(57)【要約】ここで提供されるのは、実質的に透明なシロップを製造する方法であり、この方法は、４５℃よりも高い温度において、少なくとも４０％  ｗ／ｗの濃度の１以上の基質を、少なくとも１つのアルテルナンスクラーゼ酵素と反応させる工程を包含する。好ましい実施形態では、この少なくとも１つのアルテルナンスクラーゼおよび１以上の基質は、１２時間未満にわたって４５℃よりも高く保持される。別の好ましい実施形態では、酵素は、８ユニット／グラム基質未満の濃度を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に透明なシロップを製造する方法であって、該方法は、４５℃よりも高い温度において、少なくとも４０％  ｗ／ｗの濃度の１以上の基質を、少なくとも１つのアルテルナンスクラーゼ酵素と反応させて実質的に透明なシロップを得る工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つのアルテルナンスクラーゼおよび１以上の基質が、１２時間未満にわたって４５℃よりも高く保持される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素が、８ユニット／グラム基質未満の濃度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
２０％  ｗ／ｗの濃度の前記シロップが、６５０ｎｍにおいて９３％よりも高い透過率を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記シロップが、ＤＰ１２よりも大きな０．５％未満のアルテルナンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記シロップが、８０°Ｆおよび７７％乾燥固形分濃度において１４０００ｃｐｓ未満の粘度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのアルテルナンスクラーゼ酵素が、乳酸細菌から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つのアルテルナンスクラーゼ酵素が、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓから得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つのアルテルナンスクラーゼ酵素が、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓのＮＲＲＬ  Ｂ  １３５５株、ＮＲＲＬ  Ｂ  ２３１８５株、ＮＲＲＬ  Ｂ  ２３１８６株、ＮＲＲＬ  Ｂ  ２３１８８株、ＮＲＲＬ  Ｂ  ２３３１１株、ＮＲＲＬ  Ｂ  ２１２９７株、ＮＲＲＬ  Ｂ  ３０８２１株、ＮＲＲＬ  Ｂ  ３０８９４株からなる群より選択される株から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのアルテルナンスクラーゼ酵素が、組換えにより産生される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法に従って製造された、シロップ。
【請求項１２】
請求項１１に記載のシロップを含む、食品組成物または飲料組成物。
【請求項１３】
食品または飲料を製造する方法であって、該方法は、１以上の成分を実質的に透明なシロップと混合する工程を包含し、該実質的に透明なシロップは、４５℃よりも高い温度において、少なくとも４０％  ｗ／ｗの濃度の１以上の基質を少なくとも１つのアルテルナンスクラーゼ酵素と反応させることにより製造される、方法。
【請求項１４】
前記飲料がスポーツドリンクである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのアルテルナンスクラーゼ酵素が、乳酸細菌から得られる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのアルテルナンスクラーゼ酵素が、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓから得られる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記アルテルナンスクラーゼ酵素が、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓのＮＲＲＬ  Ｂ  １３５５株、ＮＲＲＬ  Ｂ  ２３１８５株、ＮＲＲＬ  Ｂ  ２３１８６株、ＮＲＲＬ  Ｂ  ２３１８８株、ＮＲＲＬ  Ｂ  ２３３１１株、ＮＲＲＬ  Ｂ  ２１２９７株、ＮＲＲＬ  Ｂ  ３０８２１株、ＮＲＲＬ  Ｂ  ３０８９４株からなる群より選択される株から得られる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのアルテルナンスクラーゼ酵素が、組換えにより産生される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記成分のうちの少なくとも１つがビタミンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記成分のうちの少なくとも１つが高甘味度甘味料である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１３に記載の方法によって製造される、食品。
【請求項２２】
請求項１３に記載の方法によって製造される、飲料。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（背景）
飲料（例えば、スポーツドリンク）および他の食品適用の製造において使用されるコーンシロップが公知である。しかし、必要に応じて、コーンシロップと類似する甘味および官能性を有するが、より低い血糖上昇指数を有する、飲料および他の食品適用における使用のために利用可能な製品を有することが望ましい。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
（要旨）
本明細書中に提供するのは、アルテルナン（ａｌｔｅｒｎａｎ）オリゴ糖を含む実質的に透明な低血糖上昇シロップ（ＬＧＳ）の効率的な製造方法である。これらのシロップは、比較的低い血糖上昇指数を有し、増大した清澄性が所望される適用においてさらに有用である。これらの品質は、食品および飲料の配合において特に有益である。
【０００３】
いくつかの実施形態では、実質的に透明なＬＧＳを製造する方法は、４５℃よりも高い温度において、少なくとも４０％  ｗ／ｗの濃度の１以上の基質（最初のスクロース、ならびにスクロースからのグルコース単位を受け入れ得る、炭素番号２、３、６の炭素に１以上の遊離ヒドロキシル基を有する糖および糖アルコールから選択される１以上の最初のアクセプター）と、少なくとも１つのアルテルナンスクラーゼ酵素とを反応させる工程を含む。さらなる実施形態では、この基質は、少なくとも約４１％  ｗ／ｗ、少なくとも約４２％  ｗ／ｗ、少なくとも約４３％  ｗ／ｗ、少なくとも約４４％  ｗ／ｗ、少なくとも約４５％  ｗ／ｗ、少なくとも約４６％  ｗ／ｗ、少なくとも約４７％  ｗ／ｗ、少なくとも約４８％  ｗ／ｗ、少なくとも約４９％  ｗ／ｗ、少なくとも約５０％  ｗ／ｗ、少なくとも約５１％  ｗ／ｗ、少なくとも約５２％  ｗ／ｗ、少なくとも約５３％  ｗ／ｗ、少なくとも約５４％  ｗ／ｗまたは少なくとも約５５％  ｗ／ｗの濃度である。さらなる実施形態では、この基質および酵素は、４６℃よりも高い温度、４７℃よりも高い温度、４８℃よりも高い温度、４９℃よりも高い温度、５０℃よりも高い温度、または５１℃よりも高い温度において反応され得る。
【０００４】
いくつかの実施形態では、この方法は、１以上のアルテルナンスクラーゼを、比較的短い時間（例えば、１２時間未満または１１時間未満、１０時間未満、９時間未満、８時間未満もしくは７時間未満）にわたって基質と反応させる工程を包含する。
【０００５】
４５℃よりも高い温度でかつ少なくとも４０％  ｗ／ｗの基質濃度において製造された実質的に透明なＬＧＳは代表的に、より低い温度でかつより低い基質濃度において製造されたシロップと比較した場合、視覚的に、より透明である。清澄性はまた、本明細書中に記載される試験手順を用いて決定され得る。いくつかの実施形態では、実質的に透明なＬＧＳは、２０％  ｗ／ｗの濃度に調整された場合、６５０ｎｍにおいて９３％よりも高いかまたは９４％よりも高い、９５％よりも高い、９６％よりも高い、９７％よりも高い、９８％よりも高い、もしくは９９％よりも高い透明度を提示する。
【０００６】
いくつかの実施形態では、実質的に透明なＬＧＳは、ＤＰ１２（グルコース単位の重合度）よりも大きな０．５％未満のアルテルナンを含む。
【０００７】
いくつかの実施形態では、この方法は、低い粘度（例えば、８０°Ｆおよび７７％の乾燥固形分濃度において１４，０００ｃｐｓ未満の粘度）を有する実質的に透明なＬＧＳを呈する。他の実施形態では、この実質的に透明なＬＧＳは、８０°Ｆおよび７７％の乾燥固形分濃度において測定した場合、１００００ｃｐｓ未満、９０００ｃｐｓ未満、８０００ｃｐｓ未満、７０００ｃｐｓ未満、６０００ｃｐｓ未満、５０００ｃｐｓ未満または４，０００ｃｐｓ未満の粘度を呈する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、用いられるアルテルナンスクラーゼ酵素は、ＵＳ６，５７０，０６５に記載される組換え法のような組換え法によって製造され得る。さらなる実施形態では、この組換え酵素は、全長酵素「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｎａｎｓｕｃｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＮＮＲＬ  Ｂ−１３５５：ｒａｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｒａｎｄｏｍ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｇｌｕｃａｎｓｕｃｒａｓｅ」、Ｇｉｌｌｅｓ  Ｊｏｕｃｌａ，Ｄｏｃｔｒｏａｌ  Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｉｎｇｅｎｉｅｒ  ＩＮＳＡ，Ｔｏｕｌｏｕｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ，２００３と比較した場合に、小さいかまたは短縮化されている。
【０００９】
別の局面では、本発明は、食品または飲料を製造する方法を提供し、この方法は、１以上の成分を、実質的に透明なシロップと混合する工程を包含し、この実質的に透明なシロップは、４５℃よりも高い温度において、少なくとも４０％  ｗ／ｗの濃度の１以上の基質を少なくともアルテルナンスクラーゼ酵素と接触させることにより製造される。
【００１０】
本発明のこれらおよび他の目的および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から当業者に明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（詳細な説明）
（Ｉ．シロップの製造方法）
本明細書中に記載の実質的に透明なＬＧＳは、種々の物理的特徴を呈する。より詳細には、アルテルナンオリゴ糖は、１以上のアルテルナンスクラーゼ酵素と反応させる、アクセプターおよびスクロースから製造され得る。アルテルナンスクラーゼ酵素は、グルコース単位をスクロースからアクセプター糖質へと転移し、そしてフルクトースおよび種々の長さのグルコースオリゴ糖を放出する。得られる産物は、コーンシロップの甘味度と類似したレベルの甘味度、ならびにコーンシロップの口当たりおよび官能性と類似した口当たりおよび官能性を有し得る。さらに、そして本方法に関してより顕著には、得られる産物は、いくつかの実施形態において、酵素と反応していない基質（スクロースおよびアクセプター）の組合せと比較して、より低い血糖上昇指数を有することにより特徴付けられ得る。これらのシロップは、実質的に透明な低血糖上昇シロップ（ＬＧＳ）といわれる。
【００１２】
アクセプターは、グルコース単位をスクロースから受容し得る遊離ヒドロキシル基を１以上の炭素位置（２位、３位、および６位）に有する、糖または糖アルコールからなる群より選択され得る。このアクセプターは、シロップまたはシロップ固形分の形態であり得る。本明細書中での使用に適切なシロップまたはシロップ固形分の例示は、マルトース、マルトトリオース、パノース、高マルトース（４０％超）コーンシロップ、中程度から低いＤＥ（デキストロース当量）のコーンシロップ、ラフィノース、セロビオース、マルチトール、マルトトリオース、マルトテトロース、グルコース、イソマルトース、イソマルチトール、大麦シロップおよび大麦シロップ固形分、コメシロップおよびコメシロップ固形分、ラクトース、ホエー透過物、タピオカ澱粉シロップおよびタピオカ澱粉シロップ固形分、ニゲロース、コウジビオース、イソマルトオリゴ糖、水素添加澱粉シロップ、馬鈴薯澱粉シロップおよび馬鈴薯澱粉シロップ固形分、コーンシロップおよびコーンシロップ固形分などである。ブレンドにおいて使用するために適切であるシロップの例示は、Ｃａｒｇｉｌｌ，Ｉｎｃ．から入手可能なＳＡＴＩＮＳＷＥＥＴＴＭであるがこれに限定されない。ＳＡＴＩＮＳＷＥＥＴＴＭは、最少５５〜７０重量％のマルトースおよび４５〜３０重量％のグルコースおよび他のグルコース含有オリゴマーを含む。１つの実施形態では、使用されるシロップまたはシロップ固形分は、約２重量％〜約９９重量％の量のマルトースを含む。
【００１３】
ＬＧＳを生成するための反応において用いられ得るアルテルナンスクラーゼ酵素としては、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ（ＬＭ）のＮＲＲＬ  Ｂ  １３５５株、ＮＲＲＬ  Ｂ  ２３１８５株、ＮＲＲＬ  Ｂ  ２３１８６株、ＮＲＲＬ  Ｂ  ２３１８８株、ＮＲＲＬ  Ｂ  ２３３１１株、ＮＲＲＬ  Ｂ  ２１２９７株、ＮＲＲＬ  Ｂ  ３０８２１株、ＮＲＲＬ  Ｂ  ３０８９４株および本明細書中に提供される他の酵素が挙げられるがこれらに限定されない。これらの酵素は、例えば、Ｇｉｌｌｅｓ  Ｊｏｕｃｌａ，Ｄｏｃｔｒｏａｌ  Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｉｎｇｅｎｉｅｒ  ＩＮＳＡ，Ｔｏｕｌｏｕｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ，２００３に記載されるように、さらにクローニングされてもよく、そして組換えによって発現されてもよい。これらの株は培養され得、そしてこれらの酵素は、以下に提供される方法のような当該分野で任意の方法を用いて単離され得る。
【００１４】
製造されるシロップの物理的特徴は、異なる反応条件を用いて変更され得る。例えば、実質的に透明なＬＧＳは、反応液中で１以上のアルテルナンスクラーゼ酵素を比較的高濃度のスクロースおよびアクセプターと反応させることによって製造され得る。さらに、この反応の効率は、４５℃よりも高い温度において反応させることにより向上され得る。このことにより、反応の完了（残存基質が総糖質ｗ／ｗ基準で２％未満であるとき）を達成するために、より少ない酵素が必要とされることが可能になり、この反応は、より短い期間で完了され得る。例えば、この反応は、４５℃よりも高い温度において、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７時間よりも短い時間または２０時間未満の時間にわたって実施され得る。この上昇した温度はまた、いくつかの実施形態では、微生物汚染の危険性を低下させ得る。
【００１５】
ＬＧＳの特徴は、スクロースのアクセプターに対する比率を制御することにより変更され得る。一般に、実質的に透明なＬＧＳの血糖上昇指数は、スクロースのアクセプターに対する比率が約１２：１という比率まで増大するにつれて減少する。例えば、１：１（スクロース：アクセプター）の比率を用いて製造された産物は、４：１（スクロース：アクセプター）の比率を用いて製造される産物の血糖上昇指数よりも高い血糖上昇指数を有することが予測される。いくつかの実施形態では、約８：１〜約１１：１の比率が用いられる。他の実施形態では、この方法は、少なくとも４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１および１０：１というスクロース：アクセプターの比率を用いてＬＧＳを製造する工程を包含する。従って、本発明はまた、このような方法によって製造される食品および飲料の製品を提供する。
【００１６】
ＬＧＳはまた、グルコースオリゴ糖中のグルコース分子間の結合によって特徴付けられ得る。いくつかの実施形態では、このグルコースオリゴ糖は、α１，３結合およびα１，６結合の両方を有する。いくつかの実施形態では、このグルコースオリゴ糖はまた、α１，４結合のような他の結合を含む。いくつかの実施形態では、ＬＧＳは、少なくとも２０％のα１，３結合を有する。他の実施形態では、ＬＧＳは、少なくとも２０％のα１，３結合および少なくとも２０％のα１，６結合を有する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、実質的に透明なＬＧＳは、その後、フルクトースの一部または全てを除去するために加工され、それにより、フルクトースが減少したＬＧＳが得られる。フルクトースは、当該分野で公知の任意の方法を用いて（例えば、カラムクロマトグラフィーを用いて）ＬＧＳから除去され得る。一般に、ＬＧＳは、５０％未満のフルクトースを含む。実質的に透明なＬＧＳおよび／またはフルクトースが減少したＬＧＳは、さらに水素添加されて、非還元性シロップが製造され得る。
【００１８】
他の実施形態では、緩徐にではあるが完全に消化性の糖質であり、このことにより、腸の不快感も副作用も伴うことなく、ＬＧＳを、低血糖上昇応答および持続エネルギーを提供する独特の甘味料とする、重合度７〜１２のオリゴアルテルナン（ｏｌｉｇｏａｌｔｅｒａｎ）が提供される。ＮＲＲＬ  Ｂ  ３０８２１株およびＮＲＲＬ  Ｂ  ３０８９４株は、化学的変異誘発によって生成された、ＮＲＲＬ  Ｂ  ２１２９７株（Ｌｅａｔｈｅｒｓら，１９９７）の構成的変異体である。それゆえ、ＮＲＲＬ  Ｂ  ３０８２１株においては、アルテルナンスクラーゼの最大産生を誘導するために、スクロースはもはや必要ではない。
【００１９】
（ＩＩ  実質的に透明な低血糖上昇シロップ（ＬＧＳ）を含む、生成物およびブレンド）
本明細書中で記載される実質的に透明なＬＧＳは、種々の他の成分のうちの１つ以上とブレンドされ得、そして配合者（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒ）にブレンドとして販売されてもよく、またはブレンドのための成分は、配合者に別々に提供されて配合者が最終食品製品を製造する間にこれらをブレンドしてもよい。実質的に透明なＬＧＳは、１以上の他の成分（例えば、ビタミン、ミネラル、糖アルコール、高甘味度甘味料（ｈｉｇｈ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｓｗｅｅｔｅｎｅｒ）、香料、風味相乗剤、および他の従来の甘味料）とブレンドされて、所望の栄養的影響ならびに所望の風味を提供し得る。実質的に透明なＬＧＳとのブレンドの作製は、最終製品の均質性を改善すると予想される。
【００２０】
実質的に透明なＬＧＳとブレンドされ得るビタミンとしては、身体の正常な代謝、増殖および発達に必須である、タンパク質、糖質、脂肪、ミネラルおよび有機塩以外の任意の有機物質が挙げられる。ビタミンとしては、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＩ、ビオチン、コリン、葉酸、およびニコチン酸のような化合物が挙げられる。
【００２１】
実質的に透明なＬＧＳとブレンドされ得るミネラル化合物としては、身体の無機構成成分を構成する、無機元素の無機化合物が挙げられる。ミネラル塩および水は、身体から毎日排出されるので、補給される必要がある。これらは、食品または補助食品の摂取を通して補充されなければならない。ミネラルの例としては、Ｃａ、Ｆｅ、Ｐ、Ｎａ、Ｃｕ、ＫおよびＭｇが挙げられる。
【００２２】
香料および／または風味相乗剤もまたＬＧＳとブレンドされ得る。例えば、ジヒドロキシ安息香酸（全ての異性体を含め、ＤＨＢ）および香料（例えば、ペパーミント、ココアおよびバニラ）である。
【００２３】
糖アルコールはＬＧＳとブレンドされ得、そして特定の食品製品に甘味を付与するために用いられ得、そして多くの例では、糖アルコールは、従来の甘味料と比較した場合、製品のカロリー含量にはそれほど大きくは寄与しない。糖アルコールは、ケトン糖またはヘキソース糖におけるヒドロキシル基の存在によって特徴付けられる。本明細書中に記載されるＬＧＳ甘味料とブレンドされ得る糖アルコールの例としては、ソルビトール、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、キシリトール、ラクチトール、マルチトール、イソマルト（ｉｓｏｍａｌｔ）、水素添加澱粉加水分解物、およびエリスリトールが挙げられる。
【００２４】
本明細書中に開示されるＬＧＳはまた、高甘味度甘味料とブレンドされ得る。高甘味度甘味料は、非常に低い濃度で甘味強度を示す物質である。本明細書中に記載されるＬＧＳ組成物とブレンドされ得る高甘味度甘味料の例としては、サッカリン、シクラメート、アスペルテーム、モナチン（ｍｏｎａｔｉｎ）、アリテーム（ａｌｉｔａｍｅ）、アセスルファムカリウム、スクラロース、ソーマチン、ステビオシド、およびグリシルリチン（ｇｌｙｃｙｎｈｉｚｉｎ）が挙げられる。
【００２５】
実質的に透明なＬＧＳを用いて製造され得る用途および製品のさらなる例は、本明細書中に参考として援用されるＷＯ２００４０２３８９４Ａ１およびＷＯ２００５０８９４８３Ａ２に含まれる。
【００２６】
以下の実施例は特定の実施形態を提供し、当業者は、これらの実施例が例示の目的のためにのみ与えられており、特許請求の範囲を限定するとは決して解釈すべきでないことを認識している。
【実施例】
【００２７】
（実施例１：酵素溶液を製造する方法）
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  Ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＮＲＲＬ  Ｂ  ３０８２１またはＮＲＲＬ  Ｂ  ３０８９４を、種々の供給源からの１０ｇ／Ｌ酵素抽出物、５ｇ／Ｌリン酸カリウム、０．２ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム（七水和物）、０．１ｇ／Ｌ硫酸マンガン（一水和物）、０．０２ｇ／Ｌ塩化カルシウム、０．０１ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、０．０１ｇ／Ｌ硫酸鉄（ＩＩ）七水和物および２０〜４０ｇ／Ｌグルコースを含む培地において増殖させることにより、酵素調製物を作製した。Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  Ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＮＲＲＬ  Ｂ  ２１２９７培養物を、２％スクロースおよび２％高マルトースコーンシロップ（６５％マルトース）を炭素源として含むこと以外は同じ培地において増殖させた。培養物を、炭水化物が消費されるまで、２７℃〜３０℃にて、かつ（１０％  ＮａＯＨを用いて）ｐＨを６．０に制御して増殖させた。一旦炭素源が枯渇したら４℃にて３０分間、１２，２００×ｇでの遠心分離によって細胞を除去した。清澄にした培養上清を、５０，０００分子量カットオフ（５０ｋＤ  ＭＷＣＯ）メンブレンを通した限外ろ過によって濃縮して、体積あたり１０倍の酵素濃縮物を得た。ＮＲＲＬ  Ｂ  ３０８２１株およびＮＲＲＬ  Ｂ  ３０８９４株は両方とも、化学的変異誘発によってＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  Ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＮＲＲＬ  Ｂ  ２１２９７から誘導された。これらの株は両方とも、グルコース培地において増殖された場合にアルテルナンスクラーゼを構成的に発現する。
【００２８】
（実施例２：消化性を決定するためのアッセイ）
得られるシロップの消化性を、インビトロ消化アッセイによって決定した。２ｍＬの８％試験シロップを１０μＬのグルコアミラーゼ（Ｏｐｔｉｄｅｘ  Ｌ−４００、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）および２ｍＬの０．０１９Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ＝４．５）と混合し、そして６０℃にて１６〜２０時間インキュベートした。消化後、２ｍＬのシロップを取り出し、そして２ｍＬの０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．５）、０．１ｍＬの１％  ＮａＮ３、および０．１ｇのラット腸粉末（カタログ番号Ｉ−１６３０，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）と混合し、そして３７℃にて２４時間までインキュベートした。各時点で０．５ｍＬの混合物を１ｍＬの１．２Ｎ  ＨＣｌと混合してさらなる反応を停止させた。グルコアミラーゼおよびラット腸酵素での加水分解によるグルコース放出の量を、Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））を用い、０．６ｍｌ／分にて６０℃の０．０１Ｎ（規定）硫酸を移動相として用いたＨＰＬＣにより決定した。消化性を、総グルコオリゴ糖から放出されたグルコースの％として表した。消化性を以下の式によって計算する：
理論的グルコース放出％＝［グルコース］／［フルクトース］×０．４５／０．５５×１００
あるいは、最初のグルコアミラーゼ処理工程を省略し得る。
【００２９】
（実施例３：酵素アッセイおよび単位の定義）
２．５ｍＬの４０％（ｗ／ｖ）のスクロース：マルトース（９：１の比率）および０．１ｍｌの１．５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に、０．１ｍＬ〜２．４ｍＬの濃縮酵素を添加した。この体積をナノピュア水で５．０ｍｌにし、そして反応物を３７℃にてインキュベートした。１時間後、０．５ｍＬの各反応物を９０℃〜１００℃の水浴中に５分間配置した。短時間の冷却時間後、１．０ｍＬのナノピュア水を０．５ｍＬのサンプルに添加し、そして０．０５〜０．１ｇのイオン交換混合物（Ｄｏｗｅｘ  ６６およびＤｏｗｅｘ  ８８（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）からなる）を添加した。このサンプルを２〜３分間倒置し、そして０．４５μｍのナイロンフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ）を通して濾過してＨＰＬＣバイアルに入れた。サンプルを、０．９ｍＬ／分において移動相として水を用い、８５℃においてＨＰＸ−８７Ｃ糖質カラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を通してＨＰＬＣに流した。計算は、糖の合計面積に対するフルクトースの面積パーセントに基づいた。計算は以下のとおりである：
フルクトースパーセント×５ｍＬ反応物中の１ｇ総糖／１時間／使用した酵素ブロスの体積＝フルクトースのｇ／時間／ｍＬの活性。
【００３０】
次いで、値を、フルクトースの式量およびメートル変換を用いてμモル／分／ｍｌに変換した。１単位を、３７℃において１分間当たりフルクトース１μｍｏｌの放出と定義し、そして値をＵ／ｍＬで報告する。
【００３１】
（実施例４：低血糖上昇シロップの糖プロフィール分析）
低血糖上昇シロップのオリゴ糖プロフィールを、以下に記載のとおり、ＨＰＬＣ法により分析する。低血糖上昇シロップのサンプルを脱イオン水で希釈して５％〜１０％の乾燥固形分にし、イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ  ６６／Ｄｏｗｅｘ  ８８，Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）で脱灰（ｄｅ−ａｓｈ）し、そして０．４５ミクロンのフィルターを通して濾過し、その後、糖分析のためにＨＰＬＣに注入する。オリゴ糖分離を、屈折率検出器を備えた、６５℃の一続きの２つのＢｉｏＲａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−４２Ａ，３００−７．８ｍｍカラム（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて達成する。水を、０．２ｍｌ／分の流量において溶離液として用いる。代表的な低血糖上昇シロップサンプル（ＰＤＦ８）のクロマトグラムを図１に示す。このクロマトグラムに示される連続したピークは、漸増する重合度（ＤＰ）のオリゴマーに帰属される。例えば、ＤＰ３はトリサッカリドであり、ＤＰ４はテトラサッカリドである。
【００３２】
はるかに左側の、最短の時間で溶出するピークは、少なくとも２５０，０００の分子量を有するポリマーピークに帰属される。
【００３３】
（実施例５：高温での特に透明なシロップへのスクロース／マルトース基質（スクロース：マルトース比率＝９：１）の酵素的変換）
低い消化性および低い粘度を有する実質的に透明なＬＧＳは、４５℃よりも高い温度において作製され得る。上昇した温度においては、糖基質を透明なシロップへと変換する速度が大いに増大する。高温での反応速度の上昇に起因して、酵素の使用、変換時間の長さおよび加工中の微生物汚染の危険性が大いに低減される。これは、商業的製造においては特に重要なことであり、実質的に透明なＬＧＳの製造に関して経済的利点を提供する。
【００３４】
酵素調製物を、実施例１に記載のとおり、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  Ｍｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＮＲＲＬ  Ｂ  ３０８２１から得た。この酵素調製物は、実施例３における定義において９２．５単位／ｍＬの活性を有していた。この酵素調製物および水の比重を１ｇ／ｍＬとみなした。結晶スクロースおよびマルトース（両方ともＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した）を、乾燥重量基準で９：１のスクロース：マルトースの比率において乾式混合し、そしてコーヒー粉砕機で粉砕して均質な粉末基質混合物を得た。この粉末基質混合物を本明細書の以下では基質という。この糖基質を脱イオン水に溶解して、５０ｍＬのキャップしたポリプロピレン試験チューブにおいて、酵素調製物の添加を含め、最終濃度を２０重量％、３０重量％、４０重量％および５０重量％にした。０．１７ｍＬの酵素調製物のアリコートを各試験チューブに添加して、種々の酵素用量を得た（表１）。基質、水および酵素の合計重量は各試験チューブおいて８．５０ｇであった。これらの試験チューブを、３７℃に設定した水浴、４５℃に設定した水浴、５０℃に設定した水浴および５５℃に設定した水浴中に３０分間配置して、基質溶液をそれぞれの温度につき平衡化した後で酵素を添加した。
【００３５】
【表１】
2008529534.tif 000002
酵素調製物の添加後、試験チューブを、３７℃、４５℃、５０℃および５５℃のそれらのそれぞれの水浴に戻して配置した。２０時間のインキュベーション後、少量のサンプルを各試験チューブから取り出した。基質の面積パーセントを糖面積の合計に対して計算したこと以外は、サンプル中の残りの基質を実施例３に記載のとおりにＨＰＬＣによって分析した。２０時間の反応中の平均反応速度を酵素１単位あたりの減少した基質のμｍｏｌ（μｍｏｌ基質／時間／単位）として計算した。
【００３６】
以下の表２は、反応の結果を提供し、そしてより高温およびより高い基質濃度での反応がより高い基質変換およびより速い反応速度を示すことを示す。その結果、高温および高基質濃度においては、より少ない時間で反応を完了するために、より低い基質濃度およびより低い温度と比較して、より少ない酵素が必要とされることを当業者は認識する。例えば、９７％の基質利用は、２０時間以内での６．１７Ｕ／ｇの酵素を用いた３０％の濃度、３７℃において９８％の基質減少と比較して、３．７Ｕ／ｇの酵素を用いて５０％の基質濃度および５０℃において達成され、９８％の基質の完了は、４．６３Ｕ／ｇの酵素を用いて４０％の濃度にて４５℃において達成された。３７℃において２０％の濃度の反応を完了するためには、９．２５Ｕ／ｇの酵素を必要とした。産業的な操作の観点から見て、高い基質濃度での反応はまた、水およびエネルギーの使用の低減という利点を提供する。
【００３７】
この実験から、当業者はまた、遅い反応速度に起因して、高い基質濃度でかつ低い温度（例えば、３７℃）において反応を完了するためにははるかに長い時間が必要であることを理解する。
【００３８】
【表２】
2008529534.tif 000003
（実施例５：高温で製造された透明なシロップの化学的特性および物理的特性）
酵素調製物を、実施例１に記載のとおり、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  Ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＮＲＲＬ  Ｂ  ３０８２１から得た。この酵素調製物は、実施例３における定義において９２．５単位／ｍＬの活性を有した。この酵素調製物および水の比重を１ｇ／ｍＬとみなした。結晶スクロースおよびマルトース（両方ともＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した）を、乾燥重量基準で９：１のスクロース：マルトースの比率において乾式混合し、そしてコーヒー粉砕機で粉砕して均質な粉末基質混合物を得た。この粉末基質混合物を本明細書の以下では基質という。この糖基質を脱イオン水に溶解して、５０ｍＬのキャップしたポリプロピレン試験チューブにおいて、酵素調製物の添加を含め、最終濃度を５０重量％および６０重量％にした。酵素調製物のアリコートを各試験チューブに添加して、２Ｕ／ｇ、５Ｕ／ｇおよび８Ｕ／ｇの最終酵素用量を得た。基質、水および酵素の合計重量は各試験チューブおいて２０ｇであった。これらの試験チューブを５０℃に設定した水浴中に３０分間配置して、基質溶液をそれぞれの温度につき平衡化した後で酵素を添加した。５０℃にて４８時間後、サンプルを、実施例３に記載の二重Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−４２Ａ  ＨＰＬＣカラムを用いて、それらの糖組成について分析した。これらのサンプルの消化性を、実施例２に記載の方法によって決定した。
【００３９】
一般に、高温かつ高基質濃度において製造されたシロップは、より少ないポリマーおよびより多くのロイクロース（ｌｅｕｃｒｏｓｅ）を含んでいるが、類似の量のグルコオリゴ糖を含んでいた（表３）。インビトロでの消化速度はオリゴ糖の含有量に大いに起因し得るので、高温かつ高基質濃度において製造されたシロップは、低温かつ低基質濃度でのインビトロ消化性と類似のインビトロ消化性を示した。インビトロ消化速度の結果は、試験したサンプル間で類似の消化速度を示した。同じ消化条件下では、マルトースまたはマルトオリゴ糖は、８時間以内に１００％消化される（データは示さず）。
【００４０】
【表３】
2008529534.tif 000004
（実施例６：高温で製造されたシロップの清澄性）
低減したポリマー濃度に起因して、高温で製造されたシロップは、別の重要な特徴を示した。すなわち、これらは透明である。
【００４１】
Ｓａｖａｇｅ（ＭＮ，ＵＳＡ）のＣａｒｇｉｌｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ、において、２０％（ｗ／ｗ）基質濃度でかつ３７℃において製造されたシロップサンプル（ＰＤＦ０３、ＰＤＦ０４、ＰＤＦ０６、ＰＤＦ０８およびＰＤＦ１０）を、５０％（ｗ／ｗ）基質濃度でかつ５０℃において製造されたシロップサンプルと比較した。アルテルナンポリマーを除去するために限外ろ過（５０ｋＤ  ＭＷＣＯ）によってＰＤＦ７０から製造されたサンプルもまた比較に含めた。全てのサンプルを、約８０％の乾燥固形分から、脱イオン水により５０％、４０％、３０％、２０％、１０％および５％の乾燥固形分に希釈し、そして１ｃｍのセルを用い、分光光度計（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ，Ｍｏｄｅｌ  ８４５３）を６５０ｎｍにて用いて、光透過率を測定した。試験サンプルの透過率を測定する前に、分光光度計を脱イオン水で較正した。表４に示すとおり、２０％の基質濃度でかつ３７℃において製造された全てのサンプル（ポリマーを限外濾過によって除去したＰＤＦ０７を除く）は、９６．１％未満の光透過率を有し、４０％以下の乾燥固形分濃度において不透明に見えた。逆に、高温において製造したサンプルは、全ての濃度範囲（０．５％の乾燥固形分から８５％の乾燥固形分まで）において、ポリマーを限外ろ過によって除去したサンプルと同程度に透明であった。
【００４２】
【表４】
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（実施例７：高温においてＮＲＲＬ  Ｂ  ３０８９４を用いて製造されたシロップ）
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  Ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＮＲＲＬ  Ｂ  ３０８２１株おいびＮＲＲＬ  Ｂ  ３０８９４株からの酵素調製を実施例１に従って行った。シロップのバッチＰＤＦ１２を、３Ｕｇ基質の酵素（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  Ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＮＲＲＬ  Ｂ  ３０８９４株）を５０℃および５０％総糖（スクロース対マルトースの比率は９）において用いて製造した。シロップのバッチＰＤＦ６およびＰＤＦ７を、３７℃でかつ２０％総糖（スクロース対マルトースの比率は９）において６Ｕ／ｇ基質の用量のＮＲＲＬ  Ｂ  ３０８２１酵素を用いて製造した。消化アッセイを、グルコアミラーゼ前処理工程を用いずに実施例２に記載のとおりに行った。粘度の測定を、２つの異なるロットのシロップを７７％の乾燥固形分で用い、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  ＤＶ−Ｅ  Ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｄｄｌｅｂｏｒｏ，ＭＡ）を用いて、種々の温度において行った。
【００４３】
シロップのバッチＰＤＦ６およびＰＤＦ７は不透明であり、シロップのバッチＰＤＦ１２は透明なシロップであった。低温（ＰＤＦ７）および高温（ＰＤＦ１２）において製造した２種類のシロップの糖プロフィールを表６に示す。表６においては、シロップＰＤＦ１２にはポリマーが存在しないことが示された。透明なシロップは、同じ乾燥固形分レベルの不透明なシロップと比較して有意に低い粘度を有した（表７）。そして透明なシロップは、不透明なシロップと類似の速度においてラット腸粉末によって消化される（表８）。
【００４４】
【表６】
2008529534.tif 000006
【００４５】
【表７】
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【００４６】
【表８】
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（実施例８：種々のＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ株由来の酵素調製物を用いて高温において製造された透明なシロップ）
酵素調製物を、実施例１において記載される方法を用いて３つの異なるＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ株から得た。合計３ｋｇの糖基質（スクロース：マルトース＝９：１）を水道用水に溶解して、酵素添加を含め、５０％乾燥固形分ｗ／ｗまたは５２％乾燥固形分ｗ／ｗの最終濃度にした。反応を、５０℃または５２℃にて実施した（以下の表９）。アリコートを各反応の最後に取り出し、そしてそれらの糖プロフィールおよびインビトロ消化性を記載のとおりに決定した。
【００４７】
表９に示すとおり、全ての酵素調製物は反応を完了した。得られるしるっぷは、類似の化学組成およびインビトロ消化速度を示した。
【００４８】
【表９】
2008529534.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】代表的な低血糖上昇シロップサンプル（ＰＤＦ８）のクロマトグラムを図１に示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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