(57)【要約】  本発明は、昆虫細胞系において増殖させたペプチドを生産するための製造方法を提供する。該ペプチドは、脂質混合物を補足した培養物中バキュロウィルス粒子に感染させた昆虫細胞培養液中で増殖させる。次いで、接線流ろ過カスケードを使用する方法を用いて、昆虫細胞培養液から該ペプチドを単離する。単離されたペプチドは、昆虫特異的なグリコシル化パターンを有する糖ペプチドである。次いで、ペプチドと修飾基との間に置かれ、該ペプチドおよび修飾基に共有結合しているグリコシル結合基を介した結合により、該糖ペプチドを該修飾基に結合させることができる。該結合体は、グリコシルトランスフェラーゼの作用により、グリコシル化ペプチドから形成される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性相互作用クロマトグラフィーにより、ペプチドよりも低い分子量を有する不純物から前記ペプチドを分離する方法であって：
（ａ）前記ペプチドおよび前記不純物を含む混合物を、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂に適用する工程；
（ｂ）前記不純物を、前記樹脂から溶出する工程；
（ｃ）前記ペプチドを、前記樹脂から溶出する工程；および
（ｄ）前記ペプチドを含む（ｃ）由来の溶出液フラクションを採取し、それによって前記不純物から前記ペプチドを分離する工程、
を含む前記方法。
【請求項２】
前記不純物の少なくとも約５０％が、前記方法によって除去される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記不純物の少なくとも約９０％が、前記方法によって除去される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ａ）の前に：
（ｅ）前記ペプチドおよび前記不純物を含む混合物を脱塩し、脱塩ペプチド混合物を形成する工程；
（ｆ）ステップ（ｅ）の前記脱塩ペプチド混合物を、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体から溶出する工程；および
（ｇ）前記ペプチドを含む、（ｆ）由来の溶出液フラクションを採取する工程、
をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチドが、実質的に均一な昆虫特異的グリコシル化パターンを含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ペプチドが、エリスロポイエチン、顆粒球コロニー刺激因子、ＧＮＴ１、ＧａｌＴ１、ＳＴ３Ｇａｌ３、ＣＳＴ２、シアリダーゼ、ＧａｌＮＡｃＴ２、Ｃｏｒｅ１ＧａｌＴ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１、ＳＴ３Ｇａｌ１、およびＳＴ３Ｇａｌ２から選択されるメンバーである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドを含む前記混合物が、
（ｈ）昆虫細胞培養における昆虫細胞を、前記ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えバキュロウィルスに感染させる工程であって、
（ｉ）前記細胞培養培地が、脂質混合物により補足され；および
（ｉｉ）前記感染が、前記脂質混合物により補足された培養培地において生じる工程；および
（ｉ）前記核酸配列によりコードされた前記ペプチドを含む培養液を生産するために（ｈ）の感染昆虫細胞を増殖させる工程であって、前記ペプチドが、昆虫特異的グリコシル化パターンを含む工程、
を含む操作により提供される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記脂質混合物が、全培養容量の約０．５％から約３％ｖ／ｖの間に等しいパーセンテージで前記昆虫細胞培養に補足される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記感染の約０．５時間前から約２．０時間前の間に前記昆虫細胞培養を補足するために、前記脂質混合物が添加される請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記感染で、約１０−８から約１．０の間の感染多重度が用いられる請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記脂質混合物が、アルコール、界面活性剤、ステロール、洗浄剤、抗酸化剤、および脂質源を含む請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
（ｊ）前記ペプチドを含む第１の混合物を作製するために前記培養液から細胞破片を除去する工程；
（ｋ）接線流ろ過カスケードを用いて前記第１の混合物（ｊ）を調節する工程；
（ｌ）（ｋ）由来の調節された混合物のｐＨを調整し、ｐＨ調整混合物を形成する工程；
（ｍ）（ｌ）由来の前記ｐＨ調整混合物を、アニオン交換媒体から溶出する工程；
（ｎ）前記ペプチドを含む（ｍ）由来の溶出液フラクションを採取する工程；
（ｏ）（ｎ）由来の採取された溶出液フラクションを、カチオン交換媒体から溶出する工程；
（ｐ）前記ペプチドを含む（ｏ）由来の溶出液フラクションを採取する工程；
（ｑ）（ｐ）由来の前記溶出液フラクションを低ｐＨ保持操作に供して、ウィルス不活化ペプチド溶液を形成する工程；および
（ｒ）前記ウィルス不活化ペプチド溶液を濃縮する工程、
をさらに含む請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
（ｊ）の前記除去が、バッチ遠心分離、連続遠心分離、ろ過、および連続遠心分離に引き続くろ過から選択されるメンバーにより達成される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記連続遠心分離が、ディスク−スタック遠心分離機を用いて達成される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
（ｒ）の前記濃縮が、限外ろ過により達成される請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
（ｓ）（ｉ）由来の前記ペプチドを単離する工程；
（ｔ）グリコシル供与体のグリコシル部分と前記ペプチドとの間の共有結合の形成に適切な条件下で、（ｓ）由来の単離ペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼと前記グリコシルトランスフェラーゼに対する基質であり、修飾基に共有結合している前記グリコシル部分を含む修飾グリコシル供与体とに接触させ、それによって修飾糖ペプチドを生産する工程；および
（ｕ）前記修飾糖ペプチドを精製する工程、
をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより、不純物からペプチドを分離する方法であって、
（ａ）前記ペプチドおよび前記不純物を含む混合物を脱塩し、脱塩ペプチド混合物を形成する工程；
（ｂ）（ａ）由来の前記脱塩ペプチド混合物を、ヒドロキシアパタイト樹脂に適用する工程；
（ｃ）前記ヒドロキシアパタイト樹脂を洗浄し、前記樹脂から前記不純物を除去する工程；
（ｄ）溶出緩衝液により前記樹脂から前記ペプチドを溶出する工程；および
（ｅ）前記ペプチドを含む（ｄ）由来の溶出液フラクションを採取し、それによって前記不純物から前記ペプチドを分離する工程、
を含む前記方法。
【請求項１８】
前記脱塩混合物が、約０．１ｍＳ／ｃｍと約４．０ｍＳ／ｃｍとの間の伝導率を有する請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記溶出緩衝液が、アミノ酸を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記アミノ酸が、グリシンである請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記グリシンが、約５ｍＭから約５０ｍＭの最終濃度で前記溶出緩衝液に添加される請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ペプチドが、実質的に均一な昆虫特異的グリコシル化パターンを含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記ペプチドが、エリスロポイエチン、顆粒球コロニー刺激因子、ＧＮＴ１、ＧａｌＴ１、ＳＴ３Ｇａｌ３、ＣＳＴ２、シアリダーゼ、ＧａｌＮＡｃＴ２、Ｃｏｒｅ１ＧａｌＴ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１、ＳＴ３Ｇａｌ１、およびＳＴ３Ｇａｌ２から選択されるメンバーである請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記ペプチドを含む前記混合物が、
（ｆ）昆虫細胞培養における昆虫細胞を、前記ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えバキュロウィルスに感染させる工程であって、
（ｉ）前記細胞培養が、脂質混合物により補足され；および
（ｉｉ）前記感染が、前記脂質混合物により補足された前記細胞培養において生じる工程；および
（ｇ）前記核酸配列によりコードされた前記ペプチドを含む培養液を生産するために工程（ｆ）の感染昆虫細胞を増殖させる工程であって、前記ペプチドが、昆虫特異的グリコシル化パターンを含む工程、
を含む操作により提供される請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記脂質混合物が、全培養容量の約０．５％から約３％ｖ／ｖの間に等しいパーセンテージで前記昆虫細胞培養に補足される請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
感染の約０．５時間前から約２．０時間前の間に前記昆虫細胞培養を補足するために、前記脂質混合物が添加される請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記感染が、約１０−８から約１．０の間の感染多重度が用いられる請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記脂質混合物が、アルコール、界面活性剤、ステロール、洗浄剤、抗酸化剤、および脂質源を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
（ｈ）前記ペプチドを含む第１の混合物を作製するために前記培養液から細胞破片を除去する工程；
（ｉ）接線流ろ過カスケードを用いて（ｈ）由来の前記第１の混合物を調節する工程；
（ｊ）（ｉ）由来の調節された混合物のｐＨを調整し、ｐＨ調整混合物を形成する工程；
（ｋ）（ｊ）由来の前記ｐＨ調整ペプチド混合物を、アニオン交換媒体から溶出する工程；
（ｌ）前記ペプチドを含む（ｋ）由来の溶出液フラクションを採取する工程；
（ｍ）（ｌ）由来の採取された溶出液フラクションを、カチオン交換媒体から溶出する工程；
（ｎ）前記ペプチドを含む（ｍ）から溶出液フラクションを採取する工程；
（ｏ）（ｎ）由来の採取された溶出液フラクションを低ｐＨ保持操作に供して、ウィルス不活化ペプチド溶液を形成する工程；
（ｐ）前記ウィルス不活化混合物を、疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体から溶出する工程；
（ｑ）（ｐ）由来の前記ペプチドを含む溶出液フラクションを採取する工程；および
（ｒ）（ｑ）由来の前記溶出液フラクションを濃縮する工程、
をさらに含む請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
工程（ｈ）の前記除去が、バッチ遠心分離、連続遠心分離、ろ過、および連続遠心分離に引き続くろ過から選択されるメンバーにより達成される請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記連続遠心分離が、ディスク−スタック遠心分離機を用いて達成される請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
工程（ｒ）の前記濃縮が、限外ろ過により達成される請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
（ｓ）（ｇ）由来の前記ペプチドを単離する工程；
（ｔ）グリコシル供与体のグリコシル部分とペプチドとの間の共有結合の形成に適切な条件下で、（ｓ）由来の単離ペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼと前記グリコシルトランスフェラーゼに対する基質であり、修飾基に共有結合している前記グリコシル部分を含む修飾グリコシル供与体とに接触させ、それによって修飾糖ペプチドを生産する工程；および
（ｕ）前記修飾糖ペプチドを精製する工程、
をさらに含む請求項１７に記載の方法。
【請求項３４】
低ｐＨ保持操作により、ウィルス不活化ペプチド混合物を調製する方法であって、
（ａ）前記ペプチドを含む混合物のｐＨを低下させる工程；
（ｂ）選択された時間、工程（ａ）の前記ｐＨを維持する工程；および
（ｃ）前記ペプチドを含む前記混合物の前記ｐＨを上げて、ウィルス不活化ペプチド混合物を形成する工程、
を含む方法。
【請求項３５】
工程（ａ）の前記ｐＨを、約ｐＨ２．０と約ｐＨ４．０との間に低下させる請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
工程（ａ）の前記ｐＨを、約ｐＨ２．０と約ｐＨ２．５との間に低下させる請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記時間が、約３０分と約２時間との間から選択される請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記時間が、約１時間である請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ペプチドが、実質的に均一な昆虫特異的グリコシル化パターンを含む請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記ペプチドが、エリスロポイエチン、顆粒球コロニー刺激因子、ＧＮＴ１、ＧａｌＴ１、ＳＴ３Ｇａｌ３、ＣＳＴ２、シアリダーゼ、ＧａｌＮＡｃＴ２、Ｃｏｒｅ１ＧａｌＴ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１、ＳＴ３Ｇａｌ１、およびＳＴ３Ｇａｌ２から選択されるメンバーである請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
前記ペプチドを含む前記混合物が、
（ｄ）昆虫細胞培養における昆虫細胞を、前記ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えバキュロウィルスに感染させる工程であって、
（ｉ）前記細胞培養が、脂質混合物により補足され；および
（ｉｉ）前記感染が、前記脂質混合物により補足された前記細胞培養において生じる工程；および
（ｅ）前記核酸配列によりコードされた前記ペプチドを含む培養液を生産するために工程（ｄ）の感染昆虫細胞を増殖させる工程であって、前記ペプチドが、昆虫特異的グリコシル化パターンを含む工程、
を含む操作により提供される請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
前記脂質混合物が、全培養容量の約０．５％から約３％ｖ／ｖの間に等しいパーセンテージで前記昆虫細胞培養に補足される請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記感染の約０．５時間前から約２．０時間前の間に前記昆虫細胞培養を補足するために、前記脂質混合物が添加される請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記感染が、約１０−８から約１．０の間の感染多重度が用いられる請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記脂質混合物が、アルコール、界面活性剤、ステロール、洗浄剤、抗酸化剤、および脂質源を含む請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
（ａ）の前に：
（ｆ）前記ペプチドを含む第１の混合物を作製するために前記昆虫細胞培養から細胞および他の破片を除去する工程；
（ｇ）接線流ろ過カスケードを用いて工程（ｆ）の前記第１の混合物を調節する工程；
（ｈ）工程（ｇ）の前記調節された混合物のｐＨを調整し、ｐＨ調整混合物を形成する工程；
（ｉ）前記ｐＨ調整混合物（ｈ）を、アニオン交換体から溶出する工程；
（ｊ）前記ペプチドを含む（ｉ）由来の溶出液フラクションを採取する工程；
（ｋ）（ｊ）由来の前記溶出液フラクションを、カチオン交換媒体から溶出する工程；および
（ｌ）前記ペプチドを含む（ｋ）由来の溶出液フラクションを採取する工程；
をさらに含む請求項３４に記載の方法。
【請求項４７】
（ｃ）の後に：
（ｍ）（ｃ）の前記ウィルス不活化ペプチド混合物を脱塩し、脱塩ペプチド混合物を形成する工程；
（ｎ）（ｍ）由来の前記脱塩ペプチド混合物を、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体から溶出する工程；
（ｏ）前記ペプチドを含む（ｎ）由来の溶出液フラクションを採取する工程、
（ｐ）（ｏ）由来の前記溶出液フラクションを疎水性相互作用クロマトグラフィーに供する工程；
（ｑ）前記ペプチドを含む（ｐ）由来の溶出液フラクションを採取する工程；および
（ｒ）前記ペプチドを含む（ｑ）由来の前記溶出液フラクションを濃縮する工程、をさらに含む請求項３４に記載の方法。
【請求項４８】
工程（ｆ）の前記除去が、バッチ遠心分離、連続遠心分離、ろ過、および連続遠心分離に引き続くろ過から選択されるメンバーである操作により達成される請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記連続遠心分離が、ディスク−スタック遠心分離機を用いて達成される請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
工程（ｒ）の前記濃縮が、限外ろ過により達成される請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
（ｓ）（ｅ）由来の前記ペプチドを単離する工程；
（ｔ）グリコシル供与体のグリコシル部分と前記ペプチドとの間の共有結合の形成に適切な条件下で、（ｓ）由来の単離ペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼと前記グリコシルトランスフェラーゼに対する基質であり、修飾基に共有結合している前記グリコシル部分を含む修飾グリコシル供与体とに接触させ、それによって修飾糖ペプチドを生産する工程；および
（ｕ）前記修飾糖ペプチドを精製する工程、
をさらに含む請求項３４に記載の方法。
【請求項５２】
ペプチドを精製する方法であって：
（ａ）前記ペプチドを含む混合物を、接線流ろ過カスケードを用いて調整する工程であって、前記調整が前記混合物をクロマトグラフィー精製工程に供する前に行う工程、
を含む前記方法。
【請求項５３】
前記調整が：
（ｉ）第１の限外ろ過膜を通過させて前記混合物を限外ろ過する工程；
（ｉｉ）第２の限外ろ過膜を通過させて工程（ｉ）由来の透過液を限外ろ過する工程；および
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）由来の濃縮液を採取する工程、
を含む請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記第１の限外ろ過膜が、約５０ｋＤａと約１５０ｋＤａとの間の分子量カットオフを有する請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記第１の限外ろ過膜が、約１００ｋＤａの分子量カットオフを有する請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記第２の限外ろ過膜が、約５ｋＤａと約１５ｋＤａとの間の分子量カットオフを有する請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記第２の限外ろ過膜が、約１０ｋＤａの分子量カットオフを有する請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ペプチドが、実質的に均一な昆虫特異的グリコシル化パターンを含む請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
前記ペプチドが、エリスロポイエチン、顆粒球コロニー刺激因子、ＧＮＴ１、ＧａｌＴ１、ＳＴ３Ｇａｌ３、ＣＳＴ２、シアリダーゼ、ＧａｌＮＡｃＴ２、Ｃｏｒｅ１ＧａｌＴ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１、ＳＴ３Ｇａｌ１、およびＳＴ３Ｇａｌ２から選択されるメンバーである請求項５２に記載の方法。
【請求項６０】
前記ペプチドを含む前記混合物が、
（ｂ）昆虫細胞培養における昆虫細胞を、前記ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えバキュロウィルスに感染させる工程であって、
（ｉ）前記細胞培養が、脂質混合物により補足され；および
（ｉｉ）前記感染が、前記脂質混合物により補足された培養において生じる工程；および
（ｃ）前記核酸配列によりコードされた前記ペプチドを含む培養液を生産するために工程（ａ）の感染昆虫細胞を増殖させる工程であって、前記ペプチドが、昆虫特異的グリコシル化パターンを含む工程、
を含む操作により提供される請求項５２に記載の方法。
【請求項６１】
前記脂質混合物が、全培養容量の約０．５％ｖ／ｖから約３％ｖ／ｖの間に等しいパーセンテージで前記昆虫細胞培養に補足される請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記感染の約０．５時間前から約２．０時間前の間に昆虫細胞培養を補足するために、前記脂質混合物が添加される請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記感染で、約１０−８から約１．０の間の感染多重度が用いられる請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
脂質混合物が、アルコール、界面活性剤、ステロール、洗浄剤、抗酸化剤、および脂質源を含む請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
（ｄ）前記ペプチドを含む第１の混合物を作製するために前記培養液から細胞および他の破片を除去する工程；
（ｅ）前記ペプチドを含む第１の混合物のｐＨを調整し、ｐＨ調整混合物を形成する工程；
（ｆ）アニオン交換体上の（ｅ）由来の前記ペプチドを含む前記ｐＨ調整混合物を溶出する工程；
（ｇ）前記ペプチドを含む（ｆ）由来の溶出液フラクションを採取する工程；
（ｈ）（ｇ）由来の前記溶出液フラクションをカチオン交換媒体から溶出する工程；
（ｉ）前記ペプチドを含む（ｈ）由来の溶出液フラクションを採取する工程；
（ｊ）（ｉ）由来の前記溶出液フラクションを低ｐＨ保持操作に供し、ウィルス不活化ペプチド混合物を形成する工程；
（ｋ）（ｊ）由来の前記ウィルス不活化ペプチド混合物を脱塩し、脱塩ペプチド混合物を形成する工程；
（ｌ）（ｋ）由来の前記脱塩ペプチド混合物を、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体から溶出する工程；
（ｍ）前記ペプチドを含む、（ｌ）由来の溶出液フラクションを採取する工程、
（ｎ）（ｍ）由来の前記溶出液フラクションを疎水性相互作用クロマトグラフィーに供する工程；
（ｏ）前記ペプチドを含む、（ｎ）由来の溶出液フラクションを採取する工程；および
（ｐ）前記溶出液フラクションを濃縮する工程、をさらに含む請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】
工程（ｄ）の前記除去が、バッチ遠心分離、連続遠心分離、ろ過、および連続遠心分離に引き続くろ過から選択されたメンバーにより達成される請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記連続遠心分離が、ディスク−スタック遠心分離機を用いて達成される請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
工程（ｐ）の前記濃縮が、限外ろ過により達成される請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
（ｑ）（ｃ）由来の前記ペプチドを単離する工程；
（ｒ）グリコシル供与体のグリコシル部分と前記ペプチドとの間の共有結合の形成に適切な条件下で、（ｑ）由来の単離ペプチドを、グリコシルトランスフェラーゼと前記グリコシルトランスフェラーゼに対する基質であり、修飾基に共有結合しているグリコシル部分を含む修飾グリコシル供与体とに接触させ、それによって修飾糖ペプチドを生産する工程；および
（ｓ）前記修飾糖ペプチドを精製する工程、
をさらに含む請求項５２に記載の方法。
【請求項７０】
ペプチドを精製する方法であって、
（ａ）前記ペプチドを含む第１の混合物を作製するために、前記ペプチドを含む細胞培養から細胞および他の破片を除去する工程；
（ｂ）接線流ろ過カスケードを用いる工程（ａ）の前記第１の混合物を調節して、調節混合物を形成する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の前記調節混合物のｐＨを調整し、ｐＨ調整混合物を形成する工程；
（ｄ）工程（ｃ）由来の前記ｐＨ調整調節混合物を、アニオン交換媒体から溶出する工程；
（ｅ）前記ペプチドを含む（ｄ）由来の溶出液フラクションを採取する工程；
（ｆ）（ｅ）由来の前記溶出液フラクションを、カチオン交換媒体から溶出する工程；
（ｇ）前記ペプチドを含む（ｆ）由来の溶出液フラクションを採取する工程；
（ｈ）（ｇ）由来の前記溶出液フラクションを低ｐＨ保持処理に供し、前記ペプチドを含むウィルス不活化ペプチド混合物を作製する工程；
（ｉ）工程（ｈ）の前記ウィルス不活化ペプチド混合物を脱塩し、脱塩混合物を形成する工程；
（ｊ）工程（ｉ）の前記脱塩混合物を、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体から溶出する工程；
（ｋ）（ｊ）由来の前記ペプチドを含む溶出液フラクションを採取する工程；
（ｌ）工程（ｋ）の前記溶出液フラクションを疎水性相互作用クロマトグラフィーに供する工程；
（ｍ）前記ペプチドを含む（ｌ）由来の溶出液フラクションを採取する工程；および
（ｎ）（ｍ）由来の前記溶出液フラクションを濃縮する工程、
を含む前記方法。
【請求項７１】
バキュロウィルス発現ベクター系と関連させて使用するための脂質組成物であって、アルコール、界面活性剤、ステロール、洗浄剤、抗酸化剤、および脂質源を含む組成物。
【請求項７２】
約５％ｖ／ｖから約２０％ｖ／ｖの量の前記アルコール；
約５％ｗ／ｖから約１５％ｗ／ｖの量の前記界面活性剤；
約０．０２％から約０．０６％ｗ／ｖの量の前記ステロール；
約０．１％ｗ／ｖから約０．３％ｗ／ｖの量の前記清浄剤；
約０．０１％ｗ／ｖから約０．０５％ｗ／ｖの量の前記抗酸化剤；および
約０．０５％ｗ／ｖから約０．２５％ｗ／ｖの量の前記脂質源、
を含む請求項７１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、全ての目的のために、各々参照としてその全体が本明細書に組み込まれている、２００５年５月６日出願の米国仮特許出願第６０／６７８，８２２号明細書、２００５年１０月１９日出願の米国仮特許出願第６０／７２９，２４０号明細書、および２００５年３月３０日出願の米国仮特許出願第６０／６６６，５４５号明細書に対する優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ペプチド製造の分野に関する。特に本発明は、バキュロウィルス発現ベクター系を用いてグリコシル化ペプチドを製造するための生産方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
組換えＤＮＡ法の開発および改善により、治療に価値のあるペプチドの大規模生産が、遺伝子修飾細菌を用いてコスト効果の高い様式で達成できることが予想された。この予想はある程度、組換え細菌が治療用ペプチドなどの多くの生物学的産物を生産するための重要な供給源であることから支持されてきた。しかし、あいにく大腸菌で産生される多くの異種タンパク質は、不溶性であり、精製が困難である。さらに、市場で魅力的なタンパク質の大多数は、生物学的に活性なタンパク質になり得る前に、グリコシル化などの翻訳後修飾を必要とするが、細菌細胞はこれらの翻訳後修飾を行うことができない。
【０００４】
適切なグリコシル化は、治療用ペプチドのインビボ半減期および免疫原性に影響を及ぼす決定的に重要な因子であることが当業界ではよく知られている。実際、ヒトは、特定のタイプの炭水化物を付加された生物学的治療薬のみを典型的に忍容し、非哺乳動物オリゴ糖付加を含む糖タンパク質をしばしば拒絶する。例えば、グリコシル化不良のペプチドは、肝臓によって「古い」と認識され、適切にグリコシル化されたペプチドよりも迅速に体内から排泄される。対照的に、グリコシル化過剰のペプチドまたは不正確にグリコシル化されたペプチドは、免疫原性となり得る。翻訳後修飾、特に、適切なグリコシル化が必要であるため、組換え治療用糖タンパク質産生のために、しばしば選択される細胞型は哺乳動物細胞である。
【０００５】
哺乳動物は全て、同様な構造のグリカンを産生するため、糖タンパク質治療薬の生産のためには、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、およびヒト胎児腎臓−２９３（ＨＥＫ−２９３）がしばしば好ましい宿主細胞である。しかし、あいにくと哺乳動物細胞培養液は、低細胞密度および低増殖率を特徴としている。さらに、哺乳動物細胞培養液の維持および増殖は非常に高価になる可能性があり、遺伝子操作が難しく、かつ、哺乳動物細胞は、ヒト対象に影響を与え得る癌遺伝子またはウィルスＤＮＡを含有する可能性がある。したがって、哺乳動物細胞内で産生させた組換えタンパク質産物は安全性に関する広範な試験を必要とする。
【０００６】
哺乳動物細胞培養液中でのペプチド生産に関連した問題を克服するために、昆虫細胞培養系が開発された。昆虫細胞は、シグナル配列を認識し、哺乳動物細胞に類似した様式で糖タンパク質を処理する代謝経路を有している。したがって、組換え糖タンパク質生産のために、バキュロウィルス発現系と組み合わせた昆虫細胞の使用に大きな関心が持たれてきており、今までに、数百のタンパク質が、バキュロウィルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）により、昆虫細胞培養液中で発現されている。
【０００７】
バキュロウィルス発現ベクター系では、鱗翅類幼虫に由来する昆虫細胞（本明細書において昆虫細胞と称する）を使用する。ＢＥＶＳは組換えタンパク質生産系として、いくつかの利点を有する。例えば、遺伝子の単離からＢＥＶＳ発現までの時間は４〜６週間という短さであり得る。生産レベルは、哺乳動物細胞系を用いて達成されるものよりも典型的にはより高く、外来性ウィルス（哺乳動物組織培養細胞に一般的に見られる）は典型的には不在である。上記のとおり、昆虫細胞はより高級な真核生物の翻訳同時シグナルおよび翻訳後シグナルを認識することができ、リン酸化、タンパク質分解処理、カルボキシルのメチル化、およびグリコシル化などの処理をもたらすことは重要なことである。
【０００８】
組換え糖タンパク質の生産に関する哺乳動物発現系を上回るＢＥＶＳの多くの利点を考えると、昆虫細胞培養法の改善に対する関心が近年増加していることは驚くに当たらない（例えば、レビューに関しては、シュレーガー・Ｅ．（Ｓｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．）（１９９６年）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：５７−７０頁を参照）。
【０００９】
一般に、昆虫細胞培養物の増殖に適用される原理は、哺乳動物細胞培養物に関する原理と同じであり、大きな違いは、使用される増殖培地の性質である。例えば、哺乳動物細胞培養培地に比較して、大規模生産方法に用いられる昆虫細胞培養培地は典型的に、著しく濃度を増加させた多くのアミノ酸、ビタミン類、および塩類を含有し、かつ、該培地はより酸性である。
【００１０】
昆虫細胞は、振とうフラスコ内で容易に増殖させることができる。しかし、大規模な細胞増殖およびＢＥＶＳによる組換えタンパク質生産は困難であり得る。例えば、昆虫細胞は哺乳動物細胞よりも３〜１０倍高い酸素濃度を必要とするため、該培養液には、必要な酸素を供給するために空気をスパージ（ｓｐａｒｇｅ）しなければならない。しかし、昆虫細胞は、それらのサイズが大きいこと、および細胞壁が無いことから、せん断に敏感である。ウィルスに感染した昆虫細胞は、ウィルス感染時に、もとのサイズの２倍に膨張するため、さらに一層せん断に敏感である。したがって、気体スパージバイオリアクター内の気泡によるせん断から該細胞を保護しなければならない。せん断ストレスから該細胞を保護するために、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８などのブロックコポリマー界面活性剤が、大規模培養液に添加される。
【００１１】
昆虫細胞培養液にはまた、血清（例えば、ウシ胎仔血清）の添加が必要である。血清は成長促進ホルモン、例えば、ステロール類、ならびに必須および非必須脂肪酸双方を含む脂質、および昆虫細胞の増殖に必要な他の低分子量物質を提供する。あいにく、血清の質におけるバッチごとの変動に加えて、血清にはまた、外来の物質およびマイコプラズマによる汚染の可能性もあり、かつ、非常に高価でもある。実際、血清のコストが、培地の総コストの５０％以上を占めることもある。さらに、血清タンパク質は、生産中の治療用ペプチドおよびタンパク質の下流のプロセッシングを妨害する可能性がある。
【００１２】
大規模な血清使用に関連した多くの欠点のため、大規模生産方法のためのコスト効果的な血清代替物が開発された。それらの代替物としては、タンパク質加水分解物および脂質を含有する遊離培地組成物が挙げられる。
【００１３】
一定のステロールならびに必須および非必須脂肪酸に関する昆虫細胞の必要に合わせるため、したがって、昆虫細胞培養物の増殖に必要な成分の多くを供給できるように、脂質を使用することができる。昆虫細胞培養液に添加するための当業界で特に好ましい脂質調合物が、インロウ（Ｉｎｌｏｗ）ら（１９８９年）Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈ．１２：１３−１６頁に開示されており；および下記の表１に示されている。
【００１４】
【表１】
2008538181.tif 000003
【００１５】
この調合物は、昆虫細胞培養液の生産性および増殖パラメーターを増強させるために、多数の研究者および製造業者によって有利に使用されている（例えば、レビューに関して、シュレーガー・Ｅ（Ｓｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．）（１９９６年）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：５７−７０頁を参照）。
【００１６】
典型的には、細胞増殖の増加は、生産性の増加と相関すると予想されている。しかし、細胞密度の増加を導く改善が、必ずしも組換えタンパク質および細胞外バキュロウィルスの収量増加に相関するわけではないことが、シュレーガー（Ｓｃｈｌａｅｇｅｒ）（上記）によって報告されている。したがって、細胞増殖および細胞密度に関して最適化された培養培地が最適なペプチド／タンパク質生産方法に関する必要条件の全てを満足させるわけではないと、シュレーガー（Ｓｃｈｌａｅｇｅｒ）は結論づけている。
【００１７】
シュレーガー（Ｓｃｈｌａｅｇｅｒ）の結論と一致して、ギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）ら（１９９６年）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２：２１１−２１６頁は、効率的な感染およびタンパク質生産を達成するために、バキュロウィルスの感染を進行させる細胞増殖期において、脂質が必要であることを見出した。ギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）らはまた、感染時または感染直後の脂質の存在または不在は、感染性バキュロウィルスからのタンパク質の発現に影響を及ぼさないことを見出した。
【００１８】
昆虫細胞培養における脂質に関する必要性を試験するために、ギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）らは、２種の接種培養物を増殖させた；１つは、脂質を添加したもの、そして他方は、脂質を添加しないものである。該細胞が感染にとって十分な密度になった時、接種培養液を分割して遠心分離し、遠心分離後、分割した培養液を再懸濁した。該培養液の半分は、脂質を含有する培地に再懸濁し、該培養液の他方の半分は、脂質を欠いた培地に再懸濁した。組換えβ−ｇａｌレポーター遺伝子を含むバキュロウィルスの感染を２時間実施した。感染期の後に、該培養液を再び分割して遠心分離し、分割した培養液を、脂質を含有するか、または脂質を欠いた培地に再懸濁した。該培養物を増殖させると、レポーター遺伝子は７２〜９６時間発現した。
【００１９】
これらの実験から、該培養液中のβ−ｇａｌ活性の量により実証されるように、タンパク質の発現レベルは、もとの接種培養物が脂質を含むかどうかによって影響され、感染の時点で該培養物に脂質が存在するかどうかには影響されないと、ギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）らは結論づけた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
大規模タンパク質生産のための昆虫細胞培養培地の開発には、あるレベルを超えて細胞培養物の生産性を上げる改善が依然として必要であり、これは、細胞増殖パラメーターの改善から生じる。さらに、細胞のタンパク質および病原性の可能性があるウィルスなどの種々の不純物質の除去に有効であり、それによって、ヒトでの使用に安全な高品質の組換えペプチドを提供するペプチド精製方法が必要とされている。以下の開示から明らかになるように、本発明は、この必要性、および他の必要性を満足させるものである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
発明の概要
本発明は、ペプチドおよび糖ペプチドの大規模生産のための方法を提供する。一態様において、本発明は、高濃度で純度の改善された組換えペプチドを含有する細胞培養液を作出する方法を提供する。他の態様において、本発明は、組換えペプチドを精製する新規方法を提供する。これらの方法を組み合わせて、高品質の組換えペプチドを提供することのできる効率的でコスト効果的なペプチド生産方法が形成される。いくつかの実施形態において、このように生産された組換えペプチドは、糖ペプチドであり、それらのグリコシル残基の構造を合成するためにさらに処理される。他の実施形態において、糖ペプチドは、糖ペプチド結合体、例えば、ペプチド（糖ペプチド）とポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）との間の結合体を作製するために用いられる。
【００２２】
本発明は、予想外の高濃度および高純度の組換えペプチドを含有する細胞培養液を提供する新たに発見された感染方法を含む。先行技術の教示とは反対に、感染の時点で細胞培養液中に脂質混合物が存在する場合、組換えバキュロウィルス感染性の昆虫細胞は、該昆虫細胞によって発現されるペプチドの量を増加させることを、本発明は発見した。いくつかの実施形態において、該細胞培養液中のペプチド量は、脂質混合物を添加しない培養液中の量に比較して、約８２％増加する。他の実施形態において、該細胞培養液中の組換えペプチドの量は、市販の脂質混合物を添加した培養液中の量に比較して、約３８％増加する。該方法は、糖ペプチドの大規模生産のために特に有用である。
【００２３】
本発明の典型的な方法は、昆虫細胞培養液中の昆虫細胞を、あるペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えバキュロウィルスに感染させる工程を含む。この感染は、脂質混合物を添加した昆虫細胞培養液で生じる。感染した昆虫細胞は増殖して、その核酸配列にコードされたペプチドを産生する。このようにして産生されたペプチドは、昆虫特異的なグリコシル化パターンを有する。一実施形態において、このようにして産生されたペプチドは、実質的に均一な昆虫特異的なグリコシル化パターンを有する。
【００２４】
本発明はまた、組換えペプチドを精製する方法を含む。一態様において、本発明は、「接線流ろ過（ＴＦＦ）カスケード」を用いた組換えペプチドを精製する方法を提供する。この調節工程は、好ましくはクロマトグラフィー精製の前に行われ、引き続く精製工程をより効率的にする濃度および純度で該ペプチドが供給され、一定の精製工程からのペプチドの回収率が増加する。
【００２５】
他の態様において、本発明は、組換えペプチドを含有する混合物中のウィルス粒子を不活化する新規方法を含む。一実施形態において、該ウィルス不活化法は、ペプチド溶液のｐＨを、一定のウィルス（例えば、非エンベロープウィルス）の生存度を低下させるのに好適な値へと低下させ、この低ｐＨ（例えば、ｐＨ約２．２）を、好適な時間量（例えば、約１時間）維持してからｐＨを上げる工程を含む。該ペプチドを低ｐＨに曝露しつつ、該ペプチドの分解を最少化するようにｐＨ値と保持時間が選択される。いくつかの実施形態において、精製されたペプチドは、選択された低ｐＨで驚くほど安定である。
【００２６】
さらなる一態様において、本発明は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによりペプチド溶液から低分子量不純物を除去する方法を提供する。一定の不純物（例えば、低分子量の細胞タンパク質）は、ペプチドの発現（例えば、バキュロウィルス発現ベクター系による）時に細胞培養培地中に放出される。いくつかの実施形態において、それらの不純物は、精製ペプチドから分離することが難しい。本発明は、対象となっている組換えペプチドを、低分子量不純物から分離する方法を提供する。この方法により、予想外に純粋なペプチドが生産される。
【００２７】
他の態様において、本発明は、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーの効率および有効性を増加させる方法を提供する。ヒドロキシアパタイト樹脂に該ペプチド溶液を装填する前に該溶液を脱塩することにより、ＨＡカラムのペプチド結合能力が著しく増加することを本発明者は発見した。さらに、溶出緩衝液にアミノ酸を添加することにより、このクロマトグラフィー工程からのペプチドの回収率が著しく増加する。
【００２８】
さらなる一態様において、本発明は、昆虫特異的グリコシル化パターンを有する組換えペプチドを細胞培養液から単離する方法を提供する。典型的な方法は、該細胞培養液から細胞破片および他の破片を除去して、該ペプチドを含有する混合物を作製する工程を含む。この混合物を「接線流ろ過（ＴＦＦ）カスケード」に供し、ここで、ウィルス、大型分子不純物および他の不純物を除去し、該混合物を下流の精製工程のために調節する。
【００２９】
該方法はさらに、該ペプチドを含有する調節混合物のｐＨを調整し、ｐＨを調整した混合物をアニオン交換体に通し（例えば、さらにウィルス粒子を除去するために）、該ペプチドを含有する１つまたは複数の溶出物フラクションを採取する工程を含む。次いで、アニオン交換カラムから採取したフラクションをカチオン交換体上に通し、該ペプチドを含有する１つまたは複数の溶出物フラクションを採取する。次いで、カチオン交換体から採取したフラクションを、低ｐＨ保持操作に供して、ウィルスを不活化させる。次に、採取したフラクションのｐＨを上げ、得られた混合物を脱塩し、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーに供する。該ペプチドを含有する１つまたは複数の溶出フラクションを採取する。ヒドロキシアパタイトカラムから採取したフラクションを、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に供し、該ペプチドをさらに精製し、該ペプチドを低分子量不純物から分離する。ペプチドを含有するフラクションをプールして、ウィルス粒子を除去するために任意にろ過する。得られた生成物を好ましくは濃縮し、貯蔵用緩衝液中へダイアフィルトレート（ｄｉａｆｉｌｔｅｒ）する。
【００３０】
一実施形態において、該方法はさらに、抽出したペプチドの糖ＰＥＧ化および糖ＰＥＧ化ペプチドの精製を含む。糖ペグ化法は、当業界に認められており、例えば、参照としてその全体が本明細書に組み込まれている、ド・フリース（Ｄｅ  Ｆｒｅｅｓ）らに対する国際公開第０３／０３１４６４号パンフレットを参照されたい。
【００３１】
一実施形態において、本方法は、エリスロポエチン（ＥＲＯ）および顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）などの治療用ペプチドの生産に用いられる。あるいは、本方法は、ＧＮＴ１、ＧａｌＴ１、ＳＴ３Ｇａｌ３、ＣＳＴ２、シアリダーゼ、ＧａｌＮＡｃＴ２、Ｃｏｒｅ１ＧａｌＴ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１，ＳＴ３Ｇａｌ１、およびＳＴ３Ｇａｌ２などの他の組換えペプチドの生産に用いることができる。
【００３２】
さらなる一態様において、本発明は、バキュロウィルス発現系と関連させて使用するための脂質組成物を提供する。本組成物は、アルコール、界面活性剤、ステロール、洗浄剤、抗酸化剤、および脂質源を含む。
【００３３】
本発明の他の目的および利点は、以下の詳細な説明から当業者に明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
発明の詳細な説明
略号
ＰＥＧ、ポリ（エチレングリコール）；ＰＰＧ、ポリ（プロピレングリコール）；Ａｒａ、アラビノシル；Ｆｒｕ、フルクトシル；Ｆｕｃ、フコシル；Ｇａｌ、ガラクトシル；ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルガラクトサミニル；Ｇｌｃ、グルコシル；ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコサミニル；Ｍａｎ、マンノシル；ＭａｎＡｃ、マンノサミニルアセテート；Ｘｙｌ、キシロシル；およびＮｅｕＡｃ、シアリル（Ｎ−アセチルノイラミニル）」；Ｍ６Ｐ、マンノース−６−ホスフェート；ＢＥＶＳ、バキュロウィルス発現ベクター系；ＣＶ、カラム容量；ＮＴＵ、公称濁度単位；ｖｖｍ、容量／容量／分。
【００３５】
定義
別に定義しない限り、本明細書に用いられている全ての専門用語および科学用語は一般に、本発明が属する通常の当業者によって一般に認識されているものと同じ意味を有する。一般に、本明細書に用いられている命名法ならびに細胞培養における実験操作、分子遺伝学、有機化学および核酸化学およびハイブリダイゼーションは、当業界に十分知られており、一般に用いられているものである。核酸およびペプチドの合成には、標準的な方法が用いられる。技法および操作は一般に、当業界の慣例的方法および本文書を通じて提供されている種々の一般的文献（一般に、参照として本明細書に組み込まれているサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版（１９８９年）コールドスプリングハーバーラボラトリー出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州を参照）に従って行われる。本明細書に用いられている命名法ならびに分析化学における実験操作、および下記の有機合成は、当業界に十分知られており、一般に用いられているものである。化学合成および化学分析には、標準的技法、またはそれらの変法が用いられる。
【００３６】
本明細書に記載される全てのオリゴ糖は、非還元糖に関する名称または略号（すなわち、Ｇａｌ）、引き続いて、グリコシド結合の立体配置（αまたはβ）、環結合（１または２）、その結合に含まれる還元糖の環の位置（２、３、４、６または８）、次いで、還元糖の名称または略号（すなわち、ＧｌｃＮＡｃ）で記述される。各々の糖はピラノースであることが好ましい。糖生物学の標準的な命名法のレビューに関しては、「Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ」、バルキ（Ｖａｒｋｉ）ら編、ＣＳＨＬ出版（１９９９年）を参照されたい。
【００３７】
オリゴ糖は、還元端の糖が実際に還元糖であろうとなかろうと、還元端および非還元端を有していると考えられる。認められている命名法に従って、本明細書においてオリゴ糖は、左側に非還元端、右側に還元端で示される。
【００３８】
用語の「昆虫細胞培養」とは、昆虫綱の生物に由来する細胞のインビトロ増殖および培養を言う。「昆虫細胞培養」とはまた、インビトロで増殖させ、培養した昆虫綱の細胞を含む細胞培養を言う。
【００３９】
用語の「感染多重度」とは、ウィルス粒子数とそのウィルス粒子に感染する細胞数との間の比率の尺度、例えば、細胞当たりのプラーク形成単位（ｐｆｕ）の数、または細胞当たりのウィルス粒子の数を言う。感染の効率は、ＭＯＩならびにウィルス粒子の濃度および細胞の濃度に影響される。
【００４０】
感染多重度はまた、感染を開始させるために、該細胞とウィルス粒子を混合した際の各細胞に感染するウィルス粒子の平均数の反映でもある。実際、任意の所与の細胞に結合し、感染するウィルス粒子の数は、ランダムな過程であり、したがって、各細胞に結合し、感染する粒子の数には統計的な変動がある。この統計的変動は、正規分布に従う。したがって、たいていの細胞は、ＭＯＩに相当する数のウィルス粒子に感染する。しかし一部の細胞はそれより多い、または少ない粒子に感染し、また一部の細胞は、全く粒子に感染しない。感染を免れている細胞の数は、ポアソン分布を用いて算出することができる。ポアソン分布により、任意の所与のＭＯＩにおける未感染のままの細胞の数は、ｅ−ＭＯＩである。
【００４１】
「ペプチド」とは、単量体がアミノ酸であり、アミド結合を介して一緒に結合しているポリマーを言い、あるいは、ポリペプチドと称される。また、非天然アミノ酸、例えば、β−アラニン、フェニルグリシンおよびホモアルギニンもまた含まれる。遺伝子コードされていないアミノ酸もまた、本発明に使用できる。さらに、反応基、グリコシル化部位、ポリマー、治療的部分、生体分子などを含むように修飾されたアミノ酸もまた本発明に使用できる。本発明に使用されるアミノ酸は全てＤ−異性体またはＬ−異性体のいずれかであり得る。一般にＬ−異性体が好ましい。また、他のペプチド模倣物も本発明に有用である。本明細書に用いられている「ペプチド」とは、グリコシル化および非グリコシル化ペプチドの双方を言う。また、ペプチドを発現する系によって不完全にグリコシル化されているペプチドも含まれる。全般的レビューに関しては、スパトーラＡ．Ｆ．（Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．、「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｂ．ヴァインシュタイン（Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ）編、マーセルデッカー（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ），ニューヨーク、２６７頁（１９８３年）を参照されたい。ペプチドという用語は、タンパク質またはポリペプチドと一般的に称される分子を含む。
【００４２】
本明細書に用いられる用語の「糖ペプチド」とは、ペプチドに共有結合した少なくとも１つの炭水化物部分を有するペプチドを言う。糖ペプチドは、「治療用糖ペプチド」であり得ることは理解される。「糖ペプチド」という用語は、本明細書において、「糖ポリペプチド」および「糖タンパク質」という用語と交換可能に用いられる。
【００４３】
用語の「ペプチド結合体」とは、ペプチドが本明細書に記載された修飾糖と結合している本発明の種を言う。
【００４４】
本明細書に用いられる用語の「修飾糖」とは、本発明の処理において、ペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基に酵素的に付加される天然または非天然の炭水化物を言う。修飾糖は、限定はしないが、糖ヌクレオチド（モノ、ジ、およびトリ−ホスフェート）、活性化糖（例えば、グリコシルハライド、グリコシルメシレート）および活性化されてもいないし、ヌクレオチドでもない糖などの多数の酵素基質から選択される。「修飾糖」は、「修飾基」によって共有結合的に官能化される。有用な修飾基としては、限定はしないが、ＰＥＧ部分、治療的部分、診断的部分、生体分子などが挙げられる。該修飾基は、天然または非修飾炭水化物でないことが好ましい。修飾基による官能化の位置は、ペプチドへの「修飾糖」の酵素的付加を妨げないように、選択される。
【００４５】
本明細書に用いられる用語の「糖結合」とは、ポリペプチド、例えば、本発明の方法により調製されたエリスロポエチンペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基への修飾糖種の酵素的に媒介された結合を言う。「糖結合」の亜属は、修飾糖の修飾基がポリ（エチレングリコール）、アルキル誘導体（例えば、ｍ−ＰＥＧ）またはそれらの反応性誘導体（例えば、Ｈ２Ｎ−ＰＥＧ、ＨＯＯＣ−ＰＥＧ）である「糖−ＰＥＧ化」である。
【００４６】
用語の「大規模」および「工業規模」は交換可能に用いられ、１つのサイクルの完了時に、少なくとも約２５０ｍｇ、好ましくは、少なくとも約５００ｍｇ、より好ましくは、少なくとも約１グラムのペプチドを生産する反応サイクルまたはプロセスを言う。
【００４７】
本明細書に用いられる用語の「グリコシル結合基」とは、修飾基（例えば、ＰＥＧ部分、治療的部分、生体分子）が共有結合しているグリコシル残基を言い；該グリコシル結合基は、該結合体の残部に該修飾基を結合させる。「グリコシル結合基」は一般に、ペプチドのグリコシル残基またはアミノ酸への、修飾糖部分の酵素的付加により形成される。
【００４８】
用語の「単離された」とは、ある物質の生産に用いられる、成分が実質的に、または本質的に無い該物質を言う。本発明のペプチドおよびペプチド結合体に関して、用語の「単離された」とは、該ペプチドまたはペプチド結合体の調製に用いられた混合物中の物質に通常伴う成分が実質的に、または本質的に無い該物質を言う。「単離された」と「純粋な」は交換可能に用いられる。典型的には、本発明の単離されたペプチドまたはペプチド結合体は、ある範囲で表された純度レベルを有する。該ペプチド結合体に関する純度範囲の下端は、約６０％、約７０％、約７５％または約８０％であり、純度範囲の上端は、約７０％、約７５％、約８０％、約９０％またはそれ以上である。
【００４９】
該ペプチドまたはペプチド結合体が、約９０％超の純度である場合、それらの純度は、範囲として表されることも好ましい。純度範囲の下端は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％または約９８％である。純度範囲の上端は、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％または約１００％純度である。
【００５０】
純度は、任意の当業界で認められた分析法（例えば、銀染色ゲル上のバンド強度、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、または類似の手段）によって判定される。
【００５１】
本明細書に用いられる「集団の本質的に各々のメンバー」とは、該ペプチドの部位の「均一性」、および共通の構造、例えば、共通のグリコシル構造を共有するペプチドの集団を言う。
【００５２】
「均一性」とは、ペプチド集団にわたる、またはペプチド上のグリコシル化部位の集団にわたる構造的な一貫性を言う。したがって、各グリコシル部分が同一の構造を有する本発明の糖ペプチドにおいて、該糖ペプチドは、約１００％均一性であると言われる。同様に、集団の各ペプチドが本質的に同一の分子種である場合のように、本発明の糖ペプチドの集団が全て同一構造のグリコシル部分を有する場合、その集団は約１００％均一性であると言われる。均一性は典型的に、ある範囲で表される。該ペプチド結合体に関する均一性の範囲の下端は、約６０％、約７０％または約８０％であり、純度の範囲の上端は、約７０％、約８０％、約９０％または約９０％超である。
【００５３】
該ペプチド結合体が約９０％以上の均一性である場合、それらの均一性もまた、ある範囲で表されることが好ましい。均一性の範囲下端は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％、または約９８％である。純度の範囲の上端は、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％、または約１００％の均一性である。該ペプチド結合体の均一性は典型的に、当業者によく知られている１つまたは複数の方法、例えば、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、飛行分光分析のマトリクス支援レーザー脱離質量時間（ＭＡＬＤＩＴＯＦ）、毛細管電気泳動などによって判定される。
【００５４】
本発明の糖ペプチド種に関して、「実質的に均一なグリコシル化パターン」とは、同一構造のグリコシル残基を有するペプチド上のグリコシル化部位のパーセンテージを言う。例えば、複数のグリコシル化部位を含むペプチドは、可能な全てのグリコシル化部位、またはそれらの部位の９０％、またはそれらの部位の８０％もしくは７５％、に存在する同一構造のグリコシル残基を有し得る。これらの場合、該ペプチドは「実質的に均一なグリコシル化パターン」を有すると言われる。あるいは、糖ペプチドの集団が共通のグリコシル化パターンを共有する場合、該集団は、該集団内のペプチドの大多数が本質的に単一の分子種を表している場合、「実質的に均一なグリコシル化パターン」を有すると言うことができる。
【００５５】
例えば、グリコシル化ペプチドがさらなる修飾なしに細胞から単離される場合、該ペプチドは、グリカンの正確な構造においてある範囲の変動を含み得る。しかし、典型的な一実施形態において、本発明の方法に従って昆虫細胞から単離されたペプチドは、実質的に均一な昆虫グリコシル化パターンを有する。これは、該調製物中の大多数のペプチド、または実質的に全てのペプチドが１つの明確な分子種であることを表している。典型的な一実施形態において、本発明の方法によって調製されたペプチドは、実質的に均一な昆虫グリコシル化パターンを有する。
【００５６】
「実質的に均一な」の上記定義における「実質的に」という用語は一般に、受容体部分の少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはさらに１００％が、予想される昆虫細胞特異的グリコシル化パターンでグリコシル化されていることを意味する。
【００５７】
用語の「昆虫特異的グリコシル化パターン」とは、昆虫細胞によって産生された成熟糖ペプチドに見られるグリコシル化パターンを言う。昆虫細胞は典型的に、末端がマンノースの単純なＮ結合オリゴ糖を生成する（レビューに関しては、例えば、「Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ」、Ａ．バルキ（Ａ．Ｖａｒｋｉ）ら編、ＣＳＨＬ出版（１９９９年）：３２−３３頁を参照）。典型的に、昆虫細胞系によって産生されたＮ結合グリカンは、成熟時に、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を含む糖タンパク質を産生する。ペプチドに直接結合しているＧｌｃＮＡｃ残基上には、フコースも見ることができる。したがって、「昆虫特異的グリコシル化パターン」を有する細胞から生じる成熟ペプチドは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を有する１種または複数種のグリカンを含む。本発明の方法によって、昆虫細胞系に産生され、それらから単離された糖ペプチドは、実質的に均一な昆虫特異的グリコシル化パターンを有する。これは、実質的に全てのペプチド上でのグリカン構造は全てＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を有し、例えば、ＧｌｃＮＡｃに分解されないという事実を表している。
【００５８】
用語の「装填用緩衝液」とは、精製装置、例えば、クロマトグラフィーカラムまたはフィルターカートリッジに適用される、そこでペプチドが精製される緩衝液を言う。装填用緩衝液は典型的に、望ましくない不純物から、対象となっているペプチドの分離を達成できるように選択される。例えば、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）カラム上でペプチドを精製する場合、装填用緩衝液のｐＨおよび該緩衝液中の塩濃度は、最初、該ペプチドをカラム上に保持しながら、一定の不純物が流出液に見られるように選択される。
【００５９】
用語の「溶出緩衝液」は、「限定緩衝液」とも称されるが、ペプチドを先に適用した精製装置（例えば、クロマトグラフィーカラムまたはフィルターカートリッジ）から、該ペプチドを除去（溶出）するために典型的に用いられる緩衝液を言う。装填用緩衝液は典型的に、望ましくない不純物から対象となっているペプチドの分離を達成できるように選択される。溶出緩衝液中の特定の塩（例えば、ＮａＣｌ）濃度は、溶出操作中に変化させる（勾配）ことが多い。この勾配は、連続的または段階的であり得る。
【００６０】
用語の「制御下室温」とは、少なくとも約１０℃、少なくとも約１５℃、少なくとも約２０℃、または少なくとも約２５℃の温度を言う。制御下室温は典型的に、約２０℃から約２５℃の間である。
【００６１】
用語の「低分子量不純物」とは、組換えペプチドもまた含有する、細胞培養液由来の混合物中に存在する混入物を言う。低分子量不純物を含む典型的な混合物は、昆虫細胞培養液に由来する。例えば、ペプチドＥＰＯを昆虫細胞系（例えば、Ｓｆ９）に発現させる場合、該細胞培養液から単離したＥＰＯ含有混合物は、図３に示され、「不純物Ａ」と標識されている低分子量不純物を含有する。
【００６２】
序論
本発明は、ペプチドおよび糖ペプチドの大規模生産のための方法を提供する。一態様において、本発明は、濃度および純度の改善された組換えペプチドを含有する細胞培養液を作出する方法を提供する。他の態様において、本発明は、組換えペプチドを精製する新規方法を提供する。これらの方法を組み合わせて、高品質の組換えペプチドを提供できる効率的でコスト効果的なペプチド生産方法が形成される。いくつかの実施形態において、このようにして生産された組換えペプチドは、糖ペプチドであり、それらのグリコシル残基の構造を合成するためにさらに処理される。
【００６３】
本発明は、高濃度で高純度の組換えペプチドを含有する細胞培養液を提供する新たに発見された感染方法を含む。感染の時点で細胞培養物中に脂質混合物が存在する場合、該昆虫細胞培養液を組換えバキュロウィルスに感染させると、該昆虫細胞によって発現されるペプチドの量が増加することを、本発明者は発見した。いくつかの実施形態において、該細胞培養液中のペプチドの量は、脂質混合物を添加しない培養液中の量に比較して、約８２％増加する。他の実施形態において、該細胞培養液中の組換えペプチドの量は、市販の脂質混合物を添加した培養液中の量に比較して、約３８％増加する。
【００６４】
本発明はまた、組換えペプチドを精製する方法を含む。本明細書で「接線流ろ過（ＴＦＦ）カスケード」と称される一連の限外ろ過工程を用いて、組換えペプチドを該細胞培養液から取り出す。この調節工程により、該ペプチドの濃度および純度が、引き続くクロマトグラフィー精製工程をより効率的にさせるものとなる。
【００６５】
さらに、本発明は、ウィルス粒子を不活化する新規方法を含む。一実施形態において、ウィルス不活化法は、対象となっているペプチドが安定である低ｐＨで該ペプチド溶液を保持することを含む。本発明はまた、該ペプチド溶液から低分子量不純物を除去する方法を提供する。この方法では、疎水性相互作用クロマトグラフィーが使用され、予想外に純粋なペプチドが生産される。また、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーの効率および有効性を増加させる方法が提供される。クロマトグラフィーの前に、該ペプチドを含有するＨＡ装填物を脱塩することにより、結合ペプチドに対するＨＡカラム能力が増大することを本発明者は発見した。さらに、溶出緩衝液にアミノ酸を添加することにより、このクロマトグラフィー工程からのペプチド回収率が著しく増加する。
【００６６】
方法
第１の態様において、本発明は、細胞培養液中にペプチドおよび糖ペプチドを生産するための効率的な方法を提供する。
【００６７】
Ｉ．ペプチド
本発明のペプチド生産方法を、任意の組換えペプチドまたは糖ペプチドを生産するために使用することができる。一実施形態において、該ペプチドまたは糖ペプチドは、約１０ｋＤａから約１００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態において、該ペプチドまたは糖ペプチドは、約１０ｋＤａから約５０ｋＤａ、好ましくは、約１０ｋＤａから約３０ｋＤａ、より好ましくは、約２０ｋＤａから約２５ｋＤａの分子量を有する。
【００６８】
一実施形態において、該方法は、治療用ペプチドを生産するために使用される。典型的な治療用ペプチドとしては、エリスロポエチン（ＥＰＯ）および顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）が挙げられる。該方法は、ＧＮＴ１、ＧａｌＴ１、ＳＴ３Ｇａｌ３、ＣＳＴ２、シアリダーゼ、ＧａｌＮＡｃＴ２、ＣｏｒｅｌＧａｌＴ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１，ＳＴ３Ｇａｌ１、およびＳＴ３Ｇａｌ２などのペプチドの生産に任意に用いることができる。
【００６９】
ＩＩ．昆虫細胞培養液
ＩＩ．ａ）細胞
本発明のペプチドは、細菌、哺乳動物および昆虫の細胞系などの任意の有用な細胞系内に発現させることができる。典型的な一実施形態において、該ペプチドは、昆虫細胞内に発現させる。本発明における使用に好適な昆虫細胞は、組換えウィルス（例えば、バキュロウィルス）または野生型ウィルスにとっての宿主になることができ、本発明の培地組成物中で増殖でき、該ウィルスに感染した際に組換えペプチド産物を産生することのできる昆虫綱の任意の目からのものである。典型的一実施形態において、該細胞は、双翅目または鱗翅目からのものである。
【００７０】
約３００種の昆虫が核多角体ウィルス（ＮＰＶ）病を有することが報告されており、それらの大多数（２４３）が鱗翅目から単離されている（例えば、ウェイス（Ｗｅｉｓｓ）ら、「Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ  Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ」、グラナドス（Ｇｒａｎａｄｏｓ）ら（編）、Ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ：第ＩＩ巻、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、６３−８７頁の６４頁（１９８６年）を参照）。以下の昆虫に由来する昆虫細胞系が典型的なものである：Ｃａｒｐｏｃａｐｓａ  ｐｏｍｏｎｅｌｌａ（好ましくは、細胞系ＣＰ−１２８）；Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ（好ましくは、細胞系ＴＮ−３６８）；Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ；Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（好ましくは、細胞系Ｓｆ９）；Ｌｙｍａｎｔｒｉａ  ｄｉｓｐａｒ；Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ；Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ；Ｏｒｇｙｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ；Ｎｅｏｄｉｐｒｉｏｎ  ｓｅｒｔｉｆｅｒ；Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ；Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｅｕｃａｌｙｐｔｉ；Ｇｎｏｒｉｍｏｓｃｈｅｍａ  ｏｐｅｒｃｕｌｌｅｌａ；Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ；Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ；Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｚｅａ；Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ；Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ  ｏｕ；Ｐｌｏｄｉａ  ｉｎｔｅｒｐｕｎｃｔｅｌｌａ；Ａｍｓａｃｔａ  ｍｏｏｒｅｉ；Ａｇｒｏｔｉｓ  ｃ−ｎｉｔｒｕｍ、Ａｄｏｘｏｐｈｙｅｓ  ｏｒａｎａ、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｓｅｇｅｔｕｍ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｈｙｐｏｎｏｍｅｕｔａ  ｍａｌｉｎｅｌｌｕｓ、Ｃｏｌｉａｓ  ｅｕｒｙｔｈｅｍｅ、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ  ｇｅｍｍｅｔａｌｉｓ、Ａｐａｎｔｅｌｅｓ  ｍｅｌａｎｏｓｃｅｌｕｓ、Ａｒｃｔｉａ  ｃａｊａ、およびＬｙｍａｎｔｒｉａ  ｄｉｓｐａｒ。
【００７１】
典型的な一実施形態において、該昆虫細胞は、ヨウトガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）からのものであり、他の典型的な実施形態において、該細胞系は、Ｓｆ９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１）である。バキュロウィルス発現には、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、およびハイ−ファイブ（Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ）昆虫細胞が一般に用いられる。Ｓｆ９およびＳｆ２１は、ヨウトガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の卵巣細胞系である。ハイ−ファイブ（Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ）細胞は、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）の卵細胞である。Ｓｆ９、Ｓｆ２１およびハイ−ファイブ（Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ）細胞系は、室温（例えば、２５℃から２７℃）で増殖でき、ＣＯ２インキュベーターを必要としない。それらの倍増時間は、約１８時間から２４時間の間である。
【００７２】
ＩＩ．ｂ）ウィルス
本発明のペプチドおよび糖ペプチドを生産するために培養される昆虫細胞系は、ピコルナウィルス、パルボウィルス、昆虫ポックスウィルス、バキュロウィルスおよびラブドウィルスなどの多くの昆虫病原性ウィルスの増殖に好適なものである。典型的な一実施形態において、バキュロウィルスの類の核多角体病ウィルス（ＮＰＶ）および顆粒症ウィルス（ＧＶ）が好ましい。
【００７３】
バキュロウィルスは、一般に閉塞体（多角体とも称される）に閉塞されている桿状のウィルス粒子を特徴としている。バキュロウィルス科は、２つの亜科：閉塞ウィルスの２つの属；核多角体病ウィルス（ＮＰＶ）および顆粒症ウィルス（ＧＶ）を含むＥｕｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｎａｅと非閉塞ウィルスを含むＮｕｄｏｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｎａｅ亜科に分けることができる。
【００７４】
ウィルス発現系を調製し使用する方法は、当業界に一般に知られている。例えば、バキュロウィルス系に関して代表的な参考文献としては、米国特許第５，１９４，３７６号明細書、米国特許第５，１４７，７８８号明細書、米国特許第４，８７９，２３６号明細書、およびベダード・Ｃ（Ｂｅｄａｒｄ  Ｃ）ら（１９９４年）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：１２９−１３８頁；ヒンク・ＷＴ（Ｈｉｎｋ  ＷＴ）ら、（１９９１年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ７：９−１４頁；リカリ・Ｐ（Ｌｉｃａｒｉ  Ｐ）ら、（１９９２年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ３９：６１４−６１８頁が挙げられ、これらの各々は、参照としてその全体が本明細書に組み込まれている。
【００７５】
したがって、一実施形態において、本発明は、所望のポリペプチドをコードする核酸を含有するバキュロウィルスベクターを含む。バキュロウィルス発現ベクター内への所望の核酸の組み込みは、当業界によく知られている技法を用いて達成できる。例えば、このような技法は、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（第３版、２００１年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク）、およびアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（１９９７年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ジョーンウィリー＆サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク）に記載されている。
【００７６】
ＩＩ．ｃ）培養培地の組成
昆虫細胞を培養するための培地は市販されている。典型的な一実施形態において、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から入手可能なＳｆ−９００ＩＩが、バキュロウィルスに感染させる昆虫細胞培養液の増殖に使用される。該細胞を、とりわけバキュロウィルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）技法に使用できるように、Ｓｆ−９００ＩＩ培地を最適化して、単層および懸濁液適用の双方におけるＳｆ９細胞およびＳｆ２１細胞の増殖を支持する。
【００７７】
昆虫細胞培養培地を調製するためのプロトコルもまた当業界に知られている（例えば、グラナドス（Ｇｒａｎａｄｏｓ）ら（編）、Ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ：第ＩＩ巻、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、６３−８７頁の６４頁（１９８６年）におけるウェイス（Ｗｅｉｓｓ）ら、「Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ  Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ」を参照）。
【００７８】
一般に、昆虫細胞培養培地は、無機塩、例えば、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２；糖、例えば、スクロース、マルトース；アミノ酸、例えば、Ｌ−プロリン、Ｌ−チロシン；およびビタミン類、例えば、ナイアシンおよび葉酸を含有する。種々の培地成分の具体的な量は、シュレーガー・Ｅ．（Ｓｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．）（１９９６年）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：５７−７０頁の表１に開示されている。次いでこの基本培地に、血清、例えば、ウシ胎仔血清、あるいは種々の脂質組成物を添加する。
【００７９】
脂質混合物
無血清培地中での昆虫細胞培養液の増殖にとって脂質は不可欠である。昆虫細胞培養培地の一般的な展開は、参照として本明細書に組み込まれている、シュレーガー・Ｅ．（Ｓｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．）（１９９６年）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：５７−７０頁にレビューされている。典型的には、昆虫細胞は、活気のある増殖のために、ステロール、脂肪酸、アミノ酸および塩類を含む培養培地を必要とする。
【００８０】
脂質混合物の存在下、対象となっているペプチドをコードする組換えバキュロウィルスに昆虫細胞を感染させることによって、感染の時点で脂質が存在しない場合に得られる収量に比較して、該ペプチド収量の改善がもたらされることを、本発明は、先行技術の教示に反して発見した。さらに、典型的な一実施形態において、このようにして生産されたペプチドが実質的に均一なグリコシル化パターンを含む点で、該ペプチドの品質が改善される。該方法は、糖ペプチドの大規模生産にとって特に有用である。
【００８１】
一態様において、本発明は、アルコール（例えば、エタノール）、ステロール（例えば、コレステロール）、界面活性剤（例えば、ブロックコポリマー、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ６８）、非イオン性洗浄剤（例えば、ツイーン８０）、抗酸化剤（例えば、デルタ−トコフェロールアセテート）、および脂質源（例えば、タラ肝油）を含む脂質混合物を提供する。
【００８２】
この態様による一実施形態において、該脂質混合物は、約５％ｖ／ｖから約２０％ｖ／ｖの間の量のアルコール、例えばエタノール、約０．０２％から約０．０６％ｗ／ｖの間の量のステロール（例えばコレステロール）、約５％ｗ／ｖから約１５％ｗ／ｖの間の量の非イオン性界面活性剤（例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８）、約０．１％ｗ／ｖから約０．３％ｗ／ｖの間の量の非イオン性洗浄剤（例えばツイーン８０）、約０．０１％ｗ／ｖから約０．０５％ｗ／ｖの間の量の抗酸化剤（例えばデルタ−トコフェロールアセテート）、および約０．００５％ｗ／ｖから約０．２５％ｗ／ｖの間の量の脂質源（例えばタラ肝油）を含む。
【００８３】
他の実施形態において、昆虫細胞培養液を補充するために添加される脂質混合物の容量は、約０．５％から約３％ｖ／ｖの間に相当する量である。他の実施形態において、昆虫細胞培養液を補足するために添加される脂質混合物の容量は、約１．０％から約２．０％ｖ／ｖ、好ましくは、約１．０％から約１．５％ｖ／ｖ、より好ましくは、約１．５％ｖ／ｖに相当する量である。
【００８４】
他の典型的な実施形態において、該細胞培養ブロスへの脂質混合物の添加により、培養ブロスに脂質混合物が添加されていない場合のペプチドの力価に比較して、約１０％から約１００％、所望のペプチドの力価が増加する。他の実施形態において、該細胞培養ブロスへの該脂質混合物の添加により、所望のペプチドの力価が、約５０％から約１００％、好ましくは、約６０％から約１００％、増加する。
【００８５】
一実施形態において、該脂質混合物は、感染の約０．５時間前から約３．０時間前の間に相当する時点で昆虫細胞培養液に添加される。他の実施形態において、該脂質混合物は、感染の約１時間前から約２時間前、好ましくは、感染の約１時間前に添加される。
【００８６】
典型的な一実施形態において、該脂質混合物は、使用の約４８時間前以内に、好ましくは、使用の約２４時間前以内に調製される。
【００８７】
ＩＩ．ｄ）ウィルス感染
感染多重度（ＭＯＩ）
感染多重度、またはＭＯＩは、ウィルス粒子数とそのウィルス粒子に感染する細胞数との間の比率の尺度、例えば、細胞１個当たりのプラーク形成単位（ｐｆｕ）を表す。感染の効率は、ウィルス粒子および細胞の濃度だけでなく、ＭＯＩに影響される。
【００８８】
ＭＯＩは、所望の感染効率を提供するように選択される。ウィルス粒子の数が、感染する細胞の数を大幅に上回る場合、該細胞は、高ＭＯＩで感染すると言われる。例えば、感染する細胞の５倍多くウィルス粒子がある５のＭＯＩは高ＭＯＩと考えられる。ウィルス粒子の数が、数桁の大きさで細胞数未満である場合、そのＭＯＩは低いと考えられる。
【００８９】
一実施形態において、感染には、約１０−８から約１．０の間の感染多重度が用いられる。他の実施形態において、感染には、約１０−７から約０．５の間の感染多重度が用いられる。他の実施形態において、感染には、約１０−６から約０．２の間の感染多重度が用いられる。さらに他の実施形態において、感染には、約０．１から約０．２の感染多重度が用いられる。
【００９０】
バキュロウィルス系に関する標準的な感染多重度は、細胞１個当たり、約０．８ウィルス粒子から細胞１個当たり、約０．０５ウィルス粒子の間の範囲である。しかし、バキュロウィルスは、それよりはるかに低いＭＯＩでも感染できる。参照としてその全体が本明細書に組み込まれている、２００６年１月１７日出願の同時係属および共同所有特許国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０６／０１５８２号明細書には、きわめて低いＭＯＩにより、バキュロウィルス感染からの組換えペプチドの収量が増加することが開示されている。
【００９１】
一実施形態において、低ＭＯＩを用いて、本発明の方法による昆虫細胞の感染を開始させる。この実施形態において、ＭＯＩは、０．００００１（１０−５）ｐｆｕ／細胞以下である。他の実施形態において、ＭＯＩは、０．０００００１（１０−６）から０．００００１（１０−５）の間である。さらに他の実施形態において、ＭＯＩは、０．００００００１（１０−７）から０．０００００１（１０−６）の間、または０．００００００１（１０−７）から０．００００１（１０−５）の間である。さらに他の実施形態において、ＭＯＩは、０．０００００００１（１０−８）から０．００００００１（１０−７）、０．０００００００１（１０−８）から０．０００００１（１０−６）、または０．０００００００１（１０−８）から０．００００１（１０−５）の間である。
【００９２】
本発明の方法により生産する各タイプまたはクラスのポリペプチドの生産に最も好適な好ましいＭＯＩまたはＭＯＩの好ましい範囲の決定は、十分に当業技術者の能力の範囲内にある。溶液中の生存可能なウィルス粒子数を決定するために使用できる好適な滴定法は、当業界に知られている（例えば、標準的プラークアッセイ）。
【００９３】
ＩＩ．ｅ）増殖
昆虫細胞培養物は、バイオリアクター内で、高細胞密度へと増殖させることができる。典型的な増殖プロトコルは当業界に知られており、例えば、ウェイス（Ｗｅｉｓｓ）ら、上記を参照されたい。典型的な一実施形態において、感染させた昆虫細胞培養物を、約５０時間から約１００時間増殖させる。他の実施形態において、感染させた昆虫培養物を、約６０時間から約７０時間増殖させる。
【００９４】
ＩＩＩ．細胞培養液からのペプチド単離
第２の態様において、本発明は、組換えペプチドを精製する方法を提供する。任意の好適な発現系において発現させることのできるタンパク質を先ず該細胞培養物から取り出し、次いで、種々のろ過およびクロマトグラフィーの精製装置を用いて、ウィルス粒子および不必要なタンパク質などの不純物を除去する。
【００９５】
バキュロウィルス発現系においては、タンパク質は典型的には、該細胞から直接、周囲の増殖培地に分泌される。生産作業の完了時に、ウィルス粒子、細胞全体および細胞破片を、該培養液より除去してから、上澄液からの該ペプチドの単離を開始する。これらは一般に、分画遠心分離、連続遠心分離により、ろ過により、またはこれらの方法の組み合わせにより除去される。
【００９６】
直接分泌タンパク質を生産する培養物の増殖中に生じる自然な細胞死により、細胞内宿主細胞タンパク質の放出がもたらされ、細胞破片が生じる。これらの不純物は、ペプチド生産作業の過程に影響を与え得る。実際、自然な細胞死によって放出された細胞成分断片および宿主細胞タンパク質はサイズが小さいために除去が困難である。
【００９７】
幸い、本発明の典型的な方法により組換えペプチドを調製するために用いられる昆虫細胞培養液は、自然な細胞死を最少量しか経験しない。典型的な一実施形態において、低レベルの細胞死により、生産作業の終了時での培養ブロスの品質が改善され、次いで、これによって、最終的なペプチド産物の品質が改善される。さらに、培養ブロスの品質改善により、生産作業の効率およびコスト効果が改善される。
【００９８】
本発明の精製カスケードにおける典型的な工程は下記に記載されている。当然のことながら、工程の順序が明示されない限り、該典型的な工程は、任意の所望の順序で実践可能である。
【００９９】
ＩＩＩ．ａ）細胞培養物の採取
対象となっているペプチドを細胞培養液から単離するために、細胞破片および他の破片を除去して、引き続く精製工程のために好適な供給材料を作製する。破片の除去は、１回または複数回の遠心分離工程、１回または複数回のろ過工程、または遠心分離工程とろ過工程の組み合わせを用いて達成することができる。
【０１００】
細胞培養液の容量が、約２リットル以下などと少ない典型的な一実施形態において、バッチ遠心分離（例えば、ボトル遠心分離）が使用できる。典型的な一実施形態において、上澄み液を、適切なフィルターまたは連続フィルターによってさらに清澄化する。細胞培養液の容量が、約１０Ｌから約１００Ｌ（パイロット規模）である他の典型的な実施形態において、該破片は連続フィルターによって直接的に除去できる。ペプチドの大規模生産が望まれる他の典型的な実施形態において、細胞の除去は、遠心分離に加え、ろ過を用いて達成することができる。これらの例において、細胞培養液からの破片の除去は、連続遠心分離後、ろ過を用いて達成することが好ましい。
【０１０１】
遠心分離
該ペプチドを含有する細胞培養液は、任意の好適な遠心分離法を用いて遠心分離できる。典型的な一実施形態において、本発明のペプチド精製方法では、バッチ遠心分離、連続遠心分離およびそれらの組み合わせから選択される遠心分離法が用いられる。大規模精製法では、連続的に操作できる遠心分離が最も有用である。これらにより、供給材料の連続的添加、上澄液の連続的除去、および固体の非連続的、半連続的、または連続的な除去が可能になる。
【０１０２】
典型的な一実施形態において、細胞破片は、連続的ディスク−スタック遠心分離によって除去される。連続的マルチチャンバーディスクスタック遠心分離が当業界に知られており、短い沈殿距離で広い清澄化表面を提供する多数の平行ディスクを含有する。典型的な一実施形態において、バルブを介してスラッジが除去される。ディスクスタック遠心分離は、バルブを介してスラッジを押出す、遠心分離ボール内の求心加圧ポンプを用いて、半連続的に、または連続的に操作できる。有効表面積が広いため、このような装置のキャパシティーおよび半径は大きく、液体の濃さはきわめて低い。
【０１０３】
他の典型的な実施形態において、遠心分離は、バッチ遠心分離（例えば、ボトル遠心分離）を用いて達成される。
【０１０４】
最初の遠心分離工程の上澄液に、ＣａＣｌ２が任意に添加される。次いで、得られた混合物のｐＨを、塩基（例えば、水酸化ナトリウム）の添加により、約ｐＨ７．５に調整する。典型的な一実施形態において、塩基を添加した際、沈殿が形成する。塩基としてＮａＯＨを使用した場合、該沈殿物はＣａ（ＯＨ）２を含有する。該沈殿物を液体から分離する（例えば、ろ過または遠心分離により）。典型的な一実施形態において、この「ＣａＣｌ２沈殿」によって、引き続く限外ろ過工程の性能が改善される。
【０１０５】
他の典型的な実施形態において、有機酸（例えばクエン酸）の塩が細胞培養液に添加される（例えば、遠心分離の前に）。他の典型的な実施形態において、クエン酸塩は分解性酵素（例えば、エンドグリコシダーゼ）の活性を阻害する。
【０１０６】
ＩＩＩ．ｂ）ろ過
典型的には、遠心分離により、大型固体、細胞全体、および破片が、該細胞培養液から効果的に除去される。この最初の清澄化工程に加えて、ペプチド精製法は、粒子状物質、ウィルス粒子を除去するために、ならびに膜フィルターおよび限外ろ過装置などの下流の処理用品の詰まりを防ぐために、第２の清澄化工程として使用できるろ過工程を任意に含む。
【０１０７】
デプスろ過
本発明の精製法は、デプスろ過工程を任意に含む。デプスろ過は、残留している細胞破片および他の小型粒子の除去に効果的である。デプスろ過は、フィルターと不純物粒子との間の２つの主要タイプの相互作用を用いて、不純物を保持する。粒子は、それらのサイズにより保持されるが、フィルター材料への吸着によっても保持され得る。該粒子とフィルター材料との間の分子の力および／または電気的な力がこれらの物質をフィルター内に引き寄せて保持する。
【０１０８】
デプスろ過装置は当業界に知られている。典型的な一実施形態において、該フィルター材料は、線維の隙間に埋め込んだ珪藻土（ＤＥ）粒子などの無機フィルター補助物を有する厚い繊維状のセルロース構造からなる。この構造により、前記の保持機構に基づいた粒子捕捉およびフィルター能力にとって重要である広い内部表面積がもたらされる。他の典型的な実施形態において、正に荷電したデプスフィルターが用いられる。
【０１０９】
デプスろ過は、１つまたは複数のデプスフィルターを用いて達成できる。典型的な一実施形態において、２つ以上のフィルターが１つの多層フィルターに組み合わされている。一例において、第２の（下流）フィルターがタイター等級のものである２つのフィルターが用いられる。典型的な一実施形態において、デプスろ過工程は、細胞培養液の最初の遠心分離に引き続いて用いられる。
【０１１０】
膜ろ過
他の実施形態において、該ペプチド精製方法は、小型粒子を除去するために、１つまたは複数の膜ろ過工程をさらに含む。典型的な膜フィルターは、約０．１μｍから約０．５μｍ、好ましくは、約０．１μｍから約０．３μｍ、より好ましくは、約０．２０μｍから約０．２５μｍの孔径を有する。
【０１１１】
該膜フィルターは、任意に、多層フィルターまたは連続フィルターの一部である。例えば、膜フィルターを、１つまたは複数のデプスフィルターと組み合わせて、多層フィルター装置が形成される。典型的な一実施形態において、膜フィルターは、多層フィルター装置または連続フィルターの最も下流の層を形成する。
【０１１２】
ＩＩＩ．ｃ）接線流ろ過（ＴＦＦ）
膜ろ過は、ペプチドの清澄化、濃縮、および精製に広く用いられている分離技法である。接線流ろ過、または直交流ろ過は、液体溶液または懸濁液中の成分を、それらのサイズおよび電荷の差に基づいて分離するために膜を用いる、圧力駆動分離法である。直交流分離の間、供給流は加圧下、膜要素内に導入され、膜表面を横断して制御下流路に入る。供給流の一部は、該膜の中を通過し、透過液と称される。該膜を横断しない供給流の一部は、濃縮液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）と称される。
【０１１３】
一態様において、本発明は、組換えペプチドを精製する方法を提供し、該方法は、（ａ）接線流ろ過カスケードを用いて該ペプチドを含有する混合物を調節する工程を含む。該方法により、該混合物をクロマトグラフィー精製工程に供する前に調節する。該方法は、該ペプチド溶液からバキュロウィルス粒子および他の粒子を除去してから、半精製ペプチドを濃縮する上で有用である。調節は、約５ｋＤａから約２００ｋＤａの間の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する一組の限外ろ過（ＵＦ）膜を通して該ペプチド溶液をろ過することによって達成される。ＴＦＦカスケードは、任意の数の高および低ＭＷＣＯ膜を含み得る。典型的な一実施形態において、ＴＦＦカスケードは、膜が、精製されるペプチドのサイズによって選択されるＭＷＣＯを有する２つの膜フィルターを含む。これらの２つの膜フィルターは、同一の、または異なるＭＷＣＯを有し得る。
【０１１４】
典型的な一実施形態において、精製されるペプチドは、一定の不純物のサイズに比較して、相対的に小さい分子サイズを有する。一実施形態において、本発明は、大型の不純物から小型のペプチドを分離するために、独特に調整された限外ろ過法およびダイアフィルトレーション法を提供する。
【０１１５】
典型的な一実施形態において、ＴＦＦカスケードは、１つの膜が精製ペプチドよりも大きなＭＷＣＯを有し、他方の膜が精製ペプチドよりも小さなＭＷＣＯを有する２つの膜フィルターを有する。
【０１１６】
典型的な一方法は、該ペプチドを含有する混合物を調節するために、以下の工程を含有する：（ｉ）精製ペプチドよりも大きなＭＷＣＯを有する第１の限外ろ過膜を通して該ペプチド溶液を限外ろ過する工程；（ｉｉ）精製ペプチドよりも小さなＭＷＣＯを有する第２の限外ろ過膜を通して工程（ｉ）からの透過液を限外ろ過する工程；および（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）からの濃縮液を採取する工程。該精製ペプチドは、第１の限外ろ過膜の孔を通って流出し、この第１の限外ろ過工程のフロートラフ（透過液）中に含有されることが好ましい。一定の分解性酵素などの大型タンパク質は、このように除去される。第２の限外ろ過工程の間、精製ペプチドは該膜を横断しないことが好ましく、濃縮液フラクション中に見られることが好ましい。これによって、該ペプチドを濃縮し、該緩衝液系を変化させることが可能になる。該緩衝液系は、貯留濃縮液に新たな緩衝液を補充することによって変化させる。この「ダイアフィルトレーション」工程の間に、元の緩衝液は、新たな「ダイアフィルトレーション」緩衝液によって次第に希釈される。
【０１１７】
大きなＭＷＣＯを有する膜を用いる限外ろ過
典型的な一実施形態において、第１の膜を横断させてＴＦＦ供給液をろ過し、濃縮流の形成を回避しつつ透過流を生じさせることによって、該精製法を開始する。典型的な一実施形態において、約１ｐｓｉから約３０ｐｓｉの膜間圧、および約７５ｋＤａから約１２５ｋＤａ、好ましくは、約１００ｋＤａのＭＷＣＯを有するＵＦフィルター膜を用いて、ろ過を達成する。限外ろ過膜はバキュロウィルス粒子および大型タンパク質などの他の大型分子不純物を保持する一方、精製ペプチドを通過させる。
【０１１８】
他の典型的な実施形態において、この限外ろ過工程に利用される膜は、セルロースアセテート、再生セルロース、およびポリエーテルスルホンから選択された部材である。好適な膜は、膜ポリマーが化学的に修飾されているものを含む。好ましい一実施形態において、該膜は再生セルロースである。
【０１１９】
小さなＭＷＣＯを有する膜を用いる限外ろ過
典型的なＴＦＦカスケードにおいて、供給液は、精製ペプチドを濃縮する上で好適なＭＷＣＯを有する限外ろ過膜を通過させる。サンプルを濃縮するために、該膜は、精製ペプチドの分子量よりも実質的に低いＭＷＣＯを有するように選択される。一般に、限外ろ過膜が、該膜によって保持されるペプチドの分子量よりも３倍から６倍低いＭＷＣＯを有するように選択される。流速または処理時間が主要な考慮事項である場合、この範囲の下端の方のＭＷＣＯ（例えば、３×）を有する膜を選択すると、より高い流速がもたらされる。ペプチドの回収が主要な関心事である場合は、強化膜（例えば、６×）が選択される（典型的には低流速）。
【０１２０】
他の典型的な実施形態において、約１ｐｓｉから約３０ｐｓｉの膜間圧、および約５ｋＤａから約１５ｋＤａ、好ましくは、約１０ｋＤａのＭＷＣＯを有するフィルター膜を用いて、ろ過を達成する。第２のろ過工程により、濃縮流および透過流が生じる。緩衝溶液を濃縮液に添加することにより、供給液中のペプチド濃度を本質的に一定とした条件下で濃縮液を供給ペプチド溶液用の貯留に再利用する。
【０１２１】
使用されるろ過膜の表面積は一般に、精製されるペプチドの量に依存する。該膜は、吸着損失を最少化するために低結合性材料から作製でき、耐久性であり、洗浄可能であり、使用される緩衝液と適合性であることが好ましい。例えば、セルロースアセテート、再生セルロースおよびポリエーテルスルホン膜など、多数の好適な膜が市販されている。好適な膜は、膜ポリマーが化学的に修飾されているものを含む。典型的な一実施形態において、該膜は再生セルロースである。
【０１２２】
一定の膜間圧を維持するために、流速が調整される。一般に、より高い圧力およびより高い流速によって、ろ過はより速やかに進行するが、流速がより速くなると、膜通過によるペプチドの損傷またはペプチドの損失も生じ得る。また、種々のＴＦＦ装置は、それらの操作に関して一定の圧力限界を有し得るので、製造元の仕様明細書に従って、圧力を調整する。典型的な一実施形態において、圧力は、約１ｐｓｉから約３０ｐｓｉの間、および他の典型的な実施形態において、圧力は、約８ｐｓｉから約１０ｐｓｉの間である。典型的には、循環ポンプは供給チャネル内の蠕動ポンプまたは膜型ポンプであり、圧力は濃縮液バルブを調整することにより制御する。
【０１２３】
ろ過工程に引き続いて、またはＴＦＦカスケードの最後に、濃縮液を採取する。水または水性緩衝液（例えば、ダイアフィルトレーション用緩衝液）を用いて、膜フィルターを洗浄し、該膜に保持された任意のペプチドを回収することができる。洗浄液は、濃縮ペプチドを含有するもとの濃縮液と合わせることができる。部分的に精製したペプチドをアニオン交換クロマトグラフィーなどの引き続く精製工程に供する前に、該濃縮液を、トリスまたはＨＥＰＥＳなどの緩衝液に対して任意に透析する。
【０１２４】
典型的なＴＦＦカスケードは図２に示してある。この例では、供給流を第１の膜要素（１００ｋＤａ  ＴＦＦ）にポンプで流入させ、１００ｋＤａの透過流を貯留液に採取する（容器２）。次いで、ペプチド含有溶液を、容器２から第２の膜要素（１０ｋＤａ  ＴＦＦ）へポンプで流入させる。この第２のろ過工程からの１０ｋＤａ透過液を容器３に採取する。該濃縮液を、１０ｋＤａの濃縮液流を通して容器２に再導入できる。容器４は、必要に応じて容器１および容器２の中の緩衝液内容物を新しくするために用いられる緩衝液を含有する。
【０１２５】
クロマトグラフィー手段による該ペプチドの精製前に直交流ろ過（例えば、限外ろ過およびダイアフィルトレーション）を使用することには、いくつかの予想外の利点がある。第１に、該精製方法の早期に、ウィルス粒子の大部分が除去される。第２に、該ペプチド精製方法の全体的性能が増大する。大きな分子量の不純物を該方法の早期に除去することにより、下流の精製工程の性能が著しく増大する。全般的に装填材料がより清浄になることにより、引き続く精製操作に必要とされる膜面積はより少なく、必要とされるクロマトグラフィーカラムはより小さくなる。
【０１２６】
また、該方法の早期に該ペプチド溶液から分解性酵素を除去することにより、該処理の間の該ペプチドの安定性が増大し、したがって、全体的収量が改善される。該ペプチドの安定性増大により、引き続く精製工程は、制御下室温で任意に実施することができ、精製工程全体を低温室施設内で実施する必要性が除外される。輸送前の精製ペプチドの短期貯蔵（例えば、一晩保持）およびさらなる処理が可能になる。
【０１２７】
ＩＩＩ．ｄ）組換えペプチドのクロマトグラフィー精製
ペプチドおよびタンパク質の単離のために、サイズ排除クロマトグラフィー（ゲルろ過）、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、アフィニティークロマトグラフィー、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの混合様式クロマトグラフィーなど、種々の認められたクロマトグラフィー技法が用いられる。典型的な一実施形態において、本発明のペプチド精製方法では、いくつかのクロマトグラフィー技法の組み合わせが用いられる。これらの工程を実施する順序は、精製されるペプチドの性質および除去される不純物の性質に依存する。
【０１２８】
本発明の実施にとって好適な技法により、電荷、疎水性の程度、および／またはサイズに基づいて、種々の不純物から対象となっているペプチドが分離される。これらの技法の各々に対して、種々のクロマトグラフィー用の樹脂および膜が入手可能であり、精製される具体的なペプチドに対して、精製方式の正確な調整が可能となる。
【０１２９】
ある１つののクロマトグラフィー技法において、混合物中の成分が、該カラム材料と異なる相互作用を行い、カラム全長にわたって異なる速度で移動し、該カラムをさらに流下するにつれて増加する物理的分離が達成される。他のクロマトグラフィー技法において、該混合物中の対象となっているペプチドなどの成分は、分離媒体に選択的に接着し、一方、他の成分は流出液中に見られる。次いで、最初に保持された成分を、溶媒組成または緩衝液系を変化させることによって異なった溶出をさせる。他のアプローチでは、所望の成分が流出液中に見られ、一方、不純物がカラムに保持され、したがって、該混合物から除去される。
【０１３０】
イオン交換クロマトグラフィー
アニオン交換クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィーが当業界に知られている。イオン交換クロマトグラフィーでは、化合物がそれらの正味の電荷に基づいて分離される。イオン性分子は、アニオン（負の電荷を有する）またはカチオン（正の電荷を有する）として分類される。いくつかの分子（例えば、タンパク質）は、アニオン基およびカチオン基の双方を有し得る。正に荷電した支持体（アニオン交換体）は、全体として負の電荷を有する化合物に結合する。反対に、負に荷電した支持体（カチオン交換体）は、全体として正の電荷を有する化合物に結合する。イオン交換マトリックスはさらに、強交換体または弱交換体として分類できる。強イオン交換マトリックスは、広い範囲のｐＨレベルにわたって荷電（イオン化）する。弱イオン交換マトリックスは、狭いｐＨ範囲でイオン化する。交換カラムのイオン性基は、ゲルマトリックスに共有結合しており、緩衝液中に存在する低濃度の対イオンによって補われる。最も一般的なイオン交換化学としては以下が挙げられる：強アニオン交換に対して四級アンモニウム残基（Ｑ）、弱アニオン交換に対してジエチルアミノエチル残基（ＤＥＡＥ）、強カチオン交換に対してスルホン酸（Ｓ）、および弱カチオン交換に対してカルボキシメチル残基（ＣＭ）。
【０１３１】
カラムにサンプルを加えると、弱く結合した対イオンとの交換が生じる。カラムを通してサンプル成分を進行させないように、最初の溶媒が低溶出強度のものである限り、イオン交換クロマトグラフィーにおけるサンプル容量サイズの重要性は二次的なものである。このような条件下、サンプル成分は、カラム最上部に集められることが好ましい。より強力な溶出移動相を加えることにより、勾配を開始すると、サンプル成分の分離が始まる。分離不良が見られる場合は、勾配の傾斜を変化させることによって改善できる可能性がある。選択された条件下で該ペプチドがカラムに結合しない場合は、出発緩衝液の組成および／またはｐＨを変化させる必要がある。各緩衝液組成は、イオン交換体およびサンプル成分を独特に溶媒和するため、種々の緩衝塩を選択することによって、緩衝液系をさらに最適化することができる。
【０１３２】
一般に、イオン交換クロマトグラフィーには、約５ｍＭから約５０ｍＭまでの塩濃度を有する従来の緩衝液系が使用できる。しかし、アニオン交換体には正に荷電した緩衝イオンが用いられ、カチオン交換体には負に荷電した緩衝イオンが用いられる。リン酸緩衝液は一般に、双方のタイプの交換体に用いられる。典型的には、対象となっているペプチドの結合を可能にする最高の塩濃度が、出発条件として用いられる。緩衝液は全て、ミリＱ（ＭｉｌｌｉＱ）−水から調製され、ろ過される（０．４５μｍまたは０．２２μｍのフィルター）。
【０１３３】
アニオン交換クロマトグラフィー
典型的な一実施形態において、対象となっているペプチドを含有するサンプルを、該ペプチドがカラムから溶出すると考えられる濃度以下の塩濃度を含む装填用緩衝液中のアニオン交換体上に充填する。該緩衝液のｐＨは、精製ペプチドがアニオン交換カラム上に保持されるように選択される。該緩衝液のｐＨを変化させると、該ペプチドの電荷が変化し、該ｐＨ値を低下させると、アニオン交換体による保持時間が短くなる。タンパク質の等電点（ｐＩ）は、タンパク質の電荷がゼロであるｐＨである。典型的に、アニオン交換体では、該緩衝液のｐＨ値は、対象となっているペプチドのｐＩ値の１．５倍から２倍高く保持される。あるいは、不純物に優先的に結合する一方、精製ペプチドが流出液中に見られるように、アニオン交換条件を選択する。
【０１３４】
弱アニオン交換樹脂では、低伝導率の溶液が用いられ、一方、強アニオン交換樹脂では、高伝導率の溶液が用いられる。次いで、該樹脂に弱く結合している物質を除去するために、いくつかのカラム容量（ＣＶ）の緩衝液でカラムを洗浄する。次いで、慣例的方法に従い、例えば、生理食塩水勾配を用いて、カラムからフラクションを溶出させる。該溶液中の塩は、カラムに対する結合において該タンパク質と競合し、該タンパク質は遊離する。弱いイオン相互作用を有する成分は、強いイオン相互作用を有する成分よりも低い塩濃度で溶出する。サンプルフラクションをカラムから採取する。高濃度の所望ペプチドおよび低濃度の不純物を含有するフラクションをプールするか、または別個に処理する。
【０１３５】
本発明の方法に用いられるアニオン交換体は、ウィルス粒子、粒子状物質、タンパク質／ペプチドおよびＤＮＡ分子などの不純物から精製ペプチドを分離するために使用される。本発明の典型的なアニオン交換体は、四級アンモニウム樹脂およびＤＥＡＥ樹脂から選択される。一実施形態において、アニオン交換体は、四級アンモニウム樹脂（例えば、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑイオン交換膜、ポール社（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））である。
【０１３６】
カチオン交換クロマトグラフィー
典型的な一実施形態において、対象となっているペプチドを含有するサンプルを、該ペプチドがカラムから溶出すると考えられる濃度以下の塩濃度を含む装填用緩衝液中のカチオン交換樹脂上に充填する。
【０１３７】
該緩衝液のｐＨは、対象となっているペプチドがカチオン交換樹脂上に保持されるように選択される。該緩衝液のｐＨを変化させると、該ペプチドの電荷が変化し、該緩衝液のｐＨを上昇させると、カチオン交換体による保持時間が短くなる。典型的に、カチオン交換は、該ペプチドのｐＩ値の１．５から２ｐＨ単位下で実施される。あるいは、不純物に優先的に結合する一方、精製ペプチドが流出液中に見られるように、カチオン交換条件を選択する。
【０１３８】
次いで、該樹脂に弱く結合している物質を除去するために、いくつかのカラム容量の緩衝液でカラムを洗浄する。次いで、慣例的方法に従い、塩勾配を用いて、カラムからフラクションを溶出させる。サンプルフラクションをカラムから回収する。高濃度の所望ペプチドおよび低濃度の不純物を含有する１つまたは複数のフラクションを採取し、任意にプールする。
【０１３９】
典型的な一実施形態において、本発明の方法に用いられるカチオン交換体は、精製法の主要な精製工程の１つを提供する。一実施形態において、カチオン交換体は、対象となっているペプチドを含有する混合物から非所望のタンパク質の大部分を除去する。
【０１４０】
一実施形態において、本発明に使用されるカチオン交換体は、スルホン酸（Ｓ）支持体およびカルボキシメチル（ＣＭ）支持体から選択される。一実施形態において、該カチオン交換体は、スルホン酸支持体（例えば、ＵＮＯスフェアＳ、バイオラド  ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））である。
【０１４１】
本発明の方法に使用されるイオン交換体は、任意に、クロマトグラフィー樹脂またはクロマトグラフィー支持体ではなく、膜吸着体である。一実施形態において、該膜吸着体は、カチオン交換体である。他の典型的な実施形態において、該膜吸着体は、スルホン酸（Ｓ）カチオン交換体（例えば、ＳａｒｔｏｂｉｎｄＳ、ザルトリウス社（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ））である。該膜吸着体は、任意に使い捨てである。
【０１４２】
混合様式または偽アフィニティークロマトグラフィー
典型的な一実施形態において、本発明のペプチド精製方法は、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーなどの混合様式または偽アフィニティークロマトグラフィーを含む。ＨＡクロマトグラフィーは、生体分子選択性を提供する効果的な精製機構であり、イオン交換法または疎水性相互作用技法に補足的である。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは当業界に知られている。
【０１４３】
典型的なヒドロキシアパタイト吸着剤は、セラミックの、または結晶性のヒドロキシアパタイト材料から選択される。セラミックヒドロキシアパタイト吸着剤は、種々の粒子サイズで入手可能である（例えば、タイプ１、バイオラド  ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。典型的な一実施形態において、セラミックヒドロキシアパタイト吸着剤の粒子サイズは、約２０μｍから約１８０μｍの間、好ましくは、約６０μｍから約１００μｍの間、より好ましくは、約８０μｍである。
【０１４４】
一実施形態において、ヒドロキシアパタイト吸着剤は、アガロースメッシュに捕捉されたヒドロキシアパタイトの微結晶を有する架橋アガロースビーズからなる。任意に、アガロースは化学的安定化されている（例えば、強いアルカリ条件下、エピクロロヒドリンにより）。典型的な一実施形態において、ヒドロキシアパタイト吸着剤はＨＡ  Ｕｌｔｒｏｇｅｌ（ポール社（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））である。
【０１４５】
ヒドロキシアパタイトカラム上へのサンプル装填に用いられる流速、ならびに溶出流速は、ヒドロキシアパタイト吸着剤のタイプおよびカラムの幾何学的形状に依存する。典型的な一実施形態において、処理規模での装填流速は、約３０から約９００ｃｍ／ｈ、約１５０から約９００ｃｍ／ｈ、好ましくは、約５００から約９００ｃｍ／ｈ、より好ましくは、約６００から約９００ｃｍ／ｈから選択される。
【０１４６】
典型的な一実施形態において、溶出緩衝液のｐＨは、約ｐＨ７から約ｐＨ９、好ましくは、約ｐＨ７．５から約ｐＨ８．０から選択される。
【０１４７】
一態様において、本発明は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによって組換えペプチドを精製する方法を提供する。該方法は、以下の工程を含む：（ａ）該ペプチドを含有する混合物を脱塩して、該ヒドロキシアパタイト樹脂のペプチド結合能力の増加を低下させる上で十分な塩伝導率を有する脱塩混合物を形成する（例えば、ゲルろ過により）工程；（ｂ）該脱塩混合物をヒドロキシアパタイト樹脂に適用する工程；（ｃ）該ヒドロキシアパタイト樹脂を洗浄することにより、該樹脂から不要の成分を溶出させる工程；（ｄ）任意にアミノ酸を含有する溶出緩衝液によって、該樹脂から該ペプチドを溶出させる工程；および（ｅ）該ペプチドを含有する１つまたは複数の溶出フラクションを採取する工程。
【０１４８】
脱塩
一実施形態において、対象となっているペプチドを含有する混合物を、該混合物をＨＡクロマトグラフィーに供する前に脱塩する。脱塩工程により、対象となっているペプチドに結合するＨＡカラムの能力が増大する。一実施形態において、ＨＡカラム能力（ＨＡ樹脂１リットル当たりのペプチド量）は、該ペプチドを含有する装填物の塩伝導率が低下するにつれて増大する。
【０１４９】
装填物が脱塩されている典型的な一実施形態において、ＨＡ樹脂１リットル当たりのペプチドの装填質量は、約１ｇ／Ｌから約２５ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌから約２０ｇ／Ｌ、好ましくは、１ｇ／Ｌから約１５ｇ／Ｌ、およびより好ましくは、約１ｇ／Ｌから約１０ｇ／Ｌである。
【０１５０】
精製されるペプチドがＥＰＯである典型的な一実施形態において、装填用緩衝液の脱塩により、ＨＡカラム能力は、図５に示されるとおり増大する。典型的な一実施形態において、ＥＰＯペプチドのブレイクスルーが１０％未満であるペプチド結合能力は、少なくとも約２ｇ／Ｌ、少なくとも約４ｇ／Ｌ、少なくとも約６ｇ／Ｌ、少なくとも約８ｇ／Ｌ、および好ましくは、少なくとも約１０ｇ／Ｌである。
【０１５１】
他の典型的な実施形態において、装填物の伝導率は、脱塩および希釈から選択される方法を用いて低下させることができる。
【０１５２】
典型的な一実施形態において、装填用緩衝液の伝導率は、脱塩によって低下し、好ましい伝導率は、約０．１ｍＳ／ｃｍから約４．０ｍＳ／ｃｍ、好ましくは、約０．１ｍＳ／ｃｍから約１．０ｍＳ／ｃｍ、より好ましくは、約０．１ｍＳ／ｃｍから約０．６ｍＳ／ｃｍ、さらに好ましくは、約０．１ｍＳ／ｃｍから約０．４ｍＳ／ｃｍである。
【０１５３】
ペプチド溶液の脱塩は、対象となっているペプチド／タンパク質よりも小さなＭＷＣＯを有する膜フィルターを用いて達成される。該ペプチド／タンパク質は、濃縮液中に見られ、選択された緩衝液中に再構成される。しかし、比較的低分子量のペプチド（例えば、ＥＰＯ）を精製する場合、脱塩に用いられる膜のＭＷＣＯは、該膜孔を通ってペプチドが漏れることを避けるために、比較的小さくなければならない。しかしながら、小さなＭＷＣＯ膜（例えば、約５ｋＤａの孔径を有する）を介した大量の液体のろ過には、広い膜面積が必要であり、このろ過法は時間がかかる。
【０１５４】
したがって、一実施形態において、ＨＡクロマトグラフィー装填物の脱塩は、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ゲルろ過）を用いて達成される。この技法は、サイズに基づいて分子を分離する。典型的には、高分子量成分は、そのサイズにより、ビーズ孔への進入が防がれるために、小型分子よりも容易にカラムを通って進行することができる。したがって、低分子量成分は、カラムの通過に、より長い時間がかかる。このようにして、不要の塩などの低分子量物質を、対象となっているペプチドから分離することができる。
【０１５５】
典型的な一実施形態において、カラム材料は、デキストラン、アガロース、およびポリアクリルアミドゲルから選択され、該ゲルは、異なる粒子サイズによって特徴づけられる。他の典型的な実施形態において、該材料は、硬質の水適合性サイズ排除材料から選択される。本発明の典型的なゲルろ過樹脂は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｇ−２５樹脂（ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））である。
【０１５６】
典型的な一実施形態において、脱塩は、カチオン交換クロマトグラフィーに引き続いて（例えば、ＵｎｏＳｐｈｅｒｅ  Ｓクロマトグラフィーの後に）実施される。
【０１５７】
溶出緩衝液へのアミノ酸添加
一実施形態において、ＨＡ樹脂から対象となっているペプチドを溶出させるのに使用される溶出緩衝液に、アミノ酸が添加される。典型的な一実施形態において、アミノ酸は、約５ｍＭから約５０ｍＭ、約１０ｍＭから約４０ｍＭ、好ましくは、約１５ｍＭから約３０ｍＭ、より好ましくは、約２０ｍＭの最終濃度で溶出緩衝液に添加される。
【０１５８】
一実施形態において、溶出緩衝液へのアミノ酸（例えば、グリシン）の添加により、ＨＡクロマトグラフィーからのペプチドの工程回収率が、アミノ酸の添加なしで得られた回収率に比較して、増加する。典型的な一実施形態において、アミノ酸の添加により、ペプチドの回収率が、少なくとも約１％から約２０％、少なくとも約１％から約１５％、少なくとも約１％から約１０％、好ましくは、少なくとも約１％から約７％、より好ましくは、約５％増加する。
【０１５９】
他の典型的な実施形態において、アミノ酸（例えば、グリシン）の添加により、精製ペプチドの溶出ピークがより鋭くなる。したがって、ピークの尾部フラクションではより少ないペプチドが回収され、主要ピークではより多くのペプチドが回収される。他の典型的な実施形態において、アミノ酸（例えば、グリシン）の添加により、ＨＡクロマトグラフィーからの産物の純度が低下することはない。
【０１６０】
典型的な一実施形態において、該アミノ酸はグリシンである。好ましい一実施形態において、グリシンは、２０ｍＭの最終濃度で溶出緩衝液に添加される。
【０１６１】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）  
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、生体分子を、それらの表面の疎水性の違いに基づいて分離する液体クロマトグラフィー技法である。ポリペプチドの表面に露出している疎水性アミノ酸は、ＨＩＣマトリックス上の疎水性部分と相互作用することができる。露出している疎水性アミノ酸の量は、ポリペプチドによって異なるため、ＨＩＣゲルと相互作用するポリペプチドの能力も異なる。生体分子とＨＩＣマトリックスとの間の疎水性相互作用は、高イオン強度緩衝液によって増強されるため、生体分子のＨＩＣは典型的に、高い塩濃度で実施される。次いで塩勾配を低下させることによって、該カラムから、対象となっているペプチド溶出を開始させる。
【０１６２】
ＨＩＣ媒体は、それらが担持する疎水性部分により、粒子サイズ（例えば、ビーズサイズ）により、およびＨＩＣマトリックス上の疎水性部分の密度（例えば、低置換または高置換）により、区別される。典型的な一実施形態において、カラムマトリックスの疎水性部分は、アルキル基、芳香族基およびエーテル類から選択される部材である。典型的な疎水性アルキル基としては、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、およびｎ−オクチルなどの低級アルキル基が挙げられる。典型的な芳香族基としては、置換および非置換フェニルが挙げられる。
【０１６３】
他の典型的な実施形態において、ＨＩＣ媒体のマトリックスは、アガロース、セファロース（ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））、ポリスチレン、ジビニルベンゼン、およびそれらの組み合わせから選択される。典型的なＨＩＣ樹脂としては、低置換型または高置換型のＢｕｔｙｌ  Ｆａｓｔ  ＦｌｏｗおよびＰｈｅｎｙｌ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（双方ともＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））が挙げられる。好ましい一実施形態において、ＨＩＣ樹脂は、Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））である。
【０１６４】
他の典型的な実施形態において、産物がＨＩＣカラムに適用される緩衝液は、酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、および硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）などの塩を含有する。これらの、および他の塩の濃度範囲は一般に、ペプチドの最適な結合を実施するために、ＨＩＣ樹脂の各タイプに関して最適化される。
【０１６５】
典型的な一実施形態において、装填用緩衝液中の硫酸ナトリウムの濃度は、約１００ｍＭから約１ｍＭ、好ましくは、約３００ｍＭから約８００ｍＭ、より好ましくは、約４００ｍＭから約６００ｍＭである。他の典型的な実施形態において、該緩衝液中のＮａＣｌの濃度は、約１００ｍＭから約１Ｍ、好ましくは、約２００ｍＭから約４００ｍＭ、およびより好ましくは、約２００ｍＭから約３００ｍＭである。さらに他の典型的な実施形態において、装填用緩衝液中のＮａＯＡｃの濃度は、約１ｍＭから約５０ｍＭ、好ましくは、約５ｍＭから約２０ｍＭ、より好ましくは、約５ｍＭから約１５ｍＭである。
【０１６６】
他の典型的な実施形態において、ＨＩＣカラムに該産物が適用される緩衝液は、約４．０から約６．０、好ましくは、約４．５から約５．５、およびより好ましくは、約５．０のｐＨを有する。
【０１６７】
さらに他の典型的な実施形態において、該産物は約５．０から約７．５のｐＨの酢酸ナトリウム緩衝液によって、ＨＩＣ樹脂から溶出される。典型的な溶出緩衝液系としては、トリス緩衝液およびＨＥＰＥＳ緩衝液が挙げられる。任意に、該溶出緩衝液は、硫酸ナトリウムを含有しない。さらなる典型的実施形態において、該溶出緩衝液は、約５％ｖ／ｖから約１０％ｖ／ｖの量のエタノールを含有する。
【０１６８】
一態様において、本発明は、ペプチドよりも小さな分子量を有する不純物から、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって該ペプチドを分離する方法を提供する。該方法は、以下を含む：（ａ）該ペプチドおよび不純物を含有する混合物を、好適な疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂に適用する工程；（ｂ）該樹脂から不純物を溶出する工程；（ｃ）該樹脂から該ペプチドを溶出する工程；および該ペプチドを含有する１つまたは複数の溶出液フラクションを採取する工程。
【０１６９】
好ましい一実施形態において、ＨＩＣは、他の手段を用いて除去することが難しい不純物であって、好ましくは、精製されるペプチドよりも小さな分子量を有するものを除去するために、精製の直交的方法として用いられる。
【０１７０】
典型的な一実施形態において、低分子量不純物（例えば、図３における不純物Ａ）の含量は、ＨＩＣの前のその含量の少なくとも５０％減少する。他の典型的な実施形態において、不純物は、もとの含量の少なくとも６０％、好ましくは、少なくとも８０％、およびより好ましくは、少なくとも９０％減少する。一定の好ましい実施形態において、ＨＩＣによって処理される該混合物中の不純物の含量は、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％減少する。
【０１７１】
典型的な一実施形態において、図３に示されるとおり、部分的に精製されたＥＰＯのＨＩＣ精製により、低分子量不純物（不純物Ａ）がほとんど無い産物が得られる。組換えＥＰＯの分子量は、不純物Ａの分子量とほとんど同様であるが、この精製工程は、不純物ＡからのＥＰＯの分離に特に有効である。ＨＩＣクロマトグラフィーの間、不純物Ａは、流出液中に見られ、一方、ＥＰＯは、最初、ＨＩＣカラム上に保持される。
【０１７２】
典型的な一実施形態において、ＨＩＣは、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーに引き続いて実施される。この順序で２種のクロマトグラフィー工程を実施することにより、ＨＩＣ後のペプチド回収率が増加し、ＨＩＣ前の緩衝液系の調節の必要性が限定される。典型的な一実施形態において、ヒドロキシアパタイト産物プールのｐＨは、有機酸（例えば、酢酸）の添加によって、約５．０から約５．５に低下する。次いで、疎水性相互作用クロマトグラフィー用に、部分的精製ペプチドを調節するために、硫酸ナトリウムを、約５００ｍＭから約１．０Ｍ、好ましくは、約５００ｍＭの濃度まで添加する。
【０１７３】
ＩＩＩ．ｅ）ウィルス不活化
本発明のペプチド精製方法は、該混合物中に存在し得るエンベロープまたは非エンベロープウィルス粒子を不活化するために、１つまたは複数のウィルス不活化工程を含む。最終産物を生きている生物体に使用する意図がある場合、これは特に重要である。ヒトにおける使用にとって該産物を安全にするために、病原性ウィルスを除去する。ウィルス粒子の除去は、組み合わせろ過およびクロマトグラフィーの工程を用いて達成できる。エンベロープウィルスの不活化は、化学的に、例えば、洗浄剤の添加によって達成できる。残留ウィルスの不活化は、低ｐＨ保持操作によって達成できる。
【０１７４】
洗浄剤を用いるウィルス不活化
典型的な一実施形態において、ウィルス不活化は、部分的精製ペプチド溶液への洗浄剤の添加を含む。典型的な一実施形態において、該洗浄剤は、トリトンＸ（例えば、トリトンＸ−１００）である。更なる典型的な実施形態において、エンベロープウィルスを不活化するために、トリトンＸ−１００を添加する。
【０１７５】
他の典型的な実施形態において、約０．０１％から約０．１％ｖ／ｖ、好ましくは、約０．０４％から約０．０６％ｖ／ｖ、およびより好ましくは、０．０５％ｖ／ｖの最終濃度で洗浄剤を添加する。典型的な一実施形態において、洗浄剤は、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ）による精製後に、部分的精製ペプチド溶液に添加される。
【０１７６】
低ｐＨ保持操作によるウィルス不活化
多くのウィルスは、低ｐＨ培地による長期処置に生き残れないことが当業界に知られている。しかし、ペプチドおよびタンパク質を精製する場合、緩衝液系のｐＨは一般に、該産物の安定性の維持において重大である。多くのタンパク質およびペプチドは、７．０をかなり下回るｐＨには耐えられない。
【０１７７】
一態様において、本発明は、対象となっているペプチドを含有する混合物中のウィルスを不活化する方法を提供する。該方法は以下を含む：（ａ）該ペプチドを含有する混合物のｐＨをｐＨ７以下のｐＨに低下させる工程；（ｂ）選択された時間（例えば、約１時間）、工程（ａ）の低ｐＨを維持する工程；および該ペプチドを含有する混合物のｐＨを、さらなる処理に好適なｐＨへと上昇させる工程。
【０１７８】
典型的な一実施形態において、工程（ａ）のｐＨを、約ｐＨ２から約ｐＨ４へ、好ましくは、約ｐＨ２から約ｐＨ３へ、およびより好ましくは、約ｐＨ２から約ｐＨ２．５へ低下させる。好ましい一実施形態において、該産物溶液のｐＨを、約２．２から約２．５の間へ低下させる。
【０１７９】
さらなる典型的な一実施形態において、該ペプチド溶液のｐＨを、ｐＨを上昇させる前、少なくとも約３０分間から少なくとも約２時間、好ましくは、少なくとも約１時間、低ｐＨ（例えば、約ｐＨ２．２）に維持する。
【０１８０】
他の典型的な実施形態において、該ペプチド溶液を制御下室温にしながら、該産物溶液のｐＨを低下させる。
【０１８１】
典型的な一実施形態において、生体適用に好適な酸を用いて、該ペプチド溶液のｐＨを調整する。典型的な酸としては、有機酸、無機酸、およびそれらの組み合わせが挙げられる。典型的な一実施形態において、有機酸は、酢酸、クエン酸、乳酸、シュウ酸およびコハク酸から選択されるメンバーである。他の典型的な実施形態において、無機酸は、塩酸（ＨＣＬ）およびリン酸（Ｈ３ＰＯ４）から選択されるメンバーである。
【０１８２】
ＩＩＩ．ｆ）プロテアーゼおよびグリコシダーゼの不活化
一実施形態において、タンパク質分解を阻止するために、プロテアーゼ阻害剤、例えば、メチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、またはクエン酸ナトリウムを、部分的精製ペプチド溶液に添加する。他の実施形態において、グリコシダーゼ阻害剤を添加できる。この工程により、対象となっているペプチドの分解が防止される。部分的精製ペプチド溶液がさらなる処理の前に貯蔵される場合、これは特に有用である。外来不純物の増殖を防ぐために、抗生物質を任意に添加する。
【０１８３】
ＩＩＩ．ｇ）ウィルスクリアランスおよび貯蔵
典型的な一実施形態において、本発明のペプチド精製方法は、ウィルスクリアランスを実施するためにさらなる限外ろ過工程を含む。典型的に、この工程は、該精製方法の最後近くに行われ、膜を通して該ペプチドを流出させることができるように、対象となっているペプチドよりも大きなＭＷＣＯを有する膜が用いられる。典型的な一実施形態において、このウィルスクリアランス工程は、該産物のクロマトグラフィー手段による精製の後に、該方法に導入される。ウィルス除去のために推奨される多数の限外ろ過膜が入手可能である。典型的な一実施形態において、該膜はＮＦＰ膜（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））である。
【０１８４】
他の典型的な実施形態において、本発明のペプチド精製方法は、該方法の最後近くに、ダイアフィルトレーション工程を含む。典型的な一実施形態において、ダイアフィルトレーション工程は、サンプルを濃縮するために用いられる。他の典型的な実施形態において、ダイアフィルトレーション工程は、該緩衝液を変化させるために用いられる。さらに他の典型的な実施形態において、新たな緩衝液は、該産物の貯蔵に好適である。他の典型的な実施形態において、ダイアフィルトレーション膜は、約４ｋＤａから約１０ｋＤａ、好ましくは、約４ｋＤａから約６ｋＤａ、およびより好ましくは、約５ｋＤａのＭＷＣＯを有する。
【０１８５】
精製産物は、低温で貯蔵される。典型的な一実施形態において、該産物は、貯蔵用緩衝液１ｍＬ当たり、約１ｍｇから約２ｍｇのペプチドのペプチド濃度で、約−２０℃で貯蔵される。
【０１８６】
ＩＩＩ．ｈ）典型的な精製方法
本発明の一態様において、対象となっているペプチドは、図７に概説する精製方法を用いて、細胞培養液から精製する。第１の工程において、連続的ディスクスタック遠心分離により、細胞培養液から細胞および細胞破片を除去する。次いで、この遠心分離工程からの上澄液を、デプスフィルターおよび０．２μｍ膜の連続フィルターを介してろ過し、該溶液の濁度をさらに減少させる。次いで、得られた材料を接線流ろ過（ＴＦＦ）カスケードに供する。この工程において、該混合物を、先ず、１００ｋＤａのＴＦＦ膜を介してろ過する。次いで、この第１の限外ろ過工程からの流出液（透過液）を、１０ｋＤａの分子量カットオフを有する第２の限外ろ過膜を介してろ過する。この第２の限外ろ過工程からの濃縮液を採取する。典型的な一実施形態において、より大きな分子サイズを有する不純物を除去し、該混合物を濃縮して緩衝液交換を実施する引き続く精製工程用に、該ペプチドを含有する混合物を調節するため、ＴＦＦカスケードが用いられる。
【０１８７】
次いで、得られた該ペプチド含有混合物をＭｕｓｔａｎｇ  Ｑアニオン交換膜フィルターなどのアニオン交換体上に装填し、流出液トラフに該ペプチドを回収する。次いで、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００などの非イオン洗浄剤を、約０．０５％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで、産物プールに加える。次に、該混合物をカチオン交換クロマトグラフィー（例えば、ＵｎｏＳｐｈｅｒｅ  Ｓカチオン交換樹脂を用いて）に供し、ペプチド含有フラクションを採取してプールする。
【０１８８】
カチオン交換に引き続いて、該混合物を低ｐＨ保持操作に供して、ウィルス不活化を実施する。次いで、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィー用に調製するペプチド溶液の塩伝導率を低下させるために、サイズ排除カラム（例えば、Ｇ２５）を用いて、脱塩を行う。次に、脱塩した混合物を、ＨＡカラム上に装填する。次いでＨＡカラムからの溶出プールを馴化して疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に供する。さらなるウィルスクリアランスのために、ＨＩＣカラムからの溶出プールを、任意に好適な膜（ＮＦＰ膜など）を介してろ過する。該産物を５ｋＤａのＴＦＦ膜を介してダイアフィルトレートし、濃縮液を貯蔵用緩衝液中に再構成して所望のペプチド濃度（例えば、１〜２ｍｇ／ｍＬ）にする。
【０１８９】
この態様による一実施形態において、バキュロウィルス発現ベクター系を用いて、昆虫細胞培養液中における発現により、該ペプチドを生産する。
【０１９０】
他の典型的な実施形態において、上記の方法によって精製される組換えペプチドはＥＰＯである。
【０１９１】
ＩＶ．糖ペグ化
該ペプチドのグリコシル化パターンは、酵素を用いる方法によって、合成、削除、または修飾することができる。供与体から受容体へ糖を転移させる酵素を用いてペプチドおよび脂質を再構築する方法は、ド・フリース（Ｄｅ  Ｆｒｅｅｓ）らに対する国際公開第０３／０３１４６４号パンフレット（２００３年４月１７日公開）；米国特許出願公開第２００４／０１３７５５７号明細書（２００２年１１月５日出願）；米国特許出願公開第２００５／０１４３２９２号明細書（２００４年１１月２４日出願）および国際公開第０５／０５１３２７号パンフレット（２００４年１１月２４日出願）に詳細に検討されており、これらの各々は、参照としてその全体が本明細書に組み込まれている。
【０１９２】
以下の実施例は、本発明の結合体、および方法を例示するために提供されているが、請求された発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１９３】
実施例
実施例１：ＢＥＶＳ発現用脂質混合物の調製
１．１  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８溶液の調製
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８の溶液を以下のとおり調製した：８００ｍＬの脱イオン化Ｈ２Ｏを速やかに攪拌した。９０グラムのＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８を、攪拌下、該溶液に加え、脱イオン化Ｈ２Ｏにより、容量を９００ｍｌに調整した。蓋をした容器内で、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８を完全に溶解させた。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８の溶解後、脂質混合物の調製中に、該溶液を３７℃の水浴に移した。
【０１９４】
１．２  １００×脂質混合物の調製
１００ｍＬの無水エタノールを、蓋をした容器内で攪拌しながら、３７℃に温めた。該エタノールにコレステロールを加え、溶解させた。コレステロールの後に、該脂質溶液にツイーン８０を加え、コレステロールの溶解度を改善させた。次いで、該脂質混合物の残りの成分を加えた。表２に示された量の成分を該エタノールに加えた。加熱要素を有する攪拌プレートを用いて、該成分を溶解させるために攪拌しながら、該混合物を４５℃に加熱し、清澄な溶液を得た。
【０１９５】
【表２】
2008538181.tif 000004
【０１９６】
脂質混合物の調製後、Ｆ−６８溶液を水浴から取り出し、磁気攪拌棒で速やかに攪拌した。速やかに攪拌中のＦ−６８に、１００ｍＬのＥｔＯＨ／脂質混合物を滴下して添加した。添加終了後、該溶液を、密封／蓋をしながらさらに１０〜２０分間、速やかに混合した。
【０１９７】
次いで、１０％のＦ−６８／脂質混合物を清澄化させた。攪拌によって生じた気泡が消失した後、該混合物の清澄性を目視により検査した。清澄（わずかに不透明）な溶液が得られた。
【０１９８】
次いで０．２μｍの非結合性フィルターを用いて、該脂質混合物を滅菌ろ過した。一例としては、この１００×脂質混合物の１０ｍＬまたは１５ｍＬを、１リットルの昆虫細胞培養培地の補足に用いる。
【０１９９】
実施例２：Ｓｆ９昆虫細胞培養液におけるＥＰＯ生産に及ぼす脂質混合物添加の効果
エリスロポエチン（ＥＰＯ）の生産に及ぼす脂質混合物補足の効果を調べた。市販の化学的に規定された脂質濃縮物を、実施例１に記載したとおり調製した新鮮な脂質混合物と比較した。該新鮮な脂質混合物を、０％、１．０％および１．５％ｖ／ｖで、該細胞培養液に加えた。感染の時点で添加した新鮮な脂質混合物が、市販の脂質混合物を補足した培養物におけるＥＰＯ力価よりも、３８％高いＳｆ９細胞培養液におけるＥＰＯ力価を生じることが、該データによって示されている。また、１．５％の脂質補足が、対照（脂質添加なし）よりも８２％高く、１．０％補足よりも３５％高いＥＰＯ力価を与えることが、この試験により実証された。１．５％で補足された脂質調製物は双方とも、より清浄な培養ブロス、ならびにより高い品質ＥＰＯを生じさせた。また、いずれか一方の脂質混合物を添加すると、感染状態を通して、細胞生存度の低下が対照（脂質なし）よりも小さいことも観察された。
【０２００】
該細胞培養液は、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＳｆ−９００ＩＩを用いて作製した。脂質混合物中のコレステロール、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８、およびタラ肝油などの複数の成分は、Ｓｆ−９００ＩＩ培地にすでに存在している。この試験では、感染の時点でＳＦ−９００ＩＩ培地にさらに脂質混合物を補足することによる、ＥＰＯ力価および／または品質に及ぼす効果を調べた。
【０２０１】
実施例１の新鮮調製された脂質混合物、および市販の化学的に規定された脂質混合物を用いて、Ｂｉｏｓｔａｔ  Ｃ発酵槽中、１０〜１５Ｌの規模で細胞培養バッチを実施した。双方の脂質混合物の成分を表３に比較してある。
【０２０２】
２．１．  材料
作業用細胞バンク由来のＳＦ９細胞
インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）Ｓｆ−９００ＩＩ培地
市販の化学的に規定された脂質
Ｂ．ブラウン  バイオスタット（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｓｔａｔ）Ｃ  ２０Ｌ  Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒｓ、Ｚ−１１００  Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｅ、Ｆ
インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）イーストレート（Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）、限外ろ過
バキュロウィルス
生物安全フード
ＷＡＶＥ  Ｔｕｂｉｎｇ定着器
ＷＡＶＥ  Ｔｕｂｉｎｇシーラー
ガバ（Ｇｕａｖａ）  ＰＣＡ  細胞カウンター、ＡＥ−１０３８
ゲティンゲ（Ｇｅｔｉｎｇｅ）  ＮｏｖｕｓＩオートクレーブ、ＡＵ−１０００
【０２０３】
【表３】
2008538181.tif 000005
【０２０４】
２．２  標準的プラークアッセイ
標準的プラークアッセイにより、バキュロウィルス粒子の力価測定を行った。アッセイする各サンプルに対して、２つの６ウェル組織培養プレートを生物学的安定キャビネット内に入れ、対照の各々に対しても２つのプレートを入れた。予め温めたＳｆ−９００ＩＩＳＦＭ（１×）を用いて、滅菌容器中、Ｓｆ９細胞を５×１０５細胞／ｍＬに希釈し、静かに混合した。６ウェルプレートに、以下のとおりラベルした：２つのウェルに「陰性対照」とラベルし、２つのウェルに「陽性対照」とラベルし、サンプル間には確実に２つの空のウェルを置いた。重複対照プレートは同様にラベルした。各サンプルプレートで、アッセイされた各希釈物に対して２つのウェルにラベルした。重複サンプルプレートは同様にラベルした。
【０２０５】
サンプルの希釈は、該サンプルの予想されるバキュロウィルス力価に基づいて行った。例えば、およそ１×１０７ｐｆｕ／ｍＬの予想力価を有するサンプルは、１０−６、１０−７および１０−８希釈でアッセイされるであろう。
【０２０６】
希釈したＳｆ９細胞の２種のｍＬを、各々のラベルしたウェルに加え、室温で、最少１時間結合させた。細胞はウェル壁に沿って加え、静かにピペット操作して、確実に細胞を懸濁させた。Ｓｆ−９００ＩＩ  ＳＦＭ（１×）の３種のｍＬ各々を、２本の滅菌管に分割した。陽性対照ウィルス貯蔵液の３種のμｌを、各々の管に加えて混合し、１０−３希釈とした。各サンプルについて、Ｓｆ−９００ＩＩ  ＳＦＭ（１×）の適切な量をアッセイする希釈に基づいて滅菌管に分割した。サンプルは二重に調製し、アッセイに利用できる各希釈が最少３ｍＬであるように、１０倍に希釈した。
【０２０７】
陰性対照ウェル以外のＳｆ９細胞を１時間インキュベートしてから、該ウェルから培地を取り出し、標識したウェルに相当するウィルス希釈の各１ｍＬを接種した。細胞の単層の移動を最少にするために、培地はウェル壁に沿ってゆっくり加え、得られた混合物を、室温で少なくとも１時間インキュベートした。１時間の終りに、Ｓｆ−９００培地（１．３×）を用いて、４％寒天１：４に希釈することによって寒天／培地溶液を調製した。
【０２０８】
６ウェルプレートの各ウェルから接種物を取り出し、２ｍＬの寒天／培地溶液を、該溶液が添加される各ウェルの側面を該溶液を流下させることによって速やかに加えた。次いで、該プレートを室温で４５分間インキュベートした。４５分間のインキュベーションの最後に、およそ２〜４ｍＬの５ｍＭ  ＥＤＴＡで湿らせたペーパータオルを該プレートの周囲に巻きつけた。該プレートを反転させ、滅菌バッグに入れて、２７℃で７〜１０日間、または陽性対照ウェル中にプラークが裸眼で見えるまで、インキュベートした。７〜１０日後、該プレートに巻きつけたものを解き、５〜７滴のＭＴＴ染色溶液を各ウェルに添加した。室温でおよそ６時間、または、ウェル全体が紫に染色されるまで、紫色を展開させた。紫色の背景に対して、プラークが明瞭に現れた。それらのプラークをカウントし、その数を記録した。各希釈での重複ウェルに関して、平均を記録する。１０倍希釈間でのプラークの数の違いは、１０倍未満であった。少なくとも５つのプラークを有する最高希釈が、その特定希釈で形成されたプラークの代表的な数を与えた。
【０２０９】
ウィルス力価は以下のとおり決定した。例えば、１０−８希釈を代表するウェルが９つのコロニーを有していた場合、そのウィルス貯蔵液の力価は９×１０８である。用いられる単位は、プラーク形成単位／ｍＬ（ＰＦＵ／ｍＬ）である。したがって、例えば、ウィルス力価は９×１０８ＰＦＵ／ｍＬとして表される。陰性対照にプラークが存在せず、陽性対照にプラークが存在した場合、このアッセイは有効と決定された。
【０２１０】
２．３  試験Ｉ：新鮮脂質の添加対対照（脂質の補足なし）
この試験のために２つの実験を実施した。第１の実験では、Ｓｆ９細胞を用い、一方、第２の実験では、ＧＭＰ  Ｓｆ９細胞を用いた。また、実験Ｉで用いたＭＯＩは０．８であり、一方、第２の実験では、０．１〜０．２のＭＯＩを用いた。これらの実験に関するプロトコルは下記に概説されており、その結果は表８に要約されている。
【０２１１】
実験１
１．８×１０７細胞／ｍＬの生細胞密度（ＶＣＤ）および＞９０％の生存度を有する５リットルのＳｆ９細胞を発酵槽Ｚ−１１００Ｊに移した。細胞を加えた後、直ちに７リットルのＳｆ−９００ＩＩ培地を加えた。実施例１のプロトコルに従って、１５０ｍＬの新鮮脂質混合物を調製した。１９ｍｍのヘッドポート／隔膜を介して該脂質混合物を無菌的に１２Ｌの細胞に添加し、最終的な脂質混合物添加を１％とした。１時間、細胞を該脂質混合物に順化させた。標準的プラークアッセイ（上記参照）によって決定した力価＝２．２８×１０７ｐｆｕ／ｍＬで３Ｌのバキュロウィルスに、該細胞を感染させた。細胞感染ＶＣＤ（生細胞密度）は６×１０６細胞／ｍＬであり、＞９０％生存度であった。操作パラメーターは、下表４に要約されている。
【０２１２】
【表４】
2008538181.tif 000006
【０２１３】
実験２Ａ
４．７×１０６細胞／ｍＬのＶＣＤおよび＞９０％の生存度を有する２リットル（Ｌ）のＳｆ９細胞を、５リットルのＳｆ−９００ＩＩ培地を含有する発酵槽Ｚ−１１００Ｈに移した。４日後、ＶＣＤ＝６．２９×１０６細胞／ｍＬおよび生存度＝７８．５％の時、１００ｍＬのイーストレート（ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）を添加して、ＶＣＤを増加させた。翌日、ＶＣＤ＝８．０４×１０６細胞／ｍＬおよび生存度＝７４．３％の時、Ｚ−１１００Ｈ隔壁上、１９ｍｍのヘッドポート／隔膜を介して、２２５ｍＬの新鮮脂質混合物（実施例１のプロトコルに従い調製される）を添加して、１．５％の最終的な脂質混合物添加とした。１時間、細胞を該脂質混合物に順化させた。１時間後、該細胞を、２００ｍＬの濃縮ウィルス（標準的プラークアッセイによって決定した力価＝５．２２×１０７ｐｆｕ／ｍＬ）に感染させた。感染後、さらに７ＬのＳｆ−９００ＩＩ培地を加えた。操作パラメーターは、下表５に要約されている。
【０２１４】
【表５】
2008538181.tif 000007
【０２１５】
実験２Ｂ
４．１×１０６細胞／ｍＬのＶＣＤおよび＞９０％の生存度を有する２リットルのＳｆ９細胞を、５リットルのＳｆ−９００ＩＩ培地を含有する発酵槽Ｚ−１１００Ｊに移した。４日後、ＶＣＤ＝６．８５×１０６細胞／ｍＬおよび生存度＝９０．４％の時、１００ｍＬのイーストレート（ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）を添加して、ＶＣＤを増加させた。翌日、ＶＣＤ＝１０．９×１０６細胞／ｍＬおよび生存度＝９０．７％の時、Ｚ−１１００Ｊ隔壁上、１９ｍｍのヘッドポート／隔膜を介して、１５０ｍＬの新鮮脂質混合物（実施例１のプロトコルに従って調製）を添加して、１％の最終的な脂質混合物添加とした。１時間、細胞を該脂質混合物に順化させた。１時間後、該細胞を、２００ｍＬの濃縮ウィルス（標準的プラークアッセイによって決定した力価＝５．２２×１０７ｐｆｕ／ｍＬ）に感染させた。感染後、さらに７ＬのＳｆ−９００ＩＩ培地を加えた。操作パラメーターは、下表６に要約されている。
【０２１６】
【表６】
2008538181.tif 000008
【０２１７】
実験２Ｃ
４．１×１０６細胞／ｍＬのＶＣＤおよび＞９０％の生存度を有する２リットルのＳｆ９細胞を、５リットルのＳｆ−９００ＩＩ培地を含有する発酵槽Ｚ−１１００Ｉに移した。４日後、ＶＣＤ＝８．３９×１０６細胞／ｍＬおよび生存度＝８２．５％の時、１００ｍＬのイーストレート（ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）を添加して、ＶＣＤを増加させた。翌日、ＶＣＤ＝７．０８×１０６細胞／ｍＬおよび生存度＝８１．４％の時、該細胞を、２００ｍＬの濃縮ウィルス（標準的プラークアッセイによって決定した力価＝５．２２×１０７ｐｆｕ／ｍＬ）に感染させた。最終的な脂質混合物添加は０％であった。感染後、さらに７ＬのＳｆ−９００ＩＩ培地を加えた。操作パラメーターは、下表７に要約されている。
【０２１８】
【表７】
2008538181.tif 000009
【０２１９】
感染時の生存度に関わりなく、細胞培養液への脂質混合物の添加により細胞生存度の維持が助長されることを、下表８のデータは示している。脂質添加の３つの操作により、平均４％の生存度低下があり、脂質添加なしの操作における１５％の低下よりも有意に小さかった。また、同様なＭＯＩによる操作に基づくと、脂質混合物の添加を多くするほど、ＥＰＯ力価は高くなる。１．５％ｖ／ｖの脂質を添加する操作では、脂質添加をしない対照操作よりも８２％高く、１．０％ｖ／ｖ補足する操作よりも３５％高いＥＰＯ力価が生じる。脂質混合物は、ＥＰＯ力価の改善に加えて、図１に示されたＲＰ−ＨＰＬＣプロフィルに見られるとおり、ＥＰＯの品質に劇的効果を及ぼす。
【０２２０】
【表８】
2008538181.tif 000010
【０２２１】
２．４  試験ＩＩ：新鮮脂質添加対市販の脂質混合物添加
実験３
５．１７×１０６細胞／ｍＬのＶＣＤおよび９７％の生存度を有する２ＬのＳｆ９細胞を、５ＬのＳｆ−９００ＩＩ培地を含有する発酵槽Ｚ−１１００Ｅに移した。２日後、ＶＣＤ＝２．９×１０６細胞／ｍＬおよび生存度＝９１．９％の時、Ｚ−１１００Ｅ上、１９ｍｍのヘッドポート／隔膜を介して、１５０ｍＬの市販脂質混合物を添加して、１％ｖ／ｖの最終的な脂質添加とした。１時間、細胞を該脂質混合物に順化させた。１時間後、該細胞を、６０ｍＬの濃縮ウィルス（標準的プラークアッセイによって決定した力価＝１．２×１０８ｐｆｕ／ｍＬ）に感染させた。感染後、さらに３ＬのＳｆ−９００ＩＩ培地を加えた。操作パラメーターは、下表に要約されている。
【０２２２】
【表９】
2008538181.tif 000011
【０２２３】
実験４
５．１０×１０６細胞／ｍＬのＶＣＤおよび９７％の生存度を有する２ＬのＳｆ９細胞を、５ＬのＳｆ−９００ＩＩ培地を含有する発酵槽Ｚ−１１００Ｆに移した。２日後、ＶＣＤ＝２．２×１０６細胞／ｍＬおよび生存度＝８９．１％の時、Ｚ−１１００Ｆ上、１９ｍｍのヘッドポート／隔膜を介して、１５０ｍＬの新鮮脂質混合物（実施例１のプロトコルに従い調製される）を添加して、１％の最終的な脂質添加とした。１時間、細胞を該脂質混合物に順化させた。１時間後、該細胞を、５５ｍＬの濃縮ウィルス（標準的プラークアッセイによって決定した力価＝１．２×１０８ｐｆｕ／ｍＬ）に感染させた。感染後、さらに３ＬのＳｆ−９００ＩＩ培地を加えた。操作パラメーターは、下表１０に要約されている。
【０２２４】
【表１０】
2008538181.tif 000012
【０２２５】
感染時に新鮮脂質を添加すると、市販の脂質混合物で補足した同様の培養液よりも、著しく高いＥＰＯ力価が生じることを、下表１１のデータは示している。この実験におけるＥＰＯ力価の違いは約３８％であった。
【０２２６】
【表１１】
2008538181.tif 000013
【０２２７】
２．５  実験１〜４から導かれる結論
１．新鮮調製された脂質でも市販の化学的に規定された脂質混合物でも１．５％（総容量の）脂質補足により、完全グリコシル化ＥＰＯの生産量が改善する。
２．新鮮調製された脂質混合物は、市販の化学的に規定された脂質よりも性能がＥＰＯ力価に基づき３８％優れている。
３．新鮮脂質混合物および市販の化学的に規定された脂質混合物は、脂質を補足しない操作に比較して、感染の６５時間を通して、より高い生存度の維持を助長する。
４．１．５％（ｖ／ｖ）の新鮮脂質混合物補足により、１％（ｖ／ｖ）の脂質混合物添加よりも約３５％高いＥＰＯ力価、および脂質添加をしない場合よりも約８２％高いＥＰＯ力価が得られる。
５．新鮮調製された脂質でも市販の化学的に規定された脂質混合物でも１．５％（総容量の）脂質補足により、ＥＰＯに対する不純物の比率低下による細胞培養ブロスの品質改善がなされる。
【０２２８】
実施例３：昆虫細胞系における１００Ｌ規模でのＥＰＯペプチドの生産
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、ＢＥＶ系において発現する細胞外タンパク質である。２０Ｌのバイオリアクターにおいて得られるＥＰＯ力価を最大化するために、昆虫細胞培養開発作業を開始した。２０ＬのバイオリアクターにおけるＥＰＯ力価および培養ブロス品質の再現性により、＞１５ｍｇ／ＬのＥＰＯおよび清澄な培養ブロスが達成可能であることが示され、その規模でのＥＰＯ生産に関して、昆虫細胞培養方法の開発の成功が示された。当該の一連のバイオリアクター操作で、１００Ｌ規模でのＥＰＯ生産方法が再現される。また、１００Ｌ規模での方法の一貫性も調べた。該方法の安定性（または一貫性）を評価するために、操作パラメーターは、２０Ｌ規模での方法最適化の過程で見られるパラメーターと同一に保持した。
【０２２９】
３．１  材料
アレゲニー  ブラッドフォード（Ａｌｌｅｇｈｅｎｙ  Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の１００Ｌ発酵槽
Ｂ．ブラウン  バイオスタット（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｓｔａｔ）のＣ  ２０Ｌ発酵槽
コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｒｐ）のＦｅｒｎｂａｃｈ使い捨て３Ｌフラスコ
ＧＭＰ  Ｓｆ−９作業用細胞バンク
ＧＭＰバキュロウィルス貯蔵液
Ｂ  ブラウン  サートマット（Ｂ  Ｂｒａｕｎ  Ｃｅｒｔｏｍａｔ）のＢＳ１振とうインキュベーター
ガバ  テクノロジー社（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）のＧｕａｖａ  ＰＣＡ  Ｓｙｓｔｅｍ
フィッシャー  ハミルトン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ）のＣｌａｓｓＩＩ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｃａｂｉｎｅｔ
ゲティンゲ（Ｇｅｔｉｎｇｅ）のＮｏｖｕｓ  Ｉ  オートクレーブ  
【０２３０】
３．２．  実験
使用された基本培地は、インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）からのＳｆ−９００ＩＩであった。この作業で用いられた細胞系はＳｆ−９であった。ヒト赤血球成長ホルモンエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする一片の遺伝子を含有する組換えウィルスが用いられた。感染の時点で用いられたＳｆ−９細胞密度および生存度は、それぞれ、約０．４〜０．６×１０７細胞／ｍＬと約９０％であった。したがって、細胞の密度および生存度は、ガバ（Ｇｕａｖａ）のＰＣＡ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて測定した。ＥＰＯ濃度は、ＥＬＩＳＡ法によって判定した。１００Ｌの発酵槽におけるＥＰＯ生産に関して、温度は２７±０．５℃に制御し、攪拌速度は６０ｒｐｍに設定した。ウィルス感染前に、さらに細胞密度を約０．８〜１．２×１０７に増加させるために、Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ限外ろ過を用いた。一貫性のある感染率を得るために、細胞を、０．２ＭＯＩの濃縮貯蔵ウィルスに感染させた。ウィルス感染の１時間前に、新鮮調製脂質混合物を１．５％の濃度で、該培養培地に添加した。全ての操作で、溶解酸素濃度（ＤＯ濃度）を、操作の終りまで、６０％に制御した。
【０２３１】
感染６７時間後に採取を行った。ＥＰＯ生産に用いられた脂質混合物の成分は、実施例１に開示されたとおりであり、１００Ｌ規模のバイオリアクターでのＥＰＯ生産に関する典型的な処理パラメーターは、下表１２に示されている。
【０２３２】
【表１２】
2008538181.tif 000014
【０２３３】
３．３  実験結果
表１３に示された実験結果は、感染６７時間後におけるＥＰＯ生産がロバストで再現性のあることを実証している。これらの１００Ｌ操作における計算平均ＥＰＯ生産率は、２２．７±３．９ｍｇ／Ｌであった。ＥＰＯ生産の平均生産量は２２７０±３３０．９ｍｇであった。２つの操作に関する採取時の平均生細胞濃度は、０．６２±０．０１５×１０７細胞／ｍＬであり、採取時の平均細胞生存度は、８６．３±０．２５％であった。採取時にそれぞれ、７２％および１００％の非分解ＥＰＯが見られたことが、ＩＰ／ＣＥアッセイにより示されている。当該方法により、１５ｍｇ／Ｌ超の力価で、良好な品質のＥＰＯが得られることを、これらのデータは実証している。
【０２３４】
【表１３】
2008538181.tif 000015
【０２３５】
実施例４：昆虫細胞系における１０００Ｌ規模でのＥＰＯペプチドの生産
この試験で、１０００Ｌ規模でのＥＰＯ生産に関する昆虫細胞培養法の再現性を評価した。
【０２３６】
４．１  材料
アレゲニー  ブラッドフォード（Ａｌｌｅｇｈｅｎｙ  Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の１０００Ｌ      発酵槽
アレゲニー  ブラッドフォード（Ａｌｌｅｇｈｅｎｙ  Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の１５０Ｌ  発酵槽
Ｂ．ブラウン  バイオスタット（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｓｔａｔ）のＣ  ２０Ｌ  発酵槽
コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．）のフェルンバッハ（Ｆｅｒｎｂａｃｈ）使い捨て３Ｌ  フラスコ
ＧＭＰのＳｆ−９  作業用細胞バンク
ＧＭＰのバキュロウィルス貯蔵液
Ｂ  ブラウン  セルトマット（Ｂ  Ｂｒａｕｎ  Ｃｅｒｔｏｍａｔ）のＢＳ１  振とうインキュベーター
ガバ  テクノロジー社（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）のＧｕａｖａ  ＰＣＡ  Ｓｙｓｔｅｍ
フィッシャー  ハミルトン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ）のＣｌａｓｓ  ＩＩ生物学的安全キャビネット
ゲティンゲ（Ｇｅｔｉｎｇｅ）のＮｏｖｕｓＩオートクレーブ
【０２３７】
４．２  実験
本試験に用いた基本培地は、インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）からのＳｆ−９００ＩＩであった。この作業には、ヒト赤血球成長ホルモンエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする一片の遺伝子を含有する組換えウィルス、およびＳｆ９昆虫細胞系を用いた。
【０２３８】
Ｓｆ９昆虫細胞は、６×１０６の細胞密度および９８％の生存度に達するまで、振とうフラスコ中、２７℃で増殖させ、この時点で、振とうフラスコ細胞の５Ｌを、１０ＬのＳｆ−９００ＩＩ培地を含有するバイオリアクターへ加えた。１５Ｌの採取作業容量を５０ｒｐｍで攪拌し、０．０４のｖｖｍで通気した。該細胞が再び、６×１０６の細胞密度（９７％の生存度）に達したら、１５Ｌ全体を、３５ＬのＳｆ−９００ＩＩ培地を含有する１００Ｌのタンクへ移した。細胞を移した時点で、Ｓｆ９細胞の安定化を助長するために、７５０ｍＬの新鮮脂質混合物を添加した。１回の細胞倍増後、さらに５０ＬのＳｆ−９００ＩＩ培地を加えた。タンクを５０ｒｐｍで攪拌し、０．０５のｖｖｍで通気した。該細胞が６×１０６の細胞密度（９３％の生存度）に再度達したら、１００ＬのＳＦ９細胞全体を、２００ＬのＳｆ−９００ＩＩ培地および４．５Ｌの新鮮な脂質混合物を含有する１０００Ｌのタンクに移した。該タンクを２０ｒｐｍで攪拌し、０．０８３のｖｖｍで通気した。該細胞が１２×１０６の密度に達したら、さらに３００Ｌの培地を加え、引き続き、新鮮脂質の２回目の用量（１．５％）を添加した。１時間後、該細胞に０．２のＭＯＩで感染させた。該タンクのｒｐｍを３０へと増加させ、ｖｖｍを０．６へと減少させた。
【０２３９】
全ての操作で、温度は２７±０．５℃に制御し、ＤＯ濃度（溶解酸素濃度）を、６０％に制御した。細胞の密度および生存度は、ガバ（Ｇｕａｖａ）のＰＣＡ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて測定した。感染６７時間後に採取した。ＥＰＯ濃度はＥＬＩＳＡ法によって判定した。
【０２４０】
ＥＰＯ生産に用いられた脂質混合物の成分は、実施例１に開示されたとおりであり、１０００Ｌのバイオリアクター規模でのＥＰＯ生産に関する典型的な処理パラメーターは、下表１４に要約されている。
【０２４１】
【表１４】
2008538181.tif 000016
【０２４２】
４．３  実験結果
表１５に示された実験結果は、感染６７時間後におけるＥＰＯ生産が規模を増大させても再現性があることを示している。ＥＬＩＳＡアッセイに基づいたＥＰＯ力価は２８．２ｍｇ／Ｌであった。ＥＰＯ生産に関する容量生産量は１６９２０ｍｇであった。該操作の採取時における生細胞濃度は、０．７５×１０７細胞／ｍＬであり、採取時の細胞生存度は９０％であった。ＩＰ／ＣＥアッセイは、１００％のＥＰＯが採取時に非分解であったことを示している。当該方法が１０００Ｌの規模に拡大でき、２５ｍｇ／Ｌ超の力価で、適合的な品質のＥＰＯを与えることを、これらのデータは実証している。
【０２４３】
【表１５】
2008538181.tif 000017
【０２４４】
実施例５：１００ｋＤａおよび１０ｋＤａの接線流ろ過（ＴＦＦ）カスケードを用いるＥＰＯ精製
以下の実施例は、昆虫細胞培養液からのペプチドを精製するためのカスケードＴＦＦ膜系の使用法を示している。ＴＦＦカスケードは、２段階の膜分離系であり、本実施例では、異なる孔径を有する２種の膜を用いる。図４の略図に示されるように、第１段階で、１００ｋＤａの限外ろ過（ＵＦ）膜により、バキュロウィルス、大型タンパク質およびＤＮＡ不純物が除去される。１０ｋＤａのＵＦ膜を用いる第２段階で、第１段階からの透過物が濃縮される。ＥＰＯ産物は、第２段階の濃縮液に存在する。
【０２４５】
上記のカスケードＴＦＦ法により、ＥＰＯタンパク質は著しく濃縮化される一方、限定はしないが、バキュロウィルス、大型宿主タンパク質および宿主ＤＮＡなどの不純物が除去される。この方法により、バキュロウィルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）からの組換えタンパク質精製の新規方法が提供される。
【０２４６】
１００ｋＤａおよび１０ｋＤａの膜によるＴＦＦカスケード膜系は、ペプチドの精製方法にとって著しい利点を提供する。第１に、バキュロウィルスならびに大多数のグリコシダーゼなどの大型タンパク質不純物および大きな宿主ＤＮＡが、１００ｋＤａのＵＦにより、産物流から除去される。第２に、ろ過工程をプロテアーゼ／グリコシダーゼ阻害剤の添加と組み合わせることにより、ＥＰＯの安定性がさらに改善する。酵素阻害剤の添加により、この系を室温で操作することが可能になる。第３に、１００ｋＤａ膜による不純物の除去によって、１０ｋＤａ膜の性能は、装填物の減少により改善される。膜効率がより高くなることで、生産時間が短縮される。さらに重要なことには、引き続くクロマトグラフィー工程への装填量が、不純物であるタンパク質の除去によってはるかに少なくなる。クロマトグラフィーカラムの必要量が少なくなり、その結果、全体的な生産時間が短縮し、コストが低下する。
【０２４７】
６００Ｌおよび１０００Ｌ培養液（実施例４から）からのＥＰＯ採取
６００Ｌ培養物からの細胞を、細胞除去のため、アルファ・ラーバル（Ａｌｆａ  Ｌａｖａｌ）のディスクスタック遠心分離を用いて処理した。得られた上澄み液の１０Ｌに、５ｍＭの最終濃度までクエン酸ナトリウムを添加した。したがって、該溶液のｐＨは７．５に調整された。次いで、１０Ｌのセントレート（ｃｅｎｔｒａｔｅ）をミリポア１０’’オプティカル・プラグイン（ＨＣ  Ｏｐｔｉｃａｐ  Ｐｌｕｇ−Ｉｎ）フィルターを介して処理し、ＴＦＦカスケードに供した。ＴＦＦカスケードにより、最初の１０Ｌ容量を１Ｌ容量に濃縮し、６ダイア容量の２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ５ｍＭのクエン酸Ｎａ、ｐＨ７．５により、カスケードのミリポア１００ｋＤａおよび１０ｋＤａ  ＲＣ  １ｓｑｆｔ膜を通して該溶液をダイアフィルトレートした。得られた産物を、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑクロマトグラフィーに供した。
【０２４８】
ＰＡＬＬ  Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ  ＡＥＸフィルターを介してその１Ｌを処理した。該フィルターを、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｍＭのクエン酸Ｎａ、ｐＨ７．５により洗浄して該ペプチドを溶出させた。該溶液を−２０℃で１週間貯蔵した。次いで、該産物を、Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｓクロマトグラフィーに供した。９００ｍＬのＭｕｓｔａｎｇ  Ｑ流出洗浄液を７５ｍＬのＵＮＯＳｐｈｅｒｅ  Ｓカラムに装填した。０．１５ＭのＮａＣｌ段階的勾配の５カラム容量（ＣＶ）でＥＰＯを溶出させた。
【０２４９】
この６００Ｌバッチ由来の得られた溶出プール中のＥＰＯペプチドの品質は、細胞培養液の１Ｌバッチを処理した際に得られたＥＰＯの品質と同等であった。本実施例において開示される方法によって調製および単離されたＥＰＯサンプルの品質を示す代表的なウェスタンブロットが図５に示されている。この図はまた、一様な昆虫特異的グリコシル化パターンを示している。逆相ＨＰＬＣによって判定されたＥＰＯの回収率は７８％であった。逆相ＨＰＬＣによって判定された、溶出プール中のＥＰＯペプチドの純度は９２％であった。
【０２５０】
実施例６：ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）に関する精製方法
以下の実施例は、ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）に関し、規模を増大できる精製方法を示している。このペプチドは、本発明の方法に従って、バキュロウィルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）において発現させた。この方法によって精製したＥＰＯは、糖ＰＥＧ化ＥＰＯペプチドの引き続く生産に使用することができる。
【０２５１】
該方法は、遠心分離による細胞除去、０．２２μｍ膜フィルターと結合させたデプスろ過、接線流ろ過カスケード（ＴＦＦカスケード）を用いた濃縮およびダイアフィルトレーション、アニオン交換膜分離、非イオン界面活性剤によるウィルス不活化、カチオン交換クロマトグラフィー、低ｐＨによるウィルス不活化、サイズ排除クロマトグラフィーによる脱塩、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）および限外ろ過を用いた最終緩衝液交換を含む。この方法からのＥＰＯ純度は、臨床試験品質のペプチドを提供する上で十分なものである。該ペプチドの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動、ＲＰ−およびＳＥＣ−ＨＰＬＣ、ならびにｎ−グリカール分析によって判定した。１５Ｌから１００Ｌ規模の細胞培養液から出発して、全体的な処理収率は１０〜２０％であった（ＲＰ−ＨＰＬＣにより判定）。
【０２５２】
６．１  材料および装置
遠心分離機：ＬＡＰＸ−４０４（アルファ・ラバール（Ａｌｆａ  Ｌａｖａｌ））
デプスフィルタ９０ＳＰ（キューノ（Ｃｕｎｏ））；あるいは３０ＳＰまたは６０ＳＰ
膜フィルター：Ｍｉｌｌｉｐａｋ  ０．２２μｍ（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））
ＵＦ／ＤＦ膜：カスケード用にＰｅｌｌｉｃｏｎ  ２  １００ｋＤａ／１０ｋＤａ、最終緩衝液交換用に５ｋＤａ（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））
クロマトグラフィー樹脂：ＳＰセファロースＦＦカチオン交換樹脂（ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））；ＳＰセファロースＨＰカチオン交換樹脂（ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））；ＵＮＯＳｐｈｅｒｅ  Ｓカチオン交換樹脂（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））；Ｇ−２５樹脂サイズ排除樹脂（ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））；ＨＡタイプ１樹脂（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））；ブチル−４  ＦＦ疎水性相互作用樹脂（ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））；フェニル６５０疎水性相互作用樹脂（トーソーハス（ＴｏｓｏＨａｓｓ））
クロマトグラフィー系：Ｕｎｉｃｏｒｎ５．０１ソフトウェアを有するＡＫＴＡ系
１８％のトリス−グリシンゲルおよびコロイド青色および銀色染色によるＳｅｅ  Ｂｌｕｅ２分子標品を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。
緩衝液系：使用された緩衝液は全て、結果の節に記載される。
細胞培養：１５Ｌおよび１００Ｌのバイオリアクターにおいて細胞培養を実施した。
【０２５３】
６．２  実験操作
ＥＰＯは、バキュロウィルス発現ベクター系を用い、細胞培養物中で増殖させた。先ず、連続的遠心分離により、Ｓｆ９細胞および細胞破片を細胞培養液から除去し、濁度＜３０ＮＴＵにした。上澄み液を、連続デプスフィルター／膜フィルターを介してろ過し、濁度＜５ＮＴＵにした。得られた材料を１００ｋＤａのＴＦＦ膜に通した。この第１の限外ろ過工程の透過液を１０ｋＤａのＴＦＦ膜に通した。この第２の限外ろ過工程の濃縮液を採取した。このＴＦＦカスケード操作は、該混合物の濃縮および緩衝液交換の実施による引き続く精製工程用に該混合物を調節するために用いられた。
【０２５４】
得られた産物は引き続いて、予め平衡化したＭｕｓｔａｎｇ  Ｑアニオン交換膜フィルターに装填し、流出液ならびに洗浄液プールを回収した。次いで、トリトンＸ−１００（０．０５％ｖ／ｖ）を加え、該混合物を４℃で一晩置いてからカチオン交換カラムに装填した。ペプチド含有フラクション（ゲル分析）をプールし、該混合物を４℃で一晩保持した。
【０２５５】
カチオン交換カラムプールに２０ｍＭのクエン酸を添加し、ＨＣｌによってｐＨを２．１±０．１に調整し、次いで、該混合物をこの低ｐＨに１時間保持してから、ＮａＯＨによりｐＨを７．５に調整し直すことによって、第２のウィルス不活化工程を実施した。
【０２５６】
次いで、サイズ排除カラムを用いて該混合物を脱塩し、伝導率＜１ｍＳ／ｃｍにした。次に、脱塩した混合物をヒドロキシアパタイト（ＨＡ）カラムに装填した。ＨＡカラムからの溶出液プールを０．５Ｍの硫酸ナトリウム、１０ｍＭの酢酸ナトリウムにして、ｐＨ５．０に調整した。次いで、得られた中間体を、疎水性相互作用樹脂上で処理した。ＨＩＣカラムからの溶出液プールを、５ｋＤａのＴＦＦ膜を通してダイアフィルトレートし、濃縮液を貯蔵緩衝液中に再構成し、およそ２ｍｇ／ｍＬのＥＰＯペプチド濃度とした。
【０２５７】
６．２．１  遠心分離による細胞破片の除去
採取前に、該細胞培養物をバイオリアクター内で４℃に冷却し、サンプルを取り出して、細胞培養液中の固体のパーセンテージを測定した。６０００ｒｐｍのボール速度および１分当たり２リットルの流速でＬＡＰＸ−４０４ディスクスタック遠心分離機を用いて、細胞除去を実施した。固体のパーセンテージおよび流速によって排液間隔を決定し、固体に対してボール容積の８０％を超えないように調整した。排液前に、細胞培養液を、４℃で、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５を用いて、該ボールからフラッシュした。該上澄み液を採取して固体（ペレット）を廃棄した。
【０２５８】
６．２．２  連続デプス／膜フィルターによる上澄み液の清澄化
ディスクスタック遠心分離工程からの上澄み液は、６２．５Ｌ／ｍ２および流速１２０ＬＭＨで、９０ＳＰグレードのデプスフィルターを介して清澄化した。９０ＳＰ工程からのろ液を、１０００Ｌ／ｍ２および流速１９２０ＬＭＨで、０．２２μｍのＭｉｌｌｉｐａｋ  ２００フィルター膜に通した。全ての上澄み液をフィルターハウジングにポンプで引き入れたら、連続フィルターを、４℃で、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５を用いてフラッシュした。次いで、ろ液プール容量を、ろ過前の上澄み液プール容量以上の測定量になるように調整した。
【０２５９】
６．２．３  限外ろ過およびダイアフィルトレーションによる調節
清澄化培養液を、クロマトグラフィーの前に、濃縮および接線流ろ過（ＴＦＦ）カスケードによるダイアフィルトレーションによって調節した。該膜へのペプチドの非特異的結合を減少させるために、再生セルロース膜を使用した。清澄化培養液を、１００ｋＤａの分子量カットオフ膜上、発酵容量の１／１０に濃縮し、５ダイア容量の２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５でダイアフィルトレートした。１００ｋＤａ膜からの透過液を、１０ｋＤａの分子量カットオフ膜上、発酵容量の１／２０に濃縮し、６ダイア容量の２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５でダイアフィルトレートした。１００ｋＤａ膜により、バキュロウィルスならびに＞１００ｋＤａタンパク質および凝集体などの高分子量不純物が除去され、１０ｋＤａ膜によって、水および低分子量不純物が清浄化された。これらの工程は同時に、制御下室温（２０〜２５℃）で操作された。
【０２６０】
６．２．４  Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ膜ろ過による不純物の除去
１０ｋＤａ濃縮液プールを、１ＬのＭｕｓｔａｎｇ  Ｑ膜容量当たり２５０Ｌの供給量、および１分あたり２０膜容量の流速で、予め平衡化したＭｕｓｔａｎｇ  Ｑカプセルフィルター上に充填した。該フィルターカプセルを、１０膜容量の２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５でフラッシュした。標的タンパク質は該フィルターを通過し、流出液および洗浄液のフラクション中に採取される。多くの宿主細胞タンパク質、ＤＮＡおよび他の酸性不純物、ならびにバキュロウィルスがＭｕｓｔａｎｇ  Ｑ膜に保持される。
【０２６１】
６．２．５  非イオン界面活性剤によるウィルス不活化
Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑろ液プールに、トリトンＸ−１００の１０％貯蔵液を、０．０５％ｖ／ｖの最終濃度まで添加した。該混合物を４℃で一晩置いた。この工程は、エンベロープウィルスの不活化を目的としている。
【０２６２】
６．２．６  カチオン交換クロマトグラフィーによるＥＰＯの精製
次いで、アニオン交換プールをカチオン交換クロマトグラフィーに適用した。この工程は第１次精製工程として役立ち、以前に加えたトリトンＸ−１００を産物混合物から除去する。この実験で、バイオ−ラド  ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からのＵＮＯＳｐｈｅｒｅ  Ｓをカチオン交換樹脂として用い、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５へと平衡化した。Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑプールを、樹脂１ｍＬ当たり１０吸光度単位（２８０ｎｍ）を標的とする樹脂上に装填した。非結合タンパク質を、５カラム容量（ＣＶ）の平衡用緩衝液で該カラムから洗い出し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５中、２００ｍＭのＮａＣｌまでの段階的ＮａＣｌ勾配を用いて、結合タンパク質を溶出させた。該カラムから最初に溶出するピークは、宿主細胞タンパク質を表す。残りのフラクションは、産物プールとして採取した。該カラムを、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５中、１ＭのＮａＣｌでストリップした。このカチオン交換工程により、多くの宿主細胞タンパク質からのＥＰＯペプチドの分離が提供された。
【０２６３】
６．２．７  低ｐＨによるウィルス不活化
次いで、カチオン交換カラムからの産物プールを、非エンベロープウィルスの不活化を目的とした低ｐＨ保持工程に供した。ＥＰＯ含有混合物にクエン酸を加えて、２０ｍＭの最終濃度にした。次に、ｐＨを、ＨＣｌによりｐＨ２．１±０．１に調整した。該混合物をこの低ｐＨに１時間保持し、次いで、ＮａＯＨにより、ｐＨをｐＨ７．５に調整した。この工程は、制御下室温で実施した。
【０２６４】
６．２．８  サイズ排除クロマトグラフィーによる脱塩
ＨＡクロマトグラフィー用の調製物中、産物プールを脱塩し、１ｍＳ／ｃｍ以下の最終塩伝導度とするために、Ｇ−２５の粗ビーズのサイズ排除樹脂上に通した。ＨＡカラムの満足すべきペプチド保持能力を確実にするために、この低伝導率は必要である。該樹脂を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５に平衡化し、次いで、産物プールを、１５〜２０％のＣＶで該カラム上に装填した。該樹脂を２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５で洗浄し、２８０ｎｍにおける吸光度が増加した時、ペプチドの採取を開始し、吸光度がベースラインに近づいた時、かつ流出液の伝導率が２ｍＳ／ｃｍに達する前に採取を停止した。この工程は完了までに複数の注入を要する。
【０２６５】
６．２．９  ＨＡクロマトグラフィーによる精製
先ず、ヒドロキシアパタイト樹脂（タイプＩ、８０μｍ）に０．１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５を装填し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５で平衡化した。脱塩プールを、樹脂１ｍＬ当たり１０吸光度単位（２８０ｎｍ）を標的とする樹脂上に装填した。非結合成分を除去するために、該樹脂を２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５で洗浄し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２０ｍＭのグリシン、ｐＨ７．５中、１ＭのＮａＣｌへの２０ＣＶ勾配によって標的タンパク質を溶出させた。ピークフラクション全体を産物プールとして採取し、該カラムを０．１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５でストリップした。この工程により、直交精製が提供され、背景の宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、およびエンドトキシンが除去される。
【０２６６】
６．２．１０  疎水性相互作用クロマトグラフィーによる精製
ＨＡ溶出液に、１０ｍＭの酢酸ナトリウム中、硫酸ナトリウム（０．５Ｍ）を加え、ｐＨをｐＨ５．５に調製した。ブチル−４  ＦＦカラムを、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５中、０．５Ｍ硫酸ナトリウムに平衡化し、次いで、該産物を、樹脂１ｍＬ当たり、１０吸光度単位（２８０ｎｍ）を標的とするＨＩＣカラム上に装填した。非結合成分を該カラムから洗い出し、該産物を２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５まで段階的に溶出させた。ピーク全体を産物として採取し、該カラムを２０％エタノールおよび高ｐＨでストリップした。この工程により、ポリッシングおよび低分子量不純物（図３の不純物Ａ）の特異的除去が提供される。
【０２６７】
６．２．１１  膜ろ過によるウィルス除去
ＨＩＣ溶出液をＮＦＰウィルス除去フィルターを介してろ過した。今のところ、この工程は実験室規模で実施されているが、将来、製造規模で使用することが意図されている。
【０２６８】
６．２．１２  タンパク質の濃縮および貯蔵
ＨＩＣカラムからの溶出液プールを、５ｋＤａＴＦＦ膜フィルターを用いた２８０ｎｍでの吸光度による判定で、２ｍｇ／ｍＬへと濃縮し、３ダイア容量の２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５を用いてダイアフィルトレートした。次いで、該産物を２０℃で貯蔵した。
【０２６９】
６．２．１３  方法／産物の分析
該方法／産物の特性化は、本質的に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析およびＲＰ−ＨＰＬＣ分析に基づいた。
【０２７０】
実施例７：低ｐＨ保持操作によるウィルス不活化
この実施例では、ＥＰＯペプチド回収率に及ぼす低ｐＨ保持工程の効果を調べる一組の実験について説明する。低ｐＨ保持工程は、該ＥＰＯ精製方法における殺ウィルス工程として有用である。殺ウィルス工程は、臨床試験に用いられるＥＰＯの生産にとって特に重要である。該実験では、ｐＨ、ＮａＣｌ濃度、時間およびＥＰＯ濃度などのパラメーターを変化させながら、ＥＰＯペプチド回収率に及ぼす低ｐＨの効果を調べた。
【０２７１】
７．１  材料
クエン酸、酢酸、ＨＣｌ、ＮａＯＨ、トリスベース、バルクＥＰＯ、ＵＮＯＳプールＥＰＯ。
【０２７２】
７．２  実験
７．２．１  ｐＨ範囲およびＮａＣｌ濃度の調査
ｐＨ範囲およびＮａＣｌ濃度を調べる二組の実験で、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液を、ｐＨ２．０〜４．０、および０、１５０、５００ｍＭのＮａＣｌへと配合した。次いで、バルクＥＰＯを、各配合において１０倍に希釈した。サンプルを室温に１時間保持してから、ｐＨを１Ｍのトリスベースにより７．５に調製し直した。サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した。第１の実験では、ＥＰＯサンプルを、ｐＨ２．５、３．０、３．５および４．０に保持した。ｐＨ２．０からｐＨ３．０の間のｐＨ範囲をさらに調べる第２の実験では、サンプルを、ｐＨ２．０、２．２、２．５、２．７および３．０に保持した。
【０２７３】
実験１の結果
ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上で、ＥＰＯバンドは、ｐＨ２．５での低ｐＨ保持に対応するレーンで最も強く、ｐＨ３．５での低ｐＨ保持に対応するレーンで最も弱かった。ＮａＣｌの濃度に関わりなく、ｐＨ２．５に保持したサンプル中に分解または凝集は見られなかった。この実験におけるＲＰ−ＨＰＬＣの結果は、図４Ａに示されるように、ＥＰＯペプチド回収率は、ｐＨ２．５で最高であり、緩衝液のイオン強度に関係しないことを示している。ＳＥＣ−ＨＰＬＣの結果は、低ｐＨ保持サンプルにおいて、凝集体の形成がないことを示しており、ＮａＣｌ濃度に関係なく、ｐＨ２．５で最高のＥＰＯペプチド回収率が確認されている。
【０２７４】
実験２の結果
ｐＨの関数として、凝集または分解は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上に検出されず、ＥＰＯバンドの強度は、試験されたｐＨ範囲（ｐＨ２．０から３．０）を通して同等のようであった。しかし、該サンプルのＲＰ−ＨＰＬＣ分析では、ｐＨ２．０で最高の回収率が示され、図４Ｂに示されるように、該データは、ｐＨが低下するにつれて、ＥＰＯペプチドの回収率が増加する傾向を示している。ｐＨ２．０からｐＨ２．５の間に保持されたサンプルのいずれに関しても、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析で凝集体形成は現れない。
【０２７５】
７．２．２  時間およびＥＰＯペプチド濃度の調査
時間およびＥＰＯペプチド濃度を調査する実験では、バルクＥＰＯを、ＨＣｌにより、ｐＨ２．３に調製した。サンプルを、１〜３．５時間の時間経過の間、室温に置いた。ＥＰＯ濃度の効果を調べるために、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ２．３を用いて、ＥＰＯサンプルを、所望のＥＰＯ濃度に希釈した。サンプルは全て、室温に１時間保時した。次いで、１Ｍのトリスベースにより、ｐＨをｐＨ７．５に調製し直した。ｐＨ２．５およびｐＨ７．５の対照は、緩衝液中、１０倍に希釈した。サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した。
【０２７６】
結果
時間経過に関しては、ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上に凝集または分解は検出できなかった。０時間から３．５時間の時間経過サンプルを通じて、ＥＰＯ強度は同等であった。この観察事項は、ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって確認された。ＨＰＬＣクロマトグラムは、１〜３．５時間の低ｐＨ保持に関して、および４０〜８５０μｇ／ｍＬのＥＰＯ濃度に関して、同等のＥＰＯペプチド回収率を示している。
【０２７７】
７．２．３  ＥＰＯの等電点に及ぼす低ｐＨ保持効果の調査
３６０ｍＬのＵＮＯＳプールＥＰＯを半分に分けた。１８０ｍＬを、１Ｍのクエン酸貯蔵液により、２０ｍＭクエン酸とし、ＨＣｌによりｐＨ２．２に調製し、室温で１時間保持してから、１Ｍのトリスベースにより、ｐＨ７．５に調製した。ＵＮＯＳプールの双方を、Ｇ−２５粗ビーズ、９００ｃｍ／時間、および１６％ＣＶ注入により脱塩した。双方の脱塩プールに関して、ＨＡカラム上クロマトグラフィーにより、ＥＰＯのさらなる精製を実施した。次いで、サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＩＥＦ、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した。
【０２７８】
結果
ＨＡプールのＩＥＦゲルは、ＥＰＯの等電点（ｐＩ）は、該処理中の低ｐＨ保持によって変化しないことを示している。したがって、低ｐＨ保持は、ｐＩに影響を及ぼすアミド分解または他の分解を生じさせないと考えられる。
【０２７９】
７．３  結論
これらのデータは、約２．０から約２．３での低ｐＨ保持は、ＥＰＯペプチドの安定性に最少の影響しか与えないことを実証しており、低ｐＨ保持を、ＥＰＯ精製方法に組み込むことが可能になる。最高収率のためには、ｐＨは、約２．０から約２．２の間である必要がある。該プールは、室温（２０〜２５℃）で少なくとも３．５時間保持できる。該工程は、約４０μｇ／ｍＬから約８５０μｇ／ｍＬの間のＥＰＯ濃度の溶液で実施できる。
【０２８０】
実施例８：ＨＡカラム能力に及ぼす装填用緩衝液脱塩の影響およびＨＡクロマトグラフィー時のＥＰＯペプチド回収率に及ぼすグリシンの影響
ＥＰＯペプチドの臨床バッチの生産用に、ＨＡクロマトグラフィー工程のロバスト性および規模を増大させるために、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）カラムの充填能力に及ぼす充填緩衝液の塩伝導率低下の影響を調べた。ＥＰＯペプチドを含有するＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｓプールを希釈または脱塩して、伝導率を低下させた。次いで、該産物をｐＨ７．５のＨＡカラムに装填し、引き続き、適切な塩化ナトリウム濃度を含有する緩衝液を用いて溶出させた。
【０２８１】
８．１  材料
バイオラド（ＢｉｏＲａｄ）からのＨＡ１型樹脂８０μｍビーズ
ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）からＧ−２５粗ビーズ樹脂
ＧＥヘルスケアからのＸＫスタイルカラム
緩衝液：０．１ＭのＮａ２ＰＯ４（平衡／再生）、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５（平衡／洗浄／溶出）、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５（溶出）、２０ｍＭのグリシン、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５（溶出）
【０２８２】
８．２  実験
ＨＡ装填は、装填の伝導率を減少させるために希釈または脱塩により調節した。次に、Ａｋｔａシステムは、ＨＡカラム（１型樹脂）上に供給流を装填するために使用された。生成物は、塩化ナトリウムで溶出させ、カラムは、リン酸ナトリウムでストリップさせた。クロマトグラフィー中の緩衝液のｐＨおよび伝導率をモニターし、Ａｋｔａシステムにより記録した。カラム装填および生じたフラクションは、ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。
【０２８３】
ＵＮＯスフェアＳプールは、Ｇ−２５樹脂上で２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５中に脱塩された。サンプル注入は、１６〜２０％ＣＶであった。流速は、カラムハードウェアおよびシステム圧制約により９０〜３５０ｃｍ／時間まで変えた。
【０２８４】
実験１：ＨＡ回収に及ぼす装填物中の種々のＥＰＯ濃度の効果
【０２８５】
【表１６】
2008538181.tif 000018
【０２８６】
結果
装填実験では、３７．５〜１５０μｇ／ｍＬのＥＰＯ濃度を試験した。装填物中のＥＰＯ濃度が、３７．５μｇ／ｍＬと１６８μｇ／ｍＬとの間であった場合に、等しい純度および回収率が見られた。これらの結果は、プール純度（１００％）および回収率（９０％）が装填物中の産物の濃度に係わりないことを示した。９９％の純度および８２％の回収率は、１６８μｇ／ｍＬと高い産物濃度に見られた。
【０２８７】
実験２：脱塩対希釈装填の比較
【０２８８】
【表１７】
2008538181.tif 000019
【０２８９】
結果
この実験において、ＨＡカラムクロマトグラフィー時のＥＰＯペプチドの回収率に及ぼす装填用緩衝液の希釈または脱塩の効果を調べた。希釈装填では、２ｍｇ／ｍＬの装填前に１０％のブレイクスルーに達するが、一方、装填が脱塩されている場合には、＞９ｍｇ／ｍＬの装填後でもこのレベルのブレイクスルーに達しないことを図５は示している。希釈装填での工程回収率は、４５％であり、脱塩装填での工程回収率は、ｐＨ９の洗浄が除外されている場合に７４％であり、ｐＨ９の洗浄が含まれる場合に９０％である。双方の操作とも、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析により＞９５％のプール純度をもたらす。
【０２９０】
実験３：脱塩装填によるＨＡクロマトグラフィー樹脂の装填能力
【０２９１】
【表１８】
2008538181.tif 000020
【０２９２】
結果
実験３は、装填物を脱塩し、１０ｍｇ／ｍＬまでのＥＰＯ装填物に関してカラムの能力を試験することにより実施した。これらの結果により、装填物の伝導率が≦０．３３ｍＳ／ｃｍである場合、ＨＡカラムの能力が１０ｍｇ／ｍＬ超であることが示されている。
【０２９３】
実験４：ペプチド回収率に及ぼす溶出緩衝液中２０ｍＭグリシンの効果
【０２９４】
【表１９】
2008538181.tif 000021
【０２９５】
結果
本実験において、ＨＡクロマトグラフィー時にＥＰＯペプチドの回収率に及ぼすｐＨ７．５における溶出緩衝液中２０ｍＭグリシンの効果を評価した。図６に示されるように、溶出緩衝液への２０ｍＭグリシンの添加により、より鋭いピークをもたらされ、工程回収率が５％増加した。さらに、グリシンの添加により、工程回収率を殆ど維持しながら、ｐＨ９よりも低い（例えば、ｐＨ７．５から８．０まで）溶出緩衝液が可能になる。
【０２９６】
８．３  実験１〜４から引き出された結論
１．ＨＡカラムの能力は、装填物における伝導率が低下すると共に増加する。ＨＡ装填物の伝導率は、≦１ｍＳ／ｃｍである必要がある。
２．溶出緩衝液への２０ｍＭグリシンの添加により、プール純度を低下させることなくＨＡ工程回収が増加する。ＨＡ溶出は、ｐＨ７．５〜８．０で操作する必要がある。
【０２９７】
実施例９：ニワトリおよびヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩの精製方法
以下の実施例は、ニワトリおよびヒトのＮｅｕ５Ａｃ：ＧａｌＮＡｃα２、６−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ６ＧａｌＮａｃＩ）双方に関する規模を拡大できる精製方法を例示する。これらの酵素は、本明細書に記載された方法に従ってバキュロウィルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）において発現させた。この方法により精製されたＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩは、引き続く糖ＰＥＧ化ペプチド、例えば、Ｇ−ＣＳＦペプチドまたはＥＰＯペプチドの生産に使用できる。
【０２９８】
該方法は、細胞除去、ＣａＣｌ２沈殿、ＵＦ／ＤＦによる濃縮とダイアフィルトレーション、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ膜分離、ＵＮＯＳｐｈｅｒｅ  Ｓおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびＵＦ／ＤＦを用いる最終緩衝液交換を含む。この方法からのＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩの純度は、ＴＯＸ−ＡＤＭＥ品質酵素（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより推定された）を生成するのに十分である。全体的処理収率（酵素活性により判定された）は、１Ｌ規模での細胞培養液から出発して２０〜３３％であった。
【０２９９】
９．１．  材料と装置
クロマトグラフィー用樹脂：ＱおよびＳＰセファロースＸＬ（ＱＸＬおよびＳＰＸＬ）イオン交換樹脂（アマーシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））；ＵＮＯＳｐｈｅｒｅ  Ｓカチオン交換樹脂（バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））；ＨＡイオン交換樹脂（バイオ−ラド）。
クロマトグラフィーカラム：Ｏｍｉｆｉｔカラム（内径０．６６ｃｍおよび１．０ｃｍ）
クロマトグラフィーシステム：Ｕｎｉｃｏｒｎ５．０１ソフトウェア付のＡＫＴＡ清浄器
緩衝液フィルタ：Ｎａｌｇｅｎｅ０．２ミクロンフィルタユニット（ナルジーン（Ｎａｌｇｅｎｅ））
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、４〜２０％トリス−グリシンゲルおよびＣｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ染色と共にタンパク質ラダー分子標品を用いて実施された。
緩衝液系：
全ての緩衝液は、結果の節で説明される。
細胞培養：細胞培養は、１Ｌの振とう用フラスコ中で実施された。
【０３００】
９．２  実験
クーマシー染色によるＳＤＳ／ＰＡＧＥは、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩペプチドを同定するために使用された。産物の品質は、標品ペプチドを有するクーマシー染色ゲルパターンの比較により判定された。タンパク質の活性は、インビトロ酵素アッセイにより測定された。
【０３０１】
Ｎ−アセチルガラクトサミニドα２−６−シアリルトランスフェラーゼＩ（ＧａｌＮＡｃα２−６−シアリルトランスフェラーゼＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ）は、ＧａｌＮＡｃ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｏ−Ｓｅｒ−／Ｔｈｒ、およびＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒに対して活性を示すＴ６ＧａｌＮＡｃサブファミリーのメンバーである。それは、タイプＩＩ膜タンパク質トポロジーを示し、シアリルモチーフＬ、Ｓ、およびＶＳと呼ばれるシアリルトランスフェラーゼに特徴的なモチーフならびにクロサワ（Ｋｕｒｏｓａｗａ）モチーフを有する。
【０３０２】
ｓｆ９／ＢＶ細胞培養液で発現されるＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのニワトリ変異体に対する小規模精製方法は、細胞除去、上澄液調節、ＳＰセファロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を含む。
【０３０３】
この方法の規模を拡大するためには、大型ＳＰセファロースカラム（細胞培養液容量の１０％）が、直接拡大のために必要となるであろう。さらにＳＰセファロースは、一定のプロテアーゼおよびグリコシダーゼを同時精製すると、この工程時にかなりの活性喪失をもたらす。さらに、ＨＩＣ供給材料の調製には、タンパク質沈殿を生じる硫酸アンモニウムの添加を必要とし、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩタンパク質の損失がもたらされる。また、この工程は、操作の複雑性に加えて、廃物処理に費用がかかる。ＳＥＣはまた、生産性の低さ、製造コストの高さ、および操作の困難性のため、大規模製造にとって好ましくない。
【０３０４】
代替的かつ革新的な精製方法が開発されたので、以下に開示する。開発された方法はまた、一般に他のＳＴ６ファミリー酵素およびペプチドの精製に関するガイダンスを提供する。
【０３０５】
ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩを、バキュロウィルス発現ベクター系を用いて細胞培養液中で増殖させた。Ｓｆ９細胞および細胞破片は、バッチ遠心分離により細胞培養から最初に除かれた。上澄液を１０ｍＭのＣａＣｌ２沈殿により処理し、次いでコロイド状不純物および可能性としてバキュロウィルスを除去するために遠心分離で清澄化した。生じた物質は、予め平衡化されたＭｕｓｔａｎｇＱアニオン交換膜フィルター上に装填する前に、１０ｋＤａダイアフィルトレーション膜を通して濃縮および緩衝液交換により調節された。流動液および洗浄プールを採取して、カチオン交換カラム、ＵＮＯＳｐｈｅｒｅ  Ｓへの供給材料として用いた。適切な溶出液プールを、ゲルおよび活性分析に基づいて採取し、３倍に希釈し、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）カラムへの供給物として用いた。このカラムからの溶出液プールを、スピンフィルターを通して濃縮し、適切な最終貯蔵用緩衝系中に希釈した。
【０３０６】
９．２．１．  遠心分離による細胞破片の除去
ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ酵素は、細胞外タンパク質であったので、タンパク質精製方法の最初の工程は、Ｓｆ９細胞と細胞破片を除くことであった。細胞培養容量が、２リットル以下であったことを考慮して、我々の実験ではバッチ遠心分離を用いた。将来、大スケール製造のため、細胞除去は、細胞培養液操作の終末にろ過または連続遠心分離を用いて達成できた。得られた物質は、さらに適切なフィルターまたは連続フィルターにより清澄にすることができるであろう。パイロットスケール（１０〜１００Ｌ）において、細胞および破片は、適切な連続フィルターにより直接除去することもできるであろう。より大きな製造規模では、連続遠心分離に次いでろ過が好ましいと言えるであろう。
【０３０７】
細胞除去は、遠心分離前および遠心分離後、５９０ｎｍでの物質の吸光度により測定された濁度によりモニターした。同じ時間の異なる速度、異なる時間の同じ速度での遠心分離は、上澄液の濁度に大きな差異を生じさせない。
【０３０８】
種々の温度での細胞除去もまた調査した。濁度の減少については、同じ性能が全ての条件に見られた。遠心分離の効率は、細胞培養液の終末における細胞密度および生存度に大いに依存することが示された。採取時により低い生存度の培養液は、清澄化細胞培養液におけるより多い不純物量と相関した。不純物タンパク質は、細胞溶解後に上澄液に放出される可能性が高い。細胞溶解を評価する可能な方法は、細胞溶解の際にのみ検出される細胞内タンパク質である培養上澄液中のラクテートデヒドロゲナーゼ活性を測定することであると考えられる。
【０３０９】
ＳＴ６を含有する細胞培養上澄液は、さらに処理する前に−２０℃で１４週間保存された。
【０３１０】
９．２．２．  ＣａＣｌ２沈殿
塩化カルシウムを該上澄液に添加し、該溶液のｐＨを、塩基（例えば、ＮａＯＨ）を用いて上げた。その結果、水酸化カルシウムを含有する沈殿物が形成する。この沈殿方法により、細胞培養上澄液から一部の細胞破片、コロイド状不純物、およびバキュロウィルスを除去できる。沈殿不純物は、５０００ｒｐｍでの遠心分離により除去できる。さらにＣａ２＋は、ＥＤＴＡによりキレート化され、引き続きＵＦ／ＤＦよりさらに除去される。この工程においてペプチドの回収率は高く、７８％〜１１１％（酵素活性アッセイ）の範囲であった。
【０３１１】
９．２．３．  限外ろ過およびダイアフィルトレーションによる調節
クロマトグラフィー前に、ＣａＣｌ２上澄液は、接線流ろ過（ＴＦＦ）を介する濃縮およびダイフィルトレーションにより調節された。膜へのペプチドの非特異的結合を減じるために、１０ｋＤａ分子量カットオフを有する再生セルロース膜を常時用いた。緩衝液および時間を節約するために、ＣａＣｌ２沈殿からの上澄液は、最初５×まで濃縮してから、引き続きカラムクロマトグラフィー工程（全て室温、２０〜２５℃で）で使用される平衡用緩衝液の５ダイア容量によりダイアフィルトレーションされた。
【０３１２】
濃縮およびダイアフィルトレーション処理時のプロテアーゼ活性を調べるために、対照実験として直接のダイアフィルトレーションを実施した。ニワトリＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩを含有する細胞培養材料が使用された。ＵＦによる５倍の濃度は、５０％の活性喪失（質量回収率は不明）を生じると思われる。濃縮なしでは、タンパク質活性は、より高かった。これは、細胞培養液がＵＦにより濃縮される場合に酵素分解が高まることを示すと思われる。より低い倍率の濃度、例えば、２×、３×では、より高いＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ活性回収率が得られる。
【０３１３】
９．２．４．  イオン交換クロマトグラフィーによる精製
種々のｐＨにおけるペプチドのＱＸＬ樹脂への結合
ＢＥＶＳにおいて発現させたニワトリＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩがどのｐＨでＱＸＬ樹脂に結合するかを判定するために、バッチ結合実験を実施した。ＣａＣｌ２沈殿および遠心分離による清澄化後、上澄液を、１０ｋＤａ、１ｆｔ２膜を用いて５倍に濃縮し、室温で５回の緩衝液交換により２５ｍＭのＮａ２ＰＯ４／ＮａＯＡｃ、ｐＨ７．５にダイアフィルトレートした。限外ろ過透過流速は、５０ＬＭＨ（リットル／ｍ２／時間）であった。濃縮液の流速は、１２０ｍＬ／分であった。膜間圧は、８ｐｓｉであった。濃縮液サンプルのｐＨは、希釈酢酸によりｐＨ７．０、６．５、６．０、５．５または５．０のいずれかに、および希釈ＮａＯＨによりｐＨ８．０または８．５に調整した。得られた溶液を、遠心分離管中の予め平衡化させた対応するＱＸＬ樹脂に吸着させた。平衡用緩衝液で洗浄後、ペプチドを、１．０ＭのＮａＣｌを含有する平衡用緩衝液により樹脂から溶出させた。ｐＨを８．５に増すと、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃは樹脂に結合し始めた。ＱＸＬカラムは、産物を流出させる目的で、溶出緩衝液のｐＨを７．５と８．０との間に維持するべきである。
【０３１４】
ＱＸＬ／ＳＰＸＬ樹脂およびＱＸＬ／ＳＰＨＰ樹脂によるＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩの精製
濃縮／ダイアフィルトレーション工程からの濃縮液は、ＱＸＬ／ＳＰＸＬカラムカスケードに直接適用された。平衡用緩衝液により洗浄後、ＱＸＬカラムを切り離し、ペプチドを、線形勾配を用いてＳＰＸＬ樹脂から溶出させた。
【０３１５】
９．２．５．  Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ膜ろ過による精製
ＢＥＶＳにおいて、プロテアーゼ活性が通常見られ、発現タンパク質の分解の原因となることが多い。タンパク質の完全性を維持するために、プロテアーゼ阻害が必要である。あるいは、プロテアーゼは、処理中にできるだけ早く除去することができる。Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ膜フィルターは、この適用に有用である。ＱＸＬと同様に、望ましくないタンパク質および宿主ＤＮＡの除去は、この工程で達成できるであろう。さらに、これらのフィルターは、使い捨てであり、据付けおよび使用が簡便であり、ＱＸＬカラムよりも生じる圧低下は低い。このアニオン交換フィルターの別の利点は、ウィルスが除去できることである。
【０３１６】
ディスクおよびカプセル双方のＭｕｓｔａｎｇ  Ｑは、ＱＸＬよりも高効率で濁度（５９０ｎｍのＡＵにより示される）を除く。全ペプチドの回収率（ＵＶ２８０ｎｍにより測定される）は、Ｍｕｓｔａｎｇ  ＱおよびＱＸＬ双方で極めて類似している。不純物を生じる大部分の濁度は、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑの洗浄において回収された。ＱＸＬ樹脂ではそうでなかった。したがって、ＱＸＬは、粒状混入物を不可逆的に捕捉するのに有用である。
【０３１７】
Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑによるバキュロウィルスのクリアランス
細胞除去後の上澄液は、最初に３×に希釈し、該溶液のｐＨを７．５に調整した。この混合物を、予め平衡にしたＭｕｓｔａｎｇ  Ｑディスク上に装填した。種々のろ液プールを採取した。濁度は、５９０ｎｍの吸光度により測定されたが、全プールにおけるウィルス力価は、バキュロウィルスプラークアッセイを用いて測定された（実施例２）。
【０３１８】
全ての採取ろ液プールにおいて、濁度レベルは極めて低かった。バキュロウィルスは、フィルターにより除去されたが、フィルターからの溶出液中には回収されなかった。したがって、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑは、ウィルス粒子および濁度ならびに望ましくないタンパク質および宿主ＤＮＡなどの他の混入物を除去するために使用できる。
【０３１９】
９．２．６．  ＵＮＯスフェアＳによる精製
バイオ−ラッドラボラトリー（Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）からのＵＮＯスフェアＳは、ヒトおよびニワトリＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩタンパク質を精製するために使用された。溶出処理において、２本ピークが観察された。第２のピークは、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩであった。したがって、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩタンパク質は、この工程を用いてさらに精製できる。第２のピークは、生成物プールとして採取された。種々のフラクションに関するＳＤＳ−ＰＡＧＥは必要ではなかった。採取された物質は、引き続くカラム精製工程の供給材料として使用された。
【０３２０】
一実施形態において、ＵＮＯスフェアＳカラム（７ｍＬ、５７０ＣＶ）は、ヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩを含有する４Ｌの細胞培養液で装填された。別の実験において、ＵＮＯＳｐｈｅｒｅＳカラム（７ｍＬ、２８０ＣＶ）は、ニワトリＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩを含有する２Ｌの培養液で装填された。クロマトグラフィー前に細胞培養液を濃縮およびダイアフィルトレーションすることにより、ＳＰＦＦカラムに対する１０ＣＶ細胞培養と比較してはるかに高い能力が得られた。
【０３２１】
９．２．７．  ＨＡクロマトグラフィーによる精製
ヒドロキシアパタイト（タイプＩ、８０μｍ）を、０．４Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８により最初に充填され、５ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭ硫酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化した。ヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩを含有するＱＸＬ工程からの流出液および追跡物プールを、ＨＡビーズに装填した。次いで、ビーズを、種々の濃度のＮａＣｌを含有する、５ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭ硫酸ナトリウム、ｐＨ７．５で洗浄／溶出させた。種々のサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、主要なタンパク質不純物、エクジステロイドＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）は、０．３Ｍ  ＮａＣｌ洗浄（１０ＣＶ）により除去できたことを示した。ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩタンパク質はより高いＮａＣｌ濃度で溶出した。樹脂を０．４Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８で再生した場合、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃは、もはや溶出されなかった。
【０３２２】
ニワトリＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩはまた、ＨＡカラム（タイプＩ、４０μｍまたは８０μｍ）を利用して精製された。カラム寸法は、内径０．６６×１１．５ｃｍであった。ＳＰＸＬプールは最初に、バッチ実験に用いられた平衡用緩衝液に交換された緩衝液であり、次いでＨＡカラムに適用された。流速は、５ｍＬ／分（８７６ｃｍ／時間）であった。０．３ＭのＮａＣｌで１０ＣＶ洗浄後、タンパク質を、２０ＣＶ中１００％Ｂに対して線形勾配を用いて溶出した。１００％Ｂは、平衡用緩衝液プラス１．０ＭのＮａＣｌである。ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩと不純物のタンパク質、ＵＧＴとの間に良好な分離が達成された。
【０３２３】
溶出勾配は最適化された。３０％Ｂで１０ＣＶ洗浄後、１５および２０ＣＶ中５５％Ｂに対する線形勾配を、それぞれヒトおよびニワトリに関してＨＡカラムからＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩを溶出させるために用いた。主要ピークのみを採取した。得られた生成物は、高品質であった。工程勾配溶出は、純粋生成物を得るためにも使用できた。実験においてヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩを装填するカラムは、４Ｌの細胞培養液／４ｍＬのＨＡ（１Ｌ／１ｍＬ樹脂）であったが、一方、ニワトリＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのカラムは、２Ｌの細胞培養液／４ｍＬのＨＡ（０．５Ｌ／１ｍＬ樹脂）であった。
【０３２４】
９．２．８．  タンパク質濃度および貯蔵
ＨＡカラムからの溶出液プールは、ＶｉａＳｃｉｅｎｃｅ  Ｓｐｉｎフィルターを用いて１０倍から２０倍濃縮してから、５０ｍＭビス−トリス、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５緩衝液に配合した。ＵＦ／ＤＦ工程は、大規模製造から産物の濃縮を促進できる。配合産物は、５０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有する配合用緩衝液中、−２０℃で貯蔵された。
【０３２５】
９．２．９．  処理／産物分析
処理／産物特性化は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび酵素活性分析に基づいた。この結果により、遠心分離による細胞除去、およびＣａＣｌ２沈殿は、細胞および他の粒状混入物を含む主要濁度混入を除去するのに有効であることを示した。タンパク質分離は、クロマトグラフィー処理後の供給材料調製に使用されるＵＦ／ＤＦ（小型分子量の不純物を除いて、透過液が透明）時に見られなかった。Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑは、残存粒子混入のみならず酸性不純物およびウィルス粒子を除去する。ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩは、ＵＮＯＳｐｈｅｒｅ  Ｓ．を用いてさらに精製できる。残存タンパク質は、ＨＡカラムクロマトグラフィーによりさらに除去される。
【０３２６】
実施例１０：Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓを用いるバキュロウィルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）からのＥＰＯの精製
本実施例において、ザルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）のＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓのカチオン交換膜フィルターが、実施例６に使用されたＵＮＯＳｐｈｅｒｅ  Ｓカラムの代わりに使用された。このカチオン交換体オプションを用いて、主要なタンパク質不純物が除去される。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ物質は、この処理適用においてＵＮＯスフェアＳに対する代替物を提供するために試験された。
【０３２７】
ＥＰＯペプチドを含有するＭｕｓｔａｎｇ  Ｑアニオン交換カラムからの典型的な流出（ＦＴ）および洗浄液（Ｗ）が、本実験の出発物質として用いられた。この供給物は、精製処理の段階でＥＰＯ生成物に見られた典型的な不純物を含んだ。供給材料をＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ膜フィルターに適用し、フィルターを洗浄した。供給材料に存在した大部分のタンパク質不純物は、流出液および追跡物ならびに１．０Ｍ  ＮａＣｌストリッピング中で除去された。さらに、小型分子量の不純物は、７５ｍＭ、１００ｍＭおよび１０００ｍＭのＮａＣｌ溶出工程で除去された。ＥＰＯペプチドは、５０ｍＭのＮａＣｌを含有する溶出緩衝液により膜吸着器から溶出させた。生じたＥＰＯペプチドは、高純度（＞９０％）を有した。記載された実験は、少なくとも３回実施し、極めて類似した結果を有した。
【０３２８】
高純度のＥＰＯの提供に加えて、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓには、さらに多くの利点がある。伝統的なクロマトグラフィーと比較して、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓは、使い捨て膜フィルターである。したがって、クリーニング検証を必要としない。さらに、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓなどの膜吸着器を使用する場合、カラムクロマトグラフィー操作に典型的に使用される流速に比して、かなりより高い流速が使用できる。その結果、より高純度の生産性および効率が、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓを介して達成できる。タンパク質の精製が迅速かつ効率的であればあるほど、タンパク質の一部が、発現系に含まれている酵素により分解される機会が少なくなる。したがって、ペプチド製造に関する総合的な製造方法は、ザルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）Ｓカチオン交換方法の組み込みにより利益を得る。この代替法は、ＥＰＯの精製に特に有用である。
【０３２９】
当然のことながら、本明細書に記載された実施例および実施形態は、あくまでも例示することを目的としており、それらに鑑みて種々の修正または変更が、当業者に示唆され、本出願の精神と範囲内ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。本明細書に引用されている全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的のために参照として本明細書に組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【０３３０】
図面の簡単な説明
【図１Ａ】組換えＥＰＯペプチドを含有する昆虫細胞培養液のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。該細胞培養液に、感染の時点で、１．５％ｖ／ｖの新鮮脂質混合物を補足した。ＲＰ−ＨＰＬＣプロフィルは、ノイズ対（ＥＰＯ）ピーク比により、細胞培養ブロスの品質を示している。感染の時点で新鮮脂質を補足したバッチは、より高品質のブロスを生産する。
【図１Ｂ】組換えＥＰＯペプチドを含有する昆虫細胞培養液のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。該細胞培養液に、感染の時点で、脂質を補足しなかった。この抑制培養液は、ベースライン分解能の不良および非対称のＥＰＯピークを特徴とし、不良なブロス品質に一致する。
【図１Ｃ】図１Ａに示されたＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムの詳細図であり、１６分から２０分の間の保持時間を表している。この詳細図は、ＥＰＯピークおよび周囲のピークを示している。
【図１Ｄ】図１Ｂに示されたＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムの詳細図であり、１６分から２０分の間の保持時間を表している。この詳細図は、ＥＰＯピークおよび周囲のピークを示している。
【図２】１００ｋＤａおよび１０ｋＤａの分子量カットオフ膜を用いた典型的な接線流ろ過カスケード（ＴＦＦカスケード）を示す図である。
【図３】種々のＨＩＣ樹脂を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によるＥＰＯ含有産物混合物から低分子量不純物（「不純物Ａ」と標識されている）の必要な除去を示している銀染色タンパク質ゲルである。レーンは以下のとおり区別される：レーン１：ＨＩＣ充填（ＵｎｏＳｐｈｅｒｅＳ  プール）；レーン２：プールした産物フラクション（フェニルＬＳ樹脂）；レーン３：流出液および洗浄液（フェニルＬＳ樹脂）；レーン５：プールした産物フラクション（フェニル６５０Ｍ樹脂）；レーン６：流出液および洗浄液（フェニル６５０Ｍ樹脂）；レーン８：プールした産物フラクション（ブチル４セファロースＦＦ樹脂）；レーン１０：分子量マーカー；レーン４、レーン７およびレーン９：ブランク。
【図４Ａ】ＲＰ−ＨＰＬＣによって判定したＥＰＯペプチド％回収率に及ぼす低ｐＨ保持の影響を示す。この図は、この実験において、ＥＰＯペプチド回収率はｐＨ２．５で最高であり（約８０％の回収率）、緩衝液の塩化ナトリウム濃度に関係ないことを示している。この実験はさらに、ｐＨ３からｐＨ４におけるＥＰＯペプチドの著しい損失を示している。
【図４Ｂ】ＲＰ−ＨＰＬＣによって判定したＥＰＯペプチド％回収率に及ぼす低ｐＨ保持の影響を示す。この図は、ｐＨの低下につれてＥＰＯペプチドの回収率が増加する傾向を示している。この実験において、ＥＰＯ回収率は、ｐＨ２．０で約９０％であった。
【図５】種々のヒドロキシアパタイト（ＨＡ）カラム装填量（ｍｇ／ｍＬ  ＨＡ樹脂）におけるＨＡクロマトグラフィー時のＥＰＯペプチドブレイクスルーを示す図である。この図は、脱塩および希釈された装填量の効果を比較している。希釈装填物では、２ｍｇ／ｍＬ以下の装填で１０％のペプチドブレイクスルーに達するが、装填物が脱塩されている場合は、９ｍｇ／ｍＬ超の装填量でも１０％ブレイクスルーに達しないことが、このグラフによって示されている。
【図６】ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィー時のＥＰＯペプチド回収率に及ぼすグリシン添加の効果を示す図である。２０ｍＭのグリシンを含有する緩衝液を用いる場合は、グリシンなしの同一緩衝液を用いる場合の回収率に比較して、主要ピーク中のＥＰＯペプチド回収率が著しく高いことが、この図によって示されている。この図はまた、ＥＰＯピークの尾部フラクションに含有されたＥＰＯペプチド、ならびに該カラムに保持されたＥＰＯペプチドが減少することも示している。
【図７】本発明の方法による典型的なペプチド精製方法の全体図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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