作用でよい。特異的な薬物標的の飽和濃度よりも高い薬物濃度ではそれ以上の薬物効果は生じず、そして実際には望ましくない効果が現れ得る。したがって、クリアランスの結果である薬物濃度の典型的な変動は、次善最適効果（最低薬物濃度で）と副作用（最高薬物濃度で）の間の揺れに至り得る。
【００２３】
さらに背景として、溶液中の抗体−抗原相互作用が、質量作用の法則および化学平衡の法則（Ｉ．Ｐｅｃｈｔ、Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ（１９８２）、第６巻（Ｍ．Ｓｅｌａ編）、アカデミックプレス、ニューヨーク、１−６８頁；Ｍ．Ｗ．Ｓｔｅｗａｒｄ、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７４）、チャップマン・アンド・ホール、ロンドン）を含み、そして抗体解離定数と称される周知のパラメーターに従って抗体の特徴付けを可能にする、化学動力学の十分に確立されている原理に合致することが解っている。抗体解離定数は、抗体−抗原複合体が解離し得る相対的な容易さの観点から、抗原に対する抗体結合の強度の定量的指標を提供する。換言すれば抗体解離定数を、好まれる抗体−抗原複合体形成のために、またはかかる複合体の好まれる遊離抗体および遊離抗原への解離のために存在する抗体および／または抗原の相対濃度の指標として考えることができる。
【００２４】
簡単には、遊離抗体［Ａｂ］、遊離抗原［Ａｇ］および抗体−抗原複合体［ＡｂＡｇ］の濃度の間の平衡分布に基づいて、抗体解離定数ＫＤを任意の特定の抗体に関して決定することができ、ここでＫＤ＝［Ａｂ］［Ａｇ］／［ＡｂＡｇ］であり、そして物理学的な濃度のディメンションを有する（例えばモル濃度、Ｍ）。またＡｂＡｇ複合体形成（ｋｏｎ）および遊離Ａｂおよび遊離Ａｇへの複合体解離（ｋｏｆｆ）の動態速度定数から、ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎでＫＤを測定することもできる。これに代えて、３つの構成成分全て（遊離Ａｂ、遊離Ａｇおよび複合体ＡｂＡｇ）を同時に測定できない場合、抗原濃度の半分が抗体と複合体化されている抗体濃度を決定することによりＫＤを決定することができ、その濃度でＫＤ＝［Ａｂ］である。
【００２５】
前記で記したように、典型的には薬物は飽和可能な受容体として機能する特異的な薬物標的を介してその生物学的および／または薬理学的効果を奏する。特定の薬物は周知の受容体−リガンド（薬物）結合相互作用に従ってかかる特異的な薬物標的に関して特徴的な親和性を有し、それに基づいて特異的な薬物標的との薬物親和性を決定することができる（例えばＲａｎｇ，Ｈ．Ｐ．ら（編）、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（２００３）、チャーチルリビングストン、ニューヨーク、第２章）。特定の発明によれば、本明細書に開示する実施態様は（例えば身体区画において）１つ以上の薬物の望ましい濃度を維持するための方法に関し得るが、抗体解離定数ＫＤは特異的な薬物標的に対する該薬物の親和性とは独立していることに注目すべきである。この点で本発明は、その教示が合成受容体の薬物との親和性に相対して高い天然受容体の薬物との親和性に依存するプロドラッグ複合体に限定されるＵＳ２００２／０１２２８１０とはその開示全体にわたって明らかに区別され得る。ここで開示される実施態様によれば、被験体における特異的な薬物標的との薬物親和性へのかかる依存性は存在しない。代わりに、および本明細書で記したように、本明細書で開示および特許請求する実施態様によれば、抗体解離定数ＫＤは特異的な薬物標的に対する該薬物の親和性とは独立している。
【００２６】
抗体解離定数ＫＤを決定するための方法論が本明細書で記載され、そして当分野に公知である限り（例えばＷｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８６）、ブラックウェルサイエンティフィック、ボストン；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）、コールドスプリングハーバーラボラトリー）、特定の好ましい実施態様に従って、適当な抗体が被験体において使用するのに望ましい薬物濃度に実質的に類似するＫＤ値を有することに基づいて選択され得る。（ｉ）例えば特定の身体区画において特定の適応症の処置のために用いられる特定の薬物のための望ましい濃度範囲、および（ｉｉ）現在利用可能な方法論および器具類を用いて検出できるような抗体解離定数ＫＤ値の双方の決定に関する当分野で許容される基準によれば、かかる値は実質的に類似する。したがって、特定の実施態様では、実質的に類似する抗体解離定数ＫＤが薬物の望ましい濃度範囲内の値に等しい値を有するのが好ましいが、別の実施態様では、実質的に類似する抗体解離定数ＫＤは統計的に有意な様式で望ましい薬物濃度範囲内である薬物濃度の１０倍内、さらに好ましくは望ましい薬物濃度の９倍、８倍、７倍、６倍、５倍、４倍、３倍、２倍またはそれ未満内でよく、そして特定の実施態様では、ＫＤ値は望ましい薬物濃度範囲内である薬物濃度の１．７５倍、１．５倍、１．２５倍または０．５から１倍の内またはそれ未満でよい。
【００２７】
特定の関連する実施態様では、異なる抗体ＫＤ値を有する２つまたはそれより多い抗体を選択することができ、ここで各ＫＤ値は望ましい薬物濃度範囲内である薬物濃度に実質的に類似してよいが、各かかるＫＤ値はその範囲内で異なる濃度を示す。これらのおよび関連するさらなる実施態様は本明細書に記載するような身体区画における薬物濃度を調節するための抗体緩衝の使用の微調整を可能にする。非限定的な理論によれば、そして前記で論じたように、各々が薬物の望ましい濃度範囲内である望ましい薬物濃度に実質的に類似する異なるＫＤ値を有する複数の抗体のかかる使用は、平衡薬物濃度に及ぼす抗体の影響により身体区画内の薬物クリアランスの速度に影響する。関連する実施態様では、多量体抗体、例えば二重特異性抗体分子を本開示に従って緩衝抗体として使用するために操作することができ、それにより単一の抗体分子は抗原（薬物）に関して２つの異なる抗体結合部位を有することができ、かかる部位の各々は薬物の望ましい濃度範囲内である望ましい薬物濃度に実質的に類似する異なるＫＤ値を有する。当業者は二重特異性およびその他の多量体抗体（Ｐｅｉｐｐら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔ．３０：５０７（２００２）；Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：２３７（２００２））ならびにダイアボディ（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ、Ｍｅｔｈｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：３１７（２００２））を調製するための種々の計画に精通している。多量体抗体には抗原に特異的な第１Ｆｖを含み、その抗原は異なる抗原特異性を有する第２Ｆｖに随伴される二重特異性および二機能性抗体を含む（例えばＤｒａｋｅｍａｎら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ  ６：１１６９−７８（１９９７）；Ｋｏｅｌｅｍｉｊら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２２：５１４−２４（１９９９）；Ｍａｒｖｉｎら、Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｉｎ．２６：６４９−５８（２００５）；Ｄａｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１０９：３２９−４６（２００５）参照）。
【００２８】
同様に、特定のその他の実施態様によれば、本開示に鑑みて企図される実施態様で本発明により提供されるインビボ抗体緩衝を用いて薬物の各々に関する望ましい濃度範囲を維持するのが望ましいかもしれないような被験体の処置に２つまたはそれより多い薬物が適応とされ得る。例えばかかる方法は少なくとも１用量の第１薬物および第１薬物に特異的に結合する少なくとも１つの第１抗体またはその抗原結合フラグメントを投与すること；ならびに少なくとも１用量の第２薬物および第２薬物に特異的に結合する少なくとも１つの第２抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することを含み得る。
【００２９】
本発明の特定の実施態様に従って企図される方法および組成物は被験体を処置するのに有用であってよく、好ましい実施態様では、それはヒト被験体でよく、そしてその他の実施態様ではヒト以外の霊長類（例えばチンパンジー、ゴリラ、マカク、サル等）、家畜（例えばウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等）もしくはその他の哺乳動物（例えばイヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット、スナネズミ、マウス、ラット、等）哺乳動物のようなヒト以外の動物またはその他の非哺乳動物種を含むでよい。特定の実施態様は、新生物による症状のような身体区画内にある細胞または組織の異常または異常症状を特徴とする疾患または障害を有する患者である被験体における薬物の望ましい濃度範囲を維持するための方法を含む。
【００３０】
本明細書に開示する特定の実施態様は、中枢神経系区画である被験体の身体区画において薬物の望ましい濃度範囲を維持するための方法に関し、ＣＮＳ内の新生物による症状を有すると診断された被験体を含むが、本発明はそのように限定されることを意図せず、そして同様に広範なその他の疾患、障害および症状に適用可能な処置方法を企図する。例えば本明細書に記載する抗体緩衝方法および組成物を転移（例えば転移性脳腫瘍）、神経変成疾患（例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、および神経変成を特徴とするその他の疾患）もしくは血管疾患（例えば脳卒中、側頭動脈炎）を処置するためにＣＮＳ区画で薬物濃度を維持するために、または自己免疫疾患（例えば多発性硬化症およびＣＮＳ区画の脈管炎；リウマチ様関節炎および関節包および／または嚢包の脊椎炎；甲状腺のグレーブス病；等）を処置するためにもしくは身体区画において薬物の望ましい濃度範囲を維持することが有利であり得る任意のその他の適応のために身体区画における薬物濃度を維持するために有用に用いることができる。
【００３１】
被験体における新生物による症状の存在は被験体における、例えば悪性、転移性、腫瘍、非接触性抑制性および／または腫瘍形成的に形質転換細胞等（例えばグリオーマ、星細胞腫、神経線維腫、神経芽細胞腫、リンパ腫、メラノーマ、腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌、燕麦細胞癌等のような癌腫、軟骨肉腫、骨肉腫等のような肉腫）を含む異形成性、癌性および／または形質転換細胞の存在を意味し、これらは当分野に公知であり、そしてそれらに関する診断および分類のための基準が確立されている。本発明により企図される特定の好ましい実施態様では、例えばかかる癌細胞は脳実質、髄膜、脳神経、下垂体、松果体、乏突起膠細胞、上衣および脈絡叢等の形質転換細胞のような、ＣＭＳ区画内の新生物細胞である。特にこれらに関連するものおよび関連する実施態様は、限定するものではないが小細胞肺癌、腺癌、リンパ腫およびその他の新生物由来の転移を含む脳転移である。
【００３２】
（薬物／医薬組成物および投与）
本発明に従って使用するための薬物は治療および／または診断目的で被験体に投与することができる物質の任意の組成物でよい。好ましくは薬物を可溶性形態で提供する。理論に束縛されることは望まないが、薬物は被験体の細胞または組織においてその同族特異的な薬物標的と特異的に相互作用して、薬物−標的相互作用の結果として直接的（例えば酵素の阻止、受容体の遮断）または間接的（例えば望ましい事象に至るためにシグナリングカスケードを開始する受容体アゴニストとして）のいずれかで治療上の利益を付与することができる。典型的には本明細書に開示する特定の好ましい実施態様に従って使用するための薬物は「小型分子」として当分野において公知であり、そして１０５ダルトン未満、好ましくは１０４ダルトン未満、さらに好ましくは８×１０３、５×１０３、３×１０３、２×１０３または１．５×１０３ダルトン未満、およびなおさらに好ましくは１０３ダルトン未満の分子量を有する化合物を含む。
【００３３】
当業者に公知であるように、特定の疾患または障害に望ましい濃度範囲が確立されている適当な投薬量を含む１つ以上の薬物を適応とすることができる（例えばＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（２００４）、トンプソンヘルスケア、ニューヨーク；ＢｅｅｒｓおよびＢｅｒｋｏｗ（編）、Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ第１７版（１９９９）、ジョンワイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク参照）。しかしながら本発明はそのように限定される必要はなく、そしてまた望ましい濃度範囲が公知であるか、または利用可能な情報に基づいてもしくは当分野で許容されている系を用いる標準的なインビトロおよびインビボ方法論から得られるような薬理学／薬物動態的、生物学的、化学的およびその他の特性に関連する容易に作成されるデータから決定され得る新しいおよび／または実験的薬物をも企図する。例えばインビトロ（例えば細胞培養基盤）の系は、細胞表現型に及ぼす影響を明白に示すことができる最小薬物濃度範囲を確立することができるが、薬物毒性の徴候（例えば壊死、アポトーシス、呼吸および／または代謝不全等）のモニタリングから明らかであるような、従来のプロトコールに従ってインビボモデルを用いて薬物濃度範囲の上限を確立することができる。したがって、一度１つの薬物または薬物の１つの組み合わせを被験体の処置に選択すると、定義された有効レベルに基づいて各薬物に関する望ましい濃度範囲が解り、そして適切な抗体解離定数（ＫＤ）値を有する抗体を選択することができる。抗体を作成する方法は、抗体解離定数を決定するための方法と同様に本明細書に記載され、そして当分野において公知であり、望ましい同族抗原（例えば薬物のようなリガンド）との特異的結合親和性を有する抗体を選択すること、およびさらにかかる抗体の中から望ましい薬物濃度範囲内である望ましい濃度に実質的に類似するＫＤを有するものを選択することはおよび過度な実験を行うことなく容易に達成され得る。
【００３４】
したがって特定の実施態様では本発明は、被験体の身体区画において維持すべき薬物の望ましい濃度範囲を決定すること；および薬物に特異的に結合し、そして身体区画において維持すべき薬物の望ましい濃度範囲に実質的に類似する値を有する抗体解離定数ＫＤを有する抗体を調製すること、およびそれにより薬物の望ましい濃度範囲を維持することができる抗体を同定することを含む、被験体の身体区画において薬物の望ましい濃度範囲を維持することができる抗体を同定するための方法を提供する。
【００３５】
本明細書に開示する特定の本発明の実施態様により得られる別の予期せぬ利点は、被験体においてインビボで、例えば被験体の身体区画において望ましい時間１つ以上の薬物の望ましい濃度範囲を維持する能力である。抗体−抗原平衡動力学に関する前記の議論から以下のように、インビボ抗体緩衝効果の結果である身体区画内の薬物半減期の驚くべき延長により、望ましい薬物濃度を維持することができる期間の制御が可能になる。抗体解離定数ＫＤが本明細書に記載されるように到達し得る遊離（未結合）薬物のレベルを制御する場合、望ましい薬物濃度範囲を維持できる時間を算定する目的で区画容量および薬物クリアランス速度（遊離薬物の喪失の薬物動態速度）に鑑みて投与される抗体および薬物の絶対量を計算することができる。
【００３６】
被験体における１つ以上の薬物の望ましい濃度範囲を維持するための本記載の方法は、周知の方法論および技術に従って投与するために医薬組成物に処方することができる薬物および抗体の用量を含む。特定の好ましい実施態様では、投与は身体区画に行われる。医薬組成物は一般に１つ以上の薬物および／または抗体を薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤と組み合わせて含む。かかる担体は用いられる投薬量および濃度で受容者に対して無毒性である。特定の薬物および／または抗体に関して約０．０１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重が典型的には、（ＣＮＳでは）髄腔内、脳室内、硬膜外、硬膜下、くも膜下、髄膜、類洞もしくは脳実質投与による、または（その他の区画では）心膜、胸膜嚢、眼窩後腔、１つもしくはそれより多い前眼房、後眼房もしくは眼の硝子区画のような眼区画、関節包、嚢包、脾臓、胸腺もしくはリンパ節のようなリンパ区画、または卵巣、前立腺、陰嚢もしくは精巣のような泌尿生殖器区画への直接注射による、またはエアロゾル化水性溶液の鼻腔区画、細気管支もしくは肺区画への吸入による、またはその他の経路によるような（複数の）薬物の望ましい濃度範囲の維持が行われるべき身体区画に従って決定される経路により投与される。特定の好ましい実施態様に従って、身体区画は中枢神経系区画を含み、そして投与の工程は薬物の髄腔内、脳室内、実質、硬膜下、くも膜下または硬膜外導入を含む。
【００３７】
好ましい投薬量は約１μｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇであり、約５μｇ／ｋｇから約２００μｇ／ｋｇが特に好ましい。投与の数および頻度は被験体の応答に依存することは当業者には明白であろう。同様に本発明の特定の実施態様は、（ａ）（ｉ）少なくとも１用量の薬物および（ｉｉ）薬物に特異的に結合する少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントを同時または逐次的かついずれかの順序で身体区画に投与することであって、ここで該抗体に関しては、抗体解離定数ＫＤは薬物の望ましい濃度に実質的に類似する値を有し、そしてここで抗体解離定数ＫＤは被験体における特異的な薬物標的に対する該薬物の親和性とは独立している；ならびに（ｂ）薬物の少なくとも１つのさらなる用量を逐次的に投与すること；を含む被験体の身体区画において１つ以上の薬物の望ましい濃度範囲を維持するための方法を企図する。
【００３８】
さらにこの点で、身体区画液体容量中の可溶性抗体の驚くべき滞留時間を考えると、平衡計算および／または経験的な観察により、抗体−薬物解離および薬物クリアランスの組み合わせ効果が望ましい濃度を下回るまで薬物レベルを低下させたことが示された時点で、望ましい薬物濃度を維持するための方法を含む特定の関連する実施態様に従って、抗体および薬物が以前に投与された区画への遊離薬物の反復再投与（「再負荷」）が企図される。理論に束縛されることは望まないが、かかる状況下では身体区画中で薬物濃度が低く、そして薬物に対する過剰の抗体結合部位がリガンド（すなわち薬物）により占有されていない点に再平衡されている抗薬物抗体のプールは、新鮮な薬物でのかかる「再負荷」に利用可能であり、インビボでリガンドの抗体緩衝の平衡原理により再度有効な薬物濃度の維持の延長に至る。かかる再負荷はまた予期せぬ利点として、身体区画および、したがって被験体が、抗体−薬物複合体における薬物の網封鎖に至る迅速な平衡過程の初めに高々一過性のおよび短命の高レベルの遊離薬物に暴露される方法を提供する。
【００３９】
本明細書に記載したいくつかの実施態様の中で、（ｉ）少なくとも１用量の薬物および（ｉｉ）薬物に特異的に結合する少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントを同時または逐次的かついずれかの順序で投与することができるものが含まれる。その他の関連する実施態様は、薬物および抗体が混合されるか、または投与の前に予め混合されるものを含み得るが、さらにその他の関連する実施態様は、抗体および薬物が別個に投与されるか、または投与時に混合されるものを含む。
【００４０】
治療に使用するための「薬学的に許容される担体」は薬学の分野で周知であり、そして例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、マック出版社（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編（１９８５））に記載されている。例えば生理学的ｐＨの滅菌食塩水およびリン酸塩緩衝食塩水を用いることができる。保存剤、安定剤、染料およびその他の補助剤を医薬組成物に提供することができる。例えば安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルを保存剤として加えることができる。同文献１４４９。加えて、抗酸化剤および懸濁剤を用いることができる。同文献。「薬学的に許容される塩」は、かかる化合物および有機もしくは無機酸（酸付加塩）または有機もしくは無機塩基（塩基付加塩）の組み合わせから誘導される薬物化合物の塩を意味する。本明細書での使用が企図される薬物を遊離塩基または遊離塩形態のいずれかで用いることができ、双方の形態は特定の本発明の実施態様の範囲内であると考えられる。
【００４１】
１つもしくはそれより多い薬物および／または１つもしくはそれより多い抗体を含有する医薬組成物は、組成物を患者に投与することを可能にする任意の形態でよい。例えば組成物は固体、液体または気体（エアロゾル）の形態でよい。特定の好ましい実施態様に従って、組成物を液体形態にし、そして投与経路は少なくとも１用量の薬物および薬物に特異的に結合する少なくとも１つの抗体またはその抗原結合フラグメントを身体区画に同時または逐次的かついずれかの順序で投与することを含む。その他の典型的な投与経路には、限定するものではないが経口、舌下、局所、非経口（例えば舌下または口腔）、舌下、直腸、膣および鼻腔内が含まれ得る。本明細書で用いる非経口なる用語には、皮下注射、静脈内、筋肉内、髄内、胸骨内、空洞内、くも膜下腔内、道内、尿道内注射または注入技術が含まれる。
【００４２】
ヒト患者のような被験体への組成物の投与時に、そこに含有される活性成分を生体内利用できるように医薬組成物を処方する。患者に投与される組成物は１つ以上の用量または投薬量単位の形態をとり、ここで例えば予め測定された液体容量は単一の投薬量単位を含むことができ、そして液体またはエアロゾル形態の１つ以上の組成物（例えば薬物、抗薬物抗体）の容器は複数の投薬量単位を入れることができる。薬物の用量は薬物の望ましい濃度範囲、例えば身体区画における薬物の望ましい濃度範囲を達成または維持するのに十分な様式で、および時間をかけて投与される特定の薬物の治療上有効量の全てまたは一部を含み、そしてここで用量を含む薬物の絶対量は薬物、被験体、身体区画ならびに医学および薬学および関連する分野の状態に鑑みて当業者が精通するその他の基準によって異なる。特定の実施態様では、少なくとも２用量の薬物を投与することができ、そして特定のその他の実施態様では抗体および薬物をおよそ等モル濃度で（すなわち現在の統計的に有意な検出限界による均等な濃度であり、標準偏差は１５％未満、好ましくは１０％未満、さらに好ましくは５％未満、なおさらに好ましくは３、２、１または０．１％未満である）投与することができる。その他の実施態様は、抗体および薬物を少なくともおよそ２：１、２．５：１、３：１、４：１、５：１または５：１より大きい抗体対薬物モル比で投与することを企図する。
【００４３】
本明細書で用いる液体医薬組成物は溶液、懸濁液の形態またはその他の同様の形態であっても、１つ以上の以下の佐剤を含み得る：注射用水、食塩水溶液、好ましくは生理学的食塩水、リンガー溶液、食塩水溶液（例えば生理食塩水、または等張、低張もしくは高張塩化ナトリウム）、溶媒もしくは懸濁培地として提供できる合成モノもしくはジグリセリドのような不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、またはその他の溶媒のような滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のようなバッファーおよび塩化ナトリウムまたはデキストロースのような張度を調整するための薬剤。非経口調製物をガラスもしくはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは反復投与用バイアルに封入することができる。生理学的食塩水は好ましい佐剤である。注射用医薬組成物は滅菌されているのが好ましい。調製物中に、限定するものではないがアルミニウム塩、油中水エマルジョン、生分解性油ベヒクル、水中油エマルジョン、生分解性マイクロカプセルおよびリポソームを含む分配ベヒクルのようなその他の構成成分を含むのも望ましい。
【００４４】
当業者に公知の任意の適当な担体を本発明の医薬組成物に用いることができるが、担体の型は投与の様式、および本発明による抗体により得られる生物薬理学的緩衝効果に加えて従来の薬物除放もまた望ましいかどうかに依存して異なる。薬物の追加注射のような非経口投与用に、担体は水、食塩水、アルコール、脂肪、ワックスまたはバッファーを含むのが好ましい。生分解性マイクロスフェア（例えばポリ酢酸ガラクチド）を本発明の医薬組成物に担体として用いることもできる。適当な生分解性マイクロスフェアは例えば米国特許第４，８９７，２６８号および第５，０７５，１０９号に開示されている。この点でマイクロスフェアがおよそ２５ミクロンよりも大きいのが好ましい。
【００４５】
医薬組成物はまたバッファーのような希釈剤、アスコルビン酸のような抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、グルコース、スクロースまたはデキストリンを含む炭水化物、ＥＤＴＡのようなキレート剤、グルタチオンならびにその他の安定剤および賦形剤をも含有し得る。中性の緩衝食塩水または非特異的血清アルブミンと混合した食塩水は適切な希釈剤の実例である。好ましくは、適切な賦形剤溶液（例えばスクロース）を希釈剤として用いて生成物を凍結乾燥物として処方する。
【００４６】
（身体区画）
身体区画は、液体連絡において身体のその他の領域から絶対的である必要はないが実質的に分離された、例えば組織または器官構造の生成物であるような、薄膜（例えば髄膜、心膜、胸膜、骨膜、関節包膜、粘膜、基底膜、腹膜、網、器官被包膜等）によりその他の身体部分から分離され得る空間的に定義された区画のような任意の定義された解剖学的区画を含み得る。本明細書に記載する特定の好ましい実施態様では、身体区画は物理的および生理学的に血液脳関門により循環から分離されており（Ｂｅｇｌｅｙ、Ｐｈａｒｍａｃａｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ．１０４：２９（２００４））、そして髄腔内、脳室内、実質、硬膜下、くも膜下または硬膜外により接近可能なＣＮＳ区画でよい。
【００４７】
簡単な背景としては、血液脳関門（ＢＢＢ）はたいていの物質のＣＮＳ侵入に大きく影響し（Ｈｅｉｄｅｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  ８０：４９７（１９９７））、そして積極的化学療法での脳腫瘍の処置の試みの失敗に関係している（Ｃａｓｔｒｏら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．９８：７１（２００３））。その目的は血液から脳を分離して脳機能および代謝の調節を補助することである。ＢＢＢは小型の（２００ダルトン未満）の親油性の非イオン化化合物以外の全ての侵入を制限する緊密な内皮細胞接合から成る。
【００４８】
脳脊髄液（ＣＳＦ）は脳室系およびくも膜下腔を満たす液体である。それは浸透作用および能動輸送の過程を介して脈絡叢により形成される。タンパク質は通常脈絡叢を通過できず、それは免疫物質のＣＳＦへの通過を防御する。ＣＳＦ流の方向は側脳室から脳室内孔、第３脳室、中脳水道を通り、そして第４脳室に向かう。次いでそれはくも膜下腔に入り、そこでは脳の表面のどこにでも自由に流れる。くも膜は増殖して硬膜内の空間に、または上矢状静脈洞に突出する分岐したくも膜絨毛の肉眼観察できる斑点を形成する。これらのくも膜下粒を介してＣＳＦは血管系に再吸収される。
【００４９】
髄腔内化学療法に用いられる現在利用可能な薬物は急速にＣＳＦから除去される（Ｊａｅｃｋｌｅら（２００２））という事実にもかかわらず、本出願は実質的に望ましい薬物濃度に類似する解離定数を有することに基づいて選択される緩衝抗体が、かかるクリアランスを遅延させることができ、それによりその望ましい濃度でまたはそれ近くで薬物を維持することができるという予期せぬ発見を開示する。また前記でも記したように、特定の好ましい実施態様は特に、限定するものではないが小細胞肺癌、腺癌、リンパ腫およびその他の悪性腫瘍に由来する転移を含む脳転移のようなＣＮＳ新生物の処置に特に有用である。
【００５０】
リガンド（例えば薬物）のインビボ抗体緩衝を実施できるさらなる身体区画には心膜、胸膜腔、眼窩後区画、眼（さらに前房、後房および硝子区画を含む）、関節包、嚢包、リンパ区画（例えば脾臓、胸腺およびリンパ節）、腹膜腔、鼻内区画、肺、および卵巣、前立腺および陰嚢のような泌尿生殖器区画、ならびにその他の比較的定義された身体区画が含まれる。身体区画の実例はまた解剖学的におよび薬物動態によりＯｈｎｉｎｇら、Ｎｅｏｎａｔａｌ．Ｎｅｔｗ．１４：７（１９９５）；Ｏｈｎｉｎｇら、Ｎｅｏｎａｔａｌ．Ｎｅｔｗ．１４：１５（１９９５）；ならびに米国特許第６，４１４，０３３号およびそこに引用された出版物（例えばＮｏｒｄｅｎｓｔｒｏｍ，Ｂ．Ｅ．、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ｃｌｏｓｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｎ  Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（１９８３）、ストックホルム、ノルディックメディカル出版；およびＥｖａｎｓ，Ｅ．Ｅ．、Ｓｃｈｅｎｔａｇ  Ｊ．Ｊ．、Ｊｕｓｋｏ  Ｗ．Ｊ．（編）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（１９９２）、第３版、バンクーバー、ワシントン州）にも記載されている。少なくとも１用量の薬物および少なくとも１つの抗体を投与する目的のために、確立された経路による身体区画への治療のための接近は、本明細書に記載するような治療方法による医学および獣医学の分野のレパートリー内である。
【００５１】
（抗体）
ペプチド、ポリペプチドおよび薬物に特異的に結合するその他の分子である抗薬物結合分子を含む抗体もまた本発明により企図される。かかる結合分子を本明細書に記載するような１つ以上の薬物の望ましい濃度範囲を維持するための方法において用いることができる。抗薬物結合分子のような抗体は、検出可能なレベルで薬物と反応する（例えば結合する）が、構造的に異なるまたは関連性のない分子とは検出可能なように反応しない場合に、特定の薬物に特異的に結合するとされている。したがって好ましい結合分子には、例えばポリクローナル、モノクローナル、一本鎖、キメラ、ヒト化、抗イディオタイプ、もしくはＣＤＲ移植免疫グロブリンでよい抗体、またはタンパク質溶解により作成されたもしくは組換えにより生成された免疫グロブリンＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖおよび／もしくはＦｄフラグメントのようなその抗原結合フラグメント、単一ドメイン抗体（「ｄＡｂ」；Ｈｏｌｔら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：４８４（２００３））ならびにダイアボディ（Ｈｕｄｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２３１：１７７（１９９９））が含まれる。本発明による抗体は任意の免疫グロブリンクラス、例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＡに属してよい。それは動物、例えば家禽（例えばニワトリ）または、限定するものではないがマウス、ラット、ハムスター、ウサギもしくはその他のげっ歯類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ヒトまたはその他の霊長類を含む哺乳動物から得られるか、またはそこから誘導することができる。抗体は内部移行型抗体でよいか、または抗体は細胞膜を通って容易に輸送され得るように修飾され得る。
【００５２】
特定の好ましい抗体は、薬物がその同族の特異的な薬物標的と相互作用するのを阻止、妨害または遮断するこれらの抗体である。当業者が容易に実行できる例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈殿、ラジオイムノアッセイ、免疫ブロッティング等を含む従来の免疫検出法を用いて、抗体の薬物への結合特性を一般的に評価することができる。当業者はまたかかる免疫検出法に精通しており、薬物リガンドの立体構造エピトープに結合する抗体を検出するために用いる場合、薬物を変性させる可能性があり、そしてしたがってリガンド立体構造エピトープを変化させるかまたは破壊し得る任意の試薬または条件を避けるのが好ましいであろう。
【００５３】
当分野において周知の、および本明細書に記載する方法を用いて所望による特定の薬物に特異的である、ポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体を含む抗体を作成することができる。また抗体を望ましい特性を有するように設計された、遺伝子操作された免疫グロブリン（Ｉｇ）またはＩｇフラグメントとして生成することもできる。例えば説明目的であり、限定するものではないが、抗体は第１の哺乳動物種からの少なくとも１つの可変（Ｖ）領域ドメインおよび第２の異なる哺乳動物種からの少なくとも１つの定常領域ドメインを有するキメラ融合タンパク質である組換えＩｇＧを含み得る（例えばＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ８１：６８５１−５５（１９８４）；Ｓｈｉｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４５９−７６（１９８９）；Ｗａｌｌｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２９２１−２９（１９９３）；米国特許第５，４８２，８５６号参照）。最も一般的には、キメラ抗体はネズミ可変領域配列およびヒト定常領域配列を有する。かかるネズミ／ヒトキメラ免疫グロブリンは、ヒト由来Ｖ領域フレームワーク領域およびヒト由来定常領域に、抗原に関する結合特異性を付与する、ネズミ抗体から誘導される相補性決定領域（ＣＤＲ）を移植することにより「ヒト化」されていてよい（例えばＪｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−２７（１９８８）；Ｐａｄｌａｎら、ＦＡＳＥＢ  ９：１３３−３９（１９９５）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：３７７−３８３（１９８９）；Ｂａｊｏｒａｔｈら、Ｔｈｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：９５−１０３（１９９５）；欧州特許第０５７８５１５−Ａ３号）参照）。これらの分子のフラグメントをタンパク質消化により、または場合によってはタンパク質消化に続いてジスルフィド結合の穏やかな還元およびアルキル化により作成することができる。これに代えて、かかるフラグメントを組換え遺伝子操作技術により作成することもできる（例えばＨａｒｒｉｓ，Ｗ．Ｊ．、Ａｄａｉｒ，Ｊ．Ｒ．（編）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（１９９７）、シーアールシープレス、ボカラトン、フロリダ州）。
【００５４】
免疫特異的である、または本明細書で提供するような薬物に特異的に結合する抗体は検出可能なレベルで薬物と反応し、そして異なるまたは関連性のない構造を有する分子とは反応せず、好ましくは約１０４Ｍ−１より大きいかまたはそれに等しい、さらに好ましくは約１０５Ｍ−１より大きいかまたはそれに等しい、さらに好ましくは約１０６Ｍ−１より大きいかまたはそれに等しい、そしてなおさらに好ましくは約１０７Ｍ−１より大きいかまたはそれに等しい親和定数Ｋａを有する。抗体とその同族抗原との親和性は一般に解離定数ＫＤとして表現され、そして抗薬物抗体が１０−４Ｍ未満もしくはそれに等しい、１０−５Ｍ未満もしくはそれに等しい、１０−６Ｍ未満もしくはそれに等しい、１０−７Ｍ未満もしくはそれに等しい、または１０−８Ｍ未満もしくはそれに等しいＫＤで結合する場合、それは薬物と特異的に結合する。結合パートナーまたは抗体の親和性を従来の技術、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ５１：６６０（１９４９））に記載されるものを用いて、または表面プラスモン共鳴（ビアコア、バイオセンサー、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）により容易に決定することができる。例えばＷｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：２５６０−２５６５（１９９３）参照。
【００５５】
一般に当業者に公知の種々の技術のいずれかにより抗体を作成することができる。例えばＨａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールドスプリングハーバーラボラトリー（１９８８）参照。かかる技術の１つでは、例えば確立された方法論に従って、適当なキャリア上のハプテンとして薬物を用いて動物を薬物の免疫原形態で、ポリクローナル抗血清を作成するための抗原として免疫する。適当な動物には例えばウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシが含まれ、そしてマウス、ラットおよびハムスターまたはその他の種のような小型哺乳動物種もまた含まれ得る。
【００５６】
免疫原は精製されたもしくは部分的に精製された薬物を含んでよいか、または（例えばポリペプチドまたはポリヌクレオチドまたは代謝産物である薬物に関して）薬物を発現するかもしくは薬物がその免疫原性を増強する様式で導入されている細胞からなってよい。ペプチドまたはポリペプチド薬物を標準的な組換え遺伝子方法論を用いて、もしくは天然発生タンパク質のタンパク質溶解切断により作成することができるか、または化学的に合成することができる。ペプチド薬物をポリアクリルアミドゲル電気泳動のような当分野において公知の技術、または液体クロマトグラフィーのようなその他の種々の分離方法のいずれか、またはその他の適当な方法論により単離することができる。
【００５７】
ポリペプチドまたはペプチドである薬物に対して抗体を上昇させるために、免疫原として有用なペプチドは典型的には、薬物配列からの少なくとも４または５個の連続したアミノ酸配列を有し、そして好ましくは薬物ポリペプチド配列の少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、１９または２０個の連続したアミノ酸配列を有し得る。特定のその他の好ましいペプチド免疫原は薬物ポリペプチド配列の２１−２５、２６−３０、３１−３５、３６−４０、４１−５０個またはそれより多い連続したアミノ酸配列を含み得る。また宿主動物において抗原応答を生じる可能性がより高いアミノ酸配列を決定するために、免疫に有用なポリペプチドまたはペプチドを当業者に公知の方法に従って薬物ポリペプチドの１次、２次および３次構造を分析することにより選択することもできる。例えばＮｏｖｏｔｎｙ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２０１−２０７（１９９１）；Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：９３２−４０（１９８５）；Ｃｈａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７：８６３−６８（１９９５）；Ｋｏｌａｓｋａｒら、Ｖｉｏｌｏｇｙ  ２６１：３１−４２  （１９９９））参照。好ましくはポリペプチドまたはペプチドは、その薬理学的活性形態で薬物ポリペプチドの立体構造に近似する様式でフォールディングするのに十分な数のアミノ酸を含む。
【００５８】
免疫原を調製し、そして当分野において周知の方法に従って動物を免疫することができる。例えばＨａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールドスプリングハーバーラボラトリー（１９８８）参照。定期的に動物を出血させ、収集した血液から血清を分離し、そしてＥＬＩＳＡまたはオクタロニー拡散アッセイ等のようなイムノアッセイで血清を分析して特異的抗体力価を決定することにより免疫応答をモニタリングすることができる。一度抗体力価が確立されると、動物を定期的に出血させてポリクローナル抗血清を集めることができる。次いで例えば親和性クロマトグラフィーにより、精製すべき（複数の）抗体の定常領域（重または軽鎖）に特異的に結合する黄色ブドウ球菌プロテインＡまたはプロテインＧを用いて、または適当な固体支持体に固定した薬物を用いてかかる抗血清から薬物に特異的に結合するポリクローナル抗体を精製する。
【００５９】
望ましい結合特異性を有するモノクローナル抗体を生成する不死化真核細胞系である、薬物およびハイブリドーマに特異的に結合するモノクローナル抗体もまた、例えばＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７６）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９（１９７５））の技術ならびに当業者が精通するそれの改良法を用いて調製することができる。動物、例えばラット、ハムスターまたはマウスを薬物または薬物免疫原で免疫し；抗体形成細胞、典型的には脾臓細胞を含むリンパ球系細胞を免疫した動物から入手し；そしてかかる細胞を選択薬剤感受性骨髄腫（例えば形質細胞腫）細胞融合パートナーとの融合により不死化することができる。
【００６０】
モノクローナル抗体をハイブリドーマ培養物の上澄から単離するか、またはモノクローナル抗体を含有する腹水の形成を促すように処理した（例えばプリスタン刺激した）マウスから単離することができる。モノクローナル抗体の特定の特性（例えば重または軽鎖アイソタイプ、結合特異性等）に基づいて選択された適切なリガンドを用いて親和性クロマトグラフィーにより抗体を精製することができる。固体支持体に固定された適当なリガンドの実例にはプロテインＡ、プロテインＧ、抗定常領域（軽鎖または重鎖）抗体、抗イディオタイプ抗体および特異的抗体に望ましい薬物抗原が含まれる。
【００６１】
ヒトモノクローナル抗体を当業者が精通するさまざまな技術により作成することができる。またヒト免疫グロブリンファージライブラリーから、ウサギ免疫グロブリンファージライブラリーから、および／もしくはニワトリ免疫グロブリンファージライブラリーから（例えばＷｉｎｔｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−５５（１９９４）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７：１９１−２８０（１９９４）；米国特許第５，２２３，４０９号；Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−８１（１９８９）；Ｓｃｈｌｅｂｕｓｃｈら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １６：４７−５２（１９９７）およびそこに引用された参照文献；Ｒａｄｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１３６６８−７６（２０００）；Ｐｏｐｋｏｖら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２５：３２５−３５（２００３）；Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４２：１５９−３１（２０００）参照）、またはリボソームディスプレイ（例えばＨａｎｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１４１３０（１９９８））もしくは酵母ディスプレイ（例えばＣｏｌｂｙら、Ｍｅｔｈｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３８８：３４８（２００４））等のようなその他の方法論により抗体を同定し、そして単離することもできる。ヒト以外の種またはヒト以外の免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体を本明細書に記載する、および当分野において公知の方法に従って遺伝子操作して抗体またはそのフラグメントを「ヒト化」することができる。
【００６２】
特定の実施態様では、抗薬物、薬物、または抗二重変異体薬物を含む抗変異体薬物抗体を生成する免疫動物からＢ細胞を選択し、そして当分野において公知の（国際公開公報第９２／０２５５１号；米国特許第５，６２７，０５２号；Ｂａｂｃｏｏｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７８４３−４８（１９９６））および本明細書に記載する分子生物学技術に従ってＢ細胞から軽鎖および重鎖可変領域をクローニングする。好ましくは薬物または二重変異体薬物に特異的に結合する抗体を生成する細胞を選択することにより、免疫動物からのＢ細胞を脾臓、リンパ節または末梢血試料から単離する。またＢ細胞をヒトから、例えば末梢血試料から単離することもできる。
【００６３】
抗体フラグメントは特異的抗原に結合して複合体を形成するという点で抗体のように作用する任意の合成または遺伝子操作されたタンパク質でもよい。例えば抗体フラグメントには軽鎖可変領域からなる単離されたフラグメント；重および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメント；軽および重可変領域がペプチドリンカーにより連結されている組換え一本鎖ポリペプチド分子（ｓｃＦｖタンパク質）；および超可変領域を擬似するアミノ酸残基からなる最小認識単位が含まれる。かかる抗体フラグメントは好ましくは少なくとも１つの可変領域ドメインを含む。（例えばＢｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；欧州特許第Ｂ１−０３１８５５４号；米国特許第５，１３２，４０５号；米国特許第５，０９１，５１３号；および米国特許第５，４７６，７８６号参照）
特定の実施態様では、薬物に特異的に結合する抗体は細胞内タンパク質として発現される抗体でよい。かかる細胞内抗体はまた細胞内発現抗体とも称され、そしてＦａｂフラグメントを含み得るか、または好ましくはｓｃＦｖフラグメントを含み得る（例えばＬｅｃｅｒｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：４７６４−４９（２００１）参照）。ＣＤＲ領域をフランキングするフレームワーク領域を修飾して発現レベルおよび細胞内の還元環境内での細胞内発現抗体の溶解性を改善することができる（例えばＷｏｒｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２７９５−８０３（２０００）参照）。例えば細胞内の特定の標的抗原をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能なように融合することができる細胞内発現抗体の可変領域をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを構築することにより、細胞内発現抗体を特定の細胞位置またはオルガネラに志向させることができる（例えばＧｒａｕｓ−Ｐｏｒｔａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５：１１８２−９１（１９９５）；Ｌｅｎｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：１１９６−２０５（２０００）参照）。遺伝子治療ベクター、または脂質混合物（例えばイムゲネックス社、サンディエゴ、カリフォルニア州により製造されたＰｒｏｖｅｃｔｉｎ（商標））を介するものを含む当業者に利用可能な種々の技術により、または光化学的内部移行法に従って細胞内発現抗体を細胞に導入することができる。
【００６４】
核酸切断、ライゲーション、形質転換、およびトランスフェクションに関する種々の周知の手順のいずれかに従って、本明細書に記載するような薬物に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドをさまざまな公知の発現ベクターを用いて増殖および発現させることができる。したがって特定の実施態様では、大腸菌のような原核細胞宿主における抗体フラグメントの発現が好ましい（例えばＰｌｕｃｋｔｈｕｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４９７−５１５（１９８９）参照）。特定のその他の実施態様では、酵母（例えばサッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベおよびピチア・パストリス）、菌類（例えばニューロスポラ・クロッサのようなアカパンカビ細胞）、動物細胞（哺乳動物細胞を含む）または植物細胞を含む真核宿主細胞において抗体またはそのフラグメントを発現させることができる。適当な動物細胞の実例には、限定するものではないが骨髄腫、ＣＯＳ、ＣＨＯ、またはハイブリドーマ細胞が含まれる。植物細胞の実例にはタバコ、トウモロコシ、ダイズおよびコメ細胞が含まれる。
【００６５】
薬物に特異的に結合する抗体を前記したような、抗体のＫｄを決定するためのアッセイのような抗体親和性を決定するためのアッセイにおいてスクリーニングして、身体区画において維持すべき薬物の望ましい濃度に実質的に類似するＫｄ値を有する抗体を同定することができる。そのようにして選択された、および薬物に特異的に結合する抗体を本明細書に記載した方法で用いて、被験体の身体区画を含む被験体において１つ以上の薬物の望ましい濃度範囲を維持することができる。
【００６６】
限定ではなく説明の目的で以下の実施例を提示する。
【実施例】
【００６７】
（実施例１）
（脳脊髄液中の抗体緩衝）
（方法）
抗体生成
抗ＯｘハイブリドーマＮＱ１１／７．１２は以前に記載されている（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：２７１−７５（１９８４）；Ｂｅｒｅｋら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１１２１−２９（１９８７））。対照（非Ｏｘ結合）ネズミ抗リゾチーム抗体Ｄ１．３（Ａｍｉｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：７４７−５３（１９８６））をも使用した。ハイブリドーマを振動気泡ローラーボトル中で成長させ（Ｐａｎｎｅｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４６：４３−４８（１９９２））、そしてプロテインＡ−セファロースの親和性クロマトグラフィーにより各々のモノクローナル抗体を使用済み培養上澄から精製した。純度を検証するために抗体に関してＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。紫外分光法により配列から計算した減衰係数を用いてタンパク質濃度を決定した（Ｐｅｒｋｉｎｓ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５７：１６９−８０（１９８６））。抗体溶液をフィルター滅菌し、そして窒素下で４℃で保存した。
【００６８】
トリチウム標識した２−フェニル−オキサゾール−５−オン−γ−アミノブチラート抱合体（Ｏｘ）の調製
本質的にＢｅｒｅｋら（前出）に記載されるように粗製Ｏｘを調製した。３Ｈ−γ−アミノ酪酸（ＧＡＧＡ）（１ｍＣｉ／ｍｌ）をパーキンエルマーライフサイエンシズ社（ウェルズリー、マサチューセッツ州）から入手し、そして未標識ＧＡＢＡ（１Ｍ  ＮａＨＣＯ３中０．５ｍＭ）および４−エトキシ−メチレン−２−フェニル−オキサゾリン−５−オン（アセトン中３６．２６ｍｇ／ｍｌ）の溶液を調製した。未標識ＧＡＢＡ溶液５μｌを氷上で３Ｈ−ＧＡＢＡ  ５０μｌと混合した。４−エトキシ−メチレン−２−フェニル−オキサゾリン−５−オン溶液１０μｌを加え、そして反応混合物をときどき手動で混合しながら１時間氷上に置いた。次いでさらに４−エトキシ−メチレン−２−フェニル−オキサゾリン−５−オン溶液１１μｌを加え、そして反応混合物を氷上で２０分間放置した。未標識ＧＡＢＡ溶液５μｌを加え、そして反応物を高速で混合しながら２０時間室温にした。次いで濃酢酸１μｌを加え；得られた沈殿物をサーモサバントＳＰＤ１０１０スピードバックシステム中で加熱せずに乾燥させた。乾燥した沈殿物をＰＢＳに溶解した（２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４／１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）。
【００６９】
得られたＯｘ生成物をＨＰＬＣを用いて精製した。０．１Ｍギ酸アンモニウム（ｐＨ４．８）（可動相Ａ）およびアセトニトリル（可動相Ｂ）を使用前に０．２ミクロンフィルターを通して減圧ろ過した。アジレントテクノロジーズの分析用ガードカラムを伴うゾルバックスＳＢ−Ｃ１８  ＨＰＬＣカラムにＯｘを適用し、そして０．１Ｍギ酸アンモニウム（ｐＨ４．８）（可動相Ａ）およびアセトニトリル（可動相Ｂ）で溶出した。９．５％から７０％可動相Ｂのグラジエントを流速０．５ｍｌ／分で２６分間かけて流し、そして３４８ｎｍの波長を用いて容離液をモニタリングした。Ｏｘピークは２０．５分に溶出された。そのピークに収集された分画のシンチレーションカウンティングによりその同一性を確認した。Ｏｘピークからプールした分画を加熱せずにスピードバックシステムで乾燥させた。乾燥後残留物をＰＢＳ  １ｍｌに再懸濁した。Ｏｘの放射化学的純度をＨＰＬＣにより確認した。定量的ＨＰＬＣおよび紫外分光法の双方により濃度を決定した。Ｏｘ  １μｌをシンチバースＩＩ（フィッシャーサイエンティフィック）５ｍｌに希釈し、そしてベックマンＬＳ６５００シンチレーションカウンターで計数することにより特異活性を決定した。Ｏｘの特異活性は４．２×１０６ｃｐｍ／ナノモルであった。
【００７０】
３７℃での抗Ｏｘ抗体親和性の決定
パーキンエルマーＬＳ５０Ｂ発光分光計を用いて蛍光分光法により（ＦｏｏｔｅおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：５３０−３２（１９９１））抗体親和性を決定した。３７℃に加熱した水浴を循環させることによりキュベットブロックの温度制御を維持した。ＰＢＳ中２０ｎＭ  ＮＱ１１／７．１２を含有するキュベットを分光計内に置き、そして３７℃に平衡させた。３０μｇ／ｍｌユビキチンをキャリアとして加えた。帯域幅５ｎｍの励起波長２８０ｎｍおよび帯域幅１０ｎｍの発光波長３４０ｎｍを積分時間８秒で用いた。４０ｎＭ増でＯｘ−ＧＡＢＡ溶液を加え、そして平衡になる時間を見越して蛍光の読みを行った。得られた濃度／蛍光の読みを最小二乗法（ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７−９９（１９９２））により分析して各抗体のＫｄを決定した。
【００７１】
動物
雄スプラーグドーリーラット（３００ｇ）をジビックラボラトリーズ社（ゼリエノープル、ペンシルバニア州）から入手した。各ラットは注射用に右側脳室にカニューレおよび脳脊髄液（ＣＳＦ）試料採取のために大槽に第２カニューレを設置するための手術を施された。簡単にはラットを２．５％イソフルランで麻酔し、そして定位固定装置内で固定した。加熱パッドにより通常の体温を維持した。正中線切開により前頭、頭頂および後頭骨を暴露した。ラットの定位図譜から得られた座標（ブレグマから１．８ｍｍ後側、３．８ｍｍ外側および４ｍｍ腹側）を用いて側脳室を位置決定した（Ｐａｘｉｎｏｓら、Ｔｈｅ  Ｒａｔ  Ｂｒａｉｎ  ｉｎ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ（アカデミックプレス  １９９８））。頭蓋骨にドリルで孔を開け、カニューレを挿入し、そしてベトボンド（スリーエム、ミネアポリス、ミネソタ州）および歯科用セメントを用いて頭蓋骨に固定した。脳槽カニューレ用に、上矢状静脈洞の穿孔を避けるために後頭稜のちょうど後ろおよび中線の少し左にドリルで孔を開けた。頭蓋骨の底部の下２ｍｍの深さまでカニューレを挿入し、そしてベトボンドおよび歯科用セメントを用いて固定した。ネジ口カニューレダミーワイヤーをカニューレガイドに挿入して閉鎖系を維持した。脳室内注射の前少なくとも２４時間はラットを回復させた。
【００７２】
大槽（ＣＭ）の同一部位を介する注射およびＣＳＦ採取を行うための実験では、雄スプラーグドーリーラット（２５０ｇ）をチャールズリバーラボラトリーズ（ウィルミントン、マサチューセッツ州）から入手した。これらのラットは前記したものに類似する手順を用いて大槽に埋め込まれた単一のカニューレを有した。カニューレの閉塞の危険性を低減させるために、到着後実験前にラットを休ませるのはせいぜい３日間であった。
【００７３】
抗体緩衝プロトコール
注射用の試料を調製した：抗Ｏｘ抗体１０４ピコモルおよびＯｘ５２ピコモル；Ｄ１．３対照抗体１０４ピコモルおよびＯｘ５２ピコモル；ならびにＯｘ５２ピコモル単独。各試料を滅菌ＰＢＳで１０μｌまで希釈した。試料を３７℃まで加温し、そして次にスプラーグドーリーラットの脳室内または脳槽カニューレを通して１分間にわたって注入した。注入の終わりをゼロ（０）時と称した。種々の時点でＣＳＦ  １０μｌを採取した。ラット１組に関してＣＳＦ  １０μｌを、シンチバースＩＩ  ５ｍｌに入れ、そしてベックマンＬＳ６５００シンチレーションカウンター中で計数することにより直接計数した。ラットの別の組に関してＣＳＦ  １０μｌを氷冷ＰＢＳ  １００μｌに希釈し、そして以下に記載する結合対遊離Ｏｘ実験で用いた。
【００７４】
１８７．１セファロース親和性樹脂を用いる結合および遊離Ｏｘの分離
ラット抗マウスカッパ抗体１８７．１（アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、マナサス、バージニア州）（Ｙｅｌｔｏｎら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １：５−１１（１９８１））を使用済み培養培地から単離し、そしてプロテインＡ−セファロース親和性カラムを通過させることにより精製した。ＣＮＢｒ活性化セファロース４ファストフロー（アメルシャムバイオサイエンシズ）１０ｇを洗浄し、そして製造者のプロトコールに従って１８７．１と結合させた。膨潤した樹脂１０ｇあたり１８７．１を２ｍｇ使用した。
【００７５】
抗体緩衝実験の間、ＣＳＦ＋氷冷ＰＢＳ試料を希釈後すぐに１８７．１カラムに負荷した。０．５ｍｌずつ増量して３ｍｌのＰＢＳをカラムに適用した後、０．５ｍｌずつ増量して３ｍｌの０．２Ｍグリシン（ｐＨ２．５）を適用した。全てのＰＢＳ分画および全てのグリシン分画を各時点で別個に収集し、そしてスピードバック内で乾燥させた。残留物をＰＢＳ  １５０μｌに再懸濁し、そして次にシンチバースＩＩ  ５ｍｌの入ったシンチレーションバイアルに移して計数した。
【００７６】
長時間抗体緩衝プロトコール
ＮＱ１１／７．１２およびＯｘの試料およびＯｘを調製し、そして抗体緩衝プロトコールに関して前記したようにチャールズリバーラボラトリーズからのスプラーグドーリーラットの脳槽カニューレに注入した。１、１０、２０、３０、６０、９０および１２０分にＣＳＦ  １０μｌを大槽から採取した。ＣＳＦ試料１０μｌを直接的または氷冷ＰＢＳ１００μｌに希釈してのいずれかで計数し、そして１８７．１カラムに負荷して結合および遊離Ｏｘを分離した。最初の投与後２４時間および４８時間に、全容量１０μｌ中Ｏｘ５２ピコモル（滅菌ＰＢＳで希釈）を大槽カニューレを通して１分間かけて注入した。再度時点を取り、そして前記したように分析した。
【００７７】
大槽からの抗Ｏｘ抗体の薬物動態分析
Ｏｘに特異的に結合する動態学的に特徴的なモノクローナル抗体（ＮＱ１１／７．１２）（ＦｏｏｔｅおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、前出）を用いて抗Ｏｘ抗体のＣＳＦへの添加の影響を試験した。この抗体の親和性を前記したような蛍光分光法を用いて３７℃で決定し、そして１．３ｎＭであることが判明した（ＮＱ１１／７．１２）。アイソタイプ適合（ＩｇＧ１）抗鶏卵リゾチーム抗体、Ｄ１．３（Ａｍｉｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：７４７−５３（１９８６））を対照として使用した。これらの研究で各ラットを一度だけ用いてラット抗マウス抗体応答の可能性を制限した。
【００７８】
クロラミンＴ法を用いてＮＱ１１／７．１２を１２５Ｉでヨウ素化した（Ｈｕｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  １９４：４９５−９６（１９６２）；ＭｃＣｏｎａｈｅｙら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７０（Ａ）：２１０−１３（１９８０）参照）。ヨウ素の抗体への取り込みは９７％であり、そして抗体溶液の特異活性は１．２５×１０６ｃｐｍ／μｇであった。１２５Ｉ−ＮＱ１１／７．１２（２１．３ピコモル）を未標識ＮＱ１１／７．１２と最終量１．０４ナノモルまで混合した。試料を手でチャールズリバーラットの脳槽カニューレを通して１分間かけて注入し、そしてカニューレを生理食塩水２μｌで流した。注入の終わりをゼロ（０）時と称した。種々の時点でＣＳＦ  １０μｌを脳槽カニューレから採った。パッカードコブラ・オートガンマを用いて全ＣＳＦ試料を計数してＣＳＦ中のＮＱ１１／７．１２の濃度を決定した。データを図１に示す。ＣＳＦ中の抗Ｏｘモノクローナル抗体（ＮＱ１１／７．１２）はたいていの薬物の薬物動態存続時間よりも有意に長い半減期を有した。ＮＱ１１／７．１２の濃度はＣＳＦから１時間の排泄半減期でゆっくりと下降した。この速度はＣＳＦバルク流の速度に類似したが、Ｏｘの速度よりも有意に長かった。
【００７９】
ラットＣＳＦ中のＯｘ存続時間に及ぼすＮＱ１１／７．１２の影響
ＣＳＦ中のＯｘの薬物動態的挙動を決定するために、トリチウム標識したＯｘをその脳室内カニューレを通してラットに注入し、そして大槽（ＣＭ）カニューレからのＣＳＦ試料採取によりＯＸの排泄を追跡した。大槽が最大のＣＳＦ区画であるのでそこから試料採取を行った。小脳および脳幹上部の間のその位置ならびにその大きさにより、試料採取およびシンチレーション計数のためのＣＳＦへの接近が比較的容易になる（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１６：９９−１０７（２００２））。
【００８０】
５匹のラットの１組に関して、脳室内カニューレを通してＯｘを単独で、または２倍モル量のＮＱ１１／７．１２を伴うかのいずれかで投与した。特異的抗体ＮＱ１１／７．１２の存在下で、脳槽ＣＳＦ試料採取により、それがＣＭに入り、ほぼ５分で濃度がピークに達し、そして次に排泄されたときのＯｘ濃度の上昇および下降が示された。ＮＱ１１／７．１２の不在下でＯｘの濃度は急速に下降し、大槽からの半減期は１．２分であった（図２）。この短い存続時間によりＣＳＦのバルク流よりもさらに速い機構による排泄が示された。抗体バッファーを伴って投与されたＯｘはＣＭにおけるピーク濃度に決して到達しなかった。むしろＯｘが実にＣＭに達する前に排泄されてしまった。
【００８１】
第２の実験では、ラット脳槽カニューレを通してＯｘを注入した。Ｏｘを再度２倍モル量のＮＱ１１／７．１２または対照抗体と同時投与した。図３に示すように、ＮＱ１１／７．１２を伴うＯｘの投与により、Ｏｘ滞留時間が有意に延長されてＯｘ排泄半減期が１０分であることが示された。Ｄ１．３と共に投与されたＯｘは半減期１．０分でＣＳＦから排泄された。半減期のこの１０倍増加は、ＮＱ１１／７．１２結合がＣＳＦからのＯｘ排泄と拮抗していることを示している。
【００８２】
遊離Ｏｘ濃度に及ぼすＮＱ１１／７．１２の影響
化学平衡の原理により、ＣＳＦ中のＯｘが遊離形態と抗体結合形態の間で分割され、そして遊離プールは絶えず補給されて抗体Ｋｄに近い濃度を保つはずであることが予測される。別のラットの組からのＣＳＦ試料中のＯｘを、親和性カラムを通過させることにより結合形態および遊離形態に分離した。Ｏｘと同時投与したＤ１．３からの試料を並行して処理したが、有意な抗体結合標識は予測または見出されなかった。抗体−Ｏｘ複合体は固定したラット抗マウスカッパ抗体に結合したが、遊離ＯｘはＰＢＳ洗浄でカラムから溶出された（遊離Ｏｘ分画）。
【００８３】
この分析により、図４で示すように、ＯｘをＤ１．３と共に投与しようと、ＮＱ１１／７．１２と共に投与しようと、Ｏｘの遊離プールはラットＣＳＦ中に存在したことが確認された。Ｏｘを単独でまたはＤ１．３と共に初期に投与したときには、遊離Ｏｘの量は高かった（１．４ｍＭ）が、１時間で５００倍と急速に減少し、排泄半減期は０．６１分であった。しかしながら、ＯｘをＮＱ１１／７．１２共に投与したときには、Ｏｘの初期遊離濃度は低かった（６０ｎＭ）。この低濃度は長時間にわたってかなり安定し（およそ６ｎＭまで１０倍未満の低下）、Ｏｘ排泄半減期は１．５５分であった。したがって、ＮＱ１１／７．１２は本明細書に記載したリガンドの抗体緩衝の平衡原理に従って、遊離Ｏｘを緩衝していると考えられた。
【００８４】
長時間抗体緩衝
これらの実験に関して、ＮＱ１１／７．１２を一度だけ投与した。ＯｘをＮＱ１１／７．１２と初期に同時投与し、そしてＯｘ単独のさらなるアリコートを２４時間および４８時間に脳槽カニューレを通して投与した。脳槽ＣＳＦ試料を収集してＣＳＦからの全Ｏｘ排泄を追跡した。図５Ａに示すように、２４時間および４８時間に投与したＯｘの薬物動態半減期により、ＯｘをＮＱ１１／７．１２と共に初期に投与した場合に観察されたプロフィールと、Ｄ１．３と共に投与した場合のＯｘプロフィールとの間の動態プロフィールが示された。非限定的な理論によればこの観察は、長時間にわたる循環抗体の緩徐なクリアランスに起因した可能性があった。ＣＳＦ試料の別の組で遊離対結合Ｏｘ分離もまた実施し；データを図５Ｂに示す。初期の遊離Ｏｘ濃度は２４時間および４８時間で、Ｏｘを抗体バッファーと組み合わせて投与した場合よりも高かった。しかしながら、この遊離濃度は減少し、そしてＯｘは、ＯｘをＤ１．３と共に投与した場合よりも緩徐な排泄プロフィールを示した。この観察は明らかに、初期遊離Ｏｘ濃度が高いときにＯｘと初期結合した抗体の結果であり、そして次に抗体は続いて長時間にわたってＯｘを放出した。したがって、本明細書に記載したリガンドの抗体緩衝の平衡原理に従って、抗Ｏｘ抗体は初期抗体注入の後日のＣＳＦ中の遊離Ｏｘの濃度を緩衝することができた。
【００８５】
（実施例２）
（小型分子の抗体緩衝）
（方法）
抗体
３つの抗Ｏｘハイブリドーマ（ＮＱ１１／７．１２、ＮＱ１６／１１３．８、ＮＱ２２／１６．４）のパネルは以前に記載されている（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、前出；Ｂｅｒｅｋら、前出）。対照（非Ｏｘ結合）ネズミ抗リゾチーム抗体、Ｄ１．３（Ａｍｉｔら、前出）もまた使用した。これらのハイブリドーマを振動気泡ローラーボトル中で成長させ（ＰａｎｎｅｌｌおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、前出）、そしてプロテインＡ−セファロースの親和性クロマトグラフィーにより使用済み培養上澄から各々のモノクローナル抗体を精製した（実施例１もまた参照）。抗体に関してＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施して純度を検証した。紫外線分光法により配列から計算した減衰係数を用いてタンパク質濃度を決定した（Ｐｅｒｋｉｎｓ前出）。抗体溶液をフィルター滅菌し、そしてＮ２下４℃で保存した。
【００８６】
トリチウム標識した２−フェニル−オキサゾール−５−オン−γ−アミノブチラート抱合体（Ｏｘ）の調製
実施例１に記載するように粗製Ｏｘを調製した（Ｂｅｒｅｋら、前出）。３Ｈ−γ−アミノ酪酸（ＧＡＧＡ）（１ｍＣｉ／ｍｌ）をパーキンエルマーライフサイエンシズ社から入手し、そして未標識ＧＡＢＡ（１Ｍ  ＮａＨＣＯ３中０．５ｍＭ）および４−エトキシ−メチレン−２−フェニル−オキサゾリン−５−オン（アセトン中０．１７Ｍ）の溶液を調製した。未標識ＧＡＢＡ溶液５μｌを氷上で３Ｈ−ＧＡＢＡ  ５０μｌと混合した。４−エトキシ−メチレン−２−フェニル−オキサゾリン−５−オン溶液１０μｌを加え、そして反応混合物をときどき手動で混合しながら１時間氷上に置いた。次いでさらに１４−エトキシ−メチレン−２−フェニル−オキサゾリン−５−オン溶液１１μｌを加え、そして反応混合物を氷上で２０分間放置した。未標識ＧＡＢＡ溶液５μｌを加え、そして反応物を高速で混合しながら２０時間室温にした。次いで濃酢酸１μｌを加え；得られた沈殿物をサーモサバントＳＰＤ１０１０スピードバックシステム中で加熱せずに乾燥させた。乾燥した沈殿物をＰＢＳに溶解した（２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４／１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）。
【００８７】
得られたＯｘ生成物をＨＰＬＣを用いて精製した。０．１Ｍギ酸アンモニウム（ｐＨ４．８）（可動相Ａ）およびアセトニトリル（可動相Ｂ）を使用前に０．２ミクロンフィルターを通して減圧ろ過した。アジレントテクノロジーズの分析用ガードカラムを伴うゾルバックスＳＢ−Ｃ１８  ＨＰＬＣカラムにＯｘを適用し、そして０．１Ｍギ酸アンモニウム（ｐＨ４．８）（可動相Ａ）およびアセトニトリル（可動相Ｂ）で溶出した。９．５％から７０％可動相Ｂのグラジエントを流速０．５ｍｌ／分で２６分間かけて流し、そして３４８ｎｍの波長を用いた。Ｏｘピークは２０．５分に溶出した。そのピークに収集された分画の放射活性を測定することによりその同一性を確認した。Ｏｘピークからプールした分画を加熱せずにサーモサバントＳＰＤ１０１０スピードバックシステムで乾燥させた。乾燥後残留物をＰＢＳ  １ｍｌに再懸濁した。Ｏｘの放射化学的純度をＨＰＬＣにより確認した。定量的ＨＰＬＣおよび紫外分光法の双方により濃度を決定した。Ｏｘ  １μｌをシンチバースＩＩ（フィッシャーサイエンティフィック）５ｍｌに希釈し、そしてベックマンＬＳ６５００シンチレーションカウンターで計数することにより特異活性を決定した。Ｏｘの特異活性は４．４×１０６ｃｐｍ／ナノモルであった。
【００８８】
３７℃での抗Ｏｘ抗体親和性の決定
実施例１に記載するようにパーキンエルマーＬＳ５０Ｂ発光分光計を用いて蛍光分光法により（ＦｏｏｔｅおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、前出）抗体親和性を決定した。３７℃に加熱した水浴を循環させることによりキュベットブロックの温度制御を維持した。ＰＢＳ中２０ｎＭ（ＮＱ１１／７．１２）または２００ｎＭ（ＮＱ１６／１１３．８またはＮＱ２２／１６．４）のいずれかを含有するキュベットを分光計内に置き、そして３７℃に平衡させた。ＮＱ１１／７．１２の場合、３０μｇ／ｍｌユビキチンをキャリアとして加えた。帯域幅５ｎｍの励起波長２８０ｎｍおよび帯域幅１０ｎｍの発光波長３４０ｎｍを積分時間８秒で用いた。４０ｎＭ増でＯｘ−ＧＡＢＡ溶液を加え、そして平衡になる時間を見越して蛍光の読みを行った。得られた濃度／蛍光の読みを最小二乗法（ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ、前出）により分析して各抗体のＫｄを決定した。
【００８９】
ラット血漿中の抗Ｏｘ抗体半減期の決定
クロラミンＴ法を用いてＮＱ１１／７．１２を１２５Ｉでヨウ素化した（ＨｕｎｔｅｒおよびＧｒｅｅｎｗｏｏｄ、前出；ＭｃＣｏｎａｈｅｙおよびＤｉｘｏｎ、前出）。ヨウ素の抗体への取り込みは９７％であり、そして抗体溶液の特異活性は１．２５×１０６ｃｐｍ／μｇであった。ラット（３００ｇ雄スプラーグドーリーラット（ジビックラボラトリーズ社、ゼリエノープル、ペンシルバニア州））に頸静脈カニューレを埋め込んだ。納入後実験開始前に少なくとも７２時間動物を休ませ、そして実験中自由に運動させた。１２５Ｉ−ＮＱ１１／７．１２（０．３９ナノモル）を未標識ＮＱ１１／７．１２と最終量４．５４ナノモルまで混合した。この量をさらに最終容量１ｍｌまで滅菌ＰＢＳで希釈した。試料を手で頸部カニューレを通して１分間かけて注入し；カニューレをヘパリン添加した食塩水（２５０単位／ｍｌ）０．２ｍｌで流して凝固の危険性を低減させた。注入の終わりをゼロ（０）時と称した。種々の時点で血液試料（０．４ｍｌ）をカニューレから採った。即座に血液を遠心して血漿を分離した。血漿１００μｌをパッカードコブラ・オートガンマを用いて計数して血漿中のＮＱ１１／７．１２の濃度を決定した。
【００９０】
抗体緩衝実験
注射用の試料を調製した：抗Ｏｘ抗体４．５４ナノモルおよびＯｘ２．２７ナノモル；Ｄ１．３対照抗体４．５４ナノモルおよびＯｘ２．２７ナノモル；または抗体なしおよびＯｘ２．２７ナノモル。各試料を滅菌ＰＢＳで１ｍｌまで希釈した。試料を３７℃まで加温し、そして次に前記したようにスプラーグドーリーラットの頸静脈カニューレを通して１分間にわたって注入した。種々の時点で血液０．４５ｍｌを採り、そして即座に遠心して血漿を分離した。シンチバースＩＩ  ５ｍｌに血漿を入れ、そしてベックマンＬＳ６５００シンチレーションカウンター中で計数することにより血漿１００μｌを直接計数した。血漿１００μｌを以下に記載する結合対遊離Ｏｘ実験で用いた。幾匹かのラットに関して血漿を除いた血液０．１ｍｌを分析した。これらの試料を最初にシンチゲスト（フィッシャーサイエンティフィック）：イソプロパノール（１：２容量／容量）０．３ｍｌ中４０℃で１時間インキュベートすることにより脱色した。次いで３０％  Ｈ２Ｏ２  ０．２ｍｌを滴加し、そして溶液を室温で１５分間インキュベートした。いくつかの塊を崩壊させるために上下にピペッティングする必要があった。溶液を４０℃でインキュベートした後、シンチバースＩＩ  ５ｍｌ中に入れた。計数前に試料を一晩放置して化学発光を低減させた。分析を補助するために既知量のＯｘを用いて対照試料を調製した。
【００９１】
１８７．１セファロース親和性樹脂を用いる結合および遊離Ｏｘの分離
ラット抗マウスカッパ抗体１８７．１（実施例１参照）を使用済み培養培地から単離し、そしてプロテインＡ−セファロース親和性カラムを通過させることにより精製した。ＣＮＢｒ活性化セファロース４ファストフロー（アメルシャムバイオサイエンシズ）１０ｇを洗浄し、そして製造者のプロトコールに従って１８７．１と結合させた。膨潤した樹脂１０ｇあたり１８７．１を２ｍｇ使用した。
【００９２】
抗体緩衝実験の間、血漿１００μｌを遠心後すぐに１８７．１カラムに負荷した。ＰＢＳ  ３ｍｌに続いて０．２Ｍグリシン（ｐＨ２．５）３ｍｌを実施例１に記載するようにカラムに適用した。全てのＰＢＳ分画および全てのグリシン分画を各時点で別個に収集し、そしてスピードバック内で乾燥させた。残留物をＰＢＳ  １５０μｌに再懸濁し、そして次にシンチバースＩＩ  ５ｍｌの入ったシンチレーションバイアルに移して計数した。
【００９３】
長時間抗体緩衝実験
ＮＱ１１／７．１２およびＯｘの試料を調製し、そして前記したようにスプラーグドーリーラットに注入した。１、１０、２０、５０、９０および１２０分に血液試料（０．４ｍｌ）を採取した。血漿１００μｌを直接計数し、そして１００μｌを１８７．１カラムに入れて結合および遊離Ｏｘを分離した。最初の投与後２４時間および再度４８時間に、ＰＢＳ  ０．５ｍｌ中Ｏｘ２．２７ナノモルを頸部カニューレを通して１分間かけて注入した。再度時点を取り、そして前記したように分析した。
【００９４】
ラット血漿中のＯｘ存続時間に及ぼすＮＱ１１／７．１２の影響
薬物動態的挙動を決定するために、トリチウム標識したＯｘを頸部カニューレを通してラットに注入し、そして血液試料採取、遠心による血漿の分離、および血漿のシンチレーションカウンティングによりＯｘの排泄を追跡した。Ｏｘの濃度は急速に下降し、血漿からの半減期は１．２分であった。
【００９５】
Ｏｘに特異的に結合する３つの動態学的に特徴的なモノクローナル抗体の親和性を蛍光分光法を用いて３７℃で決定し、そして１．３ｎＭ（ＮＱ１１／７．１２）、４６ｎＭ（ＮＱ１６／１１３．８）および４２ｎＭ（ＮＱ２２／１６．４）であった。アイソタイプ適合（ＩｇＧ１）抗鶏卵リゾチーム抗体Ｄ１．３を対照として使用した。これらの研究で各ラットを一度だけ用いてラット抗マウス抗体応答の可能性を制限した。様々な抗体と共に投与した場合のＯｘの薬物動態パラメーターを表１に示す。
【００９６】
【表１】
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抗体は１つにはたいていの薬物の存続時間よりも遙かに長い、その長い血漿半減期のために魅力的な治療用ベヒクルであった。放射性ヨウ素化モノクローナル抗体ＮＱ１１／７．１２の血漿中の滞留時間を決定した。ＮＱ１１／７．１２抗体をラットに注入し、そしてＮＱ１１／７．１２の排泄を血液試料採取、遠心による血漿の分離、および血漿のガンマ計数により追跡した。ＮＱ１１／７．１２の濃度はゆっくりと下降し、血漿からの排泄半減期は２０時間であった。この存続時間は非常に長いので、抗Ｏｘ抗体濃度は記載した場合を除いて全薬物動態研究の経過中に、抗Ｏｘ抗体濃度は効果的に一定であった（２００±３０ｎＭ）。
【００９７】
Ｏｘを２倍モル量のＮＱ１１／７．１２または対照抗体を伴ってラット頸部カニューレを通して投与した。図６に示すように、ＮＱ１１／７．１２を伴うＯｘの投与により、Ｏｘ存在時間の有意な延長が示され、Ｏｘ排泄半減期は２０±２分であった。２つの曲線の比較により、対照のＯｘの多くは最初の時点で試料採取される前に血漿から除去されたことが示された。Ｄ１．３と共に投与された残りのＯｘにより二相性の排泄動態が示され；ほとんどが１．２±０．２分の半減期で血漿から排泄され、そして少量が１０±２分の半減期であった。抗Ｏｘ抗体と共に投与した場合のＯｘの半減期の１７倍の増加により、ＮＱ１１／７．１２結合が血漿からのＯｘ排泄と拮抗していることが示された。対照として、細胞がＯｘの有意な貯蔵所であるかどうかを決定するために血液の細胞分画でも分析を実施した。細胞分画でのＯｘ濃度は血漿中の全Ｏｘ濃度の１−２％の間の範囲であり、これによりこの分画には有意な量のＯｘが保持されなかったことが示された。動物被験体では副作用は指摘されなかった。
【００９８】
遊離Ｏｘ濃度に及ぼすＮＱ１１／７．１２の影響
動物からの血漿分画におけるＯｘの結合形態および遊離形態を親和性カラムで分離した。同時投与したＤ１．３から得られた試料を並行して処理したが、有意な抗体結合標識は予測または見出されなかった。抗体−Ｏｘ複合体を捕捉するために固定したラット抗マウスカッパ抗体を使用したが、遊離ＯｘはＰＢＳ洗浄でカラムから溶出された（遊離Ｏｘ分画）。
【００９９】
この分析により、ＯｘをＤ１．３と共に投与しようと、ＮＱ１１／７．１２と共に投与しようと、Ｏｘの遊離プールがラット血漿中に存在したことが確認された（図７）。Ｏｘを単独でまたはＤ１．３と共に初期に投与した場合の初期遊離Ｏｘ量は高かった（６．８ｎＭ）が、急速に減少し、排泄半減期は６．０±１分であった。しかしながら、ＯｘをＮＱ１１／７．１２共に投与した場合の初期Ｏｘ遊離濃度は低かった（２．２ｎＭ）。この低濃度は長時間にわたってかなり安定し、Ｏｘ排泄半減期は４１±６分であった。したがって、ＮＱ１１／７．１２の存在は本明細書に記載したリガンドの抗体緩衝の平衡原理に従って、遊離Ｏｘを緩衝していると考えられた（非限定的な理論に従う）。図７に示す、緩衝された遊離Ｏｘ濃度は１時間の間に血漿中で２．２ｎＭから０．８ｎＭまで下降したが、緩衝されなかったＯｘの半分以上が最初の時点の試料採取の前に血漿から排泄された。２．２ｎＭおよび０．８ｎＭ終点はＮＱ１１／７．１２のＫｄ（１．３Ｍ）を挟んでいる。
【０１００】
ラット血漿中のＯｘ存在時間に及ぼす抗体Ｋｄの影響
抗体Ｋｄと血漿からのＯｘ排泄を遅延させる抗体の能力との間の相関性を決定した。この実験のために、３つの抗Ｏｘ抗体ＮＱ１１／７．１２、ＮＱ１６／１１３．８およびＮＱ２２／１６．４を使用した。ＮＱ１６／１１３．８およびＮＱ２２／１６．４は各々Ｏｘに関して類似のＫｄを有し、それはＮＱ１１／７．１２のものよりも有意に高かった（表１参照）。ＯｘをＮＱ１６／１１３．８またはＮＱ２２／１６．４のいずれかと共にラットに投与した。全Ｏｘ濃度を血液試料採取により測定した（図８Ａ）。比較のためにＮＱ１１／７．１２またはＤ１．３と共に投与したＯｘの濃度をも図８Ａに示す。ＮＱ１６／１１３．８およびＮＱ２２／１６．４の双方は血漿からの全Ｏｘ排泄を遅延させた。このＯｘ半減期の増加は、Ｏｘとの親和性がより高いＮＱ１１／７．１２と共に投与した場合のＯｘ半減期の増加の程度に近似しなかった。したがって、抗体Ｋｄは血漿中の全Ｏｘの排泄速度と相関した。
【０１０１】
加えて、図８Ｂに示すように抗体Ｋｄはラット血漿中のＯｘの遊離プールに影響を及ぼした。血漿をラット抗マウスカッパ抗体親和性カラムに負荷し、そして遊離および結合Ｏｘ分画を溶出した。ＮＱ１６／１１３．８またはＮＱ２２／１６．４と共に投与したＯｘの遊離濃度（１０と１６ｎＭの間）は初期にはＮＱ１１／７．１２と共に投与したＯｘの遊離濃度（２．２ｎＭ）よりも高かった。この遊離濃度はＮＱ１１／７．１２と共に投与した遊離Ｏｘよりも非常に速く下降した。このように抗Ｏｘ抗体Ｋｄにより抗体の緩衝能力が決定された。
【０１０２】
ＮＱ１１／７．１２の長時間緩衝
初期抗体注入の後日の血漿中のＯｘ濃度を緩衝するその能力をＮＱ１１／７．１２が保持するかどうかを決定した。これらの実験に関して、ＮＱ１１／７．１２を一度だけ投与した。ＯｘをＮＱ１１／７．１２と初期に同時投与した。Ｏｘ単独のさらなるアリコートを２４時間および４８時間に投与した。血液試料を入手して血漿からの全Ｏｘ排泄を追跡した。図９Ａに示すように、２４時間および４８時間でのＯｘの薬物動態存在時間により、初期のＮＱ１１／７．１２投与の後の動態からは小さな変化しか示されず、それは長時間にわたる循環抗体の緩徐なクリアランスに起因し得る。Ｄ１．３対照抗体と同時投与したＯｘを比較のために示した。これらの血漿試料で遊離対結合Ｏｘ分離もまた実施し；データを図９Ｂに示す。初期の遊離Ｏｘ濃度は２４時間および４８時間で、Ｏｘを抗体バッファーと同時に投与した場合よりも高かった。しかしながら血漿中にすでに存在するＮＱ１１／７．１２抗体とＯｘが結合したので、遊離濃度は急速に正常化された。これはＯｘおよびＮＱ１１／７．１２を一緒に投与した場合に観察されたパターンに類似する排泄パターンであった。したがって、抗Ｏｘ抗体は初期の抗体注入の後日の血漿中の遊離Ｏｘの濃度を緩衝した。図９に示すように、後にＯｘを同時投与しても、再投与しても、血漿中のＯｘおよび抗体の平衡は遊離Ｏｘの排泄よりもかなり急速であった。
【０１０３】
（実施例３）
（リゾチームの抗体緩衝）
（方法）
１４Ｃリゾチームの調製
Ｈａｂｅｅｂ（Ｈａｂｅｅｂ、１９８３）から適用された手順である還元的メチル化を用いてリゾチームを１４Ｃで標識した。１４Ｃホルムアルデヒドをニューイングランドニュークリアから入手した（特異活性４０−６０ｍＣｉ／ミリモル）。ガラスアンプルを乾燥氷上においてホルムアルデヒドガスを凝結させた。標識混合物はリゾチーム０．７μモル（リン酸塩バッファー中２０ｍｇ／ｍｌ溶液から）、ＮａＣＮＢＨ３（新たに調製した０．１Ｍ  ＮａＣＮＢＨ３溶液から）３．５μモル、および全容量１ｍｌにするために加えた０．１Ｍリン酸塩バッファー（ＮａＨ２ＰＯ４、ＮａＯＨでｐＨ８．０）からなった。標識混合物をアンプルに加え、そして反応物を８分毎に混合して３０分間処理した。アンプルに０．０５Ｍホウ酸塩バッファー０．５ｍｌ（Ｈ３ＢＯ３、ｐＨ８．０）を加え、そして量を制御する目的でシンチレーションカウンティングのために１μｌアリコートを採った。次いで反応混合物を２×５００ｍｌホウ酸塩バッファー（ｐＨ７．０）に対して透析し、続いて滅菌ＰＢＳ  ５×５００ｍｌに対して透析した。透析バッファーのアリコートをシンチレーション液に加え、そして計数して透析を完了した時を決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施してタンパク質純度を評価し、そしてゲルをオートラジオグラフィーに供して１４Ｃタグがリゾチームバンドにのみ局在したことを検証した。配列から計算した減衰係数を用いて（Ｐｅｒｋｉｎｓ、１９８６）、紫外線分光法によりタンパク質濃度を決定した。シンチレーションカウンティングのために１μｌのアリコートを採り、リゾチームの特異活性を決定した。抗体溶液をフィルター滅菌し、そしてＮ２下４℃で保存した。
【０１０４】
抗リゾチーム抗体
ネズミ抗リゾチームハイブリドーマ、Ｄ１．３（Ａｍｉｔら、前出；Ｂｈａｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４７：４８３−８５（１９９０））を振動気泡ローラーボトル中で成長させた（ＰａｎｎｅｌｌおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９９２））。得られたモノクローナル抗体をリゾチーム−セファロース親和性カラムを通過させることにより使用済み培養上澄から精製した。分画をジエチルアミン（フィッシャーサイエンティフィック）で１Ｍトリス（ｐＨ７．４）１５０μｌの入ったチューブに溶出し、そしてプロテインＡバッファー（３Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍグリシン、ｐＨ８．９）に対して透析した。次いで透析液をプロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア）カラムを通過させた。クエン酸ナトリウムからクエン酸のグラジエントで分画を溶出し、そして３Ｍトリス（ｐＨ８．８）１００μｌの入ったチューブ内に収集した。次いで分画をＰＢＳ（２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４／１２５ｍｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に対して透析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施して純度を検証した。紫外線分光法により配列から計算した減衰係数を用いてタンパク質濃度を決定した（Ｐｅｒｋｉｎｓ（１９８６））。抗体溶液をフィルター滅菌し、そしてＮ２下４℃で保存した。Ｄ１．３のＫｄは３．７ｎＭ（２０℃）であった（ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ、前出）。
【０１０５】
Ｄ１．３抗体でＥＬＩＳＡを実施して、１４Ｃ抱合体を用いた場合にリゾチームに結合するその能力が保持されることが示された。９６ウェルプレートのウェルを炭酸塩バッファー（５．０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）中１００μｇ／ｍｌリゾチームまたは１４Ｃリゾチームでコーティングし、そして３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで洗浄し、ミルクバッファーで遮断し、再度ＰＢＳで洗浄し、そして次に１０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを加えたＰＢＳ中２０ｎｇ／ｍｌ  Ｄ１．３と共に１時間インキュベートした。対照ウェルをリゾチームに結合していない抗体ＮＱ１０／２．２２と共にインキュベートした。インキュベーションの後、プレートを再度洗浄し、そして２次抗体、Ｆｃフラグメント特異的ペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ（ジャクソンイムノケミカルズ、ウェストグローブ、ペンシルバニア州）と共に１時間インキュベートした。カラーミックス（５０ｍＭクエン酸ナトリウム／５０ｍＭクエン酸バッファー中１ｍＭ  ＡＴＢＳ基質および４ｍＭ  Ｈ２Ｏ２）を加えた後、プレートをカイネティックマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス社、サニーベール、カリフォルニア州）で読んだ。
【０１０６】
抗体緩衝実験
ラット（３００ｇスプラーグドーリー雄（ジビックラボラトリーズ社、ゼリエノープル、ペンシルバニア州））に頸静脈カニューレを埋め込んだ。ラットは実験中自由に運動させ、そして食餌および水に接近可能にした。Ｄ１．３抗体４５０μｇを伴うかまたは伴わずに、１４Ｃリゾチーム４３μｇからなる注入のための試料を調製した。滅菌生理食塩水を用いて容量を１ｍｌにし、そして試料を使用前に３７℃でインキュベートした。ＨＰ注入ポンプを用いて頸部カニューレを通して試料を５分間かけて注入した。注入後、カニューレをヘパリン添加した食塩水（２５０単位／ｍｌ）０．２ｍｌで流して凝固の危険性を低減させた。注入の終わりをゼロ（０）時と称した。種々の時点で血液試料（０．５ｍｌ）をカニューレから採った。即座に血液を遠心して血漿を分離した。血漿（０．１ｍｌ）をシンチレーション液５ｍｌと混合し、そして計数した。本明細書に記載する結合対遊離リゾチーム実験でさらに０．１ｍｌを使用した。細胞ペレットをシンチレーション液と混合し、そしてまた計数した。
【０１０７】
遊離および結合リゾチームの分離
血漿を分離するために血液試料を遠心した後、血漿０．１ｍｌをプロテインＡ−セファロースミニカラム１．５ｍｌに負荷した。カラムを０．５ｍｌずつ増量して３ｍｌのＰＢＳで、続いて０．５ｍｌずつ増量して３ｍｌの１００ｍＭクエン酸で洗浄した。ＰＢＳ（遊離リゾチーム）およびクエン酸（抗体結合リゾチーム）分画を各時点で別個に収集した。分画でＴＣＡ沈殿を実施した。タンパク質沈殿物をアセトンで洗浄し、そして沈殿物をＰＢＳに再溶解した（沈殿物の全てが溶解するわけではない）。液体および残存するペレットをシンチレーション液４ｍｌに移して計数した。
【０１０８】
種々の量の抗体での抗体緩衝
頸静脈カニューレを埋め込んだスプラーグドーリーラットに１４Ｃリゾチーム４３μｇおよびＤ１．３抗体４５０μｇまたは９００μｇのいずれかを注入した。滅菌生理食塩水を用いて注入容量を１ｍｌにした。試料を調製および注入し、そして時点を取り、そして前記したように分析した。結合対遊離分離分析を実施した。
【０１０９】
種々の量のリゾチームでの抗体緩衝
頸静脈カニューレを埋め込んだスプラーグドーリーラットにＤ１．３抗体４５０μｇおよび１４Ｃリゾチーム４３μｇまたは４３０μｇのいずれかを注入した。試料を調製し、注入し、そして時点を取り、そして前記したように分析した。
【０１１０】
二重注入実験
注入用に２つの試料を調製した。第１の試料は生理食塩水０．５ｍｌに希釈したＤ１．３抗体４５０μｇからなり、これをＨＰ注入ポンプを用いて４分間かけて注入した。循環中で抗体が平衡になる時間を見越して、ラットを１０分間ケージ中で自由に運動させた。次いで第２の試料は滅菌生理食塩水を用いて０．５ｍｌにした１４Ｃリゾチーム４３μｇからなり、これを４分間かけて注入した。第２の注入の終わりをゼロ時（０）と称した。血液試料を採取し、そして前記したように分析した。
【０１１１】
１４Ｃリゾチーム
ラットにおけるリゾチーム薬物動態の以前の研究では、血漿中のリゾチームの量を酵素アッセイにより定量した（Ｆｒａｎｓｓｅｎら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．８：１２２３−３０（１９９１））。しかしながら、Ｄ１．３はリゾチームの酵素活性を遮断した；したがってリゾチームを１４Ｃで放射標識して、血漿試料中のその量を測定することができた。リゾチームの１４Ｃホルムアルデヒドでの還元的メチル化により、特異活性７．４×１０７ｃｐｍ／ｍｇを有する１４Ｃリゾチーム抱合体を生じた。このように、リゾチームをラット血漿中のバックグラウンドレベルを超えて検出できるほど十分に標識した。図１０で示すように、１４Ｃリゾチームの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて決定し（図１０Ａ）、そしてオートラジオグラフィーを用いてリゾチームバンドに局在する放射活性シグナルを示した（図１０Ｂ）。Ｄ１．３の１４Ｃリゾチーム抱合体に効率よく結合する能力をＥＬＩＳＡにより決定した（図１０Ｃ）。Ｄ１．３リゾチーム結合は１４Ｃ抱合体で保持された。
【０１１２】
ラット血漿中のリゾチームの薬物動態
リゾチーム検出の放射活性法を用いてリゾチームの薬物動態プロフィールを決定するために、頸部カニューレを通してラットの血流に１４Ｃリゾチームを注入した。４時間にわたって種々の時間間隔で血液試料採取することによりリゾチーム排泄を追跡した。遠心後血漿を収集し、そしてシンチレーションカウンティングに供した。リゾチームが１６．４分の血漿β半減期を有することが判明した（図１１）。これらのおよび以下の研究での各ラットは１回だけ使用して、リゾチームまたは抗体のいずれかに対する免疫応答の可能性を制限した。
【０１１３】
抗体緩衝リゾチームの薬物動態
本明細書に記載したリガンドの抗体緩衝の平衡原理に従って、ネズミ抗リゾチーム抗体Ｄ１．３を１４Ｃリゾチームに関する抗体バッファーとして使用した。リゾチームを等モル量のＤ１．３と共にラットの頸部カニューレを通して投与した。図１１で示すように、単独で投与したリゾチームの濃度は排泄半減期１６．４分で急速に下降した。リゾチームを伴うＤ１．３の投与により、ラット血漿中のリゾチームの滞留時間は有意に延長され、β半減期が４２．８分まで伸びた。リゾチームをそのままで投与した場合、リゾチームの初期濃度は高く現れたが、Ｄ１．３により緩衝されたリゾチームと比較して、その量は急速に低下し、これはＤ１．３複合体形成が実際に排泄速度を低下させたことを示している。
【０１１４】
血漿分離の後、細胞ペレットをこの研究および以前の研究（前出）の双方で計数した。この分画では放射活性はほとんど見出されず、これは細胞ペレットがリゾチームまたはリゾチーム抗体複合体の有意な貯蔵所ではなかったことを示している。
【０１１５】
遊離リゾチームの薬物動態
全リゾチーム濃度を決定するためのシンチレーションカウンティングのために遠心して血漿を分離した後、血漿のアリコートをプロテインＡ−セファロースミニカラムに適用して、リゾチームの結合形態および遊離形態を分離した。遊離リゾチームはＰＢＳ洗浄で溶出されたが、Ｄ１．３に特異的に結合したリゾチームはクエン酸で溶出された。得られた大容量の溶離液は直接的なシンチレーションカウンティングを妨害するので、ＴＣＳＡ沈殿を実施してタンパク質の分離を行った。得られたタンパク質ペレットは組織溶解剤およびその他の試薬を用いる試みにもかかわらず、再溶解に抵抗し；したがって正確な遊離リゾチーム濃度を確定するのは困難であった。それにもかかわらず、リゾチーム単独のレベルおよび同一に調製されたリゾチーム−Ｄ１．３溶離液のレベルの分析により、これらの試料中の遊離リゾチームレベルの差が示された。
【０１１６】
Ｄ１．３抗体がその同族リガンド、リゾチームに関してバッファーとして作用した場合、抗体はそのリガンドの貯蔵所として作用して、かなり一定したレベルで遊離リゾチームの濃度を維持した。図１２に示すように、リゾチームをＤ１．３と共に投与した場合、リゾチームの遊離プールが存在し、そしてこの遊離プールは実験の経過中、リゾチームを単独で投与した場合に観察された遊離リゾチームのレベルよりもさらに一定で維持された（図１２）。したがって、Ｄ１．３の存在は、本明細書に記載したリガンドの抗体緩衝の平衡原理に従って抗体緩衝を提供すると考えられた。
【０１１７】
Ｄ１．３の緩衝能力に及ぼす種々のリゾチームおよび抗体濃度の影響
ラット血漿中の全リゾチームの緩衝に及ぼす種々の抗体濃度の影響を決定するために、等モル量または２倍モル量のいずれかのＤ１．３と共に１４Ｃリゾチームをラット血漿に投与した。４時間にわたって種々の時点で血液を採取した。血漿を再度遠心により分離し、そして全リゾチーム濃度をシンチレーションカウンティングにより決定した。図１３に示すように、２倍モル量のＤ１．３を伴うリゾチームの投与によりリゾチームのβ半減期が６１．３分まで延長された。この半減期は、リゾチームを等モル濃度のＤ１．３と共に投与した場合のリゾチームのβ半減期（β半減期４２．８分）と有意に異なった。したがってさらなる抗体のバッファー系への添加はリガンド半減期を大きく延長させると考えられた。
【０１１８】
また長時間にわたってラット血漿中の全リゾチーム濃度に及ぼす漸増濃度のリゾチームの影響を決定するために実験を行った。等モル濃度または１０倍モル濃度のいずれかの１４Ｃリゾチームと共にＤ１．３をラット頸部カニューレに注入した。時点を取り、そして前記したように全リゾチーム濃度に関して血漿を分析した。１０倍のリゾチームを投与されたラットにおける初期リゾチーム濃度は、リゾチーム等モル濃度のラットの濃度よりもかなり高かったが、それは低濃度リゾチームを与えられたラットのレベルの約２倍の高さのレベルまで急速に下落した（図１４）。この観察により、リガンド量の有意な増加は初期全リゾチーム濃度に大きな影響を有したが、それは後の時点でのリガンド量ではわずかな増加しか生じなかったことが示された。
【０１１９】
血漿内でのＤ１．３平衡の後に投与されたリゾチーム
Ｄ１．３を単独でラット血漿に注入するさらなる実験を実施した。血漿内の抗体の平衡を可能にするためにこの注入の１０分後に、ラット頸部カニューレを通して等モル量のリゾチームを投与した。得られた薬物動態は前記したように血液試料採取により追跡した。図１５に示すように、リゾチームの初期濃度は高かったが、Ｄ１．３およびリゾチームを一緒に投与した場合に到達したレベルに非常に類似したレベルまで急速に平衡した。これにより、Ｄ１．３は循環中に十分に保持され、そしてリゾチームに効率よく結合するその能力はインビボで変化しなかったことが示された。
【０１２０】
本明細書に言及し、そして／または出願データシートに列挙された全ての前記の米国特許、特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許出版物は、その全てを出典明示により本明細書の一部とする。
【０１２１】
前記から本発明の具体的な実施態様は説明目的で本明細書に記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の変更を行うことができることは理解されよう。したがって、本発明は添付の請求の範囲による以外には限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】大槽からの抗Ｏｘ抗体ＮＱ１１／７．１２の排泄を説明する。放射性ヨウ化ＮＱ１１／７．１２を大槽に注入し；示された時間にＣＳＦ試料を採り、そして抗体濃度を決定するために計数した。
【図２】脳室内投与したＯｘの抗Ｏｘ抗体ＮＱ１１／７．１２による緩衝を示す。ＯｘをＮＱ１１／７．１２を伴って（四角）または抗体を伴わずに（丸）動物に注入した。大槽からＣＳＦ試料を採った。
【図３】抗体を伴って（四角）または抗体を伴わずにラットの大槽にＯｘを注入した場合の抗Ｏｘ抗体ＮＱ１１／７．１２によるＣＳＦ中のＯｘの緩衝を説明する。脳槽からＣＳＦ試料を採り、そして３Ｈ−ＧＡＢＡ−Ｏｘの放射活性を計数して全Ｏｘ濃度を決定した。
【図４】抗Ｏｘ抗体ＮＱ１１／７．１２を伴って（四角）および抗体を伴わずに（丸）Ｏｘを投与した後のラットのＣＳＦ中の遊離Ｏｘの濃度を示す。
【図５】抗Ｏｘ抗体ＮＱ１１／７．１２によるＯｘの長時間緩衝を表す。５匹のラットの群で各ラットに０時にＯｘを抗体を伴って（四角）投与した。２４時間（三角）および４８時間（白丸）に抗体を伴わずにＯｘを再度投与した。動物の別の群では、Ｏｘを非特異的抗体（Ｄ１．３、抗鶏卵白リゾチーム）と共に投与した（黒丸）。図５ＡはＣＳＦ中の全Ｏｘ濃度を示し、そして図５ＢはＣＳＦ中の遊離Ｏｘ濃度を示す。
【図６】Ｏｘを抗Ｏｘ抗体ＮＱ１１／７．１２を伴って投与した場合（黒丸、ｔ１／２＝１９．７分）、対照抗体Ｄ１．３を伴って投与したＯｘの排泄（白丸、ｔ１／２＝１．２分）がより迅速に生じることを説明する。Ｏｘを各抗体を伴って頸静脈カニューレを通してスプラーグドーリーラットに注入した。各点は５匹の動物から収集したデータを示す。
【図７】ＮＱ１１／７．１２（黒丸）対Ｄ１．３（白丸）を伴ってＯｘを投与した場合の動物の血漿中の遊離Ｏｘの濃度を示す。
【図８】Ｏｘに関して異なるＫｄを有する抗Ｏｘ抗体を伴ってＯｘを投与した場合のＯｘの半減期およびラットの血漿中の遊離Ｏｘ濃度を説明する。図８Ａ：全Ｏｘ対時間。ＮＱ１１／７．１２よりも大きいＫｄを有する抗体ＮＱ１６／１１３．８（黒四角）およびＮＱ２２／１６．４（白四角）をＯｘと共に投与し、そしてＮＱ１１／７．１２を伴って投与したＯｘと比較した（黒丸）。またＯｘを非特異的抗リゾチーム抗体Ｄ１．３を伴って投与した（白丸）。図８Ｂ：遊離Ｏｘ対時間。ＮＱ１１／７．１２（黒丸）；ＮＱ１６／１１３．８（黒四角）；ＮＱ２２／１６．４（白四角）；またはＤ１．３（白丸）を伴ってＯｘを投与された動物において血漿中の遊離Ｏｘの濃度もまた決定した。
【図９】全Ｏｘ（図９Ａ）および遊離Ｏｘ（図９Ｂ）の血漿半減期を示す。ラットにＮＱ１１／７．１２と同時投与（黒丸）またはＮＱ１１／７．１２注入後２４時間に（半黒丸）、またはＮＱ１１／７．１２注入後４８時間に（白丸）Ｏｘを単独で投与した。また対照Ｄ１．３抗体を伴ってＯｘを投与した（白四角）。
【図１０】１４Ｃリゾチームの分析を説明する。図１０Ａは未標識リゾチーム（ｌｙｓｏ）および１４Ｃリゾチーム（１４Ｃ−ｌｙｓｏ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。図１０ＢはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのオートラジオグラフィー分析を示す。図１０Ｃは抗リゾチーム抗体Ｄ１．３のリゾチーム（ｌｙｓｏ）および１４Ｃリゾチーム（１４Ｃ−ｌｙｓｏ）に対する結合ならびに非特異的抗体（ＮＱ１０／２．２２）のリゾチーム（対照抗体＋ｌｙｓｏ）および１４Ｃリゾチーム（対照抗体＋１４Ｃ−ｌｙｓｏ）に対する結合を決定するＥＬＩＳＡの結果を提供する。
【図１１】抗リゾチーム抗体の存在下および不在下のリゾチームの血漿中の薬物動態を示す。ラットに１４Ｃリゾチームを単独で（四角）または抗リゾチーム抗体Ｄ１．３を伴って（丸）投与した。
【図１２】ラットに１４Ｃリゾチームを抗リゾチーム抗体Ｄ１．３を伴って投与した場合（菱形）および１４Ｃリゾチームを単独で投与した場合（四角）の遊離１４Ｃリゾチームの血漿濃度を示す。
【図１３】漸増濃度の特異的抗体を伴って全身投与したリゾチームの半減期に及ぼす影響を説明する。ラットの群に１４Ｃリゾチームを抗体を伴わずに（四角）、等モル濃度のＤ１．３を伴って（丸）、およびリゾチームの２倍モル濃度のＤ１．３を伴って（菱形）投与した。
【図１４】抗リゾチーム抗体の存在下で動物に漸増濃度のリゾチームを投与した場合、全身投与したリゾチームの半減期に及ぼす影響を示す。抗リゾチーム抗体Ｄ１．３を等モル量の１４Ｃリゾチームを伴って投与した（菱形）。またＤ１．３を、Ｄ１．３の１０倍モル量の濃度の１４Ｃリゾチームを伴って投与した（四角）。
【図１５】リゾチームを抗リゾチーム抗体Ｄ１．３と並行してまたは逐次的に投与した場合の血漿中のリゾチームの排泄を説明する。ラットの１群に初期にＤ１．３のみを注入し、続いて１０分後に１４Ｃリゾチームを投与した（四角）。動物の別の群にＤ１．３および１４Ｃリゾチームを並行して注入した（菱形）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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