(57)【要約】  本発明は、商業的に有用な量のヒト、ヒト化またはキメラ抗体を産生する細胞を得るための手段に関する。本発明によって、培養において使用して抗体を産生するために動物から高抗体産生細胞を選択および単離することが可能になる。また本発明は、ヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリンの親和性成熟のための方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト、非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の特異的な抗原に結合する、目的とする抗体を獲得または産生するための方法、あるいはこのような抗体を産生する細胞を獲得するための方法であって、
ａ）生殖細胞系列に作動可能に連結されたヒト、非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の重鎖の再編成された可変領域を少なくともコードする配列、または改変された重鎖定常領域配列を含む第１の非ヒト動物を構築することと、
ｂ）生殖細胞系列に作動可能に連結された特定のヒト、非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の軽鎖の再編成された可変領域を少なくともコードする配列、または改変された軽鎖定常領域配列を含む第２の非ヒト動物を構築することと、
ｃ）前記動物ａ）およびｂ）を交配させて子孫動物を獲得し、前記子孫動物のＢ細胞が目的とする抗体を産生できるかどうかを決定することと、
を含む方法。
【請求項２】
子孫動物が目的とする抗体を産生することができるかどうかを決定する前記ステップが、Ｂ細胞によって産生される抗体がヒト、非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の特異的な抗原に特異的に結合するかどうかを決定することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
軽鎖および重鎖の可変領域セグメントの体細胞超変異を誘発し、それに伴って前記動物からのＢ細胞により産生される抗体の親和性成熟を誘発するために、所望の表現型を有する子孫動物を処置することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ヒト、非ヒト、キメラまたはヒト化抗体を産生するＢ細胞のクローン増殖を刺激するため、および／またはＩｇＭの産生から所望のサブタイプのＩｇＧ抗体の産生へのアイソタイプスイッチを引き起こすために、所望の表現型を有する子孫動物を処置することをさらに含む請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
目的とする抗体を産生する前記動物からのＢ細胞を選択または単離することをさらに含む請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
Ｂ細胞を選択することが、Ｂ細胞によって産生される抗体のレベルを評価することを含む請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｂ細胞株を不死化することをさらに含む請求項４または５に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｂ細胞を骨髄腫細胞に融合させてハイブリドーマを産生することをさらに含む請求項６に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも、
生殖細胞系列に作動可能に連結されたヒト、非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の重鎖の再編成された可変領域を少なくともコードする配列、または改変された重鎖定常領域配列と、
生殖細胞系列に作動可能に連結された特定のヒト、非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の軽鎖の再編成された可変領域を少なくともコードする配列、または改変された軽鎖定常領域配列と
がその生殖細胞系列ＤＮＡ内に配置された非ヒト動物。
【請求項１０】
少なくとも、ネイティブのμ定常領域の上流側のヒト、非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の重鎖の再編成された可変領域と、（ｉ）ネイティブの重鎖定常領域の１つまたは複数をコードするネイティブの生殖細胞系列ＤＮＡを置換し、そして（ｉｉ）スイッチ配列に作動可能に連結された重鎖定常領域をコードする配列とがその生殖細胞系列ＤＮＡ内に配置された非ヒト動物。
【請求項１１】
ヒト、非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の免疫グロブリン軽鎖の再編成された可変領域をその生殖細胞系列ＤＮＡ内にさらに含む請求項１０に記載の動物。
【請求項１２】
生殖細胞系列に作動可能に連結されたヒト、非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の重鎖の再編成された可変領域を少なくともコードする配列、または改変された重鎖定常領域配列を含む第１のベクターと、
生殖細胞系列に作動可能に連結された特定のヒト、非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の軽鎖の再編成された可変領域を少なくともコードする配列、または改変された軽鎖定常領域配列を含む第２のベクターと
を含む、標的構築物として使用するために適切なベクターのセット。
【請求項１３】
ＩｇＨ座位の少なくとも一部を含む標的構築物として使用するために適切なベクターであって、前記ベクターまたは構築物が、
μ定常領域の上流側のヒト、非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の重鎖の再編成された可変領域と、
（ｉ）前記ＩｇＨ座位のネイティブの重鎖定常領域の１つまたは複数をコードするネイティブのＤＮＡを置換し、（ｉｉ）スイッチ配列に作動可能に連結された重鎖定常領域をコードする配列と
をさらに含むベクター。
【請求項１４】
請求項１４に記載の第１のベクターと、
生殖細胞系列に作動可能に連結された特定のヒト、非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の軽鎖の再編成された可変領域を少なくともコードする配列、または改変された定常領域配列を含む第２のベクターと
を含む、標的構築物として使用するために適切なベクターのセット。
【請求項１５】
少なくとも、
生殖細胞系列に作動可能に連結された非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の重鎖の再編成された可変領域を少なくともコードする配列、または改変された定常領域配列と、
生殖細胞系列に作動可能に連結された特定の非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の軽鎖の再編成された可変領域を少なくともコードする配列、または改変された定常領域配列と
がそのＤＮＡ内に組み込まれており、アイソタイプスイッチングを受けているアイソタイプスイッチ細胞。
【請求項１６】
少なくとも、
生殖細胞系列に作動可能に連結された非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の重鎖の再編成された可変領域を少なくともコードする配列、または改変された定常領域配列と、
生殖細胞系列に作動可能に連結された特定の非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の軽鎖の再編成された可変領域を少なくともコードする配列、または改変された定常領域配列と
がそのＤＮＡ内に組み込まれており、単一の抗体種を発現する非ヒトＢ細胞。
【請求項１７】
少なくとも、
生殖細胞系列に作動可能に連結された非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の重鎖の再編成された可変領域を少なくともコードする配列、または改変された定常領域配列と、
生殖細胞系列に作動可能に連結された特定の非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の軽鎖の再編成された可変領域を少なくともコードする配列、または改変された定常領域配列と
がそのＤＮＡ内に組み込まれた非ヒトＢ細胞であって、
前記再編成された可変領域配列によってコードされるものとはその可変領域配列が異なる抗体を生じさせることができる配列をそのゲノムＤＮＡ内に含有しない細胞。
【請求項１８】
重鎖の再編成された可変領域および軽鎖の再編成された可変領域をコードする前記配列が、前記細胞によって独立して発現される請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法、動物、ベクターまたは細胞。
【請求項１９】
重鎖および／または軽鎖の前記再編成された可変領域が、ヒトリード抗体に由来する請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法、動物、ベクターまたは細胞。
【請求項２０】
重鎖および／または軽鎖の前記再編成された可変領域が、非ヒトリード抗体に由来する請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法、動物、ベクターまたは細胞。
【請求項２１】
重鎖および／または軽鎖の前記再編成された可変領域が、マウスリード抗体に由来する請求項２０に記載の方法、動物、ベクターまたは細胞。
【請求項２２】
重鎖および／または軽鎖の前記再編成された可変領域が、１つまたは複数のアミノ酸置換を有するマウスリード抗体に由来する請求項２１に記載の方法、動物、ベクターまたは細胞。
【請求項２３】
重鎖および／または軽鎖の前記再編成された可変領域が、キメラリード抗体に由来する請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法、動物、ベクターまたは細胞。
【請求項２４】
重鎖および／または軽鎖の前記再編成された可変領域が、ＣＤＲグラフト化リード抗体に由来する請求項２３に記載の方法、動物、ベクターまたは細胞。
【請求項２５】
重鎖および／または軽鎖の前記再編成された可変領域が、リードヒト化リード抗体に由来する請求項２３に記載の方法、動物、ベクターまたは細胞。
【請求項２６】
重鎖または軽鎖の前記再編成された可変領域が、既知の特異性を有するリード抗体から得られるか、あるいは既知の特異性を有するリード抗体に由来する請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法、動物、ベクターまたは細胞。
【請求項２７】
前記重鎖定常領域配列が非ヒト起源である請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法、動物、ベクターまたは細胞。
【請求項２８】
前記軽鎖定常領域配列が非ヒト起源である請求項１〜９および１１〜２７のいずれか一項に記載の方法、動物、ベクターまたは細胞。
【請求項２９】
前記重鎖定常領域配列がマウス起源である請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法、動物、ベクターまたは細胞。
【請求項３０】
前記重鎖定常領域配列がヒト起源である請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法、動物、ベクターまたは細胞。
【請求項３１】
前記軽鎖定常領域配列がヒト起源である請求項１〜９および１１〜２７および２９〜３０のいずれか一項に記載の方法、動物、ベクターまたは細胞。
【請求項３２】
前記重鎖定常領域配列がγサブタイプを有する請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法、動物、ベクターまたは細胞。
【請求項３３】
前記重鎖定常領域配列がＧ１サブタイプを有する請求項３２に記載の方法、動物、ベクターまたは細胞。
【請求項３４】
前記重鎖定常領域がＧ１サブタイプであり、ヒンジ領域に存在して鎖間ジスルフィド架橋に関与するシステインをコードするコドンの５’近位で切断され、Ｆａｂ部分を生じさせる配列を表す請求項３２に記載の方法、動物、ベクターまたは細胞。
【請求項３５】
定常領域配列が検出可能なマーカーに組換えにより結合された請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法、動物、ベクターまたは細胞。
【請求項３６】
前記重鎖の再編成された可変領域がネイティブのμ定常領域の上流側に配置され、重鎖定常領域をコードする配列が、（ｉ）ネイティブの重鎖定常領域の１つまたは複数をコードするネイティブのＤＮＡを置換し、そして（ｉｉ）スイッチ配列に作動可能に連結される請求項１〜９および１２〜３５のいずれか一項に記載の方法、動物、ベクターまたは細胞。
【請求項３７】
前記定常領域配列が、マウスα領域、マウスＣγ３、Ｃγ１、Ｃγ２ｂおよびＣγ２ａ領域セット、および／またはε重鎖定常領域を置換する重鎖定常領域を含む請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法、動物、ベクターまたは細胞。
【請求項３８】
前記定常領域配列が、マウスε重鎖定常領域を置換するヒトεまたはγ重鎖定常領域配列を含む請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法、動物、ベクターまたは細胞。
【請求項３９】
前記定常領域配列が、マウスε重鎖定常領域を置換するヒトεまたはγ重鎖定常領域配列を含み、前記動物、ベクターまたは細胞が、以下のような配列：
５’−Ｓε−ヒトＣε−Ｓα−Ｃα−３’、または
５’−Ｓε−ヒトＣγ−Ｓα−Ｃα−３’
（ここで、Ｃは定常領域を表し、γはヒトγ定常領域のサブタイプＧ１、Ｇ２、Ｇ３またはＧ４もしくはその一部のいずれでもよく、Ｓはスイッチ配列を表し、そしてＳε、ＳαおよびＣαはヒト起源でも非ヒト起源でもよい）をそのＤＮＡ内に含む請求項３８に記載の方法、動物、ベクターまたは細胞。
【請求項４０】
前記定常領域配列が、マウスγ重鎖定常領域を置換するヒトγ重鎖定常領域配列を含み、前記動物、ベクターまたは細胞が、以下のような配列：
５’−Ｓγ−ヒトＣγ−３’
（ここで、Ｓはスイッチ配列を表し、Ｃγはヒト定常領域γサブタイプＧ１、Ｇ２、Ｇ３またはＧ４もしくはその一部を表し、そしてＳγはヒト起源でも非ヒト起源でもよい）をそのＤＮＡ内に含む請求項３７に記載の方法、動物、ベクターまたは細胞。
【請求項４１】
前記定常領域配列が、第１のネイティブの定常領域を置換する第１の重鎖定常領域と、第２のネイティブの重鎖定常領域を置換する第２の重鎖定常領域と含む請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法、動物、ベクターまたは細胞。
【請求項４２】
前記第１の重鎖定常領域が、マウスα領域および／またはマウスＣγ３、Ｃγ１、Ｃγ２ｂおよびＣγ２ａ領域セットを置換し、前記第２の重鎖定常領域が、マウスε重鎖定常領域を置換する請求項４１に記載の方法、動物、ベクターまたは細胞。
【請求項４３】
γ重鎖定常領域配列がマウスγ重鎖定常領域を置換し、前記動物、ベクターまたは細胞が、以下のような配列：
５’−Ｓγ−置換Ｃγ１−Ｓ（εまたはα）−置換Ｃγ２−３’
（ここで、Ｓはスイッチ配列を表し、Ｃγ１およびＣγ２はそれぞれ異なる定常領域γサブタイプを表す）をそのＤＮＡ内に含む請求項４１に記載の方法、動物、ベクターまたは細胞。
【請求項４４】
ヒトγ重鎖定常領域配列がマウスγ重鎖定常領域を置換し、前記動物、ベクターまたは細胞が以下のような配列：
５’−Ｓγ−ヒトＣγ１−Ｓ（εまたはα）−ヒトＣγ２−３’
（ここで、Ｓはスイッチ配列を表し、Ｃγ１およびＣγ２はそれぞれ、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３またはＧ４から独立して選択される異なるヒト定常領域γサブタイプを表し、そしてＳε、ＳαおよびＳγのそれぞれは、ヒト起源でもマウス起源でもよい）をそのＤＮＡ内に含む請求項４１に記載の方法、動物、ベクターまたは細胞。
【請求項４５】
ヒトγ重鎖定常領域配列がマウスγ重鎖定常領域を置換し、前記動物が以下のような配列：
５’−Ｓγ３−ヒトＣγ１−Ｓε−ヒトＣγ２−Ｓα−Ｃα−３’
（ここで、Ｓはスイッチ配列を表し、Ｃは定常領域を表し、Ｃγ１およびＣγ２は、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３またはＧ４から独立して選択されるヒト定常領域γサブタイプを表し、そしてＣα、Ｓε、ＳαおよびＳγのそれぞれはヒト起源でもマウス起源でもよい）をその生殖細胞系列ＤＮＡ内に含む請求項４１に記載の方法、動物、ベクターまたは細胞。
【請求項４６】
Ｓγが、マウス起源のＳγ３である請求項４０または４３〜４５のいずれか一項に記載の方法、動物、ベクターまたは細胞。
【請求項４７】
前記動物または細胞が、ラット動物または細胞である請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法、動物または細胞。
【請求項４８】
前記動物または細胞が、マウス動物または細胞である請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法、動物または細胞。
【請求項４９】
前記動物のＢ細胞が、リード抗体の特異的な抗原に結合する、目的とする抗体を産生するＢ細胞から本質的になる請求項１〜１１または１５〜４８のいずれか一項に記載の方法、動物または細胞。
【請求項５０】
請求項９〜１１または１５〜４９のいずれか一項に記載の非ヒト動物を提供することと、
ＶＨＤＪＨおよびＶＬＪＬセグメントの体細胞超変異を誘発し、それに伴って前記動物からのＢ細胞によって産生される抗体の親和性成熟を誘発するために、所望の表現型を有する子孫動物を処置することと
を含む、目的とする抗体またはそれを産生する細胞を獲得するための方法。
【請求項５１】
請求項９〜１１または１５〜５０のいずれか一項に記載の非ヒト動物を提供することと、
抗体を産生するＢ細胞のクローン増殖を刺激するため、および／またはＩｇＭの産生から所望のサブタイプＩｇＧ抗体の産生へのクラススイッチを引き起こすために、所望の表現型を有する子孫動物を処置することと
を含む、目的とする抗体またはそれを産生する細胞を獲得するための方法。
【請求項５２】
目的とする抗体をコードまたは産生する前記動物からのＢ細胞を選択することをさらに含み、前記目的とする抗体が、リード抗体配列が由来した抗体と同じ抗原に結合する請求項５０〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
Ｂ細胞による抗体産生のレベルを評価することをさらに含む請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記Ｂ細胞株を不死化することをさらに含む請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記Ｂ細胞を骨髄腫細胞に融合させてハイブリドーマを産生することをさらに含む請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
請求項９〜１１および１５〜５３のいずれか一項に記載の非ヒト動物から得られるか、あるいは請求項１〜８および１５〜５３に記載の方法に従って得られるＢ細胞。
【請求項５７】
請求項５６に記載のＢ細胞を不死化することによって得られる細胞。
【請求項５８】
請求項５６に記載のＢ細胞を第２の細胞と融合させることによって得られるハイブリドーマ。
【請求項５９】
請求項５６〜５８のいずれか一項に記載の細胞によって産生される抗体。
【請求項６０】
前記抗体がＦａｂ断片である請求項５９に記載の抗体。
【請求項６１】
前記抗体が、マウス宿主細胞において発現される同じアミノ酸配列の抗体と識別可能なグリコシル化を有する請求項５９に記載の抗体。
【請求項６２】
前記抗体が、マウス宿主細胞において発現される同じアミノ酸配列の抗体と比較して、Ｎ−グリコシドグリコシド結合糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンのフコース含量の低下、および／または抗体が特異的である抗原を発現する細胞に対するＡＤＣＣ活性を誘発する能力の増大を有する請求項５９に記載の抗体。
【請求項６３】
前記細胞が、培養液中に保持されたときに、目的とする前記抗体を細胞外の培地中に分泌する請求項５６〜５８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６４】
前記細胞が、目的とする前記抗体のみを分泌する請求項６３に記載の細胞。
【請求項６５】
免疫グロブリン重鎖の再編成された可変領域が、再編成されたＶＨＤＪＨ部分である請求項１〜６４のいずれか一項に記載の方法、動物、ベクターまたは細胞。
【請求項６６】
免疫グロブリン軽鎖の再編成された可変領域が、再編成されたＶ−Ｊ部分である請求項１〜６５のいずれか一項に記載の方法、動物、ベクターまたは細胞。
【請求項６７】
重鎖の前記再編成された可変領域および軽鎖の前記再編成された可変領域が、細胞または動物の起源の種に対してネイティブである免疫グロブリン制御配列の制御下で発現される請求項１〜６６のいずれか一項に記載の方法、動物、または細胞。
【請求項６８】
細胞が、重鎖の前記再編成された可変領域および軽鎖の前記再編成された可変領域を発現し、そして得られた鎖が細胞内で一緒に構築されて免疫グロブリンを形成し、これが次に、リード抗体の特異的な抗原に特異的に結合することができる形態で分泌されるように、請求項５６〜５８のいずれか一項に記載の細胞を栄養培地中に保持するステップを含む、重鎖および軽鎖を含む機能性免疫グロブリンを産生するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
特定の抗原と反応性であるヒト化、ヒトまたはキメラ免疫グロブリンは、有望な治療薬および／または診断薬である。しかしながら、十分な量のヒト、ヒト化および／またはキメラ抗体の産生は困難であることが証明されている。本出願は、商業的に有用な量のヒト、ヒト化またはキメラ抗体を産生するための手段を提供する。本発明によって、培養において使用して抗体を産生するために、動物から高抗体産生細胞を選択および単離することが可能になる。また本発明は、ヒト、ヒト化またはキメラ免疫グロブリンの親和性成熟のための方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
脊椎動物系の免疫グロブリン（Ｉｇ）の基本的な構造単位は、２本の同一の「軽鎖」ポリペプチド鎖（約２３ｋＤａ）および２本の同一の「重鎖」（約５３〜７０ｋＤａ）で構成される。重鎖および軽鎖はジスルフィド結合によって「Ｙ」配置で連結され、２本の重鎖の「テール」部分も共有ジスルフィド結合で結合される。
【０００３】
Ｉｇ軽鎖および重鎖はそれぞれ、Ｎ末端部の可変領域およびＣ末端部の定常領域で構成される。軽鎖では、可変領域（「ＶＬＪＬ」と呼ばれる）は、結合（ＪＬ）領域によって定常領域（ＣＬ）に結合された可変（ＶＬ）領域で構成される。重鎖では、可変領域（ＶＨＤＨＪＨ）は、多様性（ＤＨ）領域および結合（ＪＨ）領域の組み合わせによって定常領域（ＣＨ）に結合された可変（ＶＨ）領域で構成される。軽鎖および重鎖のＶＬＪＬおよびＶＨＤＨＪＨ領域はそれぞれＹの先端部で結合されて、抗体の抗原結合部分を形成し、抗原結合特異性を決定する。
【０００４】
（ＣＨ）領域は、抗体のアイソタイプ、すなわちそのクラスまたはサブクラスを定義する。異なるアイソタイプの抗体は、補体を活性化する能力、様々な種類の細胞型で存在する特異的受容体（例えば、Ｆｃ受容体）に結合する能力、粘膜および胎盤障壁を横切る能力、および基本の四鎖ＩｇＧ分子のポリマーを形成する能力など、そのエフェクター機能が著しく異なる。
【０００５】
抗体は、免疫グロブリン分子において用いられるＣＨ型に従って「クラス」に分類される（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＡ）。少なくとも５つの型のＣＨ遺伝子（Ｃμ、Ｃγ、Ｃδ、Ｃε、およびＣα）が存在し、いくつかの種（ヒトを含む）は、多数のＣＨサブタイプ（例えば、ヒトではＩｇＧサブタイプのＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、およびＣγ４）を有する。ヒトのハプロイドゲノムには、全部で９つのＣＨ遺伝子が存在し、マウスおよびラットには８つ存在し、その他の多くの種にもいくつか存在するがこれよりも少ない。これに対して、軽鎖の定常領域（ＣＬ）には通常２つのタイプ、カッパ（κ）およびラムダ（λ）だけが存在し、単一の軽鎖タンパク質中にはこれらの定常領域のうちの１つだけが存在する（すなわち、産生される全てのＶＬＪＬに対して、可能性のある軽鎖定常領域は１つだけ存在する）。それぞれの重鎖クラスは、いずれかの軽鎖クラスと関連され得る（例えば、所与の抗体においてＣＨγ領域はカッパまたはラムダ軽鎖のいずれかと関連され得る）。特定のクラスの重鎖および軽鎖の定常領域は抗原結合部位に関与せず、従って抗原特異性に関与しない。
【０００６】
重鎖および軽鎖のＶ、Ｄ、Ｊ、およびＣ領域のそれぞれは、別個のゲノム配列または遺伝子セグメントによってコードされる。抗体の多様性は、重鎖の異なるＶＨ、ＤＨ、およびＪＨ遺伝子セグメント、ならびに軽鎖のＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントの間の組換えによって生じる。異なるＶＨ、ＤＨ、ＪＨ遺伝子の組換えは、Ｂ細胞の分化の際にＤＮＡ組換えによって達成される。簡単に言うと、重鎖配列は再結合して、まずＤＨＪＨ複合体を生じ、そして次に、第２の組換え事象によってＶＨＤＨＪＨ複合体が産生される。転写において機能性重鎖が産生されたら、ＲＮＡ転写物のスプライシングが行われる。機能性重鎖の産生は軽鎖配列の組換えを引き起こして再編成されたＶＬＪＬ領域を生じ、これは次に機能性ＶＬＪＬＣＬ領域、すなわち機能性軽鎖を形成する。組換えに加えて、２つの追加的な現象によって多様性が増大されるが、これは、Ｎ多様性（Ｖ／Ｄ／Ｊ接合部におけるヌクレオチドのトリミングおよび追加）および体細胞超変異（成熟Ｂ細胞が抗原に遭遇し、その結果として、この抗原に対する変異ＩｇＧの親和性が増大されるときの、再編成されたＶＤＪセグメントにおける高度のさらなる変異）として、当該技術分野において知られている。
【０００７】
Ｂ細胞の分化の過程で、単一のＢ細胞の子孫は、可変領域によって決定される抗原特異性を変化させることなく、発現した免疫グロブリンのアイソタイプをＩｇＭからＩｇＧまたは他のクラスの免疫グロブリンにスイッチすることができる。免疫グロブリンのクラススイッチとして知られるこの現象は、各ＣＨ遺伝子（Ｃγを除く）の５’に位置するスイッチ（Ｓ）領域間で起こるＤＮＡの再編成を伴う（非特許文献１および非特許文献２においてレビューされる）。Ｓ−Ｓ組換えは、ＶＨＤＨＪＨエクソンを、同じ染色体上にある介在ＣＨ遺伝子の欠失によって発現すべきＣＨ遺伝子の近くにもたらす。クラススイッチのメカニズムはサイトカインによって指示される（非特許文献３）。スイッチ領域は、１ｋｂ（Ｓε）〜１０ｋｂ（Ｓγ１）の様々なサイズを有し、長さおよび配列の両方が異なるタンデム反復で構成される（非特許文献４）。マウスＳμ、Ｓε、Ｓγ、Ｓγ３、Ｓγ１、Ｓγ２ｂおよびＳγ２ａスイッチ領域、ならびにヒトＳμスイッチ領域を含む、いくつかのスイッチ領域が特徴付けされている（非特許文献３、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献４、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５および非特許文献１６）。
【０００８】
診断薬および治療薬としての抗体の価値および能力は、当該技術分野において長い認識されている。残念なことに、この分野は、所望の特異性を有する大量の抗体を産生するために必要とされるゆっくりとした退屈な工程によって妨害されてきた。古典的な細胞融合技法は、抗体を産生するＢ細胞を不死化細胞株と融合することによって、モノクローナル抗体の効率的な産生を可能にした。得られた細胞株は、ハイブリドーマ細胞株と呼ばれる。しかしながら、これらのモノクローナル抗体のほとんどはマウス系で産生され、ヒト免疫系によって「外来性」タンパク質と認識される。従って、患者の免疫系は抗体に対する応答を誘発し、その結果、抗体の中和および排除、ならびに／または抗体に対する免疫応答に関連する潜在的に深刻な副作用がもたらされる。
【０００９】
この問題への１つの取り組みは、外来性エピトープほど容易に「認識」されないキメラ、ヒトおよび「ヒト化」モノクローナル抗体を開発して、患者の抗体に対する免疫応答を回避することであった。しかしながら、ヒトまたはヒト化抗体の産生のための技法はそれぞれ、特定の制約および不都合に直面する。キメラ、ヒトおよびヒト化抗体は、大量生産において使用可能な条件下で十分な量の抗体を産生することができる細胞株の開発を必要とする組換え産生系（例えば、ＣＨＯ細胞系）において発現されなければならない。これらの産生系は、規制の目的のために詳細な特徴づけも必要とする。キメラ抗体を産生するために上記のような組換えＤＮＡ技法に頼っている技法の例は、特許文献１（ニューバーガー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ）ら）、ならびに特許文献２（キャビリー（Ｃａｂｉｌｌｙ）ら）および特許文献３（フェル（Ｆｅｌｌ）ら）に記載されている。これらの方法では、ＤＮＡを１つの細胞からもう１つの細胞へ転移させ、従ってその自然の座位から除去することが必要とされ、そのため最終の抗体コード化構築物が機能性である（例えば、所望の遺伝子産物の転写および翻訳が可能である）ことを保証するためにはＤＮＡの慎重なインビトロ操作が必要とされる。それらのトランスフェクタントにおいて臨床的な実施に適合する抗体の量を産生できなかったことが、抗体に基づく計画の失敗の共通の理由である。比較すると、Ｂ細胞ハイブリドーマに基づく産生は十分に特徴付けされており、そして通常は多量のモノクローナル抗体を提供し、従ってより簡単な製造工程を提供し得る。当該分野では、従来のトランスフェクション系よりも効率的な系において多数のクローニングステップを必要とせず、ハイブリドーマ細胞から実行することができる、所望のタンパク質または抗体の製造方法が明らかに必要とされている。
【００１０】
もう１つのよく使用される技術は、ヒトＩｇ座位を有する遺伝子導入マウスに基づいている。これらのマウスはヒト抗体産生Ｂ細胞を産生し、いくつかの場合には、Ｂ細胞は融合してハイブリドーマを生じることができるが、得られるほとんどのＢ細胞は製造に適さず、上記のような組換え技法を用いなければならない。さらに、遺伝子導入マウス系は標的抗原に対する抗体を得ることができず、リード抗体（例えば、目的とする特性を有する既知のヒト、キメラまたは齧歯類ｍＡｂ）に基づく開発を可能にしない。例えば、多くのヒト腫瘍抗原はマウスでは免疫原性ではなく、そのため、ヒト抗原に対する抗体を産生するＢ細胞をこれらの動物から単離するのは困難である。最後に、製造において使用可能なハイブリドーマを産生するために融合可能なＢ細胞をこのような遺伝子導入動物から得ることが可能な場合でも、Ｂ細胞は、通常、低レベルの抗体産生を提供する。
【００１１】
さらに、抗体の発現の基本的な問題（例えば、高産生Ｂ細胞を得る、または製造においてＣＨＯ細胞などの非ハイブリドーマ細胞を使用しなければならない）の範囲を越えて、古典的な免疫化手順を用いて得られる多くの抗体には、治療的な使用を対象とした抗体において所望される親和性または他の特徴が欠けている。例えば、免疫化におけるいくつかの場合には、ＩｇＭ抗体を産生するがＩｇＧ抗体を産生しないＢ細胞が得られる（ＩｇＭ抗体は通常低親和性を有する）。他の場合にはＩｇＧ産生Ｂ細胞が得られるが、抗体には所望の親和性が欠けている。さらに他の場合には、ヒト化またはキメラ化（例えば、ＣＤＲグラフティング）方法は、親和性の低下をもたらす。１つの周知の取り組みは、バクテリオファージがその表面に生物学的に機能性のタンパク質分子を発現および表示する能力を利用することによって、抗体断片の大きいライブラリーを作成するために使用されるファージ表示技術である。抗体のコンビナトリアルライブラリーはバクテリオファージラムダ発現系において作成されており、バクテリオファージプラークまたは溶原菌のコロニーとして選別され得る（非特許文献１７、非特許文献１８）。バクテリオファージ抗体の様々な実施形態がライブラリーを示しており、ラムダファージ発現ライブラリーについて記載されている（非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２１）。通常、ファージライブラリーは、ランダムオリゴヌクレオチドのライブラリーまたはＶＬおよびＶＨなどの抗体断片をコードするｃＤＮＡライブラリーを、Ｍ１３の遺伝子３またはｆｄファージに挿入することによって作成される。挿入されたそれぞれの遺伝子は、遺伝子３産物、ファージの微量のコートタンパク質のＮ−末端で発現される。結果として、多様なペプチドを含有するペプチドライブラリーを構築することができる。次に、ファージライブラリーは、抗原などの固定化された目的とする標的分子に対して親和性が選別され、特異的に結合したファージ粒子が回収されて、大腸菌宿主細胞への感染によって増幅される。一般に、受容体などの目的とする標的分子（例えば、ポリペプチド、炭水化物、糖タンパク質、核酸）は、親和性クロマトグラフィによって反応性のファージ粒子を濃縮するために共有結合によってクロマトグラフィ樹脂へ固定化され、そして／あるいはプラークまたはコロニーリフトを選別するために標識化される。この手順は、バイオパニングと呼ばれている。最後に、高親和性ファージコロニーを増幅して、特異的なペプチド配列を推定するために配列決定することができる。この問題に対処するために多数の「親和性成熟」または他の解決法が開発されてきたが、今まで、全ての方法は退屈で多大な時間を必要とするものである。従って、当該技術分野では、その抗原結合特性を改善するために候補抗体の改変を可能にする方法が必要とされている。
【特許文献１】国際公開第８６／０１５３３号パンフレット
【特許文献２】米国特許第４，８１６，５６７号明細書
【特許文献３】米国特許第５，２０２，２３８号明細書
【非特許文献１】ホンジョウ（Ｈｏｎｊｏ）（１９８３年）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：４９９〜５２８頁
【非特許文献２】シミズ（Ｓｈｉｍｉｚｕ）およびホンジョウ（Ｈｏｎｊｏ）（１９８４年）Ｃｅｌｌ  ３６：８０１〜８０３頁
【非特許文献３】ミルズ（Ｍｉｌｌｓ）ら（１９９５年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：３０２１〜３０３６頁
【非特許文献４】グリッツメイカー（Ｇｒｉｔｚｍａｃｈｅｒ）（１９８９年）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１７３〜２００頁
【非特許文献５】ニカイドウ（Ｎｉｋａｉｄｏ）ら（１９８１年）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：８４５〜８頁
【非特許文献６】マルク（Ｍａｒｃｕ）ら（１９８２年）Ｎａｔｕｒｅ  ２９８：８７〜８９頁
【非特許文献７】タカハシ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ）ら（１９８２年）Ｃｅｌｌ  ２９：６７１〜９頁
【非特許文献８】ミルズ（Ｍｉｌｌｓ）ら（１９９０年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：７３０５〜１６頁
【非特許文献９】ニカイドウ（Ｎｉｋａｉｄｏ）ら（１９８２年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：７３２２〜２９頁
【非特許文献１０】スタントン（Ｓｔａｎｔｏｎ）ら（１９８２年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：５９９３〜６００６頁
【非特許文献１１】デイビス（Ｄａｖｉｓ）ら（１９８０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９：１３６０頁
【非特許文献１２】オバタ（Ｏｂａｔａ）ら（１９８１年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：２４３７〜４１頁
【非特許文献１３】カタオカ（Ｋａｔａｏｋａ）ら（１９８１年）Ｃｅｌｌ  ２３：３５７頁
【非特許文献１４】モワット（Ｍｏｗａｔｔ）ら（１９８６年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：２６７４〜８３頁
【非特許文献１５】ツレック（Ｓｚｕｒｅｋ）ら（１９８５年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：６２０１４６頁
【非特許文献１６】ウー（Ｗｕ）ら（１９８４年）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２０３３〜４０頁
【非特許文献１７】ヒューズ（Ｈｕｓｅ）ら（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５頁
【非特許文献１８】ケイトン（Ｃａｔｏｎ）およびコプロウスキー（Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ）（１９９０年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８７：６４５０頁
【非特許文献１９】カン（Ｋａｎｇ）ら（１９９１年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８８：４３６３頁
【非特許文献２０】クラクソン（Ｃｌａｃｋｓｏｎ）ら（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４頁
【非特許文献２１】マッカファティ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら（１９９０年）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２頁
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体の産生に有用な遺伝子導入動物を提供する。本明細書において提供される遺伝子導入動物には、１）「軽（Ｌ）鎖のみの動物」と、２）「重（Ｈ）鎖のみの動物」と、３）「軽鎖のみの動物」および「重鎖のみの動物」の交配から生じる「子孫動物」とが含まれる。また、前記子孫動物のＢ細胞、および前記子孫動物からの該抗体を産生する単離Ｂ細胞によって産生されるヒト、ヒト化またはキメラ抗体も本発明によって提供される。また本発明は、前記子孫動物のＢ細胞から調製されるさまざまな特異性を有するヒト、ヒト化またはキメラ抗体を産生する不死化細胞株も提供する。
【００１３】
本発明は、その生殖細胞系列ＤＮＡ内に配置（導入）された選択された免疫グロブリン軽鎖の再編成されたＶ−Ｊ部分を含む軽（Ｌ）鎖のみの動物と、その生殖細胞系列ＤＮＡ内に配置（導入）された選択された免疫グロブリン（すなわち、既知の特異性を有するヒト、キメラ、齧歯類または他の種のｍＡｂ）重鎖の再編成されたＶＨＤＪＨ部分を含む重鎖（Ｈ）のみの動物とを包含する。また、前記軽鎖のみの動物および重鎖のみの動物の交配から生じる子孫動物も包含される。好ましくは、前記子孫動物の生殖細胞系列ＤＮＡは、選択された免疫グロブリン軽鎖の再編成されたＶ−Ｊ部分と、選択された免疫グロブリン重鎖の再編成されたＶＨＤＪＨ部分とを含み得る。
【００１４】
もう１つの実施形態では、本発明は、マウスμ定常領域の上流側に配置（導入）された選択された免疫グロブリン重鎖の再編成されたＶＨＤＪＨ部分と、マウス重鎖定常領域の１つまたは複数をコードするマウス生殖細胞系列ＤＮＡを置換する（例えば、マウスα領域、マウスＣγ３、Ｃγ１、Ｃγ２ｂおよびＣγ２ａ領域セット、ならびに／またはε重鎖定常領域を置換する）ヒト重鎖定常領域をコードする配列とを含む重（Ｈ）鎖のみの動物、好ましくはマウスまたはラットを提供する。ヒト重鎖定常領域配列は、スイッチ配列に作動可能に連結される。例えば、ヒトεまたはγ重鎖定常領域配列がマウスε重鎖定常領域を置換する場合、以下のような配列を構築することができる。
５’−Ｓε−ヒトＣε−Ｓα−Ｃα−３’、または
５’−Ｓε−ヒトＣγ−Ｓα−Ｃα−３’
ここで、Ｃは定常領域を表し、γはヒトγ定常領域のサブタイプＧ１、Ｇ２、Ｇ３またはＧ４もしくはこれらの一部のどれでもよく、Ｓはスイッチ配列を表し、そしてＳε、Ｓα−Ｃαはヒト起源でも非ヒト（例えば、マウス）起源でもよい。また本発明は、その生殖細胞系列ＤＮＡ内に配置（導入）された選択された免疫グロブリン軽鎖の再編成されたＶ−Ｊ部分を含む軽（Ｌ）鎖のみの動物、好ましくは、マウスＣＬκまたはＣＬλ配列の上流側の選択された免疫グロブリン軽鎖の再編成されたＶ−Ｊ部分を含む軽（Ｌ）鎖のみのマウスも提供し、好ましくは、マウスＣＬκまたはＣＬλ配列は、ヒトＣＬκまたはＣＬλ配列によって置換される。
【００１５】
また、前記軽鎖のみの動物および重鎖のみの動物の交配によって生じる子孫動物も包含される。
【００１６】
多数の好ましい実施例を想定することができ、本明細書においてさらに説明される。本発明は、以下のことを含むがこれら限定されない多数の利点を提供する。利点の多くは、本発明の遺伝子導入動物の生殖細胞系列ＤＮＡにおける改変の結果として、非ヒトＢ細胞によってその自然のＩｇ重鎖および軽鎖座位から、目的とする抗体（所定の抗体）を発現する可能性から発生する。初めに、１つの配置において、本発明は、目的とする抗体の一種類だけを産生するＢ細胞のセットを有する子孫動物を得ることができると規定している。これは、数多くのＢ細胞の中で最も望ましい抗体産生細胞が選択されるのを可能にする。次に、目的とする抗体（例えば、その特異性の配列が既知である抗体）の産生は、通常は不死化の後に、このような高産生細胞株から想定することができる。従って、目的とする抗体は、好ましくは、本発明の動物、ベクターおよび細胞がネイティブの調節制御配列を保持する（例えば、マウス、ラット）場合には、ネイティブ（細胞の起源の種に対して）の制御配列の制御下で発現され得る。しかしながら、ネイティブでない（例えば、ヒト）免疫グロブリン制御配列も同様に使用可能であることは認識されるであろう。Ｂ細胞は不死化されると産生によく適するので、このことは、商業的な産生細胞株が得られることを可能にする。現在の方法は、抗体が得られたときに初期免疫化から得られる細胞株からの産生、または抗体の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡの特定の産生細胞株（例えば、ＣＨＯ、骨髄腫）へのトランスフェクションのいずれかを必要とする。これらの現在の方法はどれも満足できるものではない。さらに、抗体が改変される際、キメラ、ヒト化およびＣＤＲグラフト化抗体の場合と同様に、構築物は必ず、宿主細胞にトランスフェクトされなければならない。さらに、いくつかの場合には、産生宿主細胞において目的とする抗体が発現される際にグリコシル化変化が生じ得る。例えば、ラットから得られるハイブリドーマは、マウス細胞株（例えば、ＣＨＯ）によって産生されるものとは異なるグリコシル化を有すると報告されており、いくつかのラット起源の抗体に関して、マウス細胞株は、フコース含量の増大を生じ、これは次に、標的細胞に対するＡＤＣＣ（抗体依存性の細胞の細胞傷害性）活性の減少をもたらすことがわかっている。従って、産生細胞におけるグリコシル化が初期ハイブリドーマにおけるものとは異なるいくつかの抗体に関しては、現在の方法を用いて新しい細胞株を産生することが有利であり、商業的な産生において使用され得る。
【００１７】
本発明の方法は、さらに、その内在性の免疫グロブリン遺伝子によって起こり得るように他の抗体を産生しない細胞から所定の抗体を産生する能力を提供する。ヒト化、キメラ、またはリード抗体とは異なる定常領域アイソタイプを有する抗体などの商業的に関心のある多数の抗体タイプのためには、これは一般に今までのところ不可能である。また、他のタンパク質、例えば、蛍光タンパク質へ連結された定常鎖を有する抗体を産生することも有利であり得る。マーカーに対する抗体の正確な比率は診断用途および研究用途において重要である。
【００１８】
また本発明は、その他の利点も提供する。例えば、単一の子孫動物は、異なるフォーマットの抗体を産生する異なる細胞を産生することができる。その発現がスイッチ領域の制御下にある、多数の目的とする定常領域に連結された、目的とする抗体の再編成された可変領域を有する動物を作り出すことによって、所望される任意のアイソタイプ、他の種からの定常領域、または検出可能なマーカーに連結された定常領域を有する、目的とする抗体を発現させることが可能である。これは、医薬開発において、例えば、定常領域により仲介させる効果（例えば、抗体が結合される細胞を枯渇させる）を識別するために同じリード抗体の完全抗体および抗体断片の両方を生じさせるのが望ましいことが多い場合に有用である。検出可能なマーカーを用いずに、そしてマーカーに連結したフォーマットにおいて、同じ抗体を産生する細胞を得ることができる診断および研究においても使用を見出すことができる。
【００１９】
また更なる利点において、本発明の子孫動物において可変領域の体細胞超変異を誘発する可能性の結果として、本発明は、目的とする抗体の改変および改善も提供する。例えば、その抗原に対して低親和性を有する抗体は、体細胞超変異によって改善することができ、従って親和性成熟が提供される。
【００２０】
また本発明は、マウスμ定常領域の上流側に配置された選択された免疫グロブリン重鎖の再編成されたＶＨＤＪＨ部分の配列、マウス重鎖定常領域の１つまたは複数をコードするマウス生殖細胞系列ＤＮＡを置換する（例えば、マウスα領域、マウスＣγ３、Ｃγ１、Ｃγ２ｂおよびＣγ２ａ領域のセット、および／またはマウスε重鎖定常領域を置換する）ヒト重鎖定常領域をコードする配列、ならびに２本の相同性アームを含む標的構築物も提供する。ヒト重鎖定常領域をコードする前記配列は、好ましくは、スイッチ配列に作動可能に連結される。前記標的構築物は、前記再編成されたＶＨＤＪＨ部分およびヒト重鎖定常領域をコードする前記配列が挿入されたマウスＩｇＨ座位の少なくとも一部を含む。また本発明は、Ｃカッパ（ＣＬκまたはＩｇκとも呼ばれる）またはＣラムダ（ＣＬλまたはＩｇλとも呼ばれる）軽鎖配列の上流側の選択された免疫グロブリン軽鎖の再編成されたＶ−Ｊ部分、ならびに２本の相同性アームを含む第２の標的構築物も提供し、ＣＬκおよびＣＬλ配列は、好ましくは、マウスまたはヒト起源である。特定の実施形態では、前記第２の標的構築物は、ヒトＣカッパ（ＣＬκまたはＩｇκとも呼ばれる）またはＣラムダ（ＣＬλまたはＩｇλとも呼ばれる）軽鎖配列の上流側の選択された免疫グロブリン軽鎖の再編成されたＶ−Ｊ部分ならびに２本の相同性アームを含む。
【００２１】
従って、前記第１および第２の標的構築物を含む標的構築物のセットも提供される。第１および第２の標的構築物は、任意で、選択可能なマーカーをコードする配列と、標的構築物中に含まれるＩｇ遺伝子の発現を駆動することができる免疫グロブリン（Ｉｇ）プロモーターとを含み得る。また標的構築物は、既に記載した認識、増幅および／または標的配列を含有することができる。任意で、標的構築物は、２本の相同性アームの外側に負の選択可能なマーカーを含むこともできる。
【００２２】
本発明のもう１つの目的は、前記第１または前記第２の標的構築物を有する細胞をトランスフェクトすることによって産生される、安定的にトランスフェクトされた胚性幹（ＥＳ）細胞クローンと、前記安定的にトランスフェクトされた胚性幹（ＥＳ）細胞クローンを有する遺伝子導入非ヒト哺乳類を作り出す方法とである。後者の方法によると、本発明に従って安定的にトランスフェクトされたＥＳ細胞クローンはマウスの胚盤胞に注入され、これらの胚盤胞は代理母に移され、そこから生まれた動物が交配されて、その子孫が変異の存在について選択される。これらの子孫は、その生殖細胞系列ＤＮＡ内に第１または第２の標的ベクターからの配列を挿入されたかどうかによって、「軽（Ｌ）鎖のみの動物」または「重（Ｈ）鎖のみの動物」のいずれかであり得る。このようにして得ることができる遺伝子導入非ヒト動物も本発明の目的である。
【００２３】
「軽鎖のみの動物」および「重鎖のみの動物」の交配から生じる「子孫動物」は、第１および第２の標的ベクターの両方からの配列の存在について選択される。このようにして得ることができる遺伝子導入非ヒト動物も本発明の目的であり、従って、このような動物は、その生殖細胞系列ＤＮＡ内に、（ａ）マウスμ定常領域の上流側に配置された選択された免疫グロブリン重鎖の再編成されたＶＨＤＪＨ部分と、（ｂ）好ましくは、スイッチ配列に作用的に連結された１つまたは複数の重鎖定常領域をコードするマウス生殖細胞系列ＤＮＡを置換する（例えば、マウスα領域、マウスＣγ３、Ｃγ１、Ｃγ２ｂおよびＣγ２ａ領域のセット、および／またはε重鎖定常領域を置換する）ヒト重鎖定常領域をコードする配列と、（ｃ）マウスＣＬκまたはＣＬλ配列（好ましくは、ヒトＣＬκまたはＣＬλ配列がマウスＣＬκまたはＣＬλ配列を置換する）の上流側の選択された免疫グロブリン軽鎖の再編成されたＶ−Ｊ部分とを含む。本発明のもう１つの目的は、目的とする抗体を産生するＢ細胞を得るため、またはその標的抗原に対する抗体の結合親和性の最適化のための、このような遺伝子導入非ヒト動物の使用である。
【００２４】
抗体の可変領域の結合親和性の最適化方法も提供される。これは、高親和性抗体を産生するために使用することができる。
【００２５】
本発明の特定の態様では、本発明の方法および動物は、重鎖および軽鎖可変部が前記再編成されたＶＨＤＪＨおよび再編成されたＶＪセグメントによってそれぞれコードされるリード抗体とは、配列が異なる（重鎖に関して）が機能的には関連している抗体を獲得または設計するために使用される。従って、本発明は、リード抗体の抗原結合領域を改変するため、またはリード抗体に基づいて改変された抗体を調製するための方法も包含する。得られた抗体の配列は、標的抗原に対する改善された親和性を有する抗体を産生するために選択的な方法で、非ヒト抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）および／またはヒト化フレームワーク（ＦＲ）に多様な配列を含むことができる。
【００２６】
本発明は、リード抗体またはリード配列の重鎖可変領域ポリペプチドの１つまたは複数のＣＤＲにおいて少なくとも１つのアミノ酸置換を有する１つまたは複数のＣＤＲを含む、標的抗原またはその機能性断片に対して選択的な結合親和性を表す高親和性抗体を得るための方法を提供し、前記抗体またはその機能性断片は、標的抗原結合活性、標的抗原結合特異性または標的抗原阻害活性を有し、前記高親和性抗体の標的抗原結合親和性は、親のリード抗体またはリード配列を含む抗体に関して親和性がより高い。該方法は、μ定常領域の上流側、好ましくは、Ｓμスイッチの上流側でその生殖細胞系列ＤＮＡ内にリード配列またはリード抗体をコードする再編成されたＶＨＤＪＨおよび再編成されたＶＪセグメントを含む「子孫動物」を提供することと、リード配列またはリード抗体のＢ細胞仲介の親和性成熟（体細胞超変異）を誘発するのに適切な方法で前記動物を標的抗原で免疫化することと、標的抗原結合活性、標的抗原結合特異性または標的抗原阻害活性を有する抗体を産生することができるＢ細胞を回収することとを含み、前記高親和性抗体の標的抗原結合親和性は、親のリード抗体またはリード配列として使用される前記再編成されたＶＨＤＪＨおよび再編成されたＶＪセグメントを含む抗体に関して親和性がより高い。
【００２７】
さらに好ましい実施形態は、以下の通りである。
【００２８】
１つの態様では、本発明は、ヒト、非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の特異的な抗原に結合する、目的とする抗体、またはこのような抗体を産生する細胞を獲得または産生するための方法を提供し、該方法は、
ａ）生殖細胞系列に作動可能に連結されたヒト、非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の重鎖の再編成された可変領域を少なくともコードする配列、または改変された重鎖定常領域配列を含む第１の非ヒト動物を構築することと、
ｂ）生殖細胞系列に作動可能に連結された特定のヒト、非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の軽鎖の再編成された可変領域を少なくともコードする配列、または改変された軽鎖定常領域配列を含む第２の非ヒト動物を構築することと、
ｃ）動物ａ）およびｂ）を交配させて子孫動物を得て、前記子孫動物のＢ細胞が、目的とする抗体を産生できるかどうかを決定することと
を含む。好ましくは、子孫動物が、目的とする抗体を産生できるかどうかを決定する前記ステップは、Ｂ細胞によって産生される抗体が、ヒト、非ヒトキメラまたはヒト化リード抗体の特異的な抗原に対して特異的に結合するかどうかを決定することを含む。実施形態のいずれかにおいて、方法は、軽鎖および重鎖の可変領域セグメントの体細胞超変異、従って前記動物からのＢ細胞によって産生される抗体の親和性成熟を誘発するために、所望の表現型を有する子孫動物を処置することを含むことができる。上記の実施形態のいずれかにおいて、方法は、ヒト、非ヒト、キメラまたはヒト化抗体を産生するＢ細胞のクローン増殖を刺激するため、および／またはＩｇＭ産生から所望のサブタイプのＩｇＧ抗体の産生へのアイソタイプスイッチを引き起こすために、所望の表現型を有する子孫動物を処置することを含むこともできる。好ましくは、上記の実施形態のいずれかにおいて、方法は、目的とする抗体を産生する前記動物からのＢ細胞を選択または単離することをさらに含む。好ましくは、方法は、Ｂ細胞を選択することが、Ｂ細胞によって産生される抗体のレベルを評価することを含むことを含む。好ましくは、任意で、前記Ｂ細胞を骨髄腫細胞に融合させてハイブリドーマを産生することによって前記Ｂ細胞株を不死化する。
【００２９】
もう１つの実施形態では、本発明は、少なくとも、
生殖細胞系列に作動可能に連結されたヒト、非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の重鎖の再編成された可変領域を少なくともコードする配列、または改変された重鎖定常領域配列と、
生殖細胞系列に作動可能に連結された特定のヒト、非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の軽鎖の再編成された可変領域を少なくともコードする配列、または改変された軽鎖定常領域配列と
がその生殖細胞系列ＤＮＡ内に配置された非ヒト動物を提供する。
【００３０】
もう１つの実施形態では、本発明は、少なくとも、ネイティブのμ定常領域の上流側のヒト、非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の重鎖の再編成された可変領域と、（ｉ）ネイティブの重鎖定常領域の１つまたは複数をコードするネイティブの生殖細胞系列ＤＮＡを置換し、そして（ｉｉ）スイッチ配列に作動可能に連結された重鎖定常領域をコードする配列とがその生殖細胞系列ＤＮＡ内に配置された非ヒト動物を提供する。好ましくは、この動物は、さらに、ヒト、非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の免疫グロブリン軽鎖の再編成された可変領域をその生殖細胞系列ＤＮＡ内に含む。
【００３１】
もう１つの実施形態では、本発明は、
生殖細胞系列に作動可能に連結されたヒト、非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の重鎖の再編成された可変領域を少なくともコードする配列、または改変された重鎖定常領域配列を含む第１のベクターと、
生殖細胞系列に作動可能に連結された特定のヒト、非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の軽鎖の再編成された可変領域を少なくともコードする配列、または改変された軽鎖定常領域配列を含む第２のベクターと、
を含む、標的構築物として使用するために適切なベクターのセットを提供する。
【００３２】
もう１つの実施形態では、本発明は、ＩｇＨ座位の少なくとも一部を含む標的構築物として使用するために適切なベクターを提供し、前記ベクターまたは構築物は、さらに、
μ定常領域の上流側のヒト、非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の重鎖の再編成された可変領域と、
（ｉ）前記ＩｇＨ座位のネイティブの重鎖定常領域の１つまたは複数をコードするネイティブのＤＮＡを置換し、そして（ｉｉ）スイッチ配列に作動可能に連結された重鎖定常領域をコードする配列と
を含む。もう１つの実施形態では、本発明は、上記の文で記載した第１のベクターと、生殖細胞系列に作動可能に連結された特定のヒト、非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の軽鎖の再編成された可変領域を少なくともコードする配列、または改変された定常領域配列を含む第２のベクターとを含む、標的構築物として使用するために適切なベクターのセットを提供する。
【００３３】
もう１つの実施形態では、本発明は、少なくとも、
生殖細胞系列に作動可能に連結された非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の重鎖の再編成された可変領域を少なくともコードする配列、または改変された定常領域配列と、
生殖細胞系列に作動可能に連結された特定の非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の軽鎖の再編成された可変領域を少なくともコードする配列、または改変された定常領域配列と
がそのＤＮＡ内に組み込まれたアイソタイプスイッチ細胞を提供し、前記細胞はアイソタイプスイッチングを受けている。
【００３４】
もう１つの実施形態では、本発明は、少なくとも、
生殖細胞系列に作動可能に連結された非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の重鎖の再編成された可変領域を少なくともコードする配列、または改変された定常領域配列と、
生殖細胞系列に作動可能に連結された特定の非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の軽鎖の再編成された可変領域を少なくともコードする配列、または改変された定常領域配列と
がそのＤＮＡ内に組み込まれた非ヒトＢ細胞を提供し、前記細胞は単一の抗体種を発現する。
【００３５】
もう１つの実施形態では、本発明は、少なくとも、
生殖細胞系列に作動可能に連結された非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の重鎖の再編成された可変領域を少なくともコードする配列、または改変された定常領域配列と、
生殖細胞系列に作動可能に連結された特定の非ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の軽鎖の再編成された可変領域を少なくともコードする配列、または改変された定常領域配列と
がそのＤＮＡ内に組み込まれた非ヒトＢ細胞を提供し、
前記細胞は、前記再編成された可変領域配列によってコードされるものとはその可変領域配列が異なる抗体を生じさせることができる配列をそのゲノムＤＮＡ内に含有しない。
【００３６】
多数のさらに好ましい実施形態が本明細書中に記載されており、これらが本明細書に記載される方法、動物、ベクターまたは細胞の実施形態のいずれかに適用され得ることは、当業者により認識されるであろう。本明細書における方法、動物、ベクターまたは細胞の１つの態様では、重鎖の再編成された可変領域および軽鎖の再編成された可変領域をコードする前記配列は細胞によって独立して発現され、そして好ましくは、ネイティブ（細胞起源の種に対して）または任意でネイティブでない（例えば、ヒト）免疫グロブリン制御配列の制御下で発現される。もう１つの態様では、重鎖および／または軽鎖の前記再編成された可変領域は、ヒトリード抗体に由来する。もう１つの態様では、重鎖および／または軽鎖の前記再編成された可変領域は、非ヒトリード抗体に由来する。もう１つの態様では、重鎖および／または軽鎖の前記再編成された可変領域は、マウスリード抗体に由来する。もう１つの態様では、重鎖および／または軽鎖の前記再編成された可変領域は、１つまたは複数のアミノ酸置換を有するマウスリード抗体に由来する。もう１つの態様では、重鎖および／または軽鎖の前記再編成された可変領域は、キメラリード抗体に由来する。もう１つの態様では、重鎖および／または軽鎖の前記再編成された可変領域は、ＣＤＲグラフト化リード抗体に由来する。さらにもう１つの態様では、重鎖および／または軽鎖の前記再編成された可変領域は、リードヒト化リード抗体に由来する。好ましくは、重鎖または軽鎖の前記再編成された可変領域は、既知の特異性を有するリード抗体から得られるか、あるいは既知の特異性を有するリード抗体に由来する。
【００３７】
本明細書中の方法、動物、ベクターまたは細胞のいずれかにおいて、前記重鎖定常領域配列は非ヒト起源でもよい。本明細書中の方法、動物、ベクターまたは細胞のいずれかにおいて、前記軽鎖定常領域配列は非ヒト起源である。本明細書中の方法、動物、ベクターまたは細胞のいずれかにおいて、前記重鎖定常領域配列はマウス起源である。本明細書中の方法、動物、ベクターまたは細胞のいずれかにおいて、前記重鎖定常領域配列はヒト起源である。本明細書中の方法、動物、ベクターまたは細胞のいずれかにおいて、前記軽鎖定常領域配列はヒト起源である。本明細書中の方法、動物、ベクターまたは細胞のいずれかにおいて、前記重鎖定常領域配列は、任意で、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３またはＧ４サブタイプのγアイソタイプを有する。好ましい実施例では、前記重鎖定常領域は、Ｇ１サブタイプを有し、ヒンジ領域に存在して鎖間ジスルフィド架橋に関与するシステインをコードするコドンの５’近位で切断され、Ｆａｂ部分を生じさせる配列を表す。本明細書中の方法、動物、ベクターまたは細胞のいずれかにおいて、定常領域配列はさらに、検出可能なマーカーに組換えで結合される。
【００３８】
本明細書中の方法、動物、ベクターまたは細胞のいずれかにおいて、重鎖の前記再編成された可変領域はネイティブのμ定常領域の上流側に配置されることが可能であり、重鎖定常領域をコードする配列は、（ｉ）ネイティブの重鎖定常領域の１つまたは複数をコードするネイティブのＤＮＡを置換し、そして（ｉｉ）スイッチ配列に作動可能に連結される。
【００３９】
本明細書中の方法、動物、ベクターまたは細胞のいずれかにおいて、前記定常領域配列は、マウスα領域、マウスＣγ３、Ｃγ１、Ｃγ２ｂおよびＣγ２ａ領域セット、および／またはε重鎖定常領域を置換する重鎖定常領域を含む。
【００４０】
好ましい実施形態では、前記定常領域配列は、マウスε重鎖定常領域を置換するヒトεまたはγ重鎖定常領域配列を含む。
【００４１】
もう１つの実施形態では、前記定常領域配列はマウスε重鎖定常領域を置換するヒトεまたはγ重鎖定常領域配列を含み、動物、ベクターまたは細胞が、以下のような配列：
５’−Ｓε−ヒトＣε−Ｓα−Ｃα−３’、または
５’−Ｓε−ヒトＣγ−Ｓα−Ｃα−３’
（ここで、Ｃは定常領域を表し、γはヒトγ定常領域のサブタイプＧ１、Ｇ２、Ｇ３またはＧ４もしくはその一部のいずれでもよく、Ｓはスイッチ配列を表し、そしてＳε、ＳαおよびＣαはヒト起源でも非ヒト起源でもよい）をそのＤＮＡ内に含む。
【００４２】
もう１つの実施形態では、前記定常領域配列はマウスγ重鎖定常領域を置換するヒトγ重鎖定常領域配列を含み、動物、ベクターまたは細胞は、以下のような配列：
５’−Ｓγ−ヒトＣγ−３’
（ここで、Ｓはスイッチ配列を表し、Ｃγはヒト定常領域γサブタイプＧ１、Ｇ２、Ｇ３またはＧ４もしくはその一部を表し、そしてＳγはヒト起源でも非ヒト起源でもよい）をそのＤＮＡ内に含む。
【００４３】
もう１つの実施形態では、前記定常領域配列は、第１のネイティブの定常領域を置換する第１の重鎖定常領域と、第２のネイティブの重鎖定常領域を置換する第２の重鎖定常領域とを含む。
【００４４】
もう１つの実施形態では、前記第１の重鎖定常領域はマウスα領域および／またはマウスＣγ３、Ｃγ１、Ｃγ２ｂおよびＣγ２ａ領域セットを置換し、前記第２の重鎖定常領域はマウスε重鎖定常領域を置換する。
【００４５】
もう１つの実施形態では、γ重鎖定常領域配列はマウスγ重鎖定常領域を置換し、動物、ベクターまたは細胞は、以下のような配列：
５’−Ｓγ−置換Ｃγ１−Ｓ（εまたはα）−置換Ｃγ２−３’
（ここで、Ｓはスイッチ配列を表し、Ｃγ１およびＣγ２はそれぞれ異なる定常領域γサブタイプを表す）をそのＤＮＡ内に含む。
【００４６】
もう１つの実施形態では、ヒトγ重鎖定常領域配列はマウスγ重鎖定常領域を置換し、動物、ベクターまたは細胞は、以下のような配列：
５’−Ｓγ−ヒトＣγ１−Ｓ（εまたはα）−ヒトＣγ２−３’
（ここで、Ｓはスイッチ配列を表し、Ｃγ１およびＣγ２はそれぞれ、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３またはＧ４から独立して選択される異なるヒト定常領域γサブタイプを表し、そしてＳε、ＳαおよびＳγのそれぞれは、ヒト起源でもマウス起源でもよい）をそのＤＮＡ内に含む。
【００４７】
もう１つの実施形態では、ヒトγ重鎖定常領域配列はマウスγ重鎖定常領域を置換し、動物は以下のような配列：
５’−Ｓγ３−ヒトＣγ１−Ｓε−ヒトＣγ２−Ｓα−Ｃα−３’
（ここで、Ｓはスイッチ配列を表し、Ｃは定常領域を表し、Ｃγ１およびＣγ２は、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３またはＧ４から独立して選択されるヒト定常領域γサブタイプを表し、そしてＣα、Ｓε、ＳαおよびＳγのそれぞれはヒト起源でもマウス起源でもよい）をその生殖細胞系列ＤＮＡ内に含む。
【００４８】
好ましい実施形態では、Ｓγはマウス起源のＳγ３である。
【００４９】
本明細書中の方法、動物、ベクターまたは細胞のいずれかにおいて、動物または細胞は、好ましくは、ラットまたはマウスであり、あるいは、細胞はラットまたはマウス細胞である。
【００５０】
本明細書中の方法、動物、ベクターまたは細胞のいずれかの好ましい実施形態では、前記動物のＢ細胞は、リード抗体の特異的な抗原に結合する、目的とする抗体を産生するＢ細胞から本質的になる。好ましくは、Ｂ細胞は、ネイティブ（Ｂ細胞の起源の種に対して）の制御配列の制御下で、目的とする抗体を発現する。
【００５１】
もう１つの実施形態では、本発明は、目的とする抗体またはそれを産生する細胞を得るための方法を提供し、該方法は、
本明細書に記載される実施形態のいずれかに従う非ヒト動物を提供することと、
ＶＨＤＪＨおよびＶＬＪＬセグメントの体細胞超変異を誘発し、それに伴って前記動物からのＢ細胞によって産生される抗体の親和性成熟を誘発するために、所望の表現型を有する子孫動物を処置することと
を含む。
【００５２】
もう１つの実施形態では、本発明は、目的とする抗体またはそれを産生する細胞を得るための方法を提供し、該方法は、
本明細書に記載される実施形態のいずれかに従う非ヒト動物を提供することと、
抗体を産生するＢ細胞のクローン増殖を刺激するため、および／またはＩｇＭ産生から所望のサブタイプのＩｇＧ抗体の産生へのクラススイッチを引き起こすために、所望の表現型を有する子孫動物を処置することと
を含む。
【００５３】
上記の方法の好ましい実施形態では、該方法は、目的とする抗体をコードまたは産生する前記動物からのＢ細胞を選択することをさらに含み、前記目的とする抗体は、リード抗体配列が由来した抗体と同じ抗原に結合する。方法のいずれかのもう１つの実施形態では、該方法は、Ｂ細胞による抗体産生のレベルを評価することをさらに含む。
【００５４】
方法のいずれかのもう１つの実施形態では、該方法は、前記Ｂ細胞株を不死化することをさらに含み、任意で、前記Ｂ細胞を骨髄腫細胞に融合させてハイブリドーマを産生することをさらに含む。
【００５５】
もう１つの実施形態では、本発明は、本明細書中の実施形態のいずれかの非ヒト動物から得られる、または本明細書中の方法に従って得られるＢ細胞を提供する。また、このようにして得られたＢ細胞を不死化することによって得られる細胞も包含され、前記Ｂ細胞を第２の細胞と融合させることによって得られるハイブリドーマが含まれるがこれに限定されない。また、本発明の細胞のいずれかによって産生される抗体も包含され、任意で、前記抗体はＦａｂ断片である。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本発明は、マウス宿主細胞において発現される同じアミノ酸配列の抗体と識別可能なグリコシル化を有する、本発明の実施形態に従って得られる抗体をさらに含む。前記抗体は、マウス宿主細胞において発現される同じアミノ酸配列の抗体と比較して、Ｎ−グリコシドグリコシド結合糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンのフコース含量の低下（または不在）および／または抗体が特異的である抗原を発現する細胞に対するＡＤＣＣ活性を誘発する能力の増大を有し得る。
【００５７】
もう１つの実施形態では、本発明は、本明細書中の実施形態のいずれかに従う細胞を提供し、前記細胞は、培養液中に保持されたときに、目的とする前記抗体を細胞外の培地中に分泌する。好ましくは、前記細胞は、目的とする前記抗体のみを分泌する。
【００５８】
本明細書中の実施形態のいずれかにおいて、免疫グロブリン重鎖の再編成された可変領域は再編成されたＶＨＤＪＨ部分であり、および／または免疫グロブリンの軽鎖の再編成された可変領域は、再編成されたＶ−Ｊ部分である。
【００５９】
他の実施形態では、本発明は、重鎖および軽鎖を含む機能性抗体を産生するための方法を提供し、該方法は、細胞が、重鎖の前記再編成された可変領域および軽鎖の前記再編成された可変領域を発現し、そして得られた鎖が細胞内で一緒に構築されて免疫グロブリンを形成し、これが次に、リード抗体の特異的な抗原に特異的に結合することができる形態で分泌されるように、本明細書中の実施形態のいずれかの細胞を栄養培地中に保持するステップを含む。任意で、該方法は、前記抗体を回収することを含む。
【００６０】
表の簡単な説明
表１は、本発明における使用に適した典型的なヒト化抗体を提供する。特にそれぞれのヒト、ヒト化またはキメラ抗体について本明細書において開示される核酸およびアミノ酸配列に関して、表中で引用される参考文献は、参照によってその全体が援用される。
【００６１】
表２は、ヒト、マウスおよびラットに由来する抗体産生Ｂ細胞の不死化に適した種々の典型的な骨髄腫細胞を開示する。これらの骨髄腫細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、１０８０１ユニバーシティ・ブルバード（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．）、マナッサス、ＶＡ２０１１０から得ることができる。
【００６２】
表３は、一般に使用されるリガンド／結合パートナー系である。「結合パートナー」の列に開示されるペプチド／ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、フレームにおいて、動物に挿入するためのＤＮＡ構築物の調製において使用される抗体の重鎖および／または軽鎖をコードするポリヌクレオチドの定常領域に結合され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
本明細書において使用される場合、「核酸」または「核酸分子」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生じる断片、ならびに連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生じる断片を指す。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡなど）、または天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドのアルファ−エナンチオマー形態）、もしくは両方の組み合わせであるモノマーで構成することができる。改変されたヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジンまたはプリン塩基部分に変化を有することができる。糖の改変には、例えば、ハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基による１つまたは複数のヒドロキシル基の置換が含まれる。あるいは、糖は、エーテルまたはエステルとして官能基化され得る。さらに、糖部分全体は、アザ糖および炭素環式糖類似体などの立体的および電子的に類似の構造で置換することができる。塩基部分の改変の例には、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、または他のよく知られた複素環式置換が含まれる。核酸モノマーは、リン酸ジエステル結合またはこのような結合の類似体よって連結され得る。リン酸ジエステル結合の類似体としては、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオアート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホルアニリダート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌｉｄａｔｅ）、ホスホルアミダートなどがある。核酸は一本鎖または二本鎖のいずれでもよい。
【００６４】
「トランスフェクション」という用語は、遺伝子移入によって核酸、例えば標的ベクターをレシピエント細胞内に導入することを指す。
【００６５】
「形質転換」は、本明細書において使用される場合、外因的なＤＮＡまたはＲＮＡの細胞取込みの結果として細胞の遺伝子型が変化される方法を指す。
【００６６】
本明細書において使用される場合、「導入遺伝子」という用語は、遺伝子導入動物または導入された細胞に対して部分的または完全に異種、すなわち外来性である配列、あるいは遺伝子導入動物または導入された細胞の内在性遺伝子に対して相同であるが、挿入される細胞ゲノムを変更するように、このような位置で動物のゲノムに挿入されるように設計される、または挿入される核酸配列を指す。導入遺伝子は、１つまたは複数の転写性制御配列、および選択された核酸の最適な発現に必要なイントロンなどの他の核酸に作動可能に連結されることも可能である。
【００６７】
「遺伝子導入の」という用語は、本明細書では、例えば動物または構築物の、導入遺伝子を内部に持つという性質を説明するための形容詞として使用される。例えば、本明細書において使用される場合、「遺伝子導入生物体」は、当該技術分野においてよく知られた遺伝子組換え技法（相同組換えによる相同の内在性遺伝子の置換を含むがこれに限定されない）などのヒトの介入によって導入された異種核酸を、動物の細胞の１つまたは複数が含有している任意の動物、好ましくは非ヒト哺乳類である。核酸は、計画的な遺伝子操作（マイクロインジェクションまたは組換えウィルスによる感染など）によって、直接的または細胞の前駆体への導入により間接的に細胞内に導入される。遺伝子操作という用語は古典的な交雑または体外受精を含まないが、組換えＤＮＡ分子の導入に関する。この分子は染色体内に組み込まれてもよいし、染色体外複製ＤＮＡでもよい。本明細書において記載される典型的な遺伝子導入動物では、導入遺伝子は、細胞に免疫グロブリンを発現させる。「創始系統」および「創始動物」という用語は、導入遺伝子が添加された胚の成熟産物である動物、すなわちＤＮＡが挿入され、１つまたは複数の代理宿主に移植された胚から成長した動物を指す。本発明は、本明細書において記載される導入遺伝子または発現構築物を保有する該動物ならびに末裔または子孫を包含する。
【００６８】
本明細書において使用される場合、「細胞」、「細胞株」および「細胞培養液」という表現は交換可能に使用され、このような指摘は全て子孫を含む。本発明の目的のために、このような細胞は、遺伝子導入哺乳類に由来するか、または本明細書において記載される標的構築物またはベクターの１つを用いる細胞の形質転換によって直接産生され得る。「形質転換体」および「形質転換細胞」という語は転移の数に関係なく、それが由来する最初の対象細胞および培養液を含む。また、全ての子孫は、計画的なまたは不注意の変異のためにＤＮＡ含量が正確に同一でないこともあると理解される。最初に形質転換された細胞または動物において得られると同じ機能または生物活性を有する変異子孫が含まれる。
【００６９】
「単離」、「精製」または「生物学的に純粋」という用語は、そのネイティブ状態で見られるように通常は付随されない成分を実質的または本質的に含まない材料を指す。純度および均一性は、通常、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィなどの分析化学技法を用いて決定される。調製物中に存在する優勢な種であるタンパク質は実質的に精製される。
【００７０】
「組換えの」という用語は、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関してして使用される場合、異種の核酸またはタンパク質の導入またはネイティブな核酸またはタンパク質の変更によって細胞、核酸、タンパク質またはベクターが改変されていること、あるいは細胞がそのように改変された細胞に由来することを示す。従って、例えば、組換え細胞は、細胞のネイティブ（非組換え）形態では見られない遺伝子、もしくはそうでなければ異常発現される、低発現される、または全く発現されないネイティブ遺伝子を発現する。
【００７１】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に配置されるときに「作動可能に連結される」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼせば、コード配列に作動可能に連結される。スイッチ配列については、作動可能に連結されるとは、配列がスイッチ組換えをもたらすことができることを示す。
【００７２】
「再編成された」という用語は、Ｖセグメントが、それぞれ完全なＶＨまたはＶＬドメインを本質的にコードするコンホメーションのＤ−ＪまたはＪセグメントに直接隣接して配置された重鎖または軽鎖免疫グロブリン座位の配置を指す。再編成された免疫グロブリン遺伝子座位は、生殖細胞系列ＤＮＡと比較することによって同定することができる。
【００７３】
Ｖセグメントに関連して、「再編成されていない」または「生殖細胞系列の配置」という用語は、ＶセグメントがＤまたはＪセグメントに直接隣接するように組み換えられていない配置を指す。
【００７４】
「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラスを指す。重鎖は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）またはイプシロン（ε）に分類され、それぞれ、抗体のアイソタイプを、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥと定義する。さらなる構造的変異は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）およびＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）の別個のサブタイプを特徴付ける。「アイソタイプスイッチ」は、抗体のクラスまたはアイソタイプが１つのＩｇクラスから他のＩｇクラスのうちの１つに変化する現象を指す。
【００７５】
「スイッチされていないアイソタイプ」は、アイソタイプスイッチが生じていない場合に産生された重鎖のアイソタイプクラスを指し、スイッチされていないアイソタイプをコードするＣＨ遺伝子は、通常、機能的に再編成されたＶＤＪ遺伝子（例えば、改変されていない配置のＣμ）のすぐ下流側の第１のＣＨ遺伝子である。アイソタイプスイッチは、古典的または非古典的なアイソタイプスイッチに分類されている。
【００７６】
「スイッチ配列」という用語は、アイソタイプスイッチを仲介するスイッチ組換えの原因であるＤＮＡ配列を指す。スイッチ配列、スイッチドナーおよびスイッチアクセプタは、本明細書においてさらに記載される。
【００７７】
抗体の「高親和性」という用語は、少なくとも約１０７Ｍ−１、少なくとも約１０８Ｍ−１、少なくとも約１０９Ｍ−１、少なくとも約１０１０Ｍ−１、少なくとも約１０１１Ｍ−１、または少なくとも約１０１２Ｍ−１またはそれより大きい平衡結合定数（Ｋａ）、例えば、１０１３Ｍ−１または１０１４Ｍ−１まで、もしくはそれより大きい平衡結合定数（Ｋａ）を指す。しかしながら、「高親和性」結合は他の抗体アイソタイプに対して変化し得る。
【００７８】
リード配列
当該技術分野において既知のモノクローナル抗体、または抗体を産生する細胞は、本発明に従う遺伝子導入動物の構成に必要な核酸または核酸情報を産生するための基礎としての機能を果たすことができる。このような抗体または核酸配列は、「リード抗体」または「リード配列」と称することもできる。「リード抗体」または「リード配列」は、通常、抗体への抗原結合能力を与える部分をコードする抗体または配列の一部を含むであろう。
【００７９】
例えば、文献で報告されているヒト化抗体の種々の非限定的な例は、表１において提供される（特に本明細書において開示されるヒト化抗体をコードする核酸およびアミノ酸配列に関して、これらの参考文献はそれぞれ参照によってその全体が本明細書に援用される）。これらの参考文献で開示される核酸は、以下に開示される「軽鎖のみ」または「重鎖のみ」の動物の構築において用いることができる。一般に、リード抗体は、ヒト抗体（例えば、ヒトＩｇ座位を保有するマウスの免疫化によって得られるような）、キメラ抗体、非ヒト抗体（例えば、マウス）、またはヒト化抗体である。しかしながら、いくつかの場合（例えば、標的抗原に対する親和性の増大が追及される場合）には、リード抗体は、コンビナトリアル（例えばファージディスプレイ）技法によって得られるポリペプチドでもよい。
【００８０】
「免疫グロブリン」および「抗体」という用語は、交換可能に使用することができる。
【００８１】
「キメラ抗体」は、ヒト部分および非ヒト部分を含む免疫グロブリン分子である。キメラ抗体は、非ヒト抗体分子の抗原結合特異性およびヒト抗体分子により付与されるエフェクター機能を有することができる。従って、「キメラ抗体」という用語は、抗体分子の可変領域の全てまたは一部が１つの動物種に由来し、抗体分子の定常領域が第２の動物に由来する抗体を包含する。本発明の特定の実施形態では、抗体の定常領域はヒトに由来し、そしてキメラ抗体の可変領域はマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ニワトリ、ウマ、雌ウシ、またはヒツジに由来することができる。キメラ抗体の製造方法も当該技術分野においてよく知られている（例えば、参照によってその全体が本明細書に援用される米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照）。「キメラ抗体」という用語は、ヒト化およびＣＤＲグラフト化抗体を包含する。ＣＤＲグラフト化が、ドナー抗体のＣＤＲの全てから、または一部（すなわち、少なくとも１つ）だけからの配列を保持することを含み得ることは認識されるであろう。また、ＣＤＲグラフト化は、全体のＣＤＲ配列を保持するか、あるいは特異性決定残基（ＳＤＲ）、Ａｂおよびそのリガンドの表面相補性に必須の残基のみを保持することを含み得ることも認識されるであろう。さらに、残基は、同様の特性を有する残基に交換され得る。フレームワーク、ＳＤＲ以外のＣＤＲ配列は単一のドナーから生じてもよいし、あるいは多数のドナー配列から構築されてもよい。
【００８２】
「ヒト化抗体」という用語は、当該技術分野において既知の方法に従ってヒト化されている抗体を包含する（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号明細書、米国特許第５，５３０，１０１号明細書、米国特許第５，６９３，７６２号明細書、米国特許第５，６９３，７６１号明細書、および米国特許第５，７１４，３５０号明細書が参照され、それぞれ、参照によってその全体が本明細書に援用される）。
【００８３】
本発明のさらに他の実施形態では、遺伝子導入動物は、ヒトモノクローナル抗体をコードする核酸を用いて構築することができる（すなわち、可変および定常遺伝子セグメントの両方がヒト起源であるが、別の種において組み換えられ得る）。このような実施形態では、本明細書で説明されるような遺伝子導入動物の構築において、ヒトモノクローナル抗体配列をコードする核酸が用いられる。
【００８４】
リード抗体としての使用に適したヒト化抗体を得るための方法は、当該技術分野において知られている（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号明細書、米国特許第５，５３０，１０１号明細書、米国特許第５，６９３，７６２号明細書、米国特許第５，６９３，７６１号明細書、および米国特許第５，７１４，３５０号明細書が参照され、特に、本明細書において開示されるヒト化抗体の製造方法に関して、それぞれ参照によってその全体が本明細書に援用される）。非ヒトドナー抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）の構造はコンピュータモデリングに基づいて予測され、そしてフレームワーク中の主要なアミノ酸は、ＣＤＲの形状、従って結合特異性を保持するために必要であることが予測される。これらの少ししかない主要なマウスドナーアミノ酸は、少数の定義されたカテゴリー内のその位置および特徴に基づいて選択され、ドナーＣＤＲと共にヒトアクセプタ抗体フレームワーク内に置換される。例えば、カテゴリー１：アミノ酸位置は、カバット（Ｋａｂａｔ）らにより定義されるようにＣＤＲ内にある。カバット（Ｋａｂａｔ）およびウー（Ｗｕ）（１９７２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：９６０頁。カテゴリー２：ヒトアクセプタ免疫グロブリンのフレームワーク内のアミノ酸が異常であれば、そしてその位置のドナーアミノ酸がヒト配列にとって一般的であれば、アクセプタでなくドナーアミノ酸が選択され得る。カテゴリー３：ヒト化免疫グロブリン鎖の一次配列の３つのＣＤＲのうちの１つまたは複数に直接隣接する位置において、アクセプタアミノ酸ではなくドナーアミノ酸が選択され得る。これらの基準に基づいて、ドナー抗体からの個々のアミノ酸の一連の選択が行われる。得られるヒト化抗体は、通常、約９０％のヒト配列を含む。コンピュータモデリングによって設計されるヒト化抗体は、抗原結合について試験される。あるいは、所望の特異性を有するヒト化抗体の製造は、アイレス・バイオメディカル社（Ａｅｒｅｓ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｌｔｄ）（英国ロンドン）などの種々の商業的な供給元によって実施され得る。
【００８５】
ヒト抗体を得るための方法も当該技術分野においてよく知られている。例えば、ヒト抗体は、ヒトＩｇ座位を保有するマウスを目的とする抗原で免疫化することによって得ることができる。ヒト抗体を産生するための方法および遺伝子導入マウスは、米国特許第６，７１３，６１０号明細書、米国特許第６，６７３，９８６号明細書、米国特許第６，６５７，１０３号明細書、米国特許第６，１６２，９６３号明細書、米国特許第５，９３９，５９８号明細書、米国特許第５，７７０，４２９号明細書、米国特許第６，２５５，４５８号明細書、米国特許第５，８７７，３９７号明細書、米国特許第５，８７４，２９９号明細書、ならびに国際公開第９９／４５９６２号パンフレット、国際公開第９８／２４８８４号パンフレット、国際公開第９７／１３８５２号パンフレット、国際公開第９４／２５５８５号パンフレット、国際公開第９３／１２２２７号パンフレット、国際公開第９２／０３９１８号パンフレットに記載されており、これら全ての開示は参照によって本明細書に援用される。
【００８６】
本発明に従う遺伝子導入動物の構築に必要な核酸または核酸情報は、任意の適切な方法で本発明に従って使用することができる。
【００８７】
本発明の目的のために、「動物」という用語は、モノクローナル抗体を作ることができる非ヒト動物を含む。特に、非ヒト動物は、実験動物、例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ニワトリ、ウマ、雌ウシ、またはヒツジである。好ましい実施形態では、非ヒト動物は、実験用齧歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスターなどである。明細書内ではマウスについて言及されることが多いが、その他の適切な動物も同じようにして使用され得ることは認識されるであろう。遺伝子導入動物の構築に適した動物の非限定的な例は、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスターなど）、ウサギ、ニワトリ、ウマ、雌ウシ、またはヒツジである。
【００８８】
遺伝子導入動物の構築
本発明の１つの態様では、「軽（Ｌ）鎖のみの動物」が提供される。このような動物は、少なくともリード抗体の再編成された軽鎖をコードする配列を含む。リード抗体は、好ましくは、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体、もしくはこれらの一部である。本発明の目的のために、ＣＬκ配列が参照されることが多いが、ＣＬλ配列も同じようにして使用され得ることは認識されるであろう。
【００８９】
「軽（Ｌ）鎖のみの動物」のために、リード抗体軽鎖（またはその一部。例えば、選択されたヒト、ヒト化またはキメラ抗体分子の可変領域、または選択された抗体の再編成されたＶ−Ｊセグメントをコードする核酸）をコードする配列は、相同組換えによって、正常または改変マウスＣＬκまたはＣＬλ配列内に、そして好ましくはその上流側に挿入される。マウスＣＬκまたはＣＬλ配列は、例えば、ヒトＣＬκまたはＣＬλ配列をコードするように改変されていてもよく、ヒトまたはマウス起源からの調節要素（少なくとも、エンハンサー配列）を含み得る。所望される場合には、ＣＬκまたはＣＬλ座位の残存するＪＫセグメントは、二次的なＶ−Ｊ再編成の可能性および動物を適切なバックグラウンド（例えば、Ｒａｇ欠損バックグラウンド）に戻し交配するために可能な必要性を回避するために除去することができる。このような改変ＣＬκまたはＣＬλ配列は、例えば相同組換えによって、大腸菌において操作することができる。本発明の好ましい方法には、再編成された可変領域を含有する改変マウスＣＬκまたはＣＬλ座位および改変（好ましくは、ヒト配列を含有するため）ＣＬκまたはＣＬλ配列の相同組換えによるＥＳ細胞への転移が含まれる。ＥＳ細胞が記載されるように操作されて選択されたら、ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）に注入される。次に、胚はメスの動物に転移され、成熟させられる。あるいは改変された座位は、遺伝子組換えによってマウスに転移させることができる。さらなる詳細は本明細書中で提供される。
【００９０】
ヒト、ヒト化またはキメラ抗体分子の軽鎖（またはその一部）をコードする配列は、さらに、以下に説明されるような追加の要素を含むことができる。
【００９１】
重（Ｈ）鎖のみの動物
また、本発明は、「重（Ｈ）鎖のみの動物」も提供する。このような動物は、少なくとも、リード抗体、好ましくはヒト、ヒト化またはキメラ抗体の再編成された重鎖またはその一部（例えば、重鎖の可変領域）をコードする配列を含む。配列は、相同組換えによって、正常または改変された非ヒト動物（例えば、マウス）ＣＨ座位に挿入される。マウスＣＨ座位は、任意で、ヒトＣＨ配列をコードするように改変されていてもよいが、少なくとも、リード抗体の再編成された重鎖が作動可能に連結されるヒトまたはマウス起源の調節要素（少なくとも、エンハンサー配列）を含む。このような改変重鎖座位は、相同組換えによって、例えば大腸菌において操作することができる。定常領域は、改変された（リード抗体に関して）定常領域遺伝子でもよく、定常領域は、リード抗体のヒト定常領域とは、配列、起源の種および／またはサブタイプが異なる。例えば、選択されたヒト、ヒト化またはキメラ抗体の重鎖遺伝子の再編成されたＶＨＤＪＨ部分は、相同組換えによってマウスＥＳ細胞の生殖細胞系列座位内に配置される。本発明の好ましい方法は、既知のリード抗体の再編成された可変鎖およびヒト定常領域遺伝子を含有する改変ＣＨ座位を相同組換えによって胚性幹（ＥＳ）細胞の重鎖座位に挿入することを含む。このような挿入を実施するための方法は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、ロペス−マシア（Ｌｏｐｅｚ−Ｍａｃｉａ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９９年、１８９：１７９１〜１７９８頁およびカスカルホ（Ｃａｓｃａｌｈｏ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９６年、２７２：１６４９〜１６５２頁を参照。特に遺伝子導入マウスの製造に関して、それぞれは参照によってその全体が本明細書に援用される）。ＥＳ細胞が記載されたように操作されて選択されたら、ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）に注入される。次に、胚はメスの動物に転移され、成熟させられる。あるいは改変された座位は、遺伝子組換えによって非ヒト動物（例えば、マウス）に転移させることができる。さらなる詳細は本明細書中で提供される。
【００９２】
ヒト、ヒト化またはキメラリード抗体のヒト化鎖（またはその一部）をコードする配列は、さらに、以下に説明されるような追加の要素を含むことができる。
【００９３】
ＨＣＯＡ２動物
もう１つの実施形態では、動物（例えば、マウス）の生殖細胞系列座位に、マウスμ定常領域の上流側に配置された選択された重鎖の再編成されたＶＨＤＪＨ部分を含有する「重鎖のみの動物」が提供される。ヒト重鎖定常領域（例えば、Ｇ４またはＧ１サブタイプの定常領域）をコードする第２の配列も、動物の生殖細胞系列座位に組み込まれる。配列は、好ましくは、相同組換えによってマウスＥＳ細胞の生殖細胞系列座位に配置され、マウスα領域、マウスＣγ３、Ｃγ１、Ｃγ２ｂおよびＣγ２ａ領域セット、および／またはマウスε重鎖定常領域を置換する。本発明のこの実施形態で製造される「重鎖のみの動物」は、ＨＣＯＡ２動物と称することができる。
【００９４】
もう１つの実施形態では、ヒト定常領域、例えばＧ１およびＧ４サブタイプのヒト定常領域をコードする２つの配列は、相同組換えによってマウス座位に組み込まれる。これらのうちの一方は、α領域またはマウスＣγ３、Ｃγ１、Ｃγ２ｂおよびＣγ２ａ領域セットのいずれかをコードするマウス生殖細胞系列配列を置換するために使用され、他方は、マウスε重鎖定常領域を置換するために使用され、これらの動物は、本明細書では「ＨＣＯＡ３動物」と称される。さらにもう１つの実施形態では、ヒト配列の１つは、改変された（好ましくは、ヒト）定常領域遺伝子をコードし、ここで定常領域は、リード抗体とは配列、起源の種および／またはサブタイプが異なる。
【００９５】
ヒト重鎖定常領域が、多数の適切な方法および配置のいずれかでＥＳ細胞の生殖細胞系列座位内に配列され得ることは認識されるであろう。１つの実施例では、ヒト重鎖定常領域配列は、ＨＣＯＡ２動物が、単一のｍＲＮＡ分子（例えばＶＨＤＪＨＣＨ）として転写される、再編成されたＶＨＤＪＨによってコードされる可変領域および所望のアイソタイプのヒト定常領域を有する重鎖を発現するように、再編成されたＶＨＤＪＨ部分配列と隣接される。このような動物からのＢ細胞は正常発生を起こさず、重鎖コード配列は、重鎖コードまたはアミノ酸配列を改変し得る体細胞超変異を受けることができないであろう。もう１つの実施例では、ヒトＣμおよび／またはＣδ重鎖定常領域は、ＣμおよびＣδ定常領域をコードするマウス生殖細胞系列ＤＮＡを置換する。もう１つの実施例では、マウスＣμおよびＣδ遺伝子は、ＨＣＯＡ２、ＨＣＯＡ３および本発明の他の動物において機能性のままである。好ましくは、本発明の動物は、ヒト重鎖コード配列の体細胞超変異を受けることができる。好ましい実施例では、ヒト重鎖定常領域は、α領域、Ｃγ３、Ｃγ１、Ｃγ２ｂおよびＣγ２ａ領域セット、および／またはε重鎖定常領域をコードするマウス生殖細胞系列ＤＮＡを置換するために使用される。
【００９６】
好ましくは、ヒト重鎖定常領域は、欠失された置換領域の上流側のマウススイッチ配列が機能性のままであるように、マウスα領域、Ｃγ３、Ｃγ１、Ｃγ２ｂおよびＣγ２ａ領域セット、および／またはε重鎖定常領域をコードするマウス生殖細胞系列ＤＮＡを置換する。従って、ヒト重鎖定常領域は、スイッチ配列、例えばＳγ３配列の下流側に配置される、あるいは作動可能に連結される。これらの動物は、再編成されたＶＨＤＪＨによりコードされる可変領域を有する重鎖を発現し、刺激されると、所望のアイソタイプのヒト定常領域へのクラススイッチを誘発し得る（例えば、Ｓγ３配列を持つ動物に対してはＬＰＳによる）。従って、本発明は、遺伝子導入動物において産生される異種の免疫グロブリンおよび前記動物のＢ細胞に由来するモノクローナル抗体クローンが、所望のアイソタイプ、より特別には所望のヒト定常領域サブタイプを有するように、遺伝子導入動物のゲノム内に挿入されるべき遺伝子セグメントに、アイソタイプスイッチを生じさせる配列を含有させる方法を提供する。さらにより好ましくは、本明細書においてさらに記載されるように、導入遺伝子は、遺伝子導入動物が、依然として、再編成されたＶＨＤＪＨ部分の体細胞超変異をもたらすことができるようにも構成される。
【００９７】
ヒトまたは非ヒト（例えば、マウス）起源のスイッチ配列は種々の定常領域遺伝子からグラフトされて、重鎖のみの動物を発生させるために使用される本発明の構築物中の他の定常領域（ＣＨ）遺伝子に連結されてもよい。このようなグラフト化スイッチ配列は、通常、関連されるＣＨ遺伝子とは独立して機能するので、構築物におけるスイッチは、通常、関連されるスイッチ領域の起源の機能である。スイッチ配列および定常領域領域についてのさらなる参照および配置は本明細書中で提供される。
【００９８】
スイッチ配列およびヒト重鎖定常領域は、通常、任意の適切な配置で配列され得る。マウス定常領域アイソタイプ遺伝子の少なくとも１つは、ヒト定常領域遺伝子、例えばＣμ、Ｃδ、Ｃγ、ＣαまたはＣεで機能的に置換され得る。マウスＣγ領域が置換される場合には、好ましくは、Ｃγ３、Ｃγ１、Ｃγ２ｂおよびＣγ２ａ領域セット全体が置換される。重鎖はγ、μ、α、δまたはεに分類され、それぞれ、抗体のアイソタイプをＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥと定義する。追加の構造的変異は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）およびＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）の別個のサブタイプを特徴付ける。遺伝子導入ヒト遺伝子は、例えばＣγ１→Ｃγ１を置換するネイティブ（例えばマウス）遺伝子の対応物でもよいし、異なるアイソタイプを有してもよい。好ましくは、置換された宿主領域は、Ｃμ以外および／またはＣδ以外であり得る。特に目的とするのは、例えばＣγ１→Ｃα、Ｃγ２→Ｃα、Ｃγ３→Ｃα、Ｃγ４→Ｃα、Ｃα→Ｃγ１など、Ｃγ１→Ｃεなど、Ｃα→Ｃεなど、交換され得るαおよびγ定常領域である。説明されるように、好ましい実施形態では、本発明の遺伝子導入動物はネイティブ（例えば、マウス）のＣμおよびＣδ要素を有し、再編成された抗体遺伝子のインビボ親和性成熟、およびクラススイッチをもたらすことができ、どちらにしても、遺伝子導入ヒトＣ領域、例えばＣγ、Ｃα、ＣδまたはＣεが非ヒト動物中に挿入されている。
【００９９】
更なる実施例では、少なくとも第１および第２のヒト重鎖定常領域は、α領域、Ｃγ３、Ｃγ１、Ｃγ２ｂおよびＣγ２ａ領域セット、および／またはε重鎖定常領域をコードするマウス生殖細胞系列ＤＮＡを置換する。これは、クラススイッチを誘発するために使用される方法に依存して、動物からの細胞によって２つ以上の抗体フォーマットが産生されるのを可能にするであろう。例えば、エフェクター機能の比較のために同じリード配列可変領域に基づいて異なるサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４、またはＩｇＧ２およびＩｇＧ４）の抗体を調製すること、あるいは所与のサブタイプの抗体およびそのＦａｂ断片を調製して、得られた抗体の薬力学的特性を比較することは有用であり得る。これらの重鎖定常領域は、任意のアイソタイプまたはその誘導体または変異体、その一部をコードする配列（例えば、ヒンジ領域のジスルフィド結合の下にあり得る重鎖定常領域の部分が欠けているＦａｂ断片）、または改変された（増大または減少された）エフェクター機能を有するように改変された定常領域（図４を参照）であり得る。後者の１つの例は、Ｆｃγ受容体結合を増大または減少させる１つまたは複数のアミノ酸改変を含む定常領域である（以下を参照）。好ましくは、これらのヒト重鎖定常領域のそれぞれは、発現が制御されるように別個のスイッチに作動可能に連結され、それによって、本発明に従う遺伝子導入子孫動物は所与の瞬間に単一の特定のヒト重鎖定常領域を産生するＢ細胞を有する。
【０１００】
本発明の標的構築物で使用されるスイッチは、遺伝子導入された動物の種に対してネイティブでもよいし、異なる起源であってもよい。遺伝子導入マウスの構築において使用するためのスイッチは、例えば、ヒトまたはマウス起源でよい。しかしながら、好ましくは、スイッチは、マウスにおいて最適な機能性を提供するようにマウス起源であり得る。
【０１０１】
典型的な重鎖のみの動物の標的構築物
ヒトγ重鎖定常領域配列がマウスγ重鎖定常領域を置換する重鎖のみの動物の１つの実施例では、以下のような配列：
５’−Ｓγ−ヒトＣγ−３’
をその生殖細胞系列ＤＮＡ内に含む動物を構築することができ、ここで、Ｓはスイッチ配列を表し、Ｃγはヒト定常領域γサブタイプＧ１、Ｇ２、Ｇ３またはＧ４もしくはその一部を表し、同じでも異なっていてもよく、そしてＳγはヒト起源でも非ヒト（例えば、マウス）起源でもよい。最も好ましくは、ＳγはＳγ３である。
【０１０２】
ヒトγ重鎖定常領域配列がマウスγ重鎖定常領域を置換する重鎖のみの動物のもう１つの実施例では、以下のような配列：
５’−Ｓγ−ヒトＣγ１−Ｓ（εまたはα）−ヒトＣγ２−３’
をその生殖細胞系列ＤＮＡ内に含む動物を構築することができ、ここで、Ｓはスイッチ配列を表し、Ｃγ１およびＣγ２はそれぞれ、異なるヒト定常領域γサブタイプＧ１、Ｇ２、Ｇ３またはＧ４もしくはその一部を表し、そしてＳε、ＳαおよびＳγのそれぞれは、ヒト起源でも非ヒト（例えば、マウス）起源でもよい。最も好ましくは、ＳγはＳγ３である。
【０１０３】
ヒトγ重鎖定常領域配列がマウスγ重鎖定常領域を置換する重鎖のみの動物の特に好ましい実施例では、以下のような配列：
５’−Ｓγ３−ヒトＣγ１−Ｓε−ヒトＣγ２−３’
をその生殖細胞系列ＤＮＡ内に含む動物を構築することができ、ここで、Ｓはスイッチ配列を表し、Ｃγ１およびＣγ２はヒト定常領域γサブタイプＧ１、Ｇ２、Ｇ３またはＧ４もしくはその一部を表し、異なっていても同じでもよく、そしてＳεおよびＳγのそれぞれは、ヒト起源でも非ヒト（例えば、マウス）起源でもよい。最も好ましくは、ＳγはＳγ３である。配列は、好ましくは、Ｃγ２の３’に方向付けられた要素（−Ｓα−Ｃα−）をさらに含み、ここで、ＳαおよびＣαは非ヒト起源である、または非ヒト動物にネイティブである。
【０１０４】
ヒトγ重鎖定常領域配列がマウスγ重鎖定常領域を置換する重鎖のみの動物のもう１つの実施例では、以下のような配列：
５’−Ｓμ−Ｃμ−Ｃδ−Ｓγ３−ヒトＣγ１−Ｓε−ヒトＣγ２−３’
をその生殖細胞系列ＤＮＡ内に含む動物を構築することができ、ここで、Ｃは定常領域をあらわし、Ｓはスイッチ配列を表し、Ｃγ１およびＣγ２はそれぞれ、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３またはＧ４またはその一部からなる群から選択されるヒト定常領域γサブタイプを表し、そしてＳε、ＳαおよびＳγのそれぞれは、ヒト起源でも非ヒト（例えば、マウス）起源でもよい。最も好ましくは、ＳγはＳγ３である。配列は、好ましくは、Ｃγ２の３’に方向付けられた要素（−Ｓα−Ｃα−）をさらに含み、ここでＳαおよびＣαは非ヒト起源である、または非ヒト動物にネイティブである。このような重鎖のみのマウスの作製において使用するための標的ベクターは、マウス生殖細胞系列ＩｇＨ座位を適切なベクター内に配置することによって構築することができる。リード抗体からの選択された重鎖の再編成されたＶＨＤＪＨ部分は、次に、ＪＨクラスター内で、ＩｇＨ座位のマウスμ定常領域の上流側に配置される。Ｇ４サブタイプの第１のヒト重鎖定常領域は、Ｃγ抗体重鎖定常領域（Ｃγ３、Ｃγ１、Ｃγ２ｂおよびＣγ２ａ）の全てをコードするマウス生殖細胞系列ＤＮＡを置換して、ヒトＩｇＧ４領域がマウスＳγ３スイッチ配列に作動可能に連結されるように、Ｓγ３スイッチ配列を表すマウス生殖細胞系列ＤＮＡの直ぐ下流側に、そしてＳεスイッチ配列の上流側に挿入される（図２を参照）。Ｇ１サブタイプであるが、ヒンジ領域に存在して鎖間ジスルフィド架橋に関与するシステインをコードするコドンの５’近位で切断され、Ｆａｂ部分を生じさせ、従って次にＦ（ａｂ’）２抗体も産生する配列を表す第２のヒト重鎖γ定常領域は、Ｃε抗体重鎖定常領域をコードするマウス生殖細胞系列ＤＮＡを置換して、ヒトＦａｂコード化重鎖定常領域がマウスＳεスイッチ配列に作動可能に連結されるようにＳεスイッチ配列を表すマウス生殖細胞系列ＤＮＡの直ぐ下流側に、そしてマウスＳαスイッチ配列の上流側に挿入される。次に、標的構築物は、重鎖のみの動物を得るために相同組換えによってマウスＥＳ細胞の生殖細胞系列座位内に配置される。軽鎖のみの動物およびこの重鎖のみの動物から得られる子孫動物は、リード抗体からの選択された重鎖の再編成されたＶＨＤＪＨ部分、および（ａ）ＬＰＳで攻撃されたときのヒトＩｇＧ４定常領域、または（ｂ）欧州特許出願第０２  ２９０６１０．１号明細書に記載されるようにＬＡＴＹ１３６Ｆ変異マウスに由来するＴ細胞が子孫動物に養子転移されるときにＦａｂ断片をもたらす切断されたＩｇＧ定常領域を有する抗体を産生するＢ細胞を有し得る。
【０１０５】
スイッチ
Ｂリンパ球の発生において、細胞は、増殖性に再編成されたＶＨおよびＶＬ領域によって決定される結合特異性を有するＩｇＭを初めに産生する。続いて、各Ｂ細胞およびその子孫細胞は、同じＬ鎖およびＨ鎖Ｖ領域を有する抗体を合成するが、これらは、Ｈ鎖のアイソタイプをスイッチし得る。μまたはδ定常領域の使用は、大部分は選択的スプライシングによって決定され、ＩｇＭおよびＩｇＤが単一の細胞内で同時発現されるのを可能にする。その他の重鎖アイソタイプ（γ、α、およびε）は、遺伝子再編成事象がＣμおよびＣδエクソンを欠失させた後、自然に発現されるだけである。この遺伝子再編成過程、アイソタイプスイッチは、通常、各重鎖遺伝子（δを除く）の直ぐ上流側に位置するいわゆるスイッチセグメント間の組換えによって起こる。
【０１０６】
個々のスイッチセグメントは、１ｋｂと１０ｋｂの間の長さであり、非テンプレートストランドにおける高反復性の短くてＧが豊富な配列から主になる。反復の長さは、２０〜８０ｎｔと異なる。上流側またはドナースイッチ領域はＳμである。下流側またはアクセプタスイッチ領域は、染色体に沿った物理的な順序で、マウスのＳγ３、γ１、γ２ｂ、γ２ａ、εまたはα、およびヒトＳγ３、γ１、α１、γ２、γ４、εまたはα２のいずれでもよい。組換えの正確なポイントは個々のクラススイッチで異なり、組換えのクロスオーバーポイントはスイッチ配列内のどこでもよく、特にＳμの場合は、スイッチ配列の上流側または下流側である。ダンニック（Ｄｕｎｎｉｃｋ）ら（１９９３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、２１、３６５〜３７２頁。溶液ハイブリダイゼーション動力学またはｃＤＮＡ由来のＣＨプローブによるサザンブロッティングを用いた研究によって、スイッチは、細胞からのＣＨ配列の損失に関連し得ることが確認された。Ｓα領域は配列決定されており、８０−ｂｐのタンデム反復相同性単位からなることが分かっているが、Ｓγ２ａ、Ｓγ２ｂ、およびＳγ３は全て、互いに非常によく類似している４９ｂｐの反復相同性単位を含有する（Ｐ．スズレック（Ｓｚｕｒｅｋ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３５：６２０〜６２６頁（１９８５年）およびＴ．ニカイドウ（Ｎｉｋａｉｄｏ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：７３２２〜７３２９頁（１９８２年）を参照、参照によって本明細書中に援用される）。配列決定されたＳ領域は全て、Ｓμ遺伝子の基本の反復要素である五量体ＧＡＧＣＴおよびＧＧＧＧＴの多数の出現を含み（Ｔ．ニカイドウら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：７３２２〜７３２９頁（１９８２年）、参照によって本明細書に援用される）、その他のＳ領域では、これらの五量体はＳμの場合のように正確にタンデム反復されるのではなく、より大きい反復単位に組み込まれる。Ｓγ１領域はさらなる高次構造を有し、２つの直接反復配列は、４９ｂｐのタンデム反復の２つのクラスターのそれぞれに隣接する（Ｍ．Ｒ．モワット（Ｍｏｗａｔｔ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：２６７４〜２６８３頁（１９８６年）を参照、参照によって本明細書に援用される）。ヒトＨ鎖遺伝子のスイッチ領域は、そのマウス相同体と非常に類似していることが分かっている。スイッチ配列、特に組換えに対するスイッチ長さの影響は、ザリン（Ｚａｒｒｉｎ）ら、（２００５年）ＰＮＡＳ  １０２：２４６６〜２４７０頁（その開示は参照によって援用される）においてレビューされる。ザリンらにおいて記載されるスイッチ配列、ならびに配列長さおよびセグメントに関する教示は、本発明との関連において有利に用いることができる。
【０１０７】
本発明に従う標的ベクター、従って遺伝子導入動物は、好ましくは、Ｃμコード化エクソンの上流側にＳμスイッチを含み、最も好ましくは、マウスＳμスイッチは、マウスＣμコード化エクソンの上流側にその自然の配置で提供される。μ遺伝子のスイッチ（Ｓ）領域Ｓμは、コード配列の約１〜２ｋｂ５’に位置し、（ＧＡＧＣＴ）ｎ（ＧＧＧＧＴ）の形態の配列の多数のタンデム反復で構成され、ここでｎは通常２〜５であるが、１７まで及ぶこともある（Ｔ．ニカイドウら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：８４５〜８４８頁（１９８１年）を参照）。
【０１０８】
μとα遺伝子の間のスイッチ組換えは、複合Ｓμ−Ｓα配列を産生する。通常、Ｓμまたは他の任意のＳ領域のいずれにおいても、組換えが常に生じる特異的な部位は存在しない。一般に、Ｖ−Ｊ組換えの酵素機構とは違って、スイッチ機構は、生殖細胞系列Ｓ前駆体の反復相同領域の異なるアライメントを受け入れて、次にアライメント内の異なる位置の配列と結合することができるようである（Ｔ．Ｈ．ラビッツ（Ｒａｂｂｉｔｓ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：４５０９〜４５２４頁（１９８１年）およびＪ．ラベッチ（Ｒａｖｅｔｃｈ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：６７３４〜６７３８頁（１９８０年）を参照、参照によって本明細書に援用される）。
【０１０９】
特定のアイソタイプへのスイッチの選択的な活性化のメカニズムの詳細は未知のままである。リンホカインおよびサイトカインなどの外因的な影響はアイソタイプ特異的リコンビナーゼを上方制御し得るが、同じ酵素機構が全てのアイソタイプへのスイッチを触媒すること、そしてこの機構を特異的なスイッチ領域へ向けることにおいて特異性が存在することも可能である。
【０１１０】
Ｔ細胞由来のリンホカインＩＬ−４およびＩＦＮγは、特定のアイソタイプの発現を特異的に促進することが示されている。ＩＬ−４は、ＩｇＭ、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３の発現を低下させ、ＩｇＥおよびＩｇＧ１の発現を増大させるが、ＩＦＮγは、ＩｇＧ２ａの発現を選択的に刺激し、ＩＬ−４に誘発されるＩｇＥおよびＩｇＧ１の発現の増大と拮抗する（コフマン（Ｃｏｆｆｍａｎ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：９４９〜９５４頁（１９８６年）およびスナッパー（Ｓｎａｐｐｅｒ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：９４４〜９４７頁（１９８７年）、参照によって本明細書に援用される）。ＩＬ−４およびＩＬ−５の組み合わせは、ＩｇＡの発現を促進する（コフマンら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３６８５〜３６９０頁（１９８７年）、参照によって本明細書に援用される）。
【０１１１】
マリッセン（Ｍａｌｉｓｓｅｎ）、アグアド（Ａｇｕａｄｏ）およびマリッセンによって２００２年３月１１日に出願された欧州特許出願第０２  ２９０６１０．１号明細書（その開示は、参照によって本明細書に援用される）は、妨害されたＴ細胞の発生、ならびに大量のＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３を慢性的に産生するポリクローナルＴＨ２細胞の早期および自発性の蓄積をもたらすマウスＬＡＴ（Ｔ細胞の活性化のためのリンカー）遺伝子の変異について記載しており、これは次に、アイソタイプＩｇＥおよびＩｇＧ１の発現を促進する。本発明の１つの好ましい実施形態では、ヒト重鎖定常領域をコードする配列は、遺伝子導入動物において、マウス生殖細胞系列ＤＮＡ内のマウスＣεを置換し、前記動物は、さらにＬＡＴ遺伝子の欠損を含む。例えば、動物は、ＬＡＴＹ１３６Ｆ変異を含み得る。ヒト重鎖定常領域配列は、ＬＡＴＹ１３６Ｆ動物において、動物が前記ヒト定常領域を優先的に産生するように、マウスεスイッチに作動可能に連結され得る。あるいは、本明細書においてさらに記載されるように、欧州特許出願第０２  ２９０６１０．１号明細書に記載されるマウスから得られるＣＤ４＋Ｔ細胞は、マウスイプシロン鎖を置換するヒト定常領域へのクラススイッチを誘発するために本発明に従う遺伝子導入マウスへの養子転移によって提供することができる。あるいは、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞は、簡単に、クラススイッチを誘発するために培養液中で本発明の動物から得られる細胞（例えば、ハイブリドーマ）を用いて誘発することができる。
【０１１２】
クラススイッチの誘発は、スイッチセグメントの上流側で開始する不稔転写物と関連すると思われる（ルツカー（Ｌｕｔｚｋｅｒ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：１８４９頁（１９８８年）、スタヴネザー（Ｓｔａｖｎｅｚｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：７７０４頁（１９８８年）、エッサー（Ｅｓｓｅｒ）およびラートブルフ（Ｒａｄｂｒｕｃｈ）、ＥＭＢＯ  Ｊ．８：４８３頁（１９８９年）、バートン（Ｂｅｒｔｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２８２９頁（１９８９年）、ロスマン（Ｒｏｔｈｍａｎ）ら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：６２１頁（１９９０年）、これらはそれぞれ参照によって援用される）。例えば、ＩＬ−４によるγ１不稔転写物の観察される誘発およびにＩＦＮ−γよる阻害は相互に関係があり、ＩＬ−４は培養液中のＢ細胞においてγ１へのクラススイッチを促進し、ＩＦＮ−γはγ１の発現を阻害することが観察される。従って、不稔転写物の転写に影響を与える制御配列を含むと、アイソタイプスイッチの速度にも影響が与えられ得る。例えば、特定の不稔転写物の転写の増大は、通常、隣接するスイッチ配列を含むアイソタイプスイッチ組換えの頻度を高めることが期待され得る。
【０１１３】
これらの理由で、構築物は、アイソタイプスイッチのために用いられる各スイッチ領域の上流側の約１〜２ｋｂ以内に転写性制御配列を組み込むことが好ましい。これらの転写性制御配列は、好ましくは、プロモーターおよびエンハンサー要素を含み、より好ましくは、スイッチ領域と自然に関連される（すなわち、生殖細胞系列の配置において生じる）５’隣接（すなわち、上流）領域を含む。この５’隣接領域は、通常、少なくとも約５０ヌクレオチドの長さであり、好ましくは少なくとも約２００ヌクレオチドの長さであり、より好ましくは少なくとも５００〜１０００ヌクレオチドである。
【０１１４】
１つのスイッチ領域からの５’隣接配列は、構築物を調製するための異なるスイッチ領域に作動可能に連結され得る（例えば、ヒトＳγ１スイッチからの５’隣接配列は、Ｓα１スイッチのすぐ上流側にグラフトされ得る）が、いくつかの実施形態では、構築物に組み込まれた各スイッチ領域は、天然に存在する生殖細胞系列の配置においてすぐ上流側で生じる５’隣接領域を有することが好ましい。
【０１１５】
定常領域、改変された定常領域
上述の定常領域ならびにその断片および誘導体に加えて、改変されたヒト重鎖定常領域をコードする遺伝子を含む遺伝子導入動物を構築することも可能であろう。いくつかの場合には、ヒトＦｃ受容体、特にＦｃガンマＲ３ａ（ＣＤ１６）に対して増大した結合を有するように改変された（例えば、１つまたは複数のアミノ酸置換、挿入または欠失を含む）ヒト重鎖定常領域をコードする配列を用いることが好ましいであろう。改変は、最も好ましくは、Ｇ１またはＧ３ヒト重鎖定常領域に基づくであろう。
【０１１６】
もう１つの実施例では、遺伝子導入動物の生殖細胞系列ＤＮＡは、ヒトＦｃ受容体に対して低親和性を有するヒト重鎖定常領域を含む。例えば、ヒト重鎖定常サブタイプＧ４またはＧ２は、Ｆｃ受容体への結合を最小限にするまたは除去するようＦｃ部分が改変された定常領域の基礎として使用することができる。（例えば、国際公開第０３／１０１４８５号パンフレットを参照、その開示は参照によって本明細書中に援用される）。Ｆｃ受容体結合を評価するためのアッセイ、例えば細胞に基づくアッセイは、当該技術分野においてよく知られている。１つの実施形態では、Ｆｃ受容体への結合を低減するように改変されたＧ１またはＧ３サブタイプのヒト重鎖定常領域は、動物の生殖細胞系列ＤＮＡに挿入される。もう１つの実施形態では、Ｇ４またはＧ２サブタイプのヒト重鎖定常領域は、Ｆｃ受容体への結合をさらに最小限にする、または完全に破壊するように改変される（例えば、アンガル（Ａｎｇａｌ）ら（１９９３年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３０：１０５〜１０８頁を参照、その開示の全体は参照によって本明細書に援用される）。ＩｇＧ４アイソタイプはＦｃ受容体に弱く結合し、Ｆｃ結合活性を完全には欠いてないこと（ニューマン（Ｎｅｗｍａｎ）ら（２００１年）Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（９８（２）：１６４〜１７４頁）、そして改変されていないＩｇＧ４ＭＡｂはインビボで細胞不足を起こし得ること（アイザクス（Ｉｓａａｃｓ）ら、（１９９６年）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０６、４２７頁）が示されている。Ｆｃ受容体への結合に対して主に責任があると報告されている配列は、ＬＬＧＧＰＳと定義されている（バートンら、（１９９２年）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１：１頁）。重鎖ＣＨ２領域のＮ末端部（ＥＵナンバリング２３４−２３９）に配置されるこの配列は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３、およびマウスＩｇＧ２ａアイソタイプにおいて保存され、これらは全てＦｃ受容体に強く結合する。ＩｇＧ４アイソタイプの野生型配列は、位置２３４にフェニルアラニンを含有し、モチーフＦＬＧＧＰＳを与える。同様にＦｃ受容体の弱い結合剤であるマウスＩｇＧ２ｂアイソタイプは、配列ＬＥＧＧＰＳを含有する。ニューマンら（２００１年）は、マウスＩｇＧ２ｂに関連されるグルタミン酸残基をヒト野生型ＩｇＧ４ＣＨ２ドメインに組み込んで、ＣＤＣおよびＡＤＣＣ活性を低下し、インビトロのＦｃＲＩおよびＦｃＲＩＩへの結合を事実上除去する配列ＦＥＧＧＰＳを与えた。グルタミン酸の導入に加えて、プロリンによるセリン２２８の置換は、野生型ＩｇＧ４よりも安定である分子をもたらした。ＩｇＧ４分子は、ヒンジ領域の鎖間ジスルフィド結合の非効率的な形成を示す傾向がある。プロリンの導入はヒンジに対する剛性を提供し、より効率的な鎖間結合を促進すると言われており、位置２２８におけるセリンの存在は、システイン分子を隣接させることによる鎖間ジスルフィド結合というよりも、鎖間の優先的な結合を促進し得る。米国特許第６，４０３，３１２号明細書（この開示は参照によって本明細書中に援用される）に記載されるようなコンピューティングに基づく方法を含む、定常領域を作成するためのその他の方法が知��れている。このような改変などは、本発明において使用されるヒト重鎖定常領域に対して容易に行うことができる。
【０１１７】
追加の要素
リード抗体の重鎖をコードする配列は、上記で説明されるような追加の要素を含むことができる。
【０１１８】
本発明の遺伝子導入動物を構築するために使用される抗体の重鎖または軽鎖をコードする構築物は、追加の要素を含むことができる。例えば、細胞傷害性ポリペプチドは、免疫治療薬を提供するために抗体分子の軽鎖または重鎖定常領域に組換えで結合され、重鎖または軽鎖座位に含まれることが可能である。
【０１１９】
検出可能なマーカーを軽鎖または重鎖定常領域に組換えで結合することは特に有利であり得る。次にこれを用いて、検出可能なタンパク質に連結された抗体を産生することができる。マーカーの抗体へのカップリングは、抗体（通常、Ｆａｂ）と蛍光種との間の非常に正確なカップリング比が必要とされる定量的な細胞蛍光測定法およびバイオホトニクスの分野において価値がある。また、所与の抗体の２つ以上の形態を発現することも特に有利であり得る。例えば、Ｆａｂ形態で検出可能なマーカーに連結された抗体を発現し、アイソタイプスイッチが誘発されると、Ｆａｂ形態で検出可能なマーカーに連結されていない同じ抗体を発現することが望ましいこともある。もう１つの実施形態では、第１のマーカーに連結されており、アイソタイプスイッチが誘発されると第２のマーカーに連結される所与の抗体またはＦａｂ断片を発現することが望ましいであろう。これは、マーカーポリペプチドに連結され、スイッチ配列に作動可能に連結された定常領域を挿入することによって達成され得る。これらの実施形態では、抗体は診断または研究試薬において使用される可能性があるので、構築物において使用される定常領域は、非ヒト起源（例えばマウス）であることが多いであろう。
【０１２０】
検出可能なマーカーの例はよく知られている。好ましい例は、ＤｓＲｅｄから二量体へ、そして次に、タンパク質の２つのコピーの遺伝子融合、すなわちタンデム二量体か、またはｍＲＦＰ１と指定された真のモノマー（単量体の赤色蛍光タンパク質）のいずれかへの、段階的な進化から得られるタンパク質のタンデム・レッド（ｔａｎｄｅｍ  Ｒｅｄ）である（キャンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、（２００２年）９９（１２）：７８７７〜８２頁、ならびにツィエン（Ｔｓｉｅｎ）らの米国特許第http://patft1.uspto.gov/netacgi/nph-Parser?Sect1=PTO1&Sect2=HITOFF&d=PALL&p=1&u=%2Fnetahtml%2FPTO%2Fsrchnum.htm&r=1&f=G&l=50&s1=7005511.PN.&OS=PN/7005511&RS=PN/7005511 - h0#h0http://patft1.uspto.gov/netacgi/nph-Parser?Sect1=PTO1&Sect2=HITOFF&d=PALL&p=1&u=%2Fnetahtml%2FPTO%2Fsrchnum.htm&r=1&f=G&l=50&s1=7005511.PN.&OS=PN/7005511&RS=PN/7005511 - h2#h2７，００５，５１１号明細書および米国特許出願公開第２００６／０００３４２０号明細書）。その他の例には、増強緑色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、近赤外蛍光タンパク質、単量体赤色蛍光タンパク質またはレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ、ディスクコーラル（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ）赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）（グロス（Ｇｒｏｓｓ）ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９７：１１９９０〜５頁（２０００年）、ベビス（Ｂｅｖｉｓ）およびグリック（Ｇｌｉｃｋ）．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：８３〜７頁（２００２年））、ＨｃＲｅｄ（グルスカヤ（Ｇｕｒｓｋａｙａ）ら．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５０７：１６〜２０頁（２００１年））が含まれる。
【０１２１】
あるいは、軟骨オリゴマー基質タンパク質、ロイシンジッパーのような要素、例えばパックら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９５年）２４６：２８〜３４頁）において教示されるｓｃＺＩＰまたはｓｃＴＥＴＲＡＺＩＰ構築物など、またはベロ毒素サブユニットＢ（国際公開第０３／０４６５６０号パンフレットを参照、参照によってその全体が本明細書に援用される）は、抗体分子の重鎖または軽鎖定常領域に組換えで結合して、単一特異性抗体多量体または異種特異性の抗体（例えば、二重特異性抗体）の形成を可能にすることができる。抗体多量体を調製するためのもう１つの方法は、カルボキシ末端で抗体分子の重鎖定常領域に対してロイシンジッパーまたはイソロイシンジッパーポリペプチド配列をコードする核酸配列を結合することを含む。本発明の可溶性の多量体タンパク質を産生するのに適したロイシンジッパードメインの例は、国際公開第９４／１０３０８号パンフレット（参照によって本明細書に援用される）に記載されるものである。もう１つの例は、ホッペ（Ｈｏｐｐｅ）ら、（１９９４年）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．３４４：１９１頁および米国特許第５，７１６，８０５号明細書（それぞれ、参照によってその全体が本明細書に援用される）に記載されるように、肺サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーである。
【０１２２】
「タグ」のような他の要素は、抗体分子の重鎖定常領域に組換えで結合され得る。このようなタグの非限定的な例は、当該技術分野において知られており（例えば、米国特許第６，３４２，３６２号明細書（参照によってその全体が本明細書に援用される）、アルテンドルフ（Ａｌｔｅｎｄｏｒｆ）ら［１９９９−ＷＷＷ、２０００］「大腸菌からのＡＴＰシンターゼのＦ０複合体の構造および機能」、Ｊ．ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０３：１９〜２８頁、バイオロジスツ社（Ｃｏ．ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ，Ｌｔｄ．）、Ｇ．Ｂ．バニックス（Ｂａｎｅｙｘ）［１９９９］「大腸菌における組換えタンパク質の発現」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：４１１〜２１頁、エルゼビア・サイエンス社（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．）、エイハウアー（Ｅｉｈａｕｅｒ）ら［２００１］「ＦＬＡＧＴＭペプチド、組換えタンパク質の精製のための多目的融合タグ」Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４９：４５５〜６５頁、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら［１９９５］Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ７０７：３〜２２頁、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら［１９９５］「分子認識およびバイオセパレーションにおける現在の傾向」Ｊ．ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ．７０７：３〜２２頁、エルゼビア・サイエンス、Ｂ．Ｖ．マーゴリン（Ｍａｒｇｏｌｉｎ）［２０００］「細菌細胞における巨大分子局在化のためのレポーターとしての緑色蛍光タンパク質」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０：６２〜７２頁、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ピュイグ（Ｐｕｉｇ）ら［２００１］「タンデム親和性精製（ＴＡＰ）法：タンパク質複合体精製の一般的な手順」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：２１８〜２９頁、アカデミック・プレス、サッセンフィールド（Ｓａｓｓｅｎｆｅｌｄ）［１９９０］「精製のためのタンパク質のエンジニアリング」ＴｉｂＴｅｃｈ  ８：８８〜９３頁、シェイバニ（Ｓｈｅｉｂａｎｉ）［１９９９］「原核生物遺伝子の融合発現系およびタンパク質の構造的および機能的研究におけるその使用」Ｐｒｅｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９（１）：７７〜９０頁、マーセル・デッカー社（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、スケラ（Ｓｋｅｒｒａ）ら［１９９９］「ストレプトアビジンのためのペプチドリガンドの応用：Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ」、Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １６：７９〜８６頁、エルゼビア・サイエンス、Ｂ．Ｖ．スミス（Ｓｍｉｔｈ）［１９９８］「真核生物タンパク質発現のためのクックブック：酵母、昆虫、および植物の発現系」Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  １２（２２）：２０、スミス（Ｓｍｙｔｈ）ら［２０００］「Ｓｔｒｅｐ  ＩＩ  Ｔａｇを有する組換え細胞外基質タンパク質の真核生物発現および精製」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１３９：４９〜５７頁、アンガー（Ｕｎｇｅｒ）［１９９７］「Ｓｈｏｗ  Ｍｅ  ｔｈｅ  Ｍｏｎｅｙ：原核生物の発現ベクターおよび精製システム」Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  １１（１７）：２０（これらはそれぞれ、参照によってその全体が本明細書に援用される）を参��）、あるいはアマシャム・バイオサイエンシーズ社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）（ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））、ストラタジーン（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）（カリフォルニア州ラ・ホーヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））、ノバジェン（ＮＯＶＡＧＥＮ）（ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））、キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．）（カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ））、またはインビトロジェン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）（カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ））などの売主からの市販のタグである。抗体分子の重鎖定常領域への結合のために適切なその他の「タグ」またはハンドルは表３において提供される。
【０１２３】
特定の実施形態では、タグは、（Ｈｉｓ）ｎ（ここで、ｎは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０またはそれ以上の整数である、あるいはｎは少なくとも３の整数である）からなる群から選択されるポリヒスチジンタグでよい。いくつかの実施形態では、ｎは５または６である。使用することができるもう１つのポリヒスチジンタグは［Ｈｉｓ−（Ｘａａ）］ｎであり、ここで、ｎは３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０またはそれ以上（あるいは、ｎは少なくとも３の整数である）の整数であり、Ｘａａは任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、ｎは５または６である。さらにもう１つのポリヒスチジンタグは、［（Ｘａａ）２−Ｈｉｓ］４−Ｘａａ−Ｈｉｓ−Ｘａａ−Ｈｉｓ−（Ｘａａ）２］であり、ここでＸａａは任意のアミノ酸でよい。１つの典型的な［Ｈｉｓ−（Ｘａａ）］６親和性タグは、Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｓｎでよい。典型的な［（Ｘａａ）２−Ｈｉｓ］４−Ｘａａ−Ｈｉｓ−Ｘａａ−Ｈｉｓ−（Ｘａａ）２］親和性タグは、Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓでよい。
【０１２４】
１つの実施形態では、タグは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）であり得る。ＧＳＴを含有する融合タンパク質の発現のためのプラスミドは、アマシャム・バイオサイエンシーズ社（ニュージャージー州ピスカタウェイ）から市販されている。このようなプラスミドの非限定的な例は、アマシャムにより販売されるｐＧＥＸベクターのファミリーである。あるいは、ＧＳＴをコードする核酸は、本発明の構築物に挿入することができる。
【０１２５】
本発明において使用するのに適したもう１つのタグは、ｃ−ｍｙｃタグである。ｃ−ｍｙｃエピトープタグは配列ＡＥＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＬを有する。この配列を本発明の組換え抗体に挿入すると、既知の親和性クロマトグラフィ技法およびｃ−ｍｙｃエピトープタグに特異的な抗体を用いるこれらの精製が可能になる。このような精製を容易にするキットは、上記で示したように、多数の商業的な売主から入手可能である。
【０１２６】
検出可能な抗体の発現のための典型的な重鎖のみの動物の標的構築物
マウスγ重鎖定常領域がリンカーに組換えで結合され、蛍光タンパク質（この例では、ＥＧＦＰ）配列がマウスγ重鎖定常領域を置換する重鎖のみの動物の１つの実施例では、以下の配列：
５’−Ｓμ−Ｃμ−Ｃδ−Ｓγ３−マウスＣγ１−Ｓε−マウスＣγ２−リンカー−ＥＧＦＰ−３’
をその生殖細胞系列ＤＮＡ内に含む動物を構築することができ、ここでＣは定常領域を表し、Ｓはスイッチ配列を表し、Ｃγ１およびＣγ２はそれぞれ、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３またはＧ４またはその一部からなる群から選択されるマウス定常領域γサブタイプを表し、そしてＳε、ＳαおよびＳγのそれぞれは、好ましくはマウス起源である。最も好ましくは、ＳγはＳγ３である。配列は、好ましくは、Ｃγ２の３’に方向付けられた要素（−Ｓα−Ｃα−）をさらに含み、ここで、ＳαおよびＣαは非ヒト起源である、または非ヒト動物にネイティブである。このような重鎖のみのマウスの作製において使用するための標的ベクターは、マウス生殖細胞系列ＩｇＨ座位を適切なベクター内に配置することによって構築することができる。リード抗体（例えば、ＫＴ３ｍＡｂ、ＴＣＲ複合体のマウスＣＤ３イプシロンサブユニットに特異的なラット抗体）からの選択された重鎖の再編成されたＶＨＤＪＨ部分は、次に、ＩｇＨ座位において、ＪＨクラスター内およびマウスμ定常領域の上流側に配置される。Ｇ１サブタイプであり、ヒンジ領域に存在して鎖間ジスルフィド架橋に関与するシステインをコードするコドンの５’近位で切断され、Ｆａｂ部分を生じさせ、従って次にＦ（ａｂ’）２抗体も産生する配列を表す第１のマウス重鎖定常領域は、Ｃγ抗体重鎖定常領域（Ｃγ３、Ｃγ１、Ｃγ２ｂおよびＣγ２ａ）の全てをコードするマウス生殖細胞系列ＤＮＡを置換し、ヒトＩｇＧ１領域がマウスＳγ３スイッチ配列に作動可能に連結されるように、Ｓγ３スイッチ配列を表すマウス生殖細胞系列ＤＮＡのすぐ下流側に、そしてＳεスイッチ配列の上流側に挿入される。Ｇ１サブタイプであり、ヒンジ領域に存在して鎖間ジスルフィド架橋に関与するシステインをコードするコドンの５’近位で切断され、Ｆａｂ部分を生じさせ、従って次にＦ（ａｂ’）２抗体も産生する配列を表し、そしてリンカーおよびＥＧＦＰに組換えにより結合された第２のマウス重鎖γ定常領域は、Ｃε抗体重鎖定常領域をコードするマウス生殖細胞系列ＤＮＡを置換し、ヒトＦａｂコード化重鎖定常領域がマウスＳεスイッチ配列に作動可能に連結されるように、Ｓεスイッチ配列を表すマウス生殖細胞系列ＤＮＡのすぐ下流側に、そしてマウスＳαスイッチ配列の上流側に挿入される。次に、標的構築物は、相同組換えによりマウスＥＳ細胞の生殖細胞系列座位内に配置され、重鎖のみの動物が得られる。軽鎖のみの動物およびこの重鎖のみの動物から得られる子孫動物は、ＫＴ３抗体からの重鎖の再編成されたＶＨＤＪＨ部分、および（ａ）ＬＰＳで攻撃されたときに、Ｆａｂ断片をもたらす切断されたＩｇＧ定常領域、または（ｂ）欧州特許出願第０２  ２９０６１０．１号明細書に記載されるようにＬＡＴＹ１３６Ｆ変異マウスに由来するＴ細胞が子孫動物に養子転移されるとき、または子孫動物に由来する細胞と一緒にウェル内でインキュベートされるときに、Ｆａｂ断片をもたらし、そしてＥＧＦＰタンパク質に連結される切断されたＩｇＧ定常領域を有する抗体を産生するＢ細胞を有し得る。
【０１２７】
標的ベクター
本発明の標的ベクターは、非ヒト動物の生殖細胞系列ＤＮＡに挿入すべき配列を含有するプラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウィルスなどを含むがこれらに限定されない組換えＤＮＡベクターを含む。
【０１２８】
本発明の「軽鎖のみの動物」および「重鎖のみの動物」を構築するために任意の適切な方法を使用することができるが、簡単で便利な方法は、効率的なベクターの構築、ならびに相同組換えに基づいて非ヒト動物細胞の生殖細胞系列ＤＮＡ内への標的挿入を可能にする標的ベクターを使用することにある。「軽鎖のみの動物」および「重鎖のみの動物」は、ＩｇＨ座位（ヒト起源または非ヒト起源）の全てまたは一部を含み（出発点として）、本明細書に記載される要素を用いて改変される標的ベクターを用いて、便利に構築することができる。
【０１２９】
本発明に従う細胞および遺伝子導入動物を作製するための最も便利な手段は、相同組換えにより組み込まれるように設計された標的ベクターを用いることである。培養哺乳類細胞は、プラスミド配列に相同の配列を含有する染色体位置で、外因的プラスミドＤＮＡを染色体ＤＮＡ内に組み込むことができる（フォルジャー（Ｆｏｌｇｅｒ）ら、１９８２年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２、１３７２〜１３８７頁、フォルジャーら、１９８４年、Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４９、１２３〜１３８頁、クチャラパティ（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ）ら、１９８４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１、３１５３〜３１５７頁、リン（Ｌｉｎ）ら、１９８５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２、１３９１〜１３９５頁、ロバート・ド・サン・ビンセント（Ｒｏｂｅｒｔ  ｄｅ  Ｓａｉｎｔ  Ｖｉｎｃｅｎｔ）ら、１９８３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０、２００２〜２００６頁、ショール（Ｓｈａｕｌ）ら、１９８５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２、３７８１〜３７８４頁）。また、哺乳類細胞は、ランダムな染色体部位でプラスミドＤＮＡを組み込むための、非相同組換えと呼ばれる酵素機構を含有する。相同組換えの頻度は、組換え事象の１／１００〜１／１０００の高さであると報告されているが、組換えの大多数は非相同の相互作用をから起こる（トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）ら、１９８６年、Ｃｅｌｌ  ４４：４１９〜４２８頁、スミシーズ（Ｓｍｉｔｈｉｅｓ）ら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１７：２３０〜２３４頁、ショールら、１９８５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２、３７８１〜３７８４頁、スミスら、１９８４年、Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４９、１７１〜１８１頁、サブラマニ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ）ら、１９８３年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３、１０４０〜１０５２頁）。相同組換えのための細胞機構の存在は、内在性遺伝子をその場で改変することを可能にする。いくつかの場合には、標的座位に相同のＤＮＡのセグメントおよび所望の改変を有する新しい配列のセグメントを含有するプラスミドＤＮＡを細胞内に導入することによって染色体配列を改変することができる条件が見出されている（トーマスら、１９８６年、Ｃｅｌｌ  ４４：４１９〜４２８頁、スミシーズら、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ  ３１７：２３０〜２３４頁、スミスら、１９８４年、Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４９、１７１〜１８１頁）。哺乳類細胞の染色体ＤＮＡと外因的プラスミドＤＮＡの間の相同組換えは、プラスミドの組込みまたは相同プラスミド配列による染色体配列のいくつかの置換をもたらすことができる。相同ＤＮＡ配列を置換する方法は、遺伝子変換と呼ばれている。組込みおよび変換事象は両方とも、内在の標的座位における所望の新しい配列の位置決めをもたらすことができる。
【０１３０】
通常、宿主ゲノムに挿入すべき全ての要素を含有する単一の標的ベクターが使用される。ベクターは通常、再編成されたＶＨＤＪＨまたはＶＪ遺伝子および／または少なくとも１つのヒト定常領域遺伝子、ならびに宿主標的に対して相同性の領域、すなわちヒト配列で置換され得る染色体の領域を含み得る。相同領域は、通常は少なくとも約２０、３０、５０または１００ｂｐ、いくつかの場合には少なくとも約１ｋｂであるが、通常は約１０ｋｂ以下の長さである。非哺乳類リコンビナーゼ、例えばＣｒｅ、Ｆｌｉｐなどが使用される場合には、相同領域は置換すべき領域全体を含有し、選択可能なマーカーおよび相同領域に隣接するリコンビナーゼ認識部位、例えばｌｏｘＰ、ｆｒｔを有する。任意で、本明細書においてさらに記載されるように、ベクターは、スイッチ配列、および宿主種からまたはヒトからの１つまたは複数の定常領域遺伝子（例えば、ヒトまたはマウスμおよびδ定常領域）を含む追加の要素を含有する。
【０１３１】
宿主ＤＮＡに挿入すべき標的配列（宿主との相同組換えのため）および構築物は、標的ベクターによる適切な細胞株（例えば、およびＥＳ細胞）のトランスフェクションが、置換遺伝子の宿主生殖細胞系列ＤＮＡへの標的相同組換えおよび部位特異的挿入をもたらすように、標的ベクター内に配置される。本発明の標的ベクターは、薬物耐性を付与してトランスフェクタントのスクリーニングおよび選択を補助する酵素を含むがこれらに限定されない選択可能なマーカーをコードする追加の遺伝子を含有し得る。あるいは、本発明のベクターは、このようなマーカーと共にコトランスフェクトされてもよい。組換え事象の発生を高めることができるその他の配列も同様に含まれ得る。このような遺伝子は、ＲＥＣ  Ａ、トポイソメラーゼ、ＲＥＣ１またはＣＨＩなどの組換えを高める他のＤＮＡ配列などの真核または原核組換え酵素のいずれかを含むことができるが、これらに限定されない。さらに、本発明のベクターには、相同組換えにより産生されるキメラ遺伝子の転写を高める配列も含まれ得る。このような配列は、メタロチオニンプロモーターなどの誘発性要素を含むが、これらに限定されない。上述の遺伝子によりコードされるような種々のタンパク質は、組換え頻度を増大するためにトランスフェクトされ得る。
【０１３２】
大腸菌における効率的な標的ベクターの構築のためのシステム
本発明の方法において有用ないくつかのシステムは、標的ベクターの高速で効率的な構築を可能にし、これは、その後、ゲノム内への挿入に使用することができる。１つの例は、Ｒｅｄ／ＥＴ組換えシステムである（チャン（Ｚｈａｎｇ）、Ｙ．、ブッフホルツ（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ）、Ｆ．、マイレース（Ｍｕｙｒｅｒｓ）、Ｊ．Ｐ．Ｐ．およびスチュアート（Ｓｔｅｗａｒｔ）〜Ａ．Ｆ．（１９９８年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２０、１２３−１２８頁、およびマイレース（Ｍｕｙｒｅｒｓ）、Ｊ．Ｐ．Ｐ．、チャン、Ｙ．およびスチュアート、Ａ．Ｆ．（２００１年）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２６、３２５〜３１頁）。ラムダ媒介の組換えとも呼ばれるＲｅｄ／ＥＴ組換えでは、標的ＤＮＡ分子は、ファージに誘発されるタンパク質対、ＲａｃプロファージからのＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ、またはラムダファージからのＲｅｄａ／Ｒｅｄｂのいずれかを発現する大腸菌株において相同組換えによって正確に変更される。タンパク質対は、機能的および作用的に等価物である。ＲｅｃＥおよびＲｅｄａはエキソヌクレアーゼであり、ＲｅｃＴおよびＲｅｄｂはＤＮＡアニーリングタンパク質である。
【０１３３】
もう１つの例は、「リコンビニアリング」システム（メリーランド州フレデリックのＮＣＩ  フレデリック（ＮＣＩ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ）から入手可能）、λファージから提供される組換えタンパク質を用いる大腸菌における相同組換えに基づく方法である。標的ベクターは、細菌ゲノムに挿入された欠損λプロファージを含有する細菌株において構築される。目的とするファージ遺伝子、ｅｘｏ、ｂｅｔ、およびｇａｍは、λＰＬプロモーターから転写される。このプロモーターは温度感受性リプレッサーｃＩ８５７によって３２℃で抑制され、４２℃で抑制解除される（リプレッサーは不活性である）。４２℃で１５分の熱ショックの後、十分な量の組換えタンパ質が産生される。ｅｘｏは、導入された直鎖ＤＮＡに一本鎖のオーバーハングを形成する５’−３’エキソヌクレアーゼである。ｂｅｔは、これらのオーバーハングを保護し、次の組換えプロセスを補助する。ｇａｍは、大腸菌のＲｅｃＢＣＤタンパク質を阻害することによって、直鎖ＤＮＡの分解を防止する。細菌（プラスミド、ＢＡＣ、または細菌ゲノム自体）中に既に存在する標的ＤＮＡ分子に対して５’および３’端部において十分な相同性を有する直鎖ＤＮＡ（ＰＣＲ産物、ｏｌｉｇｏなど）は、電気穿孔を用いて熱ショックおよびエレクトロコンピテント細菌内に導入することができる。導入されたＤＮＡは今では、ｅｘｏおよびｂｅｔにより改変され、標的分子による相同組換えを受けることができる。ｈｔｔｐ：／／ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖにおいてプロトコルが提供される。
【０１３４】
種々のマーカーが選択のために使用され得る。これらのマーカーは、ＨＰＲＴミニ遺伝子（レイド（Ｒｅｉｄ）ら、（１９９０年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：４２９９〜４３０３頁）、Ｇ４１８への耐性のためのｎｅｏ遺伝子、ガンシクロビルに対する感受性のためのＨＳＶチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などを含む。組換え媒介物は、ウィルス認識配列（例えば、ＳＶ４０など）、遺伝子発現などを増幅するための追加配列を含むこともできる。
【０１３５】
調製されたら、構築物は、宿主細胞を標的ベクターで形質転換することによって、宿主細胞の生殖細胞系列ＤＮＡに挿入される。好ましくは、宿主細胞は胚性幹（ＥＳ）細胞である。トランスフェクションの後、選択可能なマーカー遺伝子を発現する細胞を選択する条件下で、胚性幹細胞は培養液中で成長される。次に、これらの細胞はスクリーニングされ、相同染色体領域において組換え事象が生じたかどうかを決定する。このようなスクリーニングは、特異な大きさの断片を検出するためのサザンブロッティング、ＰＣＲ増幅、ハイブリダイゼーションなどを含む任意の便利な方法によって実施され得る。
【０１３６】
所望の組換えを有する細胞は、宿主哺乳類の胚盤胞に注入される。胚盤胞は、排卵の３〜５日後に子宮を洗い流すことによってメスから得ることができる。少なくとも１つ、そして３０までの改変された胚性幹細胞を胚盤胞の胞胚腔内に注入することができる。注入後、少なくとも１つ、そして約１５以下の胚盤胞は、偽妊娠メスのそれぞれの子宮角に戻される。次にメスは出産させられ、得られた同腹仔は、構築物を有する変異細胞についてスクリーニングされる。このようにして、軽鎖のみの動物および重鎖のみの動物が得られる。
【０１３７】
次の繁殖は、変更された座位の生殖細胞系列伝達を可能にする。ヘテロ接合の子孫を繁殖させ、そしてヘテロ接合の親からホモ接合の子孫を選択する（すなわち、両方の染色体に存在するヒト遺伝子セグメントを有するもの）ことを選ぶことができる。あるいは、胚性幹細胞は、さらなる相同組換えのために使用されてもよい。
【０１３８】
子孫動物およびその使用
本発明はさらに、「軽鎖のみ」および「重鎖のみ」（またはＨＣＯＡ２またはＨＣＯＡ３）の動物の交配から生じる「子孫動物」を提供し、交配プロセスで使用される動物は、同じヒト、ヒト化またはキメラ抗体分子に由来する抗体重鎖および軽鎖を含有することが好ましい。
【０１３９】
交配ステップから生じた子孫動物は、次に、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体に特異的な抗原で免疫化され、Ｂ細胞のクローン増殖を誘発することができる。
【０１４０】
ＶＨＤＪＨセグメントの超変異を受ける能力を保有する動物では、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体に特異的な抗原による免疫化は、ＶＨＤＪＨセグメントの体細胞超変異を誘発するためにも有用であり得る。
【０１４１】
軽鎖のみおよび重鎖のみの動物、好ましくはＨＣＯＡ２またはＨＣＯＡ３動物の交配が行われた場合には、子孫動物は、Ｂ細胞により産生される抗体の所望のアイソタイプへのクラススイッチを誘発するように処置することができる。これは、任意の適切な方法を用いて実行することができ、１つの実施例では、サイトカインが子孫動物に投与される。もう１つの実施例では、ＬＰＳが子孫動物に投与されて、Ｂ細胞により産生される抗体の、ＩｇＭからＩｇＧ４へのクラススイッチ（特異的抗原による免疫化に加えて、例えば図３を参照）を刺激する。もう１つの実施例では、欧州特許出願第０２  ２９０６１０．１号明細書に記載されるような変異マウスから得られる細胞は、子孫動物に養子転移される。もう１つの実施形態では、所望のアイソタイプへのスイッチを誘発するために子孫動物の特定の処置は必要とされない。例えば、動物が、欧州特許出願第０２  ２９０６１０．１号明細書に記載されるようなＬＡＴＹ１３６Ｆ変異を内部に持つ場合、動物は、抗体をＩｇＥおよびＩｇＧ１サブタイプ（またはマウス対応物を置換するヒト重鎖定常領域サブタイプ）から優先的に産生し得る。
【０１４２】
図２の実施例では、ヒト重鎖定常領域Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３またはＧ４は、Ｓαスイッチ配列の上流側、そしてＳγ３スイッチ配列の下流側に組み込まれ、γおよびε重鎖定常領域をコードするマウス生殖細胞系列ＤＮＡを置換する。そして、Ｇ１サブタイプであるが、ヒンジ領域に存在して鎖間ジスルフィド架橋に関与するシステインをコードするコドンの５’近位で切断されたヒト重鎖γ定常領域は、Ｃε抗体重鎖定常領域をコードするマウス生殖細胞系列ＤＮＡを置換し、Ｓεスイッチ配列を表すマウス生殖細胞系列ＤＮＡのすぐ下流側、そしてマウスＳαスイッチ配列の上流側に挿入される。この動物からのＢ細胞は、（ａ）（ｉ）子孫動物がＬＡＴＹ１３６Ｆ変異を内部に持つ場合にデフォルトにより、または（ｉｉ）ＬＡＴＹ１３６Ｆ変異を内部に持つ動物からのＴ細胞の養子転移の場合には、抗体Ｆａｂ断片と、（ｂ）ＬＰＳの投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒａｔｉｏｎ）の場合には完全抗体（例えば、Ｇ１またはＧ４サブタイプを有する）とを産生し得る。体細胞超変異が抗原により誘発される場合は、誘発は、好ましくは、抗原による免疫化の後に実行される。
【０１４３】
記載したように、任意の適切なクラススイッチステップを用いることができる。典型的なＨＣＯＡ３動物では、クラススイッチはＬＰＳによって誘発され、マウスＣγ３、Ｃγ１、Ｃγ２ｂおよびＣγ２ａ領域セットまたはα重鎖定常領域を置換するヒト重鎖の発現を誘発することができる。欧州特許出願第０２  ２９０６１０．１号明細書に記載されるマウスに由来するＣＤ４Ｔ細胞による本発明の子孫動物の処置によって、クラススイッチを誘発させて、マウスε鎖を置換するヒト重鎖の発現を誘発することができる。
【０１４４】
従って、本発明の方法は、通常、１）生殖細胞系列に作動可能に連結されたヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の重鎖の再編成されたＶ領域を少なくともコードする配列、または改変された定常領域配列を含む第１の非ヒト動物と、２）生殖細胞系列に作動可能に連結された特定のヒト、キメラまたはヒト化リード抗体の軽鎖の再編成された可変領域を少なくともコードする配列、または改変された定常領域配列を含む第２の非ヒト動物との構築を含む。次に、これらの動物は交配され、子／子孫は、ヒト、キメラまたはヒト化抗体の特異的である抗原に特異的に結合することができる抗体の産生について試験される。所望される場合には、所望の表現型を有する（例えば、所望の結合特異性を有する抗体を産生する）子孫は、特異的抗原および／またはＬＰＳまたは他の処置により攻撃され、ヒト、キメラまたはヒト化抗体を産生するＢ細胞のクローン増殖を刺激し、および／またはＶＨＤＪＨおよびＶＬＪＬセグメントの体細胞超変異と、従って既知のモノクローナルの親和性成熟とを誘発し、および／またはＩｇＭ産生から、所望のサブタイプのＩｇＧ抗体の産生へのクラススイッチを引き起こす。本発明の特に有利な態様は、動物（好ましくは、マウス）が、目的とするｍＡｂを産生するＢ細胞の実質的にモノクローナル集団を産生し得ることである。融合は、同じまたは非常に類似したｍＡｂを示す多数のクローンをもたらすべきであり、対応するハイブリドーマは、既知の方法で評価される場合に最良の産生細胞だけを保持するように選択され得る。それにより、本発明は、目的とする抗体の増大したレベルの産生が可能である細胞、好ましくはＢ細胞およびハイブリドーマを獲得、同定、または産生するための方法を提供する。
【０１４５】
従って、本発明は、インビボでリード抗体に由来する配列またはリード配列の体細胞超変異を誘発することを含む、その特異的抗原に対する抗体の親和性を増大するための方法を提供する。本発明のこの態様では、動物は特異的抗原で免疫化され（例えば、繰り返し、例えば、少なくとも５〜２０回、免疫化される）、動物のＢ細胞クローンは抗原に応答して繰り返し増殖および選択される。従って、本発明の動物は、親和性成熟抗体の調製を可能にする。「親和性成熟」抗体は、その１つまたは複数のＣＤＲにおいて、変更されていない親の抗体と比較して抗原に対する抗体の親和性における改善をもたらす１つまたは複数の変更を有するものである。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル、またはさらにピコモルの親和性を有し得る。好ましくは、該方法は、標的抗原に対する抗体による親和性を、少なくとも２０％、３０％、５０％、７５％、９０％、１００％、２００％または１０００％、あるいは、リード抗体に対して少なくとも１、２、３または４ログ（ｌｏｇ）だけ改善することを含む。
【０１４６】
好ましい実施形態では、本発明は、目的とするヒトキメラまたはヒト化抗体を産生する子孫動物からのＢ細胞を選択または単離するステップを含む。議論されるように、本発明は、目的とするヒト、キメラまたはヒト化抗体を産生するハイブリドーマを調製する方法、ヒト、キメラまたはヒト化抗体の改善された産生を有するＢ細胞およびその誘導体または子孫（例えば、ハイブリドーマなどの融合細胞）を得る方法、および改善された抗体（例えば、親和性成熟抗体）を得る方法を提供する。従って、Ｂ細胞は、単に抗体産生の陽性、または抗体産生特性（例えば、レベルまたは量または他の任意の基準）、産生される抗体の性質（親和性、サブタイプ、特異性など）などの適切な特性に基づいて選択することができる。１つの実施形態では、本発明は、ヒト、キメラまたはヒト化抗体を発現する単離されたハイブリドーマを包含する。また本発明は、本発明の子孫動物、Ｂ細胞またはハイブリドーマを用いて、目的とするヒト、キメラまたはヒト化抗体を産生するための方法にも関する。
【０１４７】
好ましくは、動物から得られるＢ細胞は、骨髄腫細胞に融合されて、ハイブリドーマを産生する（不死化細胞株）。有利に、ハイブリドーマは、ヒト、キメラまたはヒト化抗体の高レベル（量）の産生のためのその能力について選択される。特定の哺乳類に由来するＢ細胞を用いたモノクローナル抗体の産生において使用するのに適した典型的な骨髄腫細胞は表２に示される。
【０１４８】
所望の特異性を有する抗体が子孫動物において同定されたら、任意で骨髄腫細胞との融合により不死化される。これらの細胞を使用して、所望の量の抗体を産生することができ、このような細胞により産生される抗体は単離されて、所望の用途、例えば、治療、診断、研究の用途に使用することができる。
【０１４９】
また、本発明は、本発明のモノクローナル抗体を分泌する候補ハイブリドーマを同定する方法も提供する。本発明のこの態様では、個々のまたはプールされたハイブリドーマクローンの上澄みは、所定の抗原結合特異性を有する抗体を選択する結合条件下で、所定の抗原、通常は固体基質（例えば、マイクロタイターウェル）への吸着によって固定化された抗原と接触されてインキュベートされる。またヒト定常領域に特異的に結合する抗体も、抗体が少なくとも１つのヒト定常領域エピトープに選択的に結合するが、マウス定常領域エピトープには実質的に結合しないような結合条件下で、ハイブリドーマ上澄みおよび所定の抗原と接触されてインキュベートされる、従って、所定の抗原と、ヒト定常領域に特異的に結合する抗体とに結合された（そして、検出可能な標識またはレポーターで標識化され得る）ハイブリドーマ上澄み（遺伝子導入モノクローナル抗体）から本質的になる複合体が形成される。このような複合体の形成の検出は、ヒト免疫グロブリン鎖を発現するハイブリドーマクローンまたはプールを示す。
【０１５０】
１つの実施形態では、候補ハイブリドーマは、まず、特異的な抗原に結合する抗体を産生する能力についてスクリーニングされる。従って、本発明によると、本発明の遺伝子導入動物は、所定の抗原で免疫化されて、免疫応答を誘発する。Ｂ細胞は動物から採取され、適切な骨髄腫細胞にに融合されて、ハイブリドーマを産生する。次に、ハイブリドーマは、抗原への特異的結合について、そして次に抗体のアイソタイプについてスクリーニングされる。スクリーニングは、例えば、ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）（１９８８年）に記載されるように、標準技法を用いて実行することができる。
【０１５１】
抗体の更なる改変
所望される場合には、Ｂ細胞によって産生される抗体は、適切な方法で改変することができる。例えば、抗体の結合親和性は、当該技術分野において既知の種々の方法によって増大させることができる。例えば、結合特性は、直接的な変異、親和性成熟方法、ファージディスプレイ方法、または抗体分子をコードする核酸内の鎖シャッフリング方法によって改善することができる。例えば、個々の残基または残基の組み合わせは、そうでなければ同一である抗原結合部位の集団において、２０種の全てのアミノ酸が特定の位置に見出されるようにランダム化することができる。結合特性は、親和性成熟方法によっても改善することができる（例えば、ヤン（Ｙａｎｇ）ら（１９９５年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２５４、３９２〜４０３頁、ホーキンス（Ｈａｗｋｉｎｓ）ら（１９９２年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２２６、８８９〜８９６頁、またはロー（Ｌｏｗ）ら（１９９６年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２５０、３５９〜３６８頁（これらはそれぞれ、特に抗体の結合親和性を増大させる方法に関して、参照によってその全体が本明細書に援用される）を参照）。当該技術分野において既知の方法には、例えば、マークス（Ｍａｒｋｓ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９〜７８３頁（１９９２年）に記載されるＶＨおよびＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟と、バルバス（Ｂａｒｂａｓ）ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ  ９１：３８０９〜３８１３頁（１９９４年）、シーア（Ｓｃｈｉｅｒ）ら、Ｇｅｎｅ、１６９：１４７〜１５５頁（１９９５年）、イェルトン（Ｙｅｌｔｏｎ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５：１９９４〜２００４頁（１９９５年）、ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０〜９頁（１９９５年）、およびホーキンス（Ｈａｗｋｉｎｓ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９〜８９６頁（１９９２年）によって記載されるＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム変異誘発とが含まれる。
【０１５２】
抗体の最適化のための戦略は、ランダム変異誘発を用いて実行されることもある。これらの場合、位置がランダムに選択される、あるいは単純化した規則を用いてアミノ酸変化が成される。例えば、全ての残基はアラニンに変異されてもよく、アラニンスキャニングと呼ばれる。国際公開第９５２３８１３号パンフレット（参照によってその全体が本明細書に援用される）は、アラニンスキャニング変異誘発（Ａｌａｎｉｎｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いて抗体親和性を増大させるインビトロの方法を教示する。アラニンスキャニング変異誘発は、例えば、抗体の抗原結合残基を位置づけるために使用することもできる（ケリー（Ｋｅｌｌｅｙ）ら、１９９３年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：６８２８〜６８３５頁、ヴァイドス（Ｖａｊｄｏｓ）ら、２００２年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２０：４１５〜４２８頁）。配列に基づく親和性成熟方法（米国特許出願公開第２００３／０２２２４０号明細書および米国特許出願公開第２００２／１７７１７０号明細書を参照、いずれも参照によってその全体が本明細書に援用される）を用いて抗体の結合親和性を増大させてもよい。
【０１５３】
本発明のさらなる態様および利点は、以下の実験セクションにおいて開示され、実例としてみなされるべきであって、本出願の範囲を限定するとみなされてはならない。
【実施例】
【０１５４】
実施例１
マウスＩｇＨ座位のエンジニアリング
マウスＩｇＨ座位に対応してＲＰ２３−３５１Ｊ１９およびＲＰ２３−１０９Ｂ２０で示される２つのマウスＢＡＣを、ＢＡＣライブラリーから選択した（オソエガワ（Ｏｓｏｅｇａｗａ）Ｋら（２０００年）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１０：１１６〜１２８、その開示は参照によってその全体が本明細書に援用される）。これらは７６ｋｂの重複を示し、それぞれ、多様性（Ｄ）、および接合部（Ｊ）遺伝子セグメント、および定常（Ｃ、ＩｇＧ３〜ＩｇＡ）遺伝子を含有する領域の一部を包含する（図５Ａ）。パルスフィールドゲル電気泳動を用いて２つのＢＡＣにより含有される配列の完全性を決定した。
【０１５５】
ＢＡＣ  ＲＰ２３−３５１Ｊ１９とＢＡＣＲＰ２３−１０９Ｂ２０の融合
第１のステップでは、２つのＢＡＣを融合して、ＤおよびＪ遺伝子セグメントならびにＣ遺伝子を含有する組換えＢＡＣを生じさせる。２つの戦略が実行される。
【０１５６】
戦略１
まず、ピューロマイシン耐性カセット（ド・ラ・ルナ（ｄｅ  ｌａ  Ｌｕｎａ）Ｓら、（１９９２年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１６：３７６〜８５頁、この開示は参照によって本明細書に援用される）（「Ｐｕｒｏ」）をＢＡＣ  ＲＰ２３−１０９Ｂ２０に導入する。このカセットは、（１）ＩｇＨクラスターの３’末端に位置する配列と、Ｔ７配列に近接するＢＡＣ  ＲＰ２３−１０９Ｂ２０の末端に位置する配列とに対応するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて合成される。図５Ｂに示されるように、オリゴヌクレオチドプライマーの１つは、Ｉ−ＳｃｅＩ制限部位を含有する（最終の組換え基質の直線化を容易にするため、以下を参照）。合成したピューロマイシンカセットのＢＡＣ  ＲＰ２３−１０９Ｂ２０への標的化は、全Ｄ遺伝子セグメントクラスターを包含する６３ｋｂの配列の欠失（「切除（ｓｈａｖｉｎｇ）」）をもたらす。ＲＰ２３−１０９２０ｐｕｒｏと呼ばれるこの中間産物は成長され、ＳｎａＢＩで消化される。ＳｎａＢＩによるＲＰ２３−１０９Ｂ２０ｐｕｒｏの消化は、ＢＡＣライブラリーを構築するために使用されるベクターを無効にする。この株の細菌には、プラスミドｐＳＣ１０１−ＢＡＤ−ｇｂａＡ（ＥＴリコンビナーゼをコードする、スチュアート、Ａ．Ｆ．、チャン、Ｙ．、およびブッフホルツ、Ｆ．１９９７年、Ｎｏｖｅｌ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ、欧州特許出願第９８  ９６３５４１．２号明細書（またはＰＣＴ／ＥＰ９８／０７９４５））もトランスフェクトされる。従って、クロラムフェニコールおよびピューロマイシンの両方の存在下で成長する細菌は、図５Ｄに示される構造を示す組換えＢＡＣ（ＲＰ２３−３５１Ｊ１９ｐｕｒｏで示される）を含有する。予期される構造は、フィールドパルスゲル電気泳動および部分配列決定によって検証される。
【０１５７】
戦略２
バックアップ戦略２は、上記の戦略１の代替として使用することができる。ＩｇＡ  Ｃ遺伝子の３’端部に隣接する相同配列を用いて、ブラストサイジン（「Ｂｌａｓｔ」）耐性カセット（イタヤ（Ｉｔａｙａ）Ｍら、Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９０年）１０７：７９９〜８０１頁）をＢＡＣ  ＲＰ２３−３５１Ｊ１９に導入する。（図５Ｃ）。得られたＢＡＣはＲＰ２３−３５１Ｊ１９ｂｌａｓｔで示される。マイクログラム量のＢＡＣ  ＲＰ２３−３５１Ｊ１９ｂｌａｓｔおよびＢＡＣ  ＲＰ２３−１０９Ｂ２０ｐｕｒｏ（１．１．１を参照）が調製される。ＢＡＣ  ＲＰ２３−３５１Ｊ１９ｂｌａｓｔはＭｌｕＩおよびＢｓｉＷＩで消化されるが、ＢＡＣ  ＲＰ２３−１０９Ｂ２０ｐｕｒｏはＭｌｕＩおよびＢｓｉＷＩによって制限される。ＩｇＧ３Ｃ、ＩｇＤＣおよびＩｇＭＣ遺伝子ならびにＪＨ遺伝子クラスターを包含するＭｌｕＩ−ＢｓｉＷＩ断片は、ＭｌｕＩ−ＢｓｉＷＩ制限されたＢＡＣ  ＲＰ２３−３５１Ｊ１９ｂｌａｓｔにクローニングされて、ＢＡＣ  ＲＰ２３−３５１Ｊ１９ｐｕｒｏ／ｂｌａｓｔを生じさせる（図５Ｄ）。
【０１５８】
ヒトＩｇＧ１Ｃ遺伝子をコードする配列による、マウスＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３ｃおよびＩｇＧ２ａＣ遺伝子をコードする配列の置換
ステップ１
この置換は、ＢＡＣ  ＲＰ２３−３５１Ｊ１９ｐｕｒｏまたはＢＡＣ  ＲＰ２３−３５１Ｊ１９ｐｕｒｏ−ｂｌａｓｔのいずれかを用いて、組換えエンジニアリングによって実行される。ＩｇＣＨクラスターの３’端部に位置するＩｇＡおよびＩｇＥＣ遺伝子はまず、ＩｇＥＣ遺伝子の５’端部に位置する配列、およびＩｇＨＣクラスターの３’最端部に位置する配列に対応する相同アームに隣接されるアンピシリンベースのカセットを用いて、相同組換えによって欠失される。ＢＡＣＲＰ２３−３５１Ｊ１９ｐｕｒｏ−ｂｌａｓｔが使用される場合には、このステップは、ブラストサイジンカセットを除去するためにも使用される。このアプローチは、５’相同アームの範囲を指定することが注目される。
【０１５９】
ステップ２．  ヒトＩｇＧ１−Ｌｏｘ５１１−Ｈｙｇｒｏ−ｌｏｘ５１１カセットの構築および挿入
ヒトＩｇＧ１Ｃ遺伝子のエクソンＣＨ１、Ｈ、ＣＨ２およびＣＨ３にまたがる３．２ｋｂ断片は、テンプレートとしてのＢＡＣ  ＲＰ１１−４１７Ｐ２４（オソエガワＫら、（２００１年）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１１：４８３〜９６頁）、およびヒトＩｇＧ１  ＣＨ１エクソンの開始に相補的な配列を有する５’端部プライマー（プライマーａ）、およびヒトＩｇＧ１ＣＨ３エクソンの３’端部に相補的な３’端部プライマー（プライマーｂ）を用いて、ＰＣＲによって合成される。マウスＩｇＧ３Ｃ遺伝子のＣＨ１エクソンの５’端部に位置するスプライシング部位に相補的な配列は、プライマーａの５’端部に接する。マウスＩｇＧ２ａＣ遺伝子のＣＨ３エクソンの３’端部に隣接するイントロンに相補的な配列はプライマーｂの３’端部に接する。
【０１６０】
対応するＰＣＲ産物は、配列決定およびクローン化される。ｌｏｘ５１１−隣接ハイグロマイシン耐性カセット（ジオルダノ（Ｇｉｏｒｄａｎｏ）Ｔら、（１９９０年）Ｇｅｎｅ  ８８：２８５〜２８８頁、その開示は参照によって本明細書に援用される）は、ＩｇＧ２ｂｃ遺伝子のＣＨ３エクソンの３’端部で挿入される（図５Ｄ）。得られるヒトＩｇＧ１−ｌｏｘ５１１−Ｈｙｇｒｏ−ｌｏｘ５１１カセットは、リコンビニアリングによって、ＢＡＣ  ＲＰ２３−３５１Ｊ１９ｐｕｒｏまたはＢＡＣＲＰ２３−３５１Ｊ１９ｐｕｒｏ／ｂｌａｓｔに挿入される。
【０１６１】
ＶＨＤＨＪＨ１６Ｄ１０ｌｏｘＰ−Ｔａｃｅ  Ｎｅｏ−ｌｏｘＰカセットの構築および挿入
ハイブリドーマ「ＩＰＨ１」により使用されるＶＨ遺伝子を同定し、ＶＨＤＨＪＨＩＰＨ１で示した。このハイブリドーマは、カッパ軽鎖を備えたＩｇＭを分泌する。ＶＨＤＨＪＨＩＰＨ１遺伝子のプロモーターを包含し、そしてＶＨＤＨＪＨＩＰＨ１遺伝子により使用されるのＪＨ遺伝子セグメント３’端部で終わるゲノム断片は、ＩＰＨ１ハイブリドーマから抽出されたＤＮＡからＰＣＲによって合成される。ＶＨＤＨＪＨプロモーターの５’端部に位置するプライマーは、ＪＨ遺伝子クラスターの５’端部に隣接する配列に相同の配列を組み込む。ｌｏｘＰ−隣接Ｃｒｅ−ｎｅｏオートデリーター（ａｕｔｏ−ｄｅｌｅｔｅｒ）カセット（Ｔａｃｅ−Ｎｅｏカセット、ブンティング（Ｂｕｎｔｉｎｇ）Ｍら（１９９９年）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：１５２４〜８頁、その開示は参照によって本明細書に援用される）は、図５Ｄに示されるようにＶＨＤＨＪＨＩＰＨ１断片の３’端部に挿入される。ＶＨＤＨＪＨＩＰＨ１ｌｏｘＰ−Ｔａｃｅ  Ｎｅｏ−ＬｏｘＰカセットは、図５Ｄに示されるように、組換えエンジニアリングによって、ＢＡＣ  ＲＰ２３−３５１Ｊ１９ｐｕｒｏまたはＢＡＣ  ＲＰ２３−３５１Ｊ１９ｐｕｒｏ  ｂｌａｓｔに挿入される。５’および３’の単一コピーのプローブおよび適切な制限部位は、意図された挿入の各端部において、相同組換えがＥＳ細胞中で生じたことを保証するように定義される。
【０１６２】
組換えＥＳクローンの単離
ＢＡＣ  ＤＮＡは、５リットルの培養液を用いて調製され、塩化セシウムグラジエントで精製される。Ｉ−ＳｃｅＩによる消化の後、標的構築物はフェノール−クロロホルムで抽出され、エタノールで沈殿させられ、ＰＢＳ中に再懸濁される。
【０１６３】
Ｂｒｕｃｅ４  ＥＳ細胞は、Ｉ−ＳｃｅＩ直線化ＢＡＣ  ＶＨＤＨＪＨＩＰＨ１−ｍＣＭ−ｍＣＤ−ｈＣＧ１で電気穿孔される。電気穿孔の２４時間後、以下の濃度：Ｇ４１８：２００μｇ／ｍｌおよびハイグロマイシン（１６０ｍｇ／ｍｌ）で薬物の選択が開始される。Ｇ４１８およびハイグロマイシン中での選択、コロニーはサザンブロット分析によって相同組換えについてスクリーニングされる。
【０１６４】
変異マウスの産生
変異体ＥＳは、Ｂａｌｂ／ｃ胚盤胞に注入される。ハイグロマイシンおよびネオマイシンカセットは、オスの生殖細胞系列の伝達の間に自己切除される。ノックインアプローチの結果は、その独自のプロモーターにより駆動されるＶＨＤＨＪＨＩＰＨ１遺伝子、ｌｏｘＰ部位、マウスＣＭおよびＣＤ遺伝子、ヒトＣＧ１およびＬｏｘ５１１部位を含有する「再編成された」マウスＩｇＨ座位である。
【０１６５】
マウスＩｇＣカッパ座位のエンジニアリング
マウスＩｇＣカッパ座位は、マウスＩｇＨ座位と比較した場合にかなり簡単な組織化を示す。この性質のために、図５Ｅおよび５Ｆに概説されるように、適切な組換え基質を得るために３つのリコンビニアリングステップが必要とされるだけである。
【０１６６】
ＪＫ遺伝子クラスターおよびＣＫ遺伝子のサブクローニング
ＪＫ遺伝子クラスターおよびＣＫ遺伝子は、出発テンプレートとしてＢＡＣ  ＲＰ２３−４３５Ｉ４を用いて、リコンビニアリングによりｐＵＣにサブクローニングされる（オソエガワＫら、（２０００年）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  １０：１１６〜１２８頁）。得られたサブクローンは、「ＪＫクラスター−ＣＫ遺伝子」で示される。
【０１６７】
図５Ｆに示されるように、ＶＫＪＫＩＰＨ１遺伝子のプロモーターおよびＶＫＪＫＩＰＨ１遺伝子自体に対応するゲノム断片は、ハイブリドーマＩＰＨ１から単離される。ｌｏｘＰ−隣接自己欠失（ｓｅｌｆ−ｄｅｌｅｔｉｎｇ）ｎｅｏ耐性カセットは、ＶＫＪＫＩＰＨ１遺伝子の３’端部において挿入され、ＪＫクラスターの５’端部に隣接する配列に相同の領域は、ＶＫＪＫＩＰＨ１プロモーターの５’端部に接する。この断片は、図５Ｆに示されるように、リコンビニアリングによって「ＪＫクラスター−ＣＫ遺伝子」サブクローンに導入される。
【０１６８】
次に、マウスＣＫ遺伝子は、ＲＰ１１−６０１Ｎ４を用いるヒトＩｇＧ１Ｃ遺伝子のマウスＩｇＨ座位への導入について記載したものと同一の戦略を用いて、ヒトＣＫ遺伝子によって置換される（上記のステップ「ＶＨＤＨＪＨＩＰＨ１ｌｏｘＰ−Ｔａｃｅ  Ｎｅｏ−ｌｏｘＰカセットの構築および挿入」および図５Ｆを参照、オソエガワＫら、（２００１年）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１１：４８３〜９６頁）。
【０１６９】
組換えＥＳクローンの単離、ならびにヒト化ＣＫ座位および「再編成された」ＶＫＪＫＩＰＨ１遺伝子を有する変異マウスの産生は、ＩｇＨ座位について記載したように実行される。
【０１７０】
実施例２
マーカーに連結された抗体を発現する遺伝子導入動物のエンジニアリング
ＩｇＨ座位の１つのＣ遺伝子（アイソタイプスイッチによりＬａｔＹ１３６ＦインデューサーＴ細胞を用いてその発現を制御する可能性の利益を得るために、優先的に、ＣドメインのＥまたはＧ１アイソタイプ）は、リンカー−ＥＧＦＰをコードするｃＤＮＡまたはリンカー−タンデムＲｅｄ配列で構成される配列によって置換される場合に、遺伝子導入マウスが発生される。
【０１７１】
アプローチの実現可能性を証明するために、第１のステップで構築物が作成されて、単一のオープンリーディングフレームとして発現される抗体、ＫＴ３ｍＡｂ（ＴＣＲ複合体のマウスＣＤ３イプシロンサブユニットに特異的なラット抗体）のＦａｂ−リンカー−ＥＧＦＰバージョンの発現を試験する。
【０１７２】
従って、Ｘ６３−ＡｇＸ６５３において、単一のオープンリーディングフレームとして、
ａ．ＫＴ３ＶＨ遺伝子のリーダー、
ｂ．ＫＴ３ＶＨ遺伝子、
ｃ．ＫＴ３ＣＨ１（ＩｇＧ２ａ）配列、
ｄ．《Ｄ２ＡＫ２》リンカー、
ｅ．ＥＧＦＰの単量体の形態、フューリン／２４切断部位、
ｆ．完全なＫＴ３カッパ軽鎖、および
ｇ．ａｄ  ｈｏｃ発現ベクターにおける発現を容易にするためのスプライス部位
に対応する配列を含有するカセットを発現させた。
【０１７３】
構築の概略図は図６に示される。
【０１７４】
構築物の試験に続いて、本発明の方法に従って抗体を発現する遺伝子導入動物が発生され得る。簡単に言うと、動物は、実施例１と同様にして発生される。
【０１７５】
検出可能なタンパク質に連結された抗体、および検出可能なマーカーを持たない同じ抗体を発現する子孫動物を発生させるために、マウスγ重鎖定常領域配列は第１のマウスγ重鎖定常領域を置換し、リンカーおよび蛍光タンパク質（この実施例ではＥＧＦＰ）配列に組換えにより結合されたマウスγ重鎖定常領域は、第２のマウスγ重鎖定常領域を置換する。動物は、以下のような配列：
５’−Ｓμ−Ｃμ−Ｃδ−Ｓγ３−マウスＣγ１−Ｓε−（マウスＣγ２−リンカー−ＥＧＦＰ）−３’
をその生殖細胞系列ＤＮＡ内に有する。ここで、Ｃは定常領域を表し、Ｓはスイッチ配列を表し、Ｃγ１およびＣγ２はそれぞれマウス定常領域Ｇ１サブタイプを表し、またヒンジ領域に存在して鎖間ジスルフィド架橋に関与するシステインをコードするコドンの５’近位で切断され、Ｆａｂ部分を生じさせる配列を表し、そしてＳε、ＳαおよびＳγのそれぞれはマウス起源である。配列はさらに、Ｃγ２の３’に方向付けられた要素（−Ｓα−Ｃα−）を含み、ここで、ＳαおよびＣαはマウス起源である。このような重鎖のみのマウスの作製において使用するための標的ベクターは、実施例１で記載したようにマウス生殖細胞系列ＩｇＨ座位を適切なベクター内に配置することによって構築することができる。ＫＴ３ｍＡｂの再編成されたＶＨＤＪＨ部分は、図５Ｄに示されるようにＪＤＶセグメントの代わりに、ＪＨクラスター内でＩｇＨ座位のマウスμ定常領域の上流側に配置される。Ｇ１サブタイプであるが、ヒンジ領域に存在して鎖間ジスルフィド架橋に関与するシステインをコードするコドンの５’近位で切断され、Ｆａｂ部分を生じさせ、従って次にＦ（ａｂ’）２抗体も産生する配列を表す第１のマウス重鎖定常領域は、抗体重鎖定常領域（図５Ｄに示されるＩｇＧ３、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂ）をコードするマウス生殖細胞系列ＤＮＡを置換し、ヒトＩｇＧ１領域がマウスＳγ３スイッチ配列に作動可能に連結されるように、Ｓγ３スイッチ配列を表すマウス生殖細胞系列ＤＮＡのすぐ下流側に、そしてＳεスイッチ配列の上流側に挿入される。Ｇ１サブタイプであり、そしてまたヒンジ領域に存在して鎖間ジスルフィド架橋に関与するシステインをコードするコドンの５’近位で切断され、Ｆａｂ部分を生じさせ、、従って次にＦ（ａｂ’）２抗体も産生する配列を表し、そしてリンカーおよびＥＧＦＰに組換えにより結合された第２のマウス重鎖γ定常領域は、Ｃε抗体重鎖定常領域をコードするマウス生殖細胞系列ＤＮＡを置換し、ヒトＦａｂコード化重鎖定常領域がマウスＳεスイッチ配列に作動可能に連結されるように、Ｓεスイッチ配列を表すマウス生殖細胞系列ＤＮＡのすぐ下流側に、そしてマウスＳαスイッチ配列の上流側に挿入される。次に、標的構築物は、相同組換えによりマウスＥＳ細胞の生殖細胞系列座位内に配置され、実施例１のように、重鎖のみの動物が得られる。軽鎖動物は実施例１のように、ＫＴ３抗体に対して同様にして発生される。軽鎖のみの動物およびこの重鎖のみの動物から得られる子孫動物は、ＫＴ３抗体の重鎖の再編成されたＶＨＤＪＨ部分、および（ａ）ＬＰＳで攻撃されたときに、Ｆａｂ断片をもたらす切断されたＩｇＧ定常領域、または（ｂ）Ｆａｂ断片をもたらし、そしてＥＧＦＰタンパク質に連結された切断されたＩｇＧ定常領域を有する抗体を産生するＢ細胞を有し得る。ノックインマウスが作製されたら、これらは所与の抗原で免疫化され得る。特異的ハイブリドーマを誘導する方法において、十分に成長している細胞の半分を誘発して、「リンカー−ＥＧＦＰ」にスイッチさせて、所与のｍＡｂの緑色誘導体を一度に得ることができる。
【０１７６】
本明細書において引用される全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願のそれぞれが参照によって援用されると明確にそして個別に示されているかのように、参照によってその全体が本明細書中に援用される。
【０１７７】
上記の本発明は、理解を明確にするための説明および例としていくらか詳細に記載されたが、本発明の教示を鑑みて、特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなくそこに特定の変形および変更が成され得ることは、当業者には容易には分かるであろう。
【０１７８】
【表１】
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【０１７９】
【表２】
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【０１８０】
【表３】
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【０１８１】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【０１８２】
【図１】図１および２は、「軽鎖のみ」および「重鎖のみ」のマウスの構築のための概略図である。図１には、「軽鎖のみの動物」の構築物、出発点としてＪ領域から定常領域遺伝子ＣＫまでのマウスＣＫ座位の一部を含む標的ベクターが示されている。この出発物は、相同組換えによりマウスＣＫエクソンをヒトＣＫエクソンで置換し、相同組換えによりヒト軽鎖Ｖ−Ｊ配列を定常領域ＣＫエクソンの上流側に挿入することによって、記載されるような要素を用いて改変された構築物である。マウス制御配列は保持される。標的ベクターは、マウスＥＳ細胞の生殖細胞系列座位における標的相同組換えを可能にし得る、上記の要素に隣接する配列を含む。
【図２】Ｊ領域から定常領域遺伝子（例えばＣε）までのマウスＩｇＨ座位の一部を含む標的ベクターを使用して構築され、記載されるような要素を用いて改変された「重鎖のみの動物」が示される。標的構築物は、マウスμ定常領域の上流側に配置された選択される免疫グロブリン重鎖遺伝子（例えば、ヒト、キメラまたはヒト化リード抗体から）の再編成されたＶＨＤＪＨ部分を含む。ヒト重鎖定常領域Ｇ４をコードする第２の配列は、Ｓαスイッチ（Ｓ）配列の上流側およびＳγ３スイッチ配列の下流側に組み込まれて、Ｃγ３、Ｃγ１、Ｃγ２ｂおよびＣγ２ａ重鎖定常領域セットをコードするマウス生殖細胞系列ＤＮＡを置換する。標的ベクターは、マウスＥＳ細胞の生殖細胞系列座位における標的相同組換えを可能にし得る、上記の要素に隣接する（例えば再編成されたＶＨＤＪＨ部分およびヒト重鎖定常領域Ｇ４に隣接する）配列を含む。
【図３】重鎖のみのマウスおよび軽鎖のみのマウスの交配の結果生じ、目的とするヒト、ヒト化またはキメラ抗体を発現する子孫マウスの発生のための概略図である。また、抗体の「クラススイッチ」およびヒト、キメラまたはヒト化抗体のインビボの親和性成熟を誘発するための方法も示される。
【図４】そのＢ細胞において、ヒト重鎖ε定常領域を有するＩｇＥアイソタイプ抗体を発現することができる重鎖のみのマウスの構築のための図である。マウスＣεＣＨエクソンは、所望のアイソタイプのヒトＣＨエクソンによって置換される。この方法で構築された子孫動物からのＢ細胞は、ＬａｔＹ１３６Ｆ変異マウスからのＣＤ４Ｔ細胞と接触させることができ（好ましくは、子孫動物へのＣＤ４Ｔ細胞の養子転移、または子孫動物からのＢ細胞とのＣＤ４Ｔ細胞のインキュベーションによる）、これによりＩｇＥアイソタイプの抗体の発現が誘発される。
【図５Ａ】マウスＩｇ重鎖座位を設計するために使用される重複ＢＡＣを示し、このＢＡＣは、次に、ＤおよびＪ遺伝子セグメントならびにＣ遺伝子を含有する融合組換えＢＡＣを産生するために使用される。
【図５Ｂ】ＤおよびＪ遺伝子セグメントならびにＣ遺伝子を含有する組換えＢＡＣを調製するための第１の戦略を示し、ここで、Ｄ遺伝子セグメントクラスターは欠失されて、選択可能なマーカーで置換され、重複ＢＡＣは、相同組換え技法により融合される。
【図５Ｃ】ＤおよびＪ遺伝子セグメントならびにＣ遺伝子を含有する組換えＢＡＣを調製するための第２の戦略を示し、ここで、Ｄ遺伝子セグメントクラスターは欠失されて、第１のＢＡＣの選択可能なマーカーで置換され、選択可能なマーカーは第２のＢＡＣに導入され、重複ＢＡＣが連結される。
【図５Ｄ】図５Ｂおよび５Ｃのステップからそれぞれ得られるＢＡＣ  ＲＰ２３−３５１Ｊ１９ｐｕｒｏおよびＲＰ２３−３５１Ｊ１９ｐｕｒｏ／ｂｌａｓｔと、ヒトＩｇＧ１Ｃ遺伝子をコードする配列によって、マウスＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３ｃ、ＩｇＧ２ａ遺伝子をコードする配列を置換するために使用される戦略とを示しており、ここで、（ｉ）ヒトＩｇＧ１定常（Ｃ）遺伝子カセットが構築され、相同組換え技法によりＢＡＣに挿入される、そして（ｉｉ）重鎖可変領域遺伝子（ＶＨＤＨＪＨＩＰＨ１）を含有するカセットが構築され、相同組換え技法によりＢＡＣに挿入される。
【図５Ｅ】マウスＩｇＣカッパ座位の設計のための３つのステップの最初を示しており、これによりマウスＩｇカッパ遺伝子を含有するＢＡＣの部分がベクターにサブクローニングされる。
【図５Ｆ】マウスＩｇＣカッパ座位の設計のための３つのステップの第２および第３番目を示しており、これにより、図５Ｅのベクターは、（ｉ）ＶＫＪＫＩＰＨ１遺伝子のプロモーターと、ハイブリドーマＩＰＨ１から単離済みのＶＫＪＫＩＰＨ１遺伝子自体とに対応するゲノム断片、および（ｂ）マウスＣＫ遺伝子を置換するヒトＣＫ遺伝子を受け取る。両方の要素とも、相同組換え技法によって導入される。
【図６】ＫＴ３ｍＡｂのＦａｂ−リンカーＥＧＦＰバージョンの構築の原理を試験するために使用されるベクターの配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年3月19日(2008.3.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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