(57)【要約】本開示は、正常レベルのＣＤ５６および抑制されたレベルのデスミンを発現する、分化コンピテントな筋芽細胞が豊富な骨格筋細胞（ＳｋＭＣ）を増殖させる方法を提供する。本方法は、ＴＧＦ−βを添加したマイトジェンリッチな細胞培養培地でＳｋＭＣを培養する工程を包含する。本開示はまた、ＴＧＦ−β中で増殖させたＳｋＭＣを利用する治療方法、例えば自己由来または同種ＳｋＭＣの移植によって心筋梗塞を処置する方法を提供する。本発明は、骨格筋細胞（ＳｋＭＣ）培養物の増殖中に、筋芽細胞の増殖を維持しながら、筋芽細胞の筋細胞への分化を可逆的に抑制する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
成人の哺乳動物骨格筋細胞を増殖させる方法であって、該方法は、
筋芽細胞分化を可逆的に抑制するのに有効な量のＴＧＦ−βが補充されたマイトジェンリッチな細胞培養培地において、該細胞を培養する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記骨格筋細胞が、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞培養培地が、少なくとも５％の血清を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＴＧＦ−βが、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３、もしくはこれらのヘテロダイマーのうちの１つであるか、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記有効な量のＴＧＦ−βが、０．０１ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記骨格筋細胞が、初代細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記骨格筋細胞が、継代されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記骨格筋細胞が、ＴＧＦ−βの存在下において少なくとも１２時間培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記骨格筋細胞が、継代または収集の前に３０％コンフルエントを超えるまで増殖する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記骨格筋細胞が、０．１×１０５細胞／ｃｍ２を超える細胞密度まで増殖する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
骨格筋細胞によるクレアチンキナーゼの発現が、ＴＧＦ−βの補充なしで増殖させたコントロール培養物と比較して少なくとも２０％まで減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＣＤ５６陽性筋芽細胞によるデスミンの発現が、ＴＧＦ−βの補充なしで増殖させたＣＤ５６陽性筋芽細胞と比較して少なくとも２０％まで減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
骨格筋細胞によるクレアチンキナーゼの発現が、ＴＧＦ−βを添加する前の同じ骨格筋細胞の培養物と比較して少なくとも２０％まで減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ＣＤ５６陽性筋芽細胞によるデスミンの発現が、ＴＧＦ−βを添加する前の同じ骨格筋細胞の培養物におけるＣＤ５６陽性の筋芽細胞と比較して少なくとも２０％まで減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法によって作製される、細胞。
【請求項１６】
心筋梗塞を処置する方法であって、該方法は、
請求項１５に記載の細胞を梗塞性心筋層に移植する工程
を包含する、方法。
【請求項１７】
前記細胞が、自己由来または同種異系である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
正常レベルのＣＤ５６および低下したレベルのデスミンを発現する培養骨格筋細胞であって、ここでデスミン発現は、初代培養物におけるよりも少なくとも２０％低い、培養骨格筋細胞。
【請求項１９】
正常レベルのＣＤ５６および低下したレベルのデスミンを発現する培養骨格筋細胞であって、ここでデスミン発現は、ＴＧＦ−βなしで増殖させたコントロール培養物におけるよりも少なくとも２０％低い、培養骨格筋細胞。
【請求項２０】
正常レベルのＣＤ５６および低下した発現レベルのデスミンを発現する培養骨格筋細胞であって、ここでデスミン発現は、ＴＧＦ−βを添加する前の培養物におけるよりも少なくとも２０％低い、培養骨格筋細胞。
【請求項２１】
心筋梗塞を処置する方法であって、該方法は、
請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の細胞を梗塞性心筋層に移植する工程
を包含する、方法。
【請求項２２】
前記細胞が、自己由来または同種異系である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
骨格筋細胞培養物において筋芽細胞の分化状態を評価するための方法であって、該方法は、
該骨格筋細胞培養物中のＣＤ５６陽性細胞の集団によって発現されるデスミンの量を決定する工程
を包含し、該デスミンの閾値レベルより低い量は、該ＳｋＭＣ培養物中の未分化筋芽細胞の存在を示す、方法。
【請求項２４】
前記デスミンの量が、蛍光活性化細胞分離を用いて決定される、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国出願番号第６０／５０２，７６２号（２００３年１１月１７日出願）に対する優先権を主張し、米国出願番号第６０／５０２，７６２号は、本明細書においてその全体が参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、骨格筋由来細胞、および特に損傷した心臓組織への移植を意図する細胞を増殖させる方法に関連する。本発明はさらに、ＴＧＦ−βを含む細胞培養培地組成物に関連する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ほとんどが心筋の機能不全のためである心不全は、医学的および外科的進歩にも関わらず、よくある、そして生命を脅かす状態である。心筋梗塞によって起こる心機能の悪化を軽減するための、自己由来ヒト骨格筋細胞（ＨｕＳｋＭＣ）の治療的適用が、いくつかの前臨床および臨床研究において有望であった（例えば、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２を参照のこと）。これらの研究において、骨格筋生検から得られた骨格筋細胞（ＳｋＭＣ）を、インビトロで増殖させ、そして続いて損傷した心臓組織に注入する。より多い数の注入されたＳｋＭＣ（７×１０５から７×１０６細胞）および改善した心機能の間の相関が、ラット梗塞モデルにおいて確立された（非特許文献１３）。ラットおよびヒト心臓の相対的重量に基づいて、１０９程度の数のＨｕＳｋＭＣが、ヒト患者における治療的有効性のために必要であり得る。このために、生検から入手可能な細胞の数は一般的に限られているので、ＨｕＳｋＭＣを、いくつかの継代の間増殖させる必要があり得る。難題は、多数の細胞を一貫して産生することだけでなく、培養中の細胞のアイデンティティーおよび分化状態を信頼性高く特徴づけすることでもある。
【０００４】
骨格筋は衛星細胞を含み、それは成熟筋線維の基底膜および筋線維鞘の間に存在する、休止した筋芽細胞前駆体である（非特許文献１４）。成長している、または損傷した筋肉において、衛星細胞は活性化されて増殖する筋芽細胞となり、それは最終的に成熟筋線維へと分化をうける（非特許文献１５）。細胞培養において、衛星細胞の活性化およびその筋芽細胞としての増殖を、骨格筋における細胞の酵素的解離およびマイトジェンリッチな培地における培養によって達成し得る（非特許文献１４、前出）。
【０００５】
非筋芽細胞系統の細胞、主に線維芽細胞も、酵素的解離時の筋肉組織から放出される。線維芽細胞は、筋芽細胞と同時増殖し、そして潜在的に培養の優位を占め得る。筋芽細胞の成熟筋細胞への分化は、その増殖の中止を伴い（非特許文献１６）、それが今度は連続的に増殖させたＨｕＳｋＭＣ培養物において線維芽細胞の過剰増殖を可能にする。データは、損傷した心臓組織への移植後に心収縮に寄与するのは骨格筋由来培養物の筋芽細胞であることを示唆するので（例えば、非特許文献１７を参照のこと）、ＨｕＳｋＭＣの増殖における１つの目標は、線維芽細胞の存在を最小限にすることである。
【０００６】
筋芽細胞の分化は、典型的には培地中の血清および他のマイトジェンの抑制によって誘導される（非特許文献１４、前出）が、マイトジェンリッチな培養においてさえも、特に高い細胞密度において、自然発生的な分化がいくらか起こる。従って、ＨｕＳｋＭＣの増殖における別の目的は、筋芽細胞を増殖状態に維持しながら分化を抑制することである。
【０００７】
正常および形質転換した組織において見出される増殖因子である、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）は、研究下にある生物学的システムに依存して、筋芽細胞の分化を抑制または誘導することが報告されている。例えば、ＴＧＦ−βは、多くのシステムにおいて、主に確立されたクローン細胞系統または胚由来の筋芽細胞に対して行われた研究において、筋芽細胞の分化を抑制することが報告された（非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１；および非特許文献２２）。これらの発見と対照的に、他の研究者は、低い細胞密度の条件下で（非特許文献２３）、血清を含まない培地において（非特許文献２４）、およびＬ６Ｅ９筋芽細胞系統を培養するために使用したマイトジェンリッチな培地において（非特許文献２５）、ＴＧＦ−βは筋芽細胞の分化を刺激することを報告した。
【０００８】
ＴＧＦ−βの３つの哺乳動物アイソフォーム（ＴＧＦ−β１、−β２、および−β３）は、一般的にインビトロにおいて細胞に対して同様の効果を有するが、インビボにおいては区別できる生物学的役割を有しているようである（非特許文献２６）。発達している、および再生している筋肉におけるＴＧＦ−βアイソフォームの時間的および空間的分布は、他の証拠と共に、インビボにおいて筋芽細胞の融合を媒介することによる、筋芽細胞分化におけるＴＧＦ−β２を意味づける（非特許文献２６、前出）。
【非特許文献１】Ａｔｋｉｎｓら「Ｈｅａｒｔ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．」、１９９９年、第１８巻：１１７３−１１８０
【非特許文献２】Ｈｕｔｃｈｅｓｏｎら「Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．」、２０００年、第９巻：３５９−３６８
【非特許文献３】Ｐｏｕｚｅｔら「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」、２００１年、第１０２巻：２１０−２１５
【非特許文献４】Ｓｃｏｒｓｉｎら「Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．」、２０００年、第１１９巻：１１６９−１１７５
【非特許文献５】Ｊａｉｎら「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」、２００１年、第１０３巻：１９２０−１９２７
【非特許文献６】Ｇｈｏｓｔｉｎｅら「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」、２００２年、第１０６巻（補遺）：Ｉ−１３１−Ｉ−１３６
【非特許文献７】Ｔｈｏｍｐｓｏｎら「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」、２００３年、第１０８巻（補遺）：ＩＩ−２６４−ＩＩ−２７１
【非特許文献８】Ｍｅｎａｓｃｈｅら「Ｌａｎｃｅｔ」、２００１年、第３５７巻：２７９−２８０
【非特許文献９】Ｍｅｎａｓｃｈｅ「Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．」、２００３年、第５８巻：３５１−３５７
【非特許文献１０】Ｍｅｎａｓｃｈｅら「Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．」、２００３年、第４１巻：１０７８−１０８３
【非特許文献１１】Ｈａｇｅｇｅら「Ｌａｎｃｅｔ」、２００３年、第３６１巻：４９１−４９２
【非特許文献１２】Ｐａｇａｎｉら「Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．」、２００３年、第４１巻：８７９−８８８
【非特許文献１３】Ｐｏｕｚｅｔら「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」、２００１年、第１０４巻：１２２３−１２２８
【非特許文献１４】Ａｌｌｅｎら「Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．」、１９９７年、第５２巻：１５５−１７６
【非特許文献１５】Ｃａｍｐｉｏｎ「Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．」、１９８４年、第８７巻：２２５−２５１
【非特許文献１６】Ｎａｄａｌ−Ｇｉｎａｒｄら「Ｃｅｌｌ」、１９７８年、第１５巻：８５５−８６４
【非特許文献１７】Ｐｏｕｚｅｔら「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」、２００１年、第１０２巻：２１０−２１５
【非特許文献１８】Ｆｌｏｒｉｎｉら「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、１９８６年、第２６１巻：１６５０９−１６５１３
【非特許文献１９】Ｍａｓｓａｇｕｅら「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、１９８６年、第８３巻：８２０６−８２１０
【非特許文献２０】Ｒｏｕｓｓｅら「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、２００１年、第２７６巻：４６９６１−４６９６７
【非特許文献２１】Ｌｉｕら「Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．」、２００１年、第１５巻：２９５０−２９６６
【非特許文献２２】Ｏｌｓｏｎら「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、１９８６年、第１０３巻：１７９９−１８０５
【非特許文献２３】Ｄｅ  Ａｎｇｅｌｉｓら「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、１９９８年、第９５巻：１２３５８−１２３６３
【非特許文献２４】Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄら「Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．」、１９９０年、第１９１巻：１４４−１４８
【非特許文献２５】Ｚｅｎｔｅｌｌａら「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、１９９２年、第８９巻：５１７６−５１８０
【非特許文献２６】ＭｃＬｅｎｎａｎら「Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．」、２００２年、第４６巻：５５９−５６７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、当該分野において、筋芽細胞の分化におけるＴＧＦ−βの役割をより理解する、およびＨｕＳｋＭＣを増殖させる臨床的に適当な方法を開発する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、骨格筋細胞（ＳｋＭＣ）培養物の増殖中に、筋芽細胞の増殖を維持しながら、筋芽細胞の筋細胞への分化を可逆的に抑制する方法を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、ＳｋＭＣ培養物において、構成的な細胞のアイデンティティーおよび／または細胞の分化状態を決定する方法を提供する。
【００１２】
本発明はまたさらに、抑制されたレベルの筋細胞分化マーカーを発現する、分化コンピテントな筋芽細胞でＳｋＭＣ培養物を濃縮する方法を提供する。本発明は、そのような濃縮ＳｋＭＣ培養物およびこれら培養物を利用する治療方法を提供する。
【００１３】
本発明のさらなる局面および利点を、以下の説明において部分的に述べ、そして部分的に説明から理解する、または本発明の実施によって学び得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明をより容易に理解し得るために、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義を、詳細な説明中で述べる。
【００１５】
「ＣＤ５６陽性」という用語は、細胞を説明するために使用された場合、検出可能なレベルのＣＤ５６を発現している細胞を指す。同様に、「デスミン陽性」という用語は、検出可能なレベルのデスミンを発現している細胞を指す。当該分野において公知の方法を用いて、および／または実施例で記載されるように、発現をタンパク質またはＲＮＡレベルで検出し得る。
【００１６】
「マイトジェンリッチな培地」という用語は、少なくとも５％の血清または様々な血清の組み合わせを含む培地を指す。
【００１７】
「ＴＧＦ−β」という用語は、他に特に示されなければ、ＴＧＦ−βのいずれか１つの、またはそれ以上のアイソフォームを指す。現在、５つの公知のＴＧＦ−βのアイソフォーム（ＴＧＦ−β１−β５）が存在し、それらは全て実質的にお互い相同的であり（６０−８０％の同一性）、ホモダイマーを形成し、そして共通のＴＧＦ−β受容体（ＴβＲ−Ｉ、ＴβＲ−ＩＩ、ＴβＲ−ＩＩＢ、およびＴβＲ−ＩＩＩ）に対して作用する。ＴＧＦ−βは、種間で高度に保存されている。例えば、ブタ、サル、およびヒトの成熟ＴＧＦ−β１（１１２アミノ酸）は同一であり、そしてマウスおよびラットＴＧＦ−β１は、ヒトからわずかに１アミノ酸異なるだけである。ＴＧＦ−βの構造的および機能的局面は、当該分野において周知である（例えば、Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍら（編）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、２００１、７１９−７４６頁を参照のこと）。ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３のみが哺乳動物において見出される。３つのアイソフォームのタンパク質登録番号の部分的なリストを、表１で提供する。
【００１８】
【表１】
2008502310.tif 000002
他に示されなければ、述べられるＴＧＦ−βの量は、培地に加えられた活性ＴＧＦ−βの量を指し、そしてその量が血清供給源に依存して異なり得る、血清中に自然に存在するＴＧＦ−βを含まない。最も優勢なＴＧＦ−βの形式であるＴＧＦ−β１の報告された血清濃度は、１から３３ｎｇ／ｍｌの間で異なる（Ｋｙｒｔｓｏｎｉｓら（１９９８）Ｍｅｄ．Ｏｎｃｏｌ．、１５：１２４−１２８）。製造会社によると、実施例で利用したＤｅｆｉｎｅｄ  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  ＳｅｒｕｍにおけるＴＧＦ−β１の量は、平均２１ｎｇ／ｍｌである（Ｗｉｇｈｔ（２０００）Ａｒｔ  ｔｏ  Ｓｃｉｅｎｅｃｅ、第１９巻（３）：１−３）。しかし、様々な血清中に自然に存在するほとんどのＴＧＦ−βは、不活性な形式であり、すなわち、増殖因子の成熟形式に非共有結合的に結合したプロペプチドと共にある。
【００１９】
ＴＧＦ−βは多様な生物活性を示すので、ＴＧＦ−βの量および／または活性を検出および定量するために、様々なアッセイを使用し得る。ＴＧＦ−β活性に関する、より頻繁に使用されるインビトロバイオアッセイのいくつかの例は、以下のものを含む：
（１）ＥＧＦ存在下で軟寒天におけるＮＲＫ細胞のコロニー形成の誘導（Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８：５３３９−５３４３）；
（２）原始的な間葉系の細胞が軟骨の表現形を発現する分化の誘導（Ｓｅｙｅｄｉｎら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：２２６７−２２７１）；
（３）Ｍｖ１Ｌｕミンク肺上皮細胞（Ｄａｎｉｅｌｐｏｕｒら（１９８９）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１３８：７９−８６）およびＢＢＣ−１サル腎臓細胞（Ｈｏｌｌｅｙら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：５９８９−５９９２）の増殖の阻害；
（４）Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス胸腺細胞の有糸分裂誘発の阻害（Ｗｒａｎｎら（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．、６：１６３３−１６３６）；
（５）ラットＬ６筋芽細胞の分化の阻害（Ｆｌｏｒｉｎｉら（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６１：１６５０９−１６５１３）；
（６）フィブロネクチン産生の測定（Ｗｒａｎａら（１９９２）Ｃｅｌｌ、７１：１００３−１０１４）；
（７）ルシフェラーゼリポーター遺伝子に融合したプラスミノーゲン活性化因子阻害薬１（ＰＡＩ−１）プロモーターの誘導（Ａｂｅら（１９９４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１６：２７６−２８４）；および
（８）サンドイッチ型酵素結合免疫吸着検定法（Ｄａｎｉｅｌｐｏｕｒら（１９８９）Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ、２：６１−７１）。
【００２０】
「初代培養」および「初代細胞」という用語は、そのままの、または解離した組織または臓器断片から得られた細胞を指す。培養物は、それが継代される（または継代培養される）まで初代と判断され、その後は「細胞系統」または「細胞株」と呼ばれる。「細胞系統」という用語は、均質性または培養が特徴付けされた程度を意味しない。細胞系統は、もしそれが培養細胞の集団中の単一細胞から得られたなら、「クローン細胞系統」または「クローン」と呼ばれる。他に示されなければ、「骨格筋細胞（ＳｋＭＣ）」および「ＳｋＭＣ培養物」という用語は、初代および継代された骨格筋細胞の両方を指す。「ＳｋＭＣ」および「ＳｋＭＣ培養物」という用語は、骨格筋から単離された細胞、および精製筋芽細胞を含む（しかしそれに限らない）、それから精製、分離、および／または継代された非クローン細胞を指す。「高密度」という用語は、５０，０００細胞／ｃｍ２または５０％コンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）より高い細胞密度を指す。
【００２１】
「継代」という用語およびその同種のものは、細胞を新しい培養容器に移し、細胞集団を増殖させる、または同型培養を設定する過程を指す。文脈に依存して、「継代」という用語はまた、継代された培養物中の細胞、および／または連続する継代間の期間も指し得る。他に示されなければ、「第１継代」は初代培養を指す；「第２継代」は初代培養から継代された細胞を指す；「第３継代」は第２継代培養物から継代された細胞を指す、等である。
【００２２】
本発明は、部分的には、ＴＧＦ−β２は、高密度の培養においてさえも、成人ＨｕＳｋＭＣの連続的に増殖させた培養物において、筋芽細胞の分化を可逆的に抑制するという発見および実証に基づく。筋芽細胞の分化の抑制は、筋芽細胞分化の確立されたマーカーであるクレアチンキナーゼの発現の抑制によって確認された。これらの結果は、ＴＧＦ−βを使用して、臨床的に使用するためのＨｕＳｋＭＣの大規模産生の間に、筋芽細胞の分化を抑制し得ることを示す。ＳｋＭＣの連続的な増殖の間に筋芽細胞の分化を阻害することによって、ＴＧＦ−βは筋芽細胞集団を増殖性の、分化コンピテントな状態に維持する。ＳｋＭＣの培養物が高密度になった後でさえも筋芽細胞の分化を抑制するＴＧＦ−βの能力は、ＳｋＭＣの連続的な増殖の間に、より頻繁でない継代、および／またはより小さい組織培養表面領域を可能にする。未分化の細胞は、移植の最初の段階で増強された増殖および運動性を示すと考えられるので、ＴＧＦ−β中のＳｋＭＣの増殖はまた、一旦損傷した心臓組織に注入されたら、筋芽細胞の移植を促進し得る。
【００２３】
よって、本発明の１つの局面は、培養物中でＳｋＭＣを増殖させる方法である。ある実施形態において、ＳｋＭＣは成人哺乳動物から得られた初代または継代細胞、例えばＨｕＳｋＭＣである。本発明の関連する局面は、抑制されたレベルの筋細胞分化マーカーを発現する、分化コンピテントな筋芽細胞でＳｋＭＣ培養物を濃縮する方法である。その方法は、筋芽細胞の分化を可逆的に抑制するのに有効な量のＴＧＦ−βを添加したマイトジェンリッチな細胞培養培地でＳｋＭＣを培養することを含む。様々な実施形態において、ＳｋＭＣはＴＧＦ−βを添加した培地で、例えば少なくとも１２、２４、３６、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８時間またはそれ以上、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、および／または続く継代で培養された、初代または継代細胞である。さらなる実施形態において、１つまたはそれ以上の継代において、継代および／または回収の前に、細胞によって占められる培養表面のパーセンテージによって測定される、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％またはそれより高いコンフルエント以上、または０．１、０．２５、０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．１、２．３、２．５、２．７５、３、３．２５、３．５、３．７５、４、５×１０５細胞／ｃｍ２またはそれ以上の密度以上まで、細胞を増殖させる。説明の実施形態において、細胞を、ＴＧＦ−βの存在下で、第２継代で１、２、または５日間増殖させる。
【００２４】
様々な実施形態において、ＴＧＦ−βはＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３の１つまたはそのあらゆる組み合わせ、またはそのヘテロダイマーである。ＴＧＦ−β４およびＴＧＦ−β５も使用し得る。培地に添加するＴＧＦ−βの量は、筋芽細胞の分化を抑制するために有効である。いくつかの実施形態において、有効な量は０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、１．５、２、３、４、５、１０、２０、または４０ｎｇ／ｍｌである、または０．０１から２００、０．０１から１００、０．０１から５０、０．０１から２０、０．２から５０、０．２から２０、０．２から１０、０．２から５、０．２から２、０．５から５、および０．５から２ｎｇ／ｍｌの範囲から選択される。説明の実施形態において、培地に１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β２を添加する。
【００２５】
本発明はさらに、部分的には、ＣＤ５６陽性筋芽細胞によるデスミン発現の抑制は、ＴＧＦ−βによる筋芽細胞分化の抑制と関連し、一方ＣＤ５６の発現はＴＧＦ−βによって影響されないという発見および実証に基づく。
【００２６】
培養物における骨格筋細胞のクローン増殖および分化は、最初にＫｏｎｉｇｓｂｅｒｇ（１９６３）Ｓｃｉｅｎｃｅ、１４０：１２７３によって報告された。分化の間に、筋芽細胞は有糸分裂後のＧ０期に入り、そしてプレーティング後４８時間以内に筋芽細胞の融合（融合バースト（ｆｕｓｉｏｎ−ｂｕｒｓｔ））が明らかになる。融合バーストの頃に、筋肉特異的遺伝子（例えばクレアチンキナーゼ）の転写がアップレギュレートされる（Ｐａｔｅｒｓｏｎら（１９７２）Ｃｅｌｌ、１７：７７１；Ｄｅｌｖｉｎら（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ、２７０：７２５）。ＡＴＰの再産生によって筋肉収縮のためのエネルギーを供給する、クレアチンキナーゼ活性は、筋芽細胞分化の長く確立した定量可能なマーカーであり、筋芽細胞の融合と関連する（Ｓｈａｉｎｂｅｒｇら（１９７１）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、２５：１−２９）。
【００２７】
中間径フィラメントタンパク質デスミンは、増殖中の骨格筋芽細胞に発現し（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：９６０６−９６１０；Ｌａｗｓｏｎ−Ｓｍｉｔｈら（１９９８）Ｊ．Ａｎａｔ．、１９２：１６１−１７１）、そして骨格筋の成熟筋細胞において優勢である（Ｌａｚａｒｉｄｅｓら（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７３：４３４４−４３４８）。デスミンのアップレギュレーションは、筋芽細胞分化のシグナルである。対照的に、ＣＤ５６（ＮＣＡＭまたは抗原Ｌｅｕ−１９とも呼ばれる）は、増殖中の筋芽細胞に構成的に発現する（Ｉｌｌａら（１９９２）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、３１：４６−５２；およびＢｅｌｌｅｓ−Ｉｓｌｅｓら（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．、３７：３７５−３８０）が、成熟筋肉には存在しない（Ｓｃｈｕｂｅｒｔら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：３０７−３１１）。あるリンパ球およびニューロンを含む他の細胞もＣＤ５６を発現するが、線維芽細胞は発現しない。デスミンおよびＣＤ５６はどちらも、骨格筋から培養された細胞における、筋芽細胞の信頼性の高いマーカーと考えられる。
【００２８】
本発明は、部分的には、骨格筋培養物のうちほとんど全ての細胞を、２つの集団：（１）ＣＤ５６＋、デスミン＋、ＴＥ７−細胞、および（２）ＣＤ５６−、デスミン−、ＴＥ７＋細胞が説明するという発見および実証に基づく。これらの２つの集団は、それぞれ筋芽細胞および線維芽細胞である。デスミンおよびＣＤ５６は、増殖中の骨格筋芽細胞の２つのマーカーである。ＴＥ７は、骨髄（Ｃａｔｔｏｒｅｔｔｉら（１９９３）Ｂｌｏｏｄ、８１：２２５−２５１）および胸腺組織切片（Ｈａｙｎｅｓら（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１５９：１１４９−１１６８）の線維芽細胞ストローマ細胞に結合するモノクローナル抗体である。ＴＥ７抗原は、インビトロにおいて線維芽細胞のマーカーである（Ｒｏｓｅｎｄａｌら（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．、１０２：２９−３７）。
【００２９】
本発明はさらに、部分的には、ＣＤ５６陽性（ＣＤ５６＋）筋芽細胞によるデスミン発現の抑制は、ＴＧＦ−βによる筋芽細胞分化の抑制と関連し、一方ＣＤ５６の発現はＴＧＦ−βによって影響をうけないという発見および実証に基づく。一般的に受け入れられた筋芽細胞のマーカーであるデスミンの喪失にも関わらず、ＴＧＦ−β２は、予測され得たように、別の細胞型への分化転換による筋芽細胞表現型の喪失を引き起こさない（例えば、Ｋａｔａｇｉｒｉら（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１２７：１７５５−１７６６を参照のこと）。
【００３０】
よって、本発明の別の局面は、ＳｋＭＣ培養物において、筋芽細胞の分化状態を評価する方法である。その方法は、ＳｋＭＣ培養物においてＣＤ５６陽性細胞の集団によって発現されるデスミンの量を決定することを含み、ここで閾値レベル以下のデスミンの量は、ＳｋＭＣ培養物における未分化の筋芽細胞の存在を示す。
【００３１】
さらなる局面において、本発明は、本発明の方法によって、ＴＧＦ−βを添加した培地で増殖させたＳｋＭＣを提供する。ＳｋＭＣを、哺乳動物（例えばラット、マウス、ウシ、ブタ、サル、およびヒト）および非哺乳動物（例えば鳥類）を含む脊椎動物種の骨格筋から得ることができる。ＳｋＭＣに関して「成人」という用語は、これらの細胞を胎児性のＳｋＭＣと区別するために、出生後の動物（例えばヒト）から得たＳｋＭＣに関して使用される。
【００３２】
本発明の組成物は、正常レベルのＣＤ５６および抑制されたレベルのデスミンを発現する、分化コンピテントな筋芽細胞で濃縮された培養ＳｋＭＣを含む。ある実施形態において、ＣＤ５６陽性筋芽細胞によるデスミン発現は、（ａ）ＴＧＦ−βの添加無しに増殖させたコントロール培養物および／または（ｂ）初代細胞と比較して、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０％またはそれ以上抑制される。ある実施形態において、ＴＧＦ−β中で増殖させたＣＤ５６陽性筋芽細胞によるデスミン発現は、ＴＧＦ−βの添加前の同じ培養物におけるＣＤ５６陽性細胞と比較して、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０％またはそれ以上抑制される。
【００３３】
本発明の組成物はさらに、抑制された量のクレアチンキナーゼを発現する培養ＳｋＭＣを含む。ある実施形態において、ＳｋＭＣによるクレアチンキナーゼ発現は、ＴＧＦ−βの添加無しに増殖させたコントロール培養物と比較して、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０％またはそれ以上抑制される。ある実施形態において、ＴＧＦ−β中で増殖させたＳｋＭＣによるクレアチンキナーゼ発現は、ＴＧＦ−βの添加前の培養物における同じＳｋＭＣと比較して、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０％またはそれ以上抑制される。発現レベルは、関連する細胞集団の細胞数あたりで言及される。
【００３４】
ＣＤ５６、デスミンおよびクレアチンキナーゼのレベルを、ＲＮＡまたはタンパク質レベルで測定し得る。ＲＮＡレベルを、例えば定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロッティング、または例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（編）Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９において記載されたような、ＲＮＡレベルを決定する別の方法によって決定し得る。ＣＤ５６、デスミン、およびクレアチンキナーゼの発現レベルを、フローサイトメトリー（蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ））、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、酵素活性アッセイ（例えばクレアチンキナーゼアッセイ）または例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら（編）Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９８８）または実施例において記載されたような、タンパク質レベルを決定する別の方法を用いてタンパク質レベルで測定し得る。
【００３５】
ＳｋＭＣの単離および培養の方法を含む、細胞の単離および培養方法は、当該分野で公知であり、そして例えばＤａｖｉｓ（編）Ｂａｓｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、第２版、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００２、２４４−２４７頁、または実施例において記載されたように実施し得る。一般的に、必須栄養素、ビタミン、細胞機能を支えるために必要な補助因子を提供する培地中で、細胞を維持する。ほとんどの哺乳動物細胞に関して最適な培養条件は、典型的には７．２−７．５のｐＨ、２８０−３２０ｎＯｓｍｏｌ／ｋｇの容量オスモル濃度、２−５％のＣＯ２、および３２−３７℃の温度を含む。典型的には、骨格筋培養物を、５−２０、７−１５、または１０％の血清を含むマイトジェンリッチな培地中で増殖させる。血清を、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、または他の供給源から得ることができる。血清および血清バッチの選択は、部分的には使用者の経験的な評価に基づく。±２０％以内の細胞収量におけるバッチからバッチの変動は、通常十分であると判断される。
【００３６】
当業者はまた、本発明の方法において使用される培地を、様々な公知の培地、例えばイーグルの培地（Ｅａｇｌｅ（１９５５）Ｓｃｉｅｎｃｅ、１２２：５０１）、ダルベッコの最少必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏら（１９５９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８：３９６）、Ｈａｍの培地（Ｈａｍ（１９６３）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、２９：５１５）、Ｌ−１５培地（Ｌｅｉｂｖｉｔｚ（１９６３）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｙｇ．、７８：１７３）、ＭｃＣｏｙ  ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙら（１９５９）Ｐｒｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、１００：１１５）、ＲＰＭＩ培地（Ｍｏｏｒｅら（１９６７）Ｊ．Ａ．Ｍ．Ａ．、１９９：５１９）、ウィリアムスの培地（Ｗｉｌｌｉａｍｓ（１９７１）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、６９：１０６−１１２）、ＮＣＴＣ  １３５培地（Ｅｖａｎｓら（１９６８）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、３６：４３９）、Ｗａｙｍｏｕｔｈの培地ＭＢ７５２／１（Ｗａｙｍｏｕｔｈ（１９５９）Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．、２２：１００３）等から調製し得ることを認識する。これらの培地を単独で、または適当な割合で混合物として使用して、細胞培養培地を調製し得る。あるいは、培地を個々の化学物質から、および／または他の培地および例えば表２で特定されたような増殖添加物から調製し得る。本発明は、いかなる特定の濃度の培地に限らず、そして液体から半固体組成物までの範囲の培地の使用を含む。本発明の方法は、単層、多層、固体支持体上、懸濁液中、および３Ｄ培養を含む（しかしそれに限らない）、様々な条件下の培養中で増殖する細胞に適当である。
【００３７】
【表２−１】
2008502310.tif 000003
【００３８】
【表２−２】
2008502310.tif 000004
さらに別の局面において、本発明は、本発明の方法によって増殖させた自己由来または同種ＳｋＭＣの移植（例えばヒトにおいて）によって心筋梗塞を治療する方法を含む（しかしこれに限らない）、ＳｋＭＣを利用する治療的方法を提供する。ＴＧＦ−β中で増殖させた細胞は、移植の最初の段階で増強された増殖および運動性を示し、そして心機能の改善を引き起こすことが期待される。
【００３９】
以下の実施例は、本発明の説明的な実施形態を提供する。当業者は、本発明の意図または範囲を変えることなく行い得る多くの修飾およびバリエーションを認識する。そのような修飾およびバリエーションは、本発明の範囲内に含まれる。実施例は、いかなる方法においても本発明を制限しない。
【実施例】
【００４０】
（実施例１：ＨｕＳｋＭＣ株の由来）
ＨｕＳｋＭＣを、２５歳男性死体の大腿四頭筋（株Ａ）、７７歳女性で切断手術を受けた人の大腿直筋（株Ｂ）、３６歳女性死体の大腿四頭筋（株Ｃ）、または４５歳男性死体の外側（ｌａｔｅｒｕｓ）広筋（株Ｄ）から得た。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＤＲＩ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）によって提供された死体組織を、死後８から１９時間で入手した。骨格筋を輸送および０−４℃で２−４日間、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ’ｓ  ＳｏｌｕｔｉｏｎまたはＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）中で維持した。筋肉から明らかな結合組織および脂肪を切り取り、そしてリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中ですすいだ。少なくとも４グラムの湿潤重量を有する、切り取った筋肉を、約１ｍｍ３の破片に切り刻んだ。切り刻んだ筋肉を、４７０Ｕ／ｍｌのＩＩ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）中で、筋肉１グラムあたり１５−３０ｍｌの消化溶液を用いて、断続的に攪拌しながら３７℃で１時間消化した。細胞および不完全に消化された組織を、４５０ｇで７分間遠心することによって回収し、そしてペレットを０．２５％のトリプシン、１ｍＭのＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で、３７℃で２０分間消化した。胎児ウシ血清（ＦＢＳ）で消化を止め、そして細胞懸濁液を１００μｍのフィルターでろ過して不完全に消化された組織を除去した。細胞ろ液をペレット化し、そして培地に再懸濁した（実施例２を参照のこと）。第１継代における増殖のために、９−１１ｍｇの切り取った筋肉それぞれからの収量を、ＢｉｏＣｏａｔＴＭコラーゲン−Ｉでコートした組織培養フラスコ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）の１ｃｍ２あたりにまいた。ある場合には、１時間のプレプレーティング工程を使用し、それは線維芽細胞のより迅速な接着を利用することによって筋芽細胞を濃縮すると言われている。１日後、接着していない細胞および組織小片を含む培地を、新しい培地と交換した。
【００４１】
（実施例２：ＨｕＳｋＭＣの増殖）
すべての培養物を、コラーゲンＩでコートしたフラスコを用いて、３７℃、５％ＣＯ２、加湿雰囲気で増殖させた。増殖のための培地は、ＧＬＵＴＡＭＡＸＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ、１５−２０％のＦＢＳ（カタログ番号ＳＨ３００７１；Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を含むＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２から成っていた。株Ｄの増殖全体および初代継代後の株Ａの増殖に２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを使用した以外は、ｂＦＧＦの濃度は５ｎｇ／ｍｌであった。初代継代後の播種密度は、５×１０３細胞／ｃｍ２であった。ＴＧＦ−β２（Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を、他の実施例で示したように加えた。培養物に、２−４日ごとに新しい培地を与えた。７０−１００％コンフルエント、８×１０４から１．５×１０５細胞／ｃｍ２の範囲の密度の時に、細胞を０．０５％のトリプシン、０．５ｍＭのＥＤＴＡで剥離し、そして細胞懸濁液を継代培養、または下記で記載するように分析した。ある場合には、細胞を継代の間に、１０％のジメチルスルホキシド、４０％のＦＢＳ、５０％の培地中で低温保存した。研究を第２または第３継代において行った。各継代の期間は、４から７日間の範囲であった。
【００４２】
別の研究において、１ロットの１０％ＦＢＳ中の活性ＴＧＦ−β１および−β２の量を、ＥＬＩＳＡに基づくＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＴＭキット（カタログ番号ＤＢ１００およびＤＢ２５０、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を用いて定量した。活性化形式のＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２は、３１ｐｇ／ｍｌ（０．０３１ｎｇ／ｍｌ）より少ない検出レベル以下であったが、ＴＧＦ−βの酸性化後に測定した全ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２の量は、それぞれ１．１ｎｇ／ｍｌおよび０．１８ｎｇ／ｍｌであった。
【００４３】
（実施例３：フローサイトメトリーのための免疫標識手順）
デスミンまたはＴＥ７を検出するために、間接的蛍光免疫標識を行った。ＨｕＳｋＭＣ懸濁液を、ＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒドで、２０−２５℃で２０分間固定した。固定した細胞を洗浄し、そしてＰＢＳ中０．１％のサポニン、１０％のＦＢＳ（サポニン透過処理緩衝液（ＳＰＢ））中２．５−５．０μｇ／ｍｌのマウス抗デスミン抗体（クローンＤ３３；Ｄａｋｏ  Ｃｏｒｐ、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）と、またはＳＰＢ中２．２から４．０μｇ／ｍｌのマウス「抗線維芽細胞」抗体（クローンＴＥ７；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｆｌａｎｄｅｒｓ、ＮＪ）と、２０−２５℃で３０分間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、そしてＳＰＢ中１４μｇ／ｍｌのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）と、４℃で３０分間インキュベートした。
【００４４】
ＣＤ５６を検出するために、直接的蛍光免疫標識を行った。ＨｕＳｋＭＣ懸濁液を、ＰＢＳ中１．２５μｇ／ｍｌのフィコエリトリン（ＰＥ）−結合マウス抗ＣＤ５６抗体（クローンＮＣＡＭ１６．２、ＢＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）と、４℃で３０分間インキュベートした。
【００４５】
デスミンおよびＣＤ５６の同時発現を検出するために、二重蛍光免疫標識を行った。ＨｕＳｋＭＣをＰＥ結合抗ＣＤ５６抗体で標識した後、細胞を上記のようにパラホルムアルデヒドで固定し、そしてＰＢＳ中で洗浄した。次いで、固定した細胞をＳＰＢ中２．５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ結合マウス抗デスミン抗体（クローンＤ３３、Ｄａｋｏ  Ｃｏｒｐ、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）と、４℃で３０分間インキュベートした。
【００４６】
すべてのインキュベーションを、連続的に振とうしながら細胞懸濁液に対して行った。全ての洗浄のためにＰＢＳを使用し、そして免疫標識した細胞を、フローサイトメトリーのためにＰＢＳ中４℃で保存した。
【００４７】
（実施例４：フローサイトメトリー）
ＦＡＣＳｔａｒ  ＰｌｕｓＴＭフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて細胞を分析した。試料あたり１０，０００イベントのデータ取得を、ゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）無しで行った。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔＴＭソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いてデータを分析した。アイソタイプがマッチしたネガティブコントロール抗体で免疫標識したＨｕＳｋＭＣを、ＣＤ５６に関する参照として分析した。ＨｕＳｋＭＣ株の低温保存した細胞バンクを、デスミンおよびＴＥ７免疫標識およびフローサイトメトリー分析のための参照基準として調製した。報告された各研究のために、参照バンクからの細胞試料を解凍し、免疫標識し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。２１の独立したアッセイにおいて試験した参照基準は、平均して５２．７％デスミン陽性（変動計数＝６．２％）および４６．１％ＴＥ７陽性（変動計数＝６．２％）であった。
【００４８】
蛍光対前方散乱光の密度プロットにおいて、陽性集団を、陰性および陽性集団を最も良く分ける直線が１つの片の境界となった多角形の領域内で定量した。柱状グラフにおいて、陽性集団を、陰性および陽性ピークの間の最下点で始まり、そして蛍光強度目盛りの上部端まで伸びる領域マーカーを設定することによって定量した。
【００４９】
（実施例５：筋管の可視化）
細胞をコラーゲンコーティングがないスライドフラスコ（ｓｌｉｄｅｆｌａｓｋ）（Ｎｕｎｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に播種したことを除いて、ＨｕＳｋＭＣを上記のように増殖させた。培養がコンフルエントになった時、それを上記で記載した基本培地および抗生物質を含む１％ＦＢＳ中で２週間維持した。次いで接着した細胞単層を固定し、そしてインキュベーション期間を５０％増加させ、そしてインキュベーション間にＰＢＳでより徹底的な洗浄を行った以外は、細胞懸濁液に関して上記で記載したように、デスミンの検出のために間接的蛍光免疫標識をした。スライドフラスコの顕微鏡スライドをはずし、そして４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ：Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を含む固定培地（ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）を用いてカバーガラスをした。台に乗せた細胞を、蛍光顕微鏡を用いて１００×の倍率で写真を撮り、そしてＦＩＴＣ（デスミン）およびＤＡＰＩ（核）の画像を重ねた。
【００５０】
（実施例６：クレアチンキナーゼアッセイ）
血清を豊富に含む培地（上記で記載した）で増殖させた、または分化後のＨｕＳｋＭＣに対してアッセイを行った。標準的な組織培養フラスコに８×１０４細胞／ｃｍ２の密度で播種し、そして増殖培地中で１日間、次いで２％ＦＢＳ中で示した期間培養することによって分化を誘導した。
【００５１】
ＰＢＳ（ｐＨ８．０）中７５μｌの０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ＴＭ中に、２０−２５℃で１０分間懸濁することによって、約２×１０６細胞のペレットを溶解した。細胞レベル下の小片を、４℃で、１６，０００ｇで２０分間遠心することによって除去し、そして上清をＰＢＳ、ｐＨ８．０中２０ｍＭのグリシンと１：１で混合した。試料をアリコートに分け、そしてクレアチンキナーゼ活性および全タンパク質の定量のために−８０℃で保存した。
【００５２】
クレアチンキナーゼ活性の決定のための試薬混合物を、動力学アッセイにおいて、製造会社の指示によって使用した（手順＃４７−ＵＶ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。この方法によって、細胞抽出物中のクレアチンキナーゼを、基質および酵素の試薬混合物と組み合わせて一連の酵素反応を開始し、それは最終的にＮＡＤＨを産生し、それが３４０ｎｍにおける吸光度を増加させた。ａｂｓ３４０／時間の相関係数が０．９９より大きかった場合にのみ、データを考慮のために受け入れた。各細胞抽出物を、９６穴マイクロタイタープレートの３組のウェルで試験した。クレアチンキナーゼ活性を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイにおいてウシ血清アルブミン標準曲線に対して測定した、全タンパク質に対して標準化した。両方のアッセイの吸光度読み取りを、ＳｐｅｃｔｒａｍａｘＴＭ  Ｐｌｕｓ３８４分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて、直接マイクロタイタープレートのウェルにおいて行った。
【００５３】
上記のアッセイの参照標準、分化したＨｕＳｋＭＣ培養物からの抽出物を、上記のように調製し、アリコートに分け、そして−８０℃で保存した。参照標準を、４ヶ月以上の期間に渡って、４６の独立したアッセイにおいて試験した。全てのクレアチンキナーゼアッセイに含まれた参照標準のアッセイ結果は、平均して０．７２４クレアチンキナーゼユニット／ｍｇタンパク質であり、変動係数は７．８％、そして保存中に活性の損失は示さなかった。
【００５４】
（実施例７：ノーザン分析）
ＨｕＳｋＭＣ懸濁液をペレット化し、ＲＮＡｌａｔｅｒＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）中で急速冷凍（ｓｎａｐ  ｆｒｏｚｅｎ）し、そして−８０℃で保存した。ＱｉａＳｈｒｅｄｄｅｒＴＭ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）およびＲＮｅａｓｙＴＭ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）キットに含まれるプロトコールを用いてＲＮＡを単離し、そして２８０ｎｍの吸光度を測定することによって定量した。ウェルあたり８μｇを負荷した後、１％のアガロース、５％のホルムアルデヒドゲル中で電気泳動によってＲＮＡを分離した。ＲＮＡをゲルからナイロン膜に移し、そしてヒトデスミンｃＤＮＡの３２Ｐ標識７８０ヌクレオチド断片でプローブ探査した。デスミンｍＲＮＡを、ＢＡＳ−１５００ホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）（Ｆｕｇｉｆｉｌｍ、Ｓｔａｎｆｏｒｄ、ＣＴ）およびＩｍａｇｅＧｕａｇｅＴＭＶ３．４６ソフトウェア（Ｆｕｇｉｆｉｌｍ）を用いて定量した。
【００５５】
（実施例８：ＨｕＳｋＭＣ培養物は、筋芽細胞および線維芽細胞の混合集団である）
ＨｕＳｋＭＣを、ＨｕＳｋＭＣの増殖に関して記載されたように、コラーゲンでコートしたフラスコで培養した。第３継代において、筋芽細胞マーカーデスミンおよびＣＤ５６に関する二重蛍光免疫標識を行った（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：９６０６−９６１０；およびＢｅｌｌｅｓ−Ｉｓｌｅｓら（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．、３７：３７５−３８０）。２０人以上のドナーからのＨｕＳｋＭＣ培養物を、フローサイトメトリーによって分析した。その結果は、培養物は典型的には２つの主要な細胞の集団：デスミンおよびＣＤ５６マーカーの両方を発現するもの（すなわち筋芽細胞）およびどちらのマーカーも発現しないものから成ることを明らかにした。代表的な培養物（株Ａ）のフローサイトメトリー分析の結果を、図１に示す。
【００５６】
増殖したＨｕＳｋＭＣ培養物における分化コンピテントな筋芽細胞の存在を確認するために、細胞を、筋芽細胞の分化を増強する条件においた、すなわち低血清で培養した。具体的には、ＨｕＳｋＭＣの増殖に関して記載したように、ＨｕＳｋＭＣをコラーゲンでコートしたフラスコにおいて第１継代で培養した。次いで細胞を、コラーゲンコーティング無しの培養フラスコに、低密度で播種し、第２継代でコンフルエントな密度まで増殖させ、次いで細胞を１％の血清中で２週間維持して筋管の形成を促進した。分化した細胞を培養フラスコに接着している間に固定した。デスミンを蛍光免疫標識によって検出し、そして核をＤＡＰＩで染色した。多核性の筋管が観察され、培養物中の筋芽細胞が分化したことを示した。
【００５７】
増殖したＨｕＳｋＭＣ培養物における分化コンピテントな筋芽細胞の存在をさらに確認するために、第２継代のＨｕＳｋＭＣを、コートしていないフラスコに８０，０００細胞／ｃｍ２でまき、示した期間２％血清中で分化を誘導し、そしてクレアチンキナーゼ活性に関して評価した。クレアチンキナーゼ活性は、時間とともに増加し、培養物中の筋芽細胞が分化したことを示した。代表的な研究（株Ｄ）の結果を、表３に示す。
【００５８】
【表３】
2008502310.tif 000005
ＨｕＳｋＭＣの非筋芽細胞集団を特徴付けるために、低および高純度の筋芽細胞のＨｕＳｋＭＣ株（それぞれ株ＢおよびＣ）を、低温保存したバンクから解凍し、そして独立に、または約同等の割合で２つの株を混合した後（株Ｂ＋Ｃ）、第２継代まで増殖させた。低（株Ｂ）、中程度（株Ｂ＋Ｃ）および高（株Ｃ）純度の筋芽細胞の第２継代培養物を、ＴＥ７抗原またはデスミンを発現する細胞の定量のために、フローサイトメトリー分析にかけた。各培養物において、筋芽細胞純度に関係なく、デスミン陽性およびＴＥ７陽性細胞の画分は、総計約１００％であった。細胞サイズの尺度である。フローサイトメトリーによる前方散乱光のパターンは、デスミン陰性およびＴＥ７陽性集団の間で同様であった。合わせると、そのデータは、デスミンおよびＴＥ７抗原の発現は、相互に両立しないことを示す。適当な細胞をポジティブコントロールとして使用した、アセチル化ＬＤＬ取り込みアッセイ（Ｖｏｙｔａら（１９８４）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、９９（６）：２０３４−２０４０）およびオイルレッドＯアッセイ（Ｋｕｒｉ−Ｈａｒｃｕｃｈら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５（１２）：６１０７−６１０９）を用いて、ＨｕＳｋＭＣ培養物において、内皮または脂肪細胞は検出されなかった。そのデータは、増殖したＨｕＳｋＭＣは、ほとんど全部が２つの主要な細胞集団、すなわち分化コンピテントな筋芽細胞および線維芽細胞から成っていたことを示す。
【００５９】
（実施例９：ＨｕＳｋＭＣ増殖中のＴＧＦ−βの効果）
ＨｕＳｋＭＣの細胞増殖および分化に対するＴＧＦ−βの効果を決定するために、株Ａの細胞を、第２継代において増殖させ、そしてそれぞれ５日間の培養期間の終わりまで延長する、異なる間隔の間、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β２に接触させた。次いで細胞を免疫標識し、そして上記で記載したように、デスミンおよびＣＤ５６発現の定量的検出のために、フローサイトメトリーによって分析した。デスミン陰性ピークの蛍光強度のパターンはＴＧＦ−β２によって影響されなかったが、デスミン陽性ピークの蛍光強度は、ＴＧＦ−β２への接触の時間が増加するにつれて、連続的な減少を示した。この変化は、筋芽細胞集団におけるデスミン発現の減少を反映していた。
【００６０】
フローサイトメトリー結果の定量（図２）は、ＴＧＦ−β２に５日間接触させたＨｕＳｋＭＣの筋芽細胞集団の平均蛍光強度は、未処理細胞のものの４８％であったことを示した。デスミン発現における減少の約半分は、ＴＧＦ−β２への接触の１日後に起こった。ＴＧＦ−β２に反応した、観察されたデスミン発現における減少は、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β２の存在下または非存在下のいずれかで、２組で４日間増殖させた同じ株由来の細胞の、ノーザン分析の結果によってさらに支持された。デスミンｍＲＮＡを検出するノーザンブロットを、上記で記載したように調製および定量した。ＴＧＦ−β２に接触させた培養物由来のデスミンＲＮＡに対応するノーザンブロットのバンドからのシグナルの平均強度は、ＴＧＦ−β２非存在下で増殖させた培養物由来の平均シグナルの５３％であった（それぞれ１４６および１９４ピクセル対３１０および３２７ピクセル）。
【００６１】
対照的に、ＴＧＦ−β２処理は、ＣＤ５６陽性集団の蛍光強度を変化させず、デスミンおよびＣＤ５６はお互い独立に調節されていることを示した。さらに、ＣＤ５６陽性細胞によって代表される培養物の画分は、ＴＧＦ−β２の非存在下および存在下で増殖させたＨｕＳｋＭＣの間で同様であった（それぞれ６５％および６３％）。別の研究において、線維芽細胞マーカーＴＥ７の発現も、ＴＧＦ−β２によって影響を受けなかった。そのデータは、ＴＧＦ−β２は、培養物中の、線維芽細胞および筋芽細胞の全数の比は変化させないことを示す。
【００６２】
（実施例１０：デスミンのＴＧＦ−β誘導ダウンレギュレーションの可逆性）
ＴＧＦ−β２が誘導したデスミンの発現における減少が可逆的であるかどうかを決定するために、株ＣのＨｕＳｋＭＣを、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β２培地の非存在下または存在下で、第２継代において５日間増殖させ、次いでデスミンの検出のために、蛍光免疫標識およびフローサイトメトリー分析のために回収した。同時培養を、ＴＧＦ−β２中で増殖させ、次いで回収前にＴＧＦ−β２の非存在下でさらに２日間培養した。その結果を表４にまとめる。
【００６３】
【表４】
2008502310.tif 000006
表４に示すように、ＴＧＦ−β２処理培養物由来のデスミン陽性集団の平均蛍光は、未処理培養物由来のものの約５０％であった。しかし、ＴＧＦ−β２除去の２日後、培養物は、ＴＧＦ−β２に接触しなかった細胞のものと同様のデスミン発現プロファイルを獲得した。デスミン陽性集団に対応する蛍光強度を有する細胞の画分は、３つの培養物の間で同様であった。そのデータは、ＴＧＦ−β２への持続的な接触が、筋芽細胞マーカーデスミンの抑制に必要であり、そしてＴＧＦ−β２の除去によって２日以内に正常な筋芽細胞表現型を再び確立し得ることを示す。
【００６４】
（実施例１１：クレアチンキナーゼ活性に対するＴＧＦ−βの効果）
ＴＧＦ−β２の添加および除去によるデスミンの調節は、ＴＧＦ−βを使用して、ＨｕＳｋＭＣの増殖中に、筋芽細胞の分化状態をコントロールし得ることを示す。これを更に評価するために、ＴＧＦ−β２のクレアチンキナーゼ活性に対する効果を調査した。クレアチンキナーゼレベルを、図３において示されたフローサイトメトリー分析によってデスミンのダウンレギュレーションを調査するのに使用した、同じ株Ａ培養物から取った試料から、直接定量した。ＴＧＦ−β２は、デスミンに関して観察されたものと同様の割合でクレアチンキナーゼ活性を抑制し、抑制の約半分は、ＴＧＦ−β２処理の１日後に起こった（図３と図２を比較のこと）。
【００６５】
別の研究において、クレアチンキナーゼのＴＧＦ−β２誘導ダウンレギュレーションの可逆性を評価した。株ＡのＨｕＳｋＭＣを、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β２の非存在下（培養物１）または存在下（培養物２、３および４）で５日間増殖させた。ＴＧＦ−β２処理培養物の１つを、ＴＧＦ−β２中でさらに２日間増殖させ（培養物３）、そして１つをその非存在下でさらに２日間培養した（培養物４）。各培養期間の終わりに、細胞をクレアチンキナーゼ分析のために溶解した。ＴＧＦ−β２の存在下で５日間培養した株ＡのＨｕＳｋＭＣ（表５、培養物２）は、その非存在下で培養した細胞における活性（表５、培養物１）の１５％であるクレアチンキナーゼ活性を有していた。これらの細胞をＴＧＦ−β２無しでさらに２日間増殖させた場合（表５、培養物４）、クレアチンキナーゼ活性は、ＴＧＦ−β２除去後に１５倍増加し（培養物２および４を比較のこと）、ＴＧＦ−β２はこの筋肉分化マーカーの発現を永久的に阻害するわけではないことを示した。筋芽細胞はコンフルエントな場合に分化する傾向があるので、培養物４におけるＴＧＦ−β２除去後の活性の大きな増加は、部分的には、培養期間の終わりに達成された２．１×１０５細胞／ｃｍ２の高い細胞密度のためであり得る。しかし、ＴＧＦ−β２処理細胞をＴＧＦ−β２の存在下でさらに２日間、増殖因子に持続的に接触して全部で７日間培養した場合（表５、培養物３）、これらの細胞も培養物４と同様の高い密度（２．３×１０５細胞／ｃｍ２）に達したが、クレアチンキナーゼ活性は低いままであった。このデータは、デスミン発現のフローサイトメトリー分析からのデータとあわせて、ＴＧＦ−β２は、高密度のＨｕＳｋＭＣ培養物においてさえ、筋芽細胞の分化を抑制することを示す。さらに、そのあわせたデータは、ＴＧＦ−β２のこの効果は完全に可逆性であることを示し、そしてＴＧＦ−β２中で増殖させたＨｕＳｋＭＣは、その分化する能力を保持していることを示唆する。
【００６６】
【表５】
2008502310.tif 000007
（実施例１２：梗塞心筋への骨格筋細胞の移植）
この研究は、ヒトにおける梗塞後心機能のモデルとして意図された非ヒト動物（例えばＬｅｗｉｓラット）において、ＴＧＦ−βの存在下または非存在下で、インビトロで増殖させた後移植した骨格筋細胞（ＳｋＭＣ）の臨床効果を比較する。この研究で使用する細胞は、移植の前に培養および低温保存細胞バンクとして保存する。任意で、ＳｋＭＣの供給源として骨格筋を採取する２から３日前に、０．５ｍｌのマーカインＴＭ（０．５％ブピバカインクロロハイドレート（ｂｕｐｉｖｉｃａｉｎｅ  ｃｈｌｏｒｏｈｙｄｒａｔｅ））を、麻酔ラットの各後脚の前脛骨に注射し得る。この手順は、衛星細胞を活性化し、そしてそれによって続くインビトロ培養物からの基礎筋芽細胞収量を高める。
【００６７】
同系レシピエントへ移植されたドナー細胞の生存を評価する研究を、パイロット研究において任意で行い得る。簡単には、蛍光生体色素を用いてＳｋＭＣを標識する。２グループの非梗塞ラットに標識細胞を移植し、そして１週間後、動物を屠殺し、そしてその心臓をパラホルムアルデヒド固定し、そして組織像によってＳｋＭＣ細胞の生存または炎症性浸潤物の証拠に関して分析する。細胞の蛍光標識を以下のように行う。凍結細胞アンプルを解凍し、そして３ｍｌの８０％ＩＭＤＭ、２０％のＦＢＳで希釈した後、上記で記載したように１６０−２００ｇで５分間遠心することによって細胞を濃縮する。細胞のペレットを、ＨＢＳＳ（Ｃａ＋／Ｍｇ＋フリー）中で調製された１μＭのジオクタデシルオキサカルボシアニンペルクロレート（ＤｉＯ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）から成る１０ｍｌの標識培地中に懸濁する。１０ｍｌの細胞懸濁液を３７℃で５分間、暗所でインキュベートし、続いて４℃で１５分間インキュベートする。
【００６８】
主要な研究において、手術の前日（−１日）に、ラットを２グループ：対照または梗塞のうち１つに割り当てる。対照動物を、２ＤガイドＭモード心エコー検査で心機能に関して評価する。手術日（０日）に、動物を麻酔し、そして前外側開胸術により心臓を露出させる。梗塞グループに割り当てられた動物においてのみ、縫合結紮をＬＡＤの周囲に確保し、そして締めて虚血性の障害を作成する。対照グループに割り当てられた動物は、開胸術は完了するが、梗塞はさせずコントロールグループとなる。次いで梗塞グループを、縫合を用いて冠動脈を６０分間結紮することによって甚大な心筋虚血（梗塞）にし、続いて再灌流させる。梗塞の６日後、全ての動物の体重を測定し、そしてトレッドミルにおいて運動耐性を評価する。梗塞の７日後、全ての動物を、心エコー検査を用いて駆出率に関して評価する。梗塞の８日後、全ての動物を、最初の手術と同じ順番で再び手術して、心臓を再露出させる。梗塞させた動物を、それらが受けた移植によって３つのサブグループのうち１つに割り当てる：（１）細胞を含まない細胞懸濁液培地のプラセボ注射；（２）本発明の方法によってＴＧＦ−β（例えばＴＧＦ−β１、−β２、および／または−β３）の存在下で培養したＳｋＭＣ；および（３）ＴＧＦ−β無しで培養したＳｋＭＣ。対照グループに２回目の開胸術を行うが、いかなる注射も与えない。ＳｋＭＣグループの各ラットは、３０ゲージのハミルトン針を用いて、梗塞および梗塞周囲領域に直接、約１−２ｍｍ離して、全量１００μｌのＩＭＤＭ／０．５％ＢＳＡに含まれる、細胞懸濁液の６−１０回の注射を受ける（全部で３×１０６細胞／心臓）。
【００６９】
処置後、胸腔を閉じ、そして動物を回復させる。動物を毎日調査し、そして心不全の徴候（無気力、浅い呼吸、チアノーゼ）および死亡率を記録する。各動物の体重を毎週、およびあらゆる分析手順の直前に記録する。研究中のあらゆる動物の死を記録し、そして死体解剖を行って可能性のある死因を決定する。
【００７０】
移植の８週間後、動物を、トレッドミルを用いて運動能力に関して評価する。最大運動能力を、変更したげっ歯類トレッドミル（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ；Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ）で消耗するまでの走行距離として測定する。消耗を、少しの電気ショックにもかかわらず、連続して１５秒間走ることができないことと定義する。最初のトレッドミルの速度を１５°勾配において１５メートル／分に設定し、そしてその後毎分１メートル／分の増加で増加させる
心機能を、２ＤガイドＭモード心エコー検査で調査して左心室駆出率を決定する。インビボにおける心機能の心エコー検査評価を、１５ＭＨｚプローブを備えたＡｃｕｓｏｎ  ＳｅｑｕｏｉａＴＭ  Ｃ−２５６心エコー機械（Ｓｉｅｍｅｎｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＰＡ）を用いて、麻酔ラットにおいて行う。げっ歯類ノーズコーンを用いて、５％のイソフルラン（ｉｓｏｆｌｏｒａｎｅ）の吸入によって動物を麻酔し、適切な麻酔を保証するために心エコー検査の間中２．５％のイソフルランで維持する。イソフルランは、迅速でスムーズな麻酔の導入および迅速な回復を可能にし、循環器の血行動態（心室負荷、血圧、心拍数等）をほとんど変化させない。一旦麻酔すると、動物の胸部を市販の電気バリカンで剃る。心臓を２次元胸骨傍短軸の観点から画像化し、そしてＭモードの測定値を心筋梗塞のレベルで心室中央で記録する。心拍数、前方／後方壁の厚さ、および拡張期末／収縮期末の腔の寸法を、市販で入手可能な分析ソフトウェア（Ａｃｕｓｏｎ  Ｓｅｑｕｏｉａ）を用いて、Ｍモード画像から測定する。分画の短縮を、拡張期末寸法マイナス拡張期末寸法に対して基準化した収縮期末寸法として定義し、そして心収縮性機能の指標として使用する。局所的な前方および後方壁の肥厚も、それぞれの領域の拡張期および収縮期の壁寸法の比較によって評価する。初期／後期ＬＶ血液流入（Ｅ／Ａ比）および血液流入の速度を含む、拡張期機能および心室の充満のパラメーターを、僧帽弁を横切る血液速度のドップラー測定によって測定する。（より大きな動物における局所の心筋区域における心機能を、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を用いて評価し得る。）
次いで動物を麻酔し、そしてその心臓を摘出し、続いて培養した等容性に拍動する（バルーン−イン−ＬＶ（ｂａｌｌｏｏｎ−ｉｎ−ＬＶ））心臓においてＬａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ灌流システムを用いて、発達した圧の心臓の能力を分析する。簡単には、培養心臓を、４０％のヘマトクリットで修飾Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液中に懸濁したウシ赤血球から成る灌流液で逆に灌流する。Ｓｔａｔｈａｍ  Ｐ２３ＤｂＴＭ圧変換器（Ｓｔａｔｈａｍ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｈａｔｏ  Ｒｅｙ、Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ）に接続した液体を充満させたラップのバルーンを、左心室に置き、心室圧をモニターする。冠動脈灌流圧を８０ｍｍＨｇに設定し、そして次いで活性な圧−容積の関係を作る。バルーンの容積０から、バルーンに０．０５ｍｌの増加で充満させ、そして続くピーク収縮期および拡張期末圧を記録する。次いで収縮期および拡張期圧−容積の関係を得る。続いて、心臓を塩化カリウムによって、拡張期状態で、そして５ｍｍＨｇの最終拡張圧で停止させ、そして４％のパラホルムアルデヒドの逆灌流によって固定する。
【００７１】
固定後、心臓を、心房組織を切り取り、重量を計り、そして４つの等しい部分へ横断的に切断する（「ブレッド−ローフ（ｂｒｅａｄ−ｌｏａｖｅｄ）」）。心臓の部分を、パラフィンに埋包し、そしてＭａｓｓｏｎの三色組織化学および面積測定による瘢痕領域の決定のために、５μｍの薄さの切片に切断する。骨格筋組織を、骨格筋線維細胞へ分化することが期待される、移植混合物に存在する骨格筋芽細胞に基づいて同定する。骨格筋細胞の同定を、心筋を染色しない、骨格筋反応性抗ミオシン重鎖抗体を用いて免疫組織化学的に行う（例えば、Ｈａｖｅｎｉｔｈら（１９９０）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ９３：４９７−４９９において記載されたＭＹ−３２抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））。
【００７２】
ＴＧＦ−β中で培養したＳｋＭＣで処理したラットにおける心機能は、コントロールグループおよび／またはＴＧＦ−β無しで培養した同様の細胞と比較して、同等またはより良い（少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、５００％またはそれ以上）ことが予期される。さらに、ＴＧＦ−β中で増殖させた細胞は、移植の最初の段階で、増強された増殖および運動性を示すことが予期される。
【００７３】
本明細書は、本明細書中で引用された参考文献の教えに照らして、最も完全に理解される。本明細書中の実施形態は、本発明の実施形態の説明を提供し、そして本発明の範囲を制限すると解釈されるべきでない。当業者は、多くの他の実施形態が本発明によって含まれることを容易に認識する。本開示において引用された全ての出版物および特許および配列は、その全体として参考文献に組み込まれる。参考によって組み込まれる資料の範囲が本明細書に矛盾するか、または一致しない場合、本明細書があらゆるそのような資料に取って代わる。本明細書中におけるあらゆる参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明の従来の技術であることの容認ではない。
【００７４】
他に示されなければ、請求を含む本明細書中で使用される、成分の量、細胞培養物、処理条件等を表す全ての数字は、「約」という用語によって全ての場合において修飾されることが理解される。よって、他にそうでないと示されなければ、数字のパラメーターは近似であり、そして本発明によって得ようとする望ましい性質によって変わり得る。他に示されなければ、一連の要素の前にある「少なくとも」という用語は、その一連の用語の全てを指すことが理解される。当業者は、日常的な実験のみを用いて、本明細書中で記載された本発明の特定の実施形態の多くの同等物を認識する、または確かめることができる。そのような同等物は、以下の請求によって含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、株Ａの第３継代ＨｕＳｋＭＣに対して行った、デスミンおよびＣＤ５６の二重蛍光免疫標識の結果を示す。フローサイトメトリー分析は、２つの主な集団、両方の筋芽細胞マーカーを発現するもの（Ｄｅｓ＋およびＣＤ５６＋）、およびどちらのマーカーも発現しないもの（Ｄｅｓ−およびＣＤ５６−）を明らかにする。
【図２】図２は、ＴＧＦ−β２中の時間の関数として、筋芽細胞マーカーに対するＴＧＦ−β２の効果を説明する。株ＡのＨｕＳｋＭＣを、第２継代において０、０．１７、１、２、または５日間増殖させ、次いで筋芽細胞マーカーデスミンおよびＣＤ５６を検出するために、剥離および蛍光免疫標識した。デスミン陽性（実線）およびＣＤ５６陽性（破線）筋芽細胞集団の平均蛍光。結果は、２組の培養物から平均した。エラーバーは、値の範囲を同定する。Ｄｅｓ＋およびＣＤ５６＋細胞のパーセンテージおよびＣＤ５６の発現レベルは、実質的にＴＧＦ−βによって影響されなかったが、デスミンの発現は徐々に減少した。
【図３】図３は、クレアチンキナーゼ活性に対するＴＧＦ−β２の効果を説明する。同じ株Ａ培養物からの細胞の試料を、それらをフローサイトメトリー分析（図２）のために回収したのと同時に溶解し、次いでクレアチンキナーゼ活性に関して分析した。これらの細胞を、示したように、培養の最終０、０．１７、１、２、または５日間、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β２の存在下で５日間増殖させた。結果を、２組の培養物から平均した。エラーバーは値の範囲を同定する。クレアチンキナーゼ活性（図３）およびデスミン発現（図２）の減少における類似に注意すること。
【図１】
2008502310.tif 000008
【図２】
2008502310.tif 000009
【図３】
2008502310.tif 000010
【誤訳訂正書】
【提出日】平成18年12月4日(2006.12.4)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
成人の哺乳動物骨格筋細胞を増殖させる方法であって、該方法は、
筋芽細胞分化を可逆的に抑制するのに有効な量のＴＧＦ−βが補充されたマイトジェンリッチな細胞培養培地において、該細胞を培養する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記骨格筋細胞が、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞培養培地が、少なくとも５％の血清を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＴＧＦ−βが、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３、もしくはこれらのヘテロダイマーのうちの１つであるか、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記有効な量のＴＧＦ−βが、０．０１ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記骨格筋細胞が、初代細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記骨格筋細胞が、継代されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記骨格筋細胞が、ＴＧＦ−βの存在下において少なくとも１２時間培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記骨格筋細胞が、継代または収集の前に３０％コンフルエントを超えるまで増殖する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記骨格筋細胞が、０．１×１０５細胞／ｃｍ２を超える細胞密度まで増殖する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
骨格筋細胞によるクレアチンキナーゼの発現が、ＴＧＦ−βの補充なしで増殖させたコントロール培養物と比較して少なくとも２０％まで減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＣＤ５６陽性筋芽細胞によるデスミンの発現が、ＴＧＦ−βの補充なしで増殖させたＣＤ５６陽性筋芽細胞と比較して少なくとも２０％まで減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
骨格筋細胞によるクレアチンキナーゼの発現が、ＴＧＦ−βを添加する前の同じ骨格筋細胞の培養物と比較して少なくとも２０％まで減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ＣＤ５６陽性筋芽細胞によるデスミンの発現が、ＴＧＦ−βを添加する前の同じ骨格筋細胞の培養物におけるＣＤ５６陽性の筋芽細胞と比較して少なくとも２０％まで減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法によって作製される、細胞。
【請求項１６】
心筋梗塞を処置するための組成物であって、該組成物は、
請求項１５に記載の細胞を含み、ここで該組成物は、梗塞性心筋層への移植が意図される、組成物。
【請求項１７】
前記細胞が、自己由来または同種異系である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
正常レベルのＣＤ５６および低下したレベルのデスミンを発現する培養骨格筋細胞であって、ここでデスミン発現は、初代培養物におけるよりも少なくとも２０％低い、培養骨格筋細胞。
【請求項１９】
正常レベルのＣＤ５６および低下したレベルのデスミンを発現する培養骨格筋細胞であって、ここでデスミン発現は、ＴＧＦ−βなしで増殖させたコントロール培養物におけるよりも少なくとも２０％低い、培養骨格筋細胞。
【請求項２０】
正常レベルのＣＤ５６および低下した発現レベルのデスミンを発現する培養骨格筋細胞であって、ここでデスミン発現は、ＴＧＦ−βを添加する前の培養物におけるよりも少なくとも２０％低い、培養骨格筋細胞。
【請求項２１】
心筋梗塞を処置するための組成物であって、該組成物は、
請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の細胞を含み、ここで該組成物は、梗塞性心筋層への移植が意図される、組成物。
【請求項２２】
前記細胞が、自己由来または同種異系である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２３】
骨格筋細胞培養物において筋芽細胞の分化状態を評価するための方法であって、該方法は、
該骨格筋細胞培養物中のＣＤ５６陽性細胞の集団によって発現されるデスミンの量を決定する工程
を包含し、該デスミンの閾値レベルより低い量は、該ＳｋＭＣ培養物中の未分化筋芽細胞の存在を示す、方法。
【請求項２４】
前記デスミンの量が、蛍光活性化細胞分離を用いて決定される、請求項２３に記載の方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国出願番号第６０／５０２，７６２号（２００３年１１月１７日出願）に対する優先権を主張し、米国出願番号第６０／５０２，７６２号は、本明細書においてその全体が参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、骨格筋由来細胞、および特に損傷した心臓組織への移植を意図する細胞を増殖させる方法に関連する。本発明はさらに、ＴＧＦ−βを含む細胞培養培地組成物に関連する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ほとんどが心筋の機能不全のためである心不全は、医学的および外科的進歩にも関わらず、よくある、そして生命を脅かす状態である。心筋梗塞によって起こ る心機能の悪化を軽減するための、自己由来ヒト骨格筋細胞（ＨｕＳｋＭＣ）の治療的適用が、いくつかの前臨床および臨床研究において有望であった（例えば、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献 １０；非特許文献１１；非特許文献１２を参照のこと）。これらの研究において、骨格筋生検から得られた骨格筋細胞（ＳｋＭＣ）を、インビトロで増殖させ、そして続いて損傷した心臓組織に注入する。より多い数の注入されたＳｋＭＣ（７×１０５から７×１０６細胞）および改善した心機能の間の相関が、ラット梗塞モデルにおいて確立された（非特許文献１３）。ラットおよびヒト心臓の相対的重量に基づいて、１０９程度の数のＨｕＳｋＭＣが、ヒト患者における治療的有効性のために必要であり得る。このために、生検から入手可能な細胞の数は一般的に限られているので、 ＨｕＳｋＭＣを、いくつかの継代の間増殖させる必要があり得る。難題は、多数の細胞を一貫して産生することだけでなく、培養中の細胞のアイデンティティーおよび分化状態を信頼性高く特徴づけすることでもある。
【０００４】
骨格筋は衛星細胞を含み、それは成熟筋線維の基底膜および筋線維鞘の間に存在する、休止した筋芽細胞前駆体である（非特許文献１４）。成長している、ま たは損傷した筋肉において、衛星細胞は活性化されて増殖する筋芽細胞となり、それは最終的に成熟筋線維へと分化をうける（非特許文献１５）。細胞培養において、衛星細胞の活性化およびその筋芽細胞としての増殖を、骨格筋における細胞の酵素的解離およびマイトジェンリッチな培地における培養によって達成し得 る（非特許文献１４、前出）。
【０００５】
非筋芽細胞系統の細胞、主に線維芽細胞も、酵素的解離時の筋肉組織から放出される。線維芽細胞は、筋芽細胞と同時増殖し、そして潜在的に培養の優位を占 め得る。筋芽細胞の成熟筋細胞への分化は、その増殖の中止を伴い（非特許文献１６）、それが今度は連続的に増殖させたＨｕＳｋＭＣ培養物において線維芽細胞の過剰増殖を可能にする。データは、損傷した心臓組織への移植後に心収縮に寄与するのは骨格筋由来培養物の筋芽細胞であることを示唆するので（例えば、 非特許文献１７を参照のこと）、ＨｕＳｋＭＣの増殖における１つの目標は、線維芽細胞の存在を最小限にすることである。
【０００６】
筋芽細胞の分化は、典型的には培地中の血清および他のマイトジェンの抑制によって誘導される（非特許文献１４、前出）が、マイトジェンリッチな培養にお いてさえも、特に高い細胞密度において、自然発生的な分化がいくらか起こる。従って、ＨｕＳｋＭＣの増殖における別の目的は、筋芽細胞を増殖状態に維持しながら分化を抑制することである。
【０００７】
正常および形質転換した組織において見出される増殖因子である、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）は、研究下にある生物学的システムに 依存して、筋芽細胞の分化を抑制または誘導することが報告されている。例えば、ＴＧＦ−βは、多くのシステムにおいて、主に確立されたクローン細胞系統または胚由来の筋芽細胞に対して行われた研究において、筋芽細胞の分化を抑制することが報告された（非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；非特 許文献２１；および非特許文献２２）。これらの発見と対照的に、他の研究者は、低い細胞密度の条件下で（非特許文献２３）、血清を含まない培地において（非特許文献２４）、およびＬ６Ｅ９筋芽細胞系統を培養するために使用したマイトジェンリッチな培地において（非特許文献２５）、ＴＧＦ−βは筋芽細胞の分化を刺激することを報告した。
【０００８】
ＴＧＦ−βの３つの哺乳動物アイソフォーム（ＴＧＦ−β１、−β２、および−β３）は、一般的にインビトロにおいて細胞に対して同様の効果を有するが、 インビボにおいては区別できる生物学的役割を有しているようである（非特許文献２６）。発達している、および再生している筋肉におけるＴＧＦ−βアイソフォームの時間的および空間的分布は、他の証拠と共に、インビボにおいて筋芽細胞の融合を媒介することによる、筋芽細胞分化におけるＴＧＦ−β２を意味づ ける（非特許文献２６、前出）。
【非特許文献１】Ａｔｋｉｎｓら「Ｈｅａｒｔ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．」、１９９９年、第１８巻：１１７３−１１８０
【非特許文献２】Ｈｕｔｃｈｅｓｏｎら「Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．」、２０００年、第９巻：３５９−３６８
【非特許文献３】Ｐｏｕｚｅｔら「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」、２００１年、第１０２巻：２１０−２１５
【非特許文献４】Ｓｃｏｒｓｉｎら「Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．」、２０００年、第１１９巻：１１６９−１１７５
【非特許文献５】Ｊａｉｎら「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」、２００１年、第１０３巻：１９２０−１９２７
【非特許文献６】Ｇｈｏｓｔｉｎｅら「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」、２００２年、第１０６巻（補遺）：Ｉ−１３１−Ｉ−１３６
【非特許文献７】Ｔｈｏｍｐｓｏｎら「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」、２００３年、第１０８巻（補遺）：ＩＩ−２６４−ＩＩ−２７１
【非特許文献８】Ｍｅｎａｓｃｈｅら「Ｌａｎｃｅｔ」、２００１年、第３５７巻：２７９−２８０
【非特許文献９】Ｍｅｎａｓｃｈｅ「Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．」、２００３年、第５８巻：３５１−３５７
【非特許文献１０】Ｍｅｎａｓｃｈｅら「Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．」、２００３年、第４１巻：１０７８−１０８３
【非特許文献１１】Ｈａｇｅｇｅら「Ｌａｎｃｅｔ」、２００３年、第３６１巻：４９１−４９２
【非特許文献１２】Ｐａｇａｎｉら「Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．」、２００３年、第４１巻：８７９−８８８
【非特許文献１３】Ｐｏｕｚｅｔら「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」、２００１年、第１０４巻：１２２３−１２２８
【非特許文献１４】Ａｌｌｅｎら「Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．」、１９９７年、第５２巻：１５５−１７６
【非特許文献１５】Ｃａｍｐｉｏｎ「Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．」、１９８４年、第８７巻：２２５−２５１
【非特許文献１６】Ｎａｄａｌ−Ｇｉｎａｒｄら「Ｃｅｌｌ」、１９７８年、第１５巻：８５５−８６４
【非特許文献１７】Ｐｏｕｚｅｔら「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」、２００１年、第１０２巻：２１０−２１５
【非特許文献１８】Ｆｌｏｒｉｎｉら「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、１９８６年、第２６１巻：１６５０９−１６５１３
【非特許文献１９】Ｍａｓｓａｇｕｅら「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、１９８６年、第８３巻：８２０６−８２１０
【非特許文献２０】Ｒｏｕｓｓｅら「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、２００１年、第２７６巻：４６９６１−４６９６７
【非特許文献２１】Ｌｉｕら「Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．」、２００１年、第１５巻：２９５０−２９６６
【非特許文献２２】Ｏｌｓｏｎら「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、１９８６年、第１０３巻：１７９９−１８０５
【非特許文献２３】Ｄｅ  Ａｎｇｅｌｉｓら「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、１９９８年、第９５巻：１２３５８−１２３６３
【非特許文献２４】Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄら「Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．」、１９９０年、第１９１巻：１４４−１４８
【非特許文献２５】Ｚｅｎｔｅｌｌａら「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、１９９２年、第８９巻：５１７６−５１８０
【非特許文献２６】ＭｃＬｅｎｎａｎら「Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．」、２００２年、第４６巻：５５９−５６７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、当該分野において、筋芽細胞の分化におけるＴＧＦ−βの役割をより理解する、およびＨｕＳｋＭＣを増殖させる臨床的に適当な方法を開発する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、骨格筋細胞（ＳｋＭＣ）培養物の増殖中に、筋芽細胞の増殖を維持しながら、筋芽細胞の筋細胞への分化を可逆的に抑制する方法を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、ＳｋＭＣ培養物において、構成的な細胞のアイデンティティーおよび／または細胞の分化状態を決定する方法を提供する。
【００１２】
本発明はまたさらに、抑制されたレベルの筋細胞分化マーカーを発現する、分化コンピテントな筋芽細胞でＳｋＭＣ培養物を濃縮する方法を提供する。本発明は、そのような濃縮ＳｋＭＣ培養物およびこれら培養物を利用する治療方法を提供する。
【００１３】
本発明のさらなる局面および利点を、以下の説明において部分的に述べ、そして部分的に説明から理解する、または本発明の実施によって学び得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明をより容易に理解し得るために、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義を、詳細な説明中で述べる。
【００１５】
「ＣＤ５６陽性」という用語は、細胞を説明するために使用された場合、検出可能なレベルのＣＤ５６を発現している細胞を指す。同様に、「デスミン陽性」 という用語は、検出可能なレベルのデスミンを発現している細胞を指す。当該分野において公知の方法を用いて、および／または実施例で記載されるように、発現をタンパク質またはＲＮＡレベル
で検出し得る。
【００１６】
「マイトジェンリッチな培地」という用語は、少なくとも５％の血清または様々な血清の組み合わせを含む培地を指す。
【００１７】
「ＴＧＦ−β」という用語は、他に特に示されなければ、ＴＧＦ−βのいずれか１つの、またはそれ以上のアイソフォームを指す。現在、５つの公知のＴＧＦ −βのアイソフォーム（ＴＧＦ−β１−β５）が存在し、それらは全て実質的にお互い相同的であり（６０−８０％の同一性）、ホモダイマーを形成し、そして共通のＴＧＦ−β受容体（ＴβＲ−Ｉ、ＴβＲ−ＩＩ、ＴβＲ−ＩＩＢ、およびＴβＲ−ＩＩＩ）に対して作用する。ＴＧＦ−βは、種間で高度に保存されてい る。例えば、ブタ、サル、およびヒトの成熟ＴＧＦ−β１（１１２アミノ酸）は同一であり、そしてマウスおよびラットＴＧＦ−β１は、ヒトからわずかに１アミノ酸異なるだけである。ＴＧＦ−βの構造的および機能的局面は、当該分野において周知である（例えば、Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍら（編）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ   Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、２００１、７１９−７４６頁を参照のこと）。ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３のみが哺乳動物において見出される。３つのアイソフォームのタンパク質登録番号の部分的なリストを、表１で提供する。
【００１８】
【表１】
2008502310.tif 000011
他に示されなければ、述べられるＴＧＦ−βの量は、培地に加えられた活性ＴＧＦ−βの量を指し、そしてその量が血清供給源に依存して異なり得る、血清中 に自然に存在するＴＧＦ−βを含まない。最も優勢なＴＧＦ−βの形式であるＴＧＦ−β１の報告された血清濃度は、１から３３ｎｇ／ｍｌの間で異なる（Ｋｙｒｔｓｏｎｉｓら（１９９８）Ｍｅｄ．Ｏｎｃｏｌ．、１５：１２４−１２８）。製造会社によると、実施例で利用したＤｅｆｉｎｅｄ  Ｆｅｔａｌ   Ｂｏｖｉｎｅ  ＳｅｒｕｍにおけるＴＧＦ−β１の量は、平均２１ｎｇ／ｍｌである（Ｗｉｇｈｔ（２０００）Ａｒｔ  ｔｏ  Ｓｃｉｅｎｅｃｅ、第１９巻（３）：１−３）。しかし、様々な血清中に自然に存在するほとんどのＴＧＦ−βは、不活性な形式であり、すなわち、増殖因子の成熟形式に非共有結合的に結 合したプロペプチドと共にある。
【００１９】
ＴＧＦ−βは多様な生物活性を示すので、ＴＧＦ−βの量および／または活性を検出および定量するために、様々なアッセイを使用し得る。ＴＧＦ−β活性に関する、より頻繁に使用されるインビトロバイオアッセイのいくつかの例は、以下のものを含む：
（１）ＥＧＦ存在下で軟寒天におけるＮＲＫ細胞のコロニー形成の誘導（Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８：５３３９−５
３４３）；
（２）原始的な間葉系の細胞が軟骨の表現形を発現する分化の誘導（Ｓｅｙｅｄｉｎら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：２２６７−２２７１）；
（３）Ｍｖ１Ｌｕミンク肺上皮細胞（Ｄａｎｉｅｌｐｏｕｒら（１９８９）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１３８：７９−８６）およびＢＢＣ−１サル腎 臓細胞（Ｈｏｌｌｅｙら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：５９８９−５９９２）の増殖の阻害；
（４）Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス胸腺細胞の有糸分裂誘発の阻害（Ｗｒａｎｎら（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．、６：１６３３−１６３６）；
（５）ラットＬ６筋芽細胞の分化の阻害（Ｆｌｏｒｉｎｉら（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６１：１６５０９−１６５１３）；
（６）フィブロネクチン産生の測定（Ｗｒａｎａら（１９９２）Ｃｅｌｌ、７１：１００３−１０１４）；
（７）ルシフェラーゼリポーター遺伝子に融合したプラスミノーゲン活性化因子阻害薬１（ＰＡＩ−１）プロモーターの誘導（Ａｂｅら（１９９４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１６：２７６−２８４）；および
（８）サンドイッチ型酵素結合免疫吸着検定法（Ｄａｎｉｅｌｐｏｕｒら（１９８９）Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ、２：６１−７１）。
【００２０】
「初代培養」および「初代細胞」という用語は、そのままの、または解離した組織または臓器断片に由来する細胞を指す。培養物は、それが継代される（または継代培養される）まで初代と判断され、その後は「細胞系統」または「細胞株」と呼ばれる。「細胞系統」という用語は、均質性または培養が特徴付けされた程度を意味しない。細胞系統は、もしそれが培養細胞の集団中の単一細胞に由来する場合、「クローン細胞系統」または「クローン」と呼ばれる。他に示されなければ、「骨格筋細胞（ＳｋＭＣ）」および「ＳｋＭＣ培養物」という用語は、初代および継代された骨格筋細胞の両方を指す。「ＳｋＭＣ」および「ＳｋＭＣ培養物」という用語は、骨格筋から単離された細胞、および精製筋芽細胞を含む（しかしそれに限らない）、それから精製、分離、および／または継代された非クローン細胞を指す。「高密度」という用語は、５０，０００細胞／ｃｍ２または５０％コンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）より高い細胞密度を指す。
【００２１】
「継代」という用語およびその同種のものは、細胞を新しい培養容器に移し、細胞集団を増殖させる、または同型培養を設定する過程を指す。文脈に依存し て、「継代」という用語はまた、継代された培養物中の細胞、および／または連続する継代間の期間も指し得る。他に示されなければ、「第１継代」は初代培養を指す；「第２継代」は初代培養から継代された細胞を指す；「第３継代」は第２継代培養物から継代された細胞を指す、等である。
【００２２】
本発明は、部分的には、ＴＧＦ−β２は、高密度の培養においてさえも、成人ＨｕＳｋＭＣの連続的に増殖させた培養物において、筋芽細胞の分化を可逆的に 抑制するという発見および実証に基づく。筋芽細胞の分化の抑制は、筋芽細胞分化の確立されたマーカーであるクレアチンキナーゼの発現の抑制によって確認された。これらの結果は、ＴＧＦ−βを使用して、臨床的に使用するためのＨｕＳｋＭＣの大規模産生の間に、筋芽細胞の分化を抑制し得ることを示す。ＳｋＭＣ の連続的な増殖の間に筋芽細胞の分化を阻害することによって、ＴＧＦ−βは筋芽細胞集団を増殖性の、分化コンピテントな状態に維持する。ＳｋＭＣの培養物が高密度になった後でさえも筋芽細胞の分化を抑制するＴＧＦ−βの能力は、ＳｋＭＣの連続的な増殖の間に、より頻繁でない継代、および／またはより小さい 組織培養表面領域を可能にする。未分化の細胞は、移植の最初の段階で増強された増殖および運動性を示すと考えられるので、ＴＧＦ−β中のＳｋＭＣの増殖はまた、一旦損傷し
た心臓組織に注入されたら、筋芽細胞の移植を促進し得る。
【００２３】
よって、本発明の１つの局面は、培養物中でＳｋＭＣを増殖させる方法である。ある実施形態において、ＳｋＭＣは成人哺乳動物から得られた初代または継代 細胞、例えばＨｕＳｋＭＣである。本発明の関連する局面は、抑制されたレベルの筋細胞分化マーカーを発現する、分化コンピテントな筋芽細胞でＳｋＭＣ培養物を濃縮する方法である。その方法は、筋芽細胞の分化を可逆的に抑制するのに有効な量のＴＧＦ−βを添加したマイトジェンリッチな細胞培養培地でＳｋＭＣ を培養することを含む。様々な実施形態において、ＳｋＭＣはＴＧＦ−βを添加した培地で、例えば少なくとも１２、２４、３６、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８時間またはそれ以上、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、および／または続く継代で培養された、初代または継代細胞である。さらな る実施形態において、１つまたはそれ以上の継代において、継代および／または回収の前に、細胞によって占められる培養表面のパーセンテージによって測定される、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％またはそれより高いコンフルエント以上、または０．１、 ０．２５、０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．１、２．３、２．５、２．７５、３、３．２５、３．５、３．７５、４、５×１０５細胞／ｃｍ２またはそれ以上の密度以上まで、細胞を増殖させる。説明の実施形態において、細胞を、ＴＧＦ−βの存在下で、第２継代で１、２、または５日間増殖させる。
【００２４】
様々な実施形態において、ＴＧＦ−βはＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３の１つまたはそのあらゆる組み合わせ、またはそのヘテロダイマー である。ＴＧＦ−β４およびＴＧＦ−β５も使用し得る。培地に添加するＴＧＦ−βの量は、筋芽細胞の分化を抑制するために有効である。いくつかの実施形態において、有効な量は０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、１．５、２、３、４、５、１０、２０、または４０ｎｇ／ｍｌである、または０．０１から ２００、０．０１から１００、０．０１から５０、０．０１から２０、０．２から５０、０．２から２０、０．２から１０、０．２から５、０．２から２、０．５から５、および０．５から２ｎｇ／ｍｌの範囲から選択される。説明の実施形態において、培地に１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β２を添加する。
【００２５】
本発明はさらに、部分的には、ＣＤ５６陽性筋芽細胞によるデスミン発現の抑制は、ＴＧＦ−βによる筋芽細胞分化の抑制と関連し、一方ＣＤ５６の発現はＴＧＦ−βによって影響されないという発見および実証に基づく。
【００２６】
培養物における骨格筋細胞のクローン増殖および分化は、最初にＫｏｎｉｇｓｂｅｒｇ（１９６３）Ｓｃｉｅｎｃｅ、１４０：１２７３によって報告された。分化の間に、筋芽細胞は有糸分裂後のＧ０期に入り、そしてプレーティング後４８時間以内に筋芽細胞の融合（融合バースト（ｆｕｓｉｏｎ−ｂｕｒｓｔ））が明らかになる。融合バーストの頃に、筋肉特 異的遺伝子（例えばクレアチンキナーゼ）の転写がアップレギュレートされる（Ｐａｔｅｒｓｏｎら（１９７２）Ｃｅｌｌ、１７：７７１；Ｄｅｌｖｉｎら（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ、２７０：７２５）。ＡＴＰの再産生によって筋肉収縮のためのエネルギーを供給する、クレアチンキナーゼ活性は、筋芽細胞分化の 長く確立した定量可能なマーカーであり、筋芽細胞の融合と関連する（Ｓｈａｉｎｂｅｒｇら（１９７１）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、２５：１−２９）。
【００２７】
中間径フィラメントタンパク質デスミンは、増殖中の骨格筋芽細胞に発現し（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５：９６０６−９６１０；Ｌａｗｓｏｎ−Ｓｍｉｔｈら（１９９８）Ｊ．Ａｎａｔ．、１９２：１６１−１７１）、そして骨格筋の成熟筋細胞において優勢である（Ｌａｚａｒｉｄｅｓら（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７３：４３４４−４３４８）
。デスミンのアップレギュレーションは、筋芽細胞分化のシグナルである。対照的に、ＣＤ５６（ＮＣＡＭまたは抗原Ｌｅｕ−１９とも呼ばれる）は、増殖中の 筋芽細胞に構成的に発現する（Ｉｌｌａら（１９９２）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、３１：４６−５２；およびＢｅｌｌｅｓ−Ｉｓｌｅｓら（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．、３７：３７５−３８０）が、成熟筋肉には存在しない（Ｓｃｈｕｂｅｒｔら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８６：３０７−３１１）。あるリンパ球およびニューロンを含む他の細胞もＣＤ５６を発現するが、線維芽細胞は発現しない。デスミンおよびＣＤ５６はどちらも、骨格筋から培養された細胞における、筋芽細胞の信頼性の高いマーカーと考えられる。
【００２８】
本発明は、部分的には、骨格筋培養物のうちほとんど全ての細胞を、２つの集団：（１）ＣＤ５６＋、デスミン＋、ＴＥ７−細胞、および（２）ＣＤ５６−、デスミン−、ＴＥ７＋細胞が説明するという発見および実証に基づく。これらの２つの集団は、それぞれ筋芽細胞および線維芽細胞である。デスミンおよびＣＤ５６は、増殖中の骨格筋 芽細胞の２つのマーカーである。ＴＥ７は、骨髄（Ｃａｔｔｏｒｅｔｔｉら（１９９３）Ｂｌｏｏｄ、８１：２２５−２５１）および胸腺組織切片（Ｈａｙｎｅｓら（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１５９：１１４９−１１６８）の線維芽細胞ストローマ細胞に結合するモノクローナル抗体である。 ＴＥ７抗原は、インビトロにおいて線維芽細胞のマーカーである（Ｒｏｓｅｎｄａｌら（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．、１０２：２９−３７）。
【００２９】
本発明はさらに、部分的には、ＣＤ５６陽性（ＣＤ５６＋）筋芽細胞によるデスミン発現の抑制は、ＴＧＦ−βによる筋芽細胞分化の抑制と関連し、一方 ＣＤ５６の発現はＴＧＦ−βによって影響をうけないという発見および実証に基づく。一般的に受け入れられた筋芽細胞のマーカーであるデスミンの喪失にも関わらず、ＴＧＦ−β２は、予測され得たように、別の細胞型への分化転換による筋芽細胞表現型の喪失を引き起こさない（例えば、Ｋａｔａｇｉｒｉら （１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１２７：１７５５−１７６６を参照のこと）。
【００３０】
よって、本発明の別の局面は、ＳｋＭＣ培養物において、筋芽細胞の分化状態を評価する方法である。その方法は、ＳｋＭＣ培養物においてＣＤ５６陽性細胞 の集団によって発現されるデスミンの量を決定することを含み、ここで閾値レベル以下のデスミンの量は、ＳｋＭＣ培養物における未分化の筋芽細胞の存在を示す。
【００３１】
さらなる局面において、本発明は、本発明の方法によって、ＴＧＦ−βを添加した培地で増殖させたＳｋＭＣを提供する。ＳｋＭＣを、哺乳動物（例えばラット、マウス、ウシ、ブタ、サル、およびヒト）および非哺乳動物（例えば鳥類）を含む脊椎動物種の骨格筋から得ることができる。ＳｋＭＣに関して「成人」という用語は、これらの細胞を胎児性のＳｋＭＣと区別するために、出生後の動物（例えばヒト）に由来するＳｋＭＣに関して使用される。
【００３２】
本発明の組成物は、正常レベルのＣＤ５６および抑制されたレベルのデスミンを発現する、分化コンピテントな筋芽細胞で濃縮された培養ＳｋＭＣを含む。あ る実施形態において、ＣＤ５６陽性筋芽細胞によるデスミン発現は、（ａ）ＴＧＦ−βの添加無しに増殖させたコントロール培養物および／または（ｂ）初代細胞と比較して、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０％またはそれ以上抑制される。ある実施形態において、ＴＧＦ−β中で増殖させたＣＤ５６陽性 筋芽細胞によるデスミン発現は、ＴＧＦ−βの添加前の同じ培養物におけるＣＤ５６陽性細胞と比較して、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０％またはそれ以上抑制される。
【００３３】
本発明の組成物はさらに、抑制された量のクレアチンキナーゼを発現する培養ＳｋＭＣ
を含む。ある実施形態において、ＳｋＭＣによるクレアチンキナーゼ発現は、ＴＧＦ−βの添加無しに増殖させたコントロール培養物と比較して、少なくとも ２０、３０、４０、５０、６０、７０％またはそれ以上抑制される。ある実施形態において、ＴＧＦ−β中で増殖させたＳｋＭＣによるクレアチンキナーゼ発現は、ＴＧＦ−βの添加前の培養物における同じＳｋＭＣと比較して、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０％またはそれ以上抑制される。発現レベル は、関連する細胞集団の細胞数あたりで言及される。
【００３４】
ＣＤ５６、デスミンおよびクレアチンキナーゼのレベルを、ＲＮＡまたはタンパク質レベルで測定し得る。ＲＮＡレベルを、例えば定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロッティング、または例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（編）Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９において記載された ような、ＲＮＡレベルを決定する別の方法によって決定し得る。ＣＤ５６、デスミン、およびクレアチンキナーゼの発現レベルを、フローサイトメトリー（蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ））、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、酵素活性アッセイ（例えばクレアチンキナーゼアッセイ）または例え ばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら（編）Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９８８）または実施例において記載されたような、タンパク質レベルを決定する別の方法を用いてタンパク質レベルで測定し得る。
【００３５】
ＳｋＭＣの単離および培養の方法を含む、細胞の単離および培養方法は、当該分野で公知であり、そして例えばＤａｖｉｓ（編）Ｂａｓｉｃ  Ｃｅｌｌ   Ｃｕｌｔｕｒｅ、第２版、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００２、２４４−２４７頁、または実施例において記載されたように実施し得る。一般的に、必須栄養素、ビタミン、細胞機能を支えるために必要な補助因子を提供する培地中で、細胞を維持する。ほとんど の哺乳動物細胞に関して最適な培養条件は、典型的には７．２−７．５のｐＨ、２８０−３２０ｎＯｓｍｏｌ／ｋｇの容量オスモル濃度、２−５％のＣＯ２、および３２−３７℃の温度を含む。典型的には、骨格筋培養物を、５−２０、７−１５、または１０％の血清を含むマイトジェンリッチな培地中で増殖させる。 血清を、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、または他の供給源から得ることができる。血清および血清バッチの選択は、部分的には使用者の経験的な評価に基づく。±２０％以内の細胞収量におけるバッチからバッチの変動は、通常十分であると判断される。
【００３６】
当業者はまた、本発明の方法において使用される培地を、様々な公知の培地、例えばイーグルの培地（Ｅａｇｌｅ（１９５５）Ｓｃｉｅｎｃｅ、１２２： ５０１）、ダルベッコの最少必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏら（１９５９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８：３９６）、Ｈａｍの培地（Ｈａｍ（１９６３）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、２９：５１５）、Ｌ−１５培地（Ｌｅｉｂｖｉｔｚ（１９６３）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｙｇ．、７８：１７３）、ＭｃＣｏｙ  ５Ａ培地 （ＭｃＣｏｙら（１９５９）Ｐｒｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、１００：１１５）、ＲＰＭＩ培地（Ｍｏｏｒｅら（１９６７）Ｊ．Ａ．Ｍ．Ａ．、１９９：５１９）、ウィリアムスの培地（Ｗｉｌｌｉａｍｓ（１９７１）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、６９：１０６−１１２）、ＮＣＴＣ  １３５培地 （Ｅｖａｎｓら（１９６８）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、３６：４３９）、Ｗａｙｍｏｕｔｈの培地ＭＢ７５２／１（Ｗａｙｍｏｕｔｈ（１９５９）Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．、２２：１００３）等から調製し得ることを認識する。これらの培地を単独で、または適当な割合で混合物として使用し て、細胞培養培地を調製し得る。あるいは、培地を個々の化学物質から、および／または他の培地および例えば表２で特定されたような増殖添加物から調製し得る。本発明は、いかなる特定の濃度の培地に限らず、そして液体から半固体組成物までの範囲の培地の使用を含む。本発明の方法は、単層、多層、固体支持体 上、懸濁液中、および３Ｄ培養を含む（しかしそれに限らない）、様々な条件下の培養中で増殖する細胞に適当であ
る。
【００３７】
【表２−１】
2008502310.tif 000012
【００３８】
【表２−２】
2008502310.tif 000013
さらに別の局面において、本発明は、本発明の方法によって増殖させた自己由来または同種ＳｋＭＣの移植（例えばヒトにおいて）によって心筋梗塞を処置する方法を含む（しかしこれに限らない）、ＳｋＭＣを利用する治療的方法を提供する。ＴＧＦ−β中で増殖させた細胞は、移植の最初の段階で増強された増殖および運動性を示し、そして心機能の改善を引き起こすことが期待される。
【００３９】
以下の実施例は、本発明の説明的な実施形態を提供する。当業者は、本発明の意図または範囲を変えることなく行い得る多くの修飾およびバリエーションを認 識する。そのような修飾およびバリエーションは、本発明の範囲内に含まれる。実施例は、いかなる方法においても本発明を制限しない。
【実施例】
【００４０】
（実施例１：ＨｕＳｋＭＣ株の由来）
ＨｕＳｋＭＣを、２５歳男性死体の大腿四頭筋（株Ａ）、７７歳女性で切断手術を受けた人の大腿直筋（株Ｂ）、３６歳女性死体の大腿四頭筋（株Ｃ）、または４５歳男性死体の外側（ｌａｔｅｒｕｓ）広筋（株Ｄ）に由来した。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＤＲＩ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）によって提供された死体組織を、死後８から１９時間で入手した。骨格筋を輸送および０−４℃で２−４日間、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ’ｓ  ＳｏｌｕｔｉｏｎまたはＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）中で維持した。筋肉から明らかな結合組織および脂肪を切り取り、そしてリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中ですすいだ。少なくとも４グラムの湿潤重量を有する、切り取った筋肉を、約１ｍｍ３の破片に切り刻んだ。切り刻んだ筋肉を、４７０Ｕ／ｍｌのＩＩ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）中で、筋肉１グラムあたり１５−３０ｍｌの消化溶液を用いて、断続的に攪拌しながら３７℃で１時間消化した。細胞および不完全に消化された組織を、４５０ｇで７分間遠心することによって回収し、そしてペレットを０．２５％のトリプシン、１ｍＭのＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で、３７℃で２０分間消化した。胎児ウシ血清（ＦＢＳ）で消化を止め、そして細胞懸濁液を１００μｍのフィルターでろ過して不完全に消化された組織を除去した。細胞ろ液をペレット化し、そして培地に再懸濁した（実施例２を参照のこと）。第１継代における増殖のために、９−１１ｍｇの切り取った筋肉それぞれからの収量を、ＢｉｏＣｏａｔＴＭコラーゲン−Ｉでコートした組織培養フラスコ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）の１ｃｍ２あたりにまいた。ある場合には、１時間のプレプレーティング工程を使用し、それは線維芽細胞のより迅速な接着を利用することによって筋芽細胞を濃縮すると言われている。１日後、接着していない細胞および組織小片を含む培地を、新しい培地と交換した。
【００４１】
（実施例２：ＨｕＳｋＭＣの増殖）
すべての培養物を、コラーゲンＩでコートしたフラスコを用いて、３７℃、５％ＣＯ２、加湿雰囲気で増殖させた。増殖のための培地は、ＧＬＵＴＡＭＡＸＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ、１５−２０％のＦＢＳ（カタログ番号ＳＨ３００７１； Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を含むＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２から成っていた。株Ｄの増殖全体および初代継代後の株Ａの増殖に２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを使用した以外は、ｂＦＧＦの濃度は ５ｎｇ／ｍｌであった。初代継代後の播種密度は、５×１０３細胞／ｃｍ２であった。ＴＧＦ−β２（Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を、他の実施例で示したように加えた。培養物に、２−４日ごとに新しい培地を与えた。７０−１００％コンフルエント、８×１０４から１．５×１０５細胞／ｃｍ２の範囲の密度の時に、細胞を０．０５％のトリプシン、０．５ｍＭのＥＤＴＡで剥離し、そして細胞懸濁液を継代培養、または下記で記載するように分析した。あ る場合には、細胞を継代の間に、１０％のジメチルスルホキシド、４０％のＦＢＳ、５０％の培地中で低温保存した。研究を第２または第３継代において行った。各継代の期間は、４から７日間の範囲であった。
【００４２】
別の研究において、１ロットの１０％ＦＢＳ中の活性ＴＧＦ−β１および−β２の量を、ＥＬＩＳＡに基づくＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＴＭキッ ト（カタログ番号ＤＢ１００およびＤＢ２５０、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を用いて定量した。活性化形式のＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２は、３１ｐｇ／ｍｌ（０．０３１ｎｇ／ｍｌ）より少ない検出レベル以下であったが、ＴＧＦ−βの酸性化後に測定した全ＴＧＦ−β１および ＴＧＦ−β２の量は、それぞれ１．１ｎｇ／ｍｌおよび０．１８ｎｇ／ｍｌであった。
【００４３】
（実施例３：フローサイトメトリーのための免疫標識手順）
デスミンまたはＴＥ７を検出するために、間接的蛍光免疫標識を行った。ＨｕＳｋＭＣ懸濁液を、ＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒドで、２０−２５℃で ２０分間固定した。固定した細胞を洗浄し、そしてＰＢＳ中０．１％のサポニン、１０％のＦＢＳ（サポニン透過処理緩衝液（ＳＰＢ））中２．５−５．０μｇ／ｍｌのマウス抗デスミン抗体（クローンＤ３３；Ｄａｋｏ  Ｃｏｒｐ、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）と、またはＳＰＢ中
２．２から４．０μｇ／ｍｌのマウス「抗線維芽細胞」抗体（クローンＴＥ７；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｆｌａｎｄｅｒｓ、ＮＪ）と、 ２０−２５℃で３０分間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、そしてＳＰＢ中１４μｇ／ｍｌのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）と、４℃で３０分間インキュベートした。
【００４４】
ＣＤ５６を検出するために、直接的蛍光免疫標識を行った。ＨｕＳｋＭＣ懸濁液を、ＰＢＳ中１．２５μｇ／ｍｌのフィコエリトリン（ＰＥ）−結合マウス抗 ＣＤ５６抗体（クローンＮＣＡＭ１６．２、ＢＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）と、４℃で３０分間インキュベートした。
【００４５】
デスミンおよびＣＤ５６の同時発現を検出するために、二重蛍光免疫標識を行った。ＨｕＳｋＭＣをＰＥ結合抗ＣＤ５６抗体で標識した後、細胞を上記のよう にパラホルムアルデヒドで固定し、そしてＰＢＳ中で洗浄した。次いで、固定した細胞をＳＰＢ中２．５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ結合マウス抗デスミン抗体（クローンＤ３３、Ｄａｋｏ  Ｃｏｒｐ、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）と、４℃で３０分間インキュベートした。
【００４６】
すべてのインキュベーションを、連続的に振とうしながら細胞懸濁液に対して行った。全ての洗浄のためにＰＢＳを使用し、そして免疫標識した細胞を、フローサイトメトリーのためにＰＢＳ中４℃で保存した。
【００４７】
（実施例４：フローサイトメトリー）
ＦＡＣＳｔａｒ  ＰｌｕｓＴＭフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて細胞を分析した。試料あたり１０，０００イベントのデータ取得を、ゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）無しで行った。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔＴＭソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いてデータを分析した。アイソタイプがマッチしたネガティブコントロール抗 体で免疫標識したＨｕＳｋＭＣを、ＣＤ５６に関する参照として分析した。ＨｕＳｋＭＣ株の低温保存した細胞バンクを、デスミンおよびＴＥ７免疫標識およびフローサイトメトリー分析のための参照基準として調製した。報告された各研究のために、参照バンクからの細胞試料を解凍し、免疫標識し、そしてフローサイ トメトリーによって分析した。２１の独立したアッセイにおいて試験した参照基準は、平均して５２．７％デスミン陽性（変動計数＝６．２％）および４６．１％ＴＥ７陽性（変動計数＝６．２％）であった。
【００４８】
蛍光対前方散乱光の密度プロットにおいて、陽性集団を、陰性および陽性集団を最も良く分ける直線が１つの片の境界となった多角形の領域内で定量した。柱 状グラフにおいて、陽性集団を、陰性および陽性ピークの間の最下点で始まり、そして蛍光強度目盛りの上部端まで伸びる領域マーカーを設定することによって定量した。
【００４９】
（実施例５：筋管の可視化）
細胞をコラーゲンコーティングがないスライドフラスコ（ｓｌｉｄｅｆｌａｓｋ）（Ｎｕｎｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に播種したことを除いて、ＨｕＳｋＭＣを上 記のように増殖させた。培養がコンフルエントになった時、それを上記で記載した基本培地および抗生物質を含む１％ＦＢＳ中で２週間維持した。次いで接着した細胞単層を固定し、そしてインキュベーション期間を５０％増加させ、そしてインキュベーション間にＰＢＳでより徹底的な洗浄を行った以外は、細胞懸濁液 に関して上記で記載したように、デスミンの検出のために間接的蛍光免疫標識をした。スライドフラスコの顕微鏡スライドをはずし、そして４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ：Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を含む固定培地（ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）を用い
てカバーガラスをした。台に乗せた細胞を、蛍光顕微鏡を用いて１００×の倍率で写真を撮り、そしてＦＩＴＣ（デスミン）およびＤＡＰＩ（核）の画像を重ねた。
【００５０】
（実施例６：クレアチンキナーゼアッセイ）
血清を豊富に含む培地（上記で記載した）で増殖させた、または分化後のＨｕＳｋＭＣに対してアッセイを行った。標準的な組織培養フラスコに８×１０４細胞／ｃｍ２の密度で播種し、そして増殖培地中で１日間、次いで２％ＦＢＳ中で示した期間培養することによって分化を誘導した。
【００５１】
ＰＢＳ（ｐＨ８．０）中７５μｌの０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ＴＭ中に、２０−２５℃で１０分間懸濁することによって、約２×１０６細胞のペレットを溶解した。細胞レベル下の小片を、４℃で、１６，０００ｇで２０分間遠心することによって除去し、そして上清をＰＢＳ、ｐＨ８．０中 ２０ｍＭのグリシンと１：１で混合した。試料をアリコートに分け、そしてクレアチンキナーゼ活性および全タンパク質の定量のために−８０℃で保存した。
【００５２】
クレアチンキナーゼ活性の決定のための試薬混合物を、動力学アッセイにおいて、製造会社の指示によって使用した（手順＃４７−ＵＶ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。この方法によって、細胞抽出物中のクレアチンキナーゼを、基質および酵素の試薬混合物と組み合わせて一連の酵素反応を開始し、それは最終的にＮＡＤＨを産生し、それが３４０ｎｍにおける吸光度を増加させた。ａｂｓ３４０／ 時間の相関係数が０．９９より大きかった場合にのみ、データを考慮のために受け入れた。各細胞抽出物を、９６穴マイクロタイタープレートの３組のウェルで試験した。クレアチンキナーゼ活性を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイにおいてウシ血清アルブミン標準曲線に対して測定した、全タンパク質に対して標準化した。 両方のアッセイの吸光度読み取りを、ＳｐｅｃｔｒａｍａｘＴＭ  Ｐｌｕｓ３８４分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて、直接マイクロタイタープレートのウェルにおいて行った。
【００５３】
上記のアッセイの参照標準、分化したＨｕＳｋＭＣ培養物からの抽出物を、上記のように調製し、アリコートに分け、そして−８０℃で保存した。参照標準 を、４ヶ月以上の期間に渡って、４６の独立したアッセイにおいて試験した。全てのクレアチンキナーゼアッセイに含まれた参照標準のアッセイ結果は、平均して０．７２４クレアチンキナーゼユニット／ｍｇタンパク質であり、変動係数は７．８％、そして保存中に活性の損失は示さなかった。
【００５４】
（実施例７：ノーザン分析）
ＨｕＳｋＭＣ懸濁液をペレット化し、ＲＮＡｌａｔｅｒＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）中で急速冷凍（ｓｎａｐ  ｆｒｏｚｅｎ）し、そして−８０℃で保存した。ＱｉａＳｈｒｅｄｄｅｒＴＭ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）およびＲＮｅａｓｙＴＭ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）キットに含まれるプロトコールを用いてＲＮＡを単離し、そして２８０ｎｍの吸光度を測定することによって定量した。ウェルあたり ８μｇを負荷した後、１％のアガロース、５％のホルムアルデヒドゲル中で電気泳動によってＲＮＡを分離した。ＲＮＡをゲルからナイロン膜に移し、そしてヒトデスミンｃＤＮＡの３２Ｐ標識７８０ヌクレオチド断片でプローブ探査した。デスミンｍＲＮＡを、ＢＡＳ−１５００ホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）（Ｆｕｇｉｆｉｌｍ、Ｓｔａｎｆｏｒｄ、ＣＴ）およびＩｍａｇｅＧｕａｇｅＴＭＶ３．４６ソフトウェア（Ｆｕｇｉｆｉｌｍ）を用いて定量した。
【００５５】
（実施例８：ＨｕＳｋＭＣ培養物は、筋芽細胞および線維芽細胞の混合集団である）
ＨｕＳｋＭＣを、ＨｕＳｋＭＣの増殖に関して記載されたように、コラーゲンでコート
したフラスコで培養した。第３継代において、筋芽細胞マーカーデスミンおよびＣＤ５６に関する二重蛍光免疫標識を行った（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：９６０６−９６１０；およびＢｅｌｌｅｓ−Ｉｓｌｅｓら（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．、３７：３７５−３８０）。２０人以上のドナーからのＨｕＳｋＭＣ培養物を、フローサイトメトリーによって分析した。その結果は、培 養物は典型的には２つの主要な細胞の集団：デスミンおよびＣＤ５６マーカーの両方を発現するもの（すなわち筋芽細胞）およびどちらのマーカーも発現しないものから成ることを明らかにした。代表的な培養物（株Ａ）のフローサイトメトリー分析の結果を、図１に示す。
【００５６】
増殖したＨｕＳｋＭＣ培養物における分化コンピテントな筋芽細胞の存在を確認するために、細胞を、筋芽細胞の分化を増強する条件においた、すなわち低血 清で培養した。具体的には、ＨｕＳｋＭＣの増殖に関して記載したように、ＨｕＳｋＭＣをコラーゲンでコートしたフラスコにおいて第１継代で培養した。次いで細胞を、コラーゲンコーティング無しの培養フラスコに、低密度で播種し、第２継代でコンフルエントな密度まで増殖させ、次いで細胞を１％の血清中で２週 間維持して筋管の形成を促進した。分化した細胞を培養フラスコに接着している間に固定した。デスミンを蛍光免疫標識によって検出し、そして核をＤＡＰＩで染色した。多核性の筋管が観察され、培養物中の筋芽細胞が分化したことを示した。
【００５７】
増殖したＨｕＳｋＭＣ培養物における分化コンピテントな筋芽細胞の存在をさらに確認するために、第２継代のＨｕＳｋＭＣを、コートしていないフラスコに８０，０００細胞／ｃｍ２でまき、示した期間２％血清中で分化を誘導し、そしてクレアチンキナーゼ活性に関して評価した。クレアチンキナーゼ活性は、時間とともに増加し、培養物中の筋芽細胞が分化したことを示した。代表的な研究（株Ｄ）の結果を、表３に示す。
【００５８】
【表３】
2008502310.tif 000014
ＨｕＳｋＭＣの非筋芽細胞集団を特徴付けるために、低および高純度の筋芽細胞のＨｕＳｋＭＣ株（それぞれ株ＢおよびＣ）を、低温保存したバンクから解凍し、そして独立に、または約同等の割合で２つの株を混合した後（株Ｂ＋Ｃ）、第２継代まで増殖させた。低（株Ｂ）、中程度（株Ｂ＋Ｃ）および高（株Ｃ）純度の筋芽細胞の第２継代培養物を、ＴＥ７抗原またはデスミンを発現する細胞の定量のために、フローサイトメトリー分析にかけた。各培養物において、筋芽細胞純度に関係なく、デスミン陽性およびＴＥ７陽性細胞の画分は、総計約１００％であった。細胞サイズの尺度である、フローサイトメトリーによる前方散乱光のパターンは、デスミン陰性およびＴＥ７陽性集団の間で同様であった。合わせると、そのデータは、デスミンおよびＴＥ７抗原の発現は、相互に両立しないことを示す。適当な細胞をポジティブコントロールとして使用した、アセチル化ＬＤＬ取り込みアッセイ（Ｖｏｙｔａら（１９８４）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、９９（６）：２０３４−２０４０）およびオイルレッドＯアッセイ（Ｋｕｒｉ−Ｈａｒｃｕｃｈら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５（１２）：６１０７−６１０９）を用いて、ＨｕＳｋＭＣ培養物において、内皮または脂肪細胞は検出されなかった。そのデータは、増殖したＨｕＳｋＭＣは、ほとんど全部が２つの主要な細胞集団、すなわち分化コンピテントな筋芽細胞および線維芽細胞から成っていたことを示す。
【００５９】
（実施例９：ＨｕＳｋＭＣ増殖中のＴＧＦ−βの効果）
ＨｕＳｋＭＣの細胞増殖および分化に対するＴＧＦ−βの効果を決定するために、株Ａの細胞を、第２継代において増殖させ、そしてそれぞれ５日間の培養期 間の終わりまで延長する、異なる間隔の間、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β２に接触させた。次いで細胞を免疫標識し、そして上記で記載したように、デスミンおよびＣＤ５６発現の定量的検出のために、フローサイトメトリーによって分析した。デスミン陰性ピークの蛍光強度のパターンはＴＧＦ−β２によって影響されな かったが、デスミン陽性ピークの蛍光強度は、ＴＧＦ−β２への接触の時間が増加するにつれて、連続的な減少を示した。この変化は、筋芽細胞集団におけるデスミン発現の減少を反映していた。
【００６０】
フローサイトメトリー結果の定量（図２）は、ＴＧＦ−β２に５日間接触させたＨｕＳｋＭＣの筋芽細胞集団の平均蛍光強度は、未処理細胞のものの４８％で あったことを示した。デスミン発現における減少の約半分は、ＴＧＦ−β２への接触の１日後に起こった。ＴＧＦ−β２に反応した、観察されたデスミン発現における減少は、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β２の存在下または非存在下のいずれかで、２組で４日間増殖させた同じ株由来の細胞の、ノーザン分析の結果によって さらに支持された。デスミンｍＲＮＡを検出するノーザンブロットを、上記で記載したように調製および定量した。ＴＧＦ−β２に接触させた培養物由来のデスミンＲＮＡに対応するノーザンブロットのバンドからのシグナルの平均強度は、ＴＧＦ−β２非存在下で増殖させた培養物由来の平均シグナルの５３％であった （それぞれ１４６および１９４ピクセル対３１０および３２７ピクセル）。
【００６１】
対照的に、ＴＧＦ−β２処理は、ＣＤ５６陽性集団の蛍光強度を変化させず、デスミンおよびＣＤ５６はお互い独立に調節されていることを示した。さらに、 ＣＤ５６陽性細胞によって代表される培養物の画分は、ＴＧＦ−β２の非存在下および存在下で増殖させたＨｕＳｋＭＣの間で同様であった（それぞれ６５％および６３％）。別の研究において、線維芽細胞マーカーＴＥ７の発現も、ＴＧＦ−β２によって影響を受けなかった。そのデータは、ＴＧＦ−β２は、培養物中 の、線維芽細胞および筋芽細胞の全数の比は変化させないことを示す。
【００６２】
（実施例１０：デスミンのＴＧＦ−β誘導ダウンレギュレーションの可逆性）
ＴＧＦ−β２が誘導したデスミンの発現における減少が可逆的であるかどうかを決定するために、株ＣのＨｕＳｋＭＣを、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β２培地の 非存在下または存在下で、第２継代において５日間増殖させ、次いでデスミンの検出のために、蛍光免疫標識およびフローサイトメトリー分析のために回収した。同時培養を、ＴＧＦ−β２中で増殖させ、次いで回収前にＴＧＦ−β２の非存在下でさらに２日間培養した。その結果を表４にまとめる。
【００６３】
【表４】
2008502310.tif 000015
表４に示すように、ＴＧＦ−β２処理培養物由来のデスミン陽性集団の平均蛍光は、未処理培養物由来のものの約５０％であった。しかし、ＴＧＦ−β２除去 の２日後、培養物は、ＴＧＦ−β２に接触しなかった細胞のものと同様のデスミン発現プロファイルを獲得した。デスミン陽性集団に対応する蛍光強度を有する細胞の画分は、３つの培養物の間で同様であった。そのデータは、ＴＧＦ−β２への持続的な接触が、筋芽細胞マーカーデスミンの抑制に必要であり、そして ＴＧＦ−β２の除去によって２日以内に正常な筋芽細胞表現型を再び確立し得ることを示す。
【００６４】
（実施例１１：クレアチンキナーゼ活性に対するＴＧＦ−βの効果）
ＴＧＦ−β２の添加および除去によるデスミンの調節は、ＴＧＦ−βを使用して、ＨｕＳｋＭＣの増殖中に、筋芽細胞の分化状態をコントロールし得ることを 示す。これを更に評価するために、ＴＧＦ−β２のクレアチンキナーゼ活性に対する効果を調査した。クレアチンキナーゼレベルを、図３において示されたフローサイトメトリー分析によってデスミンのダウンレギュレーションを調査するのに使用した、同じ株Ａ培養物から取った試料から、直接定量した。ＴＧＦ− β２は、デスミンに関して観察されたものと同様の割合でクレアチンキナーゼ活性を抑制し、抑制の約半分は、ＴＧＦ−β２処理の１日後に起こった（図３と図２を比較のこと）。
【００６５】
別の研究において、クレアチンキナーゼのＴＧＦ−β２誘導ダウンレギュレーションの可逆性を評価した。株ＡのＨｕＳｋＭＣを、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ− β２の非存在下（培養物１）または存在下（培養物２、３および４）で５日間増殖させた。ＴＧＦ−β２処理培養物の１つを、ＴＧＦ−β２中でさらに２日間増殖させ（培養物３）、そして１つをその非存在下でさらに２日間培養した（培養物４）。各培養期間の終わりに、細胞をクレアチンキナーゼ分析のために溶解し た。ＴＧＦ−β２の存在下で５日間培養した株ＡのＨｕＳｋＭＣ（表５、培養物２）は、その非存在下で培養した細胞における活性（表５、培養物１）の１５％であるクレアチンキナーゼ活性を有していた。これらの細胞をＴＧＦ−β２無しでさらに２日間増殖させた場合（表５、培養物４）、クレアチンキナーゼ活性 は、ＴＧＦ−β２除去後に１５倍増加し（培養物２および４を比較のこと）、ＴＧＦ−β２はこの筋肉分化マーカーの発現を永久的に阻害するわけではないことを示した。筋芽細胞はコンフルエントな場合に分化する傾向があるので、培養物４におけるＴＧＦ−β２除去後の活性の大きな増加は、部分的には、培養期間の 終わりに達成された２．１×１０５細胞／ｃｍ２の高い細胞密度のためであり得る。しかし、ＴＧＦ−β２処理細胞をＴＧＦ−β２の存在下でさらに２日間、増殖因子に持続的に接触して全部で７日間培養した場合（表５、培養物３）、これらの細胞も培養物４と同様の高い密度（２．３×１０５細胞／ｃｍ２）に達したが、クレアチンキナーゼ活性は低いままであった。このデータは、デスミン発現のフローサイトメトリー分析からのデータとあわせて、ＴＧＦ−β２は、高密度のＨｕＳｋＭＣ培養物においてさえ、筋芽細胞の分化を抑制することを示す。さらに、そのあ
わせたデータは、ＴＧＦ−β２のこの効果は完全に可逆性であることを示し、そしてＴＧＦ−β２中で増殖させたＨｕＳｋＭＣは、その分化する能力を保持していることを示唆する。
【００６６】
【表５】
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（実施例１２：梗塞心筋への骨格筋細胞の移植）
この研究は、ヒトにおける梗塞後心機能のモデルとして意図された非ヒト動物（例えばＬｅｗｉｓラット）において、ＴＧＦ−βの存在下または非存在下で、 インビトロで増殖させた後移植した骨格筋細胞（ＳｋＭＣ）の臨床効果を比較する。この研究で使用する細胞は、移植の前に培養および低温保存細胞バンクとして保存する。任意で、ＳｋＭＣの供給源として骨格筋を採取する２から３日前に、０．５ｍｌのマーカインＴＭ（０．５％ブピバカインクロロハイドレート（ｂｕｐｉｖｉｃａｉｎｅ  ｃｈｌｏｒｏｈｙｄｒａｔｅ））を、麻酔ラットの各後脚の前脛骨に注射し得る。この手順は、衛星細胞を活性化し、そしてそれによって続くインビトロ培養物からの基礎筋芽細胞収量を高める。
【００６７】
同系レシピエントへ移植されたドナー細胞の生存を評価する研究を、パイロット研究において任意で行い得る。簡単には、蛍光生体色素を用いてＳｋＭＣを標 識する。２グループの非梗塞ラットに標識細胞を移植し、そして１週間後、動物を屠殺し、そしてその心臓をパラホルムアルデヒド固定し、そして組織像によってＳｋＭＣ細胞の生存または炎症性浸潤物の証拠に関して分析する。細胞の蛍光標識を以下のように行う。凍結細胞アンプルを解凍し、そして３ｍｌの８０％ ＩＭＤＭ、２０％のＦＢＳで希釈した後、上記で記載したように１６０−２００ｇで５分間遠心することによって細胞を濃縮する。細胞のペレットを、ＨＢＳＳ（Ｃａ＋／Ｍｇ＋フ リー）中で調製された１μＭのジオクタデシルオキサカルボシアニンペルクロレート（ＤｉＯ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）から成る１０ｍｌの標識培地中に懸濁する。１０ｍｌの細胞懸濁液を３７℃で５分間、暗所でインキュベートし、続いて４℃で１５分間インキュベートする。
【００６８】
主要な研究において、手術の前日（−１日）に、ラットを２グループ：対照または梗塞のうち１つに割り当てる。対照動物を、２ＤガイドＭモード心エコー検 査で心機能に関して評価する。手術日（０日）に、動物を麻酔し、そして前外側開胸術により心臓を露出させる。梗塞グループに割り当てられた動物においてのみ、縫合結紮をＬＡＤの周囲に確保し、そして締めて虚血性の障害を作成する。対照グループに割り当てられた動物は、開胸術は完了するが、梗塞はさせずコン トロールグループとなる。次いで梗塞グループを、縫合を用いて冠動脈を６０分間結紮することによって甚大な心筋虚血（梗塞）にし、続いて再灌流させる。梗塞の６日後、全ての動物の体重を測定し、そしてトレッドミルにおいて運動耐性を評価する。梗塞の７日後、全ての動物を、心エコー検査を用いて駆出率に関し て評価する。梗塞の８日後、全ての動物を、最初の手術と同じ順番で再び手術して、心臓を再露出させる。梗塞させた動物を、それらが受けた移植によって３つのサブグループのうち１つに割り当てる：（１）細胞を含まない細胞懸濁液培地のプラセボ注射；（２）本発明の方法によってＴＧＦ−β（例えばＴＧＦ− β１、−β２、および／または−β３）の存在下で培養したＳｋＭＣ；および（３）ＴＧＦ−β無しで培養したＳｋＭＣ。対照グループに２回目の開胸術を行うが、いかなる注射も与えない。ＳｋＭＣグループの各ラッ
トは、３０ゲージのハミルトン針を用いて、梗塞および梗塞周囲領域に直接、約１−２ｍｍ離して、全量１００μｌのＩＭＤＭ／０．５％ＢＳＡに含まれる、細胞懸濁液の６−１０回の注射を受ける（全部で３×１０６細胞／心臓）。
【００６９】
処置後、胸腔を閉じ、そして動物を回復させる。動物を毎日調査し、そして心不全の徴候（嗜眠、浅い呼吸、チアノーゼ）および死亡率を記録する。各動物の体重を毎週、およびあらゆる分析手順の直前に記録する。研究中のあらゆる動物の死を記録し、そして死体解剖を行って可能性のある死因を決定する。
【００７０】
移植の８週間後、動物を、トレッドミルを用いて運動能力に関して評価する。最大運動能力を、変更したげっ歯類トレッドミル（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ   Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ；Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ）で消耗するまでの走行距離として測定する。消耗を、少しの電気ショックにもかかわらず、連続して１５秒間走ることができないことと定義する。最初のトレッドミルの速度を１５°勾配において１５メートル／分に設定し、そしてその後毎分１メートル／分の増加で 増加させる。
【００７１】
心機能を、２ＤガイドＭモード心エコー検査で調査して左心室駆出率を決定する。インビボにおける心機能の心エコー検査評価を、１５ＭＨｚプローブを備えたＡｃｕｓｏｎ  ＳｅｑｕｏｉａＴＭ  Ｃ−２５６心エコー機械（Ｓｉｅｍｅｎｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＰＡ）を用いて、麻酔ラットにおいて行う。げっ歯類ノーズコーンを用いて、５％のイソフルラン （ｉｓｏｆｌｏｒａｎｅ）の吸入によって動物を麻酔し、適切な麻酔を保証するために心エコー検査の間中２．５％のイソフルランで維持する。イソフルランは、迅速でスムーズな麻酔の導入および迅速な回復を可能にし、循環器の血行動態（心室負荷、血圧、心拍数等）をほとんど変化させない。一旦麻酔すると、動 物の胸部を市販の電気バリカンで剃る。心臓を２次元胸骨傍短軸の観点から画像化し、そしてＭモードの測定値を心筋梗塞のレベルで心室中央で記録する。心拍数、前方／後方壁の厚さ、および拡張期末／収縮期末の腔の寸法を、市販で入手可能な分析ソフトウェア（Ａｃｕｓｏｎ  Ｓｅｑｕｏｉａ）を用いて、Ｍモード 画像から測定する。分画の短縮を、拡張期末寸法マイナス拡張期末寸法に対して基準化した収縮期末寸法として定義し、そして心収縮性機能の指標として使用する。局所的な前方および後方壁の肥厚も、それぞれの領域の拡張期および収縮期の壁寸法の比較によって評価する。初期／後期ＬＶ血液流入（Ｅ／Ａ比）および 血液流入の速度を含む、拡張期機能および心室の充満のパラメーターを、僧帽弁を横切る血液速度のドップラー測定によって測定する。（より大きな動物における局所の心筋区域における心機能を、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を用いて評価し得る。）
次いで動物を麻酔し、そしてその心臓を摘出し、続いて培養した等容性に拍動する（バルーン−イン−ＬＶ（ｂａｌｌｏｏｎ−ｉｎ−ＬＶ））心臓において Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ灌流システムを用いて、発達した圧の心臓の能力を分析する。簡単には、培養心臓を、４０％のヘマトクリットで修飾Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液中に懸濁したウシ赤血球から成る灌流液で逆に灌流する。Ｓｔａｔｈａｍ  Ｐ２３ＤｂＴＭ圧 変換器（Ｓｔａｔｈａｍ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｈａｔｏ  Ｒｅｙ、Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ）に接続した液体を充満させたラップのバルーンを、左心室に置き、心室圧をモニターする。冠動脈灌流圧を８０ｍｍＨｇに設定し、そして次いで活性な圧−容積の関係を作る。バルーンの容積０から、バルーンに０． ０５ｍｌの増加で充満させ、そして続くピーク収縮期および拡張期末圧を記録する。次いで収縮期および拡張期圧−容積の関係を得る。続いて、心臓を塩化カリウムによって、拡張期状態で、そして５ｍｍＨｇの最終拡張圧で停止させ、そして４％のパラホルムアルデヒドの逆灌流によって固定する。
【００７２】
固定後、心臓を、心房組織を切り取り、重量を計り、そして４つの等しい部分へ横断的に切断する（「ブレッド−ローフ（ｂｒｅａｄ−ｌｏａｖｅｄ）」）。 心臓の部分を、パラフィンに埋包し、そしてＭａｓｓｏｎの三色組織化学および面積測定による瘢痕領域の決定のために、５μｍの薄さの切片に切断する。骨格筋組織を、骨格筋線維細胞へ分化す
ることが期待される、移植混合物に存在する骨格筋芽細胞に基づいて同定する。骨格筋細胞の同定を、心筋を染色しない、骨格筋反応性抗ミオシン重鎖抗体を用 いて免疫組織化学的に行う（例えば、Ｈａｖｅｎｉｔｈら（１９９０）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ９３：４９７−４９９において記載されたＭＹ−３２抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））。
【００７３】
ＴＧＦ−β中で培養したＳｋＭＣで処理したラットにおける心機能は、コントロールグループおよび／またはＴＧＦ−β無しで培養した同様の細胞と比較し て、同等またはより良い（少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、５００％またはそれ以上）ことが予期される。さらに、ＴＧＦ−β中で増殖させた細胞は、移植の最初の段階で、増強された増殖および運動性を示すことが予期される。
【００７４】
本明細書は、本明細書中で引用された参考文献の教えに照らして、最も完全に理解される。本明細書中の実施形態は、本発明の実施形態の説明を提供し、そして本発明の範囲を制限すると解釈されるべきでない。当業者は、多くの他の実施形態が本発明によって含まれることを容易に認識する。本開示において引用された全ての出版物および特許および配列は、その全体として参考として援用される。参考として援用される資料の範囲が本明細書に矛盾するか、または一致しない場合、本明細書があらゆるそのような資料に取って代わる。本明細書中におけるあらゆる参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明の従来の技術であることの容認ではない。
【００７５】
他に示されなければ、特許請求の範囲を含む本明細書中で使用される、成分の量、細胞培養物、処理条件等を表す全ての数字は、「約」という用語によって全ての場合において修飾されることが理解される。よって、他にそうでないと示されなければ、数字のパラメーターは近似であり、そして本発明によって得ようとする望ましい性質によって変わり得る。他に示されなければ、一連の要素の前にある「少なくとも」という用語は、その一連の用語の全てを指すことが理解される。当業者は、日常的な実験のみを用いて、本明細書中で記載された本発明の特定の実施形態の多くの同等物を認識する、または確かめることができる。そのような同等物は、以下の特許請求の範囲によって含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、株Ａの第３継代ＨｕＳｋＭＣに対して行った、デスミンおよびＣＤ５６の二重蛍光免疫標識の結果を示す。フローサイトメトリー分析は、 ２つの主な集団、両方の筋芽細胞マーカーを発現するもの（Ｄｅｓ＋およびＣＤ５６＋）、およびどちらのマーカーも発現しないもの（Ｄｅｓ−およびＣＤ５６−）を明らかにする。
【図２】図２は、ＴＧＦ−β２中の時間の関数として、筋芽細胞マーカーに対するＴＧＦ−β２の効果を説明する。株ＡのＨｕＳｋＭＣを、第２継代におい て０、０．１７、１、２、または５日間増殖させ、次いで筋芽細胞マーカーデスミンおよびＣＤ５６を検出するために、剥離および蛍光免疫標識した。デスミン陽性（実線）およびＣＤ５６陽性（破線）筋芽細胞集団の平均蛍光。結果は、２組の培養物から平均した。エラーバーは、値の範囲を同定する。Ｄｅｓ＋および ＣＤ５６＋細胞のパーセンテージおよびＣＤ５６の発現レベルは、実質的にＴＧＦ−βによって影響されなかったが、デスミンの発現は徐々に減少した。
【図３】図３は、クレアチンキナーゼ活性に対するＴＧＦ−β２の効果を説明する。同じ株Ａ培養物からの細胞の試料を、それらをフローサイトメトリー分 析（図２）のために回収したのと同時に溶解し、次いでクレアチンキナーゼ活性に関して分析した。これらの細胞を、示したように、培養の最終０、０．１７、１、２、または５日間、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β２の存在下で５日間増殖させた。結果を、２組の培養物から平均した。エラーバーは値の範囲を同定する。ク レアチンキナーゼ活性（図３）およびデスミン発現（図２）の減少における類似に注意すること。
【国際調査報告】
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